(57)【要約】【課題】医師による処置や薬剤投与を必要としないＴＧＦβシグナルの制御方法の提供。【解決手段】患部又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とするＴＧＦβシグナル伝達経路の抑制方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患部又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とするＴＧＦβシグナル伝達経路の抑制方法。
【請求項２】
Ｓｍａｄ３の発現を抑制する請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｂｍｐ４、Ｉｄ３、Ｓｐｐ１及びＺｆｈｘ１ｂから選ばれる１以上のシグナル因子の発現を誘導する請求項１記載の方法。
【請求項４】
温熱刺激が、４０〜４３℃で３０〜６０分の温熱負荷である請求項１〜３の何れか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、さまざまな生体機能に関与するＴＧＦβ(Transforming growth factor beta)シグナル伝達経路の制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦβは、１９８０年代半ばに明らかとなった増殖抑制因子であり、哺乳類においてそのファミリー分子は３０種類以上存在し、ＴＧＦβ、アクチビン、骨形成因子（ＢＭＰ；bone morphogenetic protein）からなるＴＧＦβスーパーファミリーを構成している。ＴＧＦβスーパーファミリーは、発生における形態形成や、細胞の分化、増殖等において、重要な役割を果たしている
【０００３】
ＴＧＦβファミリーは、細胞膜上に存在する特異的なセリン・スレオニンキナーゼ型受容体に結合し、受容体キナーゼを介することで、細胞内情報伝達分子であるＲ−Ｓｍａｄ（receptor-regulated Smad）をリン酸化する。リン酸化されたＲ−Ｓｍａｄは核内に移行し、Ｃｏ−Ｓｍａｄ（common partner Smad）であるＳｍａｄ４や他の転写調節因子と結合することで、標的遺伝子の発現を制御している。現在までにＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８の５つのＲ−Ｓｍａｄが見つかっており、これらはＳｍａｄ２／３複合体、Ｓｍａｄ１／５／８複合体を形成することが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
一方、Ｒ−Ｓｍａｄにより伝達されるＴＧＦβシグナルは、細胞内において多くの因子により抑制を受けており、Ｉ−Ｓｍａｄ（inhibitory Smad）と呼ばれる抑制因子にはＳｍａｄ６やＳｍａｄ７が属している。また、ＢＭＰ４は、Ｓｍａｄ１を介してＳｍａｄ６やＳｍａｄ７を活性化することで、Ｓｍａｄ２／３の経路を抑制しており（非特許文献２及び３）、ほかにもinhibitor of DNA binding 3（Ｉｄ３）等の因子がＳｍａｄ２／３経路を抑制していることが知られている（非特許文献４）。
【０００５】
さらに、ＴＧＦβシグナルは核内においても負の制御を受けており、secreted phosphoprotein 1（Ｓｐｐ１）やzinc finger homeobox 1b（Ｚｆｈｘ１ｂ）等のリプレッサーがＳｍａｄ複合体に結合すると、Ｓｍａｄ複合体の転写活性が阻害されることが知られている（非特許文献５）。
【０００６】
ＴＧＦβシグナルは、様々な生体機能に関与しているが、表皮ではケラチノサイトの増殖や機能を抑制してアポトーシスを誘導することから、脱毛に深く関与することが知られている（非特許文献６および７）。これまでに、ＴＧＦβ抑制作用を有するペプチドが、育毛剤として有効であることが報告されている（特許文献１）。
【０００７】
また、ＴＧＦβシグナルは、皮膚においてはepidermal growth factor(ＥＧＦ)と共同的に作用することで、皮膚の角化にも深く関与している（非特許文献８および９）。さらに、皮膚の疾患にもＴＧＦβシグナルは関与しており、Ｓｍａｄ３阻害によってＴＧＦβシグナルを低下させると、皮膚の治癒能が上昇すること（非特許文献１０）や、皮膚ガンへの抵抗性が増加したとの報告もなされている（非特許文献１１）。従ってＴＧＦβシグナル伝達系の阻害は、脱毛予防や皮膚性状の改善、等に有効であり、その阻害剤や阻害方法は美容への利用が期待される。
【０００８】
他にもＴＧＦβシグナルは多くの生体機能や疾患に関与することが明らかになっているが、特に、その活性化により組織・器官の線維化が促進することはよく知られており、過度のＴＧＦβシグナルは、肝臓や腎臓、肺における線維化（非特許文献１２、１３及び１４）や腎尿細管間質性線維症（非特許文献１５）の原因であると考えられている。このような組織・器官の線維化は疾患の発症段階、又は進行過程で見られ、これを引き起こさないことが、疾患の予防・治療においても重要である。実際に、ＴＧＦβを抑制することで、組織線維化を予防又は治療する薬剤が報告されており（特許文献２）、ＴＧＦβ作用抑制剤の添加により、αアクチン、コラーゲンの産生が減少し、線維化が抑制されることが記されている。
