(57)【要約】【課題】芽胞形成Bacillus種、特にB．coagulansを用いる、治療組成物、治療システム、および種々の細菌胃腸感染、特にSIDSに関連する感染を処置および／または予防するための使用方法を提供すること。【解決手段】細菌の胃腸の感染を阻害するために、胃腸管に経口投与されるように処方される、Bacillus種のような非病原性乳酸産生細菌、B.coagulansの芽胞または細胞外産物を含む組成物が記載される。胃腸感染、特に乳児突然死症候群（SIDS）を処置するための組成物を使用する方法およびシステムもまた、開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、食品添加物または補充食品としての共生生物の利用に関し、特に乳児腸微生物感染に関連する、乳児突然死症候群（SIDS）を予防するための食物または補充食品におけるBacillus  coagulansの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
共生物質薬剤は、特定の環境において増殖する場合に、しばしば同じ環境において他の生物学的生物の増殖を阻害することによって利益を付与する生物である。共生物質の例には、病原体を置換または破壊するために腸において少なくとも一時的に増殖し得、そしてその宿主生物に対して他の利益を提供し得る細菌およびバクテリオファージが含まれる（Salminenら、Antonie  Van  Leeuwenhoek，70(2-4):347-358，1996；Elmerら、JAMA，275:870-876，1996；Rafter，Scand．J．Gastroenterol.，30:497-502，1995；Perdigonら、J．Dairy  Sci.，78:1597-1606，1995；Gandi，Townsend  Lett．Doctors  &  Patients，108-110頁、Jan．1994；Lidbeckら、Eur．J．Cancer  Prev．1:341-353，1992)。共生物質調製物は、1990年代の初期に、健康および長寿に対するそれらの効果について体系的に評価された（Metchnikoff，E.，Prolongation  of  Life，Wilham  Heinemann，London，1910；G.P．Putnam's  Sons，New  York，NY，1970によって再発行された)。病原微生物を処理するための、1950年ごろにおける抗生物質の発見および広範な使用以来、共生物質の使用は制約されてきた。
【０００３】
抗菌剤、特に広い範囲の抗生物質の広範な使用は、重大な結果をもたらした。抗生物質を服用している個人は、消化管の有益な微生物が死滅し、したがって胃腸フローラの均衡が変化した場合に、しばしば、胃腸の不調を患う。この不均衡は、ビタミンを産生する消化管の細菌が死滅した場合には、ビタミン欠乏を生じ得、そして病原生物が過剰増殖し、そして有益な胃の微生物を置換した場合には、さらなる病気を生じ得る。さらに、広範な抗生物質の使用は、バンコマイシン耐性細菌を含む、増大する数の抗生物質耐性病原性微生物を産生した。複数の薬物に耐性である微生物もまた発生し、種間で広がる多剤耐性をしばしば有し、既知の抗生物質の使用によっては制御不可能な全身感染に導く。従って、抗生化学物質の使用なしで病原性微生物を制御し得る予防的および治療的薬剤の必要性が存在する。
【０００４】
乳児突然死症候群（SIDS）は、見かけは健康な乳児の突然の，予期せぬ死に関し、代表的には３週間から５か月齢の間であり、約３か月齢でピークを迎える。一般的に、死は心臓呼吸性不全に起因し、死の前には重篤な病気を示す徴候を伴わずに子供が静かに死ぬが、被害者の85％において、死の前数週間以内にSIDS感染が観察される。SIDSは、世界の先進国では乳児の主な死因であるが、その原因は十分には理解されていない。
【０００５】
何人かの研究者は、種々の毒素産生性の細菌およびそれらのエンテロトキシンが、SIDSの病因学に関連すると報告している（Arnon  S.S.ら、Lanceti：1273-1277，1978；Gurwith  M.J.ら、Am．J．Dis．Child．135：1104-1106，1981；Cooperstock  M.S.ら、Pediatr．70:91-95，1982；Donta  S．およびMyers  M.，J．Pediatr．100:431-434，1982；Arnon  S.S.ら、J．Pediat．104(1):34-40，1984;Murrell  T.G.ら、Med．Hypoth．22:401-413，1987；Blackwell  C.C.ら、J．Clin．Pathol．45(11補遺):20-24，1992；Lindsay  J.A.ら、Curr．Microbiol．27:51-59，1993；Murrell  W.G.ら、J．Med．Microbiol．39(2):114-127，1993；Mach  A.SおよびLindsay  J.A.，Curr．Microbiol．28:261-267，1994；Siarakas  S.ら、Toxicon  33(5):635-649，1995)。SIDSに関連する細菌種は、Clostridium  perfringens、C．difficile、C．botulinum、Staphylococcus  aureusおよびEscherichia  coliを含むが、特定の細菌種の存在とSIDSの間の相関は、研究の間で完全には一致していない（Gurwith  M.J.ら、Am．J．Dis．Child．135:1104-1106，1981；Blackwell  C.C.ら、J．Clin．Pathol．45(11補遺):20-24，1992；Murrell  W.G.ら、J．Med．Microbiol．39(2):114-127，1993；Lindsay  J.A.ら、Curr．Microbiol．27:51-59，1993；Siarakas  S.ら、Toxicon  33(5):635-649，1995）。Clostridium種、特にC．perfringensおよびC．difficileは、SIDSで死んだ子供から得られた糞便の試料に最もしばしば関連する。糞便物質に見出される細菌トキシンおよびSIDS乳児の血清は、SIDSの病因を明らかにする薬剤であり得る。これらの細菌トキシンには、C．perfringensエンテロトキシンおよびαトキシン、StaphylococcusエンテロトキシンＢ、E.coli熱安定性トキシン（STa）、C．difficileトキシンＡおよびＢ、ならびにC．botulinumトキシン（Blackwell  C.Cら、J．Clin．Pathol  45(11補遺):20-24，1992；Murrell  W.G.ら、J．Med．Microbiol．39(2):114-127，1993；Siarakas  S.ら、Toxicon  33(5):635-649，1995）があげられる。C．perfringensＡ型エンテロトキシンは特に、そのヒト動物細胞によるサイトカイン産生を調整する能力ゆえに特に関係している（Lindsay  J.A.，Crit．Rev．Microbiol．22(4):257-277，1996）。これらのトキシンのいくつかは、相乗的に作用する（Siarakas  S.ら、Toxicon  33(5):635-649，1995）。動物において、C．perfringensは、いくつかの若い種（例えば、仔羊、子馬）の死の原因であり、そしてC．difficileは、偽膜性腸炎を引き起こす（Murrell  T.G.C.ら、Med．Hypotheses  22:401-413，1987；Murrell  W.G.ら、J．Med．Microbiol．39：114-127，1993）。
【０００６】
これらの細菌および／または細菌トキシンがいかにしてSIDSを引き起こすか、またはSIDSに寄与するかを説明するために、種々の仮説が提出されてきたが、一般的に、SIDSは、病原性細菌が腸に入り、コロニー形成し、そして静かな死に導く反応のカスケードを開始する細胞トキシンを産生する、一連の事象から生ずると考えられている（Lindsay  J.A.，Crit  Rev．Microbiol．22(4):257-277，1996；Murrell  W.G.ら、J．Med．Microbiol．39:114-127，1993）。細胞トキシンは、腸の組織に傷害を与えて、細菌の全身への移動なしでエンテロトキシンのより効率的な全身吸収を生じる。さらに、腸の傷害は、サイトカイン（例えば、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子およびインターロイキン）の増大した産生を生じ得、心臓呼吸を制御する回路を変えて生化学的カスケードに導くトキシンの効果を悪化させ、不可逆的なショックおよび死に導く（Lindsay  J．A.ら、Curr．Microbiol．27:51-59，1993；Mach  A.S.およびLindsay  J.A.，Curr．Microbiol．28:261-267，1994）。例えば、細胞膜透過性におけるトキシン誘導性の変化は、心臓組織における細胞内イオン（カリウムイオンおよび／またはカルシウムイオン）の異常なレベルを導き、心不全を導き得る。SIDSに対するこれらの説明は、全身の細菌感染非存在下における腸の傷害と敗血症の状態および離れた器官の不全の発生との間の関連を示した他の研究（Deitch  E.A.ら、Shock  1(2):141-145，1994）と一致している。
【０００７】
SIDSは、一般的に幼児において起こるので、免疫系が十分に発達する前に、SIDSに関連する細菌病原体に対するワクチンは、通常SIDS関連感染を予防することには効果的ではない。なぜなら、幼児は免疫原に応答する十分な免疫応答を産生しないからである。抗トキシン抗体（例えば、米国特許第5,599,539号）は、効力が限られている。なぜなら、これらの抗体は、トキシンを産生し続け得るトキシン産生細菌の増殖を制限せず、そして経口投与された場合に、アレルギー反応を生じ得るからである。従って、乳児の腸の有益な微生物フローラに影響を与え得、または微生物の薬剤耐性の発生に寄与する抗生物質の使用することなしで、SIDS関連病原性微生物の増殖を制御し得る予防的および治療的薬剤の必要性が存在する。一般的に安全とみなされるので、内部的に服用され得る共生物は、SIDSに関連する腸の病原体の増殖を置き換え、または防止するために使用され得る。さらに、それらの作用の様式ゆえに、共生物は抗生物質の副作用を有さないし、または薬物耐性病原体を導かない。
【０００８】
