(57)【要約】【課題】  シリカ被覆Fe微粒子(高磁化磁気ビーズ)を用いる全血からの核酸抽出において、全血に含まれる蛋白質による抽出阻害を低減するための方法を提供する。【解決手段】  金属Ｆｅのコアとシリカ被膜を備える高磁化磁気ビーズと溶解結合液を用いて、血液試料から核酸を抽出するための前処理方法において、前記溶解結合液に蛋白質可溶化剤を添加した後に、蛋白質分解酵素を添加することを特徴とする核酸抽出方法。前記溶解結合液として、界面活性剤及びアルカリ金属塩を添加した水溶液を用い、カオトロピック剤の存在下で蛋白質分解酵素を加える。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属Ｆｅのコアとシリカ被膜を備える高磁化磁気ビーズと溶解結合液を用いて、血液試料から核酸を抽出するための前処理方法において、前記溶解結合液に蛋白質可溶化剤を添加した後に、蛋白質分解酵素を添加することを特徴とする高磁化磁気ビーズを用いる血液試料からの核酸抽出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸抽出方法において、前記高磁化磁気ビーズの５０％粒径［体積基準のメディアン径（ｄ５０）］が０．１〜１０μｍであり、前記シリカ被膜中にアルミニウムを１〜５原子％含有する（アルミニウムとシリコンの和を１００原子％とする。）ことを特徴とする高磁化磁気ビーズを用いる血液試料からの核酸抽出方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の核酸抽出方法において、前記溶解結合液として、界面活性剤及びアルカリ金属塩を添加した水溶液を用いることにより、白血球の細胞膜を破壊し、細胞核を遊離させ、さらにカオトロピック剤の存在下で蛋白質分解酵素を加えることによって核膜と核蛋白を破壊することにより核酸を遊離し、前記シリカ被膜に吸着させることを特徴とする高磁化磁気ビーズを用いる血液試料からの核酸抽出方法。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸抽出方法において、前記溶解結合液に、蛋白質の可溶化を補強するために多糖類を添加することを特徴とする高磁化磁気ビーズを用いる血液試料からの核酸抽出方法。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸抽出方法において、前記多糖類として、デキストランを用いることを特徴とする高磁化磁気ビーズを用いる血液試料からの核酸抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気ビーズを用いた核酸抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療用磁気ビーズは感染症、癌、遺伝子疾患の診断のための遺伝子検査等に用いられ、年々需要が拡大している。ビーズ表面に対象生体物質を吸着させ、永久磁石との組合せにより核酸を分離捕集できるため、核酸抽出の自動化が可能である。従来行われてきたフェノール／クロロホルム抽出技術と比較して、核酸の自動抽出装置による自動化により、大量の検体の迅速な処理が可能となることで、病原菌の発見を早めたり、伝染病の流行を防いだり、癌の早期診断や病気のモニタリングに使用するなどして、将来多くの医療機関で必要不可欠なものとなっていく可能性が高い。検査する側にとっても、有機溶剤を使用しないため安全であるばかりでなく、自動化のため病原となる細菌やウィルスの感染を防ぎ、また煩雑な操作による実験誤差を低減でき、安全性・コスト・精度全ての面で利点を持つ。
【０００３】
医療用磁気ビーズの例として、超常磁性金属酸化物を用いたものが多い（特許文献１、特許文献２）。超常磁性とは、外部磁場が印加された時のみ強磁性を示す性質であり、特に自動装置に適用する場合、溶液中での磁気ビーズの再分散性を得るために役立つ。しかし、これらの磁気ビーズのコアにフェライトやマグネタイトなどの酸化物が用いられているため、磁化が低く、磁気ビーズの取りこぼし等のため対象物質の抽出性能に影響する。また磁化が低い場合は、抽出操作の高速化が困難になる。特に血液検体量が多い場合、あるいは検体の粘性が高い場合には、磁気ビーズの回収がより困難になる。
