(57)【要約】【課題】アトピー性皮膚炎の病態、特に、（１）２相性の反応、（２）皮膚炎症部位への細胞浸潤、及び（３）血清ＩｇＥ濃度の上昇の３つの特徴を明確に有し、且つ短期間で樹立可能な新たなアトピー性疾患モデルを提供すること。【解決手段】無水トリメリト酸により感作され、血清中総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上であり、且つ無水トリメリト酸の皮膚への塗布により皮膚炎を発症している非ヒト哺乳動物のアトピー性皮膚炎モデル動物としての使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無水トリメリト酸により感作され、且つ血清中総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上である非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
無水トリメリト酸の皮膚への塗布により皮膚炎を発症している、請求項１記載の哺乳動物。
【請求項３】
アトピー性皮膚炎モデル動物である、請求項２記載の哺乳動物。
【請求項４】
無水トリメリト酸により感作され、血清中総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上であり、且つ無水トリメリト酸の皮膚への塗布により皮膚炎を発症している非ヒト哺乳動物のアトピー性皮膚炎モデル動物としての使用。
【請求項５】
無水トリメリト酸により感作され、且つ血清中総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上である非ヒト哺乳動物の皮膚に無水トリメリト酸を塗布することにより該塗布部位に皮膚炎を誘導することを含む、アトピー性皮膚炎モデル動物の製造方法。
【請求項６】
感作及び皮膚炎の誘導が同一の部位へ施される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該部位が耳である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、アトピー性皮膚炎を予防又は治療し得る物質のスクリーニング方法：
（Ｉ）無水トリメリト酸により感作され、且つ血清中総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上である非ヒト哺乳動物の皮膚に無水トリメリト酸を塗布することにより該塗布部位に皮膚炎を誘導すること；
（ＩＩ）前記塗布の前又は後に被検物質を該哺乳動物に投与すること；及び
（ＩＩＩ）該哺乳動物に生じた皮膚炎を抑制した被検物質を、アトピー性皮膚炎を予防又は治療し得る化合物として選択すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アトピー性皮膚炎のモデル動物及び該動物を利用したアトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ＡＤ）は、乳幼児期に始まることが多く、寛解、増悪をくり返しながら長期間続く、痒みのある湿疹を主病変とするアレルギー性の皮膚炎である。アトピー性皮膚炎の病態の特徴としては、以下のものを挙げることが出来る：
（１）抗原誘発により２相の反応が生じること；
（２）組織への細胞浸潤が明確であること；
（３）血清中のＩｇＥ濃度が高いこと；
（４）激しい掻痒を伴うこと；
（５）繰り返しの抗原刺激により慢性炎症を生じること。
【０００３】
アトピー性皮膚炎発症の原因としては、体質的な原因と環境的な原因とが絡んでいると考えられているが、詳細は不明である。従って、アトピー性皮膚炎の治療薬の開発のためには、上記の臨床症状を良く反映する疾患モデルを開発し、このモデル動物の病態を改善する化合物をスクリーニングすることが必要となる。
【０００４】
ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）、ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）などのハプテンを繰り返し動物に塗布することにより皮膚炎を誘発するアトピー性皮膚炎の動物モデルが広く用いられている。しかし、このようなモデルの多くは、モデルの作成期間が長く、２相性の反応や、皮膚炎症部位への細胞浸潤が明確ではないという問題点を有する。
