(57)【要約】【課題】本発明は、心不全または肺うっ血の新規改善剤を提供することを課題とする。より詳しくは、塩酸モルヒネのような麻酔薬を使用することなく、効果的に心不全を改善し、心不全の症状、例えば肺うっ血等を軽減化しうる新規薬剤を提供することを課題とする。さらには、心不全改善剤または肺うっ血改善剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。【解決手段】カンナビノイド受容体アゴニスト作用を有する化合物を有効成分とする心不全改善剤または肺うっ血改善剤による。さらには、カンナビノイド受容体の活性化効果を測定することによる心不全改善剤または肺うっ血改善剤のスクリーニング方法による。【選択図】図１Ａ
2009269869.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンナビノイド受容体アゴニスト作用を有する化合物を有効成分とする心不全または肺うっ血の改善剤。
【請求項２】
心不全が、急性心不全または慢性心不全である、請求項１に記載の改善剤。
【請求項３】
肺うっ血が、心不全に起因する肺うっ血である請求項１に記載の肺うっ血改善剤。
【請求項４】
カンナビノイド受容体アゴニストが、ＣＢ１受容体アゴニストである請求項１〜３のいずれか１に記載の改善剤。
【請求項５】
カンナビノイド受容体の活性化効果を測定することによる心不全改善剤または肺うっ血改善剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
心不全改善剤が、急性心不全または慢性心不全の改善剤である、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
肺うっ血改善剤が、心不全に起因する肺うっ血の改善剤である請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
カンナビノイド受容体が、ＣＢ１受容体である請求項５〜７のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンナビノイド受容体アゴニスト作用を有する物質の新規用途に関する。具体的には、カンナビノイド受容体アゴニスト作用を有する物質を有効成分とする心疾患または肺うっ血の改善剤に関する。さらには、カンナビノイド受容体アゴニスト作用を有する物質をスクリーニングすることによる、心疾患または肺うっ血の改善剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全とは、心臓が正常に機能していない状態を示し、体組織の代謝に見合う十分な血液を供給できない状態をいう。心不全はあらゆる心疾患の末期症状であり、原因として、弁膜症や心筋梗塞、高血圧、心筋症、心筋炎、および先天性心疾患等が挙げられる。心不全は、左心不全、右心不全、両心不全に分類され、時間経過より急性心不全（acute heart failure）、慢性心不全（chronic heart failure）に分類される。急性心不全では、例えば心筋梗塞に伴う心不全が挙げられ、慢性心不全では、例えば心筋症や弁膜症に伴う心不全が挙げられる。心不全は、心エコー検査等によって診断される。
【０００３】
急性心不全には、利尿剤、強心薬、血管拡張剤が用いられてきたが、必ずしも満足のいくものではなく、上記に加えて、塩酸モルヒネが古典的に使用されてきた。塩酸モルヒネは、急性心不全での肺うっ血による呼吸困難等の軽減化のために用いられ、心不全治療に対する有効性は十分に認められるが、塩酸モルヒネが麻酔薬であることから、麻酔の取扱いで管理・使用しなければならず、取扱いが容易でないのが難点である。慢性心不全治療薬としても、利尿薬、アンジオテンシン転換酵素阻害薬、β−アドレナリン受容体遮断薬等が用いられてきたが、必ずしも満足のいくものではなかった（非特許文献１）。
【０００４】
カンナビノイド受容体は、７回膜貫通型ドメインを有するＧタンパク質(Gi/Go)共役型のＣＢ１受容体とＣＢ２受容体の２種がある。これらのうち、ＣＢ１受容体は脳等で多量に発現しており、神経伝達の抑制的制御に関与していると考えられている。一方、ＣＢ２受容体は脾臓や扁桃腺等、免疫系の臓器や細胞に多く発現しており、炎症反応や免疫応答の調節に関与していると考えられている。
【０００５】
脳内において、ＣＢ１受容体は海馬、線条体、黒質、前脳基底部、嗅球および小脳により多く存在し、脳幹、髄質、視床には少ない。ＣＢ１受容体は、シナプス前部に局在し、神経伝達物質の放出を抑制的に制御していると考えられている（非特許文献２）。
【０００６】
