(57)【要約】【課題】  スループットの効率化及びコスト削減を可能とするヒト遺伝子のアレル多型のタイピング方法と、該遺伝子アレル多型のタイピング用キットとを開発すること。【解決手段】  本発明は、ヒト遺伝子のアレル多型のタイピング方法を提供する。本発明のタイピング方法は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用オリゴヌクレオチドプライマーの第１セットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１とは異なる他の遺伝子のアレル多型検出用オリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む第１容器と、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１及び前記他の遺伝子とは異なる更に別の遺伝子のアレル多型検出用オリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む第２容器とを用意するステップを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用オリゴヌクレオチドプライマーの第１セットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１とは異なる他の遺伝子のアレル多型検出用オリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む第１容器と、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１及び前記他の遺伝子とは異なる更に別の遺伝子のアレル多型検出用オリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む第２容器とを用意するステップと、
（２）同一個人由来の検体ＤＮＡと第１及び第２セットのプライマーのそれぞれとを混和するステップと、
（３）第１及び第２容器のインキュベーションを行って遺伝子増幅産物を生成させるステップと、
（４）前記他の遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第１セットとを第１容器の遺伝子増幅産物と混和し、前記更に別の遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第２セットとを第２容器の遺伝子増幅産物と混和するステップと、
（５）第１及び第２容器のインキュベーションを行って、それぞれの容器の遺伝子増幅産物を前記アレル検出用プローブのいずれかと相補的ハイブリッド形成させるステップと、
（６）第１及び第２容器のそれぞれについて、前記担体に固定化されたアレル検出用プローブと相補的ハイブリッド形成した前記遺伝子増幅産物に取り込まれた前記プライマーか、前記遺伝子増幅産物と相補的ハイブリッド形成した前記アレル検出用プローブかを検出するステップとを含み、
前記アレル検出用プローブは１個の担体に１種または２種以上のヌクレオチド配列のプローブが固定化され、
ステップ（６）において、前記担体に固定化されたアレル検出用プローブと相補的ハイブリッド形成した前記遺伝子増幅産物に取り込まれた前記プライマーか、前記遺伝子増幅産物と相補的ハイブリッド形成した前記アレル検出用プローブかを検出するときに、前記遺伝子増幅産物のヌクレオチド配列が特定されることを特徴とする、ヒト遺伝子のアレル多型のタイピング方法。
【請求項２】
前記他の遺伝子と、前記更に別の遺伝子とは、いずれもＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ及びＨＬＡ−ＤＱからなるグループから選択される少なくとも１種類の遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載のアレル多型のタイピング方法。
【請求項３】
前記他の遺伝子はＨＬＡ−Ａ遺伝子であり、前記更に別の遺伝子はＨＬＡ−Ｂ遺伝子であることを特徴とする、請求項２に記載のアレル多型のタイピング方法。
【請求項４】
前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第１セットは配列番号２４ないし３２に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セットは配列番号３３ないし３７に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第１セットは配列番号１５３ないし１７９に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第２セットは配列番号１８０ないし２０３に列挙されるヌクレオチド配列からなるプローブが固定化された担体からなることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載のアレル多型のタイピング方法。
【請求項５】
前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第１セットは配列番号３３ないし３７に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セットは配列番号２４ないし３２に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第１セットは配列番号１８０ないし２０３に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第２セットは配列番号１５３ないし１７９に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載のアレル多型のタイピング方法。
【請求項６】
