(57)【要約】【課題】高い物理的安定性を有する酵素固定材料、酵素反応用カートリッジ及び当該酵素固定材料の製造方法を提供する。【解決手段】連通孔を有する多孔質体よりなる基材１と、記基材１の表面部に結合され、基材１の内部には非結合されたグラフト高分子鎖４と、グラフト高分子鎖４に固定された酵素５と、を備えて、酵素固定材料１０を構成した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
連通孔を有する多孔質体よりなる基材と、
前記基材の表面部に結合され、前記基材の内部には非結合されたグラフト高分子鎖と、
前記グラフト高分子鎖に固定された酵素と、
を備えることを特徴とする酵素固定材料。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素固定材料において、
前記基材は、厚さが１〜１０ｍｍ、前記連通孔の平均細孔径が０．５〜５μｍ及び前記連通孔の体積分率が７０〜８５％のシート状のものであることを特徴とする酵素固定材料。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の酵素固定材料において、
前記基材は、ポリオレフィンから構成されたものであることを特徴とする酵素固定材料。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料をカートリッジに充填して構成されていることを特徴とする酵素反応用カートリッジ。
【請求項５】
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料の製造方法において、
前記基材に電離放射線を照射する照射ステップと、
次いで、所定の官能基を有する重合性単量体を前記基材にグラフト重合することによって、当該所定の官能基を有するグラフト高分子鎖を当該基材に結合させるグラフト重合ステップと、
次いで、前記所定の官能基の少なくとも一部を、前記酵素を吸着するための吸着用官能基に変換することによって、当該所定の官能基を有するグラフト高分子鎖を、当該吸着用官能基を有するグラフト高分子鎖に変換する変換ステップと、
次いで、前記吸着用官能基に前記酵素を吸着させることによって、当該酵素を前記基材に結合されたグラフト高分子鎖に固定する固定ステップと、
を備えることを特徴とする製造方法。
【請求項６】
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料の製造方法において、
前記基材と所定の官能基を有する重合性単量体とを共存させた状態で、当該基材に電離放射線を照射し、当該所定の官能基を有する重合性単量体を当該基材にグラフト重合することによって、当該所定の官能基を有するグラフト高分子鎖を当該基材に結合させる照射・グラフト重合ステップと、
次いで、前記所定の官能基の少なくとも一部を、前記酵素を吸着するための吸着用官能基に変換することによって、当該所定の官能基を有するグラフト高分子鎖を、当該吸着用官能基を有するグラフト高分子鎖に変換する変換ステップと、
次いで、前記吸着用官能基に前記酵素を吸着させることによって、当該酵素を前記基材に結合されたグラフト高分子鎖に固定する固定ステップと、
を備えることを特徴とする製造方法。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の製造方法において、
前記グラフト高分子鎖が有する前記所定の官能基を、親水性官能基に変換することによって、前記基材に結合されたグラフト高分子鎖を親水化する親水化ステップを備えることを特徴とする製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料の製造方法において、
前記基材に電離放射線を照射する照射ステップと、
次いで、前記酵素を吸着するための吸着用官能基を有する重合性単量体を前記基材にグラフト重合することによって、当該吸着用官能基を有するグラフト高分子鎖を当該基材に結合させるグラフト重合ステップと、
次いで、前記吸着用官能基に前記酵素を吸着させることによって、当該酵素を前記基材に結合されたグラフト高分子鎖に固定する固定ステップと、
を備えることを特徴とする製造方法。
【請求項９】
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料の製造方法において、
前記基材と前記酵素を吸着するための吸着用官能基を有する重合性単量体とを共存させた状態で、当該基材に電離放射線を照射し、当該吸着用官能基を有する重合性単量体を当該基材にグラフト重合することによって、当該吸着用官能基を有するグラフト高分子鎖を当該基材に結合させる照射・グラフト重合ステップと、
次いで、前記吸着用官能基に前記酵素を吸着させることによって、当該酵素を前記基材に結合されたグラフト高分子鎖に固定する固定ステップと、
を備えることを特徴とする製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素固定材料、酵素反応用カートリッジ及び製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、穏和な条件下で化学反応を進めることができる、基質特異性を有する、反応特異性を有するなどの優れた能力を有する高性能な化学反応触媒である。
【０００３】
酵素を触媒とした化学反応（酵素反応）を利用するための技術として、酵素を固定した樹脂を用いる技術が知られている。具体的には、酵素が固定された樹脂をカラムに充填し、カラムに基質が溶解する基質溶液を透過させることによって、基質と酵素とを接触させ、生成物を得る技術が知られている。
