(57)【要約】【課題】本発明の目的は、アセチルフコイダンを有効成分とする消化管に発症した悪性腫瘍を治療するための経口投与用医薬組成物を提供することにある。【解決手段】養殖オキナワモズクを原料として製造されたアセチルフコイダンを水に溶かして経口投与することによって、マウス大腸癌由来の細胞ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅであるＣｏｌｏｎ  ２６細胞を腸に移植して大腸がんを発症させたマウスの、体重減少と悪性腫瘍の重量の増大を有意（Ｐ＝０．０５）に減少させた。 【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルフコイダンを有効成分とすることを特徴とする消化管悪性腫瘍治療用経口医薬組成物。
【請求項２】
前記アセチルフコイダンは、糖成分が１モルのＬ−フコースと、０．０３乃至０．１０モルのＤ−キシロースと、０．２乃至０．４モルのＤ−グルクロン酸と、の割合で構成された多糖であって、前記多糖が、Ｌ−フコースに換算して０．１乃至０．３残基のアセチル基と、０．２乃至０．４残基の硫酸基と、を含むことを特徴とする請求項１に記載の消化管悪性腫瘍治療用経口医薬組成物。
【請求項３】
前記アセチルフコイダンは、養殖オキナワモズクをホモゲナイズし、１０乃至３５℃で０．０１乃至０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸と硫酸と蓚酸との内から選ばれる１以上の酸を含む水によって抽出し、不溶物を除去し、中和して抽出液を得て、前記抽出液から水を蒸発させて粉末化するか、若しくは、前記抽出液にメタノール又はエタノールを加えて生成した沈殿をろ取し、乾燥して粉末化することによって製造したものであることを特徴とする請求項２に記載の消化管悪性腫瘍治療用経口医薬組成物。
【請求項４】
前記アセチルフコイダンは、請求項２に記載のアセチルフコイダンを水に溶解し、塩化バリウム若しくは酢酸バリウムを加えて沈殿を生成せしめ、前記沈殿をろ過して除き、ろ液を陽イオン交換樹脂を用いて脱塩し、水で溶出させ、溶出液を水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムで中和した後に粉末化することによって得たナトリウム塩型またはカリウム塩型のアセチルフコイダンであることを特徴とする請求項３に記載の消化管悪性腫瘍治療用経口医薬組成物。
【請求項５】
前記アセチルフコイダンを、水に溶解するか、又は懸濁する事によって製造した液体状、懸濁液状、又はゼリー状の組成物であることを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載の消化管悪性腫瘍治療用経口医薬組成物。
【請求項６】
前記アセチルフコイダンを、粉末、練り物、又は錠剤としたことを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載の消化管悪性腫瘍治療用経口医薬組成物。
【請求項７】
前記粉末、練り物、又は錠剤が、更にカプセル化されるか、又は表面にコーティング処理が施されたことを特徴とする請求項６に記載の消化管悪性腫瘍治療用経口医薬組成物。
【請求項８】
前記アセチルフコイダンを、口腔投与用に製剤化したことを特徴とする請求項項１ないし４の何れか１項に記載の消化管悪性腫瘍治療用経口医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は悪性腫瘍を治療するための経口医薬組成物に係り、より詳しくはアセチルフコイダンを有効成分とする消化管悪性腫瘍治療用経口医薬組成物に関する。
消化管は口唇と肛門で外界と連通している器官で、口腔、食道、胃、腸を含み、消化管の表面は内皮に覆われる。消化管内には消化腺から消化酵素が供給され、食物を消化する。消化管の内部は体外である。消化管悪性腫瘍は、消化管に発症した悪性腫瘍である。
【０００２】
なお、本明細書に於いては、「悪性腫瘍」を単に「腫瘍」と略記することがある。例えば、慣用表現である「抗腫瘍剤」は「抗悪性腫瘍剤」を意味する。また、「悪性腫瘍」は固形癌のみを意味し、「癌」は白血病等の液体の癌を含む点で異なる言葉であるが、本明細書では固形癌についてのみを論ずるので「悪性腫瘍」と「癌」とを同義語として使用する。例えば大腸に発症した悪性腫瘍は、慣用表現に従って大腸癌と表記する。
