(57)【要約】【課題】ネコ免疫不全ウイルス（FIV）の増殖を効率的に抑制する二本鎖RNA（dsRNA）分子およびそれを用いたFIVの複製を阻害するための組成物の提供。【解決手段】FIVのオープンリーディングフレームＡ（ORFA）のmRNAを標的とするdsRNA分子であって、該dsRNA分子の一方の鎖はFIVのORFA遺伝子配列またはその一部に同一な塩基配列を有するセンス鎖であり、他方の鎖は該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、上記dsRNA分子およびそれを用いたFIVの複製を阻害するための組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコ免疫不全ウイルス（FIV）のオープンリーディングフレームＡ（ORFA）のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子であって、一方の鎖が配列番号２で表されるORFA遺伝子配列中の少なくとも１９個以上の連続した塩基を有する配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、dsRNA分子。
【請求項２】
dsRNA分子が、一方の鎖が配列番号２で表されるORFA遺伝子配列の１９７〜２２５番目の塩基を有する配列、４１〜６９番目の塩基を有する配列、７１〜９９番目の塩基を有する配列、４２〜７２番目の塩基を有する配列および１８９〜２１８番目の塩基を有する配列からなる群から選択されるいずれかの塩基配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、請求項１記載のdsRNA分子。
【請求項３】
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、請求項１または２に記載のdsRNA分子。
【請求項４】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される、請求項３記載のdsRNA分子。
【請求項５】
請求項３または４に記載のdsRNA分子の鋳型DNAを含み該dsRNA分子を発現するベクター。
【請求項６】
FIVの複製を阻害するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載されるdsRNA分子を１つまたは複数含む組成物。
【請求項７】
FIVの複製を阻害するための、請求項５に記載されるベクターを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）のオープンリーディングフレームＡ（ORFA）のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子に関するものである。また本発明は、当該dsRNA分子を含む、FIVの複製を阻害するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
FIV（feline immunodeficiency virus = ネコ免疫不全ウイルス）は、ヒト免疫不全ウイルス (HIV) と同じレトロウイルス科レンチウイルス属に分類され、ネコ科動物にヒトのAIDSと同様の免疫不全症を引き起こすウイルスである。日本における感染率は10〜30%と、諸外国と比較しても非常に高く、小動物臨床上非常に重要なウイルスであると考えられる。
【０００３】
現在のところ、ネコ免疫不全症の治療法としては、ワクチン療法が用いられている。しかし、FIVはゲノムに変異を生じやすく、現段階で５つの血清型サブタイプ（A〜E）が存在し、そのため、ワクチンの元になるウイルスの型と感染ウイルスの型が一致しないと予防できないため、十分な治療効果を得ることは難しい。また、ワクチン療法は、ワクチンを用いたことによる副作用も生じ得る。
【０００４】
近年、FIVのgag（内殻タンパク質群遺伝子）遺伝子を標的としたRNAiによってFIVの増殖を阻害する研究が発表された（非特許文献１を参照）。この研究においては、ネコの繊維芽細胞およびFL4細胞を用いてFIVの増殖抑制を行っているが、解析に際しては遺伝子導入された細胞のみを選別し、その細胞におけるFIV RNA量を解析している。この評価法は実験的には有効であるが、臨床応用面で評価した場合、FIV感染している細胞にどれだけのRNAi分子を遺伝子導入できるのか、また、その時にどの程度のウイルス感染価の減少を誘導できるのか明らかではない。仮に、RNAi分子が100％の細胞に導入されているとしても、当該論文に記載される抑制効果が、実際の臨床応用に有効であるか否かは明らかではない。したがって、この研究の結果からgagを標的としたRNAiが実際にFIVの治療に有効であるか否かは不明である。
