(57)【要約】      （修正有）【課題】牛、豚や馬などの哺乳動物のストレスを軽減するとともに、下痢症や胃潰瘍などの消化器疾患を予防・治療することができるラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物およびその微生物を含有する乳酸菌製剤を提供する。【解決手段】ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物を含有する哺乳動物用乳酸菌製剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物を含有することを特徴とする哺乳動物用乳酸菌製剤。
【請求項２】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、配列表の配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（イ）および（ロ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である請求項１記載の哺乳動物用乳酸菌製剤：
（イ）Ｇ＋Ｃ含量が４８．３±２．０ｍｏｌ％
（ロ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）JCM 1002T株およびラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus） JCM 1185TのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
【請求項３】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７０株（寄託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−３８７）である請求項第１項または第２項記載の哺乳動物用乳酸菌製剤。
【請求項４】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、配列表の配列番号２に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ハ）および（ニ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である請求項第１項記載の哺乳動物用乳酸菌製剤：
（ハ）Ｇ＋Ｃ含量が４０．５±２．０ｍｏｌ％
（ニ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・ヴィチュリナス（Lactobacillus vitulinus） JCM 1143T、カテニバクテリウム・ミツオカイ（Catenibacterium mitsuokai）JCM 10609T株およびラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ST18株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
【請求項５】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７１株（寄託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−３８８）である請求項第１項または第４項記載の哺乳動物用乳酸菌製剤。
【請求項６】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、配列表の配列番号３に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ホ）および（ヘ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である請求項第１項記載の哺乳動物用乳酸菌製剤：
（ホ）Ｇ＋Ｃ含量が４５．５±２．０ｍｏｌ％
（ヘ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・ガストリカス（Lactobacillus gustricus） DSM 16045T、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum） JCM 1173T、ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae） JCM 12515T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
【請求項７】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、ラクトバチルス・エクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）ＤＩ８３株（寄託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−３８９）である請求項第１項または第６項記載の哺乳動物用乳酸菌製剤。
【請求項８】
哺乳動物が馬である請求項１ないし７のいずれかの項に記載の乳酸菌製剤。
【請求項９】
配列表の配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ト）および（チ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物：
（ト）Ｇ＋Ｃ含量が４８．３±２．０ｍｏｌ％
（チ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）JCM 1002T株およびラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus） JCM 1185TのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
【請求項１０】
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７０株（寄託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−３８７）である請求項第９項記載の微生物。
【請求項１１】
