(57)【要約】【課題】角層酸化タンパク質のカルボニル化を指標とする皮膚疾患の有無の簡略化検査方法の提供。【解決手段】本発明は、角層酸化タンパク質を検出するための方法であって、角層試料を角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質を含むゲルに直接接触させ、試料中の酸化タンパク質にゲル中の蛍光物質を結合させることにより蛍光標識させることを特徴とする方法、及びその方法を実施するために利用されるキットを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚疾患の有無の検査方法であって、皮膚から採取した角層試料中の酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に標識し、検出することで評価を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記皮膚疾患が乾癬又はアトピー性皮膚炎である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記標識が蛍光標識である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光標識をヒドラジノ基含有蛍光物質で行う、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記角層試料が皮膚に対するテープストリッピングにより採取されたテープ角層である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記皮膚から採取した角層試料を角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質を含むゲルに直接接触させる工程、及び当該蛍光を検出する工程、を含んで成る、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記接触工程において、室温で５分〜３０分間維持される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記検出を蛍光顕微鏡下で行い、それにより得た検出結果を画像化する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角層酸化タンパク質を指標とする、詳しくは角層酸化タンパク質のカルボニル化を指標とする皮膚疾患の有無の検査方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、皮膚の加齢に伴う老化や光老化との関係で、角層酸化タンパク質の研究が盛んに行われている。酸化タンパク質とは、酸化を受けた結果角層酸化タンパク質のカルボニル基の導入されたタンパク質をいい、一般に、タンパク質におけるLys、Arg、Proといったアミノ酸残基のNH2基が直接酸化されて角層酸化タンパク質のカルボニル基となった結果生成されたものと、脂質が酸化して過酸化脂質、更には分解して反応性の高いアルデヒドとなり、それがタンパク質と結合することで生成されたものとがある。酸化タンパク質は老化関連での研究が豊富にされており、加齢（脳、肝、線維芽細胞）、アルツハイマー病、早老症（Werner症候群）等において増加することが認められている。
【０００３】
皮膚においては、光線性弾力線維症の真皮でのカルボニル化の増加（Arch. Dermatol. Res. 2001,; 293:363-367)、紫外線による角層のカルボニル化の増加（FEBS Letter 1998 Feb 6, 422(3), 403-406)などが報告されている。さらには、アトピー皮疹部の角層、真皮においてもカルボニル化の増加が報告されている（Br. J. Dermatol. 2003; 149, 248-254)。
【０００４】
前述の通り、角層酸化タンパク質に関する研究が多々行われ、角層酸化タンパク質の様々な検出方法が記載されている。FEBS Letter 1998 （前掲）では、粘着テープを皮膚表層に貼付け、剥がすといったいわゆるテープストリッピング操作を行うことで角層の付着したテープ（「テープ角層」）を獲得し、酸化タンパク質をELISAにて検出する方法が開示されている。 J. Invest. Dermatol. 1999, Sep, 113(3), 335-359においては、テープ角層からタンパク質抽出を行い、可溶性成分をDNPH標識し、SDS-PAGEにかけ、抗DNP抗体を用いてウェスタンブロットを行うことで酸化タンパク質の検出を行っている。 J. Invest. Dermatol. 2002, Apr, 118(4), 618-625においては、ヒト皮膚組織切片をDNPHで標識し、抗DNPで染色することで酸化タンパク質の検出を行っている。これらの方法はいずれも、角層試料を採取し、タンパク質抽出に付し、そのタンパク質抽出物にDNPHを作用させて酸化タンパク質をDNPで標識し、SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写し、抗DNP抗体を作用させてからパーオキシダーゼ標識二次抗体を結合させ、そしてケミルミネッセンス試薬（ECL基質）で発色させるといった手間暇のかかる工程を包含するものであった。
【０００５】
これに対して特開2004-340935号公報は、皮膚から採取した角層試料中の角層酸化タンパク質のカルボニル基を、角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光染色して検出することで角層酸化タンパク質の角層上での性状を評価する簡略化された方法を開示している。
【０００６】
【特許文献１】特開2004-340935号公報
