(57)【要約】【課題】  糖鎖化合物の効率的な製造方法を提供する。【解決手段】  培養細胞に糖鎖プライマーを投与し、伸長されたオリゴ糖鎖を回収する糖鎖化合物の製造方法であって、培養細胞のセラミドの合成を抑制することにより、糖鎖プライマーの伸長反応効率を高めることを特徴とする方法である。本発明によれば、培養細胞由来の有用な糖鎖化合物を安価且つ効率的に生産することが可能になる。また、培地量当たりの生産量を高められるので、微量の糖鎖伸長物を検出することも可能となり、分離・精製する上でも有利となることから、多種のオリゴ糖鎖を利用した製品の迅速な実用化が可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞に糖鎖プライマーを投与し伸長されたオリゴ糖鎖を回収する糖鎖化合物の製造方法であって、該培養細胞のセラミド合成を抑制することにより糖鎖化合物の生産性を向上させることを特徴とする糖鎖化合物の製造方法。
【請求項２】
培養系にセラミド合成阻害剤を添加することを特徴とする請求項１記載の糖鎖化合物の製造方法。
【請求項３】
前記セラミド合成阻害剤がフモニシンである請求項２記載の糖鎖化合物の製造方法。
【請求項４】
前期セラミド合成阻害剤がフモニシンB1である請求項２記載の糖鎖化合物の製造方法。
【請求項５】
前期セラミド阻害剤の濃度が０．１μM以上であることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の糖鎖化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を用いた糖鎖化合物の合成・生産方法に関し、より詳しくは、糖鎖伸長法による糖鎖合成において糖鎖伸長効率を高め、生成量を増大させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は構造が複雑であり、同じ生体分子であるＤＮＡやタンパク質よりも産業上の利用の為の開発が遅れている。しかし、近年、糖鎖の研究が急速に進展し、産業上の利用への模索も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等への糖鎖の関わりについて新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や脂質と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることも明らかになってきている。
【０００３】
従来からあるオリゴ糖鎖を生産する方法としては、化学合成および酵素を用いる方法があげられる。化学合成による方法では、一つのオリゴ糖鎖を得るための反応ステップは多く、特殊な技術も必要でコストが高いという欠点がある。また、酵素を用いる方法も、利用できる酵素が限定されることや、オリゴ糖鎖合成の原料となる糖ヌクレオチドなどの糖供与体も高価であることなどの欠点がある。
【０００４】
最近、動物細胞を使用し、簡単な構造の糖鎖プライマーを培養細胞に投与すると、細胞内でこの糖鎖プライマーに糖鎖が付加されて伸長されたオリゴ糖鎖が培養液中に分泌されることが報告されている（糖鎖伸長法：特許文献1、特許文献２、特許文献３）。この方法を用いると、培養細胞や糖鎖プライマーの種類を変えることにより、多様な糖鎖を合成することができ、多様な糖鎖生産への応用が試みられている。
【０００５】
しかしながら、この糖鎖伸長法においても、糖鎖プライマーの細胞への毒性等の問題から投与量が制限されることや、転換効率が低いというようなことから、更なる生産性の向上が望まれていた。
【特許文献１】特開２０００−２４７９９２
【特許文献２】ＷＯ２００２／０８１７２３
【特許文献３】特開２００３−２７４９９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記現状に鑑み、糖鎖伸長法による糖鎖合成において、効率的にオリゴ糖鎖を合成・生産させることができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに培養細胞のセラミドの合成を抑制することにより、オリゴ糖鎖の生産効率が向上することを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は、培養細胞に糖鎖プライマーを投与し、伸長されたオリゴ糖鎖を回収する糖鎖化合物の製造方法であって、該培養細胞のセラミド合成を抑制することにより、オリゴ糖鎖の生産効率を向上させる方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、糖鎖伸長法によるオリゴ糖鎖の生産効率を向上させることができ、人型糖鎖を始めとする動物細胞由来の有用な糖鎖化合物を安価に生産することが可能となる。また、培地量当たりの糖鎖生産量を高められるので、微量の糖鎖伸長物を検出することも可能となり、分離・精製する上でも有利となることから、多種のオリゴ糖鎖を利用した製品の迅速な実用化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明では、培養細胞に糖鎖プライマーを投与し、伸長されたオリゴ糖鎖を回収する糖鎖化合物の製造法において、培養細胞のセラミドの合成を抑制することにより、投与した糖鎖プライマーの伸長反応効率を高める方法である。
【００１１】
セラミドの合成を抑制する方法としては特に限定されず、セラミド合成阻害剤を使用する方法や、ＲＮＡｉを用いてセラミド合成系の遺伝子の発現を抑制する方法や、細胞に変異を導入しセラミド合成能の低下した細胞を用いる方法などが考えられる。なかでも、セラミド合成阻害剤を用いる方法が簡便で利用しやすい。
【００１２】
セラミド合成阻害剤としては、フモニシン、ＩＳＰ−１、スフィンゴフンジンＢ、ビリジオフンジンＡ、β−クロロ−L−アラニン、L−シクロセリン等が挙げられ、フモニシンが好ましく、フモニシンＢ１がより好ましい。セラミド阻害剤濃度としては、通常０．１μＭ以上、好ましくは１μＭ以上、より好ましくは５μ以上である。上限は培養細胞による糖鎖伸長に悪影響を及ぼさない限り特に制限されないが、通常は１００μＭ以下である。フモニシンＢ１の場合、とりわけ２５〜５０μＭの範囲で、培養細胞の糖鎖伸長が効率的に高められる。
【００１３】
セラミド合成阻害剤の添加方法としては、例えば、糖鎖プライマーを投与する前の細胞の培養するための培地中に添加しておいても良いし、プライマーを投与する際に用いる培地中に添加しても良い。糖鎖プライマーを投与する前の培地中にセラミド合成阻害剤添加しておき、プライマーを投与する際に用いる培地中にも同濃度のセラミド合成阻害剤を添加する方法が好ましい。
【００１４】
糖鎖伸長に用いる細胞としては、ヒト由来、マウス由来、サル由来、ラット由来などの哺乳動物細胞が挙げられ、特にＢ１６マウスメラノーマ細胞、ラットＰＣ１２細胞、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＭＯＬＴ−４細胞、ヒトＨＬ−６０細胞、サル腎臓由来ベロ細胞などが好適に用いられ得るが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
