(57)【要約】【課題】バイオチップを用いた生体関連分子検出において、検出時のバックグラウンドノイズを抑え、目的とする生体関連物質成分のみを感度良く検出することができ、マイクロＲＮＡを面倒な検体の前処理なしに感度良く検出することが可能な電気泳動装置及びその検出方法を提供する。【解決手段】検体液収容部１０と、検体液収容部１０と連通して配置されたフィルタ２０と、フィルタ２０を介して検体液収容部１０と連通する反応液収容部３０と、反応液収容部３０と連通して配置されたバイオチップ４０と、フィルタ２０を挟んで検体液収容部１０側と反応液収容部３０側にそれぞれ配置され、生体関連物質を検体液収容部１０と反応液収容部３０との間でフィルタ２０を通過させて電気泳動させるための一対の電極５０，６０とを備え、フィルタ２０は、生体関連物質が通過するときに所定の生体関連物質を捕捉して精製する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体関連物質を含む検体液を導入するための検体液収容部と、
該検体液収容部と連通して配置されたフィルタと、
該フィルタを介して前記検体液収容部と連通する反応液収容部と、
該反応液収容部と連通して配置された、生体関連物質を検出するためのバイオチップと、
前記フィルタを挟んで前記検体液収容部側と前記反応液収容部側にそれぞれ配置され、生体関連物質を前記検体液収容部と前記反応液収容部との間で前記フィルタを通過させて電気泳動させるための一対の電極と、を備え、
前記フィルタは、生体関連物質が通過するときに所定の生体関連物質を捕捉して精製することを特徴とする電気泳動装置。
【請求項２】
前記フィルタは、所定の大きさよりも大きな生体関連物質を捕捉することを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
【請求項３】
前記フィルタは、水溶性高分子で形成されたことを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
【請求項４】
前記電極は、半透膜又は電解質膜を介して前記検体液収容部内又は前記反応液収容部内と連通することを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
【請求項５】
前記反応液収容部側に配置された電極は、前記バイオチップに設けられたことを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
【請求項６】
前記バイオチップは、前記反応液収容部内に面する電気的貫通孔を有し、
該電気的貫通孔は、その内部に生体関連物質を検出するためのプローブが固定されていることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
【請求項７】
前記反応液収容部は、前記バイオチップと前記フィルタとの間に第１の反応液収容部と、前記バイオチップを挟んで前記第１の反応液収容部と反対側に第２の反応液収容部と、を有し、
前記反応液収容部側に配置された電極は、前記バイオチップよりも前記第２の反応液収容部側に配置されたことを特徴とする請求項６に記載の電気泳動装置。
【請求項８】
生体関連物質は、核酸であることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
【請求項９】
検体液収容部と、該検体液収容部と連通して配置されたフィルタと、該フィルタを介して前記検体液収容部と連通する反応液収容部と、該反応液収容部と連通して配置された生体関連物質を検出するためのバイオチップと、前記フィルタを挟んで前記検体液収容部側と前記反応液収容部側にそれぞれ配置された一対の電極と、を備えた電気泳動装置を用いて生体関連物質を検出する方法であって、
前記検体液収容部に生体関連物質を含む検体液を導入する工程と、
前記一対の電極に電圧を印加して、生体関連物質を前記検体液収容部から前記フィルタを通過させて前記反応液収容部に電気泳動させ、前記フィルタに所定の生体関連物質を捕捉させて精製する精製工程と、
前記反応液収容部に移動した生体関連物質を前記バイオチップと接触させる工程と、を含むことを特徴とする生体関連物質検出方法。
【請求項１０】
前記精製工程では、前記フィルタに所定の大きさよりも大きな生体関連物質を捕捉させることを特徴とする請求項９に記載の生体関連物質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸等の生体関連物質の検出に適した電気泳動装置及び電気泳動を用いた生体関連物質検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、病気の診断、原因の解明のために、ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等と呼ばれるバイオチップが開発されている。このようなバイオチップは、シリコン等の基盤上にフォトグラフィー技術によって短鎖の核酸を直接固相合成していく方法（例えば、特許文献１，２）や、化学的又は物理的に修飾した基盤上に核酸等の生体関連物質プローブ（以下、プローブという）をスポッティングして固定化する方法（例えば、非特許文献１）によって製造される。
【０００３】
また、多数の中空繊維を束ねて樹脂で固定化し、その中空繊維の中空部にゲル状物と共にプローブを導入した後、この固定化物を中空繊維と直交する方向に切断し薄片化して製造するバイオチップが知られている（例えば、特許文献３）。このバイオチップは、プローブをバイオチップの表面部だけでなく厚み方向にも保持可能であるので、多量のプローブを導入可能であり、高い検出感度を得るのに適している。
【０００４】
