(57)【要約】【課題】  ポリマーの周囲環境、具体的には温度やｐＨを変化させることにより、繰返して、且つ、異なる条件下においても蛍光測定が行える新たな蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーと、その新たな用途を提供すること。【解決手段】（１）温度及び／又はｐＨにより水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマー。（２）温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマーを、水系溶媒中で蛍光発生成分を有する物質の近傍に存在させて、蛍光発生成分とポリマー中の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせ、その結果として発生した蛍光の強度を測定する工程を含む、蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法。【選択図】  図４９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなる、ポリマー。
【請求項２】
蛍光物質が親水性環境下においてより強い蛍光を発する物質である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
蛍光物質がフルオレセイン系蛍光物質又はクマリン系蛍光物質である、請求項２に記載のポリマー。
【請求項４】
蛍光物質がフルオレセイン系蛍光物質である、請求項２に記載のポリマー。
【請求項５】
ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部が光学異性体を有するアミノ酸誘導体である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項６】
少なくともｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部がイオン性基を有する化合物である、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項７】
少なくともｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、特定のｐＨ環境下でより強い蛍光を発する蛍光物質が結合されてなる、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項８】
温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマーを、水系溶媒中で蛍光発生成分を有する物質の近傍に存在させて、蛍光発生成分とポリマー中の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせ、その結果として発生した蛍光の強度を測定する工程を含む、蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法。
【請求項９】
温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーが、温度の変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
蛍光発生成分を有する物質が、蛋白質或いはオリゴ−又はポリペプチドである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマーが、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のポリマーである、請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載のポリマーであって、少なくとも温度の変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒の温度を測定する工程を含む、温度の測定方法。
【請求項１３】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載のポリマーであって、少なくともｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒のｐＨを測定する工程を含む、ｐＨの測定方法。
【請求項１４】
測定対象を含有するか又は含有することが予想される水系溶媒（ｘ）中において、及び、測定対象を含有しない水系溶媒（ｙ）中で、請求項５に記載のポリマーに由来する蛍光を温度及び／又はｐＨを変化させながらを測定し、水系溶媒（ｘ）での測定結果を水系溶媒（ｙ）での測定結果を比較することにより、水系溶媒（ｘ）中における測定対象の三次元高次構造、又は、水系溶媒（ｘ）中に測定対象が存在するか否かを判定する、判定方法。
【請求項１５】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載のポリマーであって、その少なくとも片末端には蛍光物質が結合されていないポリマーと、蛋白質、リン脂質、低分子生理活性及び担体からなる群から選択されるいずれかが結合されてなる、蛍光プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光性温度応答性及び／又はｐＨ応答性ポリマー及びこれを用いた温度測定方法に関する。特に、温度やｐＨといった周囲環境の変化によって蛍光強度が変化したり、特定の立体構造の存在によって蛍光強度の変化のパターンが変化するポリマーに関する。また、本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動を利用した蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
すべての生命活動は、蛋白質を中心とした生体分子の相互作用によって担われている。即ち、細胞内においては、特定の生体分子が他の物質と相互作用を行い、これによって反応が進行している。従って、蛋白質間相互作用、あるいは蛋白質と他の分子との相互作用を研究し、解明することは、生物の発生・分化・増殖などの生体反応や薬理機構の解明といった領域、さらにはバイオセンサー・新薬の開発といった領域への展開も期待できる。
【０００３】
上記のような研究には、生体内の状況や物質の変化を可視化する技術の開発が必須である。実際、そのような可視化の技術を伴う研究が盛んになされている。一例を挙げると、理化学研究所の宮脇敦史らのグループによる、増殖期にある細胞と休止期にある細胞との識別技術がある（非特許文献１）。宮脇らは、増殖期と休止期とで、細胞内には異なる蛋白質が増えることに着目し、その異なる蛋白質のそれぞれに別々の色調を示す蛍光物質を結合させ、蛍光の色によって細胞が何れの時期にあるかを見分けられるようにした。
【０００４】
また、小林久隆らの米国国立衛生研究所と東京大学との研究チームは、新たな蛍光物質を開発した（非特許文献２）。これらの蛍光物質は、従来のものと比べて強く発光する。従って、これらの蛍光物質を癌細胞に取り込ませたり癌細胞の表面に結合させることにより、小さな癌が発見できるようになると期待されている。
【０００５】
上記のように、高感度での測定では、蛍光が利用されている。そのような蛍光の利用技術の一つとして、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET）も知られている。ＦＲＥＴは、蛍光成分を有する物質、例えば蛋白質の空間パターンや時間的変動など、生理現象のより本質的な理解に有用な情報を提供し得ると考えられる。
【０００６】
ところで、従来の蛍光物質は、一度蛍光を発すると、その状態における測定ができるのみであった。一方、インテリジェント・マテリアルと呼ばれ、環境の変化（光、熱、ｐＨ、電気的刺激等）を感知しそれに対応して自身の機能をコントロールするような刺激感受性ポリマーが知られており、中でも、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（Poly-N-isopropylacrylamide；PNIPAAm）は、温度応答性材料として有用である。ＰＮＩＰＡＡｍは、水素結合性部位をもっている。そのため、水中において、環境温度が低い場合にはポリマー鎖のまわりに水分子が強く付着し、その結果ＰＮＩＰＡＡｍが水に溶解する。しかし、温度を上げると水素結合が切断されポリマーは裸となり、水と相分離し、不溶性となって沈殿する。このような温度応答性を蛍光物質に付与すれば、蛍光物質に新たな用途が加わると考えられる。
【０００７】
特許文献１には、温度応答性ポリマーの分子中に蛍光物質であるベンゾクロメノン化合物を結合させること、より具体的には、ベンゾクロメノン化合物が結合されてなる温度応答性ポリマーを含む蛍光試薬等が開示されている。特許文献１によると、ベンゾクロメノンイル基を有するこのポリマーの蛍光波長は極性溶媒中で４６０ｎｍ以上であり、従って、測定系に共存する芳香環による影響を受けにくいという特性を有するとのことである（段落番号［００３３］）。また、特許文献１は、このような蛍光試薬の用途として、当該試薬を含む溶液中の環境変化又は当該化合物で標識化した分子の変化の追跡を挙げている（段落番号［００３３］）。
【０００８】
さらに、特許文献２には、温度応答性を有する蛍光性温度プローブであって、二つ以上のセグメント鎖から構成されるブロックポリマーやグラフトポリマーが開示されている。しかし、特許文献２には、温度の変化に応じて発明に係るプローブの蛍光強度がどのように変化したかについて、実験結果が全く示されておらず、当該プローブのセンサー機能についても、センシングに使用できる可能性が示されているにすぎない。すなわち、特許文献２は、具体的にどのようなポリマー合成したら、どのような条件でどのようなプローブとして使用できるかに関し、具体的な記載を欠くものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−２３８４６７
【特許文献２】特開２００６−１６２５１２
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓａｋａｕｅ−Ｓａｗａｎｏ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３２，４８７−４９８（２００８）
【非特許文献２】Ｕｒａｎｏ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１５，１０４−１０９（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ポリマーの周囲環境、具体的には温度やｐＨが変化することにより蛍光強度に変化が生じる蛍光性温度応答性及び／又はｐＨ応答性ポリマーを提供することにある。
【００１２】
また、本発明の他の目的は、蛍光性温度応答性及び／又はｐＨ応答性ポリマーを用い、蛍光共鳴エネルギー移動の原理を利用して蛍光発生成分を有する物質等を測定する方法を提供することにある。ここで、蛍光発生成分とは、例えば芳香環を有する化合物であり、本発明の方法は、測定系に共存する芳香環を積極的に利用しようとするものである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、特定の蛍光性温度応答性ポリマーを用い、水系溶媒の温度を測定する方法を提供することと、特定の蛍光性ｐＨ応答性ポリマーを用い、水系溶媒のｐＨを測定する方法を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、光学異性体を有するモノマー成分を含む蛍光性温度応答性及び／又はｐＨ応答性ポリマーを用い、これと共存する測定対象の三次元高次構造、又は、当該測定対象の有無を判定する方法を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、上記の蛍光性温度応答性及び／又はｐＨ応答性ポリマーを含む蛍光プローブを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討し、下記の本発明を完成させた。
即ち、第一の発明は、温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマー（以下において、「蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー」ということがある）に関する。第一の発明のポリマーには、温度変化とｐＨ変化の中、温度変化によってのみ蛍光強度が変化する蛍光性温度応答性ポリマー、ｐＨ変化によってのみ蛍光強度が変化する蛍光性ｐＨ応答性ポリマー、及び温度変化によってもｐＨ変化によっても蛍光強度が変化する蛍光性温度及びｐＨ応答性ポリマーのいずれもが包含される。また、蛍光物質の結合部位として、そのポリマー分子の末端（例えば、直鎖状ポリマーの場合は、片末端又は両末端、グラフトポリマーの場合には、主鎖の片末端、両末端、側鎖の末端）と中間（主鎖や側鎖の末端以外の個所）とが挙げられる。従って、第一の発明のポリマーには、温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、その分子の末端及び／又は中間に蛍光物質が結合されてなるポリマーが包含される。
【００１７】
上記蛍光物質には、親水性環境下においてより強い蛍光を発する物質（例えばフルオレセイン系蛍光物質やクマリン系蛍光物質）と、疎水性環境下においてより強い蛍光を発する物質（例えばダンシル系蛍光物質）とがある。
【００１８】
上記ポリマーの一例として、その主鎖がポリエチレンであるものが挙げられる。また、ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部が光学異性体を有するアミノ酸誘導体であるものが挙げられる。
【００１９】
上記ポリマーの例として、（ｉ）ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部として、アルキルアクリルアミドを含み、少なくとも分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマー、（ｉｉ）ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部として、アルキルアクリルアミドを含み、少なくとも分子の片末端に蛍光物質が結合されてなるポリマー、（ｉｉｉ）ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部として、アクリロイル基含有アミノ酸誘導体を含み、少なくとも分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマー、（ｉｖ）ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部として、アクリロイル基含有アミノ酸誘導体を含み、少なくとも分子の片末端に蛍光物質が結合されてなるポリマー、及び（ｖ）上記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）のポリマーであって、アクリロイル基含有アミノ酸誘導体のアミノ酸が光学異性体を有するものであるポリマー等が挙げられる。
【００２０】
また、上記ポリマーの具体例としては、構成モノマーとしてアルキルアクリルアミド及びｏ−アクリル酸エステル基を有するフルオレセイン系蛍光物質とを含み、少なくとも分子の中間にフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなるポリマーや、構成モノマーとしてアルキルアクリルアミドを含み、少なくとも分子の片末端にフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなるポリマーが挙げられる。ｏ−アクリル酸エステル基を有するフルオレセイン系蛍光物質の代わりに、ダンシル  アミノエチルアクリルアミド等のアクリルアミド基を有するダンシル系蛍光物質を使用してなるポリマーや、７−（４−トリフルオロメチル）クマリン  アクリルアミド等のアクリルアミド基を有するクマリン系蛍光物質を使用してなるポリマーも、上記ポリマーの具体例である。
【００２１】
第一の発明のポリマーには、少なくともｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部として、イオン性基を有する化合物を含むポリマーや、少なくともｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、特定のｐＨ環境下でより強い蛍光を発する蛍光物質が結合されてなるポリマーも包含される。
【００２２】
第二の発明は、温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマーを、水系溶媒中で蛍光発生成分を有する物質の近傍に存在させて、蛍光発生成分とポリマー中の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせ、その結果として発生した蛍光の強度を測定する工程を含む、蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法に関する。蛍光物質の結合部位としては、そのポリマー分子の末端及び／又は中間が挙げられる。
【００２３】
蛍光発生成分を有する物質の例として、蛋白質、オリゴペプチド、ポリペプチドが挙げられる。
【００２４】
温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマーとして、第一の発明のポリマーを使用することが好ましい。ここで、第一の発明のポリマーには、温度の変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマー、ｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマー、温度の変化でもｐＨの変化でも、水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーのいずれもが包含される。
【００２５】
第三の発明は、第一の発明のポリマーであって、少なくとも温度の変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒の温度を測定する工程を含む、温度の測定方法に関する。
【００２６】
第四の発明は、第一の発明のポリマーであって、少なくともｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒のｐＨを測定する工程を含む、ｐＨの測定方法に関する。
【００２７】
第五の発明は、測定対象を含有するか又は含有することが予想される水系溶媒（ｘ）中において、及び、測定対象を含有しない水系溶媒（ｙ）中で、第一の発明のポリマーであってポリマーの構成モノマーの少なくとも一部として光学異性体を有するアミノ酸誘導体を含むポリマーに由来する蛍光を温度及び／又はｐＨを変化させながらを測定し、水系溶媒（ｘ）での測定結果を水系溶媒（ｙ）での測定結果を比較することにより、水系溶媒（ｘ）中における測定対象の三次元高次構造、又は、水系溶媒（ｘ）中に測定対象が存在するか否かを判定する、判定方法に関する。
