(57)【要約】【課題】  大腸癌患者に対して有効な治療を行うため、ゲノム異常を指標にしたリンパ節転移やステージ進展等の病態評価の方法を提供することをその主な課題とする。【解決手段】  被験者由来の癌細胞を材料として、ＦＩＳＨ法、染色体ＣＧＨ（ｃ−ＣＧＨ）法、ＢＡＣアレイＣＧＨ（ａ−ＣＧＨ）法等を用い、染色体の８ｑ２４．３領域、１３ｑ１２．３領域、染色体１７ｐ１３．３領域、染色体１７ｐ１３．１領域中から選択される１以上の領域におけるＤＮＡコピー数の異常を検出することにより、大腸癌のリンパ節転移やステージ進展等の病態評価方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の癌細胞において、染色体８ｑ２４．３領域、染色体１３ｑ１２．３領域、染色体１７ｐ１３．３領域、および染色体１７ｐ１３．１領域の中から選択される１以上の領域におけるＤＮＡコピー数の異常を検出することを特徴とする、大腸癌の病態評価の方法。
【請求項２】
被験者由来の癌細胞において、染色体の８ｑ２４．３領域におけるＤＮＡコピー数の閾値が、０．２５以上の増加であることを指標とする、請求項１に記載の大腸癌の病態評価の方法。
【請求項３】
被験者由来の癌細胞において、染色体の８ｑ２４．３領域におけるＤＮＡコピー数の閾値が、０．２以上の増加で、かつ、染色体１７ｐ１３．３領域、染色体１７ｐ１３．１領域の何れかにおけるＤＮＡコピー数の閾値が、−０．２以下の減少であることを指標とする、請求項１に記載の大腸癌の病態評価の方法。
【請求項４】
被験者由来の癌細胞において、ＺＮＦ１６遺伝子、Ｔｍｐ２１−ＩＩ遺伝子、染色体ＬＯＣ４４１３８３領域、染色体ＬＯＣ２８６１０３領域の何れかにおけるＤＮＡコピー数の閾値が、０．２以上の増加で、かつ、ＲＰＨ３ＡＬ遺伝子、ＧＬＰ２Ｒ遺伝子、ＲＣＶ１遺伝子、ＧＡＳ７遺伝子、染色体ＬＯＣ４４０４７３領域、染色体ＬＯＣ３８８４５２領域の何れかにおけるＤＮＡコピー数の閾値が−０．２以下の減少であることを指標とする、請求項１に記載の大腸癌の病態評価の方法。
【請求項５】
ＤＮＡコピー数の異常を、被験者由来の癌細胞を材料として、ＦＩＳＨ法、ｃ−ＣＧＨ法、ａ−ＣＧＨ法によって測定することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の大腸癌の病態評価方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の大腸癌の病態評価方法に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌の病態評価方法に関し、詳しくは、特定の染色体領域、又は遺伝子におけるＤＮＡコピー数の増減を指標として、大腸癌患者のステージ進展や、リンパ節転移の判定をする方法、および該判定のためのＤＮＡコピー数の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、遺伝子を含むゲノムの異常の蓄積によって生じると考えられている。癌の発生や進展との関係についての概要は一部の癌では明らかとなっているものの、癌の生物学的性状とゲノム異常との関係についての情報は依然として極めて乏しいのが現状である。ゲノム解析による癌の個性解析は、個別化医療を実現するための一つの方策として期待されている。大腸癌は日本においても増加傾向が著しい癌である。ごく一部の家族性に発症する大腸癌を除けば、殆どは散発的に発症する癌である。
【０００３】
最適な治療を行うためには、癌の病態を各症例について正確に評価することが必要である。その一つの方法としてはゲノム異常について解析することである。すでに、染色体ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を利用したゲノム解析がなされている（非特許文献１）。ＣＧＨ法では、ターゲットの染色体ＤＮＡとリファレンスとする染色体ＤＮＡをそれぞれ異なった色素で標識した後に、中期染色体標本に対して競合的にハイブリダイゼーションを行うことで染色体中のＤＮＡ量の相対比を算出する。近年になりＤＮＡマイクロアレイと呼ばれるアレイ技術が開発され、ＣＧＨにもマイクロアレイの技術が応用されるようになった（非特許文献２）。