(57)【要約】      （修正有）【課題】安定した生理活性物質の固定能を有するバイオセンサーを簡便に効率よく作製する。【解決手段】生理活性物質が固定された測定表面と、生理活性物質が固定されていない参照表面とを基板に有し、前記測定表面及び前記参照表面に供給された溶液中の検体物質と前記生理活性物質との相互作用を屈折率の変化として測定するバイオセンサーの製造方法において、基板の表面の一部に対して有機溶剤及び活性化剤を用いて活性化処理を行い、前記生理活性物質が固定可能に活性化された第１の表面と、前記活性化処理が行われていない第２の表面とを、前記基板上にそれぞれ形成し、前記基板に流路部材を取り付けて、前記第１の表面及び前記第２の表面を有する流路を形成し、前記流路に前記生理活性物質を供給して前記第１の表面と生理活性物質とを接触させ、同一流路内に前記測定表面及び前記参照表面を作製する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質が固定された測定表面と、生理活性物質が固定されていない参照表面とを基板に有し、前記測定表面及び前記参照表面に供給された溶液中の検体物質と前記生理活性物質との相互作用を屈折率の変化として測定するバイオセンサーの製造方法において、
基板の表面の一部に対して有機溶剤及び活性化剤を用いて活性化処理を行い、前記生理活性物質が固定可能に活性化された第１の表面と、前記活性化処理が行われていない第２の表面とを、前記基板上にそれぞれ形成すること、
前記基板に流路部材を取り付けて、前記第１の表面及び前記第２の表面を有する流路を形成すること、
前記流路に前記生理活性物質を供給して前記第１の表面と生理活性物質とを接触させ、同一流路内に前記測定表面及び前記参照表面を作製すること
を含むバイオセンサーの製造方法。
【請求項２】
前記基板が金属表面又は金属膜である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
金属が金、銀、銅、白金及びアルミニウムのいずれかである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記金属表面又は金属膜上に親水性ポリマーが設けられていることを特徴とする請求項２又は請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の表面および前記第２の表面よりも疎水的な第３の表面が、前記第１の表面及び前記第２の表面との間に設けられていることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記第１の表面と前記第２の表面の間の前記基板表面が不連続であることを特徴とする請求項２〜請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記活性化処理後に前記基板を乾燥させることを含む請求項１〜請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記生理活性物質含有溶液の前記流路内での送液によって、前記第１の表面に前記生理活性物質を固定することを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶剤が、水と混和可能な有機溶剤である請求項１〜請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記有機溶剤が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、酢酸メチル、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、メチルエチルケトン、エチレングリコール、グリセリン、メチルセロソルブ、セロソルブ、プロピルセロソルブ、ブチルセロソルブ、テトラヒドロフラン、ジオキサン及びアセトニトリルからなる群より選択された少なくとも１種である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性化剤が、カルボジイミド誘導体、含窒素化合物、フェノール誘導体及びモルホリン誘導体からなる群より選択された少なくとも１つである請求項１〜請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項記載の方法により製造されたバイオセンサー。
【請求項１３】
非電気化学的検出に使用される請求項１２に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
表面プラズモン共鳴分析に使用される請求項１２又は請求項１３に記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーの製造方法及びバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われている。中でも、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術が好ましく用いられている。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００３】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００４】
生理活性物質を固定化可能な官能基を有する測定表面として、例えば特許文献１に、ヒドロゲルの製造法が詳細に開示されている。具体的には、１６−メルカプトヘキサデカノールの層が金膜に結合することでバリアー層を形成する。このバリアー層の上には、デキストランが設けられた後に、デキストランにはカルボキシメチル基が導入される。
この方法に基づき製造されたカルボキシメチル変性デキストラン表面には、アミノ基を有する生理活性物質（例えばタンパク質やアミノ酸）の固定化が可能となる。
すなわち、カルボキシメチル変性デキストランにおけるカルボキシル基の一部を、反応性エステル機能を生ずるように、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）塩酸の水溶液で処理することにより変性される。このような測定表面に対し、生理活性物質（タンパク質やアミノ酸）の水溶液を接触させることで、生理活性物質をデキストランマトリックスに共有結合により結合させることができる。
【０００５】
一般に、生理活性物質を上記のようにして形成されたデキストラン表面に固定した場合、この生理活性物質（リガンド）に対する結合能を有する物質（アナライト）が更に検出可能となる。このとき、リガンドを固定して測定表面に基準となるバッファを流した後、アナライトの溶液を流してリガンド−アナライトの結合をその屈折率変化信号として検出する。結合以外の屈折率変化要因を排除するには、同時にリガンドを固定していない参照表面の屈折率変化信号を測定し、その値を差し引きして補正する方法が知られている。
【０００６】
このような測定表面及び参照表面を作り分けるには、一般に、均一な表面を流路で仕切り、測定表面に相当する部分のみを活性する方法が一般的である。しかしこの方法では、測定表面に相当する部分と参照表面に相当する部分とを作り分けるための仕切りの仕組みが複雑になるという問題を有している。
一方で、基板表面の一部を活性化してから流路部材を取り付け、リガンド含有溶液を流路に供給して測定表面を作製する方法もある。しかし、一般に一対の供給口及び排出口で構成された一の流路に測定表面又は参照表面を設けるため、流路を選択してリガンド含有溶液を供給する必要があり、手間がかかる。また、通常用いられている水溶性の活性化剤では、活性化した部分が時間と共に不活性になってしまい、リガンドの固定量が経時的に低下してしまうという問題を有している。
