(57)【要約】【課題】新規なカルシウム結合蛋白を認識する抗体およびその用途を提供する。【解決手段】ヒトに由来し、所定のアミノ酸配列を有するカルシウム結合タンパク、に対する抗体及びその利用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するか、或いは配列番号：１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されており且つ配列番号：１に示すアミノ酸配列のカルシウム結合能を維持しているアミノ酸配列を有する、カルシウム結合タンパク、或いは当該タンパクと他のタンパク又はペプチドとから成る融合タンパク、に対して親和性を有する抗体。
【請求項２】
前記カルシウム結合タンパクが配列番号：１に示すアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗体を含んで成る、炎症性疾患、腫瘍性疾患（特に扁平上皮癌）、皮膚疾患、又は血液疾患の診断薬。
【請求項４】
前記抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の診断薬。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の抗体を含んで成るカルシウム結合タンパク測定用試薬。
【請求項６】
前記抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項５に記載の測定用試薬。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の試薬を使用することを特徴とする、カルシウム結合タンパクの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規カルシウム結合タンパク、それをコードするＤＮＡ、該カルシウム結合タンパクに対する抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を含んで成る診断薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外カルシウムイオン濃度は、細胞増殖や分化の調節に関与していることが知られている。一方、細胞内カルシウムイオンは、細胞内情報伝達の鍵となる伝達因子の一つである。このカルシウムシグナルは、各種のカルシウム結合タンパク（CaBP）により媒介される。カルシウム結合タンパクは、カルモジュリン、トロポニンＣ、S100タンパクファミリーなどのEFハンドモチーフ（カルシウム結合部位）を有するものと、アネキシンファミリーなどのEFハンドを持たないものとに大別できる。これらはそれぞれ異なったそれぞれに重要な生理的役割を担っていると推測されるが、その生理的役割は必ずしも明らかではない。
【０００３】
カルモジュリンは、カルシウムイオン依存的な細胞反応の多くを媒介し、細胞分裂に必要とされる一般的なCaBPである。これに対し、S100タンパクファミリーのCaBPは細胞周期特異的または、細胞種特異的に発現し、細胞分裂・分化の特定のシグナルの伝達に係わっていると推測されている。S100タンパクファミリーには、S100α、S100β、カルサイクリン、MRP8、MRP14などがあり、それぞれ２つのEFハンドモチーフを有する。
【０００４】
最近ウシ羊水中に多量のカルシウム結合活性を持つタンパクが存在することが見いだされた。これはS100タンパクファミリーに属する新規タンパクであることが明らかとなり、CAAF1 (Calcium binding protein in Amniotic Fluid 1）と名付けられた。
【０００５】
配列番号：２に示すウシカルシウム結合タンパクは、皮膚、角膜、および全身の扁平上皮粘膜の扁平上皮細胞、また好中球、マクロファージに発現し、細胞の分化、増殖に関連していると考えられている。また、上記ウシカルシウム結合タンパクに対する抗体を用いた免疫組織学的解析から、ヒトにおいても上記ウシカルシウム結合タンパクに相同なタンパクの存在が強く示唆されている。また癌（扁平上皮癌）、炎症性疾患等の病変部における、その発現様式の正常部位との差異から、診断薬としての有用性も示唆されている。
【０００６】
このようなことから、CaBPの存在、機能を調べることは細胞増殖、分化機構の解明に重要であり、それに関連した疾患の解明、診断及び治療に有用な知見を与えると期待される。特に、ヒトでの上記ウシカルシウム結合タンパクに相同なタンパクの存在、その発現様式、生理的役割等に強い関心が持たれている。
【発明の開示】
【０００７】
発明が解決しようとする課題
従って本発明は、新規カルシウム結合タンパク及びその製造方法、その製造のための遺伝子系、該タンパクに対する抗体、その利用方法等を提供しようとするものである。
課題を解決するための手段
【０００８】
本発明者らは、図２に示すウシのカルシウム結合タンパクをコードするcDNAによりヒトcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより新規cDNAをクローニングすることに成功した。さらにそのDNA配列を決定し、コードされるアミノ酸配列を推定した。このタンパクはこれまで知られていなかったS100タンパクファミリーに属する新規カルシウム結合タンパクであり、CAAF1と命名した。
【０００９】
従って本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含んで成るカルシウム結合タンパクを提供する。
本発明はまた、上記タンパクをコードするDNA、該DNAを含んで成る発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を提供する。
本発明はまた、ヒトの組織から抽出することによる、又は上記の宿主を用いる、前記カルシウム結合タンパクの製造方法を提供する。
本発明はさらに、前記カルシウム結合タンパクに対する抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体の製造方法を提供する。
本発明はさらに、前記抗体を含んで成る診断薬及び分析方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のカルシウム結合タンパクは配列番号：１に示すアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を含んで成る。実質的に同一とは、完全に同一であるか、又は１個もしくは少数個のアミノ酸において修飾されており、且つカルシウム結合活性を維持していることを意味する。ここで修飾とは、配列番号：１に示すアミノ酸配列に対してアミノ酸が欠失、付加もしくは他のアミノ酸による置換が行われているか、又はこれらの組合わせによりアミノ酸配列が変更されていることを意味する。
【００１１】
また少数個とは、例えば配列番号：１に示すアミノ酸配列の全アミノ酸数に対して10％程度以下、例えば10個以下、好ましくは５個以下を意味する。従って、本発明において配列番号：１に示すアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列には、１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されており、なおカルシウム結合活性をもたらすアミノ酸配列を包含する。
本発明はまた、上記のごとき種々のアミノ酸配列を有するカルシウム結合タンパクの断片をも含む。これらの断片は、それがカルシウム結合活性を有するか否かに拘らず、カルシウム結合タンパクに対する抗体の製造のための免疫原として有用である。
