(57)【要約】【課題】極めて高感度で蛍光検出可能な表面プラズモン増強蛍光センサ及びそれに用いる表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムを得る。【解決手段】測定に使用する波長の光を透過させうる材料により形成される基体１２表面に、金属膜１４、該金属膜表面に直接結合する高分子化合物からなり、膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にあるバリア膜１６、及び、該バリア膜に試料が接するように試料を保持する試料保持部２０を有する表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム１０である。前記プリズム１０と、光源３２と、照射光３４を基体１２と金属膜１４との界面に向けて特定条件を満たすように入射させる入射光学系と、界面に光が入射したとき、界面から染み出すエバネッセント波に励起されて、試料２８中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段３６とを備えることで表面プラズモン増強蛍光測定センサを得る。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定に使用する波長の光を透過させうる材料により形成される基体表面に、金属膜と、バリア膜と、試料保持部と、をこの順に有し、該バリア膜が該金属膜表面に結合する高分子化合物からなり、膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲である表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム。
【請求項２】
前記バリア膜が、前記金属膜表面に固定化された重合開始剤を起点として表面グラフト重合法により形成された高分子化合物からなることを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム。
【請求項３】
前記金属膜表面に結合する高分子化合物が、アクリレート系モノマー及びメタクリレート系モノマーからなる群より選択される少なくとも１種のモノマーを含んで形成されることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム。
【請求項４】
前記金属膜表面に結合する高分子化合物が、アクリレート系モノマーの少なくとも１種を含んで形成されることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム。
【請求項５】
前記重合開始剤が、酸ハロゲン化物又は有機ハロゲン化物であることを特徴とする請求項２から請求項４のいずれか１項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム。
【請求項６】
前記重合開始剤が、１１−メルカプト−１−ウンデカノール、２−メルカプトエタノール、３−メルカプト−２−ブタノールを介して前記金属表面に固定化されていることを特徴とする請求項２から請求項５のいずれか１項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム。
【請求項７】
測定に使用する波長の光を透過させうる材料により形成される基体表面に、金属膜を形成する工程と、
該金属膜表面に、該金属膜と結合しうる結合部位と重合開始能を有する開始部位とを有する重合開始剤を固定化する工程と、
該重合開始剤を固定化した基体に重合性化合物を接触させ、該重合開始剤を起点として重合反応を生起、進行させることで、該金属膜と結合する高分子化合物からなるバリア膜を形成する工程と、
該バリア膜に試料が接するように試料を保持する試料保持部を形成する工程と、
を有する表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムの製造方法。
【請求項８】
前記バリア膜を形成する工程が、前記重合性化合物を形成するためのリビング重合反応工程を含むことを特徴とする請求項７記載の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムの製造方法。
【請求項９】
請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムと、
該表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムに測定用の所定波長の光照射する光源と、
該光源から照射される光を該基体と金属膜との界面に向けて、全反射条件を満たすように基体を通して入射させる入射光学系と、
該界面に光が入射したとき、該界面から染み出すエバネッセント波に励起されて、試料中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段と、
を備える表面プラズモン増強蛍光センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光法により試料中の特定物質を検出する蛍光センサに用いる表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム、その製造方法及びそれを用いた蛍光センサに関し、詳細には表面プラズモン増強を効率よく行うことができ、高感度測定に有用な表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム、その製造方法、及びそれを用いた蛍光センサに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光法が広く用いられている。この蛍光法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって検出対象物質の存在を確認する方法である。また、検出対象物質が蛍光体ではない場合、蛍光体で標識されて検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００３】
生化学分野の実験や研究においては、蛋白質、ＤＮＡ，薬品などが測定試料として使用される。たとえば、薬品をスクリーニングする場合には、一次試料として蛋白質などの生体物質を使用し、これをセンサ面に固定して前記センサ面に、二次試料である複数種の薬品を接触させ、それらの相互作用を調べるなどの方法をとることができる。
【０００４】
表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムは、一般的に、ガラスやプラスチックなどの透明な誘電体からなる基体（プリズム）表面に、金属膜と、バリア膜とがこの順に設けられ、さらに、一次試料を固定するための試料保持部材を有する。前記測定用プリズムにおいては、試料保持部が有する官能基を介して一次試料が該プリズム表面に固定される。
