(57)【要約】【課題】スルホ基を有する化合物もしくはスルホ基を付加可能な化合物をカラム担体に固定化する方法を提供する。【解決手段】前記化合物中のスルホ基と結合を形成可能なスルホ基結合基と、前記カラム担体の表面に存在する基と結合を形成可能な担体結合基とを有するリンカーを用いて前記化合物をカラム担体に固定化することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルホ基を有する化合物をカラム担体に固定化する化合物の固定化方法であって、
前記化合物中のスルホ基と結合を形成可能なスルホ基結合基と、前記カラム担体の表面に存在する基と結合を形成可能な担体結合基とを有するリンカーを用いて前記化合物をカラム担体に固定化することを特徴とする化合物の固定化方法。
【請求項２】
前記化合物中のスルホ基と前記リンカーのスルホ基結合基とを結合させる工程と、
前記リンカーの担体結合基と前記カラム担体の表面に存在する基とを結合させる工程と、
を有することを特徴とする請求項１に記載の化合物の固定化方法。
【請求項３】
前記スルホ基結合基がアミノ基であることを特徴とする請求項１又は２に記載の化合物の固定化方法。
【請求項４】
前記リンカーが、アミノ酸であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかの請求項に記載の化合物の固定化方法。
【請求項５】
前記担体結合基が、カルボキシ基、チオール基又は水酸基であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかの請求項に記載の化合物の固定化方法。
【請求項６】
前記スルホ基を有する化合物が、スルホ基を有しない化合物にスルホ基を付加して生成されたことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかの請求項に記載の化合物の固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物をカラム担体へ固定化する方法に関する。また、化合物を固定化した担体の製造方法と、それを用いた分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の技術の発展に伴い、タンパク質や化合物を固定化した担体が作製されるようになってきており、それらを用いてタンパク質や化合物を分離分析するための装置が開発されている。
【０００３】
例えば、特許文献１に記載されている従来のポリスチレン製担体を用いた方式では、タンパク質を担体上に固定化するために、ポリスチレンにスルホ基を導入している。
【０００４】
また、特許文献２では、担体に環状フェノール硫化物を物理的親和力を用いて固定化している。環状フェノール硫化物が金属イオンと高い親和性を有することを利用し、金属イオンを分析するカラムを作製している。
【０００５】
また、特許文献３では、両電荷性の化合物を疎水性による物理吸着を用いて担体に固定化し、唾液中に含まれる成分を分析している。
【０００６】
また、特許文献４では、アルキルスルホン酸を作用させて担体にスルホ基を導入し、そのスルホ基との共有結合により両性イオン非芳香族基を担体に固定化している。
【特許文献１】特開２００５−１６４２８５号公報
【特許文献２】特開２００２−０９８６７９号公報
【特許文献３】特開平７−７２１３２号公報
【特許文献４】特開表２００２−５２９７１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これらの特許文献に開示された固定化方法にはいくつかの問題がある。
【０００８】
特許文献１に記載された固定化方法の問題点としては、タンパク質は固定化できるが、多くの化合物に当該固定化方法を適用できないことが挙げられる。
【０００９】
特許文献２及び３に記載された固定化方法の問題点としては、多くの化合物に当該固定化方法を適用出来ないということが挙げられる。この原因は、化合物によっては常に担体との物理的親和力が高いとは限らないし、また、疎水性を利用した物理吸着メカニズムを用いることが出来るとも限らないからである。また、従来販売されているカラムの担体はアミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基のいずれかを有する化合物としか結合能を持たないものがほとんどであるからである。
【００１０】