前記ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットは配列番号１ないし１３に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットは配列番号１４ないし２３に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットは、配列番号３８ないし８５に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなり、前記ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットは、配列番号８６ないし１５２に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれかに記載のアレル多型のタイピング方法。
【請求項７】
（１）ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第１セットとを含む第１のＰＣＲ反応容器と、
（２）ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セットとを含む第２のＰＣＲ反応容器と、
（３）ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第１セットとからなる、第１のＰＣＲ反応容器に添加するためのアレル検出用プローブを固定化した担体セットとの組合せと、
（４）ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第２セットとからなる、第２のＰＣＲ反応容器に添加するためのアレル検出用プローブを固定化した担体セットとの組合せとを含むことを特徴とする、２個の容器を用いるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型のタイピング用キット。
【請求項８】
前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第１及び第２セットのうち一方は配列番号３１及び３２に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーを含み、第１及び第２セットのうち他方は配列番号３７に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーを含み、配列番号３１、３２及び／又は３７に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーによる遺伝子増幅の有無によって配列番号２０４に列挙されるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子産物のアミノ酸配列の第８６番目のアミノ酸をコード化するコドンの第２及び第３番目のヌクレオチドの配列の異なるアレルを区別することを特徴とする、請求項７に記載のアレル多型のタイピング用キット。
【請求項９】
前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第１セットは配列番号２４ないし３２に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セットは配列番号３３ないし３７に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第１セットは配列番号１５３ないし１７９に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第２セットは配列番号１８０ないし２０３に列挙されるヌクレオチド配列からなるプローブが固定化された担体からなることを特徴とする、請求項８に記載のアレル多型のタイピング用キット。
【請求項１０】
前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第１セットは配列番号３３ないし３７に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セットは配列番号２４ないし３２に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第１セットは配列番号１８０ないし２０３に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第２セットは配列番号１５３ないし１７９に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなることを特徴とする、請求項８に記載のアレル多型のタイピング用キット。
【請求項１１】
前記ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットは配列番号１ないし１３に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットは配列番号１４ないし２３に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットは、配列番号３８ないし８５に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなり、前記ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットは、配列番号８６ないし１５２に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなることを特徴とする、請求項８ないし１０のいずれかに記載のアレル多型のタイピング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子を含むヒト遺伝子のアレル多型のタイピング方法及びこれに用いるキットに関し、より具体的には、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型のタイピング方法及びこれに用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの主要組織適合性抗原複合体（ＭＨＣ）であるヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）は、白血球を含む多くのタイプの細胞の表面に発現する。ＨＬＡにはクラスＩ分子とクラスＩＩ分子があり、クラスＩ分子は内在性タンパク質由来のペプチド断片をＴ細胞レセプターに提示し、クラスII分子は外来性タンパク質由来のペプチド断片をＴ細胞レセプターに提示する。ＨＬＡ遺伝子には非常に多数の遺伝子変異が存在する。アレル多型が異なるヒトの個体間で臓器移植を行うと、移植組織と宿主との間で免疫反応が生じ、移植組織の拒絶など治療成績の悪化に繋がるおそれが高い。そこで、輸血又は臓器移植を伴う治療においては、臓器提供者と移植希望者とのＨＬＡのアレル多型をタイピングして、臓器提供者のＨＬＡのアレル多型と一致するアレル多型を有する移植希望者に移植する必要がある。また、ＨＬＡのアレル多型は感染症を含むさまざまな疾患の発症や予後と関連性がある。したがって、個々の患者の遺伝的背景に応じて適切な治療を行う、いわゆる「個の医療」が進展するにつれて、今後ますますＨＬＡのアレル多型のタイピングの需要が増大すると考えられている。
