(57)【要約】【課題】  従来技術では、ＰＣＲチューブ等の反応容器の蓋を開閉することなく、所望のタイミングで試薬を添加することが困難であった。【解決手段】  本発明に係る反応容器は、反応に用いる試薬を隔壁によって反応領域と隔離して反応容器内に具備し、前記隔壁は反応領域と別の温度制御を受けることができるように設けられており、前記隔壁を加熱によって融解させることで、前記試薬を反応領域に放出する可能に構成されていることを特徴とする。したがって、本発明に係る反応容器では、反応領域において反応を行った後に、隔壁を加熱して融解させることで、隔離していた試薬を所望のタイミングで反応領域に放出することでき、次の段階の反応を蓋の開封を伴わずに連続して行うことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応溶液を収納し得る反応領域を有する容器内に、反応に用いる試薬を更に具備した反応容器であって、
前記試薬は隔壁によって前記容器内の反応領域と隔離されており、
前記隔壁は前記反応溶液と独立して温度制御可能に設置されており、
さらに、前記隔壁の少なくとも一部が加熱によって融解することで前記試薬を前記反応領域に放出可能に構成されていることを特徴とする反応容器。
【請求項２】
前記試薬が前記隔壁内に封入されて隔離されていることを特徴とする請求項１に記載の反応容器。
【請求項３】
前記試薬の種類が複数ある場合であって、試薬の種類毎に前記試薬保持領域を設け、複数の試薬保持領域のそれぞれが隔壁によって区分されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の反応容器。
【請求項４】
前記複数の試薬保持領域の有する隔壁の各々の少なくとも一部が、融点の異なる材料で構成されていることを特徴とする請求項３に記載の反応容器。
【請求項５】
前記融点が、前記複数の試薬保持領域からの試薬の放出順に応じて、高くなるように設定されていることを特徴とする請求項４に記載の反応容器。
【請求項６】
前記隔壁の融点が、一つ前の反応段階で放出される試薬を隔離する隔壁の融点に比べて、少なくとも１０℃以上の差があることを特徴とする請求項５に記載の反応容器。
【請求項７】
前記隔壁が、４０℃以上１００℃以下の温度範囲に融点を有し、かつ、反応に用いる試薬よりも比重が小さく、また、疎水性であるワックスからなることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の反応容器。
【請求項８】
前記試薬がＰＣＲに用いる試薬のうち少なくとも１つの試薬を含むことを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の反応容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学の分野で用いる反応容器に関する。また、この容器を用いた反応方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的な反応容器とは、試料が試薬との反応のために一定量供給される容器、及びそれに相当する場所のことである。バイオテクノロジー分野で使用される反応容器には、ビーカーや試験管、フラスコや遠沈管、マイクロチューブやウェルプレート、ＰＣＲチューブ等が挙げられる。特に酵素反応、核酸増幅反応、溶液調製反応等を行う際には、処理量に合わせたサイズのマイクロチューブを用いることが多い。マイクロチューブは、各種さまざまな物が市販されている。
【０００３】
代表的な酵素反応であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、試料中の特異的な核酸配列の濃度を、指数関数的に増幅させる化学反応である。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号及び同第４，９６５，１８８号明細書に記載されている。現在では、遺伝学、分子生物学、細胞生物学、分析生化学、臨床化学、法医学等様々な分野で広く使用されている。
【０００４】
ＰＣＲに用いる試薬は、通常、次の物を含んで成る。緩衝液（室温でｐＨ８〜９、０．０５Ｍ  ＫＣｌ）、マグネシウム化合物（０．０１５Ｍ  ＭｇＣｌ2）、４種のヌクレオシドトリフォスフェート（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ（１〜５ｍＭ）、オリゴヌクレオチドプライマー（１５〜３０塩基、１〜１００μＭ）、標的核酸等。
【０００５】
これらの試薬を一つの容器に入れ、加熱・冷却を繰り返すことにより、二本鎖標的核酸の解離反応、１本鎖標的核酸へのオリゴヌクレオチドプライマーの結合反応、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応、伸長された目的の標的核酸の解離反応が繰り返される。これらの反応をＮ回繰り返すことで、目的の標的核酸は２N倍で増幅する。反応回数を増やせば増やすだけ、目的の標的核酸は増幅していくが、加熱・冷却の繰り返しにより、増幅反応効率が低下する。この場合、反応の途中で新鮮なＤＮＡポリメラーゼを追加（補充）することで、ＤＮＡポリメラーゼの活性を保持し、増幅反応効率を維持することができる。
【０００６】
しかしながら従来、ＰＣＲの反応途中で試薬を追加する場合には、反応を行っているサーマルサイクラー装置から容器を取り出し、蓋を開封して試薬を添加する必要があった。この場合、手間がかかると共に試薬の添加に伴い、外部から汚染物質が混入する恐れが多かった。
【０００７】
また、ＰＣＲは何段階かに反応を分けて行う方法もある。例えばｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲの場合、最初のＰＣＲで増幅された配列に対して相補的な、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて二段階目の増幅反応を行うことで、反応の特異性を向上することができる。
【０００８】
従来この二段階目の増幅反応の実施は、別の容器に用意をしておいた二段階目の増幅反応溶液の中に、最初のＰＣＲで増幅された配列を含んだ溶液（Ｔｅｍｐｌａｔｅ溶液）を少量分注することで実施していた。この場合にも、最初のＰＣＲ終了後にサーマルサイクラー装置から容器を取り出し、別途用意をしておいた二段階目の増幅反応を行う別の容器の中に、Ｔｅｍｐｌａｔｅ溶液を入れ替えるという手間が生じていた。
【０００９】
蓋の開封をせずに反応の途中で試薬を添加する方法として、特許第３５３２８２６号明細書には次のような内容が記載されている。この方法では、ＰＣＲチューブ内において、ＰＣＲ試薬のうち少なくとも一つの試薬を上側に、他の試薬の混合物を下側にして、グリース又は蝋の隔壁を用いて隔離させている。標的核酸をグリース又は蝋の隔壁の上側にある試薬に添加した後、ＰＣＲを開始すると、数回の反応後にグリース又は蝋の隔壁が融解して隔離されていた試薬が混ざり合い、反応を続けることができる。
【００１０】
また、特開平６−２２７９６号公報では、マイクロカプセル中にＰＣＲ試薬を包含させた系を用いることで、蓋の開封を伴わない、連続した反応を可能にしている。この方法では、ＰＣＲ溶液中にマイクロカプセルを入れてＰＣＲを開始すると、数回の反応回数の後にカプセル中から試薬が放出され、全体が均一となって反応を続けることができる。
【００１１】
