(57)【要約】【課題】種々の澱粉原料に対し、効率的な澱粉の加水分解の実現に寄与し、また、酵素の回収、再利用、連続利用が可能となるシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を提供する。【解決手段】澱粉の加水分解を行う酵素とシリカ系メソ多孔体の複合体であって、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が澱粉の加水分解を触媒する活性を有していることからなるシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体、シリカ系メソ多孔体と澱粉の加水分解酵素を溶解した溶液を混合することにより、該澱粉の加水分解酵素をシリカ系メソ多孔体上、及び細孔内に安定に吸着、保持、固定させることからなるシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法、及び上記シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を用いて澱粉の加水分解反応を行うことからなる澱粉の加水分解物の製造方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
澱粉の加水分解を行う酵素と該澱粉の加水分解酵素を固定化させたシリカ系メソ多孔体との複合体であって、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が澱粉の加水分解を触媒する活性を有していることを特徴とするシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
【請求項２】
シリカ系メソ多孔体が、ケイ素と酸素を必須成分として含む化合物の多孔体である、請求項１に記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
【請求項３】
シリカ系メソ多孔体が、ＭＣＭ、ＦＳＭ、又はＳＢＡタイプである、請求項１又は２に記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
【請求項４】
シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有する、請求項１から３のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
【請求項５】
シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有する、請求項１から４のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
【請求項６】
シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２／ｇの比表面積を有する、請求項１から５のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
【請求項７】
澱粉の加水分解を行う酵素が、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ、若しくはアミロ−１，６−グルコシダーゼ、又はこれらの１種以上の酵素とα−アミラーゼの併用である、請求項１から６のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
【請求項８】
シリカ系メソ多孔体へ澱粉の加水分解酵素が高濃度に高集積化させた状態で固定化されている、請求項１から７のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
【請求項９】
シリカ系メソ多孔体と澱粉の加水分解酵素を溶解した溶液を混合することにより、該澱粉の加水分解酵素をシリカ系メソ多孔体上、及び細孔内に安定に吸着、保持、固定させることを特徴とするシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
【請求項１０】
シリカ系メソ多孔体に酵素を固定化させる操作を繰り返すことにより、酵素の固定化量を制御又は増大させ、高集積化する、請求項９に記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
【請求項１１】
シリカ系メソ多孔体が、ＭＣＭ、ＦＳＭ、又はＳＢＡタイプである、請求項９又は１０に記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
【請求項１２】
シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有する、請求項９から１１のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
【請求項１３】
シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有する、請求項９から１２のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
【請求項１４】
シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２／ｇの比表面積を有する、請求項９から１３のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
【請求項１５】
澱粉の加水分解を行う酵素が、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ、若しくはアミロ−１，６−グルコシダーゼ、又はこれらの１種以上の酵素及びα−アミラーゼである、請求項９から１４のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
【請求項１６】
シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることにより、固定化される酵素の量及び活性を制御する、請求項９から１５のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
【請求項１７】
請求項１から８のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を用いて澱粉の加水分解反応を行うことを特徴とする澱粉加水分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリカ系メソ多孔体と澱粉の加水分解酵酵素の複合体に関するものであり、更に詳しくは、表面を未処理あるいは適切な溶液で官能基を付与する処理等を施したシリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、該酵素の固定化法として利用して合成されたシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体、その製造方法、及びその用途に関するものである。
【０００２】
本発明は、表面を未処理あるいは適切な溶液で官能基を付与する処理等を施したシリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、該酵素の固定化法として利用し、シリカ系メソ多孔体の細孔内若しくは表面に酵素を安定に固定して、その酵素の機能を発揮させることを可能としたシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体、その製造方法、及びその用途に関する新技術を提供するものである。
【０００３】