【０００４】
以上のように医療用磁気ビーズの特性として、磁気ビーズの分散性のみならず高い磁気特性も求められる。この問題を解決するために高磁化を有する被覆金属微粒子を用いた磁気ビーズが提案されている（例えば、特許文献３）。この磁気ビーズは、粒子径を１μｍ以下に微細化しても金属粒子が大気中で酸化反応を起さないための工夫が施され、高塩濃度溶液中での耐食性にも優れる。
【０００５】
医療用磁気ビーズの表面がシリカで被覆されている場合、血液検体から核酸を抽出する際、検体に含まれる夾雑物が磁気ビーズの周りに付着し核酸の吸着を妨げる傾向がある。血液がガラスなどの陰性荷電を持つ表面と接すると血液の凝固が起こることはよく知られている（例えば、非特許文献１）。このような血液の凝固は、血漿蛋白質の吸着とそれに続く血小板の活性化が原因になると言われている。
【０００６】
血漿蛋白質の吸着が磁気ビーズの表面で起こる場合は、特に高塩濃度条件で蛋白質あるいはその他の夾雑物の疎水性相互作用により磁気ビーズの凝集を招き、分散性を著しく貶める。そして、核酸抽出に用いられる表面積が減少し抽出能が著しく低下する。同時に、磁気ビーズの表面に吸着させた核酸を洗浄する段階で、洗浄効率が下がるため、核酸の純度も低下する。
【０００７】
血液検体から核酸を抽出する方法として、一般的にカオトロピック塩の存在下でのガラス粒子あるいはシリカ粒子への核酸の吸着は公知（非特許文献２）であり、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、あるいはチオシアン酸グアニジンなどの高濃度のカオトロピック塩溶液の細胞溶解とＤＮＡ分解酵素阻害作用を利用する。ＤＮＡ吸着後に７０％エタノール水で蛋白質や塩などの洗浄を行うが、実際この方法では回収率は低い（５０％以下）。
【０００８】
そこで、カオトロピック塩によるシリカ表面の抽出効率を向上すべく数々の提案がなされている。例えば、カオトロピック塩溶液にある種の極性有機溶媒を添加することによって核酸の回収率を向上させるもの（特許文献４）、また、血液の溶解工程後に白血球を含む分画を遠心分離してから核酸抽出を行うもの（特許文献５、特許文献６）などである。
【０００９】
また、特許文献７あるいは特許文献８は、抽出試薬の共沈剤としてデキストランを添加しているが、固相を利用するしないに関わらず、これは核酸の吸着あるいは沈殿を促進させるために用いられている。
【００１０】
【特許文献１】特表２０００−５１６０９１号公報
【特許文献２】特開２００４−９７１５９号公報
【特許文献３】特開２００６−９７１２３号公報
【特許文献４】特開２００５−１１８０４１号公報
【特許文献５】特開平６−２０５６７６号公報
【特許文献６】特開２００４−７３１９３号公報
【特許文献７】特開平７−２３６４９９号公報
【特許文献８】特開２００６−１９７９４１号公報
【非特許文献１】J.Margolis,”Activation of plasma by contact with glass: Evidence for a common reaction which releases plasma kinin and initiates coagulation.”,J.Physiol.,(1958),144:1-22.
【非特許文献２】R.Boom,”Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids”,J.Clin.Microbiol.,(1990),Vol.28,No.3,p.495-503.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上のように、血液検体から核酸を抽出する場合には、蛋白質などの夾雑物の影響を避け難く、シリカが核酸のみならず夾雑物も吸着し得るという非特異吸着性を持つことによって、条件によっては良い抽出効率が得られない。特に高磁化磁気ビーズを使用する場合は、外部磁場の印加により磁気ビーズの凝集が起こり易いという問題が加わるため、抽出条件によってはこの非特異吸着性が原因で磁気ビーズの非可逆的凝集が起こり、核酸抽出能に著しい悪影響を及ぼす可能性がある。
