(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオセンサにおいて反応層をより迅速に溶解させる方法を提供する。【解決手段】絶縁性基板２０と、前記絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極３０および対極５０を含む電極系と、前記電極系の上部または近傍に形成された、酵素９０および電子受容体８０を含む反応層１００と、を備えたバイオセンサ１０であって、前記反応層が、２価の金属イオンを含む炭酸塩の微粒子をさらに含むことにより反応層が試料溶液に迅速に溶解し、均一になることを特徴とする、バイオセンサである。【選択図】図１
2009236829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性基板と、
前記絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極および対極を含む電極系と、
前記電極系の上部または近傍に形成された、酵素および電子受容体を含む反応層と、
を備えたバイオセンサであって、
前記反応層が、２価の金属イオンを含む炭酸塩の微粒子をさらに含むことを特徴とする、バイオセンサ。
【請求項２】
前記炭酸塩が、炭酸亜鉛、炭酸カルシウム、炭酸コバルト、炭酸ストロンチウム、炭酸鉄、炭酸ニッケル、炭酸バリウム、炭酸マグネシウム、および炭酸マンガンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記微粒子の平均粒子径が、０．０１μｍ〜２０μｍの範囲である、請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースオキシダーゼ、フルクトースオキシダーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ、グリセロールキナーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、およびムタロターゼからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記電子受容体が、フェリシアン化カリウム、ファリシアン化ナトリウム、フェロセンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェートおよびその誘導体、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、ニトロテトラゾリウムブルー、オスミウム錯体、およびルテニウム錯体からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記反応層が、親水性高分子を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記反応層が、界面活性剤を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
測定試料が血液である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサに関する。詳細には、試料中の特定成分、特に生体試料中に含まれる特定成分の濃度を、酵素反応を利用して迅速かつ高精度に定量できるバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオセンサが医療などの分野において応用されている。バイオセンサの測定対象は低分子から高分子に至るまでの様々な化学物質であり、測定対象に応じて、種々の機
能を有するバイオセンサの開発が進められている。
【０００３】
従来、生体試料および食品中に含まれる特定成分（基質）を希釈や撹拌などを行うことなく簡易に定量することができるバイオセンサが知られている。例えば、特許文献１には、絶縁性の基板上にスクリーン印刷などの方法によって作用極および対極からなる電極系を形成し、さらに、絶縁層を形成した後、上記電極系上に親水性高分子と酵素と電子受容体からなる酵素反応層を形成したバイオセンサが開示されている。
【０００４】
このバイオセンサは、以下の方法により試料中の基質濃度を定量する。まず、基質を含む試料溶液を酵素反応層上に滴下することにより、酵素反応層が試料溶液に溶解し、基質と酵素との間で酵素反応が進行する。この酵素反応によって基質が酸化され、同時に電子受容体が還元される。酵素反応の終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から試料溶液中の基質濃度を求めるものである。
