(57)【要約】【課題】  ＺＯ−１を誘導することにより上皮あるいは内皮細胞間接着増強効果を示すもの、特にＰＨＳＲＮ及びその誘導体であるＡｃ−ＰＨＳＲＮ−ＮＨ２を提供すること。【解決手段】  ＺＯ−１を誘導することを特徴とするＰＨＳＲＮまたはＡｃ−ＰＨＳＲＮ−ＮＨ２、及びそれらの医薬として許容される塩類によって達成される。このペンタペプチド又は誘導体は、細胞間接着増強剤、オキュラーサーフェース障害治療剤または保護剤、眼内灌流液、角膜内皮保護剤、硝子体内注入液または硝子体灌流液、または腎糸球体血管内皮保護剤などに用いることができる。【選択図】          図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＺＯ−１を誘導する物質を含むことを特徴とする細胞間接着増強剤。
【請求項２】
前記ＺＯ−１を誘導する物質が、ＰＨＳＲＮまたはＡｃ−ＰＨＳＲＮ−ＮＨ２であることを特徴とする請求項１に記載の細胞間接着増強剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の細胞間接着増強剤を含有する上皮ないし内皮保護剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載の細胞間接着増強剤を含有するオキュラーサーフェース障害治療または保護剤。
【請求項５】
請求項１または２に記載の細胞間接着増強剤を含有する眼内灌流液。
【請求項６】
請求項１または２に記載の細胞間接着増強剤を含有する角膜内皮保護剤。
【請求項７】
請求項１または２に記載の細胞間接着増強剤を含有する硝子体内注入液または硝子体灌流液。
【請求項８】
請求項１または２に記載の細胞間接着増強剤を含有する腎糸球体血管内皮保護剤。
【請求項９】
ＺＯ−１を誘導することを特徴とするＰＨＳＲＮまたはＡｃ−ＰＨＳＲＮ−ＮＨ２、及びそれらの医薬として許容される塩類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＺＯ−１を誘導することにより上皮あるいは内皮細胞間接着増強効果を示すもの、特にポリペプチドであるＰＨＳＲＮ及びその誘導体であるＡｃ−ＰＨＳＲＮ−ＮＨ２に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮あるいは内皮細胞における細胞間接着部位であるタイトジャンクションには、タイトジャンクション構成タンパクとしてオクルディン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ）とクローディン（ｃｌａｕｄｉｎ）が存在している。このうち、オクルディンは、細胞内アクチンフィラメントとリンカーであるＺＯ−１を介して結合していることが知られている（特許文献１，２）。
タイトジャンクションの一般的な機能として、例えば、上皮組織では外界と生体内を隔てるバリア機能がある。消化器官では有害物の体内進入を阻止しており、タイトジャンクション形成を促進することで、有害物に対する抵抗力を増加できることが報告されている（特許文献３）。
また、上皮組織あるいは血管内皮組織の障害が発生した場合、その治癒過程において、上皮あるいは内皮細胞が各組織で接着・伸展・移動ののち、最終的に細胞間のタイトジャンクションが形成されて治癒が完結する。このように、ＺＯ−１がそのタイトジャンクション形成による細胞間接着の一翼を担っている。
一方、ＰＨＳＲＮは、特許文献４に開示されているペンタペプチドであり、外傷治癒及びがん細胞浸潤・増殖抑制効果を有することが知られているが、ＺＯ−１との関連を示唆する報告はない。
【０００３】
【特許文献１】再表９７／０３２９８２号公報
【特許文献２】特開２００２−１９１３８２号公報
【特許文献３】特開２００７−２１０９４８号公報
【特許文献４】ＷＯ９８／２２６１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来、手術時または人工透析等の処置時に、上皮あるいは内皮細胞に与える物理的外傷、化学的組織障害は、灌流液、組織の洗浄液等を使用することで創傷の発生を予防してきた。しかし、例えば眼科領域において使用されている電解質溶液、還元型及び酸化型グルタチオン製剤は、直接的な上皮、内皮細胞の創傷保護作用を十分に持たない。一方、積極的な作用が期待されるフィブロネクチンは生体成分であるため、取扱い、特に製剤化が困難であり、製剤化ができる積極的な創傷保護作用を持つ細胞間接着増強剤の開発が望まれてきた。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＺＯ−１を誘導することにより細胞間接着増強効果を示すもの、特にＰＨＳＲＮ及びその誘導体であるＡｃ−ＰＨＳＲＮ−ＮＨ２、それらの医薬として許容される塩類を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上皮あるいは内皮細胞に創傷が発生すると、ヒトの持つ恒常性によって、その創傷は自然に治癒される。この創傷治癒過程は、ＺＯ−１が誘導され細胞間接着が強固となり、正常な組織となることで終了する。本発明者らは、上皮細胞あるいは内皮細胞において、ポリペプチドであるＰＨＳＲＮ（配列番号１）及びその誘導体であるＡｃ−ＰＨＳＲＮ−ＮＨ２で、ＺＯ−１を誘導できることを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
【０００６】
第１の発明は、ＺＯ−１を誘導する物質を含むことを特徴とする上皮あるいは内皮細胞間接着増強剤である。本発明においては、前記ＺＯ−１を誘導する物質が、ＰＨＳＲＮまたはＡｃ−ＰＨＳＲＮ−ＮＨ２であることが好ましい。
また、上記上皮細胞間接着増強剤を含有するオキュラーサーフェース障害治療剤または保護剤であることが好ましい。