このようにプローブがゲルに固定化されたバイオチップのハイブリダイゼーション効率を高めるため、電気泳動装置を用いる技術が知られている（例えば、特許文献４，５）。特許文献５に記載の電気泳動装置は、特許文献３に記載されたようなバイオチップを介してその両側に各々設けられた検体液収容部と、半透膜を介して各検体液収容部の外側に設けられたバッファ液収容部と、各バッファ液収容部の外側に設けられた電極とを有している。この電気泳動装置は、さらに検体液収容部内に充填される検体液を洗浄液に入れ替える機構を有する。
【０００５】
特許文献５に記載の電気泳動装置では、一対の電極に電圧を印加すると、一方の検体液収容部内の検体液に含まれる検体（生体関連物質）が他方の検体収容部側へ電気泳動し、検体がバイオチップに接触する。このときバイオチップのゲル中へ検体が素早く拡散し、プローブと検体とのハイブリダイゼーション反応が加速される。ハイブリダイズしなかった検体は、バイオチップを通過して他方の検体収容部内へ移動する。特許文献５に記載の電気泳動装置では、一対の電極の極性を反転させて、未ハイブリダイズ検体を検体収容部間で往復させることにより、ハイブリダイゼーション効率を高めることができる。
【０００６】
特許文献５に記載の電気泳動装置では、検体をハイブリダイズさせた後、さらに検体液を洗浄液に入れ替え、再び電極に電圧を印加することにより、バイオチップから未ハイブリダイズ検体を洗浄液内へ電気泳動させて、未ハイブリダイズ検体をバイオチップから除去することができる。このような不要検体の洗浄処理によって、未ハイブリダイズ検体に起因するバックグラウンドノイズが低減され、検査精度が高められる。
【０００７】
また、近年、マイクロＲＮＡと呼ばれる核酸が、生体内での細胞の分化・再生における制御機構に重要な役割を果たしていることが知られるようになった（非特許文献２）。このため、成分量が少なく、２０塩基前後と鎖長が短い核酸が生体関連物質として盛んに注目されている。このマイクロＲＮＡは、検体中に相対的に微量しか含まれないので、検出生体から取り出した核酸混合物からマイクロＲＮＡを検出することは難しい。このため、マイクロＲＮＡを検出するには、まず生体から抽出した核酸物質から鎖長の短い核酸成分を一度分離精製した後に、バイオチップ等による検査方法に供する方法がとられている。
【０００８】
【非特許文献１】「サイエンス」（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９５年、第２７０号、ｐ．４６７−４７０
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ、２００５年、第４３５号、ｐ．７４５−７４６
【特許文献１】米国特許第５，４４５，９３４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７４４，３０５号明細書
【特許文献３】特開２０００−２７０８７８号公報
【特許文献４】特開２０００−６０５５４号公報
【特許文献５】国際公開第２００５／０３１３３５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、電気泳動装置を用いて生体関連物質を電気泳動させるとき、検体液に含まれる夾雑物が、バイオチップの表面に吸着し、このため検出のバックグラウンドレベルが高くなりノイズの原因となってしまうという問題があった。
また、夾雑物が、生体関連物質を検出するためのプローブに非特異的に吸着し、目的の生体関連物質がプローブに正しく結合又は相互作用することが妨げられてしまうという問題があった。
【００１０】
特に特許文献４，５のように、プローブがゲルに固定化されたバイオチップを用い電気泳動を利用してハイブリダイゼーションを行う際には、ゲル中に強制的に検体が拡散されるため、夾雑物の影響が出やすく、検出のバックグラウンドノイズが非常に高くなってしまう。
【００１１】
また、生体関連物質としてマイクロＲＮＡを検出する場合、上述のように、検体中に含まれるマイクロＲＮＡが相対的に微量であるので、先ず目的とする短鎖長成分を単離し、その後に単離した成分をバイオチップに接触させ検出する方法がとられている。しかしながら、短鎖長成分を単離する際、分解や精製ロスが避けられないので、この方法においても結果的に高い検出感度が得られないという問題があった。
【００１２】
本発明の目的は、バイオチップを用いた生体関連物質検出において、検出時のバックグラウンドノイズを抑え、目的とする生体関連物質成分のみを感度良く検出することができる電気泳動装置及び電気泳動を用いた生体関連物質検出方法を提供することにある。
【００１３】
また、本発明の他の目的は、マイクロＲＮＡを面倒な検体の前処理なしに感度良く検出することが可能な電気泳動装置及びその検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の電気泳動装置は、生体関連物質を含む検体液を導入するための検体液収容部と、該検体液収容部と連通して配置されたフィルタと、該フィルタを介して前記検体液収容部と連通する反応液収容部と、該反応液収容部と連通して配置された生体関連物質を検出するためのバイオチップと、前記フィルタを挟んで前記検体液収容部側と前記反応液収容部側にそれぞれ配置され、生体関連物質を前記検体液収容部と前記反応液収容部との間で前記フィルタを通過させて電気泳動させるための一対の電極と、を備え、前記フィルタは、生体関連物質が通過するときに所定の生体関連物質を捕捉して精製することを特徴とする。
【００１５】