一方、所望のタイミングで試薬を添加し、連続して反応を行う方法として、特表２０００−５００６４７には次のような内容が記載されている。この方法では、反応容器内において、ＤＮＡ分子及びリガーゼ酵素を含む試薬を上側に、ＰＣＲ試薬を下側にして、ワックスの隔壁を用いて隔離させている。壁の上側の酵素反応（３７℃程度）が終了した後に熱でワックスの隔壁を融解し、下側の溶液と混ざり合い、ＰＣＲを開始することができる。
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４，９６５，１８８号明細書
【特許文献４】特許第３５３２８２６号明細書
【特許文献５】特開平６−２２７９６号公報
【特許文献６】特表２０００−５００６４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、上述した蝋やマイクロカプセルを利用する場合、ＰＣＲ開始時から、反応溶液とグリース若しくは蝋の隔壁又はマイクロカプセルが接触しているため、反応溶液の温度変化がグリース若しくは蝋の隔壁又はマイクロカプセルに直接伝わってしまうことになる。したがって、反応中における長時間にわたって試薬を反応領域と分離した状態で維持しておく場合には適さない。さらには、所望のタイミングで試薬を添加することが困難な場合があった。
【００１３】
一方、特表２０００−５００６４７号公報に記載される方法は、所望のタイミングで試薬を添加し、連続して反応を行う方法ではあるが、温度制御を受ける反応領域内に隔離された試薬が存在するため、上側の酵素反応は、ワックスの融点以下の温度でしか反応を行えなかった。
【００１４】
これらのことから従来の技術では、ＰＣＲチューブ等の反応容器の蓋を開閉することなく、所望のタイミングで試薬を添加することが困難であった。また、同一容器内に複数の試薬を長時間保持させたまま反応を行い、反応中又は反応後に所望のタイミングで、一つずつ試薬を添加して反応を繰り返すことが困難であった。本発明の目的は、かかる従来技術における課題を解決することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の課題は下記の本発明によって解決することができる。
【００１６】
本発明に係る反応容器は、
反応溶液を収納し得る反応領域を有する容器内に、反応に用いる試薬を更に具備した反応容器であって、
前記試薬は、隔壁によって前記容器内の反応領域と隔離されており、
前記隔壁は、前記反応溶液と独立して温度制御可能に設置されており、
さらに、前記隔壁の少なくとも一部が加熱によって融解することで、前記試薬を前記反応領域に放出可能に構成されていることを特徴とする。
【００１７】
本発明に係る反応容器では、反応領域において反応を行った後に、隔壁を加熱して融解させることで、隔離していた試薬を所望のタイミングで反応領域に放出することでき、次の段階の反応を蓋の開封を伴わずに連続して行うことができる。また、試薬は隔壁によって反応領域と空間を設けて隔離されているため、反応領域での反応温度は制限されずに、試薬の添加と反応を複数回繰り返すことができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、反応容器を開閉することなく反応領域へ所望のタイミングで試薬を添加することが可能である。また複数段階の反応系において、同一容器内で連続して反応を行うことが可能となり、従来行っていたマイクロチューブの遠心や、容器の入れ替え等の工数が削減できる。これにより、反応中に外部との接触（汚染物質や阻害物質の混入や、大気との接触）を極力避けることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、同一容器内で複数段階の反応を連続して行う場合に好適な反応容器、及びこの容器を用いた反応方法に関するものである。
【００２０】
複数段階の反応とは、第一段階目の反応の途中又は第一段階目の反応終了後に、容器の蓋を開閉することなく試薬を添加し（後期添加）、その後の反応を継続又は開始することを意味する。この試薬の添加と反応を繰り返すことで、同一容器内で複数段階の反応を連続して繰り返し行うことができる。また、必要に応じて、第一段階目の反応を、試薬の添加により開始してもよい。更に、複数回の試薬添加を行う場合は、各回毎に試薬の種類を設定すればよく、各回で同一の試薬を添加する場合や異なる試薬を添加する場合などがある。
【００２１】
以下、第一段回目の反応を開始してから試薬を後期添加する場合について説明する。この場合において、第一段階目の反応を行うための試薬を出発用試薬と呼び、後で添加する少なくとも１種の試薬を総称して添加用試薬と呼ぶ。添加用試薬のうち一つ目の所望の試薬を添加した後の反応を、第二段階目の反応、さらに二つ目の所望の試薬を添加した後の反応を第三段階目の反応と呼ぶ。同一容器内で二段階の反応を行う場合には、容器内には出発用として第一の試薬と添加用として第二の試薬を有していれば良い。同一容器内で三段階の反応を行う場合には、容器内には出発用としての第一の試薬と、添加用として第二の試薬及び第三の試薬を有していれば良い。なお、これらの試薬は、単一の試薬であっても、複数種の試薬の混合物、あるいは複数種の試薬と担体や媒体とを含む組成物であってもよい。
【００２２】
本発明を適用できる反応容器の構成の好ましい例について、図を用いて説明する。以下に説明する図は、本発明の一例であって、形状や大きさ等これらに限定されない。
【００２３】
図１に示した反応容器は、二段階の反応を行うための構成を有する反応容器である。この反応容器は、容器内に、反応溶液としての第一の試薬（１）（出発用）と第二の試薬（２）（添加用）が収納されている。第一の試薬（１）が配置された反応領域と第二の試薬（２）が配置された試薬保持領域は第１の隔壁（３）で区分されており、第一の試薬（１）と隔壁（３）は、反応領域内の気相部としての空間（４）を持って隔離されている。さらに、この反応容器では、第一の試薬（１）と第二の試薬（２）は別々の温度制御可能な構成及び配置をとっている。第二の試薬（２）を封入する第１の隔壁（３）の少なくとも一部を融解することにより、所望のタイミングで第二の試薬（２）を反応領域（５）へ放出し、第一の試薬（１）に添加することが可能である。ここで、反応領域（５）とは、温度制御を受けて反応を行う反応容器の内部部分をいう。
【００２４】
図１に示した構成の反応容器では、隔壁（３）は、第一の試薬（１）とは接していない。更に、図２に示したように、第一の試薬（１）に、隔壁と同じように、少なくとも一部が加熱溶融可能である蓋（６）を設けた構成としても良い。図２に示した構成の反応容器とした場合、第一段階目の反応中、溶液（第一の試薬）の蒸発を防止することが可能となる。図２に示した構成の場合でも、第一の試薬（１）と第二の試薬（２）は、空間（４）及び隔壁（３）によって隔離されていることが特徴である。なお、第二の試薬を封入した頭部と、第一の試薬の充填が可能な、すなわち第一の試薬を充填する前の容器部分から本発明の反応容器を構成してもよい。後述する反応容器についても同様の構成を採りえる。
【００２５】
また、図１及び図２に示した本発明を適用できる反応容器は、図３に示すように、サーマルサイクラー等の装置により温度制御を受けることが可能である。図３は本発明を適用できる反応容器（図２に示した構成の反応容器）をサーマルサイクラー装置へセットした時の略図である。このような装置により、反応領域（５）を第一の温度制御部（７）で温度制御することができる。一方、第二の試薬（２）及び第１の隔壁（３）を有する反応容器の部分は、第二の温度制御部（８）により反応領域と独立して温度制御することができる。なお、第一の温度制御部（７）で温度制御を受ける反応容器の内部部分が反応領域（５）である。