本発明は、例えば、酵素を利用した生化学品、食品製造等の技術分野において、酵素の安定性や耐久性、生産速度の向上等へ寄与するばかりか、連続的生産手法の確立を可能とすると共に、生産物からの酵素の分離工程を排除することが可能であり、その工程を、従来技術に比べ、大幅に効率化、簡略化することを可能にする固定化酵素複合体を提供するものとして有用である。
【背景技術】
【０００４】
一般に、酵素を用いた生化学品、食品製造等の技術分野においては、従来、酵素を水に溶解させて用いる操作をすることが多い。この操作法では、タンパク質である酵素の溶解度に限界があり、ある一定濃度以上の酵素が存在すると凝集を起こし、活性を失うことがしばしばである。一方、酵素反応を用いた反応系では、酵素の存在量が多いほど反応速度、ひいては生成物の生産速度を高められることが予想されている。
【０００５】
その一方で、シリカ系メソ多孔体は、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有することを特徴としており、その細孔内部への酵素の導入、固定が可能である。したがって、シリカ系メソ多孔体は、数ｎｍから十数ｎｍの大きさを有する酵素、すなわちタンパク質の吸着、固定に対して有効な表面を多く有している有望な担体材料と見なすことができる。
【０００６】
このシリカ系メソ多孔体を酵素の固定化のための担体として用いた場合、高密度に存在する酵素の凝集を防ぐことが可能となり、活性を有する酵素の高集積化が可能となると考えられる。このことは、酵素を用いた反応系において、溶液においては凝集を起こしてしまう量を越えて、酵素を存在させることが可能になることが期待される。
【０００７】
担体に酵素を固定化して用いることは、従前より行われてきたことであるが、その目的は、酵素の分離、及び再利用に関するものがほとんどである。例えば、従来の酵素を用いた生化学品、食品製造等の技術分野においては、酵素を水に溶解させて用いる操作をすることが多く、この操作法では、生成物と酵素の分離操作が必要不可欠であり、また、分離された酵素は、廃棄されることが一般的である。この酵素の分離工程を省く目的で、酵素を担体に固定化して用いるための酵素の固定化技術が盛んに研究、開発されている。
【０００８】
酵素の固定化法としては、例えば、樹脂ビーズ等に直接固定化する方法や、ポリマーの被覆によるマイクロカプセル化、酵素タンパク質表面を修飾して安定化させる表面修飾法等が提案されている。しかしながら、これらの方法は、酵素が固定化担体の表面上に固定されているだけで、酵素の高集積化や固定化による酵素機能の向上を目指したものではないのが実情である。
【０００９】
酵素の再利用を目的とした酵素の固定化も検討されている。この場合も、分離工程の排除を目的とした方法と大きな差はなく、各種担体表面への単純な固定を行っているものが多い。高分子発泡体に固定化する方法も用いられており、この場合は、発泡体を圧縮することにより、生成物を含む溶液を分離すること等の操作が行われている。
【００１０】
酵素の固定化法の開発により、酵素を用いた生産プロセスにおいて、反応後の酵素の分離回収やその再利用が可能となり、生産プロセスの効率化に貢献していることは事実である。しかし、酵素の固定化により、酵素の高集積化や酵素機能そのものの向上を目的とした検討は、十分には行われていない。
【００１１】
このような状況下で、本発明者らは、酵素の固定化により酵素の高集積化や酵素機能そのものの向上を目的として、酵素の担体として有望なシリカ系メソ多孔体への酵素、すなわちタンパク質の吸着、固定化現象を研究し（特許文献１参照）、この過程で、酵素、すなわちタンパク質のシリカ系メソ多孔体の細孔内への固定や、タンパク質の熱安定性や有機溶媒耐性の向上を見出し、シリカ系メソ多孔体を用いたタンパク質の機能賦活方法（特許文献１、及び非特許文献１）を発明するに至った。
【００１２】
シリカ系メソ多孔体としては、一般に、ＭＣＭ、ＦＳＭ、ＳＢＡタイプ等の材料系が知られている。これらのシリカ系メソ多孔体は、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有することを特徴としている。酵素、すなわちタンパク質は、数ｎｍから十数ｎｍの大きさを有しており、シリカ系メソ多孔体の有する細孔径と同程度の大きさの分布を有している。このことから、シリカ系メソ多孔体を酵素の固定化担体として用いた場合、酵素を表面のみならず、細孔内にも固定化することができると考えられる。
【００１３】
シリカ系メソ多孔体は、その酵素の固定化に対する有効な表面積が、従来の技術によるものより極めて大きく、大量の酵素を固定化することができる。シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体においては、その細孔内に酵素を固定化することも可能であり、また、集積化することも可能である。
【００１４】
シリカ系メソ多孔体に酵素を固定化しようとする試みに関する、いくつかの報告がある（非特許文献２、３，４）が、工業的な利用を想定した場合、種々の問題が未解決であると思われる。また、これらの報告では、後記する事例を除いて、澱粉の加水分解を起こす酵素は扱われていない。
【００１５】
澱粉の加水分解を起こす酵素については、シリカ系メソ多孔体と酵素との相互作用、すなわち吸着作用が弱く、容易に酵素の脱離を起こすことが示されている（非特許文献５）。この問題を解決するために、同文献では、シリカ系メソ多孔体の表面に処理を加え、酵素との結合を形成する官能基をシリカ系メソ多孔体の表面に形成される方法が報告されている。しかしながら、ここで用いられている表面処理の方法は、極めて煩雑で効率の悪いものであり、また、価格的にも利点が少ないものである。生化学品、食品製造等の技術分野においては、簡便な方法で酵素の固定化が行われることが望ましいのは、言うまでもない。そのため、当該技術分野においては、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体について、酵素の固定化による機能賦活方法の開発が強く望まれていた。
【００１６】
澱粉は、通常、アミロースとアミロペクチンの混合物として存在している。アミロースは、グルコースがα−１，４−グルコシド結合している長鎖構造を有するものであり、一方、アミロペクチンは、グルコースがα−１，４−グルコシド結合のみではなく、ところどころにα−１，６−グルコシド結合を含み、枝分かれを有する構造を持つ。このように、澱粉は、グルコースをその構成単位として構成されているが、それを加水分解するためには、直鎖部分や枝分かれ部分等、種々の部位に作用する多種多様な酵素を利用することが有効である。
【００１７】
すなわち、由来や性状の異なる澱粉原料に対して、効率的にその加水分解を進行させるには、多種多様な酵素の働きを利用することが重要である。このことは、工業的な澱粉の加水分解において、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を利用及び適用する上でも重要なことである。
【００１８】
澱粉の加水分解を行う酵素をシリカ系メソ多孔体に固定化した例としては、α−アミラーゼをＭＣＭもしくはＳＢＡタイプのシリカ系メソ多孔体に固定化した事例がある（非特許文献５）。しかしながら、α−アミラーゼのみで多様な澱粉原料を効率的に加水分解することは困難であることは言うまでもなく、汎用性の高い、単一もしくは複数の澱粉の加水分解能力を有する酵素が固定化されている、多種多様なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体が強く望まれている。
【００１９】
【特許文献１】特開２００７−５１０７６号公報
【非特許文献１】ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，Ｖｏｌ．８（２００７）６６８−６７４
