(57)【要約】      （修正有）【課題】小型且つ安価な増幅核酸の検出装置、及び該装置を用いる増幅核酸の簡便かつ高精度な検出方法を提供する。【解決手段】核酸溶液を保持する平面状の試料保持部が表面に設けられ、前記核酸溶液及び前記核酸溶液を被覆する被覆液を保持する基板と、前記基板の温度を調節する温調手段と、前記核酸溶液中の光シグナルを検出するシグナル検出手段と、前記基板上の核酸溶液中及び被覆液中の気泡の有無を検出する気泡検出手段と、を備える増幅核酸の検出装置；基板表面に設けられた平面状の試料保持部に核酸溶液を保持し、該核酸溶液を被覆液で被覆して、前記核酸溶液中及び被覆液中の気泡の有無を検出し、気泡を検出しなかった場合に、前記試料保持部において核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物を検出する増幅核酸の検出方法。【選択図】図１
2009175074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅核酸の検出装置であって、
核酸溶液を保持する平面状の試料保持部が表面に設けられ、前記核酸溶液及び前記核酸溶液を被覆する被覆液を保持する基板と、
前記基板の温度を調節する温調手段と、
前記核酸溶液中の光シグナルを検出するシグナル検出手段と、
前記基板上の核酸溶液中及び被覆液中の気泡の有無を検出する気泡検出手段と、
を備えることを特徴とする増幅核酸の検出装置。
【請求項２】
前記基板表面に、試料保持部である第一親水性領域と、該第一親水性領域周縁部を包囲する第一撥水性領域とが設けられていることを特徴とする請求項１に記載の増幅核酸の検出装置。
【請求項３】
前記基板において、さらに前記第一撥水性領域の外側周縁部を包囲する第二親水性領域と、該第二親水性領域の外側周縁部を包囲する第二撥水性領域とが設けられていることを特徴とする請求項２に記載の増幅核酸の検出装置。
【請求項４】
さらに前記基板の画像を撮影する撮像手段を備え、前記気泡検出手段は撮像データから気泡の有無を検出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の増幅核酸の検出装置。
【請求項５】
前記撮像手段及びシグナル検出手段が一体化されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の増幅核酸の検出装置。
【請求項６】
前記気泡検出手段の検出結果に基づいて、気泡を検出しなかった場合に核酸増幅反応を行い、気泡を検出した場合に核酸増幅反応を行わないように核酸増幅反応の制御を行う反応制御手段を備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の増幅核酸の検出装置。
【請求項７】
基板表面に設けられた平面状の試料保持部に核酸溶液を保持し、該核酸溶液を被覆液で被覆して、前記核酸溶液中及び被覆液中の気泡の有無を検出し、気泡を検出しなかった場合に、前記試料保持部において核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物を検出することを特徴とする増幅核酸の検出方法。
【請求項８】
前記被覆液が、前記核酸溶液よりも比重が小さく且つ沸点が１００℃以上の非水溶性の液体であることを特徴とする請求項７に記載の増幅核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増幅核酸の検出装置及び該装置を用いる増幅核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略記する）は、核酸分子中の特定領域を容器内で１００万倍にも増幅する反応である。そして、増幅された核酸の一般的な検出方法としては、ＰＣＲ終了後の反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供して各核酸断片を分離してから染色し、分離された核酸断片の大きさ（分子量）により、目的とする増幅核酸を判別する方法や、前記反応溶液をドットハイブリダイゼーション法に供して、目的とする増幅核酸を検出する方法が汎用されている。
しかしながら、ＰＣＲを利用した従来の増幅核酸の検出方法においては、ＰＣＲ終了後の核酸増幅反応混合物を、一旦反応容器から取り出して処理する必要があるため、検出結果を得るのに時間を要し煩雑な作業を伴うという問題点がある。また、増幅核酸が環境中に飛散して、検出に供する他の検体に混入することがあり、この場合、混入した増幅核酸がＰＣＲの鋳型となってしまい、他の検体の検査が正確に行えなくなるという問題点があった。また、ＰＣＲ法の欠点として、検体中の増幅対象である標的核酸の初期濃度が分かりにくいという問題点もある。
【０００３】
そこで、ＰＣＲ反応を行いながら増幅核酸の量を定量する方法が提案されている。
