(57)【要約】【課題】  糖尿病は、生活習慣病の１つであり、様々な合併症を引き起こすことが知られている。治療法としては、食事療法と薬物療法との組み合わせが挙げられるが、日常生活へのマイナスの影響や、副作用の問題を避けることができない。本発明の課題は、安全性が高く、かつ、優れた抗糖尿病作用を有する抗糖尿病剤を提供することである。【解決手段】  Ｌactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株又は抗糖尿病効果を有するＬactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株の変異株を有効成分とする抗糖尿病剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株又は抗糖尿病効果を有するＬactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株の変異株を有効成分とする抗糖尿病剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗糖尿病剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、生活習慣病の１つであり、様々な合併症を引き起こすことが知られている。糖尿病は、インスリンの投与により治療し得るインスリン依存型（Ｉ型）と、インスリンで治療できない非インスリン依存型（ＩＩ型）とに分けられる。糖尿病患者の９０％以上は後者であり、食事療法と薬物療法との組み合わせにより治療されている。
しかしながら前者の方法は日常生活にマイナスの影響を及ぼすことが多々見られ、また後者の方法は副作用の問題を避けることができない。
【０００３】
したがって、糖尿病を予防するために、日常的な摂取により血糖値をコントロールできるような、天然物由来の薬剤または食品が検討されている。例えば、特許文献１には、フラボノイド類（フラバン、フラバノン、フラバノール、フラボン、フラボノール、イソフラボン、カルコンを含む）が配糖体であり、酵素処理により１個から複数個のグルコースを付加した物質を含有するＩＩ型糖尿病予防用の食品が開示されている。
【０００４】
一方、乳酸菌は、整腸作用、コレステロール低下作用、血圧低下作用等を有することが知られ、下記で説明する本発明におけるＫＷ３１１０株に抗アレルギー活性を有することが知られている（特許文献２）。しかしながら、ＫＷ３１１０株に非常に優れた抗糖尿病効果があることは知られていない。
【特許文献１】特開２００４−３２３４６９号公報
【特許文献２】特許第３５８５４８７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ＫＷ３１１０株を含有するとともに、安全性が高く、かつ、優れた抗糖尿病効果を有する抗糖尿病剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、Ｌactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株又は抗糖尿病効果を有するＬactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株の変異株を有効成分とする抗糖尿病剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＫＷ３１１０株を含有するとともに、安全性が高く、かつ、優れた抗糖尿病効果を有する抗糖尿病剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の有効成分である乳酸菌は、該乳酸菌を配合して、該乳酸菌を有効成分として含有する組成物として、また、該乳酸菌に、担体、賦形剤及び／又はその他の補助剤を添加して製剤化して利用することも可能である。
本発明の抗糖尿病剤は、飲食品への利用、及び製剤化により、経口的に投与することができる。Ｌ．paracasei ＫＷ３１１０株は、消化液に対して耐性であり、腸管への付着性の高い乳酸菌であり、経口的に摂取された場合に特に優れた効果を奏する。
【０００９】
本発明において有効成分として用いるＬ．paracasei ＫＷ３１１０株は、L.casei Ｌ１４株として、日本乳業技術協会から入手することができる。またＬ．paracasei ＫＷ３１１０株は、更に、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６３４として寄託されている。
また、該菌株の変異株は、該菌株を公知の変異処理により変異し、該変異処理を施した菌株の中から、抗糖尿病効果を有する菌株を選抜することにより、容易に取得することができる。
