(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｄ−乳酸を製造するための新規なＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を提供する。【解決手段】下記（Ａ）から（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなり、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドが導入された宿主細胞。（Ａ）特定のアミノ酸配列。（Ｂ）該アミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列。（Ｃ）該アミノ酸配列との相同性が少なくとも８０％以上のアミノ酸配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）から（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなり、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも８０％以上のアミノ酸配列。
【請求項２】
下記（ａ）から（ｃ）の何れかの塩基配列からなり、かつＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
【請求項３】
下記（ｄ）から（ｆ）の何れかの塩基配列からなり、かつＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列。
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配列の全体またはそれらの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドが導入された宿主細胞。
【請求項５】
前記細胞が細菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞である請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項４〜６に記載の宿主細胞を培養することを含む、Ｄ−乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−乳酸を製造するための新規なＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドが導入された宿主細胞に関し、さらに該宿主細胞を培養することを含むＤ−乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生分解性ポリマーであるポリ乳酸は、カーボンニュートラルの考え方から強い注目を浴びており、その原料である乳酸には高純度、効率的かつ安価な製造法が求められている。
【０００３】
現在生産されているポリ乳酸の大部分はＬ−乳酸ポリマーであるが、乳酸にはＬ−乳酸とＤ−乳酸の２種類の光学異性体があり、Ｄ−乳酸についてもポリマー原料や農薬、医薬の中間体として近年注目が集まりつつある。但しいずれの用途においても、原料たるＬ−乳酸、Ｄ−乳酸には高い物質純度と光学純度が要求され、特にポリ乳酸の製造においては、非常に高い物質純度と光学純度が要求されるのが事実である。
【０００４】
自然界には乳酸菌などの乳酸を効率良く生産する細菌が存在し、それらを用いた乳酸製造法の中には既に実用化されているものもある。例えば、Ｌ−乳酸を効率良く生産させる細菌としてラクトバシラス・デルブレッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉなどがある。また、Ｄ−乳酸を効率良く生産させる細菌としてバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）の微生物などが知られており（特許文献１）、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素遺伝子も単離されている（特許文献２）。いずれの場合も嫌気培養で乳酸の蓄積量は高いレベルに達しているが、Ｌ−乳酸発酵の場合はＤ−乳酸が、Ｄ−乳酸発酵の場合はＬ−乳酸が副産物として生成し光学純度の低下をもたらす。そして、これらを分離することは非常に困難である。
【０００５】
そのような乳酸の光学純度低下を回避するには、乳酸を本来生産しない微生物によってＤ−乳酸を生産することが効果的である。乳酸を生産しない微生物の１つには酵母が挙げられる。酵母の中でもパン酵母が好適であり、さらには、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）はゲノム情報が豊富で、遺伝子組換え宿主としての実績が十分にあるため、特にこの目的に適している。
【０００６】
これまで、酵母によってＤ−乳酸を生産させようとする試みはいくつか存在しており、
バシラス・ラエボラクティカス由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素遺伝子を導入したＤ−乳酸の生産（特許文献２）、乳酸菌の一種であるロイコノストック・メセントロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素遺伝子を導入したワイン酵母の例（特許文献３）等が知られている。ところが、前者では乳酸の生産量および効率、後者では培養時間が４日間と長く乳酸の生産速度が遅いこと、加えて、培養に天然培地を用いるために培養液中に培地由来の大量の不純物を含むことが問題であり、更に高効率かつ高生産速度で、不純物の少ないＤ−乳酸を製造する方法の確立が望まれていた。
【特許文献１】特開２００３−０８８３９２
【特許文献２】特開２００７−０７４９３９
【特許文献３】ＷＯ２００４／１０４２０２Ａ１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、宿主細胞に導入、発現させることで、Ｄ−乳酸発酵により適したＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、種々のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼについて鋭意検討した結果、Ｄ−乳酸の産生量を増大させ、同時に副産物の生成が少ないＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチドを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の態様からなる。
【００１０】
（１）下記（Ａ）から（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなり、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも８０％以上のアミノ酸配列。
【００１１】
（２）下記（ａ）から（ｃ）の何れかの塩基配列からなり、かつＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
【００１２】
（３）下記（ｄ）から（ｆ）の何れかの塩基配列からなり、かつＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列。