また、ノックアウトマウスや、自然発症モデル動物もいくつか開発されているが、１００％発症しなかったり、症状の強弱のコントロールが不可能であったりするため、薬剤のスクリーニングには適していない。
【０００５】
一方、無水トリメリト酸（Ｔｒｉｍｅｌｌｉｔｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ，ＴＭＡ）は気管支喘息の原因抗原のひとつと考えられており、抗原としてＴＭＡを使用した、いくつかの気管支喘息動物モデルが報告されている（非特許文献１〜４）。
【非特許文献１】Sailstad DM et al., Toxicology, 2003 Dec 15; 194(1-2): 147-161
【非特許文献２】Dearman RJ et al., Food Chem. Toxicol., 2002 Dec; 40(12): 1881-1892
【非特許文献３】Vento KL et al., Cell. Immunol., 1996 Sep 15; 172(2): 246-253
【非特許文献４】Andius P et al., Allergy, 1996 Aug; 51(8): 556-562
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、上述のアトピー性皮膚炎の病態、特に、（１）２相性の反応、（２）皮膚炎症部位への細胞浸潤、及び（３）血清ＩｇＥ濃度の上昇の３つの特徴を明確に有し、且つ短期間で樹立可能な新たなアトピー性疾患モデルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、気管支喘息の原因抗原と考えられているＴＭＡを、皮膚を介して動物に感作することにより、上述のヒトアトピー性皮膚炎の病態を明確に反映した、アトピー性皮膚炎動物モデルを作成し得ることを見出した。
以上の知見に基づき、本発明が完成された。
【０００８】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］無水トリメリト酸により感作され、且つ血清中総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上である非ヒト哺乳動物。
［２］無水トリメリト酸の皮膚への塗布により皮膚炎を発症している、［１］記載の哺乳動物。
［３］アトピー性皮膚炎モデル動物である、［２］記載の哺乳動物。
［４］無水トリメリト酸により感作され、血清中総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上であり、且つ無水トリメリト酸の皮膚への塗布により皮膚炎を発症している非ヒト哺乳動物のアトピー性皮膚炎モデル動物としての使用。
［５］無水トリメリト酸により感作され、且つ血清中総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上である非ヒト哺乳動物の皮膚に無水トリメリト酸を塗布することにより該塗布部位に皮膚炎を誘導することを含む、アトピー性皮膚炎モデル動物の製造方法。
［６］感作及び皮膚炎の誘導が同一の部位へ施される、［５］記載の方法。
［７］該部位が耳である、［６］記載の方法。
［８］以下の工程を含む、アトピー性皮膚炎を予防又は治療し得る物質のスクリーニング方法：
（Ｉ）無水トリメリト酸により感作され、且つ血清中総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上である非ヒト哺乳動物の皮膚に無水トリメリト酸を塗布することにより該塗布部位に皮膚炎を誘導すること；
（ＩＩ）前記塗布の前又は後に被検物質を該哺乳動物に投与すること；及び
（ＩＩＩ）該哺乳動物に生じた皮膚炎を抑制した被検物質を、アトピー性皮膚炎を予防又は治療し得る化合物として選択すること。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、（１）２相性の反応、（２）皮膚炎症部位への細胞浸潤、及び（３）血清ＩｇＥ濃度の上昇の３つの特徴を明確に有する、優れたアトピー性皮膚炎動物モデルが提供される。該モデルは、作成に要する日数が短く、１日以内に薬効を評価することが可能であるので、薬物スクリーニングに要する時間的コストを節約することが出来る。また、一方の耳にのみ感作することにより、同一個体の左右の耳において、性質の異なる（即時相、遅発相、遅延型アレルギー相）アレルギー反応を同時に評価することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．アトピー性皮膚炎モデル動物
