(57)【要約】【課題】ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、ヒト間葉系幹細胞を高度に濃縮する方法、及びそれに用いられるキットを提供すること。【解決手段】フローサイトメトリー等を用いて、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、CD271+CD90+細胞を回収する。また、その細胞集団に血球細胞が含まれる場合（例えば、骨髄、末梢血等から調製した細胞集団）には、CD45-CD235a-CD271+CD90+細胞を回収する。これらの細胞分画には、自己複製能、自己増殖能、及び多分化能を兼ね備えた間葉系幹細胞を高純度に含む。  従って、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、CD271+CD90+細胞を回収すれば、ヒト間葉系幹細胞を高度に濃縮することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト間葉系幹細胞を濃縮する方法であって、
ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、CD271(LNGFR)及びCD90(Thy-1)を発現しているCD271+CD90+細胞を選別する工程を包含するヒト間葉系幹細胞濃縮方法。
【請求項２】
抗CD271(LNGFR)抗体及び抗CD90(Thy-1)抗体を用いて、CD271+CD90+細胞を選別することを特徴とする請求項１に記載のヒト間葉系幹細胞濃縮方法。
【請求項３】
骨髄から前記細胞集団を調製する工程を包含することを特徴とする請求項１又は２に記載のヒト間葉系幹細胞濃縮方法。
【請求項４】
前記細胞集団を調製する工程が、骨髄をコラゲナーゼで処理する工程を包含することを特徴とする請求項３に記載のヒト間葉系幹細胞濃縮方法。
【請求項５】
G-CSF投与後の末梢血から前記細胞集団を調製する工程を包含することを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載のヒト間葉系幹細胞濃縮方法。
【請求項６】
CD45及びCD235aを発現していないCD45-CD235a-細胞を選別する工程を包含することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のヒト間葉系幹細胞濃縮方法。
【請求項７】
抗CD45抗体及び抗CD235a抗体を用いて、CD45-CD235a-細胞を選別することを特徴とする請求項６に記載のヒト間葉系幹細胞濃縮方法。
【請求項８】
フローサイトメトリーを用いて細胞を選別することを特徴とする請求項２又は７に記載のヒト間葉系幹細胞濃縮方法。
【請求項９】
抗CD271抗体と、
抗CD90抗体と、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１０】
さらに、抗CD45抗体と、
抗CD235a抗体と、
を含むことを特徴とする請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
さらに、コラゲナーゼを含むことを特徴とする請求項９又は１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表面抗原を用いてヒト間葉系幹細胞を濃縮する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、骨芽細胞、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞等間葉系細胞への多分化能及び自己増殖能を有しているため、骨や軟骨、筋肉等の再生医療への応用が期待されている。
【０００３】
従来、間葉系幹細胞は、骨髄等の組織から得た細胞を長期間培養した後に、培養皿に付着した細胞を増殖することによって単離されていた。そのため、培養条件が異なったり、実験者の習熟度が悪かったり、個々の手法が異なったりすると、最終的に得られる間葉系幹細胞の分化能にばらつきが生じていた。このことは間葉系幹細胞の純度や品質を管理する上で大きな問題となっていた。
【０００４】
