(57)【要約】【課題】Ｅ−カドヘリン遺伝子の転写を特異的に抑制し、上皮性のガン細胞を間充織状の形態（転移型）に転換させ、細胞培養下で簡便にカドヘリンの発現のＯＮ／ＯＦＦを制御できる実験系の提供。【解決手段】Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトＥ−カドヘリンプロモーターの塩基配列−２４〜−８５（配列番号１）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＥ−カドヘリン遺伝子遺伝子発現抑制剤。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトＥ−カドヘリンプロモーターの塩基配列−２４〜−８５（配列番号１）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＥ−カドヘリン遺伝子遺伝子発現抑制剤。
【請求項２】
更にβ−アラニン単位を含む請求項１記載のＥ−カドヘリン遺伝子遺伝子発現抑制剤。
【請求項３】
前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基が酸アミドを形成している請求項１〜２のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項４】
前記酸アミドがＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン又はメチルアミノプロピルアミンとの酸アミドである請求項３記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項５】
前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの塩基配列−２４〜−３７（配列番号５）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１〜４のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項６】
前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの塩基配列−２５〜−３３（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項５記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項７】
前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−５４〜−６９（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１〜４のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項８】
前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−５９〜−６７（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項７記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項９】
前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−６０〜−７３（配列番号５）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１〜４のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項１０】
前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−６３〜−７１（配列番号８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項９記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項１１】
前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−７５〜−８４（配列番号９）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１〜４のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項１２】
前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−７６〜−８４（配列番号１０）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１１記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項１３】
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、マウスＥ−カドヘリンプロモーターの塩基配列−２５〜−８９（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＥ−カドヘリン遺伝子遺伝子発現抑制剤。
【請求項１４】
更にβ−アラニン単位を含む請求項１３記載のＥ−カドヘリン遺伝子遺伝子発現抑制剤。
【請求項１５】
前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基が酸アミドを形成している請求項１３〜１４のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項１６】
前記酸アミドがＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン又はメチルアミノプロピルアミンとの酸アミドである請求項１５記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項１７】
前記標的領域がマウスＥ−カドヘリンプロモーターの塩基配列−２５〜−３６（配列番号１３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１３〜１６のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項１８】
前記標的領域がマウスＥ−カドヘリンプロモーターの塩基配列−２６〜−３４（配列番号１４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１７記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項１９】
前記標的領域がマウスＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−５６〜−６９（配列番号１１）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１３〜１６のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項２０】
前記標的領域がマウスＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−５９〜−６７（配列番号１２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１９記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項２１】
前記標的領域がマウスＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−７１〜−８０（配列番号１５）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１３〜１６のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項２２】
前記標的領域がマウスＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−７２〜−７９（配列番号１６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項２１記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【請求項２３】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式（ＨｕＦ）で表される請求項１記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【化１】
2009120531.tif 000032
（ＨｕＦ）
【請求項２４】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式（ＨｕＡ）で表される請求項１又は１３記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【化２】
2009120531.tif 000033
（ＨｕＡ）
【請求項２５】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式（ＨｕＡＲ）で表される請求項１記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【化３】
2009120531.tif 000034
（ＨｕＡＲ）
