(57)【要約】      （修正有）【課題】汎用的な変性ＬＤＬ検出アッセイおよびＡＧＥ検出アッセイにおいて使用するための安定な検出用分子を提供すること。【解決手段】（１）特定のアミノ酸配列；（２）特定のアミノ酸配列において、９０位および１０７位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；および（３）特定の核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸配列は、特定の対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；からなる群より選択される配列を含む、ポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、９０位および１０７位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；および
（３）配列番号１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸配列は、配列番号２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記置換は、保存的置換である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記欠失は、配列番号２の１２６位〜１３１位までのいずれか１〜６個のアミノ酸の欠失、５８位〜６３位までのいずれかのアミノ酸の欠失、もしくは１位のアミノ酸の欠失またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記付加は、配列番号４の６１位〜１４２位から選択される任意の連続する１〜８２個のアミノ酸配列の付加である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記付加は、フレキシブルなリンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメイン）を含む配列の付加である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記リンカー配列は、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列である、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記天然型ＬＯＸ−１の活性は、変性ＬＤＬの認識能である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
タグ配列をさらに有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記タグ配列は、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９である、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
標識をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
（１）配列番号８に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１７２位および１８９位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列；および
（３）配列番号７に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１７２位および１８９位のアミノ酸配列は、配列番号８における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記置換は、保存的置換である、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記欠失は、配列番号８の２０８位〜２１３位までのいずれか１〜６個のアミノ酸の欠失、１４０位〜１４５位までのいずれかのアミノ酸の欠失、もしくは１位〜８２位から選択される任意の連続する１〜８２個のアミノ酸配列の欠失である、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記天然型ＬＯＸ−１の活性は、変性ＬＯＸ−１の認識能である、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
タグ配列をさらに有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記タグ配列は、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９である、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
標識をさらに含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１に記載のポリペプチドの二量体。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドの多量体。
【請求項２１】
請求項１に記載のポリペプチドを含むポリペプチドがジスルフィド結合によって結合されている、二量体。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸分子であって、該核酸分子は、
（１）配列番号１に示される核酸配列；および
（２）（１）の核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列であって、該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸配列は、配列番号２における対応するアミノ酸を保持し、かつＬＯＸ−１の活性を示す、核酸配列
からなる群より選択される配列を含む、核酸分子。
【請求項２３】
前記ＬＯＸ−１の活性は、変性ＬＤＬの認識能である、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２４】
タグをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２５】
請求項２２に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２６】
請求項２２に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項２７】
請求項１に記載のポリペプチドを発現した細胞。
【請求項２８】
請求項１に記載のポリペプチドを含む、変性ＬＤＬ検出剤。
【請求項２９】
請求項１に記載のポリペプチドおよび基材を含む、変性ＬＤＬ検出用デバイス。
【請求項３０】
前記基材は、ビーズ、金粒子、プレート、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ダイアモンド様炭素皮膜ステンレスである、請求項２９に記載の検出用デバイス。
【請求項３１】
前記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製されるビーズを含む、請求項３０に記載の検出用デバイス。
【請求項３２】
被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法であって、該方法は、
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）該サンプルと、以下：
（１）請求項１に記載のポリペプチド；
（２）請求項１２に記載のポリペプチド；
（３）請求項１９もしくは２１に記載の該ポリペプチドの二量体；
（４）請求項２０に記載の該ポリペプチドの多量体；
（５）請求項２８に記載の変性ＬＤＬ検出剤；または
（６）請求項２９に記載の変性ＬＤＬ検出用デバイス、
のうちのいずれかとを接触させて、該Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチドと該変性ＬＤＬとの複合体を形成させる工程；および
（Ｃ）該複合体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
前記サンプルは、ＬＤＬを含む体液である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＬＤＬを含む体液は、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、肺胞洗浄液である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記変性ＬＤＬは、酸化ＬＤＬ、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬ、アクロレイン修飾ＬＤＬ、ノネナール修飾ＬＤＬ、サクシニル化ＬＤＬ、または糖化ＬＤＬから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記複合体を検出する工程は、光学的に検出する工程、物理的に検出する工程または化学的に検出する工程を包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法であって、該方法は、
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）該サンプル中の変性ＬＤＬを標識する工程；
（Ｃ）該サンプルと、請求項２７に記載の細胞とを接触させる工程；および
（Ｄ）該細胞中に取り込まれた、該サンプル中の変性ＬＤＬを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
請求項１に記載のポリペプチドを含む、変性ＬＤＬ検出用キット。
【請求項３９】
請求項１に記載のポリペプチドを含む変性ＬＤＬ検出剤と、該変性ＬＤＬ検出剤と変性ＬＤＬとの複合体を検出するための手段と、を備える、変性ＬＤＬ検出システム。
【請求項４０】
前記検出手段は、光学的検出手段、物理的検出手段または化学的検出手段を包含する、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
前記光学的検出手段は、分光光度計、ＦＡＣＳ、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、または顕微鏡を包含する、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
前記物理的検出手段は、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、または熱測定を包含する、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４３】
前記化学的手段は、質量分析、または高速液体クロマトグラフィーを包含する、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４４】
請求項１に記載のポリペプチドを含む、動脈硬化診断剤。
【請求項４５】
変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法であって、該方法は、
（Ａ）該疾患に罹患していると疑われる被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）該疾患に罹患していないコントロール被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｃ）該サンプルと、以下：
（１）請求項１に記載のポリペプチド；
（２）請求項１２に記載のポリペプチド；
（３）請求項１９もしくは２１に記載の該ポリペプチドの二量体；
（４）請求項２０に記載の該ポリペプチドの多量体；
（５）請求項２８に記載の変性ＬＤＬ検出剤；または
（６）請求項２９に記載の変性ＬＤＬ検出用デバイス；または
（７）請求項４４に記載の動脈硬化診断剤、
のうちのいずれかとを接触させて、該Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチドと該変性ＬＤＬとの複合体を形成させる工程；および
（Ｄ）該複合体を検出する工程、
（Ｅ）該被験体から単離されたサンプル中の複合体の量と、該コントロール被験体から単離されたサンプル中の複合体の量とを比較して、該被験体中の変性ＬＤＬの該コントロール被験体に対する相対値を算出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
前記変性ＬＤＬにより引き起こされる疾患は、前記変性ＬＤＬにより引き起こされる疾患は、動脈硬化症、虚血性心疾患、脳血管障害、大動脈瘤、腎梗塞、および高脂血症からなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記虚血性心疾患は、心筋梗塞、または狭心症を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記脳血管障害は、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、または一過性脳虚血発作を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１に記載のポリペプチドの、変性ＬＤＬにより引き起こされる疾患の診断のための医薬の製造のための使用。
【請求項５０】
後期糖化反応生成物レセプター（ＲＡＧＥ）ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、
（１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（３）配列番号１１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を含む、ポリペプチド。
【請求項５１】
前記置換は、保存的置換である、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
前記欠失は、配列番号１２の１位〜１５位である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
前記付加は、配列番号１０の１位〜２２位から選択される任意の１〜２２個のアミノ酸配列のＮ末端側への付加、配列番号１０の１２１位〜４０４位から選択される任意の連続する１〜２８３個のアミノ酸の付加、あるいはフレキシブルなリンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメインを含む配列の付加である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
前記リンカー配列は、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列である、請求項５３に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
前記天然型ＲＡＧＥの活性は、ＡＧＥの認識能である、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
タグ配列をさらに有する、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
前記タグ配列は、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９である、請求項５６に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
（１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（３）配列番号１３に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸配列は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列、
からなる群より選択される配列を含む、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
前記天然型ＲＡＧＥの活性は、ＡＧＥの認識能である、請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
タグ配列をさらに有する、請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
前記タグ配列は、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９である、請求項６０に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
請求項５０に記載の後期糖化反応生成物レセプター（ＲＡＧＥ）ポリペプチドをコードする核酸分子であって、該核酸分子は、
（１）配列番号１１に示される核酸配列；および
（２）（１）の核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列であって、該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、核酸配列；
からなる群より選択される配列を含む、核酸分子。
【請求項６３】
前記天然型ＲＡＧＥの活性は、ＡＧＥの認識能である、請求項６２に記載の核酸分子。
【請求項６４】
タグをコードする核酸配列をさらに含む、請求項６２に記載の核酸分子。
【請求項６５】
請求項６２に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項６６】
請求項６２に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項６７】
請求項１に記載のポリペプチドを発現した細胞。
【請求項６８】
請求項５０に記載のポリペプチドを含む、後期糖化反応生成物（ＡＧＥ）検出剤。
【請求項６９】
請求項５０に記載のポリペプチドおよび基材を含む、ＡＧＥ検出用デバイス。
【請求項７０】
前記基材は、ビーズ、金粒子、プレート、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ダイアモンド様炭素皮膜ステンレスを含む、請求項６９に記載の検出用デバイス。
【請求項７１】
前記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製されるビーズを含む、請求項７０に記載の検出用デバイス。
【請求項７２】
ＡＧＥを検出する方法であって、該方法は、
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）該サンプルと、以下：
（１）請求項５０に記載のポリペプチド；
（２）請求項５８に記載のポリペプチド；
（３）請求項６８に記載のＡＧＥ検出剤；または
（４）請求項６９に記載のＡＧＥ検出用デバイス、
のうちのいずれかとを接触させて、該ポリペプチドと該ＡＧＥとの複合体を形成させる工程；および
（Ｃ）該複合体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項７３】
前記サンプルは、タンパク質を含む体液である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記タンパク質を含む体液は、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、関節液、肺胞洗浄液、涙液または尿を含む体液である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＡＧＥは糖化タンパク質である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記複合体を検出する工程は、光学的に検出する工程、物理的に検出する工程または化学的に検出する工程を包含する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法であって、該方法は、
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）該サンプル中のＡＧＥを標識する工程；
（Ｃ）該サンプルと、請求項６７に記載の細胞とを接触させる工程；および
（Ｄ）該細胞中に取り込まれた、該サンプル中のＡＧＥを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項７８】
請求項５０に記載のポリペプチドを含む、ＡＧＥ検出用キット。
【請求項７９】
請求項５０に記載のポリペプチドを含むＡＧＥ検出剤と該ＡＧＥ検出剤とＡＧＥとの複合体を検出するための手段とを備える、ＡＧＥ検出システム。
【請求項８０】
前記検出手段は、光学的検出手段、物理的検出手段または化学的検出手段を包含する、請求項７９に記載のシステム。
【請求項８１】
前記光学的検出手段は、分光光度計、ＦＡＣＳ、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、または顕微鏡を包含する、請求項８０に記載のシステム。
【請求項８２】
前記物理的検出手段は、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、または熱測定を包含する、請求項８０に記載のシステム。
【請求項８３】
前記化学的手段は、質量分析、または高速液体クロマトグラフィーを包含する、請求項８０に記載のシステム。
【請求項８４】
請求項５０に記載のポリペプチドを含む、糖尿病性血管障害診断剤。
【請求項８５】
ＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断を支援する方法であって、該方法は、
（Ａ）糖尿病性血管障害に罹患していると疑われる被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）糖尿病性血管障害に罹患していないコントロール被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｃ）該サンプルと、以下：
（１）請求項５０に記載のポリペプチド；
（２）請求項５８に記載のポリペプチド；
（３）請求項６８に記載のＡＧＥ検出剤；
（４）請求項６９に記載のＡＧＥ検出用デバイス；または
（５）請求項８４に記載の糖尿病性血管障害診断剤、
のうちのいずれかとを接触させて、該ＲＡＧＥ様ポリペプチドと該ＡＧＥとの複合体を形成させる工程；および
（Ｄ）該複合体を検出する工程、
（Ｅ）該被験体から単離されたサンプル中の複合体の量と、該コントロール被験体から単離されたサンプル中の複合体の量とを比較して、該被験体中のＡＧＥの該コントロール被験体に対する相対値を算出する工程、
を包含する、方法。
【請求項８６】
前記ＡＧＥにより引き起こされる疾患は、糖尿病、糖尿病性血管障害、細小血管症、および大血管障害からなる群より選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記細小血管症は、腎症、網膜症、または神経症を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記大血管障害は、虚血性心疾患、脳血管疾患、または閉塞性動脈硬化症を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
請求項５０に記載のタンパク質の、ＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断剤の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＯＸ−１変異体およびＲＡＧＥ変異体、ならびにこれらを用いて生活習慣病危険因子を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レクチン様酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体１（Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：本明細書中以降、ＬＯＸ−１ともいう）は、アテローム発生の原因となる酸化ＬＤＬ（本明細書中以降、ＯｘＬＤＬともいう）のような変性ＬＤＬに対する特有のスカベンジャー受容体であり、１９９７年に、培養ウシ大動脈内皮細胞において初めて同定された。ＬＯＸ−１は、他のスカベンジャー受容体と機能的には類似しているにもかかわらず、構造的には異なる独特の構造を有している。
【０００３】
ウシＬＯＸ−１（ｂＬＯＸ−１）は、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる分子量約５０ｋＤａの糖タンパク質であり、Ｎ末端が細胞質内にあり、Ｃ末端が細胞外に出ている細胞膜１回貫通型のＩＩ型膜タンパク質である。ヒトＬＯＸ−１（ｈＬＯＸ−１）はまた、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる約３０ｋＤａ（１３９位および１８３位の糖鎖付加により、分子量約４０ｋＤａ）のＩＩ型膜タンパク質である。この受容体は、構造的には、以下の４つのドメインからなる：Ｎ末端側の細胞質ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、ネックドメイン、およびＣ型レクチン様ドメイン（本明細書中以降、ＣＴＬＤという）。このＣＴＬＤは、種間で、特に、６個のシステイン残基の位置で高度に保存されており、ＬＯＸ−１のリガンドを認識するための機能的ドメインである。このＣＴＬＤ中の６個のシステイン残基は、ｈＬＯＸ−１の分子内ジスルフィド結合に関与している。この保存されたＣＴＬＤに加えて、ｈＬＯＸ−１および他の既知の種におけるネックドメインは、高い配列同一性を有している。また、Ｘｉｅら（非特許文献１：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３２：６８−７４（２００３））によれば、ＣＴＬＤが変性ＬＤＬを結合するのに十分な最小ドメインであり、たとえＣＴＬＤがグリコシル化されていなくても、変性ＬＤＬを認識および結合できることが明らかにされた。
【０００４】
これまでの研究により、ＬＯＸ−１は、血管内皮細胞のみならず、マクロファージおよび活性化血管平滑筋細胞において発現されており、構造的に関連性のない種々の高分子（変性ＬＤＬ、細菌、老化赤血球、アポトーシスを受けた細胞、および血小板があげられる）を認識し、生体防御機構や炎症性機転などの種々の生命現象において重要な役割を果たしていること、そしてその発現は種々の条件下で、高脂血症、糖尿病、高血糖、高血圧症、高血圧性腎硬化症、動脈硬化、虚血再灌流傷害、血管バルーン傷害後のような病態；ならびに酸化ＬＤＬ、アンジオテンシンＩＩ、エンドセリン、ＴＮＦ−α、後期糖化反応生成物（ＡＧＥ）、ＴＧＦ−β、８−イソ−プロスタグランジンＦ２α、ズリ応力のような刺激によって、調節されていることが分かっている（非特許文献２：Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．  １２７，１０３−１０７（２００６））。
