(57)【要約】【課題】蛍光色素を選択して入力するだけで、最適な取得波長範囲を自動的に設定可能な走査顕微鏡を提供する。【解決手段】走査顕微鏡は、光源からの励起光を走査器を介して、前記光源と共役な位置に置かれた試料に集光する照明光学系と、前記試料中の蛍光色素から発生する蛍光を前記走査器を介して、分光器に入射させる受光光学系と、前記分光器で分光された光を検出する検出部と、前記蛍光色素を励起する励起波長を記憶する記憶部と、前記試料中に含まれる前記蛍光色素を設定する蛍光色素設定手段と、設定された前記蛍光色素を励起する、前記記憶手段に記憶された前記励起波長と前記分光器の分光特性とを用いて前記検出器で検出する最小波長を算出する演算部とを有する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの励起光を走査器を介して、前記光源と共役な位置に置かれた試料に集光する照明光学系と、
前記試料中の蛍光色素から発生する蛍光を前記走査器を介して、分光器に入射させる受光光学系と、
前記分光器で分光された光を検出する検出部と、
前記蛍光色素を励起する励起波長を記憶する記憶部と、
前記試料中に含まれる前記蛍光色素を設定する蛍光色素設定手段と、
設定された前記蛍光色素を励起する、前記記憶手段に記憶された前記励起波長と前記分光器の分光特性とを用いて前記検出器で検出する最小波長を算出する演算部と
を有する走査顕微鏡。
【請求項２】
前記分光器は、分解能が異なる複数の分光素子を備え、前記分光器の分光特性は、使用する前記分光素子の前記分解能であることを特徴とする請求項１記載の走査顕微鏡。  
【請求項３】
前記記憶部は、前記蛍光色素から発する蛍光の観測すべき波長範囲を記憶し
ており、設定された前記蛍光色素と該蛍光色素における前記記憶装置に記憶された前記観測すべき波長範囲に基づいて、前記検出器により観測すべき波長の最小値と最大値を求め、それに応じて使用する前記分光素子を選択することを特徴とする請求項２記載の走査顕微鏡。
【請求項４】
前記検出部は、複数の検出素子がライン状に配置され、
前記演算部で算出された前記最小波長の光が、前記複数の検出素子のうち最端の検出素子に入射するように前記分光器への前記蛍光の入射角を制御する制御手段を有することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の走査顕微鏡。
【請求項５】
前記蛍光色素から発する蛍光の観測すべき波長範囲は、該蛍光色素から発する蛍光の最小波長と最大波長の間の範囲であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の走査顕微鏡。
【請求項６】
前記蛍光色素から発する蛍光の観測すべき波長範囲は、当該蛍光色素から発する蛍光の強度の半値幅の範囲であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の走査顕微鏡。
【請求項７】
前記蛍光色素から発する蛍光の観測すべき波長範囲は、当該蛍光色素から発する蛍光の強度ピーク値を示す波長から、両側に予め定められた範囲であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の走査顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
走査顕微鏡は、レーザ等の点光源から発せされた光を、スキャナを用いて走査光に変換し、前記点光源と共役な位置に置かれた試料を照射する。前記試料は蛍光色素で染色されているので、励起光の照射により、前記試料からは蛍光が発生する。この蛍光を、前記スキャナを逆に通すことにより非走査光に変換し、前記試料と共役な位置に設けられたピンホールを通して、分光器により、前記蛍光の波長毎の輝度を得る。そして、前記スキャナの走査位置と、前記蛍光の輝度を演算することにより、各蛍光波長ごとの前記試料の２次元画像を得る。分光器は、プリズムや回折格子等の分光素子と、分光された光を各波長毎に受光して電気信号に変える受光素子である１次元リニアセンサ（ＰＭＴやＣＣＤ等）から成り立っている。このような走査顕微鏡の例は、例えば特開２００６−１５３７６３号公報（特許文献１）に記載されている。特許文献１に記載される走査顕微鏡においては、回折格子に入射する角度を変えることで、受光器で受光される波長帯域を変更することができ、又、回折格子を変えることで、波長分解能を変えることもできる。
