(57)【要約】【課題】高められた取り込み能力を有するリポソーム、その製法及びその使用を提供すること。【解決手段】リポソーム小胞への前駆体としての乾燥した析出物であって、該前駆体は嵩密度0.01〜0.01ｇ／cm3 を有する三次元の膨張した構造物である。１種またはそれよりも多いフィルム形成性脂質を少なくとも１種の有機溶媒に溶解して反応器中の溶液となし、溶媒を蒸発させて膨張した三次元多孔性脂質構造物となし、該脂質析出物を水性担体相と接触させ、担体相を取り込むリポソーム小胞を製造する方法及びこの発明により製造された脂質の析出のための物質担体または基盤表面として役立つ、ずらりと並んだ管または不活性充填物を含んでなる装置。【選択図】図１
2009046491.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール及びそれらの混合物から選択したリン脂質を含んでなる１種またはそれよりも多いフィルム形成性脂質を、少なくとも１種の有機溶媒に溶解して、反応容器中の溶液となすこと；及び
−周囲温度より上又は減圧下での該溶媒の蒸発による脂質の析出、ここで、該反応容器は、脂質の析出のための支持体または基盤として役に立つ網目状の不活性多孔性物質または充填物を含有してなり、該蒸発は、反応容器を吹き通す空気または不活性ガスの手段によって行い、該溶媒の蒸発により得られた脂質析出物は嵩密度0.1ｇ／cm3以下である膨張した三次元多孔性構造物である、前記析出
により生成される、乾燥した脂質析出物の形のリポソーム小胞前駆体。
【請求項２】
該脂質析出物がさらにリン酸ジセチル、コレステロール、エルゴステロール、フィトステロール、シトステロール、ラノステロール、α−トコフェロール、ステアリン酸、ステラリルアミン及びそれらの混合物から選択した物質を含有してなる請求項1に記載の小胞前駆体。
【請求項３】
該膨張した三次元脂質析出物の嵩密度が0.08ｇ／cm3以下である請求項1又は2に記載の小胞前駆体。
【請求項４】
該膨張した三次元脂質析出物の嵩密度が0.05〜0.001ｇ／cm3である請求項3に記載の小胞前駆体。
【請求項５】
該膨張した三次元脂質析出物の嵩密度が0.02〜0.01ｇ／cm3である請求項4に記載の小胞前駆体。
【請求項６】
該膨張した三次元構造物が網目状の不活性多孔性物質によって支持されている請求項1に記載の小胞前駆体。
【請求項７】
該不活性多孔性物質がずらりと並んだ管またはずらりと並んだ不活性充填物を含んでなる請求項6に記載の小胞前駆体。
【請求項８】
該管の内径が0.5mm〜５mmで、壁厚が0.5mm〜２mmである請求項7に記載の小胞前駆体。
【請求項９】
該不活性充填物が中空ガラス球、網目状の炭素、網目状のガラス質炭素、網目状の金属、ガラスまたは金属ウールおよびガラスまたは金属繊維から選択したものである請求項7に記載の小胞前駆体。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
技術分野
本発明は乾燥した脂質の析出物の形のリポソーム小胞前駆体及び１種またはそれよりも多いフィルム形成性脂質を反応容器中の少くとも１種の有機溶媒に溶解し、該溶媒を蒸発させることによって脂質を析出させ、脂質の析出物を水性溶液担体相と接触させ、該溶液を取り込んだリポソーム小胞を製造する方法に関する。本発明は該方法を実施する装置、リポソーム小胞前駆体を含むコントラスト剤及び該前駆体を用いるコントラスト剤を製造する方法にも関する。
【０００２】
従来技術
外皮が二層または多層の脂質分子からなるリポソーム小胞は多くの薬物及びコントラスト剤の治療及び診断の効力を改良することができる薬物供給システムとして長い間認識されている。リポソームを用いて薬物またはコントラスト剤をカプセル化することによって、より高い安全性のレベル、より良い治療上の活性またはより良いコントラストを達成できることが、多くの異なる抗生物質及びＸ線コントラスト剤を用いた実験により明らかになった。薬物のカプセル化システムとしてのリポソームへの大きな関心によって、そのような製品の成功した開発及び商業化には適切な特色をもつ脂質小胞の大規模生産の再生産可能な方法が必要であることを明らかにした。結果として、所望の粒径、所望の粒径の分布及び脂質混合物の性質を考えないで所望の取り込む能力のリポソームを堅実に製造する方法の追求が始まった。このような方法は、広く受け入れられる良い製造プラクティスであると同時に脂質に対する活性物質の比が不変であるリポソームを提供すべきである。研究の結果、そしてリポソームの性質は実質上種々の生産パラメーターとともに変化し得るという事実の結果、これまで多くの異なった製造法が提案された。