そこで、間葉系幹細胞を表面抗原マーカーを用いて単離する技術が開発され、これまでに、CD10、CD13、CD73(ecto-5' nucleotidase, SH3, SH4)、CD105(endoglin, SH2)、 CD166(ALCAM)等が間葉系幹細胞の陽性マーカーとして、CD34、CD45等が陰性マーカーとして同定されており、最近では、さらにCD271(LNGFR)、CD140b(PDGFR-β)、CD340(HER-2/erbB2)、CD349(frizzled-9)等が利用されている（非特許文献１参照）が、高純度で均一な間葉系幹細胞を得るにはまだ不十分であった。
【非特許文献１】Buhring Hans-Jorg, et al, Novel markers for the prospective isolation of human MSC, Annals of the New York Academy of Sciences, annals-1392-000, Haematopoietic Stem Cells VI, 10-Nov-2006.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような現状から、自己複製能、自己増殖能、及び多分化能を兼ね備えた間葉系幹細胞を、より高純度かつ均一に分離する方法が望まれていた。
【０００６】
そこで、本発明は、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、ヒト間葉系幹細胞を高度に濃縮する方法、及びそれに用いられるキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、以下の実施例に示すように、フローサイトメトリーを用いてヒト骨髄に含まれる細胞集団からCD45及びCD235aを発現せず、CD271及びCD90を発現しているCD45-CD235a-CD271+CD90+細胞を回収して解析を行ったところ、この細胞分画には、高いCFU-F (線維芽細胞コロニー形成単位）活性を有し、かつ、骨芽細胞、軟骨細胞、及び脂肪細胞等に分化し得る能力を有する間葉系幹細胞が高純度に含まれていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明にかかるヒト間葉系幹細胞濃縮方法は、ヒト間葉系幹細胞を濃縮する方法であって、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、CD271(LNGFR)及びCD90(Thy-1)を発現しているCD271+CD90+細胞を選別する工程を包含する。前記方法は、抗CD271(LNGFR)抗体及び抗CD90(Thy-1)抗体を用いて、CD271+CD90+細胞を選別してもよい。ここで、前記方法は、骨髄から前記細胞集団を調製する工程や、G-CSF投与後の末梢血から前記細胞集団を調製する工程を包含してもよい。なお、前記細胞集団を調製する工程は、骨髄をコラゲナーゼで処理する工程を包含していてもよい。
【０００９】
さらに、本発明にかかるヒト間葉系幹細胞濃縮方法は、CD45及びCD235aを発現していないCD45-CD235a-細胞を選別する工程を包含してもよい。前記方法は、抗CD45抗体及び抗CD235a抗体を用いて、CD45-CD235a-細胞を選別してもよい。
【００１０】
また、本発明にかかるヒト間葉系幹細胞濃縮方法は、フローサイトメトリーを用いて細胞を選別することもできる。
【００１１】
本発明にかかるキットは、抗CD271抗体と抗CD90抗体とを含む。前記キットは、さらに、抗CD45抗体と抗CD235a抗体とを含んでいてもよい。また、前記キットは、さらに、コラゲナーゼを含んでいてもよい。
【００１２】
なお、「（特定の）細胞を濃縮する」とは、細胞集団中で、当該特定の細胞の比率を高めることを言う。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、ヒト間葉系幹細胞を高度に濃縮する方法、及びそれに用いられるキットを提供することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明の実施の形態において実施例を挙げながら具体的かつ詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。  
市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１５】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１６】
（１）ヒト間葉系幹細胞濃縮方法