このような構成によれば、検体液収容部に検体液を導入すると共に、反応液収容部にバッファー液を配置した後、一対の電極に所定の電圧を印加することにより、検体液中の生体関連物質を検体液収容部からフィルタを通して反応液収容部に電気泳動させることができる。本発明では、生体関連物質は、フィルタを通過して反応液収容部に移動するので、検体液中に含まれる検査対象ではない所定の生体関連物質や夾雑物をフィルタによって捕捉することができる。これにより、検査対象ではない所定の生体関連物質や夾雑物に起因するバックグラウンドを低減して、バイオチップにより、目的とする生体関連物質のみを感度よく検出することができる。
【００１６】
本発明の他の好ましい態様によれば、前記フィルタは、所定の大きさよりも大きな生体関連物質を捕捉する。このような構成によれば、フィルタが捕捉する生体関連物質のサイズを適宜に設定することにより、目的とする生体関連物質（例えば、所定サイズのマイクロＲＮＡ）のみを、面倒な検体の前処理なしに感度よく検出することができる。
具体的には、前記フィルタは、水溶性高分子で形成することができる。
【００１７】
本発明の他の好ましい態様によれば、前記電極は、半透膜又は電解質膜を介して前記検体液収容部内又は前記反応液収容部内と連通する。このような構成によれば、半透膜又は電解質膜によって、電極本体を生体関連物質から隔絶して、生体関連物質が電気的酸化還元反応によって分解されてしまうことを防止することができる。
また、前記反応液収容部側に配置された電極は、前記バイオチップに設けてもよい。
【００１８】
本発明の他の好ましい態様によれば、前記バイオチップは、前記反応液収容部内に面する電気的貫通孔を有し、該電気的貫通孔は、その内部に生体関連物質を検出するためのプローブが固定されている。このような構成によれば、生体関連物質に、バイオチップの電気的貫通孔を通過させることにより、生体関連物質とプローブとを効率よくハイブリダイゼーション反応させることができる。
【００１９】
本発明の他の好ましい態様によれば、前記反応液収容部は、前記バイオチップと前記フィルタとの間に第１の反応液収容部と、前記バイオチップを挟んで前記第１の反応液収容部と反対側に第２の反応液収容部と、を有し、前記反応液収容部側に配置された電極は、前記バイオチップよりも前記第２の反応液収容部側に配置されている。
【００２０】
このような構成によれば、検体液収容部から第１の反応液収容部に移動してきた生体関連物質を、バイオチップの電気的貫通孔を通して第２の反応液収容部に移動させることができるので、生体関連物質が電気的貫通孔を通過するときに、生体関連物質を電気的貫通孔に固定されたプローブと効率よくハイブリダイゼーション反応させることができる。
本発明の他の好ましい態様によれば、生体関連物質は、核酸である。
【００２１】
また、本発明は、検体液収容部と、該検体液収容部と連通して配置されたフィルタと、該フィルタを介して前記検体液収容部と連通する反応液収容部と、該反応液収容部と連通して配置された生体関連物質を検出するためのバイオチップと、前記フィルタを挟んで前記検体液収容部側と前記反応液収容部側にそれぞれ配置された一対の電極と、を備えた電気泳動装置を用いて生体関連物質を検出する方法であって、前記検体液収容部に生体関連物質を含む検体液を導入する工程と、前記一対の電極に電圧を印加して、生体関連物質を前記検体液収容部から前記フィルタを通過させて前記反応液収容部に電気泳動させ、前記フィルタに所定の生体関連物質を捕捉させて精製する精製工程と、前記反応液収容部に移動した生体関連物質を前記バイオチップと接触させる工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、バイオチップを用いた生体関連分子検出において、検出時のバックグラウンドノイズを抑え、目的とする生体関連物質成分のみを感度良く検出することができる電気泳動装置及び電気泳動を用いた生体関連物質検出方法を提供することができる。
また、本発明によれば、マイクロＲＮＡを面倒な検体の前処理なしに感度良く検出することが可能な電気泳動装置及びその検出方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の好ましい実施形態の電気泳動装置及び電気泳動を用いた生体関連物質検出方法について、図面を参照して詳細に説明する。なお、これらは実施形態を例示するものであって、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
一般的に、バイオチップを用いた生体関連分子検出では、検体は、生体等から取り出され、バイオチップと反応させるために、ある程度単離精製される。また、検体は、製品として入手可能なシリカゲルビーズや分離膜等によって精製される。そして、精製された検体は、バイオチップでの検出が可能なように、蛍光色素や、電気化学的活性物質、放射性物質、発光性色素等が修飾される。
【００２５】
しかしながら、上述のように精製された検体には、目的とする生体関連物質だけではなく、不要成分が含まれている。不要成分は、バイオチップの基盤やプローブと非特異的に吸着し、検出効率を低下させる。本発明の電気泳動装置では、この原因物質（不要成分）を効率よく除去し、検出効率を大幅に向上させることができるように構成されている。
【００２６】
まず、図１に基づいて、本発明の第１態様の電気泳動装置について説明する。図１は、電気泳動装置１の概略構成図である。
本実施形態の電気泳動装置１は、検体液収容部１０と、フィルタ２０と、反応液収容部３０と、バイオチップ４０と、電極５０（第１の電極），６０（第２の電極）と、電源装置７０とを備えている。
【００２７】
検体液を収容する検体液収容部１０は、両端が開口した形状を有している。検体液収容部１０の一端側（外方側）の開口部は、電極５０で覆われ、他端側（内方側）の開口部は、フィルタ２０の一方の面によって覆われている。