【０００３】
慣用のリポソーム製造法は、多層または二層形成性成分（リン脂質またはリン脂質と他の脂質、たとえばコレステロールとの混合物）を丸底フラスコ中の揮発性有機溶媒または溶媒混合物に溶解し、次いで相分離を妨げる条件（温度及び圧力）下で溶媒を蒸発するという多くの段階を含む。溶媒を除去するとすぐに、通常は反応装置の壁上のフィルム状析出物の形にある乾燥した脂質混合物を、溶解された緩衝剤、塩、調整剤及び取り込まれる活性物質を含む水性媒体で水和する。リポソームは、水性媒体の部分がリポソームにカプセル化される水和段階で生成するだろう。撹拌、超音波処理またはミクロ流動体化の手段によって溶液を活性化するか、または活性化せずに水和を行ない、続いて溶液を１つまたはそれより多いポリカーボネートフィルターを通して押し出すことができる。遊離の非カプセル化活性物質を回収のために分離することができ、生成物をろ過し、殺菌し、所望により凍結乾燥し、包装する。
【０００４】
水和は、他のいかなる段階よりも多く、生成されたリポソームの型（粒径、脂質層の数、取り込み容量）に影響する。乾燥された脂質の性質、その表面積及びその多孔性は特に重要である。このようにして、水和及び取り込みの工程は乾燥した脂質のフィルムが薄く保たれている時にもっとも有効であることを立証した。このことは、脂質の量が大きいほど脂質の析出のための表面が大きいことが必要であることを意味し、その表面積を増大させるためにガラスビーズ及びその他の不活性不溶性粒子をフィルムの析出に用いるけれども、薄膜法の大部分は実験室用の方法のままであることも意味している。
【０００５】
溶媒を連続的に除去しながらの脂質の有機溶液の水性媒体中への注入、噴霧乾燥及びミクロ流動体化等を含む、リポソームを製造する他の方法が多くの刊行物またはたとえば米国特許第 4,529,561号、米国特許第 4,572,425号等の特許に提案されている。
【０００６】
リポソーム生産の規模拡大の問題を解決するための試みが米国特許第 4,935,171号（ヴェスター）に記載されている。
【０００７】
上記特許には薄膜蒸発器中で有機溶剤を蒸発することにより均質で均一な脂質フィルムを形成させることにより商業的な量でリポソームを製造する方法が開示されている。蒸発器の内壁上に形成された薄い脂質フィルムの乾燥後、ロータにより供給される撹拌の下で析出物を水性相でその場で水和する。この文献で提案された解決策は正しい方向の段階であるけれども、反応装置容積に対する脂質フィルム表面の比は、実験室規模で用いられる丸底フラスコのそれよりもほんのわずかではないとしても、少し良いだけである。該反応装置の時空収量または生産性は、経済的に堅実で競争的な製法としてはいまだに低すぎる。リポソーム製造の異なった面が扱われ、そして規模拡大の問題に対して多くの改良及び異なった解決策が提案された。たとえば、国際特許出願公開第86／00238 号、第87／00043 号、米国特許第 4,737,323号、第 4,753,788号及び第 4,781,871号のような文献は、取り込み能力の改良のために前もって製造された多層小胞の急速凍結及びそれに続く凍結−融解処理、粒径分布を改良するために多層リポソームの押出技術の使用等を提案した。大量の液体を相対的に小さな反応装置空間で処理する再生産可能な方法をその生産パラメータの制御により可能とする、大規模な工業的方法についての提言はこれまでのところない。パイロットまたは工業的規模の公知のすべての方法は、大量の希リポソーム溶液の処理が大きな床及び反応装置空間及び大量の溶液及び溶液を取り扱うことを必要とする小さいバッチに関連する。実際には、反応装置の相対的に低い時空収量及び生産性の結果、これらの方法は大規模商業生産には扱いにくすぎるし、コストがかかりすぎる。