本明細書において、間葉系幹細胞とは、CFU-F(線維芽細胞コロニー形成単位）活性を有し、かつ、骨芽細胞、骨細胞、脂肪細胞への多分化能を有する細胞である。なお、この間葉系幹細胞は、分化誘導の条件によって、軟骨細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞等へも分化することができると考えられる。
【００１７】
本発明者らは、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、CD271+CD90+細胞分画を選別することにより、間葉系幹細胞を高度に濃縮することを可能にした。なお、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団に血球系細胞が含まれる場合は、非血球系の細胞を選別するために、CD45-CD235a-細胞を選別する工程を加えてもよい。
【００１８】
以下、具体的なヒト間葉系幹細胞濃縮方法について説明する。  
本発明のヒト間葉系幹細胞濃縮方法は、細胞集団調製工程、及びヒト間葉系幹細胞選別工程を含む。
【００１９】
（i）細胞集団調製工程
本工程では、フローサイトメトリーやアフィニティー・クロマトグラフィーによってヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団を調製する。この細胞集団は、ひきつづき表面抗原の発現による選別操作がなされるため、この調製過程で、個々の細胞をばらばらに分離し、不必要な細胞を除去しておくことが好ましい。  
この細胞集団を得るための材料は特に限定されないが、例えば、骨髄や末梢血（G-CSF投与後の末梢血を含む）等が挙げられる。なお、骨髄は、脊椎、胸骨、腸骨等の骨髄を用いればよい。
【００２０】
これらの材料から目的の細胞集団を調製する際、例えば骨髄のように、この材料が間葉系幹細胞を巻き込んだ細胞塊になっている場合には、含まれている細胞を解離するために、材料に対してピペッティング等による物理的処理や、酵素等による化学的処理を行えばよい。酵素としては、トリプシン、コラゲナーゼ等、常法で用いられている酵素が使用できるが、コラゲナーゼで処理することが好ましい。解離処理後、完全に個々の細胞に分離せず、細胞塊が残るような場合など、メッシュ等を用いて細胞塊を除去することが好ましい。
【００２１】
また、末梢血から目的の細胞集団を得る場合のように、材料に赤血球が混入している場合には、予め赤血球を溶血しておくことが好ましい。そのための方法は特に限定されないが、例えば、材料を低張溶液（例えば、水等）で処理すればよい。
【００２２】
このように、用いる材料に対して適切な処理を行って、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団を調製する。
【００２３】
（ii）ヒト間葉系幹細胞選別工程
本工程では、「（i）細胞集団調製工程」で調製した細胞集団を用い、CD271+CD90+細胞を生きたまま選別する。  
ここで、CD271+CD90+細胞を選別する方法は、特に限定されない。例えば、CD271(LNGFR)は、ニューロトロフィン（NGF、BDGF、NT-3、NT-4）をリガンドとするレセプターなので、いずれかのリガンドをin vitroで発現させて精製したタンパク質を用いたアフィニティー・クロマトグラフィーによってCD271+細胞を選別することができるが、簡便さの点で、以下のように抗体を用いるのが好ましい。
【００２４】
本工程に用いられる抗体は、CD271+CD90+細胞を選別することが可能な、抗CD271抗体及び抗CD90抗体である。例えば、フローサイトメトリーを用いる場合には、FITC、PE、APC等の異なる蛍光色素で標識された抗CD271抗体と抗CD90抗体を、適宜組み合わせて用いることにより、生細胞を短時間で選別することが可能になる。フローサイトメトリー以外にも、磁気ビーズを用いる方法やアフィニティー・クロマトグラフィーを用いる方法によって、CD271+CD90+細胞を生細胞のまま選別することが可能である。抗体の種類（モノクローナル抗体かポリクローナル抗体か、IgGかIgMか、抗体分子かFab断片か、等）、及び抗体の濃度に関しては、使用者が、細胞集団の種類、抗体の活性、抗体の使用方法等によって適宜選択することができる。
【００２５】
なお、これらの方法を用いる前に、予め、死細胞を染色する蛍光色素（例えば、PI（プロピジウムアイオダイド））を細胞集団と反応させ、蛍光で染色された細胞を除去することにより、死細胞を除去してもよい。
【００２６】