【非特許文献２】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ，２（１９９６）１１５−１２６
【非特許文献３】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ，１０（２０００）４５３−４６９
【非特許文献４】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ，２２（２００３）１１９−１３３
【非特許文献５】Ｍｉｃｒｏｐｏｒ．Ｍｅｓｏｐｏｒ．Ｍａｔｅｒ．，７７（２００５）６７−７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
このような状況下において、本発明者らは、上記問題を解決するために鋭意研究を行い、シリカ系メソ多孔体に澱粉の加水分解を行う酵素を吸着させ、その酵素が固定化されていること、すなわちシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の形成を確認し、更に、このシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を用いて、酵素反応の特性評価を行い、固定化された酵素が所定の活性を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
本発明は、シリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、該酵素の固定化法として利用し、澱粉の加水分解を行う酵素とシリカ系メソ多孔体の複合体であって、固定化された酵素が澱粉の加水分解を触媒する活性を有していることを特徴とする、多種多様なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を提供すること、を目的とするものである。また、澱粉の加水分解を行う際に、酵素の分離・回収を容易にし、繰り返し使用も可能とすると共に、基質を連続的に供給することで、澱粉の加水分解を連続的に進行させることができ、一般性及び普遍性が高く、かつ簡便な操作による酵素反応を利用した加水分解物の生産を可能にするシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）澱粉の加水分解を行う酵素と該澱粉の加水分解酵素を固定化させたシリカ系メソ多孔体との複合体であって、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が澱粉の加水分解を触媒する活性を有していることを特徴とするシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（２）シリカ系メソ多孔体が、ケイ素と酸素を必須成分として含む化合物の多孔体である、前記（１）に記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（３）シリカ系メソ多孔体が、ＭＣＭ、ＦＳＭ、又はＳＢＡタイプである、前記（１）又は（２）に記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（４）シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有する、前記（１）から（３）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（５）シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有する、前記（１）から（４）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（６）シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２／ｇの比表面積を有する、前記（１）から（５）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（７）澱粉の加水分解を行う酵素が、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ、若しくはアミロ−１，６−グルコシダーゼ、又はこれらの１種以上の酵素とα−アミラーゼの併用である、前記（１）から（６）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（８）シリカ系メソ多孔体へ澱粉の加水分解酵素が高濃度に高集積化させた状態で固定化されている、前記（１）から（７）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（９）シリカ系メソ多孔体と澱粉の加水分解酵素を溶解した溶液を混合することにより、該澱粉の加水分解酵素をシリカ系メソ多孔体上、及び細孔内に安定に吸着、保持、固定させることを特徴とするシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１０）シリカ系メソ多孔体に酵素を固定化させる操作を繰り返すことにより、酵素の固定化量を制御又は増大させ、高集積化する、前記（９）に記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１１）シリカ系メソ多孔体が、ＭＣＭ、ＦＳＭ、又はＳＢＡタイプである、前記（９）又は（１０）に記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１２）シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有する、前記（９）から（１１）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１３）シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有する、前記（９）から（１２）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１４）シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２／ｇの比表面積を有する、前記（９）から（１３）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１５）澱粉の加水分解を行う酵素が、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ、若しくはアミロ−１，６−グルコシダーゼ、又はこれらの１種以上の酵素及びα−アミラーゼである、前記（９）から（１４）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１６）シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることにより、固定化される酵素の量及び活性を制御する、前記（９）から（１５）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１７）前記（１）から（８）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を用いて澱粉の加水分解反応を行うことを特徴とする澱粉加水分解物の製造方法。
