(57)【要約】【課題】標的分子の活性部位またはクレフトと相互作用する能力を有する認識分子を見出すこと。【解決手段】該認識分子は、基本認識ユニットから突出したループ構造をもつ。該ループ構造はたとえば、標的分子の活性部位またはクレフトに対する結合特異性をもつ、ラクダ科の動物の重鎖抗体のＣＤＲ３またはそのようなＣＤＲ３の誘導バージョンである。基本認識ユニットは、たとえば、標的分子に対する結合親和性をもつ抗体型構造によって形成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクダ科重鎖抗体由来のＶＨＨドメインまたは従来の抗体由来のラクダ化ＶＨドメインを含む認識分子の使用であって、生物学的に活性な標的分子の生物学的機能を中和することにおいて、該認識分子が該標的分子の活性部位の残基を認識し、相互作用する使用。
【請求項２】
該標的分子がウイルスまたは細菌特異的タンパク質である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ラクダ科重鎖抗体由来のＶＨＨドメインまたは従来の抗体由来のラクダ化ＶＨドメインを含む認識分子の使用であって、酵素の活性を阻害することにおいて、該酵素の触媒的活性部位の一部であるアミノ酸残基を認識し、相互作用する使用。
【請求項４】
該酵素が、ウイルスまたは細菌特異的タンパク質、ＨＩＶプロテアーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素、ＳＩＶプロテアーゼ、シュードモナス・アエルギノーサ由来のアルカリプロテアーゼ、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、血液セリンプロテアーゼ、因子Ｘａ、ＲＮアーゼ、アンギオゲニン、シアリダーゼ、アミラーゼ、β−グルカナーゼ、リゾチームまたは炭酸デヒドラターゼである請求項に記載の使用請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ラクダ科重鎖抗体由来のＶＨＨドメインまたは従来の抗体由来のラクダ化ＶＨドメインを含む認識分子の使用であって、毒性物質の有害な影響を阻害することにおいて、該毒性物質の毒性部位残基を認識し、相互作用する使用。
【請求項６】
該毒性物質が、スタフィロコッカス・アウレウス由来の毒素ショック症候群毒１、スタフィロコッカル・エンテロトキシンＢタンパク質、コレラ毒素、破傷風菌毒素などの細菌毒素、ガラガラヘビ由来のアダマリシンＩＩ、ナジャ・モサンビカ（naja mosambica）由来のカルディオトキシンＣＴＸ  ＩＩｂ、台湾コブラ由来のカルディオトキシンＣＴＸ  Ｖ、ブラックマンバ由来のデンドロトキシン、アジアコブラ由来のフラボリジン・ニューロトキシン−ＩおよびＩＩ、クロタラス・アトロクス（Crotalus atrox）由来のメタロプロテイナーゼＨｔ−ｃおよびＨｔ−ｄなどのヘビ毒液、アパミン、テルチアピンなどのミツバチ毒液またはクモ毒素である請求項５に記載の使用。
【請求項７】
ラクダ科重鎖抗体由来のＶＨＨドメインまたは従来の抗体由来のラクダ化ＶＨドメインを含む認識分子の使用であって、受容体をアゴナイズまたはアンタゴナイズすることにおいて、該受容体の認識部位を認識し、相互作用する使用。
【請求項８】
該認識分子がシグナルトランスダクション経路を遮断する請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ラクダ科重鎖抗体由来のＶＨＨドメインまたは従来の抗体由来のラクダ化ＶＨドメインを含む認識分子の使用であって、生物学的活性標分子をもつ寄生虫タンパク質の認識を妨げることにおいて、該標的分子の活性部位残基を認識し、相互作用する使用。
【請求項１０】
ラクダ科重鎖抗体由来のＶＨＨドメインまたは従来の抗体由来のラクダ化ＶＨドメインを含む認識分子の使用であって、酵素機能の不調またはタンパク質認識の不調を由来とする、複合した酵素的または生理的プロセスの機能不全を修復することにおいて、生物学的活性標的分子の活性部位残基を認識し、相互作用する使用。
【請求項１１】
ラクダ科重鎖抗体由来のＶＨＨドメインまたは従来の抗体由来のラクダ化ＶＨドメインを含む認識分子の使用であって、生物学的活性標的分子の単離および／または精製において、該生物学的活性分子の活性部位残基を認識し、相互作用する使用。
【請求項１２】
認識分子が、アミノ酸置換、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７ＧおよびＶ３７Ｆが導入されるＶＨドメインの天然のアミノ酸配列を含む、従来の抗体由来の修飾ラクダ化ＶＨドメインである請求項１〜１１のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１３】
請認識分子が、２つ以上の、ラクダ科重鎖抗体由来のＶＨＨドメインまたは従来の抗体由来のラクダ化ＶＨドメインを含む、二価または多価構築物である請求項１〜１２のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１４】
認識分子が、プロモーターおよび／または局在化シグナルの後ろの認識分子の遺伝子セグメントを形質転換することにより、第二のアミノ酸配列に融合した、ラクダ科重鎖抗体由来のＶＨＨドメインまたは従来の抗体由来のラクダ化ＶＨドメインである請求項１〜１３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１５】
生物学的活性標的分子の活性部位残基を認識し、相互作用する分子のスクリーニング方法であって：
ａ）ラクダ科重鎖抗体を準備し；
ｂ）ランダムなラクダ科重鎖抗体のコーディング配列を単離し、クローニングし；
ｃ）ＣＤＲ３領域のコドンの少なくとも１つのランダム突然変異誘発により、該領域において、ランダムなラクダ科重鎖抗体のコーティング配列を修飾し；
ｄ）ラクダ科重鎖抗体のコーティング配列のライブラリを作成し；
ｅ）ベクターを宿しているファージにおいてラクダ科重鎖抗体のコーディング配列を発現し；
ｆ）固定された生物学的活性標的分子でファージを選り分け；次いで
ｇ）固定された標的タンパク質／基質複合体に分子をもたらし、該固定された標的タンパク質／基質複合体に結合しない分子で継続することによって、発現したコーティング配列の間で、生物学的活性標的分子の活性部位残基に結合する分子をコードする配列であるラクダ科重鎖抗体を選択するステップ、を特徴とする方法。
【請求項１６】
ａ）ラクダ科重鎖抗体を準備し；
ｂ）ランダムなラクダ科重鎖抗体のコーディング配列を単離し、クローニングし；
ｃ）ＣＤＲ３領域のコドンの少なくとも１つのランダム突然変異誘発により、該領域においてランダムなラクダ科重鎖抗体のコーティング配列を修飾し；
ｄ）ラクダ科重鎖抗体のコーティング配列のライブラリを作成し；
ｅ）ベクターを宿しているファージにおいてラクダ科重鎖抗体のコーディング配列を発現し；
ｆ）固定された該生物学的活性標的分子でファージを選り分け；次いで
ｇ）ファージを溶出し、固定された標的タンパク質／基質複合体に分子をもたらし、該固定された標的タンパク質／基質複合体に結合しない分子で継続することによって、発現したコーティング配列の間で、生物学的活性標的分子の活性部位残基に結合する分子をコードする配列であるラクダ科重鎖抗体を選択するステップ、を特徴とする請求項１５に記載の分子のスクリーニング方法。
【請求項１７】
ファージを溶出するステップが、過剰の基質および／またはインヒビターで行われる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップａ）の前に、該生物学的活性標的分子でのラクダの免疫感作を含む請求項１５〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
ＣＤＲ３領域におけるランダムなラクダ科重鎖抗体のコーティング配列が、1つ以上のランダムなコドンによる少なくとも１つのコドンの交換によって修飾される請求項１５〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
生物学的活性標的分子の活性部位への分子の特異性および／または親和性を増加させるために、ＣＤＲ１またはＣＤＲ２領域におけるアミノ酸置換を生成するように、ランダムなラクダ科重鎖抗体のコーティング配列を修飾することをさらに含む請求項１５〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的分子の活性部位またはクレフト（裂け目）と相互作用する能力を有する認識分子に関する。さらに本発明は、それらの分子の設計および製造方法、ならびに診断、治療、ワクチンおよび標的分子の単離ならびに精製における該認識分子の用途に関する。認識分子は、酵素インヒビターとして用いるのが好ましい。また本発明は、本発明の認識分子を含む治療用組成物、診断用キット、ワクチンおよび精製材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
理論的には、ウイルス、細菌、寄生虫またはその他のいずれに由来する疾患であっても、多くの場合、病原タンパク質の酵素活性を妨害すること、または寄生タンパク質が標的分子を認識するのを妨害することによって疾患の発生を回避することができる。さらに、阻害分子を活性(毒性)部位に結合させることによって毒性物質の有害な影響を無効にすることができる。また、酵素機能の不調またはタンパク質認識の不調を由来とする、複合した酵素的または生理的プロセスの機能不全は、該複合タンパク質の活性部位またはグルーブ（みぞ）と相互作用する分子を与えることによって治癒されることも多い。
【０００３】
上記これらの例のすべてにおいて、これらの悪性分子の活性部位（酵素における触媒部位、マルチ成分システムといったような複合システムにおけるタンパク質内のグルーブ、または受容体内の認識部位など）を認識する特異的タンパク質を有することが有利である。
【０００４】
明らかに、現在、このような分子を得るための手近な最もよいテクニックは、（モノクローナル）抗体を産生するためのハイブリドーマテクノロジーである。しかし、抗体を開発する際には幾種類かの制限が存在する。たとえば、これまでに構造がわかっている抗体は、グルーブまたはキャビティ（くぼみ）のいずれかを形成する抗原結合表面かあるいはフラットな抗原結合表面を有することが知られている〔Websterら、Current Opinion in Structural Biology,4,23,1994〕。したがって、抗体の抗原結合部位は、グルーブまたはキャビティを貫通することができない。標的タンパク質の触媒性または機能的残基あるいは毒性部分は、たいていの場合、クレフト内に位置しており、その結果、活性クレフトを形成するアミノ酸との接触および相互作用が多くなり、それらのタンパク質の基質または受容体が、該タンパク質を認識するのが非常に特異的になる。しかし、クレフトおよびキャビティの少なくとも一部は分子内にあるという事実から、これらの構造はさほど免疫原性はない。より広いキャビティ（あるいは通常、タンパク質のクレフトという)でさえも、さほど免疫原性はないという不利点を有している。なぜ少数の抗体しかタンパク質の活性部位と相互作用しないか、ということの理由のひとつが、これである。
【０００５】
おそらくこれら（活性部位の低免疫原性および抗原結合部位自身のフラット表面）が、一価のフラグメント（ＦＡＢ−ＦＶ−ＳｃＦｖ）として作用する場合に、なぜ少数の（モノクローナル）抗体しか酵素活性を中和しないのか、ということの２つの主たる理由である。利用できる少数の中和モノクローナル抗体しか、抗原の活性部位と一部オーバーラップするが、より大きな特異性を付与する活性部位の内部には位置しないエピトープ上で結合しない。さらに、抗原（ウイルスコートタンパク質など）の表面における単一点突然変異によって、モノクローナル抗体のエピトープが機能を排除され、この新規変異体の検出用には使えなくなる。抗体の最後の不利点は、それらの分子量とサイズが大きいことであり、そのために迅速な生体分散あるいは効率的な組織貫通に制限が加わり、同時に、抗体のＦｃが血液からの迅速なクリアランスを妨害する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記観点から、本発明の第１の目的は、大きな特異性をもって標的分子のキャビティまたは活性部位に結合する分子を設計し、構築することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、これらの分子(本明細書を通じて認識分子と称する)を診断、治療、ワクチンおよび標的分子の単離または精製方法において使用することならびに酵素インヒビターとして使用することである。
【０００８】
本発明の第３の目的は、特定の目的用に、認識分子を製造および修飾方法を提供することである。
【０００９】
本発明の第４の目的は、本発明認識分子を含む、治療用化合物、診断キット、ワクチンおよび物質の精製に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の目的は、標的分子の活性部位またはクレフトと相互作用する能力を有する、基本認識ユニットから伸びる、露出ループ構造を特徴とする認識分子によって達成される。
【００１１】
このような認識分子においては、該ループ構造が、標的分子またはその修飾バージョンの活性部位またはクレフトに対する結合特異性を有するラクダ科の重鎖抗体の相補性決定領域３（ＣＤ３）であるのが好ましい。該ループは、利用可能な基本認識ユニットのいずれにでも組み入れることができる。しかし、基本認識部位は、少なくとも幾らかの、標的分子に対する結合親和性も有する抗体タイプの構造によって形成されるのが好ましい。
【００１２】
本発明は、まず最初に以下に述べる原則を明確にした後に創造された。本発明の認識分子は、認識ユニットから突き出た露出ループからなる（図１）。該ループは、標的タンパク質のキャビティ、グルーブまたはクレフトの内側に貫通するように設計される。良好な親和性をもつために、このループは、その固有の柔軟性が強制的に限定される必要がある。したがって、該フリーループの柔軟性は、標的分子の不在下で制限される必要がある。制限されたループそれ自体、すでに充分な親和性を有しているが、標的タンパク質の活性部位またはクレフトの周囲のアミノ酸との接触数を増加するために、結合表面から突き出ているこのループを有することが利点である（必須ではないが）。したがって、理想の認識分子は、この抗原結合表面から突出露出ループの載った抗体の抗原結合部位という特性を示すものである。
【００１３】
しかし、通常、抗体はその抗原結合部位から突出ループを形成せず、人工的に創造されたループでは、該ループが構築、抑制を必要とするように新たに設計することは困難であり、またループは標的のキャビティに対して相補的な表面を有するので、本発明者らは、従来の抗体またはＦｖといったような抗体フラグメントの抗原結合部位は、露出ループの挿入のための良好な開始足場ではないとみなした。
