(57)【要約】【課題】  ヒスタミンを０．００５ｎＭまで検出可能な超高感度ヒスタミン計測用電気化学バイオセンサ（改良型）（以下ヒスタミン計測用センサと記述）を提供し、該センサを用いた超微量抗生物質計測システムを提供する。【解決手段】  本発明のセンサはすでに特許出願しているヒスタミン計測用電気化学バイオセンサ（特願２００６−１９３３８８）のより高感度を有する改良型であって、ヒスタミン脱水素酵素、テトラチアフルバレン、金属ナノ粒子、ナフィオン、ゼラチンおよび支持体から構成され、ヒスタミン脱水素酵素とヒスタミンとの反応生成物である過酸化水素を電子メデイエータであるテトラチアフルバレンが媒介する電気化学酸化反応により、生じた電流を極めて効率的に測定する。本センサが上記の酵素反応が各種抗生物質によって著しく阻害されること、および上記ヒスタミン電気化学酸化反応に関し著しい高感度を有することを利用して、水溶液中に含まれる極めて微量の抗生物質を定量する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスタミンとヒスタミン脱水素酵素との酸化反応生成物である過酸化水素をテトラチアフルバレンが電子メデイエータとして媒介する電気化学酸化反応によって、生じた電流を計測するヒスタミン計測用センサ。
【請求項２】
上記センサは電極支持体と四層の担持被膜、すなわち電子メデイエータであるテトラチアフルバレン被膜（第一層）、テトラチアフルバレン、ナフィオンおよび金ナノ粒子からなる混合物被膜（第二層）、ヒスタミン脱水素酵素、金ナノ粒子、テトラチアフルバレンおよびゼラチンからなる混合物被膜（第三層）およびゼラチン被膜（第四層）からなる構造を有することを特徴とする請求項１記載のヒスタミン計測用センサ。
【請求項３】
上記センサを検出器に用いた超微各種量抗生物質計測システム。
【発明の詳細な説明】
【詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は魚肉などの生鮮食料品や生体組織中に含まれる神経伝達物質であるヒスタミンの超微量計測用センサの提供および該センサの特性を利用した各種抗生物質の超微量分析システムの提供に関する。
【背景技術】
【０００２】生乳など生体体液中に残存するごく微量のペニシリンＧ、テトラサイクリンその他各種の抗生物質を簡便な方法で計測するシステムの構築は医学、生理学、酪農および広範な食品産業分野において強く要請されている。これらの微量抗生物質の測定には高速液体クロマトグラフとＵＶ検出器の組み合わせによる方法（例えばＶ．Ｆ．Ｓａｍａｎｉｄｏｕ等  Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．，２９巻、１５５０−１５６０頁、２００６年）、高速液体クロマトグラフと質量分析器の組み合わせによる方法（例えばＭ．Ｋｏｚｏｎｏ等Ｓｅｉｋａｔｓｕ  Ｅｉｓｅｉ，４９巻、２２０−２２６頁、２００５年）およびガスクロマトグラフと質量分析器の組み合わせによる方法等がある。液体クロマトグラフとＵＶ検出器の組み合わせによる方法では検出限界濃度は３ｐｐｂであり、液体クロマトグラフと質量分析器の組み合わせによる方法では１ｐｐｂである。【０００３】しかしながら上記の方法は装置が高価であり、その操作に熟練した技能を要し、かつ数日の測定時間を必要とする。さらに計測システムが大型であり汎用性の面で不適である。【０００４】一方、より小型で安価な方法として、乳酸酸化酵素による乳酸の酸化反応がペニシリンＧやクロラムフェニコールなどの抗生物質の存在で阻害されることを利用し、抗生物質の量を乳酸酸化酵素による酸化反応で消費される乳酸水溶液中の溶存酸素の減少速度と、任意の量の上記抗生物質を添加した乳酸水溶液の乳酸酸化酵素による酸化反応で消費される溶存酸素の減少速度を電気化学酸素センサで測定し、減少速度の差から抗生物質濃度を決定する方法を開発した（Ｔ．Ｒｉｎｋｅｎ等  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６６巻，１３−２１頁，２００６年）。この方法は試料水溶液中の溶存酸素の減少速度を測定するため高感度は望めず、検出範囲はペニシリンＧで０．２−１ｐｐｍ，クロラムフェニコールで１−２０ｐｐｍであり、液体クロマトグラフを用いる方法に比べ著しく感度が劣る。
