(57)【要約】【課題】従来の毒性試験では予測が困難であった、ヒト特異的肝毒性を発現させる化合物について、その肝毒性を高精度で予測することが可能であり、かつ複数種のバイオマーカーを利用することによって、汎用性の高い、ヒトに対する肝毒性の少ない化合物をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】メタボロミクスを用いた肝毒性評価において、当該肝毒性評価の各工程を好適な組合せにすることによって、ヒトに対する肝毒性の少ない化合物をスクリーニングすることができる。さらに、肝毒性標品化合物として、４−ヒドロキシアニソールおよびニメスリドなどを用いて特定された共通でかつ複数種のバイオマーカーを利用し、当該メタボロミクスを用いた肝毒性評価を行なうことによって、上記課題を解決することが可能となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタボロミクスを用いた肝毒性評価による化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
メタボロミクスを用いた肝毒性評価が、
（１）被験化合物をげっ歯目動物に投与する工程、
（２）投与前後におけるげっ歯目動物の尿を採取する工程、
（３）工程（２）で採取した尿について、クロマトグラフィーおよび質量分析を組み合わせて尿中代謝物を分離する工程、
（４）工程（３）で分離した各尿中代謝物の保持時間および質量分析データを得る工程、
（５）工程（４）で得られた保持時間および質量分析データについて、データ処理用ソフトウェアを用いてピーク検出およびアライメントを行い、ピークテーブルを作成する工程、
（６）工程（５）で作成したピークテーブルから、肝毒性標品化合物によって特定されたバイオマーカーのデータを選別する工程、
（７）工程（６）で選別されたデータについて、被験化合物の投与前後における各バイオマーカーの変動を検出する工程を含むことを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
クロマトグラフィーおよび質量分析の組合せが、高圧高速液体クロマトグラフィーおよび飛行時間型質量分析の組合せである請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
データ処理用ソフトウェアが、ＭＺｍｉｎｅである請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
工程（７）において、工程（６）で選別されたデータを用いてケモメトリクス解析を行い、得られた解析結果を用いて変動を検出することを特徴とする請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
ケモメトリクス解析が、主成分分析である請求項５記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
得られた解析結果が、各検体の主成分分析のスコアプロットであり、当該スコアプロットにおける被験化合物の投与前後のスコアの差の絶対値により変動を検出することを特徴とする請求項６記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
バイオマーカーが、少なくとも２種以上の肝毒性標品化合物によって特定された複数種のバイオマーカーである請求項５記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
複数種のバイオマーカーが、表１に示される化合物からなる群より選ばれる請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
複数種のバイオマーカーが、表２−１および表２−２に示される化合物からなる群より選ばれる請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
工程（７）において、工程（６）で選別されたデータについてアレイ解析ソフトウェアを用いて、変動を検出することを特徴とする請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
バイオマーカーが、少なくとも２種以上の肝毒性標品化合物によって特定された複数種のバイオマーカーである請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
複数種のバイオマーカーが、表５−１、表５−２、表５−３、表６−１、表６−２、表６−３および表６−４に示される化合物からなる群より選ばれる請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物のスクリーニング方法に関するものであり、特にメタボロミクスを用いた肝毒性評価による、ヒト肝毒性の少ない化合物のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
医薬品開発において、医薬品候補化合物の肝臓に対する毒性評価は、実験動物を用いた毒性試験における血液生化学検査や病理組織学的検査により行われている。しかしながら、実験動物を用いた前臨床毒性試験において検出できなかった肝毒性であっても、ヒトにおいて発現してしまう場合がある。具体的には、前臨床試験と臨床試験をクリアした医薬品が、市販後に数百から数十万症例に１例程度の確率で重篤な肝障害を発現する場合である。この場合、製品開発は中断を余儀なくされ、研究開発に費やした時間とコストは回収することができない。このことは、実験動物に対して低毒性の薬物は、ヒトに対しても低毒性であろうという推定が必ずしも成立しないことを表している。
【０００３】
本問題の有効な解決策は、実験動物とヒトとの毒物感受性の差異を解明することであるが、それは極めて困難である。かかる事情により、医薬品候補化合物のスクリーニングに適用可能な、実験動物とヒトとの毒物感受性をできるだけ同等に捉えることのできるバイオマーカーの探索が行なわれている。すなわち、ヒト特異的に毒性を発現した化合物を実験動物に投与した際に、生体内でその量が変動する代謝物（バイオマーカー）を特定し、当該バイオマーカー量を変動させない化合物を見出すことができれば、毒性の少ない化合物の選定が可能となるからである。
【０００４】
近年、メタボロミクスを用いて肝毒性の指標となる新規のバイオマーカーを探索する試みがなされている（非特許文献１参照）。メタボロミクスは生体における代謝物を網羅的に分析および解析する方法であり、薬物投与による生体のレスポンスとその経時変化を包括的・相対的・定量的に評価することができる方法である。それゆえ、医薬品の毒性や有効性予測のために有用な評価方法のひとつとして期待されている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、メタボロミクス（メタボノミクス）において、ＬＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータの処理を行うための方法が開示されている。この方法は、サンプル中の代謝産物のＬＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータからケモメトリック分析を実行して、バイオマーカーを識別する方法である。しかしながら、特許文献１には、実際にこの方法を用いて生体サンプル中の代謝産物を網羅的に解析し、具体的なバイオマーカーを取得できたことは記載されていない。
【０００６】
また、例えば、特許文献２には、複数の生物学的サンプルの差異、相関などについて、メタボロミクスを用いてプロファイリングする方法およびシステムが開示されている。しかしながら、特許文献２には、野生型マウスとＡＰＯ  Ｅ３マウスの生体試料について、当該試料中の代謝物プロフィールを比較したことが記載されているにとどまり、具体的なバイオマーカーを特定したことは記載されていない。
【０００７】
さらに、例えば、特許文献３には、酸化ストレス惹起剤を投与されたマウスの肝臓および血清を試料とし、ＣＥ−ＴＯＦＭＳを用いて代謝物を網羅的に測定し、その中から酸化ストレスを判定可能なマーカーとしてオフタルミン酸を見出したことが記載されている。しかし、オフタルミン酸は酸化ストレスを判定するための単一のマーカーであるため、酸化ストレスに起因する肝毒性発現の予測に使用することはできるが、肝毒性全般について一般性を有する予測可能なスクリーニング方法として使用することは困難である。
【０００８】
また、例えば、特許文献４には、アミオダロンまたはフェノキシプロピルアミン化合物を投与したラットの尿および血清を採取し、ＣＥ−ＴＯＦＭＳにより各薬物投与群において共通に変動する代謝物を特定したことが記載されている。これらの代謝物は、薬物誘発性リン脂質症を特定するためのバイオマーカーであるため、肝毒性のバイオマーカーとして使用できることを示唆するものではない。
【０００９】
【特許文献１】特表２００７−５０３５９４号公報
【特許文献２】特表２００５−５００５４３号公報
【特許文献３】特開２００７−１９２７４６号公報