乳酸産生細菌（例えば、Bacillus、LactobacillusおよびStreptococcus種）は、食品添加物として使用され、そして栄養学的および治療的価値を提供するといういくつかの主張がある（Gorbach  S.L.，Ann．Med．22(1)37-41，1990；Reid，G.ら、Clin．Microbiol．Rev．3(4)：335-344，1990）。いくつかの乳酸産生細菌（例えば、ヨーグルトを作るのに使用されるもの）は、ヒト腫瘍を予防するために有用な抗変異原性および抗ガン性の特性を有することが示唆されている（Pool-Zobel  B.L.ら，Nutr．Cancer  20(3):261-270，1993；米国特許第4,347,240号）。いくつかの乳酸産生細菌はまた、細菌の抗微生物効果をもたらす阻害的代謝物であるバクテリオシンを産生する（Klaenhammer  T.R.，FEMS  Microbiol．Rev．12(1-3):39-85，1993；Barefoot  S.F.およびNettles  C.G.，J．Dairy  Sci．76(8):2366-2379，1993）。
【０００９】
腸でコロニー形成する共生細菌、特にLactobacillus種の治療的使用は、すでに開示されている（Winbergら、Pediatr．Nephrol．7:509-514，1993；Malinら、Ann．Nutr．Metab．40:137-145，1996；および米国特許第5,176,911号）。
【００１０】
抗生物質を産生する選択されたLactobacillus株は、感染、副鼻腔炎、痔核、歯の炎症、および他の炎症状態の処置のために有効であるとして開示されている（米国特許第4,314,995号)。L.reuteriは、グラム陰性およびグラム陽性細菌、酵母、および原生動物に対する活性を有する抗生物質を産生する（米国特許第5,413,960号および米国特許第5,439,678号)。L.casei  ssp．rhamnosus株LC-705、DSM  7061は、単独またはPropionibacterium種と組み合わせて、発酵ブロスにおいて、食物およびサイレージにおける酵母およびカビを阻害することが示されている（米国特許第5,378,458号)。また、抗真菌Serratia種、特にS.rubidaea  FB299は、単独または抗真菌B.subtilis（FB260株）と組み合わせて、動物の飼料を保存するために動物飼料および/またはサイレージに添加されている（米国特許第5,371,011号)。
【００１１】
Bacillus  coagulansは、均一発酵条件において、L(+)乳酸（右旋性）を産生する非病原性のグラム陽性芽胞形成細菌である。栄養媒地中に接種された熱処理土壌サンプルのような、天然の供給源から単離されている（Bergey's  Manual  of  Systemic  Bacteriology，Vol.2，Sneath，P.H.A.ら、編、Williams  &  Wilkins，Baltimore，MD，1986)。精製されたB.coagulans株は、エンドヌクレアーゼ（例えば、米国特許第5,200,336号)、アミラーゼ（米国特許第4,980,180号)、ラクターゼ（米国特許第4,323,651号）、およびシクロ-マルト-デキストリングルカノ-トランスフェラーゼ（米国特許第5,102,800号）を含む酵素の供給源として役立っている。B．coagulansは、乳酸を産生するために使用されている（米国特許第5,079,164号)。B.coagulansの株（L．sporogenes  Sakaguti  &  Nakayama(ATCC  31284）と呼ばれる）は、他の乳酸産生細菌およびB.nattoと組み合わされて、蒸かした大豆からの発酵食品を生じる（米国特許第4,110,477号)。B.coagulans株はまた、疾患を減少させ、そして飼料効率を改善し、それゆえ動物の成長速度を増大させるために、家禽および家畜のための動物の飼料添加物として使用されてきた（特許文献１および特許文献２)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第９３／１４１８７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９４／１１４９２号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要旨
現在、乳酸細菌が、胃腸細菌感染、特に乳児突然死症候群（SUDS）を予防する共生活性を示す能力を有するということが発見されている。非病原性乳酸細菌が好ましく使用され、好ましい実施態様では、芽胞形成Bacillus種、特にB．coagulansが用いられる。本発明は、治療組成物、治療システム、および種々の細菌胃腸感染、特にSIDSに関連する感染を処置および／または予防するための使用方法を記載する。
【００１４】
本発明の１つの局面に従って、ヒトの消化管に経口投与するために適切な薬学的に受容可能なキャリア中に生存可能な非病原性乳酸細菌を含む組成物が提供される。１つの実施態様において、Bacillus  coagulans株が、芽胞の形態で組成物に含まれる。別の実施態様において、Bacillus  coagulans株が、乾燥細胞塊の形態で組成物中に含まれる。１つの実施態様において、Bacillus  coagulans株が、103から1012コロニー形成単位／gの濃度で組成物中に含まれ、一方別の実施態様では、その濃度は、109から1013コロニー形成単位／g、105から107コロニー形成単位／g、または108から109コロニー形成単位／gである。１つの実施態様において、Bacillus  coagulans株は、ヒト乳児に経口投与するために適切な薬学的に受容可能なキャリア中に含まれ、好ましくは、粉末化した補助食品、乳児用ミルク、または経口電解質維持処方物である。
【００１５】
本発明の別の局面において、ヒトに経口投与するために適切な薬学的に受容可能なキャリアに、Bacillus  coagulans株の細胞外産物を含む組成物が提供される。１つの実施態様において、細胞外産物は、単離されたBacillus  coagulans株の培養物の上清またはろ過物である。
【００１６】
本発明の別の局面は、ヒトにおいて細菌胃腸感染を予防または処置する方法であり、非病原性乳酸細菌、好ましくはBacillus種、そしてより好ましくは単離されたBacillus  coagulans株の生存可能なコロニー形成単位を含む食物または飲料処方物をヒト被験体に経口投与する工程を含み、そしてその細菌をヒト被験体の胃腸管中で増殖することを可能にする。１つの実施態様において、ヒト被験体は、乳児突然死症候群の危険性を有する乳児である。別の実施態様において、生存可能なコロニー形成単位は、Bacillus  coagulans株の芽胞である。
【００１７】
本方法の１つの実施態様において、非病原性細菌を増殖させることを可能にする工程は、Staphylococcus種、Streptococcus種、Pseudomonas種、Escherichia  coli、Gardnerella  vaginalis、Propionibacterium  acnes、Aeromonas  hydrophilia、Aspergillus種、Proteus種、Aeromonas種、Clostridium種、Klebsiella種、Candida種およびTrichophyton種の増殖を阻害する工程をさらに含む。好ましい実施態様において、本方法は、Staphylococcus  aureus、Staphylococcus  pyrogenes、Clostridium  perfringens、C．difficile、C．botulinum、C．tributrycum、C．sporogenes、またはこれらの組み合わせを阻害する。
【００１８】
本発明の１つの局面は、ヒト幼児に経口投与するために適切な薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせた、単離されたBacillus種株を含む共生組成物であり、ここで単離されたBacillus種株は、約30℃から約65℃の温度において増殖可能であり、L(＋)右旋性乳酸を産生し、90℃までの熱に耐性の芽胞を産生し、そして乳児突然死症候群に関連する細菌の増殖を阻害する共生活性を示す。１つの実施態様において、乳児突然死症候群に関連する細菌は、Staphylococcus  aureusおよびClostridium種である。別の実施態様において、共生活性は、ヒト乳児の消化管における、単離されたBacillus種株の活気のない増殖から生じる。なお別の実施態様において、共生活性は、ヒト乳児の消化管において産生される、単離されたBacillus種株の細胞外産物から生じる。
【００１９】
本発明はまた、胃腸細菌感染、特にSIDSに関連する感染の処置、減少、または制御のための治療システムを記載し、これは、ラベルおよび本明細書中に記載されるような治療組成物を含む容器を含み、ここでこのラベルは感染を処置するための組成物の使用についての説明書を含む。
【００２０】
本明細書はいくつかの利点を有する。特に、抗生物質耐性微生物種を産生する潜在能力のために、抗生物質の使用に対する有害な効果が存在する限り、通常の抗微生物試薬を使用しない、抗微生物治療を有することは所望される。本発明は、抗生物質耐性病原体の将来の世代の産生には寄与しない。
【００２１】
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
１．ヒトにおける細菌の胃腸の感染を予防または処置する方法であって、以下の工程：
ａ）非病原性乳酸細菌の生存可能なコロニー形成単位（CFU）を含有する組成物をヒト被験体に経口投与する工程；および
ｂ）該ヒト被験体の胃腸管で該細菌の増殖を可能にする工程、
を包含する、方法。
２．前記ヒト被験体が、乳児突然死症候群の危険性を有する乳児である、項目１に記載の方法。
３．前記非病原性乳酸細菌が、Lactobacillus  acidophilus、Lactobacillus  salivarius、Lactobacillus  g.g.、Lactobacillus    planterum、Lactobacillus  delbrukeii、Lactobacillus  sporegenes、Lactobacillus  rhamnosus、Lactobacillus  casei、Bifidobacterium  longum、Bifidobacterium  bifidum、Bifidobacterium  infantus、Bacillus  coagulans、Bacillus  subtilis、Bacillus  laterosporusおよびBacillus  laevolacticusを含むものからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
４．前記細菌が、芽胞の形態にある組成物に含まれる、項目１に記載の方法。
５．前記細菌が、乾燥細胞塊の形態にある組成物に含まれる、項目１に記載の方法。
６．前記細菌が芽胞の形態にあり、そして前記方法が、適用工程の後に芽胞の出芽を可能にする工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
