(57)【要約】【課題】視神経障害の予防又は治療剤、網膜神経細胞死の抑制剤又はニューロフィラメント軽鎖の発現量回復剤として有用な化合物を見出すことは興味深い課題であり、特に経口投与により該薬理効果を発現する化合物を見出すことは非常に興味深い課題である。【解決手段】３’，５−ジ−２−プロペニル−（１，１’−ビフェニル）−２，４’−ジオール、そのエステル又はそれらの塩は、ＮＭＤＡ誘発ラット網膜障害モデルにおける経口投与において、その網膜神経細胞層中の細胞数の減少を有意に抑制し、また、同モデルにおける硝子体内投与において、網膜中のニューロフィラメント軽鎖の発現量の減少を回復させる。よって、視神経障害の予防又は治療剤、網膜神経細胞死の抑制剤又はニューロフィラメント軽鎖の発現量回復剤として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’，５−ジ−２−プロペニル−（１，１’−ビフェニル）−２，４’−ジオール、そのエステル又はそれらの塩の少なくとも一つを有効成分として含有する視神経障害の予防又は治療剤。
【請求項２】
視神経障害が緑内障性視神経障害である請求項１記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
緑内障性視神経障害が緑内障、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮又は緑内障性視神経症である請求項２記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
視神経障害が網膜神経節細胞の軸索流障害である請求項１記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
３’，５−ジ−２−プロペニル−（１，１’−ビフェニル）−２，４’−ジオール、そのエステル又はそれらの塩の少なくとも一つを有効成分として含有する網膜神経細胞死の抑制剤。
【請求項６】
網膜神経細胞死が網膜神経節細胞死である請求項５記載の抑制剤。
【請求項７】
３’，５−ジ−２−プロペニル−（１，１’−ビフェニル）−２，４’−ジオール、そのエステル又はそれらの塩の少なくとも一つを有効成分として含有するニューロフィラメント軽鎖の発現量回復剤。
【請求項８】
経口投与により薬効を奏することを特徴とする請求項１〜７記載の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
３’，５−ジ−２−プロペニル−（１，１’−ビフェニル）−２，４’−ジオール、そのエステル又はそれらの塩の少なくとも一つを有効成分として含有する、視神経障害の予防又は治療剤、網膜神経細胞死の抑制剤又はニューロフィラメント軽鎖の発現量回復剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
網膜は内境界膜、神経線維層、神経節細胞層、内網状層、内顆粒層、外網状層、外顆粒層、外境界膜、視細胞層および網膜色素上皮層の１０層から成る、厚さ０．１〜０．５ｍｍの組織であり、その中には視細胞、双極細胞、神経節細胞、水平細胞およびアマクリン細胞という網膜神経細胞が存在する。
【０００３】
網膜神経細胞は光刺激を電気信号に変換して、脳へ伝達するといった視覚情報の受容と伝達において重要な役割を果たしている。
【０００４】
その伝達メカニズムについて詳述すると、目から入った視覚情報は視細胞により電気信号化されて、水平細胞、双極細胞および／又はアマクリン細胞を経由した後に神経節細胞に伝達される。次いで、その電気信号は神経節細胞の軸索を含む視神経線維の束である視神経を経由して脳に伝達される。
【０００５】
ところで、視神経が種々の原因により障害を受けると視神経の恒常性が維持できなくなり、視覚情報の脳への伝達が妨げられて、失明、視野狭窄等の視野障害を生じる。
【０００６】
視神経を障害する原因は種々考えられるが、主な原因としては、１）眼圧上昇、２）網膜血流循環障害・網膜虚血、３）興奮性アミノ酸上昇等が挙げられ、それらの病態に伴うグルタミン酸シグナルカスケードの活性化や網膜神経節細胞の軸索障害とそれらにつづく網膜神経細胞のアポトーシスにより、視神経が障害されるものと考えられている。  
【０００７】
従って、グルタミン酸シグナルカスケードの一部を遮断することで、網膜神経細胞のアポトーシスを抑制して、網膜神経細胞を保護する薬剤、すなわち、グルタミン酸神経毒性抑制薬、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（以下、「ＮＭＤＡ」ともいう）受容体遮断薬、一酸化窒素合成阻害薬等の薬物が視神経障害およびそれに伴う眼疾患の予防又は治療剤として有用であると考えられ、現在、種々の検討がなされている。
【０００８】
