(57)【要約】【課題】肝疾患の予防又は治療薬の提供並びにインスリン抵抗改善剤の提供。【解決手段】N-(3,4-ジメトキシシンナモイル)アントラニル酸)）又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む肝疾患の予防又は治療薬、並びにN-(3,4-ジメトキシシンナモイル)アントラニル酸)）又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含むインスリン抵抗性改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
N-(3,4-ジメトキシシンナモイル)アントラニル酸又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む肝疾患予防又は治療薬。
【請求項２】
肝疾患が非アルコール性脂肪肝障害（NAFLD)である請求項１記載の肝疾患の予防又は治療薬。
【請求項３】
肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎（NASH)である請求項１記載の肝疾患の予防又は治療薬。
【請求項４】
肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に伴う肝線維化である請求項１記載の肝疾患の予防又は治療薬。
【請求項５】
肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に伴う肝脂肪化である請求項１記載の肝疾患の予防又は治療薬。
【請求項６】
肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に伴う肝炎症である請求項１記載の肝疾患の予防又は治療薬。
【請求項７】
N-(3,4-ジメトキシシンナモイル)アントラニル酸又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含むインスリン抵抗性改善剤。
【請求項８】
請求項７記載のインスリン抵抗性改善剤を含むメタボリックシンドローム改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝疾患、特に非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療薬に関する。本発明はさらに、インスリン抵抗性改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪肝(NAFLD)は先進国においてもっとも一般的な肝臓病である（非特許文献１及び２を参照）。NAFLDには幅広い肝疾患が含まれ、その範囲は単純性脂肪肝から脂肪肝炎、肝硬変におよぶ。非アルコール性脂肪肝炎(NASH)はNAFLDの重症病型であり、脂肪化、炎症、線維化を特徴とする。最近ではNAFLDはメタボリックシンドロームの一要素として認識されるになってきている（非特許文献３〜５を参照）。インスリン抵抗性はメタボリックシンドロームの基盤となる病態であり、NASHの病態形成において重要な役割を果たす。本発明者らは、最近インスリン抵抗性を有するNASHのラットモデルを作成し、PPARγ(peroxisomal proliferator activated receptor-γ)のアゴニストであるピオグリタゾンがインスリン抵抗性の改善を介してNASHの進展を予防することを証明した（非特許文献６を参照）。しかし、すべてのNASH患者がPPARγアゴニストのようなインスリン抵抗性改善薬のレスポンダーであるか否かは明らかではなく、現時点でNASHに対する最適な治療法は確立されていない。
【０００３】
TGF-β(Transforming growth factor-β)は多機能を有するペプチドであり、線維形成において重要な役割を有する（非特許文献７〜１０を参照）。肝線維組織においてTGF-βの発現が亢進しており、TGF-βは多くの肝疾患において線維化のmediatorとして働くことが知られている（非特許文献１１を参照）。TGF-βは培養星細胞でコラーゲン産生を刺激し、肝でのTGF-β過剰発現は肝線維化の原因となることが報告されている（非特許文献１２及び１３を参照）。TGF-β合成やTGF-βシグナルの阻害は肝線維化を予防することが異なった実験系を用いて報告されている（非特許文献１４〜１７を参照）。TGF-βシグナルは線維化関連肝疾患の抗線維化ターゲットとして認識することができよう。
【０００４】
トラニラスト(N-(3’,4’-dimethoxyciannamoyl)-anthranilic acid)はもともと抗アレルギー剤として開発された薬剤で、気管支喘息、アトピー性皮膚炎などに使用されている（非特許文献７を参照）。最近になって、トラニラストはTGF-βの作用を阻害することで抗線維作用を発揮することが報告された。実際に、トラニラストは皮膚瘢痕や皮膚硬化症などの線維化関連皮膚疾患に使用されている（非特許文献１８及び１９を参照）。しかしながら、現在までにトラニラストの肝疾患に対する有用性を動物モデルで証明した報告はない。
【０００５】
【非特許文献１】Reid AE. et al. Gastroenterology 2001;121:710-723.
【非特許文献２】Angulo P. et al., N Engl J Med 2002;346:1221-1231.
【非特許文献３】Marchesini G. et al, Hepatology 2003;37:917-923.
【非特許文献４】Marchesini G. et al., Diabetes 2001;50:1844-1850.
【非特許文献５】Marceau P. et al., J Clin Endocrinol Metab 1999;84:1513-1517.
【非特許文献６】Ota T. et al, Gastroenterology 2007;132:282-293.
【非特許文献７】Suzawa H. et al., Jpn J Pharmacol 1992;60:85-90.
【非特許文献８】Bonnet F. et al., Diabetes Metab 2003;29:386-392.
【非特許文献９】Ikeda H. et al., Biochem Biophys Res Commun 1996;227:322-327.
【非特許文献１０】Miyazawa K. et al., Atherosclerosis 1995;118:213-221.
