(57)【要約】【課題】水性溶媒中で、ｐＨ調節剤等を用いずにプロテアーゼを用いる単純な工程でタバコ抽出材料を処理してタンパク質を低減させることができ、かつプロテアーゼ処理後に得られるタバコ材料の重量収率が高い方法を提供する。【解決手段】（ｉ）タバコ材料を水性溶媒で抽出し、水溶性タバコ抽出物とタバコ抽出残渣に分離する工程と、（ｉｉ）（ｉ）の水性溶媒とは別の水性溶媒中で、前記タバコ抽出残渣を水性溶媒中酸性〜中性で活性を示すプロテアーゼにより処理して、前記タバコ抽出残渣中のタンパク質を分解する工程と、（ｉｉｉ）前記プロテアーゼ処理後の水性溶媒とプロテアーゼ処理タバコ抽出残渣を分離する工程と、（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）により得られるプロテアーゼ処理タバコ抽出残渣を前記工程（ｉ）により分離された前記水溶性タバコ抽出物と組み合わせる工程とを含むことを特徴とするタバコ材料中のタンパク質を低減させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）タバコ材料を水性溶媒で抽出し、水溶性タバコ抽出物とタバコ抽出残渣に分離する工程と、
（ｉｉ）（ｉ）の水性溶媒とは別の水性溶媒中で、前記タバコ抽出残渣を水性溶媒中酸性〜中性で活性を示すプロテアーゼにより処理して、前記タバコ抽出残渣中のタンパク質を分解する工程と、
（ｉｉｉ）前記プロテアーゼ処理後の水性溶媒とプロテアーゼ処理タバコ抽出残渣を分離する工程と、
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）により得られるプロテアーゼ処理タバコ抽出残渣を前記工程（ｉ）により分離された前記水溶性タバコ抽出物と組み合わせる工程と
を含むことを特徴とするタバコ材料中のタンパク質を低減させる方法。
【請求項２】
前記プロテアーゼがＥＣ．３．４．Ｘ．Ｘであって、酸性〜中性の範囲で活性を有するものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロテアーゼがＥＣ．３．４．２４．２８、Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６３、またはＥ．Ｃ．３．４．２４．２７であることを特徴とする請求項１ないし２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｉ）および工程（ｉｉ）における水性溶媒が水であることを特徴とする請求項１ないし３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｉｉｉ）において分離される前記酵素処理タバコ抽出残渣を、分解したタンパク質をさらに除去するために水性溶媒で洗浄することを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｉｉｉ）において分離される前記プロテアーゼ処理タバコ抽出残渣の重量収率が７０％以上であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか一項の方法により得られるタンパク質が低減したタバコ材料。
【請求項８】
請求項７に記載のタバコ材料を有する喫煙物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロテアーゼを用いたタバコ材料中のタンパク質の分解方法およびタンパク質が低減したタバコ材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
タバコ材料を用いて作製される喫煙物品を燃焼させた際に生じる主流煙中の芳香族アミンは除去することが望ましい成分である（非特許文献１）。この芳香族アミンの低減を目的として、タバコ材料中からタンパク質を除去することが検討されている。例えば、特許文献１には、プロテアーゼを用いてタバコ材料中のタンパク質を分解・除去する方法が開示されている。特許文献２には、タバコをプロテアーゼで分解し、微生物にその分解物を消化させる方法が開示されている。この方法はプロテアーゼによる処理に加えて微生物も使用する必要があり工程が増え煩雑である。特許文献３には、特許文献２の改良方法が記載されており、タバコをアルカリで抽出することが記載されている。特許文献４および５には、タバコ材料を水性溶媒で抽出し、その抽出残渣をプロテアーゼで分解・除去する方法が開示されている。
【非特許文献１】IARC monographs，３８巻，「CHEMISTRY AND ANALYSIS OF TOBACCO SMOKE」
【特許文献１】特表２００２−５２０００５号公報
【特許文献２】米国特許第４，４０７，３０７号明細書
【特許文献３】米国特許第４，７１６，９１１号明細書
【特許文献４】米国特許第４，８８７，６１８号明細書