【背景技術】
【０００３】
経口で摂取しても毒性がなく、消化管で分解されず、吸収もされない抗腫瘍剤を経口投与すれば、理論的には、その抗腫瘍剤は食物と共に消化管に発生した悪性腫瘍の患部に運搬され、悪性腫瘍を治療できる可能性がある。
しかし、既存の抗腫瘍剤は、一般的に抗腫瘍活性の強いものは毒性の強いものが多く、経口投与に適さないものが多い。又、消化管は、ｐＨの変化と消化酵素と常在細菌叢とによる異物の分解作用、及び、分泌物による解毒作用と腸管活動の亢進（下痢）とによる異物排泄作用が強い。また、消化液等の分泌物や飲食物で希釈される。従って、経口投与しても、薬剤の有効成分が治療効果を示す十分な濃度では患部に到達できない。経口投与によって、実際に有意な治療効果が証明された抗腫瘍剤は報告されていない。
【０００４】
フコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）は、コンブ、ワカメ、モズクなど褐藻類の粘質物中に多く含まれている分子量が数十万の硫酸多糖の一般名である。天然から得られる多糖類なので、原料種や採取方法によって、得られるフコイダンの種類は異なっている。フコイダンの多糖の主鎖はＬ−フコースがα−（１−２）結合又はα−（１−４）結合で連結され、水酸基の一部が硫酸化されているが、正確な分子構造は解明されていない。また、フコイダンはヒトの消化酵素では消化されない。
【０００５】
フコイダンは、グルクロン酸を含むＵ−フコイダン、硫酸化フコースだけからなるＦ−フコイダン、ガラクトースを含むＧ−フコイダンなどが知られている。また養殖オキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ  ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ  ＴＯＫＩＤＡ）からは水酸基の一部がアセチル化されたアセチルフコイダンが得られる（例えば特許文献１）。
フコイダンには種々の生理活性があることが見出され、１９７０年代より盛んに研究されるようになった。
【０００６】
フコイダンに抗腫瘍作用があることが報告された。例えば、カゴメ昆布の熱水抽出物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に於いて種々の悪性腫瘍細胞に対して抗腫瘍作用を示し、静脈注射によるマウスｉｎ  ｖｉｖｏ試験に於いてマウス結腸癌に対して抗腫瘍作用を示した。又、経口投与によるマウスｉｎ  ｖｉｖｏ試験に於いて、アゾキシメタンによる発癌予防作用が認められたと報告されている（例えば、特許文献２参照）。
また、アセチルフコイダンもｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に於いて抗腫瘍作用を有することが報告さている（例えば、特許文献３参照）。
【０００７】
フコイダンの活性に関しては、分子量の小さいフコイダンの方が抗腫瘍活性が強いことが示されている。例えば、フコイダンを有機酸を酸触媒として用いた緩和の条件で加水分解し得た分子量＞３０００〜５０００の画分は、静脈注射によるマウスｉｎ  ｖｉｖｏ試験に於いてＢ１６メラノーマ細胞に対する癌転移抑制作用を示すことが報告されている（例えば、特許文献４参照）。
【０００８】
また、オキナワモズクから得られるフコイダンを、酸触媒を用いて条件で加水分解し得た部分分解物に免疫機能調節作用があることが示された（例えば、特許文献５参照）。
フコイダンを加水分解する酵素によって得た部分分解生成物の構造を決定し、それらの部分分解物のうちのいくつかがｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に於いて種々の悪性腫瘍細胞に対して抗腫瘍作用を示すことが示された（例えば、特許文献６参照）。
【０００９】
しかし、前記したＢ１６メラノーマ細胞に対する癌転移抑制作用やアゾキシメタンによる発癌予防作用は、腫瘍細胞の正常細胞への接着プロセスあるいは発癌物質による正常細胞の前癌病変のプロセスに対する細胞の癌化予防作用であって、発症した悪性腫瘍細胞に直接作用して生育を阻害する抗腫瘍作用ではない。
経口投与によって抗腫瘍作用を示すフコイダン誘導体は報告されていない。
経口投与した場合に、投与した製剤から薬剤を消化管の所望の部位で放出される方法は公知である（たとえば、特許文献７参照）。
【００１０】
