(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔ細胞を活性化を共刺激する新規なＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドをコードする核酸の提供。【解決手段】一態様において該核酸はＢリンパ球抗原Ｂ７−２をコードする配列を有する。好ましくは該核酸は、特定な配列からなるヌクレオチド配列の少なくとも１部分を含むＤＮＡ分子である。当該核酸配列を様々な発現ベクターにインテグレイトし、様々な宿主、特に哺乳動物および昆虫細胞培養等の真核生物細胞で、対応するタンパク質またはペプチドを合成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４を結合する能力を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離した核酸であって、該核酸は、図８（配列番号２）に示すアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸分子の相補物に、６.０×ＮａＣｌ／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で約４５℃でハイブリダイズした後、約５０℃の温度で２×ＳＳＣで洗浄するものである単離した核酸。
【請求項２】
ペプチドが図８（配列番号２）に示したヒトＢ７−２タンパク質のアミノ酸残基２４−１３３を含む請求項１に記載の単離した核酸。
【請求項３】
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４を結合する能力を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離した核酸であって、該核酸は、図１４（配列番号２３）に示すアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸分子の相補物に、６.０×ＮａＣｌ／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で約４５℃でハイブリダイズした後、約５０℃の温度で２×ＳＳＣで洗浄するものである単離した核酸。
【請求項４】
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４を結合する能力を有する第１のペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列（第１のペプチドは図８（配列番号２）に示すヒトＢ７−２ペプチドのアミノ酸残基２４−２４５と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する）、並びに第２のペプチドをコードする第２のヌクレオチドを含むＢ７−２融合タンパク質をコードする単離した核酸であって、該核酸はＤＮＡであり、第１のペプチドが図８（配列番号２）に示すヒトＢ７−２タンパク質のアミノ酸残基２４−１３３を含んでなる単離した核酸。
【請求項５】
ポリペプチドが図８(配列番号２)に示すヒトＢ７−２のアミノ酸残基２４−１３３を含んでなる請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
腫瘍を有する患者を処置するのに用いる、Ｂ７−２発現に適した形の、配列番号２のポリペプチドに少なくとも９０％の同一性を有し、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４を結合する能力を有するポリペプチドをペプチドコードする核酸でトランスフェクトされた腫瘍細胞および医薬的に受容し得る担体を含む組成物であって、適当なビヒクル中の核酸を腫瘍中に注入することにより核酸をインビボで患者に運ぶ組成物。
【請求項７】
図８（配列番号２）に示すＢ７−２ポリペプチドを認識する抗体および配列番号２９に示すＢ７−１ポリペプチドを認識する抗体を含む組成物。
【請求項８】
更に医薬的に許容し得る担体を含む請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
Ｂ７−２を認識する抗体およびＢ７−１を認識する抗体がモノクローナル抗体である請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｂ７−２を認識する抗体およびＢ７−１を認識する抗体がヒト化抗体である請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｂ７−２を認識する抗体およびＢ７−１を認識する抗体の少なくとも１つがＩｇＧ２ａの抗体である請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
図８（配列番号２）に示すポリペプチド；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−１３３を含むポリペプチド；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−１３３よりなるポリペプチド；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−２４５を含むポリペプチド；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−２４５よりなるポリペプチド；
配列番号２に示すＢ７−２ポリペプチドと反応性の抗体；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−２４５を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
図８（配列番号２）に示すポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子；
および配列番号１で示されるヌクレオチド配列のコード領域を含む核酸分子；
よりなる群から選択される分子、並びに医薬的に許容し得る担体を含む免疫応答をモジュレートするのに使用するための医薬的投与に適した組成物。
【請求項１３】
Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−１の活性を有するペプチドを更に含んでなる請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
免疫応答をモジュレートするための医薬組成物であって、該組成物は
図８（配列番号２）に示すポリペプチド；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−１３３を含むポリペプチド；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−１３３よりなるポリペプチド；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−２４５を含むポリペプチド；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−２４５よりなるポリペプチド；
配列番号２に示すＢ７−２ポリペプチドと反応性の抗体；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−２４５含むポリペプチドをコードする核酸分子；
図８（配列番号２）に示すポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子；
配列番号１に示すヌクレオチド配列のコード領域を含む核酸分子；
よりなる群から選択される分子を含んでなり、該分子は免疫細胞と接触させ、それによりＢ７−２−リガンド相互作用により免疫細胞の共刺激を防止することを含んでなる組成物。
【請求項１５】
図８（配列番号２）に示すポリペプチド；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−１３３を含むポリペプチド；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−１３３よりなるポリペプチド；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−２４５を含むポリペプチド；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−２４５よりなるポリペプチド；
配列番号２に示すＢ７−２ポリペプチドに反応性の抗体；
図８（配列番号２）に示すアミノ酸残基２４−２４５を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
図８（配列番号２）に示すポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む核酸分子；
配列番号１に示すヌクレオチド配列のコード領域を含む核酸分子
よりなる群から選択される分子の、免疫応答をモジュレートするための医薬組成物の製造のための使用。
【請求項１６】
組成物がＴ細胞増殖をモジュレートする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
組成物が免疫応答を下方調節する請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
組成物が免疫応答を上方調節する請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
組成物が自己免疫病、アレルギー、および移植拒絶の少なくとも１つをモジュレートする請求項１２に記載の組成物。
【請求項２０】
組成物が病原体による感染をモジュレートする請求項１２に記載の組成物。
【請求項２１】
病原体がウイルスである請求項１２に記載の組成物。
【請求項２２】
ウイルスがＨＩＶである請求項１２に記載の組成物。
【請求項２３】
分子がＴ細胞増殖をモジュレートする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
分子が免疫応答を下方調節する請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
分子が免疫応答を上方調節する請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
分子が自己免疫病、アレルギー、および移植拒絶の少なくとも１つをモジュレートする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
分子が病原体による感染をモジュレートする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
病原体がウイルスである請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ウイルスがＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２である請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
分子がＴ細胞増殖をモジュレートする請求項１５に記載の使用。
【請求項３１】
分子が免疫応答を下方調節する請求項１５に記載の使用。
【請求項３２】
分子が免疫応答を上方調節する請求項１５に記載の使用。
【請求項３３】
分子が自己免疫病、アレルギー、および移植拒絶の少なくとも１つをモジュレートする請求項１５に記載の使用。
【請求項３４】
分子が病原体による感染をモジュレートする請求項１５に記載の使用。
【請求項３５】
病原体がウイルスである請求項１５に記載の使用。
【請求項３６】
ウイルスがＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２である請求項１５に記載の使用。
【請求項３７】
Ｂ細胞活性化抗原Ｂ７−２の単離された可変領域形であって、図８（配列番号２）に示すヒトＢ７−２タンパク質のアミノ酸残基２４−１３３を含むが、Ｂ７−２免疫グロブリン様定常領域ドメインを含まない可変領域形。
【請求項３８】
ヒトである請求項３７に記載のＢ７−２可変領域形。
【請求項３９】
異種ポリペプチドに作動可能に結合したＢ７−２可変領域ポリペプチドを含む融合タンパク質である請求項３７に記載のＢ７−２可変領域形。
【請求項４０】
融合タンパク質が可溶性のモノマーポリペプチドである請求項３９に記載のＢ７−２可変領域形。
【請求項４１】
Ｂ７−２可変領域ポリペプチドがヒトのＢ７−２可変領域ポリペプチドである請求項３９に記載のＢ７−２可変領域形。
【請求項４２】
ヒトのＢ７−２可変領域ポリペプチドが配列番号２の約２４−１３３のアミノ酸配列を含む請求項４１に記載のＢ７−２可変領域形。
【請求項４３】
異種ポリペプチドが免疫グロブリン定常領域である請求項３９に記載のＢ７−２可変領域形。
【請求項４４】
免疫グロブリン定常領域がヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含むＣγ１ドメインを含む請求項４３に記載のＢ７−２可変領域形。
【請求項４５】
免疫グロブリン定常領域が定常領域媒介生物学的エフェクター機能を減少させるよう修飾された請求項３９に記載のＢ７−２可変領域形。
【請求項４６】
生物学的エフェクター機能が補体活性化およびＦｃ受容体相互作用よりなる群から選択される請求項４５に記載のＢ７−２可変領域形。
【請求項４７】
免疫グロブリン定常領域がヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含むＣγ４ドメインである請求項４６に記載のＢ７−２可変領域形。
【請求項４８】
ＣＨ２ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、付加または削除により修飾されている請求項４７に記載のＢ７−２可変領域形。
【請求項４９】
異種ポリペプチドに作動可能に結合した図８（配列番号２）に示すヒトＢ７−２タンパク質のアミノ酸残基２４−１３３を含む単離されたＢ７−２融合タンパク質であって、Ｂ７−２融合タンパク質はＢ７−２免疫グロブリン様定常領域ドメインを含まないＢ７−２融合タンパク質。
【請求項５０】
ヒトＢ７−２免疫グロブリン様可変領域ドメインが配列番号２の約２４−１３３位置のアミノ酸配列を含む請求項４９に記載のＢ７−２融合タンパク質。
【請求項５１】
異種ポリペプチドが免疫グロブリン様定常領域ポリペプチドを含む請求項４９に記載のＢ７−２融合タンパク質。
【請求項５２】
Ｂ７−２融合タンパク質の可変領域形をコードする単離された核酸分子であって、Ｂ７−２融合タンパク質は異種ポリペプチドに作動可能に結合した図８（配列番号２）に示すヒトＢ７−２タンパク質のアミノ酸残基２４−１３３を含み、Ｂ７−２融合タンパク質はＢ７−２免疫グロブリン様定常領域ドメインを含まない単離された核酸分子。
【請求項５３】
Ｂ７−２可変領域ポリペプチドがヒトＢ７−２可変領域ポリペプチドである請求項５２に記載の単離された核酸分子。
【請求項５４】
ヒトＢ７−２可変領域ポリペプチドが配列番号２の約２４−１３３位置のアミノ酸配列を含む請求項５３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５５】
異種ポリペプチドが免疫グロブリン定常領域ポリペプチドである請求項５２に記載の核酸。
【請求項５６】
免疫グロブリン定常領域がヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含むＣγ４ドメインを含む請求項５５に記載の核酸。
【請求項５７】
免疫グロブリン定常領域が定常領域媒介生物学的エフェクター機能を減少させるよう修飾された請求項５５に記載の核酸。
【請求項５８】
生物学的エフェクター機能が補体活性化およびＦｃ受容体相互作用よりなる群から選択される請求項５７に記載の核酸。
【請求項５９】
免疫グロブリン定常領域がヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含むＣγ４ドメインを含む請求項５８に記載の核酸。
【請求項６０】
ＣＨ２ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、付加または削除により修飾されている請求項５９に記載の核酸。
【請求項６１】
請求項５２〜６０のいずれかに記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
【請求項６２】
請求項６１に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６３】
．免疫反応を調節するのに使用するための医薬投与に適した組成物であって、Ｂ細胞活性化抗原の単離された可変領域、請求項３７〜４８のいずれかに記載のＢ７−２、および医薬的に許容し得る担体を含む組成物。
【請求項６４】
免疫反応を調節するのに使用するための医薬投与に適した組成物であって、請求項５２〜６１のいずれかに記載のＢ７−２融合タンパク質の可変領域形をコードする単離された核酸、および医薬的に許容し得る担体を含む組成物。
【請求項６５】
組成物がＴ細胞増殖を調節する請求項６３または６４に記載の組成物。
【請求項６６】
組成物が免疫反応を上方調節する請求項６３または６４に記載の組成物。
【請求項６７】
組成物が病原体による感染を調節する請求項６３または６４に記載の組成物。
【請求項６８】
病原体がウイルスである請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
ウイルスがＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２である請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
活性化されたＴ細胞による反応を刺激するための組成物であって、Ｂ細胞活性化抗原Ｂ７−２の可変領域形を含み、Ｂ７−２の可変領域形は図８（配列番号２）に示すヒトＢ７−２タンパク質のアミノ酸残基２４−１３３を含むが、Ｂ７−２免疫グロブリン様定常領域ドメインを含まず、該Ｂ７−２の可変領域形活性化されたＴ細胞をと接触させ、その結果活性化されたＴ細胞による反応を刺激する組成物。
【請求項７１】
Ｔヘルパータイプ２（ＴＨ２）反応が優先して刺激される請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
患者におけるＴ細胞増殖および／またはサイトカイン分泌の調節のための薬剤の製造のためのＢ細胞活性化抗原Ｂ７−２の可変領域形の使用であって、Ｂ７−２の可変領域は図８（配列番号２）に示すヒトＢ７−２タンパク質のアミノ酸残基２４−１３３を含むが、Ｂ７−２免疫グロブリン様定常領域ドメインを含まない使用。
【請求項７３】
請求項１，４，若しくは５に記載の組換え発現により製造される、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４に結合する能力を有するポリペプチドと特異的に反応する抗体またはその断片であって抗体はヒト化抗体である抗体またはその断片。
【請求項７４】
ヒト定常領域および非ヒト可変領域を含む請求項７３に記載の抗体またはその断片。
【請求項７５】
ヒト定常領域およびヒト可変領域キメラを含む請求項７３に記載の抗体またはその断片。
【請求項７６】
抗体が完全にヒトのモノクローナル抗体である、請求項１，４，若しくは５に記載の組換え発現により製造される、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４に結合する能力を有するポリペプチドと特異的に反応する抗体またはその断片。
【請求項７７】
請求項７３〜７６のいずれかに記載の抗体またはその断片を含む免疫反応を調節するのに使用するための医薬投与に適した組成物。
【請求項７８】
組成物がＴ細胞増殖を調節する請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
組成物がＴ細胞媒介免疫反応を下方調節する請求項７７に記載の組成物。
【請求項８０】
組成物が、自己免疫病、アレルギーおよび移植拒絶の少なくとも１つを調節する請求項７７に記載の組成物。
【請求項８１】
Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の免疫細胞表面のその天然のリガンドとの相互作用を防止する方法であって、その方法は免疫細胞を請求項７３〜７６のいずれかに記載の抗体またはその断片と接触させ、それによってＢ７−２相互作用による免疫細胞の共刺激を防止することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＢリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離した核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原特異的なＴ細胞の活性化およびクローンエクスパンションを誘導するためには、抗原提示細胞(ＡＰＣ)により提供される２つのシグナルが静止Ｔリンパ球の表面に伝達されねばならない(Ｊenkins, Ｍ．およびＳchwartz, Ｒ．(１９８７)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１６５、３０２〜３１９; Ｍueller, Ｄ.Ｌ．等(１９９０)Ｊ．Ｉmmunol．、１４４、３７０１〜３７０９; Ｗilliams, Ｉ.Ｒ．およびＵnanue, Ｅ.Ｒ．(１９９０) Ｊ．Ｉmmunol．、１４５、８５〜９３)。免疫応答に特異性を与える第１のシグナルは、主要組織適合性遺伝子複合体(ＭＨＣ)に示された外来の抗原性ペプチドの認識後に、Ｔ細胞レセプター(ＴＣＲ)により媒介される。共刺激と呼ばれる第２のシグナルはＴ細胞が増殖し、機能性となるよう誘導する(Ｓchwartz, Ｒ.Ｈ.、(１９９０) Ｓcience、２４８、１３４９〜１３５６)。共刺激は抗原特異的でもＭＨＣ限定性でもなく、ＡＰＣにより発現される１以上の別の細胞表面分子により提供される(Ｊenkins, Ｍ.Ｋ．等(１９８８)、Ｊ．Ｉmmunol．、１４０、３３２４〜３３３０; Ｌinsley, Ｐ.Ｓ.等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７３、７２１〜７３０; Ｇimmi, Ｃ.Ｄ．等(１９９１)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８８、６５７５〜６５７９; Ｙoung, Ｊ.Ｗ．等(１９９２)、Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest．、９０、２２９〜２３７; Ｋoulova, Ｌ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７３、７５９〜７６２; Ｒeiser, Ｈ．等(１９９２)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８９、２７１〜２７５; van−Ｓeventer, Ｇ.Ａ．等(１９９０)、Ｊ．Ｉmmunol．、１４４、４５７９〜４５８６; ＬaＳalle, Ｊ.Ｍ．等(１９９１)、Ｊ．Ｉmmunol．、１４７、７７４〜８０; Ｄustin, Ｍ.Ｉ.等(１９８９)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１６９、５０３; Ａrmitage, Ｒ.Ｊ.等(１９９２)、Ｎature、３５７、８０〜８２; Ｌiu, Ｙ．等(１９９２)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７５、４３７〜４４５)。
【０００３】
ＡＰＣ上に発現されるＢ７タンパク質が一つのそのような重要な共刺激性分子であることをかなりな証拠が示唆する(Ｌinsley, Ｐ.Ｓ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７３、７２１〜７３０; Ｇimmi, Ｃ.Ｄ．等(１９９１)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８８、６５７５〜６５７９; Ｋoulova, Ｌ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７３、７５９〜７６２; Ｒeiser, Ｈ．等(１９９２)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８９、２７１〜２７５; Ｌinsley, Ｐ.Ｓ．等(１９９０)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８７、５０３１〜５０３５; Ｆreeman, Ｇ.Ｊ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７４、６２５〜６３１)。Ｂ７はＴリンパ球上で発現される２つのリガンドについてのカウンターレセプターである。ＣＤ２８と名付けられる第１のリガンドは静止Ｔ細胞上で構成的に発現され活性化後増加する。Ｔ細胞レセプターを介して信号を送った後、ＣＤ２８のライゲーションはＴ細胞が増殖し、ＩＬ−２を分泌するよう誘導する(Ｌinsley, Ｐ.Ｓ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７３、７２１〜７３０; Ｇimmi, Ｃ.Ｄ．等(１９９１)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８８、６５７５〜６５７９; Ｔhompson, Ｃ.Ｂ．等(１９８９)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８６、１３３３〜１３３７; Ｊune, Ｃ.Ｈ．等(１９９０)、Ｉmmunol．Ｔoday、１１、２１１〜６; Ｈarding, Ｆ.Ａ．等(１９９２)、Ｎature、３５６、６０７〜６０９)。ＣＴＬＡ４と名付けられる第２のリガンドはＣＤ２８と相同性であるが、静止Ｔ細胞上では発現せず、Ｔ細胞活性化の後に生じる（Ｂrunet，Ｊ．Ｆ等(１９８７)、Ｎature、３２８、２６７〜２７０）。ヒトおよびマウスＣＴＬＡ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、Ｄariavich等(１９８８)、Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．、１８(１２)、１９０１〜１９０５; Ｂrunet, Ｊ.Ｆ．等(１９８７)、上書; Ｂrunet, Ｊ.Ｆ．等(１９８８)、Ｉmmunol．Ｒev．、１０３、２１〜３６; およびＦreeman, Ｇ.Ｊ．等(１９９２)、Ｊ．Ｉmmunol．、１４９、３７９５〜３８０１に記載されている。Ｂ７はＣＤ２８に対してより、ＣＴＬＡ４に対してより大きい親和性を有するが(Ｌinsley, Ｐ.Ｓ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７４、５６１〜５６９)、ＣＴＬＡ４の機能は未だ未知である。
【０００４】
Ｂ７: ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４共刺激経路の重要性はインビトロおよびいくつかのインビボモデル系で示された。この共刺激経路を封鎖するとマウスおよびヒトの系において抗原特異的寛容の発生をもたらす(Ｈarding, Ｆ.Ａ．等(１９９２)、Ｎature、３５６、６０７〜６０９; Ｌenschow, Ｄ.Ｊ．等(１９９２)、Ｓcience、２５７、７８９〜７９２; Ｔurka, Ｌ.Ａ．等(１９９２)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８９、１１１０２〜１１１０５; Ｇimmi, Ｃ.Ｄ．等(１９９３)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、９０、６５８６〜６５９０; Ｂoussiotis, Ｖ．等(１９９３)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７８、１７５３〜１７６３)。逆に言えば、Ｂ７陰性のマウス腫瘍細胞によるＢ７の発現は、腫瘍拒絶に伴うＴ細胞媒介特異的免疫および腫瘍挑戦に対する長い永続的な保護を誘導する(Ｃhen, Ｌ．等(１９９２)、Ｃell、７１、１０９３〜１１０２; Ｔownsend, Ｓ.Ｅ．およびＡllison, Ｊ.Ｐ．(１９９３)、Ｓcienco、２５９、３６８〜３７０; Ｂaskar, Ｓ．等(１９９３)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、９０、５６８７〜５６９０)。従って、Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を操作するとヒトにおける免疫応答を刺激し、または抑制する大きい可能性を提供する。
【０００５】
【非特許文献１】Ｃell、７１、１０９３〜１１０２(１９９２)
【非特許文献２】Ｓcienco、２５９、３６８〜３７０(１９９３)
【非特許文献３】Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、９０、５６８７〜５６９０(１９９３)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明はＴ細胞活性化を共刺激する新規な分子をコードする単離された核酸に関する。好ましい共刺激分子にはＢリンパ球、専門的な抗原提示細胞(例えば単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞)、および免疫細胞に抗原を提示し、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８の両方、または他の既知のもしくは未だ定義されていない免疫細胞上の受容体に結合する他の細胞(例えばケラチノサイト、内皮細胞、神経膠星細胞、線維芽細胞、乏突起膠細胞)の表面上の抗原を含む。そのような共刺激分子は、本明細書ではＣＴＬＡ４／ＣＤ２８結合性カウンターレセプターまたはＢリンパ球抗原と呼び、活性化されたＴ細胞に共刺激を与え、それによってＴ細胞の増殖および／またはサイトカイン分泌を誘導することができる。好ましいＢリンパ球抗原には、Ｂ７−２およびＢ７−３、並びにＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８を結合し、免疫細胞の共刺激を阻害し、または誘導する能力を有するそれらの可溶性フラグメントまたは誘導体を含む。一態様では、ヒトＢ７−２Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする単離された核酸を提供する。好ましくはその核酸は、図８(配列番号１)に示す。ヒトＢ７−２をコードするヌクレオチド配列を有するcＤＮＡ分子である。他の態様ではその核酸は、図１４(配列番号２２)に示す、ミュリン(murine)Ｂ７−２をコードするヌクレオチド配列を有するcＤＮＡ分子である。
【０００７】
本発明は、Ｂ７−２活性を有し、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列、または図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、最も好ましくは少なくとも７０％の相同性であるペプチドをコードする核酸に関する。Ｂ７−２活性を有し、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列、または図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列と少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の相同性であるペプチドをコードする核酸も本発明の範囲内にある。他の態様では、Ｂ７−２活性を有するペプチドは、図８(配列番号２)のアミノ酸配列を有するペプチド、または図１４(配列番号２３)のアミノ酸を有するペプチドをコードする核酸に、高または低ストリンジェンシィ条件下にハイブリダイズする核酸によりコードされる。
【０００８】
本発明はさらに、Ｂ７−２活性を有し、少なくとも２０のアミノ酸残基長を有するペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸に関する。Ｂ７−２活性を有し、長さで少なくとも４０のアミノ酸残基、少なくとも６０のアミノ酸残基、少なくとも８０のアミノ酸残基、少なくとも１００のアミノ酸残基、または少なくとも２００以上のアミノ酸残基よりなるペプチドも本発明の範囲内である。特に好ましい核酸は、Ｂ７−２活性を有し、少なくとも２０のアミノ酸残基または以上の長さ、および図８(配列番号２)に示す配列と少なくとも５０％または以上の相同性(好ましくは少なくとも７０％)を有するペプチドをコードする。
【０００９】
１つの好ましい態様では、本発明はＢ７−２活性を有し、および式:
Ｘn−Ｙ−Ｚm
によって表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたＤＮＡに関する。
【００１０】
式中、Ｙは図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５より本質的になる。ＸnおよびＺmは、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列においてＹに隣接するアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基である。Ｘnは、図８(配列番号２)に示す配列においてＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸から選択される、すなわち、アミノ酸残基２３〜１から選択されるアミノ酸残基である。Ｚmは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸から選択される、すなわち、アミノ酸残基２４６〜３２９から選択されるアミノ酸残基である。式においてnは０〜２３の数であり(n＝０〜２３)、mは０〜８４の数である(m＝０〜８４)。特に好ましいＤＮＡは、Ｙが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５であり、n＝０、m＝０である、式Ｘn−Ｙ−Ｚmにより表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【００１１】
本発明は、Ｂ７−２活性を有する第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列、および第１のペプチドの溶解性、結合親和性、安定性、価数を変化させる部分に対応する第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、Ｂ７−２融合タンパク質をコードする単離されたＤＮＡにも関する。好ましくは、Ｂ７−２活性を有する第１ペプチドは、Ｂ７−２タンパク質の細胞外ドメイン部分(例えば図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基約２４〜２４５)を含み、第２ペプチドは、免疫グロブリンの定常領域、例えば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むヒトのＣγ１またはＣγ４ドメインであり、Ｂ７−２免疫グロブリン融合タンパク質(Ｂ７−２Ｉg)を形成する(Ｃapon等(１９８９)、Ｎature、３３７、５２５〜５３１、およびＣapon、米国特許第５,１１６,９６４号参照)。
【００１２】
本発明により得られる核酸を様々な発現ベクターに挿入し、様々な宿主、特に哺乳類および昆虫細胞培養などの真核生物細胞、およびＥ．Ｃoli等の原核生物細胞中で対応するタンパク質またはペプチドを合成させる。本発明の範囲にある発現ベクターは、本明細書に記載した新規なＢリンパ球抗原の活性を有する少なくとも１つのペプチドをコードする核酸、およびその核酸配列に作動可能に結合したプロモータを含む。一態様において、発現ベクターは、Ｂ７−２抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、および以前にキャラクタライズされたＢ７活性化抗原(本明細書でＢ７−１と呼ぶ)等の他のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを含む。そのような発現ベクターは、宿主細胞をトランスフェクションし、それによって、本明細書に記載した核酸によりコードされる、融合タンパク質を含むタンパク質またはペプチドを製造するのに使用できる。
【００１３】
Ｂリンパ球抗原Ｂ７−２およびＢ７−３を発現するＢ細胞の存在についての生物学的試料を分析するのに有用な核酸プローブも本発明の範囲にある。
【００１４】
本発明はさらに、Ｂ７−２およびＢ７−３タンパク質抗原を含む、新規なＢリンパ球抗原の活性を有する単離したペプチドに関する。Ｂ７−２活性を有する好ましいペプチドは組換え発現によって作られ、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列を含む。Ｂ７−２活性を有する他の好ましいペプチドは図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列を含む。Ｂ７−２抗原の活性を有する特に好ましいペプチドは、患者のＴ細胞媒介免疫応答を高め、または抑制するのに使用できる、細胞外ドメイン部分(例えば配列番号２のアミノ酸残基約２４〜２４５)等の成熟形のタンパク質の少なくとも一部分を含む。Ｂ７−２活性を有する他の好ましいペプチドは次式により表わされるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
Ｘn−Ｙ−Ｚm
【００１５】
式中、Ｙは、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基５５〜６８、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基８１〜８９、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１２８〜１４２、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１６０〜１６９、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１８８〜２００、図８(配列番号２)に示すアミノ酸残基２６９〜２８２よりなる群から選択されるアミノ酸残基である。式中、ＸnおよびＺmは、アミド結合によりＹに結合した付加的なアミノ酸残基であり、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列においてＹに隣接するアミノ酸残基から選択される。Ｘnは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸から選択されるアミノ酸残基である。Ｚmは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸から選択されるアミノ酸残基である。式中、nは０〜３０の数であり(n＝０〜３０)、mは０〜３０の数である(m＝０〜３０)。
【００１６】
新規なＢリンパ球抗原(例えばＢ７−２、Ｂ７−３)の活性を有するペプチドを含む融合タンパク質またはハイブリッド融合タンパク質にも関する。例えば、第１ペプチドの溶解性、結合親和性、安定性および／または価数を変化させる、免疫グロブリン定常領域等の第２ペプチドに融合した、新規なＢリンパ球抗原の細胞外ドメイン部分を含む第１ペプチドを含む融合タンパク質を提供する。一態様において、Ｃγ１またはＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応する配列のアミノ酸残基を含む第２ペプチドに結合した、Ｂ７−２タンパク質の細胞外ドメイン部分のアミノ酸残基を含む第１ペプチドを含んでなる融合タンパク質を作り、Ｂ７−２Ｉｇ融合タンパク質を形成する。他の態様においては、Ｂ７−１抗原の細胞外ドメイン部分およびＢ７−２抗原の細胞外ドメイン部分を含む第１ペプチド、およびＣγ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３に対応するアミノ酸残基を含む第２ペプチドを含むハイブリッド融合タンパク質を作る(例えばＬinsley等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７８３、７２１〜７３０; Ｃapon等(１９８９)、Ｎature、３３７、５２５〜５３１; およびＣapon 米国特許第５,１１６,９６４号参照)。
【００１７】
本発明の単離されたペプチドおよび融合タンパク質は、１以上のＢリンパ球抗原の発現を上方調節(upregulate)または阻害し、または１以上のＢリンパ球抗原のＴ細胞等の免疫細胞上でのそれらの天然のリガンドへのライゲーションをブロックし、それによってインビボでの細胞媒介免疫応答を高め、または抑制するために、患者に投与できる。
【００１８】
本発明の他の態様は、新規Ｂリンパ球抗原のペプチドまたは本明細書に記載する融合タンパク質に特異的に反応する抗体、好ましくはモノクロナール抗体を提供する。好ましい抗体は、ハイブリドーマ細胞ＨＦ２.３Ｄ１、ＨＡ５.２Ｂ７およびＨＡ３.１Ｆ９により製造される抗ヒトＢ７−２モノクロナール抗体である。これらのハイブリドーマ細胞はＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１６８６(ＨＦ２.３Ｄ１)、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１６８７(ＨＡ５.２Ｂ７)、およびＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１６８８(ＨＡ３.１Ｆ９)でアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクションに寄託されている。
【００１９】
本発明のさらなる要旨は、本発明の核酸、特にcＤＮＡを用いて、哺乳動物細胞の免疫原性を高めることを含む。好ましい態様において哺乳類細胞は、肉腫、リンパ腫、黒色腫、神経芽細胞腫、白血病、カルチノーマ等の腫瘍細胞、またはマクロファージ等の抗原提示細胞であり、これらの細胞をトランスフェクションし、本発明の新規なＢリンパ球抗原活性を有するペプチドを、細胞表面上で発現させる。Ｂ７−２抗原等のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドを発現するマクロファージは、適当な病原体関連抗原または腫瘍抗原でパルス(pulse)された場合、Ｔ細胞活性化および免疫刺激を高める、抗原提示細胞として用いることができる。
【００２０】
哺乳動物細胞を、Ｂ７−２抗原等の新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする核酸を含む適当な発現ベクターで半ビボ(ex vivo)でトランスフェクションし、次に宿主の哺乳動物に導入でき、あるいは細胞を遺伝子治療技術によりその遺伝子でインビボでトランスフェクションできる。例えばＢ７−２活性を有するペプチドをコードする核酸を単独で、または他の共刺激性分子をコードする核酸と組み合わせてトランスフェクションできる。クラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子を発現しない腫瘍の免疫原性を高める場合において、本明細書に記載するＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする核酸でトランスフェクトされるべき哺乳動物細胞中に、適当なクラスＩまたはＩＩ遺伝子を付加的にトランスフェクトすることは有益であるかもしれない。
【００２１】
本発明は、例えば本発明の新規なＢリンパ球抗原、例えばＢ７−２およびＢ７−３のＴ細胞上でのそれらの天然のリガンドとの機能的な相互作用をブロックし、それによってレセプターリガンド対を介して共刺激をブロックすることにより、患者における一般的な免疫抑制および抗原特異的な寛容を誘導する方法をも提供する。一態様においては、天然のヒトＢ７−２抗原の、その天然のリガンド(例えばＣＴＬＡ４およびＣＤ２８)に対する相互作用をブロックするのに用いることのできる阻害性分子は、Ｂ７−２結合活性を有するが、免疫細胞を共刺激する能力を有しない可溶性ペプチド、Ｂ７−２のそのリガンドへの結合をブロックし共刺激シグナルを伝達できない抗体(ブロッキング抗Ｂ７−２抗体等のいわゆる「ブロッキング抗体」)、本発明の教示に従って製造できるＢ７−２−Ｉg融合タンパク質、並びにＣＴＬＡ４ＩgまたはＣＤ２８Ｉg等の可溶性形のＢ７−２レセプターを含む。そのようなブロッキング剤は単独で、または他の共刺激性分子のそれらの天然リガンドをブロックする薬剤(例えば抗Ｂ７抗体)と組み合わせて用いることができる。本明細書に記載する方法によるＴ細胞応答の阻害およびＴ細胞寛容の誘導は、移植拒絶(固体の器官、皮膚および骨髄)および移植片対宿主病の予防、特に同種間骨髄移植において、予防的に有用であり得る。本発明の方法は、自己免疫病、アレルギーおよびアレルギー反応、移植拒絶、および移植片対宿主病の治療において、治療的にも有用であり得る。
【００２２】
本発明の他の要旨は、Ｂ７−２活性を有するペプチドおよびＢ７−２融合タンパク質等の可溶性の、多価形のＢ７−２タンパク質を含む、刺激性の形のＢ７−２抗原を用いることによる共刺激性シグナルのＴ細胞への伝達により免疫応答を上方調節する方法に関する。抗原と共に刺激性形のＢ７−２の運搬は、様々な病原体に対する予防接種の効果を高めるのに予防的に有用であり、感染中の個別的な病原体に対する、または腫瘍を有する宿主における腫瘍に対する免疫応答を上方調節するのに治療的にも有用であり得る。
本発明は、Ｂリンパ球抗原、例えばＢ７−２、Ｂ７−３のそれらのレセプターとの相互作用を阻害するか、またはそれらのレセプターを介しての細胞内信号伝達を妨げることのできる分子を同定する方法にも関する。細胞上でのＢリンパ球抗原の発現を調節できる分子を同定する方法をも提供する。更に新規なＢリンパ球抗原によるＴ細胞の共刺激に応じて産生されるサイトカインを同定する方法も本発明の範囲である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以前にキャラクタライズされたＢリンパ球活性化抗原Ｂ７(本明細書ではＢ７−１と呼ぶ)の外に、ヒトＢリンパ球はＴ細胞活性化を共刺激する他の新規な分子を発現する。これらの共刺激性分子は、Ｂリンパ球、専門的な抗原提示細胞(例えば単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞)、および免疫細胞に抗原を提示し、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８の両方、または他の既知のもしくは未だ定義されていない免疫細胞上の受容体に結合する他の細胞(例えば角化細胞、内皮細胞、神経膠星細胞、線維芽細胞、乏突起膠細胞)の表面上の抗原を含む。本発明の範囲内の共刺激性分子を本明細書では、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンド(カウンターレセプター)またはＢリンパ球抗原と呼ぶ。活性化されたＴ細胞に共刺激を与えて、それにより、Ｔ細胞の増殖および／またはサイトカイン分泌を誘導する新規なＢリンパ球抗原は、本明細書に記載し、キャラクタライズするＢ７−２(ヒトおよびミュリン)およびＢ７−３抗原を含む。
