(57)【要約】【課題】ＦＲＥＴ効率が高く、しかも分子デザインが容易なＦＲＥＴプローブを提供する。【解決手段】自己集合して二量体を形成する蛍光タンパク質（未変異型蛍光タンパク質）に変異を導入して、自己集合性を維持しながら励起極大波長及び吸収極大波長がともに異なるように改変した蛍光タンパク質（変異型蛍光タンパク質）を作出し、変異型及び未変異型の蛍光タンパク質からなる、又は、互いに異なる変異型蛍光タンパク質からなるヘテロ二量体を形成する蛍光タンパク質のペアを用いてプローブを構成することにより、様々なタンパク質やペプチド等の生体分子の分子間相互作用や分子内構造変化を検出するための、ＦＲＥＴ効率が高く、しかも分子デザインが容易なＦＲＥＴプローブが提供される。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二量体又は三量体以上の多量体を形成する自己集合性をもつ蛍光タンパク質のアミノ酸配列に変異が導入された変異型蛍光タンパク質であって、励起極大波長及び蛍光極大波長がともに変異導入前の蛍光タンパク質（以下、未変異型蛍光タンパク質という。）からシフトし、かつ、該未変異型蛍光タンパク質若しくは励起極大波長及び蛍光極大波長がともに相違する他の変異型蛍光タンパク質とヘテロ二量体を形成できる、変異型蛍光タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の変異型蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記未変異型蛍光タンパク質とヘテロ二量体を形成し、両蛍光タンパク質間でＦＲＥＴを起こすことができる、請求項１に記載の変異型蛍光タンパク質。
【請求項４】
請求項３に記載の変異型蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記変異型蛍光タンパク質とヘテロ二量体を形成し、両蛍光タンパク質間でＦＲＥＴを起こすことができ、変異型蛍光タンパク質とは励起極大波長及び蛍光極大波長がともに相違する、請求項１に記載の変異型蛍光タンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載の変異型蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記未変異型蛍光タンパク質が、サンゴ（学名：Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）に由来する蛍光タンパク質である、請求項１に記載の変異型蛍光タンパク質。
【請求項８】
前記サンゴに由来する蛍光タンパク質が、ＤｓＲｅｄ１である、請求項７に記載の変異型蛍光タンパク質。
【請求項９】
配列番号１に記載のＤＮＡ塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列をもつ蛍光タンパク質。
【請求項１０】
配列番号２に記載のアミノ酸配列をもつ蛍光タンパク質。
【請求項１１】
請求項３又は５に記載の２つの蛍光タンパク質を含むＦＲＥＴプローブ。
【請求項１２】
請求項３又は５に記載の２つの蛍光タンパク質がポリペプチドからなるリンカーを介して連結される構造をもつ融合タンパク質であるＦＲＥＴプローブ。
【請求項１３】
前記リンカーが生体分子の全部又は一部のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１４】
前記２つの蛍光タンパク質がＤｓＧ２及びＤｓＲｅｄ１である、請求項１１又は１２に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１５】
前記生体分子がＳＵＭＯ１である請求項１２又は１３に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１６】
請求項１１〜１４のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１１〜１４のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブをコードするＤＮＡを遺伝子発現ベクターに組み込んで構築した発現ベクター。
【請求項１８】
前記遺伝子発現ベクターが、ｐＥＢ６ＣＡＧｍｃｓ、ｐＥＢ６ＳＲαｍｃｓ及びｐＥＢ６ＣＭＶｍｃｓからなる群から選ばれる、請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
前記発現ベクターが、ｐＥＢ６ＣＭＶｍｃｓ−ＳＲＺである、請求項１８に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれかに記載の発現ベクターを培養細胞に導入した形質転換細胞。
【請求項２１】
前記培養細胞がヒト由来細胞株である、請求項２０に記載の形質転換細胞。
【請求項２２】
前記ヒト由来細胞株がＨＥｐ−２細胞株である、請求項２１に記載の形質転換細胞。
【請求項２３】
請求項１７〜１９のいずれかに記載の発現ベクターを含んでなるキット。
【請求項２４】
請求項２０〜２２のいずれかに記載の形質転換細胞を含んでなるキット。
【請求項２５】
請求項１１〜１５のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブを用いる、ドナー蛍光タンパク質の蛍光寿命を測定して細胞内ＦＲＥＴを検出する方法。
【請求項２６】
蛍光寿命フローサイトメーターを使用して蛍光寿命を測定する、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＲＥＴ効率が高く、しかも分子デザインが容易なＦＲＥＴプローブに関する。より詳細には、本発明は、自己集合性をもち、ヘテロ二量体を形成しやすい蛍光タンパク質を用いる、ＦＲＥＴ効率が高く、しかも分子デザインが容易なＦＲＥＴプローブ及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）とは、２つの蛍光分子が存在するとき、一方の分子の励起エネルギーが、他方の分子にトランスファーされる現象であり、その結果、エネルギーをトランスファーされた分子から蛍光が発せられる。励起エネルギーをトランスファーする方をドナー、される方をアクセプターと呼ぶ。
【０００３】
ＦＲＥＴ技術は、生体分子を可視化・画像化するための技術の１つであり、例えば、生体分子の分子間相互作用や分子内構造変化をモニタリングするために用いられ、特に、遺伝子の機能、及び疾病の発症と深く関わるシグナル伝達や遺伝子発現を解明するために好適である。これは、生体分子が分子間相互作用又は分子内構造変化によって、その生体分子を標識する２つの蛍光分子間の距離や相対的向きが変化すると、ＦＲＥＴが誘起又は解消されることを利用するものである。
【０００４】
ＦＲＥＴの誘起又は解消を検出するための蛍光センサーがＦＲＥＴプローブ（単に「プローブ」ともいう。）である。ＦＲＥＴプローブには、二分子間相互作用をする２つの生体分子のそれぞれを蛍光分子で標識したもの（２分子プローブ）と分子内構造変化又は分子間相互作用をする生体分子部分が挿入されたリンカー分子の両端を２つの蛍光分子で標識したもの（１分子プローブ）とがある。どちらの場合も、蛍光分子は合成小分子や蛍光タンパク質を利用できるが、蛍光タンパク質を用いると、フュージョンさせた融合タンパク質を生きた細胞内で発現させることができるため、低侵襲的に細胞体タンパク質の分子動態を可視化・映像化できる。
【０００５】
ＦＲＥＴの誘起・解消の検出は、ドナーとアクセプターの蛍光強度比から近似的に求められるのが普通である。これをレシオメトリック測定法といい、２種類の蛍光フィルターセットを用いて、ＦＲＥＴにより減弱したドナーの蛍光強度（Ｄｄａ）とＦＲＥＴにより増強したアクセプターの蛍光強度（Ａｄａ）を測定し、その比をＦＲＥＴ効率（Ａｄａ／Ｄｄａ）とするものである。
【０００６】
この２色の蛍光強度比を用いる定量方法（レシオメトリー測定法）で、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を高めるためには、２つの蛍光タンパク質が予め同じ分子数で細胞内に存在することが必要である。しかし、２分子ＦＲＥＴでは、２つの蛍光タンパク質の分子数を揃えることが困難あり、これまでに比較的高いＦＲＥＴ効率を実現するのは、１分子ＦＲＥＴの場合が非常に多かった。
【０００７】
現在までに実用化されているプローブには、ＦＲＥＴ効率が非常に低いものが多く、そのようなプローブを用いる場合、わずかなＦＲＥＴ効率変化を２色の蛍光強度比として定量化して検出することとなる。実際、よく用いられている開発済みのプローブでさえも、ＦＲＥＴ効率が非常に低く、２色の蛍光強度の比が、１．０から１．５への変化程度であるものも多い。