【特許文献４】特開２００７−３１５８５２号公報
【非特許文献１】ファーマコゲノミクス（Pharmacogenomics）、第６巻、第７号、６９１〜６９９ページ、２００５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ヒトに対する肝毒性の少ない化合物のスクリーニング方法を提供することにある。より詳しくは、ヒト特異的に肝毒性を発現する既知化合物について、メタボロミクスを用いて特定した複数種のバイオマーカーを利用することによって、検出精度および汎用性の高いスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、メタボロミクスを用いた肝毒性評価に使用できる各手法および各工程の好適な組合せを見出し、さらに、肝毒性標品化合物としてヒト特異的に肝毒性を発現する化合物（４−ヒドロキシアニソール、ニメスリドなど）を用いて抽出された、ヒトに対する肝毒性の指標となり得る複数のバイオマーカー候補化合物を選定し、利用することによって、高精度で汎用性の高いスクリーニングを行なうことが可能となり、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明に係る化合物のスクリーニング方法（以下、本発明のスクリーニング方法と略記することがある。）は、メタボロミクスを用いた肝毒性評価によることを特徴としている。メタボロミクスを用いた肝毒性評価は、（１）被験化合物をげっ歯目動物に投与する工程、（２）投与前後におけるげっ歯目動物の尿を採取する工程、（３）工程（２）で採取した尿について、クロマトグラフィーおよび質量分析を組み合わせて尿中代謝物を分離する工程、（４）工程（３）で分離した各尿中代謝物の保持時間および質量分析データを得る工程、（５）工程（４）で得られた保持時間および質量分析データについて、データ処理用ソフトウェアを用いてピーク検出およびアライメントを行い、ピークテーブルを作成する工程、（６）工程（５）で作成したピークテーブルから、肝毒性標品化合物によって特定されたバイオマーカーのデータを選別する工程、（７）工程（６）で選別されたデータについて、被験化合物の投与前後における各バイオマーカーの変動を検出する工程を含むことが好ましい。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法において、クロマトグラフィーおよび質量分析の組合せは、高圧高速液体クロマトグラフィーおよび飛行時間型質量分析の組合せであることが好ましく、データ処理用ソフトウェアは、ＭＺｍｉｎｅであることが好ましい。
【００１４】
工程（７）において、工程（６）で選別されたデータを用いてケモメトリクス解析を行い、得られた解析結果を用いて変動を検出することが好ましい。ケモメトリクス解析は、主成分分析であることが好ましく、主成分分析のスコアプロットにおける被験化合物の投与前後のスコアの差の絶対値により変動を検出することが好ましい。また、ケモメトリクス解析として、他の多変量解析である分散分析およびＰＬＳ回帰分析を用いてもかまわない。
【００１５】
また、工程（７）において、工程（６）で選別されたデータについてアレイ解析ソフトウェアを用いて、変動を検出することも好ましい。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法に用いられるバイオマーカーは、少なくとも２種以上の肝毒性標品化合物によって特定された複数種のバイオマーカーであることが好ましい。複数種のバイオマーカーは、ケモメトリクス解析、なかでも主成分分析を行ってバイオマーカーの変動の検出を行った場合は、表１に示される化合物からなる群より選ばれることが好ましく、表２−１および表２−２に示される化合物からなる群より選ばれることがより好ましい。また、アレイ解析ソフトウェアを用いてバイオマーカーの変動の検出を行った場合は、複数種のバイオマーカーとしては、表５−１、表５−２、表５−３、表６−１、表６−２、表６−３および表６−４に示される化合物からなる群より選ばれることが好ましい。
【００１７】
特に、本発明のスクリーニング方法は、上記した好ましい各手法を組み合わせること、各工程の手順を上記した通りに行なうこと、および上記した好ましい複数種のバイオマーカーを用いることによって、本発明の課題を解決するための好適な手段となり得る。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のスクリーニング方法を用いれば、従来の毒性試験では予測が困難であった、ヒト特異的に肝毒性を発現させる化合物についても肝毒性を予測できるため、ヒトに対する肝毒性の少ない化合物を高精度にスクリーニングすることができる。さらに、本発明のスクリーニング方法に用いられるバイオマーカーは、２種以上の肝毒性標品化合物に共通して検出されたものであることから、汎用性に優れたスクリーニングを行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書において「メタボロミクス」は、生体から得られる試料中に含まれる代謝物の網羅的な分析と得られたデータの解析により有用な情報を取得する技術を意味する。ここで、代謝物とは、生体内に本来的に存在する代謝物を意味する。
【００２０】
本明細書において「肝毒性の少ない化合物」は、ヒトに対して肝毒性を発現させるリスクが低い化合物を意味する。例えば、ジピリダモールが挙げられる。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法は、メタボロミクスを用いた肝毒性評価によるものであればよい。
【００２２】
メタボロミクスの分析対象動物は特に限定されないが、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト動物（例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯目動物（ラット、マウスなど）））であることが好ましい。哺乳動物としては、医薬品の前臨床試験に用いられる一般的な実験動物が好適であり、なかでも毒性試験に通常用いられるラット、マウスなどのげっ歯目動物が特に好ましい。分析対象試料も特に限定されず、尿、血液（血清）、臓器（例えば、肝臓）などを好適に用いることができる。なかでも、動物に苦痛を与えることなく繰り返し採取可能な尿を用いることが好ましい。
【００２３】
試料の分析方法も特に限定されず、一般にメタボロミクスに用いられる公知の方法から適宜選択することができる。例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、および質量分析と組み合わせた方法（例えば、ＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ、ＣＥ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）などを用いる方法が挙げられる。得られたデータを解析する方法も特に限定されず、採用した分析方法に応じて適切な公知のデータ解析方法を選択しデータ解析を行うことができる。
【００２４】
肝毒性評価は、通常、被験化合物を投与された個体の投与前後の試料中に含まれる代謝物の変動を検出することにより行われる。この際、既知の２種以上の肝毒性標品化合物を投与した個体の投与前後の試料中に含まれる代謝物の変動、および対照個体（無処置、溶媒投与または既知の肝毒性低リスク化合物投与）の投与前後の試料中に含まれる代謝物の変動を参照することにより、当該肝毒性標品化合物に共通して変動するバイオマーカーを検出することができ、当該バイオマーカーを用いることによって、被験化合物の肝毒性が評価され、ヒトに対する肝毒性の少ない化合物をスクリーニングすることができる。または、媒体のみを投与した個体と被験化合物を投与した個体の２群間において、採取時間毎に、各群の代謝物の変動を検出することによっても肝毒性評価を行うことができる。ここで、バイオマーカーとは、当業者にとって明らかなように、生体試料中に含まれる代謝物のうち、生体の生物学的変化に伴ってその量が変動するものをいう。
【００２５】
以下、本発明のスクリーニング方法の一実施形態について詳細に説明する。本実施形態のスクリーニング方法は、上記メタボロミクスを用いた肝毒性評価が、以下の工程（１）〜工程（７）を含むものであればよい。
【００２６】
工程（１）
工程（１）は、被験化合物をげっ歯目動物に投与する工程である。被験化合物は特に限定されないが、医薬品候補化合物であることが好ましい。医薬品候補化合物は、低分子化合物、高分子の蛋白、ポリペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子）、アンチセンス、デコイ、抗体であるか、またはワクチンなどであってもよい。げっ歯目動物は特に限定されないが、上記のように医薬品の毒性試験に通常使用されるラットまたはマウスが好ましい。被験化合物の調製、投与経路の選択、投与用量・投与回数などの条件設定は、医薬品の毒性試験に準じて行うことができる（「医薬品非臨床試験ガイドライン解説２００２」医薬品非臨床試験研究会監修、株式会社薬事日報社、２００２）。
