(57)【要約】【課題】目的物質の濃度が１００ｐＭ未満の生体サンプルから正確に目的物質の検出ができる電気化学発光免疫測定法を用いた免疫分析チップ及びそれを用いた免疫分析方法を提供する。【解決手段】予め抗体が固着した反応電極と前記反応電極の近傍に形成された対極とをもつ第１のプレートと濃縮用電極が形成された第２のプレートとからなる免疫分析チップにおいて、前記反応電極の上に前記濃縮用電極が配置されるように前記第２のプレートを前記第１のプレートに配置した免疫分析チップ。【選択図】図２
2009222637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め抗体が固着した反応電極と前記反応電極の近傍に形成された対極とをもつ第１のプレートと濃縮用電極が形成された第２のプレートとからなる免疫分析チップにおいて、
前記反応電極の上に前記濃縮用電極が配置されるように前記第２のプレートを前記第１のプレートに配置した免疫分析チップ。
【請求項２】
前記第１と第２のプレートとの間に開口部を持つスペーサーを配置した請求項１に記載の免疫分析チップ。
【請求項３】
前記開口部は前記反応電極と前記対極と前記濃縮用電極とを含むように配置された請求項２に記載の免疫分析チップ。
【請求項４】
前記第２のプレートは前記開口部に生体サンプルを注入するための注入口を持つ請求項３に記載の免疫分析チップ。
【請求項５】
前記第１のプレートはガラスもしくはポリカーボネートのいずれかの材料からなり、
前記第１のプレート上へスパッタリング法によりチタンを成膜後、さらに前記チタン成膜面へスパッタリング法により金を成膜することにより金電極を形成した請求項１に記載の免疫分析チップ。
【請求項６】
前記第２のプレートはガラスもしくはポリカーボネートのいずれかの材料からなり、
前記第２のプレート上へスパッタリング法によりチタンを成膜後、さらに前記チタン成膜面へスパッタリング法により金を成膜することにより金電極を形成した請求項１に記載の免疫分析チップ。
【請求項７】
前記スペーサーはシリコンシートからなり、中央に空間を形成するための開口部を持つ請求項２に記載の免疫分析チップ。
【請求項８】
請求項１から７に記載の免疫分析チップを用いて生体サンプルを前記反応電極と前記対極と前記濃縮用電極とに接触するように注入する生体サンプル注入ステップと、
前記濃縮電極と前記対極とに所定の電圧を引加する生体サンプル濃縮ステップと、
光学検出のための免疫複合体を形成する標識抗体反応ステップと、
前記反応電極と前記対極に所定の電圧を印加して反応電極上の発光を測定する光学検出ステップとからなる免疫分析方法。
【請求項９】
前記所定の電圧は、電気分解により前記濃縮電極上に気泡が発生しない電圧である請求項８に記載の免疫分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原と抗体の反応を分析するための免疫分析チップに関するものである。より詳細には、電気化学発光を用いて体液に含まれるタンパク質などの生体サンプルを高感度に検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
所定の検体を抗原抗体反応により検出する方法として、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）が知られている。これは、金電極上に予め目的物質に対する第１の抗体を固着させておき、検体を添加すると抗原抗体反応により検体中の目的物質と第１の抗体とが結合する。その後、夾雑物を洗浄後、光学検出のために標識した第２の抗体を添加すると再度抗原抗体反応により、第１の抗体と検体中の目的物質と第２の抗体の結合による免疫複合体が出来る。流離物を洗浄後、電気化学発光免疫測定法による発光を検出し検体の濃度を測定する。これらの抗原抗体反応はすべて試薬添加後、静置状態で行われる（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００４−３４０８１８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、前記従来の構成では、静置状態で抗原抗体反応を行うため、低い濃度（１００ｐＭ未満）の検体は予め固着された抗体との結合がほとんど行われず、必要な発光量を得ることができない。すなわち、電気化学発光免疫測定法では、目的物質の濃度が１００ｐＭ未満である生体サンプルの測定ができないという課題を有していた。
