(57)【要約】【課題】  ヘモグロビン含有溶液中のヘモグロビンが変質することを防止するための安定化剤を提供することである。【解決手段】  ヘモグロビン含有溶液中のヘモグロビンが変質することを防止するための安定化剤であって、一般式（１）で表されるアシルアルギニンエステル（Ａ）及び／又はその塩（Ａ’）、並びにカチオン性界面活性剤（Ｂ）を含有するヘモグロビン安定化剤。【化１】2009222710.tif 000009式中、Ｒ1は水素原子又はヘテロ原子を含んでもよい炭素数１〜２１の１価の炭化水素基、Ｒ2はヘテロ原子を含んでもよい炭素数１〜２１の１価の炭化水素基を表す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビン含有溶液中のヘモグロビンが変質することを防止するための安定化剤であって、一般式（１）で表されるアシルアルギニンエステル（Ａ）及び／又はその塩（Ａ’）、並びにカチオン性界面活性剤（Ｂ）を含有するヘモグロビン安定化剤。
【化１】
2009222710.tif 000007
［式中、Ｒ1は水素原子又はヘテロ原子を含んでもよい炭素数１〜２１の１価の炭化水素基、Ｒ2はヘテロ原子を含んでもよい炭素数１〜２１の１価の炭化水素基を表す。］
【請求項２】
カチオン性活性剤（Ｂ）が、一般式（２）で表されるカチオン性界面活性剤である請求項１に記載のヘモグロビン安定化剤。
【化２】
2009222710.tif 000008
［式中、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は炭素数１〜２２の直鎖又は分岐の炭化水素基であり、Ｒ3〜Ｒ6のうち少なくとも１つは炭素数６以上の炭化水素基であり、Ｒ3〜Ｒ6はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ｆは１〜８の整数、Ｘf-はｆ価の有機酸のアニオンを表す。］
【請求項３】
一般式（２）におけるＸf-が、２〜５価の多価カルボン酸のアニオンである請求項２に記載のヘモグロビン安定化剤。
【請求項４】
ヘモグロビン含有溶液が便潜血検査における便溶解液である請求項１〜３のいずれかに記載のヘモグロビン安定化剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のヘモグロビン安定化剤を用いて、ヘモグロビン含有溶液中のヘモグロビンが変質することを防止する、ヘモグロビンの安定化方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のヘモグロビン安定化剤を含有する、ヒトヘモグロビン測定用採便容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン安定化剤及びヘモグロビンの安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、大腸癌などの下部消化器の疾患を検査する方法として、消化器官からの出血に起因する便中の便潜血成分、特にヒトヘモグロビンの検出が広く行われている。このようなヒトヘモグロビンの検出方法としては、食品摂取や薬剤投与の制限を必要としない免疫学的検出法が手軽な検査法として普及している。
【０００３】
上記の免疫学的検出法としては、例えば、寒天平板内で抗ヒトヘモグロビン抗体と被検試料中のヒトヘモグロビンとの沈降線を利用する一次元免疫拡散法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した動物血球を用いる逆受身血球凝集法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したラテックス粒子を用いるラテックス凝集法、酵素や放射性元素で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を用いる酵素免疫法や放射性免疫法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した金コロイド粒子を用いる金コロイド凝集法等があげられる。
【０００４】
上記の検出法において、被検物質であるヒトヘモグロビンは、通常、溶液状態で検査に供される。例えば、便潜血検査では、便を生理食塩水や緩衝液中に溶解し、その溶液をヒトヘモグロビン測定用の被検試料として用いている。
【０００５】
しかし、被検液中のヒトヘモグロビンは、温度上昇及び時間経過に伴い、変性・分解を生じることが知られている。ヒトヘモグロビンの変性・分解は抗原決定基の失活につながり、従来からの免疫学的検出方法では検出感度が著しく低下する。特にヒトヘモグロビンが低濃度である場合には、変性・分解により検出感度以下となり、診断的判断を誤ることになる。同様に、ヒトヘモグロビンの変性が、検査性能の確認や定量を行うために利用する陽性コントロ−ル液やヒトヘモグロビン標準溶液中で生じ、正確な測定の障害となっている。
【０００６】
