(57)【要約】【課題】一つのプレートで生体サンプルを自動でＰＣＲすることができる装置で、このＰＣＲ産物の増幅の有無を連続して測定できるＰＣＲ反応から電気泳動による確認までを自動化するためにふさわしい構成を持つプレートを工夫したＰＣＲ一体型プレート方式ＰＣＲ装置を提供する。【解決手段】回転するための回転孔と、測定すべき生体サンプルを収納するための注入チャンバと、前記注入チャンバの前記生体サンプルをＰＣＲ増幅するＰＣＲ増幅部と、前記ＰＣＲ増幅部により増幅されたＰＣＲ産物を連続して分析でする分析部を備えた生体分析プレート。【選択図】図２
2009153422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
回転するための回転孔と、
測定すべき生体サンプルを収納するための注入チャンバと、
前記注入チャンバの前記生体サンプルをＰＣＲ増幅するＰＣＲ増幅部と、
前記ＰＣＲ増幅部により増幅されたＰＣＲ産物を連続して分析でする分析部を備えた生体分析プレート。
【請求項２】
前記生体サンプルは、ＤＮＡまたはＲＮＡである請求項１に記載の生体分析プレート。
【請求項３】
前記ＰＣＲ増幅部は、注入流路を介して前記注入チャンバと接続されたＰＣＲチャンバと
前記ＰＣＲチャンバにてＰＣＲ増幅されたＰＣＲ産物を前記分析部に送るための送液流路とからなり、
前記ＰＣＲチャンバの底部は前記注入流路よりも深い請求項１に記載の生体分析プレート。
【請求項４】
前記送液流路は、前記ＰＣＲチャンバの底部に設けられている請求項３に記載の生体分析プレート。
【請求項５】
前記ＰＣＲチャンバは、その内部に前記生体サンプルをＰＣＲ増幅するための試薬とワックス塊とが予め設置されている請求項３に記載の生体分析プレート。
【請求項６】
前記ワックス塊は、前記ＰＣＲチャンバの前記プレート回転面に垂直な断面の表面を全て覆う量である請求項５に記載の生体分析プレート。
【請求項７】
前記ワックスの比重は、１より小さい請求項５に記載の生体分析プレート。
【請求項８】
前記ワックスの融点は、前記酵素の反応温度よりも低く、室温（２５℃)よりも高い請求項５に記載の生体分析プレート。
【請求項９】
前記ワックスの沸点は、前記生体サンプルを含む溶液の沸点よりも高い請求項５に記載の生体分析プレート。
【請求項１０】
前記分析部は、前記送液流路に接続されたＰＣＲ産物を定量するための定量部と、
電気泳動に必要な緩衝液を入れるための緩衝液注入部と、
前記定量部で定量されたＰＣＲ産物を電気泳動するための電気泳動流路と、
前記緩衝液注入部と前記電気泳動流路とを接続するための接続流路と、
前記電気泳動流路に設けられた正負一対の電極を持つ、請求項３に記載の生体分析プレート。
【請求項１１】
請求項１に記載の生体分析プレートと、
前記生体分析プレートを回転させるためのモータと、
前記生体分析プレートを加熱するための加熱部と、
前記生体分析プレートの前記ＰＣＲ増幅部で前記生体サンプルをＰＣＲ増幅する際に
前記モータを所定の回転数で回転するとともに前記加熱部に所定の温度パターンで
温度を発生するように指示を行う制御部と、
を備えた生体サンプル分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡの増幅と分析を行う技術に関する。より詳細には、ＤＮＡ増幅から分析までの一連の工程を自動化した技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な疾患に関与する遺伝子の存在が明らかになり、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されてきており、遺伝子の利用技術が拡大している。