【００２３】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、澱粉の加水分解を行う酵素と該澱粉の加水分解酵素を固定化させたシリカ系メソ多孔体との複合体であって、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が澱粉の加水分解を触媒する活性を有していることを特徴とするものである。また、本発明は、上記シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を製造する方法であって、シリカ系メソ多孔体と澱粉の加水分解酵素を溶解した溶液を混合することにより、該澱粉の加水分解酵素をシリカ系メソ多孔体上、及び細孔内に安定に吸着、保持、固定させることを特徴とするものである。
【００２４】
本発明は、シリカ系メソ多孔体が、ＭＣＭ、ＦＳＭ、又はＳＢＡタイプであること、シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有すること、シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有すること、シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２／ｇの比表面積を有すること、シリカ系メソ多孔体へ澱粉の加水分解酵素が高濃度に高集積化させた状態で固定化されていること、シリカ系メソ多孔体に酵素を固定化させる操作を繰り返すことにより、酵素の固定化量を制御又は増大させ、高集積化すること、を好ましい実施の態様としている。
【００２５】
本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体としては、一般に、ＭＣＭ、ＦＳＭ、ＳＢＡタイプ等の材料系が適用される。これらの材料系は、その作製法の違いにより分類されているが、基本的構造は、類似したものである。ＭＣＭやＦＳＭタイプの合成は、カチオン性界面活性剤を用いて形成されるミセルを鋳型として、メソ多孔体が合成されている。但し、ＦＳＭタイプは、層状化合物であるカネマイトを原料として用いることに特徴がある。
【００２６】
一方、ＳＢＡでは、中性の非イオン性界面活性剤のブロックコポリマーを用いて形成されるミセルを鋳型としている。このような複数のタイプのシリカ系メソ多孔体が、澱粉の加水分解を行う酵素の固定用担体として挙げられる。しかし、シリカ系メソ多孔体の構造を持つものであれば、基本的には該機能及び能力を有している限り全て使用可能であって、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体として、その製造方法や性状が特段に限定されるものではない。
【００２７】
本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の作製に際しては、合成されたシリカ系メソ多孔体に対し、特段の表面処理を施すことなく、洗浄の操作のみを行ったものを用いることができる。澱粉の加水分解酵素をシリカ系メソ多孔体に固定する操作は、澱粉の加水分解酵素を溶解した溶液中に当該シリカ系メソ多孔体を浸漬、混合する操作のみにより行うことが可能であり、極めて簡便で単純な方法である。シリカ系メソ多孔体に対する表面処理等は必ずしも必要ではない。
【００２８】
しかしながら、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体の酵素に対する固定化の機能及び能力は、シリカ系メソ多孔体と酵素の間の吸着で発揮され、この際には、シリカ系メソ多孔体表面と酵素との間の親和性が重要となる上に、また、酵素の吸着は、その分散溶媒、分散溶媒中の酵素安定化剤、更には、分散溶媒のｐＨ等で影響される場合も多いので、対象とする酵素及びそれを含む溶液の成分状況等に応じて、本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体は、それを構成するシリカ系メソ多孔体の表面状態で、多少変わることもあり得る。
【００２９】
本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の作製に際し、シリカ系メソ多孔体の表面処理を施すことは、適宜可能であり、その表面処理操作の有無、処理方法等が特に限定されるものではない。例えば、シリカ系メソ多孔体表面に形成されるべき官能基としては、固定化する酵素との親和性を確保できる官能基、例えば、アルコキシ基、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基、ニトリル基、アミノ基、メルカプトプロピル基、チオール基、シラノール基、ヒドロキシル基等を挙げることができ、基本的には、シリカ系メソ多孔体の表面に形成可能な官能基であれば、いずれでも良く、ここに例示した官能基類に限定されるものではない。
【００３０】
本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成する元素は、一般には、ケイ素と酸素であるが、ケイ素の一部が他の元素に置換したシリカ系メソ多孔体も、酵素の固定化機能を有する。シリカ系メソ多孔体を構成するケイ素と置換可能なものの典型としては、例えば、アルミニウム、ホウ素、燐、ガリウム、ニオブ、チタン、錫、鉄、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、クロム、バナジウム、マンガン、ジルコニウム、タンタル、ハフニウム等を挙げることができる。しかし、これらに留まるものではなく、基本的にシリカ系メソ多孔体の構造を破壊しないものであればいずれでも良い。
【００３１】
また、その置換量に関しても、シリカ系メソ多孔体の構造を破壊しない量であれば、置換量は、いかなる量でもかまわず、該置換シリカ系メソ多孔体は、酵素固定用の担体となり得る。本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体は、いずれも熱安定性、化学安定性に優れており、しかも環境に対する負荷が低い物質であるので、本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体は、例えば、生化学品製造、医薬品製造等にとって極めて有用であり、産業上の利用可能性とその経済効果は計り知れないものがある。
【００３２】
シリカ系メソ多孔体は、一般には、数ｎｍの細孔径を有するが、その細孔径は、シリカ系メソ多孔体の合成条件により制御可能である。例えば、固定化すべき酵素が５ｎｍの大きさを有していた場合、その酵素の大きさに相応した細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を酵素固定用担体として用いる選択肢があり、その場合には、酵素の固定量が増加したり、酵素の安定性が向上することがあり得る。かかる状況を踏まえ、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成する際には、シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御することが不可欠である。本発明では、シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御することで、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成する上で、好適なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を開発することが可能である。
【００３３】
本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の酵素には、澱粉の加水分解を行う酵素として、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ、若しくはアミロ−１，６−グルコシダーゼ、又はこれらの１種以上の酵素とα−アミラーゼを用いることができるが、基本的には、澱粉の加水分解を行える酵素であれば、どのような種に由来するものであっても良く、ここに例示した酵素類に限定されるものではない。
