(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＬＡのように多型又は変異のある複数の領域が組み合わされた形で多数の対立遺伝子が構成されているＤＮＡ配列を同一基板上で捕捉かつ検出する方法の提供。【解決手段】複数の多型部位を有する特定の標的ＤＮＡ配列を当該多型性の有無に応じて選択的に増幅かつ捕捉及び/又は検出する方法であって、基板上で、前記標的ＤＮＡ配列を含むと予測されるＤＮＡ試料に対してＬｏｏＰ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法に基づく増幅反応を実施する。前記ＬＡＭＰ法において使用されるプライマーの３’未端領域及び５’末端領域の少なくとも２つが前記複数の多型又は変異部位の少なくとも２つに相当する塩基配列又はそれの相補的な配列を含み、前記ＬＡＭＰ法のプライマー及び前記増幅反応による増幅産物と特異的に結合するプローブから選択される少なくとも１つが前記基板上に固定されている方法。【選択図】図５
2009106220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の多型又は変異部位を有する特定の標的ＤＮＡ配列を当該多型又は変異の有無に応じて選択的に増幅かつ捕捉及び/又は検出する方法であって、
基板上で、前記標的ＤＮＡ配列を含むと予測されるＤＮＡ試料に対してLoop-Mediated  Isothermal  Amplification(ＬＡＭＰ)法に基づく増幅反応を実施することを含み、前記ＬＡＭＰ法において使用されるプライマーの3'未端領域及び5'末端領域の少なくとも２つが、前記複数の多型又は変異部位の少なくとも２つに相当する塩基配列又はそれの相補的な配列を含み、
前記ＬＡＭＰ法のプライマー及び前記増幅反応による増幅産物と特異的に結合するプローブから選択される少なくとも１つが前記基板上に固定されていることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記基板上に固定されているのがＬＡＭＰ法のプライマーのみであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基板上に固定されるプライマーが、LAMP法のFIP、BIP、LF、LBから選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記基板上に少なくとも２つのプライマーが固定されている請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記基板上に固定されているのが増幅産物と特異的に結合するプライマーのみであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記基板上に少なくとも２つのプライマーが固定されている請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅反応中に検出可能な標識を取り込ませ、増幅反応後に前記標識を検出することを更に含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標識がビオチン／アビジンであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
増幅あるいは伸長反応中、または増幅あるいは伸長反応後に、２本鎖DNAに結合するインターカレーターを増幅産物に結合させることにより、基板上に捕捉された増幅産物を検出することを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＬＡＭＰ法において使用されるプライマーのセットであって、それらのプライマーの3'未端領域及び5'末端領域の少なくとも２つが、複数の多型又は変異部位を有する標的配列の多型又は変異部位の少なくとも２つに相当する塩基配列又はそれの相補的な配列を含むプライマーセットと、複数のウエルを具備するプレート、及び任意にＬＡＭＰ法による増幅反応による増幅産物と特異的に結合するプローブとを備え、
前記プレートの各ウエル内表面に、前記プライマー及びプローブから選択される少なくとも１つを固定したことを特徴とする標的配列の捕捉用及び／又は検出用キット。
【請求項１１】
前記プレートに代えてビーズを備え、当該ビーズの表面に前記プライマー及びプローブから選択される少なくとも１つを固定したことを特徴とする請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
捕捉された配列を標識する標識物質を更に備えることを特徴とする請求項１０又は１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は基板上で等温増幅反応と検出反応を行うことにより特定の塩基配列を捕捉及び検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の塩基配列の存在の有無を調べることは、基礎研究、医学的研究、検査等において極めて有用である。例えば、白血病の原因となる融合遺伝子の存在の有無、検体中の病原体遺伝子の存在の有無、疾患の易罹患性や医薬品応答性に関連した多型の有無、臓器移植に関連したHLA (human leukocyte antigen、ヒト白血球抗原)アリルのタイピングにつながる複数の多型領域の存在の有無、を調べることは基礎研究、医療、食品の領域において重要であり、実際にこれらの領域において実施あるいは開発されている。
