(57)【要約】【課題】新しいメカニズムに基づく優れた抗ヒスタミン作用を有し、眠気や倦怠感などの副作用が軽減された医薬を提供する。【解決手段】抗ヒスタミン作用を有する医薬であって、ビフィズス菌の菌体（例えば、ビフィドバクテリウム・インファンテス及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体）を有効成分として含む医薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ヒスタミン作用を有する医薬であって、ビフィズス菌の菌体を有効成分として含む医薬。
【請求項２】
ビフィズス菌として少なくともビフィドバクテリウム・インファンテス及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガムを含む請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
ビフィズス菌としてビフィドバクテリウム・インファンテス及びビフィドバクテリウム・ロンガムを組み合わせて含む請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム・インファンテス及びビフィドバクテリウム・ロンガムを７：３の質量比で含む請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
抗ヒスタミン作用がヒスタミンＨ１レセプターのメッセンジャーRNA発現抑制作用及び／又はヒスチジン脱炭酸酵素のメッセンジャーRNA発現抑制作用に基づくものである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項６】
抗ヒスタミン作用がヘルパーＴ２細胞サイトカインのメッセンジャーRNA発現抑制作用を伴うものである請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
ビフィズス菌の菌体を有効成分として含むヒスタミンＨ１レセプターのメッセンジャーRNA発現及び／又はヒスチジン脱炭酸酵素のメッセンジャーRNA発現に対する抑制剤。
【請求項８】
アレルギー症状発症時におけるヒスタミン合成量を減少させる医薬であって、ビフィズス菌の菌体を有効成分として含む医薬。
【請求項９】
アレルギー症状発症時におけるヒスタミンＨ１レセプター量を減少させる作用を有する医薬であって、ビフィズス菌の菌体を有効成分として含む医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒスタミン作用を有する医薬に関する。より詳しくは、嫌気性菌であるビフィズス菌(Bifidobacterium)の菌体を有効成分として含み、新しいメカニズムに基づく抗ヒスタミン作用を有する医薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体アミンであるヒスタミンはオータコイドの一種であり、種々の動植物組織に存在し、ヒスチジンデカルボキシラーゼ(HDC)の作用によってL-ヒスチジンから生合成される。最大の貯蔵部位である肥満細胞や好塩基球に貯留されているヒスタミンは抗原-IgE抗体複合体の刺激で遊離され、ヒスタミンＨ１レセプター(H1R)を介した即時型免疫反応を惹起する。ヒスタミンの放出を誘導する抗原としてはスギなどの植物に由来する花粉や塵、ダニなどが挙げられる。即時型免疫反応の結果、アトピー性皮膚炎や花粉症、気管支喘息、蕁麻疹などのアレルギー症状が発現する。
【０００３】
ヒスタミン由来のアレルギー症状を緩和・治癒させる目的で今までに多くの抗ヒスタミン薬が開発されている。しかしながら、従来開発された抗ヒスタミン薬は、程度の差はあるものの脳関門を通過して中枢神経のH1R又はコリン作動性レセプターに作用する結果、鎮静作用、眠気、倦怠感、又は喉の渇きなどの副作用を伴うという問題がある。従って、これらの副作用のない抗ヒスタミン薬の提供が切望されている。
【０００４】
副作用のない抗ヒスタミン薬を提供するための手段として、炎症を起こしている部位にのみ作用する薬剤をスクリーニングする方法を採用することができる。例えば、花粉症の予防又は治療を目的とした抗ヒスタミン薬は鼻粘膜組織でのH1Rを介した信号伝達の減弱の程度を指標としてスクリーニングすることができる。炎症部位におけるヒスタミン-H1Rを介した信号の減弱の程度を指標としたスクリーニングを行うことにより、従来のH1R拮抗薬とは異なり、炎症部位のH1Rの数を直接減少させる薬剤（例えば花粉等による抗原刺激等で鼻粘膜組織に誘導されるH1Rの誘導量を抑制できるような薬剤）を全く異なるタイプの新しい抗ヒスタミン薬として提供することができる。あるいは、信号そのものであるヒスタミンの合成量を減少させる薬剤（ヒスタミン合成酵素であるHDCの生成量を抑制する薬剤など）も副作用の全くない新しいタイプの抗ヒスタミン薬となりうる。