【０００５】
しかしながら、上記のようなバイオセンサは溶解性が悪いという問題点がある。この問題を解決するため、反応層内に微粒子を含有させたバイオセンサが提案されている。このバイオセンサにおいては、反応層内に微粒子を含有させることによって、（１）反応層が多孔質になる、（２）試薬を固定化するための固定化剤（例えば、親水性高分子）の使用量を削減できる、などの理由により反応層の溶解性が向上すると考えられている。
【０００６】
このような微粒子として、特許文献２には、ガラスビーズ、ガラス粉末、ヒュームシリカ、シリカビーズ、シリカ粉末、ラテックス球、アルミナ粉末、ダイヤモンド粉末、ポリエチレンビーズ、鉱物繊維、酸化チタン粉末、ポリマーでコートした金属粒子が使用可能であることが記載されている。
【０００７】
また、特許文献３には、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、マレイン酸エステルおよびスチレン誘導体モノマーのうち少なくとも一つを含む重合体もしくは共重合体、またはポリアミド系高分子化合物が使用可能であることが記載されている。
【０００８】
さらに、特許文献４には、高分子化合物、セラミック、ガラス、ダイヤモンド、およびカーボンが使用可能であることが記載されている。
【特許文献１】特許第２５１７１５３号明細書
【特許文献２】特許第３９４７３５６号明細書
【特許文献３】特許第３７１３５２２号明細書
【特許文献４】特開２００４−６１４９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記特許文献２〜４に記載のバイオセンサでは、依然として反応層の溶解速度が遅い。このため、反応層の試料溶液への溶解性をさらに向上させることが望まれている。
【００１０】
そこで本発明は、バイオセンサにおいて、反応層をより迅速に溶解させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の課題に鑑み、鋭意研究を行った。その結果、２価の金属イオンを含む炭酸塩の微粒子を反応層に含有させることにより、反応層の溶解性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極および対極を含む電極系と、前記電極系の上部または近傍に形成された、酵素および電子受容体を含む反応層と、を備えたバイオセンサであって、前記反応層が、２価の金属イオンを含む炭酸塩の微粒子をさらに含むことを特徴とする、バイオセンサである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、反応層が試料溶液に迅速に溶解し、均一となる。したがって、より短時間で高精度に試料溶液中の特定成分を定量することが可能となる。特に、試料溶液として全血を使用した場合に、本発明の効果は顕著に得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための好ましい一実施形態について説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみには制限されない。
【００１５】
本発明は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極および対極を含む電極系と、前記電極系の上部または近傍に形成された、酵素および電子受容体を含む反応層と、を備えたバイオセンサであって、前記反応層が、２価の金属イオンを含む炭酸塩の微粒子をさらに含むことを特徴とする、バイオセンサである。
【００１６】
以下、本発明のバイオセンサを、図１および図２を参照しながら説明する。なお、説明の都合上、図面の寸法比率は誇張されており、図示する形態が実際とは異なる場合がある。
【００１７】
図１は、本発明の一実施形態に係るバイオセンサを示す分解斜視図である。図２は、図１のＡ−Ａ線に沿って切断したバイオセンサの断面図である。なお、本発明のバイオセンサは、反応層が２価の金属イオンを含む炭酸塩の微粒子を有することに特徴があり、他の部材（例えば、絶縁性基板、作用極、参照極、対極などの材質や大きさなど）およびこれらの形成方法については、公知の同様の部材および方法が適用できる。
【００１８】
図１および図２に示すように、バイオセンサ１０においては、絶縁性基板２０上に、作用極３０、参照極４０および対極５０からなる電極系６０が形成される。また、電極系６０を部分的に覆い、各々の電極の電気化学的に作用する部分である作用極作用部分３０ａ、参照極作用部分４０ａ、および対極作用部分５０ａが露出されるように、絶縁性ペーストを塗布／印刷し、加熱処理することにより絶縁層７０が形成される。