例えば、特許文献１にはβ遮断薬の一つであるニプラジロールを有効成分として含む網膜神経細胞保護剤が、特許文献２にはインターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパクを有効成分として含む視神経節細胞保護剤が、特許文献３にはブナゾシン等のα1受容体遮断薬を有効成分として含む視神経節細胞保護剤が、特許文献４には含フッ素プロスタグランジンＦ２α誘導体を有効成分とする網膜神経細胞保護剤が、特許文献５にはインダゾール誘導体を有効成分として含む網膜神経細胞保護剤が開示されている。
【０００９】
また、視神経障害を伴う代表的な眼疾患として、緑内障、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮、緑内障性視神経症、網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、糖尿病性網膜症、黄斑変性（萎縮型加齢黄斑変性、滲出型加齢黄斑変性等の加齢黄斑変性）、網膜色素変性症、未熟児網膜症、網膜剥離、網膜色素上皮剥離、レーベル病、虚血性視神経症等の緑内障性疾患、網膜疾患、虚血性障害等が挙げられる。
【００１０】
一方、３’，５−ジ−２−プロペニル−［１，１’−ビフェニル］−２，４’−ジオールは、生薬の厚朴［モクレン科ホオノキ（Magnolia obovata）等の樹皮］に含有される成分であり、一般的にホノキオールとして知られている。その薬理作用としては、鎮静作用、運動抑制作用、中枢性筋弛緩作用、脊髄反射抑制等の持続性の中枢抑制作用が非特許文献１、非特許文献２又は非特許文献３に、カルシウム流入阻害作用が非特許文献４又は非特許文献５に、抗胃潰瘍作用が非特許文献６に、グラム陽性菌に対する抗菌作用が非特許文献７に、脳神経細胞保護作用が非特許文献８に開示されている。
【００１１】
また、ホノキオールタイプ化合物の血管新生抑制作用が特許文献６に、細胞増殖抑制作用が特許文献７に開示されている。
【００１２】
さらに、ホノキオールの構造異性体であるマグノロール（生薬の厚朴に含有される一成分）が眼圧下降作用を有することが非特許文献９に開示されている。
【００１３】
しかしながら、いずれの文献にも３’，５−ジ−２−プロペニル−（１，１’−ビフェニル）−２，４’−ジオール、そのエステル体又はそれらの塩の視神経障害の予防又は治療効果に係る具体的な
記載はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開2001／056606号パンフレット
【特許文献２】国際公開2003／004058号パンフレット
【特許文献３】特開昭59-1418号公報
【特許文献４】国際公開2006／106915号パンフレット
【特許文献５】国際公開2006／112313号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Japan J. Pharmacol.,25,605(1975)
【非特許文献２】Planta Med.,49,103(1983)
【非特許文献３】J.Pharm.Dyn.,6,184(1983)
【非特許文献４】日本薬理学界誌,106,888(1986)
【非特許文献５】Life Sci.,47,1153(1990)
【非特許文献６】和漢医薬誌,4,100(1987)
【非特許文献７】生薬誌,36,222(1982)
【非特許文献８】Bioorg.Med.Chem.Lett.,12,1163(2002)
【特許文献６】国際公開2002／076393号パンフレット
【特許文献７】国際公開2006／107451号パンフレット
【非特許文献９】Chinese Pharm.J.,58,115(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
視神経障害の予防又は治療剤、網膜神経細胞死の抑制剤又はニューロフィラメント軽鎖の発現量回復剤として有用な化合物を見出すことは興味深い課題であり、特に経口投与により該薬理効果を発現する化合物を見出すことは非常に興味深い課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
そこで、本発明者等は視神経障害の予防又は治療剤、網膜神経細胞死の抑制剤又はニューロフィラメント軽鎖の発現量回復剤として有用な化合物を見出すべく、膨大な数の化合物について、ＮＭＤＡ誘発ラット網膜障害モデルに対する効果を検討した。その結果、３’，５−ジ−２−プロペニル−（１，１’−ビフェニル）−２，４’−ジオール、そのエステル又はそれらの塩が、１．ＮＭＤＡ誘発ラット網膜障害モデルにおける経口投与において、その網膜神経細胞層中の細胞数の減少を有意に抑制すること、
２．ＮＭＤＡ誘発ラット網膜障害モデルにおける硝子体内投与において、網膜中のニューロフィラメント軽鎖（視神経軸索の主構成成分の一つであり、視神経軸索の形態維持に重要な成分）の発現量の減少を回復させること、
を見出し、本発明を完成させた。
【００１８】
本発明において、「３’，５−ジ−２−プロペニル−（１，１’−ビフェニル）−２，４’−ジオール」とは、以下の一般式（１）で示される化合物を意味し、
