(57)【要約】【課題】少ない量の消光剤で電気化学発光剤の励起を阻害することにより、ＤＮＡとのハイブリに影響を与えない標識剤を提供する【解決手段】電気化学発光標識と電気化学発光消光部分を直鎖構造にすることによって、効率良く電気化学発光剤の励起を阻害し、ＤＮＡのハイブリに影響を与えない標識剤を提供することが可能となる。このときに、電気化学発光標識と電気化学発光消光部分が、距離によって発光量が異なるように構成する。また、この電気化学発光消光部分が、フェノール基、キノン基、ベンゼンカルボン酸基、及びフェロセン基からなる群から選択される少なくとも一の基を含む直鎖化合物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気化学発光物質と電気化学発光消光部分とが下記の化学式（化１）を満足する直鎖化合物。
【化１】
2009040721.tif 000007
【請求項２】
前記電気化学発光標識と前記電気化学発光消光部分との距離に応じて発光量が異なる請求項１に記載の直鎖化合物。
【請求項３】
前記電気化学発光消光部分が、フェノール基、キノン基、ベンゼンカルボン酸基、及びフェロセン基からなる群から選択される少なくとも一の基を含む請求項１に記載の直鎖化合物。
【請求項４】
前記電気化学発光標識がルテニウムを含む請求項１に記載の直鎖化合物。
【請求項５】
前記電気化学発光標識がオスミウムを含む請求項１に記載の直鎖化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定の物質を、電気化学発光標識及び電気化学発光消光剤を用いて測定する標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来生化学アッセイに用いられる光の測定法には、吸光・蛍光法や発光法等がある。この内発光法による測定は、高感度に測定が可能であることが知られている。この内電気エネルギーによって励起され発光する現象を、電気化学発光と呼ぶ。電気化学発光する物質としてルテニウム錯体やオスミウム錯体が挙げられる。
【０００３】
電気化学発光の反応は、例えば電気化学発光を示す代表的な物質にルテニウムビピリジル錯体（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）2+ がある。電気化学発光の作用機序は、電極上でトリプロピルアミン等によりラジカルを発生させ、ルテニウムビピリジル錯体に電子を渡し、励起状態（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）３＋となり、基底状態（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）２＋に戻る時に発光を生じる（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）。
【０００４】
この様に電気化学発光は、電気化学エネルギーにより発光種を励起し、その励起状態が放射失括する際に可視光線を放出する。発光種の励起には電気化学エネルギーを利用するため、吸光法や蛍光法に比べバックグランドノイズを減らすことが可能である。このため、電気化学発光法は、吸光法や蛍光法よりも高感度に測定が可能となる。電気化学発光による測定は、ＤＮＡ等の核酸測定や、抗原や抗体の測定として種々のアッセイに利用されつつある（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
また、アントラセンのような蛍光化合物を使用して電気化学発光を増大させ検出限界を向上させる方法や、電気化学発光物質を励起させるラジカル剤を阻害させる物質（例えば、フリーラジカルスカベンジャー）を溶液に添加することによって、電気化学発光を消光させる方法等が報告されている（例えば、特許文献２参照）。消光を用いて測定する方法は、目的物質が多く存在すると消光し、目的物質が少量の場合に発光する性質を用いる。
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，７６，５３７９−５３８６
【非特許文献２】Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２００４，１０４，３００３−３０３６
【特許文献１】特表平５−１９９８９８号公報
【特許文献２】特表２０００−５１７０５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の構成では、電気化学発光を消光させる場合にフェロセン等の消光剤が大量に必要となる。このフェロセンが大量に有ると、ＤＮＡ−ＤＮＡのハイブリを検出する場合には、フェロセンと測定すべきＤＮＡとが結合してＤＮＡのハイブリ検出が出来ないという課題を有していた。
【０００７】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、少ない量の消光剤で電気化学発光剤の励起を阻害することにより、ＤＮＡとのハイブリに影響を与えない標識剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は前記課題を解決するため、本発明の電気化学発光標識を持つ直鎖化合物は、電気化学発光物質と電気化学発光消光部分とが下記の化学式（化１）を満足する直鎖化合物であることを特徴とする。
【０００９】
【化１】
2009040721.tif 000002
【発明の効果】
【００１０】
本発明の電気化学発光標識を持つ直鎖化合物によれば、電気化学発光標識と電気化学発光消光部分を直鎖構造にすることによって、効率良く電気化学発光剤の励起を阻害し、ＤＮＡのハイブリに影響を与えない標識剤を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の免疫測定装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
