(57)【要約】      （修正有）【課題】トランスジェニックニワトリによる卵での医薬品向け高機能性タンパク質の生産手法において、完全トランスジェニックニワトリの取得のための、効率的なＧ０ファウンダーの選抜方法を提供する。【解決手段】Ａ）目的タンパク質をコードするウイルスベクターを鳥類受精卵にマイクロインジェクションする工程、Ｂ）Ａで作製した遺伝子導入鳥類につき、雄の精子ゲノムへの導入遺伝子コピー数を算出する工程、Ｃ）Ｂにより選抜された雄と雌鳥類の交配を行う工程、を含む鳥類を用いた蛋白質の製造方法。【効果】Ｇ０キメラニワトリの精子ゲノムのリアルタイムＰＣＲにより、導入遺伝子コピー数を算出することが可能となり、後代取得の容易なＧ０ファウンダーの選抜が可能となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む鳥類を用いた蛋白質の製造方法：
Ａ）目的タンパク質をコードするウイルスベクターを鳥類受精卵にマイクロインジェクションする工程、
Ｂ）Ａで作製した遺伝子導入鳥類につき、雄の精子ゲノムへの導入遺伝子コピー数を算出する工程、
Ｃ）Ｂにより選抜された雄と雌鳥類の交配を行う工程。
【請求項２】
ウイルスベクターがレトロウイルス、レンチウイルスである請求項１に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項３】
導入遺伝子コピー数の算出方法が、ＰＣＲもしくは定量ＰＣＲ法による請求項１に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項４】
ＰＣＲもしくは定量ＰＣＲ法がレトロウイルス由来のパッケージングシグナル配列を増幅する手法である請求項３に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載のパッケージングシグナル配列を増幅するためのプライマー配列であり、配列番号１および配列番号２に記載の配列。
【請求項６】
雌鳥類が、遺伝子組替え鳥類である請求項１に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項７】
目的タンパク質が、抗体、サイトカインに代表されるタンパク性医薬品原料である請求項１に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項８】
請求項１記載の鳥類の卵の卵白または卵黄に目的タンパク質を含むタンパク性医薬品原料の生産方法。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の鳥類がニワトリまたはウズラである蛋白質の製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の鳥類およびその子孫の雌個体から産卵される卵。
【請求項１１】
請求項１０記載の卵の卵白または卵黄に目的タンパク質を含むタンパク性医薬品原料の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルスベクターにより卵中に外来性の有用蛋白質を含有する遺伝子導入鳥類を作製し、その子孫である完全体遺伝子導入鳥類を効率的に作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組替え技術により、従来生体試料より微量抽出しかできなかった、また化学合成では生産困難なタンパク医薬品を微生物や真核細胞に生産させることにより工業生産されてきた。組換え技術を用いた有用タンパク質の生産方法としては、大腸菌に代表される原核生物、酵母に代表される真核生物による発現系や哺乳動物細胞や昆虫細胞の培養細胞を利用した系が成功している。
【０００３】
だが近年の目ざましい研究成果により細胞内でのタンパク質動態がより詳細に明らかになるにつれ、医薬品として望まれるタンパク質の生産方法として翻訳後修飾やフォールディング、高次構造に注目した特異的、機能的なタンパク質を生産する技術が望まれている。高機能性タンパク質製剤の製造方法としては哺乳動物細胞を利用した系が主流となっているが、この生産方法はコストが高い、生産性が悪い、ウイルスの混入による感染症の恐れといったデメリットが存在する。
【０００４】