【００２６】
次に、本発明を適用できる構成を有する反応容器の他の例について、図４を用いて説明する。図４に示した反応容器は、三段階の反応を行うことができる構成を有する反応容器である。使用する反応容器自体の基本的構造は図１に示したものと同じであるが、第二の試薬（２）及び第三の試薬（９）がそれぞれ異なる隔壁（第１の隔壁（３）及び第２の隔壁（１０））で隔離されていることに特徴がある。また、かかる構成を有する反応容器においても、図２に示した場合と同様に、第一の試薬（１）に蓋をする形態で隔壁２（６）を設けても良い。ここで、試薬を隔離するには、例えば、隔壁内に試薬を封入して反応領域以外の容器内部に保持させることによってもできる。
【００２７】
また、図５に示したように、第２の隔壁（１０）を第１の隔壁（３）と接しないように配置させることで、第２の隔壁（１０）と第１の隔壁（３）の温度制御を別個に行える構成としても良い。この場合は、第三の試薬（９）を隔離する第２の隔壁（１０）は、第二の試薬を隔離する第１の隔壁（３）と同じ材料又は近似の融点を有する材料を用いることが可能であるが、第１の隔壁（１０）が付着している部分を局所的に加熱する必要がある。しかし、後述するように、それぞれの隔壁に異なる融点を有する材料を用いれば、第二の試薬（２）と第三の試薬（９）を隔離する隔壁（第１の隔壁（３）及び第２の隔壁（１０））を同時に加熱することが可能である。
【００２８】
さらに、図２に示した第１の隔壁（３）の中に複数の試薬を個別に配置させても良い（不図示）。複数の試薬を一つの隔壁中に種類毎に隔離しておくことは、反応領域へ複数の試薬を同時に添加するのに好ましい形態である。また、試薬を隔離して保存しておくことにより、試薬の保存安定性の向上等を図ることができる。
【００２９】
本発明の反応容器中に含有される出発用の試薬と添加用の試薬は、所望の用途及び所望の反応に必要な試薬を有することができる。例えば第一段階目の反応でＰＣＲを行う場合には、出発用の試薬（第一の試薬）は、核酸、酵素、基質、緩衝液を含有した溶液とすれば良い。より好ましくは、標的核酸及び標的核酸に対して相補性を示すオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも４種のヌクレオシドトリフォスフェート（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ又はｄＵＴＰ）、緩衝液（室温でｐＨ８〜９、０．０５Ｍ  ＫＣｌ）、マグネシウム化合物（０．０１５Ｍ  ＭｇＣｌ2）を含有した溶液が好ましい。第二段階目の反応で、第一段階目のＰＣＲで得られた増幅産物の配列の一部を、異なるオリゴヌクレオチドプライマーで更に増幅したい場合には、添加用の試薬（第二の試薬）は次の物が好ましい。第一段階目の増幅産物に対して相補性を示す新しいオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも４種のヌクレオシドトリフォスフェート（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ又はｄＵＴＰ）、緩衝液（室温でｐＨ８〜９、０．０５Ｍ  ＫＣｌ）、マグネシウム化合物（０．０１５Ｍ  ＭｇＣｌ2）を含有した溶液とするのが好ましい。さらにこの場合の第一の試薬と第二の試薬は、第二の試薬を第一の試薬よりも多くすることが望ましい。
【００３０】
核酸とは、標的核酸、標的核酸に対して相補性を示すオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられ、単独でも、これらの組み合わせであっても良い。オリゴヌクレオチドプライマーは、通常１５から３０ヌクレオチドの長さである。各プライマーは通常１μＭ〜１００μＭの濃度で含有され、核酸化学の分野で公知の固相法を用いて合成できる。
【００３１】
酵素とは、所望の反応を行うのに必要な酵素であれば特に限定されず、例えばＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、当該酵素は様々な種類の物が各社から市販されている。
【００３２】
本発明で用いる隔壁は、その少なくとも一部が熱溶解することにより反応領域に対して隔離して保持されていた添加用の試薬を反応領域に所望のタイミングで放出可能なものであればよい。隔壁を構成する材料は、反応の温度条件、反応種類、添加用試薬の放出のための加熱条件などに応じて適宜選択可能である。例えば、添加用試薬の添加時点までの間は固体であり、添加時において加熱溶融可能な材料を隔壁形成用として用いることができる。反応開始前の取扱い易さなどの点からは常温（２５℃程度）では固体であるが、温度変化（加熱）によって融解し、試薬を反応領域へ放出することができる材料が好ましい。例えばこのような材料としてはワックス、油脂、低融点合金、物理ゲル（寒天やゼラチン）等が挙げられる。ワックスは、一般的に常温で固体又は半固体のアルキル基を持つ有機物であり、約４０℃以下の温度ではグリースよりもはるかに硬く、少し高い温度で溶けて水より密度の小さい液体となる。ワックスの融点はその種類にもよるが、多くは常温から１００℃付近までの温度範囲に入る。ワックスの種類は天然ワックス（木ろう、ホホバ油、みつろう、モンタンワックス、パラフィンワックス）、合成ワックス（ポリエチレンワックス、モンタンワックス誘導体、硬化ひまし油）、配合ワックス等、種々の物がある。これらはグリースよりも固体表面への付着が少ない。代表的な純粋なワックス類には、エイコサン、オクタコサン、セチルパルミテート及びペンタエリトリトールテトラベヘナート等が挙げられる。多くの有用なワックス類は、純粋なワックス類の性質と同等の性質を提供する物質類（例えばエステル類、脂肪酸類、高分子量アルコール類及び炭化水素類）の混合物である。このような混合物類には、限定される物ではないが、パラフィン、パラプラスト（ＰＡＲＡＰＬＡＳＴ、商標）、ワックス（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ）等が挙げられる。さらに、ウルトラフレックス（ＵＬＴＲＡＦＬＥＸ、商標）、ワックス（Ｐｅｔｒｏｌｉｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。さらに、ベスクアレ（ＢＥＳＱＵＡＲ、商標）、１７５ワックス（Ｐｅｔｒｏｌｉｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。ワックス類は、純粋なワックス、混合ワックス、グリース又は油等を任意の比率で混合することによって、そのワックスに特異的な硬度と低粘性を保持するように調製できる。
【００３３】
油脂とは、脂肪酸とグリセリンとのエステルのことであり、通常トリグリセリドからなるものを言う。一般に、常温で液体の物を「脂肪油」、固体のものを「脂肪」と呼び分ける。食用、工業用など様々な用途で利用されている。ヘットは牛の脂を精製した食用油で、常温では白色の固体であり、融点は摂氏３５〜５５℃である。
【００３４】
