(57)【要約】      （修正有）【課題】新規の花色を付与した花卉を得る手段を提供すること。【解決手段】ペチュニアのフェニルプロパノイド合成系遺伝子であって、花色の主成分の一つであるアントシアニンの合成に関わる遺伝子にコードされる新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするDNAを用いて新規の植物体を作成する方法。及び、花の色調を調節する方法として上記酵素の発現を調節するＲＮＡを植物から単離し、そのＲＮＡを発現するように遺伝子組み換えを行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号1に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の(c)〜(f)のいずれかのDNAからなる遺伝子。
(c) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(e) 配列番号2に示す塩基配列と80％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(f) 配列番号2に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA
【請求項３】
以下の(g)〜(i)のいずれかのDNAからなる遺伝子。
(g) 配列番号３に示す塩基配列からなるDNA
(h) 配列番号３に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、花弁での転写活性を有するDNA
(i) 配列番号３に示す塩基配列と80％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、花弁での特異的な転写活性を有するDNA
【請求項４】
請求項２に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを導入した植物細胞。
【請求項６】
請求項２に記載のDNAの全部若しくは一部を植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生することを含む、前記遺伝子の活性が促進された遺伝子組み換え植物体を作成する方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法によって得られた植物体。
【請求項８】
請求項２に記載の遺伝子の発現を抑制しうるRNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生することを含む、前記遺伝子の活性が抑制された遺伝子組み換え植物体を作成する方法。
【請求項９】
請求項２に記載の遺伝子の発現を抑制しうるRNAの導入が該RNAを植物体内で発現し得るベクターの導入により行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の方法によって得られた植物体。
【請求項１１】
花色が4クマロイルCoAリガーゼの活性を抑制していない植物体に比較して淡色となる請求項１０記載の植物体。
【請求項１２】
ゲノムDNAを植物から単離し、又はRNAを植物から単離し、逆転写によりcDNAを合成することにより、植物からDNAを得る工程、DNA増幅によりDNAから配列番号２、又は配列番号３に示される塩基配列を含有するDNA断片を増幅する工程、及び植物から得た前記DNA中の突然変異の存在を決定する工程を含む、植物体における4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの突然変異の存在の有無を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質とそれをコードするDNA、該DNAの活性発現を調節した植物体、例えば当該DNAの活性が発現又は抑制された植物体を作成する方法、並びに花弁で特異的に当該DNAを発現させる4クマロイルCoAリガーゼのプロモーターに関する。本発明の方法により、4クマロイルCoAリガーゼ活性を調節した（発現または抑制させた）植物体は、いままでにない花色を有する。例えば、4クマロイルCoAリガーゼ活性を抑制させた植物体では淡色の花色を有する。また、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質とそれをコードするDNAのプロモーターにより、効果的に異種遺伝子を特異的に花弁で発現させることができる。
【背景技術】
【０００２】
花卉の特性で最も重要な性質は花色である。花色は色素により決まり、そのなかでもアントシアニンはピンク・赤・青・紫の花色と深く関与し重要である。これまでに様々な花色を得るため、交雑や変異や遺伝子組換えによる育種が行われてきた。しかしピンクなどの淡色の花弁の生成メカニズムは殆どわかっておらず、淡色の花色の植物を人為的に得ることは容易ではなかった。また、花弁で特定の色素等を発現させることができれば、所望の花色の植物を得ることができる可能性があるが、異種遺伝子を特異的に花弁で発現させるための満足のゆくプロモーターは無かった。
【０００３】
淡色の花弁の生成メカニズムはカーネーションで調べられており、グルタチオンS転移酵素遺伝子に相同性をもつDcGST4遺伝子の機能が欠損することで、カーネーション独特のピンク色である淡色の花色が得られることが明らかになっている（非特許文献１及び２を参照）。一方、ペチュニアでは、その遺伝子に相当するAn9遺伝子が欠損することにより表現型としても白色花弁を生じることが報告されている（非特許文献３を参照）。この原因としてはペチュニアではAn9に相当するグルタチオンS転移酵素遺伝子がAn9の他に無いため、アントシアニンを液胞に運ぶことができないことが挙げられる。一方、カーネーションではDcGST4遺伝子とは別に、弱いグルタチオンS転移酵素活性を持つ未知の遺伝子が存在するため、極少量のアントシアニンを液胞に運ぶことができ、ちょうどよい淡色の花色を生み出していると考えられている（非特許文献２を参照）。ペチュニアでは文献上などでは、不完全なan2変異でも淡色になることが知られている。しかしAn2遺伝子による制御は温度に大きく依存し安定な淡色は得られない（非特許文献４を参照）。
【０００４】
全身ではなく花弁でのみ異種遺伝子を発現させる組織特異的なプロモーターについては、アントシアニン生合成経路の遺伝子のプロモーターが良く使われている。しかし、これらのプロモーターは転写因子An2の制御下にあり不安定である。また、遺伝背景が実験系統としてよく使われる系統「ミッチェル」などan2の遺伝背景を持つものでは全く発現が見られない（非特許文献５を参照）。アントシアニン生合成経路の遺伝子の中で比較的影響を受けにくいChsAのプロモーターでも、転写因子An1の影響を受けないと報告している文献があるものの（非特許文献５を参照）、同文献ではan1変異によって大きく抑制されると報告している（非特許文献５の図２を参照）。さらに植物中の糖含量により活性が変動することが知られている（非特許文献６を参照）。このようにアントシアニン生合成経路でCHSが関与する反応より下流の反応に関与する遺伝子のプロモーター中には、比較的発現能が高く花弁で安定に発現をもたらすプロモーターについての報告はない。
【０００５】
近年、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質とそれをコードするDNAが様々な植物から単離されている。該DNAはフェニルプロパノイド経路生合成の重要な基質である4クマロイルCoAを生成する酵素、すなわち4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAである。このDNAは遺伝子ファミリーを形成することが知られている。構造の系統樹から大きく分けてクラスI型とクラスII型に分けられ、前者はリグニンの合成に、後者はフラボノイドの合成に関係するとされるが、それらの基質特異性や生体での役割は不明な点が多い。4クマロイルCoAリガーゼが花弁の色素合成に直接関与することは示されていない。シロイヌナズナでも４つの4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAが見つかっており、At4CL1、2及び4がクラスI型とされ、At4CL3がクラスII型とされている（非特許文献７を参照）。しかし、報告によれば、クラスII型のAt4CL3はAtCL1やAtCL2との相同性は低く、さらに同じクラスI型のAtCL4はAtCL1やAtCL2との相同性はさらに低く、単純な相同性では比較が非常に難しい（非特許文献７の表２を参照）。さらに、4クマロイルCoAリガーゼは香気成分の合成にも関わっていることが指摘されている。ラズベリーでも３つの4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAが同定され、系統樹解析及びRi4CL3が花と実で発現が多いという事実からフラボノイドとラズベリーケトン（香気）の合成に関わっていることが予測されている（非特許文献８を参照）。しかし、これらの報告においては、遺伝子特異的なノックアウトや遺伝子サイレンシングを起こした植物を解析しなければ、これら遺伝子の正確な機能を決定することはできないと明記されている（非特許文献７及び８を参照）。