第２の問題点は、化合物にカラム担体に親和力の高い基の導入が難しい場合がある事である。例えば、化合物に直接に「カルボキシル基」をつける為には、良く知られている方法として、グリニャール試薬を用いる方法があるが、幾つかの工程が必要となり、煩雑である。
【００１１】
特許文献４に記載された方式では、従来販売されているカラム担体にアルキルスルホン酸を作用させてスルホ基を導入することで、アミノ基との結合能を有するように担体の特性を改変している。また、同時に両性イオン非芳香族基を形成するように担体の特性を改変している。しかしながら、スルホ基の付加だけであるので、前記した問題が解決されていない。また、両性イオン非芳香族基と結合能を持たない物に関しては、適用できない。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、スルホ基を有する化合物もしくはスルホ基を付加可能な化合物をカラム担体に固定化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこで、本発明に係る化合物の固定化方法は、
スルホ基を有する化合物をカラム担体に固定化する化合物の固定化方法であって、
前記化合物中のスルホ基と結合を形成可能なスルホ基結合基と、前記カラム担体の表面に存在する基と結合を形成可能な担体結合基とを有するリンカーを用いて前記化合物をカラム担体に固定化することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係る化合物の固定化方法は、前記固定化方法において、
前記化合物中のスルホ基と前記リンカーのスルホ基結合基とを結合させる工程と、
前記リンカーの担体結合基と前記カラム担体の表面に存在する基とを結合させる工程と、
を有することを特徴とする。
【００１５】
また、前記スルホ基結合基はアミノ基であることが好ましい。
【００１６】
また、前記リンカーはアミノ酸であることが好ましい。
【００１７】
また、前記担体結合基はカルボキシ基、チオール基又は水酸基であることが好ましい。
【００１８】
また、前記スルホ基を有する化合物は、スルホ基を有しない化合物にスルホ基を付加して生成することも可能である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、スルホ基を有する化合物を化学結合法によりカラム担体に直接固定化できない場合でも、リンカーを介してカラム担体に結合することができるようになる。
【００２０】
また、化合物がスルホ基を有しない場合でも、化合物にスルホ基を付加することにより、リンカーを介してカラム担体に固定化することができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、スルホ基を有する化合物をカラム担体に固定化する方法に関する。すなわち、本発明に係る化合物の固定化方法は、
スルホ基を有する化合物をリンカーを用いてカラム担体に結合させることを特徴とする化合物の固定化方法であって、
前記リンカーが、前記化合物中のスルホ基と結合を形成可能なスルホ基結合基を有し、かつ、前記カラム担体の表面に存在する基と結合を形成可能な担体結合基を有することを特徴とする。
【００２２】
本発明では、カラム担体の表面に存在する基と結合を形成する担体結合基を有し、かつ、スルホ基と結合を形成するスルホ基結合基を有する化合物をリンカーとして用いる。これにより、スルホ基を有する化合物を化学結合法によりカラム担体に直接固定化できない場合でも、スルホ基を有する化合物をリンカーを介してカラム担体に結合することができる。
【００２３】
（実施形態１）
本発明に係るスルホ基を有する化合物の固定化方法では、まず、化合物のスルホ基とリンカーのスルホ基結合基との間に結合を形成させる。そして、リンカーの担体結合基とカラム担体の表面に存在する基との間に結合を形成させることにより、スルホ基を有する化合物をリンカーを介してカラム担体に固定化する。
【００２４】
本発明における前記スルホ基を有する化合物とは、該化合物中に置換基としてスルホ基を有するものであればよい。特に、本発明に係る固定化方法の適用に当たっては、前記スルホ基を有する化合物が芳香族環を有し、該芳香族環に置換基として少なくとも１つのスルホ基を有する化合物であることが好ましい。
【００２５】