７．前記組成物が、組成物グラムあたり、103〜1012CFUの生存可能な細菌または芽胞を含む、項目１に記載の方法。
８．前記投与工程が、１日あたり、0.1〜50gの前記組成物を消化管へ導入する工程を含む、項目１に記載の方法。
９．前記投与工程が、１日あたり、102〜1010CFUの生存可能な細菌または芽胞を消化管へ導入する工程を含む、項目１に記載の方法。
１０．前記投与工程が、１日あたり、103〜106CFUの生存可能な細菌または芽胞を消化管へ導入する工程を含む、項目９に記載の方法。
１１．前記投与工程が、１日あたり、106〜109CFUの生存可能な細菌または芽胞の消化管への導入する工程を含む、項目９に記載の方法。
１２．前記組成物が、有効量のビフィドジェニックオリゴ糖をさらに含む、項目１に記載の方法。
１３．前記ビフィドジェニックのオリゴ糖が、フルクトオリゴ糖（FOS）、グルコオリゴ糖（GOS）、ラフィノース、および長鎖オリゴ糖からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
１４．前記オリゴ糖が約4〜100糖単位のポリマー鎖長を有するポリマーを含む、項目１に記載の方法。
１５．前記組成物が、組成物グラムあたり約10mgから約1gのFOSを含む、項目１に記載の方法。
１６．前記組成物が、組成物グラムあたり100〜500mgのFOSを含む、項目１に記載の方法。
１７．前記投与工程が、１日あたり10mg〜20gのフルクトオリゴ糖を、消化管に導入する工程を含む、項目１に記載の方法。
１８．前記投与工程が、１日あたり150mg〜5gのフルクトオリゴ糖を、消化管に導入する工程を含む、項目１に記載の方法。
１９．前記組成物が、食物物質、香料、ビタミンまたはミネラルをさらに含む、項目１に記載の方法。
２０．前記組成物が、粉末化した補助食品、包装された食品、乳児用ミルク、または経口電解質維持処方物である、項目１に記載の方法。
２１．前記経口電解質維持処方物が、塩化ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸またはグルコースを含む粉末である、項目２０に記載の方法。
２２．前記経口電解質維持処方物が、水で再水和され、45〜75mEq/lのナトリウム、20mEq/lのカリウム、35〜65mEq/lの塩化物、30mEq/lのクエン酸、20〜25g/lのグルコースおよび約5×105〜約5×107の生存可能なCFUの前記細菌/lを含む溶液を産生する、項目２０に記載の方法。
２３．前記組成物が、Bacillus  coagulansの細胞外産物をさらに含む、項目１に記載の方法。
２４．前記細胞外産物が、単離されたBacillus  coagulans株の培養物の上清またはろ過物である、項目２３に記載の方法。
２５．前記胃腸感染が、Staphylococcus  aureusまたはClostridium種を含む、項目１に記載の方法。
２６．細菌胃腸感染を阻害するための治療システムであって、ラベルおよび非病原性乳酸細菌の生存可能なコロニー形成単位（CFU）を含む組成物を含む容器を含み、ここで該ラベルは、該感染を阻害するための該組成物の使用のための説明書を含む、システム。
２７．ヒト被験体が、乳児突然死症候群の危険性を有する乳児である、項目２６に記載のシステム。
２８．前記非病原性乳酸細菌が、Lactobacillus  acidophilus、Lactobacillus  salivarius、Lactobacillus  g.g.、Lactobacillus    planterum、Lactobacillus  delbrukeii、Lactobacillus  sporegenes、Lactobacillus  rhamnosus、Lactobacillus  casei、Bifidobacterium  longum、Bifidobacterium  bifidum、Bifidobacterium  infantus、Bacillus  coagulans、Bacillus  subtilis、Bacillus  laterosporusおよびBacillus  laevolacticusを含むものからなる群から選択される、項目２６に記載のシステム。
２９．前記細菌が、芽胞の形態の組成物に含まれる、項目２６に記載のシステム。
３０．前記細菌が、乾燥細胞塊の形態の組成物に含まれる、項目２６に記載のシステム。
３１．前記細菌が芽胞の形態であり、そして前記方法が、適用工程の後に芽胞の発芽を可能にする工程をさらに含む、項目２６に記載のシステム。
３２．前記組成物が、組成物１グラムあたり103〜1012CFUの生存可能な細菌または芽胞を含む、項目２６に記載のシステム。
３３．前記投与工程が、１日あたり前記組成物の0.1〜50gを、消化管に導入する工程を含む、項目２６に記載のシステム。
３４．前記投与工程が、１日あたり102〜1010CFUの生存可能な細菌または芽胞を、消化管に導入する工程を含む、項目２６に記載のシステム。
３５．前記投与工程が、１日あたり103〜106CFUの生存可能な細菌または芽胞を、消化管に導入する工程を含む、項目３４に記載のシステム。
３６．前記投与工程が、１日あたり106〜109CFUの生存可能な細菌または芽胞を、消化管に導入する工程を含む、項目３４に記載のシステム。
３７．前記組成物が、有効量のビフィドジェニックのオリゴ糖をさらに含む、項目２６に記載のシステム。
３８．前記ビフィドジェニックのオリゴ糖が、フルクトオリゴ糖（FOS）、グルコオリゴ糖（GOS）、ラフィノース、および長鎖オリゴ糖からなる群から選択される、項目２６に記載のシステム。
３９．前記オリゴ糖が約4〜100糖単位のポリマー鎖長を有するポリマーを含む、項目２６に記載のシステム。
４０．前記組成物が、組成物１グラムあたり約10mgから約1gのFOSを含む、項目２６に記載のシステム。
４１．前記組成物が、組成物１グラムあたり100〜500mgのFOSを含む、項目２６に記載のシステム。
４２．前記投与工程が、１日あたり10mg〜20gのフルクトオリゴ糖を、消化管に導入する工程を含む、項目２６に記載のシステム。
４３．前記投与工程が、１日あたり150mg〜5gのフルクトオリゴ糖を、消化管に導入する工程を含む、項目２６に記載のシステム。
４４．前記組成物がさらに、食物物質、香料、ビタミンまたはミネラルを含む、項目２６に記載のシステム。
４５．前記組成物が、粉末化した補助食品、包装された食品、乳児用ミルク、または経口電解質維持処方物である、項目２６に記載のシステム。
４６．前記経口電解質維持処方物が、塩化ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸またはグルコースを含む粉末である、項目４５に記載のシステム。
４７．前記経口電解質維持処方物が、水で再水和され、45〜75mEq/lのナトリウム、20mEq/lのカリウム、35〜65mEq/lの塩化物、30mEq/lのクエン酸、20〜25g/lのグルコースおよび約5×105〜約5×107の生存可能CFUの前記細菌/lを含む溶液を産生する、項目４５に記載のシステム。
４８．前記組成物が、Bacillus  coagulansの細胞外産物をさらに含む、項目２６に記載のシステム。
４９．前記細胞外産物が、単離されたBacillus  coagulans株の培養物の上清またはろ過物である、項目４８に記載のシステム。
５０．前記胃腸感染が、Staphylococcus  aureusまたはClostridium種を含む、項目１に記載のシステム。
【００２２】
前記の一般的な記載および以下の詳細な記載の両方は、例示または説明のみのためであり、請求される本発明の限定ではないことが理解されるべきである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、乳酸細菌（特にBacillus種）が胃腸細菌感染を予防するかまたは制御する共生物質として、治療用組成物中で使用され得るという発見に関する。さらに議論するように、本組成物は多くの構成で処方され得る。なぜならば、細菌は、共生物質生物の種および形態に依存して、生存可能な生物として（例えば、栄養細胞または芽胞として）提示され、そして胃腸管の組織をコロニー形成するからである。この細胞／芽胞は、細菌を胃腸管の組織へと導入する目的に指向された、胃腸管に対する経口投与に適した種々の組成物中に提示され得る。
【００２４】
本明細書中に使用される「共生物質」とは、少なくとも一過性叢または内因性叢の一部を形成し、それによって宿主生物に対して有益な予防効果および／または治療効果を示す細菌をいう。共生物質は、安全であることが一般的に当業者に公知である。任意の特定の機構に拘束されることは望まないが、本発明の乳酸細菌の予防効果および／または治療効果は、優れたコロニー形成、望ましくない微生物への寄生、乳酸産生および／または抗菌活性を有する他の細胞外産物あるいはそれらの組み合わせに起因する、病原体の増殖の競合阻害から生じる。本発明の乳酸細菌のこれらの生成物および活性は、相乗的に作用して有益な共生物質効果を生成し得る。
【００２５】
本発明の方法および組成物に使用するために適切な乳酸細菌は、本発明における使用について定義されるように、L(+)乳酸を産生し、そしてD(-)乳酸を実質的に産生しない。本明細書中に記載のように、現在同定されている多くのL(+)乳酸産生細菌が存在する。L(+)乳酸産生の特性は、本発明の共生物質乳酸産生細菌の有効性に対して重要である。なぜならば、酸産生は、局所的な微生物叢環境において酸性度を増大するからである。これは、有害なおよび望ましくない細菌の増殖を支持しない。乳酸産生の機構により、共生物質は、競合するおよび有害な細菌の増殖を阻害する。さらに、L(+)乳酸が吸収されてグリコーゲン合成経路において代謝されるが、D(-)乳酸は、非常にゆっくりと代謝され、そしてアシドーシスのような代謝障害を導き得る。
【００２６】
本発明の共生物質として有用な代表的な乳酸産生細菌は、L(+)乳酸産生菌であり、これは、Lactobacillus  acidophilus、L．salivarius、L．g.g.、L．planterum、L．delbrukeii、L．sporegenes（aka  B．coagulans）、L．rhamnosus、L．casei、Bifidobacterium  longum、B．bifidum、B．infantus、Bacillus種などを包含する。
【００２７】
本発明に従って特に有用ないくつかのBacillus種が存在し、Bacillus  coagulans、Bacillus  subtilis、Bacillus  laterosporus、およびBacillus  laevolacticusを包含する。本発明の例示であるが、Bacillus  coagulansは、本発明に有用な共生物質細菌の他の乳酸産生種のためのモデルでしかなく、従って、本発明は、限定的であるとは考えられず、共生物質細菌の乳酸産生種のいずれもが本発明の組成物、治療システム、および方法において使用され得ることが意図される。
【００２８】
