(57)【要約】【課題】動物に免疫することにより、従来の関節特異的抗原を用いたモデルや自己抗体誘導性のモデルに比べて、簡便に安定した関節炎を任意のタイミングで誘導することが可能な関節炎誘発原性を備えるペプチドの提供。【解決手段】以下に示すアミノ酸配列を含む関節炎誘発原性ペプチドを提供する。【化４】2009179621.tif 000010（ここで、「Ile」はイソロイシン、「Phe」はフェニルアラニン、「Glu」はグルタミン酸、「N」は任意のアミノ酸残基を示す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に示すアミノ酸配列を含む関節炎誘発原性ペプチド。
【化１】
2009179621.tif 000009
（ここで、「Ile」はイソロイシン、「Phe」はフェニルアラニン、「Glu」はグルタミン酸、「N」は任意のアミノ酸残基を示す。）
【請求項２】
配列番号１記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載の関節炎誘発原性ペプチド。
【請求項３】
配列番号２又は配列番号３記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項２記載の関節炎誘発原性ペプチド。
【請求項４】
請求項1記載の関節炎誘発原性ペプチドを非ヒト動物に免疫することにより、該動物に関節炎を誘導することを特徴とする関節炎誘導方法。
【請求項５】
請求項４記載の関節炎誘導方法によって作出される関節炎動物モデル。
【請求項６】
請求項５記載の関節炎動物モデルを用いて試験物質の関節炎に対する薬理効果を評価する薬理試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節炎誘発原性ペプチドに関する。より詳しくは、動物に免疫することで、簡便に安定した関節炎を任意のタイミングで誘導することができる関節炎誘発原性ペプチド、及びこれを用いた関節炎誘導方法と関節炎動物モデル、並びにこの関節炎動物モデルを用いた薬理試験方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（rheumatoid arthritis: RA）は、関節痛や関節腫脹を主徴とする炎症性の自己免疫疾患である。RAの罹患率は世界で約1〜3％とされており、我国においても100万人余の患者が存在しているが、その発症メカニズムについてはいまだ十分な解明がなされていない。
【０００３】
RAの治療は、関節破壊の進行を遅らせるための抗リウマチ薬を用いた内科療法が行われる。併せて、痛みを抑えるための非ステロイド系消炎鎮痛剤（NSAIDs）を用いた対症療法も行われている。しかし、これらの治療ではRAを根本的な治療は難しいため、生物学的製剤などの新規治療法が臨床レベルで施行されているが、疾患を根治するにはまだ不完全と言わざるを得ない。
【０００４】
RAの発症メカニズムを明らかにし、新たな治療法の確立を行うためには、RAの病態を適切に反映したモデル動物の開発が必要となる。関節炎モデル動物としては、これまでにも、関節特異的抗原を用いたモデルや自己抗体誘導性のモデルが報告されている。
【０００５】
関節特異的抗原を用いた動物モデルとしては、軟骨の成分であるII型コラーゲンをマウスやラットなどの動物に免疫することにより作出されるII型コラーゲン誘導関節炎モデルがある（非特許文献１参照）。II型コラーゲン誘導関節炎モデルは、現在でも最もスタンダードな関節炎モデルとして用いられている。この他、関節の細胞外マトリックスを構成するアグリカンの免疫によっても関節炎を誘導できることが知られている。
【０００６】
また、自己抗体誘導性の動物モデルとしては、K/BxNマウスが知られている（非特許文献2参照）。このマウスは、KRN-T細胞受容体（TCR）トランスジーンを導入したマウスと、自己免疫疾患モデルの1つであるNOD（Non obese Diabetic）マウスとの交配により、偶然見出されたものである。K/BxNマウスは、生後25〜35日というごく早い段階で慢性進行性の関節炎を発症する。
【０００７】
このK/BxNマウスに関連して、本発明者らは、K/BxNマウス血清の腹腔内投与によって正常マウスにも関節炎を誘導できること、また血清内の免疫グロブリン（IgG）分画のみの投与によっても同様に関節炎を誘導できることを見出し、K/BxNマウス血清中に関節炎誘発原性を有する自己抗体が存在している可能性を示した。そして、この関節炎誘発原性を有する抗体がglucose-6-phosphatase isomerase(GPI)に対する自己抗体であることを報告している（非特許文献3参照）。さらに、これまでにGPIタンパクそのものの免疫によっても正常マウスに関節炎を誘導でき、特にDBA/1マウスで顕著な誘導が可能であることが報告されている（非特許文献4参照）。