【０００９】
さらに、腎機能不全においても、ＴＧＦβシグナルを抑制することが治療法として報告されており（特許文献３）、これにはＴＧＦβシグナルを阻害するＴＧＦβアンタゴニストをレニン−アンジオテンシン−アルドステロン系アンタゴニストと併用することで、腎機能不全の改善効果があることが示されている。
【００１０】
また、ＴＧＦβシグナルの過剰な活性化は眼病の発症にも関与しており、ＴＧＦβシグナルの抑制によって、前嚢下白内障の発症低下や（非特許文献１６）、増殖性硝子体網膜症が改善されたとの報告がある（特許文献４）。また、白内障を予防又は制御する方法として、ＴＧＦβの作用を阻害することが報告されており（特許文献５）、この報告の中で、抗体にてＴＧＦβの作用を阻害すると、水晶体上皮外植片の白内障様変化が抑制されることが記載されている。
【００１１】
以上のことから、ＴＧＦβシグナルを抑制することは、脱毛の予防や皮膚の角化の改善、皮膚性状の改善などに役立つとともに、肝線維化、腎線維化、肺線維化や腎尿細管間質性線維症といった様々な器官・組織の線維化、また白内障、増殖性硝子体網膜症といった眼病、さらに、腎機能不全や皮膚ガンといった疾患の予防や改善に有用であることが推測される。特に、美容的利用の観点から、簡易且つ安全に、ＴＧＦβシグナルを制御する方法の確立が望まれていた。
【特許文献１】特開２００５−２３９６９５
【特許文献２】特開２００４−３５４７５号公報
【特許文献３】特表２００６−５２５３６２号公報
【特許文献４】特開平１０−１１４６７６号公報
【特許文献５】特表平９−５０５０５７号公報
【非特許文献１】Massague J, et al. (2005) Genes Dev. 19 : 2783-2810.
【非特許文献２】Ku M, et al. (2006) J. Biol. Chem. 281 : 5277-5287
【非特許文献３】Ishida W, et al. (2000)J. Biol. Chem. 275 : 6075-6079
【非特許文献４】Saika S, et al. (2006) Am J Physiol Cell Physiol. 290 : 282-289
【非特許文献５】Bassez G, et al. (2004) Neurobiol Dis. 15 : 240-250
【非特許文献６】Kamimura A, et al. (2006) Skin Pharmacol Physiol. 19 : 259-65.
【非特許文献７】Foitzik K, et al. (2000) FASEB J. 14 : 752-760
【非特許文献８】Michael Reiss, Alan C. sartore (1987) Cancer Res. 47 : 6705-6709
【非特許文献９】Youngsook Choi, Elaine Fuchs (1990) Cell Regulation 1 : 791-809
【非特許文献１０】Flanders KC, et al. (2003) Am J Pathol. 163 : 2247-2257
【非特許文献１１】Li AG, et al. (2004) Cancer Res. 64 : 7836-7845
【非特許文献１２】Schnabl B, et al. (2001) Hepatology. 34 : 89-100
【非特許文献１３】Inazaki K, et al. (2004) Kidney Int. 66 : 597-604
【非特許文献１４】Zhao Y, Geverd DA. (2002) Biochem Biophys Res Commun. 294 : 319-323
【非特許文献１５】Lee JM, et al. (2006) J Cell Biol. 172 : 973-981
【非特許文献１６】Banh A, et al. (2006) Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 : 3450-3460
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、脱毛予防や皮膚角化の改善等の美容を主目的としたＴＧＦβシグナルの制御方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、生体への負荷が小さく、容易に実施できるＴＧＦβシグナル伝達経路の抑制方法について検討したところ、生体に安全な温度で温熱刺激を与えることにより、Ｓｍａｄ３の遺伝子発現が低下してＳｍａｄ２／３の転写活性が抑制され、ＴＧＦβシグナル経路を抑制できることを見出した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の１）〜４）の発明に係るものである。
１）患部又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とするＴＧＦβシグナル伝達経路の抑制方法。