反応液を収容する反応液収容部３０も、両端が開口した形状を有している。反応液収容部３０の一端側（外方側）の開口部は、板状のバイオチップ４０によって覆われ、他端側（内方側）の開口部は、フィルタ２０の他方の面によって覆われている。
従って、本実施形態の電気泳動装置１は、検体液収容部１０と反応液収容部３０とがフィルタ２０を挟んで対向して配置され、さらにその外方に電極５０とバイオチップ４０とが配置された構成を備えている。
【００２８】
検体液収容部１０は、内部に検体液２を保持することができる空間を有している。検体液２は、生体から取り出し、バイオチップ４０に適合するように調製された生体関連物質を含むバッファー溶液である。この検体液収容部１０の内部空間に、検体液２が導入される。
フィルタ２０は、フィルタ本体２１である水溶性高分子のアガロースが環状の支持体２２内に保持された構成である。フィルタ２０は、フィルタ本体２１が検体液収容部１０内の検体液２と接触するように、検体液収容部１０に連通して配置されている。フィルタ２０は、後述するように、生体関連物質が検体液収容部１０から反応液収容部３０に向けて通過するときに、所定の生体関連物質や夾雑物を捕捉して、生体関連物質を精製する。
【００２９】
反応液収容部３０は、内部に反応液３を保持することができる空間を有している。反応液収容部３０は、内部に満たされた反応液３がフィルタ本体２１と接触するように、フィルタ２０を介して検体液収容部１０と連通している。反応液収容部３０は、フィルタ２０を挟んで検体液収容部１０と反対側に位置している。すなわち、検体液収容部１０と反応液収容部３０は、フィルタ２０によって隔絶されている。しかしながら、これに限定されず、検体液収容部１０と反応液収容部３０とが、フィルタ２０を介さず、直接連通している部位を有していてもよい。反応液３は、例えば、２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳの混合溶液からなるバッファー液である。
【００３０】
検体液収容部１０，フィルタ２０の支持体２２，反応液収容部３０を構成する材料としては、溶液を漏出させず、化学的に安定であって、イオンやその他の成分を液中へ溶出する量が少なく、且つ溶液中の検体分子の吸着が少ないものを用いることが望ましい。例えば、ブチルゴム，ニトリルゴム，シリコンゴム，テフロン（登録商標）樹脂，アクリル樹脂，ポリカーボネート樹脂等を用いることができる。
【００３１】
バイオチップ４０は、基盤表面又は内部にプローブが固定されたバイオチップであり、所定の生体関連物質を検出することができるようになっている。バイオチップ４０は、反応液収容部３０内の反応液３と接触するように、反応液収容部３０と連通して配置されている。これにより、反応液３内に移動してきた生体関連物質と、バイオチップ４０の生体関連物質からなるプローブとが、結合または相互作用することができるようになっている。
【００３２】
電極５０は、フィルタ２０に対向し、且つ、検体液収容部１０内に露出して検体液２と接触するように配置されている。電極６０は、電極５０に対してフィルタ２０を挟んで配置されている。具体的には、電極６０は、反応液収容部３０内に一部が露出して反応液３と接触するように配置されている。電極５０，６０は白金製の電極である。しかしながら、電極材料は、これに限らず、導電性の材料であればよく、化学的に安定でイオンやその他の成分の溶液中への溶出の少ないものが好適である。
なお、電極５０，６０は、それぞれ複数の電極から構成されていてもよい。
【００３３】
また、電極５０，６０は、電極本体の表面上に電解質膜５１，６１が形成されている。これにより、生体関連物質が電極５０，６０に接触又は接近したときに、電気的酸化還元反応によって生体関連物質が分解されてしまうことを防止することができる。
また、同様の効果を得るために、電極５０，６０を半透膜で覆ってもよい。半透膜としては、検体（生体関連物質）を透過させず、溶液中の水や塩類のような低分子を透過させるようなものを用いることができ、例えば、ゼラチン膜，アセテート膜，アクリルアミド系ポリマーやポリビニルアルコール等のハイドロゲル，再生セルロース膜等を用いることができる。これにより、生体関連物質は、半透膜を通過できず電極５０，６０から隔離されて溶液中に留まり、電極５０，６０によって直接反応するのを防止することができる。
【００３４】
電源装置７０は、電極５０，６０間に接続されており、所定の電圧を電極５０，６０間に印加することができるようになっている。また、電源装置７０は、制御装置を有しており、電極５０，６０間に印加される電圧を制御することができるようになっている。このように、電極５０，６０間に所定時間電圧が印加されることにより、検体液２中の生体関連物質がバイオチップ４０側へ電気泳動される。
【００３５】
次に、本発明に用いることができるフィルタ２０についてさらに詳細に説明する。フィルタ２０は、検体液中に含まれる不要な夾雑物や比較的高分子量の生体関連物質を除去する精製機構を構成する。フィルタ２０には、生体物質関連の限外ろ過に一般的に用いられる水溶性高分子や透析膜を用いることができる。
【００３６】
水溶性高分子としては、アガロース以外に、アクリルアミド、ポリエチレングリコール及びその誘導体から選択することができる。一般的な電気泳動に用いることができるゲルを使用することができる。
水溶性高分子をフィルタとして機能させるために、高分子の構造を保持し力学的強度を強化するように支持体を用いて補強したり、高分子を３次元架橋させたりしてもよい。また、ＩＰＮ構造のゲルや、ナノコンポジットゲルと呼ばれる高強度の３次元架橋型水溶性高分子を用いてもよい。
【００３７】
