(57)【要約】 【課題】   生物界間接合を用いた真核細胞への遺伝子導入方法について、従来のからある遺伝子導入法より導入率が低いという問題があり、その生物界間接合をもちいた遺伝子導入率を向上することが本発明の課題である。【解決手段】   本発明によって真核細胞に対してAntimycin A、 OligomycinおよびErythromycinなどのミトコンドリア機能阻害剤を用いてミトコンドリア機能を操作することにより、生物界間結合による遺伝子導入効率を向上させる遺伝子導入法を提供するものである。【選択図】 図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌から真核細胞に遺伝子導入する方法において、
真核細胞のミトコンドリアの機能を操作することを特徴とする、
生物界間接合を用いた遺伝子導入方法。
【請求項２】
前記ミトコンドリアの機能の操作を、
ミトコンドリア機能阻害剤を使用して行なうものである、
請求項１記載の生物界間接合を用いた遺伝子導入方法。
【請求項３】
前記ミトコンドリア機能阻害剤が、
Antimycin A、 OligomycinおよびErythromycinである、
請求項２に記載の生物界間接合を用いた遺伝子導入方法。
【請求項４】
前記真核細胞が酵母である、
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の生物界間接合を用いた遺伝子導入方法 。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法により遺伝子を導入した真核細胞。 
【請求項６】
前記真核細胞が酵母である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法により遺伝子を導入した酵母。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法により遺伝子を導入することを目的とした遺伝子導入率増幅キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物界間接合を用いた簡便かつ効率的な真核細胞への遺伝子導入法およびその方法から得られた真核細胞、ならびにその遺伝子導入用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子導入とは、遺伝子の実験系を用いて目的遺伝子の宿主でない他生物にクローニングしたベクターを導入し、その遺伝子が有効な形質を発現できるように仕向けることであり、具体的な方法としては、リポフェクション法ないしはリポソームトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクターを用いた方法およびマイクロインジェクション法などがある。
【０００３】
リポフェクション法ないしはリポソームトランスフェクション法と呼ばれる方法は、細胞内に遺伝物質を導入するトランスフェクションの手法の一つであり、リポソームと呼ばれるリン脂質二重膜の小胞の内部に遺伝物質を封入して細胞膜を通過させるものである。具体的には、陽性荷電脂質などからなる脂質二重膜小胞（リポソーム）と導入するＤＮＡの電気的な相互作用により複合体を形成させ、貪食や膜融合により細胞に取り込ませる方法。必ずしもリポソーム内にＤＮＡを封入しない点がリポソーム法とは異なる。
【０００４】
リポフェクション法の長所としては、トランスフェクション効率が高い、オリゴヌクレオチド、高分子ＤＮＡ 、ｍＲＮＡ 、二本鎖ＲＮＡ の導入が可能である。 操作が簡単かつ短時間で終了するため、同時に多数のサンプル処理が可能。しかも、特別な装置・設備は不要である。そして、 他の方法にくらべ、細胞に対する毒性が少ないため、トランスフェクション後の細胞生存率が高く、一過性発現にも安定型発現にも用いることが可能である。最後に 幅広い細胞に適用できるなどの長所がある。しかし、短所としてトランスフェクションの細胞密度、ＤＮＡ 量、リポソーム量、培養時間、培地などの至適条件の検討が必要でありかつ至適条件の範囲が狭い。そして 一般に試薬が高価であるとの欠点がある。
【０００５】