ＤＮＡマイクロアレイとはガラス基盤上にＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等により増幅したＤＮＡ断片を貼り付けるか、あるいは基盤上で直接化学合成することにより作成したマイクロアレイ（チップ）を使用するＤＮＡ解析の総称であり、ＤＮＡ−ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応を利用することで一度に大量のＤＮＡ検出を目的とした手法である。また最近ではＤＮＡ合成料金の低下により、合成ＤＮＡをスタンピングしたオリゴＤＮＡチップも市販されるようになった。さらにはマイクロアレイの技術を利用したアレイＣＧＨ（ａ−ＣＧＨ）の商用的な販売も開始されている。アレイ技術では、遺伝子発現解析用のマイクロアレイが先発で研究開発された推移があり、発現解析用のマイクロアレイをそのまま転用してａ−ＣＧＨ解析を行っている例もある（非特許文献３）。この場合には、あくまでも染色体のエキソン部分に限った解析にとどまり、スポットされているＤＮＡの染色体における位置も等間隔ではなく、ａ−ＣＧＨプロファイルを描画する際に問題が残る可能性は否定できない。
【０００４】
ａ−ＣＧＨ用に開発されたマイクロアレイにはＢＡＣクローンをスポットした例（非特許文献４）や合成オリゴＤＮＡをスポットした例などがある。ａ−ＣＧＨは通常の遺伝子発現解析と異なり、染色体上の全ゲノムＤＮＡを対象としているためにオリゴＤＮＡを使用した場合は、実験誤差（シグナルの振動）が随分と大きくなる点が問題である。このようなマイクロアレイを実験に使用した場合には、膨大な情報が算出され、その実験誤差も無視できない。一般に用いられる多変量解析ではその計算量が変数の二乗に比例するため、膨大な数値データを処理しなければならないマイクロアレイ法は、臨床的な解析に用いることは事実上不可能である。
【０００５】
ａ−ＣＧＨ法を利用した癌の検出法としていくつかの報告がある。ａ−ＣＧＨ法で、特定の染色体領域のＤＮＡコピー数異常を検出することによって、胃癌及び口腔扁平上皮癌を検出する方法（特許文献1）、肝細胞癌の悪性度の評価方法（特許文献２）、また、ａ−ＣＧＨ法で特定染色上の遺伝子の過剰発現を検出することにより、甲状腺未分化癌の判定方法（特許文献３）が明らかにされている。
【特許文献１】特開２００６−９４７３３号公報
【特許文献２】特開２００６−９４７２６号公報
【特許文献３】特開２００７−２５２２４３号公報
【非特許文献１】Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：８１８−８２１，１９９２
【非特許文献２】Ｓｏｌｉｎａｓ  Ｔ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０：３９９−４０７，１９９７
【非特許文献３】Ｐｏｌｌａｃｋ  Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２３：４１−４６，１９９９
【非特許文献４】Ｐｉｎｋｅｌ  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０：２０７−２１１，１９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
大腸癌は、症例ごとにその悪性度は大きく異なっているが、ゲノム異常と発癌、進展との関係、さらには、癌の病態とゲノム異常との関係については殆ど知られていない。悪性度の指標の一つであるリンパ節転移とゲノム異常との関係を明らかにすることは、臨床的に大きな意義がある。本発明は、大腸癌患者に対して有効な治療を行うため、ゲノム異常を指標にしたリンパ節転移やステージ進展等の病態評価の方法を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、大腸癌患者の癌組織から得られたＤＮＡコピー数について、ａ−ＣＧＨ法により、特定の染色体領域や、特定遺伝子のＤＮＡコピー数の異常を検出することにより、大腸癌の病態を予測できる染色体領域および遺伝子を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。
【０００９】
（１）被験者由来の癌細胞において、染色体８ｑ２４．３領域、染色体１３ｑ１２．３領域、染色体１７ｐ１３．３領域、染色体１７ｐ１３．１領域中から選択される１以上の領域におけるＤＮＡコピー数の異常を検出することを特徴とする、大腸癌の病態評価の方法。
【００１０】
（２）被験者由来の癌細胞において、染色体８ｑ２４．３領域におけるＤＮＡコピー数の閾値が、０．２５以上の増加であることを指標とする上記（１）に記載の病態評価の方法。
