(57)【要約】  【課題】複雑な主光線分離器をより簡単な構成素子に代え、同時にフレキシビリティ、選択性および効率を改善し、配置選択によって、最高度のコントラストおよび効率の要求される直線走査式の共焦点型レーザ走査顕微鏡での対象物からの戻り蛍光の分光分離にも適するようにする  【解決手段】照射光波長分離用分散素子と一波長領域を対象とした顕微鏡照射方向への反射のための部分的に反射する、照射光波長分離部分に配置された一つの素子とから成っていて、顕微鏡、特に共焦点顕微鏡の照射光路における波長または波長領域を調整して集束化する【選択図】  図１
2009301053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの照射光波長分離用分散素子と、
照射光の少なくとも一波長領域を顕微鏡照射方向へ反射するために、照射光の波長分離部分に配置された少なくとも部分的に反射する一つの素子とから成っていて、
顕微鏡の照射光路における照射光の波長または波長領域を調整して集束化する顕微鏡内の光学配置。
【請求項２】
照射光の波長分離部分に配置された少なくとも部分的に反射する一つの素子として、分光された波長領域に対応する幅を持った一つまたは複数の鏡が設置されている、請求項1に記載の顕微鏡内の光学配置。
【請求項３】
前記鏡を取り換えることのできる、請求項２に記載の顕微鏡内の光学配置。
【請求項４】
前記鏡が支持体の上に設置されている、請求項２または３に記載の顕微鏡内の光学配置。
【請求項５】
前記支持体が少なくとも一部透光性に構成されている請求項４に記載の顕微鏡内の光学配置。
【請求項６】
分離された波長域全体に亘る分散面に複数の前記鏡が並置されている請求項４または５に記載の顕微鏡内の光学配置。
【請求項７】
前記顕微鏡が共焦点顕微鏡である請求項１〜６の１に記載の顕微鏡内の光学配置。
【請求項８】
前記顕微鏡がレーザ走査顕微鏡である請求項１〜６の１に記載の顕微鏡内の光学配置。
【請求項９】
前記顕微鏡が共焦点蛍光顕微鏡である請求項１〜６の１に記載の顕微鏡内の光学配置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡の照射光路における照射光の波長または波長領域を調整して集束化するための装置に関するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００２】
【特許文献１】ＷＯ特許９５／０７４４７（ＤＥ ４３３０３４７Ｃ２）
【特許文献２】ＵＳ特許４５１９７０７
【特許文献３】特開平０４−９３９１５
【特許文献４】ドイツ特許１９５１０１０２Ｃ１
【０００３】
ＷＯ特許９５／０７４４７（ＤＥ
４３３０３４７Ｃ２）には、レーザ走査顕微鏡の検出空間に配置されている装置が記述されている。
このシステムではいわゆる主光線分離器８（図２）を使用しなければならない。ところが、この主光線分離器は、複数レーザが使用されるときには、レーザ光の反射では制限された選択性と実効性しか持たない非常に複雑な層の光学系であり、またエッジコントラストおよび反射能に制限があるため、フルオロクロームで計測された光は反射の際必ず大きな損量を伴う。
主光線分離器は、レーザ走査顕微鏡においては、一般には効率および選択性を最も大きく制限する素子である。
【０００４】
ＵＳ特許４５１９７０７には、分散機能および分離式検出機能を持つマルチスペクトル検出システムが記述されている。
日本特許公開４−９３９１５で紹介されているのは遠隔探知用分光システムであり、対象物の波長による選択的検出用に複数の検出素子を有している。
ドイツ特許１９５１０１０２Ｃ１に書かれているのは、蛍光光線の評価のための共焦点型蛍光顕微鏡であり、励起光路に二つのプリズム分光器を有している。第一のプリズム分光器は、最初の帯状絞りから絞り出された励起光を扇状に広げ、第二のプリズム分光器は第二の帯状絞りから絞り出された蛍光光線を扇状に広げる作用をする。なお、検出器の前には第三のプリズム分光器が配置されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