また、細胞集団に血球細胞が含まれている場合には、CD45-CD235a-細胞を選別する工程を含むことが好ましい。選別方法は特に限定されないが、同様に、蛍光標識抗体を用いたフローサイトメトリーや磁気ビーズやアフィニティー・クロマトグラフィーを用いる方法によって、細胞集団からCD45-CD235a-細胞を選別することができる。なお、CD45-CD235a-細胞の選別は、CD271+CD90+細胞の選別前であっても、選別と同時であっても、選別後であっても構わない。  
以上のようにして、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、CD271+CD90+細胞を選別する。
【００２７】
（２）本発明のヒト間葉系幹細胞濃縮方法の有用性
現在、再生医療の分野では、移植組織が他人（ドナー）から供与される場合、ドナー不足や移植組織の拒絶反応が問題となっている。しかしながら、本発明のヒト間葉系幹細胞濃縮方法は、患者自身の、骨髄、末梢血、又はG-CSF投与後の末梢血等から、患者自身の間葉系幹細胞を高度に濃縮することができる。従って、本発明のヒト間葉系幹細胞濃縮方法を用いれば、患者自身の少量の組織から、患者自身の間葉系幹細胞を効率よく選別することができ、この細胞を、骨芽細胞、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞等へ再生させたい部位に自家移植すれば、所望の細胞や組織を効果的に再生することができると共に、ドナー不足や拒絶反応等の問題を解消することもできる。
【００２８】
（３）キット
本発明の方法を用いてヒト間葉系幹細胞を簡便に濃縮できるように、抗CD271抗体及び抗CD90抗体を、キット化してもよい。ヒト間葉系幹細胞を濃縮する際に、血球細胞を除去したい場合には、上記キットに、抗CD45抗体、抗CD235a抗体を含ませてもよい。また、所望の材料から細胞集団を効率よく調製するために、上記キットに、コラゲナーゼ等の酵素を含ませてもよい。なお、これらの抗体は、市販のものでも、当業者に公知の技術によって作製したものでもよい。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を用いて、以上に説明した実施態様を具体的に説明するが、これは例示であって、本発明をこの実施例に限定するものではない。
【００３０】
＜実施例１：CD45-CD235a-CD271+CD90+細胞の選別＞
（１）細胞集団の調製
材料は、呼吸器外科の手術時に余剰になったヒト肋骨片を使用した。また、材料が不足した場合には、Cambrex社より購入した骨髄（カタログ番号：2M-125C,2M-125D）も使用した。
【００３１】
まず、肋骨片（1cm×1cm）を、PBSで洗浄し、外科用ハサミを用いて細かくきざんだ後、HBSS+（calcium- and magnesium-free Hanks-balanced salt solution supplemented with 2% FCS, 10 mM HEPES, and 1% penicillin/streptomycin）に懸濁し、液体部分を吸引して除去した。
【００３２】
次に、残った骨片をハサミでさらに細かく刻んだ後、その骨片を0.2%コラゲナーゼ溶液(Wako 032-10534 10mM HEPESと1% P/S)に入れ、振盪機で、37℃で1時間インキュベートした。なお、コントロールとして、0.2％コラゲナーゼ溶液を入れないで残った骨片を処理し、同様の実験を行った。
【００３３】
最後に、コラゲナーゼ処理したサンプルを、セルストレーナー（ファルコン2350）で濾過し、骨の破片を除去した後、得られた細胞懸濁液を4℃で7分間遠心分離（×1200rpm）した。遠心分離後、細胞集団に混入している赤血球を除去するため、ペレットに1mlの水（SigmaW3500）を入れて5〜10秒間攪拌した後、レスキュー溶液（4%FBS・2×PBS Sigma D1408）に再懸濁した。このサンプルを再度セルストレーナーで濾過し、赤血球の破片を除去し、ヒト骨髄細胞懸濁液を得た。
【００３４】
なお、Cambrex社より購入した骨髄は、液体窒素にて凍結された状態で保存し、実験ごとに解凍して使用した。はじめに、HBSS+溶液にDNaseIを加えた溶液（以下、DNaseI HBSS+溶液とする）を37℃の恒温槽にて温めた。凍結骨髄（2M-125C、2M-125D）が入ったバイアルを37℃の恒温槽につけ、最後のひとかけらが残るくらいまで（約1、2分間）すばやく解凍した。骨髄細胞をDNaseI HBSS+溶液にて懸濁し15ml遠沈管に移した。さらにトータルボリュームが10mlになるまでDNaseI HBSS+溶液加え、室温で7分間遠心分離（×1200rpm）した。遠心分離後、細胞ペレットを崩さないようにピペットで上清を除去し、新たなDNaseI HBSS+溶液1mlで再懸濁し、ヒト骨髄細胞懸濁液を得た。