【０００３】
通常は、検体中のDNA量が少ないのでDNAの特定の領域だけを増幅した後に、プローブとのハイブリダイゼーションや塩基配列解析等により、目的とする塩基配列をもつDNAの存在の有無が調べられる。例えば Polymerase Chain Reaction (PCR) により増幅した後に、増幅中あるいは増幅後に蛍光標識した増幅産物を、基板上やビーズに固定したプローブとハイブリダイズさせ、蛍光を測定することにより目的とするDNAあるいは多型の有無が検出されている。これらは増幅と検出を別々に行う方法であるが、増幅と検出を同時に行う方法も行われている。例えば、PCRによる増幅中に、Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) により消光していたプローブが増幅に伴い切断されることにより蛍光の増大がおこることを利用した方法 (TaqMan PCR) 、PCRの増幅産物や等温増幅のLoop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)（例えば、特許文献１参照）の増幅産物の２本鎖DNAにインターカレーターを結合させることにより増大する蛍光や、増幅に伴い増大するピロリン酸とマグネシウムイオンとの結合による濁りを検出する方法等である。
【０００４】
しかしながら、HLAのように複数の多型（領域）が組み合わされた形で対立遺伝子が構成されているDNAを標的とする場合、多型（領域）をそれぞれ独立に調べる上記したような従来の方法では、対立遺伝子の組み合わせを区別できない場合がある。例えば、対立遺伝子A1が多型領域aに1という多型をもち、多型領域bに1という多型をもつ場合をA1(a:1, b:1)のように表記し、対立遺伝子A1とA2をもつ場合をA1(a:1, b:1)/A2(a:2, b:2)、対立遺伝子A3とA4をもつ場合をA3(a:1, b:2)/A4(a:2, b:1)とする。多型領域aとbにそれぞれ独立したプローブを設定し調べた場合、A1/A2の組み合わせとA3/A4の組み合わせはどちらも同じ結果となり区別できない。
本発明者等は、LAMP法で使われるFIPプライマー、BIPプライマーの5’および3’末端領域、F3プライマー、B3プライマーの3’末端領域に可能な限り多型領域が対応するようにプライマーを設計することにより、同時に複数の多型領域を認識させて増幅させる方法を開発した。本出願では、当該方法を更に発展させ、増幅したＤＮＡ配列を基板状に捕捉し、好ましくは同基板上で当該ＤＮＡ配列の有無を検出することができる方法を見いだした。
【０００５】
【特許文献１】国際公開第WO01/034838号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
即ち、本発明は、複数の多型又は変異性領域を含む特定の塩基配列を増幅するとともに当該配列を基板上に捕捉し、好ましくは同時に当該配列の有無を検出できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる課題を解決するため、本発明は、複数の多型又は変異部位を有する特定の標的ＤＮＡ配列を当該多型又は変異の有無に応じて選択的に増幅かつ捕捉する方法であって、基板上で、前記標的ＤＮＡ配列を含むと予測されるＤＮＡ試料に対してLoop-Mediated  Isothermal  Amplification(ＬＡＭＰ)法に基づく増幅反応を実施することを含み、前記ＬＡＭＰ法において使用されるプライマーの3'未端領域及び5'末端領域の少なくとも２つが、前記複数の多型又は変異部位の少なくとも２つに相当する塩基配列又はそれの相補的な配列を含み、前記ＬＡＭＰ法のプライマー及び前記増幅反応による増幅産物と特異的に結合するプローブから選択される少なくとも１つが前記基板上に固定されていることを特徴とする方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、増幅と検出とが同一の基板上で実施され得るので、それらを別々に実施していた従来法に比較して、目的とする配列の有無を迅速に検出することが可能となる。さらに、等温増幅法であるLAMP法を適用することにより、PCR法等の温度サイクルを必要とする方法に比較して安価な機器で実施することができる。また、通常は１反応容器中で１反応しか行えないLAMP法を採用しているにもかかわらず、マルチプレックス化が可能であるという利点も有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
まず、本発明で好ましく用いられる等温増幅法であるLAMP法について簡単に述べる (詳細については、Notomi T, 0kayama H，Masubuchi H，Yonekawa T, Watanabe K，Amino N，Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15; 28(12):E63.あるいは栄研化学株式会社のホームページ (http://www.loopamp.eiken.jp)を参照されたい)。この方法は、標的DNA配列を挟む2つの領域中の各々3力所の塩基配列に相補的な配列を有する4種類のプライマーを用いて標的DNA配列を増幅する方法である。即ち、図１（ａ）に示すような2本鎖DNA(標的DNA配列を含む)の試料を、標的DNA配列の3'末端側のF1cと実質的に同一な配列(F1c)とF2cと相補的な配列 (F2)とを有するプライマー (FIP)、標的DNA配列の5'末端側のB2と実質的に同一な配列(B2)とB1と相補的な配列(B1c)とを有するプライマ一 (BIP)、標的DNA配列の3'末端側のF3cと相補的な配列(F3)を有するプライマー(F3)、及び標的DNA配列の5'末端側のB3と実質的に同一な配列(B3)を有するプライマー(B3)といぅ4種類のプライマーを用いて標的DNA配列を増幅する方法である。