なお、本発明において有効成分として用いるＬ．paracasei ＫＷ３１１０株と同等の効果を発揮する菌株としては、Ｌactobacillus plantarum ＫＷ４１１０株、Ｌactobacillus paracasei ＫＷ３９２５株、Ｌactobacillus paracasei ＫＷ３９２６株、又はStreptococcus salivarius ＫＷ３２１０を挙げることができる。Ｌ．plantarum ＫＷ４１１０株はＬ．plantarum ＪＣＭ１１４９株として、Ｌ．paracasei ＫＷ３９２６株はＬ．paracasei ＪＣＭ８１３２株として、ＪＣＭ（理化学研究所微生物系統保存施設）から入手することができ、更に、Ｌ．paracasei ＫＷ３９２５株はＬ．paracasei ＮＲＩＣ１９１７株として、ＮＲＩＣ（東京農業大学）から入手することができる。
【００１０】
Ｌ．paracasei ＫＷ３１１０株は、Ｍ．Ｒ．Ｓ．（de Man, Rogosa, Sharpe）培地等の当業者に知られた乳酸菌培養用培地にて適宜培養増殖させた後、生菌で或いは殺菌処理し、必要によっては凍結乾燥或いはスプレードライして粉末化し、飲食品の有効成分として使用することができる。
【００１１】
本発明では、Ｌ．paracasei ＫＷ３１１０株から生じた形質の異なる菌株を派生株として選抜し、用いることができる。
【００１２】
本発明の抗糖尿病剤は、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することにより製剤化して用いることができる。本発明の抗糖尿病剤は、経口的或いは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤とともに製剤化することができる。なお、製剤化にあたっては、本発明の抗糖尿病剤がその機能を生体内において適時的且つ効果的に発揮できるよう、即ち溶出開始時間を制御したり、苦味マスキング剤としての機能を付加したり、酸素や湿度に対する安定性を高めたりする形、例えば特許３３４９６７７記載の酵母細胞壁を主成分としたコーティング剤でコーティングされたコーティング処理物や定法に従って軟カプセルや硬カプセルによりカプセル化することで得られるかプセル剤として共に医薬製剤や健康食品等の分野で好ましく使用することができる。薬学的に許容される賦形剤や添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。
【００１３】
製剤は例えば次のようにして製造できる。すなわち、経口剤は、有効成分として、例えば賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニトール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００）を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより製造することができる。コーティング剤としては、例えばエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸・アクリル酸共重合物）などを用いることができる。
【００１４】
注射剤は、有効成分を分散剤（例えば、ツイーン（Tween）８０（アトラスパウダー社製、米国）、ＨＣＯ ６０（日光ケミカルズ製）、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖）などと共に水性溶剤（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）等の添加物を添加してもよい。
【００１５】
外用剤は、有効成分を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造することができる。例えば、上記固状の組成物は、有効成分をそのまま、あるいは賦形剤（例えば、ラクトース、マンニトール、デンプン、微結晶セルロース、白糖）、増粘剤（例えば、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体）などを添加、混合して粉状とすることにより製造できる。上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様にして製造できる。半固状の組成物は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟骨状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれもｐＨ調節剤（例えば、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウム）、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム）などを含んでいてもよい。