【０００８】
本発明の概要
簡単に要約すると、本発明は、嵩密度が 0.1ｇ／cm3 以下、好ましくは0.08以下、さらに好ましくは0.05〜0.001 及びさらにもっと好ましくは0.02〜0.01である膨張した三次元構造物の形の支持されたまたは支持されていないリポソーム小胞前駆体に関する。支持された構造物とは、ずらりと並んだまたは網目状の不活性支持物質上に形成された脂質の多孔性析出物を意味する。析出物を形成する脂質は、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール及びそれらの混合物を含む、合成または天然、飽和または不飽和リン脂質から選択される。該脂質はさらに、リン酸ジセチル、コレステロール、エルゴステロール、フィトステロール(thytosterol) 、シトステロール、ラノステロール、α−トコフェロール、ステアリン酸、ステアリルアミン及びそれらの混合物から選択される物質を含んでもよい。
【０００９】
本発明は、１またはそれよりも多いフィルム形成性脂質を少くとも１種の有機溶媒に溶解して溶液を生成することにより高められた取り込み能力を有するリポソーム小胞を製造する方法にも関する。脂質の溶液を適当な反応容器に導入し、蒸発させることにより乾燥脂質は嵩密度が 0.1ｇ／cm3 以下、好ましくは0.08以下、もっと好ましくは0.05〜0.001 及びさらにもっと好ましくは0.02〜0.01である膨張した三次元多孔質構造物を形成する。その後、多孔性構造物を水性担体相と接触させて、担体相の部分を取り込んでいるリポソーム小胞を製造する。
【００１０】
本発明はさらに、入口及び出口を有する反応容器、真空への接続、冷却または加熱手段、制御手段並びに不活性物質が緊密に充填されたずらりと並んだ管を含んでなる充填物を有する反応容器を含んでなる上記方法による高取り込み能力のリポソームの製造装置を含む。好ましくは管は内径が 0.5mm〜５mmで壁厚が 0.5mm〜２mmであるステンレススチールの管である。代わりに静止またはたとえば流動体化のような可動であってもよい充填物は、ラシッヒリング、中空ガラス球、網目状炭素、網目状ガラス質炭素、網目状金属、ガラスまたは金属ウール並びにガラスまたは金属繊維を含むことができる。
【００１１】
本発明の三次元脂質構造物は高取り込み能力のリポソームの大規模生産に非常に適切である。コントラスト媒体を含有する水性担体相でインキュベートする時、本発明の三次元脂質構造物は、診断用コントラスト剤の製造に特に適切である。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は小胞の製造の間に、水性担体との接触に先立って少くとも１種の有機溶媒中の１またはそれよりも多いフィルム形成性脂質の有機溶液から溶媒の蒸発によって得られた脂質の析出物が嵩密度 0.1ｇ／cm3 以下、好ましくは0.08以下、もっと好ましくは0.05〜0.001 及びさらにもっと好ましくは0.02〜0.01である三次元構造物に膨張するなら、最上のリポソームの生成及び高反応装置能力が得られるという予期しない発見に基づく。このような予期しない結果の正確な理由は完全には立証されていないけれども、この方法はときわけ大きな量に対する表面の比の析出物を供給し、したがって、それに続く水和がより効率的であると推測される。したがって、高収量の所望の粒径及び粒径分布のリポソームを、特に大規模化及び制御の容易な方法によって製造する。大きな量に対する面積の比を有しているので、膨張した脂質構造物は反応装置の時空収量を改良し、そこでこの技術は工業的に非常に魅力的となる。それに加えて、大規模化を容易にし、高生産性を促進するために、この方法はより速い反応装置回転時間、水和段階の制御の容易性、減少した加工時間、安価な物質の使用、最後に、析出、溶媒の蒸発、膨張した脂質構造物の水和及び生成したリポソーム小胞の殺菌のために同じ反応装置を用いることを含む更なる利点を提供する。