【非特許文献１１】Liu X. et al., Liver Int 2006;26:8-22.
【非特許文献１２】Chapman HA. Et al., J Clin Invest 2004;113:148-157.
【非特許文献１３】Casini A. et al., Gastroenterology 1993;105:245-253.
【非特許文献１４】George J. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:12719-12724.
【非特許文献１５】Arias M. et al., BMC Gastroenterol 2003;3:29.
【非特許文献１６】Qi Z. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:2345-2349.
【非特許文献１７】Nakamura T. et al., Hepatology 2000;32:247-255.
【非特許文献１８】Shigeki S. et al, Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg 1997;31:151-158.
【非特許文献１９】Yamada H. et al., J Biochem (Tokyo)1994;116:892-897.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、肝疾患、特に非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療薬の提供を目的とする。本発明はさらに、インスリン抵抗性改善剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
過去の報告で、本発明者らはトラニラストがTGF-βを抑制することで糖尿病性腎症の腎線維化を予防することを動物モデルで発見した（Akahori H. et al., J Pharmacol Exp Ther 2005;314:514-521.)。TGF-βはNASHの進展においても中心的な役割を担うことが知られている(Williams EJ et al., J Hepatol 2000;32:754-761.）。そこで本発明者らは、トラニラスト投与がTGF-β作用と肝線維化を抑制することでNASHの病態を改善すると仮説を立てた。この仮説を検証するために、本発明者らはメチオニンコリン欠乏食を与えた肥満糖尿病ラットという確立された動物NASHモデルを用いてトラニラストの効果を検討した。
【０００８】
その結果、トラニラストが肝疾患の治療、特に肝線維化、肝脂肪化の抑制、肝炎症の改善に効果があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
さらに、本発明はトラニラストのマクロファージの活性化に対する作用を検討した。その結果、トラニラストがマクロファージの活性化を抑制することにより、インスリン抵抗性を改善し、メタボリックシンドロームを改善し、糖尿病の予防や治療や肥満を改善しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１０】
[１]  N-(3,4-ジメトキシシンナモイル)アントラニル酸又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む肝疾患予防又は治療薬。
[２]  肝疾患が非アルコール性脂肪肝障害（NAFLD)である[１]の肝疾患の予防又は治療薬。
[３]  肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎（NASH)である[１]の肝疾患の予防又は治療薬。
[４]  肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に伴う肝線維化である[１]の肝疾患の予防又は治療薬。
[５]  肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に伴う肝脂肪化である[１]の肝疾患の予防又は治療薬。
[６]  肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に伴う肝炎症である[１]の肝疾患の予防又は治療薬。
[７]  N-(3,4-ジメトキシシンナモイル)アントラニル酸又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含むインスリン抵抗性改善剤。
[８]  [７]のインスリン抵抗性改善剤を含むメタボリックシンドローム改善剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のトラニラスト(N-(3,4-ジメトキシシンナモイル)アントラニル酸)を有効成分として含む医薬組成物は、肝疾患、特に非アルコール性脂肪肝炎に伴う肝線維化、肝脂肪化を抑制し、非アルコール性脂肪肝炎に伴う肝炎症を改善する。さらに、本発明のトラニラストを有効成分として含む、医薬組成物はインスリン抵抗性を改善し、メタボリックシンドロームを改善し、糖尿病の予防や治療や肥満の改善に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はトラニラスト（N-(3,4-dimethoxyciannamoyl)-anthranilic acid；N-(3,4-ジメトキシシンナモイル)アントラニル酸)又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む肝疾患治療又は予防に用いる医薬組成物である。