そこで着目したのがトランスジェニック動物によるタンパク医薬品の生産方法である。トランスジェニック動物の開発が世界中で報告され、サイトカイン類や血液製剤用の有用タンパク質を乳中に蓄積したトランスジェニックヤギやヒツジはすでに実用段階にある。これらトランスジェニック動物によるタンパク質生産のメリットは、哺乳動物細胞での生産系と同様の翻訳後修飾、フォールディング、高次構造を有した高機能性タンパク質を大量、安価に生産できる点である。トランスジェニック動物によるタンパク医薬品生産に於いては大型哺乳動物が用いられているが、これらウシ、ヒツジ、ヤギといった大型哺乳動物の乳に生産させる手法ではその広い飼育スペースと成熟して生産ラインが確立するまでに長い期間かかる欠点がある。
【０００５】
そこで我々はニワトリに着目した。ニワトリのように長年にわたり改良されてきた家禽は成長が早く、短期間に個体の増殖が可能であり、毎日卵を産卵するため大量生産が可能な理想的な動物工場である。
【０００６】
トランスジェニック鳥類の作製は以下のようにこれまでいくつか試みられてきている。Ｌｏｖｅら（非特許文献１）はニワトリの受精卵を輸卵管から取り出し、この細胞質にマーカー遺伝子を有する直鎖ＤＮＡをマイクロインジェクションし、人工的環境下で発生、分化させた。この孵化した個体は導入遺伝子を有していたと報告されている。ただしこの手法では、受精卵を取得するのに雌鳥の屠殺を必要とし、トランスジェニック鳥類の作製効率も低い（１／８８）ことから実用向きではなかった。
【０００７】
一方、レトロウイルスにより効率的にトランスジェニックニワトリを作製する試みが為され、いくつか成功を収めている。初期には複製能を有するレトロウイルスを用いてトランスジェニックニワトリが作製された（非特許文献２）が、複製可能なレトロウイルスの混入や他のニワトリへの感染の危険性から実用的ではなく、現在では複製能を欠失させたレトロウイルスベクターを用いるのが一般的である。複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いるトランスジェニックニワトリの作製は、Ｈａｒｖｅｙら（非特許文献３）やＫａｍｉｈｉｒａら（非特許文献４）により報告されており、特開２００２―１７６８８０（特許文献１）、ＷＯ２００４／０６１０８１（特許文献２）に公開されている。
【０００８】
これら複製能欠失型レトロウイルスベクターによるトランスジェニック鳥類の作製は従来生産が困難であったエリスロポエチンや血液凝固因子等の活性発揮に複雑な翻訳後修飾を要するタンパク質の生産を可能とした。（特開２００７−８９５７８（特許文献３）、特開２００７−１８１４５５（特許文献４））
しかし、トランスジェニック鳥類において生産されたタンパク質をタンパク性医薬品として産業応用するためには、更なる問題の解決を要する。特許文献１、特許文献２に代表される従来のレトロウイルス導入方法は、放卵後の受精卵の初期胚に遺伝子導入することを特徴とする。この時点で標的の細胞数は数万以上存在し、マイクロインジェクションによりレトロウイルスによる遺伝子導入が為された細胞と遺伝子導入されない細胞が混在する。また標的鳥類の染色体ゲノムにもランダムに外来遺伝子が挿入されるため、個体を構成する全ての細胞に均一に遺伝子導入が為されない。将来的に目的有用タンパク質を大量、安定生産するためには、個体構成細胞の全てに均一に目的タンパク質をコードする遺伝子を有したトランスジェニック鳥類を大量飼育する必要がある。
【０００９】
上記問題点の解決策は、トランスジェニックニワトリの後代を取得することで解決できる。従来の放卵後の胚へのレトロウイルスベクターの導入により作製されたトランスジェニックニワトリは個体構成細胞に不均一に導入遺伝子を有するトランスジェニックキメラニワトリ（本明細書ではＧ０と称する）であるが、このＧ０の生殖細胞から分化した精子または卵子により取得される後代トランスジェニックニワトリは、個体構成細胞のすべてに均一に導入遺伝子を有する完全トランスジェニックニワトリとなりうる。
【００１０】
ところがこの完全トランスジェニックニワトリＧ１の取得は容易ではなく、通常数羽のＧ０雄を用いて複数羽の雌と交配させ、得られた受精卵を孵化させて幼雛期の段階で導入遺伝子を有していることを確認する。Ｈａｒｖｅｙら（非特許文献３）の報告では後代への遺伝子伝播効率は１％以下であり、１０００羽程度のスクリーニングを要する。Ｋａｍｉｈｉｒａら（非特許文献４）の報告でもＧ１取得確率はわずか３％（6/181）程度であった。
【非特許文献１】Biotechnology (N Y). 1994 Jan;12(1):60-3.
