(57)【要約】【課題】活性汚泥中の細菌の種類や生息数を速やかに知ること。【解決手段】本発明の分析方法は、活性汚泥に含まれる細菌のＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡの逆転写を行って逆転写ＤＮＡを得、得られた逆転写ＤＮＡを以下のＤＮＡチップのＤＮＡ断片と交雑させることを特徴とする。ＤＮＡチップ：基板上にNocardia属糸状性細菌、Rhodococcus属糸状性細菌、Beggiatoa属糸状性細菌、Thiothrix属糸状性細菌、Desulfobacter属硫黄代謝細菌、Desulfotomaculum属硫黄代謝細菌、Desulfovibrio属硫黄代謝細菌、Desulfomicrobium属硫黄代謝細菌、Desulforhopalus属硫黄代謝細菌、Nitrosomonas属硝化細菌、Nitrosospira属硝化細菌およびNitrospira属硝化細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されたＤＮＡチップ【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性汚泥に含まれる細菌のＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡの逆転写を行って逆転写ＤＮＡを得、得られた逆転写ＤＮＡを以下のＤＮＡチップのＤＮＡ断片と交雑させることを特徴とする前記細菌の分析方法。
ＤＮＡチップ：基板上に、
Nocardia属糸状性細菌、Rhodococcus属糸状性細菌、
Beggiatoa属糸状性細菌硫黄代謝細菌、Thiothrix属糸状性細菌硫黄代謝細菌、
Desulfobacter属硫黄代謝細菌、Desulfotomaculum属硫黄代謝細菌、Desulfovibrio属硫黄
代謝細菌、Desulfomicrobium属硫黄代謝細菌、Desulforhopalus属硫黄代謝細菌、
Nitrosomonas属硝化細菌、Nitrosospira属硝化細菌およびNitrospira属硝化細菌
のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されてなるＤＮＡチップ
【請求項２】
前記活性汚泥に含まれる細菌が硝化細菌である請求項１に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性汚泥に含まれる細菌の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性汚泥を用いて、これに生息している種々の細菌により、排水に含まれる汚染物質、例
えば有機態炭素などを生物学的に分解する、いわゆる活性汚泥法は、排水を浄化する排水
処理方法は、生物学的に排水を処理する生物学的排水処理方法として広く用いられている
〔特許文献１：特開平５−２３７４８８号公報、特許文献２：特開２０００−２７９９８
２号公報など〕。
【０００３】
活性汚泥に含まれる細菌は、それぞれ特定の汚染物質を選択的に分解するのが通常である
。例えば硫黄代謝細菌は、無機硫黄化合物などを選択的に分解するが、有機態炭素、アン
モニア態窒素などは分解しない。しかも、活性汚泥中の細菌は、汚染物質を分解すると、
分解量に応じて生息数が増加するが、その一方で、分解すべき汚染物質が無い状態が続く
と、次第に死滅して減少する。
【０００４】
また、同一の排水源からの排水に含まれる汚染物質の種類やその濃度は、長期間に亘り概
ね一定の範囲内にあるのが通常である。例えば家庭から排出される生活排水は、通常、有
機態炭素を主な汚染物質とし、その濃度は概ね一定の範囲内である。
【０００５】
このため、活性汚泥中の細菌の種類やその生息数は、長期間、同じ排水源からの排水を処
理し続けることより、その排水の処理に適切なものとなるのが通常である。
【０００６】
しかし、活性汚泥中の細菌が、夏場の高温、突発的な被毒物質の混入、汚染物質の急激な
増加など、様々な原因により、全て死滅する場合がある。このような場合に、他の排水源
からの排水の処理に使用している活性汚泥を投入し、排水処理を再開することがあるが、
このような活性汚泥は、処理すべき排水に含まれる汚染物質に必ずしも適したものではな
い。このため、汚染物質の分解が効率よく行われず、排水の処理が滞ると言う問題があっ
た。
【０００７】
かかる問題を解決するには、処理すべき排水に対して適切な種類の細菌を適切な生息数で
含む活性汚泥を選択して投入し、排水処理を再開すればよい。このため、活性汚泥中の細
菌の種類や、その生息数を速やかに、精度よく、知りうる方法が求められている。
【０００８】
活性汚泥中の細菌を分析する方法としては、従来から、顕微鏡により細菌の形状や個数を
観察する方法が知られている〔特許文献３：特開平５−１４６７９１号公報〕。
