(57)【要約】【課題】より効率的、かつより簡便に標本へのレーザ照射光の形状を操作して標本に照射し標本の観察を可能にする顕微鏡を提供すること。【解決手段】レーザ光源２１、２２と、標本１２面と共役な位置に配置された視野絞り２９と、前記レーザ光源と前記視野絞りとの間で、前記視野絞りから所定の距離に配置された回折拡散板２７と、前記回折拡散板を前記視野絞りへ投影するリレー光学系３０とを有し、前記所定の距離は、前記リレー光学系の投影倍率により決定される顕微鏡Ａ。【選択図】図１
2009037156.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光源と、
標本面と共役な位置に配置された視野絞りと、
前記レーザ光源と前記視野絞りとの間で、前記視野絞りから所定の距離に配置された回折拡散板と、
前記回折拡散板を前記視野絞りへ投影するリレー光学系とを有し、
前記所定の距離は、前記リレー光学系の投影倍率により決定されることを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
前記回折拡散板を光軸に略直交する面内で振動させる振動機構を有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記レーザ光源からのレーザ光を、光軸に略直交する面内で移動させるレーザ光移動手段を有することを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記回転拡散板は、光軸に対して交換可能であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記視野絞りは、光軸に対して交換可能であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ光源を用いる顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、レーザ光を用いて細胞の標本像や蛍光像を取得するレーザ走査顕微鏡やレーザ共焦点顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００６−３６６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従来の顕微鏡では、標本に照射されるレーザ光は、例えば光ファイバーの射出端の形状である円形に限定される。標本に照射するレーザ光の形状を変えるには、レーザ光を一旦拡大し、例えば四角形や長方形、を形成した絞りを標本面と共役な位置に配置してレーザ光を整形して標本に照射する必要がある。
【０００４】
このような絞りを用いる場合、拡大したレーザ光の一部のみを切り出して所望の形状にするためレーザ光の光効率を低下させる、或いは絞りの形状も限定されるため、より効率的、かつより簡便に標本への照射光の形状を操作して標本に照射し標本の観察を可能にする顕微鏡が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するため、本発明は、レーザ光源と、標本面と共役な位置に配置された視野絞りと、前記レーザ光源と前記視野絞りとの間で、前記視野絞りから所定の距離に配置された回折拡散板と、前記回折拡散板を前記視野絞りへ投影するリレー光学系とを有し、前記所定の距離は、前記リレー光学系の投影倍率により決定されることを特徴とする顕微鏡を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、より効率的、かつより簡便に標本へのレーザ照射光の形状を操作して標本に照射し標本の観察を可能にする顕微鏡を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の一実施の形態にかかる顕微鏡について図面を参照しつつ説明する。
【０００８】
図１は、実施の形態にかかる顕微鏡の光学系の構成図である。図２は、細胞分裂の観察例であり、（ａ）は従来のスポット光を用いた場合を、（ｂ）は本実施例にかかる顕微鏡における長方形光を用いた例をそれぞれ示す。
【０００９】
はじめに、図２を参照しつつ、照射パターン形状を変えたレーザ光の必要性について以下に説明する。
【００１０】
標本の一部分を照明する目的は、大きく分けて、次の二つがある。
【００１１】
（１）光刺激により、変化する蛍光ラベル
一般にＰｈｏｔｏ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ(以下ＰＡと記す)と呼ばれる蛍光物質がある。一般の蛍光物質は、ある励起波長で、蛍光を発するという性質を持っている。ＰＡの場合、蛍光を発しない状態から、所定波長による光刺激により、蛍光を発する状態になる種類がある。それ以外に、光刺激により、最初の蛍光波長から、別の波長の蛍光を発するものがある。
【００１２】