本発明は、無水トリメリト酸により感作され、且つ血清中総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上である非ヒト哺乳動物を提供する（本発明の哺乳動物Ｉ）。該哺乳動物はアトピー性皮膚炎モデル動物として、あるいは該動物の製造のために有用である。
【００１１】
哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物； ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類であり、より好ましくはマウスである。
【００１２】
無水トリメリト酸は、気管支喘息の原因物質の一つと考えられている公知の化合物であり、市販されているものを入手可能である。
【００１３】
感作とは、生体に特定の抗原を投与して、該抗原に対する免疫学的な記憶を形成させ、同一の抗原による再刺激に対して強く免疫応答する状態にすることをいう。
【００１４】
無水トリメリト酸による非ヒト哺乳動物の感作は、無水トリメリト酸の非ヒト哺乳動物への投与により行われる。投与方法としては、投与対象である非ヒト哺乳動物の血清中総ＩｇＥ濃度を４０００ｎｇ／ｍｌ以上にまで上昇させることが可能な方法であれば何れの方法でも良く、皮膚への塗布、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射又は皮下注射などが用いられる。アトピー性皮膚炎は皮膚を介した繰り返しの抗原感作により誘発されると考えられるので、この原因をモデル動物にも適切に反映させる観点から、好ましくは、無水トリメリト酸は皮膚への塗布により哺乳動物に投与される。複数の投与方法を組み合わせて用いてもよい。
【００１５】
無水トリメリト酸を皮膚へ塗布する場合の塗布部位としては、腹部、背部、耳（一方又は両方の）等を挙げることができる。本発明の哺乳動物をアトピー性皮膚炎のモデル動物として使用する場合には、少なくとも１回は、例えば２〜５回は、一方又は両方の耳に、無水トリメリト酸が塗布される。アトピー性皮膚炎の病態の指標として耳の厚さが好ましく用いられるためである。塗布する部位は、全ての投与について同一であってもよいし、あるいは複数の塗布部位を用いてもよい。例えば、最初の２〜４回は腹部へ塗布され、引き続き２〜５回は耳へ塗布される。
【００１６】
無水トリメリト酸の投与量は、１回の投与あたり通常０．１ｍｇ〜２５ｍｇ／匹程度、好ましくは１ｍｇ〜１０ｍｇ／匹である。
【００１７】
無水トリメリト酸は、適切な溶媒に溶解又は懸濁された状態で非ヒト哺乳動物に投与される。該溶媒としては、オリーブオイル、アセトン、エタノール、水等が挙げられる。また、複数の溶媒を混合して用いてもよい。
【００１８】
無水トリメリト酸は、直接非ヒト哺乳動物に投与してもよく、また、適当な担体に結合又は吸着させた複合体として投与してもよい。該担体（キャリアー）と無水トリメリト酸（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるいは吸着させた無水トリメリト酸に対してＩｇＥが効率よく誘導できれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよい。担体としては、ウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミン；ウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン；ウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン；キーホールリンペットヘモシアニン；ポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物又は共重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。
【００１９】