【非特許文献１】Arch. Dermatol. Res. 2001,; 293:363-367
【非特許文献２】FEBS Letter 1998 Feb 6, 422(3), 403-406
【非特許文献３】Br. J. Dermatol. 2003; 149, 248-254
【非特許文献４】J. Invest. Dermatol. 1999, Sep, 113(3), 335-359
【非特許文献５】J. Invest. Dermatol. 2002, Apr, 118(4), 618-625
【非特許文献６】Analytical Biochemistry 1987, 161, 245-257
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、特開2004-340935号公報の記載乃至それに準じた方法を利用し、皮膚疾患を有する患者における角層のカルボニル化を調べたところ、アトピー性皮膚炎や乾癬といった皮膚疾患を有する部位におけるカルボニル化度が有意に増大していることがわかった。よって、このような皮膚疾患の有無の判定に角層のカルボニル化を指標とすることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本願は以下の発明を包含する：
（１）皮膚疾患の有無の検査方法であって、皮膚から採取した角層試料中の酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に標識し、検出することで評価を行うことを特徴とする方法。
（２）前記皮膚疾患が乾癬又はアトピー性皮膚炎である、（１）の方法。
（３）前記標識が蛍光標識である、請求項１又は２記載の方法。
（４）前記蛍光標識をヒドラジノ基含有蛍光物質で行う、（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）前記角層試料が皮膚に対するテープストリッピングにより採取されたテープ角層である、（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）前記皮膚から採取した角層試料を角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質を含むゲルに直接接触させる工程、及び当該蛍光を検出する工程、を含んで成る、（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７）前記接触工程において、室温で５分〜３０分間維持される、（６）の方法。
（８）前記検出を蛍光顕微鏡下で行い、それにより得た検出結果を画像化する、（１）〜（７）のいずれかの方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、乾癬やアトピー性皮膚炎といった不不疾患の簡略化された検査が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明でいう皮膚疾患は、特に乾癬及びアトピー性皮膚炎である。乾癬とは、表皮細胞の増殖・分化異常と炎症細胞浸潤を特徴とする慢性、再発性の炎症性不全角化症をいい、典型疹は境界が明確な紅斑上に厚い鱗屑が付着した状態にある。乾癬は遺伝的素因に種々の環境因子が加わって発症すると考えられる。アトピー性皮膚炎とは、アトピー素因を有し、消退と再燃を繰り返すかゆみの強い湿疹をいい、かくことで掻破痕が観察される。かゆみの客観的な評価は困難であるが、掻破行動の観察、ビジュアルアナローグスケールを用いた数値化により診断される。
【００１１】
本発明の検査方法は、皮膚から採取した角層試料中の酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に標識し、検出することで評価を行うことを特徴とする。本発明の方法に従えば、乾癬やアトピー性皮膚炎といった皮膚疾患の有無を、極めて簡略化かつ客観化された方法で判定することが可能となる。
【００１２】
角層は表皮角化細胞が終末分化して形成された角質細胞と、それをとりまく細胞間脂質から構成される。角質細胞は構造タンパク質たるケラチンを主成分とし、それを包むコーニファイドエンベロープ（「角質肥厚膜」）から構成される。角層タンパク質は酸化を受けた結果カルボニル基が導入される。このような酸化には、タンパク質におけるLys、Arg、Proといったアミノ酸残基のNH2基が直接酸化されてカルボニル基となる場合と、脂質が酸化して過酸化脂質、更には分解して反応性の高いアルデヒドとなり、それがタンパク質と結合することで起こる場合とが考えられる。
【００１３】
本発明において、皮膚由来の角層試料は、所謂、外科的手段等の侵襲的な方法により取得されたものであってもよいが、簡易さを理由に、非侵襲的な方法により皮膚から取得されるものであることが好ましい。非侵襲的な方法としては、当該技術分野で常用されているテープストリッピングや擦過法等を挙げることができる。
【００１４】
テープストリッピングは、皮膚表層に粘着テープ片を貼付、剥がすことを実施することで、皮膚の二次元的状態をその粘着テープにそのまま転写させることができるため、本発明において特に好ましい。テープストリッピングによりテープ角層を採取し、裁断せずにそのままの状態で酸化タンパク質を特異的に蛍光染色すれば、実際の皮膚の二次元的性状に対応した酸化タンパク質の二次元的情報が得られることとなる。
【００１５】
テープストリッピングの好ましい方法は、まず皮膚の表層を例えばエタノールなどで浄化して皮脂、汚れ等を取り除き、適当なサイズ（例えば5×5cm）に切った粘着テープ片を皮膚表面の上に軽く載せ、テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け、その後均等な力で粘着テープを剥ぎ取ることで行われる。粘着テープは市販のセロファンテープなどであってよく、例えばScotch Superstrength Mailing Tape (3M社製）等が使用できる。
