(57)【要約】【課題】血小板凝集活性の抑制や、血流促進作用を有するプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）の血管内皮細胞における産生を効果的に増強する、血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生増強剤を提供すること、及び、該血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生増強活性を有する生理活性画分を製造する方法を提供すること。【解決手段】Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分を有効成分とする血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）産生増強剤からなり、該Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分としては、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料から精製・分離されたＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分が挙げられる。該Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料としては、ピーナッツ種皮（渋皮）等を挙げることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分を有効成分とする血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤。
【請求項２】
Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分が、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料から精製・分離されたＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分であることを特徴とする請求項１記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤。
【請求項３】
Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料が、ピーナッツ種皮であることを特徴とする請求項２記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤。
【請求項４】
Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料からのＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分の精製・分離を、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料を、熱水及び／又はアルコールを抽出溶媒とする抽出により行なうことを特徴とする請求項２又は３記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤。
【請求項５】
Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料からのＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分の精製・分離を、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料のエタノール及び酢酸エチル抽出液を、エタノールを移動相とするＬＨ２０ゲル濾過クロマトグラフィーにより行なうことを特徴とする請求項４記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤。
【請求項６】
Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分が、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料から請求項５記載の精製方法で分離されたＨＰＬＣプロファイル分析によって検出される２つの主要ピーク画分に相当するプロアントシアニジンＡ１及び／又はＡ２であることを特徴とする請求項２記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤。
【請求項７】
血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強が、血小板凝集活性を抑制するためのものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤。
【請求項８】
血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強が、血流を促進するためのものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤。
【請求項９】
血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強が、血行障害及び／又は血栓症の予防又は改善のためのものであることを特徴とする請求項７又は８記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤。
【請求項１０】
血管内皮細胞が、ヒト血管内皮細胞であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤。
【請求項１１】
Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料からエタノールを抽出溶媒として抽出した抽出液を、酢酸エチルを用いて抽出し、該抽出液をエタノールを移動相として、ＬＨ２０ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、ＨＰＬＣプロファイル分析によって検出される２つの主要ピーク画分に相当するプロアントシアニジンＡ１及び／又はＡ２を分離することを特徴とする血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強活性を有する生理活性画分の製造方法。
【請求項１２】
Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料が、ピーナッツ種皮であることを特徴とする請求項１１記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強活性を有する生理活性画分の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分を有効成分とする血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）産生増強剤、及び血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強活性を有する生理活性画分の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞は血管内壁の単層に存在する細胞で、直接血液と接触し、血液凝固・線溶活性、血圧調節、脂質代謝、血管壁への血液細胞の接着や透過などに関わる重要な生理活性物質を産生・分泌する細胞として知られている（非特許文献１）。血管内皮細胞は、血小板機能、凝固・線溶系を制御し、血管内で血栓が形成されないように働いているが、血管障害が起こると血管内に血栓が形成され、動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞、脳卒中など重篤な病気に繋がる恐れがある。血管内皮細胞は、血液凝固の初期反応である血小板凝集活性を強力に抑制するプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）を産生し、血栓形成を抑えることが知られている（非特許文献２）。
【０００３】
プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）は、血管内皮細胞膜より遊離したアラキドン酸がシクロオキシゲナーゼによって、プロスタグランジンＧ２（ＰＧＧ２）、そして、プロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）に変換され、ＰＧＩ２合成酵素によりＰＧＩ２に変化する。ＰＧＩ２は強力な血小板凝集阻害活性を有しており、健常な血管内皮細胞からはＰＧＩ２が常時産生されることが、血管内で血栓が生じない理由のひとつと考えられている（非特許文献２）。このようにＰＧＩ２は、血栓のような血行障害を予防・改善し、血流を促進する機能を有することから、ＰＧＩ２産生細胞である血管内皮細胞のＰＧＩ２産生を刺激することにより、血流促進、血行障害の予防・改善、及び血行障害に起因する疾患の予防・改善を図る方法が開示されている。
【０００４】
例えば、ニシヨモギ、リュウキュウヨモギ、又はカワラヨモギのようなヨモギ属植物の抽出物、バンジロウ（グァバ：フトモモ科）或いはボタンボウフウ（セリ科）植物の抽出物、又はその処理物等をプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）生成促進剤として用いて、肺高血圧症、高血圧症、血栓症などの予防・改善を図ることが開示されている（特許文献１）。また、紅麹を主成分とする麹の発酵抽出物をＰＧＩ２生成促進剤として用いて、肺高血圧症、高血圧症、血栓症などの予防・改善を図ることが開示されている（特許文献２）。更に、エルダーベリー（西洋ニワトコ：スイカズラ科）の抽出物を、ＰＧＩ２産生増加剤として用いて、血流促進や、血行障害の予防・改善や、血行障害に起因する疾患の予防・改善を図ることが開示されている（特許文献３）。
【０００５】
一方で、「縮合型タンニン」或いは「非加水分解性タンニン」と呼ばれる化合物で、植物体に含まれるポリフェノールの一種として、プロアントシアニジンが知られている。プロアントシアニジンは、一般的には単量体であるカテキン又はエピカテキン等のフラバン−３−オール構造を有する化合物を構成単位として、複数の分子が縮重合した化学構造を有している。結合様式の違いから、大きくはＢ型（単位間の炭素結合が、４β→８または４β→６のみ）及びＡ型（単位間結合が４β→８及び２β→Ｏ→７、または４β→６及び２β→Ｏ→７の結合を少なくとも１つ有する）に分けられる（非特許文献３，４）。Ｂ型プロアントシアニジンは、ブドウ種子、リンゴ、松樹皮、カカオなど多くの植物体に存在していることが知られている（非特許文献５−８）。一方、Ａ型プロアントシアニジンは、Ｂ型プロアントシアニジンに比べて、含有する植物体は非常に限られており、クランベリー、シナモン、ピーナッツ種皮など数種類のみ報告されている（非特許文献６、９−１１）。
【０００６】
プロアントシアニジンの血管内皮細胞に対する生理機能として、いくつかの報告がなされている。プロアントシアニジン（主にＢ型）とエピカテキンを含むチョコレートを健康な人に食べてもらったところ、血漿中エピカテキン量が増加し、血管内の血液流動性が改善したことが報告されている（非特許文献１２）。また、カカオを摂取した時に、血小板の凝集活性が低下することが報告されている（非特許文献１３）。Aldiniらは、ブドウ種子から抽出したプロアントシアニジン（Ｂ型）が、ヒト血管内皮細胞のＰＧＩ２産生を促進すると報告している（非特許文献１４）。Schrammらは、高含量のプロアントシアニジン（主にＢ型）を含有したチョコレートを摂取した人では、血漿中のＰＧＩ２産生が増加し、また、培養ヒト血管内皮細胞にカカオから抽出したプロアントシアニジン（主にＢ型）を処理したところ、有意にＰＧＩ２産生の増加が見られたと報告している（非特許文献１５）。このことから、Schrammらは、Ｂ型プロアントシアニジンが人の血管内皮細胞に作用することでＰＧＩ２の産生量が増加し、その結果、血漿中の血小板凝集活性が抑制されたと推察している。
【０００７】
しかしながら一方で、Ｂ型プロアントシアニジンを含むカカオを摂取したところ、３０分で血漿中にプロシアニジンダイマー（２量体）を検出できたが、その濃度は、カテキンやエピカテキン（単量体）に比べてかなり低いことが明らかとなり、Ｂ型プロシアニジンは腸管吸収が悪いことの可能性が指摘されている（非特許文献１６）。同様の報告として、カテキン、エピカテキン、プロシアニジンＢ３をラットに経口投与したところ、カテキン、エピカテキンは血漿、尿中に検出できたが、プロシアニジンＢ３は検出されなかった（非特許文献１７）。また、Ｂ型プロアントシアニジンは、酸性やアルカリ性条件下で分解されやすいことから、胃や腸管内で分解されることも考えられる（非特許文献１８）。そしてまた、プロアントシアニジンに比べて吸収されやすいとされるカテキン、エピカテキンについても、消化管の粘膜上皮細胞や肝臓においてグルクロン酸や硫酸などによる抱合化反応やメチル化反応を受けて活性が低下することも指摘されている（非特許文献１９）。
【０００８】
上記のとおり、プロアントシアニジンについて、Ｂ型プロアントシアニジンは、ブドウ種子、リンゴ、松樹皮、カカオなど多くの植物体に存在していることが知られており、一方、Ａ型プロアントシアニジンは、クランベリー、シナモン、ピーナッツ種皮など数種類の非常に限られた植物体にのみ存在していることが報告されているが、Ａ型プロアントシアニジンの製造方法については、ピーナッツ種皮（渋皮）からの精製・分離手段による製造方法が知られている。
【０００９】