つぎに、エレクトロポレーション法は、高電圧パルスを細胞に加えることにより一過性に脂質二重層の細胞膜構造を不安定化し、ＤＮＡを取り込ませる方法である。トランスフェクションの効率は電圧・電気パルスの長さ・温度・細胞およびＤＮＡの濃度・バッファー組成の条件により左右されるというものである。本法の長所としては、操作が簡単で、遺伝子導入効率が高いというものであるが、高価な機械を必要とすること、１回の電気パルスで１検体の遺伝子導入しかできない為に多検体の処理に手間がかかることなどの欠点が存在する。
【０００６】
ウイルスベクターを用いた方法とはウイルスの細胞への感染方法を利用して、細胞の膜融合により吸着したウイルスベクターのエンベロープが細胞の細胞膜と融合し、ウイルス内部のベクターが細胞内に送り込まれ遺伝子導入する方法である。
【０００７】
さらに、マイクロインジェクション法というものがあるが、１個の細胞に微細ガラス注入針を通じて試料を導入する方法。原理は簡単ながら、高度な技術を要する。細胞に与えるダメージを最小限に押さえるために可能な限り細い針を用い、きわめて短時間のうちに必要量を注入する必要がある。本法の長所としては、特定の細胞だけに導入でき、核と細胞質へ別々に導入できる。また、溶液であれば分子の種類（核酸・タンパク等）や大きさに限りがなく、導入効率が高く試料液が極めて少量との長所がある。しかし、特別な装置や技術が必要であり、浮遊細胞への適用が困難である。そして対象とする細胞数に限りがあるとの欠点が存在する。
【０００８】
しかしながら、以上の遺伝子導入の方法のすべてに於いては、通常の大腸菌等からプラスミドＤＮＡを抽出・調整しなければならず、操作ステップが多く時間とコストが余分にかかるという問題がある。
【０００９】
そこで、大腸菌等からプラスミドＤＮＡを抽出・調整する必要がなく、余分な時間とコストを必要としない遺伝子導入法として生物界間接合法がある。 
【００１０】
生物界間接合は1989年にHeinenmannとSpragueにより大腸菌と出芽酵母を用いて最初に報告された現象である
【非特許文献１】。この現象は、本来バクテリア間の遺伝子伝達システムであるプラスミドの移行システムが、バクテリアから真核生物へも低頻度ながらもプラスミドが伝達し得るというものである。80年代末から90年代初頭にかけてこの現象を真核生物への遺伝子導入法へ応用するための研究が行われたが、遺伝子導入効率を実用レベルまで上げる事が出来ず、その後バクテリアの遺伝子伝達システムを応用した遺伝子導入法は、アグロバクテリアのＴ−ＤＮＡ伝達システムを用いるものに取って代わられた。近年Watersにより大腸菌から動物培養細胞への生物界間接合による遺伝子導入の成功が報告され
【非特許文献２】、その潜在的な応用の可能性の高さが示されたものの、ほぼ休眠技術となっている。
【００１１】
そして、これまでの生物界間接合の研究は主に遺伝子伝達用ベクターの改変に限られており、実用レベルの遺伝子導入効率獲得には到っていない。
【非特許文献１】Heinemann, J. A. and Sprague G. F. Jr. Bacterial conjugative plasmids mobilize DNA transfer between bacteria and yeast. Nature 340, 205-209 (1989).
【非特許文献２】Waters, V. L. Conjugation between bacterial and mammalian cells. Nat. Genet., 29, 375-376 (2001).
【非特許文献３】Kawai, S., Pham, T. A., Nguyen, H. T., Nankai, H., Utsumi, T., Fukuda, Y. and Murata, K. Molecular insights on DNA delivery into Saccharomycescerevisiae. Biochem. Biophys. Res. Commun. 317,100-107 (2004).
【非特許文献４】Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. and Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriol. 153, 163-168 (1983).
