(57)【要約】【課題】顕微鏡観察下における微粒子の３次元位置を、速やかに高精度で検出する。【解決手段】３次元位置検出装置１０においては、対物レンズ１２と第２対物レンズ１５の間の瞳面に、平行光束を分割・偏向する偏向光学部材１３および分割・偏向される前の平行光束の偏向光学部材１３への透過を制限するマスク１４が設けられている。マスク１４は、偏向光学部材１３で分割された各々の光束に対し、結像光学系の瞳面における光束断面形状を所定の形状にするために設けられている。マスク１４は、所定値以上の透過率を有する開口２１を有する。本発明は、顕微鏡観察下における微粒子３次元位置を検出する光学系に適用することができる。【選択図】図２
2009036549.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の光学像を像面に結像させる結像光学系と、
前記結像光学系の瞳、前記瞳の近傍、または前記瞳の共役面に配置され、前記試料からの光束を複数に分割し、分割された複数の各光束の進行方向を相対的に異なる方向に偏向させる分割偏向手段と、
前記像面に配置され、前記分割偏向手段により分割された各光束から得られる前記結像光学系による像の２次元分布を観測する観測手段を有し、
前記観測手段によって観測された前記結像光学系による像の２次元分布情報に基づき、前記試料の位置を算出する位置検出装置において、
前記結像光学系の対物レンズよりも観測手段側に配置され、前記分割偏向手段によって分割された複数の各光束の断面形状を所定の形状を制限する光束制限手段を
備えることを特徴とする位置検出装置。
【請求項２】
前記光束制限手段は、前記分割偏向手段の近傍に配置されている
ことを特徴とする請求項１に記載の位置検出装置。
【請求項３】
前記光束制限手段は、前記分割偏向手段と隣接して配置されている
ことを特徴とする請求項１に記載の位置検出装置。
【請求項４】
前記分割偏向手段は、ダブルエッジプリズム、シングルエッジプリズム、または音響偏向素子である
ことを特徴とする請求項２または３に記載の位置検出装置。
【請求項５】
前記分割偏向手段と前記光束制限手段は、同一部材によって形成されている
ことを特徴とする請求項３に記載の位置検出装置。
【請求項６】
前記光束制限手段には複数の開口が設けられており、
前記開口のそれぞれは、前記分割偏向手段による光束を分割する境界線に対応する前記光束制限手段上の仮想線と平行な線に対して線対称とした形状である
ことを特徴とする請求項２または３に記載の位置検出装置。
【請求項７】
前記開口のそれぞれは、前記境界線に対応する前記光束制限手段上の仮想線から等距離に各開口の重心または中心が位置している
ことを特徴とする請求項６に記載の位置検出装置。
【請求項８】
前記光束制限手段に設けられた複数の開口は、相互の位置関係が前記境界線に対応する前記光束制限手段上の仮想線を軸とした線対称な位置関係を有する
ことを特徴とする請求項７に記載の位置検出装置。
【請求項９】
前記光束制限手段に設けられた複数の開口は、相互の位置関係が各開口の重心または中心を結ぶ線分の中点に関して点対称な位置関係を有する
ことを特徴とする請求項７に記載の位置検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、位置検出装置に関し、特に、顕微鏡観察下における微粒子の３次元位置を検出する場合に用いて好適な位置検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、顕微鏡観察下における微粒子（例えば水溶液中を移動する蛋白質の１分子など）の３次元位置を検出する技術が存在する（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
この従来技術の結像光学系において、微粒子である試料からの光は対物レンズにより集光され、瞳面にて平行光束となり、第２対物レンズにより像面上に結像される。
【０００４】
この結像光学系を用いて試料の３次元位置を検出するには、瞳面の位置にダブルウェッジプリズムなどの偏向光学部材を配置し、像面の位置にCCDなどの撮像素子を配置する。偏向光学部材は、対物レンズからの平行光束を複数に分割し、かつ、偏向して像面上に複数の像が得られるようになされている。像面の撮像素子は、複数の像それぞれの２次元分布（輝度が検出された領域）を観測する。
【０００５】
