(57)【要約】【課題】  イヌに対する投与に適したＩＬ−１阻害活性を有するポリペプチド、およびその効率的な製造方法を提供する。【解決手段】  成熟型イヌＩＬ−１ｒａのアミノ酸配列と９８％以上の相同性を有し且つＮ末端がメチオニンであるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換された大腸菌を２５℃〜３４℃の温度域で培養し、その培養菌体から、成熟型イヌＩＬ−１ｒａのアミノ酸配列と９８％以上の相同性を有し且つＮ末端がメチオニンであるアミノ酸配列からなるＩＬ−１受容体に対する結合活性を有するポリペプチドを採取する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し且つアミノ末端がメチオニンであるアミノ酸配列からなり、ＩＬ−１受容体に対する結合活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列中の０から３個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換して得られるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法であって、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法：
（ａ）配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し且つアミノ末端がメチオニンであるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、大腸菌で機能するプロモーター、およびＳＤ配列を作動可能な状態で連結してなるＤＮＡを作製する工程、
（ｂ）当該ＤＮＡを大腸菌で機能するベクターに連結する工程、
（ｃ）当該組換えベクターで大腸菌を形質転換する工程、
（ｄ）当該形質転換大腸菌を２５℃以上３４℃以下の温度で培養する工程、
（ｅ）当該形質転換大腸菌細胞内に蓄積したＩＬ−１受容体に対する結合活性を有する蛋白質を採取する工程。
【請求項５】
大腸菌で機能するプロモーターが、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｍｂｄａプロモーター、Ｔ７プロモーターの群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１から３に記載のポリペプチドを有効成分として含む、ヒト以外の動物用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１受容体に対する結合活性を有するポリペプチド、より詳細には動物（特にイヌ）においてＩＬ−１に起因する種々の疾患／病態の症状緩和／治療に有効なポリペプチドに関する。また、本発明は、当該ポリペプチドの製造方法に関する。さらに、本発明は、当該ポリペプチドを有効成分として含む、ヒト以外の動物用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−１（以下、ＩＬ−１と略す）は、単球・マクロファージを中心とした種々の細胞から生産され、生体が受ける障害に対して急性期の反応を引き起こす多彩な作用を持ったサイトカインである。その多彩な生物学的作用から種々の疾患あるいは病態の形成に直接また間接的に関わっていることが近年知られるようになってきた。特にＩＬ−１は種々の炎症において、その慢性化とその結果としての組織破壊に関して中心的な役割を果たしており、ＩＬ−１の作用を抑制することが疾患あるいは病態の治療に役立つという観点から、その抑制物質、すなわちＩＬ−１阻害剤が注目されている。
【０００３】
その中でも、生体内に存在するＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（以下、ＩＬ−１ｒａと略記する）が注目されている。ヒトＩＬ−１ｒａは、１９８０年代にはすでにＩＬ−１阻害物質として単球性白血病の患者や発熱患者の尿中に存在することが知られていた。１９９０年、ヒトＩＬ−１ｒａはＨａｎｎｕｍら、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇらによってヒト単球培養細胞上清中より精製・同定されるにいたった。ヒトＩＬ−１ｒａは分子量約１７ｋＤａの分泌タンパク質で、１５２個のアミノ酸から構成されている。そのアミノ酸配列はヒトＩＬ−１αと１９％、ＩＬ−１βと２６％の相同性を有する（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００４】
実際にこれまでにヒトの疾患・病態においてＩＬ−１とＩＬ−１ｒａのバランスの崩れた状態と考えられる病態、例えば慢性関節リウマチ、敗血性ショック、急性骨髄性白血病、炎症性腸疾患などで組換えＩＬ−１ｒａ投与による病態の改善が数多く報告されている（非特許文献４）。
【０００５】
これらの報告の中で注目すべきことは、その多くでＩＬ−１ｒａの投与量の多少に関わらず重篤な副作用がなく、また、ＩＬ−１ｒａに対する抗体産生が見られなかったという事実である。これはＩＬ−１ｒａが元来生体内に存在する生理活性物質であることに起因すると考えられ、ＩＬ−１ｒａが治療薬として有用な点である。一方で、ＩＬ−１ｒａを種々動物の疾病治療の目的で投与する場合、治療対象となる動物種の生体内に元来存在するＩＬ−１ｒａの使用が望ましいことを示唆する。
【０００６】
イヌは愛玩動物としても飼育されることが多く、例えば関節性リウマチなどの重篤な炎症性疾患に陥ったイヌを治療するための、副作用の少ない治療薬が求められている。前記観点から、特許文献１は、イヌＩＬ１−ｒａのアミノ酸配列を開示している。また、特許文献２はイヌＩＬ−１ｒａをコードするＤＮＡ、および、遺伝子組換え技術を利用したイヌＩＬ１−ｒａの製造方法を開示している。
