(57)【要約】【課題】本発明は、Ｄ−マンデル酸脱水素酵素−ＩＩを安定して誘導し、製造する方法を提供することを課題とする。【解決手段】Ｄ−マンデル酸脱水素酵素−ＩＩをコードする正しい塩基配列および該塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を明らかにした。さらにＤ−マンデル酸脱水素酵素−ＩＩを安定して誘導し発現させる条件も見出すことに成功した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の形質転換体を、２種以上の誘導物質もしくは誘導発現を促進する物質を添加し、温度4〜37℃で、12時間以上誘導する工程を含む、D-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素の発現を誘導する方法；
（ａ）以下の（１）〜（４）のいずれかに記載のベクターを保持する形質転換体、
（１）少なくとも配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位のアミノ酸配列を有するD-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクター
（２）さらに補酵素再生酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された（１）に記載のベクター
（３）補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素である、（２）に記載のベクター
（４）同一または異なるベクターである、（２）または（３）に記載のベクター
（ｂ）ベクターを保持する形質転換体が同一である、（ａ）に記載の形質転換体、
（ｃ）宿主細胞が微生物である、（ａ）または（ｂ）に記載の形質転換体。
【請求項２】
上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の形質転換体を、２種以上の誘導物質もしくは誘導発現を促進する物質を添加し、温度4〜37℃で、12時間以上誘導する工程を含む、D-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素を製造する方法。
【請求項３】
前記誘導物質もしくは誘導発現を促進する物質が、IPTGおよびグリセロールを少なくとも含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって誘導または製造されるD-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素を、ケトカルボン酸に接触させる工程を含む、光学活性ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、D-マンデル酸脱水素酵素-IIを安定して誘導し製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１に記載のD-マンデル酸脱水素酵素-IIを保持するプラスミドpBK-D-ManDH2を、宿主としてE.coli XLOLR, JM109, W3110を用い、30℃及び37℃で発現させたが、活性が検出されたり、検出されなかったりして不安定である、という問題があった。
従って、D-マンデル酸脱水素酵素-IIを安定して発現させ、製造するための条件が求められていた。
【０００３】
【特許文献１】特開2004-65049
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、D-マンデル酸脱水素酵素-IIを安定して誘導し、製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、上記特開2004-65049記載のD-マンデル酸脱水素酵素-II（以下、EfDMDH2と略す場合がある）を保持するプラスミドpBK-D-ManDH2を、宿主としてE.coli XLOLR、JM109、W3110株を用い、30℃および37℃で発現させたが、活性が検出されたり、されなかったりして不安定である原因について探索した。
【０００６】
そのために、まず、pBK-D-ManDH2にクローニングしたD-マンデル酸脱水素酵素-IIの配列に間違いがないか確認するために、再度ゲノムの配列を確認した。具体的には、EfDMDH2遺伝子をエンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）のゲノムより再度クローニングを行った。その結果、特開2004-65049記載のEfDMDH2遺伝子は、C末端側に11アミノ酸の欠損があることが分かった。恐らく、特開2004-65049に記載の方法により、ゲノムをSau3AIで消化し、活性染色によりショットガンクローニングを行った際に、リコンビネーション等のためにDNAの欠損が起こったものと考えられた。特開2004-65049に記載のDNA配列を、図１の上側に、正しいDNA配列を下側に示す。正しいアミノ酸配列を配列番号：１に示す。配列番号：１に記載のアミノ酸配列において３０２位〜３１２位のアミノ酸配列に相当する11アミノ酸が、特開2004-65049記載のEfDMDH2では欠失していた。
【０００７】
なお得られた正しいアミノ酸配列は、Enterococcus faecium DOの全ゲノム解析の結果より得られたアクセッション番号Q3Y316のKetopantoate reductase ApbA/PanE(EC 1.1.1.169).のアミノ酸配列と完全に一致した。
【０００８】
本発明者は、上記結果に基づいて、D-マンデル酸脱水素酵素-IIを高発現させるために、大腸菌における高発現ベクターに、本酵素をコードするDNAを挿入し、大腸菌において高発現を試みた。pBK-DMDH2は、本酵素の本来のプロモーターを用い、構成的に発現させる発現プラスミドであるため、本酵素の安定した高発現を行うために、pSE420D等IPTGもしくはlactoseで誘導可能なE.coliの高発現ベクターに本遺伝子を挿入し発現させた。しかし、高発現ベクターであるpSE420Dに接続し、当業者に一般的な誘導発現を行っても本酵素の活性は検出できなかった。
【０００９】
上記のように、誘導発現に際して技術的な困難性があるにも関わらず、本発明者はさらに、pSE420Dを元にした本酵素発現プラスミドpSL-EFM1を用いて、誘導発現の方法について検討した。その結果、IPTG濃度を引き下げ、温度４〜37℃で、12時間以上誘導を行うことにより、安定した活性発現を行うことができることを見出した。さらに、誘導開始時に誘導物質もしくは誘導発現を促進する物質を添加することにより著しい活性増加が見られることも見出した。
【００１０】
本発明によって、D-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードする正しい塩基配列および該塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を明らかにすることができた。即ち、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位のアミノ酸配列が、特開2004-65049記載のEfDMDH2では欠失していたということを見出した。さらにD-マンデル酸脱水素酵素-IIを安定して誘導し発現させる条件も見出すことに成功した。本発明によって、D-マンデル酸脱水素酵素-IIを安定して高発現させることができるようになるだけでなく、光学活性ヒドロキシカルボン酸も効率的に製造することができるようになる。
【００１１】
即ち、本発明は、以下のD-マンデル酸脱水素酵素-IIを安定して誘導し製造する方法、並びにその応用に関する。