また、透析膜としては、ゼラチン膜、アセテート膜、再生セルロース膜等、セルロースや多孔性テフロン（登録商標）膜等を用いることができる。膜の孔のサイズは、対象とする生体関連物質のサイズによって適宜選ばれる。具体的には、膜の孔のサイズは、対象とする生体関連物質よりも大きいサイズの生体関連物質を捕捉するようなサイズに設定される。
フィルタ２０の素材は、生体関連物質の特異的吸着が少ないものが望ましい。しかしながら、これに限定されず、生体関連物質を溶解させる溶液中に特異的吸着を抑える添加物を添加したり、素材表面をコーティングしたりしてもよい。特異的吸着を抑える添加物としては、ＳＤＳやＴｗｅｅｎなどの界面活性剤が挙げられる。
【００３８】
次に、検体液収容部１０に導入される生体関連物質について説明する。
生体関連物質とは、検査の対象となる生体関連物質、例えばＤＮＡ，ＲＮＡ，蛋白質，ペプチド等を含むものである。これらの生体関連物質は、バイオチップ４０に固定された対応する生体関連物質プローブと結合又は相互作用することにより、バイオチップ４０の特定のプローブに固定される。予め生体関連物質に蛍光色素，電気化学的活性物質，放射性物質，発光性色素等を修飾しておくことにより、バイオチップ４０のプローブに固定される生体関連物質を検出することができ、これにより検体中に含まれる生体関連物質の種類と量を見積もることが可能である。
【００３９】
検体液２は、生体から取り出された生体関連物質の他、電気泳動を行うために必要なバッファー液や添加剤から構成される。電気泳動を行うためのバッファー液組成成分としては、例えばトリス−ホウ酸バッファ（ＴＢ）、トリス−酢酸バッファ（ＴＡ）、塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）等の電解質を用いることができる。また、添加剤は、目的に応じて添加することができ、例えば界面活性剤により非特異的な吸着を抑えることができる。界面活性剤としては、ＳＤＳやＴｗｅｅｎなどを用いることができる。
【００４０】
次に、図２に基づいて、本発明の第２態様の電気泳動装置について説明する。なお、以下の態様では、同様の構成要素には同じ符号を付し、重複する説明は省略する。
第２態様の電気泳動装置１は、第１態様のものと同じ構成要素を有するが、フィルタ２０ａが細長い筒状の形状となっている構成の例示である。図２では、筒状の支持体２２ａ内にフィルタ本体２１ａが保持されている。
フィルタ２０ａは、上部に同じく筒状の検体液収容部１０ａが配置され、その内部の検体液２とフィルタ本体２１ａとが接触している。さらに、フィルタ２０ａは、下部が反応液３で満たされた反応液収容部３０ａ内に差し込まれ、フィルタ本体２１ａと反応液収容部３０ａ内の反応液３とが接触している。
【００４１】
支持体２２ａは、例えば、中空のキャピラリーチューブであってもよい。また、支持体２２ａの長さ及び太さは、任意に設定してよい。例えば、支持体２２ａの長さを細長くした場合には、検体液収容部１０ａと反応液収容部３０ａとを空間的に離すことができる。
フィルタ２０ａの上部には、電解質膜５１を有する電極５０ａが配置されている。
【００４２】
また、検体液収容部１０ａは、完全に密閉されている必要はなく、例えば、試験管のようなものに検体液を入れ、電極５０ａを配置すると共に、フィルタ本体２１ａを充填したキャピラリー状のフィルタ２０ａを、検体液２が導入された検体液収容部１０ａ内に差し込む構成であってもよい。この構成でも、検体液収容部１０ａから生体関連物質を反応液収容部３０ａに移動させることと、フィルタ２０ａにより生体関連物質の不要物質を除去することを同時に達成することができる。
【００４３】
次に、図３に基づいて、本発明の第３態様の電気泳動装置について説明する。
第３態様の電気泳動装置１では、バイオチップ４０ａに複数の電極６０が設けられている。このように構成すると、装置の製造を容易にすることができる。
なお、電極６０は、複数でなくてもよく、一つであってもよい。また、プローブが固定される基盤そのものが電極であってもよい。このように構成すると、反応液収容部３０に電気泳動によって移動してきた生体関連物質が、プローブ固定位置近くまで強制的に移動されるため、プローブと生体関連物質の結合または相互作用の反応を迅速化することができる。
【００４４】
次に、図４に基づいて、本発明の第４態様の電気泳動装置について説明する。
第４態様のバイオチップ４０ｂは、複数の電気的な貫通孔４１を有し、電気的貫通孔４１の内部に生体関連物質を検出するためのプローブ分子が固定されている構成である。
電気的な貫通孔４１は、バッファー液等を介してバイオチップ４０ｂの表側（電極５０側）と裏側（電極６０ａ側）との通電を可能にする貫通孔である。電気的な貫通孔４１は、具体的には、板状の基盤に穿設された貫通孔に、セルロース、アガロース、アクリルアミド、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子材料から成るゲルが満たされた構成である。プローブ分子は、水溶性高分子材料に固定されている。
【００４５】
また、電気的な貫通孔４１は、多孔質材料で形成されてもよい。基盤を多孔質材料で形成することにより、表側と裏側が物理的に貫通する。多孔質材料は、例えば、ガラス、セラミック、プラスチック等を多孔質構造として用いることができる。プローブ分子は、多孔質材料の表面に固定される。
【００４６】
反応液収容部３１は、内部に反応液３を保持することができる第１の反応液収容部３１ａと第２の反応液収容部３１ｂによって構成されている。第１の反応液収容部３１ａと第２の反応液収容部３１ｂは、これらの間にバイオチップ４０ｂが配置され、互いに隔離されている。反応液３中の精製された生体関連物質は、バイオチップ４０ｂの電気的貫通孔４１を通じて往来することができるようになっている。
【００４７】
