(57)【要約】      （修正有）【課題】一分子型発光プローブの生物発光手段としての利点を生かしつつ、外部信号に寸時に反応し検出信号を発信する、「in vivo及びin vitroリアルタイム生物発光イメージング手段」の提供。【解決手段】セカンドメッセンジャーの増減を指標とした一分子型発光プローブとして、セカンドメッセンジャー認識タンパク質及び必要に応じて当該タンパク質と結合可能なペプチドを含む一本鎖状のタンパク質のＮ末側とＣ末側のそれぞれに、発光酵素（LE）を分割したＮ末端側フラグメント（N-LE）とＣ末端側フラグメント（C-LE）とが連結されている融合タンパク質を用いることを特徴とする。前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質がセカンドメッセンジャーとの結合（脱離）によって構造変化が起こると、両端のN-LE及びC-LEとの位置が近接（解離）し、in vivoでもin vitroでも発光(減光)を観察できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セカンドメッセンジャー認識タンパク質を含む一本鎖状のタンパク質のＮ末側とＣ末側のそれぞれに、発光酵素（LE）を分割したＮ末端側フラグメント（N-LE）とＣ末端側フラグメント（C-LE）とが連結されている融合タンパク質であって、前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質がセカンドメッセンジャーとの結合又は脱離によって引き起こされた構造変化の結果、両端のN-LE及びC-LEとの位置が近接又は解離し、観察可能な波長の光を発する、又は減ずることができる融合タンパク質。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、さらに前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドを含むものであって、前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質が、セカンドメッセンジャーとの結合又は脱離により引き起こされた構造変化によって前記ペプチドと結合した結果、両端のN-LE及びC-LEとの位置が近接又は解離し、観察可能な波長の光を発する、又は減ずることができる融合タンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記発光酵素が、ガウシア・ルシフェラーゼ（GLuc）である、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記セカンドメッセンジャーがCa２＋イオンであり、セカンドメッセンジャー認識タンパク質がカルモジュリンである、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記Ca２＋イオンを認識するカルモジュリンと可逆的に結合できるペプチドがM13ペプチドであり、カルモジュリンがCa２＋イオンと結合したことで構造変化を起こしてM13ペプチドと結合した結果、両端のガウシア・ルシフェラーゼ（N- GLuc及びC- GLuc）の位置が近接又は解離し、観察可能な波長の光を発する、又は減ずることができる融合タンパク質である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５いずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子であって、セカンドメッセンジャー認識タンパク質をコードする核酸を含む直鎖状核酸分子の５’末端と３’末端のそれぞれに、発光酵素（LE）を分割したＮ末端側フラグメント（N-LE）をコードする核酸と、Ｃ末端側フラグメント（C-LE）をコードする核酸とが連結されている核酸分子。
【請求項７】
前記直鎖状核酸分子中に、さらに前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドをコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記請求項６又は７に記載の核酸分子を含む発現ベクターであって、当該発現ベクターを導入した形質転換細胞内で、セカンドメッセンジャー認識タンパク質を含む一本鎖状のタンパク質の両端に、発光酵素（LE）を分割したＮ末端側フラグメント（N-LE）とＣ末端側フラグメント（C-LE）とがそれぞれ連結されている融合タンパク質、又はさらに前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドを含む融合タンパク質を発現することが可能な、発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターが導入された細胞であり、セカンドメッセンジャー認識タンパク質を含む一本鎖状のタンパク質の両端に、発光酵素（LE）を分割したＮ末端側フラグメント（N-LE）とＣ末端側フラグメント（C-LE）とがそれぞれ連結されている融合タンパク質、又はさらに前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドを含む融合タンパク質を発現している形質転換細胞。
【請求項１０】
請求項１〜５いずれかに記載の融合タンパク質を有効成分として含むことを特徴とする、セカンドメッセンジャーの検出、同定又は定量するための分析用試薬又はそれを含むキット。
【請求項１１】
請求項１〜５いずれかに記載の融合タンパク質を有効成分として含むことを特徴とする、細胞膜表面レセプターを刺激するリガンドの検出、同定又は定量するための分析用試薬又はそれを含むキット。
【請求項１２】
前記融合タンパク質を有効成分とする分析用試薬又はそれを含むキットが、前記融合タンパク質を細胞表面又は細胞内で産生している形質転換細胞自体を含むものである、請求項１０又は１１に記載の分析用試薬又はそれを含むキット。
【請求項１３】
前記分析用試薬を含むキットが、紙片、繊維切片、断片プレート又は探針素子の少なくとも１部に前記分析用試薬が固定化されていることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれかに記載の分析用キット。
【請求項１４】
請求項８に記載の発現ベクターを有効成分とし、生細胞へ導入し、生細胞内部で発現させてセカンドメッセンジャーの産生状況を可視化することにより、生細胞表面レセプターを刺激するリガンドを検出、同定又は定量するための分析用試薬又はそれを含むキット。
【請求項１５】
請求項８に記載の発現ベクターを細胞内に導入して細胞内部で融合タンパク質を発現させ、前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質がセカンドメッセンジャーとの結合又は脱離によって引き起こされた構造変化の結果、両端のN-LE及びC-LEとの位置が近接又は解離したことで発せられる光の増減を観察することにより、細胞内のセカンドメッセンジャーの発生状況を観察することによる、セカンドメッセンジャーの検出、同定又は定量方法。
【請求項１６】
前記N-LE及びC-LEとの位置の近接又は解離が、前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質がセカンドメッセンジャーとの結合又は脱離により構造変化し、当該セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドと結合した結果引き起こされたものである、請求項１５に記載の細胞内のセカンドメッセンジャーの検出、同定又は定量方法。
【請求項１７】
請求項８に記載の発現ベクターを細胞内に導入して細胞内部で融合タンパク質を発現させ、前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質がセカンドメッセンジャーとの結合又は脱離によって引き起こされた構造変化の結果、両端のN-LE及びC-LEとの位置が近接又は解離したことで発せられる光の増減を観察することにより、細胞内のセカンドメッセンジャーの発生状況を解析し、細胞表面レセプターを刺激するリガンドの検出、同定又は定量する方法。
【請求項１８】
前記N-LE及びC-LEとの位置の近接又は解離が、前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質がセカンドメッセンジャーとの結合又は脱離により構造変化し、当該セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドと結合した結果引き起こされたものである、請求項１７に記載の、細胞表面レセプターを刺激するリガンドの検出、同定又は定量する方法。
【請求項１９】
生物・環境試料に対して請求項１５に記載の発光型リガンド検出用キットを用いることによる、生体由来試料中の遊離カルシウムの濃度検出、同定又は定量方法。
【請求項２０】
ガウシア・ルシフェラーゼ(GLuc)をコードするアミノ酸配列又はその２〜１７位のアミノ酸残基の1部もしくは全部を欠失させたアミノ酸配列において、GLucを構成するアミノ酸配列の９９位から１０６位のいずれかの位置のアミノ酸残基を分割位置とするＮ末端側フラグメント(N-GLuc)とＣ末端側フラグメント(C-GLuc)を、リガンド認識タンパク質を含む一本鎖状のタンパク質のＮ末端及びＣ末端のそれぞれに連結させた融合タンパク質であって、該リガンド認識タンパク質にリガンドが結合又は脱離することにより引き起こされた構造変化の結果、両端のN-GLuc及びC-GLucとの位置が近接又は解離し、観察可能な波長の光を発する、又は減ずることができる融合タンパク質。
【請求項２１】
前記融合タンパク質が、さらに前記リガンド認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドを含むものであって、該リガンド認識タンパク質がリガンドとの結合又は脱離により引き起こされた構造変化によって前記ペプチドと結合した結果、両端のN-GLuc及びC-GLucとの位置が近接又は解離し、観察可能な波長の光を発する、又は減ずることができる融合タンパク質である、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記Ｎ末端側フラグメントが配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記Ｃ末端側フラグメントが配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項２０又は２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２４】
請求項２０〜２２のいずれかに記載の融合タンパク質を有効成分として含むことを特徴とする、リガンドの検出、同定又は定量するための分析用試薬又はそれを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、セカンドメッセンジャーの結合又は脱離により引き起こされるセカンドメッセンジャー認識タンパク質の構造変化を利用した、リアルタイム発光イメージングプローブ用の融合タンパク質に関するものである。また、最適な位置で２分割されたガウシア・ルシフェラーゼを用いる汎用性のある一本鎖発光プローブのための融合タンパク質に関するものでもある。
【背景技術】
【０００２】
私たちが暮らしている自然界には数え切れない多くの高等・下等生物が生息しており、それらは外部の刺激に応じてDNAによるタンパク質の発現など共有の分子メカニズムに基づいて生命現象を維持している。
真核・原核細胞共に生育環境における温度・信号伝達物質・栄養分の有無などに対して迅速に対応することが生物の生死に直結する。したがって、生細胞は栄養・エネルギー制御・増殖、また視覚・聴覚のような感覚関連信号伝達においては、短くて数ミリ秒、長くても数分以内に関連信号伝達を完結してしまう。
