(57)【要約】【課題】  走査に関して厳密な調整および制御を必要とすることなく、ムラのない好適な画像を検出すること。【解決手段】  光源から射出された照明光が入射され、複数本のライン状の照明光束を形成する整形光学系と、複数本のライン状の照明光束を、被検物に導光する照明光学系と、複数本のライン状の照明光束により被検物を走査する走査部と、被検物から反射された光束または、前記被検物から発せされた蛍光を結像する結像光学系と、複数本のスリット状の開口を有し、照明光学系の絞りおよび結像光学系の絞りとして機能する絞りとを備える。【選択図】      図１
2009036851.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源から射出された照明光が入射され、複数本のライン状の照明光束を形成する整形光学系と、
前記複数本のライン状の照明光束を、被検物に導光する照明光学系と、
前記複数本のライン状の照明光束により前記被検物を走査する走査部と、
前記被検物から反射された光束または、前記被検物から発せられた蛍光を結像する結像光学系と、
複数本のスリット状の開口を有し、前記照明光学系の絞りおよび前記結像光学系の絞りとして機能する絞りと
を備えることを特徴とする共焦点ユニット。
【請求項２】
請求項１に記載の共焦点ユニットにおいて、
前記走査部は、前記被検物上を走査する際に、前記被検物における観察視野よりも広い範囲を走査する
ことを特徴とする共焦点ユニット。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の共焦点ユニットと、前記共焦点ユニットと前記被検物との間に配置される対物レンズと、前記結像光学系および前記絞りを通過した光束を検出する検出部とを備える
ことを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項４】
請求項３に記載の共焦点顕微鏡において、
前記共焦点ユニットは、前記照明光学系および前記結像光学系の光路に対して選択的に挿入可能な複数の前記整形光学系および複数の前記絞りを備える
ことを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項５】
請求項４に記載の共焦点顕微鏡と、前記光源を備える光源部とからなる共焦点顕微鏡システムであって、
前記光路に対して前記整形光学系および前記絞りを選択的に挿入する挿入制御部と、
前記光路に対して挿入した前記整形光学系および前記絞りの組み合わせに応じて、前記光源から射出する前記照明光の光量を制御する光源制御部とを備える
ことを特徴とする共焦点顕微鏡システム。
【請求項６】
請求項４に記載の共焦点顕微鏡と、前記光源を備える光源部とからなる共焦点顕微鏡システムに対する制御をコンピュータで実現するための共焦点顕微鏡システム制御プログラムであって、
前記光路に対して前記整形光学系および前記絞りを選択的に挿入する挿入制御ステップと、
前記光路に対して挿入した前記整形光学系および前記絞りの組み合わせに応じて、前記光源から射出する前記照明光の光量を制御する光源制御ステップとを有する
ことを特徴とする共焦点顕微鏡システム制御プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点ユニット、共焦点ユニットを備えた共焦点顕微鏡、共焦点顕微鏡を備えた共焦点顕微鏡システム、および共焦点顕微鏡システムに対する制御をコンピュータで実現するための共焦点顕微鏡システム制御プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
共焦点顕微鏡において、高速化等を目的として、複数本のスリットがそれぞれ平行になるように形成されたスリットアレイを採用した共焦点顕微鏡が知られている（例えば、特許第３７３４０１０等）。
【特許文献１】特許第３７３４０１０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
特許文献１の発明では、スリットアレイの走査ストロークを、スリットのピッチの整数倍に厳密に調整および制御することが重要である。走査ストロークがピッチの整数倍からずれた場合には、位置によって照明光の照射強度が異なってしまう。そのため、検出した画像に縞状のムラが生じてしまうことがある。このようなムラが生じると、測定精度が著しく悪化する。
【０００４】