【０００６】
【非特許文献１】内田康裕ら, Plant Cell Physiol., , (2006)
【非特許文献２】梅基直行ら, 園芸学雑誌, 75別1, 182 (2006)
【非特許文献３】Alfenitoら, Plant Cell, 10, 1135-49 (1998)
【非特許文献４】Quattrocchioら, Plant Cell, 11, 1433-44 (1999)
【非特許文献５】Quattrocchioら, Plant Cell, 5, 1497-1512 (1993)
【非特許文献６】塚谷裕一ら, Plant Physiol., 97, 1414-1421 (1991)
【非特許文献７】HambergerとHahlbrock, Proc Natl Acad Sci U S A., 101, 2209-14 (2004)
【非特許文献８】KumarとEllis, Plant Mol Biol., 51, 327-40 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを提供し、さらに該DNAを利用し、花弁での遺伝子の発現を調節することにより従来得られなかった花色を有する新規花卉を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、種々の植物の中で花卉園芸上重要であるペチュニアの4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAに着目し、該DNAがコードされる酵素の機能について鋭意研究を重ねた。その結果、ペチュニアのフェニルプロパノイド合成系遺伝子で今だに明らかになっていない4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの遺伝子ファミリーの中で、花色のアントシアニン合成に関わる遺伝子を新たに同定することができた。本遺伝子を解析する過程で同遺伝子の発現を抑制することで、いままでにない淡色の花色の植物体を育成できることを見出した。また、同遺伝子のプロモーター配列を得ることで異種遺伝子の花弁での効果的な特異的発現が可能になることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
[１]  以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号1に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質
【００１０】
[２]  以下の(c)〜(f)のいずれかのDNAからなる遺伝子。
(c) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(e) 配列番号2に示す塩基配列と80％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(f) 配列番号2に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA
【００１１】
[３]  以下の(g)〜(i)のいずれかのDNAからなる遺伝子。
(g) 配列番号３に示す塩基配列からなるDNA
(h) 配列番号３に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、花弁での転写活性を有するDNA
(i) 配列番号3に示す塩基配列と80％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、花弁での特異的な転写活性を有するDNA
【００１２】
[４]  [２]の遺伝子を含有する組換えベクター。
[５]  [４]の組換えベクターを導入した植物細胞。
[６]  [２]のDNAの全部若しくは一部を植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生することを含む、前記遺伝子の活性が促進された遺伝子組み換え植物体を作成する方法。
[７]  [６]の方法によって得られた植物体。
[８]  [２]の遺伝子の発現を抑制しうるRNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生することを含む、前記遺伝子の活性が抑制された遺伝子組み換え植物体を作成する方法。
【００１３】
[９]  [２]の遺伝子の発現を抑制しうるRNAの導入が該RNAを植物体内で発現し得るベクターの導入により行われる、[８]の方法。
[１０]  [８]又は[９]のいずれかの方法によって得られた植物体。
[１１]  花色が4クマロイルCoAリガーゼの活性を抑制していない植物体に比較して淡色となる[１０]の植物体。
[１２]  ゲノムDNAを植物から単離し、又はRNAを植物から単離し、逆転写によりcDNAを合成することにより、植物からDNAを得る工程、DNA増幅によりDNAから配列番号２、又は配列番号３に示される塩基配列を含有するDNA断片を増幅する工程、及び植物から得た前記DNA中の突然変異の存在を決定する工程を含む、植物体における4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの突然変異の存在の有無を検出する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、新規の4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質とそれをコードするDNAを提供する。また、該DNAの活性発現を調節した植物体、例えば該DNAの活性が発現又は抑制された植物体を作成する方法、並びに花弁で特異的に該DNAを発現させる4クマロイルCoAリガーゼのプロモーターを提供する。本発明の方法により、4クマロイルCoAリガーゼ活性を調節した（発現又は抑制させた）植物体では、いままでにない花色を有する。4クマロイルCoAリガーゼ活性を抑制させた植物体では淡色の花色を有する。また、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質とそれをコードするDNAのプロモーターにより、異種遺伝子を特異的に花弁で発現させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
１．新規の4クマロイルCoAリガーゼ
本発明のタンパク質は、４クマル酸と補酵素Aを結合する活性を持つ酵素、すなわち4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質であり、そのECナンバーは6.2.1.12である。４クマロイルCoAリガーゼのアミノ酸配列は、配列番号１に示される。
【００１６】
本発明のタンパク質は、配列番号１に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、並びに配列番号1に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質である。
本発明のタンパク質には、後記のDNAがコードされるタンパク質も含まれる。
【００１７】
上記の「配列番号１に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から20個、好ましくは１から10個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個、あるいは１個又は２個程度を意味する。
【００１８】
アミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(タカラバイオ社）やMutant-G(タカラバイオ社）などを用いて、あるいは、タカラバイオ社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。
【００１９】
上記の「4クマロイルCoAリガーゼ活性」とは、４クマール酸と補酵素Aを結合する活性をいい、該活性が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
【００２０】