対象物は多数の箇所が同時に照射されて分析される。その場合、対象物の面全体が平行に単色で照射される。このようなシステムの場合、達成可能な共焦点効果とコントラストは透明箇所を有する被照射面のカバー率に依存する。このシステムを効果的に利用するためには、達成可能なコントラストが１：１００〜１：２５になるよう必要最低限のカバー率が保証されていなければならない。スリットの使用は「テキスタイル模様の」共焦点効果を生む結果になる。このシステムは特に多重蛍光に対しては適用上欠陥がある。
【０００６】
このシステムでは、三つの分光器を相前後して接続し、また格子状の選択素子を使用しているので、膨大な調整コストおよび高度な調整安定性が要求される。しかも、三体のプリズム分光器の製作に極めて高い精度が必要とされる。
フィールド照射におけるスリットの使用および蛍光光線の間隙からの誘導により、カバレー率が高い場合は分光器の許容分散度が極く低レベルであるために蛍光光線のかなりな部分が消失してしまい、また比較的分散度を高くする場合では、スリット間の距離を少なくともスペクトル幅だけは取らなければならないので照射光線の収量が極く僅かなものになってしまう。
このシステムでは、多重蛍光の同時分析は高いコストをかけないと不可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、従来の複雑な主光線分離器をより簡単な構成素子に代え、同時にフレキシビリティ、選択性および効率を改善することを課題としている。それは、配置選択によって、最高度のコントラストおよび効率の要求される直線走査式の共焦点型レーザ走査顕微鏡での対象物からの戻り蛍光の分光にも適するようにできるものでなければならない。
【０００８】
これは、必ずしもその必要はないが、好ましくはファイバーエンドからのレーザ光を分光写真機（スペクトログラフ）およびその像面に配置される特殊バンドセレクタを通して、すなわち蛍光に対しては全反射小型鏡付き櫛、あるいは反射光に対しては部分透過型帯状鏡を配置することによって達成される。小型鏡はレーザの波長の中で選択された場所に配置され、求める波長の光を僅かな角度だけ偏向して反射し、分光写真機のほうへ跳ね返している。
【０００９】
その場合、照射光はすべて好都合にも、レーザ光集束ファイバー直近の一点、つまりレーザ走査顕微鏡のピンホールに集束される。
照射光の波長を持つ対象物からの戻り光はバンドセレクタの小型鏡に衝突し、蛍光の場合では全部ファイバー方向に反射されるので、検出光から効果的に分離され、反射の場合では透過顕微鏡の場合と同様、光の一部は部分透過型帯状鏡を通過して、検出される。
【００１０】
これについてさらに詳しく説明する。
蛍光の場合、戻り光は、照射光とは別の波長を有しているので、小型鏡の近くにある分光写真機の像形成面に当たる。
分光器の解像力について言えば、本発明により励起波長の付近にある波長でも検出できる。これらの波長は二色分離器による場合より、はるかに励起波長に接近しており、分光器による場合に比べれば透過量が多いので損量が少なくて済む。
分光写真機による光学試験で減色および加色混合に実際に使用されるような適当な形状のガラス体を使用すれば、いずれの場合でも任意の幅および分光位置を持つ複数の領域をスペクトルから切り出して、別々の受光器に誘導することができる。
【００１１】
ミラーユニットは予想される、あるいは分析対象であるレーザ波長に対しての該当地点に配置された平行並置小型鏡付き透明ガラスプレートから成っている。
これらレーザ波長は、一緒に入射して分散され、鏡を通過した後に入射時とは別なプリズム部分で反射されてピンホールに投影される。
【００１２】
鏡は、照射波長の検出（透過光の検出）を可能にするために、部分反射もできるようになっている（反射光の場合）。
蛍光測定の場合では照射波長による検出値への影響を避けるために完全反射させる。
試料光（蛍光光線）は、少なくとも一つの分散素子を通して分光分離され、フィールドレンズにより平行化されて、次に小さな楔形ガラス体を通過して集光器から別々の場所に導かれる。集光器の後に光線衝突場所の分離を促す楔形ガラス体がなければ光線はすべて集光器の焦点に集中してしまう。