配列表の配列番号２に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（リ）および（ヌ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物：
（リ）Ｇ＋Ｃ含量が４０．５±２．０ｍｏｌ％
（ヌ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・ヴィチュリナス（Lactobacillus vitulinus） JCM 1143T、カテニバクテリウム・ミツオカイ（Catenibacterium mitsuokai）JCM 10609T株およびラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ST18T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
【請求項１２】
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７１株（寄託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−３８８）である請求項第１１項記載の微生物。
【請求項１３】
配列表の配列番号３に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ル）および（ヲ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物：
（ル）Ｇ＋Ｃ含量が４５．５±２．０ｍｏｌ％
（ヲ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・ガストリカス（Lactobacillus gustricus） DSM 16045T、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum） JCM 1173T、ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae） JCM 12515T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
【請求項１４】
ラクトバチルス・エクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）ＤＩ８３株（寄託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−３８９）である請求項第１３項記載の微生物。
【請求項１５】
請求項９ないし１４の何れかの項記載の微生物を有効成分として含有することを特徴とする哺乳動物の抗ストレス用乳酸菌製剤。
【請求項１６】
哺乳動物が馬である請求項１５の抗ストレス用乳酸菌製剤。
【請求項１７】
哺乳動物（ヒトを除く）に請求項９ないし１４の何れかの項記載の微生物を含有する乳酸菌製剤を投与することを特徴とする哺乳動物（ヒトを除く）のストレス軽減方法。
【請求項１８】
哺乳動物が馬である請求項１７に記載のストレス軽減方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス軽減効果を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する新規微生物およびその微生物を含有する乳酸菌製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚や牛、馬等の家畜は、飼育にあたって様々なストレスに曝され、例えば、競走馬であれば、調教や輸送などにおいて多大なストレスを受け、輸送熱などの症状となって顕れることもある。したがって、日常飼育の中でのストレスを軽減することが望まれていた。
【０００３】
また、家畜の飼育においては、このようなストレス等に起因する下痢症や胃潰瘍などの消化器疾患がしばしば問題となる。これらの消化器疾患は、消化吸収に影響を及ぼし栄養障害につながるため、家畜の発育を阻害する要因となる。したがって、これら哺乳動物のストレスを軽減するとともに、下痢症などの消化器疾患を予防・治療する手段が望まれていた。
【０００４】
近年、馬などの哺乳動物に対して下痢の予防や治療、増体重の促進を目的として、乳酸菌を添加した飼料が使用されている。しかしながら、従来ストレス軽減効果を有する乳酸菌は知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明は、牛や馬などの哺乳動物のストレスを軽減するとともに、下痢症や胃潰瘍などの消化器疾患を予防・治療することができるラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物およびその微生物を含有する乳酸菌製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、優れた競走馬の腸内に常在するラクトバチルス（Lactobacillus）属の分布や構成を調べ、この馬の消化管由来株の分離同定を行う過程で、３種類のラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物の未同定菌株を分離した。そしてその菌株を哺乳動物に投与することにより、優れたストレス軽減効果を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物を含有することを特徴とする哺乳動物用乳酸菌製剤である。
【０００８】
また本発明は、ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、配列表の配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（イ）および（ロ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である哺乳動物用乳酸菌製剤：
（イ）Ｇ＋Ｃ含量が４８．３±２．０ｍｏｌ％
（ロ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）JCM 1002T株およびラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus） JCM 1185TのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満である。
【０００９】
