(57)【要約】      （修正有）【課題】一度に多数の試料を用いて、イネの品種判別（識別）を簡便にかつ低コストで実施できるようなＳＮＰ分析手段、並びに、該分析手段に使用する一塩基多型（ＳＮＰ）を含むポリヌクレオチド（断片）及び該ポリヌクレオチドから成るイネ品種判別用変異型プローブを提供すること。【解決手段】イネの品種判別用ＳＮＰマーカーとして有用な特定の配列で示されるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドから成るイネ品種判別用ＳＮＰマーカー及び該マーカーセット、並びに、該マーカーセット等を用いて該ＳＮＰを分析することによるイネの品種判別方法。【選択図】図１
2009100653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に示す５８種類のポリヌクレオチドから成る群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド：
（１）配列番号１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３）配列番号３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４）配列番号４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５）配列番号５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６）配列番号６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（７）配列番号７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（８）配列番号８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（９）配列番号９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１０）配列番号１０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１１）配列番号１１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１２）配列番号１２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１３）配列番号１３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１４）配列番号１４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１５）配列番号１５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１６）配列番号１６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１７）配列番号１７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１８）配列番号１８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１９）配列番号１９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２０）配列番号２０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２１）配列番号２１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２２）配列番号２２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２３）配列番号２３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２４）配列番号２４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２５）配列番号２５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２６）配列番号２６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２７）配列番号２７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２８）配列番号２８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２９）配列番号２９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３０）配列番号３０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３１）配列番号３１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３２）配列番号３２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３３）配列番号３３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３４）配列番号３４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３５）配列番号３５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３６）配列番号３６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３７）配列番号３７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３８）配列番号３８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３９）配列番号３９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はg）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４０）配列番号４０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４１）配列番号４１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４２）配列番号４２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４３）配列番号４３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４４）配列番号４４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４５）配列番号４５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa、１０番目はｇ）において、９番目及び／又は１０番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４６）配列番号４６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４７）配列番号４７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４８）配列番号４８