(57)【要約】【課題】高い感度で被検体を検出することができる検出チップ作製方法を提供することにある。【解決手段】局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属微粒子と被検体とを含む試料を検出面に接触させる接触ステップと、検出面に接触している試料中に捕捉光を照射して少なくとも金属微粒子を捕捉し、光捕捉効果により金属微粒子を、検出面のプラズモン増強場が形成されるプラズモン増強領域に収集させる収集ステップと、金属微粒子を収集させた検出面の前記プラズモン増強領域に励起光を照射し、検出面のプラズモン増強領域からの光学物理特性の強度を測定する測定ステップと、測定ステップで測定した光学物理特性の強度に基づいて試料に含まれる被検体を検出する検出ステップとを有することで上記課題を解決する。【選択図】図１
2009222484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光が照射されることでプラズモン増強場を形成する検出面を備えるプラズモン活性基体を用い、試料に含まれる被検体を検出する被検体検出方法であって、
局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属微粒子と前記被検体とを含む試料を前記検出面に接触させる接触ステップと、
前記検出面に接触している前記試料中に捕捉光を照射して少なくとも前記金属微粒子を捕捉し、光捕捉効果により前記金属微粒子を、前記検出面のプラズモン増強場が形成されるプラズモン増強領域に収集させる収集ステップと、
前記金属微粒子を収集させた前記検出面の前記プラズモン増強領域に前記励起光を照射し、前記検出面の前記プラズモン増強領域からの光学物理特性の強度を測定する測定ステップと、
前記測定ステップで測定した光学物理特性の強度に基づいて前記試料に含まれる前記被検体を検出する検出ステップとを有することを特徴とする被検体検出方法。
【請求項２】
前記接触ステップは、前記被検体を含む試料を前記検出面に接触させた後、前記試料中に前記金属微粒子または前記金属微粒子を含む試料を混入する請求項１に記載の被検体検出方法。
【請求項３】
前記接触ステップは、前記被検体を含む試料中に前記金属微粒子を混入させた後、前記被検体を含み、かつ前記金属微粒子が混入された試料を前記検出面に接触させる請求項１に記載の被検体検出方法。
【請求項４】
前記収集ステップは、前記試料中に前記捕捉光を照射して、前記試料中の前記被検体および／または前記金属微粒子を捕捉し、捕捉した前記被検体および／または前記金属微粒子を走査して前記検出面まで移動し、前記プラズモン増強領域に収集させる請求項１〜３のいずれかに記載の被検体検出方法。
【請求項５】
前記収集ステップは、前記捕捉光を前記検出面に走査させて、捕捉した前記被検体および／または前記金属微粒子を走査して前記検出面まで移動する請求項４に記載の被検体検出方法。
【請求項６】
前記収集ステップは、前記検出面に前記捕捉光を照射して、前記試料中の前記被検体および／または前記金属微粒子を捕捉し、前記検出面の前記プラズモン増強領域に収集させる請求項１〜３のいずれかに記載の被検体検出方法。
【請求項７】
前記収集ステップは、前記試料中に前記捕捉光を照射して前記被検体を捕捉し、捕捉した前記被検体を前記捕捉光により走査して移動させ、前記プラズモン活性基体の前記検出面に固定されている前記被検体と特異的に結合する物質に結合させるとともに、前記捕捉光によって、前記試料中の前記金属微粒子を捕捉し、捕捉した前記金属微粒子を走査して前記検出面まで移動し、前記プラズモン増強領域に収集させる請求項１〜５のいずれかに記載の被検体検出方法。
【請求項８】
前記収集ステップは、前記金属微粒子の表面に固定されている前記被検体と特異的に結合する物質に前記被検体を結合させ、前記試料中に照射されている前記捕捉光によって、前記被検体と結合した前記金属微粒子を捕捉し、捕捉した前記被検体および前記金属微粒子を前記検出面の前記プラズモン増強領域に収集させる請求項１〜６のいずれかに記載の被検体検出方法。
【請求項９】
前記収集ステップは、前記試料中に照射されている前記捕捉光によって、前記試料中の前記被検体および前記金属微粒子を捕捉し、捕捉した前記被検体および前記金属微粒子を前記プラズモン増強領域に収集させる請求項１〜６のいずれかに記載の被検体検出方法。
【請求項１０】
前記接触ステップは、さらに、前記被検体を、前記プラズモン活性基体の前記検出面に固定されている、前記被検体と特異的に結合する物質に結合させ、
前記収集ステップは、前記試料中に前記捕捉光を照射して前記金属微粒子を捕捉し、捕捉した前記金属微粒子を前記検出面の前記プラズモン増強領域に収集させる請求項１〜６のいずれかに記載の被検体検出方法。
【請求項１１】
被検体と局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属微粒子とを含む試料を充填または流動させる試料セルと、
前記試料と接触するように前記試料セル内に配置され、前記試料と接触している試料接触面に対して励起光が照射されることにより前記接触面にプラズモン増強場を生じるプラズモン活性基体と、
前記試料接触面に励起光を照射する励起光照射手段と、
前記試料接触面の近傍から射出される光を検出し、前記試料の物理特性を検出する物理特性検出手段と、
捕捉光を照射して光捕捉効果により前記金属微粒子を捕捉し、前記試料中の被検体および前記金属微粒子を前記試料接触面のプラズモン増強場が発生しているプラズモン増強領域に収集させる捕捉光照射手段とを有することを特徴とする被検体検出装置。
【請求項１２】
前記励起光照射手段と前記捕捉光照射手段とは、１つの光照射手段である請求項１１に記載の被検体検出装置。
【請求項１３】
前記捕捉光照射手段は、前記捕捉光として、前記励起光とは異なる波長の光を照射する請求項１１または１２に記載の被検体検出装置。
【請求項１４】
前記捕捉光照射手段は、前記捕捉光として、レーザ光を照射する請求項１１〜１３のいずれかに記載の被検体検出装置。
【請求項１５】
さらに、前記被検体を含む試料および前記金属微粒子を含む試料の少なくとも１つ、または、前記被検体および前記金属微粒子を含む試料、もしくは、前記金属微粒子を、前記試料セルに流下または滴下させる手段を有する請求項１１〜１４のいずれかに記載の被検体検出装置。
【請求項１６】
前記捕捉光照射手段は、前記捕捉光を走査させる前記請求項１１〜１５のいずれかに記載の被検体検出装置。
【請求項１７】
前記プラズモン活性基体は、前記試料接触面に局在プラズモンを誘起し得る大きさの凸部が形成されている請求項１１〜１６に記載の被検体検出装置。
【請求項１８】
前記プラズモン活性基体は、前記試料接触面に前記被検体と特異的に結合する物質が固定されている請求項１１〜１７に記載の被検体検出装置。
【請求項１９】
前記金属微粒子は、表面に、前記被検体と特異的に結合する物質が固定されている請求項１１〜１８に記載の被検体検出装置。
【請求項２０】
前記捕捉光照射手段は、前記試料中に前記捕捉光を照射して、前記試料中の前記被検体および／または前記金属微粒子を捕捉し、捕捉した前記被検体および／または前記金属微粒子を走査して前記プラズモン活性基体の前記試料接触面まで移動し、前記試料接触面の前記プラズモン増強領域に収集させる請求項１１〜１９のいずれかに記載の被検体検出装置。
【請求項２１】
前記捕捉光照射手段は、前記プラズモン活性基体の前記試料接触面に前記捕捉光を照射して、前記試料中の前記被検体および／または前記金属微粒子を捕捉し、前記試料接触面の前記プラズモン増強領域に収集させる請求項１１〜１９のいずれかに記載の被検体検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小な被検体を検出する被検体検出方法及び被検体検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微小な被検体を検出する検出装置として、局在プラズモンにより発生させた増強電場、また、局在プラズモンと光がカップリングすることで共鳴が起こる現象である局在プラズモン共鳴現象によりさらに増強された増強電場を利用した検出装置がある。