さらに本発明は、配列表の配列番号２に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ハ）および（ニ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である哺乳動物用乳酸菌製剤：
（ハ）Ｇ＋Ｃ含量が４０．５±２．０ｍｏｌ％
（ニ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・ヴィチュリナス（Lactobacillus vitulinus） JCM 1143T、カテニバクテリウム・ミツオカイ（Catenibacterium mitsuokai）JCM 10609T株およびラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ST18T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満である。
【００１０】
さらにまた本発明は、ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、配列表の配列番号３に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ホ）および（ヘ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である哺乳動物用乳酸菌製剤：
（ホ）Ｇ＋Ｃ含量が４５．５±２．０ｍｏｌ％
（ヘ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・ガストリカス（Lactobacillus gustricus） DSM 16045T、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum） JCM 1173T、ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae） JCM 12515T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の乳酸菌は、哺乳動物に投与することにより、優れたストレス軽減効果を発揮し、ストレスに起因する下痢症などの消化器疾患を予防・治療し得るものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の３種の新規な微生物はいずれも、競走馬の糞便より分離されたものである。
健常なサラブレッドの排泄後すぐの新鮮な糞便を、嫌気パック（アネロガスパック：三菱ガス化学製）に入れ、これを糞便が凍結しない７℃以下の冷蔵で運搬した。運搬された糞便を嫌気的な段階希釈法（光岡知足、「腸内菌の世界」、第２版、５３−６５、叢文社、１９８４）で段階希釈し、これの一部をＢＳ寒天培地、ＢＬ寒天培地または変法ＬＢＳ寒天培地（ともに栄研化学製）に塗抹し、嫌気培養した。嫌気培養は、アネロガスパック（三菱ガス化学株式会社）によるガスパック法または二酸化炭素でガス置換したスチール・ウール法（東量三、扇元敬司、須藤恒二、Steel woolを用いる嫌気性培養法、日本細菌学雑誌、17:802-806(1962)；秦興也、田中饒、嫌気性培養法に関する研究 Steel wool法の検討（その1）、日本細菌学雑誌、23:827-832(1968)）により行った。３７℃で４８時間嫌気培養して形成されたコロニーから３種の新規なラクトバチルス属微生物を分離した。以下にこれら微生物の性質を示す。
【００１３】
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７０株の分類学的性質
ラクトバチルス・エスピーＤＩ７０株の（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質および（ｄ）化学分類学的性質について以下に示す。
（ａ）形態的性質
（１）細菌の形：桿菌（湾曲状）
（２）細菌の大きさ：  ０．５〜１×１０〜３０μｍ
（３）先端：円形
（４）配列：単在
（５）胞子：無
（６）運動性：無
【００１４】
（ｂ）培養的性質（生育状態）
ＢＬ寒天培地での３７℃、４８時間嫌気培養により、下記性状のコロニーを生じる。
（１）形状：不定形
（２）大きさ：７〜１０ｍｍ
（３）隆起：扁平状
（４）周縁：樹根状
（５）表面：円滑
（６）構造：均質
（７）色調：褐色
（８）透明度：不透明
（９）硬度：膜状
【００１５】
（ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陽性
（２）カタラーゼ反応：陰性
（３）好気生育：なし
（４）グルコースから産生される乳酸の旋光性：Ｄ型
（５）グルコースからのガス発生：なし
（６）生育の範囲
温度    １５℃  なし
４５℃  わずかにあり
（７）糖類からの酸生成の有無
生育可能な下記組成の液体培地のsugar free培地を作成し、sugar free培地５ｍｌに糖類を０．０５ｇ添加し、完全に溶解して試験培地とした。これに、各糖類を添加し、１２１℃、１５分間高圧蒸気滅菌した。ただし、peptose類（arabinose、ribose、xylose、rhamnose）を含む試験培地は除菌フィルター（０．２μｍ孔径、ザルトリウス）によるフィルター滅菌を行った。増菌した菌液を５０mｌずつ各試験培地に接種し、３７℃のインキュベーターで７２時間嫌気培養した。インキュベーターから取り出し、ボルテックスで各試験培地をよく撹拌した。
１．０ｍｇ／ｍｌ  ＢＣＰ溶液を５００mｌずつ各試験培地に添加し、溶液が黄色に変化したものを陽性とした。
【００１６】
（sugar free ABCMブイヨン培地）
Bacto（商標）Peptone（ペプトン、BD）                                  10g
Tryptone（トリプトン、ナカライテスク）                                10g
Peptone,  Soy（ソイペプトン、ナカライテスク）                          3g
Dipotassium Hydrogenphosphate（リン酸水素二カリウム、ナカライテスク）  2.5g
Extract Yeast Dried（乾燥酵母エキス、ナカライテスク）                  5g
Lab-lemco powder  （Oxoid）                                            3g