【０００３】
アレル多型のタイピングについてのＷＨＯ（世界保健機構）の表記方法では、１桁目と２桁目は血清学レベルの判定を意味し、３桁目と４桁目は、遺伝子変異が存在し、かつ、アミノ酸変異のある遺伝子型の判定を意味し、５桁目と６桁目は、遺伝子型変異は存在するがアミノ酸変異がない遺伝子型の判定を意味する。４桁レベルでのＨＬＡのアレル多型のタイピングに現在多用される方法は、蛍光マイクロビーズアレイシステムのルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ、登録商標）法である。ビーズ表面を固相面とした相補的ハイブリッド形成法を用いた遺伝子検出方法は以前より存在するが、ルミネックス法は使用するポリスチレン製のビーズを蛍光物質で着色し、その蛍光物質の色調と濃度（蛍光量）を測定することで、１００種類に識別できる技術である。通常のビーズ法は１本のチューブに１種類のビーズ、つまり１種類のプローブでの検出しかできなかったが、ルミネックス法では１本のチューブで最大１００種類のプローブでの検出が可能となり、１００倍の処理能力と情報量を得ることが可能である。
【０００４】
ルミネックス法を利用して、ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂという２つのクラスＩ分子と、ＨＬＡ−ＤＲＢ１という１つのクラスＩＩ分子という３つの分子について遺伝子のアレル多型をタイピングするための方法が特許文献１に開示されている。特許文献１には、プローブ固相ビーズと増幅産物を混合した後、増幅産物を一本鎖にする変性を加熱による熱変性とし、変性後至適の相補的ハイブリッド形成温度まで下げることで熱変性と相補的ハイブリッド形成を連続して行うことを特長とする、ルミネックス法を改良した遺伝子型判定方法が開示される。
【特許文献１】特開２００５−１６０３５５号公報
【０００５】
特許文献１に開示の方法では、ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂ分子のアレル多型検出についてはそれぞれ１本の試験管に全てのプライマーを添加して遺伝子増幅反応を行うことができた。しかし、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のアレル多型の検出についてはＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子と、それに類する遺伝子群（ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５など）とを区別した遺伝子増幅の安定性と、増幅産物とプローブとの相補的ハイブリッド形成のＳ／Ｎ比向上とのために、プライマーを２つのセットに分けて２本の試験管で遺伝子増幅反応を行い、かつ、特異的プローブとの反応もそれぞれ別の容器で行う必要があった。つまり、１人の被検者あたり４本の試験管を使って遺伝子増幅反応を行うことになる。これはＨＬＡアレル多型タイピングのスループット効率及びコストを向上させるうえで大きな障害である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
スループットの効率化及びコスト削減のために、より少ない数の試験管で遺伝子増幅反応を行うＨＬＡ遺伝子アレル多型タイピング方法と、該遺伝子アレル多型のタイピング用キットとを開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヒト遺伝子のアレル多型のタイピング方法を提供する。本発明のアレル多型のタイピング方法は、（１）ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用オリゴヌクレオチドプライマーの第１セットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１とは異なる他の遺伝子のアレル多型検出用オリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む第１容器と、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１及び前記他の遺伝子とは異なる更に別の遺伝子のアレル多型検出用オリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む第２容器とを用意するステップと、（２）同一個人由来の検体ＤＮＡと第１及び第２セットのプライマーのそれぞれとを混和するステップと、（３）第１及び第２容器のインキュベーションを行って遺伝子増幅産物を生成させるステップと、（４）前記他の遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第１セットとを第１容器の遺伝子増幅産物と混和し、前記更に別の遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第２セットとを第２容器の遺伝子増幅産物と混和するステップと、（５）第１及び第２容器のインキュベーションを行って、それぞれの容器の遺伝子増幅産物を前記アレル検出用プローブのいずれかと相補的ハイブリッド形成させるステップと、（６）第１及び第２容器のそれぞれについて、前記担体に固定化されたアレル検出用プローブと相補的ハイブリッド形成した前記遺伝子増幅産物に取り込まれた前記プライマーか、前記遺伝子増幅産物と相補的ハイブリッド形成した前記アレル検出用プローブかを検出するステップとを含み、前記アレル検出用プローブは１個の担体には１種または２種以上のヌクレオチド配列のプローブが固定化され、ステップ（６）において、前記担体に固定化されたアレル検出用プローブと相補的ハイブリッド形成した前記遺伝子増幅産物に取り込まれた前記プライマーか、前記遺伝子増幅産物と相補的ハイブリッド形成した前記アレル検出用プローブかを検出するときに、前記遺伝子増幅産物のヌクレオチド配列が特定される。