【００２４】
Ｂリンパ球抗原Ｂ７−２は、抗免疫グロブリンまたは抗ＭＨＣクラスＩＩモノクロナール抗体のいずれかによる刺激の後、約２４時間にヒトＢ細胞により発現される。Ｂ７−２抗原は検出可能なＩＬ−２分泌およびＴ細胞増殖を誘導する。活性化後約４８〜７２時間において、ヒトＢ細胞はＢ７−１、およびＢ７−１をも結合する、モノクロナール抗体ＢＢ−１により同定された、第３のＣＴＬＡ４カウンターレセプター、Ｂ７−３の両方を発現する(Ｙokochi, Ｔ．等(１９８２)、Ｊ．Ｉmmunol．、１２８、８２３〜８２７)。Ｂ７−３抗原は、Ｂ７−１陰性の活性化されたＢ細胞上でも発現され、検出可能なＩＬ−２の産生なしにＴ細胞増殖を共刺激し、このことはＢ７−１およびＢ７−３分子は別のものであることを示す。Ｂ７−３は活性化されたＢ細胞、活性化された単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、および角化細胞を含む様々な細胞上で発現される。Ｂ細胞活性化後７２時間において、Ｂ７−１およびＢ７−３の発現は衰え始める。活性化Ｂリンパ球表面上のこれらの共刺激性分子の存在は、Ｔ細胞共刺激がＢ細胞活性後これらの分子の一時的発現により部分的に制御されていることを示す。
【００２５】
従って、本発明の要旨の一つは、Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２、そのような核酸のフラグメント、またはそれらの均等物等の新規な共刺激性分子をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。本明細書で用いる「核酸」という語は、そのようなフラグメントまたは均等物を含むことを意図する。「均等物」という語は、新規なＢリンパ球抗原の活性(すなわち、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８等の免疫細胞上のＢリンパ球抗原の天然のリガンドに結合し、免疫細胞共刺激を阻害（例えばブロック）し、または刺激（例えば高める）する能力)を有する、機能的に均等なＢリンパ球抗原、または機能的に均等なペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを意図する。そのような核酸は図８に示したヒトＢ７−２ヌクレオチド配列(配列番号１)および図１４に示したミュリンのＢ７−２ヌクレオチド配列(配列番号２２)の均等物と考えられ、本発明の範囲内にある。
【００２６】
一態様において、核酸はＢ７−２  Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするcＤＮＡである。好ましくは核酸は、図８に示すヒトＢ７−２をコードするヌクレオチド配列(配列番号１)の少なくとも一部分、または図１４(配列番号２)に示すミュリンＢ７−２をコードするヌクレオチド配列(配列番号２２)の少なくとも一部分よりなるcＤＮＡ分子である。図８(配列番号１)または図１４(配列番号)のcＤＮＡ分子の好ましい部分は分子のコーディング領域を含む。
【００２７】
他の態様においては本発明の核酸は、Ｂ７−２活性を有し、図８(配列番号２)または図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。好ましい核酸は、Ｂ７−２活性を有し、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％の相同性、より好ましくは少なくとも約６０％の相同性、および最も好ましくは少なくとも約７０％の相同性を有するペプチドをコードする。Ｂ７−２活性を有し、図８に示す配列(配列番号２)と少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％の相同性を有するペプチドをコードする核酸も本発明の範囲内である。相同性とはＢ７−２等の新規なＢリンパ球抗原の活性を有する２つのペプチド間、または２つの核酸分子間の配列類似性を言う。相同性は、比較の目的に一列に並べた各配列中の位置を比較することにより決定できる。比較される配列中のある位置が同じヌクレオチド塩基またはアミノ酸によって占められている場合には、それらの分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度(パーセント)は配列によって共有された、マッチングした、または相同な位置の数の関数である。
【００２８】
本発明の他の態様は、図８に示すアミノ酸配列(配列番号２)のすべて、または一部を有するペプチド、または図１４に示すアミノ酸配列(配列番号２３)のすべてまたは一部を有するペプチドをコードする核酸に高または低ストリンジェンシィ条件下にハイブリダイズする核酸を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシィ条件、例えば約４５℃での６.０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)、その後の５０℃での２.０×ＳＳＳ洗浄)は当業者に知られており、Ｃurrent  Ｐrotocols  in  Ｍolecnlar  Ｂiology、Ｊohn  Ｗiley  ＆  Ｓons、ニューヨーク(１９８９)、６.３.１〜６.３.６に見出すことができる。例えば洗浄工程における塩濃度は、約２.０×ＳＳＣ(５０℃)という低ストリンジェンシィから約０.２×ＳＳＣ(５０℃)という高ストリンジェンシィまで選択できる。更に洗浄工程における温度は室温、約２２℃の低ストリンジェンシィ条件から、約６５℃の高ストリンジェンシィ条件まで選択することができる。
新規なＢリンパ球抗原を有するペプチドをコードし、遺伝コードにおける縮重のため、図８(配列番号１)または図１４(配列番号２２)に示すヌクレオチド配列と異なる配列を有する単離された核酸も本発明の範囲内にある。そのような核酸は機能的に均等なペプチド(例えばＢ７−２活性を有するペプチド)をコードするが、遺伝コードにおける縮重のため、図８または図１４の配列とは配列が相異する。例えば多くのアミノ酸は１以上のトリプレットにより指定される。同じアミノ酸を示すコドン、すなわち同義語(例えばＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンについての同義語である)は、遺伝コードにおける縮重のため生じる。一例として、Ｂ７−２のヌクレオチド配列内部のＤＮＡ配列多形性（特にコドンの３番目のコドン内部の）はコードされたアミノ酸に影響しないＤＮＡ配列における「サイレント」な変異を生じるかも知れない。しかしながら、Ｂ７−２抗原のアミノ酸配列の変化を生じるＤＮＡ配列多形性が集団内部に存在するであろうことが予期される。新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする核酸の１以上のヌクレオチドにおけるこれらの変異（ヌクレオチドの約３〜４％までの）が、天然のアレル変異のため集団内部の個々のものの間に存在し得ることは当業者に認識されるであろう。どのような、そしてすべてのそのようなヌクレオチド変異体およびその結果生じるアミノ酸多形体も本発明の範囲である。さらに、本明細書に記載する新規なＢリンパ球抗原の１以上のアイソ型、または関連する交差反応性(cross−reacting)ファミリーのメンバーも存在し得る。そのようなアイソ型またはファミリーメンバーは、Ｂリンパ球抗原(例えばＢ７−２抗原)に機能およびアミノ酸配列において関連するが、異なる場所の遺伝子によるコードされたタンパク質と定義する。
【００２９】
新規なＢリンパ球抗原をコードする核酸の「フラグメント」は、Ｂリンパ球抗原の全アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より少ないヌクレオチドを有し、Ｂリンパ球抗原の活性(すなわち、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８等の、免疫細胞上のＢリンパ球抗原の天然リガンドへ結合し、免疫細胞共刺激を刺激するか阻害する能力)を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列と定義する。従って、Ｂ７−２活性を有するペプチドは、ＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８を結合し、例えば一次活性化シグナルを受け取ったＴ細胞によるサイトカイン分泌産生および／またはＴ細胞増殖により実証されるような、Ｔ細胞媒介免疫応答を刺激し、または阻害する。一態様においては、該核酸フラグメントは、ＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８に結合する抗原の能力を保持し、共刺激性シグナルをＴリンパ球に運ぶＢ７−２抗原のペプチドをコードする。他の態様では、該核酸フラグメントはヒトＢ７−２抗原の細胞外部分(例えば図８(配列番号２)に示される配列のアミノ酸残基約２４〜２４５)を含み、ＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８を結合し、一価形では共刺激を阻害し、または多価形では共刺激を誘導し、もしくは高めるのに用いることができるペプチドをコードする。
【００３０】
好ましい核酸フラグメントは、長さで少なくとも２０のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも４０のアミノ酸残基、そしてより好ましくは少なくとも６０のアミノ酸残基よりなるペプチドをコードする。長さで少なくとも８０のアミノ酸残基、少なくとも１００のアミノ酸残基、および少なくとも２００またはそれ以上のアミノ酸残基よりなるペプチドをコードする核酸フラグメントも本発明の範囲内である。特に好ましい核酸フラグメントは、式:
Ｘn−Ｙ−Ｚm
によって表わされるアミノ酸配列と、ヒトＢ７−２活性を有するペプチドをコードする。式中、Ｙは図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５を含んでなり、ＸnおよびＺmはアミド結合によりＹに結合した更なるアミノ酸残基である。ＸnおよびＺmは図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列中のＹに隣接するアミノ酸残基から選択される。式中、Ｘnは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸、すなわちアミノ酸残基２３〜１から選択されるアミノ酸残基である。Ｚmは図８(配列番号２)に示す配列のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸、すなわちアミノ酸残基２４６〜３２９から選択されるアミノ酸残基である。更に、式中、nは０〜２３の数であり(n＝０〜２３)、mは０〜８４の数である(m＝０〜８４)。特に好ましいペプチドは、n＝０、m＝０である上記の式Ｘn−Ｙ−Ｚmにより表わされるアミノ酸配列を有する。
【００３１】
本発明の範囲内の核酸フラグメントは、本明細書に記載したＢリンパ球と交差反応性(cross−reacting)の新規タンパク質を検出するためスクリーニングプロトコールにおいて使用するための、他の動物種からの核酸とハイブリダイズすることができるものを含む。これら、および他のフラグメントは以下に詳細に記載する。一般にＢリンパ球抗原のフラグメントをコードする核酸は、成熟タンパク質をコードする塩基から選択するが、いくつかの場合には、ヌクレオチド配列のリーダー配列または非コード部分からのフラグメントのすべて、または部分を選択するのが好ましい。本発明の範囲内の核酸は、リンカー配列、修飾された制限エンドヌクレアーゼ部位、および分子クローニング、組換えタンパク質の発現または構成に有用な他の配列、またはそれらのフラグメントをも含み得る。核酸配列のこれら、および他の修飾は以下に詳細に記載する。
【００３２】
Ｂ７−２抗原のような新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする核酸は、活性化されたＢリンパ球に存在するmＲＮＡから得ることができる。Ｂリンパ球抗原をコードする核酸配列をＢ細胞ゲノムＤＮＡから得ることも可能であろう。例えば、Ｂ７−２抗原をコードする遺伝子を、本明細書に記載するプロトコールに従ってcＤＮＡまたはゲノムライブラリーからクローンできる。Ｂ７−２抗原をコードするcＤＮＡは適当な細胞系からの全mＲＮＡを単離することにより得ることができる。次に、２本鎖cＤＮＡを全mＲＮＡから調製できる。次に、多くの公知の技術のいずれか一つを用いてそのcＤＮＡを適当なプラスミドまたはウイルス(例えばバクテリオファージ)ベクターに挿入できる。新規なＢリンパ球抗原をコードする遺伝子は、本発明により提供されるヌクレオチド配列情報に従い、確立されたポリメラーゼチエインリアクション技術を用いてクローンすることもできる。本発明の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましい核酸は、図８(配列番号１)に示す配列を有するヒトＢ７−２抗原をコードするcＤＮＡである。他の好ましい核酸は図１４(配列番号２２)に示す配列を有するミュリンＢ７−２抗原をコードするcＤＮＡである。
【００３３】
本発明は更に、少なくとも１つの制御配列に作動可能に結合した、本明細書に記載の新規Ｂリンパ球抗原の活性を有する少なくとも１つのペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターに関する。「作動可能に結合した」とは、該核酸配列が、その発現を可能にするような方法で制御配列に結合されている(例えばシスまたはトランスで)ことを意味することを意図する。制御配列は当業界で知られており、適当な宿主細胞中での所望のタンパク質の発現を指示するよう選択する。従って、制御配列という語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節因子を含む。そのような制御配列は当業者に知られており、Ｇoeddel、Ｇene  Ｅxpression  Ｔechnology、Ｍethods  in  Ｅnzymology、Ａcademic  Ｐress、サンディエゴ、カリフォルニア(１９９０)に記載されている。発現ベクターのデサインは、トランスフェクトされる宿主の選択、および／または発現されるよう望まれるタンパク質のタイプに依存することが理解されるべきである。一態様においては発現ベクターは、細胞外ドメイン部分等のＢ７−２タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸を含む。他の態様では、発現ベクターは、Ｂ７−２抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、およびＢ７−１等の他のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを含む。ヒトＢ７−１およびマウスＢ７−１抗原をコードするcＤＮＡは配列番号２８および配列番号３０にそれぞれ示される。これらの抗原の推論されたアミノ酸配列は、配列番号２９および配列番号３１にそれぞれ示される。そのような発現を用いて、細胞をトランスフェクトし、それによって、本明細書に記載した核酸配列によりコードされる融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを製造することができる。これ等および他の態様は本明細書に更に詳細に記載する。
【００３４】
本発明は、新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドを製造する方法にも関する。例えばＢ７−２タンパク質の活性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を指向する核酸ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を適当な条件下に培地中で培養し、ペプチドを発現させることができる。更に、Ｂ７−２の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、および第２のＢリンパ球抗原(例えばＢ７−１、Ｂ７−３)の活性を有するペプチド等の他のペプチドをコードするＤＮＡを含む１以上の発現ベクターを用いて宿主細胞をトランスフェクトし、これらのペプチドを共発現させるか、または融合タンパク質またはペプチドを製造できる。一態様では、Ｂ７−２融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターを製造できる。Ｂ７−２融合タンパク質は、Ｂ７−２活性を有する第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列、および第１のペプチドの溶解性、親和性、安定性または価数を変化させる部分に対応する第２のペプチド、例えば免疫グロブリン定常領域、をコードするヌクレオチド配列の組換え発現により製造できる。好ましくは第１のペプチドは、ヒトＢ７−２抗原の細胞外ドメインの部分(例えば図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基約２４〜２４５)よりなる。第２のペプチドは、免疫グロブリン定常領域、例えばヒトＣγ１ドメインまたはＣγ４ドメイン(例えばヒトＩgＣγ１またはヒトＩgＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域、Ｃapon等の米国特許第５,１１６,９６４号参照、同特許は本明細書の一部を構成する)を含む。生じるＢ７−２Ｉg融合タンパク質は、変化したＢ７−２の溶解性、結合親和性、安定性、および／または価数(すなわち分子あたり利用できる結合部位の数)を有し得、タンパク質精製の効率を増加させ得る。組換え技術により製造された融合タンパク質およびペプチドは分泌され、細胞および該タンパク質またはペプチドを含む培地の混合物から単離し得る。あるいは、タンパク質またはペプチドは細胞質に保持され、細胞を収穫し、溶菌し、タンパク質を単離し得る。細胞培養は典型的には、宿主細胞、培地、および他の副生物を含む。細胞培養用の適当な培地は当該技術分野で周知である。タンパク質およびペプチドは、当該技術分野で知られたタンパク質およびペプチド精製技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞、または両者から単離できる。宿主細胞をトランスフェクトし、タンパク質およびペプチドを精製する技術は本明細書に更に詳細に記載する。
【００３５】
特に好ましいヒトＢ７−２Ｉg融合タンパク質は、免疫グロブリン定常領域に結合したヒトＢ７−２の細胞外ドメイン部分または可変領域様ドメインを含む。免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリン構造に固有なエフェクター活性を減少させ、または失くす遺伝的修飾を含んでもよい。例えば、ヒトＢ７−２(hＢ７−２)の細胞外部分をコードするＤＮＡも、ヒトＢ７−２の可変領域様ドメイン(hＢ７.２Ｖ)またはヒトＢ７−２の定単領域様ドメインをコードするＤＮＡも、部位指定突然変異誘発により修飾されたヒトＩgＣγ１および／またはＩgＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードするＤＮＡに結合され得る。これらの
融合タンパク質の製造およびキャクタリゼーションは実施例７に詳細に記載する。
【００３６】
細胞の表面に１以上のＢリンパ球抗原(例えばＢ７−２、Ｂ７−３)の活性を有するペプチドを発現するトランスフェクトされた細胞も、本発明の範囲内である。一態様においては、ＣＯＳ細胞等の宿主細胞が、細胞の表面でのＢ７−２活性を有するペプチドの発現を指向する発現ベクターでトランスフェクトされる。そのようなトランスフェクトされた宿主細胞は、Ｂ７−２をＴ細胞上でそのカウンターレセプターに結合することを阻害し、あるいはＢ７−２相互作用に応答するＴ細胞への共刺激の分子内信号伝達を妨げる分子を同定する方法に使用できる。他の態様では、肉腫、黒色腫、白血病、リンパ腫、カルチノーマまたは神経芽細胞腫等の腫瘍細胞を、腫瘍細胞表面上での新規なＢリンパ球抗原の活性を有する少なくとも１つのペプチドの発現を指向する発現ベクターでトランスフェクトする。ある場合には、腫瘍細胞をトランスフェクトし、主要組織適合遺伝子複合体(ＭＨＣ)タンパク質、例えばＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖タンパク質またはＭＨＣクラスＩα鎖タンパク質、および必要ならβ２ミクログロブリンタンパク質を共発現させることも有益である。そのようなトランスフェクトされた腫瘍細胞を用いて患者における腫瘍免疫性を誘導することができる。これらのおよび他の態様は本明細書に更に詳細に記載する。
【００３７】
本発明の核酸配列は標準的な技術を用いて化学的に合成することもできる。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する様々な方法は、ペプチド合成と同様に、商業的に利用できるＤＮＡ合成機において完全に自動化された固相合成を含め、知られている(Ｉtakura等、米国特許第４,５９８,０４９号;Ｃaruthers等、同第４,４５８,０６６号;およびＩtakura等同４,４０１,７９６号および第４,３７３,０７１号参照、これらの特許は本明細書の一部を構成する。)。
【００３８】
本発明の他の要旨は、新規なＢリンパ球抗原(例えばＢ７−２、Ｂ７−３)の活性を有する単離されたペプチドに関する。Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドは、図８(配列番号２)に示すヒトＢ７−２配列、または図１４(配列番号２２)に示すミュリンＢ７−２配列等のＢリンパ球抗原とはアミノ酸配列は異なってもよいが、そのような相異はＢリンパ球抗原と同じ、または類似の方法で機能し、またはＢリンパ球抗原と同じまたは類似の特徴を有するペプチドを生じる。例えばＢ７−２タンパク質の活性を有するペプチドは、Ｔ細胞上のＣＬＴＡ４および／またはＣＤ２８等の、免疫細胞上のＢ７−２タンパク質の天然のリガンドに結合し、免疫細胞共刺激を刺激し、または阻害する能力を有するペプチドと本明細書において定義する。従ってＢ７−２活性を有するペプチドはＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８に結合し、Ｔ細胞媒介免疫応答を刺激し、または阻害する(例えば１次活性化シグナルを受けたＴ細胞によるサイトカイン産生および／または増殖により証拠づけられる)。１態様はＢ７−２結合活性を有するが、共刺激シグナルをＴ細胞に伝達する能力を欠いたペプチドを提供する。そのようなペプチドは患者におけるＴ細胞増殖および／またはサイトカイン分泌を阻害しまたはブロックするのに用いることができる。或いは、Ｂ７−２結合活性およびＴ細胞に共刺激シグナルを伝達する能力の両方を有するペプチドは患者におけるＴ細胞増殖および／またはサイトカイン分泌を刺激し、または高めるのに用いる。これらの、および他の機能的に均等なペプチドを産生するＢ７−２タンパク質の様々な修飾は本明細書に詳細に記載する。本明細書で用いる「ペプチド」の語は、ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドを言う。
【００３９】
Ｂ７−２の機能(すなわちＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８に結合し、および／またはＴ細胞共刺激を刺激し、または阻害するＢ７−２の能力)に直接関与しないアミノ酸残基の置換、付加、または削除などの、図８(配列番号２)に示すヒトＢ７−２タンパク質、または図１４(配列番号２３)に示すミュリンＢ７−２タンパク質のアミノ酸配列の修飾によりペプチドを製造できる。本発明のペプチドは、典型的には長さで少なくとも２０のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも４０のアミノ酸残基、最も好ましくは６０のアミノ酸残基である。Ｂ７−２の活性を有し、長さで少なくとも８０のアミノ酸残基、少なくとも１００のアミノ酸残基、または少なくとも２００またはそれ以上のアミノ酸残基を有するペプチドも本発明の範囲にある。好ましいペプチドは、ヒトＢ７−２抗原の細胞外ドメイン部分(例えば図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基約２４〜２４５)を含む。他の好ましい配列は、式:
Ｘn−Ｙ−Ｚm
(式中、Ｙは図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基５５〜６８、図(配列番号２)を示す配列のアミノ酸残基８１〜８９、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１２８〜１４２、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１６０〜１６９、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１８８〜２００、および図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２６９〜２８２よりなる群から選択されるアミノ酸残基である。)
によって示されるアミノ酸配列を有する。該式中、ＸnおよびＺmはアミド結合によりＹに結合した付加的なアミノ酸残基である。ＸnおよびＺmは、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列においてＹに隣接するアミノ酸より選択されるアミノ酸残基である。Ｘnは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸から選択されるアミノ酸残基である。Ｚmは、図８(配列番号２)に示す配列においてＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸から選択されるアミノ酸残基である。式中、nは０〜３０の数であり(n＝０〜３０)、mは０〜３０の数である(m＝０〜３０)。特に好ましいペプチドは、n＝０、およびm＝０である、式Ｘn−Ｙ−Ｚmによって表されるアミノ酸配列を有する。
【００４０】
本発明の他の態様は、Ｂ７−２またはＢ７−３等の新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドの実質的に純粋な製造物を提供する。そのような製造物は、該ペプチドが細胞中に天然に共にあり、または細胞により分泌された場合天然に共にあるタンパク質およびペプチドを実質的に含まない。
【００４１】
本明細書を通じて用いる「単離された」の語は、組換えＤＮＡ技術により製造される場合には細胞物質または培養培地、化学的に合成させた場合には化学的な前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、Ｂ７−２等の新規なＢリンパ球抗原の活性を有する核酸、タンパク質、またはペプチドを言う。単離された核酸は、該核酸が由来する生物において天然に該核酸の側面にある配列(すなわち該核酸の５'および３'末端に位置する配列)をも含まない。
【００４２】
本発明のこれらの、および他の要旨は以下に詳細に記載する。
Ｉ．細胞株からの核酸の単離
新規なＢリンパ球の活性を有するペプチドをコードする核酸を単離するのに用いる適当な細胞は、Ｂリンパ球抗原(例えばＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３)をコードするmＲＮＡを産生し、そのmＲＮＡを対応するタンパク質にほぼ翻訳することのできる細胞を含む。mＲＮＡの１つの源は、静止、または抗免疫グロブリン抗体若しくは抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体により活性化された、或いは腫瘍性のＢ細胞のサブセットからの通常のヒト脾Ｂ細胞である。ヒトＢ７−２抗原の発現は、静止Ｂ細胞において、および活性化Ｂ細胞において検出可能であり、mＲＮＡレベルは刺激後、静止レベルから４倍増加する。全細胞のＲＮＡは、標準的な技術を用いて、静止またはこれ等の間隔の間に活性化されたＢ細胞から得ることができ、cＤＮＡライブラリーの構築に用いることができる。
【００４３】
更に、腫瘍性Ｂ細胞の様々なサブセットはＢ７−２およびＢ７−３を発現し、cＤＮＡライブラリー構築のためのmＲＮＡ源として代わりに役立つ。例えば非ホジキンスリンパ腫を有する患者から単離された腫瘍細胞はＢ７−１mＲＮＡを発現する。結節性(nodular)の、あまり分化していないリンパ腫(ＮＰＤＬ)からのＢ細胞は、大きい細胞リンパ腫(ＬＣＬ)を拡散させ、バーキットリンパ腫細胞系もヒトＢ７−１mＲＮＡ、および恐らくＢ７−２およびＢ７−３mＲＮＡの適当な供給源であろう。ミエローマはＢ７−２を一般に発現するが、Ｂ７−１mＲＮＡを発現しないので、Ｂ７−２mＲＮＡの供給源を提供する。バーキットリンパ腫細胞系ＲajiはＢリンパ球抗原mＲＮＡの一つの供給源である。好ましくはＢ７−２mＲＮＡは静止および活性化した正常なヒトＢ細胞の両者の集団から得る。活性化Ｂ細胞は、例えば抗免疫グロブリン抗体、または抗ＭＣＨクラスＩＩ抗体を用い広い範囲の時間(例えば分から日)にわたる刺激により得られる。
ＩＩ．mＲＮＡの単離およびcＤＮＡライブラリーの構築
【００４４】
全細胞mＲＮＡは、様々な技術により、例えばChirgwin等、Ｂiochemistry、１８、５２９４〜５２９９(１９７９)のグアニジニウム−チオシアネート抽出方法を用いることにより、単離できる。この方法によれば、Ｐoly(Ａ＋)mＲＮＡを、オリゴ(dＴ)セルロース選択を用いて、cＤＮＡライブラリー構築における使用のため調製し、精製する。cＤＮＡをオリゴ(dＴ)プライミングおよび逆転写酵素を用いて、poly(Ａ＋)ＲＮＡから次に合成する。Ｍoloney  ＭＬＶ逆転写酵素(Ｇibco／ＢＲＬ、ベセスダ、メリーランドから入手できる)、またはＡＭＶ逆転写酵素(Ｓeikagaku  Ａmerica,Ｉnc．,セントピーターズバーグ、フロリダから入手できる)を好ましくは用いる。
【００４５】
逆転写の後、mＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子を通常の技術を用いて２本鎖ＤＮＡに変換し、適当なベクター中に導入する。ここでの実験は２本鎖cＤＮＡへの変換にはＥ．coli  ＤＮＡポリメラーゼＩおよびリボヌクレアーゼＨを用いる。
【００４６】
cＤＮＡのクローニングは、２本鎖ＤＮＡを適当なベクターと結合するための従来の技術のいずれかを用いて行うことができる。合成アタプターを用いることが特に好ましい。何故ならそれはクローニング前の制限酵素によるcＤＮＡの解裂の可能性を緩和するからである。この方法を用い非自己相補体の、カイネース(kinased)したアダプターを、ベクタとのライゲーション前にＤＮＡに付加する。実際上どのようなアダプタも使用し得る。以下の実施例により詳細に示すように、非自己相補性のＢstＸＩアダプターを、ＢstＸＩ消化によりクローニングのため調製したpＣＤＭ８ベクタ中へのライゲーションのために、クローニング用のcＤＮＡに好ましくは付加する。
【００４７】
真核生物cＤＮＡは、適当な真核細胞プロモーター、複製起点、およびエンハンサー、スプライスアクセプターおよび／またはドナー配列、並びにポリアデニル化シグナルを含む他の要素を提供するベクター中にセンスオリエンテーションで配置した場合に発現され得る。本発明のcＤＮＡを、原核生物プロモーター、Ｅ．coli中で機能する複製起点、ＣＯＳ細胞中で増殖を可能にするＳＶ４０複製起点、およびcＤＮＡ挿入部位を有する適当なベクター中に位置させる。適当なベクターは、πＨ３(ＳeedおよびＡruffo、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．、８４、３３６５〜３３６９(１９８７)),πＨ３m(ＡruffoおよびＳeed、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．、８４、８５７３〜８５７７(１９８７))、pＣＤＭ７およびpＣＤＭ８(Ｓeed、Ｎature、３２９、８４０〜８４１(１９８７))を含み、pＣＤＭ８ベクターが特に好ましい(Ｉnvitrogen、サンディエゴ、カリフォルニアより入手できる)。
III．宿主細胞のトランスフェクションおよび新規なＢリンパ球活性化抗原のスクリーニング
【００４８】
かく調製したcＤＮＡライブラリーを用いて、発現クローニング技術により問題の遺伝子をクローンする。基本的な発現クローニング技術は、ＳeedおよびＡruffo、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８４、３３６５〜３３６９(１９８７)、およびＡruffoおよびＳeed、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８４、８５７３〜８５７７(１９８７)に記載されているが、この技術の改変は必要であり得る。
【００４９】
１態様によれば、プラスミドＤＮＡを公知のトランスフェクション技術(例えばＤＥＡＥ−デキストラン)を用いて、サルのＣＯＳ細胞株(Ｇluzman、Ｃell)、２３、１７５(１９８１))に導入し、cＤＮＡ挿入物を複製し、発現させる。Ｂ７−１抗原を発現するトランスフェクタントを、抗Ｂ７−１モノクローナル抗体(例えば１３３およびＢ１．１)および抗ミュリンＩgＧおよびＩgＭでコートしたイムノマグネチックビーズでディプリート(deplete)させる。ヒトＢ７−２抗原を発現するトランスフェクタントを、そのトランスフェクタントを融合タンパク質ＣＴＬＡ４ＩgおよびＣＤ２８Ｉgと反応させ、次いで抗ヒトＩg抗体でコートしたプレートでパニングすることにより、陽性選択できる。ヒトＣＴＬＡ４ＩgおよびＣＤ２８Ｉg融合タンパク質を用いたが、Ｂ７−１および例えばマウスＢ７−１間でクロススピシーズ(cross  speciles)反応性があるとすれば、他の交叉反応性種と反応性の他の融合タンパク質も使用できるであろうことが期待できる。パニング(panning)後、エピソームＤＮＡをパン化された(panned)細胞から回収し、コンピテントな細菌宿主、好ましくはＥ．coli．にトランスフォームする。プラスミドＤＮＡを次にＣＯＳ細胞に再導入し、発現およびパニングのサイクルを少なくとも２回繰返す。最終サイクルの後、プラスミドＤＮＡを個々のコロニーから調製し、ＣＯＳ細胞にトラスフェクトし、例えばＣＴＬＡ４ＩgおよびＣＤ２８Ｉgを用いる間接免疫蛍光法により新規なＢリンパ球抗原の発現について分析する。
IV．新規なＢリンパ球抗原の配列決定
【００５０】
ＣＤＬＡ４ＩgおよびＣＤ２８Ｉgと強い反応性のこれらのコロニーからプラスミドを調製する。これらのプラスミドを次に配列決定する。約１.０kb以上のＤＮＡのトラクトを配列決定するのに適した従来の配列決定技術のいずれも使用できる。
【００５１】
実施例４に記載したように、９８７ヌクレオチドよりなるシングルの長いオープンリーディングフレームおよび３'非コード配列の約２７ヌクレオチドを有する１,１２０塩基対挿入物を有するヒトＢ７−２クローン(クローン２９)が得られた(図８、配列番号１)。タンパク質のオープンリーディングフレームによりコードされる予想されるアミノ酸配列を図８のヌクレオチド配列の下に示す。コードされたＢ７−２タンパク質は長さで３２９のアミノ酸残基であると予想される(配列番号２)。このタンパク質配列は、他のタイプＩ  Ｉgスーパーファミリー膜タンパク質に共通の多くの特徴を示す。タンパク質翻訳は、コンセンサス真核生物翻訳開始部位を有する領域におけるＤＮＡ相同性に基づいてメチオニンコドン(ＡＴＧ、ヌクレオチド１０７〜１０９)で始まると予言される(Ｋozak,Ｍ.(1987)、Ｎucl．Ａcids  Ｒes、１５、８１２５〜８１４８参照)。Ｂ７−２タンパク質のアミノ末端(アミノ酸１〜２３)は、位置２３および２４におけるアラニン間の予想される解裂による分泌シグナルペプチドの特徴を有する(von  Ｈeijne(１９８７)、Ｎucl．Ａcids  Ｒes．、１４、４６８３)。この部位でのプロセシングは、約３４kＤaの非修飾分子量を有する３０６アミノ酸のＢ７−２膜結合タンパク質を生じる。このタンパク質は、アミノ酸残基約２４〜２４５よりなるほぼ細胞外ＩgスーパーファミリーＶおよびＣ様ドメイン、アミノ酸残基約２４６〜２６８よりなる疎水性の膜貫通ドメイン、およびアミノ酸残基約２６９〜３２９よりなる長い細胞質ドメインよりなる。Ｉgスーパーファミリーに対する相同性は位置４０〜１１０および１５７〜２１８におけるシステインにより結合された細胞外領域における２つの隣接するＩg様ドメインによる。細胞外ドメインは８つの可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位をも有し、Ｂ７−１と同様に多分グリコシル化される。ヒトＢ７−２タンパク質のグリコシル化は約５０〜７０kＤaへ分子量を増加させ得る。ヒトＢ７−２の細胞質ドメインは、Ｂ７−１より幾分長いが、抗原提示細胞(ＡＰＣ)内部で信号伝達または制御ドメインとして多分作用する多数のシステイン、それに続く正に荷電したアミノ酸よりなる一般的な領域を含む。ヒトＢ７−２のヌクレオチドおよびアミノ配列の両方の、ＧenＢankおよびＥＭＢＬデータベースとの比較は、ヒトＢ７−１とのかなりな相同性(約２６％のアミノ配列の同一性)を示した。ヒトＢ７−１、ヒトＢ７−２およびミュリンＢ７−１はすべてヒトＣＴＬＡ４およびＣＤ２８に結合するので、相同性のアミノ酸はＣＴＬＡ４またはＣＤ２８結合配列を含むのに必要なアミノ酸を多分示す。ヒトＢ７−２をコードするcＤＮＡ挿入物を有するベクターでトランスフェクトされたＥ．coli(クローン２９)は、１９９３年７月２６日に、受託番号第６９３５７号としてアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション(ＡＴＣＣ)に寄託された。
Ｖ．他の哺乳動物種からの新規なＢリンパ球抗原のクローニング
【００５２】
本発明はヒト核酸分子に限定されず、Ｂリンパ球抗原を発現する他の哺乳動物種からの新規なＢリンパ球抗原ホモローグが、以下に記載する技術を用いてクローンされ配列決定されることを意図する。クロススピーシーズ反応性を示す、１つの種(例えばヒト)について単離されたＢリンパ球抗原を用いて、他の種(例えばマウス)におけるＴ細胞媒介免疫応答を修飾し得る。他の種からのcＤＮＡクローンの単離はハイブリダイゼーションプローブとして、ヒトＢ７−２cＤＮＡ等のヒトcＤＮＡ挿入物を用いて行うこともできる。
【００５３】
実施例６に示すように、９２７のヌクレオチドよりなるシングルの長いオープンリーディングフレーム、および３'非コード配列の約１２６ヌクレオチドを有する１,１６３の塩基対よりなる挿入物を含むミュリンＢ７−２クローン(mＢ７−２、クローン４)を得た(図１４、配列番号２２)。タンパク質のオープンリーディングフレームによりコードされる予想されるアミノ酸配列を、図１４のヌクレオチド配列の下に示す。コードされるミュリンＢ７−２タンパク質は、長さで３０９アミノ酸残基であると予想される(配列番号２３)。このタンパク質は他のタイプＩ  Ｉgスーパーファミリー膜タンパク質に共通な多くの特徴を有する。タンパク質翻訳は、コンセンサス真核生物翻訳開始部位を有する領域におけるＤＮＡ相同性に基づいて、メチオニンコドン(ＡＴＧ、ヌクレオチド１１１〜１１３)で開始すると予想される(Ｋozak,Ｍ(１９８７)、Ｎucl．Ａcids  Ｒes、１５、８１２５〜８１４８を参照)。ミュリンＢ７−２タンパク質のアミノ末端(アミノ酸１〜２３)は、位置２３のアラニンおよび位置２４のバリン間の予想される解裂を有する分泌シグナルペプチドの特徴を有する(von  Ｈeijne(１９８７)、Ｎucl．Ａcids．Ｒes．、１４、４６８３)。この部位でのプロセシングは、約３２kＤaの非修飾分子量を有する、２８６のアミノ酸よりなるミュリンＢ７−２膜結合タンパク質を生じるであろう。このタンパク質は、アミノ酸残基約２４〜２４６のほぼ細胞外ＩgスーパーファミリーＶおよびＣ様領域、アミノ酸残基約２４７〜２６５の疎水性膜貫通ドメイン、およびアミノ酸残基約２６６〜３０９の長い細胞質ドメインよりなるであろう。Ｉgスーパーファミリーに対する相同性は、位置４０〜１１０および１５７〜２１６におけるシステインにより結合された細胞外領域における２つの隣接するＩg様領域による。細胞外ドメインは９つの可能性のあるＮ−結合グリコシル化領域をも含み、ミュリンＢ７−１と同様、恐らくグリコシル化されている。ミュリンＢ７−２タンパク質のグリコシル化は約５０〜７０kＤまで分子量を増加させ得る。ミュリンＢ７−２の細胞質ドメインは、ＡＰＣ内部の信号伝達または制御ドメインとして多分機能するシステインに続く正に荷電したアミノ酸を有する一般的な領域を含む。ミュリンＢ７−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方を、ＧenＢankおよびＥＭＢＬデータベースと比較すると、ヒトおよびミュリンＢ７−１とかなりの相同性(約２６％のアミノ酸配列の同一)を示す。ミュリンＢ７−２は、そのヒトホモローグ、hＢ７−２と約５０％の同一性および６７％の類似性を示す。ミュリンＢ７−２をコードするcＤＮＡ挿入を含むベクター(プラスミドpmＢx４)でトランスフェクトされたＥ．coli(ＤＨ１０６／Ｐ３)(クローン６)は、受託番号第６９３８８号として１９９３年８月１８日にアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション(ＡＴＣＣ)に寄託された。
【００５４】
ミュリンＢ７−２等の、他の種から新規なＢリンパ球抗原をコードする核酸は、トランスジェニック動物、または「ノックアウト」動物を創出するのに用い得、その動物は治療的に有用な薬剤の開発およびスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス)は、トランスジーンを有する細胞を有する動物であり、そのトランスジーンを、動物または出生前の、例えば胚段階の動物の前身に導入する。トランスジーンはそれからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに結合されるＤＮＡである。一態様においてミュリンのＢ７−２cＤＮＡまたはその適当な配列を用いて、確立された技術によりゲノムＢ７−２をクローンし、そのゲノム配列を用いてＢ７−２タンパク質を発現する細胞を有するトランスジェニック動物を作り出すことができる。トランスジェニック動物、特にマウスのような動物、を創出する方法は当該技術分野でありふれたものとなっており、例えば米国特許第４,７３６,８６６号および同４,８７０,００９号に記載されている。典型的には特別の細胞を組織特異的なエンハンサーを用いてＢ７−２トランスジーン導入のための目標に定め、Ｔ細胞共刺激および高められたＴ細胞増殖および自己免疫性をもたらし得るであろう。胚段階にある動物の生殖系列に導入されたＢ７−２トランスジーンのコピーを含むトランスジェニック動物を用いて増加したＢ７発現の影響を調べることができる。そのような動物は、例えば自己免疫病からの保護を与えると考えられる薬剤に対するテスター動物として用いることができる。本発明のこの要旨に従い、ある動物を薬剤で処理し、トランスジーンを有する非処理動物と比べた病気の出現率の減少はその病気に対する治療的関与の可能性を示すであろう。
【００５５】
或いは、内因性のＢ７−２遺伝子および動物の胚細胞に導入された変化させたＢ７−２ゲノムＤＮＡの間の相同的な組換えの結果としてＢ７−２遺伝子の欠陥または変化を有するＢ７−２「ノックアウト」動物を作るために、Ｂ７−２の非ヒトホモローグを用いることができる。例えばミュリンＢ７−２cＤＮＡを用いて、確立された技術に従ってゲノムＢ７−２をクローンすることができる。ゲノムＢ７−２ＤＮＡの一部分(例えば細胞外ドメインをコードするエクソン等の)を削除し、またはインテグレーションをモニターするのに用いる得る選択可能なマーカーをコードする遺伝子のような他の遺伝子で置換し得る。典型的には、変化させないフランキングＤＮＡ(５'および３'末端両方での)数キロの塩基をベクター中に含ませる(例えば、Ｔhomas,Ｋ．ＲおよびＣapecchi,Ｍ．Ｒ．(１９８７)、Ｃell、５１、５０３の相同的な組換えベクターの記述を参照)。そのベクターを胚性の幹細胞系に導入し(例えばエレクトロポレーションにより)、導入されたＤＮＡが内因性のＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する(例えばＬi,Ｅ等(１９９２)、Ｃell、６９、９１５を参照)。選択した細胞を動物(例えばマウス)の胚盤胞に次に注入し、アグリゲーションキメラを形生する(例えばＢraley、Ｔeratocarcinomas  and  Ｅmbryonic  Ｓtem  Ｃell:Ａ  Ｐractical  Ａpproach、Ｅ,Ｊ．Ｒobertson編(ＩＲＬ、Ｏxtord,１９８７)１１３〜１５２頁参照)。キメラ胚を適当な偽妊娠のメスのフォスター動物に移植し、その胚を折りあわせ、「ノックアウト動物」を創出する。それらの胚細胞において相同的に組換えたＤＮＡを有する後代は標準的な技術により同定でき、動物のすべての細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを有する動物を育てるのに用いることができる。ノックアウト動物は、移植片を受容し、腫瘍を拒絶し、および感染性の病気に対し防御するそれらの能力につきキャラクタライズでき、基本的な免疫生物学の研究に用いることができる。
VI．Ｂリンパ球抗原の発現
【００５６】
新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドを発現するようトランスフェクトされた宿主細胞も本発明の範囲内である。宿主細胞は原核生物細胞、または真核生物細胞であり得る。例えばＢ７−２活性を有するペプチドを、Ｅ．coli等の細菌細胞、昆虫細胞(バクロウイルス)、酵母、チャイニーズオバリーセル(ＣＨＯ)およびＮＳＯ細胞等の哺乳動物中で発現し得る。他の適当な宿主細胞はＧoeddel(１９９０)、上書に見出され、当業者に知られている。
【００５７】