本発明における前記リンカーは、前記化合物中のスルホ基と結合を形成可能なスルホ基結合基を有し、かつ、カラム担体の表面（担体表面）に存在する基と結合を形成可能な担体結合基を有する化合物を用いることができる。前記スルホ基結合基としては、例えば、アミノ基を挙げることができる。また、前記担体結合基としては、特に限定されるものではないが、例えば、担体表面に存在する基がアミノ基である場合は、カルボキシ基とすることができる。同様に、担体表面に存在する基がチオール基である場合は、○○基とすることができる。担体表面に存在する基がカルボキシル基である場合は、アミノ基とすることができる。担体表面に存在する基が水酸基である場合は、○○基とすることができる。
【００２６】
例えば、担体表面に存在する基がアミノ基である場合は、リンカーの具体例としては、アミノ酸を挙げることができる。この場合、アミノ酸のアミノ基が化合物中のスルホ基と結合を形成し、アミノ酸のカルボキシ基が担体表面に存在するアミノ基と結合を形成することにより、スルホ基を有する化合物をカラム担体に固定化することができる。
【００２７】
本発明に用いるカラム担体は、表面に修飾基を有するものを用いることができる。例えば、修飾基としては、炭化水素に官能基を有しているものを挙げることができる。炭化水素としては、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、脂環族炭化水素等の飽和又は不飽和炭化水素が挙げられる。官能基としては、アミノ基、カルボキシ基、チオール基、ニトリル基又は水酸基等を挙げることができる。この官能基が、前記リンカーの担体結合基と結合を形成することになる。前記担体としては、特に制限されるものではないが、例えば、シリカゲル、ケイソウ土、アルミナ、粉末ゼオライト等の多孔性担体が挙げられる。
【００２８】
前記スルホ基を有する化合物とリンカーのスルホ基結合基との結合は、従来の方法により形成することができる。例えば、特に制限されるものではないが、化合物中のスルホ基とリンカーのアミノ基を反応させる場合は、重合させることにより、共有結合を形成することができる。この反応は穏和な条件下で行うことができる。
【００２９】
前記リンカーの担体結合基とカラム担体（担体表面に存在する基）を結合させる方法としては、リンカーの担体結合基と担体表面に存在する基の種類に応じて、従来の方法から適当な方法を採用することができ、特に制限されるものではない。例えば、担体表面に存在する基がアミノ基で、リンカーの担体結合基がカルボキシ基であった場合は、縮合反応によりペプチド結合を形成することができる。
【００３０】
（実施形態２）
また、本発明に係る化合物の固定化方法は、スルホ基を有しない化合物にスルホ基を付加することで、スルホ基を有しない化合物の固定化にも応用することができる。ここで言うスルホ基を付加するということは、前記スルホ基を有しない化合物中にある置換基をスルホ基に変換することも含む。
【００３１】
この場合、前記スルホ基を有しない化合物としては、分子量が５０から１０００程度の低分子の化合物であることが好ましく、さらに好ましくは分子量が１００から４００程度の化合物が好ましい。分子量が５０よりも小さい化合物では反応性が高すぎてスルホ基の付加が難しくなる傾向があり、収率が低下してしまう場合があるからである。分子量が１０００よりも大きい化合物では、反応性が低くなりスルホ基を付加しにくくなる傾向があり、反応に使用できる溶媒が限られてしまう場合があるからである。また、前記スルホ基を有しない化合物としては、主骨格を壊さないでスルホ基を付加することができる化合物であることが好ましい。
【００３２】
スルホ基を化合物に付加する方法は、公知の方法を使用することができ、特に限定されるものではない。例えば、具体的な方法として、特許文献２に記載されている硫酸溶液を用いてスルホ基を付加する方法等が利用可能である。また、他にも、例えば、チオール、ジスルフィド又はスルフィン酸化合物を過マンガン酸塩などで酸化することにより、スルホ基を有する化合物とすることができる。また、発煙硫酸あるいはクロロ硫酸などを用いて親電子置換反応を利用して、スルホ基を付加することができる。この場合、低コストで合成することが可能である。
【００３３】
次に、本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。
【００３４】
図１には、本発明の実施の形態として、化合物を担体に固定化する方法が示されている。
【００３５】
図１の１０１では、固定化しようとする化合物にスルホ基が有るか否かが判断される。固定化しようとする化合物にスルホ基がなかった場合、１０２で化合物にスルホ基を付加する操作が行われる。スルホ基を化合物に付加する方法は、公知の方法を使用することができ、特に限定されるものではない。
【００３６】