ピーナッツ渋皮からのＡ型プロアントシアニジンの工業的な抽出法および精製法に関しては、溶媒抽出法、発酵抽出法、合成吸着剤による吸着処理法などが用いられてきた。溶媒抽出法としては、例えば、水、熱水；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、プロピレングリコールのような低級アルコール類；エチルエーテル、ジオキサンのようなエーテル類、アセトンのようなケトン類等の抽出溶媒を用いて抽出する方法が知られている（特許文献４，５，６〜７、８〜１１）。発酵抽出法としては、例えば、酵母を添加発酵させ、抽出分離する方法が知られている（特許文献１２、１３）。また、合成吸着剤による吸着処理法としては、ピーナッツ渋皮を熱水抽出した抽出液を、ダイアイオンＨＰ２０に吸着させた後、アセトンで溶出し、更に、水及びエタノールに可溶の成分を分取する方法が知られている（特許文献１４）。
【００１０】
【特許文献１】特開２００５−３５０４３２号公報。
【特許文献２】特開２００６−２４８９７６号公報。
【特許文献３】特開２００７−３９４４５号公報。
【特許文献４】再表０３／０２０２９５号公報。
【特許文献５】特許３４７２１７２号公報。
【特許文献６】特許３２１７２７８号公報。
【特許文献７】特開２００４−２６９４８７号公報。
【特許文献８】特開２００１−２４７４２８号公報。
【特許文献９】特開２００４−２１７５５８号公報。
【特許文献１０】特開２００４−２７７３５０号公報。
【特許文献１１】特開２００５−２３７２０３号公報。
【特許文献１２】特開２００４−３２９０６１号公報。
【特許文献１３】特開平９−２２１４８４号公報。
【特許文献１４】特許３０１０２５８号公報。
【非特許文献１】室田誠逸、培養血管内皮細胞の特性と機能分化、代謝、２５：３−１０、１９８８。
【非特許文献２】越智宏、室田誠逸、血管内皮細胞と血小板―プロスタグランジンを中心に、実験 医学、６：４２−４７、１９８８。
【非特許文献３】Haslam E. The Flavonoids, Advances in Research since 1975, Chapman & Hall, London (1982), ｐ.417。
【非特許文献４】西岡五夫、化学と生物Vol 24, No 7, 428-439, 1986。
【非特許文献５】BourzeixM et al., Bulletin de I’ O.I.V., 1172:669-670, 1986。
【非特許文献６】Thompson RS et al., J Chem Soc Perkin Trans., 1:1387, 1972。
【非特許文献７】Masquelier J, Natural products as medicinal agents. Planta Med., 242-256, 1980。
【非特許文献８】滝沢登志男、最近のカカオポリフェノール研究、明治製菓研究年報、３７：１−１４、１９９８。
【非特許文献９】木村進ら、加藤博通編著、食品の変色の化学、光琳、５０−５４、１９９５。
【非特許文献１０】Karchesy JJ and Hemingway RW, Condensed tannins: (4β-8;2β-0-7)-linked  procyanidins in Arachis hypogaea L. J Agric Food Chem., 34: 966-970,1986。
【非特許文献１１】Lou H et al., A-type proanthocyanidins from peanut skins. Phytochemistry, 51: 297-308, 1999。
【非特許文献１２】Engler MB et al., Flavonoid-rich dark chocolate improves endothelial function and increases plasma epicatechin concentrations in healthy adults. J Am Coll Nutr., 23: 197-204, 2004。
【非特許文献１３】Rein D et al., Cocoa inhibits platelet activation and function. Am J Clin Nutr., 72: 30-35,2000。
【非特許文献１４】Aldini G et al., Procyanidinsfrom grape seeds protect endothelial cells from peroxynitritedamage and enhance endothelial-dependent   relaxation in human artery: new evidences for cardio-protection. Life Sciences 73: 2883-2898, 2003。
【非特許文献１５】Schramm DD et al., Chocolate procyanidins decrease the leukotrien- prostacyclin ratio in human aortic endothelial cells. Am J Clin Nutr., 73: 36-40, 2001。
【非特許文献１６】Holt RR et al., Procyanidin dimer B2〔epicatechin-(4β-8)-epicatechin〕in human plasma after the consumption of a flavanol-rich cocoa. AM J Clin Nutr., 76: 798-804, 2002。
【非特許文献１７】Donovan JL et al., Procyanidins are not bioavailablein rats fed a single meal containing grapeseedextract or the procyanidin dimerB3. Br J Nutr., 87: 299-306, 2002。
【非特許文献１８】Zhu QY et al., Stability of flavan-3-ols epicatechin and catechin and related dimeric procyanidinsderived from cocoa. J Agric Food Chem., 50: 1700-1705, 2002。