【００１４】
さらに、抗体は、効率的に生体分散または組織貫通するには大きすぎ、またＦｖといったような抗体フラグメントは、かなり不安定であり、低濃度で使用される場合、特に解離しやすい。
【００１５】
また、非常に小さいＶＨ抗体フラグメントまたは従来の抗体から誘導された（ｄＡｂ）と呼ばれる‘シングルドメイン抗体’（Wardら、Nature,341,544-546,1989）には、３つの主要な制限、すなわち、親のＦｖフラグメントと比べて、細菌において発現収量が低いこと（培養物１リットルあたり平均０．２mgのみ）、水溶液において溶解度が低いこと、ならびに親和性および特異性が低いことがある。
【００１６】
標的タンパク質の他のキャビティ、グルーブまたはクレフトについても同様であるが、本発明分子は、該タンパク質の活性部位に貫通し、触媒性残基と相互作用するのが好ましい。この末端に、本発明分子は、最大に挿入するのに十分に大きく、かつ標的タンパク質のキャビティに対してできるだけ相補的な露出ループを有する。点突然変異は、標的分子自体の適正な機能における有害な影響をもたらすので、標的分子の活性部位残基に対し、認識分子が良好に接着し、かつ多数接触することから点突然変異が獲得されることによって、標的分子がこの相互作用から逃れることが不可能になる。本発明の認識分子はさらに、大きさが小さいことから生体分散性ならびに組織貫通性が良好であること、細菌系において発現濃度が充分に高いので経済的であること、溶解挙動が良好であること、安定性が高く存続時間が長いこと、標的分子への親和性および特異性が高いこと、クローニングならびに加工操作が容易であることを特徴とする。本発明者らは、驚くべきことに、ラクダ科動物（フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ペルーラマ、ラマ、ビクーニャおよびアルパカ）由来の重鎖抗体から出発した場合に、これらすべての要求を満たせることを発見した。ラクダ科の動物は、重鎖抗体の形状のみの実質量の機能的抗体をもっている（Hamers-Castermanら、Nature,363,446,1993）。該重鎖抗体は、Ｈ鎖のホモダイマーからなり、Ｌ鎖が欠如している。Ｈ鎖のアミノ酸配列から、そのＮ末端ドメインには、いくつかの異常なアミノ酸置換が含まれており、そのことによって明らかに普通のＶＨとは異なることがわかる（Muyldermanら、Prot. Enging.7,1129,1994）。
【００１７】
普通のＶＨとラクダ科のＶＨを区別するために、後者の重鎖抗体を‘ＶＨＨ’（重鎖（Ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ）抗体のＶＨ）として識別する。この相異というものは、以下に述べるように、ラクダ科の重鎖抗体が他のいずれのＶＨからも明らかに相異しているという事実から完全に弁明されている。
【００１８】
ラクダ科の生殖系列が小遺伝子のＶＨおよびＶＨＨセットの両方を含んでいるという事実は、ＶＨＨドメイン（ＶＨＨ−Ｄ−Ｊ−再組み合わせ後に獲得された）が、軽鎖なしの重鎖抗体における処理用に予定されているということを証明する。
【００１９】
ＶＨＨにおけるアミノ酸置換は、他のＶＨと比較して、一次構造（配列）のいたるところにばら撒かれているけれども、それらは、通常、ＶＬドメインと相互作用する、分子の側面における三次構造（前部ＶＬサイドと呼ぶ）において空間内にクラスターを形成する。これらのアミノ酸置換は、Ｖ３７Ｆ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５ＲまたはＬ４５ＣおよびＷ４７であり、多くがＧｌｙにおいて置換されている。明らかに、このような置換は、ＶＨＨの前部ＶＬサイドの親水性を高め、それによって、ヒトまたはマウスから得られた普通の単離されたＶＨ（ｄＡｂ（シングルドメイン抗体）ともいう）の溶解度制限を克服する。Wardら、Nature,341,544(1989)に該ｄＡｂが記載されている。
【００２０】
また該置換によって、チャペロンＢｉｐ（細菌のチャペロンタンパク質）に、この領域が結合しにくくなり、そのために、発現濃度も増加することが期待される。
【００２１】
さらに、ラクダ科の重鎖抗体は、軽鎖の不在下においてインビボで成熟したので、単離されたＶＨＨが、元の重鎖抗体の抗原に対する親の親和性および特異性を保持することが仮定された。
【００２２】
結論として、ＶＨＨは、単離されたＶＨあるいはｄＡｂと比較して、少なくとも３つの主な利点、すなわち、細菌またはたの発現系における、より良好な発現収率、水溶液中での、より高い溶解度、およびより大きな親和性および特異性を有している。
【００２３】
事実、本発明に至る再調査において、細菌発現ベクター（ｐＨＥＮ４、ｐＨＥＮ１の誘導体（Hoogenboomら、Nucl. Acids Res.,19,4133(1991)））においてクローニングされたＶＨＨは、およそ１０mg／ｌ培養物の収量で発現できることが証明された。このことは、単離されたマウスＶＨドメインの細菌発現収量が０．２mg／ｌ培養物であることと比較すべきである。ｄＡｂのこれらの好ましくない特性は、前部ＶＬサイドの疎水性面が水性溶媒にさらされることに起因するものである。また、ＶＨＨは、どのような凝集の徴候も見せることなく、１０mg／ｍｌにまで容易に濃縮することができ、この濃度は、マウスのＶＨの溶解度の約１００倍に匹敵する。
【００２４】
良好な発現性や溶解性を示すと同時に、ＶＨＨは熱変性に対する耐性をも示し、構造的完全性および抗原結合能力を保持したまま３７℃で１週間維持することができた。したがって、ＶＨＨは安定な分子であるという結論が導かれた。
【００２５】
ＶＨＨの利点を備えるように、普通のＶＨをラクダ化することが可能である。いわゆる‘ラクダ化（camelisation）’とは、４４、４５および４７位置における対応するラクダアミノ酸を模倣するための、該位置にアミノ酸の突然変異を誘発することを意味する。‘ラクダ化’は溶解性を改善する（Davies & Reichmann FFBS Lett., 339,285-290,1994）。さらに、Ｖ３７Ｆ置換による３７位置の‘ラクダ化’ およびＣＤＲ１とＣＤＲ３の間へのジスルフィド結合の導入によって、単離されたドメインの安定性が著しく改善された。
【００２６】
さらなるＶＨＨクローン（ラクダおよびラマ由来）の配列分析により、それらの機能に関するいくつかのさらなる目覚しい特徴が、特に、系さ抗原結合ループの不在下で、どのようにそれらが特異的抗原結合能力を保持するのかが、明らかになった。普通のＶＨでは、それは、配列が超可変であり、抗原に接触することがわかっているＣＤＲ１（アミノ酸３１から３５）である。しかし、第１の超可変ループ（アミノ酸２６から３０）の前面のＮ末端は、普通のＶＨでは溶媒に曝露され、これらのアミノ酸は保存され、抗原に接触することは、これまでに報告されたことはなかった（３０位置のアミノ酸を除いて）。
【００２７】
ラクダ科抗体のＶＨＨでは、２６から３５位置におけるこれらのアミノ酸を超可変配列として定義することができる。第一に、このことは、このループのアミノ酸が、他の動物においてこれまでに述べられたものとは、異なるコンホーメーションをとりうることを示唆し、第二に、これらのアミノ酸が抗原に接触し得る、すなわち抗原結合プラットフォームの表面が拡張されることを示す。
【００２８】
さらに、配列および構造において最も可変なループであるＣＤＲ３が平均して普通のＶＨドメインの長さよりも長いことが発見された（マウスのアミノ酸が９であるのに対して１５アミノ酸である）。再び、抗原結合表面の増加が予測される。
【００２９】
抗原不在下においてループが長いことは、該ループがいくらかの柔軟性およびをもち、抗原と複合体を形成して固定してしまうような、より異なるコンホーメーションをとるようになるという短所をもつ。このループの固定化は、結合において大きな負のエントロピー上の影響をもたらすと考えられる。ラクダ科ＶＨＨのＣＤＲ１（またはＣＤＲ２または枠組み領域２の４５位置）およびＣＤＲ３においてシステインが同時に頻繁に出現すること（特により長いループにおいて）は、ジスルフィド結合の形成によるものである。このことは、コンホーメーションの柔軟性を低下させ、それによって抗原の結合が、結合における負のエントロピー上の寄与をより小さくすることになる。
【００３０】
ＶＨＨおよび‘ラクダ化されたＶＨ’の結果から、機能性をもつ小さな認識ユニットを産生するための２つの別々の方策を提案することができる。
【００３１】
第一の方策は、骨格として、ファージを‘ラクダ化されたＶＨ’をディスプレイするようにし、これを用いてＣＤＲ３ループをランダム化して（ＣＤＲ３から開始；次の段階において、結局は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２ループはランダム化／突然変異化される）、親和性および特異性を調整することを特徴とする。
【００３２】
第二の方策は、ラクダ（またはラマ）を所望の抗原で免疫感作し、動物の免疫系がそれ自身の重鎖抗体をインビボで成長させるようにすることを特徴とする。続いて、白血球（血液、脾臓、骨髄）由来のＶＨＨをｐＨＥＮ４などのファージディスプレイベクター内でクローニングし、抗原で選り分けることによって選択する。このテクニックを用いることにより、リゾチームの異なるエピトープに結合する２つのＶＨＨ分子と破傷風菌毒素に結合する（一方はＣフラグメントに、他方はＣフラグメントの範囲外に）２つのＶＨＨ分子の同定が成功する。これらのＶＨＨ分子を、ｃＡｂ−Ｌｙｓ２、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３およびｃＡｂ−ＴＴ１、ｃＡｂ−ＴＴ２と命名した。それらのアミノ酸およびヌクレオチド配列をカバット（Kabat）番号をつけて図２に示した（ｃＡｂとは、camel single domein antibody fragmentの意味である）。
【００３３】
ｃＡｂは、抗原に特異的であり、それぞれ、２．１０８、２．１０７、６．１０７および２．１０７Ｍ−１という親和性で該抗原に結合する。これらのｃＡｂの細菌発現濃度は、常に、mg／Ｌ培養物の値域であり、ｃＡｂは、よく折りたたまれ、溶解性がよく、熱変性実験においても安定であった。
【００３４】
ラクダ長ヒンジの中間体でｃＡｂを二価／多価にすることによって、それらの親和性を増大することが可能である。同様の方策で、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３をｃＡｂ−ＴＴ２に結合して二重特異性の構築物を製作することができる。ｃＡｂ−ＴＴ１およびｃＡｂ−ＴＴ２は、葉書風菌毒素をインビボにおいて中和する。同様にｃＡｂ−Ｌｙｓ３は、ミクロコッカス・リソデイクチカス（Micrococcus Lysodeikticus）のリゾチームの細胞壁加水分解活性を阻害する。
【００３５】
ｃＡｂ−Ｌｙｓ３は、セファロースＣＮＢｒに固定化したニワトリ卵白リゾチームを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製することができる。その抗原（ニワトリ卵白リゾチーム）と複合したｃＡｂ−Ｌｙｓ３の構造を、Ｘ線結晶解析により、分解能２．５オングストロームまで決定した。露出したループ構造（‘ＴＵＴ’モチーフともいう）をもつ小さい認識ユニットとしてのＶＨＨの開発または設計に関するｃＡｂ−Ｌｙｓ３の構造の主な情報は、以下の通りである。
【００３６】
ＶＨＨのコアの主鎖コンホーメーションは、ＶＨに類似しており、そのため、ＶＨＨを、ＣＤＲを他の有用な普通のＶＨ分子からＣＤＲを移植するのに使用することができる。
【００３７】
ｃＡｂ−Ｌｙｓ３の‘前部ＶＬ’側は、完全に新しい形になり、ほとんどＧｌｙで置換されるＶ３７Ｆ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５ＲおよびＷ４７における置換のみならず、この領域の保存されたＷ１０３、Ｑ１０５およびＱ３９の再配向により、ＶＨと比べて親水性がより大きくなる。
【００３８】
Ｈ１ループは、前述の普通のＶＨの基準的構造から完全に逸脱するコンホーメーションをもっており、普通のＶＨドメインにおいて該ドメインの内部に埋もれているアミノ酸２９が、構造の外側に飛び出して、抗原と接触する。アミノ酸２８もまた、複合体において抗原と接近する。
【００３９】
ＣＤＲ３（ｃＡｂ−Ｌｙｓ３において２４アミノ酸長）は、２つの部分（‘前部ＶＬサイド’をカバーするＣ部分および露出した、アクセス可能な、拡張され、突出ループを形成するＮ部分（‘ＴＵＴ’という））に分割することができる。このループはジスルフィド結合（ＣＤＲ１へ向かう）およびＹ３２、Ｙ９９ならびにＹ１００Ｃのクラスター形成によって形成された内部芳香コアによって安定化される。Ｙ９９もまた、Ｄ９５側鎖とＨ−結合を形成している。
【００４０】
アミノ酸７２〜７５個のループは、抗原に接近するが、さほど秩序だったものではない。
【００４１】
ＣＤＲ３のループの露出した部分は、リゾチームの活性部位の内部に深く貫通し、ループの先端は、ＡｌａおよびＳｅｒ１００ａで形成される。Ｓｅｒ１００ａは、リゾチームの触媒的Ｇｌｕ３５とＨ−結合を形成する。
【００４２】
低エネルギーエピトープ’であると考えられている酵素の領域であるリゾチームの活性クレフトに対する抗体を惹起するのが困難であるために、安定化され、大きな突き出したループ（ＴＵＴ）が、分子のこの部分‘と相互作用することがわかった。酵素の活性部位、あるいは一般的にタンパク質の表面のキャビティは、それらの免疫原性が低いこと、あるいは抗原結合部位が平坦であるかキャビティまたはグループをもつかのいずれかであることから、普通の抗体または抗体フラグメントと反応するのは困難であるが、大きな突出ループは、抗原のキャビティ、クレフトまたはグルーブを貫通できないために、抗体の抗原結合部位に見られなかった。
【００４３】
本発明の認識分子は、特にペプチド様構造をしている。広い範囲のタンパク質または分子が、標的分子として機能することができる。タンパク質のリストは、たんにどの種類のタンパク質が選択されうるかを示すだけである。キャビティまたは小さなグルーブをもつ全ての他のタンパク質が、適しており、該リストに限定されるものではない。
【００４４】
標的分子の例として、S.aureusによって分泌される毒素の大きなファミリーのメンバーであり、毒素ショック症候群の主要原因である、S.aureusの毒素ショック症候群毒１といったような細菌毒素が挙げられる。ＴＳＳＴ−１は、スタフィロコッカル・エンテロトキシンＢタンパク質、コレラ毒素、破傷風菌毒素と２０〜３０％の配列同一性をもつ。標的分子として選ばれる他の分子は、ガラガラヘビの亜鉛エンドペプチダーゼであり、高度に保存された触媒性ドメインからなる小タンパク質である、アダマリシンＩＩ、カルディオトキシンＣＴＸ  ＩＩｂ（ナジャ・モサンビカ（naja mosambica））、カルディオトキシンＣＴＸ  Ｖ（台湾コブラ）といったようなヘビ毒液である。これらのカルディオトキシンは、コブラ科（Elapidae）由来の、ヘビの毒液中にある小タンパク質である。該毒素は、結合して、細胞膜の組織、無傷性および機能を破壊することが知られている。その他、デンドロトキシンＫ（ブラックマンバ）、フラボリジン・ニューロトキシン−ＩおよびＩＩ（アジアコブラ）。アダマリシンＩＩとガラガラヘビ科の（クロタラス・アトロクス（Crotalus atrox））由来のＩＶ型コラーゲンを破壊する低分子量のメタロプロテイナーゼＨｔ−ｃおよびＨｔ−ｄにも配列類似性がある。
