(57)【要約】【課題】幹細胞の未分化状態を制御する因子を同定し、多分化能を持つ幹細胞を簡便に培養する方法を提供する。【解決手段】本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載の蛋白質をコードするＡＯＦ２遺伝子を導入することから成る、幹細胞における未分化状態の制御方法：  （ａ）哺乳動物由来のＡＯＦ２蛋白質、  （ｂ）（ａ）記載のいずれかのＡＯＦ２蛋白質のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつ、ＥＳ細胞の未分化状態を維持する活性を有する蛋白質、又は（ｃ）（ａ）記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつ、ＥＳ細胞の未分化状態を維持する活性を有する蛋白質、並びに、該方法に使用する発現用組換えベクター及びＡＯＦ２をコードする遺伝子で形質転換された幹細胞等。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＯＦ２をコードする遺伝子を導入することから成る、幹細胞における未分化状態の制御方法。
【請求項２】
幹細胞がＥＳ細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＡＯＦ２遺伝子をＥＳ細胞に導入し、ＥＳ細胞の未分化状態を維持する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＡＯＦ２遺伝子が脊椎動物由来である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＡＯＦ２遺伝子が哺乳動物由来である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＡＯＦ２遺伝子が以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載の蛋白質をコードする、請求項１記載の方法：
（ａ）哺乳動物由来のＡＯＦ２蛋白質、
（ｂ）（ａ）記載のいずれかのＡＯＦ２蛋白質のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつ、ＥＳ細胞の未分化状態を維持する活性を有する蛋白質、又は
（ｃ）（ａ）記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつ、ＥＳ細胞の未分化状態を維持する活性を有する蛋白質。
【請求項７】
ＡＯＦ２遺伝子が以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の核酸を含む、請求項３記載の方法：
（ａ）哺乳動物由来のＡＯＦ２をコードする塩基配列から成る核酸、
（ｂ）上記（ａ）に記載の塩基配列から成る核酸と相補的な塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＥＳ細胞の未分化状態を維持する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項８】
請求項１記載の方法に使用する、ＡＯＦ２遺伝子を含む発現用組換えベクター。
【請求項９】
ＡＯＦ２遺伝子で形質転換された幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＯＦ２をコードする遺伝子を導入することから成る、幹細胞における未分化状態の制御方法、該方法に使用する発現用組換えベクター、及び、ＡＯＦ２をコードする遺伝子で形質転換された幹細胞等に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞の再生医療への応用が期待され、多くの医療・研究機関において、その実用化に向けた検討が始められている。しかし盲目的で偶然に頼る研究が多く、現時点では目的とする細胞を効率よく分化誘導し安定供給することはおろか、分化誘導後の細胞の安定性等、問題が山積している。また、多能性幹細胞を生み出す技術として注目されている「体細胞核移植」は、実際のところ再プログラム化の効率は非常に低く、不完全であることが確認されている。また、その調製に卵子を使用するヒトＥＳ細胞を用いた組織分化誘導や、先ほどの体細胞核移植は、倫理的な問題を回避できない。それゆえ最近では患者自身の幹細胞を利用した再生医療の実現が待望されている。また、患者自身の体細胞の幹細胞化（脱分化）も有望な方法であるが、未だ実現に至っていない。現在の再生医療研究がこれらの問題に窮しているのは、ひとえに幹細胞の制御方法が極めて不十分であることに原因がある。これまでに、幹細胞の制御に関する報告いくつかなされているが、未だ上記目的を十分に達成する為には満足のいくものではない。
尚、多くの脊椎動物のＡＯＦ２蛋白質のアミノ酸配列は公知であり、その機能として、ヒストンH3の脱メチル化酵素であることが知られている（非特許文献５）。
【非特許文献１】Boiani, M. and Scholer, H.R. Nat Rev Mol Cell Biol. (2005) 6, 872-884
【非特許文献２】Chambers I. et al., Cell (2003) 113, 643-655.
【非特許文献３】Mitsui K. et al., Cell (2003) 113, 631-642.
【非特許文献４】Ying Q.L. et al., Cell (2003) 115, 281-292.