【請求項２６】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式（ＨｕＢ）で表される請求項１又は１３記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【化４】
2009120531.tif 000035
（ＨｕＢ）
【請求項２７】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式（ＭｓＣ）で表される請求項１３記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【化５】
2009120531.tif 000036
（ＭｓＣ）
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤を含む上皮−間充織転換抑制剤。
【請求項２９】
前記式ＨｕＦ、ＨｕＡ、ＨｕＡＲ、ＨｕＢ、ＭｓＡ、ＭｓＢ、及びＭｓＣからなる群から選ばれる一つで表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤及びそれを含む上皮−間充織転換抑制剤に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤及びそれを含む上皮−間充織転換抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
カドヘリン（Cadherin）は細胞表面に存在し細胞同士の接着を担う糖タンパク質分子である。典型的なカドヘリン（クラシックカドヘリン）の分子は、細胞外の５つのカドヘリンドメイン（カルシウムイオン結合部位を含む）、細胞膜貫通ドメイン、及び保存性の高い細胞内ドメインから成り、細胞膜構造である接着結合（Adherence Junction）の構成分子として細胞接着の形成と維持に関与している。細胞内ドメインにはα・β・γカテニン等のタンパクが結合し、細胞骨格につながっている。
【０００３】
カドヘリンは２量体を形成し、カルシウムイオンの存在下で相手方の細胞の同じ分子と（homophilic）結合して細胞接着分子として機能する。カドヘリンはカルシウムイオン存在下ではトリプシンによるタンパク分解から保護される。
この分子は、竹市雅俊によりカルシウム依存接着システムの一要素として発見され、１９８４年に、本発明者である吉田−野呂知加子と、竹市らによって同定され、カドヘリンと命名された（非特許文献１及び２）。その後、遺伝子クローニング等分子生物学的アプローチが進み、現在ではクラシックカドヘリンはＥ−、Ｎ−、Ｐ−カドヘリンなど２０種類以上が、さらにドメインをもつカドヘリンスーパーファミリーは１２０種類ほどが、ゲノム上に存在することが分かっている。また、細胞や組織の種類によってカドヘリンの機能が異なり、それが細胞の特異的な接着に関係していることが明らかになり、カドヘリンが発生、細胞の形態形成、シナプス形成、シナプスの可塑性など様々な生物現象に関わっていることが示された。
【０００４】
カドヘリンは細胞間接着構造の形成と維持に関わるだけでなく、細胞内シグナル伝達に関与していることもわかっている。その例として挙げられるのはアフリカツメガエル胚を用いた吉田−野呂らの研究である（非特許文献３及び４）。アフリカツメガエルＥ−カドヘリンを過剰発現させた胚は、発生異常となり体の前後軸が正しく形成されないこと、同じ効果はカドヘリンの細胞内ドメインと結合するβカテニンｍＲＮＡ発現をアンチセンスオリゴヌクレオチドによって低下させた場合にも観察されることから、βカテニンは細胞内シグナル分子としても作用し、カドヘリンと結合していない細胞内フリーカテニンは核に移動してＬＥＦ−１転写因子と結合し、様々な発生関連遺伝子を活性化することを明らかにした。βカテニンはＷｎｔシグナル系にも関与している。従ってＥ−カドヘリンはβカテニンを保持することで、細胞内シグナルの適正化・安定化に関与していると考えられた。このように接着分子が細胞内シグナル伝達における原因なのか結果なのかという問題は、本発明者である野呂がずっと注目してきた研究課題である（非特許文献５）。
【０００５】
カドヘリンの機能の低下、消失により、多くのガン細胞において転移が促進されることが分かってきた。特に上皮性のガン細胞は、悪性度が増し転移を起こす状態になると、間充織状の形態を示すようになる。この現象を上皮−間充織転換（Epithelial-Mesenchymal Transition：ＥＭＴ）と言い、ＴＧＦ−β等の刺激によりＥＭＴが起きることが分かっている。ＥＭＴにはＳｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、Ｓｍａｄ、β−ｃａｔｅｎｉｎ等さまざまな細胞内分子ネットワークが関与することが示されているが、最終的にＥ−カドヘリンの発現低下が起きる結果、ガン細胞が原発巣を離脱して転移するようになる。そのため、細胞接着分子でもあるＥ−カドヘリンはガン転移に重要な役割をもつ分子であり、このＥ−カドヘリンの機能を抑制すれば、上皮性のガン細胞を間充織状の形態（転移型）に転換させることができる。
【０００６】
従来、Ｅ−カドヘリン機能の抑制には、機能性モノクローナル抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等を用いるか、又は発現抑制タンパクとして知られるＳｌｕｇ、Ｓｎａｉｌなどのタンパク質を強制発現させる方法が採られていた。またガン細胞の上皮−間充織転換（ＥＭＴ）を誘導するためには、ＴＧＦ−β等の試薬を用いるか、或いは上述のＳｌｕｇ、Ｓｎａｉｌなどのタンパク質の発現を誘導する方法が一般的である。
【０００７】
ピロールイミダゾールポリアミド（以下、Ｐｙ−Ｉｍポリアミド又はＰｙＩｍとも言う）がＤＮＡの塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールできることが報告されている。
【０００８】
ピロールイミダゾールポリアミドは一群の合成化合物であり、芳香族環であるＮ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）及びＮ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）から構成されている（非特許文献６）。ピロールイミダゾールポリアミドは、Ｐｙ及びＩｍを連続してカップリングして合成することができ、γ−アミノ酪酸の存在下で折りたたまれＵ字型のコンフォメーションをとることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献１〜３）。
【０００９】
このような合成ポリアミドは二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に、高い親和性と特異性を以って結合することができる。塩基対の特異的認識はＰｙとＩｍとの１対１の対形成に依存している。即ち、ＤＮＡの副溝内でのＵ字型コンフォメーションにおいて、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対を標的とし、Ｉｍ／ＰｙはＧ−Ｃ塩基対を標的とし、そしてＰｙ／ＰｙはＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の両方を標的とする（非特許文献６）。
【００１０】
一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモータ領域において特異的な認識配列に結合する転写因子をいくつか必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子が遺伝子発現において重要であれば、転写因子の結合を遮断して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。
【００１１】
【特許文献１】特許第３０４５７０６号
【特許文献２】特開２００１−１３６９７４
【特許文献３】ＷＯ０３／０００６８３Ａ１
【非特許文献１】Yoshida-Noro, C., Suzuki, N. and Takeichi, M. (1984) Molecular nature of the calcium-dependent cell-cell adhesion system in mouse teratocarcinoma and embryonic cells studied with a monoclonal antibody. Develop. Biol. 101, 19-27
【非特許文献２】Yoshida, C. and Takeichi, M. (1982) Teratocarcinoma cell adhesion : Identification of a cell surface protein involved in calcium-dependent cell aggregation. Cell 28, 217-224
【非特許文献３】Heasman, J., Crawford, A., Goldstone, K., Garner-Hamrick, P., Gumbiner, B.,McCrea, P., Kintner, C., Yoshida-Noro, C. and Wylie, C. (1994). Overexpression of cadherins and underexpression of b-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos.  Cell 79, 791-803
【非特許文献４】Heasman, J., Ginsberg, D., Geiger, B., Goldstone, K., Pratt, T., Yoshida-Noro, C. and Wylie, C. (1994) A functional test for maternally inherited cadherin in Xenopus shows its importance in cell adhesion at the blastula stage.  Development 120, 49-57