【非特許文献５】Nishikawa, M., Suzuki, K. and Yoshida, K. DNA integration into recipient yeast chromosomes by trans-kingdom conjugation between Escherichia coliand Saccharomycescerevisiae. Curr. Genet., 21,101-108 (1992).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、生物界間接合による遺伝子導入率が従来の遺伝子導入法より低いことが問題であり、その遺伝子導入率を向上することが課題である。さらに、生物界間接合を実用的な遺伝子導入法として確立するためには、遺伝子導入効率を高めなければならない。
【００１３】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、生物界間接合を実用的な遺伝子導入法として真核細胞への遺伝子導入効率を増幅させる方法及びその方法から得られた真核細胞、ならびにその遺伝子導入用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
受容側真核細胞が接合を拒む機能についてはこれまで検討されておらず、その接合を拒む為に機能する遺伝子を探索し、それらを破壊、もしくはそれら遺伝子の発現もしくは機能を薬剤等により阻害する事で遺伝子導入効率を高めるのではないかと考えた。
【００１５】
そこで本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、真核細胞に対してミトコンドリア機能を操作することにより生物界間結合による遺伝子導入効率を向上することができることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の産業場有用な発明を包含する。
【００１６】
（１）大腸菌から真核細胞に遺伝子導入する方法において、真核細胞のミトコンドリアの機能を操作することを特徴とする、生物界間接合を用いた遺伝子導入方法。
【００１７】
（２）（１）記載のミトコンドリアの機能の操作を、ミトコンドリア機能阻害剤を使用して行なうものである、請求項１記載の生物界間接合を用いた遺伝子導入方法。
【００１８】
（３）（２）記載のミトコンドリア機能阻害剤が、Antimycin A、 OligomycinおよびErythromycinである、請求項２に記載の生物界間接合を用いた遺伝子導入方法。
【００１９】
（４）（１）記載の真核細胞が酵母である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の生物界間接合を用いた遺伝子導入方法 。
【００２０】
（５）（１）乃至（４）のいずれか１項に記載の方法により遺伝子を導入した真核細胞。 
【００２１】
（６）（５）記載の真核細胞が酵母である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法により遺伝子を導入した酵母。
【００２２】
（７）（１）乃至（４）のいずれか１項に記載の方法により遺伝子を導入することを目的とした遺伝子導入率増幅キット。
【発明の効果】
【００２３】
本発明にかかる、遺伝子導入率が向上する方法は、以上のように生物界間接合による遺伝子導入率が向上する方法であって、真核細胞のミトコンドリアの機能を操作することを特徴とする。
【００２４】
したがって、真核細胞のミトコンドリア機能を操作することにより、生物界間結合の遺伝子導入率が向上し、通常用いられる大腸菌のステップの少なくすることが可能となる。
【００２５】
さらに具体的にミトコンドリア機能を操作することとは、ミトコンドリア機能阻害剤を用いて真核細胞のミトコンドリアの機能を阻害することにより、生物界間接合による遺伝子導入率が上昇するという効果を奏する。