このような検出装置は、局在プラズモンを誘起し得る金属の凸部を表面に多数配置した基板上に被検体を載置し、被検体のラマン散乱光を局在プラズモンにより発生させた増強電場により増強させて検出する検出装置である。ここで、ラマン散乱光は、被検体毎に固有のスペクトルとなるため、被検体のラマン散乱光を検出することで、被検体を同定したり、特定の被検体の有無を検出したりすることができる。
【０００３】
さらに、局在プラズモン共鳴現象により増強された増強電場を発生させる基板としては、例えば、特許文献１及び特許文献２に記載された構成の基板がある。
特許文献１には、表面に金属の薄膜が形成された微粒子が高い密度で配置された基板が記載されている。より具体的には、特許文献１には、基板上に密に配置した誘電体あるいは半導体の微粒子を異方性ドライエッチング処理により縮小させ、蒸着もしくはスパッタリングにより金属もしくは半導体を微粒子上に半球状に付着させることにより隣り合った微粒子の金属どうしの間隙を任意の距離に制御して形成した二次元配列構造体基板が記載されている。
また、特許文献２には、多数の微細な凸部が形成され、その凸部の表面に金属膜を積層され、さらに金属膜の表面に誘電体層が積層され、誘電体層表面に試料中の被測定物質と特異的に結合して特異的結合物を構成しうる特異的結合メンバーが固定されている構成の基板が記載されている。
【０００４】
また、特許文献３には、一表面に複数の微細孔が分布形成された基体と、基板の複数の微細孔内に、頭部が基体の表面よりも上に突出するように配置された局在プラズモン共鳴を誘起し得る大きさの第１の金属微粒子とで構成される微細構造体を、第１の金属微粒子の頭部に被検体と特異的結合し得る物質を固定した状態で、溶液中に設置するとともに、溶液中に、局在プラズモン共鳴を誘起し得る大きさの複数の第２の金属微粒子を、被検体と特異的結合し得る物質を固定した状態で分散させ、微細構造体の第１の金属微粒子の頭部が突出した面に対し光を照射し、光の前記面における反射光または透過光の強度を測定し、測定された光の強度に基づいて溶液に含まれる被検体を検出する被検体検出方法が記載されている。
この特許文献３に記載の方法では、被検体と、被検体と特異的結合し得る物質を固定した第２の金属微粒子とが結合し、さらに、被検体が、頭部に被検体と特異的結合し得る物質を固定した第１の金属微粒子と結合することで、第１の金属微粒子と第２の金属微粒子が接近することにより大きく変化するプラズモン共鳴波長の変化を検出することで、被検体を検出している。
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１４４５６９号公報
【特許文献２】特開２００７−２４０３６１号公報
【特許文献３】特開２００５−１９５４４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ここで、特許文献１及び特許文献２に示す基板を用いる検出装置は、局在プラズモン共鳴を誘起しうる大きさの複数の金属微粒子、または複数の金属の突起に被検体を吸着させ、増強電場の変化や、増強電場により励起された被検体の蛍光、ラマン散乱光等を検出することで、被検体を検出することができる。
しかしながら、被検体よりも下に存在する金属微粒子の周囲で生じる増強電場しか用いることができないため、大きな増強度を得ることができないという問題がある。
【０００７】
また、特許文献２に示すように、金属膜の表面に被検体と特異的に吸着する物質を固定することで、被検体と金属膜とが結合する効率を高くすることができるが、この場合も被検体よりも下に存在する金属微粒子の周囲で生じる増強電場しか用いることができないため、大きな増強度を得ることができない。
また、被検体毎に特異的結合させる物質を選択し、金属微粒子に付着させる必要があるため、作業が煩雑となり、装置毎に使用対象も限定されてしまう。
【０００８】
また、特許文献３に記載の方法では、プラズモン共鳴波長の変化を検出しているが、特異的結合を２回行う必要がある。したがって、被検体に２分子以上の特異的結合させる物質（以下「抗体」という。）を結合させる必要がある。そのため、被検体が分子量の小さい物質である場合は、被検体に２分子の抗体を吸着させることができず、被検体を検出することができないという問題がある。
また、特許文献３に記載の方法は、被検体を介して第１の金属微粒子と第２の金属微粒子とが近接することに発生するプラズモン共鳴波長の変化を検出しているため、被検体を介して結合されている部分のみの第１の金属微粒子と第２の金属微粒子とが近接するようにする必要があるという問題もある。
また、プラズモン共鳴波長の変化を検出するためには、確実に第２の金属微粒子を被検体に吸着させる必要があるという問題もある。
【０００９】
本発明の目的は、上記従来技術に基づく問題点を解消し、簡単にかつ高い感度で被検体を検出することができる被検体検出方法及び被検体検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明は、励起光が照射されることでプラズモン増強場を形成する検出面を備えるプラズモン活性基体を用い、試料に含まれる被検体を検出する被検体検出方法であって、局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属微粒子と前記被検体とを含む試料を前記検出面に接触させる接触ステップと、前記検出面に接触している前記試料中に捕捉光を照射して少なくとも前記金属微粒子を捕捉し、光捕捉効果により前記金属微粒子を、前記検出面のプラズモン増強場が形成されるプラズモン増強領域に収集させる収集ステップと、前記金属微粒子を収集させた前記検出面の前記プラズモン増強領域に前記励起光を照射し、前記検出面の前記プラズモン増強領域からの光学物理特性の強度を測定する測定ステップと、前記測定ステップで測定した光学物理特性の強度に基づいて前記試料に含まれる前記被検体を検出する検出ステップとを有することを特徴とする被検体検出方法を提供するものである。なお、前記捕捉光は、集光された光であるのが好ましい。また、光学物理特性は、反射光、散乱光、透過光、吸収光の少なくとも１つである。
【００１１】
ここで、前記接触ステップは、前記被検体を含む試料を前記検出面に接触させた後、前記試料中に前記金属微粒子または前記金属微粒子を含む試料を混入することが好ましい。
また、前記接触ステップは、前記被検体を含む試料中に前記金属微粒子を混入させた後、前記被検体を含み、かつ前記金属微粒子が混入された試料を前記検出面に接触させることが好ましい。
また、前記収集ステップは、前記試料中に前記捕捉光を照射して、前記試料中の前記被検体および／または前記金属微粒子を捕捉し、捕捉した前記被検体および／または前記金属微粒子を走査して前記検出面まで移動し、前記プラズモン増強領域に収集させることが好ましく、また、前記捕捉光を前記検出面に走査させて、捕捉した前記被検体および／または前記金属微粒子を走査して前記検出面まで移動することが好ましい。
また、前記収集ステップは、前記検出面に前記捕捉光を照射して、前記試料中の前記被検体および／または前記金属微粒子を捕捉し、前記検出面の前記プラズモン増強領域に収集させることが好ましい。
また、前記収集ステップは、前記試料中に前記捕捉光を照射して前記被検体を捕捉し、捕捉した前記被検体を前記捕捉光により走査して移動させ、前記プラズモン活性基体の前記検出面に固定されている前記被検体と特異的に結合する物質に結合させるとともに、前記捕捉光によって、前記試料中の前記金属微粒子を捕捉し、捕捉した前記金属微粒子を走査して前記検出面まで移動し、前記プラズモン増強領域に収集させることが好ましい。
また、前記収集ステップは、前記金属微粒子の表面に固定されている前記被検体と特異的に結合する物質に前記被検体を結合させ、前記試料中に照射されている前記捕捉光によって、前記被検体と結合した前記金属微粒子を捕捉し、捕捉した前記被検体および前記金属微粒子を前記検出面の前記プラズモン増強領域に収集させることが好ましい。