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配列の全体またはそれらの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１３】
（４）請求項２または３に記載のポリヌクレオチドが導入された宿主細胞。
【００１４】
（５）前記細胞が細菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞であることを特徴とする、（４）に記載の宿主細胞。
【００１５】
（６）前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである（５）に記載の宿主細胞。
【００１６】
（７）（４）〜（６）に記載の宿主細胞を培養することを含む、Ｄ−乳酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、細胞、特に酵母におけるＤ−乳酸発酵に適したＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチドが提供され、Ｄ−乳酸を高生産可能な形質転換体を容易に得ることができ、ひいては、Ｄ−乳酸を効率よく高純度で生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１９】
（ポリペプチド、ポリヌクレオチド）
本発明において、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｄ−ＬＤＨともいう）活性とは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸をＤ−乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）に変換する活性である。
【００２０】
本発明におけるＤ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドはホタテガイ（Ｐａｔｉｎｏｐｅｃｔｅｎ ｙｅｓｓｏｅｎｓｉｓ）由来のＤ−ＬＤＨとして配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドである。さらに、本発明におけるポリペプチドは、前記配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモログも包含しており、これらのホモログは、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドでありかつＤ−ＬＤＨ活性を有しているポリペプチド、または配列番号１に示すアミノ配列との相同性が少なくとも８０％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列を有しかつＤ−ＬＤＨ活性を有しているポリペプチドを含んでいる。なお、アミノ酸配列の相同性は、この分野で汎用されているソフトウェアであるＢＬＡＳＴを用いて容易に調べることができる。ＢＬＡＳＴは、ＮＣＢＩ(National Center for Biotechnology Information)のホームページで誰でも利用可能であり、デフォルトのパラメーターを用いて容易に同一性を調べることができる。
【００２１】
また、前記配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモログは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドよりＤ−ＬＤＨ活性が向上していても良いし、熱安定性が向上していてもよい。そのようなポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを基に人工的にデザインしても良いし、天然から分離しても良い。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドは前記Ｄ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡであり、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成ＲＮＡ、レプリコンＲＮＡなど、その由来を問うものではない。また、１本鎖でも、その相補鎖を有する２本鎖であってもよい。また、天然のあるいは人工のヌクレオチド誘導体を含んでいてもよい。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはそのホモログである。本発明のポリヌクレオチドのホモログとしては、例えば、配列番号２に記載の塩基配列において、１から数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、同時にＤ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードしているものが挙げられる。ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、例えば、もとの塩基配列の任意の少なくとも２０個、好ましくは２５個、より好ましくは少なくとも３０個の連続した配列を一つあるいは複数個選択したポリヌクレオチドをプローブとして、当業者の周知のハイブリダイセーション技術（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish . John Wily & SonsSectoin 6.3-6.4）などを用いて、ハイブリダイズするポリヌクレオチドである。ここでストリンジェントな条件としては、例えば５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃、より厳しい条件としては４２℃、さらに厳しい条件としては６５℃で、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ(saline-sodium citrate)溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成：１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用いて洗浄することにより達成することができる。また、本発明のポリヌクレオチドのホモログは、配列番号２の塩基配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなることが好ましい。なお、ポリヌクレオチドの塩基配列の相同性は、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴなどによって決定することができる。
【００２４】
本発明のポリペプチドはホタテガイから公知の方法により抽出、またはペプチド合成法として知られる公知の方法を用いて調製することができ、また、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて、遺伝子組換え技術により調製することもできる。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドは、実施例に記載されるようにホタテガイからクローニングすることで調整することができるが、化学的に合成または長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞工学シリーズ７ 植物のＰＣＲ実験プロトコール、１９９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を採用して合成することもできる。
