(57)【要約】【課題】新規かつ有効な抗菌剤、抗生物質を提供する。【解決手段】海洋真菌から得られる新規スピロオキシナフタレン、それを含む抽出物、ならびにそれらを含む抗菌剤等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2009173599.tif 000007
で示される化合物。
【請求項２】
請求項１記載の化合物を有効成分として含む抗菌剤。
【請求項３】
独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−４６８として受領された微生物を培養し、次いで、該微生物から抽出し精製を行うことを含む、請求項１記載の化合物の製造方法。
【請求項４】
独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−４６８として受領された微生物を培養し、次いで、該微生物を破砕して得ることのできる、請求項１記載の化合物を含有する抽出物。
【請求項５】
請求項４記載の抽出物を有効成分として含む抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海洋真菌由来の新規抗菌物質に関する。詳細には、本発明は、海洋真菌由来の新規スピロオキシナフタレンおよびそれを含有する該海洋真菌から得られる抽出物、ならびにそれらの使用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
今世紀に入ってからフレミングのペニシリンの発見以来、有害微生物に対する抗菌剤の開発が活発に行われており、多種多様な抗菌剤が医学、薬学、食品、農業などの幅広い分野で使用され、人類に恩恵がもたらされている。しかし、これらの抗菌剤が有効でない耐性菌が出現し、さらなる抗菌剤の開発、とりわけ新たなコンセプトによる抗菌剤の開発を余儀なくされているのが現状である。
【０００３】
新たなコンセプトにより抗菌剤の開発の１つとして、細菌の情報伝達機構をターゲットとした開発が挙げられる。このコンセプトによれば、特に薬剤耐性細菌に対して有効な薬剤を開発できると期待されており、そのための研究が続けられている（非特許文献１〜４参照）。
【非特許文献１】Barrett JF, Hoch JA.  Two-component signal transduction as a target for microbial anti-infective therapy. Antimicrob Agents Chemother 42: 1529-1536 (1998)
【非特許文献２】Barrette JF, et al.  Antibacterial agents that inhibit two-component signal transduction systems. Proc Natl Acad Sci USA 95: 5317-5322 (1998)
【非特許文献３】Macielag MJ, Goldschmidt R.  Inhibitions of bacterial two-component signaling systems. Exp Opin Invest Drugs 9: 2351-2369 (2000)
【非特許文献４】Matsushita M, Janda KD.  Histidine kinases as targets for new antimicrobial agents. Bioorg Med Chem 10: 855-867 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
新規かつ有効な抗菌剤、抗生物質、農薬等を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、ヒスチジンキナーゼ（ＨＫ）を介する細菌に特異的な情報伝達機構を阻害する新規かつ効果的な抗菌物質を海洋微生物から見出して、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、細菌の情報伝達機構に対して作用する、新規かつ有効な抗菌物質が得られる。これにより、従来困難とされてきた薬剤耐性菌に対しても効果的な除菌、抗菌を行うことができ、新たな医薬品、抗菌剤、農薬等が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、１の態様において、式（Ａ）：
【化１】
2009173599.tif 000002
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ８はそれぞれ独立して水素、ハロゲンまたはＯＲａであり、
