(57)【要約】【課題】高い感度で被検体を検出することができる検出チップ作製方法を提供することにある。【解決手段】局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属部が基体の一表面に分布形成された微細構造体を作製する微細構造体作製ステップと、微細構造体の金属部の表面に被検体を付着させる被検体付着ステップと、局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属微粒子を金属部及び被検体に付着させる金属微粒子付着ステップとを有し、金属部および金属微粒子の少なくとも一方は、被検体と特異的結合をし得る物質が固定されていないことで上記課題を解決する。【選択図】図１
2009222483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属部が基体の一表面に分布形成された微細構造体を作製する微細構造体作製ステップと、
前記微細構造体の前記金属部の表面に被検体を付着させる被検体付着ステップと、
局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属微粒子を前記被検体に付着させる金属微粒子付着ステップとを有し、
前記被検体吸着ステップは、前記被検体と特異的結合をし得る物質が固定されていない前記金属部に被検体を付着させ、かつ、
前記金属微粒子付着ステップは、前記被検体と特異的結合をし得る物質が固定されていない前記金属微粒子を前記被検体に付着させることを特徴とする検査チップ作製方法。
【請求項２】
局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属部が基体の一表面に分布形成された微細構造体を作製する微細構造体作製ステップと、
前記微細構造体の前記金属部の表面に被検体を付着させる被検体付着ステップと、
局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属微粒子を前記被検体に付着させる金属微粒子付着ステップとを有し、
前記被検体吸着ステップは、前記被検体と特異的結合をし得る物質が固定されていない前記金属部に被検体を付着させる、または、前記金属微粒子付着ステップは、前記被検体と特異的結合をし得る物質が固定されていない前記金属微粒子を前記被検体に付着させることを特徴とする検査チップ作製方法。
【請求項３】
前記被検体付着ステップと前記金属微粒子付着ステップとを同時に行う請求項１または２に記載の検査チップ作製方法。
【請求項４】
前記微細構造体作製ステップは、前記基体上に金属微粒子を付着させ、前記金属部を作製する請求項１〜３のいずれかに記載の検査チップ作製方法。
【請求項５】
前記微細構造体作製ステップは、前記基体を陽極酸化し、前記基体の前記一表面に複数の微細孔を形成した後、前記基体にめっき処理を施し、前記基体の前記一表面よりも突出するまで前記微細孔に前記金属を充填して前記金属部を形成する請求項１〜３のいずれかに記載の検査チップの作製方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の検査チップ作製方法で検査チップを作製する検査チップ作製ステップと、
前記基板に光を照射し、前記金属部が形成されている面を透過した光または、反射された光を測定する測定ステップと、
前記測定ステップで測定した光の強度に基づいて前記被検体を検出する検出ステップとを有することを特徴とする被検体検出方法。
【請求項７】
前記測定ステップは、前記基板上に液体がある状態で測定する請求項６に記載の被検体検出方法。
【請求項８】
前記測定ステップは、前記基板上が乾燥している状態で測定する請求項６に記載の被検体検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、局在プラズモンを用いて被検体を検出する被検体検出装置に用いる検査チップの作製方法および局在プラズモンを用いて被検体を検出する被検体検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微小な被検体を検出する検出装置として、局在プラズモンにより発生させた増強電場、また、局在プラズモンと光がカップリングすることで共鳴が起こる現象である局在プラズモン共鳴現象によりさらに増強された増強電場を利用した検出装置がある。
このような検出装置は、局在プラズモンを誘起し得る金属部を表面に多数配置した基板上に被検体を載置し、被検体のラマン散乱光を局在プラズモンにより発生させた増強電場により増強させて検出する検出装置である。ここで、ラマン散乱光は、被検体毎に固有のスペクトルとなるため、被検体のラマン散乱光を検出することで、被検体を同定したり、特定の被検体の有無を検出したりすることができる。
【０００３】
さらに、局在プラズモン共鳴現象により増強された増強電場を発生させる基板としては、例えば、特許文献１及び特許文献２に記載された構成の基板がある。
特許文献１には、表面に金属の薄膜が形成された微粒子が高い密度で配置された基板が記載されている。より具体的には、特許文献１には、基板上に密に配置した誘電体あるいは半導体の微粒子を異方性ドライエッチング処理により縮小させ、蒸着もしくはスパッタリングにより金属もしくは半導体を微粒子上に半球状に付着させることにより隣り合った微粒子の金属同士の間隙を任意の距離に制御して形成した二次元配列構造体基板が記載されている。
また、特許文献２には、多数の微細な凸部が形成され、その凸部の表面に金属膜を積層され、さらに金属膜の表面に誘電体層が積層され、誘電体層表面に試料中の被測定物質と特異的に結合して特異的結合物を構成しうる特異的結合メンバーが固定されている構成の基板が記載されている。