【０００８】
ＦＲＥＴ効率を算出する方法としては、レシオメトリー測定法の他に、ドナー蛍光の蛍光寿命を測定する方法がある。蛍光寿命の測定は、蛍光寿命測定装置を用いて行われ、蛍光の強さが時間経過とともに減衰していく変化を測定する。
【０００９】
しかしながら、もともとＦＲＥＴ効率が非常に低い多くのプローブでは、蛍光寿命の変化もごくわずかであるため、ＦＲＥＴ効率を精度よく算出することが難しい。
【００１０】
例えば、非特許文献２（第５８頁〜第５９頁、実証実験）には、ＣＦＰ（シアン色蛍光タンパク質）とＲａｓ（癌遺伝子）との融合タンパク質と、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）とＲａｆ（セリン・スレオニンリン酸化酵素）との融合タンパク質とからなるプローブを２９３Ｆ細胞で発現させ、Ｆｌｉｃｙｍｅ（登録商標）を使用して１０万個の細胞についてドナー（ＣＦＰ）の蛍光寿命を測定したところ、ＦＲＥＴ誘起時に３．７８ｎｓから０．３２ｎｓ程度短くなる方向にシフトし、ＦＲＥＴ効率が８．５％と求められたことが記載されている。
【００１１】
プローブの分子デザインをするとき、通常は、そのプローブが置かれている環境やそのプローブ分子の状態変化によって、蛍光分子間の距離が変動することを狙って分子デザインを行う。しかし、ＦＲＥＴは双極子−双極子相互作用により起こるものであり、蛍光分子間の距離だけでなく、蛍光分子の相対的向きもまた、考慮すべき要素である。特に、巨大な蛍光タンパク質分子の場合には、合成小分子のように自由回転する双極子とみなすこともできないので、分子の向きを考慮することは、より重要である。言い換えると、２つの蛍光分子が適切な角度をもって会合するようにデザインできなければ、ＦＲＥＴ効率は非常に低いものとなる。
【００１２】
ところが、実際には、相互作用する２分子プローブどころか、１本のポリペプチド鎖として発現される１分子プローブであっても、その一次構造からタンパク質が折り畳まれた際の２つの蛍光タンパク質間の距離や角度を予測することが困難であり、蛍光タンパク質分子間の距離を至適化し、さらに角度までも最適化することは非常に困難である。
【００１３】
この問題に対する解決策のひとつとして、蛍光タンパク質のＮ末端とＣ末端の位置を作り替えた円順列変異体を用いることによって、蛍光タンパク質同士の角度を変更しようとする方法が開発されている（例えば、特許文献１）。
【００１４】
この方法は多種類の円順列変異体を用いたプローブを全て作成してみて、その中からＦＲＥＴ効率の高いものを探す方法である。
【００１５】
そのため、作成した円順列変異体の中に適切なものがなかった場合には、問題の解決が困難であり、さらに、あらゆる蛍光タンパク質で円順列変異体が作成されている訳ではないため、プローブ作成が、やはり困難である。
【００１６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０３６１７８号公報
【特許文献２】特開２００７−２３２５５９号公報
【非特許文献１】中田ら，三井造船技報，第１９０号，５４〜６０頁（２００７年）．
【非特許文献２】Ｂａｉｒｄら，米国科学アカデミー紀要，９７：１１９８４−１１９８９（２０００年）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、本発明は、上記課題を解決するため、ＦＲＥＴ効率が高く、蛍光寿命測定によってＦＲＥＴの誘起・解消を検出するために好適に用いることができ、しかも分子デザインが容易なＦＲＥＴプローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記の目的を達成するため、発明者らが鋭意検討をした結果、ＦＲＥＴプローブに用いる蛍光タンパク質には自己集合性が低いものを用いることが技術常識であるところ、あえて自己集合性の蛍光タンパク質を用いてプローブを構成することによって、前記の目的を達成できることを知得した。以下に本発明を詳細に説明する。
【００１９】
生体分子を標識するための蛍光分子としては、例えば、クマリン（黄緑色）やフルオレセイン（緑色）のような合成小分子、ＣＦＰ（シアン色）やＹＦＰ（黄色）のような蛍光タンパク質が使用される。特に、蛍光タンパク質の遺伝子が同定され、遺伝子組み換え技術を用いて細胞内で生体分子との融合タンパク質として発現できるようになってからは、蛍光タンパク質の利用が進み、新しい蛍光タンパク質の分離や新しいバリアントの開発が相次いでいる。
【００２０】
最初に発見された蛍光タンパク質は、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。前述のＣＦＰとＹＦＰは、ともにＧＦＰのバリアントであり、プローブ標識に用いられる極めて一般的な蛍光タンパク質のペアとなっている。
【００２１】
また、サンゴ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）に由来する赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）及びそのバリアントもまた、一般的に使用されている（例えば、非特許文献２）。さらに、バリアントには、異色変異体のみならず、培養細胞での大量発現に好適なようにコドン使用頻度が最適化された変異体や細胞内での凝集性を減少した変異体も存在する。
【００２２】
例えば、サンゴ由来の野生型のＤｓＲｅｄに対して、ＤｓＲｅｄ１（クロンテック社）はヒト細胞でのコドン使用頻度に最適化された変異体であり、ＤｓＲｅｄ２（クロンテック社）は野生型のＤｓＲｅｄが四量体を形成しやすいのに対して、凝集性が減少し、成熟が早い変異体である。なお、これら市販の蛍光タンパク質は、例えば、それをコードするＤＮＡが組み込まれた発現ベクター（発現コンストラクト）として提供される。
【００２３】
従来の蛍光タンパク質を用いたプローブは、ＦＲＥＴ効率が低いものが多いことは既に述べた通りである。しかも、従来の技術では、プローブの分子デザインは試行錯誤の要素が大きく、誰でもが容易にできるものでもない。
【００２４】
ＦＲＥＴ効率とはドナー／アクセプター間の蛍光共鳴エネルギーの移動効率、つまり、ドナーに吸収されたエネルギーのうち、アクセプターに転送されたエネルギーの比率を意味する。
【００２５】
ここで、フェルスターの関係式から、ＦＲＥＴ効率（Ｅ）は、
Ｅ＝｛１＋（ｒ／Ｒ０）６｝−１                              （１）
と表すことができる。ただし、ｒ［ｎｍ］はドナーとアクセプターのクロモフォア間距離であり、Ｒ０［ｎｍ］は、このドナーとアクセプターのペアのフェルスター距離（ＦＲＥＴ効率が５０％のクロモフォア間距離）である。
さらに、Ｒ０［ｎｍ］は、
Ｒ０＝［８．８×１０−２３・ｎ−４・κ２・Ｑ・Ｊ］１／６        （２）
と表すことができる。ただし、κ＝配向因子（０≦κ２≦４。自由回転している場合はκ２≒２／３。）、Ｑ＝アクセプターがないときのドナーの量子収率、ｎ＝溶媒の屈折率、Ｊ＝重なり積分（ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重なり。）である。
【００２６】
従って、２つの蛍光タンパク質分子間でのＦＲＥＴ効率は、クロモフォア間距離（ｒ）、配向因子（κ）、及び重なり積分（Ｊ）の３つのパラメタに依存する。ところが、配向因子は自由回転する分子ではκ２≒２／３と近似できること、さらに、重なり積分はドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルから決まり、２つの蛍光タンパク質の位置関係には依存しないことから、プローブの分子デザインをする上では、クロモフォア間距離が特に重視されてきた。配向因子については分子デザイン段階ではあまり考慮せず、プローブを作製してからＦＲＥＴ効率が高いものを選別するというスタンスである。従って、実用性のあるプローブを作製することは、非常に手間がかかることであり、誰もが容易にできることではない。
【００２７】
しかし、発明者らは、二量体を形成する蛍光タンパク質は、２分子間の相対的位置関係が実質的に固定されることに着目し、高いＦＲＥＴ効率を与えるために好ましいクロモフォア間距離（ｒ）と配向因子（κ）となるように自己集合して二量体を形成する蛍光タンパク質の、片方又は両方を改変し、重なり積分が存在するようにすることで、高いＦＲＥＴ効率を実現できる蛍光タンパク質のペアを得られることに想到した。
【００２８】
つまり、本発明の蛍光タンパク質は、二量体又は三量体以上の多量体を形成する自己集合性をもつ蛍光タンパク質（以下「未変異型蛍光タンパク質」という。）のアミノ酸配列を、好ましくは、クロモフォア（発色団）形成に関わるアミノ酸を置換、挿入又は欠失等の変異を導入することによって、自己集合性を維持しながら、励起極大波長及び蛍光極大波長がともに異なる蛍光タンパク質（以下「変異型蛍光タンパク質」という。）に改変したものである。
