(57)【要約】【課題】β-ケトアシルACP シンターゼに関連する組成物およびその使用方法を提供する。【解決手段】特定の対象物はCuphea種から取得することができるシンターゼである。シンターゼタンパク質因子のアミノ酸および核酸、ならびに改変された脂肪酸組成を有する遺伝子工学的に作製された植物の作製のための構築物にこうした配列を利用するための方法を提供する。特記すべき対象物は、トランスジェニック植物種子の油中の中鎖脂肪酸レベルの増大および／または割合の改変のための、植物中鎖アシルACP チオエステラーゼの発現と共に起こるシンターゼタンパク質因子の発現である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号2（図1）のアミノ酸配列を有するchKAS B-2、配列番号4(図2)のアミノ酸配列を有するchKAS B-31-7、配列番号6(図3)のアミノ酸配列を有するchKAS A-2-7、配列番号8(図4)のアミノ酸配列を有するchKAS A-1-6、配列番号10(図5)のアミノ酸配列を有するcpuKAS B/7-8、配列番号12(図6)のアミノ酸配列を有するcpuKAS B/8-7A、配列番号14(図7)のアミノ酸配列を有するcpuKAS A/p7-6A、配列番号15(図8)のDNA配列を有するcpuKAS A/p8-9A、及び配列番号17(図9)のアミノ酸配列を有するchKASIII-27、からなる群から選択されるβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KAS)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNA構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物内の脂肪酸合成に関係する植物脂肪酸シンターゼ酵素をコードする遺伝子、および植物の中鎖選択性(medium-chain preferring)チオエステラーゼタンパク質をコードする遺伝子と組合せたこれらの遺伝子の使用方法に関する。これらの使用によって、トランスジェニック植物の種子油中に産生され得る中鎖脂肪酸のレベルを増大させる方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
高等植物は共通する代謝経路を経由して脂肪酸を合成する。トリグリセリドに結合した脂肪酸がさらなる発芽のためのエネルギー源として貯蔵されている生育中の種子においては、脂肪酸合成経路はプラスチド中に局在する。第１段階は、短鎖選択性(short chain preferring)縮合酵素であるβ-ケトアシルACP シンターゼ(KAS) III によって触媒される、アセチル-CoA およびACPからのアセチルACP（アシルキャリアタンパク質）の形成である。アセチルACP の16および18炭素脂肪酸への伸長には以下の一連の反応循環作用が関与する：マロニルACP からの２炭素単位との縮合によるさらに長いβ-ケトアシルACP の形成（β-ケトアシルACP シンターゼ）、ケト官能基のアルコールへの還元（β-ケトアシルACP レダクターゼ）、脱水によるエノイルACP の形成（β-ヒドロキシアシルACP デヒドラーゼ）、および最後にエノイルACP の還元による伸長された飽和アシルACP の形成（エノイルACP レダクターゼ）。β-ケトアシルACP シンターゼI （KAS I ）は主にパルミトイルACP （Ｃ16:0）までの伸長に関与し、一方β-ケトアシルACP シンターゼII（KAS II）は主に最終のステアロイルACP（Ｃ18:0）への伸長に関与する。
【０００３】
β-ケトアシルACP シンターゼI およびIIのペプチド成分をコードする遺伝子はヒマ（Ricinus communis）およびBrassica種（特許文献１）を含む多数の高等植物種からクローン化されている。KAS I 活性は分子量が約50 kD の１つのシンターゼタンパク質因子（シンターゼ因子Ｂ）に関係し、KAS IIは２つのシンターゼタンパク質因子、50 kD のシンターゼ因子Ｂおよびシンターゼ因子Ａと命名された46 kD のタンパク質の組合せに関係していた。KAS III タンパク質をコードする植物遺伝子のクローニングおよび配列はTai およびJaworskiによって報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
植物脂肪酸シンターゼ活性の最終産物は通常16および18炭素脂肪酸である。しかし、脂肪種子中に大量の8〜14 炭素（中鎖）脂肪酸を貯蔵するいくつかの植物ファミリーがある。ラウリン酸（12:0）に富む種子油を産生する植物である、Umbellularia californica（カリフォルニアベイ(California bay)）を用いた最近の研究から、種子プラスチド内でのアシルACP チオエステラーゼの中鎖特異的イソ酵素の存在が証明された。その後のUmbellularia californicaからの12:0ACPチオエステラーゼの精製から、チオエステラーゼcDNAのクローニングが導かれ、これがArabidopsis およびBrassicaの種子中で発現され、その結果これらのトランスジェニック種子のトリグリセリドプール中でのラウリン酸の実質的な蓄積がもたらされた（特許文献２）。これらの結果ならびに別の植物種からの中鎖チオエステラーゼを用いたその後の研究によって、de novo 脂肪酸生合成中のアシルACPチオエステラーゼの鎖長を決定する役割が確認された（非特許文献２）。
【特許文献１】米国特許第5,510,255 号
【特許文献２】米国特許第5,512,482 号
【非特許文献１】Plant Physiol.(1993) 103:1361-1367
【非特許文献２】T.Voelker(1996) Genetic Engineering編.J.K.Setlow,第18巻,111-133頁
【発明の開示】
【０００５】
本発明によれば、β-ケトアシルACP シンターゼ（KAS ）に関連する組成物および使用方法が提供される。生物学的に活性な植物シンターゼに関連する方法ならびにアミノ酸および核酸配列の組成物もまた、対象である。
【０００６】