１０３では、スルホ基を有する化合物又はスルホ基が付加された化合物中のスルホ基と、リンカーのスルホ基結合基（例えばアミノ基）とを反応させる。この反応は、公知の技術を用いて行うことができ、比較的穏和な条件で進行させることが出来る。
【００３７】
１０４では、リンカーの担体結合基と担体表面に存在する基とを結合させる。
【００３８】
本発明におけるリンカーの存在により、スルホ基を有する化合物、もしくは、スルホ基を付加可能な化合物を担体に固定化できる。そして、その化合物を固定化したカラムを用いた分析装置を供することが可能になる。
【００３９】
なお、本発明では、リンカーとしての選択の幅が広く、多くの化合物をリンカーとして使用可能であるという利点がある。例えば、リンカーとして、アミノ基とカルボキシル基を有するアミノ酸、タンパク質等を用いることが可能である。
【００４０】
また、本発明の実施形態では比較的穏和な反応工程を採用できるので、固定化する化合物やリンカーの化学的性質を損なう可能性が低いという利点が得られる。
【００４１】
また、本発明の実施形態において、先に、リンカーとカラム担体を結合させておいた後、リンカーと化合物を結合させ、スルホ基を有する化合物をカラム担体に固定化することもできる。そのための構成を、図２に示す。
【００４２】
図２に示した実施形態では、２０３に示すようにリンカーの担体結合基と担体表面に存在する基とを反応させ結合を形成する。２０４では、固定化しようとする化合物のスルホ基と、リンカーのスルホ基結合基とを反応させ結合を形成する。したがって、それぞれの固定化条件に選択性の幅を広げるという効果を奏する。
【００４３】
図３に、例としてトリニトロベンゼン（以下ＴＮＢと略す）を本発明を用いてカラム担体に固定化する場合の反応式を示す。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例により本発明について説明するが、本発明は特にこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
（実施例１）
（ＴＮＢＳカラム担体の調製）
スルホ基を有する低分子化合物として、トリニトロベンゼンスルホン酸（以下ＴＮＢＳと略す）を選択し、リンカーとしてグリシンを用いてカラム担体に固定化した実施例を示す。なお、ＴＮＢＳは図３（ａ）に記載した反応により、ＴＮＢから容易に生成することができる。
【００４６】
まず、ＴＮＢＳをジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと略す）に溶解し、０．１ｍＭＴＮＢＳ溶液を調製した。また、リンカーとして用いるグリシンを０．５ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、０．１ｍＭグリシン溶液を調製した。
【００４７】
次に、両溶液を同量混合し、４℃で２４時間放置し反応（室温下）させた。なお、この混合溶液のpＨを測定したところ４．５であった。また、この反応は比較的穏和に進行させることが出来る。
【００４８】
カラム担体はＥＡＨＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた。このカラム担体の構造を図４に示す。
【００４９】
なお、このカラム担体のアミノ基は反応性がほとんどないため、後述するようにカラム担体を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドで活性化してから、本願の実施例及び比較例に供した。
【００５０】
次に、カラム担体はガラスフィルターを使用してエタノールを除き、上記のように調製した溶液に１ｗ／ｖの濃度となるように添加した。また、活性化剤として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（以下ＥＤＣと略す）を加え、室温下で遮光して２４時間放置し、カラム担体のアミノ基とＴＮＢＳに結合しているグリシンのカルボキシ基との間にペプチド結合を形成した。
【００５１】
次に、ガラスフィルターでカラム担体を回収し、純水で十分に洗浄を行い、ｐＨ２．３のグリシン溶液で洗浄した。次に、純水で洗浄し、８ＭＵｒｅａ／リン酸緩衝液で洗浄した。次に、リン酸緩衝液で洗浄した。次に、ｐＨ９．５の炭酸緩衝液で洗浄した。最後に、純水で洗浄した。
【００５２】
上記の処理を施すことによって、ＴＮＢＳをリンカーを用いてカラム担体に固定化し、ＴＮＢＳカラム担体を得た。
【００５３】
（ＴＮＢＳ−ＡＰの調製）