【００２９】
前記未変異型蛍光タンパク質と前記変異型蛍光タンパク質とのヘテロ二量体、又は、前記変異型蛍光タンパク質の励起極大波長及び蛍光極大波長がともに相違する２つの変異型蛍光タンパク質からなるヘテロ二量体は、ＦＲＥＴ効率のパラメタである、クロモフォア間距離、配向因子、及び、重なり積分が、蛍光タンパク質のペアによって決まるため、プローブの分子デザインが非常に容易である。
【００３０】
しかも、これらのヘテロ二量体を形成する蛍光タンパク質は、実質的に励起極大波長及び蛍光極大波長のみが異なるものであり、非常にＦＲＥＴ効率が高いペアが存在すれば、他のペアについては、実質的に、重なり積分のみを考慮すればよいため、高いＦＲＥＴ効率のプローブの分子デザインも容易となる。
【００３１】
一方、ＦＲＥＴ効率（Ｅ）は、次の（３）式で表すこともできる。
Ｅ＝１−τＤ´／τＤ                                      （３）
ここで、τＤ´はアクセプター存在時のドナーの蛍光寿命、τＤはアクセプターがない場合のドナー蛍光寿命を、それぞれ表す。
【００３２】
即ち、ドナーの蛍光寿命を測定すれば、ＦＲＥＴ効率も容易に得ることができる。
【００３３】
ところが、従来の技術水準では、プライマーのＦＲＥＴ効率が低く、ＦＲＥＴの誘起時と解消時で蛍光寿命にあまり差が出ず、１０−10〜１０−9秒のオーダーの蛍光寿命を精度よく蛍光寿命を測定することが困難であるため、蛍光寿命を測定してＦＲＥＴ効率を求めるのではなく、代わりに、レシオメトリック測定法で近似的にＦＲＥＴ効率が求められる。
【００３４】
しかし、本発明の蛍光タンパク質を用いてＦＲＥＴプローブを構成することによって、ＦＲＥＴの誘起・解消に伴う蛍光寿命変化が大きくなるため、蛍光寿命を測定してＦＲＥＴ効率を求めることが容易である。
【００３５】
蛍光寿命測定法では、ドナーのみの蛍光寿命を測定すればよく、細胞内のドナー／アクセプター２種類の蛍光タンパク質の分子数が揃っている必要がない。従って、この測定法は、１分子ＦＲＥＴの場合だけではなく、レシオメトリック測定法ではＳ／Ｎ比が悪い２分子ＦＲＥＴの場合にも、非常に有効である。
【００３６】
なお、２分子ＦＲＥＴは、分子間相互作用をする２つの生体分子を、それぞれ、異なる色の蛍光分子で標識し、ＦＲＥＴプローブを構成するものであり、標識された２分子間の相互作用によって、蛍光分子間の距離又は配行性が変化し、ＦＲＥＴが誘起又は解消される。また、一方、１分子ＦＲＥＴは、２つの蛍光分子部分がリンカー部分で連結された構造をもつＦＲＥＴプローブを使用するものであり、リンカー部分に生体分子の全部又は一部が挿入され、他の生体分子との分子間相互作用又はリンカー部分に挿入された生体分子の全部又は一部の部分の間での相互作用によってリンカー部分の構造が変化し、ＦＲＥＴが誘起又は解消される。
【００３７】
また、蛍光寿命測定とフローサイトメトリーのメリットを組み合わせ、細胞を高速で流しながら１細胞ごとに蛍光強度と蛍光寿命を同時に測定できる蛍光寿命フローサイトメーター（例えば、特許文献２）を好適に利用することができる。これにより、多数の細胞を高スループットで処理し、精度良く生体分子の分子間相互作用や分子内構造変化を検出できる。
【００３８】
本発明では、前記の変異型蛍光タンパク質をコードする核酸、及び、該核酸を組み込んだ遺伝子発現ベクター（発現コンストラクト）を提供する。発現ベクター（発現コンストラクト）を培養細胞にトランスフェクトして形質転換し、細胞内で前記変異型蛍光タンパク質を発現することができる。
【００３９】
本発明では、前記の変異型蛍光タンパク質を含むプローブ（蛍光タンパク質部分と生体分子部分の融合タンパク質）をコードする核酸、及び、該核酸を組み込んだ発現ベクター（発現コンストラクト）及び該ベクターを作成する方法を提供する。また、該ベクターによって形質転換された培養細胞を提供する。さらに、前記核酸、前記発現ベクター、又は前記形質転換された培養細胞を含むキットが提供される。これらにより、プローブの作成と使用が、より容易となる。
【００４０】
さらに、細胞内で起こるＦＲＥＴ効率の変化を算出するための、好ましい方法として、ドナーの蛍光寿命を測定してＦＲＥＴ効率を算出する方法が提供される。好ましい一態様では特に、三井造船（株）製の蛍光寿命フローサイトメーター“Ｆｌｉｃｙｍｅ”（登録商標）を使用して、効率的に大量の細胞の蛍光寿命を測定することができる。
【００４１】
即ち、本発明は以下のものである。
〔１〕二量体又は三量体以上の多量体を形成する自己集合性をもつ蛍光タンパク質のアミノ酸配列に変異が導入された変異型蛍光タンパク質であって、励起極大波長及び蛍光極大波長がともに変異導入前の蛍光タンパク質（以下、未変異型蛍光タンパク質という。）からシフトし、かつ、該未変異型蛍光タンパク質若しくは励起極大波長及び蛍光極大波長がともに相違する他の変異型蛍光タンパク質とヘテロ二量体を形成できる、変異型蛍光タンパク質。
〔２〕〔１〕に記載の変異型蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔３〕前記未変異型蛍光タンパク質とヘテロ二量体を形成し、両蛍光タンパク質間でＦＲＥＴを起こすことができる、〔１〕に記載の変異型蛍光タンパク質。
〔４〕〔３〕に記載の変異型蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔５〕前記変異型蛍光タンパク質とヘテロ二量体を形成し、両蛍光タンパク質間でＦＲＥＴを起こすことができ、変異型蛍光タンパク質とは励起極大波長及び蛍光極大波長がともに相違する、〔１〕に記載の変異型蛍光タンパク質。
〔６〕〔５〕に記載の変異型蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔７〕前記未変異型蛍光タンパク質が、サンゴ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）に由来する蛍光タンパク質である、〔１〕に記載の変異型蛍光タンパク質。
〔８〕前記蛍光タンパク質が、ＤｓＲｅｄ１である、〔７〕に記載の変異型蛍光タンパク質。
〔９〕配列番号１に記載のＤＮＡ塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列をもつ蛍光タンパク質。
〔１０〕配列番号２に記載のアミノ酸配列をもつ蛍光タンパク質。
〔１１〕〔３〕又は〔５〕に記載の２つの蛍光タンパク質を含むＦＲＥＴプローブ。
〔１２〕〔３〕又は〔５〕に記載の２つの蛍光タンパク質がポリペプチドからなるリンカーを介して連結される構造をもつ融合タンパク質であるＦＲＥＴプローブ。
〔１３〕前記リンカーが生体分子の全部又は一部のアミノ酸配列を含む、〔１１〕に記載のＦＲＥＴプローブ。
〔１４〕前記２つの蛍光タンパク質がＤｓＧ２（配列番号２）及びＤｓＲｅｄ１である、〔１１〕又は１２に記載のＦＲＥＴプローブ。
〔１５〕前記生体分子がＳＵＭＯ１である〔１２〕又は〔１３〕に記載のＦＲＥＴプローブ。
〔１６〕〔１１〕〜〔１４〕のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブをコードするポリヌクレオチド。
〔１７〕〔１１〕〜〔１４〕のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブをコードするＤＮＡを遺伝子発現ベクターに組み込んで構築した発現ベクター。
〔１８〕前記遺伝子発現ベクターが、ｐＥＢ６ＣＡＧｍｃｓ、ｐＥＢ６ＳＲαｍｃｓ及びｐＥＢ６ＣＭＶｍｃｓからなる群から選ばれる、〔１７〕に記載の発現ベクター。
〔１９〕前記発現ベクターが、ｐＥＢ６ＣＭＶｍｃｓ−ＳＲＺである、〔１８〕に記載の発現ベクター。
〔２０〕〔１７〕〜〔１９〕のいずれかに記載の発現ベクターを培養細胞に導入した形質転換細胞。
〔２１〕前記培養細胞がヒト由来細胞株である、〔２０〕に記載の形質転換細胞。
〔２２〕前記ヒト由来細胞株がＨＥｐ−２細胞株である、〔２１〕に記載の形質転換細胞。
〔２３〕〔１７〕〜〔１９〕のいずれかに記載の発現ベクターを含んでなるキット。
〔２４〕〔２０〕〜〔２２〕のいずれかに記載の形質転換細胞を含んでなるキット。
〔２５〕〔１１〕〜〔１５〕のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブを用いる、ドナー蛍光タンパク質の蛍光寿命を測定して細胞内ＦＲＥＴを検出する方法。
〔２６〕蛍光寿命フローサイトメーターを使用して蛍光寿命を測定する、〔２５〕に記載の方法。