【０００４】
また、特許文献３には、一表面に複数の微細孔が分布形成された基体と、基板の複数の微細孔内に、頭部が基体の表面よりも上に突出するように配置された局在プラズモン共鳴を誘起し得る大きさの第１の金属微粒子とで構成される微細構造体を、第１の金属微粒子の頭部に被検体と特異的結合し得る物質を固定した状態で、溶液中に設置するとともに、溶液中に、局在プラズモン共鳴を誘起し得る大きさの複数の第２の金属微粒子を、被検体と特異的結合し得る物質を固定した状態で分散させ、微細構造体の第１の金属微粒子の頭部が突出した面に対し光を照射し、光の前記面における反射光または透過光の強度を測定し、測定された光の強度に基づいて溶液に含まれる被検体を検出する被検体検出方法が記載されている。
この特許文献３に記載の方法では、被検体と、被検体と特異的結合し得る物質を固定した第２の金属微粒子とが結合し、さらに、被検体が、頭部に被検体と特異的結合し得る物質を固定した第１の金属微粒子と結合することで、第１の金属微粒子と第２の金属微粒子が接近することにより大きく変化するプラズモン共鳴波長の変化を検出することで、被検体を検出している。
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１４４５６９号公報
【特許文献２】特開２００７−２４０３６１号公報
【特許文献３】特開２００５−１９５４４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ここで、特許文献１及び特許文献２に示す基板を用いる検出装置は、局在プラズモン共鳴を誘起しうる大きさの複数の金属微粒子、または複数の金属の突起に被検体を吸着させ、増強電場の変化や、増強電場により励起された被検体の蛍光、ラマン散乱光等を検出することで、被検体を検出することができる。
しかしながら、被検体よりも下に存在する金属微粒子の周囲で生じる増強電場しか用いることができないため、大きな増強度を得ることができないという問題がある。
【０００７】
また、特許文献２に示すように、金属膜の表面に被検体と特異的に吸着する物質を固定することで、被検体と金属膜とが結合する効率を高くすることができるが、この場合も被検体よりも下に存在する金属微粒子の周囲で生じる増強電場しか用いることができないため、大きな増強度を得ることができない。
また、被検体毎に特異的吸着させる物質を選択し、金属微粒子に付着させる必要があるため、作業が煩雑となり、装置毎に使用対象も限定されてしまう。
【０００８】
また、特許文献３に記載の方法では、プラズモン共鳴波長の変化を検出しているが、特異的吸着を２回行う必要がある。したがって、被検体に２分子以上の特異的吸着させる物質（以下「抗体」という。）を結合させる必要がある。そのため、被検体が分子量の小さい物質である場合は、被検体に２分子の抗体を吸着させることができず、被検体を検出することができないという問題がある。
また、特許文献３に記載の方法は、被検体を介して第１の金属微粒子と第２の金属微粒子とが近接することに発生するプラズモン共鳴波長の変化の変化を検出しているため、被検体を介してのみ第１の金属微粒子と第２の金属微粒子とが近接するようにする必要があるという問題もある。
【０００９】
本発明の目的は、上記従来技術に基づく問題点を解消し、高い感度で被検体を検出することができる検出チップ作製方法、及び、簡単にかつ高い感度で被検体を検出することができる被検体検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明は、局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属部が基体の一表面に分布形成された微細構造体を作製する微細構造体作製ステップと、前記微細構造体の前記金属部の表面に被検体を付着させる被検体付着ステップと、局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属微粒子を前記被検体に付着させる金属微粒子付着ステップとを有し、前記被検体吸着ステップは、前記被検体と特異的結合をし得る物質が固定されていない前記金属部に被検体を付着させ、かつ、前記金属微粒子付着ステップは、前記被検体と特異的結合をし得る物質が固定されていない前記金属微粒子を前記被検体に付着させることを特徴とする検査チップ作製方法を提供するものである。
また、上記課題を解決するために、本発明の他の形態は、局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属で形成された金属部が基体の一表面に分布形成された微細構造体を作製する微細構造体作製ステップと、前記微細構造体の前記金属部の表面に被検体を付着させる被検体付着ステップと、局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属微粒子を前記被検体に付着させる金属微粒子付着ステップとを有し、前記被検体吸着ステップは、前記被検体と特異的結合をし得る物質が固定されていない前記金属部に被検体を付着させる、または、前記金属微粒子付着ステップは、前記被検体と特異的結合をし得る物質が固定されていない前記金属微粒子を前記被検体に付着させることを特徴とする検査チップ作製方法を提供するものである。
【００１１】
ここで、いずれの検査チップ作成方法においても、前記被検体付着ステップと前記金属微粒子付着ステップとを同時に行うことが好ましい。
また、前記微細構造体作製ステップは、前記基体上に金属微粒子を付着させ、前記金属部を作製することが好ましい。
また、前記微細構造体作製ステップは、前記基体を陽極酸化し、前記基体の前記一表面に複数の微細孔を形成した後、前記基体にめっき処理を施し、前記基体の前記一表面よりも突出するまで前記微細孔に前記金属を充填して前記金属部を形成することが好ましい。