【０００８】
特許文献1には、患者の血漿又は血清のサンプル中における、GPIに対する自己抗体の存在の検出を含む関節炎の診断方法が開示されている。これは、上記非特許文献3に報告される知見に基づき、本発明者を含む発明者らによってなされた開示である。当該文献「請求項13」には、「GPIに対する抗体の注入あるいは関節炎のK/BxNトランスジェニックマウス由来の血清又はそのフラクションの注入によって誘導されている関節炎の動物」が記載されている。
【０００９】
また、当該文献「請求項8」には「関節炎の治療または予防のための、GPIまたは自己抗体と相互作用して該自己抗体を阻害し得るGPI様の部分を含むGPI様タンパク質の使用」が記載されている。さらに、「請求項11」には「GPIに対する免疫寛容を誘導して自己抗体の発生を防止するための、GPI、あるいは免疫刺激性のエピトープを構成するGPIの部分を含むか若しくは模倣する化合物の使用」が記載されている。なお、これらの記載はGPIタンパクの部分ペプチドを示唆するものであるが、これらの部分ペプチドは関節炎の治療や自己抗体の発生を防止するために用いられているものであり、関節炎誘導のために使用されるものではない。また、当該文献中において、GPIペプチドの具体的なアミノ酸配列の開示はなされていない。
【００１０】
【特許文献１】特表２００２−５４４４７４号公報
【非特許文献１】“Autoimmunity to type II collagen an experimental model of arthritis.” Journal of experimental medicine, 1977, 146:857-868
【非特許文献２】“Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity.” Cell, 1996, 87:811-822
【非特許文献３】“Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme.”Science, 1999, 286:1732-1735
【非特許文献４】“Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell-dependent peripheral polyarthritisin genetically unaltered mice.” Journal of Immunology, 2004, Vol.172, No.7, p.4503-4509
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のII型コラーゲンやアグリカンなどの関節特異的抗原を用いた関節炎モデルでは、従来、これらの関節特異的抗原を抽出蛋白質あるいはリコンビナント蛋白として調製する必要があり、不純物の混和や精製純度の問題があり、発現ベクターの構築や、大腸菌や昆虫細胞などのホスト細胞の培養、リコンビナント蛋白の抽出精製などの作業に大変な手間を必要としていた。また、抽出蛋白あるいはリコンビナント蛋白を高い純度で精製する必要があり、精製純度が低い場合には安定した関節炎を誘導できないという問題があった。
【００１２】
この点、自己抗体誘導性の動物モデルであるK/BxNマウスは、関節炎を自然発症するため、上述のような抗原調製のための手間は生じない。しかし、単一T細胞レセプター導入マウスであることや、生後25〜30日という比較的短期間で関節炎を発症するために必要なタイミングで関節炎の誘導を行うことができないという問題点があった。
【００１３】
そこで、本発明は、動物に免疫することにより、従来の関節特異的抗原を用いたモデルや自己抗体誘導性のモデルに比べて簡便に安定した関節炎を任意のタイミングで誘導することができる関節炎誘発原性ペプチドを提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題解決のため、本発明は、以下に示すアミノ酸配列を含む関節炎誘発原性ペプチドを提供する。
【００１５】
【化１】
2009179621.tif 000002
（ここで、「Ile」はイソロイシン、「Phe」はフェニルアラニン、「Glu」はグルタミン酸、「N」は任意のアミノ酸残基を示す。）