【００２８】
第六の発明は、第一の発明のポリマーであってその少なくとも片末端には蛍光物質が結合されていないポリマーと、蛋白質、リン脂質、低分子生理活性及び担体からなる群から選択されるいずれかが結合されてなる、蛍光プローブに関する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、ポリマーの周囲環境、具体的には温度やｐＨを変化させることにより、繰返して、且つ、異なる条件下においても蛍光測定が行える、新たな蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーが提供される。このポリマーは、単独で、又は、蛋白質、リン脂質、低分子生理活性、担体等に結合させた状態で、蛍光温度センサー、蛍光ｐＨセンター、蛍光プローブとしての利用が可能である。また、イメージング・プローブや診断用プローブとして、臨床検査や疾病の診断領域での利用も可能である。すなわち、本発明により、生体内分子の動的挙動の解明に有用な、バイオイメージングのための新たな分子ラベルが提供される。
【００３０】
また、本発明により、蛍光共鳴エネルギー移動を用いた蛍光発生成分を有する物質等の測定方法が提供される。本発明によれば、蛋白質間相互作用等に基づく生体内における変化を、蛍光強度に基づいて、リアルタイムで知ることができるようになる。
【００３１】
さらに、本発明により、蛍光性温度応答性ポリマーを用いる、水系溶媒の温度を測定する方法と、蛍光性ｐＨ応答性ポリマーを用いる、水系溶媒のｐＨを測定する方法が提供される。本発明によれば、微小空間における温度やｐＨ等の環境変化を測定、感知することが可能となる。
【００３２】
本発明に係るポリマーであって、その構成モノマーの少なくとも一部として光学異性体を有するアミノ酸誘導体を含むものを使用すると、水系溶媒中において、ある測定対象（蛋白質、オリゴ−又はポリペプチド、低分子生理活性物質等）が存在するか否か、又は、その測定対象の三次元高次構造を判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、４−アミノフルオレセイン接合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の製造工程を示す図である。
【図２】図２は、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の製造工程を示す図である。
【図３】図３は、蛍光共鳴エネルギー移動を説明するための模式図である。
【図４】図４は、実施例１（２）で合成したポリマーの水溶液中における温度と透過率との関係を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例１（２）で合成した蛍光性ポリマーの水溶液中における、温度毎の蛍光スペクトルを示す。
【図６】図６は、実施例１（２）で合成した蛍光性ポリマーの水溶液中における温度と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図７】図７は、ＢＳＡ、実施例１（２）で合成した蛍光性ポリマー及びそれらが共存する場合の、それらの水溶液中における蛍光スペクトルを示す。
【図８】図８は、ＢＳＡ、ＢＳＡ凝集体、実施例１（２）で合成した蛍光性ポリマー、ＢＳＡと蛍光性ポリマーとが共存する場合、及びＢＳＡ凝集体と蛍光性ポリマーとが共存する場合の、それらの水溶液中における蛍光スペクトルを示す。
【図９】図９は、実施例３（３）において合成したポリマーの水溶液中における温度と透過率との関係を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例３（３）において合成したポリマーの水溶液中における温度と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例３（３）において合成したポリマーの水溶液の２５℃（左）と３５℃（右）における蛍光を示す写真である。
【図１２】図１２は、実施例３（２）で合成した蛍光性ポリマーの水溶液の２５乃至３６℃における蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図１３】図１３は、実施例３（２）で合成した蛍光性ポリマーの酸性水性溶液の２５乃至３６℃における蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図１４】図１４は、実施例３（２）で合成した蛍光性ポリマーの中性水性溶液の２５乃至３６℃における蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図１５】図１５は、実施例３（２）で合成した蛍光性ポリマーの塩基性水性溶液の２５乃至３６℃における蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図１６】図１６は、実施例３（２）で合成した蛍光性ポリマーの水溶液中におけるｐＨと蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図１７】図１７は、実施例３（２）で合成した蛍光性ポリマーの１Ｈ−ＮＭＲのチャートである。
【図１８】図１８は、実施例３（２）で合成した蛍光性ポリマーの１Ｈ−ＮＭＲのチャートである。
【図１９】図１９は、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／ダンシル  アミノエチルアクリルアミド）共重合体を合成するための反応スキームを示す図である。
【図２０】図２０は、実施例４（３）において合成したポリマーの水溶液中における温度と透過率との関係を示すグラフである。
【図２１】図２１は、実施例４（３）において合成したポリマーの水溶液中における温度と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図２２】図２２は、実施例４（３）において合成したポリマーの水溶液の２５℃と３５℃における蛍光を示す写真である。
【図２３】図２３は、実施例４（３）で合成した蛍光性ポリマーの水溶液の２５乃至３６℃における蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図２４】図２４は、実施例４（３）で合成した蛍光性ポリマーの１Ｈ−ＮＭＲのチャートである。
【図２５】図２５は、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／７−（４−トリフルオロメチル）クマリン  アクリルアミド）共重合体を合成するための反応スキームを示す図である。
【図２６】図２６は、実施例５（３）で合成した蛍光性ポリマーの水溶液中における温度と透過率との関係を示すグラフである。
【図２７】図２７は、実施例５（３）において合成したポリマーの水溶液中における温度と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図２８】図２８は、実施例５（３）において合成したポリマーの水溶液の２５℃と３５℃における蛍光を示す写真である。
【図２９】図２９は、実施例５（３）で合成した蛍光性ポリマーの水溶液の２５乃至３６℃における蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図３０】図３０は、実施例５（３）で合成した蛍光性ポリマーの１Ｈ−ＮＭＲのチャートである。
【図３１】図３１は、イムノグロブリンＧ接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体を合成するための反応スキームを示す図である。
【図３２】図３２は、実施例６（３）で合成した蛍光性ポリマーの水溶液中における温度と透過率との関係を示すグラフである。
【図３３】図３３は、実施例６（３）において合成したポリマーの水溶液中における温度と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図３４】図３４は、実施例６（３）において合成したポリマーの２００乃至６００ｎｍにおける吸収スペクトルを示すグラフである。
【図３５】図３５は、イムノグロブリンＧの２００乃至６００ｎｍにおける吸収スペクトルを示すグラフである。
【図３６】図３６は、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の２００乃至６００ｎｍにおける吸収スペクトルを示すグラフである。
【図３７】図３７は、（Ｎ−アクリロイル−プロリンメチルエステル）重合体を合成するための反応スキームを示す図である。
【図３８】図３８は、（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体［「ＦＬ−」と表記］と４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体［「ＦＬ＋」と表記］の、水溶液中における温度と透過率との関係を示すグラフである。
【図３９】図３９は、（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体と（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体の円二色性スペクトルを示すチャートである。
【図４０】図４０は、（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体と（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体の紫外部吸収スペクトルを示すチャートである。
【図４１】図４１は、４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−プロリンメチルエステル）重合体を合成するための反応スキームを示す図である。
【図４２】図４２は、実施例７（５）で合成した蛍光性ポリマー［４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体］の水溶液中における温度と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図４３】図４３は、実施例７（５）で合成した蛍光性ポリマー［４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体］の水溶液の１５乃至２５℃における蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図４４】図４４は、（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体［「ＦＬ−」と表記］と４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体［「ＦＬ＋」と表記］の、水溶液中における温度と透過率との関係を示すグラフである。
【図４５】図４５は、実施例８（５）で合成した蛍光性ポリマー［４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体］の水溶液中における温度と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図４６】図４６は、実施例８（５）で合成した蛍光性ポリマー［４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体］の水溶液の１５乃至２５℃における蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図４７】図４７は、実施例８（５）で合成した蛍光性ポリマー［４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体］の水溶液中における温度と透過率との関係を、アミド結合型Ｌ−プロリンポリマーの共存下と非共存下において測定した結果を示すグラフである。
【図４８】図４８は、実施例７（５）で合成した蛍光性ポリマー［４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体］の水溶液中における温度と透過率との関係を、アミド結合型Ｌ−プロリンポリマーの共存下と非共存下において測定した結果を示すグラフである。
【図４９】図４９は、実施例８（５）で合成した蛍光性ポリマー［４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体］の水溶液中における温度と蛍光強度との関係を、アミド結合型Ｌ−プロリンポリマーの共存下と非共存下において測定した結果を示すグラフである。
【図５０】図５０は、実施例７（５）で合成した蛍光性ポリマー［４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体］の水溶液中における温度と蛍光強度との関係を、アミド結合型Ｌ−プロリンポリマーの共存下と非共存下において測定した結果を示すグラフである。
【図５１】図５１は、リン脂質接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体を合成するための反応スキームを示す図である。
【図５２】図５２は、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体が細胞内に取り込まれた状態を示す写真である。
【図５３】図５３は、リン脂質接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体が細胞内に取り込まれた状態を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下に、本発明を、その実施のための最良の形態に基づいて説明する。先ず、第一の発明について説明する。
【００３５】
第一の発明のポリマーは、それ自体が温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるものである。
【００３６】
ここで、「水系溶媒」には、水の他、各種緩衝液等の無機塩水溶液や、３０容量％程度までの量で有機溶媒を含有する水を主成分とする液体も包含される。水を主成分とし、当該溶液中で、温度及び／又はｐＨの変化に伴う第一の発明のポリマーの蛍光強度の変化を測定できる限り、「水系溶媒」である。
【００３７】
第一の発明のポリマーの例としては、（１）アクリルアミド系モノマーの重合又は共重合体の片末端又は両末端に蛍光物質が結合されてなるもの、（２）アクリルアミド系モノマーとアクリル酸エステル基やアリル（allyl）基等のエチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなるもの（これは、分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（３）アクリルアミド系モノマーとエチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなり且つその片末端又は両末端に蛍光物質が結合されてなるもの（これは、分子の中間と末端とに蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（４）アクリロイル基含有モノマーの重合又は共重合体の片末端又は両末端に蛍光物質が結合されてなるもの、（５）アクリロイル基含有モノマーとエチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなるもの（これは、分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（６）アクリロイル基含有モノマーとエチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなり且つその片末端又は両末端に蛍光物質が結合されてなるもの（これは、分子の中間と末端とに蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（７）アクリルアミド系モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーとの共重合体の片末端又は両末端に蛍光物質が結合されてなるもの、（８）アクリルアミド系モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーと、エチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなるもの（これは、分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（９）アクリルアミド系モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーと、エチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなり且つその片末端又は両末端に蛍光物質が結合されてなるもの（これは、分子の中間と末端とに蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（１０）アクリロイル基含有モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーとの共重合体の片末端又は両末端に蛍光物質が結合されてなるもの、（１１）アクリロイル基含有モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーと、エチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなるもの（これは、分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、及び（１２）アクリロイル基含有モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーと、エチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなり且つその片末端又は両末端に蛍光物質が結合されてなるもの（これは、分子の中間と末端とに蛍光物質が結合されてなるポリマーである）が挙げられる。
【００３８】
主鎖をポリエチレンとするために使用される主たる構成モノマーの例として、アクリルアミド、メタクリルアミド（以下、まとめて「（メタ）アクリルアミド」ということがある）、アクリルアミド誘導体（例えばアルキル（メタ）アクリルアミド）等の（メタ）アクリルアミド系モノマー類、アクリロイル基又はメタクリロイル基含有化合物（以下、まとめて「（メタ）アクリロイル基含有化合物」ということがある）等が挙げられる。
【００３９】