【非特許文献２】Virology. 1987 Mar;157(1):236-40.
【非特許文献３】Poult Sci. 2002 Feb;81(2):202-12.
【非特許文献４】J Virol. 2005 Sep;79(17):10864-74
【特許文献１】特開２００２―１７６８８０
【特許文献２】ＷＯ２００４／０６１０８１
【特許文献３】特開２００７−８９５７８
【特許文献４】特開２００７−１８１４５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者は上記現状に鑑み、  医薬品向け高機能性タンパク質を高生産する方法としてトランスジェニックニワトリの個体構成細胞のすべてに均一に導入遺伝子を有する完全トランスジェニックニワトリの選抜、作製する方法を見出すことを試みた。
【００１２】
即ち、Ｇ０ニワトリを他の鳥類または他のトランスジェニックニワトリと交配させることにより得られる完全トランスジェニックニワトリを本明細書ではＧ１と称し、Ｇ１のさらに後代をＧ２、Ｇ３と本明細書では称する。Ｇ１の取得に成功した場合、このＧ１と他鳥類との交配により誕生する後代は１／２の確立で完全トランスジェニックニワトリが得られ、数千羽の生産ラインの構築であっても容易に行うことができる。
【００１３】
そこでＧ０ニワトリの生殖細胞への遺伝子導入効率を定量的に測定できれば、後代伝播率の良いＧ０個体（本明細書中ではＧ０ファウンダーと称する）を集中的に交配し、非常に効率的にＧ１の作製が可能となる。これまでＫａｍｉｈｉｒａら（非特許文献４）は雄Ｇ０の精子よりゲノムを抽出し、ＰＣＲ法により導入遺伝子コピー数の高いＧ０ファウンダーを選抜しようと試みてきたが定量的な解析ができなかった。
【００１４】
本発明の目的は従来方法では不可能であった定量ＰＣＲによるＧ０トランスジェニックニワトリ精子ゲノム中への導入遺伝子コピー数を算出する方法を考案し、定量的にＧ１取得確率を測定できる方法を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、効率的に個体構成細胞すべてに導入遺伝子を有する完全トランスジェニック鳥類の作製方法及びＧ０ファウンダーの選抜方法を見出し、本願発明を完成させるに至った。
【００１６】
即ち本願発明は以下のとおりである。
（１）
以下の工程を含む鳥類を用いた蛋白質の製造方法：
Ａ）目的タンパク質をコードするウイルスベクターを鳥類受精卵にマイクロインジェクションする工程、
Ｂ）Ａで作製した遺伝子導入鳥類につき、雄の精子ゲノムへの導入遺伝子コピー数を算出する工程、
Ｃ）Ｂにより選抜された雄と雌鳥類の交配を行う工程。
（２）
ウイルスベクターがレトロウイルス、レンチウイルスである（１）に記載の蛋白質の製造方法。
（３）
導入遺伝子コピー数の算出方法が、ＰＣＲもしくは定量ＰＣＲ法による（１）に記載の蛋白質の製造方法。
（４）
ＰＣＲもしくは定量ＰＣＲ法がレトロウイルス由来のパッケージングシグナル配列を増幅する手法である（３）に記載の蛋白質の製造方法。
（５）
（４）に記載のパッケージングシグナル配列を増幅するためのプライマー配列であり、配列番号１および配列番号２に記載の配列。
（６）
雌鳥類が、遺伝子組替え鳥類である（１）に記載の蛋白質の製造方法。
（７）
目的タンパク質が、抗体、サイトカインに代表されるタンパク性医薬品原料である（１）に記載の蛋白質の製造方法。
（８）
（１）記載の鳥類の卵の卵白または卵黄に目的タンパク質を含むタンパク性医薬品原料の生産方法。
（９）
（１）〜（８）に記載の鳥類がニワトリまたはウズラである蛋白質の製造方法。
（１０）
（９）に記載の鳥類およびその子孫の雌個体から産卵される卵。
（１１）