また、前記収集ステップは、前記試料中に照射されている前記捕捉光によって、前記試料中の前記被検体および前記金属微粒子を捕捉し、捕捉した前記被検体および前記金属微粒子を前記プラズモン増強領域に収集させることも好ましい。
また、前記接触ステップは、さらに、前記被検体を、前記プラズモン活性基体の前記検出面に固定されている、前記被検体と特異的に結合する物質に結合させ、前記収集ステップは、前記試料中に前記捕捉光を照射して前記金属微粒子を捕捉し、捕捉した前記金属微粒子を前記検出面の前記プラズモン増強領域に収集させることが好ましい。
【００１２】
また、上記課題を解決するために、本発明は、被検体と局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属微粒子とを含む試料を充填または流動させる試料セルと、前記試料と接触するように前記試料セル内に配置され、前記試料と接触している試料接触面に対して励起光が照射されることにより前記接触面にプラズモン増強場を生じるプラズモン活性基体と、前記試料接触面に励起光を照射する励起光照射手段と、前記試料接触面の近傍から射出される光を検出し、前記試料の物理特性を検出する物理特性検出手段と、捕捉光を照射して光捕捉効果により前記金属微粒子を捕捉し、前記試料中の被検体および前記金属微粒子を前記試料接触面のプラズモン増強場が発生しているプラズモン増強領域に収集させる捕捉光照射手段とを有することを特徴とする被検体検出装置を提供するものである。
【００１３】
ここで、前記励起光照射手段と前記捕捉光照射手段とは、１つの光照射手段であることが好ましい。
また、前記捕捉光照射手段は、前記捕捉光として、前記励起光とは異なる波長の光を照射することも好ましい。
また、前記捕捉光照射手段は、前記捕捉光として、レーザ光を照射することが好ましい。
また、さらに、前記被検体を含む試料および前記金属微粒子を含む試料の少なくとも１つ、または、前記被検体および前記金属微粒子を含む試料、もしくは、前記金属微粒子を、前記試料セルに流下または滴下させる手段を有することが好ましい。
【００１４】
また、前記捕捉光照射手段は、前記捕捉光を走査させることが好ましい。
また、前記プラズモン活性基体は、前記試料接触面に局在プラズモンを誘起し得る大きさの凸部が形成されていることが好ましい。
また、前記プラズモン活性基体は、前記試料接触面に前記被検体と特異的に結合する物質が固定されていることが好ましい。
また、前記金属微粒子は、表面に、前記被検体と特異的に結合する物質が固定されていることが好ましい。
また、前記捕捉光照射手段は、前記試料中に前記捕捉光を照射して、前記試料中の前記被検体および／または前記金属微粒子を捕捉し、捕捉した前記被検体および／または前記金属微粒子を走査して前記プラズモン活性基体の前記試料接触面まで移動し、前記試料接触面の前記プラズモン増強領域に収集させることが好ましい。
また、前記捕捉光照射手段は、前記プラズモン活性基体の前記試料接触面に前記捕捉光を照射して、前記試料中の前記被検体および／または前記金属微粒子を捕捉し、前記試料接触面の前記プラズモン増強領域に収集させることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、被検体の種類、大きさによらず、被検体の周囲に高い増強度の電場を形成することができる。これにより、被検体を高い感度で検出することができ、被検体をより確実に同定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明に係るに被検体検出方法及び被検体検出装置について、添付の図面に示す実施形態を基に詳細に説明する。
【００１７】
図１は、本発明の被検体検出方法を用いる本発明の被検体検出装置の一実施形態である被検体検出装置１０の概略構成を示す正面図であり、図２は、図１に示した被検体検出装置１０の微細構造体１２の概略構成を示す上面図である。
【００１８】
図１に示すように、被検体検出装置１０は、液体試料を貯留し、保持する試料セル１１と、試料セル１１の内部に配置された微細構造体（つまり、プラズモン活性基体）１２と、微細構造体１２に励起光Ｌｅを照射する励起光照射手段１４と、微細構造体１２で反射された反射光を検出する光検出手段１６と、微細構造体１２に捕捉光Ｌｐを照射する捕捉光照射手段１８と、試料セル１１内に被検体を含有する液体を滴下する被検体滴下手段２０と、試料セル１１内に金属微粒子を含有する液体を滴下する金属微粒子滴下手段２２とを有する。
なお、図示しないが、被検体検出装置１０は、微細構造体１２、励起光照射手段１４、光検出手段１６等の各部を覆う筐体や、被検体検出装置１０の内部で発生した迷光を除去するフィルタ等の各種の光学部材や、被検体検出装置１０の動作を制御する制御部等の被検体検出装置１０に必要な各種の部材も有する。
【００１９】
試料セル１１は、内部に液体試料を貯留し、保持する容器であり、上面には、被検体滴下手段２０及び金属微粒子滴下手段２２から供給される溶液を通過させるための開口が形成されている。この試料セル１１は、側面及び上面が透明であり、内部に入射された光を透過する。なお、試料セル１１の形状は、特に限定されず、直方体形状、円柱形状等種々の形状とすることができる。
【００２０】
微細構造体１２は、試料セル１１の内部の底面に載置されている。
図２に示すように、微細構造体１２は、誘電体基材３２および誘電体基材３２の一面に配置された導電体３４で構成された基体３０と、誘電体基材３２の導電体３４が配置された面とは反対側の面に配置された金属体３６とを有する。
【００２１】
基体３０は、金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３）で形成された誘電体基材３２と、誘電体基材３２の一面に設けられ、陽極酸化されていない金属（Ａｌ）で形成された導電体３４とを有する。ここで、誘電体基材３２と導電体３４とは、一体で形成されている。
また、誘電体基材３２には、導電体３４が配置される面とは反対側の面から導電体３４側の面に向けて延びる略ストレートな形状（直管形状）の微細孔４０が複数の開孔されている。
複数の微細孔４０は、導電体３４が配置される面とは反対側の面側の端部は、誘電体基材３２の表面まで貫通して開口が形成され、導電体３４側の端部は、誘電体基材３２の表面まで貫通していない。つまり、微細孔４０は、導電体３４までは到達していない孔となる。また、複数の微細孔４０は、測定光の波長より小さい径及びピッチで略規則的に配列されている。
ここで、測定光として可視光を用いる場合は、微細孔４０の配置ピッチを２００ｎｍ以下とすることが好ましい。
【００２２】
金属体３６は、誘電体基材３２の微細孔４０内に充填されている充填部４５と、微細孔４０上に誘電体基材３２の表面より突出して形成され、充填部４５の外径よりも大きい外径を有し、局在プラズモンを誘起し得る大きさの突出部（つまり凸部）４６とからなる複数の棒部４４で構成されている。ここで、金属体３６を形成する材料としては、局在プラズモンを発生させる種々の金属を使用でき、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、及びこれらの合金等が挙げられる。また、金属体３６は、これらの金属を２種以上含むもので形成してもよい。また、電場増強効果をより高くすることができるため、金属体３６は、Ａｕ、Ａｇ等を用いて形成することがより好ましい。
微細構造体１２は、以上のような構成であり、金属体３６の複数の棒部４４の突出部４６が配置される面が、被検体が配置される面、つまり、検出面１２ａとなる。
【００２３】
ここで、微細構造体１２の作製方法について説明する。
図３（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ微細構造体１２の作製方法の一例を示す工程図である。
