(57)【要約】      （修正有）【課題】優れた破骨細胞分化抑制作用を有する破骨細胞分化抑制剤の提供。【解決手段】骨組織は破壊（骨吸収）と形成（骨形成）との動的なサイクルによって維持され、骨吸収および骨形成は、それぞれ破骨細胞および骨芽細胞が担っている。上記破骨細胞と骨芽細胞での活性バランスが崩れると骨粗鬆症のリスクが高まるが、骨カテキンの一種であるところのエピガロカテキンガレートが骨代謝の改善効果を示し、有効な破骨細胞分化抑制剤であることを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピガロカテキンガレートを有効成分とする破骨細胞分化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞分化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織は、破壊（骨吸収）と形成（骨形成）との動的なサイクルによって維持され、骨吸収および骨形成は、それぞれ破骨細胞および骨芽細胞が担っている。
破骨細胞は、骨芽細胞によって生成されるＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ；ＲＡＮＫＬ）およびＭ−ＣＳＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）によって刺激されて単核の破骨細胞前駆細胞から分化し、その後、成熟することが知られている。
【０００３】
骨組織は、通常の状態では、破骨細胞と骨芽細胞との間で活性のバランスが保たれることにより、骨の形と量は維持される。
骨形成速度よりも骨吸収速度が高くなることにより、上記バランスが崩れると、骨に小さな穴が多発し、骨密度が低下して骨の強度が弱まり脆弱性骨折リスクが高まる。このような状態が骨粗鬆症である。骨粗鬆症は、閉経期以降の女性や高年齢の男性に多く見られる症状であり、罹患者のＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ：生活の質）を著しく低下させることから、現代の高齢化社会にとって大きな問題となっている。
【０００４】
骨粗鬆症の予防方法及び治療方法としては、（１）カルシウムやカルシウム吸収促進剤の摂取による骨形成促進、（２）骨吸収抑制剤の摂取による骨吸収抑制が知られている。
【０００５】
カルシウム吸収促進剤としては、ツイントース（特許文献１）、フラクトオリゴ糖（特許文献２）、カゼインホスホペプチド（特許文献３）、クエン酸リンゴ酸カルシウム（特許文献４）等の種々の化合物が既に知られている。しかしながら、こうした食品によるカルシウム吸収促進では、閉経に伴う急激な骨量の減少を防止するには不十分であるという問題がある。従って、閉経に伴う急激な骨量の減少を防止するためには、積極的に骨吸収を抑えることが望ましい。
一方、骨吸収を抑制する薬剤として、ビスホスフォネート製剤や選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、カルシトニン製剤等が既に知られている（非特許文献１〜３）。また、骨吸収抑制作用を有する食品成分として、玉ねぎ等に含まれるケルセチンやウコン等に含まれるクルクミン、温州ミカン等に含まれるβ−クリプトキサンチンが既に知られている（非特許文献４〜６）。
【０００６】
緑茶、紅茶、カカオ豆等に含まれるカテキン類は、コレステロール上昇抑制作用（特許文献５）、血糖上昇抑制作用（特許文献６）を有することが広く知られており、骨に対しては、カテキン類を含有するバラ科、ツバキ科またはクワ科植物より選ばれる富ポリフェノール抽出物が骨吸収作用を抑制すること（特許文献７）、カテキン類の一種であるエピガロカテキンガレートが、未熟骨芽細胞における細胞死に対して、二相性の防御効果を発揮し、骨形成を促進すること（特許文献８）が既に知られている。
【０００７】
しかし、エピガロカテキンガレートが、良好な破骨細胞分化抑制作用を有することはこれまで知られていなかった。
【特許文献１】特開平１１−４３４３８号公報
【特許文献２】特開平７−２５２１５６号公報
【特許文献３】特開平７−３０８１７２号公報
【特許文献４】特開平１−１５６９８５号公報
【特許文献５】特開昭６０−１５６６１４号公報
【特許文献６】特開平４−２５３９１８号公報
【特許文献７】特開平６−１８３９８５号公報
【特許文献８】特開２００４−１６１６６９号公報
【非特許文献１】Kushida K．ら:J．Bone Miner．Metab．(2004)22,462-468
【非特許文献２】Ohta H.:Clin.Calcium (2004)14,73-80
【非特許文献３】Hosoi T.:CLINICAL CALCIUM (2004) 14 (11), 83-86
【非特許文献４】Wattel A.ら:J.Cell.Biochem.(2004) 92,285-295
【非特許文献５】Bharti AC.ら:J.Immunol. (2004) 172,5940-5947
【非特許文献６】Uchiyama S.およびYamaguchi M.:Biochem. Pharmacol. (2004) 67,1297-1305