これらの樹脂はビーズ状であるため、樹脂内部の酵素まで基質が拡散するのに時間を要する。したがって、基質溶液を高速で透過させると基質が樹脂内部の酵素と接触できずに流出してしまうため、基質溶液を高速で透過することができず、処理に時間がかかるという問題がある。
また、酵素を樹脂に固定することによって、酵素の立体構造が変化してしまい、酵素活性が低下するという問題もある。
【０００４】
そこで、酵素活性が高く、且つ、高速で反応を行える反応効率の高い酵素固定材料として、放射線グラフト重合法を適用して作成した酵素固定材料が提案された（例えば、特許文献１及び２参照）。グラフト重合法は、さまざまな形状や材質の高分子基材に、高密度にグラフト（接ぎ木）高分子鎖を付与できる手法として知られている。
具体的には、特許文献１及び２では、多孔性基材膜（多孔性平膜や多孔性中空糸膜）の細孔表面に付与されたグラフト高分子鎖に、酵素を固定化することによって作成された酵素固定材料が提案されている。
【特許文献１】特開平０９−１９１８７７号公報
【特許文献２】特開２００２−０５１７７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１及び２の酵素固定材料は、多孔性基材膜の全体（多孔性基材膜の膜厚方向全体）にグラフト高分子鎖が付与（結合）されている。基材にグラフト高分子鎖が結合すると、その部分は基材の組織が分断されて緻密性に欠け、基材の剛性が低下する。そのため、グラフト高分子鎖が結合された部分は、溶媒に対する膨潤度が大きくなるとともに、物理的強度が低下する。したがって、特許文献１及び２の酵素固定材料のように基材の全体にグラフト高分子鎖が結合された材料は、物理的安定性の低い材料になってしまう。
【０００６】
本発明の課題は、高い物理的安定性を有する酵素固定材料、酵素反応用カートリッジ及び当該酵素固定材料の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、
酵素固定材料において、
連通孔を有する多孔質体よりなる基材と、
前記基材の表面部に結合され、前記基材の内部には非結合されたグラフト高分子鎖と、
前記グラフト高分子鎖に固定された酵素と、
を備えることを特徴とする。
【０００８】
請求項２に記載の発明は、
請求項１に記載の酵素固定材料において、
前記基材は、厚さが１〜１０ｍｍ、前記連通孔の平均細孔径が０．５〜５μｍ及び前記連通孔の体積分率が７０〜８５％のシート状のものであることを特徴とする。
【０００９】
請求項３に記載の発明は、
請求項１又は２に記載の酵素固定材料において、
前記基材は、ポリオレフィンから構成されたものであることを特徴とする。
【００１０】
請求項４に記載の発明は、
酵素反応用カートリッジにおいて、
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料をカートリッジに充填して構成されていることを特徴とする。
【００１１】
請求項５に記載の発明は、
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料の製造方法において、
前記基材に電離放射線を照射する照射ステップと、
次いで、所定の官能基を有する重合性単量体を前記基材にグラフト重合することによって、当該所定の官能基を有するグラフト高分子鎖を当該基材に結合させるグラフト重合ステップと、
次いで、前記所定の官能基の少なくとも一部を、前記酵素を吸着するための吸着用官能基に変換することによって、当該所定の官能基を有するグラフト高分子鎖を、当該吸着用官能基を有するグラフト高分子鎖に変換する変換ステップと、
次いで、前記吸着用官能基に前記酵素を吸着させることによって、当該酵素を前記基材に結合されたグラフト高分子鎖に固定する固定ステップと、
を備えることを特徴とする。
【００１２】
請求項６に記載の発明は、
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料の製造方法において、
前記基材と所定の官能基を有する重合性単量体とを共存させた状態で、当該基材に電離放射線を照射し、当該所定の官能基を有する重合性単量体を当該基材にグラフト重合することによって、当該所定の官能基を有するグラフト高分子鎖を当該基材に結合させる照射・グラフト重合ステップと、
次いで、前記所定の官能基の少なくとも一部を、前記酵素を吸着するための吸着用官能基に変換することによって、当該所定の官能基を有するグラフト高分子鎖を、当該吸着用官能基を有するグラフト高分子鎖に変換する変換ステップと、
次いで、前記吸着用官能基に前記酵素を吸着させることによって、当該酵素を前記基材に結合されたグラフト高分子鎖に固定する固定ステップと、
を備えることを特徴とする。
【００１３】
請求項７に記載の発明は、
請求項５又は６に記載の製造方法において、
前記グラフト高分子鎖が有する前記所定の官能基を、親水性官能基に変換することによって、前記基材に結合されたグラフト高分子鎖を親水化する親水化ステップを備えることを特徴とする。
【００１４】
請求項８に記載の発明は、
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料の製造方法において、
前記基材に電離放射線を照射する照射ステップと、
次いで、前記酵素を吸着するための吸着用官能基を有する重合性単量体を前記基材にグラフト重合することによって、当該吸着用官能基を有するグラフト高分子鎖を当該基材に結合させるグラフト重合ステップと、