Sodium Chloride（塩化ナトリウム、ナカライテスク）                      2g
L-cystein HCl・H2O（L-システイン塩酸塩・一水和物、ナカライテスク）    0.3g
Sodium Thioglycolate(チオグリコール酸ナトリウム、ナカライテスク)      0.3g
Hemin from Bovine（ヘミン（ウシ）、ナカライテスク）                    0.005g
精製水                                                            1,000ml
【００１７】
（Sugar free MRS液体培地）
Bacto（商標）Peptone（ペプトン、BD）                                  10g
Lab-lemco powder  （Oxoid）                                            8g
Extract Yeast Dried（乾燥酵母エキス、ナカライテスク）                  4g
Tween 80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオエレート、ナカライテスク）  1ml
Dipotassium Hydrogenphosphate（リン酸水素二カリウム、ナカライテスク）  2g
Sodium Acetate Trihydrate（酢酸ナトリウム・三水和物、ナカライテスク）  5g
tri-Ammonium Citrate（クエン酸三アンモニウム、ナカライテスク）          2g
Magnesium Sulfate・7H2O（硫酸マグネシウム・七水和物、関東化学）        0.2g
Manganese Sulfate Pentahydrate
（硫酸マンガン・五水和物、ナカライテスク）                            0.054g
精製水                                                            1,000ml
【００１８】
（＋：酸生成あり、Ｗ：酸生成わずかにあり、−：酸生成なし）
Ｌ−アラビノース      −
Ｄ−リボース          −
Ｄ−キシロース        −
グルコネート          −
グルコース            ＋
フルクトース          ＋
ガラクトース          ＋
マンノース            ＋
ラムノース            −
セロビオース          ＋
ラクトース            ＋
メリビオース          Ｗ
ラフィノース          Ｗ
サリシン              ＋
トレハロース          −
メレジトース          −
マンニトール          ＋
ソルビトース          −
スターチ              Ｗ
【００１９】
また生理学的性質について、近縁菌種の基準株（L. delbrueckii subsp. bulgaricus
JCM 1002TおよびL. crispatus JCM 1185T ）と比較した。結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
2009100692.tif 000002
【００２１】
（ｄ）化学分類学的性質
（１）Ｇ＋Ｃ含量
Mesbahらの方法（Mesbah, M., U. Premachandran, and W. E. Whitman. Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography. Int. J. Syst. Bacteriol. 39: 159-167, 1989）によって測定した。
Ｇ＋Ｃ含量：４８．３±２．０ｍｏｌ％
（２）細胞壁のペプチドグリカンタイプ：Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｓｐ（Ａ４α）
（３）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列の相同性
（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定方法）
コロニーＰＣＲにより、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）により全１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を決定した。以下の２７Ｆ、７５Ｒ、５２０Ｆ、５２０Ｒ、９３０Ｆ、８００Ｒ、１１００Ｆ、１１００Ｒのプライマーを用いた。
＜１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子増幅用および塩基配列決定用ＰＣＲプライマー＞
２７Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
７５Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
ＧＡＣＴＴ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’ 
９３０Ｆ：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
８００Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’
【００２２】
決定したラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７０株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の塩基配列１に示す。
【００２３】
（相同性検索）
このラクトバチルス・エスピーＤＩ７０株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。この結果、最も近縁のL. delbrueckii subsp. bulgaricus JCM 1002T株（アクセッションナンバーＡＢ００７９０８）との相同性は９６％であった。配列表の塩基配列１に対し相同性９７％以上であれば、本発明の微生物に含まれる。
【００２４】
（系統解析）
