(57)【要約】【課題】L-アミノ酸を効率よく生産する。【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、アセチルCoA合成酵素活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培養することによってL-アミノ酸を生産する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、アセチルCoA合成酵素活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物。
【請求項２】
アセチルCoA合成酵素をコードするacs遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、アセチルCoA合成酵素活性が増強された、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記acs遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項２に記載の微生物：
（ａ）配列番号３に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アセチルCoA合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項７】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、請求項６に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にL−リジン、L-スレオニン、L-グルタミン酸等のL-アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、アミノ酸輸液等として、Ｌ−グルタミン酸は調味料として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。例えば、Ｌ−リジンの製造法としては、例えば、特許文献１〜８に記載された方法を挙げることができる。これらの製造法においては、自然界から分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらには、組換えDNA技術により塩基性Ｌ−アミノ酸生合成酵素の活性が増強するように改変された微生物などが用いられている。
【０００３】
アセチルCoA合成酵素は酢酸とコエンザイムAとATPより、アセチルCoA、ピロリン酸、及びAMPを生成する反応を触媒する酵素であり、acs遺伝子によってコードされている（非特許文献１）。しかしながら、アセチルCoA合成酵素の活性を増強させることがＬ−アミノ酸生産に効果があることは、全く知られていなかった。
【特許文献１】欧州特許0643135号公報
【特許文献２】欧州特許0733712号公報
【特許文献３】欧州特許出願公開1477565号公報
【特許文献４】欧州特許出願公開0796912号公報
【特許文献５】欧州特許出願公開0837134号公報
【特許文献６】国際公開WO01/53459号パンフレット
【特許文献７】欧州特許出願公開1170376号公報
【特許文献８】国際公開WO2005/010175号パンフレット
【非特許文献１】J Bacteriol. 1995 May;177(10):2878-86.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる菌株を提供すること、及び該菌株を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、アセチルコエンザイムA（以下アセチルCoAと呼ぶ）合成酵素をコードするacs遺伝子の発現を増強させた微生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、アセチルCoA合成酵素活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物。
（２）アセチルCoA合成酵素をコードするacs遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、アセチルCoA合成酵素活性が増強された、（１）の微生物。
（３）前記acs遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、（２）の微生物
：
（ａ）配列番号３に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アセチルCoA合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である（１）〜（３）のいずれかの微生物。
（５）前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である（１）〜（４）のいずれかの微生物。
（６）（１）〜（５）のいずれかの微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
（７）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、（６）の製造法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の微生物を用いることにより、効率よく、L-リジン、L-オルニチン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L−シトルリンなどの塩基性アミノ酸、L-イソロイシン、L-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、L-グリシンなどの脂肪族アミノ酸、L-スレオニン、L-セリンなどのヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、L-プロリンなどの環式アミノ酸、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファンなどの芳香族アミノ酸、L-システイン、L-シスチン、L-メチオニンなどの含硫アミノ酸、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-アスパラギンなどの酸性アミノ酸を発酵生産することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物であって、アセチルCoA合成酵素（以下、ACSと呼ぶ）の活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物である。ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、培地中または菌体内に回収できる程度にＬ−アミノ酸を生成し、蓄積する能力をいう。なお、本発明の微生物は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１０】
L-アミノ酸の種類は特に制限されないが、L-リジン、L-オルニチン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L−シトルリン等の塩基性アミノ酸、L-イソロイシン、L-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、L-グリシン等の脂肪族アミノ酸、L-スレオニン、L-セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、L-プロリン等の環式アミノ酸、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン等の芳香族アミノ酸、L-システイン、L-シスチン、L-メチオニン等の含硫アミノ酸、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-アスパラギン等の酸性アミノ酸が挙げられる。
本発明の微生物は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
【００１１】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与
本発明の微生物の親株としては、エシェリヒア属細菌、パントエア属細菌を代表とする腸内細菌科に属する微生物を用いることができる。その他の腸内細菌科に属する微生物としては、エンテロバクター（Enterobacter）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。
【００１２】
エシェリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460−2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所  P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,United States
of America ）。
【００１３】
また、エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）等に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２０７）及びそれらの誘導体などを用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００１４】
以下、上述したような親株にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法について述べる。
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された遺伝子組換え株の創製等、従来、エシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００１５】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、ま
たはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルフォネート（EMS）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
遺伝子組換えとしては、目的Ｌ−アミノ酸の生合成に関する酵素をコードする遺伝子の発現を増強する方法や、目的Ｌ−アミノ酸の分解に関する酵素をコードする遺伝子の活性を低下させる方法などが挙げられる。
以下、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物の具体例を挙げるが、本発明において使用することができる微生物は以下のものには限定されない。
【００１６】
Ｌ−スレオニン生産菌
本発明のＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、本発明のL-スレオニン生産菌を誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)に、受託番号VKPM B-5318で寄託されている。
好ましくは、本発明の細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変されたものである。
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子
ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子
スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子
推定トランスメンブランタンパク質をコードするrhtA遺伝子
アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子
アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子
Escherichia coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913
.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,
GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th
International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology,
San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００１７】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
WC196株は、Escherichia coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、Escherichia coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
本発明のL-リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素
をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大している株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子(dapA)、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd)及びアスルターゼ遺伝子(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
本発明のＬ−リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
【００１８】
Ｌ−システイン生産菌
本発明のＬ−システイン生産菌を誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
Ｌ−ロイシン生産菌
本発明のＬ−ロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の細菌は、L-ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはL-ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からL-アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００２０】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
本発明のＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM
B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116
−B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM
BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E.
coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のL-ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、L-ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisIE)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
hisG及びhisBHAFIにコードされるL-ヒスチジン生合成系酵素はL-ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、L-ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
L-ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、L-ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子であるrhtを導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００２１】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するL-イソロイシン及びL-スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、L-イソロイシン要求性のL-グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
本発明のL-グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、L-グルタミン酸生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株が挙げられるが、これらに限定されない。このような遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdh）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA,acnB)、シトレートシンターゼ(gltA)、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF,lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA,pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA,pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。
本発明のL-グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げら
れる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
L-グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにL-グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
L-グルタミン酸生産菌の例としては、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられ、上記のようにして得ることができる。このような株としては、Pantoea ananatis AJ13356(米国特許第6,331,419号)がある。Pantoea ananatis AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。Pantoea ananatis AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子(sucA)の破壊によりα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損している。この株は、単離された時には、Enterobacter agglomeransと同定され、Enterobacter agglomerans AJ13356として寄託された。しかし、16S rRNAの塩基配列などに基づき、Pantoea ananatisに再分類された。AJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。