【００１９】
また、作用極作用部分３０ａ、参照極作用部分４０ａ、および対極作用部分５０ａを被覆するように、電子受容体層８０および酵素層９０を含む反応層１００が形成される。
【００２０】
反応層１００はカバー１２０によりさらに覆われ、カバー１２０には試料供給口（図示せず）が設けられている。
【００２１】
図示する形態においては、カバー１２０が使用されているが、本発明のバイオセンサはかような形態のみに制限されず、カバーを使用しないバイオセンサも好適に用いられる。また、カバー１２０を絶縁性基板２０上に固定するために、これらの間に接着層が設けられてもよい。
【００２２】
バイオセンサ１０は、体液などの試料溶液中の特定成分（以下、「基質」とも称する）
の濃度を測定するための装置である。以下、バイオセンサ１０を構成する各部材について
詳細に説明する。
【００２３】
本発明のバイオセンサは、その基体として絶縁性基板を備える。絶縁性基板は、プラスチック、紙、ガラス、セラミックなどの絶縁性材料により構成されうる。上記プラスチックとしては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエステル、ポリスチレン、プリプロピレン、ポリカーボネート、ポリイミド、アクリル樹脂などが挙げられる。絶縁性基板の形状やサイズについては、特に制限されない。
【００２４】
絶縁性基板上に形成される電極系は、バイオセンサの使用時において、後述する反応層中の試料溶液に電位を印加するための電位印加手段、および、試料溶液中に流れる電流を検出するための電流検出手段として機能する。
【００２５】
図１および図２に示すバイオセンサは、絶縁性基板に作用極、参照極および対極が電極系として設けられる、三電極方式センサである。ただし、本発明のバイオセンサは三電極方式のみに制限されず、参照極を含まない電極系を備えた二電極方式センサであってもよい。なお、電極系における電位の制御がより高感度で行われるという観点からは、二電極方式よりも三電極方式が好ましく用いられうる。その他、液量を感知するための感知電極等を含んでいてもよい。
【００２６】
作用極および対極は、バイオセンサの使用時に一対となって、後述する反応層中の試料溶液に電位を印加した際に流れる酸化電流（応答電流）を測定するための電流測定手段として機能する。バイオセンサの使用時には、参照極と作用極との間に所定の電位が印加される。
【００２７】
本発明において使用される電極は、測定対象物と試料との反応を電気化学的に検出できるものであれば特に制限されず、バイオセンサの電極系の形成に従来用いられる電極が適宜用いられうる。ただし、バイオセンサの応答感度をより一層向上させるという観点からは、電極系は表面抵抗値のより小さい材料から構成されることが好ましい。具体的な電極の一例としては、カーボン電極、金電極、銀電極、白金電極、パラジウム電極などが挙げられる。各電極（作用極、参照極、対極）を構成する材料は、それぞれ同一であってもよいし、異なっていてもよい。耐腐食性およびコストの観点から、作用極および対極はカーボンを主成分として構成されることが好ましい。また、印加電位の安定性が高いという観点から、参照極は好ましくは銀／塩化銀により構成される。
【００２８】
電極系の形成方法は特に制限されず、スクリーン印刷法やスパッタリング法などの従来公知の手法により形成されうる。この際、電極系を構成する材料は、ポリエステル等の樹脂バインダを含むペーストの形態で提供されうる。上記の手法により塗膜を形成した後には、塗膜を硬化させる目的で、加熱処理を施すとよい。
【００２９】
絶縁層は、電極系を構成する各電極間の短絡を防止するための絶縁手段として機能する。絶縁層を構成する材料は特に制限されないが、例えば、レジストインク、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙などにより構成されうる。絶縁層の形成方法についても特に制限はなく、スクリーン印刷法や接着法などの従来公知の手法により形成されうる。
【００３０】
バイオセンサの使用時には、反応層において後述する酵素反応が進行する。
【００３１】
反応層は、酵素および電子受容体を含む。また、本発明は、反応層が２価の金属イオンを含む炭酸塩の微粒子をさらに含む点に特徴を有する。以下、反応層を構成する成分について、詳細に説明する。
【００３２】