肝疾患は限定されないが、肝臓の脂肪化、線維化、炎症を伴う肝疾患が含まれる。好ましくは、非アルコール性脂肪肝障害（NAFLD)である。非アルコール性脂肪肝障害（NAFLD：Nonalcoholic fatty liver disease)は、単純性脂肪肝から脂肪肝炎、肝硬変におよび、本発明の医薬組成物はそれらの予防又は治療に有用である。非アルコール性脂肪肝障害が重症型になると、非アルコール性脂肪肝炎（NASH：Nonalcoholic steatohepatitis)となり、肝臓の脂肪化、炎症、線維化が進行する。本発明の医薬組成物は、非アルコール性脂肪肝炎（NASH)の予防又は治療薬を含み、さらに、非アルコール性脂肪肝炎に伴う脂肪化、炎症、線維化の予防又は治療薬を含む。本発明の医薬組成物は、このような肝線維化、肝脂肪化を抑制する肝線維化抑制剤、肝脂肪化抑制剤であり、さらに肝の炎症を改善する肝炎症改善剤である。
【００１３】
トラニラストは、TGF-βの発現を抑制し、種々の肝障害を改善する。
【００１４】
さらに、本発明はトラニラスト（N-(3,4-dimethoxyciannamoyl)-anthranilic acid；N-(3,4-ジメトキシシンナモイル)アントラニル酸)又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含むインスリン抵抗性改善剤、及び該インスリン抵抗性改善剤を含む糖代謝改善剤、メタボリックシンドローム改善剤、抗肥満剤、又は糖尿病の予防若しくは治療剤である。
【００１５】
トラニラストは、マクロファージの活性化を抑制し、インスリン抵抗性を抑制・改善すし、さらには糖代謝を改善し、糖尿病の予防又は治療にも用いることもできる。さらに、トラニラストは、マクロファージの活性化を抑制し、メタボリックシンドロームを改善し、抗肥満剤として用いることもできる。
【００１６】
トラニラスト又はその薬理学的に許容される塩は、化学合成により製造することができ、また市販のものを用いてもよい。トラニラスト又はその塩は例えば、特公昭56-40710号公報、特公昭57-36905号公報、特公昭58-17186号公報、特公昭58-48545号公報、特公昭58-55138号公報、特公昭58-55139号公報、特公平1-28013号公報、特公平1-50219号公報、特公平3-37539号公報等の記載に従って製造することができる。
【００１７】
トラニラストの薬理学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩基との塩、モルホリン、ピペリジン、ピロリジン等の有機アミンとの塩、アミノ酸との塩を挙げることができる。
【００１８】
本発明のトラニラスト又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む医薬組成物は、製薬上許容される担体や希釈剤等を含んでいてもよい。担体としては、限定されないが、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水等が上げられる。
【００１９】
投与経路は、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内などの非経口投与が挙げられる。望ましくは経口投与である。投与形態としては、種々の形態で投与することができ、それらの形態としては、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、細粒剤、噴霧剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。
【００２０】
乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤；ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
【００２１】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤；デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
【００２２】
注射剤は、水、ショ糖、ソルビトール、キシロース、トレハロース、果糖などの糖類；マンニトール、キシリトール、ソルビトールなどの糖アルコール；リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液などの緩衝液；脂肪酸エステルなどの界面活性剤などを添加剤として用いることができる。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、さらにpH調整剤、抗酸化剤、安定化剤、保存剤、増粘剤、キレート化剤、保湿剤、着色剤、等張剤等を含んでいてもよい。
【００２４】
本発明のトラニラスト又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む医薬組成物の投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、1日約0.01mg〜50gであり、これらを1回、又は数回に分けて投与することができる。体重1kg当たりでは、１日約0.002mg〜１gである。また、非経口投与では、1回約0.01mg〜50g(体重１kg当たりでは、１日約0.002mg〜１g)を皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。