【特許文献１】特開２００６−１５３７６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このような走査顕微鏡において、分光器により分光できる波長の範囲は、分光素子から放出される分光された光の放出角度と、分光器から受光素子までの光路長、受光素子の幅で決定される。このような制約のため、分光器により分光して出力できる波長範囲には、所定の限度があり、走査顕微鏡の使用に際しては、ユーザがこの範囲を設定する必要がある。
【０００４】
しかし、そのためには、ユーザは使用している蛍光色素の出力波長範囲の特性と、使用している走査顕微鏡の特性を理解して行う必要があり、設定動作が煩雑なものとなっていた。
【０００５】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、蛍光色素を選択して入力するだけで、最適な取得波長範囲を自動的に設定可能な走査顕微鏡を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するための第１の手段は、光源からの励起光を走査器を介して、前記光源と共役な位置に置かれた試料に集光する照明光学系と、前記試料中の蛍光色素から発生する蛍光を前記走査器を介して、分光器に入射させる受光光学系と、前記分光器で分光された光を検出する検出部と、前記蛍光色素を励起する励起波長を記憶する記憶部と、前記試料中に含まれる前記蛍光色素を設定する蛍光色素設定手段と、設定された前記蛍光色素を励起する、前記記憶手段に記憶された前記励起波長と前記分光器の分光特性とを用いて前記検出器で検出する最小波長を算出する演算部とを有する走査顕微鏡である。
【０００７】
前記課題を解決する第２の手段は、前記第１の手段であって、前記分光器は、分解能が異なる複数の分光素子を備え、前記分光器の分光特性は、使用する前記分光素子の前記分解能であることを特徴とするものである。
【０００８】
前記課題を解決する第３の手段は、前記第２の手段であって、前記記憶部は、前記蛍光色素から発する蛍光の観測すべき波長範囲を記憶しており、設定された前記蛍光色素と該蛍光色素における前記記憶装置に記憶された前記観測すべき波長範囲に基づいて、前記検出器により観測すべき波長の最小値と最大値を求め、それに応じて使用する前記分光素子を選択することを特徴とするものである。
【０００９】
前記課題を解決する第４の手段は、前記第１の手段から第３の手段のいずれかの手段であって、前記検出部は、複数の検出素子がライン状に配置され、前記演算部で算出された前記最小波長の光が、前記複数の検出素子のうち最端の検出素子に入射するように前記分光器への前記蛍光の入射角を制御する制御手段を有することを特徴とするものである。
【００１０】
前記課題を解決する第５の手段は、前記第１の手段から第４の手段のいずれかの手段であって、前記蛍光色素から発する蛍光の観測すべき波長範囲は、該蛍光色素から発する蛍光の最小波長と最大波長の間の範囲であることを特徴とするものである。
【００１１】
前記課題を解決する第6の手段は、前記第１の手段から第４の手段のいずれかの手段であって、前記蛍光色素から発する蛍光の観測すべき波長範囲は、当該蛍光色素から発する蛍光の強度の半値幅の範囲であることを特徴とするものである。
【００１２】
前記課題を解決する第7の手段は、前記第１の手段から第４の手段のいずれかの手段であって、前記蛍光色素から発する蛍光の観測すべき波長範囲は、当該蛍光色素から発する蛍光の強度ピーク値を示す波長から、両側に予め定められた範囲であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、蛍光色素を選択して入力するだけで、最適な取得波長範囲を自動的に設定可能な走査顕微鏡を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態の例を、図を用いて説明する。図１は、本発明の実施の形態の１例である走査顕微鏡の光学系の概要を示す図である。