上記のタンパク質が、実際に4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するか否かは、該タンパク質をコードするDNAをNovagen社等が販売しているHisタグ付き大腸菌発現ベクターに組み込み、タンパク質を発現させるマニュアルに従い精製を行い活性測定することにより確認できる。例えば、HambergerとHahlbrock, Proc Natl Acad Sci U S A., 101, 2209-14 (2004)等の記載に従って、活性を測定することができる。
【００２１】
本発明の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAは、例えばペチュニア等の花弁からmRNAを抽出し、これを鋳型に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCRともいう)を行い、増幅することにより得ることができる。
【００２２】
２．新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
本発明のDNAは、４クマル酸と補酵素Aを結合する活性を持つ酵素、すなわち4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAである。また、本発明は前記DNAのプロモーターであり、該プロモーターは植物の花弁で異種遺伝子を特異的に発現させることができる。
【００２３】
4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの塩基配列は、配列番号２に示される。
【００２４】
また、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの塩基配列は、配列番号３に示される。
【００２５】
本発明の新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAには、例えば、配列番号２に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAも含まれる。
【００２６】
ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が、10mM〜300mM、好ましくは20〜100mMであり、温度が25℃〜70℃、好ましくは42℃〜55℃での条件をいう。
【００２７】
また、本発明の新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAには、例えば配列番号２に示す塩基配列と80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAも含まれる。ここでいう相同性の数値は、塩基配列比較用プログラム：例えばDNASIS-Mac v3.7（日立ソフトウェアエンジニアリング社）やGENETYX ver4.0（ゼネティックス社）を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。
【００２８】
さらに本発明の新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAには、その縮重異性体も含まれる。ここいう縮重異性体とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて同一のタンパク質をコードすることのできるDNAを意味する。例えば、配列番号２の塩基配列をもつDNAに対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドン、例えばAsnに対応するコドン（AAC）が、これと縮重関係にある例えばAATに変わったものを本発明では縮重異性体と呼ぶものとする。
【００２９】
また、上記の変異型遺伝子（変異型DNA）は、Kunkel法や Gapped duplex法などの公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(タカラバイオ社)やMutant-G(タカラバイオ社)など）を用いて、あるいは、タカラバイオ社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて作製することができる。上記突然変異誘発法については、遺伝子の塩基配列を参照すれば、Molecular Cloning [Sambrookら編集, 15, Site-directed Mutagenesis of Cloned DNA, 15.3〜15.113, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)]等の文献の記載に従って、当業者であれば格別の困難性なしに選択し実施することができる。また、当業者であれば、遺伝子の塩基配列を基にして、当該塩基配列から１以上（１又は数個以上）の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を人為的に行う技術（部位特異的突然変異誘発）については、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666 (1984); WO85/00817; Nature, 316, 601-605 (1985); Gene, 34, 315-323 (1985); Nucleic Acids Res., 13, 4431-4442 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409-6413 (1982); Science, 224, 1431-1433 (1984) 等に記載の技術に従って実施することができる。
【００３０】
３. 組換えベクター
本発明の組換えベクターは、上記２．のDNAを適当なベクターに導入することにより構築することができる。ここで、ベクターとしては、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる、pBI系、pPZP系、pSMA系のベクターなどが好適に用いられる。特にpBI系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌（Escherichia coli）及びアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるLB配列とRB配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のDNAを植物核DNAに組み込むことが可能である［EMBO Journal, 10(3), 697-704 (1991)］。一方、pUC系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、pUC18、pUC19、pUC9等が挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV））、インゲンマメモザイクウイルス（BGMV））、タバコモザイクウイルス（TMV）等の植物ウイルスベクター等も用いることができる。
【００３１】
ベクターに融合遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３２】
上記の融合遺伝子は、その遺伝子の機能が発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、融合遺伝子の上流、内部、あるいは下流に、プロモーター、イントロン、エンハンサー、翻訳終止コドン、ターミネーター、ポリA付加シグナル、5'-UTR配列、選抜マーカー遺伝子等の構成要素を含むことができる。これらは、公知のものを適宜組み合わせて用いることができる。
【００３３】
プロモーターとしては、目的のDNAが植物で発現されるように、全身発現型プロモーターや花弁で機能することが知られているプロモーターを用いればよい。例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（35SP）が挙げられる。また、アグロバクテリウムのイソペンテニルトランスフェラーゼ（ipt）遺伝子やノパリン合成酵素（nos）遺伝子のプロモーター、形質転換宿主の対象となる植物のゲノムから高発現遺伝子のプロモーターを取得し、それを利用したプロモーター[Genschikら, Gene, 148, 195-202 (1994)]、これらのプロモーターを複数個組み合わせたキメラ型プロモーターの中でプロモーター活性が著しく上昇したもの[Plant J., 7, 661-676 (1995)]でもよい。また、花弁で機能し、下流に連結した遺伝子を花弁で特異的に発現し得るプロモーターとしては、例えば、本発明の4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが挙げられる。4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの塩基配列を配列番号３に示す。4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターとして、他に配列番号３に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、花弁特異的プロモーター活性すなわち花弁での転写活性を有するDNA、配列番号３に示す塩基配列と80％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、花弁特異的プロモーター活性すなわち花弁での転写活性を有するDNAが含まれる。ここでストリンジェントな条件は、上記のとおりであり、また相同性％は上記のようにして算出することができる。さらに、これらの変異型遺伝子の取得方法についても上記のとおりである。
