(57)【要約】【課題】  糖鎖化合物の効率的な製造方法を提供する。【解決手段】  細胞に糖鎖プライマーを投与し、伸長されたオリゴ糖鎖を回収する糖鎖化合物の製造方法であって、高濃度の細胞を反応液に添加することで、糖鎖プライマーの伸長反応効率を高めることを特徴とする方法である。本発明によれば、細胞由来の有用な糖鎖化合物を安価且つ効率的に生産することが可能になることから、多種のオリゴ糖鎖を利用した製品の迅速な実用化が可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に糖鎖プライマーを投与し伸長されたオリゴ糖鎖を回収する糖鎖化合物の製造方法であって、懸濁状態にある細胞と糖鎖プライマーを混合した反応液中において糖鎖化合物の生産性を向上させることを特徴とする糖鎖化合物の製造方法。
【請求項２】
細胞と糖鎖プライマーを混合した反応液中の細胞が高濃度の細胞であることを特徴とする請求項１記載の糖鎖化合物の製造方法。
【請求項３】
付着性の細胞を用いることを特徴とする請求項１記載の糖鎖化合物の製造方法。
【請求項４】
反応液を静置して反応することを特徴とする請求項1〜３記載の糖鎖化合物の製造方法。
【請求項５】
反応液を撹拌して反応することを特徴とする請求項１〜３記載の糖鎖化合物の製造方法。
【請求項６】
細胞の濃度が2×105 cells/ml以上であることを特徴とする請求項1〜５のいずれかに記載の糖鎖化合物の製造方法。
【請求項７】
細胞が培養細胞や生物体から調製された細胞であることを特徴とする請求項１〜６記載の糖鎖化合物の製造方法。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を用いた糖鎖化合物の合成・生産方法に関し、より詳しくは、糖鎖伸長法による糖鎖合成において糖鎖生産効率を高め、生成量を増大させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は構造が複雑であり、同じ生体分子であるＤＮＡやタンパク質よりも産業上の利用の為の開発が遅れている。しかし、近年、糖鎖の研究が急速に進展し、産業上の利用への模索も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等への糖鎖の関わりについて新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や脂質と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることも明らかになってきている。
【０００３】
従来からあるオリゴ糖鎖を生産する方法としては、化学合成および酵素を用いる方法があげられる。化学合成による方法では、一つのオリゴ糖鎖を得るための反応ステップは多く、特殊な技術も必要でコストが高いという欠点がある。また、酵素を用いる方法も、利用できる酵素が限定されることや、オリゴ糖鎖合成の原料となる糖ヌクレオチドなどの糖供与体も高価であることなどの欠点がある。
【０００４】
最近、動物細胞を使用し、簡単な構造の糖鎖プライマーを培養細胞に投与すると、培養工程中にある細胞内でこの糖鎖プライマーに糖鎖が付加されて伸長されたオリゴ糖鎖が培養液中に分泌されることが報告されている（糖鎖伸長法：特許文献1、特許文献２、特許文献３）。この方法を用いると、培養細胞や糖鎖プライマーの種類を変えることにより、多様な糖鎖を合成することができ、多様な糖鎖生産への応用が試みられている。
【０００５】
しかしながら、この糖鎖伸長法では付着性細胞などを用いた場合に、培養工程中に伸張反応を行うため、底面積の制限から細胞濃度を高めにくいという問題が生じ、結果的に糖鎖プライマーによる細胞への毒性等が出てしまい投与量が制限されることや、転換効率が低いというようなことから、更なる生産性の向上が望まれていた。
【特許文献１】特開２０００−２４７９９２
【特許文献２】ＷＯ２００２／０８１７２３
【特許文献３】特開２００３−２７４９９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記現状に鑑み、糖鎖伸長法による糖鎖合成において、効率的にオリゴ糖鎖を合成・生産させることができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに懸濁状態にある高濃度の細胞と糖鎖プライマーを混合することにより、オリゴ糖鎖の生産効率が向上することを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は、懸濁状態にある細胞に糖鎖プライマーを投与し、伸長されたオリゴ糖鎖を回収する糖鎖化合物の製造方法であって、懸濁状態にある高濃度の細胞を反応液と混ぜ、静置或いは撹拌しておくだけで、オリゴ糖鎖を効率的に生産する方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、糖鎖伸長法によるオリゴ糖鎖の生産において、培地量当たりの糖鎖生産量を単純に懸濁状態にある細胞と糖鎖プライマーを混合するだけで高められ、更には細胞を培養する工程を省くことができるため、工程を大幅に短縮できる。また従来法では、特に付着細胞を用いた場合において細胞濃度を高め難いという障壁のために、糖鎖プライマーによる細胞毒性が生じ、プライマー濃度を高めることが出来なかった点を克服することが可能となり、結果的に糖鎖の生産効率を大幅に向上させることができる。従って、人型糖鎖を始めとする動物細胞由来の有用な糖鎖化合物を安価に大量生産することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明では、懸濁状態にある細胞に糖鎖プライマーを投与し、伸長されたオリゴ糖鎖を回収する糖鎖化合物の製造法において、懸濁状態にある高濃度の細胞と糖鎖プライマーを混合し、静置或いは撹拌して反応させることにより、細胞による糖鎖生産の工程数、糖鎖プライマーが細胞へ与える毒性を減らし、更には投与した糖鎖プライマーの伸長反応効率を高める方法である。
