(57)【要約】【課題】  腫瘍に対するワクチン療法において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による免疫抑制効果を調節可能なものを提供すること。【解決手段】  腫瘍抗原に対する抗体を作成させるための免疫活性化剤と、ＧＩＴＲシグナルを起こさせるＧＩＴＲシグナル発生剤とを含むことを特徴とする抗腫瘍ワクチンによって達成される。このとき、免疫活性化剤は、腫瘍抗原をコードする核酸（ＤＮＡ）であり、ＧＩＴＲシグナル発生剤は、ＧＩＴＲＬまたはＧＩＴＲアゴニストポリペプチドをコードする核酸（ＤＮＡ）であることが好ましい。このとき、適当な担体（金粒子）に上記両剤をコートしておき、遺伝子銃で投与することができる。【選択図】          図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍抗原に対する抗体を作成させるための免疫活性化剤と、ＧＩＴＲシグナルを起こさせるＧＩＴＲシグナル発生剤とを含むことを特徴とする抗腫瘍ワクチン。
【請求項２】
前記免疫活性化剤が、前記腫瘍抗原をコードする核酸であることを特徴とする請求項１に記載の抗腫瘍ワクチン。
【請求項３】
前記ＧＩＴＲシグナル発生剤が、ＧＩＴＲＬまたはＧＩＴＲアゴニストポリペプチドをコードする核酸であることを特徴とする請求項１または２に記載の抗腫瘍ワクチン。
【請求項４】
前記免疫活性化剤が、前記腫瘍抗原をコードするＤＮＡであり、前記ＧＩＴＲシグナル発生剤が、ＧＩＴＲＬまたはＧＩＴＲアゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡであって、両剤が遺伝子銃で使用可能な担体にコートされていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の抗腫瘍ワクチン。
【請求項５】
前記ＧＩＴＲシグナル発生剤が、ＧＩＴＲアゴニスト的抗体、またはＧＩＴＲアゴニストであることを特徴とする請求項１または２に記載の抗腫瘍ワクチン。
【請求項６】
哺乳類に対して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の制御機構を調節しつつ、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法であって、腫瘍抗原に対する抗体を作成させるための免疫活性化剤を投与する際に、ＧＩＴＲシグナルを起こさせるＧＩＴＲシグナル発生剤を投与することを特徴とする腫瘍治療方法。
【請求項７】
前記免疫活性化剤が、前記腫瘍抗原をコードする核酸であることを特徴とする請求項７に記載の腫瘍治療方法。
【請求項８】
前記ＧＩＴＲシグナル発生剤が、ＧＩＴＲＬまたはＧＩＴＲアゴニストポリペプチドをコードする核酸であることを特徴とする請求項６または７に記載の腫瘍治療方法。
【請求項９】
前記免疫活性化剤が、前記腫瘍抗原をコードするＤＮＡであり、前記ＧＩＴＲシグナル発生剤が、ＧＩＴＲＬまたはＧＩＴＲアゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡであって、両剤を遺伝子銃に使用可能な担体にコートして、遺伝子銃で哺乳類に投与することを特徴とする請求項６〜８のいずれか一つに記載の腫瘍治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内における抗原特異的免疫反応の活性化に関し、さらに詳しくは腫瘍特異的細胞障害性Ｔ細胞による抗腫瘍活性の増強に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ガンに対する治療法として、免疫療法が期待されている。免疫療法は、生体内の免疫システムを利用した治療法の一つである。免疫応答の誘起と制御は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、抗体、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）の間の相互作用によって行われる。まず、外来抗原はＡＰＣに取り込まれてプロセシングを受け、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びII分子に結合した状態でヘルパーＴ細胞に提示される。ＭＨＣに結合した外来抗原がヘルパーＴ細胞により認識されると、Ｔ細胞の活性化が起こり、サイトカインが分泌され、抗原で刺激されたＢ細胞が抗体産生細胞へと分化するのを助けると共に、キラーＴ細胞の分化を促す。Ｂ細胞から分泌された抗体、及び活性化されたＴ細胞によって、抗原を提示する細胞が排除され、外来抗原を排除する細胞性・体液性の反応が進行する。
【０００３】
腫瘍拒絶反応においては、細胞性免疫が極めて重要であり、これには主としてＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が大きな役割を果たしている。ＣＤ８＋ＣＴＬは、試験管内及び生体内において、直接的に腫瘍細胞を破壊する能力を持つエフェクター細胞である。ＣＤ８＋ＣＴＬが持つ細胞障害活性は、ＭＨＣクラスＩに提示される抗原ペプチドに特異的に反応する。すなわち、ＣＤ８＋ＣＴＬが腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩにより提示される抗原を特異的に認識し、その腫瘍細胞を殺傷することによって腫瘍が排除される。
【０００４】
抗腫瘍免疫を活性化する方法の一つとして、腫瘍抗原を用いた癌ワクチン療法が期待されている。腫瘍抗原、すなわち腫瘍細胞上の標的分子をタンパク質やペプチドなどの形状で生体内に投与することにより、ＡＰＣが腫瘍抗原を取り込み、ＨＬＡペプチド複合体をＣＤ８＋ＣＴＬに提示することで、腫瘍特異的な細胞障害活性が引き起こされる。現在まで、様々な腫瘍抗原を用いた癌ワクチン療法に対する研究が試みられているが、癌患者に対する治療効果は、期待されるほどには認められていない。これは、現在までに同定されている腫瘍抗原の多くが自己抗原であるために、抗原反応性のＣＤ８＋ＣＴＬが免疫寛容に陥っていることが大きな原因であると考えられる。
【０００５】
生体内において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は、様々な免疫反応を抑制することにより、自己免疫寛容を誘導している。マウスにおいて、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を枯渇させると、自己抗原に対する自然発症性免疫とワクチンにより誘導される自己免疫を増強するという報告がある。また、自己抗原によりＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化すると、化学物質による腫瘍形成や腫瘍移植後の腫瘍転移を促進するという報告がある。ヒトにおいては、腫瘍局所においてＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の割合が高い場合には、ガン治療の予後が悪いという報告がある。更に、自然発症性もしくはワクチンによるＴ細胞の誘導は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞群により調節されている。