【０００４】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、目的物質の濃度が１００ｐＭ未満の生体サンプルから正確に目的物質の検出ができる電気化学発光免疫測定法を用いた免疫分析チップ及びそれを用いた免疫分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記従来の課題を解決するために、本発明の免疫分析チップは、予め抗体が固着した反応電極と前記反応電極の近傍に形成された対極とを持つ第１のプレートと濃縮用電極が形成された第２のプレートからなる免疫分析チップにおいて、前記反応電極の上に前記濃縮用電極が配置されるように前記第２のプレートを前記第１のプレートに配置することを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の免疫分析チップによれば、濃度の低い生体サンプルから正確に目的物質を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に、本発明の免疫分析チップの実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【０００８】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１における免疫分析チップの構成を示す図である。本実施の形態１にかかる免疫分析チップは、図１に示す第１のプレート１０１と第２のプレート１０２およびスペーサー１０３で構成される。本実施例では、第１のプレート１０１および第２のプレート１０２は厚さ０．７ｍｍのガラス板にスパッタリング法により金電極を形成した。電極の形成方法は第１のプレート１０１および第２のプレート１０２上へスパッタリング法によりチタンを成膜後、さらにチタン成膜面へスパッタリング法により金を成膜することで第１のプレート１０１および第２のプレート１０２と金の密着性を向上できる。また、第１のプレート１０１および第２のプレートの材質はポリカーボネートのようなプラスチックでもよい。
【０００９】
第１のプレート１０１には電極が３箇所設けてあり、本実施例では、反応電極１１１は直径３ｍｍの円形とし、対極１１２および１１３は反応電極を中心に３ｍｍほど離れた両端に位置し１ｍｍＸ５ｍｍの長方形とした。
【００１０】
反応電極１１１には、予め所定の検体を免疫反応により検出するために、検体に対して特異的結合性能を示す第１の抗体が固着している。金電極へ第１の抗体を固着させる方法は、Ｓ−Ｓ結合などの共有結合や、イオン結合などの公知の物理吸着法を用いればよい。本実施例では、血中に存在するＴＮＦ−αの検出を目的とするため、第１のプレート１０１に設けられた反応電極１１１上にＴＮＦ−αに特異的に結合する第１の抗体を含む濃度１５０ｍＭのリン酸緩衝液を添加し物理吸着により固着させた。
【００１１】
第１の抗体の濃度は７０μｇ／ｍｌとした。第１の抗体の濃度としては、６０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌが望ましい。６０μｇ／ｍｌを下回る低濃度の場合、吸着量が少なく、本免疫分析チップを用いた検出を行った時に検出感度が不足する問題が発生する。また、１００μｇ／ｍｌを超える高濃度の場合、電極上に抗体が積層される現象が起こり、本免疫分析チップにおいて、反応電極１１１に電圧を印加し発光させるような電気化学発光検出を行おうとすると、低濃度の場合と同様に検出感度が不足する問題が発生する。これは第１の抗体が積層されたことにより電極表面より距離を置いた部分で抗原抗体反応が起こり、ルテニウム錯体等の標識剤が電気２重層の外へ位置し電圧印加による標識剤の発光量が減少するためである。