【００４５】
他の標的分子は、たとえば、受容体である。受容体は、相補的生体分子またはカウンターリガンドに結合することが可能であり、その結果として機能（シグナルトランスダクションまたは貯蔵およびそれに続く放出）を生じる生物学的マクロ分子である。本発明の認識分子は、たとえばシグナルトランスダクション機能を遮断するために、受容体に対するアンタゴニストとして用いることができる。また、該認識分子は、アゴニスト活性ももつことができる。
【００４６】
標的分子としてさらに、アパミンおよびテルチアピンといったようなミツバチ毒液、クモ毒素、ＨＩＶプロテアーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素、ＳＩＶプロテアーゼ、シュードモナス・アエルギノーサ由来のアルカリプロテアーゼ、因子ｘａ様セリンプロテアーゼまたは他の血液セリンプロテアーゼなどの他のプロテアーゼ、ＲＮアーゼおよびアンギオゲニン、シアル酸と複合糖質の間のグリコシル結合の切断を触媒する、多くの疾患の病原体（サルモネラ、インフルエンザウイルス）に含まれると考えられるシアリダーゼ、種々のオリゴサッカライドのグリコシル結合の加水分解を触媒する、アミラーゼおよびβ−グルカナーゼといったようなウイルスおよび細菌特異的タンパク質が挙げられる。α−アミラーゼの活性の変化もしばしばすい臓疾患の指標となる。酵素の活性部位は、ＡドメインとＢドメインの間に存在するクレフトを形成する。触媒性残基Ａｓｐ３００、Ａｓｐ１９７およびＧｌｕ２３３は、該クレフトに位置し、相同な残基が数種のアミラーゼ構造に発見されているする。
【００４７】
標的分子の他の例は、リゾチーム、破傷風毒素およびカルボニックアンヒドラーゼである。
【００４８】
基本認識分子から出発して、基本認識ユニットおよびループ構造バリエーションからなる他の標的に対する認識分子を製作することができる。さらに、可変部の大きなグループから所望の標的に対する適当な候補を選ぶための選択システムを設計することができる。
【００４９】
原則的には、このアプローチのための出発点としてすべての認識分子を用いることができる。しかし、さらなる免疫感作を避けるために、本明細書に記載した認識分子のひとつを使用するべきである。次いで、このような分子を加工して所望の特異性を得ることができる。
【００５０】
ループおよび基本認識ユニットの修飾バージョンを導く経路は種々存在する。たとえば、ＣＤＲ３の誘導バージョンは、少なくとも一つの天然アミノ酸が一個またはそれ以上の他のアミノ酸で置換されている突然変異したＣＤＲ３である。あるいは、別の態様では、ＣＤＲ３の誘導バージョンは、１個またはそれ以上の追加のアミノ酸が付加されるかおよび／またはその天然アミノ酸配列内に組み込まれている突然変異したＣＤＲ３からなる。
【００５１】
類似した修飾を行って、基本認識ユニットを製作することができる。基本認識ユニットは、ラクダ科重鎖抗体またはその修飾バージョンの少なくとも一部によって形成されており、その修飾バージョンは、少なくとも一つの天然アミノ酸が、１個またはそれ以上の他のアミノ酸によって置換されているバージョンであるかまたは１個またはそれ以上の追加のアミノ酸が付加されるかおよび／またはその天然アミノ酸配列内に組み込まれているバージョンである。別の態様として、該ラクダ科抗体の修飾バージョンは、第二のアミノ酸配列に融合しているかまたは生物学的に活性な分子に連結しているバージョンである。
【００５２】
本発明の認識分子を得るために、以下に述べる種々の方策をとり得る。通常、第一の方法は、ラクダ科重鎖抗体を準備し；コーディング配列を単離し、ファージディスプレイベクターにおいてクローニングし；該ベクターを宿しているファージにおいて該コーディング配列を発現し；次いでファージを固定抗原で選り分けることによって抗原に特異的な認識分子を選択すること、を特徴とする。
【００５３】
第二の方策は、ラクダ（またはラマ）を所望の抗原で免疫感作し、動物の免疫系がそれ自身の重鎖抗体をインビボで成長させるようにすることを特徴とする。続いて、白血球（血液、脾臓、骨髄）由来のＶＨＨをｐＨＥＮ４などのファージディスプレイベクター内でクローニングし、抗原で選り分けることによって選択する。結合体（所望の抗原を結合する認識分子）を溶離するには、以下の方法のひとつを選択した。
【００５４】
結合物の溶離を、ｐＨショックによって行い、一般結合体を得る（活性部位結合体のみではない）。キャビティまたは活性部位結合体を得ることを望む場合は、該結合体の溶離は、基質過剰によって行う。最初の方法で固定標的タンパク質／基質複合体から‘一般結合体’を得、次いで非結合体で継続することにより、一般結合体からキャビティ結合体が選択される。
【００５５】
本発明認識分子を得るためのこの一般法の実行可能性は、この方策を用いてｃＡｂフラグメント、ｃＡｂ−ＴＴ１、ｃＡｂ−ＴＴ２、ｃＡｂ−Ｌｙｓ２およびｃＡｂ−Ｌｙｓ３タンパク質を得ることによって立証された。すべてのリゾチーム結合体のうち最も長いＣＤＲ３ループ（２４アミノ酸）およびＣＤＲ１とＣＤＲ３との間にジスルフィド結合を形成しているシステインをもつｃＡｂ−Ｌｙｓ３の構造分析から、仮定したとおり、酵素の活性部位に結合する突出ループをもつ小さい認識ユニットが確かに作成されたことが立証された。
【００５６】
他の‘標的’タンパク質を認識する認識分子を得るために第一の方策を繰り返すことは可能であるが、すべてのタンパク質が、この方策を完全に普遍化するほど充分に免疫原性があるものではない。したがって、第二の方策が開発された。
【００５７】
この方策は、出発点として、ランダムに選択された認識分子を使用する。この方策の利点は、免疫感作を回避することができ、最終分子の三次構造がすでに本質的に与えられていることである。
【００５８】
したがって、このような第二の方法は、ラクダ科重鎖抗体をランダムに選び；コーディング配列を単離し、ファージディスプレイベクターにおいてクローニングし； 該コーディング配列を少なくともひとつのコドンにおいてランダムに置換することにより修飾し；ファージディスプレイベクターにおいてランダムに突然変異したコーディング配列のライブラリを作成し；該ベクターを宿しているファージにおいて該コーディング配列を発現し；次いで、ファージを固定抗原で選り分けることによって抗原に特異的な認識分子を選択する、ステップを特徴とする。
【００５９】
この第二の方策では、ラクダの免疫感作が回避される。たとえば、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３タンパク質を修飾して、標的タンパク質のクレフトに結合するための‘ＴＵＴ’モチーフをもつ‘小認識ユニット’を作製する。２つの経路が考えられる：突出ループを新しい形にする第一の経路およびｃＡｂ−Ｌｙｓ３の突出ループの‘上張り’で終了する第二の経路である。
【００６０】
ループを新しい形にするために、いくつかの段階が必要である。まず、ループの近くに制限酵素部位を導入する。これらの部位は、次ぎに続くクローニングおよび特徴づけを補助する。次いで、ランダムなコドン（１〜Ｘ）によってアミノ酸交換する。Ｘの数が小さいほど、ライブラリーが小さく、ループの長さが短くなる。細菌の形質転換効率における実験上の制限があるために、６−７アミノ酸以上のループは、完全なライブラリーを作製するのが難しく、また、ループの柔軟になりすぎて、多反応性になり、結合が弱くなる。続いて、特異性または親和性を増大するために、ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２または７２／７５位置のループ周囲アミノ酸（図２、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３）のＮ末端を変えることによってループの周囲のプラットホームを交換する。上記ステップ２および３を循環的に繰り返して親和性および特性を成熟させる。別法として、多価構築物を作製することにより、同様に、結合活性を増強したり、あるいは二重特異的構築物を得ることができる。
【００６１】
ｃＡｂ−Ｌｙｓ３のＣＤＲ３ループの‘上張り’をするために、次のステップを行う。まず、クローニングおよび特徴づけのために、ループの周囲に制限酵素部位を導入する。次いで、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３の突出ループの外側に出ているアミノ酸を置換する。最後に、特異性または親和性を増大するために、ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２または７２／７５位置のループ周囲アミノ酸のＮ末端を変えることによってループの周囲のプラットホームを交換する。別法として、多価構築物を作製することにより、同様に、結合活性を増強したり、あるいは二重特異的構築物を得ることができる。
【００６２】
認識分子をコードするＤＮＡ配列を発現させるといったような、標準的遺伝子工学技術によって、本発明の認識分子を製造することもできる。このような方法は、たとえば、認識分子またはその先駆体をコードするＤＮＡ配列を単離し、必要に応じて、１個またはそれ以上の塩基置換、欠失または挿入を導入することによって該分子またはその先駆体を修飾し；このようにして得られた、必要に応じて修飾された、ＤＮＡ配列を適当な宿主に移入し；次いで、宿主内でＤＮＡ配列を発現する、ステップを特徴とする。本明細書で用いる語句‘先駆体’とは、製造される認識分子の（完全な）所望の特異性をもたない、すべての配列を含むことを意図している。
【００６３】
これらのアプローチにより、免疫感作の問題（免疫感作スキムが長いこと、ラクダ科動物への免疫原の毒性の影響、標的分子の免疫原性が低いこと、免疫感作のために相対的に多量の標的分子が必要であること）が回避されることは明らかである。
【００６４】
他の態様では、本発明は、標的分子の生物学的機能を中和することおよび治療における認識分子の使用に関する。したがって、本発明はまた、本発明の認識分子の一種またはそれ以上および適当な賦形剤を含む、治療用組成物に関する。
【００６５】
中和とは別の態様において、本発明認識分子は、サンプル中に標的分子が存在するかどうかを検出するのにも用いることができる。このように認識分子を診断に用いることができる。該認識分子は、普通の抗体と同様に用いることができる。したがって、当業者であれば、公知の免疫学的診断テストにおいて考え得るありとあらゆる診断テストを巧みに設計することができるであろうから、さらに解説をせずとも、類似した診断技術が企画される。このように、本発明は、一種またはそれ以上の本発明認識分子を含む診断テストキットを提供する。
【００６６】
普通の抗体のような認識分子は、（能動的）ワクチンに使用することができる。最後に、本発明は、一種またはそれ以上の本発明認識分子を含むワクチンに関する。
【００６７】
さらに、標的分子に対する認識分子の特異性を巧みに使用して、標的分子を単離もしくはさらなる精製法を開発することができる。通例の抗体または他の結合分子の代わりに本発明認識分子を用いて、アフィニティーカラムといったような標準的分離および精製技術を行うことができる。したがって、本発明はさらに、１種またはそれ以上の本発明認識分子が結合した担体からなる精製材料に関する。担体は、カラム材料であるのが好ましく、アフィニティーカラムがさらに好ましい。
【００６８】
‘ＴＵＴ’モチーフをもつ小認識ユニット（本発明認識分子）を構築すれば、たとえば、血液からの過剰分子のクリアランスが迅速であるという利点をもつ従来のモノクローナル抗体に代わって、多くの適用法においてすぐに使用することができる。しかし、他の適用においては、循環する血液中での存続時間を長くすることが好ましい。このことはヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの前面で認識ユニットをクローニングすることによって容易に実現しうる。
【００６９】
第３の適用では、これらの小認識ユニットを体内へ入れることが必要である。サイズが小さいことと、およびそれらのシングルドメイン構造が、このような使用を可能にしている。
【００７０】
遺伝子セグメント末端のＳＫＤＥＬモチーフのクローニングによって、該分子を細胞内細網の内側に保持することができるが、あるいは核標的シグナル、すなわちクロロプラストシグナルの後ろのクローニングを行っても、該タンパク質をその標的と結合し不活性化すべき、核、葉緑体、ミトコンドリアまたは他の選択された細胞器官内に留めることができる。
【００７１】
多くの場合、ループ自身の結合活性は、標的分子の活性クレフトの内側に特異的相互作用するのに充分である。
【００７２】
該ループは、好ましくは天然のタンパク質の特性を模するペプチド模擬体を合理的に設計するのに用いることもできる。
【００７３】
本発明は、後記の図および実施例を参照することにより、さらに明らかになる。
【実施例】
【００７４】
リゾチームおよび破傷風菌毒素に対する特異的認識分子に基づいて、次に述べる実施例では、本発明認識分子を得るための一般的方策をさらに詳しく説明する。しかし、本発明はこれらの標的分子に限定されるものではない。
【００７５】
実施例１
ｃＡｂ−Ｌｙｓ２およびｃＡｂ−Ｌｙｓ３の製造
１９９６年１０月３１日公開のＷＯ９６３４１０３の特許出願に、ｃＡｂ−Ｌｙｓ２およびｃＡｂ−Ｌｙｓ３を得るための操作が開示されている。
【００７６】
実施例２
ｃＡｂ−Ｌｙｓ３のＣＤＲ３ループのＮ−パートの近くへの制限酵素部位の導入
【００７７】
ｐＨＥＮ４−αＬｙｓ３（ｃＡｂ−Ｌｙｓ３タンパク質をコードするラクダＶＨＨの遺伝子を含むプラスミドｐＨＥＮ４）をテンプレートに載せ、ＶＨＢＡＣＫ（Ａ４）およびＳＭ０２０でＰＣＲを行う。他のＰＣＲを、同じテンプレートＤＮＡならびにＳＭ０１９およびＡＭ００６で行う。
ＡＭ００６は、ｐＨＥＮ４の遺伝子ｐＩＩＩの開始部に結合する。
2009040780.tif 000002
ＳＭ０１９は、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３のコドン１００ｇから１００ｍに結合する（ＳａｌＩサイトを下線で示す）。
2009040780.tif 000003
ＳＭ０２０は、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３のコドン１００ｍから９８に結合する（ＳａｌＩサイトを下線で示す）。
