(57)【要約】【課題】細胞電気生理センサの測定精度を向上させることを目的とする。【解決手段】そしてこの目的を達成するため本発明は、導通孔９を有する細胞保持板１０と、この細胞保持板１０の上方に設けられた貯留槽１２と、この貯留槽１２に細胞を注入するための細胞導入路１６とを備え、この細胞導入路１６は、その流出口１８が上方を向いているものとした。これにより本発明は、細胞を細胞屑より早く導通孔９開口部に捕捉でき、細胞と導通孔９開口部との密着性が向上し、結果として細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
導通孔を有する細胞保持板と、
この細胞保持板の上方に設けられた貯留槽と、
この貯留槽に細胞を注入するための細胞導入路とを備え、
この細胞導入路は、その流出口が上方を向いている細胞電気生理センサ用デバイス。
【請求項２】
前記貯留槽は、
基板に設けられた貫通孔で形成され、
前記細胞導入路は、
前記基板内部に形成されている請求項１に記載の細胞電気生理センサ用デバイス。
【請求項３】
前記細胞導入路内に振動を印加するアクチュエータを有する請求項１または２に記載の細胞電気生理センサ用デバイス。
【請求項４】
前記細胞導入路は、上下方向に回転する螺旋状である請求項１から３のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ用デバイス。
【請求項５】
前記細胞導入路の前記流出口における下方の内壁は、内側に湾曲している請求項１から４のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ用デバイス。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ用デバイスと、
この細胞電気生理センサ用デバイスの前記細胞保持板の上下に注入される電解液とそれぞれ電気的に接続される電極とを備えた細胞電気生理センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤に対する細胞の反応等を測定するための細胞電気生理センサ用デバイスおよびこれを用いた細胞電気生理センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば図８に示す従来の細胞電気生理センサは、導通孔１を有する細胞保持板２と、この細胞保持板２の上方に設けられた貯留槽３と、細胞保持板２の下方に設けられた流路４と、貯留槽３と流路４とにそれぞれ配置された電極５、６とを備えている。
【０００３】
また貯留槽３および流路４にはそれぞれ電解液が充填され、その後貯留槽３に、ピペット等（図示せず）を用いて細胞７が注入される。ここで、注入される細胞７の中には、細胞７の破片である細胞屑８も混入している。
【０００４】
そして導通孔１下方の流路４側から吸引等することによって導通孔１開口部に細胞７を捕捉し、密着保持させた状態で電極５、６間における電位差を測定する。
【０００５】
この時、細胞７に薬剤を投与するなど、物理化学的刺激を印加することによって電位差が変動するため、細胞７の電気化学的変化を分析することができる。
【特許文献１】特表２００２−５１８６７８号公報
【特許文献２】特表２００３−５２７５８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の細胞電気生理センサ用デバイスでは、細胞電気生理センサの測定精度が低いという課題があった。
【０００７】
その理由は、細胞７と導通孔１開口部との密着性が低いためである。
【０００８】
すなわち、細胞７に混入した細胞屑８が、導通孔１開口部周辺に付着したり、導通孔１開口部を塞いだりすることがあり、細胞７を導通孔１開口部に密着保持することができず、結果として細胞電気生理センサの測定精度が低くなるのであった。
【０００９】
そこで本発明は、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そしてこの目的を達成するために本発明は、貯留槽に細胞を注入するための細胞導入路を備え、この細胞導入路は、その流出口が上方を向いているものとした。
【発明の効果】
【００１１】
これにより本発明は、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００１２】
その理由は、細胞と導通孔開口部との密着性が向上するからである。
【００１３】
すなわち本発明は、細胞導入路の流出口が上方を向いているため、細胞と細胞屑は、一旦噴き上げられるように貯留槽に注入され、その後重力に従って落下する。
【００１４】
ここで細胞屑は細胞よりも歪な形状をしているため液体の抵抗を受けやすく、また体積が小さいため、その落下速度は液中からの抵抗が支配的となる。したがって細胞屑は細胞よりゆっくりと落下し、細胞は細胞屑より早く導通孔開口部に捕捉される。