糖鎖化合物が得られるような条件とは、例えば、上記の動物細胞を、室温から４５℃までの温度の間で１時間から７０時間までの間の時間でフモニシンB1を０．１μMから１００μMまでの範囲の濃度で添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２などの培養培地で前培養した後、糖鎖プライマー及びフモニシンB1を添加した培地に置換してさらに培養を行い、糖鎖伸長反応を行うことなどである。
【００１６】
ここで、糖鎖プライマーは、用いられる細胞種、所望の糖鎖構造により任意に選択することができる。好ましい糖鎖プライマーの例としては、式（Ｉ）：
（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)z−Ｌ−Ｎ3
や、式（２）：
（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)z−Ｌ−H
で表される化合物が挙げられる。
【００１７】
ここで、式中、Ｇ1、Ｇ2及びＧ3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2)m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−から選択される連結基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜５、さらに好ましくは０から３であり、ｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。また、mは、８〜２０の整数であり、好ましくは８〜１６、特に好ましくは１２である。単糖としては、限定はされないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。
【００１８】
このような糖鎖プライマーを各種細胞の培地に添加して細胞を培養すると、細胞は、プライマーを取り込み、その糖鎖部分に更に糖を付加してグリコシル化し、その糖付加生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に分泌する。付加される糖は、細胞により異なる。
【００１９】
以下に、本発明の糖鎖化合物の具体例を実施例の態様で示すが、本発明はこれに限定されない。
【実施例】
【００２０】
（実施例１）
まず、触媒としてルイス酸であるboron trifluoride etherate (BF3・OEt2)とアルコールを用いてグリコシル化を行った後、脱アセチル化反応を行うことにより、糖鎖プライマー：ドデシル−βラクトシドを得た（Murozuka, Y., Kasuya, M. C., Kobayashi, M., Watanabe, Y., Sato, T. and Hatanaka, K. 2005, Chemistry and Biodiversity, 2, 1063, Kasuya, M. C., Wang, L., Lee, Y. C., Mitsuki, M., Nakajima, N., Sato, T., Hatanaka, K., Yamagata, S. and Yamagata, T. 2000, Carbohydr. Res., 329, 755.）。
【００２１】
１００ｍｍのディッシュに、細胞数２×１０6ｃｅｌｌｓのマウスメラノーマＢ１６細胞及びサルの腎臓由来であるベロ細胞をそれぞれ７ｍｌの１０％  ＦＢＳ、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）及び０．１から５０μＭのフモニシンＢ１含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）に懸濁して播き、ＣＯ2インキュベーターの中で３７℃にて４８時間、前培養を行った。
【００２２】
前培養後、終濃度５０μＭのドデシル−βラクトシド、１％のＩＴＳ−Ｘサプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）、前培養時と同濃度のフモニシンＢ１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ2インキュベーターの中で３７℃にて４８時間培養し、糖鎖伸長反応を行った。糖鎖伸長反応後、培地を回収し、更にディッシュ表面を１．５ｍｌのＰＢＳで洗浄することにより、培地上清全量を回収した。回収した培地上清中に含まれる糖鎖化合物については、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて精製し、培地画分の脂質抽出物を得た。
【００２３】
培地上清を回収した後のディッシュに、２ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した後、２ｍｌの０．２５％のＥＤＴＡを含むＰＢＳを加え、３７℃にて１０分間インキュベートすることで細胞を剥離させ回収した。回収した細胞は、２ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。
【００２４】
回収した細胞に、1ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）を加え懸濁した後、３０分間超音波処理した。その後、遠心分離処理（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）し、上清を回収し上清１を得た。更に、残ったペレットに、1ｍｌのクロロホルム／２−プロパノール／水（７：１１：２）を加え懸濁した後、３０分間超音波処理した。その後、遠心分離処理（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）し、上清を回収し上清２を得た。上清１と上清２を合わせ、遠心式エバポレーターで乾燥させ、細胞画分の脂質抽出物を得た。
【００２５】
上記の操作により得られた、培地画分及び細胞画分の脂質抽出物を５０μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣ分析した結果を図１に示す。また、デンシトグラム化し、内在性のＧＭ３と、糖鎖プライマー由来の糖鎖伸長産物であるＧＭ３型糖鎖化合物を定量した結果を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】細胞へのフモニシンB1の添加による糖脂質化合物の合成量への影響についてHPTLCにて分析した結果を示す。
【図２】細胞への各種濃度のフモニシンB1添加時における、糖脂質化合物の合成量を示す。
【図１】
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【図２】
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