さらに解析ソフトＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗにより系統樹を作成した。図１は、既知のラクトバチルス属微生物とラクトバチルス・エスピーＤＩ７０株との関係を示した系統樹の図である。図中の分岐点に示された数値は、ブートストラップ信頼値であり、また括弧内の記号はアクセッションナンバーを表す。
【００２５】
（４）近縁種とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション方法は、Ｅｚａｋｉらの蛍光検出によるマイクロプレート法（Int. J.Syst. Bacteriol.,３９，２２４−２２９、１９８９）により行った。２株の近縁菌種の基準株（L. delbrueckii subsp. bulgaricus JCM 1002TおよびL. crispatus JCM 1185T）を、ラクトバチルス・エスピーＤＩ７０株と比較するのに使用した。
【００２６】
（ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性）
L. delbrueckii subsp. bulgaricus JCM 1002T：４３％
L. crispatus JCM 1185T：１６％
【００２７】
一般的に６０％以上のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を持つ菌群を同一菌種とされる。しかしながら、ラクトバチルス・エスピーＤＩ７０株は、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が５０％未満の低い相同性しか示さなかった。本願発明の微生物には、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満のものが含まれる。
【００２８】
以上の化学分類学的性質により、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７０株は、いままでに報告されていない新規な乳酸菌であると判断された。このラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７０株を平成１９年８月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、微生物寄託番号  ＮＩＴＥ  （Ｐ−３８７）として寄託した。
【００２９】
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７１株の分類学的性質：
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７１株の（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質および（ｄ）化学分類学的性質について以下に示す。
（ａ）形態的性質
（１）細菌の形：桿菌
（２）細菌の大きさ：  １〜１．５×３〜５μｍ
（３）先端：円形
（４）配列：単在
（５）胞子：無
（６）運動性：無
【００３０】
（ｂ）培養的性質（生育状態）
ＢＬ寒天培地での３７℃、４８時間嫌気培養により、下記性状のコロニーを生じる。
（１）形状：円形
（２）大きさ：２〜３ｍｍ
（３）隆起：円錐状
（４）周縁：円滑
（５）表面：円滑
（６）構造：顆粒状
（７）色調：褐色
（８）透明度：不透明
（９）硬度：粘稠
【００３１】
（ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陽性
（２）カタラーゼ反応：陰性
（３）好気生育：なし
（４）グルコースから産生される乳酸の旋光性：Ｄ型
（５）グルコースからのガス発生：あり
（６）生育の範囲
温度    １５℃  なし
４５℃  あり
（７）糖類からの酸生成の有無
上記と同様の方法により試験した。
（＋酸生成あり、Ｗ酸生成わずかにあり、−酸生成なし）
Ｌ−アラビノース      −
Ｄ−リボース          −
Ｄ−キシロース        −
グルコネート          ＋
グルコース            ＋
フルクトース          ＋
ガラクトース          ＋
マンノース            ＋
ラムノース            −
セロビオース          ＋
ラクトース            ＋
メリビオース          ＋
ラフィノース          ＋
サリシン              ＋
トレハロース          ＋
メレジトース          −
マンニトール          −
ソルビトース          −
スターチ              Ｗ
【００３２】
また生理学的性質について、近縁菌種の基準株（L. vitulinus JCM 1143T、Catenibacterium mitsuokai JCM 10609 T株、Lactobacillus sp. ST18株（NITE P-300））と比較した。結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
2009100692.tif 000003
【００３４】
（ｄ）化学分類学的性質
下記項目について上述した方法によって調べた。
（１）Ｇ＋Ｃ含量
Ｇ＋Ｃ含量：４０．５±２．０ｍｏｌ％
（２）細胞壁のペプチドグリカンタイプ：ｍｅｓｏ−ＤＡＰ型
（３）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列の相同性
【００３５】
決定したラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７０株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の塩基配列２に示す。
【００３６】
（相同性検索）
最も近縁のL. vitulinus JCM 1143T（アクセッションナンバーＭ２３７２３）との相同性は９２％であった。配列表の塩基配列２に対し相同性９７％以上であれば、本発明の微生物に含まれる。
【００３７】
（系統解析）
図２は、既知のラクトバチルス属微生物とラクトバチルス・エスピーＤＩ７１株との関係を示した系統樹の図である。図中の分岐点に示された数値は、ブートストラップ信頼値であり、また括弧内の記号はアクセッションナンバーを表す。
【００３８】