【００１３】
楔の垂直移動によってスペクトル幅（光路幅）が変化し、楔の水平移動によって興味深いスペクトル領域（光路状態）が探索できる。楔の角度は一定なので、受光器方向の偏向については全く変化がない。楔の角度は光線衝突場所を決定するが、それは楔の交換で変えることができる。さらに、例えば楔にレンズを接着させたプリズムレンズや中心から離れた分散状レンズを使用することもできる。
この場合レンズ移動の際には当該楔と共に検出器も同時に移動させねばならない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に基づく照射光の集束原理
【図２】蛍光光線または反射光の検出における本発明に基づく波長選択
【図３】楔形プリズム素子による検出光の偏向
【図４】接続された顕微鏡における光線経路
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下では本発明を図面に基づきさらに詳しく説明する。
図１では、ファイバーＦから出た光は、集光器Ｋにて平行にされ、分散素子ＤＰに衝突する。その前には光線導入のための狭いスペースで光線の向きを変えることのできるプリズム等の光の階段Ｔ(light stair case)が設置されている。
多重照射ファイバーの場合には光線集合器（図略）を設置することもできる。
分散素子ＤＰ（ここでは二分節分光プリズム）が照射光をレーザ光に含まれる個別色に分解し、その分解された光線λ1、λ2、λ3は、選択波長の光が集束する丁度その場所に小さな鏡Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３を有し、その他の部分は透明になっているミラー保有体である素子ＳＴに到達する。つまり、レーザ光の波長が集束するところでは必ず小さな鏡が、例えば鏡保有ガラス棒として配置されている。
【００１６】
照射光線が分光プリズムの中心から離れて上方部に導入されるので、個々の部分光線はレンズＬ1の上方部に入り、そこから少し斜め下方の方向に進んで小型鏡Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３上に集束し、そこでの反射と同時に光路はさらに下方に傾き、レンズＬ１を通って素子ＤＰの下方に戻る。
上記の場合、光線はフィールドレンズＦＬをも通過するが、その焦点距離はフィールドレンズＦＬとプリズムＤＰ間の空間にあるすべての波長の見掛け交点の距離と一致している。これは見掛け上の光源点の距離である。即ち、すべての光線は見掛け上はバーチャルな一点から出ていて、レンズの焦点は、その点にあることになるので、光線はすべてが光路方向に平行化される。
【００１７】
鏡Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３からの戻り光線は、分散素子ＤＰの通過後には分散が元通り収束し、複数波長を持った光としてレンズＬ２を通過し、周知の通りレーザ走査顕微鏡の中間像平面にあるピンホールに到り、平行に変換されて顕微鏡に到達する。即ち、図４に図式化されているように顕微鏡対物レンズを通って対象物に達している。
【００１８】
記載の線状励起選択器（小型鏡Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３...付き鏡保有体ＳＴ）は取り換えることができるので、単一または複数の波長をも任意に構成することができる。
対象物からの光は反射光の場合と蛍光光線の場合がある。
小型鏡Ｓ１、Ｓ２...は、反射光が検出光路に達するように半透明の状態でなければならない。このシステムおよび作用態様は原則として通常の透過顕微鏡に一致している。
励起光とは波長にずれのある蛍光光線は、小型鏡Ｓ１、Ｓ２...それぞれの中間領域に到達する。
【００１９】
これについて図２を基に説明する。
試料に跳ね返された光は、上で説明した素子を通過し、次に分散素子ＤＰを通って分散面ＤＩＥで扇状にスペクトル分布し、その後フィールドレンズＦＬで平行化される。
励起光とは波長の異なる蛍光光線は小型鏡Ｓ１〜Ｓ３の側の透光部分ＳＴを通過する。