〔２７〕前記蛍光寿命フローサイトメーターが、好ましくは、Ｆｌｉｃｙｍｅ（登録商標）である、〔２６〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００４２】
本発明の自己集合性蛍光タンパク質のペアを用いることによって、自発的に会合して二量体が形成されるため、プローブの分子デザインをする際に分子間距離と分子の配向性を考慮する必要がなく、スペクトルの重なりを考慮すれば、ＦＲＥＴ効率の高いプローブの分子デザインをすることが従来に比べて非常に容易となった。また、ＦＲＥＴ効率が高く、蛍光寿命変化も大きいことから、蛍光寿命フローサイトメーターを用いて蛍光寿命を精度良く測定し、ＦＲＥＴ効率の変化を算出する用途に好適に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
＜１＞本発明の蛍光タンパク質について説明する。
本発明の蛍光タンパク質は、二量体又は三量体以上の多量体を形成しやすい、自己集合性をもつ蛍光タンパク質である。好ましくは、自己集合性をもち、二量体又は三量体以上の多量体を形成しやすい蛍光タンパク質（以下、原型蛍光タンパク質という。）の、アミノ酸配列に変異を導入することによって、自己集合性を維持しながら蛍光極大波長及び励起極大波長をシフトさせた、変異型蛍光タンパク質である。より好ましくは、原型蛍光タンパク質と変異型蛍光タンパク質とで、又は、互いに異なる変異型蛍光タンパク質同士で、ヘテロ二量体を形成する。さらに好ましくは、前記へテロ二量体形成時に、２つの蛍光タンパク質の、クロモフォア間距離、遷移双極子モーメントの相対的向き、及び、励起波長が短い方の分子（ドナー）の蛍光スペクトルと、励起波長が長い方の分子（アクセプター）の励起スペクトルとの重なり（スペクトル・オーバーラップ）が、該ドナーから該アクセプターへのＦＲＥＴを起こす条件を満たす。いっそう好ましくは、前記ドナーと前記アクセプターの間の、クロモフォア間距離ｒとフェルスター距離（ＦＲＥＴ効率が５０％になるクロモフォア間距離）について（ｒ／Ｒ０）６を最小にするような、ｒ、κ及びＪ（但し、Ｒ０＝［８．８×１０−２３・ｎ−４・κ２・Ｑ・Ｊ］１／６、κは双極子の配向因子、Ｊはドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルの重なり積分、Ｑはアクセプターがないときのドナーの量子収率、ｎは葉液の屈折率である。）を与えるヘテロ二量体を構成する変異型蛍光タンパク質である。
【００４４】
前記変異型蛍光タンパク質は、当業者にとって自明な、コンベンショナルな遺伝子工学的手法を用いて、発現及び精製をして、取得することができる。
より詳細には、例えば、変異型蛍光タンパク質の原型蛍光タンパク質をコードする組み換えｃＤＮＡを合成し、これを適当な遺伝子発現ベクターに組み込んで発現ベクターを構築し、適切な細胞にコンベンショナルな方法でトランスフェクトしてトランスフォーメーションし、蛍光タンパク質を細胞中に発現させる。所望により、前記発現ベクターは、トランスフェクション前に大腸菌等を用いて大量調製することもできる。さらに、前記遺伝子発現ベクターに組み込まれている選択マーカーを利用して、トランスフェクションの成否とトランスフォーメーションの成否によって細胞を選択することができる。細胞内で発現される蛍光タンパク質は、コンベンショナルな方法で分離・精製をすることができる。
【００４５】
本発明の好ましい変異型蛍光タンパク質は、サンゴ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）由来の赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄの変異体であるＤｓＲｅｄ１に、遺伝子組み換えにより、８３番目のリジンをアルギニン、１２０番目のチロシンをヒスチジン、１９７番目のセリンをスレオニンに置換する変異を導入して作出した緑色蛍光タンパク質ＤｓＧ２である。ＤｓＧ２はＤｓＲｅｄ１とヘテロ二量体を形成し、そのとき、ＤｓＧ２の励起エネルギーがＤｓＲｅｄ１に移動してＦＲＥＴが起こり、ＤｓＲｅｄ１の赤い蛍光が発生する。
【００４６】
ＤｓＲｅｄは、そのクロモフォア形成及び成熟の過程において、イクオレアＧＦＰと同様に一度酸化還元反応を行って緑色の発色団を形成した後に、再度酸化還元反応を行い赤色の発色団を形成することが知られている（図１）が、緑色蛍光を発するクロモフォアが形成された段階で酸化還元反応が停止したＤｓＲｅｄ１の緑色変異体は、ＤｓＲｅｄ１とヘテロ二量体を形成し、該ＤｓＲｅｄ１緑色変異体の蛍光スペクトルとＤｓＲｅｄ１の励起スペクトルの重なりがＦＲＥＴを誘起するのに十分であるといえるから、本発明の変異型蛍光タンパク質の範囲に含まれる。
【００４７】
なお、本明細書において、ＤｓＲｅｄは、サンゴ（学名：Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）の赤色蛍光タンパク質であり、ＤｓＲｅｄ１は、サンゴのＤｓＲｅｄのコドン使用パターンをヒト型に置換した変異型であり、ＤｓＲｅｄ２は、ＤｓＲｅｄ１に点変異を導入してタンパク質凝集の傾向が抑えられた変異型である。また、ＧＦＰは、オワンクラゲ（Ａｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質であり、ＥＧＦＰはクラゲのＧＦＰのコドン使用パターンをヒト型に置換した変異型である。
【００４８】
＜２＞本発明のプローブについて説明する。
本発明のプローブに、技術常識に反して自己集合性を持つ蛍光タンパク質をあえて用いる理由は、アクセプターとドナーの２つの蛍光タンパク質が、必ずその分子特性によって決まった角度でしかも安定に結合することを意図したものであるが、必ずしもこの意図に限定されない。この角度がＦＲＥＴを起こすため好ましい角度であるならば、２種類の蛍光タンパク質に付加するアミノ酸配列や他のタンパク質に関して、所望により、あまり詳細な検討を必要とせず、確実に高いＦＲＥＴ効率を実現できるように蛍光タンパク質が自発的に会合することを期待してもよい。従って、これまでに開発されてきたプローブと比較して、著しくＦＲＥＴ効率の高いプローブを誰もが非常に簡便に開発することが可能になることを意図するものであるが、必ずしもこの意図に限定して解釈されるべきではない。
【００４９】
本発明のプローブは、１分子プローブであっても２分子プローブであってもよいが、１分子プローブのときは、２つの蛍光タンパク質部分がリンカー部分を介して連結される構造となる。ここで、２つの蛍光タンパク質部分は、一方が前記変異型蛍光タンパク質であれば、他方は原型蛍光タンパク質であっても変異型蛍光タンパク質であってもよい。リンカー部分には、好ましくは、細胞内で分子間相互作用又は分子内構造変化を受けるタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列を含む。さらに、前記アミノ酸配列は、前記タンパク質又はポリペプチドの全体又は部分であってもよいし、複数の全体又は部分が含まれてもよい。細胞内での分子間相互作用を解析するためには、好ましくは、ある一態様では、リンカー部分にタンパク質又はポリペプチドの全体又は部分を１つ含み、細胞内の標識されていない分子と相互作用することでＦＲＥＴが誘起又は解消することによって分子間相互作用を検出する。また、細胞内での分子間相互作用を解析するためには、好ましくは、別の一態様では、リンカー部分にタンパク質又はポリペプチドの全体又は部分を１つ又は２つリンカーに含み、リンカー部分が構造変化することでＦＲＥＴが誘起又は解消することによって分子内構造変化を検出する。前記１分子プローブは、好ましくは、蛍光タンパク質−リンカー−蛍光タンパク質の三重融合タンパク質として細胞内で発現される。また、２分子プローブのときには、好ましくは、２つの分子間相互作用をするタンパク質又はポリペプチドを、それぞれ蛍光タンパク質で標識する構造となる。ここで、２つの蛍光タンパク質は、一方が前記変異型蛍光タンパク質であれば、他方は原型蛍光タンパク質であっても変異型蛍光タンパク質であってもよい。好ましい態様では、前記タンパク質又はポリペプチドが結合すると、２つの蛍光タンパク質も接近し、会合し、ヘテロダイマーを形成し、ＦＲＥＴが起こり、前記結合が解かれると、２つの蛍光タンパク質も解離し、ＦＲＥＴも解消する。前記プローブは、好ましくは、蛍光タンパク質−タンパク質若しくはペプチド、又は、タンパク質若しくはペプチド−蛍光タンパク質の構造をもつ融合タンパク質として細胞内で発現される。蛍光タンパク質は、前記タンパク質又はポリペプチドのＮ末端又はＣ末端のどちらか一方に連結されればよい。前記融合タンパク質は、プローブを構成する２つの融合タンパク質分子が、別個の発現ベクター上にコードされ、二重トランスフェクトされた細胞で発現されてもよい。