2009040780.tif 000004
ＶＨＢＡＣＫ（Ａ４）は、ｐＨＥＮ４のＰｅｌＢリーダーシグナルおよびｃＡｂ−Ｌｙｓ３のコドン１から４に結合する。（ＳｆｉＩサイトを下線で示す）。
2009040780.tif 000005
両方のＰＣＲフラグメントをＳａｌＩで切断、ＶＨＢＡＣＫ（Ａ４）およびＡＭ００６プライマーとの最終ＰＣＲを行った後、ＳｆｉＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断したｐＨＥＮ４内でクローニングしうるＤＮＡフラグメントが得られる（ＢｓｔＥＩＩサイトは、すべてのＶＨＨ遺伝子セグメントのフレームワーク４に天然に生じる）。得られるプラスミドＤＮＡは、ランダム化されたＳｅｒ１００ａをもつｃＡｂ−Ｌｙｓ３をコードし、その中でｃＡｂ−Ｌｙｓ３のコドンは、突然変異している（下記）。
2009040780.tif 000006
これらのサイレント突然変異は、ＳａｌＩに対する制限酵素部位（下線）に含まれ、次に行うクローニングまたはクローンの特徴づけに用いることができる。下記のコドンのヌクレオチドもまた置換される。
2009040780.tif 000007
このサイレント突然変異は、ＢａｌＩサイト（下線）に導入され、これはＳａｌＩサイト同様に、クローニングまたはクローン選択に用いることができる。
【００７８】
この方策を用いて、約１００００個のクローンを作製し、そのうち約２４個のクローンを抽出して、個々に成長させ、次いで、それぞれについて発現濃度おｙびニワトリ卵白リゾチームへの結合を試験した。すべてのクローンは、１００ａ位置およびＳａｌＩならびにＭｌｕＩサイトに突然変異を含んでいた。わずかに親和性は低下しているが、２つのクローンのみは、リゾチームに結合していた。これらの突然変異は、それぞれＰｒｏおよびＨｉｓによってＳｅｒ１００ａが置換されたものである。すべての他のクローンは、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓといったような異なるアミノ酸を含んでおり、発現はしているが、リゾチームに結合することができないことがわかった。
【００７９】
このことから、発現レベルは保持したままであるが、もとのｃＡｂ−Ｌｙｓ３と比較すると、リゾチームに対する親和性／特異性を変化させた状態になるようにループを突然変異させることが可能であるということが立証される。
【００８０】
実施例３
‘ＴＵＴ’ループの完全ランダム化
ｃＡｂ−Ｌｙｓ３テンプレートを用いるＰＣＲにより、オリゴ体、ＶＨＢＡＣＫ（Ａ４）およびＳＮ０２１で、ＤＮＡフラグメントを作製し、ＳｆｉＩ／ＳａｌＩで切断した後、同じ酵素で切断したｐＨＥＮ４−ａＬｙｓ３に、クローニングすることができる。ＳＭ０２１の配列（ＳａｌＩサイトを下線で示す）は、コドン１００ｍから１００ｅおよび９６から９２に結合する。
2009040780.tif 000008
これらのプラスミドは、Ｔｈｒ９７からＧｌｕ１００ｄまでが除去され、ランダムコドン（ＮＮＳ）６によって置換されている配列をコードするコドンをもっている。ｐＨＥＮ４といったようなファージディスプレイベクターのライブラリーの構築後、本明細書で説明する溶離／選択方策で選り分けることによって適当なバインダーを選択する。
【００８１】
サイズの異なるループを作製することも可能である。次いで、ランダムコドン（ＮＮＳ）ｘが、ｘ＝１〜１０あるいはそれ以上の範囲で変化するようなものへと、プライマーＳＭ０２１の配列を変化させた。ｘが小さいと、ループが小さく、ｘが大きいと、ループが大きくなる。これらの異なるループをそれぞれもつ異なるライブラリーを用いて、標的タンパク質のクレフトにの最適にフィットするものを見つける。
【００８２】
実施例４
ｃＡｂ−Ｌｙｓ３の‘ＴＵＴ’ループの上張り
ループのランダム化とはわずかに異なる方法により、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３から突き出たループが、その外側表面のみ変化しているが、内部およびループ構造アミノ酸は保持されているもののライブラリーを作製する。この方策を‘上張り’と呼ぶ。該方策は、ＳＭ０２１プライマーをＳＭ０２２プライマー：
2009040780.tif 000009
と交換し、テンプレートとしてプライマーＶＨＢＡＣＫ（Ａ４）とＰＨＥＮ−αＬｙｓ３とを組み合わせてＰＣＲを行うことからなる。このプライマーをコドン１００ｍから９２とアニーリングし、コドン９７、９８、１００、１００ａ、１００ｂおよび１００ｄをランダム化し、他はすべて保持する。アミノ酸をコードするランダム化したコドンが、ループの外側を覆うことがわかった。ＰＣＲフラグメントをＳｆｉおよびＳａｌＩで切断した後、同じ酵素で切断したｐＨＥＮ４ベクター内にライブラリーを構築した。ファージウイルスに突然変異したｃＡｂを発現させた後、実施例３で説明した溶離／選択方策で選り分けることによって適当なバインダーを選択した。
【００８３】
ランダムコドン（ＳＮＮ）３を（ＳＮＮ）ｘ（ｘが、ｘ＝１〜６あるいはそれ以上であって３ではない）と交換した類似のプライマーと、プライマーＳＭ０２１に変化させ、上記プロトコルにしたがって、元のループと比べて、突出ループの先端が短くなるかまたは長くなったもののライブラリーを作製する。他のランダム化した位置もまた、より長くしたり、より短くしたりして、突出ループの側面に‘ノブ（小山）’を作製することができる。これらの異なるライブラリーを用いて標的分子を選り分け、最適バインダーを選択する。
【００８４】
実施例５
突出ループの周囲の基本認識ユニットの修飾
‘ＴＵＴ’モチーフをもつ認識ユニットを一度構築すると、‘ＴＵＴ’ループの周囲の基本認識ユニット（またはプラットホーム）に（安定な）修飾をすることによって、親和性または特異性を増加することができる。これらの修飾に最も適した３つの部位は、認識ユニットのＮ末端、ループ周辺アミノ酸７２／７５およびＣＤＲ１またはＣＤＲ２領域である。
【００８５】
１．ＶＨＨのＮ−末端は、抗原結合ループに近く、この部位は、前述した修飾部位として用いることができるが、挿入されたアミノ酸は閉じ込められない。むしろ両備生成物が得られる。したがって、この部位は、全ドメインの挿入および２重特異性分子の構築に適した部位である。
【００８６】
２．７２／７５ループを新しく形成し、新規な機能的特質を挿入／導入することにより抗原結合表面を増大させ、親和性／特異性を調節する。ラクダおよびラマＶＨＨクローン挿入において見られたように、このループは、突然変異（ランダム化）を導入するのに適した部位である。この部位は、折りたたみおよびその抗原結合活性を維持したまま、３つのアミノ酸で延長することができる。結晶中のこの領域の残りが柔軟なことから、この領域におけるｃＡｂ−Ｌｙｓ３の構造も非常によく見える。したがって、この領域が、欠失および挿入を収容するのに適当な場所であることが仮定される。オリゴヌクレオチドと結合したコドン８１から８２ａ
2009040780.tif 000010
の周囲にＢｓｐＨＩ制限酵素部位が存在することから、ＰＣＲ法および標準的クローニング法によって、この領域に突然変異を起こし得る。
たとえば、ｐＨＥＮ４−αＬｙｓ３を用いるＰＣＲ反応において、コドン６７から８２ｂ（ＢｓｐＨＩ部位を下線で示す）
2009040780.tif 000011
で結合するプライマーならびにＶＨＢＡＣＫ（Ａ４）プライマーは、ＢｓｐＨＩおよびＳｆｉＩで切断されたｐＨＥＮ４−αＬｙｓ３にクローニングしうるフラグメントを作製する。作製されたライブラリーは、コドン７２から７５が、（ＸＸＸ）ｘで置換されているｃＡｂ−Ｌｙｓ３タンパク質をコードする。（ＸＸＸ）ｘの大きさに応じて、コドン７２から７５の間にコドンを導入、欠失または置換することができる。
【００８７】
たとえば、この位置へのＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐの導入によって、タンパク質をインテグリンに変えることができ、またはこの領域においてランダム化もしくはシステインまたはヒスチジンを導入することによって、この位置で金属をキレート形成させ、メタロタンパク質を作製することができる。この位置において酵素のサブドメインまたはドメインを組み入れたい場合、ＶＨＨにおけるアミノ酸７２から７５と等価の方向性と距離をもつ所望するドメインを含むアミノ酸を見出すために‘新規な’タンパク質の構造を分析することが必要である。もし、構造が未知であるか、この要求を満たすアミノ酸がない場合、次いで、該欠点を補って、キメラタンパク質の折りたたみ、安定性および機能を阻害する、望ましくない埋込物が挿入されたドメイン上に押し付けられないようにするための、短いリンカーペプチドを導入することが望ましい。同様に、ＣＤＲ１またはＣＤＲ２のアミノ酸を変更することにより、親和性および特異性を増加することができる。
【００８８】
実施例６
‘ＴＵＴ’モチーフをもつ認識ユニットの存続時間の増加
本発明の小シングルドメインタンパク質は、優れた組織貫通性、優れた生体分散性および血液からの急速なクリアランスを示す。しかし、ある種の適用（ウイルスの中和）において、血液中で、より長い存続時間をもつことが利点となる。血液中での存続時間を長くするために、ＴＵＴモチーフをもつタンパク質を、ヒトＩｇＧ１といったようなＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの上流にクローニングすることができる。これは、標準的クローニング法を用いて行うことができる。ヒトおよびｃＡｂ−Ｌｙｓ３または他のラクダおよびラマＶＨＨ遺伝子セグメントに生じるＢｓｔＥＩＩ部位は、２つの遺伝子フラグメントを互いにライゲートするのに適した部位である。ｐＨＥＮ４発現ベクターは、これらの構築物を細菌を用いて発現させるのに用いることができるが、ｐＣＤＮＡ−３ベクターは、哺乳動物細胞系における最終発現に用いることができる。これは、このような構築物（ＣＨ１および軽鎖をもたないもの）は、両方のシステムにおいて発現性がよいことが報告されているので問題はなく、これらのシステムにおいて機能性タンパク質が得られる。
【００８９】
実施例７
体内
通常、細胞内の小器官に存在し、かつ機能する標的タンパク質および細胞内の小器官で機能する標的タンパク質と相互作用するために、ＴＵＴモチーフをもつ小認識ユニットを細胞内小器官（細胞質ゾル、核、小胞体、ミトコンドリアまたは葉緑体）の内部に持ち込むことが必要である。適当なプロモーターおよび／または局在化シグナルの後ろ、あるいは小胞体内へ標的化するためにＳＫＤＥＬコドンで延長された、ＴＵＴモチーフをもつ小認識分子の遺伝子セグメントを形質転換することにより、思うとおりに、設計した分子を細胞内小器官で発現するように、また該器官を指向するようにできる。
【００９０】
ＣＭＶプロモーターおよび葉緑体リーダーシグナルの後ろにｃＡｂ−ＴＴ２をクローニングした。タバコ（植物）において、この構築物を形質転換したところ、ＥＬＩＳＡ測定により、該構築物が発現し、機能することが示された。トランスジェニック植物の葉２グラムを２．５ｍｌのＰＢＳ、２０％グリセロール、３００μｌの１０ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルスルホニルフルオライド）とともに乳鉢ですりつぶす。ＰＤ１０ゲルろ過カラム（ファルマシア）で脱塩した後、抽出物１００μｌ、抽出物１０μｌ＋水１０μｌおよび２倍希釈物でＥＬＩＳＡを行う。コントロールとして、非形質転換植物を用いた。マイクロタイターウエルに１００μｌの６．５μg／mlの破傷風菌毒素を入れる。ＰＢＳ中の１％カゼインでブロッキングし、ウサギ抗ラクダＩｇＧおよびヤギ抗ウサギアルカリフォスファターゼ複合体（シグマ）を用いて、結合した植物ｃＡｂ−ＴＴ２を検出する；パラニトロフェニルホスフェードが基質であり、４０５ｎｍで１５分後、目盛りを読む。したがって、本発明のＴＵＴモチーフをもつ小認識分子は、体内での使用に有用である。
【００９１】
実施例８
ペプチド模擬体
一度ＴＵＴループを見出し、特徴づけすれば、強制構築ペプチドとしてそれを化学的に合成することができる。このペプチドは数多く接触するので、特異的かつ高い親和性にて標的タンパク質のキャビティの内側に結合する。１１個のアミノ酸（Ａｓｐ９５からＣｙｓ１００ｅ）が、およそ５００Ａ（オングストローム）２の表面積でリゾチーム活性クレフトと接触する。この量は、オリゴペプチドから特異的結合体を形成するのに充分である。したがって、‘ＣＧＤＳＴＩＹＡＳＹＹＥＧＳ’（下線の配列が、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３の突出ループ部であり、末端の２つのＣｙｓが、ジスルフィド結合を形成することにより、ペプチドのコンホーメーションを強制的に作製するのを補助する）といったようなオリゴペプチドの合成を用いて、リゾチームに対する特異的結合をテストする。続いてのステップでは、有機化学によって、類似の結合特性を有する、このペプチドに基づくペプチド類縁体を合成することが可能である。
【００９２】
本方策にしたがって、酵素または受容体分子由来のものといったような、他の分子的クレフトに結合する特徴づけられたＴＵＴを用いて、適当なペプチド模擬体を設計することができる。
【００９３】
実施例８Ａ
ｃＡｂ−ＴＴ２に対するモノクローナル抗体の作製
４〜６週齢の老いた雌性ＢＡＬＢ／ｃｘＣ５７／Ｂ／Ｌ，Ｆ１マウスに、完全フロイントアジュバント中の標識なしのｃＡｂ−ＴＴ２（５μｇ）をフットパッド内注射することにより、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製した。８日後、マウスを屠殺し、膝のリンパ腺を切除する。細胞を機械的にばらばらにし、ＤＭＥＭ培地で洗浄する。
【００９４】
骨髄腫パートナー細胞（ＮＳＯ）をＤＭＥＭで長期培養する。細胞を一度洗浄し、計数する。リンパ腺細胞およびＮＳＯ細胞を５〜１の比率で混合し、ＤＭＥＭ中、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）と融合させる。細胞を遠心分離によりペレット化し、予熱した培地（ＤＭＥＭ−２０％ウシ胎児血清含有ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンおよび抗生物質としてストレプトマイシンならびにペニシリン）中に静かに再懸濁させる。細胞を２５０ｍｌのＤＭＥＭに写し、マイクロプレートに約５×１０４個の細胞／ウエルで配置する。培養物を３７℃、５％ＣＯ２で１０日間インキュベートする。
【００９５】
