(57)【要約】【課題】ディスポーザブルなタイプで、小スケールで迅速・簡便に酵素活性を精度よく測定することが可能である、酵素が電極上に固定化されてなる電気化学センサーを提供する。【解決手段】金属電極上にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性高分子を介して酵素が共有結合により固定化されてなり、該固定化された酵素に対する基質が作用することにより生ずる電気化学的なシグナルの変動、例えば酸化もしくは還元電流を検出することを特徴とする電気化学センサー。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属電極上に親水性高分子を介して酵素が共有結合により固定化されてなり、該固定化された酵素に対する基質の反応を電気化学的に検出することを特徴とする電気化学センサー。
【請求項２】
金属電極が絶縁基板上に形成されてなることを特徴とする請求項１に記載の電気化学センサー。
【請求項３】
金属電極が円形であることを特徴とする請求項１又は２に記載の電気化学センサー。
【請求項４】
金属電極の半径が３ｍｍ以下であることを特徴とする請求項３に記載の電気化学センサー。
【請求項５】
親水性高分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の電気化学センサー。
【請求項６】
固定化された酵素に対する基質の結合を検出するに際して、基質を作用させることにより生じる電流変化を測定することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の電気化学センサー。
【請求項７】
共有結合が金属表面に導入されたスクシンミド基及び酵素のアミノ基とのカップリングによる結合によることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の電気化学センサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学的な方法により酵素活性を測定するための電気化学センサーに関する。より詳細には、金属電極の表面に、酵素を共有結合により固定化されてなる電気化学センサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
固定化酵素を電極と組み合わせ、電気的信号として物質を定量する酵素センサーは、酵素反応により電極上で生ずる化学物質の消費や生成を、電極で電流値や電位値の変化として測定する。酵素センサーは、グルコースセンサーが既に広く実用化されており、更にラクトースセンサー、アルコールセンサーなど多くの種類のものも報告されている。検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点で電気化学的なセンシングによる方法は有利である。
【０００３】
固定化酵素は、安定化され、連続反復での使用が可能であるので、バイオリアクターとしても古くから利用されてきている。この利点に着目した酵素電極については、既に多数の報告がなされているが、高精度化と安定性に関しては、依然として課題があり、現在も多くの研究開発が続けられている。また、近年では特にＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）への酵素電極の適用も広がっていることから、コンパクトで扱いやすく、ディスポーザブルなものが求められるようになっている。したがって、電極の小型化も重要な課題の一つとなっている。
【０００４】
酵素の固定化様式としては、担体結合法、架橋法、包括法の３つに大別されるものが知られている。これらの方法を適用された酵素電極として、多くの報告がある。例示すると、膜状の酵素固定化担体を利用したもの（特許文献１）、多孔性表面を形成した金属表面にアルデヒド基を解して固定化したもの（特許文献２）、シリカモノリスのような多孔質材料の表面に酵素を物理吸着により固定化したもの（特許文献３）などが挙げられるが、必ずしも満足いくような性質のものは得られていない。また、反応性単分子膜を介してＦＥＴゲート電極上の金属表面に蛋白質を固定化する方法も報告されている（特許文献４）。この方法では、単分子膜上に直接シアノブロマイド法やアルデヒド法を用いるため、手法的に煩雑であるうえに、酵素の安定化、固定化効率、反応性などの点においてあまり有用とはいえない。
【０００５】
一方、少ないサンプル量で迅速に測定を行うために、電極の微小化に関しても様々な報告がある。これらに関しても、多くの試みが知られているが、例えば、マイクロ流路を組み合わせた測定システム（特許文献５）や、絶縁基板上に導電性材料をパターニングすることで形成された使い捨てが可能なプレナー型電極（特許文献６）などが報告されている。しかしながら、これらの電極やシステムを応用した測定系としては、まだ有効に活用できているとは言い難く、必ずしも十分なレベルに達していないのが実情である。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−２４２０５４号公報
【特許文献２】特開平１０−２６７８８８号公報
【特許文献３】特開２００５−１２１５５１号公報
【特許文献４】特許第２５６３７３９号公報
【特許文献５】特開２００７−２４７４２号公報
