(57)【要約】【課題】レチノイン酸受容体の脳における生理作用および生体の脳高次機能に対する役割を検討し、従来にはない新規なトランスジェニックマウスを創出することを目的とする。【解決手段】レチノイン酸受容体αを前脳で発現する外来遺伝子を有し、学習能力及び記憶力が向上したトランスジェニックマウスであって、前記外来遺伝子が、αＣａＭＫＩＩプロモーターと、レチノイン酸受容体αをコードする遺伝子である、トランスジェニックマウスにより解決する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイン酸受容体αを前脳で発現する外来遺伝子を有し、学習能力及び記憶力が向上したトランスジェニックマウスであって、
前記外来遺伝子が、αＣａＭＫＩＩプロモーターと、レチノイン酸受容体αをコードする遺伝子である、トランスジェニックマウス。
【請求項２】
前記レチノイン酸受容体αの発現量が、野生型マウスの１．５倍以上である、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３】
前記レチノイン酸受容体αをコードする遺伝子が、配列番号１に記載の塩基配列を含む、請求項１又は２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４】
前記αＣａＭＫＩＩプロモーターをコードする遺伝子が、配列番号２に記載の塩基配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５】
αＣａＭＫＩＩプロモータ制御下でレチノイン酸受容体αを発現制御する外来遺伝子を構築し、前記外来遺伝子をマウスの受精卵前核にマイクロインジェクションすることで、前記レチノイン酸受容体αが前脳特異的に発現したトランスジェニックマウスを作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、学習能力及び記憶力が向上したトランスジェニックマウス及び該トランスジェニックマウスを作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＡは生命維持に必須な栄養素であり、その活性化本体であるレチノイン酸は、核内受容体に対する特異的リガンドとしての機能を有する。また、レチノイン酸受容体群（ＲＡＲ、ＲＸＲ）は、リガンド結合依存的にヘテロダイマーを形成し、応答配列ＲＡＲＥに結合することで標的遺伝子の転写を制御し生体内の様々な生理機能に関与することが明らかとなっている。
【０００３】
近年、レチノイン酸受容体群は、脳機能制御にも重要な役割を果たすことが明らかになりつつある。過去の報告では、レチノイン酸受容体ノックアウトマウス及びビタミンＡ欠乏（ＶＡＤ）マウスを用いた解析から、レチノイン酸情報伝達系の不活性化が記憶の中枢である海馬依存的な空間記憶形成に障害を引き起こすことが明らかとなっている（非特許文献１〜３）。
【非特許文献１】ChiangMY, Misner D, Kempermann G, Schikorski T, Giguere V, Sucov HM, Gage FH, StevensCF, Evans RM., An essential role for retinoid receptorsRARbeta and RXRgamma in long-term potentiation and depression, Neuron, USA,Cell Press, Volume 21, Issue 6, December 1998, Pages 1353-1361
【非特許文献２】MisnerDL, Jacobs S, Shimizu Y, de Urquiza AM, Solomin L, Perlmann T, De Luca LM,Stevens CF, Evans RM., Vitamin A deprivation results in reversible loss ofhippocampal long-term synaptic plasticity., Proc Natl Acad Sci U.S.A., NationalAcademy of Sciences, 2001 Sep 25; volume 98 Issue 20:pp11714-9.