ＣＢ１受容体については、４種のアゴニスト、すなわちジベンゾピラン環を有したテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）誘導体の古典的カンナビノイド類、ＴＨＣ構造のピラン環が開裂した２環および３環性の誘導体である非古典的カンナビノイド類、アミノアルキルインドール類、ならびに内因性アゴニストとして知られているアナンダマイド（非特許文献３）等のアラキドン酸誘導体が広く知られている。
【０００７】
カンナビノイド受容体アゴニストであるＷＩＮ５５２１２−２は、脳虚血に基づく神経細胞死を抑制することが報告されており（非特許文献４）、その作用はグルタミン酸神経シナプス前部のＣＢ１受容体の活性化を介してグルタミン酸の遊離が抑制されるためと考えられている。また、Bakerらは、多発性硬化症の動物モデルにおいて、カンナビノイド受容体アゴニストである、ＷＩＮ５５２１２−２、ＪＷＨ−１３３、ＴＨＣおよびメタアマンダアミドが振戦や攣縮を改善することを報告している（非特許文献５）。
【０００８】
カンナビノイド受容体調節剤や、カンナビノイド受容体アゴニストの用途に関して、いくつか報告がなされているが、心疾患に用いることは報告されていない（非特許文献６、特許文献１、２）。
【非特許文献１】Circulation, 102, 14-23 (2000)
【非特許文献２】Trends Pharmacological Sciences; 22, 565-572(2001)
【非特許文献３】Science, 258, 1946-1949 (1992)
【非特許文献４】Journal of Neuroscience, 19, 2987-2995 (1999)
【非特許文献５】Nature, 404, 84 (2000)
【非特許文献６】Nature Reviews, 3, 771-784 (2004)
【特許文献１】特開2005-162657号公報
【特許文献２】国際公開WO2005/016351号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、心不全または肺うっ血の新規改善剤を提供することを課題とする。より詳しくは、塩酸モルヒネのような麻酔薬を使用することなく、効果的に心不全を改善し、心不全の症状、例えば肺うっ血等を軽減化しうる新規薬剤を提供することを課題とする。さらには、心不全改善剤または肺うっ血改善剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するためにカンナビノイド受容体と心不全および心不全に伴う症状との関係に着目し、鋭意検討を重ねた結果、カンナビノイド受容体の活性化により、急性心不全および慢性心不全ならびに肺うっ血（急性肺浮腫）の症状が改善し、死亡率を減少させうることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．カンナビノイド受容体アゴニスト作用を有する化合物を有効成分とする心不全または肺うっ血の改善剤。
２．心不全が、急性心不全または慢性心不全である、前項１に記載の改善剤。
３．肺うっ血が、心不全に起因する肺うっ血である前項１に記載の肺うっ血改善剤。
４．カンナビノイド受容体アゴニストが、ＣＢ１受容体アゴニストである前項１〜３のいずれか１に記載の改善剤。
５．カンナビノイド受容体の活性化効果を測定することによる心不全改善剤または肺うっ血改善剤のスクリーニング方法。
６．心不全改善剤が、急性心不全または慢性心不全の改善剤である、前項５に記載のスクリーニング方法。
７．肺うっ血改善剤が、心不全に起因する肺うっ血の改善剤である前項５に記載のスクリーニング方法。
８．カンナビノイド受容体が、ＣＢ１受容体である前項５〜７のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のカンナビノイド受容体アゴニスト作用を有する化合物を有効成分とする心不全改善剤の投与により、急性および慢性の心不全における各種心臓機能を改善し、心不全モデルマウスの死亡率の減少を認めた。また、心不全に伴う肺うっ血、すなわち肺重量の増加を改善し、急性肺浮腫による死亡率の減少を認めた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、カンナビノイド受容体アゴニスト作用を有する化合物とは、このようなアゴニスト作用を有する化合物であれば良く、特に限定されない。例えば天然物由来のものであってもよいし、合成された化合物であってもよい。