(57)【要約】【課題】隣接する細胞等の観察対象を別個の観察対象として正確に判別する。【解決手段】入力された観察対象集合体の２次元的な位相差分布に基づいて、該位相差がピークをとる位置を観察対象候補Ｐ１，Ｐ２として特定する候補特定部と、該候補特定部により特定された隣接する２つの観察対象候補Ｐ１，Ｐ２が同一の観察対象Ａに属するか否かを、該観察対象候補Ｐ１，Ｐ２を結ぶ直線Ｅ上における位相差に基づいて判定する同一性判定部とを備える観察対象判別装置を提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
入力された観察対象集合体の２次元的な位相差分布に基づいて、該位相差がピークをとる位置を観察対象候補として特定する候補特定部と、
該候補特定部により特定された隣接する２つの観察対象候補が同一の観察対象に属するか否かを、該観察対象候補を結ぶ直線上における位相差に基づいて判定する同一性判定部とを備える観察対象判別装置。
【請求項２】
前記同一性判定部が、隣接する２つの観察対象候補を結ぶ直線上における位相差の最大差に対する当該２つの観察対象候補における位相差の絶対差の比率が所定の閾値以上であることを基準として、２つの観察対象候補が同一の観察対象に属すると判定する請求項１に記載の観察対象判別装置。
【請求項３】
前記同一性判定部が、隣接する２つの観察対象候補を結ぶ直線上における位相差の最大差と、当該２つの観察対象候補における位相差の絶対差との差が所定の閾値以下であることを基準として、２つの観察対象候補が同一の観察対象に属すると判定する請求項１または請求項２に記載の観察対象判別装置。
【請求項４】
入力された観察対象集合体の２次元的な位相差分布に基づいて、該位相差がピークをとる位置を観察対象候補として特定する候補特定ステップと、
該候補特定ステップにより特定された隣接する２つの観察対象候補を結ぶ直線上における位相差の最大差に対する当該２つの観察対象候補における位相差の絶対差の比率が所定の閾値以上であることを基準として、２つの観察対象候補が同一の観察対象に属すると判定する同一性判定ステップとを備える観察対象判別方法。
【請求項５】
入力された観察対象集合体の２次元的な位相差分布に基づいて、該位相差がピークをとる位置を観察対象候補として特定する候補特定ステップと、
該候補特定ステップにより特定された隣接する２つの観察対象候補を結ぶ直線上における位相差の最大差と、当該２つの観察対象候補における位相差の絶対差との差が所定の閾値以下であることを基準として、２つの観察対象候補が同一の観察対象に属すると判定する同一性判定ステップとを備える観察対象判別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は観察対象判別装置および観察対象判別方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、染色された測定対象の細胞を含有する培養液に近赤外光を照射して、培養液からの反射光または透過光を受光して分析する分光分析装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−１４９１４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、培養中の細胞は相互に密集して成長するため、隣接する細胞どうしが近接しており、近接している２つの細胞が１つの細胞として判別されてしまう不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、隣接する細胞等の観察対象を別個の観察対象として正確に判別することができる観察対象判別装置および観察対象判別方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、入力された観察対象集合体の２次元的な位相差分布に基づいて、該位相差がピークをとる位置を観察対象候補として特定する候補特定部と、該候補特定部により特定された隣接する２つの観察対象候補が同一の観察対象に属するか否かを、該観察対象候補を結ぶ直線上における位相差に基づいて判定する同一性判定部とを備える観察対象判別装置を提供する。
【０００６】
本発明によれば、観察対象集合体の２次元的な位相差分布が入力されると、候補特定部により、位相差がピークをとる位置が観察対象候補として特定され、同一性判別部により、当該観察対象候補が同一の観察対象に属するか否かが判定される。観察対象集合体の位相差分布は、観察対象およびその周囲の物質の屈折率の相違に基づいて発生するため、材質の変化や厚さの変化の情報を含んでいる。したがって、位相差がピークとなる位置は厚さ寸法が大きかったり、屈折率の大きな物質が存在したりすることを示すものである。
【０００７】
例えば、細胞を観察対象とする場合には、屈折率の大きな細胞核が存在することを示すことが多い。したがって、同一性判定部において、位相差がピークをとる２つの観察対象候補を結ぶ直線上の位相差を参照することにより、２つの観察対象候補が同一の観察対象に属するか否か、すなわち、観察対象が細胞の場合には、２つの観察対象候補が同一の細胞に属するものか、別個の細胞の細胞核なのかを容易に判定することができる。
【０００８】
上記発明においては、前記同一性判定部が、隣接する２つの観察対象候補を結ぶ直線上における位相差の最大差に対する当該２つの観察対象候補における位相差の絶対差の比率が所定の閾値以上であることを基準として、２つの観察対象候補が同一の観察対象に属すると判定することがこのましい。