遺伝子を利用するために核酸増幅技術が広く普及している。この技術は一般的にＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ)がとして知られており、今日では、ＰＣＲは、生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲを行うためには３つの温度制御をする必要がある。二本鎖のＤＮＡを一本鎖へと解離させる工程（熱変性）、一本鎖に解離したＤＮＡに増幅したい部分の両端の配列と相補的な配列を有したプライマーを結合させる工程(アニーリング) 、プライマーが結合した配列からＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ鎖を伸長させる工程(伸長反応) である。熱変性では９５℃で１分間温度をかけることによって、ＤＮＡを一本鎖の状態にする。アニーリングの工程では５０〜６０℃で３０秒間反応させることにより、増幅したい領域の末端部分にプライマーと呼ばれる２０塩基程度の短いＤＮＡを結合させる。伸長反応は７２℃の温度でポリメラーゼを鋳型に付加し、ＤＮＡ鎖の伸長を行う。通常、ポリメラーゼの伸長時間は１ｋｂｐ/分と考えられている。これらの温度サイクルを２５〜４０回行うことで、サイクル数に応じて理論的には２の２５乗から２の４０乗増幅できる。実質的には目的の領域を１０の６乗倍に増幅している。
【０００４】
ＰＣＲを行うための調整試薬は増幅するためのポリメラーゼ、ポリメラーゼが最適な環境で働くためのｐＨや塩濃度を調整したバッファ、ｄＮＴＰ、両末端のプライマー、鋳型、トータルボリュームを調整する滅菌水で構成される。これらの試薬のうち、ポリメラーゼ、バッファ、ｄＮＴＰ、滅菌水はどのようなＤＮＡ断片を得たい場合でも共通の試薬であるが、両末端のプライマーと鋳型は増幅したい領域に合わせて用意する必要がある。また、ポリメラーゼは活性を失わないよう細心の注意が必要であり、普段はマイナス２０℃で保存されていて、ＰＣＲを行なう段階でその都度調整する必要があった。
【０００５】
そのため、ＰＣＲを簡便に行う技術の開発が望まれていた。そこで、ＰＣＲの簡略化のためには、（１）温度工程の簡素化及び反応時間の短縮化と（２）酵素の粉体化技術の開発が必要となる。まず、温度工程の簡素化及び反応時間の短縮化については、７２℃で反応するポリメラーゼ（酵素）を改良し、６６℃の低温で反応ができるようになった。この酵素の開発によって、プライマーのアニール温度と伸長反応を同じ温度設定で行うことができ、温度工程を一つ減らすことが可能になった。次の課題である、乾燥状態でも失活しない酵素も開発がなされたため、従来、反応前の最終段階で調整しなければいけなかった酵素の添加をあらかじめ混ぜて用意しておくことができるようになった。
【０００６】
さらなる簡便化のためには、一連のＰＣＲ工程を自動化することである。そのために、マイクロタス技術の利用がなされた。マイクロタス技術とは、数百マイクロメートル（１００万分の１メートル）の微小な流路（空間）を化学反応に活用する技術のことである。マイクロタス技術を利用した従来の小型の生体サンプルプレートは、サンプルを注入する注入部とサンプルからＤＮＡを抽出する抽出チャンバとＰＣＲ反応を行うＰＣＲチャンバを備えたプレートを持ち、このプレート上でＰＣＲ増幅を自動で行うように構成されている。
【０００７】
このプレートは、加熱機構と回転機構を併せ持ち、サンプルの移動は回転と毛細管現象を利用して移送している。抽出チャンバやＰＣＲチャンバなどの化学反応や酵素反応を行うチャンバは微小流路によって連結されており、各反応をチップ上でシステマチックに構築することを可能にしている。これらのチャンバをつなぐ流路には、弁が存在し、溶液の移動を制御できる構成になっている。具体的には弁はワックスという固体物質であり、ワックスは熱により融解し、溶液になる。抽出チャンバに入った細胞はアルカリ細胞溶解液で溶解され、ある回転をかけることによって抽出チャンバで抽出されたＤＮＡが流れて増幅反応チャンバに移動する。この増幅反応チャンバでは中和用の緩衝液が加えられた後、ＰＣＲに必要なｄＮＴＰや塩、緩衝液、酵素と適量の溶出したＤＮＡを含む増幅溶液が加えられ、二本鎖ＤＮＡを変性するのに充分な温度と時間をかけて保持し、ＰＣＲの熱サイクルを行う（例えば、特許文献１参照。)。
【特許文献１】特表２００３−５０２６５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前記従来の構成では、生体サンプル中の測定すべきＤＮＡを一つのプレートで自動ＰＣＲ増幅することはできるが、このＰＣＲ産物を測定するためには、別の測定装置を必要とする。生体サンプルの自動測定には、一つのプレートでＰＣＲから測定まで行なう必要があるが、従来の技術では、同一のプレート上でＰＣＲを行ない連続して測定することができないという課題を有していた。
