(57)【要約】【課題】本発明は、異種抗体を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物、および実質的な親和性でヒト抗原に結合するヒト配列抗体を産生する方法に関する。【解決手段】ヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスジーンを含むゲノムを有するトランスジェニックマウスから入手したＢ細胞を含むハイブリドーマであって、該Ｂ細胞は、ハイブリドーマを生成するのに適した不死化細胞に融合されており、ここで、該ハイブリドーマは、インターロイキン−８に特異的に結合する検出可能な量の免疫グロブリンを産生する、ハイブリドーマ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスジーンを含むゲノムを有するトランスジェニックマウスから入手したＢ細胞を含むハイブリドーマであって、該Ｂ細胞は、ハイブリドーマを生成するのに適した不死化細胞に融合されており、ここで、該ハイブリドーマは、インターロイキン−８に特異的に結合する検出可能な量の免疫グロブリンを産生する、ハイブリドーマ。
【請求項２】
前記免疫グロブリンがGROαに特異的に結合する、請求項１に記載のハイブリドーマ。
【請求項３】
前記免疫グロブリンが、ヒトインターロイキン−８への結合についての少なくとも２×109M-1の親和定数（Ka）を有する、請求項１に記載のハイブリドーマ。
【請求項４】
前記親和定数が、少なくとも２×1010M-1である、請求項１に記載のハイブリドーマ。
【請求項５】
前記免疫グロブリンが、1F8、2D11、2F9、2G1、3E5、5E7、5F10、5H8、2C6、2D6、3A1、4D4、7C5、および10A6からなる群から選択される、請求項３に記載のハイブリドーマ。
【請求項６】
請求項３に記載のハイブリドーマによって産生される実質的に純粋な免疫グロブリンを含む組成物。
【請求項７】
実質的に純粋なヒトモノクローナル抗体を含む組成物であって、ここで該抗体が、ヒトインターロイキン−８への結合についての少なくとも２×109M-1の親和定数（Ka）を有し、そして該免疫グロブリンが、
（１）ヒトVL遺伝子セグメントおよびヒトJLセグメントによってコードされるポリぺプチド配列に実質的に同一であるポリぺプチド配列を有する軽鎖可変領域、および（２）CL遺伝子セグメントによってコードされるポリぺプチド配列に実質的に同一であるポリぺプチド配列を有する軽鎖定常領域、から構成されるヒト配列軽鎖；ならびに
（１）ヒトVH遺伝子セグメント、必要に応じてＤ領域、およびヒトJHセグメントによってコードされるポリぺプチド配列に実質的に同一であるポリぺプチド配列を有する重鎖可変領域、および（２）ヒトCH遺伝子セグメントによってコードされるポリぺプチド配列に実質的に同一であるポリぺプチド配列を有する定常領域、から構成されるヒト配列重鎖、
からなる、組成物。
【請求項８】
前記ヒトモノクローナル抗体がGROαに特異的に結合する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
患者の血管系からの好中球の流出を防止する方法であって、ヒトインターロイキン−８への結合についての少なくとも２×109M-1の親和定数（Ka）を有するヒトモノクローナル抗体の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
再灌流傷害を処置する方法であって、ヒトインターロイキン−８への結合についての少なくとも２×109M-1の親和定数（Ka）を有するヒトモノクローナル抗体の治療有効用量を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
霊長類におけるＴヘルパー細胞依存性免疫応答を抑制する方法であって、ヒトCD-4への結合についての少なくとも２×109M-1の親和定数（Ka）を有するヒトモノクローナル抗体の治療有効用量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
前記霊長類がチンパンジーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、VH4-34セグメント、JH5セグメント、配列VINWFDPを含む重鎖CDR3領域、VkL19セグメント、Jk2セグメント、および配列QQANSFPYTを含む軽鎖CD3領域を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が6G5である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、VH5-51セグメント、JH2セグメント、配列PANWNWYFVLを含む重鎖CDR3領域、VkL18セグメント、Jk4セグメント、および配列QQFISYPQLTを含む軽鎖CD3領域を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が1G2である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種抗体を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物、このようなトランスジェニック動物を産生するために使用されるトランスジーン、V-D-J組換えにおいて異種Ｄ遺伝子を機能的に再配置し得るトランスジーン、異種抗体を産生し得る不死化Ｂ細胞、複数のアイソタイプの異種抗体を産生するための方法およびトランスジーン、異種抗体を産生するための方法およびトランスジーン（ここで、可変領域配列が生殖細胞系の再配置された可変領域配列と比較して体細胞変異を含む)、ヒト一次配列を有し、そしてヒト抗原に結合する抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物、このようなトランスジェニック動物のＢ細胞から作製されるハイブリドーマ、ならびにこのようなハイブリドーマによって発現されるモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおけるモノクローナル抗体のインビボ治療適用およびインビボ診断適用の開発が直面する主要な障害の１つは、非ヒト免疫グロブリンの内因性の免疫原性である。例えば、免疫適格性のヒト患者が治療用量の齧歯類モノクローナル抗体を投与された場合、患者は、その齧歯類免疫グロブリン配列に対する抗体を産生する；これらのヒト抗マウス抗体（HAMA）は、治療的抗体を中和し、そして急性の毒性を引き起こし得る。従って、特定のヒト抗原と反応性であるヒト免疫グロブリンを産生することが望ましく、これらは見込みのある治療用および/または診断用標的である。しかし、ヒト抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリンを産生することには問題が多い。
【０００３】
モノクローナル抗体を生成するための本発明の技術は、動物（通常はラットまたはマウス）を抗原に予め曝露するかまたはプライムすること、その動物由来のＢ細胞を回収すること、およびハイブリドーマクローンのライブラリーを生成することを包含する。抗原結合特異性（イディオタイプ）についてのハイブリドーマ集団をスクリーニングすることによって、そしてまた免疫グロブリンクラス（アイソタイプ）についてスクリーニングすることによって、所望の抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択することが可能である。
【０００４】
しかし、モノクローナル抗体を生成するための本発明の方法が、ヒト抗原に対する結合特異性を有するヒト抗体を生成する目的に適用される場合、ヒト免疫グロブリンを産生するＢリンパ球を得ることは、深刻な障害である。なぜなら、ヒトは、代表的には自己抗原に対して免疫応答を生じないからである。
【０００５】
従って、ヒト抗原と特異的に反応性であるヒトモノクローナル抗体を生成する現在の方法は、明らかに不十分である。真正の自己抗原に対するモノクローナル抗体を生成することに対する同じ制限が、非ヒト種がハイブリドーマを作製するためのＢ細胞の供給源として使用される場合にあてはまることが明らかである。
【０００６】
機能的異種免疫グロブリントランスジーンを保有するトランスジェニック動物の構築は、自己抗原に反応性である抗体が産生され得る方法である。しかし、治療的に有用な抗体の発現、またはそのような抗体を産生するハイブリドーマクローンを得るために、トランスジェニック動物は、Ｂリンパ球発達経路を介して成熟し得るトランスジェニックＢ細胞を産生しなければならない。このような成熟には、トランスジェニックＢ細胞上で表面IgMの存在が必要であるが、IgM以外のアイソタイプが治療的使用に望ましい。従って、機能的V-D-J再配置を経て、組み換え的な多様性および結合的な多様性を生成し得るような、トランスジーンおよびこのようなトランスジーンを保有する動物についての必要性が存在する。さらに、このようなトランスジーンおよびトランスジェニック動物は、好ましくは、Ｂ細胞変異に必要である第一のアイソタイプから、より優れた治療的有用性を有する引き続くアイソタイプへのアイソタイプスイッチングを促進するシス作用性配列を含む。
【０００７】
多くの実験が、Ig遺伝子再配置に必要とされる特定のDNA配列を決定するためのトランスフェクト細胞株の使用を報告している（LewisおよびGellert (1989), Cell, 59, 585-588に総説される)。このような報告は、推定配列を同定しており、そして再配置に使用されるリコンビナーゼ酵素へのこれらの配列の接触可能性が、転写によって調節されることを結論づけた（YancopoulosおよびAlt (1985), Cell, 40, 271-281)。V(D)J連結のための配列は、報告によれば、高度に保存された、パリンドロームに近いヘプタマーであり、そして12または23bpのいずれかのスペーサーによって分離されたあまり良く保存されていないATリッチなナノマーである（Tonegawa (1983), Nature, 302, 575-581; Hesseら、(1989), Gene in Dev., 3, 1053-1061)。効率的な組換えは、報告によれば、異なる長さのスペーサー領域を有する組換えシグナル配列を含む部位の間のみに生じる。
【０００８】
Ig遺伝子再配置は、組織培養細胞において研究されたが、トランスジェニックマウスにおいては重点的に試験されていない。マウスに導入された再配置試験構築物を記載するわずかな報告のみが、公開されている［Buchiniら、(1987), Nature, 326, 409-411 (再配置されていないニワトリλトランスジーン）; Goodhartら、(1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4229-4233)(再配置されていないウサギκ遺伝子）; Bruggemannら（1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6709-6713 (ハイブリッドマウスヒト重鎖）]。しかし、このような実験の結果は様々であり、いくつかの場合には、トランスジーンの不完全なまたは最小の再配置を生成している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
さらに、抗体分子の種々の生物学的機能が、分子のFc部分によって発揮され（例えば、Fcεを介する肥満細胞または好塩基球との相互作用、およびFcμまたはFcγによる補体の結合）、これはさらにアイソタイプの変化による所定の特異性を有する抗体の機能的な多様性を生成するのに望ましい。
【００１０】
異種抗体の１つ以上の鎖をコードするトランスジーンを組み込んだトランスジェニック動物が生成されているが、首尾良いアイソタイプスイッチングを経験する異種トランスジーンの報告はない。アイソタイプをスイッチし得ないトランスジェニック動物は、単一のアイソタイプの異種抗体を産生することに限定され、そしてより特異的にはＢ細胞の成熟に不可欠なアイソタイプ（例えば、IgMおよびおそらくIgD）の産生に限定され、これらのアイソタイプは治療的有用性が限定されていることもあり得る。従って、Ｂ細胞の発達に必要なアイソタイプから、治療的使用のための所望の特徴を有するアイソタイプへのスイッチングが可能である異種免疫グロブリントランスジーンおよびトランスジェニック動物についての必要性が存在する。
【００１１】
上記に基づいて、異種抗体（例えば、第二の種において産生される第一の種の遺伝子配列によってコードされる抗体）を効率的に産生する方法についての必要性が存在することが明らかである。より詳細には、組み換えの多様性に寄与するＤ遺伝子セグメントの全てまたは一部を組み込んだ機能的V-D-J遺伝子再配置を経験し得る異種免疫グロブリントランスジーンおよびトランスジェニック動物についての必要性が当該分野で存在する。さらに、（１）機能的Ｂ細胞の発達が起こり得るように、そして（２）治療的に有用な異種抗体が産生され得るように、V-D-J組換えおよびアイソタイプスイッチングを支持し得るトランスジーンおよびトランスジェニック動物についての必要性が当該分野で存在する。特定の種における治療的使用または診断的使用（そのためにモノクローナル抗体が設計される）のためのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために使用され得るＢ細胞の供給源についての必要性もまた存在する。機能的V-D-J組換えおよび/またはアイソタイプスイッチングが可能な異種免疫グロブリントランスジーンは、これらの必要性を充足し得る。
【００１２】
上記に従って、目的のトランスジェニック非ヒト動物が提供され、これらは、異種抗体（例えば、ヒト抗体）を産生し得る。
【００１３】
さらに、異種抗体を発現し得るこのようなトランスジェニック動物由来のＢ細胞を提供することが目的である。ここで、このようなＢ細胞は、特定の抗原について特異的なモノクローナル抗体の供給源を提供するために不死化されている。
【００１４】
この上記の目的に従って、本発明のさらなる目的は、このような異種モノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞を提供することである。
【００１５】
なおさらに、上記の非ヒトトランスジェニック動物を産生するために有用である異種の再配置されていないおよび再配置された免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを提供することが本発明の目的である。
【００１６】
なおさらに、トランスジェニック動物の内因性の免疫グロブリン遺伝子座を破壊する方法を提供することが本発明の目的である。
【００１７】
なおさらに、上記のトランスジェニック非ヒト動物において異種抗体産生を誘導する方法を提供することが本発明の目的である。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、１つ以上の本発明のトランスジーンを構築するために使用される免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントレパートリーを生成する方法を提供することである。
【００１９】
本明細書中で議論される参考文献は、本出願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書中には、発明者らに、先行発明のためにこのような開示の日付を早める権利が与えられないことの許可として解釈されるべきものは存在しない。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
異種抗体（例えば、ヒト抗体）を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物が提供される。このような異種抗体は、種々のアイソタイプであり得る。これらには、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、IgEが含まれる。このようなトランスジェニック非ヒト動物が免疫応答を生じるためには、トランスジェニックＢ細胞およびプレＢ細胞が、Ｂ細胞発達および抗原刺激変異を達成するすために、表面結合免疫グロブリン（特に、IgM（またはおそらくIgD）アイソタイプを産生することが必要である。IgM（またはIgD）表面結合免疫グロブリンのこのような発現は、Ｂ細胞発達の抗原刺激された変異相の間にのみ必要とされ、そして成熟Ｂ細胞は、一度に１つのスイッチ化アイソタイプが産生され得るのみであるが、他のアイソタイプを産生し得る。
【００２１】
代表的には、Ｂ細胞系統の細胞は、一度に１つのみのアイソタイプを産生する。しかし、シスまたはトランスオルタナティブRNAスプライシング（例えば、μS（分泌されたμ）およびμM（膜結合μ）形態、ならびにμおよびδ免疫グロブリン鎖で天然に生じるようなもの）は、単一の細胞による複数のアイソタイプの同時発生的発現を導き得る。それゆえ、複数のアイソタイプの異種抗体を産生するために（詳細には、治療的に有用なIgG、IgA、およびIgEアイソタイプ）、アイソタイプスイッチングが生じることが必要である。このようなアイソタイプスイッチングは、古典的なクラススイッチングであり得るか、または１つ以上の非古典的アイソタイプスイッチング機構から生じ得る。
【００２２】
本発明は、異種免疫グロブリントランスジーンおよびこのようなトランスジーンを保有するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。ここで、このトランスジェニック動物は、アイソタイプスイッチングを経ることによって複数のアイソタイプの異種抗体を産生し得る。古典的なアイソタイプスイッチングは、トランスジーン中に少なくとも１つのスイッチ配列領域を含む組換え事象によって生じる。非古典的アイソタイプスイッチングは、例えば、ヒトσμとヒトΣμ配列（δ関連欠失）との間の相同組換えによって生じ得る。とりわけ、オルタナティブ非古典的スイッチング機構（例えば、トランスジーン間および/または染色体間組換え）が生じ得、そしてアイソタイプスイッチングを達成し得る。このようなトランスジーンおよびトランスジェニック非ヒト動物は、抗原刺激Ｂ細胞変異に必要な第一の免疫グロブリンアイソタイプを産生し、そして治療的および/または診断的有用性を有する１つ以上の引き続く異種アイソタイプをコードしそして産生するようにスイッチし得る。従って、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、１つの実施態様において、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列によってコードされ、そしてまた高い親和性で特定のヒト抗原に結合するIgG、IgA、および/またはIgE抗体を産生し得る。
【００２３】
本発明はまた、種々のアイソタイプの異種抗体を発現し得るこのようなトランスジェニック動物由来のＢ細胞を包含する。ここで、このようなＢ細胞は、特定の抗原に対して特異的なモノクローナル抗体の供給源を提供するように不死化されている。このようなＢ細胞に由来するハイブリドーマ細胞は、このような異種モノクローナル抗体の１つの供給源として作用し得る。
【００２４】
本発明は、上記の非ヒトトランスジェニック動物において、またはこのようなトランスジェニック動物に由来するＢ細胞系統の外植されたリンパ球において、インビボでアイソタイプスイッチングを経験し得る異種の再配置されていないおよび再配置された免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを提供する。このようなアイソタイプスイッチングは、自発的に起こり得るか、またはＴ細胞由来のリンホカインのようなアイソタイプスイッチングを促進する因子（例えば、IL-4およびIFNY）でのトランスジェニック動物または外植されたＢ系統リンパ球の処置によって誘導され得る。
【００２５】
なおさらに、本発明は、上記のトランスジェニック非ヒト動物における異種抗体産生を誘導する方法を包含する。ここで、このような抗体は、種々のアイソタイプであり得る。このような方法には、異種抗体（特に、スイッチ化アイソタイプの異種抗体（すなわち、IgG、IgA、およびIgE））の生成のためのトランスジェニック非ヒト動物において抗原刺激免疫応答を産生することが含まれる。
【００２６】
本発明は、トランスジーンがアイソタイプスイッチングを達成する配列を含むようにする方法であって、その結果トランスジェニック動物において産生された異種免疫グロブリンおよび上記動物のＢ細胞に由来するモノクローナル抗体クローンが種々のアイソタイプであり得る方法を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、特定のアイソタイプ間でのスイッチングが、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子座において代表的に生じるよりも、いっそう高いかまたは低い頻度、あるいは異なる時間的順序で起こり得るように、トランスジーンのアイソタイプスイッチングを容易にする方法を提供する。スイッチ領域は、種々のCH遺伝子から移植され得、そしてトランスジーン構築物における他のCH遺伝子に連結され得る；このような移植されたスイッチ配列は、トランスジーン構築物におけるスイッチングが、代表的には関連するスイッチ領域の起源の機能であるように、代表的には、関連するCH遺伝子とは独立して機能する。代替として、またはスイッチ配列と組み合わせて、δ関連欠失配列は、種々のCH遺伝子に連結して、２つのδ関連欠失配列間での配列の欠失による非古典的スイッチングをもたらし得る。従って、トランスジーンは、特定のCH遺伝子が異なるスイッチ配列に連結し、そしてそれにより、天然に関連するスイッチ領域が使用される場合に生じるよりも頻繁にスイッチされるように、構築され得る。
【００２８】
本発明はまた、トランスジーン配列のアイソタイプスイッチングが、免疫グロブリントランスジーンを含むトランスジェニック動物において生じたか否かを決定する方法を提供する。
【００２９】
本発明は、免疫グロブリントランスジーン構築物および免疫グロブリントランスジーン構築物（そのいくつかは、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子座配列（これは、欠失を含み得る）のサブセットを含む）を産生する方法を提供する。本発明は、２つの独特のNotI部位に隣接する独特のXhoIおよびSalI制限部位を利用するベクターを含んだ免疫グロブリントランスジーンのクローニングおよび構築を容易にするための特定の方法を含む。この方法は、XhoIおよびSalI制限部位の相補的な末端を利用し、そしてベクターにおける制限フラグメントの秩序立ったコンカテマー化によって大きな構築物を作製するために有用である。
【００３０】
本発明のトランスジーンには、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの多様性遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメント、および１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするDNAを含む重鎖トランスジーンが含まれる。免疫グロブリン軽鎖トランスジーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメント、および１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするDNAを含む。軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、トランスジェニック非ヒト動物に対して、それらがトランスジェニック非ヒト動物から構成されない種由来の免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコードするDNAに由来するかまたは対応する点で異種である。本発明の１つの局面において、トランスジーンは、個々の遺伝子セグメントが再配置されていない（すなわち、機能的免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするように再配置されていない）ように、構築される。このような再配置されていないトランスジーンは、遺伝子セグメント組換え（機能的再配置）および得られる再配置された免疫グロブリン重鎖および/または軽鎖のトランスジェニック非ヒト動物内での発現を、その動物が抗原に曝露された場合に可能にする。
【００３１】
本発明の１つの局面において、異種重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、再配置されていない異種DNAの比較的大きなフラグメントを含む。このようなフラグメントは、代表的には、異種免疫グロブリン遺伝子座に由来するＣ、Ｊ（および重鎖の場合にはＤ）セグメントの実質的な部分を含む。さらに、このようなフラグメントはまた、可変遺伝子セグメントの実質的な部分を含む。
【００３２】
１つの実施態様において、このようなトランスジーン構築物は、異種DNAに由来する配列に対応する調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、クラススイッチ領域、組換えシグナルなど）を含む。あるいは、このような調節配列は、本発明において使用される非ヒト動物の同一のまたは関連する種に由来するトランスジーンに組み込まれ得る。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、トランスジェニックマウスにおける使用のための齧歯類免疫グロブリンエンハンサー配列と組み合わせられ得る。
【００３３】
本発明の方法において、生殖細胞系の再配置されていない軽鎖および重鎖免疫グロブリントランスジーン（これは、Ｄ細胞分化の間にVDJ連結を経験する）を含むトランスジェニック非ヒト動物は、二次レパートリーＢ細胞における異種抗体の産生を誘導するために抗原と接触される。
【００３４】
本発明にはまた、本発明で使用される非ヒト動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊するためのベクターおよび方法が含まれる。このようなベクターおよび方法は、トランスジーンを利用し、好ましくは、本発明において使用される非ヒト動物に対して内因的な重鎖および/または軽鎖免疫グロブリン鎖をコードするあるクラスの遺伝子セグメントの機能的破壊を標的化するように構築されるポジティブ-ネガティブ選択ベクターである。このような内因性の遺伝子セグメントは、多様性領域遺伝子セグメント、連結領域遺伝子セグメント、および定常領域遺伝子セグメントを含む。本発明のこの局面において、ポジティブ-ネガティブ選択ベクターが、非ヒト動物の少なくとも１つの胚幹細胞に接触され、その後細胞が選択される。ここで、ポジティブ-ネガティブ選択ベクターは、相同組換えによって非ヒト動物のゲノムに組み込まれている。移植の後、得られるトランスジェニック非ヒト動物は、ベクターの染色体DNA中への相同組み込みの結果として、免疫グロブリン媒介性免疫応答を備えることが実質的に不可能である。このような免疫不全非ヒト動物は、その後、免疫不全の研究のために使用され得るか、または異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンのレシピエントとして使用され得る。
【００３５】
本発明はまた、１つ以上の種の免疫グロブリン鎖の発現を、内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊することなく抑制するために有用なベクター、方法、および組成物を提供する。このような方法は、１つ以上の内因性免疫グロブリン鎖の発現を抑制し、一方で１つ以上のトランスジーンにコードされた免疫グロブリン鎖の発現を可能にするために有用である。内因性の免疫グロブリン鎖遺伝子座の遺伝子破壊とは異なり、免疫グロブリン鎖発現の抑制は、破壊された内因性Ig遺伝子座についてホモ接合性であるトランスジェニック動物を樹立するために必要である時間のかかる繁殖を必要としない。内因性Ig遺伝子破壊に比較して、抑制のさらなる利点は、特定の実施態様において、鎖抑制が個々の動物内で可逆的であることである。例えば、Ig鎖抑制は、以下を用いて達成され得る：（１）内因性のIg鎖遺伝子配列に特異的にハイブリダイズするアンチセンスRNAをコードおよび発現するトランスジーン、（２）内因性のIg鎖遺伝子配列に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド、および（３）内因性Ig鎖ポリぺプチドに特異的に結合する免疫グロブリン。
【００３６】
本発明は、以下を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する：機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合性の対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合性の対、異種免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピー、および異種免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピー。ここで、上記動物は、抗原（例えば、ヒト抗原（例えば、CD4））で免疫した後に抗体応答を生じる。本発明はまた、このようなトランスジェニック非ヒト動物を提供する。ここで、上記の機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子は、JH領域相同性組換えノックアウトであり、上記の機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子は、Ｊκ領域相同組換えノックアウトであり、上記異種免疫グロブリン重鎖トランスジーンは、HClまたはHC2ヒトミニ遺伝子トランスジーンであり、上記異種軽鎖トランスジーンは、KC2またはKCleヒトκトランスジーンであり、そして上記抗原は、ヒト抗原である。
【００３７】
本発明はまた、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座を抑制、切断、および/または機能的に破壊するための種々の実施態様を提供する。
【００３８】
本発明はまた、ヒト配列重鎖およびキメラ重鎖（ヒト配列重鎖可変領域およびマウス配列重鎖構築物領域を含む）の両方を発現するトランスジェニックマウスを提供する。このようなキメラ重鎖は、一般に、機能的に再配置されたヒトトランスジーンと内因性マウス重鎖構築物領域（例えば、γ１、γ２ａ、γ２ｂ、γ３）との間でのトランススイッチングによって産生される。このようなキメラ重鎖を、代表的にはトランスジーンにコードされたヒト配列軽鎖または内因性マウス軽鎖との組み合わせで含む抗体は、予め決定された抗原での免疫化に応答して形成される。これらの実施態様のトランスジェニックマウスは、第一の時点でヒト配列重鎖を産生（発現）し、そしてトランススイッチして、第二の（引き続く）時点でヒト可変領域およびマウス定常領域（例えば、マウスγ１、γ２ａ、γ２ｂ、γ３）から構成されるキメラ重鎖を産生（発現）するＢ細胞を含み得る；このようなヒト配列およびキメラ重鎖は、軽鎖を有する機能的な抗体に組み込まれる；このような抗体は、このようなトランスジェニックマウスの血清に存在する。従って、再度述べれば、これらの実施態様のトランスジェニックマウスは、ヒト配列重鎖を発現し、引き続いてスイッチして（トランススイッチングまたはシススイッチングを介して）、ヒト可変領域および代わりの定常領域（例えば、γ１、γ２ａ、γ２ｂ、γ３；ヒトγ、α、ε）から構成されるキメラまたはアイソタイプスイッチ化重鎖を発現するＢ細胞を含み得る；このようなヒト配列およびキメラまたはアイソタイプスイッチ化重鎖は、軽鎖を有する機能的な抗体（ヒトまたはマウス）に組み込まれる；このような抗体は、このようなトランスジェニックマウスの血清に存在する。
【００３９】
本発明はまた、大きなトランスジーンを生成するための方法を提供する。この方法は、哺乳動物細胞に、少なくとも３つのポリヌクレオチド種を導入する工程を包含する。ここで、第一のポリヌクレオチド種は、第二のポリヌクレオチド種と共有する配列同一性の組換え遺伝子（recombinogenic）領域を有し、第二のポリヌクレオチド種は、第一のポリヌクレオチド種と共有する配列同一性の組換え遺伝子領域および第三のポリヌクレオチド種と共有する配列同一性の遺伝子領域を有し、そして第三のポリヌクレオチド種は、上記第二のポリヌクレオチド種と共有する配列同一性の組換え遺伝子領域を有する。
【００４０】
組換え遺伝子領域は、哺乳動物細胞（例えば、ES細胞）においてインビボでの相同組換え、および好ましくは、非哺乳動物真核生物細胞（例えば、Saccharaomycesおよび他の酵母または真菌細胞）の相同組換えを生成するのに充分な実質的配列同一性の領域である。代表的には、組換え遺伝子領域は、少なくとも50〜100000ヌクレオチド長またはこれを超える長さ、好ましくは500ヌクレオチド〜10000ヌクレオ長であり、そしてしばしば80〜100パーセント同一、頻繁には95〜100パーセント同一、そしてしばしば同質遺伝子である。
【００４１】
本明細書中で議論される参考文献は、単に本出願の出願日前のその開示についてのみ提供される。本明細書中には、発明者らに、先行発明のためにこのような開示の日付を早める権利が与えられないことの許可として解釈されるべきものは存在しない。
【００４２】
表１は、ベクターpGPeの配列を示す。
表２は、遺伝子ＶＨ49.8の配列を示す。
表３は、本発明のトランスジェニックマウスの血清中のヒトIgMおよびIgGの検出を示す。
表４は、VDJ連結部の配列を示す。
表５は、成体ヒト末梢血リンパ球（PBL）において見出されるＪセグメントに対する、pHC1トランスジーンにコードされる転写産物に取り込まれたＪセグメントの分布を示す。
表６は、成体ヒト末梢血リンパ球（PBL）において見出されるＤセグメントに対する、pHC1トランスジーンにコードされる転写産物に取り込まれたＤセグメントの分布を示す。
表７は、pHC1トランスジェニックマウスおよびヒトPBlにおけるインフレームのVDJ連結部を有する転写産物からのCDR3ペプチドの長さを示す。
表８は、pHC1トランスジェニックから分析した30個のクローンからのVDJ領域の推定アミノ酸配列を示す。
表９は、示した実験において用いた系統112のトランスジェニックマウスを示す；(＋)は、それぞれのトランスジーンの存在を示す、(++)は、動物がＪＨＤノックアウトトランスジーンについてホモ接合性であることを示す。
表10は、いくつかの0011マウスの遺伝子型を示す。
表11は、トランスジェニックマウスからのハイブリドーマにおけるヒト可変領域使用法を示す。
表12は、トランスジーンＶおよびＪセグメント使用法を示す。
表13は、トランスジェニックマウスにおけるHC2重鎖トランスジーンにおける体細胞変異の出現を示す。
表14は、YAC 4×17E1についてのヒトＶκセグメントの同定を示す。
表15。マウス系統KCo5-9272において発現されるヒトvk遺伝子の同定。
表16。ヒトIgGk抗nCD4モノクローナル抗体についての分泌レベル。
表17。ヒトCD4に結合するモノクローナル抗体についての速度定数および親和定数。
表18。ヒト抗ヒトCD4モノクローナル抗体の親和定数および速度定数。
表19。ヒト抗ヒトCD4モノクローナル抗体のアビディティ定数および速度定数。
表20。抗CD4モノクローナル抗体について報告されたアビディティー定数および速度定数。
表21。フローサイトメトリーにより決定された場合のヒト抗ヒトCD4モノクローナル抗体のアビディティ定数。
表22。機能的転写産物についての部分的ヌクレオチド配列。
表23。ハイブリドーマ転写産物における生殖細胞系V(D)Jセグメント使用法。
表24。ミニ遺伝子構築において使用されるプライマー、ベクター、および産物。
表25。チンパンジー末梢リンパ球に対するヒトmAbの効果。
表26。リンパ節リンパ球についてのフローサイトメトリー研究のまとめ。
表27。モノクローナル抗体分泌、アビディティ、および速度定数。
表28。ヒト抗IL8 mAbの特異性および特徴付け。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
上記で考察してきたように、治療標的および／または診断標的を約束する特異的ヒト抗原と反応性であるヒト免疫グロブリンを生成することが所望される。しかし、ヒト抗原と特異的に反応するヒト免疫グロブリンを生成することは、問題がある。
【００４４】
第１に、Ｂ細胞の供給源として役立つ免疫された動物は、提示された抗原に対して免疫応答しなければならない。動物に免疫応答させるためには、提示された抗原は外来性でなければならず、そして動物は、抗原に対して寛容であってはならない。従って、例えば、ヒトタンパク質に結合するイディオタイプを有するヒトモノクローナル抗体を生成することが所望される場合、自己寛容は、免疫されたヒトが、ヒトタンパク質に対して実質的な免疫応答をすることを防止する。なぜなら、免疫原性であり得る抗原のエピトープのみがヒト集団におけるタンパク質の多型から生じたエピトープ（同種異系エピトープ）であるからである。
【００４５】
第２に、ハイブリドーマを形成するためのＢ細胞の供給源として役立つ動物（例示的に与えた例におけるヒト）が、真正自己抗原に対して免疫応答する場合、重篤な自己免疫疾患がこの動物において生じ得る。ヒトがハイブリドーマについてのＢ細胞の供給源として使用される場合、このような自己免疫は、同時代の標準により倫理的でないと考えられる。従って、所定のヒト抗原と特異的に反応性のヒト免疫グロブリン鎖を分泌するハイブリドーマを開発することは、問題がある。なぜなら、所定のヒト抗原に対する抗体反応を誘起し得るヒト抗体分泌性Ｂ細胞の信頼性のある供給源が必要とされているからである。
【００４６】
ヒト抗原と特異的に反応するヒト抗体を得るために用いられ得る１つの方法論は、本発明のヒト免疫グロブリントランスジーン構築物を保有するトランスジェニックマウスの作製である。手短に言えば、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座の全てもしくは一部を含むトランスジーン、またはヒト重鎖および軽鎖の遺伝子座の必須の機能的エレメントを含む合成「ミニ遺伝子座」を含むトランスジーン（下記に記載され、そして同時係属中の出願である米国特許出願第08/352,322号（1994年12月7日出願）、米国特許出願第07/990,860号（1992年12月16日出願）、米国特許出願第07/810,279号（1991年12月17日出願）、米国特許出願第07/904,068号（1992年6月23日出願）；米国特許出願第07/853,408号（1992年3月18日出願）、米国特許出願第07/574,748号（1990年8月29日出願）、米国特許出願第07/575,962（1990年8月31日出願）およびPCT/US91/06185（1991年8月28日出願）、各々本明細書中に参考として援用される）は、トランスジェニック非ヒト動物を作製するために用いられる。このようなトランスジェニック非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる免疫グロブリン鎖を生成する能力を有し、そしてさらにヒト抗原に対して免疫応答し得る。従って、このようなトランスジェニック動物は、特定されたヒト抗原と反応性である免疫血清の供給源として役立ち得、そしてこのようなトランスジェニック動物からのＢ細胞は、ミエローマ細胞と融合されて、ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされるモノクローナル抗体を分泌し、かつヒト抗原と特異的に反応するハイブリドーマを生成し得る。
【００４７】
種々の形態の免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの作製は、以前に報告されている。再配置されたマウス免疫グロブリン重鎖または軽鎖の遺伝子は、トランスジェニックマウスを作製するために用いられている。さらに、μまたはγ1定常領域を含む機能的に再配置されたヒトIg遺伝子は、トランスジェニックマウスにおいて発現されている。しかし、トランスジーンが再配置されていない（V-D-JまたはV-Jが再配置されていない）免疫グロブリン遺伝子を含む実験は可変であり、いくつかの場合にはトランスジーンの不完全なまたは最少の再配置を生じる。しかし、トランスジーン内のＣＨ遺伝子間で好結果のアイソタイプスイッチを受ける、再配置されたかまたは再配置されていない免疫グロブリントランスジーンは、いずれの例についても公開されていない。
【００４８】
本発明はまた、ヒト定常領域配列に対するポリペプチド結合においてヒトVDJ配列から本質的になるヒト免疫グロブリン鎖を含むモノクローナル抗体を分泌する候補ハイブリドーマを同定する方法を提供する。このような候補ハイブリドーマは、以下を含むハイブリドーマクローンのプールから同定される：(1)ヒトVDJ領域およびヒト定常領域から本質的になる免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマクローン、および(2)ヒトVDJ領域およびマウス定常領域から本質的になるヘテロハイブリッド免疫グロブリン鎖を発現するトランススイッチハイブリドーマ。個々のまたはプールされたハイブリドーマクローンの上清は、所定の抗原、代表的には、固体基体（例えば、マイクロタイターウェル）上に吸着させることにより固定化される抗原と、所定の抗原結合特異性を有する抗体を選択するための結合条件下で接触する。ヒト定常領域に特異的に結合する抗体はまた、抗体が、少なくとも１つのヒト定常領域エピトープに選択的に結合するがマウス定常領域エピトープには実質的に結合せず；従って所定の抗原およびヒト定常領域に特異的に結合する抗体（そしてこれは検出可能な標識またはレポーターで標識され得る）に結合するハイブリドーマ上清（トランスジェニックモノクローナル抗体）から本質的になる複合体を形成するような結合条件下で、ハイブリドーマ上清および所定の抗原と接触する。このような複合体の形成の検出は、ヒト免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマクローンまたはプールを示す。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様では、スクリーニングに用いられる抗ヒト定常領域免疫グロブリンは、非μ、非δアイソタイプ、好ましくはαまたはε、より好ましくはγアイソタイプ定常領域を特異的に認識する。γアイソタイプのモノクローナル抗体が好ましい。なぜなら、(i)IgG免疫グロブリンの特徴付けは、（例えば、IgMペンタマーに比較してIgGダイマーのサイズがより小さいことに起因して）いくつかの治療適用のためにIgM免疫グロブリンに対して好ましいから、および(ii)体細胞変異のプロセスは、μ定常領域から非μ（例えば、γ）定常領域へのクラススイッチと相関するからである。クラススイッチ（例えば、IgG）を受けた免疫グロブリンの集団から選択された免疫グロブリンは、クラススイッチを受けていない（例えば、IgM）集団から選択された免疫グロブリンよりも高い親和性で抗原に結合する傾向がある。例えば、本明細書中に参考として援用されるLonbergおよびHuszar. Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)を参照のこと。
【００５０】
１つの実施態様では、候補ハイブリドーマは、γアイソタイプ定常領域について最初にスクリーニングされ、次いでIgG発現ハイブリドーマのプールは所定の抗原に対する特異的結合についてスクリーニングされる。
【００５１】
従って、本発明によれば、本発明のトランスジェニックマウスは、免疫応答を誘導するために所定の抗原で免疫される。Ｂ細胞はこのマウスから採取され、そして不死細胞と融合されてハイブリドーマを生成する。ハイブリドーマは、非μ、非δアイソタイプのIg（例えば、IgG）を分泌する個々のハイブリドーマを同定するために最初にスクリーニングされる。次いで、このセットのハイブリドーマを、目的の所定の抗原に対する特異的結合についてスクリーニングする。スクリーニングは、例えば、HarlowおよびLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1988)に記載されるような標準的技術を用いて実施される。この方法を用いて、実用的かつ効率的に高親和性免疫グロブリン（例えば、約10７Ｍ−１より大きなKa）を同定し得る。
【００５２】
定義
本明細書中で使用される用語「抗体」は、少なくとも２つの軽いポリペプチド鎖および２つの重いポリペプチド鎖を含む糖タンパク質をいう。重いおよび軽いポリペプチド鎖の各々は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む可変領域（一般に、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含む。重いおよび軽いポリペプチド鎖の各々はまた、免疫系の種々の細胞、いくつかの食細胞、および古典的補体系の第１成分（C1q）を含む宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得るポリペプチド鎖の定常領域（一般に、カルボキシル末端部分）を含む。
【００５３】
本明細書中で使用される「異種抗体」は、このような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関して定義される。異種抗体は、トランスジェニック非ヒト動物から構成されない生物に見出され、そして一般にトランスジェニック非ヒト動物の種以外の種からのアミノ酸配列またはそれに対応するコードDNA配列を有する抗体として定義される。
本明細書中で使用される「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物起源の軽鎖および重鎖を有する抗体をいう。例えば、マウス軽鎖と会合したヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。
【００５４】
本明細書中で使用される「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体のクラス（例えば、IgMまたはIgG1）をいう。
【００５５】
本明細書中で使用される「アイソタイプスイッチ」は、抗体のクラス（すなわちアイソタイプ）が、１つのIgクラスから他の１つのIgクラスに変化する現象をいう。
【００５６】
本明細書中で使用される「スイッチされていないアイソタイプ」は、アイソタイプスイッチが起きない場合に生成される重鎖のアイソタイプクラスをいい；スイッチされていないアイソタイプをコードするＣＨ遺伝子は、代表的には、機能的に再配置されたVDJ遺伝子の直ぐ下流の第１のＣＨ遺伝子である。
【００５７】
本明細書中で使用される用語「スイッチ配列」は、スイッチ組換えを担うDNA配列をいう。「スイッチドナー」配列、代表的には、μスイッチ領域は、スイッチ組換えの間に欠失される構築物領域の5'側（すなわち、下流）である。「スイッチアクセプター」領域は、欠失される構築物領域と、置換定常領域（例えば、γ、εなど）との間である。組換えが常に起きる特異的部位は存在しないので、最終的な遺伝子配列は、代表的にはこの構築物から予測可能ではない。
【００５８】
本明細書中で使用される「グリコシル化パターン」は、タンパク質、より詳細には免疫グロブリンタンパク質に共有結合した炭水化物単位のパターンとして定義される。当業者が異種抗体のグリコシル化パターンを、トランスジーンのＣＨ遺伝子が由来した種よりも非ヒトトランスジェニック動物の種における上記グリコシルパターンにさらに類似すると認識する場合、異種抗体のグリコシル化パターンは、非ヒトトランスジェニック動物の種により生じる抗体に天然に生じるグリコシル化パターンと実質的に類似であると特徴付けられ得る。
【００５９】
本明細書中で使用される「特異的結合」は、以下の抗体の特性をいう：(1)少なくとも１×10７M-1の親和性で所定の抗原に結合すること、および(2)所定の抗原または緊密に関係する抗原以外の非特異的抗原（例えば、BSA、カゼイン）についてのその親和性よりも少なくとも２倍大きな親和性で所定の抗原に優先的に結合すること。
【００６０】
目的物に適用される際に本明細書中で用いられる用語「天然に生じる」は、目的物が、天然に見出され得る事実をいう。例えば、天然の供給源から単離され得、そして研究室においてヒトにより意図的に改変されていない生物体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に生じる。
【００６１】
本明細書中で用いられる用語「再配置された」は、重鎖または軽鎖の免疫グロブリン遺伝子座の配置をいい、ここで、Ｖセグメントは、それぞれ、本質的に完全なＶＨまたはＶＬドメインをコードするコンホメーションでD-JまたはＪセグメントに直ぐ隣接して配置される。再配置された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系DNAに対する比較により同定され得る；再配置された遺伝子座は、少なくとも１つの組換えヘプタマー／ノナマー相同性エレメントを有する。
【００６２】
Ｖセグメントに関して本明細書中で用いられる用語「再配置されていない」または「生殖細胞系配置」は、ＤまたはＪセグメントに直ぐ隣接するようにＶセグメントが組換えされていない配置をいう。
【００６３】
核酸については、用語「実質的相同性」は、２つの核酸、またはその示された配列が、最適にアラインメントおよび比較された場合に、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を有して、少なくとも80％のヌクレオチド、通常少なくとも約90％〜95％、そしてより好ましくは少なくとも約98〜99.5％のヌクレオチドにおいて同一であることを示す。あるいは、実質的相同性は、セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件下でこの鎖の相補体にハイブリダイズする場合に存在する。核酸は、全細胞中に、細胞溶解産物中に、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分または他の夾雑物（例えば、他の細胞核酸またはタンパク質）から（アルカリ/SDS処理、CsCl結合、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当該分野で周知の他の技術を含む）標準的技術により精製される場合に、「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。F.Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)を参照のこと。
【００６４】
天然の配列（改変された制限部位などを除く）であるが、しばしばcDNA、ゲノムまたは混合物からの本発明の核酸組成物は、標準的な技術に従ってそれ自体が変異されて遺伝子配列を提供し得る。コード配列については、これらの変異は、所望によりアミノ酸配列に影響を与え得る。特に、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび本明細書中に記載される他のこのような配列に実質的に相同な、または由来するDNA配列が意図される（ここで、「由来する」は、配列が別の配列に同一であるかまたはそれから改変されることを示す）。
【００６５】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を与える場合は、その配列に作動可能に連結される。転写調節配列に関しては、作動可能に連結される、は、連結されるDNA配列が、隣接し、そしてここで２つのタンパク質コード領域が、隣接してそしてリーディングフレームにおいて連結されることが必要であることを意味する。スイッチ配列については、作動可能に隣接される、は、配列が、スイッチ組換えをもたらし得ることを示す。
【００６６】
異種抗体を生成し得るトランスジェニック非ヒト動物
異種抗体レパートリーを用いて外来抗原刺激に応答するトランスジェニック非ヒト動物の設計は、異種免疫グロブリントランスジーンが、正しくＢ細胞発達経路のいたるところにトランスジェニック動物機能内に含まれたことを必要とする。好ましい実施態様において、異種重鎖トランスジーンの正しい機能は、アイソタイプスイッチングを含む。従って、本発明のトランスジーンは、アイソタイプスイッチング、ならびに以下：（１）高レベルな発現および細胞型特異的発現、（２）機能的な遺伝子再配置、（３）対立遺伝子排除の活性化および対立遺伝子排除に対する応答、（４）十分な一次レパートリーの発現、（５）シグナル伝達、（６）体細胞超変異、および（７）免疫応答間のトランスジーン抗体遺伝子座の優性のうちの１つ以上を生じるように構築される。
【００６７】
以下の開示から明らかなように、前述の基準の全てを満たす必要はない。例えば、トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座が機能的に破壊されている実施態様において、トランスジーンは、対立遺伝子排除を活性化する必要はない。さらに、トランスジーンが、機能的に再配置された重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む実施態様において、機能的な遺伝子再配置の第２の基準は、少なくとも既に再配置されているトランスジーンに不必要である。分子免疫学に関する背景については、Fundamental Immunology,第２版(1989),Paul William E.編,Raven Press,N.Y.（これは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００６８】
本発明の１つの局面において、トランスジェニック動物の生殖細胞系において、再配置された異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーン、再配置されていない異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーン、または再配置されたおよび再配置されていない異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンの組み合わせを含む、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。重鎖トランスジーンの各々は、少なくとも１つのCH遺伝子を含む。さらに、重鎖トランスジーンは機能的アイソタイプスイッチ配列を含み得、これはトランスジェニック動物のＢ細胞において複数のCH遺伝子をコードする異種トランスジーンのアイソタイプスイッチングを支持し得る。このようなスイッチ配列は、トランスジーンCH遺伝子の供給源として役立つ種に由来する生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子座に天然に生じるスイッチ配列であり得るか、またはこのようなスイッチ配列は、トランスジーン構築物を受けることになっている種（トランスジェニック動物）に生じるスイッチ配列に由来し得る。例えば、トランスジェニックマウスを作製するために使用されるヒトトランスジーン構築物は、それがマウス重鎖遺伝子座に天然に生じるスイッチ配列に類似したスイッチ配列を組み込む場合、より高頻度のアイソタイプスイッチング事象を生じ得る。これは、恐らく、マウススイッチ配列はマウススイッチリコンビナーゼ酵素系を伴う機能に最適化されるが、ヒトスイッチ配列は最適化されないからである。スイッチ配列は、従来のクローニング法により単離およびクローニングされ得るか、または免疫グロブリンスイッチ領域配列に関する公開された配列情報に基づいて設計された重複合成オリゴヌクレオチドから新規合成され得る（Millsら、Nucl.Acids Res.18:7305-7316(1991)；Siderasら、Intl.Immunol.1:631-642(1989)、これらは本明細書中に参考として援用される）。
【００６９】
前述のトランスジェニック動物の各々について、機能的に再配置された異種重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、トランスジェニック動物Ｂ細胞の十分な画分（少なくとも10パーセント）に見出される。
【００７０】
本発明のトランスジーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの多様性遺伝子セグメント、１つの接合遺伝子セグメント、および少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするDNAを含む重鎖トランスジーンを含む。免疫グロブリン軽鎖トランスジーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの接合遺伝子セグメント、および少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするDNAを含む。軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらがトランスジェニック非ヒト動物からならない種に由来する免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコードするDNAに由来するか、またはそれに対応する点で、トランスジェニック非ヒト動物に対して異種である。本発明の１つの局面において、トランスジーンは、個々の遺伝子セグメントが再配置されていない（すなわち、機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするように再配置されていない）ように構築される。このような再配置されていないトランスジーンは、Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの組換え（機能的再配置）を支持し、そして好ましくは、抗原に暴露された場合、トランスジェニック非ヒト動物内での、得られた再配置された免疫グロブリン重鎖におけるＤ領域遺伝子セグメントの全てまたは一部の組込みを支持する。
【００７１】
代替の実施態様において、トランスジーンは、再配置されていない「ミニ遺伝子座（mini-locus）」を含む。このようなトランスジーンは、代表的に、Ｃ、Ｄ、およびＪセグメントの実質的部分、ならびにＶ遺伝子セグメントの部分集合を含む。このようなトランスジーン構築物において、種々の調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、クラススイッチ領域、RNAプロセシングのためのスプライスドナーおよびスプライスアクセプター配列、組換えシグナルなど）は、異種DNAに由来する対応する配列を含む。このような調節配列は、本発明において使用される非ヒト動物の同種または関連種からトランスジーンに組み込まれ得る。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、トランスジェニックマウスにおける使用のための齧歯動物免疫グロブリンエンハンサー配列と共にトランスジーン内で組み合わされ得る。あるいは、合成調節配列がトランスジーンに組み込まれ得、ここでこのような合成調節配列は、哺乳動物ゲノムに天然に生じることが知られている機能的DNA配列と相同ではない。合成調節配列は、コンセンサスルール（例えば、スプライスアクセプター部位またはプロモーター／エンハンサーモチーフの許容(permissible)配列を特定するもの）に従って設計される。例えば、ミニ遺伝子座は、天然に生じる生殖細胞系Ig遺伝子座と比較して、非必須DNA部分（例えば、介在配列；イントロンまたはその一部）の少なくとも１つの内部（すなわち、その部分の末端ではない）欠失を有するゲノム免疫グロブリン遺伝子座の一部を含む。
【００７２】
本発明はまた、重鎖および軽鎖トランスジーンを有する生殖細胞系細胞を含むトランスジェニック動物を含み、ここで上記トランスジーンのうちの一方は再配置された遺伝子セグメントを含み、他方は再配置されていない遺伝子セグメントを含む。好ましい実施態様において、再配置されたトランスジーンは軽鎖免疫グロブリントランスジーンであり、そして再配置されていないトランスジーンは重鎖免疫グロブリントランスジーンである。
【００７３】
抗体の構造および作製
全ての免疫グロブリンの基本構造は、２つの軽ポリペプチド鎖および２つの重ポリペプチド鎖からなる単位に基づく。各々の軽鎖は、可変軽鎖領域および定常軽鎖領域として知られる２つの領域を含む。同様に、免疫グロブリン重鎖は、可変重鎖領域および定常重鎖領域と呼ばれる２つの領域を含む。
【００７４】
重鎖または軽鎖の定常領域は、重または軽定常領域遺伝子（CH）セグメントと呼ばれるゲノム配列によりコードされる。特定の重鎖遺伝子セグメントの使用は、免疫グロブリンクラスを規定する。例えば、ヒトにおいて、μ定常領域遺伝子セグメントは抗体のIgMクラスを規定するが、γ、γ2、γ3、またはγ4定常領域遺伝子セグメントの使用は、抗体のIgGクラスならびにIgGサブクラスIgG1〜IgG4を規定する。同様に、α1またはα2定常領域遺伝子セグメントの使用は、抗体のIgAクラスならびにサブクラスIgA1およびIgA2を規定する。δおよびε定常領域遺伝子セグメントは、それぞれ、IgDおよびIgE抗体クラスを規定する。
【００７５】
重および軽免疫グロブリン鎖の可変領域は、共に、抗体の抗原結合ドメインを含む。広範な抗原への結合を可能にするために抗体のこの領域における多様性が必要なため、初期または一次レパートリー可変領域をコードするDNAは、特定の可変領域セグメントファミリーに由来する多数の異なるDNAセグメントを含む。軽鎖可変領域の場合、このようなファミリーは、可変（Ｖ）遺伝子セグメントおよび接合（Ｊ）遺伝子セグメントを含む。従って、軽鎖の初期可変領域は、１つのＶ遺伝子セグメントおよび１つのＪ遺伝子セグメントによりコードされ、各々は、生物のゲノムDNAに含まれるＶおよびＪ遺伝子セグメントのファミリーから選択される。重鎖可変領域の場合、重鎖の初期または一次レパートリー可変領域をコードするDNAは、１つの重鎖Ｖ遺伝子セグメント、１つの重鎖多様性（Ｄ）遺伝子セグメント、および１つのＪ遺伝子セグメントを含み、各々は、ゲノムDNA中の免疫グロブリン遺伝子セグメントの適切なＶ、Ｄ、およびＪファミリーから選択される。
抗体結合部位の形成に寄与する配列の多様性を増大させるために、重鎖トランスジーンは、再配置されたV-D-J遺伝子配列内にＤ領域遺伝子配列の全てまたは一部を組み込み得る、機能的なV-D-J再配置を支持するシス作用配列を含むことが好ましい。代表的に、発現されたトランスジーンコード重鎖（またはmRNA）の少なくとも約１パーセントは、Ｖ領域内に認識可能なＤ領域配列を含む。好ましくは、トランスジーンコードＶ領域の少なくとも約10パーセントは、認識可能なＤ領域配列を含み、より好ましくは少なくとも約30パーセント、最も好ましくは50％を超えて認識可能なＤ領域配列を含む。
【００７６】
認識可能なＤ領域配列は、一般的に、重鎖トランスジーンのＤ領域遺伝子セグメントに存在する配列および／またはこのようなＤ領域ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に対応する、少なくとも約８つの連続ヌクレオチドである。例えば、トランスジーンがＤ領域遺伝子DHQ52を含む場合、Ｖ遺伝子セグメント配列とＪ遺伝子セグメント配列との間のＶ領域に位置する配列5’-TAACTGGG-3’を含むトランスジーンコードmRNAは、Ｄ領域配列（特に、DHQ52配列）を含むので認識可能である。同様に、例えば、トランスジーンがＤ領域遺伝子DHQ52を含む場合、Ｖ遺伝子セグメントアミノ酸配列とＪ遺伝子セグメントアミノ酸配列との間のＶ領域に位置するアミノ酸配列-DAF-を含むトランスジーンコード重鎖ポリペプチドは、Ｄ領域配列（特に、DHQ52配列）を含むので認識可能であり得る。しかし、Ｄ領域セグメントは種々の程度で接合するVDJに組み込まれ得、そして種々のリーディングフレームにおける、重鎖可変領域のＤ領域範囲とトランスジーンに存在するＤ領域セグメントとの比較は、特定のＤセグメントの組込みを決定するために必要である。さらに、組換え間の潜在的なエキソヌクレアーゼ消化は、V-D-J組換え間の不正確なＶ-ＤおよびＤ-Ｊ接合を導き得る。
【００７７】
しかし、体細胞変異およびＮ領域付加のため、いくつかのＤ領域配列は認識可能であり得るが、トランスジーンにおいて連続Ｄ領域配列に全く同じに対応しないことがある。例えば、ヌクレオチド配列5’-CTAAXTGGGG-3’（ここでXはA、T、またはGであり、そしてこれは重鎖Ｖ領域に位置し、そしてＶ領域遺伝子配列およびＪ領域遺伝子配列に隣接される）は、DHQ52配列5’-CTAACTGGG-3’に対応ので認識され得る。同様に、例えば、ポリペプチド配列-DAFDI-、-DYFDY-、または-DAFDI-（Ｖ領域に位置し、そしてアミノ末端側でトランスジーンＶ遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列に隣接され、そしてカルボキシ末端側でトランスジーンＪ遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列に隣接される）は、Ｄ領域配列として認識可能である。
【００７８】
従って、体細胞変異およびＮ領域付加はトランスジーンＤ領域に由来する配列において変異を生じ得るので、以下の定義は、認識可能なＤ領域配列の存在を決定するための指針として提供される。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、（１）配列が、Ｖ領域に位置し、そして一方の側でＶ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列）に、および他方の側でＪ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列）に隣接される場合、および（２）配列が、既知のＤ遺伝子配列（ヌクレオチド配列またはコードされるアミノ酸配列）に実質的に同一であるか、または実質的に類似する場合、Ｄ領域配列として認識可能である。
【００７９】
本明細書中で使用する用語「実質的同一性」とは、ポリペプチド配列または核酸配列の特徴を示し、ここでポリペプチド配列は、参照配列と比較して少なくとも50パーセントの配列同一性、しばしば少なくとも約80％の配列同一性、および時々約90％を超える配列同一性を有し、そして核酸配列は、参照配列と比較して少なくとも70パーセントの配列同一性を有する。配列同一性の割合は、参照配列の総計35パーセント未満になる小さな欠失または付加を排除して計算される。参照配列は、より大きな配列（例えば、全Ｄ遺伝子）の部分集合であり得る；しかし、参照配列は、ポリヌクレオチドの場合、少なくとも８ヌクレオチド長であり、そしてポリペプチド場合、少なくとも３アミノ残基長である。代表的に、参照配列は、少なくとも８〜12のヌクレオチドまたは少なくとも３〜４つのアミノ酸であり、好ましくは、参照配列は、12〜15ヌクレオチド以上または少なくとも５アミノ酸である。
【００８０】
用語「実質的類似性」とは、ポリペプチド配列の特徴を示し、ここでポリペプチド配列は、参照配列と比較して少なくとも80パーセントの類似性を有する。配列類似性の割合は、同一アミノ酸または類似するような位置保存的アミノ酸置換を記録することにより計算される。位置保存的アミノ酸置換は、単一ヌクレオチド置換から生じ得る置換であり；第１のアミノ酸は第２のアミノ酸により置き換えられ、ここで第１のアミノ酸のコドンおよび第２のアミノ酸のコドンは単一ヌクレオチド置換により異なり得る。従って、例えば、配列-Lys-Glu-Arg-Val-は、配列-Asn-Asp-Ser-Val-に実質的に類似する。なぜなら、コドン配列-AAA-GAA-AGA-GUU-は、３つだけの置換変異（４つの最初のコドンのうち３つにおける単一ヌクレオチド置換）を導入することにより-ACC-GAC-AGC-GUU-に変異され得るからである。参照配列は、より大きな配列（例えば、全Ｄ遺伝子）の部分集合であり得る；しかし、参照配列は、少なくとも４アミノ残基長である。代表的に、参照配列は少なくとも５アミノ酸であり、好ましくは、参照配列は６アミノ酸以上である。
【００８１】
一次レパートリー
重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子をコードするDNAを作製するためのプロセスは、発達中のＢ細胞において主に起こる。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの接合の前に、Ｖ、Ｄ、Ｊ、および定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、たいてい、一次レパートリーＢ細胞の前駆体におけるＶ、Ｄ、Ｊ、およびＣ遺伝子セグメントのクラスターにおいて見出される。一般的に、重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントの全ては、単一染色体上で比較的きわめて近接して位置する。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの組換え前のこのようなゲノムDNAは、「再配置されていない」ゲノムDNAと本明細書中で呼ばれる。Ｂ細胞分化の間に、Ｖ、Ｄ、Ｊ（または軽鎖遺伝子の場合、ＶおよびＪのみ）遺伝子セグメントの適切なファミリーメンバー各々のうちの１つが組換えられて、機能的に再配置された重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を形成する。このような機能的な再配置は、機能的な可変領域をコードするDNAを形成するための可変領域セグメントの再配置である。この遺伝子セグメント再配置プロセスは、連続的であると思われる。最初に、重鎖ＤからＪの接合が作られ、続いて重鎖ＶからＤＪの接合および軽鎖ＶからＪの接合が作られる。軽鎖および／または重鎖における機能的可変領域のこの初期形態をコードするDNAは、「機能的に再配置されたDNA」または「再配置されたDNA」と呼ばれる。重鎖の場合、このようなDNAは、「再配置された重鎖DNA」と呼ばれ、そして軽鎖の場合、このようなDNAは、「再配置された軽鎖DNA」と呼ばれる。同様の言葉が、本発明のトランスジーンの機能的再配置を記載するために使用される。
【００８２】
機能的な重鎖および軽鎖可変領域を形成するための可変領域遺伝子セグメントの組換えは、組換え能力があるＶ、Ｄ、およびＪセグメントに隣接する、組換えシグナル配列（RSS）により媒介される。組換えを指向するのに必要かつ十分なRSSは、二回対称７量体、ATリッチ９量体、および12または23いずれかの塩基対の介在スペーサー領域を含む。これれらのシグナルは、Ｄ-Ｊ（またはＶ-Ｊ）組換えを行いそして機能的に交換可能な、異なる遺伝子座および種間で保存される。Oettingerら、(1990),Science,248,1517-1523および本明細書中に引用される参考文献を参照のこと。７量体は、配列CACAGTGまたはそのアナログ、それに続く非保存配列のスペーサーを含み、次いで９量体は、配列ACAAAAACCまたはそのアナログを有する。これらの配列は、ＪまたはＶおよびＤ遺伝子セグメント各々の下流側に見出される。生殖細胞系ＤおよびＪセグメントの直前に、さらに２つの組換えシグナル配列（最初に９量体、次いで７量体）が非保存配列により再び分離される。VL、VH、またはＤセグメント後の７量体および９量体配列は、それらが組換えるJL、Ｄ、またはJHセグメント前の配列に相補的である。７量体配列と９量体配列との間のスペーサーは、12塩基対長または22〜24塩基対長のいずれかである。
【００８３】
Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントの再配置に加えて、さらなる多様性は、軽鎖においてＶセグメントとＪセグメントとの間の、および重鎖においてＤセグメントとＪセグメントとの間の可変組換え(variable recombination)のために、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の一次レパートリーにおいて生成される。このような可変組換えは、このようなセグメントが接合される正確な場所における変化により生じられる。軽鎖におけるこのような変化は、代表的に、Ｖ遺伝子セグメントの最後のコドンおよびＪセグメントの最初のコドン内で起こる。接合における同様の不正確は、ＤセグメントとJHセグメントとの間の重鎖染色体で起こり、そして10ヌクレオチドほどの大きさにわたって伸長し得る。さらに、ゲノムDNAによりコードされない、数ヌクレオチドが、ＤとJHとの間およびVHとＤ遺伝子セグメントとの間に挿入され得る。これらのヌクレオチドの付加は、Ｎ領域多様性として知られる。
ＶＪおよび／またはVDJ再配置の後、再配置された可変領域および再配置された可変領域の下流に位置する１つ以上の定常領域遺伝子セグメントの転写は一次RNA転写物を生成し、ここで適切なRNAスプライシングが完全長の重または軽免疫グロブリン鎖をコードするmRNAをもたらす。このような重鎖および軽鎖は、Ｂ細胞膜貫通領域を通した免疫グロブリンの分泌および／またはＢ細胞膜貫通領域への免疫グロブリンの挿入をもたらすためのリーダーシグナル配列を含む。このシグナル配列をコードするDNAは、重または軽免疫グロブリン鎖の可変領域を形成するために使用されるＶセグメントの最初のエキソン内に含まれる。適切な調節配列はまた、mRNA翻訳を制御して、コードされる重および軽免疫グロブリンポリペプチド（ここでお互いの正しい会合が抗体分子を形成する）を生成するためにmRNAに存在する。
【００８４】
可変領域遺伝子セグメントにおけるこのような再配置およびこのような接合間に起こり得る可変組換えの最終的な効果は、一次抗体レパートリーの生成である。一般的に、この段階までに分化した各Ｂ細胞は、単一の一次レパートリー抗体を生成する。この分化プロセス間に、機能的に再配置されたIg遺伝子内に含まれる遺伝子セグメント以外の遺伝子セグメントの機能的再配置を抑制する細胞事象が起こる。二倍体Ｂ細胞がこのような単一特異性を維持するプロセスは、対立遺伝子排除と呼ばれる。
【００８５】
二次レパートリー
一次レパートリーを含む配列セット内からの免疫グロブリンを発現するＢ細胞クローンは、外来抗原に応答するために直ぐに利用可能である。単純なＶＪおよびVDJ接合により生じた制限された多様性のために、いわゆる一次応答により生成された抗体は、比較的低親和性の抗体である。２つの異なる型のＢ細胞は、この初期応答を構成する：一次抗体形成細胞の前駆体および二次レパートリーＢ細胞の前駆体（Lintonら、Cell 59:1049-1059(1989)）。最初の型のＢ細胞は、特定の抗原に応答するIgM分泌形質細胞に成熟する。他方のＢ細胞は、Ｔ細胞依存性成熟経路に入ることにより抗原への初期暴露に応答する。
【００８６】
抗原刺激Ｂ細胞クローンのＴ細胞依存性成熟の間に、細胞表面上の抗体分子の構造は二通りに変化する：定常領域は非IgMサブタイプに変換し、そして可変領域の配列は複数の単一アミノ酸置換により改変されて、より高い親和性の抗体分子を生成し得る。
【００８７】
以前に示したように、重または軽Ig鎖の各可変領域は抗原結合ドメインを含む。アミノ酸および核酸配列決定により、二次応答間の体細胞変異は、３つの相補性決定領域（CDR1、CDR2、およびCDR3）（超可変領域１、２、および３とも呼ばれる）を含むＶ領域のいたるところで起こることが決定されている（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest(1991)U.S. Department of Health and Human Services,Washington,DC、本明細書中に参考として援用される）。CDR1およびCDR2は、可変遺伝子セグメント内に位置するが、CDR3は、主として、ＶとＪ遺伝子セグメントとの間、またはＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメント間の組換えの結果である。CDR1、2、または3からならない可変領域の部分は、一般的に、FR1、FR2、FR3、およびFR4と称されるフレームワーク領域と呼ばれる。図１を参照のこと。超変異の間、再配置されたDNAは、変化したIg分子を有する新たなクローンを生じさせるように変異される。外来抗原に対してより高い親和性を有するクローンは、発現される抗体の親和性成熟を生じさせる、ヘルパーＴ細胞により選択的に拡大される。クローン選択は、代表的に、CDR1、2、および／または3領域内に新たな変異を含むクローンの発現をもたらす。しかし、抗原結合ドメインの特異性および親和性に影響する、これらの領域外の変異もまた起こる。
【００８８】
異種抗体を生成し得るトランスジェニック非ヒト動物
本発明の１つの局面におけるトランスジェニック非ヒト動物は、本発明の免疫グロブリントランスジーン（下文に記載される）の少なくとも１つを、非ヒト動物の接合子または初期胚に導入することにより作製される。本発明において使用される非ヒト動物は、一般的に、免疫グロブリン遺伝子セグメントを再配置して、一次抗体応答を生じ得る任意の動物を含む。このような非ヒトトランスジェニック動物は、例えば、トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックウシ、および他のトランスジェニック動物種（特に、当該分野で公知の哺乳動物種）を含み得る。特に好ましい非ヒト動物は、マウスまたは齧歯動物科の他のメンバーである。
【００８９】
しかし、本発明は、マウスの使用に限定されない。むしろ、一次および二次抗体応答を上げ得る任意の非ヒト動物が使用され得る。このような動物は、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー）、ウシ、ヒツジ、およびブタ種、齧歯動物科の他のメンバー（例えば、ラット）、ならびにウサギおよびモルモットを含む。特に好ましい動物は、マウス、ラット、ウサギ、およびモルモットであり、特に好ましくはマウスである。
【００９０】
本発明の１つの実施態様において、ヒトゲノムに由来する種々の遺伝子セグメントは、再配置されていない形態で重鎖および軽鎖トランスジーンにおいて使用される。この実施態様において、このようなトランスジーンは、マウスに導入される。軽鎖および／または重鎖トランスジーンの再配置されていない遺伝子セグメントは、マウスゲノムにおける内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントと区別可能なヒト種に独特のDNA配列を有する。それらは、Ｂ細胞からならない生殖細胞系および体細胞において再配置されていない形態で、ならびにＢ細胞において再配置された形態で容易に検出され得る。
【００９１】
本発明の代替の実施態様において、トランスジーンは、再配置された重および／または軽免疫グロブリントランスジーンを含む。機能的に再配置されたVDJまたはＶＪセグメントに対応するこのようなトランスジーンの特定のセグメントは、マウスにおける内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントと明らかに区別可能でもある免疫グロブリンDNA配列を含む。
【００９２】
DNA配列におけるこのような差違はまた、マウスＢ細胞によりコードされるアミノ酸配列と比較して、このようなヒト免疫グロブリントランスジーンによりコードされるアミノ酸配列に反映される。従って、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列は、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされる免疫グロブリンエピトープに特異的な抗体を用いて、本発明のトランスジェニック非ヒト動物において検出され得る。
【００９３】
ヒトまた他種に由来する再配置されていないトランスジーンを含むトランスジェニックＢ細胞は、適切な遺伝子セグメントを機能的に組換えて、機能的に再配置された軽鎖および重鎖可変領域を形成する。このような再配置されたトランスジーンによりコードされる抗体が、本発明を実施するために使用される非ヒト動物において天然に遭遇するDNAおよび／またはアミノ酸配列に対して異種のDNAおよび／またはアミノ酸配列を有することは、容易に明らかである。
【００９４】
再配置されていないトランスジーン