フィールドレンズの後方には、評価用管路が配置されているのと同数の偏向素子、つまり楔形ガラス製プリズムＧＫ（ここではＧＫ１、２、３、４）が光路中に組み込まれている。楔形プリズムＧＫ１、２、３、４は、対象物からの光路に対して垂直な方向に配置された下方または上方が先細な、つまり、三角形状の部材である。ＧＫ１とＧＫ４とはほぼ水平な位置関係にあって、分散方向に沿う方向にある。また、光学軸に対しては垂直な位置関係にあって、左右で厚さの違う楔形状体である。尚、Ｇ１とＧ４とでは左右が、つまり厚さ方向が逆向きに配置されている。
【００２０】
一方ＧＫ２とＧＫ３は垂直方向に厚さの異なる、互いに厚さ方向が逆向きな楔形状体である。ＧＫ２は下方が尖って、上辺が長方形なのに対し、ＧＫ３は上辺が尖っている。図ではＧＫ１は右側が（図では見えない）、ＧＫ４は左側が先細で尖っているが、ＧＫ３の場合尖っているのは上辺である。
楔形部材のうち、ＧＫ１、３、４の場合は縁から、ＧＫ２の場合は先端からそれぞれ厚さを増していき、光は楔の厚さが増す方向に偏向している。即ち、図では、ＧＫ１は左方に、ＧＫ２は上方に、ＧＫ３は下方に、ＧＫ４は右方に偏向している。
【００２１】
この点を図３で詳しく説明する : 
ここでは楔の刃部分、即ち厚さ増加の起点が線Ｋ１〜４として表されている。
ＧＫ１とＧＫ４は、それぞれ楔の刃Ｋ１またはＫ４に近づくに従い、即ちそれらに平行に右方または左方に進むに従い薄くなっている。それに対しＧＫ２は、垂直方向に行くに従い、即ち下方の楔の刃Ｋ２に近づくに従い薄くなっているが、ＧＫ３では、上方に行くに従い薄くなっており、上辺がＫ３と一体化している。
矢印で表わした光路Ｌは、楔ＧＫ１〜４の通過の際にａ１〜ａ４で示された偏向が生じる。図のａ１は左方偏向、ａ２は上方、ａ３は下方、ａ４は右方偏向である。
【００２２】
楔形プリズムの配置は図と異なる方向にすることも可能であり、考え得ることである。楔を異なった方向に配置するのは、集光器通過後の検出経路間の間隔が広く取れるので有利である。
これらのＧＫ素子は楔形状であることから偏向作用を持っている。楔の形態および方向は、それぞれの検出管路ＤＴを互に離すために区々にするのが有利である。
各管路ＤＴの光は、それぞれの楔効果の違いから集光器ＫＯ後方では別な場所に位置している。
【００２３】
プリズムＧＫにおける楔角度の違いにより様々な光の偏向を生み、プリズムを光学軸に垂直な角度で水平移動すると評価用管路ＤＴの分光位置が変化し、プリズムＧＫを垂直移動すると切り出される分光領域の幅がさらに有利に変化する。
対象物から出た光は、フィールドレンズＦＬを通って楔形プリズムＧＫの方向に平行に揃えられ、楔形プリズムＧＫによって側方に移されて平行な帯状光にされた後、受光器ＤＥ１〜４によって検出できるように、集光器を通されて点状に統合される。各帯は別な場所に収束するので、複数の検出器が配置されることになる。
図には表されてないが、集光器ＫＯと受光器ＤＥ１〜４間には必要に応じて放射フィルターを設置することができる。
【００２４】
図４は、本発明に基づく装置を、例えばレーザ走査顕微鏡に連結した場合を表したものである。
ピンホールＰＨ（ここでは２８）から出た光は、コリメータ２１により平行に変換される。この光はスキャナ群２２（図では鏡一つだけ表示）に衝突し、補助対物レンズ２３を通って顕微鏡の中間像平面に結像し、鏡胴レンズ２５および顕微鏡対物レンズ２６を通って最終的にプレパラートに達する。
プレパラートからの光は逆の光路を辿り、検出方向に進む。
【符号の説明】
【００２５】
Ｆ  ファイバー
ＤＰ  分散素子
λ1,λ2,λ3  光線
Ｓ１,Ｓ２，Ｓ３  小型鏡
Ｌ  レンズ
ＦＬ  フィールドレンズ
ＤＰ  プリズム
ＤＩＥ  分散面
ＳＴ  透光部分
ＧＫ  楔形プリズム
ＫＯ  集光器
ＤＥ  受光器
ＰＨ  ピンホール
２１  コリメータ
２２  スキャナ
２３  対物レンズ
２５  鏡胴レンズ
２６  顕微鏡対物レンズ
【図２】
2009301053.tif 000003
【図１】
2009301053.tif 000004
【図３】
2009301053.tif 000005
【図４】
2009301053.tif 000006