(57)【要約】      （修正有）【課題】骨粗鬆症や歯周病等の骨疾患に対して、安全で優れた効果を有する天然由来の骨吸収抑制剤を提供する。また、骨吸収抑制用食品、骨吸収抑制用医薬品部外品、及び骨疾患予防又は治療剤を提供する。【解決手段】カリン、シナモン、ヨモギ、サフラン及びアカメガシワより選ばれる植物の抽出物の１種又は２種以上を含有することを特徴とする。シトラス及びレモンの少なくとも一方の抽出物をさらに含有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリン、シナモン、ヨモギ、サフラン及びアカメガシワより選ばれる植物の抽出物の１種又は複数以上を含有することを特徴とする骨吸収抑制剤。
【請求項２】
シトラス及びレモンの少なくとも一方の抽出物をさらに含有することを特徴とする請求項１に記載の骨吸収抑剤。
【請求項３】
カリン、シナモン、ヨモギ、サフラン及びアカメガシワより選ばれる植物の抽出物の１種又は複数以上を含有する骨吸収抑制用飲食品。
【請求項４】
カリン、シナモン、ヨモギ、サフラン及びアカメガシワより選ばれる植物の抽出物の１種又は複数以上を含有する骨吸収抑制用医薬部外品。
【請求項５】
カリン、シナモン、ヨモギ、サフラン及びアカメガシワより選ばれる植物の抽出物の１種又は複数以上を含有する骨疾患予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨吸収抑制剤に関する。また、本発明は、骨吸収抑制用飲食品、骨吸収抑制用医薬部外品及び骨疾患予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨の恒常性は、骨リモデリングと呼ばれる骨吸収と骨形成のバランスにより維持されている（非特許文献１）。これら骨吸収と骨形成は、破骨細胞及び骨芽細胞の働きにより制御されており、破骨細胞は骨吸収に、そして骨芽細胞は骨再生において、それぞれ役割を担っている。破骨細胞は、造血細胞に由来した酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（Tartrate-Resistant Acid Phosphatase、以下ＴＲＡＰと略す）陽性の巨多核細胞であり、破骨細胞形成には、分化、融合、そして活性化（成熟化）のような複合段階を経て進行することが知られている。この破骨細胞による骨吸収の割合が過剰に増加すると、骨の崩壊や深刻な骨疾患である骨粗鬆症、骨転移、リウマチ、又は歯周病等に関わる骨疾患を引き起こす（非特許文献２）。こうした疾患に対し、食事や薬事療法などによる改善が必要とされてきた。従って、破骨細胞による過剰な骨吸収を抑え、骨リモデリングのバランスを調整することは骨疾患を改善することとして理解されている。
【０００３】
現在、これらの骨疾患の治療には、活性型ビタミンＤ３製剤、エストロゲン製剤、ビスホスホネート製剤、カルシウム製剤などが用いられる。これらの薬を服用することにより改善を試みる場合、薬の副作用があることや他の薬の併用などの面で注意が必要であり、より安全な治療薬が必要とされている。近年、破骨細胞形成に対する抑制効果を有する天然由来の有効成分を見出す研究がなされてきており、様々な天然物などを用いたスクリーニングが行われている。その結果、骨粗鬆症等に対する有効成分を含む特定の天然物が見出されてきている（特許文献１及び２）。例として、植物由来の成分であるダイゼインやゲニステインといったエストロゲン様物質にも骨吸収を抑制する作用があることが見出されている（非特許文献３及び４）。また、ヨモギにも骨芽細胞の分化を促進させることにより骨形成を促すことが知られており（特許文献３）、さらに柑橘類も破骨細胞分化抑制の効果を有することが知られている（特許文献４）。また、特許文献５には、破骨細胞の分化抑制作用を有する因子（Osteoprotegerin;ＯＰＧ又はＲＡＮＫＬ）の産生を促す物質として、植物由来のケルセチンを同定したことが開示されており、レモン等の抽出物にケルセチンが含まれることが開示されている。
【０００４】
しかしながら、破骨細胞形成は先に記したように複合段階を経て進行する複雑な経路であり、また、従来のスクリーニング方法では分化段階における作用機序についての理解が十分に得られるものが少なかった。従って、破骨細胞における分化抑制の作用機序が明らかな骨吸収抑制効果を有する天然物を同定することは、副作用の非常に少ない破骨細胞の分化抑制物として望まれており、さらに、これまで見出されてきた作用機序の異なる天然物などとの組み合わせによる相乗的な効果も期待することができる。
【０００５】
【非特許文献１】Manolagas, S. C. et al., Endocr.Rev.,21,115(2000)
【非特許文献２】Rodan, G. A. et al.,Science,289,1508(2000)
【非特許文献３】Fonseca, D. et al.,Bone,35,489(2004)