次いで、前記吸着用官能基に前記酵素を吸着させることによって、当該酵素を前記基材に結合されたグラフト高分子鎖に固定する固定ステップと、
を備えることを特徴とする。
【００１５】
請求項９に記載の発明は、
請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料の製造方法において、
前記基材と前記酵素を吸着するための吸着用官能基を有する重合性単量体とを共存させた状態で、当該基材に電離放射線を照射し、当該吸着用官能基を有する重合性単量体を当該基材にグラフト重合することによって、当該吸着用官能基を有するグラフト高分子鎖を当該基材に結合させる照射・グラフト重合ステップと、
次いで、前記吸着用官能基に前記酵素を吸着させることによって、当該酵素を前記基材に結合されたグラフト高分子鎖に固定する固定ステップと、
を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
請求項１に記載の発明によれば、酵素固定材料は、連通孔を有する多孔質体よりなる基材と、基材の表面部に結合され、基材の内部には非結合されたグラフト高分子鎖と、グラフト高分子鎖に固定された酵素と、を備えている。すなわち、酵素固定材料は、グラフト高分子鎖が結合された表面部と、グラフト高分子鎖が非結合された内部と、の２層構造で構成されている。したがって、グラフト高分子鎖が非結合された内部は、基材自体の物理的・化学的特性を維持しており、グラフト高分子鎖が結合された表面部の支持体としての役割を果たすため、グラフト高分子鎖が基材の全体に結合された従来の酵素固定材料よりも高い物理的安定性を有する。
また、基材は、連通孔を有する多孔質体よりなるため、例えば、本発明の酵素固定材料に、基質が溶解した基質溶液を透過させるだけで、酵素反応を行わせることができる。さらに、基質は、連通孔を通っている間に、連通孔内に配置されたグラフト高分子鎖に固定された酵素まで容易にアクセスできる。したがって、基質が酵素と接触せずに酵素固定材料を通り抜けてしまうことが少なく、高速処理が可能な反応効率の高い酵素固定材料を構成することができる。
【００１７】
請求項２に記載の発明によれば、請求項１に記載の発明と同様の効果が得られることは無論のこと、基材は、厚さが１〜１０ｍｍのシート状のものであり、多孔性中空糸膜や多孔性平膜を基材とした従来の酵素固定材料と比較して厚みがある。したがって、物理的強度が高い酵素固定材料を構成することができるとともに、取り扱い性に優れた酵素固定材料を構成することができる。
さらに、基材は、連通孔の平均細孔径が０．５〜５μｍ及び連通孔の体積分率が７０〜８５％のシート状のものであり、微細な連通孔を多数有している。したがって、基質溶液を高速で透過させることができるとともに、基質溶液を高速で透過させたとしても、基質が連通孔を通っている間に連通孔内に配置されたグラフト高分子鎖に固定された酵素まで容易にアクセスできる構成であるため、高速処理が可能な反応効率の高い酵素固定材料を構成することができる。
【００１８】
請求項３に記載の発明によれば、請求項１又は２に記載の発明と同様の効果が得られることは無論のこと、基材は、ポリオレフィンから構成されている。したがって、物理的・化学的安定性に優れた酵素固定材料を構成することができる。また、基材自体の反応性が低く、酵素をグラフト高分子鎖に選択的に固定できるため、酵素の立体構造を変化させることなく、酵素を安定的に固定することができる。
【００１９】
請求項４に記載の発明によれば、酵素反応用カートリッジは、請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料をカートリッジに充填して構成されているため、使い勝手が良い。
【００２０】
請求項５に記載の発明によれば、照射ステップと、グラフト重合ステップと、変換ステップと、固定ステップと、だけを備える簡単な方法で、請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料を製造することができる。
【００２１】
請求項６に記載の発明によれば、照射・グラフト重合ステップと、変換ステップと、固定ステップと、だけを備える簡単な方法で、請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料を製造することができる。
【００２２】
請求項７に記載の発明によれば、請求項５又は６に記載の発明と同様の効果が得られることは無論のこと、親水化されたグラフト高分子鎖を備える酵素固定材料を製造することができる。したがって、グラフト高分子鎖自体の反応性を低下させることができ、酵素を吸着用官能基に選択的に吸着させることによってグラフト高分子鎖に固定できるため、酵素の立体構造を変化させることなく、酵素を安定的に固定することができる。
【００２３】
請求項８に記載の発明によれば、照射ステップと、グラフト重合ステップと、固定ステップと、だけを備える簡単な方法で、請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料を製造することができる。
【００２４】
請求項９に記載の発明によれば、照射・グラフト重合ステップと、固定ステップと、だけを備える簡単な方法で、請求項１〜３の何れか一項に記載の酵素固定材料を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、図を参照して、本発明を実施するための最良の形態を詳細に説明する。なお、発明の範囲は、図示例に限定されない。