【０００６】
以上のことから、アジュバントやワクチンによりＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞群の作用を調節することが抗腫瘍効果の増強には必須であると考えられている。この点に着目した研究としては、例えば非特許文献１及び２に開示されたものがある。非特許文献１には、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（ＰＣ６１）を用いて、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を減少させると、抗腫瘍効果の増強が観察されたことが開示されている。また、非特許文献２には、ＧＩＴＲアゴニスト的モノクローナル抗体（ＤＴＡ−１）が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の免疫抑制効果を減少させることが開示されている。
【０００７】
【非特許文献１】Onizuka S, Tawara I, Shimizu J, Sakaguchi S, Fujita T, Nakayama E. Tumor rejection by in vivo administration of anti-CD25 (interleukin-2 receptor a) monoclonal antibody. Cancer Res. 1999;59:3128-3133
【非特許文献２】Shimizu J, Yamazaki S, Takahashi T, Ishida Y, Sakaguchi S. Stimulation of CD25＋CD4＋ regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat. Immunol. 2002;3:135-142
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、未だに満足できる抗腫瘍活性を生じさせるワクチン療法に関する研究はなされていない。
本発明は上記した事情に鑑みたものであり、その目的は、腫瘍に対するワクチン療法において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による免疫抑制効果を調節可能なものを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討の結果、腫瘍抗原を免疫する際に、ＧＩＴＲシグナルを発する物質を共投与することにより、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の免疫抑制効果を制御できることを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
こうして、上記目的を達成するための第１の発明に係る抗腫瘍ワクチンは、腫瘍抗原に対する抗体を作成させるための免疫活性化剤と、ＧＩＴＲシグナルを起こさせるＧＩＴＲシグナル発生剤とを含むことを特徴とする。
本発明において、前記免疫活性化剤が、前記腫瘍抗原をコードする核酸であることが好ましい。
【００１０】
また、本発明において、前記ＧＩＴＲシグナル発生剤が、ＧＩＴＲＬまたはＧＩＴＲアゴニストポリペプチドをコードする核酸であることが好ましい。
また、本発明において、前記免疫活性化剤が、前記腫瘍抗原をコードするＤＮＡであり、前記ＧＩＴＲシグナル発生剤が、ＧＩＴＲＬまたはＧＩＴＲアゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡであって、両剤が遺伝子銃で使用可能な担体にコートされていることが好ましい。
また、本発明において、前記ＧＩＴＲシグナル発生剤が、ＧＩＴＲアゴニスト的抗体、またはＧＩＴＲアゴニストであることが好ましい。
【００１１】
第２の発明に係る腫瘍治療方法は、哺乳類に対して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の制御機構を調節しつつ、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法であって、腫瘍抗原に対する抗体を作成させるための免疫活性化剤を投与する際に、ＧＩＴＲシグナルを起こさせるＧＩＴＲシグナル発生剤を投与することを特徴とする。
本発明において、前記免疫活性化剤が、前記腫瘍抗原をコードする核酸であることが好ましい。
また、本発明において、前記ＧＩＴＲシグナル発生剤が、ＧＩＴＲＬまたはＧＩＴＲアゴニストポリペプチドをコードする核酸であることが好ましい。
また、本発明において、前記免疫活性化剤が、前記腫瘍抗原をコードするＤＮＡであり、前記ＧＩＴＲシグナル発生剤が、ＧＩＴＲＬまたはＧＩＴＲアゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡであって、両剤を遺伝子銃に使用可能な担体にコートして、遺伝子銃で哺乳類に投与することが好ましい。
【００１２】
「腫瘍抗原」とは、細胞のガン化に伴って、その母細胞が保有する組織適合抗原、臓器・組織特異抗原など以外に新たに獲得され、免疫学的方法によって検出される抗原を意味する。本発明においては、腫瘍抗原は、腫瘍特異抗原（腫瘍細胞のみに存在し、他の正常細胞には見られない抗原）、または腫瘍関連抗原（他の臓器・組織あるいは異種異系の正常細胞に存在したり、発生・分化の途上において発現する抗原）を含む。ヒトの腫瘍抗原には、（１）遺伝子の構造や機能の変化によって発現する抗原（αＦＰやＣＥＡなどの胎児性抗原、悪性黒色腫のＭＡＧＥ抗原、異系の組織適合抗原、異所性ホルモン、形質細胞腫のイディオタイプ）、（２）腫瘍ウイルスやガン遺伝子産物（ＨＴＬＶのＴａｘタンパク質、乳ガンにおけるＥｒｂ−２）、（３）糖のガン性変化（血液型関連異常糖鎖、悪性黒色腫のガングリオシド、異好性抗原）などがある。本発明においては、いずれの腫瘍抗原を用いることもできるが、核酸によってコードされたタンパク性・ペプチド性のものが好ましく用いられる。また、腫瘍抗原が、タンパク性・ペプチド性の場合には、その腫瘍抗原全体を用いても良いが、抗原性が高いと認められる部分（特に、エピトープ）を用いることもできる。
【００１３】
「抗体」とは、抗原刺激の結果、免疫反応によって、Ｂ細胞の分化によって産生されるタンパク質を意味しており、ヒトでは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５種類が認められる。本発明においては、抗腫瘍効果を示すものであれば、抗体の種類は特定しない。