【００３４】
いずれの酵素を用いた場合であっても、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成する上で、シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御すること、及びシリカ系メソ多孔体表面上の官能基を制御することが可能であり、それにより、選択された酵素に対して、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成する上での好適な処理を施すことが可能である。
【００３５】
本発明では、澱粉の加水分解に際し、原料澱粉の性状や特性に応じて好適な酵素を選択して、その酵素を用いたシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を、固定化酵素として選択することができる。本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を用いることで、多種多様な澱粉原料を対象として、酵素反応により糖類を生成させることができる。
【００３６】
本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体には、上述のように、澱粉の加水分解を行う酵素として、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ、若しくはアミロ−１，６−グルコシダーゼ、又はこれらの１種以上の酵素とα−アミラーゼを用いることができるため、本発明では、これらの酵素を固定化した、酵素反応に好適なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を提供することができる。
【００３７】
本発明では、シリカ系メソ多孔体へ澱粉の加水分解酵素を高濃度に高集積化させた状態で固定化させること、シリカ系メソ多孔体に酵素を固定化させる操作を繰り返すことにより、酵素の固定化量を制御又は増大させ、高集積化すること、シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることにより、固定化される酵素の量及び活性を制御すること、が可能であることが分かった。本発明は、シリカ系メソ多孔体に酵素を固定化させることにより、活性を有する酵素の高集積化を行い、反応系中に高濃度に酵素を存在させることが容易であること、酵素を用いた反応系において、酵素溶液では凝集を起こしてしまう量を越えて、酵素を存在させることが可能であること、酵素濃度が高くても、高密度に存在する酵素の凝集を生じさせることなく酵素反応を進行させることが容易であること、酵素の回収が容易であること、酵素の繰り返し使用が可能であること、等の利点を有する。
【発明の効果】
【００３８】
本発明により、以下のような効果が奏される。
（１）本発明のシリカ系メソ多孔体は、酵素の導入可能な細孔径を有する細孔を有していることから、酵素の吸着可能な表面が大きいため、大量の酵素を固定することができ、酵素の高集積化が可能であり、また、繰り返し酵素の固定化を施すことにより、より多量な酵素を固定化することもできるため、酵素の高集積化が可能である。
（２）本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を用いることで、高集積化された酵素を反応系中に存在させることができるため、酵素反応をより効率的に進めることができ、また、固定化により高集積化された酵素を利用することから、酵素の凝集を避けることができるため、酵素を溶液に溶解した状態よりも高濃度に反応系中に存在させることが可能となり、酵素反応をより効率的に進めることに寄与できる。
（３）本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体では、シリカ系メソ多孔体に酵素が固定化されていることにより、酵素の回収が容易であり、酵素の繰り返し使用が可能であり、基質を連続的にシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体と接触して流通させ、連続的な酵素反応の実施が可能である。
（４）本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体は、環境に負荷の少ない材料系で構成されており、原材料は、入手しやすく、作製方法も簡単で安価である。
（５）本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体は、未処理若しくは適切な溶液による処理で官能基を有していることから、固定化される酵素の量や固定化状態を制御することができ、酵素反応に好適なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を選択することができ、また、その作製条件の制御により、シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることが可能であり、それにより固定化される酵素の量や活性を制御することができ、酵素反応に好適なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を選択することができる。
（６）本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体は、その作製条件の制御により、シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることが可能であり、それにより、固定化される酵素の安定性や耐久性を向上させることができ、酵素反応をより効率的に進行させることができる。
（７）上記の構成及び効果を組み合わせて利用することにより、新規の澱粉の加水分解プロセスを構築し、提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例等によって何ら制約を受けるものではない。以下の実施例では、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の合成法について説明する。
【実施例１】
【００４０】
（１）シリカ系メソ多孔体の合成１
シリカ系メソ多孔体のうち、まず、ＦＳＭタイプに属するものの作製方法を示す。カチオン性界面活性剤である塩化ベヘニルトリメチルアンモニウムを主成分とし、エチルアルコールとの混合物である界面活性剤（アーカード）１０ｇを、超純水１２５ｇに混合し、７０℃で３０分間、撹拌混合した。この撹拌混合には、ホモミキサーを用いた。別途、カネマイト６．６７ｇを超純水１３０．８３ｇと混合し、７０℃で撹拌混合した。尚、細孔径を制御する目的で、膨張剤としてトリイソプロピルベンゼンを添加することができる。
【００４１】
この撹拌混合には、マグネチックスターラーを用いた。それぞれの溶液の所定の撹拌時間を経た後、両者を混合し、更に、７０℃で２時間、ホモミキサーを用いて撹拌混合した。この撹拌混合の後、２規定の塩酸を約１時間かけて滴下し、溶液の状態をｐＨ８．５とした。ｐＨが８．５となった後、更に３時間、撹拌混合した。この溶液を吸引濾過した後、分離された固形物を７０℃の温水に再分散し、また、濾過を繰り返した。この操作を３回繰り返した後、固形物を６０℃で２４時間、乾燥した。更に、空気気流中にて５５０℃で６時間焼成することにより、各種細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を得た。
【００４２】
