(57)【要約】【課題】  微生物が生産するポリエステル中に存在する生産菌由来ＤＮＡを高感度に検出し、特に宿主やポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の由来を特定する方法を提供する。【解決手段】  ポリヒドロキシアルカン酸を可溶性有機溶剤に溶解し、水または緩衝液で抽出することにより、ポリヒドロキシアルカン酸からポリヒドロキシアルカン酸生産生物由来のＤＮＡを検出及び同定可能な程度で抽出することができる。抽出したＤＮＡから宿主の１６ＳリボソーマルＲＮＡをコードするＤＮＡや、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素ＤＮＡの断片を増幅させることができる。その塩基配列を決定することにより、該ＤＮＡの由来を特定できる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカン酸を含有する試料を可溶性有機溶剤に溶解し、水または緩衝液で試料ＤＮＡを抽出する工程と、当該試料ＤＮＡを増幅させる工程と、その増幅ＤＮＡの内部塩基配列を決定する工程からなることを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法。
【請求項２】
特定するＤＮＡが１６ＳリボソーマルＲＮＡをコードするＤＮＡである請求項１記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法。
【請求項３】
特定するＤＮＡがポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードするＤＮＡである請求項１記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法。
【請求項４】
可溶性有機溶剤がクロロホルム、ジクロロメタンおよび１，２−ジクロロエタンからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜３に記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法。
【請求項５】
試料ＤＮＡを抽出する工程で、水または緩衝液にキャリアＤＮＡを０．１〜５００ｎｇ／ｍｌになるよう添加することを特徴とする、請求項１〜４に記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法。
【請求項６】
ＤＮＡを増幅させる工程がＰＣＲ法である、請求項１〜５のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法。
【請求項７】
ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシヘキサン酸を含む重合体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法。
【請求項８】
ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸からなる共重合体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリヒドロキシアルカン酸中に含まれるポリヒドロキシアルカン酸生産生物由来のＤＮＡの抽出方法および該ＤＮＡの特定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーとして知られており、ＰＨＡ合成能を有する微生物に関して多くの報告がなされている（非特許文献１）。これらのポリマーは生分解性を有し、熱可塑性高分子であること、また、再生可能資源から産生されることから、環境調和型素材または生体適合型素材として多様な産業への応用が期待されている。
【０００３】
ＰＨＡの生産研究の例としては、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、旧名：ラルストニア・ユートロファ、現名：カプリアビダス・ネケイター）の変異株をグルコースとプロピオン酸とを炭素源として培養することによる３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ））の製造方法が開示されている（特許文献１）。また、アエロモナス・ハイドロフィラ(Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ)を用いた培養で３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）とからなる共重合ポリエステル（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ））が生産されている（非特許文献２）。
【０００４】