【非特許文献１】Veterinary Microbiology, Volume 120, Issues 3-4, 10 March 2007, Pages 207-216
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来法では、FIVの増殖を十分に阻害することができず、そのためネコ免疫不全症を十分に予防および／または治療することができなかった。そのため、当該分野においてFIVの増殖を効率的に阻害する方法が望まれていた。そこで、本発明では、FIVの増殖を効率的に阻害すべくFIVのORFAのmRNAを標的とするdsRNA分子を提供する。また、当該dsRNA分子を含む、FIVの複製を阻害するための組成物も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ORFAはFIVに特有の遺伝子であり、vifとrev、envとの間に位置しており（図１を参照）、77個のアミノ酸からなるORFAタンパク質（配列番号１）をコードしている。このORFAの一過性の発現によって、遺伝子転写活性を14倍から20倍上昇させることができ（Journal of Virology，1999, Vol.73, p. 608-617)、ORFA遺伝子に変異を導入した組換えFIVは、培養上清中のウイルス量を減少させ、欠失ミュータント株はネコ末梢血単核球における感染性が減少したことが報告されている（Journal of Virology, 2003, vol.77, p8819-8830）。さらに、ORFA遺伝子により、アポトーシス、細胞周期の遅延を誘導することも知られている（Virology, 2004, p. 167-174）。
【０００７】
そこで、本願発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、ORFA遺伝子を標的とすることで細胞に対する病原性を直接阻止できると考え、FIVのORFA遺伝子配列またはその一部に同一な塩基配列を有するセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖からなるdsRNA分子が、ORFA遺伝子の発現を効果的に抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  ネコ免疫不全ウイルス（FIV）のオープンリーディングフレームＡ（ORFA）のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子であって、一方の鎖が配列番号２で表されるORFA遺伝子配列中の少なくとも１９個以上の連続した塩基を有する配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、dsRNA分子。
［２］  dsRNA分子が、一方の鎖が配列番号２で表されるORFA遺伝子配列の１９７〜２２５番目の塩基を有する配列、４１〜６９番目の塩基を有する配列、７１〜９９番目の塩基を有する配列、４２〜７２番目の塩基を有する配列および１８９〜２１８番目の塩基を有する配列からなる群から選択されるいずれかの塩基配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、［１］のdsRNA分子。
［３］  センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、［１］または［２］のdsRNA分子。
［４］  配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される、［３］のdsRNA分子。
［５］  請求項３または４に記載のdsRNA分子の鋳型DNAを含み該dsRNA分子を発現するベクター。
［６］  FIVの複製を阻害するための、［１］〜［４］のいずれかのdsRNA分子を１つまたは複数含む組成物。
［７］  FIVの複製を阻害するための、［５］のベクターを含む組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によるdsRNA分子を用いて、FIVのORFA遺伝子の発現を有効に抑制することができ、それによってFIVの複製を阻害することができる。本発明のdsRNAは、ネコFIVの予防または治療剤として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
