(57)【要約】【課題】  二本鎖ＤＮＡの精製のための方法の提供。【解決手段】  他の構成成分との混合物中にＤＮＡを含む溶液を、前記ＤＮＡ上に存在する特定の配列とハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを共有結合により結合させてある支持体に通して、三重らせんを形成させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
他の構成成分と混ざっている環状二本鎖ＤＮＡを含む溶液を、前記ＤＮＡ中に存在する特定のホモプリン／ホモピリミジン配列とのハイブリダイゼーションにより三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドが共有結合したクロマトグラフィー用支持体に通す少なくとも一つの精製段階を含み、前記オリゴヌクレオチドが１０と３０の間の長さを有することを特徴とする、環状二本鎖ＤＮＡに基づく医薬の製造方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡを含む溶液が細胞溶解物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞溶解物が透明溶解物であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
二本鎖ＤＮＡが予め精製されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
特定の配列が二本鎖ＤＮＡ内に人工的に組み込まれていることを特徴とする、請求項１〜４の内の一つに記載の方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドがポリ（ＣＴＴ）配列を含み、かつＤＮＡ中に存在する特定の配列がポリ（ＧＡＡ）配列であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが配列ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ（配列番号１）を保持することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが配列（ＣＴＴ）７（配列番号２６）を保持することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡ中に存在する特定の配列が配列（ＧＡＡ）７、（ＧＡＡ）１４、もしくは（ＧＡＡ）１７を含むことを特徴とする、請求項７もしくは８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ中に存在する特定の配列が配列番号５の配列を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号６もしくは配列番号７の配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ中に存在する特定の配列が配列番号１７の配列を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号１８の配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ中に存在する特定の配列が配列（ＧＡ）２５を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号１９の配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
特定の配列が二本鎖ＤＮＡ中に天然に存在する特定の配列であることを特徴とする、請求項１〜４の内の一つに記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ内に天然に存在する特定の配列が、プラスミドの複製起点内に存在するホモプリン−ホモピリミジン配列であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
特定のＤＮＡ配列が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点ＣｏｌＥ１内に存在する配列番号２の配列の全部もしくは部分を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが配列番号３の配列を含むことを特徴とする、請求項１５の方法。
【請求項１７】
特定のＤＮＡ配列が、プラスミドｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子内に存在する配列番号４の配列もしくは配列番号８の配列の内の全部もしくは部分を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドが、ジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミド、もしくはアミン結合を通してクロマトグラフィー用支持体に連結されることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドが炭素鎖（ＣＨ２）ｎ［式中、ｎは１〜１８までの間の整数である］からなるアームを介してクロマトグラフィー用支持体に連結され、前記アームがリン酸を通してオリゴヌクレオチドに、次いでアミド結合を通してカラムに連結することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アームが６つの炭素原子を含む直鎖状炭素鎖でできていることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
アームが１２の炭素原子を含む直鎖状炭素鎖でできていることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの化学的改変を保持し、そのことによりそのオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して耐性となるか、もしくはヌクレアーゼに対して保護されるか、または特定の配列に対する親和性を増加させることとなることを特徴とする、請求項１から２１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドが、少なくとも一つのシトシンがメチル化されているホモピリミジン配列を保持することを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＤＮＡが更に一つもしくは複数の導入遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１から２３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２５】
二本鎖ＤＮＡが例えばプラスミドのような環状ＤＮＡであることを特徴とする、請求項１から２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２６】
二本鎖ＤＮＡ内に存在する特定の配列がオリゴヌクレオチドとのハイブリダーゼーションのための数々の位置を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
医薬が、０．５％を下回るかもしくはそれに等しい染色体ＤＮＡ含有量を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
医薬が、０．２％を下回るかもしくはそれに等しい染色体ＤＮＡ含有量を有することを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
医薬が、０．１％を下回るかもしくはそれに等しい染色体ＤＮＡ含有量を有することを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
他の構成成分と混ざっているプラスミドＤＮＡを含む溶液を、前記ＤＮＡに存在する特定のホモプリン／ホモピリミジン配列とのハイブリダイゼーションにより三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドが共有結合したクロマトグラフィー用支持体に通す少なくとも一つの段階を含み、前記オリゴヌクレオチドが１０から３０の間の長さを有することを特徴とする、プラスミドＤＮＡの精製方法。
【請求項３１】
共有結合されたオリゴヌクレオチドを含む、二本鎖ＤＮＡを精製するための支持体であって、前記オリゴヌクレオチドが前記二本鎖ＤＮＡ中のホモプリン／ホモピリミジン配列と三重らせんを形成するピリミジンに富む配列を含み、前記オリゴヌクレオチドが前記支持体にジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミドまたはアミン結合を通して連結し、そして前記支持体が官能化されたクロマトグラフィー支持体、官能化されたプラスチック表面または官能化されたラテックスビーズであり、前記オリゴヌクレオチドが１０から３０の間の長さを有する、上記支持体。
【請求項３２】
オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号１０、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２６から選択される配列を含む、請求項３１に記載の支持体。
【請求項３３】
オリゴヌクレオチドが、直鎖状炭素鎖（ＣＨ２）ｎ［式中、ｎは１〜１８までの間の整数である］を含むアームを介して支持体に連結され、前記アームがオリゴヌクレオチドに至るリン酸を通してスペーサーを介してオリゴヌクレオチドに連結する、請求項３１または３２に記載の支持体。
【請求項３４】
二本鎖ＤＮＡを精製するための支持体を作る方法であって、オリゴヌクレオチドを支持体に共有結合することを含み、ここで前記オリゴヌクレオチドはピリミジンに富む配列を含み且つ二本鎖ＤＮＡと三重らせんを形成し、ここで前記オリゴヌクレオチドはジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミドまたはアミン結合を通して支持体に共有結合し、そして前記支持体は官能化されたクロマトグラフィー支持体、官能化されたプラスチック表面または官能化されたラテックスビーズであり、前記オリゴヌクレオチドが１０から３０の間の長さを有する、上記方法。
【請求項３５】
オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号１０、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２６から選択される配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
オリゴヌクレオチドが、直鎖状炭素鎖（ＣＨ２）ｎ［式中、ｎは１〜１８までの間の整数である］を含むアームを介して支持体に連結され、前記アームがオリゴヌクレオチドに至るリン酸を通してスペーサーを介してオリゴヌクレオチドに連結する、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
オリゴヌクレオチドの支持体への共有結合が、以下の段階、
ａ）  支持体の残基を活性化すること；そして
ｂ）  活性化された支持体の残基をオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドと支持体の残基との間に共有結合をさせること、
を含んでなり、
ここで、前記オリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ中のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることによって該二本鎖ＤＮＡと三重らせんを形成するピリミジンに富む配列を含む、
請求項３４から３６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３８】
支持体が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドでエステル化することにより活性化されるヒドロキシル残基を含む樹脂を含み、そしてここで、前記活性化された残基をオリゴヌクレオチドと接触させることでオリゴヌクレオチドと支持体の残基との間に共有アミド（ＣＯＮＨ）結合が作り出される、請求項３４から３７のいずれか一に記載の方法。
【請求項３９】
クロマトグラフィー用支持体が、アガロース、デキストラン、セファデックスまたはシリカから作られる、請求項３４から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
請求項３４から３９のいずれか一つに記載の方法によって得られる、二本鎖ＤＮＡを精製するための支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ精製のための新規方法に関する。本発明に従う方法により薬剤学的に利用可能な二本鎖ＤＮＡを迅速に精製することが可能となる。一層具体的には、本発明に従う精製法は、ＤＮＡの配列とオリゴヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションに関連する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子療法および細胞療法の技術は現行では著しい発展を遂げている。しかしながらこれらの技術は薬剤学的純度の大量のＤＮＡを産生することの可能性を必要とする。実際の所、これら新規療法では医薬がＤＮＡ自体を含むことがしばしばであり、かつその医薬を適切な量で製造し、単離し、そしてヒトにおける治療学的使用法に適する様式で精製できることが必須となる。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ＤＮＡ精製のための簡便、かつ特に効果的な新規方法を記述する。この方法により特に、高収率であって特に高い純度を得ることが可能となる。
【０００４】
本発明に従う方法は本質的には、精製すべきＤＮＡ内に挿入された配列と、天然もしくは改変された塩基からなるオリゴヌクレオチドとの間の特異的相互作用に基づく。
【０００５】
最近になって、幾つかのオリゴヌクレオチドはＤＮＡ二重らせんの広い溝の中で特異的に相互作用を行って局所的に三重らせんを形成し、標的遺伝子の転写の阻害をもたらすことが可能性があることが見いだされている（Ｈｅｌｅｎｅ  ｅｔ  Ｔｏｕｌｍｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０４９（１９９０）９９）。これらのオリゴヌクレオチドはオリゴプリン−オリゴピリミジン配列、すなわち一本鎖上にオリゴプリン配列を保持し、かつその相補鎖上にオリゴピリミジン配列を保持する領域で選択的にＤＮＡ二重らせんを認識し、そしてそのためそこで局所的に三重らせんを形成する。第三鎖（オリゴヌクレオチド）の塩基はワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対のプリンと水素結合（ホッグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）もしくは逆ホッグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）結合）を形成する。
【０００６】
プラスミドを単離するためのこの種の相互作用の使用は従来の技術に記載されている。従って、Ｉｔｏら（ＰＮＡＳ  ８９（１９９２）４９５）は、あるプラスミドの特定の配列を認識し、かつそれと三重らせんを形成することが可能なビオチニル化されたオリゴヌクレオチドの使用を記載している。このように形成された複合体をその後には、ストレプトアビジンでコートした磁性ビーズと接触させる。ビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用によりその後には、そのプラスミドをそのビーズの磁性分離、次いで溶離により単離することが可能となる。しかしながら、この方法には幾つかの欠点が存在する。具体的には２つの連続的な特異的相互作用が必要とされ、最初の相互作用はオリゴヌクレオチドとプラスミドとの間ものであり、そして第二のものはビオチニル化された複合体とストレプトアビジンビーズとの間ものである。それに加え、最終溶液に、薬剤学的組成物中では用いることができないビオチニル化オリゴヌクレオチドが混入することがある。
【０００７】
本発明は、この種の相互作用を利用するＤＮＡ精製の新規改善法を記載する。より特別には、本発明の方法は支持体に共有結合により連結させたオリゴヌクレオチドを利用する。この方法は特に迅速であり、かつこの方法により特に高い収率および純度がもたらされ
る。それに加えこの方法により、特に、他の核酸、蛋白質、エンドトキシン（例えばリポ多糖のようなもの）、およびヌクレアーゼなどを含む複合体混合物からＤＮＡを精製することが可能となる。それに加え、用いられる支持体は容易に再利用することができてよく、かつ取得されるＤＮＡは薬剤学的安全性という改善された特性を呈する。最後になるが、本方法は従来の方法とは対照的に一段階のみを必要とする。
【０００８】
本発明の第一の主題は、二本鎖ＤＮＡの精製のための方法であり、この方法に従うと、他の構成成分と混合される前記ＤＮＡを含む溶液は、前記ＤＮＡ内に存在する特定の配列とのハイブリダイゼーションにより三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドと共有結合される支持体を通過させられる。この特定の配列はその二本鎖ＤＮＡ内に天然に存在する配列であるか、あるいは後者の中に人工的に組み込まれる合成配列であり得る。
【０００９】
本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡに直接ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは以下の塩基を含むことができる：
−  チミジン（Ｔ）（これは二本鎖ＤＮＡのＡ・Ｔダブレットとトリプレットを形成することが可能である）（Ｒａｊａｇｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２８（１９８９）７８５９）；
−  アデニン（Ａ）（これは二本鎖ＤＮＡのＡ・Ｔダブレットとトリプレットを形成することが可能である）；
−  グアニン（Ｇ）（これは二本鎖ＤＮＡのＧ・Ｃダブレットとトリプレットを形成することが可能である）；
−  プロトン化されたシトシン（Ｃ＋）（これは二本鎖ＤＮＡのＧ・Ｃダブレットとトリプレットを形成することが可能である）（Ｒａｊａｇｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．、（上記引用））；
−  ウラシル（Ｕ）（これは二本鎖ＤＮＡのＡ・ＵもしくはＡ・Ｔダブレットとトリプレットを形成することが可能である）。
【００１０】
用いられるオリゴヌクレオチドがシトシンに富むホモピリミジン配列を含み、かつこのＤＮＡ内に存在する特定の配列がホモプリン−ホモピリミジン配列であることが好ましい。シトシンの存在により、そのシトシンがプロトン化される酸性ｐＨでは安定化し、かつそのシトシンが中和されるアルカリ性ｐＨでは脱安定化される三重らせんを有することが可能となる。
【００１１】
ハイブリダイゼーションによる三重らせんの形成を可能にさせるためには、そのオリゴヌクレオチドと、そのＤＮＡ内に存在する特定の配列とが相補的となることが重要である。これに関連し、最高の収率および最高の選択性を取得するためには、完全に相補的なオリゴヌクレオチドと特定の配列とが本発明の方法に用いられる。特に、これらはオリゴヌクレオチドポリ（ＣＴＴ）および特定の配列ポリ（ＧＡＡ）であることができる。一例として、配列５′−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３′（ＧＡＧＧ（ＣＣＴ）７；配列番号１）のオリゴヌクレオチドを挙げることができ、この配列では塩基ＧＡＧＧは三重らせんは形成しないが、そのオリゴヌクレオチドを、間隔を開かせることで結合用アームから遠ざけることができ；配列（ＣＴＴ）７（配列番号２６）も挙げることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、相補的単位（ＧＡＡ）を含む特定の配列と共に三重らせんを形成することが可能である。問題の配列は特に、先の例に記載される要領で、７、１４、もしくは１７のＧＡＡ単位を含む領域であることができる。
【００１２】
具体的目的であるもう一つの配列は、配列：５′−ＡＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡ−３′（配列番号５）である。この配列はオリゴヌクレオチド５′−ＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡ−３′（配列番号６）もしくは５′−ＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴ
ＧＧＧＴＧＧＧＴＴ−３′（配列番号７）と共に三重らせんを形成する。
【００１３】
この場合、このオリゴヌクレオチドは逆平行方向でポリプリン鎖に結合する。これらの三重らせんはＭｇ２＋の存在下でのみ安定となる（Ｖａｓｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５、３４、７２４３−７２５１；Ｂｅａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５１、１３６０−１３６３）。
【００１４】
先に記載されるように、特定の配列は二本鎖ＤＮＡ内に天然に存在する配列もしくは後者内に人工的に組み込まれた合成配列であることができる。例えば、あるプラスミドの複製起点内、もしくはマーカー遺伝子内で、二本鎖ＤＮＡ内に天然に存在する配列と三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドを用いることが特に有利である。これに関連し、本出願人はプラスミドの配列分析を実施し、そして、特に複製起点内のそれらのＤＮＡの内の幾つかの領域がホモプリン−ホモピリミジン領域を保持することができることを示すことができた。これらの天然のホモプリン−ホモピリミジン領域と三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドの合成により、本発明の方法を、改変させていないプラスミド、特にｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、およびｐＳＶなどの種類の市販のプラスミドに適用することが可能となる。二本鎖ＤＮＡ内に天然に存在するホモプリン−ホモピリミジン配列の中では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点ＣｏｌＥ１内に存在する配列５′−ＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧ−３′（配列番号２）の全部もしくは部分を含む配列を挙げることができる。この場合、三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドは配列：５′−ＧＡＡＧＧＧＴＴＣＴＴＣＣＣＴＣＴＴＴＣＣ−３′（配列番号３）を保持し、そしてＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９２、１１４、４９７６−４９８２）、ならびにＪａｙａｓｅｎａおよびＪｏｈｎｓｔｏｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２、２０、５２７９−５２８８）により記載されるように二重らせんの二本の鎖に交互に結合する。プラスミドｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、５０４−５０８）の配列５′−ＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧ−３′（配列番号４）も挙げることができる。複製起点もしくはマーカー遺伝子の存在する配列と三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドの使用は特に有利であり、なぜならそのことにより同一のオリゴヌクレオチドを用いて前記複製起点もしくは前記マーカー遺伝子を含むいずれかのＤＮＡを精製することが可能となるためである。そのため、人工的な特定の配列をその中に組み込ませる目的でプラスミドもしくは二本鎖ＤＮＡを改変する必要はなくなる。
【００１５】
完全に相補的な配列が好ましいものの、しかしながら、そのオリゴヌクレオチドの配列と、そのＤＮＡ内に存在する配列との間の幾つかのミスマッチは、それらがあまりに大きすぎる親和性損失をもたらすことがなければ許容されることがあることが理解されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のβ−ラクタマーゼ遺伝子内に存在する配列５′−ＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧ−３′（配列番号８）を挙げることができる。この場合、そのポリプリン配列を遮るチミンは第三鎖のグアニンにより認識されることがあり、そのことにより２つのＴＡＴトリプレットによりフランクされる場合には安定となるＡＴＧトリプレットが形成される（Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９２、３１、２８２９−２８３４）。
【００１６】
ある特別な態様に従うと、本発明のオリゴヌクレオチドは配列（ＣＣＴ）ｎ、配列（ＣＴ）ｎ、もしくは配列（ＣＴＴ）ｎを含み、前記式中、ｎは１〜１５を含む整数である。（ＣＴ）ｎもしくは（ＣＴＴ）ｎの種類の配列を用いることが特に有利である。本出願人は実際、精製収率がそのオリゴヌクレオチド中のＣの量により影響を受けることを示した。具体的には実施例７に示されるように、精製収率はそのオリゴヌクレオチドが含むシトシンが減少すると増大する。本発明のオリゴヌクレオチドは（ＣＣＴ）、（ＣＴ）、もしくは（ＣＴＴ）単位を合わせることもできることが理解される。
【００１７】
用いられるオリゴヌクレオチドは天然のものであるか（改変を受けていない天然の塩基でできている）もしくは化学的に改変されたものであってよい。具体的には、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対する耐性もしくはそれに対する防御、あるいは特定の配列に対す親和性を増加させることが可能となる所定の化学的改変を保持することが有利であるかも知れない。
【００１８】
本発明に従うとオリゴヌクレオチドは更に、ヌクレアーゼに対して一層強い耐性を示すようにさせる目的でのその主鎖の改変を受けているヌクレオシドのいずれかの連結される連続物であるとも理解される。可能な改変の中でも、オリゴヌクレオチドホスホチオエート（これはＤＮＡと三重らせんを形成することが可能である）（Ｘｏｄｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９４、２２、３３２２−３３３０）、ならびにホルムアセタールもしくはメチルホスフェート主鎖を保持するオリゴヌクレオチド（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９１、１１３、７７６７−７７６８）を挙げることができる。ヌクレオチドのαアノマーで合成されるオリゴヌクレオチド（これもＤＮＡと三重ヘリックスを形成する）を用いることも可能である（Ｌｅ  Ｄｏａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９８７、１５、７７４９−７７６０）。主鎖のもう一つの改変はホスホルアミデート連結である。例えば、ＧｒｙａｚｎｏｖおよびＣｈｅｎにより記載されるＮ３’−Ｐ５’ヌクレオチド間ホスホルアミデート連結（これにより、オリゴヌクレオチドはＤＮＡと特に安定な三重らせんを形成することになる）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９４、１１６、３１４３−３１４４）を挙げることができる。主鎖の他の改変の中でも、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボース、ホスホジエステルなどの使用（Ｓｕｎ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１１６、３１４３−３１４４）も挙げることができる。最後に、リンを基にする主鎖をＰＮＡ（ペプチド核酸）における要領でポリアミド主鎖で置換してもよく（このことによっても三重らせんを形成することができる）（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７−１５００；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９３、１１５、６４７７−６４８１）、あるいはＤＮＧ（デオキシリボヌクレイックグアニジン、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９５、９２、６０７９−６１０１）（これはＤＮＡのポリカチオン性アナログであり、これも三重らせんを形成する）におけるようにグアニジンを基にする主鎖で置換してもよい。
【００１９】
第三鎖のチミンが５−ブロモウラシルにより置換されてもよく、このことによりそのオリゴヌクレオチドのＤＮＡに対する親和性が増加する（Ｐｏｖｓｉｃ  ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８９、１１１、３０５９−３０６１）。第三鎖は非天然の塩基を含んでいてもよく、これらの中でも、７−デアザ−２’−デオキシキサントシン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９３、２１、３２７−３３３）、１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−メチル−５−アミノ−１Ｈ−ピラノゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（Ｋｏｈ  ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９２、１１４、１４７０−１４７８）、８−オキソアデニン、２−アミノプリン、２’−Ｏ−メチルプソイドイソシチジン、もしくは当業者に知られるいずれかの他の改変（総説については、Ｓｕｎ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１９９３、３、３４５−３５６、を参照されたい）を挙げることができる。
【００２０】
オリゴヌクレオチドのもう一つの種類の改変は、より特別には、そのオリゴヌクレオチドと特定の配列との間の相互作用および／または親和性を改善するという目的を有する。具体的には、本発明に従う最も有利な改変は、そのオリゴヌクレオチドのシトシンをメチ