【０００９】
しかし、顕微鏡による従来の分析方法は、細菌を速やかに、精度よく分析しうるものでは
なかった。
【００１０】
【特許文献１】特開平５−２３７４８８号公報
【特許文献２】特開２０００−２７９９８２号公報
【特許文献３】特開平５−１４６７９１号公報
【非特許文献１】ＳＣＡＳ ＮＥＷＳ ２００５−II〔株式会社住化分析センター(2005年8月22日)発行、第３頁〜第６頁〕
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで本発明者は、活性汚泥中の細菌の種類や生息数を速やかに知るべく鋭意検討した結
果、本発明に至った。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち本発明は、活性汚泥に含まれる細菌のＲＮＡ〔リボ核酸〕を抽出し、抽出されたＲＮＡの逆転写を行って逆転写ＤＮＡ〔逆転写デオキシリボ核酸〕を得、得られた逆転写ＤＮＡを以下のＤＮＡチップのＤＮＡ断片と交雑させることを特徴とする前記細菌の分析方法を提供するものである。
【００１３】
ＤＮＡチップ：基板上に、
Nocardia属糸状性細菌、Rhodococcus属糸状性細菌、
Beggiatoa属糸状性細菌硫黄代謝細菌、Thiothrix属糸状性細菌硫黄代謝細菌、
Desulfobacter属硫黄代謝細菌、Desulfotomaculum属硫黄代謝細菌、Desulfovibrio属硫黄
代謝細菌、Desulfomicrobium属硫黄代謝細菌、Desulforhopalus属硫黄代謝細菌、
Nitrosomonas属硝化細菌、Nitrosospira属硝化細菌およびNitrospira属硝化細菌
のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されてなるＤＮＡチップ
【００１４】
本発明の分析方法は、活性汚泥に含まれる細菌の中でも、硝化細菌の分析に好適である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の分析方法によれば、活性汚泥中の細菌の種類を知り、また、その生息数を見積もる分析を、速やかに、精度よく、行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
〔ＤＮＡチップを構成する基板〕
本発明の分析方法に用いられる上記ＤＮＡチップを構成する基板として通常は、無機ガラス製の板が挙げられる。基板のサイズとしては、取扱いが容易である点で、通常は厚み０．５ｍｍ〜２ｍｍで、短辺が１０ｍｍ〜２０ｍｍ、長辺が５０ｍｍ〜１００ｍｍのものが使用される。このような基板としては、光学顕微鏡観察に広く用いられているスライドグラスが、入手が容易である点で、好ましく用いられ
【００１７】
〔細菌〕
かかる基板の上に固定されるＤＮＡ断片は、上記した糸状性細菌、硫黄代謝細菌および硝
化細菌のＤＮＡ塩基配列を含むものである。
【００１８】
〔糸状性細菌〕
糸状性細菌は、活性汚泥による汚染物質の分解に対して障害となりうる細菌である。糸状
性細菌の中でも、上記したNocardia属、Rhodococcus属のものは、過剰に繁殖すると活性
汚泥が浮上する膨化と呼ばれる現象の原因となって活性汚泥による分解に対する障害とな
り易いものとして、多くの活性汚泥に含まれうるものである。
【００１９】
上記ＤＮＡチップは、上記した糸状性細菌以外の糸状性細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていてもよく、中でもSphaerotilus属糸状性細菌は、比較的多くの活性汚泥に含まれうることから、これのＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていることが好ましい。
【００２０】
〔硫黄代謝細菌〕
硫黄代謝細菌は、硫黄または無機硫黄化合物を酸化しうる細菌であり、排水が硫黄または
無機硫黄化合物を含む場合に、活性汚泥に多く含まれるものである。硫黄代謝細菌の中で
も上記したDesulfobacter属、Desulfotomaculum属、Desulfovibrio属、Desulfomicrobium
属およびDesulforhopalus属のものは、活性汚泥により、その量が大きく変化しうるもの
である。
【００２１】
上記ＤＮＡチップは、上記した硫黄代謝細菌以外の硫黄代謝細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていてもよく、中でもDesulfococcus属硫黄代謝細菌、Desulfomonas属硫黄代謝細菌、Desulfuromonas属硫黄代謝細菌、Desulfurella属硫黄代謝細菌、Desulfomonile属硫黄代謝細菌、Desulfosarcina属硫黄代謝細菌、Lawsonia属硫黄代謝細菌は、活性汚泥により、その量が比較的大きく変化しうることから、そのＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていることが好ましい。