【０００５】
変性ＬＤＬ測定に関しては、疾病の早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野での活用が期待されている。これまで、ヒト血漿中の動脈硬化危険因子である変性ＬＤＬの測定には、モノクローナル抗体が用いられてきたが、特に変性ＬＤＬは分子の修飾構造は一定ではなく、意味のある分子種が明確でないなどの理由で、モノクローナル抗体による検出にも問題が多い。
【０００６】
後期糖化反応生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：本明細書中以降、ＡＧＥという）は、糖尿病患者の生活の質を損ねる元凶である血管合併症として知られる糖尿病性血管障害の発症・進展に関与している。血管合併症による眼、神経、腎臓の障害は、それぞれ糖尿病網膜症、神経症、腎症（あわせて三大合併症）とよばれており、糖尿病患者に特徴的な病態である。
【０００７】
ＡＧＥを認識する受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥ：本明細書中以降、ＲＡＧＥという）は、１９９２年に、ウシ肺から同定され、ＡＧＥと結合するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する、分子量約３５ｋＤａのＩ型膜タンパク質（糖鎖修飾を受けた完全なＲＡＧＥは、分子量５５ｋＤａ）である。ＲＡＧＥの細胞外ドメインは、１つのＶ型イムノグロブリンドメイン、続いて、２つのＣ型イムノグロブリンドメイン（Ｃ１領域およびＣ２領域）の３つのイムノグロブリンフォールド構造を取るドメインが結合した構造を取っている。ＲＡＧＥはまた、細胞膜１回貫通型のドメインおよび４３アミノ酸の細胞内ドメインを含む。ＲＡＧＥは、多様なクラスのリガンド（ＡＧＥ、Ｓ１００／カルグラニュリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎｅ）、アンホテリンおよびアミロイド−βペプチド（およびβ−シート原線維のクラス））と相互作用する。Ｖドメインは、リガンド結合に必須の部位であり、細胞内ドメインは、ＲＡＧＥ媒介性細胞内シグナル伝達に必須であることが示された（非特許文献３：Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００３；９３：１１５９−１１６９）。
【０００８】
ＲＡＧＥは、正常組織および血管系においては低レベルでしか発現されない。しかし、この受容体は、そのリガンドが蓄積した場所においてアップレギュレートされる。例えば、糖尿病患者の血管では、ＲＡＧＥの代表的リガンドとしては、以下のＡＧＥ構造体が挙げられる：（カルボキシメチル）リジン−タンパク質付加物（インビボで存在する主なＡＧＥ）、カルボキシエチル−リジン（ＣＥＬ）タンパク質付加物、ペントシジン−付加物（コラーゲンおよび基底膜の不安定化に関連した糖尿病組織において見いだされる主要なＡＧＥ架橋物質）、ピラリン、イミダゾロン、メチルグリオキサール（他の範囲のＡＧＥの形成の前駆体）、クロスリン、フルオロリンク、プロピリジン、アルグピリミジン、ベスパーリジン、グリオキサール誘導リジンダイマー、デオキシグルコサミン誘導リジンダイマーなど。ＲＡＧＥの発現は、糖尿病血管系において内皮細胞、平滑筋細胞、および浸潤性単核食細胞で増加している。ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用は、血管系ホメオスタシスにおいて重要な細胞の特性を変化させる。例えば、ＲＡＧＥがＡＧＥと結合した後、内皮細胞は、ＶＣＡＭ−１、組織因子、およびＩＬ−６の発現、ならびに高分子へのそれらの透過性を増加させる。単核食細胞において、ＲＡＧＥは、サイトカインおよび増殖因子の発現を活性化し、可溶性ＡＧＥに応じて細胞移動を誘導するのに対して、走触性は、固定リガンドで起こる（非特許文献４：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：９４９−９５５（２００１））。
【０００９】
これまでに、変性ＬＤＬを検出するために、抗酸化ホスファチジルコリンモノクローナル抗体および抗ヒトアポリポプロテインＢ抗体などが、そしてＡＧＥを検出するために抗ＡＧＥモノクローナル抗体および抗ペントシジンモノクローナル抗体、ＡＧＥ構造体を加水分解後のＨＰＬＣなどが用いられてきた。
【００１０】
また、ＬＯＸ−１およびＲＡＧＥの細胞外領域には、血液中などに存在する特異性の高いプロテアーゼの認識部位は存在せず、切断をうけることはないと予想されてきた。しかし、実際、ＬＯＸ−１の細胞外領域は、過剰量のトロンビンなどによって分解が起こり、ＲＡＧＥの細胞外領域（ｓＲＡＧＥ１という）は、過剰量のトロンビン、第Ｘａ因子などによって切断が起こることを発明者らは初めて明らかにした。これらのプロテアーゼによる分解は、ＬＯＸ−１およびＲＡＧＥを変性ＬＤＬ／ＡＧＥ検出アッセイなどにおいて活用する際に大きな問題となる。
【００１１】
また、変性ＬＤＬおよびＡＧＥは分子の修飾構造が一定ではなく、バイオマーカーとして意味のある分子種が明確でないために、モノクローナル抗体、ＨＰＬＣなどによる定量的検出にも問題が多い。ＬＯＸ−１は、それぞれ、幅広い分子種の変性ＬＤＬおよびＡＧＥを認識可能な曖昧さがありながら、変性を受けたＬＤＬには鋭敏に反応する可能性が高い。そしてＲＡＧＥは幅広い分子種のＡＧＥを認識可能なマルチリガンドレセプターであり、生体内のＡＧＥを鋭敏に検出する可能性が高い。
【非特許文献１】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３２：６８−７４（２００３）
【非特許文献２】Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．  １２７，１０３−１０７（２００６）
【非特許文献３】Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００３；９３：１１５９−１１６９
【非特許文献４】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：９４９−９５５（２００１）
【特許文献１】特開２００２−３２０４８９
【特許文献２】特開２００２−１８１８２０
【特許文献３】特開２００３−３６４９９
【特許文献４】特開２００３−２３８４０４
【特許文献５】特開２００３−１２５７８６
【特許文献６】特開２００２−１７３５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
抗体に代わる、幅広い分子種の変性ＬＤＬおよびＡＧＥを特異的に認識するペプチドを得ることが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこで本発明者らは、鋭意工夫した結果、認識能に影響を与えずにプロテアーゼ耐性を増したＬＯＸ−１およびＲＡＧＥの変異体を開発することに成功した。
【００１４】
従って、本発明はまた、ＬＯＸ−１およびＲＡＧＥの変異体を使用して変性ＬＤＬおよびＡＧＥを検出する方法を提供する。
【００１５】
一局面において、本発明は、以下を含み得るＣ型レクチン様ドメインポリペプチドを提供し得る：
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、９０位および１０７位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；または
（３）配列番号１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸配列は、配列番号２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列。
【００１６】
一実施形態において、上記置換は、保存的置換であり得る。
【００１７】
一実施形態において、上記欠失は、配列番号２の１２６位〜１３１位までのいずれか１〜６個のアミノ酸の欠失、５８位〜６３位までのいずれかのアミノ酸の欠失、もしくは１位のアミノ酸の欠失またはこれらの任意の組み合わせであり得る。
【００１８】
一実施形態において、上記欠失は、配列番号２の１２６位〜１３１位までのいずれか１〜６個のアミノ酸の欠失、５８位〜６３位までのいずれかのアミノ酸の欠失、もしくは１位のアミノ酸の欠失またはこれらの任意の組み合わせであり得る。
【００１９】
一実施形態において、上記付加は、配列番号４の６１位〜１４２位から選択される任意の連続する１〜８２個のアミノ酸配列の付加であり得る。さらに、上記付加は、フレキシブルなリンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメイン）を含む配列の付加であり得る。
【００２０】
さらなる実施形態において、上記リンカー配列は、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列であり得る。
【００２１】
別の実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるか、またはこのアミノ酸配列を含み得る。
【００２２】
上記の実施形態において、天然型ＬＯＸ−１の活性としては、例えば、変性ＬＤＬの認識能が挙げられるが、これに限定されない。
【００２３】
さらなる実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドは、タグ配列をさらに有し得る。
【００２４】
好ましい実施形態において、上記のタグ配列としては、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
さらに別の実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドは、標識をさらに含み得る。
【００２６】
一実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドは、
（１）配列番号８に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１７２位および１８９位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列；または
（３）配列番号７に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１７２位および１８９位のアミノ酸配列は、配列番号８における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
を含み得る。
【００２７】
さらなる実施形態において、上記置換は、保存的置換であり得る。
【００２８】
また、さらなる実施形態において、上記欠失は、配列番号８の２０８位〜２１３位までのいずれか１〜６個のアミノ酸の欠失、１４０位〜１４５位までのいずれかのアミノ酸の欠失、もしくは１位〜８２位から選択される任意の連続する１〜８２個のアミノ酸配列の欠失である、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。
【００２９】
上記の実施形態において、天然型ＬＯＸ−１の活性としては、変性ＬＯＸ−１の認識能が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
一実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドは、タグ配列をさらに有し得る。
【００３１】
好ましい実施形態において、上記タグ配列としては、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
一実施形態において、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドは、標識をさらに含み得る。
【００３３】
一局面において、本発明は、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドの二量体および／または多量体および／またはジスルフィド結合によって結合されている二量体を提供し得る。
【００３４】
一局面において、本発明は、Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチドをコードする核酸分子を提供しうる。ここで上記核酸分子は、
（１）配列番号１に示される核酸配列；または
（２）（１）の核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列であって、該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸配列は、配列番号２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、核酸配列
を含み得る。
【００３５】
一実施形態において、天然型ＬＯＸ−１の活性としては、変性ＬＤＬの認識能が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
一実施形態において、本発明の核酸分子は、タグをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【００３７】
一局面において、本発明は、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター、上記核酸分子を含む細胞、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドを発現した細胞を提供し得る。
【００３８】
また、別の一局面において、本発明は、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドを含む変性ＬＤＬ検出剤を提供しうる。
【００３９】
一局面において、本発明は、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドおよび基材を含む変性ＬＤＬ検出用デバイスを提供しうる。
【００４０】
好ましい実施形態において、上記基材としては、ビーズ、金粒子、プレート、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
さらに好ましい実施形態において、上記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製され得るが、使用される系に適合する限り、これらビーズはどのような材料から作られていてもよい。
【００４２】
一局面において、本発明は、被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法を提供し得る。ここでこの方法は、
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）上記サンプルと、以下：
（１）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド；
（２）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドの二量体もしくは多量体；
（３）本発明の変性ＬＤＬ検出剤；または
（４）本発明の変性ＬＤＬ検出用デバイス、
のうちのいずれかとを接触させて、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチドと上記変性ＬＤＬとの複合体を形成させる工程；および
（Ｃ）上記複合体を検出する工程、
を包含し得る。
【００４３】
一実施形態において、上記サンプルは、ＬＤＬを含む体液であり得る。好ましい実施形態において、上記ＬＤＬを含む体液としては、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、肺胞洗浄液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
別の実施形態において、上記変性ＬＤＬとしては、酸化ＬＤＬ、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬ、アクロレイン修飾ＬＤＬ、ノネナール修飾ＬＤＬ、サクシニル化ＬＤＬ、または糖化ＬＤＬが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
一実施形態において、上記複合体を検出する工程は、光学的に検出する工程、物理的に検出する工程または化学的に検出する工程を包含し得る。
【００４６】
一局面において、本発明は、被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法を提供し得る。ここでこの方法は、
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）上記サンプル中の変性ＬＤＬを標識する工程；
（Ｂ）上記サンプルと、本発明の細胞とを接触させる工程；および
（Ｃ）上記細胞中に取り込まれた、上記サンプル中の変性ＬＤＬを検出する工程、
を包含し得る。
【００４７】
一局面において、本発明は、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドを含む変性ＬＤＬ検出用キットを提供し得る。
【００４８】
一局面において、本発明は、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドを含む変性ＬＤＬ検出剤と、上記変性ＬＤＬ検出剤と変性ＬＤＬとの複合体を検出するための手段と、を備える、変性ＬＤＬ検出システムを提供しうる。
【００４９】
一実施形態において、上記検出手段は、光学的検出手段、物理的検出手段または化学的検出手段を包含し得る。
【００５０】
好ましい実施形態において、上記光学的検出手段としては、分光光度計、蛍光発色セルソーター（ＦＡＣＳ）、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、または顕微鏡が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、上記物理的検出手段としては、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、または熱測定が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
さらに別の好ましい実施形態において、上記化学的手段としては、質量分析、または高速液体クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
一局面において、本発明は、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドを含む動脈硬化診断剤を提供し得る。
【００５４】
一局面において、本発明は、変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法を提供し得る。ここでこの方法は、
（Ａ）上記疾患に罹患していると疑われる被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）上記疾患に罹患していないコントロール被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｃ）上記サンプルと、以下：
（１）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチド；
（２）本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドの二量体もしくは多量体；
（３）本発明の変性ＬＤＬ検出剤；
（４）本発明の変性ＬＤＬ検出用デバイス；または
（５）本発明の動脈硬化診断剤、
のうちのいずれかとを接触させて、上記Ｃ型レクチン様ドメインポリペプチドと上記変性ＬＤＬとの複合体を形成させる工程；および
（Ｄ）上記複合体を検出する工程、
（Ｅ）上記被験体から単離されたサンプル中の複合体の量と、上記コントロール被験体から単離されたサンプル中の複合体の量とを比較して、上記被験体中の変性ＬＤＬの上記コントロール被験体に対する相対値を算出する工程、
を包含し得る。
【００５５】
一実施形態において、上記変性ＬＤＬにより引き起こされる疾患としては、動脈硬化症、虚血性心疾患、脳血管障害、大動脈瘤、腎梗塞、または高脂血症が挙げられるが、これらに限定されない。虚血性心疾患としては、心筋梗塞、または狭心症が挙げられる。脳血管障害としては、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、または一過性脳脳虚血発作が挙げられる。
【００５６】
一局面において、本発明は、本発明のＣ型レクチン様ドメインポリペプチドの、変性ＬＤＬにより引き起こされる疾患の診断のための医薬の製造のための使用を提供し得る。
【００５７】
一局面において、本発明は、後期糖化反応生成物レセプター（ＲＡＧＥ）ポリペプチドを提供し得る。ここで上記ポリペプチドは、
（１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；または
（３）配列番号１１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列；
を含み得る。
【００５８】
一実施形態において、上記置換は、保存的置換であり得る。
【００５９】
別の実施形態において、上記欠失は、配列番号１２の１位〜１５位の欠失であり得る。
【００６０】
なお別の実施形態において、上記付加は、配列番号１０の１位〜２２位から選択される任意の１〜２２個のアミノ酸配列のＮ末端側への付加、配列番号１０の１２１位〜４０４位から選択される任意の連続する１〜２８３個のアミノ酸の付加、あるいはフレキシブルなリンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメインを含む配列の付加であり得る。
【００６１】
さらなる実施形態において、上記リンカー配列は、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列であり得る。
【００６２】
上記の実施形態において、天然型ＲＡＧＥの活性としては、ＡＧＥの認識能が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
好ましい実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、タグ配列をさらに有し得る。
【００６４】
好ましい実施形態において、上記タグ配列としては、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９が挙げられるが。これらに限定されない。
【００６５】
一実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチドは、
（１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；または
（３）配列番号１３に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸配列は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列、
を含み得る。
【００６６】
上記の実施形態において、天然型ＲＡＧＥの活性としては、ＡＧＥの認識能が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
さらに好ましい実施形態において、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチドは、タグ配列をさらに有し得る。
【００６８】
なお好ましい実施形態において、上記タグ配列としては、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
一局面において、本発明は、本発明の後期糖化反応生成物レセプター（ＲＡＧＥ）様ポリペプチドをコードする核酸分子を提供し得る。ここで上記核酸分子は、
（１）配列番号１１に示される核酸配列；または
（２）（１）の核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列であって、該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、核酸配列；
を含み得る。
【００７０】
上記の実施形態において、天然型ＲＡＧＥの活性としては、ＡＧＥの認識能が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
一実施形態において、上記核酸分子は、タグをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【００７２】
一局面において、本発明は、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター、上記核酸分子を含む細胞、または本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチドを発現した細胞を提供し得る。
【００７３】
一局面において、本発明は、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチドを含む後期糖化反応生成物（ＡＧＥ）検出剤を提供し得る。
【００７４】
一局面において、本発明は、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチドおよび基材を含むＡＧＥ検出用デバイスを提供し得る。
【００７５】
好ましい実施形態において、上記基材としては、ビーズ、金粒子、プレート、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
さらに好ましい実施形態において、上記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製され得るが、使用される系に適合する限り、これらビーズはどのような材料から作られていてもよい。
【００７７】
一局面において、本発明は、ＡＧＥを検出する方法を提供しうる。ここで上記方法は、
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）上記サンプルと、以下：
（１）本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド；
（２）本発明のＡＧＥ検出剤；または
（３）本発明のＡＧＥ検出用デバイス、
のうちのいずれかとを接触させて、上記ポリペプチドと上記ＡＧＥとの複合体を形成させる工程；および
（Ｃ）上記複合体を検出する工程、
を包含し得る。
【００７８】
一実施形態において、上記サンプルは、タンパク質を含む体液であり得る。好ましい実施形態において、上記タンパク質を含む体液としては、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、関節液、肺胞洗浄液、涙液または尿を含む体液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
別の実施形態において、上記ＡＧＥは、糖化タンパク質であり得る。