【００２７】
工程（２）
工程（２）は、投与前後におけるげっ歯目動物の尿を採取する工程である。げっ歯目動物の尿を採取するために、動物は採尿ケージ（代謝ケージ）に１匹ずつ収容することが好ましい。尿の採取は被験化合物の投与前および投与後にそれぞれ少なくとも１回行えばよいが、採尿時期、回数などについて適切な条件を設定するために、予備検討を行うことが好ましい。
【００２８】
工程（３）
工程（３）は、工程（２）で採取した尿について、クロマトグラフィーおよび質量分析を組み合わせて尿中に含まれる代謝物を分離する工程である。クロマトグラフィーとしては、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）などが挙げられる。このうち、操作性に優れ、必要な分離能を有する点から高速液体クロマトグラフィー、なかでも高圧高速液体クロマトグラフィー（例えば、ＡＣＱＵＩＴＹTM  Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）など）が好ましい。質量分析としては、クロマトグラフィーと組み合せ可能なものであれば特に限定されないが、例えば、四重極型質量分析（ＱＭＳ）、イオントラップ型質量分析（ＩＴＭＳ）、飛行時間型質量分析（ＴＯＦＭＳ）、フーリエ変換型質量分析（ＦＴＭＳ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）などが挙げられる。解析の有用性を考慮すると精密質量数が測定可能である点から飛行時間型質量分析が好ましい。高圧高速液体クロマトグラフィーと飛行時間型質量分析を組み合わせることにより、尿中代謝物のほとんど全てを分離・分析することができる。また、ＦＴＭＳを使用する場合は、尿中代謝物の分離を伴わないデータで解析することも可能である。
【００２９】
工程（４）
工程（４）は、工程（３）で分離した各尿中代謝物の保持時間および質量分析データを得る工程である。工程（３）では、通常クロマトグラフィーと質量分析とを組み合わせた市販の分析機器（例えば、ＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ）が用いられる。なかでも、工程（３）に記載した好適なクロマトグラフィーと質量分析の組合せ、すなわち、高圧高速液体クロマトグラフィーおよび飛行時間型質量分析の組合せが好ましい。各尿中代謝物の保持時間および質量分析データは、当該測定機器により自動的に取得される。
【００３０】
工程（５）
工程（５）は、工程（４）で得られた保持時間および質量分析データについて、データ処理用ソフトウェアを用いてピーク検出およびアライメントを行い、ピークテーブルを作成する工程である。用いるデータ処理用ソフトウェアは、工程（４）で得られた保持時間および質量分析データについて、ピーク検出およびアライメントを実行できるものであれば特に限定されない。本工程で使用可能な市販ソフトウェアやフリーソフトウェアは多数知られている（Journal of Chromatography A, 1158 (2007) 318-328）。具体的には、例えば、ＭＺｍｉｎｅ（フリーソフトウェア）、Ｍａｒｋｅｒｌｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．）、ＸＣＭＳ（フリーソフトウェア）などが挙げられる。なかでも、ピークの検出ミスが少ないこと、精密質量数を使用できること、および操作の簡便性の点からＭＺｍｉｎｅが特に好ましい。ＭＺｍｉｎｅは「http://mzmine.sourceforge.net/download.shtml」からダウンロードして取得することができる。使用説明書の記載に従ってＭＺｍｉｎｅを使用することにより、工程（４）で得られた保持時間および質量分析データについてピーク検出およびアライメントを実行することができる。ＭＺｍｉｎｅの具体的な使用方法の一例については、後段の実施例で詳述する。
【００３１】
ピークテーブルは、ピーク検出およびアライメントがなされた保持時間および質量分析データの表であればよく、形式は何ら限定されるものではない。例えば、ＭＺｍｉｎｅを用いてデータ処理を行うと、テキスト形式のデータファイルとしてピークテーブルを得ることができる。ピークテーブルは、その後の処理や解析に適した体裁やファイル形式に適宜修正して使用される。例えば、検体ごとに、保持時間とｍ／ｚ値とで特定されたピークの強度を全て表示したピークテーブルが挙げられる。
【００３２】
工程（６）
工程（６）は、工程（５）で作成したピークテーブルから、肝毒性標品化合物によって特定されたバイオマーカーに該当するデータを選別する工程である。「肝毒性標品化合物」は、ヒトに対して肝毒性を発現することが知られている化合物であれば特に限定されず、例えば、ニメスリド、ニトロフラントイン、フルタミド、４−ヒドロキシアニソール、アセトアミノフェン、アモジアキンが挙げられる。
【００３３】
ここで、メタボロミクスを用いてバイオマーカーを特定する場合、具体的には、上記の工程（１）〜工程（４）と同様の手順により、げっ歯目動物に肝毒性標品化合物を投与し、投与前後の尿を採取し、クロマトグラフィーおよび質量分析を組み合わせて尿中に含まれる代謝物を分離し、各尿中代謝物の保持時間および質量分析データを得る。得られた保持時間および質量分析データについて、工程（５）と同様にデータ処理用ソフトウェアを用いてピーク検出およびアライメントを行い、ピークテーブルを作成する。作成されたピークテーブルの全データを用いて後記するケモメトリクス解析を行い、解析結果からバイオマーカーを特定する。
【００３４】
ケモメトリクス解析として主成分分析を行った場合には、解析結果のうち特徴的な成分についてローディングプロットにより表示する。ローディングプロットでは、肝毒性標品化合物の投与前後に大きく変動する化合物（代謝物）は中心（ファクター１および２のローディング値がいずれも０の位置）から離れた位置に表示されるので、そのような化合物をバイオマーカーとして特定することができる。具体的には、例えば、ローディングの絶対値が大きい化合物を複数選択し、これらを用いて主成分分析を行い、スコアプロットで表示して投与前後の分離が認められれば、これらをバイオマーカー候補とする。そのなかから同一化合物（同じ保持時間やｍ／ｚ値を有するもの）や同位体などを削除し、残った化合物をバイオマーカーとして特定することができる。
【００３５】
また、工程（５）で作成したピークテーブルから、バイオマーカーを特定する解析方法として、主成分分析の代わりに後段の実施例で記載するように、アレイ解析ソフトウェア（例えば、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（Ｇｅｎｅｄａｔａ社））を用いた媒体投与群と被験化合物投与群の２標本の検定（Welchのｔ検定）を行って、特定の化合物の変動が認められれば、これをバイオマーカーとして特定してもよい（Analytical Biochemistry 363 (2007) 185-195参照）。
【００３６】
このようにして、特定されたバイオマーカーは、１種のみでもよく、複数種でもよい。化合物のスクリーニング精度・汎用性を高める観点から、複数種（２種以上）であることが好ましい。ピークテーブルにおけるバイオマーカーに該当するデータは、特定されたバイオマーカーの保持時間およびｍ／ｚ値に基づいて選別することができる。
【００３７】
工程（７）
工程（７）は、工程（６）で選別されたデータについて、被験化合物の投与前後における各バイオマーカーの変動を検出する工程である。変動を検出する方法としては、例えば、個々のバイオマーカーについて、被験化合物の投与前後におけるピークの強度を比較することにより、バイオマーカーの変動（増加または減少）を検出する方法が挙げられる。検出された被験化合物の投与前後における各バイオマーカーの変動を、既知の肝毒性標品化合物の投与前後における各バイオマーカーの変動、および対照（無処置、溶媒投与または既知の肝毒性低リスク化合物投与）における各バイオマーカーの変動と比較し、対照における変動と同等である場合には、肝毒性が少ないと判断することにより、ヒトに対する肝毒性の少ない化合物をスクリーニングすることができる。
【００３８】