このように刺激するには、所定波長の光を、決められた以上の強度で照明することが必要になる。例えば、細胞の挙動を研究するテーマの一つに、細胞内物質、主にたんぱくの移動を追跡することがある。この追跡は、細胞内外のコミュニケーション、細胞分裂、細胞移動という細胞の主要な活動に関係するものである。ひいては、生体の機能、病気の解明につながるテーマである。
【００１３】
また、細胞内の特定の物質に蛍光ラベルをつけて、顕微鏡観察することが、一般に行われている。最近、次のような蛍光ラベルが開発、商品化され、上記の蛍光観察をしながら、その蛍光を制御し、追跡の自由度を高めることが行われている。
【００１４】
ＰＡＧＦＰ(一般名称)
特定波長で照明することで、蛍光を発しない状態から、蛍光を発する状態に変化させる。
【００１５】
Ｋａｅｄｅ(製品名称)
特定波長で照明することで、緑色の蛍光が、赤色の蛍光に変化する。
【００１６】
Ｄｒｏｎｐａ（製品名称）
特定波長で照明することで、蛍光を発しない状態から、発する状態に変化し、次に、別の波長で照明することで、再び、蛍光を発しない状態になる。更に、この繰り返しを行える。
【００１７】
これらの光で刺激して、状態を変化させることをＰＡ、またはＰｈｏｔｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎと呼んでいる。このようなＰＡ蛍光ラベルを利用すると、任意のタイミングで、任意位置の物質の蛍光ラベルのＯＮ／ＯＦＦを制御し、追跡することができる。
【００１８】
他の光による蛍光ラベルの変化を利用する技術にＦＲＡＰ（Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ａｆｔｅｒ  Ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈ:部分的に蛍光ラベルを退色させた後の蛍光強度の回復/変化/移動を検出する観察手法）がある。この技術は、蛍光のための波長をより強く照射することで、蛍光ラベルがその照射エネルギにより蛍光を発しなくなる”退色”を利用している。この技術も、ＰＡ同様に、任意のタイミングで、任意位置の物質の蛍光ラベルを制御し、(この場合ＯＦＦのみ)追跡することができる。
【００１９】
図２に、ＰＡ照明、ＦＲＡＰの例として、細胞分裂時の微小管に対する部分照射を挙げ、説明する。
【００２０】
図２（ａ）、（ｂ）において、微小管とは、２組の染色体１０２をおのおのの中心１０３、１０４に移動する機能を持つ繊維状構造物１０５である。微小管には、染色体の移動以外に、細胞内の物質を移動するレールとしての機能もある。細胞１０１内の物質移動は基本的に二つの方法がある。一つは、拡散であり、もう一つが、繊維状構造物１０５に沿った移動である。
【００２１】
拡散による移動は、ブラウン運動により自由に移動することであり、方向性を持っていない。一方、繊維状構造物１０５に沿った移動の場合、それをレールのようにした移動であり、方向性を持った移動となる。この移動にＰＡ、ＦＲＡＰを利用する時、刺激する照明形状がスポットの場合、繊維状構造物１０５に正確に位置合わせして、照射する必要がある。
【００２２】
図２（ａ）は、従来のスポット照明１０６を用いた場合である。分裂中の細胞１０１の中に２組の染色体１０２があり、分裂の中心１０３、１０４から伸びた複数の繊維状構造物１０５がその一部につながっている。
【００２３】
繊維状構造物１０５は、細胞１０１内に、微小管以外にも、アクチン繊維、中間系繊維があり、微小管同様に物質移動のレールの役目も有している。アクチン繊維の身近な例は、筋肉の伸縮がある。筋肉は、アクチン繊維をミオシンと呼ばれる移動に関係するタンパクの滑り作用により伸縮を行っている。
【００２４】
このような細胞内構造の一部を光刺激する時、スポット１０６形状では、構造のサイズが小さく、照明位置を合わせることが難しいという問題がある。例えば、繊維状構造１０５の繊維上にスポット１０６を合わせることを顕微鏡下で行うことは、微妙な位置合わせを必要とし非常に困難を伴う作業を必要とする。
【００２５】
このような繊維状構造物１０５上の物質移動を観察する研究例は多く、そこでＰＡが利用されている。そのため、従来のスポット照明１０６では、位置合わせが難しいという欠点がある。
【００２６】
この欠点を解決するため、本実施の形態にかかる顕微鏡では、図２（ｂ）に示すように、所定の幅を有する長方形の照射光１０７を形成し上記繊維構造物１０５と交差させる位置に照射するように構成している。
【００２７】
図２（ｂ）の長方形の照射光１０７を用いることで、繊維状構造物１０５、例えば微小管、への位置合わせが容易になる。一方、微小管以外の余計な位置に照射されても、追跡する部位には無関係である。
【００２８】
また、図２（ｂ）のように、対象構造物である繊維状構造物１０５がほぼ同じ方向に揃っている場合、一度の照射で、複数個所の刺激を同時に実行できるという利点もある。
【００２９】