Ｒａは水素またはハロゲンで置換されていてもよい炭素数１〜４個のアルキルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、ＯＲｂ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＲｃＲｄ、ＮＯ２またはハロゲンで置換されていてもよい炭素数１〜４個のアルキルであり、
Ｒｂは水素またはハロゲンで置換されていてもよい炭素数１〜４個のアルキルであり、
ＲｃおよびＲｄはそれぞれ独立して水素またはハロゲンで置換されていてもよい炭素数１〜４個のアルキルである］で示される細菌情報伝達阻害作用を有する新規スピロジオキシナフタレン化合物に関する。
【０００８】
式（Ａ）の化合物は、形成可能な場合にはその塩および溶媒和物を包含する。例えば、式（Ａ）の化合物がカルボキシル基を有する場合にはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどの金属あるいはアミン類と塩を形成しうる。また例えば、式（Ａ）の化合物がアミノ基を有する場合にはカルボン酸などの有機酸と塩を形成しうる。さらに式（Ａ）の化合物は、その置換基の種類によっては溶媒和物を形成しうる。
【０００９】
式（Ａ）の化合物は、ヒスチジンキナーゼを介する細菌に特異的な情報伝達機構（two-component system）（「ＴＣＳ」ともいう）中のヒスチジンキナーゼ（「ＨＫ」ともいう）の自己リン酸化およびレスポンスレギュレーター（「ＲＲ」ともいう）へのリン酸基転移を阻害する。このような阻害によりＴＣＳが弱体化あるいはブロックされ、抗菌作用が発揮される。ＴＣＳは細菌に広く存在し、環境ストレスに対する応答系を形成しており、細菌増殖の抑制、種々の動植物病原菌の病原性、薬剤耐性の制御、バイオフィルム形成、植物ホルモン、抗生物質などの二次代謝産物の生産等を多面的に制御している。したがって、ＴＣＳを弱体化あるいはブロックすることのできる式（Ａ）の化合物を、広範な細菌に対する有効な除菌剤、抗菌剤、抗生物質等の医薬、農薬等として用いることができる。上述のごとく、式（Ａ）の化合物は細菌情報伝達阻害型の薬剤であるため、細胞内に複数存在する異なるＴＣＳにも作用し、今までの薬剤とは全く異なる抗生物質などの薬剤の開発が可能となる。例えば、式（Ａ）の化合物は、新規医薬、例えば新規抗生物質、新規抗菌剤として有望なだけでなく、新規農薬、例えば農業上問題になっている病害細菌の病原性抑制や植物ホルモンの調節剤、バイオフィルム形成阻害剤、例えば虫歯予防剤、あるいはクオラムセンシング阻害剤などとしても応用可能である。
【００１０】
式（Ａ）の化合物はアスコキタ（Ascochyta）属の糸状菌またはその類縁種を培養することによって得ることができる。あるいはまた、公知の化学合成法によっても合成可能である。アスコキタ属の糸状菌の培養は当業者に公知の培地を用いて行うことができる。海水またはその成分を適宜添加して培養してもよい。培養によって得られた菌体から式（Ａ）の化合物を含有する抽出物を得て、これより式（Ａ）の化合物を精製あるいは単離することができる。かかる抽出、精製、単離等の方法は当業者に公知である。式（Ａ）の化合物は抗菌作用を有するので、式（Ａ）の化合物を抗菌剤の有効成分として用いることができる。
【００１１】
式（Ａ）の化合物うち、好ましいものの例としてはＲ１〜Ｒ１１がすべて水素である化合物アスコキタシン（ascochytatin）（下式Ｉ）が挙げられる。
【化２】
2009173599.tif 000003
【００１２】
アスコキタシンは本発明者らが、海洋に棲息するアスコキタ属の糸状菌から見出し，命名した新規化合物である（実施例において「化合物１」と称される）。アスコキタシンにはいくつかの立体異性体が存在するが、本発明はそれらを包含する。アスコキタシンの好ましい立体構造は図５に示すものである。本発明者らが海洋から得たアスコキタ属の糸状菌（Ascochyta sp. NGB4）は、平成１９年１２月２５日に独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−４６８として受領された。本明細書において、この菌株を「ＮＧＢ４株」という。
【００１３】
本発明は、別の態様において、式（Ａ）の化合物、とりわけアスコキタシンの製造方法も提供する。式（Ａ）の化合物は、ＮＧＢ４株またはその類縁種を適当な培地で培養し、得られた菌体から抽出することにより得ることができる。特にアスコキタシンは、ＮＧＢ４株を適当な培地で培養し、得られた菌体から抽出することによって得ることができる。ＮＧＢ４株の培養に用いる培地は菌の増殖が可能なものであれば特に制限はないが、液体培地としては海水またはそれに準じる組成を有する液体に各成分を溶解したものが好ましい。各成分は糸状菌用の培地に用いられるものが好ましく、ポテトデキストロース培地の成分、麦芽エキス、酵母エキスなどの成分などが挙げられるがこれらに限らない。ＮＧＢ４株を培養するための好ましい液体培地の例としては、５０％の海水を含有するポテトデキストロース培地が挙げられるが、これに限らない。ＮＧＢ４株を培養するための好ましい固体培地の例としてはグルコース０．５％、グリセロール２．０％、酵母エキス０．２％、Pharmamedia（登録商標）Traders Protein ２．０％、ＮａＣｌ ０．２５％および寒天２．０％を含有するｐＨ６．５の培地が挙げられるが、これに限らない。ＮＧＢ４株用の培地の選択は当業者の技量の範囲内である。ＮＧＢ４株の培養は、２０〜３０℃、例えば２５℃で５〜２０日間、例えば７〜１４日間、好気的に行うことが好ましい。液体培地の場合には撹拌または振盪しながら培養することが好ましい。
