(57)【要約】【課題】精度の高いスポット照明を行う。【解決手段】シングルモードファイバ１２の射出部１２Ｂから射出されたレーザ光は、コリメータレンズ６１により平行光束とされ、絞り６２を透過し、リレーレンズ１４により一旦集光された後、フィールドレンズ１６により再び平行光束とされる。平行光束とされたレーザ光は、ダイクロイックミラー１７により対物レンズ１８の光軸方向に反射され、カバーグラス５の標本２側の面において全反射する条件を満たす対物レンズ１８の像側焦点面（瞳面）ＢＦの範囲内に入射する。そして、レーザ光は、対物レンズ１８により標本２のカバーグラス５と接する面において集光し、標本２にスポットを照射する。本発明は、例えば、顕微鏡用照明装置に適用できる。【選択図】図３
2009042411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、前記光源から発する照明光を平行光束にするコリメータレンズと、対物レンズとを備え、前記対物レンズを通して標本に全反射照明を行う顕微鏡用照明装置において、
前記コリメータレンズにより平行光束とされた前記照明光を前記対物レンズの像側焦点面上の所定の範囲に入射させ、前記標本を保護するカバーガラスの前記標本側の面に集光させることにより、当該標本側の面で全反射するように構成した
顕微鏡用照明装置。
【請求項２】
前記光源はレーザ光源であり、シングルモードファイバを用いて前記コリメータレンズに導かれ、前記シングルモードファイバの射出部または前記コリメータレンズは、相互に、光軸方向、光軸に垂直な方向および回転方向に調整可能に構成されている
請求項１に記載の顕微鏡用照明装置。
【請求項３】
前記シングルモードファイバの射出部、前記コリメータレンズおよび前記コリメータレンズの標本側に配置される絞りは光源ユニットを構成し、当該光源ユニット全体は光軸に垂直な方向に移動可能に構成されている
請求項２に記載の顕微鏡用照明装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡用照明装置に関し、特に、全反射照明を行う顕微鏡用照明装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞の挙動の研究において、細胞内物質（主にタンパク質）の動きの追跡が行われている。細胞内物質の動きを追跡することにより、細胞内外のコミュニケーション、細胞分裂、細胞移動などの細胞の主要な活動が解明され、ひいては、生体機能や病気の解明につながる。そこで、細胞内物質の動きを追跡するために、所定の波長の光を照射すると蛍光を発する性質を有する蛍光物質を蛍光ラベルとして観察対象とする細胞内物質につけて、顕微鏡により観察（以下、蛍光観察とも称する）することが一般的に行われている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
最近、PA-GFP（Photoactivatable GFP）、Kaede（商標）、Dronpa（商標）などの蛍光物質が開発および商品化され、細胞内物質の追跡の自由度が向上している。PA-GFPは、特定の波長の光を照射することにより、蛍光を発しない状態から蛍光を発する状態に変化する蛍光物質である。Kaede（商標）は、特定の波長の光を照射することにより、緑色から赤色の蛍光に変化する蛍光物質である。Dronpa（商標）は、特定の波長の光を照射することにより、蛍光を発しない状態から蛍光を発する状態に変化し、次に別の波長の光を照射することにより、蛍光を発しない状態に戻すことを繰り返し行うことができる蛍光物質である。
【０００４】
また、蛍光観察においては、以上のような光で標本を刺激して状態を変化させる光刺激（PA（Photo Activation）またはPhoto Conversion）の他、FRAP（Fluorescence Recovery after Photobleaching）、FCS（Fluorescence Correlation Spectroscopy）などの手法が一般的に用いられる。
【０００５】
光刺激を用いた蛍光観察法では、例えば、任意のタイミングで任意の物質の蛍光ラベルに所定の波長の光を照射することにより、蛍光のオンまたはオフを制御し、細胞内物質の追跡を行う。
【０００６】
FRAPを用いた蛍光観察法では、例えば、所定の波長の光を所定の強度より強く照射することにより、その照射エネルギーにより蛍光ラベルが蛍光を発しなくなる退色を利用し、部分的に蛍光ラベルの蛍光を消去し、その部分に移動してくる蛍光物質を観察する。
【０００７】