本発明において使用される酵素は、試料溶液中の基質の反応を触媒する酵素であれば特に制限されず、測定する基質に応じて、適宜選択されうる。具体的には、試料溶液中の基質を酸化する酸化還元酵素、試料溶液中の基質のリン酸化などの転移反応を触媒する転移酵素、試料溶液中の基質を加水分解する加水分解酵素、試料溶液中の基質分子を異性化する異性化酵素などが使用されうる。反応層に含まれる酵素の一例を挙げると、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースオキシダーゼ、フルクトースオキシダーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ、グリセロールキナーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、ムタロターゼなどが例示されうる。ただし、これら以外の酵素が用いられてもよいことは勿論である。また、種々の目的で改良が施された改良型の酵素が用いられてもよい。なお、上記の酵素は、１種のみが単独で反応層に含まれてもよいし、２種以上が組み合わされて反応層に含まれてもよい。
【００３３】
反応層における酵素の含有量については特に制限はなく、測定する基質の種類や試料溶液の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、例えば、酵素としてグリセロールデヒドロゲナーゼを使用する場合には、通常は０．００１〜１００活性単位、好ましくは０．０１〜５０活性単位、より好ましくは０．１〜２０活性単位の酵素が反応層に含まれるとよい。
【００３４】
電子受容体は、バイオセンサの使用時において、酵素の作用によって生成した電子を受け取る、すなわち還元される。そして、還元された電子受容体は、酵素反応の終了後に電極系への電位の印加によって電気化学的に酸化される。この際に流れる電流（以下、「酸化電流」とも称する）の大きさから、試料溶液中の所望の成分の濃度が算出されうる。
【００３５】
電子受容体の種類についても特に制限はなく、従来公知の電子受容体が適宜選択されうる。一例を挙げると、フェリシアン化カリウム、ファリシアン化ナトリウム、フェロセンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェートおよびその誘導体、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、ニトロテトラゾリウムブルー、オスミウム錯体、ルテニウム錯体などが例示され、これらのいずれも好ましく用いることができる。なお、上記の電子受容体は、１種のみが単独で反応層に含まれてもよいし、２種以上が組み合わされて反応層に含まれてもよい。
【００３６】
反応層における電子受容体の含有量については特に制限はなく、試料溶液の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、０．１〜２０μＬの試料溶液を添加して用いるバイオセンサの反応層には、通常は０．１〜２０００μｇ、好ましくは１〜１５００μｇ、より好ましくは１０〜１０００μｇの電子受容体が含まれるとよい。
【００３７】
本発明のバイオセンサにおいて、反応層は２価の金属イオンを含む炭酸塩の微粒子を含む。かかる炭酸塩の微粒子を含む反応層は、試料溶液に迅速に溶解して均一となるため、短時間で高精度な基質の定量が可能となる。
【００３８】
本発明に用いられる炭酸塩としては、炭酸亜鉛、炭酸カルシウム、炭酸コバルト、炭酸ストロンチウム、炭酸鉄、炭酸ニッケル、炭酸バリウム、炭酸マグネシウム、炭酸マンガン、炭酸銅、炭酸鉛が挙げられる。これらの化合物はいずれも難溶性であるが、水溶液に少量溶解する。酵素の種類によっては、これらの溶解した金属イオンが酵素に影響を及ぼし、酵素活性が阻害される可能性がある。このため、２価の金属イオンを含む炭酸塩は、使用する酵素に応じて適宜選択されることが好ましい。
【００３９】
上記炭酸塩の微粒子の大きさ（平均粒子径）は、０．０１μｍ〜２０μｍの範囲、好ましくは０．０５μｍ〜１５μｍの範囲、より好ましくは０．１μｍ〜１０μｍの範囲である。平均粒子径が０．０１μｍ以上であれば、反応層への試料溶液の浸透が十分に確保され、反応層の溶解性が向上する。一方、平均粒子径が２０μｍ以下であれば、微粒子が沈殿せず、微粒子は電極表面に付着しない。このため、反応層内の物質の拡散性が向上し、その結果反応層が試料溶液に迅速に溶解し、均一となる。
【００４０】
