(57)【要約】【課題】本発明は、細菌等による大量生産が可能な、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの提供を目的とする。【解決手段】本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、単量体であり、活性の至適ｐＨが３以上かつ５以下の範囲であり、前記活性の至適温度が３０℃以上かつ５０℃以下の範囲であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定による分子量が４０ｋＤａ以上かつ７１ｋＤａ以下の範囲であることを特徴とする。本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、形質転換体による大量生産が可能であり、アラビノガラクタン等の糖類に作用させることにより、アラビノースおよびアラビノースを含む糖類を製造することが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼであって、単量体であり、活性の至適ｐＨが３以上かつ５以下の範囲であり、前記活性の至適温度が３０℃以上かつ５０℃以下の範囲であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定による分子量が４０ｋＤａ以上かつ７１ｋＤａ以下の範囲であることを特徴とするβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ。
【請求項２】
ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の菌体に由来する請求項１記載のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ。
【請求項３】
前記ストレプトミセス属の菌体が、ストレプトミセス・エバーミチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）である請求項２記載のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ。
【請求項４】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ。
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ。
【請求項５】
下記（ｄ）から（ｆ）のいずれかに記載のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子。
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子。
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなるβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子。
【請求項６】
請求項５記載のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子を含有するベクター。
【請求項７】
請求項６記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの製造方法であって、請求項７記載の形質転換体を培養する工程を含むβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの製造方法。
【請求項９】
β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの製造方法であって、アラビノース残基を含む糖類を含む培地において、ストレプトミセス・エバーミチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）を培養する工程を含むβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの製造方法。
【請求項１０】
β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを産生する細胞のスクリーニング方法であって、
アラビノース残基を含む糖類を含む培地において、前記細胞を培養する工程と、
前記細胞が産生する物質のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性を測定する工程とを
含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１１】
アラビノース残基を含む糖類に対し、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを作用させてアラビノースを遊離させるアラビノースの製造方法であって、前記β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼとして、請求項１から４のいずれか一項に記載のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを使用することを特徴とするアラビノースの製造方法。
【請求項１２】
アラビノース残基を含む糖類から糖受容体に、アラビノース残基を転移させる糖転移方法であって、
前記糖転移を触媒する酵素として、請求項１から４のいずれか一項に記載のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを用いることを特徴とする糖転移方法。
【請求項１３】
前記糖受容体が、糖類またはアルコール類である請求項１２記載の糖転移方法。
【請求項１４】
前記糖類が、Ｄ−ガラクトース、グルコース、マンノース、キシロースおよびＬ−アラビノースからなる群から選択される少なくとも一つである請求項１３記載の糖転移方法。
【請求項１５】
前記アルコール類が、メタノール、エタノール、１−プロパノールおよび１−ブタノールからなる群から選択される少なくとも一つである請求項１３記載の糖転移方法。
【請求項１６】
アラビノース残基を含む糖類の製造方法であって、
請求項１２から１５のいずれか一項に記載の糖転移方法を用いることを特徴とする、糖類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
アラビノースは、五炭糖およびアルドースに分類される単糖であり、植物の細胞壁を構成するヘミセルロース中に、アラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン等の多糖類の構成糖として存在している。例えば、前記アラビナンは、アラビノースがα１，５結合した多糖であり、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ｓａｃｃｈａｒｉｆｅｒａ）の根の搾りかすであるシュガービートパルプ等の構成成分である。また、前記アラビノガラクタンは、アラビノースとガラクトースが結合した多糖であり、アラビアゴムノキ（Ａｃａｃｉａ ｓｅｎｅｇａｌ）から採取されるアカシアガム、カラマツ属（Ｌａｒｉｘ）の樹木から採取されるカラマツアラビノガラクタン（Ｌａｒｃｈ Ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ）等がある。前記アカシアガムやカラマツアラビノガラクタンは、菓子やアイスクリームなどの食品の乳化剤や、医薬品・化粧品・日用品の安定剤などとして幅広く使用されている。また、前記シュガービートパルプは、飼料等に利用されている。
【０００３】
一方で、アラビノースは、ヒトの消化管のスクラーゼ活性を阻害することから、ショ糖と同時摂取時に、血糖上昇を緩和する作用が知られている。そのため、血糖上昇を緩和するための健康食品や甘味料等の配合原料として注目されている。そこで、アラビノースを含有する天然物に酵素を作用させてアラビノースを製造する方法（例えば、特許文献１）や、前記天然物からアラビノースを遊離させる酵素（例えば、特許文献２）が開発されている。
【０００４】
前記アラビノースを遊離させる酵素は、その分解様式により、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、α−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ、α−Ｌ−アラビナナーゼ、α−１，５−Ｌ−アラビナナーゼに分類される。前記アラビナン分解酵素のうち、例えば、前記α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、植物や細菌における存在が数多く報告され（例えば、特許文献３）、木材パルプの脱リグニン化への利用等（例えば、特許文献３）、バイオマスの有効利用に応用されている。一方、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、前記アカシアガムやカラマツアラビノガラクタンを原料としたオリゴ糖生産における有用酵素としての利用や、食品中細菌汚染検出方法での利用（例えば、特許文献４）が報告されている。しかしながら、前記β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、キマメ（Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎ）の種子やサトイモ乾腐病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のもの（非特許文献１〜３）が報告されている程度であり、その種類は極めて少なく、例えば、原核生物由来のものは確認されていない。また、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのアミノ酸配列や、その遺伝子の塩基配列は明らかにされておらず、そのため、遺伝子工学的手法による、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの大量生産技術は確立されていない。したがって、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、産業利用が期待されているものの、実用化が困難である。
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−５０９９６号公報
【特許文献２】特開２００４−２４８６３０号公報
【特許文献３】特表平７−５０８１６２号公報
【特許文献４】特表平１１−５０６９２６号公報
【非特許文献１】Ｐ．Ｍ．Ｄｅｙ、“β−Ｌ−Ａｒａｂｉｎｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃａｊａｎｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ：ａ  ｎｅｗ  ｅｎｚｙｍｅ”、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（１９７３）３０２、ｐ．３９３−３９８
【非特許文献２】Ｐ．Ｍ．Ｄｅｙ、“Ｆｕｒｔｈｅｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  β−Ｌ−Ａｒａｂｉｎｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃａｊａｎｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ”、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（１９８３）７４６、ｐ．８−１３
【非特許文献３】辻谷祐也他３名、“Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ１２ｓ株の生産する２種のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ”、２００６年、日本応用糖質科学会平成１８年度大会要旨集、ｐ．３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、大量生産が可能なβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、単量体であり、活性の至適ｐＨが３以上かつ５以下の範囲であり、前記活性の至適温度が３０℃以上かつ５０℃以下の範囲であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定による分子量が４０ｋＤａ以上かつ７１ｋＤａ以下の範囲であることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼであってもよい。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ。
