(57)【要約】【課題】異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法を新たに開発することを課題とする。【解決手段】液胞輸送異常変異株の中から、ＶＰＳ（ｖａｃｕｏｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ）関連遺伝子欠損（破壊）株であって、親株よりも異種タンパクの分泌生産量の高い株（例えば、ｖｐｓ３、ｖｐｓ２８、ｖｐｓ３２、ｖｐｓ４５、ｖｐｓ６６欠損株）を選抜することにより、異種タンパク質分泌高生産株を選抜する。選抜された株は、異種タンパク質を高分泌発現する宿主微生物として利用することができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液胞輸送異常株の中から親株よりも異種タンパク質の分泌生産量の高い株を選抜することにより、異種タンパク質分泌高生産株を選抜すること、を特徴とする異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法。
【請求項２】
液胞輸送異常株の中から、ＶＰＳ遺伝子破壊株であって且つ親株よりも異種タンパク質の分泌生産量の高い株を選抜することにより、異種タンパク質分泌高生産株を選抜すること、を特徴とする異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法。
【請求項３】
ＶＰＳ遺伝子が、ＶＰＳ３、ＶＰＳ２８、ＶＰＳ３２、ＶＰＳ４５、ＶＰＳ６６遺伝子の少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１又は２に記載の異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法。
【請求項４】
液胞輸送異常株が酵母であること、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法。
【請求項５】
酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であること、を特徴とする請求項４に記載の異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法。
【請求項６】
異種タンパク質遺伝子を導入した選抜対象株検体すべてを同一の培養条件で培養し、得られた培養液を分離してその活性を正確に測定することにより異種タンパク質の生産量を正確に評価すること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって異種タンパク質分泌高生産株を選抜し、得られた異種タンパク質分泌高生産株を宿主微生物として利用すること、を特徴とする異種タンパク質を分泌高生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法に関するものであり、更に詳細には、異種タンパク質を高分泌発現することができる宿主微生物の選抜方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は生命活動の根本を担う生体物質であり、生物が生産する触媒としてのさまざまな機能を有する。微生物はそれ自体さまざまなタンパク質を生産するが、また、遺伝子操作技術が発達した現在では本来生産することができない宿主微生物から異種タンパク質の生産が可能となった。しかしながら、いつの場合でも異種タンパク質の生産が成功するわけではなく、遺伝子を導入したにもかかわらずまったく生産しない場合や、生産したとしても非常に少量である場合が少なくない。これら分泌生産するタンパク量を増加させる戦略はいろいろと検証されてきたが、すべての場合において有効な方法は存在せず、さまざまな手法が新規に開発されている。
【０００３】
異種タンパク質高生産戦略としては、これまでにもいくつかの方法が提案されているが、多くは「発現させるタンパク質の遺伝子やベクターの改変」が主で、強力プロモータの利用、分泌シグナル配列の改変、レアコドンの解消、５’もしくは３’ＵＴＲの改変などが行われている。
【０００４】