【非特許文献４】Khalil, D. A. et al.,Calcif Tissue Int.,76,56(2005)
【特許文献１】特許第３４７９２２４号公報
【特許文献２】特表２００１−５２４１１９号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／０３０６８３号パンフレット
【特許文献４】特開２００６−８３１５１号公報
【特許文献５】特開２００７−１３７７７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、骨粗鬆症や歯周病等の骨疾患に対して、安全で優れた効果を有する天然由来の骨吸収抑制剤を提供することである。また、同様に、骨吸収抑制用飲食品、骨吸収抑制用医薬部外品、及び骨疾患予防又は治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、骨吸収抑制効果を有する天然の成分として新たに見出された、カリン、シナモン、ヨモギ、サフラン及びアカメガシワより選ばれる植物の抽出物の１種又は複数を含有する骨吸収抑制剤を提供する。さらに、本発明の骨吸収抑制剤は、シトラス及びレモンの少なくとも一方の抽出物をさらに含有することができる。
【０００８】
また、本発明は、別の態様として、カリン、シナモン、ヨモギ、サフラン及びアカメガシワより選ばれる植物の抽出物の１種又は複数を含有する骨吸収抑制用飲食品を提供する。さらに、本発明は、別の態様として、カリン、シナモン、ヨモギ、サフラン及びアカメガシワより選ばれる植物の抽出物の１種又は複数以上を含有する骨吸収抑制用医薬部外品を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、別の態様として、カリン、シナモン、ヨモギ、サフラン及びアカメガシワより選ばれる植物の抽出物の１種又は２種以上を含有する骨疾患予防又は治療剤を提供する。また、本発明で提供される骨吸収材並びに骨疾患予防又は治療剤には、活性型ビタミンＤ３製剤、エストロゲン製剤若しくはエストロゲン様物質、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、ビスホスホネート製剤、ビタミンＫ２製剤、カルシウム製剤又はそれらの組み合わせより選択される骨疾患治療剤をさらに含有することができる。
【発明の効果】
【００１０】
このように、本発明によれば、特定の植物の抽出物を含むことにより、人体への影響が極めて低い、骨粗鬆症や歯周病等の骨疾患に安全で優れた効果を有する骨吸収抑制剤、骨吸収抑制用飲食品及び医薬部外品を提供することが可能である。また、同様に、人体への影響が極めて低く、骨疾患に安全で優れた効果を有する骨疾患予防又は治療剤を提供することができる。
【００１１】
本発明で使用される骨吸収抑制効果を有する原料植物は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性の測定により、破骨細胞の活性に抑制効能を持つ天然物として同定された。さらに、ＮＦＡＴｃ１の発現をウェスタンブロッティング法で測定することにより、破骨細胞の分化段階を抑制する作用機序を持つ天然物としてさらに絞り込まれた。
【００１２】
ＮＦＡＴｃ１は、破骨細胞の分化と活性化に関与するタンパク質の一つであるＲＡＮＫＬ（William C. Dougall, et al., Genes & Dev. 13: 2412-2424）のシグナル伝達経路において、ＲＡＮＫＬにより強く誘導されるタンパク質である。そして、ＮＦＡＴｃ１を過剰発現させたＥＳ細胞は破骨細胞へと分化し、ＮＦＡＴｃ１を欠損したＥＳ細胞では、ＲＡＮＫＬによる刺激に関わらず、破骨細胞に分化できないことが示されている(Takayanagi H, et al., Dev. Cell 2002, 3, 889-901)。従って、破骨細胞形成において、ＮＡＦＴｃ１の発現は不可欠であると考えられている。すなわち、ＮＡＦＴｃ１の発現を抑制する効果を持つ植物抽出物は、破骨細胞への分化抑制効果を有するものであり、骨疾患への治療介入の有望な標的になると考えられる。
【００１３】
本発明者らは、植物由来成分について、骨吸収活性の抑制効果だけでなく、このような作用機序も考慮したスクリーニングを鋭意行った結果、新たにカリン、サフラン、アカメガシワが有効であることを見出した。さらに、特許文献１及び２に記載されているように単独では骨粗鬆症に効果がないとされていたシナモン由来の成分が破骨細胞形成を抑制する効能を持ち、さらに分化段階を抑制する作用機序を有することが明らかとなった。
【００１４】
また、特許文献３に記載されているように、これまで骨芽細胞分化の促進により骨形成を促進することが知られていたヨモギにおいても、破骨細胞分化抑制の効果も有することを見出した。加えて、特許文献４に記載されているような破骨細胞分化抑制の効果を有するシトラスやレモンなどの柑橘類と、上記の植物由来成分との作用機序の違いを見出し、これらを組み合わせることで、破骨細胞分化抑制の効果をより向上できることを見出した。