【０００７】
該特許文献２の実施例では、成熟型のイヌＩＬ１−ｒａのアミノ末端にトロンビンの切断認識配列を介してグルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を付加した融合蛋白質をコードするＤＮＡを構築し、これを大腸菌細胞内で発現させ、当該融合蛋白質を単離後トロンビンを作用させることにより、成熟型のイヌＩＬ１−ｒａのアミノ末端にＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓが付加された蛋白質を得ている。
【０００８】
このような方法は、大腸菌細胞内で発現させた場合に不溶性の封入体として蓄積し易い蛋白質を、可溶性の蛋白質として得るための手段として有効である。また、大腸菌を宿主として用いた場合に十分な発現量が得られない蛋白質の発現量を向上させる手段としても有効である。
【０００９】
しかし、工程が煩雑になるため、目的蛋白質を取得するまでに、より多くの時間と労力を要する。
【００１０】
また、特許文献２では、上記方法により取得した、成熟型のイヌＩＬ１−ｒａのアミノ末端にＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓが付加された蛋白質が、ＩＬ−１により引き起こされるＩＬ−６遺伝子の転写誘導を阻害することを、株化されたヒト単球細胞を用いた実験で示している。しかしながら、当該蛋白質がＩＬ−１受容体に対する結合活性を有することは、直接的には示されていない。
【特許文献１】米国特許第６０１８０２９号
【特許文献２】米国特許第６０６３６００号
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，３４３，ｐ３３６−３４０
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，３４３，ｐ３４１−３４６
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ，３４４，ｐ６３３−６３８
【非特許文献４】医学のあゆみ，１７４，ｐ１２１８−１２２２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、イヌへの投与に適した、ＩＬ−１阻害活性を有するポリペプチドの提供を課題とする。また、当該ポリペプチドの効率的な製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、成熟型イヌＩＬ−１ｒａのアミノ酸配列と９８％以上の同一性を有し且つＮ末端がメチオニンであるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換された大腸菌を、大腸菌の生育至適温度より低い温度域で培養することにより、ＩＬ−１受容体に対する結合活性を有するポリペプチドを効率良く生産し得ることを見いだした。
【００１３】
さらに、本発明者らは、上記方法により生産したＩＬ−１受容体に対する結合活性を有するポリペプチドが、コンカナバリンＡにより惹起されるイヌ末梢血単核球の増殖を、用量依存的に抑制する作用があること、即ち、イヌＩＬ−１を阻害する作用があることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の（１）から（９）に関する。
（１）配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有し且つアミノ末端がメチオニンであるアミノ酸配列からなり、ＩＬ−１受容体に対する結合活性を有するポリペプチド。
（２）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列中の０から３個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換して得られるアミノ酸配列からなる（１）に記載のポリペプチド。
（３）配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０のいずれかのアミノ酸配列からなる（１）に記載のポリペプチド。
（４）ＩＬ−１受容体に対する結合活性を有するポリペプチドの製造方法であって、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法:
（ａ）前記（１）〜（３）のいずれかのいポリペプチドをコードするＤＮＡ、大腸菌で機能するプロモーター、およびＳＤ配列を作動可能な状態で連結してなるＤＮＡを作製する工程、
（ｂ）当該ＤＮＡを大腸菌で機能するベクターに連結する工程、
（ｃ）当該組換えベクターで大腸菌を形質転換する工程、
（ｄ）当該形質転換大腸菌を２５℃以上３４℃以下の温度で培養する工程、
（ｅ）当該形質転換大腸菌細胞内に蓄積したＩＬ−１受容体に対する結合活性を有する蛋白質を採取する工程。
（５）大腸菌で機能するプロモーターが、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｍｂｄａプロモーター、Ｔ７プロモーターの群より選択される、（４）に記載の方法。