バイオマーカーの変動を検出する他の方法としては、例えば、工程（６）で選別されたデータを用いてケモメトリクス解析を行い、得られた解析結果を用いて変動を検出する方法を挙げることができる。「ケモメトリクス」とは、数学や統計学などを用いて化学データを分析し、最も適切な化学情報を提供するための解析手法であり、化学実験で得られる膨大な多変量データの規則性を解析したり、特徴を抽出したりすることでそこから有益な情報を得ることを目的とした学問領域である。ケモメトリクス解析の具体的手法としては、主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ；ＰＣＡ）、自己組織化マッピング（Ｓｅｌｆ−Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  Ｍａｐｐｉｎｇ；ＳＯＭ）、ＰＬＳ回帰分析（Ｐａｒｔｉａｌ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅｓ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、判別分析（Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ；ＤＳ）、階層クラスター解析（Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ；ＨＣＡ）、分散分析などを挙げることができる。なかでも、主成分分析は、外部評価に影響されず、データそのものの特徴を捉えることに優れており、探索的なアプローチとして知られており、マーカー探索作業の第一スクリーニングとして好ましい。ここで「主成分分析」とは、多変量データの持つ情報を、少数個の総合特性値に要約する手法である。換言すれば、多数の関連性のありそうな変数を、主成分と呼ばれる少数の関連性のない変数に変換する手法である。
【００３９】
主成分分析は、市販のソフトウェアを用いることにより容易に行うことができる。主成分分析に使用されるソフトウェアは特に限定されないが、メタボロミクスにおいて広く使用されている市販のソフトウェアとして、例えば、Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅ（Ｉｎｆｏｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）、ＳＩＭＣＡ−Ｐ（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、Ｍａｒｋｅｒｌｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．）、ＭＡＴＬＡＢ（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．）などが挙げられる。本発明者らは、操作性、視覚化に優れているという理由で、Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅを使用している。
【００４０】
主成分分析の結果は、独立変数を各サンプル、従属変数を各ピークとした際には、主に、（ａ）１つの検体ごとにスコア（ｓｃｏｒｅ）をプロットして表示するスコアプロット、および（ｂ）スコアを算出する際の各ピークの寄与を表すローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）をプロットして表示するローディングプロットの２つの表示方式により表すことができる。結果をスコアプロットで表示した場合、被験化合物の投与前後における同一個体の検体のプロットから従属変数の数と同じ成分数を求めることができ、それぞれの成分のスコアの差を求めることができる。これらの差の絶対値は、各バイオマーカー全体の変動を表すものであり、この数値により全バイオマーカーの変動を一元的に検出することができる。
【００４１】
既知の肝毒性標品化合物の投与前後における各バイオマーカーのデータ、および対照（無処置、溶媒投与または既知の肝毒性低リスク化合物投与）における各バイオマーカーのデータについても、同様に主成分分析を行い、スコアをプロットして投与前後のスコアの差の絶対値を求めておき、これらと被験化合物投与群の数値（差の絶対値）と比較すること、すなわち、被験化合物群の数値（差の絶対値）が、対照における数値と同等であるか否かを判断することによって、被験化合物がヒトに対する肝毒性の少ない化合物であるか否かを予測することができる。もしくは、後記する実施例記載の、肝毒性標品化合物の投与前後で示された分離クラスターの形成の有無によっても予測することができる。
【００４２】
また、バイオマーカーの変動を検出する他の方法としては、ケモメトリクス解析の代わりにアレイ解析ソフトウェア（例えば、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（Ｇｅｎｅｄａｔａ社））を用いて、媒体投与群と被験化合物の２群間でピークの強度を統計学的に処理することにより、バイオマーカーの変動を検出する方法も挙げられる。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法において用いられるバイオマーカーは、後段の実施例で示すように肝毒性標品化合物によって特定されたものであれば特に限定されないが、メタボロミクスを用いて特定されたものであることが好ましい。また、バイオマーカーは、少なくとも２種以上の肝毒性標品化合物によって特定されたバイオマーカーであることが好ましい。「少なくとも２種以上の肝毒性標品化合物によって特定されたバイオマーカー」とは、２種以上の肝毒性標品化合物によってそれぞれ特定されるバイオマーカーのなかで、当該肝毒性標品化合物にとって、共通に変動するバイオマーカーを意味する。２種以上の肝毒性標品化合物に共通のバイオマーカーを見出し、当該バイオマーカーを用いれば、より高い精度でヒトに対する肝毒性の少ない化合物をスクリーニングすることが可能となる。
【００４４】
本発明者らは、具体的な肝毒性標品化合物として４−ヒドロキシアニソール（４−ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ）およびニメスリド（ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）の２種類を用い、それぞれラットに投与して、投与前後の尿を採取し、メタボロミクスを用いてバイオマーカーの特定を行った（詳細は、実施例を参照のこと）。その結果、表１に示す３９成分をバイオマーカーとして特定した。したがって、本発明のスクリーニング方法において用いられるバイオマーカーは、表１に示される化合物からなる群より選ばれることが好ましい。
【００４５】
さらに、本発明者らは、具体的な肝毒性標品化合物として、２種の反応性代謝物を生成する化合物群、具体的には、反応性代謝物としてニトロアニオンラジカルを生成する化合物群（例えば、ニメスリド、ニトロフラントイン（ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ））、および反応性代謝物としてキノンを生成する化合物群（例えば、４−ヒドロキシアニソール、アセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ）、アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ））を用い、それぞれラットに投与して、投与前後の尿を採取し、メタボロミクスを用いて各種の化合物群に共通なバイオマーカーの特定を行った（詳細は、実施例を参照のこと）。その結果、表５−１、表５−２、表５−３、表６−１、表６−２、表６−３および表６−４に示すように、それぞれ４５および２２成分をバイオマーカーとして特定した。
【００４６】
したがって、本発明のスクリーニング方法において用いられるバイオマーカーは、その解析方法（主成分分析またはアレイ解析ソフトウェア）に応じて表１、表２−１および表２−２または表５−１、表５−２、表５−３、表６−１、表６−２、表６−３および表６−４に示される化合物からなる群より選ばれることが好ましい。
【００４７】
なお、表１、表２−１、表２−２、表５−１、表５−２、表５−３、表６−１、表６−２、表６−３および表６−４に記載の平均ｍ／ｚ値は、以下の測定機器および測定条件により得られた数値である（なお、表１、表２−１、表２−２、表５−１、表５−２、表５−３、表６−１、表６−２、表６−３および表６−４において、平均ｍ／ｚ値の表記は、データベース検索の項でも記載したように、ｍ／ｚ値±１００ｍＤａの許容範囲で示した）。
＜測定機器＞
ＬＣシステム：ＡＣＱＵＩＴＹTM  Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ              Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）
質量分析計  ：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ  ＰｒｅｍｉｅｒTM（Ｗａｔｅｒｓ製）
＜ＬＣ／ＭＳ条件＞
・カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣTM  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ  ２．１×１５０ｍｍ
・カラムオーブン温度：４０℃
・極性：ネガティブ
・流速：３００μＬ／分
・キャピラリー電圧：２７００Ｖ
・コーン電圧：３５Ｖ
・噴霧ガス温度：３５０℃
・イオンソース温度：１２０℃
・コーンガス流速：５０Ｌ／ｈ
・噴霧ガス流速：５００Ｌ／ｈ
・モード：Ｗモード
＜移動相条件＞
・移動相成分Ａ：０．１％ギ酸水溶液