例えばジベンゾピラン環を有したテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）誘導体の古典的カンナビノイド類、ＴＨＣ構造のピラン環が開裂した２環および３環性の誘導体である非古典的カンナビノイド類、アミノアルキルインドール類、ならびに内因性アゴニストとして知られているアナンダマイドが挙げられ、具体的には、Δ９ＴＨＣ、ＷＩＮ５５２１２−２、ＣＰ５５９４０、ＣＰ５４９３９、ＨＵ３０８、ＨＵ２１１（デキサナビノール）、ナビロン、カンナビノール、11-ヒドロキシカンナビノール、Ｏ−１０５７、レボナントラドール、アナンダミド、Ｒ１−メトアナンダミド、および２−ＡＧ（2-arachidonyl glycerol）等のカンナビノイドレセプターアゴニスト；オレアミドおよびパルミトイルエタノールアミド等のエンドカンナビン模擬剤ならびにそれらに関連する合成誘導体から選択することができる。より好適には、ＷＩＮ５５２１２−２が挙げられる。カンナビノイド受容体アゴニストは、ＣＢ１受容体アゴニストであるのがより好適である。
【００１４】
本発明における心不全とは、急性心不全や慢性心不全をいい、心不全に起因して生じる症状も本発明の範囲に含まれる。例えば、左心不全は、左心房・左心室が、十分な拍出量を保てない病態であり、血液の流れで左心系の上流に位置する肺に血液がうっ滞し、肺高血圧、胸水、呼吸困難、咳嗽等の症状をきたす。左心不全は、さらに肺血流の停滞を経由し、右心系へも負荷を与えるため、左心不全は放置すれば後述する右心不全を非常に合併しやすい。右心不全は、右心房や右心室が、十分な拍出量を保てない病態である。
【００１５】
本発明の心不全または肺うっ血の改善剤は、その効果を阻害しない範囲で、他の成分を含有させることができ、例えば薬学的に許容される担体として、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、乳化剤、可溶化剤、吸収促進剤、保湿剤、吸着剤、充填剤、増量剤、付湿剤、防腐剤等の添加剤を用いて周知の方法で製剤化することができる。ここに、賦形剤としては、有機系賦形剤および無機系賦形剤等が挙げられる。
【００１６】
本発明の心不全または肺うっ血の改善剤は、従来知られている心不全改善剤または肺うっ血改善剤と併用して用いてもよい。
【００１７】
本発明の心不全または肺うっ血の改善剤の剤型は、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ、もしくはシロップ剤、注射剤等の液剤等の形態が挙げられる。
【００１８】
本発明の心不全または肺うっ血の改善剤中の有効成分の含有量は、投与経路や剤型によっても異なるが、一概に限定できず、各種剤形化が可能な範囲で、投与量との関係で適宜選択することができる。例えば液剤の場合、０．０００１〜１０（ｗ／ｖ％）、好ましくは０．００１〜５（ｗ／ｖ％）、特に注射剤の場合、０．０００２〜０．２（ｗ／ｖ％），好ましくは０．００１〜０．１（ｗ／ｖ％）、固形剤の場合、０．０１〜６０（ｗ／ｗ％）、好ましくは０．０２〜５０（ｗ／ｗ％）等として調製できるが、必ずしもこの範囲に限定されるものではない。
【００１９】
本発明の心不全または肺うっ血の改善剤の投与量は、投与経路、症状、年齢、体重、あるいは予防または治療剤の形態等によって異なり、一概に限定できないが、例えば、肺うっ血改善の場合には、一日約１〜１０００ｍｇとなるように、１回または数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。
【００２０】
本発明の心不全または肺うっ血の改善剤の投与経路としては、経口投与、静脈内投与、動脈内投与（冠動脈内投与等）、筋肉内投与、経皮投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、直腸内投与、粘膜投与、吸入等が挙げられる。より好ましい投与経路は、経口投与若しくは静脈内投与である。
【００２１】
本発明は、候補化合物について、カンナビノイド受容体の活性化効果を測定することによる心疾患改善剤または肺うっ血改善剤のスクリーニング方法にも及ぶ。カンナビノイド受容体の活性化効果は、具体的にはアデニル酸シクラーゼ活性抑制によるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）産生減少効果を測定することによる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明の理解を深めるために実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。
【００２３】
（実施例１）心不全モデルマウスの心臓および肺に及ぼすカンナビノイド受容体（ＣＢ１）アゴニストの影響
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢）を用いて、1984年11月11日に米国心臓協会（ＡＨＡ）により採択されたガイドラインに記載の方法に従って、横行大動脈縮窄（ＴＡＣ）により心不全モデルマウス（以下、単に「ＴＡＣモデル」ともいう。）を作製した。
