(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３に結合することができ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３による癌特異的ＤＮＡメチル化の生理的な抑制因子を提供する。【解決手段】（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）前記特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａ又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ｂと結合することができるジンクフィンガータンパク質のいずれかのタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａ又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ｂと結合することができるジンクフィンガータンパク質
のいずれかのタンパク質。
【請求項２】
下記：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａ又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ｂと結合することができるジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａ又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ｂと結合することができるジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチド
のいずれかのポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項５】
請求項１記載のタンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項６】
抗癌剤である、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１記載のタンパク質を用いる、請求項１記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１記載のタンパク質を含む、請求項１記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
【請求項９】
請求項２記載のポリヌクレオチドを用いる、請求項１記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項２記載のポリヌクレオチドを含む、請求項１記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１１】
配列番号２のアミノ酸位置４２０〜４７０又は１０４１〜１０９１からなるダブルＺｎフィンガーモチーフからなるポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１１記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
抗癌剤である、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１２記載のポリペプチドを用いる、請求項１記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１２記載のポリペプチドを含む、請求項１記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
【請求項１６】
請求項１１記載のポリペプチドとＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａとを接触させることを特徴とする、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項１１記載のポリペプチドとＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ＡのＰＷＷＰドメイン又はＰＨＤドメインとを接触させることを特徴とする、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１１記載のポリペプチドとＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ＡのＰＷＷＰドメイン又はＰＨＤドメインとを含むことを特徴とする、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａのタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規Ｚｎフィンガータンパク質であるＳＡＬＬ３ｃ及びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
発癌過程における、ＣｐＧアイランドのメチル化を含めたエピジェネティクな変化のメカニズムはほとんど分っていない。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼであるＤＮＭＴ３ＡとＤＮＭＴ３ＢはデノボのＤＮＡメチル化を担当する酵素として知られている（非特許文献１〜３）。そして、ＤＮＡメチル化を行う際には補助因子が必要である場合も報告されている（非特許文献４）。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３（ＤＮＭＴ３）がデノボのＤＮＡメチル化に重要であると考えられているが、実際にＣｐＧアイランドのメチル化を示した報告はわずかである。さらに、ＣｐＧアイランドメチル化の抑制機構については何も知られていない。
【０００３】
