(57)【要約】【課題】簡便で高感度な被検物質の検出方法、該検出方法に用いる測定用組成物、及び、該測定用組成物に用いる、分散安定性、色素溶出耐性及び高い検出感度を兼ね備えた蛍光性色材を含有する微粒子分散物を提供することにある。【解決手段】コア部に、蛍光性色材及びガラス転移点が−１５０〜３０℃のポリマーＣを含有し、シェル部に、特異的吸着基（抗原に対する抗体のように、ある特定の種類の物質を認識し、吸着する機能を有する基）を有するポリマーＳを含有することを特徴とする微粒子分散物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コア部に、蛍光性色材及びガラス転移点が−１５０〜３０℃のポリマーＣを含有し、シェル部に、特異的吸着基（抗原に対する抗体のように、ある特定の種類の物質を認識し、吸着する機能を有する基）を有するポリマーＳを含有することを特徴とする微粒子分散物。
【請求項２】
前記ガラス転移点が−１５０〜１５℃であることを特徴とする請求項１に記載の微粒子分散物。
【請求項３】
前記ポリマーＣが、下記一般式（１）で表されるモノマーに由来する構造またはブタジエンに由来する構造を有することを特徴とする請求項１または２に記載の微粒子分散物。
【化１】
2009179780.tif 000006
（式中、Ｒ1は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ2は炭素数４〜１８の直鎖アルキル基または炭素数８〜２０の２位分岐アルキル基を表す。）
【請求項４】
前記ポリマーＣが、下記一般式（２）で表されるモノマーに由来する構造を有することを特徴とする請求項３に記載の微粒子分散物。
【化２】
2009179780.tif 000007
（式中、Ｒ1は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ2は水素原子またはヒドロキシアルキル基を表す。）
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の微粒子分散物を含むことを特徴とする測定用組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の測定用組成物を用いることを特徴とする被検物質の検出方法。
【請求項７】
前記被検物質が蛋白質であることを特徴とする請求項６に記載の被検出物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便で高感度な被検物質の検出方法、該検出方法に用いる測定用組成物及び該測定用組成物に用いる微粒子分散物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌等の疾患に罹ると、動物の体内では特定の微量蛋白質の量が増減する現象が見られる。従って、疾患の種類や重篤度合いと、増減する蛋白質の種類に相関関係が見出される場合、動物の体内の該蛋白質量を測定することにより、疾患の識別や悪性度の診断が可能である。このような蛋白質の分析には迅速かつ高感度な分析方法が求められる。この免疫測定法（イムノアッセイともいう）には様々な分析方法が用いられるが、抗体または抗原を酵素で標識したものを用いるＥＬＩＳＡ法が広く使用されている。一般に、ＥＬＩＳＡ法の感度は、概ね蛋白質０．００１〜０．１μｇといわれている。分析ステップとしては、被検物質の蛋白質との抗原抗体反応、二次抗体との抗原抗体反応、酵素反応による発色反応の３ステップから構成されており（例えば、特許文献１及び２参照）、高感度化の手法としてはリポソームを利用した感度増幅が知られている（例えば、非特許文献１、特許文献３参照）。
【０００３】
しかし、これらの方法は酵素反応が必要であるため、比較的分析時間が長く、ＥＬＩＳＡ法よりさらに短時間で簡便な分析方法が望まれていた。
【０００４】
これを受けて近年では、標識物質として蛍光物質を用いる蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）法がしばしば使用されている。これは検出手段が蛍光測定であるため、酵素反応に比べ大幅に分析時間を短縮できる。実際に様々な蛍光ラベル化試薬が市販されているが、比較的安価で普及しているもの（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣともいう）等）では感度が充分ではなかった。
【０００５】
これに対し、特許文献４または５では、複数の蛍光色素をポリマー粒子表面に結合または内部に含有させることで、一つの検体に対し複数の信号を与える標識を付与することを可能としている。しかしながら、この方法では、粒子の液への分散安定性や粒子自身の安定性を上げるためにポリマーの親水性を調整すると、内部に含有する蛍光色素のポリマーに対する分散安定性が悪くなり、色素が凝集して充分な発光強度が保てなくなったり、表面に結合させる場合には、色素自身が粒子の分散安定性に影響を及ぼしたりする問題があり、用いる蛍光色素に対する構造の制約も大きかった。
【０００６】