【０００９】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、生体サンプル中の測定すべきＤＮＡを自動で増幅した後、この増幅されたＤＮＡ産物を連続して分析できる生体サンプル分析装置を提供する事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記従来の課題を解決するために、本発明の生体サンプルプレート及びそれを用いた生体サンプル分析装置は、回転するための回転孔と、測定すべき生体サンプルを収納するための注入チャンバと、前記注入チャンバの前記生体サンプルをＰＣＲ増幅するＰＣＲ増幅部と、前記ＰＣＲ増幅部により増幅されたＰＣＲ産物を連続して分析でする分析部を備えた生体分析プレートを備えたことを特徴としたものである。
【００１１】
さらに、本発明の生体サンプルプレート及びそれを用いた生体サンプル分析装置は、請求項１に記載の生体分析プレートと、前記生体分析プレートを回転させるためのモータと、
前記生体分析プレートを加熱するための加熱部と、前記生体分析プレートの前記ＰＣＲ増幅部で前記生体サンプルをＰＣＲ増幅する際に前記モータを所定の回転数で回転するとともに前記加熱部に所定の温度パターンで温度を発生するように指示を行う制御部と、を備えたことを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の生体サンプルプレート及びそれを用いた生体サンプル分析装置によれば、一つのプレートでＰＣＲの増幅から電気泳動による測定までの一連の工程を行うことができる。このように一つのプレートでＰＣＲ増幅からＰＣＲ産物の分析を人の手を借りずに行うことができるので、迅速な生体サンプルの分析ができる。また、ＰＣＲ産物を連続して分析するので、ＰＣＲ産物への異物の混入を防ぐ事ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に、本発明の生体サンプルプレート及びそれを用いた生体サンプル分析装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１４】
（実施の形態１）
図１に、本発明の生体サンプルプレート２００の構成図を示す。生体サンプルプレート２００は、アクリル系の樹脂を使用したプレートとその上に接着された熱耐性の粘着フィルム２２０とから構成されている。生体サンプルプレート２００には独立して同一の流路ユニット２３０が複数存在している。
【００１５】
図２は、図１で説明したプレート２００の一つの流路ユニット２３０の拡大図である。この図２、図３、図４を用いて本発明のプレートの構成と反応のために必要な試薬について説明する。
【００１６】
本発明の生体サンプルプレート２００はＰＣＲ増幅を行うためのＰＣＲユニット２３１と電気泳動を行うための電気泳動ユニット２３２とから構成される。まず、ＰＣＲユニット２３１について説明する。ＰＣＲユニット２３１には、サンプル注入口２１１を設けた注入チャンバ２０１が設けられている。このサンプル注入口２１１から、ＰＣＲを行うために必要な鋳型１０１と、プライマーＦ１０２とプライマーＲ１０３と水とを加える。注入チャンバ２０１からは、流路２０３を介してＰＣＲチャンバ２０２が接続されている。
【００１７】
ＰＣＲチャンバ２０２には、ＰＣＲを行うために必要な共通試薬である酵素１０４とｄＮＴＰ１０５及びＰＣＲバッファ１０６があらかじめ入れてある。これらの酵素１０４とｄＮＴＰ１０５とＰＣＲバッファ１０６は、サンプル注入口２１１から入れて調整したのでも良い。あるいは、ＰＣＲ反応を行うために共通の試薬類はあらかじめ生体サンプルプレート２００に入れておいてもよい。あらかじめ生体サンプルプレート２００に入れておく場合は、乾燥タイプのＰＣＲ試薬をＰＣＲチャンバに入れた後、粘着シール２２０で接着するとよい。また、ＰＣＲチャンバ２０２には、ＰＣＲ反応中に熱による溶液の蒸発を防ぐためにワックス１１０を入れておく。このワックス１１０はＰＣＲ反応中、溶液の蓋をする役割を果たし、ＰＣＲ試薬が蒸発するのを防ぐ。
