(57)【要約】【課題】酸性の溶離液を用いた場合でもアルギニン・ほう酸反応により蛍光誘導体を生成することが可能な還元糖分析方法を提供する。【解決手段】試料をカラム４に通して還元糖を分離した後、反応槽８でアルギニンとほう酸を含む反応液と反応させて蛍光誘導体を生成させ、蛍光検出器１０で検出する液体クロマトグラフィーによる還元糖の分析方法において、溶離液として酸性緩衝液を用いると共にこの酸性緩衝液を中和するに足る水酸化ナトリウム等を反応液に添加する。この方法によれば、溶離液が酸性であっても、反応時の溶液のｐＨはアルカリ性となるので、アルギニン・ほう酸反応により蛍光誘導体を生成することが可能である。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を溶離液と共にカラムに通し還元糖を分離した後、アルギニンとほう酸を含む反応液と反応させて蛍光誘導体を生成させ、蛍光検出器で検出する液体クロマトグラフィーによる還元糖の分析方法において、前記溶離液として酸性緩衝液を用いると共に、この酸性緩衝液を中和するに足る水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを前記反応液に添加することを特徴とする還元糖の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品や生化学試料中の糖類、特に還元糖を液体クロマトグラフィーにより分析する分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
還元糖を液体クロマトグラフィーにより分析する従来の方法として、カラムで分離された還元糖をアルギニンとほう酸を含む反応液と反応させて蛍光誘導体を生成させた後、蛍光検出器で検出するポストカラム誘導体化蛍光検出法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
図１は、還元糖を分析するための液体クロマトグラフの流路構成を示すもので、非特許文献１にも同様の構成が示されている。
【０００３】
以下、図１を参照しながらこの分析法の概要を説明する。
同図において、溶離液としてｐＨ８〜９に調整されたほう酸緩衝液が溶離液容器１から送液ポンプ２により試料導入部３を経てカラム４へと送液される。還元糖を含む試料は、試料導入部３からこの溶離液の流れに導入され、恒温槽５内で約６５°Ｃに保たれたカラム４を通過する過程で各成分に分離される。カラム４の出口で、反応液容器６から反応液ポンプ７により送液されるアルギニンとほう酸を含む反応液が混合され、約１５０°Ｃの反応槽８内で試料中の還元糖と反応して蛍光誘導体が生成され、冷却槽９で常温付近まで冷却された後、蛍光検出器１０で還元糖の誘導体が選択的に検出され、検出後の液体は廃液容器１１に排出される。
【０００４】
上記分析法では、反応時の溶液のｐＨはアルカリ性であることが必要で、酸性条件下では蛍光誘導体の生成反応が起こらない。そのため、溶離液としては、上記のようにアルカリ性のほう酸緩衝液を用いることが必要である。
【０００５】
【非特許文献１】「島津評論」、島津製作所、１９８３年、第４０巻第４号、ｐ．２４９〜２５２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の従来分析法において、カラムとしては陰イオン交換型カラム（例えば、商品名ＳｈｉｍｐａｃｋＩＳＡ−０７）が多く用いられるが、このカラムでは一部の糖、例えばフルクトースとアラミノースの相互分離ができないことが問題であった。
近年、溶離液にアセトニトリル・水・りん酸混合溶液を用いることにより、これまで相互分離しなかった還元糖を分離できるアミノ基結合型カラムが登場した（例えば、商品名ＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２Ｐ−５０）。このカラムを用いる場合、上記の溶離液を用いて上述のアルギニン・ほう酸反応を実施すると、蛍光誘導体が生成せず、感度が著しく低下するため、望ましい分離特性を有するにも拘わらず、このカラムを上述の還元糖分析に適用することができなかった。
【０００７】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、りん酸などを含む酸性の溶離液を用いた場合でもアルギニン・ほう酸反応により蛍光誘導体を生成することが可能な分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明方法は、上記課題を解決するために、試料をカラムに通し還元糖を分離した後、アルギニン・ほう酸反応により蛍光誘導体を生成させ、蛍光検出器で検出する液体クロマトグラフィーによる還元糖の分析方法において、溶離液として酸性緩衝液を用いると共にこの酸性緩衝液を中和するに足る水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを前記反応液に添加する。この方法によれば、溶離液が酸性であっても、反応時の溶液はアルカリ性となるので、アルギニン・ほう酸反応により蛍光誘導体を生成することが可能である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明方法によれば、アルギニン・ほう酸反応を用いるポストカラム誘導体化蛍光検出法において、酸性の溶離液を用いることが可能になり、分離条件の制約が著しく緩和されるので、これまで分離できなかった還元糖を相互に分離して高感度検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明が提供する分析方法は次のような特徴を有する。即ち、第１の特徴は、液体クロマトグラフ分離に酸性の溶離液を用いる点にあり、第２の特徴は蛍光誘導体化反応のための反応液に水酸化ナトリウム等を添加するようにした点である。