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】本発明のヒスタミン計測用センサはすでに特許出願しているヒスタミン計測用センサの改良型で、本センサを用いてきわめて高感度、安価、小型かつ操作が容易なペニシリンＧ、テトラサイクリン、その他各種の超微量抗生物質の計測システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】本発明のヒスタミン計測用センサは金属電極支持体とヒスタミン脱水素酵素、テトラチアフルバレン、金ナノ粒子、ナフィオン、ゼラチンを含む複数の被膜から構成されている電気化学バイオセンサであることを要旨とする。
抗生物質計測システムは従来の技術の項に記述したＲｉｎｋｅｎらが発見した抗生物質による酵素機能の阻害効果を利用し、ヒスタミンに対し著しい高感度を有する本発明のヒスタミン計測用センサに用いたヒスタミン脱水素酵素の抗生物質による機能阻害を利用したもので、超微量の抗生物質の阻害によるヒスタミン酸化電流の降下によってその量を計測することを要旨とする。
【０００７】請求項１記載の本センサは、水溶液中の極微のヒスタミンを測定するために、ヒスタミンとヒスタミン脱水素酵素の酸化生成物である過酸化水素の電気化学酸化を促進する電子メデイエータであるテトラチアフルバレン被膜により構成されていることを特徴とするヒスタミン計測用センサである。
【０００８】請求項２記載の本発明はセンサ支持体である金属薄板支持体とその上に担持した被膜に関する。被膜は４層から構成され、下層から順に、第１層はテトラチアフルバレンの被膜で、ヒスタミンとヒスタミン脱水素酵素の反応で生じ、拡散によってテトラチアフルバレン層に到達した過酸化水素の電気化学酸化反応を媒介し、促進する電子メデイエータ被膜である。第２層はナフィオン、テトラチアフルバレン、金ナノ粒子からなる混合物被膜であり、この層に到達した過酸化水素をテトラチアフルバレンおよび金ナノ粒子によって電気化学酸化反応を促進させ、電子を金ナノ粒子を経由して支持体に伝達させる。ナフィオンは試料中に不純物として含まれる微量のアスコルビン酸、尿酸など電気化学酸化反応に活性な有機化合物アニオンの支持体への拡散を防ぎ、酵素など蛋白質の支持体表面への直接付着による被毒を防ぐ。第３層はヒスタミン脱水素酵素、テトラチアフルバレンおよび金ナノ粒子の混合物被膜で、この層で生じた過酸化水素が酵素の活性中心に近接した金ナノ粒子上でテトラチアフルバレンを介して電気化学酸化され、生じた電子を第２層の場合と同様、互いに近接する金ナノ粒子を介して支持体まで伝達させる。金ナノ粒子は過酸化水素を電気化学酸化する電極として機能し、本センサのヒスタミン検出感度の増加に寄与するとともに、生じた電子を支持体まで伝達する機能も有している（Ｘ．Ｒｅｎ等  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，２１巻，４３３−４３７頁２００５年）。第４層は架橋したゼラチン膜で、上記の第３層において生じた過酸化水素の電解質溶液中への逃散を防ぐ。
【０００９】請求項３記載の本発明の計測システムは抗生物質によるヒスタミン脱水素酵素のヒスタミンの酸化機能阻害効果を利用した各種抗生物質計測用センサであり、ヒスタミン水溶液へのごく微量の抗生物質添加により生じるヒスタミン酸化電流の降下によって、抗生物質濃度を計測することを特徴とする。
【００１０】本発明の計測システムはヒスタミンを酸化する機能をもつヒスタミン脱水素酵素（キッコーマン（株）製）を用い、生じた過酸化水素を電気化学酸化する方式のヒスタミン計測用センサを用いるので、外気開放下で抗生物質を定量できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】以下図面を用いて本発明のヒスタミン計測用センサおよびこれを用いた抗生物質計測システムに係わる実施の形態について説明する。【００１２】図１は本発明に係わるヒスタミン計測用センサの基本的な構造図の一例である。【００１３】支持体には金薄板（１１）を用いる。【００１４】この支持体上にテトラチアフルバレン層（１２）を形成する。【００１５】さらに上部にナフィオン、テトラチアフルバレンおよび金ナノ粒子の混合物被膜（１３）を形成する。【００１６】この被膜上にヒスタミン脱水素酵素、金ナノ粒子とテトラチアフルバレンからなる混合物被膜（１４）を形成する。【００１７】最上層にはゼラチン被膜（１５）を形成する。