【００１２】
また、上記課題を解決するために、本発明は、上記のいずれかに記載の検査チップ作製方法で検査チップを作製する検査チップ作製ステップと、前記基板に光を照射し、前記金属部が形成されている面を透過した光または、反射された光を測定する測定ステップと、前記測定ステップで測定した光の強度に基づいて前記被検体を検出する検出ステップとを有することを特徴とする被検体検出方法を提供するものである。
【００１３】
ここで、前記測定ステップは、前記基板上に液体がある状態で測定することが好ましい。また、前記測定ステップは、前記基板上が乾燥している状態で測定することも好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、被検体の種類、大きさによらず、被検体の近傍に増強効果の大きい増強電場を形成することができる。これにより、高い感度で被検体を検出することができ、被検体を同定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に係るに検査チップ作製方法及び被検体検出方法について、添付の図面に示す実施形態を基に詳細に説明する。
【００１６】
図１は、本発明の検査チップ作製方法及び被検体検出方法を用いる被検体検出装置１０の概略構成を示す正面図であり、図２は、図１に示した被検体検出装置１０の微細構造体１２の概略構成を示す上面図である。
【００１７】
図１に示すように、被検体検出装置１０は、微細構造体１２と、微細構造体１２に光を照射する光照射手段１４と、微細構造体１２で反射された反射光を検出する光検出手段１６と、微細構造体１２を支持するチップ支持手段１８と、微細構造体１２に被検体を含有する液体を滴下する被検体滴下手段２０と、微細構造体１２に金属微粒子を含有する液体を滴下する金属微粒子滴下手段２２とを有する。
なお、図示しないが、被検体検出装置１０は、微細構造体１２、光照射手段１４、光検出手段１６等の各部を覆う筐体や、被検体検出装置１０の内部で発生した迷光を除去するフィルタ等の各種の光学部材や、被検体検出装置１０の動作を制御する制御部等の被検体検出装置１０に必要な各種の部材も有する。
【００１８】
図２に示すように、微細構造体１２は、誘電体基材３２および誘電体基材３２の一面に配置された導電体３４で構成された基体３０と、誘電体基材３２の導電体３４が配置された面とは反対側の面に配置された金属体３６とを有する。
【００１９】
基体３０は、金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３）で形成された誘電体基材３２と、誘電体基材３２の一面に設けられ、陽極酸化されていない金属（Ａｌ）で形成された導電体３４とを有する。ここで、誘電体基材３２と導電体３４とは、一体で形成されている。
また、誘電体基材３２には、導電体３４が配置される面とは反対側の面から導電体３４側の面に向けて延びる略ストレートな形状（直管形状）の微細孔４０が複数の開孔されている。
複数の微細孔４０は、導電体３４が配置される面とは反対側の面側の端部は、誘電体基材３２の表面まで貫通して開口が形成され、導電体３４側の端部は、誘電体基材３２の表面まで貫通していない。つまり、微細孔４０は、導電体３４までは到達していない孔となる。また、複数の微細孔４０は、励起光の波長より小さい径及びピッチで略規則的に配列されている。
ここで、励起光として可視光を用いる場合は、微細孔４０の配置ピッチを２００ｎｍ以下とすることが好ましい。
【００２０】
金属体３６は、誘電体基材３２の微細孔４０内に充填されている充填部４５と、微細孔４０上に誘電体基材３２の表面より突出して形成され、充填部４５の外径よりも大きい外径を有し、局在プラズモンを誘起し得る大きさの金属部、図示例では、突出部（つまり凸部）４６とからなる複数の棒部４４で構成されている。なお、図示例では、本発明に用いられる微細構造体１２の誘電体基材３２の表面に分布形成される金属部は、凸部を形成する突出部４６によって構成されているが、本発明はこれに限定されず、局在プラズモンを誘起し得る大きさに形成されていれば、どのような形状の金属部であっても良い。ここで、金属体３６を形成する材料としては、局在プラズモンを発生させる種々の金属を使用でき、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、及びこれらの合金等が挙げられる。また、金属体３６は、これらの金属を２種以上含むもので形成してもよい。また、電場増強効果をより高くすることができるため、金属体３６は、Ａｕ、Ａｇ等を用いて形成することがより好ましい。
微細構造体１２は、以上のような構成であり、金属体３６の複数の棒部４４の突出部４６が配置される面が、被分析物質が配置される面、つまり、検出面となる。
【００２１】
次に、光照射手段１４は、レーザ光源等の光源と光源から出射される光を導光する導光系とからなり、特定波長の光（励起光）を射出し、射出した励起光を微細構造体１２の検出面に照射する。
【００２２】
光検出手段１６は分光検出器等からなり、光照射手段１４から光が照射されることにより微細構造体１２の検出面で発生する散乱光が入射する位置に配置されている。
光検出手段１６は、微細構造体１２の検出面で発生する散乱光を分光し、ラマン散乱光のスペクトル（ラマンスペクトル）を検出する。
【００２３】
チップ支持手段１８は、台座等であり、微細構造体１２を導電体３４側から支持し、所定位置に固定する。また、チップ支持手段１８は、微細構造体１２に液体が滴下された場合に、液体が微細構造体１２上からこぼれないように、微細構造体１２の側面の外周を覆う囲いを有する。
【００２４】