【０００８】
本発明のアレル多型のタイピング方法において、前記他の遺伝子と、前記更に別の遺伝子とは、いずれもＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ及びＨＬＡ−ＤＱからなるグループから選択される少なくとも１種類の遺伝子の場合がある。
【０００９】
本発明のアレル多型のタイピング方法において、前記他の遺伝子はＨＬＡ−Ａ遺伝子であり、前記更に別の遺伝子はＨＬＡ−Ｂ遺伝子である場合がある。
【００１０】
本発明のタイピング方法において、前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第１セットは配列番号２４ないし３２に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セットは配列番号３３ないし３７に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第１セットは配列番号１５３ないし１７９に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第２セットは配列番号１８０ないし２０３に列挙されるヌクレオチド配列からなるプローブが固定化された担体からなる場合がある。
【００１１】
本発明のタイピング方法において、前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第１セットは配列番号３３ないし３７に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セットは配列番号２４ないし３２に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第１セットは配列番号１８０ないし２０３に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第２セットは配列番号１５３ないし１７９に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなる場合がある。
【００１２】
本発明のタイピング方法において、前記ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットは配列番号１ないし１３に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットは配列番号１４ないし２３に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットは、配列番号３８ないし８５に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなり、前記ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットは、配列番号８６ないし１５２に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなる場合がある。
【００１３】
本発明は、２個の容器を用いるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型のタイピング用キットを提供する。本発明のタイピング用キットは、（１）ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第１セットとを含む第１のＰＣＲ反応容器と、（２）ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セットとを含む第２のＰＣＲ反応容器と、（３）ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第１セットとからなる、第１のＰＣＲ反応容器に添加するためのアレル検出用プローブを固定化した担体セットとの組合せと、（４）ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第２セットとからなる、第２のＰＣＲ反応容器に添加するためのアレル検出用プローブを固定化した担体セットとの組合せとを含む。
【００１４】
本発明のタイピング用キットにおいて、前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第１及び第２セットのうち一方は配列番号３１及び３２に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーを含み、第１及び第２セットのうち他方は配列番号３７に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーを含み、配列番号３１、３２及び／又は３７に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーによる遺伝子増幅の有無によって配列番号２０４に列挙されるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子産物のアミノ酸配列の第８６番目のアミノ酸をコード化するコドンの第２及び第３番目のヌクレオチドの配列の異なるアレルを区別する場合がある。
【００１５】
本発明のタイピング用キットにおいて、前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第１セットは配列番号２４ないし３２に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セットは配列番号３３ないし３７に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第１セットは配列番号１５３ないし１７９に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第２セットは配列番号１８０ないし２０３に列挙されるヌクレオチド配列からなるプローブが固定化された担体からなる場合がある。