このような生命現象を覗う手段として、今まで様々な手法が開発されており、一部はすでに実用化されている。広い範囲の生命科学分野における最近の研究では、特定生命現象における細胞・動物個体内での分子イメージングが主な研究トレンドとなっている（非特許文献１）。とりわけ、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein; GFP）のような蛍光色素タンパク質を利用した生物分析の研究開発が盛んであり、特にFRET（蛍光共鳴エネルギー移動：２つの蛍光分子間で、一方の蛍光分子の励起エネルギーが他方の蛍光分子にトランスファーされて蛍光を発する現象）を利用してタンパク質間相互作用や、シグナル伝達系たんぱく質の活性度を可視化する技術、いわゆる分子イメージング技術が脚光を浴びている。一方、ホタル・ルシフェラーゼ（firefly luciferase; FLuc）のような発光酵素（Lighting Enzyme；LE）を利用した分子イメージングについても、世界各国で注目されてきており、研究開発競争が激しい。
【０００３】
これらの分子イメージング手法を、生体内での信号発生から測定までのおおよその所要時間ごとに分けてみると以下の通りである。
最も長い時間を要する分子イメージング手法としては、レポータージーンアッセイ（reporter gene assay）が挙げられる。外部からの信号によって転写因子が活性化され、結果として発現されたレポータータンパク質の発光又は蛍光強度等を指標として、最初の外部信号の強度・性質などを判定できる。この手法はレポータータンパク質の量が十分に蓄積されるまでに平均２４時間を要する。この手法はステロイド又は化学物質の活性を調べることに広く使われてきた。
２番目に長い時間を要する分子イメージング手法として、タンパク質スプライシング（protein splicing）に基づくものがある（非特許文献２）。タンパク質スプライシングとは、ある特定のタンパク質配列とタンパク質配列との間で起こる自己触媒的な組み継ぎ反応を意味する。レポーターとなるタンパク質を予め２分割し（Ｎ末側とＣ末側）、スプライシングタンパク質の両端につなげておく。後に外部信号によってレポータータンパク質断片同士がつながり、結果として回復した発光又は蛍光強度を指標に最初の外部信号の強さを判定する仕組みである。この手法は、二つの断片化されたタンパク質断片間の反応に十分な時間を要するために最低限２時間を必要とする。この手法はタンパク質の核内移行などをイメージングするのに有効に使われている。
３番目に長い時間を必要とする分子イメージング手法としては、タンパク質自己相補法（protein complementation）が挙げられる。この手法は２分割されたレポータータンパク質が再び近接するために起こる発光・蛍光強度の増加分を分析信号とするものである。例えば、ある標的タンパク質−タンパク質間の結合の有無を調べるために、各々のタンパク質にそれぞれ２分割したレポータータンパク質の一断片ずつをつなげておく。後に外部信号によって二つのタンパク質間の結合が起こった時のみにレポータータンパク質断片同士が十分に接近する。結果として回復したレポータータンパク質の発光又は蛍光強度を指標に、目的とする二つのタンパク質−タンパク質間の結合を促した本来外部信号の強度を評価する（２分子型プローブ：特許文献１，２、非特許文献３）。この手法はステロイド又は化学物質の活性を評価するのに使用され、ステロイド刺激から約２０分間の測定時間を要する。最近本発明者らは、一つの分子内のタンパク質−タンパク質間相互作用をLEの自己相補の原理に基づいてバイオイメージングする方法を開発して特許出願した（特願2007-005144）。この手法の特徴は２分割されたFLuc及び、そのＮ末端側とＣ末端側断片の間に標的リガンド認識タンパク質を一分子内に配置しておき、その後リガンドの結合により引き起こされる構造変化を一次元的な発光強度で検出することである。更に本発明者らによって、この手法を発展させた単一リガンドの両面的な活性程度をそれぞれ違う発色信号（緑と赤）で見分ける手法が開発され、特許出願されている（特願2007-202308）。
【０００４】
これより更に短い時間で実施できる分子イメージング法としては、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に基づいたものがある。この手法では、近接した２色の蛍光色素タンパク質間に起こる蛍光エネルギー移動を指標に二つのタンパク質−タンパク質間の相互作用の程度を測定できる（特許文献３、特許文献４）。本発明者らは、cGMPがその標的分子（cGMP結合タンパク質）に結合することをFRET現象に基づいて可視化することのできるプローブ（特許文献３）や、IP3を同じくFRET現象を利用して可視化することのできるプローブ（特許文献４）を提案している。この手法は、ほぼリアルタイムで一細胞内の分子現象を蛍光イメージングできる、今まで開発されたものの中では一番早いイメージング手段を提供する。
前記FRET現象を利用した標的リガンドの検出プローブ（特許文献３，４，５、非特許文献４，５）は、前述のように、短時間でのリガンド検出を可能とするとともに、アゴニストとアンタゴニストをそれぞれ分別して検出可能であるという点において優れているが、自己蛍光によるバックグラウンドの高いこと、及び２つの発色団の波長変化を高精度で測定するために高感度蛍光顕微鏡と精密フィルター装置、熟練技術者を必要とする。また、外部からの短波長光による励起を必要とするため、短波長光吸収の激しい生体レベルでの生物分析が非常に難しいものであった。
上記以外の技術として、既存の有機合成手段に基づいて開発された蛍光色素試薬であるFura、Indo-1が細胞内分子イメージングに使えると公表されている（非特許文献１１）が、これら合成物質には、細胞毒を誘発する点、細胞の一部分に偏在する点、選択性の乏しい点などの問題点がある。
【０００５】
一方、生物発光イメージングは蛍光に比べて、
（１）バックグラウンドが低い点、
（２）外部光励起を必要としない点、
（３）装置が非常に簡単で、軽量化・集積化が容易である点、
（４）光の組織透過性が優れ、生体イメージングに適した点、などの特長を持つ。
このため、本発明者らは生物発光を利用した分子イメージングプローブの開発に取り組んできた。本発明者らが以前開発した、タンパク質スプライシングや自己相補による従来の分割レポーター分子の再構成を利用したタンパク質−タンパク質間相互作用の検出法（特許文献１，２、非特許文献２）の場合は、それぞれの分割レポーター分子は、別個のプローブとして細胞内に導入されるため（２分子型プローブ）、各々のプローブの発現量が相違してしまう不都合が起こる。また、このことに起因するプローブのリガンド応答性の非効率さが強く懸念された。
そこで、本発明者らは最近一つのプローブ内にリガンド感知と信号発信に必要な全ての要素が集積され、優れた分析能を有する一分子型発光プローブを開発した（特願2007-202308、特願2007-005144）が、リガンドを認識してから信号発信まで、およそ１０分から２０分の時間が必要であり、分子量（９２ｋＤ）が大きいので、細胞に負担がかかるため、生きた生細胞における短時間の分子現象の追跡には不向きである。
すなわち、従来の生物発光イメージングプローブの場合、一分子型であろうと二分子型であろうと、リガンド特異的リセプターに内在するリガンド認識部位をプローブ内に組み込んでいることと、高分子量の発光酵素を使用していることが原因で分子量が大きくなっている。また、認識する対象のリガンドが細胞膜を透過して細胞質内のプローブまで届かなければならないが、インシュリン、各種成長ホルモン、サイトカインなどの場合は、そもそも細胞膜を透過できないので細胞内部では検出できず、細胞膜を透過できるリガンドの場合でも、膜透過ステップが律速であるので数十分程度の測定時間を必要とするため、いずれにしても細胞内のさまざまな生命現象のリアルタイム観測ができない。
【０００６】
生細胞内での生命現象をリアルタイムで観察するためには、生細胞内のセカンドメッセンジャーの情報伝達を分子イメージングすることが最も効果的であり、従来からセカンドメッセンジャー（とりわけカルシウムイオン）の分子イメージングに関連した多くの分析技術が開発され、提案されている。（特許文献４、非特許文献８）
特に、上述のFRET原理に基づいた蛍光プローブを用い、カルシウムイオン認識タンパク質であるカルモジュリン及びカルシウムイオンと結合したカルモジュリンと結合するペプチド（M13）とをつないだタンパク質の両端に、GFPの遺伝子改変によって得られた青緑蛍光タンパク質と黄色タンパク質を繋いだカルシウムセンサー（カメレオン）及びその改良型プローブが、生細胞内でのセカンドメッセンジャーであるカルシウムイオンをリアルタイムで検出できる優れたプローブとして広く用いられている。しかしながら、蛍光タンパク質は一般にｐＨに敏感に反応し、自己蛍光（autofulorescence）によるバックグラウンドも高く、両端に２つの蛍光タンパク質を連結するため分子量が大きくなるという問題点もある。また、蛍光を検出するための大型測定装置が必要であるなどの使用上の問題点も多い（特許文献４）。
またセカンドメッセンジャーを検出するための単一ＧＦＰ分子を２分割した断片を利用した蛍光分子プローブも最近開発された（非特許文献９）が、蛍光プローブそのものが持つ問題点もあるばかりか、２分割したＧＦＰが再結合してしまうと可逆性がないため、繰り返し使用には不適切であるという点と、ＧＦＰはタンパク質フォルディングに長い時間（約６時間）を要し、ミスフォルディングも起こりやすい点などの重大な欠点がある。
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００２／００８７６６号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００４／１０４２２２号パンフレット
【特許文献３】特開２００２−０１７３５９号公報
【特許文献４】特開２００７−４９９４３号公報
【特許文献５】特開２００４−３２５２５３号公報
【特許文献６】国際公開ＷＯ２００５／０７８１１９号パンフレット
【非特許文献１】Massoud, T.F., and Gambhir, S.S. Genes & Development 2003, 17, 545-580.
【非特許文献２】Kim, S.B., Ozawa, T., Watanabe, S., Umezawa, Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004, 101, 11542-11547.
【非特許文献３】Kim, S.B., Awais, M., Sato, M., Umezawa, Y., and Tao, H.  Anal. Chem. 2007, 79, 1874-1880.
【非特許文献４】Awais, M.; Sato, M.; Lee, X. F.; Umezawa, Y. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2707-2712.
【非特許文献５】Schaufele, F.; Carbonell, X.; Guerbadot, M.; Borngraeber, S.; Chapman, M.S.; Ma, A.A.; Miner, J.N.; Diamond, M.I. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 9802-9807.
【非特許文献６】Paulmurugan, R., and Gambhir, S.S. Anal. Chem. 2005, 77, 1295-1302.
【非特許文献７】Remy, I.,and Michnick, S.W. Nat. Methods 2006, 3, 977-979.
【非特許文献８】Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J.M., Adams J.A., Ikura M., Tsien R.Y. Nature 1997, 388 (6645), 882-887.
【非特許文献９】Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y.  Nat. Methods 2007, 4(5): 413-419.
【非特許文献１０】Kim, S.B., Kanno, A., Ozawa, T., Tao, H., Umezawa, Y. ACS Chem. Biol. 2007, 2 (7), 484-492.