１０日後、ハイブリッドクローンの出現を記録した。合計２２７個のコロニーが観察され、それらの上清をＥＬＩＳＡでテストする。精製したｃＡｂ−ＴＴ２（１μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ）をマイクロタイタープレートのウエルに一夜吸着させる。プレートを洗浄し、１％カゼイン−ＰＢＳでブロックし、ハイブリドーマ細胞の培養上清を３７℃にて１時間インキュベートする。ウエルをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）で再度洗浄し、アルカリフォスファターゼと複合したヤギ抗マウス免疫グロブリン（シグマ）とともにさらに１時間インキュベートする。最後の洗浄後、１ｍＭのＭｇＳＯ４を加え、ＨＣｌでｐＨ９．８に調節した１Ｍジエタノールアミンに溶解したｐ−ニトロフェニルホスフェートで酵素を検出した。着色の発展を４０５ｎｍでモニターする。
【００９６】
２２７個のハイブリッドコロニーのうち、約１０％（２４個）が、ＥＬＩＳＡにおいて陽性反応を示した。これらのうちから、２０個をさらなる分析のために選んだ。イソタイプのクラスおよびサブクラスのタイプに関しては、２０個のクローンがＩｇＧイソタイプのものであるが、残りの４個はＩｇＭクラスに属することが示された。
【００９７】
精製されたラクダＩｇＧ１（すなわち、軽鎖をもつ普通のラクダ抗体）、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３（すなわち、ラクダ重鎖イソタイプ）、未知の特異性をもつ３個のラクダＶＨＨ（ｃＡｂ−ＶＨＨ９、ｃＡｂ−ＶＨＨ１６およびｃＡｂ−ＶＨＨ２１）、またはｃＡｂ−Ｌｙｓ１、ｃＡｂ−ＴＴ１およびｃＡｂ−ＴＴ２に対するｃＡｂ−ＴＴ２特異性をもつ２０個の選択されたＩｇＧモノクローナル抗体の反応性を試験することにより、モノクローナル抗体を惹起するオリジナルの抗原であるｃＡｂ−ＴＴ２に対して強い応答が得られることが示された。２つのモノクローナル抗体（２３Ｇ８および９Ａ９）は、他のＶＨＨドメインならびにラクダＩｇＧ１を弱く認識する。ハイブリドーマ１８Ｃ１１、２１Ａ３および３Ｇ２モノクローナル抗体は、ラクダＩｇＧ１に対し、中間の応答（最大応答の５０％）を示し、モノクローナル抗体１５Ａ１１は、２つの他の関連しないＶＨＨ（ｃＡｂ−Ｌｙｓ１およびｃＡｂ−ＶＨＨ２１）を低レベル（最大結合の２０％）で認識する。したがって、抗−ｃＡｂ−ＴＴ２モノクローナル抗体のほとんどが、ｃＡｂ−ＴＴ２に対して、イディオタイプ的個特異性を示すモノ特異的である。
【００９８】
実施例９
ＴＵＴモチーフをもつ認識ユニットによる免疫感作
ＢＡＬＢ／ｃマウスにｃＡｂ−ＴＴ２をフットパッド内注射にて投与し、ｃＡｂ−ＴＴ２に対する結合活性をもつ２４個のハイブリドーマを作製した（２２７個のハイブリッドを試験したうちから）。これらのすべての２４個のモノクローナル抗体から、２個のみが、他のラクダＶＨＨに弱く結合することができたが、ｃＡｂ−ＴＴ２に対する結合は、すべての試験クローンにおいて強かった。したがって、作製されたモノクローナル抗体は、抗イディオタイプ的モノクローナル抗体のようである。
【００９９】
Zanettiらの実験（Nature,355,476(1992)）から、ＶＨのＣＤＲ３に存在するアミノ酸が免疫原性であり、マラリア原虫のエピトープをＶＨのＣＤＲ３に挿入することによって得られたタンパク質構築物を用いて、マラリアに対してマウスを免疫感作しうることがわかっている。同様に、言及した構築物において、小認識ユニット上の突出ループが、インビボ免疫感作のために他のループを挿入するのに良好な部位であることが予測される。
【０１００】
一度、特定の酵素または受容体分子に対するＴＵＴが同定されると、それを用いてモノクローナル抗体を作製しうることが確定した。抗イディオタイプ的モノクローナル抗体が、オリジナルの酵素または受容体の触媒部位を模倣するであろうことが予測される。‘ＴＵＴ’は、触媒活性をもつ抗体を開発するために用いた‘基質の遷移状態’に入れ替わる。安定な‘基質の遷移状態’の設計および合成は、困難であるかまたは不可能であることが多い。この方策は、これらの合成の困難さを解決する。
【０１０１】
実施例１０
抗原リゾチームと共結晶化したｃＡｂ−Ｌｙｓ３の構造分析
この実施例は、論文“Nature Structural Biology”,Volume3,No.9,1996年９月号の図１に示すものである。
【０１０２】
実施例１１
免疫感作プロトコル
４頭のヒトコブラクダを用いて抗原または抗原量を変えて免疫感作を行う。
ヒトコブラクダ１
抗原：ウシＲＮアーゼＡ０．１mg
炭酸デヒドラターゼ０．１mg
ｂ−ラクタマーゼ１mg
リゾチーム１mg
Ｂ型肝炎表面抗原セロタイプＡｙ０．２５mgを、約０．５ｍｌの生理的食塩水および２ｍｌ２種の植物酵素と混合する。
第０日：血清２０ml採取
ＣＦＡ（等量）で乳化した抗原混合物の注射、皮下
第７日：血清２０ml採取
第１４日：ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下＝チューブＤＡＹ１４
第２１日：血清２０ml採取
第２８日：ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下＝ＤＡＹ２８
第３１日：血液２０ml採取（リンパ球調製用）
第３５日：血清２０ml採取
第５４日：ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下＝ＤＡＹ５４
第５７日：血液２０ml採取（リンパ球調製用）
第６１日：血清２０ml採取
ヒトコブラクダ２
抗原：ウシＲＮアーゼＡ０．１mg
炭酸デヒドラターゼ０．１mg
リゾチーム１．４mg
ａ−アミラーゼ１mg
を約０．２５ｍｌの生理的食塩水と混合する。
第０日：血清２０ml採取
ＣＦＡ（等量）で乳化した抗原混合物の注射、皮下
第７日：血清２０ml採取
ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下
第１４日：ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下
ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下
第２１日：血清２０ml採取
ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下
第２８日：ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下
ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下
第３１日：血液２０ml採取
第３５日：血清２０ml採取
ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下
第３５日：血清２０ml採取
ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下
第４２日：血清２０ml採取
ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下
第４９日：血清２０ml採取
ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下
第５７日：血液２０ml採取
第６１日：血清２０ml採取
ヒトコブラクダ３
抗原：ウシＲＮアーゼＡ０．１mg
炭酸デヒドラターゼ０．１mg
ｂ−ラクタマーゼ１mg
リゾチーム１mg
ＴＡＴ０．５mg
Ｂ型肝炎表面抗原セロタイプＡｄ０．２５mgを約２．７ｍｌの生理的食塩水と混合する。
第０日：血清２０ml採取、血液２０ml採取（リンパ球調製用）
ＣＦＡ（等量）と混合した抗原混合物の注射、皮下
第７日：血清２０ml採取
第１４日：ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下
第２１日：血清２０ml採取
第２８日：ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下
第３１日：血液２０ml採取（リンパ球調製用）
第３５日：血清２０ml採取
第５４日：ＩＦＡに混合した抗原で補助注射、皮下
第５７日：血液２０ml採取（リンパ球調製用）
ヒトコブラクダ４
抗原：ＴＡＴ 
を混合し、中和抗体を作製するのに使用する。すべての注射は筋肉内注射である。
第０日：血清２０ml採取
カクテル０．１２mg＋ＰＢＳ２ｍｌ＋ＩＦＡ２ｍｌを注射
第２日：カクテル０．２４mg＋ＰＢＳ２ｍｌ＋ＩＦＡ２ｍｌで感作
第４日：カクテル０．３６mg＋ＰＢＳ２ｍｌ＋ＩＦＡ２ｍｌで感作
第７日：カクテル０．４８mg＋０．０７Ｍ硫酸ナトリウム２ｍｌ
＋０．０７ＭＣａＣｌ２２ｍｌで感作
第９日：血清２０ml採取
カクテル０．９６mg＋０．０７Ｍ硫酸ナトリウム２ｍｌ
＋０．０７ＭＣａＣｌ２２ｍｌで感作
第１１日：カクテル１．５０mg＋０．０７Ｍ硫酸ナトリウム２．５ｍｌ
＋０．０７ＭＣａＣｌ２２．５ｍｌで感作
第１４日：カクテル１．９８mg＋硫酸ナトリウム３ｍｌ＋ＣａＣｌ２３ｍｌで感作
第１６日：カクテル１．３２mg＋硫酸ナトリウム２ｍｌ＋ＣａＣｌ２２ｍｌで感作
第１８日：カクテル１．７４mg＋硫酸ナトリウム２．５ｍｌ＋ＣａＣｌ２２．５ｍｌで感作
第２１日：カクテル２．１６mg＋硫酸ナトリウム３ｍｌ＋ＣａＣｌ２３ｍｌで感作
第２４日：カクテル１．８０mg＋硫酸ナトリウム３ｍｌ＋ＣＦＡ３ｍｌで感作
第３１日：血液２０mlおよび血清２０ml採取
第６５日：カクテル０．５４mg＋硫酸ナトリウム２ｍｌ＋ＣａＣｌ２２ｍｌを
補助注射
第７２日：カクテル１．０８mg＋硫酸ナトリウム２ｍｌ＋ＣａＣｌ２２ｍｌを
補助注射
第７５日：カクテル１．６２mg＋硫酸ナトリウム２．５ｍｌ＋ＣａＣｌ２２．５ｍｌ            を補助注射
第７９日：血液５０ml採取
第８２日：血清５０ml採取
【０１０３】
実施例１２
時間と免疫応答との相関関係
実施例１１の記載にしたがって、ラクダ２（Ｄ２）に異なる抗原を注射した。血液を採取し、凝血後、血清を除去する。
マキシソルブプレートをそれぞれ下記の酵素で４℃にて一夜コーティングした。
リゾチーム（３μg／ml  ＰＢＳ）
ウシ赤血球炭酸デヒドラターゼ（４μg／ml  ＰＢＳ）
ブタ膵臓α−アミラーゼ(３μg／ml  ＰＢＳ）
ＲＮアーゼＡ
酵素の免疫感作操作をする前に、室温にて、マキシソルブプレートを０．２５％グルタルアルデヒドで３０分間処理した。水で洗浄し、次いで、１０μg／ml  ＰＢＳのＲＮアーゼＡを加え、さらに４℃で一夜インキュベートした。
１％カゼイン／ＰＢＳ溶液で少なくとも２時間、室温にてブロックした。
血清を１％カゼイン／ＰＢＳ溶液で希釈した。個々のウエルに１００μｌの希釈血清を加え、室温で１時間インキュベートした。
結合したＩｇＧをウサギポリクローナル抗ラクダＩｇＧ血清（０．１％カゼイン／ＰＢＳ中、１／１０００）およびヤギ―抗―ウサギＩｇＧアルカリフォスファターゼ複合体（０．１％カゼイン／ＰＢＳ中、１／１０００希釈）で検出した。各ステップの間にウエルを２００μｌ  ＰＢＳ／０．１％Ｔｗ２０で洗浄した。
【０１０４】
ＥＬＩＳＡ緩衝液（０．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む、１０％ジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８）中の濃度２ｍｇ／ｍｌのｐ―ニトロ―フェニル―ホスフェートの溶液１００μｌを加え、２０分後、Labsystems Multiscan RC ELISAプレートリーダーで４０５ｎｍにおけるＯＤを測定した。光学密度のバックグラウンドは補正しなかった。
【０１０５】
実施例１３
フラクション化したＤ２／５４のＩｇＧの固相結合
１．ＩｇＧのフラクション化
第５４日のラクダ血清１ｍｌをタンパク質Ｇ／Ａでフラクション化した。２７８ｎｍにて、ε１％＝１３．５を仮定して、分光光度計でタンパク質濃度を決定した。
２．マキシソルブプレートのコーティング
マキシソルブプレートをそれぞれ下記の酵素で冷室にて一夜コーティングした。
リゾチーム、シグマＬ６８７６（３μg／ml  ＰＢＳ）
ウシ赤血球炭酸デヒドラターゼ、シグマＣ３９３４（４μg／ml  ＰＢＳ）
ブタ膵臓α−アミラーゼ、Ａ６２５５(３μg／ml  ＰＢＳ）
ＲＮアーゼＡ
酵素の免疫感作操作をする前に、室温にて、マキシソルブプレートを０．２５％グルタルアルデヒドで３０分間処理した。水で洗浄した後、次いで、１０μg／ml  ＰＢＳのＲＮアーゼＡを加え、さらに４℃で一夜インキュベートした。
１％カゼイン／ＰＢＳ溶液で少なくとも２時間、室温にてブロックした。
３．結合したＩｇＧの検出
５０００〜３９ｎｇ／ｍｌの異なる固定抗原を用いて、精製したＩｇＧを個々にテストした。０．１％カゼイン／ＰＢＳ溶液で希釈した。
個々のウエルに希釈した抗体溶液１００μｌを加え、１時間インキュベートした後、結合したＩｇＧを総ウサギ血清抗ラクダＩｇＧ−ホームメイドおよび抗−ウサギ−アルカリフォスファターゼ複合体（シグマＮｏ．８０２５）で検出した。これらの試薬を０．１％カゼイン／ＰＢＳ溶液で希釈し、１：１０００希釈で使用した。各ステップの間にウエルを２００μｌのＰＢＳ／０．１％Ｔｗ２０で５回洗浄した。
最後に、ＥＬＩＳＡ緩衝液（０．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む、１０％ジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８）中の濃度２ｍｇ／ｍｌのｐ―ニトロ―フェニル―ホスフェートの溶液１００μｌを加え、１０分後、Labsystems Multiscan RC ELISAプレートリーダーで４０５ｎｍにおけるＯＤを測定した。
光学密度のバックグラウンドは補正しなかった。
【０１０６】
実施例１４
ラクダ重鎖ＩｇＧのいくつかのエピトープはキャビティである
長いＣＤＲ３ループをもつ重鎖ＩｇＧが、天然のタンパク質の表面に存在するキャビティ、キャニオンまたはクレフトに結合するのを好むことを立証するために、いくつかの実験を行った。
【０１０７】
酵素の活性部位は、最も大きなクレフトに存在することが多いので、重鎖抗体は、インヒビターの開発に特に適している。
【０１０８】
同様のα−アミラーゼおよび炭酸デヒドラターゼに対し、競合的インヒビターの存在または不在下において行った結合実験から、重鎖ＩｇＧの実質的フラクションが活性部位に結合することがわかった。
１．ウシ膵臓α−アミラーゼ
１ｍＭのアカルボース（Ｋｉ＝１０−６Ｍのシュードヘプタサッカライド）の存在または不在下における、フラクション化されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３（２５００〜１９．５ｎｇ／ｍｌ）の固相酵素に対する結合。
マキシソルブプレートを１．５μｇ／ｍｌＰＢＳのウシ膵臓α−アミラーゼで４℃にて一夜コーティングした。プレートを１％カゼイン／ＰＢＳ溶液でブロックした。結合したラクダ免疫グロブリンを抗ラクダ抗血清（Ｒ１７、１：１０００希釈）およびヤギ抗−ウサギ−アルカリフォスファターゼ複合体（シグマ、１：１０００希釈）で検出した。各ステップの間にウエルを２００μｌのＰＢＳ／０．１％Ｔｗ２０で５回洗浄した。
