(57)【要約】【課題】  酸やアルカリ等を用いない穏和な前処理条件でのセルロースの加水分解（糖化反応）を促進する。【解決手段】  セルロース含有物質を加水分解酵素により糖化するに際し、加水分解酵素による糖化反応中に間欠的にホモジナイズを行う。ホモジナイズは、例えばカッターを用いて行う。セルロース含有物質は、例えば木質系バイオマスである。木質系バイオマスは、乾式ボールミル等による粉砕処理により予め微細化する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース含有物質を加水分解酵素により糖化するに際し、前記加水分解酵素による糖化反応中に間欠的にホモジナイズを行うことを特徴とする糖化方法。
【請求項２】
前記ホモジナイズは、破砕手段を用いて行うことを特徴とする請求項１記載の糖化方法。
【請求項３】
前記破砕手段は、カッターであることを特徴とする請求項２記載の糖化方法。
【請求項４】
前記セルロース含有物質が木質系バイオマスであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の糖化方法。
【請求項５】
前記木質系バイオマスを粉砕処理により予め微細化することを特徴とする請求項４記載の糖化方法。
【請求項６】
前記粉砕処理は、乾式ボールミルにより行うことを特徴とする請求項５記載の糖化方法。
【請求項７】
加水分解酵素とともに酵母を加え、糖化とともに発酵を行うことを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の糖化方法。
【請求項８】
前記加水分解酵素として、少なくとも２種類の微生物起源のセルラーゼを混合して用いることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の糖化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間伐材や廃木材等の木質系バイオマスや各種セルロース等のセルロース含有物質を、セルラーゼ等の加水分解酵素によりグルコース等の糖類に分解する糖化方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
化石燃料の大量消費がもたらした地球温暖化の対策として、あるいは再生可能な代替エネルギー源の確保を目的として、未利用バイオマスの有効利用の方策が検討されている。例えば、木質系バイオマスの糖化、発酵により得られるバイオエタノールは、そのまま代替燃料として利用することができ、あるいは燃料電池の燃料として利用可能である。
【０００３】
間伐材や廃木材、古紙等の木質系バイオマスの乾燥重量の約５０％はグルコースポリマーであるセルロースからなり、これをグルコースに分解することによってバイオエタノール等の有用な物質に転換することが可能になる。ただし、セルロースは、グルコースがβ−１，４結合した結晶性の繊維を形成するため、同じグルコースポリマーであるα−１，４結合のデンプンと比較すると、極めて安定なポリマーであり、その分解が困難である。さらに、木材中のセルロースは、リグニンとヘミセルロースが鉄骨を補強するかの如く固くこれを覆っているため、物理的、化学的、及び酵素学的にも安定な構造となっており、グルコースへの分解を一層困難なものとしている（例えば、非特許文献１を参照）。したがって、バイオエタノールを効率的に製造するためには、木質系バイオマスのグルコースへの分解が大きな課題となる。
【０００４】
このような状況から、木材等を糖化してグルコースを得るためには、通常、高温，高圧下で酸及びアルカリ処理等によって脱リグニン及び脱ヘミセルロースを行う前処理工程を経てセルロースを取り出した後、酸または酵素セルラーゼによる加水分解を行っている（例えば、非特許文献２を参照）。
【０００５】
木質系バイオマス由来のセルロースを効率よく分解するために、予めセルロース線維を取り巻くヘミセルロース及びリグニンを除去すべきことは、多くの研究者の共通認識するところである。従来、これを達成するために木材チップ等に対して酸またはアルカリ処理を行ってきたが、この手法による前処理は大がかりな装置を必要とするばかりでなく投資エネルギーも大きい。さらには、使用する酸やアルカリを回収、再使用するシステムを構築する必要があり（例えば、非特許文献３を参照）、大量に生じる廃液や臭気の強い排煙等の処理問題も考慮しなければならない。また、酸及びアルカリ処理によって木材から副産物として生じるセルラーゼ阻害物質による糖化効率の著しい低下や、生じた単糖類が酸によってさらに分解すること（例えば、非特許文献４を参照）等が、大きな問題となっている。
【０００６】
このため、糖化効率の向上化を図るために木材チップを乾式および湿式のミル等を用いて０．１〜１ｍｍ程度の粗粉砕物とし、これに熱水処理および機械的粉砕を行った後、酵素処理を施す手法が開発され、糖化効率の向上が報告されている（例えば、特許文献１を参照）。しかしながら、この方法も比較的大規模な設備と投入すべきエネルギー量が大きい点から、さらなる改良が求められている。