【００１９】
【化１】
2009235069.tif 000002
【００２０】
「そのエステル」とは、一般式（１）における２つのヒドロキシ基の一方又はその両方がエステル化された化合物を意味し、そのヒドロキシ基部位がエステル化された化合物であれば特に制限はない。尚、エステルを形成する場合には、該ヒドロキシ基と、置換基を有してもよい低級アルキルカルボン酸、置換基を有してもよい低級アルキルスルフィン酸、置換基を有してもよい低級アルキルスルホン酸、置換基を有してもよいアリールカルボン酸、置換基を有してもよいアリールスルフィン酸又は置換基を有してもよいアリールスルホン酸とから形成されるエステルが好ましく、特に該ヒドロキシ基と置換基を有してもよい低級アルキルカルボン酸とから形成されるエステルが好ましい。
【００２１】
また、「それらの塩」とは、「３’，５−ジ−２−プロペニル−［１，１’−ビフェニル］−２，４’−ジオール又はそのエステル」の医薬として許容される塩を意味し、医薬として許容される塩であれば特に制限はない。尚、塩を形成する場合には、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属と形成される塩が好ましい。
【００２２】
それらの化合物（以下、「本化合物」ともいう）の少なくとも一つ、好ましくは、それらの化合物の一つ、を有効成分として含有する視神経障害の予防又は治療剤、網膜神経細胞死の抑制剤又はニューロフィラメント軽鎖の発現量回復剤が本発明である。
【００２３】
本発明における「視神経障害」とは、視神経障害および／又は視神経障害を伴う眼疾患を意味する。
【００２４】
ここで「視神経障害を伴う眼疾患」とは、視神経障害を伴う眼疾患であれば、特に制限はないが、緑内障性疾患、網膜疾患、虚血性障害等が例示され、具体的には、緑内障、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮、緑内障性視神経症、網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、糖尿病性網膜症、黄斑変性（萎縮型加齢黄斑変性、滲出型加齢黄斑変性等の加齢黄斑変性）、網膜色素変性症、未熟児網膜症、網膜剥離、網膜色素上皮剥離、レーベル病、虚血性視神経症等が挙げられる。
【００２５】
本発明における「緑内障性視神経障害」とは、緑内障に起因する視神経障害であれば特に制限はないが、具体的には、緑内障および／又は緑内障に伴う眼疾患を意味し、より具体的には、緑内障および緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮、緑内障性視神経症等の緑内障性眼疾患が挙げられる。
【００２６】
本発明における「網膜神経細胞」とは視覚信号の脳への伝達に関与する神経細胞を意味し、具体的には視細胞、水平細胞、双極細胞、視神経節細胞、アマクリン細胞等を意味する。
【００２７】
本発明における「網膜神経細胞死」とは、網膜神経細胞のアポトーシスおよび／又はネクローシスを意味する。
【００２８】
本発明における「ニューロフィラメント軽鎖の発現量回復剤」とは、網膜中のニューロフィラメント軽鎖の発現量の減少を抑制および／又は増加させる薬剤を意味する。尚、このニューロフィラメント軽鎖は、視神経軸索の主構成成分の一つであり、視神経軸索の形態維持に重要な成分である。
【００２９】
本発明における「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を示す。
【００３０】
本発明における「低級アルキル」とは、炭素原子数１〜６個の直鎖又は分枝のアルキルを示す。具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル基等が挙げられる。
【００３１】
本発明における「低級アルコキシ」とは、ヒドロキシの水素原子が低級アルキルで置換されたものを示す。具体的には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソプロポキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、イソペントキシ基等が挙げられる。
【００３２】
本発明における「アリール」とは、炭素原子数６〜１０個のアリールを示す。具体的には、フェニル、ナフチル等が挙げられる。
【００３３】
本発明における「アリールオキシ」とは、ヒドロキシの水素原子がアリールで置換されたものを示す。具体的には、フェニルオキシ、ナフチルオキシ等が挙げられる。
【００３４】
本発明における「置換基を有してもよい低級アルキル」とは、ハロゲン、低級アルコキシ、アリールおよびアリールオキシからなる群より選択される１又は複数の置換基を有するアルキルを示す。
【００３５】
本発明における「置換基を有してもよいアリール」とは、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アリールおよびアリールオキシからなる群より選択される１又は複数の置換基を有するアリールを示す。