〔１〕  下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の形質転換体を、２種以上の誘導物質もしくは誘導発現を促進する物質を添加し、温度4〜37℃で、12時間以上誘導する工程を含む、D-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素の発現を誘導する方法；
（ａ）以下の（１）〜（４）のいずれかに記載のベクターを保持する形質転換体、
（１）少なくとも配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位のアミノ酸配列を有するD-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクター
（２）さらに補酵素再生酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された（１）に記載のベクター
（３）補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素である、（２）に記載のベクター
（４）同一または異なるベクターである、（２）または（３）に記載のベクター
（ｂ）ベクターを保持する形質転換体が同一である、（ａ）に記載の形質転換体、
（ｃ）宿主細胞が微生物である、（ａ）または（ｂ）に記載の形質転換体。
〔２〕  上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の形質転換体を、２種以上の誘導物質もしくは誘導発現を促進する物質を添加し、温度4〜37℃で、12時間以上誘導する工程を含む、D-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素を製造する方法。
〔３〕  前記誘導物質もしくは誘導発現を促進する物質が、IPTGおよびグリセロールを少なくとも含むことを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕  〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法によって誘導または製造されるD-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素を、ケトカルボン酸に接触させる工程を含む、光学活性ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、D-マンデル酸脱水素酵素-IIを安定して高発現させることができるようになった。D-マンデル酸脱水素酵素-IIを安定して高発現させることによって、光学活性ヒドロキシカルボン酸も効率的に製造することもできるようになる。
【００１３】
〔発明を実施するための形態〕
本発明者は、特開2004-65049記載のEfDMDH2を保持するプラスミドpBK-D-ManDH2にクローニングしたD-マンデル酸脱水素酵素-IIの配列に間違いがないか確認したところ、特開2004-65049記載のEfDMDH2遺伝子は、C末端側に11アミノ酸の欠損があることを見出し、正しいアミノ酸配列（配列番号：１）を見出した。即ち、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位のアミノ酸が、特開2004-65049記載のEfDMDH2では欠失していたということを見出した。
【００１４】
そして本発明者は、この配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位のアミノ酸配列を少なくとも有する、正しいD-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドに基づいて、高発現ベクターを作製し、D-マンデル酸脱水素酵素-IIを安定して高発現させる条件を見出すことに成功した。
【００１５】
本発明において「脱水素酵素」とは、脱水素反応、即ち水素を含む化合物から水素が除去される酸化反応を触媒する酵素を意味する。さらに該酵素はケトンに対する還元活性を有し、還元的条件下においては、酸化反応の逆反応を触媒することができる。従って、本発明における「脱水素酵素」とは、前記酸化反応の逆反応である水素を付加する還元反応を触媒する作用を有する。一般に「デヒドロゲナーゼ」、「酸化還元酵素」、「オキシダーゼ」、または「レダクターゼ」等の名称で呼ばれる酵素も同様の作用を有する場合には、本発明における「脱水素酵素」に含まれる。
【００１６】
即ち本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の形質転換体を、２種以上の誘導物質もしくは発現誘導物質を添加し、温度４〜37℃で、12時間以上誘導する工程を含む、D-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素の発現を誘導する方法を提供する。
（ａ）以下の（１）〜（４）のいずれかに記載のベクターを保持する形質転換体、
（１）少なくとも配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位のアミノ酸配列を有するD-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクター
（２）さらに補酵素再生酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された（１）に記載のベクター
（３）補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素である、（２）に記載のベクター
（４）同一または異なるベクターである、（２）または（３）に記載のベクター
（ｂ）ベクターを保持する形質転換体が同一である、（ａ）に記載の形質転換体、
（ｃ）宿主細胞が微生物である、（ａ）または（ｂ）に記載の形質転換体。
【００１７】
本明細書においては、D-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素の発現を誘導する方法を、略して「D-マンデル酸脱水素酵素-IIの誘導方法」、あるいは「本発明の誘導方法」と記載する場合がある。
【００１８】
本発明の誘導方法に用いられる形質転換体の一態様として、少なくとも配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位のアミノ酸配列を有するD-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを保持する形質転換体を挙げることができる。
【００１９】
本発明において「ポリヌクレオチド」とは、DNAやRNAのような天然に存在するポリヌクレオチドであることもできるし、人工的に合成されたヌクレオチド誘導体を含むポリヌクレオチドであっても良い。
【００２０】
上記D-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号：２に示す。配列番号：２に記載の塩基配列は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質はD-マンデル酸脱水素酵素-IIの好ましい態様を構成する。
【００２１】
本発明におけるD-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドには、配列番号：１に記載のアミノ酸配列だけでなく、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位以外の部位において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列も含まれ、かつD-マンデル酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。即ち、本発明におけるD-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドには、少なくとも配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位のアミノ酸配列を有し、当該部位以外のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加等の変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。このような変異は、人為的に導入することもできるし、自然界において生じることもある。本発明のポリヌクレオチドには、これら双方の変異体が含まれる。