FCSを用いた蛍光観察法では、例えば、照明光の照射範囲を数fl（フェルムリットル）という微少体積に限定し、その領域の蛍光信号の変化を記録、解析することで、蛍光ラベルをつけた物質の挙動を明らかにする（例えば、特許文献２参照）。
【０００８】
ところで、近年、蛍光観察法の一つとして、全反射を利用した照明（以下、全反射照明、あるいは、TIRF（Total Internal Reflection Fluorescence）と称する）を用いて標本の蛍光観察を行う全反射照明蛍光観察法が普及してきている。従来の全反射照明では、対物レンズの像側焦点面（瞳面）において、標本を保護するカバーガラスの標本側の面で全反射する条件を満たす範囲（以下、TIRF範囲とも称する）内に照明光を集光させ、標本に平行光を照射することにより、標本の所定の範囲内を均一に照らすことが可能となる（例えば、特許文献３参照）。例えば、倍率が100倍の対物レンズを用いた場合、標本の直径0.1mmの円の範囲内が照明される。全反射照明蛍光観察法では、従来の落射蛍光観察法と比較して、標本の深さ方向に対して照明光が照射される範囲が極めて浅い範囲に限定され、バックグラウンドの影響を受けずに、標本の表面付近の情報を高感度で得ることが可能となる。
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−３６６２号公報
【特許文献２】特表２００３−５２４１８０号公報
【特許文献３】特開２００４−８５７９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来、光刺激、部分退色、FSC等の手法で、蛍光観察により標本の微細な領域を観察する場合、照明光を標本において集光させるスポット照明が利用される。そのスポット照明領域の分布は、照明光が通過する領域全域において標本が均質であると仮定し、対物レンズの開口数（NA）を用いて計算されるが、実際の生物標本は、細胞、組織ともに均質ではなく複雑な構造を持つため、屈折率、光の散乱状態などが標本の位置や方向により異なる。従って、計算どおりに標本内部に照明のためのスポットを形成することは非常に困難であり、照明される領域が理想的な対称形から歪んでしまう。そのため、実際の蛍光実験においては、この照明光の乱れを加味して計算したり、スポット照明の形状を予備実験などの結果に基づいて計算値を補正したりする場合が多い。
【００１１】
従って、光刺激または部分退色を用いた蛍光観察法では、厚さ方向および平面方向とも照明領域が大きくなり、標本の不必要な領域に照明光が照射されてしまう。また、FCSを用いた蛍光観察法では、照明領域のサイズが計算上の値と異なると、誤った解析結果となってしまう可能性がある。
【００１２】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、照明領域の小さい、かつ、光軸方向に極めて薄い精度の高いスポット照明を行うことができるようにし、照明領域の分布形状を理論的な大きさにするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一側面の顕微鏡用照明装置は、光源と、前記光源から発する照明光を平行光束にするコリメータレンズと、対物レンズとを備え、前記対物レンズを通して標本に全反射照明を行う顕微鏡用照明装置において、前記コリメータレンズにより平行光束とされた前記照明光を前記対物レンズの像側焦点面上の所定の範囲に入射させ、前記標本を保護するカバーガラスの前記標本側の面に集光させることにより、当該標本側の面で全反射するように構成する。
【００１４】
前記光源をレーザ光源とし、シングルモードファイバを用いて前記コリメータレンズに導かれるようにすることができ、前記シングルモードファイバの射出部または前記コリメータレンズを、相互に、光軸方向、光軸に垂直な方向および回転方向に調整可能に構成することができる。
【００１５】
前記シングルモードファイバの射出部、前記コリメータレンズおよび前記コリメータレンズの標本側に配置される絞りは光源ユニットを構成することができ、当該光源ユニット全体を光軸に垂直な方向に移動可能に構成することができる。
【００１６】