【００１８】
サンプル注入口２１１から入れた鋳型１０１とプライマーＦ１０２とプライマーＲ１０３は、プレートを回転させると流路２０３を通ってＰＣＲチャンバ２０２で酵素１０４、ｄＮＴＰ１０５、ＰＣＲバッファ１０６と混合される。鋳型１０１とプライマーF１０２とプライマーR１０３と酵素１０４とｄNTP１０５とPCRバッファ１０６との関係を図３に示す。
【００１９】
次に、電気泳動ユニット２３２について説明する。電気泳動ユニット２３２には、ポリマー注入口２１２を設けたポリマー注入チャンバ２１３が設けられている。電気泳動時に必要となる分子篩効果を持つポリマー１２０と、二本鎖ＤＮＡを標識するためのインターカレーター１２１とをこのポリマー注入チャンバ２１３に入れる。これらの状態を図4に示す。なお、プライマーＦ１０２かプライマーＲ１０３のどちらかを標識する場合は、インターカレーター１２１は不要である。
【００２０】
さて、生体サンプルプレート２００を回転させるとポリマー１２０は流路２１５を通って、電極チャンバのプラス極２０８とマイナス極２０９(以下、合わせて電極チャンバ２１０と呼ぶ。) に到達し、これらの電極チャンバにそれぞれ接続された電気泳動流路２０６と流路２１７を伝い、測定すべきサンプルを一定量保持するための定量部２０４で合流する。この時、定量部２０４と電極チャンバ２１０の液面の高さが同じ高さになる。もしポリマーの量が少なすぎると、定量部をポリマーが満たすことが出来ず、電流が流れない。逆にポリマーが多すぎる場合は、チャンバ２１４にポリマーが流れて、電極チャンバの液面の高さは一定に保たれるので、ポリマーの量はある程度余裕を持った構成になっている。ＰＣＲ反応後に、ＰＣＲ産物はＰＣＲチャンバ２０２からのびる流路２０５を通って、サンプル定量部２０４へ移送される。余分なＰＣＲ産物は廃棄チャンバ２０７に廃棄される。流路２１６はそれぞれ液の移送時に空気の逃げ道として必要とされる流路である。電極チャンバ２１０に電圧を印加すると、サンプル定量部２０４で定量されたＰＣＲ産物は、電気泳動流路２０６を電気泳動するのでサンプルの分析を行うことが出来る。
【００２１】
図５に、本発明の生体サンプルプレート２００を用いた生体サンプル分析装置の構成図を示す。本発明の生体サンプル分析装置は、ＰＣＲ増幅中に生体サンプルプレート２００を回転させるための遠心ブロックと、ＰＣＲ反応を行うためのＰＣＲブロックと、ＰＣＲ産物を電気泳動するための電気泳動ブロックと、電気泳動中のＰＣＲ反応液１７０を検出する検出ブロックとで構成される。これらの機能ブロックの実行と停止をシステム制御部３７０により指令することで、PＣＲ増幅からＰＣＲ産物の分析を自動で行う。
【００２２】
遠心ブロックは、生体サンプルプレート２００を載置するためのプレートトレイ３１１と、プレートトレイ３１１を回転させるためのモータ３１２と、モータ３１２を駆動するためのモータ駆動回路３１３と、回転制御回路３１４とから構成される。プレートトレイ３１１とモータ３１２とは、シャフト３１５を介して接続されている。回転制御回路３１４は、モータ駆動回路３１３に対してモータ３１２の起動及び停止を指示し、起動の際には回転数の指示を行なう。システム制御部３７０が、回転制御回路３１４にモータ３１２の回転数と回転時間を指示すると、回転制御回路３１４は、与えられた指令に従いモータ３１２の回転制御を行なう。
【００２３】
ＰＣＲブロックは、生体サンプルプレート２００を内部に含むＰＣＲボックス３２０を持つ。ＰＣＲボックス３２０は、図示しない開閉機構により生体サンプルプレート２００をプレートトレイ３１１に載置出来るように構成されている。ＰＣＲボックス３２０内の温度を上げるためのヒーター３２１と、加熱時にはヒーター３２１で発生した熱をＰＣＲボックス３２０循環させためのファン３２２が取り付けられている。ファン３２２はファン駆動回路３２３で駆動されており、ＰＣＲ温度制御部３２４は、ファン駆動回路３２３へファン３２２の回転開始及び停止の指令を行なう。高温制御部３２５は、ヒーター３２１の近傍に取り付けられた温度センサー３２６をモニターして９８℃を越えないようにヒーター３２１とファン駆動回路３２３とを制御する。ＰＣＲボックス３２０にはペルチェ素子を用いた冷却部３２７が取り付けられており、ＰＣＲボックス３２０の内部に取り付けられた温度センサー３２８を低温制御部３２９がモニターすることで冷却部３２７を制御し、ＰＣＲボックス３２０内の温度が６８℃の一定になるような低温制御を行なう。ＰＣＲ増幅を行なう時の高温から低温へ、低温から高温へのプロセス管理は、ＰＣＲ温度制御部３２４が行い、それぞれの期間に応じた指令を高温制御部３２５と低温制御部３２９に対して行う。