例えば哺乳動物、酵母、または昆虫細胞などの真核生物細胞中での発現は、組換えタンパク質の部分的または完全なグリコシル化および／または関連する鎖間または鎖内ジサルファイド結合の形成をもたらし得る。酵母Ｓ．cerivisaeにおける発現用のベクターの例は、pＹepＳecl(Ｂaldari等(１９８７)、Ｅmbo  Ｊ．、６、２２９〜２３４)、pＭＦa(ＫurjanおよびＨerskowitz(１９８２)、Ｃell、３０、９３３〜９４３)、pＪＲＹ８８(Ｓchultz等(１９８７)、Ｇene、５４、１１３〜１２３)およびpＹＥＳ２(Ｉnvitrogen  Ｃorporation、サンディエゴ、カリフォルニア)を含む。培養した昆虫細胞(ＳＦ９細胞)中でタンパク質の発現に利用できるバクロウィルスベクターは、pＡcシリーズ(Ｓmith等(１９８３)、Ｍol．Ｃell  Ｂiol．、３、２１５６〜２１６５)およびpＶＬシリーズ(Ｌucklow,Ｖ．Ａ．およびＳummers,Ｍ．Ｄ(１９８９)、Ｖirology、１７０、３１〜３９)を含む。一般にＣＯＳ細胞(Ｇluzman,Ｙ．(１９８１)、Ｃell、２３、１７５〜１８２)を、哺乳動物における一時的な増幅／発現のためpＣＤＭ８等のベクター(Ｓeed,Ｂ．(１９８７)、Ｎature、３２９、８４０)と組合せて用い、ＣＨＯ(dhfr−チャイニーズハムスターオベリー)細胞は、哺乳動物細胞中の安定な増幅／発現のためにpＭＴ２ＰＣ等のベクター(Ｋaufman等(１９８７)、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６、１８７〜１９５)と共に用いる。組換えタンパク質の製造用の好ましい細胞株は、ＥＣＡＣＣ(カタログ＃８５１１０５０３)から入手でき、Ｇalfre,Ｇ．およびＭilstein,Ｃ(１９８１)、Ｍethods  in  Ｅnzymology、７３(１３)、３〜４６およびＰreparation  of  Ｍonoclonal  Ａntibodies:Ｓtrategies  and  Ｐrocedure、Ａcademic  Ｐress、ニューヨークに記載されているＮＳＯミエローマ細胞株である。ベクターＤＮＡは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクチンまたはエレクトロポレーション等の通常の技術により哺乳動物細胞に導入できる。宿主細胞をトランスホームするのに適した方法は、Ｓambrook等、Ｍolecular  Ｃloning:Ａ  Ｌaboratory  Ｍannual、第２編、Ｃold  Ｓpring  Ｈarbor  Ｌaboratory  press(１９８９)および他の実験室テキストブックに見出すことができる。哺乳動物細胞中で用いる場合、発現ベクターの制御機能はウイルス材料によりしばしば提供される。例えば一般に用いるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルスス、サイトメガロウイル、および最もしばしばシミアンウイルス４０に由来する。
【００５８】
細胞の少部分(約１／１０５)が典型的にはＤＮＡをそれらのゲノムに組込む。これらの組込体を同定するために、選択可能なマーカー(すなわち抗生物質に対する抵抗性)を含む遺伝子を、問題の遺伝子と共に宿主細胞に一般に導入する。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセート等の薬剤に対する抵抗性を与えるものを含む。選択可能なマーカーは問題の遺伝子と同じプラスミドに導入してもよく、別のプラスミドに導入してもよい。問題の遺伝子を有する細胞は薬剤選択により同定できる。すなわち選択可能なマーカー遺伝子を導入した細胞は生き残り、他の細胞は死ぬ。生き残った細胞を、Ｂ細胞抗原に対するリガンド(例えばＣＴＬＡ４ＩgおよびＣＤ２８Ｉg)を用いる細胞表面染色により、新規Ｂリンパ球抗原の製造に関して次にスクリーニングし得る。或いは、該タンパク質をラベルしたアミノ酸で代謝的にラベルし、抗Ｂリンパ球抗原モノクローナル抗体、またはＣＴＬＡ４ＩgまたはＣＤ２８Ｉg等の融合タンパク質で細胞上清液から免疫沈澱させ得る。
原核生物における発現は、融合または非融合タンパク質の発現を指向する構成性または誘導性プロモーターを含むベクターを有すＥ．coli中で最もしばしば行われる。融合ベクターは、発現される標的遺伝子の通常アミノ末端に多くのアミノ酸を加える。そのような融合ベクターは、１)組換えタンパク質の発現を増加させる;  ２)標的組換えタンパク質の溶解性を増加させる、および３)アフィニティ精製におけるリガンドとして作用することにより標的組換えタンパク質の精製を助けるという３つの目的に典型的には役立つ。融合発現ベクターにおいてはしばしば、タンパク質分解解裂部位を、融合部分と標的組換えタンパク質の結合部分に導入し、融合タンパク質の精製後に、融合部分から標的組換えタンパク質を分離するのを可能にする。そのような酵素、およびそれらの同種認識配列は、因子Ｘa、トロンビン、およびエンテロキーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、標的組換えタンパク質に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトースＥ結合タンパ  
ク質、またはプロテインＡを融合するpＧＥＸ(Ａmrad  Ｃorp．、メルボルン、オーストラリア)、pＭＡＬ(Ｎew  Ｅngland  Ｂiolabs,ビバリー、マサチューセッツ)、およびpＲＩＴ５(Ｐharmacia、ピスカタウェイ、ニュージャジィ)を含む。
【００５９】
Ｅ．coli．発現系は、誘導性の発現ベクターpＴrc(Ａmann等(１９８８)、Ｇene、６９、３０１〜３１５)およびpＥＴ１１(Ｓtudier等、Ｇene  Ｅxpression  Ｔechnology:Ｍethods  in  Ｅnzymology、１８５、Ａcademic  Ｐress、サンジェゴ、カリホルニア(１９９０)、６０〜８９;  Ｎovagen  から商業的に入手できる)を含む。pＴrcベクター系においては挿入された遺伝子を、ハイブリッドtrp−lac融合プロモータからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写によるpelＢシグナル配列と共に発現させる。誘導の後、組換えタンパク質をペリプラズム部画分から精製できる。pＥＴ１１ベクター系においては、標的遺伝子を、共発現のウイルスＲＮＡポリメラーゼにより媒介されるＴ７gn１０−lac  ０融合プロモーター(Ｔ７gnl)からの転写による非融合タンパク質として発現させる。このウイルスポリメラーゼは、lacＵＶ５プロモーターの転写調節の下Ｔ７gnlを有するレジデントλプロファージから宿主Ｅ．coli株  ＢＬ２１(ＤＥ３)およびＨＭＳ１７４(ＤＥ３)により供給される。この系においては組換えタンパク質を変性した形の封入小体から精製でき、望ましいならステップブラジエント透析により復元して変性物を除去する。
【００６０】
Ｅ．coli中の組換えＢ７−２発現を最大にする１方策は、組換えタンパク質をタンパク質分解酵素によりより解裂する能力の損なわれた宿主細菌中でタンパク質を発現することである(Ｇottesman,Ｓ.、Ｇene  Ｅxpression  Ｔechnology;Ｍethods  in  Ｅnzymology、１８５、Ａcademic  Ｐress、サンディエゴ、カリフォルニア(１９９０)、１１９〜１２８)。他の方策は発現ベクターに挿入されるべきＢ７−２遺伝子または他のＤＮＡの核酸配列を、各アミノ酸の個々のコドンが高度に発現されたＥ．coliタンパク質で優先的に用いられるものであるよう変化させることであろう(Ｗada等(１９９２)、Ｎuc．Ａcids  Ｒes．、２０、２１１１〜２１１８)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的なＤＮＡ合成技術により行い得る。
【００６１】
哺乳動物細胞中または他の方法で発現した新規なＢリンパ球抗原およびその部分は、硫酸アンモニウム沈澱、分別カラムクロマトグラフィー(例えばイオン交換、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティクロマトグラフィ等)、および究極的には結晶化を含む。当該技術分野の標準的な方法に従い精製できる(一般的には、"Ｅnzyme  Ｐurification  and  Ｒelated  Ｔechniques"、Ｍethods  in  Ｅnzymology、２２、２３３〜５７７(１９７１)を参照)。部分的にまたは均一になるまで精製されると、組換え的に製造されたＢリンパ球抗原またはその部分は、以下に詳細に記載する薬学的投与に適した組成物に使用できる。
VII．本発明の核酸およびアミノ酸配列の修飾およびＢ７リンパ球抗原活性の分析
【００６２】
新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする他の核酸を上記方法により単離できることは当業者に認識されるであろう。異なった細胞株が異なった塩基配列を有するＤＮＡ分子を生ずことは予期され得る。更に、変異体が遺伝物質の遺伝的多型性および細胞媒介修飾により存在し得る。更に、Ｂリンパ球抗原のＤＮＡ配列を遺伝技術を用いて修飾し、変化したアミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドを製造し得る。そのような配列は本発明の範囲内であると考えられ、発現されたペプチドは活性化Ｔ細胞媒介免疫応答および免疫機能を誘導し、または阻害できる。
【００６３】
多くの方法が単離されたＤＮＡ配列の均等物またはフラグメントを作るのに用いることができる。Ｂ７−２タンパク質をコードする核酸の小さいサブ領域またはフラグメント、例えば長さで１〜３０の塩基、を標準的な合成有機化学手段により調製できる。その技術はＢ７−２ＤＮＡのより大きい合成フラグメントの作製に用いる、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびプライマーの調製にも有用である。
【００６４】
Ｂリンパ球抗原をコードする遺伝子のより大きいサブ領域またはフラグメントは、ポリメラーゼチェインリアクション(ＰＣＲ)(Ｓambrook、Ｆritsh および Ｍaniatis、Ｍolecular  Ｃloning;Ａ  Ｌabaratory  Ｍanual、Ｃold  Ｓpring  Ｈarbor、ニューヨーク(１９８９))を用いて関連するＤＮＡ片を合成し、このようにして得られたＤＮＡを適当な発現ベクターにライゲートすることにより、ペプチドとして発現できる。ＰＣＲを用いて、クローン化された２本鎖ＤＮＡの特殊な配列が作り出され、発現ベクターにクローン化され、次にＣＴＬＡ４／ＣＤ２８結合活性につき分析する。例えば分泌(可溶)形のヒトＢ７−２タンパク質を発現させるために、ＰＣＲを用いて、該タンパク質の膜貫通および細胞質領域をコードしないＤＮＡを合成できる。このＤＮＡ分子を適当な発現ベクターにライゲートし、ＣＨＯ等の宿主細胞に導入でき、そこでＢ７−２タンパク質フラグメントが合成され、分泌される。そのＢ７−２タンパク質フラグメントは培養培地から容易に得ることができる。
【００６５】
他の態様では、単純な削除物若しくは挿入物、塩基クラスターの系統的な削除物、挿入物若しくは置換物、または単一・塩基の置換物を作る方法を含め、多くの方法のいずれかでＤＮＡ中に突然変異を導入し、Ｂリンパ球抗原ＤＮＡの変異体または修飾された均等物を作ることができる。例えば図８(配列番号１)に示すヒトＢ７−２cＤＮＡ配列、および図１４(配列番号２)に示すミュリンＢ７−２cＤＮＡ配列における、アミノ酸置換または削除などの変化は、部位指定突然変異誘発により好ましくは得られる。部位指定突然変異誘発は当業界でよく知られている。プロトコールおよび試薬は、Ａmersham  Ｉnternational  ＰＬＣ、アマーシャム、英国より商業的に得られる。
【００６６】
新規なＢリンパ球抗原の活性、すなわち、例えば１次活性化シグナルを受取ったＴ細胞によるサイトカイン産生および／またはＴ細胞増殖により証拠づけられる、Ｔ細胞上でＢリンパ球抗原の天然のリガンドを結合し、活性化Ｔ細胞媒介免疫応答を刺激(増幅)し、または阻害(プロック)する能力を有するペプチドは本発明の範囲内にあると考えられる。より具体的には、Ｔリンパ球、例えばＣＤ２８＋に結合するペプチドは、共刺激性シグナルをＴリンパ球に運ぶことができ、該シグナルは、抗原およびクラスＩＩＭＨＣ、または１次シグナルをＴ細胞に伝えることのできる他の物質の存在下に伝達された場合、Ｔ細胞内部でのサイトカイン遺伝子の活性化を結果として生ずる。或いは、そのようなペプチドをクラスＩ  ＭＨＣと共に用い、それによりＣＤ８＋細胞溶解性Ｔ細胞を活性化できる。更に可溶性、モノマー性形のＢ７−２タンパク質は、ＣＤ２８＋Ｔ細胞上でそれらの天然のリガンドに結合する能力を保持するが、多分リガンドとの不十分な架橋のため、サイトカイン産生および細胞分裂を高めるのに必須な２次的シグナルを伝達できない。細胞中でアネルギーまたは寛容状態を誘導する手段を提供するそのようなペプチドも本発明の範囲内にあると考えられる。
【００６７】
本明細書に記載する特徴的なＢリンパ球抗原活性を保持するものについてのペプチドのスクリーニングは、１以上の、いくつかの異なった分析を用いて行うことができる。例えばそのペプチドを、細胞表面Ｂ７−２、またはＣＴＬＡ４ＩgまたはＣＤ２８Ｉg等の融合タンパク質と反応性の抗７−２モノクローナル抗体との特異的な反応性についてスクリーニングできる。具体的にはＣＯＳ細胞のような適当な細胞を、ペプチドをコードするＢ７−２ＤＮＡでトランスフェクトし、次に間接免疫蛍光およびフローサイトメトリーにより細胞表面の表現型について分析し、そのペプチドがＢ７−２活性を有するか否か決定する。トランスフェクトされた細胞の細胞表面発現は、細胞表面Ｂ７−２またはＣＴＬＡ４ＩgまたはＣＤ２８Ｉgタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて評価する。分泌形のＢ７−２の産生は免疫沈降用の抗Ｂ７−２モノクローナル抗体またはＣＴＬＡ４ＩgまたはＣＤ２８融合タンパク質を用いて評価する。
【００６８】
他の、より好ましい分析は、Ｂ７−２抗原の機能的な特徴を利用する。先に説明したように、サイトカインを合成するＴ細胞の能力は、抗原に対するＴ細胞レセプターの占有または架橋によるばかりでなく(「活性化Ｔ細胞」を作るための、例えば抗ＣＤ３またはフォルボールエステルにより提供される「１次活性化シグナル)、この場合にはＢ７−２、Ｂ７−１またはＢ７−３等のＢリンパ球抗原との相互作用による共刺激性の誘導にもよる。例えばＣＤ２８＋Ｔ細胞上でのＢ７−２のその天然のリガンドへの結合は、サイトカイン、特にインターロイキン−２の増加したレベルの産生を誘導し、次にＴリンパ球の増殖を刺激する、Ｔ細胞へのシグナルの伝達という効果を有する。Ｂ７−２機能の他の分析は、インターロイキン−２、インターロイキン−４、または他の公知の、若しくは知られていない新しいサイカイン等のサイカイン類の合成の分析、および／または１次活性化シグナルを受取ったＣＤ２８＋Ｔ細胞によるＴ細胞増殖についての分析を含む。
【００６９】
インビボで、Ｔ細胞は、抗Ｔ３モノクローナル抗体(例えば抗ＣＤ３)若しくはフォルボールエステル、より好ましくはクラスＩＩＭＨＣと結合した抗原により、第１の、または１次的な活性化シグナルを与えられる。１次活性化シグナルを受取ったＴ細胞を本明細書では活性化Ｔ細胞と言う。Ｂ７−２機能は、Ｔ細胞培養に、Ｂ７−２源(例えばＢ７−２活性を有するペプチドを発現する細胞、または分泌形のＢ７−２)およびクラスＩＩＭＨＣに結合した抗原等の１次活性化シグナルを加え、培養上清液を、インタロイキン−２、γ−インターフェロンまたは他の公知または知られていないサイトカインにつき分析することにより分析される。例えばインターロイキン−２のいくつかの従来の分析法、例えばＰroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８６、１３３３(１９８９)に記載された分析法(その関連部分は本明細書の一部を構成する)、のいずれも用いることができる。インターフェロン産生分析用キットも、Ｇenzyme  Ｃorporation(ケンブリッジ、マサチューセッツ)より入手できる。Ｔ細胞増殖も以下の実施例に記載したように測定できる。本明細書に記載したＢ７−２抗原の特徴を保持するペプチドは、Ｔ細胞によるＩＬ−２等のサイトカインの細胞あたりの生産の増加をもたらし、共刺激シグナルを欠いている陰性対照と比較して高められたＴ細胞増殖をもたらす。
【００７０】
Ｂ７−２活性を有するが、共刺激シグナルを運ぶ能力を欠いたペプチドをスクリーニングするため同じ基本的な機能的分析も使用できるが、そのようなペプチドの場合、Ｂ７−２タンパク質の添加は増殖またはＴ細胞によるサイトカイン分泌の顕著の増加をもたらさないであろう。正常なＢ７−２共刺激シグナルを阻害しまたは完全にブロックし、アネルギーの状態を誘導するそれらのタンパク質の能力は、細胞表面Ｂ７−２を発現し、抗原を提示する抗原提示細胞でＴ細胞を刺激するその後の試みを用いて測定できる。ＩＬ−２合成およびＴ細胞増殖により測定される、その後の活性化の試みにＴ細胞が非応答性であるなら、アネルギーの状態が誘導されている。本発明による分析の基礎として用いる分析システムについては、Ｇimmi,Ｃ．Ｄ．等(１９９３)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、９０、６５８６〜６５９０を参照。
【００７１】
溶解性の増加、治療または予防効果の増大、または安定性(例えば半ビボ（ex vivo)貯蔵期間、およびインビボのタンパク分解酵素による分解に対する抵抗性)の増大などの目的のための新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドの構造の修飾も可能である。そのような修飾されたペプチドは本明細書に定義したＢリンパ球抗原の機能的な均等物であると考えられる。例えばＢ７−２活性を有するペプチドを、それがＴ細胞増殖を刺激および／またはサイトカインを産生する能力を維持するよう修飾できる。Ｔ細胞上でＣＴＬＡ４／ＣＤ２８レセプターと相互作用するのに必須であると示されたこれら残基を、その必須アミノ酸を、その存在がレセプター相互作用を高め、減少させるかが、失くしはせず、または影響しない、他の好ましくは類似のアミノ酸残基で置換することにより(保存的置換)修飾できる。更に、レセプター相互作用に必須でないこれらのアミノ酸残基を、その導入が反応性を高め、減少させ、または影響しない他のアミノ酸により置換することにより修飾してもよい。
【００７２】
新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドの修飾の他の例は、システイン残基を、好ましくはアラニン、セリン、スレオニン、ロイシン、またはグルタミン酸残基で置換して、ジサルファイド結合による二量化を最小限にすることである。更に、Ｂ７−２活性を有するペプチドのアミノ酸側鎖を化学的に修飾できる。他の修飾はペプチドの環化である。
【００７３】
安定性および／または反応性を高めるために、Ｂ７−２活性を有するペプチドを、いずれかの天然のアレル変異から生じる抗原のアミノ酸配列の１以上多型性を導入するよう修飾し得る。更にＤ−アミノ酸、非天然アミノ酸、非アミノ酸アナローグで置換し、付加して本発明の範囲内の修飾タンパク質を製造し得る。更に、ペプチドをＡ．Ｓehonおよび協力者の方法(Ｗie等、上書)によるポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を用いて修飾し、ＰＥＧと結合したペプチドを作ることができる。更に、ＰＥＧはペプチドの化学合成の間に付加することができる。ペプチドの他の修飾は、還元／アルキル化(Ｔarr、Ｍethods  of  Ｐrotein  Ｍicrocharacterzation、Ｊ．Ｅ．Ｓilver編、Ｈuman  Ｐress、クリフトン、ニュージャージー、１５５〜１９９４(１９８６))、アシル化(Ｔarr、上書)、適当な担体への化学的結合(ＭishellおよびＳhiigi編、Ｓelected  Ｍethods  in  Ｃellular  lmmunology、ＷＨ  Ｆreeman、サンフランシスコ、カリフォルニア(１９８０)、米国特許第４,９３９,２３９号)、または弱いホルマリン処理(Ｍarsh(１９７１)、Ｉnt．Ａrch．of  Ａllergy  and  Ａppl．Ｉmmunol．、４１、１９９〜２１５)を含む。
【００７４】
ペプチドの精製を容易にし、溶解性をもしかすると増加させるために、タンパク質骨核にアミノ酸融合部分を付加することは可能である。例えばヘキサ−ヒスチジンを、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによる精製のためペプチドに付加することができる(Ｈochuli,Ｅ等(１９８８)、Ｂio／Ｔechnology、６、１３２１〜１３２５)。更に無関係の配列を含まないＢリンパ球抗原の単離を容易にするために、特異的なエンドプロテアーゼ解裂部位を融合部分およびペプチドの配列の間に導入できる。ペプチドに機能性の基を付加することにより、またはペプチドの疎水性領域を省くことにより、ペプチドの溶解性を増加させることは必要であり得る。
VII．Ｂリンパ球抗原およびＢ７−２活性を有するペプチドをコードしている核酸配列の用途。
【００７５】
Ａ．分子プローブ。
本発明に係る核酸は、生物学的試料中のＢリンパ球の活性化状態を測定することにより疾病の進行を追跡し、またはＢリンパ球抗原の発現に及ぼす分子の効果を検定する（例えば細胞のｍＲＮＡレベルを検出する）のに、診断上有用である。これらの診断的検定に従い、この核酸配列を、検出可能なマーカー、例えば放射性、蛍光、またはビオチニル化されたマーカーを用いて標識し、常套的なドットブロットまたはノーザンハイブリダイゼーション法を用いて生物学的試料由来の総またはポリ（Ａ＋）ＲＮＡのｍＲＮＡ分子をプロービングする。
【００７６】
Ｂ．抗体の産生。
本発明に係る核酸分子から生成されるペプチドおよび融合蛋白はさらに、Ｂリンパ球抗原と特異的に反応する抗体の産生に使用することもできる。例えば、全長のＢ７−２蛋白、または、Ｂ７−２の予想アミノ酸配列に基づくアミノ酸配列を有するそのペプチドフラグメントを使用することにより、抗蛋白／抗ペプチドポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を、標準法を用いて作製することができる。哺乳動物（例えばマウス、ハムスター、またはウサギ）を、その哺乳動物において抗体反応を顕現させる免疫原性型の蛋白またはペプチドで免疫することができる。この免疫原は、例えば組み替えＢ７−２蛋白、またはそのフラグメント、合成ペプチドフラグメントまたはその表面にＢリンパ球抗原を発現する細胞であってよい。この細胞は、例えば脾臓Ｂ細胞、またはＢリンパ球抗原がその細胞表面に発現されるような本発明に係るＢリンパ球抗原をコードしている核酸（例えばＢ７−２ ｃＤＮＡ）によりトランスフェクトされた細胞であってよい。免疫原はその免疫原性を増すために修飾することができる。例えば、ペプチドに免疫原性を付与するための技術には、担体へのコンジュゲーションまたはその他の当分野でよく知られる技術が包含される。例えば、ペプチドをアジュバントの存在下で投与することができる。免疫感作の進行は血漿または血清中の抗体力価の検出により監視することができる。標準的ＥＬＩＳＡまたはその他のイムノアッセイを、抗体のレベルを評価するための抗原としての免疫原と共に使用することができる。
【００７７】
免疫感作の後、抗血清を取得し、所望ならばこの血清からポリクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体を生成させるため、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫された動物から採取し、標準的体細胞融合法により骨髄腫細胞と融合させてこれらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を生成させることができる。このような技術は当分野においてよく知られている。例えば、ケーラーおよびミルシュタイン（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）、２５６巻４９５−４９７頁）により最初に開発されたハイブリドーマ技術、ならびにヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コズバー等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ（１９８３）、４巻７２頁）、ヒトモノクローナル抗体を生成させるためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（コール等、モノクローナル・アンティボディーズ・イン・キャンサー・セラピー（１９８５）（アレン・Ｒ．ブリス、Ｉｎｃ．、７７−９６頁）、および組み合わせ抗体ライブラリーのスクリーニング（ヒューズ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）、２４６巻１２７５頁）である。ハイブリドーマ細胞をこのペプチドと特異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングし、モノクローナル抗体を分離することができる。
【００７８】
本明細書中使用される抗体という語は、本明細書に記載される新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドまたは融合蛋白と特異的に反応するそれらのフラグメントを包含する事を意図している。抗体は常套技術を用いてフラグメント化され、そのフラグメントを、抗体全体について上に記載したものと同じ方法で、用途についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ(ａｂ')２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより生成させることができる。得られたＦ(ａｂ')２フラグメントを処理してジスルフィド橋を還元し、Ｆａｂ'フラグメントを生成させることができる。本発明に係る抗体はさらに、抗Ｂリンパ球抗原（即ちＢ７−２、Ｂ７−３）部分を有する二重特異性およびキメラ分子を包含することを意図している。
【００７９】
特に好ましい抗体は、ハイブリドーマＨＡ３.１Ｆ９、ＨＡ５.２Ｂ７およびＨＦ２.３Ｄ１により産生される抗ヒトＢ７−２モノクローナル抗体である。これらの抗体の製造および特性決定は実施例８に詳細に記載されている。モノクローナル抗体ＨＡ３.１Ｆ９はＩｇＧイソタイプのものであると確定され；モノクローナル抗体ＨＡ５.２Ｂ７はＩｇＧ２ｂイソタイプのものであると確定され；モノクローナル抗体ＨＦ２.３Ｄ１はＩｇＧ２ａイソタイプのものであると確定された。ハイブリドーマ細胞は、ＡＴＣＣ受理番号          （ハイブリドーマＨＡ３.１Ｆ９）、ＡＴＣＣ受理番号            （ＨＡ５.２Ｂ７）およびＡＴＣＣ受理番号            （ＨＦ２.３Ｄ１）として、ブダペスト条約の要件にかなうアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９４年７月１９日に寄託された。
【００８０】
ヒト以外の対象において産生された抗体が治療的に人間に使用される場合、それらは程度の差こそあれ外来性であると認識され、患者に免疫反応が起こり得る。この問題を最小にまたは排除する、全身的免疫抑制より好ましい一つのアプローチは、キメラ抗体誘導体、即ちヒト以外の動物の可変領域とヒト不変領域とを結合させた抗体分子を産生させることである。キメラ抗体分子には、例えば、ヒト不変領域を伴う、マウス、ラット、またはその他の種の抗体由来の抗原結合ドメインが包含され得る。キメラ抗体を作製するための様々なアプローチが記載されており、そして本発明に係る新規なＢリンパ球抗原の遺伝子産物を認識する免疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体の作製に使用することができる。例えば、モリソン等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１巻６８５１頁（１９８５）；タケダ等、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻４５２頁（１９８５）、キャビリー等、米国特許第４８１６５６７号；ボス等、米国特許第４８１６３９７号；タナグチ等、欧州特許公開ＥＰ１７１４９６；欧州特許公開０１７３４９４、英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂを参照されたい。このようなキメラ抗体は、対応する非キメラ抗体よりもヒト対象における免疫原性が小さいと予想される。
【００８１】
人間の治療目的のために、本明細書に記載のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドと特異的に反応するモノクローナルまたはキメラ抗体を、ヒト可変領域キメラを生成させることにより、さらにヒト化することができるが、この場合、可変領域の一部、とりわけ抗原結合ドメインの保存フレームワーク領域がヒト起源であり、超可変領域のみが非ヒト起源である。「ヒト化された」キメラ抗体の総説は、Ｓ．Ｌ．モリソン（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻１２０２−１２０７頁およびオイ等（１９８６）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４巻２１４頁に提供されている。このような変化させた免疫グロブリン分子は当分野で知られる幾つかの技術のうち任意のもの（例えばテング等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０巻７３０８−７３１２頁（１９８３）；コズボー等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４巻７２７９頁（１９８３）；オルソン等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９２巻３−１６頁（１９８２））によって作成することができ、好ましくはＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３またはＥＰ０２３９４００の教示に従って作成する。ヒト化抗体は、例えばスコットジェン・リミッティド、２ホーリー・ロード、トゥイッケンハム、ミドルセクス、英国により商業生産することができる。好適な「ヒト化」抗体は、別法としてＣＤＲまたはＣＥＡ置換により生成させることができる（ウィンターに対する米国特許５２２５５３９；ジョーンズ等（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻５５２−５２５頁；ヴェルホーヤン等（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻１５３４頁；およびバイドラー等（１９８８）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１巻４０５３−４０６０頁を参照されたい）。免疫原性を低下させたヒト化抗体が、ヒト対象における免疫療法のために好ましい。ヒト化抗体を用いる免疫療法は、付随する免疫抑制の必然性を減少させると思われ、また慢性疾患の状況または抗体処置を反復する必要のある状況の処置に対する長期有効性を増大させる結果を生むことができる。
【００８２】
マウスまたは他の種由来のモノクローナル抗体をヒト化する代わりに、ヒト蛋白に対するヒトモノクローナル抗体を生成させることもできる。ヒトＢリンパ球抗原、例えばＢ７−２で免疫され得る、ヒトの抗体レパートリーを有するトランスジェニックマウスが作り出された。次に、これらの免疫されたトランスジェニックマウスの脾臓細胞を用いて、ヒトＢリンパ球抗原と特異的に反応するヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作り出すことができる（例えば、ウッド等、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／００９０６、クチャーラパティ等、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０７４１；ロンバーグ等、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８；ケイ等、ＰＣＴ公開９２／０３９１７；Ｎ．ロンバーグ等（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻８５６−８５９頁；Ｌ．Ｌ．グリーン等（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、７巻１３−２１頁；Ｓ．Ｌ．モリソン等（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻６８５１−６８５５頁；ブラッジマン等（１９９３）、Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻３３−４０頁；テュアイロン等（１９９３）、ＰＮＡＳ、９０巻３７２０−３７２４頁；およびブラッジマン等（１９９１）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１巻１３２３−１３２６頁を参照されたい）。
【００８３】
本発明に係るモノクローナル抗体組成物は、組み替えＤＮＡ技術の分野において通常の知識を有する者によく知られるその他の方法によっても生成させることができる。「組み合わせ抗体ディスプレー」法と呼ばれる別法は、特定の抗原特異性を有する抗体フラグメントを同定し単離するために開発され、これを、本発明に係るＢリンパ球抗原を結合するモノクローナル抗体の生成に利用することができる（組み合わせ抗体ディスプレーの説明については、例えばサストリー等（１９８９）、ＰＮＡＳ、８６巻５７２８頁；ヒューズ等（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻１２７５頁；およびオーランディ等（１９８９）、ＰＮＡＳ、８６巻３８３３頁を参照されたい）。動物をＢリンパ球抗原で免疫した後、得られたＢ細胞プールの抗体レパートリーをクローニングする。オリゴマープライマーの混合物およびＰＣＲを使用することによる、免疫グロブリン分子の多様な集団の可変領域のＤＮＡ配列を直接取得するための方法は一般に知られている。例えば、５'リーダー（シグナルペプチド）配列および／またはフレームワーク１（ＦＲ１）配列に対応する混合オリゴヌクレオチドプライマー、ならびに保存された３'不変領域プライマーに対するプライマーを、幾つかのマウス抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域のＰＣＲ増幅のために使用することができる（ラーリック等（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１巻１５２−１５６頁）。同様の戦法を、ヒト抗体由来のヒト重鎖および軽鎖可変領域の増幅にも使用することができる（ラーリック等（１９９１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２巻１０６−１１０頁)。
【００８４】
例示的態様においては、例えば末梢血球、骨髄、または脾臓試料の活性化Ｂ細胞から、標準的プロトコルを用いてＲＮＡが分離される（例えば、米国特許第４６８３２０２号；オーランディ等、ＰＮＡＳ（１９８９）、８６巻３８３３−３８３７頁；サストリー等、ＰＮＡＳ（１９８９）、８６巻５７２８−５７３２頁；およびヒューズ等（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻１２７５−１２８１頁）。第一のｃＤＮＡ鎖は、重鎖の不変領域ならびにκおよびλ軽鎖の各々に対し特異的なプライマー、ならびにシグナル配列に対するプライマーを用いて合成する。可変領域ＰＣＲプライマーを用いて、重鎖および軽鎖の両者の可変領域を単独でまたは組み合わせて増幅し、ディスプレーパッケージの作成におけるさらなる操作のために適切なベクター中にライゲーションする。増幅プロトコルに役立つオリゴヌクレオチドプライマーは、特異なものであるか、縮重しているか、または縮重位置にイノシンを組み入れ得る。増幅されたフラグメントをベクター中の予め定められた発現のための読み取り枠にクローニングできるようにするため、制限エンドヌクレアーゼ認識配列もまたこのプライマー中に組み入れることができる。
【００８５】
免疫感作で誘導された抗体レパートリーからクローニングされたＶ遺伝子ライブラリーは、好ましくは、抗体ディスプレーライブラリーを形成させるための繊維状ファージから誘導されるディスプレーパッケージの集団によって発現させることができる。理想的には、このディスプレーパッケージは、極めて大きな多様な抗体ディスプレーライブラリーのサンプリング、各親和分離工程後の迅速な分類、そして精製されたディスプレーパッケージからの抗体遺伝子の容易な単離が可能な系を含む。ファージディスプレーライブラリーの作成のための入手し得る市販のキット（例えば、ファルマシアの組み替えファージ抗体系、カタログ番号２７−９４００−０１；およびストラタジーンのＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレーキット、カタログ番号２４０６１２）に加えて、多様な抗体ディスプレーライブラリーの生成の際の使用に特に従う方法および試薬の例は、例えば、ラドナー等、米国特許第５２２３４０９号；カング等、国際公開第ＷＯ９２／１８６１９号；ドウアー等、国際公開第ＷＯ９１／１７２７１号；ウィンター等、国際公開ＷＯ９２／２０７９１；マークランド等、国際公開第ＷＯ９２／１５６７９号；ブライトリング等、国際公開ＷＯ９３／０１２８８；マッカファーティ等、国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号；ガラード等、国際公開第ＷＯ９２／０９６９０号；ラドナー等、国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号；ファッハ等（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻１３７０−１３７２頁；ヘイ等（１９９２）、Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、３巻８１−８５頁；ヒューズ等（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻１２７５−１２８１頁；グリフツ等（１９９３、ＥＭＢＯ  Ｊ  １２巻７２５−７３４頁；ホーキンズ等（１９９２）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２２６巻８８９−８９６頁；クラックソン等（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻６２４−６２８頁；グラム等（１９９２）、ＰＮＡＳ、８９巻３５７６−３５８０頁；ガラド等(１９９１)、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻１３７３−１３７７頁；ホーゲンブーム等（１９９１）、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９巻４１３３−４１３７頁；およびバーバス等（１９９１）、ＰＮＡＳ、８８巻７９７８−７９８２頁に見いだすことができる。
【００８６】
或る態様において、重鎖および軽鎖のＶ領域ドメインを同じポリペプチド上で発現させ、可変リンカーによって連結して一本鎖Ｆｖフラグメントを形成し、そして続いてこのｓｃＦＶ遺伝子を所望の発現ベクターまたはファージゲノム中にクローニングすることができる。マッカファーティ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）、３４８巻５５２−５５４頁に一般的に記載されるように、可変性の（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３リンカーにより連結された抗体の完全なＶＨおよびＶＬドメインを使用して、ディスプレーパッケージを抗原親和性に基づき分離可能とすることのできる一本鎖抗体を生成させることができる。続いて、Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドと免疫反応する単離されたｓｃＦＶ抗体を、本発明方法での使用のための薬用調製物に調合することができる。
ディスプレーパッケージ（例えば繊維状ファージ）の表面上に表示されたならば、この抗体ライブラリーを、Ｂリンバ球抗原蛋白またはそのペプチドフラグメントでスクリーニングしてＢリンパ球抗原に対する特異性を有する抗体を発現するパッケージを同定および単離する。選択された抗体をコードしている核酸をディスプレーパッケージから（例えばファージゲノムから）回収し、標準的組み替えＤＮＡ技術により他の発現ベクター中にサブクローニングすることができる。
【００８７】
本発明に係る抗体は、Ｔ細胞の共同刺激に必要なレセプター：リガンド相互作用を遮断することにより、Ｔ細胞活性化の阻害に治療的に使用することができる。これらのいわゆる「遮断抗体」は、本明細書に記載されるインビトロ共同刺激検定に添加される時、Ｔ細胞増殖および／またはサイトカイン産生を阻害するそれらの能力によって同定することができる。Ｔ細胞の機能を阻害する遮断抗体の能力は、これらの抗体がインビボで投与される時、免疫抑制および／または寛容をもたらし得る。
Ｃ．蛋白の精製。
【００８８】
本発明に係るポリクローナルまたはモノクローナル抗体、例えばＢ７−２活性またはＢ７−３活性を有する組み替えまたは合成ペプチドと特異的に反応する抗体は、さらに、天然のＢリンパ球抗原を細胞から単離するために使用することができる。例えば、このペプチドと反応する抗体を使用して、天然に存在するまたは天然型のＢ７−２を活性化されたＢリンパ球から免疫親和クロマトグラフィーによって単離することができる。加えて、天然型のＢ７−３は、モノクローナル抗体ＢＢ−１を用いる免疫親和クロマトグラフィーによってＢ細胞から単離することができる。
Ｄ．その他の治療用試薬
【００８９】
本明細書に記載される核酸配列および新規なＢリンパ球抗原は、Ｔ細胞仲介免疫反応の上方調節（例えば増幅）または下方調節（例えば抑制または寛容を成立させる）のいずれかを行う能力を有する治療用試薬の開発に使用することができる。例えば、可溶性、単量体型のＢ７−２抗原またはＢ７−２融合蛋白、例えばＢ７−２Ｉｇを包含するＢ７−２活性を有するペプチド、および、最初の活性化シグナルを受け取ったＴ細胞に共同刺激シグナルを送ることのできない抗Ｂ７−２抗体を使用して、Ｔ細胞上のＢ７−２リガンドを遮断し、それにより対象に免疫抑制を惹起そして／または寛容を誘発させる特異的手段を提供することができる。このような遮断または阻害型のＢリンパ球抗原および融合蛋白および遮断抗体は、本明細書前記のようなインビトロ共同刺激検定に添加された場合のＴ細胞増殖および／またはサイトカイン産生を阻害する能力によって同定することができる。単量体型とは対称的に、刺激型のＢ７−２、例えば無傷の細胞表面Ｂ７−２は、共同刺激シグナルをＴ細胞に伝達する能力を保持しており、その結果、二次シグナルを受け取っていない活性化Ｔ細胞と比較してサイトカインの分泌が増加する。
【００９０】
加えて、別のＢリンパ球抗原（例えばＢ７−１）の活性を有する第二のペプチドと融合したＢ７−２の活性を有する第一のペプチドからなる融合蛋白を使用して、Ｔ細胞仲介免疫反応を修飾することができる。別法として、Ｂリンパ球抗原、例えばＢ７−２およびＢ７−１の活性を有する二つの別個のペプチド、または、遮断抗体の組み合わせ（例えば抗Ｂ７−２および抗Ｂ７−１モノクローナル抗体）を単一の組成物として合してまたは別々に（同時にまたは連続して）投与して、対象におけるＴ細胞仲介免疫反応を上方調節または下方調節することができる。さらに、Ｂ７−２活性および／またはＢ７−１活性を有する１またはそれ以上のペプチドの治療的有効量を他の免疫調節試薬と共に使用して、免疫反応に影響を及ぼすことができる。他の免疫調節試薬の例には、遮断抗体、例えばＣＤ２８またはＣＴＬＡ４に対するもの、他のＴ細胞マーカーに対するもの、またはサイトカインに対するもの、融合蛋白、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ、または免疫抑制薬、例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６が包含される。
【００９１】
本発明に係る核酸分子から生成されるペプチドはさらに、Ｔ細胞の破壊によりＴ細胞の機能を遮断する治療薬の組み立てにおいて有用となり得る。例えば、記載されたように、分泌された形のＢリンパ球抗原は、標準的遺伝子工学技術によって組み立てることができる。可溶性型のＢ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−３をリシンのような毒素に連結することにより、Ｔ細胞活性化を防止できる物質を作成することができる。患者の体内への１つのまたは組み合わせた免疫毒素、例えばＢ７−２−リシン、Ｂ７−１−リシンの注入は、Ｔ細胞、特により大量のＣＤ２８およびＣＴＬＡ４を発現する活性化されたＴ細胞の死をもたらし得る。一価の形のＢ７−２の可溶性型単独でも、上記のようにＢ７−２機能の遮断に有用であり、この場合は担体分子をも使用してよい。
【００９２】
Ｂリンパ球抗原の機能を妨げるもう一つの方法は、アンチセンスまたはトリプレックスオリゴヌクレオチドの使用によるものである。例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−３翻訳開始部位付近の領域に対し相補的なオリゴヌクレオチド（例えば、Ｂ７−１についてはＴＧＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧＡ（配列番号２０）ヌクレオチド３２６−３０９、そしてＢ７−２についてはＧＣＣＡＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＣＣＡ（配列番号２１）を合成することができる。１またはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、典型的には２００μｇ／ｍｌで、細胞培地に添加し、または患者に投与して、Ｂ７−１、Ｂ７−２および／またはＢ７−３の合成を妨げることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞により取り込まれ、適当なＢリンパ球抗原ｍＲＮＡとハイブリダイズして翻訳を妨げる。別法として、二本鎖ＤＮＡに結合しトリプレックス組み立て物を形成してＤＮＡの巻き戻しと転写を妨げるオリゴヌクレオチドを使用することもできる。いずれの結果においても、１またはそれ以上のＢリンパ球抗原の合成が遮断される。
Ｅ．免疫反応の下方調節による治療用途。
【００９３】