【００１１】
（３）被験者由来の癌細胞において、染色体８ｑ２４．３領域におけるＤＮＡコピー数の閾値が、０．２以上の増加で、かつ、染色体１７ｐ１３．３領域、染色体１７ｐ１３．１領域の何れかにおけるＤＮＡコピー数の閾値が、−０．２以下の減少であることを指標とする上記（１）に記載の病態評価の方法。
【００１２】
（４）被験者由来の癌細胞において、ＺＮＦ１６遺伝子、Ｔｍｐ２１−ＩＩ遺伝子、染色体ＬＯＣ４４１３８３領域、染色体ＬＯＣ２８６１０３領域の何れかにおけるＤＮＡコピー数の閾値が、０．２以上の増加で、かつ、ＲＰＨ３ＡＬ遺伝子、ＧＬＰ２Ｒ遺伝子、ＲＣＶ１遺伝子、ＧＡＳ７遺伝子、染色体ＬＯＣ４４０４７３領域、染色体ＬＯＣ３８８４５２領域の何れかにおけるＤＮＡコピー数の閾値が、−０．２以下の減少であることを指標とする上記（１）に記載の病態評価の方法。
【００１３】
（５）ＤＮＡコピー数の異常を、被験者由来の癌細胞を材料として、ＦＩＳＨ法、ｃ−ＣＧＨ法、ａ−ＣＧＨ法によって測定することを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の大腸癌の病態評価方法。
【００１４】
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の大腸癌の病態評価方法に用いるためのキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、特定の染色体領域や、特定遺伝子のＤＮＡコピー数の増加や減少から、大腸癌患者のリンパ節転移やステージ進展等の病態評価ができるため、当該患者の有効な治療が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、被験者由来の癌組織細胞における特定の染色体領域や、特定遺伝子のＤＮＡコピー数の増加や減少から、大腸癌患者のリンパ節転移やステージ進展等の病態評価を行うものである。
【００１７】
大腸癌患者の病態は、大腸壁進達度と、リンパ節転移の状況から進行度を４つのステージに分類することができる。大腸癌取り扱い規約第7版（２００６年３月大腸癌研究会編）によると、大腸壁進達度は以下のように表される。Ｍ：癌が粘膜内にとどまり、粘膜下層に及んでいない。ＳＭ：癌が粘膜下層までにとどまり、固有筋層に及んでいない。ＭＰ：癌が固有筋層までにとどまり、これを越えていない。ＳＳ：しょう膜を有する部位において、癌が固有筋層を越えて浸潤しているが、しょう膜表面に露出していない。ＳＥ：しょう膜を有する部位において、癌がしょう膜表面に露出している。ＳＩ：しょう膜を有する部位において、癌が直接他臓器に浸潤している。Ａ：しょう膜を有しない部位において、癌が固有筋層を越えて浸潤している。ＡＩ：しょう膜を有しない部位において、癌が直接他臓器に浸潤している。
【００１８】
また、リンパ節転移については、リンパ節転移を認めない(陰性)と、リンパ節転移を認める（陽性）に分類されるが、リンパ節転移が認められる場合においては、さらに領域リンパ節転移と、遠隔リンパ節転移に分類される。
【００１９】
大腸癌患者の病態の進行度について、リンパ節転移を認めない場合で、かつ、大腸壁進達度がＳＭ、ＭＰの場合、患者の病態はステージＩと評価され、大腸壁進達度がＳＳ、Ａ、ＳＥ、Ｓ１、Ａ１の場合、患者の病態はステージＩＩと評価される。また、リンパ節転移を認めた場合は、大腸壁進達度がいかなる場合でも、患者の病態はステージＩＩＩまたはＩＶと評価され、遠隔リンパ節転移であった場合は、最悪の進行度のステージＩＶと評価される。病態が、ステージＩＩＩ、ステージＩＶの場合は、病態の度合いが悪いと評価され、緊急な臨床的処置が必要となる。逆に、ステージＩ、ステージＩＩあるいは、大腸壁進達度がＭで、かつリンパ節転移も無い場合は、緊急な臨床的処置は不要と評価されることになる。
【００２０】
本発明は、被験者由来の癌細胞において、特定の染色体のＤＮＡコピー数の異常の検出により、大腸癌の病態を推定するものであり、染色体８ｑ２４．３領域、染色体１３ｑ１２．３領域、染色体１７ｐ１３．３領域、染色体１７ｐ１３．１領域中から選択される１以上の領域におけるＤＮＡコピー数の異常を検出した場合、大腸癌の病態は、リンパ節転移を起こし、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶである可能性が高いと評価することができる。これらの領域における異常の検出は、全領域ではなく一部であっても異常と認定することができる。