つまり、本発明の方法を用いる事により、大腸菌という、生物工学で誰もが有用遺伝子のクローニングに用いる生物材料から、酵母等の真核生物に簡便かつ高効率に有用遺伝子を直接導入する事が可能になり、生物界間接合を実用的な遺伝子導入法として真核細胞への遺伝子導入効率を増幅するという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれら説明に拘束されることはなく、以下の事例以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。また、本明細書中に記載された公知文献のすべてが、本明細書中において参考として援用される。
【００２７】
＜１.本発明の用語の定義＞
本発明に於いて、真核細胞とは、細胞内に細胞核と呼ばれる構造を持ち、細胞のそれ以外の部分からは膜（核膜）で区切られている細胞をいい、酵母、菌類、植物および動物細胞を指す。
【００２８】
そして、本発明に於いて、遺伝子導入とは目的遺伝子の宿主でない他生物にクローニングしたベクターを導入し、その遺伝子が有効な形質を発現できるように仕向けることであり、また、遺伝子導入をする方法とは、目的遺伝子を宿主でない他生物にクローニングしたベクターを導入し、その遺伝子を有効な形質を出現できるほうに仕向ける方法をいう。
【００２９】
また、本発明に於いて、ミトコンドリアとは、ほとんど全ての真核生物の細胞に含まれる細胞小器官であり、脂肪酸のβ酸化や、電子伝達系による酸化的リン酸化によるエネルギーの生産を行う器官である。
【００３０】
そして、ミトコンドリアの機能を操作するとは、ミトコンドリア機能阻害剤による機能阻害、嫌気条件での培養、ミトコンドリアゲノムへの突然変異の導入、ミトコンドリアタンパク質遺伝子への突然変異の導入、ミトコンドリアタンパク質遺伝子の発現を誘導する転写調節因子遺伝子の破壊などを指す。
【００３１】
さらに、そのミトコンドリアのその細胞器官の機能を阻害する、ミトコンドリア機能阻害剤には、Antimycin A、 Oligomycin、Erythromycin、Chloramphenicol、Mitomycin C、Rutamycin、Ethidiumbromide、5-iododeoxyuridine、Trichosporin-B類、Enniatin A、Valinomycin、Gramicidin、Nigericin、Dianemycin、Mikamycinなどがある。
【００３２】
本発明に於いて、生物界間接合とは原核生物である大腸菌と真核生物が生物界を越えて接合し遺伝子の伝達を行うという興味深い現象のことである。
【００３３】
そして本発明の技術を用いることにより、従来からあるリポフェクション法ないしはリポソームトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクターを用いた方法およびマイクロインジェクション法などの遺伝子導入法に比べてプラスミドDNAの調製というステップを余分に必要とせず時間とコストをかけることなく、真核細胞に対して大腸菌からダイレクトに遺伝子を導入することができるようになる。
【００３４】
すなわち、大腸菌と真核細胞のサスペンジョンを混合するのみで簡便に遺伝子を導入することが可能となる。
【００３５】
さらに、遺伝子導入率増幅キットとは、本発明の生物界間接合を用いた遺伝子導入法を含むことを特徴としており、本発明のキットは遺伝子導入効率を向上させる生物界間接合による遺伝子導入法を実施しうるものであれば良く、その他の構成を含んでいてもよい。たとえば、真核細胞のミトコンドリア機能阻害剤などの生物界間接合抑制遺伝子の機能阻害剤を含む緩衝液、嫌気培養用の酸素吸収剤を同封したパック、RNAiやアンチセンスRNAによるミトコンドリア機能遺伝子などの生物界間接合を抑制する遺伝子の発現抑制などがある。
【００３６】
＜２.本発明の生物界間接合効率上昇株の選択方法＞
本発明に於いて生物界間接合反応は、pAY205などInc Q型プラスミドのoriT配列やmob遺伝子群を含むドナープラスミド、もしくはInc P型プラスミドのoriT配列を持つドナープラスミドを、例えばS17-1 l pir株などtra遺伝子群をゲノム中に含む大腸菌、もしくはpRH210, pRH220などtra遺伝子群を含むヘルパープラスミドを保持する大腸菌に保持させて前培養する。
【００３７】
そして、その前培養した大腸菌と、各々の出芽酵母ノックアウト変異株についTNB緩衝液中で反応を行う。
【００３８】