【非特許文献１】「セルラーゼ」  (1987)  講談社サイエンティフィック
【非特許文献２】TRENDS in Biotechnology (2006)24:549-556
【非特許文献３】日経バイオビジネス  ２００２年９号  p55-56
【非特許文献４】Appl.Microbiol. Biotechnol. (2006) 69:627-642
【特許文献１】特開２００６−１３６２６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述の通り、例えば木質系バイオマスの糖化プロセスには、大型の分解反応システムと廃棄物の回収・処理施設を備えた大規模なプラントと、これを運用するに足るエネルギー投下が必要であるが、これは実用化に向けて大きな障害となる。穏和な条件でセルロースを加水分解するセルラーゼを用いた木材の糖化システムが望ましいが、木質系バイオマスの特徴であるリグニン及びヘミセルロースの存在がセルラーゼの基質セルロースへの接近と分解を困難にしており、残念ながら望ましい結果を与えてくれる技術は未だ開発されていない。また、木質系バイオマスに限らず、各種セルロース含有物質やセルロース単体の糖化においても、より効率的な糖化が大きな課題である。
【０００８】
本発明は、前述の従来技術の有する課題に鑑みて提案されたものであり、酸やアルカリ等を用いない穏和な条件でセルロースの加水分解を促進することができ、大規模なプラント等を要することなく，効率的にセルロースの糖化反応を進めることが可能な糖化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
今後望まれる持続可能型社会においては、環境にやさしく省エネルギーなバイオエタノール生産システムの構築が必須である。この点を考慮すると、酵素法による糖化が最も望ましい。ここで、酵素糖化法が抱えている問題点は、例えば木質系バイオマス等の構造特性に由来する。すなわち、ヘミセルロースとリグニンがセルロースを固く取り巻いているために、木材微粒子表面に露出しているセルロースマイクロフィブリルがセルラーゼによって分解されると、さらなる糖化が困難になるという問題である。
【００１０】
本発明者らは、このような問題を解消すべく、長期に亘り種々検討を重ねてきた。その結果、糖化反応の過程において、間欠的にホモジナイズを行うことが極めて有効であることを知見するに至った。本発明は、前記の知見に基づいて完成されたものであり、セルロース含有物質を加水分解酵素により糖化するに際し、前記加水分解酵素による糖化反応中に間欠的にホモジナイズを行うことを特徴とする。
【００１１】
酵素による糖化反応中にホモジナイズを行うと、処理対象物（セルロース含有物質）の表面上に常にセルロースミクロフィブリルが露出するようになり、加水分解酵素による分解が促進され、糖化反応が効率的に進行する。本発明の方法は、酵母存在下での同時発酵にも適用可能であり、ホモジナイズを行う時間に依存して糖化効率が亢進することが実験的に確認されている。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、酸やアルカリ等による前処理を行わない穏和な条件でセルロースを効率的に糖化することができ、投入エネルギーに対して糖化効率の向上を見込むことができる。また、本発明によれば、酸、アルカリの使用及び高温、高圧下での操作が必要ないため、簡単な施設で糖化を行うことが可能である。さらに、酸、アルカリを使用しなくて済むため、それらの回収に要するコストを削減することができ、発生する廃液や悪臭等の環境問題を緩和することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を適用した糖化法の実施形態について詳述する。
【００１４】
本発明において、糖化の対象（原料）となるのは、セルロースを含有するセルロース含有物質であり、例えば木質系バイオマスを挙げることができる。木質系バイオマスとしては、間伐材や廃木材、古紙等を挙げることができるが、これらに限定されるものではなく、糖質やデンプン質を利用した後の農産廃棄物等、いわゆるバイオエタノールの原料として用いられている木質系バイオマス全般に適用することが可能である。また、糖化対象となるセルロース含有物質は、前記木質系バイオマスに限られるわけではなく、セルロースを主成分とする古紙やセルロース単体（例えば、α−セルロースや微結晶セルロース等）等の糖化にも適用することが可能である。
【００１５】
糖化に際しては、予め粉砕処理等を行っておくことが好ましく、例えば前述の木質系バイオマスを原料とする場合、前処理として粉砕による微細化処理を施しておくことが好ましい。ここで、木質系バイオマス（例えば木材）を原料として糖化を行う場合、これを粉砕してチップ状にすることは広く行われているが、通常の粉砕では繊維の分離等が不十分であり、酸やアルカリによる前処理を行わざるを得なくなるおそれがある。そこで本発明では、物理的方法で十分な裁断、粉砕を行い、マイクロメートルレベルまで微細化しておくことが好ましい。前記微細化処理を行い、木質系バイオマスの繊維等を予め十分にほぐしておくことで、酸やアルカリ等の薬品を用いた前処理を行わなくとも、木質系バイオマスの糖化効率を上げることができる。