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４９）配列番号４９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５０）配列番号５０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５１）配列番号５１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５２）配列番号５２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５３）配列番号５３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５４）配列番号５４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５５）配列番号５５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５６）配列番号５６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５７）配列番号５７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；及び
（５８）配列番号５８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
９番目の塩基（配列番号４５で表されＤＮＡ配列の場合には、９番目及び／又は１０番目の塩基）を含むＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド１０〜２０の連続したＤＮＡ配列からなる、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１〜５８のいずれか一つで表されるＤＮＡ配列からなる、請求項１又は２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドからなるイネ品種判別用ＳＮＰマーカー。
【請求項５】
以下に示す１４種類のポリヌクレオチドから成る群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなるイネ品種判別用ＳＮＰマーカー：
（５９）配列番号５９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６０）配列番号６０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６１）配列番号６１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６２）配列番号６２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６３）配列番号６３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６４）配列番号６４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６５）配列番号６５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６６）配列番号６６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６７）配列番号６７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６８）配列番号６８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６９）配列番号６９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（７０）配列番号７０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（７１）配列番号７１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；及び
（７２）配列番号７２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項６】
９番目の塩基を含む１０〜２０の連続したＤＮＡ配列からなる、請求項５記載のイネ品種判別用ＳＮＰマーカー。
【請求項７】
配列番号５９〜７２のいずれか一つで表されるＤＮＡ配列からなる、請求項５又は６記載のイネ品種判別用ＳＮＰマーカー。
【請求項８】
請求項４及び請求項５〜７のいずれか一項に記載の７２種類のイネ品種判別用マーカーから成る群から選択された複数の任意のイネ品種判別用マーカーの組み合わせから成るイネ品種判別用ＳＮＰマーカーセット。
【請求項９】
配列番号１〜７２のいずれか一つで表されるＤＮＡ配列の９番目の塩基（配列番号４５で表されＤＮＡ配列の場合には、９番目及び／又は１０番目の塩基）における一塩基多型（ＳＮＰ）から成る群から選択された一つ又は複数の任意のＳＮＰの組み合わせから成るＳＮＰ群を分析することから成る、イネの品種を判別する方法。
【請求項１０】
配列番号１〜７２で表されるＤＮＡ配列の９番目の塩基（配列番号４５で表されＤＮＡ配列の場合には、９番目及び／又は１０番目の塩基）における一塩基多型（ＳＮＰ）から成る群から選択された一つ又は複数の任意のＳＮＰの組み合わせから成るＳＮＰ群の各ＳＮＰにおける野生型又は変異型の存在を検出し、そのパターンからイネの品種を判別する方法。
【請求項１１】
請求項８記載のイネ品種判別用マーカーセットを変異型プローブセットとして用いるドットブロット法である、請求項９又は１０記載のイネの品種判別方法。
【請求項１２】
各変異型プローブに対応する野生型プローブを用いた競合ハイブリダイズを利用するドットブロット法である、請求項１１記載のイネの品種判別方法。
【請求項１３】
ＰＣＲによりＳＮＰを含むＤＮＡ領域を増幅する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
競合ハイブリダイズにおいて使用するプローブ溶液において、標識ＤＮＡプローブに対して無標識ＤＮＡプローブが１〜１０倍量（モル比）含まれていることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
標識ＤＮＡプローブに対して無標識ＤＮＡプローブが約５倍量（モル比）含まれていることを特徴とする、請求１４に記載の方法。
【請求項１６】
標識としてジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を使用し、これを標識抗ＤＩＧ抗体を反応させることを特徴とする、請求項１１ないし１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
標識抗ＤＩＧ抗体がアルカリホスファターゼで標識された、抗ＤＩＧ−ＡＰ抗体である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
標識としてビオチンを使用し、これをアビジンと反応させることを特徴とする、請求項１１ないし１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項４及び請求項５〜７のいずれか一項に記載の７２種類のイネ品種判別用マーカーから成る群から選択された少なくとも一つのイネ品種判別用マーカー又はそれに対応する野生型のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を増幅するためのＰＣＲプライマー対。
【請求項２０】
表１〜７に記載されているフォワードプライマー及びリバースプライマーから成る、請求項１９記載のＰＣＲプライマー対。