【００１２】
本発明はまた、上記のごときカルシウム結合タンパク又はその断片と、他のタンパクとの融合タンパクをも包含する。融合タンパクを構成するパートナーとなるタンパクとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、ｌａｃＺ等、任意のタンパクが挙げられる。このような融合タンパクは、本発明のカルシウム結合タンパク又はその断片を組換え技法により効率よく発現させるために有用である。
本発明は、上記カルシウム結合タンパクおよびその断片の誘導体に関する。
【００１３】
本明細書に含まれるカルシウム結合タンパクの誘導体は、グリコシル化変異体及び他の化学成分との共有又は凝集接合体を包含する。共有誘導体は該カルシウム結合タンパクのアミノ酸側鎖、Ｎ−又はＣ−末端の官能基を、当業界において良く知られている手段により結合することによって調製され得る。これらの誘導体は、カルボキシル末端又はカルボキシル基を含む残基の脂肪族エステル又はアミド、ヒドロキシル基を含む残基のＯ−アシル誘導体、及びアミノ末端又はアミノ基含有残基、たとえばリジン又はアルギニンのＮ−アシル誘導体を含有するが、但しこれだけには限定されない。アシル基はアルキル成分、たとえばC3〜C18の直鎖アルキルの基から選択され、それによって、アルカノイルアロイル種を形成する。
【００１４】
主要誘導体は、他のタンパク質とカルシウム結合タンパク質又はそのフラグメントとの共有接合体である。これらの誘導体は、組換え培養、たとえばＮ−、Ｃ−末端融合において、又は反応性側基をとおしてのタンパク質の架橋において有用な当業界において知られている物質の使用により合成され得る。架橋剤とのカルシウム結合タンパク質の好ましい反応部位は、遊離アミノ基、遊離カルボキシル基、炭水化物成分及びシステイン残基である。
【００１５】
本発明はまた、化学成分との共有又は凝集会合による誘導体の使用にも関する。本発明のカルシウム結合タンパクはまた、たとえば該カルシウム結合タンパク測定系に利用するため、たとえばクロラミンＴ方法により放射性ヨウ素化され、稀土類キレート等の蛍光成分、又は他の検出可能基に結合、ラベルされ得る。
本発明はさらに、前記のカルシウム結合タンパク質、その断片又はその融合蛋白質の製造方法をも提供する。
【００１６】
配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するカルシウム結合タンパクは、例えばヒトの組織から単離・精製することができる。単離・精製は既知の様々な精製法を組み合わせることにより、必要とされる純度に精製することができる。精製法には、例えば、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水性、等電点、免疫アフィニティー、キレートアフィニティー、逆相などの各クロマトグラフィー、塩析などの分別沈殿等が用いられる。他の方法も可能である。
【００１７】
充分な純度および量の該カルシウム結合タンパクを得た後、そのままプロテインシークエンサーにより、Ｎ末端からアミノ酸配列を決定することができる。Ｎ末端付近以外のアミノ酸配列は、たとえばまず適当なプロテアーゼ等により該カルシウム結合タンパクを分解し、分解産物である部分ペプチドを、逆相クロマトグラフィーなどの精製法により精製し、そのアミノ酸配列をＮ末端から同様に決定し、その配列を組み合わせることにより全体のアミノ酸配列を決定することができる。
【００１８】
このようにして全アミノ酸配列を決定することができるが、それは必ずしも必要ではない。たとえば下記に示す一般的方法にて、一部のアミノ酸配列から該カルシウム結合タンパクをコードするＤＮＡをクローニングしてその塩基配列を決定し、その配列から該カルシウム結合タンパクのアミノ酸配列を導き出すことも可能である。
【００１９】
本発明のカルシウム結合タンパク及びその断片はまた、常法に従って化学合成することもできる。それらの方法は、Janis D.Young, Solid Phase Peptide Synthesis. (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984); M.Bondanszky 及びA.Bondanszky. The Practice of Peptide Synthesis. (Springer-Verlag. New York. 1984)並びにM.Bondanszky. The Principles of Peptide Synthesis. (Springer-Verlag. New York. 1984)に記載されているような方法を包含する。それらの全てが本明細書中に参考として含まれる。
【００２０】
例えば、アジド法、酸クロリド法、酸無水物法、混合酸無水物法、活性エステル（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはシアノメチルエステル）法、カルボジイミダゾール法、酸化−還元法、またはDCC／添加剤法を使用することができる。固相及び溶液相合成の両方が前記方法に適用可能である。
【００２１】
カルシウム結合タンパク質は、ペプチド合成において典型的に使用されるような上記方法に従って、通常はアミノ酸を末端アミノ酸に１つずつ順番に縮合させることを含んで成るいわゆる段階法により、またはペプチド断片を末端アミノ酸にカップリングさせることにより、適当に調製される。正しくない位置におけるカップリングを防ぐために、カップリング反応で使われないアミノ基を保護しなければならない。
【００２２】
固相合成を採用する場合、Ｃ末端アミノ酸がそのカルボキシル基を通して不溶性担体または支持体に結合される。不溶性担体はそれが反応性カルボキシル基への結合能力を有する限り特に限定されない。そのような不溶性担体の例としては、ハロメチル樹脂、例えばクロロメチル樹脂またはブロモメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、tert−アルキルオキシカルボニルヒドラジド化樹脂等が挙げられる。
【００２３】
アミノ基が保護されたアミノ酸は、その活性化カルボキシル基と予め形成されたペプチド鎖の反応性アミノ基との縮合を介して順次結合され、段階的にペプチドが合成される。完全な配列が合成された後、不溶性担体からペプチドが切断され、ペプチドが得られる。この固相アプローチは、MerrifieldらによりJ.Am.Chem.Soc, 85:2149-2156 (1963)中に一般的に記載されている。この記載は参考として本明細書中に組み込まれる。
一般的なペプチド分離の手段、例えば抽出、沈殿、電気泳動および様々な形態のクロマトグラフィー等により、調製した該カルシウム結合タンパク又はその断片を反応混合物から単離精製することができる。
【００２４】
しかしながら、本発明のカルシウム結合タンパク、その断片又はその融合タンパクの好ましい製造方法は遺伝子工学的方法である。この方法においては、所望のタンパク又はポリペプチドをコードするDNAを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、該培養物から目的とするタンパク又はポリペプチドを採取する。このための宿主としては、原核細胞でも真核細胞でもよい。原核細胞は例えば細菌であり、これはグラム陽性菌でもグラム陰性菌でもよい。
【００２５】
グラム陰性菌の例としては大腸菌（Escherichia coli）が挙げられ、グラム陽性菌としては例えばバシルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バシルス・リウクエホルミス（Bacillus liqueformis）等、宿主として常用されているものを有利に用いることができる。原核性宿主としてはさらに、放細菌、例えばストレプトマイセス（Streptomyces）属微生物を用いることもできる。