（４）近縁種とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性
３株の近縁菌種の基準株（L. vitulinus JCM 1143T、Catenibacterium mitsuokai JCM 10609T株、Lactobacillus sp. ST18株（ＮＩＴＥ  Ｐ−３００））を、ラクトバチルス・エスピーＤＩ７１株と比較するのに使用した。
【００３９】
（ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性）
L. vitulinus JCM 1143T：４５％
Catenibacterium mitsuokai JCM 10609 T：２４％
Lactobacillus sp. ST18株（NITE P-300）：９％
【００４０】
ラクトバチルス・エスピーＤＩ７１株は、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が５０％未満の低い相同性しか示さなかった。本願発明の微生物には、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満のものが含まれる。
【００４１】
以上の化学分類学的性質により、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７１株は、いままでに報告されていない新規な乳酸菌であると判断された。このラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７１株を平成１９年８月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、微生物寄託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−３８８として寄託した。
【００４２】
ラクトバチルス・エクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）ＤＩ８３株
の分類学的性質：
ラクトバチルス・エクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）ＤＩ８３株の（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質および（ｄ）化学分類学的性質について以下に示す。
（ａ）形態的性質
（１）細菌の形：球状
（２）細菌の大きさ：  ０．５〜１×０．５〜１．５μｍ
（３）先端：円形
（４）配列：束状
（５）胞子：無
（６）運動性：無
【００４３】
（ｂ）培養的性質（生育状態）
ＭＲＳ寒天培地での３７℃、４８時間嫌気培養により、下記性状のコロニーを生じる。
（１）形状：円形
（２）大きさ：３〜５ｍｍ
（３）隆起：扁平状
（４）周縁：円滑
（５）表面：円滑
（６）構造：均質
（７）色調：白色
（８）透明度：半透明
（９）硬度：脂状
【００４４】
（ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陽性
（２）カタラーゼ反応：陰性
（３）好気生育：あり
（４）グルコースから産生される乳酸の旋光性：ＤＬ型
（５）グルコースからのガス発生：なし
（６）生育の範囲
温度    １５℃  なし
４５℃  なし
（７）糖類からの酸生成の有無
ＡＰＩ  ５０  ＣＨ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＢｉｏＭｅｒｅｕｘ社製）を用いた。
（＋酸生成あり、Ｗ酸生成わずかにあり、−酸生成なし）
Ｌ−アラビノース      −
Ｄ−リボース          −
Ｄ−キシロース        −
グルコネート          Ｗ
グルコース            ＋
フルクトース          Ｗ
ガラクトース          −
マンノース            −
ラムノース            −
セロビース            −
ラクトース            ＋
メリビオース          ＋
ラフィノース          ＋
サリシン              −
トレハロース          −
メレジトース          −
マンニトール          −
ソルビトース          −
スターチ              −
【００４５】
また生理学的性質について、近縁菌種の基準株（L. gustricus DSM 16045T、L. fermentum JCM 1173T、L. mucosae JCM 12515T）と比較した。結果を表３に示す。
【００４６】
【表３】
2009100692.tif 000004
【００４７】
（ｄ）化学分類学的性質
下記項目について上述の方法により調べた。
（１）Ｇ＋Ｃ含量
Ｇ＋Ｃ含量：４５．５±２．０ｍｏｌ％
（２）細胞壁のペプチドグリカンタイプ：グルタミン酸−アラニン−リジンを含む
（３）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列の相同性
【００４８】
決定したラクトバチルス・エクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）ＤＩ８３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の塩基配列３に示す。
【００４９】
（相同性検索）
このラクトバチルス・エクイジェネロシＤＩ８３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。この結果、最も近縁のL. gustricus DSM 16045T（アクセッションナンバーＡＹ２５３６５７）との相同性は９８％であった。配列表の塩基配列３に対し相同性９７％以上であれば、本発明の微生物に含まれる。
【００５０】
（系統解析）
図３は、既知のラクトバチルス属微生物とラクトバチルス・エクイジェネロシＤＩ８３株との関係を示した系統樹の図である。図中の分岐点に示された数値は、ブートストラップ信頼値であり、また括弧内の記号はアクセッションナンバーを表す。
【００５１】
（４）近縁種とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性