α型出芽酵母BY4742株またはBY4739株から作製された、非必須遺伝子ノックアウト変異株キット (Yeast Deletion Clones (Mat-Alpha Complete Set), Invitrogen社製)、もしくはa型出芽酵母BY4741株またはBY4730株から作製された、非必須遺伝子ノックアウト変異株キット (Yeast Deletion Clones (Mat-a Complete Set), Invitrogen社製)を用いて、生物界間接合阻害遺伝子のゲノム網羅的スクリーニングを行う。
【００３９】
本発明の生物界間接合効率上昇株の選択では３回のスクリーニングを行う。
【００４０】
1回目のスクリーニングでは、生物界間接合反応後、反応液を選抜培地(ＳＣ−Ｕｒａ)プレートにスポットし、ｐＡＹ２０５の移行によりＵＲＡ３遺伝子が相補されてウラシル合成能が回復した酵母のコロニー数を計測し、コントロールと比較して４倍以上のコロニー数の上昇が観察された変異株を得る。
【００４１】
次に、２回目のスクリーニングでは、1回目のスクリーニングで得られた変異株について更に２回の接合反応を行い、合計３回の接合反応の平均値で出芽酵母株の８倍以上のコロニー数の上昇が観察された変異株を得た。
【００４２】
３回目のスクリーニングでは、２回目のスクリーニングで得られた変異株について更に３回の生物界間接合反応を行い、接合反応液の半分の量を選抜培地(ＳＣ−Ｕｒａ)プレート、５０００分の１量に相当する希釈液を大腸菌殺菌用に抗生物質を加えた完全培地 (YPD+Chloramphenicol) プレートにスポットし、transconjugantとrecipient の細胞数を計測して生物界間接合効率を決定した。
【００４３】
２回目のスクリーニング、３回目のスクリーニングの相方またはいずれかにおいて、コントロールの出芽酵母に比べ16倍以上の上昇が観察される生物界間接合効率上昇変異株が得られる。
【００４４】
1 transconjugant/ 500 recipient yeast cells以上の高い効率を示す変異株を得ることにも成功した（図２）。
【００４５】
コントロールの出芽酵母との２倍体作製による相補実験では、全ての変異が相補され、野生型の接合効率に戻るとの結果を得た。すなわち、上記の結果より、生物界間接合阻害遺伝子の破壊株は、生物界間接合を用いた遺伝子導入法で有用な受容 (recipient) 株となる事が証明された。
【００４６】
＜３.本発明のミトコンドリア機能阻害を用いた生物界間接合効率上昇の方法＞
２の本発明の生物界間接合効率上昇株の選択方法により、選択された生物界間接合効率上昇変異株の中には、核コードのミトコンドリアタンパク質遺伝子欠損株が含まれていた。
【００４７】
そこで、ミトコンドリアの機能を操作するため、ミトコンドリア機能阻害剤のAntimycin A, Oligomycin, Erythromycin、Chloramphenicol、Mitomycin C、Rutamycin、Ethidiumbromide、5-iododeoxyuridine、Trichosporin-B類、Enniatin A、Valinomycin、Gramicidin、Nigericin、Dianemycin、Mikamycinを添加する（。
【００４８】
出芽酵母である、α型 (BY4742), a型 (BY4741)相方の酵母の生物界間接合効率の上昇が観察された（図３）。
【００４９】
Antimycin Aについては、YPDプレート上で28℃にて２日間にわたり前培養を行った。出芽酵母を好ましくは2.5 μＭ以上40 μＭ以下、より好ましくは5 μＭ以上20 μＭ以下、さらに好ましくは7.5 μＭ以上15 μＭ以下の範囲でAntimycin Aを添加したYPDプレートへ植えつぎ、更に28℃にて１日間、培養を行った。2.5 μＭ以下はミトコンドリアの機能阻害が不十分との理由で好ましくなく、また40 μＭ以上は薬剤による細胞毒性の影響が強くなるとの理由から好ましくない。そして、Antimycin Aを添加したYPDプレートへ植えつぎ、更に28℃にて１日間、培養を行った。
【００５０】