【００３６】
本発明における「複数」とは、夫々が同一であっても異なるものであってもよく、その個数は、２又は３個の場合が好ましく、特に２個の場合が好ましい。
【００３７】
本化合物は水和物又は溶媒和物の形態をとっていてもよい。
【００３８】
また、本化合物に結晶多形が存在する場合、該結晶多形も本発明の範囲に包含される。
【００３９】
本化合物は経口でも、非経口でも投与することができる。投与形態としては、経口投与、眼局所投与（点眼投与、結膜嚢内投与、硝子体内投与、結膜下投与、テノン嚢下投与等）、静脈内投与、経皮投与等が挙げられ、必要に応じて医薬として許容される添加剤を適宜選択して使用し、投与形態に適した剤形に製剤化することができる。
【００４０】
投与剤形としては、経口剤の場合、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等が挙げられ、非経口剤としては、注射剤、点眼剤、眼軟膏、貼布剤、ゲル、挿入剤等が挙げられる。
【００４１】
例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の経口剤の場合、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、無水リン酸水素カルシウム、デンプン、ショ糖等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン、デンプン、部分アルファー化デンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤；ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、デンプン、部分アルファー化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、含水二酸化ケイ素、硬化油等の滑沢剤；精製白糖、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン等のコーティング剤；クエン酸、アスパルテーム、アスコルビン酸、メントール等の矯味剤、等を必要に応じて適宜選択して使用し、製剤化することができる。
【００４２】
注射剤（水性、油性、懸濁性）は、塩化ナトリウム等の等張化剤；大豆油、マクロゴール等の溶剤又は溶解補助剤；リン酸ナトリウム等の緩衝化剤；ポリソルベート８０等の界面活性剤；カルメロースナトリウム、メチルセルロース等の増粘剤等、ベンジルアルコール等の無痛化剤、等を必要に応じて適宜選択して使用し、製剤化することができ、そのｐＨは注射剤に許容される範囲内であれば特に問題はなく、好ましくはｐＨ４〜８の範囲が望ましい。
【００４３】
点眼剤（水性、油性、懸濁性）は、ヒマシ油、グリセロール、アルコール、ポリグリセロールとアルコールとのエーテル化合物等の溶剤又は溶解補助剤、塩化ナトリウム、濃グリセリン等の等張化剤；リン酸塩、炭酸塩等の緩衝化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤；クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等の安定化剤；塩化ベンザルコニウム、パラベン等の防腐剤、懸濁性点眼剤においては、水溶性高分子等の分散剤、塩化ナトリウム、濃グリセリン等の等張化剤；リン酸塩、炭酸塩等の緩衝化剤；ポリソルベート８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０等の界面活性剤；クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等の安定化剤；塩化ベンザルコニウム、パラベン等の防腐剤、等を必要に応じて適宜選択して使用し、製剤化することができ、そのｐＨは眼科用の点眼剤に許容される範囲内であれば特に問題はなく、好ましくはｐＨ４〜８の範囲が望ましい。
【００４４】
眼軟膏は、白色ワセリン、流動パラフィン等の汎用される基剤を使用し、製剤化することができる。
【００４５】
挿入剤は、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸等の生体分解性ポリマーを使用して、製剤化することができ、必要に応じて、賦形剤、結合剤、安定化剤、ｐＨ調整剤等を必要に応じて適宜選択して使用することができる。
【００４６】
眼内インプラント用製剤は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、乳酸−カプロラクトン共重合体、ポリアンハイドライド、ポリオルソエステル、ポリイプシロンカプロラクトン等の生体分解性ポリマーを使用して製剤化することができ、必要に応じて、賦形剤、結合剤、安定化剤、ｐＨ調整剤等を必要に応じて適宜選択して使用することができる。また、エチレンビニルアセテート共重合体等の生体非分解性ポリマーを使用しても製剤化することができ、必要に応じて、賦形剤、結合剤、安定化剤等を必要に応じて適宜選択して使用することができる。
