(57)【要約】【課題】微生物以外の混入物が混在した試料でも、簡便且つ迅速に微生物を検出できる検出方法を提供する。【解決手段】孔径１〜１０μｍの第一フィルター２、該フィルター２を収容すると共に該フィルター２を通じて液体を通過させるハウジング３、および該ハウジング３に固定された振動子４を備えるろ過装置１を用いて、振動子４を作動させて、前記第一フィルター２に、そのろ過面に対して略垂直方向へ０．１〜１００Ｈｚの振動を加えながら、細胞および検出対象の微生物を含有する液体試料５０を第一フィルター２でろ過し、前記細胞が除去されたろ液を回収する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と共存している液体試料中の微生物を検出する方法であって、
孔径１〜１０μｍのフィルターに、そのろ過面に対して略垂直方向へ０．１〜１００Ｈｚの振動を加えながら、前記液体試料を該フィルターでろ過し、前記細胞が除去されたろ液を回収する工程を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項２】
さらに、孔径１μｍ未満のフィルターで前記ろ液をろ過し、微生物を該フィルター上に捕集する工程を有することを特徴とする請求項１に記載の微生物検出方法。
【請求項３】
前記孔径１〜１０μｍのフィルターに対して、該フィルターのろ過面側の空間とは反対側の空間内を減圧せずにろ過することを特徴とする請求項１または２に記載の微生物検出方法。
【請求項４】
前記孔径１〜１０μｍのフィルターに加える振動の周波数が１〜２０Ｈｚであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物検出方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物検出方法で用いるろ過装置であって、
孔径１〜１０μｍのフィルター、該フィルターを収容すると共に該フィルターを通じて液体を通過させるハウジング、および該ハウジングを振動させる加振手段を備えることを特徴とするろ過装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞と共存している液体中の微生物を検出する方法および該方法で用いるろ過装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
製造設備に微生物が混入する微生物汚染は、製品中への微生物混入の原因となるだけでなく、製造工程における異常発生の原因となることがある。例えば、バイオリアクターの反応槽や培養液に、反応に本来必要ではない微生物が混入すると、製造工程に異常をきたし、目標とする品質の製品が得られなくなってしまう。そこで、試料を採取して微生物混入の有無や混入微生物種の確認を行い、微生物汚染を検証することが必要となる。
【０００３】
従来、微生物汚染の検証には、顕微鏡等を用いて、採取した試料をそのまま直接観察する方法や、採取した試料を培地に添加して培養し、培養物を観察する方法が汎用されている（非特許文献１参照）。採取した試料を直接観察する方法は、工程が簡便なので短時間での検証が可能であり、培養物を観察する方法は、微生物を増殖させるので精度の高い検証が可能である。
【非特許文献１】三井洋司監訳、「動物細胞培養の実際」、丸善株式会社、ｐ１０４〜１０５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、採取した試料をそのまま観察する方法では、微生物の検出感度が低く、試料中に微生物以外に細胞などの混入物が混在していると、これらを明確に区別して検出することが困難であり、観察可能な試料が限られるという問題点があった。
また、培養物を観察する方法では、試料の培養に最低でも二日程度の時間が必要であり、しかも培養操作が煩雑で、迅速且つ簡便に検証できないという問題点があった。
【０００５】
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、微生物以外の混入物が混在した試料でも、簡便且つ迅速に微生物を検出できる検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、
本発明は、細胞と共存している液体試料中の微生物を検出する方法であって、孔径１〜１０μｍのフィルターに、そのろ過面に対して略垂直方向へ０．１〜１００Ｈｚの振動を加えながら、前記液体試料を該フィルターでろ過し、前記細胞が除去されたろ液を回収する工程を有することを特徴とする微生物検出方法を提供する。
上記本発明の微生物検出方法は、さらに、孔径１μｍ未満のフィルターで前記ろ液をろ過し、微生物を該フィルター上に捕集する工程を有することが好ましい。
