(57)【要約】【課題】  免疫原性が低い軟骨移植片を効率的に製造可能な方法を提供する。【解決手段】  ３次元の基質中に軟骨細胞又は間充織幹細胞を組み込み増殖させて軟骨移植組織を形成する。基質はランダムにリフォールディングされたタイプＩコラーゲンのα−ヘリカルモノマーを含有している。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分的に消化されているが還元反応を受けていないタイプＩコラーゲンから、ランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーであって架橋されている前記α−ヘリカルモノマーを含有する３次元の基質中に、軟骨細胞又は間充織の幹細胞を組み込む工程と、
基質中の軟骨細胞又は間充織幹細胞を増殖する工程とからなる軟骨移植片の製造方法。
【請求項２】
前記基質はタイプＩＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを含有している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タイプＩＩコラーゲンは部分的に消化される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記軟骨細胞又は間充織幹細胞と、タイプＩコラーゲンと、タイプＩＩコラーゲンとは、２種類又は３種類の異なる動物源から調製されている請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記軟骨細胞又は間充織幹細胞と基質とは、回転及び振動される容器に配置される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記軟骨細胞又は間充織幹細胞とタイプＩコラーゲンとは、それぞれ異なる動物源から調製されている請求項２に記載の方法。
【請求項７】
部分的に消化されているが還元反応を受けていないタイプＩコラーゲンからランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーであって架橋されている前記α−ヘリカルモノマーを含有する３次元の基質中に、軟骨細胞を組み込む工程と、  
基質中の軟骨細胞を増殖する工程とからなる軟骨移植片の製造方法。  
【請求項８】
前記基質はタイプＩＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーを含有している請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タイプＩＩコラーゲンは部分的に消化される請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
軟骨細胞と、
３次元のマトリクスと、同マトリクスは、部分的に消化されているが還元反応を受けていないタイプＩコラーゲンからランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーであって架橋されている前記α−ヘリカルモノマーを含有していることと、
前記軟骨細胞は前記マトリクスに組み込まれていることとからなる軟骨移植片。
【請求項１１】
前記マトリクスはタイプＩＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーを含有している請求項１０に記載の軟骨移植片。
【請求項１２】
前記タイプＩＩコラーゲンは部分的に消化される請求項１１に記載の軟骨移植片。
【請求項１３】
前記軟骨細胞と、タイプＩコラーゲンと、タイプＩＩコラーゲンとは、２種類又は３種類の異なる動物源から調製されている請求項１１の軟骨移植片。
【請求項１４】
前記軟骨細胞とタイプＩコラーゲンとは、それぞれ異なる動物源から調製されている請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は軟骨移植片に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨組織は自己修復能力をほとんど有しない。軟骨組織の欠陥は、繊維軟骨によって自然に治癒するが、それには制限がある。それらの生化学的特性、機械特性及び生理学特性は、正常な軟骨よりも劣っている。従って、傷ついた軟骨組織は退化し易くなる。
【０００３】