最後に、ＥＬＩＳＡ緩衝液（０．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む、１０％ジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８）中の濃度２ｍｇ／ｍｌのｐ―ニトロ―フェニル―ホスフェートの溶液１００μｌを加え、１０分後、Labsystems Multiscan RC ELISAプレートリーダーで４０５ｎｍにおけるＯＤを測定した。光学密度のバックグラウンドは補正しなかった。
これらの実験から、アミラーゼ特異的重鎖抗体の実質的部分が、酵素の活性部位に結合するかまたは接近するという結論を導くことができる。より重要なことは、抗原に対するＩｇＧ１サブクラスの結合は、インヒビターによって影響を受けないという観察結果である。
２．ウシ赤血球炭酸デヒドラターゼ
１ｍＭのドロゾールアミド（Ｋｉがナノモルレンジの競合的インヒビター）の存在または不在下における、フラクション化されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３（２５００〜１９．５ｎｇ／ｍｌ）の固相酵素に対する結合。
マキシソルブプレートを４μｇ／ｍｌＰＢＳの炭酸デヒドラターゼで４℃にて一夜コーティングした。プレートを１％カゼイン／ＰＢＳ溶液でブロックした。結合したラクダ免疫グロブリンを抗ラクダ抗血清（Ｒ１７、１：１０００希釈）およびヤギ抗−ウサギ−アルカリフォスファターゼ複合体（シグマ、１：１０００希釈）で検出した。各ステップの間にウエルを２００μｌのＰＢＳ／０．１％Ｔｗ２０で５回洗浄した。
最後に、ＥＬＩＳＡ緩衝液（０．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む、１０％ジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８）中の濃度２ｍｇ／ｍｌのｐ―ニトロ―フェニル―ホスフェートの溶液１００μｌを加え、１０分後、Labsystems Multiscan RC ELISAプレートリーダーで４０５ｎｍにおけるＯＤを測定した。光学密度のバックグラウンドは補正しなかった。
これらの実験から、この酵素に対する活性部位バインダーは、ＩｇＧ３サブクラスのみに存在するという結論を導くことができる。
【０１０９】
実施例１５
Ｄ２／６１のＩｇＧ３のＶＨＨによる膵臓アミラーゼの阻害
固相酵素への結合において競合的インヒビターアカルボースが重鎖抗体に競合しえたという観察結果に基づいて、次の実験を行い、これらの抗体の一部が酵素の酵素活性を阻害するということを立証した。酵素活性の低下の原因となる免疫沈降を除外するために、フラクション化された抗体がポリ反応性であり、かつポリクローナルであるように、ＩｇＧ３のＶＨＨフラグメントのフラクションを調製した。
【０１１０】
０．１Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８）中のＳ．ａｕｒｅｕｓＶ８のエンドＧｌｕプロテイナーゼ（ベーリンガー）（１／５０、重量／重量、酵素／タンパク質）で２時間処理することによって、Ｄ２／６１のＩｇＧ３フラクション由来のこれらのＶＨＨを作製した。切断効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。ＰＢＳに対して透析をした後、タンパク質Ｇクロマトグラフィーによって、非切断物質およびＦｃ−フラグメントを除去した。カラムのフロースルーには、ＶＨＨフラグメントが含まれていた（実施例１６参照）。
【０１１１】
Ecoline(登録商標)２５アミラーゼアッセイ（メルク−ＣＮＰＧ３法）を用いて、残留酵素活性を測定した。カオトロープが誘発する解離を回避するために、出来合いの基質溶液をＰＢＳで１０倍に希釈して、ＫＳＣＮ濃度を９０ｍＭまで低下させる。
【０１１２】
ブタ膵臓α−アミラーゼ（シグマＡ−６２５５）を０．１％カゼインＰＢＳで希釈して、濃度を１．５μg／ｍｌにし、次いで、精製したＶＨＨフラグメント１００μｌとともに、この溶液５０μｌをインキュベートする（タンパク質濃度２００μｇ／ｍｌ）。６０分間プレインキュベートした後、混合物の一部を１０倍希釈基質溶液に添加することによって酵素活性を測定した。５分間のＯＤ４０５の増加から、酵素活性を算出した。酵素活性は、ＶＨＨフラグメント不在下で測定した酵素活性と比較して、６５％に減少したが、このことは、阻害抗体が存在することを立証するものである。
【０１１３】
実施例１６
Ｄ２／６１のＩｇＧ３のＶＨＨの切断および精製
０．１Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８）中のＳ．ａｕｒｅｕｓＶ８のエンドＧｌｕプロテイナーゼ（１／５０、重量／重量、酵素／タンパク質）で２時間処理することによって、第６１日に採血したラクダ２（Ｄ２／６１）のＩｇＧ３フラクションのＶＨＨ（１．７２ｍｇ／ｍｌ）を作製した。切断効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。ＰＢＳに対して透析をした後、タンパク質Ｇクロマトグラフィーによって、非切断物質およびＦｃ−フラグメントを除去した。カラムのフロースルーには、ＶＨＨフラグメントが含まれていた。ＶＨＨトップフラクションＶＨＨのタンパク質濃度を分光光度計で測定した（Ｅ１％＝２０）。このフラクションを用いて阻害アッセイを行った。
【０１１４】
０．１Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８）中のＳ．ａｕｒｅｕｓＶ８のエンドＧｌｕプロテイナーゼ（１／５０、重量／重量、酵素／タンパク質）で２時間処理することによって、Ｄ２／６１のＩｇＧ３フラクションの切断を行った。
１．分子量マーカー
２．未切断のＩｇＧ３
３．２時間後、エンドＧｌｕプロテアーゼＶ８で切断
４−５−６．タンパク質Ｇセファロースカラムのフロースルー
７−８−９．グリシン／塩酸（ｐＨ２．７）によるンパク質Ｇセファロースの溶離
【０１１５】
実施例１７
末梢血液リンパ球の調製
４頭のヒトコブラクダを用いた。各ヒトコブラクダからそれぞれ約７ｍｌの血液を採取し（ＥＤＴＡ溶液）、４℃で輸送する。血液を同量の滅菌ＰＢＳで希釈し、５０ｍｌのチューブ（Wak chemie）の頂部に入れる。チューブを２０℃、１０００ｇで２０分間遠心（２２００ｒｐｍ）する。
【０１１６】
グリッドより上の液体を５０ｍｌのファルコンチューブに移す（血小板を排除するために、上清を除去し、グリッドのすぐ上にバンドを形成しているリンパ球のみを集める方がよい）。
【０１１７】
４℃で１５分間、２５００ｒｐｍにて細胞を遠心降下させる。ペレットを０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁させる。１０μｌのアリコートを３００μｌのＰＢＳで希釈した後、細胞を計数する。各フラクションは、１ｍｌ当たり、およそ３．１０７個の細胞を含んでいた。赤血球細胞のみが少数派であった。１００ｍｌチューブ５本にそれぞれアリコートをエッペンドルフピペットで加え、２５００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを−８０℃で凍結する。各チューブには、３．１０６個の細胞が含まれる。
【０１１８】
実施例１８
末梢血液リンパ球由来のＶＨＨライブラリーの構築および選り分け
ｍＲＮＡの調製
第５４日のヒトコブラクダ２（Ｄ２）から採取した凍結したリンパ球（チューブ２本、各５×１０６個のリンパ球／チューブ）を用いて、マイクロ−ファスットトラックキット（インビトロゲン）にてｍＲＮＡを単離した。水２０μｌにて、オリゴ−Ｔ固体支持体からｍＲＮＡを溶離した。分光光度計（１のＯＤ２６０ｎｍは、３５μｇ／ｍｌである）で測定した、ｍＲＮＡの合計収量は、１．５μｇであった。
ｃＤＮＡの調製
ｃＤＮＡサイクルキット（インビトロゲン）を用い、キットの使用説明書にしたがって、１．５μｇのｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈降によってｃＤＮＡを精製した。ｃＤＮＡを１００μｌの水に再懸濁した。
ＶＨＨのＰＣＲ増幅
ＰＣＲのテンプレートとして使用する１μｌのｃＤＮＡサンプルを用い、２つの遺伝子特異的プライマーＣＨ２ＦＯＲＴＡ４およびプライマーＳＭ０１７とＳＭ０１８の等モル混合物を用い、２．５ユニットのTag ポリメラーゼ（ベーリンガー）を加えた合計体積１００μｌの緩衝液中、ＶＨＨを増幅した。９４℃で１分間変性し、５５℃で１分間アニーリングし、次いで７２℃で１分間延長した。このサイクルを３５回繰り返した。
2009040780.tif 000012
０．５μｇの臭化エチジウム／ｍｌ  ＴＢＥ中、１．０％アガロースゲル上でゲル電気泳動を行った後に可視化したところ、３６０〜４２０ｂｐであった。
【０１１９】
このＰＣＲ産物をテンプレートとして用い、重ね合わせたプライマーＡ４ＳＨＯＲＴ（ＳｆｉＩ部位（下線）を含み、３’末端の１５ヌクレオチドが、ＳＭ０１７およびＳＭ０１８の１５ヌクレオチドとオーバーラップしている）とＦＲＷＲＫ４ＦＯＲ）（ＮｏｔＩ部位（下線））で再増幅した。
2009040780.tif 000013
【０１２０】
２０本のチューブの増幅産物を混合し、Geneclean(Bio 101, Inc.)で精製し、５０ユニットのＮｏｔＩおよび５０ユニットのＳｆｉＩ（Gibco-BRL）(総体積２００μｌ)を用い、３７℃にて一夜切断した。切断した物質をGenecleanで再度精製した。
【０１２１】
ｐＨＥＮ４ベクターの作製
ｐＨＥＮ１ファージミドベクター（Hoogenboomら、Nucleic acid Research,19,4133-4137,1992）のマルチクローニング部位の周囲の領域を修飾し、にｐｅｌＢリーダーシグナル内のＳｆｉＩおよびＮｃｏＩ部位、および（MullinaxらのProc. Natl. Acad. Sci.,USA,87,8095-8099,1990）のヘマグルチニンタグに先立つＮｏｔＩ部位を含むようにした(図８）。
2009040780.tif 000014
ＰｅｌＢリーダーシグナル：４０−１０５
ＨＡ−ｔａｇ：１５７−１８６
ｇｅｎ ＰＩＩＩ：１９９で開始
ファージミド（４０μｇ）をＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで一夜切断した。クローニングベクターをアガロースゲル電気泳動およびGenecleanで精製した。切断されたｐＨＥＮ４を水４０μｌでガラスミルク（Geneclean）から溶離した。
【０１２２】
ＶＨＨ−ベクターのライゲーション
ＳｆｉおよびＮｏｔで切断したベクターおよび精製したＶＨＨ Ｓｆｉ−Ｎｏｔフラグメントをアガロースゲル上に展開し、臭化エチジウム蛍光法により、サンプルの濃度を測定する。これらの測定値に基づき、ベクター４０μｌ（２０μｇ）およびＶＨＨ４０μｌ（５μｇ）を混合し（予測モル比１：４）、総体積１００μｌ、１６℃、ライゲーション緩衝液（１倍）およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）３０ユニットにて一夜ライゲートした。その後、０．４Ｍ ＬｉＣｌの存在下、フェノール処理（phenolization）およびエタノール沈降法によって、ＤＮＡを精製した。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、最後に水１００μｌに再度懸濁する。
【０１２３】
電気的競合細胞
電気的競合細胞を作成するために、最小培地プレート上で単離したＴＧ１大腸菌コロニーのプレ培養を開始した。このプレ培養物をＭｇＳＯ４を加えた２ｘＴＹ培地１００ｍｌに移し、ＯＤが０．５に達するまで（６００ｎｍ）１８℃で成長させる。遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）によって細胞を集め、水で数回（少なくとも５回）洗浄した。最終の細胞ペレットを７％ＤＭＳＯ（１ｍｌ）に再懸濁し、次に使用するまで、５０μｌのアリコートを−８０℃で貯蔵する。５×１０８／μｇ ｐＵＣ以上の形質転換効率が得られた。
【０１２４】
形質転換およびライブラリーの構築
氷上に保持した２ｍｍ電気穿孔キュベット（EUROGENTEC、ベルギー）中のライゲートしたＤＮＡサンプルのアリコート１μｌに、５０μｌの電気的競合ＴＧ１細胞を加えた。電気的形質転換（２．５ｋＶ，２５μＦ、２００オーム）後、細胞を迅速にＳＯＣ培地（１ｍｌ）に移し、３７℃で１時間インキュベートする。これらのチューブ７０本を混合し、１００μｇのアンピシリン／ｍｌを含む、総量５０のラージ（２４．３×２４．３ｃｍ）ＬＢ寒天平板に載せ、形質転換した細胞を選択し、３７℃で一夜インキュベートした。少なくとも５×１０６個の形質変換物が得られ、２ｘＴＹ培地でこれらを平板からこすり落とし、２ｘＴＹとともに遠心分離することにより洗浄し、最後に、１００ｍｌの２ｘＴＹ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１％グルコースおよび５０％グリセロールに再懸濁した。次に使用するまで、細菌懸濁物は、−８０℃で凍結した。
【０１２５】
Ｍ１３Ｋ０７ヘルパー相の作製
Ｍ１３Ｋ０７を含む大腸菌細胞のプレ培養物を、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを加えた２ｘＴＹ培地１リットルに植え、激しく震とうしながら３７℃にて一夜インキュベートする。遠心分離（１５分、８０００ｒｐｍ）を２回行って最近を除去する。上清中に残っている細菌細胞を５５℃に加熱して３０分間インキュベートすることにより不活性化する。０．２μフィルターで上清をろ過する。ＰＥＧ沈殿法により、ファージを濃縮することができる。濃縮終了時に、１／５容の２．５Ｍ ＮａＣｌ、２０％ＰＥＧ８０００（２００ｍｌ）を上清１リットルに加え、混合物を少なくとも１時間氷上に保持する。
サンプルを５０００ｒｐｍで４０分間、あるいは１３０００ｒｐｍで１５〜２０分間遠心分離する。Ｍ１３Ｋ０７ペレットを滅菌ＰＢＳ(１０ｍｌ）に再懸濁する。ファージの濃度を、分光光度計で測定する（２６０ｎｍにおけるＯＤ１が４×１０１０個のファージ／ｍｌに対応する）こともできるが、あるいは１０ｍＭのＭｇＣｌ２中の連続希釈物を指数成長しているＴＧ１細胞に添加し、該細胞をカナマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＬＢ平板に植えることによって力価を決定することもできる。（Ｍ１３Ｋ０７は、カナマイシン耐性遺伝子をもっている）。ファージの力価は少なくとも１０１２ファージ／ｍｌにまでもってゆく。
【０１２６】
ファージの救出および選り分け
１．ファージの救出
【０１２７】