そして、解析部により、撮像素子により観測された像の２次元分布に基づいて複数の像それぞれの重心座標が算出され、算出された２つの像それぞれの重心座標が試料１の座標位置に換算されるようになされている。あるいは、撮像素子により観測された像の２次元分布のうちの最大輝度の座標が検出され、検出された２つの座標が試料の３次元位置座標に換算されるようになされている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１７５６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述した従来技術では、偏向光学部材によって分割、偏向される光束の断面形状が瞳面上でほぼ半円形となる。このとき、試料が像面に合焦される位置にあれば、撮像素子で観測される像それぞれ点像となるが、像面からデフォーカスした位置にあると観察される像は前記断面形状に依存してそれぞれ半円形に近い形状に変形してしまうため、重心座標は形状に依存してシフトし、試料の３次元位置座標を算出する際の誤差要因となっていた。
【０００８】
なぜならば、像面の撮像素子で観測される像（輝度の２次元分布）の重心座標から試料の３次元位置座標への換算は、例えば図１に示すような実測に基づいて予め生成した対応関係を用いて行うが、この対応関係は、偏向光学部材によって分割、偏向される光束の断面形状がほぼ半円形であることがその最大の要因となって非線形の曲線となってしまうからである。
【０００９】
なお、図１は、撮像素子により観測される像の重心座標ｘを縦軸、試料のｚ座標を横軸とした対応関係を示しており、対物レンズに倍率100ｘ、開口数ＮＡ＝1.4の油浸レンズを用いた場合の一例である。
【００１０】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、撮像素子で観測される像（輝度の２次元分布）の重心座標と試料の３次元位置との対応関係が線形となるようにすることにより、顕微鏡観察下における微粒子の３次元位置を、速やかに高精度で検出できるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一側面である位置検出装置は、試料の光学像を像面に結像させる結像光学系と、前記結像光学系の瞳、前記瞳の近傍、または前記瞳の共役面に配置され、前記試料からの光束を複数に分割し、分割された複数の各光束の進行方向を相対的に異なる方向に偏向させる分割偏向手段と、前記像面に配置され、前記分割偏向手段により分割された各光束から得られる前記結像光学系による像の２次元分布を観測する観測手段を有し、前記観測手段によって観測された前記結像光学系による像の２次元分布情報に基づき、前記試料の位置を算出する位置検出装置において、前記結像光学系の対物レンズよりも観測手段側に配置され、前記分割偏向手段によって分割された複数の各光束の断面形状を所定の形状を制限する光束制限手段を備えることを特徴とする。
【００１２】
前記光束制限手段は、前記分割偏向手段の近傍に配置されているようにすることができる。
【００１３】
前記光束制限手段は、前記分割偏向手段と隣接して配置されているようにすることができる。
【００１４】
前記分割偏向手段は、ダブルエッジプリズム、シングルエッジプリズム、または音響偏向素子であるようにすることができる。
【００１５】
前記分割偏向手段と前記光束制限手段は、同一部材によって形成されているようにすることができる。
【００１６】
前記光束制限手段には複数の開口が設けられており、前記開口のそれぞれは、前記分割偏向手段による光束を分割する境界線に対応する前記光束制限手段上の仮想線と平行な線に対して線対称とした形状であるようにすることができる。
【００１７】
前記開口のそれぞれは、前記境界線に対応する前記光束制限手段上の仮想線から等距離に各開口の重心または中心が位置しているようにすることができる。
【００１８】
前記光束制限手段に設けられた複数の開口は、相互の位置関係が前記境界線に対応する前記光束制限手段上の仮想線を軸とした線対称な位置関係を有するようにすることができる。
【００１９】
前記光束制限手段に設けられた複数の開口は、相互の位置関係が各開口の重心または中心を結ぶ線分の中点に関して点対称な位置関係を有するようにすることができる。
【００２０】