（６）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分として含む、ヒト以外の動物用医薬組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に従えば、ＩＬ−１受容体に対する結合活性を有するポリペプチドの効率的な生産が可能となる。さらに、本発明に従えば、当該ポリペプチドを有効成分とする動物用医薬組成物（ヒト用を除く。特にはイヌ用）が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列（Met付加イヌＩＬ−１ｒａ）と９５％以上の同一性を有し、且つ、アミノ末端がメチオニンであるアミノ酸配列からなり、ＩＬ−１受容体に対する結合活性を有するポリペプチドである。好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列中の０から３個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換して得られ且つアミノ末端がメチオニンであるアミノ酸配列からなり、ＩＬ−１受容体に対する結合活性を有するポリペプチドである。より好ましくは、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００１７】
配列番号４に示すアミノ酸配列（イヌＩＬ−１ｒａ誘導体１）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の９１番目のリジンをアラニンに置換することにより得られる。配列番号６に示すアミノ酸配列（イヌＩＬ−１ｒａ誘導体２）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の９３番目のリジンをアラニンに置換することにより得られる。配列番号８に示すアミノ酸配列（イヌＩＬ−１ｒａ誘導体３）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の９７番目のリジンをアラニンに置換することにより得られる。配列番号１０に示すアミノ酸配列（イヌＩＬ−１ｒａ誘導体４）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の９１番目のリジンをアラニンに、９７番目のリジンをアラニンに置換することにより得られる。配列番号１２（イヌＩＬ−１ｒａ誘導体５）に示すアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の９１番目のリジンをアラニンに、９３番目のリジンをアラニンに置換することにより得られる。配列番号１４（イヌＩＬ−１ｒａ誘導体６）に示すアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の９３番目のリジンをアラニンに、９７番目のリジンをアラニンに置換することにより得られる。配列番号１６（イヌＩＬ−１ｒａ誘導体７）に示すアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の９３番目のリジンをアラニンに、９８番目のアルギニンをグリシンに置換することにより得られる。配列番号１８（イヌＩＬ−１ｒａ誘導体８）に示すアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の９１番目のリジンをアラニンに、９３番目のリジンをアラニンに、９７番目のリジンをアラニンに置換することにより得られる。配列番号２０に示すアミノ酸配列（イヌＩＬ−１ｒａ誘導体９）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の９１番目のリジンをアラニンに、９３番目のリジンをアラニンに、９８番目のアルギニンをグリシンに置換することにより得られる。
【００１８】
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドはいずれも、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドよりも抗凝集性が高いことを、本発明者らは見いだした。製剤の有効期限の観点から、抗凝集性がより高い蛋白質が医薬品の有効成分として好ましい。抗凝集性は、例えば、一定濃度のポリペプチド溶液を一定温度で保存し、その濁度を経時的に測定することにより評価できる。そのような条件において、濁度の増加が少ないポリペプチドほど抗凝集性が高いと判断できる。
【００１９】
アミノ酸配列の同一性％は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づくコンピュータプログラムｂｌａｓｔｐ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を使用して、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列と対象とするアミノ酸配列を比較することにより決定され得る。
【００２０】
ＩＬ−１受容体に対する結合活性とは、ＩＬ−１受容体に特異的に結合する性質を指し、例えば、ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 237, 70-75 (1996) に記載の方法を用いることにより、それを定量することができる。即ち、可溶性ＩＬ−１受容体の溶液に対象サンプルを加えた混合物を、ＥＬＩＳＡプレートに固定したＩＬ−１レセプターアンタゴニストに接触させた後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄する。洗浄後のＥＬＩＳＡプレート上に残留するＩＬ−１受容体可溶性断片を通常のＥＬＩＳＡ手法で定量し、対象サンプルを加えなかった場合と比較して、ＩＬ−１受容体可溶性断片の残留量が有意に低下していれば、対象サンプルにＩＬ−１受容体に対する結合活性が有ると判断できる。
【００２１】
また、本発明は、上述したＩＬ−１受容体に対する結合活性を有するポリペプチドの製造方法であって、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法である：