【００２６】
真核性宿主としては、下等真核細胞でも高等真核細胞でもよい。下等真核細胞としては、例えば扱子菌、真菌等が挙げられる。真菌としては、単細胞真菌である酵母、又は糸状真菌が好ましい。酵母としては、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）等が挙げられ、糸状真菌としてアスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus orizae）等、さらにはペニシリウム（Penicillus）属糸状菌等が用いられる。
【００２７】
高等真核生物宿主としては、動物でも植物でもよい。動物性宿主としては昆虫又はその培養細胞、哺乳類又はその培養細胞等が挙げられる。昆虫としては典型的にはカイコ及びその培養細胞が使用され、哺乳類としては、マウス、ラット、ハムスター、ウシ、ブタ等又はその培養細胞、あるいはヒトの培養細胞が使用できる。動物細胞の具体例としては、例えばチャイニーズ・ハムスター・卵巣細胞（CHO）、HeLa細胞、小ラット腎臓細胞（BRK）、サル細胞（COS）等が挙げられる。
【００２８】
宿主が細胞である場合には、それを培養することにより、宿主が動・植物の場合にはそれらを飼育又は栽培することにより行われる。培養、飼育、栽培はすでに確立されている常法に従って行うことができる。培養物から、本発明のタンパクを単離・精製するには、タンパクの単離・精製に用いられる常法を用いればよく、例えばヒトの組織単離・精製する方法として前に列挙した単離操作を適宜組合わせて行うことができる。
【００２９】
本発明のカルシウム結合タンパク又はその断片は、それの所望の用途に依存して様々な純度において得ることができる。本明細書中に開示されるタンパク質精製技術を使って、または本明細書に記載される抗体による免疫アフィニティークロマトグラフィーにおいて精製を行うことができる。この免疫アフィニティークロマトグラフィーの概要は、本明細書中に示されている。
【００３０】
本発明は、例えば上記のタンパクの製造に使用するため、本発明のタンパクをコードする遺伝子、典型的にはDNAを提供する。このDNAは、典型的には配列番号：１に示す塩基配列を有するものが挙げられるが、それに限定されるものではなく、配列番号：１に記載するアミノ酸配列をコードするコドンの縮重に基づく種々の塩基配列を有するDNAも本発明に含まれる。さらに、上に記載した意味において、配列番号：１に記載するアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を含んで成るタンパクをコードするDNAも本発明に含まれる。さらには、前記のタンパク断片又は融合タンパクをコードするDNAも本発明に含まれる。
【００３１】
本発明はさらに、上記の種々のDNAとハイブリダイズすることができる程度に相同性を有し、なおカルシウム結合活性を有するタンパクをコードしているDNAをも包含する。ハイブリダイゼーション（あるいは相補的ＤＮＡ鎖の２本鎖形成過程であるリアソシエーション）に及ぼす因子は、温度、塩濃度、塩基対形成の誤り、DNA断片の長さ、多様性、などがある。また形成された２本鎖核酸の安定性は、融解温度（Tm、50％融解を起こす温度）で表わされるが、一般にプローブDNAが150塩基対以上の場合、最も高いハイブリダイゼーション速度が得られるTm−25℃の温度でハイブリダイゼーションを行うのが一般的である。
【００３２】
TmはプローブとDNAの塩基配列の相同性に影響をうけるが、ハイブリダイゼーションを行う温度として、通常68℃、50％ホルムアルデヒド存在下では42℃が用いられることが多い。この場合のハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、6ＸSSC、50％ホルムアミド、５Ｘデンハルツ溶液、20mM Tris-HCl、0.5％ SDS、100μg／ml変性サケ精子DNA、pH7.5溶液中、42℃、１昼夜が用いられる。相同性の程度は好ましくは60％以上、さらに好ましくは70％以上である。
【００３３】
上記のDNAを得るには、典型的には、ヒトの組織、例えばヒトの好中球又はケラチノサイトから作製したcDNAライブラリーを、ヒト該カルシウム結合タンパクをコードするcDNA又はその断片から調製したプローブによりスクリーニングすることにより得られる。こうして得られたDNAは、例えば配列番号：１に示す塩基配列を有する。
【００３４】
他の方法、たとえば該カルシウム結合タンパクから得られたアミノ酸配列を使ってPCRプライマーを推定し、RT-PCRによりDNAプローブを合成し、次いで該DNAプローブを用いて該カルシウム結合タンパクのcDNAを単離できる。幾つかの標準法はManiatisら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY) またはF. M. Ausubelら、Biology (Greene Publishing Associates. Brooklyn, NY)に記載されているかまたは参照されている。
【００３５】
cDNAが単離されれば、既知の方法によりその塩基配列を決定する事ができる。該塩基配列から、CAAF1の一次翻訳産物のアミノ酸配列、即ち、起こりうる翻訳後修飾前のアミノ酸配列が導き出される。
配列番号：１に示すアミノ酸配列と同一ではないが実質的に同じアミノ酸配列、すなわち、１〜少数個のアミノ酸の付加、欠失、置換等の修飾を有するアミノ酸配列をコードするDNAは、例えば配列番号：１に示す塩基配列を有するＤＮＡを鋳型として用い、変異原プライマーにより部位特定変異誘発を生じさせることにより作製することができる。
【００３６】
変異部位は予め決められているが、それは必要条件ではない。例えば、特定の残基位置における変異体の性質を最適化するために、標的コドンにおいてランダム突然変異誘発を行い、次いで発現されたCAAF1変異体を所望の性質についてスクリーニングすることができる。既知配列を有するDNA中の予め決められた部位に置換変異を作製する方法は当業界で公知であり、例えばM13プライマー突然変異誘発がある。
【００３７】
また、前記タンパクの断片をコードするDNAは、目的とする断片より長いタンパクをコードするＤＮＡを制限酵素で切断することにより、もしくはエキソヌクレアーゼにより任意の長さに短縮することにより、または、目的とする断片より長いタンパクをコードするDNAに翻訳開始コドン又は翻訳終止コドンを導入することにより作製することができる。
【００３８】
あるいは、本発明のDNAは、常法により、例えば固相合成法、例えばホスホアミダイト法、等により化学合成することもできる。
融合タンパクをコードするDNAは、本発明のカルシウム結合タンパク又はその断片をコードするDNAと、融合タンパクを構成するパートナータンパクをコードするDNAとを連結することにより作製される。
【００３９】
本発明の目的上、DNA配列は互いに機能的に関連する時それらは作用可能に連結される。例えば、ポリペプチドがプレタンパク質として発現されるかまたは膜への該ポリペプチドの局在化もしくは該ポリペプチド分泌に関係するならば、プレ配列または分泌リーダーのDNA該ポリペプチドに作用可能に連結される。ポリペプチドの転写を調節する場合、プロモーターがコード配列に作用可能に連結される。翻訳を可能にするようにコード配列が置かれる場合、リボゾーム結合部位がコード配列に作用可能に連結される。一般に、作用可能に連結されるとは、連続しており且つ読み枠内であることを意味する。しかしながら、或は遺伝的要素例えばリプレッサー遺伝子は連続的には連結されないが、発現を調節するオペレーター配列に結合している。