【００１２】
特許文献１には溶解液を添加した後にプロテアーゼを添加することが開示されているが、高磁化磁気ビーズの凝集を緩和する方法は示唆されていない。
【００１３】
特許文献２には核酸結合用磁性担体として被覆層に珪素及びアルミニウムの酸化物（アルミニウムは０．１〜３９原子パーセント相当含有）が開示されている。アルミニウムは被覆用化合物の液媒体中での流動性を向上させ、被着均一性を上げるために添加している。したがって、高磁化磁気ビーズの凝集を緩和する方法等は開示されていない。
【００１４】
特許文献３には、高磁化磁気ビーズが開示されている。しかし、溶解液とプロテアーゼを添加する方法は開示されていない。
【００１５】
特許文献４は磁性ガラス粒子を用いる。溶解液とプロテアーゼを同時に添加することは示唆されているが、高磁化磁気ビーズの凝集を緩和する方法は開示されていない。
【００１６】
特許文献５は磁気ビーズを用いない手法である。溶解液を添加し、遠心分離工程を行った後にプロテアーゼを添加するが、高磁化磁気ビーズの凝集を緩和する方法は開示されていない。
【００１７】
特許文献６には、ポリスチレンと酸化鉄からなる表面がポリスチレンで覆われた磁気ビーズが開示されている。溶解液とプロテアーゼの添加については、同時添加、後添加、前添加のいずれでも可能であるが、差異は認められない。添加順序によって高磁化磁気ビーズの凝集を緩和することは開示されていない。
【００１８】
特許文献７，８，非特許文献１，２には、溶解液とプロテアーゼの添加順序によって高磁化磁気ビーズの凝集を緩和することは開示されていない。
【００１９】
そこで本発明では、血液検体からの核酸抽出において、夾雑物の影響を抑制し、高い飽和磁化を持ちシリカ被覆を有する高磁化磁気ビーズの凝集を防ぎ、高純度および高収率の核酸抽出ができる核酸抽出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の高磁化磁気ビーズを用いる血液試料からの核酸抽出方法は、金属Ｆｅのコアとシリカ被膜を備える高磁化磁気ビーズと溶解結合液を用いて、血液試料から核酸を抽出するための前処理方法において、前記溶解結合液に蛋白質可溶化剤を添加した後に、蛋白質分解酵素を添加することを特徴とする。
ここで、血液試料とは、例えば全血又は血液分画を指す。溶解結合液は、溶解液（Ｌｙｓｉｓ）にカオトロピック剤を添加したものである。例えばｐＨ７〜７．５の緩衝溶液（バッファー）に、アルカリ金属塩と界面活性剤とカオトロピック剤を添加する。“溶解”は核酸を取り出すことに相当し、“結合”は核酸を磁気ビーズに付けることに相当する。
前処理とは、磁気ビーズに核酸を吸着させる前の段階のプロセスを指す。より好ましくは、前記溶解結合液に蛋白質可溶化剤を添加し反応させた後に蛋白質分解酵素を添加する。蛋白質分解酵素としては、例えば、プロティナーゼＫ、プロナーゼ、トリプシン、スブチリシンなどが挙げられる。
蛋白質分解酵素を先に入れてしまうと、分解生成物が磁気ビーズ表面に吸着して核酸の抽出を妨げたり、ＤＮＡ純度を低下させたりする。蛋白質可溶化剤との反応時間を十分に長くすることによって、核酸回収量を向上させる。蛋白質と蛋白質可溶化剤の可溶化の反応は、例えば、反応時間が１０分であれば十分に達せられる。
【００２１】
前記高磁化磁気ビーズの５０％粒径は０．１〜１０μｍの範囲内であり、前記シリカ被膜中にアルミニウムを１〜５原子％含有する（アルミニウム原子とシリコン原子の和を１００原子％とする。）ことが望ましい。好ましくは前記高磁化磁気ビーズの５０％粒径は１〜１０μｍであり、特に５〜８μｍの範囲内がよい。
高磁化磁気ビーズ（飽和磁化の高い磁気ビーズ）は金属鉄のコアが酸化チタン被膜で被覆され、前記酸化チタン被膜を更にシリカ被膜（最外被覆層）で被覆する構成であると高い耐食性を得られるのでより好ましい。最外被覆層に含有するシリコン（Ｓｉ）とアルミニウム（Ａｌ）の原子比は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）により測定することができる。Ｘ線光電子分光法は、高磁化磁気ビーズのごく表面のみのエネルギースペクトルを検出できるため、例えば数１０〜数１００ｎｍ程度の厚さ（膜厚）を有する最外被覆層の組成を測定するのに好適である。