【００１５】
本発明者により見出された原料植物について、破骨細胞の活性化及びＮＡＦＴｃ１の発現を抑制する効果を有しているとの知見は現在までに全くなかった。すなわち、本発明者らは、カリン、サフラン、アカメガシワ、シナモン、ヨモギ、シトラス、レモンがＮＡＦＴｃ１の発現抑制効果を有し、骨粗鬆症や歯周病等の骨疾患の予防及び治療に有効な骨吸収抑制効果を有していることを初めて見出した。
【００１６】
このように、骨吸収の制御に関わる２つの因子「破骨細胞の分化及び活性化」を共通に抑える効果を有する特定の植物抽出物を含有することにより、人体への影響が極めて低い、骨粗鬆症や歯周病等の骨疾患に安全で優れた効果を有する骨吸収抑制剤を提供することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明で用いられるカリンとは、バラ科ボケ属に属する植物であり、カリン、ボケ、クサボケ等の品種を含む。
【００１８】
本発明で用いられるシナモンとは、クスノキ科ニッケイ属に属する植物であり、シナモン、カシア、ジャワニッケイ、クリラワンノキ、イヌニッケイ、アンナンニッケイ、ガジスグス、タマラニッケイ、クスノキ、ホウショウ、マルバニッケイ、シバニッケイ、ケシバニッケイ、ヤブニッケイ、オガサワラニッケイ、ニッケイ、シバヤブニッケイ、セイロンニッケイ等の品種を含む。
【００１９】
本発明で用いられるヨモギとは、キク科ヨモギ属に属する植物であり、ヨモギ、ニガヨモギ、タラゴン、ニトロフヨモギ、オニオトコヨモギ、カワラヨモギ、オトコヨモギ、ハマヨモギ、カワラニンジン、クソニンジン、イヌヨモギ、ミヤマオトコヨモギ、エゾハハコヨモギ、サマニヨモギ、タカネヨモギ、ハハコヨモギ、シコタンヨモギ、シロヨモギ、イワヨモギ、ヒメヨモギ、ワタヨモギ、ケショウヨモギ、ヒトツバヨモギ、チシマヨモギ、ヒロハウラジロヨモギ、ヒロハヤマヨモギ、ユキヨモギ、ヤブヨモギ、オオヨモギ、ニシヨモギ、アサギリソウ、キタダケヨモギ等の品種を含む。
【００２０】
本発明で用いられるサフランとは、アヤメ科クロッカス属に属する植物であり、サフラン等の品種を含む。
【００２１】
本発明で用いられるアカメガシワとは、トウダイグサ科アカメガシワ属に属する植物であり、アカメガシワ等の品種を含む。
【００２２】
本発明で用いられるシトラスとは、ミカン属である柑橘類を指し、オレンジ、ダイダイ、スイートオレンジ、ビターオレンジ等の植物が含まれる。
【００２３】
本発明で用いられるレモンとは、ミカン科ミカン属に属する植物であり、レモン等の品種を含む。
【００２４】
本発明の原料となる植物は、上記植物体から、有効成分を効果的に抽出し得る溶媒を用いて作成した抽出物を使用する。
【００２５】
この抽出において使用される溶媒は、有効成分を効果的に抽出し得る溶媒であれば特に限定されるものではないが、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１，３ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、クロロホルム、ＤＭＳＯ、グリセリン、エチルエーテル、プロピルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、アセトン、エチルメチルケトン、生理食塩水、リン酸緩衝液及びリン酸緩衝生理食塩水から１種又は２種以上を選択して用いることが好ましい。
【００２６】
抽出方法としては、生もしくは細切・乾燥・粉砕等の処理後に抽出することが好ましい。さらに抽出は抽出溶媒に浸漬して行うこともできる。抽出効率を上げるために撹拌してもよく、抽出溶媒中でホモジナイズしてもよい。更に、抽出を２〜４回繰り返して抽出効率を高めることも可能である。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが好ましい。
【００２７】
なお、本発明に含まれる抽出物は、単一の植物から得られたものであっても良いが、２種以上の植物を混合した後、上記抽出方法を適用することも可能である。
【００２８】
これらの植物の上記溶媒による抽出物はそのまま用いる事もできるが、濃縮・乾固を水や極性溶媒に再度溶解したり、或いは微生物性リパーゼ阻害作用を損なわない範囲で脱色、脱臭、脱塩の精製処理を行ったり、カラムクログラフィーによる分画抽出をおこなうことによっても得ることができる。
【００２９】
原料植物の単独または２種以上を組み合わせたものより得られる抽出物を有効成分として、骨吸収抑制剤、骨吸収抑制用飲食品、又は骨吸収抑制用医薬部外品等を製造するには、上記のようにして得た抽出物を有効成分とし、常法に従って公知の医薬品用、飲食品用、又は医薬部外品用担体と組み合わせて製剤化すれば良い。
【００３０】