まず、図３（Ａ）に示すような直方体形状の被陽極酸化金属体４８に陽極酸化処理を行う。具体的には、被陽極酸化金属体４８を陽極とし、陰極と共に電解液に浸漬させ、陽極陰極間に電圧を印加することで陽極酸化する。
ここで、陰極としては、カーボンやアルミニウム等が使用される。電解液としては制限されず、硫酸、リン酸、クロム酸、シュウ酸、スルファミン酸、ベンゼンスルホン酸、アミドスルホン酸等の酸を、１種又は２種以上含む酸性電解液が好ましく用いられる。
なお、本実施形態では、被陽極酸化金属体４８を直方体形状としたが、その形状は制限されず、種々の形状とすることができる。また、支持体の上に被陽極酸化金属体４８が層状に成膜されたものなど、支持体付きの形態で用いることできる。
【００２４】
被陽極酸化金属体４８を陽極酸化すると、図３（Ｂ）に示すように、被陽極酸化金属体の表面から該面に対して略垂直方向に酸化反応が進行し、誘電体基材３２となる金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３）が生成される。陽極酸化により生成される金属酸化物体（つまり、誘電体基材３２）は、多数の平面視略正六角形状の微細柱状体４２が隙間なく配列した構造を有するものとなる。
また、各微細柱状体４２は、底面が丸みを帯びた形状となり、さらに、略中心部には、表面から深さ方向（つまり、微細柱状体４２の軸方向）に略ストレートに延びる微細孔４０が開孔される。陽極酸化により生成される金属酸化物体の構造は、益田秀樹、「陽極酸化法によるメソポーラスアルミナの調製と機能材料としての応用」、材料技術Vol.15,No.10、1997年、p.34等に記載されている。
【００２５】
また、規則配列構造の金属酸化物体を生成する場合の好適な陽極酸化条件例としては、電解液としてシュウ酸を用いる場合、電解液濃度０．５Ｍ、液温１４〜１６℃、印加電圧４０〜４０±０．５Ｖ等が挙げられる。この条件で生成される微細孔４０は例えば、径が約３０ｎｍ、ピッチが約１００ｎｍである。
【００２６】
次に、誘電体基材３２の微細孔４０に電気メッキ処理を施すことにより、図３（Ｃ）に示すように、充填部４５と突出部４６とからなる棒部４４を形成する。
ここで、電気メッキを行うと、導電体３４が電極として機能し、電場が強い微細孔４０の底部から優先的に金属が析出する。この電気メッキ処理を継続して行うことにより、微細孔１２内に金属が充填されて棒部４４の充填部４５が形成される。充填部４５が形成された後、更に電気メッキ処理を続けると、微細孔４０から充填金属が溢れるが、微細孔４０付近の電場が強いことから、微細孔４０周辺に継続して金属が析出していき、充填部４５上に誘電体基材３２の表面より突出し、充填部４５の径よりも大きい径を有する突出部４６が形成される。
微細構造体１２は以上のようにして作製される。
【００２７】
次に、励起光照射手段１４は、レーザ光源等の光源と光源から出射される励起光Ｌｅを導光する導光系とからなり、特定波長の光（励起光）Ｌｅを射出し、射出した励起光Ｌｅを微細構造体１２の検出面に照射する。
【００２８】
光検出手段１６は分光検出器等からなり、励起光照射手段１４から光が照射されることにより微細構造体１２の検出面で発生する散乱光が入射する位置に配置されている。
光検出手段１６は、微細構造体１２の検出面１２ａで発生する散乱光を分光し、ラマン散乱光のスペクトル（ラマンスペクトル）を検出する。
【００２９】
捕捉光照射手段１８は、レーザ光源と、レーザ光源から射出されたレーザ光を集光する集光レンズ等の導光系とからなり、レーザ光源から射出され、集光レンズで集光した光を捕捉光として検出面に照射する。また、捕捉光照射手段１８は、検出面１２ａ上における捕捉光Ｌｐの照射位置を移動させること、つまり、捕捉光Ｌｐを走査させることができる。
捕捉光照射手段１８は、集光レンズで集光した光を捕捉光Ｌｐとして検出面１２ａに照射することで、検出面１２ａ上の微粒子を光捕捉効果（つまり光ピンセット効果）で捕捉し、捕捉光Ｌｐの中心に収集させる。この点は後ほど詳細に説明する。
【００３０】
被検体滴下手段２０は、被検体を含有する液体を貯留する貯留部と、貯留部に貯留されている被検体を含有する液体を微細構造体１２に滴下する滴下機構とで構成され、微細構造体１２の検出面に対向して配置されている。ここで、滴下機構としては、スポイト等を用いることができる。
被検体滴下手段２０は、被検体を含有する液体試料Ｓを微細構造体１２の検出面１２ａに所定量滴下する。
ここで、被検体を分散する溶媒としては、種々の溶媒を用いることができ、例えば、水、エタノール等が挙げられる。また、溶媒は、被検体（つまり溶質）よりも屈折率が低くなければならない。溶媒の屈折率を被検体よりも低くすることで、電場強度の高い集光位置に被検体を捕捉させることができる。
また、例えば、液体試料に含有されている被検体を検出する場合等は、液体試料を滴下すればよい。
【００３１】
金属微粒子滴下手段２２は、金属微粒子を含有する液体を貯留する貯留部と、貯留部に貯留されている金属微粒子を含有する液体を微細構造体１２に滴下する滴下機構とで構成され、微細構造体１２の検出面１２ａに対向して配置されている。ここで、滴下機構としては、被検体滴下手段２０と同様にスポイト等を用いることができる。
金属微粒子滴下手段２２は、金属微粒子を含有する液体を微細構造体１２の検出面に滴下する。
ここで、金属微粒子は、局在プラズモンを誘起し得る大きさの粒子である。
また、金属微粒子を形成する材料としては、上述した微細構造体の金属体と同様の種々の金属を用いることができる。つまり、局在プラズモンを発生させる種々の金属を使用でき、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、及びこれらの合金等が挙げられる。また、金属微粒子は、これらの金属を２種以上含むもので形成してもよい。また、電場増強効果をより高くすることができるため、金属微粒子は、Ａｕ、Ａｇ等を用いて形成することがより好ましい。また、金属微粒子は、金属体３６と同じ金属で形成しても異なる金属で形成してもよい。
また、金属微粒子を分散する溶媒としては、種々の溶媒を用いることができ、例えば、水、エタノールや、種々の物質を溶解させた水溶液（例えば、クエン酸水溶液）等が挙げられる。
なお、金属微粒子を含有する液体としては、金属微粒子を粒径６０ｎｍの金ナノ粒子とした田中貴金属製の金コロイド溶液や、金属微粒子を粒径３０ｎｍの金ナノ粒子とした、田中貴金属製の金コロイド溶液を用いることが好ましい。
被検体検出装置１０は、基本的に以上のような構成である。
【００３２】
以下、被検体検出装置１０の作用について説明することで、本発明の被検体検出装置および被検体検出方法についてより詳細に説明する。
ここで、図４（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ本発明の被検体検出方法の一実施形態を示す工程図である。
【００３３】
まず、微細構造体１２を試料セル１１の所定位置に載置し、所定位置に固定する。
次に、図４（Ａ）に示すような微細構造体１２の検出面１２ａ上に、被検体滴下手段２０から被検体６０を含有する液体試料Ｓを微細構造体１２の検出面１２ａ上に滴下し、さらに、金属微粒子滴下手段２２から金属微粒子６２を含有する液体を滴下する。
これにより、試料セル１１が、被検体６０と金属微粒子６２を含有する液体試料Ｓを貯留し、保持している状態となり、図４（Ｂ）に示すように、微細構造体１２の検出面１２ａに被検体６０と金属微粒子６２を含有する液体試料Ｓが接触している状態となる。
【００３４】
次に、捕捉光照射手段１８のレーザ光源から射出され集光レンズにより集光された捕捉光Ｌｐを検出面１２ａ上に照射する。
検出面１２ａ上に捕捉光Ｌｐを照射することで、試料セル１１内に保持されている液体試料Ｓに含まれる被検体６０と金属微粒子６２が、光捕捉効果により捕捉光Ｌｐの中心に収集される。ここで、本発明において、「収集する」には、対象物質（つまり被検体や金属微粒子）を目標地点まで強制的に移動させることや、目標地点に誘導することも含まれる。