・移動相成分Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
０分      １００％（Ａ）      ０％（Ｂ）
７分          ０％（Ａ）  １００％（Ｂ）
１４分          ０％（Ａ）  １００％（Ｂ）
１４．１分  １００％（Ａ）      ０％（Ｂ）
２１分      １００％（Ａ）      ０％（Ｂ）
【００４８】
【表１】
2009175141.tif 000002
【００４９】
表１に示した３９成分について、Ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ（http://hmdb.ca/labm/jsp/mlims/MSDbParent.jsp）、ＭａｓｓＢａｎｋ．ｊｐ（http://www.massbank.jp/QuickSearch.html）およびＭｅｔａｂｏｌｏｍｅ．ｊｐ（http://www.metabolome.jp/mass_search/）により検索したところ、３９成分中１６成分がヒットした。なお、データベース検索にはｍ／ｚ値±１００ｍＤａの許容範囲を設けた。表２−１および表２−２に示すように、平均ｍ／ｚ値によっては複数の化合物がヒットした。本発明のスクリーニング方法において用いられるバイオマーカーは、尿中代謝物の解析時に主成分分析を行った場合、表２−１および表２−２に示される化合物からなる群より選ばれることが好ましい。なお、表２−１および表２−２に記載の化合物名は、上記データベースでヒットした化合物名であり、バイオマーカーの正確な同定には、ＭＳ／ＭＳによる分析データなど、さらに詳細な情報が必要であることは言うまでもない。
【００５０】
【表２−１】
2009175141.tif 000003
【００５１】
【表２−２】
2009175141.tif 000004
【００５２】
［実施例］
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：血液生化学検査、病理組織学的検査およびＰＣＡ解析を用いたバイオマーカーの特定
〔実験材料および実験方法〕
（１）使用動物
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｙ系雄性ラット（Ｃｒｊ：ＣＤ（ＳＤ）、日本チャールスリバー）を７週齢で購入した。体重範囲は２１２．８ｇ〜２６３．９ｇであった。試験開始前６日間、動物を検疫し、馴化させた。検疫・馴化期間中は、ステンレスケージに５匹ずつラットを収容し、飼料（ＣＲＦ−１、オリエンタル酵母）および水を自由に摂取させた。飼育室の温度は２３℃±２℃、湿度は５５％±１０％に維持した。明暗サイクルは１２間毎とし、換気回数は１５回／時間とした。
【００５３】
検疫・馴化期間終了後、体重層別無作為化法により各群の平均体重がほぼ均一となるように群分けした。群分け後、採血群の動物については、ステンレスケージで個別飼育した。同時に、採尿群の動物については、ステンレス製の代謝ケージで個別飼した。
【００５４】
（２）肝毒性標品化合物および低リスク化合物
肝毒性標品化合物として４−ヒドロキシアニソール（４−ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ）およびニメスリド（ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）を使用した。両者とも前臨床試験を通過したにも関わらず、ヒトにおいて重篤な肝毒性が発現したことにより開発中止に追い込まれた薬剤である。すなわち、ラットでは微細であった毒性が、ヒトでは時として重篤に発現する場合があることを現実に示した薬剤である。
【００５５】
４−ヒドロキシアニソールは悪性メラノーマに対して活性を示す脱色素薬剤として開発された（Eur J cancer. 28A(8-9), 1362-1364 (1992)）が、残念ながらフェーズ１においてグレード４の重大な肝毒性が起こり、最終的にこの化合物は薬剤開発から省かれた。また、ニメスリドはＣＯＸ−２を特異的に阻害する非ステロイド系抗炎症薬であり、抗炎症や痛覚症状に対して使用されていた。しかしながら，この化合物はまれに重度の肝機能障害と肝障害が臨床で確認され（Journal of Hepatology, 135-141 (1998)）、市場から撤回された。
【００５６】
一方、ヒトにおいて肝毒性が報告されていない低リスク化合物としてジピリダモールを用いた。ジピリダモールは、冠血管拡張剤として広く臨床使用されている。
【００５７】
ニメスリドおよびジピリダモールはＳＩＧＭＡから購入した。４−ヒドロキシアニソールは東京化成から購入した。４−ヒドロキシアニソールおよびジピリダモールはコーンオイル（和光純薬）を溶媒とし、ニメスリドは０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース（和光純薬）を溶媒として、１、１０および１００ｍｇ／ｍＬに用時調製した。
【００５８】
（３）試験デザイン
１群５匹のラットに、４−ヒドロキシアニソール、ニメスリドまたはジピリダモールを、それぞれ１０、１００および１０００ｍｇ／ｋｇ（投与容量：１０ｍＬ／ｋｇ）で単回強制経口投与した。溶媒対照群として、コーンオイル投与群および０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース投与群を設けた。さらに、無処置対照群を設けた。投与当日の投与前に測定した体重に基づいて、各個体の投与容量を算出した。投与時を０時間とした。投与溶液は用時調製した。
【００５９】
尿は、投与前に２回採取し（−２４〜−１７時間、および−１７〜０時間）、投与後に３回採取した（０〜７時間、７〜２４時間、２４〜４８時間）。採取した尿を３０００ｒｐｍで２０分間（４℃）遠心分離し、その上清にアジ化ナトリウムを最終濃度０．０２％となるように添加して、測定まで超低温フリーザーで保存した。血液は、−２４時間、７時間、２４時間および４８時間に、無麻酔下でラットを定位固定装置に固定し、頸静脈から採取した。採血後３０分以内に、３０００ｒｐｍで２０分間（４℃）遠心分離し血漿を分離した。フィブリンの凝固が形成された後、３０００ｒｐｍで１０分間（４℃）、再度遠心分離した。得られた血清を、測定まで超低温フリーザーで保存した。
【００６０】
（４）血液生化学検査および病理組織学的検査
肝機能のマーカーとして、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）について血清中の濃度を測定した。測定には、自動分析機（ＡＵ６４０、オリンパス）を使用した。
【００６１】
肝臓を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。定法に従って、各サンプルから外側左葉のパラフィン切片（厚さ約２−３μｍ）を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を施した。このＨＥ染色切片により病理組織学的評価を行った。
【００６２】
（５）統計処理
データは平均値±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。統計的有意性は、ダネットの多重比較検定に続くＳＡＳにより評価し、Ｐ＜０．０５の場合有意差有りとした。
【００６３】
（６）ＵＰＬＣ／ＭＳ分析
ＵＰＬＣ分析に供するために、５０μＬの尿に０．１％のギ酸を含む水１５０μＬを添加して混和し、１６０００Ｇで３分間（４℃）の遠心分離することにより得られた上清を、２μｍのＰＴＦＥフィルタでろ過した。
【００６４】
用いた機器はＵＰＬＣ／ＭＳシステムであり、高圧高速液体クロマトグラフィー部分は、ＡＣＱＵＩＴＹTM  Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）、質量分析計は、直交加速飛行時間型のＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ  ＰｒｅｍｉｅｒTM（Ｗａｔｅｒｓ製）を組み合わせたシステムを用いた。ＬＣ／ＭＳの条件は、カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣTM  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ  ２．１×１５０ｍｍ、カラムオーブン温度：４０℃、極性：ネガティブ、流速：３００μＬ／分、キャピラリー電圧：２７００Ｖ、コーン電圧：３５Ｖ、噴霧ガス温度：３５０℃、イオンソース温度：１２０℃、コーンガス流速：５０Ｌ／ｈ、噴霧ガス流速：５００Ｌ／ｈ、モード：Ｗモードに設定した。
【００６５】
移動相には、移動相成分Ａとして０．１％ギ酸水溶液、移動相成分Ｂとして０．１％ギ酸アセトニトリル溶液を用い、流速３００μＬ／分でグラジエントさせる条件で溶出させた。組成は、７分間で移動相成分Ｂを０〜１００％まで直線的に増加させ、続いて７分間１００％の移動相成分Ｂを流した後、０．１分間で移動相成分Ａを１００％に戻し、その後次のサンプル注入までの最後の７分間で再平衡化した。
【００６６】