ＣＢ１アゴニストであるＷＩＮ５５２１２−２（Tocris Bioscience社）をＤＭＳＯ（dimethyl sulphoxide）に溶解し、生理食塩液にて希釈したものを、ＴＡＣモデル作製前２日から、０．２ｍｇ／ｋｇ／日を経口投与した。コントロールとして、開胸のみを行い横行大動脈縮窄をしなかったＳｈａｍ群、横行大動脈縮窄後ＷＩＮ５５２１２−２を投与しなかったＴＡＣ群を用いた。
Ｓｈａｍ群７匹、ＴＡＣ群１９匹、ＴＡＣ＋ＷＩＮ５５２１２−２投与群１３匹について検討を行った。
【００２４】
ＴＡＣモデル作製５週間後に、マウスを屠殺し、心臓および肺について、心重量／体重比（ＨＷ／ＢＷ）と肺重量／体重比（ＬＷ／ＢＷ）を測定した。その結果、図１（Ａ：心臓、Ｂ：肺）に示すように、ＴＡＣ群では、Ｓｈａｍ群に比べて、心と肺についてそれぞれ重量が増大しており、重い心肥大と肺うっ血が認められたのに対し、ＷＩＮ５５２１２−２投与群では、心肥大と肺うっ血の程度が有意に減少することが認められた。
【００２５】
（実施例２）心不全モデルマウスの心臓に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響
実施例１と同手法で作製したＴＡＣモデルについて、左心室内腔径および後壁厚に及ぼす影響を調べた。さらに、左心室短縮率および左室駆出率についても調べた。
左心室における心室の内腔径、後壁厚、心室短縮率および血液の駆出率は心臓超音波検査により測定した。
【００２６】
その結果、左心室内腔径については、ＴＡＣ群では、Ｓｈａｍ群に比べて左室肥大の傾向を示したが、ＷＩＮ５５２１２−２投与群では、ＴＡＣ群に比べて低い傾向であり、改善効果を示した（図２Ａ，Ｂ参照）。左心室後壁厚については、拡張末期および収縮末期では殆ど差を認めなかったが（図２Ｃ参照）。左心室短縮率および左室駆出率において、ＷＩＮ５５２１２−２投与群で優れた改善効果を示した（図２Ｄ）。
ＬＶＦＳは、以下の計算により求めた。
ＬＶＦＳ＝（ＬＶＥＤｄ−ＬＶＥＳｄ）／ＬＶＥＤｄ×１００
ＬＶＦＳ：左心室短縮率
ＬＶＥＤｄ：左心室拡張期径
ＬＶＥＳｄ：左心室収縮期径
【００２７】
（実施例３）心不全モデルマウスの心臓に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響
実施例１と同手法で作製したＴＡＣモデルについて、左心室における血液力学、圧、心拍数、収縮性等の心機能に及ぼす影響を調べた。
左心室圧については、収縮期および弛緩末期についてミラーカテーテル（Miller Catheter)により測定した。その結果、左心室圧は、収縮期ではＳｈａｍ群に比べて、ＴＡＣ群およびＴＡＣ＋ＷＩＮ５５２１２−２投与群のほうが高く、心拍数は逆であった（図３Ａ，Ｂ参照）。左心室収縮性(contractility index)については、ＴＡＣ群で収縮性が低下したのに対し、ＷＩＮ５５２１２−２投与群で改善した（図３Ｃ参照）。
【００２８】
（実施例４）各因子のリン酸化に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響
１）上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）のリン酸化
ラット新生児（１〜３日目）由来心筋細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地で、２４〜７２時間培養し、さらに無血清培地で２４〜４８時間培養した。続いて、培地に、アドレナリン作動薬の１種であるフェニレフリン（phenylephrine：シグマ社）を１０−４Ｍ含む系、フェニレフリンを１０−４Ｍと内因性カンナビノイドである２−ＡＧ（2-arachidonyl glycerol：シグマ社）を１０−５Ｍ含む系、フェニレフリンを１０−４ＭとＷＩＮ５５２１２−２を１０−５Ｍ含む系で２４時間培養した。フェニレフリンおよび各種ＣＢ１受容体アゴニストを含まない系を、コントロールとした。
【００２９】
培養した細胞を細胞可溶化緩衝液内で、４℃で２０分間インキュベーションし、分解したものを試料とし、ウエスタンブロッティング法により細胞ＥＧＦ−Ｒのリン酸化を確認した。細胞ＥＧＦ−Ｒのリン酸化は、抗リン酸化チロシン抗体（抗ＰＹ抗体）を用いて測定した。細胞可溶化緩衝液の組成は、50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.3; 150 mmol/L NaCl; 2 mmol/L EDTA; 0.5% フッ化ナトリウム; 10 mmol/L リン酸ナトリウム; 0.5 mmol/L Na3VO4; 100μg/mL フェニルメチルフッ化硫黄; 2 g/mL アプロチニンTM（タンパク質分解酵素）; 1% NonidetTM P-40（非イオン性界面活性剤）である。