【００５０】
本発明の１分子プローブは、好ましい一態様では、ＤｓＧ２とＤｓＲｅｄ１をＳＵＭＯ１のアミノ酸配列を含むリンカーで連結した三重融合タンパク質である。ユビキチン様タンパク質ＳＵＭＯ１の前駆型タンパク質のＣ末端のグリシンで切断されて成熟型となることから、前記のリンカー部分にＳＵＭＯ１前駆型タンパク質のアミノ酸配列を含むＦＲＥＴプローブでは、リンカー部分が切断されることによってＦＲＥＴが解消し、アクセプターの蛍光からドナーの蛍光に変化することによって、細胞内で起こる分子間相互作用を検出することを意図したものであるが、この意図に限定されて解釈されるものではない。
【００５１】
また、前記の三重融合タンパク質は、例えば、ヒトＳＵＭＯ１遺伝子のＯＲＦをはさむオリゴＤＮＡを合成し、これを用いてヒトＨＥｐ−２細胞由来のｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲ反応によって野生型ＳＵＭＯ１のｃＤＮＡを調製し、ＳＵＭＯ１の終止コドンのかわりに他のアミノ酸をコードするように置換した塩基配列とその下流に制限酵素によって認識されて切断される配列を有するオリゴＤＮＡを合成し、これを用いてＰＣＲ反応を行い、終止コドンを持たないＳＵＭＯ１のｃＤＮＡを構築し、ＤｓＧ２のｃＤＮＡの下流に、オリゴＤＮＡ、Ｌｉｎｋ３−１ＳＥ（配列情報３）とＬｉｎｋ３−１ＡＳ（配列情報５）をアニーリングさせた１９アミノ酸からなるリンカー配列（ＬＧ３）を連結し、作成したＳＵＭＯ１のｃＤＮＡを読み枠が合うように連結し、さらにその下流に再度ＬＧ３を連結し、読み枠が合うようにＤｓＲｅｄ１のｃＤＮＡを連結して、三重融合タンパク質「ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１−ＤｓＲｅｄ１」をコードするｃＤＮＡを作成することができるが、この方法に限定されるものではなく、当業者が想到し得るいかなる方法でも用いることが可能である。
前記のｃＤＮＡを細胞中で発現する好ましい態様は、前記ｃＤＮＡを“ｐＥＢ６ＣＡＧｍｃｓ”遺伝子発現ベクターに組み込み、「ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１−ＤｓＲｅｄ１」を発現するベクターを構築し、大腸菌から大量調製し、調製した発現ベクターを市販のリポフェクション試薬を用いてヒト細胞株ＨＥｐ−２細胞に導入し、４日間、１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ロシュ社）存在下で培養することによって、細胞中で発現することができるが、この手順に限定されず、当業者が想到し得るいかなる方法でも用いることが可能である。
【００５２】
本発明の２分子プローブは、好ましい一態様では、ＤｓＧ２とＲｕｎｘ２ＲＤを連結した融合タンパク質とＤｓＲｅｄ１とＣＢＦβを連結した融合タンパク質の２分子からなる。Ｒｕｎｘ２ＲＤとＣＢＦβは１：１で結合するため、細胞中で前記の融合タンパク質が両方とも発現され、両者が結合するとＦＲＥＴが起こり、分離するとＦＲＥＴが解消することによって、細胞内で起こる２分子間の相互作用を検出することを意図するものであるが、この意図に限定して解釈されるものではない。
【００５３】
また、前記の２種類の融合タンパク質は、例えば、マウスＲＵＮＸ２遺伝子のＲｕｎｔドメイン（ＲＤ）をコードするＤＮＡ断片を調製し、前記の「ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１−ＤｓＲｅｄ１」を発現するベクターのＳＵＭＯ１−ＤｓＲｅｄ１をコードする部分と置き換えて、「ＤｓＧ２−Ｒｕｎｘ２ＲＤ」を構築することができる。同様に、ＣＢＦβをコードするＤＮＡ断片を調製し、前記の「ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１−ＤｓＲｅｄ１」を発現するベクターのＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１をコードする部分と置き換えて「ＣＢＦβ−ＤｓＲｅｄ１」を発現するベクターを構築することができる。この方法に限定されることなく、当業者が想到し得るいかなる方法でも用いることが可能である。
【００５４】
さらに、好ましくは、このｃＤＮＡを切り出してゼオシン耐性遺伝子を持つベクター“ｐＥＢ６ＣＡＧｍｃｓ−ＳＲＺ”に乗せ替えることにより、Ｇ４１８とゼオシンの二重選択によって、「ＤｓＧ２−Ｒｕｎｘ２ＲＤ」と「ＣＢＦβ−ＤｓＲｅｄ１」を同時に細胞に発現できるベクターセットを構築することができる。
【００５５】
また、所望により、ＦＲＥＴが起こらない場合の比較実験用に、「ＣＢＦβ−ＤｓＲｅｄ１」のＤｓＲｅｄ１の発色団（クロモフォア）を構成するアミノ酸配列を改変し、ＦＲＥＴアクセプターとしてまったく機能できないようにしたものを作成して用いてもよい。好ましくは、６７番目のチロシンをスレオニンに置換した変異を導入した「ＣＢＦβ−ＤｓＲｅｄ１Ｙ６７Ｔ」を構築してもよい。
【００５６】
構築した発現ベクターは、好ましくは、市販のＤＮＡ精製キットを用いて大腸菌から大量調製することができる。調製した発現ベクターは、好ましくは、市販のリポフェクション試薬を用いてヒト細胞株ＨＥｐ−２細胞に導入し、４日間、１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ロシュ社）、０．１ｍｇ／ｍｌ  ゼオシン（インビトロジェン社）両抗生物質の存在下で培養し、ＤＮＡが導入された細胞だけを選択することができる。この手順に限定されず、当業者が想到し得るいかなる方法でも用いることができる。
【００５７】
＜３＞本発明のＦＲＥＴ検出法について説明する。
本発明の好ましい一態様では、フローサイトメーターによって蛍光強度を測定し、ＦＲＥＴの誘起・解消を検出することができる。
例えば、ＳＵＭＯ１を用いたプローブは細胞内で切断を受けるため、ＦＲＥＴが解消して緑色蛍光が多くなるが、ＳＵＭＯ１ＧＡは切断を受けないためＦＲＥＴが誘起されて赤色蛍光が多くなる。ある態様では、ＳＵＭＯ１を用いたプローブでは、赤い蛍光と緑の蛍光の比は１．１と最も低くなるのに対して、ＳＵＭＯ１ＧＡを用いたプローブでは切断を受けないため、高い効率のＦＲＥＴが起こり、緑の蛍光は減弱し赤い蛍光が強くなるために蛍光強度比が１９．７にまで上がる。
【００５８】
本発明の別の好ましい一態様では、蛍光顕微鏡による観察によってＦＲＥＴを検出することができる。例えば、ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１−ＤｓＲｅｄ１又は変異ＲＵＢＹＧ２−ＳＵＭＯ１ＧＡ−ＤｓＲｅｄ１を発現させた細胞を倒立型顕微鏡で撮影すると、ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１−ＤｓＲｅｄ１は緑も赤も核内にドット状に観察されるが、変異ＲＵＢＹＧ２−ＳＵＭＯ１ＧＡ−ＤｓＲｅｄ１は赤のみが細胞質に観察され、これは、ＳＵＭＯ１が活性化されるとＦＲＥＴが解消され緑の蛍光が観察されるようになるが、ＳＵＭＯ１の活性化がおこらない場合にはＦＲＥＴが誘起されＤｓＧ２の蛍光エネルギーがＤｓＲｅｄ１に移動していると解釈できる。
【００５９】
本発明のさらに別の好ましい一態様では、フローサイトメーターによって蛍光緩和時定数（蛍光寿命）を測定してＦＲＥＴを検出することができる。
【００６０】
例えば、フローサイトメーター（Ｆｌｉｃｙｍｅ（登録商標），三井造船（株））を用いて、ｔｄ−ＤｓＧ２、ｔｄ−ＤｓＲｅｄ１及びＤｓＧ２−ＬＧ３−ＤｓＲｅｄ１の蛍光緩和時定数を測定すると、ｔｄ−ＤｓＧ２の緑色の緩和時定数は２．１ｎｓであり、ｔｄ−ＤｓＧ２とｔｄ−ＤｓＲｅｄ１を同一細胞に共発現させると緑も赤もそれぞれ蛍光を発するため緑色の緩和時定数はｔｄ−ＤｓＧ２単独発現時とほとんど同じ２．０ｎｓであるが、ＤｓＧ２−ＬＧ３−ＤｓＲｅｄ１の緑色の緩和時定数は１．３ｎｓに減少することから、ＤｓＧ２の蛍光エネルギーがＦＲＥＴによってＤｓＲｅｄ１の励起エネルギーに転移していることが確認される。また別の例では、細胞内でのＳＵＭＯ１の活性化をＦＲＥＴにより検出することを試みるとすると、ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１−ＬＧ３−ＤｓＲｅｄ１の緑色緩和時定数は２．１ｎｓ（ｔｄ−ＤｓＧ２と同じ）であるものの、切断されないＳＵＭＯ１ＧＡ変異を用いたＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１ＧＡ−ＬＧ３−ＤｓＲｅｄ１の緑色緩和時定数は１．５ｎｓに短縮することから、蛍光強度の著しい変動は、ＦＲＥＴによるものであり、しかも蛍光寿命の測定によってタンパク質の切断を検出可能であることが示される。