坐剤は、有効成分を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の組成物とすることにより製造できる。該組成物に用いる油性基剤としては、高級脂肪酸のグリセリド〔例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社製）〕、中級脂肪酸〔例えば、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社製）〕、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油）が挙げられる。水性基剤としては、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールが挙げられる。また、水性ゲル基剤としては、天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体が挙げられる。
【００１６】
本発明の抗糖尿病剤は、飲食品として用いることができる。本発明の抗糖尿病剤を飲食品に配合して用いるには、その有効成分の有効量を飲食品の製造原料段階或いは製造した製品の段階等で添加、配合する。ここで「有効成分の有効量」とは、個々の飲食品において通常喫食される量を摂取した場合に、下記のような範囲で有効成分が摂取されるような含有量をいう。
【００１７】
すなわち、本発明における有効成分の飲食品への有効量の投与量または摂取量は、受容者、受容者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定できる。例えば、本発明による有効成分を医薬として経口投与する場合、成人１人当たり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重（好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重）、非経口的に投与する場合は０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重（好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重）の範囲で一日１〜３回に分けて投与することができる。本発明による有効成分と組み合わせて用いる他の作用機序を有する薬剤も、それぞれ臨床上用いられる用量を基準として適宜決定できる。本発明における有効成分の飲食品への有効量の投与量または摂取量を、乳酸菌の菌数で表示すると、１日当たりの摂取量が５×１０9個以上が好ましく、より好ましくは１日あたり１×１０10個以上、更に好ましくは５×１０10個以上を摂取することが好ましい。したがって、通常１日あたり摂取される飲食品の量に合わせて、各々の食品あたりの含有させる乳酸菌の菌数が決定される。例えば、食品（ヨーグルト）として摂取する場合に、成人１人１日当たり５０〜５００ｇの範囲、好ましくは６０〜２００ｇの範囲の摂取量となるよう本発明による有効成分を食品に配合することができる。
【００１８】
本発明においては、本発明の抗糖尿病剤の有効成分をそのまま、或いは前記のような製剤の形態で、飲食品に配合することができる。より具体的には、本発明の飲食品は、本発明の有効成分を適宜基材と配合して、そのまま飲食品として調製したもの、或いは、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を更に配合したもの、液状、半液体状若しくは固体状にしたもの、更には、一般の飲食品へ添加、配合したもの等、種々の利用形態を採ることができる。
【００１９】
従来より、乳酸菌を利用した飲食品の分野としては、その活用の態様分類としては、乳製品類、肉類、パン類、飲料、及び野菜類に大別される。これらの乳酸菌を利用した飲食品の製造における乳酸菌又はその一部として、或いは、製造した該飲食品の添加物として、本発明の抗糖尿病剤における乳酸菌を用いて、該飲食品に抗糖尿病効果を付与することができる。
【００２０】
本発明の他の実施の態様として、有効成分である乳酸菌を飲食品に添加する場合に、乳酸菌自体の発酵を必要とせず、かつ、飲食品自体の香味の保持を図る場合には、乳酸菌を例えば加熱殺菌のような処理により殺菌して用いるのが特に好ましい。また、本発明における飲食品は、他の微生物や異物の混入を防ぎ、内容物の品質を保持するために、密封容器詰飲食品の形態で製造されることが好ましい。
【００２１】
本発明における食品としては、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、或いは病者用食品として調製することができる。また、特に、食品の形態に限定されるものではなく、飲料の形態であってもよい。
【００２２】