【非特許文献５】Shi, Y. et al., Cell (2004) 119,  941−953.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、本発明の主な目的は、幹細胞の未分化状態を制御する因子を同定し、多分化能を持つ幹細胞を簡便に培養する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
マウスES細胞はLIF（Leukemia inhibitory factor:白血病阻害因子）存在下で、未分化状態を維持しながら増殖することができるが、LIFを除くとES細胞は徐々に分化していくことが知られていた。そこで、発明者は、LIF存在下あるいは非存在下で培養したES細胞の核と細胞質から蛋白質抽出液を調製し、２次元電気泳動で変動のある蛋白質を質量分析により解析し、LIF存在下（未分化状態幹細胞に特異的に発現する蛋白質ＡＯＦ２を同定し、ＡＯＦ２を遺伝子導入したマウスＥＳ細胞がLIF非存在下においても未分化状態を維持しながら長期間（数週間）増殖することができることを初めて見出し、係る知見に基づき本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明は以下の各態様に係るものである。
［１］ＡＯＦ２をコードする遺伝子を導入することから成る、幹細胞における未分化状態の制御方法。
［２］幹細胞の未分化状態を制御する方法に使用する、ＡＯＦ２をコードする遺伝子を含む発現用組換えベクター。
［３］ＡＯＦ２をコードする遺伝子で形質転換された幹細胞。
【発明の効果】
【０００６】
本発明方法に従い、ＡＯＦ２をコードする遺伝子を導入し、該遺伝子を発現させることによって、幹細胞における未分化状態の制御を行うことが出来る。例えば、ＡＯＦ２遺伝子をＥＳ細胞に導入することによって、ＬＩＦ非存在下における長期間の培養においても、ＥＳ細胞の未分化状態を維持・促進することができる。その結果、多分化能を保持した幹細胞を安定かつ容易に大量培養することが可能となり、従来よりも効率よく幹細胞を調製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明第一の態様は、ＡＯＦ２をコードする遺伝子を導入することから成る、幹細胞における未分化状態の制御方法に係る。本明細書において、「幹細胞」は未分化状態にある細胞を広く意味し、例えば、胎性幹細胞（ＥＳ細胞）の他、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚組織幹細胞等、様々な組織性幹細胞等を包含する概念である。
【０００８】
ＡＯＦ２蛋白質のアミノ酸配列は脊椎動物間で広く保存されている。特に、ヒト由来のＡＯＦ２は８０３個のアミノ酸からなる蛋白質（National Center for Biotechnology Information (NCBI)  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）であり、サル、ウシ、ラット及びマウス等の哺乳動物、並びに、トリ、ゼブラフィッシュ、ウニ等の哺乳類由来のＡＯＦ２とアミノ酸配列において約６４％以上の類似性（相同性）がある（図３）。
【０００９】
従って、ＡＯＦ２遺伝子は、広く脊椎動物由来のものを含み、例えば、上記の哺乳動物に由来するものである。
【００１０】
より具体的には、ＡＯＦ２遺伝子が以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載の蛋白質をコードするものである。
（ａ）哺乳動物由来のＡＯＦ２蛋白質、
（ｂ）（ａ）記載のいずれかのＡＯＦ２蛋白質のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつ、ＥＳ細胞の未分化状態をする活性を有する蛋白質、又は
（ｃ）（ａ）記載のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつ、ＥＳ細胞の未分化状態をする活性を有する蛋白質。
【００１１】
更に、ＡＯＦ２遺伝子は以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の核酸を含むものである。
（ａ）哺乳動物由来のＡＯＦ２をコードする塩基配列から成る核酸、
（ｂ）上記（ａ）に記載の塩基配列から成る核酸と相補的な塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＥＳ細胞の未分化状態を維持する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【００１２】
本発明の方法において、ＡＯＦ２をコードする遺伝子は、導入する幹細胞と同じ生物種又は異なる生物種由来のもののいずれでも良いが、出来るだけ互いに近縁種であることが好ましく、特に、同じ生物種由来であることが好ましい。
【００１３】
本発明において、幹細胞における未分化状態を制御するとは、未分化状態を維持及び／又は促進することを意味する。幹細胞の分化状態は、当業者に公知の任意の方法・手段で検出・確認することが出来る。例えば、本明細書の実施例に記載されているように、細胞の形態的特徴、又は、アルカリホスファターゼ及び転写因子Oct3/4及び表面抗原蛋白質SSEA1等の適当な未分化マーカーを利用する抗体反応及びＰＣＲ等により幹細胞の分化状態を確認することが出来る。従って、未分化状態を維持及び／又は促進するとは、例えば、上記の各未分化マーカーの発現（活性）の程度がLIF存在下で培養した未分化状態のＥＳ細胞に近いか又は実質的に同程度であることを意味する。
【００１４】
従って、その具体例として、例えば、ＡＯＦ２遺伝子をＥＳ細胞に導入し、ＥＳ細胞の未分化状態を維持する方法がある。
【００１５】