上記ポリマーの製造に使用される（メタ）アクリルアミド系モノマーの例としては、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド及び（メタ）アクリロイルピロリジンが挙げられる。上記ポリマーの製造に際しては、これらの（メタ）アクリルアミド系モノマーの中のいずれか一種、或いは二種以上が使用されることが好ましい。また、これらの（メタ）アクリルアミド系モノマーに加えて、コモノマーとして、メチルアクリレート、エチルアクリレート等のアルキル（炭素数：１乃至２０程度、好ましくは１乃至３程度）アクリレートやメチルメタクリレート、エチルメタクリレート等のアルキル（炭素数：１乃至２０程度、好ましくは１乃至３程度）メタクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、ビニルビロリドン、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、スチレン等を使用してもよい。なお、アルキルアクリレートやアルキルメタクリレート（以下、まとめて「アルキル（メタ）アクリレート」ということがある）をコモノマーとして使用する場合には、その量は、アクリルアミド系モノマーとアルキル（メタ）アクリレートとの合計の５乃至６０％程度が好ましい。
【００４０】
（メタ）アクリロイル基含有化合物であるモノマーの具体例としては、Ｎ−（メタ）アクリロイルプロリンのアルキル（炭素数：１乃至２０程度、好ましくは１乃至３程度）エステル等の（メタ）アクリロイル基含有アミノ酸誘導体、（メタ）アクリロイルピリジン等が挙げられる。上記ポリマーの製造に際しては、これらの（メタ）アクリロイル基含有化合物の中のいずれか一種、或いは二種以上が使用されることが好ましい。また、これらの（メタ）アクリロイル基含有化合物とともに、上記コモノマーを使用してもよい。
【００４１】
本発明に係るポリマーの構成モノマーの少なくとも一部として、例えばＮ−アクリロイルプロリンのメチルエステルのような光学異性体を有する化合物、より具体的には光学活性アミノ酸誘導体を使用することができる。光学活性アミノ酸誘導体は、ポリマー主鎖の構成モノマーの全て（但し、蛍光物質に由来する部分を除く）であってもよいし、一部であってもよい。また、構成モノマーとして、光学活性アミノ酸誘導体の一方の光学異性体のみを使用してもよいし、光学異性体二種を、例えばブロック子ポリマーとなるように使用してもよい。
【００４２】
例えば、後記する実施例７及び８では、各々、光学異性体の一方のみをポリマー主鎖の構成モノマーの全てとして使用して、本発明のポリマーを合成している。また、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、１１０６（２００６）、１５２−１５８ページに記載されている、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−アクリロイルプロリンのメチルエステルとの共重合体も、これに蛍光物質を結合させることで、本発明のポリマーとして使用することができる。
【００４３】
主鎖の構成モノマーとして、イオン性基を有するモノマーを使用すると、本発明に係るポリマーが、ｐＨの変化により水系溶媒中での親和性が変化するものとなる。そのようなイオン性基を有するモノマーの例として、イオン性基であるカルボキシル基を有し且つエチレン性不飽和基を有するアクリル酸やメタクリル酸が挙げられる。カルゴキシル基以外のイオン性基の例としては、アンモニウム基、スルホニウム基、テトラメチルアンモニウム基、スルホン酸基等が挙げられる。
【００４４】
本発明に係るポリマーをｐＨ応答性にするためには、主鎖の構成モノマーの０．１乃至３０モル％程度、好ましくは０．５乃至２０モル％程度、さらに好ましくは１乃至１０モル％程度を、イオン性基を有するモノマーとすることが好ましい。また、イオン性基を有するモノマーとして、一般的には、カチオン性基を有する化合物とアニオン性基を有する化合物の中、いずれかのみを使用する。
【００４５】
上記ポリマーの製造に使用される蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、４−アミノフルオレセイン、ジクロロフルオレセイン、スルホンフルオレセイン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドフルオレセイン、オレゴングリーン、トーキョーグリーン、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテート等のフルオレセイン系化合物や、これらのフルオレセイン系化合物に、ポリマーの末端への結合又は主鎖構成モノマーとの共重合に適する基が導入されてなるものである。フルオレセイン系蛍光物質は、本発明に係るポリマーが親水性環境下にあるときに、より強い蛍光を発する。
【００４６】
なお、フルオレセイン系蛍光物質が結合されてなる本発明のポリマーは、主鎖を構成するモノマーとして上記したイオン性基が使用されていなくても、ｐＨの変化に応じて蛍光強度に変化が生じる。これは、フルオレセインがｐＨの変化によってその化学構造を変え、それに伴って蛍光強度に大きな変化がもたらされるからである。
【００４７】
上記ポリマーの製造に使用される蛍光物質の他の例としては、クマリン系化合物、ベンゾクロメノン化合物、スチルベン系化合物等や、これらの化合物に、ポリマーの末端への結合又は主鎖構成モノマーとの共重合に適する基が導入されてなるものである。クマリン系蛍光物質の具体例としては、７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミド等が挙げられる。ベンゾクロメノン系蛍光物質の具体例としては、２−（モルフォリン−４−イル）−ベンゾ［ｈ］クロメン−４−オン等が挙げられる。スチルベン系蛍光物質の具体例としては、レスベラトロール等が挙げられる。
【００４８】
フルオレセイン系蛍光物質やクマリン系蛍光物質は、本発明に係るポリマーが親水性環境下にあるときに、より強い蛍光を発する。ここで、「より強い蛍光」とは、蛍光強度の測定において、消光状態の蛍光強度の例えば２倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上の蛍光強度をいう。
【００４９】
上記ポリマーの製造に使用される蛍光物質のさらに他の例としては、ダンシル  アミノエチルアクリルアミド、  ダンシル  クロリド、ダンシル  エチレンジアミン等のダンシル系化合物であって、これらのダンシル系化合物に、ポリマーの末端への結合又は主鎖構成モノマーとの共重合に適する基が導入されてなるものである。ダンシル系蛍光物質は、本発明に係るポリマーが疎水性環境下にあるときに、より強い蛍光を発する。また、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール等のベンゾフラザン系蛍光物質も、疎水性でより強い蛍光を発する。
【００５０】
主鎖構成モノマーの重合又は共重合体の末端に蛍光物質を結合させる場合には、ポリマーの末端に反応性の基を導入することもでき、そのような場合には、蛍光物質として、反応性の基が導入されてなるものを使用しなくともよい。また、（メタ）アクリルアミド系モノマーや（メタ）アクリロイル基含有化合物との共重合に適する基の例としては、アクリル酸エステル基やアリル（allyl）基等のエチレン性不飽和基を含む基が挙げられる。
【００５１】
本発明のポリマーは、末端に蛍光物質が結合されてなる単独重合体であってもよいし、主鎖が蛍光物質以外のモノマー成分と蛍光物質とから構成される共重合体であってもよい。また、主鎖を構成する蛍光物質以外のモノマー成分も、一種類とは限らず、二種以上が使用されていてもよい。本発明のポリマーが共重合体である場合、それは、ランダム共重合体であっても、ブロック共重合体（グラフト共重合体等を包含する）であってもよい。特に共重合体とする場合には、モノマー成分のモル比により、また、ランダム共重合かブロック共重合かにより、そのポリマーが示す水系溶媒中での蛍光強度の変化挙動が変わり得る。従って、特に後記する第五の発明において使用する本発明のポリマーは、測定対象との関係を考慮し、分子設計をすることとなる。
【００５２】
本発明のポリマーの分子量は、特に限定されないが、モノマーの重合度（ｎ）で表して、１０乃至１，０００程度であることが好ましく、ｎ＝１０乃至５００程度であることがさらに好ましく、ｎ＝１０乃至２００程度であることが特に好ましい。蛍光物質の導入割合も、特に限定されないが、モノマー成分中の蛍光物質の割合が、０．００１乃至２０モル％であることが好ましく、０．０１乃至１０モル％であることが好ましい。なお、一般的には、ポリマーの重合度が大きくなる（分子量が大きくなる）に従い、蛍光物質の導入割合は小さくなる。
【００５３】
次に、上記ポリマーの製造方法の例を説明する。先ず、片末端にフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなるポリマーの製造方法の例を、図１を参照しながら説明する。
【００５４】
図１に示すように、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下、「ＮＩＰＡＡｍ」ということがある）と、連鎖移動剤である３−メルカプトプロピオン酸（以下、「ＭＰＡ」ということがある）とを、ラジカル開始剤である２，２´−アゾビス（イソブチロニトリル）（以下、「ＡＩＢＮ」ということがある）及び溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」ということがある）の存在下で、約７０℃にて反応させる。これにより、片末端に連鎖移動剤に由来する基を有するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（以下、「ＰＮＩＰＡＡｍ」ということがある）が得られる。ポリマーの分子量は、ＮＩＰＡＡｍとＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
【００５５】
次いで、得られたＰＮＩＰＡＡｍをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（以下、「ＮＨＳ」ということがある）と、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、「ＤＣＣ」ということがある）及び酢酸エチルの存在下で、約２５℃にて反応させ、末端をスクシニル化（活性エステル化）させる。得られた末端スクシニル化ポリマーを、１，４−ジオキサンの存在下で、約２５℃にて、フルオレセイン系蛍光物質である４−アミノフルオレセインと反応させる。このようにして、４−アミノフルオレセインが接合されたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が製造される。
【００５６】
中間にフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなるポリマーの製造方法の例を、図２を参照しながら説明する。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）と、連鎖移動剤である３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）と、フルオレセイン系蛍光物質であるフルオレセイン  ｏ−アクリレートを、ラジカル開始剤である２，２´−アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）及び溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、約７０℃にて反応させる。これにより、ポリマー分子の中間にランダムにフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなる（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体（以下、「Ｐ又はＰｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ―ｃｏ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｏ−ａｃｒｙｌａｔｅ）」ということがある）が得られる。ポリマーの分子量は、モノマー二種の合計とＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。また、蛍光物質の結合割合は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとフルオレセイン  ｏ−アクリレートとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
【００５７】
上記した図２に示された製造例では、ポリマー末端がカルボキシル基となっている。このカルボキシル基に何らかの化合物を反応させることにより、このポリマーの末端の親和性を調節し、このポリマーを、特定の物質に接近し易くさせたり、このカルボキシル基を、何らかの物質（例えば、リン脂質、蛋白質、担体等）に結合させることもできる。一例を挙げると、カルボキシル基をホスファチジルエタノールアミン等のアミノ基を有するリン脂質と結合させることができる。この場合、ポリマー末端のリン脂質部分が細胞膜のリン脂質部分に接近又は埋め込まれるようになる。また、上記ポリマー末端のカルボキシル基に、予め末端にアミノ基が導入されてなるイムノグロブリンを結合させることができる。この場合、ポリマー末端のイムノグロブリン部分が、例えば抗原抗体反応結合体部分に親和性を示すと考えられる。さらに、上記カルボキシル基で上記ポリマーを固体表面に結合させた場合には、このポリマーを、その蛍光を観察することに基づくセンサーとして使用することも可能であると考えられる。
【００５８】
ところで、温度応答性ポリマーは、水素結合が切断されると水に不溶性となり、沈殿する。このような現象を下限臨界溶解現象といい、相転移が生じる温度を下限臨界溶解温度（Lower Critical Solution Temperature：LCST）と呼ぶ。この下限臨界溶解温度は、ポリマーを構成するモノマーの選択や、コモノマーの利用（種類や使用する割合）によって調節することができる。例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３２℃に下限臨界溶解温度を有するが、下限臨界温度を３２℃超にするためには、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドよりも親水性のモノマーであるアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドンなどのコモノマーを共重合させるとよい。一方、下限臨界溶解温度を３２℃未満にしたいときは、疎水性モノマーであるスチレン、アルキルメタクリレート、アルキルアクリレートなどのコモノマーと共重合させるとよい。なお、フルオレセイン系蛍光物質が結合されてなる本発明のポリマーは、ＬＣＳＴよりも低温側でより強い蛍光を発し、ＬＣＳＴ付近で急激に蛍光強度が低下する。
【００５９】
中間にフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなるポリマーを合成する場合には、フルオレセイン系蛍光物質の親和性の程度や、その導入割合によって、得られる蛍光性温度応答性ポリマーの下限臨界溶解温度が変化することを考慮する必要がある。
【００６０】
次に、中間に蛍光物質であるダンシル  アミノエチルアクリルアミドが結合されてなるポリマーの製造方法の例を、図１９を参照しながら説明する。
【００６１】
図１９に示すように、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）と、連鎖移動剤である３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）と、ダンシル  アミノエチルアクリルアミドを、ラジカル開始剤である２，２´−アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）及び溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、約７０℃にて反応させる。これにより、ポリマー分子の中間にランダムに蛍光物質が結合されてなる（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／ダンシル  アミノエチルアクリルアミド）共重合体（以下、「Ｐ又はＰｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ―ｃｏ−ｄａｎｓｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）」ということがある）が得られる。ポリマーの分子量は、モノマー二種の合計とＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。また、蛍光物質の結合割合は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとダンシル  アミノエチルアクリルアミドとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
【００６２】
上記した図１９に示された製造例においても、ポリマー末端はカルボキシル基となっている。このカルボキシル基に何らかの化合物を反応させることにより、このポリマーの末端の親和性を調節し、このポリマーを、特定の物質に接近し易くさせたり、このカルボキシル基を、何らかの物質（例えばリン脂質、蛋白質、担体）に結合させることもできることは、図２に示された製造例の場合と同様である。
【００６３】
ダンシル  アミノエチルアクリルアミドが結合されてなる本発明のポリマーは、ＬＣＳＴよりも低温側では蛍光強度が小さく、ＬＣＳＴ付近で急激に蛍光強度が上昇する。
【００６４】
次に、中間に蛍光物質である７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミドが結合されてなるポリマーの製造方法の例を、図２５を参照しながら説明する。
【００６５】