反応層における炭酸塩の含有量については特に制限はなく、試料溶液の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、０．１〜２０μＬの試料溶液を添加して用いるバイオセンサの反応層には、通常は０．０１〜１０００μｇ、好ましくは０．０５〜１００μｇ、より好ましくは０．１〜１０μｇの炭酸塩が含まれるとよい。
【００４１】
上記炭酸塩の形態としては、例えば、紡錘形状、偏三角面体状、立方体形状、球状、板状、棒状、針状などがあり、いずれも好ましく使用することができる。
【００４２】
本発明において使用される測定試料は、特に制限されないが、水溶液がよく、例えば、全血、血漿、血清、唾液、尿、骨髄等の生体試料、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類、排水、雨水、プール用水等であり、好ましくは、全血、血漿、血清、唾液、骨髄であり、より好ましくは全血である。全血が好ましい理由は、本発明の反応層の溶解性向上効果が顕著に現れるからである。この理由は明確ではないが、以下のようなことが考推察される。
【００４３】
全血中には、わずかな量の二酸化炭素が含まれている。この二酸化炭素は２価の金属イオンを含む炭酸塩の微粒子と反応し、炭酸水素塩を生成する。例えば、炭酸塩が炭酸カルシウムである場合には、下記反応式（１）により、水溶性の炭酸水素カルシウムとなる。
【００４４】
【化１】
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【００４５】
上記反応により、反応層に含まれる酵素と炭酸カルシウムの微粒子との間にわずかな隙間ができると考えられる。この隙間に血液が浸透することにより、より迅速に酵素が溶解されると考えられる。
【００４６】
なお、この際、炭酸カルシウムは表面のごくわずかな量のみが溶解するため、微粒子としての性質は失われない。このため、炭酸カルシウムの微粒子がブラウン運動することにより、反応層内の物質の拡散を促進する。
【００４７】
以上のことにより、測定試料として血液を用いた場合に、本発明の効果が顕著に得られると考えられる。上記のような性質は今までに報告されてきた微粒子の性質とは異なり、本発明に用いられる炭酸塩の微粒子特有のものである。
【００４８】
さらに反応層は、他の成分を含みうる。他の成分としては、例えば、親水性高分子、界面活性剤、酵素安定化剤などが挙げられる。
【００４９】
反応層が親水性高分子を含む場合には、反応層内に親水性高分子が含まれる形態を有していてもよく、または反応層を覆うように親水性高分子を含む親水性高分子層を形成させた形態を有してもよい。反応層が親水性高分子を含むことにより、基板および電極系表面からの反応層の剥離が防止されうる。また、親水性高分子は、反応層表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質などの吸着性成分の電極系への吸着もまた、抑制されうる。
【００５０】
このような親水性高分子としては、特に制限されないが、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸の重合体またはその誘導体、無水マレイン酸の重合体またはその塩、スターチおよびその誘導体などが挙げられる。これらの中でも、カルボキシメチルセルロースが特に好ましく用いられうる。なお、上記の親水性高分子は、１種のみが単独で反応層に含まれてもよいし、２種以上があわせて反応層に含まれてもよい。
【００５１】
なお、このような親水性高分子の配合量は、一般には１センサあたり、好ましくは０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは１〜５００μｇであり、特に好ましくは５〜１００μｇである。
【００５２】
反応層が界面活性剤を含む場合には、反応層内に界面活性剤が含まれる形態を有していてもよく、または反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成させた形態を有してもよい。反応層に界面活性剤を添加することにより、反応層の溶解が促進されうる。
【００５３】