また、特許文献６及び７のようにコア−シェル型のポリマー粒子を用い、シェルに特異的吸着能を担わせ、コアのみに蛍光色素を内包する方法も見出されている。しかし、これら従来のコアシェル型ポリマー粒子分散物では、分散液への粒子の分散安定性や色素溶出耐性と発光強度の諸性能を充分に満たすことはできなかった。特に発光強度においてさらなる改善が望まれていた。
【特許文献１】特開昭６３−５０２９５８号公報
【特許文献２】特表２０００−５０９４９４号公報
【特許文献３】特開２００３−１４９２４６号公報
【特許文献４】特開平５−５２８４８号公報
【特許文献５】特開平６−３２２１７６号公報
【特許文献６】特開２００７−１４６１４９号公報
【特許文献７】特開２００６−１９９７９８号公報
【非特許文献１】Ｄａｎｋｅ  Ｘｕ，Ｑｕａｎ  Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４，１４３１４−１４３１５（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、その目的は、簡便で高感度な被検物質の検出方法、該検出方法に用いる測定用組成物、及び、該測定用組成物に用いる、分散安定性、色素溶出耐性及び高い検出感度を兼ね備えた蛍光性色材を含有する微粒子分散物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の上記課題は、以下の構成により達成される。
【０００９】
１．コア部に、蛍光性色材及びガラス転移点が−１５０〜３０℃のポリマーＣを含有し、シェル部に、特異的吸着基（抗原に対する抗体のように、ある特定の種類の物質を認識し、吸着する機能を有する基）を有するポリマーＳを含有することを特徴とする微粒子分散物。
【００１０】
２．前記ガラス転移点が−１５０〜１５℃であることを特徴とする前記１に記載の微粒子分散物。
【００１１】
３．前記ポリマーＣが、下記一般式（１）で表されるモノマーに由来する構造またはブタジエンに由来する構造を有することを特徴とする前記１または２に記載の微粒子分散物。
【００１２】
【化１】
2009179780.tif 000002
【００１３】
（式中、Ｒ1は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ2は炭素数４〜１８の直鎖アルキル基または炭素数８〜２０の２位分岐アルキル基を表す。）
４．前記ポリマーＣが、下記一般式（２）で表されるモノマーに由来する構造を有することを特徴とする前記３に記載の微粒子分散物。
【００１４】
【化２】
2009179780.tif 000003
【００１５】
（式中、Ｒ1は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ2は水素原子またはヒドロキシアルキル基を表す。）
５．前記１〜４のいずれか１項に記載の微粒子分散物を含むことを特徴とする測定用組成物。
【００１６】
６．前記５に記載の測定用組成物を用いることを特徴とする被検物質の検出方法。
【００１７】
７．前記被検物質が蛋白質であることを特徴とする前記６に記載の被検出物質の検出方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、簡便で高感度な被検物質の検出方法、該検出方法に用いる測定用組成物、及び、該測定用組成物に用いる、分散安定性、色素溶出耐性及び高い検出感度を兼ね備えた蛍光性色材を含有する微粒子分散物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、コア部に、蛍光性色材及びガラス転移点が−１５０〜３０℃のポリマーＣを含有し、シェル部に、特異的吸着基（抗原に対する抗体のように、ある特定の種類の物質を認識し、吸着する機能を有する基）を有するポリマーＳを含有する微粒子分散物により、分散安定性、色素溶出耐性及び高い検出感度を兼ね備えた蛍光性色材を含有する微粒子分散物が得られることを見出し、本発明に至った次第である。
【００２０】
以下、本発明について具体的に説明する。
【００２１】
〔微粒子分散物〕
本発明の微粒子分散物に用いられる微粒子（本発明の微粒子分散物において特徴を有するのは微粒子であるから、以下、本発明の微粒子分散物に用いられる微粒子を単に本発明の微粒子ともいう）は、蛍光性色材とポリマーＣとを含有するコア部（単にコアともいう）と、特異的吸着基を有するポリマーＳを含有するシェル部（単にシェルともいう）から形成される。シェル部に含有されるポリマーＳの持つ特異的吸着基とは、アビジンに対するビオチン、抗原に対する抗体のように、ある特定の種類の物質を認識し、吸着する機能を有する基である。
【００２２】