Bacillus種は、そのBacillus属の種間に共通の特性（特に、芽胞を形成する能力が挙げられる）に起因して、本発明に特に適している。芽胞は熱および他の状態に比較的耐性であり、この特性により、Bacillus種は製品処方物における保存（有効期限）に理想的となり、ならびに微生物感染に供される組織に対するpH、塩分などの条件下での組織の生存およびコロニー形成に理想的となる。さらなる有用な特性として、非病原性、好気性、通性および従属栄養性が挙げられ、このことによって、これらの種は安全となり、ならびに胃腸組織（腸絨毛を包含する）でコロニー形成し得る。
【００２９】
Bacillus芽胞は熱耐性であり、さらに乾燥粉末として貯蔵され得るので、それらは、芽胞を乳児用ミルク、乳児用食品および食品補充物、乳児用再水和および電解質維持組成物など（一般に、乳児に食べさせる前に再水和し、そして加熱する）の中に含ませることにより、SIDSと関連した細菌による感染の予防薬としてまたは処置のために特に有用である。これらの耐圧性芽胞はまた、加圧ウェハーおよび咀嚼錠のような加圧処理組成物において使用するために適切である。
【００３０】
B．coagulansはまた、胃腸感染の症状を示す1歳を超える小児または胃腸感染からの合併症の危険のある成人（例えば、年配者または免疫無防備状態の個体）のための共生物質胃腸処置として有用である。より高い年齢の小児および成人のために、B．coagulansはまた、食品または飲料物と混合される食品補充物、加圧ウェハーまたは咀嚼錠、あるいは経口投与に適した類似の周知の組成物として経口投与される。
【００３１】
従って、本発明の１つの局面は、乳児におけるSIDS関連細菌の増殖の阻害に関する。この阻害は、腸微生物叢の健常集団を促進することにおいて、阻害された生物が最終的にSIDSの原因であるか否かに関わらず、価値を有する。
【００３２】
本発明に有用な種々の異なるBacillus種が存在し、これには商業的な供給源および公共の供給源（例えば、American  Tissue  Culture  Collection（ATCC））を介して入手可能な多くの異なる株が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Bacillus  coagulans株はATCC受託番号15949、8038、35670、11369、23498、51232、11014、31284、12245、10545および7050として入手可能である。Bacillus  subtilis株はATCC受託番号10783、15818、15819、27505、13542、15575、33234、9943、6051a、25369、11838、15811、27370、7003、15563、4944、27689、43223、55033、49822、15561、15562、49760、13933、29056、6537、21359、21360、7067、21394、15244、7060、14593、9799、31002、31003、31004、7480、9858、13407、21554、21555、27328および31524として入手可能である。Bacillus  laterosporus株はATCC受託番号6456、6457、29653、9141、533694、31932および64（Bacillus  laterosporus  BODを含む）として入手可能である。Bacillus  laevolacticus株はATCC受託番号23495、23493、23494、23549および23492として入手可能である。
【００３３】
これらの種々のBacillus種の細胞培養物、細胞ペーストおよび芽胞調製物を形成する増殖は、一般に当該分野において周知である。Bacillus  coagulansについての例示的な培養および調製方法が本明細書中に記載され、そして本発明の他の乳酸産生細菌の増殖についても容易に使用および／または改変され得る。
【００３４】
胃腸細菌感染を制御、処置または減少するための共生物質としてBacillus  coagulansを使用する、例示的な方法および組成物が、本明細書中に記載される。
【００３５】
Ａ．Bacillus  coagulans組成物
本発明は、腸管における種々の細菌感染の生物学的制御のために例示的であり、そして好ましい共生物質としての精製されたBacillus  coagulansの使用を記載する。
【００３６】
B.coagulansは耐熱性の芽胞を形成するので、この種は、微生物感染を処置するための薬学的組成物を作製するために特に有用である。薬学的に受容可能なキャリア中に生存可能なB.coagulans芽胞細胞を含む処方物は、予防用および治療用組成物の両方を作製ならびに使用するのに特に好ましい。
【００３７】
B.coagulansは非病原性であり、そして一般に安全（すなわち、U.S.Food  and  Drug  AdministrationによるGRAS分類）とみなされる。グラム陽性桿菌は1.0μmより大きい細胞直径を有し、胞子嚢の可変性膨張を伴い、パラ胞子結晶の生成を伴わない。
【００３８】
１．B.coagulansの増殖
B.coagulansは好気性および通性であり、代表的には２（重量）％までのNaClを含む栄養ブロス（pH5.7〜6.8）中で増殖されるが、NaClもKClも増殖には必要とされない。約4〜約６のpHが芽胞からの増殖の開始に最適である。約30℃〜約55℃で最適に増殖され、そして芽胞は低温殺菌を耐え得る。これは、硝酸塩または硫酸塩供給源を資化することによって、通性および従属栄養性増殖を示す。B.coagulansのさらなる代謝特徴は表１に要約される。
【００３９】
表１
特徴 B.coagulans応答
カタラーゼ産生                                  あり
D-グルコース由来の酸                            あり
L-アラビノース由来の酸                          可変性
D-キシロース由来の酸                            可変性
D-マンニトール由来の酸                          可変性
グルコース由来の気体                            あり
カゼインの加水分解                              可変性
ゼラチンの加水分解                              なし
デンプンの加水分解                              あり
クエン酸塩の資化                                可変性
プロピオン酸塩の資化                            なし
チロシンの分解                                  なし
フェニルアラニンの分解                          なし
亜硝酸塩へ還元された硝酸塩                      可変性
必要とされるアラトイン（Allatoin）または尿酸塩  なし。
【００４０】
B.coagulansは種々の培地中で増殖され得るが、特定の増殖条件が高レベルの芽胞化を生じる培養物を生成することが、見出されている。例えば、芽胞化は、培養培地が1リットルあたり10mgの硫酸マンガンを含む場合増強され、約80:20の芽胞対栄養細胞の比を生じる。さらに、特定の増殖条件は、本発明に特に適した、すなわち微生物感染を制御する、代謝酵素のスペクトルを含む細菌芽胞を生成する。これらの特定の増殖条件によって生成される芽胞が好ましいが、任意の適合した増殖条件により生成される芽胞が本発明に有用なB.coagulansを生成するのに適している。
【００４１】
B.coagulansの増殖に適した培地には、Nutristart  701、PDB（ポテトデキストロースブロス）、TSB（トリプシンダイズ（tryptic  soy）ブロス）およびNB（栄養ブロス）が挙げられ、これらはすべて周知であり、そして種々の供給源から入手可能である。家禽および魚組織の酵素消化物を含む、ならびに食品酵母を含む培地補充物が特に好ましい。好ましい補充物は、少なくとも60％のタンパク質および約20％の複合糖質および６％の脂質を含む培地を生成する。培地は種々の商業的供給源、特にDIFCO（Detroit,MI）、Oxoid（Newark,NJ）、BBL（Cockeyesville,MD）およびTroy  Biologicals（Troy,MI）から入手され得る。
【００４２】
B.coagulansの調製のための好ましい手順は、実施例に記載される。
【００４３】
２．抗菌活性を有する細胞外産物
B.coagulans培養物は、抗菌活性を有する分泌生成物を含む。これらの分泌生成物は本発明に従う治療用組成物において有用である。細胞培養物は上記のように収集され、そして培養上清は、ろ過または遠心分離、あるいはその両方によって回収され、そして得られた上清は治療用組成物に有用な抗菌活性を含む。B.coagulans細胞外産物の調製は実施例に記載される。
【００４４】
B.coagulansの細胞外産物は、乳児に与える食品および液体のような組成物中に含まれ得る。
【００４５】
３．B.coagulansの供給源
精製B.coagulans細菌は、以下の受託番号を使用してAmerican  Type  Culture  Collection（Rockville,MD）から入手可能である：B.coagulans  Hammer  NRS  T27（ATCC＃11014）、B.coagulans  Hammer  Ｃ株（ATCC＃11369）、B.coagulans  Hammer（ATCC＃31284）およびB.coagulans  Hammer  NCA4259（ATCC＃15949）。精製B.coagulans細菌はまた、以下の受託番号を使用してDeutsche  Sammlung  von  Mikroorganismen  und  Zellkuturen  GmbH（Braunschweig,Germany）から入手可能である：B.coagulans  Hammer  1915ＡＬ（DSM＃2356）、B.coagulans  Hammer  1915ＡＬ（DSM＃2383、ATCC＃11014に対応する）、B.coagulans  HammerＡＬ（DSM＃2384、ATCC＃11369に対応する）およびB.coagulans  HammerＡＬ（DSM＃2385、ATCC＃15949に対応する）。B.coagulans細菌はまた、Sabinsa  Corporation（Piscataway,NJ）のような商業的供給者から入手され得る。
【００４６】