【００１０】
LAMP法では、両末端に互いに相補的な配列 (F1とF1c、B1とB1c)を有するため、図１（ｂ）に示すように、標的配列 (又はその相補的配列)の両側にループを形成したダンベル型の構造を介して増幅反応が進行するという特徴を有している。そして、ループ状の１本鎖部分 (BlとB2の間又はFlとF2の間)の領域に相補的な配列を持つループプライマー (各々、LPBスはLPFとする)を使用することにより、増幅効率を向上させることができる。
【００１１】
PCR法では、ブライマーに由来する塩基配列がそのまま鋳型として利用されるため、一度ミスリード等が起こるとそれを修正することができず、標的DMA配列を繰り返しチェックすることはできない。これに対してLAMP法では、標的DNA配列に由来する塩基配列に対してハイブリダイズする工程を多く含むため、標的塩基配列のわずかな相違を正確に検出できるとされている。上記の特許文献１に記載された発明は、このようなLAMP法の特徴に基づいて、標的DNA配列における変異又は多型を検出する方法である。
【００１２】
具体的には、プライマーFIP及びBIPの5'末端に変異／多型部位 (例えばSNPs)塩基がくるようにプライマーを設計する (図１（ｃ）参照)。そして、DNA試料に含まれる標的DNA配列がプライマーと同一の (又は相補的な)塩基を有する場合には増幅反応が進行するが、異なる塩基を有する場合には増幅反応が進行しないことに基づいて変異／多型の検出(SNPsタイピング)が行なわれる。
しかしながら、このような方法では、標的DNA配列における１力所の変異／多型 (例えばSNPs)の有無しか検出することができない。
【００１３】
本発明では、LAMP法におけるプライマーFIP及ぴBIPの5'末端に、標的DNA配列に存在する変異／多型部位 (第１の変異／多型部位)に相当する塩基配列を配置することに加えて、プライマーFIPおよぴBIPの3'領域、F3およびB3の3'領域、ループプライマー（LPB及びLPF)の3'領域の内の少なくとも１つ、好ましくは2つ以上に、標的DNA配列に存在する前記第１の変異／多型部位以外の変異／多型部位 (第ｎの変異／多型部位：ｎは2以上の整数)に相当する塩基配列が配置されるようにプライマー設計をすることにより、複数の変異／多型性部位を有する標的DNA配列を、複数のプライマーに配置した塩基配列の有無に応じて特異的に増幅させることができる。このような試みは従来になかったものであり、本発明者等は、多型のある領域が組み合わされた形で多数の対立遺伝子が構成されているHLAについて、実際に特異的増幅を実施し、対立遺伝子を特定の変異／多型部位の有無によってクループ分けすることに初めて成功した。
【００１４】
より詳細に説明すると、例えば、HLA領域に存在するDRBl遺伝子の場合、多型部位の有無及びその種類及び位置に基づいて以下の群に分類できる。
(HLA-DR1)  DRBl*0101
(HLA-DR2)  DRBl*1501,1502,1602
(HLA-DR3)  DRBl*0301,1301,1302,1402,1403,1406
(HLA-DR4)  DRBl*0401,0403,0404,0405,0406,0407,0410
(HLA-DR5)  DRBl*1101,1307
(HLA-DR6)  DRBl*1201,1202
(HLA-DR7)  DRBl*1401,1405,1407
(HLA-DR8)  DRBl*0701
(HLA-DR9)  DRBl*0802,0803
(HLA-DR10)  DRB1*0901
(HLA-DR11)  DRBl*1001
【００１５】
例として、上記HLA-DR3に属するDRBl*0301,1301,1302,1402,1403,1406のエクソン２における塩基配列 (図２参照)を、HLA-DR7に属するDRBl*1401,1405,1407の同領域の塩基配列 (図３参照)と比較してみる。HLA-DR3に属する遺伝子は、共通して96番目及び97番目の塩基が共にaであるのに対し、HLA-DR7に属する遺伝子は、共通して96番目及び97番目の塩基が共にtである。従って、前記特許文献１に記載された方法 (以下 「従来方法」という)では、当該96番目又は97番目の塩基がFIP及びBIPの5'末端にくるようにプライマーを設計しさえすれば、設定した何れかの群の遺伝子のみが選択的に増幅されることになる。
【００１６】
しかしながら、例えば、上記HLA-DR10に属するDRBl*0901においても96番目及び97番目の塩基はaであるため、前記のプライマーセットを使用したのでは、HLA-DR3とHLA-DR10の遺伝子を識別することはできない。
これに対して、本発明では、HLA-DR3の遺伝子を選択的に増幅させるに当たり、FIP及びBIPの5'末端のみならず、F3及びB3プライマー並びにループプライマー（LF及びLB)の少なくとも１つに変異／多型性部位を含ませることにより、複数の変異／多型性部位を有する遺伝子群の選択的増幅の効率及び信頼性を格段に向上させることができる。
