(57)【要約】      （修正有）【課題】高い親和性と選択性を有する蛍光標識の提供。【解決手段】下記式（１）で表される化合物。2009298725.tif 000021（Ｒ1はアルキル基、Ｘ1〜Ｘ4はＨ、アルキル基、蛍光基等を示す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体。
【化１】
2009298725.tif 000020
（但し、前記式（１）中、
Ｒ1は、置換若しくは非置換の炭素数１〜５のアルキル基を示し、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4は、同一若しくは異なって、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、フェノキシ基、トリフルオロメチル基、カルバモイル基、アミノスルホニル基、ハロゲン原子を示し、且つ
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4のうちの少なくとも一つが炭素数１〜１０のジアルコキシ基或いはアルコキシアミノ基と結合した蛍光基を示す。）
【請求項２】
前記式（１）において、
Ｒ1が、置換若しくは非置換の炭素数１〜５のアルキル基を示し、
Ｘ1及びＸ2は、同一若しくは異なって、炭素数１〜５のアルコキシ基を示し、且つ
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4のうちの少なくとも一つが炭素数１〜１０のジアルコキシ基或いはアルコキシアミノ基と結合した蛍光基を示す請求項１に記載の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体。
【請求項３】
前記式（１）において、
Ｒ1が、置換若しくは非置換の炭素数１〜５のアルキル基を示し、
Ｘ1及びＸ2は、同一若しくは異なって、炭素数１〜５のアルコキシ基を示し、
Ｘ3は、ハロゲン原子を示し、
Ｘ4は、水素原子を示し、且つ
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4のうちの少なくとも一つが炭素数１〜１０のジアルコキシ基或いはアルコキシアミノ基と結合した蛍光基を示す請求項１に記載の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を有効成分とする、アルツハイマー型痴呆、前頭側頭葉型痴呆、瀰漫性レビー小体病、血管障害、パーキンソン病関連疾患、大脳基底核変性症、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、多系統萎縮症、多発性硬化症、てんかん、髄膜炎、脳炎、末梢神経損傷、喉頭がん、乳癌、卵巣腫瘍、肝癌、大腸がん、胃癌、副腎腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、繊維芽腫、神経肉腫、肺がん、子宮癌、リンパ腫、前立腺癌、メラノーマ、精巣腫瘍、アストロサイトーマ又は異所性ホルモン産生腫瘍用の蛍光標識プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢性ベンゾジアゼピン受容体に親和性を有する蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体及びこれを有効成分とする蛍光標識プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
ベンゾジアゼピン（ＢＺ）受容体は、中枢性ベンゾジアゼピン受容体と末梢性ベンゾジアゼピン受容体（以下、ＰＢＲという。）に分類される。ＰＢＲは発見当初、末梢組織で確認されたため、このように称されているが、その後の研究により中枢組織にもその存在が認められている。中枢組織のＰＢＲは、脳内のグリア細胞に高密度に存在している。さらに、さまざまな疾患に伴って、脳内のグリア細胞の活性化が引き起こされ、ＰＢＲの密度が上昇することも知られている。
【０００３】
これまでの研究により、ＰＢＲは、アルツハイマー型痴呆、前頭側頭葉型痴呆、瀰漫性レビー小体病、血管障害、パーキンソン病関連疾患、大脳基底核変性症、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、多系統萎縮症、多発性硬化症、てんかん、髄膜炎、脳炎、末梢神経損傷、喉頭がん、乳癌、卵巣腫瘍、肝癌、大腸がん、胃癌、副腎腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、繊維芽腫、神経肉腫、肺がん、子宮癌、リンパ腫、前立腺癌、メラノーマ、精巣腫瘍、アストロサイトーマ、異所性ホルモン産生腫瘍等の疾患と関わることが報告されている。
【０００４】
ＰＢＲに特異的に結合するリガンド（ＰＢＲリガンド）として、Ｎ−メチル−Ｎ−(１−メチルプロピル−)−１−(２−クロロフェニル)−イソキノリン−３−カルボキサミド（以下、ＰＫ１１１９５という。）が知られており、Positron emission tomograph（ＰＥＴ）などの核医学診断装置によって、生きたヒトの脳内のＰＢＲの分布を画像化する際は、ＰＫ１１１９５を11Ｃで標識した［11Ｃ］ＰＫ１１１９５が広く用いられている。
【０００５】
他方、特許文献１には、Ｎ−(２,５−ジメトキシベンジル)−Ｎ−(５−フルオロ−２−フェノキシフェニル)アセトアミド（以下、ＤＡＡ１１０６という。）が記載されている。また、特許文献２には、Ｎ−（２−フルオロメチル−５−メトキシベンジル）−Ｎ−（５−フルオロ−２−フェノキシフェニル）アセタミド（以下ＦＭＤＡＡ１１０６）、及びＮ−［２−（２−フルオロ）エチル−５−メトキシベンジル］−Ｎ−（５−フルオロ−２−フェノキシフェニル）アセトアミド（以下、ＦＥＤＡＡ１１０６という。）が記載されている。
【０００６】
そして、特許文献１、２には、ＤＡＡ１１０６、ＦＭＤＡＡ１１０６及びＦＥＤＡＡ１１０６がＰＢＲに対して強い親和性と高い選択性を有することが記載されており、現在、これらの化合物の放射性標識体、例えば、11Ｃで標識した［11Ｃ］ＤＡＡ１１０６、18Ｆで標識した［18Ｆ］ＦＭＤＡＡ１１０６と［18Ｆ］ＦＥＤＡＡ１１０６が、脳内のＰＢＲの分布を画像化するトレーサーとして用いられている。
【０００７】