【実施例】
【００２５】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００２６】
実施例１  トラニラストの非アルコール性脂肪肝炎（NASH)動物モデルに対する効果
本発明の実施例は以下の方法により行った。
動物モデルと実験デザイン
肥満の２型糖尿病の動物モデルとして確立されている雄のOtsuka Long-Evans Tokushima Fatty（OLETF）ラット（大塚製薬、徳島、日本）を使用した。自然発症2型糖尿病OLETFラットは、生後8週間目から肥満と高インスリン血症を呈した。これらの動物は年齢に依存して肝臓での脂肪蓄積増加を示すので、NAFLDはOLETFラットを用いて研究される。OLETFグループのすべてのラットは生後24週間目に、糖尿病を発症した。
【００２７】
対照動物として、4週齢のOLETFラットと、OLETFと同じコロニー起源で、糖尿病にならないLong-Evans Tokushima Otsuka (LETO)ラットが得られ、制御された温度（25℃）、湿度と照明（12時間の人工の明暗サイクル）の下で育成された。動物は、標準的なラット食と水道水の自由な摂取が可能であった。生後24週目で、OLETFラットは2つの実験群に分けられて、以下の通りに8週間飼育された：MCDダイエット（オリエンタル酵母工業、東京、日本;OLETF-MCD、21％の脂肪、n = 11）、そして、MCD-トラニラストダイエット（OLETF-MCD-trani;トラニラスト濃度は、1％、n = 3；1.4％、n = 3；2％、n = 10）。加えて、生後24週間目で、雄のLETOラットも、2つのグループに分けられた：MCDダイエット（LETO -MCD、n = 9）とMCD-トラニラストダイエット（LETO -MCD-trani;トラニラストは、2％（n = 5））。ラットは自由飲水・自由摂食下で飼育された。ラットの各々の群の体重と食物摂取量は、毎週記録された。
【００２８】
血液サンプル採取と分析
8週後に、ラットは12時間の絶食ののち屠殺され、血液サンプルを心臓から採取した。血漿ブドウ糖は、Freestyleキッセイモニター（キッセイ医薬、松本、日本）で測定された。血液サンプルは遠心分離され、血清は血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、トリグリセリド、遊離脂肪酸（FFA）、コレステロール（TC）とHDLコレステロール（HDLC）濃度の測定のために70℃で凍結された。血清ALTは、分光測光法（シグマ、セントルイス、MO、USA）で測定された。血清FFAレベルは、非エステル型の脂肪酸（NEFA）C-テスト（和光、大阪、日本）によって測定された。TCとHDLC濃度は比色分析によって定量化された。血清インシュリンレベルは、ELISA（Mercodia、Uppsala、スウェーデン）によって測定された。
【００２９】
血漿グルコースレベル測定
8週後に、すべてのラットは、12時間の絶食の後、経口ブドウ糖負荷試験を受けた。体重1Kgあたり２ｇのブドウ糖が、経口投与された。血液は、血清グルコース濃度の測定のために、0、60、120分後に、尾静脈から採取された。
【００３０】
血清と肝の中性脂肪(以後、トリグリセリドか中性脂肪か、いずれかで統一)レベル測定
8週後に、ラットは屠殺され、肝臓重量と肝中性脂肪含有量が測定された。肝トリグリセリド含有量の定量化のために、肝臓は市販のキット（TG Ｅテスト;和光）のバッファで溶解された。
【００３１】
形態的分析と免疫組織化学
8週後に、ラットは屠殺され、肝臓は10％ホルマリン緩衝液で固定され、パラフィンに封埋された。肝組織変化の重症度は、H&E染色とAzan染色で、病理学者によって評価された。脂肪化、線維化と疾患活動性はNASHの等級づけの標準的な基準に従って半定量的に評価された。脂肪化の程度は脂肪滴を含んでいる肝細胞のパーセンテージで記録された。線維化のスコアは以下の通りだった：1、細胞周囲および静脈周囲の線維化;2、限局性の架橋線維化;3、小葉変形による架橋線維化; 4、肝硬変。疾患活動性は、腺房の炎症（得点0〜3）と門脈の炎症（得点0〜3）の得点の合計（得点0〜6）として評価された。
【００３２】
Azan染色したスライドについては、線維化領域（Azan染色により青く染色された領域）を画像分析システムを用いて顕微鏡下で計測した。
【００３３】
さらに、スライドは、単クローンマウス抗ヒトα-平滑筋アクチン（α-SMA）（ダコ、京都、日本）と抗ウサギTGF-β（サンタクルスBiotechnology、サンタクルス、CA、USA）で免疫染色された。この後に、Envisionキット（ダコ）を使用している免疫ペルオキシダーゼの塗布が続いた。ペルオキシダーゼ活性は、3',3'-diaminobenzidine（シグマ）の反応によって確認された。実験的なデザインについての事前知識のない2人の独立したオブザーバーが、各々のセクションを評価した。抗α-SMAまたは抗TGF-βによる染色は、WinROOFバージョン5.71（三谷商事、福井、日本）を使い、陽性領域の観察背景面積に対するパーセンテージとして表された。
【００３４】
リアルタイムPCR