【００１６】
本発明において利用できる酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識する蛍光物質は、酸化タンパク質のカルボニル基に結合できるヒドラジノ基
―ＮＨＮＨ2
を有するものが好ましい。そのような蛍光物質の例には、フルオレセイン−５−チオセミカルバジド、テキサスレッドヒドラジド、ルシファーイエローヒドラシド等が挙げられる。
【００１７】
このようなヒドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を、例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)これに適当な緩衝液（例えば100mMのMES-Na緩衝液（pH5.5））中のヒドラジノ基含有蛍光物質を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(3)反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（PBS)）にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する；
(4)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
【００１８】
酸化タンパク質の特異的な蛍光標識は、ビオチンヒドラジドと蛍光標識アビジンとの組合わせを用いることもできる。ビオチンヒドラジドもヒドラジノ基を有するため、タンパク質のカルボニル基に結合できる。この場合、まず酸化タンパク質にビオチンヒドラジドを結合させ、しかる後に蛍光標識アビジンをビオチンーアビジン結合を介してビオチンヒドラジドに結合させ、その結果酸化タンパク質は蛍光標識される。ビオチンヒドラジドは当業界においてよく知られ、例えばピアース社から製造販売されているものを使用することができる。また、蛍光アビジンは、例えばフルオレセインアビジンなどが使用できる。
【００１９】
このようなヒドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を、例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)これに適当な緩衝液（例えば100mMのMES-Na緩衝液（pH5.5））中のビオチンヒドラジドを室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(3)反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（PBS)）にて十分に洗浄した後、蛍光標識アビジンを室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(4)蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する；
(5)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
【００２０】
酸化タンパク質の特異的な蛍光標識は、酸化タンパク質のカルボニル基にジニトロフェニルヒドラジンを作用・結合させ、そのジニトロフェニル部分を蛍光色素で標識することで行うこともできる。従って、本発明の更なる好適な態様では、酸化タンパク質のカルボニル基に結合させたジニトロフェニルヒドラジンのジニトロフェニル部分を蛍光免疫測定法等で検出することができる。
【００２１】
このようなジニトロフェニルヒドラジンを利用して蛍光標識する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を、例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)これに適当な緩衝液（例えば100mMのMES-Na緩衝液（pH5.5）中のジニトロフェニルヒドラジン（DNPH)を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(3)反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（PBS)）にて十分に洗浄した後、抗DNP抗体、例えばウサギDNP抗体（ZYMED社製）の同生理溶液を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(4)反応終了後に同生理溶液にて十分に洗浄し、上記抗DNP抗体に特異的な蛍光標識抗二次抗体、例えばフルオレセイン標識抗ウサギIg（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(5)蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する；
(6)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
【００２２】