【００３０】
その結果、フェニレフリンを１０−４Ｍ含む系で培養した細胞については、コントロールと比べてＥＧＦ−Ｒのリン酸化が明らかに増加し、さらに２−ＡＧを１０−５Ｍ、ＷＩＮ５５２１２−２を１０−５Ｍそれぞれ含む系では、フェニレフリン１０−４Ｍ単独の系に比べてＥＧＦ−Ｒのリン酸化を抑制した（図４Ａ）。この結果から、ＣＢ１受容体の活性化により、心肥大シグナルであるＥＧＦ−Ｒのリン酸化が抑制されることが確認された。
【００３１】
２）各種ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ，ＪＮＫおよびＰ３８）のリン酸化
各濃度のフェニレフリンおよびＷＩＮ５５２１２−２を含む系で、上記１）と同手法にて培養したラット新生児由来心筋細胞から調製した試料について、各種ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ(extra cellular signal-regulated kinase)、ＪＮＫ(c-Jun N-terminal kinase)およびＰ３８）のリン酸化を、各因子の抗体を用いたウエスタンブロッティング法により分析し、確認した。各々の抗体（抗マウス抗体）は、抗ＥＲＫ１／２抗体、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体、抗ｐ３８抗体、抗リン酸化ｐ３８抗体、抗ＪＮＫ抗体および抗リン酸化ＪＮＫ抗体 (Sant Cruz Biotechnology社)を用いた。
【００３２】
免疫反応の検出は、ＥＣＬ(Enhanced Chemiluminescence)試薬(アマシャム社) を用いた増強化学発光法により行った。定量は、デンシトメトリー(densitometry)とイメージソフトウェアにより行った。
【００３３】
その結果、コントロールに比べ、フェニレフリンを１０−４Ｍ含む系で培養した細胞では、各種ＭＡＰキナーゼリン酸化が明らかに増加するが、さらにＷＩＮ５５２１２−２を１０−５Ｍ含む系では、各種ＭＡＰキナーゼのリン酸化を抑制した（図４Ｂ）。この結果から、ＣＢ１受容体の活性化により、心肥大のシグナルであるＭＡＰキナーゼのリン酸化が抑制されることが確認された。
【００３４】
（実施例５）ＭＡＰキナーゼのリン酸化に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響
実施例１と同手法で作製したＴＡＣモデルについて、ＷＩＮ５５２１２−２を投与したときの、各種ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ、ＪＮＫおよびＰ３８）のリン酸化を確認した。各モデルマウスの心臓から蛋白を抽出し、実施例４と同手法にて各ＭＡＰキナーゼの活性化および発現量をウエスタンブロッティング法により分析した。
【００３５】
ＥＲＫ、ＪＮＫおよびＰ３８のリン酸化は、上記実施例４の２）のウエスタンブロッティングと同手法により確認した。その結果、Ｓｈａｍ群と比べ、ＴＡＣ群では各種ＭＡＰキナーゼのリン酸化が顕著に増加し、ＷＩＮ５５２１２−２（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）の経口投与を５週間行うことにより、各種ＭＡＰキナーゼのリン酸化を抑制した（図５）。この結果から、in vivoにおいても、ＣＢ１受容体の活性化が、心肥大のシグナルであるＭＡＰキナーゼのリン酸化を抑制することが明らかとなった。
【００３６】
（実施例６）ＡＭＰＫのリン酸化に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響
ラット新生児（１〜３日目）由来心筋細胞を、実施例４と同手法にて２４〜７２時間培養し、さらに２４〜４８時間無血清培地で培養した。続いて、培地中に１０−６Ｍおよび１０−７Ｍの各濃度のＷＩＮ５５２１２−２を含む系で各細胞を３０分間培養した。ＷＩＮ５５２１２−２を含まない系をコントロールとした。
【００３７】
培養した各細胞を、実施例４と同手法にて細胞可溶化緩衝液で、４℃で２０分間インキュベーションし、分解し、ＡＭＰＫ(5'AMP-activated protein kinase)のリン酸化を確認した。ＡＭＰＫのリン酸化は、ＡＭＰＫ抗体およびＡＭＰＫリン酸化抗体を用いてウエスタンブロッティング法により分析して確認した。その結果、コントロールと比較して、１０−６Ｍおよび１０−７Ｍの各濃度のＷＩＮ５５２１２−２を加えた系では、ＡＭＰＫのリン酸化が明らかに増加した（図６）。この結果から、ＣＢ１アゴニストにより、ＡＭＰＫをリン酸化することが確認され、培養心筋細胞の代謝能を改善することが確認された。
