(57)【要約】【課題】従来法よりも圧倒的に短時間に、且つ、簡便な操作で成される遺伝子の検出方法を提供すること。【解決手段】基板を使用して検体中の遺伝子を検出する方法であって、（１）基板の表面に、オリゴＤＮＡプライマーを固定化する工程、（２）前記基板上に検体、ＰＣＲ用プライマーセット、ヌクレオチド単体、及びＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を供給する工程、（３）所定の熱サイクルを前記基板に加える工程、（４）前記オリゴＤＮＡプライマーの伸長を検出する工程、を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法であり、（３）の工程において、溶液相での遺伝子の増幅、及び基板上での固相プライマーの伸長反応が進行するものである遺伝子の検出方法。【選択図】 図１
2009060859.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板を使用して検体中の遺伝子を検出する方法であって、
（１）基板の表面に、オリゴＤＮＡプライマーを固定化する工程、
（２）前記基板上に検体、ＰＣＲ用プライマーセット、ヌクレオチド単体、及びＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を供給する工程、
（３）所定の熱サイクルを前記基板に加える工程、
（４）前記オリゴＤＮＡプライマーの伸長を検出する工程、
を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項２】
（３）の工程において、溶液相での遺伝子の増幅、及び基板上での固相プライマーの伸長反応が進行するものである請求項１記載の遺伝子の検出方法。
【請求項３】
前記基板がプラスチック材料からなるものである請求項１又は２記載の遺伝子の検出方法。
【請求項４】
前記基板の表面にホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有している請求項１〜３いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項５】
前記高分子物質が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基を有する第二単量体と、ブチルメタクリレート基を有する第三単量体との共重合体である請求項４記載の遺伝子の検出方法。
【請求項６】
（１）の工程において、前記オリゴＤＮＡプライマーを５‘末端側で固定化する請求項１〜５いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項７】
前記基板の表面に開口する凹部を少なくとも１つ以上有し、前記凹部の底部の上面が平面形状であり、前記凹部の底部上面にオリゴＤＮＡプライマーを固定化する請求項１〜６いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項８】
前記凹部の底部の厚みが０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍである請求項７記載の遺伝子の検出方法。
【請求項９】
（３）の工程において、前記凹部の開口部に蓋を施すことで封止する請求項７又は８記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１０】
前記蓋の厚みが０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍである請求項９記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１１】
（３）の工程において、所定温度のヒートブロックに基板を接触させる請求項１〜１０いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１２】
基板の上下面の両方に所定温度のヒートブロックを接触させる請求項１１記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１３】
（３）の工程において、所定の温度に各々調製された複数のヒートブロックに所定の順番で接触させることにより、熱サイクルを加える請求項１〜１２いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド単体に標識されたヌクレオチド単体が含まれている請求項１〜１３いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１５】
前記標識が蛍光基、ビオチン、又は酵素である請求項１４記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１６】
（４）の工程において、検出方法が発色測定、蛍光測定、又は目視によるものである請求項１〜１５いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板を使用した遺伝子の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の特異的ＤＮＡ配列を基板上に高密度に配置した「ＤＮＡチップ」を用いた遺伝子検出が盛んに行われており、疾患関連遺伝子の探索や迅速な臨床診断などの分野における実用化が進んでいる。
【０００３】