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、優れた破骨細胞分化抑制作用を有する破骨細胞分化抑制剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、骨代謝を改善する化合物について検討したところ、意外にも、エピガロカテキンガレートに優れた破骨細胞分化抑制作用があり、破骨細胞分化抑制のための医薬又は食品として有用であることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明はエピガロカテキンガレートを有効成分とする破骨細胞分化抑制剤に係るものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、カテキン類全体としての配合量を増加することなく、優れた破骨細胞分化抑制効果を有する食品・医薬等を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において、「破骨細胞分化抑制」とは、破骨細胞前駆細胞から、破骨細胞への過剰な分化を抑制又は阻害する作用をいう。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）は破骨細胞において強く発現しており、ＴＲＡＰ活性は、破骨細胞活性を表すことから、破骨細胞分化抑制は、ＴＲＡＰ活性の抑制として把握できる。
【００１３】
本発明に用いられるエピガロカテキンガレートは、例えば、緑茶若しくはその他の茶葉又はエピガロカテキンガレートを含有する他の植物から抽出、分離、精製すること又は化学合成により製造することができる。また、市販品を用いることもでき、斯かる市販品としては、テアビゴ（ＤＳＭニュートリショナルプロダクト社製品）、「ＰＦ−ＥＧＣｇ９０」（株式会社ファーマフーズ研究所製）、サンフェノンEGCg（太陽化学）、ポリフェノンE（三井農林）等が挙げられる。
【００１４】
上記緑茶若しくはその他の茶葉からの抽出は、Camellia属、例えばC. sinensis、C. assamica、又はそれらの雑種から得られる茶葉から製茶された茶葉に、水又は熱水やこれらに抽出助剤を添加し、攪拌抽出等をすることにより行うことができる。また、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する方法を併用してもよい。抽出助剤としては、アスコルビン酸ナトリウム等の有機酸、又はこれら有機酸塩類が挙げられる。
上記製茶された茶葉には、（１）煎茶、番茶、玉露、てん茶、釜煎り茶等の緑茶類；（２）総称して烏龍茶と呼ばれる鉄観音、色種、黄金桂、武夷岩茶等の半発酵茶；（３）紅茶と呼ばれるダージリン、ウバ、キーマン等の発酵茶が含まれる。
【００１５】
上記緑茶抽出物若しくはその他茶葉からの抽出物の濃縮は、上記抽出物を濃縮することにより行うことができ、当該茶抽出物からのエピガロカテキンガレートの精製は、溶剤やカラムを用いて精製することにより行うことができる。
【００１６】
尚、緑茶等の抽出物には、エピガロカテキンガレートの他に、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキン、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、カテキンガレート等のカテキン類が含有されている。
後述の比較例に示すとおり、精製されたエピガロカテキンガレートは、斯かる抽出物よりも優れた破骨細胞分化抑制作用を有する。従って、破骨細胞分化抑制剤として使用する場合、カテキン類に占めるエピガロカテキンガレートの割合は、５０質量％〜９９．９９質量％が好ましく、７０質量％〜９９．９９質量％がより好ましく、８０質量％から９９．９９質量％が更に好ましい。すなわち、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキン、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレート及びカテキンガレートを実質的に含まない、単離されたエピガロカテキンガレートを用いるのが好ましい。
【００１７】
後述の実施例に示すとおり、エピガロカテキンガレートは、ＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＳＦによって誘導される破骨細胞分化を抑制する作用を有する破骨細胞分化抑制剤となり得る。従って、本発明の破骨細胞分化抑制剤は、骨密度の低下や、骨量減少を抑制し、骨粗鬆症や骨粗鬆症に伴う骨折、疼痛、脊柱変形等の各種障害を予防又は改善するための、研究試薬、又はヒト若しくは動物用の、食品、医薬品若しくは医薬部外品として使用でき、あるいはそれらを製造するために、使用され得る。
【００１８】
本発明の破骨細胞分化抑制剤を、医薬品として使用する場合、任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、経口および非経口投与が挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、顆粒、シロップ、エリキシル、液剤等が挙げられる。非経口投与としては、注射、輸液、経皮、経粘膜、経鼻、吸入、坐剤、ボーラス等が挙げられる。
【００１９】
斯かる製剤では、本発明のエピガロカテキンガレートと、薬学的に許容される担体とを組み合わせて使用してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。
【００２０】
また、製剤中におけるエピガロカテキンガレートの含有量は、通常、製剤の全質量の０．０１質量％〜９５質量％であり、５質量％〜９５質量％が好ましく、１０質量％〜９５質量％がより好ましい。
【００２１】
上記製剤の投与量又は摂取量は、患者の状態、体重、性別、年齢、またはその他の要因に従って変動し得る。成人１人当りの１日投与量は、通常、２０〜１２００ｍｇ／体重６０Ｋｇ／日であり、５０〜８００ｍｇ／体重６０Ｋｇ／日が好ましく、５０〜４００ｍｇ／体重６０Ｋｇ／日がより好ましい。上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得る。