このような界面活性剤としては、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および天然型界面活性剤などが挙げられ、これらのいずれを用いてもよい。陽イオン性界面活性剤としては、セチルピリジニウムクロリド、トリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。陰イオン性界面活性剤としては、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。両性界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔなどが挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０、オクチルグルコシドなどが挙げられる。天然型界面活性剤としては、例えば、リン脂質が挙げられ、好ましくは、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添レシチン、高純度レシチンなどのレシチンなどが挙げられる。ただし、これら以外の界面活性剤が用いられてもよいことは勿論である。界面活性剤は、使用する酵素の酵素活性が低下しないものがよく、使用する酵素に応じて適宜選択することが好ましい。
【００５４】
反応層における界面活性剤の含有量については特に制限はなく、試料溶液中の脂溶性物質の量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、０．１〜２０μＬの試料溶液を添加して用いるバイオセンサの反応層には、通常は０．０１〜１０００μｇ、好ましくは０．０５〜５００μｇ、より好ましくは０．１〜１００μｇの界面活性剤が含まれるとよい。
【００５５】
反応層は１層のみからなる層であってもよいし、２層以上からなる層であってもよい。反応層が２層からなる形態としては、例えば、電子受容体を含み、酵素を実質的に含まない電子受容層と、上記電子受容層の上層に形成された、酵素および炭酸塩を含み、電子受容体を実質的に含まない酵素層とから、反応層が構成される形態が挙げられる。
【００５６】
また、図示する形態において、反応層は電極系の上層に形成されているが、場合によっては、図示する形態とは異なり、電極系の近傍に反応層を形成し、電極系と反応層とが直接接触しない形態としてもよい。なお、反応層が電極系の「近傍」に形成される形態としては、電極系と反応層との間に空間やフィルタが介在する形態や、試料供給口と電極系との間に反応層が形成される形態などが例示される。
【００５７】
以上、本発明のバイオセンサの構成について詳細に説明したが、上記の形態のみに制限されることはなく、従来公知の知見を適宜参照して、種々の改良を施すことも可能である。従来公知の知見としては、例えば、特開平２−０６２９５２号公報、特開平５−８７７６８号公報、特開平１１−２０１９３２号公報などが挙げられる。
【００５８】
続いて、本発明のバイオセンサの動作について説明する。
【００５９】
まず、濃度の測定を希望する成分（基質）を含む試料溶液の所定量を、バイオセンサの反応層に供給する。試料溶液については特に制限はなく、上述した測定試料を用いればよい。試料溶液の具体的な形態は特に制限されず、バイオセンサに用いられる酵素の基質を含む溶液が適宜用いられうる。試料溶液は原液をそのまま用いてもよいし、粘度などを調節する目的で適当な溶媒で希釈した溶液を用いてもよい。試料溶液に含まれる基質についても特に制限はなく、上述した酵素と反応しうる物質であればよい。基質としては、例えば、グルコースなどの糖類、グリセロール、ソルビトール、アラビトールなどの多価アルコール、中性脂肪、コレステロールなどの脂質、グルタミン酸や乳酸などの有機酸類、クレアチン、クレアチニンなどが挙げられる。
【００６０】
試料溶液を反応層へ供給する形態は特に制限されず、所定量の試料溶液をカバー等に設けられた試料供給口から供給すればよい。また、カバーを使用しない場合には、反応層に対して垂直に直接滴下することにより供給してもよいし、別途設けた試料溶液供給手段により、反応層に対して水平方向から試料溶液を供給してもよい。
【００６１】
反応層へと試料溶液が供給されると、試料溶液中の所望の成分は、反応層に含まれる酵素の作用によって酸化され、自身の酸化と同時に電子を放出する。基質から放出された電子は、電子受容体に捕捉され、これに伴って電子受容体は酸化型から還元型へと変化する。試料溶液の添加後、バイオセンサを所定時間放置することにより、酵素によって基質が完全に酸化され、一定量の電子受容体が酸化型から還元型へと変換される。基質と酵素との反応を完結させるための放置時間については特に制限はないが、試料溶液添加後、通常は１秒〜５分間、好ましくは３秒〜３分間である。
【００６２】
その後、還元型の電子受容体を酸化する目的で、電極系を介して、作用極と対極との間に、所定の電位を印加する。これにより、反応層中に酸化電流が流れ、この電流によって還元型の電子受容体が電気化学的に酸化され、酸化型へと変換される。この際に測定される酸化電流の値から、電位印加前の還元型の電子受容体の量が算出され、さらに、酵素と反応した基質の量が定量されうる。