ここで、「相同性」とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」（「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988);Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. &Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994);von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press,New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) 等) 。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Martin, J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994);Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) 等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の核酸（遺伝子）は、上記の蛋白質をコードするものである。ここで、「コードする」とは、本発明の蛋白質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、本発明のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は本発明の蛋白質を適当な介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者を含んでいる。
【００１７】
「核酸」とは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又はいずれの核酸の修飾体をも含む。また、核酸は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡを含んでいる。
【００１８】
本明細書において、「ストリンジェント（stringent）な条件」とは、前記のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。更に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。
【００１９】
従って、「ストリンジェントな条件」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度150〜900mM、好ましくは600〜900mM、pH 6〜8であるような条件を挙げることが出来る。ストリンジェントな条件の一具体例としては、5 x SSC (750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム)、1% SDS、5 x デンハルト溶液50% ホルムアルデヒド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1 x SSC (15 mM NaCl、1.5 mM クエン酸三ナトリウム)、0.1% SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものである。
【００２０】
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２１】
本発明の遺伝子は、当業者に公知の公的機関のデータベース又は本明細書に記載の塩基配列に基づき作製したプライマー又はプローブ等を用いて、当業者に公知の任意の方法で調製することが出来る。例えば、各種のＰＣＲ、並びに、その他のNASBA（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法及びSDA（Strand Displacement Amplification）法等の当業者に公知の任意ＤＮＡ増幅技術を用いることにより、該遺伝子のｃＤＮＡとして容易に得ることが可能である。
【００２２】
或いは、上記遺伝子は当業者に周知の方法により、本明細書に記載のcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。更に、該遺伝子のcDNAに、当業者に公知の部位特異的突然変異誘発に基づき、市販のミューテーションシステム等を用いて塩基変異を導入して調製することも可能である。
【００２３】
又、上記遺伝子は、公知の方法（例えば、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418;Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することもできる。また、本発明のポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断する等の方法によって作製することもできる。
【００２４】
本発明の遺伝子は、当業者に公知の任意の方法で幹細胞に導入し、該幹細胞を形質転換し、分化状態が制御された形質転換体を得ることが出来る。例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、トランスフェリン受容体を使用する方法、ペネトラチン等の膜透過性ペプチドを使用する方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション及びパーティクルガン等の物理的方法、更には、レトロウイルス及びアデノウイルス等の適当なウイルスを用いる方法を挙げることが出来る。
【００２５】
上記の各種形質転換法に応じて、各遺伝子は、そのまま単独の形態（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子）、又は適当なベクター（同じベクター又は別のベクター）に組み込んで作製した発現用組換えベクターの形態で導入される。例えば、このようなベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター等の各種ウィルスベクター、非ウィルス型ベクター又は混成型ベクター等を挙げることが出来る。このようなベクターには、発現調節配列には、適当なプロモーター、エンハンサ、転写ターミネータ、タンパク質をコードする遺伝子における開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、ポリアデニル化部位、及びストップコドン等の各種の遺伝子発現調節配列、クローニング部位、薬剤耐性遺伝子等の各種要素が適宜含まれており、当業者に公知の任意の方法で作製することができる。