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、アラビノピラノシダーゼの工業的使用を先駆的に達成し得る。さらに、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは微生物由来であるため、より工業的観点からの大量生産も可能であり、大量使用または消費に対する供給耐久性にも優れる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の菌体に由来するものであってもよい。前記ストレプトミセス属の菌体としては、例えば、ストレプトミセス・エバーミチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の菌体等がある。前記ストレプトミセス・エバーミチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の菌体としては、例えば、ＭＡ−４６８０株がある。前記ＭＡ−４６８０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に、ストレプトミセス・エバーミチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）  ＭＡ−４６８０（ＮＢＲＣ番号：１４８９３）として寄託されている。
【００１１】
本発明の前記（ｂ）に記載のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば、数個、好ましくは、１個以上かつ７個以下の範囲の数、より好ましくは、２個以上かつ４個以下の範囲の数である。
【００１２】
本発明の前記（ｃ）に記載のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼにおいて、配列番号１に対する相同性は、１つの局面では好ましくは６０％以上、他の局面では好ましくは７０％以上、また別の局面では好ましくは７５％以上、さらに別の局面では好ましくは８０％以上、さらに別の局面では好ましくは８５％以上、さらに別の局面では好ましくは９０％以上、あるいはさらに別の局面では好ましくは９５％以上である。相同性のアルゴリズムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴが挙げられる（以下、同様）。
【００１３】
つぎに、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子は、下記（ｄ）から（ｆ）のいずれかに記載の遺伝子である。なお、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子は、下記（ｄ）から（ｆ）に記載の塩基配列と相補配列からなる遺伝子を含む。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子。
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子。
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなるβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子。
【００１４】
本発明の前記（ｅ）に記載のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子において、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、数個の範囲、好ましくは、１個以上かつ７個以下の範囲、より好ましくは、２個以上かつ４個以下の範囲である。
【００１５】
本発明の前記（ｆ）に記載のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子において、配列番号２に対する相同性は、１つの局面では好ましくは６０％以上、他の局面では好ましくは７０％以上、また別の局面では好ましくは７５％以上、さらに別の局面では好ましくは８０％以上、さらに別の局面では好ましくは８５％以上、さらに別の局面では好ましくは９０％以上、あるいはさらに別の局面では好ましくは９５％以上である。
【００１６】
本発明のベクターは、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子を含有するベクターである。
【００１７】
本発明の形質転換体は、本発明のベクターを含む形質転換体である。
【００１８】
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの第一の製造方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含む製造方法である。
【００１９】
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの第二の製造方法は、アラビノース残基を含む糖類を含む培地において、ストレプトミセス・エバーミチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）を培養する工程を含む製造方法である。なお、本発明において、アラビノース残基としては、特に制限されないが、例えば、アラビノピラノース残基、アラビノフラノース残基等が挙げられ、好ましくは、アラビノピラノース残基である。
【００２０】
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを産生する細胞のスクリーニング方法は、アラビノース残基を含む糖類を含む培地において、前記細胞を培養する工程と、前記細胞が産生する物質のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性を測定する工程とを含むことを特徴とする。
【００２１】
本発明のアラビノースの製造方法は、アラビノース残基を含む糖類に対し、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを作用させてアラビノースを遊離させる製造方法であって、前記β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼとして、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを使用することを特徴とする。
【００２２】
本発明の糖転移方法は、アラビノース残基を含む糖類から糖受容体に、アラビノース残基を転移させる糖転移方法であって、前記糖転移を触媒する酵素として、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを用いることを特徴とする。本発明の糖転移方法において、前記糖受容体としては、糖類またはアルコール類が好ましい。本発明の糖転移方法において、前記糖類としては、Ｄ−ガラクトース、グルコース、マンノース、キシロースおよびＬ−アラビノースからなる群から選択される少なくとも一つであるのが好ましい。本発明の糖転移方法において、前記アルコール類としては、メタノール、エタノール、１−プロパノールおよび１−ブタノールからなる群から選択される少なくとも一つであるのが好ましい。
【００２３】
本発明の糖類の製造方法は、アラビノース残基を含む糖類の製造方法であって、本発明の糖転移方法を用いることを特徴とする。
【００２４】
以下に、本発明について詳細に説明する。
【００２５】
（Ａ）本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ
（Ａ−１）作用特性
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性を有する酵素であり、具体的には、糖類に含まれるβ−Ｌ−アラビノピラノース残基を加水分解して、アラビノースを遊離する酵素である。前記糖類としては、特に限定されないが、例えば、アカシアガム（Ｇｕｍ  ａｒａｂｉｃ）、カラマツアラビノガラクタン（Ｌａｒｃｈ  Ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ）等が挙げられる。なお、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、他の酵素活性を有していてもよい。前記他の酵素活性としては、特に限定されず、例えば、糖供与体から糖受容体へ糖を転移させる糖転移酵素活性等が挙げられる。本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、前記糖転移酵素活性により、例えば、前述のように、アラビノース残基を含む糖類（糖供与体）から糖受容体へ、アラビノースを転移させることができる。
【００２６】
（Ａ−２）分子量
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの分子量の範囲は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いた測定において、４０ｋＤａ以上、好ましくは６１ｋＤａ以上、より好ましくは６４ｋＤａ以上の下限を有し、かつ７１ｋＤａ以下、好ましくは６８ｋＤａ以下、より好ましくは６６ｋＤａ以下の上限を有する。前記分子量の具体的な範囲の例を、下記表１に示す。
【００２７】
【表１】
2009153516.tif 000002
【００２８】
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、天然型タンパク質および組換え型タンパク質のいずれであってもよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いた測定において、本発明の天然型タンパク質の分子量は、例えば、６４ｋＤａであってもよく、本発明の組換え型タンパク質の分子量は、例えば、６５ｋＤａであってもよい。また、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの分子量は、例えば、理論値として６４２６５Ｄａであってもよい。本発明の天然型および組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの分子量は、前述の分子量の範囲であればよく、前記分子量に限定されない。
【００２９】
（Ａ−３）酵素活性を示すｐＨ範囲
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼがアラビノース遊離活性および糖転移活性を示すｐＨ範囲は、温度３７℃の条件下では、例えば、ｐＨ２以上かつ９以下の範囲であり、好ましくは、ｐＨ２．５以上かつ７．５以下の範囲である。また、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼが、前記アラビノース遊離活性について、約５０％以上の酵素活性値を示すｐＨ範囲は、前記温度条件下では、例えば、ｐＨ２以上かつ７以下の範囲であり、好ましくは、ｐＨ２．５以上かつ６以下の範囲である。そして、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの前記両酵素活性の至適ｐＨは、前記温度条件下では、例えば、ｐＨ３以上かつ５以下の範囲にあり、好ましくは、ｐＨ３．５以上かつ４．５以下の範囲にある。また、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの前記アラビノース遊離活性の至適ｐＨは、前記温度条件下で、より好ましくは、ｐＨ４である。さらに、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼが、前記アラビノース遊離活性について、約９０％以上の残存活性値を示すｐＨ範囲は、温度３０℃の条件下において、例えば、ｐＨ３以上かつ９以下の範囲であり、好ましくは、ｐＨ４以上かつ８以下の範囲である。
【００３０】
（Ａ−４）酵素活性を示す温度範囲
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼが前記両酵素活性を示す温度範囲は、ｐＨ４．０の条件下では、例えば、１０℃以上かつ７０℃以下の範囲であり、好ましくは、２０℃以上かつ６０℃以下の範囲である。また、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼが、前記アラビノース遊離活性について、約４０％以上の酵素活性値を示す温度範囲は、前記ｐＨ条件下では、例えば、１０℃以上かつ６０℃以下の範囲であり、好ましくは、２０℃以上かつ５０℃以下の範囲である。そして、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの前記両酵素活性の至適温度は、前記ｐＨ条件下で、例えば、３０℃以上かつ５０℃以下の範囲にあり、好ましくは、３５℃以上かつ４５℃以下の範囲にある。また、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの前記アラビノース遊離活性の至適温度は、前記ｐＨ条件下で、より好ましくは、４０℃である。さらに、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼが、前記アラビノース遊離活性について、約８０％以上の残存活性値を示す温度範囲は、ｐＨ４．０の条件下において、例えば、６０℃以下であり、好ましくは、４５℃以下であり、より好ましくは、２０℃以上かつ４５℃以下の範囲である。
【００３１】
（Ａ−５）比活性
前記アラビノース遊離活性について、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの比活性は、特に限定されず、例えば、前記ＭＡ−４６８０株由来の組換え型タンパク質の場合は、１８ｕｎｉｔｓ／ｍｇである。なお、前記比活性とは、ＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシドから、１分間に１μｍｏｌのＰＮＰを遊離させる酵素量を１ｕｎｉｔとした、酵素活性比を表す数値である。
【００３２】
（Ａ−６）アミノ酸配列