【００８０】
一実施形態において、上記複合体を検出する工程は、光学的に検出する工程、物理的に検出する工程または化学的に検出する工程を包含し得る。
【００８１】
一局面において、本発明は、被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法を提供し得る。ここで上記方法は、
（Ａ）被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）上記サンプル中のＡＧＥを標識する工程；
（Ｃ）上記サンプルと、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチドを発現した細胞とを接触させる工程；および
（Ｄ）上記細胞中に取り込まれた、上記サンプル中のＡＧＥを検出する工程、
を包含し得る。
【００８２】
一局面において、本発明は、ＲＡＧＥ様ポリペプチドを含むＡＧＥ検出用キットを提供し得る。
【００８３】
別の一局面において、本発明は、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチドを含むＡＧＥ検出剤と上記ＡＧＥ検出剤とＡＧＥとの複合体を検出するための手段とを備える、ＡＧＥ検出システムを提供し得る。
【００８４】
一実施形態において、上記検出手段は、光学的検出手段、物理的検出手段または化学的検出手段を包含し得る。
【００８５】
好ましい実施形態において、上記光学的検出手段としては、分光光度計、ＦＡＣＳ、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、または顕微鏡が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
別の好ましい実施形態において、上記物理的検出手段としては、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、または熱測定を包含し得る。
【００８７】
さらに別の好ましい実施形態において、上記化学的手段は、質量分析、または高速液体クロマトグラフィーを包含し得るが、これらに限定されない。
【００８８】
一局面において、本発明は、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチドを含む、糖尿病性血管障害診断剤を提供し得る。
【００８９】
一局面において、本発明は、ＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断を支援する方法を提供し得る。ここで上記方法は、
（Ａ）糖尿病性血管障害に罹患していると疑われる被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｂ）糖尿病性血管障害に罹患していないコントロール被験体から単離されたサンプルを提供する工程；
（Ｃ）上記サンプルと、以下：
（１）本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチド；
（２）本発明のＡＧＥ検出剤；
（３）本発明のＡＧＥ検出用デバイス；または
（４）本発明の糖尿病性血管障害診断剤、
のうちのいずれかとを接触させて、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチドと上記ＡＧＥとの複合体を形成させる工程；および
（Ｄ）上記複合体を検出する工程、
（Ｅ）上記被験体から単離されたサンプル中の複合体の量と、上記コントロール被験体から単離されたサンプル中の複合体の量とを比較して、上記被験体中のＡＧＥの上記コントロール被験体に対する相対値を算出する工程、
を包含し得る。
【００９０】
一実施形態において、上記ＡＧＥにより引き起こされる疾患としては、糖尿病、糖尿病性血管障害、細小血管症、または大血管障害が挙げられるが、これらに限定されない。細小血管症としては、腎症、網膜症、または神経症が挙げられる。大血管障害としては、虚血性心疾患、脳血管疾患、または閉塞性動脈硬化症が挙げられる。
【００９１】
一局面において、本発明は、本発明のＲＡＧＥ様ポリペプチドの、ＡＧＥにより引き起こされる疾患の診断剤の製造のための使用を提供し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９２】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００９３】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００９４】
本明細書において使用される場合、用語「受容体」とは、１個以上のリガンドと可逆的、かつ特異的に複合体化する１個以上の結合ドメインを備える生物学的な構造であって、ここで、この複合体化は生物学的な構造を有する。受容体は、完全に細胞の外部（細胞外の受容体）、細胞膜の中（しかし、受容体の部分を細胞外部の環境および細胞質ゾルに向けている）、または完全に細胞の中（細胞内の受容体）に存在し得る。これらはまた、細胞と独立的に機能し得る。細胞膜中の受容体は、細胞を、その境界の外部の空間と連絡（例えば、シグナル伝達）させ、そして細胞の内側および外側への分子およびイオンの輸送において機能させることを可能とする。本明細書において使用する場合、受容体は、受容体全長であっても、受容体のフラグメントであってもよい。
【００９５】
本明細書において使用される場合、用語「レクチン様酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体１（Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」とは、ＬＯＸ−１ともいわれ、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（３）上記配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（５）配列番号３に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）上記配列番号３に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（７）上記配列番号３に示される核酸配列において１または数個のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（８）上記配列番号３に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；および（９）上記配列番号３に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド、のうちの１つである。
【００９６】
また、本明細書において使用される場合、「ＬＯＸ−１」をコードする核酸分子とは、（１）配列番号３に示される核酸配列を含む核酸分子；（２）上記配列番号３に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；（３）上記配列番号３に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子；（４）上記配列番号３によって示される核酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する核酸分子；および（５）配列番号３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子、のうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。また、ＬＯＸ−１としては、ヒトＬＯＸ−１（ｈＬＯＸ−１ともいう）、ウシＬＯＸ−１（ｂ−ＬＯＸ１ともいう）、ブタＬＯＸ−１、マウスＬＯＸ−１、ウサギＬＯＸ−１のような哺乳動物のＬＯＸ−１が挙げられるが、これらに限定されない。ｂＬＯＸ−１は、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる分子量約５０ｋＤａの糖タンパク質であり、Ｎ末端が細胞質内にあり、Ｃ末端が細胞外に出ている細胞膜１回貫通型のＩＩ型膜タンパク質である。ｈＬＯＸ−１はまた、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる約３０ｋＤａのＩＩ型膜タンパク質である。ＬＯＸ−１は、構造的には、以下の４つのドメインからなる：Ｎ末端側の細胞質ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、ネックドメイン、およびＣ型レクチン様ドメイン。本明細書において使用される場合、用語「Ｃ型レクチン様ドメイン」とは、ＣＴＬＤともいい、Ｃ型レクチンファミリーに属するメンバーの糖鎖認識部位と相同性を有する。ＣＴＬＤは、このメンバー間で、種間で非常によく保存されており、６個のシステイン残基の位置は、完全に保存されている。また、ＣＴＬＤは、ＬＯＸ−１のリガンドを認識するための機能的ドメインであり、この中の６個のシステイン残基は、ｈＬＯＸ−１の３カ所の分子内ジスルフィド結合に関与している。従って、本発明の変異ＬＯＸ−１は、配列番号４のアミノ酸配列において、１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位におけるシステインが保持されていることが好ましい。同様に、ＣＴＬＤにおいても、配列番号４のアミノ酸配列における１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位におけるシステインに対応するアミノ酸が保持されていることが好ましい。この保存されたＣＴＬＤに加えて、ｈＬＯＸ−１および他の既知の種におけるネックドメインは、高い配列同一性を有している。また、ｈＬＯＸ−１における１４０位のシステインは、分子間ジスルフィド結合に関与し、ｈＬＯＸ−１の二量体を形成する。しかし、この１４０位のシステインは、変性ＬＤＬの認識に必須ではないので、発現された場合に、必ずしもこの１４０位のシステインが保持されている必要はなく、変異されていてもよい。さらに、ｈＬＯＸ−１では、１８３位のＮと１３９位のＮにおいて糖鎖が付加されている。糖鎖が付加されたｈＬＯＸ−１の分子量は、４０ｋＤａである。通常ｈＬＯＸ−１はグリコシル化されているが、たとえグリコシル化されていなくても、グリコシル化された通常のｈＬＯＸ−１と同様に、変性ＬＤＬを認識および結合できる。上記ＣＴＬＤは、変性ＬＤＬを結合するのに必要十分な最小ドメインである。このＬＯＸ−１のＣ末端の４残基（ＬＲＡＱ）は、リガンドの認識と取り込みに必須であり、Ｃ末端の７残基（ＫＡＮＬＲＡＱ）がｈＬＯＸ−１のフォールディングと輸送に必須である。ｈＬＯＸ−１のＷ１５０、Ｒ２０８、Ｒ２２９、Ｒ２３１、Ｒ２４８等がリガンド認識と取り込みに必須のアミノ酸である。ＬＯＸ−１はまた、細胞膜から切断され、可溶性形態として放出され、健常者の血中にも存在することが報告されている。
【００９７】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ様ポリペプチド」とは、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列において９０位および１０７位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（４）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）配列番号１に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）配列番号１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸は、配列番号２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（１０）上記配列番号１に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号１に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つである。同様に、ＣＴＬＤ様ポリペプチドにおいても、システイン残基は、分子内ジスルフィド結合に関与しているので、本発明のＣＴＬＤ様ポリペプチドにおいても、配列番号４のアミノ酸配列の１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位に対応するシステインが保持されていることが好ましい。
【００９８】
また、本明細書において使用される場合、「ＣＴＬＤ様ポリペプチドをコードする核酸分子」とは、（１）配列番号１に示される核酸配列；（２）上記配列番号１に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；（３）上記配列番号１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、該核酸分子によってコードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸配列は、配列番号２における対応する位置のアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、核酸分子；（４）上記配列番号１に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子；（５）上記配列番号１によって示される核酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する核酸分子；（６）配列番号１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子であって、該核酸分子によってコードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸配列は、配列番号２における対応する位置のアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、核酸分子、のうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。上記で述べたように、発現されたＣＴＬＤ様ポリペプチドにおいては、分子内ジスルフィド結合に関与するシステインは保持されていることが好ましいので、本発明の核酸分子も、発現された場合に、配列番号４のアミノ酸配列の１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位に対応するシステインをコードしていることが好ましい。
【００９９】
本明細書において使用される場合、用語「リガンド」とは、特異的な受容体または受容体のファミリーに対する結合パートナーである。リガンドは、受容体に対する内因性のリガンドであるか、またはその代わりに、薬剤、薬剤候補、もしくは薬理学的手段のような受容体に対する合成リガンドであり得る。
【０１００】
本明細書において使用される場合、「変性ＬＤＬ」とは、ＬＤＬが体内で活性酸素、酸化的酵素、Ｆｅ３＋などと接触すること、あるいは、血管内皮細胞やマクロファージなどによる細胞依存性化学変化によって発生する種々の分子修飾を有する任意のＬＤＬ改変体である。生体内に存在する変性ＬＤＬとしては、酸化ＬＤＬ、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）、アクロレイン修飾ＬＤＬ、ノネナール修飾ＬＤＬ、小粒子ＬＤＬ（直径２５５ｎｍ以下のＬＤＬ）、糖化ＬＤＬなどが挙げられるが、これらに限定されない。酸化ＬＤＬが異常値を示す場合、動脈硬化症、虚血性心疾患（心筋梗塞、狭心症など）、脳血管障害（脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、一過性脳脳虚血発作など）、大動脈瘤、腎梗塞、高脂血症などのような疾患が予想されるがこれらに限定されない（「今日の臨床検査  ２００７−２００８」発行所  株式会社  南江堂、参照）。基準物質としては、ＭＤＡ−ＬＤＬ（正常範囲：１０〜８０Ｕ／Ｌ）および酸化ホスファチジルコリン（正常範囲：８．４Ｕ／ｍＬ〜１７．６Ｕ／ｍＬ）が使用される。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、用語「後期糖化反応生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」とは、ＡＧＥともいわれ、糖尿病患者の生活の質を損ねる元凶である血管合併症として知られる糖尿病性血管障害の発症・進展に関与している。グルコースに代表される還元糖は、タンパク質、アミノ酸のアミノ基と非酵素的に反応して、シッフ塩基またはアマドリ転位化合物などの糖化生成物を形成する。ここまでの反応は可逆的であり、前期反応とよばれている。その後、さらに縮合、開裂、架橋形成などの複雑かつ不可逆的な反応を経て、後期糖化反応生成物を形成する。このような一連の反応は、グリケーションと称される。ＡＧＥはまた、このような過程を経て生成された構造物の総称である。生体中に存在するＡＧＥ構造としては、カルボキシメチルリジン(ＣＭＬ)、カルボキエチルリジン(ＣＥＬ)、ペントシジン、ピラリン、イミダゾリン、メチルグリオキサール、クロスリンなどがが挙げられるが、これに限定されない。血漿中に存在するアルブミン、イムノグロブリン、オボアルブミンなどが上記の糖化を受けた産物もＡＧＥであり、ＡＧＥとして実験系に汎用されている。血糖コントロールの指標として用いられているヘモグロビンＡ１ｃはアマドリ転移化合物であるが、ＡＧＥに包含される。また、任意のタンパク質も、ＡＧＥに変換可能である。例えば、ＡＧＥに包含されるＣＭＬアルブミンおよびＣＥＬアルブミンは、いずれもアルブミンが糖化を受けたＡＧＥである。このようなＡＧＥ生成反応は、生体内において循環血液中、細胞外マトリクス、細胞内のいずれでも起こり得る。例えば、糖尿病患者の血管に存在するＡＧＥとしては、：蛍光性で架橋構造を有するもの（ペントシジン、クロスリンなど）および蛍光も架橋もないもの（カルボキシメチルリジン、ピラリン、メチルグリオキサール（ＭＧ）−イミダゾロンなど）の２つに大別できる。ＡＧＥが異常値を示す場合、細小血管症（腎症、網膜症、神経症など）、大血管障害（虚血性心疾患、脳血管疾患、閉塞性動脈硬化症のような疾患が予想される。基準物質としては、ピラリン（正常範囲：血漿中２３ｐｍｏｌ／ｍＬ未満）、ペントシジン（正常範囲：血漿中０．００９１５〜０．０４３１μｇ／ｍＬ（ＥＬＩＳＡで測定した場合））などが使用される（「今日の臨床検査  ２００７−２００８」発行所  株式会社  南江堂、参照）。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、用語「ＡＧＥ受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥ）」とは、ＲＡＧＥともいわれ、（１）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（３）上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（５）配列番号９に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）上記配列番号９に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（７）上記配列番号９に示される核酸配列において１または数個のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（８）上記配列番号９に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；および（９）上記配列番号９に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド、のうちの１つである。
【０１０３】
また、本明細書において使用される場合、「ＲＡＧＥをコードする核酸分子」とは、（１）配列番号９に示される核酸配列を含む核酸分子；（２）上記配列番号９に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；（３）上記配列番号９に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子；（４）上記配列番号９によって示される核酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する核酸分子；および（５）上記配列番号９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子、のうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＲＡＧＥはまた、１９９２年に、ウシ肺から同定され、ＡＧＥと結合するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する、分子量約３５ｋＤａのＩ型膜タンパク質（糖鎖修飾を受けた完全なＲＡＧＥは、分子量５５ｋＤａ）である。ＲＡＧＥの細胞外ドメインは、１つのＶ型イムノグロブリンドメイン、続いて、２つのＣ型イムノグロブリンドメイン（Ｃ１領域およびＣ２領域）の、３つのイムノグロブリンフォールド構造を取るドメインが結合した構造を取っている。ＲＡＧＥはまた、細胞膜１回貫通型のドメインおよび４３アミノ酸の細胞質ドメインを含む。ＲＡＧＥは、多様なクラスのリガンド（ＡＧＥ、Ｓ１００／カルグラニュリン、アンフォテリンおよびアミロイド−βペプチド）と相互作用する。Ｖドメインは、リガンド結合に必須の部位であり、細胞質ドメインは、ＲＡＧＥ媒介性細胞内シグナル伝達に必須である。ＲＡＧＥはまた、各ドメイン内でジスルフィド結合を有するので、本発明の変異ＲＡＧＥは、配列番号１０のアミノ酸配列の３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステイン残基を保持していることが好ましい。ＲＡＧＥは、正常組織および血管系においては低レベルでしか発現されない。しかし、この受容体は、そのリガンドが蓄積した場所においてアップレギュレートされる。ＲＡＧＥの発現は、糖尿病血管系において内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、腎メサンギウム細胞および浸潤性単核食細胞で増加している。また、ＡＧＥが蓄積している動脈硬化巣のような病的部位においても、ＲＡＧＥの発現が増加している。ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用は、血管系ホメオスタシスにおいて重要な細胞の特性を変化させる。例えば、ＲＡＧＥがＡＧＥと結合した後、血管内皮細胞は、ＶＣＡＭ−１、組織因子、およびＩＬ−６の発現、ならびに高分子へのそれらの透過性を増加させる。単核食細胞において、ＲＡＧＥは、サイトカインおよび増殖因子の発現を活性化し、可溶性ＡＧＥに応じて細胞移動を誘導するのに対して、走触性は、固定リガンドで起こる。
【０１０４】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ様ポリペプチド」とは、（１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（２）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；（３）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号１１に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１１に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号１１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号１１に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号１１に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つである。
【０１０５】
また、本明細書において使用される場合、「ＲＡＧＥ８」をコードする核酸分子とは、（１）配列番号１１に示される核酸分子；（２）上記配列番号１１に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；（３）上記配列番号１１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、該核酸分子によってコードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、核酸分子；（４）上記配列番号１１に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子；（５）上記配列番号１１によって示される核酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する核酸分子；（６）配列番号１１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子であって、該核酸分子によってコードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号１２における対応する位置のアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す核酸分子、のうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＲＡＧＥ様ポリペプチドはまた、（１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（２）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含む変異体を含むタンパク質；（３）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（４）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）上記配列番号１３に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；（７）上記配列番号１３に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号１３に示される核酸配列において１または数個のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１３に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸配列は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（１０）上記配列番号１３に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号１３に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つである。また、好ましいＲＡＧＥ様ポリペプチドとしては、ＲＡＧＥの２３〜２５０位をコードするＲＡＧＥ２、２３〜２３０位をコードするＲＡＧＥ３、１０１〜３３２位をコードするＲＡＧＥ４、または２３〜１３７位をコードするＲＡＧＥ７、ならびにこれらのいずれかを含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。上記で述べたように、ＲＡＧＥ様ポリペプチドにおいても、分子内ジスルフィド結合を形成することは好ましいので、配列番号１０のアミノ酸配列の３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステインは保持されていることが好ましい。