また、サンプルの前処理から測定・検出までを1チップ上で行うことを目的としたμ-ＴＡＳ（Micro−Total Analysis System）やラボオンチップなど各種のバイオチップも出現しており、これらチップ上で核酸を迅速かつ高感度に解析するためには、検出にかかる技術が重要な要素を占めている（非特許文献１参照）。
【０００４】
ＤＮＡチップは、プローブＤＮＡが配置されている基板に検体を作用させＤＮＡ検出を行うものが一般的に知られている。検体に存在する標的ＤＮＡは通常微量であるため、この方法を用いる場合、ＰＣＲ法等を利用して標的ＤＮＡを増幅する必要がある。
【０００５】
ＰＣＲ法は一般に、標的ＤＮＡ配列を含む2本鎖ＤＮＡを1本鎖ＤＮＡに変性させる反応、解離した1本鎖ＤＮＡにプライマーをアニーリングさせる反応、1本鎖ＤＮＡに結合したプライマーを基点としたＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応、の3段階の反応から成り、それぞれの反応に適した温度、例えば、94℃→50℃→72℃といった温度サイクルを繰り返し行うことでなされる。
【０００６】
このＰＣＲ法は、従来、コンピュータ制御能を有する自動化した温度変換装置（サーマルサイクラー）を用いて実施されている。このようなサーマルサイクラーは、反応容器を収容できる凹部を有する1つの金属製ブロックの温度を制御することで収容されている反応容器内の溶液の温度を調整する仕組みとなっている。この方法の場合、各温度変化に数十秒程度を要し、ＰＣＲ法全体では通常６０分から９０分の時間を要する。
【０００７】
広く一般に使用されている方法ではないが、予め必要な温度に設定された複数の金属ブロックに反応容器を繰り返し接触させることで、反応に必要な温度に達するまでの時間を短縮する方法も考案されている（特許文献1参照）。
【０００８】
従来のＤＮＡチップは予め前記ＰＣＲ法等により標的ＤＮＡを増幅する必要があり、その後、増幅した標的ＤＮＡと基板に固定化されたＤＮＡプローブをハイブリダイゼーションする事で検出が行われる。ハイブリダイゼーション反応には一晩かかる場合もある。また、ＤＮＡ増幅を行う部分とその反応産物を用いた検出を行う部分とがそれぞれ独立していることにより、作業が煩雑になり試料へのコンタミネーションの危険性も上がる。よって、反応から検出までをより簡略化する必要がある。
【０００９】
さらに、ＤＮＡの検出方法も簡便であることが重要である。従来の装置をそのまま使用可能、あるいは装置を全く必要としない可視による検出が行えることが望ましい。
【００１０】
【非特許文献１】マイクロ化学チップの技術と応用  化学とマイクロ・ナノシステム研究会監修  丸善株式会社  平成１６年9月２０日発行  初版
【特許文献１】特開平８−１９６２９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、従来法よりも圧倒的に短時間に、且つ、簡便な操作で成される遺伝子の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下の通りである。
（１）基板を使用して検体中の遺伝子を検出する方法であって、
（１）基板の表面に、オリゴＤＮＡプライマーを固定化する工程、
（２）前記基板上に検体、ＰＣＲ用プライマーセット、ヌクレオチド単体、及びＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を供給する工程、
（３）所定の熱サイクルを前記基板に加える工程、
（４）前記オリゴＤＮＡプライマーの伸長を検出する工程、
を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
（２）（３）の工程において、溶液相での遺伝子の増幅、及び基板上での固相プライマーの伸長反応が進行するものである（１）記載の遺伝子の検出方法。
（３）前記基板がプラスチック材料からなるものである（１）又は（２）記載の遺伝子の検出方法。
（４）前記基板の表面にホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有している（１）〜（３）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
（５）前記高分子物質が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基を有する第二単量体と、ブチルメタクリレート基を有する第三単量体との共重合体である（４）記載の遺伝子の検出方法。
（６）（１）の工程において、前記オリゴＤＮＡプライマーを５‘末端側で固定化する（１）〜（５）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
（７）前記基板の表面に開口する凹部を少なくとも１つ以上有し、前記凹部の底部の上面が平面形状であり、前記凹部の底部上面にオリゴＤＮＡプライマーを固定化する（１）〜（６）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
（８）前記凹部の底部の厚みが０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍである（７）記載の遺伝子の検出方法。
（９）（３）の工程において、前記凹部の開口部に蓋を施すことで封止する（７）又は（８）記載の遺伝子の検出方法。
（１０）前記蓋の厚みが０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍである（９）記載の遺伝子の検出方法。
（１１）（３）の工程において、所定温度のヒートブロックに基板を接触させる（１）〜（１０）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