本明細書に開示される新規なＢリンパ球抗原の構造および機能が提供されるならば、幾つかの方法でＢリンパ球抗原の機能を下方調節し、それにより免疫反応を下方調節することが可能である。下方調節は、既に進行中の免疫反応を阻害または遮断する形であってよく、または免疫反応の誘導の防止を含んでいてもよい。活性化Ｔ細胞の機能は、Ｔ細胞反応を抑制することにより、またはＴ細胞において特異的寛容を誘導することにより、またはその両者によって阻害することができる。Ｔ細胞反応の免疫抑制は、一般に、Ｔ細胞が抑制薬物に絶えずさらされていることを必要とする、活発な非抗原特異的過程である。寛容は、Ｔ細胞に不応性またはアネルギーを誘発することを含むが、これは、一般に抗原特異的であり、且つ寛容化物質への暴露が終わった後も持続することで免疫抑制とは区別できる。操作上は、寛容は、寛容化物質の不在下で特異抗原に再暴露させた時のＴ細胞反応の欠如によって立証することができる。
【００９４】
１またはそれ以上のＢリンパ球抗原機能を下方調節または妨げること、例えば活性化Ｔ細胞による高レベルリンホカイン合成の防止は、組織、皮膚および臓器移植の状況ならびに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の際に有用であろう。例えば、Ｔ細胞機能の遮断は組織移植の際の組織破壊の低下をもたらすに相違ない。典型的には、組織移植においては、移植片の拒絶はそれが外来性であるとのＴ細胞による認識で始まり、続いてその移植片を破壊する免疫反応へと続く。Ｂ７リンパ球抗原が免疫細胞上でその天然リガンドと相互作用することを阻害または遮断する分子（例えば、Ｂ７−２活性を有する可溶性単量体型のペプチドを単独で、または別のＢリンパ球抗原（例えばＢ７−１、Ｂ７−３）の活性を有する単量体型のペプチドまたは遮断抗体と組み合わせて）を移植前に投与することで、対応する共同刺激シグナルの伝達なしに免疫細胞上の天然リガンドに当該分子を結合させることができる。この方法でのＢリンバ球抗原機能の遮断は、免疫細胞、例えばＴ細胞によるサイトカイン合成を防止し、したがって免疫抑制手段として作用する。その上、共同刺激の欠如はＴ細胞のアネルギー化に十分であり、それにより対象に寛容を誘導することができる。Ｂリンパ球抗原遮断試薬による長期寛容の誘導は、これらの遮断試薬の反復投与の必要性を回避し得る。対象に十分な免疫抑制または寛容を達成するためには、組み合わせたＢリンパ球抗原の機能を遮断することも必要であるかも知れない。例えば、それらの抗原の各々の活性を有するペプチドの可溶性型の組み合わせまたは遮断抗体を移植前に投与（別々にまたは単一組成物で一諸に）することによって、Ｂ７−２およびＢ７−１、Ｂ７−２およびＢ７−３、Ｂ７−１およびＢ７−３またはＢ７−２、Ｂ７−１およびＢ７−３の機能を遮断することが望ましいかも知れない。別法として、阻害型のＢリンパ球抗原を、他の抑制剤、例えば他のＴ細胞マーカーに対するもしくはサイトカインに対する遮断抗体、他の融合蛋白、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ、または免疫抑制薬と共に使用することもできる。
【００９５】
特定の遮断試薬が臓器移植拒絶またはＧＶＨＤを防止する有効性は、人間における有効性が予想される動物モデルを用いて評価することができる。Ｂ７−１の機能上重要な側面は種間で構造的に保存されており、故に、他のＢリンパ球抗原も種にまたがって機能できると思われ、よってヒトの蛋白で構成される試薬を動物系で使用することができる。使用できる適当な系の例には、ラットにおける同種間の心臓移植およびマウスにおける異種間の膵島細胞移植が包含され、そのいずれもが、レンショウ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７巻７８９−７９２頁（１９９２）およびトゥルカ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻１１１０２−１１１０５頁（１９９２）に記載のようにＣＴＬＡ４Ｉｇ融合蛋白の免疫抑制効果をインビボで調査するために使用された。さらに、ＧＶＨＤのマウスモデル（パウル編、ファンダメンタル・イムノロジー、レイヴン・プレス、ニューヨーク、１９８９、８４６−８４７頁を参照されたい）を用いて、この疾患の進行に及ぼすインビボのＢリンパ球抗原機能遮断の効果を測定することができる。
例えばＢ７−２活性を有するペプチドを、単独、またはＢ７−１活性を有するペプチドおよび／またはＢ７−３活性を有するペプチドと組み合わせて使用することにより、Ｂリンパ球抗原機能を遮断することは、自己免疫疾患の処置にも治療上有用であり得る。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対し反応性であるＴ細胞の不適当な活性化の結果であり、これがこの疾患の病理に含まれるサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する。自己反応性Ｔ細胞の活性化の防止は疾病の症候を軽減または排除し得る。Ｂリンパ球抗原のレセプター：リガンド相互作用を破壊することによりＴ細胞の共同刺激を遮断する試薬の投与を用いてＴ細胞の活性化を阻害し、疾病の過程に含まれ得る自己抗体またはＴ細胞により誘導されるサイトカインの産生を防止することができる。さらに、遮断試薬は自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的寛容を誘導し、これは当該疾患からの長期間の治癒につながる。自己免疫疾患を防止または軽減する遮断試薬の有効性は、幾つかの十分に性格決定されたヒト自己免疫疾患の動物モデルを用いて測定することができる。例には、マウス実験的自己免疫性脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスの全身性エリテマトーデス、マウス自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットの真性糖尿病、ならびにマウスの実験的重症筋無力症が包含される（パウル編、ファンダメンタル・イムノロジー、レイヴン・プレス、ニューヨーク、１９８９、８４０−８５６頁を参照されたい）。
【００９６】
アトピー性アレルギーにおけるＩｇＥ抗体の反応は高度にＴ細胞依存性であり、したがって、Ｂリンパ球抗原の誘発するＴ細胞活性化の阻害は、アレルギーおよびアレルギー性反応の処置に治療上有用であり得る。阻害型のＢ７−２蛋白、例えばＢ７−２活性を有するペプチドを単独でまたは別のＢリンパ球抗原、例えばＢ７−１の活性を有するペプチドと組み合わせてアレルギー患者に投与して、その患者のＴ細胞仲介アレルギー反応を阻害することができる。Ｔ細胞のＢリンパ球抗原共同刺激の阻害は、適当なＭＨＣ分子と結合したアレルゲンへの暴露を随伴し得る。アレルギー反応の性質は、アレルゲンの侵入経路および肥満細胞または好塩基性細胞上のＩｇＥ沈着のパターンに応じて、全身性または局所性であり得る。そこで、阻害型のＢ７−２蛋白の適切な投与により、Ｔ細胞仲介アレルギー反応を局所的または全身的に阻害する必要があり得る。
【００９７】
Ｂリンパ球抗原機能の遮断によるＴ細胞活性化の阻害は、Ｔ細胞のウイルス感染の際にも、治療上重要であり得る。例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）において、ウイルスの複製はＴ細胞の活性化によって刺激される。Ｂ７−２機能の遮断は、より低いレベルのウイルス複製へと導き、それによりＡＩＤＳの経過を改善する。さらに、組み合わされたＢリンパ球抗原、即ちＢ７−１、Ｂ７−２およびＢ７−３の機能の遮断もまた必要であるかもしれない。驚くべき事に、ＨＴＬＶ−Ｉに感染したＴ細胞はＢ７−１およびＢ７−２を発現する。この発現はＨＴＬＶ−Ｉに感染したＴ細胞の成長において重要であり、また、Ｂ７−２および／またはＢ７−３の機能と共にＢ７−１機能の遮断はＨＴＬＶ−Ｉ誘発白血病の進行を遅くするかも知れない。別法として、単離および使用に十分な量のレトロウイルスを生成させる目的のために、刺激型のＢ７−２蛋白との接触によってＴ細胞活性化によるウイルス複製の刺激を誘発してもよい。
Ｆ．免疫反応の上方調節による治療上の用途。
【００９８】
免疫反応を上方調節する手段としてのＢリンパ球抗原機能の上方調節もまた治療に有用となり得る。免疫反応の上方調節は、存在している免疫反応の促進または最初の免疫反応の顕現という形であり得る。例えば、Ｂリンパ球抗原機能を刺激することによる免疫反応の増強は、ウイルス感染の場合に有用であり得る。ウイルス感染は主として細胞溶解性Ｔ細胞により排除される。本発明に従えば、Ｔ細胞上の天然リガンドを伴うＢ７−２、そして故にＢ７−１およびＢ７−３は、少なくとも幾らかのＴ細胞の細胞溶解活性の増加をもたらし得る。さらに、Ｂ７−２、Ｂ７−１およびＢ７−３がＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞の初期活性化および生成に関与していることも信ぜられる。単独で、または別のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドと組み合わせて、多価型で、Ｂ７−２活性を有する可溶性ペプチドを添加して共同刺激経路を介してＴ細胞活性を刺激することは、このように、ウイルスのより迅速なまたは完全な排除が有利である状況において治療上有用となるであろう。これらは、ヘルペスまたは帯状疱疹のようなウイルス性皮膚疾患を包含し、これらの場合、Ｂ７−２活性を有する多価可溶性ペプチド、または係るペプチドおよび／またはＢ７−１活性を有するペプチドおよび／またはＢ７−３活性を有するペプチドの組み合わせを局所的に皮膚に適用する。加えて、インフルエンザ、風邪、および脳炎のような全身性ウイルス疾患が、刺激型のＢリンパ球抗原の全身投与によって軽快し得る。
【００９９】
別法として、患者からＴ細胞を除去し、Ｂ７−２活性を有するペプチドを発現（単独でまたはＢ７−１活性を有するペプチドおよび／またはＢ７−３活性を有するペプチドと組み合わせて）する、ウイルス抗原でパルスしたＡＰＣにより、またはＢ７−２活性を有する可溶性ペプチドの刺激型（単独でまたはＢ７−１活性を有するペプチドおよび／またはＢ７−３活性を有するペプチドと組み合わせて）と共に、ウイルス抗原でパルスしたＡＰＣにより、インビトロでＴ細胞を共同刺激し、そしてこのインビトロで活性化したＴ細胞を再び患者に導入することによって、感染した患者における抗ウイルス免疫反応を増進させることもできる。抗ウイルス免疫反応を増進させる別の方法は、感染した細胞を患者から分離し、それらを、本明細書に記載のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードしている核酸を用いてトランスフェクトしてその細胞がその表面にＢリンパ球抗原、例えばＢ７−２またはＢ７−３の全てまたは一部を発現するようにさせ、そしてこのトランスフェクトされた細胞を再び患者の体内に導入することである。そうすれば、感染した細胞は、インビボでＴ細胞に共同刺激シグナルを伝達でき、そして故にＴ細胞を活性化することができるであろう。
【０１００】
刺激型のＢリンパ球抗原は、予防的に、種々の病原体に対するワクチンに使用することもできる。病原体、例えばウイルスに対する免疫は、適当なアジュバントに入れた、Ｂ７−２活性を有するペプチドまたはＢリンパ球抗原の活性を有する別のペプチドの刺激型を伴うウイルス蛋白によってワクチン接種することにより誘導し得る。別法として、病原性抗原およびＢリンパ球抗原の活性を有するペプチド両者のための遺伝子をコードしている発現ベクター、例えば、ウイルス蛋白をコードしている核酸と、本明細書に記載のようなＢ７−２活性を有するペプチドをコードしている核酸とを発現するよう組み立てられたワクシニアウイルス発現ベクターを、ワクチン接種に使用することもできる。例えばＢ７−２活性を有するペプチドおよびＭＨＣクラスＩα鎖蛋白およびβ２ミクログロブリンを同時発現するようトランスフェクトさせた細胞による、クラスＩ ＭＨＣ蛋白を伴うＢ７−２の提示もまた、細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をもたらし、ウイルス感染からの免疫感作を提供する。ワクチンが有用となり得る病原体には、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、結核、マラリアおよび住血吸虫症が包含される。
【０１０１】
別の態様において、Ｂリンパ球抗原の活性を有する１またはそれ以上の可溶性ペプチドの刺激型を、腫瘍を持つ患者に投与して、抗腫瘍性免疫を誘導するためのＴ細胞に対する共同刺激シグナルを提供することができる。
Ｇ．共同刺激分子を発現させるための腫瘍細胞の修飾。
【０１０２】
腫瘍細胞がＴ細胞における共同刺激シグナルを誘発できないのは、共同刺激分子の発現の欠如、たとえ腫瘍細胞が係る分子を発現できる能力があったとしても共同刺激分子の発現に失敗したこと、腫瘍細胞表面の共同刺激分子の発現が不十分であること、または適切な共同刺激分子の発現が無いこと（例えばＢ７−２および／またはＢ７−３ではなくＢ７の発現）に起因し得る。したがって、本発明の一つの態様によれば、腫瘍細胞を、腫瘍細胞表面でのＢ７−２および／またはＢ７−３の発現に好適な形のＢ７−２および／またはＢ７−３をコードしている核酸でトランスフェクトすることにより、この腫瘍細胞をＢ７−２および／またはＢ７−３を発現するよう修飾する。別法として、腫瘍細胞を、腫瘍細胞表面でのＢ７−２および／またはＢ７−３の発現を誘導または増強する物質と接触させることにより、修飾する。さらに別の態様においては、Ｂ７−２および／またはＢ７−３を腫瘍細胞の表面に結合させて修飾された腫瘍細胞を生成させる。これらのおよびその他の態様を、以下の亜項においてさらに詳細に説明する。
（１）共同刺激分子をコードしている核酸による腫瘍細胞のトランスフェクション。
【０１０３】
分離された腫瘍細胞を、その腫瘍細胞の表面に当該分子を発現するのに好適な形でＢ７−２および／またはＢ７−３およびＢ７−１をコードしている核酸でトランスフェクトすることにより、Ｂ７−２またはＢ７−３を単独でまたはＢ７−１と組み合わせて発現するよう、この腫瘍細胞をエクスビボで修飾することができる。「トランスフェクション」または「でトランスフェクト」という語は、外因性核酸を哺乳動物細胞中に導入することを意味し、電気穿孔、燐酸カルシウム沈殿化、ＤＥＡＥデキストラン処理、リポフェクション、マイクロインジェクションおよびウイルスベクターによる感染を包含する、哺乳動物細胞中に核酸を導入するのに有用な様々な技術を包含している。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための好適な方法は、サムブルック等（モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９））およびその他の研究室用教科書に見いだすことができる。導入すべき核酸は、例えば、Ｂ７−２および／またはＢ７−３をコードしている遺伝子を包含するＤＮＡ、Ｂ７−２および／またはＢ７−３をコードしているセンス鎖ＲＮＡ、またはＢ７−２および／またはＢ７−３をコードしているｃＤＮＡを含む組み替え発現ベクターであってよい。ヒトＢ７−２をコードしているｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表に示す。
【０１０４】
腫瘍細胞中にＢ７−２および／またはＢ７−３をコードしている核酸を導入するための好ましいアプローチは、Ｂ７−２および／またはＢ７−３をコードしている核酸、例えばｃＤＮＡを含むウイルスベクターの使用によるものである。使用できるウイルスベクターの例は、レトロウイルスベクター（Ｍ．Ａ．エグリティス等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻１３９５−１３９８頁（１９８５）；Ｏ．ダノスおよびＲ．ミュリガン、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻６４６０−６４６４頁（１９８８）；Ｄ．マルコヴィッツ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２巻１１２０−１１２４頁（１９８８））、アデノウイルスベクター（Ｍ．Ａ．ローゼンフェルト等、Ｃｅｌｌ、６８巻１４３−１５５頁（１９９２））およびアデノ伴生ウイルスベクター（Ｊ．Ｄ．トラッチン等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻３２５１−３２６０頁（１９８５））を包含する。ウイルスベクターによる腫瘍細胞の感染は、細胞の大部分が核酸を受け入れ、それにより、核酸を受け入れた細胞の選択の必要性が回避され、また、例えばウイルスベクター中に含まれるｃＤＮＡによりウイルスベクター内にコードされている分子は、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞中で効率よく発現されるという利点を有する。
【０１０５】
別法として、Ｂ７−２および／またはＢ７−３は、Ｂ７−２および／またはＢ７−３をコードしている核酸、例えばｃＤＮＡを含むプラスミド発現ベクターを用いて腫瘍細胞上
に発現され得る。好適なプラスミド発現ベクターは、ＣＤＭ８（Ｂ．シード、Ｎａｔｕｒｅ、３２９巻８４０頁（１９８７））およびｐＭＴ２ＰＣ（カウフマン等、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６巻１８７−１９５頁（１９８７））を包含する。宿主細胞、例えば腫瘍細胞中で核酸を発現するための好適なベクターおよび方法は、本明細書にさらに詳細に記載される。
腫瘍細胞のトランスフェクションが、その腫瘍細胞の大部分の修飾および腫瘍細胞の表面でのＢ７−２および／またはＢ７−３の効率的な発現につながる場合、例えばウイルス発現ベクターを使用する場合、腫瘍細胞は、さらなる分離またはサブクローニングなしで使用することができる。別法として、トランスフェクトされた腫瘍細胞の均質な集団は、１個のトランスフェクトされた腫瘍細胞を限界希釈クローニングし、その後この１個の腫瘍細胞を標準技術により細胞のクローン集団へと拡大することによって調製することができる。
（２）腫瘍細胞表面での共同刺激分子の誘導または発現増強。
【０１０６】
Ｂ７−２および／またはＢ７−３を発現する能力はあるがそれができない、またはＴ細胞を活性化するには不十分な量でＢ７−２および／またはＢ７−３を発現する腫瘍細胞上でＢ７−２および／またはＢ７−３の発現を誘導または発現レベルを増強することにより、Ｔ細胞において共同刺激シグナルを誘発するよう、腫瘍細胞を修飾することができる。腫瘍細胞上でＢ７−２および／またはＢ７−３の発現を誘導または増強するため、Ｂ７−２および／またはＢ７−３の発現を刺激する物質を使用することができる。例えば、腫瘍細胞を、培養基中インビトロでこの物質と接触させることができる。Ｂ７−２および／またはＢ７−３の発現を刺激する物質は、例えばＢ７−２および／またはＢ７−３遺伝子の転写を増強することにより、Ｂ７−２および／またはＢ７−３ｍＲＮＡの翻訳を増強することにより、または、細胞表面に対するＢ７−２および／またはＢ７−３の安定性もしくは輸送を増強することにより、作用し得る。例えば、Ｂ７の発現は、ｃＡＭＰを含む第二のメッセンジャー経路により細胞内で上方調節され得ることが知られている。Ｎ．ナバヴィ等、Ｎａｔｕｒｅ、３６０巻２６６−２６８頁（１９９２）。Ｂ７−２およびＢ７−３も同様にｃＡＭＰによって誘導可能である。即ち、腫瘍細胞を、細胞内ｃＡＭＰレベルを増大させる、またはｃＡＭＰ類似体のようなｃＡＭＰに近似した物質、例えばジブチリルｃＡＭＰと接触させて、この腫瘍細胞表面のＢ７−２および／またはＢ７−３の発現を刺激することができる。Ｂ細胞上の細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子をＭＨＣクラスＩＩ分子に対する抗体で架橋することにより、正常な静止Ｂ細胞上にＢ７の発現が誘導されることもまた知られている。Ｌ．クオロヴァ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３巻７５９−７６２（１９９１）。同様に、Ｂ細胞上の細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子を架橋することによってＢ７−２およびＢ７−３が静止Ｂ細胞上に誘導され得る。したがって、その表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する腫瘍細胞を抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体で処理して、その腫瘍細胞表面のＢ７−２および／またはＢ７−３発現を誘導または増強することができる。加えて、Ｂ細胞上のＢ７−２の発現を誘導することが判明しているインターロイキン４（ＩＬ−４）を用いて、腫瘍細胞上のＢ７−２の発現を上方調節することができる（Ｒ．Ｍ．スタック等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１（１８）巻４３４頁(１９９４)。
【０１０７】
腫瘍細胞表面のＢ７−２および／またはＢ７−３の発現を誘導または増強するのに使用できるもう一つの物質は、共同刺激分子をコードしている遺伝子の転写を上方調節する転写因子をコードしている核酸である。共同刺激分子の遺伝子の転写を増強させるためにこの核酸を腫瘍細胞中にトランスフェクトし、その結果共同刺激分子の細胞表面レベルの増大をもたらすことができる。
（３）腫瘍細胞の表面への共同刺激分子の結合。
【０１０８】
別の態様においては、Ｂ７−２および／またはＢ７−３を腫瘍細胞の表面に結合させることにより、この腫瘍細胞を、Ｔ細胞における共同刺激シグナルが誘発可能となるよう修飾する。例えば、Ｂ７−２および／またはＢ７−３分子は、共同刺激分子の生成および単離を可能にする標準的組み替えＤＮＡ技術および発現系を用いて取得することができる。別法として、標準的蛋白精製技術を用いてＢ７−２および／またはＢ７−３を、共同刺激分子を発現する細胞から単離することもできる。例えば、Ｂ７−３蛋白は、ＢＢ１モノクローナル抗体のような抗Ｂ７−３抗体を用いる免疫沈降によって、活性化Ｂ細胞から単離することができる。次いで、単離された共同刺激分子を腫瘍細胞に結合させる。「結合した」または「結合している」という語は、それによってＢ７−２および／またはＢ７−３が腫瘍細胞に連結し、その結果共同刺激分子が腫瘍細胞表面に存在してＴ細胞における共同刺激シグナルを誘発できるような化学的、酵素的またはその他の手段（例えば抗体）を意味する。例えば、Ｂ７−２および／またはＢ７−３は、市販品が入手可能な架橋試薬（ピアス、ロックフォード、ＩＬ）を用いて腫瘍細胞表面に化学的に架橋することができる。Ｂ７−２および／またはＢ７−３を腫瘍細胞に結合させる別のアプローチは、共同刺激分子と腫瘍細胞上の細胞表面分子の両者に結合する二重特異性抗体を使用することである。腫瘍細胞の表面に結合させた時にＴ細胞において共同刺激シグナルを誘発する能力を保持している、Ｂ７−２および／またはＢ７−３のフラグメント、突然変異体または変異体もまた使用することができる。
（４）複数の共同刺激分子を発現させるような腫瘍細胞の修飾
【０１０９】
本発明のもう一つの態様は、複数の共同刺激分子を発現するように修飾された腫瘍細胞である。活性化されたＢ細胞上の共同刺激分子の一時的発現は、Ｂ７、Ｂ７−２およびＢ７−３に対して異なっている。例えば、Ｂ７−２はＢ細胞活性化後、早期に発現され、一方Ｂ７−３は後に発現される。即ち、異なった共同刺激分子は、免疫反応の過程中、別個の機能を果たすことができる。有効なＴ細胞の反応には、Ｔ細胞が複数の共同刺激分子から共同刺激シグナルを受け取ることが必要であるかも知れない。したがって、本発明は、１以上の共同刺激分子を発現するよう修飾された腫瘍細胞を包含する。例えば、腫瘍細胞は、Ｂ７−２およびＢ７−３の両者を発現するよう修飾することができる。別法として、Ｂ７−２を発現するよう修飾された腫瘍細胞を、Ｂ７−１を発現するようさらに修飾することもできる。同様に、Ｂ７−３を発現するよう修飾された腫瘍細胞を、Ｂ７−１を発現するようさらに修飾することもできる。Ｂ７−１、Ｂ７−２およびＢ７−３を発現するよう、腫瘍細胞を修飾することもできる。本明細書に記載される任意の技術によって、複数の共同刺激分子（例えばＢ７−１およびＢ７−２）を発現するよう、腫瘍細胞を修飾することができる。
【０１１０】
修飾の前には、腫瘍細胞は、いずれの共同刺激分子も発現しないかも知れないし、または或る共同刺激分子は発現するが別のものは発現しないかも知れない。本明細書に記載のように、腫瘍細胞は、共同刺激分子をコードしている核酸でその腫瘍細胞をトランスフェクトすることにより、共同刺激分子の発現を誘導することにより、または、その腫瘍細胞に共同刺激分子を結合させることにより、修飾することができる。例えば、Ｂ７−２をコードしている核酸でトランスフェクトされた腫瘍細胞は、Ｂ７−１をコードしている核酸でさらにトランスフェクトすることができる。ヒトＢ７−１のｃＤＮＡおよび導き出されたアミノ酸配列を配列表に示す。別法として、１以上の型の修飾を施すこともできる。例えば、Ｂ７−２をコードしている核酸でトランスフェクトされた腫瘍細胞を、Ｂ７−１の発現を誘導する物質で刺激することができる。
（５）ＭＨＣ分子を発現させるためのさらなる腫瘍細胞の修飾。
【０１１１】
本発明のまた別の態様は、共同刺激分子を発現し、且つ１またはそれ以上のＭＨＣ分子をそれらの表面に発現して、Ｔ細胞に、共同刺激シグナルおよび第一の抗原特異的シグナルの両者を誘発するように修飾した腫瘍細胞を特徴とする。修飾の前には、腫瘍細胞は、ＭＨＣ分子を発現できないかも知れず、ＭＨＣ分子を発現する能力はあっても係る分子の発現ができないかも知れず、または、Ｔ細胞活性化を惹起するに十分な量のＭＨＣ分子を腫瘍細胞上に発現しないかも知れない。腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれか、または両者を発現するよう修飾することができる。ＭＨＣ分子を発現するよう腫瘍細胞を修飾する一つのアプローチは、１またはそれ以上のＭＨＣ分子をコードしている１またはそれ以上の核酸で腫瘍細胞をトランスフェクトすることである。別法として、腫瘍細胞上での１またはそれ以上のＭＨＣ分子の発現を誘導または増強する物質を用いて腫瘍細胞を修飾することもできる。腫瘍ペプチドをＣＤ４＋Ｔ細胞に直接提示するＭＨＣクラスＩＩ＋腫瘍細胞の能力は、プロフェッショナルなＭＨＣクラスＩＩ＋ＡＰＣの必要性を回避できることから、腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の誘導または増強は、腫瘍に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化にとって特に有益となり得る。可溶性の腫瘍抗原（腫瘍細胞の破片または分泌された蛋白の形）はプロフェッショナルなＭＨＣクラスＩＩ＋ＡＰＣによる取り込みに利用され得ないため、このことは腫瘍の免疫原性を改善し得る。
【０１１２】
本発明の一つの態様は、Ｂ７−２および／またはＢ７−３ならびに１またはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を細胞表面に発現する、修飾された腫瘍細胞である。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、構造的には抗原性ペプチドがその中に結合する裂け目を含み、そして、結合したペプチドを抗原特異性ＴｃＲに提示する機能を有する、細胞表面α／βへテロ二量体である。複数の異なったＭＨＣクラスＩＩ蛋白が、プロフェッショナルＡＰＣ上に発現され、異なったＭＨＣクラスＩＩ蛋白は異なった抗原性ペプチドに結合する。故に、複数のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、ＡＰＣによりまたは修飾された腫瘍細胞により提示され得る抗原性ペプチドのスペクトルを増大する。ＭＨＣクラスＩＩ分子のαおよびβ鎖は異なった遺伝子によりコードされている。例えば、ヒトＭＨＣクラスＩＩ蛋白ＨＬＡ−ＤＲは、ＨＬＡ−ＤＲαおよびＨＬＡ−ＤＲβ遺伝子によりコードされている。さらに、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の多くの多形性対立遺伝子が、ヒトおよびその他の種に存在する。特定の個体のＴ細胞は、自己のＭＨＣ分子と結合した抗原性ペプチドによる刺激に応答し、これはＭＨＣ制限と呼ばれる現象である。加えて、或るＴ細胞は、他の個体の細胞上に見いだされるＭＨＣ分子の多形性対立遺伝子による刺激にも応答することができ、これは同種性と呼ばれる現象である。ＭＨＣクラスＩＩの構造および機能の総説については、ジャーメインおよびマーギュリーズ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１巻４０３−４５０頁１９９３、を参照されたい。
【０１１３】
本発明の別の態様は、Ｂ７−２および／またはＢ７−３ならびに１またはそれ以上のＭＨＣクラスＩ分子を細胞表面に発現する、修飾された腫瘍細胞である。ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子と同様に、複数のＭＨＣクラスＩ遺伝子があり、これら遺伝子の多くの多形性対立遺伝子が、ヒトおよびその他の種で発見されている。ＭＨＣクラスＩＩ蛋白と同様に、クラスＩ蛋白は、Ｔ細胞に対する提示のために抗原のペプチドフラグメントに結合する。機能的細胞表面クラスＩ分子は、β２ミクログロブリン蛋白と結合したＭＨＣクラスＩα鎖蛋白により構成される。
（６）ＭＨＣ分子をコードしている核酸による腫瘍細胞のトランスフェクション。
【０１１４】
１またはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩα鎖および１またはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩβ鎖を、腫瘍細胞の表面でのＭＨＣクラスＩＩ分子の発現に好適な形でコードしている１またはそれ以上の核酸によって、単離された腫瘍細胞をトランスフェクトすることにより、１またはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するよう、腫瘍細胞をエクスビボで修飾することができる。表面のヘテロ二量体を形成させるためにαおよびβ鎖蛋白の両方が腫瘍細胞に存在せねばならず、いずれの鎖も単独では細胞表面に発現されないであろう。多くのマウスおよびヒトクラスＩＩ遺伝子の核酸配列が知られている。例えば、Ｌ．フード等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻５２９−５６８頁（１９８３）およびＣ．オーフレイおよびＪ．Ｌ．ストロミンガー、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５巻１９７−２４７頁（１９８７）を参照されたい。好ましくは、導入されるＭＨＣクラスＩＩ分子は自己ＭＨＣクラスＩＩ分子である。別法として、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、外来の同種ＭＨＣクラスＩＩ分子であってもよい。腫瘍細胞中に導入されるべき特定の外来ＭＨＣクラスＩＩ分子は、腫瘍を持っている対象由来のＴ細胞に、その外来ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細胞により刺激された場合にサイトカインを増加および／または分泌させるよう誘導する能力によって（即ち、同種反応を誘導する能力によって）選択することができる。トランスフェクトすべき腫瘍細胞は、トランスフェクション前にはその表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しないかも知れないし、またはＴ細胞の応答を刺激するには不十分な量を発現するかも知れない。別法として、トランスフェクション前にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する腫瘍細胞を、さらなる異なったＭＨＣクラスＩＩ遺伝子によって、またはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の他の多形性対立遺伝子によってさらにトランスフェクトし、その腫瘍細胞がＴ細胞に対して提示できる抗原性フラグメントのスペクトルを増大させることもできる。
【０１１５】
Ｔ細胞による増殖および／またはリンホカイン産生によって立証されるような、ペプチド抗原を結合させＴ細胞反応を活性化する能力を保持しているＭＨＣクラスＩＩ分子のフラグメント、突然変異体または変異体は、本発明の範囲内にあると考えられる。好ましい変異体は、αおよびβ鎖の一方または両方の細胞質ドメインが末端切除されているＭＨＣクラスＩＩ分子である。細胞質ドメインの末端切除は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるペプチドの結合およびＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面での発現を可能にするが、細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子の架橋の際ＭＨＣクラスＩＩ蛋白鎖の細胞質ドメインによって生成される細胞内シグナルによって誘発される内因性Ｂ７発現の誘導を妨げることが知られている。Ｌ．クオロヴァ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３巻７５９−７６２頁（１９９１）；Ｎ．ナバヴィ等、Ｎａｔｕｒｅ、３６０巻２６６−２６８頁（１９９２）。Ｂ７−２およびＢ７−３の発現もまた架橋している表面ＭＨＣクラスＩＩ分子によって誘導され、したがってＭＨＣクラスＩＩ分子の末端切除はＢ７−２および／またはＢ７−３の誘導をも妨げ得る。Ｂ７−２および／またはＢ７−３の構成的発現を行うようトランスフェクトさせた腫瘍細胞においては、内因性共同刺激分子の発現を阻害する、例えば、起こり得る下方調節フィードバック機作を抑制することが望ましいかも知れない。細胞質ドメイン末端切除型のＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖蛋白をコードしている核酸による腫瘍細胞のトランスフェクションは、内因性Ｂ７−１の発現および恐らくは内因性Ｂ７−２およびＢ７−３の発現をも阻害するであろう。このような変異体は、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ鎖遺伝子中の膜貫通領域をコードしているヌクレオチドの後に停止コドンを導入することによって生成させることができる。α鎖またはβ鎖蛋白いずれかの細胞質ドメインを末端切除、または、より完全なＢ７（そして恐らくはＢ７−２および／またはＢ７−３）誘導の阻害のために、αおよびβ鎖の両者を末端切除することができる。例えばグリフィス等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻４８４７−４８５２頁（１９８８）、ナバヴィ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２巻１４４４−１４４７頁（１９８９）を参照されたい。
【０１１６】
腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩα鎖蛋白をコードしている核酸でトランスフェクトすることにより、ＭＨＣクラスＩ分子を発現するよう修飾することができる。核酸の例については、Ｌ．フード等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻５２９−５６８頁（１９８３）およびＣ．オーフレイおよびＪ．Ｌ．ストロミンガー、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５巻１９７−２４７頁（１９８７）を参照されたい。所望により、その腫瘍細胞がβ２ミクログロブリンを発現しないならば、これを、β２ミクログロブリン蛋白をコードしている核酸でトランスフェクトすることもできる。核酸の例については、Ｄ．グソウ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９巻３１３２−３１３８頁（１９８７）およびＪ．Ｒ．パーンズ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８巻２２５３−２２５７頁（１９８１）を参照されたい。ＭＨＣクラスＩＩ分子と同様に、腫瘍細胞で発現されるＭＨＣクラスＩ遺伝子またはＭＨＣクラスＩ遺伝子の多形性対立遺伝子の数を増加させることにより、その腫瘍細胞がＴ細胞に提示することのできる抗原性フラグメントのスベクトルを増大させることができる。
【０１１７】
１以上の分子、例えばＢ７−２および／またはＢ７−３分子、ＭＨＣクラスＩＩα鎖蛋白およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖蛋白をコードしている核酸で腫瘍細胞をトランスフェクトする時、このトランスフェクションは同時にまたは順次実施することができる。もしトランスフェクションを同時に実施するならば、コードされる配列が使用する特定のベクターの負担能力を超えない限り、当該分子は同じ核酸上に導入できる。別法として、当該分子を別々の核酸によりコードすることもできる。トランスフェクションを連続的に実施し、且つ腫瘍細胞が選択マーカーを用いて選択される場合、一つの選択マーカーを最初に導入された核酸に関連して使用し、一方、異なる選択マーカーを次に導入される核酸に関連して使用することができる。
【０１１８】
腫瘍細胞の細胞表面でのＭＨＣ分子（クラスＩまたはクラスＩＩ）の発現は、例えば、異なるＭＨＣ分子に対する蛍光標識されたモノクローナル抗体を用いて、腫瘍細胞の免疫蛍光によって測定することができる。特定のＭＨＣ分子の非多形性領域（非対立遺伝子特異性）または特定のＭＨＣ分子の多形性領域（対立遺伝子特異性）のいずれかを認識するモノクローナル抗体を使用することができ、そしてこれらは当業者に知られている。
（７）腫瘍細胞上でのＭＨＣ分子の誘導または発現の増強。
【０１１９】
腫瘍細胞の表面でＭＨＣ分子を発現するよう腫瘍細胞をエクスビボで修飾する別のアプローチは、その腫瘍細胞表面でＭＨＣ分子の発現を誘導または増強するために、ＭＨＣ分子の発現を刺激する物質を使用することである。例えば、腫瘍細胞を培養基中、インビトロで当該物質と接触させることができる。ＭＨＣ分子の発現を刺激する物質は、例えば、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ遺伝子の転写を増強することによって、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩｍＲＮＡの翻訳を増強することによって、または、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ蛋白の細胞表面に対する安定性または細胞表面への輸送を増強することによって、働き得る。幾つかの物質がＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面発現のレベルを増強することが示されている。例えば、Ｓ．Ｍ．コックフィールド等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４巻２９６７−２９７４頁（１９９０）；Ｒ．Ｊ．ノエル等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻１７１８−１７２３頁（１９８６）；Ｊ．Ｊ．モンド等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２７巻８８１−８８８頁（１９８１）；Ｃ．Ｌ．ウィリアム等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７０巻１５５９−１５６７頁（１９８９）；Ａ．セラダおよびＲ．マキ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６巻１１４−１２０頁（１９９１）およびＬ．Ｈ．グリムチャーおよびＣ．Ｊ．カラ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０巻１３−４９頁（１９９２）およびそれらの参照文献を参照されたい。これらの物質には、サイトカイン、他の細胞表面分子に対する抗体、およびホルボールエステル類が包含される。広範囲の細胞型においてＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子を上方調節する一つの物質はサイトカインインターフェロンγである。即ち、例えば、Ｂ７−２および／またはＢ７−３およびＢ７−１を発現するよう修飾された腫瘍細胞は、インターフェロンγとの接触により、ＭＨＣ分子の発現を増強するようさらに修飾することができる。
【０１２０】
腫瘍細胞表面でのＭＨＣ分子の発現を誘導または増強するために使用できるもう一つの物質は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ遺伝子の転写を上方調節する転写因子をコードしている核酸である。このような核酸は、腫瘍細胞中にトランスフェクトされてＭＨＣ遺伝子の転写の増強を惹起することができ、その結果ＭＨＣ蛋白の細胞表面レベルを増大させる。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子は異なった転写因子によって調節されている。しかしながら、複数のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子がそうであるように、複数のＭＨＣクラスＩ遺伝子が協同的に調節されている。故に、ＭＨＣ遺伝子の発現を調節する転写因子をコードしている核酸による腫瘍細胞のトランスフェクションは、腫瘍細胞表面の幾つかの異なったＭＨＣ分子の発現を増強することができる。ＭＨＣ遺伝子の発現を調節する幾つかの転写因子が同定され、クローニングされ、そして性格決定されている。例えば、Ｗ．ライス等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、４巻１５２８−１５４０頁（１９９０）；Ｈ．Ｃ．リュー等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻１５８１−１５８４頁（１９８８）；Ｄ．Ｋ．ディディアー等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻７３２２−７３２６頁（１９８８）。
（８）腫瘍細胞における非変異鎖の発現の阻害。
本発明のもう一つの態様は、Ｔ細胞共同刺激分子（例えばＢ７−２および／またはＢ７−３およびＢ７−１）を発現するよう修飾された腫瘍細胞であって、ＭＨＣクラスＩＩに結合した蛋白、非変異鎖、の発現が阻害される腫瘍細胞を提供するものである。非変異鎖の発現が阻害されて、内因性ＴＡＡペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との結合が促進し、抗原−ＭＨＣ複合体が作り出される。この複合体は、共同刺激シグナルと関連してＴ細胞の活性化を誘導するためのＴ細胞における抗原特異的シグナルを誘発することができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子は内因性ペプチドを提示する能力のあることが示されている。Ｊ．Ｇ．ナクターン等、Ｎａｔｕｒｅ、３４３巻７４−７６頁（１９９０）；Ｓ．ワイスおよびＢ．ボーゲン、Ｃｅｌｌ、７６７−７７６頁（１９９１）。しかしながら、ＭＨＣクラスＩＩ分子を天然に発現する細胞においては、αおよびβ鎖蛋白は、小胞体からのこの蛋白の細胞内輸送の間、非変異鎖（以下Ｉｉ）と結合している。Ｉｉは、部分的には、内因性ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を妨げることにより機能すると信ぜられる。Ｗ．エリオット等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８巻２９４９−２９５２頁（１９８７）；Ｂ．ストッキンガー等、Ｃｅｌｌ、５６巻６８３−６８９頁（１９８９）；Ｌ．グアグリアーディ等、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３４３巻１３３−１３９頁（１９９０）；Ｏ．バッケ等、Ｃｅｌｌ、６３巻７０７−７１６頁（１９９０）；Ｖ．ロットルー等、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻６００−６０５頁（１９９０）；Ｊ．ピーターズ等、Ｎａｔｕｒｅ、３４９巻６６９−６７６頁（１９９１）；Ｐ．ロッチェ等、Ｎａｔｕｒｅ、３４５巻６１５−６１８頁（１９９０）；Ｌ．テイトン等、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻３９−４４頁（１９９０）。ＴＡＡは腫瘍細胞において内因性合成されるのであるから、これらから誘導されるペプチドは細胞内で利用できると思われる。したがって、Ｉｉを発現する腫瘍細胞でのＩｉの発現の阻害は、ＴＡＡペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する見込みを増大させ得る。この機作と合致して、Ｉｉ遺伝子によるＭＨＣクラスＩＩ＋、Ｉｉ−腫瘍細胞の超トランスフェクションが、この腫瘍細胞による腫瘍特異的免疫の刺激を妨げることが示された。Ｖ．Ｋ．クレメンツ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９巻２３９１−２３９６頁（１９９２）。
【０１２１】
修飾に先立ち、腫瘍細胞におけるＩｉの発現を、ノーザンブロッティングによるＩｉ ｍＲＮＡの存在もしくは不在の検出により、または免疫沈降によるＩｉ蛋白の存在または不在の検出により、評価することができる。Ｉｉの発現を阻害するための好ましいアプローチは、Ｉｉ遺伝子のコーディングまたは調節領域に対してアンチセンスの核酸を腫瘍細胞中に導入することによるものであって、これはかつて記載されている。Ｎ．コッホ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６巻１６７７−１６８３頁（１９８７）。例えば、Ｉｉ ｍＲＮＡの翻訳開始部位付近のヌクレオチドに対し相補的なオリゴヌクレオチドを合成することができる。１またはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、腫瘍細胞を含む培地に、典型的には２００μｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチド濃度で添加することができる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは腫瘍細胞により取り込まれてＩｉ ｍＲＮＡとハイブリダイズし、翻訳を妨げる。別の態様においては、組み替え発現ベクターを使用し、ここで核酸は、Ｉｉ遺伝子のコーディングまたは調節領域に対しアンチセンスであるｍＲＮＡが産生されるような向きにＩｉ遺伝子の配列をコードしている。したがってこの組み替え発現ベクターによりトランスフェクトされた腫瘍細胞は、Ｉｉ蛋白の産生を妨げるためのＩｉアンチセンス核酸の継続的な供給源を含む。別法として、腫瘍細胞におけるＩｉ発現は、この腫瘍細胞を、Ｉｉ発現を妨害する物質で処理することによって阻害することもできる。例えば、Ｉｉ遺伝子の発現、ＩｉｍＲＮＡの翻訳またはＩｉ蛋白の安定性もしくは細胞内輸送を阻害する薬物を使用することができる。