【００１２】
本実施例では、第２のプレート１０２に電極を１箇所設け、濃縮用電極１１５は直径１ｍｍの円形状とした。第２のプレート１０２にはサンプル注入口１１７が設けられ、その寸法は２ｍｍＸ２ｍｍとした。第１のプレート１０１及び、第２のプレート１０２に形成されているそれぞれの電極は、プレートの一端である端子部１１４へパターンにより配線されている。スペーサー１０３は厚さ１ｍｍのシリコンシートからなり、中央部には、空間を構成するために４ｍｍＸ１３ｍｍの開口部を設けた。
【００１３】
図２は、本発明の免疫分析チップの組み立て図である。図２（ａ）のように、反応電極１１１に濃縮電極１１５が対向するように第１のプレート１０１と第２のプレート１０２を配置し、第１のプレート１０１と第２のプレート１０２によってスペーサー１０３が挟まれる。スペーサー１０３は、その開口部が反応電極１１１と対極１１２および１１３また濃縮用電極１１５を含むように配置される。図２（ｂ）は本発明の免疫分析チップの組み立て後の図である。図２（ｃ）は、本発明の免疫分析チップの断面図で、組み立て後の免疫分析チップの内部構造を図２（ｃ）で説明する。第１のプレート１０１上に密着したスペーサー１０３と第２の電極１０２により上面のサンプル注入口のみが開放された空間を形成した。この空間に第１の電極１０１上の反応電極１１１、対極１１２および１１３、また第２のプレート１０２上の濃縮用電極１１５が露出されるように配置した。
【００１４】
次に、本発明の実施の形態１における免疫分析方法を図面とともに説明する。図３は、本発明の実施の形態１における免疫分析方法のフローチャートである。本発明の実施の形態１における免疫分析方法は、図３に示すように、全体のステップは、検体となる生体サンプルを電気泳動により濃縮用電極近傍に濃縮させる生体サンプル濃縮ステップであるｓ３０１、免疫複合体を形成しない不要な生体サンプルを含む緩衝液を除去する洗浄ステップであるｓ３０２、後に光学検出を行うための標識剤を修飾した抗体を検出目的となる検体に結合させ免疫複合体を形成する標識抗体反応ステップであるｓ３０３、及び免疫複合体の形成された反応電極に電圧を印加し電気化学発光させその光量を検出する光学検出ステップであるｓ３０４で構成される。
【００１５】
以下に、免疫分析方法のそれぞれのステップについて図４から図７を用いて詳細に説明する。まず、図４を用いて生体サンプル濃縮ステップｓ３０１について詳細に説明する。図４（ａ）は、本実施の形態における免疫分析チップの内部断面図である。免疫分析チップ組み立てにより形成された空間へＴＮＦ−αを含む緩衝液４０１をノズル４０２により充填する（生体サンプル注入ステップ）。充填された緩衝液４０１は免疫分析チップ内の空間に保持され、更に反応電極１１１、対極１１２、１１３および濃縮用電極１１５が浸漬された状態となっている。
【００１６】
緩衝液４０１は、生体内環境に近い状態にするためリン酸緩衝液を用いる。抗体のガラス面、電極表面への非特異吸着を防止するため、また抗体の凝集を防ぐ目的でＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を添加してもよい。
【００１７】
その後、対極１１２、１１３に対し濃縮用電極１１５へ端子部１１４を介して所定の電圧を印加する。これは、抗体は緩衝液４０１の環境下では通常負に帯電しており、正の電圧を帯びた濃縮用電極１１５近傍へ電気泳動する作用を利用するものである。
【００１８】
また、電圧値については、本実施例では電極間に０．９Ｖを印加しており、これは電極配置パターン及び抗体が含まれる緩衝液の種類にもよる。電極間の距離が長い場合、電圧値は高くする必要があるが、あまり高くすると緩衝液中に存在する水の電気分解により気泡が発生し抗体の濃縮が行えない場合がある。また、緩衝液に塩が多く含まれる場合は、電極自体が酸化反応により溶出してしまう問題も発生する。一方、電圧値が低い場合は、抗体の電気泳動速度が低下し、濃縮工程に相当の時間を要してしまう。以上の理由により、本発明の実施の形態１では、０．９Ｖを1時間印加するものとした。