（１０）記載の卵の卵白または卵黄に目的タンパク質を含むタンパク性医薬品原料の生産方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、個体構成細胞のすべてに均一に導入遺伝子を有する完全トランスジェニック鳥類を効率良く作製することが可能となり、トランスジェニック鳥類によるタンパク性医薬品原料の大量、安定供給が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を実施する好ましい形態を詳述するが、本発明の本質は記載の内容により不当に限定されるべきではない。
【００１９】
本発明で用いられるＧ０トランスジェニック鳥類の作製方法の一例としては特開２００２−１７６８８０（特許文献１）およびＷＯ２００４／０６１０８１（特許文献２）記載の手法が挙げられるがこれに限定することはなく、放卵後の鳥類受精卵に複製能欠失型ウイルスベクターを導入する手法であれば本発明の技術範囲に含まれる。複製能欠失型ウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ボックスウイルス、ヘルペスウイルス等宿主鳥類に目的遺伝子配列が導入可能なベクターであれば特に限定されない。この複製能欠失型ウイルスベクターにはプロモーター、目的タンパク質をコードする遺伝子、発現調節配列を最低限含み、目的とするタンパク質を鳥類で発現可能であれば特に限定はされないが、好ましくは卵白または卵黄に発現させることが可能である。目的タンパク質遺伝子は特に限定されることなく、人畜に限定されることなく、医薬品、化粧品、食品、工業用酵素などあらゆる産業で利用される。調節因子としてはＷＰＲＥ配列のような転写後調節因子やエンハンサー配列、分泌シグナル配列等、目的タンパク質を好ましい形態で発現させうるためのＤＮＡ配列を含んでいても良い。宿主鳥類としては限定されることはなく、ニワトリ、ウズラ、七面鳥、カモなどが用いられるが、なかでもニワトリやウズラは入手が容易であり産卵種としても多産であり、長年の飼育経験により安全性が認められている点で特に好ましい。
【００２０】
このようにして作製したＧ０トランスジェニック鳥類をあらゆる公知の手法によって飼育、成熟させ、その生殖細胞への導入遺伝子数を測定する。好ましくは精子取得が容易な雄より採精して、そのゲノム中への導入遺伝子数を測定する手法が好ましいが、屠殺しない限りで雌より卵子を取得してもよい。採精方法は限定しないが腹部マッサージ法等が用いられる。精子からのゲノム抽出方法は公知のいかなる手段を用いても良い。
導入遺伝子数の測定方法は定量ＰＣＲ法が好ましいが、蛍光や薬剤耐性のマーカー遺伝子を利用しても良い。定量ＰＣＲ法で増幅する標的配列としては、ウイルスベクター由来の配列や導入遺伝子、マーカー遺伝子、プロモーターや調節因子といった翻訳領域、非翻訳領域に関わらず、ウイルスベクターにより宿主ゲノム中に挿入されたＤＮＡ配列であればあらゆる部位が利用可能であるが、トランスジェニック鳥類で発現させる目的タンパク質に依存しない点でウイルスベクター由来の配列が好ましい。ウイルスベクター由来の配列としては、５´または３´ＬＴＲやパッケージングシグナル等が利用可能である。定量ＰＣＲでの検出方法は、ＰＣＲ反応でのＤＮＡ増幅時に取り込まれるサイバーグリーンの蛍光強度をモニタリングするサイバーグリーン法や、ＰＣＲ反応によって増幅されるＤＮＡにハイブリダイズし、蛍光を発するプローブ法等の公知の手法が用いられる。好ましくは検出感度、再現性の良く、バックグラウンドの少ないプローブ法が好ましい。プローブ法で用いるハイブリダイゼーションプローブは定量ＰＣＲで測定できれば限定されない。
【００２１】