【００１７】
本発明で使用するプライマーセットを用いれば、変異／多型性のある領域 (変異／多型性を示す領域が変異／多型を示す塩基と共通の塩基の数塩基から構成される場合は、末端の１塩基だけでなく共通の塩基を含めた数塩基 (１〜５塩基程度)から構成される領域)を、可能な限り多くのプライマーの末端領域(FIPおよびBIPの5'領域および3'領域、F3およびR3の3'領域、1oop  primerの3'領域)に設定することにより、複数の共通した変異／多型部位を持つアリルを特異的に増幅することができる。言い換えれば、同一DNA鎖上の変異／多型 (ハプロタイプ)を同時に調べることが可能となる。
【００１８】
例えぱHLAのように変異／多型のある複数の領域が組み合わされた形で多数の対立遺伝子が構成されているDNA配列を標的とするような場合も、各プライマーの末端領域に変異／多型を設定することにより区別することが可能となる。また、HLA等の場合、非常に多くの対立遺伝子が存在するので (各口一カスごとに少なくとも数十種類以上)、各プライマー未端領域の対応する変異／多型の組み合わせを調整することにより、対立遺伝子のグループ分けを行い、その後に対立遺伝子を同定することも可能である。
【００１９】
本発明の捕捉及び／又は検出方法は、上記の特異的増幅法を更に発展させ、等温増幅法であるLAMP法のプライマーあるいはLAMP法の増幅産物に特異的なプローブを基板上に固定して基板上で増幅反応を行わせることに標的配列を基板上に捕捉し、そして好ましくは標識を増幅産物中に取り込ませることにより、その取り込まれた標識を利用して同一基板上で標的配列を検出することが可能である。
【００２０】
本発明の方法の第一の態様では、上記したＬＡＭＰ法のプライマーの少なくとも１つが基板上に固定されている。これにより、増幅反応が進行した場合には、増幅された塩基配列の少なくとも一部が基板状に捕捉されることになる
また、反応液中に標識物質（例えばアビジン／ビオチン等）を共存させておくことにより、増幅反応中に当該標識物質が取り込まれ、増幅反応後に適当な検出法を適用することによって、増幅された配列の有無を検出することができる。例えば96ウエルプレートや384ウエルプレートの1ウエルに、LAMP法のプローブ例えばBIPを固定しておき、そのウエル中でHLAのアリル特異的LAMP反応を行わせることによりHLAのタイピングが可能となる。
【００２１】
本発明の方法の第二の態様では、ＬＡＭＰ法によって増幅された標的配列と特異的に結合するプローブが基板上に固定されている。この場合、ＬＡＭＰ法によって特異的に増幅された標的配列が存在すると、当該配列は基板上に固定されたプローブと結合することによって捕捉される。ここで、反応液中に２本鎖DNAに結合するインターカレーター、例えばサイバーグリーンを共存させておくと、増幅あるいは伸長反応中、または増幅あるいは伸長反応後に、当該インターカレーターが増幅産物に結合し、基板上に捕捉された増幅産物を検出することができる。例えば、ウエル中でHLAのアリル特異的ではなく遺伝子座特異的な増幅を行い、１ウエルに多数のアリル特異的プローブを基板上に固定しておくことにより、反応したプローブからアリルの同定（HLAタイピング）が可能となる。
【００２２】
この場合、例えば、プローブ内に多型や変異のある領域を設定し、増幅産物の捕捉標的領域とプローブの塩基配列間のミスマッチの有無によりTm（プローブが50%結合する温度）が異なることを利用し、特定のアリルや変異のある遺伝子、あるいはウイルス等を補足することが可能である。さらに、プローブの一部、例えばミスマッチの部位に、修飾した塩基、例えばLNA (locked nucleic acid)、を用いてミスマッチの有無によるTmの差を拡大し、特異性をあげることも可能である。
なお、上記した本発明の方法は、複数の多型部位又は変異部位を有する配列の捕捉及び検出に適しているが、変異／多型部位を持たない配列にも応用可能であることは言うまでもない。その場合は、ＬＡＭＰ方のプライマーを標的配列に応じて適宜設計すればよい。
【００２３】
さらに本発明は、上記した標的配列の捕捉及び／又は検出方法を実施するためのキットも提供する。即ち、本発明のキットは、複数のウエルを有するプレートの各ウエル内表面に、ＬＡＭＰ法のプライマー及び／又は標的配列と特異的に結合するプローブの少なくとも１つを固定したプレートと、上記のＬＡＰＭ法を実施するためのプライマーを備える。さらに、増幅された標的配列を標識する標識物質（アビジン／ビオチンあるいはサイバーグリーンなど）を備えていてもよい。
このキットを用いることにより、各ウエルに各々異なる試料を注入して増幅反応させることにより、何れのウエルに注入した試料が標的配列を含んでいるかが一目でわかるスポット状に可視化され、簡易かつ迅速な測定が可能となる。
【００２４】
また、本発明のキットは、複数のウエルを有するプレートに代えてビーズ、磁気ビーズ、蛍光ビーズを用いたものであってもよい。当該ビーズ類の表面に、上記のプライマー又はプローブを固定しておくことにより、標的配列をビーズ表面に特異的に捕捉することが可能となり、適当な手段によって標的配列を検出あるいは分離することが可能である。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を参照して本発明を具体的に説明する。