ル化することである（実施例５を参照されたい）。このようにメチル化されたオリゴヌクレオチドは中性に近いｐＨ範囲（≧５）で特定の配列と共に安定な三重らせんを形成させるという顕著な特質を示す。従って、このことにより従来の技術のオリゴヌクレオチドと比べると一層高いｐＨ値、すなわちプラスミドＤＮＡの変性の危険性が一層少なくなるｐＨ値で作業することが可能となる。
【００２１】
本発明の方法において用いられるオリゴヌクレオチドの長さは少なくとも３塩基であり、そして好ましくは５と３０との間である。１０塩基を上回る長さのオリゴヌクレオチドが用いられることが有利である。当業者は、その相互作用の所望の選択性および安定性に合わせるための長さを各個別の事例について採用してよい。
【００２２】
本発明に従うオリゴヌクレオチドはいずれかの既知の技術により合成されてよい。具体的にはそれらは核酸合成機により調製されてよい。当業者に知られる他のいずれかの方法が用いられてよいことも極めて明白である。
【００２３】
支持体への共有結合を可能にさせるためには、そのオリゴヌクレオチドは一般的には機能化される。従って、オリゴヌクレオチドは、５’もしくは３’の位置でチオール、アミン、もしくはカルボニル末端基により改変されてよい。具体的には、チオール、アミン、もしくはカルボキシル基の付加により、例えばそのオリゴヌクレオチドを、ジスルフィド、マレイミド、アミン、カルボキシル、エステル、エポキシド、臭化シアノゲン、もしくはアルデヒド官能基を保持する支持体に結合させることが可能となる。オリゴヌクレオチドと支持体との間のジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミド、もしくはアミン連結の確立によりこれらのカップリングが形成される。当業者に知られる他のいずれかの方法が用いられてもよく、それらは例えば二官能性カップリング剤である。
【００２４】
それに加え、連結させたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを改善させるためには、そのオリゴヌクレオチドが「アーム」および「スペーサー」の塩基配列を含むことが有利であり得る。アームの使用により実際のところ、そのオリゴヌクレオチドを支持体からの選択された距離で結合させることが可能となり、このことによりＤＮＡとの相互作用の条件が改善される。アームは１〜１８、および好ましくは６もしくは１２の（ＣＨ２）基を含む直鎖状炭素鎖、ならびにカラムへの結合を可能にさせるアミンからなることが有利である。このアームはそのオリゴヌクレオチドもしくはハイブリダイゼーションを妨害しない塩基からなる「スペーサー」のリン酸に連結する。従ってこの「スペーサー」はプリン塩基を含むことができる。一例として、この「スペーサー」は配列ＧＡＧＧを含むことができる。アームは６〜１２の炭素原子を含む直鎖状炭素鎖でできていると有利である。
【００２５】
本発明の実施のためには様々な種類の支持体を用いてよい。これらはバルクの状態でかもしくはカラム内に予め充填された状態をとる機能化されたクロマトグラフィー用支持体か、機能化されたプラスティック表面か、あるいは機能化されたラテックスビーズ（磁性を有するもの、もしくはそうでないもの）であることができる。クロマトグラフィー用支持体が用いられることが好ましい。一例としては、用いられることが可能なクロマトグラフィー用支持体はアガロース、アクリルアミド、もしくはデキストラン、ならびにそれらの誘導体（例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、スペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）など）、ポリマー類（例えば、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン））、あるいは一例ではグラフトさせたもしくはグラフトさせていないシリカである。クロマトグラフィー用カラムは拡散モードもしくは灌流モードで操作することができる。
【００２６】
精製収率をよりよくするためにはプラスミドに関しては、そのオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの幾つかの位置を含む配列を用いることが特に有利である。事実、幾つかのハイブリダイゼーションの位置の存在により前記配列とそのオリゴヌクレオチ
ドとの間の相互作用が促進され、そのことにより精製収率の改善がもたらされる。従って、（ＣＣＴ）、（ＣＴ）、もしくは（ＣＴＴ）モチーフのｎ回反復物を含むオリゴヌクレオチドのためには、少なくともｎ回の相補的モチーフ、および好ましくはｎ＋１回の相補的モチーフを含むＤＮＡ配列を用いることが好ましい。従ってｎ＋１回の相補的モチーフを保持する配列により、そのオリゴヌクレオチドとの２つのハイブリダイゼーションの位置が提供される。このＤＮＡ配列が最高１１までのハイブリダイゼーションの位置、すなわちｎ＋１０回の相補的モチーフを含むことが有利である。
【００２７】
本発明に従う方法を用いていずれかの種類の二本鎖ＤＮＡを精製することができる。後者の一例は環状ＤＮＡであり、それは例えば、プラスミドであり、これは一般的には一つもしくは複数の治療学的に有用な遺伝子を保持する。このプラスミドは更に、一つの複製起点および一つのマーカー遺伝子などを保持することがあってよい。本発明の方法を細胞溶解に直接適用してよい。この態様では、形質転換およびその後の細胞培養により増幅されたプラスミドは、その細胞の溶解の後に直接精製される。本発明の方法は更に、透明な溶解物、すなわち細胞溶解物の中和および遠心分離の後に取得される上清に応用されてもよい。この方法を既知の方法により精製された溶液にも応用してよいことは極めて明瞭である。この方法により更に、重要な配列を保持する直線状もしくは環状のＤＮＡを様々な配列のＤＮＡを含む混合物から精製することが可能となる。本発明に従う方法は二本鎖ＤＮＡの精製にも用いることができる。
【００２８】
細胞溶解物は原核生物もしくは真核生物の細胞の溶解物であることができる。
【００２９】
原核生物細胞に関しては、細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、もしくはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を例として挙げることができる。真核生物細胞に関しては、動物細胞、イースト、および真菌類などを挙げることができ、そして一層特別にはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のイースト、あるいはＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７、およびＮＩＨ３Ｔ３などの細胞を挙げることができる。
【００３０】
本発明の方法は特に有利であり、なぜならこの方法により非常に純度の高いプラスミドＤＮＡを迅速かつ簡便に取得することが可能となるためである。具体的には実施例に説明されるように、この方法により問題のプラスミドＤＮＡを混入性構成成分（例えば、分画化された染色体ＤＮＡ、エンドトキシン、蛋白質、およびヌクレアーゼなど）から効率良く分離することが可能となる。より特別には本発明の方法により、０．５％を下回るかもしくはそれに等しい染色体ＤＮＡ含有量を有する二本鎖ＤＮＡ、具体的にはプラスミド起源のものを取得することが可能となる。取得されるＤＮＡ精製物が０．２％を下回るかもしくはそれに等しい染色体ＤＮＡ含有量を有することが更に一層好ましい。従って本発明は薬剤学的、特に遺伝子療法もしくは細胞療法に用いることができるプラスミドＤＮＡを含む組成物を記載する。これに関係して、本発明の主題は更に、先に記載される方法に従って調製される二本鎖ＤＮＡ（直鎖状もしくはプラスミド起源もの）を含む薬剤学的組成物でもある。
【００３１】
本発明は更に、０．５％を下回るかもしくはそれに等しい、好ましくは０．２％を下回るかもしくはそれに等しい、そして更に一層好ましくは０．１％を下回るかそれに等しい染色体ＤＮＡ含有量を有するプラスミドＤＮＡ調製物にも関する。
【００３２】
「裸のまま」であるかもしくは輸送用担体（例えば、リポソーム、ナノパーティクル、カチオン性脂質、ポリマー、および組換えウイルスもしくは蛋白質など）と組み合わせられているプラスミドＤＮＡを含むことができる。
【００３３】
本出願人は以下に続く実施例により一層詳細に記載されるであろうし、その実施例は説明としておよび非制限として見なされるべきものである。
【００３４】
クローニングおよび分子生物学の一般的技術
例えば制限酵素での消化、ゲル電気泳動、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での形質転換、および核酸の沈殿などのような分子生物学の通常の方法は刊行物に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔ．、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ。Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．、Ｒ．Ｂｒｅｎｔ、Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｓｔｏｎ、Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ、Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ、Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ
ａｎｄ  Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ。１９８７。Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １９８７−１９８８。Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．）。ヌクレオチド配列は既に公開されているプロトコール（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７）に従う鎖停止方法により決定された。
【００３５】
制限酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ（Ｂｉｏｌａｂｓ）により供給された。
【００３６】