Antimycin A処理後の酵母を用いて生物界間接合反応を行い、３回目のスクリーニングと同様の手法で生物界間接合効率を求めた。その結果、設定した処理濃度において、コントロールと比較して生物界間接合効率上昇することができる。
【００５１】
Oligomycinについては、YPDプレート上で28℃にて２日間にわたり前培養を行った。出芽酵母を好ましくは2 mg/ml以上32 mg/ml以下、より好ましくは4 mg/ml以上16 mg/ml以下、さらに好ましくは6 mg/ml以上12 mg/ml以下の範囲でOligomycinを添加したYPDプレートへ植えつぎ、更に28℃にて２日間、培養を行った。2 mg/ml以下はミトコンドリアの機能阻害が不十分との理由で好ましくなく、また32 mg/ml以上は薬剤による細胞毒性の影響が強くなるとの理由から好ましくない。そして、Oligomycinを添加したYPDプレートへ植えつぎ、更に28℃にて2日間、培養を行った。
【００５２】
Oligomycin処理後の酵母を用いて生物界間接合反応を行い、3rdスクリーニングと同様の手法で生物界間接合効率を求めた。その結果、設定した処理濃度においてコントロールと比較して出芽酵母の生物界間接合効率上昇を観察した。
【００５３】
Erythromycinについては、YPDプレート上で28℃にて２日間にわたり前培養を行った。出芽酵母を好ましくは0.2 mg/ml以上12.8 mg/ml以下、より好ましくは0.4 mg/ml以上6.4 mg/ml以下、さらに好ましくは0.8 mg/ml以上3.2 mg/ml以下の範囲でErythromycinを添加したYPDプレートへ植えつぎ、更に28℃にて２日間、培養を行った。0.2 mg/ml以下はミトコンドリアの機能阻害が不十分との理由で好ましくなく、また12.8 mg/ml以上は薬剤による細胞毒性の影響が強くなるとの理由から好ましくない。そして、Erythromycinを添加したYPDプレートへ植えつぎ、更に28℃にて2日間、培養を行った。
【００５４】
Erythromycin処理後の酵母を用いて生物界間接合反応を行い、3rdスクリーニングと同様の手法で生物界間接合効率を求めた。その結果、設定した処理濃度においてコントロールと比較して出芽酵母の生物界間接合効率上昇を観察した。
【００５５】
以上のように、生物界間接合阻害遺伝子に対する機能阻害剤の添加は、生物界間接合を用いた遺伝子導入において有用な遺伝子導入効率上昇法となる事が証明された。
【００５６】
＜４.従来の遺伝子導入に対しての本発明の遺伝子導入効率＞
最も簡便な遺伝子導入法である簡便PEG法での導入効率は、５０００株の変異体の中から、１０２transformants / μg DNA / １０７ recipient yeast cellsで導入できる変異株が見出されている
【非特許文献３】。当然この系は大腸菌からのDNA抽出が必要である。
【００５７】
これに対し本発明では、もっとも接合効率の高い変異株では、上記の効率基準に換算すると２ｘ１０４transformants / ３．７５ｘ１０７ donor E. colicells/ １０７ recipient yeast cellsと換算でき、すぐれているのは明らかである。
【００５８】
一方、簡便PEG法よりは操作が煩雑であるものの、比較的遺伝子導入効率が高く最も汎用されている酢酸リチウム法では、４ｘ１０２ transformants / μg DNA / １０６ recipient yeast cells程度の導入効率である
【非特許文献４】。この系も大腸菌からのDNA抽出が必要である。
【００５９】
これに対し本発明にあるミトコンドリア機能阻害剤で前処理した酵母を生物界間接合を用いることにより、生物界間接合効率上昇変異株でない酵母でも従来の方法より遺伝子導入効率は高くなる。それは、大腸菌で通常高コピープラスミド（一般的に使用されるもの）は２ｍｌ程度の培養液から２ μｇほどのプラスミドＤＮＡが得られる。この培養液の中には少なくとも２．５ｘ１０8の大腸菌細胞が含まれている。ここから、生物界間接合による遺伝子導入で通常用いる３．７５ｘ１０６ 大腸菌細胞から抽出できるプラスミドＤＮＡ量は０．０３ μg程度と換算される。そこで、μg ＤＮＡあたりで換算すると，我々の生物界間接合効率上昇変異株は約６．７ｘ１０4 transformants / μg DNA / ３．３ｘ１０７ recipient yeast cells程度という事になり、非変異株においてもErythromycinでもっとも条件よく処理すると、７ｘ１０３ transformants / μg DNA / ３．３ｘ１０７ recipient yeast cells程度という事になる。