【０００５】
図３は、標識された物質を用いる蛍光法を実施するセンサの一例を示す概略図である。図３に示す蛍光センサでは、一次試料２８に含まれる抗原２２を検出するために、まず、基体３０に測定対象である抗原２２と特異的に結合する１次抗体１８を塗布する。その後、該基体３０上に設けられた試料保持部に試料２８を流し、次いで同様に蛍光体２６で標識されて抗原２２と特異的に結合する２次抗体２４を流す。その後、基体３０の表面部分に向けて光源３２から光３４（矢印で模式的に示す）が照射され、同時に光検出器３６によって蛍光検出が行われる。ここで、光検出器３６によって所定の蛍光が検出された場合、２次抗体２４と抗原２２との結合、すなわち試料２８中における抗原２２の存在を確認できることになる。
ここで直接検出されるのは、２次抗体２４の存在であるが、この２次抗体２４自体は、抗原２２と結合しなければ基体３０上に存在することはないため、２次抗体２４の存在を確認することにより、間接的に検出対象物質である抗原２２の存在が確認されることとなる。
近年、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化が進んでおり、蛍光による物質の検出法はバイオ研究には欠かせない道具となっており、さらにバイオ以外の分野においても広範に利用されている。
【０００６】
しかしながら、図３に示す如き従来の蛍光表面プラズモン増強蛍光センサでは、基板と試料との界面における励起光の反射／散乱光や、検出対象物質以外の不純物／浮遊物等による散乱光がノイズとなるため、光検出器を高性能化しても対象物の検出精度が向上しないという問題があった。
検出精度向上の手段として、エバネッセント波を用いる蛍光法が提案されている（例えば、非特許文献１参照。）。図４は、エバネッセント蛍光法を実施する蛍光センサの一例を示す概略図である。なお、以下の図においては、図３中の要素と同等の要素には同番号を付し、それらについての説明は特に必要のない限り省略する。
【０００７】
エバネッセント蛍光法に用いる蛍光センサは、基体３０に代えてプリズム（誘電体ブロック）１２を用いることを特徴し、光源３２からの照射光３４は、このプリズム１２と試料２８との界面で全反射する条件で、プリズム１２を通して照射される。この方法では、光３４が上記界面で全反射するとき該界面近傍に染み出すエバネッセント波３８により２次抗体２４が励起され、蛍光検出は、試料２８に対してプリズム１２と反対側に配された光検出器３６によって行われる。
【０００８】
このような蛍光センサにおいては、照射光３４は全反射するので、上方からの蛍光検出において、励起光検出成分が蛍光検出信号に対するバック・グラウンドとならない点、エバネッセント波３８が界面から数百ｎｍの領域にしか到達しないので、試料中の不純物による散乱を生じにくい点などの利点を有し、図３に示す如き従来の蛍光法と比べて（光）ノイズを大幅に低減でき、検出対象物質を高感度に蛍光測定できる方法として注目されている。
【０００９】
さらに、エバネッセント蛍光法の改良として、さらなる高感度化を目的とした表面プラズモン増強蛍光センサが提案されている（例えば、特許文献１参照。）。図５は表面プラズモン増強蛍光センサの構成を示す概略図である。ここに記載の表面プラズモン増強蛍光センサでは、誘電低ブロックであるプリズム１２表面に金属膜１４を形成してなる。該金属膜１４が形成されることにより、光３４が照射されたとき該金属膜１４中に表面プラズモンが生じ、その電場増幅作用によって蛍光が増幅され、条件によっては、１０００倍程度まで増幅されるようになる。このため、測定感度の大幅な向上が期待される。
しかし、このような表面プラズモン増強蛍光センサにおいては、試料中の蛍光体２６と金属膜１４とが接近し過ぎていると、蛍光体２６内で励起されたエネルギーが蛍光を発生させる前に金属膜１４へ遷移してしまい、蛍光が生じないという現象（いわゆる金属消光）が起こり得ることが指摘されている（例えば、非特許文献２、参照）。
【００１０】
この金属消光に対処するために非特許文献２には、金属膜１４の上にＳＡＭ（自己組織化膜）４０を形成することで、試料中の蛍光体２６と金属膜１４とを、形成したＳＡＭ４０の存在により離間させることが提案されている。この金属消光に関連しては、例えば、非特許文献３において、表面プラズモンにより増強された蛍光強度の、金属膜からの距離に対する依存性が検討されている。
このことから、測定用プリズム表面に固定された試料と金属膜との距離を制御することで有効な精度向上が期待されるものの、自己組織化膜（ＳＡＭ）では十分な離間距離が達成し難いものの、バリア層としての樹脂膜を形成する場合、樹脂膜厚の不均一による局所的な測定精度のばらつきが懸念され、十分な離間距離を維持しうる膜厚を有し、且つ、膜厚の高度の均一性を達成しうる解決方法が求められているのが現状である。
【特許文献１】特許第３５６２９１２号公報
【非特許文献１】楠見明弘他著「バイオイメージングでここまで理解る」Ｐ104-113（羊土社  ２００２年刊）
【非特許文献２】W.Knoll他著、「アナリティカル  ケミストリー（Analytical Chemistry）」第７５巻Ｐ２６１０（２００３年）
【非特許文献３】W.Knoll他著、「コロイド  アンド  サーフェス  Ａ（Colloids and Surfaces. A.）」、第１７１巻、Ｐ１１５（２０００年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記問題点を考慮してなされた本発明の目的は、極めて高い感度で蛍光検出することができる表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム及びその簡易な製造方法を提供することにある。
また、本発明のさらなる目的は、前記本発明の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムを備えた、蛍光検出感度の高い表面プラズモン増強蛍光センサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は鋭意検討の結果、プリズム表面に設けられた金属膜と試料保持部との間に、表面グラフト重合法により、金属膜表面と結合した高分子化合物からなるバリア膜を設けることで上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞    測定に使用する波長の光を透過させうる材料により形成される基体表面に、金属膜と、バリア膜と、試料保持部と、をこの順に有し、該バリア膜が該金属膜表面に結合する高分子化合物からなり、膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲である表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム。