このようにして生殖細胞への導入遺伝子効率が良いＧ０個体（本明細書ではＧ０ファウンダーと称する）を選抜し、他鳥類と交配させることにより効率的にＧ１作製が可能である。交配方法は人工授精による方法、自然交配による方法でも構わない。交配に用いる鳥類は限定されることなく、同種の鳥類でも他種の鳥類でも構わないし、トランスジェニック鳥類であっても非トランスジェニック鳥類でも用いることが可能である。Ｇ１完全トランスジェニック鳥類の検定方法は特に限定されず、例えばＰＣＲ、サザンブロット、ＦＩＳＨ法等のあらゆる手法により導入遺伝子を検出する方法が用いられる。目的とするタンパク質の発現を血清、全血、組織、卵白、卵黄から検出してもよい。
【００２２】
このようにして得られたＧ１は個体を構成するすべての細胞に均一に導入遺伝子を有する完全トランスジェニック鳥類である。Ｇ１が得られれば、複数のＧ１の中から所望の目的タンパク質の発現量、発現形式の好ましい個体を選抜し、他鳥類と交配させることにより容易に後代完全トランスジェニック鳥類が得られうる。この後代完全トランスジェニック鳥類をＧ２、Ｇ３などとする。このＧ１以降の完全トランスジェニック鳥類の卵を回収し、該卵の卵白または卵黄より目的タンパク質を回収する。回収する方法としては特に限定されず、濾過、アフィニティークロマトグラフや陽イオン、陰イオン交換クロマトグラフ等あらゆる公知の精製または分離手法が用いられる。
【００２３】
このようにして得られた目的タンパク質は医薬品用途に限定されずあらゆる産業応用が可能である。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）トランスジェニックニワトリの作製と精子の採取
血液凝固第七因子を発現するトランスジェニックニワトリの作製は特開２００７−１８１４５５（特許文献４）に記載されている。またネコエリスロポエチンを発現するトランスジェニックニワトリの作製は特開２００７−８９５７８（特許文献３）に記載されている。
【００２５】
特許文献４記載の雄個体３羽（Ｆ９−１、Ｆ９−２，Ｆ１３−１）および特許文献３記載の２羽（Ｅ１１−４、Ｅ１２−２）より腹部マッサージ法によりそれぞれ採精した。またコントロールとして、Ｋａｍｉｈｉｒａら（非特許文献４）が取得し、ＦＩＳＨ解析により１コピーの導入遺伝子を有する完全トランスジェニックニワトリ雄より採精した。また、ネガティブコントロールとして野生型の雄ニワトリより採精した。
【００２６】
（実施例２）精子ゲノムの抽出
実施例１記載のトランスジェニックニワトリ精子からのゲノムＤＮＡの抽出はＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。
マイクロチューブに採取した精子２０μｌに滅菌水８０μｌを加え、これに７５０μｌの溶解・吸着液と４０μｌの磁性ビーズを加えた。４℃で１時間、回転攪拌して混和し、磁気スタンドを用いて磁性ビーズを壁面に吸着させ、上清を取り除いた。これに洗浄液９００μｌを加え、５秒間ボルテックスミキサーにより激しく混和した。チューブを磁気スタンドにセットし、磁性ビーズを吸着させ、上清を取り除いた。再び９００μｌの洗浄液を加え、同様に５秒間ボルテックスミキサーで混和したのち、磁気スタンドを用いて上清を取り除いた。７０％エタノールを９００μｌ加え、ボルテックスミキサーで５秒間激しく混和し、磁気スタンドを用いて上清を取り除いた。再度７０％エタノール９００μｌを加え、５秒間激しく混和したのち、磁気スタンドにより上清を取り除いた。滅菌水１００μｌを加え、ゲノムＤＮＡを磁性ビーズから溶出させ、磁気スタンドを用いて磁性ビーズと分離させ、上清を回収した。
精子ゲノムＤＮＡを分光光度計により定量し、サンプルとした。結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
2009082032.tif 000002
（実施例３）スタンダードゲノム抽出