例えば、核酸増幅反応混合物を収容する小びんを備えた温度サイクルブロックを有する装置を使用して、ＰＣＲをモニターしながら、増幅核酸の量を定量する方法が提案されている（特許文献１〜３参照）。これらの方法においては、二本鎖核酸が存在する時に、その量に比例した強度の蛍光を発する蛍光染料を核酸増幅反応混合物に含有させておき、蛍光シグナルを検出することで、核酸濃度を算出する。蛍光シグナルの検出は、ビームスプリッタから、蛍光染料を励起する励起ビームを前記小びんに照射して、蛍光染料から蛍光を発光させる。蛍光染料からの発光ビームは、ビームスプリッタによってＣＣＤ検出器に導かれて検出される。
また、加熱／冷却ブロック中に備えられたＰＣＲチューブに光ファイバリードが接続された装置を使用して、ＰＣＲをモニターしながら、増幅核酸の量を定量する方法が提案されている（特許文献４参照）。この方法においては、前記光ファイバリードを使用して、蛍光染料を励起する励起光をＰＣＲチューブに照射し、生じた蛍光を同じ光ファイバリードを使用して分光蛍光検出装置に導き、検出する
【特許文献１】特表２００３−５２４７５４号公報
【特許文献２】特表２００５−５２６２５２号公報
【特許文献３】特開２００５−２７４５７９号公報
【特許文献４】特開平１０−２０１４６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１〜４で提案されている検出方法では、ＰＣＲを行い、且つ増幅核酸を検出する際に使用する反応容器として、マイクロタイタープレート、バイアル又はサンプルチューブを採用している。この場合通常、核酸増幅反応混合物は、前記反応容器内の試料充填部下方に存在する。
そして、特許文献１〜３で提案されている検出方法では、増幅核酸を検出する際には、励起光を核酸増幅反応混合物に正確に照射して焦点を結ばせることが必要となる。この場合、前記反応容器が複数存在し、精度を損ねることなくこれらすべての反応容器中の増幅核酸を検出するためには、これらすべての核酸増幅反応混合物に焦点を結ばせることが必要となり、そのためには、前記反応容器上方にレンズを設け、さらにこのレンズ上方に、複雑で高価なテレセントリックな光学系を設けることが必要となる。
また、特許文献４で提案されている検出方法では、励起光及び蛍光を導くための光ファイバが必要となる。
このように、従来の検出装置は特殊な構造を必要とし、装置が大型且つ高価になるという問題点があった。また、このような検出装置を使用する検出方法は、操作が煩雑であるという問題点があった。このように、目的とする増幅核酸を、精度を損ねることなく、簡便かつ低コストに検出することは困難であるのが実情であった。
【０００５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、小型且つ安価な増幅核酸の検出装置、及び該装置を用いる増幅核酸の簡便かつ高精度な検出方法を提供すること課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、増幅核酸の検出装置であって、核酸溶液を保持する平面状の試料保持部が表面に設けられ、前記核酸溶液及び前記核酸溶液を被覆する被覆液を保持する基板と、前記基板の温度を調節する温調手段と、前記核酸溶液中の光シグナルを検出するシグナル検出手段と、前記基板上の核酸溶液中及び被覆液中の気泡の有無を検出する気泡検出手段と、を備えることを特徴とする増幅核酸の検出装置である。
請求項２に記載の発明は、前記基板表面に、試料保持部である第一親水性領域と、該第一親水性領域周縁部を包囲する第一撥水性領域とが設けられていることを特徴とする請求項１に記載の増幅核酸の検出装置である。
請求項３に記載の発明は、前記基板において、さらに前記第一撥水性領域の外側周縁部を包囲する第二親水性領域と、該第二親水性領域の外側周縁部を包囲する第二撥水性領域とが設けられていることを特徴とする請求項２に記載の増幅核酸の検出装置である。
請求項４に記載の発明は、さらに前記基板の画像を撮影する撮像手段を備え、前記気泡検出手段は撮像データから気泡の有無を検出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の増幅核酸の検出装置である。
請求項５に記載の発明は、前記撮像手段及びシグナル検出手段が一体化されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の増幅核酸の検出装置である。
請求項６に記載の発明は、前記気泡検出手段の検出結果に基づいて、気泡を検出しなかった場合に核酸増幅反応を行い、気泡を検出した場合に核酸増幅反応を行わないように核酸増幅反応の制御を行う反応制御手段を備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の増幅核酸の検出装置である。
【０００７】
請求項７に記載の発明は、基板表面に設けられた平面状の試料保持部に核酸溶液を保持し、該核酸溶液を被覆液で被覆して、前記核酸溶液中及び被覆液中の気泡の有無を検出し、気泡を検出しなかった場合に、前記試料保持部において核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物を検出することを特徴とする増幅核酸の検出方法である。