【００４０】
本発明は、該カルシウム結合タンパクまたはその断片をコードするDNAを発現するベクターを提供する。
発現ベクターは、通常は適当な宿主細胞中で認識される適当な遺伝的調節要素に、作用可能に連結された目的遺伝子を含有する自己複製性DNAまたはRNA構成物である。それらの調節要素は適当な宿主内での発現に作用することができる。発現に必要な調節要素の特定の型は、使用する最後の宿主細胞に依存するだろう。
【００４１】
一般に、遺伝子調節要素は原核プロモーター系または真核プロモーター発現調節系であることができ、そのようなものとしては、転写プロモーター、転写の開始を調節する任意のオペレーター、ｍＲＮＡ発現レベルを高める転写エンハンサー、適当なリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写および翻訳を終結させる配列が挙げられる。発現ベクターは通常該ベクターを宿主細胞と独立に複製させる複製開始点も含む。
【００４２】
本発明のベクターは、本発明のタンパクをコードするDNAを含む。該DNAはウイルス性プロモーターの調節下にあることができ、そして選択マーカーをコードすることができる。本発明は、原核または真核宿主中で、本発明のタンパクをコードするDNAを発現することができる発現ベクターの利用も包含する。個々で、該ベクターは宿主と適合性であり、本発明のタンパクをコードするDNAは、該ベクターを含む宿主に発現されるようにベクター中に挿入される。
【００４３】
一般に発現ベクターは、それらの宿主細胞中で安定な発現のため、または細胞あたりの所望の遺伝子のコピー数を大きく増やす増幅のためにデザインされる。しかしながら、常に発現ベクターが宿主細胞中で増殖することを要求する必要はない。宿主細胞により認識される複製開始点を含まないベクターを使って様々な宿主中で本発明のタンパクの一時的発現を行うことが可能である。組み換えによって宿主ＤＮＡ中への本発明のタンパクをコードするＤＮＡの組み込みを引き起こすベクターを用いることも可能である。
【００４４】
ベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み可能なDNA断片、および宿主のゲノム中へのDNAの組み込みが可能である他のビヒクルを含んで成る。発現ベクターは、作用可能に連結された遺伝子の発現を行う遺伝的調節配列を含む特殊化されたベクターである。プラスミドが最もよく使われているベクターの形態であるが、同等な機能を供給しそして当業界で既知であるかまたは既知になる他のあらゆる形態のベクターも本明細書中での使用に適当である。
【００４５】
適当な宿主としては、前記のごとく、原核生物、下等真核生物および酵母または高等真核生物が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性およびグラム陽性生物、例えば大腸菌（E. coli）およびＢ．サブチルス（B. subtilis）が挙げられる。下等真核生物としては、酵母、例えばＳ．セレビシェー（S. cerevisiae）およびピチア（Pichia）並びにタマホコリカビ（Dictyostelium）といった種が挙げられる。高等真核生物としては、昆虫細胞のような非哺乳類起源と、ヒト、霊長類およびげっ歯類のような哺乳類起源の両方の動物細胞からの確立された組織培養細胞系が挙げられる。
【００４６】
原核宿主−ベクター系は、多数の様々な種のための広範なベクターを含む。本明細書で使用する時、大腸菌とそのベクターなる語は、他の原核生物用の同等なベクターを包含するように包括的に用いられるだろう。DNAを増幅させるための代表的なベクターはpBR322または任意のその誘導体である。カルシウム結合タンパク質またはその断片を発現させるのに使われるベクターとしては、lacプロモーターを含むもの（pUCシリーズ）；trpプロモーターを含むもの（pBR322-trp）；Ippプロモーターを含むもの（pINシリーズ）：λ-pPまたはpRプロモーターを含むもの（pOTS）；またはptacといったハイブリッドプロモーターを含むもの（pDR540）といったベクターが挙げられるがそれに限定されない。Brosiusら、 "Expression Vector Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses (Raymond L.RodriguezおよびDavid T.Denhardt編）中、Buttersworth. Boston. 1988. 10章、205-236 を参照のこと。
【００４７】
酵母およびタマホコリカビ（Dictyostelium）といった下等真核生物を、本発明のタンパクコード配列含有ベクターを使って形質転換することができる。本発明の目的上、多数の他の株および種も利用できるけれども、最もよく使われる下等真核宿主はパン酵母のサッカロミセス・セレビシェー（Saccharomycec cervisiae）であり、それは下等真核生物を包括的に表わすのに用いられるだろう。酵母ベクターは、複製開始点（組み込み型のものでない限り）、選択遺伝子、プロモーター、本発明のタンパクをコードするDNA、翻訳終結、ポリアデニル化および転写終結のための配列から成る。
【００４８】
適当な酵母用発現ベクターは、３−ホスホグリセレートキナーゼのような構成的プロモーターおよび種々の他の解糖酵素遺伝子プロモーターまたはアルコールデヒドロゲナーゼ２プロモーターもしくはメタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモーターを含む。適当なベクターは、次の型の誘導体を含む：自己複製性低コピー数型（例えばYRpシリーズ）：組み込み型（例えばYIpシリーズ）、またはミニクロモソーム型（例えばYCpシリーズ）。
【００４９】
高等真核生物組織培養細胞は、機能的に活性な該カルシウム結合タンパクの発現に好ましい宿主細胞である。理論的には、無脊椎動物源からであろうと任意の真核生物組織培養細胞系が利用できる。しかしながら哺乳類細胞が好ましい。そのような細胞の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は日常的技術となっている。有用な細胞系の例としては、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系、子ラット腎臓（BRK）細胞系、昆虫細胞系およびサル（COS）細胞系が挙げられる。
【００５０】
そのような細胞系のための発現ベクターは、通常、複製開始点、プロモーター、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムDNAを使用する場合）、ポリアデニル化部位および転写終結部位を含む。それらのベクターは通常は選択遺伝子または増幅遺伝子も含有する。適当な発現ベクターは、アデノウイルス、SV40、パルボウイルス、ワクシニアウイルスまたはシトメガロウイルスのように起源に由来するプロモーターを担持しているプラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスであることができる。
【００５１】
適当な発現ベクターの代表例としては、pCDNA1；pCD (Okayamaら、Mol. Cell Biol.5:1136-1142. 1985):pMClneo Poly A（Thomasら、Cell 51:503-512. 1987)：およびpAC373またはpAC610といったバキュロウイルスベクターが挙げられる。