【００４７】
本化合物の投与量は、剤形、患者の症状、年令、体重等に応じて適宜選択できる。例えば、経口投与の場合、０．０１〜５０００ｍｇ、好ましくは０．１〜２５００ｍｇ、特に好ましくは０．５から１０００ｍｇのものを１日あたり１〜数回に分けて投与することができる。注射剤の場合、０．００００１〜２０００ｍｇ、好ましくは０．０００１〜１５００ｍｇ、特に好ましくは０．００１から５００ｍｇのものを１日あたり１〜数回に分けて投与することができる。点眼剤の場合、０．００００１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．００１〜１％のものを１日１〜数回点眼することができる。眼軟膏剤の場合、０．０００１〜２０００ｍｇを含有するものを塗布することができる。挿入剤又は眼内インプラント用製剤の場合、０．０００１〜２０００ｍｇを含有するものを挿入又はインプラントすることができる。
【発明の効果】
【００４８】
後述の薬理試験の項で詳細に説明するが、本化合物は、ＮＭＤＡ誘発ラット網膜障害モデルにおける経口投与試験において、その網膜神経細胞層中の細胞数の減少を有意に抑制した。また、同モデルにおける硝子体内投与試験において、網膜中のニューロフィラメント軽鎖の発現量の減少を回復させた。
【００４９】
以上より、本化合物は、視神経障害の予防又は治療剤、網膜神経細胞死の抑制剤又はニューロフィラメント軽鎖の発現量回復剤として有用であり、特に緑内障性視神経障害の予防又は治療剤、より具体的には緑内障、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮、緑内障性視神経症等の緑内障性眼疾患の予防又は治療剤として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下に本発明の薬理試験の結果および製剤例を示す。尚、これらの例示は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
［薬理試験］
【実施例１】
【００５１】
１．ＮＭＤＡ誘発ラット網膜障害モデルを用いた試験
（被験化合物の経口投与による網膜切片評価）
視神経障害モデルとして汎用されるＮＭＤＡ誘発ラット網膜障害モデル（Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．，  ２００３；４４：３８５−３９２）を用いて、本化合物の有用性（網膜神経細胞死抑制効果）を評価した。
【００５２】
（ＮＭＤＡ誘発ラット網膜障害モデルの作製方法）
ラット[Ｓｌｃ：ＳＤ、雄性、約７週齢]に１００％（Ｖ／Ｖ）酸素  ０．５Ｌ／分と１００％（Ｖ／Ｖ）亜酸化窒素  １．５Ｌ／分の混合気体  ２Ｌ／分で３％（Ｖ／Ｖ）ハロセンを気化させたガス又は空気  １〜１．５Ｌ／分で３−４％（Ｖ／Ｖ）イソフルランを気化させたガスを吸入させて全身導入麻酔し、１％（Ｖ／Ｖ）ハロセン又は２−３％（Ｖ／Ｖ）イソフルランの条件で維持麻酔した。その後、２ｍｍｏｌ／Ｌとなるように１０％（Ｖ／Ｖ）ジメチルスルホキシド含有リン酸緩衝液（以下、「ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ」ともいう）に溶解したＮＭＤＡ（Ｓｉｇｍａ製、［カタログ番号：Ｍ３２６２］）溶液  ５μＬ（ＮＭＤＡとして１０ｎｍｏｌ）を硝子体内に投与した。
【００５３】
（網膜切片の作製・評価方法）
ＮＭＤＡ溶液の硝子体内投与７日後のラットに１００ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム注射液を腹腔内投与して全身麻酔し、眼球を摘出した。摘出した眼球を２５％（Ｗ／Ｖ）グルタルアルデヒド：１０％（Ｗ／Ｖ）中性緩衝ホルマリン＝１：９の混合液で固定した。固定した眼球をパラフィンで包埋した後に、薄切を行い網膜切片（３μｍ厚）を作製し、ヘマトキシリン−エオジンで染色した。網膜切片は１眼につき視神経乳頭部が入るように４５μｍ間隔で８切片作製した。その８切片から任意に３切片を選択し、選択した切片について、視神経乳頭から１〜１．５ｍｍ間の網膜の写真撮影を行い、網膜神経節細胞層中の細胞数を算出した（平均値）。尚、各群の例数は３匹（５−６眼）である。
【００５４】
（投与方法）
[ＰＢＳ硝子体内投与群]
１０％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ  ５μＬを硝子体内に投与した。
【００５５】
[ＮＭＤＡ硝子体内投与＋基剤経口投与群]