【請求項２１】
請求項８記載のイネ品種判別用マーカーセットを含むイネ品種判別用キット。
【請求項２２】
イネ品種判別用ＳＮＰマーカーセットを変異型プローブとして使用する請求項２１記載のイネ品種判別用キット。
【請求項２３】
更に、各変異型プローブに対応する野生型プローブを含む、請求項２２記載のイネ品種判別用キット。
【請求項２４】
請求項１９又は２０記載のＰＣＲプライマー対を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のイネ品種判別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイネの品種を判別（識別）するためのマーカーとして新たに同定された一塩基多型（ＳＮＰ）を含むポリヌクレオチド（断片）、該ポリヌクレオチドから成るイネ品種判別用変異型プローブ等のイネ品種判別用ＳＮＰマーカー及び該マーカーセット、並びに、該マーカーセット等を用いて該ＳＮＰを分析することによるイネの品種判別方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００５年に日本で50ha以上栽培されたイネ品種は約210、5ha以上栽培されたイネ品種は約300あり、互いにかなり類似するため、米の外観で品種を判定することは不可能である。一方で、一部の良食味品種が高価格で取引されるため、品種名の偽装や異品種の混米による不正が後を絶たない。そのため、混合米の中に含まれる米粒１つずつの品種を同定する技術が求められている。
【０００３】
多数ある品種を判別する方法としては、ＤＮＡ多型分析が最も有効である。作物の品種は他の品種と明確に識別できる遺伝的特性を持っていなければならないことから、遺伝子の塩基配列を分析すれば、理論上は全ての品種が判別可能である。塩基配列そのものを分析しなくても、塩基配列の差をＤＮＡ多型分析法で検出すれば、品種を判別できる。
【０００４】
ＤＮＡ多型分析に最も古くから利用されてきた方法は、サザンブロット法である。これは、ゲノムＤＮＡを制限酵素で切断してアガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜にＤＮＡを写し取って、それにアイソトープなどでラベルした特定の塩基配列のＤＮＡ断片（プローブ）をハイブリダイゼーションすることによって、ゲノムＤＮＡ中の特定塩基配列の制限酵素断片長多型(RFLP: restriction fragment length polymorphism)を分析する方法である。この方法は、信頼性が高い分析法であるが、分析に労力がかかり熟練も要する。
【０００５】
ＰＣＲ(polymerase chain reaction) は、ゲノムＤＮＡを鋳型にして、その内の特定の塩基配列の領域を増幅することが出来る技術である。この方法を利用した最も簡単なＤＮＡ多型分析法は、１０塩基程度の短いプライマーを用いてPCRを行い、増幅したＤＮＡを電気泳動法で分析するＲＡＰＤ法(random amplified polymorphic DNA)と呼ばれるものである。プライマーは無作為に選ぶだけで、極めて簡単であるが、分析結果の再現性が低い。
【０００６】
現在イネの品種判別に最も多く利用されている方法は、特定の塩基配列を持つ２０塩基程度のプライマー対でＰＣＲを行い、電気泳動分析する方法がＲＡＰＤ法に代わって用いられている。用いるプライマー対はゲノムＤＮＡ中の特定塩基配列を増幅できるように設計する。このプライマー対で増幅されるゲノム領域が一方の品種にあり他方の品種にない場合、プライマー対でＤＮＡが増幅できるかどうかで品種判別が行える（特許文献1, 2, 3）。このようなＤＮＡマーカーは優性ＳＣＡＲ(sequence characterized amplified region)マーカーと呼ばれる。鋳型に使うＤＮＡの純度がＰＣＲによるＤＮＡ増幅の成否に影響し、特に米粒から抽出したＤＮＡには不純物が多いため、ＤＮＡ増幅に失敗することがある。優性ＳＣＡＲマーカーは、ＤＮＡが増幅するかどうかを指標としているため、ＤＮＡの純度が低いときに本来増幅すべきＤＮＡが増幅せず、誤ってその塩基配列を保有しない品種と判定する危険性がある。
【０００７】
品種間に短い挿入や欠失の変異があれば、その領域を特異的に増幅する２０塩基程度のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、電気泳動分析すればDNA断片の長さの差で品種判別ができる（特許文献4, 5, 6, 7）。このようなＤＮＡマーカーは共優性ＳＣＡＲマーカーと呼ばれる。しかし、日本稲の品種のように互いに近縁な品種間では、共優性ＳＣＡＲマーカーで多型が検出できるゲノム領域は少ないため、この方法で判別できる品種は限定される。
【０００８】
ゲノムＤＮＡ中の特定塩基配列を増幅したDNA断片で多型が検出できないときは、そのＤＮＡ断片を制限酵素で切断し電気泳動分析することで、多型が検出できる場合がある。このような分析をPCR-RFLP（CAPSとも呼ばれる）という。この方法は、上記方法より分析結果の信頼性が高いが、検出できるＤＮＡ多型は制限酵素認識配列での多型に限定される。
【０００９】
２〜４塩基程度の配列が繰り返しになっている反復配列はマイクロサテライトまたは単純反復配列（simple sequence repeat, SSR）と呼ばれ、ＤＮＡ複製の時に反復数のミスが起こりやすい。そのため、反復数に品種間差があることが多く、各マイクロサテライトを含むゲノム領域をＰＣＲで特異的に増幅し、そのＤＮＡ断片長を電気泳動分析することで品種判別が可能である。２塩基や３塩基の差を検出するため、分析精度が高いポリアクリルアミドゲル電気泳動法を一般に用いて分析する。マイクロサテライト領域の多型分析はＳＳＬＰ(simple sequence length polymorphism)とも呼ばれる。ＳＳＬＰはイネの品種判別にも有効である（特許文献8, 9）が、突然変異品種とその原品種の判別には使えない。これまで述べた方法は、いずれも電気泳動法を使うので、多数（数百以上）の試料の分析には適さない。特に、マイクロサテライト分析はポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いるので煩雑である。
【００１０】
塩基配列の中である特定の１塩基に変異があることを一塩基多型(SNP; single nucleotide polymorphism)といい、ＳＮＰ分析が簡易に行えれば、突然変異遺伝子を簡易に同定でき、理論上全ての品種が判別可能となる。塩基配列を決定すればＳＮＰを同定できるが、塩基配列決定には労力と経費がかかる。
【００１１】
ＳＳＣＰ(single strand conformation polymorphism)法は、100 bpから500 bpの二本鎖DNAを変性させて一本鎖ＤＮＡとし、尿素を含まないポリアクリルアミドゲルで電気泳動するもので、ＳＮＰがそのＤＮＡ断片中にあれば、70％程度の率で多型が検出できる（非特許文献1）。
【００１２】
セロリやアブラナから抽出したミスマッチ切断酵素を用いることによって、ヘテロ二本鎖のミスマッチ部位を切断し、電気泳動分析する方法も簡単である。この方法でＳＮＰを検出できる率はＳＳＣＰよりやや低い（非特許文献2）。
【００１３】
ＳＮＰが同定されておれば、ＳＮＰがある位置で制限酵素認識部位が出来るようにプライマーを設計し、ポリアクリルアミドゲルでPCR-RFLP分析するdCAPS法という方法もある（非特許文献3）。上記いずれのＳＮＰ分析法も、電気泳動法を使うので、労力がかかり多検体の分析には適さない。
【００１４】
労力がかからない方法としては、プライマー伸長法(primer extension)がある。これは、ＤＮＡ塩基配列分析法の原理を応用したもので、4色の蛍光色素をAGCTのそれぞれ付けたヂデオキシヌクレオチドをＳＮＰの位置に取り込ませ、その色からＳＮＰを分析するものである（非特許文献4）。極めて簡易で多検体分析も可能であるが、コストがかかる。