リアルタイムＰＣＲでコピー数を算出するため、スタンダードのゲノム調整をおこなった。Ｋａｍｉｈｉｒａら（非特許文献４）が作製したｓｃＦｖＦｃを発現するトランスジェニックニワトリで、ＦＩＳＨ解析の結果、ゲノムに１コピーの導入遺伝子を有するＧ１完全トランスジェニックニワトリの全血よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてゲノム抽出を行った。
ヘパリンを入れたマイクロチューブに全血１００μｌを入れ十分に混和し、全血サンプルとした。これに７５０μｌの溶解・吸着液と４０μｌの磁性ビーズを加えた。４℃で１時間、回転攪拌して混和し、磁気スタンドを用いて磁性ビーズを壁面に吸着させ、上清を取り除いた。これに洗浄液９００μｌを加え、５秒間ボルテックスミキサーにより激しく混和した。チューブを磁気スタンドにセットし、磁性ビーズを吸着させ、上清を取り除いた。再び９００μｌの洗浄液を加え、同様に５秒間ボルテックスミキサーで混和したのち、磁気スタンドを用いて上清を取り除いた。７０％エタノールを９００μｌ加え、ボルテックスミキサーで５秒間激しく混和し、磁気スタンドを用いて上清を取り除いた。再度７０％エタノール９００μｌを加え、５秒間激しく混和したのち、磁気スタンドにより上清を取り除いた。滅菌水１００μｌを加え、ゲノムＤＮＡを磁性ビーズから溶出させ、磁気スタンドを用いて磁性ビーズと分離させ、上清を回収した。
精子ゲノムＤＮＡを分光光度計により定量し、サンプルとした。結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
2009082032.tif 000003
（実施例４）リアルタイムＰＣＲによる精子ゲノムへの導入遺伝子コピー数の測定
実施例２で調整した精子ゲノム中への導入遺伝子コピー数の測定をリアルタイムＰＣＲ（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ））により測定した。リアルタイムＰＣＲでのスタンダードは実施例３に記載のスタンダードゲノム（細胞あたり１コピーの導入遺伝子を有するゲノムＤＮＡ）を６段階希釈して用いている。リアルタイムＰＣＲに用いたプライマーは配列番号１、配列番号２に記載してある。また、ハイブリダイゼーションプローブは配列番号３および配列番号４に記載してある。ハイブリダイゼーションプローブは配列番号３が３´ＦＩＴＣラベルしており、配列番号４が５´をＬＣＲｅｄ６４０でラベルしてある。リアルタイムＰＣＲの条件は以下で行い、５８℃アニ−ル時に蛍光強度をモニタリングする設定としている。
Ｄｅｎａｔｕｒｅ（１サイクル）
９５℃  ６００秒
ＰＣＲ（４５サイクル）
９５℃  １０秒
５８℃  １５秒
７２℃  １０秒
Ｃｏｏｌｉｎｇ
４０℃  ３０秒
（実施例５）導入遺伝子コピー数の算出
リアルタイムＰＣＲにより得られたチャートより精子ゲノム中の導入遺伝子コピー数を算出した。結果を表３に示す。
コピー数の算出方法は以下の式により算出した。
（コピー数）＝（測定値）/（測定に用いたゲノム）/（１copyゲノム測定値）/（測定に用いた１copyゲノム量）
得られたコピー数を基にＧ１取得確率が計算される。
【００２９】
【表３】
2009082032.tif 000004
（実施例６）Ｇ１完全トランスジェニックニワトリの作製
実施例５で計算された各個体を野生型の雌ニワトリと交配し、得られる受精卵を３８℃でインキュベートして孵化させた。得られた雛より採血し、実施例３に記載の手法によって全血よりゲノムを抽出し、実施例４で用いたプライマーを用いてＰＣＲによりＧ１検定を行った。結果を表４に示す。
【００３０】
【表４】
2009082032.tif 000005
【配列表】
2009082032000001.app