その後、さらに、捕捉光Ｌｐを捕捉光Ｌｐの中心が検出面１２ａの１つの突出部４６に重なる位置まで走査させる。
これにより、図４（Ｃ）に示すように、突出部４６の周りに被検体６０及び金属微粒子６２が収集された状態となる。なお、図４（Ｃ）に示す捕捉光Ｌｐは、捕捉光Ｌｐの中心付近の捕捉効果が強い領域である。
【００３５】
次に、励起光照射手段１４から励起光Ｌｅを射出し、検査チップの検出面（つまり、微細構造体１２の検出面、被検体６０が付着されている面）を照明する。
【００３６】
微細構造体１２の検出面１２ａは、励起光照射手段１４から射出された光で照明されることで、金属体３６の突出部４６の表面及び金属微粒子６２の表面で局在プラズモンを発生させ、電場を形成する。
また、局在プラズモンを発生している金属（金属微粒子や突出部）同士が数１０ｎｍ以下に近接する領域（ホットスポット）では、非常に増強された電場が形成される。微細構造体では、上記条件を満たす距離に近接している金属微粒子同士の間、突出部同士の間、金属微粒子と突出部との間で、ホットスポットが形成される。
さらに、微細構造体１２では、金属体３６の突出部４６の表面及び金属微粒子６２の表面で電場をより増強させる局在プラズモン共鳴も効果的に発生する。ここで、局在プラズモン共鳴は、局在プラズモンにより局在的に集団運動している金属の自由電子が光の電場に共鳴して振動することで電場がより増強される現象である。微細構造体の凹凸形状である突出部４６（つまり凸部）および／または金属微粒子６２では、入射した光の波長と凹凸形状の大きさとが一致した領域で、突出部４６および／または金属微粒子６２の自由電子が光の電場に共鳴して振動し、入射された光が高い効率で電場に変化され、突出部４６および／または金属微粒子６２の周辺の電場がより増強される。
このように、微細構造体では、検出面で高い電場増強効果を得ることができ、増強された電場が形成される。なお、微細構造体は、電場をより強くすることができるため、突出部及び金属微粒子に局在プラズモン共鳴が発生するように励起光の波長、突出部及び金属微粒子の大きさを設計、調整することが好ましいが、少なくとも突出部及び金属微粒子に局在プラズモンが発生すればよい。
【００３７】
検出面の被検体は、特定波長の励起光が入射されることによりラマン散乱光を発生させる。被検体により発生されたラマン散乱光は、局在プラズモンに起因して発生された電場によって増強される。つまり、ラマン散乱光は、ラマン増強効果により増強される。ここで、ラマン散乱光は、測定する試料の種類によってスペクトルが変化する。
【００３８】
光検出手段１６は、微細構造体１２の検出面１２ａの散乱光を検出し、その検出結果から被検体の種類および／または検出対象となる被検体の有無を検出する。
被検体検出装置１０は、以上のようにして被検体を検出する。
【００３９】
このように、被検体検出装置１０は、検出面１２ａに捕捉光Ｌｐを照射し、光捕捉効果（つまり光ピンセット効果）により金属微粒子６２と被検体６０とを捕捉し、微細構造体１２の金属体３６の突出部４６の近傍に収集させることで被検体６０に突出部４６と多数の金属微粒子６２とを近接させることができ、被検体６０を突出部４６と金属微粒子６２とで挟みこむことができる。これにより、１つの被検体の周囲に局在プラズモンを発生させる物体を複数配置し、被検体が金属微粒子または突出部と付着（または近接）している領域がより大きくすることができ、被検体の周囲に増強電場（正確には、局在プラズモンに起因した増強電場）をより強く発生させることができる。
さらに、突出部に被検体を付着させ、さらにその被検体に金属微粒子を付着（または近接）させることで、突出部と金属微粒子との間に形成されるホットスポットに被検体を配置することが可能となり、被検体の周囲により強い増強電場を形成することができる。
以上より、被検体の周りにより強い増強電場をより多く形成することができ、被検体から生じるラマン散乱光をより増強することができ（つまり、ラマン増強効果をより大きくすることができ）、被検体をより高い感度で検出することができる。
【００４０】
また、捕捉光Ｌｐにより、被検体６０を収集させる位置を特定することができるため、測定位置を特定することができる。また、捕捉光Ｌｐにより被検体６０と金属微粒子６２を収集させることで、液体試料Ｓ中の被検体６０をより高い確率で検出することができる。
また、検出面１２ａに接触した液体試料Ｓを乾燥させる必要がないため、短時間で測定することができる。また、捕捉光Ｌｐを照射し、被検体６０と金属微粒子６２を突出部４６の近傍に収集させることで、検出面１２ａに液体試料Ｓが接触している状態でも、被検体６０を好適に検出することができる。
【００４１】
また、捕捉光で捕捉した被検体のラマン散乱光を検出することで、被検体を同定することができるため、被検体を突出部および／または金属微粒子とを特異的に結合させることなく、被検体を検出することができる。これにより、検出対象の被検体毎に突出部および／または金属微粒子に被検体と特異的に結合する物質（以下「特異的結合物質」）を選択し、選択した特異的結合物質を突出部および／または金属微粒子に固定し、突出部および／または金属微粒子と被検体とを結合させなくても被検体を検出することができる。
また、特異的結合物質を用いないことで、一回の検査で、検出したスペクトル分布から試料中に含まれる種々の被検体を同定することもできる。
また、被検体を特異的結合物質と結合させる必要がないため、被検体が微細で、特異的結合ができない物質である場合も検出することができる。
【００４２】
ここで、上記実施形態のように、捕捉光により金属微粒子と被検体の両方を捕捉することで、より確実に被検体を高い感度で検出することができるが、本発明はこれに限定されず、少なくとも金属微粒子を捕捉し、金属微粒子を突出部の近傍に収集すればよい。金属微粒子を突出部の近傍に収集することで、突出部の近傍により強い増強電場を形成することができ、突出部近傍にある被検体を好適に検出することができる。
【００４３】
また、被検体検出装置１０では、突出部と金属微粒子の両方に特異的結合物質を固定しなかったが、本発明はこれに限定されず、いずれか一方に特異的結合物質を固定してもよい。
【００４４】
金属微粒子または微細構造体の突出部の一方に特異的結合物質を配置することで、特定の被検体（つまり、特異的結合物質と結合する特性を有する被検体）と金属微粒子または微細構造体の突出部とを結合させることができる。これにより、特定の被検体、例えば、検出したい被検体を、金属微粒子または微細構造体の突出部に近接させることができ、特定の被検体をより確実に検出することができる。
また、１つの被検体に結合させる特異的結合物質は１つとなるので、被検体が小さい場合も被検体と特異的結合物質とを結合させることができる。
【００４５】
特異的結合物質としては、以下のような物質を用いることができる。
被検体が蛋白質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種である場合、被検体とイオン結合する特異的結合物質としては、被検体と反対荷電を有する表面修飾基を用いることができ、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基、アミノ基、４級アンモニウム基、イミダゾール基、グアニジニウム基、及びこれらの誘導体基等の表面修飾基が挙げられる。また、金属微粒子または突出部は、これらの表面修飾基を２種以上有していてもよい。
また、被検体が蛋白質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種である場合、被検体と共有結合する特異的結合物質としては、Ｎ−ヒドロキシスクニンイミジルエステル等の反応性エステル基、カルボジイミド基、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール基、ヒドラジド基、チオール基、反応性ジスルフィド基、マレイミド基、アルデヒド基、エポキシド基、（メタ）アクリレート基、ヒドロキシル基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、及びこれらの誘導体基等の表面修飾基が挙げられる。また、金属微粒子または突出部は、これらの表面修飾基を２種以上有していてもよい。