【０００９】
このようにすることで、隣接する２つの観察対象候補を結ぶ直線上における位相差の最大差に対する当該２つの観察対象候補における位相差の絶対差の比率が所定の閾値以上である場合、すなわち、２つの観察対象候補の位相差に差がある場合や、２つの観察対象候補間に存在する位相差の谷が浅い場合には、両観察対象候補が同一の観察対象に属すると正確に判定することができる。逆に、２つの観察対象候補間で位相差に差がない場合（同程度の位相差を有する場合）や、２つの観察対象候補間に存在する位相差の谷が深い場合には、２つの観察対象候補を別個の観察対象に属するものと正確に判定することができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記同一性判定部が、隣接する２つの観察対象候補を結ぶ直線上における位相差の最大差と、当該２つの観察対象候補における位相差の絶対差との差が所定の閾値以下であることを基準として、２つの観察対象候補が同一の観察対象に属すると判定することとしてもよい。
【００１１】
このようにすることで、２つの観察対象候補の内、位相差の小さい方の谷からの起伏量が小さい場合に、小さい方の観察対象候補を大きい方の観察対象候補と同一の観察対象に属すると判定することができる。すなわち、谷が浅く起伏量も小さい場合には、上記比率が所定の閾値以上であっても２つの観察対象候補が同一の観察対象に属しないと判定することができる。
【００１２】
また、本発明は、入力された観察対象の２次元的な位相差分布に基づいて、該位相差がピークをとる位置を観察対象候補として特定する候補特定ステップと、該候補特定ステップにより特定された隣接する２つの観察対象候補を結ぶ直線上における位相差の最大差に対する当該２つの観察対象候補における位相差の絶対差の比率が所定の閾値以上であることを基準として、２つの観察対象候補が同一の観察対象に属すると判定する同一性判定ステップとを備える観察対象判別方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、入力された観察対象の２次元的な位相差分布に基づいて、該位相差がピークをとる位置を観察対象候補として特定する候補特定ステップと、該候補特定ステップにより特定された隣接する２つの観察対象候補を結ぶ直線上における位相差の最大差と、当該２つの観察対象候補における位相差の絶対差との差が所定の閾値以上であることを基準として、２つの観察対象候補が同一の観察対象に属すると判定する同一性判定ステップとを備える観察対象判別方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、隣接する細胞等の観察対象を別個の観察対象として正確に判別することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の一実施形態に係る観察対象判別装置および観察対象判別方法について、図１〜図６を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察対象判別装置１は、観察対象として細胞を判別する装置であって、例えば、培養容器内において培養されている状態の多数の細胞群（観察対象集合体）から個別の細胞を判別する装置である。
【００１６】
本実施形態に係る観察対象判別装置１は、図１および図２に示されるように、細胞群の位相差分布を示す位相差画像が入力され（ステップＳ１）、該位相差画像から細胞候補を特定する候補特定部２と、該候補特定部２において特定された隣接する２つの細胞候補が、同一の細胞に属するものであるか否かを判定する同一性判定部３とを備えている。
【００１７】
位相差画像は、例えば、透明な培養容器の底面に接着して培養されている細胞群に対して、近赤外光を透過させることにより得られた透過光と、細胞群を透過させていない近赤外光からなる参照光とを干渉させることにより得ることができる。屈折率の大きな物質を透過した近赤外光の位相は屈折率の小さな物質を透過した近赤外光の位相よりも遅れているので、位相差の分布が発生する。また、観察対象の屈折率が均一な場合には、厚さ寸法が異なることで、同様に位相差の分布が発生する。
【００１８】
位相差画像は、上述した光の干渉により取得することにしてもよいし、焦点位置をずらした少なくとも２枚の画像から、例えば、オーストラリア特許出願公開第２００４２０１１０９号公報に示される方法を用いて計算により求めることにしてもよい。
【００１９】
候補特定部２は、図２に示されるように、まず、入力された位相差画像に対して、平滑化処理（ステップＳ２）を行った後に、２値化処理（ステップＳ３）を行うようになっている。平滑化処理は、入力された位相差画像に含まれるノイズや細胞表面の形状による細かな凹凸の影響を除去するために行われるもので、平滑化フィルタ、ガウシアンフィルタあるいはバイラテラルフィルタ等の公知のフィルタによって行われる。これにより、位相差の細かい変動を無くした平滑化位相差画像を得ることができる。また、２値化処理は、平滑化位相差画像に対して、背景（例えば、シャーレの底面）か細胞かを区別する程度の閾値によって位相差画像を２つに区分けするものである。
【００２０】
次に、候補特定部２は、このようにして２値化処理された位相差画像において、背景ではないとされた各抽出領域に対してラベリング処理（ステップＳ４）を行うようになっている。ラベリング処理は、８連結処理でも４連結処理でもよい。
【００２１】