本発明は、走査に関して厳密な調整および制御を必要とすることなく、ムラのない好適な画像を検出することができる共焦点ユニット、共焦点顕微鏡、共焦点顕微鏡システム、および共焦点顕微鏡システム制御プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の共焦点ユニットは、光源から射出された照明光が入射され、複数本のライン状の照明光束を形成する整形光学系と、前記複数本のライン状の照明光束を、被検物に導光する照明光学系と、前記複数本のライン状の照明光束により前記被検物を走査する走査部と、前記被検物から反射された光束または前記被検物から発せられた蛍光を結像する結像光学系と、複数のスリット状の開口を有し、前記照明光学系の絞りおよび前記結像光学系の絞りとして機能する絞りとを備える。
【０００６】
なお、前記走査部は、前記被検物上を走査する際に、前記被検物における観察視野よりも広い範囲を走査しても良い。
【０００７】
また、上述した共焦点ユニットを備えた共焦点顕微鏡や共焦点顕微鏡システムに対する制御をコンピュータで実現するための共焦点顕微鏡システム制御プログラムも本発明の具体的態様として有効である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、走査に関して厳密な調整および制御を必要とすることなく、ムラのない好適な画像を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、図面を用いて本発明の実施形態について説明する。
【００１０】
図１は、本実施形態の共焦点顕微鏡システム１の構成を示す図である。共焦点顕微鏡システム１は、図１に示すように、光源部１０と共焦点顕微鏡２０とコンピュータ５０とからなる。
【００１１】
光源部１０は、共焦点顕微鏡２０に対して照明光を射出する光源を備える。光源には、レーザーの他に、白色光である超高圧水銀ランプ、キセノンランプ、メタルハライドランプ等が用いられる。なお、光源として白色光を用いる場合には、光源と後述するビーム整形光学系との間に励起フィルタが設置される。
【００１２】
共焦点顕微鏡２０は、ビーム整形光学系２１、共焦点スリット絞り２２、照明系コリメートレンズ２３、ビームスプリッタ２４、スキャナ２５、スキャナレンズ２６、第２対物レンズ２７、対物レンズ２８、ステージ２９、結像系コリメートレンズ３０、集光レンズ３１、光検出器３２、反射ミラー３３・３４、フィルタ３５の各部を備える。ビーム整形光学系２１は、例えばシリンドリカルマイクロレンズ等であり、ビームスプリッタ２４は、例えばダイクロイックミラーである。また、フィルタ３５は、例えばバリアフィルタである。スキャナ２５は、両面が反射面であるスキャンミラー２５ａを備える。スキャンミラー２５ａは、図１中の矢印Ａの方向に回動可能であり、回動することにより照射光を矢印Ｂの方向に走査する（詳細は後述する）。また、ステージ２９には、例えば生体試料等の標本Ｔが静置される。光検出器３２は、例えば、ＣＣＤ等の撮像素子や受光素子等を備え、後述する結像光から２次元の輝度分布データを生成する。
【００１３】
コンピュータ５０は、マウスやキーボード等の操作部５１、ＬＣＤ等を備える表示部５２、操作部５１への操作を検知するとともに表示部５２への画像等の表示を行う制御部５３を備える。また、制御部５３は、光源部１０、スキャナ２５、光検出器３２を制御するとともに、光検出器３２から２次元の輝度分布データを取得する（詳細は後述する）。
【００１４】
次に、図１を参照して、共焦点顕微鏡システム１における導光について説明する。
【００１５】
光源部１０から射出した照明光は、ビーム整形光学系２１により、一方向に長いライン状の光束に形成される。このライン状の光束（以下「光束Ｓ」と称する）は、標本Ｔの観察面Ｔａと光学的に共役な位置に集光する。そして、この位置には、複数本のスリット状の開口を有する共焦点スリット絞り２２が設置される。
【００１６】
図２は、共焦点スリット絞り２２の平面図である。共焦点スリット絞り２２は、図２に示すように、２２ａ〜２２ｄの４本のスリット状の開口部を有する。これらの開口部は同一の形状を有し、その長手方向に対して垂直な方向に等間隔で平行に配置される。また、開口部２２ａ〜２２ｄのスリット幅をＤ１とすると、スリットとスリットとの間隔Ｄ２は、クロストークを防止するためにスリット幅Ｄ１の５倍以上であることが望ましい。
【００１７】
ビーム整形光学系２１によりライン状に形成された光束Ｓは、共焦点スリット絞り２２の開口部２２ａ〜２２ｄに入射する。光束Ｓは、開口部２２ａ〜２２ｄによって、所定の幅のライン状の光束に形成される。図３に共焦点スリット絞り２２近傍の光路詳細図を示す。このとき、共焦点スリット絞り２２は、照明光学系の絞りとして機能する。なお、図１では、４本のスリット状の開口部２２ａ〜２２ｄにより形成されるライン光束のうち、１本のみを示し、残りの３本を省略して図示する。また、照明光として使用されるのは、ビームスプリッタ２４をそのまま通過した光成分である。