（ａ）配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し且つアミノ末端がメチオニンであるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、大腸菌で機能するプロモーター、およびＳＤ配列を作動可能な状態で連結してなるＤＮＡを作製する工程、
（ｂ）当該ＤＮＡを大腸菌で機能するベクターに連結する工程、
（ｃ）当該組換えベクターで大腸菌を形質転換する工程、
（ｄ）当該形質転換大腸菌を２０℃以上３０℃以下の温度で培養する工程、
（ｅ）当該形質転換大腸菌細胞内に蓄積したＩＬ−１受容体に対する結合活性を有する蛋白質を採取する工程。
【００２２】
ここで、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し且つアミノ末端がメチオニンであるアミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列中の０から３個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換して得られ且つアミノ末端がメチオニンであるアミノ酸配列であることが好ましく、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０のいずれかで示されるアミノ酸配列であることがより好ましい。
【００２３】
配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し且つアミノ末端がメチオニンであるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、当業者にとって周知の技術で作製することができる。例えば、当該アミノ酸配列情報を基に、各アミノ酸に対応するコドンを逐次連結してなる塩基配列を設計し、ＤＮＡ合成装置を用いて当該塩基配列を有するＤＮＡを作製することができる。当該ＤＮＡを複数の部分に分けて合成した後、ＰＣＲ等の手法を用いて連結することにより作製することも可能である。
【００２４】
本発明において、「大腸菌で機能するプロモーター」とは、適当な条件下において大腸菌内で転写活性を示すＤＮＡ配列を指し、例えば、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等が挙げられる。
【００２５】
本発明において、「ＳＤ配列」とは、原核微生物においてリボゾーム結合部位として機能するプリン塩基に富んだ約３から９塩基のＤＮＡ配列を指し、ＡＧＧＡの塩基配列から構成されるものが例示できるが、大腸菌において機能するものであれば、いかなる配列も本発明の方法において使用できる。
【００２６】
配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し且つアミノ末端がメチオニンであるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、大腸菌で機能するプロモーター、およびＳＤ配列を作動可能な状態で連結してなるＤＮＡ」とは、当該プロモーターおよびＳＤ配列が大腸菌内で機能することにより、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し且つアミノ末端がメチオニンであるアミノ酸配列からなるポリペプチドが生産されるよう、必要に応じて適当なＤＮＡを介して各構成要素を連結することを意味する。必要に応じて、２シストロン発現系（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,8506,(1986)）を構成するように、各要素を連結することも可能である。
【００２７】
本発明において使用するベクターは、所望のＤＮＡを大腸菌内に導入し、それを導入された宿主大腸菌内で維持する機能を有するものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられるが、プラスミドベクターが好ましい。これらのベクターを用いて大腸菌を形質転換する手法は、当業者にとって周知の技術である。
【００２８】
本発明の方法において、形質転換された大腸菌の培養に用いる培地は、当該菌株が増殖する限り特に制限されず、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用い得る。
【００２９】
本発明の方法において、形質転換された大腸菌の培養温度は、本発明を構成する非常に重要な要素の１つである。本発明者らは、本発明の方法において、形質転換された大腸菌の培養を２５℃〜３４℃の温度域で実施することにより、目的物である本発明のポリペプチドを効率良く生産し得ることを見いだした。即ち、２５℃未満の培養温度では、形質転換された大腸菌の生育が非常に遅く培養に長時間を要すると共に、単位培養液量あたりのＩＬ−１受容体に対する結合活性の生成量が少なく、一方、３４℃超の培養温度では、単位培養液量あたりのＩＬ−１受容体に対する結合活性の生成量が少ないと共に、培養時間が至適域を超えると急激に当該活性量が低下し、培養管理が困難となる。このような現象は、目的物であるポリペプチドの性質に依存するものであり、本発明者らが鋭意検討した結果、見いだされた知見である。従って、本発明の方法において、形質転換された大腸菌の培養は２５℃〜３４℃で実施されるが、２８℃〜３１℃が好ましい。
【００３０】