全RNAはRNeasy Mini Kit（Qiagen、東京、日本）を利用して各々の肝臓から抽出された。リアルタイムPCRはTGF-β、α1(I)プロコラーゲン（コラーゲンI）、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター-1（PAI-1）、カルニチンO-パルミトイルトランスフェラーゼ-1（CPT-1）と、PPAR-αmRNAに対してABI Prism 7900 Sequence Detection System（アプライドバイオシステム、フォスターシティー、CA、USA）を使い実行された。コラーゲンIのためのプライマーのセットとTaqManプローブは、アプライドバイオシステム（TaqMan Gene Expression Assays製品）が所有していた。異なるサンプルのPCRで得られるDNAの量の変化をコントロールするため、目標シーケンスの遺伝子発現は、内因性コントロールである18SrRNA（TaqMan Control Reagent Kit;アプライドバイオシステム）の発現に関連して標準化された。PCR条件は50℃を2分、95℃を10分で1つのサイクルとし、50サイクルを行った。
【００３５】
統計分析
すべての結果は、平均値又はは平均値±SEMとして示される。データは一元配置分散分析法によって分析された、そして、P ＜0.05が統計学的に有意であると思われた。すべての計算は、Windows版のSPSSバージョン11.0(SPSS社、シカゴ、IL、USA)で実行された。
【００３６】
本実施例により以下の結果が得られた。
【００３７】
トラニラストは、MCDダイエットを与えられたラットでの耐用性は良好であった。
【００３８】
自然発症2型糖尿病OLETFラットは、8週間MCDダイエットを与えられた。MCDダイエットはゾーン3での激しい小葉性炎症と静脈周囲と細胞周囲の線維化を引き起こした（図１A及びB）。最も有効なトラニラストの量を確かめるために、OLETF-MCDラットを3つの濃度、1％、1.4％及び2％、それぞれ平均160、190及び320 mg kg-1day-1のトラニラストで治療した。これらは動物実験のために妥当な一日量であると報告されている。トラニラストは身体所見、便組成、食物又は水摂取量に影響を及ぼさず、そのことはトラニラストが十分使用に耐えうることを示していた。トラニラストでの治療は、MCD-OLETFラットで、用量依存的に脂肪化、炎症及び線維化の肝病理を改善した（図２A〜C）。その影響は2％のトラニラスト処置群においてより卓越していたので、このグループで以下の調査を行った。
【００３９】
代謝パラメーター 
MCDダイエットと、2％のトラニラスト含有餌を与えられたOLETFラットと、糖尿病にかかっていないコントロールのLETOラットの8週目の代謝パラメーターは表1に示される。トラニラストは、OLETF-MCDとLETO-MCDラット双方で有意に血清ALTを減少させ、肝重量を増加させた。血液中ブドウ糖とトリグリセリドは、トラニラストによる影響を受けなかった。さらに、インシュリン負荷試験では、トラニラスト治療をうけているラットでインスリン感受性の改善はきたさないことが示唆された（データは示さず）。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
トラニラストは、食餌性NASHの動物モデルで、星細胞の活性化と肝線維化の進行を妨げた。
Azan染色による組織学的分析で、2％のトラニラストでの治療がLETO-MCDとOLETF-MCDラットで劇的に肝臓線維症の発達を防ぐことが分かった（図３及び４）。図３はAzan染色の染色像を示し、図４はAzan染色により染色された領域の割合を示す。肝星細胞の活性化が肝線維化の進展で中心的な役割を演ずることが知られている。そして、星細胞の活性化に対するトラニラストの作用を調べるために、我々は星細胞活性化の指標であるα-SMAの免疫組織化学的な分析を行った。α-SMA陽性の細胞は、LETO-MCDラットと比較して有意にOLETF-MCDラットの肝臓で増加していた。トラニラストは、LETO-MCDとOLETF-MCDラット双方でこれらの細胞の数を減少させた（図５及び６）。図５は、単クローンマウス抗ヒトα-平滑筋アクチン（α-SMA）を用いた染色像を示し、図６は染色された領域の割合を示す。
【００４２】
トラニラストは、肝脂肪化の進行を防いだ。
現在まで、細胞内脂質蓄積に対するトラニラストの作用はほとんど報告されていない。しかし、組織学的分析では、予想外に、トラニラスト治療がLETO-MCDとOLETF-MCDラットで明らかに肝脂肪化を改善することが示された（図７）。組織学的調査結果と一致して、トラニラストはラットのこれらの2群で有意に肝トリグリセリド含有量を減少させた（図８）。
【００４３】
トラニラストは、食餌性のNASH動物モデルで、肝臓のTGF-β発現を抑えた。
トラニラストがラットで肝線維化を予防するメカニズムをはっきりさせるため、肝臓の線維化進行の主な調節因子であるTGF-βの発現が、リアルタイムPCRによって評価された（図９）。トラニラストでの治療は、OLETF-MCDラットの肝臓でTGF-βのmRNAの発現を抑制し、LETO-MCDラットの肝臓でもその発現を抑制する傾向があった。さらに、トラニラストは、線維化に関係するTGF-βの標的遺伝子、コラーゲンIとPAI-1の発現を抑えた（図１０及び１１）。mRNAの調査結果と一致して、免疫組織化学的な分析はトラニラスト治療を受けているラットの肝臓のTGF-βタンパク質発現の抑制を示した（図１２）。
【００４４】
トラニラストは、脂肪酸β-酸化に関係する遺伝子のmRNA発現を亢進させた。