本明細書中で使用する「再配置されていない免疫グロブリン重鎖トランスジーン」は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの多様性遺伝子セグメント、１つの接合遺伝子セグメント、および１つの定常領域遺伝子セグメントを含む。上記の重鎖トランスジーンの遺伝子セグメントの各々は、上記のトランスジーンが導入される非ヒト動物からならない種に由来する免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントをコードするDNAに由来するか、またはそのDNAに対応する配列を有する。同様に、本明細書中で使用する「再配置されていない免疫グロブリン軽鎖トランスジーン」は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの接合遺伝子セグメント、および少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするDNAを含み、ここで上記の軽鎖トランスジーンの各々の遺伝子セグメントは、上記の軽鎖トランスジーンが導入される非ヒト動物からならない種に由来する免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントをコードするDNAに由来するか、またはそのDNAに対応する配列を有する。
【００９５】
本発明のこの局面におけるこのような重鎖および軽鎖トランスジーンは、再配置されていない形態の上記で同定された遺伝子セグメントを含む。従って、適切な組換えシグナル配列（RSS）は、重鎖トランスジーンにおいてＶ、Ｄ、およびＪセグメント間に、および軽鎖トランスジーンにおいてＶとＪセグメントとの間に置かれる。さらに、このようなトランスジーンはまた、定常領域遺伝子セグメントとＶＪまたはVDJ再配置可変領域とを接合するための適切なRNAスプライシングシグナルを含む。
【００９６】
１を超えるＣ領域遺伝子セグメント（例えば、ヒトゲノムに由来するCμおよびCγ1）を含む重鎖トランスジーン内のアイソタイプスイッチングを容易にするために、以下に説明されるような「スイッチ領域」は、このような定常領域間の組換えを許して、免疫グロブリンクラススイッチング（例えば、IgMからIgG）を可能にするために、定常領域遺伝子セグメント各々の上流におよび可変領域遺伝子セグメントの下流に組み込まれる。このような重および軽免疫グロブリントランスジーンはまた、転写制御配列（可変領域遺伝子セグメントの上流に位置し、代表的にTATAモチーフを含む、プロモーター領域を含む）を含む。プロモーター領域は、下流配列に作動可能に連結された場合、下流配列の転写を生じ得るDNA配列とほぼ定義され得る。プロモーターは、効率的な転写を生じるために付加的な連結シス作用配列の存在を必要とし得る。さらに、好ましくは、滅菌（sterile）転写物の転写に関与する他の配列が含まれる。滅菌転写物の発現に関与する配列の例は、刊行された文献（Rothmanら、Intl.Immunol.2:621-627(1990)；Reidら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:840-844(1989)；Stavnezerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7704-7708(1988)；およびMillisら、Nucl.Acids Res.18:7305-7316(1991)（これらの各々は本明細書中に参考として援用される）を含む）に見出され得る。これらの配列は、代表的に、スイッチ領域の直ぐ上流に少なくとも約50bp、好ましくは、スイッチ領域の上流に少なくとも約200bp；より好ましくは、スイッチ領域の上流に少なくとも約200〜1000bp以上を含む。適切な配列は、ヒトSγ1、Sγ2、Sγ3、Sγ4、Sα1、Sα2、およびSεスイッチ領域の直ぐ上流に生じ；ヒトSγ1およびSγ3スイッチ領域の直ぐ上流の配列が有利に使用され得、Sγ1が一般的に好ましい。代替的にまたは組み合せて、マウスIgスイッチ配列が使用され得；トランスジェニック非ヒト動物と同じ種のIgスイッチ配列を使用することはしばしば有利であり得る。さらに、好ましくは、インターフェロン（IFN）誘導性転写調節エレメント（例えば、IFN誘導性エンハンサー）が、トランスジーンスイッチ配列の直ぐ上流に含まれる。
【００９７】
プロモーターに加えて、主としてＢ系統細胞において機能する他の調節配列が使用される。従って、例えば、軽鎖トランスジーン上で好ましくはＪと定常領域遺伝子セグメントとの間に位置する軽鎖エンハンサー配列は、トランスジーン発現を増強し、それにより対立遺伝子排除を容易にするために使用される。重鎖トランスジーンの場合、調節エンハンサーもまた使用される。このような調節配列は、トランスジーンの転写および翻訳を最大にして対立遺伝子排除を誘導し、そして比較的高レベルのトランスジーン発現を提供するために使用される。
【００９８】
前述のプロモーターおよびエンハンサー調節制御配列は包括的に記載されたが、このような調節配列は、非ヒト動物に対して異種であり得、異種トランスジーン免疫グロブリン遺伝子セグメントが得られるゲノムDNAに由来する。あるいは、このような調節遺伝子セグメントは、重および軽トランスジーンを含む、非ヒト動物または密接に関連する種のゲノムにおける対応する調節配列に由来する。
【００９９】
好ましい実施態様において、遺伝子セグメントは、ヒトに由来する。このような重および軽トランスジーンを収容するトランスジェニック非ヒト動物は、このような動物に投与される特異的抗原に対するIg媒介免疫応答を上げ得る。Ｂ細胞は、異種ヒト抗体を生成し得るこのような動物内で生成される。不死化および適切なモノクローナル抗体（Mab）の分泌後、治療ヒトモノクローナル抗体の供給源（例えば、ハイブリドーマ）が提供される。このようなヒトMabは、ヒトに治療的に投与される場合、免疫原性を有意に低減させた。
【０１００】
好ましい実施態様は、ヒト遺伝子セグメントを含む重および軽トランスジーンの構築を開示するが、本発明は、そのように限定されない。この事について、本明細書中に記載される教示は、ヒト以外の種に由来する免疫グロブリン遺伝子セグメントを利用することに容易に適応され得ることが理解されるべきである。例えば、本発明の抗体を用いたヒトの治療処置に加えて、適切な遺伝子セグメントによりコードされる治療抗体は、獣医科学における使用のためのモノクローナル抗体を作製するために利用され得る。
【０１０１】
再配置されたトランスジーン
代替の実施態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動物の生殖細胞系において、少なくとも１つの再配置された異種重鎖免疫グロブリントランスジーンを機能的に含む。このような動物は、このような再配置された重トランスジーンを発現する一次レパートリーＢ細胞を含む。このようなＢ細胞は、好ましくは、抗原と接触させられた場合に体細胞変異を受けて、抗原に対して高い親和性および特異性を有する異種抗体を形成し得る。上記の再配置されたトランスジーンは、少なくとも２つのCH遺伝子およびアイソタイプスイッチングに必要とされる会合された配列を含む。
【０１０２】
本発明はまた、重および軽トランスジーンを有する生殖細胞系細胞を含むトランスジェニック動物を含み、ここで上記のトランスジーンの一方は再配置された遺伝子セグメントを含み、他方は再配置されていない遺伝子セグメントを含む。このような動物において、重鎖トランスジーンは、少なくとも２つのCH遺伝子およびアイソタイプスイッチングに必要とされる会合された配列を有する。
【０１０３】
本発明は、本発明のトランスジーンにおいて使用される、合成可変領域遺伝子セグメントレパートリーを作製するための方法をさらに含む。この方法は、免疫グロブリンＶセグメントDNAの集団を作製する工程を包含し、ここでＶセグメントDNAの各々は、免疫グロブリンＶセグメントをコードし、そして各末端に制限エンドヌクレアーゼの切断認識部位を含む。免疫グロブリンＶセグメントDNAの集団は、その後、合成免疫グロブリンＶセグメントレパートリーを形成するために鎖状につながれる。このような合成可変領域重鎖トランスジーンは、少なくとも２つのCH遺伝子およびアイソタイプスイッチングに必要とされる会合された配列を有する。
【０１０４】
アイソタイプスイッチング
Ｂリンパ球の発達において、細胞は、最初に、豊富に再配置されたVHおよびVL領域により決定される結合特異性を有するIgMを生成する。続いて、各Ｂ細胞およびその子孫細胞は、同じＬおよびＨ鎖Ｖ領域を有する抗体を合成するが、それらはＨ鎖のアイソタイプを交換する。
【０１０５】
μまたはδ定常領域の使用は、IgMおよびIgDが単一細胞で共同発現されることを可能にするオルタナティブスプライシングにより大いに決定される。他の重鎖アイソタイプ（γ、α、およびε）は、遺伝子再配置事象がCμおよびCδエキソンを欠失させた後に、反対に発現されるだけである。この遺伝子再配置プロセス（アイソタイプスイッチングと呼ばれる）は、代表的に、各重鎖遺伝子（δを除く）の直ぐ上流に位置する、いわゆるスイッチセグメント間の組換えにより起こる。個々のスイッチセグメントは長さが２〜10kbであり、そして主に短い反復配列からなる。組換えの正確な地点は、個々のクラススイッチング事象で異なる。cDNA由来CHプローブを用いた溶液ハイブリダイゼーションキネティクスまたはサザンブロッティングを使用した研究は、スイッチングが細胞からのCH配列の消失に関連し得ることを確認した。
【０１０６】
μ遺伝子のスイッチ（Ｓ）領域、Sμはコード配列の約１〜２kb 5’側に位置し、そして形態(GAGCT)n(GGGGT)（ここでｎは、通常２〜５であるが、17ほどに変化し得る）の配列の非常に多くの縦列反復からなる（T.Nikaidoら、Nature 292:845-848(1981)を参照のこと）。
【０１０７】
数キロ塩基にわたる同様の内部反復スイッチ配列は、他のCH遺伝子の5’に見出された。Sα領域は配列決定され、そして縦列反復80bp相同性単位からなることが見出されたが、マウスSγ2a、Sγ2b、およびSγ3は全て、互いに非常に類似した反復49bp相同性単位を含む。（P.Szurekら、J.Immunol 135:620-626(1985)およびT.Nikaidoら、J.Biol.Chem.257:7322-7329(1989)（これらは本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。全ての配列決定されたＳ領域は、Sμ遺伝子の基本反復エレメントである５量体GAGCTおよびGGGGTの非常に多くの出現を含む（T.Nikaidoら、J.Biol.Chem.257:7322-7329(1989)（これは本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）；他のＳ領域において、これらの５量体はSμのように正確に縦列反復されないが、その代わりにより大きな反復単位に埋め込まれる。Sγ1領域は付加的な高次構造である：２つの直列反復配列が、49bp縦列反復の２つのクラスターの各々に隣接する。（M.R.Mowattら、J.Immunol.136:2674-2683(1986)（これは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０１０８】
ヒトＨ鎖遺伝子のスイッチ領域は、それらのマウスホモログに非常に類似することが見出されている。確かに、CH遺伝子の5’のヒトクローンおよびマウスクローン対間の類似性は、Ｓ領域に限定されることが見出された（これらの領域の生物学的重要性を確認する事実）。
【０１０９】
μ遺伝子とα遺伝子との間のスイッチ組換えは、複合のSμ-Sα配列を生成する。典型的に、Sμまたは任意の他のS領域のいずれにおいても、特異的な部位は存在しない。
一般的に、V-J組換えの酵素学的機構とは異なり、スイッチ機構は、生殖細胞系S前駆体の反復される相同領域の異なるアラインメントを明らかに提供し得、次いでアラインメント内の異なる位置での配列を接合する。（T.H.Rabbitsら、Nucleic Acids Res. 9:4509-4524（1981）およびJ. Ravetchら、Proc．Natl. Acad．Sci．USA 77:6734-6738（1980）を参照のこと、これらは本明細書中に参考として援用される。）
【０１１０】
特定のアイソタイプへのスイッチングの選択的な活性の機構の厳密な詳細は、知られていない。リンホカインおよびサイトカインのような外因性の影響は、アイソタイプ特異的リコンビナーゼをアップレギュレートし得るが、同じ酵素学的機構が全てのアイソタイプへのスイッチを触媒すること、および特異性が特異的なスイッチ領域に対するこの機構の標的化に頼ることもまた可能である。
【０１１１】
Ｔ細胞由来のリンホカインであるIL-4およびIFNγは、あるアイソタイプの発現を特異的に発現することが示されており：マウスにおいて、IL-4は、IgM、IgG2a、IgG2b、およびIgG3の発現を減少し、ならびにIgEおよびIgG1の発現を増加する；一方、IFNは、IgG2aの発現を選択的に刺激し、そしてIgEおよびIgG1の発現におけるIL-4誘導性の増加を拮抗する（Coffmanら、J．Immunol. 136:949（1986）およびSnapperら、Science 236:944（1987）、これらは本明細書中に参考として援用される）。IL-4およびIL-5の組合せは、IgA発現を促進する（Coffmanら、J．Immunol. 139:3685（1987）、これは本明細書中に参考として援用される）。
【０１１２】
スイッチに対するＴ細胞の効果を含意する実験のほとんどは、特定のスイッチ組換えを伴う、観察される細胞の増加が予めスイッチされるかまたは予め拘束される細胞の選択を反映し得る可能性を除外しないできた；しかしもっともありそうな説明は、リンホカインが、スイッチ組換えを実際に促進するということである。
【０１１３】
クラススイッチングの誘導は、スイッチセグメントの上流で開始する無効な（sterile）転写物と関連するようである（Lutzkerら、Mol．Cell．Biol．8:1849（1988）；Stavenezerら、Proc. Natl．Acad．Sci. USA 85:7704（1988）；EsserおよびRadbruch、EMBO J. 8:483（1989）；Bertonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2829（1989）；Rothmanら、Int. Immunol. 2:621（1990）、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）。例えば、観察される、IL-4によるγ1の無効な転写物の誘導、およびIFN-γによる阻害は、IL-4が、培養中のＢ細胞において、γ1へのクラススイッチングを促進し、一方IFN-γが、γ1発現を阻害するという観察と相関する。それゆえ、無効な転写物の転写を影響する調節配列の含有はまた、アイソタイプスイッチングの速度を影響し得る。例えば、特定の無効な転写物の転写を増加することは、典型的に、近接のスイッチ配列を含むアイソタイプスイッチ組換えの頻度を増強すると予測され得る。
【０１１４】
これらの理由のために、トランスジーンは、アイソタイプスイッチングについて利用されるべき各スイッチ領域の約１〜２kb上流内に転写調節配列を組込むことが好ましい。これらの転写調節配列は、好ましくは、プロモーターおよびエンハンサーエレメントを含み、そしてより好ましくは、スイッチ領域と天然で会合される（すなわち、生殖細胞系配置において生じる）５’隣接（すなわち、上流）領域を含む。この５’隣接領域は、典型的に、少なくとも約50ヌクレオチド長、好ましくは約少なくとも200ヌクレオチド長、およびより好ましくは少なくとも500〜1000ヌクレオチドである。
【０１１５】
１つのスイッチ領域からの５’隣接配列は、トランスジーン構築についての異なるスイッチ領域に作動可能に連結され得（例えば、ヒトSγ1スイッチからの５’隣接配列は、Sα1スイッチの直ぐ上流に移植され得；マウスSγ1隣接領域は、ヒトγ1スイッチ配列に近接して移植され得；またはマウスSγ1スイッチは、ヒトγ1領域上に移植され得）るが、いくつかの好ましい実施態様において、トランスジーン構築物中に組込まれた各スイッチ領域は、天然に生じる生殖細胞系配置において直ぐ上流に存在する５’隣接領域を有することが好ましい。
【０１１６】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、当業者によく知られている種々の技術によって得ることができる。簡潔には、所望の抗原で免疫された動物からの脾臓細胞が、一般に黒色腫細胞との融合によって不死化される（KohlerおよびMilstein、Eur．J．Immunol.、6:511-519（1976）を参照のこと）。免疫化の代替の方法は、エプスタインバールウイルス、ガン遺伝子、もしくはレトロウイルスでの形質転換、または当該分野において周知の他の方法を包含する。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、抗原についての所望の特異性および親和性を有する抗体の産生について、スクリーニングされ、そしてこのような細胞によって産生されるのモクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔への注入を含む種々の技術によって増強され得る。これらの分野において有用な種々の技術が、例えば、HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New York（1988）（以下を含む：免疫グロブリンを生成するための動物の免疫化；モノクローナル抗体の産生；プローブとしての使用のための標識化免疫グロブリン；イムノアフィニティー精製；およびイムノアッセイ）において考察される。
【０１１７】
トランスジェニック一次レパートリー
Ａ．ヒト免疫グロブリン遺伝子座
トランスジーン機能についての重要な要件は、広範囲の抗原についての二次免疫応答を誘発するのに十分に多様性である一次抗体レパートリーの作製である。再配置された重鎖遺伝子は、シグナルペプチドエキソン、可変領域エキソン、および多重ドメイン定常領域の直列アレイからなり、これらのそれぞれは、いくつかのエキソンによってコードされる。定常領域遺伝子のそれぞれは、免疫グロブリンの異なるクラスの定常部分をコードする。Ｂ細胞発達の間、定常領域に近位のV領域は、欠失され、新しい重鎖クラスの発現に導く。各重鎖クラスについて、RNAスプライシングの代替のパターンは、膜貫通のおよび分泌される免疫グロブリンの両方を生じる。
【０１１８】
ヒト重鎖遺伝子座は、２Mbにおよぶ約200個のV遺伝子セグメント（現在のデータは、約50〜100個のV遺伝子セグメントの存在を支持する）、約40kbにおよぶ約30個のD遺伝子セグメント、３kbの範囲内で密集される６個のJセグメント、および約300kbにわたって広がる９個の定常領域遺伝子セグメントからなることが見積もられる。完全な遺伝子座は、第14染色体の長碗の遠位の部分の約2.5Mbにおよぶ。
【０１１９】
Ｂ．遺伝子フラグメントトランスジーン
１．重鎖トランスジーン
好ましい実施態様において、免疫グロブリン重鎖トランスジーンおよび軽鎖トランスジーンは、ヒトからの再配置されていないゲノムDNAを含む。重鎖の場合において、好ましいトランスジーンは、670〜830kbの間の長さを有するNotIフラグメントを含む。このフラグメントの長さは、３’制限部位が正確にマッピングされていないので、不明瞭である。しかし、α1遺伝子セグメントとΨα遺伝子セグメントの間にあることが知られている。このフラグメントは、公知のVHファミリーの６つ全てのメンバー、DおよびJ遺伝子セグメント、ならびにμ、δ、γ3、γ1、およびα1定常領域を含む（Bermanら、EMBO J. 7:727-738（1988）、これは本明細書中に参考として援用される）。このトランスジーンを有するトランスジェニックマウス系統は、ほとんどの抗原についての二次応答を誘発するための可変領域の十分に大きなレパートリーとともに、Ｂ細胞の発達に必要とされる重鎖クラス（IgM）および少なくとも１つのスイッチ化重鎖クラス（IgG1）を正確に発現する。
【０１２０】
２．軽鎖トランスジーン
ヒト軽鎖遺伝子座からの必要な遺伝子セグメントおよび調節配列の全てを含むゲノムフラグメントは、同様に構築され得る。このようなトランスジーンは、実施例において、および米国特許出願第07/574,748号のもと、1990年８月29日に出願された「異種抗体を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物」という名称の同時係属中の出願において記載されるように構築される。
【０１２１】
Ｃ．インビボ組換えによって細胞内で作製されるトランスジーン
単一のDNAフラグメント上の、重鎖遺伝子座の全てまたは部分を単離する必要はない。従って、例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座からの670〜830kbのNotIフラグメントは、トランスジェネシスの間、非ヒト動物においてインビボで形成され得る。このようなインビボトランスジーン構築は、２つ以上の重複するDNAフラグメントを、非ヒト動物の胚核に導入することによって生成される。DNAフラグメントの重複する部分は、実質的に相同であるDNA配列を有する。胚核内に含まれるリコンビナーゼへの曝露の際、重複するDNAフラグメントは、正しい配向で相同組換えして、670〜830kbのNotI重鎖フラグメントを形成する。
【０１２２】
インビボトランスジーン構築は、任意の数の免疫グロブリントランスジーンを形成するために使用され得、これは、それらの大きさのために、そうでなければ、現在の技術によって作製または操作することは困難であるか、または不可能である。従って、インビボトランスジーン構築は、YACベクターによって操作され得るDNAフラグメントよりも大きい免疫グロブリンを作製するために有用である（MurrayおよびSzostak、Nature 305:189-193（1983））。このようなインビボトランスジーン構築は、非ヒト動物に、トランスジェニック非ヒト動物からならない種からの実質的に完全な免疫グロブリン遺伝子座を導入するために使用され得る。
【０１２３】
ゲノム免疫グロブリントランスジーンに加えて、インビボ相同組換えはまた、実施例に記載されるように、「ミニ−遺伝子座」トランスジーンを形成するために利用され得る。
【０１２４】
インビボトランスジーン構築を利用する好ましい実施態様において、各重複するDNAフラグメントは、好ましくは、あるDNAフラグメントの末端部分と第２のDNAフラグメントの末端部分との間に、重複する実質的に相同なDNA配列を有する。DNAフラグメントのこのような重複する部分は、好ましくは、約500bp〜約2000bp、最も好ましくは、1.0kb〜2.0kbを含む。インビボでトランスジーンを形成するための重複するDNAフラグメントの相同組換えは、米国特許出願第07／574,747号のもと、1990年８月29日に出願された、「DNAフラグメントの相同組換えによるDNAの細胞内作製」という名称の一般に譲渡された米国特許出願において、さらに記載される。
【０１２５】
Ｄ．ミニ遺伝子座トランスジーン
本明細書中で使用されるように、用語「免疫グロブリンミニ遺伝子座」は、通常、約150kb未満の、典型的に、約25kbと100kbとの間の、DNA配列（これは、より長い配列の中にあり得る）をいい、少なくとも以下のそれぞれ１つ：機能的な可変（V）遺伝子セグメント、機能的な接合（J）領域セグメント、少なくとも１つの機能的な定常（C）領域遺伝子セグメント、および（それが重鎖ミニ遺伝子座である場合）機能的な多様性（D）領域セグメントを含み、それによってこのDNA配列は、少なくとも１つの実質的な不連続性（例えば、相同なゲノムDNA配列に比べて、通常、少なくとも約２〜５kb、好ましくは10〜25kb、または超える、欠失）を含む。軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンは、少なくとも25kb長、典型的に50〜60kbである。重鎖トランスジーンは、典型的に、約70〜80kb長、好ましくは、スイッチ領域に作動可能に連結された２つの定常領域を有する少なくとも約60kbである。さらに、ミニ遺伝子座の個々のエレメントは、好ましくは生殖細胞系配置においてであり、およびミニ遺伝子座のエレメントによって完全にコードされる多様な抗原特異性を有する、機能的な抗体分子を発現するように、トランスジェニック動物のＢ細胞前駆体において、遺伝子再配置を受け得る。さらに、少なくとも２つのCH遺伝子および必要なスイッチング配列を含む重鎖ミニ遺伝子座は、典型的にアイソタイプスイッチングを受け得、これによって異なる免疫グロブリンクラスの機能的な抗体分子が作製される。このようなアイソタイプスイッチングは、トランスジェニック非ヒト動物内に存在するＢ細胞において、インビボで生じ得るか、またはトランスジェニック非ヒト動物から外植されたＢ細胞系統の培養細胞において生じ得る。
【０１２６】
代替の好ましい実施態様において、免疫グロブリン重鎖トランスジーンは、１つ以上のそれぞれのVH、D、およびJH遺伝子セグメント、ならびに２つ以上のCH遺伝子を含む。各適切なタイプの遺伝子セグメントの少なくとも１つは、ミニ遺伝子座トランスジーンに組込まれる。重鎖トランスジーンのCHセグメントに関して、トランスジーンが、少なくとも１つのμ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの他の定常領域遺伝子セグメント、より好ましくはγ遺伝子セグメント、および最も好ましくはγ3またはγ1を含むことが好ましい。この優先性は、コードされる免疫グロブリンのIgM形態とIgG形態との間のクラススイッチング、および高度に親和性の非IgM免疫グロブリンの分泌可能な形態の産生を許容するものである。IgD、IgA、およびIgEの産生をコードする定常領域遺伝子セグメントのような、他の定常領域遺伝子セグメントがまた使用され得る。
【０１２７】
当業者はまた、トランスジーンを作製し、ここでは重鎖CH遺伝子の存在の順序が、CH遺伝子のドナーとして作用する種の生殖細胞系において見出される天然に生じる空間的な順序とは異なる。
【０１２８】
さらに、当業者は、１つよりも多い個々の種からCH（例えば、同種CH遺伝子）を選択し得、そしてこの遺伝子を、アイソタイプスイッチングを受け得る余剰のCH遺伝子として、トランスジーンに組込み得る：次いで、得られるトランスジェニック非ヒト動物は、いくつかの実施態様において、トランスジーンCH遺伝子が得られた種において表されるアロタイプの全てを含む種々のクラスの抗体を作製し得る。
【０１２９】
なおさらに、当業者は、トランスジーンに組込むために、異なる種からのCH遺伝子を選択し得る。機能的なスイッチ配列は、各CH遺伝子とともに含まれるが、スイッチ配列は、必ずしもCH遺伝子に近接して天然に生じる配列ではない。種間のCH遺伝子の組合せは、種々の種からのCH遺伝子に対応する種々のクラスの抗体を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物を生成する。種間CHトランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト動物は、脊椎動物使用について、モノクローナルを生成するためのハイブリドーマを構築するための、Ｂ細胞の供給源として作用し得る。
【０１３０】
ヒトにおける重鎖Ｊ領域セグメントは、６つの機能的なＪセグメント、およびDNAの３kbのストレッチに密集される３つの偽遺伝子を含む。その比較的小型のサイズ、ならびに単一の23kbのSFiI／SpeIフラグメントにおけるμ遺伝子およびδ遺伝子の５’部分とともに、これらのセグメントを単離する能力を考慮すると（Sadoら、Biochem．Biophys．Res．Comm. 154:264271（1988）、これは本明細書中に参考として援用される）、J領域遺伝子セグメントの全てが、ミニ遺伝子座構築物において使用されることが好ましい。このフラグメントが、μ遺伝子とδ遺伝子との間の領域におよぶので、これはμ発現のために必要とされる３’シス連結化調節エレメントの全てを含むようである。さらに、このフラグメントは完全なＪ領域を含むので、これは重鎖エンハンサーおよびμスイッチ領域を含む（Millsら、Nature 306:809（1983）；YancopoulosおよびAlt、Ann．Rev．Immunol．4:339−368（1986）、これらは、本明細書中に参考として援用される）。これはまた、VDJ接合化を誘発して一次レパートリーＢ細胞を形成する転写開始部位を含む（YancopoulosおよびAlt、Cell 40:271−281（1985）、これは本明細書中に参考として援用される）。あるいは、36kbのBssHII/SpeI1フラグメントは、D領域上の一部を含み、23kbのSfiI/SpeI1フラグメントの代わりに使用され得る。このようなフラグメントの使用は、効率の良いD〜J接合化を促進するための５’隣接配列の量を増加する。
【０１３１】
４つの相同な９kbの小領域からなるヒトD領域は、直列に連結され（Siebenlistら（1981）、Nature、294、631-635）。このような小領域は、10個までの個々のDセグメントを含む。これらのセグメントのいくつかは、マッピングされており、そして図４に示される。２つの異なるストラテジーが、ミニ遺伝子座D領域を作製するために使用される。第１のストラテジーは、１つまたは２つの反復されるD小領域を含むDNAの短い連続的なストレッチに配置されるそれらのDセグメントのみを使用することを包含する。候補は、12個の個々のDセグメントを含む単一の15kbフラグメントである。DNAのこの断片は、２つの連続的なEcoRIフラグメントからなり、および完全に配列決定されている（Ichiharaら（1988）、EMBO J.、7、4141-4150）。12個のDセグメントは、一次レパートリーについて十分であるべきである。しかし、D領域の分散された性質を考慮すると、代替のストラテジーは、フラグメントを含む数個の非連続的なDセグメントをともに連結すること、より多数のセグメントを有するDNAのより小さな断片を生成することである。さらなるDセグメント遺伝子が、例えば、特徴的な隣接のナノマーおよびヘプタマーの配列の存在によって（上述）、ならびに文献の参照によって、同定され得る。
【０１３２】
少なくとも１つの、および好ましくは１つよりも多くのV遺伝子セグメントが、重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンを構築するために使用される。隣接配列を伴う、もしくは伴わない、再配置された、または再配置されていないVセグメントは、同時係属出願の、1990年８月29日に出願された米国特許出願第07/574,748号、1991年８月28日に出願されたPCT/US91/06185、および1991年12月17日に出願された米国特許出願第07/810,279号（これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）において記載されるように単離され得る。
【０１３３】
隣接配列を伴う、もしくは伴わない、再配置された、または再配置されていないVセグメント、Dセグメント、Jセグメント、およびC遺伝子は、同時係属出願の、1990年８月29日に出願された米国特許出願第07/574,748号、1991年８月28日に出願されたPCT/US91/06185において記載されるように単離され得る。
【０１３４】
ミニ遺伝子座軽鎖トランスジーンは、ヒトλおよびκ免疫グロブリン遺伝子座から同様に構築され得る。
【０１３５】
従って、V、D、J、および定常領域配列をコードする、例えば約75kbの、免疫グロブリン重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン構築物が、例えば、複数のDNAセグメントから形成され得、各配列は、ヒト遺伝子配列に実質的に相同である。好ましくは、配列は、転写調節配列に作動可能に連結され、および再配置を受け得る。２つ以上の適切に置かれた定常領域配列（例えば、μおよびγ）ならびにスイッチ領域を伴って、スイッチ組換えがまた生じる。例示的な軽鎖トランスジーン構築物は、同時係属出願の、1990年８月29日に出願された米国特許出願第07/574,748号において記載されるように、ヒトDNAに実質的に相同な、および再配置を受け得る、複数のDNAフラグメントから同様に形成され得る。
【０１３６】
Ｅ．アイソタイプスイッチングし得るトランスジーン構築物
理想的には、クラススイッチングを受けることが意図されるトランスジーン構築物は、無効な転写物を調節するために必要なシス作用性配列の全てを含むべきである。天然に生じるスイッチ領域、ならびに上流プロモーターおよび調節配列（例えば、IFN-誘導性のエレメント）は、アイソタイプスイッチングをし得るトランスジーン構築物において含まれる好ましいシス作用性配列である。約少なくとも50塩基対の、好ましくは約少なくとも200塩基対の、およびより好ましくは少なくとも約500〜1000塩基対の、またはそれ以上の、スイッチ領域（好ましくはヒトγ1スイッチ領域）の直ぐ上流の配列が、スイッチ配列（好ましくはヒトγ1スイッチ配列）に作動可能に連結されるべきである。さらに、スイッチ領域は、特定のスイッチ領域の隣りに天然には存在しないCH遺伝子の上流で（およびこれに近接して）連結され得る。例えば、限定のためではないが、ヒトγ1スイッチ領域は、ヒトα2、CH遺伝子から上流で連結され得るか、またはマウスγ1スイッチは、ヒトCH遺伝子に連結され得る。
【０１３７】
トランスジェニックマウスにおいて非伝統的なアイソタイプスイッチング（例えば、δ-関連性の欠失）得るための代替の方法は、ヒトμ遺伝子に隣接する400bpの直接反復配列（σμおよびｅμ）の含有を包含する（Yasuiら、Eur．J．Immunol. 19:1399（1989））。これらの２つの配列間の相同組換えは、IgDのみのB細胞においてμ遺伝子を欠失する。重鎖トランスジーンは、以下の公式的な記載によって表され得る。
(VH)x-(D)y-(JH)Z-(SD)m-(C1)n-[(T)-(SA)P-(C2)]q
ここで：
VHは、重鎖可変領域遺伝子セグメントであり、
Dは、重鎖D（多様性）領域遺伝子セグメントであり、
JHは、重鎖J（接合）領域遺伝子セグメントであり、
SDは、Saアクセプター領域セグメントとともに組換え事象に関与し得るドナー領域セグメントであり、これによってアイソタイプスイッチングが生じ、
C1は、Ｂ細胞発達において利用されるアイソタイプをコードする重鎖定常領域遺伝子セグメント（例えば、μまたはδ）であり、
Tは、少なくとも１つのプロモーターを含むシス作用性の転写調節領域セグメントであり、
SAは、選択されたSDドナー領域セグメントとともに組換え事象に関与し得るアクセプター領域セグメントであり、これによってアイソタイプスイッチングが生じ、
C2は、μ以外のアイソタイプ（例えば、γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2、ε）をコードする重鎖定常領域遺伝子セグメントである。
x、y、z、m、n、p、およびqは整数である。xは１〜100であり、nは０〜10であり、yは１〜50であり、pは１〜10であり、zは１〜50であり、qは０〜50であり、mは０〜10である。典型的には、トランスジーンがアイソタイプスイッチングをし得る場合、qは少なくとも１であるべきであり、mは少なくとも１であり、nは少なくとも１であり、およびmはnよりも大きいかまたはこれに等しい。
【０１３８】
VH、D、JH、SD、C1、T、SA、およびCZセグメントは、種々の種から、好ましくは哺乳動物種から、およびより好ましくはヒトおよびマウス生殖細胞系DNAから、選択され得る。
【０１３９】
VHセグメントは、種々の種から選択され得るが、好ましくは、ヒト生殖細胞系において天然に生じるVHセグメント（VH251のような）から選択される。典型的に約２個のVH遺伝子セグメントが含まれ、好ましくは、約４個のVHセグメントが含まれ、および最も好ましくは、少なくとも約10個よりも多いVHセグメントが含まれる。
【０１４０】
少なくとも１つのDセグメントが、典型的に含まれるが、少なくとも10個のDセグメントが、好ましくは含まれ、そしていくつかの実施態様は、10個以上のDセグメントを含む。いくつかの好ましい実施態様は、ヒトDセグメントを含む。
【０１４１】
典型的に少なくとも１つのJHセグメントがトランスジーンに組込まれるが、約６個のJHセグメントを含むことが好ましく、そしていくつかの好ましい実施態様は、６個よりも多いJHセグメントを含む。いくつかの好ましい実施態様は、ヒトJHセグメントを含み、そしてさらに好ましい実施態様は、６個のヒトJHセグメントを含み、および非ヒトJHセグメントを含まない。
【０１４２】
SDセグメントは、トランスジーンのSAセグメントとともに組換え事象に関与し得るドナー領域である。伝統的なアイソタイプスイッチングについて、SDおよびSAは、スイッチ領域（例えば、Sμ、Sγ1、Sγ2、Sγ3、Sγ4、Sα、Sα2、およびSe）である。好ましくは、スイッチ領域は、マウスまたはヒトであり、より好ましくは、SDは、ヒトまたはマウスのSμであり、およびSAは、ヒトまたはマウスのSγ1である。非伝統的なアイソタイプスイッチング（δ関連性の欠失）について、SDおよびSAは、好ましくは、ヒトμ遺伝子を隣接する400bpの直接反復配列である。
【０１４３】
C1セグメントは、典型的に、μ遺伝子またはδ遺伝子、好ましくはμ遺伝子、およびより好ましくはヒトまたはマウスのμ遺伝子である。
【０１４４】
Tセグメントは、典型的に、天然に生じる（すなわち、生殖細胞系の）スイッチ領域に近接するS’隣接配列を含む。Tセグメントは、典型的に、約少なくとも50ヌクレオチド長、好ましくは、約少なくとも200ヌクレオチド長、およびより好ましくは少なくとも500〜1000ヌクレオチド長である。好ましいTセグメントは、生殖細胞系配置におけるヒトまたはマウスのスイッチ領域の直ぐ上流に存在する５’隣接配列である。Tセグメントが、動物生殖細胞系において天然には生じないシス作用性転写調節配列（例えば、SV40、アデノウイルス、および真核生物細胞を感染する他のウイルスにおいて見出されるエンハンサーおよびプロモーターような、ウイルスのエンハンサーおよびプロモーター）を含み得る。
【０１４５】
C2セグメントは、γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2、またはｅ、CH遺伝子、好ましくは、これらのアイソタイプのヒトCH遺伝子、およびより好ましくはヒトγ2またはγ3遺伝子である。下流（すなわち、スイッチ化）アイソタイプ遺伝子は種々の種を形成し得るので、マウスγ2aおよびγ2bがまた使用され得る。重鎖トランスジーンが、免疫グロブリン重鎖ミニ遺伝子座を含む場合、トランスジーンの全長は、典型的に150kbp以下である。
【０１４６】
一般に、トランスジーンは、ネイティブな重鎖Ig遺伝子座以外である。従って、例えば、不必要な領域の欠失、または他の種からの対応の領域との置換が、存在する。
【０１４７】
Ｆ．Igトランスジーンにおける機能的なアイソタイプスイッチングを決定するための方法
トランスジェニック非ヒト動物におけるイソタイプスイッチングの存在は、当業者に公知の任意の任意の方法によって同定され得る。好ましい実施態様は、以下の物を含み、単一でまたは組合わせて用いられ得る：
１．δ以外のCH遺伝子の下流の少なくとも１つのトランスジーンに相同な配列、およびVH-DH-JH再配置された遺伝子に相同な近接配列を含むmRNA転写物の検出；このような検出は、ノザンハイブリダイゼーション、S1ヌクレアーゼ保護アッセイ、PCR増幅、cDNAクローニング、または他の方法によってであり得る；
２．トランスジェニック動物の血清における、またはトランスジェニック動物のＢ細胞から作製されたハイブリドーマ細胞の培養物の上清における、CH遺伝子の下流によってコードされる免疫グロブリンタンパク質の検出、ここで、このようなタンパク質はまた、機能的な可変領域を含むことが、免疫化学法によって示され得る；
３．トランスジェニック動物のＢ細胞からのDNAにおける、またはハイブリドーマ細胞からのゲノムDNAにおける、トランスジーン中のアイソタイプスイッチングの存在と一致する、DNA再配置の検出、このような検出は、サザンブロットハイブリダイゼーション、PCR増幅、ゲノムクローニング、もしくは他の方法によって達成され得る；または
４．アイソタイプスイッチングの他の徴候（例えば、無効な転写物の生成、スイッチングに関与する特徴的な酵素（例えば、「スイッチリコンビナーゼ」の生成）、または現代の技術によって検出、測定、もしくは観察され得る他の明示の検出。
【０１４８】
各トランスジェニック系統は、トランスジーンの取込みの異なる部位、およびトランスジーン挿入物の潜在的に異なる直列アレイを表し得るので、ならびにトランスジーンの各異なる配置、および隣接のDNA配列は、遺伝子発現を影響するので、高レベルの、特にIgGアイソタイプのヒト免疫グロブリンを発現し、ならびにトランスジーンのコピーの最も少ない数を含むマウスの系統を同定および使用することが好ましい。単一コピーのトランスジェニックは、不完全な対立遺伝子発現の潜在的な問題を最小にする。トランスジーンは、典型的に、宿主染色体DNAに、最も通常には生殖細胞系DNAに取込まれ、そして生殖細胞系トランスジェニック飼育ストック動物のその後の飼育によって増殖される。しかし、現在当該分野において知られている、またはその後に開発される他のベクターおよびトランスジェニック法が、適切なように、および実施者によって所望されるように、置換えられ得る。
【０１４９】
内因性非ヒト重鎖定常領域遺伝子のトランス−スイッチングが生じ得、そしてキメラ重鎖およびこのようなキメラヒト／マウス重鎖を含む抗体が生成され得る。このようなキメラ抗体は、本明細書中に記載される一定の使用のために所望され得るか、または所望されないかもしれない。
【０１５０】
Ｇ．内因性免疫グロブリン遺伝子座の機能的な破壊
首尾良く再配置された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のトランスジーンの発現は、トランスジェニック非ヒト動物において、内因性の免疫グロブリン遺伝子の再配置を抑制することによって、優勢な効果を有することが予測される。しかし、内因性抗体を欠く非ヒトを作製するための別の方法は、内因性免疫グロブリン遺伝子座を変異することによる。胚幹細胞技術および相同組換えを使用して、内因性免疫グロブリンレパートリーは、容易に削除され得る。以下は、マウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的な破壊（description）を記載する。しかし、開示されるベクターおよび方法は、他の非ヒト動物における使用について、容易に適合され得る。
【０１５１】
簡潔には、この技術は、生殖細胞組織に分化し得る多能性の細胞株における、相同組換えによる、遺伝子の不活性化を包含する。変化された、コピーのマウス免疫グロブリン遺伝子を含むDNA構築物が、胚幹細胞の核に導入される。細胞の一部分において、導入されたDNAは、内因性コピーのマウス遺伝子と組換わり、内因性コピーを変化されたコピーで置換える、新しく操作された遺伝子損傷を含む細胞は、宿主マウス胚に注入され、これはレシピエント雌性に再着床される。これらの胚のいくつかは、変異細胞株から完全に由来する生殖細胞を保有するキメラマウスに発達する。それゆえ、キメラマウスを飼育することによって、導入された遺伝子損傷を含む新しい系統のマウスを得ることが可能である（Capecchi（1989）、Science、244、1288−1292によって概説される）。
【０１５２】
マウスλ遺伝子座は、わずか５%の免疫グロブリンに貢献するので、重鎖および／またはk-軽鎖の遺伝子座の不活性化は十分である。これらの遺伝子座のそれぞれを破壊するための３つの方法、J領域の欠失、J-Cイントロンエンハンサーの欠失、および停止コドンの導入による定常領域コード配列の破壊がある。最後の選択項目は、DNA構築物設計の点から、最も簡単である。μ遺伝子の削除は、Ｂ細胞成熟を破壊し、それによって、任意の機能的な重鎖セグメントへのクラススイッチングを妨げる。これらの遺伝子座をノックアウトするためのストラテジーは、以下に概説される。
【０１５３】
マウスμ遺伝子およびκ遺伝子を破壊するために、標的化ベクターが、マウスβ2-μグロブリン遺伝子の首尾良い破壊についてJaenischおよび共同研究者（Zijlstraら（1989）、Nature、342、435-438）によって用いられた設計に基づいて、使用される。プラスミドpMCIneoからのネオマイシン抵抗性遺伝子（neo）が、標的遺伝子のコード領域に挿入される。pMCIneo挿入物は、ハイブリッドウイルスプロイモーター／エンハンサー配列を使用して、neo発現を駆動する。このプロモーターは、胚幹細胞において活性である。それゆえ、neoは、ノック-アウト構築物の取込みについての選択マーカーとして使用され得る。HSVチミジンキナーゼ（tk）遺伝子は、ランダムな挿入事象に対するネガティブな選択マーカーとして構築物の末端に付加される（Zijlstraら、上述）。
【０１５４】
重鎖遺伝子座を破壊するための好ましいストラテジーは、J領域の削除である。この領域は、マウスにおいてかなり小型であり、わずか1.3kbにおよぶ。遺伝子標的化ベクターを構築するために、マウスゲノムライブラリーからの分泌されるA定常領域エキソンの全てを含む15kb KpnIフラグメントが単離される。1.3kbのJ領域は、pMCIneoからの1.1kb挿入物と置換えられる。次いで、HSV tk遺伝子は、KpnIフラグメントの５’末端に付加される。相同組換えを介する、この構築物の正確な取込みは、neo遺伝子でのマウスJH領域の置換えを生じる。組換え体は、neo遺伝子に基づくプライマー、およびD領域におけるKpnIの５’のマウス配列に相同なプライマーを使用して、PCRによってスクリーニングされる。
【０１５５】
あるいは、重鎖遺伝子座は、μ遺伝子のコード領域の破壊によってノックアウトされる。このアプローチは、以前のアプローチにおいて使用されるのと同じ15kb KpnIフラグメントを含む。pMCIneoからの1.1kb挿入物は、第２エキソンにおける単独のBamHI部位で挿入され、そしてHSV tk遺伝子は、３’KpnI末端に付加される。neo挿入物の両側における二重交差事象は、tk遺伝子を削除し、次いで選択される。これらは、PCR増幅によって、選択されたクローンのプールから検出される。PCRプライマーの一方は、neo配列に由来し、他方は標的化ベクターの外側のマウス配列に由来する。マウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的な破壊は、実施例において示される。
【０１５６】
Ｇ. 内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現を抑制する
内因性Ig遺伝子座の機能的な破壊に加えて、内因性Ig遺伝子座の発現を妨げるための代替の方法は、抑制である。内因性Ig遺伝子の抑制は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって、１つ以上の取込まれたトランスジーンから生成されるアンチセンスRNAを用いて、および／または１つ以上の内因性Ig鎖に特異的な抗血清の投与によって、達成され得る。
【０１５７】
アンチセンスポリヌクレオチド
アンチセンスRNAトランスジーンは、特定の遺伝子の、部分的なまたは全体的なノック−アウト発現のために用いられ得る（Pepinら（1991）Nature 355:725；Helene., C.およびToulme, J.（1990）Biochimica Biophys. Acta 1049：99；Stout，J.およびCaskey，T.（1990）Somat．Cell．Mol．Genet. 16:369；Munirら（1990）Somat．Cell Mol．Genet. 16:383、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）。
「アンチセンスポリヌクレオチド」は、以下の：（１）参照配列（例えば、内因性Ig CHまたはCL領域の配列）の全てまたは部分に相補的である、および（２）相補的な標的配列（例えば、染色体遺伝子遺伝子座またはIg mRNA）に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。このような相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、関連の標的配列に対する特異的なハイブリダイゼーションがポリヌクレオチドの機能的な特性として保持されるかぎり、ヌクレオチドの置換、付加、欠失、または転移を含み得る。相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、個々のmRNA種に特異的にハイブリダイズし得る、ならびに転写、および／またはmRNA種のRNAプロセシング、および／またはコードされるポリペプチドの翻訳を妨げ得る、可溶性のアンチセンスRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドを含む（Chingら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A. 86:10006-10010（1989）；Broderら、Ann．Int．Med．113:604-618（1990）；Loreauら、FEBS Letters 274:53-56（1990）；Holcenbergら、WO91/11535；米国特許出願第07/530,165号（「新規なヒトCRIPTO遺伝子」）；WO91/09865；WO91/04753；WO90/13641；およびEP 386563、これらのそれぞれは本明細書中に参考として援用される）。アンチセンス配列は、少なくとも約15の連続したヌクレオチド長の、典型的には少なくとも20〜30ヌクレオチド長の、および好ましくは約30ヌクレオチド長を超える、少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子配列に相補的である、ポリヌクレオチド配列である。しかし、いくつかの実施態様において、アンチセンス配列は、特異的なハイブリダイゼーションが、アンチセンスポリヌクレオチドの特性として保持される限り、相補的な免疫グロブリン遺伝子配列と比較して、置換、付加、または欠失を有し得る。一般に、アンチセンス配列は、免疫グロブリン鎖をコードする、またはDNA再配置後にコードする可能性を有する、内因性の免疫グロブリン遺伝子配列に相補的である。いくつかの場合において、免疫グロブリン遺伝子配列に対応するセンス配列は、特に転写を妨げることによって、発現を抑制するために機能し得る。
【０１５８】
それゆえ、アンチセンスポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチドの産生を阻害する。この点に関して、１つ以上の内因性Ig遺伝子座の転写および／または翻訳を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドは、内因性Ig遺伝子座によってコードされる免疫グロブリン鎖を生成する非ヒト動物の受容力および／または特異性を変化し得る。
【０１５９】
アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクト体細胞もしくはトランスジェニック細胞（たとえば、個々の造血幹細胞集団の全てもしくは部分を再配置するために使用されるトランスジェニック多能性造血幹細胞）、またはトランスジェニック非ヒト動物において、異種発現カセットから生成され得る。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、インビトロでの培養培地において、またはインビボでの循環系もしくは間質液においてのいずれかで、外部環境に投与される。外部環境に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは、細胞質を介して得られること、および特定のmRNA種の翻訳を阻害することが示されている。いくつかの実施態様において、アンチセンスポリヌクレオチドは、リン酸メチル部分を含み、あるいは、ホスホロチオレート、またはO-メチルリボヌクレオチドが使用され得、およびキメラオリゴヌクレオチドがまた使用され得る（Dagleら（1990）Nucleic Acids Res. 18:4751）。いくつかの適用について、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリアミド核酸を含み得る（Nielsenら（1991）Science 254:1497）。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般的な方法について、Antisense RNA and DNA、（1988）、D.A. Melton編、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NYを参照のこと）。
【０１６０】
１つ以上の配列に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドが、転写、RNAのプロセシング、および／または同族mRNA種の翻訳を阻害するために使用され、そしてそれによってそれぞれのコードされるポリペプチドの量の減少を生じる。このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、インビボで、１つ以上の内因性のIg鎖の形成を阻害することによって治療的機能を提供し得る。
【０１６１】
可溶性のアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、またはアンチセンストランスジーンから転写されたアンチセンスRNAの場合にかかわらず、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、インビボで生理学的条件で内因性のIg配列に優先的にハイブリダイズするように選択される。最も代表的には、選択されるアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の重鎖または軽鎖トランスジーンによってコードされる異種Ig配列には評価し得るほどにはハイブリダイズしない（すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約25〜35％より多くはトランスジーンIgの発現を阻害しない）。
【０１６２】
坑血清抑制
内因性のIg鎖の発現の部分的または完全な抑制は、１つ以上の内因性のIg鎖に対する坑血清でマウスを注射することによって行われ得る（Weissら、（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. （U.S.A.）81，211、これは、本明細書中で参考として援用されている）。坑血清は、１つ以上の内因性の（例えば、マウス）Ig鎖と特異的に反応するが、本発明のIgトランスジーンによってコードされる異種Ig鎖と最少の交差反応性を有するかまたはまったく交差反応性を有さないように、選択される。従って、Weissら（前出）のスケジュールに象徴されるスケジュールに従う、選択された坑血清の投与は、内因性のIg鎖の発現を抑制するが、本発明のトランスジーンによってコードされる異種Ig鎖（単数または複数）の発現を許容する。抗体のための適切な抗体供給源として以下が挙げられる：
（１）モノクローナル抗体（例えば、マウスμ、γ、κ、またはλ鎖に特異的に結合するが、本発明のヒトIgトランスジーンによってコードされるヒト免疫グロブリン鎖（単数または複数）とは反応しないモノクローナル抗体）；
（２）このようなモノクローナル抗体の混合物、その結果、この混合物は、単一の種の内因性のIg鎖上の複数のエピトープと、複数の内因性のIg鎖（例えば、マウスμおよびマウスγ）と、または複数のエピトープおよび複数の鎖もしくは内因性の免疫グロブリンと結合する；
（３）ポリクローナル坑血清またはその混合物、代表的には、このような坑血清／坑血漿は、単一の種の内因性のIg鎖（例えば、マウスμ、マウスγ、マウスκ、マウスλ）への結合、または複数の種の内因性のIg鎖への結合について単特異的であり、そして最も好ましくは、このような坑血清は、本発明のトランスジーンによってコードされるヒト免疫グロブリン鎖に対して無視できる結合を有する；ならびに／あるいは
（４）ポリクローナル坑血清と、単一または複数の種の内因性Ig鎖に結合するモノクローナル抗体との混合物、そして最も好ましくは、本発明のトランスジーンによってコードされるヒト免疫グロブリン鎖に対する無視できる結合を有する。一般に、ポリクローナル抗体が好ましく、そしてこのような実質的に単特異的ポリクローナル抗体は、非ヒト動物種（例えば、マウス）に由来する抗体でのプレ吸着により、および／または、例えば、固定化したヒトIgを含む親和性樹脂上での坑血清またはその精製された画分のアフィニティークロマトグラフィーによって、ヒト免疫グロブリンに対して惹起された坑血清から有利に産生され得る（ここで、結合した画分は、坑血清中の所望の坑ヒトIgについて富化される；結合した画分は代表的には、低pHの条件またはカオトロピック塩溶液で溶出される）。
【０１６３】
細胞の分離および／または完全な固定は、内因性の（例えば、マウス）免疫グロブリン鎖を発現するリンパ球の抗体に指向される細胞除去の増強を提供するために使用され得る。１つの実施態様において、例えば、抗体は、ヒトIgトランスジーンを有するトランスジェニックマウスから得られる、マウスIgを発現する外植された造血細胞および／またはＢ系統リンパ球のエキソビボでの除去のために使用される。従って、造血細胞および／またはＢ系統リンパ球は、ヒトIgトランスジーンを有する（好ましくは、ヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスジーンの両方を有する）トランスジェニック非ヒト動物から外植され、そして外植された細胞は、抗体（単数または複数）とともにインキュベートされ、ここで抗体は、（１）内因性の免疫グロブリン（例えば、マウスμおよび／またはκ）に結合し、そして（２）トランスジーン（単数または複数）によってコードされるヒト免疫グロブリン鎖に対する実質的な結合を欠失している。このような抗体は、明確にするために、「サプレッション抗体」と呼ばれる。外植された細胞の集団は、サプレッション抗体（単数または複数）に結合する細胞が選択的に除去されている；このような除去は、例えば以下のような種々の方法によって達成され得る：（１）結合していない細胞からサプレッション抗体と結合した細胞を除去するための物理的な分離（例えば、サプレッション抗体は、サプレッション抗体に結合する細胞を固定および除去するために、固体支持体または磁気ビーズに結合され得る）、（２）サプレッション抗体によって結合された細胞の抗体依存性の細胞殺傷（例えば、ADCCによって、補体結合によって、またはサプレッション抗体に連結させた毒素によって）、および（３）サプレッション抗体によって誘導されるクローンのアネルギ−など。
【０１６４】
頻繁に、内因性のIg鎖の産生の抗体抑制のために使用される抗体は、補体結合し得る。このような抗体がエキソビボ／インビトロでの除去のための簡便な補体供給源と十分に反応するように選択され得る（例えば、ウサギ、またはモルモット補体）ことがしばしば好ましい。インビボでの除去のために、一般に、サプレッサー抗体が非ヒトトランスジェニック動物種中でエフェクター機能を有することが好ましく；従って、マウスのエフェクター機能（例えば、ADCCおよび補体結合）を有するサプレッション抗体が、一般に、トランスジェニックマウスでの使用に好ましい。
【０１６５】
１つのバリエーションにおいて、予め決定された内因性の免疫グロブリン鎖に特異的に結合するサプレッション抗体が、内因性の免疫グロブリンを発現するリンパ球のエキソビボ／インビトロでの除去のために使用される。ヒト免疫グロブリントランスジーンを有するトランスジェニック非ヒト動物由来の細胞性の外植片（例えば、リンパ球サンプル）は、サプレッション抗体と接触させられ、そしてサプレッション抗体に特異的に結合する細胞が除去される（例えば、固定化、補体結合などによる）。これによって、内因性の（非ヒト）免疫グロブリンを発現する細胞（例えば、マウスIgを発現するリンパ球）において、除去された細胞の亜集団が作製される。得られる除去されたリンパ球集団（Ｔ細胞、ヒトIgポジティブＢ細胞など）が、同種の免疫適合性（すなわち、MHC適合性）の非ヒト動物に導入され、これは、内因性の抗体を実質的に産生し得ない（例えば、SCIDマウス、RAG-1またはRAG-2ノックアウトマウス）。次いで、再構成された動物（マウス）は、高親和性（親和的に飽和した）抗体およびこのような抗体を産生するＢ細胞を得るために、抗原で免疫され得る（または外植片が得られたドナー動物を免疫化するために使用される抗原で再免疫される）。このようなＢ細胞は、従来の細胞融合物によってハイブリドーマを生成するために使用され得、そしてスクリーニングされ得る。抗体抑制は、他の内因性のIg不活化／抑制方法（例えば、JHノックアウト、CHノックアウト、Ｄ領域切除、アンチセンス抑制、埋め合わせ（compensated）フレームシフト不活化）と組み合わせて使用され得る。
【０１６６】
完全な内因性のIg遺伝子座の不活化
特定の実施態様において、ヒトの可変領域および非ヒト（例えば、マウス）定常領域を含むハイブリッド免疫グロブリン鎖が形成（例えば、トランスジーンと内因性のIg配列との間でのトランススイッチングによる）され得ないように、内因性のIg遺伝子座の完全な不活化を実施することが所望される。内因性の重鎖対立遺伝子を有するノックアウトマウスは、JH領域のみにおいて機能的に破壊されており、しばしば、トランススイッチングを示す（代表的には、ここで、トランスジーンによってコードされる再配置されたヒトの可変領域（VDJ）が、内因性のマウス定常領域に連結された融合タンパク質として発現されるが、他のトランススイッチ化された連結が可能である）。この潜在的な問題を克服するために、一般に、以下を含むがこれらに限定されない任意の種々の方法によって内因性の重鎖遺伝子座を完全に不活化することが所望される：（１）内因性の重鎖定常領域遺伝子の少なくとも１つおよび好ましくは全てでの相同組換えによる、機能的な破壊および／または除去、（２）短縮産物またはフレームシフト産物（トランススイッチ化の場合）の産生のために終結コドンをコード（または、フレームシフト）するような、内因性の重鎖定常領域遺伝子の少なくとも１つおよび好ましくは全てでの変異、ならびに、当業者に明らかな他の方法およびストラテジー。重鎖定常領域遺伝子および／またはＤ領域遺伝子の実質的な一部または全ての除去は、相同組換え標的ベクター（特に、「ヒット-アンド-ラン（hit-and-run）」型など）による連続的な除去を含む種々の方法によって達成され得る。同様に、内因性の軽鎖定常領域の遺伝子を切除するために、少なくとも１つの内因性の軽鎖遺伝子座（たとえば、κ）の機能的な破壊および／または除去が、しばしば好ましい。
【０１６７】
頻繁に、フレームシフトトランスジーンを使用することが所望され、ここで、異種トランスジーンは、遺伝子の１つ以上の（好ましくは、全ての）トランスジーン定常領域の最初の領域（すなわち、アミノ末端コード部分）においてＪセグメント中のフレームシフト（単数または複数）および埋め合わせフレームシフトを含む（すなわち、元々のリ−ディングフレームを再生するため）。内因性のIgH遺伝子座定常遺伝子に対するトランススイッチング（埋め合わせフレームシフトを含まない）は、短縮型産物またはミスセンス産物を生じ、これは、除去されるかまたは選択されないトランススイッチ化されたＢ細胞を生じ、従って、トランススイッチ化表現形を抑制する。
【０１６８】
アンチセンス抑制および抗体抑制はまた、内因性のIg遺伝子産物の発現（例えば、マウス重鎖および軽鎖配列）および／またはトランススイッチ化抗体（例えば、ヒト可変／マウス定常キメラ抗体）の実質的に完全な機能的不活化を行うために使用され得る。
【０１６９】
不活化および抑制ストラテジーの種々の組み合わせが、内因性（例えば、マウス））のIg鎖の発現の本質的に全ての抑制を行うために使用され得る。
【０１７０】
トランススイッチング
いくつかのバリエーションにおいて、トランススイッチ化免疫グロブリンを産生することが所望され得る。例えば、このようなトランススイッチ化重鎖は、キメラであり得る（すなわち、非マウス（ヒト）可変領域およびマウス定常領域）。このようなキメラトランススイッチ化免疫グロブリンを含む抗体は、非ヒト（例えば、マウス）定常領域を有することが所望される種々の適用（例えば、宿主中でのエフェクター機能の維持のため、ヒト定常領域に結合しない二次抗体の結合のためのようなマウスの免疫学的決定基の存在のため）に使用され得る。１つの実施例において、ヒトの可変領域のレパートリーは、特定の抗原に関するマウスの可変領域のレパートリーと比較した場合に、利点を有する。おそらく、ヒトVH、D、JH、VL、およびJL遺伝子は、特定の進化的に重要な抗原に結合する免疫グロブリンをコードするそれらの能力について進化の間に選択されてきた；マウスのレパートリーについて進化的な選択圧を提供する抗原は、ヒトのレパートリーを形付けるための進化的な圧力を提供するこれらの抗原から区別され得る。他のレパートリーの利点は、マウスの定常領域（例えば、トランススイッチ化マウス）アイソタイプと組み合わせた場合に、ヒトの可変領域のレパートリーの利点を有利にし得る。マウスの定常領域の存在は、ヒトの定常領域を越える利点を与え得る。例えば、トランススイッチングによってヒトの可変領域に連結されたマウスのγ定常領域は、マウスのエフェクター機能（例えば、ADCC、マウスの補体結合）を有する抗体を提供し得、その結果、予め決定された抗原と反応するこのようなキメラ抗体（好ましくは、モノクローナル）（例えば、ヒトIL-2レセプター）は、マウスの疾患モデル（例えば、移植片対宿主疾患のマウスモデル、ここで、マウス中のＴリンパ球が、機能的なヒトIL-2レセプターを発現する）で試験され得る。続いて、ヒトの可変領域をコードする配列が単離され得（例えば、供給源（ハイブリドーマクローン）からのPCR増幅またはcDNAクローニングによる）、そして免疫原性が好ましくは最小化される、ヒトの治療的用途により適切なヒト配列抗体をコードするように、所望のヒト定常領域をコードする配列がスプライシングされ得る。得られる完全なヒトコード配列（単数または複数）を有するポリヌクレオチド（単数または複数）は、宿主細胞中で発現され得（例えば、哺乳動物細胞中で発現ベクターから）、そして薬学的処方のために精製され得る。いくつかの適用のために、キメラ抗体は、ヒトの定常領域でマウスの定常領域を置換することなく直接使用され得る。トランススイッチ化キメラ抗体の他のバリエーションおよび用途が、当業者に明らかである。
【０１７１】
本発明は、一般に、ヒトの重鎖トランスジーンと内因性のマウス重鎖定常領域遺伝子との間のトランススイッチングによって生じる、キメラ抗体を発現するＢリンパ球を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。このようなキメラ抗体は、ヒト配列可変領域およおびマウス定常領域を含み、一般に、マウススイッチ化（すなわち、非μ、非δ）アイソタイプである。予め決定された抗原に対するキメラ抗体を作製し得るトランスジェニック非ヒト動物はまた、通常、ヒト重鎖およびヒト軽鎖トランスジーンをコードするヒト可変領域遺伝子およびヒト定常領域遺伝子の両方が組み込まれる場合に、完全なヒト配列抗体を作製する能力を有する。最も代表的には、動物は、機能的に破壊された重鎖遺伝子座および／または軽鎖遺伝子座についてホモ接合型であるが、トランススイッチング（たとえば、γ、α、ε）を維持し、１つ以上の内因性の重鎖定常領域遺伝子（単数または複数）、そしてしばしば、シス連結されたエンハンサーを維持している。このようなマウスは、予め決定された抗原で、通常はアジュバントと組み合わせて免疫され、そしてマウスの定常領域配列に連結されたヒト配列の可変領域からなる重鎖を含むキメラ抗体の検出可能な量を含む免疫応答が産生される。代表的には、このような免疫された動物の血清は、このようなキメラ抗体を、少なくとも約１μg/ml、しばしば、少なくとも約10μg/ml、頻繁に、少なくとも約30μg/ml、そして約50〜100μg/mlまで、またはそれ以上の濃度で含み得る。キメラヒト可変／マウス定常領域重鎖を含む抗体を含有する坑血清はまた、ヒト可変／ヒト定常領域（完全なヒト配列）重鎖を含む抗体を含む。キメラトランススイッチ化抗体は通常、（１）ヒトの可変領域およびマウスの定常領域（代表的にはマウスγ）からなるキメラ重鎖、ならびに（２）ヒトトランスジーンがコードする軽鎖（代表的には、κ）またはマウス軽鎖（代表的には、κノックアウトバックグラウンド中のλ）を含む。このようなキメラトランススイッチ化抗体は一般に、予め決定された抗原（例えば、免疫原）に、少なくとも約1×107M-1の親和性で、好ましくは、少なくとも約5×107M-1の親和性で、より好ましくは、少なくとも1×108M-1〜1×109M-1またはそれ以上の親和性で結合する。しばしば、予め決定された
抗原は、ヒトタンパク質（例えば、ヒト細胞表面抗原（例えば、CD4、CD8、IL-8、IL-2レセプター、EGFレセプター、PDGFレセプター））、他のヒトの生物学的な巨大分子（例えば、トロンボモジュリン、プロテインＣ、炭水化物抗原、シアリルLewis抗原、L-セレクチン）または非ヒト疾患関連巨大分子（例えば、細菌のLPS、ビリオンキャプシドタンパク質、またはエンベロープ糖タンパク質）など）である。
【０１７２】
本発明は、以下を含むゲノムを含む、トランスジェニック非ヒト動物を提供する：（１）トランススイッチングし得る（例えば、機能的なスイッチ組換え配列に対して、および代表的には機能的なエンハンサーに対してシス連結して）少なくとも１つのマウス定常領域遺伝子を含む、同種接合型の機能的に破壊された内因性の重鎖遺伝子座、（２）機能的なヒト重鎖可変領域をコードしそして発現するように再配置され得、そしてトランススイッチング（例えば、シス連結されたRSSを有する）され得るヒト重鎖トランスジーン；必要に応じて、さらに、（３）機能的なヒト軽鎖可変領域をコードするように再配置され得、そしてヒト配列軽鎖を発現し得るヒト軽鎖（例えば、κ）トランスジーンを含み；必要に応じてさらに、（４）ホモ接合型の機能的に破壊された内因性の軽鎖遺伝子座（κ、好ましくは、κおよびλ）を含み；ならびに、必要に応じてさらに、（５）ヒトトランスジーンによってコードされるヒト配列の可変領域からなるキメラ重鎖、および内因性のマウス重鎖定常領域遺伝子によってコードされるマウス定常領域遺伝子（例えば、γ1、γ2a、γ2b、γ3）を含む抗体を含む血清を含む。
【０１７３】
このようなトランスジェニックマウスはさらに、予め決定されたヒト抗原（例えば、CD4、CD8、CEA）に、少なくとも約1×104M-1の親和性で、好ましくは、少なくとも約5×104M-1の親和性で、より好ましくは、少なくとも1×107M-1〜1×109M-1またはそれ以上の親和性で結合するキメラ抗体を含む血清を、さらに含み得る。頻繁に、ハイブリドーマが産生され得、ここで、これによって、産生されるモノクローナル抗体は、少なくとも8×107M-1の親和性を有する。マウス定常領域およびヒト可変領域からなる重鎖を含む、しばしば、非ヒト抗原に結合し得るキメラ抗体はまた、血清中に存在し得るか、またはハイブリドーマから分泌される抗体として存在し得る。
【０１７４】
いくつかのバリエーションにおいて、完全な重鎖定常領域遺伝子を維持している不活化された内因性のマウス重鎖遺伝子座を有し、そしてトランススイッチングし得るヒト重鎖トランスジーンを有するトランスジェニックマウスを生成することが所望される。そして必要に応じて、また、ヒト軽鎖トランスジーンを有し、必要に応じて、１つ以上の不活化された内因性のマウス軽鎖遺伝子座を有する。このようなマウスは、完全なヒト重鎖を含む抗体、およびキメラ（ヒト可変／マウス定常）重鎖を含む抗体を、トランススイッチングによって別々に発現し得るＢ細胞を有利に産生し得る。上記のマウスの血清は、完全なヒト重鎖を含む抗体、およびキメラ（ヒト可変／マウス定常）重鎖を含む抗体を、好ましくは、完全なヒト軽鎖と組み合わせて含む。ハイブリドーマは、上記のマウスのＢ細胞から生成され得る。
【０１７５】
一般に、このようなキメラ抗体は、トランススイッチングによって生成され、ここで、ヒトトランスジーンがコードするヒト可変領域（インビボでの生産的なV-D-J再配置によってコードされる）およびヒト定常領域（代表的には、ヒトμ）は、非トランスジーン免疫グロブリン定常遺伝子スイッチ配列（RSS）でのスイッチ組換えを受け、それによって、上記のトランスジーンによってはコードされない重鎖定常領域とトランスジーンによってコードされる可変領域（代表的には、第２のトランスジーン上にコードされる、マウスの免疫グロブリン重鎖定常領域または異種（例えば、ヒト）重鎖定常領域）を作動可能に連結する。シススイッチングがトランスジーン内でのRSSエレメントの組換えによるアイソタイプスイッチングを意味するにもかかわらず、トランススイッチングは、トランスジーンRSSと、トランスジーンの外側のRSSエレメントとの間の組換えを含み、しばしば、トランスジーンを有する染色体とは異なる染色体上に含まれる。
【０１７６】
トランススイッチングは一般に、発現されるトランスジーン重鎖定常領域遺伝子のRSSと、内因性のマウス定常領域遺伝子のRSS（非μ、アイソタイプ、代表的にはγ）または第２のトランスジーン上に含まれるヒト定常領域遺伝子のRSSのいずれかとの間で生じ、しばしば別々の染色体上に組み込まれる。
【０１７７】
トランススイッチングが第1のRSS（発現されるトランスジーン重鎖定常領域遺伝子（例えば、μ））と、第２のトランスジーン上に含まれるヒト重鎖定常領域遺伝子のRSSとの間で生じる場合、実質的に完全なヒト配列を有する非キメラ抗体が産生される。例えば、そして限定しないが、ヒト重鎖定常領域（例えば、γ1）をコードするポリヌクレオチド、および作動可能に連結されたRSS（例えば、γ1 RSS）が、トランスジーンがコードするヒトμ鎖を含む抗体を発現するトランスジェニックマウスＢ細胞（またはＢ細胞の集団）から生成されたハイブリドーマ細胞の集団に導入され得る（例えば、トランスフェクトされる）。得られるハイブリドーマ細胞は、導入されたポリヌクレオチドの存在および／またはヒトμ鎖の可変領域（イディオタイプ／抗原反応性）を含みそして導入されたポリヌクレオチド配列（例えば、ヒトγ1）によってコードされる定常領域を有する重鎖を含むトランススイッチ化抗体の発現について選択され得る。それにより、トランスジーンにコードされるヒトμ鎖のRSSと、下流のアイソタイプ（例えば、γ1）をコードする導入されたポリヌクレオチドのRSSとの間でのトランススイッチ組換えによって、トランススイッチ化抗体を生成し得る。
【０１７８】
本発明はまた、以下を含むゲノムを含むトランスジェニックマウスを、予め決定された抗原で免疫する工程を包含する、このようなキメラトランススイッチ化抗体を産生する方法を提供する：（１）トランススイッチングし得る少なくとも１つのマウス定常領域遺伝子（例えば、γ2a、γ2b、γ1、γ3）を含む、ホモ接合型の機能的に破壊された内因性の重鎖遺伝子座、（２）機能的なヒト重鎖可変領域をコードするように再配置し得、そしてヒト配列重鎖を発現し得、そしてアイソタイプスイッチング（および／またはトランススイッチング）を受け得るヒト重鎖トランスジーン、そして必要に応じてさらに、（３）機能的なヒト軽（例えば、κ）鎖可変領域をコードするように再配置し得、そしてヒト配列軽鎖を発現し得るヒト軽鎖（例えば、κ）トランスジーンを含み、そして必要に応じてさらに、（４）ホモ接合型の機能的に破壊された内因性の軽鎖遺伝子座（代表的には、κ、好ましくは、κおよびλの両方）を含み、そして必要に応じてさらに、（５）ヒトトランスジーンによってコードされるヒト配列可変領域および内因性のマウス重鎖定常領域遺伝子（例えば、γ1、γ2a、γ2b、γ3）によってコードされるマウス定常領域配列からなるキメラ重鎖を含む抗体を含有する血清を含む。
【０１７９】
親和性タグ化：スイッチ化アイソタイプの選択
有利には、トランススイッチング（およびシススイッチング）は、体細胞の変異のプロセスと関連する。体細胞変異は、Ｂ細胞のクローンの子孫によってコードされる抗体親和性の範囲を拡大する。例えば、スイッチング（トランス-またはシス-）を受けたハイブリドーマ細胞によって産生される抗体は、スイッチングを受けていないハイブリドーマ細胞において提示されるよりも、広範な抗原結合親和性を提示する。従って、第1のヒト重鎖定常領域（例えば、μ）に連結されたポリペプチド中の第1のヒト重鎖可変領域を含む重鎖を含む第1の抗体を発現するハイブリドーマ細胞の集団（代表的には、クローン）は、第２の重鎖定常領域（例えば、ヒトγ、α、またはε定常領域）に連結されたポリペプチド中に、上記の第１のヒト重鎖可変領域を含む重鎖を含む抗体を発現するハイブリドーマ細胞クローン変異体についてスクリーニングされ得る。このようなクローン変異体は、インビトロでのシススイッチングを生じる天然のクローン変異体によって、アイソタイプスイッチングを促進する試薬（例えば、Ｔ細胞誘導性リンホカイン（例えば、IL-4およびIFNγ）の投与によるようなクラススイッチング（トランス-またはシス-）の誘導によって、トランススイッチングのための基質として提供される機能的なRSSおよび異種（例えば、ヒト）重鎖定常領域遺伝子を含むポリヌクレオチドの導入によって、あるいは、上記の組合せなどによって産生され得る。しばしば、作動可能に連結されたRSSとともにヒトの下流のアイソタイプ定常領域（例えば、γ１、γ3、など）を含むポリヌクレオチドもまた、トランススイッチ機構によってアイソタイプスイッチングを促進するためにハイブリドーマ細胞に導入される。
【０１８０】
クラススイッチングおよびアフィニティー変異は、本発明のトランスジェニック動物由来のＢ細胞の同じ集団で起こる。従って、クラススイッチ化Ｂ細胞（またはその形態に由来するハイブリドーマ）の同定は、高親和性モノクローナル抗体を得るためのスクリーニング工程として使用され得る。種々のアプローチが、クラススイッチング事象（例えば、シススイッチング（トランスジーン内スイッチング）、トランススイッチング、またはこれらの両方）を促進するために使用され得る。例えば、関連するRSSエレメントとともにμおよびガンマ定常領域遺伝子の両方、ならびにスイッチ調節エレメント（例えば、不稔性転写プロモーター）を含む単一の連続するヒトゲノムフラグメントが、トランスジーンとして使用され得る。しかし、所望の単一の連続するヒトゲノムフラグメントのいくつかの部分は、例えば、クローニング宿主中などで複製された場合の不安定性の問題によって、効率的にクローニングすることが困難であり得る；詳細には、δとγ3との間の領域は、特にμ遺伝子、γ3遺伝子、V遺伝子、D遺伝子セグメント、およびJ遺伝子セグメントを含む連続するフラグメントとして効率的にクローニングすることが困難であることが証明され得る。
【０１８１】
また、例えば、連続していないヒトトランスジーン（ミニ遺伝子）は、１つ以上の介在配列（イントロン）またはそうでなければ必須ではない配列（例えば、１つ以上のV、D、および／またはJセグメント、ならびに／あるいは１つ以上の非μ定常領域遺伝子（単数または複数））の欠失を伴う、ヒトμ遺伝子、ヒトγ3遺伝子、ヒトV遺伝子（単数または複数）、ヒトD遺伝子セグメント、およびヒトJ遺伝子セグメントからなる。このようなミニ遺伝子は、効率的な免疫グロブリン発現およびスイッチングのための全ての必須のエレメントにわたるゲノムDNAの単一の連続するセグメントを単離することと比較した場合に、いくつかの利点を有する。例えば、このようなミニ遺伝子は、クローニングが困難である配列（例えば、不安定な配列、毒性配列など）を含み得るDNAの大きな断片を単離する必要性を回避する。さらに、シス-またはトランススイッチングを生じるためのアイソタイプスイッチングに必要なエレメント（例えば、ヒトγ不稔性転写プロモーター）を含むミニ遺伝子座は、インビボで有利に体細胞変異およびクラススイッチングを受け得る。多くの真核生物DNA配列がクローニングすることが困難であることが証明され得るので、必須ではない配列を省くことが有利であると証明され得る。
【０１８２】