特に、Cuphea種由来のKAS タンパク質因子ＡおよびＢをコードする遺伝子が提供される。KAS 遺伝子は各種の適用において使用の対象であり、そして大腸菌などの細菌の細胞および植物細胞を含む形質転換された宿主細胞中にシンターゼIおよび／またはシンターゼII活性を提供するために使用することができる。シンターゼ活性は、より長いおよびより短いアシルACP に対する選択的活性（preferential activity）、ならびにKAS特異的阻害剤であるセルレニンに対する感受性によって識別される。中鎖長アシルACP に対する選択的活性を有するシンターゼタンパク質調製物はシンターゼI 型またはKAS I である。このKAS I クラスは 1μM 程度の低濃度のセルレニンによる阻害に対して感受性である。より長い鎖長のアシルACP に対する選択的活性を有するシンターゼはシンターゼII型またはKAS IIである。このII型のKAS 酵素もまた、セルレニンに感受性であるが、但し、より高い濃度（50μM ）にて感受性である。シンターゼIII 型酵素は短鎖長アシルACP に対する選択的活性を有し、セルレニン阻害剤に対しては非感受性である。
【０００７】
宿主細胞中に存在するシンターゼ活性の量、特に宿主細胞が植物宿主細胞である場合に、シンターゼI 型、シンターゼII型およびシンターゼIII 型活性の相対量を調整するために、核酸構築物中にシンターゼタンパク質をコードする核酸配列を使用することができる。その上、さらに植物細胞中で内在性シンターゼの発現を減少させるように核酸構築物を設計することもできる。１つの例は、少なくともこの酵素を正常に産生する植物細胞中で発現することが可能なプロモーターの制御下でのアンチセンスシンターゼ配列の使用である。
【０００８】
本発明の特定の対象は、シンターゼタンパク質をチオエステラーゼタンパク質の発現と協調的(coordinate)に発現することである。例えば、シンターゼ因子Ａと中鎖チオエステラーゼとの協調的発現によって、トランスジェニック植物種子から収集することができる中鎖脂肪酸のレベルを増大させる方法が提供される。さらに、シンターゼ因子Ａ遺伝子と植物中鎖チオエステラーゼタンパク質との協調的発現によっても、トランスジェニック植物中に産生される各種の中鎖脂肪酸の比率を改変することができる方法が提供される。例えば、シンターゼ因子Ａの発現によって、Ｃ8 およびＣ10脂肪酸に対する活性を有する１つのチオエステラーゼの発現の結果として、植物種子油中に産生されるＣ10／Ｃ8 脂肪酸の比率を増大させることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の植物シンターゼ因子タンパク質には、植物宿主細胞中でＣ２〜Ｃ１６ の鎖長を有するアシルACP とマロニルACP 間の縮合反応の触媒のために必要な一連のアミノ酸またはポリペプチドが含まれる。特定の植物シンターゼ因子タンパク質は（例えばモノマーまたはホモダイマーとして）植物宿主細胞中でのシンターゼ反応を触媒することが可能であるか、または植物宿主細胞中でのシンターゼ反応を触媒することが可能な多重ペプチド酵素の１成分、すなわちヘテロダイマーの１ペプチドであってもよい。
【００１０】
シンターゼI （KAS I ）はより短い炭素鎖、Ｃ２〜Ｃ１４ を有するアシルACP に対して選択的活性を示し、そして濃度 1μM のセルレニンによる阻害に対して感受性である。シンターゼII（KAS II）はより長い炭素鎖、Ｃ１４〜Ｃ１６を有するアシルACP に対して選択的活性を示し、そして高濃度のセルレニン（50μM）により阻害される。シンターゼIIIは非常に短い炭素鎖、Ｃ２〜Ｃ６を有するアシルCoA に対して選択的活性を示し、そしてセルレニンによる阻害に対して非感受性である。
【００１１】
Cuphea属の中鎖脂肪酸産生性植物種から得たシンターゼ因子ＡおよびＢ、ならびにシンターゼIII タンパク質についてここに記載する。以下の実施例において説明するように、C.hookeriana由来のシンターゼＡは天然では高レベルで、かつ種子中でのみ発現される。C.hookerianaシンターゼＢは試験したすべての組織中で低レベルで発現される。大腸菌中のシンターゼＡおよびシンターゼＢ因子の発現、ならびに生成したタンパク質の精製を使用して、各種のシンターゼ因子の活性を判定する。これらの分析の結果の結果から、Cuphea hookeriana 由来のシンターゼ因子Ａは6:0ACP 基質に対して最大の活性を有するが、Cuphea pullcherrima 由来のシンターゼ因子Ｂは14:0ACP基質に対して最大の活性を有することが示される。ヒマ由来のシンターゼ因子ＡおよびＢでの同様の研究から、Cupheaおよびヒマ由来の因子Ｂシンターゼタンパク質間での同様の活性プロフィルが実証されている。しかし、ヒマ由来のシンターゼＡクローンは14:0ACP基質に対する選択性を示している。
【００１２】
本来は中鎖脂肪酸を産生しないトランスジェニック植物種子中でCuphea hookeriana KAS A タンパク質を発現させても、この種子中で産生される脂肪酸型および含有量に検出可能な改変は何ら生じない。しかし、植物種子油中にＣ8 およびＣ10脂肪酸を産生させることが可能な中鎖アシルACP チオエステラーゼの発現と共にCuphea hookeriana KAS A タンパク質を発現させた場合、中鎖チオエステラーゼのみの発現によって達成し得るレベルと比較して中鎖脂肪酸のレベルの増加が観察される。その上、中鎖チオエステラーゼ発現の結果として有意な量のＣ8およびＣ10脂肪酸が産生される場合、Cuphea KAS Aタンパク質の同時発現によっても、得られるＣ8 およびＣ10脂肪酸の比率が改変される。例えば、Cuphea hookeriana ChFatB2 チオエステラーゼおよびchKAS A シンターゼ因子タンパク質の同時発現によってＣ10脂肪酸の比率の増大が達成される。
【００１３】
さらに、植物種子油中にＣ12脂肪酸を産生させることが可能な中鎖アシルACPチオエステラーゼの発現と共にCuphea hookeriana KAS A タンパク質を発現させた場合、中鎖チオエステラーゼのみの発現によって達成し得るレベルと比較して中鎖脂肪酸のレベルの増加がやはり観察される。その上、中鎖チオエステラーゼ発現の結果として有意な量のＣ12およびＣ14脂肪酸が産生される場合、Cuphea KAS Aタンパク質の同時発現によっても、得られるＣ12およびＣ14脂肪酸の比率が改変される。例えば、Uc FatB1チオエステラーゼおよびchKAS A シンターゼ因子タンパク質の同時発現によってＣ12脂肪酸の比率の増大が達成し得る。
【００１４】