【００２２】
前記溶解結合液として、界面活性剤及びアルカリ金属塩を水溶液（またはｐＨ７〜７．５の緩衝溶液）に添加したものを用いることにより、白血球の細胞膜を破壊し、細胞核を遊離させ、さらにカオトロピック剤の存在下で蛋白質分解酵素を加えることによって核膜と核蛋白を破壊することにより核酸を遊離し、前記シリカ被膜に吸着させることを特徴とする。カオトロピック剤は飽和に近い状態で添加されている。
【００２３】
上記核酸抽出方法において、前記界面活性剤としては、５〜１５容量％の非イオン性界面活性剤を用い、アルカリ金属塩としては、１〜１０Ｍのアルカリ金属塩或いは１〜７Ｍのチオシアン酸アルカリ塩を用い、緩衝液によりｐＨ６〜８の範囲内に溶解結合液を調整することを特徴とする。なお、界面活性剤とアルカリ金属塩は同時に使用するが、カオトロピック剤を混合した状態でも使用可能である。
【００２４】
前記カオトロピック剤として、尿素、ヨウ化アルカリ、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸のアルカリ金属塩、トリフルオロ酢酸のアルカリ金属塩、トリクロロ酢酸のアルカリ金属塩、及びチオシアン酸のアルカリ金属塩から選ばれる少なくとも１種を使用することが好ましい。
【００２５】
前記血液検体を前記界面活性剤、前記アルカリ金属塩および前記カオトロピック剤と反応させた状態で１５〜４０℃（好ましくは２０〜２５℃）に保持しつつ、前記蛋白質分解酵素を核蛋白で覆われた核酸に作用させることが望ましい。
【００２６】
上記核酸抽出方法において、前記溶解結合液は、界面活性剤、アルカリ金属塩、カオトロピック剤及び緩衝溶液以外に、蛋白質の可溶化を補強するために多糖類を添加することを特徴とする。これによって核酸回収量をさらに向上させることができる。さらに、前記多糖類としてデキストランが好ましい。より詳細には、分子量６〜９万のデキストランを前記血液検体１００μＬに対して０．５〜１ｍｇの割合で添加するとよい。
【００２７】
上記核酸抽出方法において、高磁化磁気ビーズをｐＨ６〜８の緩衝溶液あるいは極性有機溶媒（例えば低級アルコール）に予め分散させることによって核酸回収量をさらに向上させることができる。また、前記高磁化磁気ビーズの分散媒として、好ましくは蛋白質の可溶化を補強しうるイソプロピルアルコールを使用する。
【００２８】
前記血液検体として、哺乳類一般の血液に適応できるが、特にヒト全血を対象とした場合に効果が顕著に認められる。また、血液検体の保存時間が、室温の場合１日まで、冷凍の場合３ヶ月程度までのものを対象とする。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の核酸抽出方法によれば、血液検体から核酸抽出する際に蛋白質などの夾雑物の影響を軽減することが可能となり、高磁化磁気ビーズ凝集を防ぐことができる。結果として、自動抽出装置に求められる特性、即ち高純度および高収率の核酸抽出能と磁気ビーズの高い回収速度を同時に実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
発明者等は上記課題を解決すべく、（１）表面性状、（２）抽出試薬、（３）抽出工程および（４）粒径の観点から鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
本発明の高磁化磁気ビーズを用いる全血からの核酸抽出方法は、所謂Ｂｏｏｍ法（非特許文献２）を基本としながら、シリカ被膜表面への蛋白質の吸着を低減する為の方法を加えたことを主な特徴とする。そのためにはまず核酸抽出を阻害する蛋白質の影響を受け難い表面を探索し、次に、蛋白質の表面への吸着性を減少させるために蛋白質可溶化剤を選択し、抽出試薬に添加した。更に発明者等は、特に蛋白質分解工程の条件によって抽出阻害の原因となる蛋白質の分解生成物量が変動することを見出し、上記工程と溶解工程との順序の影響をしらべ、最適化を行った。最後に、比重の大きい鉄をコアとする高磁化磁気ビーズの分散性を考慮した上で、核酸の回収量及び純度に著しく影響する洗浄効率を上げるために最適な粒径を見出した。以下、本発明について具体的に説明する。