【００２６】
また、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、アミノ酸配列または塩基配列に、部位特異的変位導入法（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel etal., (1987) Publish . John Wily & Sons Sectoin 8.1-8.5）等を用いて、適宜、置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することで適宜改変することができる。また、このようなポリペプチドのアミノ酸配列またはポリヌクレオチドの塩基配列の改変は、人工的に変異を導入しあるいは合成したものに限られず、人工的な変異処理に基づいてあるいはこれに限られず自然界におけるアミノ酸の変異によっても生じたものも包含される。
【００２７】
（ポリヌクレオチド構築物）
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主細胞を形質転換して、このポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現させることにより、そのＤ−ＬＤＨ活性により宿主細胞においてＤ−乳酸を産生させることができる。形質転換にあたっては、本発明のポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドセグメントを宿主細胞内で発現可能とする、ポリヌクレオチド構築物を用いる。形質転換のためのポリヌクレオチド構築物の好ましい態様としては、プラスミド（ＤＮＡ）、バクテリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＭＡＣ等）、レプリコンＲＮＡを、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）や宿主細胞の種類に応じて選択して採用することができる。したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物は、本発明のポリヌクレオチドの他、これらのいずれかの態様のベクターの構成セグメントを備えることができる。好ましい原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクター、動物細胞性ベクター、植物細胞性ベクターは当該分野において周知である。
【００２８】
なお、プラスミドＤＮＡとしては、例えば、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣｐ５０、ｐＡＵＲ１１２またはｐＡＵＲ１２３などのＹＣｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＹＥＳ３２またはＹＥｐ１３などのＹＥｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１またはｐＡＵＲ１３５などのＹＩｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９６又はｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏｌＥ系プラスミド、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＡＣＹＣ１８４などのｐ１Ａ系プラスミド、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８又はｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）などを挙げることができる。
【００２９】
ファージＤＮＡとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１００、ｇｔ１１、ｚａｐ）、φＸ１７４、Ｍ１３ｍｐ１８又はＭ１３ｍｐ１９などを挙げることができる。
【００３０】
レトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ因子などを挙げることができる。ＹＡＣとしては、ｐＹＡＣＣ２などを挙げることができる。
【００３１】
レプリコンＲＮＡとしては、ブロモモザイクウイルス由来レプリコンを挙げることができる。
【００３２】
前記ポリヌクレオチド構築物のうち、特にＤＮＡ構築物を作製するには、本発明のＤＮＡを含むフラグメントなどを適当な制限酵素で切断し、使用するベクターＤＮＡの制限酵素部位あるいはマルチクローニングサイトに挿入等をすることによる。本発明のＤＮＡ構築物の第１の態様は、本発明のＤＮＡからなるＤＮＡセグメントを発現可能に連結されるプロモーターセグメントを備えている。すなわち、プロモーターにより制御可能にそのプロモーターの下流側に本発明のＤＮＡセグメントが連結されている。
【００３３】
本発明のポリペプチドの発現にあっては、酵母における発現が好ましいことから、前記ポリヌクレオチド構築物においては酵母中で発現するプロモーターを使用することが好ましい。かかるプロモーターとしては、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーターなどを使用することが好ましい。特に、サッカロマイセス属由来のピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）プロモーターまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ由来のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを利用することがより好ましい。これらのプロモーターは、サッカロマイセス属のエタノール発酵経路において高発現されているからである。なお、かかるプロモーター配列は、サッカロマイセス属酵母のＰＤＣ１遺伝子またはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅法によって単離することができる。
【００３４】
また、前記ポリヌクレオチド構築物であるＤＮＡ構築物の第２の態様は、本発明のＤＮＡの他、宿主染色体の相同組換えのためのＤＮＡセグメントを備える。相同組換え用ＤＮＡセグメントは、宿主染色体において本発明のＤＮＡを導入しようとするターゲット部位近傍のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡセグメントは、少なくとも１個備えられ、好ましくは、２個備えられている。例えば、２個の相同組換え用ＤＮＡセグメントを、染色体上のターゲット部位の上流側と下流側のＤＮＡに相同なＤＮＡ配列とし、これらのＤＮＡセグメントの間に本発明のＤＮＡを連結することが好ましい。
【００３５】