【００２２】
当業者であれば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位以外のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに、部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10, pp.6487 (1982), Methods in Enzymol. 100, pp.448 (1983), Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991)）等を用いて、適宜欠失、置換、挿入および／または付加変異等を導入することができる。
【００２３】
本発明において、欠失、置換等の変異が導入されるアミノ酸の数は、変異を導入されたアミノ酸配列からなるタンパク質がD-マンデル酸脱水素酵素活性を有する限り特に制限されないが、通常、５０アミノ酸以内、好ましくは３０アミノ酸以内、より好ましくは１０アミノ酸以内（例えば５アミノ酸以内、３アミノ酸以内）である。
【００２４】
一般にタンパク質の機能維持のためには、置換するアミノ酸は、置換する前のアミノ酸と類似する性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。
【００２５】
また本発明におけるD-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつD-マンデル酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。
【００２６】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチド」とは、配列番号：２に記載の塩基配列における、任意の少なくとも20個、好ましくは少なくとも30個、例えば40個、60個または100個の連続した配列を１つまたは複数選択したDNAをプローブDNAとし、例えばECL direct nucleic acid labeling and detectionsystem (Amersham Pharmacia Biotech社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（wash:42℃、0.5 x SSCを含むprimary wash buffer）において、又は0.2 x SSC (1 x SSC: 15 mM クエン酸3ナトリウム、150 mM 塩化ナトリウム）、0.1 %SDS溶液中で60℃、15分間洗浄する条件において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指すが、これらの条件に特に限定されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２７】
ストリンジェントな条件下で配列番号：２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドには、配列番号：２と類似する塩基配列を含むものが含まれる。このようなポリヌクレオチドは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードしている可能性が高い。
【００２８】
本発明において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等とは、当該タンパク質が、D-マンデル酸脱水素酵素活性を有することを意味する。
【００２９】
さらに本発明におけるポリヌクレオチドは、配列番号：１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％または80％、より好ましくは90％以上の配列の同一性（ホモロジー）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。タンパク質のホモロジー検索は、例えばEntrez protein、SWISS-PROT、SWISS-PROT+TrEMBL、PIR、PRF等のタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースや、DNA Databank of JAPAN (DDBJ)、EMBL、GenBank、Unigene等のDNAに関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベース等を対象にBLAST program、FASTA program、Smith-Waterman等のホモロジー検索アルゴリズムを用いて、例えばインターネット上で行うことができる。
本発明において同一性とは、例えばBLAST programを用いたタンパク質全体に対するIdentityの値として示される。
【００３０】
本発明におけるD-マンデル酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドには、配列番号：２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対するホモログも含まれる。ホモログは、変異の導入の他、配列番号：２に記載された塩基配列に基づいて他の生物からPCRクローニングやハイブリダイズによって単離することもできる。
【００３１】
D-マンデル酸脱水素酵素-IIを発現する形質転換体を利用し、ケトカルボン酸の還元によって光学活性ヒドロキシカルボン酸を製造する場合、D-マンデル酸脱水素酵素-IIは、NADPHに比べて安価で安定なNADHを補酵素として利用しうることから、工業的な利用において有利である。
【００３２】
光学活性ヒドロキシカルボン酸は、種々の医薬品の合成原料として重要な化合物である。例えば、(R)-2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸はアンジオテンシン変換酵素阻害剤の原料として、(R)-2-クロロマンデル酸は血液凝固阻害剤の原料やジアステレオマー分割の分割剤として、(R)-2-ヒドロキシ-3-フェニルプロピオン酸は糸状菌の生産する生理活性物質PF1022の前駆物質 (J. Antibiotics 45, 692 (1992) ) として重要な物質である。
【００３３】
ヒドロキシカルボン酸の製造においては、NADHの再生系を組み合わせて行うことができる。これらのNADH再生に必要な反応を構成する成分が補酵素再生酵素である場合には、当該補酵素再生酵素をコードするポリヌクレオチドを、ベクターに挿入しておくことができる。
【００３４】
即ち本発明の誘導方法に用いられる形質転換体の他の態様として、上述の少なくとも配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位のアミノ酸配列を有するD-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターに、さらに補酵素再生酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを保持する形質転換体を挙げることができる。
【００３５】
本発明における補酵素再生酵素は特に制限されないが、例えばギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、アルコール脱水素酵素等を例示することができる。本発明における補酵素再生酵素としては、好ましくは、ギ酸脱水素酵素が用いられる。