【００２６】
従って、このようにして調製される、ＡＯＦ２をコードする遺伝子を含む発現用組換えベクターは、本発明方法において、幹細胞の未分化状態制御剤（組成物）の活性成分として、使用することが出来る。
【００２７】
形質転換体の培養の諸条件及びそれに用いる培地は、培養する細胞の種類、細胞外分泌を促進させたい目的の蛋白質の種類、及び使用する発現ベクターの構成（プロモーターの種類等）等に応じて適当なものを適宜選択することができる。又、こうして作製されるＡＯＦ２をコードする遺伝子で形質転換された幹細胞（形質転換体）においては、ＡＯＦ２が安定的に発現されており、それによって、該形質転換体における未分化状態が制御されている。
【００２８】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は、当該技術分野における常法及び当業者に公知の標準的な方法、例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New   York, N.Y, 1995等に記載されている遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い実施した。又、本明細書中に参考文献などとして引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。
【００２９】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。尚、本明細書中で引用される技術文献の内容は、本明細書の開示内容の一部と見なされる。
【実施例１】
【００３０】
［ＡＯＦ２の同定］
マウスES細胞（American Type Culture Collection: cat No. CRL-11632）をLIF非存在下で培養すると、未分化マーカーのひとつとして知られるアルカリフォスファターゼ活性をほぼ１週間で喪失することが知られている。未分化ではアルカリフォスファターゼ陽性でコロニーを形成するが、LIF非存在下ではアルカリフォスファターゼ陰性で平たく広がった形態の中内胚葉に分化してしまう（図１）。この結果からDay0とDay7の蛋白質サンプルを比較することで、プロテオーム解析により未分化特異的な蛋白質を判別することが可能と考え、常法に従い、LIF+の状態で培養したマウスES細胞及びLIF-の状態で７日間培養した細胞から核蛋白質を抽出し、それぞれ緑及び赤の蛍光色素でラベルした後、混合し、２次元電気泳動により分離した（図２）。その結果、数十個の量的変動のある蛋白質を同定し、MALDI-TOF/TOF型質量分析器により解析したところ、マウスＥＳ細胞で未分化特異的に発現するタンパク質のひとつがＡＯＦ２であることを見出した。
【００３１】
尚、本明細書に記載の実施例において、マウスES細胞はゼラチンコートしたディッシュ上で37℃、5％CO2雰囲気下で培養し、DMEM培地(high glucose)に以下の添加物を加えた培地で培養を行った（2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 15% ES cell-qualified FBS, 1000 IU/ml ESGRO (Chemicon), 及び penicillin/streptomycin）。
【実施例２】
【００３２】
［ＡＯＦ２によるＥＳ細胞の未分化状態促進］ 
マウスＥＳ細胞において、野生型ＡＯＦ２を遺伝子導入し安定発現させた細胞株を樹立し、LIFを培地から除去し２週間培養することで通常のマウスＥＳ細胞が中内胚葉に完全に分化してしまう状況にあっても多くの細胞において、形態的にLIF存在下で培養した未分化状態のＥＳ細胞に近く、細胞がぎっしり密集したパンケーキ状の形態を示すことが分かった。また、このとき未分化マーカーの一つであるアルカリホスファターゼの活性染色を行ったところ、未分化状態を維持していることが確認された（図４）。更に、各クローンをLIF非存在下で２週間培養した後、RNAを精製し、RT-PCRによりOct3/4mRNAの発現を調べた。その結果、このようなLIF非存在下における長期間の培養でも未分化マーカー転写因子Oct3/4の発現が維持されていることがRT-PCRにより確認された（図５）。又、未分化マーカーであるOct3/4に対する抗体（sc-9081, SANTA CRUZ）及びSSEA1に対する抗体（協和発酵）を用いた、常法による免疫蛍光染色によってもこれら未分化マーカーの発現が認められ、未分化状態の維持が確認された（図６）。従って、ＡＯＦ２の遺伝子導入によりES細胞の未分化状態が維持・促進されることが分かった。実験の詳細は以下の通りである。
【００３３】
遺伝子導入方法
マウスＡＯＦ２発現ベクターは以下の方法で調製した。マウスES細胞（3x10６細胞）にISOGEN（ニッポンジーン）500 μlを加えて強く撹拌し、ISOGEN溶液中に細胞を溶かした。そこに100 μlのクロロホルムを加えて撹拌し、10分間15Krpm(4℃)で遠心を行った。上清を新しい1.5 mlチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えて撹拌し、室温で20分静置した。その後、10分間15Krpm(4℃)で遠心を行った。沈殿したRNAのペレットを確認し、上清をデカンテーションで捨て、1mlの70%エタノールを加えて10分間15Krpm(4℃)で遠心を行った。上清を捨ててペレットを風乾し、20 μlのDNase/RNase Freeの水に沈殿を溶かした。この濃度を測定した後、次にcDNA合成のステップに進んだ。Total RNA 1μgを鋳型とし、oligo dT primer、逆転写酵素(superscript II reverse transcriptase, Invitrogen)、RNase inhibitor (TaKaRa)、5×1st strand buffer、0.1M dNTP Mixを混ぜ、42℃で逆転写反応を行った。