【００３５】
（２）抗体反応
上記方法によって得られたヒト骨髄細胞懸濁液を、2.5〜5×107cells/mlの濃度になるようにHBSS+に懸濁した。
【００３６】
次に、ヒト骨髄細胞2.5〜5×107cellsに対して、1倍希釈FITC標識抗ヒトCD45抗体（DAKO）を50μl、1倍希釈FITC標識抗ヒトCD235a（GlycophotinA）抗体（DAKO）を50μl、1倍希釈PE標識抗ヒトCD271（low-affinity nerve growth factor receptor）抗体（Miltenyi Biotec）を50μl、及び1倍希釈APC標識抗CD90（Thy-1）抗体（BD Biosciences Pharmingen）を50μl加え、氷上にて30分間反応させた。
【００３７】
反応後、上記細胞懸濁液に10ml HBSS+を加え、その懸濁液を4℃で7分間遠心分離（×1200rpm）した。上清を捨てて得られたペレットに2μg/ml propidium iodide (PI)（Sigma Chemical Co.)含有HBSS+を入れ、1×107cell/mlの濃度になるように懸濁した。この懸濁溶液に対し、滅菌した60mm以下のナイロンメッシュフィルター（Miltenyi Biotec）を用いて、懸濁液中の細胞塊をとり除き、得られた細胞浮遊液を以下のフローサイトメトリーによる解析（FACS解析）に使用した。
【００３８】
なお、上記抗体の細胞への非特異的な結合を検定するためのコントロールには、FITC標識抗MouseIgG1,kappa抗体（eBioscience）、PE標識抗 Mouse IgG1 抗体（eBioscience）、APC標識抗 MouseIgG1,kappa抗体（eBioscience）を用いた。
【００３９】
（３）ヒト間葉系幹細胞の分画
抗体と反応させた骨髄細胞を、各抗体の反応性によりFACSを用いて分画した。FACSには、488nmアルゴンレーザー、600〜650nm REDレーザーが搭載されているMoFlo及びFACS Vantageを使用した。
【００４０】
まず、1×105イベント分のデータを取り込み、PI陽性細胞をゲートアウト（図1(a)）した。次にCD45-CD235a-分画にゲート（図1(b)）を設定した。最後に、横軸をCD90 (Thy-1)と、縦軸をCD271 (LNGFR)とし、共陽性分画にゲートを設定した。その後、CD45-CD235a-CD271+CD90+細胞、CD45-CD235a-CD271+CD90-細胞、CD45-CD235a-CD271-CD90+細胞、CD45-CD235a-CD271-CD90-細胞、CD45-CD235a-CD271+細胞、CD45-CD235a-CD271-細胞、CD45-CD235a-CD90+細胞、CD45-CD235a-CD90-細胞に分画し、これらの細胞を回収した。なお、非血球細胞数に対して、CD45-CD235a-CD271+CD90+細胞は0.04％、CD45-CD235a-CD271+CD90-細胞は1.73％、CD45-CD235a-CD271-CD90+細胞は0.1％、CD45-CD235a-CD271-CD90-細胞は98％であった（図1(c)を参照のこと）。
【００４１】
＜実施例２：CD45-CD235a-CD271+CD90+細胞の機能解析＞
（１）コラゲナーゼ処理の効果
まず、コラゲナーゼ処理を行った細胞懸濁液及びコラゲナーゼ処理を行わない細胞懸濁液を用い、ソーティングによって得られたCD45-CD235a-CD271+CD90+細胞分画の細胞を増殖培養液（DMEM: GIBCO11885 + 20%FBS:Hyclone +b FGF+10mM HEPES +1％P/S）に懸濁した。そのうち、96穴培養皿のウエルあたり、5×103、1×104、1×105個の細胞を播種し、37℃ 5％CO2インキュベーターにて培養した。4日後に培養上清を除去し、新しい増殖培養液を入れた。培地交換は3〜4日ごとに行なった。10日後、細胞がコンフルエントになったウエルを数え、その割合を図２に表した。  
その結果、いずれの細胞密度においても、骨髄をコラゲナーゼ処理することにより、CD45-CD235a-CD271+CD90+細胞は、高い回収率で回収された。