【非特許文献１１】Schlegel, S., Steen, M., Guse, A.H.  Mol. MED. 2006, 12, S23-S23 (Suppl. 1).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡便かつ安定的に繰り返し使用可能な一分子型発光プローブの生物発光手段としての利点を生かしつつ、セカンドメッセンジャー信号をリアルタイムで可視化できる、いわば、「in vivo及びin vitroリアルタイム生物発光イメージング手段」を提供しようとするものであり、それを可能にする融合タンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、セカンドメッセンジャー検出のための従来方法が何らかの問題点を含んでいることをふまえ、セカンドメッセンジャーのリアルタイム可視化手段として、簡便かつ安定的に繰り返し使用可能であるという発光プローブの利点を最大限生かすことを目指した。
すなわち、発光酵素は、適切な位置で断片化できれば、外部信号に対して可逆的に反応し、非細胞系でも失活しにくく安定性を保つと共に、十分な基質が提供される環境にあれば、蛍光発生装置など他からのエネルギー供給なしに自己発光できるという優れた利点があるので、一分子にコンパクト化できれば、細胞内情報伝達物質であるセカンドメッセンジャーの検出にも十分適用できるものと考えた。
外部刺激物質そのものを検出しようとした従来の一分子型発光プローブが、発光酵素断片の間に核リセプター及び核リセプター結合性領域を備えていたのに対し、外部刺激による細胞内２次現象であるセカンドメッセンジャーを認識し構造変化をするタンパク質を繋ぐことで、セカンドメッセンジャーの増減を指標とした分子イメージング手段が提供できると思い至った（図１はその概念図である。）。その際、セカンドメッセンジャーのうちでも、とりわけ多くの生体内生理作用を左右するカルシウムイオン（Ca２＋）と、その認識タンパク質として代表的なカルモジュリン（CaM）に注目した。
しかしながら、カルモジュリンの分子量は１７ＫＤときわめて小さく、従来の発光プローブで用いられていた発光酵素は３６−６４ＫＤ程度と大きいので、一分子内でＣａＭとつなげた場合、分子プローブ内各要素間における立体障害が生じ、カルシウムイオン結合によるカルモジュリンの構造変化を認識できなかった。
そこで、最近発見されており、知られている発光酵素中で最も小さいGaussia Princeps由来のガウシア・ルシフェラーゼ（GLuc）が最適であると考えたが、GLucは、一分子型発光プローブのために分割させて用いられた例はなく、一分子型で分割して用いる場合の最適な分割位置が不明であった。従来二分子型で提案されたGLucの分割位置をそのまま適用しても発光強度が十分に回復しないため、再度GLucの活性領域を正確に同定して、一分子型プローブとして最適な２分割の位置を決定した後、リンカー配列による微調整を行って本発明を完成させた。
GLucは、分子量が小さいので生細胞への負担も小さく、しかも発光強度が従来より強い（100-500倍程度）ので、生細胞内でのセカンドメッセンジャー検出には特に適しており、本発明により決定された２分割位置（99〜106位）で分割すると、外部信号に可逆的に反応し（断片間の結合定数が高いと信号が解消された時、元に戻らない）、非細胞系でも信号に瞬時に反応でき、断片化されても失活せずに安定性を保つ、優れた一分子型リアルタイム発光プローブが提供できた。そして、GLucを用いた一分子型発光プローブについては、さらに発展させ、セカンドメッセンジャー認識タンパク質に代えて、男性ホルモン受容体（ＡＲ）・ストレスホルモン受容体（ＧＲ）など、別のリガンド認識タンパク質を用いた場合でも、高い分子認識能を示すことが確認できたので、GLucを用いた汎用性の高いプローブに関するもう一つの本発明も完成した。
【０００９】
セカンドメッセンジャー認識タンパク質のCalmodulin（CaM）を一つの分子内に配置するに際し、本発明者らは、まずＸ線液晶構造解析情報からカルシウム（Ca２＋）有りの条件で引き起こされるCaMの構造変化の程度が大きいことに着目して、その両端にルシフェラーゼの断片をつなげることによってタンパク質構造変化による分子イメージングができる可能性を見出した（実施例１、２）。この場合はCa２＋無しの時はCaM両端につながっているGLucのＮ末側断片とＣ末側断片間の距離が近接しているため、発光値は高い状態を維持する。ところが、Ca２＋有りの条件ではCaM両端につながっているGLuc断片間の距離が離れてしまうため、発光は解消される形のプローブを提供する（図１、図５）。
一方、Ca２＋有りの条件でCaMと結合すると知られているM13ペプチドを連結したCaM−M13の外側にGLuc断片を連結した場合、Ca２＋刺激により構造変化したCaMが分子内のM13領域に結合した結果、GLuc断片間の距離が近接し、発光強度が増加する形の発光プローブを提供できた（図８）。このように本発明は発光値上昇型と降下型の両方を提供するため、使用者は目的に応じてどちらかを、又はどちらでも使える手段を提供できる。
【００１０】
セカンドメッセンジャーとして代表的なものは、Ca２＋以外にもcGMP、cAMPなどが知られており、これらセカンドメッセンジャーごとに応答するセカンドメッセンジャー認識タンパク質の大きさや構造変化の程度が異なるので、プローブ内各要素間の立体傷害などを勘案して、最適なルシフェラーゼを選択する必要がある。
その際の一分子型に適用できるルシフェラーゼの分割位置については、GLucの場合にＮ末端からほぼ１／２程度の位置であることを決定したのは本発明がはじめてであるが、他のルシフェラーゼの場合は、Ｎ末端からほぼ４／５程度の位置で安定して分割できることが周知であるため、これら周知の分割位置を適用することができる。
また、セカンドメッセンジャーとの結合の有無に基づくセカンドメッセンジャー認識タンパク質の構造変化を、直接両端の発光酵素活性の回復程度に置き換えて観察する方式と同時に、セカンドメッセンジャー認識タンパク質が構造変化することで結合するペプチド（例えばカルモジュリンに対してのM13ペプチド）に相当する領域を連結させておくことで、セカンドメッセンジャー認識タンパク質の構造変化がより増幅されて両端の分割発光酵素断片間の相対位置の変化に反映される。特に、セカンドメッセンジャー認識タンパク質の構造変化が大幅でない場合などは、セカンドメッセンジャー認識タンパク質とその結合ペプチドを、リンカー配列を適宜介在させて連結した融合タンパク質の両端に、２分割した発光酵素断片を連結させた方式が好ましい。
【００１１】
以上まとめると、セカンドメッセンジャーの濃度変化を指標とする一分子型リアルタイム発光プローブ作成に際しては、セカンドメッセンジャー結合に応じて立体構造を変化させるセカンドメッセンジャー認識タンパク質を選定した後、必要に応じて構造変化後のタンパク質と選択的に結合するペプチド配列を適宜リンカー配列を介して連結する。さらに、(i)セカンドメッセンジャー認識タンパク質に連結できる最適なルシフェラーゼの選定、（ii）ルシフェラーゼにおける適切な２分割位置の決定、（iii）プローブを構成する各要素間を結ぶリンカーの長さの決定、及び（iv）セカンドメッセンジャー認識タンパク質がセカンドメッセンジャーと結合した場合に起こる構造変化の度合いなどの検討も必要な工程である。
【００１２】
すなわち、本発明は、以上の知見を得て完成することができたものであり、具体的には以下の通りのものである。
〔１〕  セカンドメッセンジャー認識タンパク質を含む一本鎖状のタンパク質のＮ末側とＣ末側のそれぞれに、発光酵素（LE）を分割したＮ末端側フラグメント（N-LE）とＣ末端側フラグメント（C-LE）とが連結されている融合タンパク質であって、前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質がセカンドメッセンジャーとの結合又は脱離によって引き起こされた構造変化の結果、両端のN-LE及びC-LEとの位置が近接又は解離し、観察可能な波長の光を発する、又は減ずることができる融合タンパク質。
〔２〕  前記融合タンパク質が、さらに前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドを含むものであって、前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質が、セカンドメッセンジャーとの結合又は脱離により引き起こされた構造変化によって前記ペプチドと結合した結果、両端のN-LE及びC-LEとの位置が近接又は解離し、観察可能な波長の光を発する、又は減ずることができる融合タンパク質である、前記〔１〕に記載の融合タンパク質。
〔３〕  前記発光酵素が、ガウシア・ルシフェラーゼ（GLuc）である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の融合タンパク質。
〔４〕  前記セカンドメッセンジャーがCa２＋イオンであり、セカンドメッセンジャー認識タンパク質がカルモジュリンである、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の融合タンパク質。
〔５〕  前記Ca２＋イオンを認識するカルモジュリンと可逆的に結合できるペプチドがM13ペプチドであり、カルモジュリンがCa２＋イオンと結合したことで構造変化を起こしてM13ペプチドと結合した結果、両端のガウシア・ルシフェラーゼ（N- GLuc及びC- GLuc）の位置が近接又は解離し、観察可能な波長の光を発する、又は減ずることができる融合タンパク質である、前記〔２〕に記載の融合タンパク質。
〔６〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子であって、セカンドメッセンジャー認識タンパク質をコードする核酸を含む直鎖状核酸分子の５’末端と３’末端のそれぞれに、発光酵素（LE）を分割したＮ末端側フラグメント（N-LE）をコードする核酸と、Ｃ末端側フラグメント（C-LE）をコードする核酸とが連結されている核酸分子。
〔７〕  前記直鎖状核酸分子中に、さらに前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドをコードする核酸を含むことを特徴とする、前記〔６〕に記載の核酸分子。
〔８〕  前記〔６〕又は〔７〕に記載の核酸分子を含む発現ベクターであって、当該発現ベクターを導入した形質転換細胞内で、セカンドメッセンジャー認識タンパク質を含む一本鎖状のタンパク質の両端に、発光酵素（LE）を分割したＮ末端側フラグメント（N-LE）とＣ末端側フラグメント（C-LE）とがそれぞれ連結されている融合タンパク質、又はさらに前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドを含む融合タンパク質を発現することが可能な、発現ベクター。