この関節炎誘発原性ペプチドは、より具体的には、配列番号１記載のアミノ酸配列を含むものであり、さらに具体的には配列番号２又は３記載のアミノ酸配列からなる。
【００１６】
また、本発明は、この関節炎誘発原性ペプチドを非ヒト動物に免疫することにより、該動物に関節炎を誘導することを特徴とする関節炎誘導方法と、この関節炎誘導方法によって作出される関節炎動物モデル、さらにこの関節炎動物モデルを用いて試験物質の関節炎に対する薬理効果を評価する薬理試験方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、動物に免疫することにより、従来の関節特異的抗原を用いたモデルや自己抗体誘導性のモデルに比べて簡便に安定した関節炎を任意のタイミングで誘導することができる関節炎誘発原性ペプチドが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
上述の通り、Glucose-6-phosphatase isomerase(GPI)に関しては、そのタンパクそのものを免疫することで正常マウスにおいても関節炎を誘導できることが知られている（上記非特許文献4参照）。そこで、本発明者らは、今回、関節炎誘発原性ペプチドを得ることを目的として、GPIタンパクのT細胞エピトープの同定を試みた。そして、実施例において詳しく説明するように、多数の候補ペプチドを合成し検討を重ねた結果、GPIのT細胞エピトープとして以下に示す結合エピトープを同定し、この結合エピトープを含むペプチドが強い関節炎誘導性を有することを見出した。
【００１９】
【化２】
2009179621.tif 000003
（ここで、「Ile」はイソロイシン、「Phe」はフェニルアラニン、「Glu」はグルタミン酸、「N」は任意のアミノ酸残基を示す。）
【００２０】
この結合エピトープを含む関節炎誘発原性ペプチドとしては、より具体的には、配列番号1記載の9merのアミノ酸配列が挙げられ、さらに具体的には配列番号2記載の15mer又は配列番号3記載の20merのアミノ酸配列が挙げられる。
【００２１】
本発明に係る関節炎誘導原性ペプチドは、そのアミノ酸配列中に上記結合エピトープを１つ又は2つ以上有しているものであればよく、ペプチドの長さ（アミノ酸残基数）も、通常のペプチド合成法によって合成し得る長さのペプチドであれば特に限定されない。
【００２２】
関節炎誘導原性ペプチドは、従来公知の固相合成法又は液相合成法により合成することができる。現在一般的となっている固相合成法は、クロロメチル樹脂やヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂等のペプチド合成用樹脂を使用して行うことができる。これらの樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列に従い、各種縮合方法を用いて樹脂上で縮合させる。反応後、樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。固相合成法では、通常70〜100アミノ酸残基までのペプチドを合成することができる。これを超える長さのペプチドは、例えばネイティブケミカルライゲーション法を用いて2つのペプチドを結合させることにより合成することができる。
【００２３】
本発明に係る関節炎誘導方法では、これらの関節炎誘導原性ペプチドを非ヒト動物に免疫することで関節炎を誘導する。この誘導方法によれば、最も短いペプチドで配列番号1記載の9merのペプチド、これより長いペプチドでも配列番号2記載の15mer又は配列番号3記載の20merのペプチドを用いて関節炎を誘導することが可能である。そして、これらのペプチドは上記の合成法により簡単に、かつ高純度に合成することができる。このため、本発明に係る関節炎誘導方法によれば、従来のリコンビナントタンパクを用いた誘導方法と異なり、簡便に抗原を調製し、得られた高純度の抗原を用いて安定した関節炎を誘導することが可能である。
【００２４】
関節炎誘導原性ペプチドの免疫は、単独で、又はアジュバントとともに、動物へ接種する。アジュバントには、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバント、アラムなどの各種アジュバントを用いることができる。動物への接種は、皮内投与や皮下投与、腹腔内投与等によって行うことができる。また、反応性を高めることを目的として、Pertusssis Toxin（百日咳毒素: PT）などの付加アジュバントを、ペプチド免疫と同時又は／及び免疫後の所定時に接種してもよい。