【００１５】
ＰＣＲに利用するプライマーの3’末端の塩基にＳＮＰの部位を合わせれば、ＳＮＰの遺伝子型特異的にＤＮＡを増幅することが出来る。このような、対立遺伝子特異的増幅法によってもＳＮＰ分析が出来る。この対立遺伝子特異的増幅法（Allele specific amplification: ASA）と呼ばれる方法を利用した「イネゲノムの１塩基多型判別法の開発とイネ品種識別への応用」に関する発明が出願されている（特許文献10）。該方法は、ＰＣＲにより検出対象である数百ｂｐのＤＮＡ断片の増幅を行ない、増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動にかけ、その結果得られるバンドに基づき特定のＤＮＡ増幅の有無を識別するものである。尚、この発明の特徴は、ＰＣＲ法を用いてＳＮＰを含む数百ｂｐのＤＮＡを増幅する際に使用するプライマーの塩基にある。しかし、ＰＣＲによる増幅の有無は鋳型ＤＮＡの純度等の影響を受けやすく結果が不安定である。
【００１６】
以上の通り、これまで開発されてきたＳＮＰ分析法は、１試料の分析に労力がかかるあるいはコストがかかるため、少なくとも多数試料の分析には適さないものであった。これに対して、本発明者等は、ＳＮＰ分析法の低コスト化を鋭意検討し、ドットブロット法でＳＮＰを分析できる方法 (dot-blot-SNP) を開発した。この方法はＰＣＲで増幅したDNAをナイロンメンブランにブロッティングし、ラベルした合成DNAをハイブリダイゼーションしてＳＮＰを分析するものである。この方法によれば、一枚のメンブランに、例えば、864個の試料DNAをブロッティングでき、同時に何枚も処理できるので、一度に多数の試料のＳＮＰ分析が可能であり、コストもかからない。この方法を用いる農産物の産地判別法に関して本発明者等により特許が出願されている（特許文献11、非特許文献5）。
【００１７】
また、合成DNAを支持体に固定して、ＰＣＲでラベルした植物ＤＮＡのハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション効率の差からイネ品種の判別を行う方法も開発されている（特許文献12）。この方法は、植物ＤＮＡを固定する上記方法とは逆であり、一度の分析で品種を同定できる点で優れているが、多数試料の分析には適さない。
【特許文献１】特開2005-73655号公報
【特許文献２】特開2006-345843号公報
【特許文献３】特開2005-245244号公報
【特許文献４】特許第3685478号
【特許文献５】特開2001-95589号公報
【特許文献６】特開2002-306173号公報
【特許文献７】特開2003-135082号公報
【特許文献８】特開2004-65251号公報
【特許文献９】特開2007-37468号公報
【特許文献１０】特開2004-248635号公報
【特許文献１１】特開2007-117060号公報
【特許文献１２】特開2006-158253号公報
【非特許文献１】Sato Y and Nishio T (2003) Theor. Appl. Genet. 107: 560-567
【非特許文献２】Shirasawa K et al. (2007) Theor. Appl. Genet. On line published
【非特許文献３】Neff MM et al. (1998) Plant J. 14: 387-392
【非特許文献４】Nasu S et al. (2002) DNA Res. 9: 163-171
【非特許文献５】Shirasawa K et al. (2006) Theor. Appl. Genet. 113: 147-155
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の課題は、一度に多数の試料を用いて、イネの品種判別（識別）を簡便にかつ低コストで実施できるようなＳＮＰ分析手段を提供することであり、特に、その為に、イネの品種を判別（識別）するために使用できる一塩基多型（ＳＮＰ）を含むポリヌクレオチド（断片）、該ポリヌクレオチドから成るイネ品種判別用変異型プローブ等のＳＮＰマーカー及びマーカーセット、並びに、該マーカーセット等を用いるイネの品種判別方法等に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は、上記の課題を解決することを主な目的として鋭意研究の結果、日本稲品種間のＳＮＰを新たに７２種類同定した。これらＳＮＰは全て、上記dot-blot-SNP法等に代表されるＳＮＰ分析を利用してイネ品種を判別するためのＳＮＰマーカーとして極めて有用であることを確認し、本発明を完成した。
【００２０】
本発明は、以下の各態様に係るものである。
［態様１］以下に示す５８種類のポリヌクレオチドから成る群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド：
（１）配列番号１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３）配列番号３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４）配列番号４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５）配列番号５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６）配列番号６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（７）配列番号７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（８）配列番号８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（９）配列番号９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１０）配列番号１０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１１）配列番号１１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１２）配列番号１２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１３）配列番号１３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１４）配列番号１４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１５）配列番号１５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１６）配列番号１６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１７）配列番号１７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１８）配列番号１８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（１９）配列番号１９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２０）配列番号２０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２１）配列番号２１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