〔９〕  前記〔８〕に記載の発現ベクターが導入された細胞であり、セカンドメッセンジャー認識タンパク質を含む一本鎖状のタンパク質の両端に、発光酵素（LE）を分割したＮ末端側フラグメント（N-LE）とＣ末端側フラグメント（C-LE）とがそれぞれ連結されている融合タンパク質、又はさらに前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドを含む融合タンパク質を発現している形質転換細胞。
〔１０〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれかに記載の融合タンパク質を有効成分として含むことを特徴とする、セカンドメッセンジャーの検出、同定又は定量するための分析用試薬又はそれを含むキット。
〔１１〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれかに記載の融合タンパク質を有効成分として含むことを特徴とする、細胞膜表面レセプターを刺激するリガンドの検出、同定又は定量するための分析用試薬又はそれを含むキット。
〔１２〕  前記融合タンパク質を有効成分とする分析用試薬又はそれを含むキットが、前記融合タンパク質を細胞表面又は細胞内で産生している形質転換細胞自体を含むものである、前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の分析用試薬又はそれを含むキット。
〔１３〕  前記分析用試薬を含むキットが、紙片、繊維切片、断片プレート又は探針素子の少なくとも１部に前記分析用試薬が固定化されていることを特徴とする、前記〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の分析用キット。
〔１４〕  前記〔８〕に記載の発現ベクターを有効成分とし、生細胞へ導入し、生細胞内部で発現させてセカンドメッセンジャーの産生状況を可視化することにより、生細胞表面レセプターを刺激するリガンドを検出、同定又は定量するための分析用試薬又はそれを含むキット。
〔１５〕  前記〔８〕に記載の発現ベクターを細胞内に導入して細胞内部で融合タンパク質を発現させ、前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質がセカンドメッセンジャーとの結合又は脱離によって引き起こされた構造変化の結果、両端のN-LE及びC-LEとの位置が近接又は解離したことで発せられる光の増減を観察することにより、細胞内のセカンドメッセンジャーの発生状況を観察することによる、セカンドメッセンジャーの検出、同定又は定量方法。
〔１６〕  前記N-LE及びC-LEとの位置の近接又は解離が、前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質がセカンドメッセンジャーとの結合又は脱離により構造変化し、当該セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドと結合した結果引き起こされたものである、前記〔１５〕に記載の細胞内のセカンドメッセンジャーの検出、同定又は定量方法。
〔１７〕  前記〔８〕に記載の発現ベクターを細胞内に導入して細胞内部で融合タンパク質を発現させ、前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質がセカンドメッセンジャーとの結合又は脱離によって引き起こされた構造変化の結果、両端のN-LE及びC-LEとの位置が近接又は解離したことで発せられる光の増減を観察することにより、細胞内のセカンドメッセンジャーの発生状況を解析し、細胞表面レセプターを刺激するリガンドの検出、同定又は定量する方法。
〔１８〕  前記N-LE及びC-LEとの位置の近接又は解離が、前記セカンドメッセンジャー認識タンパク質がセカンドメッセンジャーとの結合又は脱離により構造変化し、当該セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドと結合した結果引き起こされたものである、前記〔１７〕に記載の、細胞表面レセプターを刺激するリガンドの検出、同定又は定量する方法。
〔１９〕  生物・環境試料に対して前記〔１５〕に記載の発光型リガンド検出用キットを用いることによる、生体由来試料中の遊離カルシウムの濃度検出、同定又は定量方法。
〔２０〕  ガウシア・ルシフェラーゼ(GLuc)をコードするアミノ酸配列又はその２〜１７位のアミノ酸残基の１部もしくは全部を欠失させたアミノ酸配列において、GLucを構成するアミノ酸配列の９９位から１０６位のいずれかの位置のアミノ酸残基を分割位置とするＮ末端側フラグメント(N-GLuc)とＣ末端側フラグメント(C-GLuc)を、リガンド認識タンパク質を含む一本鎖状のタンパク質のＮ末端及びＣ末端のそれぞれに連結させた融合タンパク質であって、該リガンド認識タンパク質にリガンドが結合又は脱離することにより引き起こされた構造変化の結果、両端のN-GLuc及びC-GLucとの位置が近接又は解離し、観察可能な波長の光を発する、又は減ずることができる融合タンパク質。
〔２１〕  前記融合タンパク質が、さらに前記リガンド認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドを含むものであって、該リガンド認識タンパク質がリガンドとの結合又は脱離により引き起こされた構造変化によって前記ペプチドと結合した結果、両端のN-GLuc及びC-GLucとの位置が近接又は解離し、観察可能な波長の光を発する、又は減ずることができる融合タンパク質である、前記〔２０〕に記載の融合タンパク質。
〔２２〕  前記Ｎ末端側フラグメントが配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記Ｃ末端側フラグメントが配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、前記〔２０〕又は〔２１〕に記載の融合タンパク質。
〔２３〕  前記〔２０〕〜〔２２〕のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
〔２４〕  前記〔２０〕〜〔２２〕のいずれかに記載の融合タンパク質を有効成分として含むことを特徴とする、リガンドの検出、同定又は定量するための分析用試薬又はそれを含むキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の融合タンパク質は、生きた細胞系においても、非細胞系においてもほぼリアルタイムでの発光イメージングを可能にするものであり、以下のような利点がある生物発光リアルタイムイメージングプローブを提供する。
（１）蛍光の限界を克服し、非常に簡便な生物発光分析法を提供する。
（２）秒単位でおきる生物現象を、ほぼリアルタイムで観察する生物イメージングが可能である。
（３）リガンドが細胞膜を透過する必要がないので、細胞膜の透過の出来ないリガンド（インシュリン・成長ホルモンなど）の感受性をも測定でき、透過するリガンド、細胞内に存在するリガンドの測定もできるので、事実上全てのリガンドを分析対象にできることに
なり、幅広い生物分析ができるようになった。
（４）同一のリガンド刺激に対して、発光が下がるプローブと上がるプローブを設計可能なため、使用者が必要に応じて、どちらかを選択して使える。
（５）一つの分子内にイオンセンシングと発光発信部位を集積することによって、プローブが効率化、単純化、簡便化された。特に、非細胞系では、紙片などの末端に本発光プローブを固定・乾燥した発光プローブ試験紙（発光型リガンドセンシング手段）が提供できる。
また、両端の２分割発光酵素としてGLucを用いた場合は、今まで開発された生物発光プローブの中で一番小さいプローブであるため、宿主細胞への負担が非常に少なく、GLucは既存発光酵素に比べ非常に明るいので、生きたままの生細胞条件下でも明瞭で正確な分析ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の融合タンパク質は、一分子型リアルタイム発光イメージングプローブとして用いられるものであって、その構成要素として（i）セカンドメッセンジャー認識タンパク質（ii）必要により、そのセカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチド、（iii）両端に配される分割された発光タンパク質（LE）を含む融合タンパク質であり、(iv)それぞれの構成要素はリンカーを介して、又は介さずに連結されている一本鎖の融合タンパク質である。本発明の融合タンパク質は、セカンドメッセンジャー認識タンパク質がセカンドメッセンジャーとの結合又は脱離によって引き起こされた構造変化の結果、両端のN-LE及びC-LEとの位置が近接又は解離し、観察可能な波長の光を発する、又は減ずることができるものである。さらに、(ii)のセカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチドを含む場合は、セカンドメッセンジャー認識タンパク質が、セカンドメッセンジャーとの結合又は脱離により引き起こされた構造変化によって前記ペプチドと結合した結果、両端のN-LE及びC-LEとの位置が近接又は解離し、観察可能な波長の光を発する、又は減ずることができる。すなわち、本発明の融合タンパク質は、外部の刺激によって生細胞膜リセプターが活性化され、その直下で引き起こされるセカンドメッセンジャーの増減を、生細胞内でリアルタイムイメージングでき、非細胞環境下での分析用キットとして用いることもできる。以下、本発明の融合タンパク質を、その機能的側面から、「一分子型リアルタイム発光プローブ」又は単に「プローブ」ということもある。
本発明の「一分子型リアルタイム発光プローブ」は、標的特異的リガンドによって引き起こされる生細胞の膜表面上にあるリセプター活性化の際、そのリセプターの直下で２次現象として引き起こされる様々な分子現象を生きた細胞状態のままで、リアルタイムで可視化イメージングのできるプローブであって、そのための全要素が単一融合分子内に最適集積したことを特徴とする。具体的には、上記（i）から（iii）までをその基本要素とする融合タンパク質であり、それぞれの構成要素のタンパク質又はペプチドを遺伝子組換え法又は化学合成法などで得た後、化学的に連結することもできるが、典型的には、それぞれのタンパク質をコードするDNAを直鎖状に連結したキメラDNAが挿入された発現ベクターにより生細胞内で発現されたものである。ここで、「キメラDNA」とは、幾つかの異なる由来のDNA断片が人工的に直鎖状に連結されたものであり、タンパク質又はペプチドを構成要素とする融合タンパク質分子を発現することのできるDNAであり、本発明におけるキメラDNAは、生細胞内又は細胞外で一分子型リアルタイム発光プローブとして機能する融合タンパク質を発現可能なDNA分子である。
【００１５】
これらの各構成要素は、直鎖状の融合タンパク質分子となるように、それぞれをコードするDNAが直鎖状に連結されたキメラDNAとして発現ベクターに挿入する。