本発明は、カルシウム結合タンパク質またはその断片をコードするDNAを含むベクターにより、形質転換された細胞を提供する。
【００５２】
形質転換された細胞は、組み換えDNA技術を使って作製された該カルシウム結合タンパク発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクトされている細胞である。形質転換された宿主細胞はカルシウム結合タンパク質またはその断片を発現するが、そのDNAのクローニング、増幅および操作の目的ではカルシウム結合タンパクを発現する必要はない。
本発明のタンパク及びそれをコードするDNAは、種々の用途を有する。すなわちDNAは、それがコードしているタンパクの製造のために使用されるほか、関連のもしくは相同のカルシウム結合タンパクをコードする遺伝子、カルシウム結合タンパクサブタイプをコードする遺伝子および異なる種の該カルシウム結合タンパクをコードする遺伝子を検出又は同定するのに特に有用である。
【００５３】
本発明はまた、該カルシウム結合タンパクの存在を検出又は定量するための種々の測定系及び診断薬における、該カルシウム結合タンパク、その断片、ペプチド及びそれらの融合生成物の使用にも関する。
本発明のカルシウム結合タンパク又はその断片は、上記測定系における、標準物質としても利用可能である。
【００５４】
本発明のカルシウム結合タンパク質およびその断片は、該カルシウム結合タンパク又はその断片に特異的な抗血清又は抗体産生のための免疫原として使用され得る。精製された該カルシウム結合タンパクは、純度の高くない該カルシウム結合タンパク調製物の免疫により調製されるモノクローナル抗体をスクリーニングするためにも使用され得る。さらに、該カルシウム結合タンパク断片はまた、本発明の抗体を産生するための免疫原としても利用することができる。
【００５５】
本発明は、該カルシウム結合タンパクと親和性を有する抗体を提供する。たとえば、本発明は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を持つカルシウム結合タンパクへの親和性を有する、又はそれに対して作製された抗体、およびその抗体のフラグメントに関する。抗体は、その天然に存在する型及びその組換え体型の該カルシウム結合タンパク及びその断片に対し、作製することができる。
本発明のカルシウム結合タンパクの断片に対する抗体は、免疫原性タンパク質と該断片との接合体により動物を免疫する事により作製することができる。モノクローナル抗体は、所望する抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、カルシウム結合タンパク質に対する結合についてスクリーンされ得る。
【００５６】
本発明のカルシウム結合タンパク及びその断片は、免疫原として使用されるべきポリペプチドに融合、または共有結合して、免疫する事ができる。カルシウム結合タンパク質及びそのフラグメントは、種々の免疫原、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風トキソイド等に融合、又は共有結合して免疫する事ができる。免疫する動物は、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ニワトリ、モルモット、ラット、マウス等、免疫し目的の抗体を得る事ができる動物であればその種を選ばない。
【００５７】
ポリクローナル抗血清を調製するための方法の説明には、たとえば、Microbiology, Hoeber Medical Division (Harper and Row. 1969), Landsteiner, Specificity of Serological Reactions (Dover Publications. New York. 1962)及びＷｉｌｌｉａｍｓなど、Methods in Immunology and Immunochemistry 、第１巻（Academic. Press. New York. 1967)（これらすべては、引用により本発明書に組込まれる）を参照のこと。典型的な方法は、抗原による動物の過剰免疫を包含する。
【００５８】
本発明のポリクローナル抗体は、常法に従って得ることができる。ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ニワトリ、モルモット等の動物に上記抗原ペプチドを単独で、あるいはアジュバントと混合して定期的に免疫する。望ましくは３回以上の免疫の後、免疫した動物の血液、卵等を採取し、ポリクローナル抗体を回収することができる。
本発明はまた、該カルシウム結合タンパクと結合性を有するモノクローナル抗体を提供する。本発明はさらに、前記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
【００５９】
多くの場合、種々の哺乳類宿主、たとえばマウス、ラットなどのゲッ歯類、霊長類、ヒト等からモノクローナル抗体を調製することが所望される。そのようなモノクローナル抗体を調整するための技法の説明は、Ｓｔｉｔｅｓなど、Basic and Clinical Immunology. (Lang Medical Publications. Los Altos. CA. 第４版）及びこの中の引例、及び特に、Kohler and Milstein. Nature 256:495 〜497 (1975)（モノクローナル抗体の１つの作製方法を論じる）に見出され得る。
【００６０】
簡単に要約すれば、マウス、ラット等に上記抗原を単独で、あるいはアジュバントと混合して定期的に免疫する。望ましくは３回以上の免疫の後、例えば脾臓、リンパ節を摘出し、そのＢ細胞を適当な骨髄腫細胞と細胞融合させる。その融合細胞は、インビトロで培養できる「ハイブリドーマ」である。得られたハイブリドーマ細胞を、例えば10％ウシ胎児血清を含むHAT-RPMI1640培地等の適当な培養液中で培養する。
【００６１】
培養上清中に産生された抗体を例えばRIA，ELISA等で検出することにより、カルシウム結合タンパク質に対し特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を選択し、クローン化する。各クローンは、免疫原に対する１つの抗体種を分泌する。得られる個々の抗体種は、免疫原性物質上に認識される特異的部位（エピトープ）に応答して生成される、免疫動物からの単一のＢ細胞の生成物である。
CAAF1と反応するモノクローナル抗体は、例えばマウスまたはラット腹腔にハイブリドーマ細胞を移植し、得られた腹水から回収することができる。また、ハイブリドーマ細胞の培養上清から回収することもできる。
【００６２】
回収したモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、硫安沈殿、クロマトグラフィーなどの公知の方法により分離精製することができる。
本発明の抗体はまた、アフィニティークロマトグラフィーのために使用され得る。このアフィニティークロマトグラフィーは、該カルシウム結合タンパクの精製に用いることができる。抗体が固体支持体、たとえば粒子、たとえばアガロース、セファロース又は同様のものに結合されているカラムを調製し、ここで該カルシウム結合タンパクを含む試料をカラムに通し、カラムが洗浄され、続いて弱い変性剤を流すことにより、精製された該カルシウム結合タンパクが溶出される。
【００６３】
本発明はまた、前記抗体を含んで成る、該カルシウム結合タンパクの測定方法およびその断片の検出法および測定方法を提供する。
該カルシウム結合タンパクの検出系、測定系は、均質（遊離試薬と該カルシウム結合タンパク−抗体複合体との間で分離段階を含まない）又は不均質（分離段階を含む）であり得る。