本発明において、ポリマーＣ、ポリマーＳのポリマーとしては、一般に知られているあらゆるモノマーから構成されるポリマーが使用可能であるが、好ましいポリマーとしては例えばスチレン、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、ブタジエン、イソプレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、等のモノマーを重合して得られるホモポリマーあるいはコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラール、ポリビニルアセタール等のコポリマー、ポリウレタン、ポリエステル等が挙げられ、これらはさらに組み合わさってポリマーを構成していてもよい。
【００２３】
（コア部用ポリマーＣ）
本発明において、コア部に用いるポリマーＣは、ガラス転移温度が−１５０〜３０℃であり、−１５０〜１５℃がより好ましい。ガラス転移温度は、ＤＳＣ装置（示差走査熱量分析装置）にて測定できる。
【００２４】
コア部に用いるポリマーＣとしては、例えばスチレン、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、ブタジエン、イソプレン等のモノマーから合成されるコポリマーであり、ガラス転移温度が上記範囲内となる組成のコポリマーまたはホモポリマーである。コア部に用いるポリマーＣは、前記一般式（１）で表されるモノマーに由来する構造またはブタジエンに由来する構造を有することが好ましい。
【００２５】
一般式（１）において、Ｒ1は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ2は炭素数４〜１８の直鎖アルキル基または炭素数８〜２０の２位分岐アルキル基を表す。炭素数４〜１８の直鎖アルキル基とは、例えばブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基（ラウリル基）、ステアリル基等である。炭素数８から２０までの２位分岐アルキル基とは、例えば２−エチルヘキシル基、２−ブチルオクチル基、２−ブチルデシル基、２−ヘキシルデシル基、２−オクチルデシル基、２−ヘキシルドデシル基、２−オクチルドデシル基等である。
【００２６】
コア部に用いるポリマーＣは、アクリル酸ブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリルのうち少なくとも一種のモノマーに由来する構造を有することがさらに好ましい。
【００２７】
さらに、コア部に用いるポリマーＣは、前記一般式（２）で表されるモノマーに由来する構造を有することが好ましい。
【００２８】
一般式（２）において、Ｒ1は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ2は水素原子またはヒドロキシアルキル基を表す。一般式（２）で表される化合物としては、例えば（メタ）アクリル酸、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００２９】
（シェル部用ポリマーＳ）
シェル部に用いるポリマーＳは、特異的吸着基を連結可能な構造として有する必要がある。特異的吸着基を連結可能な構造としては、例えば水酸基、アミノ基、メルカプト基、クロロ基、ブロモ基、ヨード基、フルオロ基、アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、カルボン酸基、スルホン酸基、アミド基、酸無水物残基、スクシンイミジルオキシ基、ヒドラジド基、グリシジル基、イソシアネート基、チオイソシアネート基等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
シェル部に用いるポリマーＳを構成するモノマーとして、特異的吸着基を修飾するのに好ましいモノマーは、例えば（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアリールエステル、（メタ）アクリル酸アミノアルキルエステル、（メタ）アクリル酸アミノアリールエステル、（メタ）アクリルアミド（但しＮ−Ｈ構造を有するもの）である。
【００３１】
微粒子自身の安定性や液への分散安定性の向上の観点から、好ましいシェル用ポリマーＳは、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルエステル等のモノマーから構成されるホモポリマーあるいはコポリマー、さらには上記モノマーとスチレンとのコポリマーである。
【００３２】
（蛍光性色材）
コア部に含有される蛍光性色材としては、水溶性色材と非水溶性色材が挙げられ、本発明は分散媒の主成分が水であるため、外部への溶出が抑えられるという観点から非水溶性色材が好ましい。また蛍光性色材としては、染料と顔料があり、本発明には従来公知の染料及び顔料を用いることが可能である。
【００３３】
以下に、本発明に好ましく用いられる染料を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
スチルベン色素、アクリドン色素、アゾベンゼン色素、ローダミン、フルオレセイン等のキサンテン色素、クマリン色素、シアニン色素、スクアリリウム色素、ダンシルアミド色素、ピレン、ペリレン、アントラセン等の多環芳香族色素、ＮＢＤ色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、ランタニド錯体等が挙げられる。