【特許文献５】米国特許第４，９４１，４８４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、これらの従来技術は、酵素活性を最大にするために、タバコ材料を酵素で処理する溶液に塩基性物質等を加えている。しかしながら、このようにｐＨ調節剤を加えてｐＨを変化させると、タンパク質は低減するものの、一方で望まない原料変質を招き得ることを考慮すると好ましくはない。さらに、本発明者等が引用文献４の方法を試みてタバコ材料を処理したところ、プロテアーゼ処理後に得られるタバコ材料の重量収率は５０％台と低く、製造コストの観点から改善が必要と考えられる。
【０００４】
そこで本発明は、水性溶媒中で、ｐＨ調節剤等を用いずにプロテアーゼを用いる単純な工程でタバコ抽出材料を処理してタンパク質を低減させることができ、かつプロテアーゼ処理後に得られるタバコ材料の重量収率が高い方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、本発明の１つの態様によれば、
（ｉ）タバコ材料を水性溶媒で抽出し、水溶性タバコ抽出物とタバコ抽出残渣に分離する工程と、
（ｉｉ）（ｉ）の水性溶媒とは別の水性溶媒中で、前記タバコ抽出残渣を水性溶媒中酸性〜中性で活性を示すプロテアーゼにより処理して、前記タバコ抽出残渣中のタンパク質を分解する工程と、
（ｉｉｉ）前記プロテアーゼ処理後の水性溶媒とプロテアーゼ処理タバコ抽出残渣を分離する工程と、
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）により得られるプロテアーゼ処理タバコ抽出残渣を前記工程（ｉ）により分離された前記水溶性タバコ抽出物と組み合わせる工程と
を含むことを特徴とするタバコ材料中のタンパク質を低減させる方法
が提供される。
【０００６】
また本発明の他の態様によれば、第１の態様により得られるタンパク質が減少したタバコ材料が提供される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、タバコ抽出残渣をプロテアーゼにより処理する際にｐＨを調節する必要がなく、単純な方法でタバコ抽出残渣からタンパク質を分解・除去することができる。また、本発明によれば、プロテアーゼ処理後のタンパク質が低減したタバコ抽出残渣を高い重量収率で得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【０００９】
本発明のタバコ材料からタンパク質を低減させる方法は、工程（ｉ）として水性溶媒でタバコ材料を抽出して水溶性タバコ抽出物とタバコ残渣とに分離することを含む。この抽出工程において、水溶性の成分は出来るだけ水性溶媒中に抽出しておくことが望まれる。
【００１０】
工程（ｉ）における水性溶媒としては、好ましくは水を用いることができる。タバコ材料としてはタバコ刻を用いることができ、これは抽出効率を上げるために予め細かく裁刻されていることが好ましい。タバコ材料の種類は特に問わない。タバコ材料と水性溶媒との比は、タバコ材料：水性溶媒が１：３〜１：２０が好ましい。１：３未満であると十分にタバコ材料から水溶性成分を除くことが困難となり、後に記述する酵素の洗浄工程において、例えばニコチンのような香喫味上有用と考えられるタバコ中水溶性成分のロスを生ずるために好ましくない。１：２０以上になると後に処理すべき水溶性タバコ抽出物の容積が不必要に増えて経済的にも好ましくない。抽出温度は、１０℃〜１００℃が好ましくは用いられる。１０℃未満であると効率的な抽出ができない傾向にある。１００℃を超えると、抽出液中成分の蒸発、抽出残渣成分の変質、タバコ残渣の蒸解が起きるため好ましくない。水溶性タバコ抽出物とタバコ抽出残渣の分離方法は任意の方法を用いることができ、例えばろ過により分離することができる。
【００１１】
次に、工程（ｉｉ）において、上記工程（ｉ）により分離されたタバコ抽出残渣を（ｉ）の水性溶媒とは別の水性溶媒中でプロテアーゼにより処理して、タバコ抽出残渣中のタンパク質を分解する。
【００１２】
水性溶媒としては好ましくは水を用いる。タバコ抽出残渣に水を加えると、一般的に酸性〜中性を示す。本発明は酸性〜中性で活性を有するプロテアーゼを用いてタバコ抽出残渣を処理することを特徴とする。すなわち、本発明はプロテアーゼによる処理に際してｐＨを調節するという工程を全く必要としない。本発明の方法は緩衝剤等のｐＨ調節剤を必要としないために、ｐＨが変化することにより起こり得るタバコ抽出残渣の変質が問題とならない。
【００１３】