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのアミノ酸配列は、前記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の配列である。
【００３３】
（Ａ−７）既知のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼとの物性比較
前述のように、これまでに、キマメ（Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎ）の種子やサトイモ乾腐病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）において、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの産生が報告されている。表２は、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの一実施例と、前記キマメ種子由来β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼおよび前記ヤマイモ乾腐菌由来β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼとの物性等を比較したものである。なお、同表中の安定ｐＨとは、約９０％以上の残存活性値を示すｐＨ範囲であり、安定温度とは、約９０％以上の残存活性値を示す温度範囲である。同表に例示するように、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、分子量、比活性、至適ｐＨ、安定ｐＨ、至適温度について、前記既知の２つのβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼとは全く異なる新規酵素である。
【００３４】
【表２】
2009153516.tif 000003
【００３５】
（Ａ−８）産生細胞
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、例えば、細胞等から産生されてもよい。本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを産生する前記細胞としては、特に限定されず、例えば、大腸菌、酵母、糸状菌、放線菌等の微生物、植物および動物等由来の細胞等が挙げられる。前記微生物としては、特に限定されないが、例えば、前記ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の微生物等が挙げられる。前記細胞は、例えば、天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを産生する細胞であってもよく、後述する、組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを産生する宿主細胞であってもよく、特に制限されない。
【００３６】
（Ｂ）本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子は、前記（ｄ）から（ｆ）のいずれかに記載の遺伝子である。なお、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子は、前記（ｄ）から（ｆ）に記載の塩基配列と相補配列からなる遺伝子を含む。本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子は、例えば、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのアミノ酸配列のみをコードするものでもよいし、種々のタンパク質やペプチド等との融合タンパク質をコードするものでもよい。前記融合させるタンパク質やペプチド等は、特に限定されず、例えば、タンパク質精製の手順の簡略化や低廉化、安定性の向上や可溶化等を目的とした、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグやＧＳＴタンパク質等でもよい。
【００３７】
（Ｃ）本発明のベクター
本発明のベクターは、前述のように、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子を含有する。本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子を挿入するためのベクターとしては、宿主細胞中で複製可能であれば特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミド、放線菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージ等が挙げられ、具体的には、例えば、ｐＩＪ７０２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ３６７、ｐＮＵＴ４、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＵＣ１９、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３、λｇｔ１０、後述する接合型放線菌プラスミドｐＴＯＮＡ４等が挙げられる。前記ベクターに、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子を挿入する方法としては、特に制限されず、従来公知の方法を適宜採用できる。前記遺伝子の挿入方法としては、具体的には、例えば、前記遺伝子の精製ＤＮＡを、適当な制限酵素で切断後、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入し、ベクターに連結する方法等が挙げられる。
【００３８】
また、本発明のベクターは、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子を発現し得るものであればよく、前記遺伝子以外の構造は限定されない。前記β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子以外の構造としては、例えば、発現を制御する塩基配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等が挙げられる。前記発現を制御する塩基配列としては、特に制限されないが、例えば、プロモーター、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等が挙げられる。前記遺伝子マーカーとしては、特に制限されないが、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３９】
（Ｄ）本発明の形質転換体
本発明の形質転換体は、前述のように、本発明のベクターを含む。本発明の形質転換体は、例えば、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ遺伝子を発現可能なベクターを、宿主細胞に導入して得られる。前記宿主細胞としては、導入するベクターに応じて選択すればよく、特に限定されないが、例えば、放線菌、大腸菌、酵母、糸状菌、酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｆ９細胞等の細胞が挙げられ、好ましくは、放線菌である。前記放線菌としては、特に制限されないが、例えば、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ)、ストレプトミセス・エバーミチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）等が挙げられる。本発明の形質転換体への前記ベクターの導入方法としては、特に制限されず、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト−ＰＥＧ法、アグロバクテリウム法、Ｌｉ法、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ法、パーティクル・ガン法等の従来公知の方法を適宜用いることができる。
【００４０】
（Ｅ）本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの製造方法
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの第一の製造方法は、前述のように、本発明の形質転換体を培養する工程を含む。前記第一の製造方法において、前記培養工程としては、特に制限されず、培養する形質転換体に応じて、例えば、従来公知の方法を適宜採用できる。前記第一の製造方法は、前記培養工程を含むこと以外には特に制限されず、例えば、他の工程を含んでもよい。前記第一の製造方法において、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、前記培養工程により得られた培養物から精製して採取できる。前記培養物としては、特に制限されないが、例えば、培養上清、培養細胞、細胞抽出物等が挙げられる。また、前記培養物は、前記培養上清、培養細胞、細胞抽出物等の処理物であってもよい。前記処理物としては、特に限定されないが、例えば、前記培養物の濃縮物、乾燥物、凍結乾燥物、溶媒処理物、界面活性剤処理物、酵素処理物、タンパク質分画物、超音波処理物、磨砕処理物等が挙げられる。さらに、前記培養物は、前記培養上清、前記培養細胞、前記細胞抽出物、これらの前記処理物等の混合物でもよい。前記混合物としては、任意の組み合わせおよび比率で混合することができ、特に制限されない。前記培養物の前記精製方法は、例えば、硫安沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の従来公知の方法を採用でき、特に制限されない。また、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、前記培養工程により得られた培養物を採取した粗酵素液として製造してもよい。
【００４１】
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの第二の製造方法は、前述のように、アラビノース残基を含む糖類を含む培地において、ストレプトミセス・エバーミチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）を培養する工程を含む。前記第二の製造方法は、前記培養工程を含むこと以外には、特に制限されず、他の工程を含んでもよい。前記第二の製造方法において、前記培養工程において使用する培地としては、前記アラビノース残基を含む糖類を含むこと以外に特に制限されず、ストレプトミセス・エバーミチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の培養に適した培地を適宜採用できる。前記糖類としては、アラビノース残基を含む糖類であれば特に制限されないが、例えば、アカシアガム（Ｇｕｍ  ａｒａｂｉｃ）、カラマツアラビノガラクタン（Ｌａｒｃｈ  Ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ）等が挙げられる。前記培養工程における培養温度およびｐＨ条件は、特に制限されないが、例えば、前述の至適温度および至適ｐＨの範囲が好ましい。前記第二の製造方法において、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、前記培養工程により得られた培養物から精製して採取できる。前記培養物としては、特に制限されず、例えば、前述の培養物等が挙げられる。前記培養物の前記精製方法は、前記第一の製造方法と同様に、従来公知の方法を採用でき、特に制限されない。また、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、前記第一の製造方法と同様に、前記培養工程により得られた培養物を採取した粗酵素液として製造してもよい。
【００４２】
（Ｆ）本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを産生する細胞のスクリーニング方法
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを産生する細胞のスクリーニング方法は、前述のように、アラビノース残基を含む糖類を含む培地において、前記細胞を培養する工程と、前記細胞が産生する物質のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性を測定する工程とを含む。前記スクリーニング方法は、前記両工程を含むこと以外には、特に制限されず、例えば、他の工程を含んでもよい。前記培養工程において、前記培地としては、アラビノース残基を含む糖類を含むこと以外は特に制限されず、培養する細胞等に応じて適宜選択できる。前記アラビノース残基を含む糖類としては、アラビノース残基を含むこと以外は特に制限されず、例えば、前述のアカシアガム（Ｇｕｍ  ａｒａｂｉｃ）、カラマツアラビノガラクタン（Ｌａｒｃｈ  Ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ）等が挙げられる。スクリーニングの対象となる前記細胞としては、特に限定されず、例えば、微生物、植物、動物等の細胞を適宜用いることができる。前記細胞培養は、培養する前記細胞等に応じて、例えば、従来公知の方法を用いて実施できる。また、前記β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性を測定する工程としては、特に制限されないが、例えば、アラビノピラノシド基に発色基を結合させた物質を基質とし、前記基質に、前記細胞の培養上清を作用させ、遊離した前記発色基の発色量を測定し、前記発色量から、酵素活性値を算出してもよい。前記発色基としては、特に制限されないが、例えば、４−ニトロフェニル基（ＰＮＰ基）、２−クロロ−４−ニトロフェニル基（ＣＮＰ基）等が挙げられる。