ＴＮＢＳに特異的に結合するアプタマー（以下ＴＮＢＳ−ＡＰと略す）を次のようにして調製した。なお、アプタマーは、非特許文献１（Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｐｏｌｉｓｋｙ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．２６７：２７５−３０１）及び特許文献６（特表２００３−５１７２９５号公報）を参考にして調製した。
【００５４】
２種類のＤＮＡオリゴヌクレオチド（４０ＮＲ０ＤＮＡテンプレート、および５´Ｎ７プライマー）をアニールし、クレノウでフィルインして、４０ＮＲ０ＤＮＡ転写テンプレートを生産した。このＤＮＡオリゴヌクレオチドはＯｐｅｒｏｎ社製（ミネアポリス、ＭＮ，ＵＳＡ）のものを用いた。非特許文献１に記載のように、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、３ｍＭ２−Ｆウリジン、３ｍＭシトシン、１ｍＭ２′−ＯＨグアノシン、および１ｍＭアデニン及びαＰ−ＡＴＰを使用して、このテンプレートを転写した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはＥｎｚｙｃｏ社製（デンバー、ＣＯ，ＵＳＡ）を用いた。制限酵素はすべてＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製のものを用いた。これにより、５´および３´の［固定］領域と４０塩基長のランダム並列領域を有するＲ０４０Ｎ７核酸プールを得た。
【００５５】
次に、この核酸プールをダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水と１ｍＭ塩化マグネシウムと一緒に、先に得られたＴＮＢＳカラム担体をインキュベートした。次に、ＴＮＢＳカラム担体を特許文献６の表３に示す条件で洗浄した。
【００５６】
次に、ＴＮＢＳカラム担体を５０％エタノール、４Ｍの尿素において、６５℃で４５分間処理し、アプタマーを溶出させた。そして、エタノールでアプタマーを沈殿させ、ＴＮＢＳ−ＡＰを得た。
【００５７】
次に、トリ骨髄芽球症ウィルスの逆転写酵素を使用してＴＮＢＳ−ＡＰを逆転写し、５´Ｎ７プライマーおよび３´Ｎ７プライマーを使用して１５サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【００５８】
次に、得られた転写プレートを２´−Ｆビリミジンヌクレオチド、２´−ＯＨプリンリボヌクレオチド、およびα３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、次のスポットランドに持ち越した。そして、９ラウンドを実施し、ＴＮＢＳ−ＡＰを選抜した。
【００５９】
以上の処理を行って得られたＴＮＢＳ−ＡＰとＴＮＢＳとの結合力を表面プラズモン共鳴バイオセンサにより測定した。具体的には、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）を測定し、ＴＮＢＳとＴＮＢＳ−ＡＰとがどのくらい強く結合したかを測定した。表面プラズモン共鳴バイオセンサはＢｉａｃｏｒｅ３０００（商品名、バイオコア社製）を使用した。ＴＮＢＳ−ＡＰを固定化するチップはＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（商品名、Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いた。アプタマーの固定化方法は、Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５のチップ表面のカルボキシメチルデキストラン中のカルボキシル基をＮＨＳ／ＥＤＣ混合溶液を反応させてＮＨＳ活性化し、ＴＮＢＳ−ＡＰと結合させた。つづいて、残存活性ＮＨＳ基をエタノールアミンでブロッキングし、固定化を完了した（ＮＨＳはＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅを表す）。結合状態は、ＴＮＢＳ−ＡＰをＣＭ５のチップに固定化した後、ＴＮＢＳ溶液と反応させて評価した。その結果を表１に示した。
【００６０】
（比較例１）
比較例として、スルホ基を有しない低分子化合物、すなわち、ＴＮＢ、トリニトロフェノール（ＴＮＰ）、トリニトロトルエン（ＴＮＴ）及びトリニトロベンゼンカルボン酸（ＴＮＢＣ）について、実施例１と同様の方法によりカラム担体に固定化することを試みた。
【００６１】