相同組換えにより宿主染色体に本発明のＤＮＡを導入する場合、宿主染色体上のプロモーターにより制御可能に本発明のＤＮＡを導入することができる。この場合、目的遺伝子の導入によって、同時に、本来当該プロモーターによって制御されるべき内在性遺伝子を破壊し、この内在性遺伝子に替えて外来の本発明のＤＮＡを発現させることができる。特に、当該プロモーターが、宿主細胞において高発現プロモーターである場合に有用である。
【００３６】
かかる発現系を宿主染色体上に創出するには、宿主染色体において高発現遺伝子をターゲットとし、この遺伝子を制御するプロモーターの下流にプロモーターにより制御を受けるように本発明のＤＮＡを導入するようにすることが好ましい。酵母などのエタノール発酵性微生物を宿主とする場合、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子、特にピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子をターゲットとし、内在性のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターの制御下にＤ−ＬＤＨ活性ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入することができる。この場合、相同組換え用ＤＮＡセグメントは、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のＤ−ＬＤＨの構造遺伝子領域あるいはその近傍の配列（開始コドンの近傍の配列、開始コドンの上流域の配列、構造遺伝子内の配列などを含む）と相同とすることができる。好ましくは、サッカロマイセス属、特にセレビシエを宿主として、この宿主のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子をターゲットとするＤＮＡ構築物とする。かかるＤＮＡ構築物によれば、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子の破壊とこの構造遺伝子部分のＤ−ＬＤＨによる置換を同時に達成することができる。ピルビン酸脱炭酸酵素１は、ピルビン酸からアセトアルデヒドへの付加逆反応を媒介する酵素であり、この遺伝子を破壊することにより、アセトアルデヒドを経たエタノール産生が抑制されることが期待されるとともに、ピルビン酸を基質とするＤ−ＬＤＨによる乳酸産生が促進されることが期待できる。
【００３７】
なお、第１のＤＮＡ構築物あっても、宿主染色体との相同組換えのためのＤＮＡセグメントを備えることにより、相同組換え用のＤＮＡ構築物とすることができる。第１のＤＮＡ構築物にあっては、ＤＮＡ構築物中のプロモーターセグメントを、宿主染色体との相同組換え用のＤＮＡセグメントに兼用することもできる。例えば、宿主サッカロマイセス・セレビシエに対して、サッカロマイセス・セレビシエ宿主染色体にあるプロモーター、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターをプロモーターセグメントとして有するＤＮＡ構築物は、当該遺伝子をターゲット部位とするターゲティングベクターを構成する。この場合、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子の構造遺伝子領域に対する相同配列を備えることが好ましい。
【００３８】
なお、ＤＮＡ構築物には、ターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を使用することができる。
【００３９】
（ポリヌクレオチド構築物による形質転換）
一旦、ポリヌクレオチド構築物が構築されたら、適当な宿主細胞に、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入することができる。ポリヌクレオチド構築物の導入後、その受容細胞は、選択培地で培養される。
【００４０】
宿主細胞は特に限定されないが、エッシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシラス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌、酵母、ｓｆ９、ｓｆ２１等の昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの動物細胞などとすることができる。好ましくは、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ピキア属などの酵母、特に、アルコール発酵やパン製造に利用されるパン酵母であり、さらに好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、具体例としては、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株である。また、本発明においてパン酵母とは、第一にパンの製造に用いる酵母であり、第二に該パン酵母との交配によって得られた酵母であり、それが実験用の酵母として用いられているものでもよい。
【００４１】
前記ポリヌクレオチド構築物によって形質転換された形質転換体においては、ポリヌクレオチド構築物の構成成分が染色体上あるいは染色体外因子（人工染色体を含む）上に存在することになる。なお、ポリヌクレオチド構築物が染色体外に維持されている場合、あるいは、ランダムインテグレーションにより染色体に組み込まれている場合には、Ｄ−ＬＤＨの基質であるピルビン酸を基質とする他の酵素、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素の遺伝子（サッカロマイセス属酵母においては、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子）は、ターゲティングベクターによりノックアウトされていることが好ましい。上述のポリヌクレオチド構築物であって、相同組換えを達成できるポリヌクレオチド構築物が導入されると、宿主染色体上の所望のプロモーターあるいは当該プロモーターと置換された当該プロモーターのホモログの下流に当該プロモーターによって制御可能に連結された本発明のポリヌクレオチドであるポリヌクレオチドセグメントが存在することになる。サッカロマイセス属酵母の形質転換体にあっては、宿主染色体上において、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターあるいは当該プロモーターと置換された当該プロモーターのホモログの下流に当該プロモーターによって制御可能に本発明のポリヌクレオチドを備えることが好ましい。また、通常、相同組換え体における本発明のポリヌクレオチドの下流側には、選択マーカー遺伝子や、破壊された構造遺伝子の一部（ポリヌクレオチド構築物上の相同配列に対応する部位）が存在する。
【００４２】
なお、所望のプロモーター下に本発明のポリヌクレオチドが導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、導入部位特異的プライマーによりＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物について、電気泳動において予期されるバンドを検出することによって確認できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーでＰＣＲを行うことでも確認できる。これらの方法は、当業者において周知である。