請求項８に記載の発明は、前記被覆液が、前記核酸溶液よりも比重が小さく且つ沸点が１００℃以上の非水溶性の液体であることを特徴とする請求項７に記載の増幅核酸の検出方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、基板平面上で保持された増幅核酸を高精度に検出できる。そして、基板平面上で保持された増幅核酸を検出するので、装置にテレセントリックな光学系や光ファイバが不要となる。そして、例えば、顕微鏡の光学系を使用でき、複数の核酸増幅反応混合物が発する光シグナルを同時に検出できる。このように、特殊な構造を必要としないので、検出装置を小型化できると共に安価に作製できる。さらに、検出方法を簡略化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、図面を参照しながら、本発明について詳しく説明する。
＜検出装置＞
本発明に係る増幅核酸の検出装置は、核酸溶液を保持する平面状の試料保持部が表面に設けられ、前記核酸溶液及び前記核酸溶液を被覆する被覆液を保持する基板と、前記基板の温度を調節する温調手段と、前記核酸溶液中の光シグナルを検出するシグナル検出手段と、前記基板上の核酸溶液中及び被覆液中の気泡の有無を検出する気泡検出手段と、を備えることを特徴とするものである。
ここで増幅核酸とは、ＰＣＲ法等、公知の手法を適用して増幅された核酸のことであり、核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド等いずれでも良い。
【００１０】
前記溶液中の核酸は、例えば、増幅反応で得られた増幅核酸、増幅反応時に鋳型となる核酸、増幅核酸の原料となる核酸、プライマー等である。すなわち、核酸溶液としては、酵素などの増幅反応に必要な各成分を含有する増幅反応開始前の反応液や、増幅反応中の反応液が例示できる。これら反応液は、通常水溶液である。
【００１１】
前記光シグナルとは、光学的に検出可能なシグナルであり、前記溶液中の核酸や、該核酸以外に別途含まれている標識物質などが発するものである。そして、光シグナルは通常、溶液中の核酸や標識物質などが、励起光の照射等により励起された結果発するものである。
【００１２】
前記標識物質としては、好ましいものとして蛍光物質が例示できる。
そして、該蛍光物質としては、公知の如何なるものも使用でき特に限定されない。具体的には、フルオレセイン、ローダミン（ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡ等）、アクリフラビン、アレクサ（アレクサ６４７等）、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）等が例示できる。
例えば、サイバーグリーンＩ（ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉ）は、二重らせん構造を形成している核酸と特異的にインターカレートし、その結果、青色光（波長４８８ｎｍ）を吸収し、緑色光(波長５２２ｎｍ)の蛍光を発することが知られている。したがって、サイバーグリーンＩを含む反応液を増幅反応に供して核酸を増幅すると、増幅された核酸の二重らせんにサイバーグリーンＩがインターカレートするので、励起光を照射すると蛍光を発し、この時の蛍光強度は、増幅された核酸の量に比例する。
【００１３】
標識物質は一種を単独で用いても良いし、二種以上を併用しても良い。二種以上を併用する場合には、その組み合わせ及び比率等は、目的に応じて適宜選択し得る。
また、増幅産物に導入する標識物質の量も、目的に応じて適宜選択し得る。
【００１４】
図１は、本発明に係る増幅核酸の検出装置を例示する概略構成図である。
ここに例示する検出装置は、主に核酸の増幅に関わる構成として、基板２、温調手段４を備え、主に増幅核酸の検出に関わる構成として、シグナル検出手段１３、気泡検出手段を備える。後記するように、ここでは、気泡検出手段はシグナル検出手段１３に一体化されている。また、その他に、主に光シグナルの発生や伝達に関わる構成として、照明用光学系５、光源６、励起フィルタ７、ミラー８、対物レンズ９、吸収フィルタ１０等を備える。これらは、例えば、通常の蛍光検出装置において使用されるもので良い。
【００１５】
基板２の材質は特に限定されないが、透光性の材質が好ましい。透光性の材質とは、光の透過率が高く且つ自家蛍光の少ない材質を指し、具体的にはガラス類や透明な樹脂類が例示できる。なかでも好ましいものとしては、水板ガラス、白板ガラス、ハーフホワイトガラス等のガラス類が例示できる。
基板２は、表面及び裏面が平滑なものが好ましい。ここで、基板の表面とは、後記する試料保持部が設けられている側の基板２の面を指し、基板の裏面とは、前記表面とは反対側の基板２の面を指す。
基板２の大きさは特に限定されず、例えば表面及び裏面の大きさは、目的に応じて適宜選択し得る。また、基板２の厚みも目的に応じて適宜選択し得るが、強度も考慮して取り扱いのし易さという観点からは、０．９〜１．１ｍｍであることが好ましい。
【００１６】