この段階で１つのラベルに対し１つの細胞がラベリングされるケースもあれば、１つのラベルに対して複数の細胞がラベリングされるケースもある。すなわち、複数の細胞が相互に近接している場合に、細胞の輪郭どうしが接触しており、２値化された場合に単一の領域として抽出されてしまう場合がある。
【００２２】
さらに、候補特定部２は、ラベルが付された各抽出領域について、対応する平滑化位相差画像内を探索し、位相差がピークとなる位置を細胞候補として特定するようになっている（ステップＳ５）。さらに具体的には、各抽出領域に含まれる平滑化位相差画像内の任意の画素を注目画素として選択し、該注目画素に対応づけられている位相差値が、注目画素の周囲８個の近傍画素に対応づけられている位相差値のいずれよりも大きい場合に、その注目画素を細胞候補として特定するようになっている。
【００２３】
一方、該注目画素に対応づけられている位相差値が、注目画素の周囲８個の近傍画素に対応づけられている位相差値のいずれかよりも小さい場合には、注目画素をずらして同様の特定作業を行い、これをくり返すようになっている。これにより、ラベルが付された全ての抽出領域内において、それぞれ１以上の細胞候補が特定されるようになっている。
【００２４】
ラベルが付された抽出領域内に単一の細胞候補が特定された場合には、その細胞候補の示す位相差値と当該抽出領域の最低位相差値との絶対差が所定の閾値より大きい場合に、細胞であると判定するようになっている。すなわち、上記絶対差が所定の閾値以下の場合には、細胞核ではなく、ゴミ等であると考えられるため、これを除外するようになっている。
【００２５】
一方、ラベルが付された抽出領域内に２つ以上の細胞候補が特定された場合には、同一性判定部３において、これら２つ以上の細胞候補が同一の細胞に属するものであるか否かが判定されるようになっている（ステップＳ６）。
具体的には、同一性判定部３は、図３に示されるように、まず、同一ラベルが付された抽出領域Ａ内を分水嶺領域分割法により複数の部分領域Ａ１，Ａ２に分割するようになっている。
【００２６】
分水嶺領域分割法は、各細胞候補Ｐ１，Ｐ２に属する部分領域Ａ１，Ａ２を等高線Ｃにより定めるもので、図３に示されるように、互いの等高線Ｃが接触する位置を結んで分割線Ｄを形成することにより抽出領域Ａ内を複数の部分領域Ａ１，Ａ２に分割することができる。
【００２７】
次に、同一性判定部３は、抽出領域Ａ内に２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２が特定された場合には、当該２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２を結ぶ直線Ｅ上に沿う位相差の分布から、図４に示されるように、位相差の最大差Ｈ１および２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２の位相差の絶対差Ｈ２を算出し（ステップＳ１１）、その比率Ｄ１および差分Ｄ２を算出するようになっている（ステップＳ１２）。
【００２８】
Ｄ１＝Ｈ２／Ｈ１
Ｄ２＝｜Ｈ１−Ｈ２｜
【００２９】
そして、差分Ｄ２が所定の閾値ｔｈ２以下であるか否かが判定され（ステップＳ１３）、閾値ｔｈ２以下である場合には、２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２は同一の細胞に属すると判定するようになっている（ステップＳ１４）。同一の細胞と判定された場合には、分割された部分領域Ａ１，Ａ２が結合されて単一の領域Ａに戻される（ステップＳ１５）。
【００３０】
一方、差分Ｄ２が所定の閾値ｔｈ２より大きい場合であっても、比率Ｄ１が所定の閾値ｔｈ１以上であるか否かが判定され（ステップＳ１６）、閾値ｔｈ１以上である場合には、２つの細胞候補は同一の細胞に属すると判定するようになっている。そして、いずれの条件も満たさない場合には２つの細胞候補は別個の細胞に属すると判定されるようになっている（ステップＳ１７）。
【００３１】
また、同一性判定部３は、図６に示されるように、ラベルが付された抽出領域Ａ内に３以上の細胞候補Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３が特定された場合には、全ての細胞候補Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３から任意の２つの細胞候補を選ぶ全ての組合せで２つの細胞候補（Ｐ１，Ｐ２）；（Ｐ１，Ｐ３）；（Ｐ２，Ｐ３）を直線Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３で結び、当該直線Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３が２つの部分領域（Ａ１，Ａ２）；（Ａ２，Ａ３）のみを通る組合せの細胞候補（Ｐ１，Ｐ２）；（Ｐ２，Ｐ３）についてのみ、上記判定を行うようになっている（図中、破線で示す直線Ｅ２は、３つの部分領域Ａ１，Ａ２，Ａ３を通るので、判定の対象から除かれる。）。
【００３２】
このように構成された本実施形態に係る観察対象判別装置１を用いた観察対象判別方法について以下に説明する。
本実施形態に係る観察対象判別装置１を用いて、多数の細胞を含む細胞群から個別の細胞を判別するには、任意の方法で取得した細胞群の位相差画像を細胞特定部２に入力し、細胞特定部２により、細胞候補Ｐ１，Ｐ２を特定する（候補特定ステップ）。
【００３３】