【０００７】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安定した生理活性物質の固定能を有するバイオセンサーを簡便に効率よく作製することができるバイオセンサーの製造方法とこのようにして得られたバイオセンサーとを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のバイオセンサーの製造方法は、生理活性物質が固定された測定表面と、生理活性物質が固定されていない参照表面とを基板に有し、前記測定表面及び前記参照表面に供給された溶液中の検体物質と前記生理活性物質との相互作用を屈折率の変化として測定するバイオセンサーの製造方法において、基板の表面の一部に対して有機溶剤及び活性化剤を用いて活性化処理を行い、前記生理活性物質が固定可能に活性化された第１の表面と、前記活性化処理が行われていない第２の表面とを、前記基板上にそれぞれ形成すること、前記基板に流路部材を取り付けて、前記第１の表面及び前記第２の表面を有する流路を形成すること、前記流路に前記生理活性物質を供給して前記第１の表面と生理活性物質とを接触させ、同一流路内に前記測定表面及び前記参照表面を作製することを含むものである。
【００１０】
上記バイオセンサーの製造方法では、前記基板が金属表面又は金属膜であってもよく、金属が金、銀、銅、白金およびアルミニウムのいずれかであってもよい。
上記バイオセンサーの製造方法では、前記金属表面又は金属膜上に親水性ポリマーが設けられていることが好ましい。
また、上記バイオセンサーの製造方法では、前記第１の表面及び前記第２の表面よりも疎水的な第３の表面が、前記第１の表面及び前記第２の表面との間に設けられていてもよい。
また、上記バイオセンサーの製造方法では、前記第１の表面及び前記第２の表面の間の前記基板表面が不連続であってもよい。
上記バイオセンサーの製造方法では、前記活性化処理後に前記基板を乾燥させることを含むことが好ましい。
前記生理活性物質含有溶液の前記流路内での送液によって、前記第１の表面に前記生理活性物質を固定してもよい。
【００１１】
上記バイオセンサーの製造方法において前記有機溶剤は、水と混和可能な有機溶剤であることが好ましく、前記有機溶剤が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、酢酸メチル、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、メチルエチルケトン、エチレングリコール、グリセリン、メチルセロソルブ、セロソルブ、プロピルセロソルブ、ブチルセロソルブ、テトラヒドロフラン、ジオキサン及びアセトニトリルからなる群より選択された少なくとも１種であることが更に好ましい。
【００１２】
上記バイオセンサーの製造方法において前記活性化剤が、カルボジイミド誘導体、含窒素化合物、フェノール誘導体及びホルホリン誘導体からなる群より選択された少なくとも１つであることが好ましい。
本発明のバイオセンサーは、上記バイオセンサーの製造方法により製造されたものである。
ここで上記バイオセンサーは、非電気化学的検出に使用されることが好ましい。
また上記バイオセンサーは、表面プラズモン共鳴分析に使用されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、安定した生理活性物質の固定能を有するバイオセンサーを簡便に効率よく作製することができるバイオセンサーの製造方法及びバイオセンサーを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のバイオセンサーの製造方法は、生理活性物質が固定された測定表面と、生理活性物質が固定されていない参照表面とを基板に有し、前記測定表面及び前記参照表面に供給された溶液中の検体物質と前記生理活性物質との相互作用を屈折率の変化として測定するバイオセンサーの製造方法において、基板の表面の一部に対して有機溶剤及び活性化剤を用いて活性化処理を行い、前記生理活性物質が固定可能に活性化された第１の表面と、前記活性化処理が行われていない第２の表面とを、前記基板上にそれぞれ形成すること、前記基板に流路部材を取り付けて、前記第１の表面及び前記第２の表面を有する流路を形成すること、前記流路に前記生理活性物質を供給して前記第１の表面と生理活性物質とを接触させ、同一流路内に前記測定表面及び前記参照表面を作製することを含むものである。
【００１５】
本発明によれば、生理活性物質が固定された測定表面を得るための活性化処理を、活性化剤と有機溶剤とを用いて行うと共に、基板上の表面の全面に対して均一にではなく表面の一部に対してのみ行い、その後に流路部材が取り付けられる。一般に、検体物質と生理活性物質との相互作用を屈折率の変化として測定する微量分析では、生理活性物質のわずかな失活をも排除すべきところ、活性化処理に有機溶剤を用いることによって、活性化剤による生理活性物質の固定能を長期間にわたり維持することができる。また、同一流路内に、活性化処理が行われた第１の表面と活性化処理が行われていない第２の表面とが存在するので、流路を特に選択することなく生理活性物質を供給することにより、第１の表面から測定表面、第２の表面から参照表面を、一の工程によってそれぞれ作製することができる。これにより、安定した生理活性物質の固定能を有するバイオセンサーを簡便に効率よく作製することができる
以下、本発明について説明する。
【００１６】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００１７】
本発明のバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００１８】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍ以下であれば、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができる。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００１９】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２０】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。
本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２１】
上記の基板は、測定ユニットの誘電ブロックに固定され、一体化されて測定チップを構成しており、この測定チップが交換可能に形成されていてもよい。以下にその例を示す。
【００２２】
図１は、ＳＰＲを利用した測定に用いられるセンサユニット１０の分解斜視図である。センサユニット１０は、透明な誘電体である全反射プリズム２０と、この全反射プリズム２０の上に取り付けられる流路部材３０とで構成される。流路部材３０には、複数の流路３１が、長手方向に設けられている。なお、流路３１の断面がなるべく一定であれば、流路３１の底面形状としては特に限定されない。例えば、底面形状は、直線形状、蛇行形状、円弧形状などを挙げることができる。
【００２３】