（７）データ処理および多変量解析
高圧高速液体クロマトグラフィーのデータ処理には、ピーク検出、アライメントおよび再検出を行うことができるＭＺｍｉｎｅ（参考：Bioinformatics 22 2006 634-636）を用いた。
【００６７】
具体的には、ＵＰＬＣ／ＭＳの生データをｎｅｔＣＤＦフォーマット（ＡＮＤＩファイル）に変換し、これをＭＺｍｉｎｅで開いた。解析対象データを選択し、ピーク検出を行った。ピーク検出のパラメータは、以下のように設定した。
・ｍ／ｚ  ｂｉｎ  ｓｉｚｅ：０．１
・Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｌｅｖｅｌ：０％
・Ｎｏｉｓｅ  ｌｅｖｅｌ：５
・Ｍｉｎｉｍｕｍ  ｐｅａｋ  ｈｅｉｇｈｔ：２００
・Ｍｉｎｉｍｕｍ  ｐｅａｋ  ｄｕｒａｔｉｏｎ：５
・Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍ／ｚ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ:０．１
・Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ：２０％
次に、アライメントを行った。アライメントのパラメータは以下のように設定した。
・Ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍ／ｚ  ａｎｄ  Ｒｔ：１０．０
・ｍ／ｚ  ｔｏｒｅｌａｎｃｅ  ｓｉｚｅ：０．１
・ＲＴ  ｔｏｒｅｌａｎｃｅ  ｔｙｐｅ：Ａｂｓｏｌｕｔｅ（ｓｅｃｏｎｄｓ）
・ＲＴ  ｔｏｒｅｌａｎｃｅ  ｓｉｚｅ：７
次に、Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｒｅｓｕｌｔｓ欄に新しくできたデータを選択して検出ミスおよびノイズ除去を行った。ノイズ除去のパラメータは以下のように設定した。
・ｇｉｖｅ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ：５
次に、Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｒｅｓｕｌｔｓ欄に新しくできたデータを選択してピークの再検出を行った。ピーク再検出のパラメータは以下のように設定した。
・ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：１０％
・ｍ／ｚ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｓｉｚｅ：０．１
・ＲＴ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｙｐｅ：Ａｂｓｏｌｕｔｅ（ｓｅｃｏｎｄｓ）
・ＲＴ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｓｉｚｅ：７
次に、Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｒｅｓｕｌｔｓ欄に新しくできたデータを選択してノーマライズを行った。ノーマライズの方法は、Ｔｏｔａｌ  ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌを選択した。ノーマライズ後、Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｒｅｓｕｌｔｓ欄に新しく作成されたＡｌｉｇｎｍｅｎｔファイルを選択してテキスト形式で保存し、ピークテーブルを得た。
【００６８】
本実施例では、多変量データのグループ間での類似性または相違点に関して表される関係を把握するためのケモメトリクス解析の手法として、主成分分析（以下「ＰＣＡ」と記す）を選択した。ＰＣＡは、市販のソフトウェアであるＰｉｒｏｕｅｔｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍｅｔｒｉｘ社）を用いて行った。
【００６９】
まず、Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅを用いてＰＣＡを行うために、テキスト形式のピークテーブルの体裁をＰｉｒｏｕｅｔｔｅに適合させるための処理を行った。具体的には、テキスト形式で保存したデータをエクセルで開き、「Ａｖｅｒａｇｅ  ｍ／ｚ」の列および「Ａｖｅｒａｇｅ  ＲＴ」の列、並びに各検体の生データの列を残し、これら以外を削除した。次に、「Ａｖｅｒａｇｅ  ｍ／ｚ」の数値および「Ａｖｅｒａｇｅ  ＲＴ」の数値が１つの列に表示されるようにし、不要の列を削除した。得られたファイルをエクセルブック形式で保存した。このエクセルブック形式のピークテーブルは、各検体について、ＲＴ値およびｍ／ｚ値で特定されるピークの強度が示されたものとなっている。
【００７０】
続いて、Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅの説明書に従い、エクセルブック形式で保存したファイルを「Ｏｂｊｅｃｔ  ｍａｎａｇｅｒ」に移し、多変量解析を行った。多変量解析ボタンをクリックすると「Ｒｕｎ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒｅ」ウインドウが開くので、ＡｌｇｏｒｉｔｈｍでＰＣＡを選択し，Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ＳｅｔｓでＦｕｌｌ  Ｄａｔａを選択し、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｓでデータ前処理法を選択した後、Ｒｕｎをクリックすることにより、ＰＣＡを実行した。
【００７１】
〔実験結果〕
（１）死亡動物
１０００ｍｇ／ｋｇのニメスリドを投与された全ての動物が投与当日中に死亡した。４−ヒドロキシアニソールまたはジピリダモールを投与された動物は死亡しなかった。
【００７２】
（２）血液生化学検査
投与２４時間前、投与後７、２４および４８時間目に採血して得た血清を用いて生化学マーカーを測定した。ＡＳＴおよびＡＬＴの結果を表３に示した。表３に示したように、４−ヒドロキシアニソールの１０００ｍｇ／ｋｇ投与群の２４時間目において、ＡＳＴが僅かに増加した。一方、ニメスリド投与群およびジピリダモール投与群には顕著な変化が認められなかった。
【００７３】
【表３】
2009175141.tif 000005
【００７４】
（３）病理組織学的検査
投与後４８時間目に採取した肝臓の病理組織学的検査結果を表４に示した。表４に示したように、４−ヒドロキシアニソールの１０００ｍｇ／ｋｇ投与群において、軽度の肝細胞微小細管空砲変性が５匹中１匹に、中等度の肝細胞壊死が５匹中１匹に認められた。また、ニメスリドの１０００ｍｇ／ｋｇ投与群において、軽度の肝細胞微小細管空砲変性、肝細胞の単一細胞壊死およびクッパー細胞の拡張または増加が、死亡した全動物に見出された。また、死亡した５匹中１匹に肝細胞の空砲変性が認められた。ジピリダモールの１０００ｍｇ／ｋｇ投与群において、軽度の肝細胞微小細管空砲変性が５匹中１匹に、肝細胞の細胞分裂が５匹中１匹に認められた。
【００７５】
４−ヒドロキシアニソール、ニメスリドおよびジピリダモールのいずれの化合物についても、１００ｍｇ／ｋｇ以下の用量において特有の病理組織学的所見は見出されなかった。
【００７６】
【表４】
2009175141.tif 000006
【００７７】
（４）ＰＣＡ解析結果
ＵＰＬＣ−ＴＯＦＭＳのデータで得られるｍ／ｚ情報は、クラスター形成や溶媒などのアダクトを除き、通常１つの化合物に対応している。したがって、それぞれのｍ／ｚイオンクロマト情報を用いたピークリストは未同定化合物のピークリストと考えられる。ピーク検出とアライメントをＭＺｍｉｎｅにて行い、ピークテーブルを作成し、５５１９個のリストを得、検体あたり５５１９個の全データをＰＣＡ解析に供した。
【００７８】
結果を図１、図２および図３に示した。図１（ａ）は無処置対照群、（ｂ）はコーンオイル（溶媒）投与群、（ｃ）は０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース（溶媒）投与群、（ｄ）はジピリダモール１０００ｍｇ／ｋｇ投与群のＰＣＡ解析結果のスコアプロットを示す図である。図１（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に示したように、無処置対照群および２種類の溶媒対照群においては、サンプリング時間による分離の傾向が見られたが、ほぼ重なっていることが観察された。また、図１（ｄ）に示したように、低リスク化合物として用いたジピリダモール投与群においても、無処置対照群および２種類の溶媒対照群と同様の傾向が観察された。
【００７９】