２２）配列番号２２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２３）配列番号２３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２４）配列番号２４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２５）配列番号２５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２６）配列番号２６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２７）配列番号２７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２８）配列番号２８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（２９）配列番号２９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３０）配列番号３０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３１）配列番号３１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３２）配列番号３２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３３）配列番号３３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３４）配列番号３４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３５）配列番号３５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３６）配列番号３６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３７）配列番号３７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３８）配列番号３８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（３９）配列番号３９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はg）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４０）配列番号４０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４１）配列番号４１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４２）配列番号４２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４３）配列番号４３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４４）配列番号４４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目／又は１０番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４５）配列番号４５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa、１０番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４６）配列番号４６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４７）配列番号４７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４８）配列番号４８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（４９）配列番号４９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５０）配列番号５０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５１）配列番号５１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５２）配列番号５２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５３）配列番号５３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５４）配列番号５４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５５）配列番号５５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５６）配列番号５６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（５７）配列番号５７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；及び
（５８）配列番号５８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド。
［態様２］９番目の塩基（配列番号４５で表されＤＮＡ配列の場合には、９番目及び／又は１０番目の塩基）を含むＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド１０〜２０の連続したＤＮＡ配列からなる、態様１記載のポリヌクレオチド。
［態様３］配列番号１〜５８のいずれか一つで表されるＤＮＡ配列からなる、態様１又は２記載のポリヌクレオチド。
［態様４］態様１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドからなるイネ品種判別用ＳＮＰマーカー。
［態様５］以下に示す１４種類のポリヌクレオチドから成る群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなるイネ品種判別用ＳＮＰマーカー：
（５９）配列番号５９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６０）配列番号６０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６１）配列番号６１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６２）配列番号６２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６３）配列番号６３で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６４）配列番号６４で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６５）配列番号６５で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６６）配列番号６６で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６７）配列番号６７で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｇ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６８）配列番号６８で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｔ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（６９）配列番号６９で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はｃ）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（７０）配列番号７０で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；