【００３１】
本発明の核酸抽出方法では、ヒトあるいは他の哺乳類一般の血液（１００μＬから１ｍＬ）について使用可能である。容積単位リットルをＬで示す。以下、抽出操作フローに従って、基本となる１００μＬヒト全血からの核酸抽出工程について説明する。次の段落の抽出操作フロー中の“←”は添加を意味する。Ｂ／Ｆ分離とは、シリカ被膜への吸着物質と非吸着物質の分離を表わす。
【００３２】
全血（あるいは血液分画）試料
|←  溶解結合液………………………………………（生体試料の溶解)
|←  蛋白質分解酵素……………………………（核膜と核蛋白の破壊）
|←  高磁化磁気ビーズ………………………………………（核酸吸着）
|  Ｂ／Ｆ分離
|←  洗浄液………………………………………（非特異吸着物の除去)
|  Ｂ／Ｆ分離
|←  ７０％エタノール………………………（カオトロピック塩除去)
|  Ｂ／Ｆ分離
|←  溶出液……………………………（核酸の磁気ビーズからの溶離)
|  Ｂ／Ｆ分離
上清回収
【００３３】
［基本抽出方法］
（１）磁気ビーズを８０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにイソプロピルアルコールに分散させる。
（２）蛋白質分解酵素（２５ｍｇ：凍結乾燥粉）に溶出液５ｍＬを添加し溶解させ、蛋白質分解酵素溶液を用意する。
（３）２ｍＬマイクロチューブに全血を１００μＬずつ入れ、これにカオトロピック剤を含む溶解結合液３００μＬを添加し、ボルテックスミキサー（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製、Ｖｏｌｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ２）で１０秒間撹拌する。
（４）蛋白質分解酵素溶液を１００μＬ添加し、撹拌機（アズワン製、シェイキングインキュベーターＳＩ−３００）で３分間、１２００ｒｐｍ、室温で撹拌する。
（５）磁気ビーズ分散液を１５０μＬ添加し、前記撹拌機を用い、室温で１０分間撹拌（１２００ｒｐｍ）することによってＤＮＡをシリカ（磁気ビーズの表面）へ吸着させる。
（６）上澄を磁気分離し、磁気ビーズに洗浄液（５Ｍグアニジン塩酸塩等のカオトロピック剤，３８重量％エタノール含有）８５０μＬを加え、５秒間ボルテックスミキサーで撹拌する。
（７）上澄を磁気分離し、磁気ビーズに７０〜８０容量％エタノール水（好ましくは８０容量％，ｐＨ７．５，０．０２ＭのＮａＣｌ含有）４５０μＬを加え、５秒間ボルテックスミキサーで撹拌する。この洗浄を２回繰り返す。
（８）上澄を磁気分離し、溶出液（ｐＨ８〜８．５，０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ含有）を１００μＬ加え６０℃で保温しておいた前記撹拌機で８分間撹拌（１２００ｒｐｍ）することにより磁気ビーズからＤＮＡを脱離させ、上澄を磁気分離し回収する。
【００３４】
血液試料から抽出した核酸の回収量を測定する方法（後述する図２で使用した２つの方法）をＤＮＡの場合について説明する。
（ＵＶ法：紫外部吸光光度分析）
ＤＮＡを構成する塩基は２６０ｎｍ付近に極大吸収を持つため、抽出液の吸光度を測定することによりＤＮＡ量を定量することができる。２６０ｎｍにおけるＤＮＡの吸光係数から、抽出液中のＤＮＡの濃度を算出し回収量を求めることができる。また、ＤＮＡの抽出工程においては、抽出液中に含まれるタンパク質等のＤＮＡ以外の物質（不純物）が少ないことが要求される。抽出液中のＤＮＡの純度は、タンパク質は２８０ｎｍ付近に強い吸収を持つことから、ＤＮＡの２６０ｎｍにおける吸収（ＯＤ２６０ｎｍ）とタンパク質の２８０ｎｍ（ＯＥ２８０ｎｍ）における吸収との比（ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ）によって求められる。