【００３６】
即ち本発明の誘導方法に用いられる形質転換体の他の態様として、上述の少なくとも配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位のアミノ酸配列を有するD-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターに、さらにギ酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを保持する形質転換体を挙げることができる。
【００３７】
本発明の誘導方法においては、例えば以下のようにして構築されるベクターを保持する形質転換体を用いることができる。即ち、11アミノ酸の欠失を有するEfDMDH2高発現プラスミドpSL-EFM1を構築し、さらにこのプラスミドを元に、正しい塩基配列を有するEfDMDH2高発現プラスミドpSL-EFM2を構築し、このpSL-EFM2からEfDMDH2遺伝子を含むDNAを得る。そして、マイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素を発現するプラスミドpSU-MF26を制限酵素EcoRIおよびHindIIIで消化し、EfDMDH2遺伝子を含むDNA断片をライゲーションし、共発現プラスミドpSF-EFM2を構築し、ベクターとして用いる。
【００３８】
補酵素再生酵素をコードするポリヌクレオチドは、上述のように、D-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターと同一のベクターに挿入する形態に制限されない。即ち、補酵素再生酵素をコードするポリヌクレオチドは、上述の「少なくとも配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位のアミノ酸を有するD-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクター」と同一のベクターに挿入するだけでなく、異なるベクターに挿入することも可能である。即ち本発明の誘導方法に用いられる形質転換体の他の態様として、上記同一のベクターまたは異なるベクターを保持する形質転換体を挙げることができる。なお本発明で用いられるベクターには、公知のベクターを用いることができる。
【００３９】
上述のベクターで形質転換した形質転換体を、本発明で新たに見出した条件下で培養することによって、D-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素を形質転換体より得ることができる。また本発明におけるベクターは、同一の形質転換体が有していることが好ましい。
【００４０】
本発明においてD-マンデル酸脱水素酵素-IIを発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、D-マンデル酸脱水素酵素活性を有するDNAを含む組換えベクターにより形質転換され、D-マンデル酸脱水素酵素活性を発現できる生物であれば特に制限はない。形質転換体の宿主として利用可能な微生物は、例えば以下に示す微生物を示すことができる。
【００４１】
・エシェリヒア（Escherichia）属
・バチルス（Bacillus）属
・シュードモナス（Pseudomonas）属
・セラチア（Serratia）属
・ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
・コリネバクテリウム（Corynebacterium）属
・ストレプトコッカス（Streptococcus）属
・ラクトバチルス（Lactobacillus）属
等宿主ベクター系の開発されている細菌
【００４２】
・ロドコッカス（Rhodococcus）属
・ストレプトマイセス（Streptomyces）属
等宿主ベクター系の開発されている放線菌
【００４３】
・サッカロマイセス（Saccharomyces）属
・クライベロマイセス（Kluyveromyces）属
・シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属
・チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属
・ヤロウイア（Yarrowia）属
・トリコスポロン（Trichosporon）属
・ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属
・ピキア（Pichia）属
・キャンディダ（Candida）属
等の宿主ベクター系の開発されている酵母
【００４４】
・ノイロスポラ（Neurospora）属
・アスペルギルス（Aspergillus）属
・セファロスポリウム（Cephalosporium）属
・トリコデルマ（Trichoderma）属
等の宿主ベクター系の開発されているカビ
【００４５】
本発明の実施例においては、形質転換体の宿主として大腸菌XLOLR株、HB101株またはJM109株を利用しているが、これらの菌および株に限定されない。
【００４６】
なお本発明における形質転換体を作成するための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。微生物中等において、D-マンデル酸脱水素酵素-II遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのポリヌクレオチドを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを、上記D-マンデル酸脱水素酵素-IIの正しいDNA鎖の5'側上流に、より好ましくはターミネーターを3'側下流に、それぞれ組み込めば良い。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーター等に関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng., 43, 75-102, (1990), Yeast, 8, 423-488, (1992)等に詳細に記述されている。
【００４７】
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとしてpBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac（βガラクトシダーゼ）、trp（トリプトファンオペロン）、tac、trc（lac、trpの融合）、λファージ、PL、PR等に由来するプロモーター等が利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等を用いることができる。これらの中で、市販のpSE420（Invitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターpSE420D（特開2000-189170に記載）が好適に利用できる。
【００４８】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等が利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。またプロモーター、ターミネーターとしてapr（アルカリプロテアーゼ）、npr（中性プロテアーゼ）、amy（α-アミラーゼ）等が利用できる。
【００４９】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）等で宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240等が利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとしてリパーゼ（特開平5-284973）遺伝子等が利用できる。