ところで、便潜血検査の実情は、被験者自身が自宅などで採便し、これを便溶解液に溶かし、郵送又は被験者が病院へ持参するため、検査機関における検査までに溶液状態で数日間要することが多い。また、検査機関で採便する場合においても、他項目の検査も実施しているため、検査までに多くの時間を要する場合もある。このような検査の状況下では、前述のようにヒトヘモグロビンの変性・分解が生じ好ましくない。
【０００７】
このようなヒトヘモグロビンの変性・分解を防止する目的で、便潜血検出用の便溶解液に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）やチメロサ−ル、アジ化ナトリウム等の一般的抗菌剤を添加する方法が知られている。
【０００８】
このほかにも、動物血清を添加する方法（特許文献１）、糖類を添加する方法（特許文献２）、アジ化ナトリウム、アルブミン及び乳酸を添加する方法（特許文献３）、溶菌酵素を添加する方法（特許文献４）、プロテア−ゼ阻害物質を添加する方法（特許文献５）、ｐＨをコントロ−ルする方法（特許文献６）、キレ−ト試薬を添加する方法（特許文献７）、動物ヘモグロビンを添加する方法（特許文献８）、ヘモグロビン以外の鉄タンパクとフェリシアンイオンとを添加する方法（特許文献９）、家兎アルブミン、グリシン、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩のいずれかを添加する方法（特許文献１０）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平４−１４５３６６号公報
【特許文献２】特開昭６３−２４３７５６号公報
【特許文献３】特開平６−２８１６５４号公報
【特許文献４】特開平５−６９４６６号公報
【特許文献５】特開平３−２７９８５９号公報
【特許文献６】特開平５−２８１２２６号公報
【特許文献７】特開平５−９９９２３号公報
【特許文献８】特開平２−２９６１４９号公報
【特許文献９】特開平８−２６２０２０号公報
【特許文献１０】特開平９−６１４３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、これらの公知のヒトヘモグロビン安定化技術では、便を含む被検液中のヒトヘモグロビンの変性・分解を十分に抑制できるとは言えず、更なる安定化のための新たな技術が切望されている。
【００１１】
また、ヘモグロビン溶液中に安定化剤として添加される物質は、特に便潜血検査では、便を懸濁保存する便溶解液が、採便容器中で長期間室温で流通する可能性が高いため、それ自身物質的に安定で均質なものが望ましい。
【００１２】
本発明の目的は、ヘモグロビンの新規な安定化剤を提供することである。さらに具体的には、便を含む被検試料中のヘモグロビンを安定化することで、より正確なヘモグロビンの測定を行うことを可能とするヘモグロビンの安定化剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。すなわち、本発明は、ヘモグロビン含有溶液中のヘモグロビンが変質することを防止するための安定化剤であって、一般式（１）で表されるアシルアルギニンエステル（Ａ）及び／又はその塩（Ａ’）、並びにカチオン性界面活性剤（Ｂ）を含有するヘモグロビン安定化剤；前記安定化剤を用いて、ヘモグロビン含有溶液中のヘモグロビンが変質することを防止する、ヘモグロビンの安定化方法；並びに、前記安定化剤を含有するヒトヘモグロビン測定用採便容器；である。
【００１４】
【化１】
2009222710.tif 000002
【００１５】
式中、Ｒ1は水素原子又はヘテロ原子を含んでもよい炭素数１〜２１の１価の炭化水素基、Ｒ2はヘテロ原子を含んでもよい炭素数１〜２１の１価の炭化水素基を表す。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のヘモグロビン安定化剤は、ヘモグロビン含有溶液中のヘモグロビンを安定化し、変質を防ぐことができる。具体的には、便を含むヘモグロビン溶液中のヘモグロビンを安定化することによって、より正確なヘモグロビンの測定を行うことができる。従って、本発明の安定化剤及び安定化方法は、ヘモグロビンを用いる分野（各種研究開発、診断・検査薬等）において極めて有用である。また、本発明のヘモグロビン安定化剤はヘモグロビンの耐熱性を向上する効果があるため、長期安定性が向上し、保管条件も必ずしも冷蔵保管を必要としない。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の安定化剤で安定化できるヘモグロビンとしては、便中に含まれるヒトヘモグロビン、赤血球より調製したヒトヘモグロビン及びヒトヘモグロビン標品の何れもが対象となる。従って、本発明におけるヘモグロビン含有溶液は、便を含むヘモグロビン含有溶液、赤血球により調製したヘモグロビン含有溶液、又はヘモグロビン標品を含むヘモグロビン含有溶液のいずれであってもよい。
【００１８】
ヘモグロビン含有溶液のｐＨは、ヘモグロビンの安定化の観点から、好ましくは４．５〜９．０、より好ましくは５．５〜８．０である。