（蛍光法：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）
ＤＮＡを含む抽出液中に２６０ｎｍ近傍の広い範囲で吸光ピークを有するような試薬が混入し、吸光度測定法では正確なDNAの濃度を求めることができない場合には、核酸を選択的に染色することができる蛍光試薬で核酸を染色し、その蛍光強度を測定することで核酸の濃度を求めることができる。
【００３５】
特許文献３に開示された金属Ｆｅをコアとするシリカで被覆された高磁化磁気ビーズは、市販のシリカ被覆酸化鉄微粒子｛例：飽和磁化５５．１×１０−６Ｗｂ・ｍ／ｋｇ（即ち４３．７ｅｍｕ／ｇ），保磁力１１．５ｋＡ／ｍ（即ち１４４．１Ｏｅ）｝と比較して、非常に優れた磁気特性｛例：飽和磁化１４１．１×１０−６Ｗｂ・ｍ／ｋｇ（即ち１１２ｅｍｕ／ｇ），保磁力１．７ｋＡ／ｍ（即ち２１．７Ｏｅ）｝を持つ。即ち自動核酸抽出装置に適用するために必要な、磁気ビーズを磁場から離した時の再分散性と磁場を印加した時の磁気捕集速度が大きいという特性を持つことが分かる。
【００３６】
一方、全血から核酸を抽出する場合、磁気ビーズの粒径あるいは形状によっては不都合な結果を導く場合があるので、注意が必要である。例えば、磁気ビーズ表面に吸着した長鎖のゲノムＤＮＡは、複数の磁気ビーズに吸着すると考えられる（非特許文献２）ため、吸着したＤＮＡがせん断を受ける可能性がある。
【００３７】
上記のゲノムＤＮＡのせん断は標的塩基配列の破壊の程度によっては、抽出したＤＮＡの遺伝子検査で結果を大幅に変えてしまう可能性があるので、本発明で使用した高磁化磁気ビーズについて、ＰＣＲ性能を確認する必要がある。よって、市販の血液凝固第５因子異変検出用ＰＣＲキットや高血圧症関連ＡＣＥ遺伝子検出用ＰＣＲキット(何れもＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製)等で確認試験を行ったところ、増幅効率や増幅産物量、Ｃｔ値などに関して全く問題の無い事を確認した。
【００３８】
一方、発明者等は、全血あるいは血漿を含む血液試料において特に核酸回収量の測定値が変動し易いことに気づき、フィブリン、アルブミン、ヘモグロビンなどの成分混入量が核酸回収量に影響すること（蛋白質による核酸抽出阻害）を見出した。
【００３９】
蛋白質非特異吸着性を減らすための表面性状の改質法として、一般的には親水性を高めることが推奨されている。そのためには表面にポリエチレングリコールや糖アルコール、ポリビニルアルコールのような親水性高分子あるいはゼラチンのような保護コロイドを作る蛋白質を結合させることが行われている。
【００４０】
ところがＢｏｏｍ法に基づく核酸抽出において、シリカの核酸吸着性能を維持するためには表面シラノール基を隠蔽することは好ましくないと考えられる。このような観点から、まず抽出試薬の検討を行った。そして、高塩濃度溶液中の蛋白質の親水性を高めるという意味で、溶解結合液に蛋白質可溶化剤を添加することでその効果を見出した。
【００４１】
上記蛋白質可溶化剤として、グリコーゲン、デキストラン、アルギン酸塩のような多糖類を添加した。これによって、蛋白質の疎水基を保護し、高塩濃度溶液中での蛋白質の疎水相互作用を低減させることによって、凝集や表面への吸着性を緩和した。
【００４２】
特許文献６にはデキストランが添加剤として挙げられているが、本発明の抽出工程とは全く異なる場合に用いられており、血液を溶血後遠心分離し、白血球のみ採取した後にこれらの添加剤を入れている。従って少なくとも赤血球由来のヘモグロビンや血漿由来のフィブリン、アルブミンなどはすでに除かれており、本発明のようにこれらの可溶化のためには用いられていない。
【００４３】
蛋白質可溶化剤として、他にＴｒｉｔｏｎＸ−１００，ＮＰ−４０あるいはＴｗｅｅｎ２０のような非イオン性界面活性剤も役割を果たす。蛋白質可溶化剤を添加した溶媒を１００容量％としたときに、蛋白質可溶化剤が５容量％以下の場合は可溶化が不十分になり１５容量％以上の場合には界面活性剤が沈殿する。
【００４４】