上記手法により合成されたシリカ系メソ多孔体について、粉末Ｘ線回折法、走査電子顕微鏡法、透過電子顕微鏡法及び窒素吸着等温線の測定を適用した。粉末Ｘ線回折法は、Ｂｒｕｋｅｒ製ＡＸＳ  Ｄ８−ＡＤＶＡＮＣＥ  Ｖａｒｉｏ−１を用いて実施した。得られたＸ線回折パターンより、上記手法により作製されたシリカ系メソ多孔体は、２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有していることが分かった。また、回折ピーク位置の解析から、合成時膨張剤を用いなかった場合のシリカ系メソ多孔体に比較して、膨張剤を用いた場合の方が細孔径が大きくなっていることが確認できた。
【００４３】
走査電子顕微鏡（日立製Ｓ−８００を使用）による観察から、合成されたシリカ系メソ多孔体は、不定形顆粒状の形態として観察された。透過電子顕微鏡（日本電子製Ｊ−２０１０Ｆを使用）による観察からは、合成時膨張剤を用いなかった場合のシリカ系メソ多孔体では、４ｎｍ径の細孔が分布していることが確認された。膨張剤としてトリイソプロピルベンゼンを７．５ｇ添加した場合のシリカ系メソ多孔体では、７．５ｎｍの細孔が分布していることが確認され、また、膨張剤としてトリイソプロピルベンゼンを１４ｇ添加したシリカ系メソ多孔体では、９ｎｍの細孔が分布していることが確認された。
【００４４】
窒素吸着等温線の測定は、Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ社製Ａｕｔｏｓｏｒｂにて行った。その結果を図１に示す。図１の左側が吸着等温線を示し、右側が細孔径分布を示している。膨張剤の添加量に依存して、異なる吸着等温線が得られた。合成時膨張剤を用いなかった場合のシリカ系メソ多孔体では、４ｎｍ径の細孔による鋭いピークが確認された。膨張剤としてトリイソピルベンゼンを７．５ｇ及び１４ｇ添加した場合のシリカ系メソ多孔体では、それぞれ７．５ｎｍ，９ｎｍにピークを持つ、細孔の分布が確認された。
【００４５】
以下、合成時膨張剤を用いなかった場合の４ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体をＦＳＭ−４、膨張剤としてトリイソピルベンゼンを７．５ｇ添加して合成した７．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体をＦＳＭ−７．５、同じく膨張剤としてトリイソピルベンゼンを１４ｇ添加して合成した９ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体をＦＳＭ−９、と記載する。
【００４６】
（２）シリカ系メソ多孔体の合成２
次に、シリカ系メソ多孔体のうち、ＳＢＡタイプに属するもの作製方法を示す。中性の非イオン性界面活性剤のブロックコポリマー（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））（分子量：〜５８００、ＥＯ：ＰＯ：ＥＯ＝２０：７０：２０）１２ｇを、超純水４４９ｍｌに混合し、更に、３５％の塩酸２０ｍｌを加えて、３５℃で一晩、撹拌混合した。
【００４７】
その後、シリカ源としてのＴＥＯＳ（Ｔｅｔｒａｅｔｈｌｙ  Ｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃａｔｅ）を２７．４ｍｌ加え、３５℃で２０時間、撹拌混合した。この撹拌混合には、マグネチックスターラーを用いた。この反応液をオートクレーブ容器に装填し、３５、７５，１００，１３０℃の各温度で２４時間静置した。この溶液を吸引濾過した後、６０℃で２４時間、乾燥した。更に、空気気流中にて５５０℃で６時間焼成することにより、各種細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を得た。この合成法によるＳＢＡは、Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡである。オートクレーブ容器の保持温度により細孔径が制御された。
【００４８】
Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡの合成条件は、中性の非イオン性界面活性剤のブロックコポリマー（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））（分子量：〜５８００、ＥＯ：ＰＯ：ＥＯ＝２０：７０：２０）１２ｇを、超純水４３４ｍｌに混合し、更に、３５％の塩酸２０ｍｌを加えた。しばらく撹拌混合した後、ブタノール１４．８ｍｌを加えて、３５℃で一晩、撹拌混合した。
【００４９】
その後、シリカ源としてのＴＥＯＳ（Ｔｅｔｒａｅｔｈｌｙ  Ｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃａｔｅ）を２７．４ｍｌ加え、３５℃で２０時間、撹拌混合した。この撹拌混合には、マグネチックスターラーを用いた。この反応液をオートクレーブ容器に装填し、３５、７５，１００，１３０℃の各温度で２４時間静置した。この溶液を吸引濾過した後、６０℃で２４時間、乾燥した。更に、空気気流中にて５５０℃で６時間焼成することにより、各種細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を得た。
【００５０】
上記手法により合成されたシリカ系メソ多孔体について、先のＦＳＭタイプの場合と同様に、粉末Ｘ線回折法、走査電子顕微鏡法、透過電子顕微鏡法及び窒素吸着等温線の測定を適用した。得られたＸ線回折パターンより、上記手法により作製されたシリカ系メソ多孔体は、Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡタイプの場合は、２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有していること、Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡタイプの場合は、３次元の細孔配列構造を有していることが分かった。また、回折ピーク位置の解析から、合成時の温度の違いにより、細孔径が異なっていることが確認できた。
【００５１】
走査電子顕微鏡による観察から、Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡタイプの場合は、柱状の集合体として、また、Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡタイプの場合は、不定形顆粒状の形態として、観察された。透過電子顕微鏡による観察からは、合成時の温度の違いにより、異なった細孔径を有していることを確認した。
【００５２】
窒素吸着等温線の測定も同様に行った。Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡタイプの結果を図２に、Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡタイプの結果を図３に示す。図２，３共に、左側が吸着等温線を示し、右側が細孔径分布を示している。合成時の温度の違いに依存して、異なる吸着等温線が得られた。Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡタイプのシリカ系メソ多孔体では、３５℃で合成したものは６．２ｎｍ径の細孔による鋭いピークが確認された。以下、７５℃、１００℃、１３０℃のものには、それぞれ６．７ｎｍ、８．０ｎｍ、１１．１ｎｍ径の細孔による鋭いピークが確認された。Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡタイプのシリカ系メソ多孔体では、３５℃で合成したものは６．１ｎｍ径の細孔による鋭いピークが確認された。以下、７５℃、１００℃、１３０℃のものには、それぞれ６．７ｎｍ、９．９ｎｍ、１１．０ｎｍ径の細孔による鋭いピークが確認された。