実施例１〜３ではHLAアリルまたはアリルグループを特異的に増幅するLAMP法のプライマー、FIPまたはBIPまたはLoopプライマーを基板上に固定することによりHLAアリルまたはアリルグループを特異的に増幅し基板上で可視化されたスポットとして検出できることを示す。
【００２６】
実施例４〜６では、基板上に固定したHLAアリルまたは多型領域特異的プローブと、HLAの遺伝子座または群特異的増幅を行うLAMP法の組み合わせによるHLAアリルの検出を示す。
実施例１〜５では対象としてHLA-DRB1を用いたが、実施例６ではDQB1を用い、基板上に固定したHLADQB1アリルまたは多型領域特異的プローブと、HLA-DQB1の群特異的増幅を行うLAMP法の組み合わせによるHLA-DQB1アリルの検出を示す。
【００２７】
（実施例１）
前記HLA-DR2を特異的に増幅するLAMP法プライマーを用いてHLA-DR2（DRB1*1501, DRB1*1502, DRB1*1602 ）の特異的増幅を行った。特異的増幅に用いた各プライマーの配列と反応液組成は以下に示したとおりである。
反応は65℃で60分間行った。なお、増幅に用いたヒト末梢血由来DNAは蛍光プローブSSO (sequence specific oligonucleotide) 法あるいはSBT (sequence based typing) 法によるHLAアリルタイピング済みのものを用いた。
【００２８】
プライマー配列
F3: TTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: GACTCCTCCTGGTTATAGAAGTATCTGCCTGTGGCAGCCTAAGAGG
BIP: TCCGTGCGCTTCGACAGTTCTGGCTGTTCCAGTACTCA
B3: GCGCCTGCTCCAGGAT  及び  GCGCCTGTCTTCCAGGAG（混合物）
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG  及び  ACGTGGGGGAGTTCCG（混合物）
【００２９】
反応液組成
DNA 20 ng, 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100, 8 mM MgSO4, 1.6 M Betaine, 1.4 mM dNTP, 0.3×SYBR GreenI, 1.6 uM FIP, 1.6 uM BIP, 0.8 uM LF, 0.8 uM LB, 0.2 uM F3, 0.2 uM B3, 6.4 U Bst DNA polymerase（総量 20 ulにて反応）
結果を図４に示した。HLA-DR2（DRB1*1501, DRB1*1502）が特異的に増幅され、その他のDR4 (DRB1*0401)、DR5 (DRB1*1101, DRB1*1201)、DR6 (DRB1*1302, DRB1*1402, DRB1*1405)、DR7 (DRB1*0701)、DR8 (DRB1*0802)、DR10 (DRB1*1001) は増幅されなかった。
【００３０】
このHLA-DR2（DRB1*1501, DRB1*1502, DRB1*1602）を特異的に増幅するプライマーセットの中のFIPを96ウエルプレート底面のプラスチック基板上に固定し、同一ウエル中でLAMP反応を行った。
FIP固定にはプライマー内部の1塩基をC6アミノ化し、アミノ基を介してプラスチック基板上に固定した。
陽性コントロールは3’末端をビオチン標識し、5’末端をC6アミノ化したオリゴDNA、陰性コントロールは3’末端をC6アミノ化したオリゴDNAを用い、アミノ基を介してプラスチック基盤に固定した。
【００３１】
固定したプライマーおよび陽性、陰性コントロールの配列を以下に示す。
プライマー配列
PC (陽性コントロール)オリゴDNAの塩基配列
5'-amino-C6-ATATAC(Biotin)
NC (陰性コントロール)オリゴDNAの塩基配列
5'-GGAGGGTTATTGGACCCGGC-C6-Amino
【００３２】
ウエル中でのLAMP反応は以下の反応液組成で65℃90分行った。
反応液組成
DNA 20 ng, 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100, 8 mM MgSO4, 1.6 M Betaine, 1.4 mM dNTP (-dTTP), 1.372 mM dTTP, 0.028 mM Biotin-dUTP, 0.32 uM FIP, 1.6 uM BIP, 0.8 uM LF, 0.8 uM LB, 0.2 uM F3, 0.2 uM B3, 16 U Bst DNA polymerase（総量 50 ulにて反応）
【００３３】
反応後以下の手順による発色反応を行い、プラスチック基板上に固定されたプライマーにより増幅産物が反応したものを発色させた。
1．TBS-T溶液で100倍希釈したアルカリフォスファターゼ共役ストレプトアビジン(Bio-Rad社)を基板上に展開させ、室温で15分間反応後、TBS-T溶液で基板を洗浄した。
２．0.1% Tween 20を加えた5-bromo-4-chloro-3’-indolylphosphatase (BCIP) / nitro-blue tetrazolium chloride (NBT) (Perkin Elmer社) 溶液を基板上に展開させ、室温で15分間反応後、0.1% Tween 20溶液で基板を洗浄し、乾燥させた後発色したスポットを観察した。
【００３４】