さらに、「高生産条件の検討」もさまざまに行われており、これは異種タンパク質に限らず、通常の本来のタンパク質（酵素）の生産を行う場合にも行われている。
【０００５】
本発明は、分泌発現量の向上を目指した宿主（酵母）に関するものであるが、これまでに異種タンパク質高生産戦略として宿主の開発はあまり行われていない。ましてや、関連遺伝子をはじめて見出し、しかもこのようにして見出した特定の遺伝子を変異させることなくそのまま利用するのではなく、それとは全く逆に、遺伝子を破壊、欠損させた変異遺伝子に着目して、宿主としての適正株を選抜するのに成功したのは本発明がはじめてである。
【非特許文献１】バイオテクノロジー事典、１９８６年１０月９日、株式会社  シーエムシー発行、第９７６〜９７７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、異種タンパク質高生産戦略のひとつとして、従来あまり行われたことのない分泌発現量の向上を目指した宿主を開発することを目的とし、特にこのような宿主開発の重要な１工程をなす、異種タンパク質分泌高生産株の選抜方法を新たに開発することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
既述のように、異種タンパク質高生産戦略として宿主の開発はあまり行われていないが、これまで知られている手法では、変異処理による育種・スクリーニングが主たる戦略であり、これはかなりの数の変異ライブラリよりスクリーニングを行う方法で、ライブラリの大きさや変異の程度など不確定な要素の中から目的にあった菌株を選択する方法である。これらは、結局はある一遺伝子の変異に帰結する場合が多いが、そのために確認する変異菌株数は、自身が持つ遺伝子の数よりもはるかに多く、数万から数十万の株をスクリーニングするものである。
【０００８】
また、ある特定遺伝子をターゲットに遺伝子破壊による菌株の育種では、生産されたタンパク質の分解を抑えるために特定のプロテアーゼを破壊するといった方法も行われている。しかしながら、宿主の開発については、あまり有効な手段が見出されていない。
【０００９】
このように宿主開発の困難性に鑑み、本発明者らは、発想の転換の必要性を感じ、従来低い評価しか得られなかった遺伝子利用技術にあえて着目した。そして、広範囲な検討を行った。
【００１０】
そして、本発明者らは、研究が進んでいる酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に改めて着目した。酵母サッカロマイセス・セレビシエの全遺伝子配列が明らかになって以来、それぞれの遺伝子の個別の破壊より個々の遺伝子の機能を調べることが可能となった。現在では、酵母サッカロマイセス・セレビシエにおいて非必須遺伝子として約６０００の遺伝子の破壊が可能であることがわかっている。
【００１１】
また、これまでに遺伝子の破壊によって、異種タンパク質の分泌生産量が向上したとの報告があるが、それらはプロテアーゼなど分泌生産されたタンパク質の分解にかかわる直接的な変異によって異種タンパク質の生産性を向上させたものである。しかしながら、この方法は、菌体内での異種タンパク質を分泌生産する方法ではなく、したがって、この方法では目的とする宿主を得ることは困難である。
【００１２】
そこで、本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意広範な検討の結果、莫大な数の遺伝子の中から、遺伝子破壊により、液胞へのタンパク質輸送が異常となる遺伝子である、ＶＰＳ（ｖａｃｕｏｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ）関連遺伝子（ＶＰＳ遺伝子ということもある）に着目した。
【００１３】
そして、ＶＰＳ関連遺伝子が欠損ないし破壊した菌株は液胞輸送に異常をきたすことが当然に予測されるため、液胞輸送異常菌株は菌体外にタンパク質を分泌する能力が本来の菌株に比べ優れているのではないかとの仮説をたてた。
【００１４】