また、Ｎ−（２−ヨード−５−メトキシベンジル）−Ｎ−（５−フルオロ−２−フェノキシフェニル）アセトアミド（以下、ＩＤＡＡ１１０６という。）等もＰＢＲリガンドとして機能すると期待されており、現在、131Ｉで標識した[131Ｉ]ＩＤＡＡ１１０６をSingle photon emission computed tomography（ＳＰＥＣＴ）などの核医学診断に用いるための研究が行われている。
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−１７１８４４号
【特許文献２】特開平２００４−２３１６４７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、［11Ｃ］ＰＫ１１１９５、［11Ｃ］ＤＡＡ１１０６、［18Ｆ］ＦＭＤＡＡ１１０６、［18Ｆ］ＦＥＤＡＡ１１０６、[131Ｉ]ＩＤＡＡ１１０６などはいずれも核医学診断装置のトレーサーとして開発されたものである。そのため、これらの試薬を使用するにあたって、試薬を作製するためのサイクロトロンや被曝を防止するための被曝防止設備といった特別な設備が必要となるという問題がある。
また、11Ｃ、18Ｆ、131Ｉは半減期が短いために、例えば、実験や研究で使用する際の取り扱いが非常に困難であり、試薬をストックしておくことができないという問題もある。
【００１０】
本発明は前記問題に鑑みてなされたものであり、ＰＢＲに対して高い親和性と高い選択性を有し、且つ使用にあたって特別な設備を必要とせず、実験や研究で用いる場合に取り扱いが容易でストックしておくことができ、試薬として用いることができる蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体及び蛍光標識プローブを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは前記課題を解決するため鋭意研究した結果、特開平１１−１７１８４４号に記載の化合物に蛍光基を導入することによって、ＰＢＲに対して高い親和性を示す試薬を作出することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
（１）すなわち、本発明は、下記式（１）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体である。
【００１３】
【化１】
2009298725.tif 000002
【００１４】
但し、前記式（１）中、Ｒ1は、置換若しくは非置換の炭素数１〜５のアルキル基を示し、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4は、同一若しくは異なって、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、フェノキシ基、トリフルオロメチル基、カルバモイル基、アミノスルホニル基、ハロゲン原子を示し、且つＸ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4のうちの少なくとも一つが炭素数１〜１０のジアルコキシ基或いはアルコキシアミノ基と結合した蛍光基を示す。
【００１５】
（２）本発明に係る蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体は、前記式（１）において、Ｒ1が、置換若しくは非置換の炭素数１〜５のアルキル基を示し、Ｘ1及びＸ2は、同一若しくは異なって、炭素数１〜５のアルコキシ基を示し、且つＸ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4のうちの少なくとも一つが炭素数１〜１０のジアルコキシ基或いはアルコキシアミノ基と結合した蛍光基を示すのが好ましい。
【００１６】
（３）本発明に係る蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体は、前記式（１）において、Ｒ1が、置換若しくは非置換の炭素数１〜５のアルキル基を示し、Ｘ1及びＸ2は、同一若しくは異なって、炭素数１〜５のアルコキシ基を示し、Ｘ3は、ハロゲン原子を示し、Ｘ4は、水素原子を示し、且つＸ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4のうちの少なくとも一つが炭素数１〜１０のジアルコキシ基或いはアルコキシアミノ基と結合した蛍光基を示すのが好ましい。
【００１７】
（４）本発明に係る及び蛍光標識プローブは、（１）〜（３）のいずれか１つに記載の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を有効成分とする、アルツハイマー型痴呆、前頭側頭葉型痴呆、瀰漫性レビー小体病、血管障害、パーキンソン病関連疾患、大脳基底核変性症、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、多系統萎縮症、多発性硬化症、てんかん、髄膜炎、脳炎、末梢神経損傷、喉頭がん、乳癌、卵巣腫瘍、肝癌、大腸がん、胃癌、副腎腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、繊維芽腫、神経肉腫、肺がん、子宮癌、リンパ腫、前立腺癌、メラノーマ、精巣腫瘍、アストロサイトーマ及び異所性ホルモン産生腫瘍用の蛍光標識プローブである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体は、標識体として蛍光基を用いているので、使用にあたってサイクロトロンや被曝防止設備などを必要とせず、実験や研究で用いる場合に取り扱いが容易で長期間ストックしておくことができる。
また、本発明の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体は、ＰＢＲに対して高い親和性と高い選択性を有するため、例えば、実験や研究において蛍光標本を容易に作製することができる。
【００１９】
特に、本発明の蛍光標識プローブは、前記した蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を有効成分としているので、ＰＢＲの増減と関係するアルツハイマー型痴呆、前頭側頭葉型痴呆、瀰漫性レビー小体病、血管障害、パーキンソン病関連疾患、大脳基底核変性症、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、多系統萎縮症、多発性硬化症、てんかん、髄膜炎、脳炎、末梢神経損傷、喉頭がん、乳癌、卵巣腫瘍、肝癌、大腸がん、胃癌、副腎腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、繊維芽腫、神経肉腫、肺がん、子宮癌、リンパ腫、前立腺癌、メラノーマ、精巣腫瘍、アストロサイトーマ、異所性ホルモン産生腫瘍などの疾患の蛍光標本の作製や生検を容易に行うことが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明に係る蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体及びこれを有効成分とする蛍光標識プローブについて詳細に説明する。