＜２＞  前記バリア膜が、前記金属膜表面に固定化された重合開始剤を起点として表面グラフト重合法により形成された高分子化合物からなることを特徴とする＜１＞記載の表面プラズモン増強蛍光センサ。
【００１３】
＜３＞  前記金属膜表面に結合する高分子化合物が、アクリレート系モノマー及びメタクリレート系モノマーからなる群より選択される少なくとも１種のモノマーを含んで形成されることを特徴とする＜１＞又は＜２＞に記載の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム。
＜４＞  前記金属膜表面に結合する高分子化合物が、アクリレート系モノマーの少なくとも１種を含んで形成されることを特徴とする＜１＞又は＜２＞に記載の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム。
＜５＞  前記重合開始剤が、酸ハロゲン化物又は有機ハロゲン化物であることを特徴とする＜２＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム。
＜６＞  前記重合開始剤が、１１−メルカプト−１−ウンデカノール、２−メルカプトエタノール、３−メルカプト−２−ブタノールを介して前記金属表面に固定化されていることを特徴とする＜２＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム。
【００１４】
＜７＞  測定に使用する波長の光を透過させうる材料により形成される基体表面に、金属膜を形成する工程と、該金属膜表面に、該金属膜と結合しうる結合部位と重合開始能を有する開始部位とを有する重合開始剤を固定化する工程と、該重合開始剤を固定化した基体に重合性化合物を接触させ、該重合開始剤を起点として重合反応を生起、進行させることで、該金属膜と結合する高分子化合物からなるバリア膜を形成する工程と、該バリア膜に試料が接するように試料を保持する試料保持部を形成する工程と、を有する表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムの製造方法。
＜８＞  前記バリア膜を形成する工程が、前記重合性化合物を形成するためのリビング重合反応工程を含むことを特徴とする＜７＞記載の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムの製造方法。
＜９＞  測定に使用する波長の光を透過させる材料から形成された基体と、該基体表面に形成された金属膜と、該金属膜表面に結合する高分子化合物からなり、膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にあるバリア膜と、該基体の金属膜形成面に結合し、該バリア膜に試料が接するように該試料を保持する試料保持部と、該波長の光照射する光源と、該光源から照射される光を該基体と金属膜との界面に向けて、全反射条件を満たすように基体を通して入射させる入射光学系と、該界面に光が入射したとき、該界面から染み出すエバネッセント波に励起されて、試料中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段と、を備える表面プラズモン増強蛍光センサ。
【００１５】
本発明においては、金属膜と試料保持部に保持された蛍光体との間に、金属膜表面に直接結合する高分子化合物からなり、膜厚が５〜１００ｎｍの範囲にあるバリア膜を設けているが、末端が金属膜表面に固定化された開始剤を介して結合した均一な鎖長の高分子化合物からなるバリア膜により、金属消光が生じない距離に試料が保持されるため、蛍光検出の感度が向上する。
さらに、バリア膜の膜厚を５〜１００ｎｍの範囲とすることで、金属膜と試料との間に適切な距離が維持されるため金属消光が抑制されるとともに、エバネッセント波の染み出しによる電界強度が適切に保たれるため、表面プラズモンによる電場増幅作用を確実に検出に反映させることができ、従って、高感度な蛍光検出を可能とした。
さらに、これらの高分子化合物に親水性基を導入することにより、タンパク等のバリア膜中への浸透が抑制され、タンパクの非特異吸着を抑制しうるという利点をも有することになる。また、本来、このようなバリア膜の表面に配置すべき抗体等についても、当該親水性の官能基と特異的に結合させて、バリア膜表面に吸着させるという態様も可能になる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、試料液中の蛍光体の金属消光を抑止できるため、極めて高い感度で蛍光検出することができる表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム及びその簡易な製造方法を提供することができる。
また、本発明の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムを用いることにより、蛍光検出感度の高い表面プラズモン増強蛍光センサを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。まず、本発明の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムについて、その製造方法とともに説明する。
＜表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム＞
本発明の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムは、測定に使用する波長の光を透過させうる材料により形成される基体、一般的には、誘電体ブロックとしてのプリズムの表面に、金属膜と、該金属膜表面に結合する高分子化合物からなり、膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にあるバリア膜とが順次積層されてなり、さらに、該バリア膜に試料が接するように試料を保持する試料保持部を有することを特徴とする。
図１は、本発明の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムを示す概略図である。なお、以下、本願においては、以下、適宜、表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムを単にＳＰＦ用プリズムと称し、表面プラズモン増強蛍光センサをＳＰＦと称する。ＳＰＦ用プリズム１０は、例えば、波長６３３ｎｍの光を発する半導体レーザを光源として用いる場合には、該６３３ｎｍの波長の入射光を透過させる材料からなる基板（誘電体ブロックとしてのプリズム）１２と、該基体１２の表面に形成された金属膜１４と、該金属膜１４に結合する高分子化合物からなるバリア膜１６と、からなる積層体と、該積層体のバリア膜１６形成面に接するように一次抗体１８を保持しうる試料保持部２０を有する。
【００１８】
（基体）