一実施形態において、本発明はFIVのORFAのmRNAを標的とするdsRNA分子であって、該dsRNA分子の一方の鎖はFIVのORFA遺伝子配列またはその一部に同一な塩基配列を有するセンス鎖であり、他方の鎖は該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖である、上記dsRNA分子に関する。
【００１１】
本発明のdsRNA分子は、配列特異的にFIVのORFAのmRNAを切断し、その結果ORFA遺伝子の発現を抑制するRNA干渉（RNAi）を引き起こすことができる。
【００１２】
本発明のdsRNA分子は、30塩基以上の長さで提供される場合、ダイサー（Dicer）と呼ばれるRNaseIII様酵素の作用によってプロセッシングされ、３’末端に2塩基のオーバーハングを有する21〜27塩基のsiRNA（small interfering RNA）分子を生じ得る。このsiRNA分子が、RISC(RNA-induced silencing complex)と呼ばれるタンパク質複合体に取り込まれ、ORFA mRNAをsiRNA分子との相同性により認識し分解し、発現抑制を行う。
【００１３】
本発明のdsRNA分子の塩基数は、特に限定されないが、15〜237塩基の範囲で選択される。好ましくは15〜50、さらに好ましくは20〜35塩基、さらに好ましくは25〜35塩基、特に好ましくは28〜31塩基である。
【００１４】
本発明において、ORFAの遺伝子配列に同一なセンス鎖とは、配列番号２で表されるORFA遺伝子配列中のチミンをウラシルに置換した塩基配列で表されるRNA配列を意味する。本発明のdsRNA分子を構成するセンス鎖は、ORFAの遺伝子配列と同一であることが望ましいが、実質的に同一、すなわち相同な配列であってもよい。すなわち、dsRNA分子のセンス鎖と実際に標的となるORFAのmRNA配列がハイブリダイズする限り１または複数、すなわち、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、２個もしくは１個のミスマッチがあってもよい。したがって、本発明のdsRNA分子のセンス鎖配列とORFAの遺伝子配列は、90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは95、96、97、98もしくは99％以上の配列相同性を有する。
【００１５】
本発明において、好ましくはセンス鎖が、配列番号２で表されるTM-２株ORFA遺伝子配列の１９７〜２２５番目の塩基を有する配列、４１〜６９番目の塩基を有する配列、７１〜９９番目の塩基を有する配列、４２〜７２番目の塩基を有する配列および１８９〜２１８番目の塩基を有する配列からなる群から選択される塩基配列と同一であることが好ましく、特に１９７〜２２５番目の塩基を有する配列および４１〜６９番目の塩基を有する配列と同一であることが好ましい。
【００１６】
dsRNA分子を構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖は、公知の方法に基づいて、化学合成や、プロモーターおよびRNAポリメラーゼを用いた転写系によってin vitroで合成することができる。また、適当な発現ベクターに当該アンチセンス鎖およびセンス鎖の鋳型DNAを導入し、当該ベクターを適当な宿主細胞内に投与することによってin vivoで合成することも可能である。合成されたセンス鎖およびアンチセンス鎖は、一般的な核酸の結合条件下において相補的に結合し二本鎖構造を形成し得る。
【００１７】
また、本発明のdsRNA分子は、上に定義されたセンス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結され、そのリンカー部でループ構造を形成し折りたたまれたshRNA(short hairpin RNA）分子として提供され得る。shRNA分子もまた、ダイサーによってプロセッシングされ、siRNA分子を生じ得る。
【００１８】
shRNA分子に含まれるリンカー分子は、センス鎖とアンチセンス鎖を連結しステムループ構造を形成し得る限り、ポリヌクレオチドリンカーであっても、非ポリヌクレオチドリンカーであってもよい。特に限定しないが、５〜１２塩基からなるポリヌクレオチドリンカーが好ましく、特にCUUCGAAC、CUUCGAACAおよび配列番号３で示されるポリヌクレオチドリンカーが好ましい。
【００１９】
本発明において好ましいshRNA分子は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８で表されるshRNA分子であって、特に好ましくは配列番号４および配列番号５で表されるshRNA分子である。
【００２０】