デノボのＤＮＡメチル化の詳細な機構は、いまだ解明されておらず、特に、ＤＮＡメチル化の生理的な抑制因子の存在は知られていなかった。
【０００４】
そこで、デノボのＤＮＡメチル化の抑制機構の解明及びＤＮＡメチル化の生理的な抑制因子、特に、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３（ＤＮＭＴ３）の抑制因子の開発が待たれていた。
【非特許文献１】Bachman, K. E., Rountree, M. R. & Baylin, S. B. Dnmt3a and Dnmt3b are transcriptional repressors that exhibit unique localization properties to heterochromatin. J Biol Chem 276, 32282-7 (2001).
【非特許文献２】Chen, T., Tsujimoto, N. & Li, E. The PWWP domain of Dnmt3a and Dnmt3b is required for directing DNA methylation to the major satellite repeats at pericentric heterochromatin. Mol Cell Biol 24, 9048-58 (2004).
【非特許文献３】Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A. & Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 99, 247-57 (1999).
【非特許文献４】Vire, E. et al. The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation. Nature 439, 871-4 (2006).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３に結合することができ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３による癌特異的ＤＮＡメチル化の生理的な抑制因子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意研究した結果、ＳＡＬＬ３ｃと名づけたＳＡＬＬ３の新規バリアントフォームが、ＤＮＭＴ３による癌特異的ＣｐＧアイランドのメチル化を抑制することを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
したがって、本発明は、下記：
１．下記：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａ又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ｂと結合することができるジンクフィンガータンパク質のいずれかのタンパク質、
２．下記：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａ又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ｂと結合することができるジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａ又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ｂと結合することができるジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれかのポリヌクレオチド、
３．上記２記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
４．上記３記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
５．上記１記載のタンパク質を含む、医薬組成物、
６．抗癌剤である、上記５記載の医薬組成物、
７．上記１記載のタンパク質を用いる、上記１記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法、
８．上記１記載のタンパク質を含む、上記１記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット、
９．上記２記載のポリヌクレオチドを用いる、上記１記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法、
１０．上記２記載のポリヌクレオチドを含む、上記１記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
１１．配列番号２のアミノ酸位置４２０〜４７０又は１０４１〜１０９１からなるダブルＺｎフィンガーモチーフからなるポリペプチド、
１２．上記１１記載のポリペプチドを含む、医薬組成物、
１３．抗癌剤である、上記１２記載の医薬組成物
１４．上記１２記載のポリペプチドを用いる、上記１記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法、
１５．上記１２記載のポリペプチドを含む、上記１記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット、
１６．上記１１記載のポリペプチドとＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａとを接触させることを特徴とする、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法、
１７．上記１１記載のポリペプチドとＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ＡのＰＷＷＰドメイン又はＰＨＤドメインとを接触させることを特徴とする、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法、