【００１１】
ここで言う高濃度とは細胞を前培養せずに、回収した培養細胞や生物体より調整された細胞を懸濁液の状態で保持することを意味し、懸濁液の細胞濃度としては1×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌから１×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌ が好ましく、更に好ましくは２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌから１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌｃｅｌｌｓが好ましい。  糖鎖伸長に用いる細胞としては、ヒト由来、マウス由来、サル由来、ラット由来などの哺乳動物細胞が挙げられ、特にＢ１６マウスメラノーマ細胞、ラットＰＣ１２細胞、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＭＯＬＴ−４細胞、ヒトＨＬ−６０細胞、サル腎臓由来ベロ細胞などが好適に用いられ得るが、これら細胞に限定されるものではなく、培養細胞や生物体から調製された細胞であれば良い。
ただ付着性細胞を本法に用いた場合にはプレートに細胞を播種した後、接着面積の限界が原因で細胞濃度を高められないという不利な点を解決できる点でより好ましい。
【００１２】
糖鎖化合物が得られるような条件とは、例えば、上記の動物細胞を、室温から４５℃までの温度の間で１時間から７０時間までの間の時間で、糖鎖プライマー及び1×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌから１×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌまでの濃度の細胞を添加した反応液を静置あるいは撹拌しながら反応を行い、糖鎖伸長反応を行うことなどである。
【００１３】
ここで、糖鎖プライマーは、用いられる細胞種、所望の糖鎖構造により任意に選択することができる。好ましい糖鎖プライマーの例としては、式（Ｉ）：
（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)z−Ｌ−Ｎ3    
や、式（２）：
（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)z−Ｌ−H
で表される化合物が挙げられる。
【００１４】
ここで、式中、Ｇ1、Ｇ2及びＧ3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2)m−、−Ｓ−（ＣＨ2)m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)m−から選択される連結基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜５、さらに好ましくは０から３であり、ｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。また、mは、８〜２０の整数であり、好ましくは８〜１６、特に好ましくは１２である。単糖としては、限定はされないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。
【００１５】
このような糖鎖プライマーと懸濁状態にある細胞を混合して静置もしくは攪拌することにより、細胞は、プライマーを取り込み、その糖鎖部分に更に糖を付加してグリコシル化し、その糖付加生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に高濃度に分泌する。付加される糖は、細胞により異なる。    
【００１６】
以下に、本発明の糖鎖化合物の具体例を実施例の態様で示すが、本発明はこれに限定されない。
【実施例】
【００１７】
（実施例１）
まず、触媒としてルイス酸であるboron trifluoride etherate (BF3・OEt2)とアルコールを用いてグリコシル化を行った後、脱アセチル化反応を行うことにより、糖鎖プライマー：ドデシル−βラクトシドを得た（Murozuka, Y., Kasuya, M. C., Kobayashi, M., Watanabe, Y., Sato, T. and Hatanaka, K. 2005, Chemistry and Biodiversity, 2, 1063, Kasuya, M. C., Wang, L., Lee, Y. C., Mitsuki, M., Nakajima, N., Sato, T., Hatanaka, K., Yamagata, S. and Yamagata, T. 2000, Carbohydr. Res., 329, 755.）。
【００１８】
１００ｍｍのディッシュ及び20ｍｌ容量のバイアル瓶に、細胞数２×１０６から１×１０８ ｃｅｌｌｓのマウスメラノーマＢ１６細胞及びサルの腎臓由来であるベロ細胞をそれぞれ７ｍｌの終濃度５０μＭのドデシル−βラクトシド、１％のＩＴＳ−Ｘサプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて４８時間培養し、糖鎖伸長反応を行った。反応中、１００ｍｍのディッシュは静置しておき、20ｍｌ容量のバイアル瓶は、中にミクロ撹拌子を入れ通気性シートＡｉｒＰｏｒｅ  Ｔａｐｅ  Ｓｈｅｅｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を被せ、反応中細胞が沈まない程度に低速で撹拌した。