【００６０】
すなわち、本発明を用いることにより簡便性、多検体操作性および形質転換効率を鼎立しており総合的に従来の遺伝子導入方法より勝っていることが示される。
【実施例】
【００６１】
本発明について、実施例および図１〜図５に基づいてより具体的に説明するが
、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正および改変を行うことができる。
【００６２】
＜本発明の生物界間接合効率上昇株の選択方法＞
大腸菌-酵母間の生物界間接合 
【非特許文献５】をモデル系として解析を行った（図１）。
【００６３】
生物界間接合反応は、３．７５ｘ１０６cellの、ヘルパープラスミドｐＲＨ２１０とドナープラスミドｐＡＹ２０５を保持する大腸菌HB101を96穴マイクロタイタープレートに分注し、ＹＰＤプレートで前培養（28℃，２日間）した各々の出芽酵母ノックアウト変異株5×105以上10×105以下 cellと混合し、２５ μｌのTNB緩衝液 （８０ ｍＭ Tris-HCl （ｐＨ ７．５）, ０．０５％ NaCl） 中で28℃，１時間おこなった。
【００６４】
α型出芽酵母ＢＹ４７４２株から作製された、４８２８株から成る非必須遺伝子ノックアウト変異株キット (Yeast Deletion Clones (Mat-Alpha Complete Set), Invitrogen社製) を用いて、以下の手順で生物界間接合阻害遺伝子のゲノム網羅的スクリーニングを行った。
【００６５】
１回目のスクリーニングでは、生物界間接合反応後、反応液を選抜培地（ＳＣ−Ｕｒａ）プレートにスポットし、ｐＡＹ２０５の移行によりＵＲＡ３遺伝子が相補されてウラシル合成能が回復した酵母のコロニー数を計測した。コントロールのＢＹ４７４２と比較し、４倍以上のコロニー数の上昇が観察された変異株341株を得た。
【００６６】
２回目のスクリーニングでは、１回目のスクリーニングで得られた変異株について更に２回の接合反応を行い、合計３回の接合反応の平均値でＢＹ４７４２の８倍以上のコロニー数の上昇が観察された変異株９９株を得た。
【００６７】
３回目のスクリーニングでは、２回目のスクリーニングで得られた変異株について更に３回の生物界間接合反応を行い、接合反応液の１/２量を選抜培地（ＳＣ-Ｕｒａ）プレート、１／５０００量に相当する希釈液を大腸菌殺菌用に抗生物質を加えた完全培地 (YPD+Chloramphenicol) プレートにスポットし、transconjugantとrecipient の細胞数を計測して生物界間接合効率を決定した。２回目のスクリーニング、３回目のスクリーニングの相方またはいずれかにおいて、コントロールのＢＹ４７４２株に比べ１６倍以上の上昇が観察される２２株（２２遺伝子）の生物界間接合効率上昇変異株が得られ、１ transconjugant / 500 recipient yeast cells以上の高い効率を示す変異株を得ることにも成功した（図２）。
【００６８】
a型酵母(ＢＹ４７４１)との２倍体作製による相補実験では、２２株全ての変異が相補され、野生型の接合効率に戻った。
【００６９】
上記の結果より、生物界間接合阻害遺伝子の破壊株は、生物界間接合を用いた遺伝子導入法で有用な受容 (recipient) 株となる事が証明された。
【００７０】
＜本発明のミトコンドリア機能阻害を用いた生物界間接合効率上昇の方法＞
22株の生物界間接合効率上昇変異株の中には8株の核コードのミトコンドリアタンパク質遺伝子欠損株が含まれていた為、ミトコンドリア機能阻害剤のAntimycin A, Oligomycin, Erythromycinを添加したところ、α型 (BY4742), a型 (BY4741), の両酵母の生物界間接合効率の上昇が観察された。以下にその詳細を記す。
【００７１】