【００３５】
具体例としては、Ｃ．Ｉ．ソルベントイエロー４４、Ｃ．Ｉ．ソルベントイエロー８２、Ｃ．Ｉ．ソルベントイエロー１１６、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド４３、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド４４、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド４５、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド４９、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド６０、ソルベントブルー５、ソルベントピンク、ソルベントグリーン７、ディスパーズイエロー１２１、ディスパーズイエロー１２４、ディスパーズイエロー８２、ディスパーズオレンジ１１、ディスパーズレッド５８、ディスパーズレッド６０、ディスパーズブルー７、エオシン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、テキサスレッド、インドシアニングリーン、７−ジエチルアミノ−４−メチルクマリン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  カルボン酸、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５等
次に、本発明に用いられる顔料を下記に挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
Ｌｕｍｏｇｅｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｌｕｍｏｇｅｎ  Ｌ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｌｕｍｏｇｅｎ  Ｌ  Ｒｅｄ、Ｌｕｍｏｇｅｎ  Ｌ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｌｕｍｏｇｅｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｇｒｅｅｎ７
〔微粒子分散物の製造〕
蛍光性色材が蛍光性染料の場合、コアの蛍光性色材含有微粒子は各種の方法で調製することができる。例えばモノマー中に油溶性蛍光性染料を溶解させ、水中で乳化後、重合によりポリマー中に該蛍光性染料を封入する方法、ポリマーと蛍光性染料を有機溶剤中に溶解し、水中で乳化後、有機溶剤を除去する方法等が挙げられる。それらの蛍光性色材含有微粒子にさらにポリマーで被覆シェル化を行う。
【００３７】
蛍光性色材が蛍光性顔料の場合、蛍光性顔料をポリマーと混練し、その後、水系に分散してポリマー被覆顔料コアを作製する方法、ポリマーを有機溶剤に溶解した溶液を蛍光性顔料分散液に加えた後、減圧下で溶剤を除去しポリマー被覆する方法等が挙げられる。
【００３８】
次に、シェル化する方法について説明する。ポリマーシェルを設ける方法としては、コアの水系サスペンションに水溶性のポリマー分散剤を添加し吸着させる方法、モノマーを徐々に滴下し、重合と同時にコア表面に沈着させる方法、あるいは、有機溶剤に溶解したポリマーを徐々に滴下し、析出と同時にコア表面に吸着させる方法等がある。
【００３９】
さらに、一段階でコアシェル形成する方法も考えられる。例えば、コアとなるポリマーと蛍光色材をシェルとなるポリマーに溶解または分散し、水中で懸濁後重合する方法や、その液を活性剤ミセルを含有する水中に徐々に添加しながら乳化重合していく方法等がある。この場合、シェルに用いられるポリマーの量が、総ポリマー量の５〜９５質量％であることが好ましく、さらに好ましくは１０〜９０質量％である。５質量％未満ではシェルの厚みが不十分で、蛍光色材を多く含むコアの一部が粒子表面に現れやすくなる。また、シェルのポリマーが多すぎると、コアの蛍光色材保護能が低下しやすい。
【００４０】
蛍光性色材の量は、総ポリマー量に対して２０〜１０００質量％であることが好ましい。蛍光性色材の量がポリマーに比して少なすぎると充分な発光強度が得られず、また蛍光性色材の量が多すぎるとポリマーの保護能が十分に得られない。
【００４１】
（特異的吸着基の修飾方法）
特異的吸着基をシェル用ポリマーＳに修飾する方法としては、いかなる方法を用いてもよいが、シェル化後に修飾する方法が好ましく、例えばシェル化後の微粒子の分散液に、液に対しては安定で、シェル用ポリマーＳ上のある部位に対して反応性を持ち、反応後、結合を作るような特異的吸着基導入剤を反応させる方法が挙げられる。この際必要に応じて、縮合剤、触媒等を用いてもよい。抗体の修飾については「酵素免疫測定法第３版」（石川栄治等編、医学書院）等が参考になる。
【００４２】