全反射プリズム２０は、長尺な台形柱状に形成されたプリズム本体２１と、このプリズム本体２１の一端に設けられた把持部２２と、プリズム本体２１の他端に設けられた突出部２３とからなる。この全反射プリズム２０は、例えば、押し出し法などによって型成形されるものであり、プリズム本体２１、把持部２２、突出部２３の各部は、一体に成形されている。
【００２４】
プリズム本体２１は、下底よりも上底の方が長い略台形の縦断面を有しており、底面側面から照射された光を上面２１ａに集光する。プリズム本体２１の上面２１ａには、ＳＰＲを励起するための金属膜２５が設けられている。金属膜２５は、流路部材３０の各流路３１と対面するように長方形状をなしており、例えば、蒸着法などによって成形される。この金属膜２５としては、例えば、金や銀などが使用され、その膜厚は、例えば、５０ｎｍである。なお、金属膜２５の膜厚は、金属膜２５の素材や測定時に照射される光の波長などに応じて適宜選択される。
【００２５】
金属膜２５の上には、ポリマー層２６が設けられている。ポリマー層２６は、生理活性物質を固定させるための結合基を有するものであり、このポリマー層２６を介して金属膜２５上に生理活性物質が固定される。
ポリマー層２６は、生理活性物質を固定化するための層であり、自己組織化膜形成分子、親水性ポリマー、疎水性ポリマー、又はその組み合わせから構成することができるが、親水性ポリマーを使用することが好ましい。特に好ましい態様によれば、自己組織化膜形成分子と親水性ポリマーの組み合わせから構成することができる。
また、金属膜２５は、アミノ基を有する有機層で被覆された後、活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを上記有機層と反応させてもよい。これにより、生理活性物質を固定化し得るポリマー層２６としてのヒドロゲルを簡便に作製することができる。アミノ基を有する有機層で金属膜２５を被覆する方法は、公知の方法を使用することができるが、操作が簡便なことから、自己組織化膜（ＳＡＭｓ）を用いた被覆法が好ましい。
【００２６】
自己組織化膜（ＳＡＭｓ）を用いた金属膜の被覆法は、ハーバード大のＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ教授らにより精力的に展開されており、その詳細は例えばＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ，１０５，１１０３−１１６９（２００５）に報告されている。金属として金を用いた場合、有機層形成化合物として一般式Ａ−１（一般式Ａ−１において、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を用いることにより、Ａｕ−Ｓ結合とアルキル鎖同士のｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ力に基づき、配向性を持つ単分子膜が自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作成される。具体的には、例えば、一般式Ａ−１においてＸ＝ＮＨ２である化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基を有する有機層で金表面を被覆することが可能となる。
【００２７】
【化１】
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【００２８】
上記一般式Ａ−１においてＸがＮＨ２である末端にアミノ基を有するアルカンチオールとしては、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物（一般式Ａ−２）（一般式Ａ−２において、ｎは３から２０の整数を示す）であってもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−３、Ａ−４）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた化合物であってもよい。上記末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。
【００２９】
【化２】
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【００３０】
なお、上記一般式Ａ−２において、アルキル基の繰り返し数ｎは３から２０の整数を示し、３〜１６の整数がさらに好ましく、４〜８の整数が特に好ましい。また、上記一般式Ａ−３においてアルキル基の繰り返し数ｎは３〜２０の整数を示し、３〜１６の整数がさらに好ましく、４〜８の整数が特に好ましい。また、上記一般式Ａ−４においてアルキル基の繰り返し数ｎは、それぞれ独立に１から２０の整数を示し、３〜２０の整数が好ましく、３〜１６の整数がさらに好ましく、４〜８の整数が最も好ましい。
アルカンチオール誘導体のアルキル鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキル鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。
また、上記一般式Ａ−４において、エチレンオキシド基の繰り返し数ｍは、それぞれ独立に１〜２０の整数を示し、３〜２０の整数が好ましく、３〜１６の整数がさらに好ましく、４〜８の整数が最も好ましい。
【００３１】
上記末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−３、Ａ−４）と反応させる大過剰のジアミンとしては、任意の化合物を用いることが可能であるが、バイオセンサー表面に用いる場合、水溶性ジアミンが好ましい。水溶性ジアミンとしては具体的には、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１，４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４’−ジアモノビフェニル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルケトン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミンが挙げられる。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式Ａ−５）を用いることも可能である。本発明に用いるジアミンとしては、好ましくはエチレンジアミンまたは一般式Ａ−５（一般式Ａ−５において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）で表される化合物であり、より好ましくは、エチレンジアミンまたは１，２−ビス（アミノエトキシ）エタン（一般式Ａ−５において、ｎ＝２，ｍ＝１）である。
【００３２】
【化３】
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【００３３】
上記アミノ基を有するアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他のアルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Ｌａｎｇｍｕｉｒ１７，２８４１−２８５０，５６０５−５６２０，６３３６−６３４３（２００１））。ポリマー層２６を形成するためのアミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールとしては、水酸基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−６）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式Ａ−７）（一般式Ａ−６において、ｎは３から２０の整数を示し、一般式Ａ−７において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）を用いることが好ましい。好ましくは、一般式Ａ−６において、ｎは５以上の整数であり、１０以上の整数であることがさらに好ましく、１０〜３０の整数がさらに好ましく、最も好ましくは６〜１６の整数である。