しかし、植物種子油中にＣ18およびＣ18:1脂肪酸を産生させることが可能な長鎖アシルACP チオエステラーゼの発現と共にCuphea hookeriana KAS A タンパク質を発現させた場合、長鎖脂肪酸の産生に対して何の影響も観察されなかった。さらに、Ｃ18:0およびＣ18:1脂肪族アシルACP を選択的に加水分解する、マンゴスチン由来の長鎖アシルACP チオエステラーゼ（GarmFatA1 、米国特許出願第08/440,845号）を発現するように形質転換した植物を非形質転換対照植物と交配した場合、Ｃ18:0レベルの有意な減少が得られる。GarmFatA1 を発現するように形質転換した植物とCuphea hookeriana KAS A タンパク質を発現する植物との交配により生じる植物の種子中のＣ18:0レベルについても同様の減少が観察される。
【００１５】
このように、本発明は、中鎖アシルACP チオエステラーゼとシンターゼ因子タンパク質との同時発現によって、トランスジェニック植物種子油中の中鎖脂肪酸組成物を増加および／または改変させる方法を提供する。さらに、所望する特定の脂肪酸に応じて、種々のシンターゼ因子と中鎖チオエステラーゼとの組合せを達成することができる。例えば、Ｃ14脂肪酸の産生を増加させるためには、シンターゼタンパク質因子をＣ14チオエステラーゼと組合せて発現させることができ、例えばCuphea palustrisまたはナツメグ由来のものを利用することができる（WO 96/23892 ）。その上、中鎖脂肪酸の組成に対してその他の影響を与えるために、チオエステラーゼ発現を多数の異なるシンターゼ因子タンパク質と組合せることができる。
【００１６】
本発明で使用するシンターゼとしては、変異、末端切断、増加などを受けた配列、および部分的または全体として人工的に合成されたそれらの配列などの改変されたアミノ酸配列が含まれる。本明細書中で提供するシンターゼタンパク質コード配列は、さらなるスクリーニングのためのプローブ中で使用してもよいし、あるいは宿主細胞、特に植物宿主細胞中での転写または転写および翻訳のための遺伝子工学用構築物において使用することができる。当業者であれば、抗体調製物、核酸プローブ（DNA およびRNA ）などを調製して、他の供給源からシンターゼおよび／またはシンターゼ核酸配列をスクリーニングならびに回収するために使用することができることが容易に理解されよう。典型的には、R.Communisシンターゼと所与の目的とする植物シンターゼとの間では、存在する可能性のある何らかの欠失を除いて、約60％以上の相同性、そしてより好ましくは約70％以上の相同性のとき、相同的な関係にある核酸配列として示されることになる。相同性は核酸若しくはアミノ酸の配列情報を比較するか、またはハイブリダイゼーション反応によって判定される。
【００１７】
当業界で周知の方法によって、シンターゼタンパク質因子をコードする核酸配列、またはシンターゼタンパク質因子および中鎖アシルACP チオエステラーゼをコードする核酸配列を含有する組換え構築物を調製することができる。構築物は、原核または真核細胞中のいずれかでシンターゼを産生するように設計することができる。植物細胞中での、特に中鎖チオエステラーゼの発現または植物中に観察される内在性シンターゼの量の減少と組合せたシンターゼ発現の増大が特に興味深い対象である。
【００１８】
所望する結果に応じて、脂肪酸合成の伸長縮合反応を触媒するために、シンターゼタンパク質因子を単独でまたは組合せて使用することができる。例えば、比率に影響するシンターゼ活性はシンターゼI 型、シンターゼII型、シンターゼIII 型またはこれらの酵素の組合せ次第である。さらに、シンターゼ活性は本明細書中に記載する各種のシンターゼ因子の組合せ如何による。
【００１９】
宿主細胞中で目的の核酸配列の転写および翻訳を提供するための要素を含有する構築物は「発現カセット」である。宿主に応じて調節領域は変更され、これらとしてウイルスからの構造遺伝子、プラスミドまたは染色体遺伝子などからの領域が含まれる。原核または真核微生物、特に単細胞宿主中での発現のためには、広範囲の構成性または調節性プロモーターを使用することができる。記載されている転写開始領域の中には、大腸菌、B.subtilis、Saccharomyces cerevisiaeなどの細菌および酵母宿主からの領域があり、βガラクトシダーゼ、T7ポリメラーゼ、trp-lac(tac)、trp E などの遺伝子が含まれる。
【００２０】
植物細胞中でのシンターゼ発現のための発現カセットには、5'から3'方向への転写において、植物細胞中で機能する転写および翻訳開始を制御する調節領域（「プロモーター」としても知られている）、シンターゼをコードする核酸配列、ならびに転写終結領域を含む。デサチュラーゼ構造遺伝子の広範囲の構成的、または調節的、例えば誘導性の転写を可能にする多数の転写開始領域が入手できる。植物に使用される転写開始領域の中には、カリフラワーモザイクウイルス（30S、19S）に結合した領域、ならびにノパリン(nopaline)シンターゼ若しくはマンノピン(mannopine) シンターゼなどのための構造遺伝子、またはナピン(napin) およびACP プロモーター、その他がある。こうした構造遺伝子に対応する転写／翻訳開始領域は対応する開始コドンの直近の5'上流に見られる。従って、目的の使用に応じて、別々のプロモーターが望ましいであろう。
【００２１】
本発明で特に対象とするのは、種子組織中で、特に種子油形成の初期段階に選択的にそのシンターゼを発現することが可能なプロモーターの使用である。こうした種子特異的プロモーターの例として、米国特許第5,420,034 号に記載されているようなナピン若しくは種子ACP 遺伝子、Thompsonら（Proc.Nat.Acad.Sci.(1991)88:2578-2582）によって記載されたようなデサチュラーゼ遺伝子、または米国特許第5,530,194 号に記載されたようなBce-4 遺伝子の直近の5'上流領域が含まれる。あるいは、植物シンターゼ構造遺伝子に結合した5'調節領域、すなわち植物シンターゼ構造遺伝子の直近の5'上流領域、および／または植物シンターゼ構造遺伝子のすぐ3'下流に見られる転写終結領域の使用が望ましいことが多い。一般的に、プロモーターは特定の適用に応じて変化しうる発現プロフィルに基づいて選択されることになる。
【００２２】
その上、植物油の量および／または組成の変更に影響を与えるために、発現と協同させた１以上のその他の目的の配列またはシンターゼ配列のアンチセンス、特に米国特許第5,512,482 号に記載されたような中鎖植物チオエステラーゼの転写または転写および翻訳をもたらすように選択することができる。