【００４３】
（Ｇ）本発明のアラビノースの製造方法
本発明のアラビノースの製造方法は、前述のように、アラビノース残基を含む糖類に対し、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを作用させてアラビノースを遊離させる。前記アラビノース残基を含む糖類としては、特に限定されず、例えば、アカシアガム、カラマツアラビノガラクタン、ビートファイバー、ビートパルプ、オレンジファイバー等が挙げられる。また、本発明のアラビノースの製造方法は、例えば、他の糖分解酵素を適宜併用してもよい。前記他の糖分解酵素としては、特に制限されないが、例えば、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、α−Ｌ−アラビナナーゼ、α−１，５−Ｌ−アラビナナーゼ、α−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ等のアラビナン分解酵素や、エキソ−β−１,３−ガラクタナーゼ、エンド−β−１，６−ガラクタナーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−ラムノシダーゼ等を用いることができる。本発明のアラビノースの製造方法において、例えば、タイプＩＩアラビノガラクタン鎖を含有する糖類に対し、エキソ−β−１,３−ガラクタナーゼを併用した場合には、前記アラビノース以外に、例えば、β−１，６−ガラクトビオース、β−１，６−ガラクトトリオース等のガラクトオリゴ糖を製造することができる。また、本発明のアラビノースの製造方法において、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを作用させてアラビノースを遊離させる工程としては、特に制限されないが、例えば、前記アラビノースを含む糖類を溶解した緩衝液に、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを加えて、所定ｐＨおよび所定温度条件下で所定時間反応させてもよい。前記緩衝液としては、特に制限されず、例えば、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液等を用いることができる。前記反応時のｐＨ条件としては、特に限定されないが、温度３７℃の条件下では、例えば、ｐＨ２以上かつ９以下の範囲であり、好ましくは、ｐＨ２．５以上かつ７．５以下の範囲であり、より好ましくは、ｐＨ４．０である。また、前記反応時の温度条件としては、特に制限されないが、例えば、ｐＨ４．０の条件下では、例えば、１０℃以上かつ７０℃以下の範囲であり、好ましくは、２０℃以上かつ６０℃以下の範囲であり、より好ましくは、４０℃である。また、本発明のアラビノースの製造方法は、例えば、前記反応工程以外に、他の工程を有していてもよく、特に制限されない。前記他の工程としては、特に限定されず、例えば、従来公知の工程等を適宜採用できる。
【００４４】
（Ｈ）本発明の糖転移方法
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、前述のように、アラビノピラノシダーゼ活性に加えて、他の酵素活性として、糖転移酵素活性を有してもよい。そこで、本発明の糖転移方法においては、前記糖転移の触媒酵素として本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを用いて、アラビノース残基を含む糖類（糖供与体）から、糖受容体に、アラビノース残基を転移させる。前記アラビノース残基を含む糖類（糖供与体）としては、特に限定されないが、例えば、アラビノースや、アラビノース残基を含むオリゴ糖、多糖、糖アルコール、アミノ糖、糖ペプチド、糖脂質等が挙げられる。本発明の糖転移方法において、前記糖供与体としては、一種以上であればよく、例えば、二種以上を併用してもよく、特に制限されない。また、前記糖受容体としては、特に制限されないが、例えば、糖類、アルコール類、アミノ酸、脂質、タンパク質等が挙げられる。前記糖受容体である前記糖類としては、特に限定されないが、例えば、単糖、オリゴ糖、多糖、糖アルコール、アミノ糖、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質等が挙げられる。前記糖受容体である前記糖類としては、具体的には、例えば、Ｄ−ガラクトース、グルコース、マンノース、キシロース、Ｌ−アラビノースが好ましい。前記糖受容体である前記アルコール類としては、特に限定されず、例えば、一級アルコール、二級アルコール、三級アルコール等が挙げられる。前記アルコール類としては、具体的には、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、１−ブタノールが好ましい。本発明の糖転移方法において、前記糖受容体は、一種以上であればよく、例えば、二種以上を併用してもよく、特に制限されない。本発明の糖転移方法としては、例えば、前記糖供与体および前記糖受容体を溶解させた緩衝液中に、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを加えて、前記酵素が糖転移酵素活性を示す温度およびｐＨ条件下で反応させてもよく、特に制限されない。前記緩衝液としては、特に限定されず、例えば、前述の緩衝液等を用いることができる。前記糖転移酵素活性を示すｐＨ条件としては、特に限定されないが、温度３７℃の条件下では、例えば、ｐＨ２以上かつ９以下の範囲であり、好ましくは、ｐＨ２．５以上かつ７．５以下の範囲である。また、前記糖転移酵素活性を示す温度条件としては、特に制限されないが、例えば、ｐＨ４．０の条件下では、例えば、１０℃以上かつ７０℃以下の範囲であり、好ましくは、２０℃以上かつ６０℃以下の範囲である。
【００４５】
（Ｉ）本発明のアラビノース残基を含む糖類の製造方法
本発明のアラビノース残基を含む糖類の製造方法は、前述のように、本発明の糖転移方法を用いる。前記アラビノース残基を含む糖類としては、アラビノース残基を含むこと以外は特に制限されず、例えば、オリゴ糖、多糖、糖アルコール、糖脂質、糖タンパク質、配糖体、ヌクレオシド、ヌクレオチド等が挙げられ、好ましくは、オリゴ糖、多糖、糖アルコールである。前記製造方法は、本発明の糖転移方法を用いること以外は、特に制限されず、例えば、さらに他の方法を組み合わせてもよい。前記他の方法としては、例えば、糖類の製造方法における従来公知の方法を採用することができ、具体的には、例えば、加水分解方法、酵素分解方法、加熱方法等が挙げられ、特に制限されない。
【実施例】
【００４６】
以下に、本発明を実施例により説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４７】
（本発明の天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの産生）
本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、前記ストレプトミセス・エバーミチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）  ＭＡ−４６８０（ＮＢＲＣ番号：１４８９３）株を以下のようにして培養し、その培養上清から回収した。まず、下記組成のアカシアガム含有寒天培地に前記ＭＡ−４６８０の菌体をストリークし、３０℃で培養後、下記組成の液体培地に植菌し、２８℃で前培養（回転培養）した。前培養により得られた菌体懸濁液を前記液体培地に植菌し、２８℃で回転培養した。培養６日目に培養液を回収し、濾紙で濾過して菌体を除去し、得られた培養上清を粗酵素液とした。
【００４８】
（アカシアガム含有寒天培地）
成分                              濃度（ｗ／ｖ％）
アカシアガム（Ｇｕｍ  ａｒａｂｉｃ）    １．０
ＫＨ２ＰＯ４                            ０．５
ＭｇＳＯ４・７水和物                    ０．０５
ペプトン                                ０．１
酵母エキス                              ０．１
ａｇａｒ                                ２．０
精製水                                ９６．２５
【００４９】
（液体培地）
成分                              濃度（ｗ／ｖ％）
アカシアガム（Ｇｕｍ  ａｒａｂｉｃ）    １．０
ＫＨ２ＰＯ４                            ０．５
ＭｇＳＯ４・７水和物                    ０．０５
ペプトン                                ０．１
酵母エキス                              ０．１
精製水                                ９８．２５
【００５０】
（本発明の天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの活性測定）
下記表３に示す酵素基質を用いて、以下のようにして、前記酵素基質から遊離したＰＮＰ基を定量し、前記粗酵素液の酵素活性を測定した。まず、２ｍｍｏｌ／Ｌ各酵素基質２５μＬおよびＭｃIｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｍｏｌ／Ｌ  クエン酸溶液および０．２ｍｏｌ／Ｌ  リン酸二水素ナトリウム混合水溶液、ｐＨ４．０）２０μＬに、前記粗酵素液５μＬを加え、３７℃で１０分間反応させた。反応開始１０分後、この反応液に、さらに０．２ｍｏｌ／Ｌ  炭酸ナトリウム５０μＬを加えて反応を停止させ、４００ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた吸光度から、１分間に１μｍｏｌのＰＮＰを遊離させる酵素量を１ｕｎｉｔとした比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。
【００５１】
図１のグラフに、前記粗酵素液を用い、各種酵素活性を測定した結果を示す。同グラフにおいて、横軸は用いた前記酵素基質であり、縦軸は前記比活性（Ｕｎｉｔｓ／Ｌ）である。なお、下記表３の左欄に、同グラフの横軸に略称で記載した各酵素基質を示し、同表の右欄にその和文名称を示す。同図に示すように、前記粗酵素液に、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性が認められた。また、前記粗酵素液には、前記β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性に比べて比活性値は低いものの、他に、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性およびα−Ｄ−ガラクトピラノシダーゼ活性が認められた。
【００５２】
（酵素基質）
【表３】
2009153516.tif 000004
【００５３】
（本発明の天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの精製）
つぎに、前記粗酵素液を、以下のようにして精製した。まず、前記粗酵素液を、Ｂｉｏｍａｘ（分子量１００００以下カット、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて限外ろ過し、１０倍に濃縮した。濃縮した前記粗酵素液に、硫酸アンモニウムを７０％飽和まで加え、さらに、４℃で一晩静置し、タンパク質を沈殿させた。前記沈殿を、遠心分離により回収し、得られた回収物を２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２含有５０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解後、前記緩衝液を用いて４℃で１日間透析し、硫安沈殿後の粗酵素液を得た。
【００５４】
前記硫安沈殿後の粗酵素液を、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２含有５０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で洗浄後、商品名「ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ」カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、吸着したタンパク質を０−１ｍｏｌ／Ｌの濃度勾配の塩化ナトリウムにより溶出させ、活性のあるフラクションを回収した。回収したフラクションを、商品名「シームレスセルロースチューブ、小サイズ３０」（和光純薬工業株式会社製）を用いて、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２含有５０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で透析した。前記透析した溶液を、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２含有５０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で洗浄後、商品名「Ｍｏｎｏ  Ｓ」カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、吸着したタンパク質を０−０．５ｍｏｌ／Ｌの濃度勾配の塩化ナトリウムにより溶出させ、活性のあるフラクションを回収した。なお、前記イオン交換クロマトグラフィーには、下記商品名の機器を用いた。