被検体滴下手段２０は、被検体を含有する液体を貯留する貯留部と、貯留部に貯留されている被検体を含有する液体を微細構造体１２に滴下する滴下機構とで構成され、微細構造体１２の検出面に対向して配置されている。ここで、滴下機構としては、スポイト等を用いることができる。
被検体滴下手段２０は、被検体を含有する液体を微細構造体１２の検出面に所定量滴下する。
ここで、被検体を分散する溶媒としては、種々の溶媒を用いることができ、例えば、水、エタノール等が挙げられる。ここで、本実施形態の場合は、溶媒として、揮発性の溶媒を用いることが好ましく、具体的には、エタノールを用いることが好ましい。また、例えば、液体試料に含有されている被検体を検出する場合等は、液体試料を滴下すればよい。
【００２５】
金属微粒子滴下手段２２は、金属微粒子を含有する液体を貯留する貯留部と、貯留部に貯留されている金属微粒子を含有する液体を微細構造体１２に滴下する滴下機構とで構成され、微細構造体１２の検出面に対向して配置されている。ここで、滴下機構としては、被検体滴下手段２０と同様にスポイト等を用いることができる。
金属微粒子滴下手段２２は、金属微粒子を含有する液体を微細構造体１２の検出面に滴下する。
ここで、金属微粒子は、局在プラズモンを誘起し得る大きさの粒子である。
また、金属微粒子を形成する材料としては、上述した微細構造体の金属体と同様の種々の金属を用いることができる。つまり、局在プラズモンを発生させる種々の金属を使用でき、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、及びこれらの合金等が挙げられる。また、金属微粒子は、これらの金属を２種以上含むもので形成してもよい。また、電場増強効果をより高くすることができるため、金属微粒子は、Ａｕ、Ａｇ等を用いて形成することがより好ましい。また、金属微粒子は、金属体３６と同じ金属で形成しても異なる金属で形成してもよい。
また、金属微粒子を分散する溶媒としては、種々の溶媒を用いることができ、例えば、水、エタノールや、種々の物質を溶解させた水溶液（例えば、クエン酸水溶液）等が挙げられる。ここで、本実施形態の場合は、溶媒として、揮発性の溶媒を用いることが好ましく、具体的には、エタノールを用いることが好ましい。
被検体検出装置１０は、基本的に以上のような構成である。
【００２６】
以下、被検体検出装置１０の作用について説明することで、本発明の検査チップ作製方法、及び、被検体検出方法についてより詳細に説明する。
ここで、図３（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ微細構造体１２の作製方法の一例を示す工程図である。また、図４（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ本発明の検査チップの製造方法を示す工程図である。
【００２７】
まず、被検体検出装置１０に用いる微細構造体１２の作製方法について説明する。
まず、図３（Ａ）に示すような直方体形状の被陽極酸化金属体４８に陽極酸化処理を行う。具体的には、被陽極酸化金属体４８を陽極とし、陰極と共に電解液に浸漬させ、陽極陰極間に電圧を印加することで陽極酸化する。
ここで、陰極としては、カーボンやアルミニウム等が使用される。電解液としては制限されず、硫酸、リン酸、クロム酸、シュウ酸、スルファミン酸、ベンゼンスルホン酸、アミドスルホン酸等の酸を、１種又は２種以上含む酸性電解液が好ましく用いられる。
なお、本実施形態では、被陽極酸化金属体４８を直方体形状としたが、その形状は制限されず、種々の形状とすることができる。また、支持体の上に被陽極酸化金属体４８が層状に成膜されたものなど、支持体付きの形態で用いることできる。
【００２８】
被陽極酸化金属体４８を陽極酸化すると、図３（Ｂ）に示すように、被陽極酸化金属体の表面から該面に対して略垂直方向に酸化反応が進行し、誘電体基材３２となる金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３）が生成される。陽極酸化により生成される金属酸化物体（つまり、誘電体基材３２）は、多数の平面視略正六角形状の微細柱状体４２が隙間なく配列した構造を有するものとなる。
また、各微細柱状体４２は、底面が丸みを帯びた形状となり、さらに、略中心部には、表面から深さ方向（つまり、微細柱状体４２の軸方向）に略ストレートに延びる微細孔４０が開孔される。陽極酸化により生成される金属酸化物体の構造は、益田秀樹、「陽極酸化法によるメソポーラスアルミナの調製と機能材料としての応用」、材料技術Vol.15,No.10、1997年、p.34等に記載されている。
【００２９】
また、規則配列構造の金属酸化物体を生成する場合の好適な陽極酸化条件例としては、電解液としてシュウ酸を用いる場合、電解液濃度０．５Ｍ、液温１４〜１６℃、印加電圧４０〜４０±０．５Ｖ等が挙げられる。この条件で生成される微細孔４０は例えば、径が約３０ｎｍ、ピッチが約１００ｎｍである。
【００３０】
次に、誘電体基材３２の微細孔４０に電気メッキ処理を施すことにより、図３（Ｃ）に示すように、充填部４５と突出部４６とからなる棒部４４を形成する。
ここで、電気メッキを行うと、導電体３４が電極として機能し、電場が強い微細孔４０の底部から優先的に金属が析出する。この電気メッキ処理を継続して行うことにより、微細孔１２内に金属が充填されて棒部４４の充填部４５が形成される。充填部４５が形成された後、更に電気メッキ処理を続けると、微細孔４０から充填金属が溢れるが、微細孔４０付近の電場が強いことから、微細孔４０周辺に継続して金属が析出していき、充填部４５上に誘電体基材３２の表面より突出し、充填部４５の径よりも大きい径を有する突出部４６が形成される。
微細構造体１２は以上のようにして作製される。
【００３１】