【００１９】
本発明におけるアシルアルギニンエステルを表す一般式（１）において、Ｒ1は水素原子又はヘテロ原子を含んでもよい炭素数１〜２１の１価の炭化水素基である。
【００２０】
ヘテロ原子を含んでもよい炭素数１〜２１の炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基等の炭化水素基、並びにアルキロキシアルキル基、アシルオキシアルキル基及びアシルアミノアルキル基等のヘテロ原子含有炭化水素基が挙げられる。
【００２１】
アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基、デシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、オクタデシル基及びエイコシル基等が挙げられる。アルケニル基としては、ビニル基、アリル基、プロペニル基、デセニル基及びオクタデセニル基等が挙げられる。アリール基としては、フェニル基及びナフチル基等が挙げられる。アルキルアリールとしては、メチルフェニル基、エチルフェニル基、オクチルフェニル基及びノニルフェニル基等が挙げられる。アリールアルキル基としては、ベンジル基及びフェニルエチル基等が挙げられる。アルキロキシアルキル基としては、メトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシメチル基、エトキシエチル基及びメトキシブチル基等が挙げられる。アシルオキシアルキル基としては、ホルミルオキシメチル基、アセチルオキシメチル基、アセチルオキシエチル基、アセチルオキシドデシル基及びアセチルオキシオクタデシル基等が挙げられる。アシルアミノアルキル基としては、アセチルアミノメチル基、アセチルアミノエチル基、アセチルアミノドデシル基、アセチルアミノオクタデシル基及びラウロイルアミノメチル基等が挙げられる。Ｒ1のうち、ヘモグロビンの安定化の観点から、好ましいのは炭素数１〜６のアルキル基である。
【００２２】
一般式（１）におけるＲ2は、ヘテロ原子を含んでもよい炭素数１〜２１の炭化水素基であり、前記Ｒ1で例示した基と同様の基が挙げられる。Ｒ2のうち、ヘモグロビンの安定化の観点から、好ましいのは炭素数１〜６のアルキル基である。
【００２３】
一般式（１）で表されるアシルアルギニンエステル（Ａ）の具体例としては、Ｎ−α−アセチルアルギニンメチルエステル、Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル、Ｎ−α−アセチルアルギニンプロピルエステル、Ｎ−α−アセチルアルギニンブチルエステル、Ｎ−α−ベンゾイルアルギニンエチルエステル、Ｎ−α−ヤシ油脂肪酸アシルアルギニンエチルエステル、Ｎ−α−ラウロイルアルギニンエチルエステル、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−アルギニンエチル、Ｎ−パルミトイル−Ｌ−アルギニンエチル、Ｎ−ステアロイル−Ｌ−アルギニンエチル、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−アルギニンプロピル、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−アルギニンプロピル、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−アルギニンプロピル、Ｎ−パルミトイル−Ｌ−アルギニンプロピル、Ｎ−ステアロイル−Ｌ−アルギニンプロピル、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−アルギニンブチル、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−アルギニンブチル、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−アルギニンブチル、Ｎ−パルミトイル−Ｌ−アルギニンブチル、Ｎ−ステアロイル−Ｌ−アルギニンブチル等が挙げられる。これらのうち、ヘモグロビンの安定化の観点から、Ｎ−α−アセチルアルギニンメチルエステル、Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステルが好ましい。
【００２４】
アシルアルギニンエステルの塩（Ａ’）としては、無機酸塩及び有機酸塩が挙げられる。無機酸塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩及び炭酸塩等が挙げられる。有機酸塩としては、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、りんご酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、酒石酸塩、グルタミン酸塩及びその誘導体の塩、アスパラギン酸塩及びその誘導体の塩、グリコール酸塩、並びにピロリドンカルボン酸塩等が挙げられ、これらはいずれの光学異性体も使用することができる。