【００３８】
（実施例７）ＡＭＰＫのリン酸化に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響
実施例６と同手法にて培養した細胞について、ＷＩＮ５５２１２−２を１０−６Ｍ含む系で、３０分、１時間、２時間、４時間および８時間の各時間培養したときの、ＡＭＰＫのリン酸化を、経時的に確認した。
【００３９】
その結果、コントロールと比較して、ＷＩＮ５５２１２−２を１０−６Ｍ含む系で３０分および１時間培養したときは、ＡＭＰＫのリン酸化が増加したが、２時間以上培養したときは、ＡＭＰＫリン酸化の増加を認めなかった（図７）。
この結果から、ＣＢ１アゴニストにより、ＡＭＰＫリン酸化は培養後３０分から１時間で増加することが確認され、培養心筋細胞の代謝能を改善することがわかった。
【００４０】
（実施例８）ＣＢ１遺伝子を抑制したときのＡＭＰＫのリン酸化に及ぼす影響
ＣＢ１遺伝子に対するＲＮＡｉを用いて、ＣＢ１遺伝子を抑制したときのＡＭＰＫのリン酸化について調べた。ＷＩＮ５５２１２−２を１μＭとＣＢ１遺伝子を抑制するＲＮＡｉを含む系で、実施例４と同手法にてラット新生児由来心筋細胞を培養したときの、ＡＭＰＫのリン酸化の程度を、リン酸化していないＡＭＰＫとの関係で調べた。
【００４１】
上記細胞を５０〜７０％コンフルエントな状態に培養したものに、ＣＢ１のｓｉＲＮＡを形質導入試薬であるOptifectTM（Invitrogen社製）を用いてトランスフェクトした。
ＣＢ１のｓｉＲＮＡは、以下に示す配列であり、バイオブリッジ社により設計され、合成されたものを用いた。
ｓｉＲＮＡ配列： 5'-ggg aag aug aac aag cuu a-TT (センス側) （配列番号１）
ｓｉＲＮＡ配列： 5'-uaa gcu ugu uca ucu ucc c-TT (アンチセンス側)（配列番号２）
コントロールｓｉＲＮＡ配列： uag cga cua aac aca uca a -dTdT.（配列番号３）
【００４２】
ＡＭＰＫのリン酸化は、実施例６と同手法にて確認した。その結果、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした系においては、ＷＩＮ５５２１２−２を１μＭ投与したことにより、ＡＭＰＫのリン酸化が著明に増加した。一方、ＣＢ１のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした系では、ＷＩＮ５５２１２−２を１μＭ投与した場合でもＡＭＰＫのリン酸化増加は認められなかった（図８）。この結果から、ＷＩＮ５５２１２−２がＣＢ１を介してＡＭＰＫのリン酸化に貢献していると考えられた。
【００４３】
（実施例９）血中一酸化窒素濃度に及ぼすＣＢ１アゴニストの確認
実施例１と同手法で処理したマウスから採血し、血中の一酸化窒素濃度に及ぼすＣＢ１受容体アゴニストの影響を調べた。
【００４４】
血中一酸化窒素の測定は、酸化窒素分析システム（ＥＮＯTM−１０、エイコム株式会社）を用いて行った。その結果、Ｓｈａｍ群に比べて、ＴＡＣ群では血中一酸化窒素濃度が低下していたのに対し、ＷＩＮ５５２１２−２を投与した場合は、有意に血中一酸化窒素含有量の増加を認めた。血中一酸化窒素濃度は、血管拡張機能を示す指標と同時に、心保護作用の指標ともなりうる。
【００４５】
（実施例１０）ＣＢ１アゴニストによる肺重量に及ぼす影響
実施例１と同手法にて、ＩＣＲマウス（５〜７週齢）を用いて、ＴＡＣモデルを作製した。ＷＩＮ５５２１２−２およびＡＭ２５１をいずれもＤＭＳＯに溶解し、生理食塩液にて希釈した。２−ＡＧは、無水アルコール、分散剤（Emulphor(R)、エトキシル化脂肪アルコール系乳化剤）および生理食塩液を、おのおの１：１：１８の割合で含む溶液に溶解した。
ＴＡＣモデル作製１０分前に、０．２ｍｇ／ｋｇ濃度のＷＩＮ５５２１２−２を腹腔内注射により投与した。コントロールとしてＳｈａｍ群、横行大動脈縮窄（ＴＡＣ）後にＷＩＮ５５２１２−２を投与しなかったＴＡＣ群を用いた。
Ｓｈａｍ群１６匹、ＴＡＣ群９匹、ＴＡＣ＋ＷＩＮ５５２１２−２投与群５匹について検討を行った。
【００４６】
ＴＡＣモデル作製１時間後に各マウスを屠殺し、肺重量／体重比（ＬＷ／ＢＷ）を測定した。その結果、図１０に示すように、ＴＡＣ群では、Ｓｈａｍ群に比べて、肺について肥大が認められ、肺うっ血の傾向が認められたのに対し、ＣＢ１アゴニストであるＷＩＮ５５２１２−２または２−ＡＧ投与群では、肺うっ血の程度が低くなり、ＣＢ１アンタゴニストのＡＭ２５１投与群では、肺うっ血の増悪の傾向が認められた。