【００２２】
〔糸状性細菌硫黄代謝細菌〕
糸状性細菌硫黄代謝細菌は、糸状性細菌の性質と、硫黄代謝細菌の性質を併せ持つ細菌で
あり、例えばBeggiatoa属糸状性細菌硫黄代謝細菌、Thiothrix属糸状性細菌硫黄代謝細菌
などが挙げられる。
【００２３】
〔硝化細菌〕
硝化細菌は、アンモニア態窒素または亜硝酸態窒素を酸化する菌であって、排水がアンモ
ニア態窒素を含む場合に、活性汚泥に多く含まれるものであり、アンモニア態窒素を亜硝
酸に酸化するアンモニア酸化細菌、または亜硝酸を硝酸に酸化する亜硝酸酸化細菌である
。上記したNitrosomonas属硝化細菌（アンモニア酸化細菌）、Nitrosospira属硝化細菌（
アンモニア酸化細菌）およびNitrospira属硝化細菌（亜硝酸酸化細菌）は、活性汚泥によ
り、その量が大きく変化するものである。
【００２４】
上記ＤＮＡチップは、上記した以外の硝化細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていてもよく、中でもNitrosolobus属硝化細菌（アンモニア酸化細菌）、Nitrobacter属硝化細菌（亜硝酸酸化細菌）は、活性汚泥により、その量が比較的大きく変化することから、そのＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていることが好ましい。
【００２５】
〔その他の細菌〕
上記ＤＮＡチップは、上記した糸状性細菌、硫黄代謝細菌、硝化細菌以外の細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていてもよい。かかる細菌は、好気性細菌であってもよいし、嫌気性細菌であってもよく、例えばAcinetobacter属ポリリン酸蓄積細菌、Arthrobacter属ポリリン酸蓄積細菌、Microlunatas属ポリリン酸蓄積細菌などが挙げられる。また、上記した以外の糸状性細菌、硫黄代謝細菌、糸状性細菌硫黄代謝細菌、硝化細も挙げられる。
【００２６】
〔ＤＮＡチップの調製〕
かかるＤＮＡチップは、例えば
(1)上記各細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片を調製するＤＮＡ断片調製工程および
(2)ＤＮＡ断片調製工程で得られたＤＮＡ断片を基板上に固定するＤＮＡ断片固定工程
を経て調製することができる。
【００２７】
〔ＤＮＡ断片調製工程〕
ＤＮＡ断片は、通常の方法、例えば目的とする細菌を溶菌し、ＤＮＡを抽出し、得られた
ＤＮＡを増幅する方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ反応）により調製すること
ができる。ＤＮＡ断片は両端がＤＮＡプライマーで固定されていてもよい。
【００２８】
〔ＤＮＡ断片固定工程〕
上記ＤＮＡ断片調製工程で得られたＤＮＡ断片は、通常の方法、例えば上記で得られたＤ
ＮＡ断片を溶媒で希釈し、基板上にスポット状に付着させ、次いで乾燥すればよい。
【００２９】
得られたＤＮＡチップは、通常０℃以下、好ましくは−１５℃以下で保存される。
【００３０】
〔細菌の分析〕
本発明の方法は、かかるＤＮＡチップを用いて活性汚泥に含まれる細菌の種類および量を分析するものである。
【００３１】
具体的には、
(1)活性汚泥から細菌を抽出する細菌抽出工程、
(2)細菌抽出工程で得た細菌を溶菌したのちＲＮＡを抽出する溶菌・ＲＮＡ抽出工程、
(3)溶菌・ＲＮＡ抽出工程で抽出されたＲＮＡの逆転写を行い逆転写ＤＮＡを得る逆転写工程
(4)逆転写工程で得た逆転写ＤＮＡを蛍光色素と結合させて標識化する標識化工程、および
(5)標識化工程で標識化した逆転写ＤＮＡをＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片と交雑させる交雑工程
を経て活性汚泥に含まれる細菌を分析することができる。
【００３２】
〔細菌抽出工程〕
活性汚泥から細菌を抽出するには、例えば活性汚泥を生理食塩水で希釈したのち、遠心分
離処理すればよい。遠心分離により、細菌は沈降して沈殿物となるので、遠心処理後の沈
殿物として、細菌を得ることができる。
【００３３】
〔溶菌・ＲＮＡ抽出工程〕
得られた細菌を溶菌するには、例えば細菌を溶媒中、粉砕媒体と共に震盪すればよい。粉
砕媒体としては。例えばガラスビーズなどが用いられる。震盪することにより、細菌が粉
砕媒体に衝突するなどして破壊され、細菌中のＲＮＡが溶媒中に分散する。その後、粉砕