本発明の検査方法のより好適な態様において、角層試料を角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質を含むゲルに直接接触させることによって、接触表面上で酸化タンパク質を蛍光標識させることにより、一層迅速で簡便な検出が可能となる。一般に、蛍光物質を用いてタンパク質又は核酸などの標的物質を検出する方法は、試料から標的物質を抽出するという煩雑な操作を行い、その後、検出媒体（例えば、アクリルアミドゲル等）に転写することにより行わる。これは一般的に、標的物質が試料の表面には存在せず、測定物質中の内部に存在することにより染色が困難であるためである。しかしながら、この好適な態様においては標的物質が角層試料の表面に存在している角層タンパク質であるために、角層タンパク質を角層試料から抽出する必要がなく、更に試料タンパク質をゲル中に転写させずに、試料を染色用ゲルと直接接触させることによって試料側にゲル中の蛍光物質を移行させることにより、容易かつ迅速に染色することができる。また、角層試料を蛍光染色溶液に接触させる方法では、染色後の試料中のバックグランドが高くなることから、蛍光化された角層試料をリンスし、乾燥させる操作が必要であり、さらに溶液中に試料を接触させる操作において、染色溶液に気泡が入らないように注意しなければならなかったため、時間及び労力を必要とするといった欠点があるが、この態様ではそのような問題は解消される。
【００２３】
この態様における染色用ゲルは、アガロースゲル、又はポリアクリルアミドゲルが好ましいが、特に好ましくはアガロースゲルである。これは以下のとおり調製することができる。例えば、３ｇのアガロースを、ｐＨを約３．０〜７．０、好ましくは約５．０に調整した１００ｍｌのＭＥＳバッファーに添加し、そして良く撹拌し、生じた混合物を加熱する。加熱した混合物が固まらないうちに、所望の最終濃度、好ましくは、５〜５０μＭとなるようにカルボニル基を特異的に検出するための蛍光物質を良く撹拌しながら添加し、それからセットしたガラスケースに混合溶液を流し込み、室温にて冷却することによりゲルを固める。
【００２４】
染色用ゲルに含まれる、角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識する蛍光物質は、角層酸化タンパク質のカルボニル基に結合できるヒドラジノ基を有するものが好ましく、その例としてフルオレセイン−５−チオセミカルバジド、テキサスレッドヒドラジド、ルシファーイエローヒドラシド等が挙げられる。
【００２５】
このようなヒドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)前記試料とヒドラジノ基含有蛍光物質を含むゲルとを室温にて約１５分間接触させる；
(3)テープをゲルからはがし、蛍光顕微鏡にてテープ表面上の染色された酸化タンパク質を検出する；
(4)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
【００２６】
上記の酸化タンパク質の検出方法を使用することで、酸化タンパク質の皮膚上での二次元的性状、詳しくは存在量、存在箇所、分布状態、例えば散在しているか、局在しているか、等の様々な情報を得ることができ、しかもそれは従来必要とされていたタンパク質の抽出操作、電気泳動操作、ウェスタンブロッティング操作などを必要とせず、更に蛍光標識工程がセミドライなゲルと接触させることにより行われることから、蛍光染色後に試料のリンス及び乾燥工程を必要とせず、また、その反応時間も１５分程度でプラトーに達することから迅速な染色ができるために、一度に大量の酸化タンパク質を染色することが可能となる。更に染色操作も簡便であることから、染色にかかる労力を著しく低減することができる。
【実施例】
【００２７】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。
【００２８】
テープストリッピングによる角層試料の採取
アトピー性皮膚炎又は乾癬を有する患者それぞれの皮疹部及び無疹部の表層、又は健常人の皮膚表層をエタノールで浄化して皮脂、汚れ等を取り除き、5×5cmに切った粘着テープ片（資生堂社）を皮膚表面の上に軽く載せ、テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け、その後均等な力で粘着テープ直ちに剥がし、角層最外層を非侵襲的に採取し、角層試料とした。
【００２９】
染色用ゲル（３％アガロースゲル）の調製
３ｇのアガロース２１（ワコー社）を１００ｍｌのＭＥＳバッファー（ｐＨ５．０）（和光純薬社）に添加し、そして良く撹拌した。生じた混合物を電子レンジにおいて、１分間加熱した。加熱された混合物が固まらないうちに、最終濃度が２μＭとなるように、蛍光ヒドラジド／ＤＭＳＯ（モレキュラ・プローブ社）を添加し、セットしたガラスケースに混合溶液を流し込み、室温にて３０分間冷却して染色用ゲルを調製した。
【００３０】
ゲル染色プロトコル及び蛍光顕微鏡における測定
前記試料中の酸化タンパク質に蛍光ヒドラジドを結合させるために前記の角層が付着したテープを前述のとおり調製した染色用ゲルに接触させ、遮光条件下において、室温で１５分間維持して、角層酸化タンパク質を蛍光染色させた。その後テープをゲルからはがし、テープに付着した蛍光染色された角質試料中の酸化タンパク質を蛍光顕微鏡（オリンパス社）で撮影した（図１）。さらに、画像から背景と細胞を分離し、それぞれの平均輝度を求めることで酸化タンパク質の量を数値化した（図２）。
【００３１】
図１及び２から、アトピー性皮膚炎や乾癬といった皮膚疾患を有する皮疹部では、無疹部や健常人の皮膚と比べ、角層のカルボニル化が有意に増大していることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】テープストラッピングにより得られた角層試料を蛍光染色することで蛍光染色した角層酸化タンパク質を蛍光顕微鏡により撮影した写真図。
【図２】テープストラッピングにより得られた角層試料を蛍光染色することで蛍光染色した角層酸化タンパク質を蛍光顕微鏡により撮影し、酸化タンパク質を数値化した図。
【図２】
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【図１】
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