【００６１】
また、例えば、フローサイトメーター（Ｆｌｉｃｙｍｅ（登録商標），三井造船（株））を用いて、ＨＥｐ−２細胞で発現させたＤｓＧ２−Ｒｕｎｘ２ＲＤとＣＢＦβ−野生型ＤｓＲｅｄ１とからなる２分子プローブの蛍光緩和時定数（蛍光寿命）を測定すると、ドナー（ＤｓＧ２）の緑の蛍光の緩和時定数は１．５２ｎｓであるのに対し、ＤｓＧ２−Ｒｕｎｘ２ＲＤとＣＢＦβ−ＤｓＲｅｄ１Ｙ６７Ｔ変異（ＤｓＲｅｄ１Ｙ６７Ｔ変異体：発色団となる６７番目のチロシンがスレオニンに置換され、アクセプターにならない。）とからなる２分子プローブの蛍光緩和時定数（蛍光寿命）を測定すると、ドナーの蛍光緩和時定数は２．２３ｎｓであり、前者では高い効率でＦＲＥＴが起こっていることが確認できる。
【００６２】
よって、本発明のＦＲＥＴプローブを用いる場合、ＦＲＥＴの検出は、好ましくは、蛍光顕微鏡法、レシオメトリー測定法又は蛍光寿命測定法によって行うことができる。より好ましくは、蛍光寿命測定法によって行うことができる。また、フローサイトメトリと組み合わせてＦＲＥＴの検出を行ってもよい。フローサイトメトリと組み合わせるのは、単位時間あたりにより多くの細胞を観察することを意図したものであるが、その意図に限定されて解釈されるものではない。
【００６３】
以下に、実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されない。
【実施例】
【００６４】
１：変異型ＤｓＲｅｄの調製及び蛍光特性の検証
［１］材料及び方法
Ａ．ｃＤＮＡの調製
サンゴ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）由来の赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄのバリアントであるＤｓＲｅｄ１に、遺伝子組み換えにより、８３番目のリジンをアルギニン、１２０番目のチロシンをヒスチジン、１９７番目のセリンをスレオニンに置換する変異を導入し、変異型ＤｓＲｅｄ１である緑色蛍光タンパク質を作出した。この緑色蛍光タンパク質をＤｓＧ２と命名した（配列番号２）。手順は、以下の通りである。
（１）導入しようとするアミノ酸置換を含むアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、これを用いてＰＣＲ反応によって、変異を含むＤＮＡ断片を調製した。
（２）これを野生型ＤｓＲｅｄ１タンパク質をコードするＤＮＡの当該部分と入れ替えることにより、上記変異を導入したｃＤＮＡを調製した。
【００６５】
次に、前記ｃＤＮＡをタンデムに融合させた。手順は、以下の通りである。
（１）ＤｓＲｅｄ１をコードするＤＮＡ及びＤｓＧ２をコードするＤＮＡ（配列番号１）の終止コドンを他のアミノ酸に対応するコドンに置換した塩基配列をもち、その下流に制限酵素によって認識されて切断される配列を含むオリゴＤＮＡを合成した。
（２）これを用いてＰＣＲ反応を行い、終止コドンを持たない野生型又は変異導入ＤｓＲｅｄ１をコードするＤＮＡ断片を調製した。
（３）同一のタンパク質同士を合成の翻訳の読み枠が合うように連結した（タンデムダイマーＤｓＲｅｄ１；ｔｄ−ＤｓＲｅｄ１）。
【００６６】
Ｂ．発現ベクターの作製
上記のように作製したｃＤＮＡを、本発明者らが開発した、ヒト細胞中で安定に複製・維持される遺伝子発現ベクター“ｐＥＢ６ＣＡＧｍｃｓ”、“ｐＥＢ６ＳＲαｍｃｓ”又は“ｐＥＢ６ＣＭＶｍｃｓ”に組み込んだ（これらの発現ベクターは本発明者から入手可能である）。構築した発現ベクターは、市販のＤＮＡ精製キットを用いて大腸菌から大量調製した。
【００６７】
Ｃ．形質転換細胞の作製及び選択
調製した発現ベクターを市販のリポフェクション試薬を用いてヒト細胞株ＨＥｐ−２細胞に導入し、４日間１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８存在下で培養し、ＤＮＡが導入された細胞だけを選択した。細胞をトリプシン処理して回収し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標），ベクトン・ディッキンソン社）で蛍光陽性細胞率及び個々の細胞の蛍光強度を解析した。
【００６８】
Ｄ．蛍光顕微鏡による観察
形質転換細胞の蛍光特性及び細胞内局在を、蛍光顕微鏡（ＩＸ７０，オリンパス社）及びそれに接続したＣＣＤカメラ（ＳｅｎＳｙｓ（登録商標），フォトメトリクス社）で観察した。緑色蛍光の観察は４９５±１０ｎｍの励起フィルター及び５３５±１５ｎｍの蛍光フィルターで、赤色蛍光の観察は５５５±１２ｎｍの励起フィルター及び６２０±３０ｎｍの蛍光フィルターで観察した。
【００６９】
［２］結果
フローサイトメーター及び蛍光顕微鏡による蛍光強度の測定
図２Ａ〜Ｄは、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰ、野生型ＤｓＲｅｄ１及び変異ＤｓＲｅｄ１の蛍光特性を、フローサイトメーターを用いて試験した結果を示すプロットである。
図２Ａに示すように、野生型ｔｄ−ＤｓＲｅｄ１を発現させた細胞では赤色蛍光が認められた。
野生型ＤｓＲｅｄ１の８３番目のリシンをアルギニンに置換した変異体Ｋ８３Ｒでは、確かに赤から緑に蛍光特性が変化しているものの（図２Ｃ）、まだ波長の変化が不十分であり赤い波長成分がかなり残っているため、一般的な蛍光顕微鏡において赤い蛍光を観察するためのフィルターセットで観察されてしまう（図２Ｅ）。
一方、本発明でさらにＹ１２０Ｈ及びＳ１９７Ｔの変異を２つ追加して開発したＤｓＧ２では赤い蛍光成分が軽減しているため、フローサイトメーターの結果において、より下方に細胞のプロットが現れていた（図２Ｄ）。
図２ＦはＤｓＧ２の蛍光特性を蛍光顕微鏡を用いて試験した結果を示す図である。図２Ｅと同様のフィルターセットにおいて、赤い蛍光がほとんど消失していた。このことから、本発明で開発したＤｓＧ２は、緑の蛍光タンパク質として用いることができる。
【００７０】
２：ＤｓＧ２−ＤｓＲｅｄ１間のＦＲＥＴ効率の評価
［１］材料及び方法
Ａ．ｃＤＮＡの作製
上記のように作製したｔｄ−ＤｓＧ２とｔｄ−ＤｓＲｅｄ１のｃＤＮＡを途中のリンカー部分で組み換えてタンデムに融合させ、ＤｓＧ２−ＤｓＲｅｄ１を作成した。
【００７１】
Ｂ．遺伝子発現ベクターの作製
上記のように作製したｃＤＮＡを、本発明者らが開発した、ヒト細胞中で安定に複製・維持される遺伝子発現ベクター“ｐＥＢ６ＣＡＧｍｃｓ”に組み込んだ。またｔｄ−ＤｓＲｅｄ１のｃＤＮＡを異なる薬剤耐性遺伝子をもつ同等のベクター構築した“ｐＥＢ６ＣＡＧｍｃｓ−ＳＲＺ”に組み込んで二重トランスフェクションができるようにした。発現ベクターＤＮＡは、市販のＤＮＡ精製キットを用いて大腸菌から大量調製した。
【００７２】
Ｃ．形質転換細胞の作製及び選択
調製した遺伝子発現ベクターＤＮＡを市販のリポフェクション試薬を用いてヒト細胞株ＨＥｐ−２細胞に導入し４日間、１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ロシュ社）存在下、０．１ｍｇ／ｍｌ  ゼオシン（インビトロジェン社）存在下、又は両抗生物質の存在下で培養し、ＤＮＡが導入された細胞だけを選択した。細胞をトリプシン処理して回収し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標），ベクトン・ディッキンソン社）で蛍光陽性細胞率及び個々の細胞の蛍光強度を解析した。
【００７３】
［２］結果
フローサイトメーターによる蛍光強度の測定
図３Ａに示すように、ＤｓＧ２単独の細胞は水平方向に、図３Ｂに示すように、ＤｓＲｅｄ１単独の細胞は垂直方向にプロットされるように、装置の設定を調整した。この条件下で、ＤｓＧ２とＤｓＲｅｄ１を二重導入した細胞を測定したところ、緑の平均蛍光強度はやや弱くなり、赤の平均蛍光強度はやや強くなっており、赤い蛍光と緑の蛍光の強度比は２．１であった。
一方、ＤｓＧ２とＤｓＲｅｄ１がタンデムに連結された融合タンパク質を発現する細胞を解析したところ、赤い蛍光は図３Ｂ及び図３Ｃと比較して著しく増強されていたのに対し、緑の蛍光強度は、細胞内で緑色蛍光タンパク質がかなり発現されているにもかかわらず、図３Ａ及び図３Ｃと比較して著しく減弱していた。赤い蛍光と緑の蛍光の強度比は１６．４と別々に発現させた場合の８倍の比を示し、明らかにＤｓＧ２の励起エネルギーがＤｓＲｅｄ１に移動するＦＲＥＴが高い効率で起こっていることが示唆された。
【００７４】
３：ＦＲＥＴ検出システムの応用と性能の評価
生きた細胞内でのＦＲＥＴ効率の変化と生命現象との関連を調べるため、ユビキチン様（ＵＢＬ）タンパク質のひとつであるＳＵＭＯ１について応用することを試みた。