【非特許文献１９】宮沢陽夫、天然抗酸化物質の吸収と代謝（解説）、化学と生物、３８：１０４−１１４、２０００。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、血小板凝集活性の抑制や、血流促進作用を有するプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）の血管内皮細胞における産生を効果的に増強する、血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤を提供すること、及び、該血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強活性を有する生理活性画分を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、Ａ型プロアントシアニジンの生理活性について、鋭意検討する中で、本発明者らのラットを用いた予備的試験において、Ａ型プロアントシアニジン画分は、腸管吸収に優れており、かつ殆どが抱合化などの反応を受けずにそのままの形で血漿中に存在していることが判明し、Ａ型プロアントシアニジンについて、生体内での高い生理機能が期待された。そこで、本発明者らが更にこれら成分の生理機能の探索を推し進めた結果、該生理活性成分が、血管内皮細胞におけるプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）産生を効果的に増強する活性を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明においては、Ａ型プロアントシアニジンの生体内での生理機能について探索する中で、生体内で多くの生理機能を有するヒト血管内皮細胞について着目し、その中で血管内皮細胞において産生される、血小板凝集活性を抑制する（抗血栓性）物質であるＰＧＩ２の産生について注目した。プロアントシアニジンは植物ポリフェノールの一種で、化学構造の違いでＡ型とＢ型に大別され、Ｂ型については多くの知見があるが、Ａ型については今まであまり良く知られておらず、Ａ型プロアントシアニジンが血管内皮細胞の生理機能に及ぼす影響や、血管内皮細胞が産生するＰＧＩ２産生に与える効果については、これまで報告がない。
【００１４】
Ｂ型プロアントシアニジンは、酸性やアルカリ性で不安定であり、腸管吸収が良くないことなどが分かっており、生体内に投与して生理機能があるかどうか疑問視する報告もある。一方、Ａ型は本発明者らが先に行った動物試験において、ラット血中に修飾や分解を受けないで存在することが確認されている（特願２００６−３４５９４１号等）。本発明において、Ａ型プロアントシアニジンに、血管内皮細胞のＰＧＩ２産生の誘導作用があることが見い出され、また、血中への吸収性や安定性に優れていることから、生体内に投与した時に、血管内皮細胞のＰＧＩ２産生を有効に誘導することができる。特に、本発明の製造方法で製造されたＡ型プロアントシアニジン画分は、プロスタサイクリン産生促進物質として知られるアラキドン酸に匹敵する効果を有していた。
【００１５】
すなわち、本発明は、Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分を有効成分とする血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）産生増強剤からなり、該Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分としては、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料から精製・分離されたＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分が挙げられる。該Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料としては、ピーナッツ種皮（渋皮）を特に好ましい植物材料として挙げることができる。
【００１６】
本発明において、血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生増強剤に用いられるＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分としては、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料を、熱水及び／又はアルコールを抽出溶媒として用い、抽出後、Ａ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分を精製・分離し、該画分を用いることができる。
【００１７】
例えば、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料からの熱水抽出液を、ポリスチレン系合成吸着剤及びエタノールを用いた吸着・溶出処理によりＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分を精製・分離する。該ポリスチレン系合成吸着剤としては、樹脂細孔半径３８〜８０Å（オングストローム）のポリスチレン系合成吸着剤を用い、溶出液としては、６０〜１００容量％のエタノールを用いて行うことができる。
【００１８】
また、本発明において、血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生増強剤に用いられるＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分として、本発明において開示された、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料のエタノール及び酢酸エチル抽出液を、エタノールを移動相とするＬＨ２０ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製・分離したＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分を用いることができる。該生理活性画分は、ＨＰＬＣプロファイル分析によって検出される２つの主要ピーク画分に相当するプロアントシアニジンＡ１及び／又はＡ２からなる。
【００１９】
更に、本発明は、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料からエタノールを抽出溶媒として抽出した抽出液を、酢酸エチルを用いて抽出し、該抽出液をエタノールを移動相として、ＬＨ２０ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、ＨＰＬＣプロファイル分析によって検出される２つの主要ピーク画分に相当するプロアントシアニジンＡ１及び／又はＡ２を分離することを特徴とする血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生増強活性を有する生理活性画分の製造方法を包含する。かかるＰＧＩ２産生増強活性を有する生理活性画分の製造に用いる好ましいＡ型プロアントシアニジンを含有する植物材料としては、ピーナッツ種皮（渋皮）を挙げることができる。該生理活性画分の製造方法によって製造されたものは、より精製度が高く、特に優れたＰＧＩ２産生増強活性を有する。
【００２０】
本発明の血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生増強剤により、血小板凝集活性を抑制し、血流を促進することができる。該血管内皮細胞におけるＰＧＩ２産生の増強により血行障害及び／又は血栓症の予防又は改善を図ることができる。
【００２１】