【００５０】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、pAJ43（Gene, 39, 281, (1985)）等のプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００５１】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、pCS11（特開平57-183799）、pCB101（Mol. Gen. Genet., 196, 175, (1984)）等のプラスミドベクターが利用可能である。
【００５２】
ストレプトコッカス（Streptococcus）属においては、pHV1301（FEMS Microbiol. Lett., 26, 239, (1985)）、pGK1（Appl. Environ. Microbiol., 50, 94, (1985)）等がプラスミドベクターとして利用可能である。
【００５３】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol., 137, 614, (1979)）等が利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００５４】
ロドコッカス（Rhodococcus）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）から単離されたプラスミドベクターが利用可能である（J. Gen. Microbiol., 138, 1003, (1992)）。
【００５５】
ストレプトマイセス（Streptomyces）属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特にストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）においては、pIJ486（Mol. Gen. Genet., 203, 468-478, 1986）、pKC1064（Gene, 103, 97-99, (1991)）、pUWL-KS（Gene, 165, 149-150, (1995)）が利用できる。またストレプトマイセス・バージニア（Streptomyces virginiae）においても、同様のプラスミドを利用することができる（Actinomycetol., 11, 46-53, (1997)）。
【００５６】
サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456等）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。またADH（アルコール脱水素酵素）、GAPDH（グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素）、PHO（酸性フォスファターゼ）、GAL（β-ガラクトシダーゼ）、PGK（ホスホグリセレートキナーゼ）、ENO（エノラーゼ）等のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５７】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol., 145, 382-390, (1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自立増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNA等との相同組換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456等）等が利用可能である。また、ADH、PGK等に由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５８】
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS（自律複製に関与する遺伝子）及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol., 6, 80, (1986)）。またシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーター等が利用できる（EMBO J. 6, 729, (1987)）。特にpAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５９】
チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）由来のpSB3（Nucleic Acids Res., 13, 4267, (1985)）等に由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来PHO5プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来GAP-Zr（グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素）のプロモーター（Agri.Biol.Chem., 54, 2521, (1990)）等が利用可能である。
【００６０】
ピキア（Pichia）属においては、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等にピキア由来自律複製に関与する遺伝子（PARS1、PARS2）等を利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol., 5, 3376, (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOX等強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859, (1987)）。また、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta、旧名ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast, 7, 431-443(1991)）。また、メタノール等で誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH（ギ酸脱水素酵素）のプロモーター等が利用可能である。
【００６１】
キャンディダ（Candida）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ウチルス（Candida utilis）等において宿主ベクター系が開発されている。
【００６２】
キャンディダ・マルトーサにおいては、キャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ（Agri.Biol.Chem., 51, 51, 1587, (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。またキャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは、強力なプロモーターが開発されている（特開平08-173170）。
【００６３】
アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）等がカビの中でもよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology, 7, 283-287, (1989)）。
【００６４】