【００３４】
但し、植物で機能することが知られている限り、上記プロモーターに限定されるものではない。なお、これらのプロモーターは、該プロモーターを含むDNAの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ゲノムDNAを鋳型として、PCRによる増幅反応によって得ることができる。ここでPCRに用いることができる鋳型DNAとしては、カリフラワーモザイクウイルスのゲノムDNAが挙げられる。
【００３５】
また、必要に応じてプロモーター配列と遺伝子との間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ(Adh1)のイントロン[Genes ＆ Development, 1, 1183-1200 (1987)]を導入することができる。
【００３６】
エンハンサーとしては、ウイルス起源の翻訳エンハンサーや植物起源の翻訳エンハンサーを用いることができる。ウイルス起源の翻訳エンハンサーとしては、例えば、タバコモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルスRNA4、ブロモモザイクウイルスRNA3、ポテトウイルスＸ、タバコエッチウイルスなどの配列が挙げられる[Gallieら, Nuc. Acids Res., 15, 8693-8711 (1987)]。また、植物起源の翻訳エンハンサーとして、ダイズのβ−１，３グルカナーゼ（Glu）由来の配列 [石田功, 三沢典彦著, 講談社サイエンティフィク編, 細胞工学実験操作入門, 講談社, p.119 (1992)]、タバコのフェレドキシン結合性サブユニット（PsaDb）由来の配列 [Yamamotoら, J. Biol. Chem., 270, 12466-12470 (1995)] などが挙げられる。翻訳終止コドンとしてはTAA，TAG，TGAなどの配列が挙げられる[Molecular Cloning 前出等の記載]。
【００３７】
ターミネーターとしては、前記プロモーターにより転写された目的遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（nos）遺伝子のターミネーター（nosT）、オクトピン合成酵素(ocs)遺伝子のターミネーター、CaMV 35S RNA遺伝子のターミネーター等が挙げられる [Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 44, 985-994 (1993); Plant Genetic Transformation and Gene Expression; a laboratory manual, J. Draper et al. 編, Blackwell Scientific Publication (1988)]。
【００３８】
また、プロモーター中の転写エンハンサーとして、35S遺伝子のエンハンサー部分が同定され、それらを複数個並べて繋げることにより、活性を高めることが報告されており[Plant Cell, 1, 141-150 (1989)]、この部分を組換えベクターの一部として用いることも可能である。
【００３９】
選抜マーカー遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子などが挙げられる。また、選抜マーカー遺伝子は、上記のように目的遺伝子とともに同一のプラスミドに連結させて組換えベクターを調製してもよいが、あるいは、選抜マーカー遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターと、目的遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターとを別々に調製してもよい。別々に調製した場合は、各ベクターを宿主にコトランスフェクト（共導入）する。
【００４０】
本発明の新規４クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAのプロモーターを利用する場合は、花弁で発現させようとする遺伝子を機能し得るように連結して作成すればよい。例えば、該プロモーターと連結させ花弁で発現させる遺伝子として、公知のアントシアニン生合成遺伝子、カロテノイド生合成遺伝子、ベタシアニン生合成遺伝子、香気成分生合成遺伝子などが挙げられる。
【００４１】
これらの各種構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形で組換えベクターに組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
【００４２】
４．形質転換植物体
上記３．で調製した組換えベクターを用いて、対象植物の細胞を形質転換し、再生することで本発明の新規４クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを有する形質転換植物体を調製することができる。
【００４３】
形質転換植物体を調製する際には、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、その好ましい例として、例えば、生物学的方法としては、ウイルス、アグロバクテリウムのTiプラスミド、Riプラスミド等をベクターとして用いる方法が挙げられ、物理学的方法としては、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール、パーティクルガン、マイクロインジェクション[Plant Genetic Transformation and Gene Expression; a laboratory manual, J. Draper et al. 編, Blackwell Scientific Publication (1988)]、シリコンウイスカー[Euphytica, 85, 75-80 (1995); In Vitro Cell. Dev. Biol., 31, 101-104 (1995); Plant Science, 132, 31-43 (1998)]、リポソーム、バキューム インフィルトレーション[CR Acad. Sci. Paris, Life Science, 316 :1194(1993)]等の手段によって遺伝子を導入する方法等が挙げられる。当該導入方法については、当業者であれば適宜選択し、使用することができる。
【００４４】
一般に、植物に導入した遺伝子は、宿主植物のゲノム中に組み込まれるが、その場合、導入されるゲノム上での位置が異なることにより導入遺伝子の発現が異なるポジションイフェクトと呼ばれる現象が見られるので、導入遺伝子の確認が必要である。
【００４５】
遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動などの電気泳動を行い、臭化エチジウム溶液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。
【００４６】
本発明において形質転換に用いられる植物としては、ユリ、ラン、サトイモ科の観葉植物等の単子葉植物、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン、アスター、サルビア、リンドウ等の双子葉植物などの細胞が挙げられ、特に好ましい植物の種類としては、世界での生産流通消費数量が多い３大花卉であるキク、カーネーション、バラや近年栄養系でも世界的に生産流通消費量が飛躍的に伸びているペチュニアなどが挙げられる。
【００４７】
本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、例えば、生長点、苗条原基、分裂組織、葉片、茎片、根片、塊茎片、葉柄片、プロトプラスト、カルス、葯、花粉、花粉管、花柄片、花茎片、花弁、がく片等の細胞が挙げられる。
【００４８】