例えばシェル用ポリマーＳ上のアミノ基に、特異的吸着基としてビオチンを修飾する場合、コアシェル型微粒子の水分散液にビオチンとＷＳＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｉｄｅ）等の縮合剤を加えて縮合反応を行うことで、ビオチンのカルボン酸部位とシェル用ポリマーＳ上のアミノ基とをペプチド結合で繋ぐことができる。
【００４３】
本発明の微粒子において、必要な粒子径を得るには、処方の最適化と適当な乳化法の選定が重要である。
【００４４】
処方は、用いる蛍光性色材、ポリマーによって異なるが、水中のサスペンション（水系分散物）であるので、コア用ポリマーＣよりシェル用ポリマーＳの方が一般的に親水性が高いことが必要である。
【００４５】
また、シェル用ポリマーＳに含有される蛍光性色材は、コア用ポリマーＣより少ないことが好ましく、蛍光性色材もシェル用ポリマーＳより親水性の低いことが必要である。親水性、疎水性は、例えば溶解性パラメータ（ＳＰ）を用いて見積もることができる。
【００４６】
溶解性パラメータについては、その値、測定、計算法は、ＰＯＬＹＭＥＲ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ第４版（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）６７５頁の記載が参考になる。
【００４７】
なお、本発明に用いられる蛍光性色材とコア用ポリマーＣはそのＳＰ値の差が小さいほど相溶性の観点から好ましく、具体的には色材とコア用ポリマーＣのＳＰ値の差が０〜０．５であることが好ましい。
【００４８】
また、本発明の微粒子に用いられるポリマーＣ、Ｓは、その平均分子量が５００〜１０００００、特に１０００〜３００００であることが、サスペンションの形成性、安定性の点から好ましい。
【００４９】
本発明の微粒子の分散液は、水を媒体とし、前記蛍光性色材を封入したポリマーのサスペンションからなり、よって水溶性有機溶剤を有し、該サスペンションには従来公知の各種添加剤、例えば分散剤、シリコン系等の消泡剤、クロロメチルフェノール系等の防黴剤またはＥＤＴＡ等のキレート剤、亜硫酸塩等の酸素吸収剤等が含有されていてもよい。
【００５０】
本発明に用いられる水溶性有機溶媒としては、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、セカンダリーブタノール、ターシャリーブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール等）、多価アルコール類（例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキサンジオール、ペンタンジオール、グリセリン、ヘキサントリオール、チオジグリコール等）、多価アルコールエーテル類（例えば、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、トリエチレングリコールモノメチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノフェニルエーテル、プロピレングリコールモノフェニルエーテル等）、アミン類（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、モルホリン、Ｎ−エチルモルホリン、エチレンジアミン、ジエチレンジアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリエチレンイミン、ペンタメチルジエチレントリアミン、テトラメチルプロピレンジアミン等）、アミド類（例えば、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等）、複素環類（例えば、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、シクロヘキシルピロリドン、２−オキサゾリドン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン等）、スルホキシド類（例えば、ジメチルスルホキシド等）、スルホン類（例えば、スルホラン等）、尿素、アセトニトリル、アセトン等が挙げられる。
【００５１】
本発明に係る分散剤としては、水溶性高分子からなる分散剤が好ましく、例えば下記の水溶性樹脂が好ましい例として挙げられる。
【００５２】
スチレン−アクリル酸−アクリル酸アルキルエステル共重合体、スチレン−アクリル酸−アクリル酸共重合体、スチレン−マレイン酸共重合体、スチレン−マレイン酸−アクリル酸アルキルエステル共重合体、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−アクリル酸−アクリル酸アルキルエステル共重合体、スチレン−マレイン酸ハーフエステル共重合体、ビニルナフタレン−アクリル酸共重合体、ビニルナフタレン−マレイン酸共重合体等のような水溶性高分子である。高分子分散剤の例として、その他に、アクリル−スチレン系樹脂であるジョンクリル等（ジョンソン社）が挙げられる。これらの高分子分散剤は、２種以上併用することも可能である。
