(57)【要約】【課題】  デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）上の多数の塩基置換を安価で簡便に検査するために，蛍光標識物質をなるべく用いない新しい検査手法を提供する．【解決手段】  ＤＮＡの変異部位を増幅するプライマーの５’末端に，蛍光色素の種類によって異なる特定の塩基配列を含む非相補的オリゴヌクレオチドを結合させ，各蛍光色素によって異なる特定塩基配列を持つ蛍光標識プライマーを混合してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い，得られた蛍光標識増幅産物の鎖長の違いと蛍光物質の違いを電気泳動で検出する．あるいは，ＤＮＡ上の一塩基置換（ＳＮＰ）に対応したアレル特異的プライマーの５’末端に非相補的なオリゴヌクレオチドを結合させ，ＰＣＲによって得られた鎖長の異なるＤＮＡ断片，または，事前に用意した鎖長の異なる複数のプローブとハイブリダイズさせて得られたＤＮＡ断片に，インターカーレント剤存在下で徐々に熱を加えて融解させた時の温度の違いによって塩基置換を検出する．【特許請求の範囲】
【請求項１】
あらかじめ，蛍光色素の種類によって異なる，任意の塩基配列を持つ蛍光標識プライマーを用意し，デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の特定部位を増幅する非蛍光プライマーの５’末端に，使用したい蛍光色素に相当する特定の塩基配列を含む非相補的オリゴヌクレオチドを結合させる．これらの非蛍光プライマーと蛍光標識プライマーを混合してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い，得られた蛍光標識増幅産物の鎖長の違いと蛍光物質の違いを電気泳動で検出することで塩基配列の違いを検査する方法．
【請求項２】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の一塩基置換（ＳＮＰ）に対応したアレル特異的プライマーの５’末端に鎖長の異なる非相補的なオリゴヌクレオチドを結合させ，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られた鎖長の異なるＤＮＡ断片，または，アレル特異的プライマーの５’側に付けた非相補的オリゴヌクレオチドの一部と共通する塩基配列を持つ鎖長の異なるプローブをあらかじめ用意し，対応するＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズさせて得られたＤＮＡ断片に，徐々に熱を加えて融解させた時の温度（融解曲線分析）の違いによって塩基置換を検査する方法．
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明は，デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の塩基配列の違いを安価で簡便に検出するための検査手法に関するものである．
【背景技術】
【０００２】  近年，遺伝子上の一塩基置換多型（ＳＮＰ）および繰り返し多型（ＳＴＲ）の重要性が増しており，この塩基置換を検出するための様々な検査方法が開発されている．【０００３】  ＤＮＡ上のＳＴＲを増幅する多数の蛍光標識プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い，得られたＰＣＲ増幅産物の蛍光と鎖長の違いを電気泳動によって識別するマルチプレックスＳＴＲ検査法は既に利用されている．【０００４】  ３’末端を一塩基置換部位に設定したアレル特異的プライマーの５’末端に非相補的なオリゴヌクレオチドを結合させ，ＰＣＲによって得られた増幅産物の鎖長の違いを電気泳動で検出する増幅産物鎖長多型法（ＡＰＬＰ）は既に利用されている．【０００５】  ５’末端を蛍光標識したアレル特異的プライマーを用いて得られたＰＣＲ増幅産物を電気泳動で検出するＳＮＰ検査法は既に利用されている．【０００６】  蛍光標識物質の種類や鎖長の違いによって識別される蛍光標識アレル特異的プライマーや蛍光標識プローブを反応させた後，未反応のプライマーやプローブを特定することでＳＮＰを識別する検査法は既に利用されている．【０００７】  ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し，得られた増幅産物に徐々に熱を加えて融解させた時の温度（融解曲線分析）の違いによってＳＮＰを識別する検査法は既に利用されている．【０００８】  蛍光標識プローブをＳＮＰ部位に反応させ，ハイブリダイズした部位が完全に相補的かミスマッチ部位を含んでいるかを融解曲線分析によって識別することでＳＮＰを検出する検査法は既に利用されている．