（実施の形態1）
まず、本発明の電気化学発光標識と電気化学発光消光部分の合成した直鎖物化合物の製造方法を説明する。
【００１２】
標識剤は、以下のようにして得る。まず、ＴＨＦ６０．０ｍＬに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２７．０ｍｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１．１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、冷却しながら撹拌させた。
【００１３】
この容器に、先程の反応液をゆっくり滴下させて２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ａを得た（収率４７％）。窒素雰囲気の容器に、前記生成物Ａ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）、及びジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。
【００１４】
反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬで蒸留水洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｂを得た（収率６１・５％）。塩化ルテニウム（III）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｃを得た（収率６８．２％）。窒素置換した容器に、前記生成物Ｂ０．５０ｇ（１．３５ｍｍｏｌ）、前記生成物Ｃ０．７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ）、及びエタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。
【００１５】
この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｄを得た（収率８１．６％）。さらに、前記生成物Ｄ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）、及びメタノール７０．０ｍＬを１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍｏｌ）を加え再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去した。
【００１６】
次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を一晩冷蔵し、不純物を自然ろ過で除去した。これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｅを得た（収率７１．４％）。アルミホイルで遮光した容器に、前記生成物Ｅ０．６５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル１０ｍＬに溶解させた。次に、トリエチルアミン０．２３ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）を加えた後、アセトニトリル２０ｍＬに溶解したグルタル酸無水物０．８７ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。９時間反応後、エバポレーターでアセトニトリルを留去して得た粗生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、下記化学式（化２）に示す電気化学的に活性である物質を得た（収率８７．５％）。
【００１７】
【化２】
2009040721.tif 000003
【００１８】
表１は、前述のようにして得た化学式（化２）に示す物質の1Ｈ‐ＮＭＲ結果である。
【００１９】
【表１】
2009040721.tif 000004
【００２０】
表１のＮＭＲの結果より、化学式（化２）に示す化合物が得られたことが分かる。続に、標識剤（化２）と消光剤との結合の方法を示す。まず、消光剤であるフェロセン酢酸２８３μｇ（２９．７ｐｍｏｌ）を蒸留水０．２ｍＬに溶解させ、１ｍＭに調製した（化１）の水溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．３ｍｇ（２．６μｍｏｌ）、ＷＳＣ５．１ｍｇ（２６．７μｍｏｌ）、０．１Ｍトリエチルアミン０．９μＬ（９０．０ｐｍｏｌ）を添加して室温にて２日間反応させた。反応物を、ＨＰＬＣで精製後、目的物のフラクションを採取した。このフラクション溶液を留去して標識剤と消光剤が直接結合した（化３）を得た（収率４９．８％）。
【００２１】
【化３】
2009040721.tif 000005
【００２２】
表２は、前述のようにして得た化学式（化３）に示す物質の1Ｈ‐ＮＭＲ結果である。
【００２３】
【表２】
2009040721.tif 000006
【００２４】
表２のＮＭＲの結果より、化学式（化３）に示す化合物が得られたことが分かる。次に得られた（化３）に示す化合物による発光物質の消光効果を確認した。
【００２５】
電気化学発光の測定には、次のような方法を用いた。図1に測定用に用いた測定プレートの金電極を示す。この金電極は、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで準備した。さらに、電極表面をピラニア溶液（過酸化水素：濃硫酸＝１：３）で1分間洗浄し、純水ですすいだ後、窒素ブローで乾燥させた。