植物細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには既知の組織培養法により行えばよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、「植物細胞培養マニュアル」[山田康之編著、講談社サイエンティフィク、1984）等の文献を参照することができる。
【００４９】
具体的には、まず、形質転換された植物細胞を無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。
【００５０】
カルス誘導の培養は寒天等で固化した固体培地で行い、継代培養は例えば液体培地で行うと、それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。次に、上記の継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシンやサイトカイニン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、更に完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（例えばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞及び組織等）で貯蔵等を行ってもよい。
【００５１】
また、形質転換された植物細胞を前述の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することによりカルスを経ることなく、形質転換植物体を再生させることも可能である。
【００５２】
本発明の形質転換植物体は、形質転換処理を施した再分化当代である「T1世代」のほか、その植物の自殖や他殖の種子から得られた後代である「T2世代」、薬剤選抜あるいはサザン法等による解析によりトランスジェニックであることが判明した「T2世代」植物の花を自殖や他殖して得られる次世代（T3世代）などの後代植物やT1世代を栄養系で増殖維持した個体、さらにはT1世代等の後代から特定の形質が変化したような変異個体等、T1世代を元にした、あらゆる栽培や育種の手段により得られ得る世代や個体をも含むものとする。
【００５３】
５．  4クマロイルCoAリガーゼの活性の調節
本発明は、植物の4クマロイルCoAリガーゼの活性を調節する方法を含む。CoAリガーゼの調節は、4クマロイルCoAリガーゼの酵素活性の調節及び4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの発現の調節を含む。ここで、DNAの発現の調節とは、遺伝子の発現を促進すること、遺伝子の発現を抑制することを含む。好適には、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの発現を抑制する。
【００５４】
逆にDNAの発現を促進するためには、該DNAを発現ベクターを介して植物に導入すればよく、例えば、該DNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生すればよい。
【００５５】
遺伝子の発現の抑制は、RNAi法、アンチセンス法、及びコサプレッション法（Chuang et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97, 4985-90 (2000); Wesley et al., Plant J., 27, 581-90 (2001); Ecker et al., Proc Natl Acad Sci USA, 83, 5372-5376)により行なうことができる。いずれも比較的強力な、上記に挙げられる全身発現型プロモーターや花弁で機能することが知られているプロモーターを用い、それぞれ、発現を抑制しようとする遺伝子から転写されたRNAの全部若しくは一部の塩基配列に相補的な配列であるセンス鎖及び該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖を有するヘアピン状のRNAであってRNA干渉を引き起こすRNA、発現を抑制しようとする遺伝子から転写されたRNAの全部若しくは一部に相補的なRNAであるアンチセンスRNA、並びに発現を抑制しようとする遺伝子から転写されるRNAの全部若しくは一部と同一の配列を有するRNAであって、コサプレッションを引き起こすRNAを植物体で発現させる。例えば、これらRNAを発現するベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生すればよい。RNAを発現するベクターとしては、該RNAの塩基配列に相補的なDNAを含むベクターを用いればよい。例えば、上記のヘアピン状のRNAは、発現を抑制しようとする遺伝子の一部又は全部である標的配列と相同な配列からなるセンス鎖と該センス鎖の配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖からなるショートヘアピンRNA（shRNA）であり、２本鎖部分を含みセンス鎖とアンチセンス鎖がループ配列を介して連結しているステムループ構造を有する。２本鎖構造は、１本のRNA鎖中にセンス鎖とアンチセンス鎖を逆方向配列として含む自己相補的RNA鎖によって形成される。ショートヘアピンRNAは、細胞内または生体内でプロセッシングを受けてsiRNAが産生される。２本鎖部分は、RNA干渉によりノックダウンしようとする標的遺伝子の配列またはノンコーディング領域に含まれる特定の標的配列にハイブリダイズし得る配列を有するRNA鎖（センス鎖）および該配列に相補的なRNA鎖（アンチセンス鎖）が相補的に結合した構造を有する。shRNAの標的遺伝子の標的配列の塩基数は、限定されず、15〜500塩基の範囲で選択される。例えば、配列番号２で表される4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の第463番目から768番目までの塩基配列よりなる配列を標的配列とすることができる。shRNAは、化学合成や、プロモーターおよびRNAポリメラーゼを用いた転写系によりin vitroで合成することができる。化学合成による場合は、互いに相補的な配列を逆方向配列として有し自己相補性を有するRNA１本鎖を合成し、自己相補性部分で結合させればよい。また、プロモーターおよびRNAポリメラーゼを用いる場合は、１つのプロモーターの下流にセンス鎖とアンチセンス鎖をループで連結した構造を有するテンプレートDNAを合成しRNAポリメラーゼによりRNAを転写すればよい。ベクターにテンプレートDNAを導入し、該ベクターを植物に導入し、発現させることにより上記RNAが植物内で産生され、遺伝子の発現を抑制する。本発明において、RNA干渉を引き起こすRNAを産生するベクターをRNA干渉誘導ベクターと呼ぶことがある。
【００５６】
用いるプロモーターとしては上記のプロモーターが挙げられるが、植物で機能することが知られている限り、上記のプロモーターに限定されるものではない。なお、これらのプロモーターは、該プロモーターを含むDNAの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ゲノムDNAを鋳型として、PCRによる増幅反応によって得ることができる。ここで、PCRに用いることができる鋳型DNAとしては、カリフラワーモザイクウイルスのゲノムDNAが挙げられる。
【００５７】
本発明は、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを植物に導入することにより、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの発現が促進された形質転換植物体、並びに４クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの発現を抑制し得る該発現を抑制しようとするから転写されるRNAの全部若しくは一部の塩基配列に相補的な配列であるセンス鎖及び該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖を有するヘアピン状のRNAであってRNA干渉を引き起こすRNA、発現を抑制しようとする遺伝子から転写されるRNAの全部若しくは一部に相補的なRNAであるアンチセンスRNA、並びに発現を抑制しようとする遺伝子から転写されるRNAの全部若しくは一部と同一の配列を有するRNAであって、コサプレッションを引き起こすRNAを発現し得るベクターを植物に導入して形質転換体を作成する方法を包含する。
【００５８】