【００１３】
本発明の純粋な脂質の多孔性構造物は非常に大きな量に対する表面の比を有することが立証された。不幸なことに膨張した構造物の非常なもろさの結果、膨張した脂質構造物の単位量または単位重量の正確な表面積は十分な正確さでは立証されていない。しかしながら、本発明の膨張した構造物１ｇの全表面積の控え目な概算は、表面の量に対する比が10〜 0.5×105 を意味する全表面積が 0.1〜50ｍ2 に変化することを示唆している。
【００１４】
膨張した三次元脂質構造物は、脂質の析出のための物質支持体または基盤表面として働く不活性で多孔性の網目状のものまたは支持体を含有する反応容器からの有機溶媒の蒸発により得ることができる。不活性の網目状のものは、容積に対する表面の比が相対的に大きい物質なら任意の慣用のものでよく、ずらりと並んだ管またはずらりと並んだ中空ガラス球、網目状炭素、網目状ガラス質炭素、網目状金属、ガラス、セラミックもしくは金属ウールおよびガラス、セラミックもしくは金属繊維のような不活性充填物を含んでよい。ずらりと並んだ管を用いる時、管の大きさは容積に対する表面が最大の比となるように選ばなければならない。本発明の反応装置の開発及び特徴づけの過程で行なわれた実験から、提示された形状では内径が 0.5mm〜５mmで壁の厚さが 0.5mm〜２mmの管が良い結果をもたらすが、他の形状の反応装置は他の寸法の管の方がよいかもしれないことが分かった。脂質溶液は重力により管の内表面及び外表面にわたって広がるので、ずらりと並んだ垂直に配置した管がよいけれども、らせん状の配置も可能であることが立証された。
【００１５】
脂質フィルムの均一な析出を促進するために不活性充填物を徐々に流動体化するか、ラシッヒリングまたは上述したような任意の他の不活性物質を充填した反応装置の上部から脂質溶液を送り込み、充填物を静かにしたたり落ちるままにすることができる。したたり落ちる塔配置中で得られる優れた結果は、析出物の厚さの効率の良い制御は脂質溶液及び担体をしたたり落ちるように接触させることにより達成されるという事実から生ずるものと信じられている。過剰の液体は連続的に除去され、それにより支持体の全表面上に均一な液体の厚さが保証される。さらに充填物上の脂質溶液の被覆の均一な形成を助けるために、空気または窒素のような不活性ガスをしばらくの間向流で導入してもよい。該ガスは通常は冷いが、しかしながら、特定の条件の下では、熱いガスを用いて脂質フィルムの乾燥及び膨張を助けまたは行うようにガスの温度を選択することが望ましいかもしれない。
【００１６】
純粋または通常の純度の脂質からなる析出物の三次元構造物への乾燥及び膨張後、析出物を水性担体相と接触させる。反応装置の形状に依存して、担体相をたとえばしたたり落ちる塔もしくは流動床形状の場合、反応装置の低い末端部からまたは、反応装置カラムの上部から（固定されたずらりと並んだ管の場合）導入することができる。用いられる水性担体は純粋であるか、または生物学上活性な物質、コントラスト剤もしくはその両方を含有していてもよい。本発明により製造されたリポソーム中に実質的にはいかなる生物学上活性な物質も取り込むことができる。このような物質は、限定するものではないが、抗菌性化合物、たとえばゲンタマイシン、抗ウイルス性化合物、たとえばリファマイシン、抗真菌性化合物、たとえばアンホテリシンＢ、駆虫性化合物、たとえばアンチモン誘導体、抗腫瘍性化合物、たとえばミトマイシンＣ、ドキソルビシンおよびシスプラチン、蛋白質、たとえばアルブミン、及びリポ蛋白質、免疫グロブリン、毒素、たとえばジフテリア毒素、酵素、たとえばカタラーゼ、ホルモン、神経伝達物質、放射性不透明化合物、たとえば99Tc、蛍光性化合物、たとえばカルボキシフルオロセイン、炎症抑制剤、たとえばサルチル酸及びイブプロフェン、麻酔剤、たとえばジブカインまたはリドカイン等を含む。
【００１７】
非常に良い結果及び高取り込み負荷が、ヨウ素化Ｘ−線コントラスト剤、たとえばイオパミドール、イオメプロール（iomeprol）、イオヘキソール、イオペントール（iopentol）、イオトロラン（iotrolan）、イオジキサノール(iodiranol) 、イオグルコール（ioglucol）等で達成される。本発明によるリポソーム小胞の脂質に対するヨウ素の比は少くとも2.75である。