本発明のＳＰＦ用プリズムの基体として用いる誘電体ブロックとしてのプリズムは、ＳＰＦ測定に使用する波長の光を透過させる固体を、測定波長を考慮し、適宜選択して用いる。
基体１２は、一般に測定に使用される波長、例えば、３５０〜６５０ｎｍの入射光に対して透明な誘電体、たとえば石英ガラスや硼珪酸ガラスなどの光学ガラス類、およびポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、環状ポリオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）などの光学用樹脂から形成できる。基体１２の形状としては、一般に、図１に示すように、幅方向に沿った断面が、金属膜１４が形成された側の面から金属膜１４の形成されていない側の面に向かって縮小するプリズム状の形状のものが用いられる。
基体１２は、市販品を使用することもでき、例えば、日本ゼオン株式会社製  ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）  ３３０Ｒ（屈折率１．５０）などをそのまま基体として用いることができる。
【００１９】
（金属膜）
金属膜１４を構成する金属は、ＳＰＦを生じ得るものであれば特に限定はされず、たとえば金、銀、銅、アルミニウムから選択することができるが、表面プラズモン増強倍率、及び蛍光励起波長の観点から、銀および金が好ましく、特に酸化に対する安定性に優れている点から金が好ましい。
金属膜１４の製膜は基体１２の幅の広い側の面（図１に示す断面図における上方の面）にスパッタリングなどにより行うことができる。
膜厚は、ＳＰＦ用プリズムよる測定精度の観点から、２０〜１００ｎｍ程度であることが好ましく、一般的には５０ｎｍ前後のものが用いられる。
【００２０】
（バリア膜）
バリア膜１６は、前記金属膜１４表面に直接結合する高分子化合物からなり、膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にあることを特徴とする。バリア膜１６は、後述する試料保持部２０と金属膜１４とが近接することにより生じる所望されない金属消光を抑制するために設けられる高分子化合物からなる膜であり、膜厚の均一性がＳＰＦ測定精度に影響を与えるという観点から、前記金属膜１４に結合して形成された高分子化合物からなる膜を選択したものである。
本発明の好ましい態様では、このバリア膜は、金属膜１４表面に固定化された重合開始剤を起点として表面グラフト重合法により形成された高分子化合物からなるものである。このように金属膜表面に直接、重合法により高分子化合物を生成させることで、高分子化合物を塗布により形成する膜に比較して、膜厚の均一性に著しく優れる。また、このような方法により形成されたバリア膜１６は、基体の表面積に拘わらず膜の均一性を維持しうることから、例えば、スピンコートなどによる高分子化合物からなる膜の形成に比較して、大きな面積の基体にも好適に使用することができる。
【００２１】
以下、本発明の好ましい態様である表面グラフト重合によるバリア膜１６形成方法の詳細について説明する。
まず、金属膜１４表面に重合開始剤を固定化する。重合開始剤の固定化は、重合開始剤として、金属膜１４表面への結合部位と重合開始部位とを備える化合物を用いる方法、及び、金属膜表面に自己集積膜を形成しうる化合物であって、例えば、水酸基など重合開始剤と結合しうる官能基を有する化合物を金属膜表面に浸漬などにより自己集積させて結合させ、その後、重合開始剤をその表面に適用する方法などが挙げられる。
金属膜を構成する代表的な金属である金を用いた場合、金属膜との結合部位としては、金（Ａｕ）と結合しうる硫黄原子含有部位、例えば、−ＳＨ、−Ｓ−，−Ｓ−Ｓ−などの構造を含む官能基、アミン構造、ホスフィン系官能基、などが挙げられ、これらの官能基或いは部分構造を少なくとも片末端に有する化合物を用いる。
なかでも、金属膜表面に結合し易く、且つ、重合開始官能基を導入できる官能基を有する、自己集積膜（ＳＡＭ膜）を形成しうる化合物としてのアルカンチオールを介して重合開始剤を固定化することが好ましい。ここで用いられる、アルカンチオールのなかでも、１１−メルカプト−１−ウンデカノール、２−メルカプトエタノール、３−メルカプト−２−ブタノール等が金属膜表面への自己集積性、及び重合開始官能基の導入し易さ  の観点から望ましい。
一方、重合開始部位としては、酸ハロゲン部分構造、有機ハロゲン部分構造を有するものが好ましく挙げられる。
従って、本発明に使用しうる重合開始剤としては、（４−クロロメチル）ベンゾイルクロリド、ブロモイソブチリルブロミドなどの酸ハロゲン化物、有機ハロゲン化物、ハロゲン化スルホニル化合物などの化合物であって、前記した基材結合部位を導入したものが好ましい。なお、重合開始剤としての有機ハロゲン化物、ハロゲン化スルホニル化合物については、例えば、以下に示す如き化合物が本発明に好適に使用される。
【００２２】
（１）ｏ−、ｍ−、ｐ−ＸＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｃ（Ｏ）Ｘ
（２）ｏ−、ｍ−、ｐ−Ｘ（Ｏ）Ｃ−Ｃ６Ｈ４−Ｃ（Ｏ）Ｘ
（３）ＸＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｘ
（４）Ｘ（Ｏ）Ｃ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｘ
（５）ｏ−、ｍ−、ｐ−ＸＳＯ２−Ｃ6Ｈ4−ＣＨ２−ＳＯ２Ｘ
（６）（ＸＣＨ２）（ＣＨ3）−ＣＨ２−Ｘ
なお、前記一般式（１）〜（６）において、Ｃ６Ｈ４はフェニレン基を表す。また、「ｏ−、ｍ−、ｐ−」の記載は、表示された置換基が、フェニレン基の環構造の「ｏ−、ｍ−、ｐ−」のいずれか１カ所の任意の位置に連結していることを示す。
Ｘは、塩素、又は、臭素を表す。
【００２３】
前記本発明に好適に使用しうる重合開始剤である開始部位を２つ有する重合開始剤の具体例としては、前記一般式（１）で表される開始剤としては、（４−クロロメチル）ベンゾイルクロリド、前記一般式（２）で表される開始剤としては、テレフタル酸クロリド、イソフタル酸クロリド、前記一般式（３）で表される開始剤としては、ブロモアセチルクロリド、前記一般式（４）で表される開始剤としては、スクシニルジクロリド、前記一般式（５）で表される開始剤としては、１，４ベンゼンジスルホニルジフルオリド、前記一般式（６）で表される開始剤としては、ブロモイソブチルブロミド等、が挙げられる。
【００２４】
前記例示した重合開始剤を用いるに際しては、これらの重合開始剤であって前記結合部位を導入したものを用いてもよく、また、前述の如くＳＡＭ膜などの結合部位を金属膜表面に固定化させた後、これらの重合開始剤を表面に適用してもよい。
【００２５】