植物の4クマロイルCoAリガーゼの活性を抑制することにより、例えば、4クマロイルCoAリガーゼの活性を抑制していない植物体に比較して、花色が変化し淡色となった植物体を得ることができる。このような植物体として例えばピンク色の花弁を有するペチュニアが挙げられる。一方、植物の4クマロイルCoAリガーゼの活性を促進することにより、例えば、4クマロイルCoAリガーゼの活性を促進していない植物体に比較して、花色が変化し濃色となった植物体を得ることができる。
【００５９】
６. 遺伝子変異個体の選抜
本発明は、植物における4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの突然変異の存在有無を検出するための方法を含む。
【００６０】
この方法には、ゲノムDNAを植物から単離し、又はRNAを植物から単離し、逆転写によりcDNAを合成することにより、植物からDNAを得る工程、DNA増幅によりDNAから配列番号２、又は配列番号３に示される塩基配列を含有するDNA断片を増幅する工程、及び植物体から得た前記DNA中の突然変異の存在の有無を決定する工程が含まれる。DNAやRNAの抽出は公知の方法で行うことができ、例えば、市販のキット（例えばDNeasyやRNeasy(キアゲン社)など）を使用して行うことができる。cDNAの合成する方法も公知の方法で行うことができ、例えば市販のキット（例えばスーパースクリプト ファーストストランド システム（インビトロジェン社）など）を使用して行うことができる。DNA増幅技術の使用により遺伝子断片を増幅する方法としては、PCR法やLAMP法などの技術を使うことができる。これらは継続的なポリメラーゼ反応により特異的なDNA配列の増幅（つまり、コピー数を増やすこと）を達成するためにポリメラーゼを使用することを基にした、一群の技術である。この技術は、クローニングの代わりに使用することができ、核酸配列情報を有していれば公知の方法で行うことができる。DNAの増幅を行うために、増幅しようとするDNA中の配列に相補的なプライマーを設計する。次にそのプライマーを自動DNA合成により作成する。DNA増幅方法は、当技術分野で周知であり、本明細書中で与えられる教示及び指示に基づき、当業者であれば特に並外れた経験を必要とせずに本発明に従い行うことができる。いくつかのPCR法（ならびに関連技術）は、例えば、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、同第4,800,159号、同第4,965,188号、ならびに、Innisら編、PCR Protocols:A guide to method and applicationsで述べられている。
【００６１】
DNA中に突然変異の存在の有無を検出する工程では塩基配列の決定（アプライドバイオシステムズ社）やミスマッチペアの片側を切断する酵素を用いて突然変異体を検出するTILLING法（Till et al. 2003, Genome Res 13:524-530）など変異遺伝子と正常遺伝子の相同性を利用し検出する方法であってもよい。これらは該技術から得られた配列データを4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAのうちプロモーター部分に関する配列番号３で定義される塩基配列と比較することで行うことができる。
【００６２】
特に好ましい実施形態において、上記で定義した4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの突然変異の存在の有無の決定方法を、ペチュニアから得られた材料に適用する。
【００６３】
4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAに突然変異を有する植物は、花色が野生型に対して変化している可能性がある。例えば、淡色の花色を有している可能性がある。4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAに突然変異を有する植物を単離することにより、所望の花色の植物を得ることができる。
【００６４】
７．花色評価試験
形質転換植物体の花色は、色差計を使用してL*a*b*表色系(日本工業規格JIS Z 8729)の色度を測定することによって評価することができる。例えば、ペチュニアにおける花色評価試験は、ペチュニアが開花し、花弁が充分に開ききった状態において、系統ごとに３個体の花弁についてその色度を日本電色工業の簡易型分光色差計（NF333型）で３回測定し、平均値を出すことにより評価する。また、植物の花色の評価は、開花時の花の色を日本園芸植物標準色票：ＪＨＳカラーチャート（農林水産省編  財団法人日本色彩研究所）やRHSカラーチャート（英国王立園芸協会）と比較することによっても行うことができる。
【実施例】
【００６５】
以下に本発明の実施例を記載するが、何等本発明を限定するものではない。
（実施例１）ペチュニア花弁で発現する新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする候補cDNA断片の取得
ペチュニア実験系統V30（Vrijie大学Ronald Koes教授、宮崎大学藪谷勤教授より分譲）を定法に従って温室で栽培し開花させた。蕾の花弁からmRNAの抽出をRNeasy（キアゲン社）で行った。全cDNAの合成はスーパースクリプト ファーストストランド システム（インビトロジェン社）を用いて行った。
【００６６】
この合成した全cDNAに対し、通常、相同遺伝子を取得する際はアミノ酸配列の検討からdegeneratedプライマーを合成しcDNA断片を取得する。しかし、今回はこの方法では4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAに相同性のある断片は取得できなかった。そこで、ラズベリーのRi4CL3(Genbank accession AF239685)と、At4CL3と比較的相同性の高いダイズのGm4CL3(Genbank accession AF002258)とのDNA配列比較を行い,相同性のある部分を元にプライマー[U448: CATGTCTTCAAATCAAARTTACC（配列番号６）、U449: TGRAACAACGGMAGCACGCA（配列番号７）]を用いてPCR（条件：95℃５分、（95℃30秒、55℃30秒、72℃１分）を30回、72℃10分）を行った。PCR用酵素には以降の実験も同様にExTaq（タカラバイオ社）を用いた。増幅産物は１％アガロースゲルを用い100Vで20分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。予想される約0.7ｋベースの大きさに増幅している増幅産物をTOPOTAクローニングキットシークエンシング用(インビトロジェン社)を用いてクローニングした。さらにABI310（アプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定した。当該クローンpTOPO 4CL1は4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAに相同性のあるcDNA断片を含むことが確認できた。
【００６７】
（実施例２）新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする構造遺伝子の単離
実施例１のpTOPO 4CL1クローンの配列情報を元に、実施例１で取得した実験系統V30のmRNAに対しジーンレーサーキット（インビトロジェン社）を使用し全長のcDNA配列を決定した（配列番号２）。そのcDNA配列からコードされる新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を決定した。cDNA配列について、遺伝子を取得する元になったラズベリーのRi4CL3（配列番号４）とダイズのGm4CL3（配列番号５）の相同性をそれぞれ図１A〜C及び図２A〜Bに示す。部分的な相同性が認められるが、全体としてはそれぞれ68.8%と68.7%の相同性を示している。
【００６８】
（実施例３）新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の活性が抑制された形質転換体を作成するためのベクター構築