軟骨再生の治療には、炭素材料のプラグ、骨膜、軟骨間質、肋軟骨下の穿孔、及び自己由来軟骨細胞の移植が含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、それらのうちの大多数は、自然の修復を越えるほど軟骨力学的又は生理学的に改善していない。改善された治療の選択肢の提供に対する臨床上の需要即ち、分離された軟骨細胞又は間充織幹細胞から体外で作製された軟骨移植片に対する需要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記問題点を解決するために、本発明の第１の実施形態は、タイプＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーを含有している３次元の基質中に、軟骨細胞又は間充織の幹細胞を組み込む工程と、基質中の軟骨細胞又は間充織幹細胞を増殖する工程とからなる軟骨移植片の製造方法を要旨とする。
【０００６】
上記第１の実施形態において、前記基質はタイプＩＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを含有していることを要旨とする。
上記の方法において、前記タイプＩＩコラーゲンは部分的に消化されていてもよい。
【０００７】
また、タイプＩコラーゲンは部分的に消化されていてもよい。
基質がタイプＩＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを含有している方法において、前記軟骨細胞又は間充織幹細胞と、タイプＩコラーゲンと、タイプＩＩコラーゲンとは、２種類又は３種類の異なる動物源から調製されていてもよい。
【０００８】
前記軟骨細胞又は間充織幹細胞と基質とは、回転及び振動される容器に配置されていてもよい。
基質がタイプＩＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを含有している方法において、前記軟骨細胞又は間充織幹細胞とタイプＩコラーゲンとは、それぞれ異なる動物源から調製されていてもよい。
【０００９】
本発明の第２の実施形態によると、タイプＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーを含有している３次元の基質中に、軟骨細胞を組み込む工程と、 基質中の軟骨細胞を増殖する工程とからなる軟骨移植片の製造方法を要旨とする
。
【００１０】
基質はタイプＩＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを含有していてもよい。
前記タイプＩＩコラーゲンは部分的に消化されていてもよく、前記タイプＩコラーゲン
は部分的に消化されることがある。
【００１１】
本発明の第３の実施形態によると、軟骨細胞と、３次元のマトリクスと、同マトリクスはタイプＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを含有していることと、前記軟骨細胞は前記マトリクスに組み込まれていることとからなる軟骨移植片を要旨とする。
【００１２】
前記マトリクスはタイプＩＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを含有していてもよい。
第３の実施形態において、前記タイプＩＩコラーゲンは部分的に消化されるものであってもよい。
【００１３】
また、前記タイプＩコラーゲンは部分的に消化されることが可能である。
前記軟骨細胞と、タイプＩコラーゲンと、タイプＩＩコラーゲンとは、２種類又は３種類の異なる動物源から調製されていてもよい。
【００１４】
上記の軟骨移植片において、前記タイプＩコラーゲンは部分的に消化されるものであってもよい。
第３の実施形態において、前記軟骨細胞とタイプＩコラーゲンとは、それぞれ異なる動物源から調製されていてもよい。
【００１５】
本発明は一実施態様において、３次元の基質中に軟骨細胞又は間充織幹細胞を組み込むことにより、軟骨移植片を製造する方法を有する。基質は、タイプＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーを含有しており、随意に、タイプＩＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーをさらに含有することもある。細胞基質作成物は培地に置かれる。間充織幹細胞は、媒体中に補給された分化要素によって軟骨細胞への分化を誘発することが可能である。基質の中で軟骨細胞が増殖し、分化するとともに、軟骨移植片が製造される間に細胞外マトリクスタンパク質、例えばプロテオグリカン、タイプＩＩコラーゲンなどを使用する。
【００１６】
軟骨細胞又は間充織幹細胞と、タイプＩコラーゲンと、タイプＩＩコラーゲンとは、２種類又は３種類の異なる動物源から作製し得る。例えば、ヒトから分離された軟骨細胞は、ウシのタイプＩコラーゲン及びタイプＩＩコラーゲンと組み合わせて使用し得る。軟骨細胞又は間充織幹細胞と基質とは、回転され及び振動される容器に配置し得る。同容器は軟骨形成を許容する微環境を提供する。