本発明における健康食品および機能性食品としては、各種のものをあげることができるが、それらの健康食品および機能性食品の製造に関しては、通常用いられる、食品素材、食品添加物に加え、賦形剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、分散剤、保存剤、湿潤化剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化材、カプセル基剤等の補助剤を用いた飲食品製剤形態で利用することができる。該補助剤の具体的な例示をすれば、乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはその塩、アラビアガム、ポリエチレングルコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、プルラン、カラギーナン、デキストリン、還元パラチノース、ソルビトール、キシリトール、ステビア、合成甘味料、クエン酸、アスコルビン酸、酸味料、重曹、ショ糖エステル、植物硬化油脂、塩化カリウム、サフラワー油、ミツロウ、大豆レシチン、香料等が配合できる。このような健康食品、機能性食品の製造に関しては、医薬品製剤の参考書、例えば「日本薬局方解説書（製剤総則）」（廣川書店）等を参考にすることができる。
【００２３】
また、本発明における飲食品として具体的には、プリン、クッキー、クラッカー、ポテトチップス、ビスケット、パン、ケーキ、チョコレート、ドーナツ、ゼリーなどの洋菓子、煎餅、羊羹、大福、おはぎ、その他の饅頭、カステラなどの和菓子、冷菓（飴等）、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば、きしめん等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ハム、ソーセージ、ハンバーグ、コーンビーフ等の畜肉製品や、塩、胡椒、みそ、しょう油、ソース、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、甘味料、辛味料等の調味類や、明石焼き、たこ焼き、もんじゃ焼き、お好み焼き、焼きそば、焼きうどん等の鉄板焼き食品や、チーズ、ハードタイプのヨーグルト等の乳製品や、納豆、厚揚げ、豆腐、こんにゃく、団子、漬物、佃煮、餃子、シューマイ、コロッケ、サンドイッチ、ピザ、ハンバーガー、サラダ等の各種総菜や、各種粉末（ビーフ、ポーク、チキン等畜産物、海老、帆立、蜆、昆布等水産物、野菜・果実類、植物、酵母、藻類等）や、油脂類・香料類（バニラ、柑橘類、かつお等）を粉末固形化したものや、粉末飲食品（インスタントコーヒー、インスタント紅茶、インスタントミルク、インスタントスープ、味噌汁等）等の各種食品が挙げることができるが、これらに特に制限されない。
【００２４】
特に本発明による有効成分を乳製品に含有させる場合には、本発明による有効成分を生菌として乳原料に加えて菌増殖／発酵を行い、ヨーグルト等の発酵乳酸菌飲食品とすることもできる。
【００２５】
本発明の抗糖尿病剤は、特に飲料の形で用いて、毎日継続摂取することが可能である。
【００２６】
本発明における乳酸菌を飲料へ配合する場合に、乳酸菌の配合量は適宜決定することができるが、本発明における有効成分の飲食品への有効量の投与量または摂取量を、乳酸菌の菌数で表示すると、１日当たりの摂取量が５×１０9個以上が好ましく、より好ましくは１日あたり１×１０10個以上、更に好ましくは５×１０10個以上を摂取することが好ましい。したがって、通常１日あたり摂取される飲料の量に合わせて、上記指標により、各々の飲料あたりに含有させる乳酸菌の菌数が決定される。例えば、１日あたり１００ｇの飲料が摂取されるとすれば、飲料１００ｇあたり１０9個以上の菌数を添加することが好ましい。一方、乳酸菌の添加で、飲料の香味や外観を損なわない範囲を考えると、１０11個以下が好ましい。更に、５×１０10個以下がより好ましい。飲料１００ｇ当たり、１０9〜１０11個の範囲のものが特に好ましい。なお、乳酸菌の菌体数と乾燥菌体重量の関係については、例えば、Ｌ．paracasei ＫＷ３１１０株では、菌体数１０12個が乾燥菌体重量１ｇに相当する。
【００２７】
本発明における飲料としては、各種のものを挙げることができるが、例えば、アルコール飲料（ウイスキー、バーボン、スピリッツ、リキュール、ワイン、果実酒、日本酒、中国酒、焼酎、ビール、アルコール度数１％以下のノンアルコールビール、発泡酒、酎ハイ等）や非アルコール飲料（ドリンクタイプのヨーグルト、リンゴ、ミカン、ブドウ、バナナ、ナシ、ウメ、スイカ等の果汁、トマト、ニンジン、セロリ、キュウリ等の野菜汁、清涼飲料、牛乳、豆乳、コーヒー、ココア、紅茶、緑茶、麦茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、ほうじ茶、ウーロン茶、ウコン茶、プーアル茶、ルイボスティー茶、ローズ茶、キク茶、ミント茶、ジャスミン茶等の各種ハーブ茶、スポーツ飲料、ミネラルウオーター、栄養ドリンク等）の各種飲料が挙げられる。