【特許文献１】特許第３３７１１２４号公報
【特許文献２】特開２００１−２２６４０８号公報
【特許文献３】特開２００７−５１０８１号公報
【特許文献４】特開２００５−２６３８１２号公報
【特許文献５】特開２００７−３９３４１号公報
【特許文献６】特開２００１−２２４３９４号公報
【特許文献７】特開２００１−３２６０５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
フコイダンとアセチルフコイダンと、或いはその部分分解物は糖類であり、経口投与しても体内に吸収されない。従って、静脈注射で体内に投与して示された治療効果を、経口投与で再現することは期待できない。
糖類は体内ではアレルゲンとして作用するので、フコイダンとアセチルフコイダンと、或いはその部分分解物を静脈投与した場合は重大なアレルギー反応が起こる可能性がある。
【００１２】
フコイダンまたはアセチルフコイダンは食品であり、経口で投与しても毒性がないことが特徴である。フコイダンまたはアセチルフコイダンを抗腫瘍剤として使用する場合は、経口投与によらなければ、フコイダンまたはアセチルフコイダンの特徴を生かすことができない。
本発明の目的は、経口投与によって消化管に発症した悪性腫瘍を治療する医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
かかる課題を解決するために、本発明者らはマウス大腸癌由来細胞ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅであるＣｏｌｏｎ  ２６細胞を腸内に移植して大腸癌を発症させたマウスを用いて、経口投与によって悪性腫瘍に対して治療効果を有する物質の検索を行ったところ、アセチルフコイダンを経口投与することによって、コントロール群と比較して、アセチルフコイダン投与群のマウスのＣｏｌｏｎ  ２６細胞の生育が有意に抑制されることを見出し、引き続き鋭意研究した結果、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
本発明による消化管悪性腫瘍治療用経口医薬組成物は、アセチルフコイダンを有効成分とする。
更に、本発明のアセチルフコイダンは、糖成分が１モルのＬ−フコースと、０．０３乃至０．１０モルのＤ−キシロースと、０．２乃至０．４モルのＤ−グルクロン酸と、の割合で構成された多糖であって、前記多糖が、Ｌ−フコースに換算して０．１乃至０．３残基のアセチル基と、０．２乃至０．４残基の硫酸基と、を含む。
【００１５】
更に、本発明のアセチルフコイダンは、養殖オキナワモズクをホモゲナイズし、１０乃至３５℃で０．０１乃至０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸と硫酸と蓚酸との内から選ばれる１以上の酸を含む水によって抽出し、不溶物を除去し、中和して抽出液を得て、前記抽出液から水を蒸発させて粉末化するか、若しくは、前記抽出液にメタノール又はエタノールを加えて生成した沈殿をろ取し、乾燥して粉末化することによって製造したものである
【００１６】
又、本発明のアセチルフコイダンは、前記アセチルフコイダンの粉末を、更に水に溶解し、塩化バリウム若しくは酢酸バリウムを加えて沈殿を生成せしめ、前記沈殿をろ過して除き、ろ液を陽イオン交換樹脂を用いて脱塩し、水で溶出させ、溶出液を水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムで中和した後に粉末化することによって得たナトリウム塩型またはカリウム塩型のアセチルフコイダンである
【００１７】
また本発明の経口投与用医薬組成物は、アセチルフコイダンを、水に溶解するか、又は懸濁する事によって製造した液体状、懸濁液状、又はゼリー状の組成物である。アセチルフコイダンは、粘性多糖であるので、水に溶解させるか懸濁させた場合はゼリー状となることがある。
【００１８】
また本発明の経口投与用医薬組成物は、粉末、練り物、又は錠剤である事が好ましい。
本発明の固形製剤は、更にカプセル化されるか、表面にコーティング処理が施されることが好ましい。
また、口腔、咽頭、食道などに発症した悪性腫瘍の治療には、口腔投与用製剤を用いることが好ましい。