【００１７】
本発明は上記された方法によって製造された軟骨移植片にも関する。軟骨移植片は、３次元のマトリクス即ち、軟骨移植片の細胞外の部品に組み込まれた軟骨細胞を含有している。マトリクスは上記の基質と組成が異なる。例えばマトリクスは、分解に起因してタイプＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーをより少ない量で含有し、組み込まれた軟骨細胞によって合成されたタイプＩＩコラーゲンを含有している。組み込まれた軟骨細胞には、マトリクス内部のものとマトリクス表面に付着しているものとの両方が含まれる。
【００１８】
本発明は免疫原性が低い軟骨移植片を効率的に製造可能な方法を提供する。本発明のいくつかの実施形態の詳細は、以下の詳細な説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は発明の詳細な説明及び請求項から明白となる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、免疫原性が低い軟骨移植片及びその製造方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は軟骨移植片の製造方法に関する。より詳細には、軟骨細胞又は間充織幹細胞は、３次元の基質に組み込まれている。同基質は、タイプＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを含有している。そのような細胞コラーゲン作成物は培地に置かれたときには、軟骨移植片を形成すべく成長する。
【００２１】
基質はタイプＩコラーゲンのみを含有することも、或いはタイプＩコラーゲン及びタイプＩＩコラーゲンの両方を含有することもある。タイプＩコラーゲンは、本発明の軟骨移植片を構造的に支持する。タイプＩコラーゲンは骨、皮膚及び腱の主要成分であり、成熟した瘢痕（即ち傷跡）中に主要成分として含まれるコラーゲンである。それは、腱組織から抽出し、精製することができる（米国特許第５，８７６，４４４号、レイ（Ｌａｉ）、１９９９年）。タイプＩＩコラーゲンは軟骨中に主要に含まれる種類のコラーゲンである。タイプＩＩコラーゲンは、軟骨細胞或いは間充織幹細胞の増殖及び分化の能力の維持を促進する。下記のように、軟骨組織から抽出及び精製できる。
【００２２】
本発明の方法においては、タイプＩコラーゲン及びタイプＩＩコラーゲンのα−ヘリカルモノマーは、基質内でランダムにリフォールディングされている。そのような基質に組み込まれて増殖された軟骨細胞又は間充織幹細胞から製造された軟骨移植片は予想外に低い免疫原性を示す。タイプＩ又はタイプＩＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーは、以下のように作製される。（１）酸性溶液に溶解し、プロテアーゼで部分的に分解することによって、タイプＩ又はタイプＩＩコラーゲンの３重らせんを巻き戻す。（２）タイプＩ又はタイプＩＩコラーゲンの巻き戻されたヘリカルモノマーをランダムにリフォールディングする。米国特許第５，８７６，４４４号を参照のこと。タイプＩ及びタイプＩＩコラーゲンの両方の種類を含有する基質を作製する場合、タイプＩ対タイプＩの重量比は好適には、１：１〜１：２（例えば、１：１．１，１：１．５，１：１．７）の範囲内にある。タイプＩ及びタイプＩＩコラーゲンの巻き戻されたα−ヘリカルモノマーが混合された場合には、タイプＩコラーゲンモノマーはタイプＩＩコラーゲンモノマーと巻き合ってハイブリッドオリゴマーを形成することが可能である。
【００２３】
軟骨細胞及び間充織幹細胞はそれぞれ関節軟骨と骨髄とから分離し得る。細胞はサブコンフルエンスに培養され、次に上記の基質中に組み込まれる。細胞数及び使用すべき基質の量は、当業者によって経験的に、或いは下記の実施例に従って決定し得る。そのようにして得られた細胞基質作成物は培地に置かれ、成長可能となる。間充織幹細胞が軟骨移植片をの形成に使用される場合、培地は間充織幹細胞の軟骨細胞への分化を誘発するために分化要素（例えばＩＬ−１やデクサメタゾーン）を含有している必要がある。回転及び振動される容器で作成物を増殖させることが可能である。予測を超えて、作成物は静止フラスコよりも回転及び振動される容器内ではるかに速く成長する。軟骨移植片は数週間で形成される。輸送、成型、並びに患者に移植される前に軟骨移植片は、密封した無菌の組織培養メディア箱内にて室温で数日間貯蔵可能である。患者のもとへの輸送直後に軟骨移植片が使用されない場合には、それはさらに数日間上記の状態で貯蔵され得る。