金属膜１４への重合開始剤の固定化の例を挙げれば、金属薄膜に結合する化合物である含イオウ化合物、１１−メルカプト−１−ウンデカノールのエタノール溶液に、窒素雰囲気下で基板１２と金属膜１４との積層体を浸漬し、その後、エタノールで洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥させることでＯＨ基末端ＳＡＭ膜を形成し、さらに、開始剤であるブロモイソブチリルブロミドとピリジンを脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に添加した溶液に中にそれを浸漬し、脱水ＴＨＦで洗浄後、窒素雰囲気下で乾燥する方法をとることができる。
【００２６】
このようにして重合開始剤を金属膜表面に固定化した後、これを、窒素雰囲気下にてモノマー種と接触させ、重合を行って、金属膜表面に固定化された重合開始剤を起点として高分子化合物を表面グラフト重合により生成させ、バリア膜１６が形成される。
重合は、常法により行うことができる。モノマー種としては、前記したように、タンパク質などの不純物がバリア膜１６中に浸透することを抑制する目的で親水性基を導入することが好ましく、従って、モノマー種の少なくとも１種は親水性の官能基を有することが好ましい。
【００２７】
モノマー種としては、メタクリル酸化合物、アクリル酸化合物などが挙げられ、より具体的には、例えば、メタクリレート系モノマーとしては、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロピルメタクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ノニルメタクリレート、ベンジルメタクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、２−メトキシエチルメタクリレート、ブトキシエチルメタクリレート、メトキシテトラエチレングリコールメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、３−クロロ２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルメタクリレート、２−ヒドロキシ３−フェノキシプロピルメタクリレート、ジエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート等が挙げられる。
これらのなかでも、特に、メタクリル酸ナトリウムやメチルメタクリル酸ナトリウム等が望ましい。
【００２８】
アクリレート系モノマーとしては、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、ｔ−ブチルアクリレート、ヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、ノニルアクリレート、ベンジルアクリレート、シクロヘキシルアクリレート、ラウリルアクリレート、ｎ−オクチルアクリレート、２−メトキシエチルアクリレート、ブトキシエチルアクリレート、メトキシテトラエチレングリコールアクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、３−クロロ２−ヒドロキシプロピルアクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート、２−ヒドロキシ３−フェノキシプロピルアクリレート、ジエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルアクリレートなどが挙げられる。
これらのなかでも、特に、アクリル酸ナトリウムやメチルアクリル酸ナトリウム等が望ましい。
【００２９】
本発明においては、アクリル酸、メタクリル酸以外にも他のモノマーを共重合してもよく、そのようなモノマーとしては、通常のラジカル重合可能なモノマーであれば特に制限はなく、例えば、以下の具体例が挙げられる。Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、スチレン、ｏ−、ｍ−、ｐ−メトキシスチレン、ｏ−、ｍ−、ｐ−ｔ−ブトキシスチレン、ｏ−、ｍ−、ｐ−クロロメチルスチレン等などである。
複数のモノマーを使用する場合、ランダム共重合、ブロック共重合のいずれであってもよい。
重合は、高分子鎖の形成効率の観点から、リビングラジカル重合により行われることが好ましい。
【００３０】
重合により高分子化合物からなる膜を生成させる工程においては、前記モノマー種に加え、適切な触媒を共存させることが、高分子化合物生成効率向上の観点から好ましい。触媒としては、遷移金属錯体が好ましく使用され、鉄、銅、ルテニウム、ニッケル、タングステン、モリブデン、ニオブ等のハロゲン化物から選択される遷移金属ハロゲン化物、遷移金属ハロゲン化物に配位することにより錯体を形成する配位子であるｔｒｉｓ−（２−アミノエチル）アミンなどのアミン化合物が挙げられる。
これら触媒の含有量には特に限定はないが、反応系中の濃度として、０．１ｐｐｍ〜５重量％であることが好ましく、１０ｐｐｍ〜１重量％であることがより好ましい。
【００３１】
これらモノマー種を用いてバリア層を形成する場合、モノマー種の水溶液或いは水分散液に、表面に重合開始剤を固定化した基体を浸漬し、重合反応させるが、モノマー種の含有量は、モノマー溶液濃度で０．１重量％〜５０重量％の範囲であることが好ましく、より好ましくは０．５重量％〜５重量％の範囲である。
反応温度は１５℃〜８０℃の範囲で行われ、好ましくは２０〜５０℃の範囲である。通常、ポリマー鎖長はこの重合反応時間に依存することから、ポリマー鎖長、即ち、バリア膜厚が１０〜１００ｎｍとなるよう反応時間を制御すればよく、一般的には、１０分間〜１時間の範囲である。
【００３２】
このように、固体表面に重合開始基を介して高分子化合物鎖を結合させてバリア膜を作成する方法は、上記態様に限定されず、公知のグラフト重合方法を適用することができる。このような方法としては、例えば、特開平１１−２６３８１９号公報に記載のグラフト表面固体の製造方法などが挙げられ、ここに記載の方法を本発明に適用し、バリア膜を形成することができる。
【００３３】
重合反応の終了、溶媒を除去して金属膜表面にバリア膜が形成された積層体を得ることができる。このとき、不純物の除去を行うことが、得られるＳＰＦ用プリズムの測定精度の観点から好ましい。除去対象となる不純物としては、未反応の残存モノマー、溶媒、触媒などが挙げられる。除去は公知の方法で行うことができ、例えば、積層体の超音波洗浄、乾燥などの方法を挙げることができる。
【００３４】
本発明のＳＰＦ用プリズムにおいては、このバリア膜の膜厚は５〜１００ｎｍであることを要する。この範囲を外れた場合、既述の如く、表面プラズモン増強効果、金属消光抑制効果、或いは、蛍光の測定精度が低下する可能性がある。膜厚は、より好ましくは１０〜５０ｎｍの範囲である。