１０％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯ含有ＰＢＳに溶解したＮＭＤＡ溶液  ５μＬ（ＮＭＤＡとして１０ｎｍｏｌ）を硝子体内に投与した。また、１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース水溶液を、ＮＭＤＡ硝子体内投与日から６日後までの７日間、１０ｍＬ／ｋｇの投与液量で１日１回反復経口投与した。尚、ＮＭＤＡ硝子体内投与日はＮＭＤＡ硝子体内投与３０〜６０分前に１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース水溶液を経口投与した。
【００５６】
[ＮＭＤＡ硝子体内投与＋被験化合物経口投与群]
１０％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯ含有ＰＢＳに溶解したＮＭＤＡ溶液  ５μＬ（ＮＭＤＡとして１０ｎｍｏｌ）を硝子体内に投与した。また、１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース液に懸濁させた被験化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＮＭＤＡ硝子体内投与日から６日後までの７日間、１０ｍＬ／ｋｇの投与液量で１日１回反復経口投与した。なお、ＮＭＤＡ硝子体内投与日はＮＭＤＡ投与３０〜６０分前に１％（Ｗ／Ｖ）メチルセルロース液に懸濁させた被験化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量で、経口投与した。
【００５７】
（試験結果）
被験化合物の１例として、３’，５−ジ−２−プロペニル−（１，１’−ビフェニル）−２，４’−ジオール（以下、「ホノキオール」ともいう）を用いた場合の試験結果を表１に示す。表１から明らかなように、ホノキオールはＮＭＤＡ誘発ラット網膜障害モデルにおいて生じる、網膜における神経節細胞層中の細胞数の減少を有意に抑制した。
【００５８】
【表１】
2009235069.tif 000003
【００５９】
（考察）
試験結果から、ホノキオールを含む本化合物は経口投与等の全身暴露の投与形態において、視神経障害の予防又は治療効果および網膜神経細胞死の抑制効果を有する。特に緑内障性視神経障害の予防又は治療効果を有する。
【実施例２】
【００６０】
２．ＮＭＤＡ誘発ラット網膜障害モデルを用いた試験
（被験化合物の硝子体内投与による定量的Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲともいう）評価）
（定量的ＰＣＲでの評価方法）
ＮＭＤＡ誘発ラット網膜障害モデルにおいて、視神経軸索の主構成成分であり、軸索の形態維持に重要とされるニューロフィラメント軽鎖（以下、「ＮＦＬ」ともいう）の網膜組織中での発現量を指標に、被験化合物の有効性を評価した。
【００６１】
（評価方法）
ＮＭＤＡの硝子体内投与１日後のラットに１００ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム注射液を腹腔内投与して全身麻酔した後に眼球を摘出、網膜を単離した。単離した網膜をホモジナイズし、ＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ製［カタログ番号：７９３０６］）およびＲＮｅａｓｙ  ９６  Ｋｉｔ  （２５０）（ＱＩＡＧＥＮ製［カタログ番号：７４１０６］）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ製［カタログ番号：ＲＲ０３７Ｂ］）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（１０００）（ＱＩＡＧＥＮ製、［カタログ番号：２０４５４５］）に添付されている説明書に従い、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、合成したｃＤＮＡ、ＮＦＬのプライマー・プローブ（Ｓｉｇｍａ製［オーダーメード］）およびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＡＰＤＨ」ともいう）のプライマー・プローブ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、［カタログ番号：４３５２３３８Ｅ］）を混合し、定量的ＰＣＲ装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製［カタログ番号：７５００−０３］）でＰＣＲ反応を実施し、ＮＦＬおよびＧＡＰＤＨの発現量を測定した。
【００６２】
得られたＮＦＬおよびＧＡＰＤＨの発現量から、式１に従いＮＦＬの発現量をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量で補正する事により、相対的ＮＦＬ発現量を算出した。その後、式２に従い、１０％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ硝子体内投与を行った群を１００％、１０ｎｍｏｌＮＭＤＡ硝子体内投与を行った群を０％とした場合の被験化合物のＮＭＤＡによるＮＦＬ減少に対するＮＦＬ回復率（％）を算出した。尚、各群の例数は２〜３匹（４〜６眼）である。