本発明のカリン、シナモン、ヨモギ、サフラン、アカメガシワより選ばれる植物の抽出物は骨吸収抑制効果を有することから、体内で骨吸収の割合が増加することを抑えることで、骨の崩壊や深刻な骨疾患である骨粗鬆症、骨転移、リウマチ、歯周病、関節炎等に関わる骨疾患を予防又は治療することができる。これらの植物の抽出物は、人体にとって安全であることから、骨吸収抑制剤、骨吸収用食品及び骨吸収用医薬部外品に含有させて使用することができ、その有益性は非常に高い。
【００３１】
また、本発明の骨吸収抑制剤は、種々の剤型での投与が可能であり、例えば経口投与剤としては、茶剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、ドライシロップ剤等が挙げられる。
【００３２】
本発明の骨吸収抑制剤の製造は、通常、植物抽出物を薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等とすることができる。
【００３３】
医薬用担体は、骨吸収抑制剤の投与形態および剤型に応じて選択することができる。固体組成物からなる経口剤とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等とすることができ、たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。液体組成物からなる経口剤とする場合は、薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、例えば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加してもよい。
【００３４】
一方、非経口剤とする場合は、常法に従い本発明の前記有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。また、固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
【００３５】
さらに上記各製剤には、所望により、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの薬学的に許容される添加物や他の医薬品を含有させることができる。
【００３６】
製剤化に際しては、安定化剤を配合することが好ましい。安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコールなどが挙げられる。
【００３７】
本発明の骨吸収抑制剤の有効成分となる植物抽出液の元となる乾燥重量は、通常成人１日当たり３．１ｍｇ／ｋｇ（体重）以上、好ましくは４．６ｍｇ／ｋｇ（体重）以上を摂取するのが好ましい。具体的には、カリンは２３．１ｍｇ／ｋｇ（体重）以上が好ましく、シナモンは１６．４ｍｇ／ｋｇ（体重）以上が好ましく、ヨモギは２１．６ｍｇ／ｋｇ（体重）以上が好ましく、サフランは３．１ｍｇ／ｋｇ（体重）以上が好ましく、アカメガシワは３０．７ｍｇ／ｋｇ（体重）以上が好ましく、シトラスは２５．２ｍｇ／ｋｇ（体重）以上が好ましく、レモンは３９ｍｇ／ｋｇ（体重）以上が好ましい。一般には、製剤中に含有される前記有効成分の投与量で、もちろん投与量は、種々の条件、例えば抽出溶媒の種類、使用した溶媒の使用量等によっても変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよく、所定期間に渡って行ってもよい。なお、投与量の上限は、1日当たり、２４０ｍｇ／ｋｇ（体重）以下が好ましく、４８０ｍｇ／ｋｇ（体重）以下がより好ましい。
【００３８】
本発明の骨吸収抑制剤としては、本発明に係る前記有効成分を公知の医薬と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。本発明の有効成分は、例えば、活性型ビタミンＤ３製剤、エストロゲン製剤若しくはエストロゲン様物質、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、ビスホスホネート製剤、ビタミンＫ２製剤、カルシウム製剤又はそれらの組み合わせ等と共に使用することができる。これにより、骨吸収抑制に関して相乗効果を期待することができる。
【００３９】
上記のように、本発明の骨吸収抑制用飲食品は、飲食品で通常用いられている任意成分と共に配合することができる。このようなヒトまたは動物用の飲食品としては、例えば、パン類、菓子類、麺類、肉製品・水産加工品、穀類の加工品、加工野菜・加工果実、加工卵、乳製品、粉類、即席菓子の素、食用油脂、スープの素、粉末飲料、調味料、飲料類、飼料等が挙げられる。
【００４０】