（２）照明光による蛍光ラベルの退色
励起光の強度が強い場合、または、励起する時間が長くなると、蛍光物質が変化し、蛍光を発しなくなる。これは退色と呼ばれる現象である。この退色により、部分的に蛍光を消し、その部分に移動してくる蛍光物資の挙動を知ることができる。この目的の照明には、従来のスポット照射光だけでは不十分で、少なくとも長円、楕円、長方形という縦横比の異なる照明が必要になる。
【００３０】
また、スポットスキャンでは、広い照明部分を同時に照明できない欠点がある。これは、上記(１)のライン状照明、（２）の退色用の照明に共通する欠点である。
【００３１】
以下、本実施の形態にかかる顕微鏡について図１を参照しつつ説明する。
【００３２】
図１において、顕微鏡Ａは、落射照明光学系１に、レーザ照明光学系Ｂを組み合わせたものである。
【００３３】
落射照明光学系１は、水銀ランプ２を光源として、コレクタレンズ３、リレーレンズ４、電動シャッター５、開口絞り６、リレーレンズ７、視野絞り８、リレーレンズ９で構成されている。
【００３４】
水銀ランプ２からの照明光は、ダイクロイックミラー１０で波長選択され、励起光として、対物レンズ１１方向に反射され、対物レンズ１１を通り、標本１２を照明する。
【００３５】
水銀ランプ２から射出された光は、コレクタレンズ３で集められ、リレーレンズ４を介して、開口絞り６に水銀ランプ２を結像する。リレーレンズ７の次に、標本１２と共役な位置に視野絞り８が設けられている。
【００３６】
標本１２からの光は、再び対物レンズ１１を通り、ダイクロイックミラー１０で、励起光はほとんど反射され、蛍光が透過する。さらに、バリアフィルター１３で蛍光だけが透過し、第二対物レンズ１４により、結像位置１５に蛍光像を形成する。
【００３７】
次に、レーザ照明光学系Ｂについて説明する。ここでは、Ｐｈｏｔｏ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎのためのレーザを２種類設けた例を示す。
【００３８】
第１のレーザ２１は波長４０５ｎｍ、第２のレーザは波長４８８ｎｍである。それぞれに電動シャッター２３、２４が設けられ、不図示の制御装置で射出するレーザ光の波長を選択できる構成である。また、図示していないレーザ光の強度調整機構により、照明強度を調整することができる。強度調整機構は、例えば、複数のＮＤフィルターの組み合わせや、ＡＯＭ（音響光学素子の略）により実現できる。なお、レーザ光の波長は上記に限られないことは言うまでもない。
【００３９】
第２のレーザ２２の光は、ミラー２６で反射され、ダイクロイックミラー２５で反射され、回折拡散板２７に入射する。また第１のレーザ２１の光は、ダイクロイックミラー２５を通過し、回折拡散板２７に入射する。視野絞り２９は、回折拡散板２７で形成された照明光の形状に内接もしくは、それより小さな範囲に設定され、標本に対する照明範囲を明確に限定するために設けられている。また、視野絞り２９の光軸方向の位置は、標本１２と共役となっている。
【００４０】
また、レーザ光源２１、２２からのレーザ光の光軸に直角な方向への移動を制御する移動制御手段３２を有し、回折拡散板２７で形成する照明光を標本１２上で移動させることを可能にしている。移動制御手段３２は、ミラー２６を光軸に対して傾斜させる傾角調整部材３６（例えば、光軸に略垂直に配置された平行平板ガラスを傾斜させる）や、第１、第２のレーザ２１、２２それぞれを光軸に対してチルトさせるチルト機構３４、３５などから構成されている。
【００４１】
回折拡散板２７は、振動機構２８により、一つの方向に細かく往復運動する。それにより、レーザの干渉性を除去し、標本１２への照明光を均一にすることができる。その振動方向は、照明光の形状の縦横において長い方向にすると、照明光の損失をすくなくすることができ好ましい。振動機構２８の例として、ブザーのような電磁的な往復運動、偏心駒とモーターの組み合わせたもの、或いは超音波発信子などがあり、適宜選択可能である。また振動の速さは、画像を取得する速度を考慮し、十分な速さにする必要がある。たとえば、１フレーム１／３０秒のビデオレートの撮影の場合、振動は３０Ｈｚを越える周波数にしなければならない。十分な速度としては、この５倍以上である１５０Ｈｚ以上が望ましい。
【００４２】
また、回折拡散板２７と、視野絞り２９を光軸に対して交換可能にすることで、さまざまな照明の形状を有する照明光に切り替えることが可能になる。なお、回折拡散板２７は複数の回折拡散板２７を搭載した図示していない回転機構により、照明光の形状を適宜選択可能に構成することができる。このとき、視野絞り２９も同時に、もしくは一体として回転可能に構成することが望ましい。
【００４３】
また、回折拡散板２７を視野絞り２９に対して光軸に沿って移動させる制御手段３３を有し、視野絞り２９から対物レンズ１１までの投影光学系の倍率に基づき、回折拡散板２９の位置を移動させ、標本１２上で所定の形状の照明光に形成することを可能にしている。