【０１０６】
また、本明細書において使用される場合、「ｍＲＡＧＥ１をコードする核酸分子」とは、（１）配列番号１３に示される核酸分子；（２）上記配列番号１３に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；（３）上記配列番号１３に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、該核酸分子によってコードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸配列は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、核酸分子；（４）上記配列番号１３に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子；（５）上記配列番号１３によって示される核酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する核酸分子；（６）上記配列番号１３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子であって、該核酸分子によってコードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸配列は、配列番号１４における対応する位置のアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す核酸分子、のうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。発現されたＲＡＧＥ様ポリペプチドにおいては、分子内ジスルフィド結合に関与するシステインは保持されていることが好ましいので、ｍＲＡＧＥ１をコードする核酸分子も、発現された場合に、配列番号１０のアミノ酸配列の３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステインをコードしていることが好ましい。好ましいＲＡＧＥ様ポリペプチドをコードする核酸分子としては、ＲＡＧＥの２３〜２５０位をコードするＲＡＧＥ２、２３〜２３０位をコードするＲＡＧＥ３、１０１〜３３２位をコードするＲＡＧＥ４、または２３〜１３７位をコードするＲＡＧＥ７、ならびにこれらのいずれかを含むポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプ チド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【０１０８】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０１０９】
本明細書では「核酸分子」もまた、核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本明細書では、たとえば、本発明の遺伝子には、そのスプライス変異体もまた包含され得る。
【０１１０】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【０１１１】
本明細書において「アミノ酸誘導体」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのようなアミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。本明細書では、アミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、アミノ酸と同じ生物学的機能を提供し得る限り代替として使用され得ることが理解される。
【０１１２】
本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
【０１１３】
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。
【０１１４】
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【０１１５】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。ヌクレオチドの配列は、本明細書において「ヌクレオチド配列」または「塩基配列」という。
【０１１６】
本明細書において「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書では、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同じ生物学的機能を提供し得る限り、ヌクレオチドの代替として使用され得ることが理解される。
【０１１７】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【０１１８】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【０１１９】
本明細書において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいう。例えば、ＬＯＸ−１においては、２３２位および２４９位におけるアミノ酸であり、ＲＡＧＥにおいては、１１４位、１１７位、２２８位、２７２位におけるアミノ酸である。
【０１２０】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ＬＯＸ−１）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【０１２１】
本明細書中で使用される「異種」とは、異なる配列または対応しない配列、あるいは異なる種由来の配列である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をいう。例えば、ヒトのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、マウスのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種であり、そしてヒトＬＯＸ−１の核酸配列またはアミノ酸配列は、ヒトアルブミンのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種である。
【０１２２】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【０１２３】
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、例えば、ＬＯＸ−１が変性ＬＤＬを認識する機能、ＲＡＧＥがＡＧＥを認識する機能などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【０１２４】
したがって、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。
【０１２５】
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
【０１２６】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
【０１２７】
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【０１２８】
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
【０１２９】
本明細書において「複合体」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合体としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号２のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、ＬＯＸ−１に関する生物学的な活性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合体も使用することができる。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、形質転換、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
【０１３１】
本明細書において遺伝子について言及する場合、用語「ベクター」とは、「組換えベクター」、「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」などと互換可能に使用され、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、細菌宿主細胞において自律複製が可能である、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【０１３２】
本明細書において使用される場合、用語「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーターおよび、選択マーカーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細菌細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能（例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および／またはそのタンパク質の活性など）を指標として検出され得る。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「外来」の核酸分子とは、ある対象核酸分子内に含まれるその対象核酸分子以外の起源の核酸分子などをいう。この外来の核酸分子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど）と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。
【０１３５】
遺伝子導入ベクター内に含まれる外来遺伝子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子であるが、導入される核酸分子は、核酸アナログ分子を含んでもよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単一の遺伝子分子種であっても、複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。
【０１３６】
原核細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ４８，６６９（１９８４））、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９））、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ （−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、 ＵＳ５１６０７３５）、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造）、ｐＵＣ１１８（宝酒造）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ  Ｘａ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＰＡＮ，ＰＡＣ（ａｖｉｄｉｔｙ社製）などが例示される。
【０１３７】
真核生物に対する「組換えベクター」としては、ｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＡｃＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＥＹＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＤｓＲＥＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＣＭＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＴａｒｇｅｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などが例示される。
【０１３８】
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。代表的なプロモーターとしては、Ｔ７プロモーターが挙げられるがこれに限定されない。
【０１３９】
ＲＡＧＥ遺伝子の発現にＴ７プロモーターを用いる場合は、好ましくは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが宿主細胞ゲノム中に組み込まれたλＤＥ３溶原菌を用いる。λＤＥ３溶原菌としては、例えば、ＡＤ４９４（ＤＥ３）、ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、 ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌａｃＩ、ＢＬ２１  ｔｒｘＢ（ＤＥ３）、ＢＬ２１  ｔｒｘＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬＲ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｂ８３４（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）、 Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、およびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳが挙げられるが、これに限定されない。（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）
ＲＡＧＥ遺伝子の発現にＴ７プロモーターを用いる場合、Ｔ７  ＲＮＡの天然のインヒビターであるＴ７  リゾチウムを欠損する宿主細胞株を用いることが、好ましい。このような宿主細胞としては、例えば、ＡＤ４９４（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌａｃＩ、ＢＬ２１  ｔｒｘＢ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、およびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１４０】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【０１４１】
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。このような遺伝子または遺伝子産物（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）の発現の増加または減少は、本発明の治療形態、予後形態または予防形態において有用であり得る。
【０１４２】
「形質転換体」とは、宿主細胞を形質転換することによって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特 定の文脈において特定の形態を指し得る。
【０１４３】
形質転換体を得るための宿主細菌細胞は、生理活性を保持するポリペプチドを発現するものであれば、特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細菌細胞を用いることができる。原核細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する原核細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ   ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０などが例示される。
【０１４４】
上記を考慮すると、本発明において使用するのに好ましい宿主細菌細胞は、例えば、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）である。
【０１４５】
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ、第２章  「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出される。
【０１４６】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ  Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
【０１４７】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０１４８】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【０１４９】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【０１５０】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
【０１５１】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
【０１５２】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ  ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
【０１５３】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
【０１５４】
本明細書において「相同性」は、２以上の配列の比較において、それらの配列が進化的に祖先を共有することを示す。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなうか、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなう場合、その類似性測定過程のアライメントにおける最も単純な解釈として、同一な（もしくは等価である）文字列（塩基、アミノ酸残基など）で並置されている文字列が、これらの領域が祖先配列のまま変化しなかったものであることを示し、同一でない（もしくは、等価でない）文字列が、突然変異が一方の配列で起こったものであるとの考察が可能である。アライメントにおけるギャップ（インデル）は、配列の一方で、挿入または欠失が起こったものであると考えられる。つまり、それらの配列の同一性または類似性は高いことは、それらの配列における相同性を強く示唆することが理解される。相同性は、発現抑制剤の設計において参照される。
【０１５５】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【０１５６】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【０１５７】
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
【０１５８】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、オルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【０１５９】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。
【０１６０】
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、リガンド分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【０１６１】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【０１６２】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、リガンド結合能において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタ ミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（− ２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【０１６３】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６４】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【０１６５】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【０１６６】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能（例えば、ＡＧＥの認識能など）が保持される限り、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＡＧＥの認識能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【０１６７】
本明細書において使用される場合、用語「フレキシブルなリンカー配列」とは、特定の立体構造をとらず、連結される分子の機能に影響を与えない分子をいう。このようなリンカー配列は、当業者に周知である。リンカー配列がある分子に連結した場合に、その分子がとるべき立体構造を妨害せず、その電荷に実質的に影響を及ぼさない限り、どのようなリンカー配列を使用してもよい。
【０１６８】
本明細書において使用される場合、用語「タグ配列」とは、受容体−リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質をいう。このようなタグ配列は、当該分野で周知である。
【０１６９】
本明細書において使用される場合、用語「検出剤」とは、広義には、目的の物質（例えば、変性ＬＤＬ、ＡＧＥなど）を検出できるあらゆる因子をいう。
【０１７０】
本明細書において使用される場合、用語「固相」とは、本明細書中において「基板」および「基材」と互換的に使用され、本発明のデバイスが構築される材料をいう。抗体のような分子が固定され得る平面状の支持体をいう。本発明において表面プラズモン共鳴の原理を用いて検出する場合、固相は、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面に持つガラス基板の基材であることが好ましい。本発明において水晶発振子マイクロバランスの原理を用いて検出する場合は、周波数変換素子（例えば水晶発振子、表面弾性波素子）を固相として用い、直接受容体を結合させる。水晶板の片面はシリコーンで被覆し、もう一方の面は金電極を施したものを固相として用いる。本発明において酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のような機構を使用する場合、一般に、固相（基材）としては、マイクロタイタープレートが使用される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。適切な基材としては、ビーズ、金粒子、マイクロタイタープレート、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
固相および基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコーン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、アミロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。
【０１７２】
本明細書において「チップ」は、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、ビオチン化受容体を固定化した固相を、受容体チップおよび／または受容体マイクロチップと呼ぶ。
【０１７３】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ
ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１７４】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１７５】
（遺伝子工学）
本発明において用いられる配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
【０１７６】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。
【０１７８】
従って、本明細書において「発現ベクター」または「発現プラスミド」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、哺乳動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１７９】
本発明において用いられ得る原核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ、ｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。原核生物細胞は、遺伝子の増幅、改変などに用いることができる。
【０１８０】
本明細書において用いられ得る真核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、
ｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＡｃＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＥＹＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＤｓＲＥＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＣＭＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＴａｒｇｅｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１８１】