従って、最良の形態の基本的な構成は、上記２つの要件を具備する還元糖の分析方法である。
【実施例１】
【００１１】
本発明分析法は、前述の従来方法と同じくアルギニン・ほう酸反応を用いるポストカラム誘導体化蛍光検出法の一種であり、本発明分析法を実施するには、図１に示すような従来と同様構成の液体クロマトグラフを用いるが、分析条件が従来と相違する。分析条件は一例として以下のように設定する。
カラム：アミノ基結合型糖分析用カラム
溶離液：アセトニトリル／水／りん酸混合溶液
溶離液流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０°Ｃ
反応液：１％アルギニン・３％ほう酸混合水溶液
適量の水酸化ナトリウムを含む（濃度は後記）
反応液流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
反応温度：１５０°Ｃ
蛍光検出器：励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４３０ｎｍ
【００１２】
反応液に添加する水酸化ナトリウム量は、次のように定める。まず計算により、８５％のりん酸が０．５％含まれる溶離液（りん酸濃度は約０．０７５４ｍｏｌ／Ｌ＝約０．２２５当量／Ｌ）を流量０．８ｍＬ／ｍｉｎで送液する場合、これを中和するに必要な水酸化ナトリウム所要量を、流量０．５ｍＬ／ｍｉｎの場合、濃度０．３６ｍｏｌ／Ｌと算出し、反応効率等を考慮して、実際にはこれより１０％程度過剰に濃度０．４ｍｏｌ／Ｌと設定する。
【００１３】
図３に本発明方法による分析実例を示す。同図においては、反応液中の水酸化ナトリウム濃度を異にする２つのクロマトグラムＡ、Ｂを同一紙面に記録してある。
Ａは、上記計算値よりもやや不足量の水酸化ナトリウム（濃度０．２ｍｏｌ／Ｌ）を添加した場合の分析結果である。溶離液の酸性が完全に中和されないため、蛍光物質が生成
されず、ピークは殆ど検出されない。
Ｂは、上記設定の通り、反応液中の水酸化ナトリウム濃度０．４ｍｏｌ／Ｌとして分析を行った結果である。Ａに比べて明らかに感度が改善されており、本発明の効果がよくわかる。
【００１４】
なお、上記分析条件は例示であって、本発明方法をこれに限定するものではない。例えば、溶離液としてりん酸以外の酸を用いることもでき、また、水酸化ナトリウムの代わりに水酸化カリウムを反応液に添加してもよい。
【００１５】
さらに、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム（以下、総称して水酸化ナトリウム等と記す）は、上記実施例では、予め反応液に添加調製するものとしたが、別個に水酸化ナトリウム等の容器とポンプを設けて、送液中に反応液と混合する方法も可能である。
図２はその場合の流路構成を示すもので、図１の構成に加えて、水酸化ナトリウム等を収めるアルカリ液容器１２と、この容器から水酸化ナトリウム等を送液するアルカリ液ポンプ１３を設け、アルカリ液ポンプ１３の出口側流路を反応液流路に合流させる。なお、同図中で図１と同一符合を付したものは図１と同一物である。
このように構成された装置で本発明方法を実施すれば、水酸化ナトリウム等の添加量はアルカリ液ポンプ１３の送液流量を変えることで調節できるから、例えば溶離液のｐＨや流量などの条件が変更された場合でも容易に対応可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明は食品や生化学試料中の糖類の分析に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明方法を実施するための装置構成例を示す図である。
【図２】本発明方法を実施するための他の装置構成例を示す図である。
【図３】本発明方法による分析実例を示す図である。
【符号の説明】
【００１８】
１  溶離液容器
２  送液ポンプ
３  試料導入部
４  カラム
５  恒温槽
６  反応液容器
７  反応液ポンプ
８  反応槽
９  冷却槽
１０  蛍光検出器
１１  廃液容器
１２  アルカリ液容器
１３  アルカリ液ポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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