また、遺伝子組換え技術を応用した生産研究も行われている。例えば、特許文献２ではアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子をカプリアビダス・ネケイターに導入した形質転換体を用いてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産している。そのほか、アエロモナス属細菌由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を大腸菌に導入してＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産した例（非特許文献３）や、シュードモナス属細菌由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子をシュードモナス・プチダやカプリアビダス・ネケイターに導入してよりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシアルカン酸で構成される中鎖ＰＨＡを生産した例（非特許文献４）などがある。
【０００５】
このような遺伝子組換え生物が生産したポリヒドロキシアルカン酸を工業製品として市場に供給する場合、従来の石油原料由来のポリエステルとは異なり、ポリヒドロキシアルカン酸製品中にその生産生物由来のＤＮＡが混入する可能性が考えられ、製品管理上そのＤＮＡの量及び由来等を把握する必要が生じてきている。
【０００６】
従来、ＤＮＡ量を測定する方法としてはジフェニルアミン反応による方法（非特許文献５）やインドール反応による方法（非特許文献６）が知られている。しかしこれらの方法は、検出感度がいずれも数μｇ／ｍｌ程度と高感度な測定法とはいえず、被検体中の測定対象物質が微量の場合は定量できないという欠点があった。また、試料を電気泳動したのち、ゲルをエチジウムブロマイド染色してトランスイルミネーターにて検出する方法や、ビオチン、酵素、ラジオアイソトープなどで標識された標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブを用い、これと標的核酸とをハイブリダイゼーション反応させ、未反応物を洗浄除去等で分離した後、その標識体から信号を検出する方法、または、ＰＣＲを応用した方法（非特許文献７参照）などによってＤＮＡを定量することができる。しかしながらこれらの方法はいずれも水溶液中のＤＮＡを測定するもので、ポリヒドロキシアルカン酸に包含されたＤＮＡの測定にはそのままでは適用できなかった。
【０００７】
それらに対し、微生物生産ポリヒドロキシアルカン酸製品中のＤＮＡを定量する方法として、ポリヒドロキシアルカン酸製品からＤＮＡを抽出し、ハイブリダイゼーション法により定量する方法が開示されており、その検出限界濃度は０．３ｎｇＤＮＡ／ｇポリマーである。（特許文献３）。
【０００８】
しかし、その方法によってもポリヒドロキシアルカン酸試料によっては含まれるＤＮＡが極微量のため検出限界以下になることもある。ましてや上市後のポリマーペレットなどから、製品管理上必要な自社製品であることの区別が可能になるような情報、例えばどのような生物によって生産されたものか、またＰＨＡ合成酵素の由来等を特定することはできなかった。
【特許文献１】特開昭５７−１５０３９３号公報
【特許文献２】特開平１０−１０８６８２号公報
【特許文献３】特開平１９−００００１４号公報
【非特許文献１】「生分解性プラスチックハンドブック」，生分解性プラスチック研究会編，（株）エヌ・ティー・エス，Ｐ１７８−１９７
【非特許文献２】Ｌｅｅ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７：２４０−２４４（２０００）
【非特許文献３】Ｐａｒｋ等、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２：２４８−２５４（２００１）
【非特許文献４】Ｍａｔｓｕｓａｋｉ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：６４５９−６４６７（１９９８）
【非特許文献５】Ｄｉｓｃｈｅ、Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍｉｅ，８：４（１９３０）
【非特許文献６】Ｃｅｒｉｏｔｔｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８：２９７−３０３（１９５２）
【非特許文献７】「バイオ実験イラストレイテッド３+  新版本当にふえるＰＣＲ」，中山広樹著，秀潤社，Ｐ１４１−１５０（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記の問題点を解決するためになされたものであり、生物が生産したポリヒドロキシアルカン酸中に存在するＤＮＡ情報、特に生産細胞やポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の由来を特定する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上述の課題を解決するために鋭意検討した結果、ポリヒドロキシアルカン酸を可溶性有機溶剤に溶解し、水または緩衝液で抽出することにより、ポリヒドロキシアルカン酸生産細胞由来のＤＮＡを効率的に抽出することができ、抽出したＤＮＡから１６ＳリボソーマルＲＮＡやポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードするＤＮＡを増幅させ、その塩基配列を決定することにより該ＤＮＡの由来を特定できることを見出した。