本発明の方法において、上記条件で培養された形質転換大腸菌の細胞内に蓄積したＩＬ−１受容体に対する結合活性を有するポリペプチドの採取は、当業者にとって周知の技術を用いて実施できる。例えば、当該形質転換大腸菌の培養液から、遠心分離機を用いて菌体を回収し、これを超音波破砕機で破砕した後遠心分離機で菌体残渣を除去することにより、無細胞抽出液を得る。さらに、この無細胞抽出液を、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過等に供することにより、ＩＬ−１受容体に対する結合活性を有するポリペプチドを単離できる。
【００３１】
また、本発明は、本発明のポリペプチドを有効成分として含む、ヒト以外の動物用医薬組成物、とりわけイヌ用医薬組成物である。本発明者らは、本発明のポリペプチドが、コンカナバリンＡにより惹起されるイヌ末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖を、用量依存的に抑制する作用があることを見出し、本発明に至った。即ち、本発明のポリペプチドがイヌＩＬ−１受容体に結合し、ＩＬ−１の作用を阻害することを見出した。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドを有効成分として含有するが、必要に応じ、薬学的に許容される種々の添加物を含み得る。また、本発明の医薬組成物の投与形態は、投与によりＩＬ−１を阻害する効果が得られれば特に限定されない。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において％の表示は、特に但書きがない限りｗ／ｖ％を意味する。以下の実施例においてポリペプチドの定量は、ウシ血清アルブミンを標準として、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて実施した。また、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている［
Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、
Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)］。
【００３４】
（実施例１）プラスミドの構築
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを大腸菌で生産するためのプラスミドを、以下の手順で作製した。
【００３５】
まず、ベクターｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３公報）のＮｄｅＩ部位の直前に配列表の配列番号２１に示したＤＮＡ配列を挿入し、２シストロン型発現ベクターｐＵＣＮＴ２を構築した（図１）。次に、米国特許第６０６３６００号の情報を基に、成熟型イヌＩＬ−１ｒａのＮ末端にメチオニンを付加したアミノ酸配列をコードする配列表の配列番号１に示すＤＮＡを合成した。この際、Ｎ末端のメチオニンをコードする開始コドン部分に制限酵素ＮｄｅＩ部位を、またＣ末端のグルタミン酸をコードするコドンの直後に終止コドン及びＢｇｌII切断部位を付加した。これをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したベクターｐＵＣＮＴ２に挿入し、プラスミドｐＫ９ＲＡを構築した。プラスミドｐＫ９ＲＡの制限酵素地図を図２に示す。
【００３６】
（実施例２）変異プラスミドの構築
配列表の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを大腸菌で生産するためのプラスミドを、以下の手順で作製した。
【００３７】
Gene Tailor変異導入システム（Invitrogen社）を用いて、その取り扱い説明書に従い、実施例１で作製した配列番号１に示した塩基配列からなるＤＮＡの２７１番目のＡをＧに、２７２番目のＡをＣに置換し、配列番号３に示した塩基配列からなるＤＮＡを作製した。作製したＤＮＡをプラスミドｐＫ９ＲＡの構築時と同様にベクターｐＵＣＮＴ２に挿入し、プラスミドｐＫ９ＲＡｍ３を構築した。
【００３８】
これと同様に、配列番号１に示した塩基配列からなるＤＮＡの２７７番目のＡをＧに、２７８番目のＡをＣに置換し、配列番号５に示した塩基配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＫ９ＲＡｍ５を構築した。
【００３９】
同様に、配列番号１に示した塩基配列からなるＤＮＡの２８９番目のＡをＧに、２９０番目のＡをＣに置換し、配列番号７に示した塩基配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＫ９ＲＡｍ７を構築した。
【００４０】
同様に、配列番号３に示した塩基配列からなるＤＮＡの２８９番目のＡをＧに、２９０番目のＡをＣに置換し、配列番号９に示した塩基配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＫ９ＲＡｍ９を構築した。
【００４１】
同様に、配列番号３に示した塩基配列からなるＤＮＡの２７７番目のＡをＧに、２７８番目のＡをＣに置換し、配列番号１１に示した塩基配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＫ９ＲＡｍ１１を構築した。
【００４２】
同様に、配列番号５に示した塩基配列からなるＤＮＡの２８９番目のＡをＧに、２９０番目のＡをＣに置換し、配列番号１３に示した塩基配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＫ９ＲＡｍ１３を構築した。
【００４３】
同様に、配列番号５に示した塩基配列からなるＤＮＡの２９２番目のＣをＧに置換し、配列番号１５に示した塩基配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＫ９ＲＡｍ１５を構築した。