１８．上記１１記載のポリペプチドとＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ＡのＰＷＷＰドメイン又はＰＨＤドメインとを含むことを特徴とする、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａのタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のタンパク質は、医薬品、特に、抗癌剤として、又は、医薬品を開発するためのリサーチツールとして、有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質と称することもある。）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞、例えば、肝細胞、特に、肝癌細胞由来するタンパク質であってよく、合成タンパク質であってもよい。
【００１０】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、もっとも好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
【００１１】
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。
【００１２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有することが好ましい。
【００１３】
実質的に同質の活性としては、例えば、細胞増殖抑制活性、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ結合活性、ＤＮＡメチル化抑制活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、たとえば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ結合活性が同等（たとえば、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００１４】
上記の各活性の測定には、従来公知の任意の方法を用いることができる。たとえば、細胞増殖抑制活性には、コロニーフォーメーションアッセイを、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ結合活性には、免疫沈降法（ＩＰ）、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）やＧＳＴプルダウン法を、ＤＮＡメチル化抑制活性には、ＭＳＰ解析、インビトロでのメチル基転位反応やバイサルファイトシークエンス法を、それぞれ、用いることができる。
【００１５】
また、本発明のタンパク質としては、例えば、下記：
（i）配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜６０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（iv）配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または
（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。また、上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
【００１６】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡは、好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーからのＤＮＡである。
【００１７】
上記ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
【００１８】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
【００１９】
配列番号１で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上、好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２０】
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴを用い、以下の条件で計算することができる。
期待値＝１０；
ギャップを許す；
フィルタリング＝ＯＮ；
マッチスコア＝１；
ミスマッチスコア＝−３
【００２１】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
【００２２】
ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００２３】
より具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２４】
本発明のタンパク質を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を含有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Molecular Cloning 2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２５】
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。このＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンを有することができる。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２６】