【００２６】
＜酵素固定材料、酵素反応用カートリッジ及び酵素固定材料の製造方法＞
図１に、酵素固定材料１０の製造経路の一例を示し、図２に、酵素反応用カートリッジ１００の一例を示す。
酵素固定材料１０は、酵素５が有する基質特異性や反応特異性を利用して、例えば、有用な生成物の生産や無用な基質の消費（除去）などを行う固定化酵素バイオリアクターである。
酵素固定材料１０は、例えば、連通孔を有する多孔質体よりなる基材１と、基材１の表面部に結合されるとともに基材１の内部には非結合された、酵素５を吸着するための吸着用官能基を有するグラフト高分子鎖４と、グラフト高分子鎖４に固定された酵素５と、を備えて構成される。すなわち、酵素固定材料１０は、例えば、連通孔を有する多孔質体よりなる基材１の表面部には酵素５が固定されたグラフト高分子鎖４が結合されるとともに、基材１の内部にはグラフト高分子鎖４が非結合されて２層構造で構成されている。
【００２７】
グラフト高分子鎖４に固定される酵素５は、酵素固定材料１０の用途や目的に応じて適宜選択される。具体的には、酵素５は、例えば、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、合成酵素などであり、特に限定されるものではない。
なお、酵素固定材料１０は、酵素５として、１種類の酵素を備えていても良いし、複数種類の酵素を備えていても良い。
【００２８】
酵素固定材料１０は、例えば、グラフト重合法を適用して製造される。
具体的には、酵素固定材料１０は、例えば、図１に示すように、照射ステップと、グラフト重合ステップと、変換ステップと、親水化ステップと、固定ステップと、により製造される。
なお、図１は、捕捉材料１０の製造経路の一例であり、捕捉材料１０の製造経路は、図１に限られるものではない。
【００２９】
照射ステップでは、基材１に電離放射線（例えば、電子線）を照射する。すなわち、基材１にラジカルを発生させる。
【００３０】
グラフト重合ステップでは、所定の官能基（例えば、エポキシ基）を有する重合性単量体（例えば、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ））を基材１にグラフト重合することによって、所定の官能基を有するグラフト高分子鎖２を基材１に結合させる。すなわち、ラジカルを開始点として、所定の官能基を有するグラフト高分子鎖２を成長させる。
より具体的には、例えば、所定の官能基を有する重合性単量体としてＧＭＡを選択した場合には、電離放射線が照射された基材１を、ＧＭＡ（又はＧＭＡが溶解する溶液）に所定温度で所定時間浸漬することによって、エポキシ基を有するグラフト高分子鎖２を基材１に結合させる。得られた材料をＧＭＡ材料と呼ぶ。
【００３１】
変換ステップでは、グラフト高分子鎖２が有する所定の官能基の少なくとも一部を、吸着用官能基（例えば、ジエチルアミノ基（−Ｎ(Ｃ２Ｈ５)２））に変換することによって、所定の官能基を有するグラフト高分子鎖２を、吸着用官能基を有するグラフト高分子鎖３に変換する。
より具体的には、例えば、吸着用官能基としてジエチルアミノ（ＤＥＡ）基を選択した場合には、ＧＭＡ材料を、ジエチルアミン（又はジエチルアミンが溶解する溶液）に所定温度で所定時間浸漬することによって、エポキシ基を有するグラフト高分子鎖２を、ＤＥＡ基を有するグラフト高分子鎖３に変換する。得られた材料をＤＥＡ材料と呼ぶ。
【００３２】
親水化ステップでは、吸着用官能基を有するグラフト高分子鎖３に残存する所定の官能基を、親水性官能基（例えば、２−ヒドロキシエチルアミノ基（−ＮＨＣ２Ｈ４ＯＨ））に変換することによって、基材１に結合されたグラフト高分子鎖を親水化する。
より具体的には、例えば、親水性官能基としてエタノールアミノ（ＥＡ）基を選択した場合には、ＤＥＡ材料を、エタノールアミン（又はエタノールアミンが溶解する溶液）に所定温度で所定時間浸漬することによって、基材１に結合されたグラフト高分子鎖を親水化する。得られた材料を、ＤＥＡ−ＥＡ材料と呼ぶ。
【００３３】
固定ステップでは、親水化されたグラフト高分子鎖４が有する吸着用官能基に、酵素５（例えば、負の電荷を持った酵素）を吸着させることによって、酵素５を基材１に結合されたグラフト高分子鎖４に固定する。
より具体的には、例えば、ＤＥＡ基と反対の電荷（負の電荷）を持った酵素５を、ＤＥＡ−ＥＡ材料に備えられたグラフト高分子鎖４に接触させ、ＤＥＡ基に吸着させることによって、酵素５をグラフト高分子鎖４に固定する。ここで、酵素５をグラフト高分子鎖４に接触させる手法としては、例えば、酵素５が溶解した溶液に、グラフト高分子鎖４が結合された基材１（例えば、ＤＥＡ−ＥＡ材料）を浸漬させる手法（浸漬法）、グラフト高分子鎖４が結合された基材１に、酵素５が溶解した溶液を透過させる手法（透過法）などが挙げられる。好ましい手法としては、高速に酵素５を固定できるなどの特徴を有する透過法が挙げられる。
【００３４】
酵素反応用カートリッジ１００は、例えば、図２に示すように、酵素固定材料１０をカートリッジ２０に充填して構成されている。
そして、例えば、シリンジポンプや送液ポンプなどを用いて酵素反応用カートリッジ１００に所定の基質が溶解した基質溶液を供給し、酵素固定材料１０の一方の面（例えば、下面）から他方の面（例えば、上面）に向けて基質溶液を透過させることによって、酵素固定材料１０において酵素反応を行わせる。
なお、カートリッジ２０には、１枚の酵素固定材料１０を充填しても良いし、複数枚の酵素固定材料１０を充填しても良い。
【００３５】