【００５５】
（イオン交換クロマトグラフィー機器名）
2009153516.tif 000005
【００５６】
前記各精製ステップにおいて得られた前記フラクションについて、前記天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの活性測定方法と同様にして、酵素活性を測定した。下記表４に、各精製ステップにおいて得られた回収液量、総蛋白質量、溶液中に含まれる総β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性、比活性、精製度および収率を示す。精製の結果、２１ｕｎｉｔｓ／ｍｇのβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性を有する天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを得た。
【００５７】
【表４】
2009153516.tif 000006
【００５８】
（本発明の天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの分子量）
前記「Ｍｏｎｏ  Ｓ」カラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより得られた活性フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により電気泳動し、本例の天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの分子量を決定した。図２に、前記天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により電気泳動したゲルの写真を示す。レーン１は、分子量マーカー（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｌｏｗ  Ｍａｒｋｅｒ、各１μｇ）の泳動結果であり、レーン２は、本例で得られた精製β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ（Ｍｏｎｏ  Ｓ後活性フラクション）の泳動結果である。同図中の矢印で指し示すように、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの分子量は、６４ｋＤａであった。
【００５９】
（本発明の天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのＮ末端アミノ酸配列の決定）
本例の天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシークエンサー（商品名「プロテインシークエンサーＧ１０５Ａ型」、ヒューレットパッカード社製）を用いて、以下のようにして決定した。まず、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲル中のタンパク質を、商品名「トランスブロットＳＤセル」（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、トランスファーメンブレン（商品名「Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰＳＱ」、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にブロッティングした。この膜を、０．１％ＣＢＢ染色液（商品名「ＣＢＢ−Ｒ２５０」）で染色後、前記矢印で指し示したタンパク質がブロットされた部分を切り出した。前記切り出した膜を用い、前記プロテインシークエンサーのプロトコールに従い、本例の天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、本例の天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのＮ末端アミノ酸配列は、配列番号３に示されるアミノ酸配列であることが明らかになった。
【００６０】
（本発明の天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのゲノム塩基配列の決定）
まず、本例の天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列番号３）を用いて、既知のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０（ＮＢＲＣ番号：１４８９３）株のゲノム情報に対してＢＬＡＳＴ検索を行った。その結果、前記Ｎ末端アミノ酸配列は、ＳＡＶ２１８６（配列番号４）に該当した。そこで、前記ＳＡＶ２１８６の情報を基に、フォワードプライマー（配列番号５）およびリバースプライマー（配列番号６）を合成した。また、商品名「ＩｎｓｔａＧｅｎｅ（商標）Ｍａｔｒｉｘ」（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０（ＮＢＲＣ番号：１４８９３）株からゲノムＤＮＡを単離した。前記２つのプライマーを用いて、前記ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。なお、前記ＰＣＲ反応は、商品名「Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製）を用い、１サイクル（９８℃で１０秒間、５８℃で１０秒間、７２℃で２分間を順に行う）を３５サイクル行った。前記ＰＣＲ反応により得られたＰＣＲ断片を、アガロースゲルを用いて電気泳動した結果、１９８６ｂｐの長さを示すバンドを得た。前記ＰＣＲ断片を、商品名「ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いてクローニングし、ＤＮＡシークエンサー（商品名「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で分析し、塩基配列を決定した。その結果、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのゲノム塩基配列は、配列番号２に示す塩基配列からなることが明らかになった。また、この配列情報から、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、分泌シグナル配列（アミノ酸番号１〜４４番目）、糖質加水分解酵素ファミリー２７（ＧＨ２７）に属する触媒モジュール、糖結合モジュールファミリー１３（ＣＢＭ１３）に属する糖結合モジュールからなることが明らかになった。なお、前記ＳＡＶ２１８６（配列番号４）は、従来、分泌型α−ガラクトシダーゼと推定されている配列部分であった。したがって、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性を有する本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、従来の知見とは異なる、特異的な酵素特性を有することが明らかになった。
【００６１】
（本発明の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの発現）
本例では、以下のようにして、接合型放線菌プラスミドｐＴＯＮＡ４を調製し、前記ＰＣＲ断片を前記プラスミドｐＴＯＮＡ４に導入し、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６株（ＮＢＲＣ番号：１５６７５）に発現させ、組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを得た。
【００６２】
（１）プラスミドｐＢＳａｐｈＩＩの作製
まず、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ｌｌ  ＫＳ（一）（ＴＯＹＯＢＯ社製）を鋳型にして、プライマー１（配列番号７）、プライマー２（配列番号８）およびＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、大腸菌ＪＭ１０９のｏｒｉ（０．６ｋｂ）を、ＰＣＲにより増幅させた。なお、前記ＰＣＲは、１サイクル（９４℃で２分、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分を順に行う）を３０サイクル繰り返した後、４℃に冷却して行った。
【００６３】
つぎに、大腸菌−放線菌カナマイシン耐性遺伝子ａｐｈＩＩ（１．３ｋｂ）を、ＰＣＲにより増幅させた。なお、前記ＰＣＲは、鋳型に参考文献（尾仲ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、５６巻、９５０−９５６頁、２００３年）記載のｐＴＹＭ１８を用い、プライマーにプライマー３（配列番号９）およびプライマー４（配列番号１０）を用いたこと以外は、前記ｏｒｉと同様にして行った。
【００６４】
得られた前記ｏｒｉおよび前記ａｐｈＩＩの断片を、それぞれ、制限酵素ＳｓｐｌおよびＰｓｔｌで処理し、２つの断片を互いにライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。前記大腸菌を、５０μｇ/ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地（１％ＮａＣｌ、１％ポリペブトンおよび０．５％酵母エキス）を用いて３７℃で培養した。カナマイシンを選択マーカーにして、前記大腸菌から、前記ライゲーションした断片を含むプラスミドｐＢＳａｐｈＩＩを得た。
【００６５】
（２）プラスミドｐＩＪＥ７０２の作製
得られた前記ｐＢＳａｐｈＩＩおよび参考文献（Ｍｏｌｎａｒら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７２巻、３６８−３７２頁、１９９１年）記載のｐＩＪ７０２を、それぞれ制限酵素Ｐｓｔｌで処理し、２つの断片をライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。前記大腸菌を、前記ｐＢＳａｐｈＩＩを発現させた大腸菌と同様にして培養した。カナマイシンを選択マーカーに用いて、前記大腸菌から、前記ライゲーションした断片を含むプラスミドｐＩＪＥ７０２を得た。
【００６６】
（３）プラスミドｐＩＪＥＣ´７０２の作製
ｏｒｉＴ（０．８ｋＢ）を、ＰＣＲにより増幅させた。なお、前記ＰＣＲは、鋳型にｐＴＹＭ１８を用い、プライマーにプライマー５（配列番号１１）およびプライマー６（配列番号１２）を用いたこと以外は、前記ｏｒｉと同様にして行った。得られた前記ｏｒｉＴの断片を、制限酵素ＨｉｎｃｌＩおよびＳｍａｌで処理した。また、前記ｐＩＪＥ７０２を、制限酵素ｓｓｐＩで処理した。得られた２つの断片を互いにライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。前記大腸菌を、前記ｐＢＳａｐｈＩＩを発現させた大腸菌と同様にして培養した。カナマイシンを選択マーカーに用い、前記大腸菌から、前記ライゲーションした断片を含むプラスミドｐＩＪＥＣ７０２を得た。そして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、プライマー７（配列番号１３）およびプライマー８（配列番号１４）を用いたサイレント変異により、前記ｐＩＪＥＣ７０２のＮｄｅｌ部位を欠失させ、ｐＩＪＥＣ´７０２を得た。
【００６７】
（４）プラスミドｐＴＯＮＡ４の作製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕ  ＩＦＯ１２８５２株のゲノムＤＮＡから、サイトウ・ミウラ法（サイトウら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．、７２巻、６１９−６２９頁、１９６３年）を用いて、ＰＬＤプロモーター（ＰＬＤｐ、０．３ｋＢ）およびＰＬＤターミネーター（ＰＬＤｔ、０．２ｋＢ）を調製した。
【００６８】
前記ＰＬＤプロモーターを、鋳型にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕ  ＩＦＯ１２８５２株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーにプライマー９（配列番号１５）およびプライマー１０（配列番号１６）を用いたこと以外は前記ｏｒｉと同様にして、ＰＣＲにより増幅させた。前記ＰＬＤターミネーターを、プライマーにプライマー１１（配列番号１７）およびプライマー１２（配列番号１８）を用いたこと以外は前記ＰＬＤプロモーターと同様にして、ＰＣＲにより増幅させた。
【００６９】