【００１４】
培養によって得られたＮＧＢ４株菌体を集め、アスコキタシンを抽出する。培養物からの菌体の分離は当業者に公知の方法を用いて行うことができ、遠心分離、ろ過などの方法がある。得られた菌体を破砕して抽出液を得ることができる。菌体破砕方法は公知であり、例えばらいかい器やダイノーミルなどによる磨砕、アセトン等の有機溶媒の添加、細胞壁溶解酵素の使用、凍結−融解法などがある。あるいは、培地から菌体を分離せずに、培地に直接アセトンなどの有機溶媒を添加することにより抽出を行ってもよい。抽出液が水性の場合には、アセトン、酢酸エチルなどの有機溶媒にてアスコキタシンを抽出することができる。抽出液はエバポレーターなどの公知の手段によって適宜濃縮することができる。
【００１５】
得られたアスコキタシン含有抽出液から、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによってアスコキタシンを精製あるいは単離することができる。しかしながら、アスコキタシンの精製にはクロマトグラフィー法以外の方法も使用可能である。アスコキタシン精製のためのクロマトグラフィーの担体としてはシリカゲルを用いるのが一般的であるが、他の担体であってもよい。シリカゲル担体によるカラムクロマトグラフィーを行う場合の溶離液はクロロホルム、メタノール、ヘキサン、酢酸エチル、あるいはそれらの混合物などであってもよい。所望により、得られたアスコキタシンをメタノール等の溶媒から結晶化させてもよい。なお、本発明において、単離・精製の過程で得られる部分精製されたアスコキタシンも「アスコキタシン」に含めるものとする。精製の程度は使用目的に応じて決定されうる。
【００１６】
アスコキタシンは、公知の化学合成法および光学分割方法を用いて製造することもできる。いずれの方法を用いるかは当業者の技量の範囲内である。
【００１７】
アスコキタシンは抗菌作用を有する。したがって、本発明は、アスコキタシンを有効成分として含む抗菌剤を提供するものである。アスコキタシンは、新規医薬、例えば新規抗生物質、新規抗菌剤として有望なだけでなく、新規農薬、例えば農業上問題になっている病害細菌の病原性抑制や植物ホルモンの調節剤、バイオフィルム形成阻害剤、例えば虫歯予防剤、クオラムセンシング阻害剤などとしても応用可能であるので、アスコキタシンを含有する抗菌剤はこのような用途に使用することもできる。
【００１８】
本発明の抗菌剤の剤形はいずれのものであってもよい。例えば、アセトン、酢酸エチルなどの適当な液体担体を用いて液剤としてもよく、あるいは例えばエタノールなどの媒体中に懸濁した剤形であってもよい。さらに本発明の抗菌剤は、練り薬、軟膏、パスタなどの半固形剤形であってもよく、あるいは適当な担体とともに粉末、顆粒、錠剤などの固形剤形としてもよい。本発明の抗菌剤の剤形はこれらの剤形に限定されないことはいうまでもない。当業者は、抗菌剤の用途に応じ、毒性等の諸因子を考慮して担体、剤形、適用方法を適宜選択することができる。
【００１９】
本発明の抗菌剤はいずれの方法によって適用されてもよい。例えば、抗菌作用を必要とする場所（例えば医療器具表面、皮膚表面や口腔内などの身体部位、植物体、土壌など）に、塗布、噴霧、散布などにより直接適用することができる。また、注射などによって体内にデリバリーすることもできる。
【００２０】
本発明は、別の態様において、アスコキタ属の糸状菌を培養して得られた菌体からの抽出物であって、式（Ａ）の化合物を含有する抽出物を提供する。本発明の好ましい抽出物は、ＮＧＢ４株からの抽出物であって、アスコキタシンを含有する抽出物である。したがって、本発明は、さらなる態様において、これらの抽出物を有効成分として、好ましくはアスコキタシンを含有するＮＧＢ４株の抽出液を有効成分として含有する抗菌剤を提供する。かかる抗菌剤もまた、新規医薬、例えば新規抗生物質、新規抗菌剤として有望なだけでなく、新規農薬、例えば農業上問題になっている病害細菌の病原性抑制や植物ホルモンの調節剤、バイオフィルム形成阻害剤、例えば虫歯予防剤、あるいはクオラムセンシング阻害剤などとしても応用可能である。本発明の式（Ａ）を含有する抽出液、とりわけアスコキタシンを含有する抽出液を含む抗菌剤の剤形、および適用方法は、上述のとおりである。