「免疫活性化剤」とは、免疫反応を活性化することにより、腫瘍抗原に対する免疫を活性化させるための剤を意味している。ここで、「免疫を活性化させる」とは、腫瘍抗原に対する抗体産生、腫瘍抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化などを意味している。免疫活性化剤としては、具体的には、腫瘍抗原そのもの、腫瘍抗原（の全部または一部）をコードした核酸（ＤＮＡ、またはＲＮＡが含まれるが、ＤＮＡが好ましく用いられる）が例示される。
【００１４】
「ＧＩＴＲ」とは、グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体ファミリー関連遺伝子（Glucocorticoid-induced TNF receptor-family related gene）またはその産物であるタンパク質を意味している。ＧＩＴＲは、細胞表面の膜貫通タンパク質受容体であり、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの一員である。ＧＩＴＲは、非活性化Ｔ細胞上に構築的に存在することが示されており、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）と称する別の膜貫通タンパク質に結合する。ＧＩＴＲに対するアゴニスト的（作動性）抗体であるＤＴＡ−１は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の抑制活性を阻害することが知られており、これらの細胞の活性を制御することにおいてＧＩＴＲに対して機能的な役割を示す。
【００１５】
「ＧＩＴＲシグナル」とは、ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとが結合し、ＧＩＴＲが作動することにより、Ｔ細胞内に発せられる信号を意味している。本発明においては、このシグナルを具体的に電気信号等として取り出される必要はなく、ＧＩＴＲが作動したときに、次の過程を順次に経ることにより、結果的にＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の抑制活性を阻害することができればよい。
「ＧＩＴＲシグナル発生剤」とは、ＧＩＴＲシグナルを起こさせるものを意味しており、具体的には、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲアゴニスト、アゴニスト的ＧＩＴＲ抗体（ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体が含まれるが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる）が含まれる。
「ＧＩＴＲアゴニスト」とは、ＧＩＴＲシグナルを起こさせる作動剤のことを意味しており、非ペプチド性の化合物、またはポリペプチド性のＧＩＴＲアゴニストポリペプチドが含まれる。
【００１６】
ＧＩＴＲＬまたはＧＩＴＲアゴニストポリペプチドは、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）によって、体内で発現可能な形として製造することができるので、体内投与の際に有利な形態となる。
免疫活性化剤として、腫瘍抗原をコードするＤＮＡとし、ＧＩＴＲシグナル発生剤として、ＧＩＴＲＬまたはＧＩＴＲアゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡとして、両ＤＮＡが体内で発現可能な形態としておき、これを遺伝子銃で使用可能な担体にコートすることが好ましい形態となる。このとき、免疫活性化剤としてのＤＮＡと、ＧＩＴＲシグナル発生剤としてのＤＮＡとは、同じ分子（すなわち、一つのベクター中に腫瘍抗原をコードするＤＮＡと、ＧＩＴＲＬまたはＧＩＴＲアゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方をコードしたもの）として構成することもできるし、別々の分子として構成することもできる。
【００１７】
「遺伝子銃」とは、ガスなどの圧力によって、細胞・組織・生体などの標的部位に核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を導入するための遺伝子導入法の一つである。核酸は、適当な担体（例えば、金粒子）の表面にコートされた状態で標的部位に打ち込まれる。
免疫活性化剤、またはＧＩＴＲシグナル発生剤を生体内で発現可能な組換え組換えベクターとする場合には、そのようなベクターとしてプラスミド、ファージ、コスミド、ウイルス、及び本技術分野において従来用いられているその他のベクターを用いることができる。当業者であれば、例えば、edit. Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.)、及び、edit. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987) John Wiley & Sons等に記載された技術により、様々なプラスミド及びベクターを構築することができる。
【００１８】
遺伝子発現用に使用するプロモーター、ターミネーター等の宿主内における発現制御を行う因子は、当業者であれば宿主の種類及び目的に応じて公知の制御配列から適宜選択し、腫瘍抗原遺伝子・ＧＩＴＲＬ遺伝子・ＧＩＴＲアゴニストポリペプチド遺伝子の上流及び／または下流に配置することが可能である。このとき、腫瘍抗原遺伝子・ＧＩＴＲＬ遺伝子・ＧＩＴＲアゴニストポリペプチド遺伝子由来の制御配列を用いてもよいし、異種の制御配列を用いることもできる。また、必要に応じて、抗生物質耐性マーカー等のマーカーを発現ベクターに用いることもできる。本発明におけるワクチン（免疫活性化剤またはＧＩＴＲシグナル発生剤であって、ＤＮＡから構成されるもの）は、プラスミドとしてそのまま使用可能であるが、リポソーム内へのパッケージ、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター及びＨＶＪベクター等の各種ウイルスベクターとして形成することができる(例えば、K. Adolph “ウイルスゲノム法” CRC Press, Florida (1996) 参照)。また、コロイド金粒子等の担体にコートして用いることができる。担体粒子をポリヌクレオチドでコートする技術は公知である(例えば、WO93/17706参照)。
【００１９】