【００１９】
電圧印加の方法として、本実施例では、直流電源を用い電極間に直流電圧を投入しているが、新たに参照電極を設け３電極法にてポテンシオスタットを用い印加する方法でもよい。
【００２０】
これにより、図４（ｂ）に示すように、濃縮用電極１１５近傍へ抗体４０３が濃縮され、生体サンプル濃縮ステップ前の状態より強い親和性で反応電極１１１上に固着している第１の抗体に結合する。
【００２１】
次に、図５を用いて洗浄ステップｓ３０２について詳細に説明する。生体サンプル濃縮ステップｓ３０１が終了した後、反応電極１１１上に固着している第１の抗体に結合していない不要な抗体を含む緩衝液を除去するために免疫分析チップ内の空間を洗浄する。本実施例では、図５（ａ）に示すようにノズル５０１から吹き出す１０℃の蒸留水を第２のプレート１０２に設けられたサンプル注入口より１０秒間注入した。次に上記の工程で免疫分析チップ内の空間に残留した蒸留水を除去するため、図５（ｂ）に示すようにノズル５０１を使用して、第２のプレート１０２に設けられたサンプル注入口より窒素を２ｋｇｆ／ｃｍ2の圧力で免疫分析チップ内の空間へむけて１０秒間吹き付けた。
【００２２】
次に、図６を用いて標識抗体反応ステップｓ３０３について詳細に説明する。図６は、本発明の実施の形態１における反応電極１１１上に形成された免疫複合体のモデル図である。
【００２３】
上記生体サンプル濃縮ステップｓ３０１および洗浄ステップｓ３０２において反応電極上１１１上の第１の抗体６０１−ＴＮＦ−α６０２複合体にさらにルテニウム錯体等の金属錯体６０４を標識した第２の抗体６０３を含むリン酸緩衝液を添加し、免疫複合体を形成させる。上記リン酸緩衝液には、金属錯体６０４の金電極への非特異吸着を抑制するために、界面活性剤を添加してもよい。本実施例におけるリン酸緩衝液中の標識された第２の抗体６０３の濃度は、２５０ｎｇ／ｍｌとし、添加後１時間反応した。この後、上記で説明した洗浄ステップｓ３０２により、ＴＮＦ−α６０２に結合していない不要な標識抗体を含む緩衝液を洗浄、及び残留蒸留水の除去を行う。
【００２４】
次に、図７を用いて光学検出ステップｓ３０５について詳細に説明する。標識抗体反応ステップｓ３０４にて免疫複合体が形成された後、トリプロピルアミン等を含んだ電解液７０１を免疫分析チップの空間内に充填する。この状態で、対極１１２、１１３と反応電極１１１の間に所定の電圧を印加することにより、反応電極１１１に形成されている免疫複合体に結合している金属錯体６０４が発光する。
【００２５】
電圧印加パターンは、電極配置パターン及び電解液の種類により様々であるが、本実施例における電圧印加パターンは、１秒かけて０Ｖから３．５Ｖまでリニアに電圧を上げ、その後５秒かけて３．５Ｖから０Ｖにリニアに電圧を下げるものとした。発光量の測定には、フォトマルチプライヤ（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）等の発光検出器７０２を用いて行い、電圧印加時における最大発光量を測定する。
【００２６】
以下、本発明の実施の形態１における免疫分チップによる具体的な測定例の詳細を説明する。ここでは、測定対象物となる生体サンプルを、腫瘍マーカーとして知られているＴＮＦ−αとして説明する。
【００２７】
まず、抗ＴＮＦ−α抗体を反応電極上に固着する。抗ＴＮＦ−α抗体を濃度７０μｇ／ｍｌとなるようリン酸緩衝液に混合し、反応電極上に添加し８時間静置した。その後、１０℃の蒸留水で洗浄、及び蒸留水の除去を行った。
【００２８】
次に、生体サンプル濃縮ステップとして、検体となるＴＮＦ−αを０ｐＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭの濃度になるように１％のＢＳＡが混合されているリン酸緩衝液に混合し、それぞれの検体を個別に免疫分析チップに充填し本実施例における生体サンプル濃縮ステップを行った。
【００２９】
次に、夾雑物を除去するために、本実施例における洗浄ステップｓ３０２を行った。
【００３０】