本発明に係る蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体は、下記式（１）で表される。
【００２１】
【化２】
2009298725.tif 000003
【００２２】
但し、前記式（１）中、Ｒ1は、置換若しくは非置換の炭素数１〜５のアルキル基を示す。
また、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4は、同一若しくは異なって、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、フェノキシ基、トリフルオロメチル基、カルバモイル基、アミノスルホニル基、ハロゲン原子を示し、且つこれらＸ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4のうちの少なくとも一つが炭素数１〜１０のジアルコキシ基（−Ｏ（ＣＨ2）nＯ−）或いはアルコキシアミノ基（−Ｏ（ＣＨ2）nＮ−）と結合した蛍光基を示す（ｎは１〜１０の自然数を示す。）。このように、前記式（１）に示したフェニルオキシアニリン誘導体と蛍光基との間にジアルコキシ基或いはアルコキシアミノ基を介在させることにより、蛍光基によるフェニルオキシアニリン誘導体への立体障害等を防止することができる。そのため、ＰＢＲへの結合力の低下を防ぐことができる。また、炭素数１〜１０のジアルコキシ基或いはアルコキシアミノ基を結合させたフェニルオキシアニリン誘導体と蛍光基とを結合させる際に、ジアルコキシ基の水酸基やアルコキシアミノ基のアミノ基と、当該蛍光基の反応基との化学反応を好適に行わしめることが可能となる。
【００２３】
好ましくは、前記式（１）において、Ｒ1が、置換若しくは非置換の炭素数１〜５のアルキル基を示し、Ｘ1及びＸ2は、同一若しくは異なって、炭素数１〜５のアルコキシ基を示し、且つＸ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4のうちの少なくとも一つが炭素数１〜１０のジアルコキシ基或いはアルコキシアミノ基と結合した蛍光基を示す蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体である。
【００２４】
より好ましくは、前記式（１）において、Ｒ1が、置換若しくは非置換の炭素数１〜５のアルキル基を示し、Ｘ1及びＸ2は、同一若しくは異なって、炭素数１〜５のアルコキシ基を示し、Ｘ3は、ハロゲン原子を示し、Ｘ4は、水素原子を示し、且つＸ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4のうちの少なくとも一つが炭素数１〜１０のジアルコキシ基或いはアルコキシアミノ基と結合した蛍光基を示す蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体である。
【００２５】
なお、本発明において、炭素数１〜５のアルキル基とは、直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、シクロブチル基、シクロプロピルメチル基、ペンチル基、イソペンチル基、シクロペンチル基、シクロブチルメチル基、１−エチルプロピル基などである。
【００２６】
本発明において、炭素数１〜５の置換アルキル基とは、ハロゲン原子で置換されたアルキル基であり、例えば、フロオロメチル、フロオロエチル、フロオロプロピル基などである。
【００２７】
本発明において、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子である。
【００２８】
そして、本発明において、蛍光基とは、例えば、ローダミン、ＮＢＤ、ＤＰＳ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｉｎ、Ｐｈｙｓｙｌ、ＡＢＤ、ＤＢＰＭ、ＮＡＭ、ＳＢＤ、ＤＤＢ、ＤＴＢＮ、Ｆｌｕｏｒａｌ−Ｐ、ＭＤＢ、ＢＨＢＴ、ＤＭＥＱ、ＤＭＥＱ、ＯＭＢ及びこれらの塩である。これらの中でも、ローダミンやＮＢＤを好適に用いることができる。
なお、蛍光基は、前記したように、前記式（１）中のＸ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4のうちの少なくとも一つに結合するものであり、その結合位置は、蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を生成する際の保護基の付け方等により任意に変更することができる。
【００２９】
例えば、下記反応式（２）の下式に表される本発明に係る蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体は、下記反応式（２）の上式に表されるＮ−（２−ベンジルオキシ−５−アルコキシベンジル）−Ｎ−（フェノキシフェニル）アシルアミド化合物に、例えば、ローダミンなどの蛍光基を導入することで得ることができる。
【００３０】
【化３】
2009298725.tif 000004
【００３１】
また例えば、下記反応式（３）の下式に表される本発明に係る蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体は、下記反応式（３）の上式に表されるＮ−（２−ベンジルオキシ−５−アルコキシベンジル）−Ｎ−（フェノキシフェニル）アシルアミド化合物に、例えば、ＮＢＤなどの蛍光基を導入することで得ることができる。
【００３２】
【化４】
2009298725.tif 000005
【００３３】