本発明のタンパク質の発現ベクターは、たとえば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、次いで、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００２７】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウィルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
【００２８】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
【００２９】
発現ベクターには、さらに、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーなどを含むことができる。
【００３０】
本発明のベクターを用いて、適当な宿主を形質転換することにより形質転換体を製造することができる。
【００３１】
宿主としては、細菌、たとえば、Escherichia coli、Bacillus subtilis又はSalmonella typhimuriumや哺乳類由来培養細胞などを用いることができる。
【００３２】
以下に、本発明のタンパク質、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの用途を説明する。
【００３３】
本発明のタンパク質は、ＳＡＬＬ３ｃ遺伝子のプロモーター領域が異常にメチル化されるとその発現が抑制されることから、疾患マーカーとして利用することができる。たとえば、肝臓癌の早期診断、症状の重篤度の判定、疾患進行の予測のためのマーカーとして有用である。
【００３４】
本発明のタンパク質は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる癌特異的ＣｐＧアイランドのメチル化を抑制することから、癌細胞の増殖を抑制することができる。また、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによるデノボでのＤＮＡメチル化を抑制することによって、体細胞分化や脱分化の制御などの、エピジェネティックな情報を調節することができる。
【００３５】
例えば、生体内において本発明のタンパク質が減少あるいは欠損しているために、本発明のタンパク質の活性が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質を発現させる等の方法を用いて、治療的有効量の本発明のタンパク質を適所に送達することによって、該患者における本発明のタンパク質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
【００３６】
本発明のタンパク質は、例えば、必要に応じてマイクロカプセル剤などとして経口的に、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認められる担体などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００３７】
本発明のタンパク質は、生体に由来することから、安全かつ低毒性であるので、たとえば、ヒトに投与することができる。本発明のタンパク質等の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどによって、変動させることができるが、たとえば、本発明のタンパク質を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク質を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。
【００３８】
本発明のタンパク質は、ＳＡＬＬ３ｃ遺伝子のプロモーター領域が異常にメチル化されるとその発現が抑制され、また、本発明のタンパク質は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼと結合することによって、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる癌特異的ＣｐＧアイランドのメチル化を抑制することができる。したがって、本発明のタンパク質の活性を調節（促進または阻害）する化合物は、癌などの予防・治療剤などとして使用することができることから、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を調節する化合物のスクリーニングのためのリサーチツールとして有用である。
【００３９】
すなわち、本発明は、本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性を調節（促進または阻害）する化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４０】
より具体例には、本発明のタンパク質と試験化合物とを接触させることを特徴とする、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる癌特異的ＣｐＧアイランドのメチル化の阻害剤のスクリーニング方法が挙げられる。
【００４１】
また、本発明のタンパク質は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、特に、ＤＮＭＴ３Ａに結合することによって癌特異的なデノボのＤＮＡメチル化を抑制することから、本発明のタンパク質とＤＮＭＴ３Ａと試験化合物とを接触させることを特徴とする、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる癌特異的ＣｐＧアイランドのメチル化の阻害剤のスクリーニング方法が挙げられる。
【００４２】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質、または本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を含有するものである。