上記本発明の微生物検出方法においては、前記孔径１〜１０μｍのフィルターに対して、該フィルターのろ過面側の空間とは反対側の空間内を減圧せずにろ過することが好ましい。
上記本発明の微生物検出方法においては、前記孔径１〜１０μｍのフィルターに加える振動の周波数が１〜２０Ｈｚであることが好ましい。
また本発明は、上記本発明の微生物検出方法で用いるろ過装置であって、孔径１〜１０μｍのフィルター、該フィルターを収容すると共に該フィルターを通じて液体を通過させるハウジング、および該ハウジングを振動させる加振手段を備えることを特徴とするろ過装置を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、微生物以外の混入物が混在した試料でも、簡便且つ迅速に微生物を検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明について詳しく説明する。
＜ろ過装置＞
図１は、本発明に係るろ過装置を例示する概略構成図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線における縦断面図である。
ろ過装置１おいて、ハウジング３は、第一フィルター２を収容すると共に該第一フィルター２を通じて液体を通過させるものである。
【０００９】
第一フィルター２は、細胞および微生物が共存する液体から細胞を除去するものである。微生物のサイズは通常１〜５μｍであり、細胞のサイズは通常１０μｍよりも大きく、特にバイオリイアクターへの使用に好適な動物細胞のサイズは、通常２０μｍ以上である。このような観点から、細胞を通過させないために、第一フィルター２の孔径は、１〜１０μｍの範囲内で検出対象である微生物の種類に応じて適宜選択すれば良く、３〜８μｍであることが好ましい。
【００１０】
第一フィルター２の材質は、ろ過に供する液体に対して安定なものであれば良く、例えばポリカーボネートやセルロース混合エステル等をはじめとする各種合成樹脂など、微生物や生体由来成分の分離に通常使用されるもので良い。
また、第一フィルター２の厚みは特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択すれば良い。例えば、動物細胞を除去する場合であれば、５０〜３００μｍ程度のものが好適である。
そして、第一フィルター２としては、市販のメンブランフィルターを使用しても良い。
【００１１】
ハウジング３は、ろ過に供する液体試料を導入する円筒形状の導入口３１、第一フィルター２でろ過されたろ液を外部へ排出する円筒形状の排出口３３、および前記導入口３１と排出口３３との間で液体の流路となる円筒形状のろ過室３２を備える。
そしてろ過室３２は、さらに第一フィルター２によって、液体試料の第一フィルター２への流路となる上部区画３２ａ、および第一フィルター２によるろ過で得られたろ液の流路となる下部区画３２ｂとに区分されている。
第一フィルター２は円板状で、導入口３１および排出口３３と同芯状に配置されている。
【００１２】
ハウジング３は、ろ過室３２の側面部位において上下に二分割可能とされており、その分割面に形成された凹部３２０で前記第一フィルター２の周縁部を挟持している。したがって、第一フィルター２はハウジング３に対して着脱可能であり、ハウジング３を分割することで、第一フィルター２を交換できるようになっている。本発明においては、第一フィルター２は必ずしも交換可能である必要性はなく、例えば、第一フィルター２を接着剤等によりハウジング３に固定して、ハウジング３ごと交換するようにしても良いが、ここに示すように、交換可能とされている方が、取り扱い性およびコスト面で有利であり好ましい。
なお、第一フィルター２を着脱可能にハウジング３に固定する方法は上記のものに限定されず、周知の如何なる方法でも良い。
【００１３】
そして、第一フィルター２のろ過面２０は、ハウジング３によって包囲され、導入口３１によってのみハウジング３の外部に開放されている。したがって、前記ろ過面２０は、作業空間中に浮遊している微生物などの異物が付着し難く、導入口３１の開口端を封止すれば、異物の付着を完全に抑制できるようになっている。
【００１４】
上部区画３２ａおよび下部区画３２ｂの体積は特に限定されず、目的に応じて適宜選択すれば良い。微生物汚染の検証を目的として液体試料中の微生物の検出にろ過装置１を使用する場合には、ろ過に供する液体試料の液量を考慮すると、１０〜１００ｍｌであることが好ましい。そして、第一フィルター２のろ過面２０の面積は、１〜２０ｃｍ２であることが好ましい。
また、上部区画３２ａと下部区画３２ｂとの体積比も特に限定されない。
【００１５】