【００１９】
コントロールについては、通常の生産方法に従い、１００ｍｍのディッシュに、細胞数２×１０６ｃｅｌｌｓのマウスメラノーマＢ１６細胞及びサルの腎臓由来であるベロ細胞をそれぞれ７ｍｌの１０％  ＦＢＳ、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）及び０．１から５０μＭのフモニシンＢ１含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）に懸濁して播き、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて４８時間、前培養を行った。前培養後、終濃度５０μＭのドデシル−βラクトシド、１％のＩＴＳ−Ｘサプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）、前培養時と同濃度のフモニシンＢ１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて４８時間培養し、糖鎖伸長反応を行った。
【００２０】
糖鎖伸長反応後、培地を回収し、更にディッシュ表面やバイアル瓶内壁を１．５ｍｌのＰＢＳで洗浄することにより、培地上清全量を回収した。回収した培地上清中に含まれる糖鎖化合物については、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により細胞を除去した後、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて精製し、培地画分の脂質抽出物を得た。
【００２１】
上記の操作により得られた、脂質抽出物を５０μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣ分析した結果を図１に示す。また、デンシトグラム化し、糖鎖プライマー由来の糖鎖伸長産物であるＧＭ３型糖鎖化合物を定量した結果を図２に示す。
図１、２より細胞数を増やす（高濃度の細胞と糖鎖プライマーを混合）ことでＧＭ３型糖鎖の生産を増強できることが可能となった。またこの生産性向上は静置でも攪拌でも達成することができた。
（実施例２）
触媒としてルイス酸であるboron trifluoride etherate (BF3・OEt2)と、アルコールあるいはアジド基を導入したアルコールを用いてグリコシル化を行った後、脱アセチル化反応を行うことにより、アジド基が導入された糖鎖プライマー（１２アジド−ドデシル−βラクトシド）を得た（Murozuka, Y., Kasuya, M. C., Kobayashi, M., Watanabe, Y., Sato, T. and Hatanaka, K. 2005, Chemistry and Biodiversity, 2, 1063,  Kasuya, M. C., Wang, L., Lee, Y. C., Mitsuki, M., Nakajima, N., Sato, T., Hatanaka, K., Yamagata, S. and Yamagata, T. 2000, Carbohydr. Res., 329, 755.）。
【００２２】
１００ｍｍのディッシュ及び２０ｍｌ容量のバイアル瓶に、細胞数４×１０７ｃｅｌｌｓのサルの腎臓由来ベロ細胞をそれぞれ７ｍｌの終濃度５０から２５０μＭの１２アジド−ドデシル−βラクトシド、１％のＩＴＳ−Ｘサプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて４８時間培養し、糖鎖伸長反応を行った。反応中、１００ｍｍのディッシュは静置しておき、２０ｍｌ容量のバイアル瓶は、中にミクロ撹拌子を入れ通気性シートＡｉｒＰｏｒｅ  Ｔａｐｅ  Ｓｈｅｅｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を被せ、反応中細胞が沈まない程度に低速で撹拌した。
【００２３】
糖鎖伸長反応後、培地を回収し、更にディッシュ表面やバイアル瓶内壁を１．５ｍｌのＰＢＳで洗浄することにより、培地上清全量を回収した。回収した培地上清中に含まれる糖鎖化合物については、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により細胞を除去した後、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて精製し、培地画分の脂質抽出物を得た。
【００２４】
上記の操作により得られた、脂質抽出物を５０から２５０μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣに供した。糖鎖プライマー由来の糖鎖伸長産物であるＧＭ３型及びＧｂ３型糖鎖化合物を、ＨＰＴＬＣにより定量した結果を図３に示す。
その結果、従来のように培養細胞に糖鎖プライマーを添加して培養を行った場合に比べ、
細胞と糖鎖プライマーを反応液中で混合し、細胞を高濃度にすることで、従来法で用いる糖鎖プライマー濃度では細胞に対する毒性が出て十分に糖鎖化合物が生産されない場合でも糖鎖化合物が高生産可能であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】高濃度の細胞を用いて反応させた場合の糖脂質化合物の合成量への影響についてHPTLCにて分析した結果を示す。
【図２】高濃度の細胞での反応時における、糖脂質化合物の合成量を示す。
【図３】高濃度の細胞を用いて反応させた場合の、糖鎖プライマー濃度が糖脂質化合物の合成量に及ぼす影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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