そこで、この仮説のもと、本発明者らは、酵母非必須遺伝子破壊ライブラリより、これまで報告のあるすべての液胞輸送異常変異株について、異種タンパク質の分泌生産能力を調べ、確かに液胞異常変異株が本来の菌株と比べ著しく異種タンパク質の分泌生産量が向上していることをはじめて確認した。そして、更に研究した結果、液胞異常変異株の内、特にＶＰＳ３、ＶＰＳ２８、ＶＰＳ３２、ＶＰＳ４５、ＶＰＳ６６遺伝子を破壊（欠損）した株、すなわち、ＶＰＳ遺伝子破壊株（ｖｐｓ３、ｖｐｓ２８、ｖｐｓ３２、ｖｐｓ４５、ｖｐｓ６６の各遺伝子破壊株）が著しく高い異種タンパク質の分泌生産能を有していることもはじめて見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
これらの遺伝子（ＶＰＳ３、ＶＰＳ２８、ＶＰＳ３２、ＶＰＳ４５、ＶＰＳ６６）を破壊ないし欠損することにより、異種タンパク質の分泌生産能が著しく向上し、これらＶＰＳ遺伝子破壊株が異種タンパク質分泌高生産株となり得ること、そして、卓越した宿主となり得ることは、今回、本発明者らによってはじめて見出されたものである。
【００１６】
本発明は、上記した有用新知見に基づき更に研究の結果遂に完成されたものであって、その態様は次のとおりである。
【００１７】
（１）液胞輸送異常株（液胞へのタンパク質輸送異常を示す株）より異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法であって、液胞輸送異常株の中から親株よりも異種タンパク質の分泌生産量の高い株を選抜することにより、異種タンパク質分泌高生産株を選抜すること、を特徴とする異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法。
（２）液胞輸送異常株の中から、ＶＰＳ遺伝子破壊株（液胞輸送異常を示す株について、その原因遺伝子がＶＰＳ遺伝子とされており、これらの内の特定の遺伝子をターゲットとして破壊した株）であって且つ親株よりも異種タンパク質の分泌生産量の高い株を選抜することにより、異種タンパク質分泌高生産株を選抜すること、を特徴とする異種タンパク質分泌高生産株を選抜、選択する方法。
（３）変異遺伝子がＶＰＳ遺伝子であり、特に、ＶＰＳ遺伝子が、ＶＰＳ３、ＶＰＳ２８、ＶＰＳ３２、ＶＰＳ４５、ＶＰＳ６６遺伝子の少なくともひとつであること、を特徴とする上記（１）又は（２）に記載の異種タンパク質分泌高生産株を選抜、選択する方法。
【００１８】
（４）液胞輸送異常株が酵母であること、を特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法。
（５）酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であること、を特徴とする上記（４）に記載の異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法。
【００１９】
（６）異種タンパク質遺伝子を導入した選抜対象株検体すべてを同一の培養条件（同一の培地、培養温度、培養時間）で培養し、得られた培養液を分離してその活性を正確に測定する（例えば、酵素活性）ことにより、異種タンパク質の生産量を正確に評価すること（例えば、酵素活性／菌体密度）、を特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の異種タンパク質高分泌高生産株を選抜する方法。
【００２０】
（７）上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法によって異種タンパク質分泌高生産株を選抜し、得られた異種タンパク質分泌高生産株を宿主微生物として利用すること、を特徴とする異種タンパク質を分泌高生産する方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、きわめて効率的且つ正確に、異種タンパク質分泌高生産株を選抜、選択することができる。選抜方法としては、ＶＰＳ関連遺伝子の破壊、欠損等の変異を指標として行うものである。
【００２２】
例えば、液胞輸送異常株の中からＶＰＳ関連遺伝子破壊及び／又は欠損株を選抜する方法（天然に存在する変異株を選抜する方法）、ＶＰＳ関連遺伝子を積極的にないし人工的に破壊及び／又は欠損する方法（遺伝子破壊カセットやＵＲＡ３マーカーを利用する等遺伝子破壊及び／又は欠損に常用される常法）、換言すれば、人工的、積極的に、遺伝子操作により変異させ、得られた人工変異株を選択する方法を例示することができる。