【非特許文献３】EtchamendyN, Enderlin V, Marighetto A, Pallet V, Higueret P, Jaffard R., Vitamin Adeficiency and relational memory deficit in adult mice: relationships withchanges in brain retinoid signalling., Behav Brain Res., Netherlands,Elsevier/North-Holland Biomedical Press., 2003 Oct 17; volume 145 Issue1-2:pp37-49.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
レチノイン酸受容体群は脳の広範囲に発現していることが報告されているが、脳における生理作用、生体の脳高次機能に対する役割は未だ不明な点が多いのが現状である。
【０００５】
そこで本発明では、レチノイン酸受容体の脳における生理作用および生体の脳高次機能に対する役割を検討し、従来にはない新規なトランスジェニックマウスを創出することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は上記課題を解決するために、（１）レチノイン酸受容体αを前脳で発現する外来遺伝子を有し、学習能力及び記憶力が向上したトランスジェニックマウスであって、前記外来遺伝子が、αＣａＭＫＩＩプロモーターと、レチノイン酸受容体αをコードする遺伝子である、トランスジェニックマウスを提供するものである。
【０００７】
上記発明の好ましい態様は次の通りである。（２）前記レチノイン酸受容体αの発現量が、野生型マウスの１．５倍以上である、前記（１）に記載のトランスジェニックマウス；
（３）前記レチノイン酸受容体αをコードする遺伝子が、配列番号１に記載の塩基配列を含む、前記（１）又は（２）に記載のトランスジェニックマウス；
（４）前記αＣａＭＫＩＩプロモーターをコードする遺伝子が、配列番号２に記載の塩基配列を含む、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウス。
【０００８】
また、本発明は、（５）αＣａＭＫＩＩプロモータ制御下でレチノイン酸受容体αを発現制御する外来遺伝子を構築し、前記外来遺伝子をマウスの受精卵前核にマイクロインジェクションすることで、前記レチノイン酸受容体αが前脳特異的に発現したトランスジェニックマウスを作製する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、レチノイン酸受容体αを前脳で発現する外来遺伝子をマウスに導入することにより、前記外来遺伝子を導入していないマウスと比較して、学習能力及び記憶力を向上させるトランスジェニックマウスを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本実施形態のトランスジェニックマウスについて説明する。本実施形態のトランスジェニックマウスは、レチノイン酸受容体（retinoic acid receptor; 以下、「ＲＡＲ」と称することがある）αを前脳で発現する外来遺伝子を有し、学習能力及び記憶力が向上したトランスジェニックマウスであって、前記外来遺伝子が、αＣａＭＫＩＩプロモーターと、レチノイン酸受容体αをコードする遺伝子である。
【００１１】
「学習能力及び記憶力が向上した」とは、モリス水迷路試験（Morris Water
Maze Test）又は恐怖条件付け文脈学習課題（Contextual Fear Conditioning
Test）などの複数の異なる学習課題において、野生型マウスとの間で正の有意差が認められることをいう。
【００１２】
ＲＡＲαは、レチノイン酸受容体α遺伝子を意味する。本発明の目的を達成するためには、前脳でＲＡＲαを過剰発現していることが必須である。具体的には、配列番号１に示された塩基配列又はその相補配列からなる核酸分子である。
【００１３】
ＲＡＲαを前脳で発現する外来遺伝子としては、配列番号２に示されたαＣａＭＫＩＩプロモーターと、配列番号１に示された塩基配列又はその相補配列からなる核酸分子である。
【００１４】
αＣａＭＫＩＩ（α-calcium-calmodulin kinase
II）プロモーターは、ＲＡＲαを前脳で特異的に発現させるためのプロモーターである（Mayford, M., Baranes, D., Podsypanina, K.