バリア膜の膜厚は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で測定することができる。本発明における膜厚は、ＡＦＭとして、セイコーインスツルメンツ社製：ＳＰＡ−５００（商品名）により、ＤＦＭモードで、カンチレバー：ＳＩ−ＤＦ４０Ｐ、走査エリア：１００μｍ、走査周波数：０．１Ｈｚの条件で測定した表面粗さＲＭＳ値を採用している。なお、本発明においては、プリズム表面へ重合開始剤を固定する際に、プリズムの一部にマイラーテープを貼って、重合開始剤が固定されず、その後の重合反応が生じない部分、即ち、バリア膜が形成されない金属膜表面露出領域を設けた。このようにして、重合開始剤固定領域と非固定領域を設け、その後、上記の方法によりバリア膜を形成すると、重合開始剤を呈した領域のみにバリア膜が形成されるので、形成されたバリア膜と金属膜（金属膜表面が露出した領域）との段差を測定することにより、バリア膜の膜厚を測定した。
バリア膜の膜厚測定の他の方法としては、プリズムをＳＰＦ測定することにより、重合反応過程や最終積層体における膜厚を見積もる方法が挙げられ、このような方法をとることも可能である。
本発明においては、上記の如く表面グラフト重合法をバリア膜の形成に使用することができ、バリア膜の膜厚、即ち、高分子化合物の鎖長は重合条件、主として重合反応の温度及び時間に依存するため、所望の膜厚のバリア膜を容易に形成しうるとともに、重合条件を系中で均一とすることで、膜厚のバラツキが極めて少ないバリア膜を基体の面積に拘わらず形成することができる。
例えば、ポリアクリル酸を用い、スピンコート法で２０ｎｍの被膜を形成する場合、条件によっては、±５．０ｎｍ程度のバラツキを生じるが、前記方法によれば、バラツキは、±１．０ｎｍ〜３．０ｎｍの範囲内となる。
【００３５】
（試料保持部）
次に、バリア層表面に測定対象、或いは、測定対象を間接的に検知するための測定対象と特異的に結合する一次試料を保持するための試料保持部を形成する。
試料保持部は、バリア膜表面に、試料を保持しうるアミド構造を有する化合物を結合させることで形成しうる。例えば、末端をカルボキシ基化したポリエチレングリコールを介してアミンカップリング法などにより試料保持させる方法をとることができる。
【００３６】
このアミンカップリング法の例として、３０μｌ（マイクロ・リットル）のキュベット／セルを用いた場合の例を挙げ、工程順に説明する。
まず、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）０．１モルと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）０．４モルとを等体積混合した液を３０μリットル準備し、前記バリア膜表面に塗布して、３０分間室温で静置し、親水性基である末端の−ＣＯＯＨ基を活性化する工程を行う。
次に、これをＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後するとで、試料を保持しうる活性化されたカルボキシ基を有する試料保持部が形成される。
このようにして本発明のＳＰＦ用プリズムが得られる。
【００３７】
参考までに、この試料保持部が一次抗体を保持する工程について説明する。このように試料保持部を有するＳＰＦ用プリズム表面に１次抗体溶液（５００μｇ／ｍｌ）を３０μｌ加え、３０〜６０分間室温静置する。これで試料の固定化を完了するが、未反応、即ち試料を固定化していない活性化したカルボキシ基を放置すると不純物を吸着し、測定誤差を招く懸念があるため、試料保持後に、未反応の−ＣＯＯＨ基をブロッキングする工程を行うことが好ましい。これは、試料保持部に一次抗体を保持させた後のＳＰＦ用プリズムをＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を３０μｌ加え、２０分間室温静置したのち、さらにＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄することにより行うことができる。
図１では、一次抗体１８を結合した試料保持部２０を模式的に示しているが、実際にはこれらの試料保持部２０はプリズム１２表面の全面に亘り高密度に形成される。
【００３８】
＜表面プラズモン増強蛍光センサ＞
次に、前記本発明の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムを用いて得られる表面プラズモン増強蛍光センサ（ＳＰＦ）について、図２を参照して説明する。図２は、本発明の表面プラズモン増強蛍光センサの一例の使用態様を示す概略図である。
本発明の表面プラズモン増強蛍光センサは、前記した基体１２と、金属膜１４と、バリア膜１６と、該基体１２の金属膜１４形成面に結合し、該バリア膜１６に試料が接するように該試料を保持する試料保持部２０を有するＳＰＦ用プリズム（図１に１０として記載の如きＳＰＦ用プリズム）を備え、該プリズム１０の基体１２に光３４を照射する光源３２と、該光源３２から照射される光を該基体１２と金属膜との界面に向けて、全反射条件を満たすように基体を通して入射させる入射光学系と、該界面に光が入射したとき、該界面から染み出すエバネッセント波（図示せず）に励起されて、試料中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段３６と、を備えることを特徴とする。
【００３９】
即ち、本発明の表面プラズモン増強蛍光センサは前記本発明のＳＰＦ用プリズム１０に光３４を照射する手段３２と、照射された光３４により界面から染み出すエバネッセント波に励起されて、試料中に含まれる物質が発した蛍光を検出する蛍光検出手段３６とを備える。
（光源、入射光学系）
光源３２は、予め測定試料に応じて定められた波長の光を照射する手段であり、ここから照射された光を、ＳＰＦ用プリズムにおける基体（プリズム）と金属膜との界面に、全反射条件を満たすように基体を通して入射させる入射光学系とを必要としているが、例えば、光源としてレーザなど単一波長であって、かつ、指向性の高いものを用い、光源が照射光３２を、基体１２と金属膜１４との界面に向けて、全反射条件を満たすように基体を通して入射させるように配置されている場合には、光源自体が入射光学系を構成しているため別の光学系を必要とせず、両者の機能を光源が兼ね備えることになる。また、他の態様として光源からの照射光を基体と金属膜との界面に向けて、全反射条件を満たすように基体を通して入射させるように制御しうるレンズやミラーなどからなる入射光学系を、光源とは別に設ける態様も挙げられる。
発光光源としては、通常は、波長が６３３ｎｍ程度の可視光を照射する半導体レーザが使用されるが、これに制限されず、公知の光源、例えば、ＬＥＤレーザーなどを適宜選択使用可能である。
光源から照射される光の励起波長は、標識となる色素など、測定対象や目的に応じて適宜選択され、一般的には、波長５３０〜８５０ｎｍ程度のものが使用される。