媒体を分離し、遠心分離により固形分を除去し、塩化ナトリウムおよびエタノールを加え
てＲＮＡを沈降させ、遠心分離により沈降物としてＲＮＡを得ることができる。
【００３４】
なお、上記で得られる沈降物には細菌中のＤＮＡも含まれるので、通常は、この沈降物をＤＮＡ分解酵素〔Ｄｎａｓｅ〕と接触させることにより、沈降物中のＤＮＡを分解する。
【００３５】
〔逆転写工程〕
溶菌・ＲＮＡ抽出工程で得たＲＮＡの逆転写は、例えば得られたＲＮＡを鋳型として逆転写ＤＮＡを精製する通常の方法により行うことができる。
【００３６】
〔標識化工程〕
逆転写ＤＮＡを標識化するには、例えばインドカルボシアニン（Ｃｙ）色素などの蛍光色素で標識したプライマーをＰＣＲ法により結合させればよい。
【００３７】
〔交雑工程〕
標識化した後の逆転写ＤＮＡを、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片と交雑させるには、この逆転写ＤＮＡをＤＮＡチップ上に塗布すればよい。塗布は、例えば逆転写ＤＮＡを溶媒中に分散させ、滴下したのち、乾燥することにより行われる。塗布により、逆転写ＤＮＡは、これに対応するＤＮＡ断片と結合する。
【００３８】
交雑工程の後、水洗するなどして、結合しなかった余分の逆転写ＤＮＡを除去し、紫外線照射下に蛍光を観察することにより、細菌を分析することができ、蛍光の有無から、活性汚泥に含まれる細菌の有無を分析することができ、蛍光強度から、その細菌の量を分析することができる。
【００３９】
本発明の分析方法によれば、活性汚泥に含まれる細菌、好ましくは硝化細菌の種類、量を速やかに、精度よく、分析することができるので、例えば活性汚泥中の細菌が死滅した場合に、他の活性汚泥を用いて排水処理、好ましくはアンモニア態窒素または亜硝酸態窒素を含む排水の処理を再開するにあたり、最適な活性汚泥を速やかに選択することができる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限
定されるものではない。
【００４１】
〔実施例１〕
〔ＤＮＡチップの調製〕
以下の糸状性細菌、糸状性細菌硫黄代謝細菌、硫黄代謝細菌、硝化細菌を用いてＤＮＡチ
ップを調製した。
【００４２】
なお、用いた細菌の中には属が明らかであるが、種が明らかでないものがあるので、この
ような細菌には、それぞれ（＊）を付した。また、２種類と記載している細菌は、異なる
種であることが判明している２種類の細菌のＤＮＡをそれぞれ用いたことを示す。
【００４３】
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糸状性細菌
────────────────────────────────────────
Nocardia属      ：Nocardia 1(*)、Nocardia 2(*)、Nocardia 3(*)、Nocardia 4(*)
Rhodococcus属   ：Rhodococcus 1(*)、Rhodococcus 2(*)
Thiothrix属     ：eikelbloomii 1、eikelbloomii 2、fructosivorans、
Thiothrix sp.1,EJ1M-B(*)、unzii、Eikelbloom Type 1701
Sphaerotilus属  ：Sphaerotilus(*)
上記以外の属    ：Microthrix、Haliscomenobacter、Nostocoida 1、
Nostocoida 2(*)、Nostocoida 3(*)、Achromatium 1(*)、
Achromatium 2(*)
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００４４】
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糸状性細菌硫黄代謝細菌
────────────────────────────────────────
Beggiatoa属     ：Beggiatoa1、Beggiatoa2、Beggiatoa3、Beggiatoa4、Beggiatoa5、
Beggiatoa6
Thiothrix属     ：Thiothrix1、Thiothrix2、Thiothrix3、Thiothrix4、Thiothrix5、
Thiothrix6
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【００４５】
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硫黄代謝細菌
────────────────────────────────────────
Desulfobacter属   ：Desulfobacter1(*)、Desulfobacter2(*)、Desulfobacter3(*)、