【０００５】
上記のような新しいタイプの抗ヒスタミン薬のスクリーニングを可能にすべく、本発明者らはトルエン2,4-ジイソシアネート(TDI)誘導鼻過敏症モデルラットの作出に成功している(Acta Otolaryngol, 124, pp.1053-1058, 2004)。このモデルマウスは職業アレルギーの原因物質として知られているTDIをヒスタミンに反応性が高いブラウンノルウェイラットの鼻粘膜に繰り返し塗布することにより作出することができる。このモデルマウスでは、H1Rを生成させるメッセンジャーRNA(H1R m-RNA)及びHDCを生成させるm-RNAであるHDC m-RNAの両者の発現量が高まり、H1R量及びHDC量の増加が起こる結果、激しいくしゃみや鼻水の漏出が起こる。このモデルマウスにおいて、TDIで誘導されたH1R m-RNAやHDC m-RNAの発現量亢進を抑制できる物質は、炎症発症部位で増幅されているH1Rを介した信号を直接遮断又は減弱させる新しいメカニズムに基づいた副作用のない新しい抗ヒスタミン薬となりうる可能性がある。
【０００６】
一方、嫌気性菌であるビフィズス菌(Bifidobacterium)は健康な母乳栄養児の腸内においては優性菌となっているが、人工栄養児の腸内ではビフィズス菌の菌数が少なく、大腸菌(Escherichia coli)や腸球菌(Enterococcus)等が多くなって腸内感染疾患の罹患率が高くなることが知られている。母乳栄養児は、母体から母乳の免疫力により細菌やウイルスなどの感染に対する抵抗力が強いとされている。また、成人においても、ビフィズス菌が腸内において健康時の優性菌の一つとして存在していること、及び不健康な状態ではビフィズス菌が減少又は消滅していることが確認されている。このような観点から、ビフィズス菌を用いた各種の医薬品あるいは発酵乳飲料などの健康食品や清涼飲料水等が提案され市販されている。
【０００７】
ビフィズス菌を経口摂取することにより腸内で多量の酢酸、乳酸、その他の揮発酸が生産されて腸内pHが低下し、その結果、大腸菌などの病原菌の発育が抑制され、腸のぜん動運動促進により腸内菌叢異常に伴う便秘や下痢の症状が改善される。このように、ビフィズス菌はヒトの健康維持に極めて有効であり、ビフィズス菌を含む各種の製剤が提供されている。例えば、ビフィズス菌の培養液に各種添加剤を添加した発酵製品として健康飲料として調製されるほか、ビフィズス菌の菌体を集めて乾燥した後、デンプン、乳糖、又は白糖などの適当な賦形剤と混合して散剤や錠剤などの形態とした整腸剤としても用いられている。
【０００８】
近年、ビフィズス菌や各種乳酸菌を用いたいわゆるプロバイオティクスの研究が盛んであり、医薬品のみならずビフィズス菌発酵ヨーグルトなどの使用により、花粉症改善効果や乳酸菌発酵液のアトピー性皮膚炎改善効果、免疫賦活効果、又は癌再発抑制効果などの多様な薬理効果が報告されている（プロバイオティクスとバイオジェニクス、第３章：アレルギー低減、2005年5月9日、株式会社エヌ・ティー・エス発行）。また、腸内細菌叢改善組成物（特開平7-265064号公報）、ビフィズス菌を有効成分とする抗アレルギー剤（特開平10-309178号公報）、及び生きた腸内細菌を含有する抗アレルギー剤（特開2000-86524号公報）が報告されている。しかしながら、これらのプロバイオティクスの抗アレルギー作用は、プロバイオティクスであるビフィズス菌や各種乳酸菌が宿主の腸管免疫系に働きかけ、アレルギー性のTh2細胞と抗アレルギー性のTh1細胞のバランスをTh1細胞優位に傾け、Th1細胞より産生される抗アレルギー性の各種サイトカインの生産量を増加させると同時に、Th2細胞より産生されるアレルギー性の各種サイトカイン量を減少させることで発揮されると説明されており(Int. Arch. Allergy Immunol., 135, pp.205-215, 2004)、ビフィズス菌自体が抗ヒスタミン作用を有することについてはこれらの刊行物に示唆ないし教示はない。
【非特許文献１】日薬理誌(Folia Pharmacol. Jpn.), 125, pp.245-250, 2005
【非特許文献２】Acta Otolaryngol, 124, pp.1053-1058, 2004
【非特許文献３】プロバイオティクスとバイオジェニクス、第３章：アレルギー低減、2005年5月9日、株式会社エヌ・ティー・エス発行