効率よく血清中ＩｇＥ濃度を上昇させるため、適切なアジュバントと共に無水トリメリト酸を投与してもよい。アジュバントとしては、水酸化アルミニウム等を挙げることが出来る。
【００２０】
感作は通常１〜１４日毎に１回ずつ、計４〜１０回程度行われる。効率よく、短期間で血清中ＩｇＥ濃度を上昇させるため、最初の２〜４回の投与は４〜７日毎に行い、引き続き１〜２日毎に２〜５回投与を行うことが好ましい。
【００２１】
一実施態様において、最初の２〜４回（例、２回）の無水トリメリト酸の投与は４〜７日（例、５日）毎に腹部の皮膚への塗布により行われ、引き続き１〜２日（例、１日）毎に２〜５回（例、３回）、一方の耳へ無水トリメリト酸が塗布される。
【００２２】
本発明の哺乳動物Ｉは、血清中の総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上（例えば４２００ｎｇ／ｍｌ以上）であることを特徴とする。４０００ｎｇ／ｍｌ以上の血清中総ＩｇＥ濃度を有することにより、無水トリメリト酸を皮膚へ塗布すると、ヒトのアトピー性皮膚炎と類似した病態の皮膚炎を発症する。特に、２相性の反応のうちの即時相を明確に発現するために、血清中の総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上であることが重要である。このような血清中のＩｇＥ濃度の上昇は、無水トリメリト酸による感作により誘導されたものである。例えば、４〜７日毎に２〜４回哺乳動物の腹部へ無水トリメリト酸を塗布し、引き続き１〜２日毎に２〜５回耳へ無水トリメリト酸を塗布すると、経時的に血清中総ＩｇＥ濃度が上昇し、最終塗布から３日以上（例えば３〜１４日、好ましくは４〜７日）経過すると、総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上になる。なお、本明細書中、総ＩｇＥ濃度は、ＩｇＥに特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定された値により記載する。
【００２３】
本発明の哺乳動物Ｉの皮膚へ更に無水トリメリト酸を塗布することにより、塗布した部位に皮膚炎を発症した哺乳動物を製造することが出来る。本発明は、このような皮膚炎を発症した哺乳動物をも提供する（本発明の哺乳動物ＩＩ）。本発明の哺乳動物ＩＩはアトピー性皮膚炎のモデル動物として有用である。
【００２４】
本発明の哺乳動物ＩＩの皮膚炎の主な病態としては、血清中総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上であることに加えて以下を挙げることが出来る：
（１）皮膚の肥厚（浮腫）；及び
（２）無水トリメリト酸を塗布した部位への肥満細胞、好中球及び好酸球の浸潤。
【００２５】
皮膚の肥厚は、耳の厚み等を計測することにより評価することが出来る。肥満細胞等の浸潤は、組織切片を顕微鏡により観察することにより評価することが出来る。
【００２６】
無水トリメリト酸による感作を皮膚への塗布により行い、その塗布部位と同一部位に無水トリメリト酸を塗布することにより皮膚炎を誘導した場合（例えば、感作のための塗布と皮膚炎誘導のための塗布を同側の耳に施す場合）には、ヒトアトピー性皮膚炎の病態と共通する明確な２相性の反応（皮膚の肥厚、浮腫等）を生じるので、より好適なアトピー性皮膚炎モデル動物が提供され得る。この２相性の反応は、無水トリメリト酸の塗布の約１〜２時間後をピークとする即時相、及び塗布の約８時間後をピークとする遅発相からなる。即時相の反応は、肥満細胞を介した反応であり、抗ヒスタミン剤により抑制され得る。遅発相の反応は、アトピー性皮膚炎の皮疹に近似して著しい細胞浸潤をともない、免疫抑制剤により抑制され得る。
【００２７】
無水トリメリト酸による感作を皮膚への塗布により行い、その塗布部位と異なる部位に無水トリメリト酸を塗布することにより皮膚炎を誘導した場合（例えば、感作を一方の耳に行い、皮膚炎の誘導を他方の耳に行う場合）には、１相性の反応（皮膚の肥厚、浮腫等）を生じる。この１相性の反応は、無水トリメリト酸の塗布の約２４時間後をピークとする遅延型アレルギー相からなる。
【００２８】
好ましい実施態様において、無水トリメリト酸による感作が一方の耳への塗布により行われ、皮膚炎の誘導が両方の耳への無水トリメリト酸の塗布により行われる。こうすることにより、性質の異なる上述の２相性及び１相性の反応を同時に評価することが出来る。