【００６４】
該カルシウム結合タンパクの検出系、測定系は典型的には、該カルシウム結合タンパクに結合親和性を有する標識された抗体、カルシウム結合タンパク質の源（天然に存在するもの又は組換えのもの）及びラベルされた遊離化合物から結合体を分離するための手段、たとえば該カルシウム結合タンパクを固定するための固相化した該カルシウム結合タンパクに結合親和性を有する抗体を含んで成る。
【００６５】
これらの測定系において、抗体、又は該カルシウム結合タンパクおよびその断片を、共有結合又は非共有結合により直接的又は間接的に標識することによって、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に得ることができる。直接的な標識には、たとえば放射性ラベル、たとえば 125I、酵素（アメリカ特許第３,645,090号）、たとえばペルオキシダーゼ及びアルカリフォスファターゼ、及び蛍光ラベル（アメリカ特許第3,940,475号）などがある。また、たとえばビオチニル化と、ビオチンへの上記標識群の１つで標識したアビジン、ストレプトアビジンの結合を包含する。たとえば、標識されていない抗体は、その抗体を認識する標識された第２抗体を用いることによって使用され得る。
【００６６】
得られた該カルシウム結合タンパクに対する抗体を用い、放射免疫測定法（RIA）、酵素免疫測定法（EIA）、蛍光免疫測定法（FIA）、などの公知の免疫測定法を構築することにより、該カルシウム結合タンパクまたはその断片を検出又は測定することができる。
公知の免疫測定法の一つの例として、いわゆる競合免疫測定法の応用が考えられる。例えば、検体に放射性同位元素等で標識した該カルシウム結合タンパクを一定量混合し、さらに抗該カルシウム結合タンパク抗体を混合し検体中の該カルシウム結合タンパクおよび標識該カルシウム結合タンパクと反応させる。
【００６７】
検体中の該カルシウム結合タンパクは、標識該カルシウム結合タンパクと競合して抗該カルシウム結合タンパク抗体と反応するため、検体中に該カルシウム結合タンパクが存在する分、標識該カルシウム結合タンパクとの反応が減少する。反応後、抗該カルシウム結合タンパク抗体をあらかじめ固相担体に結合させておくか、抗イムノグロブリン抗体、プロテインＡと抗該カルシウム結合タンパク抗体を反応させること等により、結合、非結合標識該カルシウム結合タンパクを分離する。一般に用いられる方法により結合していない分画を除き、結合した放射性同位元素等の標識を検出する事により該カルシウム結合タンパクを測定することが可能となる。
【００６８】
公知の免疫測定法のもう一つの例として、いわゆる２抗体サンドイッチ系の応用が考えられる。例えば、抗該カルシウム結合タンパク抗体をマイクロタイタープレート、ビーズ、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の免疫測定法に一般に用いられる固相担体に結合させ、これを検体と接触させる事により、検体中の該カルシウム結合タンパクを固相担体上にある抗該カルシウム結合タンパク抗体と反応させる。
【００６９】
一般に用いられる方法により結合していない分画を洗い、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオチン等で標識した抗該カルシウム結合タンパク抗体と接触させ、担体上にある抗該カルシウム結合タンパク抗体と結合した該カルシウム結合タンパクと反応させる。一般に用いられる方法により結合していない分画を洗い、標識されている放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオチン等を検出する事により該カルシウム結合タンパクを測定することが可能となる。
【００７０】
この測定系に用いる抗該カルシウム結合タンパク抗体、標識抗カルシウム結合タンパク質抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはその組み合わせ何れを用いる事も可能である。ここで肝要なことは、担体に結合する抗体と該カルシウム結合タンパクとの複合体が標識抗体と結合できるよう、抗体を組み合わせることであり、このような抗体の組み合わせは、前述の系を組み立て、その系に適用してみることにより選択することができる。
【００７１】
また免疫組織染色により、組織中のカルシウム結合タンパク質またはその断片を検出することができ、さらにその、組織および細胞内での局在様式を知ることができる。免疫組織染色に用いる抗体の標識の例としては、光学顕微鏡用には蛍光色素と酵素、電子顕微鏡用にはフェリチンと金コロイドなどがある。免疫組織染色のためには、例えば典型的には組織切片または細胞をアルコール、アセトン、パラホルムアルデヒドなどの適当な固定剤により固定し、抗カルシウム結合タンパク質抗体をこれに反応させる。
【００７２】
洗浄後、直接標識の場合はそのまま、間接標識の場合はさらに標識体と反応させ洗浄した後、蛍光標識の場合は蛍光顕微鏡により、酵素標識の場合は適当な基質との反応後光学顕微鏡により、金属粒子標識の場合は電子顕微鏡により標識の検出を行う。
これらの免疫測定法は、文献においても集約的に論ぜられて来た。
本発明の抗体はまた、診断のためにも有用である。
【００７３】
上記免疫組織染色や免疫測定法によって得られた結果から、カルシウム結合タンパク質の組織内および細胞内における存在様式、局在様式を知ることができる。それによりカルシウム結合タンパク質の生理的役割に関する知見が得られると共に、各種疾患との関連性も明らかにできる。疾患との関連は、その疾患における診断薬としての有用性を示唆するものである。
【００７４】
例えば、癌細胞特異的に存在する抗原であれば、癌マーカーとして診断に有用であり得る。また、例えば、好中球などの炎症に関与する細胞群に多量に存在する抗原であれば、それは炎症の進行と共に血中に漏れ出し、その血中濃度が炎症マーカーとして診断に有用であり得る。また、例えば、ある皮膚疾患に関連して、異常発現する抗原であればその疾患のマーカーになり得る。
【００７５】
従って、上記該カルシウム結合タンパク又はその断片の測定系を診断薬として用いることにより、炎症性疾患マーカーとして、腫瘍性疾患（特に皮膚、口腔、食道、呼吸器、子宮頚部等の扁平上皮癌）マーカーとして、皮膚疾患マーカーとして、あるいは血液疾患マーカーとして検診時等での患者のスクリーニング、疾患の性質の特定、および治療時の治療効果モニタリング等に有用な情報が得られる。
測定対照は例えば、患者の血液、唾液等の体液、尿、便等の排出物、採取した組織、細胞などである。
【実施例】
【００７６】
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１．プローブの調製
ウシCAAF1のDNA配列から、種間でよく保存されていると予測されるＥＦハンドモチーフ領域の配列を選び、PCRプライマーとして下記のprimer、BP7/242-261（sense primer:）とBP7/408-389（antisense primer）を合成した。
【００７７】
BP7 ／242 −261 ：５′−ATCATCAACATCTTCCACCA−３′  （配列番号：３）
BP7 ／408 −389 ：５′−TCTTTATCGGCATCCAGGTC−３′（配列番号：４）