すなわち具体的には本発明は、（１）Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分を有効成分とする血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤や、（２）Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分が、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料から精製・分離されたＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分であることを特徴とする上記（１）記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤や、（３）Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料が、ピーナッツ種皮であることを特徴とする上記（２）記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤や、（４）Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料からのＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分の精製・分離を、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料を、熱水及び／又はアルコールを抽出溶媒とする抽出により行なうことを特徴とする上記（２）又は（３）記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤からなる。
【００２２】
また本発明は、（５）Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料からのＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分の精製・分離を、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料のエタノール及び酢酸エチル抽出液を、エタノールを移動相とするＬＨ２０ゲル濾過クロマトグラフィーにより行なうことを特徴とする上記（４）記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤や、（６）Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分が、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料から請求項５記載の精製方法で分離されたＨＰＬＣプロファイル分析によって検出される２つの主要ピーク画分に相当するプロアントシアニジンＡ１及び／又はＡ２であることを特徴とする上記（２）記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤や、（７）血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強が、血小板凝集活性を抑制するためのものであることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤や、（８）血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強が、血流を促進するためのものであることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤からなる。
【００２３】
さらに本発明は、（９）血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強が、血行障害及び／又は血栓症の予防又は改善のためのものであることを特徴とする上記（７）又は（８）記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤や、（１０）血管内皮細胞が、ヒト血管内皮細胞であることを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれか記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強剤や、（１１）Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料からエタノールを抽出溶媒として抽出した抽出液を、酢酸エチルを用いて抽出し、該抽出液をエタノールを移動相として、ＬＨ２０ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、ＨＰＬＣプロファイル分析によって検出される２つの主要ピーク画分に相当するプロアントシアニジンＡ１及び／又はＡ２を分離することを特徴とする血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強活性を有する生理活性画分の製造方法や、（１２）Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料が、ピーナッツ種皮であることを特徴とする上記（１１）記載の血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン産生増強活性を有する生理活性画分の製造方法からなる。
【発明の効果】
【００２４】
プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）は、血栓のような血行障害を抑制し、血流を促進する等の機能を有し、健常な血管内皮細胞からはＰＧＩ２が常時産生され、血行を健全な状態に保っている。血管内皮細胞におけるＰＧＩ２産生に障害が発生すると、血栓や、血行障害に起因する疾患を引き起こす。そこで、本発明は、Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分を有効成分とする、血管内皮細胞におけるＰＧＩ２産生を効果的に増強するＰＧＩ２産生増強剤を提供する。該ＰＧＩ２産生増強剤による血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生増強作用により、該血管内皮細胞におけるＰＧＩ２産生を増強して、血小板の凝集（血栓の生成）活性を抑制し、血流を促進して、血行障害の予防・改善、及び血行障害に起因する疾患の予防・改善を図ることができる。
【００２５】
本発明のＰＧＩ２産生増強剤の有効成分であるＡ型プロアントシアニジンは、腸管吸収もよく、血中でも修飾や分解を受けないで存在することができるので、ＰＧＩ２産生増強剤として、生体内へ投薬し、その薬理機能を発揮するための優れた性質を有している。また、特に、本発明の製造方法で製造された血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生増強活性を有する生理活性画分は、強力なＰＧＩ２産生活性を有し、ＰＧＩ２産生促進物質として知られているアラキドン酸に匹敵する効果を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分を有効成分とする血管内皮細胞に対するプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）産生増強剤からなる。該Ａ型プロアントシアニジン生理活性成分としては、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料から精製・分離されたＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分を用いることができる。