【００２５】
本発明に係る関節炎動物モデルでは、上記の関節炎誘導方法によって関節炎の誘導を行う。この関節炎動物モデルは、関節炎誘導原性ペプチドの免疫によって、例えばマウスでは免疫後8日という短期間で典型的な臨床所見及び病理組織所見を示す関節炎を誘起することができる。このため、従来の関節炎を自然発症するモデルと異なり、必要な任意のタイミングで関節炎の誘導を行うことが可能である。
【００２６】
モデル動物には、ヒトを除く哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ等）、鳥類（例えば、ニワトリ等）を用いることができる。特にマウス及びラットで好適に関節炎の誘導が可能であるが、これら以外の動物を除外するものではない。
【００２７】
GPIタンパクそのものの免疫による関節炎は、特にDAB/1マウスで顕著な誘導が可能であることが報告されており（上記非特許文献4参照）、本発明に係る関節炎誘導原性ペプチドも、実施例において詳しく説明するように、DAB/1マウスが発現するMHC class II分子であるI-Aqの結合モチーフに基づいて得られたものである。このため、本発明に係る関節炎動物モデルは、MHC class IIとして特にI-Aqを発現する動物とすることが好適である。これにより最も感度良く関節炎を誘導することが可能である。ただし、GPI誘導関節炎はSJL/Jマウスにも誘導可能なことが知られており、I-Asやその他のアンカーが不明なMHC class IIを発現する動物において関節炎を誘導することも当然に可能である。
【００２８】
関節炎動物モデルでは、例えばマウスでは、関節炎誘導原性ペプチドの単回の免疫により、免疫後8日という短期間で、関節全体にわたる強い腫脹を伴う両側性の多発性関節炎を発症する。この関節炎では、活膜の重度の炎症像と増殖像、活膜内での血管増生といったヒトRAと共通する特徴的な所見が認められる。そして、この関節炎は、少なくとも免疫後28日間高い活動性を示し、約2ヶ月程度継続する。
【００２９】
従って、この関節炎動物モデルは、例えば、ヒトRAを含む関節炎を予防、治療又は改善し得る関節炎治療薬を得るための薬理試験に好適に用いることができる。関節炎誘導原性ペプチドの免疫前又は免疫後、治療薬の候補物質をモデル動物に投与し、誘導される関節炎の症状の有無又は改善の程度を評価することで、試験物質の薬理効果の判定が可能である。また、この薬理試験方法では、試験のスケジュールに応じて必要な任意のタイミングで動物に関節炎を誘導することができるため、極めて利用価値の高い方法となり得る。
【実施例】
【００３０】
＜実施例１：GPIのT細胞エピトープの推定＞
本発明者らは、K/BxNマウス血清中から関節炎誘発原性を有する自己抗体としてglucose-6-phosphatase isomerase(GPI)に対する抗体を見出し、抗GPI抗体の投与によって正常マウスにも関節炎を誘導できることを報告している（上記非特許文献3参照）。さらに、これまでにGPIタンパクそのものの免疫によっても正常マウスに関節炎を誘導でき、特にDBA/1マウスで顕著な誘導が可能であることが報告されている（上記非特許文献4参照）。そこで、今回、発明者らは、関節炎誘発原性ペプチドを得ることを目的として、GPIタンパクのT細胞エピトープの同定を行った。
【００３１】
GPIタンパクのT細胞エピトープ同定のため、初めに、GPI アミノ酸配列におけるMHC class II結合モチーフの検索を行った。以下、MHC class II結合モチーフと、所定アミノ酸配列中におけるその検索方法について概説する。
【００３２】
MHC class II（以下、「MHC-II」と表記する）は、約230個のアミノ酸からなる33-35kDaのα鎖と、約230 個のアミノ酸からなる27-29kDaのβ鎖が非共有結合により結合し、形質膜表面に発現する膜結合型糖蛋白である。α鎖及びβ鎖の細胞外部分は、それぞれ約90個のアミノ酸からなる2つのドメインに分かれており、α1, α2, β1及びβ2 ドメインにより構成されている。MHC-IIの先端（形質膜に遠い側）部分を構成するα1とα2ドメインには、αヘリックス構造が側壁を、βシート構造が底面を構成する溝（groove）状の構造が存在し、ペプチドはこの溝（ペプチド収容溝）に結合する。
【００３３】