本発明の一側面である位置検出装置においては、結像光学系の対物レンズよりも観測手段側に配置された光束制限手段により、分割偏向手段によって分割された複数の各光束が所定の断面形状となるように、光束の断面形状を断面形状が制限される。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の一側面によれば、顕微鏡観察下における微粒子の３次元位置を、速やかに高精度で検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に本発明の実施の形態を説明するが、本発明の構成要件と、明細書または図面に記載の実施の形態との対応関係を例示すると、次のようになる。この記載は、本発明をサポートする実施の形態が、明細書または図面に記載されていることを確認するためのものである。従って、明細書または図面中には記載されているが、本発明の構成要件に対応する実施の形態として、ここには記載されていない実施の形態があったとしても、そのことは、その実施の形態が、その構成要件に対応するものではないことを意味するものではない。逆に、実施の形態が構成要件に対応するものとしてここに記載されていたとしても、そのことは、その実施の形態が、その構成要件以外の構成要件には対応しないものであることを意味するものでもない。
【００２３】
本発明の一側面である位置検出装置は、試料の光学像を像面に結像させる結像光学系（例えば、図２の対物レンズ１２および第２対物レンズ１５）と、前記結像光学系の瞳、前記瞳の近傍、または前記瞳の共役面に配置され、前記試料からの光束を複数に分割し、分割された複数の各光束の進行方向を相対的に異なる方向に偏向させる分割偏向手段（例えば、図２の偏向光学部材１３）と、前記像面に配置され、前記分割偏向手段により分割された各光束から得られる前記結像光学系による像の２次元分布を観測する観測手段（例えば、図２の撮像素子１６）を有し、前記観測手段によって観測された前記結像光学系による像の２次元分布情報に基づき、前記試料の位置を算出する位置検出装置（例えば、図２の３次元位置検出装置１０）において、前記結像光学系の対物レンズよりも観測手段側に配置され、前記分割偏向手段によって分割された複数の各光束の断面形状を所定の形状を制限する光束制限手段（例えば、図２のマスク１４）を備える。
【００２４】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２５】
図２は、本発明の第１の実施の形態である３次元位置検出装置の構成例を示している。この３次元位置検出装置１０は、顕微鏡観察下における微粒子（例えば水溶液中を移動する蛋白質の１分子など）の３次元位置を速やかに高精度で検出するものであり、従来技術に対応する結像光学系に、マスク１４を追加したものである。
【００２６】
すなわち、３次元位置検出装置１０は、試料１１からの光を平行光束に集光する対物レンズ１２、平行光束を分割・偏向する偏向光学部材１３、分割・偏向される前の平行光束の偏向光学部材１３への透過を制限し、光束の断面形状を制限するマスク１４、分割・偏向された複数の光束をそれぞれ像面に結像させる第２対物レンズ１５、像面における複数の像の２次元分布を観測する撮像素子１６、および、観測される像の２次元分布に基づいて試料１１の３次元位置を得る解析部１７から構成される。なお、３次元位置検出装置１０においては、絞り機構およびフォーカス機構の図示を省略している。
【００２７】
偏向光学部材１３は、瞳面に配置され、光束を相対的に２光束に分割する光学部材であり、例えばダブルウェッジプリズムから構成される。なお、瞳面の全体を覆う位置に設けたダブルウェッジプリズムの代わりに、瞳の半分を覆う位置にシングルウェッジプリズムを配置したり、あるいは、AOM（音響偏向素子：Acoust Optical Modulator）などの偏向素子を瞳面に配置したりするようにしてもよい。
【００２８】
マスク１４は、偏向光学部材１３で分割された各々の光束に対し、結像光学系の瞳面における光束断面形状を所定の形状にするために設けられている。例えば、図３Ａ乃至図３Ｃに示すような形状の、所定値以上の透過率を有する開口２１を有する。
【００２９】
なお、偏向光学部材１３に、ダブルウェッジプリズムやシングルウェッジプリズムなど、偏向光学部材１３上での光束の到達位置に応じて相対的に異なる方向に偏向するような光学部材を用いた場合、偏向光学部材１３の近傍や偏向光学部材１３に隣接して設けられるマスク１４の開口の形状は以下の条件を満たすようにすることが望ましい。すなわち、偏向光学部材１３による光束の各分割領域の境界の線をマスク１４に光軸方向で射影したとき、境界の線が射影された位置に対応する仮想した線分を分割線と称する（なお、仮想した当該分割線は、図３においてｙ軸と一致する）。そして、マスク１４の開口の形状は、この分割線と平行な方向に対称軸２１ａを有するような形状にすることが望ましい。
【００３０】