【非特許文献４】Int. Arch. Allergy Immunol., 135, pp.205-215, 2004
【特許文献１】特開平7-265064号公報
【特許文献２】特開平10-309178号公報
【特許文献３】特開2000-86524号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は抗ヒスタミン作用を有する医薬を提供することにある。より具体的には、従来の抗ヒスタミン薬とは異なる新しいメカニズムに基づいて優れた抗ヒスタミン作用を発揮することができ、かつ眠気や倦怠感などの副作用が軽減ないし排除された医薬を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記の課題を解決すべくTDI誘導鼻過敏症モデルラットを用いて新しいメカニズムに基づく抗ヒスタミン性物質のスクリーニングを行った。その結果、ビフィズス菌の菌体の経口投与によりH1R m-RNA及びHDC m-RNAの発現量の亢進を抑制することができること、及び炎症性の免疫性細胞であるヘルパーT2(Th2)細胞の産生する炎症性のサイトカインであるインターロイキン(IL)-4、IL-5、及びIL-13のm-RNAの炎症発症部位での発現増幅も軽減できることを見出した。さらに、ビフィズス菌として特定の菌種のビフィズス菌を用いるか、あるいは特定の２種以上の菌種のビフィズス菌を組み合わせて用いると、極めて優れた抗ヒスタミン作用を達成できることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【００１１】
すなわち、本発明により、抗ヒスタミン作用を有する医薬であって、ビフィズス菌の菌体を有効成分として含む医薬が提供される。
本発明の好ましい態様によれば、ビフィズス菌として少なくともビフィドバクテリウム・インファンテス(Bifidobacterium infantis)を含む上記の医薬；ビフィズス菌として少なくともビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)を含む上記の医薬；ビフィズス菌としてビフィドバクテリウム・インファンテス及びビフィドバクテリウム・ロンガムの２種を含む上記の医薬；ビフィズス菌が上記２種の菌種の任意の混合物からなる上記の医薬；上記２種の菌種を７：３の質量比率で含む上記の医薬が提供される。
【００１２】
また、本発明により、抗ヒスタミン作用がヒスタミンＨ１レセプターのメッセンジャーRNA発現抑制作用に基づく上記の医薬；抗ヒスタミン作用がヒスチジン脱炭酸酵素のメッセンジャーRNA発現抑制作用に基づく上記の医薬；抗ヒスタミン作用がヒスタミンＨ１レセプターのメッセンジャーRNA発現抑制作用及びヒスチジン脱炭酸酵素のメッセンジャーRNA発現抑制作用に基づく上記の医薬；及び抗ヒスタミン作用がヘルパーＴ２細胞サイトカイン（インターロイキン４、インターロイキン５、又はインターロイキン１３）メッセンジャーRNA発現抑制作用を伴う上記の医薬が提供される。
【００１３】
また、別の観点からは、本発明により、ビフィズス菌の菌体を有効成分として含むヒスタミンＨ１レセプターのメッセンジャーRNA発現抑制剤；ビフィズス菌の菌体を有効成分として含むヒスチジン脱炭酸酵素のメッセンジャーRNA発現抑制剤；ビフィズス菌の菌体を有効成分として含むヒスタミンＨ１レセプターのメッセンジャーRNA発現及びヒスチジン脱炭酸酵素のメッセンジャーRNA発現に対する抑制剤；及びビフィズス菌の菌体を有効成分として含むヘルパーＴ２細胞サイトカインメッセンジャーRNA発現抑制剤が提供される。これらに加えて、アレルギー症状発症時におけるヒスタミン合成量を減少させる医薬であって、ビフィズス菌の菌体を有効成分として含む医薬；及びアレルギー症状発症時においてヒスタミンＨ１レセプター量を減少させる作用を有する医薬であって、ビフィズス菌の菌体を有効成分として含む医薬も本発明により提供される。
【００１４】