【００２５】
本発明におけるアシルアルギニンエステル（Ａ）及びその塩（Ａ’）は、アミノ酸の通常のエステル化反応を利用して得ることができ、具体的には、Ｎ−α−アシルアルギニン及びアルコール［一般式（１）におけるＲ2を炭化水素基とするアルコール］とをエステル化することによって得ることができ、塩はさらに対応する酸で中和することによって得ることができる。Ｎ−α−アシルアルギニンの市販品としては、Ｎ−α−アセチルアルギニン（エムピーバイオジャパン社製）等が挙げられる。エステル化の触媒としては、メタンスルホン酸又は塩化チオニル等の酸触媒が好適に用いられる。反応温度は８０℃〜１２０℃が好ましい。得られた粗生成物は、必要により通常の精製（濃縮、抽出、再結晶及び／又は乾燥等）を行って精製品を得ることができる。
【００２６】
本発明におけるカチオン性界面活性剤（Ｂ）としては、第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤（Ｂ１）及びアミン塩型カチオン性界面活性剤（Ｂ２）が挙げられ、ヘモグロビンの安定化の観点から、第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤（Ｂ１）が好ましい。
【００２７】
第４級アンモニウム塩型界面活性剤（Ｂ１）のうち、ヘモグロビンの安定化の観点から、一般式（２）で示されるカチオン性界面活性剤がさらに好ましい。
【００２８】
【化２】
2009222710.tif 000003
【００２９】
式中、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は炭素数１〜２２の直鎖又は分岐の炭化水素基であり、Ｒ3〜Ｒ6のうち少なくとも１つは炭素数６以上の炭化水素基であり、Ｒ3〜Ｒ6はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ｆは１〜８の整数、Ｘf-はｆ価の有機酸のアニオンを表す。
【００３０】
Ｒ3〜Ｒ6で示される炭化水素基（ｂ１）としては、脂肪族炭化水素基及び芳香族炭化水素基が挙げられる。
【００３１】
脂肪族炭化水素基としては、直鎖又は分岐のアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、ｉ−、ｓｅｃ−及びｔ−ブチル基、２−メチルブチル基、２，２−ジメチルプロピル基、３−メチルブチル基並びに２−エチルヘキシル基等）及びアルケニル基（ビニル基、アリル基及びメタリル基等）が挙げられる。
【００３２】
芳香族炭化水素基としては、フェニル基、アリールアルキル基（ベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基及びフェニルブチル基等）及びアルキルアリール基（メチルフェニル基、エチルフェニル基、オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、デシルフェニル基及びドデシルフェニル基等）が挙げられる。
【００３３】
Ｒ3〜Ｒ6の炭化水素基の好ましい組み合わせの第４級アンモニウムカチオンとしては、以下の（ｂ１１）〜（ｂ１４）が挙げられる。
（ｂ１１）１個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基であって、他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
ドデシルトリメチルアンモニウム、テトラデシルトリメチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、オクタデシルトリメチルアンモニウム、ドデシルジメチルエチルアンモニウム、テトラデシルジメチルエチルアンモニウム、ヘキサデシルジメチルエチルアンモニウム、オクタデシルジメチルエチルアンモニウム、ドデシルメチルジエチルアンモニウム、テトラデシルメチルジエチルアンモニウム、ヘキサデシルメチルジエチルアンモニウム及びオクタデシルメチルジエチルアンモニウム等。
【００３４】
（ｂ１２）２個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基であって、他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
オクチルデシルジメチルアンモニウム、ジオクチルジメチルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、デシルドデシルジメチルアンモニウム、ジドデシルジメチルアンモニウム、オクチルデシルメチルエチルアンモニウム、ジオクチルメチルエチルアンモニウム、ジデシルメチルエチルアンモニウム、ジドデシルメチルエチルアンモニウム、ジデシルメチルプロピルアンモニウム、ジドデシルエチルプロピルアンモニウム及びジステアリルジメチルアンモニウム等。
【００３５】