【００４３】
（Ｄ−乳酸の製造）
前記ポリヌクレオチド構築物が導入されて得られる形質転換体を培養することにより、外来遺伝子の発現産物であるＤ−乳酸脱水素酵素の作用で、培養物中にＤ−乳酸が生成する。培養物からＤ−乳酸を分離する工程を実施することにより、Ｄ−乳酸を得ることができる。なお、本発明において培養物とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体の破砕物を包含している。本発明の形質転換体の培養にあたっては、形質転換体の種類に応じて培養条件を選択することができる。このような培養条件は、当業者においては周知である。
【００４４】
細菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
【００４５】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０倍地、ＤＭＥＭ倍地またはこれらの培地にウシ胎児血清などを添加した培地を用いることができる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４６】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＧｒａｃｅ倍地、ＴＣ−１００倍地またはこれらの培地にウシ胎児血清などを添加した培地を用いることができる。培養は、通常、２７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４７】
前記形質転換体の培養は、通常、振とう培養または通気攪拌培養等の好気条件下から、通気を実施しないような嫌気条件下までの範囲で、乳酸の生産性が良い条件を設定することができるが、微好気から嫌気の条件下が好適に用いられる。培養温度は２５℃〜３７℃で行うことができるが、３０℃〜３３℃が好適である。Ｄ−乳酸が培地中に蓄積するにしたがって培養液のｐＨが低下するため、アルカリ、好ましくは二価イオンの水酸化物によって中和することもできる。また後段における乳酸の精製を容易にするために中和を行わずに培養することもできる。
【００４８】
上記のようにして得られたＤ−乳酸培養液からＤ−乳酸を精製するには、従来知られている方法によって、精製することができる。例えば、得られたＤ−乳酸培養液からフィルターにて菌体を分離した後、ｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、カルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法、ナノフィルターで精製する方法またはそれらの組み合わせなどがあるが、好ましくは、ナノフィルターで精製する方法または得られたＤ−乳酸培養液からフィルターにて菌体を分離した後、水分を蒸発させた濃縮Ｄ−乳酸溶液を蒸留する方法が挙げられる。ここで、蒸留する際には蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留するのが好ましい。Ｄ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｄ−乳酸を得ることができる。留出液として低沸点成分（エタノール、酢酸等）を含むＤ−乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をＤ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい。なお、蒸留操作後の留出液について必要に応じてイオン交換樹脂、活性炭、クロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＤ−乳酸を得ることもできる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらは単なる例示であり本発明を何等制限するものではない。
【００５０】
（実施例１）ホタテガイ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子のクローニング
ホタテガイ（Ｐａｔｉｎｏｐｅｃｔｅｎ ｙｅｓｓｏｅｎｓｉｓ）の貝柱を破砕し、得られた破砕物からQuick prep mRNA purification kit（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いてポリＡ（＋）ＲＮＡを単離し、SuperScript II Reverse Transcriptase（インビトロジェン社製）を用いOligo d(T)をプライマーとしてｃＤＮＡを合成した。次に、この反応液を鋳型として用い、Ｄ−ＬＤＨにおいて高く保存されているＤＮＡ配列に注目してデザインした配列番号３および配列番号４記載のオリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、ホタテガイ由来Ｄ−ＬＤＨの部分配列を増幅した。ＰＣＲは以下の条件で行った。９５℃（3分間）：｛９５℃（３０秒間）−４５℃（３０秒間）−７２℃（３０秒間）｝×３５サイクル：７２℃（５分間）。続いて１．０ ％アガロースゲルを用いた電気泳動によって増幅ＤＮＡ断片の確認をおこない、６００ｂｐの増幅断片をQIA quick Gel extraction kit（QIAGEN社製）を用いて精製した後、プラスミドベクターpGEMt-easy（プロメガ株式会社製）にクローニングし、ＤＮＡ配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用いSangerの方法に従って行った。
【００５１】
次に、５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥ法を用いて、ホタテガイ由来Ｄ−ＬＤＨの全ＯＲＦ配列を明らかにした。５’ＲＡＣＥは以下の方法で行った。まず、ホタテガイのポリＡ（＋）ＲＮＡを鋳型に、SuperScript II Reverse Transcriptase（インビトロジェン社製）を用い配列番号５記載のオリゴＤＮＡをプライマーとしてcDNAの合成を行った。次に、Terminal deoxynucleotidyl transferase（New England Biolabs社製）を用い、反応液にdCTPを加えることで、ｃＤＮＡの３’末端にpoly（C）tailの付与を行った。この反応液をQIA quick PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精製し、それを鋳型として配列番号５および配列番号６記載のオリゴＤＮＡをプライマーとして1度目のＰＣＲを行い、さらに、その反応液を鋳型として配列番号７および配列番号８記載のオリゴＤＮＡをプライマーとして２度目のＰＣＲを行った。続いて１．０％アガロースゲルを用いた電気泳動によって増幅ＤＮＡ断片の確認をおこない、増幅断片をQIA quick Gel extraction kit（QIAGEN社製）を用いて精製した後、プラスミドベクターpGEMt-easy（プロメガ株式会社製）にクローニングし、ＤＮＡ配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用いSangerの方法に従って行った。