【００１５】
点光源とみなせるレーザ光源１から放出された光は、コリメートレンズ２により平行光束に変換され、励起バリアフィルタ３を通って、ダイクロイックミラー４で反射される。そして、スキャナ５により２次元走査光に変換され、対物レンズにより、レーザ光源１と共役な位置に置かれた試料７に集光されて照明する。
【００１６】
試料７は、予め蛍光色素で染色されており、励起光の照明に伴って、試料７から蛍光が発生する。この蛍光は、対物レンズ６で集光されて平行光束に変えられ、スキャナ５を逆に通過することにより非走査光束となる。そして、ダイクロイックミラー４を透過し、バリアフィルタ８を通った後、集光レンズ９により、試料７と共役な位置に置かれたピンホール板１０のピンホールに集光される。
【００１７】
このピンホールを通過した光は分光器により分光される。分光器は回折格子装置１１と１次元リニアセンサ１２とからなり、回折格子装置１１は、回転盤１１ｄ上に分解能の異なる３つの回折格子１１ａ、１１ｂ、１１ｃが設けられており、回転盤１１ｄを回転させることにより、いずれかの回折格子を選択可能である。又、１つの回折格子を選択した場合にも、回折格子装置１１の回転角度を変えることにより、１次元リニアセンサ１２で受光される波長範囲を変えることができる。
【００１８】
演算制御装置１３は、分光器により分光された各波長の光を受光し、スキャナ５の動きと合わせて、各波長毎の強度変化を、スキャナ５の動きに合わせて処理し、２次元画像を形成して、図示しない表示装置に表示する。
【００１９】
演算制御装置は、これらの測定に先だち、３つの回折格子１１ａ、１１ｂ、１１ｃの選択と、分光器で取得すべき波長範囲に合わせて、回折格子装置１１の回転角度を決定する。
【００２０】
このための、演算制御装置１３の処理フローを図２に示す。このフローに先だち、装置のメモリには、使用される複数種の蛍光色素と、その励起波長、その色素が励起されたときに発する蛍光の波長範囲の最大値と最小値がそれぞれ格納されているものとする。
【００２１】
まず、ユーザが、試料に使用されている蛍光色素を選択する（ステップＳ１）。すると、演算制御装置１３は、予めメモリに格納されている対応蛍光色素が発する蛍光の波長範囲の最大値と最小値を読み出して、選択された蛍光色素が同時励起された場合に、測定すべき蛍光波長範囲の最大値と最小値を更新する（ステップＳ２）。
【００２２】
このようにして、ユーザは、同時励起を行う全蛍光色素の選択を行う。全取得蛍光色素の設定が完了したかどうかを判断し（ステップＳ３）、終わっていなければステップＳ１に戻り、次の蛍光色素の選択を行う。全取得蛍光色素の設定が終了すると、測定すべき蛍光波長範囲の最大値と最小値が決定される。
【００２３】
続いて、取得波長範囲が80nm以下かどうかを判断する（ステップＳ４）。取得波長範囲が80nm以下であれば、高分解能の測定が可能であるので、高分解能の回折格子１１ａ（グレーティングレゾリューション2.5nm）のものを選定する（ステップＳ５）。取得波長範囲が80nm以下で無ければ、取得波長範囲が160nm以下かどうかを判断する（ステップＳ６）。取得波長範囲が80nm超え、160nm以下であれば、中分解能の測定が可能であるので、中分解能の回折格子１１ｂ（グレーティングレゾリューション５nm）のものを選定する（ステップＳ７）。取得波長範囲が160nm以下で無ければ、取得波長範囲が320nm以下かどうかを判断する（ステップＳ８）。取得波長範囲が160nm超え、320nm以下であれば、低分解能の測定が可能であるので、低分解能の回折格子１１ｃ（グレーティングレゾリューション１０nm）のものを選定する（ステップＳ９）。
【００２４】
回折格子１１ａ〜１１ｃのいずれかが選択されたとき、選択された回折格子と、取得波長範囲に合わせて、回折格子装置１１の回転角を決定し、回折格子装置１１を回転させて、所定の位置に停止させる（ステップＳ１０）。
【００２５】