【００２１】
特に、被験者由来の癌細胞において、染色体８ｑ２４．３領域におけるＤＮＡコピー数の増加を検出した場合、大腸癌の病態は、リンパ節転移を起こし、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶである可能性が高いと評価することができる。
【００２２】
また、被験者由来の癌細胞において、染色体８ｑ２４．３領域におけるＤＮＡコピー数の増加で、かつ、染色体１７ｐ１３．３領域、染色体１７ｐ１３．１領域の何れかにおけるＤＮＡコピー数の減少を検出した場合、大腸癌の病態は、リンパ節転移を起こし、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶである可能性が、より高いと評価することができる。
【００２３】
さらに、本発明の大腸癌の病態の評価は、被験者由来の癌細胞から得られたサンプルにおいて、上記染色体群上に存在する遺伝子、あるいは、数１００〜５００程度の塩基からなる染色体領域のコピー数の異常を検出することによっても行うことができる。その場合、統計学的に正常細胞のコピー数と比較解析する方法を用いることが望ましい。
【００２４】
すなわち、染色体８ｑ２４．３領域に存在するＴＮＦ１６遺伝子、Ｔｍｐ２１−ＩＩ遺伝子、染色体ＬＯＣ４４１３８３領域、染色体ＬＯＣ２８６１０３領域、および染色体１３ｑ１２．３領域に存在する染色体ＬＯＣ３４１７８４領域の何れかにおけるＤＮＡコピー数の増加、および／または染色体１７ｐ１３．３領域に存在するＲＰＨ３ＡＬ遺伝子、染色体ＬＯＣ４４０４７３領域、染色体ＬＯＣ３８８４５２領域、および染色体１７ｐ１３．１領域に存在するＧＬＰ２Ｒ遺伝子、ＲＣＶ１遺伝子、ＧＡＳ７遺伝子の何れかにおけるＤＮＡコピー数の減少を検出した場合、大腸癌の病態は、リンパ節転移を起こし、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶである可能性が高いと評価することができる。
【００２５】
特に、染色体８ｑ２４．３領域に存在するＴＮＦ１６遺伝子、Ｔｍｐ２１−ＩＩ遺伝子、染色体ＬＯＣ４４１３８３領域、染色体ＬＯＣ２８６１０３領域の何れかにおけるＤＮＡコピー数の増加、かつ染色体１７ｐ１３．３領域に存在するＲＰＨ３ＡＬ遺伝子、染色体ＬＯＣ４４０４７３領域、染色体ＬＯＣ３８８４５２領域、および染色体１７ｐ１３．１領域に存在するＧＬＰ２Ｒ遺伝子、ＲＣＶ１遺伝子、ＧＡＳ７遺伝子の何れかにおけるＤＮＡコピー数の減少を検出した場合、大腸癌の病態は、リンパ節転移を起こし、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶである可能性が高いと評価することができる。
【００２６】
被験者由来の癌細胞において、特定染色体の領域や遺伝子のＤＮＡコピー数の異常を検出する場合、精度を高めるためには、２つ以上、好ましくは３つ以上の領域の異常を検出することが望ましい。しかしながら、染色体８ｑ２４．３領域におけるＤＮＡコピー数の異常を検出した場合、１％の有意差検定をもって、大腸癌の病態が、リンパ節転移を起こし、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶへ進展している可能性が高いと評価することができる。
【００２７】
遺伝子の情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）から得ることができる。
【００２８】
ゲノム配列上８番染色体に存在する、ＺＮＦ１６（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １６）遺伝子は、ジンクフィンガーのＣ２Ｈ２型を有し、転写因子として機能していると推察されている遺伝子である。Ｔｍｐ２１−ＩＩ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｍｐ２４−ｌｉｋｅ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １０）遺伝子は、膵臓のミクロゾーム中で小胞輸送機能を有するファミリーに属する遺伝子である。
【００２９】