バリエーションにおいて、高い結合親和性（例えば、少なくとも、1×107M-1、好ましくは、少なくとも1×108M-1、より好ましくは、少なくとも1×109M-1またはそれ以上）を有する抗体を産生するハイブリドーマクローンが、以下のプールからの選択によって得られる：アイソタイプスイッチングをし得るヒト重鎖トランスジーン（前出を参照のこと）を保有し、そして生産性の（インフレームで）V-D-J再配置を受け得る内因性のマウス中さ遺伝子座を実質的に欠失しているトランスジェニックマウスのＢ細胞に由来するハイブリドーマ細胞、ヒト（またはマウス）非μ重鎖定常領域へのポリペプチド連結中にヒト配列重鎖可変領域を含む重鎖を含む抗体を発現するハイブリドーマ；上記の抗体は、インビボまたは細胞培養物中でのシススイッチングおよび／またはトランススイッチングの結果として生じる「スイッチ化重鎖」を含むので、「スイッチ化抗体」と呼ばれる。ハイブリドーマは、一般に、体細胞変異のプロセスを受け、そして上記のハイブリドーマのプールは、一般に、高親和性抗体を分泌するハイブリドーマクローンが選択され得る、広範な抗原結合親和性を有する。代表的には、予め決定された抗原に対して実質的な結合親和性（1×107M-1〜1×108M-1以上）を有するヒト配列抗体を分泌するハイブリドーマ（そしてここで、上記のヒト配列抗体がヒト免疫グロブリン可変領域（単数または複数）を含む）は、２工程プロセスを包含する方法によって選択され得る。１つの工程は、スイッチ化重鎖を含む免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマ細胞を同定および単離する工程である（例えば、スイッチ化重鎖に特異的に結合し、そしてスイッチ化されていないアイソタイプ（例えば、μ）には実質的に結合しない固定された免疫グロブリンに、ハイブリドーマ細胞を結合させることによる）。もう１つの工程は、実質的な結合親和性を有して、予め決定された抗原に結合するハイブリドーマ細胞を同定する工程である（例えば、ハイブリドーマクローン上清のELISA、標識化抗原を使用するFACS分析などによる）。代表的には、スイッチ化抗体を分泌するハイブリドーマの選択は、予め決定された抗原に結合するハイブリドーマ細胞を同定する前に行われる。予め決定された抗原に対して実質的な結合親和性を有するスイッチ化抗体を発現する
ハイブリドーマ細胞が、当該分野で公知の適切な増殖条件下で、代表的には個々の選択されたクローンとして単離および培養される。必要に応じて、この方法は、モノクローナル抗体の発現に適切な条件下で上記の選択されたクローンを培養する工程を包含する；上記のモノクローナル抗体は回収され、そして治療目的、予防目的、および／または診断目的のために投与され得る。
【０１８３】
しばしば、選択されたハイブリドーマクローンが、予め決定された抗原に結合する（またはそれへの結合を付与する）免疫グロブリン（例えば、可変領域）をコードする免疫グロブリン配列を単離するためのDNAまたはRNAの供給源として提供され得る。続いて、ヒト可変領域をコードする配列が単離され得（例えば、供給源（ハイブリドーマクローン）からのPDR増幅またはcDNAクローニングによって）、そして免疫原性が好ましくは最小化されるヒトの治療的使用のためにより適切なヒト配列抗体をコードするように、所望のヒト定常領域をコードする配列がスプライシングされ得る。得られる完全なヒトコード配列（単数または複数）を有するポリヌクレオチド（単数または複数）は、宿主細胞中で発現され得（例えば、哺乳動物細胞中で発現ベクターから）、そして薬学的処方のために精製され得る。
【０１８４】
異種エンハンサー
ヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖）をコードし得る異種トランスジーンは、マウスのゲノムには由来しない、そして／または異種トランスジーンのエキソンと天然ではシスで結合しない、シス連結されたエンハンサーを有利に含む。例えば、ヒトκトランスジーン（例えば、κミニ遺伝子座）は、ヒトVK遺伝子、ヒトJK遺伝子、ヒトCK遺伝子、および異種エンハンサーを有利に含み得る。代表的には、上記の異種エンハンサーは、ヒト重鎖イントロンエンハンサーおよび／またはマウス重鎖イントロンエンハンサーを含み、代表的には、JK遺伝子とCK遺伝子との間に位置するか、またはCK遺伝子の下流に位置する。例えば、マウス重鎖J-μイントロンエンハンサー（Banerjiら（1983）Cell 33：729）が、プラスミドpKVe2（前出を参照のこと）の0.9kbのXbaIフラグメント上に単離され得る。ヒト重鎖J-μイントロンエンハンサー（Haydayら（1984）Nature 307：334）は、1.4kbのMluI／HindIIIフラグメントとして単離され得る（前出を参照のこと）。トランスジーンに対する転写活性異種エンハンサー（例えば、マウスJ-μイントロンエンハンサーにシスで連結された組み合わせヒトJ-μイントロンエンハンサー）の付加によって、トランスジーンの高レベルの発現を付与し得、特に、上記のトランスジーンは、軽鎖（例えば、ヒトκ）をコードする。同様に、ラットの3’エンハンサーは、ヒト重鎖をコードし得るミニ遺伝子座構築物中に有利に含まれ得る。
【０１８５】
特定の好ましい実施態様
本発明の好ましい実施態様は、実施例５、６、８、または14に記載される単一のコピーの軽鎖トランスジーンを含む動物と交配させた、少なくとも１つの、代表的には２〜10の、およびときどき25〜50以上の実施例12に記載されるトランスジーン（例えば、pHC1またはpHC2）を含む動物、ならびに実施例10に記載のJH欠失動物と交配させた子孫である。動物を、これらの３つの形質のそれぞれについてホモ接合型に対して交配させた。このような動物は、以下の遺伝子型を有する：単一コピー（一倍体の染色体のセットあたり）のヒト重鎖未再配置ミニ遺伝子座（実施例12に記載される）、単一コピー（二倍体の染色体のセットあたり）の再配置されたヒトκ軽鎖構築物（実施例14に記載される）、および機能的なJHセグメントの全てを除去する各内因性のマウス重鎖遺伝子座での欠失（実施例10に記載される）。このような動物を、JH欠失についてホモ接合型であり、そしてヒト重鎖および軽鎖構築物についてヘミ接合型である子孫を作製するために、JHセグメントの欠失についてホモ接合型であるマウスと交配させる。得られる動物は抗原で注射され、そしてこれらの抗原に対するヒトモノクローナル抗体の産生のために使用される。
【０１８６】
このような動物から単離されたＢ細胞は、それらが各遺伝子の単一のコピーのみを含むので、ヒト重鎖および軽鎖に関して単特異的である。さらに、これらは、ヒトまたはマウス重鎖に関して単特異的である。なぜなら、両方の内因性マウス重鎖遺伝子のコピーが、実施例９および実施例12に記載されるように導入されたJH領域にわたる欠失のために非機能的であるからである。さらに、Ｂ細胞の実質的な機能は、ヒトまたはマウスの軽鎖に関して単特異的である。なぜなら、再配置されたヒトκ軽鎖遺伝子の単一のコピーの発現が、Ｂ細胞の有意な機能において内因性のマウスおよびλ鎖遺伝子の再配置を、対立遺伝子によっておよびアイソタイプによって排除するからである。
【０１８７】
好ましい実施態様のトランスジェニックマウスは、天然のマウスと理想的には実質的に同様の、有意なレパートリーを伴って免疫グロブリンの産生を示す。従って、例えば、内因性のIg遺伝子が不活化されている実施態様において、全免疫グロブリンのレベルは、約0.1〜10mg/mlの血清の範囲、好ましくは、0.5〜５mg/ml、理想的には、少なくとも1.0mg/mlである。IgGからIgMへのスイッチを行い得るトランスジーンがトランスジェニックマウスに導入される場合、成体のマウスのIgMに対するIgGの比は、好ましくは約10：１である。もちろん、IgMに対するIgGの比は、未成熟のマウスにおいてははるかに低い。一般に、約10％より大きい、好ましくは40〜80％の脾臓およびリンパ節Ｂ細胞が、ヒトIgGタンパク質を独占的に発現する。
【０１８８】
レパートリーは、非トランスジェニックマウスにおいて示されるものに理想的に近づき、通常は、少なくとも約10％の高さ、好ましくは25〜50％以上である。一般に、少なくとも約1000の異なる免疫グロブリン（理想的には、IgG）、好ましくは、104〜106またはそれ以上が、マウスのゲノム中に導入された種々のV、J、およびD領域の数に依存して産生される。これらの免疫グロブリンは、代表的には、以下を含むが、これらに限定されない、１／２以上の高度な抗原性タンパク質を認識する：ハトチトクロムＣ、ニワトリリゾチーム、アメリカヤマゴボウ有糸分裂促進物質、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、インフルエンザ赤血球凝集素、ブドウ球菌プロテインＡ、マッコウクジラミオグロビン、インフルエンザノイラミニダーゼ、、およびλリプレッサータンパク質。いくつかのグロブリンは、少なくとも約107M-1、好ましくは108M-1〜109M-1またはそれ以上のあらかじめ選択された抗原に対する親和性を示す。
【０１８９】
いくつかの実施態様において、予め決定された抗原型に応答する抗体において提示されるV遺伝子の選択を制限するために、予め決定されたレパートリーを有するマウスを作製することが所望され得る。予め決定されたレパートリーを有する重鎖トランスジーンは、例えば、ヒトでの予め決定された抗原に応答する抗体において優先的に使用されるヒトVH遺伝子を含み得る。あるいは、いくつかのVH遺伝子は、種々の理由（例えば、予め決定された抗原について高親和性V領域をコードする低い可能性を有する；体細胞変異および親和性の削減を受ける低い傾向を有する；または特定のヒトに対して免疫原性である）のために規定されたレパートリーから排除され得る。
【０１９０】
従って、種々の重鎖または軽鎖遺伝子セグメントを含むトランスジーンの再配置の前に、このような遺伝子セグメントは、トランスジェニック動物以外の生物種から容易に同定され得る（例えば、ハイブリダイゼーションまたはDNA配列決定による）。
【０１９１】
本発明のトランスジェニックマウスは、予め決定された抗原（例えば、膜貫通タンパク質、細胞表面巨大分子、またはそれに対するヒト抗体が所望される他の適切な抗原（例えば、TNF、LPSなど））で免疫され得る。マウスは、トランスジーン間のスイッチ組換えによるクラススイッチング（シス-スイッチング）を受け、そして予め決定された抗原と反応する免疫グロブリンを発現するＢ細胞を産生する。免疫グロブリンは、ヒト配列抗体であり得、ここで、重鎖および軽鎖ポリペプチドは、ヒトトランスジーン配列によってコードされ、これは、体細胞変異およびV領域再組換え連結によって誘導される配列、ならびに生殖系によってコードされる配列を含み得る；これらのヒト配列免疫グロブリンは、たとえ他の非生殖系配列が体細胞変異および種々のV-JおよびV-D-J組換え連結の結果として存在し得るとしても、ヒトVLまたはVH遺伝子セグメント、およびヒトJLまたはJLセグメントによってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であると言われ得る。このようなヒト配列抗体に関して、各鎖の可変領域は、代表的には少なくとも80％がヒト生殖系V、Jによってコードされ、そして重鎖、Ｄ、遺伝子セグメントの場合には、しばしば、可変領域の少なくとも85％が、トランスジーン上に存在するヒト生殖系配列によってコードされる；しばしば、可変領域配列の90％または95％またはそれ以上が、トランスジーン上に存在するヒト生殖系配列によってコードされる。しかし、非生殖系配列が体細胞変異およびVJおよびVDJ連結によって導入されるので、ヒト配列抗体はしばしば、マウスの生殖系のヒトトランスジーン（単数または複数）中に見出される場合にヒトV、D、またはJ遺伝子セグメントによってコードされない、いくつかの可変領域配列（および、より少ない頻度の定常領域配列）を有する。代表的には、このような非生殖系配列（または個々のヌクレオチド位置）は、CDR中またはその付近のクラスター、あるいは体細胞変異がクラスターについて知られている領域内にある。
【０１９２】
予め決定された抗原と結合するヒト配列抗体は、イソタイプスイッチから生じ、その結果ヒト配列γ鎖（γ１、γ2a、γ2b、又はγ3のような）およびヒト配列軽鎖（Ｋのような）を含むヒト抗体が産生される。そのようなイソタイプスイッチ化ヒト配列抗体は、特に第２の（又は後続の）抗原チャレンジに引き続く、親和性成熟および抗原によるＢ細胞選択の結果として、典型的には可変領域およびCDRの約10残基中またはその内部に、しばしば１またはそれ以上の体細胞性突然変異を含む。これらの高親和性ヒト配列抗体は、少なくとも1x10９M−１、典型的には少なくとも5ｘ10９M−１、しばしば１ｘ10１０M−１以上、また、時には5ｘ10１０M−１〜１ｘ10 １１M−１またはそれ以上の結合親和性を持ち得る。このような高親和性ヒト配列抗体は、ヒトCD4およびそれに類似のヒト高分子（例えば、ヒト膜貫通、または細胞表面タンパク質、またはその他の細胞表面抗原のようなもの）のようなヒト抗原に対する高い結合親和性を持つように作成され得る。
【０１９３】
そのようなマウス由来のＢ細胞は、CD4およびその類似体のようなヒトタンパク質を含む、様々な抗原に対する単クローン高親和性（2x10９M−１以上）ヒト配列抗体を発現するハイブリドーマを作製するために使用され得る。これらのハイブリドーマは、予め決定されたヒト抗原と結合するための、少なくとも2x10９M−１の親和定数（Kａ）を持つ免疫ブロブリンを含む組成物を産生するために使用され得、ここで上記免疫グロブリンは以下の群からなる：
(1)ヒトVＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬセグメントによりコードされるポリペプチド配列と本質的に同一であるポリペプチド配列を持つ軽鎖可変領域、および(2)ヒトＣＬ遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を持つ軽鎖定常領域、から成るヒト配列軽鎖、および
(1)ヒトVＨ遺伝子セグメント、必要に応じてＤ領域、およびヒトＪＨセグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を持つ重鎖可変領域、および(2)ヒトＣＨ遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を持つ定常領域、から成るヒト配列重鎖。
【０１９４】
しばしば、ヒト配列重鎖およびヒト配列軽鎖は、ヒト重鎖トランスジーン（導入遺伝子）とヒト軽鎖トランスジーンにより別々にコードされ、各々マウス細胞ゲノム中に統合される。しかしながら、両鎖が、単一トランスジーン上にコードされ得、または、マウス生殖系において、ヒト重鎖トランスジーンと同座に統合されないVＨ配列を含むYACからV遺伝子セグメントを誘導するヒト重鎖トランスジーン（例えば、HC2）のように、１または両鎖が複数トランスジーン上にコードされ得る。
【０１９５】
１つの実施様態において、組成は、K定常領域を持つヒト配列軽鎖およびγ定常領域を持つヒト配列重鎖を含む免疫グロブリンを含有する。
【０１９６】
マウス（およびそれに由来するハイブリドーマ）は、予め決定されたヒト抗原と結合するための少なくとも１ｘ10１０M−１の親和定数（Kａ）を持つ免疫グロブリンの供給源であり、上記免疫グロブリンは以下の群からなる：
(1)ヒトVＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬセグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を持つ軽鎖可変領域、および(2)ヒトＣＬ遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を持つ軽鎖定常領域、から成るヒト配列軽鎖、および
(1)ヒトVＨ遺伝子セグメント、必要に応じてＤ領域、およびヒトＪＨセグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を持つ重鎖可変領域、および(2)ヒトＣＨ遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を持つ定常領域、から成るヒト配列重鎖。
【０１９７】
本発明は、以下を含むトランスジェニックマウスを供給する：機能性破壊を受けた内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合対、機能性破壊を受けた内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合対、少なくとも１コピーの異種免疫グロブリン軽鎖トランスジーン、および少なくとも１コピーの非相同免疫グロブリン重鎖トランスジーン、および、上記動物が、ヒト抗原による免疫の後抗体応答をおこし、ここで、抗体応答が、予め決定されたヒト抗原と結合するための、少なくとも2x10９M−１の親和定数（Kａ）を持つ免疫ブロブリンを含み、ここで、上記免疫グロブリンが以下の群からなる：
(1)ヒトVＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬセグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を持つ軽鎖可変領域、および(2)ヒトＣＬ遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を持つ軽鎖定常領域、から成るヒト配列軽鎖、および、
(1)ヒトVＨ遺伝子セグメント、必要に応じてＤ領域、およびヒトＪＨセグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を持つ重鎖可変領域、および(2)ヒトＣＨ遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を持つ定常領域、から成るヒト配列重鎖。
【０１９８】
そのようなトランスジェニックマウスは、少なくとも１つのヒトの体細胞型上に存在するヒト表面または膜貫通タンパク質と結合するヒト配列免疫ブロブリンを産生することができ、ここで、免疫ブロブリンは、1.5ｘ10９M−１と1.8ｘ10１０M−１との間の親和定数（Kａ）で、上記ヒト表面または膜貫通タンパク質と結合する。そのようなヒト表面または膜貫通タンパク質の一例はCD4であるが、所望である場合、他も免疫原として使用され得る。
【０１９９】
予め決定された抗原に対する高親和性ヒト配列抗体の開発は、統合されたヒト免疫グロブリントランスジーンを含むゲノムを持つトランスジェニックマウスにおいて、ヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリーを拡大する方法により容易とされ、この方法は、上記統合ヒト免疫グロブリントランスジーンに存在しないＶ領域遺伝子セグメントを含むV遺伝子トランスジーンをゲノム内に導入する工程を包含する。しばしば、Ｖ領域トランスジーンは、ヒトゲノム内に生じたり、または組換え法により別々にスプライスされ得るように、ヒトVＨまたはVＬ(VＫ)遺伝子セグメント配列の一部分を含む酵母人工染色体であり、故障（out-of-order）または省略V遺伝子セグメントを含み得る。時には、少なくとも５またはそれ以上の機能性Ｖ遺伝子セグメントがYAC上に含まれる。この変異において、Ｖレパートリー拡大法により生起されるトランスジェニックマウスを作成することができ、ここで、マウスは、Ｖ領域トランスジーン上に存在するＶ領域遺伝子セグメント、およびヒトIgトランスジーン上にコードされるＣ領域によってコードされる可変領域配列を含む免疫グロブリン鎖を発現する。Ｖレパートリーの拡大法の手順によって、少なくとも５の異なるＶ遺伝子を持つトランスジェニックマウスが作製され得る；少なくとも約24のＶ遺伝子またはそれ以上を持つマウスも同様であり得る。勿論、あるＶ遺伝子セグメントは非機能性であり得る（例えば、偽遺伝子など）；所望である場合、当業者に利用可能な組換え法によって、これらのセグメントは保持または選択的に欠失され得る。
【０２００】
一旦、マウス生殖系が、ＪおよびＣ遺伝子セグメントを含むヒトIgトランスジーン内に実質的には存在しない、拡大Ｖセグメントレパートリーを持つ機能性YACを含むように操作されると、その形質は繁殖されて、その他の遺伝的バックグラウンドに交配されることが可能であり、それは拡大Ｖセグメントレパートリーを持つ機能性YACが、異型ヒトIgトランスジーンを持つマウス生殖細胞系に、交配されるようなバックグラウンドを含む。拡大Ｖセグメントレパートリーを持つ複数機能性YACは、ヒトIgトランスジーン（または複数のヒトIgトランスジーン）と作動するために、生殖細胞系に交配され得る。本明細書中でYACトランスジーンとして参照されるが、そのようなトランスジーンはゲノム内に統合されると、酵母の自己複製に必要とされる配列のような酵母配列を実質的に欠如する；そのような配列は、酵母内で複製後、必要とされなくなると（すなわち、マウスES細胞またはマウスプロ接合体に導入される以前に）随意に遺伝子工学（例えば、制限消化およびパルス地磁場ゲル電気泳動またはその他の適切な方法）により削除され得る。  
【０２０１】
本発明はまた、ヒト配列免疫グロブリン発現の形質を増殖するための方法を供給し、ヒトIgトランスジーンを持ち、また必要に応じて拡大Ｖセグメントレパートリーを持つ機能性YACを有する、トランスジェニックマウスの交配を含む。VＨおよび VＬ遺伝子セグメントはいずれもYAC上に存在し得る。トランスジェニックマウスは、研究者により望まれる全てのバックグラウンドに交配されることが可能であり、他のヒトトランスジーンを潜伏するバックグラウンド、ヒトIgトランスジーンおよび/また他のヒトリンパ球プロテインを含むバックグラウンドを含む。
【０２０２】
本発明はまた、拡大Ｖ領域レパートリーYACトランスジーンを持つトランスジェニックマウスにより産生される高親和性ヒト配列免疫グロブリンを供給する。
【０２０３】
前述は本発明によるトランスジェニック動物の好ましい実施様態を説明するが、その他の実施様態は、本明細書の開示により定義され、実施例に説明されるトランスジーンによりより明確に定義される。トランスジェニック動物の４カテゴリーは次のように定義され得る：
Ｉ．再配置されていない重鎖および再配置された軽鎖免疫グロブリントランスジーンを含むトランスジェニック動物。
II．再配置されていない重鎖および再配置されていない軽鎖免疫グロブリントランスジーンを持つトランスジェニック動物。
III．再配置された重鎖および再配置されていない軽鎖免疫グロブリントランスジーンを含むトランスジェニック動物、および
IV．再配置された重鎖および再配置された軽鎖免疫グロブリントランスジーンを含むトランスジェニック動物。
【０２０４】
トランスジェニック動物のこれらのカテゴリーの好ましい選択の順序は次に示されるように、内因性軽鎖遺伝子（または少なくともκ遺伝子）が相同組換え法（または他の方法）によりノックアウトされている場合はII＞I＞III＞IV、であり、内因性軽鎖遺伝子がノックアウトされておらず、対立遺伝子排除により支配されている場合は、I>II>III>IVである。
【０２０５】
上記に説明されているように、本発明は、ヒト疾患処置に有用であるヒト配列モノクローナル抗体を供給する。モノクローナル抗体の治療的用途は、例えば、LarrickおよびBourla、Journal of Biological Response Modifiers、5:379ー393に説明されており、本明細書中に参考として援用されている。ヒトモノクローナル抗体の用途は、自己免疫疾患、ガン、感染症、臓器移植拒絶反応、凝血障害のような血液障害、およびその他疾患の治療を含む。
【０２０６】
本発明による抗体は、タンパク質輸送として医学技術分野で既知のいずれの方法によっても患者に適用され得る。抗体は、特に非経口性投与に適する（すなわち、皮下、筋肉内、または静脈内投与）。本発明による薬学的組成物は、別の薬物送達法による投与にも適する。（例えば、Langer、Science、249:1527-1533（1990)を参照のこと）
【０２０７】
非経口的投与のための薬学的組成物は、通常は受容可能キャリア、好ましくは水溶性キャリア中に溶解されたモノクローナル抗体溶液を含む。種々の水溶性担体が使用可能であり、例えば、水、緩衝水、0.4%生理食塩水、0.3%グリシンなどがある。これらの溶液は、無菌性であり、一般的には微粒子物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により殺菌される。これらの組成物は、生理学的条件を近似にするために、必要があれば、pH調整剤、緩衝剤、張度調整剤などのような、薬学的受容可能である補助物質を含み得る。それらの物質は例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどである。これらの処方物における抗体濃度は、広く変化し得る、例えば、約0.5%以下から、通常は重量比で0.1%または少なくとも0.1%から1.5%または2.0%までであり、選択された特定の投与法に応じて、主として液体容積、粘度その他に基づいて選択される。非経口的投与可能な組成物の調製のための実際の方法は、当該分野における当業者には既知または明白であり、例えば、本明細書中に参照として引用されている、Remington's Pharmaceutical Science、第17版、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania (1985) により詳細に説明されている。
【０２０８】
本抗体またはそのカクテル（合剤）を含む組成物は、予防および/または治療処置のために投与され得る。治療的適用においては、治癒、または少なくとも部分的に感染またはその合併症を阻止するに十分な量が患者に投与される。これを達成するに適切な量は、「治療的有効用量」として定義される。この使用のために有効な量は、一般的には約0.05mg/kg体重〜約5mg/kg体重の範囲であり、好ましくは約0.2mg/kg体重〜約1.5mg/kg体重である。
【０２０９】
ある場合には、生物学的活性を変化させるために本発明の免疫グロブリン分子を改変することが望ましい。例えば、免疫グロブリンは、直接的または間接的に他の化学療法剤とカップリングされ得る。標的化のために種々の化学療法剤がカップリングされ得る。例えば、カップリングされ得る抗炎症剤は、免疫調節剤、血小板活性化因子(PAF)アンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼインヒビター、リポキシゲナーゼインヒビター、およびロイコトリエンアンタゴニストを含む。いくつかの好ましい部分（moiety）は、シクロスポリンＡ、インドメタシン、ナプロキセン、FK-506、ミコフェノール酸などを含む。同様に、抗酸化剤、例えばスーパーオキシドジスムターゼは再灌流傷害の処置に有用である。同様に、ダウノマイシン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ブレオマイシンなどのような抗ガン剤も標的化され得る。
【０２１０】
本発明のモノクローナル抗体はまた、両親媒性物質（amphipath）（例えば、リポソーム）を患者における部位に標的化するために用いられ得る。これらの調製物では、送達される薬物は、ヒトモノクローナル抗体が埋め込まれるリポソームの一部として取り込まれる。
【０２１１】
本発明のヒト配列モノクローナル抗体は、部分的に有用である。なぜなら、モノクローナル抗体は、これらが指向する所定の抗原に対して特異的に結合するためである。所定の抗原がヒト抗原（すなわち、ヒトタンパク質またはそのフラグメント）である場合、本発明の免疫グロブリンがまた、非ヒト動物中、特に薬物試験（例えば、生物学的活性、薬物動態学、および安全性の前臨床試験）に頻繁に使用される動物に見出されるコグネイト抗原と結合するならば、時には好都合である。これらの動物は、マウス、ウサギ、ラット、イヌ、ブタ、ならびに特にチンパンジー、無尾猿（ape）、および有尾猿（monkey）（例えば、アカゲザルおよびカニクイザル）のような非ヒト霊長類を含む。実験動物における抗原認識能力は、特に免疫グロブリンの体内分布（biodistribution）における特異的結合の効果の決定に有用である。コグネイト抗原とは、(i）ヒト抗原と実質的に相似する構造（例えば、アミノ酸配列）を有する（すなわち、動物コグネイトタンパク質のアミノ酸配列は、代表的には少なくともヒトタンパク質と約50%同一であり、通常では少なくとも約70%同一、そしてしばしば少なくとも約80%以上同一である）；(ii)実質的にヒト抗原と同じ機能を有する；および(iii)しばしばヒト抗原と同じ細胞区画に見出される、抗原である。ヒトおよび動物のコグネイト抗原は、代表的には（しかしいつもではない）同一名を有する。コグネイト抗原の例は、ヒトチューブリンおよびマウスチューブリン、ヒトCD4およびアカゲザルCD4、ならびにヒトIgGおよびラットIgGを含む。
【０２１２】
他の局面として、本発明は、人工遺伝子によりコードされる少なくとも１つのポリペプチドを含む、抗原結合ヒトmABを提供する。人工遺伝子は、細胞由来テンプレート核酸鎖（例えば、細菌細胞、または免疫もしくはハイブリドーマ細胞から得られる核酸テンプレート）を必要としない化学的または酵素的方法により、インビトロで合成されるポリペプチドをコードする核酸セグメント、および人工遺伝子の子孫（複製による）、すなわち完全合成核酸を含む。
【０２１３】
プライマー、リンカーなどとして、短い合成核酸を使用することが遺伝子工学において日常的であるが、化学的および/または酵素的手段により、30、50以上の塩基の長さである完全合成タンパク質コード核酸を生成することもまた可能である。本発明の人工遺伝子は、合成核酸領域および細胞由来核酸領域の両方を含み得る。人工遺伝子の合成核酸領域は、一般的には少なくとも約50塩基の長さであり、しばしば少なくとも約100塩基、代表的には少なくとも約200塩基、より頻繁には少なくとも約250塩基、そして通常では300塩基または400塩基の長さを超える。代表的には、合成核酸領域は、可変遺伝子セグメントまたはその一部、例えば、CDR領域をコードし、そして定常領域は細胞由来核酸によりコードされる。免疫グロブリンポリペプチド（すなわち、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖）は、ポリペプチドをコードする人工遺伝子を使用して、便利に発現され得る。通常では、人工遺伝子は、転写プロモーター配列（例えば、免疫グロブリン遺伝子またはウイルス（例えば、SV40、CMV、HIV、RSV）由来のプロモーター配列、またはハイブリッドプロモーター）と作動可能に連結される。人工遺伝子は、同様に他の配列（例えば、ポリアデニル化配列およびイントロン）と連結され得る。免疫グロブリンポリペプチドを発現するための１方法は、免疫グロブリンポリペプチドの１領域（例えば、可変領域またはその一部）をコードする合成核酸を、免疫グロブリン鎖の残りのセグメントまたは部分（例えば、μ、γ、γ2、γ3、γ4、δ、ε、α１、またはα２定常領域）、および必要に応じて、プロモーター（例えば、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター）、ポリアデニル化配列または他配列をコードするベクターに挿入することを含む。このようなベクターは、細胞に導入されると、ベクター配列の細胞転写および翻訳が免疫グロブリンペプチドを産生するように構築されている。
【０２１４】
機能性ヒト配列免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子およびポリペプチドは、人工遺伝子を使用することにより構築することができ、所定の抗原への特異的結合のような所望の特異性を有する免疫グロブリンの産生のために使用され得る。これは、所定の抗原により免疫されたトランスジェニック動物由来の細胞、またはその動物由来のハイブリドーマにより発現されるポリペプチドと実質的に類似する免疫グロブリンポリペプチドをコードする人工遺伝子の構築により達成される。従って、本発明は、免疫グロブリンポリぺチドをコードする人工遺伝子、および人工遺伝子を使用するヒト配列免疫グロブリンを生成するための方法を提供する。
【０２１５】
本方法によれば、トランスジェニック動物（例えば、機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合対、少なくとも１コピーのヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジーン、および少なくとも１コピーのヒト免疫グロブリン重鎖トランスジーンを有するトランスジェニックマウス）が、所定の抗原、例えば、ヒトタンパク質で免疫される。次いで、核酸、好ましくはmRNAが、免疫グロブリン遺伝子再配置が起きた細胞または細胞集団から収集または単離され、免疫グロブリンの重鎖および/また軽鎖（特にＶセグメント）またはその一部をコードする核酸の配列が決定される。この配列情報は、人工遺伝子の配列のための基礎として使用される。
【０２１６】
配列決定は、一般的には、目的の遺伝子またはcDNAの少なくとも一部、例えば、免疫グロブリンポリペプチドをコードする再配置されたヒトトランスジーンまたは対応cDNAの一部の単離を必要とする。通常では、これにはヒト免疫グロブリンポリペプチドをコードするDNAまたは好ましくはmRNA（すなわち、cDNA）のクローン化が必要である。クローニングは、標準技術を使用して行われる。（例えば、本明細書中に参考として援用されている、Sambrookら、(1989) Molecular Cloning :Laboratory Guide、第1-3巻、Cold Spring Harbor Pressを参照のこと）。例えば、cDNAライブラリーは、ポリＡ+ RNA（好ましくは膜結合型（membrane-associated）mRNA）の逆転写、およびヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを使用してスクリーニングされたライブラリーにより構築され得る。しかし、好ましい実施様態においては、目的の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖可変セグメント）をコードするcDNA（または全長cDNAの一部）を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が使用される。ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子の配列は、当業者にとってたやすく入手出来るため、ヒト免疫グロブリン遺伝子もしくはそのセグメントに特異的にハイブリダイズするかまたはそれらを増幅するプローブまたはPCRプライマーは容易に設計され得る。例えば、本明細書中に参考として援用されている、Taylorら、Nuc. Acids. Res., 20:6287(1992)を参照のこと。さらに、トランスジェニックマウスのヒトトランスジーンの配列は、しばしば実施者には既知であり、プライマー配列はトランスジーンの適切な領域にハイブリダイズするように選択され得る。増幅される配列は、任意の適切なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクター内にもたやすくクローン化され得る。目的の免疫グロブリンポリペプチドのある部分の配列を決定することが可能であるかぎり、使用される特定のクローン化方法が重要ではないことは理解される。本明細書中に使用されるように、目的の核酸配列が決定され得るようにクローン化、増幅、タグ化、またはそうでなければバックグラウンド核酸から識別された核酸は、単離されたと見なされる。
【０２１７】
クローン化方法および配列決定に使用されるRNAのための１つの供給源は、トランスジェニックマウスからＢ細胞を得て、このＢ細胞を不死細胞中と融合することにより生成されるハイブリドーマである。ハイブリドーマを使用する利点は、これらは、容易にスクリーニングすることが可能であり、そして目的のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択できることである。あるいは、RNAは免疫動物のＢ細胞（または全脾臓）から単離され得る。ハイブリドーマ以外の供給源が使用される場合は、特異的結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列をスクリーニングすることが所望され得る。そのようなスクリーニングの１方法は、ファージディスプレイ技術の使用である。ファージディスプレイは、例えば、Dowerら、国際公開第WO91/17271号、McCaffertyら、国際公開第WO92/01047号、ならびにCatonおよびKoprowski、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:6450ー6454(1990)に記載されており、これらの文献のそれぞれが本明細書中に参考として援用されている。ファージディスプレイ技術を使用する１つの実施様態では、免疫されたトランスジェニックマウスからのcDNA（例えば、全脾臓cDNA）が単離され、免疫グロブリンポリペプチドの一部（例えば、CDR領域）をコードするcDNA配列を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応が使用され、そして増幅された配列がファージベクター内に挿入される。目的のペプチド（例えば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチド）をコードするcDNAが、パニングのような標準手法により同定される。
【０２１８】
次いで、増幅またはクローン化された核酸の配列が決定される。代表的には、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域全体をコードする配列が決定されるが、しかし、時には、可変領域の一部（例えば、CDRコード部分）のみを配列決定することが適切である。代表的には、配列決定される部分は少なくとも30塩基の長さであり、より頻繁には可変領域の長さの少なくとも約３分の１または少なくとも約２分の１の長さをコードする塩基が配列決定される。
【０２１９】
配列決定は、cDNAライブラリーから単離されるクローンについて、またはPCR法が使用される場合は増幅された配列のサブクローン後に、または増幅されたセグメントの直接PCR配列決定により行われ得る。配列決定は標準技術を使用して行われる（例えば、本明細書中に参考として援用されている、Sambrookら、(1989) Molecular Cloning :A Laboratory Guide、第1-3巻、Cold Spring Harbor PressおよびSanger,Fら(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467を参照のこと）。ヒト免疫グロブリン遺伝子およびcDNAの公開された配列とクローン化された核酸の配列とを比較することにより、当業者は、配列決定される領域に応じて、(i)ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを含む）の生殖細胞系セグメント使用法、および(ii)Ｎ領域付加および体細胞変異のプロセスから生じる配列を含む、重鎖および軽鎖の可変領域の配列を容易に決定し得る。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの供給源は、National Center for Biotechnology Information、National Library of Medicine、National Institutes of Health、Bethesda、MDである。
【０２２０】
他の実施様態において、目的の免疫グロブリンのアミノ酸配列は、直接タンパク質配列決定法により決定され得る。
【０２２１】
免疫グロブリン発現遺伝子（すなわち再配置されたトランスジーン）の少なくとも一部と同一かまたは実質的に類似する配列を有する人工遺伝子が構築され得る。同様に、人工遺伝子は、再配置されたトランスジーンの配列決定された部位によりコードされるポリペプチドと同一であるかまたは実質的類似性を有するポリペプチドをコードできる。遺伝暗号の縮重は、複数の核酸配列により同一のポリペプチドがコードされることを可能にする。時には、例えば、制限部位を導入するために、特定の発現系を反映するためのコドン使用頻度を変更するため、またはグリコシル化部位の除去のために、核酸配列を変更することが望ましい。さらに、ハイブリドーマ配列における変更は、免疫グロブリンの特性（例えば、結合特性）を変化させるために導入され得る。例えば、特に、重鎖および軽鎖の可変領域のCDR領域において、所定の抗原に対する免疫グロブリンの親和性を増加させるために変更が導入され得る。
【０２２２】
合成核酸を構築する方法は周知である。完全な化学合成は可能であるが、一般的に、混合した化学−酵素的合成が行われ、ここでは、より長いポリヌクレオチドを生成するために、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドは、連結反応でおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応で使用される。最も好ましい実施態様では、ポリメラーゼ連鎖反応は、増幅の結果が人工的遺伝子について所望される配列を有するDNAであるように選択された重複プライマーを使用して行われる。本発明のオリゴヌクレオチドは、固相または溶液中で合成され得る。一般的に、固相合成が好ましい。亜リン酸−トリエステル、リン酸トリエステル、およびH-ホスホネート化学によるオリゴヌクレオチドの固相合成についての手順の詳細な説明は、広く入手可能である。例えば、Itakura, 米国特許第4,401,796号；Caruthersら, 米国特許第4,458,066号および同第4,500,707号；Beaucageら, Tetrahedron Lett., 22:1859-1862；Matteucciら, J. Amer. Chem. Soc., 103:3185-3191 (1981)；Caruthersら, Genetic Engineering, 4:1-17 (1982)；Jones, 第2章, Atkinsonら, 第3章, およびSproatら, 第4章, Gait編 Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1984)；Froehlerら, Tetrahedron Lett., 27:469-472 (1986)；Froehlerら, Nucleic Acids Res., 14:5399-5407 (1986)；Sinhaら, Tetrahedron Lett., 24:5843-5846 (1983)；およびSinhaら, Nucleic Acids Res., 12:4539-4557 (1984)を参照のこと、これらは参考として本明細書に援用される。
【０２２３】
人工的遺伝子は、細胞に導入され、そして免疫グロブリンポリペプチドを産生するために発現され得る。発現のための細胞型の選択は、多くの因子（例えば、所望のタンパク質グリコシル化のレベル）に依存するが、ヒト免疫グロブリンを分泌し得る細胞が好ましい。特に好ましい細胞は、CHO細胞およびメラノーマ由来細胞（例えば、SP20およびNS0細胞株）を含む。標準的細胞培養は周知であり、そしてまた、Newmanら, Biotechnology, 10:1455-1460 (1992)；Bebbingtonら, Biotechnology, 10:169-175 (1992)；Cockettら, Biotechnology, 8:662-667 (1990)；Carterら, Biotechnology, 10:163-167 (1992)に記載され、これらのそれぞれは参考として本明細書に援用される。核酸、例えば、人工的遺伝子の導入の方法は周知であり、そしてトランスフェクション（例えば、エレクトロポレーションによってまたはリポソーム媒介される）および形質転換を含む。導入される遺伝子の発現のためのシステムは、Sambrookら, 前出に一般的に記載される。
【０２２４】
免疫グロブリン（例えば、IgG分子）がインビボで産生されるように、同じ細胞において２つの免疫グロブリンポリペプチド（すなわち、重鎖および軽鎖）を発現することが、しばしば所望される。したがって、２つの人工的遺伝子（すなわち、１つは重鎖をコードしそして１つは軽鎖をコードする）を細胞に導入することがときどき所望される。（２つの人工的遺伝子は、単一のベクターに導入され得る）。あるいは、１つの免疫グロブリンポリペプチドをコードする１つの人工的遺伝子は、他の免疫グロブリンポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている細胞に導入され得る。
【０２２５】
人工的遺伝子がトランスフェクトされる細胞が増殖するので、人工的遺伝子の全体合成核酸部分が、複製および転写のためのテンプレートとして作用することが明らかである。それにもかかわらず、子孫遺伝子は、合成核酸（すなわち、細胞由来のテンプレート核酸鎖を必要としない化学的または酵素的方法によってインビトロで合成されるポリペプチドをコードする核酸分子）に由来しており、そして本明細書で使用される場合、人工的遺伝子も考慮される。したがって、ハイブリドーマの発現されたトランスジーンに対する人工的遺伝子の合成部分の関係は、情報連結（すなわち、配列情報）があるが直接的物理的連結がないものである。
【０２２６】
本発明はまた、治療および診断適用、特にヒトの疾患の処置に有用な抗CD4モノクローナル抗体を提供する。CD4は、主として胸腺細胞およびＴ細胞において発現される細胞表面タンパク質であり、そしてこれはＴ細胞機能および抗原のMHCクラスII認識に関与する。CD4に対して指向する抗体は、CD4細胞の活性を減少させるように作用し、そのため望ましくない自己免疫反応、炎症性応答、および移植された器官の拒絶を減少させる。
【０２２７】
ヒト抗CD4 mAbが霊長類においてＴヘルパー細胞依存性免疫応答を阻害する能力は、可溶性外来抗原（例えば、破傷風トキソイド（TT））で霊長類を免疫すること、および霊長類が（例えば、ヒトmAbの注射後に）抗原に対する遅延型過敏反応（DTH）を備える能力を測定することによって、証明され得る。DTHは、CD4＋（Ｔヘルパー）細胞によって媒介される（E. BenjaminおよびS. Lescowitz, Immunology: A Short Course, 第2版, (1991) Wiley-Liss, Inc., New York, 277-292頁）。抗原特異的Ｔヘルパー細胞は、抗原提示細胞上のMHCクラスII分子によって提示されるプロセシングされた抗原を認識し、そして活性になる。活性化Ｔヘルパー細胞は種々のリンホカイン（IL2、INFγ、TNFβ、MCF）を分泌し、したがって注入部位でマクロファージおよびＴ細胞傷害性細胞を誘引しそして活性化する。DTHの一部として生じるエフェクター機能のほとんどは、マクロファージおよびＴ細胞傷害性細胞によって行われるが、それは応答を開始するＴヘルパー細胞である。したがって、Ｔヘルパー細胞が阻害され得るならば、DTHは存在しない。抗CD4 mABの投与は、動物モデルにおいて自己免疫疾患を予防（Wofsyら, J. Exp. Med., 161:378-391 (1985)）または逆転（Wofsyら, J. Immunol., 138:3247-3253 (1987)、Waldorら, Science, 227:415-417 (1985)）することが示されている。慢性関節リウマチを有する患者へのマウスまたはキメラ抗CD4 mAbの投与は、臨床的利益の証拠を示している（Knoxら, Blood, 77:20-30 (1991)；Goldberyら, J. Autoimmunity, 4:617-630；Herzogら, Lancet, ii:1461-1462；Horneffら, Arthritis Rheum., 34:129-140；Reiterら, Arthritis Rheum., 34:525-536；Wendingら, J. Rheum., 18:325-327；Van der Lubbeら, Arthritis Rheum., 38:1097-1106；Van der Lubbeら, Arthritis Rheum., 36:1375-1379；Morelandら, Arthritis Rheum., 36:307-318、およびChoyら, Arthritis and Rheumatism, 39(1):52-56 (1996)；これらのすべては、参考として本明細書に援用される）。さらに、上記のように、キメラ抗CD4 mAbは、菌状息肉腫を有する患者でいくつかの臨床的効力を示している（Knoxら (1991) Blood 77:20；これは参考として本明細書に援用される）。抗CD4抗体はまた、Newmanら, Biotechnology, 10:1455-1460 (1992)（これは参考として本明細書に援用される）に議論される。
【０２２８】
本発明はまた、治療および診断適用、特にヒトの疾患の処置に有用な抗インターロイキン-8モノクローナル抗体を提供する。インターロイキン-8（IL8）は、非常に強力なおよび好中球にほとんど特異的な化学誘引物質であり、炎症性応答で重要な役割を果たすと考えられる。IL8はまた、血管形成を誘導し、経内皮好中球遊走を媒介し、そして他の炎症性応答の原因となる。IL8および関連するサイトカインの特性は、Baggioliniら, 1994, Adv. Immunol. 55:97-179で議論され、これは参考として本明細書に援用される。
【０２２９】
IL8は、好中球に結合しそして活性化し、そしてインビトロで内皮細胞層によって好中球走化性を誘導することが示されている。血管系から炎症の部位への好中球遊出を誘導することにおけるIL8の役割は、同様にインビボで証明されている。さらに、その状況におけるIL8の阻害は、好中球補充から生じる組織傷害を抑制した。抗ウサギIL8抗体は、虚血から生じる肺再灌流損傷を抑制し得る（Sekidoら, 1993, Nature 365:654-7）。抗ウサギIL8抗体はまた、ウサギにおける内毒素誘導胸膜炎から生じる肺傷害を抑制し得る（Broaddusら, 1994, J. Immunol. 152:2960-7）。インビボ霊長類モデルはまた、血管系から炎症部位への好中球の遊走における抗ヒトIL8 mAbの効果を決定するために適切である。内毒素でのアカゲザルの皮内注射は注射部位でのIL8発現をアップレギュレートし、そして最終的には好中球局在化を生じることが示されている（Silberら, 1994, Lab. Invest. 70:163-75）。
【０２３０】
抗IL8抗体はまた、組織傷害を減少させそして成人呼吸促進症候群（ARDS）および酸誘導した肺損傷を含む急性炎症の動物モデルにおいて生存を延長することが示されている（Sekidoら, 1993, Nature 365:654-7；Mulliganら, 1993, J. Immunol. 150:5585-95；Broaddusら, 1994, J. Immunol. 152:2960-7、これらのすべては参考として本明細書に援用される）。炎症におけるIL-8の役割と一致して、ヒト抗IL-8モノクローナル抗体は、再灌流損傷（特に肺および心臓に対して）、脈管炎、敗血症性ショック、自己免疫疾患（糸球体腎炎、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、および乾癬を含む）、アレルギー性反応（例えば、喘息）、および嚢胞性線維症を含む、炎症応答によって引き起こされるまたは悪化される種々の状態の処置に使用され得る。
【０２３１】
２つの異なるIL8レセプター、IL8RAおよびIL8RBが同定されている（Holmesら, 1991, Science 253:1278-80；Murphyら, 1991, Science 253:1280-3）。両方のレセプターともIL8を結合するが、IL8RBのみが他のCXCケモカインを結合する。両方のレセプターとも、好中球およびいくつかのリンパ球上にほぼ等しい数で見られる。
【実施例】
【０２３２】
方法および材料
トランスジェニックマウスを、Hoganら,「Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory（これは参考として本明細書に援用される）に従って得る。
【０２３３】
胚幹細胞を、公表された手順（Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, E.J. Robertson編, IRL Press, Washington, D.C., 1987；Zjilstraら, Nature 342:435-438 (1989)；およびSchwartzbergら, Science 246:799-803 (1989)、これらのそれぞれは参考として本明細書に援用される）に従って操作する。
【０２３４】
DNAクローニング手順を、J. Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.（これは参考として本明細書に援用される）に従って行う。
【０２３５】
オリゴヌクレオチドを、製造者によって提供される説明書に従ってApplied Bio Systemsオリゴヌクレオチド合成機で合成する。
【０２３６】
ハイブリドーマ細胞および抗体を、「Antibodies: A Laboratory Manual」HarlowおよびDavid Lane編, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)（これは参考として本明細書に援用される）に従って操作する。
【０２３７】
実施例１
ゲノム重鎖ヒトIgトランスジーン
この実施例は、マウス接合子にマイクロインジェクトされるヒトゲノム重鎖免疫グロブリントランスジーンのクローニングおよびマイクロインジェクションを説明する。
【０２３８】
核を、Marzluffら,「Transcription and Translation: A Practical Approach」, B.D. HammesおよびS.J. Higgins編, 89-129頁, IRL Press, Oxford (1985)に記載のように、新鮮なヒト胎盤組織から単離する。単離した核（またはPBS洗浄したヒト精母細胞）を、低融点アガロースマトリクスに封埋し、そしてEDTAおよびプロテイナーゼκで溶解して高分子量DNAを曝露し、次いでこれを、M. Finney, Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubelら編, John Wiley & Sons, Supp. 4, 1988, 2.5.1項）に記載のように、制限酵素NotIでアガロース中で切断する。
【０２３９】
次いで、NotI切断したDNAを、Anandら, Nucl. Acids Res. 17:3425-3433 (1989)に記載のようにパルスフィールドゲル電気泳動によって分画する。NotIフラグメントの豊富な画分を、サザンハイブリダイゼーションによってアッセイして、このフラグメントによってコードされる１つ以上の配列を検出する。このような配列は、重鎖Ｄセグメント、Ｊセグメント、μおよびγ1定常領域を、すべての６つのVHファミリーの代表物とともに含む（このフラグメントは、Bermanら (1988), 前出によってHeLa細胞からの670kbフラグメントとして同定されるが、本発明者らは、ヒト胎盤精子DNAからの830kbフラグメントとしてであることを見い出した）。このNotIフラグメントを含むその画分（図４を参照のこと）をプールし、そして酵母細胞におけるベクターpYACNNのNotI部位にクローニングする。プラスミドpYACNNを、EcoRIでのpYAC-4 Neo（Cookら, Nucleic Acids Res. 16:11817 (1988)）の切断およびオリゴヌクレオチド5'- AAT TGC GGC CGC - 3'の存在下での連結によって調製する。
【０２４０】
重鎖NotIフラグメントを含むYACクローンを、Brownsteinら, Science 244:1348-1351 (1989)、およびGreenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1213-1217 (1990)（これらは参考として本明細書に援用される）に記載のように単離する。クローニングしたNotI挿入物を、M. Finney, 前出に記載のように、パルスフィールドゲル電気泳動によって高分子量酵母DNAから単離する。DNAを、１mM スペルミンの添加によって濃縮し、そして既述の単一細胞胚の核に直接マイクロインジェクションする。
【０２４１】
実施例２
インビボ相同組換えによって形成されるゲノムκ軽鎖ヒトIgトランスジーン
ヒトκ軽鎖の地図は、Lorenzら, Nucl. Acids Res. 15:9667-9677 (1987)（これは参考として本明細書に援用される）に記載されている。
【０２４２】
すべてのＣκ、3'エンハンサー、すべてのＪセグメント、および少なくとも５つの異なるＶセグメントを含む450kbのXhoI〜NotIフラグメントを単離し、そして実施例１に記載のように単一細胞胚の核にマイクロインジェクトする。
【０２４３】
実施例３
インビボ相同組換えによって形成されるゲノムκ軽鎖ヒトIgトランスジーン
上記のすべておよび少なくとも20より多いＶセグメントを含む750kbのMluI〜NotIフラグメントを、実施例１に記載のように単離し、そしてBssHIIで切断して約400kbのフラグメントを産生する。
【０２４４】
450kbのXhoI〜NotIフラグメント＋約400kbのMluI〜BssHIIフラグメントは、BssHIIおよびXhoI制限部位によって定義される配列重複を有する。マウス接合子のマイクロインジェクションにおけるこれらの２つのフラグメントの相同組換えは、450kbのXhoI/NotIフラグメント（実施例２）で見られるよりも少なくともさらに15〜20のＶセグメントを含むトランスジーンを生じる。
【０２４５】
実施例４
重鎖ミニ遺伝子座の構築
Ａ．pGP1およびpGP2の構築
pBR322を、EcoRIおよびStyIで切断し、そして以下のオリゴヌクレオチドで連結して、図８に示される制限部位を含む147bp塩基対挿入物を含むpGP1を生成する。これらのオリゴの一般的重複もまた図９に示す。
【０２４６】
オリゴヌクレオチドは、以下の通りである：
【化１】
2009045066.tif 000002
【０２４７】
このプラスミドは、マイクロインジェクションのためにベクター配列から単離され得る大きな挿入物を構築するための希少切断(rare cutting)NotI部位に隣接する大きなポリリンカーを含む。プラスミドは、pUCベースのプラスミドと比較して比較的低コピーであるpBR322に基づく（pGP1は、複製起点の近くにpBR322コピー数制御領域を保持する）。低コピー数は、挿入物配列の潜在的毒性を減少させる。さらに、pGP1は、アンピシリン耐性遺伝子とポリリンカーとの間に挿入されたtrpAに由来する強力な転写ターミネーター配列（Christieら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4180 (1981)）を含む。これは、さらに、アンピシリンプロモーターから生じる読み過し転写を抑制することによって、特定の挿入物と関連する毒性を減少させる。
【０２４８】
プラスミドpGP2は、ポリリンカーに追加の制限部位（SfiI）を導入するためにpGP1に由来する。pGP1を、MluIおよびSpeIで切断して、プラスミドのポリリンカー部分において認識配列を切断する。
【０２４９】
以下のアダプターオリゴヌクレオチドを、このように切断したpGP1に連結して、pGP2を形成する。
【化２】
2009045066.tif 000003
【０２５０】
pGP2は、MluIとSpeI部位との間に位置する追加のSfiI部位を含む以外は、pGP1と同一である。これは、挿入物をSfiIならびにNotIで完全に切り出させる。
【０２５１】
Ｂ．pRE3の構築（ラットエンハンサー3'）
ラット定常領域の下流に位置するエンハンサー配列は、重鎖構築物に含まれる。
Pettersonら, Nature 344:165-168 (1990)（これは参考として本明細書に援用される）に記載される重鎖領域3'エンハンサーを単離しそしてクローニングする。ラットIGH 3'エンハンサー配列を、以下のオリゴヌクレオチドを使用することによってPCR増幅する：
【化３】
2009045066.tif 000004
【０２５２】
このように形成された3'エンハンサーをコードする二本鎖DNAを、BamHIおよびSphIで切断し、そしてBamHI/SphI切断したpGP2にクローニングして、pRE3（ラットエンハンサー3'）を得る。
【０２５３】
Ｃ．ヒトJ-μ領域のクローニング
この領域の実質的部分を、ファージλ挿入物から単離された２つ以上のフラグメントを組み合わせることによってクローニングする。図９を参照のこと。
【０２５４】
すべてのヒトＪセグメントを含む6.3kbのBamHI/HindIIIフラグメント（Matsudaら, EMBO J., 7:1047-1051 (1988)；Ravetechら, Cell, 27:583-591 (1981)、これらは参考として本明細書に援用される）を、オリゴヌクレオチドGGA CTG TGT CCC TGT GTG ATG CTT TTG ATG TCT GGG GCC AAGを使用してヒトゲノムDNAライブラリーから単離する。
【０２５５】
エンハンサー、スイッチ、およびエキソンをコードする定常領域を含む隣接した10kbのHindIII/BamIIフラグメント（Yasuiら, Eur. J. Immunol. 19:1399-1403 (1989)）は、以下のオリゴヌクレオチドを使用して同様に単離する：
【化４】
2009045066.tif 000005
隣接した3' 1.5kb BamHIフラグメントを、プローブとしてクローンpMUM挿入物を使用して同様に単離し（pMUMは、以下のオリゴヌクレオチド：
【化５】
2009045066.tif 000006
μ膜エキソン１でヒトゲノムDNAライブラリーから単離された4 kb EcoRI/HindIIIフラグメントである）、そしてpUC19にクローニングする。
【０２５６】
pGP1を、BamHIおよびBglIIで、次いでウシ腸アルカリホスファターゼでの処理で切断する。
【０２５７】
図９からのフラグメント(a)および(b)を、切断したpGP1にクローニングする。次いで、5' BamHI部位がBamHI/Bgl融合によって破壊されるように配向されるクローンを単離する。これをpMUと同定する（図10を参照のこと）。pMUを、BamHIで切断し、そして図９からのフラグメント(c)を挿入する。配向をHindIII切断でチェックする。得られるプラスミドpHIG1（図10）は、ＪおよびＣμセグメントをコードする18kb挿入物を含む。
【０２５８】
Ｄ．Ｃμ領域のクローニング
pGP1を、BamHIおよびHindIIIで切断し、次いでウシ小腸アルカリホスファターゼで処理する（図14）。このように処理した図14のフラグメント(b)および図14のフラグメント(c)を、BamHI/HindIII切断したpGP1にクローニングする。フラグメント(c)の適切な配向を、HindIII切断によってチェックして、Ｃμ領域をコードする12kb挿入物を含むpCON1を形成する。
【０２５９】
pHIG1は、NotI部位に隣接するポリリンカーにSfiI 3'部位およびSpeI 5'部位を有する18kb挿入物中に、Ｊセグメント、スイッチ、およびμ配列を含むが、再配置されたVDJセグメントのために使用される。pCON1は、Ｊ領域を欠きそして12kb挿入物のみを含む以外は、同一である。再配置されたVDJセグメントを含むフラグメントの構築におけるpCON1の使用は、以下に記載される。
【０２６０】
Ｅ．γ-1定常領域のクローニング（pREG2）
ヒトγ-1領域のクローニングを図16に示す。
Yamamuraら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2152-2156 (1986)は、組込みにおいて部分的に欠失しているトランスジーン構築物からの膜結合したヒトγ-1の発現を報告した。その結果は、3' BamHI部位が、5kb未満のV-Cイントロンを有するγ遺伝子の膜貫通再配置したおよびスイッチ化コピーを含む配列を描くことを示す。したがって、再配置されていない、およびスイッチングされていない遺伝子では、全体のスイッチ領域は、最初のγ-1定常エキソンの5'末端からの5kb以下で始まる配列に含まれる。したがって、5' 5.3kb HindIIIフラグメントに含まれる（Ellisonら, Nucleic Acids Res. 10:4071-4079 (1982)、これは参考として本明細書に援用される）。Takahashiら, Cell 29:671-679 (1982)（これは参考として本明細書に援用される）はまた、このフラグメントがスイッチ配列を含み、そして7.7kbのHindIII〜BamHIフラグメントとともにこのフラグメントが、トランスジーン構築のために必要とする配列のすべてを含まなければならないことを報告する。イントロン配列は、特定の遺伝子のイントロンに存在する少なくとも15の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【０２６１】
γ-1領域を含むファージクローンを同定し、そしてγ-I(CH3)の第３のエキソンに特異的である以下のオリゴヌクレオチドを使用して単離する。
【化６】
2009045066.tif 000007
【０２６２】
7.7kbのHindIII〜BglIIフラグメント（図11のフラグメント(a)）を、HIndIII/BglII切断したpRE3にクローニングして、pREG1を形成する。上流の5.3kb HindIIIフラグメント（図11のフラグメント(b)）を、HindIII切断したpREG1にクローニングして、pREG2を形成する。正確な配向を、BamHI/SpeI切断によって確認する。
【０２６３】
Ｆ．ＣγおよびＣμを組み合わせる工程
上記のプラスミドpHIG1は、ヒトＪセグメントおよびＣμ定常領域エキソンを含む。Ｃμ定常領域遺伝子セグメントを含むトランスジーンを提供するために、pHIG1をSfiIで切断した（図10）。プラスミドpREG2もまた、SfiIで切断して、ヒトＣγエキソンおよびラット3'エンハンサー配列を含む13.5kb挿入物を産生した。これらの配列を合わせて、31.5kb挿入物に含まれる、ヒトＪセグメント、ヒトＣμ定常領域、ヒトＣγ１定常領域、およびラット3'エンハンサーを含むプラスミドpHIG3'（図12）を産生した。
【０２６４】
Ｊセグメントを含まないヒトＣμおよびヒトＣγ１をコードする第２のプラスミドを、SfiIでpCON1を切断すること、およびSfiIでpREG2を切断することによってヒトＣγ領域およびラット3'エンハンサーを含むSfiIフラグメントと合わせることによって、構築する。得られるプラスミドpCON（図12）は、ヒトＣγ、ヒトγ１、およびラット3'エンハンサー配列を含む26kb NotI/SpeI挿入物を含む。
【０２６５】
Ｇ．Ｄセグメントのクローニング
ヒトＤセグメントをクローニングするための方策を、図13に示す。Ｄセグメントを含むヒトゲノムライブラリーからのファージクローンを同定し、そして多様性領域配列に特異的なプローブを使用して単離する（Ichiharaら, EMBO J. 7:4141-4150 (1988)）。以下のオリゴヌクレオチドを使用する：
【化７】
2009045066.tif 000008
【０２６６】
DLR1、DXP1、DXP'1、およびDA1を含む5.2kb XhoIフラグメント（図13のフラグメント(b)）を、オリゴDXP1で同定したファージクローンから単離する。
【０２６７】
DXP4、DA4、およびDK4を含む3.2kb XbaIフラグメント（図13のフラグメント(c)）を、オリゴDXP4で同定したファージクローンから単離する。
【０２６８】
図13からのフラグメント(b)、(c)、および(d)を合わせて、そしてpGP1のXbaI/XhoI部位にクローニングして、10.6kb挿入物を含むpHIG2を形成する。
【０２６９】
このクローニングを連続して行う。最初に、図13の5.2kbフラグメント(b)および図13の2.2kbフラグメントを、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてXhoIおよびXbaIで切断したPGP1にクローニングする。得られるクローンを、5.2および2.2kb挿入物でスクリーニングする。5.2および2.2kb挿入物でポジティブを試験するこのクローンの半分は、BamHI切断によって決定したように、適切な配向で5.2kb挿入物を有する。次いで、図13からの3.2kb XbaIフラグメントを、フラグメント(b)および(d)を含むこの中間プラスミドにクローニングして、pHIG2を形成する。このププスミドは、独特の5'SfiI部位および独特の3' SpeI部位を有するポリリンカーにクローニングした異なるセグメントを含む。全体のポリリンカーは、NotI部位に隣接する。
【０２７０】
Ｈ．重鎖ミニ遺伝子座の構築
以下は、１つ以上のＶセグメントを含むヒト重鎖ミニ遺伝子座の構築を説明する。
Newkirkら, J. Clin. Invest. 81:1511-1518 (1988)（これは参考として本明細書に援用される）のハイブリドーマに含まれるＶセグメントと同定されるものに対応する再配置されていないＶセグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して単離する：
【化８】
2009045066.tif 000009
【０２７１】
再配置されていないＶセグメントの制限地図を決定して、5'および3'隣接配列とともに再配置されていないＶセグメントを含む約2kb長を有するDNAフラグメントを切断で提供する、独特の制限部位を同定する。5'プライム配列は、プロモーターおよび他の調節配列を含むが、3'隣接配列は、V-DJ連結に必要な組換え配列を提供する。この約3.0kbＶセグメント挿入物を、pGB2のポリリンカーにクローニングして、pVH1を形成する。
【０２７２】
pVH1をSfiIで切断し、そして得られるフラグメントを、pHIG2のSfiI部位にクローニングして、pHIG5'を形成する。pHIG2はＤセグメントのみを含むので、得られるpHIG5'プラスミドは、Ｄセグメントとともに単一のＶセグメントを含む。pHIG5に含まれる挿入物のサイズは、10.6kb＋Ｖセグメント挿入物のサイズである。
【０２７３】
pHIG5からの挿入物を、NotIおよびSpeIでの切断によって切り出し、そして単離する。Ｊ、Ｃμ、およびＣγ１セグメントを含むpHIG3'を、SpeIおよびNotIで切断し、そしてこのような配列およびラット3'エンハンサー配列を含む3'kbフラグメントを単離する。これらの２つのフラグメントを合わせ、そしてNotI切断したpGP1に連結して、１つのＶセグメント、９つのＤセグメント、６つの機能的Ｊセグメント、Ｃμ、Ｃγ、およびラット3'エンハンサーをコードする挿入物を含むpHIGを産生する。この挿入物のサイズは、約43kb＋Ｖセグメント挿入物のサイズである。
【０２７４】
Ｉ．相同組換えによる重鎖ミニ遺伝子座の構築
上記の項で示されるように、pHIGの挿入物は、単一のＶセグメントが用いられる場合、約43〜45kbである。この挿入物サイズは、プラスミドベクターに容易にクローニングされ得るサイズの限界またはその付近である。より多数のＶセグメントの使用を提供するために、以下は、接合子またはES細胞内での相同組換えの際に、ラット3'エンハンサー配列、ヒトＣμ、ヒトＣγ１、ヒトＪセグメント、ヒトＤセグメント、および多くのヒトＶセグメントを含むトランスジーンを形成する重複DNAフラグメントのインビボ相同組換えを説明する。
【０２７５】
ヒトＪセグメント（図９のフラグメント(a)を参照のこと）を含む6.3kb BamHI/HindIIIフラグメントを、以下のアダプターを使用してMluI/SpeI切断したpHIG5'にクローニングする：
【化９】
2009045066.tif 000010
【０２７６】
得られるものは、pHIG5'O（重複）と命名したプラスミドである。このプラスミドに含まれる挿入物は、ヒトＶ、Ｄ、およびＪセグメントを含む。pVH1からの単一のＶセグメントを使用する場合、この挿入物のサイズは、約17kb＋2kbである。この挿入物を単離し、そしてヒトＪ、Ｃμ、γ１、およびラット3'エンハンサー配列を含むpHIG3'からの挿入物と合わせる。両方の挿入物は、２つのDNAフラグメント間の重複の約6.3kbを提供するヒトＪセグメントを含む。マウス接合子に同時注入した場合、インビボ相同組換えは、pHIGに含まれる挿入物に等価のトランスジーンを生じることが起こる。
【０２７７】
このアプローチは、インビボで形成されるトランスジーンに多くのＶセグメントの添加を提供する。例えば、pHIG5'へ単一のＶセグメントを組込む代わりに、(1)単離されたゲノムDNA、(2)ゲノムDNAに由来する連結されたDNA、または(3)合成ＶセグメントレパートリーをコードするDNAに含まれる多くのＶセグメントを、SfiI部位でpHIG2にクローニングして、pHIG5'ＶＮを生成する。次いで、図９のＪセグメントフラグメント(a)を、pHIG5'ＶＮにクローニングし、そして挿入物を単離する。この挿入物は、現在、pHIG3'から単離された挿入物に含まれるＪセグメントと重複する多くのＶセグメントおよびＪセグメントを含む。マウス接合子の核に同時導入した場合、相同組換えが生じて、複数のＶセグメントおよび複数のＪセグメント、複数のＤセグメント、Ｃμ領域、Ｃγ１領域（すべてヒトから）、ならびにラット3'エンハンサー配列をコードするトランスジーンをインビボで生成する。
【０２７８】
実施例５
軽鎖ミニ遺伝子座の構築
Ａ．pEμ1の構築
pEμ1の構築を図16に示す。マウス重鎖エンハンサーを、以下のオリゴを使用して、ファージクローンからのXbaI〜EcoRI 678bpフラグメント（Banerjiら, Cell 33:729-740 (1983)）で単離する:
【化１０】
2009045066.tif 000011
【０２７９】
このEμフラグメントを、EcoRI部位で満たしている平滑末端によってEcoRV/XbaI切断したpGP1にクローニングする。得られるプラスミドを、pEmu1と命名する。
【０２８０】
Ｂ．κ軽鎖ミニ遺伝子座の構築
κ構築物は、少なくとも１つのヒトＶκセグメント、すべての５つのヒトＪκセグメント、ヒトＪ-Ｃκエンハンサー、ヒトκ定常領域エキソン、および、理想的には、ヒト3'κエンハンサーを含む（Meyerら, EMBO J. 8:1959-1964 (1989)）。マウスにおけるκエンハンサーは、Ｃκから9kb下流である。しかし、ヒトではまだ未同定である。さらに、構築物は、マウス重鎖Ｊ-Ｃμエンハンサーのコピーを含む。
【０２８１】
ミニ遺伝子座を、４つの成分フラグメントから構築する：
(a)マウス遺伝子座との類推によってヒトＣκエキソンおよび3'ヒトエンハンサーを含む16kb SmaIフラグメント；
(b)すべてのＪセグメントを含む、5'隣接する5kb SmaIフラグメント；
(c)pEμ1から単離されたマウス重鎖イントロンエンハンサー（この配列は、Ｂ細胞発生においてできるだけ早く軽鎖構築物の発現を誘導するために含まれる。重鎖遺伝子は軽鎖遺伝子よりも早く転写されるので、この重鎖エンハンサーは、おそらく、イントロンκエンハンサーよりも初期の段階で活性である）；および
(d)１つ以上のＶセグメントを含むフラグメント。
【０２８２】
この構築物の調製は以下の通りである。ヒト胎盤DNAを、SmaIで切断し、そして電気泳動によってアガロースゲル上で分画する。同様に、ヒト胎盤DNAを、BamHIで切断し、そして電気泳動によって分画する。16kb画分を、SmaI切断したゲルから単離し、そして11kb領域を、BamHIで切断したDNAを含むゲルから同様に単離する。
【０２８３】
16kb SmaI画分を、XhoIで切断されているλFIX II（Stratagene, La Jolla, California）にクローニングし、クレノウフラグメントDNAポリメラーゼで処理して、XhoI制限切断産物で満たす。16kb SmaI画分の連結は、SmaI部位を破壊し、そしてXhoI部位をインタクトなままにする。
【０２８４】
11kb BamHI画分を、クローニングの前にBamHIで切断されるλEMBL3（Strategene, La Jolla, California）にクローニングする。
【０２８５】
各ライブラリーからのクローンを、Ｃκ特異的オリゴでプローブした：
【化１１】
2009045066.tif 000012
【０２８６】
16kb XhoI挿入物を、XhoI切断したpEμ1にサブクローニングした。その結果ＣκはSmaI部位に隣接する。得られるプラスミドを、pKap1と命名した。
【０２８７】
上記のＣκ特異的オリゴヌクレオチドを使用して、11kbクローンを同定するためにλEMBL3/BamHIライブラリーをプローブする。5kb SmaIフラグメント（図20のフラグメント(b)）をサブクローニングし、そして続いてSmaIで切断したpKap1に挿入する。Ｊセグメント、Ｃκ、およびＥμエンハンサーの正確な配向を含むプラスミドを、pKap2と命名する。
【０２８８】
その後、１つ以上のＶκセグメントを、pKap2のMluI部位にサブクローニングして、ヒトＶκセグメント、ヒトＪκセグメント、ヒトＣκセグメント、およびヒトＥμエンハンサーをコードするプラスミドpKapHを得る。この挿入物を、NotIでpKapHを切断することによって切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動によって精製する。このように精製した挿入物を、上記のように、マウス接合子の前核にマイクロインジェクトする。
【０２８９】
Ｃ．インビボ相同組換えによるκ軽鎖ミニ遺伝子座の構築
11kb BamHIフラグメントを、3'末端がSfiI部位に向くようにBamHI切断したpGP1にクローニングする。得られるプラスミドを、pKAPintと命名する。１つ以上のＶκセグメントを、pKAPintのBamHIとSpeI部位との間のポリリンカーに挿入して、pKapHVを形成する。pKapHVの挿入物を、NotIでの切断によって切り出し、そして精製する。pKap2からの挿入物を、NotIでの切断によって切り出し、そして精製する。これらのフラグメントのそれぞれは、pKapHVからのフラグメントが、pKAp2から得られる挿入物に含まれる5kb SmaIフラグメントに実質的に相同であるＪκセグメントを含むDNAの5kb配列を含む点で、相同性の領域を含む。このように、これらの挿入物は、マウス接合子にマイクロインジェクトされてＶκ、Ｊκ、およびＣκをコードするトランスジーンを形成する場合、相同組換えが可能である。
【０２９０】
実施例６
免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子の再配置されそして発現されたコピーに対応するゲノムクローンの単離
この実施例は、目的の免疫グロブリンを発現する培養した細胞からの免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子のクローニングを説明する。このような細胞は、所定の免疫グロブリン遺伝子の複数の対立遺伝子を含み得る。例えば、ハイブリドーマは、κ軽鎖遺伝子の４コピー、融合パートナー細胞株からの２コピー、および目的の免疫グロブリンを発現する元のＢ細胞からの２コピーを含み得る。これらの４コピーのうち、これらのいくつかが再配置され得るという事実にもかかわらず、１つのみが目的の免疫グロブリンをコードする。この実施例に記載の手順は、κ軽鎖の発現されたコピーの選択的クローニングを可能にする。
【０２９１】
Ａ．二本鎖cDNA
ヒトハイブリドーマ、またはリンパ腫、あるいは細胞表面もしくは分泌されたもしくは両方の形態のκ軽鎖を有するIgMのいずれかを合成する他の細胞株からの細胞を、ポリA+ RNAの単離に使用する。次いで、RNAを、酵素の逆転写酵素を使用するオリゴdTプライムcDNAの合成に使用する（一般的方法については、Goodspeedら (1989) Gene 76:1；Dunnら (1989) J. Biol. Chem. 264:13057を参照のこと）。次いで、一本鎖cDNAを単離し、そしてＧ残基を、酵素のポリヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼを使用して3'末端に付加する。次いで、Ｇテイルの一本鎖cDNAを精製し、そしてプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを使用して第２鎖合成（酵素のDNAポリメラーゼによって触媒される）のためのテンプレートとして使用する：
【化１２】
2009045066.tif 000013
【０２９２】