【００１１】
即ち本発明は以下の通りである。
［１］ポリヒドロキシアルカン酸を含有する試料を可溶性有機溶剤に溶解し、水または緩衝液で試料ＤＮＡを抽出する工程と、前記試料ＤＮＡを増幅させる工程と、その増幅ＤＮＡの内部塩基配列を決定する工程からなることを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法、
［２］特定するＤＮＡが１６ＳリボソーマルＲＮＡをコードするＤＮＡである上記記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法、
［３］特定するＤＮＡがポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードするＤＮＡである上記記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法、
［４］可溶性有機溶剤がクロロホルム、ジクロロメタンおよび１，２−ジクロロエタンからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする上記記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法、
［５］試料ＤＮＡを抽出する工程で、水または緩衝液にキャリアＤＮＡを０．１〜５００ｎｇ／ｍｌになるよう添加することを特徴とする、上記記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法、
［６］ＤＮＡを増幅させる工程がＰＣＲ法である、上記記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法、
［７］ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシヘキサン酸を含む重合体であることを特徴とする、上記記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法、
［８］ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸からなる共重合体であることを特徴とする、上記記載のポリヒドロキシアルカン酸中のＤＮＡの特定方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
生産方法が不明な粉末やペレット状のポリマーなどからでもポリヒドロキシアルカン酸中に存在するＤＮＡを高感度に検出し、製品管理上必要な自社製品であることの区別が可能になるような情報、例えばどのような生物によって生産されたものか、ＰＨＡ合成酵素の由来等を特定することに有効な方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明におけるポリヒドロキシアルカン酸を含有する試料は、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を含有するポリエステル樹脂であればどのような形態のものでもよく、例えば、ポリヒドロキシアルカン酸生産生物から回収されたＰＨＡ粉末、およびそれを溶融してペレット化したものなどの原体、あるいは原体を種々の副原料と混練してシート状、フィルム状、繊維状、ビーズ状およびそれを発泡させたものなどの半加工品、或いはそれらの半加工品に成形加工などを施した最終加工品が挙げられる。
【００１４】
＜ＤＮＡ抽出工程＞
ポリエステルからＤＮＡを抽出する手順は、試料ポリヒドロキシアルカン酸に可溶性有機溶剤を添加して溶解させた後に、水または緩衝液を添加して混合してもよいが、試料ポリヒドロキシアルカン酸を溶解させる時に、水又は緩衝液を添加しておいてもよい。試料ポリヒドロキシアルカン酸を溶解後、混合物全体を遠心分離にかけ、水層と有機溶剤層に分ける。水層を取り出すことによって抽出されたＤＮＡ試料が得られる。
【００１５】
本発明によれば、１回の分析に使用するポリヒドロキシアルカン酸試料の量は０．０１ｇ〜１ｇ程度でよい。ポリエステル試料は小片化してある方が有機溶剤への溶解が容易である。
【００１６】
ポリエステル試料を溶解するための可溶性有機溶剤としては、ポリエステル試料を溶解し、かつ水又は緩衝液と混ざらないものであればどのような溶剤でも利用できるが、ポリエステルの溶解性が高く、水層との分離が容易である点から、クロロホルム、ジクロロメタン又は１，２−ジクロロエタンを用いることが好ましく、それらの内少なくとも１種用いることができる。可溶性有機溶剤の添加量は、ポリエステル試料が溶解できればよく、通常はポリエステル試料の２０〜２００倍量（重量比）が好適である。
【００１７】