本明細書において「哺乳動物発現ベクター」は、本発明の遺伝子の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメントが宿主細胞中で作動可能に連結されている核酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、それに関するポリヌクレオチドと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。哺乳動物発現ベクターは、好適には、哺乳動物遺伝子、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１８２】
上記のような哺乳動物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。哺乳動物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＥＣＦＰ系のベクター、ｐｃＤＮＡ系のベクターなどが好適に用いられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
【０１８４】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
【０１８５】
プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが好ましい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
【０１８６】
本明細書において、プロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の成長／増殖のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、ノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「応答性」であるとは、少なくとも１つの因子が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を因子に対して「誘導性」といい、発現量が減少する性質を因子に対して「減少性」という。「減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。因子に対して誘導性のプロモーターを本発明の部位特異的組換え誘導因子をコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された哺乳動物細胞または哺乳動物（特定の組織などを含む）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での部位特異的組換え配列の部位特異的組換えを行うことができる。
【０１８７】
本発明のポリヌクレオチドは、そのままでまたは改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切な発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技術により、宿主細胞に導入され得る。導入された遺伝子は、宿主細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、宿主細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、宿主細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリアなど）に含まれるＤＮＡを含む。
【０１８８】
大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ  ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【０１８９】
本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。
【０１９０】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１９１】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【０１９２】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
【０１９３】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
【０１９４】
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１が例示される。
【０１９５】
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法などが挙げられる。
【０１９６】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【０１９７】
本明細書において使用される場合、用語「標識」とは、特定の物質を検出するために、この物質に結合することが既知の物質に付加される分子をいう。標識としては、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９８】
本明細書において使用される場合、用語「タグ配列」とは、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する）をいう。よって、例えば、タグ配列が結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。代表的なタグ配列としては、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡ、Ａｖｉタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【０２００】
一局面において、本発明は、以下からなる群より配列を含む、ポリペプチドを提供し得る：
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、９０位および１０７位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；および
（３）配列番号１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸配列は、配列番号２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列。好ましいのは、配列番号２における９０位および１０７位のアミノ酸がＡ（アラニン）である（Ｇ２３２Ａ／Ｇ２４９Ａ）ポリペプチドである。このポリペプチドは、上記部位を変異させたことによって、大過剰のプロテアーゼに曝されても、分解されず、天然型ＬＯＸ−１の活性を保持している。
【０２０１】
本発明の一実施形態において、上記置換は、保存的置換であり得る。本発明の別の実施形態において、上記欠失は、配列番号２の１２６位〜１３１位までのいずれか１〜６個のアミノ酸の欠失、５８位〜６３位までのいずれかのアミノ酸の欠失、もしくは１位のアミノ酸の欠失またはこれらの任意の組み合わせであり得る。本発明のなお別の実施形態において、上記付加は、配列番号４の６１位〜１４２位から選択される任意の連続する１〜８２個のアミノ酸配列の付加、リンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメインを含む配列）の付加であり得る。好ましいリンカー配列としては、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０２】
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み得る。
【０２０３】
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、
（１）配列番号８に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１７２位および１８９位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列；および
（３）配列番号７に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１７２位および１８９位のアミノ酸配列は、配列番号８における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示す、アミノ酸配列；
からなる群より選択される配列を包含し得る。好ましいのは、配列番号８の１７２位および１８９位がＡ（アラニン）であるポリペプチドである。このポリペプチドは、上記部位を変異させても、天然型ＬＯＸ−１の活性を保持している。
【０２０４】
好ましい実施形態において、上記置換は、保存的置換であり得る。別の好ましい実施形態において、上記欠失は、配列番号８の２０８位〜２１３位までのいずれか１〜６個のアミノ酸の欠失、１４０位〜１４５位までのいずれかのアミノ酸の欠失、もしくは１位〜８２位から選択される任意の連続する１〜８２個のアミノ酸配列の欠失である、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。好ましくは、本発明のポリペプチドは、変性ＬＯＸ−１の認識能を有し得る。好ましいポリペプチドとしては、配列番号４のアミノ酸配列における１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位におけるシステインに対応するアミノ酸をさらに保持しているもの、および配列番号４のアミノ酸配列における１４０位におけるシステインに対応するアミノ酸をさらに保持しているものが挙げられる。
【０２０５】
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、タグ配列をさらに含み得る。上記タグ配列としては、代表的には、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のポリペプチドは、標識をさらに含み得る。代表的な標識としては、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい蛍光標識としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチアネート、ローダミン、過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン（ＤｉＤ）、過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３７，３７−テトラメチル−ｅｎｄｏ−カルボシアニン（ＤｉＩ）、Ａｌｅｘａ、蛍光タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい化学発光標識としては、ルミノール、ルシゲニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい生物発光標識としては、ルシフェラーゼ、エクオリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０６】
好ましい一実施形態において、本発明のポリペプチドは、二量体であり得る。さらに好ましくは、本発明のポリペプチドは、多量体であり得る。別の好ましい一実施形態において、本発明のポリペプチドは、ジスルフィド結合によって結合された二量体であり得る。本発明のポリペプチドは、単量体で変性ＬＤＬを認識できるので、必ずしも二量体である必要はないが、より高い認識能を発揮するためには、二量体または多量体を形成することが好ましい。本発明のポリペプチドは、１４０位（ここでこの番号付けは、ＬＯＸ−１のアミノ酸配列に従う）のシステインによって分子間でジスルフィド結合されるのが好ましい。このような分子間ジスルフィド結合によって、生体内ので通常発現されているような状態を再現することができ、より高感度な変性ＬＤＬの認識が可能になる。
【０２０７】
一局面において、本発明の核酸分子は、以下からなる群より選択される配列を包含し得る：
（１）配列番号１に示される核酸配列；および
（２）（１）の核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列であって、該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸配列は、配列番号１における対応するアミノ酸を保持し、かつＬＯＸ−１の活性を示す、核酸配列。好ましいＣＴＬＤ様ポリペプチドをコードする核酸分子は、発現された場合に、配列番号２における９０位および１０７位のアミノ酸がＡ（アラニン）であるポリペプチドをコードする核酸分子である。この発現されたポリペプチドは、上記部位を変異させたことによって、大過剰のプロテアーゼに曝されても、分解されず、天然型ＬＯＸ−１の活性を保持している。さらに好ましい核酸分子としては、発現された場合に、発現されたポリペプチドにおいて、配列番号４のアミノ酸配列における１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位におけるシステインに対応するアミノ酸を保持しているもの、および配列番号４のアミノ酸配列における１４０位におけるシステインに対応するアミノ酸を保持しているものが挙げられる。
【０２０８】
好ましい実施形態において、上記ＬＯＸ−１の活性は、変性ＬＤＬの認識能であり得る。さらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、タグをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【０２０９】
一局面において、本発明は、上記の核酸分子を含むベクターを提供し得る。本発明において使用されるベクターは、所望の目的（発現、送達、挿入、導入など）を達成する限り、どのようなベクターを用いても良いことが理解される。
【０２１０】
一局面において、本発明は、上記核酸分子を含む細胞、上記ポリペプチドを発現した細胞を提供し得る。このような細胞としては、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母細胞のような下等真核生物細胞であっても、哺乳動物細胞のような高等真核生物細胞であってもよい）、樹立細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１１】
一局面において、本発明は、上記ポリペプチドを含む、変性ＬＤＬ検出剤；変性ＬＤＬ検出用キット；動脈硬化診断剤を提供し得る。さらに、本発明は、これらを用いて被験体のサンプル中の変性ＬＤＬを検出する方法；変性ＬＤＬ検出システム；ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法を提供し得る。
【０２１２】
本発明の検出剤および診断剤は、当該分野で周知の賦形剤を含み得る。このような賦形剤は、本発明のポリペプチドのリガンド認識能を妨害しない限り、どのようなものであってもよいことが理解される。また、このような検出剤およびキット中に含まれるポリペプチドは、液体として提供されてもよいし、使用時に適宜調製するための凍結乾燥粉末として提供されてもよい。
【０２１３】
一局面において、本発明は、上記ポリペプチド、上記ポリペプチドおよび基材を含む、変性ＬＤＬ検出用デバイス、上記ポリペプチドを含む変性ＬＤＬ検出剤などを使用して変性ＬＤＬを検出する方法を提供し得る。
【０２１４】
本発明の方法は、上記ポリペプチド、デバイス、検出剤などを、サンプルと接触させて、サンプル中に含まれる変性ＬＤＬと複合体を形成させる工程を包含する。上記サンプルは、ＬＤＬを含む体液であり得る。代表的には、これらの体液としては、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、肺胞洗浄液などが挙げられるが、これらに限定されない。サンプルは、予め標識されていてもよいし、そうでなくてもよい。
【０２１５】
一実施形態において、上記デバイスは、採用される検出方法／検出手段に依存して、種々の形態をとり得る。上記デバイスにおいて使用される好ましい基材としては、ビーズ、金粒子、プレート（例えば、マイクロタイタープレート）、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製されるビーズなどであり得る。
【０２１６】
さらに、本発明の方法は、複合体を検出する工程を包含し得る。複合体を検出するための手段／検出方法はまた、本発明のポリペプチドに付加される標識によって変動し得る。代表的な検出手段としては、光学的検出手段、物理的検出手段、化学的検出手段が挙げられる。好ましい実施形態において、上記光学的検出手段としては、一般に、分光光度計、ＦＡＣＳ、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、顕微鏡などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記物理的検出手段としては、一般に、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、熱測定などが挙げられるが、これらに限定されない。上記化学的検出手段としては、一般に、質量分析法、高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１７】
最も簡便に使用される変性ＬＤＬの検出方法は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を採用するものである。ＥＬＩＳＡでは、標識系として酵素とその基質を用いる結合測定法であり、当該分野で周知である。
【０２１８】
本発明の変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法においては、上記疾患に罹患していない被験体（例えば、健常者）サンプルと、上記疾患に罹患していることが疑われる被験体（患者）サンプルの両方で変性ＬＤＬが検出され、これらのサンプル間で本発明のポリペプチドと変性ＬＤＬとの複合体の量が比較されて、上記疾患が疑われている被験体中の変性ＬＤＬのコントロール被験体に対する相対値が算出される。基準物質としては、ＭＤＡ−ＬＤＬ（正常範囲：１０〜８０Ｕ／Ｌ）および酸化ホスファチジルコリン（正常範囲：８．４Ｕ／ｍＬ〜１７．６Ｕ／ｍＬ）が使用される。これらの正常範囲を参考にすることもできる。この相対値が異常値である場合、上記疾患に罹患していると診断される。変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患は、代表的には、動脈硬化症、冠動脈疾患、動脈炎、動脈硬化症に基づく冠攣縮性狭心症、拡張型心筋症、虚血性心疾患（心筋梗塞、狭心症など）、脳血管障害（脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、一過性脳脳虚血発作など）、大動脈瘤、腎梗塞、高脂血症などなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１９】
さらなる一局面において、本発明は、以下からなる群より選択される配列を含む、後期糖化反応生成物レセプター（ＲＡＧＥ）ポリペプチドを提供し得る：
（１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（３）配列番号１１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列。好ましいのは、配列番号１２における９２位および９５位のアミノ酸が、それぞれＱ（グルタミン）およびＡ（アラニン）であるＲＡＧＥ様ドメインポリペプチドである。このポリペプチドは、上記部位を変異させたことによって、大過剰のプロテアーゼに曝されても、分解されず、天然型ＲＡＧＥの活性を保持している。
【０２２０】
一実施形態において、上記置換は、保存的置換であり得る。一実施形態において、上記欠失は、１位〜１５位であり得る。別の実施形態において、上記付加は、配列番号１０の１位〜２２位から選択される任意の１〜２２個のアミノ酸配列のＮ末端側への付加、配列番号１０の１２１位〜４０４位から選択される任意の連続する１〜２８３個のアミノ酸の付加、あるいはフレキシブルなリンカー配列もしくはその反復配列、またはＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）のＥＧＦ反復配列（上皮増殖因子受容体様システインリッチドメイン）を含む配列の付加であり得る。好ましいリンカー配列としては、Gly-Gly-Ser、配列番号１５、配列番号１６に示されるアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２１】
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、
（１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含む、天然型ＲＡＧＥの活性を示すアミノ酸配列；および
（３）配列番号１３に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸配列は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持している、アミノ酸配列、
からなる群より選択される配列を包含し得る。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＡＧＥの認識能を有し得る。好ましいのは、配列番号１４における９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸が、それぞれＱ（グルタミン）、Ａ（アラニン）、Ｎ（アスパラギン）およびＩ（イソロイシン）であるＲＡＧＥ様ドメインポリペプチドである。このポリペプチドは、上記部位を変異させたことによって、大過剰のプロテアーゼに曝されても、分解されず、天然型ＲＡＧＥの活性を保持している。さらに、好ましいＲＡＧＥ様ポリペプチドとしては、ＲＡＧＥの２３〜２５０位をコードするＲＡＧＥ２、２３〜２３０位をコードするＲＡＧＥ３、１０１〜３３２位をコードするＲＡＧＥ４、または２３〜１３７位をコードするＲＡＧＥ７、ならびにこれらのいずれかを含むポリペプチド、および上記の対応する変異を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましいＲＡＧＥ様ポリペプチドとしては、配列番号１０における３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位におけるシステインに対応するアミノ酸がさらに保持されているものが挙げられる。
【０２２２】
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、タグ配列をさらに含み得る。上記タグ配列としては、代表的には、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のポリペプチドは、標識をさらに含み得る。代表的な標識としては、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい蛍光標識としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチアネート、ローダミン、過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン（ＤｉＤ）、過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３７，３７−テトラメチル−ｅｎｄｏ−カルボシアニン（ＤｉＩ）、Ａｌｅｘａ、蛍光タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい化学発光標識としては、ルミノール、ルシゲニンなどが挙げられるが、これらに限定れない。好ましい生物発光標識としては、ルシフェラーゼ、エクオリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２３】
一局面において、本発明の核酸分子は、以下からなる群より選択される配列を包含し得る：
（１）配列番号１１に示される核酸配列；および
（２）（１）の核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列であって、該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、核酸配列。また、好ましいＲＡＧＥ様ポリペプチドをコードする核酸分子は、発現された場合に、発現されたポリペプチドにおいて、配列番号１２における９２位および９５位のアミノ酸が、それぞれＱ（グルタミン）およびＡ（アラニン）であるポリペプチドをコードする核酸分子である。このポリペプチドは、上記部位を変異させたことによって、大過剰のプロテアーゼに曝されても、分解されず、天然型ＲＡＧＥの活性を保持している。さらに、好ましいＲＡＧＥ様ポリペプチドをコードする核酸分子は、ＲＡＧＥの２３〜２５０位をコードするＲＡＧＥ２コード核酸分子、２３〜２３０位をコードするＲＡＧＥ３コード核酸分子、１０１〜３３２位をコードするＲＡＧＥ４コード核酸分子、または２３〜１３７位をコードするＲＡＧＥ７コード核酸分子、ならびにこれらのいずれかのＲＡＧＥ様ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましいＲＡＧＥ様ポリペプチドをコードする核酸分子としては、配列番号１０における３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位におけるシステインに対応するアミノ酸がさらに保持されているものが挙げられる。
【０２２４】
好ましい実施形態において、上記天然型ＲＡＧＥの活性は、ＡＧＥの認識能であり得る。さらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、タグをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【０２２５】
一局面において、本発明は、上記の核酸分子を含むベクターを提供し得る。本発明において使用されるベクターは、所望の目的（発現、送達、挿入、導入など）を達成する限り、どのようなベクターを用いても良いことが理解される。
【０２２６】
一局面において、本発明は、上記核酸分子を含む細胞、上記ポリペプチドを発現した細胞を提供し得る。このような細胞としては、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母細胞のような下等真核生物細胞であっても、哺乳動物細胞のような高等真核生物細胞であってもよい）、樹立細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２７】