図２は、４−ヒドロキシアニソール投与群のＰＣＡ解析結果のスコアプロットを示す図であり、（ａ）は１０００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｂ）は１００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｃ）は１０ｍｇ／ｋｇ投与群の結果を示す図である。図２（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に実線矢印で示したように、４−ヒドロキシアニソール投与群では、すべての用量において投与後の分離が観察された。すなわち、血液生化学検査および病理組織学的検査で影響が認められた１０００ｍｇ／ｋｇ投与群のみでなく、１００ｍｇ／ｋｇ投与群および１０ｍｇ／ｋｇ投与群でも投与後の分離が観察された。また、図２（ｂ）および（ｃ）に点線矢印で示したように、１００ｍｇ／ｋｇ投与群および１０ｍｇ／ｋｇ投与群では、投与後２４時間以降に通常の状態（投与前の状態）に戻る傾向が観察された。これらの結果から、４−ヒドロキシアニソールをラットに投与した場合、投与用量が１０００ｍｇ／ｋｇでは肝細胞に明らかな障害が起こるが、１００ｍｇ／ｋｇ以下の用量では、すぐに回復する程度の軽微な影響を肝臓に与えていることが推測された。
【００８０】
図３は、ニメスリド投与群のＰＣＡ解析結果のスコアプロットを示す図であり、（ａ）は１０００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｂ）は１００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｃ）は１０ｍｇ／ｋｇ投与群の結果を示す図である。図３（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に実線矢印で示したように、ニメスリド投与群では、すべての用量において投与後の分離が観察された。すなわち、投与後７時間目以降に全ての動物が死亡した１０００ｍｇ／ｋｇ投与群のみでなく、血液生化学検査および病理組織学的検査で何ら影響が認められなかった１００ｍｇ／ｋｇ投与群および１０ｍｇ／ｋｇ投与群においても投与後の分離が観察された。
【００８１】
ここで、ニメスリド投与群においては、４−ヒドロキシアニソール投与群の分離と異なる特徴を有することが認められた。具体的には、４−ヒドロキシアニソール投与群では、投与用量が少ない場合にはその影響がすぐに回復していたが、ニメスリド投与群では、投与用量が少ないときにはその影響が発現するまでに時間がかかる傾向が認められた。
【００８２】
（５）分析データからのバイオマーカー成分のスクリーニング
上記（４）で示したように、ＵＰＬＣ−ＴＯＦＭＳ分析によって得られた全データを用いたＰＣＡ解析の結果、肝毒性標品化合物である４−ヒドロキシアニソールおよびニメスリドにおいて、分離クラスターが形成されることが明らかとなった。しかし、得られた全データ（５５１９ピーク）が必要であるわけではなく、特徴を多く保有する化合物をバイオマーカーとして選別することが必要である。そこで、最も多くの特徴を表していると考えられる４−ヒドロキシアニソール１０００ｍｇ／ｋｇ投与群とニメスリド１００ｍｇ／ｋｇ投与群のＰＣＡの結果をローディングプロットし、分離に大きく寄与している成分をローディングの値よりそれぞれピックアップすることを試みた。
【００８３】
図４にＰＣＡ解析結果をローディングプロットにより示した。図４（ａ）は４−ヒドロキシアニソール１０００ｍｇ／ｋｇ投与群の結果であり、（ｂ）はニメスリド１００ｍｇ／ｋｇ投与群の結果である。図４中、Ｘ軸はファクター１のローディング値、Ｙ軸はファクター２のローディング値である。図４（ａ）および（ｂ）における黒点は、プロットした全成分から、ファクター１のローディング値について絶対値が大きい成分を正負それぞれ約１０００個ずつ選別したものである。
【００８４】
図４（ａ）および（ｂ）に示したように、４−ヒドロキシアニソール１０００ｍｇ／ｋｇ投与群について約１２７７成分、ニメスリド１００ｍｇ／ｋｇ投与群について約９３７成分を、ファクター１のローディング値に基づいてそれぞれ選別した。次に、共通の成分およびファクター１の分離と正負が一致する成分のみ約１００成分を選別した。選別された約１００成分のデータを用いてそれぞれＰＣＡを行い、分離クラスターが形成されることを確認した。さらに、同位体や多量体およびノイズピークを除いた３９成分を選別し、２つの化合物の影響に関して特徴を有するバイオマーカーとして特定した（表１参照）。
【００８５】
（６）スクリーニングされたバイオマーカー（３９成分）を用いたＰＣＡ解析結果
選別された３９成分を用いてＰＣＡ解析を行った。結果を図５、図６および図７に示した。図５（ａ）は無処置対照群、（ｂ）はコーンオイル（溶媒）投与群、（ｃ）は０．５％メチルセルロース（溶媒）投与群、（ｄ）はジピリダモール１０００ｍｇ／ｋｇ投与群のＰＣＡ解析結果のスコアプロットを示す図である。図５（ａ）〜（ｄ）に示したように、無処置対照群、２種類の溶媒対照群および低リスク化合物として用いたジピリダモール投与群では、全データを用いたＰＣＡ解析結果（図１（ａ）〜（ｄ）参照）と同様に、顕著な変化は認められなかった。
【００８６】
図６は、４−ヒドロキシアニソール投与群のＰＣＡ解析結果のスコアプロットを示す図であり、（ａ）は１０００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｂ）は１００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｃ）は１０ｍｇ／ｋｇ投与群の結果を示す図である。全データを用いたＰＣＡ解析結果（図２（ａ）〜（ｃ）参照）と同様に、４−ヒドロキシアニソール投与群では、すべての用量において投与後の分離が観察された（図６（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の実線矢印）。また、１００ｍｇ／ｋｇ投与群および１０ｍｇ／ｋｇ投与群では、時間経過による回復が観察された（図６（ｂ）および（ｃ）の点線矢印）。
【００８７】
図７は、ニメスリド投与群のＰＣＡ解析結果のスコアプロットを示す図であり、（ａ）は１０００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｂ）は１００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｃ）は１０ｍｇ／ｋｇ投与群の結果を示す図である。全データを用いたＰＣＡ解析結果（図３（ａ）〜（ｃ）参照）と同様に、ニメスリド投与群では、すべての用量において投与後の分離が観察された（図７（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の実線矢印）。
【００８８】
以上のように、２種類の肝毒性標品化合物（４−ヒドロキシアニソールおよびニメスリド）を投与されたラット尿を試料としたＵＰＬＣ／ＭＳ分析の全データから選別された３９成分のバイオマーカーを用いてＰＣＡ解析を行うことにより、これらが、当該肝毒性標品化合物で共通に変動するものであって、ヒト肝毒性の指標となるバイオマーカーとして用いることが可能であることがわかった。
【００８９】
（７）マーカーの同定
全データから選別された３９成分について、Ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ（http://hmdb.ca/labm/jsp/mlims/MSDbParent.jsp）、ＭａｓｓＢａｎｋ．ｊｐ（http://www.massbank.jp/QuickSearch.html）およびＭｅｔａｂｏｌｏｍｅ．ｊｐ（http://www.metabolome.jp/mass_search/）により検索したところ、３９化合物中１６化合物がヒットした（表２−１および表２−２参照）。
実施例２：アレイ解析ソフトウェアを用いたバイオマーカーの特定
〔実験材料および実験方法〕
実施例１の〔実験材料および実験方法〕記載の（１）、（２）、（３）、（６）および（７）に準じた方法で尿中代謝物をサンプリングし、アレイ解析ソフトウェアとしてＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（登録商標；Ｇｅｎｅｄａｔａ社）を用いてバイオマーカーを特定した。実施例１と異なる箇所を下記に詳述する。
【００９０】
（１）使用動物について、実施例１と同様のものを使用した。
【００９１】
（２）肝毒性標品化合物について、実施例１で使用した４−ヒドロキシアニソールおよびニメスリドに加えて、４−ヒドロキシアニソールと同様に反応性代謝物としてキノン体を生じ得る既知の肝毒性標品化合物であるアセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎｅ）およびアモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）を（これら３化合物を実験群１とする。）、ニメスリドと同様に反応性代謝物としてニトロアニオンラジカルを生じ得る既知の肝毒性標品化合物であるフルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）およびニトロフラントイン（ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）（これら３化合物を実験群２とする。）の計６化合物を使用した。