基板の表面には、核酸溶液を保持するための試料保持部が設けられている。試料保持部は、検出対象の増幅核酸を得るために、核酸増幅反応を行う部位でもある。
試料保持部は平面状であり、スポットした溶液を保持できれば如何なる形態でも良く、基板表面の特定領域をそのまま試料保持部としても良いが、試料を安定して保持できる形態とすることが好ましい。試料を安定して保持するためには、試料保持部の少なくとも一部の領域を親水性としたものが例示できる。このような基板の一例として、溶液を保持した状態のものを図２に例示する。図２（ａ）は、基板２の斜視図、（ｂ）は（ａ）のＩＩ−ＩＩ線における基板２の断面図である。
【００１７】
図２（ｂ）に示すように、基板の表面２１には、第一親水性領域２１１と、該第一親水性領域２１１の周縁部を包囲する第一撥水性領域２１２とが設けられている。核酸溶液２０は、試料保持部である第一親水性領域２１１上で安定して保持される。そして、第一撥水性領域２１２を設けることで、溶液２０の移動が抑制されるので、溶液２０がより安定して保持される。第一親水性領域２１１は、平面状であればその外形は特に限定されず、目的に応じて選択すれば良いが、図２に示すように略円形状が好ましい。第一撥水性領域２１２も平面状であることが好ましい。そしてその外形は特に限定されず、目的に応じて選択すれば良いが、リング状であることが好ましい。このようにすることで、核酸溶液２０がより安定して保持される。
【００１８】
基板の表面２１においては、図２に示すように、第一撥水性領域２１２の外側周縁部を包囲する第二親水性領域２１３と、該第二親水性領域２１３の外側周縁部を包囲する第二撥水性領域２１４とが設けられていることが好ましい。このようにすることで、保持された核酸溶液２０の蒸発を防ぐために、被覆液２５で核酸溶液２０を被覆した際に、被覆液２５も安定して保持できる。第二親水性領域２１３及び第二撥水性領域２１４は平面状であることが好ましい。そして、第二親水性領域２１３の外形は特に限定されないが、リング状であることが好ましい。このようにすることで、被覆液２５がより安定して保持される。また、第二撥水性領域２１４の外形はリング状でも良いし、その他の形状でも良く、特に限定されない。そして、第一親水性領域２１１、第一撥水性領域２１２及び第二親水性領域２１３は、同心状に設けられていることが好ましい。
【００１９】
被覆液２５としては、核酸溶液２０の主溶媒である水の蒸発を抑制し、核酸増幅時における核酸溶液２０の加温にも耐えるようにするという目的から、核酸溶液２０よりも比重が小さく且つ沸点が１００℃以上である非水溶性の液体が好ましい。このような物性を有するものであれば如何なるものも使用し得るが、好ましい市販品として、各種ミネラルオイルが例示できる。核酸溶液２０を直接被覆することで、マイクロタイタープレートやサンプルチューブを使用した場合のように、核酸溶液２０近傍に多量の空気層が存在することがなく、例えばＰＣＲの熱サイクル中に核酸溶液２０が蒸発することがなく、核酸溶液２０の濃度変化が抑制されるので、安定して核酸増幅を行うことができる。
そして、基板の表面２１に、第二親水性領域２１３及び第二撥水性領域２１４を設けることで、上記のような物性を有する被覆液２５の移動が抑制される。
【００２０】
親水性領域及び撥水性領域の寸法は、目的に応じて適宜選択し得る。例えば、０．２〜３μＬ程度の極微量の核酸溶液２０を保持する場合には、第一親水性領域２１１の直径Ｄ１は０．５ｍｍ〜６ｍｍとすることが好ましく、第一撥水性領域２１２の幅Ｌ１及び第二親水性領域２１３の幅Ｌ２は０．２ｍｍ〜３ｍｍとすることが好ましい。第二撥水性領域２１４の寸法は、基板２の大きさや試料保持部の数を考慮して、任意に選択し得る。例えば、図２に示すように、第二親水性領域２１３の外側全面を第二撥水性領域２１４としても良い。
【００２１】
親水性領域及び撥水性領域を有する基板２は、公知の方法で作製できる。具体的には、基板表面に親水処理及び撥水処理を施す方法、親水性基板表面に撥水処理を施す方法が例示できる。
親水処理としては、水酸基、アミノ基又はカルボキシ基等の親水性の官能基を基板表面に導入するものが例示できる。撥水処理としては、アルキル基、アルケニル基、アルコキシ基又はアルケニルオキシ基等の低極性の官能基や、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されたアルキル基又はアルコキシ基等の疎水性の官能基を基板表面に導入するものが例示できる。
このような、親水性領域及び撥水性領域を有する基板２としては市販品を使用しても良く、例えば、極微量の核酸溶液２０を保持する目的においては、Ａｄｖａｌｙｔｉｘ社製のＡｍｐｌｉＧｒｉｄ（登録商標）が好適である。
【００２２】
基板２は、核酸溶液２０中への異物の混入を防止するため、図１に示すように、カバー３で被覆することが好ましい。
カバー３の材質は、基板２への励起光の照射、及び光シグナルの検出を妨げないように、透光性を有する材質であることが好ましい。具体的には、基板２と同様の透光性を有する材質が例示できる。
【００２３】