このプライマーを用いて、ヒト末梢血好中球及びヒト培養表皮細胞（クラボウ）（血清添加後４８時間培養）より抽出分離したPoly A RNA 50ngより、RNA PCR Kit（宝酒造）を用い、RT-PCRを行った。Poly A RNAを逆転写後、cDNA溶液10μlに各プライマー３μｌ（10pmole ／μl）ずつを加え、10×PCRバッファー（100mM Tris-HCl(pH8.3），500mM KCl，15mM MgCl2，0.01％ゼラチン）10μl，2mM dNTP 10μl，Taq DNA Polymerase 0.5μl（5U/μl：宝酒造）に滅菌蒸留水を加え100μlにした。PCR反応はDNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer/Cetus）を用い、94℃１分、48℃２分、72℃２分の反応を35サイクル行った。
【００７８】
いずれのサンプルからも予測された約170bpのPCR産物が増幅された。ヒト末梢血好中球由来のDNA断片をMarmade Gene Cleanキット（Bio 101）を用いて、４％のアガロースゲル（FMC Bioproducts：NuSieve GTG3:1）で電気泳動後、精製し、10μlのTE溶液（10mM Tris-HCl(pH7.5）、１mM EDTA）に回収した。
【００７９】
このDNA断片溶液5μlを、pMOSBlue T-vector kit（アマシャム）を用いて、pMOSBlueベクターにライゲーションし、このベクター液５μｌにより、大腸菌JM109（東洋紡）をHanahanの方法(DNA cloning：A practical approach(ed.D.M.Glover), vol.1, p109-, IRC press,(1985))に従って形質転換させた。X-galを含むL-ampプレートに蒔き、白色のコロニーを選択する事により、アンピシリン耐性でβガラクトシダーゼ欠損のコロニーを選択した。
【００８０】
選択したクローンを、2×YT-amp培地（1.6％バクト−トリプトン、１％酵母エキス、0.5% NaCl、100μg/mlアンピシリン）で培養し、Wizard Prep DNA miniprep kit（Promega）を用いてメーカーの推奨する方法に従ってプラスミドDNAを精製した。調製したDNAを、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア）を用いて、メーカーの推奨する条件に従って反応させ、A.L.F.II DNA Sequencer（ファルマシア）により塩基配列を決定した。この配列はウシCAAF1の塩基配列と約80％の相同性を持つことを確認した。
【００８１】
さらに、得られた塩基配列の検証を目的に下記のプライマーPMN.HP7S 1-15，PMN.HP7A 126-112を合成し、前述のPoly A RNAからRT-PCRを、RNA PCR Kit（宝酒造）を用い同様の方法で、94℃１分、50℃１分、72℃２分の反応条件のもと35サイクル行った。
PMN.HP7S 1−15：５′−TACTCAGTTCGGAAG −３′    （配列番号：５）
PMN.HP7A 126− 112：５′−TTGGAATATTTCATC −３′（配列番号：６）
【００８２】
いずれのサンプルからも予測された約130bpのPCR産物が増幅された。ヒト末梢血好中球由来のDNA断片をMarmade Gene Cleanキット（Bio 101）を用いて、４％のアガロースゲル（FMC Bioproducts：NuSieve GTG 3:1）で電気泳動後、精製し、このDNA断片をTA Cloning kit（Invitrogen）を用いて、PCRIIベクターにライゲーションした。このベクター液5μlにより、大腸菌JM109（東洋紡）をHanahanの方法(DNA Cloning：A practical approach(ed.D.M.Glover), vol.1, p109-, IRCpress, (1985))に従って形質転換させ、X-galを含むL-ampプレートに蒔き、白色のコロニーを選択する事により、アンピシリン耐性でβガラクトシダーゼ欠損のコロニーを選択した。
【００８３】
選択したクローンpHP7/PMNを、2×YT-amp培地（1.6％バクト−トリプトン、１％酵母エキス、0.5% NaCl、100μg/mlアンピシリン）で培養し、Wizard Prep DNA miniprep kit（Promega）を用いてメーカーの推奨する方法に従ってDNAを精製した。調製したDNAを、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア）を用いて、メーカーの推奨する条件に従って反応させ、A.L.F.II DNA Sequencer（ファルマシア）により塩基配列を決定した。この配列はウシCAAF1の塩基配列と約80％の相同性を有し、前述の塩基配列とその重複部分が完全に一致した。
【００８４】
得られたクローンpHP7/PMNのDNA2μgを、EcoRI（20U/μl：宝酒造）により37℃で１時間反応させて切断した。このDNA断片全量を４％のアガロースゲル（FMC Bioproducts:NuSieve GTG 3:1）で電気泳動し、約130bpのDNA断片をゲルから切り出した。このDNA断片をGene Cleanキット（Bio 101）を用いて精製し、10μlのTE溶液（10mM Tris-HCl（pH 7.5）、１mM EDTA）に回収した。
【００８５】
このDNA断片溶液3μl（約25ng）を鋳型DNAとして、メガプライムDNA標識システム（アマシャム）を用い、メーカーの推奨する方法に従って、〔α-32P〕dCTP（アマシャム）で標識した。標識終了後、Nick column（ファルマシア）を用いて標識DNAを精製した。これを32P標識プローブとして、ヒトCAAF1 cDNAの単離に用いた。
【００８６】
実施例２．ヒトCAAF1 cDNAの単離と塩基配列決定
ヒト成人食道組織0.5gから、Isogen（日本ジーン）を用いてRNAを抽出し、トータルRNA約1.5mgを得た。このトータルRNAより、Oligotex-dT30＜Super＞（日本ロシュ）を用いメーカーの推奨する方法に従ってPoly A RNAを調製し、約50μgのPoly A RNAを得た。
【００８７】
このPoly A RNA 5μgより、TimeSaver cDNA Synthesis Kit（ファルマシア）を用いて、メーカーの推奨する方法に従いcDNAを合成した。プライマーには、NotI/Oligo(dT)18 primer(Directional Cloning Toolbox、ファルマシア）を用いた。合成したcDNAの両端にEcoRＩアダプターを結合させ燐酸化処理をし、さらにNotＩを加えて消化した後、脱燐酸化処理をしたλExCell(λExCell NotI/EcoRI/CIP、ファルマシア）に組み込んだ。
【００８８】
次に、Gigapack III Gold Kit（Stratagene）を用いメーカーの推奨する方法に従って、in vitroパッケージング反応を行った。反応終了後、パッケージング反応液の一部をマルトース添加ＮＺＹ培地（10g/l NZ amine，5g/l Yeast extract，5g/l NaCl，2g/l MgSO4・7H2O）で培養し、10mM MgSO4 にOD600＝2.0となるように再懸濁させた大腸菌NM522株に感染させた。その結果パッケージング反応液中には1.0×106 pfu ／mlの感染能力のあるファージが存在した。
【００８９】
作成したヒト成人食道由来cDNAライブラリーを、大腸菌NM522株に感染させ、90mmディシュあたり１×104 プラークとなるように蒔いた。この90mmディシュを20枚作成し、約2.0×105 のプラークを形成させた。形成したプラークをHybond-N+ 膜（アマシャム）に転写し、膜を0.5M NaOH、0.5M NaCl溶液で２分、0.5M Tris-HCl（pH7.5）、0.5M NaCl溶液で５分処理し、さらに0.1×SSC、0.1 M酢酸アンモニウムでよく洗浄後、濾紙上で風乾させた。