これらのB.coagulans株およびこれらの増殖必要条件は、以前に記載されている（Bakerら、Can.J.Microbiol.6:557-563、1960；Blumenstock、「Bacillus  coagulans  Hammer  1995  und  andere  thermophile  oder  mesophile、sauretolerante  Bacillus-Arten-eine  taxonomische  Untersuchung」、Doctoral  thesis、Univ.Gottingen、1984；Nakamuraら、Int.J.Syst.Bacteriol.、38:63-73、1988）。B.coagulansの株はまた、周知の手順（Bergey’s  Manual  of  Systemic  Bacteriology、2巻、1117頁、Sneath、P.H.A.ら編、Williams＆Wilkins、Baltimore、MD、1986）を使用して天然の供給源（例えば、熱処理した土壌サンプル）から単離され得る。本明細書中に記載される結果は、American  Type  Culture  Collection（ATCC＃31284）から得たB.coagulans  Hammer（これは本明細書中に記載のように増殖させ、そして凍結乾燥アリコートで−20℃で保存された）を用いて得られた。本明細書中に記載される特性を示す、全てのB.coagulansはこの株の等価物とみなされる。
【００４７】
B.coagulansは、この細菌がもともと記載されるように、Lactobacillus  sporogenesと呼ばれていたという事実を考慮して、以前はLactobacillusとして間違って特徴付けられていた（Nakamuraら、上述を参照のこと）。しかし、これは間違っている。なぜならば、本発明の細菌は芽胞を生成し、そして代謝を通じてL(+)-乳酸を排出するからであり、両方の局面はその有用性に重要な特徴を提示する。その代わり、これらの発生および代謝の局面は、細菌が乳酸bacillusとして分類されることを必要とし、それゆえ改名された。
【００４８】
４．B.coagulansの共生物質抗菌活性
B.coagulans活性によって阻害される病原性腸細菌には、Staphylococcus  aureus、S.epidermidis、Streptococcus  pyogenes、S．spp.、Pseudomonas  aeruginosa、Escherichia  coli（腸管出血性（enterohemorragic）種）、Clostridium種（C．perfingens、C.difficile、C.difficile、C．botulinum、C．tributrycum、およびC．sperogenesを含む）、Gardnerella  vaginalis、Propionibacterium  acnes、Aeromonas  hydrophilia、Aspergillus種、Proteus種およびKlebsiella種が挙げられる。これらの病原体は、種々の胃腸障害（SIDSおよび当該分野で周知の同様の状態を含む）を引き起こし得る。従って、これらの病原体を阻害する共生物質を含有する組成物の使用は、これらの病原体による感染と関連した状態を予防または処置することにおいて有用である。
【００４９】
B.coagulansは乳酸産生細菌の共通特性によって例示的であるが、本発明の乳酸細菌を含む治療用組成物は、上記病原体の多くに対して使用され得る。さらに、本発明の治療用組成物は、腸組織への経口投与のために処方される場合、SIDSと関連した細菌による感染を処置するために使用され得ることが意図される。
【００５０】
Ｂ．ビフィドジェニック（bifidogenic）オリゴ糖
ビフィドジェニックオリゴ糖は、本発明の文脈において使用されるように、本発明の乳酸細菌の増殖を優先的に促進するために特に有用な、１つのクラスの糖である。これらのオリゴ糖は、フルクトオリゴ糖（FOS）、グルコオリゴ糖（GOS）、および病原性細菌によって容易に消化されない他の長鎖オリゴ糖ポリマーを包含する。優先的増殖は、病原性細菌に比較して乳酸細菌のこのクラスの栄養要求性に起因して促進される。ビフィドジェニックオリゴ糖は、腸管中の常在性のBifidobacteriaおよびLactobacillusによってほとんど独占的に資化され、そしてBacillusによって同様に資化され得る長鎖ポリマーである。Clostridium、Staphylococcus、SalmonellaおよびE.coliのような有害な細菌はFOSまたは他のビフィドジェニックオリゴ糖を代謝し得ず、それゆえ本発明の乳酸細菌（特に、Bacillus）と組み合わせたこれらのビフィドジェニックオリゴ糖の使用は有益および共生の細菌を増殖させ、そして任意の望ましくないまたは病原性の微生物と置き換えられる。
【００５１】
本発明の治療用組成物におけるビフィドジェニックオリゴ糖の使用は相乗効果を提供し、それによって本発明の共生物質含有組成物の効果を増加させる。この相乗作用は、少なくとも共生物質細菌に対する食品補充物（これは感染組織において多くの他の細菌種よりも共生物質細菌の増殖を優先的に選択する）を増加させることによって細菌の増殖能を増加させることにより明らかである。従って、処方物におけるビフィドジェニックオリゴ糖の存在は、共生物質細菌を増殖させ、それゆえその利益を提供する能力を増加させることによってより効果的な微生物阻害を可能にする。
【００５２】
ビフィドジェニックオリゴ糖は、治療用組成物において単独または乳酸細菌と組み合わせてのいずれかで使用され得る。すなわち、ビフィドジェニックオリゴ糖の増殖促進活性に起因して、本発明は、本発明のビフィドジェニックオリゴ糖を乳酸細菌増殖促進量で含む組成物を意図する。本明細書中に示されるように、これらの量は、共生物質は、任意の代謝量の栄養オリゴ糖に応答するので広範に変化し得、従って、本発明は特に限定される必要はない。
【００５３】
好ましいおよび例示的なビフィドジェニックオリゴ糖は、FOSであるが、他の糖もまた単独または組み合わせのいずれかで資化され得る。
【００５４】
FOSは、種々の天然の供給源（商業的供給者を含む）から得られ得る。天然の供給源から生成物が単離された場合、その成分は広範に変化し得、そしてなお有益な薬剤、すなわち、FOSを提供する。FOSは代表的には約4〜200の糖単位のポリマー鎖長を有し、より長い長さのものが好ましい。例えば、純度は、その処方物中に機能的なFOSが存在する限り、広範に変化し得る。好ましいFOS処方物は、グルコース、フルクトースまたはショ糖のような、単純糖（単糖類または二糖類）と比較して、少なくとも50重量％のフルクトオリゴ糖、好ましくは少なくとも80％のフルクトオリゴ糖、より好ましくは少なくとも90％のフルクトオリゴ糖、そして最も好ましくは少なくとも95％のフルクトオリゴ糖を含む。糖含量および組成は、周知である種々の複合糖質分析検出方法のいずれかによって決定され得る。
【００５５】
FOSの好ましい供給源には、イヌリン、Imperial  Suiker  Unie（Sugar  Land、Texas）からのFrutafit  IQ（商標（tm））、Americal  Ingredients,Inc.（Anaheim,CA）からのNutraFlora（商標）、Fabrchem,Inc.（Fairfield,CT）およびFruittrimfat  Replacers  and  Sweeteners（Emeryville,CA）が挙げられる。ビフィドジェニックオリゴ糖（例えば、GOS）および他の長鎖オリゴ糖もまた、供給メーカーから市販によって入手可能である。
【００５６】
Ｃ．治療組成物
腸毒素を産生し得る生物による胃腸の細菌感染(特に、乳児の細菌感染)およびSIDSに関連する感染の予防、処置または制御における使用に適切な、本発明の組成物には、栄養細胞および/または芽胞のコロニー形成単位(CFU)の形態で提供される、本発明に従う生の共生乳酸産生細菌、B.coagulansの細胞外抗生物質代謝産物、またはそれらの組合せが含まれる。
【００５７】
活性成分(すなわち、生細菌または細胞外成分)は、乳児のために食物に添加するかまたは食品栄養補助剤として直接使用する(例えば、乳児処方物と混合した粉末として、または液体乳児ビタミンに使用されるものと同様に、点滴アプリケーターで投与される、矯味矯臭した緩衝化溶液で)乳児処方物の製造に使用するに適切な処方物中に、最終組成の約0.1重量％〜約50重量％、好ましくは１重量％〜10重量％を含む。
【００５８】
本発明の治療用組成物のための処方物は、芽胞出芽および/または細菌増殖を促進するための他の共生薬剤または栄養素を含み得る。特に好ましい物質は、本明細書に記載の有益な共生細菌の増殖を促進するビフィドジェニック因子である。組成物は、公知の抗菌剤、公知の抗ウイルス剤、公知の抗真菌剤(これらはすべて、Bacillus生物または芽胞が活性薬剤である場合、Bacillus活性薬剤の生存能の維持に適合性でなければならない)を含み得る。組成物中の他の薬剤は、共同作用剤または活性薬剤のいずれかであり得る。好ましくは、公知の抗菌剤、抗ウイルス剤および/または抗真菌剤は、Bacillusと適合性の共生薬剤である。組成物はまた、公知の抗酸化剤、緩衝化剤、および他の薬剤(例えば、着色剤、矯味矯臭薬、ビタミンまたはミネラル)を含み得る。ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、またはカルボキシメチルセルロースのような濃稠剤が、組成物に添加され得る。
【００５９】
本発明の治療用組成物の好ましいさらなる成分は、当該分野において周知の種々雑多の着色剤または矯味矯臭薬、ビタミン、繊維、酵素、および他の栄養素を含み得る。好ましいビタミンは、ビタミンＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、葉酸、Ｋ、ナイアシンなどのビタミンを含む。繊維の好ましい供給源は、オオバコ、米糠、オートムギ糠、トウモロコシ糠、コムギ糠、果実繊維などの繊維を含む繊維の種々の供給源のいずれをも含む。食事または栄養補助の酵素(例えば、ラクターゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、カタラーゼなどの酵素)もまた含まれ得る。
【００６０】
代表的なビタミンは、以下のように組成物中で使用される；コリン(160ml/lb)、B-6(10mg/lb)、B-12(２ug/lb)、ナイアシン(120mg/lb)、パントテン酸(４mg/lb)、リボフラビン(12mg/lb)、イノシトール(１gm/lb)、チアミン(1.5mg/lb)、葉酸(0.5mg/lb)など。
【００６１】
本発明の組成物に使用され得る化学物質は、種々の商業的供給源(Spectrum  Quality  Products，Inc(Gardena，CA)、Seltzer  Chemicals，Inc.,(Carlsbad，CA)およびJarchem  Industries，Inc.(Newark，NJ)を含む)から得られ得る。
【００６２】
活性薬剤が、経口投与に生理学的に適合性であるキャリアと組み合わせられる。すなわち、キャリアは、活性成分の懸濁液を作製する場合に使用される界面活性特性を除いて、好ましくは実質的に不活性である。組成物は、他の生理学的に活性な構成成分(これは組成物中の活性薬剤の効力を妨害しない)を含み得る。