さらに別の観点からは、本発明により、上記医薬又は発現抑制剤の製造のためのビフィズス菌の菌体の使用；ヒトを含む哺乳類動物の生体内においてヒスタミンの作用を抑制する方法であって、ビフィズス菌の菌体を哺乳類動物に経口投与する工程を含む方法；ヒトを含む哺乳類動物の生体内においてヒスタミンＨ１レセプターのメッセンジャーRNA発現を抑制する方法であって、ビフィズス菌の菌体を哺乳類動物に経口投与する工程を含む方法；ヒトを含む哺乳類動物の生体内においてヒスチジン脱炭酸酵素のメッセンジャーRNA発現を抑制する方法であって、ビフィズス菌の菌体を哺乳類動物に経口投与する工程を含む方法；ヒトを含む哺乳類動物の生体内においてヒスタミンＨ１レセプターのメッセンジャーRNA発現及びヒスチジン脱炭酸酵素のメッセンジャーRNA発現を抑制する方法であって、ビフィズス菌の菌体を哺乳類動物に経口投与する工程を含む方法；及びヒトを含む哺乳類動物の生体内においてヘルパーＴ２細胞サイトカインメッセンジャーRNA発現を抑制する方法であって、ビフィズス菌の菌体を哺乳類動物に経口投与する工程を含む方法が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により提供される医薬はヒトを含む哺乳類動物の生体内で優れた抗ヒスタミン作用を発揮することができ、しかも従来の抗ヒスタミン薬において頻発する眠気や倦怠感などの副作用が軽減されているという特徴がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の医薬は、抗ヒスタミン作用を有する医薬であって、ビフィズス菌の菌体を有効成分として含むことを特徴としている。ビフィズス菌は嫌気性菌であり、一般的にプロバイオティクスとしてビフィドバクテリウム・インファンテス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）などの菌株が利用されている。本発明の医薬の製造のためには任意の種類の菌株を用いることができる。本発明の医薬の製造のためには、少なくともビフィドバクテリウム・インファンテスを用いることが好ましく、あるいは少なくともビフィドバクテリウム・ロンガムを用いることが好ましい。より好ましくは、少なくともビフィドバクテリウム・インファンテス及びビフィドバクテリウム・ロンガムを組み合わせて用いることが好ましい。さらに好ましい態様では、菌体質量（湿質量又は乾燥質量のいずれでもよい）としてビフィドバクテリウム・インファンテス及びビフィドバクテリウム・ロンガムを７：３の割合で含むことが好ましい。
【００１７】
ビフィズス菌は、例えば、炭素源、窒素源、及び無機質のほか、その他の添加剤としてペプトン、酵母エキス、グルコース、及びリン酸塩などを含む液体培地で培養し、菌体を集菌して適当な凍結保護剤と共に凍結乾燥することが好ましい。液体培地の種類は特に限定されず、ビフィズス菌の培養に通常用いられるものであれば、いかなるものを用いてもよい。また、得られた菌体をデンプン、乳糖、又は白糖、あるいはそれらの混合物などの適当な賦形剤と混合してもよい。菌体は単一の菌株を単独培養してもよいが、２種以上の菌株を混合して培養してもよい。あるいは、単一の菌株の培養物をそれぞれ調製した後、適当な割合で混合して菌体混合物を製造することもできる。さらに、ビフィズス菌を各種の乳酸菌、酪酸菌、又は糖化菌などと混合してもよい。ビフィズス菌を用いた医薬や食品の製造方法は当業者に周知であり、例えば、特開平7-265064号公報、特開平10-309178号公報、及び特開2000-86524号公報などを参照することにより、当業者が容易に製造することができる。
【００１８】
粉末として得られたビフィズス菌の菌体を製剤学的に許容される適当な希釈剤を用いて希釈して散剤を製造してもよく、さらには適当な賦形剤及び滑沢剤と練合し、顆粒剤や錠剤とすることもできる。これらの製剤は、いずれも日本薬局方の「製剤総則」に記載の方法に準じて調製することができる。製剤化の際に用いられる担体、賦形剤、滑沢剤、流動化剤、崩壊剤、結合剤、等張化剤、又は安定化剤等の製剤用添加物の種類は特に限定されず、製剤学的に汎用されている各種の添加物を適宜選択して使用することができる。２種以上の製剤用添加物を組み合わせて用いてもよい。本発明の医薬は経口投与により抗ヒスタミン作用を発揮することができる。ビフィズス菌の菌体の投与量及び投与期間は特に限定されないが、投与されるべき患者の性別、年齢、体重、及び症状等により適宜選択することが望ましい。一般的には、ヒスタミン遊離によるアレルギー症状の改善を確認しつつ、十分な抗ヒスタミン作用が発揮される投与量及び投与期間を選択すればよい。
【００１９】