導入口３１は、液体試料５０導入用の注入器５の注入口５１が挿入可能とされている。そして、導入口３１の内径は、液体試料５０の導入を妨げない範囲で小さいほど好ましい。さらに、導入口３１は、注入口５１が嵌合可能とされていることが特に好ましい。このようにすることで、液体試料５０をハウジング３内に導入する時に、液体試料５０を飛散等させることなく確実に導入でき、導入操作も簡略化できる。さらに、液体試料５０を導入している間に、例えば、作業空間中に浮遊している微生物などの異物が、ハウジング３内へ混入することを防止できる。
【００１６】
排出口３３の内径および外径並びに形状は特に限定されず、例えば、ろ過液の取り扱いを考慮して、目的に応じて適宜選択すれば良い。一例を挙げれば、ろ過装置１を、ろ過液を受ける容器に接続して用いる場合には、前記容器の開口部に嵌合するように排出口３３の形状およびサイズを選択できる。
【００１７】
ハウジング３の材質は、ろ過に供する液体に対して安定なものであれば良く、例えば、取り扱い易さや強度を考慮すると各種樹脂類が好適である。なかでも、ろ過面２０の目視観察が容易であることから、透明なものが好ましい。具体的には、ポリプロピレン等が例示できる。
【００１８】
ハウジング３の外表面３０のうち側面３０ａには、振動を加える加振手段として振動子４が固定され、ハウジング３を介して第一フィルター２を振動させることができるようになっている。
振動子４は、１００Ｈｚ以下の低周波数で振動可能なものであればいずれでも良い。
そして振動子４は、その振動の方向が第一フィルター２のろ過面２０に対して略垂直となるように固定されている。
【００１９】
振動子４の数は、ここに示すように一つに限定されず、複数でも良い。振動子４の数が多いほど効率良く第一フィルター２を振動させることができるし、振動子４の数が少ないほど安価にろ過装置１を作製できる。
また、ハウジング３の外表面３０における振動子４の固定部位は、ここに示すように側面３０ａに限定されず、上面３０ｂまたは下面３０ｃでも良い。ただし、固定部位が第一フィルター２とハウジング３との接触部に近いほど、効率良く第一フィルター２を振動させることができるので、振動子４は図１に示すように、側面３０ａに固定することが好ましい。
よって、振動子４を複数固定する場合には、効率良く第一フィルター２を振動させるために、ハウジング３の側面３０ａに等間隔に固定することが好ましい。
【００２０】
振動子４をハウジング３へ固定する方法は特に限定されず、例えば、接着剤を介して固定しても良いが、突起と凹部を係脱可能に係合させて固定する方が、利便性が高く好ましい。また、先に述べたように、ハウジング３が二分割可能とされている場合には、いずれか一方のみに接触させて固定するか、あるいはいずれか一方に固定して、他方には接触するだけにしておくことが好ましい。
【００２１】
本発明のろ過装置は、孔径１〜１０μｍのフィルター、該フィルターを収容すると共に該フィルターを通じて液体を通過させるハウジング、および該ハウジングに固定された加振手段を備えるものであれば、図１に示すものに限定されない。
例えば、ここではろ過装置として、第一フィルター２のろ過面２０が、導入口３１によってのみハウジング３の外部に開放されているものを示しているが、ハウジング３の形状はこれに限定されず、ハウジング３が漏斗状で、ろ過面２０と対向する方向にハウジング３の構成が存在しなくても良い。
また、導入口３１、排出口３３およびろ過室３２は、いずれも円筒形状以外の形状でも良く、これらの径方向断面が円形状以外の、例えば多角形状等、他の形状でも良い。
【００２２】
ろ過装置１は、第一フィルター２でろ過して得られたろ液を、直ちに孔径１μｍ未満の第二フィルターでろ過できるように、該第二フィルターを備えた捕集器と組み合わせて用いることが好ましい。
このように、ろ過装置１を捕集器と組み合わせた状態の正面図を図２に示す。
【００２３】
捕集器６の内表面には、第二フィルター６２を設置すると共に該第二フィルター６２によりろ過されたろ液を通過させるための流路（図示略）が形成された支持板６１の周縁部が密着して固定されている。支持板６１は、その第二フィルター６２設置面が、捕集器６の接地面と平行となるように配置することが好ましい。そして支持板６１は、例えば、捕集器６の内表面に接着剤等で固定すれば良い。
【００２４】
そして、第二フィルター６２は、その周縁部が捕集器６の内表面に密着するように、支持板６１上に載置されている。第二フィルター６２は、安定して支持板６１上に保持できるように、例えばその周縁部近傍に金属製のリングを配して、支持板６２との間に挟持されるようにしても良い。
【００２５】
このように捕集器６は、支持板６１によって、第一フィルター２によるろ過で得られたろ液の第二フィルター６２への流路となる導入区画６ａ、および第二フィルター６２によるろ過で得られたろ液を回収する回収区画６ｂとに区分されている。
