(57)【要約】【課題】本発明は、実用上十分な活性酸素消去作用を有すると共に、明細書中に示した方法で容易かつ安価に得られる、セレノウレアおよび／またはチオウレアを含有することを特徴とする生細胞中の活性酸素消去剤およびその利用法を提供することができる。本発明の生細胞中の活性酸素消去剤は先行技術と比較して優れた活性酸素消去作用を有している。本発明の用途は人用医薬品以外に、家畜、ペットなどの動物薬として使用できる。【解決手段】 セレノウレアおよび／またはチオウレアを含有することを特徴とする生細胞中の活性酸素消去剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セレノウレアおよび／またはチオウレアを含有することを特徴とする生細胞中の活性酸素消去剤。
【請求項２】
セレノウレアおよび／またはチオウレアがN,N-Dimethyselenobenzurea（N,N-ジメチルセレノウレア） 、N,N-Diethyselenourea（N,N-ジエチルセレノウレア）、1-Selenocarbamoylpyrrolidine（１−セレノカルバモイルピロリジン）、1-Selenocarbamoylpiperidine（１−セレノカルバモイルピペリジン）、4-Selenocarbamoylmorpholine（１−セレノカルバモイルモルフォリン）、N,N-Dimethythiourea（N,N-ジメチルチオウレア）、N,N-Diethythiourea（N,N-ジエチルチオウレア）、1-Thiocarbamoylpyrrolidine（１−チオカルバモイルピロリジン）、1-Thiocarbamoylpiperidine（１−チオカルバモイルピペリジン）、4-Thiocarbamoylmorpholine（１−チオカルバモイルモルフォリン）のうちの１種または２種以上の混合物である請求項１記載の生細胞中の活性酸素消去剤。
【請求項３】
請求項１、２に記載の生細胞中の活性酸素消去剤を有効成分として配合してなる医薬用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セレノウレアおよび／またはチオウレアを含有することを特徴とする生細胞の活性酸素消去剤とその利用法に関する。詳しくは、セレノウレアおよび／またはチオウレアを含有することを特徴とする生細胞中の活性酸素消去剤、並びに本剤を含有する医薬品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内活性酸素は本来生体を守るために、殺菌および殺腫瘍物質として生成される。しかし選択毒性がないため、正常な細胞にも作用してしまうことがあり、過剰な活性酸素は、生体に対して様々の障害を引き起こすことが知られている。一例として、活性酸素は金属イオンの触媒の存在下にヒドロキシルラジカルを生成するが、ヒドロキシルラジカルは血中ＬＤＬの過酸化を引き起こし、更に酸化されたＬＤＬが血管内皮細胞に作用して血栓を形成する。その結果、生活習慣病と言われる高血圧症や、動脈硬化や、糖尿病のような病気になりやすくなる(非特許文献１参照)。
【０００３】
スーパーオキシドジスムターゼ（以下、ＳＯＤ という）は、生体内に広くかつ多量に存在し、生体内における活性酸素除去成分として重要な抗酸化系酵素である。ＳＯＤ は活性酸素の一種であるスーパーオキシドアニオンの不均化反応を触媒し、この反応によって細胞内のスーパーオキシドは１０万分の1に低下する（非特許文献２参照）。体内でＳＯＤ様作用を補強できる因子として、ＳＯＤ そのもの又はＳＯＤ 様物質がある。ＳＯＤ は大量に、安易に入手できないため、ＳＯＤ 様作用を補強する手段のほとんどがＳＯＤ 様活性物質の摂取である。例えば、ビタミンＣ（特許文献１）、ビタミンＥ（特許文献２）や、カテキン類（特許文献３，４）の摂取が挙げられる。
【０００４】
しかしこれらの物質は、安定性や吸収性等の問題で、生体内での活性酸素を除去する作用が充分でないため、より優れたＳＯＤ 様物質すなわち活性酸素消去物質の開発が望まれていた。これまでに活性酸素消去活性を示すペプチド及びペプチド混合物として、小麦グルテンの分解により得られたヘキサペプチド（特許文献５参照）、植物蛋白を酵素分解して得られるペプチド混合物（特許文献６参照）、オウゴン中のバイカレイン、バラ科植物・刺梨の果汁等に含まれている活性酸素消去物質（特許文献７，８参照）等が報告されている。
【０００５】
こうして、活性酸素消去物質は病気の予防因子や美容因子として特定保健用食品や健康食品等に利用されてきた。しかし、従来の活性酸素消去物質は、効果が十分でなかったり毒性を有すため利用範囲が限られていた。
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−３２２９９０号公報
【特許文献２】特開２００５−０２９４９０号公報
【特許文献３】特開平１０−１７５８５８号公報