Desulfobacter4(*)
Desulfotomaculum属：D. acetoxidance、D. aeronauticum、D. alkaliphilum、
D. auripigmentum、D. guttoideum、D. halophilum、
D. kuznetsovii、D. nigrificans 1、D. nigrificans 2、
D. reducens、D. ruminis、D. thermobenzoicum
Desulfovibrio属   ：Desulfovibrio 1（２種類）(*)、Desulfovibrio 2（２種類）(*)
、Desulfovibrio 3（２種類）(*)、Desulfovibrio 4(*)、
Desulfovibrio 5(*)、Desulfovibrio 6(*)、Desulfovibrio 7(*)
Desulfomicrobium属：Desulfomicrobium、D. apsheronum、D. norvegicum
Desulforhopalus属 ：Desulforhopalus 1(*)、Desulforhopalus 2(*)、
Desulforhopalus 3(*)
Desulfococcus属   ：Desulfococcus 1（biacutus）(*)、Desulforhopalus 2(*)
Desulfomonas属    ：Desulfomonas
Desulfuromonas属  ：Desulfuromonas acetoxidance、D. chloroethanica、
Desulfuromonas 1(*)、Desulfuromonas 2(*)、
Desulfuromonas 3(*)、Desulfuromonas 4(*)、
Desulfuromonas 5(*)、Desulfuromonas 6(*)
Desulfurella属    ：Desulfurella
Desulfomonile属   ：Desulfomonile limimaris、Desulfomonile sp.(*)、
Desulfomonile sp.1(*)、Desulfomonile sp.2(*)、
Desulfomonile sp.3(*)
Desulfosarcina属  ：Desulfosarcina
Lawsonia属        ：Lawsonia intracellularis
上記以外の属      ：Bilophila wadsworthia、Desulfobotulus、
Desulfobulbus 1(*)、Desulfobulbus 2(*)、
Desulfobulbus 3(*)、Desulfobulbus 4(*)、
Desulfocapsa 1(*)、Desulfocapsa 2(*)、Desulfocapsa 3(*)、
Desulfokalobium、Desulfonatronum、
Desulfonosporus thiosulfogenes、Desulfotalea 1(*)、
Desulfotalea 2(*)、Desulfuromusa 1(*)、
Desulfuromusa 2(*)、Desulfuromusa 3(*)、
Thermosulfovibrio、Thermoterrabacterium ferrireducens
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００４６】
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
硝化細菌（アンモニア酸化細菌）
────────────────────────────────────────
Nitrosomonas属    ：Nitrosomonas、Nitrosomonas sp.（２種類）(*)、
N. aestuarii、N. communis、N. cryotolerans、N. europaea、
N. halophila、N. nitrosa、N. oligotropha、N. ureae
Nitrosospira属    ：Nitrosospira、N. briensis、N. multiformis
Nitorosolobus属   ：Nitrosolobus
上記以外の属      ：Nitrosococcus、Nitrosococcus 1(*)、Nitrosococcus 2(*)、
Nitrosococcus 3(*)、Anammoxoglobus 1(*)、
Anammoxoglobus 2(*)、Brocadia、Kuenenia、Scalindua 1(*)、
Scalindua 2(*)、Scalindua 3(*)
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００４７】