MHC-IIのペプチド収容溝には、10〜30数個（多くは15個前後）のアミノ酸からなるペプチドが、伸張された形で結合する。結合状態において、ペプチドの両末端側のアミノ酸残基はペプチド収容溝からはみ出した状態となっており、ペプチド収容溝内には9個程度のアミノ酸残基のみが収容される。ペプチド収容構内のペプチドは、１アミノ酸残基進むごとに側鎖の方向が回転する。このとき、ペプチド上でMHC-IIに向かうアミノ酸残基の側鎖がアンカーとなり、これがMHC-II側のペプチド収容構に存在する３〜５個のポケットにうまく収容されることにより、ペプチドとペプチド収容構が結合する。一方、アンカーアミノ酸の間に介在している残基の側鎖は、ペプチド収容溝から露出しておりTCR（T-cell receptor）により認識される。
【００３４】
ペプチド収容構のポケットに、ペプチドのアンカーアミノ酸の側鎖が収容されるためには、アンカーアミノ酸の側鎖の大きさ、極性及び荷電などの特性が各ポケットに適合することが必要であるが、ペプチド収容溝及びポケットの形状は、MHC-IIの多型によって各MHC-IIごとに異なっている。そのため、各MHC-IIには、そのMHC-IIのペプチド収容構及びポケットの形状に適したアンカーアミノ酸を有する特定の構造をもったペプチドのみが結合できる。
【００３５】
このMHC-IIごとに決定される結合可能なペプチド構造を「結合モチーフ」という。結合モチーフは、ペプチドのアミノ酸配列におけるアンカーアミノ酸の「位置」と「種類」の組合せによって規定される。このためペプチドの一次構造を調べ、結合モチーフの有無を判定することで、そのペプチドが所定のMHC-IIに結合するか否かを推定することができる。
【００３６】
これまでの報告で、DBA/1マウスが発現するMHC class IIであるI-Aqにおけるアンカーアミノ酸は、ペプチド収容溝に収容される9アミノ酸のうちN末端側から1番目（P1）、4番目（P4）及び７番目（P7）に位置することが知られている（”T cell response of I-Aq mice to self type II collagen: meshing of the binding motif of the I-Aq molecule with repetitive sequences results in autoreactivityto multiple epitopes.” 
International Immunology, 1997, Vol.9, No.11, p.1687-1699参照）。
【００３７】
そこで、これまでにI-Aqへの結合性が知られているエピトープのアミノ酸配列に基づいて、I-Aq結合モチーフ中のP1, P4及びP7において許容され易いアミノ酸の組合せを明らかにした。「表1」には、このアミノ酸の組合せを得るために使用した既知エピトープ（タンパク名）とそのアミノ酸配列、及び引用文献を示す。
【００３８】
【表１】
2009179621.tif 000004
表中、タンパク名に付した数値は、各タンパクのアミノ酸配列中において、エピトープに対応するアミノ酸配列を、N末端からのアミノ酸番号により示す。また、アミノ酸配列中、太字はエピトープにおいて、結合モチーフのP1, P4及びP7に位置するアミノ酸を示す。
【００３９】
引用文献を以下に示す。
（１）”Identification and characterization of a T cell-inducing epitope of bovine ribonucleasethat can be restricted by multiple class II molecules.” Journal of Immunology, 1991, Vol.147, No.11, p.3672-3678.
（２）”Major histocompatibility complex-linked control of the murine immune response to myelin basic protein.” Journal of Immunology, 1985, Vol.134, No.4, p.2328-2332.
（３）”Involvement of distinct murine T-cell receptors in the autoimmune encephalitogenic response to nested epitopes of myelin basic protein.” Proceeding National Academy of Science, 1988, Vol.85, No.22, p.8608-8612.