（ｂ１３）１個のみが炭素数６〜２２の芳香族炭化水素基であって、他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
ベンジルトリメチルアンモニウム、ベンジルトリエチルアンモニウム、ベンジルトリプロピルアンモニウム及びベンジルエチルジメチルアンモニウム等。
【００３６】
（ｂ１４）１個のみが炭素数６〜２２の脂肪族炭化水素基、１個のみが炭素数６〜２２の芳香族炭化水素基かつ、他は炭素数１〜４のアルキル基である組み合わせ；
デシルジメチルベンジルアンモニウム、ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム、ヘキサデシルジメチルベンジルアンモニウム及びヤシ油アルキルジメチルベンジルアンモニウム等。
【００３７】
これらの（ｂ１）のうち、ヘモグロビンの安定化の観点から、好ましいのは（ｂ１２）、さらに好ましいのはＲ3〜Ｒ6のうちの２個が炭素数８〜１４のアルキル基であるものである。
【００３８】
一般式（２）中ののＸf-はｆ価の有機酸のアニオンを表す。有機酸としては、以下の１価カルボン酸及び多価カルボン酸があげられる。
【００３９】
１価カルボン酸；
脂肪族飽和モノカルボン酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸及び２−エチルヘキサン酸等）；脂肪族不飽和モノカルボン酸（オレイン酸等）；脂肪族オキシモノカルボン酸（グリコール酸、乳酸及びグルコン酸等）；アミノ酸（グリシン、アラニン及びロイシン等）等が挙げられる。
【００４０】
多価カルボン酸；
脂肪族飽和ジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸及びセバシン酸等）；脂肪族オキシジカルボン酸（ｄ−酒石酸等）；アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸等）；脂肪族不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマール酸及びイタコン酸等）；芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸及びテレフタル酸等）；トリカルボン酸（トリメリット酸及びクエン酸等）；テトラカルボン酸（ピロメリット酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸及びエチレンジアミン四酢酸等）；ペンタカルボン酸（ジエチレントリアミン五酢酸等）等が挙げられる。
【００４１】
これらのうち好ましいのは、ヘモグロビンの安定化の観点から、多価カルボン酸であり、さらに好ましいのは２〜５価の多価カルボン酸、特に好ましいのはトリカルボン酸及びテトラカルボン酸、最も好ましいのはテトラカルボン酸である。
【００４２】
第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤（Ｂ１）の製造方法は、例えば、以下の３つの方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
（１）第４級アンモニウムカチオンのアルキル炭酸塩にカルボキシル基が当量となる量のカルボン酸を加えて、６０〜１００℃で３〜２０時間撹拌して反応させて塩交換し、その後、精製する方法。アルキル炭酸塩のアルキル基は炭素数１〜４のアルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基及びブチル基があげられる。
（２）４級アンモニウムハロゲン化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換し、その後、精製する方法。カルボン酸の強塩基性塩としてはカルボン酸のアルカリ金属塩（ナトリウム塩及びカリウム塩等）、アンモニウム塩及びアミン塩等が挙げられる。
（３）４級アンモニウム水酸化物をカルボン酸の強塩基性塩で塩交換し、その後、精製する方法。カルボン酸の強塩基性塩としてはカルボン酸のアルカリ金属塩（ナトリウム塩及びカリウム塩等）、アンモニウム塩及びアミン塩等が挙げられる。
【００４４】
本発明において、ヘモグロビンの安定化のための、ヘモグロビンの重量に対する前記（Ａ）及び（Ａ’）の好ましい合計重量比率、並びに（Ｂ）の好ましい重量比率は以下の通りである。
【００４５】
（Ａ）及び（Ａ’）の合計重量比率は、ヘモグロビンの重量に対して好ましくは２０〜１０，０００倍、さらに好ましくは５００〜５，０００倍である。２０倍以上であれば、安定化効果をより十分に発揮しやすく、１０，０００倍以下であればヘモグロビンの測定精度の観点から好ましい。
【００４６】
（Ｂ）の重量比率は、ヘモグロビンの重量に対して好ましくは２０〜１０，０００倍、さらに好ましくは５００〜５，０００倍である。２０倍以上であれば、安定化効果をより十分に発揮しやすく、１０，０００倍以下であれば泡立ちの観点から好ましい。
【００４７】