３株の近縁菌種の基準株（L. gustricus DSM 16045T、L. fermentum JCM 1173T、L. mucosae JCM 12515T）を、ラクトバチルス・エクイジェネロシＤＩ８３株と比較するのに使用した。
【００５２】
（ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性）
L. gustricus DSM 16045T：３２％
L. fermentum JCM 1173T：１６％
L. mucosae JCM 12515T ：９％
【００５３】
ラクトバチルス・エクイジェネロシＤＩ８３株は、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が４０％未満の低い相同性しか示さなかった。本願発明の微生物には、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満のものが含まれる。
【００５４】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属の細胞形態は、桿菌であると一般に認識されている。ラクトバチルス・ガストリカス（Lactobacillus gustricus） DSM 16045Tも桿菌である、とする論文もあるが（Roos S, Engstrand L, and Jonsson H., Lactobacillus gastricus sp. nov., Lactobacillus antri sp. nov., Lactobacillus kalixensis sp. nov. and Lactobacillus ultunensis sp. nov., isolated from human stomach mucosa, Int. J. Syst. Evol. Microbiol.,55: 77-82, 2005.）、この菌種の細胞形態は球菌である。細胞形態は球菌であるが、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の系統樹はLactobacillusのクラスターに存在するので、Lactobacillus属が妥当である。このLactobacillus gastricusに近縁であるＤＩ８３株も、細胞形態は球菌であるが、Lactobacillus属が妥当と判断された。
【００５５】
以上の生理学的、化学分類学的性質等により、ＤＩ８３株は、いままでに報告されていない新規な乳酸菌であると判断され、ラクトバチルス・エクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）と命名された。このラクトバチルス・エクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）ＤＩ８３株を平成１９年８月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、微生物寄託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−３８９として寄託した。
【００５６】
上記３種の本発明の微生物を得るには、通常の培養方法に準じて培養を行えばよい。例えばラクトバチルス・エスピーＤＩ７０および７１株は、ＡＢＣＭブイヨン培地に接種し、３７℃で１４時間程度嫌気培養して得られる。また、ラクトバチルス・エクイジェネロシＤＩ８３株は、ＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で１４時間程度嫌気培養して得ることができる。嫌気培養は、アネロガスパック（三菱ガス化学株式会社）によるガスパック法や、二酸化炭素でガス置換したスチール・ウール法（東量三、扇元敬司、須藤恒二、steel woolを用いる嫌気性培養法、日本細菌学雑誌、17:802-806(1962)；秦興也、田中饒、嫌気性培養法に関する研究 steel wool法の検討（その1）、日本細菌学雑誌、23:827-832(1968)）により行うことができる。
【００５７】
本発明の乳酸菌製剤は、上記のように培養した本発明の３種の新規乳酸菌の培養液をそのまま用いることもできるが、遠心分離等の手段を用いて集菌した菌体をスキムミルク等に分散して懸濁液として用いてもよい。さらに、培養液や懸濁液を凍結乾燥等により乾燥させた乾燥菌体として用いることもできる。
【００５８】
本発明の乳酸菌製剤の剤型としては特に限定はなく、錠剤、粉剤、粒剤、カプセル、ペレット、液剤等の任意の剤型とすることができ、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、シュクロース、スキムミルク等の賦形剤やその他フラクトオリゴ糖など各種のプレバイオティクス成分等の任意成分を配合することもできる。
【００５９】
かくして得られた本発明の新規乳酸菌を哺乳動物に投与することにより、乳酸菌が消化管に付着・定着し、ストレスを軽減し、下痢や胃潰瘍などの消化器疾患を予防・治療することができる。新規乳酸菌の投与量は、例えば馬の場合１頭当たり１日に１×１０7〜１×１０9ｃｆｕ（コロニー形成単位）程度、特に１×１０8〜１×１０10ｃｆｕ程度が好ましい。
【００６０】
本発明の乳酸菌製剤の投与対象である哺乳動物としては、馬、牛、豚、ヒツジ、山羊等が挙げられる。種々の哺乳動物のストレス反応に関して、ラット、マウス、ブタ、ヒト、サルなどを対象とし、ストレス―腸内環境（乳酸菌、ビフィズス菌など）―神経系の相互作用は、各哺乳動物でも共通した方向であることが示唆されている（須藤信行、ストレスと腸内フローラ、腸内細菌学会誌、19：25−29、2005）。また、腸内環境を考える際、経口投与されるラクトバチルス（Lactobacillus）属はその腸管定着性や効果が宿主特異的であることが知られており、本発明の３菌種は、すべてサラブレッドの消化管から新菌種として分離されていることから、特にウマに対してストレス軽減効果を発揮するものである。
【００６１】
本発明の乳酸菌製剤は、哺乳動物に直接、経口投与してもよく、飼料や餌等に混ぜて投与してもよい。
【００６２】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６３】
実  施  例  １
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７０株の培養：