【００４２】
（２）CD271+CD90+選別の効果
実施例１に示す各分画に対して、増殖培養液（DMEM: GIBCO11885 + 20%FBS:Hyclone +b FGF+10mM HEPES +1％P/S）に懸濁した細胞100〜8000個を35mm培養皿に播種し、37℃ 5％CO2インキュベーターにて培養した。4日後に培養上清を除去し、新しい増殖培養液を入れた。培地交換は3〜4日ごとに行なった。10日後、位相差顕微鏡にて培養皿を観察し、50個以上の細胞からなるコロニーをカウントした。このようにして、播種した細胞の個数のうち、いくつの細胞がコロニーを形成したかを測ることにより、CFU-F(線維芽細胞コロニー形成単位）活性を有する細胞の頻度を比較した。なお、WBM(whole bone marrow)とは全骨髄細胞を示す。
【表１】
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【００４３】
その結果、表１に示す通り、CD90+細胞のみ、あるいはCD271+細胞のみによる選別に比べ、CD271+CD90+細胞による選別によって、CFU-F(線維芽細胞コロニー形成単位）活性を有する細胞は、それぞれ約50倍及び約27倍濃縮できることが分かった。一方、WBM、CD90-細胞のみ、CD271-細胞のみによる選別では、CFU-F活性を有する細胞は認められなかった。また、WBM100000個を100mm培養皿に、CD90-細胞300000個をT75培養フラスコに、CD271-細胞240000個をT75培養フラスコに播種して、上記と同様の実験を行ったが、CFU-F活性を有する細胞は認められなかった。
【００４４】
さらに、文献（Aslan H, Zilberman Y, Kandel L, et al. Osteogenic differentiation of noncultured immunoisolated bone marrow-derived CD105+ cells. Stem Cells. 2006;24:1728-1737.、及びQuirici N, Soligo D, Bossolasco P, et al. Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies. Exp Hematol. 2002;30:783-791.）に記載の数値と比較しても、CD105+細胞のみ（Aslan H, Zilberman Y, Kandel L, et al. Osteogenic differentiation of noncultured immunoisolated bone marrow-derived CD105+ cells. Stem Cells. 2006;24:1728-1737.）、あるいはCD271+細胞のみ（Quirici N, Soligo D, Bossolasco P, et al. Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies. Exp Hematol. 2002;30:783-791.）による選別に比べ、CD271+CD90+細胞による選別によって、CFU-F活性を有する細胞の濃縮率は、はるかに高かった。なお、抗105抗体は内皮細胞、初期のBリンパ球、単球を認識する抗体である。
【表２】
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【００４５】
（２）分化アッセイ
（i）骨芽細胞への分化
（a）分化誘導
CFU-Fアッセイを行った後のCD271+CD90+細胞を継代し、コンフルエントになった状態で、培地を増殖培養液から骨芽細胞誘導培地（CAMBREX PT-4120）に交換し、37℃ 5％CO2インキュベーターにて培養した。3〜4日ごとに新しい骨分化誘導培地に交換し、2週間分化誘導を行った。
【００４６】
（b）染色
分化誘導した細胞を4％PFAにて室温で10分間固定し、その後、PBSで5分間の洗浄を3回行った。アルカリフォスファターゼ（ALP）基質キットであるヒストファイン(株式会社ニチレイバイオサイエンス Code,415161)を用いて、骨芽細胞の染色を行なった。
【００４７】
その結果、図３に示すように、桃色〜赤色に染まった骨芽細胞が認められ（図３では、灰色〜黒色に相当）、骨芽細胞へ分化することが示された。
【００４８】
（ii）脂肪細胞分化アッセイ