連結を実施するためには、ＤＮＡ断片をファージＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下、５０ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＡＴＰを含む緩衝液中でインキュベートする。
【００３７】
オリゴヌクレオチドは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ８６００自動ＤＮＡ合成機で、製造業者の推奨条件を用い、シアノエチル基によりβ位で保護されるホスホルアミデートを用いるホスホルアミデート化学合成法を用いて合成される（Ｓｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．、Ｊ．Ｂｉｅｒｎａｔ，Ｊ．  ＭｃＭａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｈ．Ｋｏｅｓｔｅｒ、１９８４。Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＸＶＩＩＩ：Ｕｓｅ  ｏｆ  β−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ−Ｎ，Ｎ−ｄｉａｌｋｙｌａｍｉｎｏ−／Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｏｆ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｓｉｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ。Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２、４５３９−４５５７：Ｇｉｌｅｓ，Ｊ．Ｗ．  １９８５。Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ。Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、Ｎｏｖ．／Ｄｅｃ．）。
【００３８】
形質転換の効率について検査される予定の連結ＤＮＡもしくはＤＮＡを用いてコンピテントにさせてある以下の株を形質転換させた：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α［Ｆ／ｅｎｄＡｌ，ｈｓｄＲ１７，ｓｕｐＥ４４，ｔｈｉ−１，ｒｅｃＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｒｅｌＡ１，Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９，ｄｅｏＲ，Φ８０ｄｌａｃ（ｌａｃＺΔＭ１５）］。
【００３９】
プラスミドＤＮＡのミニ調製物はＫｌｅｉｎら、１９８０、のプロトコールに従って作製される。
【００４０】
ＬＢ培養培地が大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ）の成長用に用いられる（Ｍａｎｉａｔｉｓ  
ｅｔ  ａｌ．、１９８２）。株は３７℃下でインキュベートする。細菌を適切な抗生物質を補足してあるＬＢ培地のディッシュ上でプレート培養する。
【実施例１】
【００４１】
１．１．  カラムの調製
装置
用いられるカラムは扇動ポンプ（出力＜１  ｍｌ／分）に連結させてある、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で活性化させた１  ｍｌのＨｉＴｒａｐカラムである。用いられる特異的オリゴヌクレオチドは５’末端にＮＨ２基を保持し、その配列は以下のとおりである：
５′−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３′（配列番号１）。
この実施例に用いられる緩衝液は以下のとおりである：
カップリング用緩衝液：０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３。
緩衝液Ａ：０．５Ｍ  エタノールアミン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３。
緩衝液Ｂ：０．１Ｍ  酢酸塩、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４。
【００４２】
方法：
カラムを６ｍｌの１ｍＭ  ＨＣｌで洗浄し、そしてカップリング用緩衝液中に希釈されるオリゴヌクレオチド（１ｍｌ中の５０ｎモル）をその後にそのカラムにかけ、そして室温に３０分間放置する。そのカラムを６ｍｌの緩衝液Ａで３回連続洗浄し、そしてその後に６ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した。オリゴヌクレオチドはこのようにして共有結合により、ＣＯＮＨ結合を通してカラムに連結させる。このカラムをＰＢＳ、０．１％  ＮａＮ３中、４℃で保存し、そして少なくとも４回は使用されてよい。
【００４３】
１．２．  プラスミドの構築
以下の２本のオリゴヌクレオチドを合成した。
オリゴヌクレオチド  ４８１７：
５’−
ＧＡＴＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号９）
オリゴヌクレオチド  ４８１８：
５’−
ＡＡＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧ−３’（配列番号１０）。
【００４４】
これらのオリゴヌクレオチドはハイブリダイズさせ、そしてプラスミド内にクローン化させた場合には、ホモプリン−ホモピリミジン配列（ＧＡＡ）１７を先に記載される要領で対応プラスミド内に組み込ませる。
【００４５】
ハイブリダイズさせたこれら２本のオリゴヌクレオチドに対応する配列をプラスミドｐＢＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ
ＣＡ）（このプラスミドはアンピリシン耐性遺伝子を保持している）の多重クローニング部位でクローニングさせた。この目的のためには、このオリゴヌクレオチドを以下の様式でハイブリダイズさせた：１  μｇのこれら２本のオリゴヌクレオチドを、５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む４０ｍｌの最終緩衝液内に一緒に入れた。この混合物を９５℃に加熱し、そしてその後に室温に置いたため温度はゆっくりと下降したはずである。ハイブリダイズさせた１０ｎｇのオリゴヌクレチドを３０μｌの最終容量中に含まれる、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化させた２００ｎｇのプラスミドｐＢＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ
社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）と連結させた。連結後、アリコートをＤＨ５ａ内に形質転換させた。この形質転換混合物をアンピリシン（５０ｍｇ／ｌ）およびＸ−ｇａｌ（２０ｍｇ／ｌ）を補足してあるＬ培地上でプレート培養した。組換えクローンは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダーゼの断片ωのα−相補性を可能にさせる親プラスミド（ｐＢＫＳ＋）と反してこの培地上では青色着色の非存在を呈するはずである。６つのクローンからのプラスミドＤＮＡのミニ精製の後にはそれらは全て、ｐＢＫＳ＋のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位の間に位置するＰｓｔＩ部位の消失、ならびに多重クローニング部位を含む４４８−ｂｐのＰｖｕＩＩバンドの分子量の増加を呈する。一つのクローンを選択し、そして対応プラスミドをｐＸＬ２５６３と表示した。クローン化された配列は、プラスミドｐＢＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ社、Ｌａ
Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）のためのプライマー−２０（５′−ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧ−３′（配列番号１１））（Ｖｉｅｒａ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ。１９８２。Ｔｈｅ  ｐＵＣ  ｐｌａｓｍｉｄｓ，ａｎ  Ｍ１３ｍｐ７−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒｓ。Ｇｅｎｅ、１９、２５９−２６８）を用いる配列決定により確認した。プラスミドｐＸＬ２５６３はＷｉｚａｒｄ  Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に従い、供給会社の推奨事項に従って精製した。その後には、このプラスミドＤＮＡ調製物を以下に記載される実施例に用いた。
【００４６】
１．３．  プラスミドの精製
装置：
プラスミドｐＸＬ２５６３（１．２に記載される）をオリゴヌクレオチドに連結させてあるＨｉＴｒａｐカラム（１．１．に記載される）上で、プラスミドｐＢＫＳ＋を含む溶液からも精製した。この精製に用いた緩衝液は以下のとおりである：
緩衝液Ｆ：２Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ  酢酸塩、ｐＨ４．５〜５。
緩衝液Ｅ：１Ｍ  トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ９、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ。
【００４７】
方法：
このカラムを６ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄し、そしてプラスミド（４００μｌの緩衝液Ｆ中の２０μｇのｐＸＬ２５６３および２０μｇのｐＢＫＳ＋）をそのカラムにかけ、そして２時間室温でインキュベートした。このカラムを１０ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄し、そしてその後に緩衝液Ｅでの溶離を実施する。プラスミドは１％アガロースゲル上での電気泳動および臭化エチジウム染色の後に検出される。溶液中のプラスミドの比率は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるそれらの形質転換性活性を測定することにより推測される。