本発明の抗腫瘍ワクチンは、いかなる方法により投与することもできるが、適当な非経口経路、例えば静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃法(電子銃等による)、点鼻薬等の形態での粘膜経路を介する方法等により投与することが好ましい。これらの投与方法うち、加速粒子による遺伝子形質転換技術は、米国特許第4,945,050号、第5,240,842号等にも記載されており、その改良法に基づく装置も市販されている(Biorad Laboratories)。
【００２０】
本発明における哺乳類の種類は特に限定されないが、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、猫、豚、ヒツジ、牛、馬、並びに、サル及びヒト等の霊長類が含まれる。これらのうち、ヒトがより好ましい。
本発明において用いられる抗腫瘍ワクチンの投与量は、疾患の種類、程度、性別、年齢、体重、投与経路等によって異なり、それぞれ適当な量を用いることができるが、通常は一回あたり０.００１μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０.０１μｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは０.１μｇ〜１００μｇを投与する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、腫瘍に対するワクチン療法において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による免疫抑制効果を調節可能な抗腫瘍ワクチン等を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
＜材料及び方法＞
マウス
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスは７週齢〜１０週齢のものを日本クレアから購入し、三重大学医学部動物センターにて飼育した。実験プロトコールについては、三重大学医学部の倫理委員会の承認を得た。
【００２３】
ガン細胞
ＣＭＳ５は、ＢＡＬＢ／ｃ由来の細胞株を３−メチルコラントレンで誘導されたザルコーマ細胞株である。ＣＭＳ５ａは、ＣＭＳ５から得られたサブクローン細胞株であり、変異ＭＡＰキナーゼ及び変異ＥＲＫ２（ｍＥＲＫ２）を発現する腫瘍細胞である。Ｐ１．ＨＴＲは、ＤＢＡ／２由来の肥満細胞腫Ｐ８１５のサブクローン細胞株である。
遺伝子銃による免疫
プラスミドＤＮＡ（インジェクション当り１μｇ）をコートした金粒子を調製し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの剃毛した腹壁に注射した。注射には、ヘリオス・ジーン・ガン・システム（バイオラド社製）を使用した。注射時のヘリウムガス圧力は、３５０〜４００ｐｓｉとした。
【００２４】
抗体と試薬
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ４抗体（ＧＫ１.５、ラットＩｇＧ２ｂ）及び抗ＣＤ８抗体（１９／１７８、ラットＩｇＧ２ｂ）を尾静脈に投与することにより取り除いた。抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（１４５−２Ｃ１１、ハムスターＩｇＧ１）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４ｍＡｂ（ＧＫ１.５、ラットＩｇＧ２ｂ）、抗ＣＤ８ｍＡｂ（５３−６.７、ラットＩｇＧ２ａ）、及びＰＥ結合抗ＣＤ２５ｍＡｂ（３Ｃ７、ラットＩｇＧ２ｂ）は、ＢＤバイオサイエンスから購入した。合成ｍＥＲＫ２１３６−１４４−９ｍペプチド（アミノ酸配列：ＱＹＩＨＳＡＮＶＬ）、及びＨＥＲ２ｐ６３−７１（Ｔ）ペプチド（アミノ酸配列：ＴＹＬＰＴＮＡＳＬ）は、宝酒造株式会社から購入した。ＣＴＬエピトープ９ｍを含むｍＥＲＫ２の領域をコードするｃＤＮＡは、ｐＣＡＧＧＳ−Ｎｅｗにクローニングし、エンドフリー・プラスミド・ミクシー・キット（キアゲン社）を用いて精製した。ｐＣＡＧＧＳ−Ｎｅｗは、阪大の宮崎博士からの提供を受けた。マウスＧＩＴＲＬ  ｃＤＮＡは、後述のプライマーを用いて、マウス脾臓ｃＤＮＡライブラリーから逆転写し、ｐＣＤＮＡ３.１（インビトロージェン社）にクローニングした後、エンド・フリー・プラスミド・マクシー・キット（キアゲン社）にて精製した。
【００２５】
フローサイトメトリー及びテトラマー染色
細胞は、２％ウシ胎児血清を含むＰＢＳに４℃にて１５分間の処理を行い、表面を染色した後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  フローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社）にて解析した。テトラマー染色は、既報（Nishikawa H, Sato E, Briones G, Chen LM, Matsuo M, Nagata Y, Ritter G, Jager E, Nomura H, Kondo S, Tawara I, Kato T, Shiku H, Old LJ, Galan JE, Gnjatic S. In vivo antigen delivery by a Salmonella typhimurium type III secretion system for therapeutic cancer vaccines. J Clin Invest. 2006;116:1946-1954）に従って実施した。簡単に説明すると、次の通りである。ＣＤ８＋Ｔ細胞をＦＩＴＣ−ＣＤ８モノクローナル抗体（ＢＤバイオサイエンス社）にて４℃、１５分間染色した後、ＰＥ標識９ｍ−Ｋｄテトラマー（ルートビッヒ協会コア機関（Ludwig Institute Core Facility）のギルモア博士らによる調製）にて３７℃、１５分間染色した。細胞を洗浄後、細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）にて解析した。
【００２６】
細胞の精製
脾細胞を抗ＣＤ８マイクロビーズ（ミルテニュイ・バイオテック社）と混合した後、ＭＡＣＳカラムを用いた陽性選択によりＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。得られたＣＤ８＋Ｔ細胞は、更に９５％以上の純度となるまで精製した。いくつかの実験においては、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞は、更にＦＩＴＣ抗ＣＤ８染色及びＰＥ−９ｍ−Ｋｄテトラマー染色後にＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社）によりＣＤ８＋９ｍ−Ｋｄテトラマー＋Ｔ細胞に精製した。このＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の純度は、９９％以上であった。ＣＤ４＋単離キット（ミルテニュイ・バイオテック社）を用いた陰性選択によりＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した後、ＦＩＴＣ抗ＣＤ２５抗体とＰＥ抗ＣＤ４抗体を用いた染色処理し、ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社）にてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を精製した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の純度は、９９％以上であった。