【００３４】
【化４】
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【００３５】
アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合、一般式Ａ−２〜一般式Ａ−４のアルキル基の繰返し数は、４以上２０以下の整数であり、４以上１６以下の整数が好ましく、４以上１０以下の整数が最も好ましい。また同様に、アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合には、一般式Ａ−６及び一般式Ａ−７のアルキル基の繰返し数ｎは、３以上１６以下の整数であり、３以上１２以下の整数が好ましく、３以上８以下の整数が最も好ましい。
【００３６】
これらのアミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、アミノ基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には、活性エステル化されたカルボキシル基含有ポリマーの結合量が低下し、親水性基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には、非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールの混合比は、１／１〜１／１，０００，０００の範囲であることが好ましく、１〜１／１，０００の範囲であることがより好ましく、１〜１／１０の範囲であることがさらに好ましい。活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水性基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。
【００３７】
上記アルカンチオールには、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ大学のＧｒｚｙｂｏｗｓｋｉ教授らによる総説（Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，８，１７６３−１７９７（２００４）．）およびその引用文献に基づいて合成された化合物を用いてもよく、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＳｅｎｓｏＰａｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．社等から購入可能である。本発明においてアルカンチオールの酸化生成物であるジスルフィド化合物は、アルカンチオールと同様に用いることが可能である。
【００３８】
本発明で用いることができる親水性ポリマーとしては、ゼラチン、アガロース、キトサン、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、セルロース又はこれらの誘導体、例えばカルボキシメチル誘導体、又は水膨潤性有機ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール又はこれらの誘導体などを挙げることができる。
【００３９】
本発明で使用可能な親水性ポリマーとしては更に、カルボキシル基含有合成ポリマーおよびカルボキシル基含有多糖類が挙げられる。カルボキシル基含有合成ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびこれらの共重合体、例えば特開昭５９−５３８３６号第３頁右上第２行目〜第６頁左下第９行目、特開昭５９−７１０４８号第３頁左下第１行目〜第５頁左上第３行目に記載されているようなメタクリル酸共重合体、アクリル酸共重合体、イタコン酸共重合体、クロトン酸共重合体、マレイン酸共重合体、部分エステル化マレイン酸共重合、水酸基を有するポリマーに酸無水物を付加させたものなどが挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等が挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるＣＭＤ、ＣＭＤ−Ｌ、ＣＭＤ−Ｄ４０（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。
【００４０】
ポリマー層２６を構成するポリマーは、好ましくはカルボキシル基を含有する多糖類であり、より好ましくはカルボキシメチルデキストランである。
【００４１】
これらの親水性ポリマーの重量平均分子量は特に制限されないが、重量平均分子量が１０００〜５００００００であることが好ましく、重量平均分子量が１００００〜２００００００であることがより好ましく、重量平均分子量が１０００００〜１００００００であることがさらに好ましい。この範囲より重量平均分子量が小さい場合には生理活性物質の固定量が小さくなってしまい、この範囲より重量平均分子量が大きい場合には高い溶液粘度のため取り扱いが困難となる。
【００４２】
上記したような親水性ポリマーは、本明細書中以下に説明するような自己組織化膜又は疎水性ポリマーを介して基板に固定してもよいし、あるいはモノマーを含む溶液から直接基板上に形成させることもできる。さらに、上記した親水性ポリマーは架橋することもできる。親水性ポリマーの架橋は当業者に自明である。
【００４３】
センサー表面に固定する親水性ポリマーは、水溶液中の膜厚が１ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが好ましい。膜厚が薄いと生理活性物質固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の親水性ポリマー固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の親水性ポリマー膜厚はＡＦＭ、エリプソメトリーなどで評価することができる。
【００４４】
また、本発明では、センサー表面に固定する親水性ポリマーの固定量は、３ｎｇ／ｍｍ２以上３０ｎｇ／ｍｍ２以下（３×１０−６ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上３０×１０−６ｐｍｏｌ／ｍｍ３）以下であることが好ましく、３ｎｇ／ｍｍ２以上２０ｎｇ／ｍｍ２以下（３×１０−６ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上２０×１０−６ｐｍｏｌ／ｍｍ３）が更に好ましく、３ｎｇ／ｍｍ２以上１５ｎｇ／ｍｍ２以下（３×１０−６ｐｍｏｌ／ｍｍ３以上１５×１０−６ｐｍｏｌ／ｍｍ３）が最も好ましい。又は、親水性ポリマーの膜厚として、３ｎｍ以上３０ｎｍ以下であることが好ましく、３ｎｍ以上２０ｎｍ以下が更に好ましく、３ｎｍ以上１５ｎｍ以下が最も好ましい。
【００４５】