【００１５】
そしてその結果、細胞と導通孔開口部との密着性が向上し、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（実施の形態１）
図１に示すように本実施の形態における細胞電気生理センサ用デバイスは、導通孔９を有する細胞保持板１０と、この細胞保持板１０の外側面を支える保持プレート１１と、この保持プレート１１および細胞保持板１０の上方に設けられた貯留槽１２と、保持プレート１１および細胞保持板１０の下方に設けられた流路１３とを備えている。すなわち本実施の形態は、貯留槽１２と流路１３とを細胞保持板１０で仕切っている構造である。
【００１７】
そして本実施の形態では、貯留槽１２はウェルプレート１４（樹脂基板）に加工された貫通孔１５で形成され、このウェルプレート１４の内部には、貯留槽１２に細胞を注入するための細胞導入路１６が形成されている。この細胞導入路１６は、ウェルプレート１４が樹脂からなる場合、射出成形によって形成することができる。
【００１８】
またこの細胞導入路１６は、両端が開口する管状であって、一方の開口部がウェルプレート１４の上面に露出し、この開口部を細胞の流入口１７としている。そして他方の開口部はウェルプレート１４の貫通孔１５内壁に露出し、この開口部を流出口１８としている。
【００１９】
そして本実施の形態における細胞導入路１６は、ウェルプレート１４上面からウェルプレート１４内部において一旦斜め下方に下がり、その後斜め上方に折れ曲がってウェルプレート１４の貫通孔１５内壁に露出する構造をしている。すなわち本実施の形態における細胞導入路１６は、その流出口１８が斜め上方を向いているものである。
【００２０】
なお、この細胞導入路１６の、流出口１８に向けて上方に折り曲がる部分は、本実施の形態では、細胞保持板１０に対し、２０度〜３０度程度上方に傾けた。この角度は、細胞注入時の水圧や被検体となる細胞の質量などによって適宜調整する。
【００２１】
また本実施の形態では、図２に示すように、細胞導入路１６の流出口１８における下方の内壁１９は、内側に湾曲するよう、Ｒ加工が施されている。このように流出口１８を湾曲させることによって、被検体となる良細胞が破損するのを抑制することができる。
【００２２】
本実施の形態では、図１に示す導通孔９開口部の直径は１μｍ〜３μｍとし、深さを３μｍ〜１０μｍとした。この範囲の大きさの導通孔９が、被検体として直径１０μｍ〜１００μｍ程度の細胞を対象とした場合、効率よく細胞を密着保持することができる。
【００２３】
また本実施の形態の細胞保持板１０は、シリコン基板あるいはいわゆるＳＯＩ基板からなり、微細な導通孔９を高精度に加工することができる。
【００２４】
また保持プレート１１はエポキシ樹脂、あるいはガラス等で形成し、ウェルプレート１４はエポキシ樹脂等で形成した。
【００２５】
そして上記のような細胞電気生理センサ用デバイスを用いた細胞電気生理センサとは、貯留槽１２および流路１３内にそれぞれ電極２０、２１を配置したものであり、電極２０、２１の位置、形状は本実施の形態に限定されず、細胞保持板１０上方の貯留槽１２および細胞保持板１０下方の流路１３に充填される電解液（後述する細胞内液、細胞外液など）とそれぞれ電気的に接続されればよい。
【００２６】
次に、本実施の形態１における細胞電気生理センサを用いて、細胞電気生理現象を測定する方法について図面を用いて説明する。
【００２７】
まず、図１に示す流路１３に細胞内液（電解液）を充填する。ここで哺乳類筋細胞の場合、代表的な細胞内液としては、Ｋ+イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ+イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液が挙げられる。
【００２８】
その後、貯留槽１２に細胞外液を貯留する。ここで哺乳類筋細胞の場合、代表的な細胞外液としてはＫ+イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ+イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液が挙げられる。この時、細胞外液は、細胞導入路１６以外から注入してもよいが、細胞導入路１６から注入することによって、貯留槽１２へと細胞導入路１６の気泡を追い出すことができ、細胞注入時における気泡の流出を抑制することができる。また予め細胞導入路１６内壁を濡らしておくことによって、細胞を滑らかに注入することができる。
【００２９】
そして次に貯留槽１２と流路１３とに電極２０、２１を挿入し、電極２０、２１間に計測器（図示せず）を接続すると、細胞保持板１０で仕切られた細胞内液、細胞外液との間の電気的特性（電流、抵抗値、電圧など）が測定できる。
【００３０】