低融点金属又は低融点合金とは、融点が３５０℃以下の低い金属及びその合金の総称である。低融点金属としては、例えば、インジウム（融点１５６．６℃）、すず（融点２３１．９℃）、鉛（融点３２７．０℃）、ビスマス（融点２７４．１℃）、カドミウム（融点３２０．８℃）等が挙げられる。また、低融点合金としては、これらの低融点金属を２種以上含有する合金であり、例えば、ビスマス／鉛＝５５．５／４４．５（ｗｔ％）（融点１２４℃）、ビスマス／すず／カドミウム＝５３．９／２５．９／２０．２（ｗｔ％）（融点１０２．５℃）、ビスマス／すず／インジウム＝５７．５／１７．３／２５．２（ｗｔ％）（融点７８．８℃）、ビスマス／鉛／すず／インジウム＝４９．４／１８．０／１１．６／２１．０（ｗｔ％）（融点５８℃）、ビスマス／鉛／すず／カドミウム／インジウム＝４４．７／２２．６／８．３／５．３／１９．１（ｗｔ％）（融点４６．７℃）、亜硫酸金（Ｉ）ナトリウム溶液（２３℃で液状）、ヘキサヒドロキソ白金（ＩＶ）酸カリウム溶液（２３℃で液状）、塩化ロジウム（ＩＩＩ）溶液（２３℃で液状）等が挙げられる。
【００３５】
物理ゲル（寒天やゼラチン）とは、水素結合やイオン結合、配位結合などによって架橋されたもので、熱などの外部刺激により可逆的にゾル-ゲル転移するものもある。
また、隔壁に用いる材料は、所望の反応を行う際に不活性であり、所望の反応に悪影響を及ぼさないことが望まれる。さらに、融解して反応領域内に融け落ちた後に、反応溶液に溶け込まず、反応溶液上に蒸気バリアーを形成することが望ましいため、隔壁に用いる材料は反応に使用する試薬よりも比重が小さく、かつ疎水性の物質であることが望まれる。
【００３６】
図２に示した第１の隔壁（３）と蓋（６）は、両者とも同じ材料で構成されても、異なる材料を用いて構成されても、どちらでも良い。なお、蓋（６）は第一の試薬での反応中は固体又は液体状態にあり蓋として機能し、第二の試薬の添加時にその少なくとも一部が熱溶融し、第二の試薬の添加が可能となるものであればよい。
【００３７】
図４に示した第１の隔壁（３）と第２の隔壁（１０）は、融点の異なる物質を用いて構成されることが好ましい。さらに、第１の隔壁（３）よりも第２の隔壁（１０）の方が融点が低いことが好ましい。
【００３８】
図４に示した第１の隔壁（３）よりも第２の隔壁（１０）の方が融点が低い場合、第２の隔壁（１０）の融点まで、第二の温度制御部（８）によって第２の隔壁（１０）の温度を上昇させることで、第三の試薬（９）のみを反応領域（５）へ放出させることができる。この場合、第１の隔壁（３）は融解しないため、第二の試薬（２）はそのままの状態で容器内に具備されることになる。
【００３９】
一方、図４に示した第１の隔壁（３）よりも第２の隔壁（１０）の方が融点が高い場合は、第２の隔壁（１０）が融解するまで温度を上昇させると、第１の隔壁（３）も融解するため、第三の試薬（９）と第二の試薬（２）が同時に反応領域（５）へ放出されることになる。なお、第１の隔壁（３）と第２の隔壁（１０）に同じ材料を用いた場合も同様である。
【００４０】
図４に示したような構成の反応容器とする場合、第２の隔壁の融点が第１の隔壁の融点よりも５℃以上低いことが好ましく、７℃以上低いことがより好ましく、特に１０℃以上低いことがより好ましい。第１の隔壁及び第２の隔壁の好ましい材料の組み合わせとしては、例えば、パラフィンワックス及びパラフィンワックス、木ろう及びパラフィンワックス、パラフィンワックス及びマイクロクリスタリンワックス等が挙げられる。
【００４１】
また、複数段階の反応を行うことができる反応容器には、望む反応回数に応じて試薬を封入する隔壁を設けることが必要となる。その場合においても、それぞれの隔壁は、各反応段階において融解される順に応じて、すなわち隔壁内に保持する試薬の放出順に応じて、融点が高くなるように構成されることが好ましい。かかる場合においても、それぞれの隔壁の融点が次の反応段階で融解される隔壁の融点よりも、５℃以上低いことが好ましく、７℃以上低いことがより好ましく、特に１０℃以上低いことがより好ましい。
【００４２】
本発明を適用できる反応容器を使用すれば、従来別々の反応容器で行っていた複数段階の反応を、同一容器内で所望のタイミングで連続して行うことができる。反応方法の一例を、図６を用いて説明する。
【００４３】
図６は、本発明の反応容器を用いた反応を示したフロー図の一例である。本発明の反応容器は予め、図６の反応フローを考慮した上で準備することが望ましい。はじめに、反応領域内で反応を行うか否かを判断する。反応を行うと判断した場合には、反応領域で第一段階目の反応を開始する。第一段階目の反応又は第一段階目の反応終了後に試薬を添加するか否かを判断する。試薬を添加する場合には、隔壁を融解させ、試薬を反応領域へ放出させる。反応領域への試薬添加後、反応を行うか否かを判断する。反応を行うのであれば、第二段階目の反応を開始する。反応を行わないのであれば、次の試薬を添加するのか否かを判断し、試薬を添加しないのであれば反応終了となる。第二段階目の反応中又は第二段階目の反応終了後に試薬を添加するか否かを判断する。その判断に基づき、その後の処理を上記と同様に進める。また、第一段階目の反応を行わない場合、まず試薬を添加するかどうかを判断する。添加する場合には上記と同様に隔壁に外部刺激を与えて試薬を反応領域へ放出させる。その後の処理は上記と同様である。図６において試薬を添加するか否かの判断は、２回目以降の判断でＮｏの選択が可能となる。１回目の判断でＮｏの処理を進めるということは、従来例と同じことであり、本発明を用いた反応容器の反応方法には含まれない。
【００４４】
例えば、三段階の反応を連続して行う場合について、図４に示した構成の反応容器を例に挙げて、以下に述べる。なお、反応容器の温度制御は図３に示したようなサーマルサイクラー装置を用いることとする。まず、第一の温度制御部（７）を第一の試薬（１）に所望の熱サイクルを与える条件に設定することで第一段階目の反応を行うことができる。その間、第二の試薬（２）及び第三の試薬（９）は、第二の温度制御部（８）によって隔壁の融点以下に保つことができる。第一段階目の反応中又は反応終了後に、第二の温度制御部（８）によって第２の隔壁（１０）をその融点以上（第１の隔壁（３）の融点以下）に加熱し、第２の隔壁（１０）を融解させ、第三の試薬（９）を反応領域（５）へ放出させる。第三の試薬添加後、第一の温度制御部（７）により反応領域（５）に存在する溶液（反応溶液）に熱サイクルを与えることで第二段階目の反応を開始することができる。また、第一の試薬（１）と第三の試薬（９）は反応溶液に生じた熱対流によって混合することができる。このとき、融解した隔壁（ワックス）は、反応溶液よりも比重が小さく、疎水性であるため、反応溶液の上に層をなして存在することになり、熱対流による混合の妨げとはならない。次に、第二段階目の反応中又は反応終了後、第二の温度制御部（８）によって第１の隔壁（３）をその融点以上に加熱して融解させ、第二の試薬（２）を反応領域（５）へ放出させる。そして、反応領域に放出された第二の試薬は反応容液に生じた熱対流によって混合され、第三段階目の反応を開始することができる。さらに、第１の隔壁（３）の融解物及び第２の隔壁（１０）の融解物は反応溶液よりも比重が小さく、疎水性であるため、上述のように反応溶液の上に層をなして蒸気バリアーを形成し、反応溶液の蒸発を最小限に抑えることができる。反応終了後に反応溶液が冷却されると、反応溶液の上の第１の隔壁及び第２の隔壁は再び固体となり、反応容器を開封する際に反応溶液が環境中に飛散するのを防止することができる。また、環境中から反応容器内への汚染物質の混入を防ぐことができる。
【００４５】