本発明の一側面においては、コリメータレンズにより平行光束とされた照明光が対物レンズの像側焦点面上の所定の範囲に入射され、標本を保護するカバーガラスの前記標本側の面に集光されることにより、当該標本側の面で全反射される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、エバネッセント光を用いる、原理的に浅い領域を照明する全反射照明で、照明光をカバーガラスの標本面側に集光して照明用スポットを形成するので、照明領域が小さく精度の高いスポット照明を、照明領域の分布形状を理論的な大きさにして行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明の実施の形態を説明するが、本発明の構成要件と、明細書又は図面に記載の実施の形態との対応関係を例示すると、次のようになる。この記載は、本発明をサポートする実施の形態が、明細書又は図面に記載されていることを確認するためのものである。従って、明細書又は図面中には記載されているが、本発明の構成要件に対応する実施の形態として、ここには記載されていない実施の形態があったとしても、そのことは、その実施の形態が、その構成要件に対応するものではないことを意味するものではない。逆に、実施の形態が構成要件に対応するものとしてここに記載されていたとしても、そのことは、その実施の形態が、その構成要件以外の構成要件には対応しないものであることを意味するものでもない。
【００１９】
本発明の一側面の顕微鏡照明装置（例えば、図１の顕微鏡１、図４の顕微鏡１０１、または、図５の顕微鏡２０１の照明光学系）は、光源（例えば、図１のレーザ光源５１、レーザ光源５４、図４のレーザボックス１２１、または、図５のレーザボックス２１１）と、前記光源から発する照明光を平行光束にするコリメータレンズ（例えば、図１のフィールドレンズ１６、図４のフィールドレンズ１６、または、図５リレーレンズ２１７）と、対物レンズ（例えば、図１、図４または図５の対物レンズ１８）とを備え、前記対物レンズを通して標本に全反射照明を行う顕微鏡用照明装置において、前記コリメータレンズにより平行光束とされた前記照明光を前記対物レンズの像側焦点面上の所定の範囲に入射させ、前記標本を保護するカバーガラス（例えば、図１、図４または図５のカバーガラス５）の前記標本側の面に集光させることにより、当該標本側の面で全反射するように構成した。
【００２０】
前記光源はレーザ光源であり、シングルモードファイバ（例えば、図１のシングルモードファイバ１２）を用いて前記コリメータレンズに導かれ、前記シングルモードファイバの射出部（例えば、図１の射出部１２Ｂ）または前記コリメータレンズは、相互に、光軸方向、光軸に垂直な方向および回転方向に調整可能に構成されている。
【００２１】
前記シングルモードファイバの射出部、前記コリメータレンズおよび前記コリメータレンズの標本側に配置される絞り（例えば、図１の絞り６２）は光源ユニット（例えば、図１の光源ユニット１３）を構成し、当該光源ユニット全体は光軸に垂直な方向に移動可能に構成されている
【００２２】
以下、図面を参照して本発明を適用した実施の形態について説明する。
【００２３】
図１は、本発明を適用した顕微鏡の照明光学系の一実施の形態を示す図である。図１の顕微鏡１の照明光学系は、レーザユニット１１、シングルモードファイバ１２、光源ユニット１３、リレーレンズ１４、ダイクロイックミラー１５、フィールドレンズ１６、ダイクロイックミラー１７、対物レンズ１８、シングルモードファイバ２１、コリメータレンズ２２、水銀ランプ３１、コリメータレンズ３２、電動シャッタ３３、リレーレンズ３４、視野絞り３５、フィールドレンズ３６、励起フィルタ３７、ダイクロイックミラー３８、バリアフィルタ４１、および、第２対物レンズ４２を含むように構成される。
【００２４】
そのうち、レーザユニット１１、シングルモードファイバ１２、光源ユニット１３、リレーレンズ１４、フィールドレンズ１６、ダイクロイックミラー１７、および、対物レンズ１８によりスポット照明光学系が構成される。また、図示せぬレーザ光源、シングルモードファイバ２１、コリメータレンズ２２、ダイクロイックミラー１５、フィールドレンズ１６、ダイクロイックミラー１７、および、対物レンズ１８によりTIRF照明光学系が構成される。さらに、水銀ランプ３１、コリメータレンズ３２、電動シャッタ３３、リレーレンズ３４、視野絞り３５、フィールドレンズ３６、励起フィルタ３７、ダイクロイックミラー３８、および、対物レンズ１８により落射照明光学系が構成される。
【００２５】
また、図１においては、顕微鏡１による観察対象となる標本２は、スライドグラス３内の溶液４内に浸され、カバーガラス５により保護されている。また、対物レンズ１８のカバーガラス５と接する部分には、オイル６が満たされている。
【００２６】