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
硝化細菌（亜硝酸酸化細菌）
────────────────────────────────────────
Nitrospira属      ：Nitrospira、N. marina、N. moscoviensis
Nitrobacter属     ：Nitrobacter、Nitrobacter 1(*)、Nitrobacter 2(*)、
Nitrobacter 3(*)、Nitrobacter 4(*)
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００４８】
〔ＤＮＡ断片の調製〕
各細菌はのＤＮＡ断片は、各種の遺伝子データベースに掲載されている１６ＳｒＲＮＡ（
リボゾームＲＮＡ）塩基配列情報から固有の遺伝子領域を選出し、そのクローンを合成す
ることにより得た。
【００４９】
〔ＤＮＡ断片の固定〕
上記で得たＤＮＡ断片をそれぞれスライドガラス上の所定位置にスポット状に付着させ、
乾燥することにより、固定してＤＮＡチップを得た。得られたＤＮＡチップは、以下の交
雑に使用するまで−２０℃で保管した。
【００５０】
〔細菌の分析〕
上記で得たＤＮＡチップを用いて、化学工場の生物学的排水処理施設から採取した活性汚泥４検体を用いて、それぞれの活性汚泥に含まれる細菌の種類数および量を以下の手順で分析した。活性汚泥は、生物学的排水処理施設に流入する排水の性状が変化したと見込まれる場合について（第１回採取検体〜第３回採取検体）、また生物学的排水処理施設の水温が数℃上昇したと見込まれる場合（第４回採取検体）にそれぞれ採取した。
【００５１】
〔細菌の抽出〕
活性汚泥４ｍＬに生理食塩水〔大塚製薬社製〕３６ｍＬを加えたのち振盪した。その後、
２ｍＬを分取し、１５０００回転／分の遠心分離を行ったのち、上澄み液を分離して沈降
物を得、緩衝水溶液〔エーエムアール社（岐阜市）製「ライシス・バッファー」〕１５０
μＬを加えて希釈した。なお、使用した器具は全て滅菌処理したものである。
【００５２】
〔溶菌およびＲＮＡの抽出〕
上記で希釈した後の沈降物に、ジルコニアビーズ〔エーエムアール社（岐阜市）製〕を加え、９０℃で１０分間保持した後、細胞破砕機〔安井機器社製「Multibeads Shocker」〕により２５００ｒｐｍで６０秒間振盪した。その後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液〔濃度０．２質量％〕２００μＬを加え、１分間、ボルテックス撹拌を行い、１５０００回転／分で５分間、遠心分離した後、上澄み液を分取し、この上澄み液に対して０．０５容量倍の塩化ナトリウム水溶液〔５モル／Ｌ〕および２容量倍のエタノール〔１００％〕を加え、３０秒間、ボルテックス撹拌を行った。その後、１５０００回転／分で５分間、遠心分離して沈殿物を分取し、５５℃で５分間保持することにより乾燥して、ＲＮＡを含む沈降物を得た。この沈殿物をＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ 滅菌蒸留水〔ＲＮＡ分解酵素を含まない滅菌蒸留水〕２００μＬに懸濁して懸濁液とした。
【００５３】
次いで、この懸濁液４３μＬに、緩衝水溶液〔１０×ＤＮＡａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン社製）〕５μＬおよびＤＮＡ分解酵素水溶液〔ＤＮＡａｓｅ Ｉ（インビトロジェン社製）〕２μＬを加え、３７℃にて２時間保持してＤＮＡを分解した。その後、５５℃に昇温し、同温度を５分間保持してＤＮＡ分解酵素を失活させた後、４℃に冷却した。
【００５４】
〔逆転写〕
上記でＤＮＡを分解した後の混合物５μＬにＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ 滅菌蒸留水１３．５μＬを加え、これに市販のＰＣＲ反応用溶液〔「ＴａＫａＲａ−Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ」（宝酒造社製）〕および「１６ＳｒＲＮＡ８ＵＡ−５１９Ｂプライマーセット」（シグマアルドリッチジャパン社）を用いて５０μＬの反応系で４２℃で６０分間保持し、９８℃で５分間保持後、４℃に冷却することにより逆転写を行って、逆転写ＤＮＡを含む混合物を得た。
【００５５】
〔標識化〕
上記で得た逆転写ＤＮＡに、市販の「１６ＳｒＲＮＡ８ＵＡ−５１９Ｂプライマーセット」（シグマアルドリッチジャパン社製）を用いて１００μＬのＰＣＲ法により、逆転写ＤＮＡの増幅を行った。
【００５６】