【特許文献１】特許第３０５７５５３号公報
【非特許文献１】ＡｍｐＦＬ  ＳＴＲ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ（アプライド・バイオシステムズ社）検査キットマニュアル
【非特許文献２】Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．９９，３４−３７（１９９７）
【非特許文献３】Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｖｏｌ．２２，４１８−４２０（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）上の多数の一塩基置換多型（ＳＮＰ）および繰り返し多型（ＳＴＲ）を検査するには，検査する座位（ローカス）に対応した蛍光標識プライマーや蛍光標識プローブを多数用意しなくてはならず検査コストが非常に高くなるという問題点がある．【００１０】  融解曲線分析を用いたＳＮＰ検査では，ＳＮＰの種類によっては融解温度に差がでない場合もあり，必ずしも明瞭にＳＮＰを識別できないという問題点がある．【００１１】  さらに，融解曲線分析を用いたＳＮＰ検査では，一度に検査できるローカスは通常１ヶ所であり，多数のＳＮＰを検査するには多数の反応系を用意しなくてはならず，多量の鋳型ＤＮＡが必要になると共に検査コストが非常に高くなるという問題点がある．【００１２】  したがって，本発明の課題は，蛍光標識試薬をなるべく用いない検査システムを考案し，ＤＮＡ上の多数の塩基置換部位を一度に安価で簡便に検出できる検査手法を提供することである．
【課題を解決するための手段】
【００１３】  この発明は，ＤＮＡ上の特定部位を増幅するプライマーの５’末端に，蛍光色素の種類によって異なるように予め決められた，数種類の特定塩基配列のうちの何れかを含む非相補的オリゴヌクレオチドを結合させ，蛍光色素の種類によって予め決められた特定の塩基配列を持つ蛍光標識プライマーと混合してＰＣＲを行い，得られた蛍光標識増幅産物の鎖長の違いと蛍光物質の違いを電気泳動で検出することを特徴とする検査方法である．【００１４】  また，ＤＮＡ上のＳＮＰに対応したアレル特異的プライマーの５’末端に非相補的なオリゴヌクレオチドを結合させ，ＰＣＲによって得られた鎖長の異なるＤＮＡ断片，または，非相補的なオリゴヌクレオチドの一部と共通するように，予め用意された鎖長の異なるプローブとハイブリダイズして得られたＤＮＡ断片を，インターカーレント剤存在下で徐々に加温して融解させた時の温度（融解曲線分析）の違いによって塩基置換を検査することを特徴とするものである．
【発明の効果】
【００１５】  本発明によれば，使用する蛍光色素の種類によって異なる，予め決められた特定塩基配列を持つ蛍光標識プライマーと，５’末端に特定塩基配列の何れかと共通する塩基配列を含む非相補的なオリゴヌクレオチドを結合させた非蛍光プライマーを用意することで，数十ヶ所から数百ヶ所の塩基置換部位を同時に分析することができ，使用する蛍光標識プライマーの数を大幅に削減することができるので，非常に安価なマルチプレックス多型検査法を提供できる．【００１６】  また，鎖長の異なるＤＮＡ断片，あるいは鎖長の異なるプローブとハイブリダイズさせたＤＮＡ断片を，インターカーレント剤存在下で融解曲線分析することで，蛍光物質を用いずに安価に塩基置換を検査することができ，アレル特異的プライマーの５’末端に付加する非相補的なオリゴヌクレオチドの数と塩基配列によって，ＰＣＲ増幅されるＤＮＡ断片の鎖長や，プローブとハイブリダイズする相補部位の鎖長を自由に設計することができるため，複数のＤＮＡ断片を同時に確実に識別できるように各ＤＮＡ断片の融解温度を自由に調節することができる．
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】  以下，本発明を実施するための最良の形態について説明する．【００１８】  まず，４種類〜６種類の蛍光色素を用意し，それぞれ別の蛍光色素で５’末端を標識した蛍光標識プライマー（Ａ〜Ｆ）を作製する．各蛍光標識プライマーの塩基配列は任意に決めてよいが，それぞれの塩基配列は特徴的で互いに大きく異なり，ミスマッチしないようにし，且つアニーリング温度がほぼ同じになるように設計する．【００１９】  次に，ＤＮＡ上の多数のＳＴＲ部位を選択し，それぞれの部位をＰＣＲ増幅するためのプライマーセットを作製する．この時，フォワードプライマーかリバースプライマーの何れか一方の５’末端に，使用する蛍光色素に対応する蛍光標識プライマー（Ａ〜Ｆのうちの何れか）と同じ塩基配列を持つ非相補的なオリゴヌクレオチドを結合させる．ただし，同じ蛍光色素で標識されたＰＣＲ増幅産物の鎖長が重ならないように各ＳＴＲ部位を振り分けるか，ＰＣＲ増幅産物の鎖長が同じにならないように非相補的なオリゴヌクレオチドを追加してプライマーの鎖長を調節する．