【００２４】
本発明は、上記された方法によって作製された軟骨移植片にも関する。例えば可動結合部及び椎間円板内などの軟骨欠陥を修復するために使用された場合にはそのような移植片は、軟骨移植片を作製するために使用される、軟骨細胞或いは間充織幹細胞であるタイプＩコラーゲンと、タイプＩＩコラーゲンとが異なる動物源から調製された場合であっても、低い免疫原性を示す。例えば、ウサギ関節軟骨から分離された軟骨細胞は、ラット尾から調製されたタイプＩコラーゲン及び、ウサギ軟骨から調製されたタイプＩＩコラーゲンと混合することができる。予測を超えて、そのような移植片はウサギ膝関節の軟骨欠陥を修復するために使用できる。
【００２５】
下記の特定の実施例は、単に例示として解釈されるべきものであり、いかようにも残りの明細書の開示を限定するものではない。それ以上の詳細を提供することなく、当業者ならば本明細書の記載に基づき本発明を十分に利用可能である。
【００２６】
軟骨移植片の作製
（１）  タイプＩコラーゲンの抽出及び精製
タイプＩコラーゲンは、ニュージーランドシロウサギの腱又はラット尾の腱から抽出及び精製された。（米国特許第５，８７６，４４４号、レイ（Ｌａｉ）、１９９９年）血漿タンパクを除去するために腱を剥離、薄切り及び、冷却蒸留水を数回取替えながら洗浄し、次に、５０ｍＭ、ｐＨ  ７．４のトリス塩酸中の０．５Ｍ  ＮａＣｌを使用して４℃で一晩継続して攪拌しながら抽出した。上清を静かに移動し、残りは塩類を除去するために冷却蒸留水を数回取り替えて洗浄し、次に０．５Ｍ  ＨＯＡｃ（ｐＨ  ２．５）中にて４℃で一晩培養し、水溶性抽出物を得た。抽出物を塩性水溶液（０．９Ｍ  ＮａＣｌ）で沈澱した。沈殿物を３０分間１３，０００ｒｐｍで遠心分離機にかけ、コラーゲン含有溶液を形成するために０．０５Ｍ  ＨＯＡｃに溶解した。沈澱させるために別の塩溶液（０．０２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４）を２４〜４８時間の間にわたってコラーゲン含有溶液に２度加えた。沈殿物を遠心分離機にかけ、次に別のコラーゲン含有溶液を得るために５０ｍＭ  ＨＯＡｃに溶解した。溶液を５ｍＭ  ＨＯＡｃに対して透析し、凍結乾燥した。
【００２７】
（２）  タイプＩＩコラーゲンの抽出及び精製
タイプＩＩコラーゲンは、変更したミラー法（雑誌  酵素学大系（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）第８２巻第３３〜６４ページ）によって作製された。ウサギ軟骨を薄切りし、０．０５Ｍ  トリスバッファ（ｐＨ  ７．４）中の、０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄した。４Ｍ  グアニジン−ＨＣｌで糖タンパクを除去し、抽出物を１ｍｇ／ｍｌのペプシンとともに０．５Ｍ  酢酸に溶解した。０．９Ｍ  ＮａＣｌを加え、完全に酸と塩を除去すべく７０％のアルコールで数回洗浄し、１Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０５Ｍ  トリスバッファ（ｐＨ  ７．４）に溶解することによってコラーゲンを沈澱させた。沈降反応のためにＮａＣｌを３．５Ｍまで加え、上清は回収した。その後ＮａＣｌを４．５Ｍまで加えることによりタイプＩＩコラーゲンを沈澱させた。ペレットを７０％のアルコールで数回洗浄し、２〜４ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで１０ｍＭ  酢酸中に再び溶解した。
【００２８】
（３）  軟骨細胞の単離及び培養
軟骨細胞を、ニュージーランドシロウサギの新生児の関節軟骨から分離した（レイ（Ｌａｉ）、医学博士論文、ハーバード大学医学部、１９９３年）。細胞のスライスを、ヒアルロニダーゼ１ｍｇ／ｍｌ及びコラゲナーゼ１ｍｇ／ｍｌを含有する、ハンクのバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）中で一晩インキュベートした。遠心分離後に、組織ペレットを１０％
ＰＢＳ、５０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン、１００ユニット／ｍｌ  ペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍｌ  硫酸ストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍｌ  ファンギゾンをもって、ＤＭＥＭ中に再懸濁された。１０ｃｍペトリ皿につき５×１０５個の組織を播種し、３７℃で５％炭酸ガスインキュベータにおいて培養した。媒体を３〜４日毎に取り替え、組織をサブコンフルエントまで成長させた。