カプセル化製剤やコーティング製剤は公知の方法を利用して製造できる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のアセチルフコイダンを有効成分とする消化管悪性腫瘍治療用経口医薬組成物は、経口投与によって消化管に発症した悪性腫瘍を治療する効果を有する。また、経口投与剤であるので、患者は自宅で治療でき、患者の負担を軽減できる。
アセチルフコイダンは養殖オキナワモズクを原料とする食用の多糖類であって、毒性は認められないので、従来の化学療法剤のような副作用はなく、患者の副作用の負担を軽減できる。
養殖オキナワモズクを原料とするので、大量養殖が可能であり、安価に製造できる。
【００２０】
アセチルフコイダンは多糖であり、水に溶解し、副作用のない安定な化合物なので、製剤化や保存や取り扱いが容易である。アセチルフコイダンは水溶性なので、水に溶解させるか、又は水に懸濁させた液状製剤にして経口投与することによって投与することができる。この方法は、例えば注射や点滴による投与より患者の負担を軽減することができる。一方、固形製剤の方が、液状製剤よりも多量の有効成分を処方でき、またドラッグデリバリーシステムを利用できる。
本発明の消化管悪性腫瘍治療用経口医薬組成物の固形製剤をカプセル化するか、コーティングすることによって、公知のドラッグデリバリーシステムを利用して有効成分を患部に輸送することができ、またアセチルフコイダン特有の香味を防ぐことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
アセチルフコイダンは多糖類であり、経口投与しても体内に吸収されない。本発明の消化管悪性腫瘍治療用経口医薬組成物が示した、Ｃｏｌｏｎ  ２６細胞により腸に発症した悪性腫瘍を治療する効果は、アセチルフコイダン又はその部分分解物が消化管内を輸送されて腸管に達して、抗腫瘍作用を示したものであると考えられる。因みに、アセチルフコイダンは消化酵素によっては消化されないが、消化管内で部分分解される可能性がある。
【００２２】
特許文献５には、オキナワモズク由来のアセチルフコイダンを酸で部分分解して得たオリゴ糖成分に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で、さまざまな免疫機能調節作用があることが報告されている。以下で述べる、本発明の実施例１の試験条件は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で示される活性が治療効果に反映される可能性のある条件である。
【００２３】
本発明のアセチルフコイダンは、消化分解されずに、または部分分解されて悪性腫瘍の患部の輸送されることが望ましいので、製剤はカプセル化し、又はコーティング化して、患部に対応した公知のドラッグデリバリーシステムを利用して、患部に輸送することが望ましい。例えば、直腸や大腸に発症した悪性腫瘍の治療には、腸溶性カプセル化又は腸溶性フィルム素材を用いたコーティング化が好ましい。
また、口腔、咽頭、食道などに発症した悪性腫瘍の治療には、口腔投与用製剤を用いることが好ましい。口腔投与用製剤は、例えばアラビヤゴムと混練するなどによって容易に製造することができる。
【００２４】
本発明のアセチルフコイダンは、特有の香味を有するので、摂取しやすくするためにカプセル化するか、糖衣でコーティングすることが好ましい。複数の目的の製剤化を行う場合には、目的に応じた性質を有するカプセル材又はコーティング材を重層して使用できる。
以下に、実施例を挙げて本発明の実施の形態を詳細に説明するが、これは本発明を説明するためのものであり、本発明の権利範囲を制限するものではない。本発明思想から逸脱しない限り、これらの実施形態について種々の変更又は変形が可能なことは言うまでもない。
【００２５】
（１）アセチルフコイダンの製造
本発明で用いるアセチルフコイダンは、例えば特許文献１に記載された、オキナワモズクから製造したアセチルフコイダンを好適に用いることができる
ミキサー或いはホモゲナイザーを使用して細胞壁を破壊したオキナワモズクを０．０１乃至０．２ｍｏｌ／Ｌの酸を加えた水に分散させる。オキナワモズクは、採取した新鮮な湿潤藻体でも、オキナワモズクを乾燥したものでもよい。又、前記の酸は特に限定されないが、硫酸と塩酸と修酸とを好ましい具体例として挙げることができる。分散液から不溶物を除去し、中和して抽出液を得て、前記抽出液から水を蒸発させて粉末化するか、若しくは、前記抽出液にメタノール又はエタノールを加えて生成した沈殿をろ取し、乾燥して粉末化することによって粗フコイダンを製造した。このフコイダンは淡褐色を呈する。