（４）”Identification and characterization of a tolerogenicT cell determinant within residues 181-209 of chick type II collagen.” Clinical Immunology Immunopathology, 1995, Vol.75, No.1, p.33-38.
（５）”Identification of an immunodominanttype-II collagen peptide recognized by T cells in H-2q mice: self tolerance at the level of determinant selection.” European Journal of Immunology, 1992, Vol.22, No.7, p.1819-1825.
（６）”T cell epitopes of type II collagen that regulate murine collagen-induced arthritis.” Journal of Immunology, 1993, Vol.151. No.1, p.500-505.
（７）”T cell response of I-Aqmice to self type II collagen: meshing of the binding motif of the I-Aq molecule with repetitive sequences results in autoreactivity to multiple epitopes.” International Immunology, 1997, Vol.9, No.11, p.1687-1699.
【００４０】
「図1」は、結合モチーフのP1, P4及びP7において許容され易いアミノ酸の組合せを示した図である。図は、P1に許容され易いアミノ酸は、A(Alanine), F(Phenylalanine), L(Leucine), I(Isoleucine), P(Proline), S(Serine), V(Valine)であり、P2に許容され易いアミノ酸は、A, P, F, S, V, L N(Asparagine), R(Arginine)であり、P7にはE(GlutamicAcid), D(Aspartic Acid), Q(Glutamine), P, N, Iが許容され易いことを示す。
【００４１】
この組合せを満たす9アミノ酸残基からなる配列を、GPIの558アミノ酸配列（配列番号5）から検索し、32種類の配列（以下「コアエピトープ」という）を抽出した。抽出されたコアエピトープを「表2」に示す。
【００４２】
【表２】
2009179621.tif 000005
表中「GPI a.a.No.」は、各コアエピトープが対応するGPIアミノ酸配列のN末端からのアミノ酸番号を示す。
【００４３】
＜実施例２：GPIのT細胞エピトープの同定＞
実施例1で抽出された32種類のコアエピトープを含むペプチドを合成し、各ペプチドについてT細胞に対するサイトカイン産生誘導能を評価することによりT細胞エピトープのスクリーニングを行った。
【００４４】
（１）ペプチドの合成
ペプチドは、上記のコアエピトープをアミノ酸配列の中央に含む20merのペプチドとして25種類を合成した。ペプチドは、MIMOTOPES社に委託して、クルードなペプチドとして合成を行った。合成したペプチドのアミノ酸配列を「表3」に示す。
【００４５】
【表３】
2009179621.tif 000006
表中「GPI a.a.No.」は、各ペプチドが対応するGPIアミノ酸配列のN末端からのアミノ酸番号を示す。また、アミノ酸配列中、下線を付した太字は、各ペプチドに含まれるコアエピトープを示す。
【００４６】
（２）サイトカイン産生誘導能の評価
抗原提示細胞からGPI抗原の提示を受けたCD4＋T細胞は、INF-γを産生するTh1型のT細胞及びIL-17を産生するTh17型のT細胞に分化することが知られている（”T(H)-17: a giant step from T(H)1 and T(H)2.”Nature Immunology, 2005, Vol.6, No.11 p.1069-70参照）。そこで、in vitroにおいて、各ペプチドのT細胞に対するINF-γ及びIL-17産生誘導能を評価することにより、T細胞エピトープのスクリーニングを行った。