【００５３】
以下、Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡタイプのシリカ系メソ多孔体で、合成時３５℃としたものをＰ６ｍｍ−３５、以下同様に、７５℃、１００℃、１３０℃のものを、Ｐ６ｍｍ−７５、Ｐ６ｍｍ−１００、Ｐ６ｍｍ−１３０、と記載する。また、Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡタイプのシリカ系メソ多孔体で、合成時３５℃としたものをＩａ３ｄ−３５、以下、同様に、７５℃、１００℃、１３０℃のものを、Ｉａ３ｄ−７５、Ｉａ３ｄ−１００、Ｉａ３ｄ−１３０、と記載する。
【実施例２】
【００５４】
（１）シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の作製
澱粉の加水分解酵素の固定化用担体として用いたシリカ系メソ多孔体を、以下の表に示す（表１参照）。Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡ４種（窒素吸着による細孔径、６．２ｎｍ、６．７ｎｍ、８．０ｎｍ、１１．１ｎｍのもの）、Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡ４種（窒素吸着による細孔径、６．１ｎｍ、６．７ｎｍ、９．９ｎｍ、１１．０ｎｍのもの）、ＦＳＭタイプのもの３種（窒素吸着による細孔径、４．０ｎｍ、７．５ｎｍと９．０ｎｍのもの）を用いた。
【００５５】
まず、グルコアミラーゼの吸着等温線を作成した。酵素として、グルコアミラーゼ（Ｗａｋｏ  ０７７−０４０７１）を用いた。購入したグルコアミラーゼの瓶に、８ｍｌ程度の超純水を入れて溶かすと、およそ３０ｍｇ／ｍｌ程度の溶液になる。正確な濃度をγグロブリンをコントロールとしたＢＣＡ法で測定した。それを０．１Ｍの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）で希釈することで、目的濃度のグルコアミラーゼ溶液を得た。吸着等温線の作成は、以下の手順によった。
【００５６】
１．チューブに各メソポーラスシリカを１０ｍｇずつ量り取った。
２．グルコアミラーゼ溶液の希釈系列（０〜１６ｍｇ／ｍｌ）を作成した。
３．メソポーラスシリカを量り取ったチューブに、タンパク質溶液を１ｍｌずつ入れ、良く攪拌混合した。
４．４℃で一晩（８時間以上）転倒混和した。
５．チューブを遠心し、その上清に残ったタンパク質濃度を、ＢＣＡキットで測定した。
６．測った濃度から、メソポーラスシリカに吸着されたグルコアミラーゼ量を算出し、吸着等温線を作成した。
【００５７】
これらの手法を用いることで、グルコアミラーゼの最大吸着量を算出した。これらの結果を図４〜６に示す。図４に示すように、Ｐ６ｍｍ−３５、Ｐ６ｍｍ−７５、Ｐ６ｍｍ−１００、Ｐ６ｍｍ−１３０のグルコアミラーゼ最大吸着量は、それぞれ１０，２０，５０，８０ｍｇであることが分かった。同様に、図５に示すように、Ｉａ３ｄ−３５、Ｉａ３ｄ−７５、Ｉａ３ｄ−１００、Ｉａ３ｄ−１３０のグルコアミラーゼ最大吸着量は、それぞれ５，１５，７５，３００ｍｇであり、図６に示すように、ＦＳＭ−４、ＦＳＭ−７．５、ＦＳＭ−９のグルコアミラーゼ最大吸着量は、それぞれ７５，２００，４２０ｍｇであることが分かった（表１参照）。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
これらの結果から、グルコアミラーゼは、ＦＳＭ−９に最も多く吸着することが分かった。そこで、グルコアミラーゼが吸着するとき、ＦＳＭ−９の細孔の中にも入っているのか否かを確認した。ＦＳＭ−９をバッファーのみとグルコアミラーゼを溶解したバッファーでそれぞれ処理し、窒素吸着等温線を測定した。測定手順は以下によった。
【００６０】
１．１０ｍｌチューブにＦＳＭ−９を４０ｍｇずつ測り取った。
２．６ｍｇ／ｍｌ  グルコアミラーゼ溶液又はバッファーを、それぞれ４ｍｌずつ加えて混合した。固まりが見られる場合は、超音波又はポンプで引いて空気を抜いた。
３．４℃で９時間ローテーターで回転させて、グルコアミラーゼを吸着させた。
４．チューブを３０００ｒｐｍで５分遠心した後、上清を除去して、上清の未吸着タンパク濃度をＢＣＡ法で測定した。
【００６１】
５．チューブに酢酸バッファー４ｍｌを加えて洗浄した（１回）。
６．チューブにエタノール４ｍｌを加えて、洗浄した（１回）。
７．上清を除去したＦＳＭ−９（＋グルコアミラーゼ）を少量のエタノールでシャーレに移し、６０℃のオーブンで３日乾燥させた。
８．乾燥させたＦＳＭ−９（＋グルコアミラーゼ）を約２０ｍｇセルに測り取り、６０℃で２４時間、脱ガスの前処理した後、窒素吸着等温線の測定を行った。
【００６２】
結果を図７に示す。図７の左側が吸着等温線を示し、右側が細孔径分布を示している。比較のため、グルコアミラーゼを吸着させたものと、させていないものの結果を示している。右側の図より、グルコアミラーゼの吸着により全細孔体積が減少していることが分かり、グルコアミラーゼは、ＦＳＭ−９の細孔内にも入っていることが確認できた。
【００６３】
（２）シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の酵素活性測定
グルコアミラーゼの活性測定には、キッコーマン製  商品コード６０２１２「糖化力分別定量キット」を用いた。あらかじめ、本実験に使用するグルコアミラーゼ標品は、検出可能なα−グルコシダーゼ活性を持たないことを確認した。本キットは、糖化力とα−グルコシダーゼ活性を測るためのキットであるが、α−グルコシダーゼを無視できるため、糖化力の値がそのままグルコアミラーゼ活性の値となる。また、基本的には、キットに添付されるインストラクションにしたがって活性測定を行うが、そのスケールを１０分の１にし、かつ吸光度の検出をプレートリーダーで行うため、活性単位の算出に関しては計算方法が若干異なる。
【００６４】
グルコアミラーゼのシリカ系メソ多孔体への固定化は、以下の手順によった。酵素としては、グルコアミラーゼ（Ｗａｋｏ  ０７７−０４０７１）を用いた。シリカ系メソ多孔体としては、ＳＢＡタイプとＦＳＭタイプのものを複数用いた。
１．０．１Ｍの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）に溶かした１ｍｌのグルコアミラーゼ（４ｍｇ／ｍｌ）と１０ｍｇのメソポーラスシリカを混合し、４℃で一晩転倒混和した。
２．遠心して上清を除いた。（吸着したタンパク質量を測定した。）
３．１ｍｌの酢酸バッファーでメソポーラスシリカを再懸濁した後、遠心する操作を5回繰り返し、吸着されなかったグルコアミラーゼを完全に除いた。
４．１ｍｌの酢酸バッファーに懸濁したものをサンプルとし、酢酸バッファーで更に５倍希釈した懸濁液を１ｍｌ用意した。
【００６５】
まず、固定化したグルコアミラーゼの耐熱性向上を確認するために、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体に対する熱処理を行った。処理は、以下のような手順を用いた。
１．先に準備された懸濁液１ｍｌを十分に攪拌し、先端をカットオフしてメソポーラスシリカの粒子が詰らないようにしたイエローチップを用いて、１００μｌずつ６本のエッペンドルフチューブに分注した。
２．３７，４５，５５，６５，７５，８５℃のヒートブロックを準備した。
３．１０分加熱した。
４．加温後、すぐに氷水中につけて急冷した。
【００６６】
グルコアミラーゼの活性測定は、以下の手順により測定した。
１．「糖化力分別定量キット」に含まれる、糖化力測定用基質溶液と酵素溶液を３７℃で予備加温した。
２．基質溶液と酵素溶液を等量ずつ混ぜ、反応溶液とした。