【非特許文献５】Yoshida-Noro, C., Takeichi M. and Okada, T. S. (1985) Detection of the initial step of mesenchymal differentiation of teratocarcinoma cells using the monoclonal antibody ECCD-1. Develop. Growth Differ. 27, 673-678
【非特許文献６】Dervan:Bioorg Med Chem.2001;9:2215-35.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
Ｅ−カドヘリン機能を抑制しガン細胞の上皮−間充織転換（ＥＭＴ）を誘導するために従来用いられていた、機能性モノクローナル抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等を用いる方法、又は発現抑制タンパクとして知られるＳｌｕｇ、Ｓｎａｉｌなどのタンパク質を強制発現させる方法は、Ｅ−カドヘリン遺伝子から発現したｍＲＮＡ及びタンパク質を抑制する手法であるが、その抑制効果は間接的かつ不完全であった。また、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムを用いる方法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。
【００１３】
一方、Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ強制発現系ではシグナル伝達系全体のバランスが変化し、またＳｌｕｇ、Ｓｎａｉｌなどのタンパク質は他の遺伝子プロモータにも結合するため、観察された上皮−間充織転換（ＥＭＴ）がカドヘリン発現抑制の直接的効果かどうかの判定が複雑となっていた。また、これらの方法を用いるためには細胞にこれらの薬剤を導入するための試薬（リポフェクチン等）又はウィルスベクターなどのドラッグデリバリーシステムが必要であり、それらの細胞への影響が無視できず、またヒトに応用する際にはこれらの試薬の混入が問題であった。
【００１４】
また、Ｅ−カドヘリンやＮカドヘリンは発生過程でも重要な分子であるため、ノックアウトマウスを作成すると胎生致死となる。コンディショナルノックアウトを用いて、特定の臓器でＥ−カドヘリンを欠失させガンとの関係を調べている報告はあるが、大がかりな実験系であり、カドヘリン分子の発現・非発現の制御を簡単に行うことはできない。
【００１５】
従って、細胞培養下で簡便にカドヘリンの発現のＯＮ／ＯＦＦを制御できる実験系が望まれている。そしてＥ−カドヘリン遺伝子の発現制御の重要なポイントである転写そのものを特異的に抑制することができれば、上皮性のガン細胞を間充織状の形態（転移型）に転換させることができ、ガン細胞の転移抑制剤、ひいてはガン抑制剤（制癌剤）の開発・スクリーニングに極めて有用であり、そのようなＥ−カドヘリン転写抑制剤の開発が望まれていた。
【００１６】
これまでに、Ｅ−カドヘリンの遺伝子プロモータ領域に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを用いたＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤についての報告はない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、ヒトＥ−カドヘリン遺伝子のプロモータ領域（配列番号１、図１Ｂ及びＣ）又はマウスＥ−カドヘリン遺伝子のプロモータ領域（配列番号２、図１Ａ）の特定の領域に特異的に結合して、ヒト又はマウスＥ−カドヘリン遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドの開発とその薬理効果について鋭意研究した。
【００１８】
そこで、本発明者らは、ヒトＥ−カドヘリンプロモータ領域（配列番号１）の様々な断片を標的とするポリアミド類のうち、
ヒトＥ−カドヘリンプロモータ領域の−２４〜−８５の領域のＣＡＡＴ配列前後及びＥ−ｂｏｘ配列、
好ましくは−２４〜−３７又は−５４〜−６９又は−６０〜−７３の領域、
より好ましくは
−２５〜−３３（ＨｕＢ）又は−５９〜−６７（ＨｕＡ又はＨｕＡＲ）又は−６３〜−７１（ＨｕＦ）の領域
に結合する化合物が、ヒトＥ−カドヘリン遺伝子プロモータの活性を有意に阻害することを見出した。
【００１９】
また、本発明者らは、マウスＥ−カドヘリンプロモータ（配列番号２）の様々な断片を標的とするポリアミド類のうち、
マウスＥ−カドヘリンプロモータ領域の−２５〜−８９の領域のＣＡＡＴ配列前後及びＥ−ｂｏｘ配列、
好ましくは−２５〜−３６又は−５６〜−６９又は−７１〜−８０又は−８２〜−８９の領域、
より好ましくは−２６〜−３４（ＭｓＢ）又は−５９〜−６７（ＭｓＡ）又は−７２〜−７９（ＭｓＣ）の領域
に結合する化合物が、マウスＥ−カドヘリン遺伝子プロモータの活性を有意に阻害することを見出した。
【００２０】
これらのピロールイミダゾールポリアミドが、ヒト肝ガン細胞株及びマウス胚性ガン腫細胞においてＥ−カドヘリン遺伝子の発現を低下させ、かつ細胞形態に上皮−間充織転換様変化をもたらすことを見出し、本発明をなすに至った。
【００２１】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトＥ−カドヘリンプロモーターの塩基配列−２４〜−８５（配列番号１）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＥ−カドヘリン遺伝子遺伝子発現抑制剤。
（２）更にβ−アラニン単位を含む上記（１）記載のＥ−カドヘリン遺伝子遺伝子発現抑制剤。
（３）前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基が酸アミドを形成している上記（１）〜（２）のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（４）前記酸アミドがＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン又はメチルアミノプロピルアミンとの酸アミドである上記（３）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（５）前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの塩基配列−２４〜−３７（配列番号５）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）〜（４）のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（６）前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの塩基配列−２５〜−３３（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（５）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（７）前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−５４〜−６９（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）〜（４）のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（８）前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−５９〜−６７（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（７）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（９）前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−６０〜−７３（配列番号７）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）〜（４）のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（１０）前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−６３〜−７１（配列番号８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（９）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（１１）前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−７５〜−８４（配列番号９）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）〜（４）のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（１２）前記標的領域がヒトＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−７６〜−８４（配列番号１０）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１１）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【００２２】