ゲノム配列上１７番染色体に存在する、ＧＬＰ２Ｒ（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子は、消化管で発現されるＧタンパク質共役受容体スーパーファミリーに属する遺伝子である。ＲＣＶ１（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ）遺伝子は、光で活性化されたロドプシンのリン酸化を遮断することで、光伝達の連鎖増幅停止を長引かせる可能性をもつ遺伝子である。ＧＡＳ７（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ７）遺伝子は、分化最終の脳細胞で主として発現され、成熟小脳のプルキンエ神経細胞で支配的に発現される。神経細胞の発生に働くと推定される遺伝子である。
【００３０】
ＤＮＡコピー数の検出法としては、被験者由来の癌細胞を材料として、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法、染色体ＣＧＨ（ｃ−ＣＧＨ）法、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）アレイＣＧＨ（ａ−ＣＧＨ）法等を用いることができる。
【００３１】
ＦＩＳＨ法は、大腸癌患者における遺伝子のコピー数異常を検出する方法として有用である。ＦＩＳＨ法による遺伝子のコピー数異常を測定する方法は、以下のように行うことができる。まず、特定の遺伝子とハイブリダイズする蛍光標識されたＤＮＡプローブを作成する。次いでプローブを被検細胞と接触させ、細胞中の当該遺伝子とハイブリダイズした蛍光標識ＤＮＡプローブを測定することにより行なわれる。癌細胞と正常細胞の蛍光強度の違いから、ＤＮＡコピー数の増加または減少を検出することができる。
【００３２】
前記プローブはゲノムＤＮＡ断片、オリゴマー、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。例えば、遺伝子とハイブリダイズするよう設計させたプローブは、ポリヌクレオチド、それに相補的なポリヌクレオチド、それらの変異体、それらにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、或いは１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片からなる群から選択することができる。
【００３３】
本発明で使用するａ−ＣＧＨ法は、Ｐｉｎｋｅｌら（Ｐｉｎｋｅｌ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０：２０８−２１１，１９９８）により報告された方法で、ＣＧＨアレイ上のＢＡＣクローンを用いることにより、精度の高い分析が可能になる方法である。これは、Ｍａｃｒｏｇｅｎ’ｓ  ＫＯＧＥＮＯＭＥ  Ｐｒｏｊｅｃｔで作成されたＤＮＡ断片からなるＢＡＣクローンを、スライドガラス上にスポットしたアレイを用いて行うもので、ＢＡＣクローンとのハイブリダイゼーション法を用いて、腫瘍／正常の蛍光強度比を測定するものである。
【００３４】
ａ−ＣＧＨ法による分析は、ＢＡＣクローンをスポットした市販のものを入手して利用することも可能である。例えば、Ｍａｃｒｏｇｅｎ社のＭＡＣ  Ａｒｒａｙ（登録商標）、ＳＰＥＣＴＲＡＬ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ社のＳｐｅｃｔｒａｌＣｈｉｐ（登録商標）等がある。ＭＡＣ  Ａｒｒａｙ（登録商標）の場合、アレイスライド上には全染色体を網羅する４０３０個のＢＡＣクローンがスポットされている。ＢＡＣ開始位置、終了位置などの情報クローン情報は、Ｍａｃｒｏｇｅｎ社のＨＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｃｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｅｎｇ／ｆｉｌｅ／４Ｋ＿ｌｉｓｔ＿０４１２２１．ｘｌｓ）に掲載され更新されている。
【００３５】
ＢＡＣクローンと反応させる試験用ＤＮＡおよび対照ＤＮＡは、ランダムプライム法などで標識するが、このような方法で蛍光標識する場合、癌細胞、正常細胞はそれぞれ別の色素による標識を行う。癌細胞由来の試験用ＤＮＡは、Ｃｙａｎｉｎｅ５−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で、正常細胞由来の対照ＤＮＡはＣｙａｎｉｎｅ３−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で標識することができる。試験用ＤＮＡおよび対照ＤＮＡ由来の蛍光による画像は、レーザースキャナーや、ＣＣＤカメラなどの定量的検出装置により取得し、ＣＧＨ解析用ソフトウェアにより画像解析を行うことができる。