【００２９】
２．スクリーニング方法
本発明は、上述のアトピー性皮膚炎のモデル動物を用いる、アトピー性皮膚炎を予防又は治療し得る物質のスクリーニング方法を提供する。該モデル動物は、ヒトのアトピー性皮膚炎の病態と近似しており、また比較的短期間に皮膚炎を発症させることができ、更には薬効評価も短時間で得られることから、アトピー性皮膚炎の予防・治療薬の候補物質を効率よく探索することが出来る。
【００３０】
具体的には、本発明のスクリーニング方法は以下の工程を含む：
（Ｉ）無水トリメリト酸により感作され、且つ血清中総ＩｇＥ濃度が４０００ｎｇ／ｍｌ以上である非ヒト哺乳動物の皮膚に無水トリメリト酸を塗布することにより該塗布部位に皮膚炎を誘導すること；
（ＩＩ）前記塗布の前又は後に被検物質を該哺乳動物に投与すること；及び
（ＩＩＩ）該哺乳動物に生じた皮膚炎を抑制した被検物質を、アトピー性皮膚炎を予防又は治療し得る化合物として選択すること。
【００３１】
工程（Ｉ）は、上述の「１．アトピー性皮膚炎のモデル動物」の項で記載した方法と同様に実施することが出来る。
【００３２】
工程（ＩＩ）に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００３３】
工程（ＩＩＩ）においては、被検物質を投与された哺乳動物における皮膚炎の程度が、被検物質を投与されていない対照哺乳動物における皮膚炎の程度と比較される。皮膚炎の程度は、皮膚の厚み（例、耳の厚み）、浸潤細胞数、血清中総ＩｇＥ濃度等を指標に評価することが出来る。皮膚炎の程度の比較は、好ましくは、統計学的有意差の有無に基づいて行われる。被検物質を投与されていない対照哺乳動物における皮膚炎の程度は、被検物質を投与された哺乳動物における皮膚炎の程度の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。
【００３４】
比較の結果、哺乳動物における皮膚炎の程度を改善した物質を、アトピー性皮膚炎を予防又は治療し得る物質として選択することが出来る。
【００３５】
好ましい態様として、工程（Ｉ）において、無水トリメリト酸による感作が一方の耳への塗布により行われ、皮膚炎の誘導が両方の耳への無水トリメリト酸の塗布により行われる。これにより感作した耳においては、即時相及び遅発相の反応に対する被検物質の効果を、非感作の耳においては、遅延型アレルギー相に対する被検物質の効果を同一個体で同時に評価することが可能となる。
【００３６】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
（実施例１：アトピー性皮膚炎動物モデルの作成）
方法
ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮｃｒｌＣｒｌｊマウス（雄、５週齢）を日本チャールズリバーより購入し、前日にシックインジェクター（一枚刃；シック・ジャパン社）を用いて剃毛したマウスの腹部に、１０重量％ＴＭＡ（アセトン：オリーブ油＝４：１）溶液１００μＬを塗布して感作した（ｄａｙ０）。５日後に再び１０重量％ＴＭＡ溶液を腹部に１００μＬを塗布することにより追加感作を行った（ｄａｙ５）。さらにその５日後から３日間連続して、１０重量％ＴＭＡ溶液を２５μＬ右耳に塗布し（ブースト：ｄａｙ１０−１２）、最終塗布操作日より５日後（ｄａｙ１７）に１０重量％ＴＭＡ溶液を２５μＬずつ両耳に塗布することにより、皮膚炎を誘発した（チャレンジ）。炎症の程度は、皮膚炎誘発後の耳の厚みを、ＰＥＡＣＯＣＫ  Ｄｉａｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｇａｕｇｅ  Ｇ（尾崎製作所）を用いて測定した。また、血清中の総ＩｇＥ濃度を経時的に測定した。