【００２０】  また，ＤＮＡ上の多数のＳＮＰ部位を検出するために，それぞれの部位を特異的にＰＣＲ増幅するアレル特異的プライマーを作製する．この時，対立する２つのアレルに対応するアレル特異的プライマーの５’末端に，別々の蛍光標識プライマー（Ａ〜Ｆのうちの何れか）と同じ塩基配列を持つ非相補的なオリゴヌクレオチドを結合させる．同じ蛍光色素を使用したい場合には，標識されたＰＣＲ増幅産物の鎖長が重ならないように，一方のアレル特異的プライマーの５’側に非相補的オリゴヌクレオチドを追加することでプライマーの鎖長を調節する．【００２１】  これらの非蛍光プライマーと，予め用意された蛍光標識プライマーを混合し，ＰＣＲを行った後，増幅産物を電気泳動で分離し，蛍光標識されたＰＣＲ増幅産物を検出することで，ＤＮＡ上の多数の多型部位を同時に検出する．【００２２】  あるいは，ＤＮＡ上の複数のＳＮＰに対応したアレル特異的プライマーの５’末端に非相補的なオリゴヌクレオチドを結合させ，インターカーレント剤存在下でＰＣＲ増幅する．蛍光発光する鎖長の異なる２本鎖ＤＮＡ断片が多数増幅される．これを融解曲線分析すると，塩基配列と鎖長によって決定される固有の融解温度において蛍光の消失が観察される．【００２３】  または，鎖長の異なる複数のプローブを予め用意する．プローブの塩基配列は任意に決めてよいが，それぞれの塩基配列は特徴的で互いに大きく異なり，各プローブのハイブリダイズ温度が十分（最低でも５℃以上）離れるようにプローブの長さや塩基配列（特にＧＣ含有量）を調整する．【００２４】  ＤＮＡ上の多数のＳＮＰ部位を検出するために，それぞれの部位を特異的にＰＣＲ増幅するアレル特異的プライマーを作製する，この時，対立する２つのアレルに対応するアレル特異的プライマーの５’末端に，それぞれ別のプローブと同じ塩基配列を持つ非相補的なオリゴヌクレオチドを結合させる．これらのアレル特異的プライマーに共通プライマーを加えてＰＣＲ増幅すると，各アレルごとに，異なるプローブ配列を５’末端に持つＤＮＡ断片が増幅される．【００２５】  こうして得られたＰＣＲ増幅産物の一部に，予め用意した複数のプローブを大量に加え，インターカーレント剤存在下９５℃以上で熱変性したあと徐々に温度を下げていくと，プローブの塩基配列と鎖長の違いによって決定される固有の温度で，ＰＣＲ増幅産物と対応するプローブとのハイブリダイズが起こる．これを融解曲線分析すると固有の融解温度において蛍光の消失が観察される．
【実施例】
【００２６】  以下に，いくつかの実施例について説明する．
【実施例１】
【００２７】  ４種類の蛍光色素（６−ＦＡＭ，ＶＩＣ，ＮＥＴ，ＲＯＸ）で標識した，互いに配列の異なる蛍光標識プライマー（アニーリング温度は，いずれも５６℃になるように調整した）を用意した．【００２８】  次に，ヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子座のエクソン６と７にある点変異部位，グライコフォリンＡ遺伝子座にある点変異部位，アメロゲニン遺伝子座にある点変異部位を含む合計２４ヶ所の変異部位を増幅するために，それぞれに対応した２つのアレル特異的プライマーとリバースプライマーを設計し，合計７２種類の非蛍光プライマーを合成した．【００２９】  この時，ＰＣＲ増幅産物の鎖長が重ならないように各変異部位を４つのグループに分け，それぞれのグループごとに４種類の蛍光色素のうちの一つを割り振り，４種類の蛍光標識プライマーの何れか一つと共通する塩基配列を含む非相補的なオリゴヌクレオチドをアレル特異的プライマーの５’末端に結合させた．【００３０】  ４種類の蛍光標識プライマーと７２種類の非蛍光プライマーを混合したものに，鋳型ＤＮＡを加えてＰＣＲを行い，キャピラリー電気泳動装置で分析したところ，４種類の蛍光色素で標識されたＰＣＲ増幅産物が鎖長の違いによって分離され，２４ヶ所の変異部位を一度に判定することができた．
【実施例２】
【００３１】  ヒトの第８染色体上にあるＡ／Ｔトランスバージョン変異（Ｎｙ９５座位）に対応した２つのアレル特異的プライマーとリバースプライマーを合成した．この時，アデニン（Ａ）に対応したアレル特異的プライマーの５’末端に非相補的なオリゴヌクレオチドを結合させることで，ＰＣＲ増幅産物の鎖長が４２塩基対（Ｔアレル）と１００塩基対（Ａアレル）になるように調整した．このプライマーセットにインターカーレント剤を加えてＰＣＲ増幅すると，蛍光発光する鎖長の異なる２本鎖ＤＮＡ断片（４２塩基対と１００塩基対）が増幅された．これを融解曲線分析すると，鎖長の違いによって融解温度７７．６℃（４２塩基対）と８４．９℃（１００塩基対）で蛍光の消失が観察され，その温度の違いからＮｙ９５座位の型を容易に判定することができた．