図２５に示すように、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）と、連鎖移動剤である３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）と、７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミドを、ラジカル開始剤である２，２´−アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）及び溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、約７０℃にて反応させる。これにより、ポリマー分子の中間にランダムに蛍光物質が結合されてなる（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミド）共重合体（以下、「Ｐ又はＰｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ―ｃｏ−７−（４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｏｕｍａｒｉｎａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）」ということがある）が得られる。ポリマーの分子量は、モノマー二種の合計とＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。また、蛍光物質の結合割合は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドと７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミドのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
【００６６】
上記した図２５に示された製造例においても、ポリマー末端はカルボキシル基となっている。このカルボキシル基に何らかの化合物を反応させることにより、このポリマーの末端の親和性を調節し、このポリマーを、特定の物質に接近し易くさせたり、このカルボキシル基を、何らかの物質（例えばリン脂質、蛋白質、担体）に結合させることもできることは、図２に示された製造例の場合と同様である。
【００６７】
７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミドが結合されてなる本発明のポリマーは、ＬＣＳＴよりも低温側では蛍光強度が大きく、ＬＣＳＴ付近で急激に蛍光強度が低下する。
【００６８】
次に、片末端に蛍光物質である４−アミノフルオレセインが結合されてなるポリマーの製造方法の例を、図３７及び図４１を参照しながら説明する。
【００６９】
図３７に示すように、まずは、Ｄ−又はＬ−プロリンのメチルエステル化を行う。次いで、得られたＤ−又はＬ−プロリンのメチルエステルに塩化アクリロイルを反応させ、Ｎ−アクリロイルプロリンのメチルエステルを合成する。このＮ−アクリロイルプロリンのメチルエステルを、連鎖移動剤である３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、ラジカル開始剤である２，２´−アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）及び溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、約８０℃にて反応させる。これにより、Ｎ−アクリロイルプロリンのメチルエステルの重合体（以下、「Ｐ又はＰｏｌｙ（Ｎ−Ａ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ）」ということがある））が得られる。ポリマーの分子量は、モノマーとＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
【００７０】
次いで、Ｐｏｌｙ（Ｎ−Ａ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ）を、ＮＨＳ、ＤＣＣ及び酢酸エチルの存在下で反応させ、末端をスクシニル化（活性エステル化）させる。得られた末端スクシニル化ポリマーを、１，４−ジオキサンの存在下で、フルオレセイン系蛍光物質である４−アミノフルオレセインと反応させる。このようにして、４−アミノフルオレセインが片末端に結合されたポリ（Ｎ−アクリロイルプロリンのメチルエステル）が製造される。
【００７１】
上記の例において、Ｎ−アクリロイルプロリンのメチルエステルの一部をＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）に変えることで、主鎖がＮ−アクリロイルプロリンのメチルエステル由来部分とＮ−イソプロピルアクリルアミド由来部分とのランダム共重合体であり、４−アミノフルオレセインが片末端に結合されたポリマーを得ることができる。
【００７２】
以上説明した第一の発明に係るポリマーは、それが温度の変化により水系溶媒に対する親和性が変化するものである場合には、「蛍光性温度応答性ポリマー」と、また、それがｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するものである場合には、「蛍光性ｐＨ応答性ポリマー」と呼称される。
【００７３】
第一の発明に係るポリマーの製造に使用される連鎖移動剤の例としては、３−メルカプトプロピオン酸、２−メルカプトエタノール、及び２−メルカプトエチルアミンが挙げられる。連鎖移動剤は、これらに限定されず、チオール基を含有する各種化合物や四塩化炭素も使用可能である。また、連鎖移動剤に由来する末端部分に蛍光物質を結合させるために、蛍光物質に導入される基としては、アミノ基、カルボキシル基、オキシエチレン基等が挙げられる。
【００７４】
次に、第二の発明について説明する。第二の発明は、蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法であって、任意の蛍光性且つ温度及び／又はｐＨ応答性のポリマーを、水系溶媒中で蛍光発生成分を有する物質の近傍に存在させて、蛍光発生成分とポリマー中の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせ、その結果として発生した蛍光の強度を測定する工程を含む方法に関する。
【００７５】
第二の発明では、使用する蛍光性且つ温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーは、温度及び／又はｐＨ応答性であり、且つ、蛍光物質が結合されてなるポリマーである限り、特に限定されないが、第一の発明のポリマーを使用することが好ましい。
【００７６】
蛍光発生成分を有する物質の変化の測定とは、蛍光発生成分（例えば芳香環化合物）を有する物質（例えば蛋白質やペプチド）自体の変化、具体的には熱変性や立体構造の変化、凝集等が生じたか否かを、蛍光発生成分と蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動が生じた結果として測定される蛍光を測定することで、認識することをいう。また、蛍光発生成分を有する物質の周囲環境の変化の測定とは、前記熱変性や立体構造の変化、凝集等が周囲環境の変化によって生じている場合に、その周囲環境の変化が引き起こした蛍光発生成分を有する物質（例えば蛋白質やペプチド）の変化を、前記蛍光共鳴エネルギー移動が生じた結果として測定される蛍光を測定することで、周囲環境の変化を認識することをいう。
【００７７】
ここで、図３を参照しながら、蛍光共鳴エネルギー移動について説明する。ドナーとなる分子（本発明における「蛍光発生成分を有する物質」又は「蛍光発生成分」）の蛍光スペクトルと、アクセプターとなる分子（本発明における「蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質」）の励起スペクトルに重なりがあり、これら二つの分子が約１００ｎｍ以内、好ましくは１０ｎｍ以内の距離に近づいた場合、ドナーを励起するとエネルギーがアクセプターに移動し、アクセプターとなる分子が励起される現象が生じる。これが、蛍光共鳴エネルギー移動である。従って、蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせるためには、通常はドナーの励起波長で光を照射し、検出は、ドナーあるいはアクセプターの蛍光強度測定で行う。ドナーの蛍光強度は、二分子間の距離が近いとアクセプターに光が吸収されるために低くなり、距離が離れると高くなる。アクセプターの蛍光強度は、この逆となる。なお、前記したように、ドナーとなる分子の蛍光スペクトルとアクセプターとなる分子の励起スペクトルとに重なりがあることが必要であるので、好ましい例である、アクセプターである蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質の発する蛍光強度を測定する場合には、変化の測定対象である蛍光発生成分を有する物質（蛋白質等）の蛍光スペクトルを考慮し、その蛍光波長よりも１０乃至５０ｎｍ程度長波長側に励起波長がある蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーを使用することが好ましい。
【００７８】
第二の発明では、水系溶媒中で、蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーを蛋白質等の蛍光発生成分を有する物質の近傍に存在させて、蛍光発生成分からポリマー中の蛍光物質への蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせる。例えば、蛋白質自体の発する蛍光強度が、バックグラウンド蛍光と区別できなかったり、蛋白質の変化に伴う蛍光強度の変化が小さいために、蛍光強度を測定してもその変化を認識することができない場合であっても、蛋白質中の蛍光発生成分（トリプトファン等の芳香環化合物）の励起波長で光を照射すると、エネルギーが蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質へ移動し（蛍光共鳴エネルギー移動が生じ）、このとき、蛍光性温度応答性ポリマー中の蛍光物質が励起されて発光する蛍光の強度は大きいため、この蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質が発する蛍光の強度を測定すれば、蛋白質等やその周囲環境の変化を認識することができる。なお、「水系溶媒」とは、水、各種の緩衝液等の水溶液、水とメタノールやエタノール等の極性溶媒との混合物であって、水を主成分とするもの等をいう。水系溶媒を使用すると、バックグラウンド蛍光の強度は、一般的には小さい傾向にある。
【００７９】
さらに、第三の発明について説明する。第三の発明は、第一の発明のポリマー中、温度応答性を示すポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒の温度を測定する工程を含む、温度の測定方法である。
【００８０】
蛍光性温度応答性ポリマーは、それぞれ特有の下限臨界溶解温度を有する。これらのポリマーは、下限臨界溶解温度未満では親水的環境下にあり、一方、下限臨界溶解温度を超えると疎水性環境下におかれる。すなわち、溶解性が急激に低下する。蛍光性温度応答性ポリマーの中、フルオレセイン系蛍光物質やクマリン系蛍光物質が結合されてなるものは、下限臨界溶解温度未満、すなわち親水的環境下において強い蛍光を発するが、この温度を超えると蛍光強度は著しく小さくなる。一方、ダンシル系蛍光物質が結合されてなるポリマーは、下限臨界溶解温度未満では蛍光が弱く、この温度を超えると蛍光強度は著しく大きくなる。第三の発明は、蛍光性温度応答性ポリマーのこの性質を利用するものである。即ち、蛍光性温度応答性ポリマーに由来する強い蛍光が発せられるか否かで、当該ポリマーが存在する水系環境の温度を特定するものである。
【００８１】
蛍光性温度応答性ポリマーは、それぞれ特有の下限臨界溶解温度を有するので、測定したい温度に応じて、適する蛍光性温度応答性ポリマーを選択し、又は設計する。
【００８２】
また、蛍光性温度応答性ポリマー中の蛍光物質は、それぞれ特有の励起波長及び蛍光波長を有するので、当該蛍光物質に応じた波長で、励起エネルギーを与える。
【００８３】
さらに、第四の発明について説明する。第四の発明は、第一の発明のポリマー中、ｐＨ応答性を示すポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒のｐＨを測定する工程を含む、ｐＨの測定方法である。
【００８４】
蛍光性ｐＨ応答性ポリマーは、それぞれ特有の相転移ｐＨ（水系溶媒に対する溶解性が急激に変化するｐＨ）を有する。蛍光性ｐＨ応答性ポリマーの中、フルオレセイン系蛍光物質やクマリン系蛍光物質が結合されてなるものは、親水的環境下（このとき、ポリマーは水系溶媒中に溶解している）において強い蛍光を発するが、疎水性環境下（このとき、ポリマーの水系溶媒に対する溶解度は低い）では蛍光強度は著しく小さくなる。一方、ダンシル系蛍光物質が結合されてなるポリマーは、親水的環境下では蛍光が弱く、疎水性環境下では蛍光強度は著しく大きくなる。第四の発明は、蛍光性ｐＨ応答性ポリマーのこの性質を利用するものである。即ち、蛍光性ｐＨ応答性ポリマーに由来する強い蛍光が発せられるか否かで、当該ポリマーが存在する水系環境のｐＨを特定するものである。
【００８５】
蛍光性ｐＨ応答性ポリマーは、それぞれ特有の溶解性に著しい変化が生じる（すなわち相転移）ｐＨを有するので、測定したいｐＨに応じて、適する蛍光性ｐＨ応答性ポリマーを選択し、又は設計する。
【００８６】
また、蛍光性ｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質は、それぞれ特有の励起波長及び蛍光波長を有するので、当該蛍光物質に応じた波長で、励起エネルギーを与える。
【００８７】
第五の発明について説明する。第五の発明では、第一の発明のポリマー中、ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部が光学異性体を有するアミノ酸誘導体である蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーを使用する。第五の発明では、測定対象を含有するか又は含有することが予想される水系溶媒（ｘ）中において、及び、測定対象を含有しない水系溶媒（ｙ）中で、上記ポリマーに由来する蛍光を温度及び／又はｐＨを変化させながらを測定し、水系溶媒（ｘ）での測定結果を水系溶媒（ｙ）での測定結果を比較することにより、水系溶媒（ｘ）中における測定対象の三次元高次構造、又は、水系溶媒（ｘ）中に測定対象が存在するか否かを判定する。
【００８８】
ここで、「測定対象」とは、例えば、生体中に存在する蛋白質（プロテインＡ、Ｇ蛋白質等）、オリゴ−又はポリペプチド（アンギオテンシン、バソプレッシン等）、多糖類（Ｎ−アセチルグルコサミン等）、及び各種アミノ酸、ホルモン様物質、ステロイド類等の低分子生理活性物質等をいう。ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部が光学異性体を有するアミノ酸誘導体である蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーは、「測定対象」と共存することにより、そのポリマーの温度応答挙動及び／又はｐＨ応答挙動に変化が生じ得る。そのような変化の有無に基づき、特定の「測定対象」が存在するか否か、あるいは、特定の「測定対象」がどのような三次元高次構造を取っているかを判定する。
【００８９】
ここで、「測定対象」のモデル化合物としてＬ−プロリン重合体を用い、また、本発明のポリマーとして、その主鎖の構成モノマーとして光学活性を有するプロリンを含む蛍光性温度応答性ポリマー（Ｌ−プロリンのみを含むものとＤ−プロリンのみを含むもの）を使用して、測定対象が共存するか否かにより、本発明の蛍光性温度応答性ポリマーの温度と蛍光強度との関係が影響を受けるか否かを測定した実験（実施例９）について言及する。
【００９０】
例えば図４９に示すように、主鎖構成モノマーがＬ−プロリンを含有するモノマーであるポリマー単独（試料（ａ））での温度と蛍光強度との関係（Ｉ）を、Ｌ−プロリン重合体が共存する（試料（ｂ））場合の温度と蛍光強度との関係（ＩＩ）と比較すると、異なる傾向が示されていることがわかる。一方、図５０に示すように、主鎖構成モノマーがＤ−プロリンを含有するモノマーであるポリマー単独（試料（ｃ））での温度と蛍光強度との関係（Ｉ）を、Ｌ−プロイン重合体が共存する（試料（ｄ））場合の温度と蛍光強度との関係（ＩＩ）と比較すると、ほぼ同様の傾向が示されていることがわかる。このような相違に基づき、ある試料中に、あるいは例えば生体内のある個所に、「測定対象」が存在するか否か、また、存在する場合、その「測定対象」の三次元高次構造はどのようであるかを判定することができるのである。
【００９１】
この実験では、「測定対象」のモデル化合物としてＬ−プロリン重合体を使用した。ここで、Ｌ−プロリン重合体とＤ−プロリン重合体とは、三次元高次構造が異なっていることが知られている。従って、上記実験は、「測定対象」をプロリン重合体とする場合には、その三次元高次構造（より具体的にはＬ−プロリン重合体であるかＤ−プロリン重合体でるか）を判定することになる。ここでは、「測定対象」のモデル化合物としてＬ−プロリン単独重合体を使用したが、たとえばポリヌクレオチド中のプロリンがＬ体であるかＤ体であるかの相違により、ポリヌクレオチド自体の三次元高次構造が異なるものとなる場合もあり、そのような場合には、本発明の方法により、ポリヌクレオチド（測定対象）の三次元高次構造を判定することができるのである。
【００９２】
第六の発明は、蛍光プローブに関する。この蛍光プローブは、第一の発明のポリマー中、その少なくとも片末端には蛍光物質が結合されていないポリマーと、蛋白質、リン脂質、低分子生理活性及び担体からなる群から選択されるいずれかが結合されてなる。このような蛍光プローブは、例えば図３１に示すように、第一の発明のポリマーの片末端にあるカルボキシル基に、アミノ基含有イムノグロブリンのアミノ基を反応させてアミド結合を生じさせることにより、製造することができる。また、図５１に示すように、第一の発明のポリマーの片末端にあるカルボキシル基に、アミノ基含有リン脂質のアミノ基反応させてアミド結合を生じさせることにより、製造することができる。
【００９３】
先に述べたように、第一の発明のポリマーの中、その末端がカルボキシル基となっているものは、このカルボキシル基に何らかの化合物を反応させることができる。その一例を、図３１に基づいて説明する。この例では、Ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｏ−ａｃｒｙｌａｔｅ）に、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中においてアミノ基が導入されてなるイムノグロブリンを反応させることにより、イムノグロブリン接合Ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｏ−ａｃｒｙｌａｔｅ）が得られる。また、図５１に示された例では、Ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｏ−ａｃｒｙｌａｔｅ）を活性エステルに変換し、その活性エステル化体を、１，４−ジオキサン中でアミノ基が導入されてなるリン脂質と反応させている。
【００９４】
このような蛍光プローブは、例えば、このプローブを構成する蛋白質やリン脂質、あるいは低分子生理活性物質と親和性のある環境に移動して留まるため、バイオイメージングに利用することができる。また、担体を有する本発明の蛍光プローブの近傍には、そのポリマー部分に親和性を有する物質が留まり、その結果、蛍光プローブの温度又はｐＨ応答性の挙動に変化が生じ得るので、その変化に基づき、蛍光プローブの近傍に留まった物質が何であるか、又はどのような三次元高次構造を取っているか等を、判定することができる。