血清中の総ＩｇＥ濃度の測定は以下のように行った。一次抗体のＲａｔ  ＩｇＥ２ａ  κ（コスモバイオ社）（５μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに一晩コートした。翌日一次抗体液を除き、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル社）液を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、室温でブロッキング処理を行った。洗浄操作を行った後、血清サンプル及び０〜２００ｎｇ／ｍｌのＩｇＥ標準液（ｍＡｂ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＤＮＰ  ＩｇＥ：ヤマサ醤油）を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、１時間、室温で反応させた。洗浄操作を行った後、二次抗体（Ｒａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、１時間、室温で反応させた。洗浄操作を行った後、基質液（１：１  ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２  ｍｉｘ：Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、１５分間、室温で反応させ、続いて２重量％シュウ酸溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え反応を停止させた。波長４０５ｎｍの吸光度を測定し、標準液から算出される血中のＩｇＥ濃度を計算した。
【００３８】
結果
血清中の総ＩｇＥ濃度は、インタクト及びブースト前にはほとんど検出されなかったが、ｄａｙ０及び５の２回の感作によりチャレンジ前までに約１０００（ｎｇ／ｍｌ）にまで上昇した（図１）。Ｄａｙ１０−１２の連続感作によってもこの濃度はほとんど不変であったが、驚くべきことにｄａｙ１３からｄａｙ１７にかけて、血清中の総ＩｇＥ濃度は４０００（ｎｇ／ｍｌ）を超えるレベルにまで上昇した（図１）。
Ｄａｙ１０において、ＴＭＡ溶液を右耳に塗布すると、約２４時間後にピークを有する遅延性の肥厚反応のみが誘発された（図２）。
Ｄａｙ１７において、ＴＭＡ溶液を耳に塗布すると、右耳は、約１〜２時間後にピークを有する即時性の肥厚反応と、約８時間後にピークを有する遅延性の肥厚反応とからなる明確な２相性の変化を示した。一方、左耳は、約２４時間後にピークを有する遅延性の肥厚反応のみを示した。このような左右の耳における肥厚反応の違いは、使用した動物の雌雄に関わらず認められた（図３）。
Ｄａｙ１７の右耳の組織像を図４に示す。ＴＭＡ溶液の、塗布前においては若干の水腫および炎症性細胞の浸潤を示すのみであったが、ＴＭＡ塗布の８時間後においては、著しい浮腫、糜爛、並びに肥満細胞、好中球及び好酸球の浸潤が認められた。
Ｄａｙ１０と１７の間の時期における肥厚反応を検討すると、ｄａｙ１３においては、血清中総ＩｇＥ濃度が２０００（ｎｇ／ｍｌ）を超えていたが、ＴＭＡ溶液の右耳への塗布によっても２相性の肥厚反応は認められなかった。
Ｄａｙ１４及び１５においては、血清中総ＩｇＥ濃度が３０００（ｎｇ／ｍｌ）を超えていた。ＴＭＡ溶液の右耳への塗布によって２相性の肥厚反応は認められたものの、ｄａｙ１７でチャレンジしたときと比較して即時性の肥厚反応が微弱であった。
以上の結果から、ＴＭＡにより感作を行い、血清中の総ＩｇＥ濃度が４０００（ｎｇ／ｍｌ）を超えた段階で、更にＴＭＡを皮膚に塗布することにより、明瞭な２相性の肥厚反応及び顕著な細胞浸潤を呈するアトピー性皮膚炎様の皮膚炎を誘発し得ることが明らかとなった。
【００３９】
（実施例２：アトピー性皮膚炎動物モデルによる薬効評価）
方法
実施例１において作成したアトピー性皮膚炎動物モデルに対する種々の薬剤の薬効を評価した。薬効評価はｄａｙ１７におけるＴＭＡの塗布から１及び８時間後の右耳の厚みを指標として行った。肥厚反応の程度は、それぞれの時間における耳の厚みの測定値と、ＴＭＡ塗布前の値との差として表し、溶媒対照群のそれと比較して抑制率を算出した。
薬剤はＴＭＡ誘発３０分前及び４時間後の２回投与した。薬剤は原則としてＤＭＳＯに溶解させた後、０．５重量％メチルセルロース溶液にて希釈して、所望の濃度に調製した。いずれの溶液もＤＭＳＯの最終濃度が２．５重量％となるように調製した。薬剤は０．５ｍｌ／匹ずつ経口投与した。
【００４０】
結果