トリコデルマ（Trichoderma）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）を利用した宿主ベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーター等が利用できる（Biotechnology, 7, 596-603, (1989)）。
【００６５】
また微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主ベクター系が開発されており、特にカイコを用いた昆虫（Nature, 315, 592-594, (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモ等の植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に使用することができる。
【００６６】
即ち、本発明において用いられる形質転換体としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）のいずかに記載の形質転換体を挙げることができる。
（ａ）以下の（１）〜（４）のいずれかに記載のベクターを保持する形質転換体、
（１）少なくとも配列番号：１に記載のアミノ酸配列における３０２位〜３１２位のアミノ酸配列を有するD-マンデル酸脱水素酵素-IIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクター
（２）さらに補酵素再生酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された（１）に記載のベクター
（３）補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素である、（２）に記載のベクター
（４）同一または異なるベクターである、（２）または（３）に記載のベクター
（ｂ）ベクターを保持する形質転換体が同一である、（ａ）に記載の形質転換体、
（ｃ）宿主細胞が微生物である、（ａ）または（ｂ）に記載の形質転換体。
【００６７】
本発明は、上記いずれかの形質転換体を誘導する工程を含む、D-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素の発現を誘導する方法、およびD-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素の製造方法を提供する。
【００６８】
本明細書においては、D-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素の製造方法を、略して「D-マンデル酸脱水素酵素-IIの製造方法」、あるいは「本発明の製造方法」と記載する場合がある。
【００６９】
即ち本発明は、上記本発明の形質転換体を誘導する工程を含む、D-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素の発現を誘導する方法を提供する。また、上記本発明の形質転換体を誘導する工程を含む、D-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素を製造する方法を提供する。
【００７０】
上記D-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素の発現を誘導する方法、あるいは製造する方法には、いずれも２種以上の誘導物質もしくは誘導発現を促進する物質を添加する工程が含まれる。
【００７１】
本発明における誘導物質としては、上記本発明の形質転換体からD-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素の発現を誘導することができる物質であれば制限はない。好適に用いられる物質として、例えば、IPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を挙げることができる。
【００７２】
また誘導発現を促進する物質としては、上記本発明の形質転換体に物理的あるいは生化学的に影響を与え誘導を引き起こす物質であれば制限はない。好適に用いられる物質としては、例えば、グリセロール、エチレングリコール等を挙げることができる。物理的あるいは生化学的に影響を与える例として、フォールディングに関連するタンパク質の誘導を挙げることができる。
【００７３】
本発明の方法においては、上述の誘導物質のみを２種以上添加してもよく、あるいは上述の誘導発現を促進する物質のみを２種以上添加してもよい。あるいは、上述の誘導物質と上述の誘導発現を促進する物質の双方を組み合わせて添加してもよい。好ましくは、誘導物質もしくは発現を誘導する物質として、IPTGおよびグリセロールを少なくとも含む物質が挙げられる。
【００７４】
本発明のD-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素の発現を誘導する方法、あるいは製造する方法においては、適切な温度設定をすることができる。誘導および製造に適した温度としては4〜37℃、より好ましくは4〜25℃、より好ましくは10〜25℃、さらに好ましくは15〜20℃を設定することができる。
【００７５】
また本発明の誘導方法あるいは製造方法は、12時間以上誘導する工程を含むことが好ましい。なお本発明の誘導する方法あるいは製造する方法においては、上述の２種以上の誘導物質もしくは誘導発現を促進する物質を添加し、上記温度で、12時間以上誘導する工程を含むだけでなく、必要に応じて、さらに他の条件を設定することも可能である。
【００７６】
なおD-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素を回収し取得するには、上記本発明の形質転換体あるいは形質転換体を含む培養物から、当業者に公知の方法を用いて回収し取得することができる。例えば、形質転換体の培養終了後、遠心分離等の処理により菌体を回収する。その後、緩衝液中で、ガラスビーズ、酵素処理、あるいは超音波処理等によって該菌体を破砕し、上清画分として無細胞抽出液を得る。このとき、緩衝液に以下のような成分を加えて酵素を保護することが望ましい。
【００７７】
・還元剤：2-メルカプトエタノール等
・プロテアーゼ阻害剤：フェニルメタンスルホニルフルオリド、ペプスタチンA、ロイペプチン、および金属キレーター等
・PLP
【００７８】
目的とする酵素は、こうして得られた無細胞抽出液から、例えば以下のような各種のタンパク質の分画方法、およびクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることによって精製することができる。
【００７９】
・タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や、硫安等による塩析等）
・陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー
・キレート、色素、抗体等を用いたアフィニティークロマトグラフィー
【００８０】
あるいはD-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素を含む微生物の処理物を元に取得することができる。上記「処理物」には、具体的には、界面活性剤やトルエン等の有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物が含まれる。
【００８１】
即ち本発明のD-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素を製造する方法には、D-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素を回収する工程が含まれる。
【００８２】
本発明におけるD-マンデル酸脱水素酵素-IIの酵素活性は、例えば以下のようにして測定することができる。