【特許文献６】特開２００７−２７８９８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ディスポーザブルなタイプの、小スケールで迅速・簡便に酵素活性を精度よく測定することが可能である、酵素が電極に固定化されてなる電気化学センサーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【０００９】
（１）金属電極上に親水性高分子を介して酵素が共有結合により固定化されてなり、該固定化された酵素に対する基質の反応を電気化学的に検出することを特徴とする電気化学センサー。
（２）金属電極が絶縁基板上に形成されてなることを特徴とする（１）の電気化学センサー。
（３）金属電極が円形であることを特徴とする（１）又は（２）の電気化学センサー。
（４）金属電極の半径が３ｍｍ以下であることを特徴とする（３）の電気化学センサー。
（５）親水性高分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかの電気化学センサー。
（６）固定化された酵素に対する基質の結合を検出するに際して、基質を作用させることにより生じる電流変化を測定することを特徴とする（１）〜（５）のいずれかの電気化学センサー。
（７）共有結合が金属表面に導入されたスクシンミド基及び酵素のアミノ基とのカップリングによる結合によることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかの電気化学センサー。
【発明の効果】
【００１０】
本発明における方法を用いることにより、微量サンプルを用いた酵素反応を簡便に行うことが可能である。ディスポーザブルな使用が可能であり取り扱いやすい手でも有利である。また、精度よく安定した酵素アッセイに有用なものとして期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、電気化学センサーに関するものであり、金属電極上に親水性高分子を介して酵素が共有結合により固定化されてなり、かつ該固定化酵素に対する基質の反応を電気化学的に検出することを特徴とするものである。電気化学的に検出される方法は、特に限定されるものではないが、例えば、基質を作用させることによる酸化もしくは還元反応により生じる電流の変化をアンペロメトリーにより測定する方法が挙げられる。
【００１２】
ここで、電気化学測定の方法は特に限定されないが、一般的なポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることができる。一般的なテスターを用いてもよい。測定システムとしては、二電極であっても三電極系であってもよい。本発明においては、作用電極には白金、金、銀、ニッケル、パラジウムなどの金属を用いることを特徴とする。なかでも、金が特に好ましい。参照電極としては、特に限定されるものではなく、電気化学実験において一般的なものを適用することができるが、例えば飽和カロメル電極、銀−塩化銀などが挙げられる。
【００１３】
ところで、チオール基は金属と特異的に反応して、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を形成することが知られている。作用電極に金属を用いると、この原理を適用して、容易に表面に官能基を導入することが可能になる。こうして、酵素の電極表面への固定化が可能になる。この固定化方法では、特に包括法による酵素の固定化と比較して、酵素の固定化密度をコントロールしやすくなり、再現性の点で有利になる。金属電極は、このように容易にＳＡＭ形成を行うことができる点で扱いやすいというメリットがある。
【００１４】
本発明においては、金属電極上において、特に親水性高分子を介して酵素が共有結合により固定化されていることを特徴とする。このような構成を有することで、酵素の安定性が向上するだけでなく、基質との反応性も向上することができる。したがって、精度の高い測定を実現することができるものである。
【００１５】
本発明において、親水性高分子とは水に可溶もしくは水に膨潤する性質をもつ、繰り返し単位をもつ化合物のことを言い、合成物であっても天然物であってもよい。具体的に例示すると、親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、さらにはキトサン、カラギーナン、グルコマンナンなどの多糖類が挙げられる。これらの中でも、ポリエチレングリコール、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリビニルピロリドン等のＯＨ基、カルボン酸やその塩、アミン、イミンなど反応性を有する部分を持たないものが好ましく、最も好ましくはＰＥＧである。
【００１６】
こうした親水性高分子を介した形で、酵素を固定化するには、例えばＰＥＧを用いるのであれば、官能基等で修飾されたＰＥＧ誘導体を用いることが可能である。特に金属電極を用いる場合、チオール基を末端に有するＰＥＧ誘導体を用いることが好ましい。更には、蛋白質の一種である酵素をカップリングすることが可能であるような官能基を他方のＰＥＧ末端に有することがより好ましい。該官能基としては、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、スクシンミド基などが挙げられるが、特にスクシンミド基であることが特に好ましい。すなわち、チオール基とスクシンミド基を併せ持ったＰＥＧ誘導体を架橋剤として用いると、１ステップで金属電極表面にスクシンミド基を導入することができる。また、チオール基とカルボキシル基を併せ持ったＰＥＧ誘導体を架橋剤として用い、水溶性カルボジミドを用いた縮合反応による固定化を行ってもよい。また、これらの場合のＰＥＧ架橋剤におけるエチレングリコールの繰り返しは、３〜２５程度の長さであることが好ましい。