プレドニゾロン 及びサイクロスポリンＡは、遅発相のみを有意に抑制し、即時相はほとんど抑制しなかった。一方、感作時から投与したレフルノミド（抗リウマチ剤、ＩｇＥ産生阻害剤）、エピナスチン（抗ヒスタミン剤）、セチリジン（抗ヒスタミン剤）及びケトチフェン（抗ヒスタミン剤）は、即時相のみを有意に抑制し、遅発相はほとんど抑制しなかった。Ｎ，Ｌ−Ａｒｇ（ＮＯＳ阻害剤）は、即時相及び遅発相の両方を有意に抑制した。また、トラニラスト（抗アレルギー剤）、Ｙ−２４１８０（抗ＰＡＦ剤）、ＬＹ−２２３９８２（抗ＬＴＢ４剤）及びオキサトミド（抗ヒスタミン剤）は、即時相はわずかに抑制したが、遅発相はほとんど抑制しなかった（表１）。
【００４１】
【表１】
2009060810.tif 000002
【００４２】
以上の結果より、本発明のモデルを用いることにより、アトピー皮膚炎の治療薬をスクリーニングし得ること、並びに 即時相及び遅発相への薬剤の効果をそれぞれ見極め得ることが示された。
【００４３】
（比較例１：ＤＮＦＢリピートモデルの作成）
方法
剃毛したマウスの腹部に０．２又は０．５重量％の濃度のＤＮＦＢを塗布して、感作を行った後、マウスの右耳に１週間に１回の頻度で０．２又は０．５重量％の濃度のＤＮＦＢを塗布することにより感作マウスを作成した。試験開始から４２日後に、同様にＤＮＦＢを塗布した後の耳の厚みの経時変化を観察した。また、血清中の総ＩｇＥ濃度を測定した。
【００４４】
結果
ＤＮＦＢを塗布してから８時間後に、ＤＮＦＢの塗布量に関わらず、右及び左耳が顕著に肥厚した（図５）。右耳においては、即時性の反応が明確には認められなかった。血清中の総ＩｇＥ濃度は、ＤＮＦＢの塗布量に関わらず、４０００（ｎｇ／ｍｌ）を下回っており、実施例１のＴＭＡモデルと比較して低かった（図６）。
【００４５】
（比較例２：ＴＭＡ以外のハプテンを用いたモデルの比較）
ＢＡＬＢ／Ｃ雄性マウスの腹部を悌毛し、それぞれ、以下に示す濃度のハプテン溶液を塗布して感作した。その５日後に同様の操作を繰り返し、さらにその５日後から３日間、右耳介に以下に示す濃度のハプテン溶液を塗布して、繰り返し局所感作を行った。最終局所感作の５日後に採血を行い、血清中の総ＩｇＥ値を先に示したのと同様の方法にて測定した。ハプテンによって濃度がそれぞれ異なっているのは、皮膚炎を誘発するのに最適な濃度を選択したことによる。
腹部の感作：
ＴＭＡ：１０重量％溶液（アセトン：オリーブ油＝４：１）、１００μＬ
オキサゾロン：１．０重量％（アセトン：オリーブ油＝４：１）、１００μＬ 
ＤＮＦＢ：０．５重量％溶液（アセトン：オリーブ油＝４：１）、１００μＬ
塩化ピクリル：７重量％溶液（エタノール）１００μＬ
右耳介の局所感作：
ＴＭＡ：１０重量％溶液（アセトン：オリーブ油＝４：１）、２５μＬ
オキサゾロン：０．３重量％（アセトン：オリーブ油＝４：１）、２５μＬ 
ＤＮＦＢ：０．２重量％溶液（アセトン：オリーブ油＝４：１）、２５μＬ
塩化ピクリル：１重量％溶液（エタノール）２５μＬ
【００４６】
結果を表２に示す。血清中の総ＩｇＥ濃度は、ＴＭＡ以外のハプテンを用いた場合にはいずれも４０００（ｎｇ／ｍｌ）を下回っていた。
【００４７】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、（１）２相性の反応、（２）皮膚炎症部位への細胞浸潤、及び（３）血清ＩｇＥ濃度の上昇の３つの特徴を明確に有する、優れたアトピー性皮膚炎動物モデルが提供される。該モデルは、作成に要する日数が短く、１日以内に薬効を評価することが可能であるので、薬物スクリーニングに要する時間的コストを節約することが出来る。また、一方の耳にのみ感作することにより、同一個体の左右の耳において、性質の異なる（即時相、遅発相、遅延型アレルギー相）アレルギー反応を同時に評価することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＴＭＡ感作による血清中総ＩｇＥ濃度の上昇を示す。
【図２】Ｄａｙ１０におけるＴＭＡチャレンジ後の右耳の腫れの経時的変化を示す。
【図３】Ｄａｙ１７におけるＴＭＡチャレンジ後の耳の腫れの経時的変化を示す。白丸は右耳を、黒丸は左耳を示す。
【図４】右耳の組織像を示す。
【図５】ＤＮＦＢチャレンジ後の耳の腫れの経時的変化を示す。白丸は右耳を、黒丸は左耳を示す。
【図６】ＤＮＦＢ又はＴＭＡチャレンジ後の血清中総ＩｇＥ濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図４】
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