【００４７】
スクリーニングは、リコンビナントGPI（rGPI）の免疫により関節炎を誘導したDBA/1マウスの脾臓から分離したCD4+T細胞と抗原提示細胞に対し、各ペプチドを処置し、INF-γ及びIL-17の産生量をELISAにより測定することにより行った。以下、簡単にその手順を説明する。
【００４８】
rGPIは、ヒトGPI cDNA（配列番号4参照）をpGEX-4T3プラスミド（Pharmacia）にクローニングし、大腸菌を用いてGST(glutathione S-transferase)融合タンパクとして発現させた。発現させたGST融合rGPIは、gultathione-sepharoseカラムを用いて精製した。
【００４９】
完全フロイントアジュバントにてエマルジョン化した精製rGPI 300μgを、DBA/1マウス（日本チャールズ・リバー・ラボラトリーズ）の尾根部皮内に注射し、関節炎を誘導した。
【００５０】
関節炎誘導7日後のマウスから脾臓を摘出し、溶血を行った後、10％FBS含RPMI1640（Sigma-Aldrich）中で細胞を分散させた。細胞分散液中のCD4+T細胞を磁気細胞分離（Magnetic cell sorting:MACS）により分離した。MACSには、Miltenyi Biotech社の装置を使用した。また、抗原提示細胞は、関節炎誘導後の脾細胞をマイトマイシンC処理して用いた。CD4+T細胞と抗原提示細胞を5：1で共培養し、各ペプチドを10μM濃度で培養液中に添加した。添加後24時間培養の後、培養上清を回収し、市販のELISAキット（R&D Systems）を用いてINF-γ及びIL-17の産生量を測定した。
【００５１】
25種類のペプチドについて、INF-γ及びIL-17の産生量を測定した結果を「図2」に示す。図（A）はINF-γの測定結果、（B）はIL-17の測定結果を示す。図中、横軸はペプチドNo.、縦軸はサイトカイン濃度（pg/ml）を表す。
【００５２】
図2に示すように、培養上清中のINF-γ及びIL-17は、No.118及びNo.125ペプチドを処置した細胞で顕著に高い濃度を示した。このことから、No.118及びNo.125ペプチドが、T細胞エピトープを含んでいる可能性が高いと考えられた。
【００５３】
続いて、さらにT細胞エピトープを絞り込むため、 No.118及びNo.125ペプチドをそれぞれ15merの2つのペプチドとして高純度で再合成し、同様のサイトカイン産生誘導能の評価を行った。ペプチドは、Invitrogen社に委託して、純度90％以上のペプチドとして合成を行った。合成したペプチドのアミノ酸配列を「表4」に示す。
【００５４】
【表４】
2009179621.tif 000007
表中「GPI a.a.No.」は、各ペプチドが対応するGPIアミノ酸配列のN末端からのアミノ酸番号を示す。また、アミノ酸配列中、下線を付した太字は、各ペプチドに含まれるコアエピトープを示す。
【００５５】
No.118ペプチドは、「表2」に示すNo.22及びNo.23の2つのコアエピトープを有する。そのため、No.118ペプチドは、No.22コアエピトープを含む15merのペプチド（No.118-1）と、No.23のコアエピトープを含む15merのペプチド（No.118-2）に分割して再合成した。また、No.125ペプチドは、そのN末端側が、「表3」に示すNo.124ペプチドと一部重複するアミノ酸配列となっている。しかし、No.124ペプチドそのものはサイトカイン産生誘導能を示さなかったことから（図2参照）、No.125ペプチドについてはNo.124ペプチドと重複しないC末端側について2種類の15merペプチド（No.125-1, No.125-2）を再合成した。
【００５６】
再合成した4種類のペプチド（No.118-1, No.118-2, No.125-1, No.125-2）について、上述の方法でINF-γ及びIL-17の産生量を測定した結果を「図3」に示す。図（A）はINF-γの測定結果、（B）はIL-17の測定結果を示す。図中、横軸はペプチドNo.、縦軸はサイトカイン濃度（pg/ml）を表す。
【００５７】
図3に示すように、培養上清中のINF-γ及びIL-17は、No.118-1ペプチドを処置した細胞で顕著に高い濃度を示した。このことから、No.118-1ペプチドが、GPIのT細胞エピトープを含み、No.118-1ペプチドに含まれるNo.22コアエピトープが主要なエピトープ（ドミナントエピトープ）となっていると考えられた。