次に、作製した微細構造体１２をチップ支持手段１８に載置し、所定位置に固定する（図４（Ａ）参照）。
次に、被検体滴下手段２０から被検体６２を含有する液体を微細構造体１２の検出面上に滴下する。その後、検出面上の液体（つまり溶媒）を乾燥させる。
液体を乾燥させることで、図４（Ｂ）に示すように、微細構造体１２の金属体３６の突出部４６の表面に被検体６２が付着した状態となる。
【００３２】
次に、金属微粒子滴下手段２２から金属微粒子６４を含有する液体を微細構造体１２の検出面上に滴下する。その後、検出面上の液体を乾燥させる。
液体を乾燥させることで、図４（Ｃ）に示すように、被検体６２が付着した突出部４６の周りに金属微粒子６４が付着した状態となる。
以上のようにして、微細構造体１２の検出面上に測定対象である被検体６２と金属微粒子６４が積層された検査チップを作製する。
【００３３】
次に、光照射手段１４から光を射出し、検査チップの検出面（つまり、微細構造体１２の検出面、被検体６２が付着されている面）を照明する。
【００３４】
検査チップの検出面は、光射出手段１４から射出された光で照明されることで、金属体３６の突出部４６の表面及び金属微粒子６４の表面で局在プラズモンを発生させ、電場を形成する。
また、局在プラズモンを発生している金属（金属微粒子や突出部）同士が数１０ｎｍ以下に近接する領域（ホットスポット）では、非常に増強された電場が形成される。検査チップでは、上記条件を満たす距離に近接している金属微粒子同士の間、突出部同士の間、金属微粒子と突出部との間で、ホットスポットが形成される。
さらに、検査チップでは、金属体３６の突出部４６の表面及び金属微粒子６４の表面で電場をより増強させる局在プラズモン共鳴も効果的に発生する。ここで、局在プラズモン共鳴は、局在プラズモンにより局在的に集団運動している金属の自由電子が光の電場に共鳴して振動することで電場がより増強される現象である。検査チップの凹凸形状である突出部４６（つまり凸部）および／または金属微粒子６４では、入射した光の波長と凹凸形状の大きさとが一致した領域で、突出部４６（つまり凸部）および／または金属微粒子６４の自由電子が光の電場に共鳴して振動し、入射された光が高い効率で電場に変化され、突出部４６および／または金属微粒子６４の周辺の電場がより増強される。
このように、検査チップでは、検出面で高い電場増強効果を得ることができ、増強された電場が形成される。なお、検査チップは、電場をより強くすることができるため、突出部及び金属微粒子に局在プラズモン共鳴が発生するように励起光の波長、突出部及び金属微粒子の大きさを設計、調整することが好ましいが、少なくとも突出部及び金属微粒子に局在プラズモンが発生すればよい。
【００３５】
検出面の被検体は、特定波長の励起光が入射されることによりラマン散乱光を発生させる。被検体により発生されたラマン散乱光は、局在プラズモンに起因して発生された電場によって増強される。つまり、ラマン散乱光は、ラマン増強効果により増強される。ここで、ラマン散乱光は、測定する試料の種類によってスペクトルが変化する。
【００３６】
光検出手段１６は、微細構造体１２の検出面の散乱光を検出し、その検出結果から被検体の種類および／または量を検出する。
被検体検出装置１０は、以上のようにして被検体を検出する。
【００３７】
このように、被検体検出装置１０は、微細構造体の金属の突出部が形成された検出面上に被検体を付着させた後、金属微粒子を付着（または近接）させることで、被検体を突出部と金属微粒子とで挟みこむことができる。つまり、金属微粒子を付着（または近接）させることで、微細構造体の突出部上に被検体を付着した状態では、被検体の突出部とは接しない面に金属微粒子を付着（または近接）させることができる。これにより、１つの被検体の周囲に局在プラズモンを発生させる物体を複数配置し、被検体が金属微粒子または突出部と付着（または近接）している領域をより大きくすることができ、被検体の周囲により多くの増強電場（正確には、局在プラズモンにより発生した増強電場）を発生させることができる。
さらに、突出部に被検体を付着させ、さらにその被検体に金属微粒子を付着（または近接）させることで、突出部と金属微粒子との間に形成されるホットスポットに被検体を配置することが可能となり、被検体の周囲により強い増強電場を形成することができる。
以上より、被検体の周りにより強い増強電場をより多く形成することができ、被検体から生じるラマン散乱光をより増強することができ（つまり、ラマン増強効果をより大きくすることができ）、被検体をより高い感度で検出することができる。
【００３８】
また、突出部に付着した被検体のラマン散乱光を検出することで、被検体を同定することができるため、被検体を突出部および／または金属微粒子とを特異的に結合させることなく、被検体を検出することができる。これにより、検出対象の被検体毎に突出部および／または金属微粒子に被検体と特異的に結合する物質（以下「特異的結合物質」）を選択し、選択した特異的結合物質を突出部および／または金属微粒子に固定し、突出部および／または金属微粒子と被検体とを結合させなくても被検体を検出することができる。
また、特異的結合物質を用いないことで、一回の検査で、検出したスペクトル分布から試料中に含まれる種々の被検体を同定することもできる。
また、被検体を特異的結合物質と結合させる必要がないため、被検体が微細で、特異的結合ができない物質である場合も検出することができる。
【００３９】
以下、具体的な実施例とともに本発明についてより詳細に説明する。
実施例では、被検体を含有させた液体として、被検体をＲ６Ｇとし、溶媒をエタノールとし、エタノールにＲ６Ｇを１００μＭで含有させて作製したＲ６Ｇエタノール溶液を用いた。また、金属微粒子を含有させた液体として、金属微粒子を粒径６０ｎｍの金ナノ粒子とした、田中貴金属製の金コロイド溶液を用いた。また、微細構造体として、金属体を金で形成した（つまり、突出部が金で形成されている）、検出面が１ｃｍ四方の微細構造体を用いた。