【００２７】
Ａ型プロアントシアニジンは、クランベリー、シナモン、ピーナッツ種皮などに存在していることが知られており、本発明においては、これらの植物材料をＡ型プロアントシアニジンを含有する植物材料として用いることができるが、Ａ型プロアントシアニジンを精製・分離するに際して、特に好ましい植物材料としては、ピーナッツ種皮（渋皮）を挙げることができる。
【００２８】
本発明において、ピーナッツ種皮（渋皮）等の植物材料からＡ型プロアントシアニジンを精製・分離する手段は、Ａ型プロアントシアニジンを含有する植物材料から、血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生増強活性を有するＡ型プロアントシアニジン生理活性成分を精製・分離する手段である限り特に限定はされないが、ピーナッツ種皮（渋皮）等からのＡ型プロアントシアニジンの抽出法及び精製法として公知のＡ型プロアントシアニジンの精製・分離手段を適用することができる。
【００２９】
ピーナッツ渋皮からのＡ型プロアントシアニジンの工業的な抽出法および精製法に関しては、溶媒抽出法、発酵抽出法、合成吸着剤による吸着処理法などが用いられてきた。溶媒抽出法としては、例えば、水、熱水；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、プロピレングリコールのような低級アルコール類；エチルエーテル、ジオキサンのようなエーテル類、アセトンのようなケトン類等の抽出溶媒を用いて抽出する方法が知られている（特許文献４，５，６〜７、８〜１１）。発酵抽出法としては、例えば、酵母を添加発酵させ、抽出分離する方法が知られている（特許文献１２、１３）。
また、合成吸着剤による吸着処理法としては、ピーナッツ渋皮を熱水抽出した抽出液を、ダイアイオンＨＰ２０に吸着させた後、アセトンで溶出し、更に、水及びエタノールに可溶の成分を分取する方法が知られている（特許文献１４）。これらの公知のＡ型プロアントシアニジンの精製・分離手段を適用することができる。
【００３０】
これら公知の方法以外にも、特にＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを精製・分離する手段として、オリゴマー類の吸着に適した樹脂細孔半径を有するポリスチレン系合成吸着剤に、ピーナッツ種皮（渋皮）熱水抽出液を添加し、洗浄後に適当な濃度の含水エタノール溶液で溶出させることが挙げられる。この場合に適する樹脂細孔半径としては、３８〜８０Å（オングストローム）で、一例としてセパビーズＳＰ８２５、ＳＰ８５０（三菱化学製）等が好ましい吸着剤として挙げられる。また、適する含水エタノール溶液の濃度としては、６０〜１００容量％エタノールが好ましく用いられる。
【００３１】
しかしながら、本発明者らは、上記手法とは異なり、本発明において、ピーナッツ種皮（渋皮）のようなＡ型プロアントシアニジンを含有する植物材料から、強力な血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生増強活性を有する、精製度の高いＡ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分を精製・分離する方法を開発した。該Ａ型プロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする生理活性画分の精製・分離方法の基本的構成は、ピーナッツ種皮（渋皮）のようなＡ型プロアントシアニジンを含有する植物材料を、例えば７０％エタノールのようなエタノール溶液を抽出溶媒として用いて得られた抽出液を、更に酢酸エチルを用いて抽出し、該抽出液をエタノールを移動相として、ＬＨ２０ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、ＨＰＬＣプロファイル分析によって検出される２つの主要ピーク画分に相当するプロアントシアニジンＡ１及び／又はＡ２を分離することからなる。該精製・分離方法によって取得された生理活性画分は、血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生の強力な誘導作用を有し、該活性はＰＧＩ２産生促進物質として知られるアラキドン酸に匹敵する効果を有する。
【００３２】
本発明の血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生増強剤は、医薬品或いは飲食品等に添加して、適宜の形態で投薬することができる。医薬品或いは飲食品等に有効成分として含まれるＡ型プロアントシアニジンの含有量は、本発明の作用、即ち、ＰＧＩ２産生増強により、血流促進、血行障害の予防・改善、又は血行障害に起因する疾患の予防・改善等が達成される限り特に制限はなく、適宜決定することができる。なお、本発明の各種製剤には、有効成分の作用に実質的な影響を及ぼさない限り、当業者に公知のその他の各種成分が含まれていても良い。
【００３３】
本発明のＰＧＩ２産生増強剤を医薬品の形態で投与する場合は、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、又は、注射剤などの液剤など適宜の形態で調製することができる。これらの医薬品の製剤化には通常用いられる結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調整剤などを適宜使用してもよい。該医薬品製剤は、経口的に或いは非経口的に、適宜に使用される。すなわち、経口、静脈、腹腔内の投与などによって、生体内に投与することができる。医薬品における有効成分（Ａ型プロアントシアニジン）の投与量は、その種類、その剤型、また患者の年令、体重、適応症状などによって適宜設定すればよい。
【００３４】
また、本発明のＰＧＩ２産生増強剤は、飲食品に添加して、飲食品の形態で投与することができる。本発明の飲食品の形態としては、例えば、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、又は、液体状の任意の形態に調製した飲食品の形態で生体内に投与することができる。これらには、食品中に含有することが認められている当業者に公知の各種物質、例えば、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調整剤などを適宜含有させることができる。飲食品に対するＡ型プロアントシアニジンの添加量は、血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生増強活性を考慮して、適宜決定することができる。特に、特定保健用食品、機能性食品、または健康志向食品等として利用する場合には、本発明の有効成分を所定の作用が十分発揮されるような量で含有させることが好ましい。