トラニラストがラットで肝脂肪化を改善するメカニズムをはっきりさせるために、脂肪酸β-酸化に関係する遺伝子の発現が、リアルタイムPCRで測定された（図１３A及びB）。β-酸化の制御の中心となる転写因子であるPPAR-αのmRNA発現はOLETF-MCDとLETO-MCDラットの肝臓で、トラニラストによって有意に亢進していた。加えて、トラニラストは、ミトコンドリアへの脂肪酸β-酸化の律速段階酵素であるCPT-1のmRNA発現も誘導した。
【００４５】
以上の結果より以下のことが判明した。
【００４６】
線維化はNASHの病理学的生化学的な特徴としてよく知られている。線維化の進展は肝不全と門脈圧亢進の原因となり、肝臓がんの危険因子となる。したがって、肝線維化は重要なNASHの治療ターゲットであり、各種の線維化阻害薬がNASH治療薬の候補として検討されている(Gressner AM et al., J Cell Mol Med 2006;10:76-99.)。
【００４７】
本実施例により、抗線維化薬であるトラニラストが動物モデルのNASHの肝線維化を改善することがはじめて証明された。トラニラストの投与は肝星細胞の活性化を阻害し、TGF-βとその標的分子の発現を減弱させ、おそらくこの減弱が線維化を予防したものと思われる。この研究はトラニラストによる抗線維化治療がNASHに対する有益で有望なアプローチであるという証拠を提供した。
【００４８】
線維化誘導能を有する多くのメディエーターのなかで、TGF-βはもっとも強力な効果を有するとされる(Gressner AM et al., Front Biosci 2002;7:d793-d807.)。TGF-β合成やTGF-βシグナルの阻害は肝線維化を予防することが異なった実験系を用いて報告されている(George J. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:12719-12724.; Arias M. et al., BMC Gastroenterol 2003;3:29.; Qi Z. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:2345-2349.; Nakamura T. et al., Hepatology 2000;32:247-255.)。本実施例においては、トラニラストの投与が肝臓におけるTGF-β遺伝子発現とα-SMA陽性細胞の両者を減弱させることが証明されており、トラニラストはTGF-β発現を直接抑制することで肝線維化と肝障害を改善したことが推測される。この所見はトラニラスト投与がTGF-β遺伝子発現を減弱することで肝星細胞の活性化を抑制することをin vitroで証明した過去の報告と合致する(Ikeda H. et al., Biochem Biophys Res Commun 1996;227:322-327.)。加えて、トラニラストはTGF-β標的遺伝子のひとつであるPAI-1の発現をも減弱させた。PAI-1はエタノールによる肝障害に対するメトフォルミンの治療標的であることが報告された(Bergheim I et al., Gastroenterology 2006;130:2099-2112.)。したがって、トラニラストはアルコール性肝疾患に対しても有用である可能性がある。
【００４９】
肥満、2型糖尿病、脂質異常症はNASHに頻繁に合併する。インスリン抵抗性はこれらの代謝異常症の基盤となる要素であり、NAFLDの病態形成にも重要な役割を担うとされる。インスリン抵抗性改善薬がNAFLDの重症型であるNASHの病理所見を改善することが、動物モデルにおいてもヒトにおいても示されてきた(Ota T. et al, Gastroenterology 2007;132:282-293.; Belfort R et al., N Engl J Med 2006;355:2297-2307.)。本実施例における検討では、トラニラスト投与はラットのインスリン感受性には影響を与えなかった。さらに、ピオグリタゾンの作用とは異なり(Ota T. et al, Gastroenterology 2007;132:282-293.; Belfort R et al., N Engl J Med 2006;355:2297-2307.)、トラニラストはインスリン抵抗性を有さないNASHのモデルであるLETOラットに対しても有効であった。トラニラストのNASHに対する効果はインスリン抵抗性に依存しない経路を介している可能性があり、トラニラスト投与はインスリン抵抗性改善薬のノンレスポンダーに対しても有効である可能性がある。
【００５０】
本実施例において、驚いたことに、トラニラストが肝線維化のみならず肝脂肪化の進展を抑制することが見出された。トラニラストの細胞内脂肪蓄積への作用を証明した報告はなく、この発見は予想外のことであった。Realtime-PCR解析からCPT-IやPPAR-αといった脂肪酸β酸化関連遺伝子の発現がトラニラスト投与によって亢進することが明らかとなった。このことからトラニラストによって誘導されたβ酸化の増強がラットの肝脂肪化を減弱させた可能性が示唆された。
【００５１】
上記のように、本実施例により、トラニラストがラットモデルにおける非アルコール性脂肪肝炎の進展を予防すること、そしておそらくこの効果がインスリン抵抗性とは独立した経路によることが証明された。その結果、トラニラストによるTGF-βへの標的化がNASHに対する新規治療法を導くことが示唆された。
【００５２】
実施例２  トラニラストの非アルコール性脂肪肝炎（NASH)ヒト患者に対する効果