【００４４】
同様に、配列番号１１に示した塩基配列からなるＤＮＡの２８９番目のＡをＧに、２９０番目のＡをＣに置換し、配列番号１７に示した塩基配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＫ９ＲＡｍ１７を構築した。
【００４５】
同様に、配列番号１１に示した塩基配列からなるＤＮＡの２９２番目のＣをＧに置換し、配列番号１９に示した塩基配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＫ９ＲＡｍ１９を構築した。
【００４６】
（実施例３）形質転換体の作製
実施例１および２で作製したプラスミドｐＫ９ＲＡ、ｐＫ９ＲＡｍ３、ｐＫ９ＲＡｍ５、ｐＫ９ＲＡｍ７、ｐＫ９ＲＡｍ９、ｐＫ９ＲＡｍ１１、ｐＫ９ＲＡｍ１３、ｐＫ９ＲＡｍ１５、ｐＫ９ＲＡｍ１７、およびｐＫ９ＲＡｍ１９の各々を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ株式会社）を形質転換し、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ５）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ７）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ９）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ１１）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ１３）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ１５）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ１７）、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ１９）を作製した。形質転換方法は、タカラバイオ株式会社の取り扱い説明書に従った。
【００４７】
（実施例４）ポリペプチドの単離
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを以下に示す方法で単離した。
【００４８】
実施例３で作製した形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡ）を、トリプトン２．４％、イーストエキス２．４％、リン酸水素二カリウム１．２％、リン酸二水素カリウム０．２％からなる液体培地（ｐＨ７．０）２００ｍｌを分注した振盪フラスコ５本に接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。培養液から遠心分離により菌体を集め、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２５０ｍｌに懸濁した。これを、ＵＨ−６００型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、１００００×Ｇで５分間の遠心分離に供し、不溶性画分を除去した。
【００４９】
可溶性画分を、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて予め平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）カラム（１９０ｍＬ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウムのリニアグラジエント（０Ｍから０．７Ｍまで）により活性画分を溶出させた。
【００５０】
ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分に終濃度１．５Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを添加し、１．５Ｍの硫酸アンモニウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にて予め平衡化したＢｕｔｙｌ−Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）カラム（１８０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１．５Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対して透析を行った後、分画分子量５ｋＤａの再生セルロース膜（ミリポア社）を用いて濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示すポリペプチドの精製品を得た。得られた精製品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果を図３に示す。
【００５１】
（実施例５）変異ポリペプチドの単離
配列表の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを、以下に示す方法で単離した。
【００５２】