【００２３】
このようにして選抜した異種タンパク質分泌高生産株は宿主微生物として利用することができるので、本発明は、宿主微生物の選抜方法ないしその製造方法（育種方法）ということもでき、すぐれた宿主微生物自体を提供できるものである。
【００２４】
また、本発明によれば、このようにして宿主を選抜、分離した後、この宿主菌に目的とする異種タンパク質遺伝子を導入し、得られた形質転換体を培養することにより、該遺伝子を高発現せしめて、目的とする異種タンパク質を細胞外に高分泌、高生産させることができる。したがって、本発明は、異種タンパク質の高分泌方法及び／又は高生産方法も提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明を実施するには、酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ非必須遺伝子破壊株ライブラリを利用し、ＶＰＳ遺伝子破壊株（液胞輸送異常株）から異種タンパク質高分泌生産株のスクリーニングを行う。酵母非必須遺伝子破壊株ライブラリ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社より市販）は、酵母の約６０００個の非必須遺伝子（１つを破壊しても生存できる遺伝子）をシステマティックに破壊した酵母株セットからなるライブラリであり、天然に遺伝子が破壊されているものを集めてライブラリ化したものではない。本発明において、ＶＰＳ遺伝子破壊株としては、各種ＶＰＳ遺伝子を破壊した株であればいずれもが使用可能であるが、例えば、ＶＰＳ３遺伝子破壊株、ＶＰＳ２８遺伝子破壊株、ＶＰＳ３２遺伝子破壊株、ＶＰＳ４５遺伝子破壊株、ＶＰＳ６６遺伝子破壊株の少なくともひとつが使用できる。
【００２６】
具体的には、例えば、酵母の破壊株ライブラリの親株であるＢＹ４７４２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４２：Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社より入手）で利用できるマーカー遺伝子（例えば、ＬＥＵ２）を持った発現用プラスミドを作成し、それに酵素遺伝子（例えば、タカアミラーゼ遺伝子：ＥＭＢＬ（欧州分子生物学研究所）ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ１２７２５、Ｘ１２７２６、Ｘ１２７２７）を組み込んだプラスミドを作成しておき、このプラスミドを用いて検体菌株について形質転換を行う。そして、それぞれの形質転換株における酵素（例えば、タカアミラーゼ）の分泌生産量の比較を行う。
【００２７】
菌体外へ分泌された異種タンパク質の生産量を正確に評価するには、さまざまな方法があるが、それぞれの遺伝子変異体の培養液を分離しその活性を正確に測定することで分泌タンパク質である酵素を正確に定量できる。また、その分泌量は経時的に変化するものであり、正確な培養時間において正確な測定を行う必要がある。発明者らは液胞輸送異常変異株について網羅的かつ、これら詳細な分泌酵素の定量を行うことによって本来の菌株と比べ著しくタンパク質分泌生産量の高い菌株を見出す方法を発見するに至ったのである。
【００２８】
異種タンパク質の生産量を正確に評価するには、例えば、検体すべてを同一の培養条件（同一の、培地、培養温度、培養時間）で培養し、得られた培養液を分離してその活性（例えば酵素活性）を正確に測定する。そして、例えば、酵素活性（Ｕ）／菌体密度（ＯＤ値）により、異種タンパク質の生産量を正確に評価することができる。
【００２９】
上記した方法により、ＶＰＳ関連遺伝子欠損株についてスクリーニングを行った結果、これらの内、特に、ＶＰＳ３、ＶＰＳ２８、ＶＰＳ３２、ＶＰＳ４５、ＶＰＳ６６欠損株が高い分泌量を示すことを確認し、目的とする異種タンパク質分泌高生産株がこれらの菌株であることをはじめて確認し、あわせて、異種タンパク質分泌高生産に関与する遺伝子が、特に、ｖｐｓ３、ｖｐｓ２８、ｖｐｓ３２、ｖｐｓ４５、ｖｐｓ６６であり、しかも、これらが存在するのではなくそれとは全く逆にこれら特定の遺伝子が欠損ないし破壊された場合に分泌生産能が向上することをはじめて見出したものである。