【００１８】
共焦点スリット絞り２２を通過した光束Ｓは、照明系コリメートレンズ２３により平行光に変換され、反射ミラー３３によりスキャナ２５の方向に反射される。そして、スキャンミラー２５ａの第１の面２５ａ−ｓで反射された光束Ｓは、スキャナレンズ２６の方向へ反射される。スキャナレンズ２６を通過した光束Ｓは、第２対物レンズ２７および対物レンズ２８を順に通過して、標本Ｔの観察面Ｔａに４本のライン状の照明領域として集光される。図４は、標本Ｔへの照明光の照射状態を示す平面図である。また、図５は、標本Ｔへの照明光の照射状態を示す立体図である。図４および図５に示すように、光束Ｓは、４本のライン状の照明光として標本Ｔ上に照射される。
【００１９】
標本Ｔ上に光束Ｓが照射されることにより、標本Ｔは蛍光を発したり光束Ｓを反射したりする。この蛍光もしくは反射光（以下「光束Ｋ」と称する）は、照明光である光束Ｓと逆の経路をたどって共焦点スリット絞り２２へ導光される。すなわち、光束Ｋは、対物レンズ２８、第２対物レンズ２７、スキャナレンズ２６を順に通過してスキャナ２５に導かれる。そして、スキャンミラー２５ａの第１の面２５ａ−ｓで反射された光束Ｋは、反射ミラー３３の方向へ反射され、さらに、反射ミラー３３により照明系コリメートレンズ２３の方向に反射される。照明系コリメートレンズ２３により集光された光束Ｋは、共焦点スリット絞り２２に入射する。このとき、共焦点スリット絞り２２は、結像光学系の共焦点絞りとして機能し、焦点から外れた余分な光をカットする。
【００２０】
共焦点スリット絞り２２を通過した光束Ｋは、ビームスプリッタ２４により結像系コリメートレンズ３０の方向へ反射される。そして、結像系コリメートレンズ３０により平行光に変換された光束Ｋは、反射ミラー３４によりスキャナ２５の方向に反射される。そして、光束Ｋは、スキャンミラー２５ａの第２の面２５ａ−ｒにより集光レンズ３１の方向へ反射され、集光レンズ３１により２次元の輝度分布として光検出器３２の検出面上に結像される。なお、光検出器３２の検出面上に結像された輝度分布は、観察面Ｔａ上の輝度分布に対応する。
【００２１】
以上説明した構成の共焦点顕微鏡システム１において、標本Ｔの輝度分布データを取得する際の制御部５３の動作について図１を参照して説明する。操作部５１を介して輝度分布データの取得が指示されると、制御部５３はこれを検知し、光源部１０を制御して標本Ｔに対する照明光の照射を開始する。また、制御部５３は、スキャナ２５を制御して、スキャンミラー２５ａを回動する。そして、スキャンミラー２５ａの振幅角を変化させることにより、標本Ｔへの光束Ｓの照射領域をその短軸方向（矢印Ｂの方向）に移動させる。矢印Ｂの方向はスキャナ２５による走査方向に相当し、スキャナ２５は光束Ｓをスキャンして標本Ｔ上を走査する。さらに、スキャナ２５は、標本Ｔにおいて反射された光束Ｋをデスキャンして光検出器３２に導く。すなわち、スキャナ２５は、第１の面２５ａ−ｓにより照明系のスキャナとして機能し、第２の面２５ａ−ｒにより結像系のスキャナとして機能する。したがって、照明系のスキャナと結像系のスキャナとを独立に設ける場合と異なり、２つのスキャナの同期をとる必要がない。
【００２２】
以上説明したように、光束Ｓが標本Ｔ上を移動すると、光検出器３２の受光面上には、標本Ｔ上の光束Ｓの移動に対応したライン状の像が結像される。このとき、標本Ｔ上の観察視野をＦ（図４参照）とすると、制御部５３は、スキャナ２５を制御して走査範囲Ｅ（図４および図５参照）を走査する。走査範囲Ｅは、観察視野Ｆよりも広い範囲であり、走査範囲Ｅは、観察視野Ｆを完全にカバーする範囲である。このように、４本のライン状の照明光（光束Ｓ）をあたかも１本のライン光のように走査するので、原理上、走査範囲内にムラが発生することはない。
【００２３】
さらに、観察視野Ｆ内のある１点に着目すると、１回のスキャンにおいて４本のライン状の照明光が通過する。したがって、光量の大きい強い照明光を１回照射する代わりに、光量の小さい弱い照明光を複数回照射することができる。例えば、同じ総光量の照明光を照射する場合、１本のライン状の照明光が１回だけ通過する場合に比べて、光量を１／４に低減することができる。生細胞の観察においては、極力弱い光（励起光）を照射して蛍光褪色、光毒性を抑制しつつ、高速で変化を捉える必要性がある。そこで、本実施形態のように光量を低減することにより、蛍光観察時の褪色を抑えることができる。
【００２４】