温調手段４は、試料保持部に保持された核酸溶液２０中でＰＣＲ等の核酸増幅を行う時に、図１に示すように、基板２を装着してその温度を調節するものである。基板２は通常、基板裏面２２が温調手段４の熱伝導部に接触するように装着される。
温調手段４は、加温及び冷却が可能な公知のものから適宜選択して使用できるが、温度調節を迅速かつ高精度に行える観点から、市販品を使用してもよく、例えば、ＰＣＲ用のサーマルサイクラーが好適である。
基板２は、温調手段４の熱伝導部に直接接触させて装着してもよいし、熱伝導性の材質からなる介在物を介して間接的に接触させて装着してもよい。
なお、ここでは、基板２を温調手段４に装着した例について示しているが、例えば、別途設けた支持体で基板２を支持しながら、温調手段の熱伝導部を直接又は間接的に基板２に接触させてもよい。
【００２４】
温調手段４の熱伝導部の材質は、耐熱性で且つ熱伝導性の高いものが好ましく、アルミニウム、鉄、銅などの金属、ステンレスなどの合金、熱伝導性の各種樹脂類が例示できる。なかでも安定性、熱伝導性に優れることから、金属又は合金が好ましく、アルミニウムが特に好ましい。
【００２５】
温調手段４は、図１に示すように、コンピュータ１５に電気的に接続されていることが好ましい。このようにすることで、核酸増幅時における温度、時間、サイクル数などを自動で制御できる。また、核酸溶液中の気泡の有無の検出結果に基づいて、核酸増幅反応の進行又は停止を自動で制御できる。これにより、膨大な数のサンプルも迅速に処理できる。
【００２６】
温調手段４の配置位置は、試料中の光シグナルの検出を妨げない限り特に限定されない。
温調手段４は、公知の加温冷却装置等と同様に作製できる。
【００２７】
光源６は、核酸溶液中への照射による励起で、光シグナルを生じさせるものであり、例えば、ハロゲンランプ、キセノンランプが使用できる。
また、照明用光学系５は公知のものでよく特に限定されない。
【００２８】
励起フィルタ７は、光源６からの照射光６０のうち、励起に必要な特定範囲の波長の光のみを透過させて励起光６１とするものであり、励起対象、例えば標識物質の種類に応じて選択すれば良い。そして、反射光や迷光から生じるゴースト像の発生を防止するために、励起に必要な波長範囲以外の光を精度良く減衰させるものが好ましく、例えば、蛍光物質としてサイバーグリーンを使用する場合には、４８８nm近傍を中心とする波長帯域の光を透過させるものが好ましい。
【００２９】
ミラー８は、励起光６１を反射又は透過させてこれを標識物質に導く。
対物レンズ９は、励起光６１により励起されて生じた光シグナルを拡大して通過させる。
吸収フィルタ１０は、光シグナルの特定範囲の波長の光のみを透過させ、検出光とするものであり、光シグナルに応じて選択すれば良い。そして、反射光や迷光から生じるゴースト像の発生を防止するために、目的とする波長範囲以外の光を精度良く減衰させるものが好ましく、例えば、蛍光物質としてサイバーグリーンを使用する場合には、５２２nm近傍を中心とする波長帯域の光を透過させるものが好ましい。
【００３０】
シグナル検出手段１３は、光シグナルの強度を検出できるものであれば良く、公知の光検出器等を使用できる。ここでは、核酸溶液中の光シグナルのうち、吸収フィルタ１０を透過した検出光を検出するようになっている。なかでも、基板２を撮影できる撮像手段と一体化されたものが好ましく、基板２の撮像データから光シグナルの強度を算出できるものがより好ましく、ＣＣＤカメラを備えたものが例示できる。
【００３１】
また、シグナル検出手段１３は、コンピュータ１５に電気的に接続されていることが好ましい。このようにすることで、光シグナルの検出結果に基づいて、増幅核酸の量を自動で算出できる。また、シグナル検出手段１３が撮像手段と一体化されていれば、光シグナル検出時の撮像回数、撮像タイミング、露光時間等を自動で制御できる。これにより、膨大な数のサンプルも迅速に処理でき、所望の情報を効率的且つ高精度に入手できる。
【００３２】
気泡検出手段は、核酸溶液又は被覆液の画像を光学的に解析できるものが好ましく、基板２の撮像データから気泡の有無を検出できるものが好ましい。この場合、吸収フィルタ１０を介さずに撮像データを取得するのが好ましい。したがって、吸収フィルタ１０は、検出装置において移動可能とされていることが好ましく、例えば、検出装置に設けられた回転軸に固定され、該回転軸の回転に伴ってフィルタ面と略平行な面内において移動可能とされた、ターレット式のものが好ましい。
図１に示すように、撮像手段がシグナル検出手段１３と一体化されている場合には、コンピュータ１５によって、撮像データの自動解析が可能なので、気泡の有無を自動で効率的に判別できる。
【００３３】
ここでは、シグナル検出手段、撮像手段及び気泡検出手段を一体に設けた例を示しており、このような構成とすることで検出装置を小型化かつ合理化しているが、これら各手段を個別に設けても良い。この場合にも、シグナル検出手段、撮像手段及び気泡検出手段は、コンピュータ１５に電気的に接続することが好ましい。
【００３４】