酵素反応用カートリッジ１００の製造方法としては、例えば、基材１をカートリッジ２０に充填し、その状態で、照射ステップから固定ステップを行う手法であっても良いし、照射ステップで得られた材料をカートリッジ２０に充填し、その状態で、グラフト重合ステップから固定ステップを行う手法であっても良いし、グラフト重合ステップで得られた材料をカートリッジ２０に充填し、その状態で、変換ステップから固定ステップを行う手法であっても良いし、変換ステップで得られた材料をカートリッジ２０に充填し、その状態で、親水化ステップから固定ステップを行う手法であっても良いし、親水化ステップで得られた材料をカートリッジ２０に充填し、その状態で、固定ステップを行う手法であっても良いし、固定ステップで得られた材料（酵素固定材料１０）をカートリッジ２０に充填する手法であっても良い。
【００３６】
基材１の形状は、連通孔を有する多孔質体であれば、特に限定されるものではない。
基材１の好ましい形状としては、例えば、厚さが１〜１０ｍｍ、連通孔の平均細孔径が０．５〜５μｍ及び連通孔の体積分率が７０〜８５％のシート状が挙げられる。
【００３７】
基材１の厚さが１ｍｍ未満の場合には、厚さが薄くなり過ぎる。そのため、取り扱い難く、例えば、カートリッジ２０への充填が困難であるなどの傾向を示すとともに、物理的強度が低く、例えば、繰り返し使用に適さないなどの傾向を示す。
一方、基材１の厚さが１０ｍｍを超える場合には、厚さが厚くなり過ぎる。そのため、取り扱い難く、例えば、カートリッジ２０への充填が困難であるなどの傾向を示す。
【００３８】
また、連通孔の平均細孔径が０．５μｍ未満の場合には、孔径が小さくなり過ぎる。そのため、基質溶液を酵素固定材料１０の一方の面から他方の面へと透過させる際の溶液透過性が低下し、高速処理が困難になる傾向を示す。
一方、連通孔の平均細孔径が５μｍを超える場合には、孔径が大きくなり過ぎる。そのため、基質溶液を酵素固定材料１０の一方の面から他方の面へと透過させて基質を酵素５と接触させる際、基質溶液を高速に透過させると、基質が酵素５と接触せずに酵素固定材料１０を通り抜けてしまう傾向を示す。
ここで、連通孔の平均細孔径とは、例えば、バブルポイント法などの所定の評価法を利用して得られる平均流量細孔径のことである。
【００３９】
また、連通孔の体積分率が７０％未満の場合には、連通孔の割合が少なくなり過ぎる。そのため、基質溶液を酵素固定材料１０の一方の面から他方の面へと透過させる際の溶液透過性が低下し、高速処理が困難になる傾向を示す。
一方、連通孔の体積分率が８５％を超える場合には、連通孔の割合が多くなり過ぎる。そのため、物理的強度が低く、例えば、繰り返し使用に適さないなどの傾向を示す。
【００４０】
基材１を形成する材料は、グラフト重合法を適用して酵素固定材料１０を製造できるのであれば、特に限定されるものではない。
基材１を形成する好ましい材料としては、例えば、物理的・化学的安定性に優れている、基材１自体の反応性が低いなどの特徴を有するポリオレフィン（例えば、ポリエチレンやポリプロピレンなど）が挙げられる。その他、基材１を形成する材料としては、例えば、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）などのフッ素樹脂、ポリオレフィンとフッ素樹脂との組み合わせ（混合体や共重合体）などが挙げられる。また、例えば、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリスチレンなども挙げられる。
【００４１】
グラフト重合法は、所定の官能基を有するグラフト高分子鎖２を、基材１にグラフトすることができるのであれば、特に限定されるものではない。
好ましいグラフト重合法としては、例えば、重合開始剤が不要である、基材１の形状に制限がない、基材１全体にラジカルを生成することができるなどの特徴を有する電離放射線（電子線、Ｘ線、α線、β線、γ線など）を用いる重合法が挙げられる。その他、グラフト重合法としては、例えば、紫外線を用いる重合法、重合開始剤を用いる重合法などが挙げられる。
【００４２】
所定の官能基を有するグラフト高分子鎖２を形成する重合性単量体は、その所定の官能基を、吸着用官能基に変換することができるのであれば、特に限定されるものではない。
好ましい所定の官能基としては、例えば、吸着用官能基への変換が容易であるなどの特徴を有するエポキシ基が挙げられる。したがって、好ましい重合性単量体としては、例えば、エポキシ基を有する重合単量体であるグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）やグリシジルアクリレートなどが挙げられる。
【００４３】
グラフト高分子鎖３，４が有する吸着用官能基は、酵素５を吸着することができるのであれば、特に限定されるものではない。
具体的には、吸着用官能基としては、例えば、イオン交換基や疎水性官能基などが挙げられる。
【００４４】
イオン交換基としては、例えば、スルホン酸基やリン酸基、カルボキシル基などのカチオン交換基、１級アミノ基や２級アミノ基、３級アミノ基、４級アンモニウム基などのアニオン交換基が挙げられる。
酵素５は、溶液中では、その溶液のｐＨが酵素５の等電点よりも低いときには正に帯電し、その溶液のｐＨが酵素５の等電点よりも高いときには負に帯電する。したがって、グラフト高分子鎖４に固定したい酵素５が溶解する溶液のｐＨが、その酵素５の等電点よりも低い場合には、吸着用官能基として負に帯電したカチオン交換基を選択すると、その溶液中の酵素５をグラフト高分子鎖４に接触させることによって、吸着用官能基と酵素５との静電相互作用により、酵素５をグラフト高分子鎖４に固定することができる。一方、グラフト高分子鎖４に固定したい酵素５が溶解する溶液のｐＨが、その酵素５の等電点よりも高い場合には、吸着用官能基として正に帯電したアニオン交換基を選択すると、その溶液中の酵素５をグラフト高分子鎖４に接触させることによって、吸着用官能基と酵素５との静電相互作用により、酵素５をグラフト高分子鎖４に固定することができる。