レーザユニット１１は、波長が488nmのレーザ光（以下、第１スポットレーザ光とも称する）を射出するレーザ光源５１、シャッタ５２、ミラー５３、波長が547nmのレーザ光（以下、第２スポットレーザ光とも称する）を射出するレーザ光源５４、シャッタ５５、波長が488nmの光を透過し、波長が547nmの波長を反射する特性を有するダイクロイックミラー５６を含むように構成される。また、レーザユニット１１には、シングルモードファイバ１２の入射部１２Ａが接続されている。
【００２７】
なお、以下、第１スポットレーザ光および第２スポットレーザ光を特に区別する必要がない場合、単に、スポットレーザ光と称する。
【００２８】
シングルモードファイバ１２の入射部１２Ａ、レーザ光源５１、ミラー５３、レーザ光源５４、および、ダイクロイックミラー５６には、図示せぬ調整機構が設けられている。各調整機構を調整することにより、レーザ光源５１から射出される第１スポットレーザ光は、ミラー５３により反射され、ダイクロイックミラー５６を透過し、シングルモードファイバ１２の入射部１２Ａに１本の光線として導かれる。また、各調整機構を調整することにより、レーザ光源５４から射出される第２スポットレーザ光は、ダイクロイックミラー５６により反射され、シングルモードファイバ１２の入射部１２Ａに１本の光線として導かれる。また、シャッタ５２およびシャッタ５５の開閉を外部から制御することにより、第１スポットレーザ光および第２スポットレーザ光のオンまたはオフが制御される。
【００２９】
なお、図１のレーザユニット１１においては、レーザ光源を２つ設ける構成となっているが、３つ以上設けるようにすることも可能である。その場合、例えば、レーザ光源、シャッタ、ダイクロイックミラー、および、調整機構の組み合わせを新たに追加することにより、実現することができる。
【００３０】
また、図１において、TIRF照明光学系のシングルモードファイバ２１およびコリメータレンズ２２を、スポット照明光学系のシングルモードファイバ１２乃至リレーレンズ１４のように構成することで、２点の薄いスポット照明を実現できる。同様に、この照明光学系をダイクロイックミラーとともに増やすことが可能である。
【００３１】
シングルモードファイバ１２の入射部１２Ａは、上述したようにレーザユニット１１に接続され、射出部１２Ｂは光源ユニット１３に接続されている。シングルモードファイバ１２は、入射部１２Ａから入射されるスポットレーザ光を光源ユニット１３内に設けられた射出部１２Ｂから射出する。
【００３２】
光源ユニット１３は、コリメータレンズ６１、および、絞り６２を含むように構成される。シングルモードファイバ１２の射出部１２Ｂから射出されたスポットレーザ光は、コリメータレンズ６１により平行光束とされ、絞り６２を透過し、リレーレンズ１４に入射する。なお、絞り６２の絞り径は、固定および可変のいずれでもよい。
【００３３】
なお、シングルモードファイバ１２の射出部１２Ｂは、図示せぬ調整機構により、光軸方向および光軸に垂直な方向に移動することができ、位置を調整することが可能である。すなわち、射出部１２Ｂとコリメータレンズ６１との間隔、および、コリメータレンズ６１に入射するスポットレーザ光の位置を調整することが可能である。また、射出部１２Ｂは、図示せぬ角度調整機構により、スポットレーザ光の射出口を中心に回転することができ、スポットレーザ光を射出する角度を調整することが可能である。
【００３４】
さらに、光源ユニット１３自体も、図示せぬ調整機構により、光軸に垂直な方向に移動することができ、リレーレンズ１４に入射するスポットレーザ光の位置を調整することが可能である。
【００３５】
なお、射出部１２Ｂの調整機構および角度調整機構の機能の一部または全部を、コリメータレンズ６１側に設けるようにすることも可能である。すなわち、コリメータレンズ６１を光軸および光軸に垂直な方向に移動させたり、回転させたりできるようにすることも可能である。
【００３６】
光源ユニット１３から射出されたスポットレーザ光は、リレーレンズ１４により一旦集光され、ダイクロイックミラー１５を透過し、フィールドレンズ１６により再び平行光束とされる。さらに、平行光束とされたスポットレーザ光は、ダイクロイックミラー１７により対物レンズ１８の光軸方向に反射され、対物レンズ１８の像側焦点面（瞳面）ＢＦに入射する。そして、スポットレーザ光は、対物レンズ１８により標本２のカバーガラス５と接する面において集光し、標本２をスポット照明する。このようにして、スポットレーザ光による全反射のスポット照明が実現される。なお、スポット照明光学系の動作の詳細については、図２および図３を参照して後述する。
【００３７】