一局面において、本発明は、上記ポリペプチドを含む、ＡＧＥ検出剤；ＡＧＥ検出用キット；糖尿病性血管障害診断剤を提供し得る。さらに、本発明は、これらを用いて被験体のサンプル中のＡＧＥを検出する方法；ＡＧＥ検出システム；ＡＧＥによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法を提供し得る。
【０２２８】
本発明の検出剤および診断剤は、当該分野で周知の賦形剤を含み得る。このような賦形剤は、本発明のポリペプチドのリガンド認識能を妨害しない限り、どのようなものであってもよいことが理解される。また、このような検出剤およびキット中に含まれるポリペプチドは、液体として提供されてもよいし、使用時に適宜調製するための凍結乾燥粉末として提供されてもよい。
【０２２９】
一局面において、本発明は、上記ポリペプチド、上記ポリペプチドおよび基材を含む、ＡＧＥ検出用デバイス、上記ポリペプチドを含むＡＧＥ検出剤などを使用してＡＧＥを検出する方法を提供し得る。
【０２３０】
本発明の方法は、上記ポリペプチド、デバイス、検出剤などを、サンプルと接触させて、サンプル中に含まれるＡＧＥと複合体を形成させる工程を包含する。上記サンプルは、タンパク質を含む体液であり得る。代表的には、これらの体液としては、血液、血清、血漿、髄液、漿膜腔液、関節液、肺胞洗浄液、涙液、尿などが挙げられるが、これらに限定されない。サンプルは、予め標識されていてもよいし、そうでなくてもよい。サンプルは、予め標識されていてもよいし、そうでなくてもよい。
【０２３１】
一実施形態において、上記デバイスは、採用される検出方法／検出手段に依存して、種々の形態をとり得る。上記デバイスにおいて使用される好ましい基材としては、ビーズ、金粒子、プレート（例えば、マイクロタイタープレートが挙げられる）、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、または金属薄膜などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記ビーズは、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂、天然樹脂、プラスチック、ゼラチン、シリカゲル、金属、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、アガロース、ポリアミノ酸、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレン、ポリスルフォン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリメチルメタクリレート、セルロースジアセテート、メチレンビニルアルコールから作製されるビーズなどであり得る。
【０２３２】
さらに、本発明の方法は、複合体を検出する工程を包含し得る。複合体を検出するための手段／検出方法はまた、本発明のポリペプチドに付加される標識によって変動し得る。代表的な検出手段としては、光学的検出手段、物理的検出手段、化学的検出手段が挙げられる。好ましい実施形態において、上記光学的検出手段としては、一般に、分光光度計、ＦＡＣＳ、比色計、蛍光光度計、化学発光検出器、電気化学発光検出器、イメージアナライザー、顕微鏡などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記物理的検出手段としては、一般に、電気検出、表面プラズモン共鳴、水晶発振マイクロバランス、熱測定などが挙げられるが、これらに限定されない。上記化学的検出手段としては、一般に、質量分析法、高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３３】
最も簡便に使用されるＡＧＥの検出方法は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）とＡＧＥ構造体を加水分解後に化学的に検出する方法を採用するものである。ＥＬＩＳＡでは、標識系として酵素とその基質を用いる結合測定法であり、当該分野で周知である。
【０２３４】
本発明のＡＧＥによって引き起こされる疾患の診断を支援する方法においては、上記疾患に罹患していない被験体（例えば、健常者）サンプルと、上記疾患に罹患していることが疑われる被験体（患者）サンプルの両方でＡＧＥが検出され、これらのサンプル間で本発明のポリペプチドとＡＧＥとの複合体の量が比較されて、上記疾患が疑われている被験体中のＡＧＥのコントロール被験体に対する相対値が算出される。基準物質としては、ピラリン（正常範囲：血漿中２３ｐｍｏｌ／ｍＬ未満）、ペントシジン（正常範囲：血漿中０．００９１５〜０．０４３１μｇ／ｍＬ（ＥＬＩＳＡで測定した場合））が使用される（「今日の臨床検査  ２００７−２００８」発行所  株式会社  南江堂、参照）。これらの正常範囲を参考にすることもできる。この相対値が異常値である場合、上記疾患に罹患していると診断される。ＡＧＥによって引き起こされる疾患は、代表的には、糖尿病、非糖尿病性の腎機能障害、糸球体腎炎、糖尿病性血管障害、腎不全、細小血管症（腎症、網膜症、神経症など）、大血管障害（虚血性心疾患、脳血管疾患、閉塞性動脈硬化症などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３５】
（使用）
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドの、変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患（例えば、動脈硬化症など）、またはＡＧＥによって引きおこされる疾患（例えば、糖尿病性血管障害）を診断するための薬剤を製造するための使用を提供する。ここで使用されるポリペプチドは、本明細書において上記される任意のものであり得ることが理解される。
【０２３６】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０２３７】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２３８】
（材料および方法）
以下に示す実施例において、特段の記載がない場合、一般的に、以下に記載される材料および方法を用いて実験を行った。
【０２３９】
（実施例１：ＬＯＸ−１は、大過剰のプロテアーゼによって分解される）
本発明者らは、変性ＬＤＬおよびＡＧＥを検出することにおいてより安定な変性ＬＤＬ認識分子を得るために、ＬＯＸ−１のリガンド認識に必須のＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ；ＬＯＸ−１のアミノ酸配列の１４３位〜２７３位）のプロテアーゼに対する安定性について試験した。
【０２４０】
ｃＤＮＡライブラリーを、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）から単離したｍＲＮＡ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）により、コピーキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡライブラリーを構築した。Ｓａｗａｍｕｒａら（Ｎａｔｕｒｅ  ３８６（６６２０），７３−７７（１９９７））に示される配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２５４３もまた参照のこと）に基づいて、ＣＴＬＤに適合する２種類の特異的プライマー：
５’−ＧＴＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＧＡ−３’（順方向プライマー；配列番号２０）；および
５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＧＣＣ−３’（逆方向プライマー；配列番号２１）
を用いて増幅した。増幅転写物を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＤＮＡ配列分析により確認した。
【０２４１】
Ｎ末端ビオチン化タンパク質を生産するために、ｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＮｄｅＩ切断部位の上流に、ＡｖｉＴａｇをコードする配列を挿入し、ｐＥＴ  Ｎ−Ａｖｉベクターを構築した。ＣＴＬＤをコードするＤＮＡ（配列番号１）をＮｄｅＩ切断部位、ＸｈｏＩ切断部位でｐＥＴ  Ｎ−Ａｖｉにクローニングした。ＣＴＬＤ内の分子間Ｓ−Ｓ結合を正しく構成するため、発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。上記で得られたベクターを、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）に形質転換した。Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。ＡｖｉＴａｇを付加する場合、ＡｖｉＴａｇおよび目的タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターと、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクターとで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で２５℃で培養した。ＣＴＬＤの発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導し、２０℃で２０時間培養した後、菌体を収菌後、ＴＢＳにて洗浄し超音波破砕した。９５％程度のＣＴＬＤは封入体を形成し、可溶性ポリペプチドとして得られるのは、５％程度であったが、可溶性ポリペプチド画分をＮｉ−アガロースに吸着させた後、イミダゾールによる濃度勾配で溶出し、ＣＴＬＤを部分精製した。得られたＣＴＬＤは、Ｎｉ−アガロース上に固定した状態で、ＤｉＤ−ＡｃＬＤＬを認識し結合することを確認した。
【０２４２】
このようにして得られたＣＴＬＤ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）をプロテアーゼ処理した。反応は、０．１ｍｌ（最終濃度で０．０２ｍｇのＣＴＬＤ含む）の系で行い（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）、２ユニットのトロンビン（１ユニット（１ｕ）は、１ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度である）、１０ｕのエンテロキナーゼ（１ｕは、０．０５ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）、または１０ｕの第Ｘａ因子（１ｕは、０．０５ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）とともに２５℃で１８時間反応させた。１８時間後にフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加し、反応を停止した直後に、この反応産物を、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に処理した。プロテアーゼ非処理である対象区は、プロテアーゼ添加と同時にＰＭＳＦを添加してプロテアーゼを不活化すると共に、直ちにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプル処理に供し、−２０℃にて保存した。プロテアーゼ処理区、非処理区をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色に供したところ、低分子領域にＣＴＬＤの断片が認められた（図３を参照のこと）。さらに、ペプチドマッピングを行ったところ、ＣＴＬＤは、ＬＯＸ−１のＲ２３１とＧ２３２の間、およびＲ２４８とＧ２４９との間に対応する位置で切断され、この切断部位はＬＯＸ−１のリガンド認識に必須なアミノ酸残基を含むことが明らかになった（図５を参照のこと）。
【０２４３】
従って、本発明者らは、リガンド認識能に影響を与えずにプロテアーゼ耐性が付与されたＣＴＬＤ様ポリペプチドの生成を試みた。
【０２４４】
（実施例２：ＣＴＬＤ様ポリペプチドの生成）
実施例１において得られた知見に基づいて、上記の切断部位２箇所に変異を導入したＣＴＬＤ様ポリペプチド（Ｇ２３２Ａ／Ｇ２４９Ａ；本実施例中、ＰＲ−ＣＴＬＤともいう）をコードする核酸を、定法に従って生成した。定法に従って、この核酸を、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を融合させた哺乳動物用発現ベクターｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）に導入することによって、Ｎ末端にＣＦＰが融合したＰＲ−ＣＴＬＤコード核酸を含むプラスミドを構築した。ＣＨＯ細胞を１０％  ＦＣＳを補充したＦ１２培地中、３７℃において５％ＣＯ２加湿雰囲気下で培養した。１×１０４細胞／ｍｌの密度で懸濁したＣＨＯ細胞４００μｌを、トランスフェクションを行う２４時間前に、カバーガラス上に播種した。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬を用いて製造業者のプロトコルに従って、細胞をトランスフェクトし、４８時間インキュベートし、ＣＨＯ細胞に一過性発現させた。その後、この細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、ＣＦＰの蛍光によりＣＴＬＤ様ポリペプチド発現細胞が確認できた。また、リガンドである変性ＬＤＬを蛍光色素である過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン（ＤｉＤ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により標識し、この変性ＬＤＬをＣＴＬＤ様ポリペプチド発現細胞に添加したところ、リガンドの認識能および取り込み能が確認できた（図４）。
【０２４５】
これらの結果から、ＰＲ−ＣＴＬＤ発現細胞は、明瞭なリガンド取り込み能を示し、プロテアーゼ耐性を付与するために行ったアミノ酸置換は、変性ＬＤＬ認識能には何ら影響を与えていないことが示された。
【０２４６】
さらに、このＰＲ−ＣＴＬＤのプロテアーゼ感受性を検討したところ、２ｕ（１ｕは、１ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）のトロンビンで、０．０２ｍｇのＰＲ−ＣＴＬＤを１８時間処理しても分解が起こらないことが確認され、プロテアーゼ耐性ＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤ）を生成することに成功した（図３）。
【０２４７】
（実施例３：タグ配列付加ＣＴＬＤ様ポリペプチドの生成）
実施例２において生成したＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤ）に加えて、さらに、ＣＴＬＤ様ポリペプチドと同様のプロテアーゼ耐性変異を導入した長さの異なるタンパク質ＰＲ−ＣＴＬＤ１４（ネック領域の１４アミノ酸を含む、ＬＯＸ−１のアミノ酸１２９位〜２７３位；図５）を作成した。ＰＲ−ＣＴＬＤ１４のアミノ酸配列には分子間Ｓ−Ｓ結合に関与するＣｙｓが含まれる。分子間Ｓ−Ｓ結合を形成しなくても認識能はあるが、細胞上で機能を発現する際には、一定以上の分子密度をとる必要がある（Ｘｉｅら、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３（２）：１１１−１１７（２００４）およびＭａｔｓｕｎａｇａら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
３１３：１２０３−１２１４（２００７））。そこで、高密度集積に寄与しえる構造として分子間Ｓ−Ｓ結合形成が可能なＰＲ−ＣＴＬＤ１４もまた、実施例２と同様に生成して、変性ＬＤＬを検出するアッセイ系を構築するのに使用した。
【０２４８】
発現させたプロテアーゼ耐性のＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４）を検出／評価系において活用する際には、有効な修飾が施されていることが望ましい。そこでこれらの分子のＮ末側に２種類のタグ（一つは大腸菌内でビオチン化を受ける配列ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号１７））、他方はストレプトアビジンに直接認識される配列であるＳｔｒｅｐｔａｇ（ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ（配列番号１８））またはＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９））を付加した。ビオチンとストレプトアビジンの結合は非共有結合で最も強く（ＫＤ＝１０−１５Ｍ）、ストレプトアビジンを介した固定化などへの発展に際しても有効である。しかし、ビオチン化のためには、培地中へのビオチンの添加、ビオチンリガーゼを共発現させる必要があるなどの手間が掛かる。そこで、結合の強さでは劣るが（ＫＤ＝１０−７Ｍ）、遺伝子配列上でタグを付加し大腸菌で発現させればストレプトアビジンへの結合が
可能なＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９））付加タンパク質も生成した。いずれもｐＥＴ系ベクターの５’側に、タグ配列をコードする核酸配列を導入して発現用プラスミドとした（ｐＥＴ  Ｎ−Ａｖｉ、ｐＥＴ  Ｎ−ＳｔＩＩ）。定法に従って、これらの発現ベクターそれぞれにＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４を導入して、発現構築物を生成した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質のビオチン化のために、ｐＥＴ系ベクターと同一菌体内で保持可能なｐＡＣ系ベクターにビオチンリガーゼをコードしているＢｉｒＡ遺伝子を導入し、発現用プラスミドを作製した（ＢｉｒＡ／ｐＡＣ）。
【０２４９】
ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４はともに、分子内Ｓ−Ｓ結合の形成が構造の安定化と機能に必須である。そこで発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。プロテアーゼ耐性ＣＴＬＤ様ポリペプチドにＡｖｉＴａｇを付加する場合、ＡｖｉＴａｇおよび目的タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターと、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクターとで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩコード核酸を含む発現ベクターで形質転換した場合は、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４の発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。
【０２５０】
予備実験として、ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４を可溶性ポリペプチドとして発現するための温度条件および誘導時間を調べた。温度条件は、（１）３７℃、（２）２５℃および（３）２０℃に設定した。誘導時間は、（Ａ）２時間、（Ｂ）４時間、（Ｃ）８時間、（Ｄ）１８時間、（Ｅ）２４時間に設定した。まず、これらの宿主細胞を３７℃で誘導し、誘導されたタンパク質の分子量を測定したところ、予想される分子量のタンパク質の誘導が確認されたが、１００％が不溶性画分に回収された。この結果に鑑みて、誘導時間を変動させずに、誘導時の温度を２５℃に下げたところ、わずかながら可溶性ポリペプチドとしての発現が確認された。さらに誘導時の温度を２０℃にまで下げて、誘導時間の検討を行ったところ、可溶性ポリペプチドとして回収するためには、温度条件（３）および誘導時間（Ｄ）１８時間〜（Ｅ）２４時間、特に２０〜２４時間の誘導が適切であると結論付けられた（図６を参照のこと）。
【０２５１】
上記の形質転換細胞を３７℃で１２時間前培養した。本培養は、この前培養液を、２０倍希釈になるように上記の各ＬＢ培地に添加し、２５℃で旋回培養した。上記で得られた条件に基づいて、培養液の光学密度（Ａ６００）が約０．５に達したときに、培養温度を２０℃に下げると同時に、１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質を生成する場合は、誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現される目的タンパク質のビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後２０〜２４時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離により菌体をペレット化して上清を廃棄し、適量のＴＢＳで洗浄した。
【０２５２】
ＴＢＳに懸濁した菌体を、超音波破砕機にて破砕後、１５，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離により回収される上清を可溶性画分とした。発現された目的タンパク質の９０％以上が不溶性画分に残った。目的タンパク質は、精製のためのＨｉｓタグがＣ末側に付加されているので、Ｎｉ−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させ精製した（図７）。検出用として付加したＡｖｉＴａｇも精製に利用可能であり、この場合は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍｕｔｅｉｎ  ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）に吸着後、ビオチ
ンにより溶出させた。ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩの場合、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＩＢＡ，ＵＳ）に吸着後、ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎにより溶出させた。ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４とも、１Ｌ当たりの収量は、以下の表１に示すように、０．５ｍｇ未満であった。
【０２５３】
【表１】
2009082076.tif 000002
【０２５４】
（実施例４：ＣＴＬＤ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬの検出）
ヒト血漿中の動脈硬化危険因子である変性ＬＤＬの測定手法は、疾病の早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野での活用が期待されている。しかし、変性ＬＤＬは分子の修飾構造が一定ではなく、意味のある分子種が明確でないために、モノクローナル抗体による変性ＬＤＬの検出は、必ずしも正確であるとは言えなかった。一方で、ＬＯＸ−１は、幅広い分子種の変性ＬＤＬを認識可能な曖昧さがありながら、変性を受けたＬＤＬには鋭敏に反応する可能性が高い。そこで、簡便かつ汎用性が高いＥＬＩＳＡシステムにおいて、抗体に代わる分子として受容体認識能を活用可能か検討した。
【０２５５】
（１）リガンドの調製
リガンドとして、以下のものを使用した：ＬＤＬ（変性を受けていない正常なＬＤＬ（ネガティブコントロール。ヒト血漿より調製、またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，ＵＳＡより購入）；完全酸化ＬＤＬ（銅酸化法により調製）；部分酸化ＬＤＬ（銅酸化法により調製）；マロンジアルデヒド化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ（酸化ストレスの指標）。ＭＤＡ修飾により調製）。
【０２５６】
酸化ＬＤＬを、以下のように調製した。調製に際して、可能なものはすべて滅菌し、可能な限り無菌的に操作した。
【０２５７】
完全酸化ＬＤＬに関しては、ＬＤＬを、必要な場合、酸化する前に予め透析して、ＥＤＴＡを完全に取り除いた。このＥＤＴＡ非含有ＬＤＬを、ＥＤＴＡ非含有ＰＢＳ（以下、（−）ＰＢＳという）で１ｍｇ／ｍＬ濃度の溶液にし、その溶液に、最終濃度が５μＭになるようにＣｕＳＯ４を添加した。次いで、この溶液を、３７℃で２０時間インキュベートし、その後、５０μＭ  ブチル化ヒドロキシトルエンまたは１ｍＭ  ＥＤＴＡ（最終濃度）を添加して、酸化を停止した。この溶液を、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＥＤＴＡ）またはＰＢＳ（−）（１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７  ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ  ７．４）に対して透析した。得られた完全酸化ＬＤＬ含有溶液を濾過滅菌し、その濾液に０．０２％  ＮａＮ３（最終濃度）を添加し、使用時まで４℃で保存した。
【０２５８】
部分酸化ＬＤＬに関しては、同様に、ＥＤＴＡ非含有ＬＤＬを、ＥＤＴＡ非含有ＰＢＳ（以下、（−）ＰＢＳという）で２ｍｇ／ｍＬ濃度の溶液にし、その溶液に、最終濃度が２μＭになるようにＣｕＳＯ４を添加した。次いで、この溶液を、３７℃で４時間インキュベートし、その後、５０μＭ  ブチル化ヒドロキシトルエンまたは１ｍＭ  ＥＤＴＡ（最終濃度）を添加して、酸化を停止した。この溶液を、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（５０ｍＭ  
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＥＤＴＡ）またはＰＢＳ（−）に対して透析した。得られた部分酸化ＬＤＬ含有溶液を濾過滅菌し、その濾液に０．０２％  ＮａＮ３（最終濃度）を添加し、使用時まで４℃で保存した。
【０２５９】
ＭＤＡ−ＬＤＬを以下のように調製した。０．１６５ｍＬのマロンアルデヒドビス（ジメチルアセタール）（Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）の急速酸加水分解（０．２ｍＬの１２Ｍ