shRNA分子も、上記したように公知の方法に基づいて、in vitroまたはin vivoにて合成することが可能である。合成に際しては、センス鎖とアンチセンス鎖を逆方向配列として含む1本のRNA鎖を合成し、その後この1本のRNA鎖を自己相補的結合によって二本鎖構造を形成させshRNA分子を得ることができる。
【００２１】
dsRNA分子を構成するセンス鎖またはアンチセンス鎖は必要に応じて、3’末端にオーバーハングを有していてもよく、該オーバーハングの塩基の種類、数は限定されず、例えば、１〜５、好ましくは１〜３、さらに好ましくは１もしくは２塩基からなる配列が挙げられ、例えば、TTT、UUやTTが挙げられる。本発明において、オーバーハングとは、dsRNA分子の一方の鎖の末端に付加された塩基であって、もう一方の鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。オーバーハングはDNAを構成する塩基であってもよい。さらに、dsRNA分子を構成するセンス鎖またはアンチセンス鎖は、遺伝子の配列決定など種々の実験操作を円滑に行うために、siRNA活性に対して影響を与えない範囲で必要に応じて１〜３塩基、さらに好ましくは１もしくは２塩基の置換、付加、欠失をさらに含んでも良い。
【００２２】
また、センス鎖またはアンチセンス鎖は必要に応じて、5’末端がリン酸化されていてもよく、shRNA分子については5’末端に三リン酸（ppp）が結合していても良い。
【００２３】
さらに、本発明のdsRNA分子は、5’末端および／または3’末端を上記のように修飾した21〜27塩基の長さのsiRNAとして提供することも可能である。
【００２４】
また、一実施形態において、本発明は、本発明のshRNA分子を発現するベクターに関する。本発明のベクターは、本発明のshRNA分子の鋳型DNAを適当なプロモーター下に作動可能に連結した発現ベクターである。プロモーターとしては、T3プロモーター、T7プロモーター、U6プロモーター、H1プロモーターなどのPolIIIプロモーター等、当業者に公知
であるプロモーターを適宜使用することができる。ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクターなどを用いることができる。プラスミドベクターとしては、pBAsiベクター、pSUPERベクター等を用いることができる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等を用いることができる。非ウイルスベクターとしては、リポソームベクター等を用いることができ、特にセンダイウイルス−リポソームベクターが好ましい。ベクターはまた、ターミネーター等発現調節に関与する配列を適宜含んでも良い。
【００２５】
また、一実施形態において、本発明は、FIVの複製を阻害するための、本発明のdsRNA分子を含む組成物および本発明のベクターを含む組成物に関する。本発明の組成物は、本発明のdsRNA分子またはベクターを１種または複数種を組み合わせて含んでも良い。例えば、配列番号４〜８で表される５種類のdsRNA分子の１種、２種、３種、４種または５種を含んでも良い。本発明の組成物はまた、本発明のdsRNA分子またはベクターと共に、適当なキャリア、希釈剤、エマルジョンなどを含んでも良い。例えば、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水などを組成物中に含めることができる。本発明の組成物が、医薬的組成物として用いられる場合には、組成物は、経口ルート、ならびに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または非経腸的ルートで投与することに適した形態で調製することが可能である。
【００２６】
本発明は、上記dsRNA分子または発現ベクターを有効成分として含むネコFIVの予防または治療剤を提供し得る。該予防または治療剤は正常ネコ、FIVに感染しているネコまたはFIVを発症しているネコに投与することにより、FIVの感染を予防し、感染したFIVの増殖を抑制しFIVの発症を予防し、またはFIV感染症を治療することができる。該予防または治療剤の投与量は限定されないが、例えば、リンパ球あたり少なくとも１コピーのdsRNA分子が導入されるように投与することができ、例えば１投与単位あたり、dsRNA分子量で1nM〜100μM、好ましくは10nM〜50μM、より好ましくは100nM〜20μMである。投与量は、患者ネコの状態、年齢、性別、重篤度などに応じて変化させることができ、専門獣医の判断により決定される。さらに、本発明は上記dsRNA分子または発現ベクターをネコに投与してネコFIVを予防または治療する方法を提供し得る。
【００２７】
本発明の組成物は、その成分として含まれるdsRNA分子またはベクターの働きにより、FIVのORFAの発現を抑制し、その結果FIVの複製を阻害し得る。