本発明の一分子型リアルタイム発光プローブをコードするDNAを含み、細胞内で発現可能な制御配列に繋ぎ、典型的には、当該DNAを含む細胞発現ベクターを用いて生細胞に導入する。生細胞内で発現させた一分子型リアルタイム発光プローブを用いて、披検物質によって２次的に引き起こされるセカンドメッセンジャーが関与する細胞内現象を可視化イメージングすることによって、被検物質の性質、濃度、活性強度が解析できる。すなわち、セカンドメッセンジャー自身を検出、同定又は定量をすることと共に、細胞膜表面レセプターを刺激する外部リガンドを間接的に検出、同定又は定量できる。
本発明において、「生細胞」とは、生物本来の生細胞（原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、ヒトを含めた哺乳類動物細胞）のみならず、その本来の機能を維持した状態の培養細胞（原核細胞、真核細胞）または生物個体内に移植、感染した細胞を指し、典型的にはマウスなど実験動物又はその細胞である。
本発明で用いる「発現ベクター」としては、公知の真核または原核細胞発現ベクターを特段の制限なく使用することができる。また、前記のキメラDNAからのプローブ発現を制御するため（例えば、生物個体における特定組織での発現、または特定リガンド・刺激物による発現）公知の組織特異的、または特定刺激特異的プロモーター配列を組み込むようにしてもよい。またプローブ発現ベクターの導入は、例えばマイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法、脂質試薬によるトランスフェクション法（TransIT, Mirus）により細胞内に導入することができる。また、これらの手法で導入される発現ベクターに単純にプローブの発現だけを託すのではなく、プローブの上流に発現制御をし得る制御配列を繋げることによって、プローブそのものの発現有無を指標に更なる生物分析系を組むことができる。
さらに、本プローブをコードするキメラDNAを、pMXのようなレトロウイルスベクターにつなげ、高力価のウイルス産生能を有するパッケイジング細胞PLATEに導入することによって、動物に感染するレトロウイルスの作成が可能である。このウイルスを動物の各臓器に感染させることによって、各臓器内におけるセカンドメッセンジャー特性のリアルタイムイメージングができる。
本発明における「リガンド」とは、生細胞膜上又は生細胞内の特定タンパク質と特異的に結合してその機能を変化させうる物質を意味する。例えば、核リセプターにおけるステロイド又は合成化学物質を指し、サイトカイン受容体においては各種サイトカインを、インシュリン受容体のような細胞膜上受容体に対してはインシュリンを含む刺激物質を指す。
【００１６】
以下、一分子型リアルタイム発光プローブの各構成要素について説明する。
本発明における「セカンドメッセンジャー認識タンパク質」とは、細胞外部の刺激によって細胞内で引き起こされる「セカンドメッセンジャー」と結合し、立体構造が変化するタンパク質を指す。そのことで「セカンドメッセンジャー」の濃度変化に依存したセカンドメッセンジャー認識タンパク質の構造変化を観察することが可能になる。その際、当該セカンドメッセンジャー認識タンパク質が構造変化することで、さらに他のタンパク質の一部分、又はそのペプチド断片（以下、単に「ペプチド」という。) と可逆的に結合又は解離できる特徴をもっているものが好ましい。
ここでいう「セカンドメッセンジャー」とは、ホルモンや神経伝達物質などの細胞外情報伝達物質が細胞膜に存在する受容体と結合することによって、細胞内で新たに生成される別種の細胞内情報伝達物質をいう。例えば、cGMP、cAMP、PIP、PIP2、PIP3、inositol trisphosphate (IP3)、IP4、Ca２＋、diacylglycerol、arachidonic acidを対象にすることができる。
これらセカンドメッセンジャーとそれを認識するセカンドメッセンジャー認識タンパク質との好ましい組み合わせを以下に示す。
セカンドメッセンジャーのCa２＋を認識するCa２＋認識タンパク質としては、カルモジュリン（CaM）及びリコベリン（recoverin）等が挙げられ、cAMPを認識するcAMP認識タンパク質としてはcAMP-gated cation channel及びprotein kinase A (PKA)が挙げられる。Diacylglycerolを認識するDiacylglycerol認識タンパク質としてはprotein kinase C (PKC)を利用することができる。また、cGMPを認識するcGMP認識タンパク質としてはcGMP-gated Na+ channelが挙げられる。
【００１７】
また、本発明における「セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合できるペプチド」とは、セカンドメッセンジャー認識タンパク質が、セカンドメッセンジャーと結合し、活性化されたことに基づく構造変化に対応して、セカンドメッセンジャー認識タンパク質と可逆的に結合又は解離できる「ペプチド」を指し、本質的に長いタンパク質ドメインでも、短いペプチドでもよい。
たとえば、カルモジュリン（CaM）に対しては、myosin light chain kinase由来のペプチドであるM13（26個のアミノ酸：KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL）が好ましく用いられる。また、M13以外にもカルモジュリンに対して結合できるタンパク質として、アデニリルシクラーゼ、カルモジュリンキナーゼIIのようなCaM依存性タンパク質キナーゼ類を挙げることができる。このようなタンパク質の一部分を上記M13の代わりに使い、CaMとの結合を可視化することもできる。
【００１８】
また本発明における「発光酵素（LE）」は、Ｎ末側とＣ末側に分割でき（それぞれN-LEとC-LEという）、ホタル・ルシフェラーゼ（firefly luciferase；FLuc）、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ（Renilla luciferase；RLuc）、ガウシア・ルシフェラーゼ（Gaussia luciferase；GLuc）、クリックビートル・ルシフェラーゼ（Click Beetle luciferase；CBLuc）などが好ましいが、本発明の実施例ではガウシア・ルシフェラーゼ（GLuc）を用いた。
これらのLEは、アミノ酸配列や遺伝子（DNA）の塩基配列が公知であり（例えば、FLucはGenBank/AB062786等、CBLucはGenBank/AY258592.1等、GLucはGenBank/ AY015993等）、これらの配列情報に基づいて公知の方法によりDNAを取得することができる。
「分割された発光酵素（LE）」というとき、単一タンパク質であるLEを、２分割することで、一時的に発光活性を非活性化したことを意味する。二つの分割LEが近接した場合に切片間の相互作用によって酵素活性を変えることができるように好適に再構築される部位で分割される必要がある。ここで、分割位置はアミノ酸残基位置で示す。例えばGLuc（1‐185アミノ酸）の９９位の位置で分割するというとき、９９位と１００位の間で分割することであり、９９/１００位の位置で切断するという表現と同義である。
これらのLEを２分割する位置は、公知の情報等を参考に適宜に設定することができ、通常、最初から４/５の位置にある既知の親水性領域を適当に切断すれば、分割で光を失い、再結合により発光する分割位置が簡単に決定できる。例えば、FLucの場合には、非特許文献６に開示されているように、そのアミノ酸配列の４３７/４３８部位で切断することができ、CBLucの場合には、後記実施例に示したように４１２/４１３部位で切断することができる。またRLucの場合には、特許文献２に開示されているように（２分子型の場合）、適当な部位での分割が可能であるが、そのアミノ酸配列９１/９２で切断した場合に、再構成後の発光強度が最も強くなる。さらに、CBLucの場合には、そのアミノ酸配列の４３９/４４０、又は４１２/４１３の位置等で２分割することができる。また後記の実施例に示したように、Ｎ末端フラグメント（N-LE）とＣ末端フラグメント（C-LE）の一部は重複したり、または欠失したものを使用することもできる。
【００１９】
しかしながら、GLucの場合は、全アミノ酸配列のほぼ真中に親水性領域を持ち、液晶構造が未だに解明されておらず、Ｎ末側に細胞外分泌シグナル配列を有している点で他のルシフェラーゼとは異なっている。
２分子型発光プローブにおいて、GLucに関してＮ末側フラグメントとＣ末側フラグメントの分割位置が種々検討された例が報告されており、その結果は１０９番目のアミノ酸位置での分割が最適とされ、実際にこの位置で分割した両フラグメントをそれぞれ別個にビオチンとアビジンに連結し、発光性を回復させている（非特許文献７）。
しかし、この分割位置を本発明の１分子型発光プローブにそのまま適用することはできない。すなわち、上記非特許文献７で提案された位置で分割したGLucのＮ末端側フラグメント及びＣ末端側フラグメントを、セカンドメッセンジャー認識タンパク質を含む１本鎖ポリペプチドの両端に連結した場合には、再結合時に発光性が十分に回復できない。
本発明者らは、本発明の１分子型発光プローブに用いるためのGLucの最適な分割位置を詳細に検討し（実施例２）、アミノ酸配列の９９位から１０６位のいずれかの位置であることを決定した。Ｎ末端側フラグメントにおけるＮ末側の疎水性のシグナル配列部分（２〜１７位）は削除することができ、そのことで発光プローブ全体の大きさが小さくなるので、生細胞内に導入又は発現させる際には細胞への負荷が小さく好ましい。なお、Ｎ末端のmethionine（Ｍ）は遺伝子組換え法により細胞内で発現させるためには必須である。すなわち、GLucをコードするアミノ酸配列又はその２〜１７位のアミノ酸残基の１部もしくは全部を欠失させたアミノ酸配列において、GLucをコードするアミノ酸配列の９９位から１０６位のいずれかの位置のアミノ酸残基を分割位置とするＮ末端側フラグメント(N-GLuc)とC末端側フラグメント(C-GLuc)を、セカンドメッセンジャー認識タンパク質を含む一本鎖状のタンパク質のＮ末端及びＣ末端のそれぞれに連結させた融合タンパク質は、配列番号４又は配列番号４の２〜１７位の１部を欠失したアミノ酸配列からなるＮ末端フラグメントと、配列番号５からなるＣ末端フラグメントに分割することができ、両フラグメントは解離した位置では発光せず、十分に近接した位置に近づくと発光する。この両フラグメントからなるポリペプチドセットは、新規で有用なポリペプチドのセットであると言うこともでき、本発明のセカンドメッセンジャー発生による細胞内現象検出用のセカンドメッセンジャー認識タンパク質と組み合わせたリアルタイム発光プローブのために、特に適したセットである。そして、当該ポリペプチドセットは、セカンドメッセンジャー認識タンパク質ではなく、他の一般的なリガンド認識タンパク質を含むポリペプチドの両端に繋いだ場合には、リガンド認識タンパク質にリガンドが結合したことによる構造変化に応じて発光又は消光するので、直接リガンドを検出できる発光プローブとして用いることもできる。