【００４０】
（蛍光検出手段）
光検出器３６としては、エバネッセント波に励起されて、試料中に含まれる物質が発した蛍光を検出することができれば、いずれの装置も用いることができ、例えば、ＣＣＤ、フォトダイオード（ＰＤ）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等の公知のものを適宜選択使用可能である。市販品としては、例えば、富士写真フイルム株式会社製  ＬＡＳ−１０００（商品名）などが好適に用いられる。
前記蛍光検出手段（ＬＡＳ−１０００）が検出対象としているのは、例えば、ＣＲＰ抗原（分子量１１万  Ｄａ）であり、この検出方法を説明するに、試料保持部にはＣＲＰ抗原と特異的に結合する１次抗体（モノクロナール抗体）が固定されている。この１次抗体は、例えば末端をカルボキシル基化したＰＥＧを介して、アミンカップリング法により、上記高分子化合物からなるバリア膜表面に固定される方法は、先に詳述したとおりである。
測定対象である２次抗体は、蛍光体（Ｃｙ５色素）で標識化したモノクロナール抗体であり、前記１次抗体とはエピトープ＜ｅｐｉｔｏｐｅ；抗原決定基＞が異なるものである。
【００４１】
以下、この蛍光センサの使用態様について、試料に含まれるＣＲＰ抗原を検出する場合について説明する。
まず本発明の表面プラズモン増強蛍光センサのＳＰＦ用プリズ１０における試料保持部２０の中において液体状の試料２８（一次試料）が流され、次いで同様に蛍光体２６で標識されて測定対象であるＣＲＰ抗原２２と特異的に結合する２次抗体２４が流される。なお上記Ｃｙ色素は、波長６３５ｎｍの励起光により励起されて、所定波長の蛍光を発するものである。
その後、ＳＰＦ用プリズム１０の基体１２と金属膜１６との界面に向けて光源３２から光３４が照射され、それにより基体１２と金属膜１６との界面からエバネッセント波が染み出すようになり、それを光検出器３６により蛍光検出する。
【００４２】
このとき、もし１次抗体１８にＣＲＰ抗原２２が結合していれば、さらに該ＣＲＰ抗原２２に２次抗体２４が結合し、その２次抗体２４の標識である蛍光体２６がエバネッセント波によって励起されることとなる。励起された蛍光体２６は所定波長の蛍光を発し、その蛍光は光検出手段３６によって検出される。こうして、光検出手段３６が所定波長の蛍光を検出した場合は、それにより、ＣＲＰ抗原２２に２次抗体２４が結合していること、すなわち試料２８中にＣＲＰ抗原２２が含まれていることを確認できる。
【００４３】
なお、エバネッセント波は、基体１２と金属膜１６との界面から数百ｎｍ程度の領域にしか到達しないため、試料中の不純物／浮遊物からの散乱により変動する懸念は殆どない。さらに、基体であるプリズム１２中の不純物が存在した場合でも、不純物による散乱光は通常の伝搬光であるため、金属膜１６により遮断されて、光検出手段３６に到達することがない。このよう理由により本発明の蛍光センサにおいては、光ノイズを殆ど皆無までに低減することができ、極めて高Ｓ／Ｎの蛍光検出が可能となる。
【００４４】
さらに、本発明の蛍光センサにおいては、基体１２表面に金属膜１６が形成され、ここで表面プラズモンが励起され、この表面プラズモンの電場増幅作用によって蛍光が増幅されて、より一層高Ｓ／Ｎの蛍光検出が可能となる。
また、金属膜１６上に膜厚が全領域にわたり均一な高分子化合物からなるバリア膜１８が設けられているので、試料中の蛍光体と金属膜１６との間に所定の距離が保持され、金属消光が抑制されるため、表面プラズモンによる電場増幅作用を確実に得て、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
（実施例１）
（ＳＰＦ測定用プリズムの作製）
基体１２として、日本ゼオン株式会社製  ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）  ３３０Ｒ（屈折率１．５０）を用いた。その表面に膜厚５０ｎｍの金（Ａｕ）膜１４をスパッタリング法により形成した。
金膜１４を形成したプリズム１２をエタノールで洗浄し、ＵＶオゾンクリーニングを行い、さらにエタノールで洗浄して、乾燥した。
洗浄後の基体を１１−メルカプト−１−ウンデカノールの１ｍＭエタノール溶液に窒素雰囲気下、室温で１時間浸漬し、窒素雰囲気下で乾燥することにより、ＯＨ基末端ＳＡＭ膜を形成した。その後、さらにピリジン２．１ｍｌ及びブロモイソブチルブロミド３．１ｍｌを脱水ＴＨＦ２５ｍｌに添加した溶液に、窒素雰囲気下、室温で３時間浸漬し、脱水ＴＨＦで洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥することにより、金属膜１４表面に重合開始剤を固定した。
【００４６】
重合開始剤を固定した基体を、アルゴン気流下、塩化銅及び２，２’−ビピリジルを触媒として、アクリル酸ナトリウム３．０質量％水溶液に浸漬し、窒素雰囲気下、室温にて２時間アクリル酸ナトリウム水溶液を攪拌し、重合反応させた後、純水で洗浄することにより、表面グラフト重合により形成されたポリアクリル酸からなるバリア膜１６を有する積層体を得た。
ここで、バリア膜１６の膜厚をＡＦＭ（セイコーインスツルメンツ社製：ＳＰＡ−５００）により、ＤＦＭモードで、カンチレバー：ＳＩ−ＤＦ４０Ｐ、走査エリア：１００μｍ、走査周波数：０．１Ｈｚの条件で金表面とバリア膜の段差を測定したところ、膜厚は２０ｎｍであった。膜厚の測定はプリズム表面の３箇所で行い、そのバラツキをＲＭＳの値から求めた結果、２０ｎｍ±０．２ｎｍであり、均一な膜厚のバリア膜が形成されたことが確認された。
なお、本実施例においては、プリズム基体に重合開始剤を固定する際に、プリズムの一部にマイラーテープを貼ることで、重合開始剤が固定されず、その後の重合反応が生じない領域を設けて、その後、バリア膜形成のための重合反応を行うことで、部分的にバリア膜を形成し、バリア膜非形成領域において露出している金属膜表面と形成されたバリア膜表面の段差を測定することにより、バリア膜の膜厚を測定した。
【００４７】
次に、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）０．１モルと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）０．４モルとを等体積混合した液を３０μリットル準備し、前記バリア膜表面に塗布して、３０分間室温で静置し、親水性基である末端の−ＣＯＯＨ基を活性化する工程を行い、ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄して、活性化されたカルボキシ基を有する試料保持部２０を形成し、実施例１のＳＰＦ用プリズムを得た。
【００４８】
（ＳＰＦ測定）