【００９５】
以下に、実施例により、本発明を具体的に説明する。
【実施例】
【００９６】
実施例１：蛍光分子温度センサーの作製
（１）試薬
N−イソプロピルアクリルアミド（M.W.=113.16）
メタクリル酸ブチル（M.W.=142.2）
２，２´−アゾビスイソブチロニトリル（M.W.=164.21）
３−メルカプトプロピオン酸（M.W.=106.15）
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、脱水（M.W.=73.09）
フルオレセイン  ｏ−アクリレート（M.W.=386.35）
４−アミノフルオレセイン
液体窒素
アセトン，脱水（M.W.=58.08）
ジエチルエーテル（M.W.=74.12）
１，４−ジオキサン，脱水（M.W.=88.11）
酢酸エチル，脱水（M.W.=88.11）
Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（M.W.=206.33）
Ｎ−ヒドロキシスクシイミド（M.W.=115.09）
HPLC用メタノール（M.W.=32.04）
Ekicrodisc（登録商標）13 CR（0.45μm PTFE）（Gelman Japan）
PTFEメンブランフィルター（PTFE, 3.0 μm, 90 mm）（ADVANTEC）
透析膜（Spectra/Por（登録商標）Biotech Regenerated Cellulose Dialysis Membranes MWCO:3,500）（Spectrum Laboratories） 
HPLC用N,N−ジメチルホルムアミド（M.W.=73.09）
塩化リチウム（M.W.=42.39）
【００９７】
（２）ポリマーの合成
（２−１）ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の合成
精製Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２５．０ｇとラジカル開始剤の２，２´−アゾビスイソブチロニトリル０．１４５ｇ、連鎖移動剤の３−メルカプトプロピオン酸０．６５６ｇを用い、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０ｍＬ中でのラジカル重合により、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を得た（図１参照）。
【００９８】
具体的には、次のようにして合成した。上記の原料及び溶媒を重合管に入れ、三方活栓を取り付け輪ゴムで固定した。そして、コックを閉じた状態で重合管を液体窒素中に入れ完全に凍結させ、次にコックを開いて真空ポンプを用いて脱気した。次に再びコックを閉じて重合管をメタノール中に入れ管内の試料を完全に溶解させた。この操作を３回繰り返した（凍結融解脱気法）。このように、充分脱気された試料で減圧状態になっている重合管を、室温に放置し、その後、７０℃の振とう恒温槽に入れ、５時間ラジカル重合反応を行わせた。このようにして、片末端にカルボキシル基をもつポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）を合成した。反応後、重合管が室温になるまで放置し、溶媒（ＤＭＦ）を４０℃で減圧蒸留して濃縮し、残留物を氷冷したジエチルエーテルに滴下し、沈殿物としてポリマーを得た。得られたポリマーをＰＴＦＥメンブランフィルター濾取し、常温でデシケーター中で一晩減圧乾燥を行った。その乾燥物をアセトンに溶解させ、再び氷冷したジエチルエーテルに滴下して精製した。この操作をさらに２回繰り返し行った（再沈精製法）。
【００９９】
（２−２）（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の合成
精製Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２５．０ｇとラジカル開始剤の２，２´−アゾビスイソブチロニトリル０．１４５ｇ、連鎖移動剤の３−メルカプトプロピオン酸０．６５６ｇ、蛍光物質であるフルオレセイン  ｏ−アクリレート０．０８５ｇを用い、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０ｍＬ中でのラジカル重合により蛍光性温度応答性ポリマーである（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体を得た（図２参照）。N−イソプロピルアクリルアミド：Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレートは、１０：１（モル比）であった。
【０１００】
具体的には、次のようにして合成した。上記の原料及び溶媒を重合管に入れ、ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）の合成と同様の操作を行い、片末端にカルボキシル基をもつ蛍光性温度応答性ポリマーを合成した。
【０１０１】
（２−３）４−アミノフルオレセイン接合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の合成
（２−１）で合成したポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）をスクシニル化した後、蛍光物質である４−アミノフルオレセイン（励起波長：４９０ｎｍ；蛍光波長：５１５ｎｍ）にスクシニル化ポリマーを結合させ、片末端に蛍光分子を持つ蛍光性温度応答性ポリマーである ４−アミノフルオレセイン接合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド） を得た（図１参照）。
【０１０２】
具体的には、次のようにして合成した。モル比が、ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド：Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド＝１：２．５：２．５となるように、これらの原料を秤量した。ナス型コルベンにポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）と酢酸エチルを入れて溶解させた後、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドを加えて溶解させた。次に４℃の氷冷中で２時間攪拌し、２５℃の恒温槽で一晩攪拌した。溶液をろ過し、副生成物であるジシクロヘキシル尿素を取り除き、ろ液を氷冷したジエチルエーテルに滴下して精製し、生成物をろ取・減圧乾燥してスクシニル化ポリマーを得た。
【０１０３】
次に、このスクシニル化ポリマーをアミノプロピルシリカゲルに修飾する要領で、蛍光物質を修飾させた。具体的には、スクシニル化ポリマーを１，４−ジオキサンに溶解させ、４−アミノフルオレセインを加えて２５℃の恒温槽で一晩振とうさせた。未結合の蛍光物質を取り除くため、１，４−ジオキサンを蒸発させ、乾固した試料を水に溶解させて５（w/v）%の水溶液に調製した。この溶液を生成セルロース透析膜に入れ、メタノール中で４８時間透析を行った。透析後の溶液中の溶媒を蒸発させ、乾固した試料（４−アミノフルオレセイン接合ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）を回収し、−８０℃で保存した。
【０１０４】
（３）分子量の測定
合成したポリマーの分子量は、ＧＰＣ測定器によって決定した。検量線はポリスチレン標準液を用いることで得た。移動相には１００ｍＭＬｉＣｌ−ＤＭＦ溶液を使用し、サンプルは５ｍｇ／ｍＬ濃度にそれぞれ調製し、有機系０．４５μｍのフィルターに通して試料溶液とした。各ポリマーの平均分子量（Mw）と平均分子数（Mn）を、表１に示す。
【０１０５】
【表１】
2009236906.tif 000003
【０１０６】
（４）透過率の測定
合成したポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体、４−アミノフルオレセイン接合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を、それぞれ水に溶解させ、０．５（w/v）%水溶液を調製し、測定波長５００ｎｍにおいて、各温度での透過率を測定した。結果を図４に示す。図４において、黒丸がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、四角が（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体、三角が４−アミノフルオレセイン接合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である。
【０１０７】
また、透過率が５０%を示すときの温度を、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）と定義した。なお、測定装置や測定条件は、次のとおりであった。
【０１０８】
（装置）
Spectrophotometer：Ｖ−６３０（日立製）
付属品名          ：ＥＴＣ−７１７、ＰＴ−３１（日本分光製） 
（測定条件）
バンド幅          ：１．５ｎｍ
レスポンス        ：Ｍｅｄｉｕｍ
測定波長          ：５００ｎｍ
光源切換          ：３４０ｎｍ
【０１０９】
（５）蛍光強度の測定
合成した蛍光性ポリマーが蛍光分子温度センサーとしての機能を有するか否かを確認するために、温度変化と蛍光強度との関係を測定した。（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体と、４−アミノフルオレセイン接合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）のそれぞれにつき、１００ｍＭ水溶液を調製し、励起波長４９０ｎｍで励起を行い、各温度の最大蛍光強度を測定した。結果を図５に示す。また、最大蛍光波長５１５ｎｍにおける蛍光強度と温度との関係をプロットしたグラフを、図６に示す。図５及び６において、（Ａ）が（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体、（Ｂ）が４−アミノフルオレセイン接合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である。
【０１１０】
（装置）
蛍光光度計      ：Fluorescence Spectrophotometer F-3000（日立製）
循環恒温水槽    ：ＰＴ−３１（日本分光製）
（測定条件）
励起波長        ：２８０ｎｍ
スキャンスピード：６０ｎｍ／分
スリット幅      ：励起・蛍光ともに３．０ｎｍ
【０１１１】
（６）結果と考察
上記した二つの蛍光性ポリマー、即ち（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体と４−アミノフルオレセイン接合ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）は、低温側、つまり、ポリマー鎖が親水的環境下にあるときに強い蛍光を発した（図５参照）。また、図６より、水溶液中でこれらの蛍光性ポリマーの蛍光強度は、６乃至９℃の温度上昇、特に相転移を生ずる（すなわち溶解性が変化する）温度付近で、鋭く減少することが明らかとなった。この親水的環境下でのみ強い蛍光を発する蛍光性ポリマーは、温度応答性も有し、温度低下を感知可能な蛍光性温度センサーであるといえる。従って、これらのポリマーは、蛋白質や細胞内などの微小環境における親水性の増加を検出する際に有効であると考えられた。図６から明らかなように、上記した二つの蛍光性ポリマーは、２８乃至３６℃の温度に適応するものであるが、この温度幅は、ポリマーを合成する際に疎水性モノマーあるいは親水性モノマーを共重合させることで自由に温度設定可能であるため、所望の特有の温度幅をもつ蛍光分子温度計を作製することが可能であると考えられる。
【０１１２】
実施例２：  蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によるタンパク質凝集過程の可視化
蛍光プローブとして、実施例１で合成した（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体を、また、モデルタンパク質として牛血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」ということがある）を用いて、蛍光共鳴エネルギー移動によるタンパク質凝集過程の可視化を試みた。
【０１１３】
（１）実験条件
（１−１）試薬
牛血清アルブミン（minimum 96% electrophoresis）  SIGMA製
リン酸水素二ナトリウム（M.W.=141.96）
リン酸水素二ナトリウム・12水和物（M.W.=358.14） 
リン酸（M.W.=98.00）
【０１１４】
（１−２）試料調製
（１−２−１）ＢＳＡ凝集体の調製
先ず、１６．７ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）を調製し、これに、ＢＳＡを０．１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように加えた。次いで、これを７０℃にて１２０分間加熱した。
【０１１５】
（１−２−２）蛍光スペクトル測定用試料の調製
ＢＳＡ及びＢＳＡ凝集体（以下、「ＢＳＡ−ａｇｇ」と略すことがある）は、その濃度が１２０μｇ／ｍＬとなるように、１６．７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）に加えた。（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体は、その濃度が１００μＭとなるように、１６．７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）に加えた。
【０１１６】
このようにして、ＢＳＡ試料、ＢＳＡ−ａｇｇ試料、蛍光性ポリマー試料を調製した。また、ＢＳＡ試料と蛍光性ポリマー試料との１：１（容量）混合物と、ＢＳＡ−ａｇｇ試料と蛍光性ポリマー試料との１：１（容量）混合物も調製した。
【０１１７】
（１−３）蛍光スペクトル測定条件
（装置）
蛍光光度計      ：Fluorescence Spectrophotometer F-3000（HITACHI）
循環恒温水槽    ：ＰＴ−３１（日本分光）
（測定条件）
励起波長        ：２８０ｎｍ
スキャンスピード：６０ｎｍ／分
スリット幅      ：励起・蛍光ともに３．０ｎｍ
【０１１８】
（２）結果と考察
図７に示す蛍光スペクトルから明らかなように、蛍光性ポリマー溶液中にＢＳＡを共存させたところ、ＢＳＡと蛍光性ポリマー中の蛍光物質との間でＦＲＥＴが生じ、蛍光性ポリマー中の蛍光物質に由来する蛍光の強度の増加が認められた（図７中の矢印Ｂを参照のこと）。即ち、ドナーであるＢＳＡ中の蛍光成分（トリプトファン等）が放出する光がアクセプターである蛍光性ポリマー中の蛍光物質を励起したため、ドナーの蛍光強度が減少し（図７中の矢印Ａを参照のこと）、アクセプターの蛍光強度が増加した。また、図８に示す蛍光スペクトルから明らかなように、ＢＳＡが凝集してＢＳＡ−ａｇｇになると、自然発光（図８中の矢印Ａ）とＦＲＥＴ蛍光（蛍光性ポリマーが共存する場合；図８中の矢印Ｂ）のいずれにおいても、強度の低下が認められた。
【０１１９】
多くの蛋白質が示す自然発光（蛍光）の強度が凝集や変性によって変化するのは、蛋白質の高次構造が壊れることでアミノ酸の周辺環境（疎水性、ｐＨなど）が変化するためであると考えられている。この実験結果より、ＢＳＡが変性すると、蛍光性ポリマー中の蛍光物質と相互作用をし難い構造となり、ＦＲＥＴが生じ難くなったことが示唆された。この時、自然蛍光強度の減少量（図８中の矢印Ａ）と、ＦＲＥＴ蛍光強度の減少量（図８中の矢印Ｂ）の比（Ｂ／Ａ）を算出すると、約１．３の値であった。つまり、ＦＲＥＴ現象を利用することで、自然蛍光測定よりも増幅して、ＢＳＡの変化を検出できることが示された。
【０１２０】
その変化を測定しようとする対象物質（蛋白質等）とＦＲＥＴが生じ易くなるように、蛍光性温度応答性ポリマーの分子設計を行う（具体的には、合成に際して使用するコモノマーの種類及び量を検討する）ことで、ＦＲＥＴ蛍光のより増幅度が大きい新たな機能性蛍光プローブの開発が可能である。そして、ＦＲＥＴ現象を利用して、蛋白質等と他の分子との相互作用を可視化することが可能である。これにより、蛋白質等のより本質的な生理現象の理解に必要な情報が得られるようになる可能性がある。
【０１２１】
実施例３：  （Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体［Poly(NIPAAm-co-fluorescein o-acrylate)の合成と、物性等の評価
（１）使用した試薬
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）：  興人から恵与されたものをｎ−ヘキサンで再結晶したもの
２，２´−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）：  和光純薬工業製
３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）：  和光純薬工業製
フルオレセイン  ｏ−アクリレート：  SIGMA-ALDRICH製
その他の試薬及び溶媒：  市販特級以上のもの
Ｈ２Ｏ：  Mill-Q water purification systemから精製したもの
【０１２２】
（２）測定装置及び方法
（２−１）１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定
テトラメチルシランを内部標準物質とし、Ｊｏｅｌ  ＪＮＭ―ＥＣＰ６００核磁気共鳴装置（６００ＭＨｚ）を用いて測定した。
【０１２３】
（２−２）透過率の測定
紫外可視近赤外分光光度計（Ｖ−６３０、ＪＡＳＣＯ製、日本）に、ＥＴＣ−７１７型水冷ペルチェ式恒温セルホルダ（ＪＡＳＣＯ製）及び電動式ペルチェ温度自動調節機（ＰＴ３１、KR&Uuml;SS製、ドイツ）を装着したものを使用した。
【０１２４】
（２−３）蛍光強度及び蛍光スペクトルの測定
蛍光光度計Ｉ（Fluorescence Spectrophotometer F-3000、日立製）に電動式ペルチェ温度自動調節機（ＰＴ３１、KR&Uuml;SS製、ドイツ）を装着したもの、又は、蛍光光度計ＩＩ (Spectrofluorometer FP-6300、ＪＡＳＣＯ製) にＥＴＣ−２７３Ｔ型水冷ペルチェ式恒温セルホルダ（ＪＡＳＣＯ製、日本）及び電動式ペルチェ温度自動調節機（ＰＴ３１、KR&Uuml;SS製、ドイツ）を装着したものを使用した。