そして、回収区画６ｂには、該区画内を捕集器６の外部へ開放する通気口６４が設けられている。該通気口６４は、円筒形状であり、吸引ポンプなどの減圧手段（図示略）と接続することで、回収区画６ｂ内を減圧することも可能なものである。
【００２６】
導入区画６ａの開口部６３は、前記ろ過装置１の排出口３３が挿入可能とされていれば、その形状およびサイズは特に限定されない。そして、ろ過装置１を安定させるために、前記開口部６３は、前記排出口３３が嵌合可能とされていることが好ましい。
【００２７】
支持板６１は、第二フィルター６２によりろ過されたろ液を集約して排出する排出管６１１を備えている。そして、支持板６１の材質は、ろ過に供する液体に対して安定なものであれば良く、ガラスや各種樹脂類などが挙げられる。
なお支持板６１としては、ここに示すものに限定されず、例えば、排出管６１１を備えたものでなくても良いし、ガラス製の多孔質板などを用いても良い。
【００２８】
捕集器６の材質も、前記支持板６１同様に、ろ過に供する液体に対して安定なものであれば良いが、第二フィルター６２のろ過面や、第一フィルター２によるろ過で得られたろ液、第二フィルター６２によるろ過で得られたろ液などの目視観察が容易であることから、透明なものが好ましい。
【００２９】
第二フィルター６２の孔径を１μｍ未満とすることで、第一フィルター２によって細胞が除去されたろ液中の微生物が、第二フィルター６１上にろ別され、捕集される。
第二フィルター６２の孔径は１μｍ未満の範囲で、検出対象である微生物の種類に応じて適宜選択し得る。
また、第二フィルター６２の材質は、ろ過に供する液体に対して安定なものであれば良く、前記第一フィルター２の材質と同様で良い。第二フィルター６２の厚みは特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択すれば良い。そして、第二フィルター６２として、市販のメンブランフィルターを使用しても良い。
【００３０】
捕集器６は、孔径１μｍ未満の第二フィルターを備えたものであれば、図２に示す形態以外のものも適宜使用し得る。
【００３１】
＜微生物検出方法＞
細胞と共存している液体試料中の微生物は、上記ろ過装置１を用いて、以下のようにして検出できる。
振動子４を作動させると、振動がハウジング３を介して第一フィルター２に伝達される。その結果、第一フィルター２はハウジング３に固定されているので、ハウジング３と一体となって振動する。このように第一フィルター２に振動を加えながら、ハウジング３の導入口３１より第一フィルター２上へ前記液体試料５０を導入すると、第一フィルター２を通じて液体試料５０がろ過される。この時、第一フィルター２の孔径は細胞よりもサイズが小さく、検出対象の微生物よりもサイズが大きいので、該フィルター上に細胞がろ別される。同時に第一フィルター２の孔径よりもサイズの大きいその他の異物もろ別される。そして、得られたろ液中に検出対象の微生物が含有されるので、このろ液を回収して、微生物の検出に供すれば良い。
【００３２】
第一フィルター２に加える振動の方向は、ろ過面２０に対して略垂直とする。このようにすることで、第一フィルター２の目詰まりが抑制される。
【００３３】
振動子４作動時の周波数は、０．１〜１００Ｈｚ、好ましくは１〜２０Ｈｚ、より好ましくは５〜１０Ｈｚとする。周波数を上記範囲とすることで、第一フィルター２の目詰まりが抑制される高い効果が得られる。ここで、周波数が１００Ｈｚを超えると細胞を痛める可能性があり、０．１Ｈｚ未満であると十分なろ過効果が得られない。
振動子４作動時の振幅は特に限定されないが、５ｍｍ以下が好ましい。このようにすることで、ろ過を一層効率良く行うことができる。
【００３４】
第一フィルター２で液体試料５０をろ過する時は、下部区画３２ｂの圧力を上部区画３２ａの圧力よりも小さくするための減圧操作を加えないことが好ましい。下部区画３２ｂの圧力を上部区画３２ａの圧力よりも小さくすると、上部区画３２ａに導入された液体試料５０のろ過がろ過開始直後は促進されるが、その後、細胞またはその構成成分が第一フィルター２を目詰まりさせることがある。
したがって、第一フィルター２による液体試料５０のろ過は、吸引ろ過や減圧ろ過ではなく、液体試料５０を第一フィルター２上へ導入するだけの自然ろ過で行うのが好ましい。
【００３５】
液体試料５０の温度は、液体試料５０の種類に応じて適宜選択すれば良いが、通常、細胞および微生物が破壊されないように、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０以下、特に好ましくは２０℃以下とする。温度の下限は、液体試料５０が凍結しなければ、いずれでも良い。