（１３）Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、マウスＥ−カドヘリンプロモーターの塩基配列−２５〜−８９（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（１４）更にβ−アラニン単位を含む上記（１３）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（１５）前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基が酸アミドを形成している上記（１３）〜（１４）のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（１６）前記酸アミドがＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン又はメチルアミノプロピルアミンとの酸アミドである上記（１５）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（１７）前記標的領域がマウスＥ−カドヘリンプロモーターの塩基配列−２５〜−３６（配列番号１３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１３）〜（１６）のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（１８）前記標的領域がマウスＥ−カドヘリンプロモーターの塩基配列−２６〜−３４（配列番号１４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１７）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（１９）前記標的領域がマウスＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−５６〜−６９（配列番号１１）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１３）〜（１６）のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（２０）前記標的領域がマウスＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−５９〜−６７（配列番号１２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１９）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（２１）前記標的領域がマウスＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−７１〜−８０（配列番号１５）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１３）〜（１６）のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
（２２）前記標的領域がマウスＥ−カドヘリンプロモーターの以下に示す塩基配列−７２〜−７９（配列番号１６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（２１）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【００２３】
（２３）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式（ＨｕＦ）で表される上記（１）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【化１】
2009120531.tif 000003
（ＨｕＦ）
（２４）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式（ＨｕＡ）で表される上記（１）又は（１３）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【化２】
2009120531.tif 000004
（ＨｕＡ）
（２５）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式（ＨｕＡＲ）で表される上記（１）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【化３】
2009120531.tif 000005
（ＨｕＡＲ）
（２６）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式（ＨｕＢ）で表される上記（１）又は（１３）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【化４】
2009120531.tif 000006
（ＨｕＢ）
（２７）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式（ＭｓＣ）で表される上記（１３）記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤。
【化５】
2009120531.tif 000007
（ＭｓＣ）
（２８）上記（１）〜（２７）のいずれか一項記載のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤を含む上皮−間充織転換抑制剤。
（２９）前記式ＨｕＦ、ＨｕＡ、ＨｕＡＲ、ＨｕＢ、ＭｓＡ、ＭｓＢ、及びＭｓＣからなる群から選ばれる一つで表されるピロールイミダゾールポリアミド。
（３０）上記式（ＨｕＦ）で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
（３１）上記式（ＨｕＡ）で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
（３２）上記式（ＨｕＡＲ）で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
（３３）上記式（ＨｕＢ）で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
（３４）上記式（ＭｓＡ）で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
（３５）上記式（ＭｓＢ）で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
（３６）上記式（ＭｓＣ）で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、遺伝子発現を特異的に抑制することができるため化学療法剤のような副作用がなく、また低分子化合物であるためリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない、Ｅ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤を得ることができる。
本発明のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤は、導入試薬やベクターを用いることなく細胞核内に浸透し、二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に高い親和性と特異性をもって結合し特定の遺伝子の発現を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカー）は互いに酸アミド結合で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献１〜３参照）。
【００２６】
例えば、ピロールイミダゾールポリアミドはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって簡便に製造することができる（特許文献３）。固相Ｆｍｏｃ法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、ＤＮＡに対してアルキル化能を有する化合物を必要に応じて導入することもできる。固相Ｆｍｏｃ法は市販のタンパク（ペプチド）合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体（コンジュゲート）を合成することもできる。また、Ｆｍｏｃ法はｔ−ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物（酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む）の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡ（又はそれらの誘導体）との共役体を自動的に合成することも可能である。
【００２７】
上記公知のＦｍｏｃ法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ−アラニン残基（β−アミノプロピオン酸残基）やγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端にβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれＦｍｏｃでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β−アラニン又はγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法により合成することができる。