【００２２】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
本発明のＬ−フェニルアラニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089
(ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL-フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００２３】
Ｌ−トリプトファン生産菌
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレート
シンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL-トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
本発明のL-トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にL-トリプトファン及びL-セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
本発明のL-トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりL-トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりL-トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００２４】
Ｌ−プロリン生産菌
本発明のＬ−プロリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、L-プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の細菌は、L-プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。L-プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、L-プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からL-アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
L-プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【００２５】
Ｌ−アルギニン生産菌
本発明のＬ−アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のL-アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、L-アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【００２６】
Ｌ−バリン生産菌
本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるL-バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
本発明のL-バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow
117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００２７】
Ｌ−イソロイシン生産菌
本発明のＬ−イソロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのL-イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００２８】
＜１−２＞ACS活性の増強
本発明の微生物は、上述したようなＬ−アミノ酸の生産能を有する腸内細菌科に属する微生物を、ACS活性が増強するように改変することによって得ることができる。ただし、ACS活性が増強するように改変を行った後に、Ｌ−アミノ酸の生産能を付与してもよい。
なお、ACS活性の増強は、後述するように、ACSをコードする遺伝子の発現量を増強させるように改変することによって達成でき、これらの発現量の増強はプロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる内因性遺伝子の発現増強であってもよいし、遺伝子を含むプラスミドの導入などによる外因性遺伝子の発現増強であってもよい。さらに、これらを組み合わせてもよい。
【００２９】
本発明において、ACS活性とは、酢酸とコエンザイムA（CoA）とATPより、アセチルCoA、ピロリン酸、及びAMPを生成する活性（EC6.2.1.1）を意味する。
コエンザイムA + 酢酸 + ATP ⇔アセチルCoA + ピロリン酸 + AMP
ACSは、上記反応だけでなくプロピオン酸からプロピオニルCoAを合成する反応も触媒する（Eur J Biochem 2002;269(24);6184-94）ことも報告されていおり、また、4-coumarate CoAリガーゼとしての機能も予想されている（Genome Biol 4(9);R54）。
コエンザイムA + プロピオン酸 + ATP ⇔ プロピオニルCoA + ピロリン酸 + AMP
コエンザイムA + 4-coumarate + ATP ⇔ coumaroyl-CoA + ピロリン酸+ AMP
ACS活性の増強は、in vitroで生成されるアセチルCoAを、例えば、アセトヒドロキサム酸に変換して測定する（Meth. Enzymol. 1, 585-591）ことにより確認できる。
【００３０】
「ACS活性が上昇するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対して細胞あたりのACSの分子の数が増大した場合や、ACSの１分子当たりの活性が向上した場合が該当する。ACSの活性は野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり150%以上、好ましくは200％以上、さらに望ましくは菌体当たり300％以上に向上するように改変されていることが好ましい。ここで、対照となる野生株の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCCNo.47076）、及びW3110株（ATCCNo.27325）、パントエア・アナナティスAJ13335株（FERM BP-6615）などが挙げられる。
【００３１】
ACS活性の増強は、ACSをコードする遺伝子の発現量を増強させるように改変することによって達成できる。発現が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、mRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。また、ACS活性の増強は、ACSのタンパク質量が非改変株、野生株と比較して上昇していることによって確認することができ、例えば抗体を用いてウェスタンブロットによって検出することが出来る。（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。
【００３２】
ACS活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（acs遺伝子）としては、例えば、エシェリヒア・コリのacs遺伝子、具体的には、配列番号３のacs遺伝子(GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号 4283436..4285394の相補鎖)が挙げられる。
【００３３】
他の微生物由来のacs遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No. NC_004088の577565..579529の相補鎖に示されるエルシニア・ペスティスのacs遺伝子、GenBank Accession No. AL627282の120832..122790の相補鎖に示されるサルモネラ・チフィのacs遺伝子、GenBank Accession No. NC_002505の305121..307121の相補鎖に示されるビブリオ・コレラエのacs遺伝子、NC_003197の4513714..4515672の相補鎖に示されるサルモネラ・チフィムリウムのacs遺伝子などが挙げられる。
さらに、acs遺伝子のホモログは、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、エシェリヒア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ−プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよく、例えば配列番号１、２に示される合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅出来るものであってもよい。アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin および AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl.
Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))やPearsonによるFASTA(Methods Enzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。
【００３４】