【００４５】
疎水性官能基としては、例えば、フェニル基、アルキル基（ブチル基、オクチル基、オクタデシル基など）などの炭化水素基、それら炭化水素基の水素原子のハロゲン原子置換体などが挙げられる。
酵素５は、その構成アミノ酸として疎水性のアミノ酸を含んでいることが多い。したがって、酵素５が疎水性のアミノ酸残基を有する場合には、吸着用官能基として疎水性官能基を選択すると、グラフト高分子鎖４に固定したい酵素５をグラフト高分子鎖４に接触させることによって、吸着用官能基と酵素５との疎水性相互作用により、酵素５をグラフト高分子鎖４に固定することができる。
【００４６】
なお、グラフト高分子鎖３，４は、吸着用官能基として、１又は複数種類のイオン交換基を有していても良いし、１又は複数種類の疎水性官能基を有していても良いし、１又は複数種類のイオン交換基及び１又は複数種類の疎水性官能基を有していても良い。
【００４７】
好ましい吸着用官能基としては、例えば、より多くの酵素５を固定することができる、酵素５の立体構造を変化させることなくより安定的に酵素５を固定することができるなどの特徴を有するイオン交換基が挙げられる。
基材１に結合されたグラフト高分子鎖に吸着用官能基として正に帯電するイオン交換基又は負に帯電するイオン交換基を導入すると、吸着用官能基同士の荷電反発によって、グラフト高分子鎖４が伸長する。この状態で、吸着用官能基と反対の電荷を持った酵素５が連通孔内に導入されると、酵素５は、グラフト高分子鎖４同士の間にできた空間に３次元的に多層に固定される。したがって、吸着用官能基としてイオン交換基を選択すると、酵素５を高密度に固定することができる。
また、伸長したグラフト高分子鎖４はモビリティーが高く、多点（複数の吸着用官能基）で酵素５を吸着固定することができる。すなわち、グラフト高分子鎖４は、酵素５の形状に合わせて、酵素５に絡まりながら、酵素５を固定することができる。したがって、吸着用官能基としてイオン交換基を選択すると、酵素５を安定的に固定することができる。
【００４８】
グラフト高分子鎖４が有する親水性官能基は、グラフト高分子鎖２，３が有する所定の官能基よりも親水性の官能基であれば、特に限定されるものではない。
好ましい親水性官能基としては、例えば、所定の官能基（例えば、エポキシ基）からの変換が容易であるなどの特徴を有する２−ヒドロキシエチルアミノ基（ＥＡ基）、ジオール基（２個のヒドロキシル基）などが挙げられる。その他、親水性官能基としては、例えば、ヒドロキシル基や、ヒドロキシアルキル基（アルキル基は好ましくは低級アルキル基）、ピロリドニル基などが挙げられる。
なお、吸着用官能基としてアニオン交換基（例えば、ＤＥＡ基など）を選択した場合、親水性官能基としてＥＡ基を選択すると、ＥＡ基もアニオン交換基であるため、吸着用官能基として機能することができ、好適である。
【００４９】
グラフト高分子鎖４（グラフト高分子鎖２，３，４）は、連通孔の表面にグラフト（接ぎ木）されて、連通孔内において“ポリマーブラシ”を形成している。すなわち、グラフト高分子鎖４の少なくとも一部は、連通孔内に配置されている。また、酵素５は、グラフト高分子鎖２を形成する重合性単量体、吸着用官能基及び親水官能基よりも嵩高く、基材１内に入り込むことが困難であるため、連通孔内に配置されたグラフト高分子鎖４に固定されて、連通孔内に配置されている。
【００５０】
グラフト高分子鎖４（グラフト高分子鎖２，３，４）は、基材１の表面部に結合され、基材１の内部には非結合されている。
グラフト高分子鎖４が基材１の表面部に結合されて基材１の内部には非結合された酵素固定材料１０は、例えば、グラフト重合における重合性単量体の濃度、溶媒の種類、反応温度、反応時間などを制御して所定の官能基を有するグラフト高分子鎖２を基材１の表面部のみに結合させることによって得られる。
【００５１】
グラフト高分子鎖４が基材１の表面部に結合されて基材１の内部には非結合されると、すなわち、酵素固定材料１０が、グラフト高分子鎖４が結合された表面部と、グラフト高分子鎖４が非結合された内部と、の２層構造で構成されると、グラフト高分子鎖４が非結合された内部が、グラフト高分子鎖４が結合された表面部の支持体としての役割を果たすため、グラフト高分子鎖４が基材１の全体に結合されている場合と比較して、膨潤を抑えることができる、物理的強度が高い、などの利点がある。
ここで、グラフト高分子鎖４が結合される表面部は、基材１の膜厚方向における基材１の表面部（表層）を指し、グラフト高分子鎖４が非結合される内部は、基材１の膜厚方向における基材１の内部（内層）を指す。
【００５２】
基材１にグラフト高分子鎖４（グラフト高分子鎖２，３，４）が結合すると、その部分は基材１の組織が分断されて緻密性に欠け、基材１の剛性が低下する。そのため、グラフト高分子鎖４が結合された部分は、溶媒に対する膨潤度が大きくなるとともに、物理的強度が低下する。その一方で、グラフト高分子鎖４が非結合された部分の割合が多いと、酵素固定材料１０における酵素５の固定量が少なくなるため、反応効率が低下する、高速処理が行えないなどの問題が生じる。したがって、捕捉材料１０の膜厚方向におけるグラフト高分子鎖４が結合された表面部（両面の場合はその合計）の厚さの割合を、捕捉材料１０の厚さの４０〜６０％、捕捉材料１０の膜厚方向におけるグラフト高分子鎖４が非結合された内部の厚さの割合を、捕捉材料１０の厚さの６０〜４０％に設定すると、酵素固定材料１０の性能（反応効率や処理速度）と、物理的安定性（膨潤度や物理的強度（変形耐性を含む））と、のバランスを良好に保つことができる。