【００４８】
結果：
３０％のｐＸＬ２５６３および７０％のｐＢＫＳ＋を含む混合物から出発し、１００％のｐＸＬ２５６３を含む溶液をカラムの出口で回収する。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでのＯＤ比率により推測される純度は１．９から２．５へと上昇し、このことにより混入性蛋白質がこの方法により除去されたことが示される。
【実施例２】
【００４９】
２．１．  −  この実施例はプラスミドＤＮＡの精製実験を記載する。オリゴヌクレオチド（５′−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３′（配列番号１））のカラムへの連結は実施例１に記載される要領で実施される。この連結のためにはオリゴヌクレオチドは、６つの炭素原子を含むアーム（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  ＳＡ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によりスペーサーのリン酸に連結されたアミン基で５’末端が改変される。プラスミドｐＸＬ２５６３を、Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．社、Ｍａｄｉｓｏｎ
、ＷＩ）を用い、供給会社の推奨事項に従って精製した。この実施例に用いられた緩衝液は以下のとおりである：
緩衝液Ｆ：０〜２Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ  酢酸塩、ｐＨ４．５〜５。
緩衝液Ｅ：１Ｍ  トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ９、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ。
【００５０】
このカラムを６ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄し、そして４００μｌの緩衝液Ｆ中に稀釈された１００μｇのプラスミドｐＸＬ２５６３をその後にそのカラムにかけ、そして室温で２時間インキュベートする。そのカラムを１０ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄し、そしてその後に緩衝液Ｅでの溶離を実施する。プラスミドは２６０ｎｍでの光学密度を測定することにより定量する。この実施例では結合は、ＮａＣｌに関するモル濃度が０〜２Ｍに変化する緩衝液（緩衝液Ｆ）中で実施される。精製収率はＮａＣｌのモル濃度が下がる場合には減少する。結合用緩衝液のｐＨは４．５〜５に変化することができ、精製収率は４．５の時に一層良くなる。塩基性ｐＨのもう一つの溶離用緩衝液を用いることも可能であり：従って溶離は、５０ｍＭのホウ酸塩、ｐＨ９、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液で実施された。
【００５１】
２．２．  −  このカラムへのオリゴヌクレオチド（５′−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３′（配列番号１））の連結は実施例１に記載される要領で実施される。プラスミドｐＸＬ２５６３を、Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用い、供給会社の推奨事項に従って精製した。この実施例に用いられる緩衝液は以下のとおりである：
緩衝液Ｆ：０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ  酢酸塩、ｐＨ５。
緩衝液Ｅ：１Ｍ  トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ９、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ。
【００５２】
このカラムを６ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄し、そして４００μｌの緩衝液Ｆ中に稀釈された１００μｇのプラスミドをその後にそのカラムにかけ、そして室温で１時間インキュベートする。そのカラムを１０ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄し、そしてその後に緩衝液Ｅでの溶離を実施する。そのオリゴヌクレオチドカラムを通す過程前および後にプラスミド試料中に存在する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノムＤＮＡもしくは染色体ＤＮＡの含有量を測定する。このゲノムＤＮＡは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇａｌＫ遺伝子内のプライマーを用いることでＰＣＲにより定量される。以下のプロトコールに従い：これらのプライマーの配列がＤｅｂｏｕｃｋら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９８５、１３、１８１４−１８５３）により記載される：
５′−ＣＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＴＴＣ−３′（配列番号２４）、および５′−ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＧＧ  ＴＧＴ−３′（配列番号２５）。この反応用培地は、２５μｌのＰＣＲ用緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｆｒａｎｃｅ社、Ｃｈａｒｂｏｎｎｉ  ｒｅｓ）中に：１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．２ｍＭ  ｄＸＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｏｒｓａｙ）；０．５μＭ  プライマー；２０Ｕ／ｍｌ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含む。この反応は以下の順番：
−  ９５℃で５分
−  ９５℃で１０秒
６０℃で３０秒
７８℃で１分、を３０周期
−  ７８℃で１０分
に従って実施される。増幅された１２４塩基対分の長さのＤＮＡ断片をＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅ、ＵＳＡ）の存在下、３％アガロースゲル上での電気泳動により分離させ、そしてその後に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｂ（Ｓｉｇｍａ社、ｒｅｆ  Ｄ４８８９）からのＵｌｔｒａｐｕｒ  ゲノムＤＮＡに照合させることにより定量する。
【００５３】
そのカラムにかけた試料中には１％の染色体ＤＮＡが存在し、そしてその試料の内の０．２％がオリゴヌクレオチドカラム上で精製される。
【実施例３】
【００５４】
透明溶菌物についての実験
この実施例は、いわゆる「ミニプレップ」スケールでの細菌培養物の透明溶菌物からのプラスミドＤＮＡ精製を記載する：プラスミドｐＸＬ２５６３を含む１．５ｍｌのＤＨ５α株の一晩培養物を遠心分離にかけ、そしてそのペレットを１００μｌの５０ｍＭ  グルコース、２５ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁させる。その後に２００μｌの０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳを添加し、その試験管を反転させて混合させ、１５０μｌの３Ｍ  酢酸カリウム、ｐＨ５、をその後に添加し、そしてその試験管を反転させて混合させる。遠心分離後、その上清を回収し、そして実施例１に記載される要領で取得されるオリゴヌクレオチドカラムにかける。結合、洗浄、および溶離は実施例１に記載されるものと同一である。約１μｇのプラスミドが１．５ｍｌの培養物から回収される。取得され、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により分析されたプラスミドは「超コイル状の」環状ＤＮＡのシングルバンドの形態をとる。高分子量の（染色体）ＤＮＡもしくはＲＮＡの痕跡はこの方法により精製されたプラスミド中には全く検出されない。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの光学密度の比率は２を上回る。
【実施例４】
【００５５】
４．１：この実施例は、プラスミドｐＸＬ２５６３を含むＤＨ５α株の２０ｍｌの細菌培養物から出発して実施例３と同一の条件下で実施されるプラスミドＤＮＡ精製実験を記載する。細胞ペレットを１．５ｍｌの５０ｍＭ  グルコース、２５ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶かす。溶菌は２ｍｌの０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳで実施し、そして中和は１．５ｍｌの３Ｍ  酢酸カリウム、ｐＨ５、で実施する。その後にこのＤＮＡを３ｍｌの２−プロプラノロールで沈殿させ、そしてそのペレットを０．５ｍｌの０．２Ｍ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に溶かし、そして実施例１に記載される要領で取得されるオリゴヌクレオチドカラムにかける。結合、カラムの洗浄、および溶離は実施例１に記載される要領で実施されるが、例外は洗浄用緩衝液であり、ＮａＣｌに関するモル濃度は０．１Ｍである。約１６μｇのプラスミドＤＮＡが取得される。取得され、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により分析されるプラスミドは「超コイル状の」環状ＤＮＡのシングルバンドの形態をとる。高分子量の（染色体）ＤＮＡもしくはＲＮＡの痕跡は精製されたプラスミド中には全く検出されない。制限酵素でのプラスミドの消化により３キロベースの予想分子量にシングルバンドが生じる。試料中の蛋白質濃度は、透明溶菌物中の１２５μｇ／ｍｌから精製されたプラスミド（Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡ  ａｓｓａｙ、Ｐｉｅｒｃｅ社）中１μｇ／ｍｌを下回る濃度へと減少する。ＬＡＬアッセイ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ社）により予測されるエンドトキシン濃度は、出発透明溶菌物に比例し、精製されたプラスミドでは１０を上回る因子で割り算される。