【００２０】
また、本発明のプローブを構成する各構成要素は直接連列する場合もあるが、通常は、「リンカー配列」を介して連結する。その際、リンカーの長さが発光プローブの性能を決める重要な要素ともなる（非特許文献１０）。連結するリンカー配列の種類及び長さを変えることで、各構成要素の距離を適宜調整でき、その結果、両端の２分割発光酵素断片の位置の微妙な調整ができる。ここで、用いるリンカーとしては、本発明のプローブを一本鎖の融合タンパク質として発現するためにペプチド配列であることが好ましく、特に、セカンドメッセンジャー認識タンパク質とセカンドメッセンジャー認識タンパク質相互作用ペプチドは、リガンドのセカンドメッセンジャー認識タンパク質への結合に際して互いが近接して結合するように、立体妨害（steric hindrance）の少ない柔軟性の高いアミノ酸（glycine (G), alanine (A)など）を主成分とし、更に親水性を付与するためにSerine（Ｓ）を一部添加したリンカーペプチド（典型的には、グリシンとセリンの繰り返し配列からなるGSリンカー）で連結することが好ましい。本実施例では、Glycine（Ｇ）からなる５アミノ酸相当のリンカー配列を用いたが、通常は、各構成要素間を主としてグリシン（Ｇ）及び／又はセリン（Ｓ）からなる１〜１０アミノ酸程度の長さのリンカーペプチドで連結する。最適には５〜１０個のＧＳリンカーが用いられる。このように、融通性のある「やわらかなリンカー」を用いることで、両端の２分割発光酵素の発光性が回復する際に融通性をもたせることができる。
また、各構成要素のタンパク質又はペプチドをコードするDNAを連結する際に、通常、それぞれのDNAの両端に制限酵素切断部位を設けるが、その際に、制限酵素切断部位由来のコドンが付加される場合があり、その結果付加されたアミノ酸は結果的にリンカー配列を構成する。
したがって、本発明においては、「セカンドメッセンジャー認識タンパク質を含む一本鎖状のタンパク質」などと、リンカー配列の存在を省略して表現するが、適宜１〜１０アミノ酸に相当するリンカー配列を各要素の間に介在させる場合を含むものである。
【００２１】
以下の表１は、（i）本手法の対象になれる標的膜上受容体と、（ii）それによって引き起こされる生理現象、又、（iii）その二つを結びつける細胞内信号伝達物質であるセカンドメッセンジャーの種類を示したものである。
【表１】
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【００２２】
以上の各構成要素は、両端に分割したLEが位置することを条件に、任意の順序で連結することができる。ただし、その中には、一つのセカンドメッセンジャー認識タンパク質のみがあってもいいし（ｎ＝１）、さらにセカンドメッセンジャー認識タンパク質と結合できるペプチドが加えられてもよい（ｎ＝２）。
具体的なプローブ構成においては、発光値降下型プローブのためには、N末端側から[N-LE／CaM／C-LE]であり、発光値上昇型プローブのためには[N-LE／CaM／M13／C-LE]である。ただし、発光値上昇型プローブにおいては、N末端側から[N-LE／M13／CaM／C-LE]の順番でも本質的には問題ない。
他の外部刺激による細胞内特定セカンドメッセンジャーの発光イメージングのためには、それぞれに適宜なLEの分割位置に基づいたLE断片らとセカンドメッセンジャー認識タンパク質、さらに必要であれば、セカンドメッセンジャー認識タンパク質と結合できるペプチドを上記の連結順序に基づいてつなげればプローブを構成できる。発現ベクターへのDNA挿入は当業者であれば容易に行うことができ、適切な連結順序についても、適宜確認することができる。
【００２３】
本発明における「外部刺激による細胞内セカンドメッセンジャー活性の定性定量分析」とは、生細胞中で予め発現している本発光プローブのいずれかが披検物質である外部刺激物質による２次信号として細胞内に発生するセカンドメッセンジャーを認識し、結果として発光した波長及び強度を指標に、披検物質である外部刺激の性質及び活性の程度を判定することを意味する。発光強度のリアルタイム測定は、市販の発光プレートリーダーが用いられる。
本発明の各検出、同定、又は定量方法においては、典型的には一分子型リアルタイム発光プローブをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて形質転換した生細胞を披検物質で刺激し、発光した光の強度を測定するものである（in vivoイメージング）。また上記生細胞から発現された本プローブを細長い紙片上の一方に構えておき、もう一方に刺激物質を垂らすことによって、刺激物質の定性、定量分析が可能である（in  vitroイメージング）。
本発明の非細胞系発光イメージング手段としては、紙片、断片プレート、探針素子などの末端に本発光プローブを固定・乾燥した、発光型リガンドセンシング手段を提供できる。材質としては、nitrocellulose紙等の紙片、ナイロン６６、polyvinylidene fluoride,hydrophobic polymerなどのストリップが用いられる。特に、nitrocellulose紙片を用いることで、リトマス試験紙のような取り扱いやすい発光プローブ付着型試験紙が提供できる。
このように、本発明のプローブでは、刺激物質センシングと発光信号発信に必要な全ての要素が一分子に集積されているので、本プローブを紙片末端に付着すれば、カルシウムのような生体試料内に存在する各種生理物質を標的にすることができる。したがって、生体試料（血液、尿、汗、唾液）に対して、当該キットを用いると、ヒトの健康状態の指標として各種生理物質の濃度を計測することができる。そのために、使用者が簡便に自分の健康状態を観測することができる。例えば、血液サンプル内カルシウム濃度は骨のミネラル状態、血液凝固システム、細胞膜電位維持と直結する重要な指標である。
【００２４】
キットに提供する発光プローブは、本発明の融合タンパク質を合成もしくは遺伝子組換え技術により製造後、精製もしくは未精製のまま用いることができるが、組み換え融合タンパク質を発現している形質転換細胞をそのまま用いることもできる。その場合、当該形質転換細胞は、細胞内のセカンドメッセンジャーの発生量にリアルタイムで応じて発光又は消光できるから、細胞表面のレセプターを刺激する各種生理物質を同定・定量するセンサー細胞として活用できる。それを利用して、ホルモン・薬・化学物質による生細胞内分子メカニズム解明のような基礎生命科学研究ツールともなり得る。また、生体内各部位・臓器における、カルシウムのような生理物質の活性を細胞に大きな負荷をかけることなく可視化イメージングできる。従来のMRIのような物理的分子現象に基づいた、生体内分子現象イメージングツールとは異なり、生体内のある特定分子現象の有無をピンポイントで判定できる特長を持つ。例えば、動物実験において、当該融合タンパク質をコードする遺伝子を用いてトランスジェニックマウスを作成し、Ca２＋の振動による筋肉の萎縮を特異的に可視化できる。これにより、生体における運動（筋肉萎縮）が起こる場所のみの特異的な分子イメージングが可能となるため、筋肉萎縮に関する病気の危険因子同定、分子メカニズム解明等に大きく役に立つ。
【００２５】
上記細胞からプローブを取り出し、精製し又は未精製のまま紙片上で用いることで、生体試料内の各種生理物質の一例としてカルシウム濃度を測定することによって、カルシウム過剰症、骨粗しょう症などの、迅速な病気診断を可能とする。
本発明の一分子型リアルタイム発光プローブは、上述の真核細胞のみならず、細菌のような原核細胞で大量発現させることもできる。真核細胞の場合、適切なシグナル配列（MGVKVLFALICIAVAEAなど）を繋いで培地中に大量に分泌させることによって、精製工程なしでも分析に用いることのできる、大量なプローブ含有培養上清が得られる。また、原核細胞の場合には精製用のタグ（例えば、His Tag; HHHHHH）をつけることで、大量に精製された一分子型リアルタイム発光プローブを得ることができる。これらの精製一分子型リアルタイム発光プローブを持つ紙ストリップと、発光酵素の基質を組み合わせたキットは、これらの発光プローブを発現している生細胞を用いるキットと同様に、外部刺激とそれによる２次現象であるセカンドメッセンジャーの定性定量分析ができるキット構成することができる。
【００２６】
一分子型リアルタイム発光プローブを用いて分析、又はスクリーニングをするために、生きた細胞を利用した以下の方法を適用できるが、この方法には限定されない。
(i)一分子型リアルタイム発光プローブをコードするDNAを持つプラスミドを２４穴プレート上の生細胞に導入し、さらに１６時間培養する。
(ii)上記細胞の培養液を除去し、その代わりに基質（coelenterazine）を含んだ２００mL緩衝溶液（例えば、HBSSバーファー）に細胞を浸す。
(iii)上記細胞を特定刺激物質で刺激し、その刺激前後の発光変化値を発光プレートリーダー（luminescence plate reader; 例えば、LB 941 Multimode Reader（Berthold））を用いて観測する。
【００２７】
また、一分子型リアルタイム発光プローブを用いた非細胞系実験（in vitro）として、以下の分析、スクリーニングができるが、この方法には限定されない。
(i)精製された一分子型リアルタイム発光プローブを直径１．２センチの十字架型紙ストリップの末端に垂らして乾燥させる。
(ii)上記十字架型紙ストリップの中央に刺激物質を含む基質溶液１５mLを点滴し、即時に発光Scanner（例えば、RAS-3000；FujiFilm）で発光値を観測する。
このように、本発明のスクリーニング用キットとしては、一分子型リアルタイム発光プローブをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて形質転換した生細胞を含むキットのほか、一分子型リアルタイム発光プローブをコードする核酸を含む発現ベクターとプローブ内の発光酵素の基質とを組み合わせたキット、ならびに一分子型リアルタイム発光プローブを末端にもつ発光ストリップとその発光酵素の基質とを組み合わせたキットも用いられる。
【００２８】
本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA技術）」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種タンパク質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース（URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等）から入手することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。また、リアルタイムイメージングプローブに適用できる発光酵素をGLucのみに限定するものではないが、GLucを中心に説明する。