（９）修飾される腫瘍細胞の型。
【０１２２】
本明細書に記載されるような修飾を受ける腫瘍細胞は、Ｂ７−２および／またはＢ７−３を単独またはＢ７−１と組み合わせて発現するための、本発明により包含される１またはそれ以上のアプローチによりトランスフェクトまたは処理することができる腫瘍細胞を包含する。必要ならば、この腫瘍細胞をさらに修飾してＭＨＣ分子またはＩｉ発現の阻害剤を発現するようにすることができる。腫瘍細胞を取得する腫瘍は、例えば人間の患者において、自然発生したものであってよく、または、例えば動物対象において実験的に誘導もしくは誘発したものであってよい。腫瘍細胞は、例えば、臓器の充実性腫瘍、例えば肺、肝臓、乳房、結腸、骨などの腫瘍から取得することができる。充実性臓器の悪性腫瘍には、癌腫、肉腫、黒色腫および神経芽細胞腫が包含される。腫瘍細胞は、リンパ腫、骨髄腫または白血病のような血液に由来する（即ち、分散された）悪性腫瘍から取得することもできる。
【０１２３】
修飾されるべき腫瘍細胞は、トランスフェクション前にその細胞表面にＭＨＣ分子を発現するもの、および皆無または低いレベルのＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子を発現するものを包含する。正常な細胞型のうち少数がＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する。故に、多くの腫瘍細胞は天然にはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しないであろうと予想される。これらの腫瘍は、Ｂ７−２および／またはＢ７−３およびＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するよう修飾することができる。幾つかの型の腫瘍、例えば黒色腫（ヴァン・ドゥイネン等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４８巻１０１９−１０２５頁、１９８８）、び慢性大細胞リンパ腫（オキーン等、Ｃａｎｃｅｒ、６６巻１１４７−１１５３頁、１９９０）、頭頸部の扁平上皮癌（マティジュセン等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６巻９５−１００頁、１９９１）および大腸直腸癌（モラー等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６巻１５５−１６２頁、１９９１）は、表面ＭＨＣクラスＩＩ分子を天然に発現することが判明している。天然にクラスＩＩ分子を発現する腫瘍細胞は、Ｂ７−２および／またはＢ７−３、そしてさらに、他のクラスＩＩ分子を発現するよう修飾して、その腫瘍細胞により提示され得るＴＡＡペプチドのスペクトルを増大させることができる。殆どの非悪性腫瘍細胞の型はＭＨＣクラスＩ分子を発現する。しかしながら、悪性腫瘍への形質転換はしばしば腫瘍細胞の表面でのＭＨＣクラスＩ分子の発現の下方調節を伴う。Ａ．シバ等、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５０巻６９９−７０９頁（１９８４）。重要なことに、腫瘍細胞によるＭＨＣクラスＩ抗原の発現の喪失は、腫瘍細胞のより大きな攻撃性および／または転移可能性を伴う。Ｐ．Ｉ．シュリアー等、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻７７１−７７５頁（１９８３）；Ｃ．Ａ．ホールデン等、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、９巻８６７−８７１頁（１９８３）；Ｍ．バニヤッシュ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２９巻１３１８−１３２３頁（１９８２）。ＭＨＣクラスＩ発現が阻害されることが示されている腫瘍の型には、黒色腫、大腸直腸癌および扁平上皮癌が包含される。ヴァン・ドゥイネン等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４８巻１０１９−１０２５頁（１９８８）；モラー等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６巻１５５−１６２頁（１９９１）；Ａ．シバ等、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５０巻６９９−７０９頁（１９８４）；Ｃ．Ａ．ホールデン等、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、９巻８６７−８７１頁（１９８３）。クラスＩ分子の発現ができない、または低レベルのＭＨＣクラスＩ分子のみを発現する腫瘍細胞は、本明細書に記載される１またはそれ以上の技術により修飾して、腫瘍細胞表面でのＭＨＣクラスＩ分子の発現を誘導または増強させ、腫瘍細胞の免疫原性を亢進させることができる。
（１０）インビボでの腫瘍細胞の修飾。
【０１２４】
本発明のもう一つの態様は、Ｂ７−２および／またはＢ７−３およびＢ７−１を発現させてＴ細胞における共同刺激シグナルを誘発させるよう、腫瘍細胞をインビボで修飾することにより、この腫瘍細胞の免疫原性を増大させるための方法を提供する。加えて、腫瘍細胞をインビボでさらに修飾してＭＨＣ分子を発現させ、Ｔ細胞における第一の、抗原特異的シグナルを誘発させるようにすることができる。Ｂ７−２および／またはＢ７−３およびＢ７−１をコードしている核酸を、腫瘍細胞の表面での共同刺激分子の発現に好適な形でその腫瘍細胞中に導入することにより、この腫瘍細胞をインビボで修飾することができる。同様に、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子またはＩｉ遺伝子のアンチセンス配列をコードしている核酸を腫瘍細胞中にインビボで導入することができる。一つの態様において、遺伝子治療の一形式として、組み替え発現ベクターを用いて、Ｂ７−２および／またはＢ７−３およびＢ７−１をコードしている核酸を腫瘍細胞にインビボで送り込むことができる。インビボ遺伝子治療に有用なベクターはかつて記載されており、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターを包含する。例えば、Ｍ．Ａ．ローゼンフェルト、Ｃｅｌｌ、６８巻１４３−１５５頁（１９９２）；Ｗ．Ｆ．アンダーソン、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２６巻４０１−４０９頁（１９８４）；Ｔ．フリードマン、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻１２７５−１２８１頁（１９８９）を参照されたい。別法として、腫瘍細胞中への裸の核酸の直接注射により、核酸を腫瘍細胞にインビボで送り込むこともできる。例えば、Ｇ．アサディ等、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻８１５−８１８頁（１９９１）を参照されたい。送り込むための装置は市販品が入手可能である（バイオラド）。所望により、注射に好適となるように、この核酸をリポソームのような担体と複合体形成させることができる。リポソームと複合体形成したＭＨＣクラスＩ分子をコードしている核酸は、黒色腫の患者の腫瘍中に直接注射された。Ｍ．ホフマン、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻３０５−３０９頁（１９９２）。
腫瘍細胞は、本明細書に記載のように、Ｂ７−２および／またはＢ７−３およびＢ７−１（そして必要ならばＭＨＣ分子）の発現を誘導または増強する物質の使用により、インビボで修飾することもできる。この物質は、全身的に、例えば静脈内注射、または好ましくは腫瘍細胞に局所的に投与できる。
（１１）抗腫瘍Ｔ細胞仲介免疫反応のエフェクター相。
【０１２５】
本発明に係る修飾された腫瘍細胞は、腫瘍特異的Ｔ細胞における抗原特異的シグナルおよび共同刺激シグナルを誘発することにより抗腫瘍Ｔ細胞仲介免疫反応の刺激に有用である。この、免疫反応の誘導的または求心的相に続いて、Ｔ細胞のエフェクター集団が生成される。これらのエフェクターＴ細胞集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両者を含み得る。このエフェクター集団は、例えば腫瘍細胞の細胞溶解による、腫瘍細胞の排除を担う。いったんＴ細胞が活性化されると、共同刺激分子の発現は、エフェクターＴ細胞による標的細胞の認識またはＴ細胞のエフェクター機能にとって標的細胞上で必要ない。Ｆ．Ａ．ハーディングおよびＪ．Ｐ．アリソン、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻１７９１−１７９６頁（１９９３）。故に、本発明に係る修飾された腫瘍細胞により誘導される抗腫瘍Ｔ細胞仲介免疫反応は、修飾された腫瘍細胞および共同刺激分子を発現しない非修飾腫瘍細胞の両者に対して有効である。
【０１２６】
さらに、Ｔ細胞仲介免疫反応の求心的および遠心的相に要する細胞表面のＭＨＣ分子の密度および／または型は相違し得る。Ｔ細胞の最初の活性化に要するより少ないＭＨＣ分子または或る型のＭＨＣ分子のみ（例えばＭＨＣクラスＩＩではなくＭＨＣクラスＩ）が、エフェクターＴ細胞による認識のために腫瘍細胞上で必要であるかも知れない。故に、天然で少量のＭＨＣ分子を発現するが、より大量のＭＨＣ分子を発現するよう修飾された腫瘍細胞は、非修飾腫瘍細胞に対して有効なＴ細胞仲介免疫反応を誘導することができる。別法として、天然でＭＨＣクラスＩ分子を発現するがＭＨＣクラスＩＩ分子は発現せず、そこでＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するよう修飾された腫瘍細胞は、親のＭＨＣクラスＩ＋、クラスＩＩ−腫瘍細胞を排除し得るエフェクターＴ細胞集団を含むＴ細胞仲介免疫
反応を誘導することができる。
（１２）腫瘍細胞の治療用組成物。
【０１２７】
本発明のもう一つの態様は、対象へのインビボでの薬学的投与に好適な生物学的に適合し得る型の、修飾された腫瘍細胞の組成物である。この組成物は、或る量の修飾された腫瘍細胞および生理学上許容し得る担体を含む。修飾された腫瘍細胞の量は、治療上有効であるように選択する。「インビボでの薬学的投与に好適な生物学的に適合し得る型」という語は、その腫瘍細胞の毒性効果よりその腫瘍細胞の治療効果が優っていることを意味する。「生理学上許容し得る担体」とは、対象と生物学的に適合し得る担体である。許容し得る担体の例には、食塩水および緩衝剤水溶液が包含される。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、また容易な被注射性が成立する程度まで流体でなければならない。「対象」という語は、腫瘍が発生または実験的に誘導され得る生体を包含することを意図している。対象の例には、人間、犬、猫、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が包含される。
【０１２８】
本発明に係る治療用組成物の投与は、所望の結果を達成するために有効な期間および用量で、既知の方法を用いて実施することができる。例えば、修飾された腫瘍細胞の治療的有効量は、年齢、性別および個体の体重、腫瘍細胞の型および腫瘍負荷の程度、ならびに対象の免疫学的応答能のような因子に応じて変わり得る。投与計画は最良の治療応答を提供するよう調節することができる。例えば、修飾された腫瘍細胞の単一の用量を投与することができ、または幾つかの用量を回を追って投与することができる。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内および皮下注射を含む注射によるものであってよい。
（１３）腫瘍特異的Ｔリンパ球のインビトロ活性化。
【０１２９】
Ｔ細胞における共同刺激シグナルの誘発により抗腫瘍Ｔ細胞仲介免疫反応を誘導または亢進するもう一つのアプローチは、腫瘍を持っている対象からＴリンパ球を取得し、腫瘍細胞および単独またはＢ７−１と組み合わせたＢ７−２および／またはＢ７−３の刺激型でこれを刺激することによってこれをインビトロで活性化することである。Ｔ細胞は対象から、例えば末梢血から取得できる。末梢血はさらに分画して赤血球を除き、そしてＴリンパ球またはＴリンパ球亜集団に富ませまたはこれを単離することができる。Ｔ細胞は、刺激型のＢ７−２および／またはＢ７−３と合した、対象から（例えば、生検から、または血液由来の悪性腫瘍の場合は末梢血から）取得した腫瘍細胞と共に培養することにより、または別法として、本明細書に記載されるような修飾された腫瘍細胞に暴露することにより、インビトロで活性化することができる。「刺激型」という語は、その共同刺激分子がＴ細胞上のそのレセプターと架橋してＴ細胞において共同刺激シグナルを誘発できることを意味する。共同刺激分子の刺激型は、例えば、共同刺激分子の可溶性多価分子、または例えば固体支持体に結合させた共同刺激分子の固定型であってよい。Ｔ細胞において共同刺激シグナルを誘発する能力を保持するＢ７−２および／またはＢ７−３のフラグメント、突然変異体または変異体（例えば融合蛋白）もまた使用することができる。好ましい態様においては、Ｂ７−２および／またはＢ７−３の可溶性細胞外部分を使用してＴ細胞に共同刺激を提供する。腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化するため、Ｔ細胞を腫瘍細胞およびＢ７−２および／またはＢ７−３と共に、または修飾された腫瘍細胞と共にインビトロで培養した後、このＴ細胞を、例えば静脈内注射により対象に投与することができる。
（１４）修飾された腫瘍細胞の治療用途。
【０１３０】
本発明に係る修飾された腫瘍細胞は、腫瘍の免疫原性を増大させるのに使用することができ、故に腫瘍を持つ対象または腫瘍が発生するおそれのある対象においてＴリンパ球仲介抗腫瘍免疫を誘導または亢進するために治療的に使用することができる。腫瘍を持つ対象を処置するための方法は、その対象から腫瘍細胞を取得し、その腫瘍細胞を、例えば、適当な核酸でそれらをトランスフェクトすることにより、Ｔ細胞共同刺激分子を発現するようエクスビボで修飾し、そしてこの修飾された腫瘍細胞の治療的有効用量を対象に投与することを含む。腫瘍細胞中に導入すべき適当な核酸は、本明細書に記載の、単独の、またはＢ７−１、ＭＨＣ分子（クラスＩまたはクラスＩＩ）またはＩｉアンチセンス配列をコードしている核酸と合した、Ｂ７−２および／またはＢ７−３をコードしている核酸を包含する。別法として、対象から腫瘍細胞を取得した後、Ｂ７−２および／またはＢ７−３の発現を誘導または増強する物質を用いて（そしてことによるとＢ７−１またはＭＨＣ分子を誘導または増強する物質をも使用して）これらをエクスビボで修飾することができる。
【０１３１】
腫瘍細胞は、例えば、腫瘍細胞の外科的除去、例えば腫瘍の生検によって対象から、または、血液由来の悪性腫瘍の場合には対象の血液試料から取得できる。実験的に誘導された腫瘍の場合、その腫瘍の誘導に使用される細胞、例えば腫瘍セルラインの細胞を使用することができる。充実性腫瘍の試料は、最大のトランスフェクション効率のために、修飾に先立ち、腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を生成するよう処理することができる。可能性ある処理には、細胞の手動分散または結合組織の繊維の、例えばコラゲナーゼによる酵素的消化が包含される。
【０１３２】
腫瘍細胞は、対象から取得した直後にトランスフェクトすることができ、またはその腫瘍細胞のさらなる性格決定（例えば、細胞表面分子の発現の測定）を可能とするためトランスフェクション前にインビトロ培養することができる。トランスフェクション用に選択される核酸は、その腫瘍細胞により発現される蛋白の性格決定後に決定することができる。例えば、その腫瘍細胞の細胞表面でのＭＨＣ蛋白の発現、および／またはその腫瘍細胞におけるＩｉ蛋白の発現を評価することができる。皆無のまたは限られた量または型のＭＨＣ分子（クラスＩまたはクラスＩＩ）を発現する腫瘍は、ＭＨＣ蛋白をコードしている核酸でトランスフェクトすることができ、Ｉｉ蛋白を発現する腫瘍はＩｉアンチセンス配列でトランスフェクトすることができる。必要ならば、トランスフェクションの後に、目的とする核酸と共に腫瘍細胞中に導入された選択マーカー（例えば薬物耐性）を用いることにより、当該核酸の導入について腫瘍細胞をスクリーニングすることができる。
【０１３３】
対象への投与に先立ち、修飾された腫瘍細胞が対象内でそれ以上増殖できないようにする処理をし、それによりその修飾された腫瘍細胞の考え得る生長を防ぐことができる。可能な処理は照射またはマイトマイシンＣ処理であり、これらは、腫瘍細胞の増殖能を破棄する一方で、Ｔ細胞における抗原特異的および共同刺激シグナルを誘発し、そのようにして免疫反応を刺激する当該腫瘍細胞の能力を維持する。
【０１３４】
修飾された腫瘍細胞は、その腫瘍細胞を対象に注射することによって対象に投与することができる。注射の経路は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下とすることができる。元の腫瘍の部位への修飾された腫瘍細胞の投与は、元の腫瘍に対する局所Ｔ細胞仲介免疫反応の誘導にとって有益となり得る。播種的方法、例えば静脈内注射）での修飾された腫瘍細胞の投与は、全身的な抗腫瘍免疫を提供し、さらに、元の部位からの腫瘍細胞の転移性拡散から保護し得る。修飾された腫瘍細胞は、他の治療形態の前にまたはそれと一緒に投与することができ、または、化学療法もしくは外科的侵襲のような他の処置の後に投与することができる。
【０１３５】
さらに、１以上の型の修飾された腫瘍細胞が対象に投与され得る。例えば、有効なＴ細胞反応は、１以上の型の共同刺激分子への暴露を必要とするかも知れない。さらに、異なる共同刺激分子に対するＴ細胞の時間を追って連続した暴露が、有効な反応の生成にとって重要であるかも知れない。例えば、活性化の際Ｂ細胞は、その反応の初期にＢ７−２を発現することが知られている（刺激の約２４時間後）。続いてＢ７−１およびＢ７−３がＢ細胞により発現される（刺激の約４８−７２時間後）。即ち、Ｔ細胞は、免疫反応中のＢ７−１および／またはＢ７−３への暴露による免疫反応の誘導の初期にＢ７−２への暴露が必要であるのかも知れない。したがって、腫瘍細胞に対する有効な免疫反応を対象に生成させるために、異なる型の修飾された腫瘍細胞を異なった時期に投与することができる。例えば、Ｂ７−２を発現するよう修飾された腫瘍細胞を対象に投与することができる。この投与の後、同じ腫瘍由来であるがＢ７−３を発現（単独でまたはＢ７
−１と共に）するよう修飾された腫瘍細胞を、その対象に投与することができる。
【０１３６】
腫瘍によって対象を処置するもう一つの方法は、単独でまたはＢ７−１、ＭＨＣ分子および／またはＩｉ発現の阻害剤と共にＢ７−２および／またはＢ７−３を発現するよう、腫瘍細胞をインビボで修飾することである。この方法は、本明細書の前項に記載のようなインビボ遺伝子治療のために有効なベクターおよび運搬法を用いて、発現されるべき蛋白をコードしている核酸を提供することにより、腫瘍細胞をインビボで修飾することを含み得る。別法として、Ｂ７−２および／またはＢ７−３、そしてことによるとＢ７−１またはＭＨＣ分子の発現を誘導または増強する１またはそれ以上の物質を、腫瘍を持つ対象に投与することができる。
【０１３７】
本発明に係る修飾された腫瘍細胞は、腫瘍の転移性分散を防止または処置するための、または腫瘍の再発を防止または処置するための方法に使用することもできる。以下の実施例の一つに詳細に立証されるように、Ｂ７−１発現腫瘍細胞により誘導される抗腫瘍免疫は、再暴露の腫瘍細胞がＢ７−１を発現するか否かに拘わらず、腫瘍細胞による後のチャレンジに対して有効である。即ち、本明細書に記載されるような修飾された腫瘍細胞の投与または腫瘍細胞のインビボ修飾は、元の、非修飾腫瘍の細胞ならびに元の腫瘍の転移または可能な元の腫瘍の再成長に対する腫瘍の免疫を提供することができる。
【０１３８】
さらに本発明は、ＣＤ４＋Ｔ細胞における抗腫瘍反応を特異的に誘導するための組成物および方法を提供する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結びついた抗原によって活性化される。ＴＡＡのペプチドフラグメントとＭＨＣクラスＩＩ分子との結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるこれらの抗原性ペプチドの認識を産む。Ｂ７−２および／またはＢ７−３と共にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するよう修飾された、または、Ｂ７−２および／またはＢ７−３と共にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するようインビボ修飾された腫瘍細胞を対象に提供することは、腫瘍抗原の提示をＭＨＣクラスＩＩ経路に向かわせるのに有用であり、それにより、腫瘍細胞に対し特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞による抗原認識およびその活性化がもたらされる。抗ＣＤ４または抗ＣＤ８抗体によるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞いずれかのインビボでの涸渇を用いて、特異的抗腫瘍免疫が特定の（例えばＣＤ４＋）Ｔ細胞亜集団により仲介されることを立証することができる。
【０１３９】
修飾された腫瘍細胞に最初に暴露された対象は、その後の非修飾腫瘍細胞への暴露に対して有効な抗腫瘍特異的Ｔ細胞反応を示す。即ち、その対象は抗腫瘍特異的免疫を示す。別の人間の対象における抗腫瘍免疫を誘導する免疫原としての一人の人間の対象からの本発明に係る修飾された腫瘍細胞の一般的使用は、血縁のない人間間の組織適合性の相違によって阻まれる。しかしながら、将来の腫瘍出現の可能性から防御するために、或る個体からの修飾された腫瘍細胞を使用して別の個体における抗腫瘍免疫を誘導することは、家族性悪性腫瘍の場合に有用であるかも知れない。この状況においては、修飾されるべき腫瘍細胞の、腫瘍を持つドナーは、修飾された腫瘍細胞の（腫瘍を持たない）受容者と濃い血縁関係にあり、故にドナーおよび受容者はＭＨＣ抗原を共有する。或る型の悪性腫瘍、例えば或る乳癌および直腸癌には強い遺伝性要素が確認されている。特定の悪性腫瘍への易罹患性がわかっており、一人が現在腫瘍を持っている家族において、その一人からの腫瘍細胞を、Ｂ７−２および／またはＢ７−３を単独でまたはＢ７−１と組み合わせて発現するよう修飾し、易罹患性の組織適合性の家族成員に投与して、その家族が罹患し易い型の腫瘍に対する受容者の抗腫瘍免疫反応を誘導することができる。この抗腫瘍反応は、免疫感作された受容者におけるその後の腫瘍出現に対する防御免疫を提供し得る。
（１５）腫瘍特異的Ｔ細胞寛容。
【０１４０】
実験的に誘導された腫瘍の場合、対象（例えばマウス）を、非修飾腫瘍細胞によりチャレンジする前に本発明に係る修飾された腫瘍細胞に暴露することができる。即ち、最初に対象は、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞を活性化するＢ７−２および／またはＢ７−３、およびＢ７−１と共に腫瘍細胞上のＴＡＡペプチドに暴露される。すると活性化されたＴ細胞は、非修飾腫瘍細胞によるその後のチャレンジに対して有効となる。自然発生腫瘍の場合は、人間の患者の場合がそうであるが、対象の免疫系は、本発明に係る修飾された腫瘍細胞への暴露の前に、非修飾腫瘍細胞に暴露される。即ちこの対象は、共同刺激シグナルの不在下で腫瘍細胞上のＴＡＡペプチドに最初に暴露される。この状況は、非修飾腫瘍細胞に暴露されており且つ接触しているＴ細胞においてＴＡＡ特異的Ｔ細胞の寛容を誘導すると思われる。共同刺激シグナルを誘発できる修飾された腫瘍細胞への対象の二次的な暴露は、この腫瘍への一次暴露によりアネルギー化されたＴＡＡ特異的Ｔ細胞の寛容に打ち勝つには十分でないかも知れない。故に、既に非修飾腫瘍細胞に暴露された対象における抗腫瘍免疫を誘導するための修飾された腫瘍細胞の使用は、小さな腫瘍負荷、例えば転移していない小さな限局性腫瘍を有する早期に診断された患者において最も効果的となり得る。この状況においては、腫瘍細胞は身体の限られた領域に限定されており、したがってＴ細胞レパートリーの一部分が腫瘍抗原に暴露されアネルギー化しているに過ぎない。例えば限局された腫瘍の外科的除去および分離された腫瘍細胞の修飾の後の全身的方法による修飾された腫瘍細胞の投与は、非アネルギー化Ｔ細胞を、単独、またはＢ７−１と組み合わせたＢ７−２および／またはＢ７−３と共に腫瘍抗原に暴露させ、それにより非アネルギー化Ｔ細胞における抗腫瘍反応を誘導することができる。この抗腫瘍反応は、可能性ある腫瘍の再成長に対して、または、検出されていないかも知れない元の腫瘍の微小転移に対して有効であり得る。対象において腫瘍細胞に対する広汎に広がった末梢Ｔ細胞寛容に打ち勝つためには、サイトカインのようなさらなるシグナルを、修飾された腫瘍細胞と共に対象に提供する必要があるかも知れない。Ｔ細胞成長因子として機能するサイトカイン、例えばＩＬ−２は、修飾された腫瘍細胞と共に対象に提供することができる。インビトロ系においてＩＬ−２は、二次アロ抗原刺激の時点で外因性ＩＬ−２を添加する時、前にアネルギー化されたＴ細胞のアロ抗原特異的反応を回復できることが示されている。Ｐ．タン等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻１６５−１７３頁（１９９３）。
【０１４１】
腫瘍に対する対象のＴ細胞の寛容にも拘わらず対象における抗腫瘍Ｔ細胞反応を生成させる別のアプローチは、腫瘍に暴露されていない別の対象（ナイーヴドナーと称する）由来のＴ細胞において抗腫瘍反応を刺激し、このナイーヴドナーからの刺激されたＴ細胞を、腫瘍を持つ対象に移し、その結果、移されたＴ細胞が当該腫瘍細胞に対する免疫反応を装備できるようにする事である。このＴ細胞を本発明に係る修飾された腫瘍細胞を用いてインビトロで刺激することにより、ナイーヴドナー由来のＴ細胞で抗腫瘍反応が誘導される。このような養子免疫伝達のアプローチは一般に、移入されるＴ細胞と腫瘍を持つ受容者との間の組織適合性の相違のため、異系交配された集団では妨げられる。しかしながら、同種骨髄移植における進歩をこの状況に適用して、受容者による養子免疫伝達された細胞の受容および移植片対宿主病の防止を可能にすることができる。まず、腫瘍を持つ対象（宿主と称する）を既知の方法によってナイーヴドナーからの同種骨髄移植のために準備し、移植を施す。宿主の準備は、全身の照射を含み、これは、腫瘍に対し寛容が成立しているＴ細胞および腫瘍細胞自身を含む、宿主の免疫系を破壊する。骨髄移植は、骨髄移植片からの成熟Ｔ細胞の涸渇といったような移植片対宿主病を防止するための処置、免疫抑制剤による宿主の処置、または宿主組織に対するドナーＴ細胞の寛容を誘導するためのＣＴＬＡ４Ｉｇのような物質による宿主の処置を伴う。次に、宿主に残った腫瘍細胞または宿主の元の腫瘍の再成長もしくは転移に対して応答し得る抗腫瘍特異的Ｔ細胞を宿主に提供するため、ナイーヴドナーからのＴ細胞を本明細書に記載のようにＢ７−２および／またはＢ７−３を発現するよう修飾した、この宿主由来の腫瘍細胞によってインビトロで刺激する。即ち、ドナーＴ細胞は最初に共同刺激シグナルと共に腫瘍細胞に暴露され、故にこの腫瘍細胞に応答するよう活性化される。次いでこれらの活性化された抗腫瘍特異的Ｔ細胞を、非修飾腫瘍細胞に対し反応性である宿主に移入する。宿主はドナーの免疫系により再構成されているため、この宿主は移入されたＴ細胞を拒絶せず、さらに、移植片対宿主病を防止するための宿主の処置が、移入されたＴ細胞と正常な宿主組織との反応性を妨げるであろう。
Ｈ．Ｂリンパ球抗原医薬製剤の投与
【０１４２】
本発明のペプチドはＴ細胞を介する免疫反応を強化または抑制するための生体内医薬投与に適する生物学的に適応性ある剤型として対象体に投与される。「生体内投与に適する生物学的に適応性ある剤型」とは治療効果が毒性効果を凌いでいる投与される蛋白質の製剤を意味する。対象体という用語は免疫反応を起こす生物体、たとえば哺乳類、を含むものを意図する。対象体の例には、ヒト、犬、猫、マウス、ラットならびにこれらのトランスジェニック種を含む。ここに記載する新規Ｂリンパ球抗原の活性を持つペプチドの投与はペプチド単独あるいは他種Ｂリンパ球抗原の活性を持つペプチドとの組合せでの治療的活性量および医薬的に許容される担体を含むいかなる医薬的剤型をとることもできる。本発明の治療用組成物の治療的有効量の投与とは所期結果を得るために必要な用量と時間において有効な量であると定義される。例えば、Ｂ７−２活性を持つペプチドの治療的有効量は病状、年齢、性および個体の体重および個体中で所期反応を起こすペプチドの能力のような因子によっても変化しうる。用量範囲は最適な治療反応を得るように調整してもよい。例えば、毎日数回に分割した用量を投与してもよいし、用量を治療状況の実情が示すものに比例して減量してもよい。
【０１４３】
活性化合物（たとえば、ペプチド）は注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮投与または直腸投与のような好都合な方法でも投与されうる。投与経路に依存して、活性化合物は化合物を不活化するかもしれない酵素や酸の作用および他の天然の条件から化合物を保護する物質で被覆することもありうる。
非経口投与以外によりＢ７−２活性を持つペプチドを投与するためには、そのペプチドの不活化を阻止する物質で被覆するか、またはそれと同時に投与することが必要になることもありうる。例えば、Ｂ７−２活性を持つペプチドを個体に適当な担体、希釈剤またはアジュバント内で投与するか、酵素阻害剤と同時に投与するか、またはリポソームのような適当な担体中で投与する。医薬的に許容される希釈剤は食塩水および緩衝水溶液を含む。アジュバントは最広義に解され、インターフェロンのようないかなる免疫促進化合物をも含む。ここにアジュバントにはレゾルシノール類、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤をも含むことが意図されている。酵素阻害剤には膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＰ）およびトラシロールをも含む。リポソームには水中油中水型乳剤ならびに通常のリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎなど（１９８４年）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻：２７頁）を含む。
【０１４４】
活性化合物は非経口的または腹腔内にも投与されうる。分散剤はグリセリン、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中および油中で製造することもできる。通常の貯蔵および使用条件の下では、これらの製剤には微生物の生育を予防するための保存剤をも含ませうる。
【０１４５】
注射のために適当な医薬的組成物には無菌水溶液（水溶性の場合）または水分散剤および無菌注射用溶液または分散剤の要時調製用無菌粉末剤を含む。すべての場合、組成物は無菌でなければならず、また容易に注射できる程度に流動性でなければならない。それは製造保存条件下に安定でなければならず、細菌およびカビのような微生物の汚染から予防されていなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびその混合物を含む溶媒または分散媒体であることができる。適当な流動性は、例えば、レシチンのような被覆剤の使用、分散剤の場合には必要な粒子径の維持および界面活性剤の使用などにより維持することができる。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌剤および抗カビ剤により達成することができる。多くの場合、組成物内に、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましいと思われる。注射剤組成物の長時間の吸収は組成物内に、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を含有させることによって行うことができる。
【０１４６】
無菌注射剤溶液は活性化合物（たとえばＢ７−２活性を持つペプチド）の適量を、要すれば前記成分１種または組合せを含む適当な溶媒中に添加し、続いて無菌濾過することにより製造することができる。一般に、分散剤は活性化合物を基礎的分散媒体および前記からの必要な他種成分を含む無菌賦形剤中に添加することにより製造される。無菌注射溶液を製造するための無菌粉末の場合、好適な製法は真空乾燥および凍結乾燥であって、予め無菌濾過した溶液からの活性成分（たとえば、ペプチド）プラス所期追加的成分の粉末を与える。
【０１４７】
活性化合物が前記のように適当に保護されている時、蛋白質は、例えば不活性希釈剤または同化しうる食用担体とともに経口投与もされうる。ここに使用する「医薬的に許容される担体」にはすべてのいかなる溶媒、分散媒体、被覆、抗菌剤および抗カビ剤、等張剤および吸収遅延剤などをも含む。医薬的活性物質のためのそれら媒体および薬剤の使用は当該技術分野でよく知られている。この活性化合物にその通常の媒体または薬剤が配合禁忌である場合を除き、この治療的組成物中での使用は意図されているものである。この組成物中には補助的活性化合物を添加することもできる。
【０１４８】
投与容易化と用量均一化のために非経口投与組成物を単位用量剤型に製剤化することは殊に有利である。ここに使用する単位用量剤型は、処置さるべき哺乳類対象体への均一な投与に適し、各単位が所期治療効果を得られるように予め計算された活性化合物の所定量および必要な医薬的担体とともに含む、物理的に区別された単位を示す。本発明の単位用量剤型の処方は（イ）活性化合物に独特な特性および達成さるべき特定の治療効果と（ロ）各個体の感受性に対する処置のために活性化合物を混合する技術に必然的な制限とにより決定され、直接的に依存する。
Ｉ．共刺激により誘発されるサイトカインの認識
【０１４９】
ここに記載する新規Ｂリンパ球抗原活性を持つペプチドをコードする核酸配列を使用して、たとえばＢ７−２のようなＢリンパ球抗原の一型による刺激に反応してＴ細胞によって生産されるサイトカインを認識することができる。Ｔ細胞は試験管内ではホルボールエステル、抗−ＣＤ３抗体または好ましくは抗原とＭＨＣクラスＩＩ分子とのような一次活性化シグナルにより準最適（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）の刺激を受け、例えばＢ７−２活性を持つペプチドをコードする核酸でトランスフェクトされて表面にペプチドを発現する細胞によるか、またはそのペプチドの可溶性刺激型によるようなＢ７−２抗原の刺激型から共刺激的（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）シグナルを受ける。培地に放出される既知サイトカインはＥＬＩＳＡにより、また、Ｔ細胞増殖を阻害するサイトカインを遮断する抗体の能力やサイトカインにより誘発される他種細胞型の増殖を阻害する抗体の能力により認識することができる。ＩＬ−４ＥＬＩＳＡキットやＩＬ−７遮断抗体はＧｅｎｚｙｍｅ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手できる。ＩＬ−９およびＩＬ−１２に対する遮断抗体はＧｅｎｅｔｉｃｓ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手できる。
【０１５０】
前記試験管内Ｔ細胞共刺激検定法は共刺激によっても誘導されうる新規サイトカインを認識する方法においても使用することができる。もし、共刺激により誘導される特定の活性、たとえばＴ細胞増殖、が既知サイトカインに対する遮断抗体の添加によって阻止できなければ、その活性は未知サイトカインの作用に起因するかもしれない。共刺激後、このサイトカインを常法により培地から精製してＴ細胞増殖を誘発する能力によりその活性を測定することができる筈である。
【０１５１】
寛容性の誘導を予防するサイトカインを認識するために前記の試験管内Ｔ細胞共刺激検定法を用いることができる。この場合、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを与え、続いて共刺激シグナルを与えずに、選択したサイトカインと接触させる。Ｔ細胞を洗浄し、休止させた後に、細胞に一次活性化シグナルおよび共刺激シグナルの両方を与える。もしＴ細胞が応答（たとえば、増殖するかまたはＩＬ−２を生産する）しなければ、細胞は耐性を獲得しており、そのサイトカインは寛容性誘導を予防しなかったものである。しかしながら、もしＴ細胞が応答すれば、そのサイトカインにより寛容性誘導が予防されたものである。寛容性誘導を予防できるサイトカインは移植受容者または自己免疫疾患患者の寛容性を誘発するためにより効果的な手段としてのＢリンパ球抗原を遮断する薬剤に関連する生体内遮断のための目標とすることができる。例えば、Ｂ７−２遮断剤をサイトカイン遮断抗体とともに対象体に投与することができよう。
Ｊ．共刺激を阻止する分子の認識
【０１５２】
本発明の新規Ｂリンパ球抗原の活性を持つペプチド（たとえば、Ｂ７−２およびＢ７−３）の別の応用はこれらペプチドの１種またはそれ以上を共刺激リガンド結合の阻止剤および／または共刺激後のＴ細胞の細胞内シグナル伝達の阻止剤である未発見分子を発見するスクリーニング検定法で使用することである。例えば、Ｂ７−２のようなＢリンパ球抗原の活性を持つペプチドを使用する固相結合検定法はその抗原と適当なＴ細胞リガンド（たとえば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８）との結合を阻止する分子を認識するために使用することができるであろう。加えるに、前記の試験管内Ｔ細胞共刺激検定法は、その分子のＴ細胞増殖および／またはサイトカイン生産の阻止能（しかし、Ｂリンパ球抗原のその受容体への結合は予防しない）で判定される、共刺激後にＴ細胞を経る細胞内シグナル伝達を阻害する分子を発見するために使用することができるであろう。例えば、サイクロスポリンＡ化合物はＴ細胞活性化をＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路ではなく、Ｔ細胞受容体経路を経由する刺激によって阻止する。それ故、共刺激には異なる細胞内シグナル伝達経路が含まれている。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を経る細胞内シグナル伝達を阻害する分子は生体内で免疫抑制剤（サイクロスポリンＡの効果に類似の）として有効であろう。
Ｋ．Ｂリンパ球抗原発現を調節する分子の認識
【０１５３】
本発明の蛋白質とペプチドとを用いて生産されるモノクローナル抗体は細胞上のＢリンパ球抗原発現を調節する分子のスクリーニング検定法で使用できる。例えば、Ｂリンパ球抗原誘導に導く細胞内シグナル伝達をもたらす分子、たとえばＢ７−２またはＢ７−３は細胞表面におけるＢリンパ球抗原１種またはそれ以上の発現を検定することによって認識することができる。ある分子の存在下での抗−Ｂ７−２抗体による免疫螢光染色の低減はその分子が細胞内シグナルを阻止することを指摘すると思われる。Ｂリンパ球抗原発現を増強する分子は免疫螢光染色の強化をもたらす。他に、Ｂ７−２のようなＢリンパ球抗原の発現へのある分子の効果はプローブとしてＢ７−２ｃＤＮＡを使用して細胞Ｂ７−２ｍＲＮＡ水準を検出することにより判定できる。例えば、Ｂ７−２活性を持つペプチドを発現する細胞は被検分子と接触させ、その細胞内でのＢ７−２ｍＲＮＡ濃度の増減をノーザンハイブリッド化分析または検出しうるマーカーで標識したＢ７−２ｃＤＮＡプローブを使用するｍＲＮＡまたは全ポリ（Ａ＋）ＲＮＡの通常のドット
ブロット検定のような標準的技術により検出できる。Ｂリンパ球抗原発現を調節する分子は単独でまたは可溶性遮断剤または刺激剤とともに免疫反応を増強または減衰するために治療上有用であろう。例えば、Ｂ７−２の発現を阻止する分子はＢ７−２遮断剤とともに免疫抑制の目的で投与できるであろう。前記の検定法で検査できる分子にはＩＬ−４、γＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびプロスタグランジンのようなサイトカインを含む。
【実施例】
【０１５４】
本発明を以下の実施例により例示するが、これらには限定的意図はない。本明細書中に引用した全ての参考文献および公表された特許出願の内容は参考のために提示するものである。
実施例１、２及び３では以下の方法論を使用した。
【０１５５】
方法および材料
Ａ．細胞
単核球はＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法により正常ヒト脾臓の遊離細胞懸濁液から単離し、羊赤血球によるロゼット形成によりＥ−およびＥ＋画分に分離した（Ｂｏｙｄ，Ａ．Ｗ．など（１９８５年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４巻：１５１６頁）。Ｂ細胞はＥ−画分から単球のプラスチックへの付着および抗−ＣＤ４、−ＣＤ８、−ＣＤ１１ｂ、−ＣＤ１４および−ＣＤ１６モノクローナル抗体を用いる抗−ＭｓＩｇＧおよび抗−ＭｓＩｇＭ被覆磁性ビーズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ・Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）での処理２回による残留Ｔ、天然キラー細胞（ＮＫ）および残留単球の除去により精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は同じ脾臓のＥ＋画分からプラスチックへの付着とＮＫ、Ｂ細胞および残留単球の磁性ビーズおよび抗−ＣＤ２０、−ＣＤ１１ｂ、−ＣＤ８およびＣＤ１６モノクローナル抗体での除去後に分離した。ＣＤ２８＋Ｔ細胞は同様にこのＥ＋画分から抗−ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、−ＣＤ１４および−ＣＤ１６モノクローナル抗体を用いて分離した。精製効果は間接的免疫螢光法およびＥＰＩＣＳフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を使用するフローサイトメトリーで分析した。Ｂ細胞製品は＞９５％ＣＤ２０＋、＜２％ＣＤ３＋、＜１％ＣＤ１４＋であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞製品は＞９８％ＣＤ３＋、＞９８％ＣＤ４＋、＜１％ＣＤ８＋、＜１％ＣＤ２０＋、＜１％ＣＤ１４＋であった。ＣＤ２８＋Ｔ細胞製品は＞９８％ＣＤ３＋、＞９８％ＣＤ２８＋、＜１％ＣＤ２０＋、＜１％ＣＤ１４＋であった。
Ｂ．モノクローナル抗体および融合蛋白質
【０１５６】
別段の記述がない限り、モノクローナル抗体は精製Ｉｇとして使用した：抗−Ｂ７：１３３、ＩｇＭは遮断抗体であって、以前に報告があり（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：３２６０〜３２６７頁）；抗−Ｂ７：Ｂ１．１、ＩｇＧ１（ＲｅｐｌｉＧｅｎ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂなど（１９９３年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４２巻：１０２９〜１０４０頁）は非遮断モノクローナル抗体であり；ＢＢ−１：ＩｇＭは遮断抗体（Ｄｒ．Ｅ．Ｃｌａｒｋ、ワシントン大学、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）（Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔなど（１９８２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２８巻：８２３〜８２７頁）であり；抗−ＣＤ２０：Ｂ１、ＩｇＧ２ａ（Ｓｔａｓｈｅｎｋｏ，Ｐなど（１９８０年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２５巻：１６７８〜１６８５頁）；抗−Ｂ５、ＩｇＭ（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．など（１９８５年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４巻：２２２８〜２２３５頁）；抗−ＣＤ８：７ＰＴ３Ｆ９，ＩｇＧ２ａ；抗−ＣＤ４：１９Ｔｈｙ５Ｄ７，ＩｇＧ２ａ；抗−ＣＤ１１ｂ：Ｍｏ１，ＩｇＭおよび抗−ＣＤ１４：Ｍｏ２，ＩｇＭ（Ｔｏｄｄ，Ｒなど（１９８１年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２６巻：１４３５〜１４４２頁）；抗−ＭＨＣクラスＩＩ：９−４９，ＩｇＧ２ａ（Ｄｒ．Ｒ．Ｔｏｄｄ、ミシガン大学、Ａｎｎ・Ａｒｂｏｒ）、（Ｔｏｄｄ，Ｒ．Ｉ．など（１９８４年）、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０巻：２３〜４０頁）；抗−ＣＤ２８：９．３，ＩｇＧ２ａ（Ｄｒ．Ｃ．Ｊｕｎｅ、Ｎａｖａｌ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、（Ｈａｎｓｅｎ，Ｊ．Ａ．など（１９８０年）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１０巻：２４７〜２６０頁）；抗−ＣＤ１６：３Ｇ８，ＩｇＧ１（腹水症として使用）、（Ｄｒ．Ｊ．Ｒｉｔｚ、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ・Ｃａｎｃｅｒ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｏｓｔｏｎ）；抗−ＣＤ３：ＯＫＴ３，ＩｇＧ２ａハイブリドマはアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手し精製モノクローナル抗体をプラスチック板に１μｇ／ｍＬの濃度で付着させた。抗−ＣＤ２８Ｆａｂ断片は製造元（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の指示書に従って９．３モノクローナル抗体からパパイン消化により発生させ、蛋白質Ａカラム上で精製した。ヒトＣＴＬＡ４融合蛋白質（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）および対照融合蛋白質（対照−Ｉｇ）は以前の報告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６５８６〜６５９０頁）通りに製造した。Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（印刷用に受理済）。