ＳＵＭＯ１は、ＳＵＭＯタンパク質のひとつである。ＳＵＭＯタンパク質は、細胞内の他のタンパク質に一時的に共有結合してその機能を助ける小さなタンパク質であり、タンパク質のＳＵＭＯ化は、細胞核−細胞質の輸送、転写制御、アポトーシス、タンパク質の安定化、ストレス応答、細胞周期の進行など様々な細胞内のプロセスに関係する翻訳後修飾の１つである。
図４はプローブのデザインと、働く機構の概念図である。ＳＵＭＯ１は、前駆型タンパク質のＣ末端付近のグリシンの後ろでプロペプチドが切断されて成熟型となり、活性化して、基質に結合することが知られている（図４Ａ）。そこで、ＤｓＧ２の下流にＳＵＭＯ１を融合し、さらにその下流にＤｓＲｅｄ１を融合した、「ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１−ＤｓＲｅｄ１」三重融合タンパク質を細胞中に発現させると、初めはＳＵＭＯ１が切断による活性化を受けていない（図４Ｂ）ため、特別に工夫されたリンカー配列を使っていなくても、ＤｓＧ２とＤｓＲｅｄ１が分子内で自発的に会合し、極めて高い効率でＦＲＥＴが誘起されるために、緑の蛍光は著しく減弱し、赤い蛍光が高くなる。これに伴って、ドナーの蛍光寿命ｄＴｃ１が短縮する。一方、ＳＵＭＯ１が活性化され切断が起こると、ＤｓＧ２とＤｓＲｅｄ１が解離し（図４Ｃ）、ＦＲＥＴが解消されて緑の蛍光が強く検出されるようになり、蛍光寿命ｄＴｃ１がもとの長さに回復する。
【００７５】
［１］材料及び方法
以上のモデルを検証するために、以下の手順で実験を行った。
Ａ．ｃＤＮＡの調製
ヒトＳＵＭＯ１遺伝子のＯＲＦをはさむオリゴＤＮＡを合成し、これを用いてヒトＨＥｐ−２細胞由来のｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲ反応によって野生型ＳＵＭＯ１のｃＤＮＡを調製した。ＳＵＭＯ１の終止コドンのかわりに他のアミノ酸をコードするように置換した塩基配列とその下流に制限酵素によって認識されて切断される配列を有するオリゴＤＮＡを合成し、これを用いてＰＣＲ反応を行い、終止コドンを持たないＳＵＭＯ１のｃＤＮＡを構築した。実施例１で作製したＤｓＧ２のｃＤＮＡの下流に、１９アミノ酸からなるリンカー配列（ＬＧ３）を連結し、作成したＳＵＭＯ１のｃＤＮＡを読み枠が合うように連結した。さらにその下流に再度ＬＧ３を連結した後、読み枠が合うようにＤｓＲｅｄ１のｃＤＮＡを連結しＤｓＧ２−ＬＧ３−ＳＵＭＯ１−ＬＧ３−ＤｓＲｅｄ１を作成した。
また、切断を受けない比較実験用に、ＳＵＭＯ１のＣ末近くのグリシンをアラニンに置換した変異体ＳＵＭＯ１ＧＡも作成し、同様のプローブＤｓＧ２−ＬＧ３−ＳＵＭＯ１ＧＡ−ＬＧ３−ＤｓＲｅｄ１を作成した。
【００７６】
Ｂ．発現ベクターの作製
上記のように作製したｃＤＮＡを、“ｐＥＢ６ＣＡＧｍｃｓ”ベクターに組み込んだ。構築した発現ベクターは、市販のＤＮＡ精製キットを用いて大腸菌から大量調製した。
【００７７】
Ｃ．形質転換細胞の作製及び選択
調製した発現ベクターを市販のリポフェクション試薬を用いてヒト細胞株ＨＥｐ−２細胞に導入し、４日間、１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ロシュ社）存在下で培養し、ＤＮＡが導入された細胞だけを選択した。細胞をトリプシン処理して回収し、フローサイトメーター（Ｆｌｉｃｙｍｅ（登録商標），三井造船（株））で蛍光緩和時定数（蛍光寿命）、蛍光陽性細胞率及び個々の細胞の蛍光強度を解析した。
【００７８】
Ｄ．蛍光顕微鏡による観察
形質転換細胞を用い、形質転換細胞の蛍光特性及び細胞内局在を、蛍光顕微鏡（ＩＸ７０，オリンパス社）及びそれに接続したＣＣＤカメラ（ＳｅｎＳｙｓ（登録商標），フォトメトリクス社）で観察した。緑色蛍光の観察は４９５±１０ｎｍの励起フィルター及び５３５±１５ｎｍの蛍光フィルターで、赤色蛍光の観察は５５５±１２ｎｍの励起フィルター及び６２０±３０ｎｍの蛍光フィルターで観察した。
【００７９】
［２］結果
Ａ．フローサイトメーターによる蛍光強度の測定
実施例２と同様にフローサイトメーターのパラメーターを調整して測定を行った。図５Ｅに示すように、赤い蛍光が非常に弱くなり検出される蛍光は緑が多くなったため、赤い蛍光と緑の蛍光の比は１．１と最も低くなった。一方、切断を受けないＳＵＭＯ１ＧＡを用いたプローブでは図５Ｄと同様に高い効率のＦＲＥＴが起こり、緑の蛍光は減弱し赤い蛍光が強くなったために蛍光強度比が１９．７にまで上がった。以上のことから、２つの蛍光タンパク質の間にＳＵＭＯ１を挿入した場合にも、非常に簡単に高いＦＲＥＴ効率を実現することができ、しかもＳＵＭＯ１の切断によって、このＦＲＥＴが解消することから、タンパク質の切断を極めて高感度にＦＲＥＴを用いて解析できることが明らかとなった。
【００８０】
Ｂ．蛍光顕微鏡による観察
図５ＦとＨは、ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１−ＤｓＲｅｄ１あるいはＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１ＧＡ−ＤｓＲｅｄ１を発現させた細胞を倒立型顕微鏡で撮影した図である。示されるように、ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１−ＤｓＲｅｄ１は緑も赤も核内にドット状に観察された。一方、変異ＲＵＢＹＧ２−ＳＵＭＯ１ＧＡ−ＤｓＲｅｄ１は赤のみが細胞質に観察された。このことは図４の概念図に示した通り、ＳＵＭＯ１が活性化されるとＦＲＥＴが解消され緑の蛍光が観察されるようになるが、ＳＵＭＯ１の活性化がおこらない場合にはＦＲＥＴが誘起されＤｓＧ２の蛍光エネルギーがＤｓＲｅｄ１に移動していることを示唆する。また、ＳＵＭＯ１の場合には、切断による活性化に伴う細胞内局在の変化（細胞質から核への移行）もイメージングできることが示された。
【００８１】
Ｃ．フローサイトメーターによる蛍光緩和時定数の測定
図６は、ｔｄ−ＤｓＧ２、ｔｄ−野生型ＤｓＲｅｄ１及びＤｓＧ２−ＬＧ３−ＤｓＲｅｄ１の蛍光緩和時定数をフローサイトメーター（Ｆｌｉｃｙｍｅ（登録商標），三井造船（株））を用いて試験した結果を示すヒストグラムである。
ｔｄ−ＤｓＧ２の緑色の緩和時定数は２．１ｎｓだった（図６Ａ）。
ｔｄ−ＤｓＲｅｄ１の赤色の蛍光は緑のチャンネルにはほとんど入らないため細胞の自家蛍光成分と考えられる弱い蛍光のみが検出され、緑色の緩和時定数は１．３ｎｓだったが細胞間のばらつきが非常に大きく、蛍光タンパク質由来の蛍光寿命とは明らかに異なった。（図６Ｂ）。
ｔｄ−ＤｓＧ２とｔｄ−ＤｓＲｅｄ１を同一細胞に共発現させると緑も赤もそれぞれ蛍光を発するため緑色の緩和時定数はｔｄ−ＤｓＧ２単独発現細胞の図７Ａとほとんど同じ２．０ｎｓだった（図６Ｃ）。
しかし、ＤｓＧ２−ＬＧ３−ＤｓＲｅｄ１の緑色の緩和時定数は１．３ｎｓに減少した。また赤い蛍光においてはわずかだが蛍光寿命の延長も見られた（図６Ｄ）。
このことからＤｓＧ２の蛍光エネルギーがＦＲＥＴによってＤｓＲｅｄ１の励起エネルギーに転移していることが確認された。
そこで、細胞内でのＳＵＭＯ１の活性化をＦＲＥＴにより検出することを試みた。ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１−ＬＧ３−ＤｓＲｅｄ１の緑色緩和時定数は２．１ｎｓで、ｔｄ−ＤｓＧ２と同じだった（図７Ａ）。
しかしながら、切断されないＳＵＭＯ１ＧＡ変異を用いたＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１ＧＡ−ＬＧ３−ＤｓＲｅｄ１の緑色緩和時定数は１．５ｎｓに短縮した（図７Ｂ）。
このことから、蛍光強度の著しい変動は、ＦＲＥＴによるものであり、しかも蛍光寿命の測定によってタンパク質の切断を検出可能であることが示された。
【００８２】
次に、この蛍光寿命の変化が、ＤｓＧ２がＳＵＭＯ１と結合したことによる何らかの影響によるものかどうかを確認する実験を行った。
図８はＥＧＦＰあるいはＤｓＧ２にＳＵＭＯ１を融合させたときの蛍光寿命ｄＴｃ１を示した図である。ＥＧＦＰ、ＤｓＧ２ともにＳＵＭＯ１あるいはＳＵＭＯ１ＧＡを融合させてもｄＴｃ１はｔｄ−ＤＳＧ２とほとんどかわらなかった。これによりＳＵＭＯ１との融合で蛍光寿命が減少した訳ではないことが確認された。
従って、ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１ＧＡ−ＤｓＲｅｄ１での蛍光寿命の短縮は、ＤｓＧ２の蛍光エネルギーがＦＲＥＴによってＤｓＲｅｄ１の励起エネルギーに転移したことがわかった。