得られた前記ＰＬＤプロモーター断片を、制限酵素ＡｓｅｌおよびＥｃｏＲＩで処理し、前記ＰＬＤターミネーター断片を、ＥｃｏＲｌおよびＢｇｌｌｌで処理し、前記ｐＩＪＥＣ´７０２を、制限酵素ＡｓｅＩおよびＢｇｌＩＩで処理した。得られた３つの断片を、ライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９に導入し、前述と同様にして培養した。前記大腸菌ＪＭ１０９から、カナマイシンを選択マーカーにして、ライゲーションした断片を含むプラスミドｐＴＯＮＡ４を得た。
【００７０】
図３に、得られたプラスミドｐＴＯＮＡ４の構成（制限酵素地図）を示す。同図に示すように、前記プラスミドｐＴＯＮＡ４は、前記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕ  ＩＦＯ１２８５２株のｐｌｄ遺伝子のプロモーター配列（ＰＬＤｐ）およびターミネーター配列（ＰＬＤｔ）を備える発現ベクターである。
【００７１】
（５）形質転換体の調製
前記ｐＴＯＮＡ４により、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６株（ＮＢＲＣ番号：１５６７５）を形質転換させ、本例の形質転換体を得た。前記形質転換体を、５００ｍＬバッフルフラスコに入れたＴＳＢ培地１００ｍＬに植菌し、２８℃、回転数１５０ｒｐｍの条件下で回転培養した。培養３日目に培養液を回収し、濾紙でろ過して菌体を除去することにより、粗酵素液を得た。前記粗酵素液に７０％飽和硫安を加えて沈殿させ、得られた沈殿を５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、前記リン酸緩衝液で透析後、Ｌａｃｔｏｓｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法により分離した。なお、前記アフィニティクロマトグラフィー法は、参考文献（Ｓ．Ｉｔｏ、Ａ．Ｋｕｎｏ、Ｒ．Ｓｕｚｕｋｉ、Ｓ．Ｋａｎｅｋｏ、Ｙ．Ｋａｗａｂａｔａ、Ｉ．Ｋｕｓａｋａｂｅ  ＆  Ｔ．ＨＡＳＥＧＡＷＡ、“Ｒａｔｉｏｎａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆａｍｉｌｙ  １０  ｘｙｌａｎａｓｅ”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００４年、１１０、ｐ．１３７−１４２）記載の方法により行った。前記透析後の酵素液を、Ｌａｃｔｏｓｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに供し、流速０．５ｍｌ/ｍｉｎの５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２)で溶出させ、フラクションに分離した。回収した前記フラクションについて、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性を測定した。そして、前記フラクション中、前記活性を有するフラクションを回収し、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析後、組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ酵素液とした。
【００７２】
（本発明の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの分子量）
前記組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ酵素液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて電気泳動した。図４の写真に、前記電気泳動の結果を示す。同図の写真において、レーン１は分子量マーカー（商品名「ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｌｏｗ  Ｍａｒｋｅｒ」、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）であり、レーン２は、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼである。本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの分子量は、約６４０００Ｄａであり、本例の天然型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの分子量と近似していた。
【００７３】
（本発明の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性の測定）
本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの酵素活性を、以下のようにして確認した。まず、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシド２５μＬおよびＭｃＩｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液および０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム混合水溶液、ｐＨ４．０）２０μＬに、前記組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ酵素液５μＬを加え、３７℃で１０分間反応させた。反応開始１０分後、この反応液に、さらに０．２ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム５０μＬを加えて反応を停止させ、４００ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた吸光度から、１分間に１μｍｏｌのＰＮＰを遊離させる酵素量を１ｕｎｉｔとした比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。その結果、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、アラビノースのβ−Ｌ−結合に作用してＰＮＰを遊離させ、その比活性は１８ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。したがって、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ酵素活性を有し、本例のポリヌクレオチドは、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼをコードする遺伝子配列であることが確認された。
【００７４】
（本発明の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの至適ｐＨ）
本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの至適ｐＨ範囲を、以下のようにして確認した。まず、前記組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ酵素液５μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシド２５μＬ、所定ｐＨ（ｐＨ２．６、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、７．６）のＭｃＩｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ２０μＬを混合し、３７℃で１０分間反応させた。反応開始１０分後に、さらに０．２ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム５０μＬを加えて反応を停止させ、４００ｎｍにおける吸光度を測定した。前記吸光度から、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性が最大値を示したｐＨにおける酵素活性値を１００としたときの、各ｐＨにおける酵素活性値を算出した。図５のグラフに、前記酵素活性値を示す。同図のグラフにおいて、縦軸は、酵素活性値（％）であり、横軸は、ｐＨである。図示のように、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、ｐＨ４．０近傍を至適ｐＨとし、ｐＨ２．５以上かつ６以下の範囲で、酵素活性値が５０％以上となる、高いβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性を示した。
【００７５】
（本発明の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのｐＨ安定性）
本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのｐＨ安定性を、以下のようにして確認した。まず、緩衝液として、所定ｐＨ（ｐＨ１．０、２．０、２．６）のＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ、所定ｐＨ（ｐＨ７．５、８．０）のＳｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、所定ｐＨ（ｐＨ８．０、９．０）のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ、所定ｐＨ（ｐＨ９．５、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０）のＧｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ  ｂｕｆｆｅｒおよび所定ｐＨ（ｐＨ２．６、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、７．６）のＭｃＩｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒを、それぞれ調製した。そして、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ酵素液５μＬ、前記所定ｐＨの緩衝液４０μＬおよび１ｗ／ｖ％ＢＳＡ５μＬを混合し、３０℃の条件下で１時間インキュベートした。インキュベート終了後、前記処理済み酵素液に、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液および０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム混合水溶液、ｐＨ４．０）およびＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシドを加え、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの残存活性を、前述と同様にして測定した。図６のグラフに、前記測定結果を示す。同図のグラフにおいて、縦軸は、酵素活性値（％）であり、横軸は、ｐＨである。図示のように、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、ｐＨ４．０以上かつ８．０以下の範囲において、酵素活性値９０％以上の、高いｐＨ安定性を示した。
【００７６】
（本発明の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの至適温度）
本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの至適温度を、以下のようにして確認した。まず、前記組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ酵素液５μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシド２５μＬ、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．０）２０μＬを混合し、所定温度条件下（２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０℃）で１０分間反応させた。反応開始１０分後に、さらに０．２ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム５０μＬを加えて反応を停止させ、４００ｎｍにおける吸光度を測定した。β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性が最大値を示した温度における酵素活性値を１００とし、各温度における酵素活性値を相対値として算出した。図７のグラフに、前記酵素活性値を示す。同図のグラフにおいて、縦軸は、酵素活性値（％）であり、横軸は、温度（℃）である。図示のように、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、４０℃近傍を至適温度とし、２０℃以上かつ５０℃の範囲で、酵素活性値が約４０％以上となる、高いβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ活性を示した。
【００７７】
（本発明の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの温度安定性）