二本鎖cDNAを単離し、そして発現された免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖をコードするmRNAの5'末端のヌクレオチド配列を決定するために使用する。次いで、これらの発現された遺伝子のゲノムクローンを単離する。発現された軽鎖遺伝子をクローニングするための手順を、以下のＢ部に概説する。
【０２９３】
Ｂ．軽鎖
Ａ部に記載の二本鎖cDNAを変性し、そして以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用するDNA合成の第３ラウンドのためのテンプレートとして使用する：
【化１３】
2009045066.tif 000014
【０２９４】
このプライマーは、κ軽鎖メッセージの定常部分に特異的な配列（TCA TCA GAT GGC GGG AAG ATG AAG ACA GAT GGT GCA）ならびに新しく合成したDNA鎖のPCR増幅のためのプライマーとして使用され得る独特の配列（GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG）を含む。配列を、以下の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してPCRによって増幅する：
【化１４】
2009045066.tif 000015
【０２９５】
次いで、PCR増幅した配列を、ゲル電気泳動によって精製し、そしてプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを使用するジデオキシ配列決定反応のためのテンプレートとして使用する：
【化１５】
2009045066.tif 000016
【０２９６】
次いで、配列の最初の42ヌクレオチドを使用して、免疫グロブリンメッセージを転写した遺伝子を単離するための独特のプローブを合成する。DNAのこの合成42ヌクレオチドセグメントは、以下でo-κという。
【０２９７】
次いで、Ig発現細胞株から単離され、そして個々に、およびSmaIを含むいくつかの異なる制限エンドヌクレアーゼと対で組み合わせて切断された、DNAのサザンブロットを、32-P標識した独特のオリゴヌクレオチドo-κでプローブする。独特の制限エンドヌクレアーゼ部位を、再配置されたＶセグメントの上流で同定する。
【０２９８】
次いで、Ig発現する細胞株からのDNAを、SmaIおよび第２の酵素（またはＶセグメント内にSmaI部位が存在する場合、BamHIもしくはKpnI）で切断する。何らかの得られる非平滑末端を、酵素T4 DNAポリメラーゼで処理して、平滑末端化DNA分子を得る。次いで、リンカーをコードする制限部位（フラグメントに存在しない部位に依存してBamHI、EcoRI、またはXhoI）を付加し、そして対応するリンカー酵素で切断して、BamHI、EcoRI、またはXhoI末端を有するDNAフラグメントを得る。次いで、DNAを、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画し、そして発現したＶセグメントを覆うDNAフラグメントを含む画分を、λEMBL3またはλFIX（Stratagene, La Jolla, California）にクローニングする。Ｖセグメント含有クローンを、独特のプローブo-κを使用して単離する。DNAを、ポジティブクローンから単離し、そしてpKap1のポリリンカーにサブクローニングする。得られるクローンを、pRKLと呼ぶ。
【０２９９】
実施例７
免疫グロブリン重鎖μ遺伝子の再配置され発現されたコピーに対応するゲノムクローンの単離
この実施例は、目的の発現された免疫グロブリンの培養された細胞からの免疫グロブリン重鎖μ遺伝子のクローニングを説明する。この実施例に記載された手順は、μ重鎖遺伝子の発現されたコピーの選択的クローニングを可能にする。
【０３００】
二本鎖cDNAを、本明細書で上記のように調製しそして単離する。二本鎖cDNAを変性し、そして以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してDNA合成の３ラウンドのためのテンプレートとして使用する：
【化１６】
2009045066.tif 000017
【０３０１】
このプライマーは、μ重鎖メッセージの定常部分に特異的な配列（ACA GGA GAC GAG GGG GAA AAG GGT TGG GGC GGA TGC）ならびに新しく合成したDNA鎖のPCR増幅のためのプライマーとして使用され得る独特の配列（GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG）を含む。配列を、以下の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用するPCRによって増幅する：
【化１７】
2009045066.tif 000018
【０３０２】
次いで、PCR増幅した配列を、ゲル電気泳動によって精製し、そしてプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを使用するジデオキシ配列決定反応のためのテンプレートとして使用する：
【化１８】
2009045066.tif 000019
【０３０３】
次いで、配列の最初の42ヌクレオチドを使用して、免疫グロブリンメッセージを転写した遺伝子を単離するための独特のプローブを合成する。DNAのこの合成42ヌクレオチドを、以下ではo-μという。
【０３０４】
次いで、Ig発現細胞株から単離され、そして個々に、およびMluI（MluIは、ＪセグメントとμCH1との間を切断する希な切断酵素である）を含むいくつかの異なる制限エンドヌクレアーゼと対で組み合わせて切断された、DNAのサザンブロットを、32-P標識した独特のオリゴヌクレオチドo-μでプローブする。独特の制限エンドヌクレアーゼ部位を、再配置されたＶセグメントの上流で同定する。
【０３０５】
次いで、Ig発現する細胞株からのDNAを、MluIおよび第２の酵素で切断する。次いで、MluIまたはSpeIアダプターリンカーを、末端に連結し、そして切断して上流部位をMluIまたはSpeIに変換する。次いで、DNAを、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画し、そして発現したＶセグメントを覆うDNAフラグメントを含む画分を、プラスミドpGPIに直接的にクローニングする。Ｖセグメントを含むクローンを、独特のプローブo-μを使用して単離し、そして挿入物を、MluIまたはMluI/SpeI切断したプラスミドpCON2にサブクローニングする。得られるプラスミドを、pRMGHと呼ぶ。
【０３０６】
実施例８
ヒトκミニ遺伝子座トランスジーンの構築
軽鎖ミニ遺伝子座
ヒトゲノムDNAファージライブラリーを、κ軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングし、そしてＪκ−Ｃ領域にわたるクローンを単離した。pGP1dにＪκ2-5およびＣκを含む13kb XhoIフラグメントとともに、Ｊκ1を含む5.7kb ClaI/XhoIフラグメントをクローニングし、そしてプラスミドpKcorを生成した。このプラスミドは、Ｊκ1-5、κイントロンエンハンサー、およびＣκを、4.5kbの5'および9kbの3'隣接配列とともに含む。これはまた、Ｖκセグメントをクローニングするための独特の5'XhoI部位、および追加のシス作用調節配列を挿入するための独特の3'SalI部位を有する。
【０３０７】
Ｖκ遺伝子
ヒトゲノムDNAファージライブラリーを、Ｖκ軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングし、そしてヒトＶκセグメントを含むクローンを単離した。機能的Ｖセグメントを、DNA配列分析によって同定した。これらのクローンは、TATAボックス、リーダーおよび可変ペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（２システイン残基を含む）、スプライス配列、および組換えヘプタマー−12bpスペーサー−ノナマー配列を含む。クローンの３つをマッピングしそして配列決定した。クローンの２つ、65.5および65.8は、機能的であるようであり、これらは、TATAボックス、リーダーおよび可変ペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（２システイン残基を含む）、スプライス配列、および組換えヘプタマー−12bpスペーサー−ノナマー配列を含む。第３のクローン、65.4は、非規範的(non-canonical)組換えヘプタマーを含むので、ＶκＩ偽遺伝子をコードするようである。
【０３０８】
機能的クローンの１つの、Ｖκ65-8は、VκIIIファミリー遺伝子をコードし、これを使用して、軽鎖ミニ遺伝子座構築物を構築した。
【０３０９】
pKC1
κ軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンpKC1（図32）を、Ｖκ65.8を含む7.5kb XhoI/SalIフラグメントをpKcorの5'XhoI部位に挿入することによって生成した。トランスジーン挿入物を、注入前にNotIで切断することによって単離した。
【０３１０】
精製した挿入物を、受精した(C57BL/6×CBA)F2マウス胚の前核にマイクロインジェクトし、そしてHoganら（Methods of Manipulating the Mouse Embryo, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）によって記載されるように偽妊娠雌に生存胚を移入した。注入された胚から発生したマウスを、テイルDNAのサザンブロット分析によってトランスジーン配列の存在について分析した。トランスジーンコピー数を、クローニングしたDNAの公知の量を含むコントロール標準に対するバンド強度によって評価した。血清を、これらの動物から単離し、そしてHarlowおよびLane（Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）に記載のように、ELISAによって、ヒトIgκタンパク質をコードするトランスジーンの存在についてアッセイした。マイクロタイタープレートウェルを、ヒトIgκ（クローン6E1, #0173, AMAC, Inc., Westbrook, ME）、ヒトIgM（クローンAF6, #0285, AMAC, Inc., Westbrook, ME）、およびヒトIgG1（クローンJL512, #0280,AMAC, Inc., Westbrook, ME）に特異的なマウスモノクローナル抗体でコーティングした。血清サンプルを、ウェル中に連続希釈し、特異的免疫グロブリンの存在を、マウス免疫グロブリンとの交差反応性を最小にするために予め吸着されているアフィニティー単離されたアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIg（多価）で検出した。
【０３１１】
図35は、８匹のマウス（I.D. #676、674、673、670、666、665、664、および496）からの血清のELISAアッセイの結果を示す。これらのマウスの最初の７匹は、pKC1トランスジーン挿入物を注入した胚から発生し、そして８番目のマウスは、pHC1トランスジーンのマイクロインジェクションによって生成したマウスに由来する（既述）。KC1注入した胚からの７匹のマウスの内の２匹（I.D.#666および664）は、DNAサザンブロット分析によってアッセイされる場合トランスジーン挿入物を含まず、そして５匹のマウス（I.D.#676、674、673、670、および665）は、トランスジーンを含んだ。KC1トランスジーンポジティブ動物の１匹を除く全ては、ヒトIgκタンパク質の検出可能レベルを発現し、そして単一の非発現動物は、DNAサザンブロット分析を基準として遺伝子モザイクであるようである。pHC1ポジティブトランスジェニックマウスは、ヒトIgMおよびIgG1を発現するがIgκを発現せず、これは、アッセイに使用される試薬の特異性を証明する。
【０３１２】
pKC2
κ軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンpKC2を、Ｖκ65.5を含む8kb XhoI/SalIフラグメントをpKC1の5'XhoI部位に挿入することによって生成した。得られるトランスジーン挿入物は、２つのＶκセグメントを含み、これをNotIでの切断によってマイクロインジェクションの前に単離した。
【０３１３】
pKVe2
この構築物は、Ｊκの5'に1.2kbのさらなる配列を含みそしてＶκ65.8の3'に4.5kbの配列がないこと以外は、pKC1と同一である。さらに、マウス重鎖Ｊ-μイントロンエンハンサー（Banerjiら, Cell 33:729-740 (1983)）を含む0.9kb XbaIフラグメントを、下流に挿入されたヒト重鎖Ｊ-μイントロンエンハンサー（Haydayら, Nature 307:334-340 (1984)）を含む1.4kb MluI/HindIIIフラグメントとともに含む。この構築物は、対立遺伝子およびアイソタイプの排除をもたらすために、軽鎖ミニ遺伝子座の初期再配置を開始する可能性を試験する。類似の構築物は、種々のエンハンサー、すなわち、マウスまたはラットの3'κまたは重鎖エンハンサーとともに生成され得る（MeyerおよびNeuberger, EMBO J. 8:1959-1964 (1989)；Pettersonら Nature 344:165-168 (1990)、これらは参考として本明細書に援用される）。
【０３１４】
再配置された軽鎖トランスジーン
κ軽鎖発現カセットを設計して、ヒトＢ細胞DNAからPCRによって増幅されている機能的に再配置された軽鎖遺伝子を再構築した。スキームは、図33に概略する。PCR増幅した軽鎖遺伝子を、κ軽鎖遺伝子65.5から単離された3.7kbの5'隣接配列を含むベクターpK5nxにクローニングする。次いで、5'転写配列に融合したＶＪセグメントを、Ｊκ2-4、Ｊκイントロンエンハンサー、Ｃκ、および9kbの下流配列を含むベクターpK31sの独特のXhoI部位にクローニングする。得られるプラスミドは、胚へのマイクロインジェクションのためにNotIで切り出され得る再構築した機能的に再配置されたκ軽鎖トランスジーンを含む。プラスミドはまた、さらなるシス作用調節配列の挿入のために3'末端に独特のSalI部位を含む。
【０３１５】
２つの合成オリゴヌクレオチド（o-130、o-131）を使用して、ヒト脾臓ゲノムDNAからの再配置したκ軽鎖遺伝子を増幅した。オリゴヌクレオチドo-131（gga ccc aga (g,c)gg aac cat gga a(g,a)(g,a,t,c)）は、ＶκIIIファミリー軽鎖遺伝子の5'領域に相補的であり、そしてリーダー配列の最初のATCと重複する。オリゴヌクレオチドo-130（gtg caa tca att ctc gag ttt gac tac aga c）は、Ｊκ1の3'の約150bpの配列に相補的であり、そしてXhoI部位を含む。これらの２つのオリゴヌクレオチドは、Ｊκセグメントに連結した再配置されたＶκIII遺伝子に対応するヒト脾臓DNAからの0.7kb DNAフラグメントを増幅する。PCR増幅したDNAを、NcoIおよびXhoIで切断し、そして個々のPCR産物をプラスミドpNN03にクローニングした。５クローンのDNA配列を決定し、そして機能的VJ連結（オープンリーディングフレーム）を有する２つを同定した。さらなる機能的に再配置された軽鎖クローンを収集する。機能的に再配置されたクローンは、上記の軽鎖発現カセットに個々にクローニングされ得る（図33）。再配置された軽鎖構築物で生成したトランスジェニックマウスは、重鎖ミニ遺伝子座トランスジェニックと繁殖して、初代レパートリーの多様性のすべてが重鎖によって与えられる完全ヒト抗体のスペクトルを発現するマウスの系列を産生し得る。軽鎖多様性の１つの供給源は、体細胞変異からであり得る。すべての軽鎖が、種々の異なる重鎖と組み合わせる能力に関して等価ではないので、それぞれ異なる軽鎖構築物を含む異なる系列のマウスが生成されそして試験され得る。このスキームの有利点は、再配置されない軽鎖ミニ遺伝子座の使用とは反対に、重鎖VDJ連結が生じるとすぐに重鎖と対になるように軽鎖を準備することから生じる、増加した軽鎖対立遺伝子およびアイソタイプ排除である。この組み合わせは、完全なヒト抗体を発現するＢ細胞の増加した頻度を生じ得、したがって、ヒトIgを発現するハイブリドーマの単離を容易にし得る。
【０３１６】
プラスミドpIGM1、pHC1、pIGG1、pKC1、およびpKC2のNotI挿入物を、アガロースゲル電気泳動によってベクター配列から単離した。精製した挿入物を、受精した(C57BL/6×CBA)F2マウス胚の前核にマイクロインジェクトし、そしてHoganら（Hoganら, Methods of Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1986)）によって記載されるように偽妊娠雌に生存胚を移入した。
【０３１７】
実施例9
マウスκ軽鎖遺伝子の相同組換えによる不活化
この実施例は、胚幹(ES)細胞における相同組換えによってマウスの内因性κ遺伝子座を不活化すること、次いで不活化κ対立遺伝子(allele)を有する標的ES細胞を初期マウス胚(胚盤胞)中に注入することによって、標的ES細胞マウス生殖細胞系へ変異遺伝子を導入することを記載する。
【０３１８】
このストラテジーは、JKおよびCKを、マウスκ遺伝子座に相同なDNA配列を含むベクター(ここで、この遺伝子座のJK遺伝子およびCKセグメントにわたる4.5kbのセグメントが欠失し、そして選択マーカーneoによって置換される)による相同組換えによって欠失させることである。
【０３１９】
κ標的化ベクターの構築
プラスミドpGEM7(KJ1)は、クローニングベクターpGEM-7Zf(+)中、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)プロモーター(XbaI／TaqIフラグメント；Adraら、(1987) Gene 60: 65)の転写制御下で、ネオマイシン耐性遺伝子(neo)(これはトランスフェクトされたES細胞の薬物選択のために用いられる)を含む。このプラスミドはまた、neo遺伝子のための異種ポリアデニル化部位を含む。これはマウスpgk遺伝子の3'領域由来である(PvuII/HindIII フラグメント；Boerら、Biochemical Genetics, 28: 299-308 (1990))。このプラスミドをκ標的化ベクターの構築のための出発点として使用した。第一の段階は、neo発現カセットのκ遺伝子座3'に相同な配列を挿入することであった。
【０３２０】
マウスκ鎖配列(図20a)は、肝臓DNAから誘導されたゲノムファージライブラリーから、Cκ遺伝子座に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ：
【化１９】
2009045066.tif 000020
およびJκ5遺伝子セグメントに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ：
【化２０】
2009045066.tif 000021
を用いて単離された。
【０３２１】
マウスCKセグメントの3'側に延びる8kbのBglII/SacIフラグメントをポジティブファージクローンから2つの小片で(1.2kbのBglII/SacIフラグメントおよび6.8kbのSacIフラグメントとして)単離し、そしてBglII/SacI切断pGEM7(KJ1)にサブクローン化して、プラスミドpNEO-K3'を産生した(図20b)。
【０３２２】
JK領域の5'側に延びる1.2kbのEcoRI/SphIフラグメントもまたポジティブファージクローンから単離された。SphI/XbaI/BglII/EcoRIアダプターをこのフラグメントのSphI部位に連結し、そして得られたEcoRIフラグメントをEcoRI切断pNEO-K3'に、neo遺伝子および下流の3'κ配列と同じ5'から3'への方向で連結して、pNEO-K5'3'を産生した(図20C)。
【０３２３】
次に単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(TK)遺伝子を、相同組換えを有するESクローンを富化するために、Mansourら、Nature 336：348-352(1988)(これは本明細書中に参考として援用される)に記載のように、この構築物中に入れた。HSV TKカセットはプラスミドpGEM7(TK)から得られた。これは、pGEM7(KJ1)について上記のように、マウスpgkプロモーターおよびポリアデニル化配列でにより挟まれたHSV TK遺伝子についての構造配列を含む。pGEM7(TK)のEcoRI部位を改変してBamHIとし、そして次にTKカセットをBamHI/HindIIIフラグメントとして切り出し、そしてpGP1b中にサブクローン化して、pGP1b-TKを産生した。このプラスミドをXhoI部位で直線化し、そしてpNEO-K5'3'由来のXhoIフラグメント(これはJKの5'由来のゲノム配列およびCKの3'由来のゲノム配列が隣接したneo遺伝子を含む)をpGP1b-TK中に挿入して、標的化ベクターJ/C KIを産生した(図20d)。J/C K1での相同組換えに続くゲノムκ遺伝子座の推定構造を図20eに示す。
【０３２４】
κ対立遺伝子の標的化された不活化を有するES細胞の産生および分析
使用されるES細胞は、有糸分裂的に不活性なSNL76/7細胞支持層上で増殖するAB-1株であった(McMahonおよびBradley, Cell 62: 1073-1085(1990))。これは(Robertson, E.J. (1987)、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E.J. Robertson編(Oxford: IRL Press)、第71-112頁)の記載と本質的に同じである。他の適切なES株としては、E14株(Hooperら、(1987) Nature 326: 292-295)、D3株(Doetschmanら、(1985) J. Embryol. Exp. Morph. 87: 27-45)、およびCCE株(Robertsonら、(1986) Nature 323: 445-448)が挙げられるが、これらに限定されない。マウス株を特異的な標的化された変異を有するES細胞から作製させることの成功は、ES細胞の多能性(すなわち、いったん宿主の胚盤胞に注入されると、胚形成に関与し、そして結果として生ずる動物の生殖細胞に寄与する、その能力)に依存する。
【０３２５】
所与のES細胞株の多能性は、培養時間、およびそれらが取り扱われた世話によって変化し得る。多能性についての唯一の決定的なアッセイは、標的化に使用されるES細胞の特定の集団が、ESゲノムの生殖細胞系伝達(transmission)が可能なキメラを生じさせ得るかどうかを決定することである。この理由のため、遺伝子標的化の前に、AB-1細胞の親集団の一部をC57Bl/6J胚盤胞に注入して、この細胞が広範囲なES細胞の寄与を有するキメラマウスを生じ得るかどうか、そしてこれらのキメラの大部分がESゲノムを子孫に伝達し得るかどうかを確認する。
【０３２６】
κ鎖不活化ベクターJ/C K1をNotIで切断し、そして記述された方法で(Hastyら、Nature, 350: 243-246(1991))でAB-1細胞中にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションされた細胞を100mmディッシュ上に1-2×106細胞／ディッシュの密度でプレートした。24時間後、G418(200μg/mlの活性成分)およびFIAU(0.5μM)を培地に加え、そして薬物耐性クローンを10〜11日間成長させた。クローンを採取し、トリプシン処理し、2つの部分に分け、そしてさらに増殖させた。次に各クローン由来の細胞の半分を冷凍し、そして他の半分をベクター配列と標的配列との間の相同組換えについて分析した。
【０３２７】
DNA分析をサザンブロットハイブリダイゼーションで行った。DNAをクローンから記載(Lairdら、Nucl. Acids Res. 19:4293 (1991))のように単離し、XbaIで切断し、そして図20eでプローブAとして図示される800bpのEcoRI/XbaIフラグメントでプローブした。このプローブは、野生型遺伝子座中の3.7kbのXbaIフラグメント、および標的化ベクターで相同的に組み換えされた遺伝子座中の1.8kbの診断的バンドを検出する(図20aおよびe参照)。サザンブロット分析でスクリーニングされた901個のG418およびFIAU耐性クローンのうち7個が、κ遺伝子のうちの1つの中の相同組換えを示す1.8kbのXbaIバンドを示した。これらの7個のクローンを酵素BglII、SacI、およびPstIでさらに切断して、ベクターがκ遺伝子のうちの1つの中に相同的に組み込まれたことを検証した。診断的な800bpのEcoRI/XbaIフラグメント(プローブA)でプローブすると、野生型DNAのBglII、SacI、およびPstI切断により4.1、5.4、および7kbのフラグメントが各々生じ、他方、標的化されたκ対立遺伝子の存在は、2.4、7.5、および5.7kbのフラグメントで各々示される(図20aおよびe参照)。XbaI切断で検出された7個のポジティブクローンは全て、κ軽鎖での相同組換えを診断する、予期されたBglII、SacI、およびPstI制限フラグメントを示した。さらに、標的化されたクローンのNsiI切断をneo特異的プローブ(プローブB、図20e)を用いてサザンブロット分析すると、予想された4.2kbのフラグメントのみが生じた。これは、これらのクローンが各々、標的化ベクターの単一のコピーのみを含んでいたことを示す。
【０３２８】
不活化κ鎖を有するマウスの作製
前節で記載した標的化されたESクローンのうちの5つを解凍し、そして(Bradley, A. (1987)、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E.J. Robertson編(Oxford: IRL Press)、第113-151頁)に記載のように、C57Bl/6J胚盤胞に注入し、そして偽妊娠した雌の子宮に移して、導入したES細胞および宿主胚盤胞由来の細胞の混合物から生じるキメラマウスを作製した。ES細胞がキメラに寄与する程度は、黒色のC57Bl/6Jのバックグラウンド上でのES細胞株由来のアグーチ毛色の量によって視覚的に評価され得る。標的化されたクローンの胚盤胞への注入の結果得られる子孫のおよそ半数がキメラであり(すなわちアグーチならびに黒色の色素沈着を示す)、そしてそのうちの大部分が毛皮の色素沈着に対する広範囲(70％以上)のES細胞の寄与を示す。AB1 ES細胞はXY細胞株であり、そしてこれらの高割合のキメラの大部分が、雄のES細胞でコロニー形成(colonized)された雌の胚の性転換のために雄であった。5つの標的化されたクローンのうちの4つに由来する雄のキメラをC57BL/6J雌と繁殖させ、その子孫を、ESゲノムの生殖細胞系伝達を示す優性アグーチ毛色の存在についてモニターした。これらのクローンのうちの2つに由来するキメラは、一貫してアグーチの子孫を生じた。注入されたESクローンにおいてκ遺伝子座の1つのコピーのみが標的化されたので、各アグーチ仔が変異した遺伝子座を遺伝により受け継ぐチャンスは50％であった。標的化された遺伝子のスクリーニングを、標的化されたESクローンの同定に利用したプローブ(プローブA、図20e)を用いて、尾の生検からのBgl II切断DNAのサザンブロット分析によって行った。予期されたように、およそ50％のアグーチ子孫が2.4kbのハイブリダイズするBgl IIバンドを4.1kbの野生型バンドに加えて示した。これは標的化されたκ遺伝子座の生殖細胞系伝達を示す。
【０３２９】
この変異に関してホモ接合性のマウスを作製するために、ヘテロ接合体同士で繁殖させ、そして子孫のκ遺伝子型を上記のようにして決定した。予期されたように、3種の遺伝子型がヘテロ接合体の交配から誘導された。正常κ遺伝子座の2つのコピーを有する野生型マウス、κ遺伝子の標的化されたコピー1つおよびNTκ遺伝子1つを有するヘテロ接合体、ならびにκ変異に関してホモ接合性のマウスである。これらの後者のマウス由来のκ配列の欠失はJKに特異的なプローブ(プローブC、図20a)でのサザンブロットのハイブリダイゼーションによって検証された。ヘテロ接合性の同胞および野生型の同胞由来のDNAサンプルに対してJKプローブのハイブリダイゼーションが観察されたのに対し、ホモ接合体ではハイブリダイズシグナルは存在しなかった。これはκ遺伝子座の両コピーが標的化された変異の結果としての欠失によって不活化されている新規なマウス系統の作製を立証する。
【０３３０】
実施例10
相同組換えによるマウス重鎖遺伝子の不活化
この実施例は、胚幹(ES)細胞における相同組換えによる内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の不活化を記載する。このストラテジーは、内因性重鎖Jセグメントを、JH領域が欠失し、そして選択的マーカーneoについての遺伝子で置換された重鎖配列を含むベクターによる相同組換えによって欠失させることである。
【０３３１】
重鎖標的化ベクターの構築
JH領域を含むマウス重鎖配列(図21a)を、D3 ES細胞株(Gosslerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 9065-9069(1986))由来のゲノムファージライブラリーから、JH4特異的オリゴヌクレオチドプローブ：
【化２１】
2009045066.tif 000022
を用いて単離した。
【０３３２】
JH領域にわたる3.5kbのゲノムSacI/StuIフラグメントをポジティブファージクローンから単離し、そしてSacI/SmaI切断pUC18中にサブクローン化した。得られたプラスミドをpUC18 JHと命名した。トランスフェクトされたES細胞の薬物選択のために用いられるネオマイシン耐性遺伝子(neo)は、プラスミドpGEM7(KJ1)の修復されたバージョンから誘導された。文献(Yenofskyら、(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:3435-3439)中の報告は、いくつかの一般的に使用される発現ベクターのneoコード配列の点変異を立証し、この発現ベクターは構築pMC1neo(Thomas および Cappechi (1987) Cell 51: 503-512)を包含し、これはpGEM7(KJ1)で使用されるneo遺伝子の供給源として役立つ。この変異はneo遺伝子産物の活性を低下させ、そしてこの変異を包含する制限フラグメントを野生型neoクローン由来の対応の配列で置換することによって修復される。調製されたpGEM7(KJ1)中のHindIII部位を合成アダプターの追加によってSalI部位に転換し、そしてneo発現カセットをXbaI/SalIで切断して切り出した。次にneoフラグメントの末端をDNA polIのKlenow形態で処理して平滑末端化し、そしてこのneoフラグメントをpUC18 JHのNaeI部位中にサブクローン化して、プラスミドpUC18 JH-neo(図21b)を産生した。
【０３３３】
標的化ベクターのさらなる構築は、プラスミドpGP1bの誘導体において行った。pGP1bを制限酵素NotIで切断し、そしてアダプターとして以下のオリゴヌクレオチドと連結させた：
【化２２】
2009045066.tif 000023
【０３３４】
得られたプラスミドをpGMTと呼び、これをマウス免疫グロブリン重鎖標的化構築物の構築に用いた。
【０３３５】
単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(KT)遺伝子を、相同組換え体を有するESクローンを富化するために、Mansourら、Nature 336：348-352(1988)に記載のように、この構築物中に入れた。HSV TK遺伝子はプラスミドpGEM7(TK)からEcoRIおよびHIndIIIによる切断によって得られた。TK DNAフラグメントをpGMTのEcoRI部位とHindIII部位との間にサブクローン化して、プラスミドpGMT-TK(図21c)を作製した。
【０３３６】
標的化される配列に対して相同性の広範囲な領域を提供するために、JH領域の5'に位置する5.9kbのゲノムXbaI/XhoIフラグメントを、ポジティブゲノムファージクローンから、XhoIによるDNAの制限的切断、およびXbaIによる部分的切断によって誘導した。図21aに示されるように、このXbaI部位はゲノムDNA中には存在せず、ポジティブファージクローン中のクローン化ゲノム重鎖挿入物に直接隣接するファージ配列から誘導した。このフラグメントをXbaI/XhoI切断pGMT-TK中にサブクローン化して、プラスミドpGMT-TK-JH5'(図21d)を産生した。
【０３３７】
構築の最終工程は、pUC18 JH-neoから2.8kbのEcoRIフラグメントを切り出すことを伴い、このフラグメントはneo遺伝子およびJHの3'側の隣接するゲノム配列を含んでいた。このフラグメントをKlenowポリメラーゼで平滑末端化し、そして同様に平滑末端化されたpGMT-TK-JH5'のXhoI部位中にサブクローン化した。得られた構築物JHKO1(図21e)は、JH遺伝子座に隣接する6.9kbのゲノム配列を含み、JH領域にわたる2.3kbの欠失があり、ここにneo遺伝子が挿入されている。図21fは標的化構築物での相同組換えの後の内因性重鎖遺伝子の構造を示す。
【０３３８】
実施例11
標的化されるES細胞の産生および分析
AB-1 ES細胞(McMahonおよびBradley, Cell 62: 1073-1085(1990))を、有糸分裂的に不活性なSNL76/7細胞支持層上で増殖させた。これは(Robertson, E.J. (1987)、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E.J. Robertson編(Oxford: IRL Press)、第71-112頁)の記載と本質的に同じである。前の実施例で記載のように、ES細胞を標的化構築物JHKO1でエレクトロポレーションする前に、ES細胞の多能性を、ESゲノムの生殖細胞系伝達が可能であることを示すAB-1由来のキメラの生成によって決定した。
【０３３９】
重鎖不活化ベクターJHKO1をNotIで切断し、そして記述された方法で(Hasty ら、Nature, 350: 243-246(1991))でAB-1細胞中にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションされた細胞を100mmディッシュ上に1-2×106細胞／ディッシュの密度でプレートした。24時間後、G418(200mg/mlの活性成分)およびFIAU(0.5mM)を培地に加え、そして薬物耐性クローンを8〜10日間成長させた。クローンを採取し、トリプシン処理し、2つの部分に分け、そしてさらに増殖させた。次に各クローン由来の細胞の半分を冷凍し、そして他の半分をベクター配列と標的化される配列との間の相同組換えについて分析した。
【０３４０】
DNA分析をサザンブロットハイブリダイゼーションで行った。DNAをクローンから記載(Lairdら、(1991) Nucleic Acids Res. 19:4293)のように単離し、StuIで切断し、そして図21fでプローブAとして示される500bpのEcoRI/StuIフラグメントでプローブした。このプローブは、野生型遺伝子座中の4.7kbのStuIフラグメントを検出し、他方3kbのバンドは標的化ベクターでの内因性配列の相同組換えに対して診断的である(図21aおよびf参照)。サザンブロットハイブリダイゼーションでスクリーニングされた525個のG418およびFIAU二重耐性クローンのうち12個が、標的化ベクターによる組み換えに対して診断的である3kbのフラグメントを含むことが見いだされた。これらのクローンがJH遺伝子座での予期される標的化の事象を表す(図21fに示すように)ということは、HindIII、SpeIおよびHpaIでさらに切断することによって確認された。プローブA(図21f参照)のHindIII、SpeI、およびHpaI切断DNAのサザンブロットに対するハイブリダイゼーションにより、野生型遺伝子座については2.3kb、＞10kb、および＞10kbのバンドが各々生じ(図21a参照)、他方、標的化された重鎖遺伝子座については、5.3kb、3.8kb、および1.9kbのバンドが各々予期される(図21f参照)。StuI切断で検出された12個のポジティブクローンは全て、標的化されたJH遺伝子に対して診断的な、予想されるHindIII、SpeIおよびHpaIバンドを示した。さらに、neo特異的プローブ(プローブB、図21f)を用いる12個のクローンの全てのStuI切断のサザンブロット分析により、予想された3kbのフラグメントのみが生じた。これはこれらのクローンが各々、標的化ベクターの単一のコピーのみを含むことを示す。
【０３４１】
JH欠失を有するマウスの作製
前節で記載した標的化されたESクローンのうちの3つを解凍し、そして記載される(Bradley, A. (1987)、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E.J. Robertson編(Oxford: IRL Press)、第113-151頁)ように、C57BL/6J胚盤胞に注入し、そして偽妊娠した雌の子宮に移した。ES細胞がキメラに寄与する程度は、黒色のC57BL/6Jのバックグラウンド上でのES細胞株由来のアグーチ毛色の量によって視覚的に評価された。標的化クローンのうちの2つの胚盤胞への注入の結果得られる子孫の半数がキメラであり(すなわちアグーチならびに黒色の色素沈着を示す)；第3の標準化クローンはキメラ動物を生じなかった。キメラ細胞の大部分が、毛皮の色素沈着に対する顕著な(約50％以上)のES細胞の寄与を示した。AB-1 ES細胞はXY細胞株であるため、雄のES細胞でコロニー形成された雌の胚の性転換のために、キメラの大部分が雄であった。雄のキメラをC57BL/6J雌と繁殖させ、その子孫を、ESゲノムの生殖細胞系伝達を示す優性アグーチ毛色の存在についてモニターした。両方のクローンに由来するキメラが、一貫してアグーチの子孫を生じた。注入されたESクローンにおいて重鎖遺伝子座の1つのコピーのみが標的化されたので、各アグーチ仔が変異した遺伝子座を遺伝により受け継ぐチャンスは50％であった。標的化された遺伝子のスクリーニングを、標的化されたESクローンの同定に利用したプローブ(プローブA、図21f)を用いて、尾の生検からのStuI切断DNAのサザンブロット分析によって行った。予期されたように、およそ50％のアグーチ子孫が約3kbのハイブリダイズするStuIバンドを4.7kbの野生型バンドに加えて示した。これは標的化されたJH遺伝子セグメントの生殖細胞系伝達を示す。
【０３４２】
この変異に関してホモ接合性のマウスを作製するために、ヘテロ接合体同士で繁殖させ、そして子孫の重鎖遺伝子型を上記のようにして決定した。予期されたように、3種の遺伝子型がヘテロ接合体の交配から誘導された。正常JH遺伝子座の2つのコピーを有する野生型マウス、遺伝子の標的化されたコピー1つおよび正常コピー1つを有するヘテロ接合体、ならびにJH変異に関してホモ接合性のマウスである。これらの後者のマウス由来のJH配列の非存在は、JHに特異的なプローブ(プローブC、図21a)でのStuI切断DNAのザンブロットのハイブリダイゼーションによって検証された。ヘテロ接合性同胞および野生型の同胞由来のDNAサンプル中の4.7kbフラグメントに対してJHプローブのハイブリダイゼーションが観察されたのに対し、JH変異体ホモ接合体由来のサンプルではシグナルは存在しなかった。これは重鎖遺伝子の両コピーがJH配列の欠失によって変異している新規なマウス系統の作製を実証する。
【０３４３】
実施例12
重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン
A.  大きなDNA配列のクローン化のためのプラスミドベクターの構築
1.  pGP1a
プラスミドpBR322をEcoRIおよびStyIで切断し、そして以下のオリゴヌクレオチドと連結させた：
【化２３】
2009045066.tif 000024
【０３４４】
得られたプラスミドpGP1aは非常に大きなDNA構築物のクローン化のために設計され、これはあまり切断しない(rare cutting)制限酵素NotIで切り出され得る。これはNotI制限部位を、trpA遺伝子(Christie ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4180 (1981))由来の強力な転写終結シグナルの下流(アンピシリン耐性遺伝子AmpRに対して)に含む。この終結シグナルは、NotI部位に挿入されるコード配列の潜在的な毒性を、AmpR遺伝子からの読み通し転写を排除することによって低下させる。さらに、このプラスミドはpBR322コピー数制御領域を保持しているので、pUCプラスミドと比べて低コピー性である。この低コピー数は挿入配列の潜在的な毒性をさらに低下させ、そしてDNA複製に起因する大きな挿入断片に対する選択を低下させる。ベクターpGP1b、pGP1c、pGP1d、およびpGP1fはpGP1a由来であり、そして異なるポリリンカークローン化部位を含む。ポリリンカー配列を以下に示す。
【化２４】
2009045066.tif 000025
【０３４５】
これらのプラスミドの各々が大きなトランスジーン挿入物の構築のために使用され得、トランスジーン挿入物はNotIで切り出され得るので、このトランスジーンDNAはマイクロインジェクションの前にベクター配列から取り出されて精製され得る。
【０３４６】
2. pGP1b
pGP1aをNotIで切断し、そして以下のオリゴヌクレオチドと連結させた：
【化２５】
2009045066.tif 000026
【０３４７】
得られたプラスミドpGP1bはNotI部位が隣接した短いポリリンカー領域を含む。これはNotI切断によって切り出され得る大きい挿入物の構築を促進する。
【０３４８】
3.  pGPe
以下のオリゴヌクレオチド：
【化２６】
2009045066.tif 000027
を用いて、免疫グロブリン重鎖3'エンハンサー(S. Pettersonら、Nature 344:165-168 (1990))をラット肝臓DNAからポリメラーゼ連鎖反応技術で増幅した。
【０３４９】
増幅された産物をBamHIおよびSphIで切断し、そしてBamHI/SphI切断pNNO3(pNNO3はpUC由来のプラスミドであり、以下の、順に列記する制限部位を有するポリリンカーを含む：NotI、BamHI、NcoI、ClaI、EcoRV、XbaI、SacI、XhoI、SphI、PstI、BglII、EcoRI、SmaI、KpnI、HindIII、およびNotI)中にクローン化した。得られたプラスミドpRE3をBamHIおよびHindIIIで切断し、そしてラットIg重鎖3'エンハンサーを含む挿入物をBamHI/HindIII切断pGP1b中にクローン化した。得られたプラスミドpGPe(図22および表1)はいくつかの独特の制限部位を含み、その中に配列がクローン化され得、そして次に3'エンハンサーと共にNotI切断によって切り出され得る。
【０３５０】
表１
【０３５１】
B.  IgM発現ミニ遺伝子座トランスジーンpIGM1の構築
1.  J-μ定常領域クローンの単離およびpJM1の構築
ファージベクターλEMBL3/SP6/T7中にクローン化されたヒト胎盤ゲノムDNAライブラリー(Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)をヒト重鎖J領域特異的オリゴヌクレオチド：
【化２７】
2009045066.tif 000028
でスクリーニングし、そしてファージクローンλ1.3を単離した。このクローン由来の6kbのHindIII/KpnIフラグメント(6つのJセグメント全てを含み、ならびにDセグメントDHQ52および重鎖J-μイントロン性エンハンサーを含む)を単離した。同じライブラリーをヒトμ特異的オリゴヌクレオチド：
【化２８】
2009045066.tif 000029
でスクリーニングし、そしてファージクローンλ2.1を単離した。10.5KbのHindIII/XhoIフラグメント(μスイッチ領域およびμ定常領域エキソンの全てを含む)をこのクローンから単離した。これらの2つのフラグメントを互いにKpnI/XhoI切断pNNO3と連結させて、プラスミドpJM1を得た。
【０３５２】
2. pJM2
4kbのXhoIフラグメントをファージクローンλ2.1から単離した。これはpJM1中の配列のすぐ下流の配列を含み、これは特定のIgD発現B細胞中のμのδ-関連欠失に関与するいわゆるΣμエレメントを包含する(Yasuiら、Eur. J. Immunol. 19: 1399(1989)、これは本明細書中に参考として援用される)。このフラグメントをDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントで処理し、そしてXhoIで切断されKlenow処理されたpJM1に連結させた。得られたプラスミドpJM2(図23)は、内部XhoIを失ったが、Klenow酵素による不完全な反応に起因する3’XhoI部位を保持していた。pJM2は完全なヒトJ領域、重鎖J-μイントロン性エンハンサー、μスイッチ領域および全てのμ定常領域エキソンを含み、ならびにμ遺伝子のδ-関連欠失に関与する2つの0.4kbの直接反復、δμおよびΣμを含む。
【０３５３】
3.  D領域クローンの単離およびpDH1の構築
以下のヒトD領域特異的オリゴヌクレオチド：
【化２９】
2009045066.tif 000030
を用いて、ヒト胎盤ゲノムライブラリーをD領域クローンについてスクリーニングした。ファージクローンλ4.1およびλ4.3を単離した。5.5kbのXhoIフラグメント(これはDエレメントDK1、DN1、およびDM2を含む(Ichiharaら、EMBO J. 7:4141 (1988))をファージクローンλ4.1から単離した。隣接する上流の5.2kbのXhoIフラグメントを(これはDエレメントDLR1、DXP1、DXP'1、およびDA1を含む)をファージクローンλ4.3から単離した。これらのD領域XhoIフラグメントの各々をプラスミドベクターpSP72(Promega、Madison、WI)のSalI部位中にクローン化して、2つの配列を連結するXhoI部位を破壊するようにした。次に上流フラグメントをXhoIおよびSamIで切り出し、そして下流フラグメントをEcoRVおよびXhoIで切り出した。得られた単離フラグメントをSalI切断pSP72と共に連結して、プラスミドpDH1を得た。pDH1は10.6kbの挿入物を含み、挿入物は少なくとも7つのDセグメントを含み、そしてXhoI(5')およびEcoRV(3')で切り出され得る。
【０３５４】
4.  pCOR1
プラスミドpJM2をAsp718(KpnIのイソシゾマー)で切断し、そして突出部をDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントでフィルインした。得られたDNAを次にClaIで切断し、そして挿入物を単離した。この挿入物をpDH1のXhoI/EcoRV挿入物およびXhoI/ClaI切断pGpeに連結して、pCOR1(図24)を産生した。
【０３５５】
５．  pVH251
2つのヒト重鎖可変領域セグメントVH251およびVH105(Humphriesら、Nature 331: 446 (1988)、これは本明細書中に参考として援用される)を含む10.3kbゲノムHindIIIフラグメントをpSP72中にサブクローン化して、プラスミドpVH251を得た。
【０３５６】
6.  pIGM1
プラスミドpCOR1をXhoIで部分的に切断し、そして単離されたpVH251のXhoI/SalI挿入物を上流XhoI部位にクローン化して、プラスミドpIGM1(図25)を産生した。pIGM1は2つの機能的なヒト可変領域セグメント、少なくとも8つのヒトDセグメント、6つ全てのヒトJHセグメント、ヒトJ-μエンハンサー、ヒトσμエレメント、ヒトμスイッチ領域、全てのヒトμコードエキソン、およびヒトΣμエレメントを、ラット重鎖3'エンハンサーと共に含み、その結果、これらの全ての配列エレメントが単独のフラグメント上で、ベクター配列から、NotIによる切断によって単離され得、そしてマウス胚前核中にマイクロインジェクションされてトランスジェニック動物を生じさせ得る。
【０３５７】
C.  IgMおよびIgG発現ミニ遺伝子座トランスジーンpHC1の構築
1.  γ定常領域クローンの単離
ヒトIgg定常領域遺伝子に特異的な以下のオリゴヌクレオチド：
【化３０】
2009045066.tif 000031
を用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。ファージクローン129.4およびλ29.5を単離した。ファージクローンλ29.4の4kbのHindIIIフラグメント(γスイッチ領域を含む)を用いて、ファージベクターλFIXTMII中にクローン化されたヒト胎盤ゲノムDNAライブラリー(Stratagene、La Jolla、CA)をプローブした。ファージクローンλSg1.13が単離された。異なるγクローンのサブクラスを決定するために、ジデオキシ配列決定反応を3つのファージクローンの各々のサブクローンをテンプレートとして用い、そして以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて行った：
【化３１】
2009045066.tif 000032
【０３５８】
ファージクローンλ29.5およびλSγ1.13は両方ともγ1サブクラスであることが決定された。
【０３５９】
2.  pγe1
ファージクローンλ29.5の7.8kbのHindIIIフラグメント(γ1コード領域を含む)をpUC18中にクローン化した。得られたプラスミドpLT1をXhoIで切断し、Klenow処理し、そして再連結させて、内部XhoI部位を破壊した。得られたクローンpLT1xkをHindIIIで切断し、そして挿入物を単離し、そしてpSP72中にクローン化して、プラスミドクローンpLT1xkを産生した。pLT1xkをポリリンカーXhoI部位およびヒト配列由来BamHI部位で切断して、γ1定常領域コードエキソンを含む7.6kbのフラグメントを産生した。この7.6kbのXhoI/BamHIフラグメントをファージクローンλ29.5由来の隣接する下流の4.5kbのBamHIフラグメント共にXhoI/BamHI切断pGPe中にクローン化して、プラスミドクローンpγe1を産生した。pγe1は全てのγ1定常領域コードエキソンを5kbの下流配列と共に含み、これはラット重鎖3'エンハンサーに連結される。
【０３６０】
3. pγe2
γ1スイッチ領域を含む5.3kbのHindIIIフラグメントおよびプレスイッチが無効な転写物(pre-switch sterile transcript)(P. Siderasら、(1989) International Immunol. 1, 631)の第1エキソンを、ファージクローンλSγ1.13から単離し、そしてpSP72中に挿入物の5'末端に隣接するポリリンカーXhoI部位と共にクローン化して、プラスミドクローンpSγ1を産生した。pSγ1のXhoI/SalI挿入物をXhoI切断pγe1中にクローン化して、プラスミドクローンpγe2(図26)を産生した。pγe2は、全てのγ1定常領域コードエキソン、ならびに上流スイッチ領域および無効な転写エキソンを5kbの下流配列と共に含み、これはラット重鎖3'エンハンサーに連結する。このクローンは独特なXhoI部位を挿入物の5'末端に含む。挿入物全体はXhoI部位および3'ラットエンハンサーと共に、ベクター配列からNotIによる切断によって切り出され得る。
【０３６１】
4.  pHCl
プラスミドpIGM1をXhoIで切断し、そして43kbの挿入物を単離し、XhoI切断pge2中にクローン化して、プラスミドpHC1(図25)を産生した。pHC1は2つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも8つのヒトDセグメント、6つ全てのヒトJHセグメント、ヒトJ-μエンハンサー、ヒトσμエレメント、ヒトμスイッチ領域、全てのヒトμコードエキソン、ヒトΣμエレメント、およびヒトγ1定常領域(関連するスイッチ領域および無効転写物関連エキソン)を、ラット重鎖3'エンハンサーと共に含み、その結果、これらの全ての配列エレメントが単独のフラグメント上で、ベクター配列から、NotIによる切断によって単離され得、そしてマウス胚前核中にマイクロインジェクションされてトランスジェニック動物を生じさせ得る。
【０３６２】
D.  IgMおよびIgG発現ミニ遺伝子座トランスジーンpHC2の構築
1.  ヒト重鎖V領域遺伝子VH49.8の単離
ヒト胎盤ゲノムDNAライブラリーであるλ、FIXTMII(Stratagene、La Jolla、CA)を以下のヒトVH1ファミリー特異的オリゴヌクレオチドでスクリーニングした：
【化３２】
2009045066.tif 000033
【０３６３】
ファージクローンλ49.8を単離し、そして可変セグメントVH49.8を含む6.1kbのXbaIフラグメントをpNNO3中に(ポリリンカーClaI部位がVH49.8の下流になり、そしてポリリンカーXhoI部位が上流になるように)サブクローン化して、プラスミドpVH49.8を得た。この挿入物の800bpの領域を配列決定し、そしてVH49.8がオープンリーディングフレームおよびインタクトなスプライシングおよび組換えシグナルを有することが見いだされ、それゆえこの遺伝子が機能的であることが示された(表2)。
【０３６４】
表２
【０３６５】
2.  pv2
プラスミドpUC12中にサブクローン化された、ヒトVHIVファミリー遺伝子VH4-21(Sanzら、EMBO J.、 8: 3741 (1989))を含む4kbのXbaIゲノムフラグメントをSmaIおよびHindIIIで切り出し、そしてポリメラーゼIのKlenowフラグメントで処理した。次に、平滑末端化されたフラグメントを、ClaIで切断され、Klenw処理されたpVH49.8中にクローン化した。得られたプラスミドpV2はVH4-21の上流に同じ方向で連結したヒト重鎖遺伝子VH49.8を含み、この挿入物の3'末端に独特のSalI部位および5'末端に独特のXhoI部位を有する。
【０３６６】
3. pSγ1-5'
0.7kbのXbaI/HindIIIフラグメント(プラスミドpγe2中、5.3kbのγ1スイッチ領域含有フラグメントのすぐ上流に隣接する配列を提示する)を隣の上流の3.1kbのXbaIフラグメントと共にファージクローンλSg1.13から単離し、そしてHindIII/XbaI切断されたpUC18ベクター中にクローン化した。得られたプラスミドpSγ1-5’は、γ1アイソタイプへのスイッチングの前にB細胞中に見いだされる無効転写物(sterile transcript)の開始部位の上流の配列を提示する3.8kbの挿入物を含む(P. Siderasら、International Immunol.. 1:631(1989))。この転写物がアイソタイプスイッチングの開始に関係するので、そして上流のシス作用性配列がしばしば転写調節に関して重要であるので、これらの配列をトランスジーン構築物中に入れて、無効転写物および関連するスイッチ組み換えの正確な発現を促進する。
【０３６７】
4. pVGE1
pSγ1-5'挿入物をSmaIおよびHindIIIで切り出し、Klenow酵素で処理し、そして以下のオリゴヌクレオチドリンカー：
5'-ccg gtc gac cgg-3'
と連結させる。この連結産物をSalIで切断し、そしてSalI切断pV2と連結させた。得られたプラスミドpVPは、2つのヒト可変遺伝子セグメントVH49.8およびVH4-21の下流に連結した3.8kbのγ1スイッチ5'隣接配列を含む(表2参照)。pVP挿入物をSalIによる部分的切断およびXhoIによる完全切断によって単離し、次にアガロースゲル上で15kbのフラグメントを精製した。次にこの挿入物をpγe2のXhoI部位中にクローン化してプラスミドクローンpVGE1(図27)を産生した。pVGE1は、ヒトγ1定常遺伝子および関連のスイッチ領域の上流に、2つのヒト重鎖可変遺伝子セグメントを含む。可変領域と定常領域との間の独特なSalI部位を用いて、D、J、およびμ遺伝子セグメント中にクローン化し得る。ラット重鎖3'エンハンサーをγ1遺伝子の3'末端に連結し、そして挿入物全体をNotI部位に隣接させる。
【０３６８】
5. pHC2
プラスミドクローンpVGE1をSalIで切断し、そしてpIGM1のXhoI挿入物をその中にクローン化した。得られたクローンpHC2(図25)は、4つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも8つのヒトDセグメント、6つ全てのヒトJHセグメント、ヒトJ-mエンハンサー、ヒトσμエレメント、ヒトμスイッチ領域、全てのヒトμコードエキソン、ヒトΣμエレメント、およびヒトγ1定常領域(関連のスイッチ領域および無効転写物関連エキソンを含む)を、無効転写物開始部位の上流の4kbの隣接配列と共に含む。これらのヒト配列をラット重鎖3'エンハンサーに連結し、その結果、全ての配列エレメントが単独のフラグメント上でベクター配列からNotIでの切断によって単離され得、そしてマウスの胚の前核中にマイクロインジェクションされて、トランスジェニック動物が生じるようにする。挿入物の5'末端の独特なXhoI部位を用いて、さらなるヒト可変遺伝子セグメント中にクローン化し得、この重鎖ミニ遺伝子座(minilocus)の組み換えの多様性をさらに広げ得る。
【０３６９】
E. トランスジェニックマウス
プラスミドpIGM1およびpHC1のNotI挿入物をベクター配列からアガロースゲル電気泳動で単離した。精製された挿入物を受精(C57BL/6×CBA)F2マウス胚の前核中にマイクロインジェクションし、そして生存している胚を、Hoganら(B. Hogan, F. Constantini, およびE. Lacy, Meshods of Manipulating the Mouse Embryo, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)に記載のように、偽妊娠雌中に移入した。注入した胚から発生したマウスをトランスジーン配列の存在について尾のDNAのサザンブロット分析で分析した。トランスジーンのコピー数を、既知量のクローン化DNAを含む対照標準に対してのバンド強度によって見積もった。3週から8週齡で、これらの動物から血清を単離し、そしてトランスジーンでコードされるヒトIgMおよびIgG1の存在について、HarlowおよびLane(E. HarlowおよびD. Lane. Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)に記載のようにして、ELISAによってアッセイした。マイクロタイタープレートのウェルをヒトIgM(クローンAF6、＃0285、AMAC、Inc. Westbrook、ME)およびヒトIgMおよびIgG1(クローンJL512、＃0280、AMAC、Inc. Westbrook、ME)に対して特異的なマウスモノクローナル抗体で覆った。血清サンプルをウェル中に系列希釈し、そして特異的免疫グロブリンの存在をアフィニティー単離された(affinity isolated)アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIg(多価)(これは交差反応性を最小化するために、マウス免疫グロブリンで予め吸着されている)で検出した。表3および図28は、プラスミドpHC1のトランスジーン挿入物を注入された胚から発生した2匹の動物の血清中のヒトIgMおよびIgG1の存在についてのELISAアッセイの結果を示す。試験した全ての対照の非トランスジェニックマウスはこのアッセイによりヒトIgMおよびIgG1の発現についてネガティブである。pIGM1 NotI挿入物を含む2系統由来のマウス(系統＃6および15)はヒトIgMを発現するが、ヒトIgG1を発現しない。本発明者らは、pHC1挿入物を含む6系統由来のマウスを試験し、そしてこれら系統のうち4つ(系統＃26、38,57および122)がヒトIgMおよびヒトIgG1の両方を発現し、他方これらの系統のうち2つからのマウス(系統＃19および21)はヒト免疫グロブリンを検出可能なレベルで発現しないことを見いだした。ヒト免疫グロブリンを発現しなかったpHC1トランスジェニックマウスはいわゆるGoマウスであり、これはマイクロインジェクションされた胚から直接発生し、そしてトランスジーンの存在についてモザイクであり得る。サザンブロット分析は、これらのマウスのうち多くが、1細胞当たり1コピー以下のトランスジーンを含むことを示す。pIGM1トランスジェニックの血清中のヒトIgM、およびpHC1トランスジェニック中のヒトIgMおよびIgG1の検出は、トランスジーン配列がVDJ連結(joining)、転写、およびアイソタイプスイッチングに向けられて正しく機能していることの証拠を提供する。動物のうちの1つ(＃18)はサザンブロット分析によればトランスジーンについてネガティブであり、そして検出可能なレベルのヒトIgMもIgG1も示さなかった。第2の動物(＃38)はサザンブロットでのアッセイによれば約5コピーのトランスジーンを含み、そしてヒトIgMおよびIgG1の両方を検出可能なレベルで示した。トランスジーンを注入した胚から発生した11の動物ELISAアッセイの結果を以下の表(表3)にまとめる。
【０３７０】
表３：トランスジェニック動物の血清中のヒトIgMおよびIgG1のELISAアッセイによる検出
【表１】
2009045066.tif 000034
【０３７１】
表3は、組み込まれたトランスジーンDNAの存在とトランスジーンでコードされる免疫グロブリンの血清中の存在との相関を示す。pHC1トランスジーンを含むことが見いだされた動物のうちの2匹は、検出可能なレベルのヒト免疫グロブリンを発現しなかった。これらは両方とも低コピー数動物であり、そしてトランスジーンの完全なコピーを含まないかも知れず、あるいはこれらの動物は遺伝子的モザイクであり得(動物＃21について見積もられる1細胞当たり＜1のコピーによって示される)、そしてトランスジーン含有細胞が造血系に存在しなかったかも知れない。あるいは、トランスジーンはその発現の助けとならないゲノム位置に組み込まれたかもしれない。pIGM1トランスジェニックの血清中のヒトIgM、ならびにpHC1トランスジェニック中のヒトIgMおよびIgG1の検出は、トランスジーン配列が、VDJ連結、転写、およびアイソタイプスイッチングに正しく向けられて機能していることを示す。
【０３７２】
F. cDNAクローン
VDJ連結およびクラススイッチングにおけるpHC1トランスジーンの機能性、ならびにB細胞発生および対立遺伝子排除における、トランスジーンでコードされるヒトB細胞レセプターの関与を評価するために、トランスジェニックマウス脾臓mRNA由来の免疫グロブリンcDNAクローンの構造を検査した。DおよびJセグメントの使用に焦点を置いたトランスジーンでコードされる重鎖の全体としての多様性、N領域の付加、CDR3長の分布、および機能性mRNA分子を生じる連結の頻度を検査した。VH105およびVH251を取り込んだIgMおよびIgGをコードする転写物を検査した。
【０３７３】
ポリアデニル化RNAを、11週齡の雄の第二世代で産生した系統57pHC1トランスジェニックマウスから単離した。このRNAを用いて、オリゴ-dTでプライムされた一本鎖cDNAを合成した。次に得られたcDNAを以下の4つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる4つの独立したPCR増幅のための鋳型として用いた：VH251特異的オリゴ-149、cta gct cga gtc caa gga gtc tgt gcc gag gtg cag ctg (g, a, t, c)；VH105特異的o-150、gtt gct cga gtg aaa ggt gtc cag tgt gag gtg cag ctg (g, a, t, c)；ヒトγ1特異的オリゴ-151、ggc gct cga gtt cca cga cac cgt cac cgg ttc；およびヒトμ特異的オリゴ-152、cct gct cga ggc agc caa cgg cca cgc tgc tcg。反応1はプライマーo-149およびo-151を用いてVH251-γ1転写物を増幅し、反応2はo-149およびo-152を用いてVH251-μ転写物を増幅し、反応3はo-150およびo-151を用いてVH105-γ1転写物を増幅し、そして反応4はo-150およびo-152を用いてVH105-μ転写物を増幅した。得られた0.5kbのPCR産物をアガロースゲルから単離した；μ転写産物は、対応のELISAデータ(図34)と一致して、γ転写産物よりも豊富であった。PCR産物をXhoIで切断し、そしてプラスミドpNN03中にクローン化した。二本鎖プラスミドDNAを4つのPCR増幅物の各々からの9つのクローンのミニプレップから単離し、そしてジデオキシ配列決定反応を行った。クローンのうち2つはDまたはJセグメントを含まない欠失物であることが判明した。これらは正常なRNAスプライシング産物由来ではあり得ず、そしてPCR増幅の間に導入された欠失が起源でありそうであると思われた。DNAサンプルの1つは2つの独立したクローンの混合物であることが判明し、そして3つのさらなるクローンは読みとり可能なDNA配列を産生しなかった(おそらく、DNAサンプルが十分清浄ではなかったためである)。残りの30個のクローンからのVDJ連結物のDNA配列を表4にまとめる。各配列は独特であり、これは遺伝子再配置の単一の経路が存在しないことを示し、あるいはB細胞を発現するトランスジーンの単一のクローンが優勢であることを示す。どの2つの配列も似ていないという事実はまた、わずか2つのVセグメント、10個のDセグメントおよび6個のJセグメントを含むコンパクトなミニ遺伝子座から発現され得る免疫グロブリンの高い多様性を示す。トランスジーン中に含まれる両方のVセグメント、7個全部のJセグメント、および10個のDセグメントのうちの7個がVDJ連結物中で使用される。加えて、両方の定常領域遺伝子(μおよびγ1)が転写物中に取り込まれる。VH105プライマーは、行われた反応においてVH105について特異的ではないことが判明した。従って、反応3および4由来のクローンのうちの多くが、VH251転写物を含んでいた。さらに、結合反応3PCR産物から単離されたクローンはIgGではなくIgMをコードすることが判明した；しかし、これは、DNAが同じゲル上で単離されるときの反応4由来のPCR産物による混入を反映し得る。成人ヒト末梢血リンパ球(PBL)から免疫グロブリン重鎖配列を増幅し、そしてVDJ連結物のDNA配列を決定する同様の実験が、近年Yamadaら(J. Exp. Med. 173:395-407 (1991)、これは本明細書中に参考として援用される)によって報告された。本発明者らは、ヒトPBLからのデータを本発明者らのpHClトランスジェニックマウスからのデータと比較した。
【０３７４】
表４
【０３７５】
G. Jセグメントの選択
表5は、pHC1トランスジーンでコードされる転写物中に取り込まれたJセグメントの分布を成人ヒトPBL免疫グロブリン転写物中に見いだされるJセグメントと比較した。分布プロファイルは非常に似ており、J4が両方の系で優勢なセグメントであり、次にJ6である。J2はヒトPBLおよびトランスジェニック動物で一番普通でないセグメントである。
【０３７６】
表５：Jセグメントの選択
【表２】
2009045066.tif 000035
【０３７７】
H. Dセグメント選択
Yamadaらが分析したクローンの49％(82のうち40)は、pHC1トランスジーン中に含まれるDセグメントを含んでいた。さらに11クローンが、著者らによっていかなる既知のDセグメントにも割り当てられなかった配列を含んでいた。これらの11の割り当てられなかったクローンのうち2つはpHC1構築物中に含まれるDIR2セグメントの逆位由来であるように見える。この機構は、Ichihara ら(EMBO J. 7:4141 (1988))によって予想され、そしてSanz (J. Immunol. 147:1720-1729 (1991))によって観察されており、Yamadaら (J. Exp. Med. 173:395-407 (1991))によって考慮されなかった。表5は、pHClトランスジェニックマウスについてのDセグメント分布と、YamadaらによるヒトPBL転写物について観察される分布との比較である。Yamadaらのデータを再編集して、使用したDIR2を含め、そしてpHC1トランスジーン中に存在しないDセグメントを除外した。表6は、Dセグメントの取り込みの分布がトランスジェニックマウスおよびヒトPBLで非常に似ていることを示す。2つの優勢なヒトDセグメントDXP'1およびDN1はまたトランスジェニックマウス中に高い頻度で見いだされる。この2つの分布の間での最も劇的な違いは、トランスジェニックマウスにおけるDHQ52がヒトの場合と比べて高い頻度であることである。このDHQ52の高頻度は、ヒト胎児肝臓中のDセグメントの分布を暗示する。Sanzは14％の重鎖転写物がDHQ52配列を含むことを観察した。pHC1中に見いだされないDセグメントを分析から除外すると、Sanzによって分析された胎児転写物の31％がDHQ52を含む。これはpHC1トランスジェニックマウスで本発明者らが観察した27％に匹敵する。
【０３７８】
表６：Dセグメント選択
【表３】
2009045066.tif 000036
【０３７９】
I. VDJ連結物の機能性
表7は、pHC1トランスジェニックから分析された30クローンからのVDJ領域の予想アミノ酸配列を示す。翻訳された配列は、30個のVDJ連結物のうちの23個(77％)が可変部およびJセグメントに関してインフレームであることを示す。
【０３８０】
V-D-J連結物の機能性
表７
【０３８１】
J. CDR3の長さの分布
表8は、pHC1トランスジェニックマウスにおけるインフレームVDJ連結物を有する転写物からのCDR3ペプチドの長さをヒトPBLにおける長さと比較した。ヒトPBLのデータはこれもまたYamadaらからのものである。このプロファイルはトランスジェニックプロファイルと似ており、ヒトPBLで観察されるものよりも、より小さいCDR3ペプチド側にわずかに偏っている。トランスジェニックマウスにおけるCDR3の平均長は10.3アミノ酸である。これは、Sanz (J. Immunol. 147: 1270-1729 (1991))によって信頼のおけるヒトCDR3ペプチドについて報告された平均サイズと実質的に同じである。
【０３８２】
表８：CDR3長の分布
【表４】
2009045066.tif 000037
【０３８３】
実施例13
再配置された重鎖トランスジーン
A. 再配置されたヒト重鎖VDJセグメントの単離
ファージベクターλEMBL3/SP6/T7中にクローン化された2つのヒト白血球ゲノムDNAライブラリー(Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)を、ヒト重鎖J-μイントロン性エンハンサーを含むλ1.3の1kbのPacI/HindIIIフラグメントでスクリーニングする。ポジティブクローンを以下のVH特異的オリゴヌクレオチドの混合物とのハイブリダイゼーションについて試験する：
【化３３】
2009045066.tif 000038
【０３８４】
VおよびJ-μプローブの両方とハイブリダイズするクローンを単離し、そして再配置されたVDJセグメントのDNA配列を決定する。
【０３８５】
Ｂ．再配置されたヒト重鎖トランスジーンの構築
機能的VJセグメント（オープンリーディングフレームおよびスプライスシグナル）を含むフラグメントを、プラスミドベクターpSP72にサブクローン化し、その結果、プラスミド由来XhoI部位は、挿入配列の5’末端に隣接する。機能的VDJセグメントを含むサブクローンを、XhoIおよびPacI（PacI（希切断酵素）はJ-mイントロンエンハンサー付近の部位を認識する）で消化し、そして挿入物をXhoI/PacI消化したpHC2にクローン化し、機能的VDJセグメント、J-μイントロンエンハンサー、μスイッチエレメント、μ定常領域コードエキソン、およびγ1定常領域を有するトランスジーン構築物を作製し、これらは、不毛転写関連配列、γ1スイッチ、およびコードエキソンを含む。このトランスジーン構築物を、NotIで切除し、そしてマウス胚の前核に微量注入して、上記のようなトランスジェニック動物を作製する。
【０３８６】
実施例14
軽鎖トランスジーン
Ａ．プラスミドベクターの構築
１．プラスミドベクターpGP1c
プラスミドベクターpGP1aを、NotIで消化し、そして以下のオリゴヌクレオチドを連結する：
オリゴ−81  5’-ggc cgc atc ccg ggt ctc gag gtc gac aag ctt tcg agg atc cgc-3’
オリゴ−82  5’-ggc cgc gga tcc tcg aaa gct tgt cga cct cga gac ccg gga tgc-3’
得られるプラスミドpGP1cは、NotI部位に隣接するXmaI、XhoI、SalI、HindIII、およびBamHI制限部位を有するポリリンカーを含む。
【０３８７】
２．プラスミドベクターpGP1d
プラスミドベクターpGP1aを、NotIで消化し、そして以下のオリゴヌクレオチドを連結する：
オリゴ−87  5’-ggc cgc tgt cga caa gct tat cga tgg atc ctc gag tgc-3’
オリゴ−88  5’-ggc cgc act cga gga tcc atc gat aag ctt gtc gac agc-3’
得られるプラスミドpGP1dは、NotI部位に隣接するSalI、HindIII、ClaI、BamHI、およびXhoI制限部位を有するポリリンカーを含む。
【０３８８】
Ｂ．JκおよびCκクローンの単離
ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）にクローン化したヒト胎盤ゲノムDNAライブラリーを、ヒトκ軽鎖J領域特異的オリゴヌクレオチド：
オリゴ−36  5’-cac ctt cgg cca agg gac acg act gga gat taa acg taa gca-3’
でスクリーニングし、そしてファージクローン136.2および136.5を単離した。Jκセグメントを含む7.4kb XhoIフラグメントを、136.2から単離し、そしてプラスミドpNNO3にサブクローン化して、プラスミドクローンp36.2を作製した。Cκ遺伝子セグメントとともにJκセグメント２から５を含む隣接する13kb XhoIフラグメントを、ファージクローン136.5から単離し、そしてプラスミドpNNO3にサブクローン化して、プラスミドクローンp36.5を作製した。これらの２つのクローンは一緒になって、Jκ1の7.2kb上流に始まりCκの９kb下流に終わる領域にわたる。
【０３８９】
Ｃ．再配置された軽鎖トランスジーンの構築
１．pCK1、再配置された可変セグメントを発現するためのCκベクター
Cκ遺伝子を含むプラスミドクローンp36.5の13kb XhoI挿入物を、下流配列の９kbとともに、プラスミドXhoI部位に隣接する挿入物の5’末端を有するプラスミドベクターpGP1cのSalI部位にクローン化した。得られるクローンpCK1は、独特の5’XhoI部位への再配置されたVJκセグメントを含むクローン化フラグメントを受容し得る。次いで、トランスジーンを、NotIで切除し得、そしてベクター配列から、ゲル電気泳動によって精製し得る。得られるトランスジーン構築物は、ヒトJ-Cκイントロンエンハンサーを含み、そしてヒト3’κエンハンサーを含み得る。
【０３９０】
２．pCK2，再配置された可変セグメントを発現するための重鎖エンハンサーを有するCκベクター
マウス重鎖J-μイントロンエンハンサー（J.Banerjiら、Cell 33:729-740（1983））を含むマウスゲノムDNAの0.9kb XbaIフラグメントを、pUC18にサブクローン化して、プラスミドpJH22.1を作製した。このプラスミドを、SphIで線状化し、そして末端を、Klenow酵素で充填した。次いで、Klenow処理化DNAを、HindIIIで消化し、そしてヒト重鎖J-μイントロンエンハンサー（Haydayら、Nature 307:334-340（1984））を含む、ファージクローンλ1.3（以前のサンプル）の1.4kb MluI/HindIIIフラグメントを、それに連結した。得られるプラスミドpMHE1は、それらが単一のBamHI/HindIIIフラグメントで切り出されるように、pUC18にともに連結されたマウスおよびヒト重鎖J-μイントロンエンハンサーから構成される。この2.3kbフラグメントを単離し、そしてpGP1cにクローン化して、pMHE2を作製する。pMHE2を、SalIで消化し、そしてp36.5の13kb XhoI挿入物をそこにクローン化する。得られるプラスミドpCK2は、マウスおよびヒト重鎖J-μイントロンエンハンサーを、トランスジーン挿入物の3’末端に融合する以外は、pCK1と同一である。最終トランスジーンの発現を調節するために、類似の構築物を、異なるエンハンサー、すなわちマウスまたはラット3’κまたは重鎖エンハンサー（MeyerおよびNeuberger, EMBO J., 8:1959-1964（1989）；Pettersonら、Nature, 344:165-168（1990））で作製し得る。
【０３９１】
３．再配置されたκ軽鎖可変セグメントの単離
ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）にクローン化した２つのヒト白血球ゲノムDNAライブラリーを、p36.5の3.5kb XhoI/SmaIフラグメントを含むヒトκ軽鎖J領域でスクリーニングした。ポジティブクローンを、以下のVκ特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについて試験した：
オリゴ−65  5’-agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc-3’
VおよびJプローブの両方とハイブリダイズしたクローンを単離し、そして再配置VJκセグメントのDNA配列を決定した。
【０３９２】
４．再配置ヒト軽鎖構築物を含むトランスジェニックマウスの作製
機能的VJセグメント（オープンリーディングフレームおよびスプライスシグナル）を含むフラグメントを、ベクターpCK1およびpCK2の独特のXhoI部位にサブクローン化して、再配置κ軽鎖トランスジーンを作製する。トランスジーン構築物を、ベクター配列から、NotIでの消化によって単離する。アガロースゲル精製挿入物を、マウス胚前核に微量注入して、トランスジェニック動物を作製する。ヒトκ鎖を発現する動物を、重鎖ミニ遺伝子座（minilocus）含有トランスジェニック動物と交配し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを作製する。
【０３９３】
全てのVJκ組合せが、異なる重鎖VDJ組合せの幅広いスペクトルと安定な重−軽鎖複合体を形成することが可能であり得るわけではないので、いくつかの異なる軽鎖トランスジーン構築物を、異なる再配置VJκクローンの各々を用いて作製し、そしてこれらの構築物から得られるトランスジェニックマウスを、重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン発現マウスと交配する。末梢血、脾臓、およびリンパ節リンパ球を、二重トランスジェニック（重鎖および軽鎖の両構築物）動物から単離し、ヒトおよびマウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン（Pharmingen, San Diego, CA）に特異的な蛍光抗体で染色し、そしてFACScan分析器（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いるフローサイトメトリーによって分析する。最高数のＢ細胞の表面で最高レベルのヒト重鎖／軽鎖複合体を生じ、そして免疫細胞区画に有害に影響しない（ＢおよびＴ細胞サブセット特異的抗体とのフローサイトメトリー分析によってアッセイされるように）再配置軽鎖トランスジーン構築物を、ヒトモノクローナル抗体の作製について選択する。
【０３９４】
Ｄ．再配置軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの構築