ここで、特異的結合物質としては、例示した表面修飾基の中でも、反応性エステル基、ヒドラジド基、チオール基、及び反応性ジスルフィド基等を用いることが好ましい。
なお、上記記載中、「反応性」とは被検体と反応性を有することを意味する。
【００４６】
さらに、金属微粒子または突出部には、被検体とイオン結合する特異的結合物質及び共有結合する特異的結合物質の両方を固定することが特に好ましい。
この場合、金属微粒子または突出部に対して、被検体とイオン結合する特異的結合物質と、被検体と共有結合する特異的結合物質とを同時に固定してもよいし、これらの特異的結合物質を順次固定してもよい。また、これらの特異的結合物質の表面修飾位置は特に制限されず、これらの特異的結合物質同士が互いに結合していてもよいし、これらの特異的結合物質が互いに独立して金属微粒子または突出部に結合していてもよい。
【００４７】
また、金属微粒子または突出部に対して、被検体とイオン結合する特異的結合物質を固定し、さらにこの特異的結合物質を、被検体と共有結合する特異的結合物質で活性化することも特に好ましい。
例えば、はじめに金属微粒子または突出部に被検体とイオン結合するカルボキシ基を導入し、さらに導入したカルボキシ基を反応性エステル基、ヒドラジド基、チオール基、及び反応性ジスルフィド基等の被検体と共有結合する官能基の形態に誘導して、活性化することが好ましい。
被検体とイオン結合する特異的結合物質と、被検体と共有結合する特異的結合物質とが互いに近接するため、１つ1つの被検体がイオン結合及び共有結合によって金属微粒子の表面または突出部の表面に対して強固に吸着させることができる。
【００４８】
ここで、被検体とイオン結合する表面修飾基と、被検体と共有結合する表面修飾基とを両方備えた特異的結合物質としては、４，４−ジチオジブチル酸（ＤＤＡ）、１０−カルボキシ−１−デカンチオール、１１−アミノ−１−ウンデカンチオール、７−カルボキシ−１−へプタンチオール、１６−メルカプトヘキサデカン酸、１１，１１’−チオジウンデカン酸等の自己組織化膜を形成する分子；アガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、及びセルロース等のヒドロゲル、又はこれらの誘導体（例えばカルボキシメチル誘導体）；ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、及びポリエチレングリコール等の水膨潤性有機ポリマー等が挙げられる。
例えば、被検体がアデニンの場合、被検体とイオン結合する表面修飾基と、被検体と共有結合する表面修飾基とを両方備えた特異的結合物質としては、４，４−ジチオジブチル酸（ＤＤＡ）、及びカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）等が好ましく用いられる。
【００４９】
以下、微細構造体の突出部に特異的結合物質を固定する場合の被検体検出方法について説明する。図５（Ａ）〜（Ｆ）は、それぞれ被検体検出方法の各工程を示す工程図である。
【００５０】
まず、図５（Ａ）に示すように、試料セル１１の底面の所定位置に微細構造体１２を載置する（参照）。
次に、図５（Ｂ）に示すように微細構造体１２の突出部４６の表面に特異的結合物質６４を固定する。ここで、特異的結合物質６４は、検出対象となる被検体６０によって適宜選択すればよく、特異的結合物質６４を突出部４６に固定する方法も特に限定されない。
【００５１】
次に、被検体滴下手段２０から被検体６０を含有する液体試料Ｓを微細構造体１２の検出面上に滴下する。これにより、試料セル１１が被検体６０を含有する液体試料Ｓを貯留し、保持している状態となり、図５（Ｃ）に示すように、微細構造体１２の検出面に被検体６０を含有する液体試料Ｓが接触している状態となる。
その後、液体試料Ｓに含有されている被検体６０は、検出面の突出部４８に固定されている特異的結合物質６４に捕捉され、図５（Ｄ）に示すように、被検体６０が突出部４８の近傍に捕捉された状態となる。ここで、液体試料Ｓ中の被検体６０を特異的結合物質６４に捕捉させる方法は特に限定されず、滴下後一定時間放置することで、被検体６０を捕捉させても、試料セル１１を揺動し、液体試料Ｓを攪拌して対流させることで、積極的に被検体６０を捕捉させるようにしてもよい。
なお、捕捉光照射手段１８のレーザ光源から射出され集光レンズにより集光された捕捉光Ｌｐを検出面上に照射して被検体６０を捕捉し、被検体６０を特異的結合物質６４の近傍に移動または収集して、特異的結合物質６４に捕捉させるようにすることが好ましい。捕捉光を利用することで特異的結合物質６４に被検体６０をより確実に捕捉させることができる。
【００５２】
次に、金属微粒子滴下手段２２から金属微粒子６２を含有する液体を滴下する。
これにより、試料セル１１が、被検体６０と金属微粒子６２を含有する液体を貯留し、保持している状態となり、図５（Ｅ）に示すように、微細構造体１２の検出面１２ａに被検体６０と金属微粒子６２を含有する液体試料Ｓが接触している状態となる。なお、上述したように被検体６０は、特異的結合物質６４により捕捉され、突出部の近傍に配置された状態となっている。
【００５３】
次に、捕捉光照射手段１８のレーザ光源から射出され集光レンズにより集光された捕捉光Ｌｐを検出面上に照射する。
検出面１２ａ上に捕捉光Ｌｐを照射することで、試料セル１１内に保持されている液体試料Ｓに含まれる金属微粒子６２が、光捕捉効果により捕捉光Ｌｐの中心に収集される。
その後、さらに、捕捉光Ｌｐを捕捉光Ｌｐの中心が検出面の１つの突出部４６（具体的には被検体６０を捕捉している突出部４６）に重なる位置まで走査させる。
これにより、図５（Ｆ）に示すように、被検体６０を捕捉した突出部４６の周りに金属微粒子６２が収集された状態となる。
その後は、上述した被検体測定方法と同様に励起光Ｌｅで検出面１２ａを照明し、検出面１２ａ上に局在プラズモンによる増強電場を発生させ、被検体６０のラマン散乱光を増強し、光検出手段１６で検出面の散乱光を検出し、検出結果から被検体６０の種類および／または検出対象となる被検体６０の有無を検出する。
【００５４】
このように、微細構造体１２の金属体４４の突出部４６に特異的結合物質６４を固定しても、捕捉光Ｌｐで金属微粒子６２を突出部４６上に収集させることで、被検体６０を突出部４６と金属微粒子６２とで挟み込むことができ、上述と同様に好適に被検体６０を検出することができる。また、特異的結合物質６４により被検体６０を突出部４６上に捕捉することで、より確実に被検体６０を検出することができる。
また、捕捉光Ｌｐにより金属微粒子６２を収集させることで、２分子以上の特異的結合物質で被検体６０を捕捉することなく、被検体６０に複数の局在プラズモンを誘起し得る物質を近接させることができ、被検体６０のラマン散乱光をより増強することができる。
【００５５】
なお、図５に示す被検体検出方法では、試料セル１１に載置した後に微細構造体１２の突出部４６に特異的結合物質６４を固定したが、本発明はこれに限定されず、微細構造体１２の突出部４６に特異的結合物質６４を固定した後、微細構造体１２を試料セル１１に配置してもよい。
【００５６】
次に、金属微粒子に特異的結合物質を固定する場合の被検体検出方法について説明する。図６（Ａ）〜（Ｅ）は、それぞれ被検体検出方法の各工程を示す工程図である。
【００５７】
まず、図６（Ａ）に示すように、試料セル１１の底面の所定位置に微細構造体１２を載置する（参照）。
次に、被検体滴下手段２０から被検体６０を含有する液体試料を微細構造体１２の検出面上に滴下する。これにより、試料セル１１が被検体６０を含有する液体試料を貯留し、保持している状態となり、図６（Ｂ）に示すように、微細構造体１２の検出面に被検体６０を含有する試料が接触している状態となる。
【００５８】