その後、「Ｃｙ Ｄｙｅ ８ＵＡ−５１９Ｂプライマーセット」（シグマアルドリッチジャパン社製）（蛍光色素）を用いて１００μＬの反応系でＰＣＲ法により、逆転写ＤＮＡを蛍光色素と結合させて標識化した。
【００５７】
その後、逆転写ＤＮＡを蛍光色素と結合させた後の混合物に対して０．０５容量倍の塩化ナトリウム水溶液〔５モル／Ｌ〕および２容量倍のエタノール〔１００％〕を加え、３０秒間、ボルテックス撹拌を行った。その後、１５０００回転／分で５分間、遠心分離して沈殿物を分取し、ＰＣＲグレードの純水２０μＬに懸濁させて懸濁液としたのち、−２０℃で保管した。
【００５８】
〔交雑〕
先に調製したＤＮＡチップを、塩化ナトリウム（０．１５モル／Ｌ）−クエン酸ナトリウ
ム（０．０１５モル／Ｌ）混合水溶液〔以下、ＳＳＣ水溶液とする。〕２容量部およびＳ
ＤＳ水溶液（濃度０．２質量％）１容量部の混合液を用いて室温で１５分間洗浄し、さら
に９５℃で５分間洗浄したのち、超純水により３回洗浄した。その後、８００回転／分に
て遠心乾燥した。
【００５９】
一方、上記〔標識化〕で得た懸濁液に純水を加えてＤＮＡ濃度が１００ｎｇ／μＬとなる
ように希釈し、２８μＬを分取し、ＳＳＣ水溶液１０μＬおよびＳＤＳ水溶液（濃度０．
２質量％）２μＬを加えた後、ＤＮＡチップ上に滴下し、次いで気泡が入らないようにカバーガラスを被せ、５０℃〜６５℃で１２時間〜１６時間保持した。その後、ＤＮＡチップを３７℃にて、塩化ナトリウム（０．３モル／Ｌ）、クエン酸ナトリウム（０．０３モル／Ｌ）およびＳＤＳ（濃度０．２質量％）の水溶液に１分間浸漬してカバーガラスを脱落させ、次いで、塩化ナトリウム（０．３モル／Ｌ）、クエン酸ナトリウム（０．０３モル／Ｌ）およびＳＤＳ（濃度０．２質量％）の水溶液中で５分間振盪し、ＳＳＣ水溶液にて洗浄後、８００回転／分にて遠心乾燥した。
【００６０】
〔蛍光強度の測定〕
上記で乾燥したのちのＤＮＡチップに、レーザースキャナー〔ＧＳＩ ＬＵＭＯＮＩＣＳ
社製、「Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ ４０００」にて紫外線を照射し、蛍光シグナルの強度を測
定し、相対強度を求めた。
【００６１】
蛍光強度の測定には、画像解析ソフト〔日立ソフト社製「ＤＮＡＳＹＳ ＡＲＲＡＹ」〕
を用いた。蛍光強度は、検出された全ての蛍光シグナルの合計強度を１００％とし、０．
１％未満の蛍光強度は、非検出とした。
【００６２】
４回採取した活性汚泥の各種細菌群のＲＮＡ測定結果を図１〜図３に示す。それぞれ、硝化細菌群、糸状性細菌群及び硫黄代謝細菌群の測定結果であり、柱状グラフは検出菌種数を、折れ線グラフは蛍光シグナルの相対強度の合計値を示す。糸状性細菌であり硫黄代謝細菌であるものは両方に計上した。これらの図に示されるように、当該生物学的処理装置に対して流入排水の水質が変化したり、水温が上昇したりした可能性が考えられたが、活性汚泥中のこれら細菌群の活動度とみなしうるＲＮＡの測定結果によれば、当該生物学的処理装置の活性汚泥の機能は、菌種数、検出レベルともおおむね一定に保たれていることが判明した。
【００６３】
〔実施例２〕
図４に示す生物学的処理試験槽〔曝気部容積１Ｌ、沈降部容積０．３Ｌ〕(1)に化学工場の活性汚泥〔濃度５０００ｍｇ−ＭＬＳＳ／Ｌ、ＭＬＳＳは浮遊懸濁物質を意味する〕(2)を入れ、温度を任意に調節できる恒温室（インキュベータ）(図示せず)に収納した。この生物学的処理試験槽(1)は、連続通水式のものであり、エアストーン〔直径約２ｃｍ〕(3)による空気(A)の供給と、この空気による攪拌機能を有する曝気部〔容積１Ｌ、有効深さ約４０ｃｍ〕(11)と、下部〔底面から約２ｃｍ高さまで〕(12)のみが曝気部と開通された沈降部(13)から構成される。この沈降部(13)は、間仕切り板(14)により曝気部(11)から仕切られている。曝気部の上部から排水(B)を連続的に流入し、沈降部(13)の上方側面に開けられた排出口(15)から処理水(C)を排出する構造である。なお、この生物学的処理試験槽の材質は全て透明塩化ビニル樹脂である。
【００６４】
この試験槽に同工場の排水（汚濁物質として主として有機性の物質とアンモニア性の物質を含有する）を７８ｍＬ／時の流速で連続的に流入して好気的処理を行った。処理成績の指標として、有機性汚濁物質に対してはＴＯＣ（総有機態炭素）濃度をＴＯＣ計（島津製作所製「ＴＯＣ−５０００」）によって、アンモニア性汚濁物質に対してはアンモニア態窒素濃度を紫外線吸光光度法（ＪＩＳ日本工業規格Ｋ０１０２  ４５．２）によって、それぞれ経時測定した。まず試験槽を処理水温３６℃の条件で運転開始し、汚濁物質処理がおおむね安定したと見られる時点で、処理水温を４２℃に上昇した。温度上昇の直前、上昇後１日経過後及び４２℃の条件に活性汚泥がおおむね適応（馴化）したとみなされる温度上昇後２０日経過後の３時点で、試験槽から活性汚泥を採取し、実施例１に記載した手順によってＲＮＡを抽出し、逆転写を行って、ＤＮＡチップを用いた硝化細菌、糸状性細菌及び硫黄代謝細菌の分析を行った。