【００１６】
前記微細化処理においては、裁断後の粒子は細かければ細かいほど良く、繊維が解けるように微粒子化することが好ましい。微粒子の具体的サイズとしては、長径が２００μｍ以下であることが好ましい。裁断した木質系バイオマスの粒子サイズが大きすぎると、糖化後のグルコース濃度や還元糖濃度、発酵後のエタノール収量が不十分となるおそれがある。
【００１７】
前記木質系バイオマスの微細化処理は、物理的方法により行えばよく、具体的には、湿式ボールミル、乾式ボールミル、乾式カッターミル等が好適である。ボールミルは、原料とメディア（粉砕ボール）を容器内に入れ、容器を回転させて撹拌することで粉砕を行うものである。粉砕ボールとしては、金属球やセラミック球等を用いることができる。撹拌に際して溶媒を加える場合が湿式ボールミルであり、溶媒を加えず原料と粉砕ボールのみを撹拌する場合が乾式ボールミルである。湿式ボールミル、乾式ボールミルのいずれの場合にも、粉砕ボール間で原料である木質系バイオマスが破砕されて微粒子化される。なお、湿式ボールミルと乾式ボールミルとでは、乾式ボールミルの方が粉砕後の微粒子のサイズが小さくなる傾向にある。乾式カッターミルは、複数枚のカッターを回転させて木質系バイオマスを微細に裁断するものであり、ボールミルと同様、マイクロメートルレベルへの微粒子化が可能である。なお、これら物理的方法の中では、乾式ボールミルによる微細化処理において、最も良好な結果が得られることが、実験的に確かめられている。
【００１８】
前記微細化を前処理とし、得られた木質系バイオマスの微粒子に加水分解酵素を加え、グルコース等の糖への転換（分解）を行う。α−セルロースや微結晶セルロースを糖化する場合には、前記微細化処理は不要である。糖化のための加水分解酵素としては、セルラーゼ等を用いる。セルラーゼによる酵素加水分解により、セルロースはグルコースに分解される。加水分解酵素であるセルラーゼとしては、例えば各種微生物起源のセルラーゼを用いることができるが、異なる微生物起源の複数（例えば２種類）のセルラーゼの混合物を併用することが好ましい。異なる微生物起源の２種類のセルラーゼ混合物を共存させることにより、生成グルコース濃度が向上し、より一層効率的な糖化が実現される。
【００１９】
糖化に際しては、前記加水分解酵素とともに酵母を加え、同時糖化発酵とすることも可能である。同時糖化発酵は、セルロースに加水分解酵素であるセルラーゼと酵母を同時に作用させて、一段階の反応でアルコールを得るものであり、別々の工程として行われてきた糖化やこれに付随する処理、発酵を一工程に納めることができ、エタノール産生物の増収、反応速度の増進等を図ることが可能である。
【００２０】
このとき、エタノール発酵のための酵母としては、任意の酵母を用いることができる。酵母共存下での微生物起源のセルラーゼ混合物の作用により、例えば木質系バイオマス等に含まれるセルロースが糖化され、さらにエタノール発酵によりエタノール産生物に転換される。
【００２１】
いずれの場合においても、本発明では、糖化反応の際に反応液を間欠的にホモジナイズし、処理対象物（セルロース含有物質）の表面上に常にセルロースミクロフィブリルが露出するようにし、糖化反応を促進する。ホモジナイズは、各種破砕手段により行えばよく、例えばミキサー等のようなカッターを備えた装置により撹拌すればよい。あるいは、湿式ボールミル等により行うことも可能である。また、前記ホモジナイズを行う時間的間隔は、任意に設定することができ、例えば数時間毎に行えばよい。
【００２２】
前記ホモジナイズを行うことで、酸やアルカリによる前処理を行わなくても、加水分解酵素による分解を促進することができ、糖化反応を効率的に進行させることができる。特に、同時糖化発酵における糖化反応の促進は、最終産生物であるバイオエタノールの収量の向上にも繋がり、エタノール産生物の増収、反応速度の増進等を実現することが可能である。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明の具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。
【００２４】
木質系バイオマスの糖化
スギ心材チップを乾式ボールミルにより粉砕し、微細子化を行った。乾式ボールミルによる粉砕においては、乾燥スギ心材チップ５ｇとボールを入れた専用タングステンカーバイト製容器を遊星型ボールミル（Plantary micro mill pulverisette 7, FRITSCH）に充填し、回転速度speed８にて５分間粉砕処理を行うことにより、微細化粒子を調製した。
【００２５】