また、上記上皮細胞間接着増強剤を含有する眼内灌流液であることが好ましい。
また、上記上皮細胞間接着増強剤を含有する角膜内皮保護剤であることが好ましい。
また、上記上皮細胞間接着増強剤を含有する硝子体内注入液または硝子体灌流液であることが好ましい。
また、上記細胞間接着増強剤を含有する腎糸球体血管内皮保護剤であることが好ましい。
【０００７】
また、上記、細胞間接着増強剤は、手術時または、人工透析等の処置時における灌流液、組織の洗浄液とできる。また、この使用では、既存の組織灌流液、例えば眼内灌流液ではオペガード（登録商標：千寿製薬）、ビーエスエスプラス（登録商標：日本アルコン）、人工透析液ではソリタ（登録商標：味の素）等と混合して用いる事ができる。
また、第２の発明は、ＺＯ−１を誘導することを特徴とするＰＨＳＲＮまたはＡｃ−ＰＨＳＲＮ−ＮＨ２、及びそれらポリペプチドの医薬として許容される塩類である。
【０００８】
「ＺＯ−１」とは、分子量が約２２０ＫＤａの細胞質蛋白であり、細胞間接着接合体であるタイトジャンクション（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）及びアドヘレンスジャンクション（ａｄｈｅｒｅｎｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を構成する分子の一つである。
「ＰＨＳＲＮ」とは、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎの五個のアミノ酸から構成されるペンタペプチドを意味する。このペンタペプチドは、フィブロネクチンの活性部位として知られている。本願出願人は、このペプチドの生理効果に着目し、鋭意研究を行っている（例えば、特開２００４−２１０６９２号公報）。また、上記アミノ酸は多数の鏡像異性体を生じ得る場合、これらすべての鏡像体及びそれらの混合物はすべて本発明に含まれるものであり、ＰＨＳＲＮをモチーフとして形成された組成物についても均等の範囲として本発明の権利範囲に解釈されるべきである。
【０００９】
「Ａｃ−ＰＨＳＲＮ−ＮＨ２」とは、上記ＰＨＳＲＮにおいて、Ｎ末端側をアセチル化し、Ｃ末端側をアミド化したものを意味する。
なお、本明細書中において、アミノ酸残基については、次のような省略記号を用いる。つまり、アスパラギンはＡｓｎまたはＮを、アルギニンはＡｒｇまたはＲを、ヒスチジンはＨｉｓまたはＨを、プロリンはＰｒｏまたはＰを、セリンはＳｅｒまたはＳを意味する。また、Ａｃはアセチル基を、ＮＨ２はアミド基を意味する。
「上皮」とは、体の内外の遊離面を覆うものを意味し、例えば角結膜、皮膚、呼吸器、口腔、鼻腔、消化器、膣、血管組織などが含まれる。発生学的には、外胚葉由来（皮膚の表皮など）、内胚葉由来（腸の粘膜上皮など）、中胚葉由来（腹膜の上皮など）がある。
【００１０】
「オキュラーサーフェース障害治療剤または保護剤」とは、オキュラーサーフェースを障害から治癒する、または障害から保護する製剤を意味し、例えば点眼液として点眼使用されるものを含む。オキュラーサーフェース障害にはドライアイ等を含む。
「眼内灌流液」とは、眼内を灌流させる液を意味し、例えば白内障及び硝子体等の手術時において手術補助剤として使用されるものを含む。
「角膜内皮保護剤」とは、角膜内皮を保護する剤を意味し、例えば白内障及び硝子体等の手術時において手術補助剤として使用されるものを含む。
「硝子体内注入液または硝子体灌流液」とは、硝子体の内部に注入される液及び硝子体内を灌流する液を意味し、例えば糖尿病性網膜症の治療のために使用されるものを含む。
「腎糸球体血管内皮保護剤」とは、腎糸球体の血管内皮を保護する剤を意味し、例えば人工腎臓透析において使用されるものを含む。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、創傷発生過程において、ＺＯ−１を誘導することにより、組織を創傷発生から保護させるものを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
細胞間接着部位であるタイトジャンクションには、構成タンパクとして、オクルディンとクローディンが存在している。このうち、オクルディンは、細胞内アクチンフィラメントとリンカーであるＺＯ−１を介して結合している（特許文献１，２）。上皮組織あるいは血管内皮組織の障害が発生した場合、その治癒過程において、上皮あるいは内皮細胞が各組織で接着・伸展・移動ののち、最終的に細胞間のタイトジャンクションが形成されて治癒が完結する。このとき、ＺＯ−１が、タイトジャンクション形成による細胞間接着の一翼を担っていると考えられる。
【００１３】
タイトジャンクションの一般的な機能として、例えば上皮組織では外界と生体内を隔てるバリア機能がある。消化器官では有害物の体内進入を阻止しており、タイトジャンクション形成を促進することで、有害物に対する抵抗力を増加できる。例えば、特許文献３にはトコフェリルリン酸化合物が、クローディンとオクルディンの発現を増加させることにより、紫外線照射に対して、抵抗力を増加させることが示されている。
本発明者らは、ペンタペプチドであるＰＨＳＲＮと、ＺＯ−１との関連を調べるための試験を行った。
【００１４】
＜不死化ヒト角膜上皮細胞＞
不死化ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）細胞は独立行政法人理化学研究所より入手し、３７℃、５％  ＣＯ２下、非働化したウシ胎児血清（１５％ＦＢＳ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、コレラ毒素（０.１μｇ／ｍＬ）、組換えヒト上皮成長因子（ＥＧＦ：１０ｎｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（４０μｇ／ｍＬ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２培地（ＳＨＥＭ）中で培養した。