ＨＣｌ）により、マロンジアルデヒドを室温で生成し、４．８ｍＬの０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．４）をこの溶液に添加し、１０Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを６．４に調節した。ＥＤＴＡ非含有ＬＤＬを、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０１％  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（緩衝液Ａ）中の等量のタンパク質（５〜１０ｍｇ／ｍＬ）と、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．４）中の新たに調製した０．２Ｍ  マロンジアルデヒドとを混合し、この混合物を３７℃で３時間インキュベートすることによって修飾した。この混合物を緩衝液Ａに対して、４℃で１６時間透析することにより、反応を停止した。ＭＤＡ−ＬＤＬ含有溶液を濾過滅菌し、その濾液に０．０２％  ＮａＮ３（最終濃度）を添加し、使用時まで４℃で保存した。
【０２６０】
（２）ＣＴＬＤ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬの検出
９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に、ＬＤＬおよび上記のように調製した各リガンドを、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌにＴＢＳで希釈した後、１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置した。ＴＢＳでプレートを洗浄し、２％スキムミルク／ＴＢＳにて１時間ブロッキングし、さらにＴＢＳで洗浄した後、５μｇ／ｍｌに希釈した受容体（各ネイティブＣＴＬＤ、ネイティブＣＴＬＤ１４、ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４）溶液１００μｌを添加し、２時間室温で放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１００，０００×希釈溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、さらに室温で１時間放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄後、ＨＲＰの発色基質である３，３’，５，５’  テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を５０μｌ／ウェルで添加し、発色を確認後に反応停止液として１Ｎ  ＨＣｌを５０μｌ／ウェルで加え、Ａ４５０における吸光度を測定した。比較対照として、市販の抗酸化ＬＤＬ抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｈｏｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ＣＴＬＤ様ポリペプチドの代わりに使用した。抗体使用時は、ＨＲＰ−ストレプトアビジンの代わりに、ＨＲＰ標識２次抗体を使用した。
【０２６１】
その結果、ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４はともに、１μｇ／ｍｌの濃度（ウェル当たりでは、１００ｎｇ）の濃度の完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬを十分認識可能なことが示された。未変性のＬＤＬとも反応はするが、１０μｇ／ｍＬ（ｗｅｌｌ当たりでは１μｇ）と検出感度が低かった。また、目的タンパク質の変性ＬＤＬ認識能は、以下の表２に示されるように、プロテアーゼ耐性変異を導入していないネイティブＣＴＬＤ、ネイティブＣＴＬＤ１４と比較しても、何ら遜色が無いことが示された。
【０２６２】
さらに、市販の抗酸化ＬＤＬ抗体、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体は、以下の表３に示されるように、未変性ＬＤＬとも反応する上、酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬへの特異性が特別高くないことが明らかになった。
【０２６３】
これらの結果から、ＰＲ−ＣＴＬＤ、ＰＲ−ＣＴＬＤ１４は、ＥＬＩＳＡにおける抗体に代わる変性ＬＤＬ検出系として十分に機能し得ることが示された。
【０２６４】
【表２】
2009082076.tif 000003
【０２６５】
【表３】
2009082076.tif 000004
【０２６６】
総変性ＬＤＬを捕捉した後、総変性ＬＤＬに占める各種変性ＬＤＬ分子種の検出への可能性を明らかにする目的で、サンドイッチＥＬＩＳＡシステムにおけるＰＲ−ＣＴＬＤの有効性を検討した。
【０２６７】
９６穴のプレートに５μｇ／ｍｌの濃度にＴＢＳにて希釈した受容体（ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４）溶液を、１００μｌ／ウェルで添加した。４℃で一晩放置した後、２％  スキムミルク溶液で１時間ブロッキングし、さらにＴＢＳでの洗浄後、ＬＤＬ、完全酸化ＬＤＬ、部分酸化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬの各リガンドを添加し、室温で２時間反応させた。ＴＢＳにて十分に洗浄した後、抗酸化ＬＤＬ抗体、または抗ＭＤＡ−Ｌ
ＤＬ抗体と反応させ、ＴＢＳで十分に洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識２次抗体と反応させ、ＴＢＳで十分に洗浄した。この９６穴プレートに、ＴＭＢを基質として添加し、上記のようにＡ４５０の吸光度を測定した。上記で説明したように、使用した抗体の特異性が低いために、完全なタイプ分けには至らなかったが、各種ＬＤＬを捕捉後、異なった特異性の抗体などの分子を使用することにより、最初の段階で捕えられた総変性ＬＤＬを分類可能なことが示された（表４）。
【０２６８】
【表４】
2009082076.tif 000005
【０２６９】
（実施例５：ＣＴＬＤ様ポリペプチドによる変性ＬＤＬ含有溶液からの変性ＬＤＬの除去）
溶液中に存在する変性ＬＤＬなどの除去にＰＲ−ＣＴＬＤなどが有効であるか明らかにする目的で、ＰＲ−ＣＴＬＤ等をビーズ上に固定化し、この固定化ビーズに変性ＬＤＬを結合させた。Ｍｕｔｅｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ  １０μｌ（５０％スラリー）とビオチン化ＣＴＬＤまたはビオチン化ＰＲ−ＣＴＬＤ（５μｇ／１００μｌ  ＴＢＳ）を４℃で３０分間反応させた。２，５００ｒｐｍ×５分間のスイングローターによる遠心分離でこのＭａｔｒｉｘを回収後、冷ＴＢＳで繰り返し洗浄した。続いて、ＤｉＤ標識変性ＬＤＬと５分間反応させた後、このＭａｔｒｉｘと上清を回収した。コントロールとして、ＣＴＬＤを結合させていないＭｕｔｅｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ  １０μｌ（５０％スラリー）のみを添加した実験区を設けた。回収した上清（１００μｌ）を蛍光フリーのマイクロタイタープレートに分注し、マイクロタイタープレート対応の蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）により蛍光強度を測定した。その結果、ＣＴＬＤもしくはＰＲ−ＣＴＬＤを結合したＭａｔｒｉｘと反応させた上清からは蛍光がほとんど検出できず、ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤにより変性ＬＤＬが溶液中から完全に除去されたことが示された。
【０２７０】
上記の結果から、表５に示すように、固相上に固定化されたＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤは、変性ＬＤＬを結合し、このことによって溶液中から除去可能なことが示された。
【０２７１】
【表５】
2009082076.tif 000006
【０２７２】
（実施例６：ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４を発現する細胞株による変性ＬＤＬの検出）
変性ＬＤＬを検出する方法として、ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４を発現する細胞を生成し、この細胞株を用いてサンプル中に含まれる変性ＬＤＬを蛍光強度により測定することにより検出することを試みる。
【０２７３】
実施例２に記載されるＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４を発現する細胞を、
１×１０４細胞／ｍＬの密度でカバーガラスに播種して、８０％コンフルエントになるま
で定法に従って培養する。実施例４（１）に記載されるように調製したリガンドまたはヒト患者から得られたサンプルを定法に従ってＤｉＤで標識する。この標識サンプルまたは上記の各標識リガンド４μｇを、カバーガラスに添加し、３７℃で１時間、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下でインキュベートする。次いで、培地にて洗浄後、観察用チャンバーに装着し、細胞に取り込まれた蛍光強度を計測する。
【０２７４】
これらの実験を行うことによっても、図４に示されるように、サンプル中の変性ＬＤＬを検出できることが確認できる。
【０２７５】
（実施例７：ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４の動脈硬化診断への応用）
実施例４（２）に記載されるように、変性ＬＤＬを測定を測定する。動脈硬化患者から得られた血漿または健常者から得られた血漿をサンプルとして使用する。９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に、これらサンプルを１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置する。ＴＢＳでプレートを洗浄し、２％スキムミルク／ＴＢＳにて１時間ブロッキングおよびＴＢＳで洗浄した後、５μｇ／ｍｌに希釈した受容体（ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４）溶液１００μｌを添加し、２時間室温で放置する。ＴＢＳにて十分に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１００，０００×希釈溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、さらに室温で１時間放置する。ＴＢＳにて十分に洗浄後、ＨＲＰの発色基質である３，３’，５，５’
テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を５０μｌ／ウェルで添加し、発色を確認後に反応停止液として１Ｎ  ＨＣｌを５０μｌ／ウェルで加え、Ａ４５０における吸光度を測定する。得られた吸光度値からサンプル中に含まれる変性ＬＤＬの相対量を算出する。これらの値を、臨床検査で使用される値と比較することによって、変性ＬＤＬによって引き起こされる疾患に罹患しているかどうかを予想することができる。
【０２７６】
（実施例８：ＲＡＧＥは、大過剰のプロテアーゼによって分解される）
本発明者らは、ＡＧＥを検出することにおいてより安定なＡＧＥ認識分子を得るために、図８に模式的に示されるＲＡＧＥの細胞外ドメイン（ｓＲＡＧＥ１；ＲＡＧＥのアミノ酸配列の２３位〜３３２位）のプロテアーゼに対する安定性について試験した。
【０２７７】
ヒト肺ｐｏｌｙＡ  ＲＮＡを鋳型に逆転写反応後、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３６４３２に示される配列に基づいて、ＲＡＧＥに適合する２種類の特異的プライマー：
５’−ＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧ（順方向プライマー；配列番号２２）；および
５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＧＴＡＣＴＡＣ−３’（逆方向プライマー；配列番号２３）
を用いて増幅した。増幅転写物を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＤＮＡ配列分析により確認した。
【０２７８】
ｐＥＴ系ベクターの３’側にＡｖｉタグ配列をコードする核酸配列を導入して、Ｃ末端ビオチン化タンパク質の生産を可能とするベクターを構築し発現用プラスミドとした（ｐＰＥＴ  Ｃ−Ａｖｉ）。定法に従って、発現ベクターにＲＡＧＥ１を導入して、発現構築物を生成した。
【０２７９】
ＲＡＧＥは、ＣＴＬＤと同様に、Ｓ−Ｓ結合の形成が構造の安定化と機能に必須である。そこで発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオン
レダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。ビオチン化ペプチドとして生産させるために、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクター（ｐＥＴ系ベクターと同一菌体内で保持可能なｐＡＣ系ベクターにビオチンリガーゼをコードしているＢｉｒＡ遺伝子を導入）とで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で２５℃で培養した。ＲＡＧＥ様ポリペプチドの発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。誘導は２５℃で１８時間行った。２５℃で誘導することにより、９０％以上が可溶性ポリペプチドとして発現された。誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現される目的タンパク質のビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後１８時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離により菌体をペレット化して上清を廃棄し、適量のＴＢＳで洗浄した。
【０２８０】
ＴＢＳに懸濁した菌体を、超音波破砕機にて破砕後、１５，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離により回収される上清を可溶性画分とした。目的タンパク質は、精製のためのＨｉｓタグがＣ末側に付加されているので、Ｎｉ−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させ精製した。検出用として付加したＡｖｉＴａｇも精製に利用可能であり、この場合は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍｕｔｅｉｎ  ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）に吸着後、ビオチンにより溶出させた。精製したタンパク質は、認識されている結合特異性およびＲ−ＡＧＥ（リボースにより糖化処理をしたＢＳＡ）、Ｆ−ＡＧＥ（フルクトースにより処理をしたＢＳＡ）、Ｇ−ＡＧＥ（グルコースにより糖化処理をしたＢＳＡ）に対する親和性を示した。このことは、この精製タンパク質がビオチン化されていることを利用し、ＢＩＡＣＯＲＥのストレプトアビジンセンサーチップ上に、リガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化し、このセンサーチップをＢＩＡＣＯＲＥ本体に挿入後、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により確認した。
【０２８１】
このようにして得られたｓＲＡＧＥ１（０．２５ｍｇ／ｍＬ）をプロテアーゼ処理した。反応は、０．１ｍｌ（最終濃度で０．０２ｍｇのｓＲＡＧＥ１含む）の系で行い（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）、２ユニットのトロンビン（１ｕは、１ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）、１０ｕのエンテロキナーゼ（１ｕは、０．０５ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）、または１０ｕの第Ｘａ因子（１ｕは、０．０５ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）とともに２５℃で１８時間反応させた。１８時間後にＰＭＳＦを添加し、反応を停止した直後に、この反応産物を、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に処理した。プロテアーゼ非処理である対象区は、プロテアーゼ添加と同時にＰＭＳＦを添加しプロテアーゼを不活化すると共に、直ちにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプル処理に供し、−２０℃にて保存した。プロテアーゼ処理区、非処理区を、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ＣＢＢ染色に供したところ、低分子領域にｓＲＡＧＥの断片が認められた（図９を参照のこと）。さらに、ペプチドマッピングを行ったところ、ｓＲＡＧＥ１は、大過剰のトロンビンではＲＡＧＥのＲ１１４とＶ１１５の間、およびＲ２２８とＶ２２９との間に該当する位置で、大過剰の第Ｘａ因子ではＲＡＧＥのＲ１１４とＶ１１５の間、Ｖ１１７とＹ１１８との間、およびＭ２７２とＫ２７３との間に該当する位置で切断されることが明らかになった（図８を参照のこと）。
【０２８２】
従って、本発明者らは、リガンド認識能に影響を与えずにプロテアーゼ耐性が付与されたＲＡＧＥ様ポリペプチドの生成を試みた。
【０２８３】
（実施例９：ＲＡＧＥ様ポリペプチドの生成））
実施例８において得られた知見に基づいて、上記の切断部位４箇所に変異を導入したｓ
ＲＡＧＥ１様ポリペプチド（Ｒ１１４Ｑ／Ｖ１１７Ａ／Ｒ２２８Ｎ／Ｍ２７２Ｉ；本実施例中、ｍＲＡＧＥ１ともいう）を定法に従って生成した。この核酸を、定法に従って、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を融合させた哺乳動物用発現ベクターｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）またはｐＴａｒｇｅｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に導入することによって、Ｎ末端にＣＦＰが融合したｍＲＡＧＥ１コード核酸を含むプラスミドを構築した。ＣＨＯ細胞を１０％  ＦＣＳを補充したＦ１２培地中、３７℃において５％ＣＯ２加湿雰囲気下で培養した。１×１０４細胞／ｍｌの密度で懸濁したＣＨＯ細胞４００μｌを、トランスフェクションを行う２４時間前に、カバースリップ上に播種した。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬を用いて製造業者のプロトコルに従って、細胞をトランスフェクトし、４８時間インキュベートし、ＣＨＯ細胞に一過性発現させた。その後、この細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、ＣＦＰの蛍光によりｍＲＡＧＥ１発現細胞が確認できた。また、リガンドであるリボースにより糖化処理したＢＳＡ（Ｒ−ＢＳＡ）を蛍光色素であるＡｌｅｘａ６３３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）により標識し、この標識糖化ＢＳＡをｍＲＡＧＥ１発現細胞に添加したところ、リガンドの認識能および取り込み能が確認できた。
【０２８４】
ｍＲＡＧＥ１発現細胞は、明瞭なリガンド取り込み能を示し（図１０）、プロテアーゼ耐性の増大を狙ったアミノ酸置換は、リガンド認識能には影響を与えていないことが示された。
【０２８５】
さらに、そのプロテアーゼ感受性を検討したところ、天然型に比べ耐性が上昇していることが示され、プロテアーゼ耐性の上がったＲＡＧＥ分子の作出に成功した（図１１）。
【０２８６】
（実施例１０：ＲＡＧＥのリガンド認識能に必須の最小領域の決定）
これまで、ＲＡＧＥの細胞外領域がリガンド認識に必須であることは知られていたが、細胞外領域のどの部分がリガンド認識に必要十分であるかは明らかにされていない。よってリガンド認識に必須の最小領域を決定する目的で、領域欠損などによる削りこみを行って、ｍｉｎｉＲＡＧＥを作製した。
【０２８７】
ｍｉｎｉＲＡＧＥとして、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３６４３２に示される配列に基づいて、以下のプライマー：
順方向プライマー（ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ９に共通）
５’−ＣＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号２４）
逆方向プライマー
ＲＡＧＥ１については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号２５）
ＲＡＧＥ２については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧＣＴＧ−３’（配列番号２６）
ＲＡＧＥ３については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣ−３’（配列番号２７）
ＲＡＧＥ７については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＡＧＴ−３’（配列番号２８）
ＲＡＧＥ８については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＡＧＡＣＡＣＧＧ−３’（配列番号２
９）
ＲＡＧＥ９については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号３０）
ＲＡＧＥ４については、順方向プライマー
５’−ＴＣＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＣＡＧＧＡＡＴＧＧ−３’（配列番号３１）
逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号３２）
を設計し、ＲＡＧＥ２（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２５０位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ３（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２３０位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ４（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列１０１〜３３２位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ７（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１３７位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ８（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１２０位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ９（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１１２位）をコードするＤＮＡを得た。
【０２８８】
これらｍｉｎｉＲＡＧＥをコードするＤＮＡを、制限酵素の認識配列を付加した特異的プライマーによりＰＣＲにより増幅した後、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をクローニング用ベクターとしてＴＡクローニングを行い、塩基配列を確認した。
【０２８９】
（実施例１１：タグ配列付加ＲＡＧＥ様ポリペプチドの生成）
実施例１０において生成したＲＡＧＥ様ポリペプチド（ｓＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２〜ＲＡＧＥ８）を検出／評価系において活用する際には、有効な修飾が施されていることが望ましい。そこでこれらの分子のＮ末側に２種類のタグ（一つは大腸菌内でビオチン化を受ける配列ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号１７））、他方はストレプトアビジンに直接認識される配列であるＳｔｒｅｐｔａｇ（ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ（配列番号１８）またはＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９））を付加した。ビオチンとストレプトアビジンの結合は非共有結合で最も強く（ＫＤ＝１０−１５Ｍ）、ストレプトアビジンを介した固定化などへの発展に際しても有効である。しかし、ビオチン化のためには、培地中へのビオチンの添加、ビオチンリガーゼを共発現させる必要があるなどの手間が掛かる。そこで、結合の強さでは劣るが（ＫＤ＝１０−７Ｍ）、遺伝子配列上でタグを付加し大腸菌で発現させればストレプトアビジンへの結合が可能なＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９））付加タンパク質も生成した。いずれもｐＥＴ系ベクターの３’側にタグ配列をコードする核酸配列を導入して、発現用プラスミドとした（ｐＥＴ  Ｃ−Ａｖｉ、ｐＥＴ  Ｃ−ＳｔＩＩ）。定法に従って、これらの発現ベクターに、ｍＲＡＧＥおよびｍｉｎｉＲＡＧＥを導入して、発現構築物を生成した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質のビオチン化のために、ｐＥＴ系ベクターと同一菌体内で保持可能なｐＡＣ系ベクターにビオチンリガーゼをコードしているＢｉｒＡ遺伝子を導入したＢｉｒＡ／ｐＡＣを作製した。
【０２９０】
ＲＡＧＥは、ＣＴＬＤと同様に、Ｓ−Ｓ結合の形成が構造の安定化と機能に必須である。そこで発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。ＲＡＧＥ様ポリペプチド（ｓＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２〜ＲＡＧＥ８をまとめて「ＲＡＧＥ様ポリペプチド」と称する）にＡｖｉＴａｇを付加する場合、ＡｖｉＴａｇおよびこのポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターと、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクターとで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリ
ン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩコード核酸を含む発現ベクターで形質転換した場合は、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＲＡＧＥ様ポリペプチドの発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。
【０２９１】
予備実験として、ＲＡＧＥ様ポリペプチドを可溶性ポリペプチドとして発現するための温度条件および誘導時間を調べた。温度条件は、（１）３７℃、（２）２５℃および（３）２０℃に設定した。誘導時間は、（Ａ）１８時間、（Ｂ）２０時間、および（Ｃ）２４時間に設定した。まず、これらの宿主細胞を３７℃で誘導し、誘導されたタンパク質の分子量を測定したところ、大部分が不溶性画分に回収された。培養温度を２５℃に下げるとｓＲＡＧＥの場合、９０％以上が可溶性ポリペプチドとして発現されたが、ｍＲＡＧＥ１の場合は、２０％程度しか可溶性ポリペプチドとして発現されなかった。各ｍｉｎｉＲＡＧＥに関しては、欠損部分が長くなるほど可溶化率が下がる傾向が観察された。ＲＡＧＥ８およびＲＡＧＥ９に関しては培養温度を下げても殆どが不溶性となり、可溶性ポリペプチドとして発現させるのは困難であった。上記の結果に鑑みて、培養温度を２５℃に維持して、誘導時間の検討を行ったところ、誘導時間（Ａ）１８時間が適切であることが分かった（図１３を参照のこと）。
【０２９２】
上記の形質転換細胞を３７℃で１２時間前培養した。本培養は、この前培養液を、２０倍希釈になるように上記の各ＬＢ培地に添加し、２５℃で旋回培養した。上記で得られた条件に基づいて、培養液の光学密度（Ａ６００）が約０．５に達したときに、１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質を生成する場合は、誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現される目的タンパク質のビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後１８時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離により菌体をペレット化して上清を廃棄し、適量のＴＢＳで洗浄した。
【０２９３】
ＴＢＳに懸濁した菌体を、超音波破砕機にて破砕後、１５，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離により回収される上清を可溶性画分とした。目的タンパク質は、精製のためのＨｉｓタグがＣ末側に付加されているので、Ｎｉ−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させ精製した（図１３）。検出用として付加したＡｖｉＴａｇも精製に利用可能であり、この場合は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍｕｔｅｉｎ  ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）に吸着後、ビオチンにより溶出させた。ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩの場合、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＩＢＡ，ＵＳ）に吸着後、ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎにより溶出させた。各ＭｉｎｉＲＡＧＥの発現効率、可溶性ポリペプチドとして発現する比率、収率などは以下の表６に示すとおりである。
【０２９４】
【表６】
2009082076.tif 000007
【０２９５】
（実施例１２：ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるＡＧＥの検出）
ヒト血液、尿中などのＡＧＥの測定手法は、糖尿病性血管障害の早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野での活用が期待される。しかし、ＡＧＥは分子の修飾構造が一定ではなく、バイオマーカーとして意味のある分子種が明確でないなど、モノクローナル抗体やＨＰＬＣなどによるＡＧＥの定量的検出は、必ずしも正確であるとは言えなかった。一方でＲＡＧＥは幅広い分子種のＡＧＥを認識可能なマルチリガンドレセプターであり、生体内のＡＧＥを鋭敏に検出する可能性が高い。そこで、広く様々な分野で活用されており汎用性が高いＥＬＩＳＡシステムにおいて、受容体認識能を活用可能か検討した。
（１）リガンドの調製
リガンドとして、以下のものを使用した：ｃＢＳＡ（糖化処理をしていないＢＳＡ，ネガティブコントロールとして使用）；Ｒ−ＡＧＥ（リボースにより糖化処理をしたＢＳＡ）、Ｆ−ＡＧＥ（フルクトースにより処理をしたＢＳＡ）；Ｇ−ＡＧＥ（グルコースにより糖化処理をしたＢＳＡ）。
【０２９６】
糖化ＢＳＡを、以下のように調製した。調製に際して、可能なものはすべて滅菌し、可能な限り無菌的に操作した。
【０２９７】
エタノールで洗浄したスパチュラを使用して、各糖（グルコース  ４．５１ｇ、フルクトース  ４．５１ｇおよびリボース  ３．７５ｇ）を秤量して、滅菌したキャップ付きプラスチックチューブ中に入れた。各プラスチックチューブに、２０ｍＬの滅菌１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を無菌的に添加し、穏やかに転倒混和することによってその溶液を混合した。最後に２１ｍＬのエンドトキシンフリーの蒸留水を添加した。各成文の最終濃度は、４００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中、５０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、５００ｍＭ  グルコース（Ｇｌｕ５００  ＢＳＡ）、５００ｍＭ  フルクトース（Ｆｒｕ５００  ＢＳＡ）、５００ｍＭ  リボース（Ｒｉｂ５００  ＢＳＡ）であった。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ０．２２μｍフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過滅菌した後、これらの糖−ＢＳＡ溶液を、最大１２週間、遮光して３７℃でインキュベートした。１週間に１回、無菌条件下で、チューブをアルコールに浸したペーパータオルで拭いてからキャップを開け、各糖−ＢＳＡ調製物を８０μｌ取り出し、３．５ｍｍマイクロプローブを備えたｐＨメーターでｐＨをモニターした。各糖−ＢＳＡ溶液のｐＨを、１０Ｎ  水酸化ナトリウム溶液（エンドトキシンフリー）で７．４に調節した。１週間に１回ｐＨを調節した後、５〜１０ｍＬずつ分注して、分析に供するまで−８０℃で保存した。未反応の糖を除去することによってこの反応を停止するために、分注したものをすべて解凍して透析チューブに入れ、オートクレーブ処理したビーカー中で
滅菌ＰＢＳに対して完全に透析した。透析チューブから糖−ＢＳＡ溶液を取り出す前に、チューブの開口部を７０％エタノールで滅菌した。取り出した糖−ＢＳＡ溶液を、滅菌チューブに入れ、使用時まで４℃で保存した。
（２）ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるＡＧＥの検出
９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に、ＢＳＡおよび上記のように調製した各リガンドを、ＴＢＳにて０．１μｇ／ｍｌ、１，５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌにＴＢＳにて希釈した後、１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置した。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅブロッキング剤（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）により１時間ブロッキングおよびＴＢＳで洗浄した後、５μｇ／ｍｌに希釈した受容体（ｓＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ１〜ＲＡＧＥ８）溶液を１００μｌを添加し、２時間室温で放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１００，０００×希釈溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、さらに室温で１時間放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄後、ＨＲＰの発色基質である３，３’，５，５’  テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を５０μｌ／ウェルで添加し、発色を確認後に反応停止液として１Ｎ  ＨＣｌを５０μｌ／ウェルで加え、Ａ４５０における吸光度を測定した。比較対照として、市販の抗ＡＧＥ抗体（Ｔｒａｎｓ  Ｇｅｎｉｃ
Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）、抗ペントシジン抗体（Ｔｒａｎｓ  Ｇｅｎｉｃ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を各ＲＡＧＥ様ポリペプチドの代わりに使用した。抗体使用時は、ＨＲＰ−ストレプトアビジンの代わりに、ＨＲＰ標識２次抗体を使用した。
【０２９８】
その結果、４箇所に変異を導入したｍＲＡＧＥ１にも天然型のＲＡＧＥに遜色がない認識能が確認された。さらに、可溶性ポリペプチドとして調製可能であったＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、およびＲＡＧＥ７も認識能を有していた。
【０２９９】
以下の表７は、可溶性ポリペプチドとして発現されるＲＡＧＥ様ポリペプチドについての結果を示す。いずれもネガティブコントロールであるｃＢＳＡはほとんど認識せず、特異性が強いことが示された。いずれのＲＡＧＥでも反応のバックグランドが高いという難点はあるが、検出感度もよく、０．１μｇ／ｍｌ（ウェル当たりでは１０ｎｇ）でも十分に検出可能であり、また、生体内における反応性  Ｒ−ＡＧＥ  ＞  Ｆ−ＡＧＥ  ＞  Ｇ−ＡＧＥと一致した反応の強度を示した。また、バックグラウンドが高く、リガンドごとに値が異なるため、各実験においてリガンドを添加しなかった場合のＡ４５０もまた測定し、表中に示した。
【０３００】
さらに、市販の抗ＡＧＥ抗体も検出に使用可能であったが、検出感度はＲＡＧＥの方が高かった。抗ペントシジン抗体は、いずれのタイプのＡＧＥとの反応も確認できず、ＥＬＩＳＡ系への適用は難しいことが示された。
【０３０１】
【表７】
2009082076.tif 000008
【０３０２】
総ＡＧＥを捕捉した後、総ＡＧＥに占める各種ＡＧＥ分子種の検出への可能性を明らかにする目的で、サンドイッチＥＬＩＳＡシステムにおけるＲＡＧＥ様ポリペプチドの有効性を検討した。
【０３０３】
９６穴のプレートに５μｇ／ｍｌの濃度にＴＢＳにて希釈した受容体（各ＲＡＧＥ様ポリペプチド）溶液を１００μｌ／ウェルで添加した。４℃で一晩放置した後、Ｐｒｏｅｔｉｎ−Ｆｒｅｅブロッキング剤で１時間ブロッキングおよびＴＢＳでの洗浄後、Ｃ−ＢＳＡ、Ｒ−ＢＳＡ、Ｆ−ＢＳＡ、Ｇ−ＢＳＡの各ＡＧＥを添加し、室温で２時間反応させた。ＴＢＳにて十分に洗浄し、抗ＡＧＥ抗体と反応させ、ＴＢＳで十分に洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識２次抗体と反応させ、ＴＢＳで十分に洗浄した。この９６穴プレートに、ＴＭＢを基質とて添加し、上記のようにＡ４５０の吸光度を測定した。上記で説明したように、使用した抗体の特異性が低いために、完全なタイプ分けには至らなかったが、各種ＡＧＥを捕捉後、異なった特異性の抗体などの分子を使用することにより、最初の段階で捕えられた総ＡＧＥを分類可能なことが示された（表８）。
【０３０４】
【表８】
2009082076.tif 000009
【０３０５】
（実施例１３：ＲＡＧＥ様ポリペプチドによるＡＧＥ含有溶液からのＡＧＥの除去）
溶液中に存在するＡＧＥなどの除去にｍＲＡＧＥ１などが有効であるか明らかにする目的で、ＲＡＧＥ様ポリペプチドをビーズ上に固定化し、この固定化ビーズにＡＧＥ（Ｒ−ＢＳＡ）を結合させた。Ｍｕｔｅｉｎ  Ｍａｔｒｉｘと１０μｌ（５０％  スラリー）とビオチン化ネイティブＲＡＧＥまたはビオチン化ｍＲＡＧＥ１（５μｇ／１００μｌ  ＴＢＳ）を４℃で３０分間反応させた。２，５００ｒｐｍ×５分間のスイングローターによる遠心分離でこのＭａｔｒｉｘを回収後、冷ＴＢＳにて繰り返し洗浄した。続いて、Ａｌｅｘａ６３３標識Ｒ−ＢＳＡと５分間反応させた後、Ｍａｔｒｉｘと上清を回収した。コントロールとしてＲＡＧＥもｍＲＡＧＥ１も結合させていないＭｕｔｅｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ  １０μｌ（５０％  スラリー）のみを添加した実験区を設けた。回収した上清（１００μｌ）を蛍光フリーのマイクロタイタープレートに分注し、マイクロタイタープレート対応の蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）により蛍光強度を測定した。その結果、ＲＡＧＥもしくはｍＲＡＧＥを結合したＭａｔｒｉｘと反応させた上清からは蛍光がほとんど検出できず、ＲＡＧＥおよびｍＲＡＧＥによりＡＧＥ溶液中から完全に除去されたことが示された（表９）。
【０３０６】
【表９】
2009082076.tif 000010
【０３０７】
（実施例１４：ＲＡＧＥ様ポリペプチドを発現する細胞株によるＡＧＥの検出）
ＡＧＥを検出する方法として、ＲＡＧＥ様ポリペプチドを発現する細胞を生成し、この細胞株を用いてサンプル中に含まれるＡＧＥを蛍光強度により測定することにより検出することを試みる。
【０３０８】
実施例９に記載されるＲＡＧＥ様ポリペプチドを発現する細胞を、１×１０４細胞／ｍＬの密度でチャンバ付きスライドガラスに播種して、８０％コンフルエントになるまで定法に従って培養する。実施例１２（１）に記載されるように調製したリガンドまたはヒト患者から得られたサンプルを定法に従ってＡｌｅｘａ６３３で標識する。この標識サンプルまたは上記の各標識リガンド４μｇを、カバーガラスに添加し、３７℃で１時間、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下でインキュベートする。次いで、培地にて洗浄後、観察用チャンバーに装着し、細胞に取り込まれた蛍光強度を計測する。
これらの実験を行うことによっても、図１０に示されるように、サンプル中のＡＧＥを検出できることが確認できる。
【０３０９】
（実施例１５：ＲＡＧＥ様ポリペプチドの糖尿病性血管障害への応用）
実施例１２（２）に記載されるように、ＡＧＥを測定を測定する。糖尿病性血管障害患者から得られた血漿プール、糖尿病患者から得られた血漿プール、または健常者から得られた血漿プールをサンプルとして使用する。９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に、これらサンプルを１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置する。ＴＢＳでプレートを洗浄し、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅブロッキング剤にて１時間ブロッキングおよびＴＢＳで洗浄した後、５μｇ／ｍｌに希釈した受容体（ＲＡＧＥ様ポリペプチド）溶液１００μｌを添加し、２時間室温で放置する。ＴＢＳにて十分に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１００，０００×希釈溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、さらに室温で１時間放置する。ＴＢＳにて十分に洗浄後、ＨＲＰの発色基質である３，３’，５，５’  テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を５０μｌ／ウェルで添加し、発色を確認後に反応停止液として１Ｎ  ＨＣｌを５０μｌ／ウェルで加え、Ａ４５０における吸光度を測定する。得られた吸光度値からサンプル中に含まれるＡＧＥの相対量を算出する。これらの値を、臨床検査で使用される値と比較することによって、ＡＧＥによって引き起こされる疾患に罹患しているかどうかを予想することができる。
【産業上の利用可能性】
【０３１０】
ＣＴＬＤ様ポリペプチドおよびＲＡＧＥ様ポリペプチドは、動脈硬化、糖尿病性血管障害などの早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野で活用できる。
【図面の簡単な説明】
【０３１１】
【図１】図１は、ＬＯＸ−１の模式図をあらわす。図中の数字は、ＬＯＸ−１のアミノ酸配列の番号付けに従うアミノ酸残基の位置を表す。
【図２】図２は、ＲＡＧＥの模式図を表す。図中の数字は、ＲＡＧＥのアミノ酸配列の番号付けに従うアミノ酸残基の位置を表す。
【図３】図３は、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）およびＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤ）のプロテアーゼによる分解の程度を示す。ＣＴＬＤまたはＰＲ−ＣＴＬＤを大過剰のプロテアーゼ（Ｔ：トロンビン、Ｅ：エンテロキナーゼ、Ｘａ：第Ｘａ因子）ともに３７℃で１８時間インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した後、ＣＢＢ染色した。Ａは、天然型Ｃ型レクチン様ドメイン（ネイティブＣＴＬＤ）のプロテアーゼによる分解を示す。Ｂは、ＰＲ−ＣＴＬＤ（Ｇ２３２Ａ／Ｇ２４９Ａ変異が導入されている）のプロテアーゼによる分解を示す。
【図４】図４は、ＣＴＬＤ様ポリペプチド発現細胞  による変性ＬＤＬ  の認識および取り込みを示す。Ａは、ＰＲ−ＣＴＬＤをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の明視野像を示す。Ｂは、ＣＦＰの蛍光により、ＰＲ−ＣＴＬＤの発現が確認された細胞を示す。Ｃは、ＣＦＰの蛍光によりＰＲ−ＣＴＬＤの発現が確認された細胞によるＤｉＤ標識ＡｃＬＤＬの明瞭な取り込みを示す。
【図５】図５は、ＬＯＸ−１の細胞外領域および変性ＬＤＬの認識に必須の最小領域、ならびに分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するアミノ酸残基を含むネック由来の１４アミノ酸残基とＣＴＫＤからなるＣＴＬＤ１４を示す。図中の矢印は、大過剰のトロンビンに対して感受性の部位を示す。
【図６】図６は、温度および誘導時間を変化させた場合の形質転換細胞において発現されたＣＴＬＤ様ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す。Ａは、ＰＲ−ＣＴＬＤを含む発現ベクターで形質転換した細胞を３７℃で培養したときのＰＲ−ＣＴＬＤの発現状態を示す。レーン１：誘導前；レーン２および３：誘導後２時間；レーン４および５：誘導後４時間。レーン２および４は、可溶性画分を示す。レーン３および５は、不溶性画分を示す。発現は良好であるが、１００％が不溶性として発現した。Ｂは、誘導後２０℃で培養したときの時のＰＲ−ＣＴＬＤの発現状態を示す。発現量は低いが、可溶性画分へ発現する割合は増えた。レーン１：誘導前；レーン２：誘導２４時間後の可溶性画分、レーン：誘導２４時間後の不溶性画分。
【図７】図７は、形質転換細胞から発現されたＰＲ−ＣＴＬＤ可溶性画分をＮｉ−アガロースに吸着させた後、０．１Ｍイミダゾールで洗浄し、０．５Ｍイミダゾールにて溶出させた結果を示す。レーン１は、Ｎｉ−アガロース吸着画分であり、レーン２は、０．５Ｍ  イミダゾール溶出画分である。
【図８】図８は、ｈＲＡＧＥおよびｈＲＡＧＥの可溶性ドメイン（ｈｓＲＡＧＥ）およびｈｓＲＡＧＥを構成する各ドメインを模式的に示す。図中の矢印およびアミノ酸の１文字表記と数字の組み合わせは、大過剰のプロテアーゼに感受性の部位を示す。括弧中の記号は、Ｔ：トロンビン、Ｘａ：第Ｘａ因子を示す。矢印で示される位置に、アミノ酸置換Ｒ１１４Ｑ、Ｖ１１７Ａ、Ｒ２２８Ｎ、Ｍ２７２Ｉを導入して、ＰＲ−ＣＴＬＤを作製する。
【図９】図９は、ｈｓＲＡＧＥのプロテアーゼによる分解の程度を示す。ｈｓＲＡＧＥを大過剰のプロテアーゼ（Ｔ：トロンビン、Ｅ：エンテロキナーゼ、Ｘａ：第Ｘａ因子）とともに３７℃で１８時間インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した後、ＣＢＢ染色した。０で示されるレーンは、プロテアーゼ非処理区のｈｓＲＡＧＥを泳動した。１８で示されるレーンは、１８時間のプロテアーゼ処理後のｈｓＲＡＧＥを泳動した。Ｈｉｓタグ除去の目的のために、ｐＥＴ  Ｃ−Ａｖｉにはエンテロキナーゼ認識配列が挿入されている。エンテロキナーゼによる切断は、デザインに従いタグ部分のみが除去された予想される分子量の減少が起こっている。それに対して、ＴやＸａにより処理した結果、ｈｓＲＡＧＥにはプロテアーゼによって特異的に切断される部位が存在しないにもかかわらず、予想外の切断による断片が確認された。
【図１０】図１０は、ｍＲＡＧＥ１発現細胞  によるＡＬｅｘａ６３３標識ＡＧＥの認識および取り込みを示す。Ａは、ｍＲＡＧＥ（Ｒ１１４Ｑ／Ｖ１１７Ａ／Ｒ２２８Ｎ／  Ｍ２７２Ｉ  ）をトランスフェクトした細胞の明視野像を示す。Ｂは、  ｍＲＡＧＥ発現細胞におけるＡＬｅｘａ６３３標識ＡＧＥの顕著な取り込みを示す。
【図１１】図１１は、ｍＲＡＧＥのプロテアーゼによる分解の程度を示す。Ａは、ｈｓＲＡＧＥ１（天然型）のプロテアーゼ処理結果を示す。Ｂは、ｍＲＡＧＥのプロテアーゼ処理結果を示す。それぞれ、レーン１は、第Ｘａ因子（必要量の１００倍濃度）添加直後に、反応を停止させたものを示し、レーン２は、必要量の１０倍濃度の第Ｘａ因子を添加し、２３℃で４時間反応させたものを示し、レーン３は、必要量の１００倍濃度の第Ｘａ因子を添加し、２３℃で２時間反応させたものを示す。反応停止後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢ染色した。レーン２でｈｓＲＡＧＥに観察される切断されたＲＡＧＥ由来のバンドがｍＲＡＧＥでは少なく、レーン３でも同様な傾向が観察され、ｍＲＡＧＥはプロテアーゼ抵抗性が増していることが確認された。
【図１２】図１２は、領域欠損によるｈｓＲＡＧＥの削りこみを示す。図中の数字は、ＲＡＧＥのアミノ酸配列のアミノ酸番号付けに従う。
【図１３】図１３は、温度および誘導時間を変化させた場合の形質転換細胞において発現されたRAGE様ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す。上段は、左から順に、天然型RAGE１（ｈｓＲＡＧＥ１）、ｍＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３およびＲＡＧＥ７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す。レーン１は、可溶性画分であり、レーン２は、不溶性画分である。欠損により分子量が小さくなるに連れ、発現量、可溶性ポリペプチドとしての発現量が共に低下した（表６もまた参照のこと）。下段は、Ｍｕｔｅｉｎ−Ｍａｔｒｉｘに吸着後、ビオチンで溶出することにより精製したＲＡＧＥ様ポリペプチドを示す。Ｎ：天然型ＲＡＧＥ１（ｈｓRAGE1）；Ｍ：ｍＲＡＧＥを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０３１２】
配列番号１：ＰＲ−ＣＴＬＤまたはＣＴＬＤをコードする核酸配列
配列番号２：ＰＲ−ＣＴＬＤまたはＣＴＬＤのアミノ酸配列
配列番号３：ＰＲ−Ｌｏｘ−１またはＬｏｘ−１をコードする核酸配列
配列番号４：ＰＲ−Ｌｏｘ−１またはＬｏｘ−１のアミノ酸配列
配列番号５：ＰＲ−ＣＴＬＤ１４またはＣＴＬＤ１４をコードする核酸配列
配列番号６：ＰＲ−ＣＴＬＤ１４またはＣＴＬＤ１４のアミノ酸配列
配列番号７：Ｌｏｘ−１のＣＴＬＤ＋ネックまたはＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネックをコードする核酸配列
配列番号８：Ｌｏｘ−１のＣＴＬＤ＋ネックまたはＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネックのアミノ酸配列
配列番号９：ＲＡＧＥまたはｍＲＡＧＥをコードする核酸配列
配列番号１０：ＲＡＧＥまたはｍＲＡＧＥのアミノ酸配列
配列番号１１：ＲＡＧＥ８またはｍＲＡＧＥ８をコードする核酸配列
配列番号１２：ＲＡＧＥ８またはｍＲＡＧＥ８のアミノ酸配列
配列番号１３：ＲＡＧＥ１またはｍＲＡＧＥ１をコードする核酸配列
配列番号１４：ＲＡＧＥ１またはｍＲＡＧＥ１のアミノ酸配列
配列番号１５：Gly-Gly-Gly-Ser
配列番号１６：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
配列番号１７：AviTagのアミノ酸配列
配列番号１８：Streptagのアミノ酸配列
配列番号１９：StreptagIIのアミノ酸配列
配列番号２０：ＣＴＬＤの順方向プライマー
配列番号２１：ＣＴＬＤの逆方向プライマー
配列番号２２：ＲＡＧＥの順方向プライマー
配列番号２３：ＲＡＧＥの逆方向プライマー
配列番号２４：ｍｉｎｉＲＡＧＥ（ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ９）の順方向プライマー
配列番号２５：ＲＡＧＥ１の逆方向プライマー
配列番号２６：ＲＡＧＥ２の逆方向プライマー
配列番号２７：ＲＡＧＥ３の逆方向プライマー
配列番号２８：ＲＡＧＥ７の逆方向プライマー
配列番号２９：ＲＡＧＥ８の逆方向プライマー
配列番号３０：ＲＡＧＥ９の逆方向プライマー
配列番号３１：ＲＡＧＥ４の順方向プライマー
配列番号３２：ＲＡＧＥ４の逆方向プライマー
【図１】
2009082076.tif 000011
【図２】
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【図３】
2009082076.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009082076.tif 000018
【図９】
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【図１０】
2009082076.tif 000020
【図１１】
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【図１２】
2009082076.tif 000022
【図１３】
2009082076.tif 000023
【配列表】
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