次に、後に光学検出を行うための標識剤を修飾した抗体を目的物質となる検体に結合させ免疫複合体を形成するために、本実施例における標識抗体反応ステップｓ３０３を行った。標識剤としてルテニウム錯体が修飾された抗ＴＮＦ−α抗体を濃度２５０ｎｇ／ｍｌの濃度となるようにリン酸緩衝液に混合した。リン酸緩衝液は、ルテニウム錯体の金電極への非特異吸着を抑える目的で、界面活性剤として０．０５％のカチオーゲンを含む。
【００３１】
最後に、上記の工程で反応電極上に形成された免疫複合体を検出するために、本実施例における光学検出ステップｓ３０４を行った。電解液としてトリプロピルアミンを用いた。
【００３２】
本発明の効果の比較として、生体サンプルの濃縮のための電圧印加を行わない測定を行い、これを従来測定とし、本発明測定と区別した。従来測定は、生体サンプル濃縮ステップｓ３０１における対極１１２、１１３に対し濃縮用電極１１５への電圧印加を行わず、緩衝液４０１を免疫分析チップ内の空間に保持した状態で1時間静置した以外は、本発明の実施の形態１と同じ工程を行った。
【００３３】
濃度別の検体について測定した結果をＳＮ比にして図８に示す。プロット８０１は生体サンプルの濃縮のための電圧印加を行わない測定の光学検出結果を示し、プロット８０２は本発明の実施の形態１におけるサンプル濃縮のための電圧印加を行った測定の光学検出結果を示す。これらの結果を、検体濃度０ｐＭの光学検出結果をノイズ（Ｎ）とし、１ｐＭ、１０ｐＭ及び１００ｐＭの光学検出結果をシグナル（Ｓ）とし、ＳＮ比を求めた。
【００３４】
図８から明らかなように、従来測定では、検体量１ｐＭと１００ｐＭの発光量の差はほとんど見られなかったが、本発明測定では、検体量１００ｐＭにおける発光量は検体量１ｐＭにおける発光量に対し明らかな優位性が見られる。また、発光量の絶対値も充分観測できる値であり、１００ｐＭ未満の検体の測定を行えることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の免疫分析チップは、目的物質の濃度が１００ｐＭ未満の生体サンプルから正確に目的物質を検出する効果を有し、電気化学発光を用いて体液に含まれるタンパク質などの生体サンプルを高感度に検出する技術として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の実施の形態１における免疫分析チップの構成図
【図２】本発明の実施の形態１における免疫分析チップの組み立て図
【図３】本発明の実施の形態１における免疫分析方法のフローチャート
【図４】本発明の実施の形態１における免疫分析方法の生体サンプル濃縮ステップの説明図
【図５】本発明の実施の形態１における免疫分析方法の洗浄ステップの説明図
【図６】本発明の実施の形態１における免疫分析方法の免疫複合体のモデル図
【図７】本発明の実施の形態１における免疫分析方法の光学検出ステップの説明図
【図８】本発明の実施の形態１における免疫分析チップ及び免疫分析方法の実験結果を示す図
【符号の説明】
【００３７】
１０１  第１のプレート
１０２  第２のプレート
１０３  スペーサー
１１１  反応電極
１１２、１１３  対極
１１４  端子部
１１５  濃縮用電極
１１６  開口部
１１７  注入口
ｓ３０１  生体サンプル濃縮ステップ
ｓ３０２  洗浄ステップ
ｓ３０３  標識抗体反応ステップ
ｓ３０４  光学検出ステップ
４０１  緩衝液
４０２、５０１  ノズル
４０３  抗体
６０１  第１の抗体
６０２  ＴＮＦ−α
６０３  第２の抗体
６０４  金属錯体
７０１  電解液
７０２  発光検出器
８０１、８０２  プロット
【図１】
2009222637.tif 000003
【図２】
2009222637.tif 000004
【図３】
2009222637.tif 000005
【図４】
2009222637.tif 000006
【図５】
2009222637.tif 000007
【図６】
2009222637.tif 000008
【図７】
2009222637.tif 000009
【図８】
2009222637.tif 000010