(57)【要約】【課題】リン酸化ＣＤＣ４８抗体の提供および当該抗体を用いたリン酸化ＣＤＣ４８測定用試薬、リン酸化ＣＤＣ４８測定法の提供。【解決手段】ほ乳類由来ＣＤＣ４８／ＶＣＰ／ｐ９７に由来するペプチドを動物に免疫して得られるリン酸化ＣＤＣ４８抗体を得た。ウエスタンブロット法、免疫組織化学染色等にこの抗体を用いることによってリン酸化ＣＤＣ４８測定法を得た。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列における７８４位のセリン残基がリン酸化されたＣＤＣ４８／ＶＣＰ／ｐ９７を選択的に認識するリン酸化ＣＤＣ４８抗体。
【請求項２】
配列番号２で示されるペプチドを含む抗原を動物に免疫して得られるリン酸化ＣＤＣ４８抗体。
【請求項３】
前記動物がウサギまたはマウスである請求項１または２に記載のリン酸化ＣＤＣ４８抗体。
【請求項４】
リン酸化ペプチドでアフィニティー精製したものである請求項１〜３のいずれかに記載のリン酸化ＣＤＣ４８抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のリン酸化ＣＤＣ４８抗体を用いるリン酸化ＣＤＣ４８の測定方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のリン酸化ＣＤＣ４８抗体を含有するリン酸化ＣＤＣ４８測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリン酸化ＣＤＣ４８に対して特異的に反応する特異抗体に関する。また、この抗体を用いるリン酸化ＣＤＣ４８の測定方法およびその測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤＣ４８は、ＶＣＰ（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）またはｐ９７とも呼ばれ、ＡＡＡファミリー（ＡＴＰａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）に属する細胞内タンパク質である（非特許文献１、参照）。この遺伝子は酵母の低温感受性変異体として発見された（非特許文献２、参照）。
【０００３】
現在、細胞生物学分野の研究によって、このＣＤＣ４８が多機能な分子シャペロンとして細胞内のタンパク合成、タンパク分解、膜融合、核移行、細胞分裂等のさまざまな細胞機能に関与することが知られている（非特許文献３、４、参照）。ＣＤＣ４８は細胞内のシグナル伝達に従ってリン酸化され、これによって分子構造が変化し、タンパク質の機能が変化または活性化すると推定されている。これまでの研究によって、魚類細胞およびヒト細胞ではチロシン残基Ｔｙｒ８０５のリン酸化が細胞分化および細胞増殖に必須であることが明らかにされている（非特許文献５、６、参照）。
【０００４】
また、ヒトＣＤＣ４８のリン酸化部位としてセリン残基Ｓｅｒ７８４も同定されている。細胞への紫外線照射が刺激となって活性化したＤＮＡ−ＰＫおよび他のＰＩＫＫファミリーによって、ＣＤＣ４８のセリン残基Ｓｅｒ７８４のリン酸化が生じる（非特許文献７、参照）。この研究では、ＣＤＣ４８のリン酸化を検出するため、酵素分解したリン酸化ペプチド断片を質量分析によって解析し、リン酸化を測定している。また、チェックポイント制限タンパク質Ｃｈｋ２リン酸化抗体が本来の基質であるＣｈｋ２のリン酸化部位とアミノ酸配列が類似していることを見いだし、リン酸化されたＣＤＣ４８と交差する作用を利用して、ＣＤＣ４８のリン酸化を検出している。しかしながら、この抗体の特異性は低く、セリン残基Ｓｅｒ７８４がリン酸化されたＣＤＣ４８だけでなく、ウエスタンブロットによってフィラミン、ＤＮＡ−ＰＫ等の他のタンパク質に対しても反応することが示され、リン酸化ＣＤＣ４８だけを特異的に検出する抗体はこれまでに報告されていない。
【０００５】
従って、紫外線、放射線、細胞分化等の刺激によって、リン酸化が生じ、ＣＤＣ４８分子の分子機能が活性化することが考えられるが、リン酸化されたＣＤＣ４８の細胞内作用の解析のため、リン酸化ＣＤＣ４８を特異的に抗体で検出することは不可能であった。
【０００６】
ＣＤＣ４８は、脳および筋肉の障害を引き起こす遺伝病の原因遺伝子であることが同定されている（非特許文献８〜１０、参照）。これらの医学的知見から、ＣＤＣ４８とそのリン酸化シグナルは重要な生理的役割を果たしていると考えられ、ＣＤＣ４８のリン酸化シグナルを検出し、定量化することによる病態の診断法や治療法の提供が望まれている。
【非特許文献１】Ｚａｌｋ  Ｒ  ａｎｄ  Ｓｈｏｓｈａｎ−Ｂａｒｍａｔｚ  Ｖ．，  ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｐ９７／ＶＣＰ  （ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ），  ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＡＡＡ  ＡＴＰａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．２００３；３７４：４７３−４８０．
【非特許文献２】Ｍｏｉｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ−ｃｙｃｌｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ：  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ａｎｄ  ｐｓｅｕｄｏｒｅｖｅｒｓｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９８２；１００：５４７−５６３．