次に、金属微粒子滴下手段２２から特異的結合物質６６が固定されている金属微粒子６２を含有する液体を滴下する。なお、特異的結合物質６６は、検出対象となる被検体６０によって適宜選択すればよく、特異的結合物質６６を金属微粒子６２に固定する方法も特に限定されない。
これにより、試料セル１１が、被検体６０と金属微粒子６２（正確には、特異的結合物質６６が固定されている金属微粒子６２）を含有する液体試料Ｓを貯留し、保持している状態となり、図６（Ｃ）に示すように、微細構造体１２の検出面１２ａに被検体６０と金属微粒子６２を含有する液体試料が接触している状態となる。
【００５９】
その後、液体試料Ｓに含有されている被検体６０は、金属微粒子６２に固定されている特異的結合物質６６に捕捉され、図６（Ｄ）に示すように、被検体６０が金属微粒子６２に捕捉された状態となる。ここで、液体試料Ｓ中の被検体６０を特異的結合物質６６に捕捉させる方法も特に限定されず、滴下後一定時間放置することで、被検体６０を捕捉させても、試料セル１１を揺動し、液体試料Ｓを攪拌して対流させることで、積極的に被検体６０を捕捉させるようにしてもよい。
【００６０】
次に、捕捉光照射手段１８のレーザ光源から射出され集光レンズにより集光された捕捉光Ｌｐを検出面上に射出する。
検出面上に捕捉光Ｌｐを照射することで、試料セル１１内に保持されている液体試料Ｓに含まれる、特異的結合物質６６が固定されている金属微粒子６２が、光捕捉効果により捕捉光Ｌｐの中心に収集される。
その後、さらに、捕捉光Ｌｐを捕捉光Ｌｐの中心が検出面の１つの突出部４６に重なる位置まで走査させる。
これにより、図６（Ｅ）に示すように、突出部４６の周りに被検体６０を捕捉した金属微粒子６２が収集された状態となる。
その後は、上述した被検体測定方法と同様に励起光で検出面を照明し、検出面上に局在プラズモンによる増強電場を発生させ、被検体のラマン散乱光を増強し、光検出手段１６で検出面の散乱光を検出し、検出結果から被検体の種類および／または検出対象となる被検体の有無を検出する。
【００６１】
このように、金属微粒子６０に特異的結合物質６６を固定しても、被検体６０を特異的結合物質６６により捕捉した金属微粒子６６を捕捉光Ｌｐで突出部４６上に収集させることで、被検体６０を突出部４６と金属微粒子６２とで挟み込むことができ、上述と同様に好適に被検体６０を検出することができる。また、特異的結合物質６６により被検体６０を金属微粒子６０の近傍に捕捉することで、より確実に被検体６０を検出することができる。
また、光捕捉光Ｌｐにより金属微粒子６２を収集させることで、２分子以上の特異的結合物質で被検体６０を捕捉することなく、被検体６０に複数の局在プラズモンを誘起し得る物質を近接させることができ、被検体６０のラマン散乱光をより増強することができる。
【００６２】
ここで、捕捉光照射手段１８から射出する捕捉光は、被検体に吸収されない波長の光とすることが好ましい。被検体に吸収されない波長の光とすることで、捕捉光の強度が検出面で低減することを防止でき、より強い光捕捉効果を得ることができる。
また、捕捉光照射手段１８のレーザ光源としては、安定性の高い波長１０６４ｎｍを連続発振（ＣＷ）するネオジウムヤグレーザ（Ｎｄ3+：ＹＡＧレーザ）を用いることが好ましい。ネジオム配合のＹＡＧレーザを用いることで、射出した光が物質で吸収されることを防止でき、強い強度の捕捉光を検出面上に照射することができる。
また、捕捉光照射手段１８の集光レンズとしては、１００倍の対物レンズ（Ｎ．Ａ．１．３）のレンズを用い集光することで、検出面上で好適に光捕捉効果を得ることができる。
【００６３】
また、本実施形態の微細構造体１２は、陽極酸化を利用して製造されたものであるので、誘電体基材３２の微細孔４０及び金属体３６の突出部４６が略規則配列された微細構造体１２を簡易に製造できる。また、これら微細孔の配列をランダム配列にすることもできる。
【００６４】
また、本実施形態では、誘電体基材３２の製造に用いる被陽極酸化金属体４８の主成分としてＡｌのみを挙げたが、陽極酸化可能で生成される金属酸化物が透光性を有するものであれば、任意の金属が使用できる。Ａｌ以外では、Ｔｉ、Ｔａ、Ｈｆ、Ｚｒ、Ｓｉ、Ｉｎ、Ｚｎ等が使用できる。被陽極酸化金属体４８は、陽極酸化可能な金属を２種以上含むものであってもよい。
【００６５】
また、微細構造体の形状は、微細構造体１２の形状に限定されず、基体上に局在プラズモンを誘起し得る大きさの凸部が形成されていればよく、種々の形状とすることができる。
【００６６】
図７（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、図７（Ｂ）は、図７（Ａ）の上面図である。
図７（Ａ）及び図７（Ｂ）に示す微細構造体８０は、基体８２と基体８２上に配置された多数の金属微粒子８４とで構成されている。
基体８２は、板状の基板である。基体８２は、金属微粒子８４を電気的に絶縁して支持可能な材料で形成すればよく、材料としては、例えば、シリコン、ガラス、イットリウム安定化ジルコニア（ＹＳＺ）、サファイヤ、およびシリコンカーバイド等が挙げられる。
【００６７】
多数の金属微粒子８４は、局在プラズモンを誘起し得る大きさの微粒子であり、基体８２の一面上に分散された状態で固定されている。
ここで、金属微粒子８４は、上述した金属体３６で例示した各種金属で形成することができる。また、金属微粒子８４は、上述した金属微粒子６２と同様の金属微粒子でも異なる金属微粒子でもよい。また、金属微粒子の形状は特に限定されず、例えば、丸型で、直方体型でもよい。
このような構成の微細構造体８０も金属微粒子が配置された検出面に励起光が照射されることで、金属微粒子の周りに局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
【００６８】
また、微細構造体８０を用いて作製した微細構造体も金属微粒子６２と、基体８２上の凸部となる金属微粒子８４とで被検体６０を挟むことができるため、被検体で生じるラマン散乱光を増強することができる。したがって、微細構造体８０を用いて作製した被検体検出装置でも、高い感度で被検体を検出することができる。
【００６９】
次に、図８は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す上面図である。
図８に示す微細構造体９０は、基体９２と基体９２上に配置された多数の金属ナノロッド９４とで構成されている。
ここで、基体９２は、上述した基体８２と同様の構成であるのでその詳細な説明は省略する。
【００７０】
金属ナノロッド９４は、局在プラズモンを誘起し得る大きさであり、短軸長さと長軸長さが異なる棒状の金属ナノ粒子であり、基体９２の一面に、分散された状態で固定されている。金属ナノロッド９４は、その短軸長さが３ｎｍ〜５０ｎｍ程度、長軸長さが２５ｎｍ〜１０００ｎｍ程度であり、長軸長さは励起光の波長よりも小さいサイズのものである。金属ナノロッド９４は、上述した金属微粒子と同様の金属で作製することができる。なお、金属ナノロッドの詳細な構成については、例えば、特開２００７−１３９６１２号公報に記載されている。
ここで、微細構造体９０は、上述した微細構造体８０と同様の方法で作製することができる。
このような構成の微細構造体９０も金属ナノロッドが配置された検出面に励起光が照射されることで、金属ナノロットの周囲に局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
以上のような構成の微細構造体９０を用いた場合も、微細構造体１２及び微細構造体８０と同様に、微細構造体を作製することができ、さらに、被検体を高い感度で検出することができる。
【００７１】
次に、図９（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、図９（Ｂ）は、図９（Ａ）の断面図である。
図９に示す微細構造体１００は、基体１０２と基体１０２上に配置された多数の金属細線１０４とで構成されている。
ここで、基体１０２は、上述した基体８２と同様の構成であるのでその詳細な説明は省略する。
【００７２】