【特許文献４】特開平０７−３００４１２号公報
【特許文献５】特許第２８３５５０４号
【特許文献６】特許第３１０８０５９号
【特許文献７】特開昭６４−５０８７７号公報
【特許文献８】特開平３−８３５４８号公報
【非特許文献１】カレントテラピー，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．１，１０５−１０９頁，１９９８
【非特許文献２】今堀和友ら監修，「生化学辞典第３版」，東京化学同人，７４３頁
【非特許文献３】Koketsu, M., Fukuta Y. and Ishihara, H., Preparation of N,N-unsubstitutedselenoureas and thioureas from cyanamides, Tetrahedron Lett., 42, 6333-6335 (2001).
【非特許文献４】Ishihara, H., Koketsu, M., Fukuta Y. and Nada F., Reaction of lithium aluminum hydride with elemental selenium: Its application as a selenating reagent into organic molecules, J. Am. Chem. Soc., 123, 8408-8409 (2001).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記課題を解決するものであり、実用上十分活性を有する生細胞中の活性酸素消去剤並びに本剤を含有する医薬品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の現状に鑑み、鋭意検討の結果、セレノウレアおよび／またはチオウレアが生細胞中の活性酸素消去作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、次の［１］〜［３］である。
［１］セレノウレアおよび／またはチオウレアを含有することを特徴とする生細胞中の活性酸素消去剤。
［２］セレノウレアおよび／またはチオウレアがN,N-Dimethyselenourea（N,N-ジメチルセレノウレア） 、N,N-Diethyselenourea（N,N-ジエチルセレノウレア）、1-Selenocarbamoylpyrrolidine（１−セレノカルバモイルピロリジン）、1-Selenocarbamoylpiperidine（１−セレノカルバモイルピペリジン）、4-Selenocarbamoylmorpholine（１−セレノカルバモイルモルフォリン）、N,N-Dimethythiourea（N,N-ジメチルチオウレア）、N,N-Diethythiourea（N,N-ジエチルチオウレア）、1-Thiocarbamoylpyrrolidine（１−チオカルバモイルピロリジン）、1-Thiocarbamoylpiperidine（１−チオカルバモイルピペリジン）、4-Thiocarbamoylmorpholine（１−チオカルバモイルモルフォリン）のうちの１種または２種以上の混合物である前記［１］記載の生細胞中の活性酸素消去剤。
［３］前記［１］［２］に記載の生細胞中の活性酸素消去剤を有効成分として配合してなる医薬用組成物。
【００１０】
すなわち、本発明は、化学合成で得られるセレノウレアおよび／またはチオウレアを含有することを特徴とする生細胞中の活性酸素消去剤とその利用法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、実用上十分な生細胞中の活性酸素消去作用を有すると共に、安価に得られる、セレノウレアおよび／またはチオウレアを含む組成物およびその利用法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明で用いるセレノウレアおよび／またはチオウレアはセレンまたは含硫化合物で、アミドのカルボニル酸素がセレン元素および／または硫黄元素に置き換えられ、α位の窒素原子上が2個の置換基を導入した構造が特徴である。本発明で用いるセレノウレアおよび／またはチオウレアは文献記載の方法（非特許文献３、非特許文献４）で化学合成により得ることができる。本発明に使用することができるセレノウレアおよび／またはチオウレアのうち、N,N-Dimethyselenourea（N,N-ジメチルセレノウレア） 、N,N-Diethyselenourea（N,N-ジエチルセレノウレア）、1-Selenocarbamoylpyrrolidine（１−セレノカルバモイルピロリジン）、1-Selenocarbamoylpiperidine（１−セレノカルバモイルピペリジン）、4-Selenocarbamoylmorpholine（１−セレノカルバモイルモルフォリン）、N,N-Dimethythiourea（N,N-ジメチルチオウレア）、N,N-Diethythiourea（N,N-ジエチルチオウレア）、1-Thiocarbamoylpyrrolidine（１−チオカルバモイルピロリジン）、1-Thiocarbamoylpiperidine（１−チオカルバモイルピペリジン）、4-Thiocarbamoylmorpholine（１−チオカルバモイルモルフォリン）が適しており、特にN,N-ジメチルセレノウレア（以下セレノウレアＡという）と１−セレノカルバモイルピロリジン（以下セレノウレアＢという）が最適である。本発明では、上記のセレノウレアおよび／またはチオウレアのうちの１種または２種以上の混合物を用途に合わせ利用することができる。