本発明の第一段階目の反応としては、融解、溶解、撹拌、混合、合成、分解、切断等の種々の化学反応が挙げられる。例えば、タンパク質分解酵素によるタンパク質の分解、溶菌酵素による細菌の細胞壁（細胞膜）破壊、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ、又は制限酵素による切断反応等が挙げられる。
【００４６】
また、本発明の第二段階目の反応又は第三段階目の反応としても、第一段階目の反応と同様の反応が挙げられる。さらには、第一段階目の反応で得られた生成物に、第二の試薬を添加して混合するという溶液調製反応としても良いし、第一段階目の反応を行わず使用直前に複数の溶液を混合する用途としても良い。所望の反応に応じた試薬を反応容器内に有することが好ましい。
【００４７】
これらの複数段階の反応は、それぞれが同一の反応でも良いし、異なる反応でも良く、特に限定されることはない。
【００４８】
本発明の反応容器へ熱を与える装置としては、単なるヒーターやペルチェ素子等を使用でき、特に形状や種類に限定はなく、第一の試薬と複数の試薬を別々に温度制御ができる構成の装置であればよい。使用の容易さで言えば「サーマルサイクラー」と呼ばれる自動温度制御装置が挙げられる。一般的にサーマルサイクラー温度は、プログラム可能なマイクロプロセッサーの制御下にあり、ユーザーは予めサイクル数や各サイクルでの異なるインキュベート温度の数、各温度、各温度でのインキュベート時間、及び温度間の移動時間を指定することができる。また、この装置は、バイブレーション機能を有することもできる。バイブレーション機能により、隔壁を融解した直後に本発明に係る反応容器に微振動を与えることで、隔壁に封入されていた試薬を効率的に反応領域へと放出させることができる。
【００４９】
本発明の反応容器の素材としては、サーマルサイクラーのような温度制御装置からの温度変化（−１０℃〜１００℃程度）を、反応容器内外へすばやく伝えることができることが望まれる。また、反応中に水蒸気や液体が漏れることを防ぎ、各種の反応を阻害しない物質でできていることが望まれる。一般的にはポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテン、ポリエステル、ナイロン、フルオロカーボン、フッ化炭化水素、ポリメチルメタクリレート、又はポリスチレン等のプラスチックが好適である。反応容器の形状は特に限定されないが、使用する温度制御装置に図３のように設置できる形状の物がよい。一般的なサーマルサイクラー装置と同様な装置を用いるのであれば、反応容器の形状は下半分が円錐形であり、上半分は円筒形又は半球体をした物が好ましい。
【００５０】
本発明の反応容器は、予め容器内に第一の試薬や複数の試薬を具備させた状態で保存しておいても良いし、片方の試薬のみを具備させた状態で保存しておいても良い。好ましくは、後期添加させる複数の試薬を予め具備させた状態の反応容器として保存しておくと、第一の試薬として様々な物を用いることができるので好ましい。
【００５１】
例えば、第一の試薬中に含まれる核酸を制限酵素により切断する反応を、熱サイクルを与えることで行い、次いで第二段階目の反応を熱サイクルによるＰＣＲを行うこともできる。この場合第一の試薬と第二の試薬は、空間を設けて隔壁で隔離されているため、第一段階目の反応に必要な熱サイクル（温度変化）を自在に与えることができる。また、第一段階目の反応中、第二の試薬は隔壁の融点以下の温度に制御することができる。第一段階目の反応中又は反応終了時に、隔壁をその融点以上に加熱することで隔壁を融解させ、第二の試薬を反応領域へ放出させることができる。
【００５２】
さらに、本発明の反応容器は、単なる溶液調製容器としても用いることができる。例えば、使用直前に２種類の溶液を混合したい場合に用いることができる。特に２種類の溶液を長期間混合した状態で保管すると、互いの試薬の活性が衰えてしまうことがある。その場合、保管している間は互いを隔離した状態におき、使用直前に混合することが可能となる。また溶液を混合する際に、各々の溶液を過熱してから混合することもできる。これらは、溶液内の試薬が析出した場合（例えば塩等）に有効である。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を挙げ、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００５４】
（実施例１）本発明を適用できる反応容器を用いた二段階の反応（ＰＣＲ）の実施
ここでは、本発明を適用した反応容器の一例を用いて、第一段階目の反応としてＰＣＲを行い、次いで、装置や容器の蓋を開閉することなく酵素を追加し、第二段階目の反応としてもＰＣＲを行った結果を示す。また、従来法と増幅産物量を比較した。
【００５５】
（１）試薬の準備
下表に示した第一の試薬と第二の試薬、及び対照試薬を準備した。
【００５６】
【表１】
2009106221.tif 000002
【００５７】
【表２】
2009106221.tif 000003
【００５８】
【表３】
2009106221.tif 000004
【００５９】
上記のＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡは、次のように用意をした。ＰＢＳ  Ｂｕｆｆｅｒ中にＳ．ａｕｒｅｕｓのコロニーを分散させた溶液０．１８ｍＬに対して、０．０２ｍＬの溶菌酵素（Ｎ−アセチルムラミディス／生化学工業株式会社製）を加えて、３７℃で３０分間インキュベートをした。インキュベート後のサンプルを、核酸自動抽出機（Ｍａｇｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ６ＧＣ／プレシジョンシステムサイエンス（株）製）にて核酸抽出を行い、０．０５ｍＬのＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ（溶液）を得た。
【００６０】
商品名Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＬＤは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のものを用い、１０×反応液、ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘは付属品のものを用いた。また、Ｐｒｉｍｅｒ  ＳｅｔＡは増幅Ｐｒｉｍｅｒ混合液であり、表４に示した各Ｐｒｉｍｅｒが各々０．５μＭになるように、１×ＴＥバッファー中に混合した物である。
【００６１】
【表４】
2009106221.tif 000005
【００６２】
（２）反応容器の準備
図７、図８に示した構成を有する反応容器を用意した。
【００６３】
図７に示した容器蓋部（１１）は、直径４．５ｍｍ、高さ６ｍｍ、肉厚０．２ｍｍ程度の筒状をなしており、片方の末端は半球体のような形状となっている（図面では簡略化のため平板状として描いた）。つまみ部（１２）は、容器蓋部（１１）と図８に示した容器部（１３）を合体させたり、取り外したりする際に取り扱いやすいようについており、容器蓋部（１１）の外周に設けられている。
【００６４】
容器部（１３）は、一般的なＰＣＲチューブ（蓋の部分を除く）と同様な外形をしている。上部開放部の内径４．５ｍｍ、チューブ高さ２１ｍｍ、肉厚０．２ｍｍ程度である。
【００６５】
（３）隔壁の準備