【００３０】
（実施例１）
Ca２＋を認識するカルモジュリン（CaM）を含む一分子型発光プローブ用の種々の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むプラスミドの構築
外部刺激によって引き起こされる、生きた細胞内での反応現象をリアルタイムでイメージングできる本プローブを英語名に因んでSimorプローブ（a SIngle MOlecule-format bioluminescent probe for Realtime imaging）と称する。カルモジュリン（CaM）を介したプローブをSicaとする。一方、カルモジュリン（CaM）と共にその認識ペプチド配列（M13）を介したプローブをSicaｍと名づける。各プローブを組み込んだ真核細胞発現ベクターをpSica、又はpSicamと称する。
Xenopus laevis（African clawed frog）由来のCa２＋認識タンパク質であるカルモジュリン（CaM; 1-150 AA; GenBank/NM001087395）をコードするcDNAの両端に制限酵素サイトのKpnIとBamHIを導入するためにPCR増幅を行った。一方、一分子型プローブとしてCaMに連結できる最適な発光酵素としてGaussia princeps由来のluciferase（GLuc; 1−189 AA; GenBank/AY015993）を利用することにした。GLucのcDNAの５箇所をPCR反応によって断片化した５つのペアを作成し、実施例２に示す、GLucの最適分割位置の検討に用いた（図３）。
図２で示したように、GLucのN末とC末側(GLuc-NとGLuc-C)に挟まれた形でCaMをつなげたcDNA constructを作成した。また、pSica-5の骨格内にCaMに加えM13をつなげ、さらにその外側にGLucのN末とC末側をつなげた融合タンパク質を発現できるcDNA constructを作成した。
また、生細胞内で発現させるプローブの発現が分析対象である生細胞本来の生理作用にできるだけ負担をかけない工夫として、本発明者らはGLucの疎水性分布グラフと、GLucにおける各ドメインの役割を考察し、GLucの最初２〜１７番目までのアミノ酸が発光活性には影響しないであろうと予測してこの範囲のアミノ酸を含まない形で本発明のプローブを設計した。この結果、GLucの全体分子量からおよそ１１％を減らした形での発光プローブを作成できた。
また本発明では、プローブ内の各要素を、通常４〜５アミノ酸程度のグリシン（Ｇ）及び／又はセリン（Ｓ）を介するように設計するが、当該実施例では、５アミノ酸相当のGlycine（Ｇ）リンカーを用いている。このリンカー配列を省略して図式化すると、本実施例のプローブは、[GLuc-N/CaM/GLuc-C]、又は[GLuc-N/CaM/M13/GLuc-C]と表すことができ、当該遺伝子コンストラクトを、pcDNA3.1(+)ベクター骨格（Invitrogen）にサブクローニングしてプラスミドを構築した。なお、構築したプラスミドはBigDye Terminator Cycle SequencingキットとABI Prism310遺伝子解析装置より配列確認を行った。GLucのＮ末側断片とＣ末側断片の間にCaMのみを持つプラスミドをpSica系統（pSica-1〜-5）と名づけた。
その対照群として、ホタルルシフェラーゼ（FLuc）の断片であるFLuc-N及びFLuc-Cを用いた場合の、[FLuc-N/CaM/FLuc-C]、又は[FLuc-N/CaM/M13/FLuc-C]の遺伝子コンストラクトを作成し、同様にpcDNA3.1(+)ベクター骨格（Invitrogen）にサブクローニングした。
【００３１】
（実施例２）
GLucの分割位置の検討
本発明者らはGLucの全アミノ酸配列における疎水性分布解析をベースにGLucのアミノ酸配列内９０位から１０８位までの親水性領域がGLucを形成する二つのタンパク質ドメイン間領域であると予測し、この領域を中心に５箇所の分割位置をきめ、上述のようにGLucのcDNAの５箇所をPCR反応によって断片化した５つのペアを作成した（図３）。
これら５つのGLucのＮ末側断片とC末側断片ペアの間にCaMのみを持つプラスミドをpSica系統と名づけ、その分割位置の違いからpSica-1から-5までの名前をつけた。
各プローブの発光値を見比べたところ、１−３番分割位置を有するプローブの発光値はほぼゼロであるのに対し、４−５番分割位置を持つプローブは５００万RLU程度の強い発光値を示した（図３）。この結果は、３番と４番分割位置の間にある７個のアミノ酸がGLuc の活性中心である可能性を示している。また図３と４の結果から４番と５番の分割位置の間の領域がGLucを使った一分子型発光プローブを作成する上で最適な分割位置であることを示している。また、この結果は、４−５番付近の位置で切断されたGLucを持つプローブは、十分な発光酵素活性を回復できるため、カルシウムイオンの増減を指標とした分析用試薬（リアルタイム発光プローブ）としてきわめて優れていることを示すものである。また同時に、光が殆ど出なかった３番と多く出た４番の間にあるアミノ酸は酵素の発光活性を司る重要なアミノ酸を含んでいる可能性を示唆するものであるため、以下のポイント変異実験を行った（実施例３）。
一方、対照として作成したFLuc断片を用いたプローブはカルシウムに対する応答性を示さなかった（図２（Ｂ））。
【００３２】
（実施例３）
ポイント変異型プラスミドの作成とその発光スペクトルの作成
上記GLucの３番と４番切断位置の間には七つのアミノ酸配列（93RCHTYEG99）が存在する。今実験ではこのアミノ酸の中、GLucの発光活性を司るアミノ酸を検索するためにそれぞれのアミノ酸を一つずつglycine（Ｇ）にポイント変異したＮ末側の断片を作成し、その各々のポイント変異型GLuc-N末断片を含む融合タンパク質をコードする核酸を用いて６種類のプラスミドを作成した。
このポイント変異体を作成するために以下の手順で作業をした。pSica-4を鋳型にし、GLucのＮ末側断片における一部分のアミノ酸であるＲＣＨＴＹＥＧをコードするcDNAを、それぞれポイント変異を引き起こすプライマーシステムを使い、PCR合成した。その結果、合成されたＮ末側断片を精製し、その両端をHindIIIとKpnI切断酵素で切断する。一方のpSica-4も同じくHindIIIとKpnIサイトで切断し、上記変異型N末側断片をそれぞれ組み込んだプラスミドを作成した。これらをそれぞれpSica-4m1から数字を変えpSica-4m6まで名づけた。ここで言う“m”の意味はmutationのことを示す。
上記pSica‐4m1から‐4m6までのプラスミドをそれぞれ導入した細胞による発光スペクトルを測定した（図４）。結果からするとpSica-4m6による発光スペクトルは他の場合に比べて480 nm近傍の発光値が高いのが分かる。一方、pSica-4m4による480 nm近傍の発光値はpSica-4m6とその他のプラスミドによる発光値の真中に当たる。またpSica-4m1から-4m3およびpSica-4m5による発光値は比較的に低いことが分かる。この結果は以下に解析できる。
上記GLucの３番と４番切断位置の間には七つのアミノ酸配列（RCHTYEG）の中で、発光活性に重要なアミノ酸はＲ、Ｃ、Ｈ、とＹであり、これらに比べて、GLucアミノ酸配列中の９６位のＴと９８位のEは発光活性にあまり重要ではないアミノ酸であることが分かった。この実験は、本一分子型リアルタイム発光プローブが刺激物質の定量可視化手段を提供するのみならず、発光タンパク質そのものに関する基礎研究でも有力な手段であることを示している。
【００３３】
（実施例４）
pSica-5を導入したCOS-7細胞におけるATP濃度依存的な発光変化値の測定
２４穴プレートに培養したCOS-7細胞にpSica-5を、Transfection試薬（TransIT-LT1（Mirus））を用いて導入した。さらに１６時間培養後、培地をHBSS緩衝溶液（1.3 mM Ca２＋含有）と基質混合溶液２００mLに換え、その後の発光変化値を発光プレートリーダーでモニターした（図５）。約５分後、それぞれ違う濃度のATPを加え、その後の発光値の変化を観測した。結果によると１mM、１００mM、１０mM ATP刺激に対して、それぞれ刺激濃度依存的な発光値の変化が観測された。一方、緩衝溶液そのもの（phosphate buffer saline; PBS）に対しては観測できる値の発光値の変化は認められなかった。
【００３４】
（実施例５）
pSica-5を導入したCOS-7細胞における外部刺激物質による発光強度変化の測定
２４穴プレートに培養したCOS-7細胞にpSica-5を、Transfection試薬（TransIT-LT1（Mirus））を用いて導入した。さらに１６時間培養後、培地をHBSS緩衝溶液（1.3 mM Ca２＋含有）と基質混合溶液２００mLに換え、その後の発光変化値を発光プレートリーダーでモニターした（図６）。その後、２mM ionomycinを加えることによって、細胞外のCa２＋が細胞内に入るようにした条件で発光値の変化を観測した（外部から細胞へのCa２＋導入）。更に、１mM ATPと１mM histamineを加え、細胞内endoplasmic reticulum（ER）から細胞質へのCa２＋排出を促進した条件で発光値の変動を測定した（細胞内部でのCa２＋分泌促進）。この全過程における発光値の変化を発光プレートリーダーで観測した。この結果から、細胞内における代表的な信号伝達手段であるCa２＋濃度変化が生きた細胞のままで、リアルタイムで測定できることが分かった。
【００３５】
（実施例６）
pSica-5を導入した生細胞のCa２＋濃度依存的な発光強度及び濃度検定曲線
２４穴プレートに培養したCOS-7細胞又はHeLa細胞にpSica-5を、Transfection試薬（TransIT-LT1、Mirus）を用いて導入した。さらに１６時間培養後、細胞培地を基質であるcoeleterazineと２mM ionomycinを含んだPBS緩衝溶液２００mLに換え、その後の発光変化値を発光プレートリーダー（Mithras LB 940; Berthold）でモニターした（図７（Ａ））。発光強度が安定化された４分後、10-3.5から10-5.5 MになるようにCa２＋をウェル上細胞に加えた。その後、即時に上記発光プレートリーダーで発光値の変化をモニターした。加えたCa２＋濃度依存的な発光値の変化が観測された。このCa２＋濃度における発光変動値をベースに、三種類の培養細胞によるCa２＋濃度検定曲線を作成した。
Ca２＋濃度による発光強度値変化を基に得られた５０％活性濃度（effective concentration 50%）は、COS-7とHeLa細胞に対してそれぞれ、0.25 x 10-4 Mと0.50 x 10-4 Mであることが分かった。HeLa細胞内に引き起こされたCaMとCa２＋と間の解離係数（Kd）は、その発光値から0.63 x 10-17 M4であることが分かった。