蛋白質可溶化剤として、ここで溶解結合液中の尿素、ヨウ化アルカリ、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸のアルカリ金属塩、トリフルオロ酢酸のアルカリ金属塩、トリクロロ酢酸のアルカリ金属塩、及びチオシアン酸のアルカリ金属塩などのカオトロピック剤がその主要な役割を果たしていることは明らかである。
【００４５】
次に抽出工程の中で、発明者等は血液検体の前処理の段階で、蛋白質分解酵素を溶解結合液を入れる前に添加して蛋白質分解を行うと、反応時間を長くすれば長くするほど蛋白質阻害が大きくなることを見出した。この問題を解決するために、血液検体にまず溶解結合液を添加し、よく撹拌した後に蛋白質分解酵素を入れたところ、核酸抽出能の阻害が少なくなった。このことから、蛋白質分解酵素による分解を受けた蛋白質が凝集する前に、予め血液検体をカオトロピック塩および上記蛋白質可溶化剤と混和しておくことによって、親水化され分散し易くなり、シリカ表面への吸着が緩和されるものと考えられる。
【００４６】
ここで、蛋白質分解酵素を作用させる前に溶解結合液あるいは溶解液を添加する例は、特許文献５で示されているが、ＤＮＡ抽出はアルコールによる沈殿を基本としており、磁気ビーズはもとより固相すら用いられていない。
【００４７】
他に、特許文献６では順序として同時・前・後すべて可という記述があり、また特許文献１の実施例には蛋白質分解酵素を添加する前に溶解液と反応させるものがあるが、これらの特許には本発明で配慮する蛋白質分解酵素の使用順序の影響について特に何も記載されていない。
【００４８】
磁気ビーズの非特異吸着に対するもう１つの対策法として、磁気ビーズの核酸吸着に寄与すると考えられる表面シラノール基を残したままシリカ表面を改質する検討を行った。そして、シリカ被覆層にアルミニウムを１〜５原子パーセント添加したところ、蛋白質吸着性を緩和できることが明らかになった。
【００４９】
ここで、特許文献２は、核酸結合用磁性担体として被覆層に珪素及びアルミニウムの酸化物（アルミニウムは０．１〜３９原子パーセント相当含有）を開示しているが、アルミニウムは被覆用化合物の液媒体中での流動性を向上させ、被着均一性を上げるために添加しているので、本発明の観点とは異なる。
【００５０】
最後に夾雑物による磁気ビーズの凝集が起こり難い条件の探索として、シリカ被覆微粒子の粒径の影響を調べた。その結果、５０％粒径［体積基準のメディアン径（ｄ５０）］が０．１〜１０μｍ、好ましくは１〜１０μｍ、特に好ましくは５〜８μｍであることがわかった。５０％粒径が３μｍ以下である場合は、核酸がより多くの磁気ビーズに吸着し互いに絡まりあうために、また、粒間の溶媒の表面張力を考慮した場合にも粒子間隙に残る塩あるいは蛋白質などの洗浄が難しくなっていくと考えられる。また、５０％粒径が１０μｍを超える場合は、比重が大きくなりすぎて抽出操作時の磁気ビーズの撹拌が困難になる。
【００５１】
５０％粒径は、金属微粒子の試料粉末を溶媒中に分散させて、レーザー回折・散乱法により測定した粒度分布から求めることができる。粒度分布の測定結果から得られた積算分布曲線において、５０％の積算値における粒子径が５０％粒径（ｄ５０）である。５０％粒径は一般にメディアン径とも言われている。粒径が５００ｎｍ以下と小さい場合は、試料を透過型電子顕微鏡又は走査型電子顕微鏡で観察し、その粒度分布から５０％粒径を求めることができる。電子顕微鏡を用いる方法では、５０個以上の粒子を測定するのが望ましい。個々の粒子の粒径（直径）とは、被覆層を有する微粒子の外径に相当するが、投影面が円形でない場合には最大長さと最小長さの平均値をその微粒子の粒径と見なす。
【００５２】
以上、高磁化磁気ビーズを血液検体からの撹拌抽出に用いる場合、前記諸々の条件を同時に満たすことによって十分な性能を発現させることが可能となる。
【００５３】
以下、本発明に関わる実施例を詳細に説明する。ただし、これら実施例によって必ずしも本発明が限定されるわけではない。ここで、参照用として用いられる市販品は上述の低磁化の磁気ビーズと同じものである。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
λＤＮＡを用いたＰＣＲ阻害度の測定