Ｃ．ＣＨＯ細胞のトランスフェクション
【０１５７】
Ｂ７−１トランスフェクト体（ＣＨＯ−Ｂ７）はＢ７−１陰性のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系から製造し、パラホルムアルデヒドで固定し、以前の報告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：６５７５〜６５７９頁）通りに使用した。
Ｄ．試験管内でのＢ細胞活性化およびＢ７＋およびＢ７−細胞の選択
【０１５８】
脾臓Ｂ細胞を組織培養フラスコ中の完全培養培地｛１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ−グルタミン、１ｍＭ−ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および硫酸ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）｝中で、２×１０６細胞／ｍＬに培養し、ｓＩｇをＡｆｆｉ−Ｇｅｌ７０２ビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）（Ｂｏｙｄ，Ａ．Ｗ．など（１９８５年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４巻：１５１６頁）に結合したアフィニティー精製ウサギ抗−ヒトＩｇＭとの交差結合によって、またはＡｆｆｉ−Ｇｅｌ７０２ビーズに結合したＭＨＣクラスＩＩの９−４９抗体との交差結合によって活性化した。Ｂ細胞は７２時間活性化し、活性化全Ｂ細胞集団として使用するか、または抗−Ｂ７（Ｂ１．１）モノクローナル抗体およびイソチオシアン酸フルオレッセイン（ＦＩＴＣ）で標識したヤギ抗−マウス免疫グロブリン（Ｆｉｓｈｅｒ社、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）で間接的に染色し、フローサイトメトリー細胞分別法（ＥＰＩＣＳ・Ｅｌｉｔｅ・ｆｌｏｗ・ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｃｏｕｌｔｅｒ社）によりＢ７−１＋およびＢ７−１−集団に分画して使用した。
Ｅ．免疫螢光法およびフローサイトメトリー
【０１５９】
表面フェノタイプ分析のため、６、１２、２４、４８、７２および９４時間交差結合したＭＨＣクラスＩＩまたはｓＩｇにより活性化したＢ細胞集団を抗−Ｂ７（１３３）、ＢＢ−１モノクローナル抗体、対照ＩｇＭ抗体、ＣＴＬＡ４Ｉｇまたは対照−Ｉｇにより染色した。細胞懸濁液を１０μｇ／ｍＬの一次モノクローナル抗体に続いて適当な２次試薬による２段階間接膜染色法で染色した。具体的には、抗−Ｂ７（１３３）およびＢＢ−１モノクローナル抗体との免疫反応性をヤギ抗−マウスＩｇまたは免疫グロブリンＦＩＴＣ（Ｆｉｓｈｅｒ）を２次試薬として使用する間接染色法により検討し、融合蛋白質との免疫反応性はビオチン化ＣＴＬＡ４Ｉｇまたはビオチン化対照−Ｉｇおよびストレプトアビジン−フィコエリスリンとを２次試薬に使用して検討した。希釈および洗浄剤には１０％ＡＢ血清添加ＰＢＳを使用した。細胞を０．１％パラホルムアルデヒドで固定して、フローサイトメーター(ＥＰＩＣＳ・Ｅｌｉｔｅ・Ｃｏｕｌｔｅｒ)で分析した。
Ｆ．増殖検定法
【０１６０】
Ｔ細胞は９６穴平底マイクロタイター板穴当り１×１０５細胞の濃度で３７℃
で３日間５％ＣＯ２中で培養した。同遺伝子型活性化Ｂ細胞（全Ｂ細胞集団また
はＢ７＋およびＢ７−画分）を照射（２５００ラド）し、穴当り１×１０５細胞
濃度で培地に添加した。検討因子を穴当り最終全容積２００μＬになるのに必要な濃度で添加した。指定した時にはＴ細胞を抗−ＣＤ２８Ｆａｂ（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）と３０分間４℃でインキュベーションし、続いて実験用板に添加した。同様に、ＣＨＯ−Ｂ７またはＢ細胞はＣＴＬＡ４Ｉｇまたは対照Ｉｇ（１０μｇ／ｍＬ）と３０分間４℃でインキュベーションした。分裂促進活性の指標としてのチミジン取込みは培養の最終１５時間に｛メチル−３Ｈ｝チミジン（Ｄｕ
・Ｐｏｎｔ社、ボストン、ＭＡ）１μＣｉ（３７ｋＢｑ）とインキュベーションした後に評価した。濾過して細胞を収穫し、乾燥濾板上の放射能をＰｈａｒｍａｃｉａ社ベータプレート液体シンチレーションカウンター中で測定した。
Ｇ．ＩＬ−２およびＩＬ−４検定
【０１６１】
ＩＬ−２とＩＬ−４との濃度はＥＬＩＳＡ法（Ｒ＆Ｄ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｍｉｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮおよびＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）により培養開始２４時間後に集めた上清液中で検定した。
【０１６２】
実施例１  Ｔ細胞増殖を誘発する新規ＣＴＬＡ４リガンドの活性化Ｂ細胞上での発現
交差結合表面Ｉｇはヒト休止Ｂ細胞がＢ７−１を７２時間目に最大（５０〜８０％）に発現するように誘導するので、活性化したヒトＢリンパ球が準分裂促進的に（ｓｕｂｍｉｔｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）活性化したＴ細胞を増殖させ、ＩＬ−２を分泌させる能力を測定した。図１には抗−ＣＤ３モノクローナル抗体で準分裂促進的に活性化したヒト脾臓ＣＤ２８＋Ｔ細胞のＢ７（Ｂ７−１）をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｂ７）または抗−Ｉｇで７２時間活性化した同遺伝子型脾Ｂ細胞での共刺激反応を示す。３Ｈ−チミジン取込みは７２時間培養の最終１５時間に検定した。ＩＬ−２はＥＬＩＳＡにより培養２４時間後の上清液で検定（検出限界：３１〜２０００ｐｇ／ｍＬ）した。図１は１７回の実験結果を表す。
【０１６３】
準分裂促進的に活性化したＣＤ２８＋Ｔ細胞はＣＨＯ−Ｂ７（図１、ａ）で与えられるＢ７−１共刺激に反応して増殖し、高濃度のＩＬ−２を分泌した。増殖もＩＬ−２分泌もＣＨＯ細胞上のＢ７−１分子を抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体でまたは高アフィニティー受容体であるＣＴＬＡ４の融合蛋白質によって遮断することで完全に阻止された。同様に、増殖とＩＬ−２分泌はＦａｂ抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体のＣＤ２８を経るＢ７−１シグナル伝達の遮断によって取除かれた。対照モノクローナル抗体または対照融合蛋白質は無効であった。増殖とＩＬ−２分泌の殆ど同じ共刺激は抗−Ｉｇで７２時間活性化した脾臓Ｂ細胞によって示された（図１、ｂ）。抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体はＣＨＯ−Ｂ７により起きる増殖とＩＬ−２分泌を完全に取除くことができたが、抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体は活性化Ｂ細胞により誘導される増殖を５０％しか確実に阻止しなかったが、一方ＩＬ−２分泌は完全に阻止された。抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体に誘導される増殖の部分遮断とは対照的に、ＣＴＬＡ４ＩｇもＦａｂ抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体も増殖とＩＬ−２分泌を完全に遮断した。これらの結果は活性化ヒトＢ細胞はＴ細胞増殖とＩＬ−２分泌とを誘導できる追加的なＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンド１個またはそれ以上を発現するという仮説に適合する。
【０１６４】
実施例２  活性化ヒト脾臓Ｂ細胞はＢ７−１とは異なるＣＴＬＡ４リガンドを発現する
前記観察から見て、別のＣＴＬＡ４結合性カウンターレセプターが活性化Ｂ細胞上に発現するかどうか確認することにした。このため、ヒト脾臓Ｂ細胞を抗−Ｉｇで７２時間活性化し、次にＢ７−１を介する共刺激を阻止しない抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体（Ｂ１．１）で染色した。イソチオシアン酸フルオレッセイン（ＦＩＴＣ）とｍＡｂＢ１．１を用い、フローサイトメトリーで細胞選択を行ってＢ７−１＋画分とＢ７−１−画分とを分離した。得られた分離後陽性集団は９９％Ｂ７−１＋であり、分離後陰性集団は９８％Ｂ７−１−（図２）であった。
【０１６５】
各集団の共刺激能を検討するため、ヒト脾臓ＣＤ２８＋Ｔ細胞を照射Ｂ７−１＋またはＢ７−１−抗−Ｉｇ活性化（７２時間）脾臓Ｂ細胞の存在下に抗−ＣＤ３モノクローナル抗体で準分裂促進的に刺激した。３Ｈ−チミジン取込みは７２時間培養の最後の１５時間に検討した。ＩＬ−２はＥＬＩＳＡにより培養２４時間後の上清液について評価（検定の検出限界：３１〜２０００ｐｇ／ｍＬ）した。図３は１０回の実験結果を示す。Ｂ７−１＋Ｂ細胞は抗−ＣＤ３活性化Ｔ細胞に増殖とＩＬ−２の分泌を誘導した（図３ａ）が、ＩＬ−４は誘導しなかった。未分画活性化Ｂ細胞集団で観察されたように、抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体（１３３）は増殖を５０％しか阻止しなかったが、ＩＬ−２分泌は十分に消滅した。前記の通り、Ｆａｂ抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体によるＣＴＬＡ４Ｉｇ結合またはＣＤ２８の遮断は増殖もＩＬ−２分泌も完全に阻止した。対照モノクローナル抗体と対照−Ｉｇは阻止的ではなかった。Ｂ７＋Ｂ細胞により起こされる残余非Ｂ７仲介増殖の原因となっているかもしれない他種潜在的ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８結合性共刺激リガンドを発見する試みでは、増殖とＩＬ−２分泌に対するＢＢ−１モノクローナル抗体の効果を試験した。前記のように、ＢＢ−１モノクローナル抗体は増殖およびＩＬ−２分泌を完全に阻止した（図３ａ）。図３ｂはＢ７−１−活性化ヒト脾臓Ｂ細胞の共刺激能を提示する。照射Ｂ７−１−活性化（７２時間）Ｂ細胞は準分裂促進的活性化ＣＤ４＋リンパ球に明瞭な共刺激シグナルを伝達するであろう。この共刺激は検出可能なＩＬ−２（図３ｂ）またはＩＬ−４の蓄積も伴なわず、抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体は増殖を阻止しなかった。しかしながら、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｆａｂ抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体およびＢＢ−１モノクローナル抗体はすべて増殖を完全に阻止した。
【０１６６】
Ｂ７−１＋およびＢ７−１−活性化脾臓Ｂ細胞のフェノタイプ分析は前記機能的結果を確認した。図４は分画されたＢ７−１＋およびＢ７−１−で活性化されたＢ細胞上でのＢ７−１、Ｂ７−２およびＢ７−３の細胞表面発現を示す。図４に示すように、Ｂ７−１＋活性化脾臓Ｂ細胞は抗−Ｂ７−１（１３３）モノクローナル抗体、ＢＢ−１モノクローナル抗体および結合ＣＴＬＡ４Ｉｇで染色した。対照的に、Ｂ７−活性化脾臓Ｂ細胞は抗−Ｂ７−１（１３３）モノクローナル抗体で染色しなかったが、ＢＢ−１モノクローナル抗体およびＣＴＬＡ４Ｉｇでは染色した。これらフェノタイプおよび機能的結果はＢ７−１＋およびＢ７−１−活性化（７２時間）ヒトＢリンパ球が１）準分裂促進的に活性化されたＴ細胞に検出可能なＩＬ−２分泌を伴わずに増殖を誘導し、また、２）ＢＢ−１モノクローナル抗体には認識されるが、抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体には認識されないＣＴＬＡ４結合カウンターレセプターを発現することを証明する。そこで、これらＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドはＢ細胞活性化後の一時的発現およびそれらとＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗−Ｂ７モノクローナル抗体との反応性を基にして区別することができる。図４は５回の実験結果を表す。
【０１６７】
実施例３  ヒトＢ細胞活性化後、３種の異なるＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドが発現する
活性化後ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプターの逐次的発現を判定するため、ヒト脾臓Ｂ細胞を表面ＩｇまたはＭＨＣクラスＩＩの交差結合により活性化し、Ｂ７−１、Ｂ７−３およびＢ７−２結合蛋白質の発現をフローサイトメトリー分析により検討した。ＩｇまたはＭＨＣクラスＩＩの交差結合は同様なパターンのＣＴＬＡ４Ｉｇ結合を誘導した（図５および６）。図５は抗−Ｂ７−１およびＢＢ−１結合の実験２５回の結果およびＣＴＬＡ４Ｉｇ結合の実験５回の結果を表す。図６は抗−Ｂ７−１結合の実験２５回の結果およびＣＴＬＡ４Ｉｇ結合の実験５回の結果である。これらの実験結果は２４時間より前にはこれらの分子はどれも発現されていないことを示す。活性化後２４時間には多数の細胞がＣＴＬＡ４Ｉｇに結合する蛋白質を発現するが（Ｂ７−２）、しかしながら２０％以下がＢ７−１またはＢ７−３を発現する。ＭＨＣクラスＩＩの交差結合は４８時間目にＢ７−１およびＢ７−３を最大に誘導し、Ｉｇの交差結合は７２時間目に最大発現を誘導し、その後は発現が減少する。これらの結果は新種のＣＴＬＡ４結合カウンターレセプターは２４時間に発現され、種類の異なるＢ７−１とＢ７−３蛋白質の一時的発現と時間的に一致しているように見えることを示唆する。
【０１６８】
一連の実験を行って、このＣＴＬＡ４結合カウンターレセプターの一時的発現とＴ細胞の増殖および／またはＩＬ−２分泌を共刺激する能力との相関が異なるかどうかを判定した。抗−ＣＤ３で準分裂促進的に刺激したヒト脾臓ＣＤ２８＋Ｔ細胞をあらかじめ試験管内で２４、４８または７２時間ｓＩｇと交差結合して活性化しておいた照射ヒト脾臓Ｂ細胞の存在下に７２時間培養した。ＩＬ−２分泌は２４時間後上清液中でＥＬＩＳＡにより評価し、Ｔ細胞増殖は培養７２時間の最終１５時間の間の３Ｈ−チミジン取込みにより評価した。図７は実験５回の結果を表す。図７ａに見られるように、２４時間活性化Ｂ細胞は中庸な水準のＩＬ−２生産を伴う共刺激的シグナルを与えたが、その増殖の程度は４８時間および７２時間活性化ヒトＢ細胞で観察されるよりも顕著に少なかった（３Ｈ−チミ
ジン取込みのスケールに注目）。抗−Ｂ７−１（１３３）またはＢＢ−１はいずれも増殖もＩＬ−２蓄積も阻止しなかった。対照的にＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗−ＣＤ２８Ｆａｂモノクローナル抗体は増殖とＩＬ−２蓄積を完全に消滅させた。４８時間活性化したＢ細胞は共刺激を起こし、その結果殆ど最大の増殖とＩＬ−２分泌に到った（図７ｂ）。ここに、抗−Ｂ７−１（１３３）モノクローナル抗体は増殖を約５０％阻止したが、ＩＬ−２蓄積は完全に遮断した。ＢＢ−１モノクローナル抗体は増殖およびＩＬ−２分泌を完全に阻止した。前記のように、ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＦａｂ抗−ＣＤ２８も増殖およびＩＬ−２生産を完全に遮断した。最後に、７２時間活性化Ｂ細胞は４８時間活性化Ｂ細胞により誘導されるものと同じＴ細胞の反応を誘導した。もし、準分裂促進的シグナルがホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）から伝達されれば、また、ヒト脾臓Ｂ細胞がＩｇ交差結合でなくて、ＭＨＣクラスＩＩにより活性化されていれば同様な結果が観察される。これらの結果はＣＴＬＡ４結合分子には３種あり、一時的に活性化Ｂ細胞に発現され、各々がＴ細胞に準分裂促進的な増殖を刺激誘導できることを示す。これらの分子の中で２種、早期ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプター（Ｂ７−２）およびＢ７−１（１３３）はＩＬ−２生産を誘導するが、一方、Ｂ７−３は検出可能なＩＬ−２生産なしに増殖を誘導する。
【０１６９】
以前の報告には抗−Ｂ７モノクローナル抗体、１３３およびモノクローナル抗体ＢＢ−１が同じ分子を認識するか否かについて矛盾する証拠を提出されていた（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：３２６０〜３２６７頁；Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．など（１９８２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２８巻：８２３〜８２７頁；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻：２７１４〜２７２２頁）。両モノクローナル抗体はヒトＢ細胞活性化４８時間後に発現する分子を認識するが、いくつかの報告はＢ７（Ｂ７−１）とモノクローナル抗体ＢＢ−１が認識する分子とは細胞系により、またＢ細胞新生物上で、異なって発現されるので相違することを示唆していた（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：３２６０〜３２６７頁；Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．など（１９８２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２８巻：８２３〜８２７頁；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻：２７１４〜２７２２頁；Ｃｌａｒｋ，Ｅ．とＹｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．（１９８４年）、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ・Ｔｙｐｉｎｇ，１ｓｔ・Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ・Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ・Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、３３９〜３４６頁；Ｃｌａｒｋ，Ｅ．など（１９８４年）、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ・Ｔｙｐｉｎｇ，１ｓｔ・Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ・Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ・Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、７４０頁）。加えて、これらＩｇＭモノクローナル抗体の免疫沈降とウエスターンブロッティングはそれらが異なる分子を認識することを示唆した（Ｃｌａｒｋ，Ｅ．とＹｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．（１９８４年）、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ・Ｔｙｐｉｎｇ，１ｓｔ・Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ・Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ・Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、３３９〜３４６頁；Ｃｌａｒｋ，Ｅ．（１９８４年）、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ・Ｔｙｐｉｎｇ，１ｓｔ・Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ・Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ・Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、７４０頁）。本来の抗−Ｂ７モノクローナル抗体１３３は抗−免疫グロブリン活性化ヒトＢリンパ球での免疫により生成したが、一方、ＢＢ−１モノクローナル抗体はヒヒの細胞系での免疫によって生成した。それ故に、ＢＢ−１モノクローナル抗体はヒヒとヒトとの間で保存されているヒト細胞のエピトープを認識する筈である。
【０１７０】
ヒトＢ７遺伝子（Ｂ７−１）の分子クローニングと発現の後、Ｂ７トランスフェクトＣＯＳ細胞が抗−Ｂ７（１３３）とＢＢ−１モノクローナル抗体で同様に染色されることが見出され、それら両方が同一の広い分子バンド（４４〜５４ｋＤ）を沈降してそれらが同じ分子を認識することを強く示唆した（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻：２７１４〜２７２２頁）。この発見はＢＢ−１モノクローナル抗体により認識される分子をコードする遺伝子が以前に染色体１２に割付けられ（Ｋａｔｚ，Ｆ．Ｅ．など（１９８５年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０３〜６頁）、一方、２つのグループがＢ７遺伝子を染色体３に置いた（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９９２年）、Ｂｌｏｏｄ、７９巻：４８９〜４９４頁；Ｓｅｌｖａｋｕｍａｒ，Ａ．など（１９９２年）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、３６巻：１７５〜１８１頁）ので、予想外であった。その後、Ｂ７（Ｂ７−１）とＢＢ−１モノクローナル抗体が認識する分子の間のフェノタイプ発現に別の相違が注目された。ＢＢ−１モノクローナル抗体は胸腺上皮細胞（Ｔｕｒｋａ，Ｌ．Ａ．など（１９９１年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６巻：１４２８〜３６頁；Ｍｕｎｒｏ，Ｊ．Ｍ．など、Ｂｌｏｏｄ、投稿済）およびケラチノサイト（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．など（１９９３年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４２巻：１０２９〜１０４０頁；Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｍ．など（１９９３年）、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１００巻：２７５〜２８１頁）を染色するが、一方、抗−Ｂ７はこれを染色しなかった。最近、Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆなど（１９９３年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４２巻：１０２９〜１０４０頁はＢＢ−１および抗−Ｂ７（Ｂ１．１および１３３）モノクローナル抗体を用いてケラチノサイトでＢＢ−１モノクローナル抗体およびＢ７が認識する分子の不協和な発現を報告した。ＮｉｃｋｏｌｏｆｆなどはこれらＢＢ−１陽性細胞はＢ７ｍＲＮＡを発現しないがＣＤ２８トランスフェクトＣＯＳ細胞に結合して、モノクローナル抗体ＢＢ−１と結合する異なる蛋白質の存在に対する別の証拠があることも証明した。
【０１７１】
今回の発見はＢＢ−１モノクローナル抗体Ｂ７−３が認識する別のＣＴＬＡ４カウンターレセプターが存在することおよびこの蛋白質が機能的にはＢ７−１（１３３）とは相違することを確認するものである。Ｂ細胞活性化後のＢ７−１およびＢ７−３の発現はＢ７陽性Ｂ細胞では時間的に一致すると思われるが、これらの研究からＢ７−３分子はＢ７陰性活性化Ｂ細胞でも発現されることを立証する。さらに重要なことには、Ｂ７−３分子は検出可能なＩＬ−２またはＩＬ−４生産なしにＴ細胞増殖を誘導できると思われることである。この結果はＩＣＡＭ−１は検出可能なＩＬ−２またはＩＬ−４の生産なしにＴ細胞増殖を共刺激できる（Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．印刷中）という以前の観察に類似している。これらのデータはＢＢ−１モノクローナル抗体はＢ７−１蛋白質上のエピトープを認識することおよびこのエピトープは共刺激的機能を持っているが異なる蛋白質Ｂ７−３にも存在することを示す。フェノタイプおよび遮断の研究からＢＢ−１モノクローナル抗体はこれら蛋白質の１種（Ｂ７陰性細胞上）または両方（Ｂ７陽性細胞上）を認識できることが証明された。対照的に、抗−Ｂ７モノクローナル抗体１３３およびＢ１．１はＢ７−１蛋白質のみを認識する。総合すると、これらの結果は表面免疫グロブリンまたはＭＨＣクラスＩＩの交差結合によるＢ細胞の活性化４８時間後、Ｂ細胞は一方は抗−Ｂ７およびＢＢ−１モノクローナル抗体の両方により認識されるものおよび他方はＢＢ−１モノクローナル抗体のみにより認識されるものの少なくとも２種の異なるＣＴＬＡ４結合カウンターレセプターを発現することを示唆する。
【０１７２】
Ｂ７−２抗原は活性化Ｂ細胞上では１２時間後には検出されないが、２４時間には強く発現し、機能を示す。増殖とＩＬ−２生産がＦａｂ抗−ＣＤ２８モノクローナルにより完全に阻害されるので、この分子はＣＤ２８を経てシグナル伝達しているように思われる。抗−Ｂ７モノクローナル抗体がＩＬ−２生産を完全に遮断するので、活性化４８時間後になるとＩＬ−２分泌はＢ７−１共刺激に起因していると思われる。
【０１７３】
以前の研究およびここに記載した結果からＢ細胞活性化後４８時間まではＢ７（Ｂ７−１）は発現されず（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：３２６０〜３２６７頁；Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９９１年）、Ｃｅｌｌ・Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：４２９〜４３７頁）Ｔ細胞増殖またはＩＬ−２分泌を共刺激することもできないことが立証される。以前の研究から共刺激不在下でのＴＣＲを経るＴ細胞の活性化（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６５８６〜６５９０頁；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．など（１９８９年）、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５４巻：６０５〜１０頁；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｂ．など（１９９２年）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４巻：６６１〜６７１頁）およびＩＬ−２の不在（Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、投稿済；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｂ．など（１９９２年）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４巻：６６１〜６７１頁；Ｗｏｏｄ，Ｍ．など（１９９３年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻：５９７〜６０３頁）はアネルギーを起こすことが証明されている。Ｂ７−１がＩＬ−２分泌の誘導が可能な唯一の共刺激分子であったとすれば、ＩＬ−２生産を共刺激するＢ７−１が存在しないので、Ｔ細胞は活性化後最初の２４時間にはアネルギー化されるものと思われる。それ故、他に最初の２４時間にＩＬ−２分泌を共刺激できる早期誘導可能な共刺激分子の存在はアネルギーではなく、効果的免疫反応を誘導するために必要と思われる。Ｂ細胞活性化１２時間と２４時間との間の早期ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプター、Ｂ７−２、の出現はこの機能を果たす。
【０１７４】
追加されたこれらＣＴＬＡ４結合カウンターレセプター２種の生物学的および潜在的臨床的意義について２個の新知見が光明をもたらした。第一に、Ｂ７（Ｂ７−１）欠失マウスが開発されたが、その抗原提示細胞もＣＴＬＡ４Ｉｇに結合することが見出された（ＦｒｅｅｍａｎとＳｈａｒｐｅ、投稿準備中）。このマウスは健常であり、分離された単核球は試験管内でＴ細胞と培養する時には検出可能な水準のＩＬ−２を誘導する。それ故、別のＣＤ２８共刺激的カウンター受容体または別のＩＬ−２生産経路が機能している筈である。第二にはネズミとヒトの系で抗原特異的アネルギーを誘導する最有力な試薬はＣＴＬＡ４ＩｇおよびＦａｂ抗−ＣＤ２８であるが、一方、抗−Ｂ７モノクローナル抗体ははるかに弱い（Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．Ａ．など（１９９２年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻：６０７〜６０９頁；Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ｄ．Ｊ．など（１９９２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７巻：７８９〜７９２頁；Ｃｈｅｎ，Ｌ．など（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、７１巻：１０９３〜１１０２頁；Ｔａｎ，Ｐ．など（１９９３年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻：１６５〜１７３頁）。これらの観察もＩＬ−２を誘導することのできる別種ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドが存在するとの仮説に一致し、ここに提出する結果を勘案すれば、ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプター３種全てがＴ細胞免疫の誘導に必須であろうことを示唆する。さらにＴ細胞アネルギーの誘導のためにはそれらの遮断が必要であると思われる。同一の結果がヒトのＢ７−１およびＢ７−２分子に対応するＣＴＬＡ４結合リガンド２種の認識によりネズミの系でも観察された。Ｂ７欠失マウスのＡＰＣはＣＴＬＡ４と結合し、ＩＬ−２分泌を誘導できる。総合すると、これらの観察はネズミの系では多重ＣＴＬＡ４結合のカウンターレセプターが存在し、逐次にＴ細胞活性化を共刺激していることを示す。
【０１７５】
実施例４  Ｂ７−２抗原のクローニング、配列決定および発現
Ａ．ｃＤＮＡライブラリーの構築
文献記載（Ａｒｕｆｆｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））のヒト抗−ＩｇＭ活性化Ｂ細胞からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いてｐＣＤＭ８ベクター（Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３２
９巻：８４０頁（１９８７年））中にｃＤＮＡライブラリーを構築した。脾臓Ｂ細胞を組織培養フラスコ中、完全培養培地｛１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ−グルタミン、１ｍＭ−ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および硫酸ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）｝中２×１０６細胞／ｍＬに培養し、ｓＩｇとＡｆｆｉ−Ｇｅｌ・７０２ビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）（Ｂｏｙｄ，Ａ．Ｗ．など（１９８５年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４巻：１５１６頁）結合アフィニティー精製ウサギ抗−ヒトＩｇＭとの交差結合により活性化した。活性化Ｂ細胞を１／６、１／２、４、８、１２、２４、４８、７２および９６時間後に収穫した。
【０１７６】
活性化Ｂ細胞を４Ｍ−チオシアン酸グアニジン、０．５％ザルコシール、２５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、０．１３％Ｓｉｇｍａ社アンチフォームＡおよび０．７％メルカプトエタノールの溶液中でホモゲナイズしてＲＮＡを調製した。ＲＮＡはこのホモジェネートを５．７Ｍ−ＣｓＣｌ、１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、２５ｍＭ−酢酸ナトリウム、ｐＨ７から毎分３２０００回転で２４時間遠心分離して精製した。ＲＮＡのペレットを５％ザルコシル、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、１０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５に溶解し、５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール混液２容で抽出した。ＲＮＡはエタノールから２回沈降させた。ｃＤＮＡライブラリー構築に用いたポリ（Ａ）＋ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）−セルロース選択２サイクルにより精製した。
【０１７７】
抗−ＩｇＭ活性化ヒトＢ細胞ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ５．５μｇから５０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．３、７５ｍＭ−ＫＣｌ、３ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ−ジチオスレイトール、５００μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、オリゴ（ｄＴ）１２〜１８５０μｇ／ｍＬ、ＲＮａｓｉｎ１８０単位／ｍＬおよびＭｏｌｏｎｅｙ−ＭＬＶ逆転写酵素１００００単位／ｍＬを全容５５μＬ中に含む反応液中で３７℃１時間で相補ＤＮＡを合成した。 逆転写後、溶液を２５ｍＭ−トリ ス、ｐＨ８．３、１００ｍＭ−ＫＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、各２５０μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５ｍＭ−ジチオスレイトール、ＤＮＡポリメラーゼＩ２５０単位／ｍＬ、リボヌクレアーゼＨ８．５単位／ｍＬに調整し、１６℃で２時間インキュベーションして、ｃＤＮＡを二重鎖ＤＮＡに変換した。ＥＤＴＡを添加して１８ｍＭとし、溶液を５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール混液等容で抽出した。ＤＮＡは２．５Ｍ−酢酸アンモニウムと担体としての直線状ポリアクリルアミド４μｇとの存在下にエタノール２容で沈殿させた。別に抗−ＩｇＭ活性化ヒトＢ細胞ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ４μｇから５０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．８、オリゴ（ｄＴ）１２〜１８５０μｇ／ｍＬ、ＲＮａｓｉｎ３２７単位／ｍＬおよびＡＭＶ逆転写酵素９５２単位／ｍＬを全容１００μＬ中に含む反応液中０．６７時間４２℃でｃＤＮＡを合成した。逆転写後、７０℃に１０分間加熱して逆転写酵素を不活化した。水３２０μＬと０．１Ｍ−トリス、ｐＨ７．５、２５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ−ＫＣｌ、ウシ血清アルブミン２５０μｇ／ｍＬおよび５０ｍＭ−ジチオスレイトールの溶液８０μＬとを加え、溶液を各２００μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼＩ５０単位／ｍＬ、リボヌクレアーゼＨ８単位／ｍＬに調整し、１６℃で２時間インキュベートしてｃＤＮＡを二重鎖ＤＮＡに変換した。ＥＤＴＡを添加して１８ｍＭとし、溶液を５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール混液等容で抽出した。ＤＮＡを２．５Ｍ−酢酸アンモニウムおよび担体としての直線状ポリアクリルアミド４μｇの存在下にエタノール２容で沈降させた。
【０１７８】
ＡＭＶ逆転写４μｇおよびＭｏｌｏｎｅｙＭＬＶ逆転写２μｇからのＤＮＡを混合した。非自己相補ＢｓｔＸＩアダプターを以下のようにＤＮＡに添加した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ６μｇからの二重鎖ｃＤＮＡをキナーゼ処理した配列ＣＴＴＴＡＧＡＧＣＡＣＡ（配列番号１５）のオリゴヌクレオチド３．６μｇおよびキナーゼ処理した配列ＣＴＣＴＡＡＡＧ（配列番号１６）のオリゴヌクレオチド２．４μｇとを６ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５、６ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＮａＣｌ、ウシ血清アルブミン３５０μｇ／ｍＬ、７ｍＭ−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ−ＡＴＰ、２ｍＭ−ジチオスレイトール、１ｍＭ−スペルミジンおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ６００単位を含む溶液全容０．４５ｍＬ中、１５℃で１６時間インキュベーションした。ＥＤＴＡを添加して３４ｍＭとし、溶液を５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール混液等容で抽出した。ＤＮＡは２．５Ｍ−酢酸アンモニウムの存在下にエタノール２容から沈降させた。
【０１７９】
６００ｂｐより大きいＤＮＡは以下の通りに選択した：アダプターＤＮＡを１０ｍＭ−トリス、ｐＨ８、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、６００ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１％ザルコシル中に再溶解し、セファロースＣＬ−４Ｂカラム上、同一緩衝液でクロマトグラフィーした。カラム空隙容積中のＤＮＡ（６００ｂｐ以上のＤＮＡを含む）を集め、エタノール沈降した。
【０１８０】
ｐＣＤＭ８ベクターをＢｓｔＸＩ消化とアガロースゲル精製とにより調製し、ｃＤＮＡクローニングに用いた。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ６μｇからのアダプターＤＮＡを２．２５μｇのＢｓｔＸＩ切断ｐＣＤＭ８に６ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５、６ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＮａＣｌ、ウシ血清アルブミン３５０μｇ／ｍＬ、７ｍＭ−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ−ＡＴＰ、２ｍＭ−ジチオスレイトール、１ｍＭ−スペルミジンおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ６００単位を全容１．５ｍＬ中に含む溶液中で１５℃で２４時間リゲートした。リゲート反応混合物を感応大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３に形質転換して独立のｃＤＮＡクローン合計４２９００００個を得た。
プラスミドＤＮＡはｃＤＮＡライブラリー形質転換体の培養液５００ｍＬから製造した。プラスミドＤＮＡをアルカリ分解法により精製し、続いてＣｓＣｌ平衡勾配２回でバンド化分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８７年））。
Ｂ．クローニング操作法
【０１８１】
スクリーニングの第一段階で、５０％密集生長ＣＯＳ細胞の１００ｍｍシャーレ３０個を抗−ＩｇＭ活性化ヒトＢ細胞ライブラリーＤＮＡ０．０５μｇ／ｍＬでＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｅｅｄなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））を用いてトランスフェクトした。細胞をトリプシン処理し、２４時間後に再播種した。４７時間後、細胞をＰＢＳ／０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４／０．０２％アジ化ナトリウム中で３０分間３７℃でインキュベーションして剥離した。脱離細胞をＣＴＬＡ４ＩｇおよびＣＤ２８Ｉｇ１０μｇ／ｍＬで４５分間４℃で処理した。細胞を洗い、アフィニティー精製ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体で被覆した培養皿に散布し、室温で付着させた。３時間後、プレートをＰＢＳ／０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４／０．０２％アジ化ナトリウム、５％ＦＣＳで２回と０．１５Ｍ−ＮａＣｌ、０．０１Ｍ−Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、５％ＦＣＳで１回穏やかに洗浄した。エピソームＤＮＡを培養（ｐａｎ）細胞から集め、大腸菌ＤＨ１０Ｂ／Ｐ３に形質転換した。プラスミドＤＮＡを文献記載のスフェロプラスト融合（Ｓｅｅｄなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））によりＣＯＳ細胞に再導入し、発現と培養を２回反復した。
【０１８２】
選択の第二および第三段階では、４７時間後、脱離したＣＯＳ細胞を初めにα−Ｂ７−１ｍＡｂｓ（１３３およびＢ１．１、１０μｇ／ｍＬ）とインキュベーションし、Ｂ７−１を発現するＣＯＳ細胞をα−マウスＩｇＧおよびＩｇＭ被覆磁気ビーズで除去した。ＣＯＳ細胞を次にヒトＣＴＬＡ４Ｉｇ（ｈＣＴＬＡ４Ｉｇ）およびヒトＣＤ２８Ｉｇ（ｈＣＤ２８Ｉｇ）１０μｇ／ｍＬで処理し、ヒトＢ７−２発現ＣＯＳ細胞をヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体プレートのディッシュ上で培養して選択した。第三段階後、各コロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＣＯＳ細胞上のＢ７−２発現はＣＴＬＡ４Ｉｇとの間接免疫螢光法により分析した。
【０１８３】
選択の最終段階後、各コロニーからプラスミドＤＮＡを製造した。候補クローン４８個の中から全部で４個が約１．２ｋｂのｃＤＮＡ挿入断片を含んでいた。これら４個のクローンをＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。クローン４個全てはＣＴＬＡ４Ｉｇを用いる間接免疫螢光法およびフローサイトメトリー分析によればＢ７−２発現が強陽性であった。
Ｃ．配列決定
【０１８４】
クローン２９のＢ７−２ｃＤＮＡ挿入断片を以下の方策を用いてｐＣＤＭ８発現ベクター中で配列決定した。最初の配列決定はプライマーＴ７、クローン化したＢ７−２ｃＤＮＡに隣接するＣＤＭ８ベクター配列に相同のＣＤＭ８Ｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った（表Ｉ参照）。配列決定は色素終結反応およびＡＢＩ自動ＤＮＡ配列決定器（ＡＢＩ社、Ｆｏｓｔｅｒ・Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して行った。これらのプライマーを使用して得られたＤＮＡ配列を用いて次の配列決定プライマーを設計した（表Ｉ参照）。この配列決定および次のプライマー選択のサイクルを両鎖についてＢ７−２ｃＤＮＡが完全に配列決定されるまで継続した。
【表１】
2009060905.tif 000002
【０１８５】
ヒトＢ７−２クローン２９は１１２０塩基対の挿入断片と９８７ヌクレオチドの単一の長い読み枠および約２７ヌクレオチドの３’非コード配列を含んでいた（図８、配列番号１）。この蛋白質のオープン読み枠がコードすると予測されるアミノ酸配列を図８のヌクレオチド配列の下に示す。コードされた蛋白質であるヒトＢ７−２は長さ３２９アミノ酸であると予測される（配列番号２）。この蛋白質配列は他の１型Ｉｇスーパーファミリー膜蛋白質に共通の特徴を多数示す。蛋白質翻訳はコンセンサス真核細胞翻訳開始部位（Ｋｏｚａｋ，Ｍ（１９８７年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１５巻：８１２５〜８１４８頁）とのこの領域でのＤＮＡ相同性を基にして、ＡＴＧコドン（ヌクレオチド１０７〜１０９）から始まると予測される。ヒトＢ７−２蛋白質のアミノ端末（アミノ酸１から２３）は２３位と２４位のアラニンの間に予測切断部位（ｖｏｎ・Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１４巻：４６８３頁）のある分泌シグナルペプチドの特性を持つ。この部位でのプロセッシングは未修飾分子量約３４ｋＤａを持つ３０６アミノ酸のヒトＢ７−２膜結合蛋白質をもたらすと思われる。この蛋白質は大体アミノ酸残基２４〜２４５の細胞外ＩｇスーパーファミリーＶおよびＣ様ドメイン、大体アミノ酸残基２４６〜２６８の親水性膜貫通ドメインおよび大体アミノ酸残基２６９〜３２９の長い原形質ドメインからなると思われる。Ｉｇスーパーファミリーとの相同性は４０から１１０位および１５７から２１８位にあるシステインで結合する細胞外領域中の近接するＩｇ様ドメイン２個に起因する。細胞外ドメインはＮ−結合グリコシル化の可能性ある部位８個も含む。ヒトＢ７−２蛋白質をコードするクローン２９のｃＤＮＡ挿入断片を含むベクターでトランスフェクトした大腸菌は、１９９３年７月２６日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号６９３５７で寄託された。