TIRF照明光学系の図示せぬレーザ光源から射出されたレーザ光（以下、TIRFレーザ光とも称する）は、シングルモードファイバ２１に入射され、射出部２１Ａからコリメータレンズ２２の光軸方向に射出される。シングルモードファイバ２１から射出されたTIRFレーザ光は、コリメータレンズ２２により平行光束となり、ダイクロイックミラー１５により、フィールドレンズ１６の光軸方向に反射され、フィールドレンズ１６を透過する。このとき、フィールドレンズ１６は集光レンズとして作用し、フィールドレンズ１６を透過したTIRFレーザ光は、ダイクロイックミラー１７により対物レンズ１８の光軸方向に反射され、対物レンズ１８の像側焦点面（瞳面）ＢＦの所定の領域において集光する。そして、対物レンズ１８の像側焦点面（瞳面）ＢＦ上の所定の領域において集光したTIRFレーザ光は、対物レンズ１８により平行光束となり、標本２を照射する。このようにして、TIRFレーザ光による全反射照明が実現される。
【００３８】
なお、シングルモードファイバ２１の射出部２１Ａにも、シングルモードファイバ１２の射出部１２Ｂと同様の図示せぬ調整機構および角度調整機構が設けられ、光軸方向および光軸に垂直な方向への移動、および、射出部２１Ａの射出口を中心とする回転が可能である。
【００３９】
落射照明光学系の水銀ランプ３１から発せられた光（以下、落射照明光とも称する）は、コリメータレンズ３２により平行光束となり、電動シャッタ３３、リレーレンズ３４、視野絞り３５、フィールドレンズ３６を透過し、励起フィルタ３７により、所定の波長成分のみが選択透過する。励起フィルタ３７を透過した落射照明光は、ダイクロイックミラー３８により対物レンズ１８の光軸方向に反射され、ダイクロイックミラー１７、対物レンズ１８を透過し、標本２に照射される。
【００４０】
なお、電動シャッタ３３は外部から開閉することができ、落射照明光学系の照明のオンまたはオフを切換えることができる。
【００４１】
第１スポットレーザ光、第２スポットレーザ光、TIRFレーザ光または落射照明光を照射することにより標本２が発した蛍光、または、標本２が反射した反射光は、対物レンズ１８により集められ、ダイクロイックミラー１７およびダイクロイックミラー３８により、観察に必要な成分のみ透過され、不要な成分は反射される。そして、ダイクロイックミラー３８を透過した光のうち所定の波長の光が、バリアフィルタ４１を透過し、第２対物レンズ４２により像面IMに結像する。
【００４２】
次に、図２および図３を参照して、スポット照明光学系の動作の詳細について説明する。
【００４３】
図２および図３は、図１の顕微鏡１の照明光学系のうち、スポット照明光学系に関わる部分を抽出した図である。ただし、図２および図３において、レーザユニット１１の図示は省略されている。
【００４４】
なお、以下、シングルモードファイバ１２の射出部１２Ｂの射出口のコア直径＝3.5umとし、シングルモードファイバ１２が、NA＝0.11（＝約13度の角度）の条件で射出部１２Ｂからスポットレーザ光を放射しているものとする。
【００４５】
図２は、スポットレーザ光のファイバ射出端面の発光中心が光学系の光軸上に位置するように調整した場合の例を示している。
【００４６】
約13度の角度で射出部１２Ｂから放射されたスポットレーザ光の明るさは一様ではなく、ガウス分布に従い中央ほど明るく周辺ほど暗くなる。そのため、暗い周辺光を制限する場合に絞り６２が用いられる。例えば、スポットレーザ光の放射範囲は、絞り６２により約半分の角度に制限される。
【００４７】
絞り６２を透過したスポットレーザ光は、リレーレンズ１４により一旦集光され、さらに、フィールドレンズ１６により平行光束となる。フィールドレンズ１６により平行光束とされたスポットレーザ光は、ダイクロイックミラー１７により、対物レンズ１８の光軸方向に反射され、対物レンズ１８の像側焦点面（瞳面）ＢＦに、平行光束となったスポットレーザ光が到達する。これにより、スポットレーザ光は、対物レンズ１８の標本２側の焦点面に集光する。
【００４８】
図３は、図２と比較して、レーザ光の光軸に対して垂直な矢印Ａ３１で示される方向に距離ｄ３１だけ光源ユニット１３を平行移動させた場合の例を示している。
【００４９】
光源ユニット１３を平行移動させることにより、スポットレーザ光の進路は、対物レンズ１８の光軸の中心から図内で右方向にずれ、スポットレーザ光は、対物レンズ１８の像側焦点面（瞳面）ＢＦの端部を通過する。スポットレーザ光が対物レンズ１８の像側焦点面（瞳面）ＢＦを通過する位置が、NA＝1.38以上の位置になると、スポットレーザ光は、カバーガラス５の標本２側の面において集光するとともに全反射され、標本２に対して全反射のスポット照明が行われる状態となる（ただし、カバーガラス５の屈折率ncov＝1.5255、カバーガラス５より標本側の媒質の屈折率nobj＝1.33とする。）。