【００１６】
本発明のタイピング用キットにおいて、前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第１セットは配列番号３３ないし３７に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セットは配列番号２４ないし３２に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第１セットは配列番号１８０ないし２０３に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル検出用プローブを固定化した担体の第２セットは配列番号１５３ないし１７９に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなる場合がある。
【００１７】
本発明のタイピング用キットにおいて、前記ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットは配列番号１ないし１３に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットは配列番号１４ないし２３に列挙されるヌクレオチド配列のプライマーからなり、前記ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットは、配列番号３８ないし８５に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなり、前記ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル検出用プローブを固定化した担体のセットは、配列番号８６ないし１５２に列挙されるヌクレオチド配列のプローブが固定化された担体からなる場合がある。
【００１８】
本発明のヒト遺伝子のアレル多型のタイピング方法及びタイピングキットにおいてアレル多型のタイピングの対象となるヒト遺伝子とは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子に加えて、以下に説明するＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ等の組織適合性に関与する遺伝子、シトクロームＰ４５０その他の薬物の代謝に関与する遺伝子、ケモカインレセプターのＣＣＲ３及びＣＣＲ５その他のＨＩＶ等の感染症耐性に関与する遺伝子、一塩基多型（ＳＮＰ）その他の疾患等のヒト遺伝形質と連関するアレル多型が存在するいずれかの遺伝子を含むが、これらに限定されない、臓器移植、法医学その他の分野でヒト遺伝子のアレル多型のタイピングを行うことがあるいずれかの遺伝子をいう。
【００１９】
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型については、、ＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ｄｏｃｓ／ｒｅｌｎｏｔｅｓ．ｈｔｍｌ）、ＡＳＥＡＴＴＡ（Ｔｈｅ  Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａｎ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈ  Ｅａｓｔ  Ａｓｉａｎ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｅａｔｔａ．ｏｒｇ．ａｕ／ｎｏｍｅｎｃｌａ．ｈｔｍ）及び日本組織適合性学会（ｈｔｔｐ：／／ｓｑｕａｒｅ．ｕｍｉｎ．ａｃ．ｊｐ／ＪＳＨＩ／ｈｌａ＿ｄａｔａ／ｄａｔａ．ｈｔｍｌ）等のインターネット上のサイトで公表されている。本発明のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットと、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル検出用プローブとは、それぞれの遺伝子について日本人におけるアレル多型の頻度が０．００５％以上のものを対象としたとき、それらのホモ／へテロの区別なくタイピングが可能であることを条件としていかなるヌクレオチド配列であってもかまわない。
【００２０】
本明細書において、遺伝子増幅とは、１対もしくはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型ＤＮＡとを用いて、該鋳型ＤＮＡのうち、前記プライマーのそれぞれと相補性のあるヌクレオチド配列を有する前記鋳型ＤＮＡの部分にはさまれた領域を特異的に複製することのできるいずれかの遺伝子工学的技術をいい、ＰＣＲ法と、ＳＭＡＰ（SMart Amplification Process）法と、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法とを含むが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明のＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットは、配列番号１から１３までに列挙されたヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドのセットを含むが、これらに限定されない。本発明のＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットは、配列番号１４から２３までに列挙されたヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドのセットを含むが、これらに限定されない。本発明のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセットは、配列番号２４から３７までに列挙されたヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドのセットを含むが、これらに限定されない。本発明のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーは、ビオチン、ジゴキシンその他の低分子化合物で標識される場合がある。標識されたプライマーによって増幅された産物は、増幅産物のヌクレオチド配列に相補的なプローブと相補的ハイブリッド形成して担体に固定化され、前記低分子化合物と特異的に結合する蛍光標識特異的結合パートナーと結合することによって検出される。