【非特許文献３】Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＡＡ−ＡＴＰａｓｅ  ｐ９７／Ｃｄｃ４８ｐ，  ａ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００２；２２：６２６−６３４．
【非特許文献４】Ｍａｙｒ  ＰＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ９７（ＶＣＰ）  ａｎｄ  ｐ４７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｐ３４ｃｄｃ２  ｋｉｎａｓｅ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；７８：２２４−２３２．
【非特許文献５】Ｅｇｅｒｔｏｎ  Ｍ，  Ｓａｍｅｌｓｏｎ  ＬＥ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９：１１４３５−１１４４１．：
【非特許文献６】Ｉｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ  ｇｅｎｅ  ＣＤＣ４８  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｏｌｄ  ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｃｅｌｌｓ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００３；５４９：１４−２０．
【非特許文献７】Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｓｅｒ７８４  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５；６５：７５３３−７５４０．
【非特許文献８】Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｅｒｎｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＡＡＡ  ＡＴＰａｓｅ  ｐ９７／ＶＣＰ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ．２００３；１４：４２２１−４２２９
【非特許文献９】Ｗａｔｔｓ  ＧＤ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ  ｍｙｏｐａｔｈｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐａｇｅｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｎｔ  ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００４；３６：３７７−３８１．
【非特許文献１０】Ｇｕｙａｎｔ−Ｍａｒｅｃｈａｌ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００６；６７：６４４−６５１．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、セリン残基（Ｓｅｒ７８４）がリン酸化された活性型のＣＤＣ４８に対して特異的に反応してその存在を測定することができる特異抗体を得ることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、このリン酸化部位の周辺に位置する特定のアミノ酸配列のペプチドを抗原とすることで、活性型のＣＤＣ４８に特異的に反応する抗体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ＣＤＣ４８のセリン残基Ｓｅｒ７８４のリン酸化シグナルを特異的に検出するために、ほ乳類由来ＣＤＣ４８／ＶＣＰ／ｐ９７に由来するペプチドを動物に免疫して得られるリン酸化ＣＤＣ４８抗体を提供するものである。本発明者らは、このリン酸化ＣＤＣ４８抗体を用いてリン酸化ＣＤＣ４８の免疫学的測定法を提供し、更に、このリン酸化ＣＤＣ４８抗体を含有するリン酸化ＣＤＣ４８測定用試薬を提供するものである。
【０００９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（６）に記載のリン酸化ＣＤＣ４８抗体、リン酸化ＣＤＣ４８の免疫学的測定法およびリン酸化ＣＤＣ４８測定用試薬等に関する。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列における７８４位のセリン残基がリン酸化されたＣＤＣ４８／ＶＣＰ／ｐ９７を選択的に認識するリン酸化ＣＤＣ４８抗体。
（２）配列番号２で示されるペプチドを含む抗原を動物に免疫して得られるリン酸化ＣＤＣ４８抗体。
（３）前記動物がウサギまたはマウスである上記（１）または（２）に記載のリン酸化ＣＤＣ４８抗体。
（４）リン酸化ペプチドでアフィニティー精製したものである上記（１）〜（３）のいずれかに記載のリン酸化ＣＤＣ４８抗体。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のリン酸化ＣＤＣ４８抗体を用いるリン酸化ＣＤＣ４８の測定方法。