【００４４】
これにより、標本１２上で照明光の形状を拡大・縮小することを可能にし、縮小時には投影光学系の解像度で決まる形状まで可変することが可能になる。
【００４５】
図１に示す光学系において、回折拡散板２７によるレーザ光の回折角度をθ（光軸と回折光のなす角度）、リレーレンズ３０の倍率をｍ、リレーレンズ７の焦点距離をｆ１、リレーレンズ９の焦点距離をｆ２、及び対物レンズの焦点距離をｆｏとすると、標本面における照明サイズｙは、以下の式で求められる。
ｙ＝２×ｆ１×ｓｉｎ（θ×ｍ）×（ｆｏ／ｆ２）
以下に具体的な数値実施例を示す。
【００４６】
（実施例１）
例えば、ｍ＝１／５、ｆ１＝５０ｍｍ、ｆ２＝１２０ｍｍ、ｆｏ＝２ｍｍの場合の各拡散角度θと標本面における照明サイズｙの関係を以下に示す。なお、小数点以下は四捨五入している。
【００４７】
θ（単位：度）      ｙ（単位：μｍ）
０．５                  ３
５                    ２９
１０                    ５８
２０                  １１６
【００４８】
（実施例２）
実施例２では、図１に示すリレーレンズ３０を２つのレンズ３０ａと３０ｂで構成し、３０ａを回折拡散板２７側に、３０ｂをダイクロイックミラー３１側に配置している。また、レンズ３０ａの焦点距離をｆａ、レンズ３０ｂの焦点距離をｆｂとすると、開口絞り６の位置では、回折拡散板２７の拡散角度θを、θ×（ｆａ／ｆｂ）にすることができ、リレーレンズ３０の倍率ｍは、ｍ＝（ｆａ／ｆｂ）となる。このとき、標本面における照明サイズｙは、上記の式で求められる。
【００４９】
例えば、ｆａ＝１０ｍｍ、ｆｂ＝５０ｍｍとすると、ｍ＝ｆａ／ｆｂ＝１／５となる。リレーレンズ３０を上記２つのレンズで構成し、リレーレンズ７、リレーレンズ９、及び対物レンズ１１の焦点距離を実施例１と同様にそれぞれ、ｆ１＝５０ｍｍ、ｆ２＝１２０ｍｍ、ｆｏ＝２ｍｍとした場合の各拡散角度θと標本面における照明サイズｙの関係は実施例１と同様の関係となる。なお、小数点以下は四捨五入している。
【００５０】
θ（単位：度）      ｙ（単位：μｍ）
０．５                  ３
５                    ２９
１０                    ５８
２０                  １１６
【００５１】
以上述べたように、本実施の形態にかかる顕微鏡Ａでは、図２（ｂ）に示すような、例えば長方形状のレーザ光を、レーザ照明光学系に配置された回折拡散板で形成し、観察対象である細胞の所望の位置に照射することが可能になる。標本に照射するレーザ光の形状は、回折拡散板を用いることにより、長方形に限らず、円形、楕円形、複数のスリット形状、格子状、など任意の形状を形成することができる。
【００５２】
また、スポットスキャンに比べ簡単な構成で、実用的な照明形状の照明を実現することができ、スポットスキャンにできない、蛍光画像観察との同時照明ができる。
【００５３】
また、回折拡散板を用いることによって、所定の形状の開口絞りを用いる場合より高い効率でレーザ光を標本に照射することができる。
【００５４】
また、所定の条件で設計された回折拡散板を光軸に交換可能に構成することにより、いろいろな形状の照明光を容易に形成し、標本に照射することが可能になり、観察者にとって使いやすい顕微鏡を提供することができる。
【００５５】
なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実施の形態にかかる顕微鏡の光学系の構成図である。
【図２】有糸細胞分裂の観察例であり、（ａ）は従来のスポット光を用いた場合を、（ｂ）は本実施例にかかる顕微鏡における長方形光を用いた例をそれぞれ示す。
【符号の説明】
【００５７】
Ａ    顕微鏡
Ｂ    レーザ照明光学系
１    落射照明光学系
２    水銀ランプ
３    コレクタレンズ
４    リレーレンズ
５    電動シャッター
６    開口絞り
７    リレーレンズ
８    視野絞り
９    リレーレンズ
１０  ダイクロイックミラー
１１  対物レンズ
１２  標本
１３  バリアフィルター
１４  第二対物レンズ
１５  結像位置
２１  第１のレーザ
２２  第２のレーザ
２３、２４  電動シャッター
２５  ダイクロイックミラー
２６  ミラー
２７  回折拡散板
２８  振動機構
２９  視野絞り
３０  リレーレンズ
３１  ダイクロイックミラー
３２  移動制御手段
３３  制御手段
３４、３５  チルト機構
３６  傾角調整部材
１０１  細胞
１０２  染色体
１０３、１０４  分裂の中心
１０５  繊維状構造物
１０６  スポット照明
１０７  ライン状照明
【図１】
2009037156.tif 000003
【図２】
2009037156.tif 000004