【００１５】
その他の試薬として、次のものを用いた。ＺＯ−１ウサギポリクロナール抗体、ｏｃｃｌｕｄｉｎウサギポリクロナール抗体、およびｃｌａｕｄｉｎウサギポリクロナール抗体はＺｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎウサギポリクロナール抗体、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎウサギポリクロナール抗体、およびＴｕｂｌｉｎウサギポリクロナール抗体はＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より、Ｉ型コラーゲンウサギポリクロナール抗体はＬＳＬ社より、西洋ワサビペルオキシダーゼ２次抗体はＰｒｏｍｅｇａ社より購入した。
【００１６】
＜実施例１＞
試験には、不死化ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥ）をＳＨＥＭで２４時間培養したものを用いた。ＨＣＥをＰＢＳで洗浄後、（ＦＢＳなど添加物を含まない）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地について、（１）ＰＨＳＲＮを０.５μｇ／ｍＬ添加したもの、（２）Ｎ末端とＣ末端とを逆向きとしたリバース体であるＮＲＳＨＰ（配列番号２）を０.５μｇ／ｍＬ添加したもの、及び（３）コントロール（無添加）の三通りに分けた後、２４時間再培養した。
【００１７】
免疫ブロット分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）
上記のＰＨＳＲＮ添加、ＮＲＳＨＰ添加、または無添加のＤＭＥＭ／Ｆ１２で２４時間培養したＨＣＥ細胞の培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳ除去後、細胞に１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２％ＳＤＳ、５ｎＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）を含む水溶液２０μＬを加え融解した。この細胞溶解液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、１次抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ２次抗体で暴露した。免疫複合体を化学蛍光試薬であるＥＣＬウエスタンブロット検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で増強し、化学発光法によりＺＯ−１、ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎおよびｔｕｂｌｉｎをそれぞれ検出した。
結果を図１に示した。図より明らかなように、特にＺＯ−１の検出において、ＰＨＳＲＮは、コントロールおよびＮＲＳＨＰに比較して顕著に増加していた。残りの二つについては、ほぼ同等の検出量であった。
【００１８】
＜実施例２＞
ＳＨＥＭで２４時間前培養した不死化ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）細胞をＰＢＳで洗浄後、ＰＨＳＲＮ（５、２５、１００、および２００μＭ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、又は無添加のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２４時間培養した細胞を洗浄・融解し、実施例１と同様に、ＺＯ−１をウエスタンブロットにより検出した。
結果を図２に示した。図より明らかなように、ＰＨＳＲＮの濃度に依存して、ＺＯ−１の発現量が増加することが示された。
図２について、誘導されたＺＯ−１の各スポットをデンシトメトリにより定量化し、統計分析（ダネット検定）した結果を図３に示した。ＰＨＳＲＮ（２００μＭ）は、コントロール（無添加）に対し、有意にＺＯ−１の発現を亢進することが明らかとなった。
【００１９】
このように、本実施形態によれば、ＰＨＳＲＮ及びその誘導体であるＡｃ−ＰＨＳＲＮ−ＮＨ２が細胞間接着において、ＺＯ−１を誘導することにより、細胞間接着を増強し、治療または保護を促進させることが明らかとなった。このペンタペプチド又は誘導体は、細胞間接着増強剤、オキュラーサーフェース障害治療剤または保護剤、眼内環流液、角膜内皮保護剤、硝子体内注入液または硝子体灌流液、または腎糸球体血管内皮保護剤などに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＨＣＥにＰＨＳＲＮ、またはＮＲＳＨＰを添加して培養したときのＺＯ−１、ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎおよびｔｕｂｌｉｎの発現を確認したときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真図である。
【図２】ＨＣＥにＰＨＳＲＮ（５、２５、１００、及び２００μＭ）を添加して培養したときのＺＯ−１及びＴｕｂｌｉｎの発現を確認したときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真図である。
【図３】図２について、誘導されたＺＯ−１をデンシトメトリにより定量化した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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