（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のリン酸化ＣＤＣ４８抗体を含有するリン酸化ＣＤＣ４８測定用試薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のリン酸化ＣＤＣ４８抗体を用い、ＣＤＣ４８のリン酸化シグナルを検出し、定量化することによって検査対象における病態の診断法や治療法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」には、配列番号１で示されるアミノ酸配列における７８４位のセリン残基がリン酸化されたＣＤＣ４８／ＶＣＰ／ｐ９７を選択的に認識できる抗体であればいずれのものも含まれる。
【００１２】
本発明の「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」は、配列番号２で示されるペプチドを含む抗原を動物に免疫して得られるリン酸化ＣＤＣ４８抗体であることが特に好ましい。
配列番号２で示されるペプチドのアミノ酸配列は、コンピュータ解析の結果、図１に示されたように、広く動物由来のＣＤＣ４８において、高度に保存されており、ヒト（アクセション番号ＮＰ＿００９０５７）、マウス（アクセション番号ＮＰ＿０３３５２９）、ラット（アクセション番号ＮＰ＿４４６３１６）、イヌ（アクセション番号１３０３３３４Ａ）、ウシ（アクセション番号ＮＰ＿００１０２９４６６）等ほ乳類由来のＣＤＣ４８で完全に保存されている。ニワトリ（アクセション番号ＢＡＥ９２９３７）ではセリンリン酸化部位周辺の１残基、アフリカツメガエル（アクセション番号ＮＰ＿００１００５６７７）では２残基、ゼブラフィッシュ（アクセション番号ＢＡＣ８７７４０）では３残基だけでアミノ酸置換が見られるという、非常に保存されたアミノ酸配列を有している。また、このペプチドは抗原性および親水性が高く、ペプチド抗原として適していることが見出された。
【００１３】
配列番号２で示されるリン酸化部位セリン７８４を中心とするポリペプチドはアプライドバイオシステムズ社製ＡＢＩ  ４３１Ａ、パーセプティブ社製９０５０型、島津製作所製ＰＳＳＭ−８など等の一般に用いられている固相合成法による全自動ペプチド合成機で化学合成したものを用いることが好ましい。全自動ペプチド合成機で化学合成されたペプチドは、飛行時間型質量分析計、液体クロマトグラフ質量分析計などを用いて質量分析より目的のペプチドであることが確認できる。また、このポリペプチドは、合成を行う業者に委託して作成されたものも用いることができる。
【００１４】
本発明の抗体の製造にあたり、用いられる抗原としては配列番号２で示されるペプチドをそのまま用いることもできるが、抗原性を高めるために、キャリアーを用いることが好ましい。
キャリアーとしてヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、以下、ＫＬＨとする）、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン等を用いることができるが、特にＫＬＨを用いることが好ましい。配列番号２で示されるペプチドのＣ末端にシステインを付加した抗原ペプチドとキャリアーと結合は、ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  −Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  エステル（ＭＢＳ）を用いて抗原ペプチドのＣ末端に付加したシステイン残基のチオール基に対してキャリアーを架橋して結合させ、抗原として用いることが好ましい。また、グルタールアルデヒド、カルボジイミドなど他の架橋剤を用いて抗原ペプチドとキャリアータンパク質とを結合させる方法や多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）によってキャリアータンパク質を用いないで抗原性を高める方法も利用できる。
【００１５】
本発明の「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」は一般的に知られている方法で製造することができる。上記のように調製した配列番号２で示されるペプチドを含む抗原を動物に免疫することで、本発明の「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」を含む抗血清を得ることできる。具体的には、リン酸化ＣＤＣ４８ペプチド−ＫＬＨ溶液を抗原としてフロイント完全アジュバントと混合し、ウサギ皮下に２週間に１回投与し、２〜４ケ月後静脈血を採取し、抗血清を得ることで製造することができる。免疫に用いる動物としては、一般によく使用されるウサギを初めとしてヤギ、ラット、マウス、ニワトリなどが挙げられる。この「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」を含む抗血清も本発明の「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」に含まれる。
【００１６】
本発明によって得られた「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」の抗体価の検定はＥＬＩＳＡ法によって行われることが好ましい。