具体的には、１次リニアセンサ１２は複数の検出素子（例えば、３２個）から構成され、第１の検出素子（光の進行方向で向かって左端）で取得する蛍光波長は、複数の蛍光色素を励起する複数の励起光のうち最小波長と選択した回折格子の分解能を用いて所定の演算式（最小蛍光波長＝最小励起波長  +  定数×回折格子の分解能）から算出される値である。そのため、回折格子によって分光された蛍光の１次回折光のうち、算出された波長の蛍光一次回折光が第１の検出素子に入射するように回折格子装置の回転角が決定される。これにより、複数の蛍光色素を励起する複数の励起光が、回折格子により分光された結果、最小波長の励起光の一次回折光を第１の検出素子から予め設定した距離だけ離れた位置に出射させることができ、その一次回折光が検出器に入射するのを防止することができる。
【００２６】
なお、ステップ２で決定した測定すべき蛍光波長範囲の最小値が第１の検出素子からはみ出ることになっても、所定の演算式で算出された蛍光波長が優先される。
【００２７】
また、測定すべき蛍光波長範囲の最大値が予め設定した限界測定波長を越える場合は、３２個の検出素子のうち、検出素子として有効に機能する（蛍光を受光したのち、光電変換する）のは、第１の検出素子から限界測定波長に対応する検出素子（例えば、第１の検出素子から第２９の検出素子）までであり、それ以降の検出素子（第３０の検出素子から第３２の検出素子）は無効になる。
【００２８】
測定すべき蛍光波長範囲の最大値が予め設定した限界測定波長を越えない場合は、３２個の検出素子のうち、検出素子として有効に機能する（蛍光を受光したのち、光電変換する）のは、第１の検出素子から最大波長に対応する検出素子（例えば、第１の検出素子から第２７の検出素子）までであり、それ以降の検出素子（第２８の検出素子から第３２の検出素子）は無効になる。
【００２９】
ステップＳ８で、取得波長範囲が320nm超えの場合は、取得波長範囲が測定可能な最大波長範囲より大きいためエラーとする（ステップＳ１１）。
【００３０】
以上説明したように、本実施の形態においては、ユーザは試料に使用されている蛍光色素の種類を指定すれば、後は、自動的に最適な回折格子、及び回折格子への光入射角が選択されるように、自動的に回折格子装置１１の回転角度が設定されるので、測定作業のほとんどが自動化できて、測定が簡単となる。
【００３１】
なお、以上の実施の形態では、３つの分解能の異なる回折格子を選択して使用していたが、１つの回折格子で目的が達成できるときは、回折格子は１つで良く、又、目的に応じて回折格子の数は任意に選択できる。
【００３２】
以上の例においては、装置のメモリには、使用される蛍光色素と、その色素が励起されたときに発する蛍光の波長範囲の最大値と最小値が格納され、ステップＳ２においては、予めメモリに格納されている対応蛍光色素が発する蛍光の波長範囲の最大値と最小値を読み出して、測定すべき波長範囲の最大値と最小値を更新するようにしていたが、装置のメモリに、使用される蛍光色素と、その色素が励起されたときに発する蛍光の半値幅の範囲、蛍光がピーク値を示す波長から、両側に予め定められた範囲、波長の平均値を中心として両側に３σの波長の範囲、蛍光のピーク値から所定の割合だけ強度が低下する波長範囲等とを記憶させておき、ステップ２においては、記憶されている波長範囲をカバーするように、測定すべき波長範囲の最大値と最小値を更新するようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の実施の形態の１例である走査スペクトラル顕微鏡の光学系の概要を示す図である。
【図２】回折格子装置の回転角度を決定するための、演算制御装置の処理フローを示す図である。
【符号の説明】
【００３４】
１…レーザ光源、２…コリメートレンズ、３…励起バリアフィルタ、４…ダイクロイックミラー、５…スキャナ、６…対物レンズ、７…試料、８…バリアフィルタ、９…集光レンズ、１０…ピンホール板、１１…回折格子装置、１１ａ…回折格子、１１ｂ…回折格子、１１ｃ…回折格子、１１ｄ…回転盤、１２…１次元リニアセンサ、１３…演算制御装置
【図１】
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【図２】
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