【０１８６】
ヒトＢ７−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の双方のＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースとの比較で、ヒトおよびネズミＢ７−１蛋白質だけが関連していることが判った。Ｂ７蛋白質配列３種を並べると（図１３）ヒトＢ７−２はヒトＢ７−１と約２６％のアミノ酸同一性を持つことが判る。図１３はヒトＢ７−２（ｈＢ７−２）（配列番号２）、ヒトＢ７−１（ｈＢ７−１）（配列番号２８および２９）およびネズミＢ７（ｍＢ７）（配列番号３０および３１）のアミノ酸配列の比較を示す。ヒトＢ７−１およびネズミＢ７（以下ネズミＢ７−１と記載する）のアミノ酸配列は各々Ｇｅｎｂａｎｋに寄託番号＃Ｍ２７５３３およびＸ６０９５８として見出すことができる。図１３の垂直線はｈＢ７−２およびｈＢ７−１またはｍＢ７との間の同一のアミノ酸を示す。ｈＢ７−１とｍＢ７との間の同一アミノ酸は示していない。ｈＢ７−２蛋白質はＩｇスーパーファミリーが持つ共通のシステイン（ＩｇＶドメインの４０位と１１０位、ＩｇＣドメインの１５７位と２１７位）および他の多数の共通アミノ酸により定義付けられるｈＢ７−１と同じ一般構造を示す。ｈＢ７−１とｍＢ７は両方ともヒトＣＴＬＡ４およびヒトＣＤ２８に結合することが知られているので、これらの関連蛋白質２種の間に共通なアミノ酸はＣＴＬＡ４またはＣＤ２８結合配列を含むのに必要であると思われる。この配列の例はＫＹＭＧＲＴＳＦＤ（８１〜８９位、ｈＢ７−２）（配列番号１７）またはＫＳＱＤＮＶＴＥＬＹＤＶＳ（１８８〜２００位、ｈＢ７−２）（配列番号１８）である。別の関連配列は配列比較から明らかであり、他はアスパラギン酸とグルタミン酸、アラニンとグリシンおよび他の認められた機能関連アミノ酸のような相同的に関連したアミノ酸を考慮することによって推論できる。Ｂ７配列はおそらく細胞内シグナル伝達に関与しているであろう原形質部分ＷＫＷＫＫＫＫＲＰＲＮＳＹＫＣ（２６９〜２８２位、ｈＢ７−２）（配列番号１９）に高度にプラス荷電したドメインを持つ。
【０１８７】
実施例５  組換えＢ７−２抗原の特性
Ａ．Ｂ７−２はＣＴＬＡ４Ｉｇと結合するが抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３モノクローナル抗体とは結合しない
ＣＯＳ細胞をベクターＤＮＡ（ｐＣＤＮＡＩ）またはＢ７−１（Ｂ７−１）またはＢ７−２（Ｂ７−２）を含む発現プラスミドのいずれかでトランスフェクトした。７２時間後、トランスフェクトしたＣＯＳ細胞を０．５ｍＭ−ＥＤＴＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で３０分間３７℃でインキュベーションして脱離した。この細胞を細胞表面発現について間接免疫螢光法とイソチオシアン酸フルオレッセイン結合（ＦＩＴＣ）ヤギ抗−マウスＩｇまたはヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを用いるフローサイトメトリー分析法で分析した（図９）。Ｂ７−１の細胞表面発現はｍＡｂｓ１３３（抗−Ｂ７−１）およびＢＢ−１（抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３）で、およびＣＴＬＡ４Ｉｇで検出し、一方Ｂ７−２はＣＴＬＡ４Ｉｇのみと反応させた。Ｂ７トランスフェション体はいずれもイソタイプ対照（ＩｇＭまたは対照Ｉｇ）では染色されなかった。ベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞はどの検出試薬でも染色されなかった。さらに、どの細胞もＦＩＴＣ標識検出試薬でも染色されなかった。これはＢ７−２がＣＴＬＡ４カウンターレセプターである蛋白質をコードしてはいるが、Ｂ７−１ともＢ７−３とも異なることを証明する。
Ｂ．非刺激および活性化ヒトＢ細胞、細胞系および骨髄腫におけるＢ７−２発現のＲＮＡブロット分析
【０１８８】
ヒト脾臓Ｂ細胞をＴ細胞と単核球を除去することにより文献記載（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｃ．，Ｄａｌｅｙ，Ｊ．，Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７年）、１３７巻：３２６０〜３２６７頁）通りに分離した。脾臓Ｂ細胞を抗−Ｉｇビーズを用いて活性化し、細胞を記載の時点で収穫した（Ｆｒｅｅｄｍａｎなど（１９８７年）、前出）。骨髄標本のＥロゼット化と付着を用いて報告（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９年）、１４３巻：２７１４〜２７２２頁）通りにＴ細胞および単核球を除去してヒト骨髄腫を精製した。ＲＮＡをチオシアン酸グアニジンによるホモゲナイズ化および塩化セシウム遠心分離によって調製した。等量のＲＮＡ（２０μｇ）をアガロースゲル上で電気泳動し、染色し、３２Ｐ−標識Ｂ７−２ｃＤＮＡにハイブリド化した。図１０のａには非刺激および抗−Ｉｇ活性化ヒト脾臓Ｂ細胞およびＲａｊｉ（Ｂ細胞バーキットリンパ腫）、Ｄａｕｄｉ（Ｂ細胞バーキットリンパ腫）、ＲＰＭＩ８２２６（骨髄腫）、Ｋ５６２（赤白血病）およびＲＥＸ（Ｔ細胞急性リンパ芽球白血病）を含む細胞系のＲＮＡブロット分析を示す。図１０のｂにはヒト骨髄腫のＲＮＡブロット分析を示す。
【０１８９】
Ｂ７−２ｃＤＮＡへのハイブリッド化により１．３５、１．６５および３．０ｋｂのｍＲＮＡトランスクリプト３個を検出した（図１０のｂ）。ＲＮＡのブロット分析はＢ７−２ｍＲＮＡは非刺激ヒト脾臓Ｂ細胞中に発現され、活性化後４倍に増加することを証明した。Ｂ７−２ｍＲＮＡはＢ細胞新生物系（Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ）と骨髄腫（ＲＰＭＩ８２２６）とで発現されたが、赤白血病Ｋ５６２およびＴ細胞系ＲＥＸでは発現されなかった。対照的に、我々は以前にＢ７−１ｍＲＮＡは休止Ｂ細胞では発現されず、活性化後は一時的に発現されることを報告した（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、前出）。ヒト骨髄腫から分離したｍＲＮＡの研究からＢ７−２ｍＲＮＡは患者６人中で６人に発現されていることを証明したが、Ｂ７−１はこの６人中で１人にのみ発見された（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、前出）。そこで、Ｂ７−１とＢ７−２との発現は独立に制御されていることが明らかである。
Ｃ．共刺激
【０１９０】
ヒトＣＤ２８＋Ｔ細胞を以前の文献報告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６５８６〜６５９０頁）通りに免疫磁気ビーズ除去法によりＢ細胞、天然キラー細胞およびマクロファージに対するモノクローナル抗体を用いて分離した。Ｂ７−１、Ｂ７−２およびベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞をトランスフェクト後７２時間に収穫し、マイトマイシンＣ２５μｇ／ｍＬと１時間インキュベーションし、次に十分に洗浄した。１０５ＣＤ２８＋およびＴ細胞をホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）１ｎｇ／ｍＬおよび指摘した数のＣＯＳトランスフェクト体とインキュベーションした（図１１）。図１１のａに示すように、Ｔ細胞の増殖は７２時間のインキュベーションの最後の１２時間に取込まれた３Ｈ−チミジン（１μＣｉ）により測定した。図１１のｂは培養開始２４時間後に収穫した上清液を用いるＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＣＡ）により測定されたＴ細胞によるＩＬ−２生産を示す。
Ｄ．Ｂ７−２共刺激は抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３ｍＡｂｓでは遮断されないが、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗−ＣＤ２８Ｆａｂによって遮断される
【０１９１】
ヒトＣＤ２８＋Ｔ細胞をＢ細胞、天然キラー細胞およびマクロファージに対するｍＡｂｓを用いて以前の報告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．、Ｇｒｉｂｂｅｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｇｒａｙ，Ｇ．、Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６５８６〜６５９０頁）通りに免疫ビーズ除去法により分離した。Ｂ７−１、Ｂ７−２およびベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞をトランスフェクション後７２時間目に収穫し、マイトマイシンＣ２５μｇ／ｍＬと１時間インキュベーションし、次に十分に洗浄した。ＣＤ２８＋Ｔ細胞１０５個をホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）１ｎｇ／ｍＬとＣＯＳトランスフェクト体２×１０４個とともにインキュベーションした。遮断剤（１０μｇ／ｍＬ）は図１２の左端に示したが、１）モノクローナル抗体不含（遮断剤なし）、２）ｍＡｂ１３３（抗−Ｂ７−１ｍＡｂ）、３）ｍＡｂＢＢ−１（抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３ｍＡｂ）、４）ｍＡｂＢ５（対照ＩｇＭｍＡｂ）、５）抗−ＣＤ２８Ｆａｂ（ｍＡｂ９．３）、６）ＣＴＬＡ−Ｉｇおよび７）対照Ｉｇを含む。図１２のａは７２時間インキュベーションの最後の１２時間の３Ｈ−チミジン（１μＣｉ）取込みにより測定された増殖を示す。図１２のｂは培養開始２４時間後に収穫した上清液を用いてＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＣＡ）で測定したＩＬ−２生産を示す。
【０１９２】
Ｂ７−１およびＢ７−２をトランスフェクトしたＣＯＳ細胞は広範な刺激体／応答体細胞比率で検査した時に相応水準のＴ細胞増殖を共刺激した（図１１）。Ｂ７−１と同様にＢ７−２をトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の共刺激は広範な刺激体／応答体細胞比率でＩＬ−２生産を示した（図１１）。対照的に、ベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞はＴ細胞増殖もＩＬ−２生産も共刺激しなかった。
Ｅ．Ｂ７−２共刺激は抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３ｍＡｂｓでは遮断されないが、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび抗−ＣＤ２８Ｆａｂによって遮断される
【０１９３】
ヒトＣＤ２８＋Ｔ細胞をＢ細胞、天然キラー細胞およびマクロファージに対するｍＡｂを用いて以前の報告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．、Ｇｒｉｂｂｅｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｇｒａｙ，Ｇ．、Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６５８６〜６５９０頁）通りに免疫ビーズ除去法により分離した。Ｂ７−１、Ｂ７−２およびベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞をトランスフェクション後７２時間目に収穫し、マイトマイシンＣ２５μｇ／ｍＬと１時間インキュベーションし、次に十分に洗浄した。ＣＤ２８＋Ｔ細胞１０５個をホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）１ｎｇ／ｍＬおよびＣＯＳトランスフェクト体２×１０４個とともにインキュベーションした。遮断剤（１０μｇ／ｍＬ）は図１２の左端に示したが、１）モノクローナル抗体不含（遮断剤なし）、２）ｍＡｂ１３３（抗−Ｂ７−１ｍＡｂ）、３）ｍＡｂＢＢ−１（抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３ｍＡｂ）、４）ｍＡｂＢ５（対照ＩｇＭｍＡｂ）、５）抗−ＣＤ２８Ｆａｂ（ｍＡｂ９．３）、６）ＣＴＬＡ−Ｉｇおよび７）対照Ｉｇを含む。図１２のａは７２時間インキュベーションの最後の１２時間に取込まれた３Ｈ−チミジン（１μＣｉ）により測定された増殖を示す。図１２のｂは培養開始２４時間後に集めた上清液を用いてＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＣＡ）で測定したＩＬ−２生産を示す。
【０１９４】
Ｂ７−２をＢ７−１およびＢ７−３から区別するために、Ｂ７−１およびＢ７−３に対するｍＡｂを用いて準分裂促進的に活性化したヒトＣＤ２８＋Ｔ細胞の増殖およびＩＬ−２生産を阻止した。Ｂ７−１およびＢ７−２ＣＯＳトランスフェクト体はＴ細胞の増殖およびＩＬ−２生産を共刺激した（図１２）。ｍＡｂ１３３（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）前出）（抗−Ｂ７−１）およびＢＢ１（Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．Ａ．など（総説中）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．、Ｈｏｌｌｙ，Ｒ．Ｄ．、Ｃｌａｒｋ，Ｅ．Ａ．（１９８２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２８巻：８２３〜８２７頁）（抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３）はＢ７−１により誘導された増殖およびＩＬ−２生産を完全に阻止したが、Ｂ７−２をトランスフェクトしたＣＯＳ細胞による共刺激には効果がなかった。イソタイプに適合した対照Ｂ５ｍＡｂは無効であった。Ｂ７−２シグナルがＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を辿るかどうか決定するために抗−ＣＤ２８ＦａｂおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合蛋白質を検査してこれらがＢ７−２共刺激を阻止するかどうか判定した。抗−ＣＤ２８ＦａｂおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇの双方ともＢ７−１またはＢ７−２ＣＯＳトランスフェクト体により誘導された増殖およびＩＬ−２生産を阻止したが、一方、対照Ｉｇ融合蛋白質は無効であった（図１２）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇは増殖のＢ７−２共刺激を９０％だけ阻止したが、別の実験では阻止はさらに大きかった（９８〜１００％）。遮断剤はどれもＰＭＡとフィトヘマグルチニンとの組合せにより誘導されたＴ細胞の増殖もＩＬ−２生産も阻害しなかった。
【０１９５】
Ｂ７−１と同様に、Ｂ７−２はＣＤ２８およびＣＴＬＡ４・Ｔ細胞表面分子に対するカウンターレセプターである。両蛋白質は次の点で類似している：１）ＡＰＣ表面に発現する、２）構造的にＩｇスーパーファミリーに関連し、ＩｇＶおよびＩｇＣドメインを持ち、アミノ酸同一性２６％を持つ；３）Ｔ細胞を共刺激してＩＬ−２を生産し、増殖させる。しかしながら、Ｂ７−１とＢ７−２とはいくつかの点で基本的に相違する。第一に、Ｂ７−２ｍＲＮＡは非刺激Ｂ細胞に構造的に発現されるが、一方、Ｂ７−１ｍＲＮＡは４時間目まで現出せず、細胞表面蛋白質は２４時間目まで検出されない（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）、前出；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、前出）。非刺激ヒトＢ細胞は細胞表面上にＣＴＬＡ４カウンターレセプターを発現せず、Ｔ細胞増殖を共刺激しない（Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．Ａ．など、前出）。それ故、非刺激Ｂ細胞におけるＢ７−２ｍＲＮＡの発現は活性化後にその細胞表面上におそらく貯蔵ｍＲＮＡまたは蛋白質からであろうＢ７−２蛋白質を急速に発現させるものと思われる。Ｂ７−２トランスフェクト体による共刺激は部分的にはパラホルムアルデヒド固定化に敏感であるが、一方、Ｂ７−２共刺激は抵抗性である（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９１年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：６５７５〜６５７９頁）。第二に、細胞系とヒトＢ細胞新生物とでのＢ７−１とＢ７−２との発現は実質的に異なっている。第三に、Ｂ７−２蛋白質はＢ７−１より長い原形質ドメインを持ち、これがＢ細胞の分化に役割を演じるであろう。これらのフェノタイプおよび機能的な相違はこれらの相同性分子は生物学的に明確に異なる機能を持つであろうことを示唆する。
【０１９６】
実施例６  ネズミＢ７−２抗原のクローニングと配列決定
Ａ．ｃＤＮＡライブラリーの構築
文献記載（Ａｒｕｆｆｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））の通りにジブチリル環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）活性化Ｍ１２細胞（ネズミＢ細胞腫瘍系）からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いてｐＣＤＭ８ベクター（Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３２９巻：８４０頁（１９８７年））でｃＤＮＡを構築した。
Ｍ１２細胞を１×１０６細胞／ｍＬまで組織培養フラスコの中で完全培養培地｛１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ−グルタミン、１ｍＭ−ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および硫酸ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）｝で培養し、ジブチリルｃＡＭＰ３００μｇ／ｍＬで活性化した（Ｎａｂａｖｉ，Ｎ．など（１９９２年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６０巻：２６６〜２６８頁）。０、６、１２、１８、２４および３０時間後に活性化Ｍ１２細胞を収穫した。
【０１９７】
ＲＮＡは活性化Ｍ１２細胞を４Ｍ−チオシアン酸グアニジン、０．５％ザルコシル、２５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、０．１３％Ｓｉｇｍａ社アンチフォームＡおよび０．７％メルカプトエタノール混液中でホモゲナイズして調製した。ホモゲネートを５．７Ｍ−ＣｓＣｌ、１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、２５ｍＭ−酢酸ナトリウム、ｐＨ７混液中２４時間毎分３２０００回転で遠心分離してＲＮＡを精製した。ＲＮＡのペレットを５％ザルコシル、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、１０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５中に溶解し、５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール２容で抽出した。ＲＮＡをエタノールから２回沈降させた。ｃＤＮＡライブラリー構築に使用したポリ（Ａ）＋ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）セルロース選択２サイクルで精製したものである。
【０１９８】
相補ＤＮＡを５０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．３、７５ｍＭ−ＫＣｌ、３ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ−ジチオスレイトール、５００μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、オリゴ（ｄＴ）１２〜１８５０μｇ／ｍＬ、ＲＮａｓｉｎ１８０単位／ｍＬおよびモロニー−ＭＬＶ逆転写酵素１００００単位／ｍＬの反応液全容積５５μＬ中、ジブチリルｃＡＭＰで活性化したネズミＭ１２細胞のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ５．５μｇから１時間３７℃で合成した。逆転写後、溶液を２５ｍＭ−トリス、ｐＨ８．３、１００ｍＭ−ＫＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、各２５０μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５ｍＭ−ジチオスレイトール、ＤＮＡポリメラーゼＩ２５０単位／ｍＬ、リボヌクレアーゼＨ８．５単位／ｍＬに調製し、２時間１６℃でインキュベーションしてｃＤＮＡを２重鎖ＤＮＡに変換した。ＥＤＴＡを１８ｍＭまで添加し、溶液を５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール混液等容で抽出した。ＤＮＡを２．５Ｍ−酢酸アンモニウムの存在下エタノール２容および担体としての線状ポリアクリルアミド４μｇで沈降させた。逆転写後、逆転写酵素は７０℃に１０分間加熱して不活化した。水３２０μＬおよび０．１Ｍ−トリス、ｐＨ７．５、２５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ−ＫＣｌ、ウシ血清アルブミン２５０μｇ／ｍＬおよび５０ｍＭ−ジチオスレイトールの混液８０μＬを添加し、溶液を各２００μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼＩ５０単位／ｍＬ、リボヌクレアーゼＨ８単位／ｍＬに調製し、２時間１６℃でインキュベーションしてｃＤＮＡを２重鎖ＤＮＡに変換した。ＥＤＴＡを１８ｍＭまで添加し、溶液を５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール混液等容で抽出した。ＤＮＡを２．５Ｍ−酢酸アンモニウムの存在下エタノール２容および担体としての線状ポリアクリルアミド４μｇで沈降させた。
【０１９９】
このＤＮＡに非自己相補ＢｓｔＸＩアダプター２μｇを次のようにして添加した：ポリ(Ａ)＋ＲＮＡ５．５μｇからの２重鎖ｃＤＮＡを配列ＣＴＴＴＡＧＡＧＣＡＣＡ(配列番号１５)のキナーゼ処理オリゴヌクレオチド３．６μｇおよび配列ＣＴＣＴＡＡＡＧ(配列番号１６)のキナーゼ処理オリゴヌクレオチド２．４μｇと６ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５、６ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＮａＣｌ、ウシ血清アルブミン３５０μｇ／ｍＬ、７ｍＭ−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ−ＡＴＰ、２ｍＭ−ジチオスレイトール、１ｍＭ−スペルミジンおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ６００単位を含む全容０．４５ｍＬの溶液中、１５℃で１６時間インキュベーションした。ＥＤＴＡを３４ｍＭまで添加し、溶液を５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール混液の等容で抽出した。ＤＮＡを２.５Ｍ−酢酸アンモニウムの存在下にエタノール２容から沈降させた。
【０２００】
６００ｂｐ以上のＤＮＡは次の通りに選択した：アダプターＤＮＡを１０ｍＭ−トリス、ｐＨ８、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、６００ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１％ザルコシル中に再溶解し、セファロースＣＬ−４Ｂカラム上、同じ緩衝液でクロマトグラフィーした。カラム空隙容積中のＤＮＡ（６００ｂｐ以上のＤＮＡを含む）を集めてエタノールで沈降させた。
ｃＤＮＡクローニング用のｐＣＤＭ８ベクターをＢｓｔＸＩによる消化とアガロースゲル精製によって調製した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ５．５μｇからのアダプターＤＮＡを６ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５、６ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＮａＣｌ、ウシ血清アルブミン３５０μｇ／ｍＬ、７ｍＭ−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ−ＡＴＰ、２ｍＭ−ジチオスレイトール、１ｍＭ−スペルミジンおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ６００単位を含む溶液全容積１．５ｍＬ中、１５℃で２４時間に２．２５μｇのＢｓｔＸＩ切断ｐＣＤＭ８にリゲートした。結合反応混合物を有能大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３に形質転換し、独立のｃＤＮＡクローン全部で２００×１０６を得た。
【０２０１】
プラスミドＤＮＡは原ｃＤＮＡライブラリー形質転換体培養液５００ｍＬから製造した。プラスミドＤＮＡをアルカリ分解操作により精製し、続いてＣｓＣｌ平衡勾配中で２回バンド化分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８７年））。
Ｂ．クローニング操作法
【０２０２】
スクリーニングの第一段階では５０％密集生長ＣＯＳ細胞の１００ｍｍシャーレ３０個を活性化Ｍ１２ネズミＢ細胞ライブラリーＤＮＡ０．０５μｇ／ｍＬでＤＥＡＥ−デキストリン法（Ｓｅｅｄなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））を用いてトランスフェクトした。細胞をトリプシン処理し、２４時間後に再播種した。４７時間後、細胞をＰＢＳ／０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４／０．０２％アジ化ナトリウム中、３７℃で３０分間インキュベーションして脱離した。脱離細胞をヒトＣＴＬＡ４ＩｇとネズミＣＤ２８Ｉｇ１０μｇ／ｍＬで４５分間４℃で処理した。細胞を洗い、アフィニティー精製ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体で被覆した培養皿に散布し、室温で付着させた。３時間後、プレートをＰＢＳ／０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４／０．０２％アジ化ナトリウム、５％ＦＣＳで２回および０．１５Ｍ−ＮａＣｌ、０．０１Ｍ−Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、５％ＦＣＳとで１回穏やかに洗浄した。エピソームＤＮＡを培養した細胞から収穫し、大腸菌ＤＨ１０Ｂ／Ｐ３に形質転換した。プラスミドＤＮＡを文献記載のスフェロプラスト融合（Ｓｅｅｄなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））によりＣＯＳ細胞に再導入し、発現と培養のサイクルを２回反復した。選択の第二および第三段階では、４７時間後、脱離したＣＯＳ細胞をまずα−ネズミＢ７−１ｍＡｂ（１６−１０Ａ１、１０μｇ／ｍＬ）とインキュベーションし、Ｂ７−１を発現するＣＯＳ細胞をα−マウスＩｇＧおよびＩｇＭでコートした磁気ビーズで除去した。ＣＯＳ細胞を次にヒトＣＴＬＡ４ＩｇおよびネズミＣＤ２８Ｉｇの１０μｇ／ｍＬで処理し、ネズミＢ７−２発現ＣＯＳ細胞をヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体被覆ディッシュ上で培養して選択した。第三段階の後、各コロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＣＯＳ細胞上のＢ７−２の発現はＣＴＬＡ４Ｉｇとの間接免疫螢光法により分析した。
【０２０３】
選択の最終段階後、各コロニーからプラスミドＤＮＡを製造した。候補クローン８個の中、全部で６個が約１．２ｋｂのｃＤＮＡ挿入断片を含んでいた。クローン８個のプラスミドＤＮＡをＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。１．２ＫｂのｃＤＮＡ挿入断片を持つクローン６個は全てＣＴＬＡ４Ｉｇを用いる間接免疫螢光法とフローサイトメトリー分析によればＢ７−２発現が強陽性であった。
Ｃ．配列決定
【０２０４】
クローン４のＢ７−２ｃＤＮＡ挿入断片を次の方策を用いてｐＣＤＭ８発現ベクター中で配列決定した。最初の配列決定は配列決定プライマーＴ７、クローンしたＢ７−２ｃＤＮＡに隣接するＣＤＭ８ベクター配列に相同のＣＤＭ８Ｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った（表ＩＩ参照）。配列決定は色素ターミネーター反応とＡＢＩ自動ＤＮＡ配列決定器（ＡＢＩ社、Ｆｏｓｔｅｒ・Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて行った。これらのプライマーを用いて得られたＤＮＡ配列を使って次の配列決定プライマーを設計した（表ＩＩ参照）。この配列決定および次段プライマー選択のサイクルをネズミＢ７−２ｃＤＮＡが両鎖について完全に配列決定されるまで続行した。
【表２】
2009060905.tif 000003
【０２０５】
得られたネズミＢ７−２クローン（ｍＢ７−２、クローン４）の一つは１１６３塩基対の挿入断片と９２７ヌクレオチドの単一の長いオープン読み枠および約１２６ヌクレオチドの３’非コード配列（図１４、配列番号２２）が含まれていた。この蛋白質のオープン読み枠がコードすると予測されたアミノ酸配列を図１４のヌクレオチド配列の下に示す。コードされたネズミＢ７−２蛋白質は長さが３０９アミノ酸残基であると予測される（配列番号２３）。この蛋白質配列は他のＩ型Ｉｇスーパーファミリー膜蛋白質に共通の特徴多数を示す。蛋白質翻訳はコンセンサス真核細胞翻訳開始部位（Ｋｏｚａｋ，Ｍ（１９８７年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１５巻：８１２５〜８１４８頁参照）とのこの領域でのＤＮＡ相同性を基にすればメチオニンコドン（ＡＴＧ、ヌクレオチド１１１〜１１３）から始まると予測される。ネズミＢ７−２蛋白質のアミノ端末（アミノ酸１から２３）は２３位のアラニンと２４位のバリンとの間に予測切断部位（ｖｏｎ・Ｈｅｉｊｎｅ（１９８７年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１４巻：４６８３頁）のある分泌シグナルペプチドの特性を持つ。この部位でのプロセッシングは未修飾分子量約３２ｋＤａを持つ２８６アミノ酸のネズミＢ７−２膜結合蛋白質をもたらすと思われる。この蛋白質はほぼアミノ酸残基２４〜２４６の細胞外ＩｇスーパーファミリーＶおよびＣ様ドメイン、ほぼアミノ酸残基２４７〜２６５の親水性膜貫通ドメインおよびほぼアミノ酸残基２６６〜３０９の長い原形質ドメインから構成されると思われる。Ｉｇスーパーファミリーとの相同性は４０から１１０位および１５７から２１６位にあるシステインが結合する細胞外領域中の近接するＩｇ様ドメイン２個に起因する。細胞外ドメインはＮ−結合グリコシル化の可能性ある部位９個も含み、ネズミＢ７−１と同様、おそらくグリコシル化されている。ネズミＢ７−２蛋白質のグリコシル化は分子量を約５０〜７０ｋＤａに増加する。ネズミＢ７−２の原形質ドメインはシステンとそれに続いておそらくＡＰＣ内でシグナル伝達または制御ドメインとして機能するプラスに荷電したアミノ酸を持つ共通領域を含む。ネズミＢ７−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の双方のＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースとの比較で、ヒトおよびネズミＢ７−１が有意な相同性（アミノ酸配列同一性約２６％）を示した。ネズミＢ７−２はヒトの同族体ｈＢ７−２と同一性５０％と類似性６７％を示した。ネズミＢ７−２（クローン４）をコードするｃＤＮＡ挿入断片を含むベクター（プラスミドｐｍＢｘ４）でトランスフェクトした大腸菌（ＤＨ１０６／ｐ３）は１９９３年８月１８日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号６９３８８で寄託された。
Ｄ．共刺激
【０２０６】
ＣＤ４＋マウスＴ細胞を第一にトリス−ＮＨ４Ｃｌで処理して赤血球を除去して精製した。Ｔ細胞をナイロンウールカラムを通して濃縮した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗−ＭＨＣクラスＩＩおよび抗−ＣＤ２８のｍＡｂ混合物とウサギ補体で２回処理して精製した。ネズミＢ７−１（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ癌研究所、ボストン、ＭＡのＧｏｒｄｏｎ・Ｆｒｅｅｍａｎ博士から恵与；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９９１年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４巻：６２５〜６３１頁参照）、ネズミＢ７−２およびベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞をトランスフェクションの７２時間後に収穫し、マイトマイシンＣ２５μｇ／ｍＬと１時間インキュベーションし、十分に洗浄した。ネズミＣＤ４＋Ｔ細胞１０５個をホ
ルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）１ｎｇ／ｍＬおよびＣＯＳトランスフェクト体２×１０４個とインキュベーションした（表ＩＩＩ）。Ｔ細胞増殖は７２時間のインキュベーションの最終１２時間に取込まれた３Ｈ−チミジン（１μＣｉ）により測定した。
【表３】
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【０２０７】
実施例７  ヒトＢ７−２免疫グロブリン融合蛋白質の構築と特性
Ａ．ヒトＢ７−２Ｉｇ融合蛋白質の製造
ヒトＢ７−２の細胞外部分を免疫グロブリン定常領域に結合した融合蛋白質として製造した。免疫グロブリン定常領域は免疫グロブリン構造に必須のエフェクター活性を減弱または除去する修飾を含む遺伝子的修飾を含んでいてもよい。総括的にはｈＢ７−２の細胞外部分をコードするＤＮＡを指向性突然変異によって修飾したヒトＩｇＣγ１またはヒトＩｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードするＤＮＡに結合した。これは以下のサブセクションに記載のようにして行った。
Ｂ．遺伝子融合体の調製
【０２０８】
目的とするＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ断片は下記プライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製した。一般的に、ＰＣＲ反応物はプライマー（各１μＭ）、ｄＮＴＰ（各２００μＭ）、テンプレートＤＮＡ１ｎｇ、およびＴａｑポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉなど（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：４８７〜４９１頁）を含むＴａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｇｅｎｅ・Ａｍｐ・ＰＣＲキット、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）最終容積１００μＬ中で調製した。ＰＣＲによるＤＮＡ増幅はサーモサイクラー（Ｅｒｉｃｏｍｐ、Ｓａｎ・Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて各々が変性段階（９４℃で１分間）、再生段階（５４℃で３０秒間）および鎖伸長段階（７２℃で１分間）から構成される２５から３０サイクルを行った。各ｈＢ７−２−Ｉｇ遺伝子融合体の構造はＢ７−２の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＣγ１またはＩｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに結合する分泌促進シグナルの配列から構成される。ＩｇＣγ１およびＩｇＣγ４の配列はヒンジ領域内にあるジスルフィド結合形成能のあるシステイン残基をセリン残基で置換したヌクレオチド変換を含み、さらにＣＨ２ドメインにＦｃ受容体へのＩｇＣ結合および補体活性化に必要と思われるアミノ酸を置換するヌクレオチド変換を含んでいよう。  配列分析でｍγ４およびｍγ１クローンの構造を確認し、各々の構築を用いて２９３細胞をトランスフェクトして過渡的発現を検査した。ｈＩｇＧ・ＥＬＩＳＡによって両構築について１００ｎｇ蛋白質／ｍＬ細胞上清液にほぼ等しい過渡的発現水準が観測され／確認された。ＮＳＯ細胞系をトランスフェクトして融合蛋白質の永続的発現を行った。
Ｃ．ｈＢ７−２Ｉｇ融合蛋白質遺伝子の構築
【０２０９】
（１）シグナル配列の調製
ＰＣＲ増幅を用いて哺乳類細胞からのＢ７−２Ｉｇ融合蛋白質の分泌に適する免疫グロブリンシグナル配列を製造した。このＩｇシグナル配列はネズミＩｇＧ重鎖遺伝子を含むプラスミド（Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．など（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻：３８３３３８３７頁）からオリゴヌクレオチド５’−ＧＧＣＡＣＴＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＡＣ−３’（＃０１）（配列番号：）を正方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ・ｐｒｉｍｅｒ）とし、オリゴヌクレオチド５’−ＧＣＴＴＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧ−３’（＃０２）（配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ・ＰＣＲ・ｐｒｉｍｅｒ）として用いて調製した。正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）は制限酵素ＢｓａＩの認識配列を含み、Ｉｇシグナル配列の５’開始メチオニンへの配列に相同である。逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はｈＢ７−２の細胞外ドメイン５’端末およびＩｇシグナル配列３’端末から誘導された配列から構成される。これらのプライマーを用いるネズミＩｇシグナルテンプレートＤＮＡのＰＣＲ増幅は２２４ｂｐ生成物を与えるが、これはＢｓａＩ制限部位とそれに続いてｈＢ７−２の細胞外ドメインをコードする最初の２０ヌクレオチドの配列に融合するＩｇシグナル領域の配列から構成されている。シグナル配列とｈＢ７−２との間の結合点はシグナル配列で開始する蛋白質翻訳が正しい読み枠中のｈＢ７−２を通って継続するものである。
【０２１０】
（２）ｈＢ７．２遺伝子セグメントの調製
ｈＢ７−２遺伝子の細胞外ドメインは発現ベクターｐＣＤＮＡＩ（Ｆｒｅｅｍａｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２巻：９０９〜１１頁（１９９４年））に挿入したｈＢ７−２ｃＤＮＡを含むプラスミドのＰＣＲ増幅により調製した：
ｈＢ７−２の細胞外ドメインはオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＣＡＡＧＣ−３’（＃０３）（配列番号：）を正方向プライマーとし、オリゴヌクレオチド５’−ＧＧＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣ−３’（＃０４）（配列番号：）を逆方向プライマーとして使用するＰＣＲ増幅により調製した。正方向ＰＣＲプライマーはＢ７−２細胞外ドメインの最初の２０ヌクレオチドに相当する配列を含み、逆方向ＰＣＲプライマーはＢ７−２細胞外ドメインの最後のヌクレオチド２２個とそれに続いてＢｃｌＩ制限部位および非コードヌクレオチド７個に対応する配列を含む。プライマー＃０３および＃０４でのＰＣＲ増幅はｈＢ７−２の細胞外ＩｇＶおよびＩｇＣ様ドメインとそれに続く独特なＢｃｌＩ制限部位に対応する６７３ｂｐ生成物を与える。
シグナル配列は次の通りＰＣＲによってｈＢ７−２の細胞外部分に結合した。前記で得られたシグナル配列およびｈＢ７−２細胞外ドメインに対応するＤＮＡのＰＣＲ生産物を等モル量混合し、１００℃に加熱して変性し、５４℃に３０℃間維持して相補端末をアニーリングさせ、両鎖をｄＮＴＰとＴｏｑポリメラーゼを用いて充足した。ＰＣＲプライマー＃０１および＃０４を添加し、ＰＣＲ増幅して完全断片を製造してＢｓａＩ制限部位とそれに続いてｈＢ７−２の細胞外ドメインに融合したシグナル配列とそれとに続くＢｃｌＩ制限部位から構成される〜８８０断片を得た。
【０２１１】
（３）免疫グロブリン融合ドメインのクローニングおよび修飾
プラスミドｐＳＰ７２１ｇＧ１はヒトＩｇＧ１重鎖ゲノムＤＮＡの２０００ｂｐセグメント（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．など（１９８２年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１０巻：４０７１〜４０７９頁）をクローニングベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の多重クローニング部位にクローニングして調製した。プラスミドｐＳＰ７２１ｇＧ１はヒト重鎖ＩｇＣγ１遺伝子のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードするゲノムのＤＮＡを含んでいた。重鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分を中間のＤＮＡと共に増幅するように設計されたＰＣＲプライマーは次の通りに調製した。正方向ＰＣＲプライマー５’−ＧＣＡＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣ−３’（配列番号：）はＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｃｌＩ制限部位を含み、システイン残基３個をセリンに変更させるヌクレオチド置換５個を除きヒンジドメイン配列について相同であった。逆方向ＰＣＲプライマー５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：）は購入可能なＴ７プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と同一であった。これらのプライマーによる増幅で、５’−端末でＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｃｌＩ制限部位に結合し、３’−端末でＢａｍＨ１、Ｓｍａ１、Ｋｐｎ１、Ｓａｃ１、ＥｃｏＲ１、Ｃｌａ１、ＥｃｏＲ５およびＢｇ１１１制限部位に結合する１０５０ｂｐ断片が得られた。この断片はＩｇＣヒンジドメインを含んでいたが、そこではシステインコドン３個がセリンコドンに置換され、続いてイントロン、ＣＨ２ドメイン、イントロン、ＣＨ３ドメインおよび後続の３’配列が付いていた。ＰＣＲ増幅後、ＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲ１で消化し、同じ制限酵素で消化した発現ベクターｐＮＲＤＳＨにクローニングした。これでプラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１が得られた。
【０２１２】
同様なＰＣＲによる方策を用いて、ヒトＩｇＣγ４定常領域のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインをクローニングした。完全なＩｇＣγ４重鎖ゲノム配列を含む（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．、Ｂｕｘｂａｕｍ，Ｊ．およびＨｏｏｄ，Ｌ．Ｅ．（１９８１年）、ＤＮＡ、１巻：１１〜１８頁）プラスミドｐ４２８Ｄ（Ｍｅｄｉｃａｌ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｃｏｕｎｃｉｌ、ロンドン、英国）を、オリゴヌクレオチド５’ＧＡＧＣＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣ−３’（配列番号：）を正方向ＰＣＲプライマーとし、オリゴヌクレオチド５’ＧＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＣＣＡＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとして用いるＰＣＲ増幅の鋳型に用いた。正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はＢｃｌＩ制限部位に続いてＩｇＣγ４のヒンジドメインをコードする配列を含む。ヒンジ領域のシステイン残基をセリン残基に入れ換えるためにヌクレオチド置換を行った。逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はＰｓｐＡＩ制限部位（５’ＣＣＣＧＧＧ−３’）を含む。これらプライマーでのＰＣＲ増幅で１１７９ｂｐのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ生産物をＢｃｌＩとＰｓｐＡＩで消化し、同じ制限酵素で消化したｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１にリゲートしてプラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４を得た。この反応物ではＩｇＣγ４ドメインがｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１中に存在したＩｇＣγ１ドメインの代わりになっていた。