【００２６】
上記の粗フコイダンを塩化バリウム溶液又は酢酸バリウム溶液に溶解後、ケイソウ土の層を通してろ過を行うことによって、白色のフコイダンを製造する事が出来る。
上記の方法で製造したフコイダンはバリウム塩型である。ナトリウム又はカリウム塩型に変換するためには、陽イオン交換樹脂で脱塩後、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム溶液で中和し、粉末化することによって製造する事が出来る。湿潤モズク藻体からの収率は２．０％である。
【００２７】
製造したアセチルフコイダンは天然物を原料とするので、原料や採取方法によって得られるアセチルフコイダンの成分は変動する。本発明のアセチルフコイダンは、糖成分が１モルのＬ−フコースに対して、０．０３乃至０．１０モルの割合のＤ−キシロースと、０．２乃至０．４モルの割合のＤ−グルクロン酸と、から構成され、且つ、Ｌ−フコースに換算して０．１乃至０．３残基のアセチル基と、０．２乃至０．４残基の硫酸基と、を含み、平均分子量が５００，０００乃至６００，０００の範囲であった。
（製造例１）
【００２８】
新鮮なオキナワモズクの乾燥体５０ｇに、０．１モルの塩酸２Ｌを加え、室温で３時間攪拌を行った後、ケイソウ土の層を通してろ過を行い、淡褐色の透明な液を得た。この液に０．１モル水酸化ナトリウムを添加して中和を行い、２倍量のエタノールを加えて沈殿させ、得られた沈殿を取り出し、減圧乾燥を行って２２ｇの淡褐色を呈するアセチルフコイダンを得た。
【００２９】
上記のアセチルフコイダン１０ｇを０．１モルの塩化バリウム溶液５００ｍＬに分散し、１時間撹拌して溶解し、ケイソウ土の層を通してろ過を行い、エタノールを加えて沈殿させることによって７．７ｇのアセチルフコイダンを得た。このアセチルフコイダンを陽イオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０、スペルコ社）のカラムを通し、溶出液を水酸化ナトリウムで中和し、凍結乾燥することによって、４．５ｇのナトリウム型のアセチルフコイダンを得た。本製造例の成分分析によれば全糖は６７．０％（重量／重量、以下同じ）、ウロン酸含量は１３．２％、硫酸は１２．０％、灰分は２２．３％、水分は３．０％であった。
【００３０】
（２）腫瘍細胞
本発明では、マウス大腸癌由来細胞ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅであるＣｏｌｏｎ  ２６細胞を用いて、経口投与で悪性腫瘍を治療する方法の開発研究を行った。
（製造例２）
【００３１】
（Ｃｏｌｏｎ  ２６細胞の調整）
マウス大腸癌由来細胞ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅであるＣｏｌｏｎ  ２６細胞をプラスチック  ディッシュ（Ａｓａｈｉ  Ｔｅｃｈｎｉｃｏ  Ｇｌａｓｓ  社）中で、細胞培養培地（ＲＰＭＩ１６４０  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｊａｐａｎ  社）にウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｊａｐａｎ  社）１０％とカナマイシン１００μｇ／ｍＬを添加して、５％の炭酸ガスを含む空気中で３７℃で４８時間培養した。底面に付着した単層培養細胞をリン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄した後、１ｍＬの細胞分離液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎ社）で２４時間培養し、浮遊した細胞を採取し、細胞培養培地ＲＰＭＩ１６４０）にカナマイシン１００μｇ／ｍＬを添加した培地に懸濁し、５×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞密度に調整した。
【００３２】
（３）投与試験
９周齢の雄のＢＡＬＢ／ｃマウスを、試験開始まで１周間馴化させた後、プラスチック製の飼育箱で飼育した。試験動物を２４時間絶食させた後、酸素と笑気の混合ガスにイソフルレンを加えて麻酔した。腹部を中央切開し、Ｃｏｌｏｎ  ２６細胞懸濁液を５回、小腸にマイクロニードで注入した。手術終了後より通常水を飲ませたコントロール群と、通常水に５％アセチルフコイダンを溶解させて飲ませた試験群と、に分けて２週間飼育し、体重の変化を記録した。