【００１７】
また、チオール基の場合、安定性が比較的劣るため、チオール基が保護されてなる架橋財、好ましくはＰＥＧ誘導体からなる架橋剤を簡単な化学的処理を行うことにより、チオール基を要時調製により形成させて、金属電極の表面処理を施してもよい。具体的には、Ｓ−アセチル基を末端に有する化合物が挙げられる。これを脱アセチル処理を施すことによりチオール基を形成することができる。より好ましくは、Ｓ−アセチル基とともにスクシンミド基も併せ持ったＰＥＧ誘導体を用いることが好ましい。
【００１８】
本発明において、金属電極は絶縁基板上に形成されてなることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成されることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられ、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものがより好ましい。
【００１９】
本発明において、金属電極の形状は特に限定されるものではなく、円形、楕円形、四角形などの形状が挙げられるが、円形であることが、固定化する酵素溶液のマウントのしやすさの点から特に好ましい。また、円形の形状である場合、その半径は３ｍｍ以下であることが好ましく、２．５ｍｍ以下がより好ましく、２ｍｍ以下が更に好ましい。酵素溶液の容量としては１〜５μｌ程度で十分であり、２−３μｌ程度の量で行うのがより好ましい。酵素溶液をマウントした後の固定化反応は、湿潤条件下で静置して行うのが好ましい。
【００２０】
本発明において、酵素の種類は特に限定されるものではなく、広く酸化還元酵素、加水分解酵素、リアーゼなどを用いることが可能である。１種類の酵素を単独で用いてもよいし、複数種類を組合せて用いてもよい。
【００２１】
酵素反応に用いる溶液の種類は、特に限定されるものではないが、ＰＢＳのようなリン酸緩衝液、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳなどのＧＯＯＤの緩衝液などが例示される。緩衝液のｐＨとしては４．０〜９．０程度が好ましく、より好ましくは５．０〜８．０程度、更に好ましくは５．５〜７．５程度である。濃度としては、１〜２００ｍＭ程度が好ましく、より好ましくは１０〜１５０ｍＭ程度、更に好ましくは２０〜１００ｍＭ程度である。
【００２２】
酵素反応と電極間の電子移動を仲介するためのメディエーターを用いることも効果的である。適用できるメディエーターの種類は特に限定されるものではないが、電子対として、ベンゾキノン／ハイドロキノン、フェリシアン／フェロシアン、フェリシニウム／フェロセンなどが挙げられる。その他にも、オスミウムやルテニウムなどの金属錯体を用いることも可能である。水溶性の低い化合物をメディエーターとして用いる場合、有機溶媒を用いると、酵素自体の安定性を損なったり、酵素活性を失活させてしまう可能性がある。そこで、水溶性を高めるために、ＰＥＧのような親水性高分子で修飾されたものを用いてもよい。またメディ−ターについても種々の官能基による修飾体を用いて、酵素とともに金属電極上に固定化させて用いてもよい。
【００２３】
酵素反応は、所望の容量の反応溶液中に、所望の量の酵素とメディエーターを加えて混合された状態において、基質を含有する試料溶液を所定量加えると同時に測定を開始する。酵素反応が進行するとメディエーターを介在した電子の移動に伴って生ずる電流の変化をシグナルとして測定することが好ましい。測定に供する試料の種類は特に制約されるものではなく、酵素の基質を成分として含有する化含有する可能性のある水溶液はもとより、血液、体液、尿などの生体試料であってもよい。また、測定に際しては、可能な範囲で反応温度を一定にして行う方が好ましい。マイクロ流路デバイス等を用いた微量解析に展開することも可能である。
【実施例】
【００２４】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明する。なお、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００２５】
（実施例１）
図１（Ａ）に示すような、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極（金・丸型；バイオデバイステクノロジー製）上に、２ｍＭ  ＰＥＧ６−ＣＯＯＮＨＳ  ａｌｋａｎｅｔｈｉｏｌ（ＳｅｎｓｏＰａｔｈ製ＳＰＴ−００１２Ｃ；式（Ｉ）を参照）溶液（エタノール：水／１：９９容量比）２μＬをマウント（図１（Ｂ）参照）して、湿潤環境下、室温で２時間静置して、スクシンミド基表面を形成させた。ＰＥＧ６−ＣＯＯＮＨＳ  ａｌｋａｎｅｔｈｉｏｌはＰＥＧ末端にチオール基とスクシンミド基を併せ持ったＰＥＧ誘導体である。電極を水及びエタノールで十分に洗浄して、エアーブローにより乾燥させた後、１０ｍｇ／ｍｌ濃度のペルオキシダーゼであるＰＥＯ−３０２（２４６Ｕ／ｍｇ；東洋紡績製）溶液（ＰＢＳ溶液）２μＬをマウントして、湿潤環境下、室温で３時間静置して、固定化反応を行った。金表面に導入されたスクシンミド基とペルオキシダーゼ蛋白質に有するアミノ基とが反応することにより固定化することができる。
【００２６】
【化１】
2009139113.tif 000002
【００２７】