また、（Ａ）及び（Ａ’）の合計と、（Ｂ）の重量比率［（Ａ）及び（Ａ’）の合計／（Ｂ）］は、ヘモグロビン安定化の観点から、好ましくは０．０５〜２０、さらに好ましくは０．１〜１０である。
【００４８】
なお、ヘモグロビン含有溶液中のヘモグロビンの濃度（μｇ／ｍＬ）は、通常、０．００１〜１０であり、（Ａ）、（Ａ’）及び（Ｂ）の合計の濃度（重量％）は、ヘモグロビン安定化の観点から、好ましくは０．０１〜１、さらに好ましくは０．０２〜０．５である。
【００４９】
本発明のヘモグロビン安定化剤は、本発明の効果を損なわない限り、ｐＨ緩衝剤、公知のヘモグロビン安定化剤及びその他の添加剤を含有していてもよい。
【００５０】
ｐＨ緩衝剤としては、リン酸緩衝液及びグッド緩衝液などが利用できる。グッド緩衝液としては、グリシン、グリシルグリシン、トリス−塩酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸［ＭＥＳと略記］、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳと略記］、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸［ＴＥＳと略記］、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸［ＭＯＰＳと略記］、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）［ＰＩＰＥＳと略記］、３−（Ｎ’Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸［ＤＩＰＳＯと略記］及びＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸［ＴＡＰＳと略記］等が挙げられる。ｐＨ緩衝剤の含有量は、ヘモグロビン含有溶液のうちの５重量％以下が好ましい。
【００５１】
公知のヘモグロビン安定化剤としては、アジ化ナトリウム、アルブミン、アルブミンを含む血清及びホウ酸等が挙げられる。公知のヘモグロビン安定化剤の含有量は、（Ａ）、（Ａ’）及び（Ｂ）の合計重量に対して２００重量％以下が好ましい。
【００５２】
その他の添加剤としては、（Ａ）、（Ａ’）及び（Ｂ）によるヘモグロビンの安定化効果をさらに向上させる添加剤であって、塩化ナトリウム等の無機塩類、糖類、アミノ酸類及びキレート剤等が挙げられる。さらに、ヘモグロビンの検出を抗原抗体反応で行う場合は、ポリエチレングリコール及びデキストラン等が含有されてもよい。無機塩類の含有量は生理環境と同程度（例えば、０．９重量％）が好ましく、その他の添加剤の含有量は、（Ａ）、（Ａ’）及び（Ｂ）の合計重量に対して５０重量％以下が好ましい。
【００５３】
本発明の安定化剤の使用方法は、安定化を目的とするヘモグロビン含有溶液に本発明の安定化剤を常温（例えば２５℃）で前記の好ましい濃度になるように添加し、均一に攪拌して混合することで達成できるが、ヘモグロビンの安定化の観点から、安定化剤にヘモグロビン含有溶液を添加する方法がより好ましい。なお、ヘモグロビン含有溶液に本発明の安定化剤を添加する場合は、安定化剤の構成成分を別々に添加してもよい。
【００５４】
本発明のヘモグロビンの安定化剤は、ヘモグロビンを安定化する用途であれば特に制限されず利用できるが、ヘモグロビン安定化を特に必要とする便潜血測定に好適に使用できる。特に、検査までに時間を要する場合に、ヘモグロビン安定化剤の溶液を便溶解液として用いることにより、ヘモグロビンを安定化することができるので、臨床検査に有用に使用できる。本発明の安定化剤を便潜血測定に利用する場合の方法としては、ヒトヘモグロビン測定用採便容器に、上記安定化剤の溶液を予め入れておき、採便者が一定量の糞便を採取して安定化剤溶液に溶解できるようにしておく方法等が挙げられる。
【００５５】
本発明におけるヘモグロビンの濃度の測定法としては、特に限定されないが、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的検出方法が好ましい。免疫学的検出方法として、例えば、金コロイド凝集比色法がある。金コロイド凝集比色法は、金コロイド標識抗ヒトヘモグロビン抗体がヒトヘモグロビンを介して凝集する際に生じる色差を分光学的に測定してヒトヘモグロビンを検出する方法である。
【００５６】
本発明の他の実施態様であるヘモグロビンの安定化方法は、前述の本発明の安定化剤の使用方法に従ってヘモグロビンが変質することを防止する方法である。
【００５７】
本発明のさらに他の実施態様であるヒトヘモグロビン測定用採便容器は、本発明の安定化剤を便潜血測定に利用する場合に用いることが出来る前述のヒトヘモグロビン測定用採便容器であって、ガラス製あるいはプラスチック製が好ましく、採便容器には採便用具（例えばスティック状のもの）等を付属することができるものである。
ここで採便容器とは公知文献（例えば特開２０００−２５８３０８号公報）に記載のものと同様のものが挙げられる。