【００２３】
目的とする２以上の核酸配列の組合せ効果について形質転換された植物を提供しようとする場合、別々の核酸構築物をそれぞれ供給するかまたは同一の植物形質転換構築物中に構築物の両方を存在させてもよい。伝統的な植物育種方法を介したトランスジェニック植物の交配によるこれらの特性の導入を含む、同一のまたは異なる方法によって、構築物を宿主細胞中に導入することができる。ただし、生成する産物がそのゲノム中に組み込まれた両方の性質を有する植物である場合に限る。
【００２４】
通常、DNA 構築物に含まれるのは、宿主中で発現するために必要な調節領域を有し、そして形質転換された細胞の選択を付与する構造遺伝子である。その遺伝子は、細胞傷害剤（例えば、抗生物質、重金属、毒素、その他）に対する抵抗性、栄養要求性の宿主に対するプロトトロフィー(prototrophy)を付与する相補性(complementation)、ウイルス免疫性、などを付与し得る。発現構築物またはその成分が導入される別種の宿主の数に応じて、１以上のマーカーを使用することができ、この場合別種の宿主に対して異なる選択条件を使用する。
【００２５】
DNA 構築物を植物宿主中に導入する手法は本発明にとって重要ではない。効率的な形質転換をもたらすどのような方法も使用可能である。植物細胞の形質転換の各種の方法として、TiまたはRiプラスミドの使用、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム融合、DNA ボンバード(bombardment) などが含まれる。多くの例において、構築物がT-DNA と一端または両端で接していること、特に左および右端接触、さらによいのは右端接触を有することが望ましい。構築物が形質転換のモードとしてA.tumefaciens またはA.rhizogenesを使用する場合に、これは特に有用である。ただし、T-DNA 端部はその他の形質転換モードにおいても用途が見いだされる。
【００２６】
この発現構築物を広範囲の植物生体、特に植物油の製造に関与する植物生体に使用することができる。これらの植物として、限定するわけではないが、菜種、ピーナツ、ヒマワリ、ベニバナ、綿、大豆、コーンおよび種子油ヤシが含まれる。
【００２７】
Agrobacterium を使用した植物細胞の形質転換のためには、外植片を形質転換したAgrobacterium と混合して、形質転換のために十分な時間インキュベートし、細菌を死滅させ、そして植物細胞を適切な選択培地中で培養するのがよい。カルスが形成された後、既知の方法にしたがって適切な植物ホルモンを使用することにより、新芽の形成を促進することができ、そしてその新芽を発芽用培地に移して植物を再生させる。次に植物を種子形成まで生長させて、その種子を継代生産の確立および植物油の単離のために使用することができる。
【００２８】
本発明をここに全般的に記載したが、以下の実施例を参照することによってさらに容易に理解されるであろう。しかし、この実施例は本発明を単に説明する目的のものであって、これらを限定する意図はない。
【実施例】
【００２９】
実施例  １  Cuphea KAS因子ＡおよびＢ遺伝子のクローニング
Cuphea hookeriana およびCuphea pullcherrima の生育中の種子から単離した全RNA を市販の１ベース(based) クローニングベクター中でのcDNA合成のために使用した。各型のKAS 遺伝子のクローニングのため、未増幅組み換えファージ約400,000〜500,000をプレーティングし、プラークをニトロセルロースに移した。C.hookerianaからのKAS 因子Ｂのクローニングのためには、Brassica napus KAS因子ＢおよびRicinus communis（ヒマ）KAS 因子Ｂ放射性標識cDNAを含有する混合プローブを使用した。同様に、C.hookerianaからのKAS 因子Ａ遺伝子を得るために、Brassica napus KAS因子ＡおよびRicinus communis KAS因子Ａ cDNA クローンを含有する混合プローブを使用した。KASIIIについては、C.hookerianaからKASIIIクローンを単離するため、Dr.Jan Jaworski から入手したホウレンソウ KASIII cDNAクローンを放射性標識して、プローブとして使用した。C.pullcherrimaからの KAS B および KAS A のクローニングのために、C.hookeriana KAS Bおよび KAS A 遺伝子である chKAS B-2 および chKAS A-2-7 （下記参照）を放射性標識して、プローブとして使用した。
【００３０】
Cuphea KASクローンに関するDNA 配列および翻訳アミノ酸配列を図１〜９に示す。Cuphea hookeriana KAS 因子Ｂクローンである chKAS B-2 および chKAS B-31-7を図１および２に示す。これらのクローンのいずれも全長ではない。Cuphea hookeriana KAS 因子Ａクローンである chKAS A-2-7 および chKAS A-1-6 を図３および４に示す。chKAS A-2-7 は KAS 因子タンパク質の全コード配列を含有する。別の植物シンターゼタンパク質との比較に基づいて、トランジット(transit) ペプチドはヌクレオチド 125-466によってコードされるアミノ酸で表示されると考えられる。chKAS A-1-6 は何らかのトランジットペプチドをコードする配列が存在するが、全長ではない。ヌクレオチド 1-180がトランジットペプチドをコードする配列を表示し、そして成熟タンパク質をコードする配列はヌクレオチド 181で開始すると考えられる。
【００３１】
Cuphea pullcherrima KAS 因子ＢクローンであるcpuKAS B/7-8および cpuKAS B/8-7A を図５および６に示す。このクローンの両者ともにKAS 因子Ｂタンパク質の全コード配列を含んでいる。cpuKAS B/7-8の最初の35アミノ酸がトランジットペプチドを表示し、成熟タンパク質をコードする配列がヌクレオチド233 で開始すると考えられる。cpuKAS B/8-7A の最初の39アミノ酸がトランジットペプチドを表示し、成熟タンパク質をコードする配列がヌクレオチド209 で開始すると考えられる。Cuphea pullcherrima KAS 因子Ａクローンである cpuKAS A/p7-6Aおよび cpuKAS A-p8-9Aを図７および８に示す。このクローンの両者ともにKAS 因子Ａタンパク質の全コード配列を含んでいる。cpuKAS A/p7-6Aの翻訳されたアミノ酸配列を提供する。成熟タンパク質は595-597 でコードされたリジン残基で開始すると考えられ、そして最初の126 アミノ酸がトランジットペプチドを表示すると考えられる。KAS A クローンである cpuKAS A-p8-9AのDNA 配列は予備のためである。最終的なDNA 配列を決定し、この遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を明らかにするため、さらに分析を実施することとする。