（１２）基板の上下面の両方に所定温度のヒートブロックを接触させる（１１）記載の遺伝子の検出方法。
（１３）（３）の工程において、所定の温度に各々調製された複数のヒートブロックに所定の順番で接触させることにより、熱サイクルを加える（１）〜（１２）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
（１４）前記ヌクレオチド単体に標識されたヌクレオチド単体が含まれている（１）〜（１３）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
（１５）前記標識が蛍光基、ビオチン、又は酵素である（１４）記載の遺伝子の検出方法。
（１６）（４）の工程において、検出方法が発色測定、蛍光測定、又は目視によるものである（１）〜（１５）いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の検出方法によれば、ＤＮＡ増幅反応等の酵素反応および反応で得られた物質の検出をワンポットで行うことができ、従来法より短時間に、また簡便な操作で検出が可能となる。反応から検出までにかかる時間は、従来の１０分の１程度まで短縮することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、基板を使用して検体中の遺伝子を検出する方法であって、（１）基板の表面に、オリゴＤＮＡプライマーを固定化する工程、（２）前記基板上に検体、ＰＣＲ用プライマーセット、ヌクレオチド単体、及びＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を供給する工程、（３）所定の熱サイクルを前記基板に加える工程、（４）前記オリゴＤＮＡプライマーの伸長を検出する工程、を含む遺伝子の検出方法である。
【００１５】
本発明に使用する基板は、反応系に悪影響を及ぼさない材質であれば良い。基板の素材としてガラスを用いても良い。しかし、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００１６】
また、反応検出方法によっても好ましい材質が異なってくる。基板下方より光学検出する場合は透明性が高い方が望ましく、例えば、PC（ポリカーボネート）、ＰＰ（ポリピロピレン）、シクロオレフィン系ポリマーなどの透明樹脂を用いることができる。さらに、蛍光を検出する場合は自家蛍光の小さい材質の基板が好ましく、例えば、シクロオレフィン系ポリマーなどを用いることができる。
また、例えばＰＣＲ法のような１００℃程度の熱を必要とする反応に用いるために、基板は１００℃以上の熱に耐えられる材質であることが好ましい。
透明性、耐熱性、耐薬品性や反応系に対する影響などの点から環状オレフィン系樹脂やメチルペンテン系樹脂を用いることが好ましい。
【００１７】
本発明に用いる基板の形状は限定されるものではないが、市販されている蛍光スキャナーで容易に読み取ることができるスライド板形状（２５ｍｍ±５ｍｍ×７５ｍｍ±５ｍｍ程度の寸法）が好ましい。
【００１８】
本発明に使用する基板には、基板の表面に開口する凹部を少なくとも１つ以上有し、凹部の底部の上面が平面形状であることが好ましい。この凹部の底部上面にオリゴＤＮＡプライマーを固定化することができる。
【００１９】
本発明における基板の一実施形態を図１に示す。図１は、略長方形の板状の基板２に、試料および試薬を反応させるための凹部３が複数形成されている。
【００２０】
凹部の底部４の厚みは、（ｉ）熱伝導性が良い、（ｉｉ）凹部底部の上面に固定された蛍光をウェル下方から読み取れる、（ｉｉｉ）底部のゆがみがない、の条件を満たす厚みが望ましい。
このような条件を満たす基板として凹部の底部４の厚みが０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍのものが好ましい。より好ましくは、０．０５ｍｍ〜０．３ｍｍであり、更に好ましくは０．０５ｍｍ〜０．２ｍｍである。厚みが上限値を超えると熱伝導性が悪くなる恐れがあり、下限値未満では底部にゆがみを生じる恐れがある。
【００２１】
基板２の厚みは市販されている検出器で使用できる厚みが好ましく、０．５〜３ mmのものが最も好ましい。
【００２２】
基板に占める凹部３の割合は、市販の検出器で用いた際ゆがみが生じない程度が好ましく、凹部が基板２の体積に対し０．１〜５０％の空隙を占めるものが最も好ましい。
【００２３】
凹部の形状は円柱形でも多角柱形でも良く特に限定されるものではないが、凹部の開口部から底面まで壁面が傾斜している形状であることが好ましい（図２参照）。
【００２４】
凹部の底部上面を表面処理することにより、任意のオリゴＤＮＡプライマーを固定できるようにする必要がある。その一例として、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に塗布する処理方法が挙げられる。
【００２５】
表面処理に使用される高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基を有する第二単量体と、ブチルメタクリレート基を有する第三単量体との共重合体等が挙げられる。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の基板表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