形質転換された細胞またはｐＨＥＮ４組換体を含む細胞を２ｘＴＹ、アンピシリン（１００μg／ｍｌ）、１％グルコースにおいて成長させる。細胞を一回ペレット化し、培養物をＯＤ０．６（６００ｎＭ）にする。細胞ペレットを２ｘＴＹ培地で洗浄し、アンピシリン（１００μg／ｍｌ）を追加した同じ培地に懸濁させる。感染多重度を１０〜２０にて細胞をＭ１３Ｋ０７に感染させる。室温にて２０分間インキュベートした後、細胞懸濁液に７０μgカナマイシン／ｍｌを加え、３７℃で一夜激しく震とうしながらインキュベートする。
【０１２８】
まず、遠心分離ステップ（５０００rpm、１５分間）によって細菌細胞を除去し、０．４または０．２μｍフィルターでろ過することによってウイルス粒子およびビリオンを精製する。１／４容のＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を添加し、少なくとも１時間氷上でインキュベートすることによってファージを沈殿させる。１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより、ファージをペレット化する。約１ｍｌのＰＢＳ中にファージを再懸濁し、０．２５ｍｌのＰＲＧ溶液を加えて、さらにインキュベートする場合もあった。氷上で３０分間インキュベートした後、エッペンドルフ遠心分離管を用い、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによってファージをペレット化することができる。ファージをＰＢＳ（１００μｌ）に再懸濁する。ＵＶ吸収（２６０ｎｍ）によってファージの濃度を測定する。ＯＤ１は２２×１０１０ファージ／ｍｌのファージ濃度または４４×１０１０ファージミドビリオン／ｍｌの濃度に相当する。１％カゼイン含有ＰＢＳでファージ／ファージミドの濃度を１０１２／ｍｌに到達させ、選り分けに用いる。
【０１２９】
２．選り分け
二種類の方法で選り分けを行った。ひとつの方法では、ナンク（Nunc）免疫管（Nunc maxisop、スターチューブ）を用いて抗原を４℃にて一夜コートした〔アミラーゼ１ｍｌ（１００μｇ／ｍｌ ＰＢＳ）、リゾチーム１ｍｌ（２００μｇ／ｍｌ ＰＢＳ）またはＲＮアーゼＡ１ｍｌ（１００μｇ／ｍｌ ＴＢＳ／ＣａＣｌ２、０．２５％グルタルアルデヒド）〕。救出されたビリオンとともにインキュベーションする前に、滅菌ＰＢＳでチューブを１０回洗浄した。１時間インキュベーションした後、滅菌ＰＢＳ，Ｔｗｅｅｎで少なくとも１０回洗浄することにより、未結合のビリオンおよびファージを除去する。トリエチルアミン１ml（０．１Ｍ）を添加することにより、結合したビリオンおよびファージを溶離し、室温で５分間インキュベートし、０．５ｍｌの１Ｍトリス，ｐＨ７．４で中和する。指数的に成長するＴＧ１細胞２ｍｌを加え、２０分間インキュベートした後、細胞をＬＢ／アンピシリンプレートに載せる。翌日、コロニーをプレートから擦り取り、次のＭ１３Ｋ０７で救出した後の選り分けラウンドに用いる。
第二の方法では、抗原を固定するためにマイクロタイタープレートの４個のウエルを用いた（１００μｌ容／ウエルを使用する以外は、上述したとおり）。ウエルを洗浄し、ファージ／ファージミドとともにインキュベートし、上述したとおり、ＴＧ１感染を行う。ブロッキング剤（１％カゼイン／ＰＢＳ）のみでコートしたウエルにウイルス粒子を添加することにより、バックグラウンドを測定する。４種の異なる抗原から得られる結果は次のとおりである：
第１ラウンド          インプット    溶出              バックグラウンド
アミラーゼ            ４×１０１０    ０．０６×１０６  ０．０２５×１０６
炭酸デヒドラターゼ    ４×１０１０    ０．０６×１０６  ０．０２５×１０６
リゾチーム            ４×１０１０    ０．１×１０６    ０．０２５×１０６
ＲＮアーゼＡ          ４×１０１０    ０．０６×１０６  ０．０２５×１０６
第２ラウンド          インプット    溶出              バックグラウンド
アミラーゼ            ４×１０１１    １．３×１０６    ０．２７×１０６
炭酸デヒドラターゼ    ４×１０１１    １．３×１０６    ０．０５６×１０６
リゾチーム            ４×１０１１    ０．２６×１０６  ０．２×１０６
ＲＮアーゼＡ          ４×１０１１    １．３×１０６    ０．０４８×１０６
第３ラウンド          インプット    溶出              バックグラウンド
アミラーゼ            ４×１０１０    ０．０６×１０６  ０．０８×１０６
炭酸デヒドラターゼ    １×１０８     ０．０６×１０６  ０．００８×１０６
リゾチーム            １×１０１０    ０．１×１０６    ０．０１６×１０６
ＲＮアーゼＡ          １×１０１０    ０．０６×１０６  ０．００４×１０６
個々のバインダーの選択
【０１３０】
選り分けの最後のラウンドを行った後、プレートからランダムに２４個のクローンを選び、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２ｘＴＹ中で細胞を成長させることによって、抗原バインダーを選択する。２つのプロトコルを用いて抗原結合ＶＨＨの存在を検出した。細胞が指数成長期に到達したときに１ｍＭのＩＰＴＧでＶＨＨの発現を誘発するか、またはＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージに細胞を感染させるかのいずれかを行った。前者の方策では、培養物の上清を抗―ＨＡ―タグ（クローン  ＢＢＢＢＢ  ＡｂＣｏ）でＥＬＩＳＡに付すことによりｃＡｂの抗原結合能力をチェックすることができた。第二の方策では、抗−Ｍ１３検出キット（ファルマシア）を用いるＥＬＩＳＡによって、先端に抗原バインダーをもつビリオンのスクリーニングを行った。
【０１３１】
ＥＬＩＳＡ実験またはファージＥＬＩＳＡでは、炭酸デヒドラターゼによる選り分けを行った２４個のクローンのうち２３個が炭酸デヒドラターゼに結合していた。これらのクローンにＣＡ０１からＣＡ２４までの番号をつけた。ＲＮアーゼＡ選り分けについては、２４個のクローンすべてが陽性という評点であり、これらにＲＮ０１からＲＮ２４の番号をつけた。ＲＮ０１からＲＮ１２までのクローン由来のプラスミドＤＮＡを調製し、挿入物の配列決定を行った。ＲＮ０２およびＲＮ０６は、同一であり、ＲＮ０６を選んだ。他のクローンのすべては、第二セットのために選ばれたＲＮ０５クローンと同一である
【０１３２】
炭酸デヒドラターゼの１２個のクローン（ＣＡ０１〜ＣＡ１２）の配列決定を行った。配列は、ＣＡ０１＝ＣＡ０６＝ＣＡ０７＝ＣＡ０９＝ＣＡ１２であり、ＣＡ０４およびＣＡ１０のクローンはユニークであり、ＣＡ０２、ＣＡ０３、ＣＡ０５、ＣＡ０８およびＣＡ０８は、ＣＡ０５のＣＤＲ３にサイレント突然変異が存在し、第１アミノ酸（ＰＣＲプライマーによって押し込まれている）が異なる以外は同一である少なくとも４つの異なるセットのクローンが生じたので、ＣＡ０４、ＣＡ０５、ＣＡ０６、ＣＡ１０を選ぶ。
【０１３３】
ＣＡ０４およびＣＡ０５の核酸配列を実施例１９で得る。ＣＡ０４およびＣＡ０５の両方のクローンが、確かに重鎖抗体に由来し、普通の抗体（軽鎖をもつ）に由来しないＶＨＨであることがわかりうる。キーマーカーＳｅｒ１１（コドン３１〜３３ｎｃ）、Ｐｈｅ３７（コドン１０９〜１１１ｎｃ）、Ｇｌｕ４４−Ａｒｇ４５（コドン１３０〜１３５ｎｃ）およびＧｌｙ４７（コドン１３９〜１４１ｎｃ）が存在することから、この説が提出される。余分のシステイン（ＣＡ０４においてコドン９７〜９９ｎｃおよびコドン３１３〜３２１ｎｃ、またはＣＡ０５においてコドン３１９〜３２１ｎｃ）の存在によって示されるように、両者ともに、ＣＤＲ１とＣＤＲ３の間にジスルフィド結合が存在する可能性があることもまた、ラクダＶＨＨにはしばしば観察されることである。１８アミノ酸からなるＣＡ０４の長いＣＤＲ３（コドン２９５〜３４８ｎｃ）および１９アミノ酸からなるＣＡ０５の長いＣＤＲ３（コドン２８９〜３４５ｎｃ）は、両方のｃＡｂがｃＡｂ−Ｌｙｓ３のループに類似した、長い第３の超可変ループをもつことを示している。
【０１３４】
ＣＡ０４は炭酸デヒドラターゼの活性部位に結合するが、ＣＡ０５は結合しないことが実施例１８において示される。炭酸デヒドラターゼの結晶構造がわかっており、この酵素の活性部位が、酵素の第二の最も大きなグルーブのみであるというることから、このことは、ＣＡ０５の長いループが抗原のグルーブに結合することができないということを意味しない。最も大きなグルーブは、活性部位とは反対の端に位置し、ＣＡ０５の長いＣＤＲ３ループは、このグルーブに結合すると考えられる。
【０１３５】
３種の方法で選り分けを行った。第１の方法では、ナンク免疫管を用いて抗原（アミラーゼ、炭酸デヒドラターゼ、リゾチームおよびＲＮアーゼＡ）をコートする。救出されたビリオンとともにインキュベーションする前に、滅菌ＰＢＳでチューブを１０回洗浄した。１時間インキュベーションした後、滅菌ＰＢＳ，Ｔｗｅｅｎで少なくとも１０回洗浄することにより、未結合のビリオンおよびファージを除去する。トリエチルアミン１ml（０．１Ｍ）を添加することにより、結合したビリオンおよびファージを溶離し、室温で５分間インキュベートし、０．５ｍｌの１Ｍトリス，ｐＨ７．４で中和する。指数的に成長するＴＧ１細胞２ｍｌを加え、２０分間インキュベートした後、細胞をＬＢ／アンピシリンプレートに載せる。翌日、コロニーをプレートから擦り取り、次のＭ１３Ｋ０７で救出した後の選り分けラウンドに用いる。
【０１３６】
第二の方法では、抗原を固定するためにマイクロタイタープレートの４個のウエルを用いた。溶離は、トリエチルアミン１００μｌで行う。
【０１３７】
実施例１８ａ
炭酸デヒドラターゼの活性部位へのラクダシングルドメイン抗体ＣＡ０４の結合
炭酸デヒドラターゼで選り分けた後に単離した２４個のクローンすべてを１ｍＭのＩＰＴＧで誘発した。ペリプラズムから、発現したラクダシングルドメインＶＨＨ（ｃＡｂ）を抽出し、マイクロタイタープレートのウエルに炭酸デヒドラターゼを固定するＥＬＩＳＡ実験に用いた。ペリプラズムから抽出されたタンパク質（１００μｌ）を、５０μｌのＰＢＳまたは５０μｌの２％ドロゾールアミド溶液（ＴＲＵＳＯＰＴ登録商標）または５０μlのアセタゾールアミド溶液（ＤＩＡＭＯＸ登録商標−シアナミド）の存在下でインキュベートした。１時間インキュベートした後、ウエルをＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎで洗浄し、０．１％カゼインＰＢＳ中、室温にて１時間、１／５０００ＢＡＢＣＯ抗−ＨＡ抗体をインキュベートし、洗浄し、ウサギ抗−マウスアルカリフォスファターゼ複合体（シグマ）の１／１０００希釈液とともにインキュベートした。基質は、ｐａｒｅニトロフェニルホスフェート（２ｍｇ／ｍｌ）であり、読み取りは、１０分後に４０５ｎｍにて行った（表）。
2009040780.tif 000015
【０１３８】
クローンＣＡ１５は、炭酸デヒドロターゼに結合しないかまたは弱く結合する。
クローンＣＡ１６は、ドロゾールアミドおよびアセタゾールアミドの両方によって一部交代されるのみである。
クローンＣＡ０２、ＣＡ０３、ＣＡ０５、ＣＡ０８、ＣＡ１０、ＣＡ１１、ＣＡ２３およびＣＡ２４のｃＡｂの結合は、活性部位結合剤によって交代されない。
クローンＣＡ０１、ＣＡ０４、ＣＡ０６、ＣＡ０７、ＣＡ０９、ＣＡ１２、ＣＡ１３、ＣＡ１４、ＣＡ１７、ＣＡ１８、ＣＡ１９、ＣＡ２０、ＣＡ２１、ＣＡ２２ｃＡｂの結合は、ドロゾールアミドおよびアセタゾールアミドの両方によって交代される。したがって、これらのｃＡｂは活性部位バインダーとみなされる。活性部位バインダーの比率は、２４個のクローンのうち１４である。ＣＡ０１からＣＡ１２の配列決定データから、活性部位バインダーにおいて少なくとも２つの異なるグループ（ＣＡ０４，ＣＡ０６）があることがわかる。
【０１３９】
実施例１９
Ｈｉｓ６タグをもつバインダーの再クローニングと発現およびｃＡｂの特徴付け
ｐＨＥＮ６での再クローニング
ｐＨＥＮ４のＮｏｔＩとＥｃｏＲＩ遺伝子の間のＨＡタグおよびＭ１３ ｐＩＩＩ遺伝子を６個のＨｉｓコドンで置換した。ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位のなかに、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３遺伝子を挿入した（‘ＴＣＡＣＧＣ’によって置換されたＶＨＨの最後のＳｅｒコドン‘ＡＧＣ’とともに、これは追加のＳｅｒ−Ａｒｇジペプチドを誘導することになる）。ｐＨＥＮ６−Ｌｙｓ３について次の配列が得られる（図）。
【０１４０】
酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）にとって最適の緩衝液および温度条件下で、プラスミドｐＨＥＮ６−Ｌｙｓ３をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断する。ｃＡｂ−Ｌｙｓ３を含むフラグメントを、ＮｃｏＩで処理することにより、さらに切断する。０．４ＭのＬｉＣｌの存在下、フェノライゼイションおよびエタノール沈降法によって、直線化したプラスミドＤＮＡを精製する。ＤＮＡを水２０μｌに再懸濁し、３μｌを使用して、アガロースゲル蛍光法によって濃度を測定し、残りの物質の濃度を１００ｎｇ／μｌまで到達させる。
【０１４１】
ｐＨＥＮ４−ＣＡ０４またはｐＨＥＮ４−ＣＡ０５をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩによって同様に切断する。ｃＡｂ−ＣＡ０４およびｃＡｂ−ＣＡ０５含有フラグメントをGenecleanを用いてアガロースゲルから精製する。およそ１００ｎｇのこれらのフラグメント（アガロースゲル蛍光法で測定）を１００ｎｇのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ切断ｐＨＥＮ６ベクターと混合し、総体積１０μｌにおいて２．５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）で室温にて一夜ライゲートする。ライゲートしたＤＮＡ（２μｌ）を電気的競合ＷＫ６細胞と混合し、ＬＢ／アンピシリンプレートに載せる。ｐＨＥＮ６−ＣＡ０４またはｐＨＥＮ６−ＣＡ０５を含むコロニーを、コロニーＰＣＲによってユニバーサル前後配列決定プライマーでスクリーニングする（標準的ＰＣＲ条件）。ｃＡｂ−Ｌｙｓ３挿入のためのより大きなＣＤＲを得るために、ＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩで切断し、得られるフラグメントを５％アクリルアミドゲルで分離して、残りのｐＨＥＮ６−Ｌｙｓ３およびｐＨＥＮ６−ＣＡ０４またはｐＨＥＮ６−ＣＡ０５の間で同定および識別を行う
【０１４２】