【００２４】
電気泳動ブロックは、生体サンプルプレート２００の電極チャンバ２１０上に設けられた電極端子に接触するための電極ピン３３０を持つ電極プレート３３１が、プレートトレイ３０１の直上に配置されている。電極プレート３３１と生体サンプルプレート２００とは、図示しない位置合わせ機構により、電極ピン３３０が生体サンプルプレート２００の電極端子に接触できるように構成されている。電極プレート３３１は、電極プレート上下駆動機構３３２に接続されており、電極プレート上下駆動機構３３２は、プレート上下駆動部３３３により上下に駆動される。電圧制御回路３３５は、電気泳動時に電極ピン３１０に所定の電圧を印加する。これらプレート上下駆動部３３３と電圧制御回路３３５とは電気泳動制御部３３４に接続されている。電気泳動制御部３３４は、電気泳動時には電極プレート３３１を生体サンプルプレート２００の電極端子に接触する位置まで下降させて電極ピン３１０に所定の電圧を印加し、それ以外の時には生体サンプルプレート２００と接触しない位置まで電極プレート３３１を上昇させるようにプレート上下駆動部３３３と電圧制御回路３３５に指令する。
【００２５】
検出ブロックは、蛍光標識されたサンプルの標識剤を励起するためのレーザー３４１と、コリメータ３４２と励起光以外の波長をカットする励起フィルタ３４３と、励起光を反射しサンプルからの蛍光を透過するするダイクロイックミラー３４４と、生体サンプルプレート２００の電気泳動流路に励起光を照射するための対物レンズ３４５からなる投射光学系を持つ。また、サンプルからの蛍光のみを透過する蛍光フィルタ３４５、集光レンズ３４６、スリット３４７及び光検出器３４８とからなる検出光学系を持つ。電気泳動流路を流れるサンプルの標識剤から発せられた蛍光は、対物レンズ３４５を介してダイクロイックミラー３４４を通過し、蛍光フィルタ３４５により蛍光領域の光のみ選択される。選択された蛍光は、集光レンズ３４６とスリット３４７により光検出器３４８に集光されサンプルの蛍光量が測定できる。
【００２６】
以上説明した本発明の生体サンプルプレートと生体サンプル分析装置を用いて、サンプルのＤＮＡの自動分析についての具体的な実施の形態について詳細に説明する。
【００２７】
本発明の実施の形態１で用いる鋳型１０１は、植物、動物、または人の細胞や血液等から抽出したＤＮＡを使用する。プライマーＦ１０２とプライマーＲ１０３は鋳型１０１の中で増幅したい領域の末端の配列を持った配列を選定する。例えば、ＰＣＲ増幅をｃ−ｋ−ｒａｓＰＣＲの増幅はＴＩＴＡＮＩＵＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて増幅した。鋳型１０１はｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。フォワード側のプライマーＦ１０２は蛍光色素、ここではＣｙ５で標識した、５’−（Ｃｙ５）−ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ−３‘を、リバース側のプライマーＲ１０３は５’−ＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣ−３‘を、それぞれ終濃度５００ｎＭになるように加えた。その他のＰＣＲ反応液の組成（酵素１０４、ｄＮＴＰ１０５、ＰＣＲバッファ１０６）はＴＩＴＡＮＩＵＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）にかかれてあるとおりの要領で使用した。この条件で調整されたＰＣＲ溶液をＰＣＲ反応液１７０とする。