【００３２】
Cuphea hookeriana KASIIIクローンである chKASIII-27 のDNAおよび翻訳したアミノ酸配列を図９に示す。chKASIII-27 のヌクレオチド 37-144 からのコード配列がトランジットペプチドをコードすると考えられ、推定される成熟タンパク質をコードする配列はヌクレオチド 145-1233 からのものである。
【００３３】
C.hookeriana KAS因子Ｂおよび KAS 因子Ａ cDNA から推定されるアミノ酸配列はすでに報告されている Brassica napusおよび Ricinus communisクローンに強い相同性を有することがわかる。C.hookeriana KAS因子Ｂクローンは Ricinus および Brassica KAS因子Ａクローンに対する（両者について60％）よりも、Ricinus および Brassica KAS因子Ｂクローンに対しての方がより相同性が高い（それぞれ94％および91％）。さらに、C.hookeriana KAS因子Ａクローンは Ricinus および Brassica KAS因子Ｂクローンに対する（両者について60％）よりも、Ricinus および Brassica KAS因子Ａクローンに対しての方がより相同性が高い（それぞれ85％および82％）。chKAS B-2 および chKAS B-31-7で示される C.hookeriana KAS因子Ｂ cDNA はポリペプチドの成熟部分の範囲内で96％の同一性を有する。同様に、C.hookeriana KAS因子Ａクローンである chKAS A-2-7 および chKAS A-1-6 の成熟タンパク質領域の推定アミノ酸配列は96％の同一性を有する。C.pullcherrima KASクローンもまた R.communisおよび Brassica napus KASクローンへの相同性を明示している。各種の Cuphea種中のすべての KAS 因子Ａファミリーのメンバーの成熟タンパク質部分が95％の同一性を有する。同様に、Cuphea内の KAS 因子Ｂ遺伝子の成熟タンパク質部分もまた互いに95〜97％の同一性を有する。しかし、KAS 因子ＢおよびKAS 因子Ａクローン間では、Cupheaの同一のまたは異なる種間のいずれにおいても、わずかに約60％の配列同一性しか有していない。
【００３４】
実施例２  発現のレベルおよびパターン
Cuphea hookeriana 中の KAS 発現の組織特異性を試験するため、種子、根、葉および花組織から単離した全RNA を使用して、ノーザンブロット分析を実施した。２つに分離しているが同一のブロットを chKAS B-31-7または chKAS A-2-7 コード領域プローブのいずれかとハイブリダイズさせた。このRNA ブロット分析からのデータは、KAS A 発現は種子中でのみ検出されるが、KAS B は試験したすべての組織中で同程度のレベルで発現されることを示している。これらの結果は各シンターゼについて異なるレベルの発現をも証明している。KAS B は低レベルで発現されるが、KAS A は豊富な(abundant)メッセージである。さらに、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下（65℃、0.1×SSC、0.5％ SDS ）でも、KAS A プローブは2.3 および1.9 kbの２つの種子転写物と同程度によくハイブリダイズする。大きい方のハイブリダイズバンドは KAS A-2-7 遺伝子の転写物と見られる。なぜならばそのcDNAのサイズは 2046bp であるからである。またcDNAスクリーニングから得られたクローンの数はmRNAの見かけの移動度およびブロット上の存在量によく対応している。
【００３５】
実施例  ３  植物KAS 遺伝子の大腸菌中の発現
Cuphea hookeriana KAS A cDNAおよび Cuphea pullcherrima KAS B cDNAの成熟ポリペプチドをコードするDNA 断片をPCR によって取得し、QIAexpress発現ベクター（Qiagene ）中にクローン化した。これらのクローンのすべてについて最大発現レベルの実験条件を決定し、最高レベルの可溶性画分に関するパラメーターを同定した。1 M ソルビトールおよび2.5 mMベタインを含有するECLB培地中で細胞を一晩増殖させ、同一の培地中で1:4 希釈で継代培養した。次に細胞を（約.6〜.8 O.D. まで）２時間増殖させ、 0.4 mM IPTGで誘導して、さらに５時間増殖させた。
【００３６】
chKAS A-2-7 および cpuKAS B/8-7A クローンの過剰発現から取得したアフィニティ精製組み換え酵素について、広範囲のアシルACP 基質（6:0〜16:1-ACP ）を使用して、酵素活性を測定した。cpuKAS B/8-7A についての活性プロフィルを図10に示す。このデータはこの酵素が試験したすべてのアシルACP 基質について活性であることを証明している。ただし、6:0〜14:0-ACP 基質に対する活性の方が16:0および16:1基質に対するよりも実質的に大きい。
【００３７】
C.hookeriana KAS AクローンであるchKAS A-2-7 および chKAS A-1-6 の活性プロフィルを図11に示す。この C.hookeriana KAS AクローンはＣ:6について最も活性で、Ｃ:16:0 基質に対して最少の活性を有する。しかし、このクローンの好ましいＣ:6:0基質に対する活性でも C.pullcherrima KAS Bクローンの活性よりも50倍も低い。
【００３８】