【００５６】
４．２：用いられるプラスミドは、サイトメガロウイルスプロモーター、ルシフェラーゼをコードする遺伝子、およびプラスミドｐＸＬ２５６３に由来するホモプリン−ホモピリミジン配列（ＧＡＡ）１７を含むカセットを含む。このプラスミドを含む株ＤＨ１（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９）を７リットル用発酵器内で培養する。透明溶菌物が２００グラムの細胞から調製され：その細胞ペレットを２リットルの２５ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ６．８、５０ｍＭ  グルコース、１０ｍＭ  ＥＤＴＡに溶かし、これに２リットルの０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳを添加する。この溶菌物を、１リットルの３Ｍの酢酸カリウムを添加することにより中和させる。ダイアフィルトレーションの後に４ｍｌのこの溶菌物を、実施例１．１．に記載される方法に従い配列５′−ＧＡ
ＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３′（配列番号１）のオリゴヌクレオチドに連結される５ｍｌのＨｉＴｒａｐ−ＮＨＳカラムにかける。洗浄および溶離は実施例１に記載される要領で実施する。約４００マイクログラムのプラスミドが回収される。実施例２．２に記載される技術により測定されるこの試料中のゲノムＤＮＡのレベルは０．１％である。
【実施例５】
【００５７】
改変させたオリゴヌクレオチドの使用
この実施例はメチル化させたシトシンを保持するオリゴヌクレオチドの使用を記載する。用いられるオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである：５’−ＧＡＧＧＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴ−３’（配列番号１２）。
【００５８】
このオリゴヌクレオチドは５’末端にＮＨ２基を保持する。ＭｅＣ＝５−メチルシトシン。このオリゴヌクレオチドによりプラスミドｐＸＬ２５６３を実施例１の条件下、ｐＨ５の結合用緩衝液で精製することが可能となる（プラスミドの変性の危険性はこのことにより減少する）。
【実施例６】
【００５９】
先の実施例では、用いられるオリゴヌクレオチドは、６つの炭素原子を含むアーム：ＮＨ２−（ＣＨ２）６を通してリン酸に連結されるアミン基で５’末端が改変される。この実施例ではアミン基は、１２の炭素原子を含むアーム：ＮＨ２−（ＣＨ２）１２を通して５’末端のリン酸に連結される。オリゴヌクレオチドのカップリングおよびカラムを通す過程は、緩衝液Ｆ：２Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ  酢酸塩、ｐＨ４．５、を用い、実施例２に記載される要領で実施される。このオリゴヌクレオチドによりより良い精製収率を得ることが可能となる：５３％の収率が観察される一方で、６つの炭素原子を含むオリゴヌクレオチドを用いると、この収率は同一条件下で４５％のオーダーとなる。
【実施例７】
【００６０】
実施例１．２に記載されるクローニング手法に従い、ホモプリン−ホモピリミジン配列を保持する他の２つのプラスミド：配列（ＧＡＡ）１６を含むプラスミドｐＸＬ２７２５、および配列（ＧＡ）２５を含むプラスミドｐＸＬ２７２６、を構築した。
【００６１】
実施例７．１：プラスミドの構築
プラスミドｐＸＬ２５６３に類似するプラスミドｐＸＬ２７２５およびｐＸＬ２７２６を、実施例１．２に記載されるクローニング手法に従い、以下のオリゴヌクレオチド対を用いて構築した：
５９８６：５′−ＧＡＴＣＣ（ＧＡ）２５ＧＧＧ−３′（配列番号１３）
５９８７：５′−ＡＡＴＴＣＣＣ（ＴＣ）２５Ｇ−３′（配列番号１４）
５９８１：５′−ＧＡＴＣＣ（ＧＧＡ）１７ＧＧ−３′（配列番号１５）
５９８２：５′−ＡＡＴＴ（ＣＣＴ）１７ＣＣＧ−３′（配列番号１６）。
【００６２】
オリゴヌクレオチド対５９８６および５９８７を用い、ｐＢＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位にそのオリゴヌクレオチドをクローニングすることによりプラスミドｐＸＬ２７２６を構築した一方で、オリゴヌクレオチド５９８１および５９８２を、プラスミドｐＸＬ２７２５の構築用に用いた。プラスミドｐＸＬ２５６３の構築用のものと同一の実験条件を用い、かつオリゴヌクレオチド対のみが違っていた。同様に、クローン化された配列はそのプラスミドにおける配列決定により確認した。このことにより、プラスミドｐＸＬ２７２５が予想配列に関連する改変を保持する、つまり：１７回反復される配列Ｇ
ＧＡの代わりにＧＧＡＧＡ（ＧＧＡ）１５（配列番号１７）が存在するという所見を得ることが可能となる。
【００６３】
実施例７．２：カラムの調製および精製
これらのホモプリン配列と三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを、実施例１．１に記載される技術に従いＨｉＴｒａｐカラムに連結させた。配列５′−ＡＡＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴ−３′（配列番号１８）のオリゴヌクレオチドをプラスミドｐＸＬ２７２５の精製用に用い、そして配列５′−ＡＧＴＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３′（配列番号１９）のオリゴヌクレオチドをプラスミドｐＸＬ２７２６の精製に用いた。
【００６４】
このことにより取得された２本のカラムにより、以下の緩衝液：
緩衝液Ｆ：２Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ  酢酸塩、ｐＨ４．５。
緩衝液Ｅ：１Ｍ  トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ９、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
を用い、実施例２に記載される技術に従い対応プラスミドを精製することが可能となる。得られる収率は、ｐＸＬ２７２５およびｐＸＬ２７２６につき、各々２３％および３１％である。
【実施例８】
【００６５】
この実施例は、精製収率における、プラスミド内に存在する特定の配列の長さの影響を説明する。
【００６６】
実施例８．１：プラスミドの構築
本発明の組成物の活性を証明するためにこれらの実施例で用いられるレポーター遺伝子はルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする遺伝子である。
【００６７】
プラスミドｐＸＬ２６２１は制限酵素ＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの開裂によりｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から抽出された６６１−ｂｐのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含むカセット（これは、ルシフェラーゼをコードする遺伝子の上流のＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位でベクターｐＧＬ塩基性Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）内にクローン化されている）を含む。このプラスミドは分子生物学の標準的技術を用いて構築された。
【００６８】
プラスミドｐＸＬ２７２７−１およびｐＸＬ２７２７−２は以下の様式で構築した：
２マイクログラムのプラスミドｐＸＬ２６２１をＢａｍＨＩで直線化し；その酵素を６５℃、１０分間の処理により不活化させ；同時にオリゴヌクレオチド６００６および６００８をプラスミドｐＸＬ２５６３の構築について記載される要領でハイブリダイズさせた。
６００６：５′−ＧＡＴＣＴ（ＧＡＡ）１７ＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴ−３′（配列番号２０）
６００８：５′−ＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧ（ＴＴＣ）１７Ａ−３′（配列番号２１）。
【００６９】
このハイブリダイゼーション混合物をプラスミドｐＸＬ２６２１のＢａｍＨＩ末端でクローン化し、そしてＤＨ５ａ内への形質転換の後に組換えクローンをＰｓｔＩ酵素による制限分析により同定したが、なぜならこのオリゴヌクレオチドによりＰｓｔＩ部位が導入されるためである。２つのクローンを選択し、そしてクローン化断片のヌクレオチド配列を、配列決定反応用のプライマーとしてのプライマー（６２８２、５′−ＡＣＡＧＴＣＡＴＡＡＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧ−３′（配列番号２２））（Ｖｉｅｒａ  Ｊ．  ａｎｄ  
Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ、１９８２。Ｔｈｅ  ｐＵＣ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ａｎ  Ｍ１３ｍｐ７−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒｓ。Ｇｅｎｅ  １９：２５９−２６８）を用いて確認した。
【００７０】
第一クローン（ｐＸＬ２７２７−１）は１０回反復される配列ＧＡＡを含む。第二クローン（ｐＸＬ２７２７−２）は配列５′−ＧＡＡＧＡＡＧＡＧ（ＧＡＡ）７ＧＧＡＡＧＡＧＡＡ−３′（配列番号２３）を含む。
【００７１】
実施例８．２：カラムの調製および精製
例えば実施例１に記載されるもののようなカラムであって、かつオリゴヌクレオチド５′−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３′（配列番号１）に連結されるカラムが用いられる。