【００４７】
（実施例１１）生存率に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響
実施例１と同手法にて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢）を用いて作製したＴＡＣモデルおよびＴＡＣ後ＷＩＮ５５２１２−２を投与したモデルマウスの生存率を調べた。その結果、ＴＡＣ後０〜４日目において、明らかに、ＴＡＣ後ＷＩＮ５５２１２−２を投与した群での生存率が高かった（図１１）。同様に、ＴＡＣ後６週間後のＴＡＣモデルの生存率を、ＷＩＮ５５２１２−２投与群と非投与群において比較した。その結果、ＴＡＣ後ＷＩＮ５５２１２−２を投与した群では、非投与群と比較して、生存率が高い傾向を認めた（図１２）。以上の結果により、ＴＡＣモデルにおいて、急性および慢性において、ＣＢ１アゴニストであるＷＩＮ５５２１２−２投与群で、有意に生存率が改善したことが確認された。
【００４８】
（実施例１２）ＣＢ１アゴニストによるカテコラミン血中濃度に及ぼす影響（急性）
実施例１と同手法にて、ＩＣＲマウス（５〜７週齢）を用いて、ＴＡＣモデルを作製し、カテコラミン血中濃度について確認した。ＷＩＮ５５２１２−２をＤＭＳＯ（dimethyl sulphoxide）に溶解し、生理食塩液にて希釈し、０．２ｍｇ／ｋｇ濃度をＴＡＣモデル作製１０分前に、腹腔内注射により投与した。コントロールとしてＳｈａｍ群、横行大動脈縮窄（ＴＡＣ）後にＷＩＮ５５２１２−２を投与しなかったＴＡＣ群を用いた。Ｓｈａｍ群７匹、ＴＡＣ群１２匹、ＴＡＣ＋ＷＩＮ５５２１２−２投与群９匹について検討を行った。ＴＡＣモデル作製１時間後に各マウスを屠殺し、カテコラミンであるエピネフリンおよびノルエピネフリンの血中濃度を測定した。エピネフリンおよびノルエピネフリンの血中濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。
【００４９】
その結果、図１３に示すように、ＴＡＣ群では、Ｓｈａｍ群に比べて、エピネフリンおよびノルエピネフリンともに上昇の傾向が認められたのに対し、ＣＢ１アゴニストであるＷＩＮ５５２１２−２投与群では、エピネフリンおよびノルエピネフリン量が低くなった。カテコラミン血中濃度の上昇が、死亡率および心機能に影響を及ぼすものと考えられた。
【００５０】
（実施例１３）ＣＢ１アゴニストによるカテコラミン血中濃度に及ぼす影響（慢性）
実施例１と同手法にて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢）を用いて作製し、カテコラミン血中濃度について確認した。ＣＢ１アゴニストであるＷＩＮ５５２１２−２をＤＭＳＯに溶解し、生理食塩液にて希釈したものを、ＴＡＣモデル作製前２日から、０．２ｍｇ／ｋｇ／日を経口投与した。コントロールとして、Ｓｈａｍ群、横行大動脈縮窄後ＷＩＮ５５２１２−２を投与しなかったＴＡＣ群を用いた。Ｓｈａｍ群９匹、ＴＡＣ群１１匹、ＴＡＣ＋ＷＩＮ５５２１２−２投与群７匹について検討を行った。
【００５１】
その結果、ＴＡＣ後５週間後において、図１４に示すようにＴＡＣ群では、Ｓｈａｍ群に比べて、エピネフリンおよびノルエピネフリンともに上昇の傾向が認められたのに対し、ＣＢ１アゴニストであるＷＩＮ５５２１２−２投与群では、エピネフリンおよびノルエピネフリン量が低くなった。カテコラミン血中濃度の上昇が、死亡率および心機能に影響を及ぼすものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上説明したように、本発明のカンナビノイド受容体アゴニスト作用を有する化合物を有効成分とする心不全改善剤の投与により、急性および慢性の心不全における各種心臓機能を改善し、心不全モデルマウスの死亡率の減少を認めた。また、心不全に伴う肺うっ血、すなわち肺重量の増加を改善し、急性肺浮腫による死亡率の減少を認めた。
これにより、カンナビノイド受容体アゴニスト作用を有する化合物は、急性心不全、慢性心不全の改善薬として利用することができ、さらには心不全に伴う急性肺浮腫改善薬としても利用できる。さらには、本発明のスクリーニング方法、つまりカンナビノイド受容体アゴニスト作用を有する物質をスクリーニングすることにより、新規な心不全改善剤、肺うっ血改善剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ】ＴＡＣモデルの心臓に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例１）
【図１Ｂ】ＴＡＣモデルの肺に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例１）