１．pJCK1、Jκ、ミニ遺伝子座トランスジーンを構築するためのベクターを含むCκ
p36.5のXhoI挿入物を含む13kb Cκを、Klenow酵素で処理し、そしてHindII消化してKlenow処理したプラスミドpGP1dにクローン化する。プラスミドクローンを、挿入物の5’末端がベクター由来ClaI部位に隣接するように、選択する。得られるプラスミドp36.5-1dを、ClaIで消化し、そしてKlenow処理する。次いで、p36.2の7.4kb XhoI挿入物を含むJκを、Klenow処理し、そしてClaI、Klenow処理したp36.5-1dにクローン化する。p36.2挿入物が、p36.5挿入物と同じ方向にあるクローンを選択する。このクローンpJCK1（図34）は、7.2kbの上流配列および９kbの下流配列とともに、全体のヒトJκ領域およびCκを含む。挿入物はまた、ヒトJ-Cκイントロンエンハンサーを含み、そしてヒト3’κエンハンサーを含み得る。挿入物は、重鎖または軽鎖エンハンサーのようなさらなる3’隣接配列をクローン化するために、独特の3’SalI部位に隣接する。独特のXhoI部位を、再配置されていないVκ遺伝子セグメントにおいてクローン化するために、挿入物の5’末端に配置する。独特のSalIおよびXhoI部位は、ベクター配列とは離れた完了したトランスジーン構築物を単離するために使用されるNotI部位に、順に隣接する。
【０３９５】
２．再配置されていないVκ遺伝子セグメントの単離およびヒトIg軽鎖タンパク質を発現するトランスジェニック動物の作製
Vκ特異的オリゴヌクレオチド、オリゴ−65（上記）を使用して、ファージベクターlEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）にクローン化したヒト胎盤ゲノムDNAライブラリーをプローブする。得られるクローンからの可変遺伝子セグメントを配列決定し、そして機能性であるようであるクローンを選択する。機能性を判定するための基準としては、以下が挙げられる：オープンリーディングフレーム、インタクトなスプライスアクセプターおよびドナー配列、ならびにインタクトな組換え配列。選択した可変遺伝子セグメントを含むDNAフラグメントを、プラスミドpJCK1の独特のXhoI部位にクローン化して、ミニ遺伝子座構築物を作製する。得られるクローンを、NotIで消化し、そして挿入物を単離し、そしてマウス胚前核に注入して、トランスジェニック動物を作製する。これらの動物のトランスジーンは、Ｂ細胞の発生においてV-J接合を受ける。ヒトκ鎖を発現する動物を、重鎖小型遺伝子座含有トランスジェニック動物と交配し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを作製する。
【０３９６】
実施例15
ゲノム重鎖ヒトIgトランスジーン
本実施例は、ヒトゲノム重鎖免疫グロブリントランスジーンのクローニングを記載し、この遺伝子は、次いで、接合子への微量注入またはES細胞における組み込みを介して、マウス生殖細胞系に導入される。
【０３９７】
核を、Marzluff,W.F.ら（1985）、Transcription and Translation: A Practical Approach, B.D.Hammes and S.J.Higgins編、89-129頁、IRL Press, Oxfordによって記載されるように、新鮮なヒト胎盤組織から単離する。単離した核（または、PBS洗浄したヒト精母細胞）を、0.5％低融点アガロースブロックに包埋し、そして核について、500mM EDTA中１mg/mlプロテイナーゼＫ、１％SDSとともに、または精母細胞について、500mM EDTA中１mg/mlプロテイナーゼＫ、１％SDS、10mM DTTとともに、50℃にて18時間溶解する。プロテイナーゼＫを、TE中40μg/ml PMSFにおいて、50℃にて30分間、ブロックをインキュベートすることによって不活化し、次いで、過剰のTEで洗浄する。次いで、DNAを、アガロースにおいて、M.Finney in Current Protocols in Molecular Biology（F.Ausbelら編、Jhon Wiley & Sons, Supp. 4, 1988,例えば、2.5.1節）によって記載されるように、制限酵素NotIで消化する。
【０３９８】
次いで、NotI消化したDNAを、Anandら、Nuc.Acids Res. 17:3425-3433（1989）によって記載されるように、パルスフィールドゲル電気泳動によって分画する。NotIフラグメントが豊富な画分を、サザンハイブリダイゼーションによってアッセイして、このフラグメントによってコードされる１つ以上の配列を検出する。このような配列は、全ての６つのVHファミリーの代表とともに、重鎖Ｄセグメント、Ｊセグメント、およびγ1定常領域を含む（このフラグメントは、HeLa細胞からの670kbフラグメントとして、Bermanら（1988）（前出）によって同定されるが、本発明者らは、それが、ヒト胎盤および精子DNAからの830kbフラグメントであることを見いだしている）。このNotIフラグメントを含むこれらの画分を、ベクターpYACNNのNotIクローニング部位に、記載のようにに連結する（McCormickら、Technique 2:65-71（1990））。プラスミドpYACNNを、pYACneo（Clontech）のEcoRIでの消化、およびオリゴヌクレオチド5’-AAT TGC GGC CGC-3’の存在下での連結によって調製する。
【０３９９】
重鎖NotIフラグメントを含むYACクローンを、Traverら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86:5898-5902(1989)によって記載されるように単離する。クローン化NotI挿入物を、高分子量酵母DNAから、M.Finney（前掲書）によって記載されるように、パルスフィールドゲル電気泳動によって単離する。DNAを、１mMスペルミンの添加によって濃縮し、そして以前に記載の単細胞胚の核に直接微量注入する。あるいは、DNAを、パルスフィールドゲル電気泳動によって単離し、そしてリポフェクション（Gnirkeら、EMBO J. 10:1629-1634（1991)）によってES細胞に導入するか、またはYACを、スフェロプラスト融合によって、ES細胞に導入する。
【０４００】
実施例16
不連続ゲノム重鎖Igトランスジーン
ヒトゲノムDNAの85kb SpeIフラグメント（VH6、Ｄセグメント、Jセグメント、μ定常領域、およびγ定常領域の一部を含む）は、本質的に実施例１に記載の通りにYACクローン化によって単離した。生殖細胞系可変領域からのフラグメントを保有するYAC（例えば、V1からV5の複数コピーを含む上記の670〜830kb NotIフラグメントの上流の570kb NotIフラグメント）を、記載のように単離する。（Bermanら（1988）（前出）は、２つの570kb NotIフラグメントを検出した。各々は、複数のＶセグメントを含む。）２つのフラグメントを、実施例１に記載のように、マウス単細胞胚の核に同時注入する。
【０４０１】
代表的には、２つの異なるDNAフラグメントの同時注入は、染色体内の同じ挿入部位での両方のフラグメントの組み込みを生じる。それゆえ、２つのフラグメントの各々の少なくとも１つのコピーを含む、得られるトランスジェニック動物の約50％は、定常領域含有フラグメントの上流に挿入されたＶセグメントフラグメントを有する。これらの動物のうち、約50％は、DNA転換によるＶ−DJ接合を実施し、そして約50％は欠失により、これは、85kb SpeIフラグメントの位置に対する570kb NotIフラグメントの方向に依存する。DNAを、得られるトランスジェニック動物から単離し、そしてサザンブロットハイブリダイゼーションによって両方のトランスジーンを含むことが見いだされたこれらの動物（詳細には、複数のヒトＶセグメントおよびヒト定常領域遺伝子の両方を含むこれらの動物）を、標準的な技術に従って、ヒト免疫グロブリン分子を発現するそれらの能力について試験する。
【０４０２】
実施例17
トランスジェニックＢ細胞における機能的再配置可変領域配列の同定
目的の抗原を使用して、以下の遺伝形質を有するマウスを免疫化する（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York（1988）を参照のこと）：JHの欠失について内因性重鎖遺伝子座(endogenous having chain locus)でのホモ接合性（実施例10）；再配置されていないヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの単コピーのためのヘミ接合性（実施例５および14）；ならびに再配置されたヒトκ軽鎖トランスジーンの単コピーのためのヘミ接合性（実施例６および14）。
【０４０３】
免疫化のスケジュールに続いて、脾臓を摘出し、そして脾臓細胞を使用して、ハイブリドーマを作製する。目的の抗原と反応性の抗体を分泌する個々のハイブリドーマクローンからの細胞を使用して、ゲノムDNAを調製する。ゲノムDNAのサンプルを、独特の６塩基対配列を認識するいくつかの異なる制限酵素で消化し、そしてアガロースゲルで分画する。サザンブロットハイブリダイゼーションを使用して、２〜10kb範囲において、２つのDNAフラグメントを同定する。そのうちの１つは、再配置されたヒト重鎖VDJ配列の単コピーを含み、そしてそのうちの１つは、再配置されたヒト軽鎖VJ配列の単コピーを含む。これらの２つのフラグメントを、アガロースゲルでサイズ分画し、そしてpUC18に直接クローン化する。次いで、クローン化挿入物を、定常領域配列を含む重鎖および軽鎖発現カセットに、それぞれサブクローン化する。
【０４０４】
プラスミドクローンpγe1（実施例12）を、重鎖発現カセットとして使用し、そして再配置VDJ配列を、XhoI部位にクローン化する。プラスミドクローンpCK1を、軽鎖発現カセットとして使用し、そして再配置されたVJ配列を、XhoI部位にクローン化する。得られるクローンをともに使用して、SP0細胞をトランスフェクトし、目的の抗原と反応する抗体を産生する（Co.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2869（1991）、これを、本明細書中で参考として援用する）。
【０４０５】
あるいは、mRNAを、上記のクローン化ハイブリドーマ細胞から単離し、そして使用して、cDNAを合成する。次いで、発現したヒト重鎖および軽鎖VDJおよびVJ配列を、PCRによって増幅し、そしてクローン化する（Larrickら、Biol.Technology, 7:934-938（1989））。これらのクローンのヌクレオチド配列を決定した後、同じポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを合成し、そして合成発現ベクターを、Queenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 84:5454-5458（1989）によって記載されるように作製する。
【０４０６】
トランスジェニック動物の複合体抗原での免疫化
以下の実験は、トランスジェニック動物が、ヒト赤血球におけるような複合体抗原で首尾良く免疫され得、そして正常マウスにおいて観察された応答速度論と同様の速度論で応答し得ることを実証した。
【０４０７】
血液細胞は、一般的に、適切な免疫原であり、そして赤血球および白血球の表面で、多くの異なる型の抗原を含む。
【０４０８】
ヒト血液での免疫化
単一のドナーからのヒト血液のチューブを収集し、そして使用して、機能的に破壊された内因性重鎖遺伝子座（JHD）を有し、そしてヒト重鎖ミニ遺伝子構築物（HC1）を保有するトランスジェニックマウスを免疫化した：これらのマウスを、112系統と称す。血液を洗浄し、そして50mlのHanksに再懸濁し、そして１×108細胞／mlに希釈した。次いで0.2ml（２×107細胞）を、28ゲージ針および１ccシリンジを用いて腹腔内に注射した。この免疫化プロトコルを6週間、ほぼ毎週くり返した。血清価を、眼窩の後方の（retro-orbital）出血から血液を採取し、そして血清を回収し、そして後に特異的抗体について試験することによってモニターした。免疫前出血もまた、コントロールとして採取した。最後の免疫化で、これらの動物を、血清およびハイブリドーマのために屠殺するまさに３日前、１×107細胞の一回の免疫化を、尾を介して静脈内に与えて、ハイブリドーマの産生を増強した。
【０４０９】
【表５】
2009045066.tif 000039
マウス番号2343および2348は、所望の表現型：重鎖ノックアウトバックグラウンド上のヒト重鎖ミニ遺伝子トランスジェニック、を有する。
【０４１０】
ハイブリドーマの生成
ハイブリドーマを、記載のように（前出）免疫化された約16週齢のトランスジェニックマウスのマウス脾臓細胞を、非分泌HAT感受性ミエローマ細胞株Ｘ63 Ag8.653からなる融合パートナーと融合させることによって生成した。ハイブリドーマクローンを培養し、そして血液細胞抗原に対して特異的な結合親和性を有する免疫グロブリンを含むハイブリドーマ上清を、例えばフローサイトメトリーによって同定した。
【０４１１】
フローサイトメトリー
血清およびハイブリドーマ上清を、フローサイトメトリーを用いて試験した。ドナーからの赤血球をハンクス平衡化塩溶液で４回洗浄し、そして50,000細胞を1.1mlのポリプロピレン微小管に入れた。細胞を、30分間、染色培地（フェノールレッドまたはビオチンを含まない１×RPMI 1640培地（Irvine Scientific）３％新生ウシ血清、0.1%アジ化Na）中で抗血清またはハイブリドーマからの上清と氷上でインキュベートした。コントロールは、他の遺伝子型を有する同腹仔マウスからなった。次いで、細胞をSorvall RT600B中で４℃で５〜10分間1000rpmで遠心分離することにより洗浄した。細胞を２回洗浄し、次いで抗体を蛍光発色試薬を用いて細胞表面上で検出した。２つのモノクローナル試薬を使用して試験した。一方はFITC標識マウス抗ヒトμ重鎖抗体（Pharmagen、San Diego、CA）、そして他方は、PEで標識したラット抗マウスκ軽鎖（Beckton-Dickinson、San Jose、CA）であった。これらの両試薬は類似の結果を与えた。全血（赤血球および白血球）および白血球単独を標的細胞として使用した。両方のセットはポジティブの結果を与えた。
【０４１２】
トランスジェニックマウスおよび同腹仔コントロールの血清を、ドナーからの赤血球細胞または別の個体からの白血球のいずれかとインキュベートし、洗浄し、次いで抗ヒトIgM FITC標識抗体で発色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。結果は、ヒトミニ遺伝子座についてトランスジェニックであるマウス（マウス２３４３およびマウス２３４８）からの血清がヒトIgM反応性を示すが、全ての同腹仔動物（２３４４、２３４５、２３４６、２３４７）は示さないことを示した。正常マウス血清（NS）およびリン酸緩衝化生理食塩水(PBS）をネガティブコントロールとして使用した。赤血球を非ゲート化（ungate）し、そして白血球をゲート化（gate）してリンパ球のみを含ませた。線をｘ軸およびｙ軸上に描いて参照を提供する。フローサイトメトリーを、融合体2348からの100個の上清で実施した。４つの上清は血球抗原に対してポジティブな反応性を示した。
【０４１３】
実施例18
アンチセンスRNAによる内因性マウス免疫グロブリン発現の減少
Ａ．アンチセンスIgG配列の発現のためのベクター
１．クローニングベクターpGP1hの構築
ベクターpGP1b（以前の実施例を参照のこと）をXhoIおよびBamHIで消化し、そして以下のオリゴヌクレオチド：
5' - gat cct cga gac cag gta cca gat ctt gtg aat tcg -3'
5' - tcg acg aat tca caa gat ctg gta cct ggt ctc gag -3'
と連結してプラスミドpGP1hを生成した。このプラスミドは、以下の制限部位を含むポリリンカーを含む；NotI、EcoRI、BglII、Asp718、XhoI、BamHI、HindIII、NotI。
【０４１４】
pBCE1の構築
pVH251（以前の実施例を参照のこと）の0.8kb XbaI/BglIIフラグメント（これは、ヒトのVH-Vファミリー免疫グロブリン可変遺伝子セグメントのプロモーターリーダー配列エキソン、第一のイントロン、および第二のエキソンの一部を含む）をXbaI/BglII消化ベクターpNN03に挿入してプラスミドpVH251を生成した。
【０４１５】
ヒト成長ホルモン遺伝子のコードエキソン（hGH；Seeburg、（1982）DNA １：239-249）を含む2.2kbのBamHI/EcoRI DNAフラグメントをBglII／EcoRIで消化したpGH1hへクローニングした。得られたプラスミドをBamHIで消化し、pVH251NのBamHI/BglIIを、hGH遺伝子と同一の方向に挿入してプラスミドpVhghを生成した。
【０４１６】
マウス重鎖J-μイントロンエンハンサー（Banerjiら、（1983）Cell 33：729-740）を含むマウスゲノムDNAの0.9kb XbaIフラグメントをpUC18にサブクローニングして、プラスミドpJH22.1を生成した。このプラスミドをSphIで線状化し、そして末端をクレノウ酵素を用いて充填した。次いで、クレノウ処理したDNAをHindIIIで消化して、そしてファージクローンλ1.3（以前の実施例）の1.4kb MluI（クレノウ）／HindIIIフラグメント（これは、ヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー（Haydayら、（1984）Nature 307：334-340）を含む）をそれに対して連結した。得られたプラスミドpMHE1は、それらが単一のBamHI/HindIIIフラグメントで切り出され得るように、ともにpUC18中に連結されたマウスおよびヒトの重鎖J-μイントロンエンハンサーからなる。
【０４１７】
pMHE1のBamHI/HindIIIフラグメントを、BamHI／HindIII切断pVhghにクローニングしてＢ細胞発現ベクターpBCE1を生成した。このベクターは図36に示すが、アンチセンスDNAフラグメントがクローニングされ得るXhoIおよびAsp718の独特クローニング部位を含む。これらのアンチセンス配列の発現は、上流の重鎖プロモーター−エンハンサーの組合せによって駆動され、下流のhGH遺伝子配列は、トランスジーン構築物の発現を促進するイントロン配列に加えてポリアデニル化配列を提供する。pBCE1から生成されたアンチセンストランスジーン構築物は、NotIでの消化によってベクター配列から分離され得る。
【０４１８】
Ｂ．IgMアンチセンストランスジーン構築物
以下の２つのオリゴヌクレオチド：
5' - cgc ggt acc gag agt cag tcc ttc cca aat gtc -3'
5' - cgc ctc gag aca gct gga atg ggc aca tgc aga -3'
を、マウス脾臓cDNAを基質として用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるマウスIgM定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用する。得られた0.3kb PCR産物をAsp718およびXhoIで消化し、そしてAsp718/XhoI消化pBCE1へクローニングしてアンチセンストランスジーン構築物pMAS1を生成する。pMAS1の精製したNotI挿入物を、単独でかまたは１つ以上の他のトランスジーン構築物と組み合わせて、半日齢マウス胚の前核に微量注入して、トランスジェニックマウスを作製する。この構築物は、マウスIgM mRNAとハイブリダイズするＢ細胞においてRNA転写物を発現する。従ってマウスIgMタンパク質の発現をダウンレギュレートする。pMAS1およびヒト重鎖トランスジーンミニ遺伝子座（例えば、pHC1）を含む二重トランスジェニックマウス（両方の構築物の同時注入かまたは単一のトランスジェニックマウスの交配のいずれかによって作製した）は、ヒト重鎖ミニ遺伝子座単独についてトランスジェニックであるマウスよりも高い割合のＢ細胞上でIgレセプターをコードするヒトトランスジーンを発現する。ヒトIgレセプター発現細胞のマウスIgレセプター発現細胞に対する割合は、Ｂ細胞分化および増殖を促進する因子および細胞についての２つの集団の間の競合に部分的に起因する。IgレセプターがＢ細胞発生において鍵となる役割を果たすので、Ｂ細胞発生の間にマウスIg特異的アンチセンスダウンレギュレーションに起因してそれらの表面上に低減したレベルのIgMを発現するマウスIgレセプター発現Ｂ細胞は、ヒトレセプターを発現する細胞と同様に競合しない。
【０４１９】
Ｃ．Igκアンチセンストランスジーン構築物
以下の２つのオリゴヌクレオチド：
5' - cgc ggt acc gct gat gct gca cca act gta tcc -3'
5' - cgc ctc gag cta aca ctc att cct gtt gaa gct -3'
を、マウス脾臓cDNAを基質として用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるマウスIgκ定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用する。得られた0.3kb PCR産物をAsp718およびXhoIで消化し、そしてAsp718/XhoI消化pBCE1へクローニングしてアンチセンストランスジーン構築物pKAS1を生成する。pKAS1の精製したNotI挿入物を、単独でかまたは１つ以上の他のトランスジーン構築物と組み合わせて半日齢マウス胚の前核に微量注入して、トランスジェニックマウスを作製する。この構築物は、マウスIgK mRNAとハイブリダイズするＢ細胞においてRNA転写物を発現する。従って、pMAS1について上述したように、マウスIgKタンパク質の発現をダウンレギュレートする。
【０４２０】
実施例19
本実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおける首尾良い免疫化および免疫応答を実証する。
【０４２１】
マウスの免疫化
１分子当たり400より多いジニトロフェニル基と結合したキーホールリンペットヘモシアニン（Calbiochem、La Jolla、California）（KLH-DNP）を、以前に公開された方法（Practical Immunology、L.HudsonおよびF.C.Hay、Blackwell Scientific（発行）、９頁、1980）に従って明礬沈降した。100μLのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中において100μgのジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドを伴う400μgの明礬沈降KLH-DNPを各マウスに腹腔内注射した。血清サンプルを、６日後に、眼窩洞の後方から採血することによって採取した。
【０４２２】
血清におけるヒト抗体反応性の分析
抗体反応性および特異性を、間接酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて評価した。いくつかの標的抗原を試験して、免疫原による抗体誘発を分析した。キーホールリンペットヘモシアニン（Calbiochem）を使用して、タンパク質成分、ハプテンおよび／または改変アミノ基に対する反応性についてウシ血清アルブミン−DNP、および総免疫原に対する反応性についてKLH-DNPに対する反応性を同定した。抗原に対するヒト抗体の結合を、マウス免疫グロブリンに対して交叉反応性を有さないIgMおよびIgGサブクラスに特異的な酵素結合体によって検出した。手短には、PVCマイクロタイタープレートをPBS中に５μg/mLタンパク質の抗原を37℃で一晩乾燥させることでコーティングした。PBS、５％ニワトリ血清、0.5%Tween-20中に希釈した血清サンプルを、ウェル中で１時間室温でインキュベートし、続いて同様の希釈の抗ヒトIgG FcおよびIgG F(ab')−西洋ワサビペルオキシダーゼまたは抗ヒトIgM Fc−西洋ワサビペルオキシダーゼとインキュベートした。室温で１時間後酵素活性を、ABTS基質（Sigma，St.Louis、Missouri）の添加によって評価し、そして30分後、415〜490nmで読み取った。
【０４２３】
ヒト重鎖のトランスジェニックマウスにおける免疫応答への関与
図37A〜37Dは、３つのマウス同腹仔のKLH-DNPでの免疫化に対する応答を示す。マウス番号1296は、ヒトIgMおよびIgGを再配置されていないトランスジーンを保有し、そしてマウスIg重鎖ノックアウトについてホモ接合性であった。マウス番号1299は、非ノックアウトバックグラウンド上にトランスジーンを保有したが、マウス1301は、これらのセットの遺伝子を一つも遺伝しなかった。別の同腹仔であるマウス1297は、ヒトトランスジーンを保有し、そしてマウス重鎖ノックアウトに関してヘミ接合性であった。それは、非免疫化コントロールとして含まれた。
【０４２４】
結果は、ヒトIgGおよびIgM応答の両方が、タンパク質に対する結合体化の文脈でハプテンに対して発生したことを実証する。ヒトIgMはまた、KLH分子に対して発生したが、有意なレベルのヒトIgGはこの時点では存在しなかった。同一のマウスからの免疫前血清サンプルにおいて、ヒト抗体の同一の標的抗原に対する力価は有意ではなかった。
【０４２５】
実施例20
本実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおけるヒト抗原による首尾良い免疫化および免疫応答を実証し、そして非無作為体細胞変異がヒトトランスジーンの可変領域配列において生じることを示すデータを提供する。
【０４２６】
ヒト糖タンパク質抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖を含む抗体応答の実証
本実験に使用したトランスジェニックマウスは、機能性内因性（マウス）重鎖産生の非存在をもたらす、接合（Ｊ）領域（前出）でのトランスジーンの導入によって生成した、機能的に破壊されたマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性であった。トランスジェニックマウスはまた、少なくとも１つの完全には再配置されていないヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン（HCl、前出）を有し、これは、単一の機能的VH遺伝子（VH251）、ヒトμ定常領域遺伝子、およびヒトγ1定常領域遺伝子を含んだ。ヒト免疫グロブリントランスジーン産物（前出）を発現することが示されたトランスジェニックマウスをヒト抗原での免疫化のために選択して、トランスジェニックマウスの、ヒト抗原免疫化に対する免疫応答を起こす能力を実証した。３匹のHC1-26系統マウスおよび３匹のHC1-57系統（前出）マウスにヒト抗原を注射した。
【０４２７】
明礬上に不溶化された100μgの精製ヒト癌胎児性抗原（CEA）を完全フロイントのアジュバント中で０日目に注射し、続いて１週間毎に、不完全フロイントのアジュバント中の明礬沈降CEAを７日目、14日目、21日目、および28日目に注射した。血清サンプルを眼窩後方からの採血によって、CEAの注射前の各日に採取した。等量の血清を各群の３匹のマウスの各々から分析のためにプールした。
【０４２８】
マイクロタイターウェル上に固定したヒトCEAに結合した、ヒトμ鎖含有免疫グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンの力価を、ELISAアッセイによって決定した。ヒトμ鎖含有免疫グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンについてのELISAアッセイの結果を、それぞれ図38および図39に示す。有意なヒトμ鎖Ig力価が両方の系統について７日目までに検出され、そして約21日目まで上昇したことが観察された。ヒトγ鎖Igについて、有意な力価が遅滞し、これは、まず系統HC1-57について14日目、そして後に系統HC1-26について21日目に明白になった。ヒトγ鎖Igについての力価は実験の経過の間経時的な増加を示し続けた。観察されたヒトμ鎖Ig応答、続くプラトーは、上昇を続ける、後に発生するγ鎖応答と組み合わせて、親和性成熟とともに見られるパターンに特徴的である。21日目のサンプルの分析は、無関連の抗原であるキーホールリンペットヘモシアニン（KLC）に対する反応性の欠如を示し、これは、抗体応答が特異的な様式でCEAに対して指向されたことを示唆する。
【０４２９】
これらのデータは、ヒトの再配置されていない免疫グロブリン遺伝子座についてトランスジェニックである動物が：（1）ヒト抗原（例えば、ヒト糖タンパク質、CEA）に対して応答し得、（2）観察された、μからγへのクラススイッチに例示される、アイソタイプスイッチング（「クラススイッチング」）を受け得、そして（3）それらの体液性免疫応答における親和性成熟の特徴を示す。一般に、これらのデータは、以下：（1）ヒトIgトランスジェニックマウスが規定された抗原に応答して異種抗体産生を誘発する能力を有すること、（2）単一トランスジーン重鎖可変領域の規定された抗原に対して応答する能力、（3）一次応答発生および二次応答発生に代表的な時間にわたる応答の反応速度、（4）トランスジーンをコードする体液性免疫応答のIgMからIgGへのクラススイッチング、および（5）トランスジェニック動物のヒト抗原に対するヒト配列抗体を産生する能力を有することを示す。
【０４３０】
ヒト重鎖トランスジーンミニ遺伝子座における体細胞変異の実証
複数コピーのHC1トランスジーンを含む系統HC1-57トランスジェニックマウスを、免疫グロブリン重鎖欠損マウスと交配して、HC1トランスジーンを含む、かつ内因性マウス重鎖の両方の対立遺伝子に破壊を含むマウスを得た（前出）。これらのマウスは、ヒトμおよびγ1重鎖をマウスκおよびλ軽鎖とともに発現する（前出）。これらのマウスのうちの１匹を、ヒト癌胚抗原に対して１ヶ月半の経過にわたって腹腔内注射を反復することによって超免疫化した。このマウスを屠殺し、そしてリンパ球を脾臓、鼠径リンパ節および間質リンパ節ならびにパイヤー斑から単離した。細胞を合わせ、そして総RNAを単離した。第一鎖のcDNAをRNAから合成司、そして以下の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR増幅のための鋳型として用いた：
149 5'-cta gct cga gtc caa gga gtc tgt gcc gag gtg cag ctg (g/a/t/c) -3'
150 5'-ggc gct cga gtt cca cga cac cgt cac cgg ttc -3'
【０４３１】
これらのプライマーは、VH251/γ1cDNA配列を特異的に増幅する。増幅配列を、Xho1で消化し、そしてベクターpNN03中にクローニングした。23のランダムなクローンの挿入物からのDNA配列を図40に示す。生殖細胞系配列からの配列の変動を示し、ドットは、生殖細胞系と同一な配列を示す。cDNA配列のVH251トランスジーンの生殖細胞系配列との比較によって、クローンの内３つが完全に変異を受けていなかったが、他の20クローンは、体細胞性変異を含むことが明らかになっている。３つの変異を受けていない配列の一つは、VDJ接合のフレーム外に由来する。特異的な位置で観察された体細胞性変異は、ヒトリンパ細胞において観察された変異（Caiら、（1992）、J.Exp.Med. 176：1073、本明細書中で参考として援用する）と、類似の頻度および類似の分布パターンで生じる。体細胞性変異の全体の頻度は、約１％であったが、頻度は、CDR1内部で約５％に上昇し、このことは、抗原結合に影響するアミノ酸変化のための選択を示す。これは、抗原が駆動したヒト重鎖配列の親和性成熟を実証する。
【０４３２】
実施例21
本実施例は、完全なヒト軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンを形成するように組み換える２つの別個のポリヌクレオチドの同時導入によるトランスジーンの首尾良い形成を実証する。
【０４３３】
２つの重複するDNAフラグメントの同時注入による再配置されていない軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの生成
１．再配置されていない機能性Vκ遺伝子セグメントである、vk65.3、vk65.5、vk65.8、およびvk65.15の単離
Vκ特異的なオリゴヌクレオチドであるオリゴ-65（5' -agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc -3'）を使用して、ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laboratories、Inc. Palo Alto、CA）中にクローニングしたヒト胎盤ゲノムDNAライブラリーをプローブした。ポジティブファージクローンからの、Vκセグメントを含むDNAフラグメントをプラスミドベクター中にサブクローニングした。得られたクローンからの可変遺伝子セグメントを配列決定し、そして機能的であるようであるクローンを選択した。機能性を判断する基準は、以下を含む：オープンリーディングフレーム、インタクトなスプライスアクセプターおよびドナー配列、ならびにインタクトな組換え配列。この手順によって単離された４つの異なるプラスミドクローン由来の、４つの機能的なVκ遺伝子セグメント（vk65.3、vk65.5、vk65.8、およびvk65.15）のDNA配列を図41〜44に示す。４つのプラスミドクローン、p65.3f、p65.5gl、p65.8、およびp65.15fを以下に記載する。
【０４３４】
（1a）p65.3f
ファージクローンλ65.3の３kbのXbaフラグメントをpUC19にサブクローニングして、ベクターに由来するSalI部位を挿入物の3'末端の近位に、そしてベクターに由来するBamHI部位を5'部位の近位になるようにした。このクローンの3kbのBamHI/SalI挿入物をpGP1fにサブクローニングして、p65.3を生成した。
【０４３５】
（1b）  p65.5g1
ベクターに由来するXhoI部位が挿入物の5'末端にそしてベクターに由来するSalI部位が3'に近接するように、ファージクローンλ65.5の6.8kb EcoRIフラグメントをpGP1fにサブクローン化した。得られたプラスミドを、p65.5g1と命名する。
【０４３６】
（1 c）p65.8
ファージクローンλ65.8の6.5kb HindIIIフラグメントをpSP72にクローン化し、p65.8を生成した。
【０４３７】
（1 d）p65.15f
ファージクローンλ65.16の10kb EcoRIフラグメントをpUC18にサブクローン化し、プラスミドp65.15.3を生成した。プラスミド挿入物内のVκ遺伝子セグメントを、4.6kb EcoRI/HindIIIサブフラグメントにマッピングし、これをpGP1fにクローン化した。得られたクローンp65.15fは、挿入物のそれぞれ5'および3'末端に位置する特有のXhoIおよびSalI部位を有する。
【０４３８】
２．pKV4
p65.8のXhoI/SalI挿入物を、p65.15fのXhoI部位にクローン化し、プラスミドpKV2を生成した。p65.5g1のXhoI/SalI挿入物を、pKV2のXhoI部位にクローン化し、pKV3を生成した。pKV3のXhoI/SalI挿入物を、p65.3fのXhoI部位にクローン化し、プラスミドpKV4を生成した。このプラスミドは、４つの機能的Vκ遺伝子セグメントを含む単一の21kb XhoI/SalI挿入物を含む。全挿入物はまた、NotIで切り出し得る。
【０４３９】
３．pKC1B
（3 a）pKcor
ヒトゲノムDNAファージλクローン由来の２つのXhoIフラグメントを、プラスミドベクターにサブクローン化した。第１の13kb Jκ2-Jκ5/Cκを含むフラグメントを、クレノウ酵素で処理し、そしてHindIII消化クレノウ処理プラスミドpGP1dにクローン化した。プラスミドクローン（pK-31)を、挿入物の5'末端がベクターに由来するClaI部位に隣接するように選択した。3'挿入物XhoI部位が、ベクターSalI部位への連結によって破壊されるように、第２のXhoIフラグメントのJκ1を含むDNAの7.4kb切片を、XhoI/SalI消化pSP72にクローン化した。得られたクローンp36.2sは、Jκ1の4.5kb上流に挿入物由来のClaI部位、そしてJκ1とJκ2との間の天然に生じるXhoI部位の代わりに下流にポリリンカーに由来するClaI部位を含む。このクローンをClaIで消化し、正確な5'から3'方向でClaI消化pK-31にクローン化した4.7kbフラグメントを放出させ、全ての５つのヒトJkセグメント、ヒトイントロンエンハンサーヒトCκ、4.5kbの5'隣接配列、および９kbの3'隣接配列を含むプラスミドを生成した。このプラスミドpKcorは、挿入物のそれぞれ5'および3'側に、特有の隣接XhoI部位およびSalI部位を含む。
【０４４０】
（3 b）pKcorB
ヒト3'κエンハンサーを含む４kb BamHIフラグメント（Judde, J. -G.およびMax, E.E. (1992) Mol. Cell. Biol. 12: 5206、本明細書中に参考として援用される）を、5'末端がベクターXhoI部位に近接するようにpGP1fにクローン化した。得られるプラスミドp24Bfを、XhoIで切断し、そしてpKcorの17.7kb XhoI/SalIフラグメントを、エンハンサーフラグメントと同じ方向でそれにクローン化した。得られたプラスミドpKcorBは、挿入物の5'および3'末端に、それぞれ特有のXhoI部位およびSalI部位を含む。
【０４４１】
（3 c）pKC1B
pKcorBのXhoI/SalI挿入物を、p65.3fのSalI部位にクローン化し、軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンプラスミドpKC1Bを生成した。このプラスミドは、単一の機能的ヒトVκセグメント、全ての５つのヒトJκセグメント、ヒトイントロンエンハンサー、ヒトCκ、およびヒト3'κエンハンサーを含む。全25kbの挿入物は、NotI消化によって単離され得る。
【０４４２】
４．Co4
プラスミドpKV4およびpKC1B由来の２つのNotI挿入物を、微量注入緩衝液中でそれぞれ2.5μg/mlの濃度で混合し、そして先述の実施例において記載されるように、半日齢のマウス胎仔の前核に同時注入した。得られたトランスジェニック動物は、トランスジーン挿入物（Co4と命名される、図45に示される組換えの産物）を含み、ここに２つのフラグメントが同時組込みされる。3'の３kbのpKV4挿入物と5'の３kbのpKC1B挿入物とは、同一である。いくつかの組込み事象は、３kbの共有配列にわたる２つのフラグメント間の相同組換えを表す。Co4遺伝子座は、トランスジェニックマウスにおいて、ヒト配列軽鎖のレパートリーの発現を指向する。
【０４４３】
実施例２２
本実施例は、特定の免疫原と反応性のモノクローナル抗体を分泌する、マウスハイブリドーマクローンの首尾良い産生を実証する。ここで、モノクローナル抗体は、ヒトIgトランスジーンによってコードされるヒト免疫グロブリン鎖を含む。
【０４４４】
ヒト重鎖トランスジーン産物を組込むモノクローナル抗体の生成
１．ヒト重鎖トランスジーンを保有するマウスの免疫化
トランスジーンをコードし、そして内因性重鎖遺伝子座（実施例２０（前出）を参照のこと）のノックアウト（すなわち、機能的な破壊）についてホモ接合性のヒト重鎖を含むマウスを、精製したヒトCEAで免疫化し、続いて適切な免疫応答期間後に脾臓細胞を収集した。マウス脾臓細胞を、従来技術を用いてマウス骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマを生成した（KohlerおよびMilstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976); HarlowおよびLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1988)を参照のこと）。免疫化のために使用したマウスは、ヒトの再配置されていない重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンを含み、これは単一の機能的VH遺伝子（VH251)、ヒトＤおよびＪセグメント、ヒトμ定常領域、およびヒトγ1定常領域遺伝子を含んだ。それが由来するトランスジェニック系統を、HC1-57と命名した（前出）。
【０４４５】
ミョウバン上で不溶化した100μgの精製したヒト癌胎児性抗原（CEA)（Crystal Chem, Chicago, ILまたはScripps Labs, San Diego, CA)を、０日目にフロイント完全アジュバント中で注射し、続いて７日目、14日目、21日目、および28日目にフロイント不完全アジュバント中のミョウバン沈降CEAをさらに毎週注射した。さらなる20μgの可溶性CEAを、83日目に、続いてフロイント不完全アジュバント中の50μgのミョウバン沈降CEAを92日目に静脈内投与した。CEAに対するヒト重鎖応答を、骨髄腫細胞との脾臓細胞の融合前に血清サンプルにおいて確認した。95日目に動物を屠殺し、脾臓を取り出し、そしてポリエチレングリコールを用いてP3X63-Ag8.653マウス骨髄腫細胞（ATCC CRL 1580, American Type Culture Collection, Rockville, MD)と融合した。２週間後、融合ウェルからの上清を、CEAとの特異的に反応性の抗体の存在についてスクリーニングした。これは、ELISAによってヒト重鎖μまたはγ定常領域エピトープを含んだ。手短には、精製したヒトCEAを2.5μg/mlでPVCマイクロタイタープレート上にコートし、そして培養上清（PBS、0.5％ Tween-20、５％ニワトリ血清において１：４または１：５に希釈した）とともにインキュベートした。プレートを洗浄し、続いてヒトIgG Fcに特異的な西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗血清、またはヒトIgM Fc5Muに特異的なウサギ抗血清（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を添加した。捕捉抗体に結合した結合体の存在を、さらなる洗浄後にABTS基質の添加によって決定した。２つの独立した融合ウェルは、CEAへの実質的な結合を有する抗体を含むことが見出された。クローニング後、両方のハイブリドーマは、ELISAによってヒトμ鎖およびマウスκ鎖の存在についてポジティブであることが見出された。類似のアッセイを用いて、マウスIgGもIgMも検出されなかった。
【０４４６】
２つの独立した親ハイブリドーマのサブクローニングは２つのクローンを生じ、92-09A-4F7-A5-2および92-09A-1D7-1-7-1と命名した。両方の株を、ブタベスト条約下でATCC特許培養寄託機関（ATCC Patent Culture Depository）に寄託し、そしてそれぞれATCC Designation HB 11307およびHB 11308と指定された。これらの細胞株由来の培養上清物を、ELISAを用いて、いくつかの精製した標的タンパク質に対する反応性について試験することによって特異性について評価した。図46に示されるように、種々の抗原に対するモノクローナル抗体の反応性を決定するためのELISAアッセイは、CEAおよびCEA関連抗原NCA-2のみが有意な反応性を示すことを実証し、このことは、ヘテロハイブリッド免疫グロブリン分子の可変領域についての制限された反応性の発達を示す。
【０４４７】
実施例２３
本実施例は、ヒトIgミニ遺伝子座トランスジーンによってコードされた再配置されたヒトVDJ遺伝子が、キメラヒト／マウスIg鎖をコードする内因性Ig定常領域遺伝子を含む転写物として、例えばトランス−スイッチングの機構によって転写され得ることを実証する。
【０４４８】
キメラヒト−マウス重鎖をコードするトランス−スイッチ転写物の同定
RNAを、内因性重鎖Ｊセグメント欠失（前出）についてホモ接合性も超免疫化HC1系統57トランスジェニックマウスから単離した。cDNAを、Taylorら、(1993) Nucleic Acids Res. 20: 6287（本明細書中において参考として援用される）に従って合成し、そして以下の２つのプライマーを用いるPCRによって増幅した：
【化３４】
2009045066.tif 000040
【０４４９】
オリゴヌクレオチドo-149は、HC1コード可変遺伝子セグメントVH251について特異的であるが、o-249は、以下の特異性の順序でマウスおよびヒトの両方のγ配列にハイブリダイズする：
マウスγ１  ＝  マウスγ2b  ＝  マウスγ３  ＞マウスγ2a  ＞＞ヒトγ１。
PCR産物から生成した10のランダムに選択したクローン由来のDNA配列を決定し、そして図47に示す。２つのクローンは、ヒトVDJおよびマウスγ１を含み；４つのクローンはヒトVDJおよびマウスγ2bを含み；そして４つのクローンはヒトVDJおよびマウスγ３を含んだ。これらの結果は、トランスジェニックＢ細胞の画分において、トランスジーンによりコードされたヒトVDJが、クラススイッチングまたは類似の組換えによって内因性マウス重鎖中に組み換えたことを示す。
【０４５０】
実施例２４
本実施例は、ハイブリドーマのプールをスクリーニングし、キメラヒト／マウスIg鎖をコードするクローンと、ヒトIg鎖をコードおよび発現するクローンを識別するための方法を提供する。例えば、ヒトIg重鎖トランスジーンを含み、そしてＪ領域を破壊した内因性重鎖遺伝子座についてホモ接合性のトランスジェニックマウスから作成されたハイブリドーマクローンのプールにおいて、トランス−スイッチヒトVDJ-マウス定常領域重鎖をコードするハイブリドーマクローンを同定し、そしてヒトVDJ−ヒト定常領域重鎖を発現するハイブリドーマクローンと区別し得る。
【０４５１】
キメラIg鎖を除去するハイブリドーマのスクリーニング
スクリーニングプロセスは、２つの段階を含み、これは、単一で、または必要に応じて組み合わせて行われ得る：(1)予備的なELISAに基づくスクリーニング、および(2)候補ハイブリドーマの２次的な分子特徴付け。好ましくは、予備的なELISAに基づくスクリーニングを、ヒトVDJ領域およびヒト定常領域を発現する候補ハイブリドーマの初期の同定のために使用する。
【０４５２】
抗原とポジティブな反応性を示すハイブリドーマ（例えば、トランスジェニックマウスにおける抗体応答を惹起するために使用される免疫原）を、マウスμ、γ、κ、およびλ、ならびにヒトμ、γ、およびκと特異的に反応するモノクローナル抗体のパネルを使用して試験する。ヒト重鎖および軽鎖についてポジティブであり、そしてマウス鎖についてネガティブであるハイブリドーマのみを、ヒト免疫グロブリン鎖を発現する候補ハイブリドーマとして同定する。従って、候補ハイブリドーマは、特定の抗原との反応性を有し、そしてヒト定常領域のエピトープ特徴を有することが示される。
【０４５３】
RNAを、候補ハイブリドーマから単離し、そして第１鎖cDNAを合成するために使用する。次いで、第１鎖cDNAを、予め決定した配列（オリゴ-X)の特有の一本鎖オリゴヌクレオチドにRNAリガーゼ（これは、一本鎖DNAを連結する）を用いて連結する。次いで、連結したcDNAを２つのセットのオリゴヌクレオチドプライマーを使用するPCRによる２つの反応において増幅する。セットＨ（重鎖）は、ヒトμまたはヒトγ１のいずれか（ELISAの結果に依存する）に特異的にアニーリングするオリゴ、およびオリゴ−Ｘ配列にアニーリングするオリゴを含む。これは、特定のＶセグメント（ヒトミニ遺伝子座にトランス再配置し得るマウスＶセグメントを含む）の検出に対する偏りを防ぐ。第２のセットのプライマー（セットＬ（軽鎖））はヒトκに特異的にアニーリングするオリゴ、およびオリゴＸに特異的にアニーリングするオリゴを含む。PCR産物を、分子的にクローン化し、そしていくつかのDNA配列は、ハイブリドーマを、ヒトIg配列とマウスIg配列との配列比較に基づいて特有のヒト抗体を産生するか否かを確認するために決定する。
【０４５４】
実施例２５
本実施例は、ヒト軽鎖(κ)ミニ遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスの生成を実証する。
【０４５５】
ヒトκミニ遺伝子座トランスジェニックマウス
KC1
ファージクローン由来の13kb XhoI Jκ2-Kκ含有フラグメント（κ特異的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによってヒトゲノムDNAファージライブラリーから単離される（例えば、前出））を、クレノウ酵素で処理し、そしてpGP1dのクレノウ処理HindIII部位にクローン化し、pK-31を生成した。このことは、挿入XhoI部位を破壊し、そしてJκ2の次の5'末端に、特有のポリリンカーに由来するXhoI部位を配置した。特定のポリリンカーに由来するClaI部位は、このXhoI部位と挿入配列との間に位置するが、特有のポリリンカーに由来するSalI部位は、挿入物の3'末端に位置する。Jκ1および上流配列を含む7.5kb XhoIフラグメントをまた、ヒトゲノムDNAファージクローン（κ特異的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによってヒトゲノムDNAファージライブラリーから単離される（例えば、前出））から単離した。この7.5kb XhoIフラグメントを、pSP72（Promega, Madison, Wisconsin)のSalI部位にクローン化し、従って両方のXhoI部位を破壊し、そしてJκ1の3'にポリリンカーClaI部位を配置した。得られたクローンのClaIでの消化は、Jκ1および4.5kbの上流配列を含む4.7kbのフラグメントを放出した。この4.7kbのフラグメントを、pK-31のClaI部位にクローン化し、pKcorを作製した。残りの特有の5'XhoI部位は、ポリリンカー配列に由来する。再配置されていないヒトVκIII遺伝子セグメント65.8（プラスミドp65.8、実施例２１）を含む6.5kb XhoI/SalI DNAフラグメントをpKcorのXhoI部位にクローン化し、プラスミドpKC1を作製した。pKC1のNotI挿入物を1/2日齢のマウス胎仔に微量注入し、トランスジェニックマウスを作製した。２つの独立したpKC1に由来するトランスジェニック系統を樹立し、そして重鎖および軽鎖のミニ遺伝子座を含むマウスを交配するために使用した。これらの系統KC1-673およびKC1-674は、サザンブロットハイブリダイゼーションによって、トランスジーンのそれぞれ約１および10〜20コピーの組込みを含むと推定された。
【０４５６】
KC1e
プラスミドpMHE1（実施例１３および１８）を、BamHIおよびHindIIIで消化し、マウスおよびヒトの両方の重鎖J-μイントロンエンハンサーを含む2.3kbの挿入物を切り出した。このフラグメントを、クレノウ処理し、SalIリンカー（New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)に連結し、そしてpKC1の特有の3'SalI部位にクローン化し、プラスミドpKC1eを生成した。pKC1eのNotI挿入物を、1/2日齢のマウス胎仔に微量注射し、トランスジェニックマウスを生成した。４つの独立したpKC1eに由来するトランスジェニック系統を樹立し、そして重鎖および軽鎖のミニ遺伝子座を含むマウスを交配するために使用した。これらの株KC1e-1399、KC1e-1403、KC1e-1527、およびKC1e-1536は、サザンブロットハイブリダイゼーションによって、トランスジーンのそれぞれ約20〜50、５〜10、１〜５、および３〜５コピーの組込みを含むと推定された。
【０４５７】
pKC2
再配置されていないヒトVκIII遺伝子セグメント65.5（プラスミドp65.5g1、実施例２１）を含む6.8kb XhoI/SalI DNAフラグメントを、pKC1の特有の5'XhoI部位にクローン化し、プラスミドpKC2を生成した。このミニ遺伝子座トランスジーンは、２つの異なる機能的VκIII遺伝子セグメントを含む。pKC2のNotI挿入物を、1/2日齢のマウス胎仔に微量注射し、トランスジェニックマウスを生成した。５つの独立したpKC2に由来するトランスジェニック系統を樹立し、そして重鎖および軽鎖の両方のミニ遺伝子座を含むマウスを交配するために使用した。これらの株KC2-1573、KC2-1579、KC2-1588、KC2-1608、およびKC2-1610は、サザンブロットハイブリダイゼーションによって、トランスジーンのそれぞれ約１〜５、10〜50、１〜５、50〜100、および５〜20コピーの組込みを含むと推定された。
【０４５８】
実施例２６
本実施例は、ヒトκトランスジーンを保有するトランスジェニックマウスが、機能的ヒトκ鎖を含む抗体を形成する抗原誘導抗体応答をなし得ることを示す。
【０４５９】
ヒトIgκ軽鎖と関連する抗体応答
HC1-57ヒト重鎖およびKC1eヒトκトランスジーンを含むトランスジェニックマウスを、精製した可溶性CD4（ヒト糖タンパク質抗原）で免疫した。ポリスチレンラテックス粒子（Polysciences, Warrington, PA)への結合によって不溶化した20μgの精製したヒトCD4（NEN Research products, Westwood, MA)を、０日目にジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（Calbiochem, San Diego, CA)を含む生理食塩水中で腹腔内注射し、続いてさらに、20日目および34日目に注射した。
【０４６０】
眼窩の後方（retro-orbital)の採血を25日目および40日目に取り、そしてCD4に対する抗体の存在についてスクリーニングした。これは、ELISAによってヒトIgMまたはヒトIgG重鎖を含んだ。手短には、精製したヒトCD4を、2.5μg/mlでPVCマイクロタイタープレート上にコートし、そして培養上清（PBS、0.5％ Tween-20、５％ニワトリ血清において１：４／１：５に希釈した）とともにインキュベートした。プレートを洗浄し、続いてヒトIgG Fcに特異的な西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗血清、またはヒトIgM Fc5Muに特異的なウサギ抗血清（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を添加した。捕捉抗体に結合した結合体の存在を、さらなる洗浄後にABTS基質の添加によって決定した。抗原と反応性のヒトμを、両方の採血において検出したが、本質的に検出不能なγ反応性が存在した。40日目のサンプルをまた、ヤギ抗ヒトκペルオキシダーゼ結合体（Sigma, St. Louis, MO)と同じアッセイを用いて抗原反応性ヒトκ鎖について試験した。CD4結合κ反応性をこの時点で検出した。アッセイ結果を、図48に示す。
【０４６１】
実施例２７
本実施例は、機能的に破壊されたマウス重鎖および軽鎖遺伝子座（重鎖およびκ鎖遺伝子座）についてホモ接合性であり、そして機能的なヒト重鎖および機能的なヒト軽鎖をコードするように生産的に再配置し得るヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスジーンを同時に保有する、マウスの首尾良い生成を示す。そのようなマウスを「0011」マウスと呼び、これは、最初の２つの数字における２つの０が、マウスが機能的重鎖および軽鎖遺伝子座を欠くことを示し、そして第２の数字における１が、マウスがヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスジーンについてヘミ接合性であることを示す。本実施例は、そのような0011マウスが予め決定された抗原に対する特異的な抗体応答をなし得ること、およびそのような抗体応答がアイソタイプスイッチングを含み得ることを示す。
【０４６２】
0011/0012マウス：内因性Igノックアウト＋ヒトIgトランスジーン
機能的なJH領域を欠損し（JHD++またはJHΔ++と命名する）、そしてまたヒトHC1トランスジーンを保有する機能的に破壊された内因性重鎖遺伝子についてホモ接合性であるマウス（例えば、上記のHC1-26トランスジェニックマウス系統）を、機能的JH領域を欠く機能的に破壊された内因性κ鎖遺伝子座についてホモ接合性なマウス（本明細書中でJKD++またはJKΔ++と命名する；実施例９を参照のこと）と異種交配し、機能的に破壊した重鎖およびκ鎖遺伝子座（重鎖／κ鎖ノックアウト）についてホモ接合性のマウスを生成し、JHD++/JKD++と命名し、そしてこれはHC1トランスジーンを含んだ。そのようなマウスを、異種交配によって生成し、そしてゲノムDNAのサザンブロットによって評価されるような遺伝子型に基づいて選択した。これらのマウス（HC1-26+/JKD++/JHD++マウスと命名した）を、ヒトκ鎖トランスジーン（系統KC2-1610、KC1e-1399、およびKC1e-1527；実施例２５を参照のこと）を保有するマウスと異種交配し、そしてゲノムDNAのサザンブロット分析を用いて、機能的に破壊された重鎖および軽鎖遺伝子座についてホモ接合性であり、そしてまたHC1トランスジーンおよびKC2またはKC1eトランスジーンについてホモ接合性である子孫マウスを同定した。そのようなマウスを数で命名し、そしてそれらの遺伝子型に関して以下の略語で同定した：HC1-26+は、HC1-26系統ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン組込みについてのヘミ接合性を示し；JKD++は、JHノックアウトについてのホモ接合性を示し；JKD++は、Jκノックアウトについてのホモ接合性を示し；KC2-1610+は、系統KC2-1610におけるように組み込まれたKC2ヒトκトランスジーンについてのヘミ接合性を示し；KC1e-1527+は、系統KC1e-1527についてのように組込まれたKC1eヒトκトランスジーンについてのヘミ接合性を示し；KC1e-1399+は、系統KC1e-1399におけるように組込まれたKC1eヒトκトランスジーンについてのヘミ接合体を示す。
【０４６３】
得られた個々の子孫にそれぞれ数字の名称を与え（例えば、6295、6907など）、そしてそれぞれをJHノックアウト対立遺伝子、Jκノックアウト対立遺伝子、HC1-26トランスジーン、およびκトランスジーン（KC2またはKC1e)の存在について評価し、そして各遺伝子座にてヘミ接合性(+)またはホモ接合性（++)のいずれかであると決定された。表10は、数字の名称、性別、およびいくつかの子孫マウスの遺伝子型を示す。
【０４６４】
表１０
【表６】
2009045066.tif 000041
【０４６５】
本発明者らは、３匹の６週齢の雌マウスから脾臓を摘出した。マウス＃7655を、サザンブロットハイブリダイゼーションによって、HC1（系統26）およびKC2（系統1610）トランスジーン組込みについてヘミ接合性であり、そしてマウスμおよびκJ領域のJHΔおよびJκΔ標的化欠失についてホモ接合性であると決定した。マウス#7656を、サザンブロットハイブリダイゼーションによって、KC2（株1610）トランスジーン組込みについてヘミ接合性であり、そしてマウスμおよびκJ領域のJHΔおよびJκΔ標的化欠失についてホモ接合性であると決定した。マウス#7777を、サザンブロットハイブリダイゼーションによって、マウスμおよびκJ領域のJHΔおよびJκΔ標的化欠失についてヘミ接合性であると決定した。これらの欠失の劣性性質のために、このマウスは、表現型的に野生型であるはずである。
【０４６６】
0011マウスにおける内因性Ig鎖の発現
ヒトμ、マウスμ、ヒトκ、マウスκ、またはマウスγのいずれかと反応性の抗体のパネルを用いてFACS分析を使用し、以下から外植されるリンパ球を分別した：（1)野生型マウス（7777)、(2)重鎖およびκノックアウト対立遺伝子についてホモ接合性であり、そしてヒト軽鎖トランスジーンを保有する0001マウス（7656)、ならびに(3)重鎖およびκノックアウト対立遺伝子についてホモ接合性であり、そしてヒト軽鎖トランスジーンおよびヒト重鎖トランスジーンを保有する0001マウス（7655)。
【０４６７】
本発明者らは、MishellおよびShiigi（Mishell, B.B. およびShiigi, S.M. （編）Selected Methods in Cellular Immunology. W.H. Freeman ＆ Co., New York, 1980)によって記載されるように、脾臓から単一の細胞懸濁液を調製し、そしてNH4Clで赤血球を溶解させた。リンパ球を以下の試薬で染色する：ヨウ化プロピジウム（Molecular Probes, Eugene, OR)、FITC結合抗ヒトIgM（クローンG20-127；Pharmingen, San Diego, CA)、FITC結合抗マウスIgM（クローンR6-60.2；Pharmingen, San Diego, CA)、フィコエリスリン結合抗ヒトIgκ（クローンHP6062；CalTag, South San Francisco, CA)、FITC結合抗マウスIgλ(クローンR26-46；Pharmingen, San Diego, CA)、FITC結合抗マウスB220（クローンRA3-6B2；Pharmingen, San Diego, CA)、およびCy-Crome結合抗マウスB220（クローンRA3-6B2；Pharmingen, San Diego, CA)。本発明者らは、FACScanフローサイトメーターおよびLYSIS IIソフトウェア(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて染色細胞を分析した。マクロファージおよび残りの赤血球を、前方向および側方向散乱(scatter)を通す(gate on)ことによって除去した。図49および50におけるフローサイトメトリーのデータは、サザンブロットハイブリダイゼーションデータを確認し、そしてマウス#7655が、ヒトμおよびヒトκ、そしてもし存在すれば比較的少ないマウスμまたはマウスκのいずれかを発現することを実証する。にもかかわらず、Ｂ細胞の有意な画分（約70〜80％）は、ヒト重鎖およびマウスλ軽鎖からなるハイブリッドIgレセプターを発現するようである。
【０４６８】
図49は、細胞表面上でヒトμまたはマウスμを発現するＢ細胞の相対分布を示し；0011マウス（7655)リンパ球は、ヒトμについてポジティブであるが、相対的にマウスμを欠き；0001マウス（7656)リンパ球は、多くのヒトμまたはマウスμを発現せず；野生型マウス（7777)リンパ球は、マウスμは発現するがヒトμを欠く。
【０４６９】
図50は、細胞表面上でヒトκまたはマウスκを発現するＢ細胞の相対分布を示し；0011マウス（7655)リンパ球は、ヒトκについてポジティブであるが、相対的にマウスκを欠き；0001マウス（7656)リンパ球は、多くのヒトκまたはマウスκを発現せず；野生型マウス（7777)リンパ球は、マウスκは発現するがヒトκを欠く。
【０４７０】
図51は、細胞表面上でマウスλを発現するＢ細胞の相対分布を示し；0011マウス（7655)リンパ球は、マウスλについてポジティブであり；0001マウス（7656)リンパ球は、有意なマウスλを発現せず；野生型マウス（7777)リンパ球は、マウスλは発現するが、0011マウス（7655)より比較的低いレベルである。
【０４７１】
図52は、ヒトκ（トランスジーンコード）と比較した場合の、内因性マウスλについてポジティブなＢ細胞の相対分布を示す。左上のパネルは、機能的内因性重鎖および軽鎖対立遺伝子を有し、そしてヒトトランスジーンを欠く野生型マウス由来の細胞の結果を示し；細胞は、マウスλについてポジティブである。右上のパネルは、κノックアウトバックグラウンドを有し（JKD++)、そしてKC1e-1399系統のヒトκトランスジーン組込みを保有するマウス（#5822)由来の細胞を示し；細胞は、ヒトκまたはマウスλについておおよそ比例した量でポジティブである。左下のパネルは、κノックアウトバックグラウンドを有し（JKD++)、そしてKC2-1610系統のヒトκトランスジーン組込みを保有するマウス（#7132)由来の細胞を示し；より多くの細胞は、ヒトκについてよりマウスλについてポジティブであり、おそらくKC2-1610トランスジーン組込みがKC1e-1399トランスジーン組込みより効率的ではないことを示す。右下のパネルは、ヒトκミニ遺伝子座トランスジーン(KCo4)を保有し、そして機能的内因性マウスκ対立遺伝子を欠くマウス由来の細胞を示す。図52に示されるデータはまた、トランスジーン間の表現型発現の可変性を示す。そのような可変性は、個々のトランスジーン、および／または組み込まれたトランスジーンから生じる１つ以上の所望の表現型特徴（例えば、アイソタイプスイッチング、高レベル発現、低いマウスIgバックグラウンド）を発現するトランスジェニック系統について選択する望ましさを示す。一般には、単一または複数のトランスジーン種（例えば、pKC1e、pKC2、KCo4)を別々に使用し、以下によって異なる複数の個々のトランスジェニック系統を形成する：(1)トランスジーン、(2)トランスジーン組込みの部位、および／または(3)遺伝的バックグラウンド。個々のトランスジェニック系統を、以下のような所望のパラメーターについて試験する：(1)予め決定した抗原に対する免疫応答を備える能力、(2)トランスジーンコード定常領域内のアイソタイプスイッチングの頻度、および／または内因性（例えば、マウス）Ig定常領域遺伝子へのトランス−スイッチングの頻度、(3)トランスジーンコード免疫グロブリン鎖および抗体の発現レベル、(4)内因性（例え
ば、マウス）免疫グロブリンの免疫グロブリン配列の発現レベル、ならびに(5)生産性VDJおよびVJ再配置の頻度。代表的には、最も高い濃度のトランスジーンコード（例えば、ヒト）免疫グロブリン鎖を生成するトランスジェニック系統が選択され；好ましくは、選択された系統は、トランスジェニック動物の血清において少なくとも約40μg/mlのトランスジーンコード重鎖（例えば、ヒトμまたはヒトγ）、および／または少なくとも約100μg/mlのトランスジーンコード軽鎖（例えば、ヒトκ）を生成する。
【０４７２】
マウスを、それらの非免疫化血清、および特定の抗原（ヒトCD4）での免疫後のそれらの血清における、ヒトおよびマウス免疫グロブリン鎖の発現について試験した。図53は、種々の遺伝子型の４つの別々の免疫化していない0011マウスの血清中に存在するヒトμ、ヒトγ、マウスμ、マウスγ、ヒトκ、マウスκ、およびマウスγ鎖の相対的な発現を示し（nt =試験せず）；ヒトκは、最も豊富な軽鎖として優勢であり、そしてヒトμおよびマウスγ（おそらく、トランス−スイッチングの産物）は、最も豊富な重鎖であり、存在する系統間での可変性を有し、マウス鎖の発現を最小化するがヒト鎖の発現を可能にする有利な遺伝子型組み合わせを同定する選択工程の利用性を示す。マウス#6907および7088は、ヒトμからヒトγへのアイソタイプスイッチング（トランスジーン内のシス−スイッチング）を示す。
【０４７３】
図54は、種々の0011遺伝子型のマウスにおける、ヒトμ(huμ)、ヒトγ(huγ)、ヒトκ(huκ)、マウスμ(msμ)、マウスγ(msγ)、マウスκ(msκ)、およびマウスγ(msγ)についての血清免疫グロブリン鎖レベルを示す。
【０４７４】
0011マウスにおける特異的抗体応答
0011マウス（#6295)を、以下の免疫スケジュールに従って、免疫誘発用量のヒトCD4で免疫した：０日目、100μlのCD4マウス免疫血清の腹腔内注射；１日目、100μl中、DDAを有するラテックスビーズ上の20μgのヒトCD4（American Bio-Tech)の注射；15日目、100μl中、DDAを有するラテックスビーズ上の20μgのヒトCD4（American Bio-Tech)の注射；29日目、100μl中、DDAを有するラテックスビーズ上の20μgのヒトCD4（American Bio-Tech)の注射；43日目、100μl中、DDAを有するラテックスビーズ上の20μgのヒトCD4（American Bio-Tech)の注射。
【０４７５】
図55は、３週目および７週目でのCD4免疫に対する相対的な抗体応答を示し、これは、抗CD4応答におけるヒトμ、ヒトκ、およびヒトγ鎖の存在を示す。ヒトγ鎖は、７週目の血清において顕著に増加した豊富さで存在し、このことは、重鎖トランスジーン内のシス−スイッチング（アイソタイプスイッチング）が、野生型動物におけるアイソタイプスイッチングのものに類似する時間関係で生じていることを示す。
【０４７６】
図56は、種々のヒト重鎖および軽鎖トランスジーンの図の収集を示す。
【０４７７】
実施例２８
本実施例は、マウスλ軽鎖遺伝子座の標的化ノックアウトを提供する。
【０４７８】
マウスλ軽鎖遺伝子座の標的不活化
Ig重鎖およびκ軽鎖遺伝子座とは異なり、マウスVλJλおよびCλ遺伝子セグメントを、5'〜3'整列で配置された３つのファミリーにグループ分けしないが、代わりに分散させる。ほとんどの5'部分は、続く２つのＶセグメント（Vλ2およびVλX)からなり、3'方向に進行し、２つの定常領域エキソンが続き、それぞれはそれ自体のＪセグメント（Jλ2Cλ2および偽遺伝子Jλ4Cλ4)と関連する。次は、最も広範に使用されるＶセグメント（Vλ1)であり、これに定常領域エキソン（Jλ3Cλ3およびJλ1Cλ1)の第２のクラスターが続く。全体的に、遺伝子座は約200kbにわたり、２つのクラスターの間に約20〜90kbの間隔を有する。
【０４７９】
λ遺伝子座の発現は、Vλ2またはVλXの、優勢にはJλ2への、そしてほんのまれにはさらにJλ3またはJλ1の3'への再配置を含む。Vλ1は、Jλ3およびJλ1の両方と組換え得る。従って、λ遺伝子座は、遺伝子座の組換えおよび発現を十分に除去するために変異され得る。
【０４８０】
２つのλ遺伝子クラスター間の距離は、マウスIg重鎖およびκ軽鎖遺伝子座を不活化する際に使用したように、単一の緻密な標的化欠失の生成を介して遺伝子座の発現を不活化することを困難にする。代わりに、λ軽鎖の発現を除去する小さな単一の欠失は、約120kbにわたり、Jλ2Cλ2からJλ1Cλ1に伸長する（図57）。このことは、λ定常領域エキソンの全て、ならびにVλ1遺伝子セグメントを除去し、このことは、遺伝子座の不活化を確実にする。
【０４８１】
置換型標的化ベクター（ThomasおよびCapecchi (1987) 前掲書中）を構築する。ここで、欠失した120kbを、PGK発現カセット内の選択マーカー遺伝子neoで置換する。マーカーを、欠失に隣接するゲノムλ配列内に埋め込み、λ遺伝子座に対する相同性を提供し、そしてまた、相同性の領域の内の１つの末端にHSV-tk遺伝子を含み、ベクターを相同的に組み込んだ細胞についての富化を可能にし得る。λ遺伝子座ゲノムクローン配列を、標的化するES株に同質遺伝子の株129/Svゲノムファージライブラリーのスクリーニングによって得る。なぜなら、標的化する染色体DNAに同質遺伝子の標的化ベクターの使用は、相同組換えの効率性を増強することが報告されているからである。λ遺伝子座に対する相同性の長さにおいて異なる標的化ベクターを構築する。第１のベクター（図58におけるベクター１）は、約８〜12kbのλ遺伝子座配列の全てに隣接するマーカー遺伝子を含む。標的化事象（置換ベクターが、数kbのDNAの付加または検出を媒介する）について、このことは、十分な程度の相同性より多いことが実証されている（Hastyら、(1991）前掲書中；Thomasら、(1992）前掲書中）。さらに約40〜60kbの隣接λ配列を有するベクターもまた構築する（図58中のベクター２）。少なくとも80kbのヒトIgミニ遺伝子座を、日常的にクローン化し、そしてプラスミドベクターpGP1において増殖する（Taylor ら、(1993）前掲書中）。
【０４８２】
λ遺伝子座の不活化についての代替のアプローチは、２つの独立した変異（例えば、同じES細胞中の、２つの定常領域クラスターまたは２つのＶ領域遺伝子座の変異）を使用する。両方の定常領域はそれぞれ約６kbのDNA内に含まれるために、Ｖ遺伝子座のうちの１つは約19kbにわたるが、標的化ベクターを、Jλ2Cλ2/Jλ4Cλ4およびJλ3Cλ3/Jλ1Cλ1遺伝子座を独立に欠失するように構築する。図58に示されるように、各ベクターは、PGK発現カセット中の選択マーカー（例えば、neoまたはpac)からなり、これは、各欠失をブランクで示す全てで約８〜12kbのλ遺伝子座ゲノムDNAに囲まれる。HSV-tk遺伝子は、ポジティブ−ネガティブ選択による相同組換え事象について富化するように標的化ベクターに付加し得る。ES細胞を、定常領域遺伝子座の内の１つの欠失を有するクローンを生成するように２つのベクターで連続的に標的化し；次いで、これらのクローンを、定常領域遺伝子座の内の１つの欠失を有するクローンを生成するように、２つのベクターで連続的に標的化し、次いでこれらのクローンを、残りの機能的な定常領域クラスターの欠失を生じるように標的化する。両方の標的化事象は、このように同じ細胞に指向されるため、２つの標的化について異なる選択マーカーを使用することが好ましい。図58において示される図の例において、ベクターの内の１つは、neo遺伝子および他のpac（ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を含む。第３の潜在的な優性選択マーカーはhyg（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）遺伝子である。pacおよびhyg遺伝子の両方は、neo遺伝子をIg重鎖およびκ軽鎖遺伝子座に標的化するために首尾良く使用されるPGK発現構築物に挿入され得る。２つのλ定常領域クラスターを硬く連結するので、２つの変異が同じ染色体上に存在することが重要である。おそらく、２つの独立した標的化事象によって同じ対立遺伝子を変異する50％の可能性が存在し、そして変異の連結を、二重に標的化したES細胞由来のキメラの交配の間の同時分離によって確立する。
【０４８３】
実施例２９
本実施例は、マウス重鎖遺伝子座の標的化ノックアウトを提供する。
【０４８４】
マウス重鎖遺伝子座の標的化不活化
図59において示される構造を有する相同組換え遺伝子標的化トランスジーンを使用して、少なくとも１つ、そして好ましくは実質的に全てのマウス重鎖遺伝子座定常領域遺伝子を、ES細胞中の遺伝子標的化によって欠失する。図59は、標的化トランスジーンの一般的な模式図を示す。セグメント(a)は、欠失されるべき定常領域遺伝子の上流（すなわち、JH遺伝子の近位）に位置するクローン化したゲノムDNA配列であり；セグメント(b)は、ポジティブ選択マーカー（例えば、pgk-neo)を含み；セグメント(c)は、欠失させるべき定常領域遺伝子の下流（すなわち、定常領域遺伝子およびJH遺伝子の遠位）に位置するクローン化したゲノムDNA配列であり；そしてセグメント(d)（これは、任意である）は、ネガティブ選択マーカー遺伝子（例えば、HSV-tk)を含む。図60は、Immunoglobulin Genes, Honjo, T, Alt, FW, およびRabbits TH（編）、Academic Press, NY (1989)、129頁から得られるようなマウス重鎖遺伝子座の地図を示す。
【０４８５】
図59による構造を有する標的化トランスジーン：(1)(a)セグメントは、クローンJH8.1の11.5kb挿入物（Chenら、(1993) Int. Immunol. 5: 647)、またはマウスCμ遺伝子の上流に位置する少なくとも約１〜４kbの配列を含む等価の部分であり、(2)(b)セグメントは、上記のようなpgk-neoであり、(3)(c)セグメントは、図61に示される1674bp配列、または以下の配列を有する末端標識化オリゴヌクレオチドを用いてマウスゲノムクローンライブラリーをスクリーニングすることによって単離されたマウスCα遺伝子のファージクローンから単離された４〜６kb挿入物を含み：
5'- gtg ttg cgt gta tca gct gaa acc tgg aaa cag ggt gac cag - 3'
および、(4)(d)セグメントは、上記のHSV-tk発現カセットを含む。
【０４８６】
あるいは、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子の段階的な欠失を実施し、ここで第１の標的化トランスジーンは、定常領域遺伝子に隣接する配列に相同な相同領域（すなわち、セグメント（a)および(c)）、ポジティブ選択マーカー遺伝子の第１種（pgk-neo)、およびHSV-tkネガティブ選択マーカーを含む。従って、(a)セグメントは、少なくとも約１〜４kbの、Cγ3の上流に位置する領域に相同な配列を含み得、そして(c)セグメントは、少なくとも約１〜４kbの、Cγ2aの上流に位置する領域に相同な配列を含み得る。この標的化トランスジーンは、Cγ3、Cγ1、Cγ2b、およびCγ2a遺伝子を欠失する。この第１の標的化トランスジーンを、ES細胞に導入し、そして正確に標的化した組換え体（例えば、G418を有する）を選択し、正確に標的化したＣ領域欠失を生成する。次いで、HSV-tkカセットの損失についてのネガティブ選択を実施する（例えば、ガンシクロビルまたはFIAC)。得られた正確に標的化した第１回のＣ欠失組換え体は、Cγ3、Cγ1、Cγ2b、およびCγ2a遺伝子を欠失する重鎖遺伝子座を有する。
【０４８７】
第２の標的化トランスジーンは、定常領域遺伝子に隣接する配列に相同な相同性領域（すなわち、セグメント(a)および(c)）、第１種とは異なる第２の種のポジティブ選択マーカー遺伝子（例えば、gptまたはpac)、およびHSV-tkネガティブ選択マーカーを含む。従って、(a)セグメントは、少なくとも約１〜４kbの、およびCεの上流に位置する領域に相同な配列を含み得、そして(c)セグメントは、少なくとも約１〜４kbの、およびCαの上流に位置する領域に相同な配列を含み得る。この標的化トランスジーンは、CεおよびCα遺伝子を欠失する。
【０４８８】
この第２の標的化トランスジーンを、第１の標的化事象から得られる正確に標的化されたＣ領域組換えES細胞に導入する。第２のノックアウト事象について正確に標的化される（すなわち、第２の標的化トランスジーンとの相同組換えによる）細胞を、第２種のポジティブ選択マーカー遺伝子について特異的である選択薬物（例えば、gptについて選択するためのミコフェノール酸；pacについて選択するためのピューロマイシン）を有することについて選択する。次いで、HSV-tkカセットの損失についてのネガティブ選択を実施する（例えば、ガンシクロビルまたはFIAC）。これらの得られた正確に標的化した第２回のＣ領域組換え体は、Cγ3、Cγ1、Cγ2b、Cr2a、Cε,およびCα遺伝子を欠失する重鎖遺伝子座を有する。
【０４８９】
１つ以上のC領域遺伝子を欠損する正確に標的化された第一ラウンド(round)または第二ラウンド組換えES細胞を、記載のように（前出）、胚盤胞接種のために使用し、そしてキメラマウスを作製する。標的化した重鎖対立遺伝子の生殖細胞系伝達が確立され、得られた始原マウスの繁殖を行って、Ｃ−領域ノックアウトについてのホモ接合性であるマウスを作製する。このようなＣ−領域ノックアウトマウスは、JHノックアウトマウスと比較していくつかの利点を有する。一例として、Ｃ−領域ノックアウトマウスは、ヒト重鎖トランスジーンと内因性重鎖遺伝子定常領域との間トランススイッチングを受け、従って、トランスジェニックマウス中のキメラヒト／マウス重鎖の頻度を減少させる能力が減少している（または能力を完全に欠損する）。マウスγ遺伝子のノックアウトが好ましいが、μおよびΔはまた、しばしば相同標的化により欠失される。Ｃ−領域ノックアウトは、内因性マウス重鎖遺伝子座の他の標的化破壊とともになし得る；Ｃ−領域欠損は、内因性マウス重鎖遺伝子座の生産性のVDJ再配置を防止するために、そしてヒト重鎖トランスジーンと、とりわけ、マウス重鎖遺伝子座との間のトランススイッチングを防止するかまたは減少させるためにJHノックアウトと併用され得る。いくつかの実施態様に関して、内因性重鎖遺伝子座の１つ以上のＣ−領域遺伝子を特異的に欠損するが、しかし特定の他のＣ−末端領域遺伝子を保持するマウスを作製することが所望され得る。例えば、そのようなIgAが有利な表現型を付与し、そしてマウスの所望される有用性を実質的に妨害しない場合、トランススイッチングによりキメラヒト／マウスIgAの産生を可能にするマウスＣα遺伝子を保持することが好ましくあり得る。