【００１８】
有機溶媒または有機溶媒混合物の蒸発は周囲温度より上または減圧またはその両方で行なわれる。蒸発速度は脂質構造物の膨張の程度に強い影響を有することが実験により明らかになった。だから、最適な膨張のために、反応器内の熱及び圧力の量を適当に制御するだろう。制御は溶媒の蒸発の最後に近く、すなわち、溶液が濃くなり、粘着性になったときに特に重要である。この時点で、圧力を少々減少させると相対的に速い膨張（泡立ち）を生ずるだろう。与えられた溶媒または溶媒混合物について温度と圧力の釣り合いをとることによって、脂質析出物の異なった程度の膨張が達成できる。有機溶媒が石油エーテル、クロロホルム、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、tert−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン及びそれらの混合物から選択されたときに、最も良い結果が得られる。溶媒としては二つの溶媒の共沸混合物が好ましい。エタノールとシクロヘキサン、クロロホルムとメタノール及びイソプロパノールとヘキサンの共沸混合物を用いると良い結果が得られた。
【００１９】
リポソーム小胞の製造に用いられる脂質は慣用のものであって、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール及びホスファチジン酸を含む、合成または天然、飽和及び／または不飽和リン脂質から選択される。次のリン脂質は特に有用である：ジパルミチルホスファチジルコリン、ジパルミチルホスファチジルグリセロール、ジパルミチルホスファチジン酸、ジパルミチルホスファチジルエタノールアミン及び対応するジステアリル−及びジミリスチル−対の片方並びにそれらの混合物。それらの脂質またはそれらの混合物はさらにリン酸ジセチル、コレステロール、エルゴステロール、フィトステロール、シトステロール、ラノステロール、α−トコフェロール、ステアリン酸、ステアリルアミン及びそれらの混合物から選択される物質を含んでもよい。
【００２０】
本発明は、密度が 0.1ｇ／cm3 以下、好ましくは0.08ｇ／cm3 の及びもっと好ましくは密度が0.05〜0.01ｇ／cm3 の膨張した乾燥脂質の支持されたまたは支持されていない三次元構造物も含む。支持された構造物は、ずらりと並んだ不活性支持物質上に形成された脂質の多孔性析出物を意味する。
【００２１】
膨張した三次元脂質構造物は、高取り込み能力を有するリポソームの製造に、特にこれらのリポソームが薬物または診断上のコントラスト剤を運ぶのに用いられるときに非常に有用である。このような場合、三次元脂質構造物を活性成分として薬物または診断剤を含有する水性溶液と接触させるとそれによりリポソームが生成し、該成分を取り込むだろう。活性物質を携帯するリポソームは次いで、慣用な方法で適切に処理される。代りに「空」のリポソーム小胞、すなわち、水性液体担体だけを含有している小胞の懸濁液を最初に形成することができる。次の段階でこれらの「空」のリポソームを活性成分を含有している溶液と接触させ、そして、小胞はたとえば経膜（trans-membrane）負荷技術を用いて負荷される。
【００２２】
本発明はさらに入口及び出口、真空への接続、冷却及び加熱手段、制御手段及び充填物が不活性物質を緊密に充填したずらりと並んだ管によって特徴づけられた充填物を含んでなる高取り込み能力を有するリポソームを製造するための装置を含む。内径 0.5mm〜５mmで壁厚が 0.5〜２mmである管が垂直に配置されたものが好ましいが、コイル状の配置も可能である。
【００２３】
次の例はさらに本発明を説明するためのものである：
例  １
反応装置の特色
底末端部を金属製格子に固定された垂直の、温度調節された、高さ１ｍ、内径50mmの316Lステンレススチールカラムを12本のステンレススチール管で満たした。管の内径は４mmで壁厚は１mmであった。反応装置に管を挿入する前に、ずらりと並んだ平行な管を形成するために管をスポット溶接した。直径が２mm及び３mmの管を用いる以外は同じ構造の反応装置も準備し、試験した。