【００４３】
また、本発明のタンパク質は、そのＺｎフィンガードメインがＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ＡのＰＷＷＰドメインに結合することによって、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａの活性を抑制する。したがって、本発明のタンパク質Ｚｎフィンガードメインは、本発明のタンパク質Ｚｎフィンガードメインと同様な作用、すなわち、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ＡのＰＷＷＰドメインに結合することによって、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａの活性を抑制する物質をスクリーニングするためのリサーチツールとして用いることができる。
【００４４】
また、本発明のタンパク質は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａのメチル化能を亢進させるＥＺＨ２と、競合的にＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａに結合する。ＥＺＨ２は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ＡのＰＨＤドメインに結合することが知られている。したがって、本発明のタンパク質は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ＡのＰＨＤドメインに結合することによって、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａの活性を抑制する物質をスクリーニングするためのリサーチツールとして用いることができる。
【００４５】
以下において、実施例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
まず、染色体ゲノム解析法であるＣＡ−ＲＬＧＳ法（Yoshikawa, H. et al. Chromosomal assignment of human genomic NotI restriction fragments in a two-dimensional electrophoresis profile. Genomics 31, 28-35 (1996).）を用いて、癌特異的変化を示すＮｏｔＩサイトの一つを特定した。そのＮｏｔＩサイトはＳＡＬＬ３遺伝子の５’側に存在した。正常肝臓ＲＮＡを用いて、そのＮｏｔＩサイトに関連した遺伝子をクローニングしたところ、ＧｅｎＢａｎｋに登録されたＳＡＬＬ３（ＮＭ＿１７１９９９）（Kohlhase, J. et al. SALL3, a new member of the human spalt-like gene family, maps to 18q23. Genomics 62, 216-22 (1999).）のヌクレオチド位置２９１７から３１３２の２１６ｂｐからなるヌクレオチドがスプライスアウトされたオルターネートフォームであることが判った。ＳＡＬＬ３には別のバリアントフォ−ム（ＡＪ００７４２１）が知られていたが、これとも５’側のアミノ酸配列が異なっていた。そこで、クローニングした１２２８アミノ酸よりなる新規のオルターネートスプライスフォームをＳＡＬＬ３ｃと名づけた。
【００４７】
ＳＡＬＬ３ｃは８個のＣ２Ｈ２タイプのＺｎフィンガーを有しており、そのうちの４個が２個のダブルＺｎフィンガーモチーフを形成しているのが特徴である（図１）。
【００４８】
ＭＳＰ法を用いてＳＡＬＬ３ｃ遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化状態を調べたところ、１０個の肝細胞癌細胞株のうち、５個で異常なメチル化を認めた。一方、正常肝臓サンプルではメチル化を認めなかった（図２）。
【００４９】
バイサルファイトシークエンス法ではＨｕＨ２とＨｅｐ３Ｂで非常に密なＤＮＡメチル化を認めたが、ＦＬＣ４と正常肝臓細胞では僅かなメチル化が存在するのみであった（図３）。
【００５０】
ＲＴ−ＰＣＲ法によるＳＡＬＬ３ｃのＲＮＡ発現解析では１０個のＨＣＣ細胞株のなかでＦＬＣ４のみが発現していた。これらの結果は、ＤＮＡメチル化のある細胞株がＳＡＬＬ３ｃを発現していないことを示唆した。興味深いことに正常肝臓サンプルにはＳＡＬＬ３ｃの発現は認められなかった。ＤＮＡメチル化と関連した発現抑制であるか否かを区別するために、脱メチル化剤である５Ａｚａ−ｄＣで処理した４個の細胞株を調べた。細胞株は、ＳＡＬＬ３ｃにＤＮＡメチル化が存在する３個と、検索範囲で認められなかったもの１個の計４個である。この４個の細胞株のすべてにおいて５Ａｚａ−ｄＣ  処理によるＳＡＬＬ３ｃ遺伝子の再活性化を認めた。このことから、ＳＡＬＬ３ｃはＤＮＡメチル化が関連する不活性化を受けることが明らかとなった。
【００５１】
ＨｕＨ４においては、調べたプロモーター領域にＤＮＡメチル化が存在しなかったにも関らず、５Ａｚａ−ｄＣ処理によってＳＡＬＬ３ｃ遺伝子が再活性化されたことから、調べたプロモーター領域以外に発現抑制と関連したＤＮＡメチル化がある可能性が考えられた。そこで、翻訳開始点あたりのＤＮＡメチル化状態を調べたところ、この部分においても異常なＤＮＡメチル化が存在し、また、ＳＡＬＬ３ｃを発現するＦＬＣ４でも部分的なＤＮＡメチル化が存在した。その結果、図２及び３で調べた、翻訳開始点から−３ｋｂあたりにおけるＤＮＡのメチル化が発現抑制と相関することが示された。次いで肝細胞癌の外科的切除サンプルにおいてＤＮＡメチル化を検索した。３０個のサンプルのうち１１個（３７％）に癌特異的なＤＮＡメチル化を認めた。非腫瘍部の肝臓にはＤＮＡメチル化は検出されなかった。
【００５２】