【００３６】
なお、第一フィルター２で液体試料５０をろ過する時は、第一フィルター２上へ前記液体試料５０を導入してから振動子４を作動させても良いが、第一フィルター２の目詰まりを抑制する効果が高いことから、上記のように振動子４を作動させてから第一フィルター２上へ前記液体試料５０を導入する方が好ましい。
【００３７】
第一フィルター２によるろ過で回収されたろ液は、そのまま微生物の検出に供しても良いし、例えば、濃縮など適宜適当な処理を行ってから微生物の検出に供しても良い。濃縮する場合には、過度な加温処理は微生物にとって好ましくなく、半透膜を用いた濃縮が好適である。
【００３８】
そして、第一フィルター２によるろ過で回収されたろ液は、さらに孔径１μｍ以下の第二フィルターでろ過することにより、検出対象の微生物を該第二フィルター上に回収することが特に好ましい。このようにすることで、検出対象の微生物を迅速に検出できる。
この場合、前記捕集器６を組み合わせて用いれば、第一フィルター２でろ過して得られたろ液を、直ちに第二フィルター６２でろ過でき、操作も簡便で好適である。
【００３９】
第二フィルター６２によるろ過が終了するまでの各工程においては、細胞や微生物の破壊を抑制することが好ましい。特に細胞が破壊されると、細胞の構成成分がろ過に用いるフィルター、特に第二フィルター６２を目詰まりさせて、ろ過詰まり等の工程トラブルを生じることがある。細胞や微生物の破壊を抑制するためには、例えば、これらを含有する液体試料に１ｋＨｚを超えるような高い周波数の振動を加えたり、５０℃を超えるような高温に該液体試料を加熱したりしなければ良い。
【００４０】
上記のようにして回収されたろ液中の微生物や、ろ紙上に捕集された微生物は、顕微鏡等を用いて公知の手法で容易に検出できる。
【００４１】
本発明の微生物検出方法によれば、第一フィルターの孔径と、第一フィルターに加える振動の方向および周波数を上記のように選択することで、細胞を破壊せずにろ過詰まり等の工程トラブルを伴うことなく液体試料から簡便に除去できる。同時に、細胞と同等以上のサイズのものも簡便に除去できる。このように、顕微鏡等を用いて微生物を直接検出する際の障害となる混入物を簡便に除去できるので、このような混入物が混在した試料でも、微生物の培養を行うことなく直接検出に供することができ、簡便且つ迅速に微生物を検出できる。本発明の微生物検出方法は、特に動物細胞が混入した試料に好適である。
【実施例】
【００４２】
以下、具体的な実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
[実施例]
図２に示すろ過装置および捕集器を用いて、微生物の検出を行った。検出に供した液体試料は、細胞として動物細胞を含有するものであった。また、ポリプロピレン製のハウジングに、第一フィルターとして、セルロース混合エステル製の、直径４．７ｃｍ、厚み１６０μｍ、孔径５μｍのものが収容されたろ過装置を用い、第二フィルターとして、直径２．５ｃｍ、厚み１０μｍ、孔径０．２μｍのポリカーボネートメンブランフィルターが設置された捕集器を用いた。そして、振動子を第一フィルターのろ過面に対して略垂直方向に８Ｈｚで振動させて前記第一フィルターに振動を加えながら、前記液体試料を該第一フィルター上に導入し、ろ過を行った。次いで、得られたろ液を直ちに、捕集器に備えた第二フィルターでろ過した。
その結果、１０ｍｌの前記液体試料を３４秒間でろ過でき、第二フィルター上に顕微鏡で微生物を検出できた。
【００４３】
［比較例］
振動子を備えていないろ過装置を用いたこと以外は、上記実施例と同様にろ過を行ったところ、液体試料のろ過に５２秒間を要し、目詰まりの影響により、振動を加えた場合よりもろ過速度が遅くなった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、製造設備等の微生物汚染の検証に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明に係るろ過装置を例示する概略構成図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線における縦断面図である。
【図２】本発明に係るろ過装置の、微生物を捕集するための捕集器と組み合わせた状態を示す正面図である。
【符号の説明】
【００４６】
１・・・ろ過装置、２・・・第一フィルター、２０・・・ろ過面、３・・・ハウジング、３２・・・ろ過室、３２ａ・・・上部区画、３２ｂ・・・下部区画、４・・・振動子、６・・・捕集器、６１・・・第二フィルター、５０・・・液体試料
【図１】
2009118780.tif 000003
【図２】
2009118780.tif 000004