【００２４】
脂質析出物の膨張を指向する試験に先立って次の脂質組成物を用いて非−膨張脂質フィルムの析出によって反応装置の特徴づけを行った：モル比９：１の水素添加大豆レシチン／リン酸ジセチル。管の中での脂質の析出にもっとも良い状態を決定し、脂質の濃度、管の内径及び性質並びに脂質溶液の排液速度の影響を確認するために実験を行った。すべての場合に、脂質のクロロホルム溶液を室温で管に導入し、底部から管を満たした後で脂質溶液を制御した速度で排液した。析出物を80℃で窒素のもとで溶媒の蒸発により乾燥させ、乾燥した析出物を小量のクロロホルムで３回すすいだ。
【００２５】
【表１】
2009046491.tif 000003
【００２６】
表１及び図３の種々の脂質濃度及び二つの異なった直径のステンレススチール管で析出させた脂質の量に示されているように、脂質の被覆は、脂質の濃度の増加につれ増加した。それに加え、単位面積当りの析出物は４mm管よりも３mm管で得られた方が厚い。両方の場合、析出した脂質の量は脂質濃度の２乗に比例するようである。
【００２７】
表２から分るように、析出した脂質の量は排液流量とともに増加した。しかしながら、これらの結果を排液流量（ml／分）でよりも排液速度（cm／分）の関数として表わすと、析出した脂質の量は線速度にほぼ比例するようである。実際の管のサイズに依存していない。図４参照。
【００２８】
【表２】
2009046491.tif 000004
【００２９】
ステンレススチール管の代りにガラス管を用いた以外は同一の装置で行った追加の実験により、脂質の析出に関して二つの支持体で大きな差がないことが分かった。脂質の被覆の同質性は、被覆されたスチール管を上から10cm間隔で切断し、フィルムの厚さを測定することにより決定した。得られた結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】
2009046491.tif 000005
【００３１】
三つの異なった反応装置の構造で得られた脂質の析出物の見かけの（嵩）密度の計算により２mm管についての嵩密度は0.04〜0.06ｇ／cm3 、３mm管については0.02〜0.04ｇ／cm3 、４mm管についての嵩密度は0.01〜0.03ｇ／cm3 であることが分かった。
【００３２】
リポソームの製造
特徴づけの後で、 250本のステンレススチール管を有する新しい反応装置を作り、図５で示される回路に接続した。26ｇの水素添加大豆ホスファチジルコリン（Nattermann）と２ｇのリン酸ジセチル及び 106ｇのクロロホルムを、撹拌機、加熱用ジャケット及びコンデンサーを備えた１ｌのガラス製反応装置（１）の中に置き、完全に溶解するまで撹拌下で60℃に加熱した。脂質溶液を殺菌フィルター（３）でろ過し、 250本の平行で長さ１ｍの 304ステンレススチール管を充填した、加熱用ジャケットを有する316Lステンレススチールカラム（４）中に蠕動ポンプ（２）手段により装填した。過剰の溶液を除去し、80℃でカラムの底から空気を循環させることにより、溶媒を蒸発させ、脂質を析出させた。
【００３３】
撹拌機、加熱用ジャケット及びコンデンサーを備えた２ｌのガラス製反応容器（５）に、 849ｇのイオパミドール、1196ｇの水、0.54ｇのEDTA及び1.60ｇのトリス（Tris）を満たし、90℃で撹拌下で完全な溶解が得られるまで加熱した。次いでイオパミドール溶液をろ過し、ガラス製反応装置（６）に移し、そこからカラム（４）に移した。該溶液をギアポンプ（７）手段によって、反応装置（６）及びカラム（４）の間を75℃で循環させた。次いで生成したリポソーム懸濁液をフィルター（８）を通して押し出し、反応容器（９）に回収し、次いでポンプ手段（11）によりミクロろ過システム（10）を用いて濃縮した。濃縮溶液を塩（Saline）で洗浄し、遊離イオパミドールを除去した（完全ろ過、diafiltration)。異なった実験条件のもとでの多数の実験の連続について典型的な脂質に対するヨウ素の比（Ｉ／Ｌ）は、 2.5〜3.5 の範囲で脂質の濃度は25〜35mg／mlでリポソームの平均粒径は 570nmであった。