結果を図５に示した。DRB1*1502をもつサンプルのみが陽性スポットを示し、HLAアリルの特異的増幅と検出が可能であった。
【００３５】
（実施例２）
DR8を特異的に増幅するプライマーセットの確認を行った後、プライマーセットの中のBIPを基板上に固定し、実施例１と同様な実験を行った。反応液組成は実施例１と同じものを用い、プライマーは以下に示した配列のものを用いた。
プライマー配列
【００３６】
F3: TTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: TACTCCTCTTGGTTATAGAAGTATCTGTCCGTTTCTTGGAGTACTCTACGGG
BIP: TACGTGCGCTTCGACAGCTGGCTGTTCCAGTACTCGG
B3: CCGCCTGTCTTCCAGGA
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
【００３７】
結果を図６に示した。HLA-DR8 (DRB1*0803) が特異的に増幅され、その他のHLA-DR1 (DRB1*0101)、HLA-DR2（DRB1*1501, DRB1*1502）、DR4 (DRB1*0401)、DR5 (DRB1*1101, DRB1*1201)、DR6 (DRB1*1302, DRB1*1402, DRB1*1405)、DR7 (DRB1*0701)は増幅されなかった。
【００３８】
このHLA-DR8 (DRB1*0803)を特異的に増幅するプライマーセットの中のBIPを96ウエルプレート底面のプラスチック基板上に固定し、同一ウエル中でLAMP反応を行った。
以下の反応液組成を用い、その他は実施例１と同様に行った。
反応液組成
DNA 20 ng, 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100, 8 mM MgSO4, 1.6 M Betaine, 1.4 mM dNTP (-dTTP), 1.372 mM dTTP, 0.028 mM Biotin-dUTP, 1.6 uM FIP, 0.32 uM BIP, 0.8 uM LF, 0.8 uM LB, 0.2 uM F3, 0.2 uM B3, 16 U Bst DNA polymerase（総量 50 ulにて反応）
結果を図７に示した。DRB1*0802または（および）DRB1*0803をもつサンプルのみで陽性のスポットが観察された。
【００３９】
（実施例３）
HLA-DR9 (DRB1*0901)を特異的に増幅するプライマーセットの確認を行った後、プライマーセット中のLoopプライマー（この場合はLF）を固定した実験を実施例１と同様に行った。反応液組成は実施例１と同じものを用い、プライマーは以下に示した配列のものを用いた。
【００４０】
プライマー配列
F3: TTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: TGCCTCTGTGCAGATACCGCGTTTCTTGAAGCAGGATAAGTTTG
BIP: GGCATCTATAACCAAGAGGAGAACGTTCCAGGACTCGGCGA
B3: GCCTCCGCTCCAGGAAG
LF: CTCCGTCCCGTTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
【００４１】
結果を図８に示した。HLA-DR9 (DRB1*0901) が特異的に増幅され,その他のDR5 (DRB1*1101, DRB1*1201)、DR6 (DRB1*1302, DRB1*1405)、DR8 (DRB1*0802)、DR10 (DRB1*1001) は増幅されなかった。
【００４２】
このHLA-DR9 (DRB1*0901) を特異的に増幅するプライマーセットの中のLFを96ウエルプレート底面のプラスチック基板上に固定し、同一ウエル中でLAMP反応を行った。
以下の反応液組成を用い、その他は実施例１と同様に行った。
【００４３】
反応液組成
DNA 20 ng, 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100, 8 mM MgSO4, 1.6 M Betaine, 1.4 mM dNTP (-dTTP), 1.372 mM dTTP, 0.028 mM Biotin-dUTP, 1.6 uM FIP, 1.6 uM BIP, 0.27 uM LF, 0.8 uM LB, 0.2 uM F3, 0.2 uM B3, 16 U Bst DNA polymerase（総量 50 ulにて反応）
その結果を図９に示した。DRB1*0901をもつサンプルのみで陽性のスポットが観察された。
【００４４】
（実施例４）
HLA-DR遺伝子座特的増幅を行うために以下に示したプライマーセットをデザインし、LAMP法による増幅を行った。反応液組成は実施例１に示したものと同じものを用いた。
プライマー配列
F3: CCCCMCAGCACGTTTCYTG
FIP: ACTCCCCCACGTCGCTGARTGTYAWTTCTTCAAYGGGACGG
BIP: CCGGGCGGTGACGGAGCCCCGTAGTTGTGTCTGCA
B3: KCTGCACYGTGAAGCTCTC
LF: CAGNWACYGCACCCG
LB: CTGGAACAGCCAGAAGGAC
【００４５】