肝生検や臨床所見より、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）と診断した、高血圧及び肥満にて加療中の32才の女性患者に対して、トラニラストを用いて治療を行った。通年性鼻アレルギー症の合併があったため、トラニラスト300ｍｇ／日の投与で開始した。投与間隔は毎食後、１日３回であった。投与開始後２２ヵ月後に、肝生検を行った。投与開始時と比べて、体重（83.4→82.0kg）、血圧及び耐糖能に著変なく（図１４）、また途中の薬剤の変更もなかったにもかかわらず、肝機能（AST63→24，ALT89→30，γGTP41→18）が大きく改善しており（図１５）、さらに肝組織もNASHから脂肪肝（NAFLD class 3→2/4，Grade 2→2/3, Stage 2→1/4）へ改善していた（図１６）。また、脂肪化、マロリー体、腺房炎症、門脈域炎症及び風船様変性についても改善が認められた（図１７）。すなわち、トラニラストは，肝臓に直接作用して、肝機能を改善し、NASH病理、とりわけ肝の炎症と線維化を顕著に抑制した（図１８）。
【００５３】
従って、トラニラストはヒトNASH患者に有効であった。
【００５４】
実施例３  トラニラストの脂肪肝、食事誘発性肥満、代謝異常動物モデルに対する効果
脂肪組織において、慢性的な栄養過多によりマクロファージの浸潤が起こり、それが局所炎症につながってインスリン抵抗性を増強する可能性が推測されている。
【００５５】
そこで、トラニラストが、過栄養な肥満糖尿病モデルラットの肝臓におけるマクロファージの活性化の抑制や、インスリン抵抗性を改善させるのか検討した。
【００５６】
（１）in vitroでのマクロファージの活性化の抑制
マウス・マクロファージ系細胞株（RAW細胞）をLipopolysaccharide（LPS）にて刺激し、Real-Time RT-PCR法とELISAにて、トラニラストがマクロファージの活性化を抑制するか検討した。
【００５７】
RAW細胞を1μg/mL LPSの存在下で培養した。この際、トラニラストを30又は300μmol/Lの濃度で添加した。培養後、TNF-α、IL-6及びiNOSのmRNA発現をReal-Time RT-PCRにて測定した。
【００５８】
結果を図１９に示す。図１９に示すように、RAW細胞において、トラニラストは、LPSで上昇したマクロファージ活性化の指標であるTNF-α、IL-6及びiNOSのｍRNAの発現を抑制した。
【００５９】
また、培養RAW細胞の培地中のTNF-α及びIL-6濃度をELISAにより測定した。
【００６０】
結果を図２０に示す。図２０に示すように、RAW細胞において、トラニラストは、マクロファージ活性化の指標であるTNF-α及びIL-6の上清中の濃度を低下させた。
【００６１】
（２）in vivoでのマクロファージの活性化の抑制
以下のように、各ラットにトラニラスト（Tra)を含むか含まない食事を８週間与え、肝臓におけるマクロファージの活性化とインスリン抵抗性を検討した。
１．コントロールラット（LETOラット；25週齢）＋通常食（ＣＯＮ群）
２．肥満糖尿病モデルラット（OLETFラット；25週齢）＋高脂肪食（DM群）
３．OLETFラット＋Tra（1.6％）混餌高脂肪食（DM+Tra群）
【００６２】
図２１に25週齢のLETOラットとOLETFラットの写真を示す。また、図２２にLETOラットとOLETFラットの週齢による病態の発症の様子を示す。
【００６３】
図２３に上記のCON群、DM群及びDM+Tra群の８週間後の体重等を示す。図２３に示すように、トラニラストは、摂食量は変化させなかったが、体重を687±15から605±27ｇへ、内臓脂肪量を72±6から53±5ｇへ低下させた。また空腹時血糖値を低下させた。
【００６４】
用いたラットの肝臓を採取し、H&E染色を行った。図２４に肝臓におけるHE染色の結果を示す。図２４に示すように、トラニラストは、組織学的に肝脂肪化を抑制し、肝臓の中性脂肪含有量を減少させた。
【００６５】
また、ED-1（マクロファージマーカー）を用いた免疫染色を行った。結果を図２５に示す。図２５に示すように、トラニラストは、ED-1陽性細胞数を減少させた。
【００６６】
また、採取した肝臓を用いて、肝臓における細胞接着因子であるICAM及びVCAMのmRNA発現量をRealtime PCR法にて測定した。結果を図２６に示す。図２６に示すように、肝臓において、トラニラストは、細胞接着因子であるICAMのmRNA発現量を減少させた。
【００６７】
さらに、糖負荷試験、インスリン負荷試験を行なった。それぞれの結果を図２７及び図２８に示す。また、図２９に随時血糖値（A)、血清インスリンレベル（B)及び血糖値×インスリン値（C)を示す。トラニラストは、糖負荷時の0分、120分後の血糖値を各々141±6から102±3mg/dlへ、444±33から231±53mg/dlへと低下させた。また、空腹時の血中インスリン値を107±12から38±14μU/mlに低下させた。これらの結果より、トラニラストは、インスリン抵抗性を改善したことがわかった。
【００６８】
さらに、肝臓におけるG6PC（Glucose-6-phosphatase, catalytic subunit）とIRS1(Insulin receptor substrate-1)のmRNA発現量をRealtime PCR法にて測定した。それぞれの結果を図３０A及びBに示す。この結果は、トラニラストによるインスリン抵抗性の改善は、G6PCおよびIRS1発現への直接作用を介したものではないことを示す。
【００６９】