本発明に使用するセレノウレアおよび／またはチオウレアは、製造法により規定されないが、たとえば、３級アミドのジエチルエーテル溶液にオキサリルクロリドを添加する。別のフラスコにて調製したLiAlHSeHを前述の反応溶液に添加し、セレノウレアおよび／またはチオウレア得ることができる。さらに、すでに市場で販売されているセレノウレアおよび／またはチオウレア（たとえばシグマ社製等）を利用することも可能である。
【００１３】
本発明の生細胞の活性酸素消去剤は、上記のセレノウレアおよび／またはチオウレアを合計０．０１から９０重量％、好ましくは０．１から５０重量％、より好ましくは１から３０重量％含有する。セレノウレアおよび／またはチオウレアの含有量が０．０１重量％未満では生細胞中の活性酸素消去効果が認められない。また、セレノウレアおよび／またはチオウレア含有量を９０重量％より多くしても、効果の顕著な増加は認められない。
【００１４】
次に、本発明の生細胞中の活性酸素消去剤を配合してなる医薬用組成物について説明する。本発明の生細胞中の活性酸素消去剤を配合してなる製剤は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、動物およびヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜に選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤があげられる。
【００１５】
本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤としての経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明の生細胞中の活性酸素消去剤の配合量は０．０１から５０重量％、好ましくは０．１から３０重量％、より好ましくは１から１０重量％含有する。活性酸素消去剤の含有量が０．０１重量％未満では活性酸素消去効果が認められない。また。活性酸素消去剤の含有量が５０重量％より多くしても、効果の顕著な増加は認められない。この種の製剤には本発明の活性酸素消去剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００１６】
上記の活性酸素消去剤を含有する医薬用組成物は懸濁液、エマルション剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させてもよい。
【００１７】
本発明の医薬用組成物は、生細胞の活性酸素の消去をねらいとして利用するものであれば、それを使用する上で何ら制限を受けることなく適用される。
【００１８】
次に、本発明を実験例、実施例、比較例にてさらに詳しく説明する。
【００１９】
（実験例１）活性酸素消去能の測定：
木村らのヒポキサンチン−キサンチンオキシダ−ゼによるス−パ−オキシド発生系とウミホタルルシフェリン誘導体(MCLA)を用いた化学発光法で行った（Kimura, H., Nakano, M., 1988. Highly sensitive and reliable chemiluminescencemethod for the assay of superoxide dismutase in human erythrocytes.  FEBS Letters, 239 2 347-350.）。
【００２０】
試薬： MCLAは、東京化成工業株式会社から購入した。MCLAは蒸留水で溶解し、使用するまでは-80℃に保存した。MCLAの濃度は、吸光係数ε=9600M-1cm-1(吸光度430nm)により決定した。ホルボール-12-ミリステート-13-アセテート (PMA)とジメチルスルホオキシド(DMSO)はシグマ・アルドリッチより購入した。PMAは、DMSOに溶解し、5mg/mLに調整し、-80℃に保存した。WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium]は株式会社同仁化学研究所より購入した。Alexa Fluor 532 phalloidin、AlexaFluor 488 rabbit anti-goat IgG (H + L)や 4,6-diamidino-phenylindole (DAPI)はモルキュラープローブから購入した。Anti- nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidasep47 phagocyte oxidase (p47phox)はSanta Cruz Biotechnologyより購入した。その他の試薬はすべて特級であり、そのまま使用した。