金属細線１０４は、局在プラズモンを誘起し得る線幅の線状部材であり、基体１０２の一面に格子状に配置されている。金属細線１０４は、上述した金属微粒子、金属体と同様の金属で作製することができる。また、金属細線１０４の作製方法は、特に限定されず、蒸着、メッキ等、金属配線を作製する種々の方法で作製することができる。
ここで、金属細線１０４の線幅は、５０ｎｍ以下、特に３０ｎｍ以下であることが好ましい。また、金属細線１０４の配置パターンは、特に限定されない。例えば、複数の金属細線を交差させずに、互いに平行に配置してもよい。また、金属細線の形状も直線に限定されず、曲線としてもよい。
【００７３】
このような構成の微細構造体１００も金属細線が配置された検出面に励起光が照射されることで、金属細線の周囲に局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
以上のような構成の微細構造体１００を用いた場合も、微細構造体１２、微細構造体８０及び微細構造体９０と同様に、微細構造体を作製することができ、さらに、被検体を高い感度で検出することができる。
【００７４】
また、微細構造体は、上述した微細構造体１２、微細構造体８０、微細構造体９０及び微細構造体１００にも限定されず、ぞれぞれの局在プラズモンを誘起し得る凸部を組み合わせた構成としてもよい。
また、基体に蒸着して金属微粒子を形成する場合は、基体上への蒸着を種々の方向から行うようにしてもよい。
ここで、微細構造体は、基体上に金属微粒子を配置してから、基体上へ、金属膜を蒸着し、凸部を形成することが好ましい。このように金属微粒子配置してから、金属膜を蒸着することで、金属微粒子の間に金属膜（微細な金属微粒子）を形成することができ、金属微粒子と金属膜とを近接させることができるため、微細構造体の検出面のホットスポットをより多くすることができる。
【００７５】
ここで、被検体検出装置１０では、金属微粒子滴下手段により液体試料中に金属微粒子を含有する液体を滴下したが、液体試料に金属微粒子を含有させる方法は、これに限定されない。例えば、固体の金属微粒子を金属微粒子に混入させるようにしてもよい。試料セルに滴下する（または投入する）液体試料に予め金属微粒子を混合させておいてもよい。
【００７６】
また、上記実施形態では、いずれも試料セルが、液体試料を貯留し、保持したが、本発明はこれに限定されず、試料セルを流路とし、この流路に液体試料を流しつつ、被検体を検出してもよい。
【００７７】
また、本実施形態では、励起光照射手段と捕捉光照射手段とを別々の光照射手段としたが、本発明はこれに限定されず、１つの光照射手段としてもよい。１つの光照射手段とした場合は、捕捉光と励起光とで異なる波長の光を射出させても、同じ波長の光を射出させてもよい。
【００７８】
また、検出面の複数箇所に捕捉光を照射し、検出面の複数箇所で被検体の検出を行ってもよい。検出面の複数箇所で被検体の検出を行うことで、凸部の配置密度や液体試料中の金属微粒子、被検体の分布にばらつきがあった場合も高い精度で被検体を検出することができる。また、捕捉光で収集させた領域を検出することで、液体試料中の被検体及び金属微粒子を測定領域に集めることができる。これにより、全体を測定した場合よりも検出時間や測定時の演算量を少なくしつつ、高い精度で検出することができる。
【００７９】
また、上述した被検体検出装置１０のように、捕捉光照射手段から射出する捕捉光を走査させることで、金属微粒子及び被検体をより確実に捕捉することができ、より高い精度で被検体を検出することができるが、本発明はこれに限定されず、捕捉光を走査させずに固定してもよい。捕捉光を固定して場合でも光捕捉効果により、所定範囲内にある金属微粒子を捕捉光の中心に収集させることができる。
【００８０】
以上、本発明に係る被検体検出方法及び被検体検出装置について詳細に説明したが、本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良や変更を行ってもよい。
【００８１】
例えば、より微小な被検体は検出できず、また被検体の少なくとも２箇所以上を特異的結合物質により捕捉する必要があるが、金属微粒子と微細構造体の局在プラズモンを誘起しうる凸部の両方に特異的結合物質を固定し、２つの特異的結合物質で挟み込んで被検体を検出する被検体検出装置にも用いることができる。
このような被検体検出装置の場合も捕捉光により金属微粒子を捕捉し、凸部近傍に収集させることで、より確実に、金属微粒子に固定された特異的結合物質で被検体を捕捉することができ、かつ、凸部に固定された特異的結合物質で被検体を捕捉することができる。これにより、より確実に被検体を検出することができる。
【００８２】
被検体検出装置１０では、微細構造体１２の検出面側から光を照射し、検出面からの反射光を検出したが、本発明はこれに限定されず、微細構造体１２の検出面とは反対側の面から光を照射し、検出面からの透過光を検出してもよい。このように透過光を検出する場合は、微細構造体１２の基体を透明部材することが好ましい。
さらに、検出面（のプラズモン増強領域）から検出する光は、反射光、透過光にも限定されず、散乱光、吸収光を検出してもよい。このように、光学物理特性、つまり、反射光、透過光、散乱光、吸収光の少なくとも１つを検出することで、被検体を検出することができる。
【００８３】
また、上記実施形態では、被検体のラマン散乱光を検出したが本発明はこれに限定されず、局在プラズモンに起因して発生した増強電場により増強される被検体の蛍光を検出してもよい。ここで、被検体の蛍光を検出する場合は、被検体に蛍光物質を結合させても、被検体自身の蛍光を検出してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明の被検体検出方法を用いる被検体検出装置の一実施形態の概略構成を示すブロック図である。
【図２】図１に示す被検体検出装置の微細構造体の一実施形態の概略構成を示す斜視図である。
【図３】（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ微細構造体の作製方法を示す工程図である。
【図４】（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ本発明の被検体検出方法の一実施形態を示す工程図である。
【図５】（Ａ）〜（Ｆ）は、それぞれ本発明の被検体検出方法の他の実施形態を示す工程図である。
【図６】（Ａ）〜（Ｅ）は、それぞれ本発明の被検体検出方法の他の実施形態を示す工程図である。
【図７】（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）の部分上面図である。
【図８】微細構造体の他の一例の概略構成を示す上面図である。
【図９】（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）の断面図である。
【符号の説明】
【００８５】
１０  被検体検出装置
１１  試料セル
１２、８０、９０、１００  微細構造体
１４  励起光照射手段
１６  光検出手段
１８  捕捉光照射手段
２０  被検体滴下手段
２２  金属微粒子滴下手段
３０、８２、９２、１０２  基体
３２  誘電体基材
３４  導電体
３６  金属体
４０  微細孔
４２  微細柱状体
４４  棒部
４５  充填部
４６  突出部
４８  被陽極酸化金属体
６０  被検体
６２、８４  金属微粒子
９４  金属ナノロッド
１０４  金属細線
【図１】
2009222484.tif 000003
【図２】
2009222484.tif 000004
【図３】
2009222484.tif 000005
【図４】
2009222484.tif 000006
【図５】
2009222484.tif 000007
【図６】
2009222484.tif 000008
【図７】
2009222484.tif 000009
【図８】
2009222484.tif 000010
【図９】
2009222484.tif 000011