本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの温度安定性を、以下のようにして確認した。まず、前記組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ酵素液５μＬ、前記各温度（２０〜９０℃）のＭｃＩｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．０）４０μＬ、１％ＢＳＡ５μＬを混合し、所定温度条件下（２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０℃）で１時間インキュベートした。インキュベート終了後、前記処理済み酵素液に、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液および０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム混合水溶液、ｐＨ４．０）およびＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシドを加え、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの残存活性を、前述と同様にして測定した。図８のグラフに、前記測定結果を示す。同図のグラフにおいて、縦軸は、酵素活性値（％）であり、横軸は、温度（℃）である。図示のように、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、２０℃以上かつ４５℃以下の範囲において、酵素活性値８０％以上の、高い温度安定性を示した。
【００７８】
（他のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼとの酵素特性比較）
前述のように、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの前述した酵素特性を、既報のキマメ（Ｃ．ｉｎｄｉｃｕｓ）およびサトイモ乾腐病菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの酵素特性と比較した。前記表２に、前記酵素活性の比較結果を示す。なお、報文中に記載された、キマメ由来β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの比活性の測定方法は、以下の通りである。１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシド５００μＬおよびＭｃＩｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５）２０００μＬに、キマメ由来アラビノピラノシダーゼ酵素液３００μＬを加え、３０℃で１５分間反応させた。反応開始１５分後、この反応液に、さらに０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム５ｍＬを加えて反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。１分間に１μｍｏｌのＰＮＰを遊離させる酵素量を１ｕｎｉｔとし、得られた吸光度から、キマメ由来β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの比活性（ｍｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。同表に示すように、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、キマメおよびサトイモ乾腐病菌由来β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのいずれとも、異なる特性（分子量、比活性、至適ｐＨ・安定ｐＨ・至適温度）を有している。また、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、前述のように、触媒モジュール（ＧＨ２７）および糖結合モジュール（ＣＢＭ１３）を含む。このＧＨ２７触媒モジュールを有する酵素群において、触媒モジュールの分子量は約４００００であることが明らかになっている。このことからも、分子量２５９００のキマメ由来β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼとは異なるファミリーに属する酵素であると考えられる。したがって、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、既報のキマメおよびサトイモ乾腐病菌由来β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼとは異なる、新規なβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼである。
【００７９】
（本発明の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの基質特異性）
本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを、以下のようにして、下記表５記載の２０種類のＰＮＰ基質に対して作用させ、ＰＮＰ基質に対する特異性を確認した。まず、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＮＰ基質２５μＬおよびＭｃＩｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．０）２０μＬに、前記組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ酵素液５μＬを加えて、３７℃で１０分間反応させた。つぎに、０．２ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム５０μＬをさらに加えて反応を停止し、４００ｎｍにおける反応液の吸光度を測定した。３回の測定値の平均値を算出し、ＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシドに対する分解活性を１００とした場合の各基質の分解活性を、分解率（％）として算出した。同表に、前記分解率を示す。同表に示すように、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、ＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシドに対して特異的な分解活性を示し、他の基質としては、ＰＮＰ−α−Ｄ−ガラクトピラノシドに対して１．５％の分解率を示すのみであった。この結果より、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼが、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼに特異的な活性を有することが示された。
【００８０】
【表５】
2009153516.tif 000007
【００８１】
（アラビノースおよびガラクトオリゴ糖の産生）
本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ、およびエキソ−β−１,３−ガラクタナーゼを、以下のようにして、カラマツアラビノガラクタンに作用させ、得られた分解産物を分析した。まず、０．５％カラマツアラビノガラクタンおよびＭｃＩｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．０）の混合溶液に酵素液を加え、３７℃で３０分間反応させた。なお、前記酵素液としては、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ（０．０３ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）のみを含む酵素液と、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ（０．０３ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）およびエキソ−β−１,３−ガラクタナーゼ（０．０３ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を含む酵素液との２種類を用いた。反応開始３０分後に反応液を１００℃で１０分間熱処理し、反応を停止させた後、パルスアンペロメトリ検出高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）に供し、ＣａｒｂｏＰａｃ（商標）ＰＡ１カラム（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用いて分解産物を検出した。図９に、前記検出結果を示す。同図中、上のパネルは、カラマツアラビノガラクタンに本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ（０．０３ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）のみを反応させた結果であり、下のパネルは、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ（０．０３ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）およびエキソ−β−１,３−ガラクタナーゼ（０．０３ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を反応させた結果である。両パネルにおいて、縦軸は、検出パルス（ＰＡＤ、μＣ）であり、横軸は、リテンションタイム（分）である。また、同図中の矢印で指し示したピークは、検出された各分解産物（糖）であり、Ａｒａはアラビノース、Ｇａｌはガラクトース、Ｇａｌ２はβ−１，６−ガラクトビオース、Ｇａｌ３はβ−１，６−ガラクトトリオースを示している。同図に示すように、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのみを作用させた場合には、アラビノースの産出が確認され、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼおよびエキソ−β−１,３−ガラクタナーゼを作用させた場合には、アラビノースに加えて、ガラクトビオースやガラクトトリオース等のオリゴ糖の産出が確認できた。
【００８２】
（糖転移反応１）
アラビノース残基を含む糖類（糖供与体）としてＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシドを用い、糖受容体としてＤ−ガラクトースを用いて、以下のようにして、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼによる糖転移反応を行った。
【００８３】
まず、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液および０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム混合水溶液、ｐＨ４．０）１５μＬに、ＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシド１ｍｇおよびガラクトース４ｍｇを懸濁し、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ酵素液５μＬを加え、４０℃で反応させた。反応開始０、２７、４８、７１時間後に、前記反応液２μＬをそれぞれサンプリングし、１００℃で１０分間加熱処理して反応を停止させ、水１８μＬをさらに加えて不溶物を完全に溶解させた。前記溶解液２μＬを、ＴＬＣ（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｓｈｅｅｔｓ、Ｍｅｒｃｋ社製）に供し、酢酸エチル：酢酸：水＝７：２：２の展開溶媒を用いて２回展開を行った。２回展開後、ＴＬＣに硫酸を噴霧し、１７０℃に加熱して糖スポットを検出した。なお、マーカーとして、Ｄ−ガラクトースおよびＬ−アラビノースを用い、上記と同様に２回展開した。図１０の写真に、前記検出結果を示す。同図において、レーン１はＤ−ガラクトース、レーン２はＬ−アラビノース、レーン３は反応液（反応開始０時間後）、レーン４は反応液（同２７時間後）、レーン５は反応液（同４８時間後）、レーン６は反応液（同７１時間後）をそれぞれ展開した結果である。また、同図中の黒いスポットは、上から順に、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクトース、反応後生成した糖のスポットである。同図に示すように、反応開始２７時間以降の反応液（レーン４〜６）には、Ｄ−ガラクトースのスポットの下部に新規なスポット（反応後生成した糖のスポット）が検出された。すなわち、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの作用により、新たな糖が生成し、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼが、糖転移触媒作用を有することが示唆された。また、新規に検出された糖（反応後生成した糖）は、Ｄ−ガラクトースにＬ−アラビノースが結合した二糖であると推測された。そして、反応開始２７時間以降の反応液（レーン４〜６）には、Ｌ−アラビノースのスポットも検出された。すなわち、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼによるＬ−アラビノースの産生が確認された。
【００８４】
（糖転移反応２）