【００２６】
この金電極の作用極に（化３）を５μＬ滴下（最終濃度：１Ｅ−７  Ｍ）し、６０度中で５分静置させ、乾燥させた後、作用極に電解液をそれぞれ７５μＬ滴下した。その後、電圧を印加し、この時に生じた電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、３秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧掃印中における最大発光量を測定した。電解液の組成はリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ｐＨ７．４）に０．１Ｍのトリエチルアミンを溶解させたものを使用した。
【００２７】
本実施例では金電極を用いたが、特に限定されず、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属や、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭化物や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物や、Ｓｉ、Ｇｅ、 ＺｎＯ、 ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体等が挙げられる。この電極に、（化３）を滴下し固定させる。固定化手法は特に限定されず、電極上で乾燥させる手法や、電極上に導電性のある樹脂をコーティングし、その樹脂と物理吸着させる手法、カチオン若しくはアニオン性の樹脂を電極に塗布し、静電的に吸着させる手法、電極に正若しくは負電荷を帯びさせて、電気的に吸引させる手法等が挙げられる。また、前記電気化学活性物質由来の電気化学的な信号は、添加する種類により異なるが、酸化還元電流を生じる電気化学活性物質を用いた場合には、ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、電気化学発光を生じる電気化学活性物質を用いた場合には、フォトマルチプライヤー等を用いて計測が可能である。
【００２８】
図１に本発明で用いられる電極を示す。電極の形成方法及びその材料は、該構造を構成でき、且つ電気化学的検出に適用できるものであれば限定されるものではないが、例えば、ステンレス鉄線全般、純ニッケル、モネルメタル、チタニウム、銅、真鍮、アルミニウム及び同合金線、鉄線、亜鉛めっき鉄線などで作製されたメッシュ金網や、該メッシュ金網を金、白金、ニッケル、パラジウム、ロジウム、銅、銀、クロム、亜鉛、錫、半田、鉛などのメッキが可能な単一金属やこれらの合金で被覆するのでもよい。また、電鋳法により作製することも可能であり、例えば金、ニッケル、銅、鉄、銀、コバルト、亜鉛などの単一金属やそれらの組み合わせでもよい。また被覆の方法としては他に、真空蒸着法または浸漬法なども挙げられる。
【００２９】
以上説明した金電極を持つ測定プレートを用いて、上記の方法により次の５種類の物質の最大発光強度（ＲＬＵ）を測定した。
（１）Ｒｕ錯体からなら従来の標識剤。
（２）フェロセン酢酸単体。
（３）本発明の（化３）で示される直鎖化合物。
（４）（化３）で示される直鎖化合物とフェロセン酢酸との混合比を１：１とした混合物      。
（５）（化３）で示される直鎖化合物とフェロセン酢酸との混合比を１：１０とした混合      物。
【００３０】
結果を図２に示す。（１）のＲｕ錯体単体（最終濃度：１Ｅ−７  Ｍ）の最大発光量と比較すると、（２）の本発明の（化３）で示される直鎖化合物（最終濃度：１Ｅ−７  Ｍ）の最大発光量は、約１／３となり、消光効果が高いことを示している。また、（４）および（５）で示した（化３）で示される直鎖化合物とフェロセン酢酸との混合物においても（３）と同程度の最大発光量となっている。これは、Ｒｕの電気化学発光の阻害が、本発明の（化３）で示される直鎖化合物によるもので、溶液中に存在する遊離フェロセンによるものではないことを示している。
【００３１】
次にＲｕ錯体とフェロセン酢酸との混合比を変えた次の５種類の溶液を用意して、先と同様に最大発光強度（ＲＬＵ）を測定した。
（１）Ｒｕ  最終濃度：１Ｅ−７  Ｍ、フェロセン酢酸
（２）Ｒｕ  最終濃度：１Ｅ−６  Ｍ、フェロセン酢酸
（３）Ｒｕ  最終濃度：１Ｅ−５  Ｍ、フェロセン酢酸
（４）Ｒｕ  最終濃度：１Ｅ−４  Ｍ、フェロセン酢酸
（５）Ｒｕ  最終濃度：１Ｅ−３  Ｍ、フェロセン酢酸
結果を図３に示す。フェロセン酢酸の濃度が高くなるにつれ、最大発光量が減少する傾向にある。図２の結果と比較すると、（化３）の濃度（最終濃度：１Ｅ−７  Ｍ）と同等の消光作用を示すフェロセン酢酸の濃度は１Ｅ−５Ｍとなる。従って、本発明の直鎖化合物を用いれば、消去剤を約１／１００に減らすことが可能である。このため、本発明を利用するとＤＮＡのハイブリに影響を与えない標識剤を提供することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明にかかる電気化学発光物質とラジカル消去物質とを直鎖化合物とする（化３）は、ＤＮＡハイブリに影響を与えない標識剤を提供することが可能となり、特定の配列を有する遺伝子を高感度に検出することができ、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】電気化学発光の測定に利用した電極図
【図２】発光強度と発光阻害剤との関係を示す図
【図３】Ｒｕ錯体と濃度を変えたフェロセン酢酸とを反応させた際の発光強度を示す図
【図１】
2009040721.tif 000008
【図２】
2009040721.tif 000009
【図３】
2009040721.tif 000010