また、第２の反応液収容部３１ｂ内に連通して、電極６０ａがバイオチップ４０ｂと対向するように配置されている。これにより、電極６０ａは、第２の反応液収容部３１ｂ内の反応液３と接触している。
【００４８】
このような構成であるので、電源装置７０によって電極５０，６０ａ間に所定極性の電圧が印加されると、検体液収容部１０内の生体関連物質は、電気泳動の原理によってフィルタ２０を通過し、精製され、一旦、第１の反応液収容部３１ａに到達する。
第１の反応液収容部３１ａに到達した精製された生体関連物質は、電気泳動によって、さらにバイオチップ４０ｂの電気的貫通孔４１を通過する。電気的貫通孔４１を通過する際、生体関連物質の一部が、内部に固定化されたプローブと結合または相互作用反応する。プローブと結合または相互作用反応しない生体関連物質は、第２の反応液収容部３１ｂに移動する。
【００４９】
所定時間後に、電源装置７０によって電極５０，６０ａに印加する電圧の極性が反転されると、第２の反応液収容部３１ｂに移動した生体関連物質は、電気泳動によって、再びバイオチップ４０ｂの貫通孔４１を通過する。貫通孔４１の通過の際、生体関連物質は、プローブとの結合または相互作用反応を行う。第４態様の電気泳動装置１では、この極性反転を繰り返し行うことにより、プローブと精製された生体関連物質との反応の効率が高まり、検出の感度及び速度を向上させることができる。
【００５０】
次に、図５に基づいて、本発明の第５態様の電気泳動装置について説明する。
第５態様の電気泳動装置１では、第４態様のバイオチップ４０ｂを用いている。第５態様では、第１の反応液収容部３１ａにさらに電極６０ｂ（第３の電極）が設けられている。電源装置７０ａは、内部に切替えスイッチ７１を有している。このスイッチ７１は、電源出力を電極５０，６０ｂのいずれかに選択的に接続するものである。
【００５１】
このように構成されているので、第５態様の電気泳動装置１では、まず、スイッチ７１が電極５０に接続されている状態で電源装置７０ａによって電圧が印加されると、生体関連物質は検体液収容部１０から第１の反応液収容部３１ａに向けて移動される。そして、生体関連物質がフィルタ２０を通過するときに、生体関連物質をフィルタ２０によって精製することができる。所定の生体関連物質がフィルタ２０を通過した時点で、電源装置７０ａによってスイッチ７１が電極６０ｂに切替えられる。
【００５２】
その後、所定時間毎に、電源装置７０ａの出力電圧の極性が、電極６０ａ，６０ｂの間で切替えられることにより、生体関連物質を、第１の反応液収容部３１ａと第２の反応液収容部３１ｂとの間で、バイオチップ４０ｂの電気的貫通孔４１を通して効率よく往復移動させることができる。これにより、生体関連物質を、効果的にプローブと反応させることができる。
【００５３】
次に、生体関連物質が核酸である場合を例として、本発明の電気泳動装置の作用について説明する。ここでは、第４態様の電気泳動装置１を例にとって説明する。
図６は、フィルタ２０の作用を説明するための原理模式図である。生体から抽出されバイオチップ４０ｂ用に調製された検体液中に含まれる核酸４は、図６に示すように、大小様々な大きさの核酸４ａ，４ｂから構成されている。
【００５４】
本出願人は、鋭意研究した結果、大きなサイズの核酸４ｂは、バイオチップ４０ｂの表面と非特異吸着を起こし易く、バックグラウンドノイズの原因物質となることを突き止めた。
また、核酸サイズの大きな核酸４ｂがプローブとハイブリダイゼーション反応した場合、核酸サイズが大きいため、他のプローブとの干渉が起こり、他の核酸がハイブリダイゼーションする立体障害となってしまう。このため、核酸サイズの大きな核酸４ｂは、ハイブリダイゼーションの効率を下げる原因となることが分かった。
【００５５】
さらに、本出願人は、バイオチップ４０ｂのプローブの固定されている材料がゲルである場合、大きなサイズの核酸４ｂがゲル中に非特異的に絡まってしまいバックグラウンドノイズの原因物質となることを突き止めた。
これらのことから、本出願人は、大きなサイズの核酸４ｂを除去しながらハイブリダイゼーションを行うことにより、バックグラウンドを低減しつつ、ハイブリダイゼーションの効率を上げ、感度を向上させることができることを見出した。
【００５６】
図６に示すように、検体液収容部１０に導入された検体（核酸）４は、電気泳動の原理により、フィルタ２０を通過しバイオチップ４０ｂに接近する。その際、フィルタ２０によって上記の大きなサイズの核酸４ｂ及び夾雑物が除去され、比較的短い核酸４ａのみがフィルタ２０を通過する。この比較的短い核酸４ａはバイオチップ４０ｂに搭載されたプローブと接触して効率よくハイブリダイゼーションすることができると同時に、不都合な非特異的吸着を引き起こさないため、検出の感度が向上する。
【００５７】
また、生体から取り出される核酸物質中に含まれるマイクロＲＮＡは、他の核酸に比べて極めて微量である。このため、従来は、バイオチップ４０ｂに振り掛ける前に、２００塩基程度以下の短い核酸成分のみを別処理で抽出する必要があった。しかしながら、電気泳動装置１を用いることにより、このような抽出処理を別途行う必要がなく、検査を簡便に行うことができる。また、従来は、短い核酸成分の抽出の際にロスや分解が発生していたが、電気泳動装置１を用いることにより、このようなロスや分解が生じないため、検出の感度を向上させることができる。このように、電気泳動装置１は、マイクロＲＮＡの検出にも有効である。
以下、本発明の効果をより明確にするために、実施例を用いて説明する。
【実施例】
【００５８】
＜実施例１＞
（電気的貫通孔を有するＤＮＡチップの製造）