【００４０】
まず、微細構造体の表面にＲ６Ｇエタノール溶液を検出面上に１０μｌ滴下し、乾燥させた。次に、微細構造体の表面に金コロイド溶液を１０μｌ滴下し、乾燥させた。
このようにして作製した検査チップに光照射手段から射出させた光を照射し、検出面から生じる散乱光のスペクトルを光検出手段で検出した。
ここで、光照射手段から射出する励起光は、励起波長７８５ｎｍで、集光位置のレーザーパワーを２ｍＷとした。
また、光検出手段は、検出面から発せられる光を１０秒間測定しその積算値を算出する測定を２回行い、その平均値を検出したスペクトルとした。
【００４１】
また、比較のために、金属微粒子を滴下しない点（検出面に被検体のみを配置する点）以外は、上述した検査チップと同じ条件で検査チップを作製した。
この金属微粒子を滴下していない検査チップについても比較例として、検出面から生じる散乱光のスペクトルを測定した。
【００４２】
ここで、図５（Ａ）及び（Ｂ）に金属微粒子を滴下する前の検出面と滴下した後の検出面を観察した観察図を示す。図５（Ａ）は、金属微粒子を滴下前の検出面を示す上面図であり、図５（Ｂ）は、金属微粒子を滴下後の検出面の上面図である。
図５（Ａ）に示すように、突出部（図５（Ａ）中多数の白い部分）が形成された状態の検出面に、金属微粒子を滴下することで、図５（Ｂ）に示すように、多数の突出部と金属膜（図５（Ｂ）中多数の白い部分）が形成及び配置された状態の検出面となる。
このように、検出面に金属微粒子を滴下することで、検出面上の金属成分が増加することが分かる。
【００４３】
次に、図６に実施例と比較例のそれぞれのスペクトルの測定結果を示す。ここで、図６は、光検出手段が検出した光のスペクトル分布を示すグラフであり、横軸を波長［ｃｍ−１］とし、縦軸を強度とした。また、本具体例の測定結果を点線で示し、比較例の結果を実線で示す。
【００４４】
図６から、検出面に被検体を滴下した後に金属微粒子を滴下することで、検出面に被検体を検出したのみの場合よりもラマン散乱光をより増強することができ、検出面から射出される光の強度を高くすることができることがわかる。
ここで、被検体として配置したＲ６Ｇの固有のラマン散乱波長である１３６０ｃｍ−１と、１５００ｃｍ−１の強度の検出結果（具体的には測定強度）及び比較例と実施例との強度比の算出結果を下記表１に示す。
【００４５】
【表１】
2009222483.tif 000003
【００４６】
上記表１に示すように、金属微粒子を配置することで、金属微粒子を配置しない場合よりもＲ６Ｇから射出されるラマン散乱光をより増強することができ、より高い強度で検出することができることがわかる。
具体的には、表１に示すように、１３６０ｃｍ−１で約１２倍、１５００ｃｍ−１で約１７倍と金属微粒子を配置しない場合よりも１桁高い感度で検出することができる。
以上より、本発明の効果は明らかである。
【００４７】
ここで、本実施形態の微細構造体１２は、陽極酸化を利用して製造されたものであるので、誘電体基材３２の微細孔４０及び金属体３６の突出部４６が略規則配列された微細構造体１２を簡易に製造できる。また、これら微細孔の配列をランダム配列にすることもできる。
【００４８】
また、本実施形態では、誘電体基材３２の製造に用いる被陽極酸化金属体４８の主成分としてＡｌのみを挙げたが、陽極酸化可能で生成される金属酸化物が透光性を有するものであれば、任意の金属が使用できる。Ａｌ以外では、Ｔｉ、Ｔａ、Ｈｆ、Ｚｒ、Ｓｉ、Ｉｎ、Ｚｎ等が使用できる。被陽極酸化金属体４８は、陽極酸化可能な金属を２種以上含むものであってもよい。
【００４９】
また、微細構造体の形状は、微細構造体１２の形状に限定されず、基体上に局在プラズモンを誘起し得る大きさの凸部が形成されていればよく、種々の形状とすることができる。
【００５０】
図７（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、図７（Ｂ）は、図７（Ａ）の上面図である。
図７（Ａ）及び図７（Ｂ）に示す微細構造体８０は、基体８２と基体８２上に配置された多数の金属微粒子８４とで構成されている。
基体８２は、板状の基板である。基体８２は、金属微粒子８４を電気的に絶縁して支持可能な材料で形成すればよく、材料としては、例えば、シリコン、ガラス、イットリウム安定化ジルコニア（ＹＳＺ）、サファイヤ、およびシリコンカーバイド等が挙げられる。
【００５１】
多数の金属微粒子８４は、局在プラズモンを誘起し得る大きさの微粒子であり、基体８２の一面上に分散された状態で固定されている。
ここで、金属微粒子８４は、上述した金属体３６で例示した各種金属で形成することができる。また、金属微粒子８４は、上述した金属微粒子６４と同様の金属微粒子でも異なる金属微粒子でもよい。また、金属微粒子の形状は特に限定されず、例えば、丸型で、直方体型でもよい。
このような構成の微細構造体８０も金属微粒子が配置された検出面に励起光が照射されることで、金属微粒子の周りに局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
【００５２】
以下、図８を用いて、微細構造体８０を用いた検査チップを作製する方法を説明する。
ここで、図８（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ、微細構造体８０を用いて検査チップを作製する工程を示す工程図である。
まず、基体８２上に多数の金属微粒子８４を固定し、図８（Ａ）に示すように、微細構造体８０を作製する。