【００６３】
尚、本発明に用いたＮＦＬのプライマー・プローブ配列は以下の通りである。
【００６４】
【表２】
2009235069.tif 000004
【００６５】
［式１］
相対的ＮＦＬ発現量＝（ＮＦＬ発現量／ＧＡＰＤＨ発現量）
［式２］
ＮＦＬ回復率（％）＝（ＥＸ−Ｅ０）／（ＥＰ−Ｅ０）×１００
ＥＰ：１０％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ硝子体内投与を行った群の相対的ＮＦＬ発現量
Ｅ０：１０ｎｍｏｌＮＭＤＡ硝子体内投与を行った群の相対的ＮＦＬ発現量
ＥＸ：１０ｎｍｏｌＮＭＤＡに各化合物を混合し、硝子体内投与に薬物経口投与を行った群の相対的ＮＦＬ発現量
（投与方法）
［１０％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ硝子体内投与群］
１０％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ  ５μＬを硝子体内に投与した。
【００６６】
［ＮＭＤＡ硝子体内投与群］
１０％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯ含有ＰＢＳに溶解したＮＭＤＡ溶液  ５μＬ（ＮＭＤＡとして１０ｎｍｏｌ）を硝子体内に投与した。
【００６７】
［各化合物硝子体内投与群］
１０％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯ含有ＰＢＳに溶解したＮＭＤＡと被験化合物の混合溶液  ５μＬ（ＮＭＤＡとして１０ｎｍｏｌ、被験化合物として０．０２５ｎｍｏｌ）を硝子体内に投与した。
【００６８】
（結果）
被験化合物の１例として、ホノキオールとその構造異性体であるマグノロール（基本的にホノキオールと同様な作用を有することが知られている）を用いた場合の試験結果を表３に示す。表３から明らかなように、ホノキオールは、ＮＭＤＡ誘発ラット網膜障害モデルにおいて生じるＮＦＬの発現量の減少を回復させるのに対して、ホノキオールの構造異性体であるマグノロールは、ホノキオールと同濃度において、ＮＦＬの発現量の減少を回復させず、むしろ、増悪傾向を示した。
【００６９】
【表３】
2009235069.tif 000005
【００７０】
（考察）
試験結果から、ホノキオールを含む本化合物は局所投与の形態においても視神経障害の予防又は治療効果予防又は治療効果を有し、また、ＮＦＬの発現量の回復効果も有する。
さらに、ホノキオールの構造異性体であるマグノロールにおいては、ＮＦＬの発現量の減少を回復させる作用が認められず、むしろ、増悪傾向を示したことから、微細な化学構造の相違が本作用の強度や発現に大きな影響を与えているものと考えられる。
【００７１】
［製剤例］
本化合物の代表的な製剤例を以下に示す。
【実施例３】
【００７２】
１）錠剤（１５０ｍｇ中）
本化合物                                      １０ｍｇ
乳糖                                          ９０ｍｇ
トウモロコシデンプン                          ４０ｍｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム        ５．５ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース                    ４ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                    ０．５ｍｇ
上記処方の錠剤にコーティング剤(例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マ
クロゴール、タルク、酸化チタン、シリコーン樹脂等のコーティング剤)3mgを用いてコー
ティングを施し、目的とする錠剤を得ることができる。また、本化合物並びに添加物の種
類および／又は量を適宜変更することで、所望の錠剤を得ることもできる。
【実施例４】
【００７３】
２）カプセル剤（１５０ｍｇ中）
本化合物                                     ５０ｍｇ
乳糖                                         ９０ｍｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム       ４．５ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース                   ４ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                   １．５ｍｇ