１５日目に犠死させ、開腹し、腫瘍サイズを測定した。その後に病巣を摘出して組織のヘマトキリシン・エオシン染色よる腫瘍の侵潤と免疫組織化学染色によるアポトーシス細胞の有無を検討した。
【００３３】
（４）免疫組織化学的分析
アポトーシスの過程で生じる断片化ＤＮＡを、キットを用いてビオチン標識ヌクレオチドで標識した後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを反応させて染色・検出を行った。キットにはＩＳＥＬ法を用いるＫｌｅｎｏｗ  Ｋｉｔと、ＴＵＮＥＬ法を用いるＴｄＴ  Ｋｉｔがある。本発明では、ＴｄＴ  Ｋｉｔを使用した。
【実施例１】
【００３４】
（投与試験）
１群１０匹の９周齢の雄のＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ社より購入）４群（４０匹）を、試験開始まで１周間馴化させた後、各群ごとにプラスチック製の飼育箱で、温度２１±２℃、湿度４５±１０℃、１２時間の照明、１２時間の暗室の環境下で通常の餌（ＭＦ、オリエンタル酵母株式会社製）を投与して飼育した。
試験動物を２４時間絶食させた後、３０％の酸素と７０％の笑気の混合ガスに５％のイソフルレンを加えて麻酔を導入し、手術時はイソフルレンを２％とした。手術は、腹部を中央切開し、５×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞密度のＣｏｌｏｎ  ２６細胞懸濁液３０μＬを５回、小腸にマイクロニードル（１００μＬ、Ｔｅｒｕｍｏ社）で注入した。Ｃｏｌｏｎ  ２６細胞を移植した後、傷口をナイロン糸で縫合した。
手術終了後より通常水を飲ませたコントロール群と、通常水に５％アセチルフコイダンを溶解させて飲ませた試験群と、に分けて２週間飼育し、体重の変化を記録した。
１５日目にペントバルビタールの過剰投与によって犠死させ、開腹した。
【００３５】
図１にコントロール群とアセチルフコイダン投与群との体重の変化を示すグラフを示す。図１に示すように、アセチルフコイダン投与群はコントロール群に較べ、有意（Ｐ＝０．０５）に体重減少が抑制された。
図２Ａにコントロール群の代表例の病巣写真を示し、図２Ｂにアセチルフコイダン投与群の代表例の病巣写真を示す。図２Ａ、Ｂに示すように、アセチルフコイダン投与群はコントロール群に較べ、悪性腫瘍の発育が抑制されていた。
腫瘍を摘出し腫瘍サイズを測定した。図３に腫瘍を摘出し腫瘍サイズを測定したグラフを示す。
悪性腫瘍の体積は次式に従って算出した
腫瘍体積［ｍｍ３］＝長さ［ｍｍ］×幅［ｍｍ２］×１／２
図３に示すように、アセチルフコイダン投与群はコントロール群に較べ、悪性腫瘍の体積が有意（Ｐ＝０．０５）に減少していた。
【実施例２】
【００３６】
（１）組織のヘマトキリシン・エオシン染色
摘出した組織を４％パラホルムアルデヒド溶液で室温で１０分間固定した。固定組織で連続切片を作成し、組織のヘマトキリシン・エオシン染色を行った。図４コントロール群の組織のヘマトキリシン・エオシン染色の写真を示し、図５にアセチルフコイダン投与群の組織の染色の写真を示す。図４に示すように、コントロール群は腸上皮に接種した悪性腫瘍細胞が正常組織に強く浸潤しているが、図５に示すように、アセチルフコイダン投与群では▲印のところに境界線が形成され、腸上皮に接種した悪性腫瘍細胞による正常組織への浸潤が抑制されている。
【実施例３】
【００３７】
（免疫組織化学的分析）
固定組織の切片を、リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ＤＥＡＥセルロース（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ  ＧＥヘルスケアヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて３０分間透過し、３％過酸化水素水の４０％メタノール溶液に５分間浸漬して内因性ペルオキシダーゼブロックを消去し、アポトーシスの過程で生じる断片化されたＤＮＡを、ビオチン標識ヌクレオチドで標識するためのＤＮＡキットである、ＴＡＣＳ  ２  ＴｄＴ−ＤＡＢ  キット（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ  Ａｐｏｐｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）の標識液で３７℃で１時間インキュベートしてアポトーシス細胞をＴＡＣＳでラベルし、正常な核をメチルグリーンで染色した。