【００９２】
４−ヒドロキシアニソールは東京化成から購入し、これ以外の５化合物はいずれもＳＩＧＭＡ社から購入した。
【００９３】
（３）試験デザインについて、１群５匹のラットに、以下に示すように肝毒性標品化合物をそれぞれラットに単回強制経口投与した。４−ヒドロキシアニソール（１００ｍｇ／ｋｇ）、アセトアミノフェン（１０、１００および１０００ｍｇ／ｋｇ）、アモジアキン（５、５０および５００ｍｇ／ｋｇ）、ニメスリド（１００ｍｇ／ｋｇ）、フルタミド（３０、１００および３００ｍｇ／ｋｇ）、ニトロフラントイン（３０、１００および３００ｍｇ／ｋｇ）。４−ヒドロキシアニソールはコーンオイル（和光純薬）を溶媒とし、それ以外の肝毒性標品化合物については０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース（和光純薬）を溶媒として調製した。４−ヒドロキシアニソールおよびニメスリドは１０ｍｇ／ｍＬ，アセトアミノフェンは１、１０および１００ｍｇ／ｍＬ，アモジアキンは０．５、５および５０ｍｇ／ｍＬ、フルタミドおよびニトロフラントインは３、１０および３０ｍｇ／ｍＬに調製した。溶媒対照群として０．５ｗ／ｖ％メチルセルロースを投与した。
【００９４】
また、尿は投与前に１回採取し（−２４〜０時間）、投与後に５回採取した（０〜７時間、７〜２４時間、２４〜４８時間、４８〜７２時間および７２〜９６時間）。以降の試料の処理方法は実施例１と同様である。
【００９５】
（６）ＵＰＬＣ／ＭＳ分析について、実施例１と同様の方法で尿中代謝物の各データを取得した。
【００９６】
（７）データ処理について、上記（６）で得られた高圧高速液体クロマトグラフィーのデータ処理は、実施例１と同様にＭＺｍｉｎｅを用いてピークテーブルを作成した。
【００９７】
当該ピークテーブルから、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔを用いて下記の手順に従ってバイオマーカーの特定を行った。
【００９８】
特定の化合物でのみ発現増加するピークを特定し、それ以外でバッググラウンドレベルのピークを除外した。残りのピークの平均値（合計値）が同じになるようにノーマライズ（補正）を行った。媒体対照群と各肝毒性標品化合物投与群との２群間において、Welchのｔ検定を行い、変動比が２以上、ｐ値が0.05または0.01より小さい値を示したピークを特定し、変動ピークとして選択した。いずれかの尿サンプル採取のタイミングで変動が見られたピークを抽出した。実験群１および２のそれぞれにおいてこの変動が見られたピークのうち、３化合物のうち２化合物で変動したピークに限定した。各実験群の各投与量について、上記したピークの抽出作業を行い、得られた変動ピークを和集合のバイオマーカー候補化合物とした。さらに、これらの各ピークの発現変動を確認し、尿中代謝物における肝毒性発現の指標となり得るバイオマーカーを絞り込んだ。
〔実験結果〕
（１）アレイ解析ソフトを用いて抽出されたバイオマーカー成分の同定
上記実施例２の方法に基づいて絞り込んだバイオマーカーについて、実施例１記載の３種のデータベースにより検索したところ、実験群１および実験群２において、それぞれ４５および２２化合物が同定できた（実験群１の結果は、表５−１、表５−２および表５−３で示し、実験群２の結果は、表６−１、表６−２、表６−３および表６−４で示した）。したがって、本発明のスクリーニング方法において用いられるバイオマーカーは、尿中代謝物の解析時にアレイ解析ソフトウェアを用いた場合、表５−２、表５−３、表５−４、表６−２、表６−３および表６−４に示される化合物からなる群より選ばれることが好ましい。
【００９９】
【表５−１】
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【０１００】
【表５−２】
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【０１０１】
【表５−３】
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【０１０２】
【表６−１】
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【０１０３】
【表６−２】
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【０１０４】
【表６−３】
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【０１０５】
【表６−４】
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【０１０６】
これらのことから、メタボロミクスを用いた肝毒性評価において、尿中代謝物の解析方法として、主成分分析またはアレイ解析ソフトウェアを組み合わせることによって、２種以上の肝毒性標品化合物で共通して変動することが特定されたバイオマーカーを見出すことができた。さらにこれらのバイオマーカーを利用することによって、被験化合物の投与前後および媒体対照群と被験化合物の２群間で、当該バイオマーカーの変動の有無を検出することができるため、ヒトに対する肝毒性の少ない化合物のスクリーニングを行うことが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明によれば、メタボロミクスを用いた肝毒性評価において、２種以上の肝毒性標品化合物によって特定されたバイオマーカーを利用するため、高精度でかつ汎用性の高い、ヒトに対する肝毒性の少ない化合物をスクリーニングする方法を提供することができる。さらに、本発明は、臨床開発段階での利用および臨床での低分子医薬品投与におけるヒト肝障害予測診断へも応用可能である。したがって、本発明は、医薬品開発において多大な貢献をもたらすものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】全データ（５５１９個）を用いたＰＣＡ解析結果のスコアプロットを示す図であり、（ａ）は無処置対照群、（ｂ）はコーンオイル（溶媒）投与群、（ｃ）は０．５％メチルセルロース（溶媒）投与群、（ｄ）はジピリダモール１０００ｍｇ／ｋｇ投与群の結果を示す図である。
【図２】全データ（５５１９個）を用いた４−ヒドロキシアニソール投与群のＰＣＡ解析結果のスコアプロットを示す図であり、（ａ）は１０００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｂ）は１００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｃ）は１０ｍｇ／ｋｇ投与群の結果を示す図である。
【図３】全データ（５５１９個）を用いたニメスリド投与群のＰＣＡ解析結果のスコアプロットを示す図であり、（ａ）は１０００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｂ）は１００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｃ）は１０ｍｇ／ｋｇ投与群の結果を示す図である。
【図４】全データ（５５１９個）を用いたＰＣＡ解析結果をローディングプロットにより示した図であり、（ａ）は４−ヒドロキシアニソール１０００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｂ）はニメスリド１００ｍｇ／ｋｇ投与群の結果である。
【図５】３９成分のバイオマーカーのデータを用いたＰＣＡ解析結果のスコアプロットを示す図であり、（ａ）は無処置対照群、（ｂ）はコーンオイル（溶媒）投与群、（ｃ）は０．５％メチルセルロース（溶媒）投与群、（ｄ）はジピリダモール１０００ｍｇ／ｋｇ投与群の結果を示す図である。
【図６】３９成分のバイオマーカーのデータを用いた４−ヒドロキシアニソール投与群のＰＣＡ解析結果のスコアプロットを示す図であり、（ａ）は１０００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｂ）は１００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｃ）は１０ｍｇ／ｋｇ投与群の結果を示す図である。
【図７】３９成分のバイオマーカーのデータを用いたニメスリド投与群のＰＣＡ解析結果のスコアプロットを示す図であり、（ａ）は１０００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｂ）は１００ｍｇ／ｋｇ投与群、（ｃ）は１０ｍｇ／ｋｇ投与群の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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