【００２７】
酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ
ＩＦＮ−γを分泌するペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の個数は、既報に従ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって調べた。その方法を簡単に示すと以下の通りである。ラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体（Ｒ４−６Ａ２、ファルミンジェン（PharMingen）社製）をコートした９６穴ニトロセルロースコート・マイクロタイタープレート（ミリポア社製）に、精製した１ｘ１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞を、ｍＥＲＫ２１３６−１４４−９ｍまたはＨＥＲ２ｐ６３−７１（Ｔ）ペプチドでパルス刺激した１ｘ１０５個のＭＭＣ−処理Ｐ１.ＨＴＲと共に２４時間培養した。ビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１.２、ファルミンジェン社製）、アルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジン（マブテック（MABTECH）社製）、及びアルカリフォスファターゼ基質キット（バイオラド社製）を用いてスポットを発育させた後に、その数をカウントした。
【００２８】
腫瘍の誘導
５匹のマウスのそれぞれの右後背部の皮下に１ｘ１０６個のＣＭＳ５ａを含むＰＢＳ（０.２ｍｌ）を投与し、腫瘍の発育を１週間に渡って観察した。直径が５ｍｍより大きな腫瘍を原発腫瘍として計数した。
増殖試験
９ｍ単独またはＧＩＴＲＬと共に免疫したマウスから得られたＣＤ８＋９ｍ−Ｋｄテトラマー＋Ｔ細胞（１ｘ１０４個）を、ワイルドタイプＢＡＬＢ／ｃマウス由来の放射能処理した脾臓のＴｈｙ−１−抗原提示細胞（ＡＰＣ）（５ｘ１０４個）と共に、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体の存在下、９６穴フラット底プレートで培養した。
この培養系において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を加えた。７２時間の培養時間のうち最後の６時間に、１穴あたり０.５μＣｉの［３Ｈ］チミジンを添加することにより、細胞増殖を評価した。［３Ｈ］チミジンの取り込みをシンチレーションカウンターにより測定した。
統計解析
統計的な有意差は、スチューデントｔ検定により評価した。
【００２９】
＜試験結果＞
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導は、ＧＩＴＲＬの投与の有無によって評価した。
本発明者らは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期または／及びメモリー反応をＧＩＴＲシグナルが増強させるか否かを評価した。初回免疫、追加免疫、または両免疫におけるＧＩＴＲシグナルの効果を調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、ＣＭＳ５に対する腫瘍拒絶抗原であるｍＥＲＫ２をコードしたプラスミドを単独で、またはマウスＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドと共に、２回の免疫を行った。２回目の免疫から１週間後に脾臓からＣＤ８＋Ｔ細胞を調製し、特異的Ｔ細胞の誘導をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。図１（Ａ）に示すように、マウスＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドを初回免疫または初回免疫と追加免疫との両方で、ｍＥＲＫ２をコードしたプラスミドと共に投与した群では、ｍＥＲＫ２をコードしたプラスミドのみを投与した群に比べると、約１０倍の特異的Ｔ細胞が誘導された。これに対し、追加免疫の際にｍＥＲＫ２をコードしたプラスミドとマウスＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドを共に投与した群では、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導の効果は限定されたものとなった。
【００３０】
ＧＩＴＲＬによるＧＩＴＲシグナルは、ＧＩＴＲアゴニスト的モノクローナル抗体によるＧＩＴＲシグナルに比べると、特異的Ｔ細胞の誘導を強めやすい。
従来の知見によれば、マウスに対して、ヒトｇｐ１００を免疫するときに、抗ＧＩＴＲアゴニスト的モノクローナル抗体（ＤＴＡ−１）を共に投与すると、特異的Ｔ細胞の誘導が強化されることが知られている。この知見に基づき、我々は、ＧＩＴＲＬシグナルが、ＤＴＡ−１と同様に、特異的Ｔ細胞の誘導を強化するか否かを調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、９ｍをコードしたプラスミドの単独投与、９ｍをコードしたプラスミドとマウスＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドとの共投与、９ｍをコードしたプラスミドとＤＴＡ−１との共投与を２回に渡って免疫した。２回目の免疫から１週間後に脾臓からＣＤ８＋Ｔ細胞を調製し、特異的Ｔ細胞の誘導をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。驚いたことに、マウスＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドを経由したＧＩＴＲシグナルは、ＧＩＴＲアゴニスト的モノクローナル抗体によるＧＩＴＲシグナルに比べると、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のエピトープである９ｍ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導について、より有効に働くことが分かった（図２）。