【０４９０】
実施例30
この例は、ヒトトランスジーンを有するトランスジェニックマウスから得られたリンパ球サンプル由来の内因性（マウス）免疫グロブリンを発現するリンパ球のエクスビボ枯渇を証明する。マウスIgを発現するリンパ球は、トランスジーンによりコードされるヒト免疫グロブリンへ実質的に結合することのない抗マウス免疫グロブリン抗体へ特異的に結合することにより、選択的に枯渇される。
【０４９１】
マウスIgを発現するＢ細胞のエクスビボ枯渇
ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン(HC2)およびヒト軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーン(KCo4)についてホモ接合性のマウスを、C57BL/6(B6)近交系マウスと
繁殖させて、2211マウス（すなわち、機能性内因性マウス重鎖遺伝子座についてホモ接合性であり、機能性内因性軽鎖遺伝子座についてホモ接合性であり、そして１コピーのヒト重鎖トランスジーンおよび１コピーのヒト軽鎖トランスジーンを有するマウス）を得る。このような2211マウスはまた、B6主要組織適合抗原および副組織適合性抗原を発現する。これらのマウスを、抗原の免疫原性用量で初回刺激し、そして約１週間後に、脾臓を単離する。マウスIgに対してポジティブであるＢ細胞を、標準的な方法(Wysockiら,(1978) Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 75: 2844; MACS magnetic cell sorting, Miltenyi Biotec Inc., Sunnyvale, CA)に従って、固相結合抗体依存性細胞分離、続いて抗体依存性補体仲介細胞溶解(Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell BBおよびShiigi SM(編), W.H. Freeman and Company, New York, 1980, 211-212頁)により除去して、マウスIgに対してポジティブな残存細胞を実現的に除去する。枯渇させたサンプル中の残存細胞（例えば、ヒトIgに対してポジティブであるＴ細胞、Ｂ細胞）を、好ましくは、生じるＢ細胞を枯渇させるためにさらなる抗マウスIg抗体と共にSCID/B6またはRAG/B6マウスへi.vで注射する。次いで、再構成したマウスを、抗体およびハイブリドーマクローンを産生するための親和性成熟細胞を得るための抗原に対して、さらに免疫する。
【０４９２】
実施例31
体細胞キメラ中の完全なヒト抗体の産生
体細胞キメラマウス中に完全なヒト抗体を産生する方法が記載される。これらのマウスは、胚盤胞ヒト免疫グロブリン(Ig)重鎖および軽鎖トランスジーンを有し、機能性マウスIg重鎖およびκ軽鎖を欠損する胚幹細胞の、RAG-1またはRAG-2欠損マウス由来の胚盤胞への導入により生産される。
【０４９３】
RAG-1およびRAG-2欠損マウスは(Monbaertsら、(1992) Cell 68:869; Shinkaiら、 (1992) Cell 68: 855)、VDJ再配置を開始不能し、そしてIgおよびＴ細胞レセプター(TCR)をコードする遺伝子セグメントを組み立てる能力がないことに起因して、マウスＢ細胞およびＴ細胞を欠損する。Ｂ細胞およびＴ細胞の産生における欠損は、RAG-2欠損動物由来胚盤胞への野生型ES細胞の注射により補完され得る。得られたキメラマウスは、注射されたES細胞に全てが由来する、成熟Ｂ細胞および成熟Ｔ細胞を産生する(Chenら、(1993) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90: 4528)。
【０４９４】
注射されたES細胞の遺伝子操作は、キメラのすべてのＢおよび／またはＴ細胞へ明確にされた変異および／または外因性DNA構築物を挿入するために使用される。Chenら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4528-4532)は、、RAG胚盤胞に注射される場合、Ｂ細胞の非存在下でＴ細胞を作るキメラを産生するIg重鎖遺伝子座のホモ接合性不活化を有するES細胞を作製した。。再配置化したマウス重鎖の変異ES細胞へのトランスフェクションによって、Ｂ細胞発生のレスキューおよびキメラ中のＢ細胞およびＴ細胞の両方の産生が生じる。
【０４９５】
マウスIg重鎖またはκ軽鎖合成の非存在下で完全なヒト抗体を発現するキメラマウスが、作製され得る。ヒトIg重鎖および軽鎖構築物を、マウスIg重鎖およびκ軽鎖の両方の不活化について、ホモ接合性であるES細胞へ導入する。次いで、ES細胞を、RAG2欠損マウス由来胚盤胞へ注射する。得られたキメラは、マウスIg重鎖およびκ軽鎖遺伝子を発現するが、ヒトIg遺伝子を発現し得ない注射されたES細胞にのみ由来するＢ細胞を含有する。
【０４９６】
免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子の不活化についてのES細胞ホモ結合性の産生
不活化したIg重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座を有するマウスを、公知の方法(それぞれ、Chenら、 (1993) EMBO J. 12: 821およびChenら、(1993) Int Immunol. 前出)に従って、ES細胞中での、IgJHおよびJK/CK配列の標的化された欠損により作製した。マウスの２つの変異系統を繁殖させて、両方のIg遺伝子座の不活化についてホモ結合性である系統を作製した。この二重改変系統は、ES細胞の誘導体化のために使用した。使用されたプロトコルは、本質的に、Robertson(1987, Tetratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, 71-112頁、E.J. Robertson編、IRL Press)により記載されたプロトコルであった。手短にいうと、胚盤胞を、ホモ結合性二重変異マウスの自然交配により作製した。妊娠したメスを、妊娠2.5日に、卵巣切除し、そして「遅延した」胚盤胞を妊娠の７日で子宮から流し、そして、それらの非分化状態の維持を助けるために支持細胞で培養した。それらの形態学により同定可能である、胚盤胞の内部細胞塊由来の幹細胞を、拾い、剥離し、そして支持細胞へ継代した。正常な核型を有する細胞を同定し、そして雄性の細胞株をこれらのキメラ産生能力について試験し、そしてマウスの細菌細胞への寄与を試験する。雄性のES細胞は、なぜなら雌性株よりも好ましい雄性キメラが有意により多くの子孫を産生し得るからである。
【０４９７】
マウスIg重鎖およびκ軽鎖欠損ES細胞へのヒトIg遺伝子の導入
ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を、HC2およびKC-C04のようなミニ遺伝視座構築物、またはJ1.3PのようなYACクローンのいずれかとして、変異体ES細胞へ導入する。ヒトIg DNAを有するES細胞のトランスフェクションをエレクトロポレーションまたはカチオン性脂質を用いるリポフェクションのような技術により実施する。ヒトDNAを取り込んだES細胞の選択を可能にするために、選択可能マーカーを構築物へ連結するか、または構築物とともにES細胞へ同時トランスフェクトする。変異体ES細胞は、Ig遺伝子の不活化をもたらす遺伝子標的化現象ののネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子を含むので、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hyg)またはピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ(pac)のような異なる選択マーカーを使用して、ES細胞へヒトIg遺伝子を導入する。
【０４９８】
ヒトIg重鎖および軽鎖遺伝子は、異なる選択可能マーカーを使用して、同時にまたは連続的に、変異体ES細胞へ導入し得る。トランスフェクション後、細胞を適切なマーカーで選択し、そして、薬剤抵抗性クローンを、凍結のため、ならびにヒト遺伝子配列の取り込みを確認および分析するためのDNA分析のために増殖する。
【０４９９】
キメラの産生
ヒトIg重鎖および軽鎖遺伝子を含むESクローンを、記載されるように(Bradley, A (1987) Tetratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, 113-151頁、E.J. Robertson編、IRL Press)RAG-2胚盤胞へ注射し、そして、偽妊娠雌の子宮へ移す。子孫を血清サンプルのELISAアッセイによりヒト抗体の存在についてスクリーニングする。ポジティブ動物を、免疫のために使用し、そしてヒトモノクローナル抗体の産生のために使用する。
【０５００】
実施例32
この実施例は、スイッチ組換えを受けるＢ細胞の欠損を誘導するマウス重鎖遺伝子座へ標的化したフレームシフト変異、ES細胞中の相同組換えを介した組込みを記載する。このフレームシフトしたマウスはヒト配列免疫グロブリンをコードする非マウス（例えば、ヒト）トランスジーンを有させるに通した宿主である。
【０５０１】
新規のフレームシフトマウスは、とりわけ、重鎖トランスジーンおよび／または軽鎖トランスジーンによりコードされる非マウス（例えば、ヒト）配列免疫グロブリンを発現するために、ならびに、導入されたトランスジーン由来、クラススイッチされた親和性成熟のヒト配列抗体を発現するハイブリドーマの単離のために使用され得る。フレームシフトを、４つのマウスJH遺伝子セグメントの１つ、およびマウスμ遺伝子の最初のエキソンへ導入する。この２つの導入されたフレームシフト変異は、お互いに代償し合い、Ｂ細胞が機能性VDJ連結のためにフレームシフトされたJHを使用する場合、完全に機能性のマウスμ重鎖の発現を可能にする。他の３つのJHセグメントは、残りのJH遺伝子において代償されないμ中のフレームシフトのため、機能性VDJ連結のために使用され得ない。あるいは、代償性フレームシフトは、複数のマウスJH遺伝子中へ操作され得る。
【０５０２】
代償され、フレームシフトされた免疫グロブリン重鎖対立遺伝子についてホモ接合性のマウスは、ほぼ生理学的なレベルの末梢神経性Ｂ細胞、およびマウスおよびヒトμの両方を含むほぼ生理学的なレベルの血清IgMを有する。しかし、胚中心へ補充されるＢ細胞は、非μアイソタイプのためのクラススイッチを頻繁に受ける。外因性μ鎖を発現するＢ細胞中のこのようなクラススイッチは、残っている非μCH遺伝子が、代償性フレームシフトを有さないので、代償されないフレームシフトmRNAの発現を誘発する。得られたＢ細胞は、Ｂ細胞受容体を発現せず、そして消失する。従って、マウス重鎖を発現するＢ細胞は、それらがアイソタイプスイッチングが生じる分化の段階に達すると、消失する。しかし、アイソタイプスイッチングが可能であリ、そしてこのようなアイソタイプ制限的フレームシフトを含まない非マウス（例えば、ヒト）トランスジーンによりコードされる重鎖を発現するＢ細胞は、アイソタイプスイッチングおよび／または親和性成熟などを含むさらなる発生が可能である。
【０５０３】
それゆえ、フレームシフトしたマウスは、マウス重鎖（μ）に関して損なわれた二次応答を有するが、しかしトランスジーンをコードした重鎖に関して有意な二次応答を有する。クラススイッチングに受けることが可能である重鎖トランスジーンが、この変異バックグランドへ導入される場合、非IgM二次応答はトランスジーンを発現するＢ細胞により支配される。従って、これらのフレームシフトマウスからハイブリドーマを発現する親和性成熟ヒト配列免疫グロブリンを単離することは可能である。さらに、フレームシフトしたマウスは、一般に、ヒト重鎖トランスジーンが可変領域の限定されるレパートリーのみをコードし得る場合有利であり得る、免疫学的予防レベルのマウスIgMを有する。
【０５０４】
ヒト配列モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの作製のために、トランスジェニック変異マウスを免疫し；それらの脾臓をメラノーマ細胞株と融合し；そして得られたハイブリドーマを、ヒト非μアイソタイプをコードするトランスジーンの発現についてスクリーニングする。さらに、フレームシフトしたマウスは、JH欠損マウスよりも有利であり得る。なぜなら、そのマウスが、シススイッチングのための活性基質として役立つ転写VDJに隣接する機能性μスイッチ配列(Guら、(1993) Cell 73:1155)を有し；従って、キメラヒト／マウス抗体を発現するトランススイッチされるＢ細胞のレベルを減少させるからである。
【０５０５】
フレームシフトベクターの構築
２つのフレームシフトベクターを構築する。ベクターの１つを、マウスJ4遺伝子セグメントの３’末端で２つのヌクレオチドを導入するために使用され、そして、ベクターの１つをマウスμ遺伝子のエキソン１の５’末端からそれらの同じ２つのヌクレオチドを欠損させるために使用する。
【０５０６】
1.  JHベクター
マウス重鎖Ｊ領域およびμイントロンのエンハンサーを網羅する3.4kbのXhoI/EcoRI フラグメントを、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（tk/neoカセット；Hastyら、(1991) Nature 350:243)の制御下で、ネオマイシン抵抗性遺伝子ならびにヘルペスチミジンキナーゼを有するプラスミドベクターへサブクローニング  する。次いで、このクローンを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して２つのPCRフラグメントを産生するための基質として使用する：
o-A1 5'-cca cac tct gca tgc tgc aga agc ttt tct tga-3'
o-A2 5'-ggt gac tga ggt acc ttg acc cca gta gtc cag-3'
o-A3 5'-ggt tac ctc agt cac cgt ctc ctc aga ggt aag aat ggc ctc-3'
o-A4 5'-agg ctc cac cag acc tct cta gac agc aac tac-3'
【０５０７】
オリゴヌクレオチドo-A1およびo-A2は、SphIおよびKpnIで消化される1.2kbフラグメントの増幅のために使用する。オリゴヌクレオチドo-A3およびo-A4は、KpnIおよびXbaIで消化される0.6kbフラグメントの増幅のために使用する。次いで、これら２つの消化されたフラグメントは、プラスミドＢを産生するためにSphI/XbaI消化されたプラスミドＡへクローニングする。
【０５０８】
プラスミドＢは、Ｊ４の末端に２つのヌクレオチド挿入を含み、さらに挿入の上流に新しいKpnI部位を含む。KpnI部位を、挿入のための診断マーカーとして使用する。
さらなる、隣接配列は、5'XhoI部位へクローニングされ得、そして、その相同的組み換え効率を上昇させるためにプラスミドＢの3'EcoRI部位へクローニングされる。次いで、得られたプラスミドを、SphIで、または挿入物内に単一部位を有する別の制限酵素で消化し、次いで、Hastyら(1991)前出により記載されるようにG418で選択される胚幹細胞へエレクトロポレーションする。相同組換えをサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定し、次いで、JH4中にただ２つの挿入および新たなKpnI部位を有する消失サブクローンを得るために、Hastyらにより記載されるようにFIAUで選択する。これらを、KpnIで消化されたDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定し、そしてPCRで増幅したJHDNAのDNA配列分析により確認する。
【０５０９】
得られたマウスは、変異されていない配列と変換されたJH4セグメントを含む：
...TGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG＿＿gtaagaatggcctctcc...
TrpGlyGlnGlyThrSerValThrVA1SerSerGlu
変異配列：
...TGGGGTCAAGGTACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGAGgtaagaatggcctctcc..
TrpGlyGlnGlyThrSerValThrVa1SerSerGlu
【０５１０】
μエキソン１ベクター
JH4セグメントへの２塩基対挿入を操作する上記の類似のインビトロ変異誘発方法論を用いて、PCR産物およびゲノムサブクローンを、最初のμエキソンの５’末にの２塩基対欠損を含むベクターを作製するために組み立てる。さらに、変異を標識するために、新たなXmnI部位がまた、AからGへの変化により下流へ挿入される。
【０５１１】
変異されていないμ遺伝子の配列は：
...ctggtcctcagAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCTTCCCCCTCGTC...
GluSerGLnSerPheProAsnValPheProLeuVal
変異されたμ遺伝子の配列は：
XmnI
．．．ctggtcctcag_＿AGTCAGTCCTTCCCGAATGTCTTCCCCCTCGTC...
SerGlnSerPheProAsnValPheProLeuVal
変異配列を含む相同組換えベクターを線状化し、そしてJH4挿入物を含むES細胞系へエレクトロポレーションする。相同組み換え体をネオマイシン抵抗性クローンから同定する。JH4挿入と同一の染色体へのフレームシフト挿入を含むそれらの相同組換えを、KpnI/BamHIで消化されたDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定する。JH4挿入物は、フラグメントを含むJ-μイントロンのサイズを野生型11.3kbから変異体9kbまで減少させる新たなKpnI部位と関連する。次いで、得られたクローンを、FIAUを使用して挿入されたtk/neoカセットの欠損に関して選択する。変異体μエキソンを含むクローンを、XmnIで消化されたDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定する。変異体は、PCR増幅したμエキソン１ DNAのDNA並列分析により確認する。
【０５１２】
フレームシフトしたマウスの作製
次いで、JH4中の２塩基対挿入およびエキソン１中の２塩基対欠損の両方を含むES細胞系を、次いで、キメラを産生するために偽妊娠雌へ挿入される胚盤胞段階の胚仔へ導入する。キメラ動物、生殖細胞系伝達を得るために繁殖させ、そして得られた動物をホモ接合で繁殖させて、代償性のフレームシフトした重鎖遺伝子座についてホモ接合性であり、そしてマウス重鎖を発現するＢ細胞中で損なわれた二次体液性免疫応答を有する変異動物を得る。
【０５１３】
例えば、pHC1およびpHC2などのようなヒト重鎖トランスジーンは、フレームシフトしたマウスIgH遺伝子座を有するマウスとのこのようなヒトトランスジーンを有するマウスの交雑により、マウス重鎖フレームシフトバックグランドへと繁殖させ得る。異種交配および戻し交配を介して、μ代償されたフレームシフトしたマウスIgH対立遺伝子についてのマウスIgH遺伝子座にてホモ接合性（すなわち、マウスμのみのインフレーム発現を代償可能ではあるが、マウス非μのインフレーム発現の代償は可能ではない）であり、そして機能性ヒト重鎖トランスジーン(例えば、pHC1またはpHC2)の少なくとも１つの組込まれたコピーを有するマウスが作製される。このようなマウスは、記載のように（前出）、内因性マウスκおよび／またはλ遺伝子座のノックアウトを含み得、そして、ヒトまたは他の非マウス軽鎖トランスジーン（例えば、pKCle、pKC2など）を含み得る。
【０５１４】
あるいは、ヒトトランスジーン（重および／または軽）は、代償性フレームシフトを含み得、その結果、トランスジーンJ遺伝子は、トランスジーン定常領域遺伝子中のフレームシフトにより代償される、フレームシフトを含む。内因性定常領域遺伝子のトランススイッチングは代償されず、そして短縮型またはノンセンス産物を産生する；このような代償されないトランススイッチングされた免疫グロブリンを発現するＢ細胞を、反対に選択し、そして枯渇させる。
【０５１５】
実施例33
Ｄ領域切除による内因性重鎖不活化
この実施例は、非機能性再配置化VDJセグメントを有するマウス生殖細胞系免疫グロブリン重鎖D領域の置換のためのポジティブ−ネガティブ選択相同組換えベクターを記載する。得られた対立遺伝子は、対立遺伝子内の重鎖クラススイッチングを受ける対立遺伝子とともに、正常な非生産性対立遺伝子としてＢ細胞内で機能し、それによって、活性トランスジーン遺伝子座へのトランススイッチングのレベルを減少させる。
【０５１６】
Ｄ領域標的化構築物
マウスＤ領域の上流に位置する8〜15kb DNAフラグメントを単離し、そしてGenBankに列挙されるDFL16.1セグメントについて公開された配列の約50連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブを使用して、マウス系統129ファージライブラリーからサブクローンする。DFL16.1は、Dセグメントの上流（すなわち、Ｖ領域遺伝子クラスターの近位および定常領域遺伝子クラスターの遠位）にある。
【０５１７】
同様に、JH3、JH4、Eμ、Sμおよびμ定常領域の最初の２つをコードしているエキソンからなる9.5kb BamHIを単離し、マウス系統129ゲノムファージライブラリーからサブクローンする。
【０５１８】
次いで、5〜10kb再配置VDJを、マウスハイブリドーマ（任意の系統）から単離し、そして終止コドンを含む合成リンカーをＪセグメントへ挿入する。Ｊ内の終止リンカーは、Ｖ置換再配置の可能性のため、アウトオブフレームVDJ接合部に好ましい。
【０５１９】
これら３つのフラグメントを、相同性組換えによりPGKneoポジティブ選択カセットおよびPGKHSVtkネガティブ選択カセットを共に組み立てて、129由来ES細胞(例えば、AB1)中のマウスＤ領域を除去するために、ポジティブ−ネガティブ選択ベクターを形成させるための標的ベクターを、8〜15kb DNAフラグメントをポジティブ選択カセット(例えば、PGKneo)へ連結することにより形成する。このポジティブ選択カセット自身を、再配置された5〜10kb再配置VDJへ連結し、それ自身が9.5kb BamHIフラグメント連結する；次いで、ネガティブ選択カセット（例えば、PGKHSVtk）自身を標的構築物の末端のいずれかへ連結する。このようなＤ領域を標的化ベクター構築を、図63に模式的に示す。
【０５２０】
Ｄ領域標的化構築物をAB1 ES細胞へ移入し、ポジティブおよびネガティブの選択を上記のように行い、そして正確に標的化したEs細胞をクローニングする。正確に標的化されたES細胞を、胚盤胞へ注射に使用し、そしてキメラマウスを作製する。キメラマウスを繁殖させて、Ｄ領域不活化重鎖対立遺伝子を有する始原マウスを作製する。子孫の異種交配を伴って、機能性外来重鎖遺伝子座を欠失し、そしてホモ接合体を作製する。このようなホモ接合体を使用してヒトIgGトランスジーン(例えば、pHC1、pHC2、pCK2、PkCle、KCo4)有するマウスｗｐ交配させて、機能性外来重鎖遺伝子座を欠失し、そしてヒト重鎖トランスジーン(および好ましくはまた、ヒト軽鎖トランスジーン)を有するマウスを(機能性Ｄ領域を欠失するホモ接合体とさらに戻し交配することによって)得る。いくつかの機能性外来軽鎖遺伝子座（例えば、λ遺伝子座）が残るという実施態様において、トランスジーンがヒト軽鎖（例えば、κ）ポリペプチドの高レベルな発現を指向する転写制御配列を含み、従って、トランスジーン遺伝子座が残っている外因性軽鎖(例えば、λ)遺伝子座と効果的に競合するを可能にすることが通常望ましい。例えば、Co4κ軽鎖トランスジーンは、一般に、トランスジェニック動物において外因性λ遺伝子座と効果的に競合する能力に関してpKC1と比べて好ましい。
【０５２１】
実施例34
この実施例は、ヒトκ軽鎖ミニ遺伝子座およびヒトVκ遺伝子座の一部を含む酵母人工染色体の同時注入によるヒト軽鎖トランスジーンV遺伝子レパートリーの拡大を記載する。
【０５２２】
Vκ含有YAC DNAおよびκミニ遺伝子座の同時導入による機能性ヒト軽鎖Ｖセグメントの導入
ヒトVκ遺伝子座の部分を含む約450kbYACクローンを、公共利用可能となるICRF YACライブラリーのクローン4×17E1由来非増幅YAC DNAとして得た(Larinら、 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 4123; Genome Analysis Laboratory, Imperial Cancer Research Fund, London, UK)。この450Kb YACクローンを、製造者の説明書通りのパルスフィールドゲル電気泳動(CHEF DR-II electrophoresis cell, BioRad Laboratories, Richmond, CA)による予備増幅なしに単離した。６つの個々のパルスフィールドゲルを、エチジウムブロマイドで染色し、そしてYACクローンDNAを含むこのゲル材料をゲルから切り出し、次いで三角形のゲルトレイ中の新たな(標準的なゲル緩衝液中の低融点アガロース)ゲルキャストへ包埋した。得られた三角形のゲル(６つの切り出しYACを含むゲルブロック)を、標準的な電気泳動緩衝液に加えて、2Mの酢酸ナトリウムを含むナローアガロースゲルを用いて頂点へと拡張した。次いで、このゲルを標準的なゲル緩衝液中に浸した電気泳動チャンバーに置いた。Ｙ形状ゲル形成器の上に上昇させ、その結果電流が、狭い高塩ゲル部分にのみ流れ得る。プレキシガラスブロックを、緩衝液中へのNaOAcの拡散防止のために高塩ゲル片の上に置いた。次いで、YAC DNAを基の切り出しゲル片（包埋された）の中から、および狭い高塩ゲル部分へと電気泳動した。低塩ゲルから高塩ゲルへの転移の点において、三角形ゲルの頂点でDNAの移動を効果的に停止させる抵抗の落差が存在する。電気泳動およびエチジウムブロマイドによる染色によって、濃縮されたYAC DNAを、ゲルの残りから切り出し、そしてアガロースをGELase(EpiCentre Technologies, Madison, Wisconsin)で消化した。次いで、1.68g/mlの密度を得るために塩化セシウムを、得られたYACを含む液体へ加えた。この溶液を、任意の汚染物質からYAC DNAを分離するために、36時間37,000rpmで遠心分離した。得られた密度勾配の0.5ml分画を単離し、そしてピークDNA分画を5mM Tris (pH7.4)、5mM NaCl、0,1M EDTAに対して透析した。透析後、得られた0.65mlのYAC DNA溶液の濃縮物は、2μg/mlのDNAが含まれることが見出された。このYAC DNAを、20:1:1(μg YAC4x17E1:KC1B:KV4)の割合で、プラスミドpKC1BおよびpKV4から精製したDNA挿入物と混合した。得られた2μg/mlの溶液を、半日齢のB6CBF2胚の前核へ注入し、そして95個の生存する微量注入した胚を偽妊娠メスの卵管へ移した。微量注入した胚から発生した12匹のマウスが生まれた。
【０５２３】
実施例35
この実施例は、クラススイッチング、体細胞変異、および不活化内因性免疫グロブリン遺伝子座についてホモ結合性であり、ならびにHC1またはHC2重鎖トランスジーンを含む免疫化トランスジェニックマウスにおけるＢ細胞発生を記載する。
ヒト配列生殖細胞系配置ミニ遺伝子座が、標準の遺伝子座を機能的に置換し得ることを証明するために、発明者らは、外因性IgHを欠くマウス系統をヒト生殖細胞系配置IgHトランスジーンを含む系統と繁殖させた。２つのトランスジーンミニ遺伝子座のHC1およびHC2は、それぞれ１つと４つの機能性可変(V)セグメント、それぞれ10および16の多様性(D)セグメント、全ての６つの連結(JH)セグメント、およびμおよびガンマ１定常領域セグメントを含む。このミニ遺伝子座は、コード領域に密接して連結されるJH-μイントロンエンハンサーおよびμならびにγ１スイッチ配列のようなヒトシス作用性調節配列を含む。これらはまた、ラットIgH遺伝子座の３’末端由来のさらなるエンハンサーエレメントを含む。本発明者らは、HC1およびHC2トランスジェニックマウスを記載のような（前出）JHセグメントを欠損し、そして、それゆえ機能性重鎖配置を受け得ない幹細胞由来変異マウス(JHDマウス)と交配させた。得られたトランスジェニックJHDマウスは、導入した重鎖配列に依存性であるＢ細胞を含む。
【０５２４】
免疫化およびハイブリドーマ
本発明者らは、50〜100μgの抗原の腹腔内注射によりマウスを免疫した。抗原はヒト癌胎児性抗原(CEA; Crystal Chem, Chicago, IL)、雌卵白リゾチーム(HEL; Pierce, Rockfold, IL)、およびキーホールリンペットヘモシアニン(KLH; Pierce,Rockford, IL)を含んだ。一次注射について、本発明者らは、完全なフロイントアジュバンドと混合し、次の注射について、本発明者らは不完全なフロイントアジュバンド(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)を使用した。本発明者らは、脾臓細胞を、非分泌性マウスミエローマP3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL1580)と融合した。本発明者らは、ELISAにより、血清サンプルおよびハイブリドーマ上清を、ヒト重鎖配列を含む特異的および非特異的抗体の存在についてアッセイした。非特異的抗体の検出について、本発明者らは、マイクロタイターウェルを、ヒト重鎖アイソタイプ特異的抗体(マウス MAbαヒトIgG1、クローンHP6069、Calbiochem, La Jolla, CA; マウスMAbαヒトIgM, クローンCH6, The Binding Site、Birmingham、UK)でコートし、ペルオキシダーゼを結合した抗血清(ポリクローナルヤギαヒトIgG(fc)由来の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アフィニティー精製fabフラグメント、cat#109-036-098;アフィニティー精製西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ポリクローナルウサギαヒトIgM(fc)、cat#309-035-095. Jackson Immuno Research, West Grove, PA)を用いて発色した。抗原特異的抗体の検出のために、本発明者らは、抗原でマイクロタイタープレートをコーティングし、そして、ペルオキシダーゼ結合ヒト重鎖アイソタイプ特異的抗血清で発色した。本発明者らは、過酸化水素および2,2'-アジノ-ビス-(３-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸、Sigma, Chem. Co., St. Louis, MO)とインキュベートすることにより結合したペルオキシダーゼを検出した。反応産物はを415nmの吸収により測定し、そして490nmでの吸収について補正する。
【０５２５】
フローサイトメトリー
本発明者らは、MishellおよびShiigiにより記載されるように、脾臓、骨髄、および腹腔由来の単一細胞懸濁液を処理し、そしてNH4Clで赤血球を溶解した。リンパ球を以下の試薬を使用して、染色した：すなわちフィコエリトリン結合抗マウスIgκ(クローン X36; Becton Dickinson, San Jose, CA)、FITC結合抗マウスIgD(クローン SBA 1, Southern Biotech, AL)、FITC結合抗マウスCD5(クローン 53-7.3; Becton Dickinson, San Jose, CA)、FITC結合抗マウスIgλ(クローン R26-46; Pharmingen, San Diego, CA)、およびCy-Chrome結合抗マウスB220(クローン RA3-6B2; Pharmingen, SanDiego, CA)。本発明者らは、FACScanフローサイトメーターおよびLYSIS IIソフトウェア(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して、染色された細胞を分析した。ほとんどのマクロファージ、好中球、および残存赤血球細胞を、前方散乱および側方散乱でゲート化することにより排除した。
【０５２６】
Ｂ細胞区画のレスキュー
HClトランスジェニック-JHDの腹腔中に、本発明者らは、正常レベルのCD5+B細胞、および通常のCD5+細胞の正常レベルの約４分の１を見出す。トランスジェニック腹腔CD5+B細胞は、正常な動物に記載されるいわゆるB-1細胞と似ている：それらは通常のＢおよびＴリンパ球よりも大きく、それらは脾臓で見いだされる通常のＢ細胞よりも低レベルのB220を発現し、そしてそれらは、より高い割合のλ軽鎖を発現する細胞を含む。90%を超える脾臓Ｂ細胞は、κを発現する一方、50%までの腹腔Ｂ細胞は、λを発現する。従って、通常のＢ細胞のレベルが全ての組織中で一様に減少される一方で、自己再生に関してはるかに大きな容量を有することが報告されているB-1のレベルは、HClトランスジェニック-JHD動物で正常であるようである。
【０５２７】
クラススイッチング
トランスジェニック-JHDマウスにおいて、抗原への曝露の繰り返しによって、ヒトγ１抗体およびμ抗体の産生を生じる。本発明者らは、１週間の間隔でトランスジェニック-JHDマウスへヒトCEAを注射し、そして４週間にわたって、抗原特異的IgMおよびIgG1の血清レベルをモニターした(図63)。１週間目で、検出可能なIgM応答はあるが、IgG1応答はない。しかし、２週間後、IgG1応答はIgM応答よりも大きく、そしてIgG1応答は増加し続ける一方、IgM応答が比較的一定のままである。最初のIgM反応続いてIgG反応は、二次免疫反応の代表である；そして、このパターンは、トランスジーン中に含まれるシス作用性配列はクラススイッチングを指向するサイトカインに対して応答性であり得ることを示唆する。本発明者らは、その各々の文献で議論されている非μアイソタイプの発現のための３つの潜在的な機構を考慮する。これらの機構は：μ遺伝子の欠損を含まないオルタナティブのスプライシング；隣接するフランキング繰り返し配列間の相同組換えを介するμ遺伝子の欠損を伴う「δ型」スイッチング；およびスイッチ領域間の非相同組換え。以下に記載される本発明者らの実験の結果は、スイッチ領域組換えモデルの指摘である。
【０５２８】
２つのタイプの非欠失性オルタナティブスプライシング機構は、アイソタイプのシフトを説明するために呼び出し得る。第一に、μおよびλ１の両方をカバーする単一な転写物が、トランスジーンから発現されることが可能である；この転写物は、抗原への曝露により誘導されたサイトカインに応答して、オルタナティブスプライスされ得た。あるいは、サイトカインにより誘導されたγ１の上流で開始する転写物は、μ転写物へとトランススプライスされ得た。これら機能のいずれかがヒトγ１配列の発現を担う場合、本発明者らは、μおよびλ１の両方を発現するハイブリドーマを単離し得ることを予想する。しかし、本発明者らは、ヒトμまたはλ１のどちらかを発現する何百ものハイブリドーマをスクリーニングしたが、本発明者らはどのような二重プロデューサー(μ＋、γ＋)ハイブリドーマも検出できなかった。これは、γ１の発現が、μ遺伝子の欠失に付随することを示す。
μ遺伝子の欠損は、μスイッチ領域とγ１スイッチ領域との間の相同組換えにより、またはHC1およびHC2トランスジーンに含まれる２つの隣接400bp直接反復(σμおよびΣμ)間の相同組換えにより仲介され得る。σμとΣμとの間の欠損組換えは、いくつかのヒトＢ細胞のIgD+、IgM-表現型を担う原因となることが報告されている。第一の機構である非相同スイッチ組換えが、種々の長さのスイッチ産物を産生するはずである一方で、第２の機構であるσμ／Σμ組換えは、常に同様の産物を生産するはずである。本発明者らは、３つのハイブリドーマ(図64A)、μを発現する１つのハイブリドーマおよびγ１を発現する２つのハイブリドーマから単離したゲノムDNAのサザンブロット分析を行った。本発明者らは、２つのγ１スイッチ領域中においてトランスジーンγ１の上流にのみゲノム再配置を見出した(図64B)。さらに、観測された構造のどちらも、σμとΣμとの間の同種組換えと互換性がない。それゆえ、本発明者らの結果は、μをコードしたトランスジーンおよびγ１スイッチ領域との間の欠損性非相同組換えにより仲介されるγ１アイソタイプ発現のためのモデルと一致している。
【０５２９】
トランススイッチング
ヒトγ１に加えて、本発明者らは、HC1およびHC2トランスジェニックJHDマウスの血清中にマウスλを見出した。本発明者らはまた、これらの動物由来のハイブリドーマを発現するマウスλを得た。非トランスジェニックホモ接合性JHD動物は検出可能なマウス免疫グロブリンのレベルを発現するので、本発明者らは、HC1およびHC2トランスジェニックJHD動物におけるマウスの発現はトランススイッチの現象に起因すると考える。本発明者らが分析した全てのトランスジェニックハイブリドーマは、マウスまたはヒトのいずれかの定常領域配列を発現するが、両方は発現しない。それゆえ、トランススプライシング機構は関与しないようである。本発明者らは、トランススイッチ産物のcDNAクローンを単離するためにPCR増幅を使用し、そして得られた10クローンのヌクレオチド配列を決定した(図65)。PCR増幅物中の５’オリゴヌクレオチドは、VH251をコードするトランスジーンに特異的であり、そして３’オリゴヌクレオチドはマウスのγ１、γ２、およびγ３配列に特異的である。本発明者らは、これらマウスの定常領域の全ての３つを組み入れているトランススイッチ産物の例を見出す。
【０５３０】
体細胞変異
図７に示されるトランススイッチ産物の可変領域内の約１％のヌクレオチドは、生殖細胞系をコードしない。これはおそらく、体細胞変異による。変異させた配列は、外因性遺伝子座へ転移されているので、これらの変異を指向するシス作用性は、配列に直接的なこれらの変異は、マウスγスイッチの３’のどこかに位置し得る。しかし、本発明者らが以下に記載するように、本発明者らはまた、これらのこのような転移を受けていないVDJセグメント中の体細胞変異を観察する；そしてこれらの結果は、重鎖体細胞変異により必要とされる配列がトランスジーン中に含まれることを示す。
【０５３１】
HC1およびHC2構築物がトランスジェニックJHDマウス中に生じる体細胞変異に十分なシス作用性配列を含むかどうかを決定するために、本発明者らは、２つの独立のHC1トランスジェニック系統および１つのHC2系統由来のcDNAクローンを単離し、そして部分的に配列決定した。本発明者らは、トランスジェニックJHDマウス由来のいくつかのγ１転写物が、広範な体細胞変異を有するＶ領域を含むことを見出した。これれの変異した転写物の頻度は、免疫化の反復に伴って増加するようである。図66Aおよび66Bは、２組のcDNA配列を示す：１組は、本発明者らがRNAを単離する５日前に抗原の単回注射により免疫した、HC1(系統26)トランスジェニックJHDマウス由来である；２組めは、本発明者らがRNA単離前の５ヶ月の初めの異なる３日間で抗原を注射することにより過剰免疫した、HC1(第26行目)トランスジェニックJHDマウス由来である。曝露後５日間のマウス由来の13個のＶ領域のうち２つだけが、任意の非生殖細胞系をコードしたヌクレオチドを含む。これらのＶ領域の各々は、単一ヌクレオチド変化のみを含み、このサンプルに関して0.1%未満の全体としての体細胞変異頻度を与える。対照的に、過剰免疫した動物由来の13個のV配列のいずれも、完全に生殖細胞系ではなく、そして全体としての体細胞変異頻度は1.6%である。
【０５３２】
単一組織サンプルから単離されたμ転写物とγ1転写物との比較により、体細胞変異の頻度が、クラススイッチを受けているトランスジーンコピーではより高いことが示される。本発明者らは、過剰免疫した、CH1系統57のトランスジェニックJHDマウスから47の独立したμ cDNAクローンおよびγ1 cDNAクローンを単離し、そして部分的に配列決定した（図67Aおよび67B）。大部分のμ cDNAクローンは、生殖細胞系配列に関して改変しない。一方、半分を超えるγ1クローンは、複数の非生殖細胞系がコードされたヌクレオチドを含む。γ1を発現する細胞は、μを発現する細胞とは異なっている。一方で、２つのプロセスは、必ずしも関連しておらず、クラススイッチおよび体細胞変異は、Ｂ細胞の同じ亜集団に生じる。
【０５３３】
本発明者らは、過剰免疫していないCH1トランスジェニックマウスでは、VH251遺伝子の広範な体細胞変異を見出していないが、未処置のHC2トランスジェニックマウスのVH56p1遺伝子およびVH51p1遺伝子でかなりの体細胞変異を見出している。本発明者らは、免疫していない９週齢の雌性HC2トランスジェニック動物から脾臓RNAおよびリンパ節RNAを単離した。本発明者らは、個々に、Ｖ特異的プライマーおよびγ1特異的プライマーを用いて、HC2トランスジーンの４つのＶ領域各々を取り込むγ1転写物を増幅した。特異的PCR産物の各々の相対的収量は、VH56p1>>VH51p1>VH4.21>VH251であった。この技術は、厳密に定量的ではないが、HC2マウスのＶセグメント利用に偏っていることを示し得る。図68は、４つのＶ特異的プライマーすべての等モル混合物を用いたPCR増幅物に由来する23のランダムに選択したγ1 cDNA配列を示す。本発明者らはまた、VH56p1に偏っていることを観察する（19/23クローン）。さらに、VH56p1配列は、Ｖ遺伝子セグメント内に全体的な頻度の2.1％を有する、かなりの体細胞変異を示す。CDR3配列の点検によって、19の個々のVH56p1クローンのうち17が独特であるにもかかわらず、それらは、ほんの７つの異なるVDJ組み換え事象に由来することが明らかになる。従って、VH56p1を発現するＢ細胞は、未処理動物において、おそらく内因性の病変体または自己抗原によって、選択されるようである。この同じ遺伝子は、ヒトの胎性レパートリーに過剰に示されるということと関係があり得る。
【０５３４】
要旨
上流のシス作用配列は、個々のスイッチ領域の機能性を定義し、これはクラススイッチングに必要である。本発明者らの観察（HC1トランスジーン内のクラススイッチングは、二次応答に関与する細胞にほとんど限定され、そしてＢ細胞集団全体においてはランダムに生じない）は、トランスジーンとともに含まれる最小配列が十分であることを示唆する。この構築物に含まれるγ配列は、γ産生不能転写物の開始部位のわずか116ヌクレオチド上流で開始するので、スイッチ調節配列は、コンパクトである。
【０５３５】
本発明者らの結果は、これらの重要なシス作用調節エレメントが、個々のγ遺伝子に接近して連結されるか、またはHC1トランスジーンおよびHC2トランスジーンに含まれる3'重鎖エンハンサーに関連するかのいずれかであることを実証する。HC1挿入物およびHC2挿入物が、トランスジーン自律的クラススイッチング（これは、体細胞変異したようである配列についてのマーカーとして作用し得る）を受けるので、本発明者らは、内因性の遺伝子座への転移には起因しない、過剰変異した転写物を容易に見出し得た。本発明者らは、３つの独立したトランスジェニック系統（２つのHC1系統および１つのHC2系統）において体細胞変異したγ転写物を見出した。それゆえ、トランスジーンの組み込み部位に隣接する配列は、このプロセスに影響を及ぼさないようである；代わりに、トランスジーン配列は、体細胞変異に指向するのに十分である。
【０５３６】
実施例３６
この実施例は、不活化内因性免疫グロブリン遺伝子座に接合性であるマウスに由来し、そしてヒト配列重鎖およびヒト配列軽鎖をコードするトランスジーン配列を含むハイブリドーマの作製を記載する。記載されるハイブリドーマは、ヒト配列重鎖およびヒト配列軽鎖を含むモノクローナル抗体を分泌し、そしてＴリンパ球上に発現された、予め決定された抗原に結合する。この実施例はまた、ヒト由来の免疫原であるヒトCD4に応答して、ヒト配列抗体を産生するマウスの能力を実証する。そしてヒト抗原に反応性のヒト配列モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するための供給源としてこのようなマウスが適切であることを実証する。
【０５３７】
Ａ．ヒトCD4抗原で免疫されたHC1トランスジェニックマウス由来のヒトIgモノクローナル抗体の産生
機能的に破壊されたJH遺伝子座に接合性であり、そしてヒト配列重鎖をコードするために再配置し得るトランスジーンおよびヒト配列軽鎖をコードするために再配置し得るトランスジーンを保有するトランスジェニックマウスを免疫した。マウスの遺伝型は、HC1-26＋ KCle-1536＋ JHD＋/＋ JKD−であった。そして、これはマウス重鎖不活化ならびにHC1ヒト配列重鎖トランスジーンおよびKCleヒト配列軽鎖トランスジーンの生殖細胞系コピーの存在にホモ接合性であることを示す。
【０５３８】
マウスを、安定にトランスフェクトしたポリヌクレオチドによりコードされるマウス−ヒトハイブリッドCD4分子を発現するEL4細胞株(ATCC)の変種で免疫した。発現されたCD4分子は、実質的にヒト様のCD4配列を含む。100μlの完全Freund'sアジュバント(CFA)を伴った100μlのPBS中の約５×106細胞を、０日目に腹腔内注射を介してマウスに導入した。接種を、７、14、21、28、60、および77日目に繰り返し、18、35、および67日目に試験採血した。脾臓を81日目に摘出し、そして約7.2×107脾細胞を、約1.2×107融合パートナー細胞(P3x63Ag8.653細胞株；ATCC)と標準的方法（PEG融合）により融合し、そしてRPMI 1640、15％FCS、4mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムおよびHATならびにPSN培地中で培養した。複数回融合を行った。
【０５３９】
ハイブリドーマを増殖させ、上清を、商業的供給源から得られる、CHO細胞で発現させた精製組み換え可溶性ヒト配列CD4(American Bio-Technologies, Inc. (ABT), Cambridge, MA)および/またはNEN-DuPontから得たCD4との結合についてELISAで試験した。ABTサンプルは、ヒトCD4のV1ドメインからV3ドメインまでを含む、精製55kDヒトCD4分子を含んだ。組み換えヒト配列CD4（CHO-K1細胞において産生された）をアッセイプレートに吸着させ、そしてハイブリドーマ上清由来の抗体を捕獲するために用い、次いで、捕獲された抗体をヒトμ、ヒトκ、ヒトγ、マウスμまたはマウスκのいずれかに結合する抗体の一団の結合について評価した。
【０５４０】
１つのハイブリドーマを、その培養プレートウェルからサブクローニングし、1F2と称した。ABT CD4調製物に結合した1F2抗体は、ヒトμおよびヒトκについてはポジティブであった。ならびにヒトγ、マウスγ、およびマウスκについてはネガティブであった。
【０５４１】
Ｂ．ヒトCD4およびヒトIgEで免疫したHC2トランスジェニックマウス由来のヒトIgモノクローナル抗体の産生
重鎖トランスジーンHC2を図56に示し、前出に記載した（実施例34を参照のこと）。
【０５４２】
図56に示したヒト軽鎖トランスジーンであるKCo4を、マウスゲノム中の単一の部位で個々にクローニングした２つのDNAフラグメントを同時組み込みして産生した。そのフラグメントは、４つの機能的Vκセグメント、5Jセグメント、CKエキソン、ならびにイントロンエレメントおよび下流エンハンサーエレメントの両方を含む（実施例21を参照のこと）(MeyerおよびNeuberger（1989）, EMBO J. 8:1959〜1964;JuddeおよびMax(1992), Mol. Cell Biol. 12:5206〜5216)。２つのフラグメントが一般的な３kb配列を共有しているので（図56を参照のこと）、それらは、重複配列の間の相同的組み換えの後に、潜在的にゲノムDNA中に連続的な43kbトランスジーンとして組み込まれ得る。このような組み換え事象は、頻繁に重複DNAフラグメントのマイクロインジェクションの際に生じることが実証されている(Pieperら（1992）、Nucleic Acids Res. 20:1259〜1264)。同時注射されたDNAのフラグメントはまた、接合体の中に同時組み込みされる傾向がある。そして個々にクローニングされたフラグメント内に含まれる配列を、引き続いてＢ細胞発達の間にDNA再配置によって連結する。表12は、少なくとも２つのトランスジェニック系統由来のトランスジーン挿入物が、機能的であることを示す。Ｖセグメントをコードした４つのトランスジーンの各々および5Jセグメントの各々を取り込むVJ接合部の例を、36クローンのこのセットに示す。
【０５４３】
表１２
【０５４４】
23の軽鎖ミニ遺伝子座ポジティブマウスおよび18の重鎖ミニ遺伝子座ポジティブマウスを注射した胎仔から成長させた。これらのマウスおよびその子孫を、機能的マウス重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の非存在下で、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖を含むマウスを得るために、内因性マウス重鎖遺伝子座（JHD系統）およびκ軽鎖遺伝子座(JCKD系統)に標的化された変異を含むマウスと交配させた。これらのマウスにおいて、マウス軽鎖の唯一の寄与は、もしあるなら、マウスλ遺伝子座由来である。
【０５４５】
表13は、体細胞変異が、トランスジーンがコードした、トランスジェニックマウスのヒト重鎖転写物の可変領域に生じることを示す。HC2トランスジェニックマウス由来の23のcDNAクローンを部分的に配列決定して、可変領域内の非生殖細胞系がコードされたヌクレオチドの頻度を決定した。このデータは、各クローンに由来するＶセグメントコドン17〜94の配列のみを含み、そしてＮ領域は含まない。RNAをマウス5250(ヘミ接合性HC2系統2550、ホモ接合性JHD)の脾臓およびリンパ節から単離した。単鎖cDNAを合成し、そしてγ転写物を、記載のように（参考文献）PCRにより増幅させた。増幅させたcDNAをプラスミドベクター中にクローニングし、そして23のランダムに選択したクローンを、ジデオキシチェーンターミネーション法により部分的に配列決定した。PCR導入したヌクレオチド変化の頻度は、0.2％未満の場合に定常領域配列から評価した。
【０５４６】
表13：非生殖細胞系をコードされたヌクレオチドを含むHC2トランスジェニックマウスでのヒトγ転写物の可変領域
【表７】
2009045066.tif 000042
【０５４７】
フローサイトメトリー
本発明者らは、FACScanフローサイトメーターおよびLYSIS IIソフトウェア(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて染色細胞を分析した。脾細胞を以下の試薬で染色した：ヨウ化プロピジウム(Molecular Probes, Eugene, OR)、フィコエリトリン結合αヒトIgκ（クローンHP6062；Caltag, S. San Francisco, CA）、フィコエリトリン結合αマウスIgκ（クローンX36；Becton Dickinson, San Jose, CA）、FITC結合αマウスIgλ（クローンR26-46; Pharmingen, San diego, CA）、FITC結合αマウスIgμ（クローンR6-60.2；Pharmingen, San Diego, CA）FITC結合αヒトIgμ（クローンG20-127; Pharmingen, San Diego, CA）、およびCy-Chrome結合αマウスB220(クローンRA3-6B2; Pharmingen, San Diego, CA)。
【０５４８】
ヒトIgトランスジーンの発現
図69は、JHD変異およびJCKD変異の両方についてホモ接合性であるKCo4およびHC2マウス由来の脾細胞のフローサイトメトリー分析を示す。ヒト配列HC2トランスジーンは、JHD変異バックグラウンドでのＢ細胞発生をレスキューし、脾臓のB220＋細胞の相対数を、野生型動物の約２分の１まで回復させた。これらのＢ細胞は、重鎖をコードされたトランスジーンを用いた細胞表面免疫グロブリンレセプターを発現した。ヒトKCo4トランスジーンもまた、機能的であり、そしてインタクトな内因性λ軽鎖遺伝子座と首尾良く競合した。重鎖ヒトトランスジーンおよび軽鎖ヒトトランスジーンの両方を含む（二重トランスジェニック）JHD/JCKDホモ接合性変異マウスにおいて95％近くの脾臓Ｂ細胞が、完全にヒト細胞表面IgMκを発現した。
【０５４９】
血清Igレベルを、以下のように行ったELISAにより決定した：ヒトμ：マイクロタイターウェルをマウスMabαヒトIgM（クローンCH6、The Binding Site, Birmingham, UK）でコーティングし、そしてペルオキシダーゼ結合ウサギαヒトIgM(fc)（cat＃309-035-095, Jackson Immuno Research, West Grove, PA）で発色させた。ヒトγ：マイクロタイターウェルをマウスMabαヒトIgG1（クローンHP6069, Calbiochem, La Jolla, CA）でコーティングし、そしてペルオキシダーゼ結合ヤギαヒトIgG(fc)（cat＃109-036-098，Jackson Immuno Research, West Grove, PA）で発色させた。ヒトκ：マイクロタイターウェルをマウスMabヒトIgκ（cat＃0173, AMAC, Inc. Igκ（cat＃A7164, Sigma Chem. Co. , St. Louis, MO））でコーティングした。マウスγ：マイクロタイターウェルをヤギαマウスIgG（cat＃115-006-071, Jackson Immuno Research, West Grove, PA）でコーティングした。マウスλ：マイクロタイターウェルをラットMabαマウスIgλ（cat＃02171D, Pharmingen, San Diego, CA）でコーティングし、ペルオキシダーゼ結合ウサギαマウスIgM(fc)（cat＃309-035-095, Jackson Immuno Research, West Grove, PA）で発色させた。結合させたペルオキシダーゼは、過酸化水素水および2,2'-アジノ-ビス-)3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸（Sigma Chem, Co., St. Louis. MO)とのインキュベーションにより検出する。反応産物を415nmでの吸収によって測定する。
【０５５０】
二重トランスジェニックマウスはまた、血清中にヒト抗体を十分に発現する。図70は、数匹の異なるトランスジェニック創始動物由来の、内因性重鎖不活化およびκ軽鎖不活化についてホモ接合性の、18匹の二重トランスジェニックマウス個々について免疫グロブリンタンパク質の血清レベルを測定したものを示す。本発明者らは、検出可能レベルのヒトμ、γ1、およびκを見出した。本発明者らは、発現されたヒトγ1が、トランスジーンμとγ1スイッチング領域との間のゲノム組み換えにより、標準的なクラススイッチングをもたらすことを、前出に示している。さらに、本発明者らは、トランスジーン内クラススイッチングが、重鎖可変領域の体細胞変異に付随したことを見出した。ヒト免疫グロブリンに加えて、本発明者らはまた、血清中にマウスγおよびλを見出した。内因性遺伝子座は完全にインタクトであるので、マウスλタンパク質の存在が、予測される。本発明者らは、マウスγ発現が、内因性重鎖遺伝子座へのトランスジーンVDJセグメントのトランススイッチング組み換えの結果であることを、他で示した。このトランススイッチング現象（これは、本来野生型重鎖対立遺伝子であることが実証され、VDJトランスジーンを再配置した（Durdikら(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2346〜2350; Gersteinら(1990), Cell 63:537〜548））は、変異JHDバックグラウンドに生じる。なぜなら、下流重鎖定常領域およびそれらのそれぞれのスイッチエレメントが、やはりインタクトであるからである。
【０５５１】
二重トランスジェニックマウスでのヒトIgMκの血清濃度は、約0.1mg/mlであり、動物間または系統間での偏差は極めて小さかった。しかし、ヒトγ1、マウスγ、およびマウスλのレベルは、0.1〜10μg/mlの範囲である。観察された個々の動物間でのγレベルの変動は、γが誘導性定常領域であるという事実の結果であり得る。おそらく、発現は、動物の健康、抗原への曝露、およびおそらくMHC型のような因子に依存する。マウスλ血清レベルは、個々のトランスジェニック系統に相関するようであるパラメーターに過ぎない。組み込みあたり最も少ないコピー数のトランスジーン（約１〜２コピー）を有するKCo4系統4436マウスは、最も高い内因性λレベルを有する。一方、KCo4系統4437マウス（組み込みあたり約10コピー）は、最も低いλレベルを有する。これは、内因性λがκトランスジーンに引き続いて再配置し、そして血清λレベルが選択されないモデルと一致するが、前駆体Ｂ細胞プールの相対サイズの反映の代わりである。複数の軽鎖挿入物を含むトランスジーン遺伝子座は、これらのうちの１つが機能的であるという可能性の増加を伴って、１つより多いＶからＪの組み換え事象を受ける機会を有し得る。従って、高コピー系統は、より小さいプールの潜在的λ細胞を有し得る。
【０５５２】
ヒトCD4およびIgEでの免疫
トランスジェニックＢ細胞が免疫応答に関与する能力を試験するために、本発明者らは、二重トランスジェニックマウスをヒトタンパク質抗原で免疫し、そしてELISAにより抗原特異的免疫グロブリンの血清レベルを測定した。マウスを、完全Freund'sアジュバント中にポリスチレンビーズ（cat#08226, Polysciences Inc., Warrington, PA）と共有結合させた、50μgの組み換えsCD4（cat.＃013101, American Bio-Technologies Inc., Cambridge, MA）で腹腔内注射により免疫した。各々のマウスは、内因性μおよびκ遺伝子座の破壊についてホモ接合性であり、そしてヒト重鎖トランスジーンHC2系統2500およびヒトκ軽鎖トランスジーンKCo4系統4437についてはヘミ接合性である。
【０５５３】
方法
血清サンプルを、組み換えsCD4でコーティングしたマイクロタイターウェル中に希釈した。ヒト抗体をペルオキシダーゼ結合ウサギαヒトIgM(fc)(Jackson Immuno Research, West Grove, PA)またはペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgκ（Sigma, St. Louis, MO）で検出した。
【０５５４】
図71Aは、組み換えヒト可溶性CD4で免疫したトランスジェニックマウスの１次応答を示す。４匹の免疫した動物全てが、１週間で抗原特異的ヒトIgM応答を示す。CD4特異的血清抗体は、ヒトμ重鎖およびヒトκ軽鎖の両方を含む。
【０５５５】
２次応答に関与するHC2トランスジーンの能力を評価するために、本発明者らは、抗原での注射を繰り返すことにより、トランスジェニックマウスを過剰免疫した。そして誘導された抗体の重鎖アイソタイプをモニターした。ヒト重鎖トランスジーンHC2およびヒトκ軽鎖トランスジーンKCo4についてホモ接合性のマウスを、０日目に、完全Freund'sアジュバント中、25μgのヒトIgEκ（The Binding Site, Birmingham, UK）で免疫した。その後、動物を約週１回の間隔で、不完全Freund'sアジュバント中のIgEκで注射した。血清サンプルを、1:10に希釈し、そして抗原特異的ELISAを、λコーティングしたプレート上でヒトIgEについて実施した。
【０５５６】
図71Bは、これらの動物由来の代表的な経時的免疫応答を示す：本発明者らは、完全Freund'sアジュバント中のヒトIgEを二重トランスジェニックマウスに注射し、続いて、不完全Freund'sアジュバント中のIgEの追加免疫を１週間ごとに行う。初期のヒト抗体応答は、IgMκであり、続いて抗原特異的IgGκが出現した。これらのマウスで誘導された血清抗体は、ヒトIgMともBSAとも交叉反応性を示さなかった。ヒトIgGの時間を超えた発生は、
【０５５７】
本発明者らはまた、インビトロでのクラススイッチングを受ける重鎖トランスジーンの能力を試験した：脾細胞性Ｂ細胞を、LPSおよび組み換えマウスIL-4の存在下で、ヒトIgMからヒトIgG1へスイッチする、同じ重鎖構築物（HC2、系統2550）にヘミ接合性である動物から精製した。しかし、インビトロでのスイッチングは、LPSおよび組み換えマウスIL-2、またはLPSのみの存在下では生じなかった。
【０５５８】
本発明者らは、二重トランスジェニック/二重ノックアウト(0011)マウスの脾臓、リンパ節、腹膜、および骨髄にIgM発現細胞を見出す。腹腔は、通常数のＢ細胞を含むが、骨髄および脾臓のトランスジェニックＢ細胞の絶対数は、正常Ｂ細胞数の約10〜50％である。この減少は、トランスジーン依存性Ｂ細胞発生の遅延から生じ得る。二重トランスジェニック/二重ノックアウト(0011)マウスはまた、これらのマウス中でヒトμ、γ1、およびκの有意なレベルで、血清中に十分なヒト抗体を発現する。発現されたヒトγ1は、トランスジーンμとγ1スイッチ領域との間のゲノム組み換えにより、標準的なクラススイッチングから生じる。さらに、トランスジーン内クラススイッチングは、トランスジーンによりコードされる重鎖可変領域の体細胞変異に付随する。ヒト免疫グロブリンに加え、本発明者らは、これらのマウスでマウスμおよびマウスλを見出す。このマウスμ発現は、トランススイッチング組み換えの結果であるようである。ここで、トランスジーンVDJ遺伝子を、内因性マウス重鎖遺伝子座へ組み換える。トランススイッチング（これは、本来は野生型重鎖対立遺伝子について、文献内で観察され、そしてVDJトランスジーンを再配置した）は、本発明者らのJH-/-バックグラウンドに生じる。なぜなら、マウス下流重鎖定常領域およびそれらのそれぞれのスイッチエレメントが、やはりインタクトだからである。
【０５５９】
免疫応答に関与するトランスジェニックＢ細胞の能力を実証するために、本発明者らは、ヒトタンパク質抗原で0011マウスを免疫し、そして抗原特異的免疫グロブリンの血清レベルをモニターした。初期のヒト抗体応答はIgMであり、抗原特異的ヒトIgGの発現が続く（図71Bおよび図73）。ヒトIgG抗体の出現の前の遅れは、クラススイッチングと抗原に対する二次応答との間の関連に一致する。
【０５６０】
ヒトCD4で免疫したトランスジェニックマウスでは、CD4抗原に対するヒトIgG反応性が2×10-2〜1.6×10-4の範囲の血清濃度で検出可能であった。
【０５６１】
抗ヒトCD4ハイブリドーマの同定
ヒト重鎖トランスジーンHC2およびヒトκ軽鎖トランスジーンKCo4についてホモ接合性のトランスジェニックマウスを、完全Freund'sアジュバント中、20μgの組み換えヒトCD4で０日目に免疫した。その後、動物を不完全Freund'sアジュバント中のCD4で、約１週間の間隔で注射した。図73は、トランスジェニックマウスの血清中におけるヒトCD4に対するヒト抗体の応答を示す。血清サンプルを1:50に希釈し、そして抗原特異的ELISAをヒトCD4をコーティングしたプレート上で実施した。各々の線は、個々のサンプル決定を示す。黒丸は、IgMを示し、白四角は、IgGを示す。
【０５６２】
本発明者らはまた、ヒトCD4免疫に応答したマウスのうちの１匹からハイブリドーマ細胞株を単離した。クローニングされたハイブリドーマのうち５つが、組み換えヒトCD4に結合し、他の糖タンパク質抗原の一団とは交叉反応しない（ELISAにより測定した場合）ヒトIgGκ（ヒトγ1/ヒトκ）抗体を分泌する。２つのIgGκハイブリドーマ（4E4.2および2C5.1）により分泌されるモノクローナル抗体のために免疫するヒトCD4抗原の会合および解離速度を決定した。実験的に得られた結合定数(Ka)は、抗体4E4.2および抗体2C5.1について、それぞれ、約9×107M-1および8×107M-1であった。これらのＫa値は、他の研究者ら（Chenら(1993) Int. Immunol. 6:647）によって臨床的試行に用いられているマウスIgG抗ヒトCD4抗体の範囲内に入る。
【０５６３】
系統＃7494(0012; HC1-26+; JHD++; JKD++; KC2-1640++)のマウスを、0、13、20、28、33、および47日目にヒトCD4で免疫した。そしてヒトκおよびヒトμまたはγからなる抗ヒトCD4抗体を産生した。
【０５６４】
28日目までに、ヒトμおよびヒトκが血清中に存在していることを見出した。47日目までに、ヒトCD4に対する血清応答は、ヒトμおよびヒトγの両方、ならびにヒトκを含んだ。50日目に、脾細胞をP3X63-Ag8.653マウスミエローマ細胞と融合し、そして培養した。700ウェルのうち44（6.3％）が、ヒトγおよび/またはκ抗ヒトCD4モノクローナル抗体を含んだ。これらのウェルのうち３つは、ヒトγ抗CD4モノクローナル抗体を含んでいたことを確認したが、ヒトκ鎖が欠失していた（おそらくマウスλを発現している）。１次ウェルのうち９つは、十分にヒトIgMκ抗CD4モノクローナル抗体を含み、そしてさらなる特徴付けのために選択した。十分にヒトIgMκ抗CD4モノクローナル抗体を発現するこのようなハイブリドーマの１つを、2C11-8と称した。
【０５６５】
１次ハイブリドーマを限界希釈によりクローニングし、そしてCD4に対して反応性のヒトμおよびκモノクローナル抗体の分泌について評価した。９つのハイブリドーマのうち５つがCD4 ELISAにおいてポジティブのままであった。ヒトCD4に対するこれらのヒトIgMκモノクローナル抗体の特異性を、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、キーホールカザガイ（keyhole limpet）ヘモシアニン（hemacyanin）およびガン胎児性抗原を含む他の抗原との反応性を欠失することにより実証した。これらのモノクローナル抗体が細胞表面上のCD4（すなわち天然のCD4）を認識し得るか否かを決定するために、これらの５つのクローンに由来する上清を、CD4＋Ｔ細胞株であるSupT1との反応性についてもまた試験した。５つのヒトIgMκモノクローナル抗体のうち４つがこれらのCD4+細胞と反応した。これらのIgMκモノクローナル抗体の特異性をさらに確認するために、新鮮な単離したヒト末梢血リンパ球(PBL)を、これらの抗体を用いて染色した。５つの１次ハイブリドーマのうち４つに由来するクローンからの上清は、CD4+リンパ球にのみ結合し、CD8+リンパ球には結合しなかった（図72）。
【０５６６】
図72は、IgMκ抗CD4モノクローナル抗体とヒトPBLとの反応性を示す。ヒトPBLを、各クローンからの上清またはネガティブコントロールモノクローナル抗体をマッチさせたアイソタイプとインキュベートした。次いで、PEに結合させたマウス抗ヒトCD4モノクローナル抗体（上列）またはFITCに結合させたマウス抗ヒトCD8 Ab（下列）のいずれかとインキュベートした。任意の結合させたヒトIgMκを、FITCまたはPEにそれぞれ結合させたマウス抗ヒトμで検出した。１つのクローンである2C11-8（右側)およびコントロールIgMκ（左側）についての代表的な結果を示す。予測されたように、ネガティブコントロールのIgMκは、Ｔ細胞と反応せず、そしてヤギ抗ヒトμは、PBLの約10％と反応した。これは、おそらくヒトＢ細胞であった。
【０５６７】
良好な増殖およびIgMκ抗CD4モノクローナル抗体産生が高レベルであることは、開発のためのクローンのハイブリドーマ細胞株を選択する上で重要な因子である。ハイブリドーマの１つである2C11-8からのデータは、5pg/細胞/日まで産生することを示す（図74）。同様の結果を、第２のクローンでも見出した。一般的に見られるように、細胞として産生は劇的に増加し、定常期増殖にはいる。図74は、細胞増殖および小規模培養でのヒトIgMκ抗CD4モノクローナル抗体分泌を示す。同型培養物には、総容量２ml中２×105細胞/mlで播種した。その後、24時間毎に４日間培養物を採取した。細胞増殖を生細胞を計数することにより決定し、IgMκ産生を、総ヒトμ（上部パネル）について、ELISAにより定量した。細胞あたり１日あたりの産生を、IgMκの量を細胞数で除することにより算出した（下部パネル）。
【０５６８】
図75は、ヒトIgMκ抗CD4モノクローナル抗体のエピトープマッピングを示す。競合性結合フローサイトメトリー実験を用いて、IgMκ抗CD4モノクローナル抗体、2C11-8により認識されるエピトープを局在化させた。これらの研究のために、CD4上の独特の、重複しないエピトープに結合するマウス抗CD4モノクローナル抗体Leu3aおよびRPA-T4を用いた。PE蛍光のCD4+細胞を、RPA-TAまたはLeu-3aのいずれかの漸減濃度で予めインキュベートし、続いてPE結合ヤギ抗ヒトIgMで検出した2C11-8で染色した。Leu3aによるヒトIgMκ抗CD4モノクローナル抗体2C11-8の結合についての濃度依存性競合が存在したが、PRA-T4によるものは存在しなかった（図75）。従って、2C11-8により認識されるエピトープは、モノクローナル抗体Leu3aにより認識されるものと類似するかまたは同一であった。しかし、RPA-T4により認識されるものとは異なっていた。
【０５６９】
要約すると、本発明者らは、天然のヒトCD4と特異的に反応するヒトIgMκモノクローナル抗体を分泌するいくつかのハイブリドーマクローンを作製し、そしてこれを用いてヒトPBLをCD4+およびCD4-亜集団に弁別し得た。３つの抗体のうち少なくとも１つは、モノクローナル抗体Leu3aにより定義されたエピトープにまたはその近傍に結合する。このエピトープに指向されたモノクローナル抗体は、混合された白血球応答を阻害することを示している（Englemanら、J. Exp. Med.(1981)153:193）。モノクローナル抗体Leu3aのキメラバージョンは、菌状息肉腫を有する患者にいくらかの臨床的有効性を示している（Knoxら(1991) Blood 77:20）。
本発明者らは、３つの異なるハイブリドーマ細胞株(2C11.8、2C5.1、および4E4.2)由来のcDNAを単離した。そしてこれらの細胞株の各々に発現されたいくつかの免疫グロブリン遺伝子の部分的ヌクレオチド配列を決定した。配列分析のために、総RNAを約５×106ハイブリドーマ細胞から単離した。sscDNAをoligo dTで逆転写を初回刺激することにより合成した。このsscDNAの一部を、(i)HC1トランスジーンまたはHC2トランスジーンおよび定常ヒトγ配列に特異的な単一下流オリゴ内に含まれる重複可変骨組み領域、または(ii)KC2トランスジーンまたはKCo4トランスジーンおよび定常ヒトκ配列に特異的な単一下流オリゴ内に含まれる軽鎖可変骨組み領域のいずれかについて特異性を有するオリゴのプールにより初回刺激される二重PCR反応に用いた。これらのPCR反応の産物を、適切な制限酵素で消化し、ゲル精製し、そしてpNNO3ベクター中に独立してクローニングした。DNAを単離し、そして手動ジデオキシおよび/または自動化蛍光配列決定反応をdsDNAについて実施した。
【０５７０】
３つのハイブリドーマ、2C11.8、2C5.1、および4E4.2の特徴付けを、以下の表11に示す。
【０５７１】
表11  ハイブリドーマのヒト可変領域使用
【表８】
2009045066.tif 000043
【０５７２】
２つのIgGκハイブリドーマ2C5.1および4E4.2由来の発現された重鎖および軽鎖配列のヌクレオチド配列分析は、それらが、同じ前駆体Ｂ細胞由来の同胞クローンであることを明らかにする。２つのクローン由来の重鎖および軽鎖V(D)J結合を同定するが、正確なヌクレオチド配列は、推定的体細胞変異により異なる。重鎖VDJ接合部配列は：
【化３５】
2009045066.tif 000044
軽鎖VJ接合部は：
【化３６】
2009045066.tif 000045
以下の非生殖細胞系にコードされるコドンを、同定した（おそらく体細胞変異）：
2CS.1   重鎖    AGC→AGG  S28R（置換）
軽鎖    CCG→ACG  P119T（置換）
4E4.2   重鎖    AGC→AGG  S28R（置換）
CTG→CTA  L80L（サイレント）
軽鎖    GAG→GAC  E41D（置換）
AGG→AAG  R61K（置換）
CCG→ACG  P119T（置換）
【０５７３】
本発明者らは、これら２つのγハイブリドーマが、限定された量の体細胞変異を受けたＢ細胞由来であることを結論づける。このデータは、HC2トランスジェニック動物が、VH5-51(VH251として知られる)Ｖセグメントを用いることを示す。本発明者らは、以前VH4-34、VH1-69、およびVH3-30.3が、これらのマウスにより発現されることを示している。これらの結果の組み合わせにより、HC2トランスジェニックマウスが、ヒトVH遺伝子をコードした４つのトランスジーン全てを発現することを実証する。
【０５７４】
本発明者らは、ヒト免疫グロブリン発現Ｂ細胞が発達を受けて、そしてマウス免疫系の文脈において抗原に応答することを結論づける。抗原応答性は、免疫グロブリン重鎖アイソタイプスイッチングおよび可変領域体細胞変異をもたらす。本発明者らはまた、従来のハイブリドーマ技術を用いて、これらのマウスからモノクローナルヒト配列抗体を取得し得ることを示した。それゆえ、これらのトランスジェニックマウスは、ヒト標的抗原に対するヒト抗体の供給源の代わりになる。
【０５７５】
実施例37
この実施例は、不活化内因性重鎖およびκ鎖遺伝子座にホモ接合性および複数の下流ヒトCH遺伝子にアイソタイプスイッチングし得るトランスジーンを保有するトランスジェニックマウスの作製を記載する。
【０５７６】
この実施例はまた、例えば、マイクロインジェクションされたES細胞またはそのクローンの子孫におけるような、重複相同配列接合部（図76を参照のこと）を含む複数のDNAフラグメントの同時マイクロインジェクションによって、大きなトランスジーン（例えば、160kb）をアセンブルするためのクローニング戦略（これは、インビボでアセンブルされたフラグメントのセットの遠位末端で数々の相同性領域の相同組み換えによる、２つより多い重複フラグメントからの大きいトランスジーンの構築を可能にする）を実証する。この実施例はまた、とりわけ、トランスジェニック動物から単離されたリンパ球を誘導して、例えば、IL-4およびLPSを用いるような、インビトロでのアイソタイプスイッチングを受けさせ得る。
【０５７７】
５つの異なるプラスミドクローンのセットを、実質的にベクター配列がないプラスミド挿入物を単離し得るように；かつ挿入物を、約150kb長にわたる重複配列の単一の重なり合うセットと一緒に形成するように構築した。このセットは、ヒトＶ、Ｄ、Ｊ、μ、γ3、およびγ1コード配列、ならびにマウス重鎖3'エンハンサー配列を含む。この５つのクローンは、5'から3'の順に、pH3V4D、pCOR1xa、p11-14、pP1-570、およびpHP-3a（図76）である。いくつかの異なるクローニングベクターを用いて、このセットのクローンを産生した。ベクターのいくつかを、大きなトランスジーンを形成する目的のために具体的に設計した。これらのベクター（pGP1a、pGP1b、pGP1c、pGP1d、pGP1f、pGP2a、およびpGP2b）は、pUCベクターより、１細胞あたり低いコピー数で維持されるpBR322ベースのプラスミドである(Yanisch-Perronら(1985) Gene 33:103〜119)。このベクターはまた、ポリリンカーとプラスミドβラクタマーゼ遺伝子の3'末端との間にtrpA転写終結シグナルを含む。このポリリンカーは、稀な切断をする酵素であるNotIの制限部位に隣接する；従って、胚マイクロインジェクションの前にベクター配列から離れた挿入物の単離を可能にする。NotI部位の中に、ポリリンカーは、いずれかの末端で独特のXhoIおよびSalI部位を含む。pGP1ベクターは、Taylorら(1992) Nucleic Acids Res. 23:6287に記載されている。pGP1fを最初にAlwNIで消化し、そして合成オリゴヌクレオチドo-236およびo-237（o-236、5'-ggc gcg cct tgg cct aag agg cca -3'; o-237、5'-cct ctt agg cca agg cgc gcc tgg -3'）と連結して、pGP2ベクターを産生した。得られたプラスミドをpGP2aと称する。次いで、プラスミドpGP2aをKpnIおよびEcoRIで消化した。そしてオリゴヌクレオチドo-288およびo-289（o-288、5'-aat tca gta tcg atg tgg tac -3'; o-289、5'-cac atc gat act g-3'）と連結して、pGP2bを作製した（図77Aおよび図77B）。
pGPプラスミドでのトランスジーン構築のための一般的な模式図を、図78に概説する（経路ＡおよびＢ）。構成DNAフラグメントの全てを、第１にpGPベクターの同じ5'から3'方向に個々にクローニングする。挿入物NotI部位、XhoI部位、およびSalI部位を、オリゴヌクレオチド変異誘発により破壊するか、または可能であるなら部分的消化、ポリメラーゼの組み込み、および平滑末端結合により破壊する。これにより、各挿入物の5'末端および3'末端においてポリリンカーに由来するXhoIおよびSalI部位のみが残る。次いで、個々の挿入物を１つのクローンからXhoI/SalIフラグメントを単離するプロセスにより段階的に合わせ得る。そして単離されたフラグメントを別のクローンの5'XhoI部位または3'SalI部位のいずれかに挿入する（図78、経路Ａ）。次いで、形質転換体を、組み立てたクローンを得るために１つ以上の挿入フラグメントとフィルターハイブリダイゼーションによりスクリーニングする。XhoI/SalI接合部位は、いずれの酵素でも切断され得ないため、得られた産物は、独特の5'XhoI部位および3'SalI部位を維持し、そして構築の工程で使用され得る。この模式図の改変を、ベクターpGP2aおよびpGP2bを用いて実施する（図78、経路Ｂ）。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子とプラスミドの複製起点との間のSfiI部位を含む。SfiIおよびXhoIまたはSalIで切断することによって、挿入物を、薬剤耐性配列または複製起点のいずれかとともに単離し得る。１つのSfiI/XhoIフラグメントを、合成の各工程で１つのSfiI/SalIと連結する。この模式図には、３つの利点が存在する：(i)バックグラウンド形質転換体が、両方のフラグメントからの配列がアンピシリンの存在下でプラスミド複製が必要であるので、減少し得る；(ii)連結は単一5'から3'方向に生じ得るのみである；および(iii)SfiI末端は、自家適合性ではなく、SalIおよびXhoIとも適合性ではない。従って、非産生性連結のレベルが減少する。この模式図の欠点は、挿入物SfiI部位をNotI部位、XhoI部位、およびSalI部位と同様、除去しなければならないことである。これらの中程度コピーのベクターは、普通に用いられるpUC由来のクローニングベクターに対する改善である。大きなDNA挿入物を維持するこれらベクターの能力を比較するために、ヒトJH/Cμ領域を含む43kbのXhoIフラグメントを、pSP72（Promega, Madison WI）、pUC19(BRL, Grand Island, NY)、およびpGP1fのSalI部位に連結した。形質転換体コロニーをニトロセルロースに移し、クローンを含む挿入物を放射性標識したプローブとハイブリダイゼーションにより選択した。ポジティブクローンを３mlの培地中で一晩増殖させ、DNAを単離した：得られたDNAのEcoRI消化により、挿入物を欠失したクローン由来の全てのpSP27およびpUC19が明らかになる（図79）；しかし、クローン由来の18のpGP1fのうち12が、インタクトな挿入物を含んでいた。両方の方向を、これらの12クローンについて示す。
【０５７８】
HCo7トランスジーンを産生するために用いた、５つのクローン（pH3V4D、pCOR1xa、p11-14、pP1-570、およびpHP-3a）の構築および単離を、以下に概説する。
【０５７９】
pH3V4D.