ＳＵＳ３０４鋼板（縦３５ｍｍ、横３５ｍｍ、厚さ０．１ｍｍ）の中央部２．１ｍｍ×２．１ｍｍの範囲に、直径０．３２ｍｍの孔が縦横各方向に０．４２ｍｍ間隔で１２行１２列に１４４個設けられた多孔板を２枚準備した。２枚の多孔板を積層し、対向する各孔に、ポリカーボネート製中空繊維（外径０．２８ｍｍ、内径０．１６ｍｍ、長さ１００ｃｍ）を略平行に通した。次いで、２枚の多孔板の位置が中空繊維の一方の端部から１０ｃｍと６０ｃｍの位置となるように多孔板の間隔を５０ｃｍに広げ、さらに２枚の多孔板及びその間の中空繊維束の周囲を厚さ１０ｍｍのポリテトラフルオロエチレン製板で直方体状に囲った。
【００５９】
次に、この囲いの中にカーボンブラック（三菱化学（株）製、ＭＡ１０００）で着色したポリウレタン樹脂（日本ポリウレタン工業（株）製、ニッポラン４２７６，コロネート４４０３）を流し込んだ。引き続き、室温で１週間静置して樹脂を硬化させた。樹脂の硬化後、多孔板とポリテトラフルオロエチレン製板の囲いを取り除き、２０ｍｍ、２０ｍｍ、長さ５０ｍｍの角柱状の中空繊維配列体を得た。この中空繊維配列体には、その断面の中央部７ｍｍ×７ｍｍの範囲に１４４本の中空繊維が配列されていた。
【００６０】
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド：４．５質量部、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド：０．５質量部、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩：０．１質量部、水：９５質量部からなる組成の混合溶液を調製した。この混合溶液を、中空繊維配列体の６４本の中空繊維の中空部に導入した。
【００６１】
表１にＤＮＡチップに搭載する核酸プローブの塩基配列リストを示す。表１の４０種類の各塩基配列のＤＮＡを、前記混合溶液に濃度が５ｎｍｏｌ／ｍｌになるように添加して４０種類の溶液を作製した。各溶液を、中空繊維配列体の残り８０本の中空繊維の中空部に各２本ずつ導入した。次いで、７０℃で３時間かけて重合させ、中空繊維の中空部にゲル状物を生成させた。その後、ミクロトームを用いて中空繊維軸と直角方向に、厚みが０．５ｍｍとなるように薄片を切り出した。更にその周囲をトリミングして１２ｍｍ×１２ｍｍ×０．５ｍｍのＤＮＡチップ（バイオチップ４０ｂ）を得た。
【００６２】
【表１】
2009036719.tif 000003
【００６３】
（アガロースゲルを用いたフィルタの製造）
フィルタ２０を作製するため、図７に示すポリカーボネート製の枠（支持体２２）を用意した。支持体２２は、外形が２ｃｍ角、厚さ２ｍｍであり、中央部に円形の孔２３が設けられている。孔２３は直径１．５ｃｍである。円形の孔２３の内面は、ゲル状のフィルタ本体２１との密着性を向上させるために、粗面加工が施されており、また脱落を防ぐために段２４が設けられている。
この支持体２２に、熱湯に溶かしたアガロース（５重量％）を流し込み、上下をスライドガラスで挟み込み、アガロースがゲル化し固まるまで放置した。アガロースがゲル化した後、スライドガラスを取り除いてフィルタ２０を得た。
【００６４】
（電気泳動用カートリッジ）
次いで、図８に示す電気泳動用カートリッジ５を組み立てた。検体液収容部１０、第１の反応液収容部３１ａ、第２の反応液収容部３１ｂには、ブチルゴム製の矩形状のパッキン（外形２ｃｍ角、厚み２ｍｍ、開口部１ｃｍ角）を用いた。
フィルタ２０は、上述のアガロースゲルフィルタを用いた。
バイオチップ４０ｂは、上述のＤＮＡチップを用いた。
また、検体液収容部１０の上側開口と、第２の反応液収容部３１ｂの下側開口を覆うため、半透膜８１を用いた。半透膜８１には、スペクトラム社製「スペクトロポア」（カットオフ分子量：３５００）を用いた。
【００６５】
さらに、これらを挟持して一体化するため、ポリカーボネート製の矩形状のカートリッジハウジング８０ａ，８０ｂを用いた。ハウジング８０ａ，８０ｂは、中央部に矩形の貫通孔が形成されている。
そして、ハウジング８０ａ，半透膜８１，検体液収容部１０，フィルタ２０，第１の反応液収容部３１ａ，バイオチップ４０ｂ，第２の反応液収容部３１ｂ，半透膜８１，ハウジング８０ｂをこの順に積層し、液が漏れ出さないようにハウジング８０ａ，８０ｂをポリカーボネート製のネジ８２で固定した。これにより、電気泳動用カートリッジ５を得た。
【００６６】
（検体液及びバッファー液の調製）
検体の調製は、Ｍｏｕｓｅ  ＰｏｌｙＡ−ＲＮＡ５μｇを出発原料として行った。Ｔ７増幅法により転写増幅する際、Ｃｙ５−ＵＴＰを混在させることにより、転写増幅されるａＲＮＡにＣｙ５を取り込ませた。さらに、Ｚｎバッファーによる断片化を行った。これを濃縮し、５μｇ相当を２００μＬのバッファー液に溶解させ検体液とした。バッファー液は、２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳの混合溶液を用いた。
【００６７】
（電気泳動用カートリッジへの各液の導入）
上記検体液を検体液収容部１０内に注射器で注入した。また、上記バッファー液を反応液収容部３１ａ，３１ｂ内にそれぞれ注射器で注入した。
【００６８】
（ハイブリダイゼーション及び洗浄）
次に、検体液及びバッファー液が導入された電気泳動用カートリッジ５を、図９のようなハイブリダイゼーション用の槽６に取り付け、槽６内をバッファー液で満たした。電気泳動用カートリッジ５は、槽６の中央部に設けられた保持部６ａに取付けた。槽６は、保持部６ａの両側、すなわち、ハウジング８０ａ側（図中左側）と、ハウジング８０ｂ側（図中右側）とに、それぞれバッファー液を保持する第１槽６ｂ，第２槽６ｃが形成されており、各槽にバッファー液を満たした。
【００６９】
第１槽６ｂ，第２槽６ｃには、それぞれハウジング８０ａ，８０ｂと対向するように、電極５０，６０ａが取付けられている。各槽６ｂ，６ｃは、電極５０，６０ａと保持部６ａ間の幅が３５ｍｍ、奥行き（図９の上下方向長さ）が７０ｍｍ、深さ（図９の紙面方向長さ）が５０ｍｍである。