（a）分化誘導
CFU-Fアッセイを行った後のCD271+CD90+細胞を継代し、コンフルエントになった状態で、培地を増殖培養液から脂肪細胞誘導培地（CAMBREX PT-4135）に交換し、37℃ 5％CO2インキュベーターにて培養した。3日後に脂肪細胞維持培地（CAMBREX PT-4122）に交換し、その後3〜4日ごとに脂肪細胞誘導培地と脂肪細胞維持培地とを交互に交換し、2週間分化誘導を行った。
【００４９】
（b）染色
分化誘導した細胞を4％PFAにて室温で10分間固定し、その後、PBSで5分間の洗浄を3回行った。オイルレッドO染色溶液(武藤化学株式会社, Lot No,060822)を用いて、脂肪細胞の染色を行った。  
その結果、図３に示すように、赤色に染まった脂肪細胞の油滴が認められ（図３では、灰色〜黒色に相当）、脂肪細胞へ分化することが示された。
【００５０】
（iii）軟骨分化アッセイ
（a）分化誘導
CFU-Fアッセイを行った後のCD271+CD90+細胞を継代し、細胞数が2×105cellsになったところで、これらの細胞を軟骨細胞誘導培地（CAMBREX PT-4121）に懸濁し、15ml遠沈管に移した後、5分×150gで遠心した。上清を除去し、軟骨細胞誘導培地+TGF-β3（CAMBREX PT-4124）+BMP-6（R&D Systems 507-BP/CF）に懸濁した。5分×150g遠心した後、ペレット状の細胞をそのまま37℃・5％CO2インキュベーターにて培養した。3〜4日ごとに新しい軟骨分化誘導培地と交換し、3週間分化誘導を行った。
【００５１】
（b）染色
分化誘導した細胞塊を4％PFAにて室温で1時間固定し、その後、PBSで5分間の洗浄を3回行った。次いで、細胞塊をパラフィン包埋し、6μmにスライスした。0.05％トルイジンブルー溶液（pH4.1 Wako 209-14545）を用いて、切片を染色した。  
その結果、図３に示すように、紫色に染まった軟骨に特有な多糖類が認められ（図３では、灰色〜黒色に相当）、軟骨への分化が明らかになった。  
このように、CD45-CD235a-CD271+CD90+細胞は、間葉系細胞である骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞への分化能を有する。そして、ヒト骨髄に含まれる細胞集団から、CD45-CD235a-CD271+CD90+細胞を選別すれば、ヒト間葉系幹細胞を高度に濃縮することができる。
【００５２】
＜実施例３：間葉系幹細胞が存在する組織の検討＞
本実施例では、間葉系幹細胞は、骨髄、末梢血、及びG-CSF投与後の末梢血には存在するが、臍帯血には存在しないことを示す。  
ヒト臍帯血、末梢血、及びG-CSF投与後の末梢血は、廃棄される患者検体を使用した。また、実施例1に記載の方法を用いて、ヒト臍帯血、末梢血、及びG-CSF投与後の末梢血から細胞集団を調製し、FACS解析を行った。  
その結果、図４に示すように、CD45-CD235a-CD271+CD90+細胞は、CD45陰性CD235a陰性分画にゲートを設定した場合、骨髄中では0.01〜0.04％、G-CSF投与後の末梢血では0〜0.015％、末梢血では0〜0.008％含まれていた。一方、CD45-CD235a-CD271+CD90+細胞は、臍帯血には含まれていなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の一実施例において、ヒト骨髄細胞と、PI、抗CD45抗体、抗CD235a抗体、抗CD271抗体、及び抗CD90抗体との反応性を、フローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、ヒト骨髄から回収される間葉系幹細胞の回収率に対するコラゲナーゼ処理の効果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、フローサイトメトリーを用いてCD45-CD235a-CD271+CD90+細胞を回収し、当該細胞の多分化能を検討した結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、CD45-CD235a-CD271+CD90+細胞が骨髄以外の組織にも存在することを、フローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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