この状態では、導通孔９のみを介して細胞外液および細胞内液が導通する電気的回路が構成されており、その特性として、例えば電気抵抗、Ｉ−Ｖ特性として観測され、通常、１ＭΩ程度の電気抵抗を持つ。
【００３１】
次に、貯留槽１２に図１の矢印２２方向に細胞導入路１６を介して細胞を注入する。細胞は、細胞外液に浸して保存しているため、細胞外液とともに注入する。この時、細胞外液を加圧しながら注入する。
【００３２】
そして、図３に示すように、細胞２３は細胞屑２４とともに細胞導入路１６の流出口１８から貯留槽１２へと噴き上げられる。そして流路１３側を減圧吸引することで、細胞２３が導通孔９に引き付けられ、細胞２３が導通孔９開口部を塞ぐことによって、細胞外液、細胞内液間が１ＧΩ以上の十分に高い電気抵抗を持つ（ギガシールと呼ぶ）。
【００３３】
このギガシール状態において、吸引圧力をさらに高めることで細胞２３の細胞膜に微小の細胞膜穴が開く。
【００３４】
これによって、細胞膜のイオンチャネルを介して流れる数ｎＡ程度の微小電流を測定できるようになり、各種イオンチャネルの電気特性、薬剤に対する反応特性、その他外的刺激に対する反応などを測定することができる。
【００３５】
次に、本実施の形態における効果を以下に説明する。
【００３６】
本実施の形態では、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００３７】
その理由は、細胞を導通孔９開口部に効率よく密着保持できるからである。
【００３８】
すなわち従来は、図８に示すように、貯留槽３上部から細胞保持板２に向けて下方に水圧を掛け、細胞７を注入していた。ここでこの時、細胞７中にはどうしても細胞屑８が混入してしまう。
【００３９】
そしてこの細胞屑８が導通孔１開口部周辺に付着したり、あるいは導通孔１開口部を塞いだりすることがあり、良細胞７を導通孔１開口部に密着させて保持出来ないことがあった。なお、従来の細胞電気生理センサにおいて、細胞７および細胞屑８の落下速度は、それぞれの体積や形状よりも細胞７注入時の水圧に大きく影響を受けていたと考えられる。
【００４０】
これに対し本実施の形態では、図３に示すように、細胞２３と細胞屑２４は、一旦噴き上げられるように貯留槽１２に注入され、その後重力に従って落下していく。ここで細胞屑２４は細胞２３よりも体積が小さいため、その落下速度は液中（細胞外液）からの抵抗が支配的となる。したがって細胞屑２４は細胞２３よりゆっくりと落下し、細胞２３は細胞屑２４より早く導通孔９開口部に捕捉される。
【００４１】
そしてその結果、細胞２３と導通孔９とを密着させた状態で保持することができ、上述のギガシールを実現することによって、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００４２】
また細胞２３は一般に細胞屑２４よりも質量が大きいため、遠くまで噴き上げられることなく速やかに下方へ落下し、細胞屑２４より早く導通孔９開口部に到達する。
【００４３】
さらに細胞屑２４は細胞２３と比較して、いびつな形状のものが多いため、表面積が大きく、液体（細胞外液）の抵抗を受けやすい。したがって、導通孔９に到達するまで時間がかかり、細胞屑２４によって導通孔９が塞がれる前に細胞２３を導通孔９開口部に捕捉することができる。
【００４４】
また本実施の形態では、細胞導入路１６の折れ曲がった部分では、外周の方が内周よりも流れが速くなるため、外側には質量の大きい細胞２３が集まり、内側には質量の小さい細胞屑２４が集まりやすい。
【００４５】
したがって、流出口１８間際では、細胞２３が細胞導入路１６の下側に片寄っているため、図２に示すように、流出口１８における下方の内壁１９を、内側に湾曲させ、流出口１８で下方に垂れ下がる形状にしておくことによって、その湾曲面に沿って液体（細胞外液）の流れが形成され、この流れに伴って細胞２３が下方へ落ちやすくなる。
【００４６】
さらに本実施の形態では、図１に示すように、細胞導入路１６をウェルプレート１４内部に組み込んだ一体型の為、流出口１８の位置が固定される。したがって、流出口１８の最適な位置を維持した状態で、細胞を注入することができ、細胞を効率よく捕捉することができる。
【００４７】
なお、本実施の形態では、細胞導入路１６の開口部１８は斜め上方を向いているが、垂直に上方を向かせてもよい。この場合、細胞導入路１６を流路１３側から貯留槽１２へ引き回してもよい。このように細胞導入路１６の開口部１８が細胞保持板１０に対して垂直方向に上方を向いた場合も、本実施の形態と同様に、良細胞を効率よく捕捉し、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００４８】
（実施の形態２）
本実施の形態と、実施の形態１との違いは、図４に示すように、細胞導入路１６内に定在波を発生させるため、ウェルプレート１４の貫通孔１５内壁にアクチュエータ２５を配置した点である。