【００３０】
なお、これらの遺伝子（例えば、ＶＰＳ３、ＶＰＳ２８、ＶＰＳ３２、ＶＰＳ４５、ＶＰＳ６６）については、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅに記載されてはいるが、これまでの知見からでは、何故これらの遺伝子のそれぞれの破壊によって分泌生産能が向上するのか、また、他のＶＰＳ遺伝子との相違は何かなど、現時点においては、分泌生産能力が向上の理由、そのメカニズムは何も明らかになっていない。現時点においては、これらの遺伝子が得られたという以上の高分泌との関わりはわかっておらず、したがって、本発明は、新規性はもとより進歩性に関する要件も充分に具備しているものである。すなわち、本発明の特許性を従来技術から否定することはできないのである。
【００３１】
以上、該特定のＶＰＳ関連遺伝子がもともと破壊及び／又は欠損している場合について述べたが、これとは逆に、該特定のＶＰＳ関連遺伝子を外部からないし人工的に破壊及び／又は欠損させる場合も本発明に包含される。
【００３２】
この場合、該特定のＶＰＳ関連遺伝子を含有する菌株を親株とし、遺伝子破壊カセット（市販品も使用可）を利用したり、ＵＲＡ３マーカー等を利用するといった、遺伝子破壊ないし欠損の常法にしたがって、親株中の該ＶＰＳ関連遺伝子を破壊及び／又は欠損させてもよい。これらの処理はひとつの遺伝子に対して行うほか、他の遺伝子に対して行うことも可能であって、二重破壊株、三重破壊株、あるいはそれ以上の破壊株の作成も可能である。この破壊（欠損）操作は、天然の欠損株に対して行うことも可能である。
【００３３】
なお、本発明において、遺伝子の破壊及び／又は欠損とは、遺伝子の一部を欠損したり、置換したりするほか、全体を欠損したりする等、遺伝子を機能させないことをすべて指すものである。なお、本明細書において、遺伝子破壊及び／又は欠損を遺伝子破壊ということにする。
【００３４】
このようにして選抜した異種タンパク質分泌高生産株は宿主として使用するのに好適であって、目的とする異種タンパク質遺伝子を導入したプラスミドで形質転換し、得られた形質転換体を培養する等、遺伝子操作における常法によって処理することにより、異種タンパク質遺伝子を高発現させて、目的とする異種タンパク質を菌体外に分泌高生産させることができる。
【００３５】
本発明によれば、親株に比して、１．５倍〜２倍〜１０倍もの分泌生産能力が得られ、１５倍あるいはそれ以上の分泌生産能力も期待できる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の非必須遺伝子破壊株ライブラリ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社より入手）より、親株であるＢＹ４７４２株及び液胞輸送異常株（ｖｐｓ欠損株）を選び出した。
【００３８】
一方、プラスミドｐＧ−１（酵母における汎用プラスミド）をベースとし、酵母の破壊ライブラリの親株であるＢＹ４７４２で利用できるマーカー遺伝子（ＬＥＵ２）を持った酵母発現用プラスミドｐＧ−１（ＬＥＵ２）を作成した。このｐＧ−１（ＬＥＵ２）プラスミドのＢａｍＨＩサイトにタカアミラーゼ遺伝子ＴＡＡを組み込んだＴＡＡ−ｐＧ−１（ＬＥＵ２）を作成した（図１）。
【００３９】
続いて、そのプラスミドを用いて常法に従って親株及び液胞輸送異常株（ｖｐｓ株）を形質転換した。ＶＰＳ関連遺伝子はＶＰＳ１〜７５の合計６１遺伝子が同定されており、その中にはＯＲＦ自体が怪しいと判断されている株がＶＰＳ６１、６３、６５、６９の４株ある。それら４株を除いたＶＰＳ関連遺伝子欠損株５７株について、すべてに異種タンパク質であるタカアミラーゼ遺伝子を導入し、培養液のタカアミラーゼ活性を測定し、それぞれの株においてのタカアミラーゼの分泌生産量の比較を行った。
【００４０】