【００２１】
本発明は、さらなる態様において、抗菌剤の製造のための式（Ａ）の化合物、とりわけアスコキタシンの使用を提供する。
【００２２】
本発明は、さらなる態様において、式（Ａ）の化合物、とりわけアスコキタシンを適用することを特徴とする、細菌に対する抗菌方法を提供する。
【００２３】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の説明のためのものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２４】
１．アスコキタ属の糸状菌の単離および同定
長崎県の漁港（北緯３２度４７分３１秒、東経１２９度４６分５５秒）にて採取した腐敗した漁網からＮＢＧ４株を単離した。ＮＢＧ４株を、５０％海水中に調製されたポテトデキストロース寒天培地（Difco）上で維持した。
【００２５】
単離菌の分類学的考察を下記のように行った。使用培地はポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）、２％麦芽寒天培地（ＭＡ）、オートミール寒天培地（ＯＡ）、三浦培地（ＬｃＡ）およびコーンミール寒天培地（ＣＭＡ）であった。ＮＢＧ４株を２５℃で２週間培養後、コロニーを観察した。コロニーの色の表現はKornerup A, Wanscher JH. Methen handbook of colour, 3rd ed., Eyre Methen, London, UK. (1978)に従った。ＰＤＡプレート上のコロニーは直径４７〜６０ｍｍに達し、その表面性状は、羊毛状もしくは平坦状であり、放射状に溝があり、色調は褐色ないし灰色がかった褐色（５Ｅ−４ないし５Ｅ−３）であった。ＭＡ上のコロニーは直径５３〜５６ｍｍに達し、その表面性状は羊毛状もしくは平坦状であり、色調はオリーブ色（３Ｅ−Ｆ−８）であった。ＯＡ上のコロニーは直径６０〜６５ｍｍに達し、その表面性状は羊毛状であり、色調は薄いオレンジ色ないしオレンジ色を帯びた白色（５Ａ−５ないし５Ａ−２）であった。ＬｃＡ上のコロニーは直径５５〜５６ｍｍに達し、その表面性状は羊毛状であり、色調は薄いオレンジ色ないしオレンジ色を帯びた白色（５Ａ−５ないし５Ａ−２）であった。ＣＭＡ上のコロニーは直径３５〜３７ｍｍに達し、その表面性状は平坦状であり、色調は白色（１Ａ−１）であった。菌糸は寒天表面もしくは寒天内に形成され、無色、平滑、有隔壁菌糸の形成が認められた。ＰＤＡおよびＣＭＡ培地上では分生子果の形成が認められた。分生子果は分生子殻で、球形〜亜球形、黒色〜黒褐色、寒天培地表面あるいは培地中に埋没して形成される様子が観察された。分生子形成細胞であるフィアライドはたる型、卵型または頚部が細長くなるアンプル型（７〜１０μｍ  ｘ  ２〜３μｍ）で無色、無隔壁、単細胞性であった。分生子の形成様式は内生出芽的に形成されるフィアロ型を示した。分生子は楕円形〜長楕円形（３〜５μｍ  ｘ  １．５〜２μｍ）、無色、壁はやや厚く、主に２細胞であり、わずかながら３細胞性のものも観察された。約１ヶ月の培養においても有性生殖器官の形成は確認できなかった。これらの形態的特徴から、ＮＧＢ４株をアナモルフの菌類、不完全菌類の一種、アスコキタ属（Sutton BC. The Coelomycetes-fungi imperfecti with pycnidia acervuli and stoma-, CAB International, Wallingford, UK. (1980)）と同定した。
【００２６】
２．B. subtilis １６８株およびB. subtilis ＣＮＭ２０００株を用いたバイオアッセイ方法
ＮＧＢ４株のアセトン抽出物およびアスコキタシンのＴＣＳ阻害活性を、Watanabe T, Hashimoto Y, Yamamoto K, Hirao K, Ishihama A, Hino M, Utsumi R.  Isolation and characterization of inhibitors of the essential histidine kinase, YycG in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. J Antibiot 56: 1045-1052 (2003)に記載された方法により調べた。ＮＧＢ４株の菌体のアセトン抽出物または後述の化合物１（アスコキタシン）を試料とした。シャーレ中のトリプチカーゼソイ（０．７５％）寒天（１．５％）プレート上に試料（１μｌ）をスポットし、B. subtilis 168株またはB. subtilis CNM2000株の一晩培養液３０μｌを含む３ｍｌの寒天（０．５％）を重層した。３７℃で２４時間培養後、B. subtilis 168株およびB. subtilis CNM2000株生育阻害ゾーンの直径を測定した。B. subtilis 168株よりもB. subtilis CNM2000株において大きな阻害ゾーンが得られる場合に、ＴＣＳ中のＨＫの自己リン酸化とＲＲへのリン酸基転移が阻害されるものとした。そして、阻害ゾーンが大きいほど阻害活性が高いものとした。以下に述べる化合物Ｉの単離操作において、上記バイオアッセイ法を適宜使用してＴＣＳ阻害活性をモニターした。