acs遺伝子のホモログとは、他の微生物由来または天然もしくは人工の変異型遺伝子で、上記のacs遺伝子と構造が高い類似性を示し、宿主に導入あるいは増幅した際にACS活性を向上させる機能を有する遺伝子を意味する。acs遺伝子のホモログは、配列番号４のア
ミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有し、かつ、ACS活性を有するタンパク質をコードするものを意味する。なお、ACS活性を有することは、これらの遺伝子を宿主細胞で発現させ、ACS活性を調べることによって確認することができる。
【００３５】
また、本発明に用いるacs遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるタンパク質のACS活性が損なわれない限り、配列番号４のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を意味する。上記置換は保存的置換が好ましく、保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、acs遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００３６】
またacs遺伝子は、配列番号３の塩基配列の相補配列又は該配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ACS活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００３７】
上記acs遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中のこれらの遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、これらの遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。
【００３８】
acs遺伝子としてエシェリヒア・コリのacs遺伝子を用いる場合、配列番号３の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号１，２に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、acs遺伝子を取得することができる。他の微生物のacs遺伝子も、それぞれその微生物において公知のacs遺伝子もしくは他種の微生物のacs遺伝子又はACSタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから、取得することができる。なお、染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００３９】
次に、PCR法により増幅されたacs遺伝子を、宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターDNAに接続して組換えDNAを調製する。宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。
【００４０】
エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184,（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）, RSF1010（Gene vol.75 (2), p271-288, 1989）, pBR322, pMW219、pMW119（pMWはニッポンジーン社より入手可）、pSTV28、pSTV29（宝バイオ社製）等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００４１】
これらの遺伝子を上記ベクターに連結して組み換えＤＮＡを調製するには、acs遺伝子を含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００４２】
上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。また、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）を使用することもできる。
【００４３】
一方、acs遺伝子のコピー数を高めることは、これらの遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にこれらの遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、acs遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。染色体上にこれらの遺伝子が転移したことの確認は、これらの遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００４４】
さらに、acs遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載されたようにして、染色体DNA上またはプラスミド上のこれらの遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、これらの遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅、これらの遺伝子の発現を低下させ
るようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。
プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1,
105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりacs遺伝子の発現が強化される。
【００４５】
さらに、acs遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強するために、ACS活性が上昇するような変異をこれらの遺伝子に導入してもよい。ACS活性が上昇するような変異としては、acs遺伝子の転写量が増大するようなプロモーター配列の変異、及び、ACSタンパク質の比活性が高くなるようなこれらの遺伝子のコード領域内の変異が挙げられる。
【００４６】
＜２＞Ｌ−アミノ酸の製造法
本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする製造法である。
【００４７】
使用する培地は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００４８】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
【００４９】
なお、塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御する、あるいは又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方
法で製造を行ってもよい。（特開2002-065287号参照）
【００５０】
［実施例］
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００５１】
＜１＞  acs増幅用プラスミドの構築
acs遺伝子のリジン収率に寄与する増幅効果を確認する為に、acsを増幅するためのプラスミドを構築した。エシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)の染色体の全塩基配列は既に明らかにされている（Science, 277, 1453-1474 (1997)）。この文献に報告されているacs遺伝子の塩基配列に基づいて、５'側プライマーとして、GenBankのACCESSION No. NC000913の塩基番号4285765〜4285784の相補的な配列にSalIサイトを付加した、配列番号1の合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとして、同塩基配列の塩基番号4283415〜4283435の配列にBamHIサイトを付加した、配列番号2に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行った。
精製したＰＣＲ産物を、SalI,BamHIで消化したベクターpMW119（タカラバイオ社製）に連結して、acs増幅用プラスミドpMWacsを構築した。
【実施例２】
【００５２】
＜２＞リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA,ldcC遺伝子破壊株の構築
まずリジンデカルボキシラーゼ非産生株の構築を行った。リジンデカルボキシラーゼは、cadA遺伝子（Genbank Accession No. NP_418555. 配列番号5）、ldcC遺伝子（Genbank Accession No. NP_414728. 配列番号7）によってコードされている（国際公開WO96/17930号パンフレット参照）。ここで親株は、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産株として、ＡＥＣ(Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン)耐性株であるWC196株（WO96/17930号国際公開パンフレット参照）を用いた。
【００５３】
リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA、ldcC遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000， vol. 97， No. 12， p6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH， Gumport RI， Gardner JF.）によって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5'側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を３'側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る（特開2005-058227）。