（７１）配列番号７１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド；及び
（７２）配列番号７２で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（９番目はa）において、９番目の塩基を含む１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド。
［態様６］９番目の塩基を含む１０〜２０の連続したＤＮＡ配列からなる、態様５記載のイネ品種判別用ＳＮＰマーカー。
［態様７］配列番号５９〜７２のいずれか一つで表されるＤＮＡ配列からなる、態様５又は６記載のイネ品種判別用ＳＮＰマーカー。
［態様８］態様４及び５〜７のいずれか一項に記載の７２種類のイネ品種判別用マーカーから成る群から選択された複数の任意のイネ品種判別用マーカーの組み合わせから成るイネ品種判別用ＳＮＰマーカーセット。
［態様９］配列番号１〜７２のいずれか一つで表されるＤＮＡ配列の９番目の塩基（配列番号４５で表されＤＮＡ配列の場合には、９番目及び／又は１０番目の塩基）における一塩基多型（ＳＮＰ）から成る群から選択された一つ又は複数の任意のＳＮＰの組み合わせから成るＳＮＰ群を分析することから成る、イネの品種を判別する方法。
［態様１０］配列番号１〜７２で表されるＤＮＡ配列の９番目の塩基（配列番号４５で表されＤＮＡ配列の場合には、９番目及び／又は１０番目の塩基）における一塩基多型（ＳＮＰ）から成る群から選択された一つ又は複数の任意のＳＮＰの組み合わせから成るＳＮＰ群の各ＳＮＰにおける野生型又は変異型の存在を検出し、そのパターンからイネの品種を判別する方法。
［態様１１］態様８記載のイネ品種判別用マーカーセットを変異型プローブセットとして用いるドットブロット法である、態様９又は１０記載のイネの品種判別方法。
［態様１２］各変異型プローブに対応する野生型プローブを用いた競合ハイブリダイズを利用するドットブロット法である、態様１１記載のイネの品種判別方法。
［態様１３］ＰＣＲによりＳＮＰを含むＤＮＡ領域を増幅する、態様１２記載の方法。
［態様１４］競合ハイブリダイズにおいて使用するプローブ溶液において、標識ＤＮＡプローブに対して無標識ＤＮＡプローブが１〜１０倍量（モル比）含まれていることを特徴とする、態様１２に記載の方法。
［態様１５］標識ＤＮＡプローブに対して無標識ＤＮＡプローブが約５倍量（モル比）含まれていることを特徴とする、請求１４に記載の方法。
［態様１６］標識としてジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を使用し、これを標識抗ＤＩＧ抗体を反応させることを特徴とする、態様１１ないし１５のいずれか一項に記載の方法。
［態様１７］標識抗ＤＩＧ抗体がアルカリホスファターゼで標識された、抗ＤＩＧ−ＡＰ抗体である、態様１６記載の方法。
［態様１８］標識としてビオチンを使用し、これをアビジンと反応させることを特徴とする、態様１１ないし１５のいずれか一項に記載の方法。
［態様１９］態様４及び態様５〜７のいずれか一項に記載の７２種類のイネ品種判別用マーカーから成る群から選択された少なくとも一つのイネ品種判別用マーカー又はそれに対応する野生型のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を増幅するためのＰＣＲプライマー対。
［態様２０］表１〜７に記載されているフォワードプライマー及びリバースプライマーから成る、態様１９記載のＰＣＲプライマー対。
［態様２１］態様７記載のイネ品種判別用マーカーセットを含むイネ品種判別用キット。
［態様２２］イネ品種判別用ＳＮＰマーカーセットを変異型プローブとして使用する態様２１記載のイネ品種判別用キット。
［態様２３］更に、各変異型プローブに対応する野生型プローブを含む、態様２２記載のイネ品種判別用キット。
［態様２４］態様１９又は２０記載のＰＣＲプライマー対を含む、態様２１〜２３のいずれか一項に記載のイネ品種判別用キット。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によって、イネの品種判別（識別）の為のＳＮＰ分析に使用できる多数のＳＮＰマーカーが提供され、これらＳＮＰマーカーを利用する本発明方法、特に、ドットブロット法によって、一度に多数の試料を用い簡便にかつ低コストでイネの品種判別が実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１〜７２のいずれか一つで表されるＤＮＡ配列の９番目（配列番号４５で表されＤＮＡ配列の場合には、９番目及び／又は１０番目の塩基）にＳＮＰを有するポリヌクレオチドを含むものである。このＳＮＰは、日本晴型イネの遺伝子（野生型）の塩基配列に対する変異型である塩基配列として見出されたものである。尚、日本晴型イネのゲノム配列はデータベース（http://rgp.dna.affrc.go.jp/J/index.html）公表されている。本明細書の実施例の記載から明らかなように、本発明の全てのポリヌクレオチドは、ＳＮＰ分析によるイネ品種判別方法においてイネ品種判別用ＳＮＰマーカーとしての共通の性質を有しており、変異型である塩基配列を検出することができるという共通する性質に不可欠である重要な構成要素、即ち、ＳＮＰを有している。
【００２３】
ＳＮＰを有する９番目の塩基（配列番号４５で表されＤＮＡ配列の場合には、９番目及び／又は１０番目の塩基）を含む限り、全体の塩基長に特に制限はなく、使用するＳＮＰ分析の原理等に応じて、当業者が適宜、選択することができる。例えば、ＳＳＣＰ法によるＳＮＰ分析では、ＳＮＰを含む１００〜５００の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド、ドットブロット法によるＳＮＰ分析では、ＳＮＰを含む、数十の連続したＤＮＡ配列、例えば、１０〜２０個の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド、より具体的には、配列番号１〜７２のいずれか一つで表されるＤＮＡ配列（表１〜７において、各ＳＮＰマーカーの「変異型のプローブ配列」として示されている塩基配列）そのものから成るポリヌクレオチド（１０〜１７の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド）がイネ品種判別用ＳＮＰマーカーとして有用である。
【００２４】
更に、判別の対象となるイネの種類・数等に応じて、本発明の７２種類の各ＳＮＰを有するイネ品種判別用ＳＮＰマーカーの中から、適当な種類の本発明のイネ品種判別用ＳＮＰマーカーを任意に選択して組み合わせ、イネ品種判別用ＳＮＰマーカーセットを構成することができる。通常、本明細書に記載の７２種類のイネ品種判別用ＳＮＰマーカーの全てを使用する必要はなく、その中から、例えば、５〜３０種類を選択してイネ品種判別用ＳＮＰマーカーセットを構成することができる。
【００２５】