方法としては、実施例１におけるＴＮＢＳを、それぞれの化合物に置き換えて固定化を試み、得られた担体をそれぞれＴＮＢカラム担体、ＴＮＰカラム担体、ＴＮＴカラム担体及びＴＮＢＣカラム担体とした。
【００６２】
また、それぞれの化合物に対するアプタマーの選抜は、実施例１と同様に行い、得られたアプタマーをそれぞれＴＮＢ−ＡＰ、ＴＮＰ−ＡＰ、ＴＮＴ−ＡＰ及びＴＮＢＣ−ＡＰとした。
【００６３】
調製したアプタマーとそれぞれ対応する化合物との結合力を評価し、表１に示した。
【００６４】
（比較例２）
比較例として、リンカーを用いずにＴＮＢＳと反応させたカラム担体を用いて選抜したアプタマーをＣｏｎｔ−ＴＮＢＳ−ＡＰとしたところ、ＴＮＢＳとＣｏｎｔ−ＴＮＢＳ−ＡＰのアフィニティの値は１であった。これは、ＴＮＢＳがカラム担体にほとんど固定化されていなかったため、アプタマーがほとんど選抜されなかったためであると考えられる。
【００６５】
（結果の比較１）
表１に示すように、ＴＮＢＳとＴＮＢＳ−ＡＰ間には強いアフィニティ（結合）が認められた。このＴＮＢＳとＴＮＢＳ−ＡＰ間のアフィニティの値を１００と表した場合、他の化合物と対応するアプタマーとのアフィニティの値を算出したところ、ＴＮＢＣとＴＮＢＣ−ＡＰのアフィニティの値は２０、ＴＮＰとＴＮＰ−ＡＰのアフィニティの値は５、ＴＮＴとＴＮＴ−ＡＰのアフィニティの値は１、そしてＴＮＢとＴＮＢ−ＡＰのアフィニティの値は０であった。
【００６６】
ＴＮＢＳカラム担体がＴＮＢＳ−ＡＰと強いアフィニティを示した原因は、ＴＮＢＳがカラム担体にリンカーを介して強固に固定化されたため、ＴＮＢＳに結合するアプタマーを選抜することができたためと考えられる。
【００６７】
一方で、ＴＮＢ、ＴＮＰ、ＴＮＴおよびＴＮＢはそれぞれ対応するアプタマーと十分なアフィニティが得られなかった。この原因は、これらの化学物質がカラムに十分に固定化されなかったため、それぞれの化合物に結合するアプタマーが選抜されなかったためであると考えられる。十分に固定されなかった原因は、スルホン酸、カルボン酸、およびフェノールの順に酸の強度が低下することに伴う、リンカーへの結合力の低下によるものと考えられる。
【００６８】
【表１】
2009069050.tif 000002
【００６９】
（実施例２）
低分子化合物としてお茶の成分の１つであるカテキンを選択し、該カテキンにスルホ基を付加し、リンカーとしてシステインを用いてカラムの担体に固定化した実施例を示す。
【００７０】
まず、１ｇのカテキンを１０ｍｌの１Ｍクロロ硫酸中でゆっくりと撹拌しながら反応させ、カテキンの水酸基の１つをスルホン化した。そして、精製後に得られたスルホン化したカテキン（以下、Ｓ−カテキンと略す）をＤＭＳＯで溶解し、０．１ｍＭＳ−カテキン溶液を調製した。
【００７１】
次に、リンカーとして使用するシステインを０．５ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、０．１ｍＭシステイン溶液を調製した。
【００７２】
Ｓ−カテキン溶液及びシステイン溶液をそれぞれ同量混合し、４℃で２４時間放置し、反応させた。
【００７３】
カラム担体は実施例１と同様のものを用いた。そして、実施例１と同様の処理を行い、Ｓ−カテキンカラム担体を作製した。
【００７４】
つづいて、Ｓ−カテキンカラム担体を用いて、実施例１と同様の方法によりアプタマーを選抜し、得られたアプタマーをＳ−カテキン−ＡＰとした。
【００７５】
そして、Ｓ−カテキンとＳ−カテキン−ＡＰのアフィニティーを実施例１に準じて評価した。その結果を表２に示した。
【００７６】
（比較例３）
比較例として、スルホ基を有しない低分子化合物であるカテキンについて、実施例１と同様の方法によりカラム担体への固定化を試みた。
【００７７】
方法としては、実施例２におけるＳ−カテキンを、カテキンに置き換えて固定化を試み、カテキンカラム担体を作製した。
【００７８】
また、上記カテキンカラム担体を用いて、実施例１と同様の方法によりアプタマーを選抜し、得られたアプタマーをカテキン−ＡＰとした。
【００７９】
そして、カテキンとカテキン−ＡＰのアフィニティーを実施例１に準じて評価した。その結果を表２に示した。
【００８０】
（結果の比較２）
Ｓ−カテキンとＳ−カテキン−ＡＰとの間には強いアフィニティが認められた。この原因としては、スルホン化されたカテキンがカラムに強固に固定化されたため、Ｓ−カテキンに結合するアプタマーを選抜することができたためと考えられる。
【００８１】