２）Ｓｍａｄ３の発現を抑制する上記１）の方法。
３）Ｂｍｐ４、Ｉｄ３、Ｓｐｐ１及びＺｆｈｘ１ｂから選ばれる1以上のシグナル因子の発現を誘導する上記１）の方法。
４）温熱刺激が、４０〜４３℃で３０〜６０分の温熱負荷である上記１）〜３）の何れかの方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法は、生体への負荷が小さく、医師による処置や薬剤投与を必要とせずエステシャン等が容易に実施できる。従って、本発明によれば、簡易且つ安全にＴＧＦβシグナルの過剰な活性化に起因して発症する脱毛や表皮の角化の抑制又は改善を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のＴＧＦβシグナル伝達経路の抑制方法は、脱毛予防や皮膚角化の改善等、皮膚性状の改善を図るものであり、医療目的以外の目的、主に美容を目的として行われるものであって、いわゆる医療行為を含むものではない。
【００１７】
後記実施例に示すとおり、マウスに温熱刺激を与えることにより、Ｓｍａｄ３の遺伝子発現が低下し、Ｂｍｐ４及びＩｄ３の遺伝子発現が増加し、また、Ｓｐｐ１、Ｚｆｈｘ１ｂの遺伝子発現が増加する。
ＴＧＦβファミリーの細胞内情報伝達分子であるＲ−Ｓｍａｄ（receptor-regulated Smad）は、現在までにＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８の５つのＲ−Ｓｍａｄが見出され、これらはＳｍａｄ２／３複合体、Ｓｍａｄ１／５／８複合体を形成している（前記非特許文献１）。従って、温熱刺激によってＳｍａｄ３の発現を抑制すれば、ＴＧＦβシグナルを抑制することができる。
また、Ｒ−Ｓｍａｄにより伝達されるＴＧＦβシグナルは、Ｉ−Ｓｍａｄ（inhibitory Smad）と呼ばれる抑制因子（Ｓｍａｄ６やＳｍａｄ７が属する）によってその発現が制御され、また、ＢＭＰ４はＳｍａｄ１を介してＳｍａｄ６やＳｍａｄ７を活性化することで、Ｓｍａｄ２／３の経路を抑制している（前記非特許文献２及び３）。さらに、Ｉｄ３（inhibitor of DNA binding 3）がＳｍａｄ２／３経路を抑制している（前記非特許文献４）。  さらに、ＴＧＦβシグナルは核内においても、Ｓｐｐ１（secreted phosphoprotein 1）やＺｆｈｘ１ｂ（zinc finger homeobox 1b）等のリプレッサーがＳｍａｄ複合体に結合すると、Ｓｍａｄ複合体の転写活性が阻害されることが知られている（非特許文献５）。
従って、温熱刺激によってＢｍｐ４、Ｉｄ３、Ｓｐｐ１及びＺｆｈｘ１ｂから選ばれる1以上のシグナル因子の発現を誘導すれば、ＴＧＦβシグナルを抑制することができる。
【００１８】
ここで、Ｓｍａｄ３の発現を抑制するとは、Ｓｍａｄ３又はその遺伝子の発現が低下することいい、Ｂｍｐ４、Ｉｄ３、Ｓｐｐ１及びＺｆｈｘ１ｂから選ばれる1以上のシグナル因子の発現を誘導するとは、これらのシグナル因子又はその遺伝子の発現が増加することをいう。
【００１９】
本発明に用いる温熱刺激としては、ヒト又は動物の患部、すなわちＴＧＦβシグナルの過剰な活性化により、それに基づく病態が発現している部位（臓器・器官）、もしくは全身に外部から温熱負荷を与えるのが好ましい。
人の場合、少なくとも３８℃以上の温熱負荷を３０分以上、好ましくは４０〜４３℃の温熱負荷を３０〜６０分与えるのがよい。
【００２０】
温熱刺激は、最低1週間に1回、好ましくは３日に1回とし、この温熱刺激を1回もしくは複数回繰り返すことにより行うことができる。
【００２１】
温熱刺激は、ＴＧＦβシグナル伝達経路の抑制が可能な温熱負荷手段を用いて行えばよいが、好適には、既存の温熱負荷装置又は器具を用いて、上記の温熱負荷を与えるのがよい。
【００２２】
熱負荷装置・器具は、ヒト又は動物の患部又は全身に温熱刺激を加えることができ、その熱量、温度が制御可能であれば、どのような熱負荷装置又は器具を用いてもよい。
【００２３】
温熱負荷装置・器具の熱源は、通常ガス、電気等であり、熱源で作られた熱の搬送手段は、パイプ、電線等が挙げられる。これらの熱をヒト、動物等に伝える媒体としては、気体、液体、伝熱性のある固体等が挙げられる。例えば、温熱負荷装置として、電源を必要とするエアーインキュベーターである場合、電気により発生させた熱を、電線やパイプで搬送し、気体を媒体として生体に熱を伝えればよい。また、超音波振動や、マイクロ波による温熱負荷等も、本発明の温熱負荷法として用いることができる。
また、熱を発生する市販の温熱カイロ類や温熱貼布剤を用いることもできる。
【実施例】
【００２４】
試験動物はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢  ♂）（日本クレア）を用いた。試験開始前の１週間、室温２３±２℃、湿度５５±１０％、１２時間の明暗サイクル（明期；ＡＭ７：００〜ＰＭ７：００）下で予備飼育した。尚、飼育期間中、すべてのマウスに、ＣＥ−２固形食を自由摂食させるとともに、水道水を自由飲水させた。
【００２５】