【０２１３】
ＩｇＣ内のＣＨ２ドメインでＦｃ受容体に結合に関与すると思われるアミノ酸を入れ換える修飾は次の通りに行った。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１をＩｇＣγ１ＣＨ２ドメインの修飾用鋳型に用い、プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４をＩｇＣγ４ＣＨ２ドメインの修飾用鋳型に利用した。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１は正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）およびオリゴヌクレオチド５’−ＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＣＧＧＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマーに用いてＰＣＲ増幅した。正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）は前に記載があり、逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はアミノ酸２３４、２３５および２３７（Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｍ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９１年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３巻：１４８３〜１４９１頁）を各々ＬｅｕからＡｌａ、ＬｅｕからＧｌｕおよびＧｌｙからＡｌａに変換するように設計されたヌクレオチド置換５個を除いてＩｇＧ１のＣＨ２ドメインのアミノ末端部分と相同である。これらＰＣＲプライマーの増幅で修飾ヒンジドメイン、イントロンおよび修飾ＣＨ２ドメイン部分から構成される２３９ｂｐのＤＮＡ断片が得られる。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１についてはオリゴヌクレオチド５’−ＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣ−３’（配列番号：）を正方向プライマーとし、オリゴヌクレオチド（配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとするＰＣＲ増幅も行った。正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はプライマー（配列番号：）に対して相補的で、ＣＨ２のアミノ酸置換に必要な相補ヌクレオチド変化５個を含む。逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）は前に記載がある。これらのプライマーでの増幅は修飾されたＣＨ２ドメイン部分、イントロン、ＣＨ３ドメインおよび３’付加的配列から構成される８７５ｂｐの断片を与えた。修飾ヒンジドメイン、修飾ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインから構成される完全ＩｇＣγ１セグメントは更に１回のＰＣＲ反応によって調製した。前記２回のＰＣＲ反応の生成物を精製し、混合し、変性（９５℃、１分間）し、次に再生（５４℃、３０秒）して断片２個の相補的末端をアニーリングさせた。両鎖をｄＮＴＰとＴａｑポリメラーゼを用いて充足（ｆｉｌｌ・ｉｎ）し、全断片を正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）および逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）を用いて増幅した。得られた１０５０ｂｐの断片を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、予め同じ制限酵素で消化したｐＮＲＤＳＨにリゲートしてプラスミドｐＮＲＤＳＨＩｇＧ１ｍを得た。
【０２１４】
免疫グロブリンの２３５位と２３７位にあるアミノ酸２個を各々ＬｅｕからＧｌｕおよびＧｌｙからＡｌａに変更してＩｇＣγ４ＣＨ２ドメインにあるＦｃ受容体結合部を除去した。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４を正方向プライマー（配列番号：）およびオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＣＡＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＡＡＣＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号：）を逆方向プライマーに用いてのＰＣＲ増幅も行った。正方向プライマーは前に記載があり、逆方向ＰＣＲプライマーは前記アミノ酸置換のために設計されたヌクレオチド置換３個を除いてＣＨ２ドメインのアミノ末端部分と相同である。このプライマーは後続するクローニングのためにＰｍＩＩ制限部位も含む。これらプライマーでの増幅で修飾ヒンジ領域、イントロンおよびＣＨ２ドメインの修飾５’部分から構成される２５６ｂｐの断片を得た。
【０２１５】
オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧ−３’（配列番号：）を正方向プライマーとし、オリゴヌクレオチド（配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとしてもプラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４をＰＣＲ増幅した。正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はプライマー（配列番号：）に対して相補的で、ＣＨ２アミノ酸入換えのために必要な相補ヌクレオチド変化３個を含む。逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）は前に記載がある。これらのプライマーでの増幅で修飾ＣＨ２ドメイン部分、イントロン、ＣＨ３ドメインおよび３’付加配列から構成される１０１２ｂｐの断片を得た。修飾ヒンジドメイン、修飾ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインから構成される完全ＩｇＣγ４セグメントは更に一回のＰＣＲ反応で調製した。前記２回のＰＣＲ反応の生成物を精製し、混合し、変性（９５℃、１分間）し、次に再生（５４℃、３０秒）して断片２個の相補的末端をアニーリングさせた。両鎖をｄＮＴＰとＴａｑポリメラーゼを用いて充足し、全断片を正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）および逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）を用いて増幅した。得られた１１７９ｂｐの断片を精製し、ＢｃＩＩとＰｓｐＡＩで消化し、予め同じ制限酵素で消化しておいたｐＮＲＤＳＨにリゲートしてプラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４ｍを得た。
（４）最終ｈＢ７−２Ｉｇ遺伝子の組立
【０２１６】
前記で調製したＩｇシグナル−ｈＢ７−２遺伝子融合体に対応するＰＣＲ断片をＢｓａＩおよびＢｃｌＩ制限酵素で消化し、予めＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｃｌＩで消化しておいたｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１、ｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１ｍ、ｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４およびｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４ｍにリゲートした。結合プラスミドをＣａＣｌ２能力細胞大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｆｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｅ．およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．編、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を含むＬ−寒天上で選択した。形質転換大腸菌から分離されたプラスミドを制限酵素消化により分析した。予測された制限プラスミドを配列決定してシグナルｈＢ７−２−ＩｇＧ遺伝子融合セグメントの全部分を確認した。
Ｄ．ｈＢ７−２Ｖ−ＩｇＧ１およびｈＢ７−２Ｃ−ＩｇＧ１の発現クローニング
【０２１７】
ヒトＢ７−２の可変および定常ドメインを別々にｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１中にクローニングした。これらのクローニングはＰＣＲを用いて行った。可変および定常領域に対応するｈＢ７−２の部分はイントロン／エキソン地図および公表された遺伝子構造分析から決定した。
【表４】
2009060905.tif 000005
【０２１８】
（１）ｈＢ７−２ＶＩｇの組立
ｈＢ７−２ＶドメインＩｇ配列は前記と同様なＰＣＲ方策を用いて組立てた。シグナル配列はｏｎｃｏＭ遺伝子を含むプラスミドのＰＣＲ増幅によりｏｎｃｏＭ遺伝子からオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＡＡＣＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＧ−３’（＃０５）（配列番号：）を正方向ＰＣＲプライマーとし、５’−ＡＧＴＣＴＣＡＴＴＧＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧ−３’（＃０６）（配列番号：）を逆方向プライマーとして用いて誘導した。正方向ＰＣＲプライマー（＃０５）はＨｉｎｄＩＩＩ制限部位およびｏｎｃｏＭシグナル配列のアミノ端末部分を含む。逆方向ＰＣＲ（＃０６）はｈＢ７−２ＩｇＶ様ドメインの５’端末に融合したｏｎｃｏＭシグナル配列の３’部分に対応する配列を含む。
【０２１９】
ｈＢ７−２ＩｇＶ様ドメインはオリゴヌクレオチド５’−ＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＧＡＣ−３’（＃０７）（配列番号：）を正方向、オリゴヌクレオチド５’−ＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＣＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣ−３’（＃０８）（配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとして用いるｈＢ７−２ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得られた。これらのプライマーでのＰＣＲ増幅でｏｎｃｏＭシグナル配列の３’末端部分を５’端末に、ＢｃｌＩ制限部位を３’端末に持つｈＢ７−２ＩｇＶドメインを得た。シグナルおよびＩｇＶドメインをＰＣＲ反応で結合した。そこではｏｎｃｏＭシグナルおよびＩｇＶドメインＤＮＡ断片等モル量を混合し、変性し、アニーリングし、鎖を充足した。正方向プライマー＃０５および逆方向プライマー＃０８を用いる後続ＰＣＲ増幅でＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続いてＢ７−２ＩｇＶドメインに融合したｏｎｃｏＭシグナル、続いてＢｃｌＩ制限部位を含むＤＮＡ断片を得た。このＰＣＲ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｃｌＩで消化し、同じ制限酵素で消化した発現ベクターｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１にクローニングしてｐＮＲＤＳＨ／Ｂ７−２ＣＩｇを得た。
（２）ｈＢ７−２ＣＩｇの組立
【０２２０】
ｈＢ７−２ＩｇＣドメインのための発現プラスミドはＩｇＣドメインに特異的なＰＣＲプライマーを使用した点を除いてＩｇＶのために前記したようにして製造した。シグナル配列ｏｎｃｏＭはオリゴヌクレオチド＃０５を正方向ＰＣＲプライマーとし、オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＡＡＡＴＴＧＧＴＡＣＴＡＴＴＴＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧ−３’（＃０９）（配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとして用いて製造した。ｈＢ７−２ＩｇＣドメインはオリゴヌクレオチド５’−ＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＴＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＴＡＧＴＡＣＣＡＡＴＴＴＣ−３’（＃１１）（配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとして用いて製造した。両ＰＣＲ生成物を混合し、プライマー＃０５および＃１１で増幅してシグナル配列ｏｎｃｏＭとｈＢ７−２ＩｇＣドメインを組立てた。このＰＣＲ生成物を次にＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｃｌＩで消化し、同様な制限酵素で消化した発現ベクターｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１にリゲートして最終発現プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ｈＢ７−２ＣＩｇＧ１を得た。
Ｅ．ヒトＢ７−２Ｉｇ融合蛋白質による競合的結合の検定
【０２２１】
種々のＢ７族−Ｉｇ融合蛋白質がビオチン化ＣＴＬＡ４Ｉｇの固定化Ｂ７−２−Ｉｇへの結合を競合的に阻害する性能を測定した。競合結合検定は次の通りに行い、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ａ．（１９８５年）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４巻：２１３〜２２８頁）に従って分析した。溶解性ｈＣＴＬＡ４Ｉｇを１２５Ｉで約２×１０６ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比活性に標識した。ｈＢ７−２−Ｉｇ融合蛋白質１０μｇ／ｍＬｐＨ８．０の１０ｍＭ−トリス溶液で５０μＬ／ウェルで一夜マイクロタイター板を被覆した。ウェルを結合緩衝液（１０％熱不活化ＦＢＳ、０．１％ＢＳＡおよび５０ｍＭ−ＢＥＳを含むＤＭＥＭ、ｐＨ６．８）により２時間室温でブロックした。各ウェルに完全長Ｂ７−２（ｈＢ７−２Ｉｇ）、完全長Ｂ７−１（ｈＢ７−１Ｉｇ）、Ｂ７−２（ｈＢ７−２ＶＩｇ）可変領域様ドメインおよびＢ７−２（ｈＢ７−２ＣＩｇ）定常領域様ドメインを含む非標識競合Ｉｇ融合蛋白質の存在または不在下に標識ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（４ｎＭ）を添加し、室温で２．５時間結合させた。ウェルを氷冷結合緩衝液で１回洗浄し、次に氷冷ＰＢＳで４回洗浄した。ウェルを０．５Ｎ−ＮａＯＨで５分間処理して結合放射能を回収し、溶解物質を取り、ガンマ線計測器でカウントした。
【０２２２】
これらの検定結果を図１５に示すが、ここではｈＢ７−２Ｉｇ（１０〜２０ｎＭ）およびｈＢ７−２ＶＩｇ（３０〜４０ｎＭ）の双方が固定化Ｂ７−２蛋白質へのＣＴＬＡ４Ｉｇの結合を阻害している。ｈＢ７−２ＣＩｇは可溶性ＣＴＬＡ４と競合せず、Ｂ７−２結合領域は可変領域様ドメインにあることが判明した。Ｆ．Ｂ７−１およびＢ７−２融合蛋白質のための競合的結合の検定
【０２２３】
種々の型の組換えＣＴＬＡ４がｈＢ７−１またはｈＢ７−２に結合する性能を次の通りに競合的結合ＥＬＩＳＡ検定により評価した。精製組換えｈＢ７−Ｉｇ（２０μｇ／ｍＬＰＢＳ）５０μＬ中、室温で一夜コスターＥＩＡ／ＲＩＡ９６ウェルマイクロタイター皿（Ｃｏｓｔａｒ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）に結合させた。各ウェルをＰＢＳ２００μＬで３回洗浄し、１％ＢＳＡ・ＰＢＳを添加（２００／穴）して非結合部分を室温で１時間ブロックした。各ウェルは前記のように洗浄した。ビオチン化ｈＣＴＬＡ４ＩｇＧ１（ｒｅｆ、ＭＦＧＲ、１μｇ／ｍＬ、順次２倍希釈、１５．６ｎｇ／ｍＬまで、５０μＬ）を各ウェルに添加し、室温で２．５時間インキュベーションした。各ウェルは前記の通り洗浄した。結合したビオチン化ＣＴＬＡ４Ｉｇはストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）１：２０００希釈液５０ｌ／ｌを室温で３０分間加えて検出した。ウェルを前記の通りに洗浄し、ＡＢＴＳ（Ｚｙｍｅｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）５０μＬを添加し、３０分後に４０５ｎｍで青色の呈色を観測した。典型的な結合検定結果のグラフを図１６に示す。種々の量の競合蛋白質と非飽和性が証明されたビオチン化ＣＴＬＡ４ＩｇＧ１一定量（すなわち、７０ｎｇ／ｍＬ、１．５ｎＭ）とを混合し、前記の通り結合検定を行い、種々の型のＣＴＬＡ４がビオチン化ＣＴＬＡ４ＩｇＧ１と競合する性能を評価した（図１５）。ビオチン化ＣＴＬＡ４ＩｇＧ１に予期されるシグナル（４０５ｎｍ吸光）の低下はｈＢ７−１への結合での競合を示す。
ＣＴＬＡ４がＢ７−１に親和性の高い受容体であるとの前記証拠を考慮して、ＣＴＬＡ４とＣＤ２８とのＢ７−１およびＢ７−２への結合力を比較した。Ｂ７−１−ＩｇまたはＢ７−２−Ｉｇをビオチンで標識し、種々の濃度の非標識Ｂ７−１−ＩｇまたはＢ７−２−Ｉｇの存在または不在下に固定化ＣＴＬＡ４−Ｉｇに結合させた。実験は１２５Ｉ−標識Ｂ７−１−ＩｇまたはＢ７−２−Ｉｇでも反復した。この固相結合検定法を使用して、Ｂ７−２のＣＴＬＡ４に対する結合力（２．７ｎＭ）はＢ７−１で観測されたもの（４．６ｎＭ）より約２倍大きいと測定された。実験的に決定したＩＣ５０値は図の上右隅に示した。ＣＤ２８に対するＢ７−１およびＢ７−２の双方の親和性は低くて信頼性よく結論を出すことは困難であった。
【０２２４】
実施例８  ヒトＢ７−２に対するモノクローナル抗体の製造と特性
Ａ．免疫および細胞融合
Ｂａｌｂ／ｃ雌性マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ研究所、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹから入手）を１匹当り完全フロインドアジュバント（Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に乳濁化したヒトＢ７．２−Ｉｇ５０μｇまたはＣＨＯ−ヒトＢ７．２細胞１０６個を腹腔内投与して免疫した。マウス
を不完全フロインドアジュバント（Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ）中に乳濁化したヒトＢ７．２−Ｉｇ１０〜２５μｇで２回またはＣＨＯ−ヒトＢ７．２細胞で初めの免疫に続いて次の２ケ月間１４日の間隔で追加免疫した。マウスの眼窩後部から採血し、血清をヒトＢ７．２−Ｉｇに対するＥＬＩＳＡによりこの免疫原に反応する抗体の存否について検定した。ｈＣＴＬＡ４−Ｉｇに対するＥＬＩＳＡも行ってＩｇテイル指向性抗体反応に対する対照とした。強い血清反応を示したマウスに尾部静脈からヒトｈＢ７．２−Ｉｇ２５μｇを燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ・Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）に希釈して静脈内追加免疫を行った。この追加免疫後３日から４日後にマウス脾臓に免疫グロブリンの重鎖も軽鎖も分泌できない（Ｋｅａｒｎｅｙなど（１９７９年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２３巻：１５４８頁）ＳＰ２／０骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ・Ｔｙｐｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ・Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、Ｎｏ．ＣＲＬ８００６）を５：１で注入した。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎが開発した方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５年）、２５６巻：４９５頁）に基づく標準法を用いた。
Ｂ．抗体スクリーニング
【０２２５】
１０日〜２１日後、注入液からのハイブリドマコロニーを含むウェルの上清液をヒトＢ７．２に対して反応性のある抗体の存在を次の通りにスクリーニングした：平底９６穴板（Ｃｏｓｔａｒ社、カタログ番号３５９０）の各ウェルをヒトＢ７．２−Ｉｇ１μｇ／ｍＬ溶液５０μＬでコートするか、リジン被覆板に４℃で燐酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２中、３Ｔ３−ｈＢ７．２細胞５×１０４個でコートした。ヒトＢ７．２−Ｉｇ溶液を吸引し去るか、細胞をグルタルアルデヒドで板に結合し、各ウェルをＰＢＳで３回洗い、次に１％ＢＳＡ（ＰＢＳ）溶液（１００μＬ／穴）で１時間室温でブロックした。このブロッキング用インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで３回洗い、ハイブリドーマ上清液を穴当り５０μＬ加え、室温で１．５時間インキュベーションした。このインキュベーション後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、次に室温でホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合、親和性精製、ヤギ抗−マウスＩｇＧまたはＩｇＭ重鎖および軽鎖−特異性抗体（ＨＲＰ、Ｚｙｍｅｄ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ・Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）の１：４０００希釈液ウェル当り５０μＬと共に１．５時間インキュベーションした。穴を次にＰＢＳで３回洗浄し、続いて結合した抗体を検出するＨＲＰへの基質として３０％過酸化水素１：１０００希釈を加えた１ｍＭ−２，２−アジノビス−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）の０．１Ｍ−クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．２溶液ウェル当り５０μＬ中で３０分間インキュベーションした。続いて自動読取分光光度計（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、ＶＡ）によりＯＤ４１０で吸光度を測定した。
３種、ＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２．３Ｄ１がヒトＢ７．２−Ｉｇに対する抗体を生産することを確認した。ＨＡ３．１Ｆ９はＩｇＧ１イソタイプ、ＨＡ５．２Ｂ７はＩｇＧ２ｂイソタイプおよびＨＦ２．３Ｄ１はＩｇＧ２ａイソタイプであると判定した。これらハイブリドマはさらに２回サブクローニングしてモノクローナルであることを確認した。各ハイブリドマ細胞はブタペスト条約の規定に適合するアメリカンタイプカルチャーコレクションにＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１６８８（ハイブリドマＨＡ３．１Ｆ９）、ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ１１６８７（ハイブリドマＨＡ５．２Ｂ７）およびＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１６８６（ハイブリドマＨＦ２．３Ｄ１）として１９９４年７月１９日に寄託した。
Ｃ．競合的ＥＬＩＳＡ
【０２２６】
ハイブリドマＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２．３Ｄ１からの上清液をさらに競合的ＥＬＩＳＡで解析し、固定化ｈＢ７−２免疫グロブリン融合蛋白質へのビオチン化ｈＣＴＬＡ４Ｉｇの結合を阻止するモノクローナル抗体の性能を検討した。ｈＣＴＬＡ４Ｉｇのビオチン化はＰｉｅｒｃｅ社のＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ・ＮＨＳ−ＬＣ・Ｂｉｏｔｉｎ（カタログ番号２１３３５）を用いて行った。使用したＢ７−２免疫グロブリン融合蛋白質はｈＢ７．２−Ｉｇ（完全長ｈＢ７−２）、ｈＢ７．２−ＶＩｇ（可変ドメインのみのｈＢ７−２）およびｈＢ７．２−ＣＩｇ（定常ドメインのみのｈＢ７−２）であった。ｈＢ７．１−Ｉｇ融合蛋白質を対照として用いた。ＥＬＩＳＡ用には、９６ウェル板をＩｇ融合蛋白質（２０μｇ／ｍＬ溶液を５０μＬ／穴）で一夜室温でコートした。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液で１時間室温でブロックし、さらにＰＢＳで３回洗浄した。各穴にＢｉｏ−ｈＣＴＬＡ４−Ｉｇ（７０ｎｇ／ｍＬ）５０μＬと競合モノクローナル抗体上清液５０μＬとを添加した。対照抗体は抗−Ｂ７．１ｍＡｂ（ＥＷ３．５Ｄ１２）および抗−ｈＢ７−２ｍＡｂＢ７０（ＩｇＧ２ｂκ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）であった。各ウェルを再び洗い、ストレプトアビジン−結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ社から、カタログ番号２１１２６、１：２０００希釈、５０μＬ／穴）を添加し、室温で３０分間インキュベーションした。再びウェルを洗浄し、続いてＨＲＰの基質として抗体を検出するために３０％過酸化水素を１：１０００希釈で添加したＡＢＴＳの０．１Ｍ−クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．２溶液ウェル当り５０μＬ中で３０分間インキュベーションした。続いて、自動読取分光光度計（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、ＶＡ）によりＯＤ４１０で吸光度を測定した。下記表ＩＶに示す結果はハイブリドマＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２．３Ｄ１から生産される各ｍＡｂはｈＣＬＴＡ４Ｉｇの完全長ｈＢ７．２−ＩｇまたはｈＢ７．２−ＶＩｇへの結合を競合的に阻止できることを証明する（ｈＣＬＴＡ４ＩｇはｈＢ７．２−ＣＩｇには結合しない）。
【表５】
2009060905.tif 000006
Ｄ．フローサイトメトリー
【０２２７】
ハイブリドマＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２．３Ｄ１からの上清液をフローサイトメトリーによっても解析した。クローンから集めた上清液をｈＢ７．２を発現するようにトランスフェクトしたＣＨＯおよび３Ｔ３細胞（ＣＨＯ−ｈＢ７．２および３Ｔ３−ｈＢ７．２）上または対照をトランスフェクト３Ｔ３細胞（３Ｔ３−Ｎｅｏ）上でフローサイトメトリーによりスクリーニングした。フローサイトメトリーは次の通りに行った：細胞１×１０６個を１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で３回洗浄し、次に細胞を１×１０６細胞当りハイブリドマ上清液または培養液５０μＬ中で４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で３回洗浄し、次にフルオレッセイン結合ヤギ抗−マウスＩｇＧまたはＩｇＭ抗体（Ｚｙｍｅｄ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ・Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）１：５０希釈液を１×１０６細胞当り５０μＬを用いて４℃で３０分間インキュベーションした。次に細胞を１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で３回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド溶液で固定化した。細胞標本を次にＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ・Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ・Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。図１７、１８および１９に示す結果はハイブリドマＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２．３Ｄ１により生産されるモノクローナル抗体は各々細胞表面上のｈＢ７−２に結合することを証明している。
Ｅ．抗−ｈＢ７−２ｍＡｂによるヒトＴ細胞増殖の阻止
【０２２８】
抗−ヒトＢ７−２ｍＡｂを含むハイブリドーマ上清液がヒトＴ細胞のｈＢ７−２共刺激を阻止する性能について検討した。この検定では、精製ＣＤ２８＋ヒトＴ細胞を準分裂促進量のＰＭＡ（１ｎｇ／ｍＬ）で処理して一次シグナルを得、表面にｈＢ７−２を発現するＣＨＯ細胞で共刺激シグナルを得た。Ｔ細胞の増殖は培養液中３日後に３Ｈ−チミジンを添加して残りの１８時間の間に測定した。表Ｖに示すように３Ｈ−チミジン（５１０ｐｍ）取込法による測定では休止Ｔ細胞は増殖を示さなかった。ＰＭＡによるシグナル１の放出ではいくらかの増殖（３８００ｐｍ）が見られ、一次（ＰＭＡ）および共刺激（ＣＯＳ／ｈＢ７−２）シグナルの両方を受けたＴ細胞では最高に増殖（９０２０ｃｐｍ）した。検査した抗−ｈＢ７−２ｍＡｂ３個全ては共刺激シグナルが誘導した増殖をＰＭＡ単独処理細胞で見られる増殖にまで低減し、これらｍＡｂがＢ７／ＣＤ２８共刺激経路を遮断することによってＴ細胞増殖を阻止することを示した。
【表６】
2009060905.tif 000007
【０２２９】
実施例９  Ｂ７−２を発現するようにトランスフェクトした移植腫瘍細胞の退縮  
この実施例ではトランスフェクトしていないか、Ｂ７−２をトランスフェクトしたＪ５５８形質細胞腫細胞を腫瘍退縮研究に用いて動物に移植した時、この腫瘍細胞表面に発現するＢ７−２の腫瘍細胞成長に対する効果を検討した。
【０２３０】
Ｊ５５８形質細胞腫細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手、＃ＴＩＢ６）にマウスＢ７−２（ｐＡＷＮＥ０３）またはＢ７−１（ｐＮＲＤＳＨまたはｐＡＷＮＥ０３）およびネオマイシン耐性遺伝子をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトした。ネオマイシン耐性を基準にして安定なトランスフェクト体を選択し、腫瘍細胞上のＢ７−２またはＢ７−１の細胞表面発現を抗−Ｂ７−２または抗−Ｂ７−１抗体を用いるＦＡＣＳ分析により確認した。
【０２３１】
同遺伝子型Ｂａｌｂ／ｃマウスを１群５〜１０匹として腫瘍細胞上のＢ７−２細胞表面発現が移植腫瘍細胞の退縮をもたらすかどうかを判定できるように設計した実験に用いた。未トランスフェクトおよびトランスフェクトＪ５５８細胞を試験管内で培養し、採取し、Ｈａｎｋの緩衝塩溶液（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ・Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ）で洗浄後、１０８細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。各マウスの右側腹部の皮膚の一部を脱毛薬で脱毛し、２４時間後にマウス１匹当り腫瘍細胞５×１０６個を皮内または皮下に移植した。２日または３日毎にカリパスと定規を用いて腫瘍容積を（３垂直方向の直線的測定で）計測した。典型的実験を１８〜２１日継続したが、終了時には、未トランスフェクト対照Ｊ５５８細胞を移植したマウスでは腫瘍サイズはマウス体容積の１０％を超えていた。図２０に示す通り、マウスは表面にＢ７−２を発現するようにトランスフェクトしたＪ５５８細胞を排除した。３週間後にさえ、腫瘍生育は観察されなかった。同様な結果は表面にＢ７−１を発現するようにトランスフェクトしたＪ５５８細胞でも観察された。対照的に、未トランスフェクト（野生型）Ｊ５５８細胞では１２日目には動物に治療不能な大きな腫瘍を造った。この実施例は腫瘍細胞へのＢ７−２ｃＤＮＡのトランスフェクションによるような腫瘍細胞のＢ７−２細胞表面発現が感受性動物に腫瘍細胞拒絶を起こすに十分な抗腫瘍反応を誘導することを証明するものである。
均等
【０２３２】
当業者は通例的実験以上を用いずとも、ここに記載した本発明の特定的態様に多数の均等体を認識するか、または確信できるものである。このような均等範囲は本請求項に包含されるべきであると意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】媒地、抗ＣＤ３単独、または以下のモノクローナル抗体若しくは組換えタンパク質、αＢ７(１３３、抗Ｂ７−１);ＣＴＬＡ４Ｉg;ＦabαＣＤ２８;コントロールＩg融合タンパク質(ＣＴＬＡ４Ｉgについてのアイソタイプコントロール);またはαＢ５(抗Ｂ５、抗Ｂ７−１についてのアイソタイプコントロール)の存在下での抗ＣＤ−３中で培養された、Ｂ７(Ｂ７−１)でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞(パネルａ)、または同系の(syngeneic)活性化Ｂリンパ球(パネルｂ)により提供される共刺激に対する、３Ｈチミジン導入またはＩＬ−２分泌により評価した、ＣＤ２８＋Ｔ細胞の応答のグラフ表示である
【０２３４】
【図２】表面免疫グロブリン(sＩg)架橋で活性化された脾Ｂ細胞上でのＢ７−１の細胞表面発現のlog蛍光強度のグラフである。全(パネルａ)、Ｂ７−１陽性(Ｂ７−１＋、パネルｂ)およびＢ７−１陰性(Ｂ７−１−、パネルｃ)活性化Ｂ細胞を、抗Ｂ７−１モノクローナル抗体(１３３)およびフルオロセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)ラベルのヤギ抗マウス免疫グロブリンで染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【０２３５】
【図３】、媒地、抗ＣＤ３単独、または以下のモノクローナル抗体若しくは組換えタンパク質、αＢＢ−１(１３３、抗Ｂ７−１および抗Ｂ７−３);αＢ７(抗Ｂ７−１);ＣＴＬＡ４Ｉg;ＦabαＣＤ２８;コントロールＩg融合タンパク質またはαＢ５(抗Ｂ５)の存在下での抗ＣＤ３中で培養した、Ｂ７−１＋(パネルa)またはＢ７−１−(パネルｂ)活性化同系のＢリンパ球により提供される共刺激に対する、３Ｈ−チミジン導入およびＩＬ−２分泌により評価される、ＣＤ２８＋Ｔ細胞の応答のグラフ表示である。
【０２３６】
【図４】分別したＢ７−１＋およびＢ７−１−活性化Ｂリンパ球上でのＢ７−１、Ｂ７−３および全ＣＴＬＡ４カウンターレセプターの細胞表面発現のグラフ表示である。
【０２３７】
【図５】sＩg架橋により活性化された脾Ｂ細胞上でのＢ７−１(ＣＴＬＡ４ＩgおよびmＡbsＢＢ−１および１３３)、Ｂ７−３(ＣＴＬＡ４ＩgおよびmＡbＢＢ１)およびＢ７−２(ＣＴＬＡ４Ｉg)カウンターレセプターの時間的な表面発現のグラフ表示である。
【０２３８】
【図６】ＭＨＣクラスＩＩ架橋により活性化された脾Ｂ細胞上でのＢ７−１(ＣＴＬＡ４ＩgおよびmＡbsＢＢ−１および１３３)、Ｂ７−３(ＣＴＬＡ４ＩgおよびmＡbＢＢ１)、およびＢ７２(ＣＴＬＡ４Ｉg)カウンターレセプターの時間的な表面発現のグラフ表示である。
【０２３９】
【図７】媒地、抗ＣＤ３単独、または次のモノクローナル抗体若しくは組換えタンパク質、αＢ７(１３３、抗Ｂ７−１);αＢＢ１(抗Ｂ７−１、抗Ｂ７−３);ＣＴＬＡ４Ｉg;ＦabαＣＤ２８;およびαＢ５(抗Ｂ５)の存在下での抗ＣＤ３中で培養された、２４時間(パネルａ)または４８時間(パネルｂ)、sＩg架橋により活性化された同系のＢリンパ球により提供される刺激に対する、３Ｈ−チミジン導入およびＩＬ−２分泌により評価される、ＣＤ２８＋Ｔ細胞の応答のグラフ表示である。
【０２４０】
【図８−１】ヒトＢリンパ球抗原Ｂ７−２のヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列である(hＢ７−２−クローン２９)。
【０２４１】
【図８−２】ヒトＢリンパ球抗原Ｂ７−２のヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列である(hＢ７−２−クローン２９)。
【０２４２】
【図８−３】ヒトＢリンパ球抗原Ｂ７−２のヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列である(hＢ７−２−クローン２９)。
【０２４３】
【図９】コントロールmＡb(ＩgＭ)、抗Ｂ７−１(mＡbs１３３およびＢＢ−１)、組換えタンパク質ＣＴＬＡ４Ｉg、またはアイソタイプのマッチしたコントロールＩgタンパク質に続く適当な第２のＦＩＴＣラベルの免疫グロブリンで染色し、フローサイトメトリーで分析した、コントロールプラスミド(pＣＤＮＡＩ、Ｂ７−１を発現するプラスミド(Ｂ７−１)、またはＢ７−２を発現するプラスミド(Ｂ７−２)でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞のグラフ表示である。
【０２４４】
【図１０】刺激されない、および抗Ｉg活性化ヒト脾Ｂ細胞および細胞系(パネルa)およびヒトミエローマ(パネルＢ)中のＢ７−２発現のＲＮＡブロット分析を示す。
【０２４５】
【図１１】ベクター単独またはＢ７−１またはＢ７−２の発現を指向するベクターでトランスフェクトされたフォルボールミリスチン酸(ＰＭＡ)およびＣＯＳ細胞でのサブミトジェニック(submitogenic)刺激に対する、３Ｈ−チミジン導入またはＩＬ−２分泌により評価した、ＣＤ２８＋Ｔ細胞の増殖のグラフ表示である。
【図１２−１】ベクター単独(ベクター)、またはＢ７−１(Ｂ７−１)若しくはＢ７−２(Ｂ７−２)を発現するベクターでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞、およびＰＭＡによる刺激に対する、３Ｈ−チミジン導入およびＩＬ−２分泌により評価した、ＣＤ２８＋Ｔ細胞の増殖の組換えタンパク質およびmＡbsによる阻害のグラフ表示である。阻害の研究は、ＰＭＡ刺激ＣＯＳ細胞混合ＣＤ２８＋Ｔ細胞への、抗体添加なし(no  mＡＢ)、抗Ｂ７mＡb１３３(１３３)、抗Ｂ７mＡbＢＢ−１(ＢＢ１)、抗Ｂ５mＡb(Ｂ５)、抗ＣＤ２８のＦabフラグメント(ＣＤ２８Ｆab)、ＣＴＬＡ４Ｉg(ＣＴＬＡ４Ｉg)、またはＩgコントロールタンパク質(コントロールＩg)の添加で行った。
【０２４６】
【図１２−２】ベクター単独(ベクター)、またはＢ７−１(Ｂ７−１)若しくはＢ７−２(Ｂ７−２)を発現するベクターでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞、およびＰＭＡによる刺激に対する、３Ｈ−チミジン導入およびＩＬ−２分泌により評価した、ＣＤ２８＋Ｔ細胞の増殖の組換えタンパク質およびmＡbsによる阻害のグラフ表示である。阻害の研究は、ＰＭＡ刺激ＣＯＳ細胞混合ＣＤ２８＋Ｔ細胞への、抗体添加なし(no  mＡＢ)、抗Ｂ７mＡb１３３(１３３)、抗Ｂ７mＡbＢＢ−１(ＢＢ１)、抗Ｂ５mＡb(Ｂ５)、抗ＣＤ２８のＦabフラグメント(ＣＤ２８Ｆab)、ＣＴＬＡ４Ｉg(ＣＴＬＡ４Ｉg)、またはＩgコントロールタンパク質(コントロールＩg)の添加で行った。
【０２４７】
【図１３−１】ヒトＢ７−２タンパク質(hＢ７−２)推定アミノ酸配列(配列番号２)並びにヒトＢ７−１タンパク質(hＢ７−１)(配列番号２８および２９)およびミュリンＢ７−１タンパク質(mＢ７)(配列番号３０および３１)の両方のアミノ酸配列間の配列相同性を示す。
【０２４８】
【図１３−２】ヒトＢ７−２タンパク質(hＢ７−２)推定アミノ酸配列(配列番号２)並びにヒトＢ７−１タンパク質(hＢ７−１)(配列番号２８および２９)およびミュリンＢ７−１タンパク質(mＢ７)(配列番号３０および３１)の両方のアミノ酸配列間の配列相同性を示す。
【０２４９】
【図１４−１】マウスＢ７−２抗原(mＢ７−２)のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列(配列番号２２および２３)である。
【０２５０】
【図１４−２】マウスＢ７−２抗原(mＢ７−２)のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列(配列番号２２および２３)である。
【０２５１】
【図１４−３】マウスＢ７−２抗原(mＢ７−２)のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列(配列番号２２および２３)である。
【０２５２】
【図１４−４】マウスＢ７−２抗原(mＢ７−２)のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列(配列番号２２および２３)である。
【０２５３】
【図１５】Ｂ７ファミリー−Ｉg融合タンパク質による、固定化Ｂ７−２Ｉgに対するビオチニル化ＣＴＬＡ４Ｉgの結合の競合的阻害のグラフ表示である。競合物として調べたＩg融合タンパク質は、全長Ｂ７−２(hＢ７.２)、全長Ｂ７−１(hＢ７.１)、Ｂ７−２の可変領域様ドメイン(hＢ７.２Ｖ)、またはＢ７−２の定常領域様ドメイン(hＢ７.２Ｃ)である。
【０２５４】
【図１６】ラベルしないＢ７−１−Ｉg(パネルＡ)またはＢ７−２−Ｉg(パネルＢ)の濃度を増加させることによる、固定化ＣＴＬＡ４−Ｉgに対するビオチニル化Ｂ７−１−Ｉg(パネルＡ)またはＢ７−２−Ｉg(パネルＢ)の結合の競合的阻害のグラフ表示である。実験的に決定したＩＣ５０値を、パネルの上右隅に示す。
【０２５５】
【図１７】抗hＢ７−２モノクローナル抗体、ＨＡ３.１Ｆ９で染色した細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。抗体で染色した細胞(３Ｔ３−ｈＢ７.２)は、ヒトＢ７−２を発現するようトランスフェクトされたＣＨＯ細胞(ＣＨＯ−hＢ７.２)、ヒトＢ７−２を発現するようトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞（３Ｔ３−ｈＢ７.２）、およびコントロールのトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３−ネオ)である。抗hＢ７.２抗体Ｂ７０を陽性コントロールとして用いた。
【０２５６】
【図１８】抗hＢ７−２モノクローナル抗体、ＨＡ５.２Ｂ７で染色した細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。その抗体で染色した細胞は、ヒトＢ７−２を発現するようトランスフェクトしたＣＨＯ細胞(ＣＨＯ−hＢ７.２)、ヒトＢ７−２を発現するようトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３−hＢ７.２)、およびコントロールのトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３−ネオ)である。抗hＢ７.２抗体Ｂ７０を陽性コントロールとして用いた。
【０２５７】
【図１９】抗hＢ７−２モノクローナル抗体、ＨＦ２.３Ｄ１で染色した細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。該抗体で染色した細胞は、ヒトＢ７−２を発現するようトランスフェクトしたＣＨＯ細胞(ＣＨＯ−hＢ７.２)、ヒトＢ７−２を発現するようトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３−hＢ７.２)、およびコントロールのトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３−ネオ)である。抗hＢ７.２抗体Ｂ７０を陽性コントロールとして用いた。
【０２５８】
【図２０】Ｂ７−１(Ｊ５５８−Ｂ７.１)またはＢ７−２(Ｊ５５８−Ｂ７.２)を発現するようトランスフェクトしたＪ５５８形質細胞腫細胞、またはＪ５５８形質細胞腫細胞の移植後のマウス中の腫瘍細胞の成長(腫瘍の大きさで測定)のグラフ表示である。
【図１】
2009060905.tif 000008
【図２】
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【図３】
2009060905.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2009060905.tif 000020
【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
2009060905.tif 000023
【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５】
2009060905.tif 000029
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2009060905.tif 000033
【図２０】
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【配列表】
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