３．先を３ミリほどカットオフしたイエローチップを用いて、良く懸濁した固定化グルコアミラーゼサンプルから１０μｌを吸い上げ、９６穴ウェル中入れた。
４．反応溶液を１００μｌずつ入れ、３７℃で１０分間インキュベートした。
５．反応停止液２００μｌを入れ、反応を停止させた。
６．３０分ほど静置し、メソポーラスシリカを沈殿させた。
７．沈殿したメソポーラスシリカを吸い込まないように注意しながら、２００μｌの反応後の溶液を吸い上げ、プレートリーダー用のプレートに移した。
８．波長４００ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度が１．６程度までは、リニアに活性を反映するので、吸光度が１．６を超えたサンプルについては、希釈して測定した。
【００６７】
本キットでは、４−ニトロフェニルβ−マルトシドが、グルコアミラーゼによって分解され、４−ニトロフェニルβ−グルコシドを生じ、更に、共役酵素として添加したβ−グルコシダーゼによって生ずる４−ニトロフェノールの吸光度を測ることによって糖化力活性を測定する。糖化力の１Ｕ（ユニット）は、インストラクションに従う条件下で、１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを生ずる力価として定義されている。
【００６８】
その計算式は、糖化力（Ｕ／ｍｌ）＝サンプルの吸光度×０．１７１×希釈倍率である。本実験の場合、糖化力がグルコアミラーゼの活性と等しいとして扱い、希釈倍率が１０であり、プレートリーダーを用いることで、吸光度が０．５倍（ポジティブコントロールを用いて検討済み）になっていることを考慮すると、下記の式により、
グルコアミラーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）＝サンプルの吸光度×０．１７１×１０×（１／０．５）
酵素活性は、サンプルの吸光度×３．４２と換算される。
【００６９】
これらのシリカ系メソ多孔体に固定化したグルコアミラーゼの活性を測定した。活性の測定に際し、反応温度を変化させ温度による依存性も合わせて確認した。その結果を図８〜１０に示す。これらの図には、それぞれのシリカ系メソ多孔体についてグループ毎に示している。耐熱性に関しては、いずれの固定化グルコアミラーゼも６５℃付近で９０％以上の活性を失うという意味では違いが見られなかった。ただし、メソ穴の大きさと、酵素活性には相関があることを示している。例えば、Ｐ６ｍｍ及びＦＳＭタイプでは、メソ穴が大きいほど良好で、Ｉａ３ｄタイプでは、９．９ｎｍ程度の細孔径の方が比活性が高い。
【００７０】
また、特に重要なことは、溶液中に溶解させたグルコアミラーゼの酵素比活性（図中、Ｎａｔｉｖｅで標記）に比較した場合、ＦＳＭ−９、Ｐ６ｍｍ−１３０及びＩａ３ｄ−１００に吸着、固定されたα−アミラーゼの比活性は、同程度の比活性を示している。このことは、細孔径を適合させたシリカ系メソ多孔体に固定化されたグルコアミラーゼが、溶液中に分散した状態のグルコアミラーゼと同等の比活性を示していることを示している。
【００７１】
このことから、澱粉の加水分解のための反応系において、シリカ系メソ多孔体に固定化されたグルコアミラーゼを共存させることにより、その溶解度を超えた量のグルコアミラーゼを反応系内に存在させることが可能であることが分かる。このことは、言うまでもなく、反応速度、すなわち澱粉の加水分解速度の向上に寄与するものであり、また、反応生成物からも容易に酵素を回収することが可能である。グルコアミラーゼが固定化されたシリカ系メソ多孔体を更に固定し、そこに、澱粉を含む溶液を流すような装置を構成すれば、連続的な酵素反応の実施が可能である。
【００７２】
一般に、酵素、すなわちタンパク質の溶解度には限界があり、それを越えると凝集という現象を起こす。グルコアミラーゼの場合も例外ではなく、１０ｍｇ／ｍｌを越えるような高濃度にすると凝集が起こり、凝集を起こした酵素は活性に寄与しない。一方で、シリカ系メソ多孔体に固定化されたグルコアミラーゼの場合、先に示したＦＳＭ−９  １０ｍｇに対して、グルコアミラーゼが４．２ｍｇ程度、吸着、固定されたシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を、１ｍｌの反応基質、すなわち澱粉の溶解した溶液中に５０ｍｇ分散させることは容易である。この反応系においては、溶液１ｍｌにα−アミラーゼ４．２×５０／１０＝２１ｍｇを活性を有した状態で存在させられることが理解できる。すなわち、１０ｍｇ／ｍｌを超えた酵素量を反応系内に容易に存在させることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
以上詳述したように、本発明は、シリカ系メソ多孔体と澱粉の加水分解酵素の複合体に関するものであり、本発明により、表面を未処理あるいは適切な溶液で官能基を付与する処理等を施したシリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、該酵素の固定化法として利用して合成したシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体、その製造方法、及びその用途を提供することができる。本発明によれば、シリカ系メソ多孔体の表面に未処理若しくは適切な溶液による処理で官能基を付与することができ、また、その合成条件を制御することで細孔径を制御できることから、固定化酵素として好適なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を提供することができる。
【００７４】
本発明では、澱粉の加水分解に際し、原料澱粉の性状や特性に応じて好適な酵素を選択して、その酵素を用いたシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を、固定化酵素として選択することができる。そのため、酵素の回収が容易であり、繰り返し使用も可能となる他、基質を連続的にシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体と接触して流通させる連続的な酵素反応の実施も可能となる。
【００７５】
また、本発明によれば、固定化により高集積化された酵素を利用することから、酵素の凝集を避けることができるため、酵素を溶液に溶解した状態よりも高濃度に反応系中に存在させることが可能となり、酵素反応をより効率的に進めることに寄与できる。本発明は、例えば、多種多様な澱粉原料から、複数の酵素を作用させた状態で良質な加水分解物を効率的に製造する新規の澱粉加水分解プロセスのシステムを構築し、提供することを可能とするものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、シリカ系メソ多孔体の細孔分布を示す。
【図２】図２は、シリカ系メソ多孔体の細孔分布を示す。
【図３】図３は、シリカ系メソ多孔体の細孔分布を示す。
【図４】図４は、シリカ系メソ多孔体のグルコアミラーゼ吸着量を示す。
【図５】図５は、シリカ系メソ多孔体のグルコアミラーゼ吸着量を示す。
【図６】図６は、シリカ系メソ多孔体のグルコアミラーゼ吸着量を示す。
【図７】図７は、シリカ系メソ多孔体の細孔分布を示す。
【図８】図８は、シリカ系メソ多孔体に固定化されたグルコアミラーゼの比活性を示す。
【図９】図９は、シリカ系メソ多孔体に固定化されたグルコアミラーゼの比活性を示す。
【図１０】図１０は、シリカ系メソ多孔体に固定化されたグルコアミラーゼの比活性を示す。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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