本培養は、ＹＰＤ培地（１％イーストエキストラクト、２％ポリペプトン、２％Ｄ−グルコース）５ｍＬ、３０℃の条件下で行い、前培養液を加えＯＤ660＝０．１でスタート、培養にはＬ字管を用いた。開始３日後の培地中のアミラーゼ活性をＯＤ660（菌体密度）で割った値で評価した。その値はすなわち酵母あたりの分泌生産能力を示す。
【００４１】
ＶＰＳ遺伝子破壊株（ＢＹ４７４２）５７株および親株において分泌生産されたアミラーゼ活性の比較の結果、ｖｐｓ３、ｖｐｓ２８、ｖｐｓ４５、ｖｐｓ６６各破壊株については親株であるＢＹ４７４２と比べ大きく分泌レベルが高くなっていることが確認できた（図２）。
【００４２】
（実施例２）
ＢＹ４７４２を親株とした非必須遺伝子破壊株ライブラリを利用したスクリーニングの結果、ｖｐｓ３、ｖｐｓ２８、ｖｐｓ４５、ｖｐｓ６６各破壊株について分泌生産量の増加が確認できた。そこで、酵母親株をＹＰＨ４９９（サッカロマイセス・セレビシエ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９：ＡＴＣＣより入手可能、ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ：２０４６７９）に換え、さらにＶＰＳ３、ＶＰＳ２８、ＶＰＳ４５、ＶＰＳ６６についてＫａｎＭＸ遺伝子破壊カセット（非必須遺伝子破壊株ライブラリ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社より市販）よりＰＣＲにて作成）を利用した遺伝子破壊株を新たに作成し、タカアミラーゼの分泌生産能力の比較を行った。
【００４３】
培養条件は、ＹＰＤ培地５ｍｌ、３０℃。培養にはＬ字管を用いた。３日目のアミラーゼ活性及びＯＤ660を測定した。
【００４４】
菌体量当たりのタカアミラーゼ分泌生産量を示す、培養中の活性を濁度（ＯＤ660）で割った値で分泌生産量を評価すると、ｖｐｓ３、ｖｐｓ２８、ｖｐｓ４５、ｖｐｓ６６各破壊株のどれも親株（ＹＰＨ４９９）よりも高い値を示し、これら遺伝子破壊によって酵母の分泌生産能力が向上していることがわかる（図３）。特に、ｖｐｓ４５破壊株については、親株と比べ約２倍の分泌生産能力が示された。
【００４５】
（実施例３）
スクリーニング試験で使用したＢＹ４７４２株につき親株およびＶＰＳ３、ＶＰＳ２８、ＶＰＳ４５、ＶＰＳ６６各破壊株の分泌生産能力も同様に詳細な検討を行った。
【００４６】
培養条件は、ＹＰＤ培地５ｍｌ、３０℃。培養にはＬ字管を用いた。３日目のアミラーゼ活性及びＯＤ660を測定した。
【００４７】
培養中の活性を濁度（ＯＤ660）で割った値で、菌体量当たりのタカアミラーゼ分泌生産量を比較すると、ｖｐｓ３、ｖｐｓ２８、ｖｐｓ４５、ｖｐｓ６６各破壊株はどれも親株（ＢＹ４７４２）よりも高い値を示し、これら遺伝子破壊によって酵母の分泌生産能力が向上していることがわかる。特に、ｖｐｓ６６については、親株と比べ約１０倍の分泌生産能力が示された（図４）。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ＢＹ４７４２で利用できるマーカー遺伝子（ＬＥＵ２）を持った酵母発現用プラスミドに、タカアミラーゼ遺伝子を組み込んだＴＡＡ−ｐＧ−１（ＬＥＵ）の構築図である。
【図２】異種タンパク質（タカアミラーゼ）高分泌生産株のスクリーニングＶＰＳ遺伝子破壊株（ＢＹ４７４２）５７株において分泌生産されたアミラーゼ活性の比較図である。図中、△は遺伝子破壊株を示す（以下同じ）。
【図３】ｖｐｓ３、ｖｐｓ２８、ｖｐｓ４５、ｖｐｓ６６各破壊株について異種タンパク質（タカアミラーゼ）分泌生産能力の検討（ＹＰＨ４９９株（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））した図である。
【図４】ｖｐｓ３、ｖｐｓ２８、ｖｐｓ４５、ｖｐｓ６６各破壊株について異種タンパク質（タカアミラーゼ）分泌生産能力を検討（ＢＹ４７４２株（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））した図である。
【図１】
2009060797.tif 000002
【図２】
2009060797.tif 000003
【図３】
2009060797.tif 000004
【図４】
2009060797.tif 000005