ＥＬＩＳＡ法は一般的に知られているいずれの方法も用いる事ができるが、例えばリン酸化ペプチド溶液を９６穴マイクロプレートに加え、室温にて一晩放置することによりペプチド抗原をプレートに固相化し、これを一次抗体として希釈した上記抗血清と反応させた後、０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳを加え、さらに二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させた後、０．０５％ツイーン２０および０．１５  Ｍ  食塩を含有するトリス塩酸緩衝液（ＴＢＳＴ）で洗浄することで行うことができる。そして、ＥＬＩＳＡ試薬（バイオラッド社）を基質として加えて発色させ、４５０ｎｍの吸光度を９６穴マイクロプレートリーダーで測定することで、抗体価の検定をすることができる。
【００１７】
本発明の「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」、または「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」を含む抗血清は、必要に応じて精製して用いることが好ましい。精製には、例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー等の一般的な精製法を用いてもよいし、更に、リン酸化ペプチドでアフィニティー精製することが好ましい。リン酸化ペプチドでアフィニティー精製する場合には、セファロース４Ｂに抗原ペプチドであるリン酸化ペプチドを固定化したゲルカラムを用いることで、リン酸化ＣＤＣ４８抗体を高度に精製することができる。このようにして、ＣＤＣ４８のリン酸化部位ペプチドに対する抗体を容易に多量に得ることができる。
【００１８】
このようにして製造された本発明の「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」を用いてリン酸化ＣＤＣ４８の測定用試薬を調製することができる。例えば組織化学で用いられる代表的な酵素免疫分析用の試薬が挙げられ、具体的にはリン酸化ＣＤＣ４８抗体、ビオチン化二次抗体、アビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体、過酸化水素、ジアミノベンチジンからなる測定用試薬等が挙げられる。
【００１９】
また、本発明の「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」をリン酸化ＣＤＣ４８の測定法に用いることができる。本発明の「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」を用いるリン酸化ＣＤＣ４８の測定法として、例えばウエスタンブロット法や免疫組織化学染色において「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」を一次抗体として用いることで、対象試料に含まれるリン酸化ＣＤＣ４８を測定することができる。
測定の対象に用いる試料とは、ＣＤＣ４８を有するものであればいずれも用いることができるが、ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ等の培養細胞、生体組織等を用いる事ができ、このＣＤＣ４８リン酸化の測定によって、ガンマ線照射、紫外線照射、熱ストレス、低温ショック、飢餓ストレス等の刺激による培養細胞および生体組織等の影響を調べることができる。
【００２０】
例えば、「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」を用いたリン酸化ＣＤＣ４８の測定法を用い、本発明者らは低線量ガンマ線照射によってアタキシア症原因酵素ＡＴＭキナーゼが活性化し、このＡＴＭキナーゼの作用によってＣＤＣ４８セリン７８４残基のリン酸化が誘導されることを見いだしている。このように、本発明の「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」を用いたリン酸化ＣＤＣ４８の測定法により、放射線によるＤＮＡダメージによって引き起こされる細胞内リン酸化シグナルを解析することができる。
さらに従来、ＡＴＭキナーゼの基質として、ｐ５３、Ｃｈｋ２、Ｎｂｓ１、Ｂｒｃａ１、ＦａｎｃＤ２の５種類のタンパク質が見つかっている（参考文献１、参照）が、この結果からＣＤＣ４８はＡＴＭキナーゼの新しい基質として活性化されることが明らかとなった。このように、照射に伴って生じるＤＮＡダメージによってリン酸化ＣＤＣ４８が誘導されることから、リン酸化ＣＤＣ４８は放射線生物学の新しいバイオマーカーとして利用できることが示された。
参考文献１：ＭｃＫｉｎｎｏｎ  ＰＪ：ＡＴＭ  ａｎｄ  ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ．  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．２００４；５，７７２-７７６．
【００２１】
また、ラパマイシン標的タンパク質  （以下、ＴＯＲキナーゼとする）は飢餓およびオートファジーが生じる際にリン酸化が抑制されるという特徴をもつシグナル分子であることが知られている（参考文献２、３、参照）。