イネ品種判別用マーカーには、検出のために、当業者に公知の任意の標識物質を結合させることが出来る。例えば、放射性同位元素である32Ｐ等で標識されたヌクレオチドによる放射能標識、又は、非放射能標識として、卵黄由来のビタミンＢ群の一種であるビオチン及びジギタリス由来のストロイドハプテンであるジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等を代表的例として挙げることが出来る。非放射能標識は放射能の危険もなく安全管理の点で好ましい。これらの標識は、夫々の性質に応じて、当業者に公知の適当な方法でプローブに結合させ、均質標識又は末端標識とすることが出来る。例えば、ビオチンの場合にはビオチン標識したビオチン−ｄＵＴＰ（ＴＴＰ）を用いるか、又は光活性基を導入したフォトビオチンを使用して直接ＤＮＡに結合させることができる。又、ジゴキシゲニンの場合には、環境汚染の心配もなく好適である。これらの非放射能標識は、その後に、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又はペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と結合したアビジンや抗ＤＩＧ−ＡＰ抗体等の二次物質（二次抗体）と反応させ、結合した酵素による化学発光又は発色反応によって測定することが出来る。或いは、ＡＲＥＳ法等によってＤＮＡに蛍光色素を直接結合させることも可能である。
【００２６】
このようなイネ品種判別用ＳＮＰマーカーを用いてＳＮＰ分析することによって、一度に多数の試料について、イネの品種判別（識別）を簡便にかつ低コストで実施することができる。尚、本発明のあるイネ品種判別用マーカーについて、野生型を示す品種と変異型を示す品種を判別するような場合には、一種類のＳＮＰマーカーを単独で用いてＳＮＰ分析を行うことによってどちらの品種であるのかを極めて簡単に判別することが可能である。
【００２７】
即ち、配列番号１〜７２のいずれか一つで表されるＤＮＡ配列の９番目の塩基（配列番号４５で表されＤＮＡ配列の場合には、９番目及び／又は１０番目の塩基）における一塩基多型（ＳＮＰ）から成る群から選択された一つ又は複数の任意の組み合わせから成るＳＮＰ群を分析することによって、イネの品種判別が可能となる。より具体的には、配列番号１〜７２で表されるＤＮＡ配列の９番目の塩基（配列番号４５で表されＤＮＡ配列の場合には、９番目及び／又は１０番目の塩基）における一塩基多型（ＳＮＰ）から成る群から選択された一つ又は複数の任意の組み合わせから成るＳＮＰ群の各ＳＮＰにおける野生型又は変異型の存在を検出し、そのパターンからイネの品種を判別することができる。尚、本明細書中に、主なウルチ１７品種（表１〜７）及びもち４０品種（表８）について、各ＳＮＰマーカーにおける野生型（日本晴型）配列（Ａ）及び変異型配列（Ｂ）の存在の有無が開示されているので、試料を用いて得られた結果をこのパターンと照合することによって、それがどの品種か容易に判別することができる。尚、照合作業自体は当業者に公知の適当なソフトウェアを使用してコンピューターに行わせることも可能である。
【００２８】
ＳＮＰ分析は、既に記載したような当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。低コストで多数試料を簡便に分析する方法としては、本発明者等が開発したdot-blot-SNPが好ましい。本明細書の実施例に記載されているように、このドットブロット方法では、本発明のＳＮＰマーカーを含む適当な長さ（百数十〜数百ｂｐ）のＤＮＡ断片をイネ試料から抽出したＤＮＡから調製し、これを適当なメンブランにドットブロット（固定）し、このＤＮＡ断片と本発明の変異型プローブ（ＳＮＰマーカー）との間のハイブリダイゼーションを利用してＳＮＰ分析を行う。更に、各変異型プローブに対応する野生型プローブ（日本晴型イネ由来）を用いた競合ハイブリダイズを利用するとより優れた感度が得られる。
【００２９】
本明細書の実施例に具体的に記載されているように、この競合ハイブリダイズにおいては、或るＤＮＡ変異を検出する為に使用するプローブ溶液には、当該ＤＮＡ変異と特異的にハイブリダイズする塩基配列を有するプローブ（変異型プローブ）であって適当な標識物質で標識されたプローブ（検出用プローブ）と、該ＤＮＡ変異に対して野生型である塩基配列に対して特異的にハイブリダイズする塩基配列を有するプローブ（野生型プローブ）であって標識されていないプローブ（競合用プローブ）を、検出用プローブに対して競合用プローブが適当に過剰となるような割合、例えば、標識ＤＮＡプローブに対して無標識ＤＮＡプローブが１〜１０倍量、好ましくは約５倍量（モル比）含まれている。その結果、高特異性及び高感度の検出結果を得ることが出来るのである。
【００３０】
イネ試料から抽出したＤＮＡの量が検出に十分であれば、特に増幅することなく、以後の操作に供することが出来る。通常は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法又はＲＴ−ＰＣＲ法、並びに、その他のＩＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）法、ＮＡＳＡＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法およびＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等の当業者に公知の任意の遺伝子増幅法により適当な量に増幅した後に、ドットプロットによる検出にかけることが好ましい。
【００３１】
このような遺伝子増幅法に用いる各種プライマーは、夫々の検出対象となる本発明のＳＮＰマーカーを含む適当な長さ（百数十〜数百ｂｐ）のＤＮＡ断片（遺伝子又はその一部を含む）が増幅されるように、適当に調製することができる。これらプライマーの長さは、通常、数十ｂｐ程度、例えば、１０〜３０ｂｐの長さを有する。各ＳＮＰマーカーに対するこのようなプライマーの一例として、各ＳＮＰマーカーに対するＰＣＲプライマー対（フォワードプライマー:Forward primer及びリバースプライマー:Reverse primer）の具体的な塩基配列が表１〜７に記載されている。従って、本発明は、本発明の７２種類のイネ品種判別用マーカーから成る群から選択された任意のイネ品種判別用マーカー、又はそれに対応する野生型のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を増幅するためのＰＣＲプライマー（対）にも係るものである。
【００３２】
尚、本発明のイネ品種判別用ＳＮＰマーカー及び上記のプライマーは、日本晴型イネのゲノム配列はデータベース（http://rgp.dna.affrc.go.jp/J/index.html）及び本明細書に開示された配列番号１〜７２で表されるＤＮＡ配列情報に基づき当業者が容易に設計し調製することが出来る。
【００３３】
尚、ハイブリダイゼーションは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））等に記載の当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販の装置・器具を使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００３４】
尚、ＤＮＡを抽出するイネの試料としては、例えば、イネの任意の一部（例えば、種子、葉及び茎等）、それらの抽出又は精製物、又は、それらの加工品を挙げることが出来る。加工品の具体例としては、籾、玄米、精米及び米粉、並びに、それらを更に加工した餅及び米菓等を挙げることが出来る。尚、これら試料からのＤＮＡの抽出及び調製は、当業者に公知の方法で行うことができる。
【００３５】