表１に示すように前記微細化粒子に二次処理（蒸煮及びマイクロ波）を行い、糖化反応に供した。前記二次処理において、蒸煮の条件は１２１℃、１．２気圧、６０分間とした。マイクロ波は、シャープ社製の装置Ｒ−７０７を用い、１分間×２回の条件で行った。糖化反応においては、糖化酵素（加水分解酵素）として、セルラーゼＴ「アマノ」４及びヘミセルラーゼ「アマノ」９０を用い、これらをそれぞれ１００ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解した。糖化は、三角フラスコ内において、０．１％ＮａＮ３を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００ｍｌ中で行った。ホモジナイズはカッターを用いたカッター処理として行い、１，２，４及び６時間目にカッターミル（Force mill、大阪ケミカル社製）を用いて、１分×２回行った。
【００２６】
前記カッター処理の有無による糖化率の相違を測定した。測定に際して、サンプリングは、０，２，４及び８時間経過後に糖化反応液を０．１ｍｌずつ抜き取り、１００℃で１０分間の酵素失活処理を施した後、蒸留水０．９ｍｌを添加して測定まで−２５℃で保存した。グルコースの定量は、グルコースオキシダーゼ・パーオキシダーゼ法を用いて行った。結果を図１〜図３に示す。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
これら図１〜図３を見ても明らかなように、いずれの場合においても糖化反応中にカッター処理を行った場合に糖化率の増加が確認された。この結果から、酵素反応と同時にカッター処理を行うことが木質系バイオマスの糖化に有効であることが示された。
【００２９】
セルロース標品の糖化
セルロース標品としては、α−セルロース（Sigma）及び微結晶性セルロース（フナセル）を用いた。二次処理は行っていない。これらセルロース標品に対して、表２に示す条件で同様の糖化反応を行い、カッター処理の有無による糖化率の相違を測定した。結果を図４及び図５に示す。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
セルロース標品においても、ホモジナイズ（カッター処理）の効果が確認された。すなわち、糖化反応中にカッター処理を行った場合に糖化率の増加が確認された。
【００３２】
同時糖化発酵
微細化処理を行った木質バイオマス微粒子を用い、セルラーゼと酵母の共存下で反応を行い、糖化及びエタノール発酵を行った。反応に際しては、ホモジナイズ（カッター処理）を行った。図６は、時間経過に伴うグルコース濃度の変化、及びエタノール濃度の変化を示すものである。図６から明らかなように、木質系バイオマスを微粒子化することにより、グルコース濃度の減少に伴いエタノール濃度が上昇しており、糖化及びエタノール発酵が効率的に行われていることがわかる。
【００３３】
２種類のセルラーゼの併用に関する検討
異なる微生物起源の２種類のセルラーゼ（セルラーゼＡ及びセルラーゼＢ）を用い、ホモジナイズを行いながら糖化反応を行った。セルロース含有物質としては、微結晶性セルロースを用いた。セルラーゼＡとセルラーゼＢの比率を変え、セルロースの分解によるグルコース濃度変化を調べた。結果を図７及び表３に示す。
【００３４】
【表３】
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【００３５】
これら図７や表３からも明らかなように、２種類のセルラーゼを併用することで糖化がさらに効率化され、グルコース濃度が上昇している。本実験においては、セルラーゼＡとセルラーゼＢを１：１とした場合に最も良好な結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】木質系バイオマス微細化粒子（二次処理無し）を糖化反応させた時のカッター処理の有無によるグルコース濃度変化の相違を示す特性図である。
【図２】木質系バイオマス微細化粒子（二次処理：蒸煮）を糖化反応させた時のカッター処理の有無によるグルコース濃度変化の相違を示す特性図である。
【図３】木質系バイオマス微細化粒子（二次処理：マイクロ波）を糖化反応させた時のカッター処理の有無によるグルコース濃度変化の相違を示す特性図である。
【図４】α−セルロースを糖化反応させた時のカッター処理の有無によるグルコース濃度変化の相違を示す特性図である。
【図５】微結晶性セルロースを糖化反応させた時のカッター処理の有無によるグルコース濃度変化の相違を示す特性図である。
【図６】同時糖化発酵におけるグルコース濃度変化及びエタノール濃度変化を示す特性図である。
【図７】２種類のセルラーゼの比率によるグルコース濃度変化の相違を示す特性図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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