【００６３】
具体的には、共生乳酸細菌には、摂取されて乳児(一般には、２週齢から６ヶ月齢)の消化管内微生物叢の部分を形成し得る、生存可能な細菌または芽胞(まとめて、「コロニー形成単位」と呼ばれる)が含まれる。
【００６４】
代表的な治療用組成物は、１ｇの投薬処方物中に、10３〜10１２、好ましくは２×10５〜10１０コロニー形成単位（CFU）の生存可能乳酸細菌（すなわち、栄養細胞）または細菌芽胞を含む。1つの好ましい実施態様において、治療用組成物は、約10mg〜１gのビフィドジェニックオリゴ糖、好ましくはフルクトオリゴ糖を含み得る。処方物は、種々のキャリアおよび/または結合剤のいずれかを使用して、重量を完成され得る。好ましいキャリアは、１gの投薬総重量を完成するに十分な量で添加された、微結晶性セルロース(MCC)である。本発明の治療用組成物についての特に好ましい処方物は、実施例に記載される。
【００６５】
関連する実施態様において、本発明は、ビフィドジェニックオリゴ糖を含む治療用組成物を企図する。組成物は、代表的には、乳酸細菌増殖を促進する量のビフィドジェニックオリゴ糖を含む。増殖促進量は、広範に変化し得、そして本明細書に記載のような増殖アッセイにより容易に測定され得る。組成物は、代表的には、投薬量、投与経路、および意図される用途に依存して、１gの組成物あたり10mg〜１gのビフィドジェニックオリゴ糖を含む。
【００６６】
キャリアは、粉末化された形態の処方物のための固体ベースの乾燥物質であり得、そして液体またはゲル形態の処方物のための液体もしくはゲルベースの物質であり得、これらの形態は、一部、投与経路または投与様式に依存する。
【００６７】
乾燥処方物のための代表的なキャリアには、トレハロース、マルト-デキストリン、米粉、微結晶性セルロース(MCC)、ステアリン酸マグネシウム、イノシトール、FOS、グルコ-オリゴ糖(GOS)、デキストロース、スクロース、タルクなどのキャリアが挙げられる。
【００６８】
組成物が乾燥しており、そして組成物がケーキングする性向(成分である芽胞、塩、粉末、およびオイルの粘着)を作り出す気化オイル(evaporated  oil)を含む場合、成分を分散させる乾燥賦型剤であって、ケーキングを防ぐ乾燥賦型剤を含むことが好ましい。例示的な抗ケーキング剤には、MCC、タルク、ケイ藻土、非晶質シリカなどが挙げられ、代表的には、約１〜95重量％の量で添加される。
【００６９】
再水和される乾燥処方物(例えば、乳児処方物、果実風味の飲料混合物)または乾燥状態で乳児に与えられる乾燥処方物(例えば、咀嚼可能なオブラート、歯生期乳児用錠剤(teething  tablet))が水和処方物よりも好ましい。乾燥処方物(例えば、粉末)は、市販の食品(例えば、乳児処方物、裏ごし食品(strained  prepared  food)、アイスクリーム、またはアイスミルク)を補充するために添加され得る。乳児に適切な処方物の型は、親または乳幼児保護者によって容易に決定されるが、一般には、より若年の乳児(約４ヶ月齢以下)には、液体処方物(例えば、電解質組成物および乳児処方物)が適切であり、より成長した乳児(約４ヶ月から６ヶ月以上)には、固体処方物が適切である。液体形態で乳児に与えられる組成物のためには、好ましくは、B．coagulans芽胞が乳児処方物、乳児食品または乳児栄養補助剤、乳児再水和および電解質維持組成物、ならびに使用前に再水和される同様な型の組成物に含まれる。これらは、使用前に加熱(約55℃まで)および冷却され得る。
【００７０】
キャリアは、好ましくは、例えば、B．coagulansが懸濁され得る処方物であり、より好ましくは、乳児に与えられる前に使用者による水和のために懸濁され得る処方物である。例えば、処方物は、B．coagulans芽胞が混合および懸濁されている、任意の標準的な粉末化乳児処方物であり得る。これは、次いで、使用前に、調製(水和)される。同様に、B．coagulans芽胞は、グルコース、クエン酸カリウム、塩化ナトリウム、および/またはクエン酸ナトリウムを含む、粉末化再水和処方物に懸濁され得る。これに、使用前に水が加えられて、例えば、約５×10５〜５×10７CFUの細菌/l、45〜75mEq/lのナトリウム、20mEq/lのカリウム、35〜65mEq/lの塩素、30mEq/lのクエン酸および25g/lのグルコースを含有する溶液が作製される。
【００７１】
適切な液体またはゲルベースのキャリア、例えば、水および生理学的塩溶液、尿素、アルコールおよびグリコール(例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、およびプロピレングリコール)などが、当該分野で周知である。好ましくは、水ベースのキャリアは、ほぼ中性のpHである。
【００７２】
適切な液体キャリア、例えば、水、果汁、グルコースまたはフルクトース溶液、生理学的電解質溶液などが、当該分野で周知である。これらは、冷蔵または凍結して保存され得る(例えば、凍結アイスキャンディー(popsicle)として)。好ましくは、水ベースのキャリアは、ほぼ中性のpHである。組成物はまた、天然のもしくは合成の矯味矯臭薬および食品品質着色剤(food-quality  coloring  agent)(これらはすべて乳酸細菌の生存可能性の維持と適合性でなければならない)を含み得る。周知の濃稠剤、例えば、コーンスターチ、グアーガム、キサンタンガムなどが、組成物に添加され得る。
【００７３】
芽胞を含む液体ベースの組成物が提供される場合、長期の保存を促進するために、芽胞出芽インヒビターを含ませることが望ましい。任意のインヒビターが使用され得、したがって本発明は限定として解釈されるべきではない。代表的で好ましいインヒビターには、当該分野において周知の過剰生理食塩水(hyper-saline)キャリア、メチルパラベン、グアーガム、ポリソルベート、保存剤などの出芽インヒビターが含まれる。
【００７４】
適切なキャリアには、水性キャリアおよび油性キャリア(例えば、白色ワセリン、イソプロピルミリステート、ラノリンもしくはラノリンアルコール、鉱油、芳香性油(fragrant  oil)もしくは精油、キンレンカ抽出油(nasturtium  extract  oil)、ソルビタンモノ-オレエート、プロピレングリコール、セチルステアリルアルコール(共にまたは種々の組み合わせで)、ヒドロキシプロピルセルロース(MW＝100,000〜1,000,000)、界面活性剤(例えば、ステアリン酸ポリオキシルまたはラウリル硫酸ナトリウム)を含み、そしてローション、ゲル、クリーム、または半固体組成物を形成するために水と混合される。他の適切なキャリアは、油中水型エマルジョンまたは水中油型エマルジョン、ならびに乳化剤および軟化剤と溶媒(例えば、スクロースステアレート、スクロースココエート、スクロースジステアレート、鉱油、プロピレングリコール、2-エチル-1,3-ヘキサンジオール、ポリオキシプロピレン-15-ステアリルエーテル、および水)との混合物を含む。例えば、水、グリセロールステアレート、グリセリン、鉱油、合成鯨蝋、セチルアルコール、ブチルパラベン、プロピルパラベン、およびメチルパラベンを含むエマルジョンが市販されている。保存剤もまたキャリア中に含まれ得、これには、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、およびエチレンジアミン四酢酸塩が含まれる。周知の矯味矯臭剤および/または着色剤もまたキャリア中に含まれ得る。組成物はまた、グリセロールまたはポリエチレングリコール(MW＝800〜20,000)のような可塑剤を含み得る。キャリアの組成は、活性成分の薬理学的活性または乳酸細菌もしくはBacillus芽胞の生存能力に顕著に干渉しない限り、変化され得る。
【００７５】
治療用組成物は、実施例にさらに詳細に記載されるように、例えば、液体、粉末化食品栄養補助剤、固形食品、パッケージされた食品(foor)、オブラートなどで、種々の方法の経口投与に適切であるように処方され得る。他の処方物は、当業者に容易に明らかである。
【００７６】
Ｄ．  細菌感染を処置するための治療方法
本発明は、本発明の治療用組成物または治療システムを使用して、胃腸細菌感染を処置、減少、または制御するための方法を意図する。開示された処置方法は、胃腸感染に関連する病原性細菌増殖を阻害し、そしてまたこれらの病原性感染の症状を減少させる。
【００７７】
共生乳酸細菌、特にB．coagulansは、一般に、当業者により安全と見なされ、したがって食糧でのもしくは食品栄養補助剤としての摂取に適切であると見なされる。
【００７８】
本発明の方法は、細菌感染を処置または予防するために、ヒトまたは動物の胃腸管へ、生存乳酸細菌を含む組成物を投与することを包含する。投与は、好ましくは、経口投与と適合性である液体、粉末、固形食品などの処方物を使用してなされる。すべてが、当該分野において周知の方法を使用して本発明の治療用組成物を含むように処方される。
【００７９】
本発明の方法は、腸における腸毒素産生と関連する症状を処置または予防するために、ヒトまたは動物へ、乳酸細菌細胞および/または芽胞または単離された細胞外B．coagulans抗生物質性代謝産物を含有する組成物を投与することを包含する。特に、ヒト乳児のためには、方法は、乳児に、例えば、B．coagulansを食品でまたは食品栄養補助剤として投与することを包含する。経口投与は、好ましくは、既に食品に処方されているかまたは使用者により食品に添加される組成物としてのいずれかの水性懸濁液、エマルジョン、粉末もしくは固体においてである。腸への投与はまた、肛門坐薬の形態(例えば、ゲルまたは半固体処方物)であり得る。このようなすべての処方物は、標準的な方法を使用して作製される。
【００８０】
治療用組成物の投与は、好ましくは、本発明の治療用組成物を含む、ゲル、懸濁液、エアロゾルスプレー、カプセル、錠剤、粉末、または半固体処方物(例えば、坐薬)を使用して、腸に対してである。すべてが、当該分野において周知の方法を使用して処方される。
【００８１】
細菌感染の予防または処置に有効である活性共生乳酸細菌を含む組成物の投与は、一般に、１日〜１ヶ月までの間、１投薬あたり10mg〜10gの組成物での１〜10回の投薬からなる。投与は、一般に、12時間ごとに１回から４時間ごとに１回である。好ましくは、１〜７日間、約0.1g〜５g/用量の１日あたり２〜４回の組成物投与が、細菌感染の予防または処置に十分である。もちろん、特定の経路、投薬量、投与の時期は、一部、特定の病原体ならびに/または処置される状態およびその状態の程度に依存する。
【００８２】
好ましい方法は、１日あたり103〜1012の生存細菌または芽胞の投与を含み、好ましくは１日あたり105〜1010、そしてより好ましくは約５×108〜109の生存細菌または芽胞の投与を含む。処置される状態がSIDSであり、そして患者が６ヶ月齢を下回る乳児である場合、投薬量は、１日あたり、代表的には10３〜10６、好ましくは約5,000〜10５、そしてより好ましくは約10,000〜50,000の生存CFUの細菌または芽胞である。処置される状態がSIDSであり、そして患者が６ヶ月齢を超える乳児である場合、投薬量は、１日あたり、代表的には10６〜10９、好ましくは約50,000〜250,000、そしてより好ましくは約150,000〜200,000の生存CFUの細菌または芽胞である。