以上に説明した本発明に係る蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体は、下記式（４）で表される化合物がＰＢＲリガンドとして機能するため、ＰＢＲの高密度化を伴う疾患、例えば、アルツハイマー型痴呆、前頭側頭葉型痴呆、瀰漫性レビー小体病、血管障害、パーキンソン病関連疾患、大脳基底核変性症、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、多系統萎縮症、多発性硬化症、てんかん、髄膜炎、脳炎、末梢神経損傷、喉頭がん、乳癌、卵巣腫瘍、肝癌、大腸がん、胃癌、副腎腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、繊維芽腫、神経肉腫、肺がん、子宮癌、リンパ腫、前立腺癌、メラノーマ、精巣腫瘍、アストロサイトーマ又は異所性ホルモン産生腫瘍に対して高い親和性を有する。
また、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4のうちの少なくとも一つが蛍光基であるため、蛍光基を励起させることによって、例えば、前記疾患の関連部位の組織片などを容易に蛍光染色し、観察することができる。
そのため、蛍光標識プローブとして用いることができるため、ＰＢＲの増減を伴う前記疾患の実験や研究、早期診断、生検等に用いることができる。
【００３４】
【化５】
2009298725.tif 000006
【００３５】
なお、本発明に係る蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体及び蛍光標識プローブは、必要に応じて、生理食塩水に溶解したり、常用の増量剤、結合剤、ｐＨ調節剤、溶解剤などを添加したりすることができる。
【実施例】
【００３６】
次に、本発明に係る蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体の実施例について説明する。
なお、以下に説明する実施例で用いたジメチルホルムアミドはシグマ−アルドリッチ社製のものを用いた。トリエチルアミン、ジクロロメタン、メタノール、ヘキサン、及びジエチルエーテルは和光純薬社製のものを用いた。ＣＤＣｌ3は東京化成社製のものを用いた。また、ＮＢＤ−Ｃｌはシグマ−アルドリッチ社製のものを用い、ローダミンはAcros Organics社製のものを用いた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーに用いたシリカゲルカラムは、ガラス管にメルク社製のシリカゲルを充填したものを用いた。
【００３７】
［実施例１］
予め合成し、準備しておいた下記式（５）で表されるＮ−（２−ベンジルオキシ−５−アルコキシベンジル）−Ｎ−（フェノキシフェニル）アシルアミド化合物（２６１ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）に、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）と、トリエチルアミン（０．３１ｍＬ＝２．２ｍｍｏｌ≒５等量）を加え、室温で約５分間撹拌した。
均一な溶液になったことを確認してから、下記式（６）で表されるＮＢＤ−Ｃｌ（１１４ｍｇ≒０．３等量）を加え、アルミホイルで遮光した状態で室温にて終夜撹拌し、反応混合物を得た。
【００３８】
【化６】
2009298725.tif 000007
【００３９】
【化７】
2009298725.tif 000008
【００４０】
得られた反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタンを溶出溶媒としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。なお、精製の際にはグラジエント条件としてメタノールを０〜１％まで変化させた。
得られた褐色のオイル状の精製物をヘキサン及びジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥することによって下記式（７）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を得た。収量は１４０．３ｍｇ、収率は５０．８％であった。
また、得られた蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）を用いて分析した。
1H-NMR(300MHz, CDCl3): 1.23(2H,m), 1.72(2H,m), 1.86(2H,m), 1.98(3H,s), 3.51-3.72(4H,m), 3.63(3H,s), 4.75(1H,d,J=14.3Hz), 5.12(1H,d,J=14.3Hz), 6.19(1H,br), 6.62-6.71(3H,m), 6.78-6.95(5H,m), 7.11(1H,t,J=7.5Hz), 7.28-7.33(2H,m), 7.61(1H,br), 8.47(1H,d,J=8.7Hz)
【００４１】
【化８】
2009298725.tif 000009
【００４２】
［実施例２］
下記式（８）で表されるＮ−（２−ベンジルオキシ−５−アルコキシベンジル）−Ｎ−（フェノキシフェニル）アシルアミド化合物（２６６ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）に、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）と、トリエチルアミン（０．３１ｍＬ＝２．２ｍｍｏｌ≒５等量）を加え、室温で約５分間撹拌した。
均一な溶液になったことを確認してから、下記式（９）で表されるＮＢＤ−Ｃｌ（１１４ｍｇ≒０．３等量）を加え、アルミホイルで遮光した状態で室温にて終夜撹拌し、反応混合物を得た。
【００４３】
【化９】
2009298725.tif 000010
【００４４】
【化１０】
2009298725.tif 000011
【００４５】
得られた反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタンを溶出溶媒としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。なお、精製の際にはグラジエント条件としてメタノールを０〜１％まで変化させた。
得られた褐色のオイル状の精製物をヘキサン及びジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥することによって下記式（１０）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を得た。収量は１６４．５ｍｇ、収率６０．６％であった。
得られた蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）を用いて分析した。