【００５３】
水溶性高分子の分散液全量に対する含有量は、分散液全量に対し０．１〜１０質量％であるのが好ましく、さらに好ましくは０．３〜１０質量％である。
【００５４】
本発明における分散粒子の平均粒子径は５０〜２００ｎｍであることが好ましく、より好ましくは５０〜１２０ｎｍであり、平均粒子径が５０ｎｍ未満では色材とポリマーからなる分散粒子の形成が困難であり、２００ｎｍを越えると分散液の透明性や色の鮮やかさが低下する。
【００５５】
顔料の分散方法としては、ボールミル、サンドミル、アトライター、ロールミル、アジテーター、ヘンシェルミキサ、コロイドミル、超音波ホモジナイザー、パールミル、湿式ジェットミル、ペイントシェカー等を用いることができる。
【００５６】
本発明では顔料分散体の粗粒分を除去する目的で、遠心分離装置やフィルターが好ましく用いられる。
【００５７】
分散液に好ましく使用される界面活性剤としては、ジアルキルスルホコハク酸塩類、アルキルナフタレンスルホン酸塩類、脂肪酸塩類等のアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル類、アセチレングリコール類、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックコポリマー類等のノニオン性界面活性剤、アルキルアミン塩類、第４級アンモニウム塩類等のカチオン性界面活性剤が挙げられるが、特にアニオン性界面活性剤を好ましく用いることができる。
【００５８】
本発明の分散液には、この他、防腐剤、防黴剤、ｐＨ調整剤、粘度調整剤等を必要に応じて添加することも可能である。
【００５９】
次に、本発明の微粒子分散液の製造において用いられる乳化方法について説明する。本発明の微粒子分散液の乳化法としては、各種の方法を用いることができる。それらの例は、例えば、「機能性乳化剤・乳化技術の進歩と応用展開  シー  エム  シー」の８６ページの記載にまとめられている。本発明においては、特に、染料コアの形成には超音波、高速回転せん断、高圧による乳化分散装置を使用することが好ましい。
【００６０】
超音波による乳化分散では、いわゆるバッチ式と連続式の２通りが使用可能である。バッチ式は、比較的少量のサンプル作製に適し、連続式は大量のサンプル作製に適する。連続式では、例えば、ＵＨ−６００ＳＲ（株式会社エスエムテー製）のような装置を用いることが可能である。このような連続式の場合、超音波の照射時間は、分散室容積／流速×循環回数で求めることができる。超音波照射装置が複数ある場合は、それぞれの照射時間の合計として求められる。超音波の照射時間は実際上は１００００秒以下である。また、１００００秒以上必要であると、工程の負荷が大きく、実際上は乳化剤の再選択等により乳化分散時間を短くする必要がある。そのため１００００秒以上は必要でない。さらに好ましくは、１０秒以上、２０００秒以内である。
【００６１】
高速回転せん断による乳化分散装置としては、「機能性乳化剤・乳化技術の進歩と応用展開  シー  エム  シー」の２５５〜２５６ページに記載されているような、ディスパーミキサーや、２５１ページに記載されているようなホモミキサー、２５６ページに記載されているようなウルトラミキサー等が使用できる。これらの型式は、乳化分散時の液粘度によって使い分けることができる。これらの高速回転せん断による乳化分散機では、攪拌翼の回転数が重要である。ステーターを有する装置の場合、攪拌翼とステーターとのクリアランスは通常０．５ｍｍ程度で、極端に狭くはできないので、せん断力は主として攪拌翼の周速に依存する。周速が５〜１５０ｍ／Ｓであれば、本発明の乳化・分散に使用できる。周速が遅い場合、乳化時間を延ばしても小粒径化が達成できない場合が多く、１５０ｍ／Ｓにするにはモーターの性能を極端に上げる必要があるからである。さらに好ましくは、２０〜１００ｍ／Ｓである。
【００６２】
これらの乳化・分散装置は単独で用いてもよいが、必要に応じて組み合わせて使用することが可能である。コロイドミルや、フロージェットミキサ等も単独では本発明の目的を達成できないが、本発明の装置との組み合わせにより、短時間で乳化・分散を可能にする等本発明の効果を高めることが可能である。
【００６３】
〔被検物質の検出方法〕
本発明の前記微粒子分散物を含む測定用組成物は、被検物質の検出方法に用いられる。
【００６４】
本発明の被検物質の検出方法における、被検物質は、該被検物質を特異的に認識する物質が存在すれば、特に限定されることはない。本発明の被検物質の検出方法は、被検物質が蛋白質であることが好ましい。
【００６５】
被検物質と、該被検物質を特異的に認識する物質の関係の一例としては、免疫学的な関係にある物質が挙げられる。具体的には、抗原と抗体の関係が挙げられる。抗原と抗体の関係において、被検物質が抗原である場合、該抗原を特異的に認識する物質は抗体であり、被検物質が抗体である場合、該抗体を特異的に認識する物質は抗原である。
【００６６】