【００２１】
多核白血球（PMNs）の分離
PMNsは、健常人由来ヘパリン処理末梢血から分離した。PMNsは、密度勾配法により、Polymorphoprep(Accurate Chemical & Scientific Corp)のプロトコールに従って分離した。ランドルフ染色により、PMNsの純度は98%以上であるを確認した。
【００２２】
PMNsからのO2-消去効果の測定  
セレノウレアやセレノアミドは、ハンクス緩衝液 (HBSS)で希釈した。これらの化合物のO2-除去効果を経時的に測定するために、我々は高感度でO2-に特異的なプローブとしてMCLAを用いた化学発光法を使用した。簡潔に記すと、7 × 104のPMNsをMCLA (3μM)および0から100μMの有機セレン化合物と37℃で5分間プレインキュベーションした。インキュベーション後、PMNsを100ng/mLのPMAで刺激した。化学発光は、ルミネッセンスリーダー (BLR-102, Aloka)で15分間、緩やかに攪拌しながら37℃で測定した。最終的な反応液の容量は、2mLで測定した。
【００２３】
ス−パ−オキシド消去能(superoxide scavenging activity 以下「SOSA」と略す)は次の式で算出し、SOSA(％)とした。SOSA(％)＝発光阻害率(％)＝(I0-Ii)/I0×100。ここで I0 は対照発光量、 Ii  はサンプル発光量である。
【００２４】
（実験例２）典型的なセレノウレアおよび／またはチオウレアの調製：N,N-ジメチルセレノウレア（N,N-Dimethylselenourea）の合成。ジメチルシアナミド（0.08 mL, 1.0 mmol）の無水THF溶液(10 mL)にアルゴン気流下、氷冷にて1N HClの無水エーテル溶液(2 mL, 2.0 mmol)を加え、2時間撹拌した。別のフラスコにてセレン粉末（0.08g, 1.0mmol）の無水THF溶液（10mL）に氷冷下水素化アルミニウムリチウム（0.046g, 1.2mmol）を加え、30分撹拌しLiAlHSeHを得た（Ishihara, H., Koketsu, M., Fukuta Y. Nada, F., Reaction of lithium aluminum hydride with elemental selenium: Its application as a selenating reagent into organic molecules, 2001 J. Am. Chem. Soc., 123, 8408-8409.）。ここで得たLiAlHSeHに前述の反応溶液を滴下し、さらに、3時間撹拌した。反応混合液をジクロロメタンで抽出し、水洗、無水硫酸ナトリウムによる乾燥後ロータリーエバポレーターで溶媒を留去した。フラッシュクロマトグラフィー（展開溶媒：ジクロロメタン/エーテル＝１/1）で単離精製し、N,N-ジメチルセレノウレアを黄色結晶（105 mg, 収率70％）として得た（非特許文献４）。
【実施例１】
【００２５】
セレノウレアＡとセレノウレアＢのそれぞれのＳＯＳＡを図１に示した。また、セレノウレアＡとセレノウレアＢのそれぞれの化学式と５０％活性阻害濃度（ＩＣ５０）を実験例１の方法で測定した結果を表１に示した。
【００２６】
（比較例１）
ビタミンＣ（和光純薬）、D-αトコフェロール（エーザイ）や、（−）エピガロカテキン緑茶由来（和光純薬）の活性酸素消去能を実験例１の方法で測定した結果を表２に示した。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
【表２】
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【００２９】
表１と表２の比較から、本発明の生細胞中の活性酸素消去剤が先行技術と比較して優れた活性酸素消去作用を有していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は人以外に、家畜、ペットなどの動物用として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】セレノウレアＡとセレノウレアＢのそれぞれのＳＯＳＡを図１に示した。
【符号の説明】
【００３２】
▲：セレノウレアA、■：セレノウレアB。
【図１】
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