【００２８】
電気泳動流路に充填するためのポリマー１２０は分子篩効果を持つものなら何でも良く、例えば、アクリルアミドポリマーやＰＥＧ、デキストラン、セルロースなどが挙げられる。ＰＥＧ（分子量５０万）を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．４）で３．５％になるように希釈し、一晩静置した後、０．４５μｍ以下のフィルタでろ過したものを使用する。
【００２９】
本発明で説明したインターカレーターは、ＤＮＡの二本鎖に入り込み蛍光を発する標識剤のことを言う。例えば、エチジウムブロマイドやＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮなどがある。インターカレーター１２１はプライマーＦ１０２またはプライマーＲ１０３のどちらかに蛍光物質等の標識剤を標識している場合は入れる必要はない。
【００３０】
ワックス１１０は体温よりも高く、酵素反応温度よりも低い温度で融解する性質を持っていれば良い。ワックスが体温以下で融解すると、ＰＣＲ反応液の調整段階でワックスが液体になってしまうので、ＰＣＲチャンバ２０２にあらかじめ入れられてある酵素１０３を溶かしてしまい、酵素を失活してしまう恐れがあり、適切でない。またワックスの融点が酵素反応温度よりも高いと、ＰＣＲ反応を行うより高い温度をかける必要があり、酵素を変性する恐れがあり、適切でない。
【００３１】
ワックスは回転中に温度をかけて融解したものをＰＣＲ反応液の蓋をするために使用するものであるので、ＰＣＲ反応段階でワックスが固形状態で存在することは好ましくない。また、ワックスの沸点は１００℃以上がよい。なぜならワックスの沸点が１００℃より低い温度ならば、ＰＣＲを行うときの反応サイクルでワックスが蒸発してしまい、ＰＣＲ反応液の蒸発を防ぐ蓋の役割を果たせないので好ましくない。また水より比重が軽い性質でなければならない。なぜなら、ワックスの比重が水より重いと、回転により遠心力がかかった場合にワックスが水より中心方向に対して外側の壁面に存在することになり、ＰＣＲ反応液の蒸発を防ぐ役割を果たすことができないので好ましくない。以上の条件を満たすワックスであれば何でもよい。今回はＡｍｐｌｉＷａｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
【００３２】
ＰＣＲチャンバにおいて行われるＤＮＡの増幅から電気泳動による分析までの一連の動きについて図６から図８を用いて説明する。
【００３３】
まず、鋳型１０１とプライマーＦ１０２とプライマーＲ１０３を用意し、プライマーＦ１０２とプライマーＲ１０３と鋳型１０１とを最終濃度が一定になるように水を加えたものを注入チャンバ２０１に入れる。ＰＣＲチャンバ２０２にあらかじめ加えてある酵素１０４、ｄＮＴＰ１０５、ＰＣＲバッファ１０６は鋳型１０１とプライマーＦ１０２とプライマーＲ１０３と水を注入チャンバ２０１に加えるときに一緒に加えたのでもよい。ワックス１１０も後から加えても良いが、融解した液体の状態でピペット操作をすることは困難なのであらかじめプレートに入れておいた方が適切である。ワックス１１０を後から入れる場合、注入チャンバ２０１のサンプル注入口２１１が固形のワックス１１０より大きな径にする必要があるので、ワックス１１０はあらかじめ入れておいたほうが適切である。分子ふるい効果を持つポリマー１２０とインターカレーター１２１はポリマー注入口２１２に入れる。
【００３４】
プレート２００を回転し、鋳型１０１プライマーＦ１０２とプライマーＲ１０３と水とを遠心力で注入チャンバ２０１とＰＣＲチャンバ２０２をつなぐ流路２０３を通ってＰＣＲチャンバ２０２へ移動させる。本実施例では、縦横１０ｃｍのプレートを３０００ｒｐｍで回転させた。
【００３５】
ＰＣＲチャンバ２０２へ移動させた後、７５℃で温度制御しながら回転を続け、ワックス１１０を溶かす。溶けたワックスが中心方向に、ＰＣＲ反応試薬が外側に２層を形成するのに必要な時間をかけて行なう。本実施例では、５分程度３０００ｒｐｍで遠心を行なった。このときの温度範囲は、７５℃から８０℃が好適である。ＰＣＲチャンバ２０２で熱せられたワックス１１０は液体状態になり、さらに水より比重の軽いワックス１１０はＰＣＲ反応液１７０より内側（中心方向）にきて、図６の状態になる。この状態のＰＣＲチャンバの断面図は図７のようになっている。