ＡＢＣＭブイヨン培地（栄研社製）に、ＢＬ寒天培地（栄研社製）で３７℃、４８時間培養したラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７０株のコロニーを接種し、３７℃、１４時間、アネロガスパック（三菱ガス化学株式会社）によるガスパック法により嫌気培養した。培養後の菌数は、５．５×１０８個／ｍｌであった。
【００６４】
実  施  例  ２
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７１株の培養：
ＡＢＣＭブイヨン培地（栄研社製）に、ＢＬ寒天培地（栄研社製）で３７℃、４８時間培養したラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７１株のコロニーを接種し、３７℃、１４時間、アネロガスパック（三菱ガス化学株式会社）によるガスパック法により嫌気培養した。培養後の菌数は、４．０×１０８個／ｍｌであった。
【００６５】
実  施  例  ３
ラクトバチルス・エクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）ＤＩ８３
株の培養：
ＭＲＳ液体培地（栄研社製）に、ＢＬ寒天培地（栄研社製）で３７℃、４８時間培養したラクトバチルス・エクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）ＤＩ８３株のコロニーを接種し、３７℃、１４時間、アネロガスパック（三菱ガス化学株式会社）によるガスパック法により嫌気培養した。培養後の菌数は、２．３×１０８個／ｍｌであった。
【００６６】
試  験  例  １
拘束ストレス試験：
ラットに拘束ストレスを負荷し、血中コルチコステロンの濃度を測定することによりストレス軽減効果を評価した。金属製の拘束装置を用い、ラットを８時間（午前０時〜午前８時）拘束した。拘束の前後で尾静脈からの採血を行いコルチコステロンの血中濃度を測定した。コルチコステロン量の測定は、ＡＣＴＩＶＥ  Ｒａｔ  Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（ＤＳＬ社、１０−８１１００）を用いてイムノアッセイ法で測定した。試験群には、実施例１ないし３で得られた１０の８乗レベルとなる量のラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７０株およびＤＩ７１株、ラクトバチルス・エクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）ＤＩ８３株をそれぞれ５日間連続で経口投与した（ｎ＝６）。乳酸菌を与えない群をコントロールとした。５日目に拘束ストレスをかけ、前日の血中コルチコステロン濃度と拘束ストレス負荷後の血中コルチコステロン濃度を求めた。結果を図４に示す。
【００６７】
哺乳動物はストレスがかかると、血液中のコルチコステロン濃度が上昇する。コントロール群および各乳酸菌投与群ともにストレス負荷をかける前は、図のとおり４３〜１０５  ｎｇ／ｍｌの範囲であった。血中コルチコステロン量は、コントロール群は、ストレス負荷後に有意に上昇しており、有効なストレス刺激が負荷されたことが確認された。ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７０株およびＤＩ７１株、ラクトバチルス・エクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）ＤＩ８３株投与群はいずれもコントロール群に比べて血中コルチコステロン濃度は有意に低くなり、ストレス軽減効果を認められた。
【００６８】
試  験  例  ２
強制水泳ストレス試験：
直径２０ｃｍ、高さ５０ｃｍのプラスチック製の円筒に２７℃の水を４０ｃｍまで入れ、ラットを１５分間強制水泳させ、強制水泳前後で尾静脈から採血し血中コルチコステロン量を測定した。試験群には、実施例１ないし３で得られた１０の８乗レベルとなる量のラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＤＩ７０株およびＤＩ７１株、ラクトバチルス・エクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）ＤＩ８３株をそれぞれ５日間連続で経口投与した（ｎ＝６）。乳酸菌を与えない群をコントロールとした。５日目に強制水泳させ、前日の血中コルチコステロン濃度と強制水泳ストレス負荷後の血中コルチコステロン濃度を求めた。結果を図４に併せて示す。
【００６９】
血中コルチコステロン量は、コントロール群はストレス負荷後に有意に上昇しており、有効なストレス刺激が負荷されたことが確認された。乳酸菌投与群はそれぞれコントロール群に比べ血中コルチコステロン量が有意に抑制され、ラットのストレス軽減効果があることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明のラクトバチルス属微生物は、馬などの哺乳動物に投与することによってそのストレスを軽減することができ、ストレスに起因する下痢や胃潰瘍など消化器疾患の予防・治療効果を有するものである。
【００７１】
したがって、本発明のラクトバチルス属微生物は、馬などの哺乳動物に投与する乳酸菌製剤として有利に利用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】既知のラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物とラクトバチルスＤＩ７０株との関係を示した系統樹である。
【図２】既知のラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物とラクトバチルスＤＩ７１株との関係を示した系統樹である。
【図３】既知のラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物とラクトバチルスＤＩ８３株との関係を示した系統樹である。
【図４】試験例１における、拘束ストレス負荷前後の各乳酸菌投与群とコントロール群の血中コルチコステロン濃度および試験例２における、強制水泳ストレス負荷前後の各乳酸菌投与群とコントロール群の血中コルチコステロン濃度を示す図である。
【図１】
2009100692.tif 000005
【図２】
2009100692.tif 000006
【図３】
2009100692.tif 000007
【図４】
2009100692.tif 000008
【配列表】
2009100692000001.app