ＤＮＡメチル化が関連したＳＡＬＬ３ｃの発現抑制が明らかとなったので、ＳＡＬＬ３ｃ遺伝子が細胞増殖に影響を与えるか否かを検討した。ＳＡＬＬ３ｃがメチル化不活性化されている２種類の細胞株（ＨｕＨ２及びＨｅｐ３Ｂ）にＳＡＬＬ３ｃ遺伝子を導入してコロニーフォーメーションアッセイを行ったところ、２種類の細胞株共にコロニーの数が減少した。したがって、ＳＡＬＬ３ｃには増殖抑制作用があることが証明された。
【００５３】
さらに詳しくＳＡＬＬ３ｃの機能を解析するために、蛍光顕微鏡でＳＡＬＬ３ｃの細胞内局在を調べた。ＳＡＬＬ３ｃは核内で特徴的な点状の染色像を呈した。これはＤＮＭＴ３の染色像と似ていた。そこで、ＳＡＬＬ３ｃとＤＮＭＴ３ＡあるいはＳＡＬＬ３ｃとＤＮＭＴ３Ｂを共発現させてコンフォーカル顕微鏡で観察したところ、多くの場所でＳＡＬＬ３ｃとＤＮＭＴ３Ａあるいは  ＤＮＭＴ３Ｂは共局在することが分かった。そこで、ＳＡＬＬ３ｃとＤＮＭＴ３が結合するか否かを免疫沈降法によって調べた。大量のＤＮＭＴ３ＡがＳＡＬＬ３ｃと共に沈降した。ＤＮＭＴ３Ｂはそれよりも量的に少ないが、やはりＳＡＬＬ３ｃと共に沈降した（図４）。免疫沈降法による解析からＳＡＬＬ３ｃとＤＮＭＴ３は結合することが明らかとなった。ＳＡＬＬ３ｃはＤＮＭＴ３ＢよりＤＮＭＴ３Ａに強く結合したので、以降の実験ではＤＮＭＴ３Ａについて検討した。
【００５４】
ＳＡＬＬ３ｃとＤＮＭＴ３Ａの結合に重要な分子内の領域を明らかにするために、まずＳＡＬＬ３ｃの欠失変異体を作成した（図５、Δ１〜７）。免疫沈降法による解析で、変異体１，４，５と７はＤＮＭＴ３Ａと結合したが、変異体２，３と６は結合しなかった。興味深いことに、ＤＮＭＴ３Ａと結合したＳＡＬＬ３ｃの変異体はすべてダブルＺｎフィンガーモチーフを有していた。対照的に、ダブルＺｎフィンガーモチーフのない変異体は結合していなかった。この結果はＳＡＬＬ３ｃのダブルＺｎフィンガーモチーフがＤＮＭＴ３Ａとの結合に必須であることを示唆している。このことを確認するために、インビトロでのＧＳＴプルダウン解析を行った。
【００５５】
３５Ｓ−メチオニンの存在下でインビトロ−トランスレーション−トランスクリプション反応によって作成したＳＡＬＬ３ｃの欠失変異体と、ＧＳＴタグ付の全長ＤＮＭＴ３Ａ（ＧＳＴ−ＤＮＭＴ３Ａ）を用いた。全長のＳＡＬＬ３ｃ及び、３種のＳＡＬＬ３ｃ欠失変異体（Δ１、３、７）のうちダブルＺｎフィンガーモチーフを有する２種（Δ１、７）が選択的にＧＳＴ−ＤＮＭＴ３Ａに結合した。しかしながら、ダブルＺｎフィンガーモチーフのない変異体は結合しなかった。この結果よりＳＡＬＬ３ｃのダブルＺｎフィンガーモチーフがＤＮＭＴ３Ａと直接結合することが示された。
【００５６】
次いで、ＳＡＬＬ３ｃと結合するＤＮＭＴ３Ａの分子内領域を調べた。３５Ｓ−メチオニンの存在下でインビトロ−トランスレーション−トランスクリプション反応によって作成したＤＮＭＴ３Ａの欠失変異体と、ＧＳＴタグ付のダブルＺｎフィンガーモチーフを有するＳＡＬＬ３ｃの欠失変異体を用いた。全長のＤＮＭＴ３ＡはＧＳＴ−ＳＡＬＬ３ｃ欠失変異体に結合し、同等の結合がＰＷＷＰドメインを有するＤＮＭＴ３Ａの欠失変異体に認められた。しかしながらＰＨＤドメインを有するがＰＷＷＰドメインのない欠失変異体は、ＧＳＴ−ＳＡＬＬ３ｃ欠失変異体に結合しなかった（図６）。このことは、ＰＷＷＰドメインがＳＡＬＬ３ｃとの結合に必要であることを示唆している。以上より、ＳＡＬＬ３ｃのダブルＺｎフィンガーモチーフとＤＮＭＴ３ＡのＰＷＷＰドメインが直接結合すると結論づけられた。
【００５７】
ＳＡＬＬ３ｃとＤＮＭＴ３Ａの直接結合がインビトロとインビボで示されたので、次にＳＡＬＬ３ｃがインビトロでＤＮＭＴ３Ａのメチル基転移活性を調節し得るかを調べた。細胞から免疫沈降で単離したＤＮＭＴ３Ａを用いて、Ｓアデノシル３ＨメチオニンからＳＯＣＳ−３プラスミドＤＮＡへのメチル基の転移を測定した。ＳＯＣＳ−３遺伝子はある種の癌細胞株ならびにＨＣＣの切除サンプルにおいてメチル化されているので（Niwa, Y. et al. Methylation silencing of SOCS-3 promotes cell growth and migration by enhancing JAK/STAT and FAK signalings in human hepatocellular carcinoma. Oncogene 24, 6406-17 (2005).）、メチル化を測定する基質として好適と考えた。過剰発現させた細胞から単離したＤＮＭＴ３Ａはコントロールに比して、顕著なメチル基転移能を認めた。興味深いことに、ＳＡＬＬ３ｃとＤＮＭＴ３Ａを共発現させるとＤＮＭＴ３Ａ単独発現の場合より、ＤＮＭＴ３Ａのメチル基転移能が低下した。ＤＮＭＴ３Ａのタンパク発現量は、この２者の間で殆ど同じであった（図７）。
【００５８】
ＳＡＬＬ３ｃがインビトロでＤＮＭＴ３Ａの酵素活性を抑制することを見出したので、ＳＡＬＬ３ｃの新規ＤＮＡメチル化の抑制についてさらに解析した。癌特異的なメチル化を受けるＣｐＧアイランドのメチル化を実験的に示した報告はほとんどなく、癌におけるＣｐＧアイランドの新規メチル化についての理解は甚だ不十分である。
【００５９】
まず、異常なＣｐＧアイランドのメチル化が誘導できる癌細胞株の樹立を行った。肝細胞癌株であるＨｕＨ２を９日間に渡り５Ａｚａ−ｄＣで処理した後、生存細胞をコロニー化させた。その一つ（クローン１２）を用いてＨＣＣでメチル化される部位を調べた所、その殆どの部位で脱メチル化あるいはメチル化の顕著な減少を認めた。このクローンを用いることによって、癌特異的なＣｐＧアイランドのメチル化の変化を細胞で効果的に調べることが可能となった。
【００６０】