（ヒスタミン計測用センサの製造工程）【００１８】本発明のヒスタミン計測用センサの製造工程の一例を示す。【００１９】表面積０．５ｃｍ２、厚さ０．０３ｍｍの金板をアルミナ研磨し、これに直径０．３ｍｍ、長さ７ｃｍの金線をリード線としてスポットウエルドし、アセトンおよび精製水で順次超音波洗浄し、支持体とする。【００２０】上記支持体をテトラチアフルバレン７ｍｇ、２−プロパノール５ｍｌ、精製水５ｍｌの混合液にｄｉｐｐｉｎｇ塗布した後、直ちに精製水で洗浄し、室内乾燥させ第１層のテトラチアフルバレン被膜を形成させる（図１（１２））。【００２１】上記被膜の上にテトラチアフルバレン、ナフィオン、金コロイドの混合液をｄｉｐｐｉｎｇ塗布し、数時間室内乾燥することによってテトラチアフルバレン、ナフィオン、金微粒子の混合被膜である第２層被膜を形成する（図１（１３））。上記の混合液は以下の方法で作製する。テトラチアフルバレン７ｍｇを５％ナフィオン−１１７溶液（シグマアルドリッチ社）０．５ｍｌに加え、Ｖｏｌｔｅｘで攪拌後、６０℃の水浴中で溶液の色が黄色から褐色になるまで溶液をよく振りながら加熱し、得られた溶液と５ｎｍ金コロイド溶液（シグマアルドリッチ社）を容量比１：１で混合する。【００２２】得られた第２層被膜上にヒスタミン脱水素酵素、テトラチアフルバレン、金コロイド、ゼラチンからなる混合液をｄｉｐｐｉｎｇ塗布し、１昼夜室内乾燥することによってテトラチアフルバレン、ヒスタミン脱水素酵素、ゼラチン、金ナノ粒子の混合物被膜である第３層被膜を形成する（図１（１４））。混合液は以下の方法で作製する。ヒスタミン脱水素酵素１６ｍｇを２００μｌの精製水に溶かし、得られた溶液１６０μｌ、テトラチアフルバレン１２ｍｇを溶かしたアセトン溶液１ｍｌ、および１％ゼラチンを溶かした３７％ホルムアルデヒド水溶液の２０％水溶液０．５ｍｌを混合した溶液と５ｎｍ金コロイド溶液を容量比１：１で混合する。【００２３】上記の第３層被膜上に１％ゼラチン−３７％ホルムアルデヒド溶液の２０％水溶液をｄｉｐｐｉｎｇ塗布し、第４層被膜を形成させ、数時間室内乾燥させてヒスタミン計測用センサの製作を完了する。
（抗生物質計測システムの構築）【００２４】図２にヒスタミン計測用センサを含む計測システムを示す。【００２５】計測システムはヒスタミン計測用センサ（２１）、参照電極（２２）、対抗電極（２３）からなる電気化学セル、電気化学アナライザー（１２００Ａ  ビーエーエエス社製）（２６）およびＰＣ（２７）から構成される。用いた参照電極は銀／塩化銀電極（ビーエーエス社製）、対抗電極は白金線電極（ビーエーエス社製）である。計測に際しては計測用センサの電位を参照電極に対して＋６５０ｍＶに設定し、ヒスタミンまたは抗生物質を定量する場合は電解セル中のリン酸緩衝溶液にヒスタミンまたは抗生物質を濃度１ｐｐｔから１ｐｐｍまで段階的に加え、対応するヒスタミン酸化電流の変化を順次測定する。他方生乳中の抗生物質を定量する場合は、リン酸緩衝液で生乳濃度を１／１０に希釈して試料溶液とした。
（微量ヒスタミンの定量測定）【００２６】図３にヒスタミン酸化電流とヒスタミン濃度の関係を示す。ヒスタミン酸化電流（Ｉ）とヒスタミン濃度Ｃｈｉｓには濃度４ｐｐｂ以下では次の関係がなりたつ。ここでｋ１は比例定数である。
Ｉ＝ｋ１ｌｏｇＣｈｉｓ            式１【００２７】本図に示したように、本発明のヒスタミン計測用センサのヒスタミンの検出限界は０．５ｐｐｔであり、さきに特許出願したヒスタミン検出用電気化学バイオセンサの検出感度を１０倍上回る。