1H-NMR(300MHz, CDCl3): 1.27(2H,m), 1.51(2H,m), 1.66(2H,m), 1.82(2H,m), 2.02(3H,s), 3.64(3H,s), 4.67(1H,d,J=14.3Hz), 5.17(1H,d,J=14.3Hz), 6.17(1H,d,J=8.6Hz), 6.62-6.91(8H,m), 7.11(1H,t,J=7.2Hz), 7.27-7.33(2H,m), 7.63(1H,br), 8.46(1H,d,J=8.6Hz)
【００４６】
【化１１】
2009298725.tif 000012
【００４７】
［実施例３］
予め合成し、準備しておいた下記式（１１）で表されるＮ−（２−ベンジルオキシ−５−アルコキシベンジル）−Ｎ−（フェノキシフェニル）アシルアミド化合物（２２４ｍｇ、０．３８６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１０等量、０．５４ｍＬ）を加えた。そして、氷冷下で、下記式（１２）で表されるLissamine-Rhodamine-Sulfonyl chloride（１．２等量、２６７ｍｇ）を加え、室温で終夜反応させた。
【００４８】
【化１２】
2009298725.tif 000013
【００４９】
【化１３】
2009298725.tif 000014
【００５０】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でＮ−（２−ベンジルオキシ−５−アルコキシベンジル）−Ｎ−（フェノキシフェニル）アシルアミド化合物の消失を確認した後、得られた反応混合物を、トリエチルアミン０．１％含有させたジクロロメタンを溶出溶液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的のフラクション部分を濃縮し、粗結晶を得た。なお、精製の際にはグラジエント条件としてメタノールを０〜１％まで変化させた。
得られた粗結晶を、ｎ−ヘキサンで洗浄し、減圧下で乾燥することによって下記式（１３）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を得た。収量は３３３ｍｇ、収率は８５．６％であった。
得られた蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）を用いて分析した。
1H-NMR(300MHz, CDCl3): 1.28(12H, t, J=7.0Hz), 1.40(6H,t,J=7.3Hz), 1.99(3H,s), 3.08-3.17(6H,m), 3.52-3.58(6H,m), 3.63(3H,s), 4.73(1H,d,J=14.3Hz), 5.03(1H,d,J=14.3Hz), 6.13(1H,t,J=5.9Hz), 6.62-6.70(4H,m), 6.76-6.84(8H,m), 6.85-6.91(1H,m), 7.10(1H,t,J=7.3Hz), 7.19(1H,d,J=8.1Hz), 7.27-7.32(3H,m), 8.01(1H,dd,J=1.8, 8.1Hz), 8.83(1H,d,J=1.8Hz)(calcd for 59H)
【００５１】
【化１４】
2009298725.tif 000015
【００５２】
［実施例４］
予め合成し、準備しておいた下記式（１４）で表されるＮ−（２−ベンジルオキシ−５−アルコキシベンジル）−Ｎ−（フェノキシフェニル）アシルアミド化合物（２５１ｍｇ、０．４３２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１０等量、０．５４ｍＬ）を加えた。そして、氷冷下で、下記式（１５）で表されるLissamine-Rhodamine-Sulfonyl chloride（１．２等量、２６７ｍｇ）を加え、室温で終夜反応させた。
【００５３】
【化１５】
2009298725.tif 000016
【００５４】
【化１６】
2009298725.tif 000017
【００５５】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でＮ−（２−ベンジルオキシ−５−アルコキシベンジル）−Ｎ−（フェノキシフェニル）アシルアミド化合物の消失を確認した後、得られた反応混合物を、トリエチルアミン０．１％含有させたジクロロメタンを溶出溶液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的のフラクション部分を濃縮し、粗結晶を得た。なお、精製の際にはグラジエント条件としてメタノールを０〜１％まで変化させた。
得られた粗結晶を、ｎ−ヘキサンで洗浄し、減圧下で乾燥することによって下記式（１６）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を得た。収量は３８８ｍｇ、収率は８８．０％であった。
得られた蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）を用いて分析した。
1H-NMR(300MHz, CDCl3): 1.29(12H,t,J=7.1Hz), 1.37-1.44(4H,m), 1.41-1.61(4H,m), 1.98(3H,s), 3.04-3.15(6H,m), 3.44-3.56(6H,m), 3.64(3H,s), 4.70(1H,d,J=14.3Hz), 5.04(1H,d,J=14.7Hz), 5.52(1H,t,J=5.9Hz), 6.66(4H,d,J=2.2Hz), 6.78-6.96(9H,m), 7.10(1H,t,J=7.2Hz), 7.20(1H,d,J=7.9Hz), 7.27-7.32(3H,m), 7.99(1H,dd,J=1.56 ,8.0Hz), 8.83(1H,d,J=1.7Hz) 
(calcd for 61H)
【００５６】
【化１７】
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【００５７】
［ＰＢＲに対する親和性］
Zhang, M.-RらのNucl. Med. Biol. 2002, 29, 469.及びJ. Med. Chem. 2004, 47, 2228に記載の従来法により、インビトロにおけるＰＢＲに対する親和性を調べた。