本発明に用いられるプロテアーゼは、酸性〜中性のｐＨで活性を有するプロテアーゼであれば任意のものを用いることができる。例えば、ＥＣ．３．４．Ｘ．Ｘであって、酸性〜中性の範囲のｐＨで活性を有するものを挙げることができる。ここで、ＥＣ．３．４．Ｘ．Ｘとは、国際生化学連合により付与された酵素番号であり、Ｘは数字を表す。特に好ましくは、ＥＣ．３．４．２４．２８またはＥＣ．３．４．２１．６３を用いることができる。これらのプロテアーゼは弱酸性〜中性領域で活性を有するために、ｐＨ調節剤を加えなくても、タバコ抽出残渣に水を加えた際のｐＨで十分な活性を有する。タバコ抽出残渣を水性溶媒中でプロテアーゼにより処理する際の処理温度は、３５〜６５℃であることが好ましい。３５℃未満であるとプロテアーゼの活性が十分に得られないために好ましくない、一方で６５℃を超えるとプロテアーゼの活性が失活する傾向がある。このプロテアーゼによる処理時間は５時間以上であることが好ましい。５時間未満であると、プロテアーゼによるタンパク質の分解が不十分であるので好ましくない。処理時間は５時間であれば十分である。
【００１４】
前記プロテアーゼによる処理によりタバコ抽出残渣中のタンパク質を分解したら、工程（ｉｉｉ）において、この酵素処理後の水性溶媒と不溶性の酵素処理タバコ抽出残渣に分離する。この分離手段としては、遠心分離、ろ過等の任意の手段を用いることができる。さらに分離の際に、分解したタンパク質および処理に用いた酵素をさらに除去するために、プロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣を水性溶媒で洗浄することが好ましい。分離したプロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣は、酸化等の変質を避けるために好ましくは調和させる。すなわち、その水分含有量が製造環境条件における平衡状態に達するまで乾燥放置する。この放置時間は４８時間であることが好ましい。
【００１５】
本発明によれば、このプロテアーゼ処理した後のタバコ抽出残渣の重量収率を７０％以上とすることができ、非常に高い重量収率でタンパク質が除去されたタバコ抽出残渣を得ることができる。
【００１６】
プロテアーゼ処理し、任意に調和させた後のタバコ抽出残渣を、先の工程（ｉ）において分離した水溶性タバコ抽出物と組み合わせる。水溶性タバコ抽出物は濃縮、凍結乾燥等をされていてもよい。この組み合わせには任意の方法を用いることができる。例えば、プロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣に、水溶性タバコ抽出物を噴霧等により組み合わせることができる。タバコ抽出残渣と水溶性タバコ抽出物を組み合わせてタバコ材料を作製したら、このタバコ材料を任意の方法により乾燥させてもよい。
【００１７】
以上のようにして、本発明の方法工程（ｉ）〜（ｉｖ）を経ることにより、タンパク質が低減したタバコ材料が得ることができる。得られたタバコ材料を用いて喫煙物品を作製する。喫煙物品としては例えばシガレットを作製することができる。タバコ材料中のタンパク質が低減しているために、この喫煙物品を燃焼した際の主流煙中の芳香族アミン等の発生を低減させることができる。
【実施例】
【００１８】
Ａ．タバコ抽出残渣の調製方法
予め裁刻したタバコ刻３００ｇに対して水３Ｌを加え、温浴下６０℃で１時間撹拌した。その後、不溶物を手絞りでろ過し、水溶性タバコ抽出物とタバコ抽出残渣に分離した。
【００１９】
Ｂ．タバコ抽出残渣中のタンパク質の定量方法および増減率の決定
タバコ抽出残渣中のタンパク質の分析に当たり、残渣からの成分抽出効率を上げるために、タバコ抽出残渣を研究室用ミルで粉砕し、粉末状のサンプルを調製・使用した。各々のサンプルをＢＣＡ法を用いて以下の通りに分析した。
【００２０】
２０ｍｇの粉末状のサンプルを遠心チューブに入れ、ここに９ｍｌの中性リン酸バッファ（ｐＨ  ６．８６）と９００μｌの１．５ｍｇ／ｍｌデオキシコール酸ナトリウムを加えた。１０℃以下で１５分間超音波処理した後、ホモジナイザで１分間遠心チューブ中の粉末サンプルを処理し、３０分間振盪した。その後、この処理液の１．１ｍｌを２ｍｌの丸底チューブに採取し、０．１ｍｌの７２％のトリクロロ酢酸水溶液を加え、冷却遠心分離した。その後上澄み液を捨て、続いて０．２ＮのＮａＯＨ水溶液を加え、ボルテックスミキサで混合した。この混合液の８０μｌを２ｍｌの丸底チューブに採取し、１．６ｍｌのタンパク質定量用ビシンコニン酸（ＢＣＡ）水溶液を加えた。３０分間、３７℃で温めた後、温度を室温にまで冷却した。この溶液を用いて紫外可視分光光度計において、６６０ｎｍの波長でＵＶ測定を行い、タバコ抽出残渣中のタンパク質量を定量した。以上のようにしてプロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣、および対照サンプルであるプロテアーゼ処理を行わなかったタバコ抽出残渣中のタンパク質の定量を行った。この分析は３回繰り返して行い、残渣中のタンパク質の重量平均値および標準偏差を求めた。標準偏差は平均４．５％以内であり、この重量平均値はバラつきが少なく信頼性が高い値であることがわかった。この重量平均値を下記の式に当てはめ、タバコ抽出残渣中のタンパク質の低減率を求めた。