図１に磁気ビーズの粒径とＰＣＲ阻害の関係を示す。太線（実線）：市販の核酸抽出用磁気ビーズ、細線（実線）：高磁化磁気ビーズ８μｍ、太破線：高磁化磁気ビーズ４．５μｍという関係にある。ヒト全血１００μＬから上記の方法で核酸を抽出し、λＤＮＡのＰＣＲ反応液中に一定量抽出液を添加する。同時にヒトＤＮＡの増幅の起こらない条件のもとλＤＮＡのＰＣＲを行うというものである。λＤＮＡ量を同一にし一定量の抽出液を入れることによって、阻害成分の量がλＤＮＡの増幅曲線に直接影響する。図は市販の磁気ビーズ（１０μｍ）、高磁化磁気ビーズ８μｍ材、及び同４．５μｍ材によって抽出された核酸について、ＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標））を用いて測定したλＤＮＡ１ｎｇの増幅曲線を比較したものである。その結果、８μｍ材は市販の磁気ビーズと同等以上のＰＣＲ性能を示し、４．５μｍ材と比較してＰＣＲ阻害物質の高い洗浄効率を持つことがわかる。なお、高磁化磁気ビーズ８μｍ材は、ＦｅからなるコアをＴｉＯ２で被覆した微粒子をさらにシリカで被覆してなる磁気ビーズであり、５０％粒径が８μｍのものである。高磁化磁気ビーズ４．５μｍは、５０％粒径が４．５μｍのものである。
【００５５】
（実施例２）
ヒト全血１００μＬからの核酸抽出能
図２に蛋白質分解酵素と溶解結合液添加順序の核酸抽出能への影響(核酸回収量)を示す。Ｌ１，Ｌ２とＷ１，Ｗ２はそれぞれ溶解結合液と洗浄液の成分が異なることを示す。図３に蛋白質分解酵素と溶解結合液添加順序の核酸抽出能への影響（核酸純度）を示す。Ｌ１，Ｌ２とＷ１，Ｗ２はそれぞれ溶解結合液と洗浄液の成分が異なることを示す。ヒト全血１００μＬから上記の基本抽出方法で高磁化Ａｌ添加材（５原子％）、高磁化磁気ビーズ８μｍ材及び市販の磁気ビーズにより核酸抽出を行った。溶解結合液、洗浄液ともそれぞれ２種類の成分のものを使用した。蛋白質分解酵素と溶解結合液の添加順序を変え、それぞれ１０分間反応させた後、もう一方を添加した。その結果、どの磁気ビーズについても溶解結合液を先に添加した方が、ＤＮＡ回収量・ＤＮＡ純度とも高いことが分かった。なお、高磁化Ａｌ添加材はシリカ被膜にアルミニウムを５原子％含有する点以外は、高磁化磁気ビーズ８μｍ材と同等の磁気ビーズである。
【００５６】
（実施例３）
ヒト全血１００μＬからの核酸抽出能
図４には溶解結合液への糖添加効果（核酸回収量）を示す。図５には溶解結合液への糖添加効果（核酸純度）を示す。ヒト全血１００μＬから上記の基本抽出方法で高磁化Ａｌ添加材（５原子％）、高磁化磁気ビーズ８μｍ材及び市販の磁気ビーズにより核酸抽出を行った。最も効果の高い、溶解結合液３００μＬにデキストラン（分子量６万−９万）１ｍｇを添加した場合について比較した。その結果、本発明で用いる高磁化磁気ビーズ（アルミニウム添加の有無に関わらず）はデキストラン添加効果があることが分かった。
【００５７】
（実施例４）
ヘモグロビンによるλＤＮＡの抽出阻害
図６にヘモグロビン添加量とＤＮＡ回収量の相関を示す。２．５μｇλＤＮＡにヘモグロビンを添加すると、上記の基本抽出方法でＤＮＡ抽出阻害があることが分かった。ところが、高磁化Ａｌ添加材（５原子％）では１ｍｇまでその影響がみられなかった。従って、高磁化Ａｌ添加材へはへモグロビンが吸着し難いことが考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】磁気ビーズの粒径とＰＣＲ阻害の関係を示すグラフである。
【図２】蛋白質分解酵素と溶解結合液添加順序の核酸抽出能への影響を示すグラフである。
【図３】蛋白質分解酵素と溶解結合液添加順序の核酸抽出能への影響を示すグラフである。
【図４】溶解結合液への糖添加効果を示すグラフである。
【図５】溶解結合液への糖添加効果を示すグラフである。
【図６】ヘモグロビン添加量とＤＮＡ回収量の相関を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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