遺伝子の活性を形質転換によって抑制する方法としては、強力なプロモーターで駆動する構成を持つ逆方向の相補鎖遺伝子断片の発現（植物で一般的にRNAi法と呼ばれる）で行った[Chuangと Meyerowitz Proc Natl Acad Sci U S A., 97,  4985-90 (2000)；WesleyらPlant J., 27, 581-90 (2001)]。実施例２で取得した全長cDNAに対し、プライマー[U489: GAGCTCTAGACGTGATCCTGGAGAAAATGA（配列番号８）、U490: GGATCCATATGAGGAAGCACACATAGCACCA（配列番号９）]を用いてPCR（条件：95℃５分、（95℃30秒、55℃30秒、72℃１分）を30回、72℃10分）を行い、遺伝子断片（配列番号２の463番目から768番目の塩基）を取得した。バイナリーベクターpKT11（特開2001-161373号公報）を基本として、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、当該遺伝子断片（図３中、４CLで示す）を順方向、シロイヌナズナのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子（AT4g14210）の第２イントロン、当該遺伝子断片を逆方向、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターの順に連結を行い、植物形質転換用ベクターpKT180を作成した（コンストラクトを図３の中段に示す）。
【００６９】
（実施例４）形質転換植物体の作出と花色および花色色素の解析
実施例３で作製したベクターをエレクトロポレーション法(GelvinとSchilperoor編, Plant Molecular Biology Manual, C2, 1-32 (1994), Kluwer Academic Publishers)により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL0株(ATCC No. BAA-100)に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL0株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ−フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/lスクロ−ス、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5 mlを10,000rpm、３分間遠心して集菌後、カナマイシンを除くために１mlのLB培地で洗浄した。更に10,000rpm、３分間遠心して集菌後、1.5 mlのYEB培地に再懸濁し、感染用菌液とした。
【００７０】
ペチュニア品種「パープルウェーブ」（キリンアグリバイオ社）の無菌植物体から若い葉を採取し、アグロバクテリウム感染用の葉とした。この葉を１片が0.5〜1 cmになるようにメスで無菌的に切断し、上記のアグロバクテリウムの菌液上に葉の裏を上にして置き、５分間静かに振とうした後、滅菌済みの濾紙上に葉を置いて過剰のアグロバクテリウムを除いた。シャーレ内のMS培地（ベンジルアデニン1.0 ppm、インドール酪酸 0.1 ppm、及び寒天 0.8 %を含む、pH5.8）[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]上に、ワットマン No．1濾紙（Φ 7.0 cm）を置き、この濾紙に裏を上にして葉を置いた。シャーレをパラフィルムでシールし、培養は3日間25℃、16時間照明（光量子束密度32μE/m2ｓ）／８時間無照明の条件下で行った。ついでカナマイシン100 ppm、クラフォラン250 ppm、ベンジルアデニン0.3 ppm、ナフタレン酢酸0.1 ppm、を含む1/2 MS培地（pH5.8）上に移した。この間に葉片の周囲がカルス化し、シュート原基が生じた。更に培養後、伸張したシュートをクラフォラン 250 ppm及びカナマイシン 100 ppmを含み、植物生長調節物質を含まないMS培地（pH5.8）に置床した。発根したシュートをカナマイシン耐性の生長した植物体の中から外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、PCR（条件：95℃５分、（95℃30秒、55℃30秒、72℃１分）を30回、72℃10分）を行うことで検出し、該再分化植物体が形質転換植物体であることを確認した。ここで、カナマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーとして、TAAAGCACGAGGAAGCGGT（配列番号１０）、及びGCACAACAGACAATCGGCT（配列番号１１）を用いた。以上から、ベクターpKT180が導入されたペチュニアの形質転換植物体26個体を取得した。これらin vitro個体をペチュニア栽培用の培養土に馴化し、バイオハザード温室で定法に従い栽培し開花させた。
【００７１】
（実施例５）形質転換植物体の花色の解析
実施例４で得られた26個体のうち９個体において目視にて明らかに色素の発現が抑制された個体が得られ選抜した。図４に写真を示す。図４Aが非形質転換体、図４B〜D（それぞれ、#4, #26, #29）がpKT180形質転換体を示す。これらの個体は生長速度、形態、開花時期については非形質転換植物体との違いは認められなかった。花色の評価は、開花時の花の色をL*a*b*表色系(日本工業規格JIS Z 8729)における色度の測定によって行った。測定は、形質転換ペチュニアが開花し、花弁が充分に開ききった状態の全個体から各系統につき３つずつ花弁を採取し、その色度を日本電色工業の簡易型分光色差計（NF333型）で３回測定し、それらの平均値を出すことにより行った。これらのうち図４の写真で示した代表的な３個体（#4, #26, #29）と非形質転換植物体の数値を表１に示した。大きく花色が変化し淡色になっていることがわかる。なお表色測定は観察された色の表現型を記述するための代替的な手段であり、認識された色の指標としてみなされるべきものであり、得られうる潜在的な色を限定するものではない。
【００７２】
【表１】
2009153402.tif 000002
【００７３】
驚くべきことに、これらの結果で明らかなように当該4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの活性を抑制させても白色になる形質転換植物体は得られなかった。いままでの研究から4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAは、リグニンやフラボノイドというように最終産物によって遺伝子を使い分けていると考えられてきた（HambergerとHahlbrock, Proc Natl Acad Sci U S A., 101, 2209-14 (2004)；KumarとEllis, Plant Mol Biol., 51, 327-40 (2003)）。しかし今回の結果から、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの遺伝子ファミリーを形成しており、これらが一部の機能を重複していることを示している。今回取得した遺伝子は花色のアントシアニン合成系に大きく寄与しているが、他の未知である4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAが存在することにより、わずかにアントシアニンが合成されていることがわかった。さらに、この主要に働くDNAの活性を抑制することで、都合のいいことに魅力的な淡色のペチュニアを育成することができることがわかった。つまり、主にアントシアニン合成系で働いている4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを不活化させることや、そのDNAに変異があるものを選抜することによって、効果的かつ魅力のある淡色の花色をもつ新規花卉を育成できることがわかった。
【００７４】
（実施例６）形質転換植物体の花色色素の解析
実施例５で開花した非形質転換植物体と#26形質転換植物体の花弁が充分に開ききった状態の全個体から各系統につき３つずつ花弁を採取し、それぞれ50%(v/v)酢酸で抽出し、定法に従いInertsil ODS-2カラム（GLサイエンス社）を用いて高速液体クロマトグラフィーD-7000（日立ハイテク社）で解析した。総アントシアニン量は、吸光度530nmをkeracyanin（フナコシ社）を基準として定量した。非形質転換植物体では湿重量gあたり総アントシアニン量は3.2mgであったのに対し、#26形質転換植物体では0.21mgであり、非形質転換植物体の6.6%であった。
【００７５】
（実施例７）新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするプロモーター部分の単離とプロモーター活性検定用ベクター構築