and Kandel, E.R. (1996). The 3-untranslated region of CaMKIIαis a cis-acting signal for the
localization and translation of mRNA in dendrites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93, 13250-13255.）。具体的には、配列番号２に示された塩基配列又はその相補配列からなる核酸分子である。
【００１５】
図１に示すように、αＣａＭＫＩＩプロモーターはレチノイン酸受容体αをコードする遺伝子の上流から、ＲＡＲαの発現を制御する。ＲＡＲαのＮ末端側に外来タンパク質検出を目的としたＨＡ配列（an hemiagglutinin virus
(HA)-tag sequence）を含む配列、（配列番号３）が付加され、ＲＡＲα遺伝子の終止コドンの３’側にはポリＡシグナルを含む配列（配列番号４）が配置されている。
【００１６】
図２に、αＣａＭＫＩＩプロモーター制御下で前脳特異的にＲＡＲαを過剰発現するトランスジェニックマウス２ライン（ｌｉｎｅＥ０２及びｌｉｎｅＥ０４）を作製した例を示す。
【００１７】
ＲＡＲαを発現する遺伝子は本来マウスに存在しているが、本実施形態のトランスジェニックマウスはＲＡＲαを前脳で発現する外来遺伝子を導入することにより、野生型マウス（ＷＴ）よりもＲＡＲαの発現量が多くなっている。トランスジェニックマウスがＲＡＲαを過剰発現しているか確認するには、脳内トランスジーン発現量をノザンブロット分析等により解析することができる。
【００１８】
図２に示すように、本実施形態のトランスジェニックマウス（ｌｉｎｅＥ０２及びｌｉｎｅＥ０４）においてトランスジーンの発現が観察され、さらにＲＡＲα発現量の増加も観察された。一方、β-actinの発現量は野生型マウス（ＷＴ）とトランスジェニックマウスとの間で差がないことから、トランスジェニックマウスではＲＡＲα発現量が特異的に増加していることが明らかとなった。
【００１９】
前記ＲＡＲαの発現量は、トランスジェニックマウスの学習能力及び記憶能力の向上効果を確実に得るためには、少なくとも、野生型マウスの１．５倍以上であることが好ましい。
【００２０】
本実施形態のトランスジェニックマウスは、αＣａＭＫＩＩプロモーター制御下でレチノイン酸受容体αを発現する外来遺伝子を構築し、前記外来遺伝子をＣ５７Ｂ１／６マウスの受精卵前核にマイクロインジェクションすることで作製することができる。
【００２１】
本実施形態のトランスジェニックマウスは正常に生育し、痙攣など行動異常や著明な形態学的異常は認められないことが確認されている。なお、本実施形態のトランスジェニックマウスは、東京農業大学応用生物科学部バイオサイエンス学科動物分子生物学研究室にて分譲可能である。
【実施例】
【００２２】
１  トランスジェニックマウスの作製
αＣａＭＫＩＩプロモータ制御下でレチノイン酸受容体αを発現制御する前記外来遺伝子を構築した。精製された外来遺伝子をＣ５７Ｂ１／６マウスの受精卵前核にマイクロインジェクションすることで、トランスジェニックラインを作製した。子孫に外来遺伝子が継代されるラインを選択し、ノザンブロット分析により、外来遺伝子の顕著な発現が観察されたラインをＲＡＲα過剰発現マウスとした。
【００２３】
２  評価試験例
（１）空間記憶形成能力の評価
上記１で得られたＲＡＲα過剰発現マウスを用いて、モリス水迷路試験（Morris
Water Maze Test）を用いて空間記憶形成能力を評価した。
【００２４】
図３は、モリス水迷路試験（Morris Water Maze Test）を説明するための図である。このテストではまず、ＲＡＲα過剰発現マウスに部屋の模様を手がかりに、プールの水中に存在する足場（プラットホーム）の位置を学習させた。実際には、直径１２０ｃｍの円形のプールを用意し、水面下１ｃｍの位置に透明なプラットホームを設置した。
【００２５】
プラットホームの位置を学習させるため、トレーニングとして一日２回、計１０日間ＲＡＲα過剰発現マウスをプールの端から泳がせ、プラットホームに辿り着くまでの時間を計測した。ＲＡＲα過剰発現マウスがプラットホームの位置を記憶しているほど、トレーニングでのプラットホームへの到達時間が短くなる。
【００２６】
そして、プローブテストとして、５日目と１０日目のトレーニングの後、プラットホームを取り除いた状態でＲＡＲα過剰発現マウスを１分間泳がせ、その軌跡をモニターした。その後、プールを４つの区画に分け、それぞれの区画に滞在した時間を測定し、ＲＡＲα過剰発現マウスの空間記憶形成能力を測定した。プラットホームの存在した区画に滞在した時間が長いほど、ＲＡＲα過剰発現マウスがプラットホームの位置を記憶していると判断される。