【００３１】
ＧＩＴＲＬの共投与によって、投与された腫瘍細胞の拒絶は、ＣＤ８依存的に強化される。
次いで我々は、ＣＭＳ５ａモデル系における腫瘍からの回復能力を調べることにより、ＧＩＴＲシグナルが腫瘍拒絶効果の増強を示すか否かを調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに１ｘ１０６個のＣＭＳ５ａ細胞を接種した。腫瘍接種と同日に、遺伝子銃によって、マウスに対する免疫を行った。腫瘍の増殖を見るために、腫瘍の大きさを１週間あたりに３回計測した。コントロール群に比べると、ＣＴＬエピトープ９ｍをコードしたプラスミドを免疫した群では、腫瘍増殖を遅延させたものの、ＣＭＳ５ａ腫瘍を完全には排除できなかった。これに対し、ＣＴＬエピトープ９ｍをコードしたプラスミドとＧＩＴＲＬとを共免疫した群では、ＣＭＳ５ａ腫瘍を排除することができた（図３（Ａ））。
【００３２】
腫瘍退行を誘導するためのＧＩＴＲシグナルを起こさせる共投与物のメカニズムを探るために、ＧＩＴＲシグナルを起こす物質を共投与された腫瘍細胞接種マウスからＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞を取り除いたときの効果を確認した。抗ＣＤ８モノクローナル抗体を投与すると、ＧＩＴＲシグナルを起こす物質を共投与されたときの効果は、著しく減少した。これに対し、抗ＣＤ４モノクローナル抗体を投与した場合には、ＧＩＴＲシグナルを共投与されたときの腫瘍退行は影響を受けなかった（図３（Ｂ））。これらの結果より、ＧＩＴＲシグナルを起こす物質を共投与されたときの効果は、ＣＤ８依存的であることがわかった。
【００３３】
９ｍをコードしたプラスミドとＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドとを共免疫したマウスから調製された腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制効果に対抗し得る。
最近の研究によれば、腫瘍部位には多数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が存在しており、この制御性Ｔ細胞が抗腫瘍反応を起こすためのシグナルを押さえているらしい。ＧＩＴＲシグナルを起こす物質を共投与されたときの腫瘍退行効果について、ＧＩＴＲシグナルがＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の抗腫瘍反応抑制活性に影響を与えるか否かを評価した。ＧＩＴＲシグナルがＣＤ８＋Ｔ細胞を通して直接に作用するというデータに基づき、９ｍをコードするプラスミドとＧＩＴＲＬをコードするプラスミドとを共免疫されたマウスでは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の抑制反応に対抗し得るのではないかと考えた。
【００３４】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対し、９ｍをコードしたプラスミドのみの免疫（９ｍ）、９ｍをコードしたプラスミドとマウスＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドとの共免疫（９ｍ＋ＧＩＴＲＬ）を２回づつ行い、ＣＤ８＋９ｍＫｄテトラマー＋Ｔ細胞に該当する９ｍ特異的Ｔ細胞（ＣＴＬ）の個数を調べたところ、９ｍをコードしたプラスミドのみで免疫した群に比べると、９ｍをコードしたプラスミドとＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドとの両方を免疫した群では、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによれば、４倍の個数が認められた。ＣＤ８＋Ｔ細胞を調整した後、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いて、ＣＴＬエピトープ９ｍ特異的Ｔ細胞を精製したところ、純度は９９％以上であった。ＢＡＬＢ／ｃマウス（何の抗原免疫をしていないもの）の脾臓から調整した１ｘ１０４個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を、１ｘ１０４個のＣＤ８＋９ｍ−Ｋｄテトラマー＋Ｔ細胞と、放射線処理後ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から調整した５ｘ１０４個のＴｈｙ−１−抗原提示細胞とに加え、抗ＣＤ３モノクローナル抗体と共に培養した。細胞増殖は、前述の方法に従って評価した。
【００３５】
ＣＴＬエピトープ９ｍをコードしたプラスミドのみで免疫したマウスから得られたＣＤ８＋９ｍ−Ｋｄテトラマー＋Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞によって、完全に抑制された。これに対し、ＣＴＬエピトープ９ｍとＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドで免疫したマウスから得られたＣＤ８＋９ｍ−Ｋｄテトラマー＋Ｔ細胞の増殖能は維持されていた（図４）。上記２種類の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面抗原を調べたが、際だった相違は認められなかった。これらの結果より、初回及び追加免疫の際にＧＩＴＲシグナルを起こす物質を共投与することにより、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の細胞増殖抑制効果を減少させられることがわかった。
【００３６】
＜考察＞
我々は、マウスＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドを作成し、この分子の能力について、次の（１）〜（３）を評価した。（１）抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導が増強されるか否か、（２）腫瘍拒絶能力が増強されるか否か、及び（３）抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の細胞増殖抑制効果に対抗しうるか否か。マウスに対して、ＣＭＳ５ａの腫瘍拒絶抗原であるｍＥＲＫ２とマウスＧＩＴＲＬとをコードしたプラスミドを初回及び追加免疫の際に用いたところ、１０倍の抗原特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導された（図１（Ａ））。更に、ＣＴＬエピトープ９ｍとＧＩＴＲＬとをコードしたプラスミドを共免疫したところ、ＣＴＬエピトープ９ｍをコードしたプラスミドを単独で免疫した場合には得られなかったＣＭＳ５ａ腫瘍排除能が認められた（図３（Ａ））。これらのデータは、ＧＩＴＲシグナルを生じさせるものを癌抗原と同時に投与することにより、癌ワクチンの効果を増強できることを示している。