アラビノース残基を含む糖類（糖供与体）としてＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシドを用い、単糖および二糖を糖受容体として用い、以下のようにして、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼによる糖転移反応を行った。なお、下記表６に、糖受容体として用いた前記単糖および二糖を示す。
【００８５】
まず、ＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシド（５０ｍｇ／ｍｌ）および各種糖受容体（２００ｍｇ／ｍｌ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、前記組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ酵素液１ｕｎｉｔを加え、４０℃で反応させた。また、コントロールとして、糖受容体を含まない反応液を同様に反応させた。反応開始６時間後に、前記反応液をそれぞれサンプリングし、１００℃で１０分間加熱処理して反応を停止させた。これを水で希釈し、パルスアンペロメトリ検出高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）に供し、ＣａｒｂｏＰａｃ（商標）ＰＡ１カラム（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用いて糖転移産物の有無を検出した。また、検出されたピーク面積から、下記式１を用いて、前記各種糖類の糖転移率（％）を算出した。
糖転移率（％）＝Ｂ／（Ａ＋Ｂ）×１００        ・・・（１）
Ａ＝アラビノースのピーク面積
Ｂ＝糖転移産物のピーク面積
【００８６】
図１１に、糖受容体としてグルコースを用いたときの前記検出結果を示す。同図において、上のパネルは、前記コントロール（糖受容体を含まない反応液）の結果であり、下のパネルは、グルコースを糖受容体として用いた結果である。両パネルにおいて、縦軸は、検出パルス（ＰＡＤ、μＣ）であり、横軸は、リテンションタイム（分）である。また、同図中の指し示したピークは、検出された各分解産物（糖）であり、Ａｒａはアラビノース、Ｇｌｃはグルコース、アスタリスクは反応後生成した物質を示している。同図に示すように、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼにより糖供与体から産生されたアラビノース、および糖受容体として加えたグルコースのピークの他に、新規なピーク（反応後生成した物質のピーク）が検出された。すなわち、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのグルコースに対する糖転移能が確認できた。
【００８７】
下記表６に、各種糖受容体の前記糖転移率を示す。同表に示すように、単糖では、ガラクトース、グルコース、マンノース、キシロースおよびＬ−アラビノースを糖受容体とした場合に、糖転移産物が確認され、特に、ガラクトース、グルコースおよびキシロースは、高い糖転移率を示した。また、二糖では、ラクトース、マルトースおよびセロビオースを糖受容体とした場合に、糖転移産物が確認され、特に、ラクトースは、高い糖転移率を示した。すなわち、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、単糖または二糖を糖受容体とした糖転移反応を触媒することが確認された。
【００８８】
【表６】
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【００８９】
（糖転移反応３）
糖受容体としてアルコール類を用い、アラビノース残基を含む糖類（糖供与体）としてＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシドを用い、以下のようにして、本例の組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼによる糖転移反応を行った。なお、前記アルコール類としては、メタノール、エタノール、１−プロパノールおよび１−ブタノールを用いた。
【００９０】
まず、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシドおよび各種アルコール類（１５ｖ／ｖ％）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、前記組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ酵素液１ｕｎｉｔを加え、４０℃で反応させた。また、コントロールとして、糖受容体を含まない前記リン酸緩衝液を同様に反応させた。反応開始３時間後に、前記反応液２０μＬをそれぞれサンプリングした。前記反応液およびマーカー（Ｌ−アラビノース）を、ＴＬＣ（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｓｈｅｅｔｓ、Ｍｅｒｃｋ社製）に供し、クロロホルム：メタノール：水＝３０：２０：４の展開溶媒を用いて１回展開を行った。１回展開後、ＴＬＣに硫酸を噴霧し、１７０℃に加熱して糖スポットを検出した。図１２の写真に、前記検出結果を示す。同図において、レーン１はマーカー（Ｌ−アラビノース）、レーン２はコントロール反応液、レーン３はメタノール反応液、レーン４はエタノール反応液、レーン５は１−プロパノール反応液、レーン６は１−ブタノール反応液をそれぞれ展開した結果である。また、同図中、左端の矢印で指し示すスポットは、Ｌ−アラビノースのスポットであり、右端の矢印で指し示すスポットは、反応後に生成した物質（生成物）のスポットである。同図に示すように、各種アルコールを糖受容体として用いた反応液（レーン３〜６）には、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼにより糖供与体から産生されたＬ−アラビノースのスポットの他に、コントロール反応液（レーン２）には見られない新規なスポット（生成物のスポット）が検出された。すなわち、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、アルコール類を糖受容体とした糖転移反応を触媒することが確認された。
【００９１】
（糖転移産物からのアラビノースの産生）
前記糖転移反応２により得られた糖転移産物に、以下のようにして、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを作用させ、アラビノースの産生を確認した。なお、前記糖転移産物には、グルコースを糖受容体とした反応により生成した糖転移産物を用いた。すなわち、まず、前記反応液を、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ−４０Ｓを用いたクロマトグラフィーに供し、ＰＮＰおよびβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを分離除去した。前記分離除去後の液を、活性炭素を用いたクロマトグラフィーに供し、単糖を分離除去し、前記糖転移産物を含むフラクションを回収した。回収した各フラクションを、エバポレーターにより濃縮し、ＴＬＣ（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｓｈｅｅｔｓ、Ｍｅｒｃｋ社製）に供し、糖転移産物を精製した。前記糖転移産物を含む水溶液４μＬに、前記組換え型β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ酵素液１μＬを加え、４０℃で所定時間（１および２時間）反応させた。得られた反応液およびマーカー（Ｌ−アラビノースおよびＤ−グルコース）を、ＴＬＣ（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｓｈｅｅｔｓ、Ｍｅｒｃｋ社製）に供し、クロロホルム：メタノール：水＝３０：２０：４の展開溶媒を用いて１回展開を行った。１回展開後、ＴＬＣに硫酸を噴霧し、１７０℃に加熱して糖スポットを検出した。図１３の写真に、前記検出結果を示す。同図において、レーン１はマーカー（Ｌ−アラビノース）、レーン２はマーカー（Ｄ−グルコース）、レーン３は糖転移産物、レーン４は１時間反応液、レーン５は２時間反応液をそれぞれ展開した結果である。また、同図中、矢印で指し示すスポットは、上から順に、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルコース、糖転移産物のスポットである。同図に示すように、反応液（レーン４〜５）には、糖転移産物のスポットの他に、糖転移産物を基質として、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼにより生産されたＬ−アラビノースのスポットおよび分解産物であるＤ−グルコースのスポットが検出された。このように、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの糖転移酵素活性により得た糖転移産物に、本例のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを作用させることにより、そのアラビノピラノシダーゼ活性によるＬ−アラビノースの産生が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明により、大量生産可能な、新規β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼが提供される。本発明の新規β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼを用いれば、例えば、乳化剤として利用される前記アカシアガムやカラマツアラビノガラクタンに作用させて、その糖鎖構造を改変することにより、菓子等の製造時における乳化工程の調節あるいは改変した乳化剤の製造が可能になる。また、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼは、アラビノピラノシダーゼ活性に加えて、アラビノース残基の糖転移酵素活性を有するため、アラビノースの製造のみならず、アラビノース残基を含む糖類の製造にも利用可能である。したがって、本発明は、例えば、食品分野や医療分野等の幅広い分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの一例の精製ステップにおいて、菌体培養後の培養液中の各種酵素活性を測定した結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのその他の例をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により電気泳動した結果を示す写真である。
【図３】図３は、本発明のベクターの一例の構成（制限酵素地図）を示す図である。
【図４】図４は、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのさらにその他の例をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により電気泳動した結果を示す写真である。
【図５】図５は、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのさらにその他の例のｐＨによる酵素活性変化を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのさらにその他の例のｐＨ安定性を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのさらにその他の例の温度による酵素活性変化を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのさらにその他の例の温度安定性を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのさらにその他の例およびエキソ−β−１,３−ガラクタナーゼによる、カラマツアラビノガラクタン分解産物の分析結果を示すチャートである。上パネルは、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのみを作用させたときの分解産物、下パネルは、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼおよびエキソ−β−１，３−ガラクタナーゼを作用させたときの分解産物の分析結果を示している。
【図１０】図１０は、本発明の糖転移方法の例による糖転移反応結果を示すＴＬＣ写真である。
【図１１】図１１は、本発明の糖転移方法のその他の例による糖転移反応結果を示すチャートである。上パネルは、糖受容体を含まないコントロールの結果であり、下パネルは、グルコースを糖受容体とした場合の結果を示している。
【図１２】図１２は、本発明の糖転移方法のさらにその他の例による糖転移反応結果を示すＴＬＣ写真である。
【図１３】図１３は、本発明の糖転移方法のその他の例により得られた糖転移産物に本発明のβ−Ｌ−アラビノピラノシダーゼのさらにその他の例を作用させたときの分解産物の分析結果を示すＴＬＣ写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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