【００５８】
なお、本発明のヘモグロビン安定化剤は、ヘモグロビンの安定化効果以外にも、血液中や便中のタンパク質の安定化することができるので、血漿分画等の精製工程でのタンパク質の変質を抑制することができる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下特に定めない限り、％は重量％を示す。
【００６０】
製造例１
＜Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル（Ａ−１）の製造＞
５００ｍＬ容のコルベンに、Ｎ−α−アセチルアルギニン（エムピーバイオジャパン社製）１２．６ｇ（０．０５当量）、メタンスルホン酸１ｇ及びエタノール９２ｇ（２当量）を加え、マグネチックスターラーで２０℃で均一混合した後、８０℃で５時間加熱撹拌し、エバポレーターで濃縮後、水から再結晶し、減圧乾燥（６０℃、２０Ｐａ）して、Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル（Ａ−１）を得た（収率８８％）。
【００６１】
製造例２
＜Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル・塩酸塩（Ａ−３）の製造＞
製造例１で製造したＮ−α−アセチルアルギニンエチルエステル（Ａ−１）１４．０ｇ（０．０５当量）に１モル／Ｌ塩酸水溶液１００ｇ（０．１当量）を加え、２５℃で２時間撹拌し、エバポレーターで濃縮後水から再結晶し、減圧乾燥（６０℃、２０Ｐａ）して、Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル・塩酸塩（Ａ−３）を得た（収率９３％）。
【００６２】
製造例３
＜Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル・クエン酸塩（Ａ−４）の製造＞
製造例１で製造したＮ−α−アセチルアルギニンエチルエステル（Ａ−１）１４．０ｇ（０．０５当量）に１モル／Ｌクエン酸水溶液１００ｇ（０．３当量）を加え、２５℃で２時間撹拌し、エバポレーターで濃縮後水から再結晶し、減圧乾燥（６０℃、２０Ｐａ）して、Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル・クエン酸塩（Ａ−４）を得た（収率９０％）。
【００６３】
製造例４
＜Ｎ−α−アセチルアルギニンプロピルエステル・塩酸塩（Ａ−５）の製造＞
エタノールをプロパノールに変更する以外は製造例１と同様にしてＮ−α−アセチルアルギニンプロピルエステルを得た。次にＮ−α−アセチルアルギニンプロピルエステル１４．７ｇ（０．０５当量）に１モル／Ｌ塩酸水溶液１００ｇ（０．１当量）を加え、２５℃で２時間撹拌し、エバポレーターで濃縮後水から再結晶し、減圧乾燥（６０℃、２０Ｐａ）して、Ｎ−α−アセチルアルギニンプロピルエステル・塩酸塩（Ａ−５）を得た（収率９０％）。
【００６４】
製造例５
＜Ｎ−α−アセチルアルギニンメチルエステル（Ａ−６）の製造＞
エタノールをメタノール６４ｇ（２当量）に変更する以外は製造例１と同様にしてＮ−α−アセチルアルギニンメチルエステル（Ａ−６）を得た（収率８５％）。
【００６５】
製造例６
＜Ｎ−α−ラウロイルアルギニンエチルエステル・塩酸塩（Ａ−７）の製造＞
５００ｍＬ容のコルベンにアルギニン８．７１ｇ（０．０５当量）、ラウリン酸２０．０ｇ（０．１当量）を加え１０５℃で５時間加熱撹拌し、４０℃まで放冷後、水で抽出し、エバポレーターで濃縮後、水から再結晶し、減圧乾燥（６０℃、２０Ｐａ）して、Ｎ−α−ラウロイルアルギニンを得た。次に、５００ｍＬ容のコルベンに、Ｎ−α−ラウロイルアルギニン１０．７ｇ（０．０３当量）、メタンスルホン酸１ｇ及びエタノール９２ｇ（２当量）を加え、マグネチックスターラーで２０℃で均一混合した後、８０℃で５時間加熱撹拌し、エバポレーターで濃縮後、水から再結晶し、減圧乾燥（６０℃、２０Ｐａ）して、Ｎ−α−ラウロイルアルギニンエチルエステルを得た。次に、Ｎ−α−ラウロイルアルギニンエチルエステル７．６９ｇ（０．０２当量）に、１モル／Ｌ塩酸水溶液１００ｇ（０．１当量）を加え、２５℃で２時間撹拌し、エバポレーターで濃縮後水から再結晶し、減圧乾燥（６０℃、２０Ｐａ）して、Ｎ−α−ラウロイルアルギニンエチルエステル・塩酸塩（Ａ−７）を得た（収率８８％）。
【００６６】
製造例７
＜ジデシルジメチルアンモニウム・ブタンテトラカルボン酸塩（Ｂ−１）の製造＞
５０ｍｌ三角フラスコに、ジデシルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩１６．０４ｇ（カチオン基として０．０４当量）を入れ、撹拌しながら、ブタンテトラカルボン酸２．３４ｇ（カルボキシル基として０．０４当量）を少量ずつ加えた。撹拌機付き恒温槽で８０℃に加温しながら８時間撹拌し続けると、二酸化炭素及びメタノールが系外に放出され、ジデシルジメチルアンモニウム・ブタンテトラカルボン酸塩（Ｂ−１）を得た（収率９９％）。