本発明においては、図１に示すように、暗箱１４を設けることが好ましい。このようにすることで、正確に特定範囲の波長の励起光を照射でき、光シグナルの検出を高精度に行なうことができる。また、暗箱１４を使用する代わりに、光シグナルの検出を暗室内で行っても良いし、暗幕を使用して光シグナルの検出を行っても良い。
【００３５】
本発明においては、励起フィルタ７に代わり、励起光を透過させるダイクロイックミラーを使用しても良いし、吸収フィルタ１０に代わり、検出光を透過させるダイクロイックミラーを使用しても良い。
【００３６】
上記のように、コンピュータ１５により、検出装置の制御及び情報処理を行うことができる。
気泡の検出に際しては、基板２の撮像条件及び撮像データ解析条件を予め設定しておくことで、撮像データの取得及び解析、並びに気泡の有無の判別を自動で行うことができる。
核酸の増幅に際しては、増幅反応の進行条件を予め設定しておくことで、増幅反応の進行及び停止を自動で行うことができる。また、増幅反応時の温度、時間、サイクル数等の増幅条件を予め設定しておくことで、増幅反応を自動で行うことができる。
光シグナルの検出に際しては、シグナルデータ解析条件を予め設定しおくことで、増幅核酸の量を自動で算出できる。この時、光シグナルの検出を基板２の撮像により行う場合には、シグナル検出手段１３の撮像回数、撮像タイミング、露光時間等の検出条件を予め設定しておくことで、シグナルデータの取得を自動で行うことができる。
【００３７】
なお、本発明の検出装置においては、本発明の効果を損なわない範囲において、上記構成の一部を削除又は変更しても良いことは、言うまでも無い。
【００３８】
本発明の検出装置においては、基板２平面上で保持された核酸溶液２０中の増幅核酸を検出できるので、従来のテレセントリックな光学系や光ファイバが不要である。そして、例えば、顕微鏡の光学系を使用でき、基板２上の複数の光シグナルも同時に検出できる。また、基板２と核酸溶液２０との接触面で焦点調整を行うので、焦点位置を溶液量に影響されることなく一定にでき、核酸溶液２０ごとに焦点調整を行う必要がない。したがって、装置の小型化と安価な作製が可能である。
【００３９】
＜検出方法＞
本発明に係る増幅核酸の検出方法は、基板表面に設けられた平面状の試料保持部に核酸溶液を保持し、該核酸溶液を被覆液で被覆して、前記核酸溶液中及び被覆液中の気泡の有無を検出し、気泡を検出しなかった場合に、前記試料保持部において核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物を検出することを特徴とするものである。そして、上記本発明の検出装置を使用するのが好適である。
本発明においては、気泡の有無の検出に供する核酸溶液は、増幅反応開始前の反応液でもよいし、増幅反応中の反応液でもよい。
すなわち、増幅反応開始前の反応液中及び被覆液中の気泡の有無を検出し、気泡が存在しないことを確認してから核酸増幅反応を行えばよい。あるいは、増幅反応開始前に気泡が存在しなかった反応液中及び被覆液中には、何らかの理由により増幅反応開始後に気泡が生じることがあるので、増幅反応中の反応液中及び被覆液中の気泡の有無を検出し、気泡が存在することを確認したら増幅反応を停止すればよい。
【００４０】
核酸溶液中に気泡が存在すると、増幅反応中の温度変化に伴って気泡が破裂し、核酸溶液が飛散することがある。この場合、破裂が生じた核酸溶液においては、その組成が破裂前と異なることがある。さらに、試料保持部が平面状であると、飛散した液が、同時に増幅反応を行っている他の核酸溶液中に混入し易い。すると、増幅反応を正確に行うことができず、増幅核酸の検出精度が低下してしまう。これは被覆液についても同様であり、被覆液中の気泡が破裂することで、被覆されていた核酸溶液が飛散してしまうことがある。しかし、本発明においては、核酸溶液中及び被覆液中のいずれかに気泡が存在する場合には増幅反応を行わないので、核酸溶液の飛散や、飛散した液の混入が防止され、高精度に増幅核酸を検出できる。被覆液中の気泡の有無の検出は、核酸溶液中の場合と同様に行えば良い。
【００４１】
本発明の検出方法においては、例えば図２で例示したように、好ましくは親水性領域及び撥水性領域が設けられた基板を使用して、核酸溶液を被覆液で被覆する。このようにすることで、増幅反応中の核酸溶液の蒸発が抑制され、核酸増幅を安定して行うことができる。
そして、核酸増幅反応を検出装置の試料保持部で行いながら、得られた反応液中及び被覆液中の気泡の有無をリアルタイムで検出できるし、増幅核酸をリアルタイムで検出できる。
【００４２】
試料保持部に保持する核酸溶液の量は、目的に応じて設定すれば良いが、試料保持部の平面上に溶液を保持するので、極微量としても高精度に増幅核酸を検出できる。例えば、図２に示すような基板を使用する場合には、溶液の量は０．１〜５μＬであることが好ましく、０．２〜３μＬであることがより好ましく、０．５〜２μＬであることが特に好ましい。
また被覆液の量は、核酸溶液を被覆できる範囲で選択すれば良いが、例えば、核酸溶液の量が上記範囲である場合には、１〜１０μＬであることが好ましく、２〜８μＬであることがより好ましく、４〜６μＬであることが特に好ましい。