100 mMリン酸カリウム（pH 6.5）、10 mMベンゾイルギ酸ナトリウム、0.2 mM NADHを含む反応液中で30℃で行い、NADHの減少に由来する340 nmの吸光度の減少を測定する。1ユニット（U）は上記の条件下、1分間に1μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。
【００８３】
また本発明におけるギ酸脱水素酵素の酵素活性は、例えば以下のようにして測定することができる。
100 mMリン酸カリウム（pH 7.0）、100 mMギ酸ナトリウム、2.5 mM NAD+を含む反応液中、30℃で行い、NADHの増加に由来する340 nmの吸光度の増加を測定する。1ユニット（U）は上記の条件下、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。
【００８４】
さらに本発明におけるタンパク質の定量は、例えばBio-Rad製試薬を用い、Bradfordの方法で測定することができる。
【００８５】
また本発明は、光学活性ヒドロキシカルボン酸を製造する方法を提供する。即ち、上記本発明の形質転換体を、２種以上の誘導物質もしくは誘導発現を促進する物質を添加し、温度４〜37℃で、12時間以上誘導する工程を含む、D-マンデル酸脱水素酵素-IIの発現を誘導する方法、あるいは製造する方法によって誘導または製造されるD-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素を、ケトカルボン酸に接触させる工程を含む、光学活性ヒドロキシカルボン酸を製造する方法を提供する。
【００８６】
上記本発明の誘導方法あるいは製造方法によって誘導または製造されるD-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素と、原料であるケトカルボン酸との接触形態は任意である。例えばケトカルボン酸を含む溶媒に、上記酵素を混合することによって接触させることができる。あるいは、上記本発明の形質転換体、形質転換体を含む培養物、あるいはその処理物を、ケトカルボン酸と接触させることにより、目的とする光学活性ヒドロキシカルボン酸を製造するための酵素反応を行わせることができる。
【００８７】
接触（作用）させる条件として、上記酵素作用の維持に好ましい条件を選択することができる。例えばケトカルボン酸は、上記酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒等に溶解させておくことができる。
【００８８】
ケトカルボン酸の濃度は制限されない。通常、０．０１％〜５０％程度、好ましくは０．１％〜３０％、より好ましくは１％〜２０％の濃度が用いられる。ここで「濃度」とは、反応液中に存在する、原料であるケトカルボン酸の濃度をいう。原料は必ずしも完全に溶解していなくてもよい。
【００８９】
なお酵素が溶媒に不溶性の場合には、溶媒中に酵素が分散され、必要に応じて分離することができる。あるいはケトカルボン酸を含む溶媒と酵素を、基質透過性の膜で分離して接触させることもできる。このような接触形体は、酵素の回収と再利用を容易にする。
【００９０】
なおD-マンデル酸脱水素酵素-II、またはD-マンデル酸脱水素酵素-IIおよび補酵素再生酵素を、ケトカルボン酸と接触させる形態は、上述の例に限定されるものではない。
【００９１】
本発明による光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造方法において原料となるケト酸としては、2-ケト酪酸、2-ケト吉草酸、2-ケトイソ吉草酸、2-ケトカプロン酸、2-ケトイソカプロン酸、ベンゾイルギ酸、2-クロロベンゾイルギ酸、3-クロロベンゾイルギ酸、フェニルピルビン酸、インドールピルビン酸等をあげることができる。
【００９２】
なお本発明における「光学活性ヒドロキシカルボン酸」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含まれるヒドロキシカルボン酸、もしくはある光学異性体のみからなるヒドロキシカルボン酸を意味する。本発明の「光学異性体」は、「光学活性体」および「鏡像異性体」と呼ばれる場合もある。
【００９３】
ヒドロキシカルボン酸の製造方法においては、上述のように、NADHの再生系を組み合わせることができる。還元反応に付随して、NADHからNAD＋が生成する。NAD＋からNADHへの再生は、微生物の持つNAD＋還元能（解糖系等）を用いて行うことができる。これらNAD＋還元能は、反応系にグルコースまたはエタノールを添加することにより、増強することが可能である。また、NAD＋からNADHを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、アルコール脱水素酵素等を含む微生物、その処理物、ならびに精製酵素を用いてNADHの再生を行うことができる。例えば、上記グルコース脱水素酵素の場合には、グルコースからδ−グルコノラクトンへの変換を利用することにより、NADHの再生が行われる。
【００９４】
これらのNADH再生に必要な反応を構成する成分は、ヒドロキシカルボン酸の製造のための反応系に添加、もしくは固定化したものを添加することができる。あるいはNADHの交換が可能な膜を介して接触させることができる。
【００９５】
また、上記本発明のベクターで形質転換した形質転換体（微生物）を、菌体の状態で前記ヒドロキシカルボン酸の製造方法に利用する場合には、NADH再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、NADH再生活性の高い微生物を宿主として用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、NADH再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。
【００９６】
本発明の形質転換体並びにその処理物を用いた、酸化反応もしくは還元反応は、水系溶媒中、あるいは水に溶解しにくい有機溶媒と水系溶媒の２相系中で実施することができる。
【００９７】
本発明における水に溶解しにくい有機溶媒として、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n-ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルt-ブチルエーテル等を示すことができる。一方、水系溶媒としては、水、あるいは酵素の酵素活性を維持する緩衝液等を示すことができる。
【００９８】
さらに、水に溶解する有機溶媒中、あるいは水系溶媒と水に溶解する有機溶媒との混合系中で、原料と酵素を接触させることもできる。水に溶解する有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシド等を示すことができる。
【００９９】
なお上述の反応は、固定化酵素、膜リアクター等を利用して行うことも可能である。
【０１００】
本発明のD-マンデル酸脱水素酵素-IIによる酵素反応は、例えば、以下の条件で行うことができる。
・反応温度：本発明のD-マンデル酸脱水素酵素-IIが、その酵素活性（作用）を維持できる温度であり、例えば4〜60℃、好ましくは10〜37℃を示すことができる。
・pH：本発明のD-マンデル酸脱水素酵素-IIが、その酵素活性（作用）を維持できる範囲を選択することができ、例えばpH 3〜10、好ましくはpH 4〜9、さらに好ましくはpH5〜8を示すことができる。
・基質濃度：0.01〜50%、好ましくは0.1〜30%、より好ましくは1〜20％
【０１０１】
反応は、攪拌下、あるいは静置下で行うことができる。また反応系には必要に応じて、任意の添加物を添加することができる。添加物は、酵素活性の増強、酵素活性の安定化、あるいは反応液の流動性の増加等を目的として添加される。例えば、補酵素NAD＋またはNADHを0.001〜100 mM、好ましくは0.01〜10 mM添加することができる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的（間欠的）に添加することが望ましい。