【００２８】
アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。
【００２９】
固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）との共役体を合成することもできる。ＦＩＴＣは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定のＤＮＡ配列を認識することを証明するために用いることができる。
【００３０】
本発明のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、図１Ａ〜Ｃに示されるヒト又はマウスＥ−カドヘリンプロモーター領域の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（標的領域）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
【００３１】
通常、ＤＮＡのらせん骨格は２種類の溝をつくり、広くて深い溝を主溝（メジャーグルーブ）、狭くて浅い溝を副溝（マイナーグルーブ）と呼んでいる。ここで上記ピロールイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝（マイナーグルーブ）に高い親和性と特異性を以って非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝のＣ−Ｇ塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドのＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中のγ−アミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとる。
【００３２】
副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドのＰｙとＩｍの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対とＰｙ−Ｉｍ対が上述のように対応していないピロールイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。
【００３３】
本発明のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤は、転写開始領域からは遠位の上流に標的領域を有する。即ち本発明のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤は、ヒトＥ−カドヘリンプロモータ領域の−２４〜−８５の領域のＣＡＡＴ配列前後及びＥ−ｂｏｘ配列、好ましくは−２４〜−３７又は−５４〜−６９又は−６０〜−７３の領域、より好ましくは−２５〜−３３又は−５９〜−６７又は−６３〜−７１の領域の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域を標的領域とする。
【００３４】
また、本発明のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤は、マウスＥ−カドヘリンプロモータ領域の−２５〜−８９の領域のＣＡＡＴ配列前後及びＥ−ｂｏｘ配列、好ましくは−２５〜−３６又は−５６〜−６９又は−７１〜−８０の領域、より好ましくは−２６〜−３４又は−５９〜−６７又は−７２〜−７９の領域の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域を標的領域とする。
ヒトＥ−カドヘリン遺伝子調節領域の塩基配列は図１Ｂ、Ｃ及び配列番号１に示す通りである。マウスＥ−カドヘリン遺伝子調節領域の塩基配列は図１Ａ及び配列番号２に示す通りである。
【００３５】
本発明のピロールイミダゾールポリアミド及びそれに関連するピロールイミダゾールポリアミドは、本明細書においては以下のように称されるものとし、
ヒトＥ−カドヘリンＡ（以下ＨｕＡとも言う）
ヒトＥ−カドヘリンＡＲ（以下ＨｕＡＲとも言う）
ヒトＥ−カドヘリンＢ（以下ＨｕＢとも言う）
ヒトＥ−カドヘリンＦ（以下ＨｕＦとも言う）
ヒトＥ−カドヘリンＦ−ＦＩＴＣ（以下ＨｕＦ−ＦＩＴＣとも言う）
ヒトＥ−カドヘリンＧミスマッチ（以下ＨｕＧｍｉｓとも言う）
マウスＥ−カドヘリンＡ（以下ＭｓＡとも言う）
マウスＥ−カドヘリンＡ−ＦＩＴＣ（以下ＭｓＡ−ＦＩＴＣとも言う）
マウスＥ−カドヘリンＢ（以下ＭｓＢとも言う）
マウスＥ−カドヘリンＢ−ＦＩＴＣ（以下ＭｓＢ−ＦＩＴＣとも言う）
マウスＥ−カドヘリンＣ（以下ＭｓＣとも言う）
マウスＥ−カドヘリンＣ−ＦＩＴＣ（以下ＭｓＣ−ＦＩＴＣとも言う）
マウスＥ−カドヘリンＤ（以下ＭｓＤとも言う）
マウスＥ−カドヘリンＥ（以下ＭｓＥとも言う)
ヒトＥ−カドヘリンＡミスマッチ及びマウスＥ−カドヘリンミスマッチ（両者とも同じ化合物であり、以下Ａｍｉｓとも言う）
の構造式、分子量等は下記に示す通りである。
【００３６】
ヒトＥ−カドヘリンＡは分子式C88H106N34O17、分子量１９１２を有し、その標的配列はヒトＥ−カドヘリン遺伝子調節領域の−５４〜−６９の領域（配列番号３）であり、直接的には−５９〜−６７（配列番号４）の９塩基に結合することにより、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制する。
ヒトＥ−カドヘリンＡ（ＨｕＡ）
【化６】
2009120531.tif 000008
ESMS: C88H106N34O17 m/z 理論値:1912.0、測定値:1912.1
【化７】
2009120531.tif 000009
【００３７】
ヒトＥ−カドヘリンＡＲは分子式Ｃ88H106N34O17、分子量１９１２を有し、その標的配列は上記ヒトＥ−カドヘリンＡと同様であるが、γ−アミノ酪酸単位が構成するヒンジ部分がＨｕＡとは反対側に来るように設計したものである。
ヒトＥ−カドヘリンＡＲ（ＨｕＡＲ）
【化８】
2009120531.tif 000010
ESMS: C88H106N34O17 m/z 理論値:1912.0、測定値:1912.2
【化９】
2009120531.tif 000011
【００３８】
ヒトＥ−カドヘリンＢは分子式C87H105N35O17、分子量１９１３を有し、その標的配列はヒトＥ−カドヘリン遺伝子調節領域の−２４〜−３７（配列番号５）の領域であり、直接的には−２５〜−３３（配列番号６）の９塩基に結合することにより、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制する。
ヒトＥ−カドヘリンＢ（ＨｕＢ）
【化１０】
2009120531.tif 000012
ESMS: C87H105N35O17 m/z 理論値:1913.0、測定値:1913.0
【化１１】
2009120531.tif 000013
【００３９】
ヒトＥ−カドヘリンＦは分子式C87H105N35O17、分子量１９１３を有し、その標的配列はヒトＥ−カドヘリン遺伝子調節領域の−６０〜−７３の領域（配列番号７）であり、直接的には−６３〜−７１（配列番号８）の９塩基に結合することにより、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制する。
ヒトＥ−カドヘリンＦ（ＨｕＦ）
【化１２】
2009120531.tif 000014
ESMS: C87H105N35O17 m/z 理論値:1913.0、測定値:1913.0
【化１３】
2009120531.tif 000015
ヒトＥ−カドヘリンＦ−ＦＩＴＣは上記ヒトＥ−カドヘリンＦのアセチル末端にＦＩＴＣ部分が結合したもので、分子式C109H119N37O22S、分子量２３３１を有し、その標的配列は上記ＨｕＦと同様である。
ヒトＥ−カドヘリンＦ−ＦＩＴＣ（ＨｕＦ−ＦＩＴＣ）
【化１４】
2009120531.tif 000016
【００４０】
ヒトＥ−カドヘリンＧミスマッチは分子式C85H103N37O17、分子量1915と下記の構造を有し、ヒトＥ−カドヘリン遺伝子調節領域の−７５〜−８４（配列番号９）の領域、直接的には−７６〜−８４（配列番号１０）の９塩基に対するミスマッチとして設計された。
ヒトＥ−カドヘリンＧミスマッチ（ＨｕＧｍｉｓ）
【化１５】
2009120531.tif 000017
ヒトＥ−カドヘリンＡミスマッチは分子式C88H106N34O17、分子量１９１２と下記の構造を有し、ＨｕＡの標的配列に対するミスマッチとして設計された。なおこのミスマッチはマスウＥ−カドヘリンＡミスマッチ、即ちＭｓＡの標的配列に対するミスマッチと同じ構造の化合物である。
ヒトＥ−カドヘリンＡミスマッチ（Ａｍｉｓ）
【化１６】
2009120531.tif 000018
【００４１】
マウスＥ−カドヘリンＡは分子式C88H106N34O17、分子量１９１２を有し、その標的配列はＥ−カドヘリン遺伝子調節領域の−５６〜−６９の領域（配列番号１１）であり、直接的には−５９〜−６７（配列番号１２）の９塩基に結合することにより、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制する。なお、マウスＥ−カドヘリンＡ（ＭｓＡ）は上記のヒトＥ−カドヘリンＡ（ＨｕＡ）と同一の化合物である。
マウスＥ−カドヘリンＡ（ＭｓＡ）
【化１７】
2009120531.tif 000019
ESMS: C88H106N34O17 m/z 理論値:1912.0、測定値:1912.1