【００２７】
結果を図４に示す。トレーニングの結果、トレーニングを重ねるに伴い野生型マウス群（ＷＴ）、２ラインのＲＡＲα過剰発現マウス群ともに、プラットホームに辿り着くまでの時間が減少し、ＲＡＲα過剰発現マウスがプラットホームの位置を学習したと判断された。
【００２８】
図５に、プローブテスト１及び２の結果を示す。トレーニング５日目から２４時間後に行ったプローブテスト１の結果では、野生型マウス群（ＷＴ）において、プラットホームの存在した区画（ＴＱ区）に滞在した時間が他の区画と同程度であり、この群はプラットホームの位置を記憶していないと判断された。それに対し、２ラインのＲＡＲα過剰発現マウス群（lineE02、lineE04）ではＴＱ区の滞在時間が他の区画よりも有意に長く、これらの群はプラットホームの位置を記憶していたと判断された。
【００２９】
そして、トレーニング１０日目の２４時間後に行ったプローブテスト２では、すべての群がプラットホームの位置を記憶していたと判断された。
【００３０】
この結果、野生型マウス群（ＷＴ）に比べ２ラインのＲＡＲα過剰発現マウス群（lineE02、lineE04）ではより早く空間記憶を形成できており、レチノイン酸受容体の過剰発現は海馬依存的空間記憶能力の形成を向上させることが示唆された。
【００３１】
（２）海馬・扁桃体依存的な記憶形成能力の評価
上記１で得られたＲＡＲα過剰発現マウスの海馬・扁桃体依存的な記憶形成能力を評価するため、恐怖条件付け文脈学習課題（Contextual Fear Conditioning Test）を行った。この課題は、マウスに場所と電気ショックの痛みによる恐怖とを関連付けて学習させ、すくみ反応（freezing）の長さを測定することで恐怖記憶形成能力を評価するものである。
【００３２】
図６は、恐怖条件付け文脈学習課題（Contextual Fear
Conditioning Test）を説明するための図である。まず、トレーニングとして床に電線を設置したショックチャンバーにマウスを入れ、１４８秒後に０．４ｍＡの電気ショックを２秒間与えた。そして２４時間後にテストとして、再度同じチャンバー内にマウスを３００秒間入れ、すくみ反応時間（freezing time）を測定した。このすくみ反応時間（freezing time）が長いほど、マウスは痛みによる強い恐怖記憶を形成していると判断できる。
【００３３】
図７に恐怖条件付け文脈学習課題の測定結果を示す。テストの結果、２ラインのＲＡＲα過剰発現マウス群（lineE02、lineE04）では野生型マウス群（ＷＴ）と比較して、すくみ反応時間（freezing time）の有意な上昇が観察された。これにより、レチノイン酸受容体過剰発現が海馬・扁桃体依存的な恐怖記憶形成能力も向上させることが強く示唆された。
【００３４】
以上説明したように、海馬や扁桃体依存的なモリス水迷路試験（Morris Water
Maze Test）と恐怖条件付け文脈学習課題（Contextual Fear Conditioning
Test）の結果より、本発明のＲＡＲα過剰発現マウスは学習・記憶能力の向上が見られたことから、レチノイド情報伝達系が学習・記憶能力を正に制御することが示唆された。
【００３５】
かかる知見により、広く食品に含まれるビタミンＡが学習・記憶能力を正に制御する因子であることが明らかにされ、加齢に伴う学習・記憶能力低下や学習・記憶能力が減退した精神障害に対して、ビタミンＡ情報伝達経路を標的とした薬剤や食品が有効であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】レチノイン酸受容体αをコードする外来遺伝子の構成図である。
【図２】αＣａＭＫＩＩプロモーター制御下で前脳特異的にＲＡＲαを過剰発現するトランスジェニックマウスを作製した例を示す図である。
【図３】モリス水迷路試験を説明するための図である。
【図４】ＲＡＲα過剰発現マウスにおけるモリス水迷路試験の結果を示す図である。
【図５】ＲＡＲα過剰発現マウスにおけるプローブテスト１及び２の結果を示す図である。
【図６】恐怖条件付け文脈学習課題を説明するための図である。
【図７】ＲＡＲα過剰発現マウスにおける恐怖条件付け文脈学習課題の測定結果を示す図である。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【配列表】
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