【００２８】
また、本発明は、上記組成物を用いた、FIVの複製阻害方法を提供し得る。本方法において、上記組成物をFIVに感染した細胞、組織または個体に投与し、組成物中に含まれる本発明のdsRNA分子および発現ベクターを送達する。送達されたdsRNA分子および発現ベクターは、FIVのORFAの発現を抑制し、その結果FIVの複製を阻害し得る。
【００２９】
dsRNA分子および発現ベクターは、当業者に公知である核酸導入法、例えば、これらに限定さないがHydrodynamic法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃を用いた方法などを用いて細胞や組織に導入することが可能である。被験体が動物個体である場合には、dsRNA分子および発現ベクターは、適当なキャリア、希釈剤、エマルジョンなどと共に含む組成物の形態で、経口ルート、ならびに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または非経腸的ルートで投与することが可能である。
【００３０】
本発明のdsRNA分子の効果は、dsRNA分子を導入された細胞や組織、および個体におけるORFAのmRNAまたはタンパク質の発現量が、当該dsRNA分子を導入していない（または導入前の）細胞や組織、および個体におけるORFAのmRNAまたはタンパク質の発現量と比較して低下していることを指標にして評価することが可能である。ここで測定されるORFAは、予めおよび／または同時に導入されたORFAを発現する発現ベクターより発現されたものであっても、FIV感染により検出されるものであってもよい。発現量が低下しているとは、対照と比較して9割以上発現量が減少している場合のみならず、5割以上あるいは1割以上発現量が減少している場合も含まれる。測定対象がmRNAである場合には、ノザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、in situ hybridizationなどによって測定することができる。また、測定対象がタンパク質である場合には、ウエスタンブロッティング、ELISA、抗体を結合させたプロテインチップを用いた測定、タンパク質の活性測定などによって測定することができる。検出されるORFAが、予めおよび／または同時に導入したベクターに由来するものである場合には、当該ベクターにORFAと共に検出可能な標識（例えば、EGFPなど）遺伝子を組み込み、ORFAと該標識からなる発現された融合タンパク質を適当な手段で検出して、比較することができる。
【実施例】
【００３１】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１．ORFA発現ベクターの構築
FIV TM2株（血清型B）のORFA遺伝子（配列番号２：E03581）の配列を基に、5’側にFLAG tag 配列およびNheI切断配列を含むプライマー、および3’側にEcoRI切断配列を含む以下のプライマーを作製し：
配列番号９；順方向プライマー  5’-CATGGCTAGCCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGAC-3’
配列番号10；逆方向プライマー  5’-TCGACTGCAGAATTCGAGGCAGTATTTATGGATAATGT-3’
これらプライマーとTM2株感染MYA-1細胞由来のゲノムDNAを用いてPCRを行い、ORFA遺伝子クローニングした。クローニングしたORFA遺伝子を、NheIおよびEcoRIで制限酵素処理し、断片を精製した後、pEGFP-N3 (Takara bio) のNheI- EcoRI 部位にクローニングした。当該ベクターより発現されたORFAタンパク質は、EGFPとの融合体であるために細胞内において安定しており、また蛍光顕微鏡下で可視化できる。
【００３２】
実施例２．shRNA発現ベクターの構築
FIV TM2株（血清型B）のORFA遺伝子配列（配列番号２：E03581）を基に、ORFAを標的とする以下の6種類のshRNAを設計した（Si1〜Si6）。
【００３３】
【表１】
2009095306.tif 000002
【００３４】
設計した6種類のshRNAの鋳型DNAを、piGENE ｔRNA Vector（Takara  Bio）に挿入し、6種類のshRNA発現ベクターを作製した。対照ベクターは、shRNAを挿入していないpiGENE ｔRNA Vectorとした。
【００３５】
実施例３．shRNA分子によるORFA発現抑制効果の解析