【００３８】
図６にコントロール群の腫瘍の免疫組織化学染色の写真を示し、図７にアセチルフコイダン投与群の腫瘍の免疫組織化学染色の写真を示す。矢印がアポトーシスを示すアポトーシス染色陽性細胞である。図６に示すように、コントロール群はアポトーシスを示すアポトーシス染色陽性細胞はほとんど見られないが、図７に示すように、アセチルフコイダン投与群ではアポトーシスを示すアポトーシス染色陽性細胞がみられ、特に正常細胞と悪性腫瘍細胞の境界に多くみられる。
【実施例４】
【００３９】
（ゼリー状製剤の製造）
調製槽にて、精製水（１００ｇ）に、製造例１で製造したナトリウム型アセチルフコイダン（１０ｇ）を室温にて添加し、６０乃至８０℃で攪拌して溶解させた。これにカッパカラギーナン（０．４ｇ）、イオタカラギーナン（０．９ｇ）、及びローカストビーンガム（０．４ｇ）、デキストリン（５ｇ）、ポリアクリル酸ナトリウム（４ｍｇ）を添加し、８０乃至９０℃にて撹拌して溶解させた。さらに、Ｄ−ソルビトール（５６ｇ）、グリセリン（２７ｇ）、パラオキシ安息香酸プロピル（０．５ｇ）、香料（微量）を添加し、さらに精製水を適宜加えて全体で１９８ｇになるように調整した。これを８０乃至９０℃にて１時間加熱して殺菌処理してゼリー状製剤を製造した。
【実施例５】
【００４０】
（腸溶性カプセル製剤の製造）
ｐＨ３．０以下の酸性では溶解せず、中性ないし弱アルカリ性で溶解するヒドロキシアルキルセルローズ（信越化学工業製、商品名ＨＰ−５５）を成型加工して製造した日本薬局方１号の腸溶性ハードカプセルに、製造例１で製造したナトリウム型アセチルフコイダンの粉末１０重量部とカルボキシメチルセルロースカルシウム５重量部の混合粉末を０．１５ｇ充填し、嵌合部を腸溶性基材でシールして腸溶性のコンアルブミン・ハードカプセル製剤を製造した。
【実施例６】
【００４１】
製造例１で製造したナトリウム型アセチルフコイダン（２５．６重量％）、乳糖（４８．４重量％）、結晶セルロース（２０．０重量％）、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（ＬＨ−２１）（５．０重量％）、ステアリン酸マグネシウム（１．０重量％）を打錠して、錠剤を作成した。
【実施例７】
【００４２】
請求項６で製造した錠剤に、内層として、オイドラギットＥ（商品名、ジメチルアミノエチルメタクリレート−メチルメタクリレート共重合体、デグサジャパン株式会社、７重量部）と、エタノール（７０重量部）と、水（１９．５重量部）と、タルク（３．５重量部）と、からなる溶液を、５０℃で連続的に噴霧することにより塗布した。
噴霧後、該核を乾燥し、次に上層として、オイドラギットＳ（商品名、メタアクリル酸―メチル．  メタアクリレート共重合体、デグサジャパン株式会社、７重量部）と、エタノール（７０重量部）と、水（１８．８重量部）と、タルク（３．５重量部）と、ポリエチレングリコール６０００（０．７重量部）と、からなる溶液を、５０℃で連続的に噴霧することにより塗布し、腸溶性コーティングされた錠剤を製造した。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】コントロール群とアセチルフコイダン投与群との体重の変化を示すグラフである。
【図２】Ａはコントロール群の代表例の病巣写真であり、Ｂはアセチルフコイダン投与群の代表例の病巣写真である。
【図３】腫瘍を摘出し腫瘍サイズを測定したグラフである。
【図４】コントロール群の組織のヘマトキリシン・エオシン染色の写真である。
【図５】アセチルフコイダン投与群の組織のヘマトキリシン・エオシン染色の写真である。
【図６】コントロール群の腫瘍の免疫組織化学染色の写真である。
【図７】アセチルフコイダン投与群の腫瘍の免疫組織化学染色の写真である。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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