エーテル麻酔下で雄Wistarラット（１５０−１７０ｇ，６匹）を屠殺後、脳を素早く取り出し、ドライアイス中で凍結させた。Cryostat microtome（MICROM HM560, Carl Zeise GmbH, Germany）を使い、ラットの脳の矢状型切片を３６枚作製した。予めこれらの切片を５０ｍＭ  Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４、室温）中にて３０分間インキュベーションを行った。
その後、これらの切片を取り出し、下記の種々の試薬を含めた５０ｍＭ  Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４、室温）中に個別に入れ、それぞれ３０分間インキュベーションを行った。
【００５８】
試薬：
1. [11C]DAA1106(1 nM)
2. [11C]DAA1106(1 nM)＋DAA1106(1 μM)
3. [11C]DAA1106(1 nM)＋式(7)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(0.1 nM)
4. [11C]DAA1106(1 nM)＋式(7)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(1 nM)
5. [11C]DAA1106(1 nM)＋式(7)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(10 nM)
6. [11C]DAA1106(1 nM)＋式(7)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(100 nM)
7. [11C]DAA1106(1 nM)＋式(7)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(500 nM)
8. [11C]DAA1106(1 nM)＋式(7)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(1 μM)
9. [11C]DAA1106(1 nM)＋式(7)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(5 μM)
10.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(7)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(10 μM)
11.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(10)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(0.1 nM)
12.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(10)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(1 nM)
13.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(10)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(10 nM)
14.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(10)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(100 nM)
15.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(10)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(500 nM)
16.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(10)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(1 μM)
17.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(10)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(5 μM)
18.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(10)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(10 μM)
19.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(13)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(0.1 nM)
20.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(13)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(1 nM)
21.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(13)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(10 nM)
22.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(13)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(100 nM)
23.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(13)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(500 nM)
24.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(13)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(1 μM)
25.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(13)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(5 μM)