【００５３】
ここで、グラフト高分子鎖４が基材１の表面部に結合されて基材１の内部には非結合されているか否かは、例えば、吸着用官能基としてカチオン交換基を選択し、酵素５を固定する前に、金属イオンを吸着用官能基に吸着させることによって確認することができる。すなわち、グラフト高分子鎖４が結合された部分に、金属イオンが吸着すること利用して確認することができる。具体的には、Ｘ線マイクロアナライザー（ＸＭＡ）を用いて膜厚方向の金属イオン分布を測定することによって、膜厚方向のグラフト高分子鎖４分布を確認することができる。また、発色している金属イオン（例えば、銅イオンなど）を吸着させると、目視にて（又は顕微鏡などを用いて）着色部分の分布を観察することによって、膜厚方向のグラフト高分子鎖４分布を確認することができる
【００５４】
以上説明した本発明の酵素固定材料１０によれば、連通孔を有する多孔質体よりなる基材１と、基材１の表面部に結合され、基材１の内部には非結合されたグラフト高分子鎖４と、グラフト高分子鎖４に固定された酵素５と、を備えている。すなわち、酵素固定材料１０は、グラフト高分子鎖４が結合された表面部と、グラフト高分子鎖４が非結合された内部と、の２層構造で構成されている。したがって、グラフト高分子鎖４が非結合された内部は、基材１自体の物理的・化学的特性を維持しており、グラフト高分子鎖４が結合された表面部の支持体としての役割を果たすため、グラフト高分子鎖４が基材１の全体に結合された従来の酵素固定材料よりも高い物理的安定性を有する。
また、基材１は、連通孔を有する多孔質体よりなるため、例えば、酵素固定材料１０に、基質が溶解した基質溶液を透過させるだけで、酵素反応を行わせることができる。さらに、基質は、連通孔を通っている間に、連通孔内に配置されたグラフト高分子鎖４に固定された酵素５まで容易にアクセスできる。したがって、基質が酵素５と接触せずに酵素固定材料を通り抜けてしまうことが少なく、高速処理が可能な反応効率の高い酵素固定材料を構成することができる。
また、グラフト高分子鎖４は、酵素５を、多層に固定することができるとともに、多点で固定することができる。したがって、酵素５を高密度に固定することができるとともに、酵素５の立体構造を変化させることなく酵素５を安定的に固定することができる。
【００５５】
また、本発明の酵素固定材料１０によれば、基材１は、厚さが１〜１０ｍｍのシート状のものであり、多孔性中空糸膜や多孔性平膜を基材とした従来の酵素固定材料と比較して厚みがある。したがって、物理的強度が高い酵素固定材料１０を構成することができるとともに、取り扱い性に優れた酵素固定材料１０を構成することができる。
さらに、基材１は、連通孔の平均細孔径が０．５〜５μｍ及び連通孔の体積分率が７０〜８５％のシート状のものであり、微細な連通孔を多数有している。したがって、基質溶液を高速で透過させることができるとともに、基質溶液を高速で透過させたとしても、基質が連通孔を通っている間に連通孔内に配置されたグラフト高分子鎖４に固定された酵素５まで容易にアクセスできる構成であるため、高速処理が可能な反応効率の高い酵素固定材料を構成することができる。
【００５６】
また、本発明の酵素固定材料１０によれば、基材１は、ポリオレフィンから構成されている。したがって、物理的・化学的安定性に優れた酵素固定材料１０を構成することができる。また、基材１自体の反応性が低く、酵素５をグラフト高分子鎖４に選択的に固定できるため、酵素５の立体構造を変化させることなく、酵素５を安定的に固定することができる。
【００５７】
また、以上説明した本発明の酵素反応用カートリッジ１００によれば、酵素固定材料１０をカートリッジ２０に充填して構成されているため、使い勝手が良い。
【００５８】
また、以上説明した本発明の酵素固定材料１０の製造方法によれば、照射ステップと、グラフト重合ステップと、変換ステップと、親水化ステップと、固定ステップと、だけを備える簡単な方法で、酵素固定材料１０を製造することができる。
【００５９】
また、本発明の酵素固定材料１０の製造方法によれば、親水化ステップで、基材１に結合されたグラフト高分子鎖を親水化することができる。したがって、グラフト高分子鎖４自体の反応性を低下させることができ、酵素５を吸着用官能基に選択的に吸着させることによってグラフト高分子鎖４に固定できるため、酵素５の立体構造を変化させることなく、酵素５を安定的に固定することができる。
【００６０】
なお、本発明は、上記した実施の形態のものに限るものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。
【００６１】
＜変形例１＞
上記した実施の形態では、照射ステップと、グラフト重合ステップと、変換ステップと、親水化ステップと、固定ステップと、によって酵素固定材料１０を製造するようにしたが、例えば、所定の官能基を有する重合性単量体に代えて、吸着用官能基を有する重合性単量体を基材１にグラフト重合すると、グラフト重合ステップのみで、吸着用官能基を有するグラフト高分子鎖４を基材１に結合させることができるため、変換ステップを省略することができるとともに、吸着用官能基としてイオン交換基を用いるとイオン交換基は親水性であるため、親水化ステップを省略することができる。