【００４３】
本発明の検出方法において、核酸増幅反応は、前記基板を使用してその試料保持部で行うこと以外は公知の方法で行うことができる。例えば、基板の温度調節を特定の温度サイクルで行うことができるので、ＰＣＲ法等の核酸増幅法も容易に適用できる。
【００４４】
また、増幅核酸の検出も、前記基板を使用すること以外は、公知の方法で行うことができ、例えば、増幅反応後の核酸溶液中における光シグナルを検出すれば良い。そして、例えば、標識物質、好ましくはサイバーグリーン等の蛍光物質を使用して増幅核酸を標識化することにより、光シグナルの強度が増幅産物の量に比例することを利用して、増幅核酸の量を算出できる。
【００４５】
基板の温度調節を特定の温度サイクルで行う場合には、温度サイクルごとに、増幅核酸を一回又は二回以上検出することが好ましい。このように増幅核酸をリアルタイムで検出し、定量することにより、鋳型として使用した核酸の増幅反応前の量を迅速且つ高精度に定量できる。増幅核酸を定量する回数は、状況に応じて選択すれば良い。
同様に、気泡の有無の検出も、温度サイクルごとに一回又は二回以上行うことが好ましい。このようにリアルタイムで検出することにより、高精度に増幅核酸を検出できる。
【００４６】
次に、図１に示す検出装置を使用した場合の本発明の検出方法について、具体的に説明する。
光源６からの照射光６０は、励起フィルタ７によって、特定範囲の波長の光のみが透過して励起光６１となり、照明用光学系５を通過後、ミラー８によって反射され、基板２上の核酸溶液２０に照射される。
励起光６１の照射により生じた光シグナル２００は、対物レンズ９を通過し、吸収フィルタ１０によって、特定範囲の波長の光のみが透過して、検出すべき検出光２０１となる。そして、検出光２０１はシグナル検出手段１３によって検出される。
【００４７】
本発明の検出方法においては、上記のように増幅核酸を高精度に検出できる。しかも、平面上に核酸溶液を保持するので、極微量の増幅核酸も検出に供することができる。さらに、平面状に保持した核酸溶液は、該核酸溶液や被覆液中の気泡の破裂に起因する飛散が防止されるので、増幅核酸が極微量でも高精度に検出できる。また、基板と核酸溶液との接触面で焦点調整を行うので、焦点位置を溶液量に影響されることなく一定にでき、検出操作の簡略化が可能である。
【実施例】
【００４８】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００４９】
［実施例１］
図１に示す検出装置を使用して、以下に示す方法でＲＮＡの逆転写反応およびＰＣＲを行い、蛍光増幅産物をリアルタイムで検出した。
（検出装置）
核酸溶液を保持する基板として、図２に示す構成のＡｍｐｌｉＧｒｉｄ・ＡＧ４８０Ｆ（商品名、Ａｄｖａｌｙｔｉｘ社製）を使用した。また、サーマルサイクラーとして、ＡｍｐｌｉＳｐｅｅｄ（商品名、Ａｄｖａｌｙｔｉｘ社製）を使用し、ｉｎ  ｖｉｖｏ生体観察システムＯＶ１１０（商品名、オリンパス社製）に接続した。この生体観察システムは、ＣＣＤカメラを備え、基板を撮像できるものである。また、サーマルサイクラー及び生体観察システムはコンピュータに接続し、自動で制御可能とした。
【００５０】
（核酸溶液）
増幅反応を行うための試料として、表１に示す組成の、濃度が５通りのＲＮＡ溶液を調製した。なお、表１中、２×  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）は、サイバーグリーンＩを含む。
【００５１】
【表１】
2009175074.tif 000003
【００５２】
（気泡の有無の検出）
ピペットを用いて、前記５種類のＲＮＡ溶液を前記基板の親水性領域に１μｌずつ分注した。さらに、これら溶液上部に、シーリングソリューション（Ａｄｖａｌｙｔｉｘ社製）を５μｌずつ分注し、図２に示すように、ＲＮＡ溶液をシーリングソリューションで被覆した。
次いで、この基板を前記検出装置に装着し、基板上の全てのＲＮＡ溶液及びシーリングソリューションを一度に撮像した。取得した画像を図３に示す。図３（ａ）は１６ｎｇ／μｌ、（ｂ）は１．６ｎｇ／μｌ、（ｃ）は１６０ｐｇ／μｌ、（ｄ）は１６ｐｇ／μｌ、（ｅ）は１．６ｐｇ／μｌのＲＮＡ濃度の場合の画像である。撮像データを解析した結果、前記５種類のＲＮＡ溶液及びシーリングソリューション中には、いずれも気泡が全く検出されなかった。
【００５３】
（核酸増幅反応）
この検出結果に基づいて、引き続き、以下に示す温度条件で基板を加熱及び冷却して、基板上に保持した溶液中で逆転写反応とリアルタイムＰＣＲを行った。
・逆転写反応とＰＣＲの温度条件
５５℃／３０分  →  ９４℃／２分  →  （９４℃／１５秒  →  ５５℃／３０秒  →  ７２℃／３０秒）×５０サイクル  →  ２５℃
【００５４】
（光シグナルのリアルタイム検出）
ＰＣＲ中の各サイクル７２℃の工程において、基板上方から励起光を基板に照射し、ＣＣＤカメラで基板上の全てのＰＣＲ反応液を一度に撮像した。この時、前記生体観察システムの観察チャンネルをＧＦＰ領域とし、生じたサイバーグリーンＩの蛍光を検出することで、増幅産物を検出した。この時取得した画像を図４に例示する。図４（ａ）は１サイクル、（ｂ）は２０サイクル、（ｃ）は３０サイクル時における画像である。