【００２９】
（４）  軟骨移植片の作製
タイプＩ及びタイプＩＩコラーゲンの両方をガンマ線で殺菌し、５ｍＭ  ＨＯＡｃにそれぞれ溶解した。コラーゲンは、テロペプチドを除去するためにペプシンで部分的に消化させた。例えば米国特許第５，８７６，４４４号を参照されたい。タイプＩコラーゲン含有溶液及びタイプＩＩコラーゲン含有溶液を緩慢に混合した。必要な場合には混合を促進するために溶液を３０〜４０℃に加熱した。タイプＩＩコラーゲン対タイプＩコラーゲン
の重量比は１：１〜１：２である。
【００３０】
（１〜１０）×１０６個の軟骨細胞１．０ｍｌを、２〜４ｍｇ／ｍｌのタイプＩ及びタイプＩＩコラーゲンを含有している別の溶液１．０ｍｌに混合した。２４のウサギ基質（即ちウサギのタイプＩコラーゲン及びウサギのタイプＩＩコラーゲンを含有している基質）、及び２４のラット基質（即ちラットのタイプＩコラーゲン及びウサギのタイプＩＩコラーゲンを含有している基質）のそれぞれに軟骨細胞を播種した。混合物が重合するまで６ウェル又は２４ウェルの皿に置いた。軟骨細胞−コラーゲン作成物をさらに、特定の栄養素と薬物とを含有しているＤＭＥＭ中で培養した。上記の特定の栄養素は、１０〜２０％ウシ胎児血清、ＨＡＭ  Ｆ−１２Ｋ、０．３〜０．５ｍＭ  プロリン、及び５０〜７０ｍｇ／Ｌ  アスコルビン酸を含有する。上記の薬物は５％ＣＯ２下、３７℃において、５０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン、１００ユニット／ｍｌペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍｌファンギゾンを含有する。
【００３１】
軟骨細胞−コラーゲン作成物を、３〜５日間フラスコ内でまず静地培養した。次にそれらの半分、即ち軟骨細胞−ウサギ基質作成物１２個と、軟骨細胞−ラット基質作成物１２個とを容器に移し、ある程度の振動をもって８〜１６ｒｐｍで緩慢に回転させた。作成物の残り半分は静止しているフラスコに残した。媒体を２〜４日毎に取り替え、軟骨細胞−コラーゲン作成物は２〜４週間で徐々に軟骨移植片になった。
【００３２】
４つの軟骨細胞−コラーゲン作成物即ち、静止フラスコ中の軟骨細胞−ウサギ基質作成物と、静止フラスコ中の軟骨細胞−ラット基質作成物と、回転振動容器中の軟骨細胞−ウサギ基質作成物と、回転振動容器中の軟骨細胞−ラット基質作成物とを、１，２，３，４週間で除去した。作成物を肉眼で検査し、１０％ホルマリンに固定し、パラフィンに組み込み、５〜１０ミクロンに連続的に分割（サクラスレッジ（Ｓａｃｕｒａ  Ｓｌｅｄｇｅ）ミクロトーム）した。組織切片をヘマトキシリン／エオシン染色し、軟骨形成分化を評価した。
【００３３】
（５）  免疫組織化学
組織切片を第１の抗体（抗タイプＩＩコラーゲン及び抗コンドロイチン硫酸塩）又は制御血清ブランクで培養した。タイプＩＩコラーゲンは細胞外マトリクスの軟骨に特有の成分である。コンドロイチン硫酸塩は軟骨プロテオグリカンの主成分である。抗原−第１抗体錯体は、第２抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体でさらに培養された。タイプＩＩコラーゲン及びコンドロイチン硫酸塩の濃度は、第３の抗原−抗体錯体の量を３−３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で検出することによって決定した。
【００３４】
組織化学的結果は、表１に要約される。
表１  軟骨細胞−コラーゲン作成物の軟骨形成
【００３５】
【表１】
2009226221.tif 000002
【００３６】
予測を超えて、回転及び振動させた容器中の軟骨細胞−ラット基質作成物は１週間でのわずかな軟骨形成及び、２週後の軟骨形成の異常発達を示した。回転振動容器中の軟骨細胞−ウサギ基質作成物及び、静止フラスコ中の軟骨細胞−ラット基質作成物は、２週間でわずかな軟骨形成を開始し、３週後に軟骨形成の異常発達を示した。静止フラスコ中の軟骨細胞−ウサギ基質作成物は３週後まで軟骨形成を示さなかったが、わずかな軟骨形成異常発達が４週目までに観察された。
【００３７】
一般に、静止フラスコ中のものより回転振動容器中で増殖した作成物で軟骨細胞周囲でのより多くの欠陥部分形成が観察された。全てのグループ中の大部分の軟骨細胞−コラーゲン作成物は４週間で軟骨状の外観を示した。免疫組織化学的評価は、タイプＩＩコラーゲン及びコンドロイチン硫酸塩が全ての異常発達軟骨細胞−コラーゲン作成物中に存在していることを示した。