【００３７】
ＣＴＬエピトープ９ｍ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導させる場合に、ＧＩＴＲアゴニスト的モノクローナル抗体を通してＧＩＴＲシグナルを生じさせる場合に比べると、ＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドを通してＧＩＴＲシグナルを生じさせた方が、より効果が高いことがわかった（図２）。このことは、ＣＴＬエピトープとマウスＧＩＴＲＬとをコードしたプラスミドを同じ抗原提示細胞に取り込ませることが可能なヘリオス・ジーン・ガン・システムを用いたことに依るのかも知れない。つまり、モノクローナル抗体の場合には、全身投与となるために、ＧＩＴＲシグナルの作用がＣＴＬエピトープを取り込んだ抗原提示細胞で働くとは限らないからである。今回のモノクローナル抗体の投与量が最適でなかったために、十分な効果が得られなかった可能性がある。しかし、ＧＩＴＲアゴニスト的抗体を過剰に投与すると、免疫寛容状態が崩れてしまい、致命的な自己免疫疾患を引き起こすことが知られている。このように、ＧＩＴＲシグナルの調節は難しいが、遺伝子銃（遺伝子銃）を用いることにより、ガン抗原を取り込んだ抗原提示細胞と同じ細胞中にＧＩＴＲシグナルを生じさせることができるので、効果的であると考えられる。
【００３８】
標的細胞へのＧＩＴＲＬの導入効果を増強するために、ｍＥＲＫ２から得られた腫瘍特異的ＣＴＬエピトープ９ｍをコードしたミニジーンプラスミドを作成し、ｍＥＲＫ２の全配列を用いた場合のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化を避けた。また、抗ＣＤ４モノクローナル抗体を用いることにより、免疫操作を行っている間のＣＤ４＋Ｔ細胞を排除した。ＣＴＬエピトープ９ｍとマウスＧＩＴＲＬとをコードしたミニジーンプラスミドで免疫したマウスと、抗ＣＤ４モノクローナル抗体を投与したマウスでは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導増強には影響が認められなかったことから、ＧＩＴＲＬは直接的にＣＤ８＋Ｔ細胞に作用していると考えられた。この仮説は、ＧＩＴＲＬの共投与による腫瘍排除能力の増強が抗ＣＤ８モノクローナル抗体によって完全に抑制されたことによっても裏づけられる。これに対し、抗ＣＤ４モノクローナル抗体を投与した場合には、ＧＩＴＲＬの共投与による腫瘍排除能力の増強効果には、影響が見られなかった（図３（Ｂ））。
【００３９】
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体が抗原特異的活性化Ｔ細胞を排除している可能性は残るものの、上記データによれば、ＧＩＴＲＬは抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して直接的に作用し、ＣＤ４＋Ｔ細胞、特にＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞には関与が少ないことがわかった。今回得られたデータは、ＧＩＴＲ刺激がＣＤ８＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖活性を増強させ、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖活性は刺激しないという従来の知見と一致するものである。一方、ＧＩＴＲアゴニスト的モノクローナル抗体を用いたＤＮＡ免疫による特異的Ｔ細胞の誘導は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の除去によって減少することが知られている。このことは、遺伝子銃を用いたときのＧＩＴＲシグナルと、モノクローナル抗体を用いたときのＧＩＴＲシグナルとが、異なる形態を取っていることを示しているのかも知れない。
【００４０】
最近になって、異種ＤＮＡ免疫単独の場合に比べると、異種ＤＮＡ免疫とＧＩＴＲアゴニスト的モノクローナル抗体とを組み合わせることによって、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導が増強されること、及びＧＩＴＲアゴニスト的モノクローナル抗体（ＤＴＡ−１）は初回免疫ではなく、追加免疫の際に共投与することによって、その効果が認められることが示された。更に、初回免疫及び追加免疫の両方にＤＴＡ−１を投与すると、細胞死を誘導してしまうことも示されている。この知見は、今回の我々の結果とは、著しい対比を示すものである。本研究では、遺伝子銃モデルを用いることにより、更に良好な結果を得ることができた。マウスに対して、ヒトＨＥＲ２をコードしたプラスミドを単独で或いはマウスＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドと共に２回の免疫を行うことにより、ＨＥＲ２とマウスＧＩＴＲＬとをコードしたプラスミドを追加免疫のときにのみ投与した場合に比べると、ＨＥＲ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増強が認められた。
【００４１】
これに対しマウスに、ＨＥＲ２とマウスＧＩＴＲＬとをコードしたプラスミドを初回及び追加免疫の際、または初回免疫の際に用いた場合には、ＨＥＲ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は減少した。これらのデータは従来の知見と矛盾しないものであり、ＧＩＴＲシグナルを臨床的に用いる場合には、重要な知見となる。ヒト腫瘍抗原はほとんどの場合に自己抗原なので、本研究で用いたヒト腫瘍抗原に関する実験系は臨床応用に際して非常に重要なものである。異種抗原とマウス腫瘍自己抗原とを用いた場合の免疫反応の相違は、ＧＩＴＲシグナルを同時に生じさせたときに（特に低濃度の抗ＣＤ３抗体を用いた場合）、ほぼ適当な抗原刺激が認められるという従来の知見と同様に、もっともらしい。
【００４２】