【００８３】
さらに、本発明は、病原体の増殖に対して優先的に共生乳酸細菌の増殖を促進するために、１日あたり10mg〜20gのビフィドジェニックオリゴ糖、好ましくはフルクトオリゴ糖、好ましくは１日あたり約50mg〜10g、そしてより好ましくは約150mg〜５gを含む組成物の経口投与を包含する方法を意図する。この方法は、本明細書に記載される共生乳酸細菌を使用する処置方法と組み合わされ得る。
【００８４】
細菌感染の処置のための特定の方法は、実施例に記載されており、これには、乳児突然死症候群(sudden  infant  distress  syndrome；SIDS)などが挙げられる。
【００８５】
Ｅ．  細菌感染を処置するための治療システム
本発明はさらに、ラベルおよび本発明に従う治療用組成物を含む容器を含む、細菌感染を処置、減少、および/または制御するための治療システムを意図し、ここで、上記ラベルは、上記感染を処置するための組成物の使用のための使用説明書を含む。
【００８６】
代表的には、このシステムは、本発明の治療用組成物を含むパッケージの形態で存在するか、またはパッケージング物質との組み合わせで存在する。パッケージング物質は、パッケージの成分の使用のためのラベルまたは使用説明書を含む。使用説明書は、本発明の方法または組成物について本明細書に記載されるような、パッケージングされた成分の意図される使用を示す。
【００８７】
例えば、このシステムは、１つ以上の単位投薬量の、本発明に従う治療用組成物を含み得る。あるいは、このシステムは、大量の治療用組成物を含み得る。ラベルは、適切なように単位用量またはバルク形態のいずれかで治療用組成物を使用するための使用説明書を含み、そして組成物の保存、疾患表示、投薬量、投与経路および様式などに関する情報を含み得る。
【００８８】
さらに、特に意図される使用に依存して、このシステムは必要に応じて、以下の成分のうちの１つ以上を、組み合わせてかまたは別個のパッケージでのいずれかで含み得る：ビフィドジェニックオリゴ糖、矯味矯臭薬、キャリアなどの成分。１つの特に好ましいシステムは、治療方法における使用のために、共生物質を処方物と組み合わせるための使用説明書と共に、従来の乳児液体処方物生成物との組合せでの使用のためのBacillus芽胞の単位用量パッケージを含む。
【００８９】
他に規定されない限り、本明細書で使用される全ての科学用語および技術用語は、関連する技術分野の当業者により通常に理解されるのと同じ意味を有する。他に言及されない限り、本明細書で用いられるかまたは意図される技術は、当業者に周知の標準的な方法論である。実施態様の例は、例示のためだけのものである。
【００９０】
本明細書および下記の請求の範囲を通じて、その文脈が他を要求しない限り、用語「含む」およびその変形は、言及された任意の要素の包括的な意味を有するが、言及されていない要素の排除を意味しないことが理解される。
【実施例】
【００９１】
本発明に関する以下の実施例は、例示であり、もちろん、本発明を特に制限するものとして解釈されるべきではない。さらに、当業者の技術範囲内にある、現在公知であるかまたは今後開発される、本発明のこのようなバリエーションは、本明細書中以下で請求される本発明の範囲内にあるとみなされるべきである。
【００９２】
実施例１：B．coagulans培養物の調製
B.coagulans  Hammer細菌（ATCC#31284）は、標準的なエアリフト（airlift）醗酵容器を30℃で使用して、５gのペプトン、３gの肉抽出物、10〜30mgのMnSO４、および1,000mlの蒸留水を含み、pH7.0に調製された栄養ブロス中に接種されて、そして細胞密度を約108〜109細胞/mlまで増殖させた。芽胞化のために受容可能なMnSO４の範囲は１mg/l〜１g/lである。栄養細胞は65℃まで活発に繁殖し得、そして芽胞は90℃まで安定である。醗酵後、B.coagulans  Hammer細菌細胞または芽胞を標準的な方法（例えば、ろ過、遠心分離）を使用して回収し、そして回収した細胞および芽胞を凍結乾燥、噴霧乾燥、風乾または凍結させ得る。本明細書中に記載されるように、細胞培養物からの上清を回収し、そして本発明の処方物中において有用な抗菌活性を有する、B.coagulansによって分泌された細胞外薬剤として使用され得る。
【００９３】
上記の培養物由来の代表的な収量は、乾燥前は約109〜1013生存芽胞の範囲であり、より代表的には１ｇあたり約1000〜1500億細胞／芽胞である。芽胞は、乾燥後、室温で保存した場合は7年目までは少なくとも90％の生存率を維持し、それゆえ室温でのB.coagulans  Hammer芽胞を含む組成物の効果のある有効期限は約10年である。
【００９４】
実施例２：B．coagulans芽胞の調製
乾燥されたB.coagulans芽胞の培養物を、以下のように交互に調製した。1000万個の芽胞を、24gのポテトデキストロースブロス、10gの家禽および魚肉片の酵素消化物、5gのFOSおよび10gのMnSO4を含む１リットル培養物に接種した。培養物を高酸素環境下で、37℃にて72時間維持し、培養物1gあたり約1500億個細胞を有する培養物を生成した。その後、培養物を、濾過して培養培地液体を取り除いた。そして細菌ペレットを水で再懸濁して凍結乾燥した。次いで、凍結乾燥したパウダーを、標準的な優良製造規範(GMP)を使用して微細なパウダーに粉砕した。
【００９５】
実施例３：B.coagulans細胞外産物の調製
B.coagulansの１リットル培養物を、実施例１に記載のように調製した。培養物を、FOSを5g/lで添加した場合での記載のように５日間維持し、そして培養を続けた。次いで、７日目に20mlのニンジンの果肉を添加し、培養物が飽和した(実質的に細胞分裂がない)時に、培養物を回収した。培養物をまず30分間、華氏250度でオートクレーブにかけ、次いで4000rpmにて15分間遠心した。得られた上清を回収し、0.8ミクロン(μ)フィルターを通してブーフナー漏斗で濾過した。そして濾液(通過したもの)を回収して、さらに0.2μのNalge吸引フィルターに通して濾過した。得られた濾液を回収して(約900ml)、細胞外産物を含む液体を形成し、そして、阻害研究に使用した。
【００９６】
実施例４に記載のアッセイ（Candida  albicansを使用することを除く）の後に、上記で生成した１mlの細胞外産物を生存しているB．coagulansの代わりに試験プレートに添加した。同じ培養時間の後に、約10〜25mmの阻害ゾーンを観察した。これは、実施例４の用語法を使用すると、「優れた」質の強力な抗菌活性を示した。
【００９７】
実施例４：  B.coagulansの抗菌活性
B.coagulansの細菌病原体を阻害する能力を、インビトロアッセイを使用して実証した。アッセイは、標準的な細菌病原体スクリーニング（米国食品医薬品庁）の一部であり、そして固体支持体ディスク（DIFCO(R)BACTROL(R)  disk  set）において市販されている。このアッセイにおいて、ポテト-デキストロースプレート(DIFCO(R))を標準的な手順を使用して調製し、試験した細菌の各々の種についてコンフルエントなベッド(1.5×106)を使用して個別に接種した。B.coagulansによる阻害を、１プレートあたり約８mm直径の１試験位置で10μlのブロスまたは緩衝液中の約1.5×106CFUをポテト-デキストロースプレートの中央に直接プレートして、プレート上に配置することによって試験した。最低３回の試験位置を、各アッセイについて使用した。ネガティブコントロールは、10μl滴の滅菌生理食塩水溶液であり、そしてポジティブコントロールは、10μl容量のグルタルアルデヒドであった。次いで、阻害ゾーンを測定する場合は、プレートを30℃にて約18時間インキュベートした。本明細書中で使用される場合、「優れた（excellent）阻害」とは、阻害ゾーンが直径10mm以上であったことを意味し；そして「良好な（good）阻害」とは、阻害ゾーンが直径2mmより大きいが直径10mm未満であったことを意味する。
【００９８】
ネガティブコントロールでは、阻害は認められなかった。ポジティブコントロールでは、優れた阻害(直径約16.2mm、３回の試験の平均値)が認められた。試験した腸内生物、Clostridium種およびE.coliについては、B．coagulansによる優れた阻害が認められた。Clostridium種であるC．perfringens、C．difficile、C．botulinum、C．tributrycum、およびC．sporogenesについては、阻害のゾーンが、直径15mmよりも一貫してより大きかった。同様に、優れた阻害はまた、日和見的な病原体であるPseudomonas  aeruginosaおよびStaphylococcus  aereusについて観察された。
【００９９】
実施例５：経口電解質維持溶液におけるB．coagulans
経口電解質維持粉末を、塩化ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸、グルコース、および粉末化B．coagulans芽胞（実施例２に記載するように実質的に調製した）を含有するように処方し、滅菌水または沸騰させて（そして冷却した）水で再水和する。再水和後、終濃度は：45〜75mEq/lのナトリウム、20mEq/lのカリウム、35〜65mEq/lの塩化物、30mEq/lのクエン酸、20〜25g/lのグルコース、および５×105〜５×107の芽胞/lである。香料（例えば、チェリー、オレンジ、グレープ、または風船ガム香料）が、標準的な市販の香料を使用して含め得る。粉末化処方物は、好ましくは、再水和のために１流体リットルに、または個々のアリコートに（例えば、再水和のための個々のパケットは100mlまで）パッケージングする。粉末化処方物は、再水和されるまで室温で乾燥保存する。再水和した溶液は、１週間まで冷蔵して保存される。再水和した溶液はまた、立方体またはアイスキャンディー状(popsicle）に凍結され得、そして-5℃〜-20℃で6ヶ月まで凍結され得る。
【０１００】
実施例６：補助食品としての不活性キャリア中のB．coagulans
凍結乾燥したB．coagulans（実質的に実施例１に記載するように調製した）を、粉末形態の不活性キャリア（例えば、ライスマルトデキストリン、ソルビトール、ゼラチン、粉末化ロールドオーツ（powdered  rolled  oats)、コーンスターチなど、またはキャリアの組み合わせ）と十分に混合して、約105〜108芽胞/gの最終濃度を有する懸濁液を形成する。粉末化した懸濁液を、水、ミルク、乳児処方物、果汁、または類似の液体に約0.1〜0.5g/100mlで添加し、そして乳児に経口的に与える前に混合する。