ここで、基体８２上に金属微粒子を固定する方法としては、特に限定されず、シランカップリングを用いる方法、クエン酸をＣＴＢＡに置換し自然蒸発させる方法、金属微粒子８４を含有する溶液を基体８２上に塗布し、溶媒を自然蒸発させる方法、基体８２上に薄膜を形成しリソグラフィー、エッチング、スパッタ等により金属微粒子となる部分以外を除去する方法、基体８２上に金属微粒子を蒸着する方法（基体８２への蒸着開始直後に蒸着を終了することで、基体８２に部分的な蒸着をすることができる。）、基体８２上の金属膜を蒸着した後、金属膜をアニール処理し金属膜を凝集させることで金属微粒子を作製する方法等が例示される。
【００５３】
次に、被検体滴下手段２０から被検体６２を含有する液体を微細構造体８０の検出面上に滴下する。その後、検出面上の液体（つまり溶媒）を乾燥させる。
液体を乾燥させることで、図４（Ｂ）に示すように、微細構造体８０の金属微粒子８４の表面に被検体６２が付着した状態となる。
【００５４】
次に、金属微粒子滴下手段２２から金属微粒子６４を含有する液体を微細構造体８０の検出面上に滴下する。その後、検出面上の液体を乾燥させる。
液体を乾燥させることで、図４（Ｃ）に示すように、被検体６２が付着した金属微粒子８４の周りに金属微粒子６４が付着した状態となる。
【００５５】
このように、基体８２上に多数の金属微粒子８４が固定された微細構造体８０を用いても検査チップを作製することができる。
また、微細構造体８０を用いて作製した検査チップも金属微粒子６４と、基体８２上の凸部となる金属微粒子８４とで被検体６２を挟むことができ、被検体６２の周りにより強い増強電場を形成できるため、被検体６２で生じるラマン散乱光を増強することができる。したがって、微細構造体８０を用いて作製した被検体検出装置でも、高い感度で被検体を検出することができる。
【００５６】
次に、図９は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す上面図である。
図９に示す微細構造体９０は、基体９２と基体９２上に配置された多数の金属ナノロッド９４とで構成されている。
ここで、基体９２は、上述した基体８２と同様の構成であるのでその詳細な説明は省略する。
【００５７】
金属ナノロッド９４は、局在プラズモンを誘起し得る大きさであり、短軸長さと長軸長さが異なる棒状の金属ナノ粒子であり、基体９２の一面に、分散された状態で固定されている。金属ナノロッド９４は、その短軸長さが３ｎｍ〜５０ｎｍ程度、長軸長さが２５ｎｍ〜１０００ｎｍ程度であり、長軸長さは励起光の波長よりも小さいサイズのものである。金属ナノロッド９４は、上述した金属微粒子と同様の金属で作製することができる。なお、金属ナノロッドの詳細な構成については、例えば、特開２００７−１３９６１２号公報に記載されている。
ここで、微細構造体９０は、上述した微細構造体８０と同様の方法で作製することができる。
このような構成の微細構造体９０も金属ナノロッドが配置された検出面に励起光が照射されることで、金属ナノロットの周囲に局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
以上のような構成の微細構造体９０を用いた場合も、微細構造体１２及び微細構造体８０と同様に、検査チップを作製することができ、さらに、被検体を高い感度で検出することができる。
【００５８】
次に、図１０（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、図１０（Ｂ）は、図１０（Ａ）の断面図である。
図１０に示す微細構造体１００は、基体１０２と基体１０２上に配置された多数の金属細線１０４とで構成されている。
ここで、基体１０２は、上述した基体８２と同様の構成であるのでその詳細な説明は省略する。
【００５９】
金属細線１０４は、局在プラズモンを誘起し得る線幅の線状部材であり、基体１０２の一面に格子状に配置されている。金属細線１０４は、上述した金属微粒子、金属体と同様の金属で作製することができる。また、金属細線１０４の作製方法は、特に限定されず、蒸着、メッキ等、金属配線を作製する種々の方法で作製することができる。
ここで、金属細線１０４の線幅は、光によって金属中で振動する電子の平均自由行程以下であることが好ましく、具体的には５０ｎｍ以下、特に３０ｎｍ以下であることが好ましい。また、金属細線１０４の配置パターンは、特に限定されない。例えば、複数の金属細線を交差させずに、互いに平行に配置してもよい。また、金属細線の形状も直線に限定されず、曲線としてもよい。
【００６０】
このような構成の微細構造体１００も金属細線が配置された検出面に励起光が照射されることで、金属細線の周囲に局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
以上のような構成の微細構造体１００を用いた場合も、微細構造体１２、微細構造体８０及び微細構造体９０と同様に、検査チップを作製することができ、さらに、被検体を高い感度で検出することができる。
【００６１】
また、微細構造体は、上述した微細構造体１２、微細構造体８０、微細構造体９０及び微細構造体１００にも限定されず、ぞれぞれの局在プラズモンを誘起し得る凸部を組み合わせた構成としてもよい。
また、基体に蒸着して金属微粒子を形成する場合は、基体上への蒸着を種々の方向から行うようにしてもよい。
ここで、微細構造体は、基体上に金属微粒子を配置してから、基体上へ、金属膜を蒸着し、凸部を形成することが好ましい。このように金属微粒子配置してから、金属膜を蒸着することで、金属微粒子の間に金属膜（微細な金属微粒子）を形成することができ、金属微粒子と金属膜とを近接させることができるため、微細構造体の検出面のホットスポットをより多くすることができる。
【００６２】