ポジティブであると評価されたコロニーのプラスミドをアルカリライシス法にて調製し、ジデオキシ配列決定のためのテンプレートとして用いる。ＨｉｎＤＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間のｐＨＥＮ６−ＣＡ０４またはｐＨＥＮ６−ＣＡ０５を図面に示す（ｃＡｂ−ＣＡ０４またはｃＡｂ−ＣＡ０５は太字で示し、ｈｉｓ６−タグは下線で示す）。
【０１４３】
タンパク質の発現および精製
プラスミドｐＨＥＮ６−ＣＡ０４またはｐＨＥＮ６−ＣＡ０５で新たに形質転換したＷＫ６細胞の一夜培養物を用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０．１％のグルコースを含む８リットルのＴＢ培地に植えた。３７℃で培養し、培養物の６００ｎｍにおける吸光度が０．７５〜１．０に達した後、最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えて発現を誘発し、２８℃でさらに１６時間細胞成長を続けた。本質的にSkerraおよびPluckthn（Science,240,1038-1041,1988）に従って、ペリプラズムフラクションを調製した。４℃にて４０００ｇで１０分間遠心分離して細胞を採集し、もとの体積の氷冷ＴＥＳ緩衝液（０．２Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  スクロース）中に再懸濁した。氷上で１時間インキュベートした後、１．５％体積の氷冷１：４希釈ＴＥＳ緩衝液を加えることによって、細胞に緩やかな浸透圧ショックを与えた。氷上で１時間インキュベートした後、４℃にて１３０００ｇで３０分間遠心分離し、最終濃度１ｍＭになるようにＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）を上清２００ｍｌに加え、ペリプラズムフラクションを作製した。
【０１４４】
アミコンセル（ＭＷ５ｋＤａのミリポアフィルター）で限外ろ過することによって、このペリプラズムフラクションを１０倍濃縮した後、２ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアフィニティーカラム（キアジェン）に入れる。４０ｍｌの５０ｍＭ硫酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール緩衝液で洗浄した後、Ｈｉｓ６個のタグ付けをしたシングルドメイン抗体を、同じ緩衝液中の直線濃度勾配が０〜０．５Ｍのイミダゾール４０ｍｌを用いて溶離した。ｃＡｂ−ＣＡ０４またはｃＡｂ−ＣＡ０５をそれぞれ含むフラクションを集め、限外ろ過によって１０倍濃縮し、スーパーデックス−７５（ファルマシア）カラムにＰＢＳ緩衝液を用いて通してイミダゾールを除去した。１．５ｍｇの純粋なタンパク質が得られ（２８０ｎｍにて分光光度計で測定）、限外ろ過によって３ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【０１４５】
実施例２０
競合的ＥＬＩＳＡによるＣＡ０４−ＨＩＳ構築物の親和性の測定
形質転換したＴＧ１細胞にＩＰＴＧで可溶性タンパク質の産生を誘発した。４０ｍｌの培養物から細胞を採取した後、ペリプラズムフラクションを調製した。簡単に述べると、氷冷ＴＥＳ（５０ｍＭのＴＲＩＳ１．２ｍｌ、ｐＨ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％スクロース）に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。遠心分離後、上清を除去し、ペレットを冷水１．２ｍｌに再懸濁した。懸濁液を氷上にさらに３０分間置いた。１４０００ｒｐｍで遠心分離後、上清を回収し、次の結合および競合アッセイに用いる。
【０１４６】
結合アッセイおよび競合アッセイのいずれにおいても、Maxisorbプレート（ナンク）に炭酸デヒドラターゼをＰＢＳ中の濃度１μｇ／ｍｌにてコートした（１００μｌ、４℃にて一夜）。プレートを２００μｌの１％カゼイン／ＰＢＳにて室温で２時間ブロックした。競合アッセイのために、０．１％カゼイン／ＰＢＳで１／１００に希釈した、濃度を１〜１０４ｎＭの間で変化させた遊離抗原と上清の混合物を調製した。これらの混合物１００μｌをプレートの異なるウエルに加えた。２時間後、結合したＣＡ０４−Ｈｉｓをヒスチジンタグ特異的モノクローナル抗体（Dianova、dia９００、マウスモノクローナル抗体ＩｇＧ１、抗（Ｈｉｓ）６タグ）、続いて、ウサギ抗−マウスアルカリフォスファターゼ複合体で検出した。、両方の第２試薬は、０．１％カゼイン／ＰＢＳで１／１０００に希釈して用いた。基質（１００μｌの２ｍｇ／ｍｌパラニトロフェノールホスフェート／ＥＬＩＳＡ緩衝液）を加え、１５分後、４０５ｎｍのＯＤを測定した。４０５ｎｍ対遊離抗原のＯＤのプロットから、５０ｎＭのＫｄが算出された。
【０１４７】
実施例２１
ＣＡ０４：炭酸デヒドラターゼ相互作用の親和性測定および動力学的分析
ＩＡｓｙｓバイオセンサー装置にて、ＣＡ０４炭酸デヒドラターゼ相互作用のｋｏｎ、ｋｏｆｆおよびＫｄを決定した。
ＩＡｓｙｓカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）キュベットを、次の相互作用に用いた。ＣＭＤマトリックスへの静電吸着および次に続く、ＣＭＤポリマー上のリシル基と活性化したカルボキシル基との共有反応によって、抗原をキュベットに固定した。ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングキット（アフィニティーセンサーズ）を用い、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学反応（Johnsonら）によって、カルボキシル基の活性化を行った。
【０１４８】
ＣＭＤキュベットの活性化の７分後に、１０ｍＭのＮａＡｃ緩衝液でキュベットを洗浄した。キュベットをＰＢＳで洗浄した後、続いて、１Ｍのエタノールアミン、ｐＨ８を加えて、残っている活性化カルボキシル基を不活性化した。不活性化した後、１０ｍＭのＮａＯＨによる洗浄を数回行って、共有的に結合していないすべての炭酸デヒドラターゼを除去した。固定化された抗原の量は、６ｎｇ／ｍｍ２であると算出された。飽和量のＣＡ０４をキュベットに加えることによって結合を化学量論的に評価したところ、０．４であった。
【０１４９】
すべての実験は、ＰＢＳ中２７℃にて行い、セッティＰＢＳ中２７℃にて行い、セッティング１００にて攪拌した。再生条件は最適条件であった。洗浄は１０ｍＭのＮａＯＨで１分間行った。
【０１５０】
ＣＡ０４の濃度を変化させて（２×１０−８Ｍ〜１．５×１０−７Ｍ）結合を追跡し、これを３回繰り返して平衡化した。曲線はＦＡＳＴｆｉｔ（アフィニティーセンサーズ）を用いると、一価指数的にフィットした。ベースライン補正も考慮に入れた。これらのフィットから得られた仮の一次速度定数をＣＡ０４の濃度に対してプロットした。線形回帰法により、ｋｏｎを決定したところ、６．２×１０５Ｍ−１Ｓ−１の値が得られた。マストランスポート制限が生じるので、この値を下限として用いる。これは、有意な曲率を示す高濃度のＣＡ０４についてのシグナル対シグナルをプロットすることによって見られる。
【０１５１】
０．６μＭの炭酸デヒドラターゼの存在下で、飽和量のＣＡ０４を添加した後にキュベットをＰＢＳで洗浄した場合の解離相を追跡した（３回）。ＦＡＳＴｆｉｔソフトウェア（アフィニティーセンサーズ）を用いて曲線をフィットさせた。
曲線は、遅い相が再結合の結果として説明され、速い相が実際の脱離速度を反映するような二価指数的にフィットした。この値は、等しく０．０２ｓ−１である。
【０１５２】
動力学的分析に基づいてＫｄを算出した値は、３２ｎＭである。
【０１５３】
Ｋｄの値もまた、平衡値に対してＣＡ０４濃度（３×１０−８Ｍ〜１×１０−７Ｍ）をプロットすることによって決定し、再度ＦＡＳＴｆｉｔ（アフィニティーセンサーズ）を用いると、双曲線関係にフィットした。この分析から得られたＫｄの値は、６０ｎＭである。
【０１５４】
実施例２２
ＣＡ０４−Ｈｉｓによるウシ赤血球炭酸デヒドラターゼの阻害
炭酸デヒドラターゼ（シグマ、Ｃ−３９３４）をＰＢＳに溶解し、タンパク質濃度を、２８０ｎｍ（Ｅ１％＝１９）にて分光光度計を用いて決定した。
【０１５５】
精製したＣＡ０４−Ｈｉｓの濃度を、算出された吸光係数Ｅ１％＝１７を用いて決定した（ＰｃＧｅｎｅ）。固定最終濃度２．３μＭの酵素に、一定定体積（６０μｌ）のＣＡ０４−Ｈｉｓの濃度を変化させて（１〜８μＭ）混合した。室温にて１５分間プレインキュベートした後、ＰＢＳ９４５μｌおよびパラニトロフェニルアセテート５μｌ（２％無水エタノール溶液）（Pocker Y.およびStone J.T.，Biochemistry,6,1967,668−678）を加えた。反応混合物を迅速にキュベットに移し、少なくとも５分間室温にてＯＤ４０５ｎｍをモニターした。基質の同時加水分解に対し、酵素反応速度を補正した。ＣＡ０４−Ｈｉｓのない条件下で測定された酵素活性と比較して残りの活性を算出した。
【０１５６】
実施例２３
破傷風菌毒素のインビボ中和
Simptonらの記載（J.Pharm.Exp.Therapeutics,254,98-103,1990）に従って、破傷風菌毒素の中和を行った。８〜１２週齢の６４匹のＮＭＲＩマウス（雄性および雌性）をランダムに８つのグループに分ける（雄性４および雌性４）。マウスに腹腔内注入にて破傷風菌毒素（ＲＩＴ、スミスクラインビーチャム、Rixensart、ベルギー）、抗体フラグメント、あるいは両方を次のように注入する。
グループ１  ＰＢＳ＋ｃＡｂ−ＴＴ１
グループ２  ＰＢＳ＋ｃＡｂ−ＴＴ２
グループ３  ＰＢＳ＋破傷風菌毒素（１０×ＬＤ５０）
グループ４  ＰＢＳ＋破傷風菌毒素（１０×ＬＤ５０）＋ｃＡｂ−ＴＴ１（４μｇ）
グループ５  ＰＢＳ＋破傷風菌毒素（１０×ＬＤ５０）＋ｃＡｂ−ＴＴ１（４０μｇ）
グループ６  ＰＢＳ＋破傷風菌毒素（１０×ＬＤ５０）＋ｃＡｂ−ＴＴ２（４μｇ）
グループ７  ＰＢＳ＋破傷風菌毒素（１０×ＬＤ５０）＋ｃＡｂ−ＴＴ２（４０μｇ）
グループ８  ＰＢＳ＋破傷風菌毒素（１０×ＬＤ５０）＋非特異的ｃＡｂ−ＶＨＨ２１（４０μｇ）
注入総量は、すべての場合において０．１ｍｌである。注入前にＶＨＨと破傷風菌毒素の混合物を室温にて３０分間インキュベートする。マウスは二週間観察する。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】本発明認識分子の図的表現である。
【図２−１】ｃＡｂ−ＴＴ１のアミノ酸およびヌクレオチド配列である。
【図２−２】ｃＡｂ−ＴＴ２のアミノ酸およびヌクレオチド配列である。
【図２−３】ｃＡｂ−Ｌｙｓ２のアミノ酸およびヌクレオチド配列である。
【図２−４】ｃＡｂ−Ｌｙｓ３のアミノ酸およびヌクレオチド配列である。
【図３ａ】リゾチームに対する機能時間中の免疫応答を示す。実施例１２を参照せよ。
【図３ｂ】炭酸デヒドラターゼウシ赤血球に対する機能時間中の免疫応答を示す。実施例１２を参照せよ。
【図３ｃ】リボヌクレアーゼに対する機能時間中の免疫応答を示す。実施例１２を参照せよ。
【図３ｄ】α−アミラーゼに対する機能時間中の免疫応答を示す。実施例１２を参照せよ。
【図４ａ】アミラーゼ、リゾチームおよび炭酸デヒドラターゼのＲＮＡアーゼＡに対する、Ｄ２／５４のフラクション化されたＩｇＧの固相結合を示す。実施例１３参照。
【図４ｂ】アミラーゼ、リゾチームおよび炭酸デヒドラターゼのＲＮＡアーゼＡに対する、Ｄ２／５４のフラクション化されたＩｇＧの固相結合を示す。実施例１３参照。
【図４ｃ】アミラーゼ、リゾチームおよび炭酸デヒドラターゼのＲＮＡアーゼＡに対する、Ｄ２／５４のフラクション化されたＩｇＧの固相結合を示す。実施例１３参照。
【図４ｄ】アミラーゼ、リゾチームおよび炭酸デヒドラターゼのＲＮＡアーゼＡに対する、Ｄ２／５４のフラクション化されたＩｇＧの固相結合を示す。実施例１３参照。
【図５ａ】異なるＩｇＧに対するウシおよび膵臓α−アミラーゼの光学密度を示す。実施例１４参照。
【図５ｂ】異なるＩｇＧに対するウシおよび膵臓α−アミラーゼの光学密度を示す。実施例１４参照。
【図５ｃ】異なるＩｇＧに対するウシおよび膵臓α−アミラーゼの光学密度を示す。実施例１４参照。
【図５ｄ】異なるＩｇＧに対するウシおよび膵臓α−アミラーゼの光学密度を示す。実施例１４参照。
【図６ａ】異なるＩｇＧに対するウシ赤血球炭酸デヒドラターゼの光学密度を示す。実施例１４参照。
【図６ｂ】図異なるＩｇＧに対するウシ赤血球炭酸デヒドラターゼの光学密度を示す。実施例１４参照。
【図６ｃ】異なるＩｇＧに対するウシ赤血球炭酸デヒドラターゼの光学密度を示す。実施例１４参照。
【図６ｄ】異なるＩｇＧに対するウシ赤血球炭酸デヒドラターゼの光学密度を示す。実施例１４参照。
【図７】実施例１６で得られたクロマトグラフを示す。
【図８】遺伝子配列を示す。実施例１８参照。
【図９】ＣＡ０４の遺伝子配列を示す。実施例１９参照。
【図１０】ＣＡ０５の遺伝子配列を示す。実施例１９参照。
【図１１】コンペティティブＥＬＩＳＡによるＣＡ０４−ＨＩＳ構築物のアフィニティー測定を示すグラフである。実施例２０参照。
【図１２】炭酸デヒドラタ−ゼの阻害を現すグラフである。実施例２２参照。
【図１３】実施例７で説明するグラフである。
【図１】
2009040780.tif 000016
【図２−１】
2009040780.tif 000017
【図２−２】
2009040780.tif 000018
【図２−３】
2009040780.tif 000019
【図２−４】
2009040780.tif 000020
【図３ａ】
2009040780.tif 000021
【図３ｂ】
2009040780.tif 000022
【図３ｃ】
2009040780.tif 000023
【図３ｄ】
2009040780.tif 000024
【図４ａ】
2009040780.tif 000025
【図４ｂ】
2009040780.tif 000026
【図４ｃ】
2009040780.tif 000027
【図４ｄ】
2009040780.tif 000028
【図５ａ】
2009040780.tif 000029
【図５ｂ】
2009040780.tif 000030
【図５ｃ】
2009040780.tif 000031
【図５ｄ】
2009040780.tif 000032
【図６ａ】
2009040780.tif 000033
【図６ｂ】
2009040780.tif 000034
【図６ｃ】
2009040780.tif 000035
【図６ｄ】
2009040780.tif 000036
【図７】
2009040780.tif 000037
【図８】
2009040780.tif 000038
【図９】
2009040780.tif 000039
【図１０】
2009040780.tif 000040
【図１１】
2009040780.tif 000041
【図１２】
2009040780.tif 000042
【図１３】
2009040780.tif 000043