【００３６】
次にＰＣＲ増幅を行なう。ＰＣＲ反応液１７０をワックス１１０により蓋をした状態で、そのままＰＣＲ反応サイクルに移行し、９５℃と６８℃の温度サイクルを２５回から４０回繰り返すことによって反応液はチャンバ内で移動することなくそして蒸発することなく、反応を行うことができる。
【００３７】
得られたＰＣＲ反応液１７０は温度が高いままで、回転を止め、プレート２００を静止状態にした後、温調を止める。このとき、図８に示すようにＰＣＲ反応液１７０はチャンバの底側にワックスは上側に層を形成し、温度の下降とともにワックスは固まる。このとき、室温でワックスを固めてもよいし、冷却部を備えた温調ユニットがあれば、冷やしながら固めたのでもよい。
【００３８】
図６の状態からＰＣＲ反応液１７０が定量部２０４へ移送される動作について説明する。
プレート２００の回転を停止して、温度が十分に冷えてワックス１１０が固まった状態から（図８）、再びプレートを回転させる。ＰＣＲ反応液１７０は流路２０５を通って定量部２０４に到達し、残りのＰＣＲ反応液は廃棄チャンバ２０７に流れて、ＰＣＲ反応液の一部が定量部２０４に保持される状態となる。ＰＣＲチャンバと定量部をつなぐ流路２０５はＰＣＲチャンバの底部に設けられていて、ＰＣＲ反応液のみが流路２０５を通って定量部へ移送できるようになっている。さらに流路２０５はＰＣＲチャンバ２０２の中心方向側から流路が伸びているためＰＣＲ反応液全てではなく一部だけを取り出すことができる。
【００３９】
そして定量部が満たされた後の残りのＰＣＲ反応液は廃棄チャンバへ移動し、必要な分量だけを定量部で保持することができる。このように２段階にＰＣＲ反応液を減らしていくことによって微小流路で過剰になりがちな溶液量の微妙な調整ができる工程になっている。
ＰＣＲ反応液１７０を定量部２０４に保持した後、電圧印加部２１０に電圧を印加する。定量部２０４に移送されたＰＣＲ反応液１７０が電気泳動流路２０６を通ってマイナス極２０９からプラス極２０８に向かって泳動される。電気泳動されたＰＣＲ反応液１７０を電気泳動流路２０６を検出ユニットでスキャンすることによってＤＮＡを検出し、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅の有無を電気泳動で確認する。
【００４０】
一般に、ＰＣＲ産物を電気泳動して、そのＰＣＲ産物が目的の産物であるかどうかを分子量で確認するために、内部標準物質として適当な濃度に調整した標準試料と既知の分子量のＤＮＡ断片を含むマーカーＤＮＡを同時に電気泳動する必要がある。ＰＣＲ産物とマーカーＤＮＡを同一流路で測定する場合、ＰＣＲ産物とマーカーＤＮＡの標識剤は異なるものである方がよい。たとえばＰＣＲ産物をＣｙ５で標識し、マーカーＤＮＡをＦＡＭで標識している場合、６３５ｎｍの光を当てて、Ｃｙ５標識ＰＣＲ産物を励起し、６５０ｎｍの蛍光をディテクターで検出することにより、ＰＣＲ産物を検出する。同じ流路を４９５ｎｍの光を当てて、マーカーＤＮＡを励起し、５１２ｎｍの蛍光をディテクターで検出することにより、マーカーＤＮＡを検出し、それぞれのデータを重ね合わせることで、移動度と分子量の関係より、目的の断片の分子量を測定することが出来る。また蛍光量を計算することで、濃度も計算できる。このように同一流路で複数標識のサンプルを測定する場合、装置の仕様としては多色の検出系が必要となる。しかし、流路間のバラツキを考慮する必要がなく、正確で直接的な分子量を測定することが出来る。この場合、内部標準物質は入れなくてもよい。
【００４１】
また、検出系がひとつでＰＣＲ産物やマーカーＤＮＡといったＤＮＡの標識剤が一つである場合は、ＰＣＲ産物とマーカーＤＮＡを電気泳動する流路は変える必要がある。また、ＰＣＲ産物は内部標準物質と一緒に電気泳動し、マーカーＤＮＡと内部標準物質の移動速度を比較することで流路間のバラツキを考慮する必要がある。内部標準物質を含むＰＣＲ産物とマーカーＤＮＡの移動度からＰＣＲ産物の分子量を計算することが出来る。