【０１２５】
（３）（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の合成
重合管に、精製Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２５．０ｇ（２２１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５０ｍＬ）、フルオレセイン  ｏ−アクリレート８５ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ１４５ｍｇ（０．８８ｍｍｏｌ）及びＭＰＡ６５６ｍｇ（６．１８ｍｍｏｌ）を順次添加し、真空下で凍結融解を行った（−１９６℃）。重合管を室温に戻した後、７０℃で５時間、重合反応に付した。反応停止後、反応溶液を氷冷ジエチルエーテル２Ｌに滴下し、再沈精製を行い、粗生成物を得た。この粗生成物をアセトンに溶解し、ジエチルエーテルで再沈精製を行った。この操作を３回繰り返し、目的ポリマーである（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体（１６．２ｇ、２．４８ｍｍｏｌ）を得た。この反応式は、図２を参照されたい。
【０１２６】
（４）（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の 物性評価
（４―１）数平均分子量（Ｍｎ）の測定
数平均分子量（Ｍｎ）の測定数平均分子量（Ｍｎ）は、末端滴定法により算出した。具体的には、次のようにしてＭｎを求めた。
【０１２７】
ポリマー５０ｍｇを正確に秤量し、水（Ｈ２Ｏ）２０ｍＬに溶かし、得られた溶液を氷冷した。この溶液を滴定試料として用いた。指示薬としてフェノールフタレインを１滴滴下し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ濃度の水酸化ナトリウム水溶液で滴定を行った。Ｍｎは、以下の式から算出した。
【０１２８】
Ｍｎ＝Ｇ／Ｎ・Ｆ・Ｖ
ここで、Ｇはポリマー重量（ｇ）であり、Ｎは水酸化ナトリウム水溶液のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、ｆは水酸化ナトリウム水溶液のファクター値であり、Ｖは滴定に要した水酸化ナトリウム水溶液の量（Ｌ）である。
（３）で合成したポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、６，５３３であった。
【０１２９】
（４−２）下限臨界溶解温度（Lower Critical Solution Temperature：LCST）の測定
下限臨界溶解温度は、ポリマー水溶液の透過率測定（測定波長：５００ｎｍ）により算出した。具体的には、次のようにしてＬＣＳＴを求めた。
【０１３０】
５ｍｇ／ｍＬ濃度のポリマー水溶液を調製した。これを、０．１℃／分の温度勾配で昇温させつつ透過率を測定し、透過率が５０％となる温度をＬＣＳＴとした。
【０１３１】
温度と透過率との関係を示すグラフを図９に示す。図９から明らかなように、（３）で合成したポリマーのＬＣＳＴは、３０．５℃であった。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド単独重合体のＬＣＳＴは３２℃であり、疎水性官能基の導入により、ＬＣＳＴが若干低下した。
【０１３２】
（４−３）蛍光強度の測定
温度と蛍光強度との関係は、５ｍｇ／ｍＬ濃度のポリマー水溶液を、０．１℃／分の温度勾配で昇温させつつ蛍光強度を測定して求めた。なお、蛍光強度は、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ、スリット幅は励起、蛍光のいずれも３．０ｎｍにて測定を行った。
【０１３３】
温度と蛍光強度との関係を示すグラフを図１０に示す。図１０から明らかなように、（３）で合成したポリマーの水溶液は、ＬＣＳＴ付近で蛍光強度が大きく変化した。また、２５℃及び３５℃における蛍光を、図１１に示す。フルオレセインは親水性環境下で強い蛍光を発することから、ＬＣＳＴ以下の温度である２５℃（左側）（親水性環境下）では強い蛍光が発せられたが、ＬＣＳＴ超の温度である３５℃（右側）（疎水性環境下）では、蛍光強度が小さかった。
【０１３４】
（４−４）蛍光スペクトルの測定
蛍光スペクトルは、５ｍｇ／ｍＬ濃度（０．５％）のポリマー水溶液、０．０５％濃度のポリマーのクエン酸緩衝液溶液（ｐＨ４．０）、０．０５％濃度のポリマーのリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）及び０．０５％濃度のポリマーのホウ酸緩衝液溶液（ｐＨ９．０）について、測定した。
【０１３５】
各ポリマー溶液について、先ず２５℃にて、励起波長４９０ｎｍ、スリット幅は励起、蛍光のいずれも５．０ｎｍ、スキャンスピードは６０ｎｍ／分で測定を行った。次いで、ポリマー溶液の温度を１℃上昇させて、同様の測定を行った。これを３６℃まで行った。
【０１３６】
結果を図１２乃至図１５に示す。いずれの図においても、最も蛍光強度が大きいスペクトルは、２５℃で測定したものであり、最も蛍光強度が小さいスペクトルは、３６℃で測定したものである。また、各温度におけるｐＨと蛍光強度との関係を図１６に示す。
【０１３７】
フルオレセインのｐＫａは６．４であり、ｐＨ５乃至９の範囲でｐＨ依存性の吸収と蛍光放出を起こす。以下に示すように、フルオレセインは、低ｐＨ（図１３；ｐＨ４．０）では環状構造をとるが、高ｐＨ（図１５；ｐＨ９．０）では開環構造をとる。後者では、分子構造が同一平面にあり、 全てが共鳴している状態になる。このため、励起状態から基底状態へ戻るとき、分子の回転構造などによってエネルギーが逃げることがなく、よって、前者よりも強い蛍光を発するのである。
【０１３８】
【化１】
2009236906.tif 000004
【０１３９】
（４−５）フルオレセイン  ０−アクリレート導入量の測定
フルオレセイン  ０−アクリレート導入量は、１Ｈ−ＮＭＲにより算出した。（３）で合成したポリマーの重クロロホルム溶液を調製し、それを１Ｈ−ＮＭＲに付した。
【０１４０】
結果を図１７及び図１８に示す。これらの図（チャート）において、７．７ｐｐｍのシングレットのピークは、フルオレセイン  ０−アクリレートの芳香族プロトン（２Ｈ）に由来し、４．０ｐｐｍのシングレットのピークは、ＮＩＰＡＡｍのＣ２位のメチンプロトン（１Ｈ）に由来することから、それぞれの積分値をもとに、フルオレセイン  ０−アクリレート導入量を算出した。フルオレセイン  ０−アクリレート導入量は、０．０８質量％であった。
【０１４１】
実施例４：  （Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／ダンシル  アミノエチルアクリルアミド）共重合体［Poly(NIPAAm-co-dansyl aminoethylacrylamide)］の合成と、物性等の評価
（１）使用した試薬
実施例３（１）と同様である。なお、塩化ダンシルは、東京化成工業製を使用した。
【０１４２】
（２）測定装置及び方法
実施例３（２）と同様である。
【０１４３】
（３）（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／ダンシル  アミノエチルアクリルアミド）共重合体の合成
反応式は、図１９に示すとおりである。
【０１４４】
（３−１）ダンシルエチレンジアミンの合成
氷冷下、塩化ダンシル（dansylchloride）４００ｍｇ（１．４８ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（CH2Cl2）溶液（１２ｍＬ）に、１，２−エチレンジアミン８９０ｍｇ（１４．８ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を５分間攪拌した後、室温に戻して１時間攪拌し、反応させた。得られた反応溶液を、２Ｍ塩酸を用いて酸性にし、次いで塩化メチレン２０ｍＬで２回抽出した。水相に５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加してアルカリ性にした後、塩化メチレン２０ｍＬで２回抽出した。次いで、有機相（塩化メチレン溶液）を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、 溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［移動層：クロロホルム−メタノール（10：1, v/v）］で精製し、目的のダンシルエチレンジアミン（２４０．８ｍｇ、０．８１８ｍｍｏｌ）を得た。
【０１４５】
（３−２）ダンシルアミノエチルアクリルアミドの合成
氷冷下、ダンシルエチレンジアミン（２４０．８ｍｇ、０．８１８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（３０ｍＬ）に、アクリロイルクロリド７９μL（０．９８２ｍｍｏｌ）を加え、さらにトリエチルアミン１３６μＬ（０．９８２ｍｍｏｌ）を滴下した。反応終了を確認した後、溶媒を留去し、残渣に塩化メチレン及び水を加えて分液抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー［移動相：ジエチルエーテル−塩化メチレン（1：4, v/v）］で精製し、目的のダンシルアミノエチルアクリルアミド（１６４ｍｇ、０．４７２ｍｍｏｌ）を得た。
【０１４６】
（３−３）（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／ダンシルアミノエチルアクリルアミド）共重合体の合成
重合管に、精製Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１０．０ｇ（８８．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）に、ダンシルアミノエチルアクリルアミド３０．８ｍｇ（０．０８８ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ５８ｍｇ（０．３５３ｍｍｏｌ）及びＭＰＡ２６３ｍｇ（２．４８ｍｍｏｌ）を順次添加し、真空下で凍結融解を行った（−１９６℃）。重合管を室温に戻した後、７０℃で５時間、重合反応に付した。反応停止後、反応溶液を氷冷ジエチルエーテルに滴下し、再沈精製を行い、粗生成物を得た。この粗生成物をアセトンに溶解し、ジエチルエーテルで再沈精製を行った。この操作を３回繰り返し、目的ポリマーである（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／ダンシルアミノエチルアクリルアミド）共重合体（７．００ｇ、１．１１ｍｍｏｌ）を得た。
【０１４７】
（４）（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／ダンシルアミノエチルアクリルアミド）共重合体の物性評価
（４―１）数平均分子量（Ｍｎ）の測定
実施例３（４−１）と同様の方法で、数平均分子量を求めた。（３）で合成したポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、６，３３５であった。
【０１４８】
（４−２）下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）の測定
実施例３（４−２）と同様の方法で、ＬＣＳＴを求めた。温度と透過率との関係を示すグラフを図２０に示す。図２０から明らかなように（３）で合成したポリマーのＬＣＳＴは、３１．１℃であった。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド単独重合体のＬＣＳＴは３２℃であり、疎水性度の高いジメチルナフタレン・ユニットの導入により、ＬＣＳＴが若干低下した。
【０１４９】
（４−３）蛍光強度の測定
温度と蛍光強度との関係は、５ｍｇ／ｍＬ濃度のポリマー水溶液を、０．１℃／分の温度勾配で昇温させつつ蛍光強度を測定して求めた。なお、蛍光強度は、励起波長３３５ｎｍ、蛍光波長５２６ｎｍ、スリット幅は励起、蛍光のいずれも３．０ｎｍにて測定を行った。
【０１５０】
温度と蛍光強度との関係を示すグラフを図２１に示す。図２１から明らかなように、（３）で合成したポリマーの水溶液の蛍光強度には、ＬＣＳＴ付近で変曲点が見られた。ＬＣＳＴ以下の温度（親水性環境下）での蛍光強度は、ＬＣＳＴ以上の温度における蛍光強度と比較して小さい傾向にあった。また、ＬＣＳＴ以上の温度では、蛍光強度は一旦下降した後、再び上昇した。塩化ダンシル自体が疎水性環境下で強い蛍光を発することから、ＬＣＳＴ以下の温度 (親水性環境下) では蛍光強度は弱く、ＬＣＳＴ以上（疎水性環境下）では蛍光強度が強くなった。
【０１５１】
また、２５℃及び３５℃における蛍光を、図２２に示す。ダンシルアミノエチルアクリルアミドは疎水性環境下で強い蛍光を発することから、ＬＣＳＴ以下の温度（親水性環境下）では蛍光が弱いが、ＬＣＳＴを超える（疎水性環境下）と、蛍光強度が大きくなった。なお、さらに温度を上昇させると、極大蛍光波長は低波長領域へとシフトする。
【０１５２】
（４−４）蛍光スペクトルの測定
蛍光スペクトルは、５ｍｇ／ｍＬ濃度（０．５％）のポリマー水溶液について、測定した。先ず２５℃にて、励起波長３３５ｎｍ、スリット幅は励起、蛍光のいずれも５．０ｎｍ、スキャンスピードは６０ｎｍ／分で測定を行った。次いで、ポリマー溶液の温度を１℃上昇させて、同様の測定を行った。これを３６℃まで行った。
【０１５３】
結果を図２３に示す。最も蛍光強度が大きいスペクトルは、３６℃で測定したものであり、最も蛍光強度が小さいスペクトルは、２５℃で測定したものである。
【０１５４】
（４−５）ダンシルアミノエチルアクリルアミド導入量の測定
ダンシルアミノエチルアクリルアミド導入量は、１Ｈ−ＮＭＲにより算出した。（３）で合成したポリマーの重クロロホルム溶液を調製し、それを１Ｈ−ＮＭＲに付した。
【０１５５】
結果を図２４に示す。この図（チャート）において、３．９７ｐｐｍのシングレットのピークは、Ｎ−イソプロピルアミノ基のメチルプロトン（１Ｈ）に由来し、１．１２ｐｐｍのシングレットのピークは、Ｎ−イソプロピルアミノ基のメチル基の水素（６Ｈ）に由来する。
【０１５６】
実施例５：  （Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／７−（４−トリフルオロメチル）クマリン  アクリルアミド）共重合体［Poly(NIPAAm-co-7-(4-trifluoromethyl)coumarin  acrylamide)］の合成と、物性等の評価
（１）使用した試薬
実施例３（１）と同様である。なお、７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミドは、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製を使用した。
【０１５７】
（２）測定装置及び方法
実施例３（２）と同様である。
【０１５８】
（３）（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミド）共重合体の合成
反応式は、図２５に示すとおりである。
【０１５９】
重合管に、精製Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２５．０ｇ（２２１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５０ｍＬ）、７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミド６２．６ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ１４５ｍｇ（０．８８ｍｍｏｌ）及びＭＰＡ６５６ｍｇ（６．１８ｍｍｏｌ）を順次添加し、真空下で凍結融解を行った（−１９６℃）。重合管を室温に戻した後、７０℃で５時間、重合反応に付した。反応停止後、反応溶液を氷冷ジエチルエーテルに滴下し、再沈精製を行い、粗生成物を得た。この粗生成物をアセトンに溶解し、ジエチルエーテルで再沈精製を行った。この操作を３回繰り返し、目的ポリマーである（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミド）共重合体（１８．８ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）を得た。
【０１６０】
（４）（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミド）共重合体の物性評価
（４―１）数平均分子量（Ｍｎ）の測定
実施例３（４−１）と同様の方法で、数平均分子量を求めた。（３）で合成したポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、５，５３５であった。
【０１６１】
（４−２）下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）の測定
実施例３（４−２）と同様の方法で、ＬＣＳＴを求めた。温度と透過率との関係を示すグラフを図２６に示す。図２６から明らかなように（３）で合成したポリマーのＬＣＳＴは、３１．４℃であった。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド単独重合体のＬＣＳＴは３２℃であり、疎水性官能基の導入により、ＬＣＳＴが若干低下した。
【０１６２】
（４−３）蛍光強度の測定
温度と蛍光強度との関係は、５ｍｇ／ｍＬ濃度のポリマー水溶液を、０．１℃／分の温度勾配で昇温させつつ蛍光強度を測定して求めた。なお、蛍光強度は、励起波長３７６ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ、スリット幅は励起、蛍光のいずれも３．０ｎｍにて測定を行った。
【０１６３】
温度と蛍光強度との関係を示すグラフを図２７に示す。図２７から明らかなように、（３）で合成したポリマーの水溶液は、ＬＣＳＴ付近で蛍光強度が大きく変化した。また、２５℃及び３５℃における蛍光を、図２８に示す。クマリンは、フルオレセイン同様、親水性環境下で強い蛍光を発することから、ＬＣＳＴ以下の温度である２５℃（左側）（親水性環境下）では強い蛍光が発せられたが、ＬＣＳＴ超の温度である３５℃（右側）（疎水性環境下）では、蛍光強度が小さかった。
【０１６４】
（４−４）蛍光スペクトルの測定
蛍光スペクトルは、５ｍｇ／ｍＬ濃度（０．５％）のポリマー水溶液について、測定した。先ず２５℃にて、励起波長３７６ｎｍ、スリット幅は励起、蛍光のいずれも２．５ｎｍ、スキャンスピードは１００ｎｍ／分で測定を行った。次いで、ポリマー溶液の温度を１℃上昇させて、同様の測定を行った。これを３６℃まで行った。
【０１６５】
結果を図２９に示す。最も蛍光強度が大きいスペクトルは、２５℃で測定したものであり、最も蛍光強度が小さいスペクトルは、３６℃で測定したものである。