【００２８】
本発明において、飲料を製品化するに際しては、食品衛生法に定められた方法に従って、適宜、飲料の殺菌を行うことができる。該殺菌方法としては、飲料のpHによって、パストル殺菌、ホットパック殺菌、ＵＨＴ殺菌、レトルト殺菌等を使い分けることができる。
【００２９】
更に、製品形態としては、通常飲料の製品形態に使用されている密封容器入り飲料の形態が特に好ましく、該密封容器としては、缶、ビン、ＰＥＴ、紙容器のいずれの形態でもよい。また、容量についても特に制限はないが、一般的に、消費者が日常的に飲料として摂取している量と、配合する乳酸菌の菌数と1日の必要菌数を考慮して、適宜、決定することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は下記例に制限されるものではない。
【００３１】
実施例１
Ｌactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株をＭ．Ｒ．Ｓ．（de Man, Rogosa, Sharpe）培地（ＯＸＯＩＤ）で４８時間培養したものを、滅菌水で３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。
【００３２】
実施例１
６週齢の雄性ＳＤ系ラット（１群６匹）の尾静脈にストレプトゾトシンを１回投与することにより糖尿病を惹起した。
前記ＫＷ３１１０株の投与量を５００μｇ／ｋｇとし、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与の１時間前に経口投与し、その翌日より１日１回１３日間連続経口投与した。最終投与の翌日に５０％グルコース水溶液（１０ｍｌ／ｋｇ）を経口投与し、経時的に血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を測定（ｏ−トルイジン・ホウ酸）した。
【００３３】
なお、正常対照群としてＳＴＺを投与せずに滅菌水のみを投与した群、病態対照群としてＳＴＺを投与して滅菌水を投与した群、および陽性対照群としてＳＴＺを投与してニコチン酸アミド（５０ｍｇ／ｋｇ）を投与した群を設けた。ニコチン酸アミドはＳＴＺ糖尿病モデルに対して有効であることが報告されている（新薬開発のための動物利用集成，４１９−４２２頁，Ｒ＆Ｄプランニング，１９８５年）。
【００３４】
糖尿病は糖代謝能力が低下し高血糖を呈する疾患である。本実施例においてはグルコース投与１時間後に血糖値のピークを認めるが、病態対照群では最高血糖値が３６０ｍｇ／ｄｌであり、正常対照群では最高血糖値は１６４ｍｇ／ｄｌであった。病態対照群の最高血糖値は正常対照群のそれと比較して約２倍を示し、病態対照群では糖代謝能力の低下が認められた。
【００３５】
ＫＷ３１１０株の活性は、式１により病態対照群の血糖値に対する抑制率（％）を算出した。
【００３６】
（式１）
抑制率（％）＝〔１−（ＫＷ３１１０株投与群または陽性対照群の最高血糖値−正常対照群の最高血糖値）／（病態対照群の最高血糖値−正常対照群の最高血糖値）〕×１００
【００３７】
その結果、ＫＷ３１１０株投与群の抑制率は６５．０％であった。陽性対照群の抑制率は４３．０％であった。したがって、ＫＷ３１１０株投与群は、病態対照群に比較して、優れた血糖値の低下が認められ、糖代謝能力が改善されていた。本実施例によりＫＷ３１１０株が、糖尿病の予防および治療に対して有用であることが明らかである。
【００３８】
比較例１
前記ＫＷ３１１０株をラクトバチルス・カゼイに変更したこと以外は実施例１を繰り返した。その結果、抑制率は５．０％であった。
【００３９】
実施例２
（茶系飲料の製造）
８５℃の熱水で抽出した烏龍茶、紅茶、緑茶、ほうじ茶、ジャスミン茶の抽出液に対して、茶葉使用率が０．８重量％になるように脱イオン水を追加した。その際、アスコルビン酸を０．０２５重量％になるように添加し、ついで重曹を用いて飲みやすいｐＨに調整した。さらに当該調合液１００ｇに対して、乳酸菌ＫＷ３１１０株を菌数が１．５×１０10個、３×１０10個になるように添加した後、常法通りＵＨＴ殺菌をおこない、３５０ｍｌ容ＰＥＴボトルに充填した。
【００４０】
実施例３
（ヨーグルトの製造）
乳を含む原材料（牛乳、脱脂粉乳、クリーム、砂糖液糖、安定剤、香料、水）を均一に混合し、１２８℃、１５秒の加熱殺菌を行い、４０℃以下まで冷却後、乳酸菌スターターＫＷ３１１０を添加し、３７℃に維持した発酵タンクで発酵を開始した。乳酸菌ＫＷ３１１０が混合液中の乳糖を分解し乳酸が生成して、約１８時間でｐＨ４．６となり、乳タンパク質の等電点凝集により、ゲル化が安定した時点で撹拌冷却した。撹拌によりペースト状になったヨーグルトを紙容器に充填、密封し、１０℃以下の冷蔵庫で冷却保管した。冷却後、官能検査により、ヨーグルトとして適正な食味と物性を有することを確認した。