【００２２】
本発明の破骨細胞分化抑制剤を、食品として使用する場合、一般食品の他、骨吸収性疾患の予防または改善を目的とした、美容食品、病者用食品、栄養機能食品または特定保健用食品等の機能性食品とすることができる。食品は、固形、半固形または液状であり得る。食品の例としては、パン類、麺類、菓子類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、その他加工食品、飲料、スープ類、調味料、栄養補助食品等、およびそれらの原料が挙げられる。食品は、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。
【００２３】
本発明の破骨細胞分化抑制剤を、食品として使用する場合、エピガロカテキンガレートと、他の食品材料とを組み合わせて使用してもよく、また、必要に応じて食品添加物を含有してもよい。食品添加物の例としては、溶剤、油、軟化剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、甘味料、香料等が挙げられる。
【００２４】
また、食品中におけるエピガロカテキンガレートの含有量は、通常、食品の全質量の０．００２５質量％〜５質量％であり、０．０１２５質量％〜５質量％が好ましく、０．０２５質量％〜１質量％がより好ましい。
【００２５】
上記の医薬品または食品は、少なくとも１種のカルシウム摂取もしくは吸収促進剤または骨代謝改善剤と組み合わせて調製されてもよい。カルシウム摂取もしくは吸収促進剤としては、炭酸カルシウム等のカルシウム塩、ツイントース、フラクトオリゴ糖、カゼインホスホペプチド、クエン酸リンゴ酸カルシウム、ビタミンＤ、グルコース−１−リン酸等が挙げられる。骨代謝改善剤としては、ビタミンＤ、ビタミンＫ、大豆イソフラボン、コラーゲン、ＭＢＰ（乳塩基性タンパク質）等が挙げられる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００２７】
エピガロカテキンガレート（和光純薬）、緑茶抽出物であるテアフラン９０Ｓ（伊藤園）を、各々被験物質とし、破骨細胞分化抑制活性を測定した。
【００２８】
実施例１  破骨細胞分化抑制活性の測定
【００２９】
ＲＡＷ２６４．７細胞を３０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で４８ｗｅｌｌプレートに播種し、１０％ＦＣＳを含む  ＭＥＭ培地（大日本住友製薬）中で培養した。翌日、被験物質を含む培地に交換し１日間培養した後、被験物質存在下、５０ｎｇ／ｍｌ  ｓＲＡＮＫＬ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  ＥＣ）、５０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ）にて破骨細胞の分化を誘導した。被験物質の分化抑制活性は、被験物質の溶媒のみを添加したｗｅｌｌのＴＲＡＰ（酒石酸耐性酸性ホスファターゼ）活性をポジティブコントロール（１００％分化）、分化誘導しなかったｗｅｌｌのＴＲＡＰ活性をネガティブコントロール（０％分化）として百分率で表した。
ＴＲＡＰ活性測定は以下の方法で行なった。プレートから培養液をアスピレーターで除き、３．７％ホルマリン溶液を０．４ｍｌ添加して室温にて１０分以上放置し、細胞を固定した。その後、ホルマリン溶液をアスピレーターにて除き、エタノール：アセトン＝１：１を０．４ｍｌ添加して、約３０秒放置した。これをアスピレーターにて除き、風乾させた。風乾したプレートに、ＴＲＡＰ活性測定溶液（５．５ｍＭ  ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ５０ｍＭ  酒石酸ナトリウム，  ５０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ  ４．５））０．４ｍｌを加えて、３７℃にて１〜２時間振とうした。各ウェルの反応液を予め２０μｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨを添加した９６ウェルプレートに１００μｌずつ入れ、吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ、酒石酸ナトリウム、クエン酸一水和物、水酸化ナトリウムはいずれも和光純薬製を用いた。結果を図１に示す。
【００３０】
図１から、エピガロカテキンガレートには、優れたＴＲＡＰ活性抑制作用が認められ、破骨細胞分化抑制作用を有することがわかる。また、いずれの終濃度においても、エピガロカテキンガレートを用いた場合のＴＲＡＰ活性が、テアフラン９０Ｓ（エピガロカテキンガレート：３４．２％（Ikeda I et al. J Nutr. 2005 Feb;135(2）:155-9））を用いた場合のＴＲＡＰ活性よりも低く、エピガロカテキンガレートは、テアフラン９０Ｓよりも破骨細胞分化抑制作用が高いことがわかる。
【００３１】
図１の結果から、エピガロカテキンガレートは、混合物であるテアフランよりも優れたＴＲＡＰ活性抑制作用を有し、破骨細胞分化抑制剤として有用であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】エピガロカテキンガレートの破骨細胞分化抑制活性を示す図である。
【図１】
2009107995.tif 000002