そこで、本発明者らは本発明の「リン酸化ＣＤＣ４８抗体」を用いたリン酸化ＣＤＣ４８の測定法により、ＴＯＲキナーゼの基質として、ＣＤＣ４８のセリン７８４がリン酸化を受けることを見いだした。そして、オートファジーのシグナル分子としてもＣＤＣ４８がリン酸化され活性化するという新しい成果が得られた。このことより、ＴＯＲキナーゼによって直接制御される分子としてＣＤＣ４８がリン酸化によって活性化され、細胞内のタンパク分解、タンパク質の変性抑制などに関与する分子メカニズムが推定された。
参考文献２：Ｋｉｍ  ＫＷ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２００６；２８１（４８），３６８８３−３６８９０
参考文献３：田中啓二・大隈良典編集、蛋白質核酸酵素  「ユビキチン−プロテアソーム系とオートファジー」共立出版、２００６年
【００２２】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
１．抗原の作製
配列番号２のペプチドのＣ末端にシステイン残基を導入したペプチドは、株式会社日本バイオサービスによって化学合成されたものを抗原として用いた。キャリアーとしてＫＬＨを用い、抗原ペプチドのＣ末端のシステイン残基におけるチオール基とＫＬＨとを架橋試薬ＭＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて結合させ、免疫源とした（参考文献４、５参照）。
参考文献４：Ｔ．Ｋｉｔａｇａｗａ  ａｎｄ  Ｔ．Ａｉｋａｗａ．  Ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ．（１９７６）．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９，２３３−２３６．
参考文献５：大海忍・辻村邦夫・稲垣昌樹：  抗ペプチド抗体実験プロトコール、秀潤社、ｐｐ．１−３１２、１９９４年
【００２４】
２．抗体の作製
このＣＤＣ４８−Ｓｅｒ−７８４リン酸化ペプチド−ＫＬＨ溶液（タンパク質濃度２ｍｇ／ｍＬ）を等量のフロイント完全アジュバンド（ＰＩＥＲＣＥ社製）と混合した後、これを抗原として、ウサギに２週間に１回免疫し、１３３日後静脈血を採取し、抗血清を得た。こうして得られたウサギ抗血清をＰＢＳで二倍に希釈した後、リン酸化ＣＤＣ４８ペプチド抗原を固定化したセファロース４Ｂゲルと３７℃で１時間震盪して混合し、次に４℃で８時間反応させた。次いで、ゲルをカラムに充填した後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳおよびＰＢＳで未反応の成分を洗浄し除去した。２８０ｎｍにてタンパク質の溶出位置をモニターしながら、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２）にて抗体をカラムから溶出した。溶離した抗体溶液に対して、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）を添加して中和した。こうして、アフィニティー精製抗体１．８ｍｇ（タンパク質濃度３６７μｇ／ｍＬ）を得た。
【実施例２】
【００２５】
抗体の特異性の確認
実施例１で得た抗体が、セリン残基（Ｓｅｒ７８４）がリン酸化されたＣＤＣ４８に特異的に反応するかどうかをＥＬＩＳＡ法により調べた。すなわち、ペプチド抗原を希釈したものをマイクロプレートに分注し、ウェルに吸着させた後、ＢＳＡのブロッキング溶液でブロッキングすることで抗原ペプチドを固相化した９６穴マイクロプレートに対してウェルを洗浄したあと、一次抗体としてこの抗体の希釈液を加え反応させたのち、ＰＢＳで洗浄した。さらにペルオキシダーゼ標識二次抗体を各ウェルに添加し反応させたあと、ＰＢＳで洗浄した。この各ウェルにＴＭＢＺ（３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン）基質を加え発色させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した（参考文献５参照）。その結果、図２に示すように、抗血清および精製した抗体はいずれもリン酸化ポリペプチドに対して反応した。一方、リン酸化していないペプチドを用いたＥＬＩＳＡ分析では、抗血清および精製した抗体はいずれも反応しなかった。これらの結果から、得られた抗体は、ＣＤＣ４８由来ポリペプチドのセリン残基（Ｓｅｒ７８４）がリン酸化されたものに対して高い特異性を有することが確認された。
【実施例３】
【００２６】
リン酸化ＣＤＣ４８の測定法
（ウエスタンブロット法による抗体解析）
上記で作成したリン酸化ＣＤＣ４８抗体を用い、通常、タンパク質の抗体検出法に用いられているウエスタンブロット法により既報の分析法（参考文献５、参照）に従って対象試料を解析した。すなわち、直径１０ｃｍのシャーレを用いて牛胎児血清（５％）、ペニシリン（５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）含むライボビッツＬ１５培地（インビトロジェン社）を使用し３０℃で培養したゼブラフィッシュ培養細胞に対してγ線を照射したのち、サンプルバッファー（２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（コンプリートミニ、ロッシュ社）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６．８）を用いて１００℃で２分間加熱処理して細胞を溶解し、電気泳動用試料を調製した。この試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動５％ゲルまたは７．５％ゲル（株式会社アトー製）を用いて分離したのち、ＰＶＤＦ膜（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に電気的に転写した。一次抗体としてアフィニティー精製抗体の１０００倍希釈液を用い、二次抗体として１％カゼインを含むペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）の１００００倍希釈液と反応させた後、ＴＢＳＴで洗浄後、ケミルミネッセンス反応キット（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いてＸ線フィルムに抗原抗体反応の化学発光シグナルを露光して検出した。