【００６５】
図５に試験槽のＴＯＣ、アンモニア態窒素（ＮＨ４−Ｎ）負荷推移及び処理水温変化を示す。経過日数１７日目に温度を約３６℃から約４２℃に上昇した。
【００６６】
図６に試験槽のＴＯＣ除去率及びＮＨ４−Ｎ除去率の推移を示す。経過日数１７日目に汚濁物質処理がおおむね安定したと見て水温を約３６℃から４２℃に上昇し、水温上昇の直前（１７日目）及び１日後（１８日目）に活性汚泥を採取して、それぞれＸ−１及びＸ−２と命名した。特開２００６−２６３６４２号公報に記載されるように、生物学的処理装置の水温が４０℃を超える温度領域に到達したときには一時的に有機性排水の処理水質が悪化するが、時間の経過に伴って次第に回復することが知られている。図６において、水温を４２℃に上昇の１日後に約６０％であったＴＯＣ除去率が、水温上昇から約２０日後の、経過日数３８日目には約８０％にまで回復したので活性汚泥を採取し、Ｘ−３と命名した。ＮＨ４−Ｎ除去率は、水温上昇前には５０％程度であったのが水温上昇後には２０％前後に低下し、ＴＯＣ除去率とは異なり、時間が経過しても回復が見られなかった。
【００６７】
採取した各活性汚泥から抽出したＲＮＡのＤＮＡチップによる測定結果を図７〜９に示す。それぞれ、硝化細菌群、糸状性細菌群及び硫黄代謝細菌群の測定結果であり、柱状グラフは検出菌種数を、折れ線グラフは蛍光シグナルの相対強度の合計値を示す。糸状性細菌であり硫黄代謝細菌であるものは両方に計上した。
【００６８】
硝化細菌（図７）は、検出菌種数、蛍光シグナルの相対強度とも、水温上昇前（試料名Ｘ−１）に比較して水温上昇１日後（Ｘ−２）には低下し、その２０日後（Ｘ−３）も回復が見られず、図６に示したＮＨ４−Ｎ除去率の推移をほぼ反映する結果が得られた。糸状性細菌（図８）及び硫黄代謝細菌（図９）は、必ずしも有機性汚濁除去を行うすべての細菌群を含むものではないが、水温が上昇した直後（Ｘ−２）に検出菌種数及び蛍光シグナルの相対強度が若干増加するものの、水温変動に伴う極端な変化はなく、４２℃の高水温環境に対する活性汚泥の有機性汚濁処理機能の比較的早い適応（馴化）を裏付ける推移の傾向を示している。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】化学工場の生物学的処理装置における採取試料毎の硝化細菌群ＲＮＡの変化を示す。横軸は１〜４回目採取の活性汚泥試料をあらわし、縦軸の柱状グラフは検出菌種数を、折れ線グラフは蛍光シグナルの相対強度の合計値を示す。
【図２】化学工場の生物学的処理装置における採取試料毎の糸状性細菌群ＲＮＡの変化を示す。横軸は１〜４回目採取の活性汚泥試料をあらわし、縦軸の柱状グラフは検出菌種数を、折れ線グラフは蛍光シグナルの相対強度の合計値を示す。
【図３】化学工場の生物学的処理装置における採取試料毎の硫黄代謝細菌群ＲＮＡの変化を示す。横軸は１〜４回目採取の活性汚泥試料をあらわし、縦軸の柱状グラフは検出菌種数を、折れ線グラフは蛍光シグナルの相対強度の合計値を示す。
【図４】実施例２で用いた連続通水式の生物学的処理試験槽を模式的に示す図である。
【図５】生物学的処理試験槽のＴＯＣ、アンモニア態窒素（ＮＨ４−Ｎ）負荷推移及び処理水温変化を示す。横軸は試験開始からの経過日数、左縦軸はＴＯＣ及びＮＨ４−Ｎの負荷量（１日あたりグラム数）及び右縦軸は処理水温（℃）である。
【図６】生物学的処理試験槽のＴＯＣ除去率及びＮＨ４−Ｎ除去率の推移を示す。横軸は試験開始からの経過日数、縦軸は除去率（％）である。
【図７】生物学的処理試験槽における採取試料毎の硝化細菌群ＲＮＡの変化を示す。横軸は試料名（Ｘ−１、Ｘ−２及びＸ−３）をあらわし、縦軸の柱状グラフは検出菌種数を、折れ線グラフは蛍光シグナルの相対強度の合計値を示す。
【図８】生物学的処理試験槽における採取試料毎の糸状性細菌群ＲＮＡの変化を示す。横軸は試料名（Ｘ−１、Ｘ−２及びＸ−３）をあらわし、縦軸の柱状グラフは検出菌種数を、折れ線グラフは蛍光シグナルの相対強度の合計値を示す。
【図９】生物学的処理試験槽における採取試料毎の硫黄代謝細菌群ＲＮＡの変化を示す。横軸は試料名（Ｘ−１、Ｘ−２及びＸ−３）をあらわし、縦軸の柱状グラフは検出菌種数を、折れ線グラフは蛍光シグナルの相対強度の合計値を示す。
【符号の説明】
【００７０】
１：生物学的処理試験槽
11：曝気部  12：下部      13：沈降部    14：間仕切り板  15：排水口
２：活性汚泥
３：エアストーン
Ａ：空気      Ｂ：排水      Ｃ：処理水
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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