実験系統V30の葉からDNeasy（キアゲン社）を使い、ゲノムDNAを取得した。これを制限酵素NdeI（タカラバイオ社）で切断後、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ社）で環状化を行った。この環状化したDNAを鋳型とし、（実施例２）で得られた構造遺伝子の配列情報から作成したプライマー[U721: CCTTCTGGGCTTCAACACTC(配列番号１２）、U455: TTTAATCACAGGGGTGGCTC(配列番号１３）]を用いてインバースPCR（条件：95℃５分、（95℃30秒、55℃30秒、72℃5分）を30回、72℃10分）を行った。約6kbのPCR産物が得られ、TOPOTAクローニングキットシークエンシング用を用いてクローニングしプロモーター遺伝子部分の塩基配列を決定した（配列番号３）。
【００７６】
この配列情報からプライマー[U731: AAGCTTGCATGTTCGTGCATATCAA（配列番号１４）、U741: TCTAGATTGGCCTATATCTTGGTTAT（配列番号１５）]を作成した。これ用いてプロモーター活性解析用のDNA断片を、ゲノムDNAに対しPCR（条件：95℃５分、（95℃30秒、55℃30秒、72℃5分）を30回、72℃10分）を行い取得した。増幅産物を同じくTOPOTAクローニングキットシークエンシング用を用いてクローニングし塩基配列を決定した。この遺伝子断片と、タバコのフェレドキシン結合性サブユニットの翻訳エンハンサーとトウゴマのカタラーゼ遺伝子のイントロンを含むGUS遺伝子（特許第3905607号公報）を組み合わせて実施例３と同様にしてカルフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーターのpKT19、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター（４CLP)活性検定用ベクターpKT228を作成した（pKT19及びpKT228のコンストラクトをそれぞれ図３の上段及び下段に示す）。
【００７７】
（実施例８）新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター活性
実施例７で作製したベクターpKT228と、対照としてpKT19を実施例３で作製したベクターをエレクトロポレーション法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL0株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL0株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地(pH7.2)にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5 mlを10,000rpm、３分間遠心して集菌後、カナマイシンを除くために１mlのLB培地で洗浄した。更に10,000rpm、３分間遠心して集菌後、1.5 mlのYEB培地に再懸濁し、感染用菌液とした。
【００７８】
ペチュニア品種「パープルウェーブ」（キリンアグリバイオ社）の無菌植物体から若い葉を3〜4mm角と、温室で栽培した蕾（花弁長3.5cmで若干着色を開始した状態）の花弁を5〜7mm角に切断し、アグロバクテリウム感染用の植物体とした。上記のアグロバクテリウムの菌液上に葉の裏を上にして置き、５分間静かに振とうした後、滅菌済みの濾紙上に葉を置いて過剰のアグロバクテリウムを除いた。シャーレ内のMS培地（ベンジルアデニン1.0 ppm、インドール酪酸 0.1 ppm、及び寒天 0.8 %を含む、pH5.8）[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]上に、ワットマン No．1濾紙（Φ 7.0 cm）を置き、この濾紙に裏を上にして葉を置いた。シャーレをパラフィルムでシールし、培養は3日間25℃、16時間照明（光量子束密度32μE/m2/ｓ）／８時間無照明の条件下で行った。
【００７９】
組織化学的なGUS活性の測定はCastle & Morris の方法(Plant Molecular Biology Manual, B5 (1994) 1-16 (Ed.)S.B.Gelvin&R.A.Schilperoort, Kluwer Academic Publishers) に従い行った。37℃で1晩インキュベートした後、70％ メタノールで脱色し、組織の青い染色を観察することによりGUS活性を測定した。その結果を図５に示す。図５AがpKT19を導入した葉、図５BがpKT228を導入した葉、図５CがpKT19を導入した花弁、図５DがpKT228を導入した花弁の結果である。葉では、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーターのpKT19では活性である青い活性染色部位が観察されるが、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAのプロモーターであるpKT228では殆ど活性は観察されなかった。一方、花弁ではpKT19でもpKT228でもほぼ同等でかつ強い活性染色が認められた。このことから、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAのプロモーターは全身発現でなく、花弁に特異性を持ちかつカリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーターと同レベルの活性を示すことがわかる。
【００８０】
（実施例９）新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAが変異した植物体のスクリーニング
ペチュニア系統06B（キリンアグリバイオ社）を量子ビーム（炭素イオン220MeV、5Gy照射）で変異処理を行った自殖種子後代の植物体（キリンアグリバイオ（株）岡村主研分譲）の10個体からそれぞれ葉を採取しDNeasyでゲノムＤＮＡを採取した。これをプライマー[U731: AAGCTTGCATGTTCGTGCATATCAA （配列番号１６）、U741: TCTAGATTGGCCTATATCTTGGTTAT  （配列番号１７）]でプロモーター領域を、プライマー[U489: GAGCTCTAGACGTGATCCTGGAGAAAATGA（配列番号１８）、U490: GGATCCATATGAGGAAGCACACATAGCACCA（配列番号１９）]を用いて構造遺伝子を、PCR（条件：95℃５分、（95℃30秒、55℃30秒、72℃５分）を30回、72℃10分）を行い、遺伝子領域を取得した。さらにTOPOTAクローニングキットシークエンシング用を用いてクローニングした。さらにABI310を用いて塩基配列を決定した。その結果、今回分譲を受けた10株の中に変異遺伝子を持つ系統は存在しないことがわかった。しかし、十分な変異処理を施した植物に対し、この操作を繰り返すことで変異遺伝子を持つ植物を獲得することは可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の新規4クマロイルCoAリガーゼ、及びこの遺伝子を用いる植物体作成方法は、花卉植物の花色の幅を広げることができ、観賞用植物の開発に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１Ａ】本発明の新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするcDNA配列とラズベリーのRi4CL3の相同性をDNA解析ソフトGENETYX（ver4.0、ゼネティックス社）で解析した結果を示す。
【図１Ｂ】図１Aの続きである。
【図１Ｃ】図１Bの続きである。
【図２Ａ】本発明の新規4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするcDNA配列とダイズのGm4CL3の相同性をDNA解析ソフトGENETYX（ver4.0、ゼネティックス社）で解析した結果を示す。
【図２Ｂ】図２Aの続きである。
【図２Ｃ】図２Bの続きである。
【図３】4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAの活性を抑制するためのベクター、4クマロイルCoAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAのプロモーター活性測定用ベクターの構造を示す図である。導入する遺伝子部分のT-DNAのライトボーダー(RB)、レフトボーダー(LB)の内部の構造、制限酵素部位を示してある。
【図４】pKT180形質転換体系統の花の写真である。
【図５】組織化学的なGUS活性の測定の結果を示す写真である。組織（葉、花弁）に対しベクター（pKT19、pKT228）を含むアグロバクテリウムを感染させ一過的GUS活性を測定した結果である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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