７３〜８０℃融解性パラフィン（アルドリッチケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））を、８０〜９５度に熱した平らな底面を有する金属容器内で融解し、ゆっくりと冷却することで１ｍｍ厚のプレート状に加工した。加工後、８０度程度に温めた直径４．５ｍｍ、肉厚０．１ｍｍの筒状の金属パイプで円形に抜き取ることで、直径４．３ｍｍ厚さ１ｍｍの円形の加工済みパラフィン１を得た。
【００６６】
（４）試薬の充填
まず、容器蓋部（１１）の内側に、７３〜８０℃融解性パラフィンを熱して液状にしたものを適量分注し、容器蓋部（１１）の内壁に薄く塗り広げた。図９は容器蓋部（１１）を逆さにして斜めから見た図である。なお、図９〜図１２では、つまみ部（１２）を点線で示す。
【００６７】
次に、第二の試薬（２）を内壁にパラフィンが塗られた容器蓋部（１１）に分注した後、上記（３）で用意をした加工済みパラフィン１を上から被せた。その後、加熱素子（１４）で容器の一部分を加熱して加工済みパラフィン１の一部を融解し、再びゆっくりと冷却することで、図１０に示したように第二の試薬（２）をパラフィン（隔壁（３））に封じ込め、第二の試薬が封入された容器蓋部を作製した。この時、冷却装置（１５）にて容器蓋部（１１）の底部を冷却しておくことで、第二の試薬の変性や蒸発を防止した。
【００６８】
第一の試薬（１）は、容器部（１３）に分注し、第一の試薬（１）の上に加工済みパラフィン１を図１３に示したようにのせ、第一の試薬が充填された容器部を作製した。
【００６９】
（５）ＰＣＲの開始
上記（４）で作製した第二の試薬が封入された容器蓋部と第一の試薬が充填された容器部を図１４に示したように合体させ、サーマルサイクラー装置にセットした（条件Ａとする）。用いたサーマルサイクラー装置は、Ｔ−３０００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ  ＧｍｂＨ  ｉ．Ｌ．社製）である。
【００７０】
また、本発明の対照として従来法によるＰＣＲを行った。まず、上記（１）で準備をした対照試薬を容器部（１３）に分注した後、容器蓋部（１１）と合体させて一つの反応容器とし、サーマルサイクラー装置にセットした（条件Ｒとする）。第一段階目の反応条件を表５に示した。その間、第二の温度制御部（８）の温度は８℃に保った。
【００７１】
【表５】
2009106221.tif 000006
【００７２】
第一段階目の反応終了後、第二の温度制御部（８）の温度を９０℃に上昇させて第二段階目の反応を開始した。第二段階目の反応条件は表５と同様である。
【００７３】
（６）電気泳動による増幅産物量の確認
第二段階目の反応終了後、容器部にある反応溶液について電気泳動法を用いて増幅産物量を測定した。用いた電気泳動装置及び分析用チップは、アジレント２１００バイオアナライザ電気泳動装置とアジレントＤＮＡ７５００キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）である。アジレントＤＮＡ７５００キットのマニュアルに従い、各反応溶液を１．０μｌずつ用いて増幅産物量の測定を行った。測定後検出されたバンドは、両条件共に１５００ｂｐあたりに１本のみ確認された。
【００７４】
結果は表６の通りであった。
【００７５】
【表６】
2009106221.tif 000007
【００７６】
条件Ａと条件Ｒの結果から、本発明を適用した反応容器及び反応方法で得られた結果の方が、従来法による結果と比べて約２倍の増幅産物量を得ることができた。
【００７７】
（７）隔壁の状態の確認
上記（５）のＰＣＲの開始の際に、条件Ａをもう一組別に用意し、第一段階目の反応を行った。反応条件は表５の通りである。第一段階目の反応終了後に、反応容器を装置から取り出し、隔壁（３）（パラフィン）の状態を確認したところ、第二の試薬（２）は上記（４）で封入したままの状態で、隔壁（３）に封じ込められた状態であった。また、第一の試薬（１）の上にのせた加工済みパラフィン（６）は反応領域に加えられた熱により融解して、第一の試薬上に蓋をする状態で層をなして固形化していた。
【００７８】
続いて、取り出した反応容器を再度サーマルサイクラー装置にセットし、上記（５）と同様に、第二の温度制御部（８）の温度を９０℃に上昇させた後、第二段階目の反応を行った。第二段階目の反応終了後に、反応容器を取り出し、隔壁（３）（パラフィン）の状態を確認したところ、第二の試薬（２）は上記（４）で封入したままの状態ではなく、隔壁（３）の内部は空の状態になっており、蓋の内壁には若干のパラフィンだけが残っているだけで、容器部（１３）側のパラフィンの量が増えていた。また反応領域（５）に溶け落ちた隔壁（３）の融解物は、第一の試薬と第二の試薬が混合された反応溶液上に蓋をする状態で層をなして固形化していた。
【００７９】
以上の結果から、本発明を適用することにより、装置や容器を開閉することなく、第二の試薬を第一の試薬中に添加することができ、反応を続けることが確認できた。また、表６に示したように、従来法よりも２倍程度増幅効率が向上することが示された。
【００８０】
（実施例２）本発明を適用できる反応容器を用いた三段階の反応（二段階ＰＣＲとハイブリ溶液混合）の実施
ここでは、本発明を適用した反応容器の一例を用いて、第一段階目の反応としてＰＣＲを行い、次いで、装置や容器の蓋を開閉することなく酵素、Ｐｒｉｍｅｒ、Ｂｕｆｆｅｒ等を追加し、第二段階目の反応としてもＰＣＲを行った。さらに、Ｂｕｆｆｅｒを追加して混合し、第三段階目の反応としてハイブリダイゼーション溶液の調製を行った。
【００８１】
対照として、従来法により二段階ＰＣＲとハイブリダイゼーション溶液の調製を実施した。
【００８２】
（１）試薬の準備
下表に示した第一の試薬、第二の試薬及び第三の試薬を準備した。
【００８３】
【表７】
2009106221.tif 000008
【００８４】
【表８】
2009106221.tif 000009
【００８５】
【表９】
2009106221.tif 000010
【００８６】
上記のＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡは、次のように用意をした。ＰＢＳ  Ｂｕｆｆｅｒ中にＳ．ａｕｒｅｕｓのコロニーを分散させた溶液０．１８ｍＬに対して、０．０２ｍＬの溶菌酵素（Ｎ−アセチルムラミディス／生化学工業株式会社製）を加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後のサンプルを、核酸自動抽出機（Ｍａｇｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ６ＧＣ／プレシジョンシステムサイエンス（株）製）にて核酸抽出を行い、０．０５ｍＬのＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ（溶液）を得た。
【００８７】
商品名Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＬＤは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のものを用い、１０×反応液、ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘは付属品のものを用いた。Ｐｒｉｍｅｒ  ＳｅｔＡは、表４の通りである。
【００８８】
また、Ｐｒｉｍｅｒ  ＳｅｔＢは、表１０に示した５’末端がＣｙ３で標識されたＰｒｉｍｅｒであり、１×ＴＥバッファー中に１０μＭで溶解した物である。
【００８９】
【表１０】