反応後、65℃で10分処理し、逆転写酵素を失活させた後、氷上において急冷した。合成されたcDNAを1/5希釈したものを鋳型とし、データベースに登録されているマウスＡＯＦ２遺伝子配列情報に基づき作製した特異的プライマー（F: 5’-GGAATTcatggctacgggggcg-3’（配列番号１）、 R:   5’-CGGCTCGAGtcacatacttggggactgctg-3’（配列番号２））を用いてPCRを行った。PCRの条件は、KOD plas(TOYOBO)をポリメラーゼとして使用し、94℃２分加熱変性後、94℃15秒、60℃30秒、68℃２分のサイクルを35回繰り返し、68℃で10分伸長反応した後4℃で保管した。これを1%のアガロースゲルで分電気泳動（100ボルト、20分）で分離し、エチジウムブロマイドで20分処理しUVを照射しマウスＡＯＦ２DNAのバンドを検出した。  このDNAバンドをナイフで切り出し精製した後、EcoRIとEcoRVで酵素消化した。同様に発現ベクター（pCAG-IP-Flag, Yoshida-Koide et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. (2004) 313, 475-481にFlagタグ配列（sense: 5’-AATTGACCGCCATGGACTACAAGGACGATGATGACAAGGGCG-3’, 配列番号３, antisense: 5’-AATTCGCCCTTGTCATCATCGTCCTTGTAGTCCATGGCGGTC-3’, 配列番号４）をEcoRIサイトに挿入して作成）についてもEcoRIとEcoRVで酵素消化し、精製したマウスＡＯＦ２断片をライゲーションし、発現ベクターpCAG-IP-Flag-ＡＯＦ２を構築した。この結果、制御遺伝子を恒常的に発現させるCMVプロモーターというウイルス由来の外来プロモーターによって導入されたＡＯＦ２遺伝子は発現制御される。このようにして作成した発現ベクターをリポフェクション試薬、リポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いてマウスES細胞に遺伝子導入した。
【００３４】
アルカリホスファターゼ活性染色
アルカリホスファターゼ活性染色については、細胞をPBSで洗浄後、３％ホルマリン/PBSで5分処理した後、アルカリホスファターゼ発色試薬（BM purple AP substrate（Roche））を加え、室温で30分インキュベートした。  その後、細胞をPBSで2回洗浄した後、光学顕微鏡で観察した。
【００３５】
Oct3/4のRT-PCR
Oct3/4のRT-PCRについては、マウスES細胞から上記の方法を使用してmRNAを抽出しcDNAを合成した。プライマーはF: 5’-tgcggagggatggcatac-3’（配列番号5）, R: 5’-ctccaacttcacggcattg-3’ （配列番号６）を用いてPCRをおこなった。PCRの条件は、KOD plas(TOYOBO)をポリメラーゼとして使用し、94℃２分加熱変性後、94℃15秒、60℃30秒、68℃２分のサイクルを25回繰り返し、68℃で10分伸長反応した後4℃で保管した。これを1%のアガロースゲルで分電気泳動（100ボルト、20分）で分離し、エチジウムブロマイドで20分処理しUVを照射しマウスＡＯＦ２DNAのバンドを検出した。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明で同定されたＡＯＦ２の遺伝子導入することにより体細胞を幹細胞化する技術が提供される。更に、この蛋白質などが特異的に欠如、あるいは異常発現しているヒトなどの疾病の診断や、分泌に関与する因子の欠陥や欠損などに起因するヒトなどの異常や疾病を治療する目的などに有用な材料を提供することが可能となる。また、そのような異常や疾病に関する研究のためのよい材料を提供することや、それらの異常や疾病を治療するための薬剤の開発における有用なアッセイ系の材料を提供することも期待できる。更に、関連試薬を開発すること、ヒトの疾病の治療法の開発や診断法を開発するなど、種々な用途が拓ける。更に、再生医療をより強力に推進することも可能となる。 
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】マウスＥＳ細胞のLIF除去に伴う形態及びアルカリホスファターゼ活性の減少を示す写真である。
【図２】マウスES細胞の核抽出液の２次元電気泳動（pH 3-10, 12.5 ％ SDS-PAGE）を示す写真である。緑色のスポットは未分化状態特異的に発現している蛋白質（LIF+）であり、赤色のスポットは分化し発現が上昇してくる蛋白質（LIF-）を示している。矢印はその後の質量分析でＡＯＦ２として同定された蛋白質スポットを示す。
【図３】ヒト（human）、サル（monkey）、ウシ（bovine）、ラット（rat）、マウス（mouse）、トリ（chuck）、ゼブラフィッシュ（sebrafish）、ウニ（sea urchin）のＡＯＦ２のアミノ酸（一文字表記）を示す。
【図４】LIF非存在下で培養した野生型ＡＯＦ２を安定発現させたマウスＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ活性染色の結果を示す写真である。Mock: コントロール空ベクターを導入したクローン。ＡＯＦ２: 野生型ＡＯＦ２を導入したクローン。
【図５】LIF非存在下で培養した野生型ＡＯＦ２を安定発現させたマウスES細胞のOct3/4mRNAの発現を示す写真である。Mock: コントロール空ベクターを導入したクローン。ＡＯＦ２: 野生型ＡＯＦ２を導入したクローン。
【図６】LIF非存在下で培養した野生型ＡＯＦ２を安定発現させたマウスＥＳ細胞のOct3/4蛋白質及びSSEA1蛋白質の発現を示す写真である。Mock: コントロール空ベクターを導入したクローン。ＡＯＦ２: 野生型ＡＯＦ２を導入したクローン。Oct3/4：赤、SSEA1：緑、DAPI：青。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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