この処理を施すことにより、任意のオリゴＤＮＡプライマーをアミド結合等により凹部の底部上面に固定することが可能となる。また、底部上面の親水性も上がり余分な生理活性物質の非特異的吸着を低減できる。
【００２６】
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００２７】
また、プラズマ処理やその他の活性基を持ったポリマーの塗布などの表面処理を施すことにより任意のオリゴＤＮＡプライマーを固定しても良い。
【００２８】
次に、基板の凹部の底部上面へのオリゴＤＮＡ（オリゴＤＮＡプライマー）の固定化方法について説明する。例えば、（ｉ）基板上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とオリゴＤＮＡとを反応させて共有結合を形成させることにより、基板表面でオリゴＤＮＡを固定化し、続いて（ｉｉ）オリゴＤＮＡを固定化した以外の基板表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、オリゴＤＮＡのみを表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００２９】
上記工程（ｉ）において、オリゴＤＮＡを溶解または分散した液体を基板の凹部の底部上面に点着する、あるいは、凹部をその液体で満たす方法が好ましい。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がオリゴＤＮＡと反応して共有結合が形成される。
【００３０】
このオリゴＤＮＡを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
【００３１】
また、点着後、基板表面に固定化されなかったオリゴＤＮＡを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
【００３２】
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はオリゴＤＮＡを固定化した以外の表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【００３３】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【００３４】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００３５】
また、基板に固定化するオリゴＤＮＡには、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたオリゴＤＮＡを用いることにより、効率よくかつ強固に担体の表面上にオリゴＤＮＡを固定化することができる。アミノ基の導入位置はオリゴＤＮＡの３´末端あるいは５´末端どちらであってもよいが、５‘末端側に導入して基板と固定化することが好ましい。
【００３６】
以上により、基板の凹部の底部上面にオリゴＤＮＡが固定化された反応チップ用基板が得られる。
【００３７】
又、基板の凹部の底部上面に複数種類のプローブＤＮＡを点着により固定化することによって、一度に多検体の検出を行うことができる。
【００３８】
本発明の遺伝子検出方法において、上記オリゴＤＮＡプライマーを固定化した基板の凹部に遺伝子を含む検体、ＰＣＲ用プライマーセット、ヌクレオチド単体、及びＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を供給する。
【００３９】
ＰＣＲ用プライマーセットは、フォワードプライマー、リバースプライマーを含むもので、検体中の遺伝子の増幅（ＰＣＲ）に使用される。
【００４０】
ヌクレオチド単体に標識されたヌクレオチド単体が含まれていることが好ましい。標識としては蛍光基、ビオチン、酵素等が挙げられる。これよって、伸長したオリゴＤＮＡプライマーが発色測定、蛍光測定、目視等により検出できる。
【００４１】
検体を含む溶液を供給した後、所定の熱サイクルを基板全体に加える。この際に、凹部を形成した基板を用いる場合は、凹部の封止のために蓋に用いることが好ましい。蓋の材質は反応系に悪影響を及ぼさないものであれば良い。また、適用する反応に際して与えられる温度で変形や不純物溶出等を生じない程度の耐熱性および耐薬品性等を有するものであればよい。しかし、熱伝導性を向上させるために薄いシートの方が好ましい。厚みは、好ましくは０．０５〜０．５ｍｍであり、更に好ましくは０．０５〜０．２ｍｍである。また、反応検出方法によって好ましい材質が異なってくる。凹部の開口部から光学的測定器で測定する場合は透明ないし半透明のシートを用いる方が良い。例えば、PC（ポリカーボネート）、ＰＰ（ポリピロピレン）、ＰＥ（ポリエチレン）、シクロオレフィン系ポリマーなどの透明樹脂を用いることができる。シートは柔軟なフィルムであってもよいし硬質の板状体であってもよい。
【００４２】
フィルムシートを基板に接着させる方法として、粘着材を用いることも可能であるが、接着剤により酵素反応が阻害される場合があるので、ヒートシールを用いた方法が好ましい。
【００４３】
本検出方法で行う熱サイクルの温度制御の方法について説明する。任意の温度に調節された熱板（ヒートブロック）に基板を接触させることにより反応溶液の温度を制御することが可能である。複数個の熱板を各々所定の温度状態に予め制御しておき、その上を基板が順次移動していくという方法により格段に速く反応溶液の温度調整を行うことが可能となる。また、熱板は基板下方のみでなく上方からも接触させることでより短時間で反応溶液の温度調整をすることができる。
【００４４】
本検出方法の熱サイクルに用いる温度制御装置に関して説明する。