開口２１の具体的な形状について、図３を参照して説明する。図３Ａは、開口２１をｙ軸で２分割した際のそれぞれの形状が、重心で点対称な円となる開口２１を示している。図３Ｂは、開口２１をｙ軸で２分割した際のそれぞれの形状が、重心で点対称な楕円となる開口２１を示している。
【００３１】
図３Ａおよび図３Ｂに示すそれぞれの開口２１には、ここではｙ軸と同じ位置にある分割線と平行な対称軸２１ａが図示されたように設定できる。一方、偏向光学部材１３で分割された直後の各光束の断面形状は、偏向光学部材１３による分割線とマスク１４の開口の形状で決めることができる。そこで、その光束の断面形状が偏向光学部材１３の分割線とマスクの開口の外縁形状でもって、分割線と平行な対称軸２１ａを持つ光束断面形状にするようにしてもよい。例えば、図３Ｃは、開口２１をｙ軸で２分割した際のそれぞれの形状が、重心で点対称な矩形となる開口２１を示している。
【００３２】
このように、マスク１４の開口がそれぞれ、偏向光学部材１３の各分割領域を分割する境界線に対応するマスク１４上の仮想の分割線を中心にして左右にある場合、マスク１４の各々の開口を左右対称な形状を有する。これにより、撮像素子１６で観測される像がデフォーカス状態であっても、デフォーカス量の変化による像の広がり方が左右均一なので、各光束での像の重心位置を正確に得ることができる。
【００３３】
また、偏向光学部材１３による光束の分割領域が同様な場合、分割線から等距離の位置に各開口の重心や中心を来るように各開口を位置決めすることで、撮像素子１６に結像する像に与える収差の影響が概略同じになるので、撮像素子１６の像の重心位置をより正確な得ることができる。
【００３４】
さらに、複数の開口における相互の位置関係が、各開口の重心または中心を結ぶ線分の中点に関して点対称な位置関係を有するように設定することで、各光束により形成される撮像素子１６の像に与える収差の影響の隔たりがなくなる。
【００３５】
なお、マスク１４の開口２１を瞳径に可能な限り内接するように設定すれば、光量ロスを抑止することができる。
【００３６】
一方、図１に示された、従来技術に対応する曲線の非線形性は、結像光学系のＮＡが大きいほど顕著であり、また特に、試料１１のｚ位置、すなわちデフォーカス量が大きいほど顕著となる。従来技術により試料１１の３次元位置を高精度で検出するには、ｚ座標の測定範囲が重心座標と試料１１の３次元位置の線形性が保たれる範囲（図１に示された対応関係の場合、線形性が成り立つｚ±０．２乃至０．３μｍ）に限られてしまう。
【００３７】
これに対して、本願発明を適用した３次元位置検出装置１０では、マスク１４によって瞳を制限することによって焦点深度が深くなるので、この結果、同じ光量のｚ座標の検出範囲が拡大するという効果を得ることもできる。
【００３８】
図４Ａ乃至図４Ｃは、マスク１４の開口２１の形状が図３Ａ乃至図３Ｃである場合にそれぞれ対応する、撮像素子１６により観測される像の重心座標ｘを縦軸、試料１１のｚ座標を横軸とした対応関係を示している。同図と従来技術に対応する図１を比較して明らかのように、マスク１４を設けることによって当該対応関係がほぼ直線となって線形性の保たれた範囲が従来よりも拡大する。よって、試料１１の座標値の測定精度を向上させるとともに、ｚ方向の座標値を従来よりも広い範囲で測定することができる。
【００３９】
ところで、図２の場合、マスク１４は、偏向光学部材１３の入射側（試料１１側）に隣接して設けられており、偏向光学部材１３に入射される前の平行光束の断面形状を制限しているが、マスク１４を偏向光学部材１３の出射側（撮像素子１６側）に隣接して設け、偏向光学部材１３で分割・偏向された複数の平行光束の形状を制限するようにしてもよい。
【００４０】
また、マスク１４と偏向光学部材１３を同一部材により一体形成してもよい。
【００４１】
あるいは、マスク１４を液晶セルで構成し、電気的制御によって開口２１の有無や形状を瞬時に変更できるようにしてもよい。あるいは、開口２１の形状がそれぞれ異なる複数のマスク１４を用意し、光軸上に挿脱入れ替え可能となるように構成してもよい。これにより、ｚ座標の測定範囲と像の明るさを必要に応じて選択的に変更することができる。
【００４２】
次に、３次元位置検出装置１０の動作について、図５を参照して説明する。図５は、マスク１４の開口２１に、図３Ｂに示された楕円が２つ並ぶ形状を採用したものである。
【００４３】
例えば、図５Ａに示すように試料１１が原点に存在している場合、撮像素子１６では図５ａに示すように、フォーカスされた状態の２つ点が観測される。観測結果は解析部１７に供給され、解析部１７により、当該２つの点それぞれの重心座標が容易に特定され、試料１１の座標値に換算される。