結果を図１０に示した。HLA-DRB1*0101, 1502, 1602, 0401, 0403, 1104, 1201, 1302, 1405, 0701, 0801, 0803, 0901, 1001の各アリルの増幅がみられたが、テンプレートDNAを加えないものでは増幅がみられなかった。その他のアリルも報告されている塩基配列から同様に増幅すると予想されるので、このプライマーセットでほぼ全てのHLA-DRアリルの増幅（HLA-DR遺伝子座特異的増幅）可能であると考えられた。なお、このプローブセットでDRB3を含む他の多型がほとんど無い遺伝子座も増幅される場合があるが、検出用プローブがアリルまたは多型（領域）特異的であるので問題とならない。
図中DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0803、DRB1*0901はホモ接合体であり、その他のものはヘテロ接合体である。
【００４６】
DRB1*13特異的に反応するようにデザインしたプローブを96ウエルプレート底面のプラスチック基板上に固定し、同一ウエル中で上に示したDR遺伝子座特異的増幅を行うプライマーセットを用いてLAMP反応を行った。
【００４７】
DRB1*13特異的に反応するプローブは次の５種類をデザインしプラスチック基板上に固定した。
DRB1*13特異的プローブ
DRB1_13 (1):  GGACATCCTGGAAGACGA
DRB1_13 (2):  GACATCCTGGAAGACGA
DRB1_13 (3):  ACATCCTGGAAGACGA
DRB1_13 (4):  CATCCTGGAAGACGA
DRB1_13 (5):  ATCCTGGAAGACGA
【００４８】
実施例１に示した陽性及び陰性コントロールの他に、DRB1アリルの共通配列領域に反応するプローブを第２の陽性コントロールとしてデザインし使用した。
DRB1アリル共通プローブ
DRB1共通:  CCCCACGTCGCTGTCG
【００４９】
反応液組成は以下のものを用い、その他は実施例１と同様に行った。
反応液組成
DNA 20 ng, 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100, 8 mM MgSO4, 1.6 M Betaine, 1 mM dNTP (-dTTP), 0.98 mM dTTP, 0.02 mM Biotin-dUTP, 1.6 uM FIP, 1.6 uM BIP, 0.8 uM LF, 0.8 uM LB, 0.2 uM F3, 0.2 uM B3, 16 U Bst DNA polymerase（総量 50 ulにて反応）
【００５０】
結果を図１１に示した。DRB1*1302をもつサンプルのみで陽性のスポットが観察された。65℃で反応を行っているが、プローブの配列の長さに対応してスポットの濃度が薄くなっている。これはプローブの反応が特異的に起こっていることを示唆している。
【００５１】
（実施例５）
DRB1アリル特異的に反応するようにデザインしたプローブを96ウエルプレート底面のプラスチック基板上に固定し、同一ウエル中で実施例４に示したDR遺伝子座特異的増幅を行うプライマーセットを用いてLAMP反応を行った。反応は全て実施例４と同様な条件で行った。
【００５２】
日本人集団で観察されるDRB1アリルの塩基配列から予想される各プローブの特異性、および塩基配列は以下の通りである。
DRB1_13 (1):  GGACATCCTGGAAGACGA
特異性：  DRB1*1301, DRB1*1302
DRB1_14_17:  TTCCAGTGCTCCGCAG
特異性：  DRB1*1401, DRB1*1407
【００５３】
その結果を図１２に示した。固定したプローブに対応するアリルを持つサンプルのみで陽性スポットが得られた。これにより、同一反応容器内で複数の塩基配列を標的としたLAMP法（この実施例では遺伝子座特異的増幅）を行い、同一容器内に存在する基板上に複数種類のプローブを固定し、同時に複数の標的塩基配列を検出することが可能であることが示された。
【００５４】
（実施例６）
HLA-DQ2、DQ3、DQ4のDQB1遺伝子を群特異的に増幅するLAMPプライマーをデザインし、それを用いてLAMP反応を行った。
プライマー配列
F3:  GTGGCTGAGGGCAGAGAC 
B3:  CGCTCACCTCGCCGC 
FIP:  ACGTCGCTGTCGAAGCGTCTCCCGAGGATTTCGTGT
BIP:  GCCGAGTACTGGAACAGCCAGTGCAAGGTCGTGCGGA
LF:  TCCCGTTGGTGAAGTAGCA 
LB:  CAGACACAACTACCAGTTGGAG
【００５５】
反応液組成
DNA 20 ng, 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100, 8 mM MgSO4, 1.6 M Betaine, 1 mM dNTP, 0.3×SYBR GreenI, 1.6 uM FIP, 1.6 uM BIP, 0.8 uM LF, 0.8 uM LB, 0.2 uM F3, 0.2 uM B3, 6.4 U Bst DNA polymerase（総量 20 ulにて反応）
【００５６】