【００４２】
本実施の形態で実験したＰＣＲ産物の電気泳動結果を図９に示す。同一検出系でＰＣＲ産物と内部標準物質を電気泳動した。縦軸に蛍光強度、横軸に時間(秒)を示している。時間の早い方から、分子量の小さい内部標準物質(１０ｂｐ)、プライマー（２０ｍｅｒ）、ＰＣＲ産物（６０ｂｐ）、内部標準物質(２００ｂｐ)の順にピークが検出されている。今回増幅するＰＣＲ産物の長さは６０ｂｐであり、これは検出されたピークが示す長さと一致しており、本実施の形態でＰＣＲが行えたことを示唆している。
【００４３】
ＰＣＲからＰＣＲ産物の確認までを自動で行う本発明は、工程数に応じてチャンバの数を多くし、ワックスによって溶液の流れを制御できることから、ＤＮＡ抽出等の前処理にも応用展開が可能である。
【００４４】
さらに、ＤＮＡの標識のために、従来用いられているエチジウムブロマイドなどの発がん性物質でＤＮＡを電気泳動したゲルを染色する必要がないので、使用者が取り扱い時に汚染されることがない。また、自動化することで、人的操作ミスを減らすことが出来、測定誤差がの低減が図れる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明にかかる生体サンプルプレート及びそれを用いた生体サンプル分析装置は、DNAが含まれた生体サンプルを分析プレートに注入するだけで自動的にＤＮＡ増幅して正確にＤＮＡ分析を行うことが出来るので、ＤＮＡ分析を行う生体分析装置に有用である。また、正確さと簡便さを合わせ持つことから、特に野外で用いる医療用検査装置としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の生体分析プレート示す全体図
【図２】本発明の流路ユニットの詳細を示す図
【図３】本発明のＰＣＲ反応液の組成を示す図
【図４】本発明のＤＮＡとポリマーとインターカレーターの状態を表す図
【図５】本発明の生体分析装置を示す概略図
【図６】本発明のＰＣＲチャンバ２０２のＰＣＲ反応時の溶液の状態を表す図
【図７】本発明のＰＣＲ反応時のＰＣＲチャンバ２０２の断面図
【図８】本発明のＰＣＲ反応後の次の工程に移る前のＰＣＲチャンバ２０２の断面図
【図９】本発明のＰＣＲ産物と内部標準物質を電気泳動したグラフ
【符号の説明】
【００４７】
１０１  鋳型
１０２  プライマーＦ
１０３  プライマーＲ
１０４  酵素
１０５  ｄＮＴＰ
１０６  ＰＣＲバッファ
１１０  ワックス
１２０  ポリマー
１２１  インターカレーター
１５１  レーザー
１５２  励起フィルタ
１５３  ダイクロイックミラー
１５４  蛍光フィルタ
１５５  スリット
１５６  ディテクター
１７０  ＰＣＲ反応液
２００  プレート
２０１  注入チャンバ
２０２  ＰＣＲチャンバ
２０３  流路
２０４  定量部
２０５  流路
２０６  電気泳動流路
２０７  廃棄チャンバ
２０８  プラス極
２０９  マイナス極
２１０  電極チャンバ
２１１  サンプル注入口
２１２  ポリマー注入口
２１３  ポリマー注入チャンバ
２１４  チャンバ
２１５  流路
２１６  流路
２１７  流路
２２０  粘着シール
２３０  流路ユニット
２３１  ＰＣＲユニット
２３２  電気泳動ユニット
３１１  プレートトレイ
３１２  モータ
３１４  回転制御回路
３１５  シャフト
３２０  ＰＣＲボックス
３２１  ヒーター
３２２  ファン
３２３  ファン駆動回路
３２４  ＰＣＲ温度制御部
３２５  高温制御部
３２６  温度センサー
３２７  冷却部
３２８  温度センサー
３２９  低温制御部
３３０  電極ピン
３３１  電極プレート
３３２  電極プレート上下駆動機構
３３３  プレート上下駆動部
３３４  電気泳動制御部
３３５  電圧制御回路
３７０  システム制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年11月13日(2008.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009153422000001.app