【００２２】
本発明のＨＬＡ−Ａのアレル検出用プローブは、配列番号３８から８５までに列挙されたヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。本発明のＨＬＡ−Ｂのアレル検出用プローブは、配列番号８６から１５２までに列挙されたヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。本発明のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル検出用プローブは、配列番号１５３から２０３までに列挙されたヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明の担体は、プローブとの相補的ハイブリッド形成の際に遺伝子増幅産物を変性させるための加熱処理に耐えることが可能であり、かつ、プローブとの相補的ハイブリッド形成により担体と結合したＰＣＲ産物の存在を検出する際に、当該担体に固定化されたプローブを同定することが可能であることを条件として、いかなる材料で製造されてもかまわない。本発明においては、１個の担体に２種類、３種類又は４種類以上のプローブが結合する場合と、１個の担体に１種類のプローブだけが結合する場合とがある。好ましい担体は、ルミネックス社から入手可能な「ＭｉｃｒｏＰｌｅｘ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」というポリスチレン製担体である。「ＭｉｃｒｏＰｌｅｘ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」は２種類の蛍光物質がそれぞれ１０段階の異なる濃度の組合せで着色されている。そのため全部で１００種類の担体を識別同定することができる。また「ＭｉｃｒｏＰｌｅｘ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」の表面はアビジンもしくはカルボキシル基でコートされており、ビオチンもしくはアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドを結合・固相することができる。本発明のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル検出用プローブを担体に固定化することは、それぞれのオリゴヌクレオチドの末端部をアミノ基で修飾し、それとカルボキシル基コートされた「ＭｉｃｒｏＰｌｅｘ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」とで共有結合反応を行うことにより達成される。
【００２４】
本発明のタイピング方法及びタイピングキットでは、アレルの一部は、ヒト遺伝子のアレル検出用プライマーのセットと検体ＤＮＡとから得られた遺伝子増幅産物がどのプローブに結合するかによって判定される。アレルの別の一部は、前記プライマー由来の遺伝子増幅産物の有無によって判定される。例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型は、配列番号２０４に列挙されるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１０１の遺伝子産物のアミノ酸配列の第８６番目のアミノ酸をコード化するコドンがＧＧＴであるかＧＴＧであるかによって大きく２つのグループに分類することができる。遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１０１の遺伝子産物のアミノ酸配列と遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０２０１の遺伝子産物のアミノ酸配列とは、前者の第８６番目のアミノ酸をコード化するコドンがＧＧＴでグリシンをコードするのに対し、後者の第８６番目のアミノ酸をコード化するコドンがＧＴＧでバリンをコードする点を除くと、他は同一である。そこで、一部のプライマーの３’末端が第８６番目のアミノ酸に対応する部位のヌクレオチド配列を含むようにしておくことによって、当該プライマー由来の遺伝子増幅産物が得られる場合には当該プライマーのヌクレオチド配列に相補的な配列を検体ＤＮＡは有することがわかり、かかる遺伝子増幅産物が得られない場合には、当該プライマーのヌクレオチド配列に相補的な配列を検体ＤＮＡは有しないことがわかる。表１に列挙される本発明のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル検出用プライマーのうち、配列番号３１、３２及び３７に列挙されるヌクレオチド配列を有するそれぞれＤ２Ｒ１、Ｄ２Ｒ２及びＤ２Ｒ３は、遺伝子増幅産物の有無によってＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子産物の第８６番目のアミノ酸に対応する部位のヌクレオチド配列の多型を検出することができる。
【００２５】
本発明のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル検出用プライマーのセットは、２組のセットに分けて、２個の容器のそれぞれに添加される。２組のセットへの分別は、遺伝子増幅反応が安定して進行し、かつ、増幅産物とプローブとの相補的ハイブリッド形成のＳ／Ｎ比がタイピングの妨げにならないことを条件として、いずれのヌクレオチド配列がいずれのセットに配分されてもかまわない。配列番号２４から３２までに列挙されたヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを１組のセットとし、配列番号３３から３７までに列挙されたヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを別の１組のセットとすることが好ましい。これらの好ましいＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル検出用プライマーの２組のセットのいずれか一方がＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル検出用プライマーと同じ容器に添加され、他方がＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル検出用プライマーと同じ容器に添加される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明について詳細に説明する。以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。