６種類のshRNA発現ベクターをORFA発現ベクターとともに、培養細胞にトランスフェクションし、各shRNA分子によるORFA発現抑制効果を以下の解析系を用いて調べた。
（I）ORFAの共焦点レーザー顕微鏡による解析
実施例１で作製したORFA発現ベクターと実施例２で作製した各shRNA発現ベクターを以下の通り、293T細胞にトランスフェクトした。当該細胞株は、10％ウシ胎児血清（FCS）含有Dulbecco’s modified Eagle’s medium (D-MEM)中で37℃、5％CO2環境下にて培養および維持した。また該細胞は6ウェルプレートに1×106 個/ウェルの密度で播き、16時間後、細胞が80〜90％コンフルエントの状態になったところで、リポフェクション法により細胞にORFA発現ベクターおよびshRNA発現ベクターを導入した。また、ルシフェラーゼ発現ベクター（pCMV-luc）も同時に導入することで、遺伝子導入効率の指標とした。
【００３６】
導入するベクター混合液は、100μLのOpti-MEM (Invitrogen)と3μLのFuGENE6 Transfection Reagent (Roche MolecularBiochemicals)を混合し、室温で5分静置した後、これに0.5μｇのORFA発現ベクター、2.5μｇのshRNA発現ベクター（または対照ベクター）および0.01μｇのpCMV-lucの混合液を加え室温でさらに15分静置した。この後、各ウェルにこの混合液を滴下した。その後、プレートを静かに撹拌してから、37℃、5% CO2 条件下で静置培養した。48時間後、共焦点レーザー顕微鏡を用いてEGFPを検出し、ORFA−EGFP融合タンパク質の発現量を確認した。その後、各ウェルの細胞を回収してタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティング法によるORFA−EGFP融合タンパク質の定量解析を行った。
【００３７】
（II）ウエスタンブロッティング解析
上述のように遺伝子導入した細胞を48時間後に回収し、コンプリートミニ（ロシュ）を含む100μlの細胞溶解バッファー(10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.15 M NaCl, 1% NP40)に溶解した。DC protein assay kit（Bio Rad)にてタンパク質の定量を行った後、各タンパク質を6μｇ使用して10% SDS-PAGE還元状態で泳動した。続いてイモビロンＰ（ミリポア）に120V定電圧下、2時間、4℃にて転写した後、１％BSA, 5% 脱脂粉乳(DIFCO）を含むTBST (20 mM, 137 mM NaCl, 0.05% Tween20)で4℃にて一晩ブロッキングした。その後、1次抗体として抗FLAG-M2抗体(シグマ・アルドリッヒ)をTBSTで1000倍に希釈した溶液で室温にて1時間反応した後、TBSTで3回洗浄した。次いでHRP結合抗マウスIgG抗体(Promega)をTBSTで5000倍に希釈した溶液で室温にて1時間反応した後、TBSTで3回洗浄した。
【００３８】
シグナルの検出にはSuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce)を用いた。シグナル検出器はVersa Doc 5000 (Bio Rad)を使用し、定量プログラムであるQuantity One (Bio Rad) にて定量解析を行った。
【００３９】
（III）ORFAのリアルタイムPCR法による定量解析
AD293細胞を6ウェルプレートに4×10５個/ウェルの密度で播き、18時間後に、各ウェルあたり、0.5μｇのORFA発現ベクター（pEGFP-FLAG-ORFA）、1.0μｇのshRNA発現ベクター（または対照ベクター）および0.1μｇのpCMV-lucを上記（I）と同様の方法で細胞にトランスフェクションし各発現ベクターを導入した。
【００４０】
28時間後に各ウェルの細胞を回収して総RNAを抽出し、以下の条件によるリアルタイムPCR法によってORFA  mRNAの定量解析を行った。
順方向プライマー：GGCTTATCAGGTAGACAGATACAG（配列番号１１）
逆方向プライマー：ATGTAGATTGCAACGCCAATA（配列番号１２）
プローブ：CAGCCAGCATAAACAA（配列番号１３）
2009095306.tif 000003
【００４１】
（IV）解析結果
共焦点レーザー顕微鏡およびウエスタンブロット法による解析結果
ａ．ルシフェラーゼ活性測定による遺伝子導入効率の判定
ルシフェラーゼ活性測定の結果を表２および図３に示す。この結果より各系においてルシフェラーゼ活性に大きな差はなく、遺伝子導入が等しく問題なく行われたことが示された。
【００４２】