また、本発明の骨吸収抑制用飲食品には、例えば、ビタミン剤などの栄養補助食品、栄養補助飲料、動物用健康食品等が含まれ、通常用いられている各種形態、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、フィルム等として製剤化される。製剤化に際しては、骨吸収抑制効果を有する植物抽出物とともに、賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、吸収促進剤、吸着剤、滑沢剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が配合される。
【００４１】
これらの栄養補助食品、栄養補助飲料などは、この分野で通常知られた慣用的な方法により製造される。
【００４２】
このような飲食品における骨吸収抑制効果を有する植物抽出物の添加量は、原料植物ごと、飲食品の形態ごとに応じた範囲で前述した摂取量となるように添加されれば良く、飲食品には、０．００１重量％〜２０．０重量％の範囲内で添加することが好ましい。例えば、液状の飲食品に対し０．０１〜２０．０重量％、固体状の飲食品に対し０．００１〜２０．０重量％、錠剤状の飲食品に対し、０．００１〜２０．０重量％の範囲内で添加することが好ましい。さらに具体的には、コーヒー牛乳には、０．０１〜２０．０重量％、コーヒー豆乳には、０．０１〜２０．０重量％、豆乳には、０．０１〜２０．０重量％、ミルクティーには、０．０１〜２０．０重量％、プリンには、０．００１〜２０．０重量％、キャンディーには、０．００１〜２０．０重量％、ヨーグルトには、０．００１〜２０．０重量％、保健用飲料には、０．０１〜２０．０重量％、ヨーグルト風味酸性乳飲料には、０．００１〜２０．０重量％、機能性烏龍茶には、０．０１〜２０．０重量％、ハードカプセルには、０．００１〜２０．０重量％、ソフトカプセルには、０．００１〜２０．０重量％の範囲内で添加することが好ましい。
【００４３】
また、本発明の骨吸収抑制用医薬部外品としては飴類、歯磨き粉類、液体歯磨き剤類、ジェル状歯磨き剤類、ガム類等が含まれる。また、骨吸収用医薬部外品は、医薬部外品で通常用いられている任意成分と共に配合することができる。
【００４４】
これらの骨吸収抑制用医薬部外品は、この分野で通常知られた慣用的な方法により製造される。
【００４５】
このような骨吸収抑制用医薬部外品における当該植物抽出物の添加量は、原料植物ごと、医薬部外品の形態ごとに応じた範囲で前述した摂取量となるように添加されれば良く、医薬部外品には、０．００１〜２０．０重量％の範囲内で添加することが好ましい。例えば、固体状の医薬部外品に対し、０．００１〜２０．０重量％、液体状の医薬部外品に対し、０．００１〜１０．０重量％、ジェル又はペースト状の医薬部外品に対し、０．００１〜２０．０重量％の範囲内で添加することが好ましい。さらに具体的には、飲料品に対し、０．００１〜２０．０重量％、飴に対し０．００１〜２０．０重量％、歯磨き粉に対し、０．００１〜２０．０重量％、液体歯磨き剤類に対し０．００１〜２０．０重量％、ジェル状歯磨き剤類に対し、０．００１〜１０．０重量％、ガム類に対し０．００１〜１０．０重量％の範囲内で添加することが好ましい。
【実施例】
【００４６】
以下に製造例、試験例及び実施例を挙げ、本発明について更に説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【００４７】
（製造例）
これらの植物を乾燥させる。この乾燥物１０重量部に９９．５％エタノール又はＤＭＳＯを２００重量部加え、室温で時々攪拌しながら３日間抽出し、濾過して、溶媒を留去し、抽出物を得た。これらを試料として以下の試験例の方法により破骨細胞の分化及び活性化に対する阻害能を測定した。破骨細胞の活性化に対する阻害能に関する結果を表１に示し、破骨細胞の分化に対する阻害能に関する結果を図１に示した。
【００４８】
（試験方法及び評価方法）
（酒石酸アルカリホスファターゼ活性の測定）
酒石酸アルカリホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の活性を破骨細胞の活性化として測定し、各植物抽出物の阻害率（％）を算出することにより阻害作用を評価した。ＴＲＡＰ活性を測定するに当たり、Ｗｏｏらの手法にやや改良を加えて行った。すわわち、ＲＡＷ２６４．７細胞をＦＢＳ入りのＭＥＭ−α培地に浮遊させ、４８ウェルプレートに５万細胞/ウェルとなるよう播種し、そのまま２４時間インキュベートした。次に、それらは各植物抽出液を最終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるように添加した。２時間インキュベートをした後で、最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるようにＲＡＮＫＬ（Receptor Activator for Nuclear Factor k B Ligand）を添加することで細胞を刺激し、２日間インキュベートした。培養が終了した際に、培地を取り除き、細胞単層をリン酸緩衝液で２回やさしく洗浄した。その後、細胞は０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶解させた。細胞溶解液の水層に１０ｍＭの酒石酸及び５ｍＭｐ-ニトロフェニルフォスフェートを含むクエン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．６)を添加し、３７度で３０分インキュベートした。反応停止は０．１規定水酸化ナトリウムを加えることで行い、１４２０ＡＲＶＯシリーズ・マルチレーベルカウンターで４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４９】