尚、試料から調製されるＤＮＡの種類に特に制限はないが、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ等を挙げることが出来る。これらはその性質、並びに、試料の種類・性質等に応じた当業者に公知の適当な方法で抽出・精製することが出来る。例えば、ゲノムＤＮＡの場合には、ＣＴＡＢ法、ボイル法、及び必要に応じて、アミラーゼ又はプロテアーゼなど処理を伴う酵素法を使用することもできる。
【００３６】
又、本発明において、ＰＣＲ等の各種遺伝子増幅におけるプライマー、又は、ドットブロットにおけるＳＮＰマーカー（変異型プローブ又は野生型プローブ）として使用する各種のオリゴヌクレオチド（オリゴＤＮＡ）は、当業者に公知の方法、例えば、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380;Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90;Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することもできる。
【００３７】
本発明は、更に本発明方法に使用するイネ品種判別用キットに係る。該キットは本発明のイネ品種判別用ＳＮＰマーカーセットを含む。更に、ＳＮＰ分析の種類等に応じて、ＤＮＡ増幅用の各種プライマーセット及び／又はマーカー、その他、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、並びに反応プレート（容器）等の中からその構成・目的等に応じて、適宜、必要なものを含むことが出来る。例えば、ドットブロット法に使用するキットには、イネ品種判別用変異型プローブ、及び、各変異型プローブに対応する野生型プローブが含まれる。
【００３８】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。なお、本明細書において使用される用語は特に言及しない場合には、当該技術分野において通常使用される意味で用いられている。
【００３９】
又、特に記載のない場合には、各操作は、例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Molecular cloning third.ed.（Cold Spring Harbor Lab.Press，2001）; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い実施することが出来る。又、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明のＳＮＰマーカーの一つである「E2439」（表６、配列番号５８）を変異型プローブとして用いた競合ハイブリダイズを利用するドットブロット法による、多数のイネ品種のＳＮＰ分析の具体例を示す。他のＳＮＰマーカーを使用した場合も同様にＳＮＰ分析を行うことができる。
【００４１】
イネ48品種の種子を粉砕後、DNA抽出緩衝液（200 mM Tris-HCl緩衝液 pH 7.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS）を加え、良く混和し、遠心分離後に上清を回収し、等量のイソプロパノールを加え、DNAを析出させた。再び遠心分離を行い、沈殿を1xTE（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA）緩衝液に溶かし、DNA溶液とした。10 μlのPCR反応液（10 ng DNA, 10 pmol E2439用プライマー対（表４）, 1x ExTaq buffer, 2 μmol dNTP, 0.5 U Taq polymerase（ExTaq, TaKaRa Biomedicals社））を、94℃で1分間保温した後、94℃で30秒、58℃で30秒、72℃で30秒の反応を40回行い、最後に72℃で1分間保温することで、SNPを含むゲノムDNA領域を増幅させた。増幅したDNA溶液に等量のアルカリ変性液（0.8 N NaOH, 20 mM EDTA）を加え、マルチピンブロッター（ATTO社）を用いて、2枚のナイロンメンブラン（NytranN, Schleicher & Schuell社）に同じ配置でドットブロットし、UVクロスリンカーでDNAをメンブランに結合させた。ハイブリダイゼーション溶液（5×SSC, 0.1% sarcosyl, 0.02% SDS, 1% Blocking Reagent（Roche社））によるプレハイブリダイゼーションを50℃で1時間以上行い、ハイブリダイゼーションを一晩50℃で行った。
【００４２】
プローブには、5’末端をビオチン標識した、日本晴型のSNPが中央（9塩基目）にある17塩基の5 μlの100 μM合成オリゴヌクレオチド（検出用プローブ、表６）を10 mlのハイブリダイゼーション溶液に加えたものを用い、変異型のSNPを持つ無標識の25 μlの100 μM合成オリゴヌクレオチドを競合用プローブとして加えた。これが、日本晴型対立遺伝子検出用プローブ液となる。逆に、変異型対立遺伝子検出用のプローブ溶液は、変異型SNPを持つ5’末端ビオチン標識の5 μlの100 μM合成オリゴヌクレオチド（検出用プローブ）と、日本晴型SNPを持つ無標識の25 μlの100 μM合成オリゴヌクレオチド（競合用プローブ）を10 mlのハイブリダイゼーション溶液に加えて作った。プローブは、使用前に10分間、熱湯中で変性させ急冷した。メンブランを2×SSC/0.1% SDSで5分間、室温で2回洗浄し、次に0.1×SSC/0.1%SDSで20分間、50℃で2回洗浄した。メンブランをTBS（50 mM Tris-HCl緩衝液, 0.9% NaCl, 0.02% NaN3, pH 8.0）で5分間、室温で洗浄し、ブロッキング溶液（TBS中に1% Blocking Reagentを加える）によるブロッキングを30分間以上、室温で行った。メンブランを、ストレプトアビジン-アルカリ性フォスファターゼ複合体溶液（Promega社製をブロッキング液で10000倍の濃度に希釈した液）に浸し、TBSで10分間、室温で3回洗浄した。メンブランをAP 9.5（100 mM Tris-HCl緩衝液, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 9.5）に室温で3分間浸した後、CSPD溶液（CSPD（Roche社）をAP 9.5で500倍に希釈）に5分間、37℃で浸した。X線フィルムに露光し、シグナルを検出した。得られた結果を図１に示す。
【００４３】
【表１】
2009100653.tif 000003
【００４４】
【表２】
2009100653.tif 000004
【００４５】
【表３】
2009100653.tif 000005
【００４６】
【表４】
2009100653.tif 000006
【００４７】
【表５】
2009100653.tif 000007
【００４８】
【表６】
2009100653.tif 000008
【００４９】
【表７】
2009100653.tif 000009
【００５０】
【表８】
2009100653.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明を用いることによって、ＳＮＰ分析に基づき、簡便にかつ低コストで多数のイネの品種判別（識別）を行うことが可能となり、品種名の偽装や異品種の混米による不正を有効に防ぐ手段として有効である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明のＳＮＰマーカーの一つである「E2439」（配列番号５８）を変異型プローブとして用いた競合ハイブリダイズを利用するドットブロット法による、イネ品種のＳＮＰ分析の結果を示す。尚、図の下の表に示したイネの品種名は上の各ドットブロットの位置に対応する。
【図１】
2009100653.tif 000011