【００５０】
ここで、具体例を挙げて、スポットレーザ光が全反射照明となる条件、および、スポットレーザ光によるスポット照明の照射範囲について考える。なお、以下、シングルモードファイバ１２の射出部１２Ｂのコア直径φs＝3.5μm、開口数NAs＝0.11、コリメータレンズ６１の焦点距離fc＝5mm、リレーレンズ１４の焦点距離fr＝1000mm、フィールドレンズ１６の焦点距離ff＝200mm、対物レンズ１８の倍率Mobj＝100倍、開口数NAobj＝1.49、焦点距離fobj＝2mmとする。
【００５１】
この場合、対物レンズ１８の像側焦点面（瞳面）ＢＦにおいてNA＝1.38からNA＝1.49までの範囲内、すなわち、カバーガラス５の標本２側の面において全反射する条件を満たす、対物レンズ１８の像側焦点面（瞳面）ＢＦにおける範囲内をスポットレーザ光が通過するとき、全反射照明が実現される。つまり、スポットレーザ光が対物レンズ１８の像側焦点面（瞳面）ＢＦの辺縁部の幅0.22mm（＝fobj×（1.49−1.38）＝2×（1.49−1.38））の範囲（TIRF範囲）内を通過した場合に、全反射照明が実現される。
【００５２】
一方、シングルモードファイバ１２から射出されるスポットレーザ光の光束の大きさ（直径）は、コリメータレンズ６１を出たところで、φ1.1ｍｍ（＝fc×NAs×2＝5×0.11×2）となる。さらに、スポットレーザ光の光束の大きさは、リレーレンズ１４およびフィールドレンズ１６を透過することにより、φ0.22ｍｍ（＝φ1.1ｍｍ×ff／fr＝φ1.1ｍｍ×200／1000）に縮小される。すなわち、スポットレーザ光の光束の大きさは、TIRF範囲の幅に収まる。
【００５３】
対物レンズ１８から標本２を照射するスポットレーザ光のNASLは、シングルモードファイバ１２および各レンズの焦点距離から、以下の式（１）により求められる。
【００５４】
NASL＝NAs×fc／fr×ff／fobj＝0.11×5／1000×200／2＝0.055  ・・・（１）
【００５５】
標本２を照射したときのスポットレーザ光の照射範囲は、このNASLを用いて以下の式（２）により求められる。
【００５６】
照射範囲＝（n×スポットレーザ光の代表波長）÷（2×NASL）
＝（1.55×スポットレーザ光の代表波長）÷（2×0.055）  ・・・（２）
ただし、n：オイル６およびカバーガラス５の屈折率の代表値
【００５７】
従って、第１スポットレーザ光および第２スポットレーザ光の照射範囲は、以下の式（３）および式（４）より、それぞれ約7μmおよび約8μmとなる。
【００５８】
第１スポットレーザ光の照射範囲＝（1.55×488nm）÷（2×0.055）
≒6.9μm≒約7μm  ・・・（３）
第２スポットレーザ光の照射範囲＝（1.55×547nm）÷（2×0.055）
≒7.7μm≒約8μm  ・・・（４）
【００５９】
また、第１スポットレーザ光または第２スポットレーザ光による対物レンズ１８を介した全反射照明の厚みは、約0.15μm（エバネッセント光が照明光として働くエバネッセント光の厚み）になることが分かっている。
【００６０】
なお、シングルモードファイバ１２から射出されるスポットレーザ光の光束の大きさを調整することにより、スポット照明の照射範囲を調整することが可能である。
【００６１】
以上のようにして、カバーガラス５と接する標本２の面のエバネッセント層と呼ばれる範囲にスポット照明を行うことができる。また、全反射照明の理論上、標本２の屈折率および光の散乱状態に関わらず、スポット照明の面積および厚みは理論値に近くなるため、精度の高いスポット照明を行うことができる。
【００６２】
これにより、光刺激やFRAPを用いた蛍光観察法において、標本２に照明光を照射する範囲を狭く抑えることができ、標本２を効率よく照らすとともに、照明により標本２が受けるダメージを小さくすることができる。
【００６３】
ここで、顕微鏡１を用いてFCSによる蛍光観察を行う場合について考える。
【００６４】
上述したように、FCSを用いた蛍光観察法では、照明光の照射範囲の体積を数fl（フェルム・リットル）以下にする必要がある。通常の対物レンズによる集光サイズを例に挙げると、倍率100倍、NA＝1.2の水浸タイプの対物レンズの場合、光軸に垂直な方向の照明の幅が約0.3μｍ、光軸方向の照明の厚みは約2μmと計算される。集光部分を円筒として計算すると、その体積は、約0.14fl（＝0.152×π×2×10-9（mm2））なる。