【００５８】
＜実施例３：ドミナントエピトープによる関節炎誘導実験＞
GPIの関節誘発原性は、No.118-1ペプチド、特にはNo.22コアエピトープをドミナントエピトープとするものであることが示唆された。そこで、本実施例においては、正常マウスを用いて、No.118-1ペプチドについてその関節炎誘導能の評価を行った。
【００５９】
完全フロイントアジュバントにてエマルジョン化したペプチド25μgをDBA/1マウスの尾根部皮内に注射して関節炎を誘導した。反応性を増強させる目的で、ペプチドの免疫と同時及び免疫後2日目にPertusssis Toxin（百日咳毒素: PT）200ngを腹腔内に投与した。
【００６０】
ペプチド免疫後28日目まで、以下の基準により、誘導された関節炎のスコアを評価した。スコアは、2踵関節及び2手関節の合計として評価した。最大スコアは12である。
（１）スコア0：炎症徴候なし
（２）スコア1：局所の発赤を伴う局部的な腫脹
（３）スコア2：明らかな関節腫脹があるが、関節周囲のみに限局
（４）スコア3：関節全体にわたる強い腫脹
【００６１】
関節炎スコアの評価結果を「図4」に示す。図は、No.118-1ペプチドの免疫により誘導された関節炎のスコア変化を示す。図中、横軸は免疫後の日数、縦軸は関節炎スコアを示す。
【００６２】
また、「図5」には、免疫後14日目の関節の外部所見像（A）と病理所見像（C）を示す。図5中（B）及び（D）には、それぞれ関節炎誘導を行っていない対照マウスの外部所見像と病理所見像を示す。
【００６３】
No.118-1ペプチドを免疫したマウスでは、免疫後8日目から顕著な両側性の多発性関節炎を呈し、この関節炎は観察を行った28日目まで継続した（図4参照）。
【００６４】
No.118-1ペプチドを免疫したマウスでは関節全体にわたる強い腫脹が認められる（図5（A）参照）。また、病理所見では、活膜の重度の炎症像と増殖像、活膜内での血管増生といった特徴的な所見が認められた（図（C）参照）。
【００６５】
他方、結果の図示は省略するが、No.118-2, No.125-1, No.125-2ペプチドの免疫では関節炎の誘導は不能であった。
【００６６】
以上の結果から、No.118-1ペプチド、特にこのペプチドに含まれるNo.22コアエピトープが、強い関節炎誘導原性を有し、GPIのドミナントエピトープとなっていることが明らかとなった。このことは、No.22コアエピトープのアミノ酸配列「INCFGCETH」が有する以下のMHC II結合モチーフが強い関節炎誘発原性を備えていることを強く示唆するものである。
【００６７】
【化３】
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（ここで、「Ile」はイソロイシン、「Phe」はフェニルアラニン、「Glu」はグルタミン酸、「N」は任意のアミノ酸残基を示す。）
【００６８】
従って、No.118-1ペプチド（配列番号2）に加え、この結合モチーフを有するNo.22コアエピトープ（配列番号1）及びNo.118ペプチド（配列番号3）についても同様に関節炎誘発が可能であり、これらのペプチドを動物に免疫することで典型的な関節炎を簡便かつ迅速に誘導できるものと考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】結合モチーフのP1, P4及びP7において許容され易いアミノ酸の組合せを示した図である。
【図２】実施例2において、合成した25ペプチドのサイトカイン産生誘導能の評価結果を示す図である。図（A）はINF-γの測定結果、（B）はIL-17の測定結果を示す。
【図３】実施例2において、再合成した4ペプチドのサイトカイン産生誘導能の評価結果を示す図である。図（A）はINF-γの測定結果、（B）はIL-17の測定結果を示す。
【図４】実施例3において、No.118-1ペプチドの免疫により誘導された関節炎のスコアを示す図である。図中、横軸はペプチド免疫後の日数、縦軸は関節炎スコアを示す。
【図５】実施例3において、No.118-1ペプチドの免疫後14日目の関節の外部所見像（A）と病理所見像（C）を示す図である。図（B）及び（D）は、それぞれ関節炎誘導を行っていない対照マウスの外部所見像と病理所見像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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