本発明化合物並びに添加剤の種類および又は量を適宜変更することで、所望のカプセル剤を得ることができる。
【実施例５】
【００７４】
３）水溶性点眼液（１００ｍｌ中）
本化合物                                    １００ｍｇ
１−Ｏ−ｎ−ドデシル−３−Ｏ−メチル−２−Ｏ−２’，３’−ジヒドロキシプロピルグリセロール
７０００ｍｇ
エタノール                                      ５ｍＬ
塩化ナトリウム                              ９００ｍｇ
滅菌精製水                                      適量
本化合物および添加物の種類および／又は量を適宜変更することで、所望の水性点眼剤を得
ることができる。
【実施例６】
【００７５】
４）油性点眼液  （１００ｍｌ中）
本化合物                                    １００ｍｇ
ヒマシ油                                        適量
本化合物および添加物の種類および／又は量を適宜変更することで、所望の油性点眼剤を得
ることができる。
【実施例７】
【００７６】
５）懸濁性点眼液（１００ｍｌ中）
本化合物                                    １００ｍｇ
塩化ナトリウム                              ７５０ｍｇ
塩化ベンザルコニウム                            ５ｍｇ
ポリソルベート８０                             適量
ヒドロキシプロピルメチルセルロース             適量
エデト酸ナトリウム                             適量
リン酸水素ナトリウム                           適量
リン酸二水素ナトリウム                         適量
滅菌精製水                                     適量
本化合物および添加物の種類および／又は量を適宜変更することで、所望の懸濁性点眼剤を
得ることができる。
【実施例８】
【００７７】
６）水性注射剤（１００ｍｌ中）
本化合物                                   １００ｍｇ
塩化ナトリウム                             ７５０ｍｇ
マクロゴール４００                       １０００ｍｇ
水酸化ナトリウム                               適量
塩酸                                           適量
滅菌精製水                                     適量
本化合物および添加物の種類および／又は量を適宜変更することで、所望の水性注射剤を得
ることができる。
【実施例９】
【００７８】
７）油性注射剤（１００ｍｌ中）
本化合物                                  １００ｍｇ
大豆油                                        適量
本化合物および添加物の種類および／又は量を適宜変更することで、所望の油性注射剤を得
ることができる。
【実施例１０】
【００７９】
８）懸濁性注射剤（１００ｍｌ中）
本化合物                                   １００ｍｇ
塩化ナトリウム                             ７５０ｍｇ
カルメロースナトリウム                     ７５０ｍｇ
ポリソルベート  ８０                          ４０ｍｇ
ベンジルアルコール                            ４０ｍｇ
水酸化ナトリウム                              適量
塩酸                                          適量
滅菌精製水                                    適量
本化合物および添加物の種類および／又は量を適宜変更することで、所望の懸濁性注射剤を
得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本化合物は、視神経障害の予防又は治療剤、網膜神経細胞死の抑制剤又はニューロフィラメント軽鎖の発現量回復剤として有用であり、特に緑内障性視神経障害の予防又は治療剤、より具体的には緑内障、緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮、緑内障性視神経症等の緑内障性眼疾患の予防又は治療剤として有用である。