【００５５】
（検出結果）
取得した各画像より、カイネティックコンピュータを用いて、各ＰＣＲ反応液の蛍光強度を算出した。
１サイクル時では、いずれの反応液も蛍光強度は等しかった。これは、ＰＣＲ産物がまだ増幅されていないことを示しており、蛍光シグナルは増幅反応前のＤＮＡ自体に由来するものである。
２０サイクル時では、ＲＮＡ濃度が１６ｎｇ／μｌ、１．６ｎｇ／μｌ、１６０ｐｇ／μｌである反応液の蛍光強度が強まってきたことが確認でき、蛍光強度は増幅産物の濃度に比例していた。
３０サイクル時には、ＲＮＡ濃度が１６ｎｇ／μｌ、１．６ｎｇ／μｌ、１６０ｐｇ／μｌである反応液の蛍光強度が等しかった。一方、ＲＮＡ濃度が１６ｐｇ／μｌ、１．６ｐｇ／μｌである反応液においては、蛍光強度が強まってきたことが確認でき、蛍光強度は増幅ＲＮＡの濃度に比例していた。
算出された蛍光強度をサイクル数に対してプロットしたグラフを図５に示す。図５から明らかなように、ＰＣＲ産物が増幅される速度はＲＮＡの濃度に比例していることが確認された。
【００５６】
［実施例２］
実施例１と同様にＲＮＡ溶液を調製し、ＲＮＡ溶液及びシーリングソリューションを撮像し、画像解析した結果、５種類のＲＮＡ溶液のうち、ＲＮＡ濃度が１．６ｎｇ／μｌであるものに一つの気泡が検出され、残りのＲＮＡ溶液及びシーリングソリューション中にはいずれも気泡が全く検出されなかった。この時取得した画像を図６に示す。このように気泡が検出されたので、すべてのＲＮＡ溶液について、ＰＣＲを一時中止し、気泡が検出されたＲＮＡ溶液は除去して、同じ濃度のＲＮＡ溶液を再調製して、基板に分注し、シーリングソリューションで被覆した。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、核酸の増幅反応を必要とするゲノム研究に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明に係る増幅核酸の検出装置を例示する概略構成図である。
【図２】溶液を保持した状態の本発明における基板を例示する図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）は（ａ）のＩＩ−ＩＩ線における断面図である。
【図３】実施例１におけるＰＣＲ前のＲＮＡ溶液及びシーリングソリューションの画像であり、（ａ）は１６ｎｇ／μｌ、（ｂ）は１．６ｎｇ／μｌ、（ｃ）は１６０ｐｇ／μｌ、（ｄ）は１６ｐｇ／μｌ、（ｅ）は１．６ｐｇ／μｌのＲＮＡ濃度の場合の画像である。
【図４】実施例１におけるＰＣＲ反応液の画像であり、（ａ）は１サイクル、（ｂ）は２０サイクル、（ｃ）は３０サイクル時における画像である。
【図５】実施例１における蛍光強度の算出結果を示すグラフである。
【図６】実施例２におけるＲＮＡ溶液及びシーリングソリューションの画像であり、（ａ）は１６ｎｇ／μｌ、（ｂ）は１．６ｎｇ／μｌ、（ｃ）は１６０ｐｇ／μｌ、（ｄ）は１６ｐｇ／μｌ、（ｅ）は１．６ｐｇ／μｌのＲＮＡ濃度の場合の画像である。
【符号の説明】
【００５９】
２・・・基板、２０・・・核酸溶液、２１・・・基板表面、２００・・・光シグナル、２０１・・・検出光、２１１・・・第一親水性領域、２１２・・・第一撥水性領域、２１３・・・第二親水性領域、２１４・・・第二撥水性領域、２５・・・被覆液、４・・・温調手段、６０・・・照射光、６１・・・励起光、１３・・・検出手段、１５・・・コンピュータ
【図１】
2009175074.tif 000004
【図２】
2009175074.tif 000005
【図３】
2009175074.tif 000006
【図４】
2009175074.tif 000007
【図５】
2009175074.tif 000008
【図６】
2009175074.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月12日(2008.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
親水性領域及び撥水性領域を有する基板２は、公知の方法で作製できる。具体的には、基板表面に親水処理及び撥水処理を施す方法、親水性基板表面に撥水処理を施す方法が例示できる。
親水処理としては、水酸基、アミノ基又はカルボキシ基等の親水性の官能基を基板表面に導入するものが例示できる。撥水処理としては、アルキル基、アルケニル基、アルコキシ基又はアルケニルオキシ基等の低極性の官能基や、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されたアルキル基又はアルコキシ基等の疎水性の官能基を基板表面に導入するものが例示できる。
このような、親水性領域及び撥水性領域を有する基板２としては市販品を使用しても良く、例えば、極微量の核酸溶液２０を保持する目的においては、Ａｄｖａｌｙｔｉｘ社製のＡｍｐｌｉＧｒｉｄ（商標）が好適である。