26.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(13)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(8.25 μM)
27.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(13)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(10 μM)
28.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(16)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(0.1 nM)
29.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(16)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(1 nM)
30.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(16)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(10 nM)
31.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(16)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(100 nM)
32.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(16)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(500 nM)
33.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(16)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(1 μM)
34.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(16)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(5 μM)
35.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(16)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(8.25 μM)
36.[11C]DAA1106(1 nM)＋式(16)の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体(10 μM)
【００５９】
２回目のインキュベーションが終了した後、それぞれ切片を取り出し、氷冷した５０ｍＭ  Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４）中に２分間２回浸した。そして、これらの切片を氷冷した蒸留水に浸した後、乾燥した。これらの切片をイメージングプレート（BAS-MS2025，富士写真フィルム社製）に１時間コンタクトした後、FUJIX BAS-1800II bioimaging analyzer（富士写真フィルム工業社製）にて切片上の放射能分布を調べた。関心領域（ＲＯＩ）を小脳と定め、放射能をPhoto-Stimulated-Luminescence(PSL)/mm2regionに表した。[11Ｃ]ＤＡＡ１１０６（１μＭ）存在下における式（７）、式（１０）、式（１３）、式（１６）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体の結合量を非特異結合とし、それぞれの結合量から差し引くことにより［11Ｃ］ＤＡＡ１１０６の特異結合を求め、プロビット法によってこれらの薬物のＩＣ50（μＭ）を算出した。その結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
表１に示すように、式（７）、式（１０）、式（１３）及び式（１６）で表されるいずれの蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体もＩＣ50はμＭオーダーであることが分かった。
また、ローダミンを結合させた蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体（式（１３）、式（１６））よりも、ＮＢＤを結合させた蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体（式（７）、式（１０））の方が、ＰＢＲへの親和性がやや高いことも分かった。
【００６２】
［蛍光イメージング（１）］
前記と同様にしてWistarラットの脳の矢状型切片を作製し、式（１３）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を用いて、ＰＢＲ密度が非常に高い脳室の蛍光イメージングを試みた。
脳室の蛍光イメージングは、以下のようにして行った。予めこれらの切片を５０ｍＭ  Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４、室温）中にて３０分間インキュベーションを行った。
その後、これらの切片を取り出し、５０ｍＭ  Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４、室温）中に式（１３）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体（１μＭ）を加えて調製した試薬と、５０ｍＭ  Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４、室温）中に式（１３）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体（１μＭ）及びＰＫ１１１９５（１０μＭ）を加えて調製した試薬と、５０ｍＭ  Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４、室温）中にローダミン（１０μｍ）を加えて調製した試薬とを個別に用意し、それぞれの試薬の中に切片を入れて３０分間インキュベーションを行った。その後、蛍光顕微鏡（オリンパス社製FLUOROVIEW FV1000）を用いて撮影し、蛍光イメージングを行った。