【００３６】
試験用ＤＮＡおよび対照ＤＮＡ由来の蛍光による画像においては、試験用ＤＮＡのコピー数が多い場合には、試験用ＤＮＡの蛍光強度が増加し、試験用ＤＮＡのコピー数が少ない場合には、対照ＤＮＡの蛍光強度が増加することから、大腸癌組織から得られたＤＮＡサンプルのアレイスポットの特定の蛍光波長における蛍光強度を測定することによって、ＢＡＣクローンごとの異常を検出することができる。ａ−ＣＧＨに用いるＤＮＡにはＢＡＣクローンのほか、より短い配列のＤＮＡを用いることもできる。
【００３７】
ＤＮＡコピー数増減の判定においては、閾値を用いる。閾値とは、試験用ＤＮＡの蛍光強度を分子、対照ＤＮＡの蛍光強度を分母とする、すなわちＣｙ５／Ｃｙ３値を、対数ｌｏｇ２で表した数値である。癌細胞が正常の場合は、比が１であり、閾値は０となる。癌細胞で増加している場合は、比は１より大きくなりｌｏｇ２の値は正の数を示し、減少している場合は、比は１より小さくなりｌｏｇ２の値は負の数を示す。ＤＮＡコピー数の増加の判定基準は、閾値が０．２以上とすることが望ましく、０．５以上の高レベルの増加（増幅）とした場合は、より精度の高い判定が可能になる。また、ＤＮＡコピー数の減少の判定基準は、閾値が−０．２以下とすることが望ましく、−０．５以下ではより精度の高い判定が可能になる。しかしながら、有用性の高い判定のためには、閾値の絶対値は低いことが望ましい。
【００３８】
本発明はまた、染色体８ｑ２４．３領域、染色体１３ｑ１２．３領域、染色体１７ｐ１３．３領域、染色体１７ｐ１３．１領域、ＴＮＦ１６遺伝子、Ｔｍｐ２１−ＩＩ遺伝子、ＲＰＨ３ＡＬ遺伝子、ＧＬＰ２Ｒ遺伝子、ＲＣＶ１遺伝子、ＧＡＳ７遺伝子染色体ＬＯＣ４４１３８３領域、染色体ＬＯＣ２８６１０３領域、染色体ＬＯＣ３４１７８４領域、染色体ＬＯＣ４４０４７３領域、染色体ＬＯＣ３８８４５２領域のから選択される少なくとも１領域についてＤＮＡコピー数の異常を検出するためのフォワードプライマー、リバースプライマー、蛍光標識プローブ等の大腸癌の病態評価用のキットを提供する。
【００３９】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００４０】
＜大腸癌組織と組織切片作成＞
山口大学医学部倫理委員会にて承認され、インフォームドコンセントが得られた外科手術後の大腸癌患者７７例の癌組織を用いた。表１にその臨床データを示す。大腸癌組織は凍結保存しておき、試験開始時に７０％エタノールにて固定し、１００％エタノールで脱水後、型通りにパラフィン包埋し、１０μｍの切片を１症例当たり２０−５０枚作成した。
【００４１】
【表１】
2009153464.tif 000002
【００４２】
＜組織片からのＤＮＡ抽出、及び蛍光色素標識＞
上記組織切片にヘマトキシリン・エオジン染色を行い、顕微鏡下にて注射針（２６Ｇ）を用いて選択的に癌細胞のみ採取した（ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）。採取した癌細胞からＤＮＡ抽出キット（Ｄｎｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ，  ＱＩＡＧＥＮ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ社）を利用してゲノムＤＮＡを抽出した。内部標準試料に用いるＤＮＡはヒトゲノムＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ，Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた。それぞれのＤＮＡ５００ｎｇをランダムプライミング法（ＢｉｏＰｒｉｍｅ（登録商標）  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により、試験用ＤＮＡのチューブには３μｌの１ｍＭＣｙａｎｉｎｅ５−ｄＣＴＰ（Ｃｙ５  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を、対照ＤＮＡのチューブには３μｌの１ｍＭＣｙａｎｉｎｅ３−ｄＣＴＰ（Ｃｙ３  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を加えてそれぞれ標識を行った。標識を行ったＤＮＡは精製し、混合した後にハイブリダイゼーション用バッファーに溶解し、a-ＣＧＨに供した。