【００９０】
プラークDNAの結合した膜面をUV処理し、DNAを膜にクロスリンキングさせた。この膜を、プレハイブリダイゼーション溶液（６×NET、0.2×Blotto、50％ホルムアミド、0.5％SDS、200μg/ml変成サケ精子DNA）中で、42℃２時間保温し、ブロッキングした。プレハイブリダイゼーション溶液を捨て、新しいハイブリダイゼーション溶液（５×NET、0.1×Blotto、30％ホルムアミド、0.4％SDS、10％デキストラン硫酸、200μg/ml変成サケ精子DNA）に、96℃５分処理後の急冷により１本鎖に変成させた32P標識プローブを加え、膜を浸し、42℃で１晩保温し、ハイブリダイズさせた。
【００９１】
膜を２×SSC、0.5％SDS溶液で室温15分、同じ組成の溶液で50℃15分、続いて0.5×SSC、0.1％SDS溶液で50℃15分、さらに同じ組成の溶液で50℃15分、洗浄した。これを露光フィルムとカセットに入れ、−80℃で１昼夜露光させ、現像した。
ハイブリダイズシグナルが検出された領域のプラークを回収し、さらに同様の方法でプラークを形成させ、プラークの単離を行った。このようにして目的のDNA断片を含む１個のファージクローンλExCell/HP7/ESO310を得た。
【００９２】
ファージクローンλExCell/HP7/ESO310を大腸菌NP66株に感染させることより、λExCell/HP7/ESO310からファージミドpExCell/HP7/ESO310をin vivoで放出させ、Wizard Prep DNA miniprep kit（Promega）を用いて分離回収した。次に精製したpExCell/HP7/ESO310を大腸菌JM109（東洋紡）に感染させ形質転換させた。X-galを含むL-ampプレートに蒔き、白色のコロニーを選択する事により、アンピシリン耐性でβガラクトシダーゼ欠損のコロニーを選択した。
【００９３】
選択したコロニーをヘルパーファージVCSM-13（Stratagene）と共に2×YT-amp培地（1.6％バクト−トリプトン、１％酵母エキス、0.5％NaCl、アンピシリン100μg/ml、カナマイシン40μg/ml）で培養し、Wizard M13 DNA miniprep kit（Promega）を用いて、メーカーの推奨する方法に従って一本鎖ＤＮＡを分離精製した。
【００９４】
pExCell/HP7/ESO310の一本鎖DNA 2μgを、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア）を用いて、メーカーの推奨する条件に従って反応させ、A.L.F.II DNA Sequencer（ファルマシア）により塩基配列を決定した。この配列はウシCAAF1の塩基配列と73％の相同性を有し、前述のpHP7/PMNの塩基配列とその重複部分が完全に一致した。
【００９５】
さらに、得られた塩基配列の検証を目的に下記のプライマーを合成し、ヒト成人食道由来のPoly A RNA 100ngより、RT-PCRを行った。第１鎖cDNAは、Ready-to-GO T-Primed First-Strand Kit（ファルマシア）を用いて、メーカーの推奨する方法に従い合成した。PCRは94℃１分、60℃１分、72℃１分の反応条件のもと３５サイクル行った。
HP7S 7−26：５′−ACATTAGGCTGGGAAGATGA−３′  （配列番号：７）
HP7A 336−317 ：５′−GGACATTGCTGGGTAAAAAG−３′（配列番号：８）
【００９６】
その結果、予測された330bpのPCR産物が増幅され、４％のアガロースゲル（FMC Bioproducts:NuSieve GTG 3:1）で電気泳動後、精製し、このDNA断片を、制限酵素SmaＩで消化したPCRScriptベクター（Stratagene）に組み込んだ。このベクターpHP7/ESOにより、大腸菌JM109（東洋紡）を形質転換させ、X-galを含むL-ampプレートに蒔き、白色のコロニーを選択する事により、アンピシリン耐性でβガラクトシダーゼ欠損のコロニーを選択した。
【００９７】
選択したクローンを、ヘルパーファージVCSM-13（Stratagene）と共に2×YT-amp培地（1.6％バクト−トリプトン、１％酵母エキス、0.5％ NaCl、アンピシリン100μg/ml、カナマイシン40μg/ml）で培養し、Wizard M13 DNA miniprep kit（Promega）を用いてメーカーの推奨する方法に従って一本鎖DNAを分離精製した。
【００９８】
pHP7/ESOの一本鎖DNA 2μgを、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア）を用いて、メーカーの推奨する条件に従って反応させ、A.L.F.II DNA Sequencer（ファルマシア）により塩基配列を決定した。この配列は前述のpExCell/HP7/ESO310の塩基配列とその重複部分が完全に一致した。
一方、ヒト好中球由来のPoly A RNAを用いて、同様にRT-PCRを行い、塩基配列を決定し、pExCell/HP7/ESO310の塩基配列の確認を行った。
【００９９】
ヒト成人好中球由来のPoly A RNA 100ngから、TaKaRa RNA PCR Kit（宝酒造）を用いて、メーカーの推奨する方法に従い、第１鎖cDNAを合成した。PCRは、プライマーに上記のHP7S 7-26，HP7A 336-317を用い、94℃１分、58℃１分、72℃２分の反応条件のもと35サイクル行った。
【０１００】
その結果、予測された330bpのPCR産物が増幅された。この一部を、４％のアガロースゲル（FMCBioproducts:NuSieve GTG Agarose）で電気泳動し、DNA断片をゲルから回収精製した。このDNA断片を、TA Cloning Kit（Invitrogen）を用い、メーカーの推奨する方法に従って、pCRIIベクター（Stratagene）に組み込み、大腸菌JM109（東洋紡）を形質転換させた。これをX-galを含むL-ampプレートに蒔き、白色のコロニーを選択する事により、アンピシリン耐性でβガラクトシダーゼ欠損のコロニーを選択した。
【０１０１】
選択したコロニーを、2xYT-amp培地（1.6％バクト−トリプトン、１％酵母エキス、0.5％NaCl、アンピシリン100μg/ml、カナマイシン40μg/ml）で培養し、Wizard Minipreps DNA Purification System（Promega）を用いて、メーカーの推奨する方法に従いDNAを調製した。このプラスミドDNAを、pHP7/NEUと名付けた。
【０１０２】
pHP7/NEU DNA 10μgを、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア）を用いて、メーカーの推奨する条件に従って反応させ、A.L.F.II DNA Sequencer（ファルマシア）によりベクターに組み込まれたDNAの塩基配列を決定した。この配列は前述のpExCell/HP7/ESO310の塩基配列とその重複部分が完全に一致した。
【０１０３】
また、ヒトケラチノサイトについても同様にRT-PCRを行い、増幅物の塩基配列を決定したところ、pExCell/HP7/ESO310の塩基配列とその重複部分が完全に一致した。
決定された全塩基配列を、図１に示す。
この塩基配列から、ヒトCAAF1の一次翻訳産物のアミノ酸配列、即ち、起こりうる翻訳後修飾前のアミノ酸配列が導き出される。
【配列表】
2009040791000001.app