（ウェスタンブロッティングによるＮＦＡＴｃ１の発現測定）
免疫細胞であるマクロファージが破骨細胞に分化する際に、ＮＦＡＴｃ１タンパクの発現が上昇することが知られている。すなわち、ＮＦＡＴｃ１の発現を指標としてウェスタンブロッティング法にて測定し、各植物抽出物の阻害作用を評価した。また、恒常的に発現することで知られるGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（以下、ＧＡＰＤＨと称する）を標準タンパクとして測定した。
【００５０】
ＲＡＷ細胞は細胞溶解用の緩衝液（１０ｎＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８、 １５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、そしてプロテアーゼ阻害剤）により溶解した。各細胞の溶出液をポリアクリルアミドーＳＤＳゲルで分画を行い、ＢＩＯ  ＣＲＡＦＴ社のセミドライブロッターを用いてニトロセルロース膜にそのタンパク質を転写した。その後、ブロッキング溶液（５％ ノンファット・ドライミルクを０．１％  Ｔｗｅｅｎ-２０を含むリン酸緩衝液も溶かしたもの）中で１時間インキュベートした。膜は、１次抗体と共に４度で一晩インキュベートさせた。膜を洗浄し、ホースラディッシュ結合２次抗体に１時間曝露し、最後にGE Healthcare Bio-sciences社のECL Plus Western Blotting Detection Systemで検出を行った。
【００５１】
（試験結果）
表１の通り、本発明の特定の植物抽出物には、若干程度の差はあるが、破骨細胞の分化及び活性化を抑制する作用を有することが確認され、骨疾患、及び歯周病改善剤として使用できる。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
（処方例）
本発明の植物抽出物を含む歯周病や骨粗鬆症等の骨疾患予防又は改善のための骨吸収抑制剤、骨吸収抑制用飲食品、骨吸収抑制用医薬部外品、又は骨疾患予防又は治療剤の製造上記の評価結果に従い、以下にその処方例を示すが、各処方例は各製品の製造における常法により製造したもので良く、配合量のみを示した。又、本発明はこれらに限定されるわけではない。
【００５４】
上記のようにして得た植物抽出物を医薬部外品に添加することも可能である。このようにして得られた骨吸収抑制用医薬部外品は、骨疾患の予防又は改善効果が期待でき、医薬部外品として有用である。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００５５】
また、上記のようにして得た植物抽出物を通常の飲食物中に添加することも可能である。このようにして得られた骨吸収抑制用飲食物は、日常的に摂取することが可能であり、骨疾患の予防又は改善効果が期待でき、骨疾患の予防又は改善用飲食品として有用である。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【００５６】
また、上記のようにして得た植物抽出物を骨疾患予防又は治療剤に添加することも可能である。このようにして得られた骨疾患予防又は治療剤は、骨疾患の予防又は改善効果が期待でき、医薬組成物として有用である。
下記の成分をゼラチンの皮膜でコーティングした。
【表１９】
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【００５７】
下記の成分をゼラチン及びグリセリンの皮膜でコーティングした。
【表２０】
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【００５８】
本発明の、骨吸収抑制剤等に含まれる植物抽出物は、すでに食品や民間薬として使用されているもので、安全性において特に問題になる点はない。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ウェスタンブロッティング法によりＮＦＡＴｃ１の発現測定結果を示した写真データである。
【図１】
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