【００５２】
３’ＲＡＣＥは以下の方法で行った。まず、ホタテガイのポリＡ（＋）ＲＮＡを鋳型に、SuperScript II Reverse Transcriptase（インビトロジェン社製）を用いOligo d(T)をプライマーとしてｃＤＮＡの合成を行った。次に、この反応液を鋳型としてOligo d(T)および配列番号９記載のオリゴＤＮＡをプライマーとして1度目のＰＣＲを行い、さらに、その反応液を鋳型としてOligo d(T)および配列番号１０記載のオリゴＤＮＡをプライマーとして２度目のＰＣＲを行った。続いて１．０％アガロースゲルを用いた電気泳動によって増幅ＤＮＡ断片の確認をおこない、増幅断片をQIA quick Gel extraction kit（キアゲン社製）を用いて精製した後、プラスミドベクターpGEMt-easy（プロメガ株式会社製）にクローニングし、DNA配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用いSangerの方法に従って行った。
【００５３】
本発明のホタテガイ由来Ｄ−ＬＤＨのアミノ酸配列（配列番号１）およびＯＲＦ配列（配列番号２）は、上記の方法で得られた配列をつなぎ合わせて決定した。
【００５４】
（実施例２）ホタテガイ由来Ｄ−ＬＤＨ発現プラスミドの構築
ホタテガイ由来Ｄ−ＬＤＨのＯＲＦ５’側とＯＲＦ３’側に相当する配列番号１１および配列番号１２記載のオリゴＤＮＡをプライマーとして、ホタテガイのポリＡ（＋） ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行なった。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで切断し、同じく制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで切断した酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図１）の切断部位に導入した。以後、このプラスミドベクターをｐＴＲＳ１１ＰｙＤＬＤＨと呼称する。ここでｐＴＲＳ１１ベクターは、ｐＮＶ１１ベクター（Ｎａｔｕｒｅ, ｖｏｌ３５７, ２５ ＪＵＮＥ １９９２, ｐ７００）を制限酵素ＸｈｏＩで切断し、セルフライゲーションすることで作成した。
【００５５】
（実施例３）ホタテガイ由来Ｄ−ＬＤＨ発現プラスミドの酵母への導入
実施例２のようにして得られたｐＴＲＳ１１ＰｙＤＬＤＨを酵母サッカロマイセス・セレビシエ  ＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換した。形質転換は、YEASTMAKER Yeast Transformation System（クローンテック社製）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするサッカロマイセス・セレビシエ  ＮＢＲＣ１０５０５株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＲＳ１１ＰｙＤＬＤＨの持つＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＲＳ１１ＰｙＤＬＤＨの導入された形質転換体の選択が可能である。
【００５６】
このようにして得られた形質転換体へのＤ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクター導入の確認は、ウラシル非添加の液体培地で培養した形質転換株から、ゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）によりプラスミドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として用いたＰＣＲにより行った。プライマーには、ホタテガイ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子をクローニングした際に用いたプライマーを使用した。その結果、全ての形質転換体において、ホタテガイ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が導入されていることを確認した。
【００５７】
（実施例４）Ｄ−乳酸生産性テスト
実施例３のようにして得られたｐＴＲＳ１１ＰｙＤＬＤＨが導入されたサッカロマイセス・セレビシエ  ＮＢＲＣ１０５０５株（以下ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＲＳ１１ＰｙＤＬＤＨ株と示す）を用いてＤ−乳酸生産性テストを行った。
【００５８】
表１に示した組成の培地（以下、ＳＣ−Ｕｒａ培地と略す。）１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量の各株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前培養）。次に、ＳＣ−Ｕｒａ培地１０ｍＬを試験管にいれ、各前培養液をそれぞれ１００μＬ植菌し、３０℃で振とう培養した（本培養）。本培養開始後４０時間の培養液を遠心分離し、上清に含まれる乳酸を下記に示す条件でＨＰＬＣにより測定した。
【００５９】
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（株式会社島津製作所製）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【００６０】
測定結果から算出したＤ−乳酸の蓄積濃度を表２に示す。
【００６１】
【表１】
2009261262.tif 000002
【００６２】
【表２】
2009261262.tif 000003
【００６３】
（実施例５）ホタテガイ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子の酵母染色体への導入
実施例２で得られたホタテガイ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を含むｐＴＲＳ１１ＰｙＤＬＤＨを鋳型として配列番号１３および１４記載のオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲにより、各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を含む約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（図２のステップ１に相当）。ここで配列番号１３記載のオリゴＤＮＡはＰＤＣ１遺伝子の上流６５ｂｐに相同性のある配列が付加されるようにデザインした。
【００６４】
次にプラスミドｐＲＳ４２４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ:Ｕ０３４５３）を鋳型として配列番号１５および１６記載のオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＴＲＰ１遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（図２のステップ２に相当）。ここで配列番号１６に記載のオリゴＤＮＡはＰＤＣ１遺伝子の下流６５ｂｐに相同性のある配列が付加されるようにデザインした。
ＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離した後、QIA quick Gel extraction kit（キアゲン社製）を用いて精製した。ここで得られたＤ−ＬＤＨ遺伝子を含む１．１ｋｂ断片、ＴＲＰ１遺伝子を含む１．４ｋｂ断片をそれぞれ混合したものを鋳型として配列番号１３および１６記載のオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲによりＤ−ＬＤＨ遺伝子、ＧＡＰＤＨターミネーター及びＴＲＰ１遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（図２のステップ３に相当）。
【００６５】
上記のＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離、QIA quick Gel extraction kit（キアゲン社製）を用いて精製後、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換し、トリプトファン非添加培地で培養することにより、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【００６６】
上記のようにして得られた形質転換株が、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１７、１８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約３．２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．４ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、ホタテガイに由来するＤ−ＬＤＨ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、ＰｙＤＬＤＨ株とする。
【００６７】
（実施例６）Ｄ−乳酸生産性テスト
実施例５のようにして得られたＰｙＤＬＤＨ株および表３に示した組成の培地（以下、ＳＣ−Ｔｒｐ培地と略す。）を用いて実施例４と同様の方法でＤ−乳酸生産性テストを行った。測定の結果、いずれの実験区においてもＬ−乳酸は検出されなかった。乳酸の蓄積および測定限界から導かれる光学純度を表４に示す。
【００６８】
【表３】
2009261262.tif 000004
【００６９】
【表４】
2009261262.tif 000005
【００７０】
（実施例７）Ｄ−乳酸生産性テスト
実施例５のようにして得られたＰｙＤＬＤＨ株を用いてＤ−乳酸生産性テストを行った。ＳＣ−Ｔｒｐ培地１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量のＰｙＤＬＤＨ株及びを植菌し、３０℃で一晩培養した（前々培養）。次に、ＳＣ−Ｔｒｐ培地１００ｍＬを５００ｍｌ容三角フラスコにいれ、各前々培養液をそれぞれ全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前培養）。続いて、ＳＣ−Ｔｒｐ培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養開始から２４時間後の前培養液をそれぞれ全量植菌し、攪拌速度（１２０ｒｐｍ）、通気量（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、温度（３０℃）、１Ｎの水酸化カルシウムによりｐＨ（ｐＨ５）を一定にして培養を行った（本培養）。本培養開始後４０時間の培養液を遠心分離した後、実施例４に記した条件で乳酸および酢酸を測定し、対糖収率は次式で計算した。
対糖収率（％）＝乳酸総生産量／培養系に添加したグルコース総量。
【００７１】
測定の結果、Ｌ−乳酸は検出されなかった。乳酸の蓄積および測定限界から導かれる光学純度を表５に示す。
【００７２】
【表５】
2009261262.tif 000006
【００７３】
（実施例８）乳酸の精製
実施例７で得られた培養液をｐＨが２．０になるまで濃硫酸（和光純薬製）を滴下後、1時間２５℃で撹拌し、培養液中の乳酸カルシウムを乳酸と硫酸カルシウムに変換した。次いで、沈殿した硫酸カルシウムを、定性濾紙Ｎｏ２（アドバンテック製）を用いて吸引濾過により濾別した。さらに、不純物を分離するため、ナノフィルター（ピペラジンポリアミド半透膜ＵＴＣ６０、東レ株式会社製）に濾液を通し、透過水を回収した。透過水に含まれる乳酸と酢酸の濃度を、実施例４に記載した方法で分析した結果、透過水には１８．６ｇ／Ｌの乳酸と０．１８ｇ／Ｌの酢酸が含まれており、高純度の乳酸が精製された（表６）。
【００７４】
【表６】
2009261262.tif 000007
【００７５】
（比較例１）バシラス・ラエボラクティカス由来Ｄ−ＬＤＨ発現プラスミドが導入された酵母のＤ−乳酸生産性テスト
バシラス・ラエボラクティカス由来のＤ−ＬＤＨ発現プラスミドが導入されたＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株（特開２００７−７４９３９参照）を用いて、実施例４と同一の条件でＤ−乳酸生産性テストを行った。測定結果から算出したＤ−乳酸の蓄積濃度を表２に示す。
（比較例２）ロイコノストック・メセントロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来、フゾバクテリウム・ヌクレアトム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）由来、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来、サイクロフレクサス・トルクイズ（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ）由来の各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子のクローニング
ロイコノストック・メセントロイデス（ＮＢＲＣ３４２６）を独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より、フゾバクテリウム・ヌクレアトム（ＡＴＣＣ２５５８６）、クロストリジウム・アセトブチリカム（ＡＴＣＣ８２４）、サイクロフレクサス・トルクイズ（ＡＴＣＣ７００７５５）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手し、Ｇｅｎとるくん（タカラバイオ社製）を用いてゲノムＤＮＡの精製をおこなった。このゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、配列番号１９から２２に記載した各Ｄ−ＬＤＨをコードするＤＮＡ断片を得た。
【００７６】