【化１８】
2009120531.tif 000020
マウスＥ−カドヘリンＡ−ＦＩＴＣは上記マウスＥ−カドヘリンＡのアセチル末端にＦＩＴＣ部分が結合したもので、分子式C110H120N36O22S、分子量２３３０を有し、その標的配列は上記ＭｓＡと同様である。
【００４２】
マウスＥ−カドヘリンＡ−ＦＩＴＣ（ＭｓＡ−ＦＩＴＣ）
【化１９】
2009120531.tif 000021
ESMS: C110H120N36O22S m/z 理論値:2330.4、測定値:2330.1 
【化２０】
2009120531.tif 000022
【００４３】
マウスＥ−カドヘリンＢは分子式C87H105N35O17、分子量１９１３を有し、その標的配列はマウスＥ−カドヘリン遺伝子調節領域の−２５〜−３６の領域（配列番号１３）であり、直接的には−２６〜−３４（配列番号１４）の９塩基に結合することにより、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制する。なお、マウスＥ−カドヘリンＢ（ＭｓＢ）は上記のヒトＥ−カドヘリンＢ（ＨｕＢ）と同一の化合物である。
マウスＥ−カドヘリンＢ（ＭｓＢ）
【化２１】
2009120531.tif 000023
ESMS: C87H105N35O17 m/z 理論値:1913.0、測定値:1913.0
【化２２】
2009120531.tif 000024
マウスＥ−カドヘリンＢ−ＦＩＴＣは上記マウスＥ−カドヘリンＢのアセチル末端にＦＩＴＣ部分が結合したもので、その標的配列は上記ＭｓＢと同様である。
マウスＥ−カドヘリンＢ−ＦＩＴＣ（ＭｓＢ−ＦＩＴＣ）
【化２３】
2009120531.tif 000025
【００４４】
マウスＥ−カドヘリンＣは分子式C75H93N31O15、分子量１６６９を有し、その標的配列はマウスＥ−カドヘリン遺伝子調節領域の−７１〜−８０の領域（配列番号１５）であり、直接的には−７２〜−７９（配列番号１６）の８塩基に結合することにより、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制する。
マウスＥ−カドヘリンＣ（ＭｓＣ）
【化２４】
2009120531.tif 000026
ESMS: C75H93N31O15 m/z 理論値:1668.7、測定値:1668.6
【化２５】
2009120531.tif 000027
マウスＥ−カドヘリンＣ−ＦＩＴＣは上記マウスＥ−カドヘリンＣのアセチル末端にＦＩＴＣ部分が結合したもので、その標的配列は上記ＭｓＣと同様である。
マウスＥ−カドヘリンＣ−ＦＩＴＣ（ＭｓＣ−ＦＩＴＣ）
【化２６】
2009120531.tif 000028
マウスＥ−カドヘリンＤは分子式C47H61N19O9、分子量１０３６と下記の構造を有し、マウスＥ−カドヘリン遺伝子調節領域の−３８〜−４２の領域の５塩基を標的配列として設計された。
マウスＥ−カドヘリンＤ（ＭｓＤ）
【化２７】
2009120531.tif 000029
【００４５】
マウスＥ−カドヘリンＥは分子式C75H93N31O15、分子量１６６９と下記の構造を有し、マウスＥ−カドヘリン遺伝子調節領域の−８２〜−８９の領域（配列番号１７）の８塩基を標的配列として設計された。
マウスＥ−カドヘリンＥ（ＭｓＥ）
【化２８】
2009120531.tif 000030
ESMS: C75H93N31O15 m/z 理論値:1668.7、測定値:1668.8
【化２９】
2009120531.tif 000031
【００４６】
上皮−間充織転換（ＥＭＴ）は発生中に見られる基本的なプロセスであり、上皮細胞の細胞接着が低下し、伸張した形態を有する間充織細胞となり、移動性を獲得して下部の結合組織（細胞外マトリックス）へと浸潤していく現象である。この現象はガン細胞の転移現象とよく似ており、転移防止の観点から多くの研究が行われている。この現象と関連する主たる遺伝子として知られているのが、上皮細胞の細胞接着を担うＥ−カドヘリンである。最終的にはＥ−カドヘリンの発現が低下することで、細胞は接着性を失い、ＥＭＴ及び転移を開始することは明らかである。その発現低下のきっかけとなるＥＭＴ関連分子群としてＳｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、ＳＩＰ１などのカドヘリン抑制転写因子やそれらの発現を活性化するＴＧＦ−β／Ｓｍａｄシグナルの関与なども調べられている。βカテニンやＬＥＦ−１転写因子及びＴｗｉｓｔ転写因子によるＮ−カドヘリン発現誘導もＥＭＴに関与していると言われている。しかし、これらのうちどれが最初のキーとなる分子であるのかについては議論となっているところである。これまでのところ、ＴＧＦ−β／ＳｍａｄシグナルとＳｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ関連分子群の発現がＥＭＴの最初の引き金であり、Ｅ−カドヘリンの発現低下はその結果であるという報告がほとんどである。それはこれまで直接Ｅ−カドヘリンの転写を抑制する研究方法がなかったからである。
【００４７】
このような細胞接着分子とＥＭＴの関係を調べる研究を行うためには、接着分子の発現を人為的に操作できる系が必要とされる。従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡを用いる方法は、既に転写された細胞内ｍＲＮＡプールを破壊するという手法であり、ｍＲＮＡを完全には除去できず、およそ半減するといった程度の効率である。また細胞に導入するには通常リポフェクトアミン等の導入試薬やガラス針による注入、電気による導入等を必要とする。これらはそれ自体が細胞を刺激し、シグナル伝達のきっかけになる可能性がある。
【００４８】
それに比べると本発明のＥ−カドヘリンプロモータ部位に結合するピロールイミダゾールポリアミドは直接転写を抑えるメカニズムによりｍＲＮＡ発現を効率良く抑制し、しかも低分子有機化合物なので、導入試薬なしに直接培養に添加することで細胞核内に移行し効果を得ることができる。
【００４９】
ピロールイミダゾールポリアミドは低分子有機化合物であり、導入試薬なしに細胞核内に浸透し、ＤＮＡ二重らせんの副溝（マイナーグルーブminor groove）中の特定の塩基対に高い親和性と特異性をもって結合することができる。
【００５０】
本発明者らはＥ−カドヘリンプロモータの特定の領域を標的とするＰｙ−Ｉｍポリアミド類を合成した。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムと比較して、ポリアミドはよりすぐれた透過性（低濃度、トランスフェクション媒体不要）とより高い安定性をヒト肝ガン細胞株及びマウス胚性ガン腫細胞において示した。本発明はポリアミドの高い透過性と安定性は遺伝子治療法のための真核細胞の核への理想的な薬剤アプローチを提供するものである。
【００５１】
Ｅ−カドヘリン遺伝子（ヒト及びマウス）の発現制御部位に対する本発明のピロールイミダゾールポリアミドをヒト肝ガン細胞株ＨｅｐＧ２細胞株及びマウス胚性ガン腫細胞の培養系に加えると、添加後２４時間以内に細胞核に集積し、Ｅ−カドヘリン遺伝子発現が抑制され、上皮−間充織転換が引き起こされる効果が認められた。この効果は配列特異的かつ濃度依存的である。添加４日後までには、細胞は大きな形態変化を示すが、この間細胞増殖度にはほとんど影響がなかった。また発現制御部位付近のいくつかの部位に対して設計したポリアミドを比較した結果、配列依存的に上述の効果があることが判明し、また効果の濃度依存性も確認された。効果は、適切な時期に培養液から薬剤を除去することにより可逆性を示した。一方、マウスの相同部位の配列に対するポリアミドをマウス胚性ガン腫細胞に添加すると、カドヘリン遺伝子の発現が抑制され、この細胞の上皮様形態及び未分化性が消失して間充織様細胞へと分化した。本発明の配列のピロールイミダゾールポリアミドを用いることにより、Ｅ−カドヘリンの発現を顕著に抑制することができ、またその結果ヒト肝ガン細胞に２４時間以内に、増殖抑制なしに上皮−間充織転換を誘導することができた。細胞増殖度に対する影響はほとんど認められなかった。
【実施例】
【００５２】
Ｉ．Ｐｙ−Ｉｍポリアミドの設計と合成
（１）Ｅ−カドヘリンプロモータに対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの設計
Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとして、ヒトＥ−カドヘリンプロモータにおいて、転写開始点上流−２５から−８４のＣＡＡＴ配列前後及びＥ−ｂｏｘ配列を主なターゲットとした。特に、転写開始点上流−２５〜−３３、−５９〜−６７、−６３〜−７１、−７６〜−８４の塩基対にそれぞれ結合するように、上記のようなＨｕＢ、ＨｕＡ（及びＨｕＡＲ）、ＨｕＦ、ＨｕＧｍｉｓを設計、合成した。また、マウスＥ−カドヘリンプロモータの−２６〜−３４、−５９〜−６７、−７２〜−７９、−８２〜−８９の塩基対にそれぞれ結合するように、上記のようなＭｓＢ、ＭｓＡ（及びＭｓＡ−ＦＩＴＣ）、ＭｓＣ、ＭｓＥを設計、合成した。また、ＨｕＡ及びＭｓＡのミスマッチであるＡｍｉｓも設計、合成した。
【００５３】
（２）Ｆｍｏｃ法を用いたＰｙ−Ｉｍポリアミドのマシンアシスト（機械補助）自動合成
ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）（アプライドバイオシステムズ）を用いて０．１ｍｍｏｌスケール（２００ｍｇのＦｍｏｃ−β−アラニン−ＣＬＥＡＲ酸レジン、０．５０ｍｅｑ／ｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）で実施した。自動固相合成はＤＭＦ洗浄、Ｆｍｏｃ基の２０％ピペリジン／ＤＭＦによる除去、ＤＭＦ及びメタノール洗浄、ＨＣＴＵ及びＤＩＥＡ（それぞれ４当量）の存在下でのモノマーとの６０分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸／ピリジンによる保護、及び最終的なＤＭＦ洗浄からなっている。Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは一般に中程度の収率（１０−３０％）で得られた。
【００５４】
ＦＩＴＣカップリング：  ４倍過剰のイソチオシアネート化されたフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡをＤＭＦに溶解したものをカラムを通して６０分間フラッシュした。
一般的手順：  Ｆｍｏｃ−β−アラニン−Ｗａｎｇ樹脂のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をＤＭＦで連続的に洗浄した。カップリング工程をＦｍｏｃアミノ酸で実施し、次いでＤＭＦでの洗浄を行った。これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。カップリング工程を終えた後、必要に応じてＮ末端アミノ基を保護するか又はＦＩＴＣでカップリングし、ＤＭＦで洗浄し、反応容器を取りはずした。
【００５５】
カルボン酸としての分解：  合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（９１％ＴＦＡ−３％／ＴＩＳ−３％ＤＭＳ−３％水の混合物５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ）の後に単離した。
【００５６】
アミンとしての分解：  合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ、５０℃、一晩）の後に単離した。
【００５７】
精製：  最終精製は、１０ｍｌ／ｍｉｎの流速の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水又は０．１％ＡｃＯＨ／水）中Ｂ（アセトニトリル）の直線勾配を用いて、３５０ｎｍのＵＶ検出により行った。
得られたＨｕＡ、ＨｕＡＲ、ＨｕＢ、ＨｕＦ、ＨｕＧｍｉｓ、及びＭｓＡ、ＭｓＡ−ＦＩＴＣ、ＭｓＢ、ＭｓＣ、ＭｓＥのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造確認データを図２〜図１１にそれぞれ示す。また、Ａｍｉｓについてのデータも図１２−１に示す。また、ＨｕＦ−ＦＩＴＣ、ＭｓＢ−ＦＩＴＣ、ＭｓＣ−ＦＩＴＣ、ＭｓＤについてのデータも図１２−２、図１２−３、図１２−４、図１２−５にそれぞれ示す。
【００５８】
ＩＩ．ヒトＥ−カドヘリンＰｙ−Ｉｍポリアミドの細胞に対する効果
（１）ＨｅｐＧ２細胞株の上皮−間充織転換（ＥＭＴ）
上皮形態を持つヒト肝臓ガンＨｅｐＧ２細胞株をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培養液で培養下、５μＭのＰｙ−Ｉｍポリアミド（ＤＭＳＯに溶解したストックを培地に対して千分の一添加）を培養開始時（０．５％トリプシン１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ３７℃１５分処理、培養液で一度洗った後播種、２．５ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／直径６ｃｍ培養皿  培養液２ｍｌ）から添加し、１〜４日目の継時変化を観察した。図１３に示すように、ＨｕＡ及びＨｕＦ添加においては１日目から細胞の形態が変化して間充織細胞様となり、３日目には顕著に間充織細胞形態をとるようになった。４日目には完全に間充織形態となり、ＨｕＡやＨｕＦ添加では長く伸張した細胞も観察されるようになった。ＨｕＡよりはＨｕＦの効果がより顕著で、ＨｕＢにも少しその効果があったが、ＨｕＡのミスマッチＨｕＡｍｉｓ（２塩基分の配列が不合）及びＨｕＧｍｉｓには全く効果がなく、コントロールであるＤＭＳＯ（培地に千分の一量添加）及び無添加の正常培地における形態と同じであった。ＨｕＡのヒンジ部分を反対側に設計したＨｕＡＲは、ＨｕＡと同じ効果を示した。
【００５９】
この実験と同時に、ＨｅｐＧ２細胞株の増殖に対するＰｙ−Ｉｍポリアミドの影響を見たところ、ほとんど影響がなかった（図１４）。すなわちこれらのＰｙ−Ｉｍポリアミドは増殖に影響を及ぼさずに（細胞毒性なく）、ＥＭＴを引き起こすことがわかった。従って、この系はガン転移のモデル系として最適である。
【００６０】
次に、効果の見られたＨｕＡ、ＨｕＢ、ＨｕＦについて１〜２０μＭの間で濃度を変えて、上記と同様に培養に添加し、２日目と４日目に観察したところ、それぞれ図１５及び１６のように種類によって効果濃度に差が見られた。一番効果の高いのはＨｕＦであり、１μＭでも効果が見られた。ＨｕＡは５μＭ以上、ＨｕＢは１０μＭ以上で効果があった。
【００６１】
（２）効果の可逆性
この形態変化に関するＰｙ−Ｉｍポリアミドの効果は可逆的であり、培養液からＰｙ−Ｉｍポリアミドを除去することにより細胞形態はある程度元に戻った。ＨｕＡ、Ｈｕ  Ｂ、及びＨｕＦ添加の培養系について５μＭ添加培養後１日目及び２日目で培地を交換してＤＭＳＯコントロール培地とし、さらに２日間培養して観察した結果を図１７に示す。培養１日目にＰｙ−Ｉｍポリアミドを除去すると２日経過後に細胞はほとんど元の形態に戻った。２日目に除去した場合は若干戻りが悪かった。さらに添加培養後４〜５日目に除去した場合は戻る効率が悪くなった。従って、ある程度初期の段階でＥＭＴが開始した時点であれば、このＥＭＴプロセスは可逆的であり、Ｐｙ−Ｉｍポリアミド除去により元に戻る段階にあることがわかった。このことはこの試薬がＥＭＴをＯＮ／ＯＦＦする良い指令となることを示している。
【００６２】
（３）E−カドヘリンの発現抑制
次に実際にこれらの試薬がＥ−カドヘリンの発現を抑制しているかどうかについて、ＲＴ−ＰＣＲによって調べた。細胞にＰｙ−Ｉｍポリアミド添加培養後適当な時期に細胞をスクレイパーで剥がしとり、洗浄後集めて液体窒素で急速凍結保存した。ＲＮＡはＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｍｉｎｉキットで精製し（ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ処理によりゲノムＤＮＡを除去）、定量後０．３μｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡよりｃＤＮＡを合成した（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。Ｅ−カドヘリンのプライマーでＰＣＲ（５５℃  アニール、３５サイクル）を行ったところ、図１８に示すようにＨｕＡ、ＨｕＢ、ＨｕＦではＨｕＧｍｉｓに比べて発現が大きく（８割以上）抑制されていることが分かった。したがって細胞観察によるＥＭＴ形態とカドヘリンの発現抑制との間には相関があると考えられる。
【００６３】
上記実験はＰｙ−Ｉｍポリアミドを１０μＭ添加培養した系で行ったが、さらに詳細に５μＭ添加培養後の過程を追ったＲＴ−ＰＣＲにより、ＨｕＦによるカドヘリンの抑制は１日目には起こっており、３日目にはＥＭＴ関連として知られる制御因子Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、Ｔｗｉｓｔ等の発現上昇が見られることが分かった。この結果より添加後２日目まではまだＥＭＴ転換途上にあると考えられ、この間にＰｙ−Ｉｍポリアミドを除去するとＥＭＴ反応が戻るという観察と合致する。
ＩＩＩ．マウスＥ−カドヘリンＰｙ−Ｉｍポリアミドの細胞に対する効果
（１）目的
マウスＥ−カドヘリンのプロモータに対して設計したＰｙ−ＩｍポリアミドのＥ−カドヘリン発現抑制効果及び胚性がん腫細胞の分化誘導への影響を調べた。
（２）方法
上皮様形態を持つテラトカルシノーマ未分化幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＥＣ）細胞）ＡＴ８０５株を用い、培養液（１５％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ）中にマウスＥ−カドヘリンプロモーター領域配列に対して設計したＰｙ−Ｉｍポリアミド（ＤＭＳＯに溶解して培養液の１／１０００量を添加）１０μＭを添加して、継時的に細胞形態を観察した（コントロールはＤＭＳＯのみ添加及び通常培地）。一定時間後に細胞を回収し、ＲＴ−ＰＣＲ法及び免疫組織学的方法により、Ｅ−カドヘリンの発現量の変化や、Ｏｃｔ３／４、Ｃｒｉｐｔｏ、ＡＬＰ、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｃｄｘ２、Ｇａｔａ６、ＡＦＰ、ＦＧＦ５、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｐａｘ６等の幹細胞分化マーカーの発現を調べ、細胞分化への効果及び分化の方向性を検討した。
（３）結果
ＣＡＡＴ−ｂｏｘに対するＭｓＡを培養開始後２４時間目に添加すると、添加後２４時間後には劇的にＥＣ細胞形態に変化が見られ、添加後４８時間後には別の種類の細胞が出現し、細胞分化が起こったことがわかる（図１９及び２０参照）。
一方Ｅ−ｂｏｘに対するＭｓＢ及びＥ−ｐａｌに対するＭｓＣ添加ではあまり形態変化が観察されなかったが、若干細胞間隙が拡がる現象が観察された。
添加のタイミングを２４時間後から９時間〜０時間と変化させた結果、Ｐｙ−Ｉｍポリアミドの効果には培養開始と添加のタイミングが重要であり、培養開始と同時（０時間）の添加が最も効果が顕著であることがわかった（図２１及び２２参照）。