【図２Ａ】ＴＡＣモデルの左心室壁に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例２）
【図２Ｂ】ＴＡＣモデルの左心室面積に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例２）
【図２Ｃ】ＴＡＣモデルの左心室後壁厚に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例２）
【図２Ｄ】ＴＡＣモデルの左心室収縮期機能に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例２）
【図３Ａ】ＴＡＣモデルの心機能（血液力学）に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例３）
【図３Ｂ】ＴＡＣモデルの左心室圧および心拍数に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例３）
【図３Ｃ】ＴＡＣモデルの左心室収縮性に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例３）
【図４Ａ】培養細胞における各種因子のリン酸化に対するＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例４）
【図４Ｂ】培養細胞における各種因子のリン酸化に対するＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例４）
【図５】培養細胞における各種因子のリン酸化に対するＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例５）
【図６】培養細胞における各種因子のリン酸化に対するＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例６）
【図７】培養細胞における各種因子のリン酸化に対するＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例７）
【図８】ｓｉＲＮＡを用いたＣＢ１遺伝子の欠失と各種因子のリン酸化に及ぼす影響を示す図である。（実施例８）
【図９】ＴＡＣモデルの血中一酸化窒素濃度に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例９）
【図１０】ＴＡＣモデルの肺重量（肺うっ血）に及ぼす各種ＣＢ１アゴニストおよびアンタゴニストの影響を示す図である。（実施例１０）
【図１１】ＴＡＣモデル（急性）の生存率に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例１１）
【図１２】ＴＡＣモデル（慢性）の生存率に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例１１）
【図１３】ＴＡＣモデル（急性）のカテコラミン血中濃度に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例１２）
【図１４】ＴＡＣモデル（慢性）のカテコラミン血中濃度に及ぼすＣＢ１アゴニストの影響を示す図である。（実施例１３）
【図２Ｂ】
2009269869.tif 000003
【図２Ｃ】
2009269869.tif 000004
【図２Ｄ】
2009269869.tif 000005
【図３Ｂ】
2009269869.tif 000006
【図３Ｃ】
2009269869.tif 000007
【図９】
2009269869.tif 000008
【図１０】
2009269869.tif 000009
【図１１】
2009269869.tif 000010
【図１２】
2009269869.tif 000011
【図１３】
2009269869.tif 000012
【図１４】
2009269869.tif 000013
【図１Ａ】
2009269869.tif 000014
【図１Ｂ】
2009269869.tif 000015
【図２Ａ】
2009269869.tif 000016
【図３Ａ】
2009269869.tif 000017
【図４Ａ】
2009269869.tif 000018
【図４Ｂ】
2009269869.tif 000019
【図５】
2009269869.tif 000020
【図６】
2009269869.tif 000021
【図７】
2009269869.tif 000022
【図８】
2009269869.tif 000023
【配列表】
2009269869000001.app