【００３４】
生産ユニットを殺菌でき（たとえば蒸気）、それは閉環無菌大規模生産ユニットとして期待される。
【００３５】
例  ２
規模を４倍に拡大した以外は、図５に示された実験装置で例１を繰り返した。 518.6ｇの水素添加大豆ホスファチジルコリン(Natterman) と41.4ｇのリン酸ジセチル及び2130.0ｇのクロロホルムを、撹拌機、加熱用ジャケット及びコンデンサーを備えた３ｌガラス反応装置（１）の中に置き、完全に溶解するまで撹拌しながら60℃に加熱した。脂質の溶液を0.22μｍの殺菌フィルター（３）上を蠕動ポンプ（２）を用いてろ過した。次いで脂質溶液を1000本の平行な長さ１ｍの 304ステンレススチール管を充填した加熱ジャケットを有する316Lステンレススチール管（４）に移し、過剰の脂質溶液を除去した。80℃でカラムの底から空気を循環させることにより、クロロホルムを蒸発させ、膜質を乾燥析出させた。
【００３６】
撹拌機、加熱用ジャケット、コンデンサーを備えた７ｌステンレススチール（316L）反応装置（５）に2920ｇのイオパミドール、4110ｇの水、1.87ｇのEDTA及び5.50ｇのトリス（HCl qsp PH 7.2）を充填し、撹拌下で完全な溶解が得られるまで90℃で加熱した。次いでイオパミドール溶液を殺菌フィルター（図示しない）を通し、ギアポンプ（７）を用いてカラムに移し、しばらくの間、反応装置（６）及びカラム（４）の間を循環させた。生成したリポソーム懸濁液を反応装置（６）中で回収し、75℃でフィルター（８）を押し出し、リポソームを反応装置（９）中で回収した。次いで、リポソーム溶液をミクロろ過システム（10）を用いて濃縮した。異なった実験条件下の多数の実験の連続についての典型的な脂質に対するヨウ素の比（Ｉ／Ｌ）は 2.5〜3.5 の範囲で脂質濃度は25〜35mg／ml、リポソームの平均粒径は 570nmであった。脂質析出物の嵩密度は実験条件の作用として変化したが、0.08〜0.05ｇ／cm3 と概算した。
【００３７】
しかしながら、最も良いリポソームは嵩密度が0.01〜0.02ｇ／cm3 で製造された。
【００３８】
例  ３
溶媒としてクロロホルムとメタノール（87／13＝ｖ／ｖ）の共沸混合物を用いて例２を繰返した。減圧下で、溶媒の蒸発後、60℃の温蒸留水を反応装置に加えた。加えた水の温度は用いられた脂質の転移点（54℃）より上である。得られた膨張した三次元脂質析出物を水和させることができ、生成したリポソーム液体中に均一に分布させた。
【００３９】
MLV型のリポソームが高収量で生成する。約１時間後、５mg／mlの脂質を含有するリポソーム懸濁液を60℃で２μｍのポリカーボネート膜(Nuclepore) を通して押し出し、室温まで冷却後、0.22μｍのミクロフィルターシステム Prostak (Millipore)を用いてミクロろ過によって30mg／mlに濃縮した。
【００４０】
濃縮リポソーム懸濁液に、1040ｇの（Ｓ）−Ｎ，Ｎ′−ビス〔２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）−エチル〕−２，４，６−トリイオド−イソフタルアミド（イオパミドール）、すなわち 520ｇ／ｌの共有結合ヨウ素を含有する１ｌの水溶性溶液を60℃で加えた。ヨウ素濃度 260ｇ／ｌの生じた混合物（２ｌ）を約30分、60℃でインキュベートした。その時間の後にリポソームのコアの外側及び内側のヨウ素濃度は等しくなった。生じた調製物を30ｇ脂質／ｌまで濃縮した。取り込まれた脂質に対するヨウ素の比（Ｉ／Ｌ）は約 4.0であった。
【００４１】
例  ４