なお、本実施形態において、開口部の形状や本数の異なる複数の共焦点スリット絞りを備え、使用する対物レンズの種類や観察対象である試料の種類等に応じて、適宜交換して使用する構成としても良い。なお、共焦点スリット絞りを複数備える場合には、各共焦点スリット絞りの開口部の形状に応じて複数のビーム整形光学系を用意し、共焦点スリット絞りとビーム整形光学系とをセットで交換する構成とすれば良い。
【００２５】
本実施形態の共焦点顕微鏡システム１が、複数の共焦点スリット絞りおよびビーム整形光学系を備える場合の制御部５３の動作について、図６に示すフローチャートを用いて説明する。図６のフローチャートは、複数の共焦点スリット絞りのうち何れかの共焦点スリット絞りが選択された際の動作を示す。
【００２６】
ステップＳ１において、制御部５３は、選択された共焦点スリット絞りとその共焦点スリット絞りに応じたビーム整形光学系とを光路上に挿入する。
【００２７】
ステップＳ２において、制御部５３は、選択された共焦点スリット絞りに応じて、照明光の光量および走査パターンを決定する。
【００２８】
ステップＳ３において、制御部５３は、光源部１０を制御して、ステップＳ２で決定した光量および走査パターンにしたがった照明光の射出を開始する。
【００２９】
ステップＳ４において、制御部５３は、スキャナ２５および光検出器３２を制御して輝度分布データの取得を開始する。
【００３０】
なお、従来から共焦点顕微鏡において一般的であるピンホール式の共焦点絞りを組み合わせても良い。すなわち、上述したスリット状の開口部を有する共焦点スリット絞りとピンホール式の共焦点絞りとを備え、使用する対物レンズの種類や観察対象である試料の種類等に応じて、適宜交換して使用する構成としても良い。スリット状の開口部を有する共焦点スリット絞りは、高速化が可能であるとともに光量面でのメリットが大きく、ピンホール式の共焦点絞りは、共焦点効果が高い。したがって、共焦点スリット絞りとピンホール式の共焦点絞りとを選択的に使用できる構成は非常に有用である。なお、本実施形態で説明した共焦点顕微鏡システム１にピンホール式の共焦点絞りをさらに備える場合には、スキャナ２５に代えて直交する２方向に走査可能なスキャナを備えれば良い。そして、共焦点スリット絞りを使用する場合には、スキャナを１方向のみに走査し、ピンホール式の共焦点絞りを使用する場合には、スキャナを２方向に走査すれば良い。
【００３１】
以上説明したように、本実施形態によれば、走査に関して厳密な調整および制御を必要とすることなく、ムラのない好適な画像を検出することができる。例えば、生細胞の観察においては、膜電位の測定を共焦点顕微鏡像の蛍光強度で捉える方法がある。このような場合には、画像に縞状のムラが生じると測定精度が著しく悪化してしまう。しかし、本実施形態の共焦点顕微鏡によれば、画像にムラを生じる可能性を原理的に排除することができる。さらに、本実施形態によれば、光量を低減して蛍光観察時の褪色を抑えることができる。
【００３２】
なお、本実施形態では、光源部１０と共焦点顕微鏡２０とコンピュータ５０とからなる共焦点顕微鏡システム１を例に挙げて説明したが、本発明はこの例に限定されない。例えば、本実施形態では、スキャナ２５が照明系のスキャナと結像系のスキャナとを兼用する例を示したが、照明系のスキャナと結像系のスキャナとを独立に設ける構成でも良い。また、光検出器を備えない、あるいは光検出器を交換可能な共焦点顕微鏡にも本発明を同様に適用することができる。さらに、光源部やコンピュータを内蔵した共焦点顕微鏡にも本発明を同様に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本実施形態の共焦点顕微鏡システム１の構成を示す図である。
【図２】共焦点スリット絞り２２の平面図である。
【図３】共焦点スリット絞り２２近傍の光路詳細図である。
【図４】標本Ｔへの照明光の照射状態を示す平面図である。
【図５】標本Ｔへの照明光の照射状態を示す立体図である。
【図６】制御部５３の動作を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００３４】
１…共焦点顕微鏡システム，１０…光源部，２０…共焦点顕微鏡，２１…ビーム整形光学系，２２…共焦点スリット絞り，２３…照明系コリメートレンズ，２４…ビームスプリッタ，２５…スキャナ，２６…スキャナレンズ，２７…第２対物レンズ，２８…対物レンズ，３０…結像系コリメートレンズ，３１…集光レンズ，３２…光検出器，５０…コンピュータ，５３…制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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