この電極を水で十分に洗浄して、エアーブローにより乾燥させた後、２ｍｇ／ｍｌ濃度のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥＰＡ−２０Ｈ（日本油脂製）溶液（ＰＢＳ溶液）２μＬをマウントして、湿潤環境下、室温で１時間静置して、未反応のスクシンミド基のブロッキングを行った。ＭＥＰＡ−２０Ｈは、末端にアミノ基を有するＰＥＧ誘導体であり、分子量は２，０００である。
【００２８】
上記のように調製された電極を、５ｍＭ濃度のＦｅｒｒｏｃｅｎｙｌ  ＰＥＧ（１１−Ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌｕｎｄｅｃｙｌ  ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｅｔｈｅｒ）（同仁化学製）のＰＢＳ溶液（以下、ＰＥＧ−フェロセン溶液という。）６０μＬ中に入れて、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ専用コネクターを用いて、汎用電気化学測定器ポテンショ／ガルバノスタット１１１２型（扶桑製作所製）に接続した。
【００２９】
上記のＰＥＧ−フェロセン溶液中に、過酸化水素を添加して、その際に生ずる還元電流の測定を行った。図２に、測定の概念を示した。ポテンショ／ガルバノスタットの電位は０ボルトに設定して測定を行った。過酸化水素はＰＢＳで希釈して、所望の濃度のものを用いた。
【００３０】
１００ｍＭ  過酸化水素を８μｌのインジェクションを、５０秒おきに６回行い、その際の電流の変化を測定した。測定の結果を図３に示した。過酸化水素のインジェクションに伴って、負の還元電流の値が増していく様子が観察されている。
【００３１】
更に、過酸化水素の濃度による影響も検討した。ＰＢＳ、ＰＢＳ、１０ｍＭ  過酸化水素、１００ｍＭ  過酸化水素、１Ｍ  過酸化水素の順に８μｌずつインジェクションを行い、その際に生ずる還元電流の測定を行った。図４に測定の結果を示した。
【００３２】
ブランクとして用いたＰＢＳのインジェクションにおいては、ほとんど電流の変化が生じていないが、過酸化水素をインジェクションした場合は、その濃度が高くなるほど、還元電流の値が大きくなる様子が確認されている。したがって、本発明の電気化学センサーを用いて、酵素反応を精度よくモニターすることが可能になった。
【００３３】
（実施例２）
式（ＩＩ）に示すようなＳＡＴ（ＰＥＯ）４（Ｐｉｅｒｃｅ製）の２５０ｍＭストック液（ＤＭＳＯ溶解液）をＰＢＳで２５０倍希釈したＡ液と、ヒドロキシルアミン（Ｐｉｅｒｃｅ製）の０．５Ｍ溶液（２５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳに溶解）であるＢ液を調製し、Ａ液とＢ液を４：１の容量比になるように混合して、室温で２時間反応させて、脱アセチル処理を行いチオール基末端とした。この反応液をＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極（金・丸型；バイオデバイステクノロジー製）上に２μＬをマウントして、湿潤環境下、室温で２時間静置して、スクシンミド基表面を形成させた。その後は、実施例１と同様にして、ペルオキシダーゼの固定化及びブロッキング処理を行い、電極の作製を行った。
【００３４】
【化２】
2009139113.tif 000003
【００３５】
上記のように調製された電極を、実施例１の場合と同様に、５ｍＭ濃度のＰＥＧ−フェロセン溶液（ＰＢＳ溶液）６０μＬ中に入れて、過酸化水素を加えた際の還元電流の測定を行った。実施例１と同様に、ＰＢＳ、ＰＢＳ、１０ｍＭ  過酸化水素、１００ｍＭ  過酸化水素、１Ｍ  過酸化水素の順に８μｌずつインジェクションを行い、その際に生ずる還元電流の測定を行った。図５に測定の結果を示した。
【００３６】
この場合も、ブランクであるＰＢＳのインジェクションによってはほとんど電流の変化が生じていないが、過酸化水素をインジェクションした場合は、その濃度が高くなるほど、還元電流の値が大きくなる様子が確認された。したがって、本発明の電気化学センサーを用いて、酵素反応を精度よくモニターすることが可能になった。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明を利用することにより、小スケールの電極センサーによる微量サンプルを用いた電気化学的な酵素アッセイを、精度よく行うことが可能である。またディスポーザブルな使用態様も可能であることから、簡便で取り扱いやすく、医療検査、環境因子の分析、食品分野等における品質管理など幅広い産業分野における応用展開が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】（Ａ）実施例で用いた電極の写真を示す図である。（Ｂ）実施例において、金電極上に溶液をマウントした状態を示す写真である。
【図２】実施例における、ペルオキシダーゼ固定化電極を用いて、フェロセン溶液中に過酸化水素を加えた際の還元電流を測定する概念を示す図である。
【図３】実施例１において、
【図４】実施例１において、各濃度の過酸化水素をインジェクションした際の、フェロセンの還元電流を測定した結果である。
【図５】実施例２において、各濃度の過酸化水素をインジェクションした際の、フェロセンの還元電流を測定した結果である。
【図２】
2009139113.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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