ＭｓＡには細胞が離れて拡がる効果、ＭｓＢには細胞が丸くなる効果、ＭｓＣには細胞間隙が拡がる効果が見られた。ＭｓＤにはそれらの効果が認められなかったので、これらのＰｙ−Ｉｍポリアミドの効果は配列特異的であることが示唆された。
添加培養後３６時間後にマウスＥ−カドヘリンのｍＲＮＡ発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで調べたところ、ＭｓＡ、ＭｓＢ、ＭｓＣともに発現が低下していること、ＭｓＤでは低下していないことがわかった。形態ではＭｓＡ添加で一番変化があったが、発現抑制に関してはＭｓＢ添加で一番効果が認められた（図２３参照）。
また、様々な分化マーカー遺伝子について発現変化をＲＴ−ＰＣＲで調べたところ、ＭｓＡ添加では間充織細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ）のマーカーであるＳｌｕｇ遺伝子の発現が若干上昇していた。この結果から、上皮様幹細胞であるＥＣ細胞から間充織細胞への転換・分化が起こっていることがわかり、ヒトＥ−カドヘリンに対するＰｙ−Ｉｍポリアミドのヒト肝がん細胞への効果との共通性が示唆された。また、細胞毎の反応結果を見るために、抗体を用いて免疫組織化学的染色を行ったところ、形態が変化した細胞では抗カドヘリン抗体（ＥＣＣＤ−２）による染色が見られなかった（図２４参照）。図２４中、濃い茶色がカドヘリンを発現している細胞である。このことからタンパク質レベルでもカドヘリン発現の抑制が起こっていることが確認され、またカドヘリン発現抑制と細胞分化との相関が示唆された。
なおマウスのＰｙ−ＩｍポリアミドのＰｙとＩｍの配列設計に関しては図１Ａに記載されている。
また、ゲルシフトアッセイでプロモータ配列がＰｙ−Ｉｍポリアミドに結合すること（図２５）、及び一例として蛍光標識したＭｓＣ（ＦＩＴＣ−Ｃ）が細胞核に集積すること（図２６）も確認済みである。
ＭｓＡ、ＭｓＢ、ＭｓＣについてマウスプロモータＣＡＡＴ配列近傍（ＭｓＡ、ＭｓＣ配列を含みＭｓＢを含まない）オリゴＤＮＡと反応させ、結合して分子量が増加するかどうか（シフト）を調べた。１０ｐｍｏｌ  ＭｓＡ又はＭｓＣ添加でシフトが見られたが、ＭｓＢではシフトしなかった。１００ｐｍｏｌ添加では量比が均等でないためか、非特異的な移動が見られた。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明のＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制剤は、上皮性のガン細胞を間充織状の形態（転移型）に転換させることができる。この転換はガン転移に重要なプロセスである。ガンの転移を防止できれば、外科的切除により効率良くガンの克服が可能となる。本薬剤によるヒトＥ−カドヘリン遺伝子発現抑制及び上皮−間充織転換誘導系はガン転移の分子メカニズム解明研究に役立つ。本発明の試薬を用いて、ガン転移悪性化の初期プロセスにおける遺伝子ネットワークを解析し、そのシステムを明らかにすることができれば、転移防止薬剤の開発につなげることができる。
【００６５】
また、現在先端的な製薬会社では、コンビナトリアル・ケミストリーによって作られた数十万から数百万の化合物ライブラリを持っており、その中から新薬の候補となるリード化合物を見つけるために、アッセイロボット等を利用したハイスループットスクリーニングを行っている。このうち約５０％は、細胞を利用したアッセイである。従って効率良くリード化合物を見つけるためには、良い細胞アッセイ系、即ち迅速な細胞反応で、かつ顕微鏡下に細胞形態等で、薬剤の効果を判断できる系の開発が必須である。
【００６６】
本発明のピロールイミダゾールポリアミドは、ガンの悪性化前段階における転移防止薬の細胞スクリーニング系の開発に利用できる。本発明は、基礎研究のみならず、ガン転移予防薬開発研究や再生医療研究などのトランスレーショナルリサーチにも有用な研究用試薬としての価値がある。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１Ａ】マウスＥ−カドヘリン遺伝子調節領域の塩基配列を示す。
【図１Ｂ】ヒトＥ−カドヘリン遺伝子のプロモータ領域の塩基配列を示す。
【図１Ｃ】ヒトＥ−カドヘリン遺伝子のプロモータ領域の塩基配列を示す。
【図２】ＨｕＡのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図３】ＨｕＡＲのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図４】ＨｕＢのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図５】ＨｕＦのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図６】ＨｕＧｍｉｓのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図７】ＭｓＡのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図８】ＭｓＡ−ＦＩＴＣのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図９】ＭｓＢのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図１０】ＭｓＣのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図１１】ＭｓＥのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図１２−１】ＡｍｉｓのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図１２−２】ＨｕＦ−ＦＩＴＣのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図１２−３】ＭｓＢ−ＦＩＴＣのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図１２−４】ＭｓＣ−ＦＩＴＣのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図１２−５】ＭｓＤのＨＰＬＣ分析による純度、及びエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）による構造データを示す。
【図１３】ヒトＥ−カドヘリンＰｙ−ＩｍポリアミドによるＨｅｐＧ２細胞株の上皮−間充織転換の継時変化を示す。
【図１４】ＨｅｐＧ２細胞株の増殖に対するヒトＥ−カドヘリンＰｙ−Ｉｍポリアミドの影響を示す。
【図１５】ＨｕＡ、ＨｕＢ、ＨｕＦによるＨｅｐＧ２細胞株の上皮−間充織転換の継時変化（２日目）を示す。
【図１６】ＨｕＡ、ＨｕＢ、ＨｕＦによるＨｅｐＧ２細胞株の上皮−間充織転換の継時変化（４日目）を示す。
【図１７】Ｐｙ−Ｉｍポリアミドの効果の可逆性を示す。
【図１８】ｍＲＮＡ発現の抑制を調べるＰＣＲの結果を示す。
【図１９】マウスＥ−カドヘリンＰｙ−Ｉｍポリアミドによる胚性がん腫細胞ＡＴ８０５株の分化誘導を示す（培養２４時間＋ＰｙＩｍ２４時間）。
【図２０】マウスＥ−カドヘリンＰｙ−Ｉｍポリアミドによる胚性がん腫細胞ＡＴ８０５株の分化誘導を示す（培養２４時間＋ＰｙＩｍ４８時間）。
【図２１】マウスＥ−カドヘリンＰｙ−Ｉｍポリアミドによる胚性がん腫細胞ＡＴ８０５株の分化誘導を示す（培養０時間＋ＰｙＩｍ３０時間）。
【図２２】マウスＥ−カドヘリンＰｙ−Ｉｍポリアミドによる胚性がん腫細胞ＡＴ８０５株の分化誘導を示す（培養０時間＋ＰｙＩｍ６０時間）。
【図２３】Ｐｙ−ＩｍポリアミドのマウスＥ−カドヘリンｍＲＮＡ発現への影響を示す。
【図２４】抗マウスＥ−カドヘリン抗体による免疫組織染色を示す。
【図２５】マウスＥ−カドヘリンＰｙ−Ｉｍポリアミドのゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図２６】マウスＥ−カドヘリンＰｙ−Ｉｍポリアミドの細胞核への集積を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
2009120531.tif 000041
【図４】
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【図５】
2009120531.tif 000043
【図６】
2009120531.tif 000044
【図７】
2009120531.tif 000045
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2009120531.tif 000049
【図１２−１】
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【図１２−２】
2009120531.tif 000051
【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３】
2009120531.tif 000055
【図１４】
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【図１５】
2009120531.tif 000057
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2009120531.tif 000061
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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