図９はＤｓＧ２の蛍光強度が蛍光寿命ｄＴｃ１に及ぼす影響を検討した結果を示す図である。蛍光強度を変えるために用いたプロモーターは、本発明者らがプロモーター強度を確認済みのＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター。ＣＭＶプロモーターである（プロモーター強度：ＣＡＧプロモーター＞ＳＲαプロモーター＞ＣＭＶプロモーター）。
図９Ａに示すように、いずれのプロモーターでもほとんどすべての細胞で蛍光が観察され、その蛍光強度はＣＡＧプロモーター＞ＳＲαプロモーター＞ＣＭＶプロモーターだった。
一方、図９Ｂに示すように、ｄＴｃ１にはほとんど違いはなかった。
このことからＤｓＧ２の蛍光強度はｄＴｃ１にほとんど影響しておらず、ｄＴｃ１の短縮は蛍光強度の違いによるものではなく、ＦＲＥＴによるものであることが確認された。
【００８３】
４：２分子間ＦＲＥＴ検出システムへの応用と性能の評価
生きた細胞内でのタンパク質間相互作用を本発明を応用した２分子間ＦＲＥＴによって検出できる可能性を調べるため、転写因子Ｒｕｎｘ２とＣＢＦβ間での結合について応用することを試みた。
転写因子Ｒｕｎｘ２は、骨芽細胞の分化を制御することで知られる転写因子であり、その結合パートナーであるＣＢＦβと１：１で結合する。
【００８４】
［１］材料及び方法
以上のモデルを検証するために、以下の手順で実験を行った。
Ａ．発現ベクターの作製
マウスＲＵＮＸ２遺伝子のＲｕｎｔドメイン（ＲＤ）をコードするＤＮＡ断片を調製し、上記の「ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１−ＤｓＲｅｄ１」を発現するベクターのＳＵＭＯ１−ＤｓＲｅｄ１をコードする部分と置き換えて、「ＤｓＧ２−Ｒｕｎｘ２ＲＤ」を構築した。同様にＣＢＦβをコードするＤＮＡ断片を、「ＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１−ＤｓＲｅｄ１」を発現するベクターのＤｓＧ２−ＳＵＭＯ１をコードする部分と置き換えて「ＣＢＦβ−ＤｓＲｅｄ１」を発現するベクターを構築した後、このｃＤＮＡを切り出してゼオシン耐性遺伝子を持つベクター“ｐＥＢ６ＣＡＧｍｃｓ−ＳＲＺ”に乗せ替えた。これにより、Ｇ４１８とゼオシンの二重選択によって、「ＤｓＧ２−Ｒｕｎｘ２ＲＤ」と「ＣＢＦβ−ＤｓＲｅｄ１」を同時に細胞に発現できるベクターセットを構築した。
また、ＦＲＥＴが起こらない場合の比較実験用に、「ＣＢＦβ−ＤｓＲｅｄ１」のＤｓＲｅｄ１の６７番目のチロシンをスレオニンに置換した変異を導入した「ＣＢＦβ−ＤｓＲｅｄ１Ｙ６７Ｔ」も構築し、ＦＲＥＴアクセプターとしてまったく機能できないようにした。
構築した発現ベクターは、市販のＤＮＡ精製キットを用いて大腸菌から大量調製した。
【００８５】
Ｂ．形質転換細胞の作製及び選択
調製した発現ベクターを市販のリポフェクション試薬を用いてヒト細胞株ＨＥｐ−２細胞に導入し、４日間、１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ロシュ社）、０．１ｍｇ／ｍｌ  ゼオシン（インビトロジェン社）両抗生物質の存在下で培養し、ＤＮＡが導入された細胞だけを選択した。細胞をトリプシン処理して回収し、フローサイトメーター（Ｆｌｉｃｙｍｅ（登録商標），三井造船（株））で蛍光緩和時定数、蛍光陽性細胞率及び個々の細胞の蛍光強度を解析した。
【００８６】
［２］結果
フローサイトメーターによる蛍光緩和時定数の測定
図１０は、ＤｓＧ２−Ｒｕｎｘ２ＲＤと組み合わせて、ＣＢＦβ−野生型ＤｓＲｅｄ１又はＣＢＦβ−ＤｓＲｅｄ１Ｙ６７Ｔ変異を細胞に発現させての蛍光緩和時定数をフローサイトメーター（Ｆｌｉｃｙｍｅ（登録商標），三井造船（株））を用いて試験した結果を示すヒストグラムである。
ＤｓＧ２−Ｒｕｎｘ２ＲＤとＣＢＦβ−野生型ＤｓＲｅｄ１（野生型のｔｄ−ＤｓＲｅｄ１）との組み合わせを用いた場合には、ドナー（ＤｓＧ２）の緑の蛍光の緩和時定数は１．５２ｎｓであった（図１０Ａ）。
一方、ＤｓＧ２−Ｒｕｎｘ２ＲＤとＣＢＦβ−ＤｓＲｅｄ１Ｙ６７Ｔ変異（６７番目のチロシンがスレオニンに置換されている）との組合せを用いた場合には、ドナーの蛍光緩和時定数は２．２３ｎｓであり、ＤｓＧ２のままであった（図１０Ｂ）。ＣＢＦβ−ＤｓＲｅｄ１Ｙ６７Ｔ変異はタンパク質としては生合成されるが、発色団（クロモフォア）のＹ６７がＴに置換されているため、アクセプターとして機能できないので蛍光寿命の短縮は起こらないためである。
以上から、ＤｓＧ２−Ｒｕｎｘ２ＲＤとＣＢＦβ−野生型ＤｓＲｅｄ１との組み合わせを用いた場合に、ドナーの蛍光緩和時定数が１．５２ｎｓまで短縮し、高い効率でＦＲＥＴが起こっていることが確認できた。
このように本発明を用いると、２分子間での相互作用もＦＲＥＴによって簡便に検出できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明のＦＲＥＴプローブは、分子デザインが容易で、様々な生体分子の解析に利用することができ、生体分子が生きた細胞中の、いつ、どこで、分子間相互作用や分子内構造変化を受けているのかを可視化・画像化することができる。それによって、細胞内での機能分子の動態を明らかにすることができるため、創薬スクリーニングのためのツールとして利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】（Ａ）ＡｅｑｕｏｒｅａＧＦＰと（Ｂ）ＤｓＲｅｄについて、蛍光タンパク質の発色団（クロモフォア）の自己触媒的な形成と成熟の過程を比較する図である。切断部位が矢尻形で示される。可視光吸収のためのπ共役系が緑又は赤で示される。
【図２】（Ａ−Ｄ）：ＤｓＲｅｄ１、ＥＧＦＰ及びＤｓＧ２を細胞に発現させ、蛍光強度をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで測定した結果を示す図である。図中数値は上段が蛍光陽性細胞割合、下段が平均蛍光強度を示す（但しＡ：赤色蛍光について、Ｂ：緑色蛍光について）。（Ｅ，Ｆ）：変異型ＤｓＲｅｄ１を細胞に発現させ、倒立顕微鏡を用いて観察した結果を示す図である。
【図３】ＤｓＧ２からＤｓＲｅｄ１へのＦＲＥＴ効率をフローサイトメーターを用いて検出した図である。
【図４】ＳＵＭＯ１のタンパク質切断をＦＲＥＴを用いて検出するしくみの模式図である。
【図５】ＳＵＭＯ１活性化検出ベクターを細胞に発現させ、フローサイトメーター及び倒立顕微鏡を用いて観察した結果を示す図である。
【図６】ＤｓＧ２、ＤｓＲｅｄ１を細胞に発現させ、ＦｌｉｃｙｍｅによってｄＴｃ１を測定した結果を示す図である。Ａ：ｔｄ−ＤｓＧ２、Ｂ：ｔｄ−ＤｓＲｅｄ１、Ｃ：ｔｄ−ＤｓＧ２及びｔｄ−ＤｓＲｅｄ１、Ｄ：ＤｓＧ２とＤｓＲｅｄ１を融合
【図７】ＳＵＭＯ１とその不活性化型変異体ＳＵＭＯ１ＧＡの切断を検出できるプローブをを細胞に発現させ、ＦｌｉｃｙｍｅによってｄＴｃ１を測定した結果を示す図である。Ａ；野生型ＳＵＭＯ１、Ｂ：不活性化型変異体ＳＵＭＯ１ＧＡ
【図８】ＥＧＦＰあるいはＤｓＧ２にＳＵＭＯ１及びその不活性化型ＳＵＭＯ１ＧＡを融合させ、細胞に発現させ、ＦｌｉｃｙｍｅによってｄＴｃ１を測定した結果を示す図である。
【図９】強度の異なるプロモーターを用いてｔｄ−ＤｓＧ２を発現させ、蛍光強度及びｄＴｃ１を測定した結果を示す図である。  Ａ：ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによる測定、Ｂ：Ｆｌｉｃｙｍｅによる測定
【図１０】Ｒｕｎｘ２とＣＢＦβの間の相互作用を、２分子間ＦＲＥＴで検出した結果を示す図である。  Ａ：ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによる測定、Ｂ：Ｆｌｉｃｙｍｅによる測定
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
配列番号１−ＤｓＧ２のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号２−ＤｓＧ２のアミノ酸配列
配列番号３−オリゴＤＮＡ（Ｌｉｎｋ３−１ＳＥ）の塩基配列
配列番号４−ＬＧ３のアミノ酸配列（Ｌｉｎｋ３−１ＳＥ）
配列番号５−オリゴＤＮＡ（Ｌｉｎｋ３−１ＡＳ）の塩基配列
【図１】
2009261259.tif 000003
【図２】
2009261259.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
2009261259.tif 000009
【図１０】
2009261259.tif 000010
【図７】
2009261259.tif 000011
【図８】
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【配列表】
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