また、被検物質を特異的に認識する物質は、被検物質を間接的に認識できる物質であってもよい。即ち、被検物質を特異的に認識する物質を認識することのできる物質であってもよい。具体的には、被検物質を認識する抗体（一次抗体）を認識することのできる抗体（二次抗体）が挙げられる。
【００６７】
二次抗体として、被検物質を認識できる一次抗体作製に用いた動物種に特異的な抗体を認識することのできる抗体を用いることにより、該動物種で一次抗体を作製可能な様々な被検物質に対して、共通してこの同じ二次抗体を使用することが可能となる。本発明の被検物質の検出法を利用したキットを作製する上で、この二次抗体を表面に有する微粒子は有用である。
【００６８】
上記抗体を作製するために用いる動物としては、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等が挙げられる。抗体としては、動物に免疫することによって得られるポリクローナル抗体でも、ハイブリドーマ法から得られるモノクローナル抗体でもよい。ポリクローナル抗体を用いる場合には、動物として取り扱いやすいウサギ抗体が好ましい。
【００６９】
抗原としての被検物質として、例えば血液中等に微量に存在する蛋白質ホルモン、活性ペプチド、オータコイド、腫瘍マーカー、免疫グロブリン等の生体成分や薬剤等が挙げられるが、これらに限定されることはなく、被検物質に対する抗体を作製できるもの等であれば特に制限はない。
【００７０】
その他、本発明の被検物質の検出方法における、被検物質と、該被検物質を特異的に認識する物質として、酵素と基質、酵素と阻害剤、ホルモンと受容体、レクチンと糖鎖、ＤＮＡとＲＮＡ、ＤＮＡとＤＮＡ、血清アルブミンと色素ブルー、酵素と補酵素、蛋白質とコンビナトリアルリガンドペプチド等の、様々な組み合わせのものを挙げることができる。酵素と補酵素の組み合わせの例としては、酸化還元酵素と補酵素ＮＡＤＨの組み合わせ等を挙げることができる。
【００７１】
本発明の被検物質の検出方法においては、ＥＬＩＳＡ測定用に調製された被検物質をそのまま使用することができる。また、被検物質を担体に固定化して用いてもよい。被検物質を固定化する担体としては、被検物質を固定化可能な担体であれば、特に限定されることはない。
【００７２】
上記担体の形状としては、膜状、チップ状、アレイ状、ビーズ状のもの等が挙げられる。上記担体の素材例としては、被検物質を固定化可能な素材であれば特に限定されないが、ポリビニリデンフルオリド、ニトロセルロース、ナイロン等が挙げられる。
【００７３】
担体の孔径は、本発明の微粒子の粒子径に合わせて適宜選定すればよい。本発明の微粒子の粒子径よりも大きい孔径の担体を用いることにより、検出感度を向上させることができる。また、担体として、細胞を用いることもできる。即ち、被検物質を細胞表層に発現している細胞を担体として挙げることができ、該細胞は遺伝子組換えにより被検物質を発現するように改変されたものであってもよい。
【００７４】
本発明の被検物質の検出法は、ドットブロッティング法、ウエスタンブロッティング法、サザンブロッティング法、ノザンブロッティング法、等の様々な測定法に適用でき、またラボオンアチップ、イムノクロマトチップ等の形で使用することができる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７６】
実施例
〔微粒子分散液１〜１４、１６〜１９の調製〕
（コア用ポリマー分散液の合成）
フラスコに酢酸エチル１０ｇを入れ、窒素下で２時間加熱還流した。表１記載の割合でモノマー総量が１０ｇとなる量のモノマーを混合して酢酸エチル（窒素下にて加熱還流済みのもの）１０ｇに溶解し、２，２′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．２ｇを加え、これを前記フラスコに２時間かけて滴下し、同温で５時間反応を行い、コア用ポリマー分散液を調製した。このコア用ポリマーのガラス転移点（Ｔｇ）をＤＳＣ法によって測定した。
【００７７】
（コアシェル型蛍光色素含有の微粒子分散液の調製）
上記コア用ポリマー分散液（固形分１０ｇ）と、表１記載の蛍光性色材１０ｇ、及び酢酸エチル４５ｇをセパラブルフラスコに入れ、フラスコ内をＮ2置換後、撹拌して完全に溶解した。ラウリル硫酸ナトリウム１．９ｇを含む水溶液９０ｇを滴下して撹拌後、超音波分散機ＵＨ−１５０型（（株）エスエムテー製）を用いて３００秒間乳化した。その後、減圧下で酢酸エチルを除去し、蛍光色素を含浸する微粒子を得た。１．５ｇの過硫酸カリウムを加えて溶解し、８０℃に加温後、さらに１．５ｇのスチレン、１．４ｇの２−ヒドロキシエチルメタクリレート及び０．１ｇの２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチルメタクリレートの混合液を滴下しながら７時間反応させて、コアシェル型蛍光色素含有の微粒子分散液を得た。
【００７８】
（シェル部に特異的吸着基の付与）