以上のin vitro及びin vivoでの検討により、トラニラストは、in vitroでマクロファージの活性化を抑制することがわかった。さらに、トラニラストは、肥満糖尿病ラットの体重、内臓脂肪、肝脂肪化、肝のマクロファージの浸潤及びインスリン抵抗性を抑制することがわかった。これらの結果は、トラニラストがマクロファージ活性化抑制作用を介して、メタボリックシンドロームやインスリン抵抗性を改善し得ることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】糖尿病ラット（OLETF)及び非糖尿病ラット（LETO)の肝病理（脂肪化、炎症及び線維化）におけるトラニラストの用量依存的効果を示すH&E（図１A)及びAzan染色（図１B)像を示す図（拡大倍率は×100）である。
【図２】ラットの肝病理（脂肪化、炎症及び線維化）におけるトラニラストの用量依存的効果を示す図である。
【図３】トラニラストを投与した又は非投与の糖尿病ラット（OLETF)及び非糖尿病ラット（LETO)における肝臓のAzan染色像を示す図（拡大倍率は×100）である。
【図４】トラニラストを投与した又は非投与の糖尿病ラット（OLETF)及び非糖尿病ラット（LETO)における肝臓のAzan染色領域の割合を示す図である。
【図５】トラニラストを投与した又は非投与の糖尿病ラット（OLETF)及び非糖尿病ラット（LETO)における肝臓の単クローンマウス抗ヒトα-平滑筋アクチン抗体を用いた染色像を示す図（拡大倍率は×100）である。
【図６】トラニラストを投与した又は非投与の糖尿病ラット（OLETF)及び非糖尿病ラット（LETO)における肝臓の単クローンマウス抗ヒトα-平滑筋アクチン抗体による染色領域の割合を示す図である。
【図７】トラニラストを投与した又は非投与の糖尿病ラット（OLETF)及び非糖尿病ラット（LETO)における肝臓のH&E染色像を示す図（拡大倍率は×100）である。
【図８】トラニラストを投与した又は非投与の糖尿病ラット（OLETF)及び非糖尿病ラット（LETO)における肝トリグリセリド含量を示す図である。
【図９】トラニラストを投与した又は非投与の糖尿病ラット（OLETF)及び非糖尿病ラット（LETO)における肝臓でのTGF-βのmRNA発現量を示す図である。
【図１０】トラニラストを投与した又は非投与の糖尿病ラット（OLETF)及び非糖尿病ラット（LETO)における肝臓でのコラーゲンIのmRNA発現量を示す図である。
【図１１】トラニラストを投与した又は非投与の糖尿病ラット（OLETF)及び非糖尿病ラット（LETO)における肝臓でのPAI-1のmRNA発現量を示す図である。
【図１２】トラニラストを投与した又は非投与の糖尿病ラット（OLETF)及び非糖尿病ラット（LETO)における肝臓でのTGF-β発現量を示す免疫染色像を示す図（拡大倍率は×100）である。
【図１３】トラニラストを投与した又は非投与の糖尿病ラット（OLETF)及び非糖尿病ラット（LETO)における脂肪酸β-酸化に関係する遺伝子の発現を示す図である。図１３AはPPARαのmRNA発現を示し、図１３BはCPT1のmRNA発現を示す。
【図１４】トラニラストを投与したヒトNASH患者における体重及び耐糖能の変化を示す図である。
【図１５】トラニラストを投与したヒトNASH患者における肝機能の変化を示す図である。
【図１６】トラニラストを投与したヒトNASH患者におけるNASHの改善効果を示す図である。
【図１７】トラニラストを投与したヒトNASH患者における肝臓の脂肪化、マロリー体、腺房炎症、門脈域炎症及び風船様変性の変化を示す図である。
【図１８】トラニラストを投与したヒトNASH患者における効果のまとめを示す図である。
【図１９】培養細胞におけるトラニラストによるTNF-α(A)、IL-6(B)及びiNOS(C)のmRNAの発現を示す図である。
【図２０】培養細胞におけるトラニラストによる培地中のTNF-α(A)及びIL-6(B)濃度を示す図である。
【図２１】LETOラットとOLETFラットの写真である。
【図２２】LETOラットとOLETFラットの週齢による病態の発症の様子を示す図である。
【図２３】CON群、DM群及びDM+Tra群ラットの薬剤投与後８週間後の体重等を示す図である。
【図２４】CON群(A)、DM群(B)及びDM+Tra群(C)ラットの薬剤投与後８週間後の肝臓におけるH&E染色の結果を示す写真である。
【図２５】CON群(A)、DM群(B)及びDM+Tra群(C)ラットの薬剤投与後８週間後の肝臓におけるED-1（マクロファージマーカー）を用いた免疫染色の結果を示す写真である。
【図２６】CON群、DM群及びDM+Tra群ラットの薬剤投与後８週間後の肝臓における細胞接着因子であるICAM(A)及びVCAM(B)のmRNA発現量を示す図である。
【図２７】CON群、DM群及びDM+Tra群ラットの薬剤投与後８週間後の糖負荷試験の結果を示す図である。
【図２８】CON群、DM群及びDM+Tra群ラットの薬剤投与後８週間後のインスリン負荷試験の結果を示す図である。
【図２９】CON群、DM群及びDM+Tra群ラットの薬剤投与後８週間後の随時血糖値（A)、血清インスリンレベル（B)及び血糖値×インスリン値（C)を示す図である。
【図３０】CON群、DM群及びDM+Tra群ラットの薬剤投与後８週間後の肝臓におけるG6PC（Glucose-6-phosphatase, catalytic subunit）(A)とIRS1(Insulin receptor substrate-1)(B)のmRNA発現量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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