【００４９】
本実施の形態におけるアクチュエータ２５は、チタン酸ジルコン酸鉛やニオブ酸リチウムなどの圧電層を二層の電極（白金や金など）で挟んだものであり、圧電層には定在波を発生させるため、例えば下記の周波数ｆの振動を発生する電圧を印加する。
【００５０】
すなわち、周波数ｆは、細胞導入路１６の幅をＷ、細胞導入路１６に導入する液体成分（細胞外液）および固形成分（細胞、細胞屑）の混合物のうち、液体成分における音速をｖとすると
ｆ＝（ｎ／２）×ｖ／Ｗ  （ｎは自然数）
を満たす周波数ｆである。
【００５１】
これにより、細胞導入路１６内に定在波が発生し、図５に示すように、細胞導入路１６内中央に一つの節２６ができ、この節２６に細胞２３を整列させることができる。
【００５２】
なお、一般に細胞２３は細胞屑２４よりも体積が大きい為、定在波から受ける力の大きさも大きく、細胞２３を優先的に節２６に集めることができる。
【００５３】
以上のように細胞２３を細胞導入路１６内で整列させておけば、細胞２３を一定の水圧で貯留槽（図４の１２）に噴き上げることによって、細胞２３を導通孔９開口部に向けて定位置に落下させることができる。したがって、細胞２３の捕捉率が向上し、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００５４】
なお、本実施の形態では、図５に示すように、細胞導入路１６内に定在波を発生させ、細胞２３を整列させたが、定在波振動でなくてもよい。すなわち、細胞導入路１６内に進行波振動を発生させた場合は、その振動によって細胞２３や細胞屑２４が細胞導入路１６内にこびり付くのを抑制することができる。
【００５５】
また、例えばアクチュエータ（図４の２５）を複数設け、これらのアクチュエータ２５に印加する電圧を増減することによって、比較的体積が大きく移動させやすい細胞２３と、体積が小さく移動させにくい細胞屑２４とを分離することができる。したがって、細胞２３と細胞屑２４とを分離させた状態で貯留槽（図４の１２）へ噴き上げることができ、細胞２３のみを導通孔（図４の９）に捕捉しやすくなる。
【００５６】
その他実施の形態１と同様の構成および効果については説明を省略する。
【００５７】
（実施の形態３）
本実施の形態と実施の形態１との違いは、図６に示すように、管状の細胞導入路１６をウェルプレート１４の貫通孔１５内壁に取り付け、この細胞導入路１６の形状を、斜め上方から斜め下方に回転する螺旋状とした点である。
【００５８】
このように細胞導入路１６が螺旋状に回転している部分では、図７に示すように、矢印２７方向の遠心力によって質量の大きい細胞２３が細胞導入路１６の外側に、質量の小さい細胞屑２４が内側に片寄り、流出口１８では細胞２３が下方、細胞屑２４が上方に集まった状態となる。
【００５９】
そしてその状態で細胞２３および細胞屑２４は貯留槽（図６の１２）に注入されるため、細胞屑２４はより上方へと噴き上げられると考えられる。また細胞２３は下方へ落下し、導通孔９開口部にすみやかに捕捉され、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００６０】
その他実施の形態１と同様の構成および効果については説明を省略する。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、細胞を導通孔開口部に効率よく捕捉することができ、細胞電気生理センサの測定精度を向上させるのに有効である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図
【図２】図１のＸ部拡大断面図
【図３】本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの動作を示す要部拡大断面図
【図４】本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサの断面図
【図５】同細胞電気生理センサの動作を模式的に示す断面図
【図６】本発明の実施の形態３における細胞電気生理センサの断面図
【図７】同細胞電気生理センサの動作を示す要部拡大断面図
【図８】従来の細胞電気生理センサの断面図
【符号の説明】
【００６３】
９  導通孔
１０  細胞保持板
１１  保持プレート
１２  貯留槽
１３  流路
１４  ウェルプレート
１５  貫通孔
１６  細胞導入路
１７  流入口
１８  流出口
１９  内壁
２０  電極
２１  電極
２２  矢印
２３  細胞
２４  細胞屑
２５  アクチュエータ
２６  節
２７  矢印
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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