結果を図１３に示した。HLA-DQ2 (DQB1*0202)、HLA-DQ3 (DQB1*0301, DQB1*0302, DQB1*0303)、HLA-DQ4 (DQB1*0401)の増幅はみられたがHLA-DQ5 (DQB1*0501)、HLA-DQ6 (DQB1*0601, DQB1*0602)およびテンプレートDNAを加えないものでは増幅はみられなかった。なお、図中DQB1*0202、DQB1*0301、DQB1*0401はそれぞれのホモ接合体であることを示し、DQB1*0302, 0503、DQB1*0303, 0604、DQB1*0401, 0503はそれぞれのヘテロ接合体であることを示す。
【００５７】
このプライマーセットを用い、各アリル特異的になるようにデザインしプラスチック基盤に固定したプローブを用いて、アリル特異的検出を行った。反応は全て実施例４と同様な条件で行った。
日本人集団で観察されるDQB1アリルの塩基配列から予想される各プローブの特異性、および塩基配列は以下の通りである。
【００５８】
プローブ配列
DQB1_02:  GTCGAAGCGCACGATCTCTT
特異性：DQB1*0201, DQB1*0202
DQB1_04:  CGGTCCTCCTCCAGGATG
特異性：DQB1*0401, DQB1*0402
DQB1_0301_0601:  CGGAGCGCGTGCGTTAT
特異性：DQB1*0301, DQB1*0601
DQB1_236:  GGAGCGCGTGCGTCT
特異性：DQB1*0201, DQB1*0202, DQB1*0302, DQB1*0303, DQB1*0602, DQB1*0602, DQB1*0603, DQB1*0604, DQB1*0609
DQB1共通:  AGCCAGAAGGAMRTCCTGGAG
特異性：全てのDQB1アリル
【００５９】
結果を図１４に示した。固定したプローブに対応するアリルを持つサンプルのみで陽性スポットが得られた。これにより、同一反応容器内で複数の塩基配列を標的としたLAMP法（この実施例では群特異的増幅）を行い、同一容器内に存在する基板上に複数種類のプローブを固定し、同時に複数の標的塩基配列を検出することが可能であることが再び示された。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】（ａ）LAMP法において使用されるプライマー等を示す説明図、（ｂ）LAMP法において生成されるダンベル型構造を示す模式図、及び（ｃ）LAMP法を用いた従来のSNPs検出方法を示す概略図である。
【図２】HLA-DR3遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図３】HLA-DR7遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図４】LAMP法によるDR2グループ（ DRB1*1501, 1502, 1602 アリル）の特異的増幅を示すグラフである。
【図５】FIPプライマーを基板上に固定することによるHLA-DRB1*1502の特異的増幅と検出を示す図である。固定したプライマーおよび陽性、陰性コントロールの位置を図中の上段に示し、予想されるスポット位置を図中の下段に示した。
【図６】LAMP法によるDR8グループ（ DRB1*0802, 0803, 0809 アリル）の特異的増幅を示すグラフである。
【図７】BIPプライマーを基板上に固定することによるHLA-DRB1*0802, 0803の特異的増幅と検出を示す図である。固定したプライマーおよび陽性、陰性コントロールの位置を図中の上段に示し、予想されるスポット位置を図中の下段に示した。
【図８】LAMP法によるDR９グループ（ DRB1*0901 アリル）の特異的増幅を示すグラフである。
【図９】LFプライマーを基板上に固定することによるHLA-DRB1*0901の特異的増幅と検出を示す図である。固定したプライマーおよび陽性、陰性コントロールの位置を図中の上段に示し、予想されるスポット位置を図中の下段に示した。
【図１０】LAMP法によるHLA-DRの遺伝子座特異的増幅を示すグラフである。
【図１１】DRB1*13特異的プローブを基板上に固定することによるHLA-DRB1*13の特異的検出を示す図である。固定したプライマーおよび陽性、陰性コントロールの位置を図中の上段に示し、予想されるスポット位置を図中の下段に示した。
【図１２】DRB1アリル特異的プローブを固定することによるDRB1アリルの特異的検出を示す図である。固定したプライマーおよび陽性、陰性コントロールの位置を図中の上段に示し、予想されるスポット位置を図中の下段に示した。
【図１３】LAMP法によるHLA-DQB1の群特異的増幅を示すグラフである。
【図１４】基板上に固定したHLA-DQB1アリル特異的プローブとLAMP法でのHLA-DQB1群特異的増幅の組み合わせによるHLA-DQB1アリルの検出を示す図である。固定したプライマーおよび陽性、陰性コントロールの位置を図中の上段に示し、予想されるスポット位置を図中の下段に示した。
【図１】
2009106220.tif 000003
【図２】
2009106220.tif 000004
【図３】
2009106220.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2009106220.tif 000015
【図１４】
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【配列表】
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