【実施例１】
【００２７】
サンプル及び染色体ＤＮＡ抽出
サンプルは日本人健常者計９５検体から、株式会社医学生物学研究所及び富士フィルム株式会社のＤＮＡ抽出キットを用いて染色体ＤＮＡを抽出、精製した。２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＤＮＡの定量と純度の測定を行い、１０−２０ｎｇ／μＬの濃度に調製した。これらの検体のＨＬＡ遺伝子アレル多型は、株式会社医学生物学研究所が販売する既存の判定方法（ジェノサーチＨＬＡ  ｖｅｒ．２）等の別法での判定により既知である。
【００２８】
アレル多型検出用プライマー
表１は、第１の容器に添加されるプライマー（Ａ／ＰＳ１増幅系）と、第２の容器に添加されるプライマー（Ｂ／ＰＳ２増幅系）とに用いるプライマーのリストである。第１の容器に添加するプライマーは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセット（配列番号１ないし１３）と、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第１セット（配列番号２４ないし３２）とである。第２の容器の添加されるプライマーは、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーのセット（配列番号１４ないし２３）と、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーの第２セット（配列番号３３ないし３７）とである。本実施例のアレル多型検出用遺伝子増幅プライマーは５’末端をビオチンで標識したオリゴヌクレオチドを用いた。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
ＰＣＲ増幅反応
Ａ／ＰＳ１増幅系及びＢ／ＰＳ２増幅系のプライマーをそれぞれ第１及び第２の容器に適切な濃度で混合した。増幅用緩衝液は最終濃度  ５０  ｍＭ  ＫＣｌ、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２％  ＤＭＳＯ、０．２  ｍＭ  ｄＮＴＰｓとした。これに０．５−１．０  μＭの上記プライマーセット、２５  Ｕ／ｍＬのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび検体ゲノムＤＮＡ  ５０−１００  ｎｇを加え、全量を２５μＬとした。第１及び第２の容器をサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に装着し、９４°Ｃで２分保持した後、９４°Ｃで３０秒間保温するステップと、６５°Ｃで３０秒間保温するステップと、７２°Ｃで３０秒間保温するステップとからなる熱サイクルを４０回繰り返す条件でＰＣＲ増幅反応を行った。
【００３１】
アレル多型検出用プローブ
表２−１及び２−２は、Ａ／ＰＳ１増幅系のアレル多型検出用プライマーを用いて第１の容器でＰＣＲ増幅反応を行って得られた増幅産物と相補的にハイブリッド形成するプローブのリストである。表３−１及び３−２は、Ｂ／ＰＳ２増幅系のアレル多型検出用プライマーを用いて第２の容器でＰＣＲ増幅反応を行って得られた増幅産物と相補的にハイブリッド形成するプローブのリストである。
【００３２】
【表２−１】
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【００３３】
【表２−２】
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【００３４】
【表３−１】
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【００３５】
【表３−２】
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【００３６】
アレル多型用プローブの蛍光マイクロスフェア粒子への固定化
ルミネックス法のｘＭＡＰ（商標）マイクロスフェア粒子は、蛍光波長の異なる２種類の蛍光色素をそれぞれ１０段階の異なる濃度で含むポリスチレン製マイクロビーズ粒子で、１つのグループに１００種類の粒子が含まれる。したがって、第１及び第２の容器のそれぞれで増幅された産物について、最大１００種類までのプローブとの相補的ハイブリッド形成が起こるかどうかを検出することができる。ＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル多型検出用プローブは４８種類で、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型検出用プローブの第１セットは２７種類である。これらの各プローブを第１のグループの１００種類のマイクロスフェア粒子のいずれか１種類に固定化させるように割り当て、各プローブの末端に標識したアミノ基と、マイクロスフェア粒子の表面にコーティングされたカルボキシル基とのカップリング反応により両者を固定化する。この作業を４８種類のＨＬＡ−Ａ遺伝子のアレル多型検出用プローブと、２７種類のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型検出用プローブの第１セットとについて行って、これらのプローブを固定化した粒子を調製した。６７種類のＨＬＡ−Ｂ遺伝子のアレル多型検出用プローブと、２４種類のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型検出用プローブの第２セットとについても、同様に、第２のグループの１００種類のマイクロスフェア粒子のいずれか１種類に固定化されるように割り当て、これらのプローブを固定化した粒子を調製した。調製された第１及び第２グループのマイクロスフェア粒子は、ＴＭＡＣ（塩化四メチルアンモニウム）、ＥＤＴＡ、ザルコシンおよびＴｒｉｓ緩衝液を含むハイブリダイゼーション緩衝液に１回の測定あたり各粒子が約３５０個ずつ含まれるように粒子濃度を調整して再分散させ、それぞれ、第１及び第２の粒子混合液を調製した。