【００６３】
酸化電流を流す際に印加される電位の値は特に制限されず、従来公知の知見を参照して適宜調節されうる。一例を挙げると、−２００〜７００ｍＶ程度、好ましくは０〜６００ｍＶの電位を、対極と作用極との間に印加すればよい。電位を印加するための電位印加手段についても特に制限はなく、従来公知の電位印加手段が適宜用いられうる。
【００６４】
酸化電流値の測定、および当該電流値から基質濃度への換算の手法としては、所定の電位を印加してから一定時間後の電流値を測定するクロノアンペロメトリー法を用いてもよいし、クロノアンペロメトリー法による電流応答を時間で積分して得られる電荷量を測定するクロノクーロメトリー法を用いてもよい。簡単な装置系により測定されるという点で、クロノアンペロメトリー法が好ましく用いられうる。
【００６５】
以上、還元型の電子受容体を酸化する際の電流（酸化電流）を測定することにより中性脂肪濃度を算出する形態を例に挙げて説明したが、場合によっては、還元されずに残存している酸化型の電子受容体を還元する際の電流（還元電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態を採用してもよい。
【００６６】
本発明のバイオセンサは、いずれの形態で使用してもよく特に制限されない。例えば、使い捨て用途としてのディスポーザブルタイプのバイオセンサ、少なくとも電極部分を人体に埋め込んで連続的に血糖値、ポリオールなどの所定の値を測定するためのバイオセンサなど、様々な用途に使用できる。
【００６７】
例えば、グリセロールなどのポリオールを基質としたバイオセンサ（酵素としてグリセロールデヒドロゲナーゼを使用）の場合には、以下の方法により基質の定量が可能である。
【００６８】
グリセロールデヒドロゲナーゼは、下記式に示されるように、グリセロールと酸化型電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。
【００６９】
【化２】
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【００７０】
上記式において、酸化型電子受容体の減少、還元型電子受容体の増加、ジヒドロキシアセトンの量を測定することによって、簡便にグリセロールを定量することができる。このように、本発明のバイオセンサを使用すると、グリセロール等のポリオールを含む試料中のポリオール量が定量できる。
【００７１】
また、本発明のバイオセンサは、血清、血漿、全血等の中性脂肪測定にも使用することができる。すなわち、これらの試料に含まれる中性脂肪は、例えばリポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールとに分解されるが、ここで生じたグリセロールを、グリセロールデヒドロゲナーゼを用いて定量することができる。精神病治療患者および透析患者においては、中性脂肪測定時に遊離グリセロールが問題になるが、本発明のバイオセンサを用いてグリセロールを予め消去するか、もしくはその量を測定しておくことで真の中性脂肪値を求めることが可能である。なお、本発明のバイオセンサは溶液中に界面活性剤を含んでいてもポリオールを正確に定量することができる。
【実施例】
【００７２】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
［実施例］
本発明のバイオセンサの一例として、以下の手法により、図１および図２に示す形態の中性脂肪センサを作製した。
【００７３】
（中性脂肪センサの作製）
電極系が形成されたセンサ基板として、ディスポーザブル印刷電極  ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ  ＥＰ−Ｎ（有限会社バイオデバイステクノロジー製）を使用した。ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ  ＥＰ−Ｎは、絶縁性基板２０の上に、それぞれカーボンからなる作用極３０、参照極４０、対極５０が形成され、絶縁層７０を挟んで、カーボンからなる作用極作用部分３０ａ、銀／塩化銀からなる参照極作用部分４０ａ、カーボンからなる対極作用部分５０ａが形成されている。
【００７４】
電子受容体層８０は以下のようにして作製した。２０ｍＭ  グリシルグリシンバッファー（ｐＨ８．５）に溶解した２００ｍＭ  １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファートと、同バッファーに溶解した０．１％  カルボキシメチルセルロースとを等量ずつ混合し、混合液を得た。