プライマーとして、ロイコノストック・メセントロイデス由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子（Accession No. AB233384、配列番号１９）の増幅には配列番号２３および２４記載のオリゴＤＮＡを、フゾバクテリウム・ヌクレアトム由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子（Accession No. AE009951、配列番号２０）の増幅には配列番号２５および２６記載のオリゴＤＮＡを、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子（Accession No. AE001437、配列番号２１）の増幅には配列番号２７および２８記載のオリゴＤＮＡを、サイクロフレクサス・トルクイズ由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子（Accession No. NZ_AAPR01000005で登録されている全ゲノム配列よりＤ−ＬＤＨ遺伝子領域を参照、配列番号２２）の増幅には配列番号２９および３０記載のオリゴＤＮＡを用いた。
【００７７】
上記のようにして得られた増幅断片は、プラスミドベクターｐＴＲＳ１１にクローニングした。以後これらのプラスミドベクターを、それぞれｐＴＲＳ１１ＬｍＤＬＤＨ、ｐＴＲＳ１１ＦｎＤＬＤＨ、ｐＴＲＳ１１ＣａＤＬＤＨ、ｐＴＲＳ１１ＰｔＤＬＤＨ、と呼称する。
【００７８】
（比較例３）各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子の酵母染色体への導入
特開２００７−７４９３９で開示されるバシラス・ラエボラクティカス由来Ｄ−ＬＤＨ伝子を含むｐＴＭ６３、比較例２で得られたロイコノストック・メセントロイデス、フゾバクテリウム・ヌクレアトム、クロストリジウム・アセトブチリカム、サイクロフレクサス・トルクイズ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子をそれぞれ含むｐＴＲＳ１１ＬｍＤＬＤＨ、ｐＴＲＳ１１ＦｎＤＬＤＨ、ｐＴＲＳ１１ＣａＤＬＤＨ、ｐＴＲＳ１１ＰｔＤＬＤＨを鋳型として、それぞれ、配列番号１４と３１、配列番号１４と３２、配列番号１４と３３、配列番号１４と３４、配列番号１４と３５に記載のオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲにより、各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を含む約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（図２のステップ１に相当）。ここで配列番号３１から３５記載のオリゴＤＮＡはＰＤＣ１遺伝子の上流６５ｂｐに相同性のある配列が付加されるようにデザインした。
【００７９】
次に、実施例５記載の方法によって、酵母選択マーカーであるＴＲＰ１遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（図２のステップ２に相当）。それぞれのＤＮＡ断片を、実施例５記載の方法によって精製した。ここで得られた各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を含む１．１ｋｂ断片、ＴＲＰ１遺伝子を含む１．４ｋｂ断片をそれぞれ混合したものを鋳型として配列番号１６と３１、配列番号１６と３２、配列番号１６と３３、配列番号１６と３４、配列番号１６と３５記載のオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲにより各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子、ＧＡＰＤＨターミネーター及びＴＲＰ１遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（図２のステップ３に相当）。
【００８０】
上記のＤＮＡ断片を実施例５記載の方法によって精製後、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換し、トリプトファン非添加培地で培養することにより、各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。このようにして得られた形質転換株が、各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることを実施例５記載の方法で確認した。以下、バシラス・ラエボラクティカス、ロイコノストック・メセントロイデス、フゾバクテリウム・ヌクレアトム、クロストリジウム・アセトブチリカム、サイクロフレクサス・トルクイズのそれぞれに由来するＤ−ＬＤＨ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、それぞれ、ＢｌＤＬＤＨ株、ＬｍＤＬＤＨ株、ＦｎＤＬＤＨ株、ＣａＤＬＤＨ株、ＰｔＤＬＤＨ株とする。
【００８１】
（比較例４）Ｄ−乳酸生産性テスト
比較例３のようにして得られたＢｌＤＬＤＨ株、ＦｎＤＬＤＨ株、ＣａＤＬＤＨ株、ＰｔＤＬＤＨ株を用いて、実施例６記載の方法によって、Ｄ−乳酸生産性テストを行った。測定結果から算出したＤ−乳酸の蓄積濃度を表４に示す。
【００８２】
（比較例５）Ｄ−乳酸生産性テスト
比較例３のようにして得られたＬｍＤＬＤＨ株を用いて、実施例７記載の方法によって、Ｄ−乳酸生産性テストを行った。測定結果から算出したＤ−乳酸の対糖収率、乳酸、および酢酸の蓄積濃度を表５に示す。また、Ｄ−乳酸の光学純度測定を実施例６に記した条件で行った。測定の結果、Ｌ−乳酸は検出されなかった。乳酸の蓄積および測定限界から導かれる光学純度を表５に示す。その結果、ロイコノストック・メセントロイデス由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を導入した酵母と、ホタテ由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を導入した酵母の合成培地を用いたＤ−乳酸の発酵成績は、後者が、収率、副生物の生成の両方において優れていた。
【００８３】
（比較例６）乳酸の精製
比較例５で得られた培養液を、実施例８と同様の方法で精製した結果、透過水には１６．５ｇ／Ｌの乳酸と０．６２ｇ／Ｌの酢酸が含まれていた（表６）。
【００８４】
以上、実施例と比較例で示したように、種々のＤ−ＬＤＨを酵母に導入し乳酸発酵力価を検討した結果、ホタテ由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を導入した酵母を用いると、不純物の混入の少ない高純度の乳酸を、高収率で製造できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、本発明で用いられる酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【図２】図２は、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター下流にＤ−ＬＤＨ遺伝子を導入する方法を説明する概略図である。
【図１】
2009261262.tif 000008
【図２】
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【配列表】
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