【００６３】
図１は、脳室の蛍光イメージングによって得られた写真であって、（ａ）は、式（１３）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体（１μＭ）を用いた脳室の蛍光イメージングの写真であり、（ｂ）は、式（１３）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体（１μＭ）及びＰＫ１１１９５（１０μＭ）を用いた脳室の蛍光イメージングの写真であり、（ｃ）は、ローダミン（１０μｍ）のみを用いた脳室の蛍光イメージングの写真である。
【００６４】
図１（ａ）に示すように、ＰＢＲ密度が非常に高いラットの脳室においては、式（１３）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体が多く集積する部位を確認することができる。他方、式（１３）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体は、脳室以外の領域には集積しないことが分かった。
【００６５】
図１（ｂ）に示すように、ＰＢＲ特異的なリガンドであるＰＫ１１１９５を大量に添加することによって、脳室における式（１３）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体の取り込みがほぼ消失することが分かった。
また、図１（ｃ）に示すように、ローダミンのみを用いた場合では、脳室を特異的に描出することができなかった。
これらから、式（１３）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体は、ＰＢＲに特異的な蛍光標識プローブとして機能することが分かった。
【００６６】
［蛍光イメージング（２）］
［蛍光イメージング（１）］と同様にしてWistarラットの脳の矢状型切片を作製し、式（７）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体を用いて、ＰＢＲ密度が非常に高い脳室の蛍光イメージングを試みた。
脳室の蛍光イメージングは、以下のようにして行った。予めこれらの切片を５０ｍＭ  Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４、室温）中にて３０分間インキュベーションを行った。
その後、これらの切片を取り出し、５０ｍＭ  Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４、室温）中に式（７）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体（１μＭ）を加えて調製した試薬と、５０ｍＭ  Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４、室温）中に式（７）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体（１μＭ）及びＰＫ１１１９５（１０μＭ）を加えて調製した試薬と、５０ｍＭ  Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４、室温）中にローダミン（１０μｍ）を加えて調製した試薬とを個別に用意し、それぞれの試薬の中に切片を入れて３０分間インキュベーションを行った。その後、蛍光顕微鏡（オリンパス社製FLUOROVIEW FV1000）を用いて撮影し、蛍光イメージングを行った。
【００６７】
図示はしないが、式（７）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体も、式（１３）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体と同様の結果を確認することができた。すなわち、図１（ａ）と同様に、ＰＢＲ密度が非常に高いラットの脳室において、当該式（７）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体が多く集積する部位を確認することができた。他方、式（７）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体は、脳室以外の領域には集積しないことも確認することができた。
【００６８】
また、図１（ｂ）と同様に、ＰＢＲ特異的なリガンドであるＰＫ１１１９５を大量に添加することによって、脳室における式（７）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体の取り込みがほぼ消失することを確認することができた。
さらに、図１（ｃ）と同様に、ローダミンのみを用いた場合では、脳室を特異的に描出することができないことを確認することができた。
これらから、式（７）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体は、ＰＢＲに特異的な蛍光標識プローブとして機能することが分かった。
【００６９】
以上、本発明の蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体及び蛍光標識プローブについて、発明を実施するための最良の形態及び実施例により詳細に説明したが、本発明の趣旨はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲の記載に基づいて広く解釈されなければならないことはいうまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】脳室の蛍光イメージングによって得られた写真であって、（ａ）は、式（１３）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体（１μＭ）を用いた脳室の蛍光イメージングの写真であり、（ｂ）は、式（１３）で表される蛍光標識フェニルオキシアニリン誘導体（１μＭ）及びＰＫ１１１９５（１０μＭ）を用いた脳室の蛍光イメージングの写真であり、（ｃ）は、ローダミン（１０μｍ）のみを用いた脳室の蛍光イメージングの写真である。
【図１】
2009298725.tif 000022