ＤＮＡを抽出するための緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液等を用いることができ、例えばＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）が好ましく用いることができる。水又は緩衝液には抽出されたＤＮＡが試験管の器壁などに吸着して失われるのを防ぐ目的でキャリアＤＮＡを添加しておくことができる。キャリアＤＮＡとしては、例えばニシンやサケの精子ＤＮＡを超音波処理したものが好適に使用できる。その濃度は０．１〜５００ｎｇ／ｍｌが好ましく、更に好ましくは１〜２００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌである。水又は緩衝液の添加量は前記有機溶剤の添加量に対して重量換算で０．２〜５倍が好ましく、より好ましくは０．５〜１倍が適当である。
【００１８】
＜ＤＮＡを増幅させる工程＞
抽出したＤＮＡを増幅させる工程としては、ＰＣＲ法やＩＣＡＮ法等が利用可能であり、特にＰＣＲ法が好適である。
【００１９】
これまで種々微生物由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子がクローニングされており、それらは合成するＰＨＡの種類により、いくつかのクラスに分類できる。しかし、例えばカプリアビダス・ネケイターを代表例とするクラスＩに属するＰＨＡ合成酵素遺伝子においても、またシュードモナス・アエルギノーサを代表例とするクラスＩＩに属するＰＨＡ合成酵素遺伝子においてもクラスを超えて非常に良く保存されている領域がいくつか存在していることが報告されている。      即ち、Ｎ末端から３１９番目のアミノ酸に相当するシステインが活性中心とされており、その周辺のアミノ酸配列は微生物種にかかわりなく比較的良く保存されている。またそこから約４０アミノ酸程度Ｎ末端に近い領域、即ち２８０番目のトリプトファンを中心とする領域や活性中心から約６０〜７０アミノ酸程度Ｎ末端に近い領域も比較的良く保存されていることが報告されている（Ｓｔｅｉｎｂｕｆｆｅｌ等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、ｖｏｌ．１０３，ｐ２１７−２３０、（１９９２）、Ｓｔｅｉｎｂｕｆｆｅｌ等、Ａｄｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｎｇ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．７１，  ｐ８１−１２３，（２００１））。従って、適宜相同性の高い２ヶ所を選択し、アミノ酸配列から考えられるＰＣＲ用プライマーセットを作製し、ＬＡ  Ｔａｑ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ製）等でＰＣＲを行うことにより増幅断片を得ることができる。
【００２０】
また別のクラスに属するＰＨＡ合成酵素を有する微生物種としては、例えばアエロモナス・キャビエのＰＨＡ合成酵素が例示できる。アエロモナス・キャビエのＰＨＡ合成酵素は前記カプリアビダス・ネケイター等のグループ用プライマーセットではＰＣＲ法による増幅断片は効率よく得られない。しかし、アエロモナス・キャビエのＰＨＡ合成酵素遺伝子用に適当なプライマーセットを使用することにより、同酵素遺伝子断片をＰＣＲ法にて増幅させることも可能である。特に、国際公開公報ＷＯ  ２００４／１０１７９６号パンフレットに記載されているようなアミノ酸置換を伴う変異体酵素（例えばＮ１４９Ｓ変異体やＤ１７１Ｇ変異体）においては、その置換部分が内部に含まれるようなプライマーセットを用いることにより、対応する塩基置換が行われたＰＨＡ合成酵素遺伝子断片として増幅可能である。
【００２１】
その他、たとえ全クラスに対応するようなプライマーセットでは増幅困難な場合でも、各クラスや生物学的に近縁の属や種のみで良く保存されている領域を選択すれば、対応する遺伝子断片の増幅が可能である。
【００２２】
更に適宜プライマーセットを選択すれば、定量的ＰＣＲ法による増幅やリアルタイムＰＣＲ法による増幅を行えば、１６ＳリボソーマルＲＮＡをコードするＤＮＡ（以下１６ＳｒＤＮＡと略記する）やＰＨＡ合成酵素遺伝子断片を基にポリエステル試料中に含まれるＤＮＡの定量も可能である。
【００２３】
微生物の同定方法はコロニーの形態、種々の炭素源の資化性、ビタミンやアミノ酸などの栄養要求性、種々の酵素等の生産性、抗生物質に対する耐性等を指標として行われてきたが、一般的には専門の同定機関に依頼されていた。しかし、分子生物学の発展や塩基配列決定装置の普及・低価格化などにより、対象微生物の１６ＳｒＤＮＡを解析することで、特に同定経験が無くとも系統分類を行うことができるようになってきた。特に細菌の１６ＳｒＤＮＡには１０個の可変領域（微生物の帰属する属や種によって非常に異なる領域）と１１個の保存領域とが交互に反復された構造をとっている。その中でも特にＶ３及びＶ１０と言われる領域は変化に富んでおり、菌種に特異的な配列が含まれていることが多い（江崎  孝行等、腸内細菌学雑誌  ｖｏｌ．２０、ｐ２４５（２００６）、  Ｄｅｌｏｎｇ等、  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、ｖｏｌ．８９、ｐ５６８５（１９９２）、  Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ等編、  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ．（１９９１））。