【実施例１】（ペニシリンＧの定量）【００２８】以下に本発明のヒスタミン計測用センサを用いたペニシリンＧの定量測定方法と測定結果を示す。測定に際してはヒスタミン濃度１００ｐｐｂのリン酸緩衝溶液を電解質溶液に用い、この溶液にペニシリンＧを濃度１ｐｐｔから１００ｐｐｂまで、順次段階的に加え、各ペニシリンＧ濃度に対応するヒスタミン酸化電流の減少値を逐次測定した。【００２９】まず１００ｐｐｂヒスタミンを含むリン酸緩衝溶液に１ｐｐｔのペニシリンＧを加えたときのヒスタミン酸化電流の経時変化を図４に示す。図から明らかなようにペニシリンＧ添加後、酸化電流値ははじめ時間とともに減少し、５−１０分後にほゞ一定になる。【００３０】１ｐｐｔ−１００ｐｐｂのペニシリンＧ濃度に対応するヒスタミン酸化電流の減少値のプロットを図５に示す。ペニシリンＧの添加によるヒスタミン酸化電流の減少値（−△Ｉ）はペニシリンＧ濃度、ＣＰＧ、５０ｐｐｂ以下では次の関係がなりたつ。ここでｋ２は比例定数である。
−ΔＩ＝ｋ２ｌｏｇ（ＣＰＧ）      式２【００３１】本図に示したように、本発明の計測システムにおけるペニシリンＧの検出限界は０．５ｐｐｔであり、既報の高速液体クロマトグラフによるペニシリンＧの検出限界を約２０００倍上回る。
【実施例２】（テトラサイクリンの定量）【００３２】以下に本発明のセンサを用いたテトラサイクリンの定量測定と測定結果を示す。測定方法は実施例１の場合と同じである。テトラサイクリンの測定濃度範囲は１ｐｐｔから１０ｐｐｂである。【００３３】測定結果を図６に示す。テトラサイクリン添加によるヒスタミン酸化電流の減少値はテトラサイクリン濃度１００ｐｐｔまではテトラサイクリン濃度の対数に比例し、式２と同様の関係で表される。【００３４】本図で示したように、本発明の計測システムにおけるテトラサイクリンの検出限界は０．５ｐｐｔであり、ペニシリンＧの検出限界と同一である。
【実施例３】（生乳中のペニシリンＧの定量）【００３５】以下に本発明のセンサを用いて、生乳中のペニシリンＧの定量測定と測定結果を示す。測定法は実施例１、２の場合と同じである。ペニシリンＧの測定濃度範囲は６ｐｐｔから１５ｐｐｂである。【００３６】測定結果を図７に示す。ペニシリンＧ添加によるヒスタミン酸化電流の減少値は２００ｐｐｔまでペニシリンＧ濃度の対数に比例し、実施例１、３の場合と同様、式２で表される。検出限界は１ｐｐｔである。この結果から本センサは生乳に含まれる蛋白、脂肪、糖などに影響されず抗生物質の定量測定ができることが確かめられた。
【発明の効果】
【００３７】以上説明したように本発明の計測システムは下記の効果を有する。
１．検出限界濃度が０．５−１ｐｐｔである。
２．既報の電気化学酸素センサによる計測システムにくらべ、１０６−１０７倍の感度を有し、ＵＶ検出器と組み合わせた液体クロマトグラフ法による方法よりも約２０００倍の感度を有する。
３．小型かつ安価であり、操作が容易である。
４．外気開放下で測定ができる。
【００３８】本発明の電気化学バイオセンサは上記の特徴から、食品衛生学、医学および生理学その他のさまざまな研究分野および酪農、食品加工、その他多くの生産現場において利用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】（図面の図番号に合わせた各図の説明文を記載します。）
【図１】センサ電極の断面図を示す図である。
【図２】センサ電極および計測システムを示す図である。
【図３】リン酸緩衝溶液中のヒスタミン濃度とヒスタミン酸化電流の関係を示す図である。
【図４】ヒスタミン含有リン酸緩衝溶液中への１ｐｐｔペニシリンＧ添加によるヒスタミン酸化電流変化の時間経過を示す図である。
【図５】ヒスタミン含有リン酸緩衝溶液中のペニシリンＧ濃度と電流の関係を示す図である。
【図６】ヒスタミン含有リン酸緩衝溶液中のテトラサイクリン濃度と酸化電流の関係を示す図である。
【図７】リン酸緩衝溶液による１／１０希釈生乳中のペニシリンＧ濃度と酸化電流の関係を示す図である。
【符号の説明】
【００３９】１１  金電極支持体
１２  テトラチオフルバレン錯体被膜
１３  テトラチオフルバレン錯体、金ナノ粒子、ナフィオン混合物被膜
１４  ヒスタミン脱水素酵素、テトラチオフルバレン錯体、金ナノ粒子、ゼラチン混合物被膜
１５  ゼラチン被膜
２１  電気化学バイオセンサ
２２  銀／塩化銀参照電極
２３  白金対抗電極
２４  テフロン被覆
２５  テフロン製キャップ
２６  ポテンシオスタット
２７  レコーダー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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