【００４３】
＜蛍光スキャナによる読み取り＞
３７℃にて７２時間ハイブリダイゼーションを行ったマイクロアレイを４５℃の５０％ホルムアミド溶液、２ｘＳＳＣ溶液で洗浄し、常温でリン酸緩衝液、２ｘＳＳＣ溶液でさらに洗浄を行った。なお、マイクロアレイのバックグランドが高いときにはエタノール洗浄を行った。マイクロアレイを完全に乾燥させた後にスキャナ（ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ａ、Ａｘｏｎ社）で読み取りを行った。１６ｂｉｔのＴＩＦＦ画像からＣｙ３、Ｃｙ５の蛍光強度比を計算し、ｌｏｇ２ベースで蛍光強度比を表した。異なる蛍光色素を異なるレーザーで読み取っているために、ＬＯＷＥＳＳ（Ｌｏｃａｌｌｙ  Ｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ  ｐｌｏｔ  Ｓｍｏｏｔｈｅｒ）にてグローバルノーマライゼーションを行った値（ＭａｃＶｉｗｅｒ，  Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）を採用した。
【００４４】
＜結果＞
１．ａ−ＣＧＨの全体像
症例毎にコピー数異常を呈するＢＡＣクローンは異なっていた。７７例の大腸直腸がんにおいて、ＤＮＡコピー数増加を呈したクローン数は平均４１０．５（±２５４．８，標準偏差）種であり、ＤＮＡコピー数減少を呈したクローン数は平均５２２．６（±３５８．９）種であった。（図１）。
【００４５】
２．クローンの解析
得られたデータについて、大腸癌７７サンプルの中、リンパ節転移陽性とリンパ節転移陰性に分類し、また、別の分類として、ステージＩ、ＩＩを軽度、およびステージＩＩＩ、ＩＶを重度と分類した場合において、リンパ節転移があり、大腸癌のステージが重度であるという大腸癌の病態を、ＤＮＡコピー数異常による判定を行った時、高い有意差をもって判定できるクローン部分を見いだした。該当するクローンは表２に示すように、Ｂａｃ−ｃｌｏｎｅ−ＩＤ  ２４７８、４５４、５１３０、２８０１であった。各クローンの染色体領域は８ｑ２４．３、１３ｑ１２．３、１７ｐ１３．３、１７ｐ１３．１である。この領域には、ＺＮＦ１６遺伝子、Ｔｍｐ２１−ＩＩ遺伝子、ＲＰＨ３ＡＬ遺伝子、ＧＬＰ２Ｒ遺伝子、ＲＣＶ１遺伝子、ＧＡＳ７遺伝子のほかに、ＬＯＣ４４１３８３、ＬＯＣ２８６１０３、ＬＯＣ３４１７８４、ＬＯＣ４４０４７３、ＬＯＣ３８８４５２など、数１００〜５００程度の塩基からなる染色体領域が存在する。
【００４６】
【表２】
2009153464.tif 000003
【００４７】
被験者由来の癌細胞において、各クローンが増加あるいは減少した被験者数を、増加の閾値をｃｌｏｎｅ−ＩＤ  ２７４８では０．２５以上、ｃｌｏｎｅ−ＩＤ  ４５４では０．５以上、減少の閾値をｃｌｏｎｅ−ＩＤ  ５１３０では−０．５以下、ｃｌｏｎｅ−ＩＤ  ２８０１では−０．４８以下として選別し、さらにｃｌｏｎｅ−ＩＤ  ２７４８では増加の閾値が０．２以上で、かつ、ｃｌｏｎｅ−ＩＤ  ５１３０、ｃｌｏｎｅ−ＩＤ  ２８０１では減少の閾値が−０．２以下として選別したものを表３に示した。
【００４８】
【表３】
2009153464.tif 000004
【００４９】
前記クローンのコピー数の増減の動向から、大腸癌の悪性度を示すリンパ節転移や、ステージの進展度を、特定の染色体領域や遺伝子のＤＮＡコピー数の増減によって評価することができることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
特定の染色体領域や遺伝子のＤＮＡコピー数の増減を検出することは、容易で、かつ安価な検査法で行うことができるため、早期に大腸癌患者の有効な治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】大腸癌７７例におけるＤＮＡコピー数異常部位とその頻度を示した図である。（上方０．００〜１．００の中の波線：ＲＤＮＡコピー数の増加があった頻度、下方０．００〜−１．００の中の波線：ＤＮＡコピー数の減少があった頻度、縦実線：染色体切り替え位置、縦点線：セントロメアの位置、縦軸：ＤＮＡコピー数異常頻度、横軸：４０３０個のＢＡＣクローンの染色体位置。）
【図１】
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