【００２７】
３．ＢＭＧ４株の培養および化合物１（アスコキタシン）の単離
５０％海水を用いて調製されたポテトデキストロース培地（Difco）にて、２５℃で７日間、１００ｒｐｍで振盪しながらＢＭＧ４株を種培養した。１ｍｌの種培養を、ステンレス製プレート（３２０ｘ１９０ｍｍ）中の生産用寒天培地（４００ｍｌ）に接種した。生産用寒天培地の組成は、グルコース０．５％、グリセロール２．０％、酵母エキス０．２％、Pharmamedia（登録商標）Traders Protein ２．０％、ＮａＣｌ ０．２５％および寒天２．０％であり、オートクレブ前にｐＨ６．５に合わせた。２５℃で１４日間培養後、合計８リットルの寒天培地からアセトン抽出を行った。抽出物をエバポレーションしてアセトンを除去し、水性残渣（約２リットル）を同体積の酢酸エチルで２回抽出した。抽出物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムにてクロマトグラフィーを行った。溶出は、クロロホルム／メタノール混合物を用い、メタノールを０％、１％、１０％、そして１００％とするステップワイズ法により行った。１％メタノール−クロロホルムフラクションがB. subtilis 168株よりもB. subtilis CNM2000株において最も大きな阻害ゾーンを生じさせたので、このフラクションをヘキサン／酢酸エチル（１：１）を溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、さらに精製した。活性フラクションを集め、減圧蒸発させて８０ｍｇの白色粉末（化合物１）を得た。この粉末１の半分をメタノールから結晶化させてＸ線結晶解析を行った。この結晶化により無色針状結晶（１２ｍｇ）を得た。
【００２８】
４．化合物１の構造決定
（ｉ）一般的方法
化合物１の構造決定には下記の方法および機器、ならびに誘導体を使用した。
ＵＶスペクトルをBeckman DU 640型スペクトル計にて得た。ＩＲスペクトルをJasco FT/IR-430型装置にて得た。融点を柳本製作所の装置にて測定した。１Ｈ ＮＭＲおよびすべての二次元ＮＭＲスペクトルをVarian Unity INOVA 750型装置により７５０ＭＨｚにて記録した。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルをVarian Unity INOVA 500型装置により１２５ＭＨｚにて記録した。化学シフトはＣＤ３ＯＤのδＨ３．３１およびδＣ４９．１５、ならびにＣＤＣｌ３のδＨ７．２５およびδＣ７７．０の溶媒ピークを基準にした。低分解能および高分解能ＦＡＢ−ＭＳデータをJeol JMS700スペクトル計にて得た。ＥＳＩ−ＭＳのデータをThermoFinigan LCQ Advantage型装置にて測定した。
【００２９】
（ｉｉ）Ｘ線結晶解析方法および化合物１に関する結果
メタノールから結晶化した化合物１についてＸ線結晶解析を行った。Bruker-AXS SMART Apex II CCDシステムを用いてＭｏ Ｋα照射（λ＝０．７１０７３Å）を行い１００Ｋで解析した。
化合物１に関するデータは以下のとおり：Ｃ４０Ｈ２８Ｏ１４（２個の分子），無色針状，Ｍｒ＝７３２．６２，単斜晶系，Ｐ２（１），ａ＝１２．８１５０（１４）Å，ｂ＝８．２８５８（９）Å，ｃ＝１５．６７５６（１８）Å，α＝９０°，β＝１０９．９２３０（１０）°，γ＝９０°，Ｖ＝１５６４．９（３）Å３，Ｚ＝２，ρｃａｌｃｄ．＝１．５５５Ｍｇｍ−３，μ＝０．１５８ｍｍ−１，Ｔ＝１００Ｋ，８９７６個の測定された反射，４５４９個［Ｒ（ｉｎｔ）＝０．０４３４］の独立した反射，４９５個のパラメータ，ＧＯＦ＝１．０１３，ならびにＲ１（ｗＲ２）＝０．０６１１（０．１５８１）。
直接法により結晶構造を解明し、ＳＨＥＬＸＴＬプログラムを用いたＦ２上のフルマトリックス最小二乗法によりリファインした。吸収補正はＳＡＤＡＢＳプログラムにて行った。ＣＣＤＣ６６９９５２は、ここに示したデータに対する補足的な結晶像のデータを含んでいる。これらのデータを、The Cambridge Crystallographic Data Centreから、www.ccdc.cam.ac.uk/data_request/cifを通じて無料で得ることができる。
【００３０】
（ｉｉｉ）誘導体の合成
（ｉｉｉ−１）トリメチルアスコキタシン（化合物２）の合成
ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（５：１）混合物（２ｍｌ）中の化合物１（５ｍｇ，１３．６μｍｏｌ）の溶液に、過剰量のトリメチルシリルジアゾメタン（東京化成工業株式会社製）を添加した。室温（約２５℃）で３６時間撹拌後、反応混合物を蒸発乾固させ、残渣をシリカゲルカラム（直径１０ｍｍ，長さ１５０ｍｍ）によるクロマトグラフィーに供して（ヘキサン／酢酸エチル（２：１）にて溶出）化合物２（３．５ｍｇ）を得た。
化合物２のデータ：白色固体；ＴＬＣ Ｒｆ値０．７（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１０：１））および０．２（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ（１：１））；１Ｈ ＮＭＲ（７５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：３．７１（１Ｈ，ｔ，３．８，Ｈ−３），３．６７（１Ｈ，ｄ，３．８，Ｈ−２），３．６９（３Ｈ，ｓ，８−Ｏ−ＣＨ３），３．９２（３Ｈ，ｓ，５−Ｏ−ＣＨ３），３．９８（３Ｈ，ｓ，４’−Ｏ−ＣＨ３），４．２６（１Ｈ，ｂｒｓ，４−ＯＨ），５．３８（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−４），６．８０（１Ｈ，ｄ，９．０，Ｈ−３’），６．９５（１Ｈ，ｄ，８．３，Ｈ−７’），６．９８（１Ｈ，ｄ，９．０，Ｈ−２’），６．９９（２Ｈ，ｓ，重複したＨ−６およびＨ−７），７．４１（１Ｈ，ｔ，８．３，Ｈ−６’），７．８２（１Ｈ，ｄ，８．３，Ｈ−５’）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５３．１２（Ｃ−２），５４．２１（Ｃ−３），５５．８６（４’−Ｏ−ＣＨ３），５６．２６（５−Ｏ−ＣＨ３），５７．８６（８−Ｏ−ＣＨ３），６３．７１（Ｃ−４），９６．７３（Ｃ−１），１０５．５３（Ｃ−３’），１０８．８２（Ｃ−２’），１０９．６７（Ｃ−７’），１１３．１１（Ｃ−６と相互交換可能なＣ−８ａ’），１１３．１９（Ｃ−８ａ’と相互交換可能なＣ−６），１１５．２９（Ｃ−７），１１５．３９（Ｃ−５’），１２１．９７（Ｃ−８ａ），１２５．４１（Ｃ−４ａ），１２５．８９（Ｃ−４ａ’），１２６．４９（Ｃ−６’），１４０．７４（Ｃ−１’），１４７．３７（Ｃ−８’），１５０．０５（Ｃ−４’），１５１．８３（Ｃ−５），１５４．３２（Ｃ−８）。
【００３１】
（ｉｉｉ−２）（Ｒ）−ＭＴＰＡエステル（化合物３）の合成
ピリジン（１００μｌ）中の化合物２（１．５ｍｇ，３．７μｍｏｌ）の溶液に、（＋）−（Ｓ）−メトキシ−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸クロリライド（ＭＴＰＡＣｌ）（１５μｌ，関東化学株式会社製）を添加した。室温（約２５℃）で１４時間撹拌後、反応混合物をＣＨＣｌ３で希釈し、次いで、ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌで続けて洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させ、残渣をシリカゲルカラム（直径１０ｍｍ，長さ２００ｍｍ）によるクロマトグラフィーに供して（ヘキサン／酢酸エチル（２：１）にて溶出）化合物３（１．３ｍｇ）を得た。
化合物３のデータ：白色固体；ＴＬＣ Ｒｆ値０．４（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ（１：１））；１Ｈ ＮＭＲ（７５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：３．５０（３Ｈ．ｓ，５−Ｏ−ＣＨ３），３．６５（３Ｈ，ｂｒｓ，ＭＴＰＡの−Ｏ−ＣＨ３），３．６９（１Ｈ，ｄ，４．５，Ｈ−２），３．６９（３Ｈ，ｓ，８−Ｏ−ＣＨ３），３．９０（１Ｈ，ｔ，４．５，Ｈ−３），３．９９（３Ｈ，ｓ，４’−Ｏ−ＣＨ３），６．６４（１Ｈ，ｄ，４．５，Ｈ−４），６．８１（１Ｈ，ｄ，８．３，Ｈ−３’），６．８５（１Ｈ，ｄ，９．０，Ｈ−６），６．９７（１Ｈ，ｄ，７．５，Ｈ−７’），７．００（１Ｈ，ｄ，８．３，Ｈ−２’），７．０３（１Ｈ，ｄ，９．０，Ｈ−７），７．３９（３Ｈ，ｍ，ＭＴＰＡのフェニル基），７．４３（１Ｈ，ｔ，７．５，Ｈ−６’），７．７１（２Ｈ，ｍ，ＭＴＰＡのフェニル基），７．８４（１Ｈ，ｄ，７．５，Ｈ−５’）。
【００３２】
（ｉｉｉ−３）（Ｓ）−ＭＴＰＡエステル（化合物４）の合成
化合物２（１．５ｍｇ，３．７μｍｏｌ）を（−）−（Ｒ）−ＭＴＰＡＣｌ（１５μｌ）（関東化学株式会社製）で処理し、上記と同じ手順により化合物４（１．０ｍｇ）を得た。