【０１６６】
（４−５）７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミド導入量の測定
７−（４−トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミド導入量は、１Ｈ−ＮＭＲにより算出した。（３）で合成したポリマーの重クロロホルム溶液を調製し、それを１Ｈ−ＮＭＲに付した。
【０１６７】
結果を図３０に示す。この図（チャート）において、３．９９ｐｐｍのシングレットのピークは、Ｎ−イソプロピルアミノ基のメチルプロトン（１Ｈ）に由来し、１．１２ｐｐｍのシングレットのピークは、Ｎ−イソプロピルアミノ基のメチル基の水素（６Ｈ）に由来する。
【０１６８】
実施例６：  イムノグロブリンＧ接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体［Poly(NIPAAm-co-fluorescein o-acrylate) conjugated IgG］の合成と、物性等の評価
（１）使用した試薬
実施例３（１）と同様である。イムノグロブリンＧは、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製を使用した。
【０１６９】
（２）測定装置及び方法
実施例３（２）と同様である。なお、吸収スペクトルの測定は、紫外可視近赤外分光光度計（Ｖ−６３０、ＪＡＳＣＯ製、日本）に、ＥＴＣ−７１７型水冷ペルチェ式恒温セルホルダ（ＪＡＳＣＯ製）及び電動式ペルチェ温度自動調節機（ＰＴ３１、KR&Uuml;SS製、ドイツ）を装着したものを使用した。
【０１７０】
（３）イムノグロブリンＧ接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の合成
反応式は、図３１に示すとおりである。
【０１７１】
ＩｇＧ５０ｍｇを溶解したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）７ｍＬに、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体２１６ｍｇのＤＭＦ溶液（６２０ｍＬ）を、３０分毎に５回に分けて添加した。得られた混合物を、４℃にて１時間撹拌した。次いで、４℃にて２４時間、反応液を透析した。このようにして、分子量が２０，０００以下の物質を除去した。その後、ゲルろ過を行い、得られたイムノグロブリンＧ接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体を精製した。
【０１７２】
（４）イムノグロブリンＧ接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の物性評価
（４−１）下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）の測定
ＬＣＳＴは、５ｍｇ／ｍＬ濃度のポリマー水溶液の代わりに、５ｍｇ／ｍＬ濃度のポリマーのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液を使用したこと以外は、実施例３（４−２）と同様の方法で求めた。
【０１７３】
温度と透過率との関係を示すグラフを図３２に示す。図３２から明らかなように（３）で合成したポリマーのＬＣＳＴは、２９．０℃であった。このように、ＩｇＧ接合前（３０．５℃）と比べて、ＬＣＳＴは若干低下した。
【０１７４】
（４−２）蛍光強度の測定
温度と蛍光強度との関係は、５ｍｇ／ｍＬ濃度のポリマー水溶液を、０．１℃／分の温度勾配で昇温させつつ蛍光強度を測定して求めた。なお、蛍光強度は、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ、スリット幅は励起、蛍光のいずれも３．０ｎｍにて測定を行った。
【０１７５】
温度と蛍光強度との関係を示すグラフを図３３に示す。図３３から明らかなように、（３）で合成したポリマーの水溶液は、ＬＣＳＴ付近で蛍光強度が大きく変化した。
【０１７６】
（４−３）ＩｇＧ接合の確認
（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体に確かにＩｇＧが接合していることを確認するため、紫外可視近赤外分光光度計（日立スペクトロフォトメータＵ−３０００）にて、イムノグロブリンＧ接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体、イムノグロブリンＧ及び（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の吸収スペクトルを測定した。
【０１７７】
結果を図３４乃至図３６に示す。イムノグロブリンＧ接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の吸収スペクトル（図３４）には、イムノグロブリンＧに含まれるトリプトファンの吸収（２８０ｎｍ、図３５参照）と、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の吸収（４９５ｎｍ、図３６参照）が観測された。すなわち、合成されたポリマーは、イムノグロブリンＧ接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体であった。
【０１７８】
実施例７：  蛍光性プロリンポリマー［４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体；Poly(N-acryloyl-D-proline methylester) containing a 4-aminofluorescein］の合成と、物性等の評価
（１）使用した試薬
Ｄ−プロリン：  和光純薬工業製
Ｎ，Ｎ´−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）：  関東化学工業製
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）：  Ｍｅｒｃｋ製
塩化チオニル：  東京化成工業製
塩化アクリロイル（acryloyl chloride）：  東京化成工業製
４−アミノフルオレセイン：  東京化成工業製
シリカゲル（クロマトグラフィー用）：  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０（７０−２３０メッシュ）、Ｍｅｒｃｋ製
その他の試薬及び溶媒：  市販特級以上のもの
Ｈ２Ｏ：  Mill-Q water purification systemから精製したもの
【０１７９】
（２）測定装置及び方法
（２−１）１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定
テトラメチルシランを内部標準物質とし、Ｊｏｅｌ  ＪＮＭ―ＥＣＰ６００核磁気共鳴装置（６００ＭＨｚ）を用いて測定した。
【０１８０】
（２−２）円二色性（ＣＤ）スペクトルの測定
ＪＡＳＣＯ  ＣＤ−１５９５を用いて測定した。
【０１８１】
（２−３）透過率の測定
紫外可視近赤外分光光度計（Ｖ−６３０、ＪＡＳＣＯ製、日本）に、ＥＴＣ−７１７型水冷ペルチェ式恒温セルホルダ（ＪＡＳＣＯ製）及び電動式ペルチェ温度自動調節機（ＰＴ３１、KR&Uuml;SS製、ドイツ）を装着したものを使用した。
【０１８２】
（２−４）蛍光強度及び蛍光スペクトルの測定
蛍光光度計（Fluorescence Spectrophotometer F-3000、日立製）に電動式ペルチェ温度自動調節機（ＰＴ３１、KR&Uuml;SS製、ドイツ）を装着したものを使用した。
【０１８３】
（３）（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体の合成
プロリンから（Ｎ−アクリロイルプロリンメチルエステル）重合体の合成までの反応式は、図３７に示すとおりである。
【０１８４】
（３−１）Ｄ−プロリンメチルエステル塩酸塩の合成
Ｄ−プロリン９．７ｇ（８４．２ｍｍｏｌ）をメタノール１５０ｍＬに溶解させ、メタノール溶液を調製した。氷冷下、このメタノール溶液に塩化チオニル（thionyl chloride）７．５ｍＬ（１０４．４ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた溶液を攪拌した。この溶液（反応液）を室温に戻し、８時間加熱還流した。その後、溶媒を留去し、無色油状物１０．６ｇ（６４．０ｍｍｏｌ）を得た。
【０１８５】
（３−２）Ｄ−プロリンメチルエステルの合成
Ｄ−プロリンメチルエステル塩酸塩１０．６ｇ（６４．０ｍｍｏｌ）を水５０ｍＬに溶解させ、水溶液を調製した。氷冷下、この水溶液に１０％水酸化ナトリウム水溶液３０ｍＬを滴下し、溶液をｐＨ１０に調整した。得られた溶液（反応液）から、クロロホルム及び飽和炭酸ナトリウム水溶液で分液抽出した。有機相を無水炭酸ナトリウムで乾燥し、 溶媒を留去し、淡黄色油状物６．２ｇ（４８．０ｍｍｏｌ）を得た。
【０１８６】
（３−３）Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステルの合成
窒素気流下、Ｄ−プロリンメチルエステル６．２ｇ（４７．７ｍｍｏｌ）を塩化メチレン２００ｍＬに溶解させ、塩化メチレン溶液を調製した。この溶液に、塩化アクリロイル４．２ｍＬ（５２．５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン７．９ｍＬ（５７．２ｍｍｏｌ）を−２０℃にて順次滴下し、得られた溶液を攪拌した。反応終了後、反応液から水及び塩化メチレンで分液抽出した。有機相を無水炭酸ナトリウムで乾燥し、 溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２５×３．５ｃｍ  ｉ．ｄ．，  クロロホルム−アセトン（4:1, v/v））に付して、黄色油状物９．５ｇ（５１．６ｍｍｏｌ）を得た。
【０１８７】
（３−４）（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体の合成
重合管内にて、Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル９．５ｍｇ（５１．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ３０ｍＬに溶解させ、得られたＤＭＦ溶液に、ＭＰＡ１５６．１ｍｇ（１．４７ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ２３．３ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）を順次添加し、真空下で凍結融解を行った（−１９６℃）。重合管を室温に戻した後、７０℃で５時間、重合反応に付した。反応終了後、反応溶液を氷冷ジエチルエーテルに滴下し、再沈精製を行い、粗生成物を得た。この粗生成物をアセトンに溶解し、ジエチルエーテルで再沈精製を行った。このようにして、目的ポリマーである（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体（４．０ｇ）を得た。
【０１８８】
（４）（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体の物性評価
（４−１）数平均分子量（Ｍｎ）の測定
実施例３（４−１）と同様の方法で、数平均分子量を求めた。（３）で合成したポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、２，０６７であった。
【０１８９】
（４−２）下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）の測定
実施例３（４−２）と同様の方法で、ＬＣＳＴを求めた。温度と透過率との関係を示すグラフを図３８に示す。図３８から明らかなように、（３）で合成したポリマーのＬＣＳＴは、２２．０℃であった。
【０１９０】
（４−３）円二色性スペクトルの測定
図３９から明らかなように、（３）で合成したポリマー（「Ｐｏｌｙ（Ｎ−Ａ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ）と表記」では、負のコットン効果が観察された。
【０１９１】
（４−４）紫外部吸収スペクトルの測定
（３）で合成したポリマーの紫外部吸収スペクトルは、図４０に示すとおりであった。
【０１９２】
（５）４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体の合成
図４１に、（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体から４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体までの反応式を示す。なお、図４１では、Ｄ体とＬ体とを区別していない。
【０１９３】
（５−１）（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体の活性エステル化（スクシニル化）
（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体２ｇ（０．３ｍｍｏｌ）を酢酸エチル２５ｍＬに溶解させた。得られた溶液に、ＤＣＣ１７１．９ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ９５．９ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）を順次添加した。得られた溶液を４℃にて２時間撹拌し、次いで２５℃で一昼夜撹拌した。反応終了後、溶液をろ過して副生成物を除去した。ろ液を氷冷ジエチルエーテル中に滴下し、再沈精製を行い、目的のスクシニル化ポリマー（１．２ｇ）を得た。
【０１９４】
（５−２）４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体の合成
スクシニル化された（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体１．２ｇ（０．２ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解させた。得られた溶液に４−アミノフルオレセイン１７１ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を添加し、一昼夜室温で撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し、粗生成物１．５ｇを得た。粗生成物を、５ｗ／ｖ％濃度となるようにメタノールに溶解させ、再生セルロース膜 (MWCO 3500)を用い、得られた溶液を４８時間透析した。このようにして、目的化合物である４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体（０．９ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を得た。
【０１９５】
（６）４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体の物性評価
（６−１）下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）の測定
実施例３（４−２）と同様の方法で、ＬＣＳＴを求めた。温度と透過率との関係を示すグラフを図３８に示す。図３８から明らかなように、（５）で合成したポリマーのＬＣＳＴは、１７．７℃であった。この値は、蛍光分子導入前のもの（（３）で合成したもの）と比べて低下していた。
【０１９６】
（６−２）蛍光強度の測定
温度と蛍光強度との関係は、５ｍｇ／ｍＬ濃度のポリマー水溶液を、０．１℃／分の温度勾配で昇温させつつ蛍光強度を測定して求めた。なお、蛍光強度は、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ、スリット幅は励起、蛍光のいずれも５．０ｎｍにて測定を行った。
【０１９７】
温度と蛍光強度との関係を示すグラフを図４２に示す。図４２から明らかなように、（５）で合成したポリマーの水溶液は、ＬＣＳＴ付近で蛍光強度が大きく変化した。ＬＣＳＴ以下の温度では、ポリマー鎖が伸張し、親水性蛍光分子であるフルオレセインが強く応答したものと考えられる。
【０１９８】
（６−３）蛍光スペクトルの測定
蛍光スペクトルは、５ｍｇ／ｍＬ濃度（０．５％）のポリマー水溶液について、測定した。先ず１５℃にて、励起波長４９０ｎｍ、スリット幅は励起、蛍光のいずれも５．０ｎｍ、スキャンスピードは６０ｎｍ／分で測定を行った。次いで、ポリマー溶液の温度を１℃上昇させて、同様の測定を行った。これを２５℃まで行った。
【０１９９】
結果を図４３に示す。最も蛍光強度が大きいスペクトルは、１５℃で測定したものであり、最も蛍光強度が小さいスペクトルは、２５℃で測定したものである。
【０２００】
実施例８：  蛍光性プロリンポリマー［４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体；Poly(N-acryloyl-L-proline methylester) containing a 4-aminofluorescein］の合成と、物性等の評価
（１）使用した試薬
Ｌ−プロリン：  和光純薬工業製
Ｎ，Ｎ´−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）：  関東化学工業製
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）：  Ｍｅｒｃｋ製
塩化チオニル：  東京化成工業製
塩化アクリロイル（acryloyl chloride）：  東京化成工業製
４−アミノフルオレセイン：  東京化成工業製
シリカゲル（クロマトグラフィー用）：  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０（７０−２３０メッシュ）、Ｍｅｒｃｋ製
その他の試薬及び溶媒：  市販特級以上のもの
Ｈ２Ｏ：  Mill-Q water purification systemから精製したもの
【０２０１】
（２）測定装置及び方法
実施例７（２）と同様であった。
【０２０２】
（３）（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体の合成
プロリンから（Ｎ−アクリロイルプロリンメチルエステル）重合体の合成までの反応式は、図３７に示すとおりである。
【０２０３】
（３−１）Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩の合成
Ｄ−プロリンの代わりにＬ−プロリンを用いたこと以外は、実施例７（３）（３−１）と同様に合成を行った。
【０２０４】
（３−２）Ｌ−プロリンメチルエステルの合成