１週間の予備飼育後、平均体重が等しくなるように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをコントロール群（５匹）と加温群（５匹）の２群に分けた。加温群のマウスは、４１℃のヒートチャンバーに１時間入れることで温熱刺激を与え、その後はコントロール群と同様に、通常の飼育を行った。温熱刺激時によるマウスの脱水症状を避けるため、ヒートチャンバー内では４１℃の水を自由摂取できるようにした。
【００２６】
温熱刺激から１２時間後、コントロール群、加温群それぞれのヒラメ筋を採取し（Ｎ＝５）、１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）内でホモジナイズ後、−８０℃で凍結保存した。ＲＮＡの調製は、ＩＳＯＧＥＮのマニュアルに従った。
【００２７】
調製したＲＮＡは濃度をそろえ、６５℃、１０分間の熱処理を行い、急冷後に使用した。逆転写には、１２５ｎｇ相当のＲＮＡを使用し、２０μｌの反応液（１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  II（Roche）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2（Roche）、１ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（Takara），２．５ｍＭ  Ｏｌｉｇｏ  ｄ（Ｔ）１８  ｍＲＮＡ  ｐｒｉｍｅｒ（New England Biolabs）、１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Takara））を調製した。反応は４２℃，６０分→５２℃、３０分→９９℃、５分→４℃で行い、得られたｃＤＮＡは、使用時まで−２０℃で保存した。また、定量的ＰＣＲのスタンダード用として、５００ｎｇ相当のＲＮＡを使用し、同様の反応系で逆転写を行った。
【００２８】
逆転写反応によって得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７５００  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems）にて定量的ＰＣＲを行った。スタンダード用ｃＤＮＡを７段階希釈したものをスタンダードとして、作成した標準曲線に基づき、定量を行った。得られた解析結果は３６Ｂ４の発現量を内部標準として補正し、相対的ｍＲＮＡ発現量として表した。反応液は、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Applied Biosystems）  ２５μｌ、１００μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  １μｌ、１００μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  １μｌ、ｄＨ2Ｏ  ２２μｌ、ｃＤＮＡ  １μｌ、となるように調製した。定量的ＰＣＲの温度条件は５０℃２分、９５℃１０秒の後、９５℃１５秒と６０℃１分の反応を４０  サイクル繰り返した。
以下に、定量的ＰＣＲで用いたプライマーの配列を示す。
【００２９】
【表１】
2009226069.tif 000002
【００３０】
試験結果は平均値±標準偏差(Average(Ave)±standard deviation(SD))で表した。有意差検定はｔ−ｔｅｓｔを用いて行い、ｐ値が０．０５未満のものを統計学的有意差があるとした。
【００３１】
マウスに温熱刺激を与えることにより、Ｓｍａｄ３の遺伝子発現が有意に低下した（図１）。したがって、温熱刺激はＳｍａｄ３を低下させることにより、ＴＧＦβシグナル伝達経路を減衰させることが示された。
【００３２】
また、温熱刺激はＢｍｐ４、Ｉｄ３の遺伝子発現も有意に増加させた（図１）。これらの分子は直接又は間接的にＴＧＦβシグナルの伝達を抑制する因子であることから、温熱刺激はＢｍｐ４、Ｉｄ３を増加させることによっても、ＴＧＦβシグナル伝達経路を抑制することが示された。
【００３３】
さらに、温熱刺激はＳｐｐ１やＺｆｈｘ１ｂの遺伝子の発現も有意に増加させた（図１）。これらはＳｍａｄ２／３転写複合体に結合するリプレッサーであり、Ｓｐｐ１やＺｆｈｘ１ｂの増加は、ＴＧＦβシグナルの減衰を引き起こす。このことから、温熱刺激はＳｐｐ１やＺｆｈｘ１ｂといったリプレッサーの発現を増強し、ＴＧＦβシグナル伝達経路を抑制することが示された。
【００３４】
以上のことから、温熱刺激は、Ｓｍａｄ３の発現低下と、ＴＧＦβシグナルの抑制因子・リプレサーの発現増加を引き起こし、それによってＴＧＦβシグナル伝達経路を抑制することが示された。従って、温熱刺激は、ＴＧＦβがその発症に重要な役割を果たすと考えられる脱毛や表皮の角化等の諸現象の制御に有効であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】温熱刺激による各シグナル因子の遺伝子発現量を示す図。
【図１】
2009226069.tif 000003
【配列表】
2009226069000001.app