【００２１】
低減率（％）＝［（対照サンプル中のタンパク質重量平均値−処理サンプル中のタンパク質重量平均値）／対照サンプル中のタンパク質重量平均値］×１００
Ｃ．プロテアーゼ処理後のタバコ残渣の重量収率決定法
プロテアーゼ処理し調和した後のタバコ抽出残渣の重量測定を行い、その重量から水分量を引いた重量をプロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣重量とし、プロテアーゼ処理前のタバコ抽出残渣２０ｇに対する重量収率を求めた。具体的には、水分測定に際し、予め重量測定した秤量瓶にプロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣を１ｇ採取した。この秤量瓶ごと乾燥装置に入れ、１００℃で１時間乾燥させた。その後、秤量瓶を放熱させるためデシケータに保管し、室温にまで下がった後に重量測定を行った。乾燥前後でのタバコ抽出残渣を入れた秤量瓶の重量の差を水分含量とした。このタバコ抽出残渣１ｇ当たりの水分含量を元にプロテアーゼ処理後調和したタバコ残渣の全重量中の水分含量を求め、これを調和後のタバコ残渣全重量から差し引き、プロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣重量とした。これを下記の式にあてはめ、プロテアーゼ処理後のタバコ残渣の重量収率とした
重量収率（％）＝［水分含量を差し引いたプロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣重量／水分含量を差し引いたプロテアーゼ処理前のタバコ抽出残渣重量］×１００。
【００２２】
Ｄ．タバコ抽出残渣から生成する煙中成分の評価
赤外加熱炉を用いた熱分解により、プロテアーゼ処理前後のタバコ抽出残渣から生成する芳香族アミン類である２−アミノナフタレンと４−アミノビフェニルの量を分析した。
【００２３】
具体的には、対照サンプルとしてプロテアーゼ処理を行わなかったタバコ抽出残渣、およびプロテアーゼ処理を施したタバコ抽出残渣のそれぞれ１５０ｍｇを石英ガラス管に詰めた。このサンプルを詰めた石英ガラス管を赤外加熱炉（ＵＬＶＡＣ  理工社製）中に入れ、窒素雰囲気下、１０００℃／分の昇温速度で室温〜８００℃まで加熱した（Food and Chemical Toxicology Volume 42, 1409-1417を参照のこと）。上記加熱中に発生するタールをガラスフィルタに捕集した。ガラスフィルタに捕集したタールを０．２Ｎの塩酸で抽出し、得られた抽出液をイオン交換樹脂カラム（Ｏａｓｉｓ  ＭＣＸ  Ｗａｔｅｒｓ社製）に供した。カラムをアセトニトリルで洗浄した後、５％アンモニア水メタノール溶液をカラムに導入し、樹脂に吸着した混合物を溶出した。溶出液を窒素雰囲気下で濃縮し、濃縮液にヘキサン−ジクロロメタン溶液と分析用内部標準（重水素化した２−アミノナフタレンおよび４−アミノビフェニル）を加えた後、無水フッ化プロピオン酸を加えて誘導化した。この処理液を窒素雰囲気下で濃縮した後、濃縮液をガスクロマトグラフ質量分析器で分析し、２−アミノナフタレンおよび４−アミノビフェニルを定量した。上記の熱分解作業及び連続する分析作業を３回繰り返して行い、タバコ抽出残渣１ｇから生成する各成分重量平均値および標準偏差を算出した。標準偏差は平均５％以内であり、この重量平均値はバラつきが少なく信頼性が高い値であることがわかった。この重量平均値を下記の式に当てはめ、プロテアーゼ処理による各成分生成量の低減率を求めた。
【００２４】
低減率（％）＝［（対照サンプルより生成する各成分の重量平均値−処理サンプルより生成する各成分の重量平均値）／対照サンプルより生成する各成分の重量平均値］×１００
実施例１〜３
上記方法Ａにより分離したタバコ抽出残渣２０ｇに対して４００ｍｌの水を加えて、酵素を２００ｍｇ添加した。この際、実施例１では酵素としてＥＣ．３．４．２４．２８（プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ，天野エンザイム社製）を、実施例２では酵素としてＥＣ．３．４．２１．６３（プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ，天野エンザイム社製））を、および実施例３では酵素としてＥＣ．３．４．２４．２７（プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ，天野エンザイム社製）をそれぞれ用いた。それぞれの酵素の至適温度（実施例１においては４５℃、実施例２においては５５℃、実施例３においては５０℃）に合わせた温度の温浴下で５時間撹拌した。その後、この混合物中の不溶物を手絞りでろ過して、プロテアーゼ処理液とプロテアーゼ処理残渣に分離した。このプロテアーゼ処理残渣を４８時間調和した。調和後、プロテアーゼ処理残渣を用いて方法Ｂに従って、プロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣１ｇ当たりのタンパク質を定量し、またタバコ抽出残渣中のタンパク質の低減率を求めた。タバコ抽出残渣１ｇ当たりのタンパク質量を表１に、タンパク質の低減率を図１に示す。また、方法Ｃに従って、プロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣の重量収率を求めた。結果を表１および図１に併せて示す。