驚くべきことに本研究では、９ｍとＧＩＴＲＬとをコードしたプラスミドで免疫したマウスから得られたＣＴＬエピトープ９ｍ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による免疫抑制反応に対抗し得ること、及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の腫瘍局所への浸潤にも対抗して腫瘍拒絶効果を発揮し得ることがわかった。ＧＩＴＲによる刺激によってＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の活性が抑制されてしまうという可能性も否定はできないが、ＧＩＴＲシグナルは培養期ではなく免疫時にのみ作用していることから考えると、ＧＩＴＲシグナルはＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞に対して直接に作用するのではなく、ＣＴＬエピトープ９ｍ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に作用を及ぼすものと考えられた。現在までに同定されているほとんどのヒト腫瘍抗原は自己抗原であることからすると、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による免疫抑制活性を打破することは、非常に重要なポイントである。全身的にＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の活性を落としてしまい、非特異的な制御メカニズムを阻害してしまうと、自己免疫疾患を生じさせてしまう。そこで、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を調節しつつ、抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞に対抗する制御性Ｔ細胞のみを抑制することが癌ワクチンの開発にとって重要である。
このように本実施形態によれば、腫瘍に対するワクチン療法において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による免疫抑制効果を調節可能なものを提供することできた。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導は、ＧＩＴＲＬを共投与することによって増強されることを示すグラフである。  （Ａ）ＢＡＬＢ／ｃに対して、ｍＥＲＫ２をコードするプラスミドを単独で投与、またはマウスＧＩＴＲＬをコードするプラスミドを共投与したときの結果を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、２度目の免疫から１週間後に脾臓から調製し、特異的Ｔ細胞の誘導は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより調べた。標的細胞は、ｍＥＲＫ２１３６−１４４−９ｍ−パルス投与Ｐ１．ＨＴＲ（黒棒）またはＨＥＲ２ｐ６３−７１（Ｔ）−パルス投与Ｐ１．ＨＴＲ（白棒）である。  （Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃに対して、９ｍをコードするプラスミドを単独で投与、またはマウスＧＩＴＲＬをコードするプラスミドを共投与したときの結果を示す。ランゲルハンス細胞におけるＧＩＴＲＬの発現は、フローサイトメトリーによって調べた。  これらの実験は、２回〜４回に渡って、同様の結果が得られた。データは、平均値±ＳＤで示した。
【００４４】
【図２】ＧＩＴＲアゴニスト的モノクローナル抗体を経由したＧＩＴＲシグナルに比べると、ＧＩＴＲＬを経由したＧＩＴＲシグナルの方が、特異的Ｔ細胞の誘導効果が強いことを示すグラフである。  ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、９ｍをコードしたプラスミドを単独で免疫、またはマウスＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドと共に免疫した。右端の群には、抗ＧＩＴＲアゴニスト的モノクローナル抗体（ＤＴＡ−１）を共投与した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、２度目の免疫から１週間後に脾臓から調製し、特異的Ｔ細胞の誘導は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより調べた。標的細胞は、図１に示したものと同じである。実験は、２回実施し、同様の結果を得た。データは、平均値±ＳＤで示した。
【００４５】
【図３】ＧＩＴＲＬの共投与により、ＣＤ８Ｔ細胞依存的に腫瘍拒絶効果が認められたことを示すグラフである。  （Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して１ｘ１０６個のＣＭＳ５ａを皮下投与し、９ｍをコードするプラスミドを単独で免疫、またはマウスＧＩＴＲＬをコードするプラスミドを共投与した。  （Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して１ｘ１０６個のＣＭＳ５ａを皮下投与し、９ｍをコードするプラスミドを単独で免疫、またはマウスＧＩＴＲＬをコードするプラスミドを共投与した。このとき、抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ＧＫ１.５）、または抗ＣＤ８モノクローナル抗体（Ｌｙｔ−２.２）を投与した群を設けた。  各群には５匹のマウスを使用した。マウスは、１週間について、３度の観察を行った。実験は、２回〜４回行い、同様の結果を得た。データは、平均値±ＳＤで示した。
【００４６】
【図４】９ｍとＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドで免疫したマウスから得られた腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の免疫抑制効果に対抗し得ることを示すグラフである。  ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、９ｍをコードしたプラスミドを単独で、またはマウスＧＩＴＲＬをコードしたプラスミドと共に、２回投与した。ＣＤ８＋９ｍ−Ｋｄテトラマー＋Ｔ細胞は、ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターによって分離した。ＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓由来ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を調製し、１ｘ１０４個のＣＤ８＋９ｍ−Ｋｄテトラマー＋Ｔ細胞と、５ｘ１０４個の放射能処理後ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓由来Ｔｈｙ−１−抗原提示細胞との培養系に加え、ＣＤ３モノクローナル抗体存在下で培養した。実験は２回実施し、同様の結果を得た。データは、平均値±ＳＤで示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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