【００６５】
一方、顕微鏡１において第２スポットレーザ光を用いた場合、スポット照明の照射範囲の直径が約7.7μm、厚みが0.15μmとなるので、その体積は、約7fl（＝3.852×π×0.15×10-9（mm2））となる。先ほどの例と比較して、照射範囲の体積は大きくなっているが、数flレベルとなっているため、顕微鏡１により、FCSを用いて蛍光観察を行うことは十分可能である。
【００６６】
図４は、図１の顕微鏡１のスポット照明光学系の光源（レーザユニット１１、シングルモードファイバ１２、および、光源ユニット１３）を、光源ユニット１１１に置き換えた顕微鏡１０１の照明光学系の実施の形態を示している。なお、図中、図１と対応する部分については同じ符号を付してあり、処理が同じ部分に関しては、その説明は繰り返しになるので省略する。
【００６７】
光源ユニット１１１は、レーザボックス１２１、ビームエクスパンダ１２２、および、絞り１２３を含むように構成される。レーザボックス１２１から射出されたレーザ光（以下、スポットレーザ光と称する）は、ビームエクスパンダ１２２に入射し、その直径が拡大され、絞り１２３により所定のサイズの光束とされ、リレーレンズ１４に入射する。リレーレンズ１４以降の動作は、顕微鏡１と同様である。
【００６８】
レーザボックス１２１は、顕微鏡１のシングルモードファイバ１２の射出部１２Ｂと同様に、図示せぬ角度調整機構により、射出口を中心にして回転することができ、スポットレーザ光を射出する角度を調整することが可能である。
【００６９】
また、光源ユニット１１１自体も、顕微鏡１の光源ユニット１３と同様に、図示せぬ調整機構により、光軸に垂直な移動することができ、リレーレンズ１４に入射するスポットレーザ光の位置を調整することが可能である。
【００７０】
図５は、スポットレーザ光の角度を変える光学素子と、コンピュータ制御の回折拡散板を利用し、標本面に複数のスポットを形成可能な顕微鏡２０１の照明光学系の実施の形態を示している。なお、図中、図１と対応する部分については同じ符号を付してあり、処理が同じ部分に関しては、その説明は繰り返しになるので省略する。
【００７１】
図５の顕微鏡２０１は、レーザボックス２１１、シャッタ２１２、ステアラ制御部２１３、コンピュータ制御の回折発生素子（Computer controlled diffraction generator）２１４、絞り２１５、リレーレンズ２１６、リレーレンズ２１７、ダイクロイックミラー１７、対物レンズ１８、バリアフィルタ４１、および、第２対物レンズ４２を含むように構成される。また、ステアラ制御部２１３は、第１ステアラ２３１および第２ステアラ２３２を含むように構成される。第１ステアラ２３１および第２ステアラ２３２は、外部からの制御により、各々独立して、レーザボックス２１１から射出されるレーザ光（以下、スポットレーザ光と称する）に対する角度の調整、および、スポットレーザ光の光軸に垂直な方向の位置の調整を行うことが可能である。
【００７２】
レーザボックス２１１から出射されたスポットレーザ光は、シャッタ２１２を通り、第１ステアラ２３１および第２ステアラ２３２により反射され、回折発生素子２１４に入射する。上述したように、第１ステアラ２３１および第２ステアラ２３２は、スポットレーザ光に対する角度と位置の調整が可能であり、それぞれの角度と位置を調整することにより、回折発生素子２１４に入射するスポットレーザ光の方向と位置を自由に変えることが可能である。
【００７３】
なお、図５においては、レーザボックス２１１、シャッタ２１２、第１ステアラ２３１、および、第２ステアラ２３２が同一平面上に描かれているが、レーザボックス２１１からのスポットレーザ光の射出方向により、それぞれの位置関係は変化する。例えば、レーザボックス２１１が、紙面に対して垂直な方向（紙面の上から下に突き抜ける方向）にスポットレーザ光を射出し、第１ステアラ２３１が、紙面に向かうスポットレーザ光を第２ステアラ２３２の方向に反射し、第２ステアラ２３２が、図内のリレーレンズ２１６の方向にスポットレーザ光を反射するようにすることが考えられる。
【００７４】
ここで、図６を参照して、回折発生素子２１４によるスポット形成について説明する。なお、図６は、図５の顕微鏡２０１の照明光学系のうち、説明に関係ある部分のみを抽出したものである。また、説明の便宜上、図６では、回折発生素子２１４、リレーレンズ２１６、リレーレンズ２１７、ダイクロイックミラー１７、および、対物レンズ１８が同じ光軸上にくるよう図示しているが、実際には、各部品は図５に示されるような配置となる。