まず、位相差画像について平滑化が施され、平滑化位相差画像が２値化されることにより、細胞が含まれる領域が抽出され、各抽出領域Ａにラベルが付される。そして、ラベルが付された抽出領域Ａに含まれる平滑化位相差画像内が探索され、位相差がピークとなる位置が、各抽出領域内の細胞候補Ｐ１，Ｐ２として特定される。
【００３４】
同一の抽出領域Ａ内に２つ以上の細胞候補Ｐ１，Ｐ２が特定された場合には、それらの細胞候補Ｐ１，Ｐ２が同一の細胞に属するか否かについて同一性判定部３により判定が行われる（同一性判定ステップ）。同一の抽出領域Ａ内に２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２のみが特定された場合には、２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２を結ぶ直線Ｅ上の位相差分布が抽出され、比率Ｄ１および差分Ｄ２が算出される。
【００３５】
算出された差分Ｄ２が所定の閾値ｔｈ２以下である場合には２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２は同一の細胞に属すると判定される。
細胞候補Ｐ１，Ｐ２が２つ存在する場合には、それらの細胞候補Ｐ１，Ｐ２間には必ず位相差が最小値をとる位置が存在している。差分Ｄ２は、特定された細胞候補Ｐ１，Ｐ２の内、位相差が小さい方の細胞候補Ｐ２が、２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２間に存在する最小位相差に対して相対的にどのくらい大きい位相差を有しているのかを示している。
【００３６】
したがって、差分Ｄ２が所定の閾値ｔｈ２以下である場合には、位相差が小さい方の細胞候補Ｐ２については細胞核が存在せず、ゴミ等の他の要因によってピークとなっているものと判断でき、同一の細胞に属するものであると判定することができる。
【００３７】
一方、算出された差分Ｄ２が所定の閾値ｔｈ２より大きい場合には、算出された比率Ｄ１が所定の閾値ｔｈ１以上である場合に、２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２は同一の細胞に属すると判定される。比率Ｄ１は、２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２間に存在する最小位相差による谷の深さの度合いを示している。
【００３８】
すなわち、２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２の位相差に差がない場合や、谷が深い場合には、比率Ｄ１は所定の閾値ｔｈ１より小さくなるので、２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２は別個の細胞に属すると判定される。一方、２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２の位相差の差が大きい場合や、谷が浅い場合には、比率Ｄ１は所定の閾値ｔｈ１以上となるので、２つの細胞候補Ｐ１，Ｐ２は同一の細胞に属すると判定される。上記差分Ｄ２による判定の後に比率Ｄ１による判定を行うことで、差分Ｄ２では判定できなかった細胞候補Ｐ１，Ｐ２についてより詳細にその帰属を判定することができる。
【００３９】
このように、本実施形態に係る観察対象判別装置１および観察対象判別方法によれば、単に位相差画像の２値化により細胞を特定するのではなく、２値化により抽出された抽出領域Ａ内において細胞候補Ｐ１，Ｐ２を特定し、各細胞候補Ｐ１，Ｐ２が帰属する細胞を判定するので、多数の細胞が密集している場合においても、細胞数、細胞の位置、細胞の形態および細胞の大きさを正しく特定することができるという利点がある。
【００４０】
なお、本実施形態においては、観察対象として細胞を例示して説明したが、これに限定されるものではなく、密集した多数の任意の観察対象の集合体から個別の観察対象を判別する場合に適用することにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明の一実施形態に係る観察対象判別装置を示すブロック図である。
【図２】図１の観察対象判別装置による観察対象判別方法を示すフローチャートである。
【図３】図１の観察対象判別装置における同一性判定部による判定処理を説明する細胞候補が２つの場合の抽出領域の平面図である。
【図４】図３の判定処理における判定手法を説明するための細胞候補を結ぶ直線上の位相差分布を示すグラフである。
【図５】図２の観察対象判別方法における細胞帰属の判定処理を説明するフローチャートである。
【図６】図１の観察対象判別装置における同一性判定部による判定処理を説明する細胞候補が３つ存在する場合の抽出領域の平面図である。
【符号の説明】
【００４２】
１  観察対象判別装置
２  候補特定部
３  同一性判定部
Ｅ  直線
Ｈ１  最大差
Ｈ２  絶対差
Ｄ１  比率
Ｄ２  差分（差）
Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３  細胞候補（観察対象候補）
Ｓ５  候補特定ステップ
Ｓ６  同一性判定ステップ
ｔｈ１，ｔｈ２  閾値
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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