2009106221.tif 000011
【００９０】
（２）反応容器の準備
実施例１の（２）と同様に反応容器の準備を行ったが、容器蓋部（１１）の高さが、１０ｍｍの物を用意した。
【００９１】
（３）隔壁の準備
実施例１の（３）と同様に隔壁の準備を行った。さらに、５２〜５８度融解性パラフィン（アルドリッチケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））を、６０〜７５度に熱した金属容器内で融解し、ゆっくりと冷却することで１ｍｍ厚のプレート状に加工した。加工後、８０℃程度に温めた直径４．５ｍｍ、肉厚０．１ｍｍの筒状の金属パイプで円形に抜き取ることで、直径４．３ｍｍ厚さ１ｍｍの円形の加工済みパラフィン２を得た。
【００９２】
（４）試薬の充填
実施例１の（４）と同様に、第二の試薬（２）の容器蓋部（１１）への封入を行い、第二の試薬が封入された容器蓋部を作製した（図１１参照）。
【００９３】
次に、以下のように第三の試薬（９）の封入を行った。まず、第二の試薬が封入された容器蓋部の内部に、５２〜５８℃融解性パラフィンを６０〜７０℃程度に熱して液状にした物を適量入れ、容器蓋部の内壁及び隔壁（３）となる部分に薄く塗り広げた。次に、第三の試薬（９）を分注し、加工済みパラフィン２を上から被せた。その後、加熱素子（１４）を用いて容器の一部分を加熱して加工済みパラフィン２の一部を融解し、再び冷却することで、第三の試薬（９）を第２の隔壁としての隔壁（１０）（パラフィン）内に封じ込め、第二の試薬及び第三の試薬が封入された容器蓋部を作製した（図１２）。この時、冷却ヒーター（１５）で容器蓋部の底部を冷却しておくことで、第二の試薬及び第三の試薬の変性や蒸発を防止した。
【００９４】
第一の試薬（１）は、容器部（１３）に分注し、第一の試薬の上に加工済みパラフィン２を図１３に示したようにのせ、第一の試薬が充填された容器部を作製した。
【００９５】
（５）本発明を適用したＰＣＲ及びハイブリダイゼーションの実施
（５）−１．二段階ＰＣＲの実施
上記（４）で用意をした第二の試薬及び第三の試薬が封入された容器蓋部と第一の試薬が充填された容器部を図１４に示したように合体させ、さらに同じ物をもう一つ用意し、両者をサーマルサイクラー装置にセットした（条件Ｃ１−１、Ｃ１−２とする）。用いたサーマルサイクラー装置は、Ｔ−３０００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ  ＧｍｂＨ  ｉ．Ｌ．社製）である。第一段階目の反応条件を表１１に示した。その間、第二の温度制御部（８）の温度は８℃に保った。
【００９６】
【表１１】
2009106221.tif 000012
【００９７】
第一段階目の反応終了後、サーマルサイクラー装置の第二の温度制御部（８）の温度を７０℃に上昇させて５分程度維持し、第２の隔壁としての隔壁（１０）を融解させ、第三の試薬（９）を反応領域内に放出させた。次いで第二段階目の反応を開始した。第二段階目の反応条件は表５と同様である。また第二段階目の反応中、第二の温度制御部（８）の温度は８℃に保った。
【００９８】
（５）−２．ハイブリダイゼーション溶液の調製
第二段階目の反応終了後、サーマルサイクラー装置の第二の温度制御部（８）の温度を９５℃に上昇させて５分程度維持し、隔壁（３）を融解させ、第二の試薬（２）を反応領域内に放出させた。次いで第三段階目の反応として、第一の温度制御部（７）の温度を９５℃に上昇させた後に、第一の温度制御部（７）及び第二の温度制御部（８）の温度を２５℃にゆっくりと下げた。
【００９９】
（６）対照の実施
（６）−１．二段階ＰＣＲの実施
対照として、各段階の反応を別々の容器で行い、従来の方法によりハイブリダイゼーション溶液を調製した。
【０１００】
まず、第一の試薬（１）を容器部（１３）に分注し、容器蓋部（１１）と合体させて一つの反応容器とし、サーマルサイクラー装置にセットした。第一段階目の反応条件は表１１に示した条件と同じである。
【０１０１】
第一段階目の反応終了後に、装置の蓋を開けて反応容器を取り出し、増幅産物の精製をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。溶出量は１０μＬとした。
【０１０２】
溶出後に回収された溶液をテンプレート溶液として第三の試薬と混合して総量５０μＬとした。全量を新しい容器部（１３）に分注し、容器蓋部（１１）と合体させて反応容器とし、サーマルサイクラー装置にセットした（条件Ｒ２）。第二段階目の反応条件は、表５の通りである。また、条件Ｒ２はＮ＝２で行い、それぞれ条件Ｒ２−１、Ｒ２−２とした。
【０１０３】
（６）−２．ハイブリダイゼーション溶液の調製
第二段階目の反応終了後に、装置の蓋を開けて容器を取り出し、増幅産物の精製をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。溶出量は５０μＬとした。
【０１０４】
溶出後に回収された溶液に、第二の試薬のうちＳＤＳ以外の試薬を分注して混合した。ＳＤＳは塩が析出する可能性があったので、最後に分注して混合した。
【０１０５】
（７）調製物の比較
本発明を適用した反応容器を用いて二段階ＰＣＲ及びハイブリダイゼーション溶液の調製を行った場合、その結果物は、従来法により調製したものと同等のハイブリダイゼーション効率を示した。詳細については、実施例３に記載した。
【０１０６】
（８）隔壁の状態の確認
上記（５）のＰＣＲの開始の際に、条件Ｃ１−１、Ｃ１−２と同じ物をもう一組用意した（条件Ｃ２、Ｃ３）。条件Ｃ２は第二段階目の反応まで行い、条件Ｃ３は第三段階目の反応まで行った。反応条件等は条件Ｃ１−１、Ｃ１−２と同じである。
【０１０７】
第二段階目の反応終了後に条件Ｃ２を取り出し、隔壁の状態を確認した。第二の試薬（２）は図１１のように、第１の隔壁としての隔壁（３）に覆われた状態で具備されていた。また、第一の試薬（１）が充填されていた容器部の溶液量が５倍に増えていたことから、第三の試薬（９）が反応領域（５）に放出され、第一の試薬（１）と混合されていることが確認できた。さらに、第一の試薬（１）の上方にのせていた加工済みパラフィン２及び第２の隔壁としての第２の隔壁（１０）は融解して反応領域に融け落ち、第一の試薬と第三の試薬が混合された反応溶液上に層をなして固形化していた。
【０１０８】
第三段階目の反応終了後に条件Ｃ３を取り出し、第１の隔壁（３）の状態を確認した。容器蓋部には試薬は残っていなかった。このことから、第二の試薬（２）は反応領域（５）に放出され、第一の試薬と第三の試薬が混合された反応溶液に添加されたことが確認できた。また反応領域（５）に融け落ちた隔壁は、全て溶液上に層をなして固形化していた。
【０１０９】
【表１２】
2009106221.tif 000013
【０１１０】
以上のことから、従来のハイブリダイゼーション溶液の調製では、容器の入れ替えや試薬の追加、マイクロチューブの撹拌遠心等多数の工数がかかっていたが、本発明を適用した反応容器を用いることで、工数が大幅に削減できた。
【０１１１】
（実施例３）ハイブリダイゼーション反応による、本発明を適用した反応容器及び反応方法の効果確認
（１）マイクロアレイの準備
（１）−１  基板担体の準備
合成石英のガラス基板（サイズ：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）をアルカリ性の洗浄液と超純水にて洗浄を行った。次に基板表面にアミノ基を導入し、さらにマレイミド基を導入した。