また、第１槽６ｂ，第２槽６ｃには、バッファー液を循環させるための循環装置（図示せず）が取付けられている。循環装置は、熱交換器つき循環器を有しており、槽６内のバッファー液を温度を保持したまま（例えば、５５℃）循環させることができる。
【００７０】
槽６内をバッファー液で満たした後、電源装置７０によって電極５０，６０ａ間に６Ｖの電圧（電極５０が負極）を４０分間印加した。負に帯電した検体は、検体液収容部１０フィルタ２０を通過して、第１の反応液収容部３１ａ内に移動しようとする。このとき、夾雑物や、大きなサイズの生体関連物質がフィルタ２０により捕捉され精製される。これにより、精製された生体関連物質、すなわち、比較的サイズの小さい生体関連物質のみがフィルタ２０を通過し、第１の反応液収容部３１ａ内に移動する。
【００７１】
さらに、電気泳動により、第１の反応液収容部３１ａ内に移動した生体関連物質は、バイオチップ４０ｂのゲル内部へ泳動する。このとき、ゲルに固定されたプローブに特異的な検査対象の生体関連物質（検体）は、プローブとハイブリダイズしてゲル内に保持される。プローブに相補的でない生体関連物質はプローブとハイブリダイズせず、第２の反応液収容部３１ｂに泳動する。
未ハイブリ検体を除くため、電気泳動用カートリッジ５を、槽６の新しいバッファー液中に、さらに５５度で２０分間放置し洗浄した。
【００７２】
（蛍光検出）
次いで、三菱レイヨン社製イメージアナライザを用いて、ハイダイゼーションさせたＤＮＡチップ（バイオチップ４０ｂ）の各スポットの蛍光強度を定量評価した。露光時間及びＣＣＤカメラの条件を同じにすることで比較できるデータを取得した。
【００７３】
（比較例１）
上記のアガロースゲルを用いたフィルタ２０及び第１の反応液収容部３１ｂを使用せずに、図１０に示す構成の電気泳動用カートリッジを使用して、実施例１と同様のハイブリダイゼーション処理を行った。
【００７４】
図１１は、実施例１及び比較例１の蛍光強度の測定結果から、４０種類の遺伝子プローブを搭載した各スポットの蛍光強度プロファイルをプロットしたグラフである。
また、図１２は、遺伝子プローブを搭載していない全ブランクスポットの平均蛍光強度を示すグラフである。図１３は、遺伝子プローブを搭載したスポットのうち、蛍光強度の強い上位５つのプローブの平均値を示すグラフである。
【００７５】
図１２から分かるように、ブランクスポットの平均蛍光強度（すなわちブランクノイズ）は、フィルタ２０を使用した場合（実施例１）には７４１であり、フィルタ２０を使用しなかった場合（比較例１）には４０７９であった。このように、フィルタ２０を使用することにより、ブランクノイズを略１／５．５に低減することができた。
【００７６】
図１３から分かるように、遺伝子プローブを搭載したスポットの上位５つの平均蛍光強度は、フィルタを使用した場合（実施例１）には３３５００であり、フィルタ２０を使用しなかった場合（比較例１）には２８５００であった。このように、フィルタ２０を使用することにより、ハイブリダイゼーションの効率を１．２倍程度向上させることができた。
【００７７】
また、図１１から分かるように、ハイブリダイゼーションによる蛍光強度が１００００以下のプローブに関しては、フィルタを使用しなかった場合（比較例１）には、数千程度のブランクノイズに埋もれて精度良く測定できていなかったが（例えば、スポット１１，１３，２６等）、フィルタを使用した場合（実施例）には、数千程度の低い強度のスポットに関しても精度良く測定することができた。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の第１態様の電気泳動装置の概略説明図である。
【図２】本発明の第２態様の電気泳動装置の概略説明図である。
【図３】本発明の第３態様の電気泳動装置の概略説明図である。
【図４】本発明の第４態様の電気泳動装置の概略説明図である。
【図５】本発明の第５態様の電気泳動装置の概略説明図である。
【図６】本発明の電気泳動装置の作用の説明図である。
【図７】本発明の電気泳動装置を構成するフィルタの支持体の説明図である。
【図８】本発明の電気泳動装置を構成する電気泳動用カートリッジの分解斜視図である。
【図９】本発明の電気泳動装置の説明図である。
【図１０】比較例の電気泳動用カートリッジの分解斜視図である。
【図１１】実施例及び比較例のプルーブ搭載スポットの蛍光強度プロファイルを示すグラフである。
【図１２】実施例及び比較例のブランクスポットの平均蛍光強度を示すグラフである。
【図１３】実施例及び比較例のプルーブ搭載スポットの上位５つの平均蛍光強度を示すグラフである。
【符号の説明】
【００７９】
１‥電気泳動装置、２‥検体液、３‥反応液、４‥核酸、
５‥電気泳動用カートリッジ、
６‥槽、６ａ‥保持部、６ｂ，６ｃ‥槽、
１０，１０ａ‥検体液収容部、
２０，２０ａ‥フィルタ、２１，２１ａ‥フィルタ本体、
２２，２２ａ‥支持体、
３０，３０ａ，３１‥反応液収容部、
３１ａ‥第１の反応液収容部、３１ｂ‥第２の反応液収容部、
４０，４０ａ，４０ｂ‥バイオチップ、４１‥電気的貫通孔、
５０，５０ａ，６０，６０ａ，６０ｂ‥電極、
７０，７０ａ‥電源装置、７１‥切替えスイッチ、
８０ａ，８０ｂ‥カートリッジハウジング、
８１‥半透膜、８２‥ネジ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2009036719.tif 000013
【図１１】
2009036719.tif 000014
【図１２】
2009036719.tif 000015
【図１３】
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