本発明の医薬は抗ヒスタミン作用を有している。本発明の医薬の抗ヒスタミン作用は、例えば、トルエン2,4-ジイソシアネート(TDI)誘導鼻過敏症モデルラット(Acta Otolaryngol, 124, pp.1053-1058, 2004)などの実験動物を用いることにより、当業者が容易に確認することができる。TDI感作ラットで観察されるH1R m-RNAレベルの上昇はH1R発現量を上昇させること、及びHDC m-RNAレベルの上昇はHDC発現量を上昇させることが確認されている(日薬理誌(Folia Pharmacol. Jpn.), 125, pp.245-250, 2005)。本発明の医薬の有効成分であるビフィズス菌はTDIの感作により惹起される鼻粘膜細胞のH1R m-RNAレベルの上昇及びHDC m-RNAレベルの上昇を抑制することができ、その結果として抗ヒスタミン作用を発揮する。炎症性の免疫性細胞であるヘルパーT1(Th1)細胞及びヘルパーT2(Th2)のバランス(Th1/Th2)によらず、H1Rを介してヒスタミンの信号伝達に対して抑制的に作用する医薬、特にビフィズス菌製剤は従来知られていない。また、炎症性Th2由来のサイトカインであるIL-4、IL-5、及びIL-13のm-RNAは炎症を発症している鼻粘膜に於いて発現量が増幅されているが、本発明の医薬はこれらのサイトカインの発現量を抑制する作用を有している。これらの抗ヒスタミン作用に基づいて、本発明の医薬はヒスタミン遊離に伴うアレルギーの各種症状の予防及び／又は治療に有効である。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：TDI誘導アレルギーモデルラットでの抗アレルギー効果
日本薬局方外医薬品規格2002度版記載の方法で調製したB. infantis及びB. longumの7:3混合菌体粉末をTDI誘導アレルギーモデルラットに3週間連続投与した。ビフィズス菌菌体粉末の生菌数は1.0×1011個/gであり、この菌体粉末を20 mg/mLとなるように1/15 Mのリン酸緩衝液pH 6.8で懸濁し、その2 mLを毎日ラットに経口投与した。菌体懸濁液は用時調製とした。ラットとしてはヒスタミンに反応性の高いブラウンノルウェイラットを用い、菌体投与1時間後に10%濃度で酢酸エチルにTDIを溶解した10％TDI液10μLをマウス鼻粘膜に塗布することにより感作を行った。初期感作として連続5日間、2日間のインターバルの後、後期感作としてさらに5日間TDIを塗布した。その一週間後に最終の誘発 (Provocation)を行い、10分間鼻水漏出量の観察及びくしゃみ回数の測定を行った。TDI刺激後4時間後に屠殺し鼻粘膜を回収した。
【００２１】
ラット鼻粘膜からtotal m-RNAを抽出し、逆転写酵素（インビトロジェン社製）を用いてcDNAを合成した。２種のプライマーとTaqManプローブ（北海道システムサイエンス社製）を用いてPCR反応を行い、PCR産物の増幅曲線をリアルタイムで測定し、解析及び定量を行った（リアルタイムPCR定量システム Sequence Detection System 5700、アプライドバイオシステムズ社製を使用）。内部標準としてグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。試験は一群4匹ずつのラットを使用した。その結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
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各m-RNAレベルはグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素のm-RNAレベルを対照とした。
鼻水漏出スコアーは鼻中に若干鼻水が観察できる状態を1、鼻から鼻水が垂れ流れる状態を3とし、その中間の状態を2とした。
【００２３】
表１に示した様に、ビフィズス菌の経口摂取は鼻過敏症モデルラットの鼻水漏出量を有意に減少させ、くしゃみ回数も有意に減少させた。またTDIの鼻粘膜連続塗布で誘導させたH1R m-RNA及びHDC m-RNAのレベルの上昇を共に有意に抑制した。TDIで誘導した鼻過敏症モデルラットで観察されるH1R m-RNAレベル上昇はH1R発現量を上昇すること、及びHDC m-RNAレベルの上昇はHDC発現量を上昇することが知られている。従って、上記の結果は、ビフィズス菌の経口摂取によりアレルギー症状発症時にヒスタミン合成量を減少させるとともに、レセプター量の減少に起因するヒスタミン感受性を低減させ、それによりモデルラットで観察された鼻水漏出量の減少、くしゃみ回数の減少を引き起こしているものと考えられる。
【００２４】
また、本発明の医薬はアレルギー性のヘルパーT細胞であるTh2細胞の産生するIL-4、IL-5、及びIL-13の各m-RNAレベルも有意に抑制していた。IL-4及びIL-13の産生増強はIL-2と協調してB細胞からのIgEの放出を誘導することが知られており、各種サイトカイン関連遺伝子の発現レベルの推移からもビフィズス菌の経口摂取は生体内において抗ヒスタミン作用を有効に発現しており、その結果、アレルギー症状発症時の症状の予防及び／又は緩和に有効である。