ＤＮＭＴ３Ａをクローン１２に一過的に発現させて、親細胞のＨｕＨ２ではメチル化されているが、クローン１２では脱メチル化されている１０個のＣｐＧアイランドについてメチル化状態を調べた。ＤＮＭＴ３Ａ発現細胞において、ＳＯＣＳ−３、ＳＡＬＬ３ｃ、ＥＭＸ１のＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化亢進を認めた。対照的に、コントロール細胞ではＤＮＡメチル化の変化は認められなかった。また、ＤＮＭＴ３Ｂの発現ではメチル化の亢進が示されなかった。重要なこととして、ＳＡＬＬ３ｃとＤＮＭＴ３Ａを共発現させると、上記３箇所のＣｐＧアイランドで認められたＤＮＭＴ３Ａによるメチル化亢進が減弱した。ＤＮＭＴ３Ａの発現量はＤＮＭＴ３Ａのみの発現細胞でも、ＤＮＭＴ３ＡとＳＡＬＬ３ｃの共発現細胞でも同じであった。また、５Ａｚａ−ｄＣで脱メチル化した他のクローンでも同様の結果を得た。
【００６１】
次いで、私たちはレトロウイルスを用いて恒常的にＤＮＭＴ３Ａ、ＳＡＬＬ３ｃを発現するクローン１２細胞を作成した。ＤＮＭＴ３Ａを恒常的に発現する細胞において再び、ＳＯＣＳ−３、ＳＡＬＬ３ｃおよびＥＭＸ１のＣｐＧアイランドのメチル化亢進がＭＳＰ解析によって示された。特に、ＳＯＣＳ−３のＣｐＧアイランドのメチル化は顕著であった。一過性発現の時と同様にＳＡＬＬ３ｃとＤＮＭＴ３Ａを共発現させると、ＤＮＭＴ３ＡによるＤＮＡメチル化が減少した。
【００６２】
ＤＮＭＴ３ＡによるＤＮＡメチル化と、ＤＮＭＴ３Ａ依存的メチル化に対するＳＡＬＬ３ｃの抑制作用を確かめるために、バイサルファイトシーケンス法で恒常的発現細胞のメチル化状態を調べた。上記３個のＣｐＧアイランドにおいて、ＤＮＭＴ３Ａ恒常的発現細胞では著明なＤＮＡメチル化の亢進があり、ＳＡＬＬ３ｃとＤＮＭＴ３Ａを共発現する細胞では、ＤＮＭＴ３ＡによるＤＮＡメチル化の減少を認めた。
【００６３】
これらの結果は、癌特異的変化を示す一群のＣｐＧアイランドのメチル化をＤＮＭＴ３Ａが促進するということを示している。さらに重要な事は、ＳＡＬＬ３ｃの過剰発現がＤＮＭＴ３ＡによるＣｐＧアイランドのメチル化を抑制するという結果である。このＳＡＬＬ３ｃによるゲノムＤＮＡメチル化の阻害は、インビトロでのＳＡＬＬ３ｃによるＤＮＭＴ３Ａ酵素活性の抑制と一致する。私たちは、ＭＳＰ法によってＤＮＭＴ３ＡによるＤＮＡメチル化誘導を３個のＣｐＧアイランドで見出したが、調べた別の７個のＣｐＧアイランドにおいてはＤＮＭＴ３Ａに対する感受性が認められなかった。この結果は、ＤＮＭＴ３ＡによるＣｐＧアイランドメチル化を過小評価しているかもしれない。なぜなら、限られた領域におけるＤＮＡメチル化の亢進は、しばしばＭＳＰ法では検出できないからである。
【００６４】
次いで私たちは、ＳＡＬＬ３ｃの発現抑制が癌細胞でＤＮＡメチルを促進するか否かを調べた。１０種類のＨＣＣ細胞株のうちＳＡＬＬ３ｃを発現するのはＦＬＣ４のみであった。ＦＬＣ４ではＤＮＭＴ３Ａも発現したので、ＲＮＡ干渉法を用いてＦＬＣ４細胞のＳＡＬＬ３ｃ発現を抑制した。２種のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ１及びｓｉＲＮＡ２）が効果を示したが、ｓｉＲＮＡ１の方がより強くＳＡＬＬ３ｃの発現を抑制した。そこで、ｓｉＲＮＡ１を用いてＳＡＬＬ３ｃ発現を抑制したＦＬＣ４細胞で、３箇所のＣｐＧアイランドのメチル化状態を調べた。クローン１２細胞においてＤＮＡメチル化状態を調べたＳＯＣＳ−３とＥＭＸ１のＣｐＧアイランドの領域は、ＦＬＣ４細胞では既に完全なメチル化を受けていたため、ＳＡＬＬ３ｃ、ＥＣＥＬ１とＨｓ．６７０８０７のＣｐＧアイランドについてバイサルファイトシークエンス解析を行った。
【００６５】
コントロール細胞と比較した時、ＳＡＬＬ３ｃ発現を抑制した細胞でより密度の高いＤＮＡメチル化をこの３個のＣｐＧアイランドにおいて見出した。以上のＳＡＬＬ３ｃ過剰発現とＲＮＡ干渉による発現抑制の実験結果から、ＳＡＬＬ３ｃは癌特異的なＤＮＡメチル化を受ける一群のＣｐＧアイランドのデノボのメチル化を抑制する新たな因子であると結論づけられた。
【００６６】
ＳＡＬＬ３ｃがＤＮＭＴ３ＡによるＣｐＧアイランドのメチル化を抑制する機構をより深く理解するために、ＤＮＭＴ３Ａ、ＳＡＬＬ３ｃ単独あるいは、その二者をトランスフェクションしたクローン１２細胞を用いてクロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）による解析を行った。ＤＮＭＴ３Ａを導入した細胞では、ＤＮＭＴ３Ａがメチル化を亢進させた３種類（ＳＯＣＳ−３、ＳＡＬＬ３ｃ及びＥＭＸ１）のクロマチン領域と、ＤＮＭＴ３Ａとの結合が観察された。重要なこととして、ＳＡＬＬ３ｃとＤＮＭＴ３Ａの共発現がＤＮＭＴ３Ａとクロマチンの結合を減少させた。
【００６７】
ＤＮＭＴ３Ａの発現量はＤＮＭＴ３Ａ単独発現細胞と、ＤＮＭＴ３ＡとＳＡＬＬ３ｃの共発現細胞間で同等であった。ＤＮＭＴ３Ａが特異的にクロマチンに結合し、ＳＡＬＬ３ｃがそれを抑制することを確かめるために、ＲＮＡ干渉でＳＡＬＬ３ｃの発現抑制を行った細胞を用いてＣｈＩＰ解析を行った。ＳＡＬＬ３ｃのＲＮＡ干渉を行った細胞では、ＳＡＬＬ３ｃの発現抑制によってメチル化が亢進した３個（ＳＡＬＬ３ｃ、ＥＣＥＬ１及びＨｓ．６７０８０７）のクロマチン領域と、ＤＮＭＴ３Ａとの結合が増大した。これらの結果よりＳＡＬＬ３ｃは、ＤＮＭＴ３Ａとクロマチンとの結合を抑制することが示された。このことより、ＳＡＬＬ３ｃがＤＮＭＴ３Ａ依存的なＤＮＡメチル化を抑制することを説明できる。
【００６８】
ＳＡＬＬ３ｃのダブルＺｎフィンガーモチーフとＤＮＭＴ３ＡのＰＷＷＰドメインの結合によって、ＳＡＬＬ３ｃがＤＮＭＴ３Ａを抑制することが明らかとなった。ＥＺＨ２はＤＮＭＴ３のＰＨＤドメインと結合することによって、ＤＮＭＴ３をＥＺＨ２のターゲットシークエンスにリクルートする。結果、その部位がメチル化を受けると報告されている（Vire, E. et al. The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation. Nature 439, 871-4 (2006).）。私たちは、ＳＡＬＬ３ｃがＥＺＨ２とＤＮＭＴ３Ａの結合を抑制する可能性を考えた。これを調べるため、競合的なインビトロの結合アッセイを行った。ＧＳＴ−ＤＮＭＴ３Ａ、一定量のＥＺＨ２、様々な量のＳＡＬＬ３ｃを用いてＧＳＴプルダウンアッセイを行った。ＳＡＬＬ３ｃの量依存的に、ＳＡＬＬ３ｃはＥＺＨ２とＤＮＭＴ３Ａの結合を減少させた。この結果は、ＳＡＬＬ３ｃがＥＺＨ２とＤＮＭＴ３Ａとの結合を抑制することを示している。