前記のようにして得られたＳＰＦ用プリズム表面に、１次抗体水溶液（５００μｇ／ｍｌ）を３０μｌ加え、３０〜６０分間室温静置し、一次抗体１８を固定化した。その後、ＳＰＦ用プリズムをＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を３０μｌ加え、２０分間室温静置した、さらにＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄することにより、未反応のカルボキシ基を封止した。
この一次抗体１８を固定化したＳＰＦ用プリズムに、測定対象である２次抗体として、蛍光体（Ｃｙ５色素）で標識化したモノクロナール抗体を用い、ＰＢＳバッファーで希釈して、５０μｇ／ｍｌの溶液を調製したもの３０μｌ接触させ、３０〜６０分間室温静置した。ここで用いられる２次抗体は、前記１次抗体とはエピトープ＜ｅｐｉｔｏｐｅ；抗原決定基＞が異なるものである。
【００４９】
光源としては波長６３０ｎｍの半導体レーザを用い、ＳＰＦ用プリズムのプリズムと金属膜との界面に向かって全反射条件で光照射した。蛍光の検出には、富士フイルム株式会社製ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（商品名）を用いた。
測定は１０回行った。その結果、蛍光発光の検出限界の最大値は２８ｆＭ、最小値は２１ｆＭであり、１０回測定の平均値は２４．５ｆＭであった。このことから、本発明のＳＰＦ用プリズムを用いて測定を行った場合、蛍光発光の測定限界のばらつきが小さく、測定精度に優れることがわかる。
【００５０】
（実施例２）
（ＳＰＦ測定用プリズムの作製）
基体１２として、日本ゼオン株式会社製  ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）  ３３０Ｒ（屈折率１．５０）を用いた。その表面に膜厚５０ｎｍの金（Ａｕ）膜１４をスパッタリング法により形成した。
金膜１４を形成したプリズム１２をエタノールで洗浄し、ＵＶオゾンクリーニングを行い、さらにエタノールで洗浄して、乾燥した。
洗浄後の基体を１１−メルカプト−１−ウンデカノールの１ｍＭエタノール溶液に窒素雰囲気下、室温で１時間浸漬し、窒素雰囲気下で乾燥することにより、ＯＨ基末端ＳＡＭ膜を形成した。その後、さらに（４−クロロメチル）ベンゾイルクロリドの２ｍＭ脱水トルエン溶液に、窒素雰囲気下、室温で１２時間浸漬し、脱水ＴＨＦで洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥することにより、金属膜表面に重合開始剤を固定した。
【００５１】
重合開始剤を固定した基体を、アルゴン気流下、２ｍＭに調整した臭化銅及びトリス−［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミンを触媒として、２−ビニルピリジンの２Ｍアセトニトリル溶液５ｍｌに浸潰し、窒素雰囲気下、室温で３時間攪拌し、重合反応させた後、アセトニトリルで洗浄することにより、表面グラフト重合により形成されたバリア膜１６を有する積層体を得た。
ここで、バリア膜１６の膜厚を実施例１と同様にして測定したところ、膜厚は２０ｎｍであった。膜厚の測定はプリズム表面の３箇所で行い、そのバラツキを測定したＲＭＳから求めたところ、２０ｎｍ±０．５ｎｍであり、均一な膜厚のバリア膜が形成されたことが確認された。
その後、実施例１と同様にして試料保持部を形成し、実施例２のＳＰＦ用プリズムを得た。
【００５２】
（ＳＰＦ測定）
前記のようにして得られた実施例２のＳＰＦ用プリズム表面に、１次抗体を実施例１と同様に固定化し、同様にしてＳＰＦを測定した。
測定は１０回行った。その結果、蛍光発光の検出限界の最大値は３０ｆＭ、最小値は２２ｆＭであり、１０回測定の平均値は２６ｆＭであった。このことから、本発明のＳＰＦ用プリズムを用いて測定を行った場合、蛍光発光の測定限界のばらつきが小さく、測定精度に優れることがわかる。
【００５３】
【表１】
2009042096.tif 000003
【００５４】
（比較例１）
（ＳＰＦ測定用プリズムの作製）
基体１２として、日本ゼオン株式会社製  ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）  ３３０Ｒ（屈折率１．５０）を用いた。その表面に膜厚５０ｎｍの金（Ａｕ）膜をスパッタリング法により形成した。
金膜を形成したプリズムをエタノールで洗浄し、ＵＶオゾンクリーニングを行い、さらにエタノールで洗浄して、乾燥した。
洗浄後の基体を１１−メルカプト−１−ウンデカノールの１ｍＭエタノール溶液に窒素雰囲気下、室温で１時間浸漬し、窒素雰囲気下で乾燥することにより、ＯＨ基末端ＳＡＭ膜により形成されたバリア膜を有する積層体を得た。
ここで、バリア膜の膜厚を実施例１と同様にして測定したところ、膜厚は２．５ｎｍであった。膜厚の測定はプリズム表面の３箇所で行い、そのバラツキを測定したＲＭＳから求めたところ、２．１ｎｍ±０．５ｎｍであり、均一な膜厚のバリア膜が形成されたことが確認された。
その後、実施例１と同様にして試料保持部を形成し、比較例１のＳＰＦ用プリズムを得た。
【００５５】
（ＳＰＦ測定）
前記のようにして得られた比較例１のＳＰＦ用プリズム表面に、１次抗体を実施例１と同様に固定化し、同様にしてＳＰＦを測定した。
測定は１０回行った。その結果、蛍光発光の検出限界の最大値は２０．０ｐＭ、最小値は１．０ｐＭであり、１０回測定の平均値は１５．５ｆＭであった。このことから、バリア膜の膜厚の均一性は高いが、形成された膜の膜厚が不十分であるため、比較例１のＳＰＦ用プリズムを用いて測定を行った場合、蛍光発光の検出感度が低く、実施例に比べ、測定感度に劣ることがわかる。これは、蛍光体と金属膜の距離が十分ではないため生じる金属消色の影響を受けたためと推測される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムの一態様を示す概略図である。
【図２】本発明の表面プラズモン増強蛍光センサの一例及びその使用態様を示す概略図である。
【図３】標識された物質を用いる蛍光法を実施する従来の蛍光測定用センサの一例を示す概略図である。
【図４】エバネッセント蛍光法を実施する従来の蛍光センサの一例を示す概略図である。
【図５】従来の表面プラズモン増強蛍光センサの構成の一例を示す概略図である。
【符号の説明】
【００５７】
１０  表面プラズモン増強蛍光測定用プリズム
１２    プリズム（誘電体ブロック）
１４    金属膜
１６    バリア膜
１８    １次抗体
２０    試料保持部
２２    検体
２４    ２次抗体
２６    蛍光体
２８    一次試料（試料）
３２    露光光源
３６    光検出器（蛍光検出器）
【図１】
2009042096.tif 000004
【図２】
2009042096.tif 000005
【図３】
2009042096.tif 000006
【図４】
2009042096.tif 000007
【図５】
2009042096.tif 000008