【００７５】
回折発生素子２１４が、視野面２１４Ａの円周Ｃ１の図内の最上部にスポットＳａ１を形成すると、スポットＳａ１を２次光源とするスポットレーザ光は、リレーレンズ２１６の光軸の中心を通過し、リレーレンズ２１７により、リレーレンズ２１７の光軸方向に進行方向が変化する。そして、スポットレーザ光は、ダイクロイックミラー１７により対物レンズ１８の光軸方向に反射され、対物レンズ１８の像側焦点面（瞳面）ＢＦの円周Ｃ２の図内の最下部にスポットＳａ２を形成する。同様に、回折発生素子２１４が、視野面２１４Ａ上の円周Ｃ１の図内の最下部にスポットＳｂ１を形成すると、対物レンズ１８の像側焦点面（瞳面）ＢＦの円周Ｃ２の図内の最上部にスポットＳｂ２が形成される。
【００７６】
従って、円周Ｃ２が対物レンズ１８の像側焦点面（瞳面）ＢＦのTIRF範囲内に入るように、円周Ｃ１の位置を設定し、第１ステアラ２３１および第２ステアラ２３２の角度と位置を調整し、円周Ｃ１上の任意の位置に回折発生素子２１４によりスポットを形成することにより、全反射のスポット照明が実現される。そして、第１ステアラおよび第２ステアラの角度と位置を調整し、円周Ｃ１上のスポットの位置を変えずに、そのスポットに入射するスポットレーザ光の入射角度を調整することにより、全反射照明の状態を維持しながら、標本２上のスポット照明の位置を移動させることができる。
【００７７】
また、スポットを高速に連続移動させることにより、任意の形状の照明を形成することが可能となる。さらに、シャッタ２１２のオンまたはオフの切替えと連動させることにより、複数ポイントのスポット照明を実現することができ、例えば、FCSを用いた蛍光観察において、標本の複数ポイントの観察が可能になる。
【００７８】
また、スポットレーザ光の角度および位置の調整を、ガルバノミラー、AOM（音響光学素子、Acousto-Optic Modulator）等の高速の素子により行うことにより、スポット移動を高速化できるだけでなく、複数ポイントにおけるスポット照明をほぼ同時に実行できるようになる。
【００７９】
さらに、スポット照明部をスキャンすることにより、全反射照明のコンフォーカルを実現することができる。そして、従来のコンフォーカルに比べ、より光軸方向（厚さ方向）の厚みが薄い照明を確実に実現することができる。例えば、従来は、倍率が100倍でNAが1.4の対物レンズを用いた場合に、照明の厚みは約0.4μmとなるが、本発明では、約0.15μmとすることができる。
【００８０】
なお、以上の説明では、レーザ光を用いる例を示したが、本発明の実施の形態においては、例えば、キセノンランプ、水銀ランプなどの他の種類の光源の光を、絞りなどにより光束の大きさが十分小さくなるように絞って用いるようにしてもよい。
【００８１】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】本発明を適用した顕微鏡の照明光学系の第１の実施の形態を示す図である。
【図２】スポット照明光学系の動作の詳細について説明するための図である。
【図３】スポット照明光学系の動作の詳細について説明するための図である。
【図４】本発明を適用した顕微鏡の照明光学系の第２の実施の形態を示す図である。
【図５】本発明を適用した顕微鏡の照明光学系の第３の実施の形態を示す図である。
【図６】スポット照明の位置の調整について説明するための図である。
【符号の説明】
【００８３】
１  顕微鏡，  ２  標本，  ３  スライドグラス，  ５  カバーガラス，  ６  オイル，  １１  レーザユニット，  １２  シングルモードファイバ，  １３  光源ユニット，  １４  リレーレンズ，  １６  フィールドレンズ，  １７  ダイクロイックミラー，  １８  対物レンズ，  ５１  レーザ光源，  ５４  レーザ光源，  ５５  シャッタ，  ６１  コリメータレンズ，  ６２  絞り，  １０１  顕微鏡，  １１１  光源ユニット，  １２１  レーザボックス，  １２２  ビームエクスパンダ，  １２３  絞り，  ２０１  顕微鏡，  ２１１  レーザボックス，  ２１２  シャッタ，  ２１３  ステアラ制御部，  ２１４  回折発生素子，  ２１５  絞り，  ２１６，２１７  リレーレンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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