【００２７】
分子量マーカーはＭａｇｉｃＭａｒｋ  ＸＰ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（インビトロジェン社）を用いた。対照として、ｐ５３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ｐ５３（Ｓｅｒ−１５）リン酸化抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＡＴＭ抗体（Ａｂｃａｍ社）、ＡＴＭ（Ｓｅｒ−１９８１）リン酸化抗体（Ａｂｃａｍ社）および本発明者が作製したゼブラフィッシュＣＤＣ４８アミノ酸配列におけるフェニルアラニン残基１３８位からメチオニン残基１５８位までの２０残基のポリペプチド（配列番号３）を抗原とした抗体であるＣＤＣ４８抗体（ウサギポリクローナル抗体）（非特許文献６、参照）を分析に用いた。その結果、図３に示すように、本発明のリン酸化ＣＤＣ４８抗体を用いることによって、ゼブラフィッシュ細胞抽出物にリン酸化ＣＤＣ４８が存在することが確認された。
このＣＤＣ４８のＳｅｒ７８４のリン酸化反応は、放射線照射によって自己リン酸化がＡＴＭ（Ｓｅｒ−１９８１）で生じるとともに、ＡＴＭのリン酸化反応性の基質であるｐ５３（Ｓｅｒ−１５）リン酸化も生じた。一方、通常のタンパク質に対する抗体ｐ５３抗体、ＡＴＭ抗体では、放射線で誘導されなかった。以上のように、ＣＤＣ４８のリン酸化は放射線強度に依存して、リン酸化反応が生じたことから、ＣＤＣ４８は、ＡＴＭリン酸化によって生じる新しいタンパク質基質であることが明らかとなった。
【実施例４】
【００２８】
ＣＤＣ４８リン酸化シグナルの免疫組織化学染色キット及び測定法
リン酸化ＣＤＣ４８抗体を用いて、動物組織および培養細胞を対象として、ＣＤＣ４８のリン酸化シグナルが誘導された細胞を特異的に検出する目的に利用する検査キットを作製した。この検査キットに含まれる試薬類を表１に示した。
【００２９】
このキット化された試薬類を用いることによって、既報の細胞組織染色法によって染色した。すなわち、ゼブラフィッシュ胚より樹立されたＺＥ細胞株を用いて、牛胎児血清（５％）、ペニシリン（５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）含むライボビッツＬ１５培地（インビトロジェン社）を使用し３０℃で培養した。細胞をカバーグラスの上に培養して、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで１５分間固定した。ＰＢＳでカバーグラスを洗浄後、３％牛胎児血清を含むＰＢＳでブロッキングしたのち、一次抗体としてアフィニティー精製抗体の希釈液を用いて１時間室温で処理した。次に、二次抗体として、ｆｌｕｏｒ４８８蛍光標識抗ウサギＩｇＧと３０分間室温で反応したあと、ＰＢＳで１０分間洗浄した。ＤＡＰＩ染色液（和光純薬工業株式会社製）で対比核染色を行った後、カバーグラスをのせて顕微鏡で染色像を観察した。次に、共焦点レーザー顕微鏡（ライカ社）でリン酸化されたＣＤＣ４８の細胞内の局在性を観察した。培地をＰＢＳで置き換えて１時間培養することによる飢餓試験の結果、図４に矢印で示すようにＣＤＣ４８（Ｓｅｒ−７８４）リン酸化が誘導され、核でのシグナルが増大し、飢餓によるシグナル活性化がＣＤＣ４８で生じることが示された。従って、このキットを用いることで、ＣＤＣ４８のリン酸化シグナルが誘導された細胞を特異的に検出できることが確認された。
【００３０】
【表１】
2009120524.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明によって得られたリン酸化ＣＤＣ４８抗体は、ＡＴＭキナーゼおよびＴＯＲキナーゼのシグナル経路の解析に関する放射線生物学、分子細胞生物学の新しい分析試薬として、生命科学研究の進展に対して寄与するとともに、ＡＴＭキナーゼおよびＴＯＲ関連の病態の解析、診断および治療などに関わる分析測定技術に活用される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＣＤＣ４８ペプチドのアミノ酸配列をコンピュータ解析した結果を示した図である。
【図２】ＥＬＩＳＡによる抗体の特異性の測定結果を示した図である（実施例２）。
【図３】ウエスタンブロットによるリン酸化抗体の特異性確認を示した図である（実施例３）。
【図４】ＣＤＣ４８セリン−７８４リン酸化抗体を用いる免疫組織化学染色を示した図である（実施例４）。
【図１】
2009120524.tif 000003
【図２】
2009120524.tif 000004
【図３】
2009120524.tif 000005
【図４】
2009120524.tif 000006
【配列表】
2009120524000001.app