【００２４】
従って、例えばＶ３領域を含む断片を増幅させるような複数のユニバーサルプライマーと言われるようなプライマーセットを調製しておけば殆どの微生物に対応可能であり、菌種に特異的な配列が含まれる遺伝子断片として増幅可能である。
【００２５】
例えば腸内細菌科の菌群であれば、１６ＳｒＤＮＡ増幅用プライマーセットを含む解析用キットも市販されている。
【００２６】
Ｖ３領域だけでなく、他の領域に対応する断片も増幅させ、内部塩基配列を決定することで、より精度の高い分類も可能である。更にネスティッドＰＣＲ法と言われる２段階のＰＣＲ法を利用することも好適である。また、１回目のＰＣＲ法と塩基配列決定で大まかな分類を推定し、その後の２回目或いは３回目のＰＣＲ法や塩基配列決定で属や種等を特定していくことも可能である。
【００２７】
＜増幅断片の塩基配列を確認する工程＞
ＰＣＲ法により増幅した断片の塩基配列確認は通常の方法で可能である。増幅断片を精製後、一旦ｐＵＣ１９等のクローニング用ベクターにサブクローニングしてもよく、サブクローニングせずに直接、サンガー法等でシークエンスすることも可能である。塩基配列の確認方法としては、例えばＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行うことができる。
【００２８】
その結果得られる増幅断片内部の塩基配列により、ＰＨＡ合成に使用された宿主生物や合成酵素遺伝子の由来を特定することが可能である。
【００２９】
更に複数の領域断片が増幅可能であれば、それぞれの断片の内部配列を確認することにより、より精度の高い推定が可能となる。
【実施例】
【００３０】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。
【００３１】
（実施例１）  ポリヒドロキシアルカン酸試料からのＤＮＡの抽出
アエロモナス・キャビエのＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した遺伝子組換えカプリアビダス・ネケイターにより産生されたポリヒドロキシアルカン酸試料として５種類（ｂ〜ｆ）を用意した。これらは紡糸用或いはブロー成型用に配合されたペレット又は粉末サンプルである。
【００３２】
まずそれぞれのポリヒドロキシアルカン酸試料を約１ｇ秤量し、クロロホルムを２０ｍｌ及びＴＥ緩衝液（Ｓａｕ３ＡＩ消化したλファージＤＮＡを５００ｎｇ／ｍｌ含む）を４ｍｌ加え、ポリエステル試料が溶解するまで撹拌した。
【００３３】
次に４℃、４０００ｇで１５分間の遠心分離を行い、水層約３．４ｍｌを分取した。ついでこの水層をＮｕｃｌｅｏ  Ｔｒａｐ  Ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ製）を用いて精製し、最終的に２５μｌのＴＥ緩衝液で溶出してＤＮＡ抽出液とした。
【００３４】
（実施例２）ＰＨＡ合成酵素遺伝子断片のＰＣＲ法による増幅
実施例１で調製したＤＮＡ抽出液をテンプレートとし、ＰＣＲ法による増幅用酵素としてはＬＡ  Ｔａｑ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ製）を用いた。アエロモナス・キャビエのＰＨＡ合成酵素遺伝子断片の増幅用プライマーセットとしては、（１）配列番号１と配列番号２に示すプライマー、（２）配列番号３と配列番号４に示すプライマー、（３）配列番号５と配列番号６に示すプライマーセットを用いた。その他のＰＣＲ条件は、（イ）９６℃で２分、（ロ）９６℃で１０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１５秒、を３５サイクル繰り返した。ＰＣＲ反応液のそれぞれ１０μｌを４％アガロースで電気泳動を行って増幅断片を確認した。（１）のプライマーセットと（２）のプライマーセットを用いた際の結果を図１に示す。
【００３５】
（実施例３）  増幅断片の内部塩基配列の決定
実施例２で増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、その溶出液の一部をテンプレートＤＮＡとし、それぞれ増幅に用いたＰＣＲプライマーをシークエンス用プライマーとしてＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製）によるシークエンス反応を行った。反応液をＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いて解析した結果、プライマーセット（１）で増幅した断片ではアエロモナス・キャビエのＰＨＡ合成酵素由来のＮ１４９Ｓ変異を含む塩基配列が確認され、またプライマーセット（２）で増幅した断片ではアエロモナス・キャビエのＰＨＡ合成酵素由来のＤ１７１Ｇ変異を含む塩基配列が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＰＣＲ法にて増幅させた断片の電気泳動結果を示した図。
【図１】
2009060855.tif 000002
【配列表】
2009060855000001.app