【００７５】
バイオセンサ一枚あたり、上記混合溶液  ２μＬを、作用極作用部分３０ａ、参照極作用部分４０ａ、および対極作用部分５０ａを被覆するように滴下し、風を当てながら室温で乾燥させることにより、センサ基板上に電子受容体層８０を形成した。
【００７６】
酵素層９０は以下のようにして作製した。グリセロールデヒドロゲナーゼの濃度が１Ｕ／μＬ、かつリポプロテインリパーゼの濃度が１Ｕ／μＬとなるように、両酵素を２０ｍＭ  グリシルグリシンバッファー（ｐＨ８．５）に溶解させ、酵素溶液を調製した。
【００７７】
また、同バッファーに溶解した平均粒子径０．５μｍの炭酸カルシウム  ０．１％溶液、カルボキシメチルセルロース  ０．３％溶液、およびＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００  ０．１５％溶液を等量ずつ混合し、炭酸カルシウム溶液を調製した。
【００７８】
上記で調製した酵素溶液  ２μＬと炭酸カルシウム溶液  １．５μＬとを混合し混合溶液を得た。
【００７９】
バイオセンサ一枚あたり、上記混合溶液  ３．５μＬを、ポリエチレンからなるカバー１２０に接着剤（両面テープ）を張り合わせた隙間に滴下後、風を当てながら室温で乾燥させることにより、酵素層９０を形成した。
【００８０】
上記で作製した電子受容体層８０が形成されたセンサ基板と酵素層９０が形成されたカバー１２０とを接着剤（両面テープ）で張り合わせることにより、バイオセンサ（中性脂肪センサ）を作製した。
【００８１】
（特性評価）
試料溶液を反応層（電子受容体層および酵素層）に滴下して１分３０秒後に、参照極４０を基準として作用極３０に対しアノード方向に＋１５０ｍＶの定電位を印加し、２０秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。この電流値は、還元された電子受容体の濃度、すなわち試料溶液中の中性脂肪濃度に比例するため、この電流値から試料中の中性脂肪濃度を求めることができる。
【００８２】
上記方法により、中性脂肪濃度が異なる３人の全血（１０２、２１３、３９０ｍｇ／ｄｌ）を試料として、５回測定を行った。結果を図３に示す。
【００８３】
［比較例］
炭酸カルシウムの微粒子を含まないこと以外は全て実施例と同じ条件で測定を行った場合の結果を図４に示す。
【００８４】
（結果）
図３および図４に示される結果より、反応層に炭酸カルシウムの微粒子を含む実施例（図３）は、反応層に炭酸カルシウムの微粒子を含まない比較例に比べて、応答電流値のばらつきが小さいことがわかる。特に、高濃度領域（中性脂肪濃度３９０ｍｇ／ｄｌ）でのばらつきが顕著に抑制されている。これは、炭酸カルシウムの微粒子を加えることにより、反応層が迅速に溶解したためであると考えられる。
【００８５】
以上から、２価の金属イオンを含む炭酸塩の微粒子を含む反応層を備えたバイオセンサを用いると、従来のバイオセンサと比較して、より短時間で高精度に試料溶液中の特定成分を定量しうることが示される。
【００８６】
なお、炭酸カルシウム以外の２価の金属イオンを含む炭酸塩に関しても同様の結果が得られることが確認された。
【００８７】
なお、酵素と電子受容体の組み合わせは上記実施例に限定されることはなく、本発明の主旨に合致するものであれば使用できる。また、上記実施例においては、三電極系の場合について述べたが、対極と作用極からなる二電極系でも測定は可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明の一実施形態に係るバイオセンサを示す分解斜視図である。
【図２】図１のＡ−Ａ線に沿って切断したバイオセンサの断面図である。
【図３】実施例における、バイオセンサの応答特性図を示すグラフである。
【図４】比較例における、バイオセンサの応答特性図を示すグラフである。
【符号の説明】
【００８９】
１０  バイオセンサ、
２０  絶縁性基板、
３０  作用極、
３０ａ  作用極作用部分、
４０  参照極、
４０ａ  参照極作用部分、
５０  対極、
５０ａ  対極作用部分、
６０  電極系、
７０  絶縁層、
８０  電子受容体層、
９０  酵素層、
１００  反応層
１２０  カバー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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