Ｄ−プロリンメチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−プロリンメチルエステル塩酸塩を用いたこと以外は、実施例７（３）（３−２）と同様に合成を行った。
【０２０５】
（３−３）Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステルの合成
Ｄ−プロリンメチルエステルの代わりにＬ−プロリンメチルエステルを用いたこと以外は、実施例７（３）（３−３）と同様に合成を行った。
【０２０６】
（３−４）（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体の合成
重合管内にて、Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル１２．３ｍｇ（６７．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解させ、得られたＤＭＦ溶液に、ＭＰＡ１９９ｍｇ（１．９ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ４４ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）を順次添加し、真空下で凍結融解を行った（−１９６℃）。重合管を室温に戻した後、７０℃で５時間、重合反応に付した。反応終了後、反応溶液を氷冷ジエチルエーテルに滴下し、再沈精製を行い、粗生成物を得た。この粗生成物をアセトンに溶解し、ジエチルエーテルで再沈精製を行った。このようにして、目的ポリマーである（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体（８．７ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を得た。
【０２０７】
（４）（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体の物性評価
（４−１）数平均分子量（Ｍｎ）の測定
実施例３（４−１）と同様の方法で、数平均分子量を求めた。（３）で合成したポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、６，７４８であった。
【０２０８】
（４−２）下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）の測定
実施例３（４−２）と同様の方法で、ＬＣＳＴを求めた。温度と透過率との関係を示すグラフを図４４に示す。図４４から明らかなように、（３）で合成したポリマーのＬＣＳＴは、２１．０℃であった。
【０２０９】
（４−３）円二色性スペクトルの測定
図３９から明らかなように、（３）で合成したポリマー（「Ｐｏｌｙ（Ｎ−Ａ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ）と表記」では、正のコットン効果が観察された。
【０２１０】
（４−４）紫外部吸収スペクトルの測定
（３）で合成したポリマーの紫外部吸収スペクトルは、図４０に示すとおりであった。
【０２１１】
（５）４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体の合成
図４１に、（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体から４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体までの反応式を示す。なお、図４１では、Ｄ体とＬ体とを区別していない。
【０２１２】
（５−１）（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体の活性エステル化（スクシニル化）
（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体２ｇ（０．５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル２５ｍＬに溶解させた。得られた溶液に、ＤＣＣ２５８ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ１４４ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を順次添加した。得られた溶液を４℃にて２時間撹拌し、次いで２５℃で一昼夜撹拌した。反応終了後、溶液をろ過して副生成物を除去した。ろ液を氷冷ジエチルエーテル中に滴下し、再沈精製を行い、目的のスクシニル化ポリマー（０．６ｇ）を得た。
【０２１３】
（５−２）４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体の合成
スクシニル化された（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体０．６ｇを１，４−ジオキサン３０ｍＬに溶解させた。得られた溶液に４−アミノフルオレセイン７５ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を添加し、一昼夜室温で撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物を、５ｗ／ｖ％濃度となるようにメタノールに溶解させ、再生セルロース膜 (MWCO 3500)を用い、得られた溶液を４８時間透析した。このようにして、目的化合物である４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体（０．５ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を得た。
【０２１４】
（６）４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体の物性評価
（６−１）下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）の測定
実施例３（４−２）と同様の方法で、ＬＣＳＴを求めた。温度と透過率との関係を示すグラフを図４４に示す。図４４から明らかなように、（５）で合成したポリマーのＬＣＳＴは、１８．７℃であった。この値は、蛍光分子導入前のもの（（３）で合成したもの）と比べて低下していた。
【０２１５】
（６−２）蛍光強度の測定
温度と蛍光強度との関係は、５ｍｇ／ｍＬ濃度のポリマー水溶液を、０．１℃／分の温度勾配で昇温させつつ蛍光強度を測定して求めた。なお、蛍光強度は、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ、スリット幅は励起、蛍光のいずれも３．０ｎｍにて測定を行った。
【０２１６】
温度と蛍光強度との関係を示すグラフを図４５に示す。図４５から明らかなように、（５）で合成したポリマーの水溶液は、ＬＣＳＴ付近で蛍光強度が大きく変化した。ＬＣＳＴ以下の温度では、ポリマー鎖が伸張し、親水性蛍光分子であるフルオレセインが強く応答したものと考えられる。
【０２１７】
（６−３）蛍光スペクトルの測定
蛍光スペクトルは、５ｍｇ／ｍＬ濃度（０．５％）のポリマー水溶液について、測定した。先ず１５℃にて、励起波長４９０ｎｍ、スリット幅は励起、蛍光のいずれも５．０ｎｍ、スキャンスピードは６０ｎｍ／分で測定を行った。次いで、ポリマー溶液の温度を１℃上昇させて、同様の測定を行った。これを２５℃まで行った。
【０２１８】
結果を図４６に示す。最も蛍光強度が大きいスペクトルは、１５℃で測定したものであり、最も蛍光強度が小さいスペクトルは、２５℃で測定したものである。
【０２１９】
実施例９：  実施例７及び８で合成した蛍光性プロリンポリマーと、アミド結合型Ｌ−プロリンポリマー［Poly(L-proline)］との相互作用の検討
（１）使用した試薬
アミド結合型Ｌ−プロリンポリマー［Poly(L-proline)］：  ＳＩＧＭＡ製
その他の試薬は、実施例７（２）及び８（２）と同様であった。
【０２２０】
（２）測定装置及び方法
実施例７（２）と同様であった。
【０２２１】
（３）試料の調製
実施例７及び８で合成した蛍光性プロリンポリマーの各々につき、０．５ｗ／ｖ％水溶液を調製した。また、アミド結合型Ｌ−プロリンポリマーについても、０．５ｗ／ｖ％水溶液を調製した。これら３種の水溶液を用い、以下の４種類の試料を調製した。
【０２２２】
（ａ）４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体の０．２５ｗ／ｖ％水溶液
（ｂ）４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体を０．２５ｗ／ｖ％、アミド結合型Ｌ−プロリンポリマーを０．２５ｗ／ｖ％含有する水溶液
（ｃ）４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体の０．２５ｗ／ｖ％水溶液
（ｄ）４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体を０．２５ｗ／ｖ％、アミド結合型Ｌ−プロリンポリマーを０．２５ｗ／ｖ％含有する水溶液
【０２２３】
（４）下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）の測定
実施例３（４−２）と同様の方法で、ＬＣＳＴを求めた。試料（ａ）及び（ｂ）の温度と透過率との関係を示すグラフを図４７に、試料（ｃ）及び（ｄ）の温度と透過率との関係を示すグラフを図４８に示す。
【０２２４】
図４７から明らかなように、４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体単独（試料（ａ））の場合のＬＣＳＴは２１．０℃であったが、アミド結合型Ｌ−プロリンポリマーが共存する（試料（ｂ））と、ＬＣＳＴは１９．７℃に低下した。
【０２２５】
一方、図４８から明らかなように、４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体単独（試料（ｃ））の場合のＬＣＳＴは２０．１℃であり、アミド結合型Ｌ−プロリンポリマーが共存する（試料（ｄ））のＬＣＳＴは１９．９℃であった。すなわち、試料（ｃ）と（ｄ）では、ＬＣＳＴの差が小さかった。
【０２２６】
以上の結果より、アミド結合型Ｌ−プロリンポリマー（モデルペプチド）に対し、４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）は、何らかの相互作用を示しており、その相互作用の程度は、４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）よりも大きいといえる。
【０２２７】
（５）蛍光強度の測定
温度と蛍光強度との関係は、試料（ａ）乃至（ｄ）のそれぞれについて、０．１℃／分の温度勾配で昇温させつつ蛍光強度を測定して求めた。なお、蛍光強度は、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ、スリット幅は励起、蛍光のいずれも５．０ｎｍにて測定を行った。
【０２２８】
試料（ａ）及び（ｂ）の温度と蛍光強度との関係を示すグラフを図４９に、試料（ｃ）及び（ｄ）の温度と蛍光強度との関係を示すグラフを図５０に示す。
【０２２９】
図４９から明らかなように、４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）重合体単独（試料（ａ））の場合に比べ、アミド結合型Ｌ−プロリンポリマーが共存する（試料（ｂ））と、ＬＣＳＴ以下の温度において、蛍光強度が増大した。
【０２３０】
一方、図５０から明らかなように、４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）重合体の場合には、単独（試料（ｃ））でもアミド結合型Ｌ−プロリンポリマーが共存（試料（ｄ））しても、蛍光強度はほぼ同じであった。
【０２３１】
以上の結果より、アミド結合型Ｌ−プロリンポリマー（モデルペプチド）に対し、４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチルエステル）は、何らかの相互作用を示しており、その相互作用の程度は、４−アミノフルオレセイン含有（Ｎ−アクリロイル−Ｄ−プロリンメチルエステル）よりも大きいといえる。
【０２３２】
実施例１０：  リン脂質接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体［Poly(NIPAAm-co-fluorescein o-acrylate) conjugated phospholipid］の合成
（１）使用した試薬
Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン  ジオレイル（ＤＯＰＥ）は、和光純薬工業性を使用した。その他の試薬及び溶媒は、いずれも市販特級以上のものを用いた。
【０２３３】
（２）リン脂質接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の合成
反応式は、図５１に示すとおりである。
【０２３４】
（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体（Ｍｎ＝６，５３３）５００ｍｇ（０．０７７ｍｍｏｌ）を酢酸エチル (１５ｍＬ) に溶解した。得られた溶液に、ＤＣＣ３９．５ｍｇ（０．１９１ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ２２ｍｇ（０．１９１ｍｍｏｌ）を順次添加した。得られた溶液を４℃にて２時間攪拌した。その後、室温に戻し、さらに一昼夜攪拌した。
【０２３５】
反応溶液をろ過し、ジシクロヘキシル尿素を除去した。ろ液を氷冷下にジエチルエーテルに滴下し、沈澱を生じさせた（再沈精製）。沈澱物をろ別し、ろ液を減圧乾燥した。このようにして、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体のＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル化体を、白色固体として得た（３５８．２ｍｇ）。
【０２３６】
得られた活性エステル化体２１９．５ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン２０ｍＬに溶解させた。得られた溶液にＬ−α−ホスファチジルエタノールアミン  ジオレイル（ＤＯＰＥ）２５ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を一昼夜撹拌した。
【０２３７】
反応溶液中の反応溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。その粗生成物をメタノールに溶解し、４℃にて透析（ＭＷＣＯ  ３５００）を行って精製した。このようにして、ＤＯＰＥ接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体を黄白色固体として得た（１３２ｍｇ）。
【０２３８】
実施例１１：  （Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体と、ＤＯＰＥ接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の細胞取り込み実験
（１）使用した細胞及び培地
細胞：  ＲＡＷ細胞（Abelson leukemia virusで転換したマクロファージ様細胞）
培地：  ＤＭＥＭ+１０％ＦＢＳ+１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ+１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン
【０２３９】
（２）実験 
細胞５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを、新鮮な培地で一晩培養した (チャンバー使用)。この培地に、蛍光ポリマー溶液Ａ［（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の１０μｇ／ｍＬ溶液］２５μＬ又は蛍光ポリマー溶液Ｂ［ＤＯＰＥ接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体の１０μｇ／ｍＬ溶液］２５μＬを添加した。３７℃、５％ＣＯ２環境下で２時間インキュベートした。
【０２４０】
培地を除去し、ＤＭＥＭ５００μＬで細胞を１回洗浄した。次いで、ＨＢＳＳ（平衡塩溶液）５００μＬで細胞を２回洗浄した。
【０２４１】
細胞に４％パラホルムアルデヒド５００μＬを加え、その後、室温に３０分間放置した（細胞の固定化）。
【０２４２】
ホルムアルデヒドを除去し、ＨＢＳＳ（平衡塩溶液）５００μＬで細胞を２回洗浄した。  カバーガラスをつけ、共焦点レーザー顕微鏡ＦＶ１０００Ｄ（オリンパス製）にて細胞を観察し、細胞内部の写真を撮影した。
【０２４３】
（３）結果 
細胞内の顕微鏡観察の結果を、図５２及び図５３に示す。図５２から明らかなように、細胞内が緑色に染まっている。すなわち、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体は、細胞膜を透過して細胞質に取り込まれたことがわかる。また、図５３においても、細胞内が緑色に染まっている。すなわち、ＤＯＰＥ接合（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン  ｏ−アクリレート）共重合体も、細胞膜を透過して細胞質に取り込まれたことがわかる。なお、図５２及び図５３に関し、グレースケースの写真では、上記緑色部分は、微細な白色の点として表れている。
【産業上の利用可能性】
【０２４４】
本発明は、生体内等において、微小空間における環境の状況（温度やｐＨ等）の測定を可能にする。また、本発明は、微小空間に存在する物質の三次元高次構造の判定を可能にする。さらに、本発明は、バイオイメージングにも利用することができる。
【図１】
2009236906.tif 000005
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２９】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図３】
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【図１１】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２８】
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【図３０】
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【図５２】
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【図５３】
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