【表２】
2009095306.tif 000004
【００４３】
ｂ．共焦点レーザー顕微鏡によるORFAタンパク質の発現量低下の確認
ORFA−EGFP融合タンパク質の発現量を、EGFPの蛍光強度を共焦点レーザー顕微鏡によって解析することによって調べた結果を図４に示す。対照ベクター（FIVORFA）を導入した系の蛍光強度に比べて、shRNA発現ベクターを導入した系では蛍光強度が低下していることが観察された。特にSi−1およびSi−2の発現ベクターを導入した系では蛍光強度が著しく低下し、またSi−3、Si-5、Si-6の発現ベクターを導入した系でも有意に蛍光強度が低下した。このことからSi−1、Si−2、Si−3、Si-5、Si-6、特にSi−1およびSi−2で示されるshRNA分子が、ORFAタンパク質の発現を有効に抑制できることが示された。
【００４４】
ｃ．ウエスタンブロット法によるORFAタンパク質の発現量低下の確認
ORFA−EGFP融合タンパク質の発現量を、ウエスタンブロット法によって定量解析した結果を図５および表３に示す。表３は、図５の各バンドを数値化した結果を示す。これらの定量解析から、対照ベクター（FIVORFA）を導入した系と比較して、shRNA発現ベクターを導入した系では検出されるタンパク質量が減少していることが示された。特にSi−1およびSi−2の発現ベクターを導入した系ではORFA−EGFP融合タンパク質の量が著しく減少し、またSi−3、Si-5、Si-6の発現ベクターを導入した系でも有意に当該タンパク質の量が減少した。このことからSi−1、Si−2、Si−3、Si-5、Si-6、特にSi−1およびSi−2で示されるshRNA分子が、ORFAタンパク質の発現を有効に抑制できることが示された。この結果は、上記の共焦点レーザー顕微鏡による解析結果と一致した。
【００４５】
【表３】
2009095306.tif 000005
【００４６】
リアルタイムPCR法による解析結果
ａ．ルシフェラーゼ活性測定による遺伝子導入効率の判定
ルシフェラーゼ活性測定の結果を表４および図６に示す。この結果より各系においてルシフェラーゼ活性に大きな差はなく、遺伝子導入が等しく問題なく行われたことが示された。
【００４７】
【表４】
2009095306.tif 000006
【００４８】
ｂ．リアルタイムPCRによるORFA  mRNAの発現量低下の確認
リアルタイムPCRによって定量解析した結果を表５および図７に示す。
【００４９】
【表５】
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【００５０】
これらの定量解析から、対照ベクター（FIVORFA）を導入した系と比較して、shRNA発現ベクターを導入した系では検出されるORFA  mRNAの量が減少していることが示された。特にSi−1およびSi−2の発現ベクターを導入した系ではORFA  mRNAの量が著しく減少し、またSi−3、Si-5、Si-6の発現ベクターを導入した系でも有意に減少していることが示された。このことからSi−1、Si−2、Si−3、Si-5、Si-6、特にSi−1およびSi−2で示されるshRNA分子が、ORFA  mRNAの発現を有効に抑制できることが示された。この結果は、上記のタンパク質の定量解析の結果と一致した。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のFIVのORFA  mRNAを標的とするdsRNA分子は、ORFAのmRNAおよびタンパク質の発現量を有効に抑制することが可能であり、それによってFIVの複製を阻害し得る。また、本発明のdsRNA分子を用いてFIVの複製を阻害することによって、ネコ免疫不全症を有効に予防および／または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】FIVの遺伝子構造とORFA領域の遺伝子配列を示す模式図である。
【図２】ルシフェラーゼ活性測定による遺伝子導入効率の判定結果を示す図である。
【図３】共焦点レーザー顕微鏡によるORFA−EGFP融合タンパク質の解析結果を示す図である。それぞれ左の写真は蛍光像、右の写真は光学像を示す。
【図４】ウエスタンブロット法によるORFA−EGFP融合タンパク質の発現解析結果を示す図である。
【図５】ルシフェラーゼ活性測定による遺伝子導入効率の判定結果を示す図である。
【図６】リアルタイムPCRによるORFA  mRNAの定量解析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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