Antimycin Aについては、YPDプレート上で28℃にて２日間にわたり前培養を行ったBY4742, BY4741株を、40 μM以下の範囲でAntimycin Aを添加したYPDプレートへ植えつぎ、更に28℃にて１日間、培養を行った。
【００７２】
Antimycin A処理後の酵母を用いて生物界間接合反応を行い、3rdスクリーニングと同様の手法で生物界間接合効率を求めた。その結果、図３に示すように、10 μMの処理濃度において、0 mg/mlのものと比較してBY4742では4.9倍， BY4741では3.9倍の生物界間接合効率上昇を観察した。
【００７３】
Oligomycinについては、YPDプレート上で28℃にて２日間にわたり前培養を行ったBY4742, BY4741株を、8 μg/ml以下の範囲でOligomycinを添加したYPDプレートへ植えつぎ、更に28℃にて2日間、培養を行った。
【００７４】
Oligomycin処理後の酵母を用いて生物界間接合反応を行い、3rdスクリーニングと同様の手法で生物界間接合効率を求めた。その結果、図４に示すように、8 μg/mlの処理濃度において0 mg/mlのものと比較してBY4742では4.7倍， BY4741では2.8倍の生物界間接合効率上昇を観察した。
【００７５】
Erythromycinについては、YPDプレート上で28℃にて２日間にわたり前培養を行ったBY4742, BY4741株を、6.4 mg/ml以下の範囲でErythromycinを添加したYPDプレートへ植えつぎ、更に28℃にて2日間、培養を行った。
【００７６】
Erythromycin処理後の酵母を用いて生物界間接合反応を行い、3rdスクリーニングと同様の手法で生物界間接合効率を求めた。その結果、図５に示すように、1.6 mg/mlの処理濃度において0 mg/mlのものと比較してBY4742では6.8倍， BY4741では6.6倍の生物界間接合効率上昇を観察した。
【００７７】
以上のように、生物界間接合阻害遺伝子に対する機能阻害剤の添加は、生物界間接合を用いた遺伝子導入において有用な遺伝子導入効率上昇法となる事が証明された。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
以上のように、本発明では、真核細胞のミトコンドリアの機能を阻害することにより、遺伝子導入率を向上することができるため、簡便かつ高効率に有用遺伝子を直接導入する事が出来る。
【００７９】
遺伝子導入は医学・薬学・農学・発酵工学・一般生物学研究すべてにおいて、基礎／応用分野を問わずおこなわれており、そのため本発明を用いることにより真核細胞への遺伝子導入において、本発明は安価で簡便な手法として広く利用できる可能性がある。            
【００８０】
さらに、ゲノム網羅的な遺伝子導入をおこなう時など、特に多サンプルの遺伝子導入が必要な時に、プラスミドDNA調製の必要がないため、自動化しやすく迅速な遺伝子導入法となる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】大腸菌から真核細胞に対して生物界間接合により遺伝子が導入されることを模式的に示した図である。
【図２】生物界間接合効率上昇変異株22株の生物界間接合効率を示した図である。
【図３】生物界間接合阻害遺伝子機能阻害剤Antimycin Aの添加による接合効率の上昇、およびそれぞれの濃度の各薬剤を含むYPD培地で１日処理したBY4742株とBY4741株について検討した結果を示した図である。
【図４】生物界間接合阻害遺伝子機能阻害剤Oligomycinの添加による接合効率の上昇、およびそれぞれの濃度の各薬剤を含むYPD培地で2日処理したBY4742株とBY4741株について検討した結果を示した図である。
【図５】生物界間接合阻害遺伝子機能阻害剤Erythromycinの添加による接合効率の上昇、およびそれぞれの濃度の各薬剤を含むYPD培地で１日処理したBY4742株とBY4741株について検討した結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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