【０１０１】
実施例７：固形オブラート（wafer）処方物中のB．coagulans
凍結乾燥したB．coagulans（実質的に実施例１に記載されたように調製された）を、コムギまたはオートムギベースの混合物（水および必要に応じて塩化ナトリウム、グルコース、および/または炭酸水素ナトリウム、ならびに保存剤を含む、コムギまたはオートムギの粉末）とともに十分に混合して、約106〜109芽胞/gの最終濃度にした。混合物を圧縮して各々約0.1ｇの薄いオブラートにし、そして約50℃で、約１〜10分間、乾燥するかまたは焼いて、比較的乾燥したオブラートを生成し、これを、室温で１年間まで保存した。代替の処方物において、上記の混合物は、オブラートあたり150国際単位（IU)のラクターゼをさらに含有する。ラズベリーまたはオレンジのような香料を、風味のために添加する。
【０１０２】
実施例８：SIDSの動物モデルにおけるB．coagulans芽胞の有効性
実験用ニュージーランド白ウサギ（１〜３kg）は、B．coagulans芽胞とともにその水供給において103芽胞/mlの濃度で標準的な研究室動物条件下で１週間（自由な食物および水は、-７日〜-１日まで）提供された。ポジティブコントロール動物は、食物および水を同じ期間受けた（B．coagulans芽胞なしで）。０日目に、実験用のウサギに、108〜109個のC．perfringens  Ａ型細胞（群Ｉ）または108〜109個のC.difficile細胞（群II)を含有する５mlの生理学的緩衝化塩溶液を腹腔内投与し、そして実験用コントロールウサギ（群III）に、５mlの滅菌生理学的緩衝化塩溶液を腹腔内にモック注射する。ポジティブコントロール動物に、同様に腹腔内注射し：108〜109個のC．perfringensＡ型細胞を群IVに、108〜109個のC．difficile細胞を群Vに、そして群VIはモック注射した。各群は、10匹のウサギを含む。全てのウサギに、通常の研究室介護および103のB．coagulans芽胞/mlを含む（群I〜III）または芽胞を含まない（群IV〜VI）水を与える。０日目の注射の後、動物を、行動（嗜眠）、呼吸、および心拍数について１時間毎に、その後3日間（1〜3日目）モニターする。群IIIのコントロール動物は全て、全てのパラメーターについて全期間正常のままである。群Ｉの動物は、一般に、注射の約２〜３時間後に嗜眠し始める。群Ｉの動物のいくつかは、表在呼吸および心拍数の減少を注射の４〜６時間後までに示し、そして注射の６〜７時間後に静かに死ぬ。群IIの動物は、注射の約２〜３時間後に嗜眠し始めるが、注射の４〜６時間後までには、3日目にモニター期間が終わるまで、すべてのパラメーターについて回復し、正常であるようである。群IIIおよび群VIの動物は、１〜３日の全てにわたって正常のようである。群IVおよび群Vの動物は、注射の約１〜３時間後に全てが嗜眠するようであり、注射後２〜６時間で死ぬまでに呼吸および心拍数が減少する。
【０１０３】
従って、この動物モデルにおいて、B．coagulans芽胞の経口投与は、C．perfringensまたはC．difficileを注射した動物のSIDS症状および死を有意に阻害する。
【０１０４】
実施例９：経口投与されたB．coagulansでの乳児ボツリヌス中毒症の処置
医療施設に受け入れられた種々の症状（吐き気、下痢、嗜眠または弛緩性麻痺、食欲減退、表在呼吸、発熱）を伴う腸障害を有する３週間〜６ヶ月齢の乳児を、マウス毒素の中和試験（Arnon  S．S.ら、Lancet  i:1273-1277，1978）を使用してボツリヌス毒素の存在について試験する。乳児を、実質的に実施例５に記載するように、滅菌水中に溶解した経口電解質維持粉末を使用して経口再水和により処置する。受け付け後、乳児由来のサンプルを、C．botulinumＡ型毒素に特異的な抗毒素で中和し得る熱不安定性の物質が存在するか否かを決定する。簡単には、各乳児から得た希釈していない血清または結腸の内容物の緩衝液抽出物をアリコートに分割し、そして１つのアリコートを100℃まで10分間で過熱し、１つのアリコートは処理せず、そして３個目のアリコートを、トリプシンで処理して毒性を増大させる。３つのアリコート（各々約0.5ml）を、マウスの腹腔内に注射し、これはC．botulinumＡ型毒素が存在する場合、24時間以内に死んだ。熱不安定性毒素に対して陽性であったサンプルについては、C．botulinumＡ型毒素の存在を、抗毒素中和サンプル（これは、マウスを殺傷しない）を使用するアッセイを反復することによって確認する。処理の２日および３日後、糞便または結腸の内容物のサンプルを、C．botulinumＡ型毒素について同じアッセイを使用して試験する。
【０１０５】
入院の直後、および入院から始めの４〜６時間の間、B．coagulansを約５×105芽胞/lで含有する経口電解質維持溶液を乳児に与える。乳児に、経口電解質維持溶液を以下のように与える。５kg（11〜12lb）までの乳児に、約200〜250mlの経口電解質維持溶液を与える；約６kg（12〜15lb）の乳児に約300〜350mlを与える；約８kg（15〜20lb）の乳児に、約400〜450mlを与える；そして約10kg（20〜25lb）以上の乳児に、約500mlを与える。その後、入院後の最初の24時間の間に、乳児は、主治医によって決定されるように、必要であれば経口的に再水和される。入院後の２〜７日の間に、約５×105芽胞/日を投与するために、B．coagulans芽胞を含有する十分な経口電解質維持溶液を乳児に与える。
【０１０６】
入院において確認された乳児ボツリヌスを有する乳児は、経口再水和に陽性に反応し、そして処置の１日または２日後に採取した糞便または結腸の内容物のサンプルにおいて、C．botulinumＡ型毒素の証拠を示すものはない。
【０１０７】
実施例10：ヒト乳児におけるSIDSの予防におけるB．coagulansの有効性
SIDSは、症状が進展して表れないので、SIDS予防のヒトの研究は、ヒト乳児の統計学的な分析に依存する。研究開始時に、母性喫煙のためにSIDSの危険にある各々500人の乳児の２つの群には、通常の医学的検診によって生後２週間〜８ヶ月まで追跡する。群Ｉには、毎日、水中または乳児処方物中において、B．coagulans芽胞の用量（２週齢〜２ヶ月齢の乳児には105個の芽胞、９週齢〜６ヶ月齢の乳児には106個の芽胞、そして６ヶ月齢超〜８ヶ月齢の乳児には107個の芽胞の週間用量）を与える。群II（年齢の一致するコントロール）には、実質的に同じ量の水および乳児処方物（すなわち、B．coagulans芽胞を含まない通常の栄養必要量）を与える。別のコントロール群（群III)は、群Ｉにも群ＩＩにも含まれないが、研究の経過の間に、ＳＩＤＳで死に、そして同じ医学的施設において検死される任意の乳児を含む。この第３の群には、最初にこの研究に含まれた乳児は年齢が一致するが、１〜５ヶ月齢の乳児を含む。
【０１０８】
研究の経過の間に、群Ｉおよび群IIについては、糞便のサンプルを、毎週収集し、分析し、そして血清サンプルを毎月収集し、そして分析する。群IIIについては、糞便および血清サンプルを、検死の間にできるだけ早く得て、そしてその後に分析する。全てのサンプルを、収集の1時間以内に分析しない場合には、-20℃で、分析するまで保存し、収集の際に凍結しない場合には、氷上（0℃）で保存する。血清サンプルを、熱不安定性毒素の存在について（実質的には実施例６に記載されるように）分析し、そしてC．perfringens、C．difficile、C．botulinum、およびS．aureusに由来する毒素については、実質的に以前に記載したようにイムノアッセイを使用する（Murrell  W.G.ら、J．Med．Microbiol．39:114-127，1993）。細菌の検出および糞便サンプルの列挙を、標準的な方法（Bergey's  Manual  of  Systemic  Bacteriology，第１〜２巻、Sneath，P.H.A.ら、（編）、Williams＆Wilkins，Baltimore，MD，1986）を使用して、実質的に以前に記載されたように（Murrell  W.G.ら、J．Med．Microbiol．39:114-127，1993）行う。糞便サンプル中の熱不安定性毒素を、実質的に実施例９に記載のように決定する。
【０１０９】
群II中の乳児は、Murrell  W．Gら（J．Med．Microbiol．39:114-127，1993）によって報告される年齢の一致するコントロールに大体対応し、そして同様なSIDS関連細菌感染および毒素の発生数を有する。群IIの乳児は、Murrell  W.Gら（J．Med．Microbiol．39:114-127，1993）によって報告された年齢の一致するコントロールより大きいサンプルサイズであり、母性喫煙のためにSIDSのより高い危険にあり、それゆえSIDS関連細菌感染および毒素のいくらか高い発生率を有すると予測される。胃腸感染の症状を示し、そして糞便または結腸の内容物のサンプル中にSIDS関連細菌（C．perfringens、C．difficile、C．botulinum、またはS．aureus）の存在を確認した群IIにおける乳児を、コントロール群IIから迅速に除き、そして実質的に実施例９に記載するように、B．coagulans芽胞を含有する経口電解質維持溶液を投与する。その後、これらの処置された乳児は、B．coagulans芽胞を含有する食物または液体を投与されつづけ、そして群Ｉの乳児に含める。
【０１１０】
群Ｉの乳児は、全試験期間を生き残り、そして群ＩＩと比較して有意により少ない胃腸感染の症状を有する。群Ｉ乳児からの糞便サンプル中の細菌の計数は、群IIに比較して、C．perfrigens、C．difficile、C．botulinum、およびS．aureusについて有意により少ない。
【０１１１】
群III乳児（SIDS犠牲者）は、C．perfringens、C．difficile、C．botulinum、またはS．aureusの胃腸感染の有意に高い頻度、および群Ｉまたは群IIのいずれかにおける乳児よりも血清毒素の有意に高い頻度を示す。従って、群Ｉの乳児は、試験期間の間に、ＳＩＤＳに起因する少なくとも１人の死を有することが予想され、B．coagulans共生は、SIDSを有効に予防したようであり、そしてSIDS関連細菌またはその毒素が検出される頻度を有意に低減したようである。
【０１１２】
本発明は、上記の例において、種々の処方物を用いて記載されたが、共生組成物と適合性である種々の他のキャリア剤が、同様の結果を与えるために実施例において置換され得ることが明らかであるはずである。従って、本発明は、その精神において本発明から逸脱しない他の特定の形態において実施され得る。実施例は、全ての局面において、例示的に過ぎず、そして制限的ではないと考えられるべきであり、そして本発明の範囲は、以下の請求の範囲によって示される。請求項の法的な等価物の意味および範囲内にある全ての改変は、その範囲内に包含されるべきである。