【００６９】
発現ベクターの構築
全長ヒトＳＡＬＬ３ｃ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ及びＥＺＨ２をＰＣＲによって増幅した。ＳＡＬＬ３ｃでは配列番号３及び４、ＤＮＭＴ３Ａでは配列番号５及び６、ＤＮＭＴ３Ｂでは配列番号７及び８、そして、ＥＺＨ２では、配列番号９及び１０に示したプライマーを用いた。増幅したＤＮＡを、Ｎ末端をＨＡ又はFlagタグに置換した改変pcDNA3.1ベクター（Invitrogen）に挿入した。ＳＡＬＬ３ｃ欠失変異体を作るために用いたプライマー配列は、欠失１では配列番号１１及び１２、欠失２では配列番号１３及び１４、欠失３では配列番号１５及び１６、そして欠失４では配列番号１７及び１８であった。ＳＡＬＬ３ｃ欠失変異体５は、２つのＤＮＡ（全長ＳＡＬＬ３ｃのEcoRI-NheIフラグメント及び欠失変異体２のNheI-EcoRIフラグメント）をアセンブルすることによって作った。欠失変異体６は、欠失変異体１のEcoRI-NotIフラグメントである。欠失変異体７は、欠失変異体１のNotI-XbaIフラグメントである。全てのＳＡＬＬ３ｃ変異体をFlagタグpcDNA3.1に挿入した。ＤＮＭＴ３Ａ欠失変異体１は、全長ＤＮＭＴ３ＡのEcoRI-KpnIフラグメントである。ＤＮＭＴ３Ａ欠失のためのプライマーは、欠失２ではＴ７プライマー及び配列番号１９、欠失３では配列番号２０及びpcDNA3.1リバースプライマーであった。プライマーのセット（プロモーター１について配列番号２１及び２２、プロモーター２について配列番号２３及び２４）を用いて、ＳＡＬＬ３ｃプロモーター領域（−１１５７〜−３２７３及び＋２０〜−１１７７）をpGL3-basic vector（Promega）にクローニングした。ＳＯＣＳ−３プラスミドは、Niwa, Y. et al. Methylation silencing of SOCS-3 promotes cell growth and migration by enhancing JAK/STAT and FAK signalings in human hepatocellular carcinoma. Oncogene 24, 6406-17 (2005)に記載されたとおりである。E. coliでの発現については、pcDNA3.1ベクター中のＳＡＬＬ３ｃ欠失変異体７及び全長ＤＮＭＴ３Ａ  ｃＤＮＡをpGEXベクター（GE healthcare）に移した。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ＳＡＬＬ３ｃタンパク質の概略図である。ＳＡＬＬ３ｃは、８つのＣ２Ｈ２タイプＺｎフィンガーを含む（縦線で示した。）。４つのフィンガーは、２つのダブルＺｎフィンガーモチーフを構成する。
【図２】上のパネルは、ＳＡＬＬ３ｃプロモーター領域におけるＣｐＧ密度を表す。縦線は、ＣｐＧ配列を示す。翻訳開始部位を「１」として示した。矢印及び三角印は、ＭＳＰ及びビサルファイトシークエンスのそれぞれにセットされたプライマーを示す。下のパネルは、肝癌細胞株のＭＳＰ分析を表す。ＨｕＨ４〜ＦＬＣ４は、肝癌細胞株である。Ｍレーンのバンドは、メチル化産物であり、Ｕレーンのバンドは、非メチル化産物である。
【図３】バイサルファイトシークエンス分析の結果を示す。ＳＡＬＬ３ｃの５’領域（−３１３９〜―２４３１）のメチル化状態を３つの肝癌細胞株（ＦＬＣ４、ＨｕＨ２及びＨｅｐ３Ｂ）及び正常肝サンプルで調べた。各サンプルについて、１０個の独立したクローンをシークエンスした。黒丸及び白丸は、それぞれ、メチル化及び非メチル化を示す。
【図４】ＳＡＬＬ３ｃのＤＮＭＴ３への結合を表す。細胞をＨＡ−ＳＡＬＬ３ｃ又はもとのベクター（ＨＡ）に加えてＦｌａｇ−ＤＮＭＴ３Ａ又はＦｌａｇ−ＤＮＭＴ３Ｂ発現ベクターでコトランスフェクションした。抗ＨＡ免疫沈降を、抗Ｆｌａｇ又は抗ＨＡ抗体を用いるイムノブロッティングによって解析した。
【図５】ダブルＺｎフィンガーモチーフを含むＳＡＬＬ３ｃ変異体とＤＮＭＴ３Ａとの相互作用を表す。Ｆｌａｇでタグを付けた数種類のＳＡＬＬ３ｃ欠失変異体をＤＮＭＴ３Ａとコトランスフェクションした。抗ＤＮＭＴ３Ａ抗体を用いるイムノブロッティングによって抗Ｆｌａｇ免疫沈降を解析した。上のパネルに変異体１〜７の概略を示した。Ｖｅｃｔｏｒは、ベクターのコントロールである。野生型（ＷＴ）は、全長のＳＡＬＬ３ｃである。
【図６】ＰＷＷＰドメインを含むＤＮＭＴ３Ａ変異体は、インビトロでダブルＺｎフィンガーモチーフを含むＳＡＬＬ３ｃ欠失変異体に結合する。ＧＳＴプルダウンアッセイを固定化ＧＳＴ−ＳＡＬＬ３ｃΔ７とインビトロで翻訳された３５Ｓでラベルした野生型ＤＮＭＴ３Ａ又はＤＮＭＴ３Ａ変異体を用いて行った。
【図７】インビトロのメチルトランスフェラーゼ活性アッセイを表す。ＤＮＭＴ３Ａを指示されたプラスミドでトランスフェクションした細胞から抗Ｆｌａｇ免疫沈降によって単離した。メチルトランスフェラーゼ反応を単離したＤＮＭＴ３Ａ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］メチオニン及びＳＯＣＳ−３−プラスミドＤＮＡを用いて行った。細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、そしてＦｌａｇ、ＨＡ又はアクチン抗体のいずれかでのイムノブロッティングによって解析した。
【図１】
2009095262.tif 000002
【図２】
2009095262.tif 000003
【図３】
2009095262.tif 000004
【図４】
2009095262.tif 000005
【図５】
2009095262.tif 000006
【図６】
2009095262.tif 000007
【図７】
2009095262.tif 000008
【配列表】
2009095262000001.app