【００３５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
［ピーナッツ種皮からのＡ型プロアントシアニジン画分の抽出・精製及び分析・同定］
【００３７】
＜材料と実験方法＞
（ｉ．ピーナッツ種皮からのＡ型プロアントシアニジン画分の抽出及び精製方法）
ピーナッツ種皮１００ｇを入れた三角フラスコにｎ−ヘキサン３００ｍｌを加えて振り混ぜ静置し、溶媒を除去する操作を３回繰り返して種皮を脱脂した。その後、種皮はドラフト内で排気しながら、自然乾燥を行なった。この乾燥種皮に７０％エタノール（ｖ／ｖ）２５０ｍｌを加えて、攪拌しながら室温で２時間抽出を行なった。抽出液は、４，０００回転で１０分間遠心分離して上澄み液を分取した後、残渣に対して同様の操作を２回繰り返し、上澄み液を合わせて一緒にした。この上澄み液は、４０℃以下で減圧濃縮した後、分液ロートに移し、等容量の酢酸エチルを加えて混合振とうした。
【００３８】
静置後に酢酸エチル層を分取し、以下、同様の操作を３回行い、全ての酢酸エチル層を合わせて一緒にした。酢酸エチル層は無水硫酸ナトリウムで脱水し、４０℃以下で減圧濃縮した後、凍結乾燥を行なった（収量１４．６ｇ）。回収した酢酸エチル画分２．８３ｇを、ＬＨ２０（ファルマシア製ゲルろ過剤）を充填したカラム（径２．５ｃｍ×高さ４３ｃｍ、容量２１１ｍｌ）に添加し、エタノールを移動相として溶出を行なった。ピークの検出は紫外部（ＵＶ）吸収２８０ｎｍで行ない、最初のピーク（Ｆｒ．１画分）が溶出した後、第２のピーク（Ｆｒ．２画分）を分取し、溶媒を４０℃以下で減圧濃縮した後、凍結乾燥を行ない、精製画分を得た（収量３８４ｍｇ）。
【００３９】
（ii．ピーナッツ種皮から分離・精製した成分の分析と同定）
ｉ．の操作で得たピーナッツ種皮からの分離・精製画分（Ｆｒ．２）についての成分分析と同定を以下の方法で行った。
【００４０】
（１）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるピーク成分プロファイル分析：
Ｆｒ．２画分はＨＰＬＣ（日本分光製）により成分分離を行ない、検出されたピーク成分は標準物質（カテキン、エピカテキン等）との保持時間の比較及びフォトダイオードアレイ検出器によるＵＶスペクトルパターンによる解析を行なった。ＨＰＬＣには、カラムにInertsil ODS-3（φ４．６×１５０ｍｍ）（ＧＬサイエンス社製）を用い、溶出はＡ液（２．５％酢酸）及びＢ液（アセトニトリル／２．５％酢酸＝８０／２０）の２液グラジェント法を使用し、３５℃、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎの条件で行なった。グラジェントは、最初の８分間をＢ液濃度が移動相全体の３％になるように維持してから、次の４２分間でＢ液濃度を５０％に上昇させ、その次の５分間でＢ液濃度を１００％に上昇後５分間維持することにより行なった。検出はＵＶ２８０ｎｍで行ない、スペクトルパターン解析のためのＵＶ吸収波長範囲は、２００〜３５０ｎｍとした。
【００４１】
（２）高速液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）による質量分析：
ＨＰＬＣにより検出されたＦｒ．２画分のピーク成分をＬＣ−ＭＳ（マイクロマス社製；ＺａｂＳｐｅｃＱ）を用いて質量分析を行った。ＬＣ−ＭＳは、カラムにDevelosil-ODS-MG（φ２．０×１５０ｍｍ）（日本分光製）を用い、溶出はＡ液（１％酢酸）及びＢ液（１％酢酸含有アセトニトリル）の２液グラジェント法（Ｂ液濃度を２０分間で２０％から４５％に上昇）を使用し、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎの条件で行なった。イオン化はＥＳＩ（エレクトロスプレー法）を用い、負イオンモード、質量範囲（ｍ／ｚ）：１００〜１１００で検出を行なった。
【００４２】
（３）ＮＭＲによる成分の同定
ＨＰＬＣを用いてＦｒ．２画分中の主なピーク成分を分取し、精製した後、ＮＭＲ（プロトン１Ｈ  ，カーボン１３Ｃ）法により成分の同定を行った。
【００４３】
＜結果＞
（Ａ．ピーナッツ種皮酢酸エチル抽出物のゲルろ過クロマトグラフィー分析）
実験例１のｉ．で得られた酢酸エチル抽出物をＬＨ２０ゲルろ過クロマトグラフィーで精製した時の成分溶出パターンを図１（ピーナッツ種皮酢酸エチル抽出物のゲル濾過クロマトグラフィー分析）に示した。ＵＶ２８０ｎｍの吸収において２つのピーク画分（Ｆｒ．１とＦｒ．２）が得られた。Ｆｒ．１画分については、ＨＰＬＣによる標準物質との比較及びＵＶスペクトルパターン解析から、カテキン及びエピカテキン等の単量体を主とする画分であると考えられた。Ｆｒ．２画分の成分については、カテキン等の標準物質とは異なっていたことから、成分を特定する為に、ＨＰＬＣによる成分プロファイルの分析の他に、ＬＣ−ＭＳによる質量分析、ＮＭＲによる成分同定を行なった。
【００４４】
（Ｂ．ピーナッツ種皮の分離・精製画分（Ｆｒ．２）の成分分析と同定）
ＨＰＬＣによるＦｒ．２画分の成分プロファイル分析の結果を図２に示した［図中、符号ａ〜ｈは、次の成分を示す：ａ：プロアントシアニジンダイマー（Ｂ型）；ｂ：プロアントシアニジンダイマー（Ａ型）；ｃ：プロアントシアニジン類（未同定）；ｄ：プロアントシアニジン類（未同定）；ｅ：プロアントシアニジントリマー（Ａ型）；ｆ：プロアントシアニジントリマー（Ａ型）；ｇ：プロシアニジンＡ１；ｈ：プロシアニジンＡ２］。この画分には、主ピークの２つの成分（ｇとｈ）とごく小さなピーク成分群（ａ〜ｆ）が検出された。ＵＶスペクトルパターン分析の結果より、これらのピークはいずれもプロアントシアニジンのパターンを示しており、マススペクトル分析の結果から２量体（Ａ型は分子量５７６、Ｂ型は５７８）以上のオリゴマー成分と考えられた。また、主なピークである２成分（ｇ，ｈ）を分取してＮＭＲにて解析を行ったところ、２成分ともＡ型プロアントシアニジン（２量体）であり、それぞれプロアントシアニジンＡ１（ｇ）及びプロアントシアニジンＡ２（ｈ）と同定された。これらの結果から、Ｆｒ．２画分に含まれるプロアントシアニジン成分の大半は、Ａ型プロアントシアニジン（Ａ１とＡ２）であることがわかった。
【実施例２】
【００４５】
［血管内皮細胞に対するＡ型プロアントシアニジン画分の効果］
【００４６】
＜材料と実験方法＞
（ｉｉｉ．ヒト臍帯由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の継代培養法）