【００３７】
ＰＣＲ増幅産物とアレイ多型検出用プローブとの相補的ハイブリッド形成
ハイブリダイゼーション反応緩衝液（３．７５  Ｍ  ＴＭＡＣ、６２．５ｍＭ  ＴＢ  ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１２５％  Ｎ−ラウロイルサルコシン）を４０μＬに、上記ビーズミックスを５μｌと、ＰＣＲ増幅産物を５μＬ加えて、５０μＬとした。これらをＧｅｎｅＡｍｐ９７００に装着し、９５°Ｃで２分間保温してＰＣＲ増幅産物を熱変性させてから、５２°Ｃで３０分間保温する条件で雑種形成反応を行った。
【００３８】
粒子に不動化されたＰＣＲ増幅産物の検出
相補的ハイブリッド形成後、ストレプトアビジン標識フィコエリスリン（ＳＡ−ＰＥ、ＭＯＳＳ社）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１×ＰＢＳ(ｐＨ７．５)、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で１００倍に希釈したもの（以下、「ＳＡ−ＰＥ反応液」という。）を５０μＬずつ添加した。スイング型のプレート遠心機にて１８００×ｇ、２分間遠心分離し、上清を除いた。再度ＳＡ−ＰＥ反応液を５０μＬずつ加え、上記条件で遠心し、上清を除いた。再々度ＳＡ−ＰＥ反応液を５０μＬずつ加え、ピペッティングでマイクロスフェア粒子と反応液を撹拌して、それらをＧｅｎｅＡｍｐ９７００にセットし、５２°Ｃで１０分間保温させた後、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００システム（９６サンプル用）に装着し、測定を行った。得られた反応パターンを入力したアレル多型タイピングソフトウェアを用いて、アレル多型のタイピングを行った。
【００３９】
結果
日本人由来の９５検体ゲノムＤＮＡについてＰＣＲ増幅を行い、上記の実験条件を用いて２個の容器でＬｕｍｉｎｅｘ法によるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子タイピングを行った。表４−１から表６−４までに、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子アレル多型タイピングのプローブ判定パターンをそれぞれ示した。本方法は日本人集団で遺伝子頻度が０．００５％以上みられるアレル（表４−１から表６−４までを参照））について、ホモ、ヘテロの組合わせについて４桁レベルのタイピングが可能である。また、日本人以外の他集団では頻繁に観察されるＡ２９やＡ３２の判定についても、型判定可能な方法である。
【００４０】
【表４−１】
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【００４１】
【表４−２】
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【００４２】
【表４−３】
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【００４３】
【表４−４】
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【００４４】
【表５−１】
2009261358.tif 000011
【００４５】
【表５−２】
2009261358.tif 000012
【００４６】
【表５−３】
2009261358.tif 000013
【００４７】
【表５−４】
2009261358.tif 000014
【００４８】
【表６−１】
2009261358.tif 000015
【００４９】
【表６−２】
2009261358.tif 000016
【００５０】
【表６−３】
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【００５１】
【表６−４】
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【００５２】
表７−１及び７−２に、本発明の方法によるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型タイピングの結果の代表例を示す。
【００５３】
【表７−１】
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【００５４】
【表７−２】
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【００５５】
本発明の方法では、２つの容器でＰＣＲ増幅反応を行うために、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型検出用プライマーのセットを第１セットと第２セットの２つに分割した。その結果、第１セットのＰＣＲ増幅産物がプローブと相補的ハイブリッド形成した結果と、第２セットのＰＣＲ増幅産物がプローブと相補的ハイブリッド形成した結果とが整合しないときには、例えば、以下の表８−１及び８−２に示すとおり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のアレル多型が決定不能となるエラーが頻繁に発生する。そこで、本発明はサンプルの取り違えによるアレル多型タイピングのミスを防止することができる。
【００５６】
【表８−１】
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【００５７】
【表８−２】
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【配列表】
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