【０１０２】
NADH再生のために反応系に添加される化合物、例えばグルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくは2-プロパノール等は、基質ケトカルボン酸に対してモル比で0.1〜20、好ましくは0.5〜5倍過剰に添加することができる。NADH再生用の酵素、例えばグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素等は、本発明のNAD＋依存性D-マンデル酸脱水素酵素に比較して酵素活性で0.1〜100倍、好ましくは0.5〜20倍程度添加することができる。
【０１０３】
また、反応後に生じる光学活性ヒドロキシカルボン酸は、可溶化、遠心分離やろ過等による分離、有機溶媒による抽出、イオン交換クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、吸着剤による吸着、凝集剤、脱水剤による脱水もしくは凝集、晶析、蒸留等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
【実施例】
【０１０４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により制限されるものではない。
【０１０５】
〔実施例１〕11アミノ酸の欠失（deletion）を持つEfDMDH2高発現プラスミドpSL-EFM1の構築
特開2004-65049実施例3の方法により得られたポジティブクローンに含まれるプラスミドをpBK-D-ManDH2と命名した。本プラスミドを鋳型として、プライマーEFDM2-ATG1 (GGAGAATTCATTCATGAAAATAGCAATTGCAGGCG／配列番号：３) 及びEFDM2-TAA1 (GGAAAGCTTAGAGCTCAGTCAAGAAATCACA／配列番号：４) を用いてPCRを行った。増幅されたDNAをEcoRI及びHindIIIで消化し、同制限酵素で消化したpSE420Dとライゲーションし、pSL-EFM1を構築した。
【０１０６】
〔実施例２〕正しい塩基配列を有するEfDMDH2高発現プラスミドpSL-EFM2の構築
pSL-EFM1内EfDMDH2-ORFの3’-末端近傍に存在するSacI制限酵素部位を利用し、pSL-EFM1をSacI及びHindIIIで消化し、以下のDNA断片を挿入し、pSL-EFM2を構築した。
5’-TGTCCATGCAAAAGAAGATAGTTTGAACGTAAAATA-3’（配列番号：５）
3’-TCGAACAGGTACGTTTTCTTCTATCAAACTTGCATTTTATTCGA-5’（配列番号：６）
【０１０７】
〔実施例３〕Mycobacterium vaccae由来ギ酸脱水素酵素（formate dehydrogenase）とEfDMDH2を共発現するプラスミドpSF-EFM2の構築
EfDMDH2を発現するプラスミドpSL-EFM2をEcoRI及びHindIIIで消化し、EfDMDH2遺伝子を含むDNA断片を得た。Mycobacterium vaccae由来ギ酸脱水素酵素（formate dehydrogenase）を発現するプラスミドpSU-MF26 (WO 2006-132145) を同制限酵素で消化し、EfDMDH2遺伝子を含む上記DNA断片をライゲーションして、共発現プラスミドpSF-EFM2を構築した。
【０１０８】
〔実施例４〕
実施例１，２，３で構築したプラスミドで大腸菌HB101またはJM109株を形質転換し、得られた組換え大腸菌の培養は、LB培地で行った。培養後600nmにおける濁度が1.0-2.0に達した時点で誘導物質としてIPTGを、及び誘導発現を促進する物質グリセロールを添加し、所定の温度、時間で誘導発現を行った。試験管における培養および誘導例を以下に示す。
【０１０９】
プレート上のコロニー
↓ 21 mmφチューブに7 mL-LB+Ampを接種
↓ 26℃で13時間55分振とう
↓ OD600測定(OD600(B) は、BioRad Spectrophotometerでの測定値, * 0.791 = OD(DU-65))
↓ IPTG 0.02 mM および2% グリセロールを添加
↓ 20℃で27.5時間振とう
↓ 2 mL培養培地  遠心分離
ウェットな細胞（凍結）
【０１１０】
培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、50 mM KPB (pH 8.0)及び0.02% 2-メルカプトエタノールを含む破砕液に懸濁し、超音波により菌を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、上清画分として無細胞抽出液を調製し、活性測定に利用した。無細胞抽出液の調製について以下に示す。
【０１１１】
E. coli 細胞 (2 mL相当) 
↓ 1.0 mLの破砕バッファー2 (50 mM KPB (pH 8.0) および0.02% 2-ME) で懸濁
↓ 超音波 (密閉式超音波破砕器を用いて、超音波破砕4.5分)
※ 30秒破砕, 60秒休止を9サイクル; 菌体量、液量が多かったため長くした。
↓ 遠心分離 (15,000 rpm で10分) 
無細胞抽出液
【０１１２】
D-マンデル酸脱水素酵素の酵素活性の測定は、100 mMリン酸カリウム (pH 6.5), 10 mM ベンゾイルギ酸ナトリウム、0.2 mM NADHを含む反応液中で30℃で行い、NADHの減少に由来する340 nmの吸光度の減少を測定した。1Uは、上記の条件下1分間に1μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。
【０１１３】
ギ酸脱水素酵素の測定は、100 mM リン酸カリウム (pH7.0), 100 mM ギ酸ナトリウム, 2.5mM NAD+を含む反応液中、30℃で行い、NADHの増加に由来する340 nmの吸光度の増加を測定した。1Uは、上記の条件下1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。結果を表１に示す。
【０１１４】
タンパク質の定量は、酵素活性が高い順にそれぞれ上位2株について、Bio-Rad製試薬を用い、Bradfordの方法で測定した。
【０１１５】
【表１】
2009261261.tif 000002
【０１１６】
上記表１における宿主XLOLRとは、特開2004-65049の実施例１で使用の宿主である。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明により、D-マンデル酸脱水素酵素-IIを安定して高発現させることができるようになった。本発明によって安定して高発現するD-マンデル酸脱水素酵素-IIを利用することにより、光学活性ヒドロキシカルボン酸を効率的に製造することが可能となった。さらに、D-マンデル酸脱水素酵素-IIを利用して、収率よくアルコールを生産することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は、特開2004-65049に記載のDNA配列を上側に、正しいDNA配列を下側に示す。本発明によって、特開2004-65049に記載のDNA配列は、C末端側に11アミノ酸の欠損があることが確認された。
【図２】プラスミドpSL-EFM1の構築を示す図である。
【図３】プラスミドpSL-EFM2の構築を示す図である。
【図４】Mycobacterium vaccae由来ギ酸脱水素酵素とEfDMDH2を共発現するプラスミドpSF-EFM2の構築を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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