【００５４】
（２−１）cadA遺伝子の破壊
PCRの鋳型としてPCRの鋳型として、プラスミドpMW118-attＬ−Cm-attR（特開2005-058827）を使用した。pMW118-attＬ−Cm-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるcat遺伝子を挿入したプラスミドであり、attＬ−cat-attRの順で挿入されている
【００５５】
このattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3'末端に、目的遺伝子であるcadA遺伝子の一部に対応するプライマーの5'末端に有する配列番号9及び10に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行った。
【００５６】
増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリWC196株にエレクトロポレーションにより導入した。プラスミドpKD46（Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000， vol. 97， No. 12， p6640-6645）は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムのRed レコンビナーゼをコードする遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含むλファージの合計2154塩基のDNAフラグメント（GenBank/EMBL アクセッション番号 J02459、 第31088番目〜33241番目）を含む。プラスミドpKD46はPCR産物をWC196株の染色体に組み込むために必要である。
【００５７】
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、100mg／Lのアンピシリンを含んだLB培地中で３０℃、一晩培養したエシェリヒア・コリWC196株を、アンピシリン（20mg/L）とＬ−アラビノース（1mM）を含んだ5mLのSOB培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook， J.ら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））で100倍希釈した。得られた希釈物を３０℃で通気しながらＯＤ600が約０．６になるまで生育させた後、100倍に濃縮し、10%グリセロールで３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは７０μＬのコンピテントセルと約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのＳＯＣ培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook， J.ら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））を加えて３７℃で２．５時間培養した後、３７℃でＣｍ（クロラムフェニコール）(25mg/L)を含むＬ−寒天培地上で平板培養し、Ｃｍ耐性組換え体を選択した。次に、pKD46プラスミドを除去するために、Ｃｍを含むＬ−寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、pKD46が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。
【００５８】
クロラムフェニコール耐性遺伝子によって識別できた変異体のcadA遺伝子の欠失を、PCRによって確認した。得られたcadA欠損株をWC196ΔcadA::att-cat株と名づけた。
【００５９】
次に、cadA遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミド上述のpMW-intxis-ts（特開2005-058827）を使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ(Xis)をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである
【００６０】
上記で得られたWC196ΔcadA::att-cat株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、３０℃で50 mg/Lのアンピシリンを含むＬ−寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。
次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、Ｌ−寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びクロラムフェニコール耐性を試験し、att-cat、及びpMW-intxis-tsが脱落しているcadA破壊株であるクロラムフェニコール、アンピシリン感受性株を取得した。この株をWC196ΔcadAと名づけた。
【００６１】
（２−２）WC196ΔcadA 株のldcC遺伝子の欠失
WC196ΔcadA 株におけるldcC遺伝子の欠失は、上記手法に則って、ldcC破壊用プライマーとして、配列番号11、12のプライマーを使用して行った。これによって、cadA ldcC破壊株であるWC196ΔcadAΔldcCを得た。
【実施例３】
【００６２】
＜３＞エシェリヒア属細菌L-リジン生産株でのacs遺伝子増幅の効果
WC196ΔcadAΔldcC株へのlys生産用プラスミド導入
WC196ΔcadAΔldcC株をdapA、dapB及びlysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）で常法に従い形質転換し、WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株（WC196LC/pCABD2）を得た。
WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株を、実施例１で用いたacs増幅用プラスミドpMWacsと、比較対照用プラスミドpMW119で形質転換し、ストレプトマイシン・アンピシリン耐性株を得た。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、acs増幅用プラスミドpMWacs導入株をWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2-acs株、比較対照用プラスミドpMW119導入株をWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2-119株と名づけた。
WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2-acs株とWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2-119株を50 mg/Lのアンピシリン、20mg/Lのストレプトマイシンを含むL培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注しグリセロールストックにして、-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。
これらの株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、50 mg/Lのアンピシリン、20mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500mL坂口フラスコの、50 mg/Lのアンピシリン、20mg/Lのストレプトマイシンを含む発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において19時間培養した。培養後、培地中に蓄積したリジンの量を公知の方法（サクラ精機  バイオテックアナライザーAS210）により測定した。
【００６３】
発酵培地の組成を以下に示す(g/L)。
グルコース                  40
（NH4）2SO4                  24
KH2PO4                      1.0
MgSO4・７H2O                1.0
FeSO4・７H2O                0.01
MnSO4・５H2O                0.01
イーストエキストラクト      2.0
Up to 1L
KOHでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ（但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別殺菌）
局法CaCO3 30g/L(180℃で2時間乾熱滅菌したもの)を入れる。
【００６４】
19時間目のＬ−リジン蓄積と収率を表１に示す。表1から分かるように、WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2-acs株は、acs遺伝子を導入しないWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2-119株と比較して多量のリジンを蓄積した。
【００６５】
【表１】
2009060791.tif 000002
【配列表】
2009060791000001.app