R.communis KAS因子Ａクローンの成熟タンパク質をコードする部分を含有する断片もまた上述のようにQIAexpress発現ベクター（Qiagene ）中にクローン化し、大腸菌中で発現させ、酵素をアフィニティ精製した。ヒマKAS A についての活性プロフィルを図12に示す。Ｃ6:0 およびＣ16:1についても何らかの活性が見られるが、最高活性はＣ14:0基質について観察される。比較のため、やはりQIAexpress発現系を使用し、精製した R.communis KAS因子Ｂから得られた活性プロフィルを図13に示す。このKAS B クローンは R.communis KAS Aクローンよりも実質的に高いレベルの活性（10倍およびそれ以上）を示す。KAS 因子Ｂの6:0〜14:0-ACP 基質に対する選択性は、このタンパク質がKAS I 活性をもたらすというこれまでの観察と一致する。
【００３９】
実施例  ４  トランスジェニック種子中のKAS およびTE発現
CpFatB1 （C.hookerianaチオエステラーゼcDNA；Deheshら(1996)Plant Physiol.110:203-210 ）および chKAS A-2-7 の両方をPCR 増幅し、配列決定し、そしてナピン発現カセット中にクローン化した。ナピン／cp FatB1およびナピン／KAS A-2-7 融合体を別々にバイナリー(binary)ベクター pCGN1558 （McBride およびSummerfelt（Pl.Mol.Biol.(1990)14:269-276）中に連結し、A.tumefaciens,EHA101中に形質転換した。生成したCpFatB1 バイナリー構築物は pCGN5400であり、chKAS A-2-7 構築物は pCGN5401である。Radke らによって記載されたように（Theor.Appl.Genet.(1988)75:685-694；Plant Cell Reports(1992)11:499-505 ）、Brassica napusカノーラ(canola)変種の Agrobacterium によって仲介された形質転換を実施した。pCGN5400および pCGN5401構築物のそれぞれについていくつかのトランスジェニック植物体(event) が産生された。
【００４０】
ナピン／chKAS A-2-7 発現構築物と組合せたナピン／cpFatB1 発現構築物を含有する二重遺伝子構築物をも組み立てて、バイナリーベクター中に連結し、カノーラ Brassica 変種の共培養のために使用した。chFatB1 および chKAS A-2-7 発現構築物を含有するバイナリー構築物は pCGN5413である。
【００４１】
chKAS A-2-7 を含有するトランスジェニック系（5401系）26の脂肪酸分析では、形質転換された変種の野性型であるカノーラ種子の同様の分析に比較して、油含有量またはプロフィルに何ら有意な変化を示さなかった。
【００４２】
cpFatB1 を含有するトランスジェニック系（5400系）36の脂肪酸分析では、トランスジェニック種子中でＣ:8およびＣ:10 のレベルの増大が示された。１プールの種子サンプル中で観察されたＣ:8の最高レベルは4.2 mol％ だった。Ｃ:10レベルはＣ:8含有量の30および35％の間だった。縦列の TE／KAS A（TE/KAS A tandem）を含有するトランスジェニック系（5413系）25の脂肪酸分析では、TEのみの含有系（5400）で観察されたものに比較してＣ:8およびＣ:10 レベルの両者ともに全体として増加することが証明された。cpFatB1 構築物のみを含有する系では、Ｃ:8の平均レベルは 1.5 mol％であり、一方縦列の TE／KAS A を含有する系におけるＣ:8の平均レベルは 2.37 mol％ だった。両集団において、Ｃ:10 に対するＣ:8の比率は一定のままだった。Ｃ:8含有量に対応させたトランスジェニック植物体の数を図14に示す。これらのデータは縦列の TE／KAS A 構築物でのトランスジェニック植物体がTEのみの構築物による植物体よりも高いＣ:8レベルを有する系を多く生産することを示している。例えば、TE／KAS A pCGN5413構築物では7 mol％ に近いＣ8 を含有する系がいくつか得られたが、pCGN5400 TE のみの形質転換からの最高のＣ8 含有系は4.2 mol％ Ｃ8 を含有していた。
【００４３】
ChFatB2 （C.hookerianaチオエステラーゼ；Deheshら(1996) The Plant Journal 9:167-172）を発現するトランスジェニックカノーラ植物のT3世代の半分の種子（half seed）の分析では、これらの植物が8:0 および10:0脂肪酸を22重量％（33 mol％）まで蓄積することができることを示している（4804-22-357 ）。分離分析では、これらの形質転換体が２遺伝子座を含有し、そしてこれらがここではホモ接合であることが示される。これらの半分の種子から生育させ、選択した植物を温室中に移し、後に Cuphea hookeriana KAS A （5401）のみ、またはKAS A/CpFatB1 二重構築物（5413）のいずれかで形質転換しておいたT1形質転換体と交配した。
【００４４】
ChFatB2（4804-22-357）およびchKAS A-2-7（5401-9） を含有するトランスジェニック系間の交配から生成したいくつかの植物体の脂肪酸分析ではＣ:10／Ｃ:8 レベル比の増加が見られる（図15）。ChFatB2 TEのみを含有するトランスジェニック植物体のほとんどすべてにおいて、このＣ:10／Ｃ:8 比は３および６の間で変動するが、一方 TEおよび KAS A-2-7 の両方を含有するトランスジェニックのF1世代においては、この比は22程度と高くなり得る。このＣ:10 レベルの増大は総Ｃ:8＋Ｃ:10 含量の増大をともなう（図16）。ヘテロ接合系は通常ホモ接合系よりも実質的に少ないＣ:8およびＣ:10 を含有するが、ヘテロ接合F1系のＣ:8およびＣ:10 脂肪酸の合計はホモ接合母系（4804-22-357 ）のものと同程度である。
【００４５】
4804-22-357（ChFatB2）および 5413-17植物体（CpFatB1および chKAS A-2-7 縦列）間で実施した交配の結果生成したF1世代の種子において、同様の結果が観察された。5413-17 系のＣ:8およびＣ:10 のレベルはそれぞれ6.3 および2.8 mol％だった。図17に示すデータは、4804-22-357（ChFatB2）×5401-9（chKAS A-2-7 ）交配で観察されたように、Ｃ:10 脂肪酸側へのシフトがあることを示している。さらに、図18は２つの別のヘテロ接合体の集団の存在を示している。約9〜11 重量％のＣ:10＋Ｃ:8 を含有するものは ChFatB1 TE遺伝子の１コピーを含有し、5413からの CpFatB1 および chKAS A 遺伝子のコピーを含有しない子孫を示すと考えられる。約15〜20重量％のＣ:10＋Ｃ:8 を含有する植物は ChFatB1 TE遺伝子１個ならびに5413からの CpFatB1 および chKAS A 遺伝子を含有するヘテロ接合体を示すと考えられる。こうして、ChKAS A 遺伝子のコピーが存在する場合は、Ｃ:10＋Ｃ:8 脂肪酸のレベルは親系で検出されたものの50％までは減少しない。