生殖細胞系配置の重鎖可変遺伝子セグメントは、VH１およびVH３クラスの合成オリゴヌクレオチドプローブを使用してファージ1ゲノムDNAライブラリーから単離した。VH１クラスのプローブは、ｏ-49：
５’−gtt aaa gag gat ttt att cac ccc tgt gtc ctc tcc aca ggt gtc−３'
であった。
VH３クラスのプローブは、ｏ-184：
５’−gtt tgc agg tgt cca gtg t(c,g)a ggt gca gct g(g,t)t gga gtc (t,c)(g,c)g−３’
であった。
【０５８０】
ポジティブにハイブリダイズするクローンを単離し、部分的に制限地図マッピングし、サブクローニングし、そして部分的に配列決定した。ヌクレオチド配列から、o-49プローブで単離されたVH1クローンのひとつが、公開されているhv123遺伝子配列(Chenら、（1989)Arthritis Rheum. 32:72)と同一のアミノ酸配列を含むVH遺伝子セグメント49.8をコードすることを決定した。ｏ-184プローブを使用して単離した３個のVH3遺伝子（184.3、184.14、および184.17)は、公開されているVH遺伝子DP-50、DP-54、およびDP-45に含まれるもの（Tomlisonら、(1992)J.Mol.Biol.227:776)と同一のアミノ酸配列をコードする配列を含んでいた。これら４個のVH遺伝子を、pH3V4Dプラスミドの構築に使用した。
【０５８１】
184.3遺伝子は、３kbのBamHIのフラグメント内に含まれることを見出した。このフラグメントを、ポリリンカーのXhoI部位が遺伝子の５'側、そしてSalI部位が３’側になるようにプラスミドベクターgGP1fにサブクローン化した。得られるプラスミドを、p184.3.36fと称する。184.14遺伝子は、4.8kbのHindIIIのフラグメント間に含まれることを見出した。このフラグメントを、遺伝子の0.7kb上流にあるゲノムのXhoIの部位でのXho1/Sal1消化による3.5kbのフラグメントおよび遺伝子の３’側のポリリンカー誘導のSalI部位としてさらに単離し得る様な方向でプラスミドベクターpUC19にサブクローニングした。得られるプラスミドを、p184.14.1と称する。184.17遺伝子は、5.7kbのHindIIIのフラグメント内に含まれることを見出した。このフラグメントを、ポリリンカー由来のXhoIおよびSalI部位が、それぞれ遺伝子の５’および３’にあるような方向に、プラスミドベクターpSP72(Promega,Madison,WI)にサブクローニングした。このプラスミドの挿入物は、XhoIでの部分消化、Klenowフラグメントの埋め込み（filling in)、そして再連結により除去された遺伝子の３’末端側にXhoI部位を含む。得られたプラスミドをp184.17SKと称する。49.8遺伝子は、6.3kbのXbaIのフラグメント内に含まれることを見出した。このフラグメントを、ポリリンカー誘導のXhoIおよびClaI部位がそれぞれ遺伝子の５’および３’にあるように、プラスミドベクターpNNO3にサブクローニングし、プラスミドpVH49.8（Taylorら、(1994)International Immunol. 6:579)を作製した。次いで、pVH49.8のXhoI/ClaI挿入物を、pGP1fにサブクローン化し、p49.8fプラスミドを作製した。これは49.8遺伝子の５’および３’末端にそれぞれ独特なXhoIおよびSalIの部位を含む。
【０５８２】
p184.14.1の3.5kbのXhoI/Salフラグメントを、p184.3.36fのXhoI部位にクローニングし、pRMVH1プラスミドを生成した。これは同じ配向で184.14および184.3遺伝子の両方を包含する。このプラスミドをXhoIで消化し、そしてp184.17SKの5.7kbのXhoI/SalIフラグメントを挿入してプラスミドpRMVH2を作製した。このプラスミドは５’から３’に向かって、３個のVH遺伝子である184.17、184.14、および184.3を含み、全て同一の配向であった。次いで、プラスミドpRMVH2をXhoIで切断し、そしてp49.8fの6.3kbのXhoI/SalIの挿入物を挿入し、プラスミドpH3VH4を作製した。このプラスミドは５’から３’に向かって、４個のVH遺伝子である49.8、184.17、184.14および184.3を含み、全て同じ配向であった。
【０５８３】
ヒトのD領域クローンpDHI（例えば、実施例12において上述されている）の10.6kbのXhoI/EcoRVの挿入物を、XhoI/EcoRVで消化したpGPeプラスミドベクターにクローニングし、新しいプラスミドpDH1eを作製した。次いで、このプラスミドをEcoRVで消化し、そしてSalI部位（５’−ccg gtc gac ccg−３’）を包含する合成リンカーフラグメントと連結した。得られたプラスミドpDH1esは、挿入物の内側にヒトのＤ１のクラスターの大半を含み、これはXhoIおよびSalIで切り出され得、この結果、XhoI部位が５’末端、そしてSalI部位が３’末端にある。この挿入物を単離し、そしてpH3VH4のSalI部位にクローニングし、プラスミドpH3VH4Dを作製した。このプラスミドは４個のヒトの生殖細胞系の配置のヒトVH遺伝子セグメントおよび8個の生殖細胞系列配置のセグメントDを含み、全て同じ５’から３’の配向にある。このクローンの挿入物は、NotIの消化によりベクターの配列を実質的に含まないように単離され得る。
【０５８４】
pCOR1xa
９個のヒトＤセグメント、６個のヒトＪセグメント、Ｊμイントロン性重鎖エンハンサー、μスイッチ領域、およびＣμコードエキソンを含む32kbのXhoIの挿入物を含むプラスミドｐCOR1（上記）を、XhoIで部分消化し、Klenow処理し、そして合成SalIリンカーを連結して新しいプラスミドpCOR1xaを作製した。このプラスミドは５’末端に独自のXhoI部位、そして３’末端に独自のSalI部位を有する。pCOR1およびpCOR1xaの両方は、0.6kbのラット重鎖の３’エンハンサーフラグメントを３’末端に含み、プラスミドをXhoIまたはXhoI/SalIの代わりにNotIで消化した場合、挿入物中に含まれる。
【０５８５】
pp1-570
ファージP1ライブラリー（Genome Systems Inc.,St.Louis,Missouri)を、オリゴヌクレオチドプライマー対を使用したPCRによりスクリーニングした：
５’−tca caa gcc cag caa cac caa g−３’
５’−aaa agc cag aag acc ctc tcc ctg−３’
このプライマー対をヒトのγ遺伝子をテンプレートとして216bpのPCR産物を産生するために設計した。同定されたP1クローンのひとつが、80kbの挿入物内にヒトのγ３およびγ１遺伝子の両方を含むことが見出された。このクローンの挿入物（図80に表される）は、NotIおよびSalIの消化によりベクターの配列は実質的に含まないように単離され得る。
【０５８６】
p11-14
ヒトγ３／γ１クローンP1-570の制限酵素地図作製は、挿入物の５’末端の近傍の14kbのBamHIのフラグメントを明らかにした。この14kbのフラグメントをプラスミドベクターpGP1fにサブクローニングし、その結果としてポリリンカーに由来するSalI部位が挿入物の５’末端に隣接した。得られたプラスミドをpB14と称する。別々に、プラスミドクローンpJ1NA（Choiら、(1993)Nature Genetics 4:117)に由来する、ヒトμ遺伝子の３’末端およびヒトδ遺伝子の５’末端におよぶ11kbのNdeI/SpeIゲノムDNAフラグメントを、合成オリゴヌクレオチドアダプターを使用してpBluescript(Stratagene,LaJolla,CA)のSalI部位にサブクローニングした。次いで、得られたSalI挿入物を単離し、そしてpB14のSalI部位にクローニングした。その結果、pJ1NAからのμフラグメントの５’から３’の相対的な配向は、P1-570のγフラグメントの配向と同じである。得られたクローンをp11-14と称した。このクローンの挿入物は、NotIの消化によりベクターの配列を実質的に含まないように単離され得る。
【０５８７】
pHP-3a
マウス重鎖３’エンハンサー（Dariavachら、(1991)Eur,J.Immunol. 21:1499;Liebersonら、(1991)Nucleic Acids Res. 19:933)を、balb/cマウスゲノムDNAλファージライブラリーからクローニングした。プローブを入手するために、balb/cマウス胸腺総DNAを、以下の二つのオリゴヌクレオチドを使用したPCR増幅のためのテンプレートとして使用した。
cck76: ５’−caa tag ggg tca tgg acc c−３’
cck77: ５’−tca ttc tgt gca gag ttg gc−３’
得られた220bpの増幅産物を、TA CloningTM Kit(Invitrogen,San Diego,CA)を使用してクローニングし、そして挿入物をマウスのファージライブラリーのスクリーニングに使用した。得られたファージクローンのひとつから、ポジティブにハイブリダイズする5.8kbのHindIIIフラグメントをpGP1fにサブクローン化した。このサブクローンpHC3'ENfaの挿入物の配向は、結果として、ポリリンカーのXhoI部位が挿入物の５’末端に隣接し、そしてSalI部位が３’末端に隣接するようになる。このHindIIIフラグメントの一部のヌクレオチド配列解析により、これが３’重鎖エンハンサーを含むことが確認された。pHC3'ENfaの挿入は、エンハンサー配列のコアにおいて、EcoRI部位の約19kb上流のXhoI部位を含む。このXhoI部位を部分消化により除去し、Klenow埋め込み、そして再連結して、クローンpH3'Efxを作製した。このクローンは、挿入物の５’末端および３’末端にそれぞれ独自のXhoIおよびSalI部位を含む。
【０５８８】
ヒトγ３／γ１クローンP1-570の３’末端を以下の通りにサブクローニングした：P1-570DNAをNotIで消化し、klenow処理し、次いでXhoIにより消化し；そして13kbの末端フラグメントを単離し、プラスミドベクターpGP2b（BamHIで消化し、klenow処理し、次いでXhoIで消化したもの）に連結した。得られたプラスミドpPX-3は挿入物の５’末端のポリリンカーXhoI部位に隣接するポリリンカーNotI部位を失っていた；しかし、XhoI部位はもとのままであり、そして挿入物をNotIおよびXhoI、またはSalIおよびXhoIでの消化により単離し得る。pH3'EfxのXhoI/SalI挿入物を含む３’エンハンサーを単離し、そしてのpPX-3の３’のSalI部位に連結してプラスミドpHP-3Aを作製した。pHP-3a挿入物内のエンハンサー含有フラグメントを、P1-570クローンの３’末端と逆の配向で連結する。従って、pHP-3aは内部SalI部位を含み、そして挿入物はXhoIおよびNotIでの消化により単離すされる。なぜならこれはエンハンサーエレメントであり、５’から３’への配向は通常は機能には重要ではないからである。
【０５８９】
HCo7.
前核のマイクロインジェクションのためのHCo7 DNA混合物の調製するために、上述の５個のプラスミドそれぞれからのDNAを制限酵素で消化し、そしてアガロースゲルで分離した。クローンpH3V4DをNotIで切断し；pCOR1XaをNotIで切断し；p11-14をNotIで切断し；pP1-570をNotIおよびSalIで切断し；そしてpHP-3aをNotIおよびXhoIで切断した。DNA挿入物を電気溶出し、そしてさらにエチジウムブロミド無しのCsClの平衡勾配で精製した。この挿入物を注入緩衝液に透析し、そして以下のように混合した：50μlのpH3V4D挿入物（20.4ng／μl）;50μlのpCOR1xa挿入物(20.8ng／μl);50μlのp11-14挿入物  ＠  15.6ng／μl);300μlのpP1-570挿入物  ＠  8.8ng／μl);60μlのpHP-3a挿入物  ＠  10.8ng／μl);および1.49mlの注入緩衝液
【０５９０】
Hco7のトランスジェニック動物
Hco7のDNA混合物を、1.5日齢の胚の前核にマイクロインジェクションし、そして、胚をHoganらの記載通りに偽妊娠の雌の卵管に移した（Manipulating the mouse embryo,Cold Spring Harbor laboratories,Cold Spring Harbor NY)。
【０５９１】
尾部の先端部のDNAを、マイクロインジェクトされた胚から発達した202匹の動物から単離した。このDNAのサザンブロット解析は、ヒトμおよびDHの配列を含んだプローブを使用し、HCo7トランスジーンの少なくとも一部分を組み込んだ22匹の創立者動物（founder animals)を明らかにした。図８１は、HCo7のDNAをマイクロインジェクトされた胚から発達した6匹のGO動物の血清中の、ヒトμおよびヒトγ1の発現の解析を示す。ヒト免疫グロブリンタンパク質の血清のレベルを、Lonbergら、(1994)Nature 368:856に記載されるように、ELISAによって測定した。これら６匹のマウスのうち４匹は、サザンブロット解析によりトランスジーンの組込みの証拠を示し、そして、これらのマウスの３匹は、血清中でヒトμおよびヒトγ１タンパク質の両方を発現した。ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現しない１匹のトランスジェニックマウスは、サザンブロット解析により、わずかなコピー数のトランスジーンしか含まないことが決定された。完全なトランスジーンが組み込まれなかったか、またはこのマウスは遺伝的にモザイク（mosaic)であった可能性がある。二匹の創立者HCo7マウス、#11952および#11959を、ヒトκミニ遺伝子座（KCo4 4436系統)トランスジェニックマウス(これもまた、内因性重鎖およびκ軽鎖遺伝子座の破壊についてホモ接合型である（Lonbergら、前掲））と交配させ、二つの内因性遺伝子座の破壊についてホモ接合であり、そして二つの導入されたヒトのミニ遺伝子座（KCo4およびHCo7)についてヘミ接合であるマウスを生成した。これらのいわゆる二重トランスジェニック／二重欠損マウスの５匹を、ヒトIgM、ヒトIgG1、およびヒトIgG3の発現について解析した。コントロールとして、３匹のHC2/KCo4の二重トランスジェニック／二重欠損マウスをこの解析に含めた。この実験を図８２に示す。この図中のELISAのデータは、Lonbergら、（前掲書で）と同様に収集した。但し、ヒトIgG3の検出については、コートする抗体はヒトIgG3に対して指向された特異的なmAb(cat.# 08041,Pharmacia,La Jolla,CA)であり;IgG3アッセイの他の詳細は、IgG1について公開されているのものと同一であった。HC2/Kco4マウスはヒトIgMおよびヒトIgG1のみを発現するのに対し、HCo7/KCo4マウスはこれらの二つのアイソタイプに加えてヒトIgG3もまた発現する。HCo7マウスでのヒトγ３およびγ１の発現もまた、トランスジェニックマウスの脾臓から単離されたRNAから合成されたcDNAのPCRの増幅により検出された。図８３は、３つの異なる系統のトランスジェニックマウスからの脾臓cDNAを使用して合成されたPCR増幅生成物を示す：2550系統はHC2のトランスジェニック系統であり、一方、11959および11952系統はHCo7トランスジェニック系統である。一本鎖cDNAを、Taylorら(1992)Nucleic Acid Res. 20:6287に記載されるように脾臓のRNAから合成した。次いで、cDNAを以下の二つのオリゴヌクレオチドを使用してPCRで増幅した：
ｏ−382:５’−gtc cag aat tcg gt(c,g,t) cag ctg gtg (c,g)ag tct gg−３’
ｏ−383:５’−ggt ttc tcg agg aag agg aag act gac ggt cc−３’
【０５９２】
このプライマー対は、ヒトのγ転写物のヒンジ領域にわたるPCR生成物の合成を指向する。ヒトγ１およびγ３のヒンジ領域の構造が異なることから、PCR増幅はこれら二つの転写物間を区別する。ヒトγ１のテンプレートは、752bpのPCR生成物の合成を指向し得るが、一方で、ヒトγ３は893bpの生成物の合成を指向する。ヒトγ１のテンプレートのみが、HC2の2550系統およびHCo7の11959系統の脾臓で検出可能である一方で、γ１およびγ３の両方の転写物はHCo7の11952系統の脾臓で検出可能である。このアッセイは定量的でないこと、そして個々の動物間でγ3の発現には差異があることから（図８２でのELISAにより示される）、図８３においてHCo7の11959系統の脾臓でγ3の観察が出来ないことは、γ3がこの系統で発現しないことを示すわけではない。HCo7/KCo4マウスからの単離された脾臓細胞はまた、LPSおよびIL4での刺激によりインビトロでIgG1およびIgG3の両方の発現を誘導し得る。この実験を図８４に示す。７週齢の雄のHCo7/KCo4の二重トランスジェニック／二重欠損マウス(#12496;11959/4436系統）由来の脾臓細胞を、単独および種々のサイトカインとの組合せにおける胸腺に非依存性のB細胞のマイトジェン、LPSに応答した免疫グロブリンの分泌について試験した。脾細胞を、T細胞の細胞傷害性除去によりB細胞について富化させた。B富化細胞を、24ウェルのプレートに、PPMI-1640中の2mlの10％ FCSで、１ウェル当たり２×106細胞でプレートした。LPSを全てのウェルに10マイクログラム／mlで加えた。IL-2を50ユニット／mlで加え、IL-4を15ng/mlで加え、IL-6を15ng/mlで加え、γIFNを100ユニット／mlで加えた。培養物を37℃、5％CO2で10日間インキュベートし、次いで、上清をヒトIgG1およびIgG3についてELISAにより解析した。ELISAの全ての試薬は、捕捉抗ヒトIgM（これはThe Binding Site（Birmingham,UK)karaのモノクローナル抗体である)を除いて、Jackson Immunologicals(West Grove,PA)からのポリクローナル抗血清であった。
【０５９３】
実施例38
本実施例は、ヒトのκ軽鎖ミニ遺伝子座および複数のヒトVκセグメントを含むYACクローンの同時注入による、機能的ヒト軽鎖Vセグメントのマウスゲノムへの首尾良い導入を実証する。この実験は、YACに含まれるVκセグメント遺伝子が、得られたマウスでの、ヒトκ鎖の発現されたレパートリーに貢献することを示す。この実施例は、トランスジーンでコードされたヒト免疫グロブリンタンパク質のレパートリー拡大のための方法を実証し、そして、ヒトκ鎖可変領域のレパートリーが、ヒト免疫グロブリン可変領域セグメントを含む関連されていないポリヌクレオチドの同時導入によりいかにして拡大し得るかを具体的に示す。
【０５９４】
Vk含有酵母人工染色体クローンDNAおよびk軽鎖ミニ遺伝子座のクローンDNAの同時注入による機能的ヒト軽鎖Vセグメントの導入
I.クローニングされたヒトVκ遺伝子セグメントを含む酵母株の解析。
全てのゲノムDNAを、ヒトのVκ遺伝子座の部分を含む450kbの酵母人工染色体（YAC)(ICRF YACライブラリー指定４x17E1)を含む酵母株から単離した。このYACクローンに含まれるいくつかのVκ遺伝子セグメントの同定を決定するために、ゲノムDNAを一連のVκファミリー特異的PCR増幅反応の基質として使用した。４セットの増幅において、４個の異なる５’プライマーを単一のコンセンサスな３’プライマーとそれぞれ対にした。５’プライマーは以下のものであった：ｏ−270(５’−gac atc cag ctg acc cag tct cc−３’）、ｏ−271（５’−gat att cag ctg act cag tct cc−３’）、ｏ−272(５’−gaa att cag ctg acg cag tct cc−３’）、およびｏ−273（５’−gaa acg cag ctg acg cag tct cc−３’）。これらのプライマーを、Marksら、(Eur.J.Immunol.1991.21,985)による、Vκファミリー特異的プライマーとして使用する。３’のプライマー、ｏ−274（５’−gca agc ttc tgt ccc aga ccc act gcc act gaa cc−３’）は、FR3のコンセンサス配列に基づく。４セットのそれぞれのプライマーは、YACクローンの4x17E1を含む酵母ゲノムDNAからの、期待された0.2kbのフラグメントの増幅を指向した。次いで、４つの異なるセットの増幅生成物をゲル精製し、そしてプラスミドベクターpSP72(Promega)のPvuII/HindIII部位にクローニングした。11個の得られたクローンのヌクレオチド配列の解析は、７個の異なるV遺伝子を同定した。これらの結果を以下の表14に示す。
【０５９５】
【表９】
2009045066.tif 000046
【０５９６】
YACクローンから増幅された全ての配列は、遠位のクラスターにマップされたVκ遺伝子に明確に割り当てられるか、またはそれらは、遠位の遺伝子の配列と適合性であるかのいずれかである。近位のV遺伝子に明確に割り当てられ得る配列がないので、YAC 4x17E1は遠位のVκ領域からの配列を含むようである。さらに、同定された配列のひとつであるクローン#７(VkO2)が、遠位のクラスターのJ近位末端近くをマップする一方で、別の配列であるクローン#1および4（VkL22)は、遠位のクラスターのJ遠位末端近くである、300kb上流にわたってマップする。従って、450kbのYACクローン4x17E1が、対応するヒトゲノムフラグメントの欠失していないコピーを示す場合、それは少なくとも32個の異なるVκセグメントを含む。しかしながら、これらのいくつかは機能を持たない偽遺伝子である。
【０５９７】
2.YACに由来するVκ遺伝子セグメントを含むトランスジェニックマウスの生成
胚の前核にマイクロインジェクションするための精製YAC DNAを入手するために、全ゲノムDNAをアガロースゲルでサイズ分画した。YAC 4x17E1を含む酵母細胞を溶解に先立ちアガロースで包理し、そして標準的なパルスフィールドゲル電気泳動（製造者の説明書による：CHEF DR-II electrophoresis cell,BIO-RAD Laboratories,Richmond.CA)により、酵母染色体DNAからYACのDNAを分離した。６個の個々のパルスフィールドゲルをエチジウムブロミドで染色し、ゲル物質を含むYACのクローンを残りのゲルから切り取った。次いで、YACを含むゲル断片を、三角のゲルのトレイ中でキャストした新しい（低融点）アガロースゲルに包理した。得られた三角のゲルを、標準ゲル緩衝液に加え２モル／リットルの酢酸ナトリウムを含む狭小なゲルと共に先端で広げた（図８５)。
次いで、ゲルを、標準的なゲル緩衝液に浸した電気泳動チェンバに置いた。「Y」の形をしたゲルのフォーマーを緩衝液の表面上まで持ち上げて、その結果、狭小で高塩のゲルの断片のみに電流が流れ得る。プレキシガラスのブロックを、高塩のゲルのスライスの上に置いて、NaOAcのゲルの緩衝液への拡散を防ぐ。次いで、YACのDNAを、元のゲルのスライスから、および狭小で高塩なブロックへと電気泳動した。低塩のゲルから高塩のゲルへの転移の終了時に、ゲルを介したYACのDNAの転移を効率的に停止させる電気抵抗の低下がある。これは三角形のゲルの頂点にあるYACのDNAの濃縮を誘導する。電気泳動および染色に引き続き、濃縮されたYACのDNAを残りのDNAから切り放し、そしてGELase(EPICENTRE Technologies)でアガロースを消化した。次いで、塩化セシウムを、液体を含むYACのDNAに加え、1.68g/mlの密度を得た。この溶液を37,000回転、36時間で遠心分離し、DNAを混入物質から分離した。得られた密度勾配の0.5mlの画分を単離し、そしてDNAのピークを含む画分を５mM tris(pH7.4)/５mM NaCl/0.1Ｍ EDTAに対して透析した。透析後、得られた0.65mlのYACのDNAの溶液の濃度は２マイクログラム／mlであることが見出された。このDNAを、pKC1BプラスミドおよびpKV4プラスミド（Lonbergら、1994.Nature 368,856)から精製したDNAのフラグメントと、20:1:1（μgで  YAC4x17E1：KC1B:KV4)の比で混合した。得られた２マイクログラム／mlの溶液を、半日齢のマウスの胚の前核に注入し、そして95個の生存する微量注入した胚を偽妊娠の雌の卵管に移した。微量注入した胚から発生した39匹のマウスが誕生した。これらのマウスの２匹、#9269および#9272をトランスジェニックの系統の樹立に使用した。この系統をKco5-9269およびKCo5-9272と命名した。
【０５９８】
KCo5-9269およびKCo5-9272系統のマウスのゲノムDNAのサザンブロット分析を実施して、YACの4x17E1に由来するVκセグメントが、これらのゲノムへ組み込まれたかどうか決定した。遠位のVκクラスターの中心部からのVκ遺伝子のセグメントVkA10（受託番号#:x12683;Straubingerら、1988.Biol.Chem.Hoppe-Seyer 369,601-607)をサザンブロット分析のプローブとして選んだ。クローニングされたプローブを得るために、VkA10遺伝子をPCRにより最初に増幅した。二つのオリゴヌクレオチド、Ｏ−337（５’−cgg tta aca tag ccc tgg gac gag ac−３')およびＯ−338（５’−ggg tta act cat tgc ctc caa agc ac−３’）をプライマーとして使用して、YACの4x17E1から１kbのフラグメントを増幅した。増幅産物をゲル精製し、HincIIで消化し、そしてpUC18へクローニングして、プラスミドp17E1A10を得た。次いで、このプラスミドの挿入物を使用して、KCo5-9269およびKCo5-9272のDNAのサザンブロット分析をプローブした。このブロットは、KCo5-9272マウスのDNAのみに予測された制限酵素断片へのプローブのハイブリダイゼーションを示した。これはVkA10遺伝子がKCo5-9272のゲノムに組み込まれ、Kco5-9269には組み込まれないことを示す。次いで、KCo5-9272系統のマウスをHC2-2550/JHD/JKDマウスと繁殖させ、内因性の重鎖およびκ軽鎖ならびにヘミの遺伝子座を破壊するためのホモ接合、ならびにHC2もしくはKCo5のトランスジーンのヘミ接合性またはホモ接合性のマウスを得、内因性の重鎖およびk軽鎖遺伝視座の破壊についてのホモ接合性であり、そしてヒトの重鎖およびk軽鎖のトランスジーンについてヘミ接合性またはホモ接合性の動物を、二重トランスジェニック／二重欠失マウスと称する。
【０５９９】
cDNAのクローニング実験を実施して、任意のYACに由来するVκ遺伝子が、KCo5-9272系統のマウスで発現されるか決定した。二重トランスジェニック／二重欠失マウス#12648(HC2-2550/KCo5-9272/JHD/JKD)を屠殺し、そして脾臓から総RNA（例えば、mRNA、tRNA等全てを含む）を単離した。一本鎖cDNAをRNAから合成し、そしてオリゴヌクレオチドｏ−270,ｏ−271,ｏ−272,ｏ−273を５’側のプライマーとして、そしてCkに特異的なオリゴヌクレオチドｏ−186(５’−tag aag gaa ttc agc agg cac aca aca gag gca gtt cca −３’）を３’側のプライマーとして使用する４つの異なるPCR反応のテンプレートとして使用した。増幅産物を、pCRII TAクローニングベクター(Invitrogen)としてサブクローニングした。19個の挿入物のヌクレオチド配列を決定した。配列解析の結果を以下の表15にまとめる。
【０６００】
【表１０】
2009045066.tif 000047
* トランスジーンのプラスミドの配列によってコードされるVk遺伝子
** YAC由来のトランスジーンの配列により独自にコードされるVk遺伝子
【０６０１】
これらの結果は、少なくとも３個のYAC由来のVk遺伝子のセグメントA10,L18,およびL24が、KCo5-9272系統のマウスのヒトのレパートリーの発現に寄与することを示す。
【０６０２】
骨髄および脾臓における種々のB220+細胞集団の大きさの、レパートリーの増加の効果を同定するために、フローサイトメトリー分析をKCo5-9272系統のマウスで実施した。この分析の一部を図86および87に示す。二匹の二重トランスジェニック／二重欠失マウス（一匹はKCo5トランスジーンを含み、そして一匹はKCo4トランスジーンを含む）をこの実験で比較した。これら２個のトランスジーンは同じ連結配列および定常領域の配列、ならびに同じイントロン配列および３’エンハンサー配列を共有する。これらはまた、４個の異なるクローニングされたV遺伝子のセグメントを共有する；しかし、KCo5トランスジーンは、KCo4トランスジーンを含まないYAC ４x17E1由来のさらなるVセグメントを含む。マウス#13534(HC2-2550/KCo5-9272/JHD/JKD)およびマウス#13449(HC2-2550/KCo4-4436/JHD/JKD)から細胞を単離した。骨髄細胞を抗マウスB220(Caltag,South San Francisco,CA)、抗マウスCD43(Pharmingen La Jolla,CA)、および抗ヒトIgM(Jackson Immunologic,West Grove,PA)で染色した。脾臓細胞を抗マウスB220および抗ヒトIgMで染色した。
【０６０３】
図86は、KCo5およびKCo4マウスの骨髄B細胞およびB細胞前駆体集団の比較を示す。骨髄でのB細胞の割合（B220+、IgM+)は、KCo5マウス(６％）ではKCo4マウス(２％）より約３倍高いプレB細胞集団（B220+,CD43+,IgM+）はまた、KCo5マウスが（９％についての、KCo4についての５％と比較して）高い。さらに、プロＢの区画（B-220+,CD43+)は、これらのマウス（KCo5について11％およびKCo4について５％）では上昇する。これらの３個のそれぞれの区画は、KCo5マウスにおいてKCo4マウスにおけるよりも大きいが、レベルは、それでも野生型で見られる物の約半分である。骨髄のB細胞の数の増加は、おそらく、レパートリーサイズの増加の直接的な結果である。これらのマウスのより大きな一次レパートリーは、内因性の抗原についていくらかの最小閥値の親和性を有する膜のIgを提供し得る。次いで、レセプター結合において、反応性のIgを発現するこれらのB細胞の増殖を可能にし得る。しかし、プレB、およびプロB細胞は軽鎖の遺伝子を発現しないので、KCo5マウスでのこれら２個の区画のサイズの増大を説明することは、即時にははっきりしない。B細胞の数の増加は、これらの集団の拡大にさらにつながる骨髄環境を作り出すので、KCo5マウスでのB細胞の前駆体の区画はより大きくあり得る。この影響は、分泌された因子により、もしくはB細胞と前駆体細胞との間の細胞間接触により直接媒介され得るか、あるいは因子の力価測定により、もしくはさもなくば生存を阻害し得る細胞、もしくは前駆体細胞の増殖により間接的に媒介され得る。
【０６０４】
図.87は、KCo5およびKCo4マウスにおける脾臓のB細胞（B220+,IgM+)の集団の比較を示す。これら二つのマウスの間の主要な差異はそれぞれのB220dullB細胞集団の相対的サイズ（KCo5マウスでは６％、およびKCo4マウスでは13％）である。B220dull細胞は、B220brightB細胞よりも大きく、そしてそれらのより高い割合のl軽鎖を発現する。これらは野生型マウスの腹膜のB細胞の集団を通常支配する、いわゆるB1の集団の特徴である。KCo5マウスは、これらの細胞のさらに標準的な分布を有するが、一方で、KCo4マウスの脾臓は異常に高い割合のB220dull細胞を含む。ただし両方の系統は、通常数のおよそ1/2から1/3の脾臓のB細胞を含む。
【０６０５】
実施例39
本実施例は、高親和性、抗原特異的なヒトのIgGモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを単離するための実施例38のKCo5トランスジェニックマウスの首尾良い使用を実証する。
【０６０６】
免疫化.  二重欠失／二重トランスジェニックマウス（KCo5-9272/HC2-2550/JHD/JKD,#12657)を８週間にわたって毎週４回、照射された10×106個のT4D3細胞（ヒトのCD4を発現するマウスT細胞株（Dr.Jane Parnes,Stanford Unibersity))を腹腔内に続いて、二週間後に、一回のインジェクションに、不完全なフロイントのアジュバンド(Sigma)中の20mgの可溶性の組換えのヒトのCD4(sCD4;Intracell）で免疫した。マウスの20mgのsCD4を融合する３日前に一回、静脈内に追加免疫をした。
【０６０７】
ハイブリドーマ融合.  免疫したマウスからの脾臓リンパ球の単一の細胞の懸濁物を、1/6の数のP3X63-Ag8.653の非分泌のマウスのミエローマ細胞（ATCC CRL 1580)と50％ PEG(Sigma)で融合した。約2×105個の細胞を平底のマイクロタイタープレートにプレートし、続いて、20％ Fetal Clone Serum（HyClone)、18％ 「653」馴化培地、5％ Origen(IGEN)、4mM Ｌ−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055mM 2-メルカプトエタノール、50ユニット/ml mM ペニシリン、50mg/ml ストレプトマイシン、50mg/ml mM ゲンタマイシン、および1×HAT(Sigma;このHATは融合の24時間後に加える）を含む選択培地で２週間インキュベーションした。２週間後、細胞をHATからHTに置き換えた培地中で培養した。一旦広範なハイブリドーマの増殖または培地の使用が観察されるとウェルをELISAおよびフローサイトメトリーによりスクリーニングした。
【０６０８】
ELISAによるハイブリドーマのスクリーニング.  抗CD4のmAbを検出するために、マイクロタイタープレート(Falcon)を、PBS中の50mlの2.5mg/ml sCD4で一晩、４℃でコーティングし、PBS中の100mlの5％ ニワトリ血清で室温で１時間ブロックし、そして、次いで、ハイブリドーマの上清の1:4の稀釈物、ヤギ抗ヒトIgG（Jackson)結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)のF(ab')2のフラグメントの1:1000の稀釈物、またはに結合したヤギ抗ヒトIgK抗体(Sigma)の1:250の稀釈物および1％の正常マウス血清、ならびに最後に0.1M クエン酸ナトリウム緩衝液（pH4、0.0024％のH2O2で含有）中の0.22mg/ml ABTSとそれぞれ室温で１時間、連続的にインキュベートした。プレートを、最初のインキュベーションを除いて全てのインキュベーション間に洗浄緩衝液（PBS中の0.5％ Tween-20)で3〜6回洗浄した。稀釈物（５％のニワトリ血清を含む洗浄緩衝液）を上清およびHRPO結合体の稀釈に使用した。吸光度を二つの波長を使用して測定された（415nmのODから参照波長の490nmのODを減ずる）。
【０６０９】
マウスλを含有するmAbを検出するために、以下の例外を伴う上記のELISAのプロトコルを使用した。マイクロタイターのウェルを、100mlの、１）1.25mg/ml ヤギ抗マウスλ(Pierce)、２）1.25mg/ml ヤギ抗ヒトFcγ(Jackson)もしくは、３）2.5mg/ml sCD4(ABT)でコートした。同定する工程については、100mlのビオチンに結合のヤギ抗マウス１(SBA)の1:5000の稀釈物を、100mlのHRPO(Jackson)に結合のストレプトアビジンの1:1000の稀釈物に引き続き使用した。マウスおよびヒトのmAbの標準を指示された濃度で使用した。無関連の抗原の交叉反応性を調べるために、ウェルをCEA(Crystal Chem)、KLH(CalBiochem)、HSA(Sigma)、BSA(Sigma)、もしくはOVA(Sigma;CEAの2.5mg/mlを除いて、全て２mg/ml）でコートした。適切な抗体の力価を測定し、そしてポジティブコントロールとして使用した（ヒトIgM抗CEA(GenPharm)、ウサギ抗KLH(Sigma)、ヒツジ抗HSA(The Binding Site）、ヒツジ抗BSA(The Binding Site）、およびヒツジ抗OVA(The Binding Site））。任意の結合抗体を、ヤギ抗ヒトIgM、ロバ抗ウサギIgG、もしくはロバ抗ヒツジIgG(全て1:1000に稀釈、およびJacksonから入手）のHRPO結合体を用いて同定した。それ以外は、標準的なELISAのプロトコルに従った。
【０６１０】
フローサイトメトリーアッセイによるハイブリドーマのスクリーニング.  天然の細胞表面のCD4に反応性のmAbをさらにスクリーニングするために、5×105個のSupT1細胞（ATCC CRL 1942)を1:2の稀釈の使用済みの融合プレートからの上清を氷上で30分インキュベーションし、冷却した染色緩衝液（PBS中で、0.1％ BSA、0.02％ NaN3)で二回洗浄し、FITC結合ヤギ抗ヒトFcg(FITC-GaHuIgG;Jackson)の、1.5mg/mlのF(ab')2フラグメントで15分間インキュベートし、一回洗浄し、そして直ちにFACScan(Becton-Dickinson)で分析した。
【０６１１】
CD4反応性のハイブリドーマ.  上記のELISAおよびフローサイトメトリック技術を使用して、天然のヒトのCD4に特異的に反応するヒトのIgGを分泌した12個のハイブリドーマのクローンを同定した。これら12個のクローンのうち10個をさらにサブクローニングした。これら８個のサブクローンをヒトのIgG1κを分泌するハイブリドーマと同定した。他の２個はマウスのλ軽鎖を発現した。８個の完全なヒトのクローンについてのもとのウェルは、1E11,2E4,4D1,6C1,6G5,7G2,10C5,および1G1だった。完全なヒトのIgGkサブクローンの３個の結合のフローサイトメトリックアッセイ（4D1.4,6G5.1,および10C5.6)を図88に示す。
【０６１２】
図88はIgGκ抗nCD4のモノクローナル抗体のCD4+SupT1細胞への結合を示す。対数増殖期の培養物由来の細胞を洗浄し、そしてモノクローナル抗体なしの4E4.2(ネガティブコントロールとして）、キメラLeu3a(ポジティブコントロールとして）、もしくは10個のIgG抗-nCD4モノクローナル抗体の一つを用いて染色した。結合したモノクローナル抗体のいくつかをFITCに結合したヤギ抗ヒトFcγで同定した。10個のモノクローナル抗体全てがSupT1細胞に結合したが、これらのうち３個のデータのみをここに示す。
【０６１３】
クローニングしたハイブリドーマによる、ヒト抗体分泌の分析.  mAbsの増殖と分泌のレベルを比較するために、サブクローンを、最初の密度が2×105細胞/mlの、24ウェルプレートのHT培地中の複製培養物の中においた。７日間の各日、各サブクローンの複製培養物の一つを採取し、そして細胞数、細胞生存度（トリパンブルー排除による）、および上清中のmAbの量（全量のヒトγのための定量的なELISAによる）を決定した。表16は７個のハイブリドーマのサブクローンによる抗体分泌のデータを示す。
【０６１４】
【表１１】
2009045066.tif 000048
* pg/細胞＝（mAbの最大量）/(生存細胞の最大数）
pg/細胞/日＝（pg/細胞)/７日間
【０６１５】
ヒトmAbの精製。  個々のハイブリドーマクローンを、HTおよびOrigenを含まない培地において増殖させ、FCSを最終１Lの培養物において約２〜３％まで徐々に減少させた。上清を、一旦ハイブリドーマの生存度が約30％未満に低下したら回収した。IgGκ mAbを精製するために、使用した上清を遠心分離して細胞を除去し、限外濾過によって約50〜100mlまでに濃縮し、PBS(pH7.4)で1:5に希釈し、そして5mlのプロテインＡ(Pharmacia）カラムにロードした。３〜５カラム容量のPBSで洗浄した後、ヒトIgGκ mAbを0.1 HCl、150mM NaCl(pH2.8)で溶出し、1M Tris塩基で迅速に中和した。OD280>0.2を有する材料を含有するカラム画分をプールし、そしてPBS中にて透析した。次いで、OD280を決定し、そして1.4の吸光係数を用いてヒトIgGのタンパク質濃度を計算した。mAbはフロースルー（flow through)中には検出されず、そして回収％は93〜100％の範囲であった。＞90％の純度で、３〜６mgの各精製mAbを得た。
【０６１６】
クローン化ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体の分析。
mAbの結合の特異性を調査するために、ヒトPBMCをFicollにかけて単離し、そして以下のように染色した。染色緩衝液中のヒトPBMC(106)を、30分間氷上で別々の反応物において、３つのサブクローン化ハイブリドーマ（4D1.4、6G5.1、および10C5.6）の各々からの等容量の上清か、またはアイソタイプが適合したネガティブコントロールmAbとともにインキュベートし、２回洗浄し、そして20分間氷上で1mg/mlのFITC-GaHuIgGとともに、フィコエリスリン（PE）に結合体化したマウス抗ヒトCD4 mAb (Leu3a; Becton-Dickinson）の10mlか、またはPEに結合体化したマウス抗ヒトCD8 mAb（Leu2a; Becton-Dickinson）の10mlか、またはPEに結合体化したマウス抗ヒトCD19 mAb (SJ25-Cl; Caltag）の5mlのいずれかと一緒にインキュベートした。次いで、ゲートした（gated）リンパ球を、FACScanフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Jose, CA）で分析した。３つ全ての抗体が、ヒトPBMCのCD4画分に特異的に結合することが見出された。
【０６１７】
これらの３つのmAbによって認識されたエピトープの位置を概算するために、５×105 SupT1細胞を、20分間氷上で緩衝液、染色緩衝液中の2.5mg/ml RPA-T4、または2.5mg/ml Leu3aとともに、次いで（1:2に希釈された上清中の)10個のヒトIgG mAbのうちの１つとともに30分間、そして最後に0.5mg/mlのFITC結合体化ヤギ抗ヒトFcγとともにプレインキュベートし、任意の結合したヒトIgGを検出した。細胞を染色緩衝液で最終工程の前に２回、そして後に１回洗浄した。このブロッキングアッセイの結果を図89に示す。３つの抗体のいずれも、RPA-T4とはエピトープを共有しないが、6G5.1および10C5.6は、Leu3aによって認識されるものと同一の（または近くの）エピトープを認識するようである。
【０６１８】
速度定数および平衡定数の決定。
ヒトsCD4（2500〜4200 RU）を、製造業者の説明書に従って、アミン基を介してセンサーチップ表面に共有結合させることにより固定化した。抗体希釈を、平衡が達成されるまで抗原結合センサーチップ上に流し、次いで緩衝液のみを流した。反応、結合、および解離の各相について、結合した抗体の画分を経時的にプロットした。結合曲線の微分係数（dR/dt）を計算し、そして各濃度についての応答に対してプロットした。次いで、結合速度定数（k結合)を算出するために、これら得られた直線の勾配をモノクローナル抗体の濃度に対してプロットした。このグラフからの直線の勾配は、k結合に対応していた。解離速度定数（k解離）を（緩衝液フロー相中の）時間間隔に対する応答の低下のlogから計算した。Kaは、k結合をk解離で割り算することによって誘導した。KCo5/HC2二重トランスジェニック/二重欠失マウスに由来する５つの異なる精製モノクローナル抗体、および市販の供給源（Becton Dickinson, San Jose, CA）から入手した１つの精製抗体について測定した速度および親和定数データを表17に示す。
【０６１９】
表17. ヒトCD4に結合するモノクローナル抗体についての速度定数および親和定数。
【表１２】
2009045066.tif 000049
【０６２０】
混合リンパ球反応（MLR)。  KCo5トランスジェニックマウス由来のヒトモノクローナル抗体10C5.6のインビトロ効力を、マウス抗体Leu3aのインビトロ効力と比較するために、MLRアッセイを行った。２つの関連していないドナーからのヒトPBMCをFicoll上で単離し、そして各ドナーからのCD4+ PBLを、CD4カラム（ヒトCD4 Cellect, Biotex Laboratories, Inc., Canada）を製造業者の指示に従って使用して精製した。不活化スティミュレーター細胞を、両方のドナーからのPBMCを、培養培地（10％熱不活化ヒトAB血清（NABI由来）、Hepes、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン酸、pen/strep、およびb-メルカプトエタノール（全て製造業者の推奨する濃度で使用した）を含むRPMI 1640）中で100mg/mlマイトマイシンＣ（Aldrich）で30分間37℃で処理し、その後培養培地で３回洗浄することによって得た。培養培地中で希釈した種々の濃度のmAbかまたは培養培地のみを滅菌濾過し、ウェルあたり100mlで96ウェル丸底プレート中に３連で添加した。次いで、培養培地中の一方のドナーからの50mlの105 CD4+ PBLおよび50mlの培養培地中の他方のドナーからの105マイトマイシンＣ処理PBMCを各ウェルに添加した。CD4+ PBLリスポンダー単独およびmAbを有するコントロールプレートを、mAbの任意の毒性または分裂促進的な効果についてのコントロールのためにセットアップした。スティミュレーターのみのコントロールおよび培地バックグランドコントロールもまた含めた。37℃、５％ CO2加湿インキュベーター中での７日間の後、各ウェルからの100mlの上清を除去し、そして20mlの比色定量試薬（Cell Titer 96AQキット、Promega Corporation, Madison, WI）を添加した。４〜６時間発色させ、そしてプレートを490nmで読んだ。図90に示されるこの実験の結果は、ヒトIgG1k抗体10C5.6が、このアッセイではヒトPBMC CD4細胞の機能をブロックすることにおいて、少なくともLeu3aと同じくらい効果的であることを示す。
【０６２１】
実施例40
ヒトIgGκ抗CD4モノクローナル抗体の結合特性。
この実施例は、ヒトCD4で免疫したHC2/KCo5/JHD/JCKDトランスジェニックマウスから得たハイブリドーマクローン由来のヒトIgGκモノクローナル抗体の結合特性を提供する。モノクローナル抗体は、組換えおよび天然のヒトCD4に対する高いアビディティーおよび親和性を有することが示される。
【０６２２】
ヒトCD4と反応性であるヒトIgGκモノクローナル抗体（mAb）を分泌する10の個々のハイブリドーマ細胞株（1E11、1G2、6G5、10C5、1G1、6C1、2E4、7G2、1F8、および4D1）由来の細胞は、JHD/JCKD/HC2/KCo5トランスジェニックマウスに由来した。細胞株を培養中で増殖させ、そして抗体タンパク質を上清から単離した（Fishwildら、1996, Nature Biotechnology 14, 845-851、これは本明細書中で参考として援用される）。プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した抗体を使用して、結合定数を測定した。結果を表18および19に示す。
【０６２３】
表18に示す速度定数および平衡定数は、センサーチップに結合させたヤギ抗ヒトIgG (Fc特異的）を使用し、そして飽和濃度のmAbおよびその後に種々の濃度の抗原（rCD4）を流すことによってBIAcore (Pharmacia Biosensor）を用いて決定した。これらの定数は、精製mAbを使用する３つの実験から導かれた。
【０６２４】
表18. 親和定数および速度定数。
【表１３】
2009045066.tif 000050
【０６２５】
表19に表される速度定数および平衡定数を、センサーチップに結合させた抗原（rCD4）を使用して、mAbをその上に流すことによってBIAcoreで決定した。これらの定数は、精製mAbを使用する少なくとも３つの独立した実験から得た。
【０６２６】
表19. アビディティー定数および速度定数
【表１４】
2009045066.tif 000051
【０６２７】
表20は、科学文献に表される抗CD4 mAbについての平衡定数を提供する。
表20. 抗CD4モノクローナル抗体について報告されたアビディティー定数および速度定数
【表１５】
2009045066.tif 000052
【０６２８】
上記のアビディティーおよび親和性決定を、組換えCD4（rCD4）を用いて行なった。天然CD4（nCD4）についてのヒトモノクローナル抗体のアビディティーを決定するため。抗体が改変されるのを必要としないさらなる結合アッセイを用いた。具体的には、抗体の連続希釈物を、SupT1細胞とともに氷上で６時間インキュベートし、洗浄し、そしてFITC-ヤギ抗ヒトFcγと結合した任意の抗体を検出した。Kaを、最大蛍光の２分の１を与える抗体の濃度から決定する（４つのパラメーターフィットを用いた）。結果は、10個全てのヒトモノクローナル抗体が、非常に良好にnCD4に、＞10９Ｍ-1のKa値で結合することを示す（表21）。キメラLeu3aを含むほとんどの抗体は、rCD4に対してよりもnCD4に対しての方が良好に結合しなかった。このことは、抗原密度の相違ならびに２つの抗原間の相違に起因し得る。
【０６２９】
表21フローサイトメトリーにより決定したアビディティー定数
【表１６】
2009045066.tif 000053
＊ヒトモノクローナル抗体を、連続希釈物においてSupT1細胞とともに６時間インキュベートし、２回洗浄し、そしてFITC結合ヤギ抗ヒトFcγ抗血清とともにインキュベートし、洗浄し、そして固定した。Kaを、４つのパラメーターフィットから決定した場合に最大蛍光の２分の１を生じる抗体濃度から計算した。
【０６３０】
実施例41
ヒトIgGκ抗CD4抗体をコードするヌクレオチド配列の同定。
本実施例は、試験したハイブリドーマの各々が、適切な機能的対立遺伝子排除に一致して、１つの機能的重鎖または軽鎖のRNA転写産物しか生成しないことを実証する。さらに、重鎖および軽鎖のCDRセグメントの配列分析は、免疫グロブリントランスジーンの体細胞変異が生じたことを示す。
【０６３１】
ヒトCD4と反応性であるヒトIgGκモノクローナル抗体を分泌し、そしてJHD/JCKD/HC2/KCo5トランスジェニックマウスに由来する５つの個々のハイブリドーマ細胞株（1E11、1G2、6G5、10C5、および4D1）からの細胞を用いて、個々の抗体の各々をコードするRNAを単離した（Fishwildら, 1996, Nature Biotechnology 14, 845-851）。RNAを、cDNAを合成するための基質として用い、次いでcDNAを用いてヒトIg γおよびκ転写産物配列を、ヒトVH、Ｖκ、ＣγおよびＣκに特異的なプライマー（Taylorら, 1992, Nucleic Acids Res. 20, 6287-6295; Larrick, J.W.ら, (1989), Bio/technology. 7. 934-938; Marks, J.D.ら, (1991). Eur. J. Immunol. 21. 985-991; Taylorら, 1994, Int. Immunol. 6, 579-591）を用いるPCRにより増幅した。増幅したIg重鎖およびκ軽鎖配列を、細菌プラスミド中にクローン化し、そしてヌクレオチド配列を決定した。重鎖VDJおよび軽鎖VJ連結物にわたる配列の分析は、５つのクローンの各々についてインフレームの重鎖および軽鎖転写産物を、そしていくつかの場合には非機能的対立遺伝子を示すさらなるフレーム外の無効な転写産物を明らかにした。適切な機能的対立遺伝子排除と一致して、個々のクローンの各々について同定された特有の機能的重鎖または軽鎖転写産物が１つより多く存在する場合はなかった。10個の機能的転写産物の各々についての部分的ヌクレオチド配列は、以下の配列番号が割り当てられ、そしてこれらは表22に示される：1E11γ[配列番号 ]；1E11κ[配列番号 ]；1G2γ[配列番号 ]；1G2κ[配列番号 ]；6G5γ[配列番号 ]；6G5κ[配列番号 ]；10C5γ[配列番号 ]；10C5κ[配列番号 ]；4D1γ[配列番号 ]；4D1κ[配列番号 ]。全ての配列を、5'から3'の配向で示す。
【０６３２】
表22。機能的転写産物についての部分的ヌクレオチド配列
1E11γ[配列番号 ]
【化３７】
2009045066.tif 000054
1E11κ[配列番号 ]
【化３８】
2009045066.tif 000055
1G2γ[配列番号 ]
【化３９】
2009045066.tif 000056
1G2κ[配列番号 ]
【化４０】
2009045066.tif 000057
6G5γ[配列番号 ]
【化４１】
2009045066.tif 000058
6G5κ[配列番号 ]
【化４２】
2009045066.tif 000059
10C5γ[配列番号 ]
【化４３】
2009045066.tif 000060
10C5κ[配列番号 ]
【化４４】
2009045066.tif 000061
4D1γ[配列番号 ]
【化４５】
2009045066.tif 000062
4D1κ[配列番号 ]
【化４６】
2009045066.tif 000063
【０６３３】
これらのDNA配列の分析は、５つのハイブリドーマクローンが、４つの個々の始原Ｂ細胞の子孫であることを実証する。表23は、10個のCDR3領域の各々について誘導されたアミノ酸配列、およびこれらの転写産物をコードする遺伝子の各々に組み込まれた生殖細胞系の遺伝子セグメントについての割り当てを示す。生殖細胞系の割り当ては、National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Mdから利用可能な公開された遺伝子配列に基づく。また、Cookら 1994, Nature Genet. 7, 162-168; Tomlinsonら 1992, J. Mol. Biol. 227, 776-798; Matsudaら 1993, Nature Genet. 3, 88-94; SchableおよびZachau, 1993, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374, 1001-1022; Coxら 1994, Eur. J. Immunol. 24, 827-836; Ravetchら 1981, Cell 27, 583-591; Ichiharaら 1988, EMBO J. 7, 4141-4150; Yamadaら 1991, J. Exp. Med. 173, 395-407; Sanz, 1991, J.Immunol. 147, 1720-1729を参照のこと。
【０６３４】
表23.ハイブリドーマ転写産物における生殖細胞系V(D)Jセグメント使用法。
【表１７】
2009045066.tif 000064
n.d.は、ヌクレオチド配列から決定され得なかった。
【０６３５】
実施例42
トランスフェクトした細胞株におけるヒトIgGκ抗CD4抗体の発現のためのミニ遺伝子の構築
本実施例は、免疫グロブリンポリペプチド（すなわち、免疫グロブリン重鎖または軽鎖）をコードする完全に人工的な遺伝子を作製するプロセスを実証する。プラスミドを、PCR増幅されるＶ重鎖およびＶ軽鎖のcDNA配列を用いて完全な重鎖および軽鎖のミニ遺伝子を再構築し得るように構築した。
【０６３６】
κ軽鎖プラスミドpCK7-96は、κ定常領域およびポリアデニル化部位[配列番号 ]を含み、その結果、開始メチオニンの上流のHindIII部位を含む5'プライマーを用いて増幅されたκ配列は、HindIIIおよびBbsIで消化され得、そしてHindIIIおよびBbsIで消化したpCK7-96にクローン化されて、ポリアデニル化部位を伴う完全な軽鎖コード配列を再構築し得る。このカセットを、HindIII/NotIフラグメントとして単離し、そして転写プロモーター配列に連結して細胞中へのトランスフェクションのための機能的ミニ遺伝子を作製し得る。
【０６３７】
γ1重鎖プラスミドpCG7-96は、ヒトγ1定常領域およびポリアデニル化部位[配列番号 ]を含み、その結果、開始メチオニンの上流のHindIII部位を含む5'プライマーを用いて増幅されたγ配列は、HindIIIおよびAgeIで消化され得、そしてHindIIIおよびAgeIで消化したpCG7-96にクローン化されて、ポリアデニル化部位を伴う完全なγ1重鎖コード配列を再構築し得る。このカセットを、HindIII/SalIフラグメントとして単離し、そして転写プロモーター配列に連結して細胞中へのトランスフェクションのための機能的ミニ遺伝子を作製し得る。
【０６３８】
以下の実施例は、ハイブリドーマからのヌクレオチド配列データをどのように用いて、機能的Ig重鎖および軽鎖ミニ遺伝子を再構築し得るかを実証する。ハイブリドーマ6G5および10C5からの重鎖および軽鎖の転写産物のヌクレオチド配列を用いて、オーバーラップするセットの合成オリゴヌクレオチドを設計して、天然の配列と同一のアミノ酸コード能力を有する合成Ｖ配列を作製した。合成重鎖およびκ軽鎖配列（HC6G5[配列番号 ]およびLC6G5[配列番号 ]と称する）は、以下の３つの点で天然の配列とは異なっていた：一続きの反復ヌクレオチド塩基が中断されてオリゴヌクレオチド合成およびPCR増幅を容易にしていた；最適の翻訳開始部位がKozakの法則（Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870）に従って取り込まれた；そしてHindIII部位が翻訳開始部位の上流に操作された。
【０６３９】
Ａ．合成κ軽鎖。
軽鎖PCR反応１。
以下のオリゴヌクレオチドをプールした：o-548［配列番号 ］、o-549［配列番号 ］、o-550［配列番号 ］、o-551［配列番号 ］、o-552［配列番号 ］、o-563［配列番号 ］、o-564［配列番号 ］、o-565［配列番号 ］、o-566［配列番号 ］、o-567［配列番号 ］。そして以下の２つのプライマーを用いて増幅した：o-527［配列番号 ］およびo-562［配列番号 ］。
【０６４０】
軽鎖PCR反応２。
以下のオリゴヌクレオチドをプールした：o-553［配列番号 ］、o-554［配列番号 ］、o-555［配列番号 ］、o-556［配列番号 ］、o-557［配列番号 ］、o-558［配列番号 ］、o-559［配列番号 ］、o-560［配列番号 ］、o-561［配列番号 ］、o-562［配列番号 ］。そして以下の２つのプライマーを用いて増幅した：o-552［配列番号 ］およびo-493［配列番号 ］。
【０６４１】
軽鎖PCR反応３。
次いで、軽鎖PCR反応１および２の産物を合わせ、そして以下の２つのプライマーを用いて増幅した：o-493［配列番号 ］およびo-527［配列番号 ］。
次いで、軽鎖PCR反応３の産物を、HindIIIおよびBbsIで消化し、そしてHindIII/BbsI消化pCK7-96［配列番号 ］にクローン化してpLC6G5［配列番号 ］を生成した。
【０６４２】
Ｂ．合成γ重鎖。
重鎖PCR反応１。
以下のオリゴヌクレオチドをプールした：o-528［配列番号 ］、o-529［配列番号 ］、o-530［配列番号 ］、o-531［配列番号 ］、o-532［配列番号 ］、o-543［配列番号 ］、o-544［配列番号 ］、o-545［配列番号 ］、o-546［配列番号 ］、o-547［配列番号 ］。そして以下の２つのプライマーを用いて増幅した：o-496［配列番号 ］およびo-542［配列番号 ］。
【０６４３】
重鎖PCR反応２。
単離されたpCG7-96［配列番号 ］の439bpのBbsIフラグメントとともに以下のオリゴヌクレオチドをプールした：o-533［配列番号 ］、o-534［配列番号 ］、o-535［配列番号 ］、o-536［配列番号 ］、o-537［配列番号 ］、o-538［配列番号 ］、o-539［配列番号 ］、o-540［配列番号 ］、o-541［配列番号 ］、o-542［配列番号 ］。そして以下の２つのプライマーを用いて増幅した：o-490［配列番号 ］およびo-520［配列番号 ］。
【０６４４】
重鎖PCR反応３。
次いで、重鎖PCR反応１および２の産物を合わせ、そして以下の２つのプライマーを用いて増幅した：o-520［配列番号 ］およびo-521［配列番号 ］。
次いで、重鎖PCR反応３の産物を、HindIIIおよびAgeIで消化し、そしてHindIII/AgeI消化pCG7-96［配列番号 ］にクローン化してpHC6G5［配列番号 ］を生成した。
【０６４５】
表24.ミニ遺伝子構築に用いられるプライマー、ベクター、および産物
pCK7-96［配列番号 ］
【化４７】
2009045066.tif 000065
【化４８】
2009045066.tif 000066
【化４９】
2009045066.tif 000067
pCG7-96［配列番号 ］
【化５０】
2009045066.tif 000068
【化５１】
2009045066.tif 000069
【化５２】
2009045066.tif 000070
O-548［配列番号 ］
【化５３】
2009045066.tif 000071
O-549［配列番号 ］
【化５４】
2009045066.tif 000072
O-550［配列番号 ］
【化５５】
2009045066.tif 000073
O-551［配列番号 ］
【化５６】
2009045066.tif 000074
O-552［配列番号 ］
【化５７】
2009045066.tif 000075
O-563［配列番号 ］
【化５８】
2009045066.tif 000076
O-564［配列番号 ］
【化５９】
2009045066.tif 000077
O-565［配列番号 ］
【化６０】
2009045066.tif 000078
O-566［配列番号 ］
【化６１】
2009045066.tif 000079
O-567［配列番号 ］
【化６２】
2009045066.tif 000080
O-527［配列番号 ］
【化６３】
2009045066.tif 000081
O-562［配列番号 ］
【化６４】
2009045066.tif 000082
O-553［配列番号 ］
【化６５】
2009045066.tif 000083
O-554［配列番号 ］
【化６６】
2009045066.tif 000084
O-555［配列番号 ］
【化６７】
2009045066.tif 000085
O-556［配列番号 ］
【化６８】
2009045066.tif 000086
O-557［配列番号 ］
【化６９】
2009045066.tif 000087
O-558［配列番号 ］
【化７０】
2009045066.tif 000088
O-559［配列番号 ］
【化７１】
2009045066.tif 000089
O-560［配列番号 ］
【化７２】
2009045066.tif 000090
O-561［配列番号 ］
【化７３】
2009045066.tif 000091
O-493［配列番号 ］
【化７４】
2009045066.tif 000092
pLC6G5［配列番号 ］
【化７５】
2009045066.tif 000093
【化７６】
2009045066.tif 000094
【化７７】
2009045066.tif 000095
O-528［配列番号 ］
【化７８】
2009045066.tif 000096
O-529［配列番号 ］
【化７９】
2009045066.tif 000097
O-530［配列番号 ］
【化８０】
2009045066.tif 000098
O-531［配列番号 ］
【化８１】
2009045066.tif 000099
O-532［配列番号 ］
【化８２】
2009045066.tif 000100
O-543［配列番号 ］
【化８３】
2009045066.tif 000101
O-544［配列番号 ］
【化８４】
2009045066.tif 000102
O-545［配列番号 ］
【化８５】
2009045066.tif 000103
O-546［配列番号 ］
【化８６】
2009045066.tif 000104
O-547［配列番号 ］
【化８７】
2009045066.tif 000105
O-496［配列番号 ］
【化８８】
2009045066.tif 000106
O-542［配列番号 ］
【化８９】
2009045066.tif 000107
O-533［配列番号 ］
【化９０】
2009045066.tif 000108
O-534［配列番号 ］
【化９１】
2009045066.tif 000109
O-535［配列番号 ］
【化９２】
2009045066.tif 000110
O-536［配列番号 ］
【化９３】
2009045066.tif 000111
O-537［配列番号 ］
【化９４】
2009045066.tif 000112
O-539［配列番号 ］
【化９５】
2009045066.tif 000113
O-540［配列番号 ］
【化９６】
2009045066.tif 000114
O-541［配列番号 ］
【化９７】
2009045066.tif 000115
O-538［配列番号 ］
【化９８】
2009045066.tif 000116
O-490［配列番号 ］
【化９９】
2009045066.tif 000117
O-520［配列番号 ］
【化１００】
2009045066.tif 000118
O-521［配列番号 ］
【化１０１】
2009045066.tif 000119
pHC6G5［配列番号 ］
【化１０２】
2009045066.tif 000120
【化１０３】
2009045066.tif 000121
【化１０４】
2009045066.tif 000122
【化１０５】
2009045066.tif 000123
HC6G5［配列番号 ］
【化１０６】
2009045066.tif 000124
LC6G5［配列番号 ］
【化１０７】
2009045066.tif 000125
【０６４６】
実施例43
非ヒト霊長類リンパ球へのヒト抗CD4モノクローナル抗体の結合
動物モデルにおいてヒト抗CD4モノクローナル抗体の前臨床毒性試験及び薬物動態試験を実施できるのが望ましい。その動物が、ヒトCD4と交叉反応性のエピトープを含むCD4を発現する、非ヒト霊長類であり、その結果、このモノクローナル抗体により認識されることもいくつかの目的について望ましい。チンパンジー、アカゲザル、およびカニクイザルの３種の異なる非ヒト霊長類種を、ハイブリドーマ由来の５種類の異なるヒト抗CD4モノクローナル抗体(1E11、1G2、6G5、10C5、および4D1)を用いて交叉反応性CD4エピトープについて試験した。末梢血リンパ球は、チンパンジー、アカゲザル、およびカニクイザルの全血から単離した。単離した細胞を、この５種類のハイブリドーマからそれぞれ得られたヒト抗体（FITC抗ヒトIgGで検出される）およびPE抗CD8またはPE抗CD4を用いて二重染色した。その後、染色された細胞をフローサイトメトリーで分析して、各ヒトモノクローナル抗体がこれら３種の非ヒト霊長類のそれぞれから得られたリンパ球の表面上の内因性CD4が結合したか否かを決定した。これら５種類の抗体のうち４種（1E11、6G5、10C5、および4D1）がチンパンジーのCD4細胞に結合することが見出された。さらに、これら５種類の抗体のうち４種（6G5、1G2、10C5、および4D1）はアカゲザルおよびカニクイザルの両方のCD4細胞に結合することが見出された。従って、これら５種類の抗体のうち３種（6G5、10C5、および4D1）の何れかは、試験した３種の非ヒト霊長類種の各々のCD4細胞に結合する。
【０６４７】
実施例44
調節と非枯渇との間の相関性の欠如
モノクローナル抗体（mAb）が、患者で枯渇していないかまたは免疫抑制性であるかを確実に予測することができるインビトロの試験は知られていない。しかし、ヒトならびにチンパンジーおよびカニクイザルのような非ヒト霊長類間で３種のmAbが枯渇する（または枯渇しない）能力に相関があることが観察された（例えば、M.Jonkerら、Clin.Exp.Immunol.、93:301-307（1993）、及びJ.A.Powelsonら、Transplantation、57:788-793（1994）を参照のこと）。従って、非ヒト霊長類では、ヒトmAbを用いて試験を行った。