【００３８】
軟骨修復
（１）  軟骨欠陥及び移植
３６個のオスのニュージーランドシロウサギがこの実験で使用された。各ウサギは約２．５ｋｇの体重を有し、平均年齢は４か月であった。ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ、０．６５ｍｌ／体重ｋｇ）及びキシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ、０．３０ｍｌ／体重ｋｇ）の混合物の筋肉注射によってウサギに麻酔をした。膝前部周辺の皮膚を削り、ヨウ素で洗浄した。膝関節に到達するために内側傍膝蓋アプローチを使用した。膝蓋骨を摘出し、関節軟骨の４ｍｍの環状全層欠陥を４ｍｍドリルで形成した。孔は中間の大腿部内側顆状突起に設けられた。深さ４ｍｍかつ、骨髄穴の海綿質骨へ延伸する円錐形の欠陥を形成した。交絡因子の影響を回避するために、半数のウサギは右膝継手に欠陥を形成し、残りの半数は左膝継手に欠陥を形成した。
【００３９】
欠陥を上記の軟骨移植片で修復した。１２個のウサギを軟骨細胞−ウサギマトリクス移植片（ＣＲＢＴＣＭ）で治療した。他の１２個のウサギを軟骨細胞−ラットマトリクス移植片（ＣＲＴＴＣＭ）で治療した。残りの１２個のウサギは、外科対照群として移植組織で治療しなかった。外科手術をしていない膝関節は完全な膝関節コントロールとして使用された。
【００４０】
外科手術後１，２，３か月で軟骨修復部を検査した。各回ごとに各グループ中の３個のウサギを使用した。膝関節は端受けが除去され微視的に検査された。大腿骨の末端部をホルマリンで固着し、脱灰し、欠陥部に垂直かつ矢状方向に切断した。これらの切断部は欠
陥の中心部から得られた。試験片をヘマトキシリン／エオシンで染色し、微視的に検査した。
【００４１】
（２）  微視的検査
正常な関節軟骨は大腿顆の関節をなす端部を覆って、黄色を帯びた半透明白色の外観を有する。移植をしていない外科的欠陥は凹面に観察され、４週で白色光沢を有する組織で充填された。欠陥の端縁は明確であった。１２週で欠陥表面は、繊維によって不規則な形状になっていた。
【００４２】
予測を超えて、ＣＲＢＴＣＭ及びＣＲＴＴＣＭで手術された両方のグループにおいて、骨増殖体、軟骨浸食、或いは滑膜増殖などの骨関節炎の徴候は観察されなかった。欠陥は外科手術後４週間で白い不透明な組織で充填された。１２週後に両方のグループにおいて、外科手術箇所を被覆する軟骨状の組織が観察された。修復組織は半透明に観察され、端縁部は隣接している健康な組織と一体化していた。
【００４３】
（３）  組織学
（外科対照群）
１か月後に軟骨の緩慢な退化、繊維攣縮及び細分化が傷及び隣接した領域で観察された。欠陥はわずかな軟骨芽細胞の成長とともに繊維芽細胞によって修復された。２か月後に軟骨の通常から重篤な退化、繊維性攣縮、及び細分化が傷内部及び隣接した領域で観察された。欠陥は繊維及び部分的軟骨芽細胞内の成長によって修復された。３か月後に欠陥の軟骨下骨が曝され、繊維組織によって被覆された。
【００４４】
（ＣＲＢＴＣＭグループ及びＣＲＴＴＣＭグループ）
予測を超えて、１か月後に欠陥は軟骨芽細胞でほぼ充填された。軟骨細胞の組織形態は円形から多角形類似まで多様であった。軟骨芽細胞は肋軟骨下の層に入り込んだ。わずかな炎症が両グループ中の移植箇所底部で観察された。
【００４５】
２か月後には１か月後の同一グループのものと比較して、より多くの繊維軟骨が観察された。さらに、より多くの繊維軟骨がＣＲＢＴＣＭグループよりＣＲＴＴＣＭグループで観察された。さらに、ＣＲＴＴＣＭグループでは移植箇所で適度な炎症が観察されたが、ＣＲＢＴＣＭグループではわずかな炎症のみが移植箇所で観察された。
【００４６】
３か月後、欠陥はＣＲＴＴＣＭ及びＣＲＢＴＣＭの両グループで類似線維軟骨によって修復された。軟骨移植組織は周囲の隣接した正常な軟骨より薄かった。欠陥の端縁にて、軟骨移植組織は隣接した健康な組織と一体化した。いずれのグループでも炎症反応は観察されなかった。
【００４７】
他の実施形態
本明細書に示された特徴はすべて、任意の組合せとして組み合わせてもよい。本明細書に示された各特徴は、同一、等価、又は類似目的の役割を果たす代替の特徴で置換されてもよい。したがって、特に明示されない場合には、示された各特徴は一般的な一連の等価又は同様の特徴を例示のみするものである。
【００４８】
上記の記載から当業者ならば容易に本発明の本質的な特性を認識し、その精神及び範囲から逸脱することなく、様々な使用法及び条件に適応させるべく本発明の様々な変更及び修飾を加えることが可能である。従って、他の実施形態もまた請求項の範囲内にある。