【００６７】
製造例８
＜ジデシルジメチルアンモニウム・クエン酸塩（Ｂ−２）の製造＞
ブタンテトラカルボン酸の代わりにクエン酸２．５６ｇ（カルボキシル基として０．０４当量）を使用する以外は製造例７と同様に行い、ジデシルジメチルアンモニウム・クエン酸塩（Ｂ−２）を得た（収率９９％）。
【００６８】
製造例９
＜ジステアリルジメチルアンモニウム・ピロメリット酸塩（Ｂ−３）の製造＞
ジデシルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩の代わりにジステアリルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩２４．４７ｇ（カチオン基として０．０４当量）、ブタンテトラカルボン酸の代わりにピロメリット酸２．１８ｇ（カルボキシル基として０．０４当量）を使用する以外は製造例７と同様に行い、ジデシルジメチルアンモニウム・ピロメリット酸塩（Ｂ−３）を得た（収率９８％）。
【００６９】
製造例１０
＜ジステアリルジメチルアンモニウム・酢酸塩（Ｂ−５）の製造＞
ジデシルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩の代わりにジステアリルジメチルアンモニウムのメチル炭酸塩２４．４７ｇ（カチオン基として０．０４当量）、ブタンテトラカルボン酸の代わりに酢酸２．４０ｇ（カルボキシル基として０．０４当量）を使用する以外は製造例７と同様に行い、ジステアリルジメチルアンモニウム・酢酸塩（Ｂ−５）を得た（収率９８％）。
【００７０】
実施例１〜１９、比較例１〜４
＜ヘモグロビン溶液の調製＞
市販の２回結晶化ヘモグロビン（シグマ社製）を濃度１ｍｇ／ｍｌの溶液となるように生理食塩水で希釈した。
＜評価用試料溶液の調製＞
評価用試料溶液として以下の成分を含む生理食塩水を調製した。
緩衝剤としてのＭＥＳを３０ｍＭ（ｐＨ６．３）；ヒトヘモグロビンを４００ｎｇ／ｍｌ（上記の１ｍｇ／ｍｌの溶液を使用）；便濃度１ｍｇ／ｍｌ；アシルアルギニンエステル（Ａ）としての前記（Ａ−１）、Ｎ−α−ベンゾイルアルギニンエチルエステル（Ａ−２）（エムピーバイオ株式会社製）及び（Ａ−３）〜（Ａ−７）を表１又は表２記載の濃度（％）；カチオン性界面活性剤（Ｂ）としての前記（Ｂ−１）〜（Ｂ−３）、ジデシルジメチルアンモニウム・アジピン酸塩（Ｂ−４）（三洋化成工業製）、（Ｂ−５）、ベンザルコニウム・塩酸塩（Ｂ−６）（和光純薬工業製）、セチルトリメチルアンモニウム・塩酸塩（Ｂ−７）（和光純薬工業製）及びジデシルジメチルアンモニウム・塩酸塩（Ｂ−８）（三洋化成工業製）を表１又は表２記載の濃度（％）；比較物質を表２記載の濃度（％）；残部を塩化ナトリウム０．９％水溶液
【００７１】
実施例１〜１９及び比較例１〜４の（Ａ）、（Ｂ）及び比較物質のそれぞれの濃度（％）を表１及び表２に示す。
【００７２】
【表１】
2009222710.tif 000004
【００７３】
【表２】
2009222710.tif 000005
【００７４】
評価方法
＜ヒトヘモグロビンの残存率の測定方法＞
ヒトヘモグロビンの残存率の測定は、金コロイド凝集比色法で行った。
ＥＩＡ用マイクロプレートに評価用試料溶液２５μｌを分注し、検体希釈液（ヘモプレートオートＩＩ  検体希釈液；株式会社アズウェル製）５０μｌ、金コロイド試薬液（ヘモプレートオートＩＩ  金コロイド試薬；株式会社アズウェル製）１００μｌを添加後、１５秒間マイクロミキサーで撹拌し、撹拌開始後１分後と７分後の吸光度（５４０ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（和光純薬工業株式会社製）を用いて測定し、その吸光度差を求めた。本測定では、ヒトヘモグロビン濃度の増加に依存して、吸光度差は増加する。
評価用試料溶液調製直後（２５℃）と、４℃と２５℃で数日間静置保存した後に、各試料溶液について吸光度差を測定した。各温度で保存後の吸光度差と調製直後の吸光度差との比を百分率で表してヒトヘモグロビン残存率（％）とした。 結果を表３に示す。
【００７５】
【表３】
2009222710.tif 000006
【００７６】
表３より、従来の安定化剤を添加した比較例１〜４では、４℃で保存した場合、１日目でヘモグロビンの残存率が減少し、さらに経時的に残存率が減少する。一方、本発明の安定化剤を添加した実施例１〜１９では、初期の残存率が高く、しかも経時的な残存率の減少も少ない。本発明のヘモグロビン安定化剤には、ヘモグロビンの顕著な安定化効果が認められた。また、２５℃で保存した場合、従来の安定化剤では顕著に残存率が低下するが、本発明の安定化剤では、ヘモグロビンの安定化効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明のヘモグロビン安定化剤を使用すると、ヘモグロビンを安定化することができる。従って、便潜血測定用の便溶解液として使用することで、ヘモグロビンの正確な測定をすることができる。