親水性ポリマーの固定量は、種々の膜厚測定方法・重量測定方法などで検出した値を使用することができる。膜厚測定方法の例としては、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）などの走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）などの電子顕微鏡、エリプソメトリー法などの方法が挙げられる。
【００４６】
ポリマー層２６を構成するポリマーは、薄膜状態で基板と反応させることが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。これらの薄膜形成法については、「コーティング技術の進歩」原崎勇次著、総合技術センター（１９８８）、「コーティング技術」技術情報協会（１９９９）、「水性コーティングの技術」シーエムシー（２００１）、「進化する有機薄膜  成膜編」住べテクノリサーチ（２００４）、「高分子表面加工学」岩森暁著、技報堂出版（２００５）、等に説明されている。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
これらの方法を用いて例えば上記親水性ポリマーを塗布する場合には、ポリマー濃度は０．００５質量％〜５質量％であることが好ましく、０．０５質量％〜３質量％であることが更に好ましく、０．１〜２質量％であることが最も好ましい。
【００４７】
また、ポリマー層２６を構成するポリマーとしての疎水性ポリマーは、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０質量％以下、より好ましくは１質量％以下、最も好ましくは０．１質量％以下である。
疎水性ポリマーを形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性ポリマーとしては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
本発明で好ましく用いられる疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００４８】
疎水性ポリマーの基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
疎水性ポリマーのコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。疎水性ポリマーの重量平均分子量は特に限定されないが、好ましい範囲は１万から５０００万である。
【００４９】
流路部材３０は、軟質で弾性変形可能な材料、例えば非結晶ポリオレフィンエラストマーで構成することができる。このように流路部材３０を、弾性変形可能な材料で構成することにより、全反射プリズム２０との密着性を高め、全反射プリズム２０との間に構成される流路３１の密閉性を確保することができる。
図２に示されるように、同一の流路３１には、生理活性物質（図２中、Ｄ）の固定された測定領域Ｅ１と、生理活性物質が固定されていない参照領域Ｅ２が設けられている。
【００５０】
本発明では、上記のような金属膜２５及びポリマー層２６に流路部材３０を取り付ける前に、ポリマー層２６の一部に対して有機溶剤及び活性化剤を用いて活性化処理を行う。これにより、前記生理活性物質が固定可能に活性化された第１の表面（表面１ということがある。）と、前記活性化処理が行われていない第２の表面（表面２ということがある。）とが形成される。その後に、これらの表面に対して流路部材３０を取り付けると、第１の表面及び前記第２の表面を有する流路３１が得られる。
なお、センサユニット１０において１つの流路３１には第１の表面及び第２の表面がそれぞれ１つずつ設けられているが、連通した１の流路３１内に設けられる第１の表面の数及び第２の表面の数はそれぞれ１つに限定されない。またこの場合、流路部材３０も複数であってもよい。
【００５１】
本発明において活性化剤としては、活性化効率の観点から、カルボジイミド誘導体、含窒素化合物、フェノール誘導体及びモルホリン誘導を単独で又は２種以上を併用して用いることが好ましい。
【００５２】
カルボジイミド誘導体としては、水溶性カルボジイミドであることが好ましく、下記の化合物（Ｉ−１）〜（Ｉ−３）がより好ましく、特に、1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride)が特に好ましい。
活性化剤としてのカルボジイミド誘導体の混合比は、この用途で用いられる一般的な量をそのまま適用可能であるが、充分にポリマーを固定化するという観点から、ポリマー層２６中の官能基、例えばカルボキシ基に対するカルボジイミド誘導体の混合モル比は、１×１０−４〜１であることが好ましい。
【００５３】
【化５】
2009075016.tif 000007
【００５４】
含窒素化合物としては、具体的には、下記一般式（IIａ）又は（IIｂ）［式中、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して置換基を有してもよいカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表し、Ｒ１及びＲ２は結合により５〜６員環を形成してもよく、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（ｎ−１）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す］に示される含窒素化合物を挙げることができる。
【００５５】
【化６】
2009075016.tif 000008
【００５６】
ここで、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して置換基を有してもよいカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表すが、好ましくはＲ１及びＲ２は結合により５〜６員環を形成する。特に好ましくは、ヒドロキシコハク酸、ヒドロキシフタル酸、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３、４−ジヒドロキシ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１、２、３−ベンゾトリアジン、及びその誘導体が提供される。
【００５７】
また、好ましくは下記化合物IIｃ〜IIｅ示される含窒素化合物を用いることもできる。
【００５８】
【化７】
2009075016.tif 000009
【００５９】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（III）［式中、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表す］で表される化合物を用いることもできる。
【００６０】
【化８】
2009075016.tif 000010
【００６１】
また、上記一般式（III）で示される含窒素化合物としては、具体的には、下記の化合物（III―１）〜（III―３）などを用いることができる。
【００６２】
【化９】
2009075016.tif 000011
【００６３】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記の化合物（III―４）を用いることもできる。
【００６４】
【化１０】
2009075016.tif 000012