【０１１２】
（１）−２  プローブＤＮＡの合成
表１３の配列を有するプローブ５種を合成した。なおこの配列は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子領域をコードする配列に相補的な配列となっている。プローブＤＮＡは基板担体に対して共有結合させるため、定法に従って５’末端にチオール化処理を
施したのち、ＤＮＡ合成時に副反応を避けるために結合してある保護基を全て除去し、さらにＨＰＬＣ精製及び脱塩処理を施した。
【０１１３】
【表１３】
2009106221.tif 000014
【０１１４】
得られたプローブＤＮＡは純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【０１１５】
（１）−３  ＢＪプリンターによるＤＮＡ吐出、及び基板への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意したプローブを上記の混合溶媒に規定濃度（１０μＭ）となるように溶解した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０  キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【０１１６】
なお、ここで用いたバブルジェットプリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液を約１２０マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【０１１７】
続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、印字操作をおこなった。１枚のＤＮＡチップあたり、各プローブＤＮＡが１６スポットずつ吐出が行われるよう印字のパターンをあらかじめ作成し、印字した。印字が確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
【０１１８】
（１）−４  洗浄
３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖ＤＮＡが固定したＤＮＡマイクロアレイを得た。
【０１１９】
（２）ハイブリダイゼーション
上記（１）で作製したＤＮＡマイクロアレイと、実施例２で調製したハイブリダイゼーション溶液を用いて、ハイブリダイゼーション反応を行った。
【０１２０】
（２）−１  ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）を１ｗｔ％となるように１００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解した。この溶液に上記（１）−４で作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸し、ブロッキングを行った。その後０．１ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２×ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ：３００ｍＭ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ，Ｃ6Ｈ5Ｎａ3・２Ｈ2Ｏ）：３０ｍＭ、ｐＨ７．０）で洗浄した。そして純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
【０１２１】
（２）−２  ハイブリダイゼーション
水切りしたＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットした。以下に示すハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【０１２２】
＜ハイブリダイゼーション条件＞
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  →  ９２℃、２ｍｉｎ  →  ４５℃、４ｈｒ  →  Ｗａｓｈ  ｗｉｔｈ  ２×ＳＳＣ／０．１ｗｔ％ＳＤＳ  ａｔ  ２５℃  →  Ｗａｓｈ  ｗｉｔｈ  ２×ＳＳＣ  ａｔ  ２０℃  →  （Ｒｉｎｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｈ2Ｏ：Ｍａｎｕａｌ）  →  Ｓｐｉｎ  ｄｒｙ
（３）蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡマイクロアレイをＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）を用いて蛍光測定を行った。励起波長５３２ｎｍの測定モードによってＣｙ３の蛍光輝度を測定した。
【０１２３】
なお、バックグランドに相当するスポットのない部分からの蛍光強度を引いた値を蛍光輝度の実測値とした。また測定は２回実施し、各プローブ合計３２スポットの輝度データの平均値を測定結果とした。蛍光輝度の測定結果を表１４に示す。
【０１２４】
【表１４】
2009106221.tif 000015
【０１２５】
表１４の結果から、次のことが言える。本発明を用いたＰＣＲの実施及びハイブリダイゼーション溶液の調製法（条件Ｃ１−１、Ｃ１−２）と、従来法（Ｒ２−１、Ｒ２−２）との間に差がないことが判明した。つまり、本発明を用いて二段階ＰＣＲ及びハイブリダイゼーション溶液の調製を連続して行うことで、マイクロアレイでの検出感度を劣化させることなく、溶液調製の工数を大幅に削減することが可能であった。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】本発明を適用できる二段階の反応を行うための反応容器の一例の図
【図２】本発明を適用できる二段階の反応を行うための反応容器の一例の図
【図３】本発明を適用できる反応容器をサーマルサイクラーへセットした時の図
【図４】本発明を適用できる三段階の反応を行うための反応容器の一例の図
【図５】本発明を適用できる三段階の反応を行うための反応容器の一例の図
【図６】本発明の反応フローの一例
【図７】本発明を適用した反応容器の一例（容器蓋部）
【図８】本発明を適用した反応容器の一例（容器部）
【図９】本発明を適用した反応容器の一例の一部を加熱する方法を示した図
【図１０】本発明を適用した反応容器の一例に第二の試薬を封入した後の一例の図
【図１１】本発明を適用した反応容器の一例に第二の試薬を封入した後の一例の図
【図１２】本発明を適用した反応容器の一例に第三の試薬を封入した後の一例の図
【図１３】本発明を適用した反応容器の一例に第一の試薬を充填した後の一例の図
【図１４】本発明を適用した反応容器の蓋と本体とを合体させた後の一例の図
【符号の説明】
【０１２７】
１・・・第一の試薬
２・・・第二の試薬
３・・・第１の隔壁
４・・・空間
５・・・反応領域
６・・・隔壁２
７・・・第一の温度制御部
８・・・第二の温度制御部
９・・・第三の試薬
１０・・第２の隔壁
１１・・容器蓋部
１２・・つまみ部
１３・・容器部
１４・・加熱素子
１５・・冷却ヒーター
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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