化合物４のデータ：白色固体；ＴＬＣ Ｒｆ値０．４（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ（１：１））；１Ｈ ＮＭＲ（７５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：３．５２（３Ｈ，ｂｒｓ，ＭＴＰＡの−Ｏ−ＣＨ３），３．６４（１Ｈ，ｄ，４．５，Ｈ−２），３．７１（３Ｈ，ｓ，８−Ｏ−ＣＨ３），３．７６（３Ｈ．ｓ，５−Ｏ−ＣＨ３），３．７９（１Ｈ，ｔ，４．５，Ｈ−３），３．９８（３Ｈ，ｓ，４’−Ｏ−ＣＨ３），６．７４（１Ｈ，ｄ，４．５，Ｈ−４），６．７８（１Ｈ，ｄ，８．３，Ｈ−３’），６．９５（１Ｈ，ｄ，８．３，Ｈ−２’），６．９６（１Ｈ，ｄ，９．０，Ｈ−６），６．９６（１Ｈ，ｄ，７．５，Ｈ−７’），７．０７（１Ｈ，ｄ，９．０，Ｈ−７），７．３７（３Ｈ，ｍ，ＭＴＰＡのフェニル基），７．４２（１Ｈ，ｔ，７．５，Ｈ−６’），７．６２（２Ｈ，ｍ，ＭＴＰＡのフェニル基），７．８２（１Ｈ，ｄ，７．５，Ｈ−５’）。
【００３３】
（ｉｖ）化合物１の構造
上述のごとくＮＧＢ４株抽出物から単離された化合物１を用いた。化合物１の物理化学的特性を表１にまとめた。
【表１】
2009173599.tif 000004
【００３４】
ＨＲＦＡＢ−ＭＳおよび１３Ｃ ＮＭＲのデータから分子式をＣ２０Ｈ１４Ｏ７と決定した。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは２０個の分離したシグナルを示した。それらのうち１６個は芳香族炭素であり、３個は酸素を有する脂肪族炭素であった。残りの１個（δｃ １００．２９）はアセタール炭素である可能性があった。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは１０個のプロトンに対応する１０個のシグナルを示した。残りの４個のプロトンは相互交換可能であり、ヒドロキシル基のプロトン（−ＯＨ）と考えられた。すべての直接１Ｈ−１３ＣコネクションはＨＳＱＣ（Hetero-nuclear Single Quantum Coherence）により決定された。１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ（Correlation Spectroscopy）のデータは４個のスピン系を示し、３個は芳香族部分であり（図１ａ、ｃ、ｄ参照）、１個の脂肪族部分も明らかであった（図１ｂ参照）。
【００３５】
脂肪族部分注のエポキシド基は１Ｈおよび１３Ｃ化学シフトから推測された。図２に示す化合物１の平面構造はＨＭＢＣ（Heteronuclear Multiple-Bond Correlation）シグナルから推定された。
【００３６】
化合物１のＮＭＲのデータを表２に示す。
【表２】
2009173599.tif 000005
【００３７】
化合物１は、スピロアセタールによって結合された（１’および８’ヒドロキシ基を介して結合された）ユニークな１’，４’，８’−トリヒドロキシナフタレン単位を有し、それに結合されているもう一方の単位は部分的に還元され、官能基を有するナフタレン単位であった。
【００３８】
上述の方法に従ってＸ線結晶解析を行って化合物１の構造を確認し、その相対的な立体構造について決定した。化合物１のＯＲＴＥＰプログラムによる図を図３に示す。Ｘ線結晶解析によってＮＭＲの結果から推定された構造が証明され、相対的な立体構造の確定が可能となった。
【００３９】
改良Mosher法（Ohtani I, Kusumi T, Kashman Y, Kakisawa H.  High-field FT NMR application of Mosher's method. The absolute configurations of marine terpenoids. J Am Chem Soc, 113: 4092-4096 (1991)）を用いて化合物１の絶対配置を決定した。上述の方法により、化合物１の３個のフェノール性およびナフトール性のヒドロキシ基（５−ＯＨ、８−ＯＨおよび４’−ＯＨ）をメチル化してシグナルの複雑化を避け、さらにトリメチル化誘導体（化合物２）を（Ｒ）または（Ｓ）−ＭＴＰＡエステル（それぞれ、化合物３または４）に変換した。１Ｈ−ＮＭＲ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣのデータによって各誘導体のプロトンを帰属した。重要なΔδ（δＳ−δＲ）値を図４に示す。これらのデータからわかるように、Ｃ−４の絶対位置はＲであった。
【００４０】
以上の解析結果より、化合物１（アスコキタシン）の構造を式（Ｉ）に示すごとく決定し、その立体構造を図５に示すごとく決定した。
【００４１】
５．アスコキタシンに対するB. subtilis 168株およびB. subtilis CNM2000株の感受性