【００６５】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（IV）［式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表し、Ｍは（ｎ−１）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す］を用いることもできる。
【００６６】
【化１１】
2009075016.tif 000013
【００６７】
ここで、Ａで表される炭素原子またはリン原子の置換基としては、置換基を有するアミノ基が好ましく、ジメチルアミノ基やピロリジノ基の様なジアルキルアミノ基が好ましい。Ｍで表される（ｎ−１）価の元素は、リン原子、ホウ素原子、ヒ素原子などが挙げられるが、好ましくはリン原子があげられる。Ｘで表されるハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、好ましくはフッ素原子が挙げられる。
【００６８】
また一般式（IV）で表される含窒素化合物の具体例としては、下記の化合物（IV−１）〜（IV−６）などが挙げられる。
【００６９】
【化１２】
2009075016.tif 000014
【００７０】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（Ｖ）［式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（ｎ−１）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す］を用いることもできる。
【００７１】
【化１３】
2009075016.tif 000015
【００７２】
具体的には、下記の化合物（V-1）などを用いることができる。
【００７３】
【化１４】
2009075016.tif 000016
【００７４】
活性化剤としての上記含窒素化合物の混合比は、この用途で用いられる一般的な量をそのまま適用可能であるが、充分にポリマーを固定化するという観点から、ポリマー層２６中の官能基、例えばカルボキシ基に対する含窒素化合物の混合モル比は、１×１０−７〜１であることが好ましい。
【００７５】
また、フェノール誘導体としては、充分にポリマーを固定化するという観点から電子吸引性基を有するフェノール誘導体であることが好ましく、更に電子吸引性基のσ値が０．３以上であることが充分にポリマーを固定化するという観点から好ましい。具体的には、下記化合物（VI−１）〜（VI−４）などを用いることができる。なお、（VI−４）中Ｘ−はアニオンを表す。）
活性化剤としてのフェノール誘導体の混合比は、この用途で用いられる一般的な量をそのまま適用可能であるが、充分にポリマーを固定化するという観点から、ポリマー層２６中の官能基、例えばカルボキシ基に対するフェノール誘導体の混合モル比は、１×１０−４〜１であることが好ましい。
【００７６】
【化１５】
2009075016.tif 000017
【００７７】
モルホリン誘導体としては、好ましくは下記化合物（VII）を挙げることができる。活性化剤としてのモルホリン誘導体の混合比は、この用途で用いられる一般的な量をそのまま適用可能であるが、充分にポリマーを固定化するという観点から、ポリマー層２６中の官能基、例えばカルボキシ基に対するモルホリン誘導体の混合モル比は、１×１０−４〜１であることが好ましい。
モルホリン化合物は、単独で用いることもできるが、カルボジイミド誘導体、含窒素化合物、フェノール誘導体と併用してもよい。
【００７８】
【化１６】
2009075016.tif 000018
【００７９】
上記のカルボジイミド誘導体、含窒素化合物、フェノール誘導体及びモルホリン化合物は、単独で用いても併用してもよいが、充分にポリマーを固定化するという観点からこれらのうち２種以上を併用して用いることが好ましく、カルボジイミド誘導体と含窒素化合物との併用が更に好ましい。
【００８０】
さらに、カルボキシル基を含有するポリマーにおけるカルボン酸を活性化する手法としては、特開２００６−５８０７１号公報  段落番号「００１１」〜「００２２」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いて活性化することによりカルボン酸アミド基を形成する方法）、並びに特開２００６−９０７８１号公報  段落番号「００１１」〜「００１９」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとした後に、アミンと反応させることによりカルボン酸アミド基を形成する方法）を好ましく用いることもできる。
【００８１】
なお、上記した特開２００６−５８０７１号公報における特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体とは、下記一般式（１）で表されるウロニウム塩、下記一般式（２）で表されるホスホニウム塩、又は下記一般式（３）で表されるトリアジン誘導体を示す。
【００８２】
【化１７】
2009075016.tif 000019
【００８３】
一般式（１）〜（３）において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は結合により炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ３は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ−はアニオンを示す。一般式（２）において、Ｒ４とＲ５はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は結合により炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ６は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ−はアニオンを示す。一般式（３）において、Ｒ７はオニウム基を示し、Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に電子供与基を示す。
【００８４】
活性化剤と共に活性化処理に用いられる有機溶剤は、上述した活性化剤によるポリマーの官能基を活性化する機能を大きく損なわないものであればよく、活性剤とカルボキシル基の反応性の観点から、適度に水と混和可能な有機溶剤であることが好ましい。ここで「水と混和可能な有機溶剤」とは、２５℃において水への溶解度が５容量％以上あるものをいう。このような有機溶剤としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、酢酸メチル、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、メチルエチルケトン、エチレングリコール、グリセリン、メチルセロソルブ、セロソルブ、プロピルセロソルブ、ブチルセロソルブ、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル等を挙げることができ、中でも水との混和性の高さから、メタノール、エタノール、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリルが更に好ましい。これらの有機溶剤は、活性化処理に用いる際には、水あるいは別の溶剤と混合させて使用してもよい。水又は他の溶媒と混合する場合には、上記有機溶媒は、少なくとも１０容量％以上であればよく、好ましくは３０容量％以上、最も好ましくは５０容量％以上とする。
【００８５】