pSica-5を導入したCOS-7、MCF‐7、およびHeLa細胞のATP濃度による発光強度変化を測定した（図７（Ｂ））。ATPによって刺激された場合、細胞膜上に存在するATPリセプターがATPを認識し、活性化されたリセプターの直下にIP3の濃度が増加する。結果的にIP3によるCa２＋濃度が増加する。従って、外部からの与えられたATP濃度依存的な発光強度を示した。１mM ATP刺激によって各細胞における増加された細胞内Ca２＋の濃度は下記表に示した。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
（実施例７）
pSicamを導入したCOS-7細胞における外部刺激物質による発光強度変化の測定
１２穴プレート上に培養したCOS-7細胞にpSicamを導入した。１６時間後、外部刺激依存的な発光強度変化を発光プレートリーダーでモニターした（図８）。図８（Ａ）においては、１２穴プレート上の細胞培地をHBSS緩衝溶液（1.3 mM Ca２＋含有）と基質混合溶液200 mLに換え、その後の発光変化値を発光プレートリーダーでモニターした。その後、ATP有り無しの条件で発光値の変化をモニターした。図８（Ｂ）に関しては、まず、１２穴プレート上の細胞培地をHBSS緩衝溶液（1.3 mM Ca２＋含有）と基質混合溶液２００mLに換え、その後の発光変化値を発光プレートリーダーで約５分間モニターした。その後、２mL ionomycinを加え、最後には１ｍM ATPで刺激した。各段階における発光強度の変化を引続き発光プレートリーダーで観測した。この結果は、pSicamを導入したCOS-7細胞は外部刺激依存的に発光強度を増加させることが分かった。この理由は、pSicam内部に挿入したCaMとM13間の結合が外部刺激依存的に起こり、その結果、CaMとM13の更に外側に連結したGLuc断片間の相互作用によって酵素活性が回復されたからだと解析できる。図８（Ｃ）はCaMとM13間の結合による酵素活性回復の概念図であり、右辺にはカルシウム有りの条件でCaMとM13が結合した時の液晶構造を示す。
この実験結果は、本手法が生きた細胞内外の分子現象をリアルタイムで観測できることを示している。
【００３８】
（実施例８）
核受容体を組み込んだ一分子型発光プローブ発現用のプラスミドの構築と刺激応答性測定
上記プラスミドを使った実験によって見出された、GLuc内最適切断位置が汎用的な切断位置であることを示すために核受容体（nuclear receptor; NR）のプラスミドを構築した。
核受容体の代表的なものである、人間由来の男性ホルモン受容体（human androgen receptor; AR  GenBank/M27430）又は、グルココルチコイド受容体（human glucocorticoid receptor; GR GenBank/P04150）のリガンド結合ドメイン（ligand binding domain; LBD）のcDNAから、PCR反応により各N-とC-末側に制限酵素サイトであるKpnIとBamHIを導入した。上記pSica-5におけるCaMのcDNAの変わりに本AR LBD又はGR LBDを導入したプラスミドを作成した。これらをそれぞれpSimarとpSimgrに名づけた。図９（Ａ）はpSimarとpSimgr内のコンストラクトの遺伝子設計図である。
図９（Ｂ）と（Ｃ）はそれぞれpSimarとpSimgrを導入した生細胞のリガンド感受性を示す。pSimarを導入した細胞は男性ホルモン（DHT）に対して特異的な発光強度を示し、一方、pSimgrを導入した細胞はストレスホルモン（cortisol）に強い感受性を示した。この結果は、本AR LBDとGR LBDを搭載したプローブが生細胞の中で確かに発現されており、リガンド選択性と感受性を持つことを示している。また、本プローブに搭載したGLucの断片が、pSica-5で採用された切断位置と一致することから、この切断位置が、一分子型発光イメージングプローブのために一般的に使用できるものであることを強く示唆する。
【００３９】
【表３】
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【００４０】
（実施例９）
発光紙片を用いたCa２＋活性の可視化イメージング
本一分子型リアルタイム発光プローブは、一つの分子内に信号認識とシグナル（発光）発信に必要なすべての要素が集積された形態であるため、生きた細胞のみならず、in vitro実験でも幅広く使用できる。その一例として、ガラス基板上に紙片を形成させた形のリガンドの可視化イメージング手段を提供できる。
本実施例では、ニトロセルロースペーパーから十字架様ストリップを切断し、取り出した紙片をガラス基板上に付着した発光ストリップを製作した（図１０）。上記生細胞から分離精製したプローブを十字架型発光ストリップの末端に点滴・乾燥し、その後、Ca２＋感受性を測定した。Ca２＋イオンありの条件では強い発光を提示していることが分かった。一方、Ca２＋イオンなしの条件では、発光が目立たないほど弱いのが分かる。
この結果は、本一分子型リアルタイム発光プローブが生細胞のリアルタイム発光イメージングのみならず、非細胞系においても一般的な分析ツールを形成できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、人体の感覚センサー（細胞膜上にリセプターを有する）の基本メカニズムを利用して、細胞膜上リセプターの直下におきる分子現象を可視化イメージングするものであり、生物そのもの信号増幅原理を生かしつつ、感度のよい、且つ幅広い分野で適用できる基礎生物分析法を提供する。本プローブを生きた細胞に導入すると、細胞そのものがセンサー細胞に変わり、リアルタイムで生きた細胞内における様々な生命現象の可視化イメージングを可能としてくれる。一例として、食中毒、アレルギーによって引き起こされるヒスタミンに対して、生きた細胞内で上昇するCa２＋濃度変動を観測できる。他にも視覚、聴覚、触覚、エネルギー代謝などで同様の応用ができる。
また、細長い紙片などの一方に本プローブを乗せて乾燥させておき、測定の時に少量のサンプルを滴下することによって、非細胞系においてもOn-site、リアルタイムで、かつ小型化された分析手段を提供する。既存に市販されている妊娠診断試薬、排卵診断試薬のような形で、標的リガンドの定量可視化を可能にする、簡便な分析手段を提供できる。  アレルギー、ストレス物質のような生体内障害因子の高速スクリーニング、抗がん剤の薬作用の迅速・簡便かつ高サンプル処理能での定量評価（新薬開発）に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】リガンド刺激によって引き起こされる、細胞内の代表的なセカンドメッセンジャーであるCa２＋認識タンパク質（カルモジュリン；CaM）の構造変化（Ａ）と、これをベースとした発光プローブの概念図（Ｂ）。CaMはCa２＋なしではそのＮ末とＣ末間の距離が近接している。一方、Ca２＋と結合するとCaMのＮ末とＣ末間の距離が遠くなっていることが図から分かる。
【図２】カルモジュリン（CaM）を取り込んだ一分子型リアルタイムプローブの設計図（Ａ）とそれぞれのプローブにおけるリガンド感受性測定（Ｂ）。またそれぞれのプローブ内におけるカルモジュリンの液晶構造変化図（Ｃ）。プローブの構造としては、GLuc全長又はFLucを２分割し、その中にはCa２＋認識タンパク質であるCaMとM13、又はCaMのみを介したものである。
【図３】Gaussia  Luciferase  （GLuc）の適切な切断位置の決定。（Ａ）はGLuc内の具体的な切断位置、（Ｂ）はその各々の切断位置をベースとした発光プローブの生物発光の強度。４、５番の切断位置が有力である。（Ｃ）はGLucを構成するアミノ酸配列の疎水性分布図である。アミノ酸９０−１００番の間に親水性領域があるのが分かる。
【図４】Gaussia  Luciferase（GLuc）の切断位置の３番から４番の間にある各アミノ酸をGlycineにポイントミュテーション（変異）したことによるCaMプローブの発光値の変化スペクトル。（Ａ）は変異した位置を示し、（Ｂ）はそれぞれの変異によって変わった発光値のスペクトルを示す。
【図５】GLucの５番切断位置をベースにした発光プローブのATP濃度依存性測定（Ａ）。この発光プローブの構造変化概念図（Ｂ）。例えば、１００ mMのATP刺激に対して、COS-7細胞の本来の膜上リセプターであるATPリセプターが反応し、Ca２＋の濃度を増加させる。増加したCa２＋にプローブ内CaMが反応した結果、発光強度が下がる。この現象はATP濃度依存的である。
【図６】最適CaMプローブを使った生物発光リアルタイムイメージングの例（Ａ）。また、発光スペクトルの例（Ｂ）。生きた細胞からの生物発光が外部刺激に応じて変動することが分かる。また（Ｂ）からみれば、発光値は刺激依存的に下がっていることが分かる。
【図７】最適CaMプローブであるpSica-5を導入した生細胞のCa２＋濃度依存性発光強度の経時変化（Ａ）及び検定曲線（Ｂ）。全てが、生きたままの細胞に刺激をかけその生物発光変動を測定したものである。
【図８】最適化されたCaMM13プローブであるpSicamを導入した細胞の刺激による生物発光の経時変化（Ａ）とそのionomycin, 又は、ATP濃度依存的な発光応答の変化（Ｂ）。CaMM13プローブの分子応答メカニズム概念図（Ｃ）。CaMがM13と結合する前後で、両タンパク質末端間の距離が95.14 Åから50.52 Åまで近接する事が分かる。
【図９】最適切断位置で分割されたGLuc両断片（dissection point #5； G106/G107）を両端に持つAR LBD又はGR LBDのリガンド感受性測定。（Ａ）はその遺伝子設計図、（Ｂ）はAR LBDを内在したプローブ（pSimar）のステロイドホルモン感受性、（Ｃ）はGR LBDを内在したプローブ（pSimgr）のステロイドホルモン感受性を示す。
【図１０】ガラス基板上に形成したNitrocellulose紙片上に導入・乾燥された発光プローブのCa２＋感受性。（Ａ）はガラス基板上に形成した直径１センチの十字架様センサーストリップの実物写真である。（Ｂ）はセンサーストリップの末端に固定化した各プローブの位置であり、（Ｃ）は本センサーストリップのCa２＋感受性を示している。Ca２＋イオンありの条件で強い発光を提示していることが分かる（白い点）。一方、Ca２＋イオンなしの条件では、発光が目立たないほど弱いのが分かる。（Ｄ）ガラス上に形成された発光ストリップのCa２＋イオン依存的な発光値上昇の半面像（profile）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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