【０６４８】
本試験にはチンパンジーを用いた。なぜなら、抗CD4 mAbの一つ（1E11）はアカゲザルあるいはカニクイザルではなくチンパンジーのみにおいてCD-4を認識するからである。第２のmAb(6G5)は、チンパンジー、アカゲザル、およびカニクイザルにおいてCD4を認識する。第３のmAb（1G2）は、チンパンジーではCD4を認識せず、アカゲザルおよびカニクイザルでは認識する。このmAbは、カニクイザルでインビボで枯渇しないことを示すことが既に示されている。
【０６４９】
末梢血でのCD4+ T細胞数に対するヒトmAbの効果を試験することに加えて、インビボでのT細胞の機能に対するmAb投与による効果も評価した。このことを実施するに当たって、最も受け入れられている方法として、ツベルクリンおよび破傷風トキソイドのような抗原で事前に感作し、そして皮膚の過敏症反応を上昇させる動物を用いる方法がある。
【０６５０】
３頭の雄チンパンジーを本試験において記録した。ベースライン全血サンプルを−７日目、−３日目、１目目に得た。第１日目の採血後、各１例のチンパンジーに、２種類のヒトmAb（1E11または6G5）のうち１種を２mg/kgで静脈内注入した。３頭目のチンパンジーには体重１kg当たり同容量の緩衝液のみを投与した。血液は、注入後30分、２時間、８時間、24時間および48時間後に採取した。２日目に皮膚反応性試験を実施した。
【０６５１】
以下の表25に示した結果により、1E11が、末梢リンパ球の一過性の枯渇を生ずる（ほとんどのCD4+T細胞が枯渇される）ことは明らかに示される。たとえ6G5がリンパ球の枯渇もCD4+ T細胞の枯渇も生じなかったとしても、両mAbともに対照のチンパンジーと比較して破傷風トキソイドに対する過敏症反応を阻害することができた。従って、両ヒトmAbはインビボで免疫抑制性であるようであり、そしてこの免疫抑制は必ずしもT細胞の枯渇を必要としない。
【０６５２】
表25. チンパンジーの末梢リンパ球に対するヒトmAbの効果
【表１８】
2009045066.tif 000126
【０６５３】
チンパンジーからの全血サンプルを試験５、８、15及び29日目に採取した。全血サンプルからのPBMCを単離し、フローサイトメトリーにより調べてPBMC中に存在するCD4 T細胞、CD45RA/CD4 T（ナイーブ）細胞、CD45RO/CD4 T（記憶）細胞、CD8 T細胞及びCD19 B細胞の百分率を決定し；細胞当たりのCD4分子の密度を測定し；そしてヒトmAbがこれらの細胞に結合したか否かを測定した。これらの細胞は、記載された（Fishwildら、1996、Nature Biotechnology 14: 845-851）ようにフローサイトメトリー用に調製した。リンパ球を定量するために全血サンプルにより全血球算定を行った。次いで、総リンパ球数をこれらの細胞の百分率に乗ずることにより任意の所定のサブセットに対する細胞総数が得られた。
【０６５４】
CD4+細胞はPE-OKT4によるPBMCのポジティブ染色（Fisher）とFITC-CD8によるネガティブ染色（CalTag）から決定した。CD3+、CD８-、CD45RA+（ナイーブCD４+T）細胞の百分率およびCD３+、CD８-、CD45RO+（記憶CD4+T）細胞の百分率を、それぞれTriColor-CD８（CalTag）、FITC-Leu4a（Becton-Dickinson）及びPE-CD45RA（CalTag）、またはTriColor-CD８、FITC-Leu4a及びRECD45RO（Caltag）で染色されたPBMCから決定した。その後、総CD4+細胞数（左上）及びナイーブ対記憶CD4細胞比（右上）を計算した。CD4量（左下）はPE-OKT4+リンパ球の平均チャンネル蛍光により決定した。CD4+（PE-BF5+、SeroTec）細胞（右下）へのヒトmAbの結合量は、FITC-ヤギ抗ヒトFcγ+細胞の平均チャンネル蛍光（MCF）により決定した。ゲートを通った（gated）リンパ球で得られた結果のみを本実施例に示した。
【０６５５】
図91に示したように、たとえCD4+ T細胞に1E11および6G5の両方が同等に十分に結合したとしても、6G5ではなく1E11だけが循環血中のCD4+ T細胞を枯渇させた。（枯渇とは、循環、リンパ組織あるいは両者から特異的な免疫細胞数が喪失あるいは減少することをいう）。予想通り、1E11は強く、そして6G5は弱くインビボでT細胞上のCD4抗原を調節した（図91）。30分後から２日目までに観察された6G5と比較してCD4+細胞に対する1E11の結合が僅かに弱かったのは、おそらく1E11で観察されたCD4調節がより大きかったという結果による（調節(modulation)とは、細胞表面からの抗原の喪失または抗原表面密度の減少をいう。この喪失は、通常、抗原-抗体複合体の形態での抗原の脱落あるいは内部移行の結果として起こり得る。）。記憶及びナイーブCD4+細胞は1E11により等しく影響される。予想と違わず、1E11は５日目までに単球（CD4+である）を枯渇させたのに対し、6G5は枯渇させなかった。
【０６５６】
1E11動物では、CD8+細胞だけに一過性および非特異的な枯渇が存在した（図92）のに対し、CD19+ B細胞はどのチンパンジーでも影響を受けなかった。CD8+、CD3+（Tサプレッサー）細胞の総数（左）およびCD19+細胞の総数（右）は、それぞれPE-CD8とFITC-Leu4aにより同時染色されたかまたはFITC-CD19（CalTag）により染色されたPBMCから決定した。
【０６５７】
まとめると、インビトロ及びインビボの両方で広範囲のCD4調節を誘導した1E11は、期待に反してCD4+ T細胞を枯渇させた。インビトロ及びインビボの両方で中程度にCD4調節を誘導する6G5は、期待に反してCD4+ T細胞を枯渇させなかった。従って、他の抗CD4 mABで観察されている調節と非枯渇との見かけの相関には反証が挙げられた。
【０６５８】
実施例45
インビボでのT-ヘルパー依存性免疫応答の予防
実施例44に記載した動物に−21日目に大腿部に破傷風トキソイド（TT、Fort Dodge Animal Health Care、Fort Dodge、IA）1.5 mlを筋肉内注射することにより免疫した。この動物は、2日目及び29日目に背部に0.1 mlの10％TT溶液あるいは生理食塩水単独を皮内に受けた。この部位を、24時間後に検査した。反応は、注射部位に変化がなかった場合には評点0、注射部位が赤くなった場合には評点１、注射部位が赤くなり、かつ隆起した場合には評点２、そして注射部位が赤くなり、隆起し、かつ堅い場合には評点３とした。２日目に、２種類のヒトmAb（1E11あるいは6G5）の何れかを受けたチンパンジーにはTTに対する注射部位の反応は見られなかったが、PBS注射を受けたチンパンジーでは赤くなった注射部位を有した。29日目に、全てのチンパンジーは、TTに対して赤くなった注射部位を有した。いずれの日にも、生理食塩水を注射した部位には反応が見られなかった。従って、ヒトmAbが存在する間は（２日目）、これらはインビボで明らかにT-ヘルパー依存性免疫応答を防止し得た。
【０６５９】
実施例46
カニクイザルでの枯渇試験
カニクイザルでの枯渇試験も実施した。ベースライン全血サンプルを４頭のカニクイザルから０日目に得た。この血液を採取した後、カニクイザル１頭ずつに３種類のmAbのうち１種（1E11、6G5あるいは1G2）を２ mg/kgで静脈内注入した。４番目のカニクイザルはkg当たり同容量のPBSのみを受けた。血液を、０日目の注入２時間後及び８時間後に採血した。血液を、１日目、２日目、４日目、７日目、11日目、18日目及び32日目（注入後約24時間毎）に毎日採血した。全血から得られたPBMCは標準的手順に従ってFicollで単離した。その後、PBMCのアリコートを、実施例44のように、CD4+ T細胞及びCD8+T細胞をモニターするための各種の蛍光色素モノクローナル抗体結合物、並びにCD４+T細胞に結合したヒトモノクローナル抗体で染色した。
【０６６０】
実施例43に記載したように、この種では1E11 mAbはCD4を認識しないが、それに対して6G5および1G2 mAbはともに認識する。従って、1E11はカニクイザルの試験でネガティブコントロールのヒトmABとして役立つ。
【０６６１】
図93に示したように、不十分に調節する6G5 mAbを含むいずれの抗体もCD4+ T細胞を枯渇させなかった。また、CD8+ T細胞に対する効果も全くなかった。6G5および1G2は両方ともCD4+ T細胞に結合したが、1G2だけがインビボでCD4の調節を誘導した。更に、1G2および1E11はインビボで広範囲にCD4を調節したが、１種類のmABは枯渇したが、もう一方は枯渇しなかった。従って、調節と枯渇との間に相関はないようである。図93にCD4+細胞百分率（左上）とCD8+細胞百分率（右上）を示す。CD4+細胞はPE-OKT4（Ortho）でPBMCのポジティブ染色およびFITC-CD8（Becton-Dickinson）によるネガティブ染色により決定した。CD4の量（左下）はPE-OKT4+リンパ球のMCFにより決定した。CD4+（PE-OKT4+）細胞（右下）に結合したヒトmAbの量は、FITCヤギ抗ヒトFcγ+細胞のMCFにより決定した。ゲートを通ったリンパ球について得られた結果のみを示す。
【０６６２】
実施例47
リンパ節リンパ球
ヒトmAbが血管系を流出して、他の末梢器官に現れるか否かを決定するために、以前に記載したチンパンジー研究の一部として、鼠径部リンパ節を−７、２および29日目に調べた。生検を行い、そして培地中の単一細胞懸濁液を調製した。リンパ節単核球細胞中に存在するCD4、CD8、およびCD3細胞のパーセントを測定し、実施例43〜45に記載した方法を使用して、ヒトmAbがリンパ節単核球細胞に結合したか否かを決定した。
【０６６３】
表26および図94に示すように、2日目に1E11および6G5の両方は、リンパ節中のCD4＋ T細胞がわずかに枯渇していた。この効果は、6G5について29日目に逆転したが、1E11についてはより明白となった。CD4＋ T細胞が枯渇した全ての日で、CD8＋T細胞の対応する増加があった。チンパンジーA008の29日目のCD4＋T細胞の減少は、CD3＋細胞のパーセント減少（およびB細胞パーセントの同時増加）が、全てではないが、一部原因であり得ると説明される。
【０６６４】
1E11および6G5の両方は、リンパ節中のCD4＋T細胞に結合した。従って、これらの２種類のmAbは血液を脱出し、そしてリンパ組織に入り得た。これらが可溶性抗体としてそうなったのか、またはCD4細胞に接着してそうなったのかは、これらのデータからは決定し得ない。1E11は、リンパ節中のCD4抗原を調節したが、6G5は、CD4を（全く調節しないのでなければ）ほんの少し調節した。この効果は2日目にのみ観察された。
【０６６５】
図94で、CD4＋ Ｔ細胞(上部左)のパーセント、およびCD8＋ T細胞、CD3＋ T細胞(上部右)のパーセントを、リンパ節リンパ球のPE−OKT4によるポジティブ染色およびFITC−CD8のネガティブ染色、あるいはPE−CD8およびFITC−Leu4aで共染色したリンパ球から測定した。PE−OKT4＋ リンパ球のMCFから測定したCD4（底部左）の量を示す。CD4＋ (PE−BF5＋)に結合したヒトモノクローナル抗体（底部右）の量は、FITC−ヤギ抗ヒトFcγ＋細胞のMCFから測定した。
【０６６６】
【表１９】
2009045066.tif 000127
【０６６７】
要約すると、これらのデータから、ヒトmAbはリンパ組織に移動し得たことが明らかである。これらのmAbは2日目と29日目の間でリンパ節から除去された。リンパ節に存在する場合、同じ研究日の末梢血よりも低い程度までであるが、1E11はCD4調節を誘発した。これらの抗体の一つである1E11は、2および29日目でリンパ節からCD4＋ T細胞を枯渇させた。このように、1E11は末梢血よりも長期間にわたり末梢器官からCD4＋T細胞を枯渇させ得るようである。
【０６６８】
実施例48
非ヒト霊長類でのヒトモノクローナル抗体の半減期
カニクイザル研究（実施例46に記載）の一部として、種々の時点で血漿サンプルを採集し、ヒトmAbの存在についてアッセイした。アッセイ前にカニクイザル血漿を1:1000および1:10000に希釈し、そして希釈緩衝液単独の代わりに、mAb標準を1:1000および1:10000の正常カニクイザル血漿で希釈緩衝液に希釈した以外は、標準的な定量的rCD4 ELISA(Lonbergら、1994、Nature 368;856-9）を使用した。
図95に示すように、カニクイザルCD4を認識しないヒトmAbである1E11の半減期は10日であった。カニクイザルCD4、6G5、および1G2を認識するヒトmAbの血清半減期は、各々39および14時間であった。このように、抗体シンク(sink)の存在は、ヒトmAbの半減期を有意に短縮し得て、抗原の代謝回転（CD4調節で起こる）は、さらに血清半減期を短縮し得るようである。従って、長期の臨床試用のための最も望ましいmAbは、6G5のような非枯渇、非調節mAbであろう。
【０６６９】
実施例49
破傷風トキソイドに対する応答に対する効果
CD4の膜遠位領域を認識する全てのヒトIgGk抗CD4 mAbは、混合リンパ球反応（MLR）のように、インビトロで同種抗原（細胞表面発現MHCクラスII分子）に対する応答を阻害し得ることが上記に示されている。次いで、これらのヒト抗CD4 mAbの、可溶性外来抗原である破傷風トキソイド(TT)に対するヒト細胞応答を阻害する能力を、インビトロで測定した。ヒトドナーからのPBMCを、TTに対する反応性について予めスリーニングし、反応性PBMCを−80℃で保存し、続いてこれらの応答性ドナー由来の新たに解凍したPBMCを使用して、抗体阻害についてアッセイした。連続希釈したヒトモノクローナル抗体をウェルあたり1×105 のPBMCの培地に添加し、続いてTT(Wyeth-Ayerst)の5LF/mlを加えた。細胞を全7日間培養し、そして回収の16時間前に3H-チミジンを添加した。
【０６７０】
図96に示すように、試験した全ての3種類の抗CD4 mAbは、TTに対する応答を阻害した。1E11抗体は、6G5あるいは1G2のいずれかよりも非常に強力であった。ネガティブコントロールのヒトmAbである４E4は、効果がなかった。
【０６７１】
実施例50
ヒト抗IL8 mAbの産生
ｐETシステム(Novagen)を使用して、E.coli中で組換えヒトIL8(rhIL8)を発現し、そしてヘパリンアフィニティークロマトグラフィー（hi-trap,Pharmacia）を用いて、次いでサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex75、Pharmacia)およびC18逆相HPLC（ultrashere ODS, Beckman）を用いて、N-末端配列均一まで精製した。HuMAbトランスジェニックマウスを、フロイント完全アジュバンド中の20μgの組換えヒトIL8で免疫し、次いでフロイント不完全アジュバンド中の5μgのrhIL8を毎週注入して免疫した。免疫化の第１および2ラウンドで、3種類の異なる系統からのトランスジェニックマウスを使用した(HＣo７/KCo4マウス５匹、HC2/KCo5マウス9匹、およびHC2/HＣo7/KCo4/KＣo5マウス3匹；全てJhD/JkD)。免疫化の第３ラウンドで、２種類の異なる系統からのトランスジェニックマウスを使用した（HC2/KCo5マウス４匹およびHＣo7/KＣo5マウス６匹；全てCmD/JkD）。各免疫化の前に血清を除去し、ELISAにより、ヒトIgGおよびIgM抗体の存在を試験した。簡単には、マイクロタイタープレートのウェルを、rhIL８の炭酸緩衝液０.２μg/mlで、4℃で、一晩被覆し、PBSの5％ニワトリ血清で、37℃、2時間、ブロックし、ヤギ抗ヒトIgGあるいはIgMで、37℃、1時間、インキュベートし、そして最後にABTS基質で、25℃で、1時間インキュベートした。各工程の間で、プレートを入念に洗浄した。
【０６７２】
全ての系統の全てのトランスジェニックマウスは、rhIL8による免疫化に対して容易に応答したが、ヒトIgM抗体は血清中のヒトIgG抗体前に検出された。ヒトIgG応答は4週目あたりでピークとなったが、図97に示すように、さらなる免疫化で増大しなかった。一般に、HCo7トランスジーンを含むマウスは、HC2トランスジーンのみを含むものよりもわずかな程度、良好に応答した。これは、これら２つのトランスジーン（4つのVh領域のうちの１つのみが、両方のトランスジーンに共通である）に存在する特定のV領域、あるいは組込み部位か、あるいはまだ未決定の因子のような他のものに関連し得る。いずれにしても、反応性の差異は小さかった。
【０６７３】
4匹のマウス由来の脾臓（２つは、HC2/HCo7/KCo4/KCo5/JhD/JkDマウス由来、そして２つは、HCo7/KCo5/CmD/JkDマウス由来）を除去し、記載されるように（Fishwildら、1996、Nature Biotechnology 14:845-851）、融合のためにプロセスした。これらのマウスを、選択した。なぜなら、血清中に最高力価のヒトIgG抗IL8抗体を有していたからである。IgGk抗rhIL8 mAbを分泌する合計29種類のハイブリドーマを親ウェルで検出した。試みた21種類の親ハイブリドーマのうち、これらのハイブリドーマの18種類を首尾良くサブクローニングした。検出した親ハイブリドーマの全数、あるいはこれらのサブクローニング効率のいずれかに関して、これら２つのトランスジェニック系統の間に有意な差異はなかった。
【０６７４】
実施例51
ヒトIgGk抗IL8mAbの特性づけ
得られた最初の14種類のサブクローン化したハイブリドーマおよびこれらの分泌したモノクローナル抗体を広範に特性づけた（全てを、HC2/HCo7/KCo4/KCo5/JhD/JkDマウスから得た）。他の4種類のサブクローン化したハイブリドーマを、部分的に特性づけた。
【０６７５】
各ハイブリドーマにより分泌されたmAbの量は、以前に記載（Lonbergら、1994、Nature 368:856-9）されたように、定量的ELISAにより測定した。rhIL8がrCD4の代わりに、BIAcoreセンサーチップに連結された以外は、記述（Lonbergら、1994，Nature 368:856-9）されたように、ヒトmAbのオンオフ速度も測定した。
【０６７６】
表27に示すように、これらのハイブリドーマの大部分は、0.5〜32μg/mlの範囲にわたる、非常に高度の量のヒト抗体（＞10μg/ml）を分泌した。これらのmAbの大部分は、Ka値＞10９M-1と、非常に高い結合アビディティーを有していた。非常に広範囲のオン速度(k結合)およびオフ速度（k解離）が存在した。さらに、多くのオンオフ速度は独特であり、これらの14種類のmAbのなかで、少なくとも10種類の異なるmAbが存在し得る（すなわち、同一の親脾臓Ｂ細胞に由来しない）ことを示唆する。
【０６７７】
表２７
【表２０】
2009045066.tif 000128
【０６７８】
次いで、mAbの特異性を試験した。種々のCXCケモカイン（IL8、IP10、Nap2、ENA78、GROα、GROβ、およびGROγ）をELISAプレートに吸着し、そしてIL8 ELISAについて実施例48に記載しているように、これらケモカインに対するヒトmAbの結合を、酵素に結合体化した抗ヒトIg抗血清により検出した。ヒトmAbが、１）放射能標識IL8のIL8RA発現トランフェクタントへの結合、2)放射能標識IL8の好中球への結合、3)放射能標識GROaのIL8RB発現トランスフェクタントへの結合、および４）好中球におけるIL8誘発Ca++フラックスに対する効果、を阻害し得るか否かを調べることにより、特異性およびIL8を中和する能力を決定した。
【０６７９】
記載（Campbellら、1996，J．Cell Biol．134:255-66;Ponathら，1996，J．.Exp．Med．183:2437-48）されているように、マウスのプレBリンパ腫細胞系(L1-2)を使用して、安定なIL8RA発現トランスフェクタントを作製した。全ての発現構造物を、pcDNA３（Invitrogen，CA）において作製した。野生型IL-8RAおよびIL-8RB cDNAを、それぞれHindIII−Not IおよびEcoRI−NotI部位にサブクローニングした。IL-8RB配列（MESDS...のアミノ酸配列に対応する）の第2の開始部位を使用した。48時間のトランスフェクション後、0.8mg/mlのG418を添加し、そして96ウェルプレートに細胞の連続希釈をプレートした。１〜２週間後、適切な抗IL-8R抗体により、Ｇ418耐性細胞を染色した。限定希釈および再スクリーニング、あるいはＦＡＣＳ選別（sorting）のいずれかにより、高レベルの発現を富化した。
【０６８０】
以下のように、リガンド結合アッセイを実施した。Amersham（Arlington Heights，IL)またはDuPont NEN（Boston，MA）より、12５I標識ヒトIL8を購入した。各結合反応に対して、60μlの細胞（洗浄し、5％BSAを含むHBSSに5×10６/mlの割合で再懸濁したもの）を、２×反応混合物の60μlと混合し、37℃で、30分間インキュベートした。大部分の実験について、反応物中の12５I−IL8の最終濃度は0.1nMであった。非特異的な結合を、100nMの末標識IL8の存在下で測定した。混合物の100μlをジブチルフタル酸塩／ビス2−エチルヘキシルフタル酸塩（1:1混合物）の200μlを含むチューブに移すことにより結合反応を停止し、12Krpmで3分間遠心した。上清をドライアイスで凍結し、そしてチューブ底面の細胞ペレットをカットオフし、そしてガンマーカウンターでカウントした。Scatchard分析のために、12５I-IL8の0.05nMを未標識IL8の増加濃度に添加した。データを曲線にフィッティングさせ、そしてコンピユータープログラムLigand（Munsonら、1980，Anal．Biochem．107:220−239）を使用して、KdおよびBmaxを算出した。
【０６８１】
Ca++フラックスアッセイのために、フルオロクロームFluo−3（Molecular Probes）とともに、10７細胞/mlの好中球を室温で、30分間インキュベートし、2回洗浄し、２×106細胞/mlで再懸濁した。Fluo−3標識細胞に、mAbとともにか、あるいはなしで、IL8を添加し、経時的にFACScan上でFL1を分析することにより、内部Ca++濃度を測定した。
【０６８２】
2匹のマウスから単離した14種類のヒト抗rhIL8モノクローナル抗体のうち、10種類はrhIL8に対して特異的であり、そして3種類は他のケモカインと交差反応した（1種類は試験されていない）。10種類のIL8特異的mAbの9種類は中和された（表28参照）。他のCXCケモカインと交差反応した1種類のmAbである7C5は、IL8結合を阻害し得たが、GROaのみと交差反応した他の2種類のmAb、IF8および５F10は、IL8結合を阻害しなかった。IL8RAトランスフェクタントへのIL8結合を阻害し得たmAbはまた、好中球へのIL8結合も阻害し得て、IL8誘発Ca++フラックスを妨害し得た。GROαと結合した3種類のmAbのいずれも、GROα結合を阻害し得なかった。
【０６８３】
これらの特異性データに基づけば、IL8には、認識される少なくとも３種類の異なるエピトープがあるようである。第１のものはIL8に対して独特であり、第２のものはIL8とGROαとの間で共有され、そして第３のものはCXCケモカインにより広範に分布しているのが見出される。
【０６８４】
表２８
【表２１】
2009045066.tif 000129
*IL8、GROα、GROβ、GROγ、IP10、ENA78、およびNAP２との反応性について、ELISAによりHuMAbを試験した。
ｎｄ＝測定されなかった。
**2A2は、これらのアッセイについてのポジティブコントロールとして使用したマウス抗hIL8 IgGモノクローナル抗体である。ネガティブコントロールは、mAbなしであった。
【０６８５】
1種類のヒトmAb、２C6のIL8阻害能をより詳細に調べた。mAbを、使用した組織培養液からプロテインＡカラム上で精製し、そして好中球の化学走性および好酸球エステラーゼ放出の阻害能を調べた。
【０６８６】
化学走性アッセイで、半透過性膜にHUVECあるいはECV304細胞を接着させた。フィルター上部チャンバーにヒト白血球を添加し、底部チャンバーにIL8（ヒトmAbとともにか、あるいはなしで）を添加した。底部チャンバーへとフィルターに接着させた内皮細胞を通して移動した細胞を、前方向および側方向散乱を使用するフローサイトメーターで計数した。エラスターゼ放出アッセイについて、好中球を、サイトカラシンＢ、次いでmAbまたは緩衝液、続いてエラスターゼ基質とともにインキュベートした。次いで、蛍光をIL8添加後即座に、および10分後に測定した。
【０６８７】
ヒトmAb2C6は、IL8誘発好中球化学走性およびエラスターゼ放出の両方の用量依存的阻害を示した（図98を参照）。2C6のIC50値は、それぞれ270ng/mlおよび330ng/mlであった。１μg/ml程度のmAbにより、化学走性およびエラスターゼ放出の両方は完全に阻害された。このヒトmAbは、現在までに調べられた最も強力なマウス抗ＩＬ8 mAbよりもわずかに強力である。
【０６８８】
本発明の好ましい実施態様の前述の記載は、例示および説明のために提示されている。これらは、網羅的であるとも、または開示されたとおりの態様に発明を限定するとも意図されていない。そして、数多くの改変および変形が、上記の教示を考えれば可能である。特定の変化および改変が、請求の範囲内で実施し得ることは明らかである。本明細書中の全ての出版物および特許出願は、個々の出版物あるいは特許出願が参考文献により、具体的に、そして個々に参考として援用されることが示されているかと同様の程度に参考として援用される。同一出願人による出願である、1996年10月10日に出願されたU.S.S.N.08/728,463、1995年10月10日に出願されたU.S.S.N.08/544,404、1994年12月7日に出願されたU.S.S.N.08/352,322、1994年3月9日に出願されたU.S.S.N.08/209,741、1993年11月18日に出願された08/155,301の一部継続出願である1993年12月10日に出願されたU.S.S.N.08/165,669および1993年12月3日に出願されたU.S.S.N.08/161,739、WO92/03918、1991年12月17日に出願されたUSSN07/810,279、1992年3月18日に出願されたUSSN07/853,408、1992年6月23日に出願されたUSSN07/904,068、1992年12月16日に出願されたUSSN07/990,860、WO93/12227、ならびに1993年4月26日に出願されたUSSN08/053,131は、各々本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０６８９】
【図１】図１は、再配置されていないゲノムDNAおよび再配置された免疫グロブリン重鎖遺伝子から発現されるmRNAにおける相補性決定領域CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにフレームワーク領域FR1、FR2、FR3、およびFR4を示す。
【図２】図２は、ヒトλ鎖遺伝子座を示す。
【図３】図３は、ヒトκ鎖遺伝子座を示す。
【図４】図４は、ヒト重鎖遺伝子座を示す。
【図５】図５は、ヒトγ３およびγ１定常領域を含む25kbフラグメント、続いてラット鎖3'エンハンサー配列を含む700bpフラグメントに連結された再配置されたIgM遺伝子を含むトランスジーン構築物を示す。
【図６】図６は、インビボでの相同組換えにより軽鎖トランスジーンを形成するために用いられるフラグメントを示すヒトκ鎖遺伝子座の制限酵素地図である。
【図７】図７は、pGP1の構築を示す。
【図８】図８は、pGP1に含まれるポリリンカーの構築を示す。
【図９】図９は、本発明のヒト重鎖トランスジーンを構築するために用いられるフラグメントを示す。
【図１０】図10は、pHIG1およびpCON1の構築を示す。
【図１１】図11は、pRE3（ラットエンハンサー3'）に挿入されてpREG2を形成するヒトCγ1フラグメントを示す。
【図１２】図12は、pHIG3'およびPCONの構築を示す。
【図１３】図13は、本発明のトランスジーンの構築に用いられるヒトＤ領域セグメントを含むフラグメントを示す。
【図１４】図14は、pHIG2（Ｄセグメント含有プラスミド）の構築を示す。
【図１５】図15は、本発明のトランスジーンを構築する際に用いられるヒトＪκおよびヒトＣκ遺伝子セグメントにわたるフラグメントを示す。
【図１６】図16は、pEμの構造を示す。
【図１７】図17は、pKapHの構築を示す。
【図１８−１】図18Aは、マウスの内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ-ネガティブ選択ベクターの構築を示す。
【図１８−２】図18Bは、マウスの内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ-ネガティブ選択ベクターの構築を示す。
【図１８−３】図18Cは、マウスの内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ-ネガティブ選択ベクターの構築を示す。
【図１８−４】図18Dは、マウスの内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ-ネガティブ選択ベクターの構築を示す。
【図１９−１】図19Aは、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ-ネガティブ選択ベクターの構築を示す。
【図１９−２】図19Bは、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ-ネガティブ選択ベクターの構築を示す。
【図１９−３】図19Cは、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ-ネガティブ選択ベクターの構築を示す。
【図２０】図20Aから図20Eは、κ軽鎖標的化ベクターの構造を示す。
【図２１−１】図21Aから21Cは、マウス重鎖標的化ベクターの構造を示す。
【図２１−２】図21Dから21Fは、マウス重鎖標的化ベクターの構造を示す。
【図２２】図22は、ベクターpGPeの地図を示す。
【図２３】図23は、ベクターpJM2の構造を示す。
【図２４】図24は、ベクターpCOR1の構造を示す。
【図２５】図25は、pIGM1、pHC1、およびpHC2についてのトランスジーン構築物を示す。
【図２６】図26は、pγe2の構造を示す。
【図２７】図27は、pVGE1の構造を示す。
【図２８】図28は、pHC1トランスジェニックマウスにおけるヒトIg発現のアッセイ結果を示す。
【図２９】図29は、pJCK1の構造を示す。
【図３０】図30は、合成重鎖可変領域の構築を示す。
【図３１】図31は、重鎖ミニ遺伝子座（minilocus）構築物pIGM１、pHC1、およびpHC2の模式図である。
【図３２】図32は、重鎖ミニ遺伝子座構築物pIGG1およびκ軽鎖ミニ遺伝子座構築物pKC1、pKVe1、およびpKC2の模式図である。
【図３３】図33は、機能的に再配置された軽鎖遺伝子を再構築するためのスキームを示す。
【図３４】図34は、血清ELISAの結果を示す。
【図３５】図35は、８匹のトランスジェニックマウスからの血清のELISAアッセイの結果を示す。
【図３６】図36は、プラスミドpBCE1の模式図である。
【図３７】図37A〜図37Cは、、KLH-DNP（37A）、KLH（37B）、およびBSA-DNP（37C）に特異的なIgGおよびIgMのレベルを測定することによる、KLH-DNPに対する本発明のトランスジェニックマウスの免疫応答を示す。
【図３８】図38は、ヒトガン胎児抗原（CEA）に結合し、そしてヒトμ鎖を含む抗体の存在を実証するELISAのデータを示す；各パネルは、示した免疫後日数でマウスから得てプールした血清サンプルからの相互系列希釈物を示す。
【図３９】図39は、ヒトガン胎児抗原（CEA）に結合し、そしてヒトγ鎖を含む抗体の存在を実証するELISAのデータを示す；各パネルは、示した免疫後日数でマウスから得てプールした血清サンプルからの相互系列希釈物を示す。
【図４０】図40は、生殖細胞系トランスジーン配列（上端の行）と比較した場合の、ヒトガン胎児抗原（CEA）で免疫したHC1トランスジェニックマウスのリンパ組織から得たmRNAから生成した23個のランダムに選択されたcDNAのアラインメントされた可変領域配列を示す；各列において、生殖細胞系配列に比較して変化するヌクレオチドを示す。重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3に対応する領域を示す。生殖細胞系にコードされないヌクレオチドを、大文字で示す。
【図４１】図41は、Ｖκ遺伝子セグメントを含む、vk65.3と称されるヒトDNAフラグメントのヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域の推定アミノ酸配列もまた示す；スプライシングおよび組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）を四角で囲って示す。
【図４２】図42は、Ｖκ遺伝子セグメントを含む、vk65.5と称されるヒトDNAフラグメントのヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域の推定アミノ酸配列もまた示す；スプライシングおよび組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）を四角で囲って示す。
【図４３】図43は、Ｖκ遺伝子セグメントを含む、vk65.8と称されるヒトDNAフラグメントのヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域の推定アミノ酸配列もまた示す；スプライシングおよび組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）を四角で囲って示す。
【図４４】図44は、Ｖκ遺伝子セグメントを含む、vk65.15と称されるヒトDNAフラグメントのヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域の推定アミノ酸配列もまた示す；スプライシングおよび組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）を四角で囲って示す。
【図４５】図45は、同時注射された２つのオーバーラップするフラグメントの間の相同組換えによる軽鎖ミニ遺伝子座の形成を示す。
【図４６】図46は、CEAおよび非CEA抗原と反応性のモノクローナル抗体についてのELISAの結果を示し、これは抗原結合の特異性を示す。
【図４７】図47は、ヒトVDJおよびマウス定常領域配列を有する転写産物を増幅するために、PCRにより増幅された10個のcDNAのDNA配列を示す。
【図４８】図48は、ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンおよびヒトκミニ遺伝子座トランスジーンの両方を保有するマウスから得た血清の種々の希釈物についてのELISAの結果を示す；マウスは、ヒトCD4で免疫した。そして示したデータは、ヒトCD4と反応性であり、そしてそれぞれ、ヒトκ、ヒトμ、またはヒトγのエピトープを保有する抗体を示す。
【図４９】図49は、３つのマウス遺伝子型についてFACSにより決定した場合にヒトμまたはマウスμについて染色されるリンパ球の相対分布を示す。
【図５０】図50は、３つのマウス遺伝子型についてFACSにより決定した場合にヒトκまたはマウスκについて染色されるリンパ球の相対分布を示す。
【図５１】図51は、３つのマウス遺伝子型についてFACSにより決定した場合にマウスλについて染色されるリンパ球の相対分布を示す。
【図５２】図52は、４つのマウス遺伝子型についてFACSにより決定した場合にマウスλまたはヒトκについて染色されるリンパ球の相対分布を示す。
【図５３】図53は、免疫していない0011マウスの血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、およびマウスλ鎖の量を示す。
【図５４】図54は、種々の遺伝子型の免疫していない0011マウスの血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、およびマウスλ鎖の量を示す散乱プロットを示す。
【図５５】図55は、ヒトCD4で0011マウスを免疫した後に、免疫後３週間または７週間で採取した血清中の抗CD4抗体におけるヒトμ、ヒトγ、またはヒトκ鎖を含む抗体の力価を示す。
【図５６−１】図56は、ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンpHC1およびpHC2、ならびに軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンpKC1、pKC1e、ならびに示した部位でのpKC2とCo4との間の相同組換えにより作製される軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの模式図を示す。
【図５６−２】図56は、ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンpHC1およびpHC2、ならびに軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンpKC1、pKC1e、ならびに示した部位でのpKC2とCo4との間の相同組換えにより作製される軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの模式図を示す。
【図５７】図57は、Storbら（1989） 前掲書中から得られたようなマウスλ軽鎖遺伝子座の連鎖地図を示す；点描した四角は偽遺伝子を示す。
【図５８】図58は、相同遺伝子標的化によるマウスλ遺伝子座の不活化の模式図を示す。
【図５９】図59は、重鎖定常領域遺伝子のような遺伝子を欠失させるための相同組換え標的化トランスジーンの構造を模式的に示す。
【図６０】図60は、Immunoglobulin Genes, Honjo, T, Alt, FW,およびRabbits TH（編） Academic Press, NY (1989) 129頁から取ったBALB/cマウス重鎖遺伝子座の地図を示す。構造遺伝子を、上端の行において黒四角で示し；２行目および３行目には記号で示した制限部位を示す。
【図６１】図61は、マウス重鎖遺伝子座α定常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図６２】図62は、マウス重鎖遺伝子座Ｊ４遺伝子中に２bpのフレームシフトを導入するためのフレームシフトベクター（プラスミドＢ）の構築を示す。
【図６３】図63は、超免疫の間のトランスジェニック動物のアイソタイプ特異的応答を示す。反応性のヒトμおよびγ１の相対レベルは、比色ELISAアッセイ（ｙ軸）により示される。本発明者らは、Freundアジュバンド中のCEAの腹腔内注射により、ホモ接合性JHDバックグラウンドの３匹の７〜10週齢の雄性HC1系統57トランスジェニック動物（＃1991、＃2356、＃2357）を免疫した。この図は、CEAでコートしたマイクロタイターウェルに対する、250倍希釈のプールした血清（各注射の前に収集された）の結合を示す。
【図６４−１】図64Aおよび図64Bは、クラススイッチ組換えにより媒介される、トランスジーンにコードされるγ1アイソタイプの発現を示す。２つの異なるヒトγ1発現ハイブリドーマにおいて組み込まれたトランスジーンのゲノム構造は、μスイッチ領域とγ1スイッチ領域との間の組換えに一致する。図64Aは、３つのトランスジーン発現ハイブリドーマから単離されたPacI/SfiI消化DNAのサザンブロットを示す。左から右へ：クローン92-09A-5H1-5、ヒトγ1＋/μ−；クローン92-90A-4G2-2、ヒトγ1＋/μ−；クローン92-09A-4F7-A5-2、ヒトγ1−,μ＋。３つ全てのハイブリドーマは、HC1-57組込みがヘミ接合性であり、JHD破壊がホモ接合性である７ヶ月齢の雄性マウスに由来する（マウス＃1991）。ブロットは、ヒトγ1スイッチ領域の3'側の半分にわたる2.3kb BglII/SfiI DNAフラグメントに由来するプローブとともにハイブリダイズされる。スイッチ産物はμ発現ハイブリドーマにおいて見出されず、一方２つのγ1発現ハイブリドーマ（92-09A-5H1-5および92-09A-4G2-2）は、それぞれ5.1kbおよび5.3kbのPacI/SfiIフラグメントとなるスイッチ産物を含む。図64Bは、μからγ1へのクラススイッチが生じ得る２つの可能な欠失機構の図である。ヒトμ遺伝子は、組み換わってμを欠失させ得る400bpの直接反復（σμおよびΣμ）に隣接する。この機構によるクラススイッチは、常に、6.4kbのPacI/SfiIフラグメントを生成し、一方、μスイッチ領域とγ1スイッチ領域との間の組換えによるこのクラススイッチは、４と７との間のkbのPacI/SfiIフラグメントを生成し、個々のスイッチ事象によりこのサイズは異なる。図64Aにおいて試験した２つのγ1発現ハイブリドーマは、μスイッチ領域とγ1スイッチ領域との間で組換えをしたようである。
【図６４−２】図64Aおよび図64Bは、クラススイッチ組換えにより媒介される、トランスジーンにコードされるγ1アイソタイプの発現を示す。２つの異なるヒトγ1発現ハイブリドーマにおいて組み込まれたトランスジーンのゲノム構造は、μスイッチ領域とγ1スイッチ領域との間の組換えに一致する。図64Aは、３つのトランスジーン発現ハイブリドーマから単離されたPacI/SfiI消化DNAのサザンブロットを示す。左から右へ：クローン92-09A-5H1-5、ヒトγ1＋/μ−；クローン92-90A-4G2-2、ヒトγ1＋/μ−；クローン92-09A-4F7-A5-2、ヒトγ1−,μ＋。３つ全てのハイブリドーマは、HC1-57組込みがヘミ接合性であり、JHD破壊がホモ接合性である７ヶ月齢の雄性マウスに由来する（マウス＃1991）。ブロットは、ヒトγ1スイッチ領域の3'側の半分にわたる2.3kb BglII/SfiI DNAフラグメントに由来するプローブとともにハイブリダイズされる。スイッチ産物はμ発現ハイブリドーマにおいて見出されず、一方２つのγ1発現ハイブリドーマ（92-09A-5H1-5および92-09A-4G2-2）は、それぞれ5.1kbおよび5.3kbのPacI/SfiIフラグメントとなるスイッチ産物を含む。図64Bは、μからγ1へのクラススイッチが生じ得る２つの可能な欠失機構の図である。ヒトμ遺伝子は、組み換わってμを欠失させ得る400bpの直接反復（σμおよびΣμ）に隣接する。この機構によるクラススイッチは、常に、6.4kbのPacI/SfiIフラグメントを生成し、一方、μスイッチ領域とγ1スイッチ領域との間の組換えによるこのクラススイッチは、４と７との間のkbのPacI/SfiIフラグメントを生成し、個々のスイッチ事象によりこのサイズは異なる。図64Aにおいて試験した２つのγ1発現ハイブリドーマは、μスイッチ領域とγ1スイッチ領域との間で組換えをしたようである。
【図６５】図65は、トランススイッチにより生成したキメラヒト／マウス免疫グロブリン重鎖を示す。トランススイッチ産物のcDNAクローンを、過免疫HC1トランスジェニックJHDマウス（＃2357；動物および免疫スケジュールの説明についての図63の説明文を参照のこと）から単離した脾臓およびリンパ節のRNAの混合物の逆転写およびPCR増幅により生成した。10個のランダムに取り出したクローンの部分的ヌクレオチド配列を示す。小文字は、生殖細胞系列コード物を示し、大文字は公知の生殖細胞系列配列に割り当てできないヌクレオチドを示す；これらは、体細胞変異、Ｎヌクレオチド、または短縮されたＤセグメントであり得る。両方の書体は、マウスγ配列を示す。
【図６６−１】図66Aおよび図66Bは、再配置されたVH251トランスジーンが過免疫において体細胞変異を受けることを示す。図66Aでは抗原に対する一次応答を、そして図66Bにおいては二次応答を示す、CH1系統26マウスからのIgG重鎖可変領域cDNAクローンの部分的ヌクレオチド配列。生殖細胞系配列を上端に示す；生殖細胞系から変化するヌクレオチドを、各クローンについて示す。ピリオドは、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字は、同定された生殖細胞系起源が存在しないことを示す。配列は、Ｊセグメント使用法に従ってグループ化した。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列を示す。CDR3配列内の小文字は、HC1トランスジーン中に含まれる公知のＤセグメントに対する同一性を示す。割り当てられたＤセグメントを、各配列の末端に示す。割り当てられていない配列は、Ｎ領域付加または体細胞変異に由来し得るか；またはいくつかの場合には、これらはランダムなＮヌクレオチドを公知のＤセグメントから区別するためにはとても短すぎるだけである。図66A、一次応答：13個のランダムに拾ったVH251-γ1 cDNAクローン。４週齢の雌性HC1系統の26-JHDマウス（＃2599）に、KLHおよび完全Freundsアジュバントの１回の注射を与え；脾臓細胞RNAを５日後に単離した。Ｖセグメント内の体細胞変異の全体の頻度は、0.06％（2/3,198bp）である。図66B、二次応答：13個のランダムに拾ったVH251-γ1 cDNAクローン。２ヶ月齢の雌性HC1系統26-JHDマウス（＃3204）に、HELおよびFreundsアジュバントの１ヶ月にわたる３回の注射（最初の注射は、完全アジュバントを、そしてブーストは不完全を１週間および３週間で）を与え；脾臓およびリンパ節RNAを４ヶ月後に単離した。Ｖセグメント内の体細胞変異の全体の頻度は、1.6％（52/3,198bp）である。
【図６６−２】図66Aおよび図66Bは、再配置されたVH251トランスジーンが過免疫において体細胞変異を受けることを示す。図66Aでは抗原に対する一次応答を、そして図66Bにおいては二次応答を示す、CH1系統26マウスからのIgG重鎖可変領域cDNAクローンの部分的ヌクレオチド配列。生殖細胞系配列を上端に示す；生殖細胞系から変化するヌクレオチドを、各クローンについて示す。ピリオドは、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字は、同定された生殖細胞系起源が存在しないことを示す。配列は、Ｊセグメント使用法に従ってグループ化した。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列を示す。CDR3配列内の小文字は、HC1トランスジーン中に含まれる公知のＤセグメントに対する同一性を示す。割り当てられたＤセグメントを、各配列の末端に示す。割り当てられていない配列は、Ｎ領域付加または体細胞変異に由来し得るか；またはいくつかの場合には、これらはランダムなＮヌクレオチドを公知のＤセグメントから区別するためにはとても短すぎるだけである。図66A、一次応答：13個のランダムに拾ったVH251-γ1 cDNAクローン。４週齢の雌性HC1系統の26-JHDマウス（＃2599）に、KLHおよび完全Freundsアジュバントの１回の注射を与え；脾臓細胞RNAを５日後に単離した。Ｖセグメント内の体細胞変異の全体の頻度は、0.06％（2/3,198bp）である。図66B、二次応答：13個のランダムに拾ったVH251-γ1 cDNAクローン。２ヶ月齢の雌性HC1系統26-JHDマウス（＃3204）に、HELおよびFreundsアジュバントの１ヶ月にわたる３回の注射（最初の注射は、完全アジュバントを、そしてブーストは不完全を１週間および３週間で）を与え；脾臓およびリンパ節RNAを４ヶ月後に単離した。Ｖセグメント内の体細胞変異の全体の頻度は、1.6％（52/3,198bp）である。
【図６６−３】図66Aおよび図66Bは、再配置されたVH251トランスジーンが過免疫において体細胞変異を受けることを示す。図66Aでは抗原に対する一次応答を、そして図66Bにおいては二次応答を示す、CH1系統26マウスからのIgG重鎖可変領域cDNAクローンの部分的ヌクレオチド配列。生殖細胞系配列を上端に示す；生殖細胞系から変化するヌクレオチドを、各クローンについて示す。ピリオドは、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字は、同定された生殖細胞系起源が存在しないことを示す。配列は、Ｊセグメント使用法に従ってグループ化した。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列を示す。CDR3配列内の小文字は、HC1トランスジーン中に含まれる公知のＤセグメントに対する同一性を示す。割り当てられたＤセグメントを、各配列の末端に示す。割り当てられていない配列は、Ｎ領域付加または体細胞変異に由来し得るか；またはいくつかの場合には、これらはランダムなＮヌクレオチドを公知のＤセグメントから区別するためにはとても短すぎるだけである。図66A、一次応答：13個のランダムに拾ったVH251-γ1 cDNAクローン。４週齢の雌性HC1系統の26-JHDマウス（＃2599）に、KLHおよび完全Freundsアジュバントの１回の注射を与え；脾臓細胞RNAを５日後に単離した。Ｖセグメント内の体細胞変異の全体の頻度は、0.06％（2/3,198bp）である。図66B、二次応答：13個のランダムに拾ったVH251-γ1 cDNAクローン。２ヶ月齢の雌性HC1系統26-JHDマウス（＃3204）に、HELおよびFreundsアジュバントの１ヶ月にわたる３回の注射（最初の注射は、完全アジュバントを、そしてブーストは不完全を１週間および３週間で）を与え；脾臓およびリンパ節RNAを４ヶ月後に単離した。Ｖセグメント内の体細胞変異の全体の頻度は、1.6％（52/3,198bp）である。
【図６６−４】図66Aおよび図66Bは、再配置されたVH251トランスジーンが過免疫において体細胞変異を受けることを示す。図66Aでは抗原に対する一次応答を、そして図66Bにおいては二次応答を示す、CH1系統26マウスからのIgG重鎖可変領域cDNAクローンの部分的ヌクレオチド配列。生殖細胞系配列を上端に示す；生殖細胞系から変化するヌクレオチドを、各クローンについて示す。ピリオドは、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字は、同定された生殖細胞系起源が存在しないことを示す。配列は、Ｊセグメント使用法に従ってグループ化した。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列を示す。CDR3配列内の小文字は、HC1トランスジーン中に含まれる公知のＤセグメントに対する同一性を示す。割り当てられたＤセグメントを、各配列の末端に示す。割り当てられていない配列は、Ｎ領域付加または体細胞変異に由来し得るか；またはいくつかの場合には、これらはランダムなＮヌクレオチドを公知のＤセグメントから区別するためにはとても短すぎるだけである。図66A、一次応答：13個のランダムに拾ったVH251-γ1 cDNAクローン。４週齢の雌性HC1系統の26-JHDマウス（＃2599）に、KLHおよび完全Freundsアジュバントの１回の注射を与え；脾臓細胞RNAを５日後に単離した。Ｖセグメント内の体細胞変異の全体の頻度は、0.06％（2/3,198bp）である。図66B、二次応答：13個のランダムに拾ったVH251-γ1 cDNAクローン。２ヶ月齢の雌性HC1系統26-JHDマウス（＃3204）に、HELおよびFreundsアジュバントの１ヶ月にわたる３回の注射（最初の注射は、完全アジュバントを、そしてブーストは不完全を１週間および３週間で）を与え；脾臓およびリンパ節RNAを４ヶ月後に単離した。Ｖセグメント内の体細胞変異の全体の頻度は、1.6％（52/3,198bp）である。
【図６７−１】図67Aおよび67Bは、多数の体細胞変異が、γ1配列に制限されることを示す：体細胞変異およびクラススイッチは、同じ集団のＢ細胞内で生じる。CEAに対して過免疫されたHC1系統57トランスジェニック-JHDマウス（＃2357）の脾臓およびリンパ節細胞から単離されたVH251 cDNAクローンの部分的ヌクレオチド配列（免疫スケジュールについては、図63を参照のこと）。図67A：IgM：23個のランダムに拾ったVH251-μ cDNAクローン。CDR1および2ならびに周囲の残基を含む156bpセグメントのヌクレオチド配列。体細胞変異の全体のレベルは、0.1％（5/3,744bp）である。図67B：IgG：23個のランダムに拾ったVH251-γ1 cDNAクローン。CDR1から3および周囲の残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞変異の全体の頻度は、1.1％（65/5,658bp）である。図67Aにおけるμ配列との比較については、最初の156ヌクレオチドについての変異頻度は1.1％（41/3,588bp）である。記号の説明のための図66Aおよび図66Bの説明文を参照のこと。
【図６７−２】図67Aおよび67Bは、多数の体細胞変異が、γ1配列に制限されることを示す：体細胞変異およびクラススイッチは、同じ集団のＢ細胞内で生じる。CEAに対して過免疫されたHC1系統57トランスジェニック-JHDマウス（＃2357）の脾臓およびリンパ節細胞から単離されたVH251 cDNAクローンの部分的ヌクレオチド配列（免疫スケジュールについては、図63を参照のこと）。図67A：IgM：23個のランダムに拾ったVH251-μ cDNAクローン。CDR1および2ならびに周囲の残基を含む156bpセグメントのヌクレオチド配列。体細胞変異の全体のレベルは、0.1％（5/3,744bp）である。図67B：IgG：23個のランダムに拾ったVH251-γ1 cDNAクローン。CDR1から3および周囲の残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞変異の全体の頻度は、1.1％（65/5,658bp）である。図67Aにおけるμ配列との比較については、最初の156ヌクレオチドについての変異頻度は1.1％（41/3,588bp）である。記号の説明のための図66Aおよび図66Bの説明文を参照のこと。
【図６７−３】図67Aおよび67Bは、多数の体細胞変異が、γ1配列に制限されることを示す：体細胞変異およびクラススイッチは、同じ集団のＢ細胞内で生じる。CEAに対して過免疫されたHC1系統57トランスジェニック-JHDマウス（＃2357）の脾臓およびリンパ節細胞から単離されたVH251 cDNAクローンの部分的ヌクレオチド配列（免疫スケジュールについては、図63を参照のこと）。図67A：IgM：23個のランダムに拾ったVH251-μ cDNAクローン。CDR1および2ならびに周囲の残基を含む156bpセグメントのヌクレオチド配列。体細胞変異の全体のレベルは、0.1％（5/3,744bp）である。図67B：IgG：23個のランダムに拾ったVH251-γ1 cDNAクローン。CDR1から3および周囲の残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞変異の全体の頻度は、1.1％（65/5,658bp）である。図67Aにおけるμ配列との比較については、最初の156ヌクレオチドについての変異頻度は1.1％（41/3,588bp）である。記号の説明のための図66Aおよび図66Bの説明文を参照のこと。
【図６８−１】図68は、VH51P1およびVH56P1が、免疫していないマウスにおいて多数の体細胞変異を示すことを示す。９週齢の免疫していない雌性HC2系統2550トランスジェニック-JHDマウス（＃5250）からのIgG重鎖可変領域cDNAクローンの部分的ヌクレオチド配列。19個のVH56p1セグメントとの体細胞変異の全体の頻度は、2.2％（101/4,674bp）である。単一のVH51p1セグメント内の体細胞変異の全体の頻度は、2.0％（5/246bp）である。記号の説明についての図66Aおよび図66Bの説明文を参照のこと。
【図６８−２】図68は、VH51P1およびVH56P1が、免疫していないマウスにおいて多数の体細胞変異を示すことを示す。９週齢の免疫していない雌性HC2系統2550トランスジェニック-JHDマウス（＃5250）からのIgG重鎖可変領域cDNAクローンの部分的ヌクレオチド配列。19個のVH56p1セグメントとの体細胞変異の全体の頻度は、2.2％（101/4,674bp）である。単一のVH51p1セグメント内の体細胞変異の全体の頻度は、2.0％（5/246bp）である。記号の説明についての図66Aおよび図66Bの説明文を参照のこと。
【図６９】図69。破壊された内因性Ig遺伝子座を有する二重トランスジェニックマウスは、ヒトIgMκポジティブＢ細胞を含む。異なる遺伝子型の４匹のマウスの脾臓から単離された細胞のFACS。左欄：コントロールマウス（＃9944、６週齢雌性JH+/-、JCκ+/-；ヘテロ接合性野生型マウス重鎖およびκ-軽鎖遺伝子座、非トランスジェニック）。第２欄；ヒト重鎖トランスジェニック（＃9877、６週齢雌性JH-/-、JCκ-/-、HC2系統2550＋；破壊されたマウス重鎖およびκ-軽鎖遺伝子座についてホモ接合性、HC2トランスジーンについてホモ接合性）。第３欄：ヒトκ-軽鎖トランスジェニック（＃9878、６週齢雌性JH-/-、JCκ-/-、KCo4系統4437＋；破壊されたマウス重鎖およびκ-軽鎖遺伝子座についてホモ接合性、KCo4トランスジーンについてヘミ接合性）。右欄：二重トランスジェニック（＃9879、６週齢雌性JH-/-m JCκ-/-、HC2系統2550＋、KCo4系統4437＋；破壊されたマウス重鎖およびκk-軽鎖遺伝子座についてホモ接合性、HC2およびKCo4トランスジーンについてヘミ接合性）。上端の列：マウスλ軽鎖（ｘ軸）およびヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色した脾臓細胞。第２列：ヒトμ重鎖（ｘ軸）およびヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色した脾臓細胞。第３列：マウスμ重鎖（ｘ軸）およびマウスκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色した脾臓細胞。下端の列：マウスB220抗原の発現について染色した脾臓細胞のヒストグラム（log蛍光：ｘ軸；細胞数：ｙ軸）。２色のパネルの各々について、示された四分円部分の各々における細胞の相対数を、ヨウ化プロピジウム染色および光散乱に基づくｅパラメーターゲートの％として与える。下端の列に示されるサンプルの各々におけるB220＋細胞の画分を、リンパ球光散乱ゲートの％として与える。
【図７０】図70。二重トランスジェニックマウスの血清における分泌免疫グロブリンレベル。内因性重鎖およびκ軽鎖遺伝子座破壊についてホモ接合性である18個の個々のHC2/KCo4二重トランスジェニックマウスからのヒトμ、γ、およびκ、ならびにマウスγおよびλ。マウス：(+)HC2系統2550（組込みあたり約５コピーのHC2）、KCo4系統4436（組込みあたり１〜２コピーのKCo4）；(O)HC2系統2550、KCo4系統4437（組込みあたり約10コピーのKCo4）；(x)HC2系統2550、KCo4系統4583（組込みあたり約５コピーのKCo4）；(□)HC2系統2572（組込みあたり30〜50コピーのHC2）、KCo4系統4437；(△)HC2系統5467（組込みあたり20〜30コピーのHC2）、KCo4系統4437。
【図７１】図71Aおよび71Bは、ヒト抗原に対するヒト抗体応答を示す。図71A：組換えヒト可溶性CD4に対する一次応答。ヒトIgMおよびヒトκ軽鎖のレベルを、４匹の二重トランスジェニックマウスからの採血前（０）および免疫後（・）の血清について報告する。図71B：ヒトIgGへのスイッチは、インビボで起きる。ヒトIgG（丸）は、1.5μ/ml過剰のIgE、κおよび非特異的交叉反応性を阻害するための１％正常マウス血清の存在下で用いられたペルオキシダーゼ結合ポリクローナル抗ヒトIgGで検出された。ヒトκ軽鎖（四角）は、１％正常マウス血清の存在下でペルオキシダーゼ結合ポリクローナル抗ヒトκ試薬を用いて検出された。１匹のマウス（＃9344；HC2系統2550、KCo4系統4436）からの代表的結果を示す。各点は、二連のウェルの平均からバックグランド吸光度を引いたものを示す。
【図７２】図72は、ヒトCD8+リンパ球からヒトCD4+リンパ球を区別するハイブリドーマ上清とのヒトPBLのFACS分析を示す。
【図７３】図73は、トランスジェニックマウス血清中のヒトα-CD4 IgMおよびIgGを示す。
【図７４】図74は、トランスジェニックマウスα-ヒトCD4ハイブリドーマモノクローナル（2C11-8）と、RPA-TAおよびLeu-3Aモノクローナルとを比較する競合結合実験を示す。
【図７５】図75は、培養2C11-8ハイブリドーマのIg発現についての生成データを示す。
【図７６】図76は、HCo7トランスジーンを構成するプラスミド挿入物のオーバーラップセットを示す。
【図７７−１】図77Aは、pGP2bプラスミドベクターのヌクレオチド配列および制限酵素地図を示す。
【図７７−２】図77Bは、pGP2bプラスミドベクターの制限酵素地図を示す。
【図７８】図78（Ａ部およびＢ部）は、大きなトランスジーンをアセンブルするためのクローニングストラテジーを示す。
【図７９】図79は、大きな挿入物が多コピー性pUC由来プラスミドにおいて不安定であることを示す。
【図８０】図80は、ファージP1クローンP1-570を示す。挿入物は、スイッチエレメントとともに、γ3およびγ1におよぶヒト重鎖定常領域の部分にまたがる。Ｎ、NotI；Ｓ、SalI、Ｘ、XhoI。
【図８１】図81は、HCo7トランスジェニック創始動物におけるヒトμおよびγ1の血清発現を示す。
【図８２】図82は、HCo7/KCo4二重トランスジェニック／二重欠失マウスにおけるヒト免疫グロブリンの血清発現を示す。
【図８３】図83は、HCo7トランスジェニックマウス脾臓RNAにおけるヒトγ1およびγ3転写産物のRT PCR検出を示す。
【図８４】図84は、インビトロでのLPSおよびIL-4によるヒトIgG1およびIgG3の誘導を示す。
【図８５】図85。YAC DNAの濃縮のためのアガロースゲル電気泳動装置。
【図８６】図86。HC2/KCo5/JHD/JKDマウスおよびHC2/KCo4/JHD/JKDマウスからの骨髄細胞の二色FACS分析。B220＋/CD43−、B220＋／CD43＋、およびB220＋/IgM＋のゲートの各々における細胞の画分を％として示す。
【図８７】図87。HC2/KCo5/JHD/JKDマウスおよびHC2/KCo4/JHD/JKDマウスからの脾臓細胞の二色FACS分析。B220明/IgM＋およびB220濁/IgM＋のゲートの各々における細胞の画分を％として示す。
【図８８】図88。CD4+ SupT1細胞に対するIgGκ抗nCD4モノクローナル抗体の結合。
【図８９】図89。フローサイトメトリーによるIgG抗nCD4モノクローナル抗体についてのエピトープ決定。SupT1細胞を、緩衝液（左欄）、2.5mg/ml RPA-T4（中央欄）、または2.5mg/ml Leu3a（右欄）とともに、次いで（1:2に希釈した上清において）10個のヒトIgGモノクローナル抗体の内の１つまたはキメラLeu3aとともに予めインキュベートした。３つの代表的なヒトIgGモノクローナル抗体についての結果をこの図に示す。
【図９０】図90。ヒトIgGκ抗CD4モノクローナル抗体によるMLRの阻害。
【図９１−１】図91は、CD4＋細胞へのhuMAb投与の効果を示す。
【図９１−２】図91は、CD4＋細胞へのhuMAb投与の効果を示す。
【図９２】図92は、CD4−細胞へのhuMAb投与の効果を示す。
【図９３−１】図93は、カニクイザル細胞へのhuMAb投与の効果を示す。
【図９３−２】図93は、カニクイザル細胞へのhuMAb投与の効果を示す。
【図９４−１】図94は、リンパ節リンパ球へのhuMAb投与の効果を示す。
【図９４−２】図94は、リンパ節リンパ球へのhuMAb投与の効果を示す。
【図９５】図95は、カニクイザルにおけるhuMAbの血清半減期を示す。1E11および6G5に由来するデータは２区画モデルにフィットさせたが、1G2由来のデータは１区画モデルにフィットさせた。
【図９６】図96は、破傷風トキソイド（TT）に対するヒト細胞応答のヒト抗CD4 mAbによる阻害を示す。パネル(a)および(b)は、２つの異なるアッセイについての結果を示す。mAbのロット番号を、括弧内に示す。
【図９７】図97は、トランスジェニックマウスにおけるヒトIgMおよびIgG抗IL8血清力価を示す。免疫原に対する個々のマウスの応答を、ELISAにより評価し、力価に変換（１=1:50希釈の血清でOD＞0.1；２=1:250希釈の血清でOD＞0.1；３=1:1250希釈の血清でOD＞0.1；４=1:6250希釈の血清でOD＞0.1；および５=1:31250希釈の血清でOD＞0.1）し、そして平均化した。
【図９８】図98は、IL8誘導性好中球走化性およびエラスターゼ放出に対するヒト抗IL8 mAbの効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６−１】
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【図５６−２】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４−１】
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【図６４−２】
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【図６５】
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【図６６−１】
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【図６６−２】
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【図６６−３】
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【図６６−４】
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【図６７−１】
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【図６７−２】
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【図６７−３】
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【図６８−１】
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【図６８−２】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７−１】
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【図７７−２】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１−１】
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【図９１−２】
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【図９２】
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【図９３−１】
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【図９３−２】
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【図９４−１】
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【図９４−２】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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