有機溶剤及び活性化剤を用いた活性化処理は、ポリマー層２６中の官能基が生理活性物質を固定可能になれば、活性化剤と有機溶剤とを同時に又は連続的に使用してもよいが、活性化効率の観点から、活性化剤を用いた第一の処理とこれに続く有機溶剤を用いた第二の処理とで構成されることが好ましい。ここで活性化剤は、生理活性物質が固定可能となるようにポリマー層２６中の官能基を活性化し、一方、有機溶剤は、ポリマー層２６における活性化された官能基の固定化能を保持すると推測される。
有機溶剤による処理は、活性化剤と共に又は活性化剤による処理後にポリマー層２６の第１の表面へ滴下などによって供給することによって行えばよく、好ましくは、滴下と除去を複数回繰り返すことが、活性化された官能基の固定可能を確実に保持するために好ましい。第１の表面への供給量は、第１の表面の領域サイズによって適宜選択可能である。
有機溶剤の供給量は、使用される溶剤の種類及び選択された活性化剤の種類等によって異なるが、一般に第１の表面の領域サイズに対し、厚さ０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下、反応性と蒸発の観点から好ましくは０．３ｍｍ以上３ｍｍ以下となる量とすることができる。
【００８６】
また活性化処理は、ポリマー層２６の一部に対して行われるものである。これにより、ポリマー層２６上には、活性化処理が行われた第１の表面が形成されると同時に、活性化処理が行われなかった表面として、第２の表面も形成される。
ポリマー層２６の一部に第１の表面と第２の表面とを形成するためには、ポリマー層２６の表面の一部に活性化剤及び有機溶剤による活性化処理を施せばよいが、第１の表面と第２の表面との間に、これらの表面よりも疎水的な第３の表面を設けてもよい。これにより、第１の表面及び第２の表面と第３の表面との表面特性の違いに基づく撥水効果により、活性化剤及び有機溶剤を用いた活性化処理を効率よく行うことができる。このとき、疎水的な第３の表面は、例えば疎水性ポリマーをポリマー層２６上に形成すればよい。このような疎水性ポリマーとしては、前述したものを挙げることができる。
疎水性ポリマーの形成には、疎水性ポリマーをポリマー層２６に直接化学反応で固定する方法、又は、疎水性ポリマーを有機溶剤に溶解させてポリマー層２６の上にコートする方法が挙げられる。
なお、このような第３の表面は、第１の表面及び第２の表面の間に設けられていればよく、第１の表面の周囲又は第２の表面の周囲に設けてあってもよい。
【００８７】
また、基板上の表面を不連続にしたものであってもよく、例えば予め不連続な金属膜２５の上にポリマー層２６を形成し、活性化処理を行ってもよい。このような不連続な金属層２５又はポリマー層２６は、均一に形成した後に溝等を形成し又はマスク等を取り付けて、段差を設けたものとしてもよい。あるいは、全反射プリズム２０上に予め設けた後に金属層２５又はポリマー層２６を形成することによって、得たものとしてもよい。これにより、活性化処理を行う際に、第１の表面のみに対する活性化処理を容易に行うことができる。
さらに、このように第１の表面と第２の表面とを不連続とした場合には、第１の表面と第２の表面との独立性が高くなるため、必要があれば、それぞれの表面に対して個々に処理を行うこともできる。このような処理は、同一のものであってもよく異なるものであってもよく、如何なる反応・処理を行うかについては、目的に応じて適宜選択することができる。
【００８８】
本発明においては、このような活性化処理の後に基板を乾燥させることが好ましい。これにより、活性化処理によって活性化されたポリマー層２６の官能基が、乾燥した有機溶剤によって保護されて、官能基の固定化能を効果的に維持することができる。
乾燥には、活性化剤又は有機溶剤をポリマー層２６上に滴下後に静置することによる自然乾燥や、加熱や送風などによって容器が乾燥する速度を上げ、意図的に乾燥させることも含む。特に、活性化剤による第一の工程後に有機溶剤を滴下して乾燥を行うことによって、活性化剤の劣化を効果的に防止することができるため、好ましい。
【００８９】
このように得られた第１の表面と第２の表面に対向して流路部材３０を取り付けると、第１の表面及び第２の表面を有する流路３１が得られる。この流路３１に、生理活性物質を含有する溶液（生理活性物質含有溶液）を供給すると、活性化処理が行われたポリマー層２６に生理活性物質が接触して生理活性物質が固定されて測定領域Ｅ１が得られる。このとき第２の表面に対しても生理活性物質含有溶液が同時に供給されるが、第２の表面は活性化処理が行われていないため、生理活性物質は固定されず、この結果、生理活性物質が固定されていない参照領域Ｅ２が得られる。
【００９０】
生理活性物質含有溶液を用いた生理活性物質の固定化は、生理活性物質と第１の表面とが接触すればよく、生理活性物質含有溶液を流路３１に供給するものであっても、供給後に生理活性物質含有溶液の送液を行って連続的に固定化処理を行ってもよい。
【００９１】
固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００９２】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原２６、８６、５５、１１１、１５７などに対する抗体等を使用することができる。
【００９３】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００９４】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００９５】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００９６】
上記生理活性物質は、適当な溶解液に溶解して生理活性物質含有溶液として流路３１へ供給される。このときの生理活性物質含有溶液の濃度は、対象となる生理活性物質の種類及び分子量等によって適宜変更することができるが、一般に、０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００９７】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００９８】
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明におけるバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００９９】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【０１００】
表面プラズモン共鳴とは、金属膜２５に照射光が入射されることによって発生する二種類の波、すなわち、金属膜２５の光出射側表面に発生した微弱なエネルギー波（所謂、エバネッセント波）と、全反射プリズム２０と金属膜２５との界面において発生した粗密波（所謂、エバネッセント波）と、の両者の波数が等しくて波数整合が成立しているときに両者は共鳴状態となり、光のエネルギーの少なくとも一部が表面プラズモン共鳴に移行して金属膜２５と全反射プリズム２０との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する現象である。すなわち、金属膜２５からの反射光強度が全反射減衰する現象である。なお、上記エバネッセント波は、照射光を金属膜２５に対して全反射角以上の特定入射角で入射させたときに、金属膜２５の照射光の入射側とは反対の表面に生じる。
【０１０１】