【００７２】
プラスミドｐＸＬ２７２７−１は１４回分の配列ＧＡＡを含む。従って、わずか７回分の対応ハイブリダイゼーション配列ＣＴＴを含み、先に記載されるオリゴヌクレオチドは、８つの異なる位置でこのプラスミドとハイブリダイズすることができる。それとは対照的にプラスミドｐＸＬ２７２７−２は、そのカラムに結合するオリゴヌクレオチドのものと同一の長さのハイブリダイズ用配列（ＧＡＡ）７を保持する。従って、このオリゴヌクレオチドはｐＸＬ２７２７−２上の唯一の位置でのみハイブリダイズすることができる。
【００７３】
この実験は実施例２に記載されるものと同一であり、以下の緩衝液が用いられる：
緩衝液Ｆ：２Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ  酢酸塩、ｐＨ４．５。
緩衝液Ｅ：１Ｍ  トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ９、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ。
精製収率はプラスミドｐＸＬ２７２７−１に関しては２９％、そしてｐＸＬ２７２７−２に関しては１９％である。
【００７４】
実施例８．３：哺乳類細胞のインビトロトランスフェクション
用いられる細胞はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞であり、これを実験前日に５０，０００細胞／ウエルを基に２４ウエル培養プレート内に撒種する。このプラスミドを１５０ｍＭのＮａＣｌ中に希釈し、そしてリポフェクション用作用物質ＲＰＲ１１５３３５と混合する。６に等しいリポフェクション用作用物質陽性荷電／ＤＮＡ陰性荷電比率を用いる。この混合物をボルテックスミキサーにかけ、室温に１０分間放置し、ウシ胎仔血清非含有性培地で希釈し、そしてその後に、培養用ウエルあたり１μｇのＤＮＡの比率で細胞に添加する。３７℃で２時間置いた後、１０％容量／容量のウシ胎仔血清を添加し、そしてその細胞を３７℃で４８時間、５％のＣＯ２の存在下でインキュベートする。その細胞を２度ＰＢＳで洗浄し、そしてルシフェラーゼ活性を記載されるプロトコールに従い（Ｐｒｏｍｅｇａキット、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０１ルミノメーター（ＥＧ  ａｎｄ  Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社、Ｅｖｒｙ）において測定する。実施例８．２に記載される要領で精製されるプラスミドｐＸＬ２７２７−１により、Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて精製される同一のプラスミドで取得されるものの２倍ものトランスフェクション収率が得られる。
【００７５】
【表１】
2009045070.tif 000002
【００７６】
【表２】
2009045070.tif 000003
【００７７】
【表３】
2009045070.tif 000004
【００７８】
【表４】
2009045070.tif 000005
【００７９】
【表５】
2009045070.tif 000006
【００８０】
【表６】
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【００８１】
【表７】
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【００８２】
【表８】
2009045070.tif 000009
【００８３】
【表９】
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【００８４】
【表１０】
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【００８５】
【表１１】
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【００８６】
【表１２】
2009045070.tif 000013
【００８７】
以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。
【００８８】
１．  他の構成成分と混ざっている二本鎖ＤＮＡを含む溶液を、前記ＤＮＡ中に存在する特定の配列とのハイブリダイゼーションにより三重らせんを形成することが可能なオリゴヌクレオチドが共有結合した支持体を通す少なくとも一つの段階を含むことを特徴とする二本鎖ＤＮＡの精製方法。
２．  前記ＤＮＡを含む溶液が細胞溶解物であることを特徴とする、上記１に記載の方法。
３．  細胞溶解物が透明溶解物であることを特徴とする、上記２に記載の方法。
４．  二本鎖ＤＮＡが予め精製されることを特徴とする、上記１に記載の方法。
５．  ＤＮＡ中に存在する特定の配列がホモプリン−ホモピリミジン配列を含み、かつ前記オリゴヌクレオチドがそのホモプリン−ホモピリミジン配列と三重らせんを形成する配列を含むことを特徴とする、上記１に記載の方法。
６．  特定の配列が二本鎖ＤＮＡ内に人工的に組み込まれていることを特徴とする、上記１〜５の内の一つに記載の方法。
７．  オリゴヌクレオチドがポリ（ＣＴＴ）配列を含み、かつそのＤＮＡ内に存在する特定の配列がポリ（ＧＡＡ）配列であることを特徴とする、上記５に記載の方法。
８．  オリゴヌクレオチドが配列ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ（配列番号１）を保持することを特徴とする、上記５に記載の方法。
９．  オリゴヌクレオチドが配列（ＣＴＴ）７（配列番号２６）を保持することを特徴とする、上記５に記載の方法。
１０．  前記ＤＮＡ中に存在する特定の配列が配列（ＧＡＡ）７、（ＧＡＡ）１４、もしくは（ＧＡＡ）１７を含むことを特徴とする、上記８もしくは９に記載の方法。
１１．  前記ＤＮＡ中に存在する特定の配列が配列番号５の配列を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号６もしくは配列番号７の配列を含むことを特徴とする、上記５に記載の方法。
１２．  前記ＤＮＡ中に存在する特定の配列が配列番号１７の配列を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号１８の配列を含むことを特徴とする、上記５に記載の方法。
１３．  前記ＤＮＡ中に存在する特定の配列が配列（ＧＡ）２５を含み、かつオリゴヌクレオチドが配列番号１９の配列を含むことを特徴とする、上記５に記載の方法。
１４．  特定の配列が二本鎖ＤＮＡ中に天然に存在する特定の配列であることを特徴とする、上記１〜５の内の一つに記載の方法。
１５．  前記ＤＮＡ内に天然に存在する特定の配列が、プラスミドの複製起点内に存在するホモプリン−ホモピリミジン配列であることを特徴とする、上記１４に記載の方法。
１６．  特定のＤＮＡ配列が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点ＣｏｌＥ１内に存在する配列番号２の配列の全部もしくは部分を含むことを特徴とする、上記１５に記載の方法。
１７．  オリゴヌクレオチドが配列番号３の配列を含むことを特徴とする、上記１６の方法。
１８．  特定のＤＮＡ配列が、プラスミドｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子内に存在する配列番号４の配列もしくは配列番号８の配列の内の全部もしくは部分を含むことを特徴とする、上記１４に記載の方法。
１９．  オリゴヌクレオチドが、ジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミド、もしくはアミン結合を通して支持体に連結されることを特徴とする、前述の上記の内の一つに記載の方法。
２０．  オリゴヌクレオチドが炭素鎖（ＣＨ２）ｎ［式中、ｎは１〜１８までの間の整数である］からなるアームを介してカラムに連結され、前記アームがリン酸を通してオリゴヌクレオチドに、次いではアミド結合を通してカラムに連結することを特徴とする、上記１９に記載の方法。
２１．  アームが６つの炭素原子を含む直鎖状炭素鎖でできていることを特徴とする、上
記２０に記載の方法。
２２．  アームが１２の炭素原子を含む直鎖状炭素鎖でできていることを特徴とする、上記２０に記載の方法。
２３．  オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの化学的改変を保持し、そのことによりそのオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して耐性となるか、もしくはヌクレアーゼに対して保護されるか、または特定の配列に対する親和性を増加させることとなることを特徴とする、前述の上記の内の一つに記載の方法。
２４．  オリゴヌクレオチドが、少なくとも一つのシトシンがメチル化されている、ホモピリミジン配列を保持することを特徴とする、上記２３に記載の方法。
２５．  ＤＮＡが更に一つもしくは複数の治療学的に重要な配列を含むことを特徴とする、前述の上記の内の一つに記載の方法。
２６．  二本鎖ＤＮＡが例えばプラスミドのような環状ＤＮＡであることを特徴とする、前述の上記の内のいずれか一つに記載の方法。
２７．  二本鎖ＤＮＡ内に存在する特定の配列がオリゴヌクレオチドとのハイブリダーゼーションのための数々の位置を含むことを特徴とする、上記１に記載の方法。
２８．  支持体が、機能化させたクロマトグラフー用支持体、機能化させたプラスチック表面、および機能化させたラテックスビーズから選択されることを特徴とする、上記１に記載の方法。
２９．  支持体がクロマトグラフィー用支持体であることを特徴とする、上記２８に記載の方法。
３０．  上記１〜２９の内の一つに記載される方法により取得されるＤＮＡを含む薬剤学的組成物。
３１．  ０．５％を下回るかもしくはそれに等しい染色体ＤＮＡ含有量を特徴とする、精製された組換えプラスミドＤＮＡの調製物。
３２．  ０．２％を下回るかもしくはそれに等しい染色体ＤＮＡ含有量を特徴とする、精製された組換えプラスミドＤＮＡの調製物。
３３．  ０．１％を下回るかもしくはそれに等しい染色体ＤＮＡ含有量を特徴とする、精製された組換えプラスミドＤＮＡの調製物。
３４．  二本鎖ＲＮＡの精製のための、上記１に記載の方法。