ガラス製カラム（高さ 500mm及び直径50mm）をラシッヒリングで充填し、したたり落ちる塔反応装置として操作した。クロロホルム中のモル比５：４：１のジステアリルホスファチジルコリン（DSPC）、コレステロール及びリン酸ジセチルを、支持体としてのニッケル製網上に広がった35層のラシッヒリングを取り付けたカラムを底部の最後の層が完全に溶液につかるまで、したたり落した。過剰の溶液を除去し、熱い（80℃）窒素を底から反応装置中を吹き通した。脂質析出物を２時間乾燥させた。窒素の流れを停止し、反応装置を真空（１〜２トル）に連結し、すべてのクロロホルムが除去されるまで析出物を乾燥させた。溶媒の蒸発後、ヨウ素濃度 260ｇ／ｌのイオメプロール溶液を60℃で反応装置に加えた。膨張した三次元脂質析出物を30分間水和させておいた。リポソーム懸濁液を60℃で２μｍのポリカーボネート膜(Nuclepore) を通して押し出し、室温まで冷却後、30ｇ脂質／ｌまで濃縮した。取り込まれたヨウ素の脂質に対する比（Ｉ／Ｌ）は 4.0より上であった。
【００４２】
同じ実験を、カラム充填物として、網目状炭素、網目状ニッケル及び網目状ガラス質炭素を用いて繰り返した。これらの実験で得られた三次元脂質構造物の嵩密度は0.05〜0.005 ｇ／cm3 であった。ヨウ素に対する脂質の比が 3.5〜4.5 であるリポソームが得られた。
【００４３】
例  ５
ガラス製のカラム（高さ 500mm及び直径50mm）をずらりと並んだ不活性充填物としての中空ガラスで満たし、流動床反応器として操作した。シクロヘキサン／エタノール共沸混合物（69.5／30.5ｖ／ｖ）中のモル比５：４：１のジパルミチルホスファチジルコリン（DPPC）、コレステロール及びジパルミチルホスファチジン酸（DPPA）の混合物の50ｇ／ｌを含有する脂質溶液を多孔質ガラスフリットによって支持された高さ 100mmの中空ガラス球床を含有するカラムに導入した。溶液が完全にガラスビーズを濡らすようにさせ、過剰の溶液を除去した。熱（80℃）空気の流れを反応装置の底から通して、脂質の析出物がほとんど乾くまで流動体化した。次いで空気の流れを停止し、反応装置を真空（１〜２トル）に接続し、完全に溶媒が除去されるまで析出物を乾燥させた。溶媒の蒸発後、水中のリドカイン HCl溶液（PH.7.2）の４重量％を60℃で反応装置に加えた。生成したリポソームを80℃で２μｍポリカーボネート膜(Nuclepore) を通して押し出し、室温まで冷却後、35mgの脂質／mlまで濃縮した。リポソームに取り込んだリドカインは0.35ミリモルリドカイン／脂質のｇであった。
【００４４】
流動体化の間に、床の種々の膨張（20−80％）は析出物の性質にほとんど影響しないことが分かった。
【００４５】
例  ６
不活性充填物を用いないで、高さ 500mmのガラス製カラムを用いて例４を繰り返した。エタノール／シクロヘキサン、クロロホルム／メタノール及びイソプロパノール／ヘキサンの共沸混合物から調製した 100mlの脂質溶液（80ｇ／ｌ）で、カラムを満たした。有機溶媒を最初に55℃で 300mmHgの圧力で、次いで70℃で10mmHgで泡状の乾燥した析出物の生成まで蒸発させた。すべての場合に、得られた三次元膨張脂質構造物を70℃でイオメプロールの水溶液で水和し、イオメプロール懸濁液を取り込んだリポソームを製造した。70℃で 0.6μｍポリカーボネート膜(Nuclepore) を押出した後、リポソーム懸濁液を濃縮した。異なった実験条件下の多数の実験の連続についての典型的な脂質に対するヨウ素の比（Ｉ／Ｌ）は 1.9〜2.5の範囲で、脂質濃度は25〜35mg／mlであった。膨張した脂質構造物の嵩密度は0.05〜0.001 ｇ／cm3 と概算した。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、本発明の膨張した三次元脂質構造物を示す、切り欠きを有する反応装置の概要図である。
【図２】図２はずらりと並んだ不活性の管を有する反応装置の概要図である。
【図３】図３は濃度に対する脂質の析出のプロットである。
【図４】図４は線速度に対する脂質析出のプロットである。
【図５】図５は本発明の膨張した脂質構造体を用いるコントラスト媒体製造のフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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