ここで、被検体検出装置１０では、金属微粒子滴下手段により金属微粒子を含有する液体を滴下したが、微細構造体の検出面の凸部に被検体を配置した後に、検出面上に金属微粒子を配置（もしくは付着）する方法は、これに限定されない。
例えば、微細構造体の検出面の凸部に被検体を配置した後に、基板上に金属を蒸着する方法、基体８２上の金属膜を蒸着した後、金属膜をアニール処理し金属膜を凝集させることで金属微粒子を作製する方法、基体８２上に薄膜を形成しリソグラフィー、エッチング、スパッタ等により金属微粒子となる部分以外を除去する方法等が挙げられる。
【００６３】
また、上述した実施形態では、いずれも、微細構造体の凸部に被検体を吸着（若しくは付着）させた後、金属微粒子を配置させたが、本発明はこれに限定されず、被検体と金属微粒子の両方を含有する液体を微細構造体上に流し込み（または滴下し）、上述した検査チップを作製してもよい。
【００６４】
また、上述した実施形態では、いずれも、微細構造体上を乾燥させた後、検出面に光を照射し、被検体のラマン散乱光を検出したが、本発明はこれにも限定されず、微細構造体に被検体と金属微粒子の両方を含有する液体が流し込まれた状態（濡れている状態）で測定してもよい。
【００６５】
また、上述した実施形態では、いずれも金属微粒子または微細構造体の凸部に特異的結合物質を表面修飾させずに、金属微粒子と微細構造体とで被検体を挟みこんだが、本発明はこれに限定されず、金属微粒子または微細構造体の凸部に特異的結合物質を表面修飾させてもよい。
金属微粒子または微細構造体の凸部の一方に特異的結合物質を配置することで、特定の被検体（つまり、特異的結合物質と結合する特性を有する被検体）と金属微粒子または微細構造体の凸部とを結合させることができる。これにより、特定の被検体、例えば、検出したい被検体を、金属微粒子または微細構造体の凸部に吸着させることができ、特定の被検体をより確実に検出することができる。
また、１つの被検体に結合させる特異的結合物質は１つとなるので、被検体が小さい場合も被検体と特異的結合物質とを結合させることができる。
【００６６】
以上、本発明に係る検査チップ作製方法及び被検体検出方法について詳細に説明したが、本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良や変更を行ってもよい。
【００６７】
例えば、被検体検出装置は、さらに、検出面を乾燥させる乾燥手段を設けてもよい。ここで、乾燥手段としては、微細構造体の検出面を加熱する加熱装置が例示される。
乾燥手段を設け、検出面を乾燥させることで、検出面の液体成分をより短時間で除去することができ、被検体の検出を短時間で行うことが可能となる。
【００６８】
また、上述した被検体検出装置では、被検体のラマン散乱光を検出したが、本発明はこれに限定されず、増強電場を形成することで被検体から検出される値がより大きくなる物性値を検出する種々の方式の検出装置及び検出方法に用いることができる。例えば、増強電場により非線形光学効果（第２高調波発生など）を高めて被検体を検出する方法、被検体または被検体を捕捉した蛍光物質からの蛍光を増強電場により増強して検出する方式に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の被検体検出方法を用いる被検体検出装置の一実施形態の概略構成を示すブロック図である。
【図２】図１に示す被検体検出装置の微細構造体の一実施形態の概略構成を示す斜視図である。
【図３】（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ微細構造体の作製方法を示す工程図である。
【図４】（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ本発明の検査チップの製造方法を示す工程図である。
【図５】（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ微細構造体の上面図である。
【図６】光検出手段が検出した光のスペクトル分布を示すグラフである。
【図７】（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）の部分上面図である。
【図８】（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ図７に示す微細構造体を用いて検査チップの製造方法の他の一例を示す工程図である。
【図９】微細構造体の他の一例の概略構成を示す上面図である。
【図１０】（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）の断面図である。
【符号の説明】
【００７０】
１０  被検体検出装置
１２、８０、９０、１００  微細構造体
１４  光照射手段
１６  光検出手段
１８  チップ支持手段
２０  被検体滴下手段
２２  金属微粒子滴下手段
３０、８２、９２、１０２  基体
３２  誘電体基材
３４  導電体
３６  金属体
４０  微細孔
４２  微細柱状体
４４  棒部
４５  充填部
４６  突出部
４８  被陽極酸化金属体
６２  被検体
６４、８４  金属微粒子
９４  金属ナノロッド
１０４  金属細線
【図１】
2009222483.tif 000004
【図２】
2009222483.tif 000005
【図３】
2009222483.tif 000006
【図４】
2009222483.tif 000007
【図６】
2009222483.tif 000008
【図７】
2009222483.tif 000009
【図８】
2009222483.tif 000010
【図９】
2009222483.tif 000011
【図１０】
2009222483.tif 000012
【図５】
2009222483.tif 000013