この微粒子分散液に０．２ｇのｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ビオチン（テクノケミカル社）と０．４ｇのＷＳＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｉｄｅ、縮合剤）を加え、室温で１２時間反応させた後にゲルろ過し、水を加えて１２０ｇに仕上げ、微粒子分散液１〜１４、１６〜１９を得た。
【００７９】
〔微粒子分散液１５の調製〕
Ｌｕｍｏｇｅｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ５０ｇをポリビニルブチラール１０ｇ、酢酸エチル１５０ｇと混合し、０．５ｎｍのジルコニアビーズを体積率で５０％充填したサンドグラインダーを用いて平均粒径６０ｎｍになるまで分散し、遠心分離機で沈降物を除去して分散液を得た。この分散液１２．５ｇにポリビニルブチラール４ｇ及び酢酸エチル３６ｇをセパラブルフラスコに入れ、フラスコ内をＮ2ガスで置換後、撹拌し混合した。ラウリル硫酸ナトリウム１．９ｇを含む水溶液９０ｇを滴下して撹拌後、前記超音波分散機を用いて３００秒間乳化した。その後、減圧下で酢酸エチルを除去し、着色したコア用ポリマー分散液を調製した。このコア用ポリマーのガラス転移点（Ｔｇ）は３０℃であった。
【００８０】
これに１．５ｇの過硫酸カリウムを加えて溶解し、８０℃に加温後、さらに１．５ｇのスチレン、１．４ｇの２−ヒドロキシエチルメタクリレート及び０．１ｇの２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチルメタクリレートの混合液を滴下しながら７時間反応させ、この液に０．５ｇのｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ビオチン（テクノケミカル社）と１ｇのＷＳＣを加え、室温で１２時間反応させた後にゲルろ過し、コアシェル型蛍光顔料含有の微粒子分散液１５を得た。
【００８１】
〔微粒子分散液２０の調製〕
微粒子分散液１の調製において、シェル部に特異的吸着基の付与を行わずに、水を加えて１２０ｇに仕上げ、微粒子分散液２０を得た。
【００８２】
【表１】
2009179780.tif 000004
【００８３】
〔微粒子分散液の評価〕
各微粒子分散液について下記評価を行った。評価の結果を表２に示す。
【００８４】
（色素溶出性）
表１に記載の各微粒子分散液を遠心分離にかけて上澄み液を取り出し、蛍光強度を測定した。これを調製直後の溶液と室温で２週間保管したものについて蛍光強度を比較することで、色材の微粒子からの溶出性を判断し、以下の基準で評価した。なお、測定は５回行った。
【００８５】
○：５回の測定で全て、２週間経過後の蛍光強度の値が調製直後の値と同等であった
△：５回の測定のうち１回だけ、２週間経過後の蛍光強度の値が調製直後の値を上回った
×：５回の測定のうち２回以上、２週間経過後の蛍光強度の値が調製直後の値を上回った
○、△が使用可能なレベルである。
【００８６】
（分散安定性）
各微粒子分散液を室温で２ヶ月間保存し、目視によって凝集物の有無を判断し、下記基準で評価した。
【００８７】
○：凝集物が全く見られない
△：凝集物がわずかに確認できる
×：凝集物が明らかに確認できる
○、△が使用可能なレベルである。
【００８８】
（被検物質の検出方法への適用）
ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ストレプトアビジン結合ビーズ（磁気ビーズ）を被検物質とし、該ビーズの分散液を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、その１０倍希釈液、１００倍希釈液もそれぞれ調製した。被検試料５ｍｌに対し、参照のビオチン化フルオレセイン溶液（２００ｐｍｏｌ／ｍｌ）５ｍｌ、あるいは各微粒子分散液（合成時に用いたビオチン化試薬が全て使われたと仮定して、ビオチン当量が２００ｐｍｏｌ／ｍｌとなるように水を加えて調液した。）５ｍｌと混合し、１時間振盪を行った。その後、磁石を利用してビーズを集め、上澄み５ｍｌだけを取り除き、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：リン酸緩衝生理食塩水）５ｍｌを加えて１５分間振盪し、再び上澄み５ｍｌを取り除いた。この、ＰＢＳを加えて振盪し上澄みを抜く一連の洗浄操作を２回繰り返し、最後にＰＢＳを加えて１０ｍｌの微粒子分散液となるように調製した。その後各試料の蛍光強度を測定し、被検物質が検出可能かどうかを下記基準で評価した。
【００８９】
◎：全て検出可能であった
○：１００倍希釈液のみ検出不可で、それ以外は検出可能であった
△：１０倍希釈液と１００倍希釈液が検出不可で、原液のみ検出可能であった
×：全て検出不可であった
◎、○が物質の検出方法として好適に実用できるレベルである。
【００９０】
【表２】
2009179780.tif 000005
【００９１】
表より、本発明の微粒子分散液は色素の溶出性に問題がなく、きわめて分散安定性が高いことが分かる。また、本発明の微粒子分散液は被検物質の検出方法として好適に用いることができ、検出感度も極めて良好であることが分かる。