【表１】
2009261314.tif 000002
【００２５】
さらにプロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣を加熱した際に生成する煙中成分中の芳香族アミンの量を評価するために、方法Ｄに従って評価し、タバコ抽出残渣１ｇから生成する煙中成分重量平均値および低減率を求めた。各成分重量平均値を表２に、低減率を図２に示す。
【表２】
2009261314.tif 000003
【００２６】
比較例１
上記方法Ａにより分離したタバコ抽出残渣２０ｇに対して４００ｍｌの水を加えて、酵素を２００ｍｇ添加した。酵素として一般的に用いられるＥＣ３．４．２１．１４を用い、この酵素の至適温度である３７℃に合わせた温浴を用いた。さらにこのタバコ抽出残渣を酵素を撹拌する際に、ＥＣ３．４．２１．１４の至適ｐＨ（ｐＨ≒８）に調整するため、Ｎａ２ＣＯ３を４ｇ混入した。方法Ｂに従ってプロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣中のタンパク質を定量して増減率を決定し、また方法Ｃに従ってプロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣の重量収率を求めた。結果を表１および図１に併せて示す。また、プロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣を加熱した際に生成する煙中成分中の芳香族アミンの量を評価するために、方法Ｄに従って評価し、その低減率を求めた。結果を表２および図２に併せて示す。
【００２７】
実施例１〜３は、ｐＨ等を調節する必要なく、タバコ抽出残渣に水を加えてそこにプロテアーゼを混入して撹拌するという非常に簡単な方法であるにも関らず、表１および図１の結果から明らかなように、実施例１においてはタバコ抽出残渣中のタンパク質を約４０％低減させることができ、さらにプロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣の重量収率も７０．９％と非常に高いことがわかった。実施例２はタンパク質低減率は約３０％と若干劣るものの、プロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣の重量収率は７３．４％とさらに高いものであった。実施例３はタンパク質低減率は約１０％と劣るものの、プロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣の主重量収率は７７．０％と実施例の中では最も高いものであった。一方で、比較例１のプロテアーゼを用いた際は、タンパク質低減率は若干高いものの、プロテアーゼ処理に際してｐＨを調節するという必要があり、かつプロテアーゼ処理後のタバコ抽出残渣の重量収率は５９％と低いものであった。さらに、表２および図２から煙中成分中の芳香族アミン低減率を比較してみると、２−アミノナフタレンに関しては、実施例１および２共に、比較例１と同程度の低減率を達成した。また、４−アミノビフェニルに関しては、実施例１は比較例１よりも若干高い低減率を達成していた。
【００２８】
以上詳述した通り、本発明によれば、水性溶媒中で、ｐＨ調節剤等を用いずにタバコ抽出残渣をプロテアーゼにて処理するという単純な工程でタバコ抽出残渣中のタンパク質を低減することができる。本発明によるプロテアーゼ処理後に得られるタバコ抽出残渣の重量収率は７０％を超え、非常に高いものであった。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例１ないし３、並びに比較例１のプロテアーゼを用いてタバコ抽出残渣を処理した際のタンパク質低減率と残渣回収重量収率を表すグラフ。
【図２】実施例１ないし３、並びに比較例１のプロテアーゼを用いてタバコ抽出残渣を処理した際の煙中芳香族アミンの低減率と残渣回収重量収率との関係を表すグラフ。
【図１】
2009261314.tif 000004
【図２】
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