【００４６】
Cuphea hookeriana KAS A 酵素の鎖長特異性をさらに特性決定するため、カリフォルニアベイ（Umbellularia californica）12:0特異的チオエステラーゼ、UcFatB1 （米国特許第5,344,771 号）を含有するトランスジェニック Brassica napus系および chKAS A-2-7（5401-9）間の交配を実施した。Uc fatB1 を含有するトランスジェニック植物の半分の種子の分析で、これまでにこれらの植物がホモ接合２半数体系（LA86DH186 ）の種子油中に52 mol％ Ｃ12:0 まで蓄積することができることが示されている。系 LA86DH186と非形質転換対照 Brassica間の交配ではＣ12:0レベルの減少が明示された。
【００４７】
しかし、LA86DH186 および5401-9ヘミ接合系間の交配はF1子孫の種子油中に57 mol％Ｃ12:0までの蓄積を導いた（図19）。興味深いことに、LA86DH186 ×非形質転換対照系およびLA86DH186 ×5401-9の交配では、F1子孫の種子中のＣ14:0のレベルがホモ接合LA86DH186 系で得られたレベルの50％まで減少した（図20）。さらに、Ｃ12:0脂肪酸の割合の増加の結果、すべての長鎖脂肪酸群（Ｃ16:0、Ｃ18:0、Ｃ18:2、およびＣ18:3）の割合が実質的に減少した。これらの結果は、ChKAS A-2-7 はＣ6:0 からＣ10:0-ACPの範囲の基質特異性を有する酵素であること、そしてその過剰発現は結局長鎖アシルACP プールを減少させることを示している。
【００４８】
5401-9系と Garcinia mangostana からの18:1／18:0 TE（GarmFatA1、米国特許出願第08/440,845号）を発現するトランスジェニック系（5266）との交配において、ChKAS A-2-7 の鎖長特異性を支持する別の証拠が得られる。トランスジェニック Brassica系5266はホモ接合系の種子油中に24 mol％Ｃ18:0まで蓄積することが示されている（図21）。しかし、5266および5401-9間の交配のF1子孫の種子油中では、Ｃ18:0のレベルが約12 mol％に減少した。さらに、これらの交配から生成されたＣ16:0のレベルは非トランスジェニック対照植物の種子油から得られたレベルと同程度だった。
【００４９】
実施例  ５  植物KAS 酵素の in vitro 分析
非トランスジェニック対照またはSlabaughら（Plant Journal,1998、印刷中）およびLeonard ら（Plant Journal,1998、印刷中）に記載されたような chKAS A-2-7 を発現するトランスジェニック Brassicaの生育中の種子から種子抽出物を調製した。Post-Beittenmiller（J.Biol.Chem.(1991),266:1858-1865）によって記載されたように、in vitro脂肪酸合成アッセイを実施した。硫酸アンモニウム沈殿およびP-6 カラム（Bio-Rad,Hercules,CA ）を使用した脱塩によって抽出物を濃縮した。反応物（65μl ）には0.1 M Tris/HCl（pH 8.0）、1 mMジチオトレイトール、25 mM 組み換えホウレンソウ ACP1 、1 mM NADH 、2 mM NADPH、50μMマロニルCoA 、10μM[1-１４Ｃ] アセチルCoA（50 mCi/mmol）、1 mg/ml BSA 、および0.25 mg/ml種子タンパク質を含ませた。選択した種子抽出物をセルレニンとともに23℃で10分予備インキュベートした。2.25 M尿素を含有する18％アクリルアミドゲル上で反応生成物を分離し、ニトロセルロース上にエレクトロブロットし、Image QuaNT ソフトウェア（Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA ）を使用したホスポルイメージング(phosporimaging)によって定量した。真正アシルACP について並行して実施し、イムノブロットし、最後に抗ACP 血清によって検出して、脂肪酸の鎖長を確認した。
【００５０】
これらの結果（図22）から、試験したすべての時点でのＣ8:0-およびＣ10:0-ACPの相対存在量によって測定したところ、トランスジェニック Brassica（5401-9）種子抽出物の脂肪酸合成能力が非トランスジェニック対照から得られたものよりも大きかったことがわかる。さらに、抽出物のセルレニンでの前処理ではトランスジェニックおよび非トランスジェニック対照種子抽出物の両方においてより長鎖の脂肪酸の合成が著しく減少した。しかし、ホウレンソウACP の伸長(extension) は、非トランスジェニック対照 Brassicaの種子抽出物中よりもトランスジェニック系からの種子抽出物中ではずっと阻害が少なかった。
【００５１】
これらのデータは Ch KAS A-2-7が中鎖アシルACP に活性な縮合酵素であること、および植物中のこの酵素の発現の結果、中鎖特異的チオエステラーゼによって加水分解される基質プールが拡大することをさらに支持する。さらに、これらのデータは chKAS A-2-7 もまたセルレニン耐性縮合酵素であることを示唆している。
【００５２】
本明細書中に記載した刊行物および特許出願のすべてが本発明が属する分野の当業者の技術レベルを示すものである。各刊行物および特許出願のそれぞれが特定的にそして個別に参照として組み込まれることを意味するのと同程度に、全刊行物および特許出願を参照としてここに組み入れる。
【００５３】
前記の発明を、明確な理解を目的として、説明および例によってある程度詳細に記載したが、特許請求の範囲内で何らかの変更および改変が実践され得ることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１−１】Cuphea hookeriana KAS因子Ｂクローン chKAS B-2 のDNA および翻訳されたアミノ酸配列が示されている。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−２の続き。