予め温度が設定された温調ブロックを２種類以上設けてあり、各ブロックの間を反応基板が行き来できるように搬送路が設けてあるのが良い。３ステップＰＣＲを行う場合は３種類以上の温調ブロックが設けてあるのが望ましい。また、反応基板との接触は下方向のみからでも良いが上下両方向からの接触の方がより効率良く温度制御されるので、上下両方に設けてあるのがさらに望ましい。図３にその一例を示したが、温調ブロック（７〜１２）が上下両方に設けてある。
さらに、単なる接触よりも効率良く温度制御を行い、且つ、基板が傷つくことを回避するために、反応基板を挟み込む、基板から離れるという動作を行えるよう各温調ブロックが上下運動できる構造になっている好ましい  
また、搬送路の温調ブロック以外の位置に反応容器の停止位置を設けると共に、この停止位置に例えば光学的検出を行えるような検出器を備え付けることで、反応の進行具合を経時的に測定することが可能となる。
【００４５】
本発明の遺伝子の検出方法の原理について、図４を用いて説明する。まずプローブＤＮＡ‘オリゴＤＮＡプライマー）を基板の凹部の底部上面に固定化しておく。その後、標識化したヌクレオチドが含まれている検体溶液を加え、熱サイクルを行なうことによって、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応が液相中で起こる（図４左上）。熱サイクルの際、増幅されている標的ＤＮＡと基板に固定化したプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションが起きる（図４第１ステップ）。続いて、反応溶液中に含まれているＤＮＡポリメラーゼにより標的ＤＮＡを鋳型としてプローブＤＮＡの伸長反応が起こり標識化したヌクレオチドが取り込まれる（図４第２ステップ）。熱をかけることにより２本鎖ＤＮＡが解離する（図４ 第３ステップ）。再度、増幅されている標的ＤＮＡと基板に固定化したプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションが起きる（図４第１ステップ）。このステップを繰り返し行うことでＤＮＡ増幅及び基板に固定化したプローブＤＮＡの伸長を同時に進行する。このようにして取り込まれた標識化ヌクレオチドの有無を検出することにより標的ＤＮＡの検出を行うことができる。
【００４６】
通常は抽出してきたＤＮＡをＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などにて予め増幅させてから、検出系に持って行くのだが、本検出方法を用いた場合、上記に示したようにＤＮＡの増幅反応を行うのと同時に基板凹部の底部上面に固定化したプローブＤＮＡへのターゲットＤＮＡのハイブリダイゼーションを行うことができるので、従来法よりも容易にかつ短時間で検出を行うことが可能となる。この場合、基板上に洗浄液等試薬収容部を別に設けておき、必要な試薬を収容しておいても良い。
【００４７】
本発明の検出方法は、一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）の解析にも用いることができる。
基板に固定する側とは反対側の先端付近にＳＮＰ配列を持つようなプローブＤＮＡを基板の凹部底面に固定する。凹部に標識化したヌクレオチドが含まれている試料溶液を加え、ＤＮＡ増幅反応を行うのと同時にプローブＤＮＡの伸長反応を行なう。プローブＤＮＡと標的ＤＮＡがミスマッチの場合、先端付近のハイブリダイゼーションが完全に成されないためＤＮＡの伸長反応は起きず、完全に一致したときのみ伸長反応が起こる。反応終了後、2本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性させる。この操作により、プローブＤＮＡの伸長反応が起こった場合のみ基板上に標識化ヌクレオチドが残り、これを検出することにより一塩基の違いを検出することができる。
【００４８】
また、逆転写酵素を用いることでｃＤＮＡを基板上に固定することができる。
標的ＲＮＡの一部と相補的な配列のプローブを基板の凹部底面に固定する。標的ＲＮＡ溶液を凹部に加え、プローブとハイブリダイゼーションさせる。その後、逆転写酵素を用いて逆転写反応を行うことで標的ＲＮＡと相補的なｃＤＮＡ鎖が基板に固定される。
【実施例】
【００４９】
（スライドガラス状基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物
、ＭＦＲ（Ｍｅｌｔ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）を用い、射出成形により凹部（寸法：７ｍｍ×７ｍｍ  底部厚み：２００iｍ）を有したスライドガラス形状の基板（寸法：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ）を得た。
【００５０】
（スライドガラス状基板の表面処理）
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンーブチルメタクリレートーｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ―ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）、各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
【００５１】
（プローブＤＮＡの固定）