一方、Ｓ−カテキンとＳ−カテキン−ＡＰ間のアフィニティの値を１００としたとき、カテキンとカテキン−ＡＰのアフィニティの値は７と、低い値であった。この原因は、カテキンがカラムに十分に固定化されなかったため、カテキンに結合するアプタマーを選抜することができなかったためと考えられる。カテキンがカラム担体に十分に固定化されなかった原因は、リンカーと結合する置換基がカテキンにないためと考えられる。
【００８２】
【表２】
2009069050.tif 000003
【００８３】
（実施例３）
低分子化合物として、ピーチフレーバーの主成分であるベンズアルデヒドスルホン酸（ＢＡＳ）を選択し、リンカーとしてグリシンを用いてカラム担体に固定化した実施例を示す。
【００８４】
まず、ＢＡＳをＤＭＳＯに溶解し、０．１ｍＭＢＡＳ溶液を調製した。また、グリシンを０．５ｍＭのリン酸緩衝液に溶解し、０．１ｍＭグリシン溶液を調製した。
【００８５】
０．１ｍＭＢＡＳ溶液と０．１ｍＭグリシン溶液を同量混合し、４℃で２４時間放置し反応させた。
【００８６】
カラム担体は実施例１と同様のものを用いた。そして、同様の処理を行い、ＢＡＳカラム担体を作製した。
【００８７】
次に、ＢＡＳカラム担体を用いて、実施例１と同様の方法によりアプタマーを選抜し、このアプタマーをＢＡＳ−ＡＰとした。
【００８８】
そして、ＢＡＳとＢＡＳ−ＡＰのアフィニティーを実施例１に準じて評価した。その結果を表３に示した。
【００８９】
（比較例４）
比較例として、スルホ基を有しない低分子化合物、すなわち、カルボキシベンズアルデヒド（ＣＢＡ）、ヒドロキシベンズアルデヒド（ＨＢＡ）及びベンズアルデヒド（ＢＡ）について、実施例１と同様の方法によりカラム担体への固定化を試みた。
【００９０】
方法としては、実施例３におけるＢＡＳを、それぞれの化合物に置き換えて固定化を行い、ＣＢＡカラム担体、ＨＢＡカラム担体およびＢＡカラム担体を作製した。
【００９１】
また、作製したＣＢＡカラム担体、ＨＢＡカラム担体およびＢＡカラム担体を用いて、実施例１と同様の方法によりアプタマーを選抜し、それぞれのアプタマーをＣＢＡ−ＡＰ、ＨＢＡ−ＡＰ及びＢＡ−ＡＰとした。
【００９２】
そして、それぞれの化合物と対応するアプタマーとのアフィニティーを実施例１に準じて評価した。その結果を表３に示した。
【００９３】
（結果の比較３）
ＢＡＳとＢＡＳ−ＡＰ間には強いアフィニティが認められた。このＢＡＳとＢＡＳ−ＡＰ間のアフィニティの値を１００とした場合、ＣＢＡとＣＢＡ−ＡＰのアフィニティの値は６０、ＨＢＡとＨＢＡ−ＡＰのアフィニティの値は３０、そしてＢＡとＢＡ−ＡＰのアフィニティの値は３であった。
【００９４】
ＢＡＳがＢＡＳ−ＡＰとアフィニティを示した原因は、ＢＡＳがリンカー（グリシン）を介してカラムに強固に固定化されたため、ＢＡＳに特異的に結合するアプタマーを選抜することができたためと考えられる。
【００９５】
一方で、ＣＢＡとＣＢＡ−ＡＰ、ＨＢＡとＨＢＡ−ＡＰ、そしてＢＡとＢＡ−ＡＰの順にアフィニティの値が低下した原因は、ＣＢＡ、ＨＢＡ、ＢＡはリンカーを介してカラム担体に結合されず、これらの化合物に特異的に結合するアプタマーが選抜されなかったためと考えられる。これらの化合物がリンカーを介してカラム担体に固定化されなかったのは、スルホン酸、カルボン酸、およびフェノールの順に酸の強度が低下するため、この順にリンカーへの結合力が低下したことによると考えられる。
【００９６】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明の活用例として、スルホ基を有する化合物、もしくは、スルホ基を付加可能な化合物を担体に固定化し、カラムとして利用することができる。これにより、例えば、抗体抗原反応やアプタマーの作製に用いることができる。例えば、固定化した化合物に対する結合能の有無を利用して抗体やアプタマー等の選別や分析をすることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明の実施形態の一例を示す工程図。
【図２】本発明の実施形態の一例を示す工程図。
【図３】本発明をＴＮＢの固定化に適用したときの反応式。
【図４】ヘルスケアバイオサイエンス社製のＥＡＨＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂの構造を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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