凍結保存していたＨＵＶＥＣ細胞（旭テクノグラス社製）を３７℃で速やかに融解し、１，５００回転、５分間の遠心操作により細胞凍結保護液を除去した。増殖培地（ＭＣＤＢ１０７＋１０ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞成長因子；ｂＦＧＦ＋１０μｇ／ｍｌヘパリン＋１０％胎児ウシ血清；ＦＢＳ）で細胞浮遊液を調製し、増殖培地５ｍｌの入ったＩ型コラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）処理したＴ−２５培養フラスコ（２５ｃｍ２；ＮＵＮＣ社製）中に、４０〜５０×１０４個の細胞を植え込み３〜４日間培養し、ほぼ飽和状態（２〜２．５×１０６個）にまで増殖させた。細胞はトリプシン液（０．０５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液）で分散させ、２個のコラーゲン処理したＴ−２５培養フラスコに分割（１：２分割）して、３〜４日毎に継代培養を行なった。試験には８〜１２継代した細胞を用いた。全ての実験の培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２  ｉｎ  ａｉｒのインキュベーター内で行なった。
【００４７】
（ｉｖ．ＨＵＶＥＣのＰＧＩ２産生に対するＡ型プロアントシアニジン画分（Ｆｒ．２）の効果）
継代培養したＨＵＶＥＣ細胞は、まず、Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝液（ＰＢＳ−）で２回洗浄し、トリプシン液処理を行なって細胞を分散させた後、血球計算盤で細胞数を計測した。Ｉ型コラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）処理した２４穴培養用プレート（ＣＥＬＬＳＴＡＲ社製）に４〜８×１０３個の細胞を植え込み、細胞数が５〜１０×１０４個になるまで、３〜４日間培養した。次に、培地を吸引除去し、ＰＢＳ  で１回細胞を洗浄した後、各種テストサンプルの入った１ｍｌの検定用成分既知培地（ＭＣＤＢ１０７）に培地交換し、３０分培養後、５００μｌの培養上清液を回収した。回収後、残りの培地を吸引除去し、再度１回ＰＢＳ−で洗浄後、５００μｌのトリプシン液で細胞を分散させ、コールターカウンター（コールター社製）で細胞数を計測した。各サンプルでの細胞数は、５穴の培養ウェルのデータを平均値として表した。
【００４８】
５穴の培養ウェルから回収した培養上清は別々の凍結用バイアルに移して定量試験を行なうまで−３０℃で凍結保存した。ＰＧＩ２は不安定な物質で、速やかに安定な６−ｋｅｔｏ−ｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ  Ｆ１α（６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α）に変換することが知られている。従って、６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１αを測定するＥＬＩＳＡキット（OXFORD BIOMEDICAL RESEARCH社製）を用いてＨＵＶＥＣ細胞が産生するＰＧＩ２量の定量を行なった。６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α量の定量は、キットのマニュアルに従って行なった。抗原−抗体反応で発色させたサンプルは、マイクロプレートリーダー（BIO RAD社製）を用いて６５０ｎｍの吸収を測定することにより６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α量を定量した。計測は１サンプルにつき５回行い、平均値±ＳＥＭとして表した。
【００４９】
＜結果＞
（Ｃ．ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するＡ型プロアントシアニジン画分（Ｆｒ．２）の６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α産生への効果）
実施例１の方法で得られたＡ型プロアントシアニジン画分（Ｆｒ．２）のそれぞれの濃度（０，０．２５，０．５，１．０，２．５，５．０μｇ／ｍｌ）で処理した培養上清液について、６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１αの産生量を調べた（図３：ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するＡ型プロアントシアニジンの６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１αの産生への効果）。
【００５０】
コントロールのＡ型プロアントシアニジン（Ｆｒ．２）無添加培地では、６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１αの産生は見られなかった。しかし、０．２５μｇ／ｍｌの低い濃度でも０．２３６μｇ／ｍｌの産生が見られ、さらに濃度に依存して６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１αの産生量が増加し、Ａ型プロアントシアニジン（Ｆｒ．２）２．５μｇ／ｍｌで最大値（０．９０６μｇ／ｍｌ）となり、ＰＧＩ２産生促進作用が知られているアラキドン酸（ＡＡ，２０μＭ）添加による６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α産生量（０．８９μｇ／ｍｌ）と同等の高い値となった。しかし、さらに高い濃度（５μｇ／ｍｌ）では、６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α産生が抑制されることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明のピーナッツ種皮からのＡ型プロアントシアニジン画分の抽出・精製及び分析・同定についての実施例において、ピーナッツ種皮酢酸エチル抽出物のゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
【図２】本発明のピーナッツ種皮の分離・精製画分（Ｆｒ．２）の成分分析と同定についての実施例において、ＨＰＬＣによるＦｒ．２画分の成分プロファイル分析の結果を示す図である。
【図３】本発明のヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するＡ型プロアントシアニジン画分（Ｆｒ．２）の６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α産生への効果についての実施例において、Ａ型プロアントシアニジン画分（Ｆｒ．２）のそれぞれの濃度（０，０．２５，０．５，１．０，２．５，５．０μｇ／ｍｌ）で処理した培養上清液について、６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１αの産生量を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
2009120565.tif 000003
【図３】
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