本方法を用いてＳＮＰ検出を行った。５’末端がアミノ基で修飾された、（ｉ）標的ＤＮＡ１(wild type)、配列ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＴＴＣ（配列番号１）  のプローブＤＮＡ（２２塩基）、（ｉｉ）標的ＤＮＡ２(mutant type)、配列ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＴＴＴ（配列番号２）のＤＮＡプローブ（２２塩基）（ｉｉｉ）ポジティブコントロール用ＤＮＡ、配列ＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＴＧＴＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３）のプローブＤＮＡ（２０塩基）、（ｉｖ）ネガティブコントロール用ＤＮＡ、配列ＣＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣ（配列番号４）のプローブＤＮＡ（２０塩基）を０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液をマイクロピペッターを用いて基板の凹部上面にスポットした。プローブＤＮＡをスポットした各基板を、８０℃のオーブン内にて３０分静置し、プライマーを固定化させ、その後ブロッキング処理を施した。
【００５２】
（ＰＣＲおよびプローブＤＮＡの伸長反応）
上記（ｉｉｉ）の配列と（ｉ）あるいは（ｉｉ）の配列を含むＤＮＡを導入したプラスミド溶液に、ＨＳ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、ヌクレオチド標識ｄＵＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、フォワードプライマー（配列ＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴ（配列番号５、２１塩基））、リバースプライマー（配列ＣＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＣＴＧＧＣ（配列番号６、１９塩基））を添加し、ＰＣＲ反応溶液を調製した。この溶液を上記プローブを固定化した基板ウェル内に供給し、市販のＰＣＲ用プレートシール（厚み１００μｍ、１．５ｃｍ×１．５ｃｍに切断したもの）により密閉状態とした。続いて、図３の温度制御装置を用いて、９４℃で熱変性処理、６０℃でアニール処理、７２℃で伸長反応としたヒートサイクルを３５回繰り返し行うことによりＤＮＡ増幅反応及びプローブの伸長反応を行った。
反応は約１０分程度で終了した。
【００５３】
（目視検出）
前記伸長反応の後、反応液を回収し、基板を熱湯及び界面活性剤水溶液によって洗浄した。その後、Alkaliphosphatase-avidinを反応させ、界面活性剤水溶液によって洗浄後、ＢＣＩＰ−ＮＢＴにより可視化した。その結果、反応溶液に添加したプラスミドの配列特異的に検出された。すなわち、前記（ｉ）標的ＤＮＡ１、配列ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＴＴＣ（配列番号１）のプローブＤＮＡ（２２塩基）を導入したプラスミドを用いた場合は（ｉ）の点着部分での染色が観察され（ｉｉ）の点着部分では確認されなかった（図5（a））。逆に、前記（ｉｉ）標的ＤＮＡ２、配列ＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＴＴＴ（配列番号２）のプローブＤＮＡ（２２塩基）を導入したプラスミドを用いた場合は（ｉｉ）の点着部分で染色が観察され（ｉ）の点着部分では確認されなかった（図５（b））。どちらの場合においても、（ｉｉｉ）ポジティブコントロール用ＤＮＡ、配列ＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＴＧＴＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３）のプローブＤＮＡ（２０塩基）点着部分での染色が観察でき、ネガティブコントロールである（ｉｖ）配列ＣＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣ（配列番号４）のプローブＤＮＡ（２０塩基）では染色は検出されなかった。
反応から検出まで一連の操作に要した時間は３０分程度であった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の検出方法に用いる基板の一例を示す概略図（（ａ）平面図及び（ｂ）断面の側面図）である。
【図２】本発明の検出方法に用いる基板の凹部の一例を示す概略図（（ａ）平面図及び（ｂ）凹部断面の側面拡大図）である。
【図３】本発明の検出方法に用いる温度制御装置の一例を示す概略図
【図４】本発明の検出方法の原理を示す概略図
【図５】実施例のＤＮＡ検出結果（（ａ）標的ＤＮＡ１検出、（ｂ）標的ＤＮＡ２検出、（c）各スポットの説明図）である。
【符号の説明】
【００５５】
１  反応用基板
２  基板
３  凹部
４  凹部の底部
５  反応溶液
６  凹部開口部の封止用シート
７〜１２  熱ブロック
【図１】
2009060859.tif 000003
【図２】
2009060859.tif 000004
【図３】
2009060859.tif 000005
【図４】
2009060859.tif 000006
【図５】
2009060859.tif 000007
【配列表】
2009060859000001.app