ここで、吸着用官能基を有する重合性単量体は、酵素５を吸着するためのイオン交換基を有する重合性単量体や、酵素５を吸着するための疎水性官能基を有する重合性単量体であれば任意である。
具体的には、吸着用官能基を有する重合性単量体としては、例えば、イオン交換基（カチオン交換基）を有するアクリル酸などが挙げられる。また、例えば、所定の官能基（例えば、エポキシ基）を有する重合性単量体（例えば、グリシジルメタクリレートやグリシジルアクリレートなど）の所定の官能基を吸着用官能基に変換することによって作成した重合性単量体などが挙げられる。
【００６２】
以上説明した変形例１の酵素固定材料１０の製造方法によれば、照射ステップと、グラフト重合ステップと、（親水化ステップと、）固定ステップと、だけを備える簡単な方法で、酵素固定材料１０を製造することができる。
【００６３】
＜変形例２＞
上記した実施の形態では、照射ステップと、グラフト重合ステップと、変換ステップと、親水化ステップと、固定ステップと、によって酵素固定材料１０を製造するようにしたが、例えば、基材１と所定の官能基を有する重合性単量体とを共存させた状態で、基材１に電離放射線を照射すると（照射・グラフト重合ステップ）、上記した実施の形態における照射ステップとグラフト重合ステップとを同時に行うことができる。
ここで、基材１と所定の官能基を有する重合性単量体とを共存させた状態とは、例えば、所定の官能基を有する重合性単量体が溶解する溶液（ＧＭＡ溶液など）中に基材１を浸漬させた状態や、所定の官能基を有する重合性単量体が溶解する溶液を基材１に含浸させた状態などのことである。
【００６４】
以上説明した変形例２の酵素固定材料１０の製造方法によれば、照射・グラフト重合ステップと、変換ステップと、親水化ステップと、固定ステップと、だけを備える簡単な方法で、酵素固定材料１０を製造することができる。
【００６５】
＜変形例３＞
上記した実施の形態では、照射ステップと、グラフト重合ステップと、変換ステップと、親水化ステップと、固定ステップと、によって酵素固定材料１０を製造するようにしたが、例えば、基材１と吸着用官能基を有する重合性単量体とを共存させた状態で、基材１に電離放射線を照射すると（照射・グラフト重合ステップ）、上記した実施の形態における変換ステップ（及び親水化ステップ）を省略できるとともに、照射ステップとグラフト重合ステップとを同時に行うことができる。
ここで、基材１と吸着用官能基を有する重合性単量体とを共存させた状態とは、例えば、吸着用官能基を有する重合性単量体が溶解する溶液中に基材１を浸漬させた状態や、吸着用官能基を有する重合性単量体が溶解する溶液を基材１に含浸させた状態などのことである。
【００６６】
以上説明した変形例３の酵素固定材料１０の製造方法によれば、照射・グラフト重合ステップと、（親水化ステップと、）固定ステップと、だけを備える簡単な方法で、酵素固定材料１０を製造することができる。
【００６７】
上記した実施の形態では、親水化ステップを変換ステップの後に行うようにしたが、親水化ステップを行うタイミングに制限は無く、グラフト重合ステップの後で行っても良いし、固定ステップの後に行っても良い。変形例２についても同様である。
また、親水化ステップは、必ずしも行う必要はない。親水化ステップは、所定の官能基がエポキシ基のように疎水性の官能基であり且つ吸着用官能基がイオン交換基のように親水性の官能基である場合は有効であるが、所定の官能基が親水性の官能基であり且つ吸着用官能基が疎水性官能基である場合は特に行う必要はない。
【００６８】
上記した実施の形態及び変形例１〜３では、基材１の形状は、シート状に限ることはなく、例えば、円板状や四角板状などであっても良く、従来の捕捉材料の基材のように中空糸状やフィルム状などであっても良い。
【００６９】
上記した実施の形態及び変形例１〜３では、酵素固定材料１０において酵素反応を行わせる際、酵素固定材料１０をカートリッジ２０に充填するようにしたが、これに限ることはなく、例えば、容器内に所定量の酵素固定材料１０を収容し、その中へ基質溶液を注入するなどして、酵素反応を行わせても良い。
【００７０】
上記した実施の形態及び変形例１〜３では、酵素固定材料１０が備える酵素５を、基質溶液中の基質に作用させるようにしたが、これに限ることはなく、酵素固定材料１０が備える酵素５は、酵素固定材料１０が有する連通孔を通過できる物質（気体、液体、ゾル、ゲルなど）であれば、その物質中に存在する基質と作用することができる。
【００７１】
上記した実施の形態及び変形例１〜３では、酵素固定材料１０の用途として固定化酵素バイオリアクターを挙げたが、これに限ることはなく、酵素固定材料１０の用途は、酵素５が有する基質特異性や反応特異性を利用する用途であれば任意である。具体的には、例えば、酵素固定材料１０は、例えば、血液中や尿中の病因物質を定量するための診断用材料や、定量の難しい物質を転化させて検出を容易にさせる分析支援材料などとしても使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の酵素固定材料の製造経路の一例を示す図である。
【図２】本発明の酵素反応用カートリッジの一例を示す図である。
【符号の説明】
【００７３】
１  基材
２  所定の官能基を有するグラフト高分子鎖
３，４  吸着用官能基を有するグラフト高分子鎖
５  酵素
１０  酵素固定材料
２０  カートリッジ
１００  酵素反応用カートリッジ
【図１】
2009100673.tif 000003
【図２】
2009100673.tif 000004