上で説明したバイオアッセイ法により実験を行った。図６に示すように、野生型のB. subtilis 168株の阻害ゾーンよりも変異株であるB. subtilis CNM2000株の阻害ゾーンのほうが大きく鮮明であり、感受性が高いことがわかった。この結果から、アスコキタシンは細菌のＴＣＳの機能を阻害することがわかった。
【００４２】
６．化合物１の抗菌活性および細胞毒性
（ｉ）抗菌活性
アスコキタシン（濃度２００ｐｐｍまたは２０ｐｐｍ）１５μｌを直径６ｍｍのペーパーディスクにアプライし、ディスクをクリーンベンチ中で３０分乾燥させた。その後ディスクを下記微生物を含有する各寒天培地上に置いた。試験した微生物はArthrobacter paraffineus ATCC21220, Brevibacterium sp. JCM6894, Staphylococcus aureus IFO12732, Bacillus subtilis IFO3134, Cytophaga marinoflava IFO14170, Pseudovibrio sp. MBIC3368, Escherichia coli IFO3301, Pseudomonas aeruginosa IFO3446, Candida albicans IFO1060 および Saccharomyces cervisiae ATCC27202であった。４８時間培養後、ハロ形成を観察した。結果を下表に示す。
【表３】
2009173599.tif 000006
【００４３】
アスコキタシンはグラム陽性細菌およびCandida albicansに対して強力かつ特異的な抗菌活性を示すことがわかった。
【００４４】
（ｉｉ）細胞毒性
Ａ５４９細胞（ヒト肺癌細胞系）およびJurkat細胞（ヒト白血病細胞系）を大日本住友製薬株式会社から購入して用いた。１０％ウシ胎児血清を含有するDulbeccoの改変Eagle培地（ＤＭＥＭ）にてＡ５４９細胞を培養した。平底９６ウェルマイクロプレートに細胞密度４０００個／２００μｌ／ウェルで細胞を撒き、インキュベーター（５％ ＣＯ２−空気）中３７℃で１４時間培養した。系列希釈試料を各ウェルに添加し、さらに４８時間細胞を培養した。そしてAlamar BlueTMアッセイにより生菌数をカウントした。ブランク対照と比較して生菌数を５０％に抑制する試験化合物の濃度としてＩＣ５０値を決定した。１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地にてJurkat細胞を培養した。ウェルに撒いた細胞密度を２０００個／２００μｌ／ウェルとした以外は、Ａ５４９細胞に対するＩＣ５０値と同様にしてJurkat細胞に対するＩＣ５０値を決定した。
【００４５】
Ａ５４９細胞に対するアスコキタシンのＩＣ５０値は４．８μＭであり、Jurkat細胞に対するＩＣ５０値は６．３μＭであった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、細菌情報伝達阻害型の新規抗菌性薬剤アスコキタシンを提供するものであり、今までの薬剤とは全く異なる抗生物質などの薬剤の開発が可能となる。したがって、本発明のアスコキタシンは新規医薬、例えば新規抗生物質、新規抗菌剤として有望なだけでなく、新規農薬、例えば農業上問題になっている病害細菌の病原性抑制や植物ホルモンの調節剤、バイオフィルム形成阻害剤、例えば虫歯予防剤、あるいはクオラムセンシング阻害剤などとしても応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１はＣＯＳＹから決定された化合物１の部分構造を示す。
【図２】図２はＨＭＢＣから推定された化合物１の平面構造を示す。太線はＣＯＳＹからのスピン系を示し、それらは図１の平面構造ａ、ｂ、ｃおよびｄに対応する。矢印はＨＭＢＣシグナルを示す。
【図３】図３は化合物１のＯＲＴＥＰを示す。
【図４】図４は化合物１のトリメチル誘導体のＭＴＰＡエステルのΔδ（δ（Ｓ）−ＭＴＰＡエステル−δ（Ｒ）−ＭＴＰＡエステル）値を示す。
【図５】図５は決定された化合物１の構造式である。
【図６】図６は化合物１に対するB. subtilis 168株およびB. subtilis CNM2000株の感受性を示す実験結果である。１には１０００μｇ／ｍｌの化合物１、２には５００μｇ／ｍｌの化合物１、３には２５０μｇ／ｍｌの化合物１、４には１２５μｇ／ｍｌの化合物１、５には６２．５μｇ／ｍｌの化合物１、６には３１．３μｇ／ｍｌの化合物１を各々１μｌスポットした。
【図１】
2009173599.tif 000008
【図２】
2009173599.tif 000009
【図３】
2009173599.tif 000010
【図４】
2009173599.tif 000011
【図５】
2009173599.tif 000012
【図６】
2009173599.tif 000013