光の屈折率の二乗によって示される誘電率は、このエバネッセント波に影響するので、金属膜２５表面で引き起こされる生理活性物質と検体物質との間の相互作用は、誘電率に差異を生じさせ、これが表面プラズモンに影響し、共鳴角度の変化、すなわち屈折率の変化、として捉えることができる。
金属膜２５表面における生理活性物質と、供給された検体溶液に含まれる検体物質と、との間で相互作用が生じると、金属膜２５表面の誘電率が変わり、屈折率（共鳴の角度）が変化する。このため、金属膜２５上に固定された生理活性物質上に、選択的に異なる検体（検体溶液）を供給することで、屈折率の変化を経時的に測定し、分子間相互作用を解析することができる。
【０１０２】
ここで、測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２のそれぞれの誘電率から屈折率情報が得られる際に、測定領域Ｅ１の屈折率情報を、参照領域Ｅ２の屈折率情報によって補正することにより、各測定領域Ｅ１における検定物質の屈折率情報を得ることができる。この結果、測定領域Ｅ１に固定された生理活性物質と検体物質との相互作用情報を得ることができる。
【０１０３】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、公知の各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【０１０４】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１０５】
［実施例１］
蛋白質を固定できる表面１、参照表面２を作成し、蛋白質の固定量、および化合物の結合検出性を評価した。
【０１０６】
（１）基板の作成
6-Amino-1-octanethiol, hydrochloride（同仁化学社製）の１ｍＭ水溶液を作成した。この溶液をＡ液と呼ぶ。
次に、ゼオネックス（日本ゼオン社製）を射出成型して得られたプラスチックプリズムの上面に以下の方法で金薄膜を製膜した。
スパッタ装置の基板ホルダにプリズムを取り付け、真空（ベースプレッシャー１×１０−３  −３Ｐａ以下）に引いてからＡｒガスを導入し（１Ｐａ）、基板ホルダを回転（２０ｒｐｍ）させながら、基板ホルダにＲＦ（高周波数の電気信号）パワー（０．５ｋＷ）を約９分間印加してプリズム表面をプラズマ処理する。次に、Ａｒガスを止めて真空に引き、Ａｒガスを再び導入し（０．５Ｐａ）、基板ホルダを回転（１０〜４０ｒｐｍ）させながら、８ｉｎｃｈのＣｒターゲットにＤＣ（ＤＣ電圧）パワー（０．２ｋＷ）を約３０秒間印加して２ｎｍのＣｒ薄膜を成膜する。次に、Ａｒガスを止めて再び真空に引き、Ａｒガスを再び導入し（０．５Ｐａ）、基板ホルダを回転（２０ｒｐｍ）させながら、８ｉｎｃｈのＡｕターゲットにＤＣパワー（１ｋＷ）を約５０秒間印加して５０ｎｍ程度のＡｕ薄膜を成膜した。
基板ホルダにはマスクを取り付けることによって、表面１（測定領域Ｅ１に対応）及び表面２（参照領域Ｅ２に対応）にそれぞれ相当するＡｕ膜の間に、３ｍｍのギャップを設けた。
上記で得られたＡｕ薄膜を成膜したプラスチックプリズムを、Ａ液に４０℃１時間浸漬し、超純水で５回洗浄した。
【０１０７】
（２）ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン）の活性エステル化
１重量％のＣＭＤ（名糖産業製：重量平均分子量１００万）溶液２０ｇを溶解した後、１０ｍＭのＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride）を２０ｍｌ加え、室温で１時間攪拌した。
【０１０８】
（３）ＣＭＤの基板への結合反応
上記（１）で作製された基板（Ａｕ薄膜を成膜したプラスチックプリズム）の上に、上記（２）で作成されたＣＭＤとＥＤＣの混合溶液を１ｍｌ滴下し、１０００ｒｐｍで４５秒スピンコートし、室温で１５分間静置させて反応させることで、アミノ基を有する基板上にカルボキシメチルデキストラン薄膜を固定させた。１ＮのＮａＯＨ水溶液に３０分浸漬し、超純水で５回洗浄することで、ＣＭＤ膜を成膜した。
【０１０９】
（４）センサースティックの作製
上記（３）で作製されたＣＭＤ膜上の表面１に相当する表面に、表１に記載の活性化溶液を１０μｌずつ滴下し、７分間静置させた。静置後、滴下した液を吸い取り、同表面上を表１に記載の溶媒（１０μｌ）による滴下／吸収を３回繰り返した。滴下したときの厚みは約１ｍｍ程度であった。溶媒を表面から充分取り除いて１時間乾燥させた後、同一流路内に表面１、表面２が存在するように流路を取り付け、センサースティック１〜４を得た。流路の容積は１０μｌ、底面積は１ｍｍ２であった。
【０１１０】
［実施例２］
実施例１の上記（１）の工程のマスク形状を変更し、表面１、２にギャップの無いＡｕ薄膜を成膜し、表１に記載の液を使用して実施例１（２）〜（４）の工程を同様に行い、センサースティック５を得た。
【０１１１】
［実施例３］
実施例３は、実施例１、２で得られたセンサー試料に対する蛋白質の固定に関するものである。蛋白質としては、ＣＡ（Carbonic Anhydrase：SIGMA社製）を用いた。
実施例１、２で作成した試料の表面に水を被覆した状態で１時間放置したのち、表面プラズモン共鳴装置にセットした。ＰＢＳバッファーを注入し、ベースラインを確認した後（この時の共鳴角を基準点とする）、０．１ｍｇ／ｍｌのＣＡ溶液（酢酸バッファーｐＨ５．０）を注入し１５分静置、次にＰＢＳバッファーを注入し１分静置、次に１Ｍエタノールアミン溶液（ビアコア社）を注入し７分静置、次にＰＢＳバッファーを注入し１分静置、次に１０ｍＭのＮａＯＨを注入し１分静置を３回行い、最後にＰＢＳバッファーを注入し１分静置し、この時の共鳴角と原点の共鳴角の差をＣＡ固定量とした。ここでは、ＤＭＳＯ１容量％あたりの共鳴角の差をタンパクの固定量１５００ＲＶとして表す。
【０１１２】
次に、１０μＭのフロセミド（Furosemide）溶液（ＰＢＳバッファー／ＤＭＳＯ１０容量％混合溶媒）を準備し、ベースとなるＰＢＳバッファー／ＤＭＳＯ１０容量％混合溶媒、およびフロセミド溶液を流路に注入し、フロセミドのＣＡへの結合を測定した。ベースラインはフロセミド溶液を注入する直前の値を使用した。フロセミドの測定は合計３回行い、結合量の平均値を算出した。なお、表面１と表面２の屈折率変化による影響を補正するため、（ＰＢＳバッファー／ＤＭＳＯ９．５容量％混合溶媒）、（ＰＢＳバッファー／ＤＭＳＯ１０．５容量％混合溶媒）を３回ずつ流して較正を行った。作製後、実験室内で１４日経過したセンサー試料に対しても同様に処理を行った。
【０１１３】
各試料おける表面１のＣＡ固定量とフロセミド結合量を表１に示す。化合物の検出は、５ＲＶ以上あると検出できると判断できるが、本発明は、簡便な方法で時間が経過しても多量の蛋白質を固定化し、精度よく低分子量の化合物の測定ができることがわかった。
【０１１４】
【表１】
2009075016.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】センサユニットの概略構成を示す分解斜視図である。
【図２】センサユニットの概略断面図である。
【符号の説明】
【０１１６】
１０  センサユニット
２０  全反射プリズム
２１  プリズム本体
２５  金属膜
２６  ポリマー層
３０  流路部材
３１  流路
【図１】
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【図２】
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