【００４４】
これに対して、図５Ｂに示すように、試料１１がｚ軸上を撮像素子１６から離れる方向に変位した場合、撮像素子１６では図５ｂに示すように、デフォーカスされた状態の楕円の像（輝度の２次元分布）が観測される。観測結果は解析部１７に供給され、解析部１７により、それぞれの重心座標が誤差なく算出され、さらに試料１１の座標値に換算される。
【００４５】
また、図５Ｃに示すように、試料１１がｚ軸上を撮像素子１６に近づく方向に変位した場合、撮像素子１６では図５ｃに示すように、デフォーカスされた状態の楕円形の像が観測される。観測結果は解析部１７に供給され、解析部１７により、それぞれの重心座標が誤差なく算出され、さらに試料１１の座標値に換算される。
【００４６】
図５Ａ乃至図５Ｃにおいて、重心座標から試料１１の座標値への換算方法としては、例えば特許次文献１に記載の方法を用いることができる。
【００４７】
以上説明したように、３次元位置検出装置１０の動作は基本的に従来と同様ながら、マスク１４を設けたことにより、撮像素子１６により観測される像の重心座標と、試料１１の座標値との対応関係が線形となるので、試料１１の座標値の測定精度を向上させるとともに、ｚ方向の座標値を従来よりも広い範囲で測定することができる。
【００４８】
ところで、上述した３次元位置検出装置１０においては、対物レンズ１２と第２対物レンズ１５の間の瞳面に偏向光学部材１３およびマスク１４を設けるようにしたが、図６に示す本発明の第２の実施の形態である３次元位置検出装置３０のように、対物レンズ１２と第２対物レンズ１５の後方に、第３対物レンズ３１と第４対物レンズ３２からなるリレー光学系を設け、リレー光学系の瞳共役面に、偏向光学部材１３およびマスク１４を設けるようにしてもよい。
【００４９】
また、本実地の形態における結像光学系の光学配置は、顕微鏡光学系で一般的に無限光学系と称される光学配置を元に説明しているが、本願発明を適用する３次元位置検出装置に用いる結像光学系は、上述した無限遠光学系だけに限られず、有限光学系を採用してもよい。有限光学系を採用した場合、瞳近傍の光束は平行光束では無くなるが、瞳位置における各光束の断面形状が上述に示すような内容であればよい。
【００５０】
一方、マスク１４については、グレースケールマスクなどの透過率分布を複数段階持たせたマスクを採用してもよい。この際、マスクの開口２１については、透過率が観察条件（試料から得られる光量や撮像素子１６の感度やＳＮ比など）に基づき決まる所定値以上の透過率を有するか否かで、その開口の領域が決定される。その際、決定された開口の領域から、その領域の形状が上述に示す内容を具備していれば本発明の実施の形態における効果が得られることは言うまでも無い。
【００５１】
また、マスク１４が効果的に作用する配置場所は、結像光学系の瞳、瞳の近傍および瞳の共役面であるが、マスク１４の配置場所はこれらに限定されず、結像光学系のうち、最も試料側にある結像に寄与する光学部材より撮像素子側にあってもよく、偏向光学部材１３で分割された各光束の断面形状が結像光学系の瞳において、上述のような形状を有していれば、上述した効果を奏することができることは言うまでもない。
【００５２】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】従来技術における、輝度の２次元分布と試料の位置との非線形な対応関係を示す図である。
【図２】本発明の第１の実施の形態である３次元位置検出装置の構成例を示すブロック図である。
【図３】図２のマスクの孔の形状の例を示す図である。
【図４】図３の３例にそれぞれ対応する、輝度の２次元分布と試料の位置との線形な対応関係を示す図である。
【図５】図２の撮像素子によって観測される像の形状を示す図である。
【図６】本発明の第２の実施の形態である３次元位置検出装置の構成例を示すブロック図である。
【符号の説明】
【００５４】
１０  ３次元位置検出装置
１１  試料
１２  対物レンズ
１３  偏向光学部材
１４  マスク
１５  第２対物レンズ
１６  撮像素子
１７  解析部
２０  ３次元位置検出装置
２１  開口
３１  第３対物レンズ
３２  第４対物レンズ
【図１】
2009036549.tif 000003
【図２】
2009036549.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
2009036549.tif 000007
【図６】
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