【図１−４】図１−３の続き。
【図２−１】Cuphea hookeriana KAS因子Ｂクローン chKAS B-31-7のDNA および翻訳されたアミノ酸配列が示されている。
【図２−２】図２−１の続き。
【図２−３】図２−２の続き。
【図２−４】図２−３の続き。
【図２−５】図２−４の続き。
【図３−１】Cuphea hookeriana KAS因子Ａクローン chKAS A-2-7 のDNA および翻訳されたアミノ酸配列が示されている。
【図３−２】図３−１の続き。
【図３−３】図３−２の続き。
【図３−４】図３−３の続き。
【図３−５】図３−４の続き。
【図３−６】図３−５の続き。
【図４−１】Cuphea hookeriana KAS因子Ａクローン chKAS A-1-6 のDNA および翻訳されたアミノ酸配列が示されている。
【図４−２】図４−１の続き。
【図４−３】図４−２の続き。
【図４−４】図４−３の続き。
【図４−５】図４−４の続き。
【図４−６】図４−５の続き。
【図５−１】Cuphea pullcherrima KAS因子Ｂクローン cpuKAS B/7-8のDNA および翻訳されたアミノ酸配列が示されている。
【図５−２】図５−１の続き。
【図５−３】図５−２の続き。
【図５−４】図５−３の続き。
【図６−１】Cuphea pullcherrima KAS因子Ｂクローン cpuKAS B/8-7A のDNA および翻訳されたアミノ酸配列が示されている。
【図６−２】図６−１の続き。
【図６−３】図６−２の続き。
【図６−４】図６−３の続き。
【図６−５】図６−４の続き。
【図７−１】Cuphea pullcherrima KAS因子Ａクローン cpuKAS A/p7-6AのDNA および翻訳されたアミノ酸配列が示されている。
【図７−２】図７−１の続き。
【図７−３】図７−２の続き。
【図７−４】図７−３の続き。
【図７−５】図７−４の続き。
【図７−６】図７−５の続き。
【図７−７】図７−６の続き。
【図８−１】Cuphea pullcherrima KAS因子Ａクローン cpuKAS A/p8-9Aの主要なDNA配列が示されている。
【図８−２】図８−１の続き。
【図８−３】図８−２の続き。
【図８−４】図８−３の続き。
【図８−５】図８−４の続き。
【図９−１】Cuphea hookeriana KASIII クローン chKASIII-27 のDNA および翻訳されたアミノ酸配列が示されている。
【図９−２】図９−１の続き。
【図９−３】図９−２の続き。
【図９−４】図９−３の続き。
【図９−５】図９−４の続き。
【図１０】各種のアシルACP 基質を使用した精製 cpuKAS B/8-7Aの活性プロフィルが示されている。
【図１１】各種のアシルACP 基質を使用した精製 chKAS A-2-7およびchKAS A-1-6の活性プロフィルが示されている。
【図１２】各種のアシルACP 基質を使用した精製ヒマ KAS因子Ａの活性プロフィルが示されている。
【図１３】各種のアシルACP 基質を使用した精製ヒマ KAS因子Ｂの活性プロフィルが示されている。
【図１４】CpFatB1 を含有するトランスジェニック植物に対するCpFatB1＋chKAS A-2-7を含有するトランスジェニック植物についての、Ｃ8:0 含量にしたがってまとめた植物の数を示すグラフである。
【図１５−１】ChFatB2を含有するトランスジェニック植物（4804-22-357）ならびに4804-22-357と5401-9との交配により生じる植物（chKAS A-2-7 植物）における％Ｃ10／％Ｃ8 比を示すグラフである。
【図１５−２】図１５−１の続き。
【図１６】ChFatB2を含有するトランスジェニック植物（4804-22-357）ならびに4804-22-357と5401-9との交配により生じる植物（chKAS A-2-7 植物）における％Ｃ10＋％Ｃ8 含量を示すグラフである。
【図１７−１】ChFatB2を含有するトランスジェニック植物（4804-22-357）ならびに4804-22-357と5413-17との交配により生じる植物（chKAS A-2-7＋CpFatB1植物）における％Ｃ10／％Ｃ8 比を示すグラフである。
【図１７−２】図１７−１の続き。
【図１８−１】ChFatB2を含有するトランスジェニック植物（4804-22-357）ならびに4804-22-357と5413-17との交配により生じる植物（chKAS A-2-7＋CpFatB1植物）における％Ｃ10＋％Ｃ8含量 を示すグラフである。
【図１８−２】図１８−１の続き。
【図１９−１】Uc FatB1を含有するトランスジェニック植物（LA86DH186 ）ならびに野性型（X WT）とCh KAS A-2-7を発現する系との交配により生じる植物における％Ｃ12:0を示すグラフである。
【図１９−２】図１９−１の続き。
【図１９−３】図１９−２の続き。
【図２０】Uc FatB1を含有するトランスジェニック植物（LA86DH186 ）の種子ならびに野性型（X WT）とCh KAS A-2-7を発現する系との交配により生じる植物におけるＣ12:0およびＣ14:0脂肪酸の相対比を示すグラフである。
【図２１−１】Garm FatB1を含有するトランスジェニック植物（5266）ならびに野性型（X WT）とCh KAS A-2-7を発現する系との交配により生じる植物の種子における％Ｃ18:0を示すグラフである。
【図２１−２】図２１−１の続き。
【図２１−３】図２１−２の続き。
【図２２】Ch KAS A-2-7を含有するトランスジェニック植物からのタンパク質抽出物中のCh KAS Aの活性プロフィルである。抽出物を指示した濃度のセルレニン(cerulenin) で前処理した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
2009045074.tif 000064
【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２】
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【配列表】
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