実施例３で作製した形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ５）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ７）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ９）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ１１）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ１３）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ１５）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ１７）、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡｍ１９）の各々を、トリプトン２．４％、イーストエキス２．４％、リン酸水素二カリウム１．２％、リン酸二水素カリウム０．２％からなる液体培地（ｐＨ７．０）２００ｍｌを分注した振盪フラスコ５本に接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。培養液から遠心分離により菌体を集め、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２５０ｍｌに懸濁した。これを、ＵＨ−６００型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、１００００×Ｇで５分間の遠心分離に供し、不溶性画分を除去した。
【００５３】
可溶性画分のｐＨを酢酸を用いて５．５に調整した後、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）にて予め平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）カラム（１９０ｍＬ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウムのリニアグラジエント（０Ｍから１Ｍまで）により活性画分を溶出させた。
【００５４】
ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分に終濃度１．５Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを添加し、アンモニア水でｐＨ６．５に調整した後、１．５Ｍの硫酸アンモニウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にて予め平衡化したＢｕｔｙｌ−Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）カラム（１８０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１．５Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対して透析を行った後、分画分子量５ｋＤａの再生セルロース膜（ミリポア社）を用いて濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示す各ポリペプチドの精製品を得た。得られた精製品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果を図３および図４に示す。
【００５５】
（実施例６）ＩＬ−１受容体に対する結合活性の評価
実施例４および５で調製した各精製ポリペプチドのＩＬ−１受容体に対する結合活性を評価した。本発明は動物（特にはイヌ）用医薬組成物として有用なＩＬ−１受容体結合性ペプチドの取得／提供を目指すものであるが、この段階では試材の入手容易性等の観点から、Anal Biochem., 15, 237 (1996) を参考に、ヒトＩ型ＩＬ−１受容体（以下、ＩＬ−１Ｒ１と略記する）を用いて以下のように評価した。なお、動物（イヌ）用薬としての有効性については、後述の実施例９に示すように、他の評価系にて改めて評価を行った。
【００５６】
ヒトＩＬ−１ｒａ（Ａｍｇｅｎ社）をＰＢＳ（リン酸二水素ナトリウム・１水和物０．０１５７％、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物０．１９８％、塩化ナトリウム０．８１％）を用いて１００μＭの濃度に希釈し、これを９６穴イムノプレート（Ｎｕｎｃ社）のウェル中に５０μｌ分注後、室温で一晩静置して、これを固定化する。ウェル中の溶液を除去し、イムノブロック（大日本住友製薬株式会社）を２５０μｌ分注後、室温で２時間静置し、ブロッキングを行う。ウェル中のブロッキング溶液を除去し、ＰＢＳにて３回洗浄する。ＰＢＳＡ（リン酸二水素ナトリウム・１水和物０．０１５７％、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物０．１９８％、塩化ナトリウム０．８１％、ウシ血清アルブミン３．０％）で段階希釈した被験サンプル１２μｌと、ＰＢＳＡで２０８ｐＭに希釈したヒトＩＬ−１Ｒ１溶液４８μｌとの混合液のうち５０μｌをウェルに添加し、室温で２時間静置する。ウェル中の溶液を除去し、ＰＢＳにて３回洗浄する。ＰＢＳＡで０．２μｇ／ｍｌに希釈したラット抗ヒトＩＬ−１Ｒ１モノクローナル抗体（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）を５０μｌウェルに分注し、室温で１時間静置する。ウェル中の溶液を除去し、ＰＢＳにて３回洗浄する。ＰＢＳＡで１０μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ標識ウサギ抗ラットＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社）を２５μｌウェルに分注後、室温で１時間静置する。ウェル中の溶液を除去後、ＰＢＳで４回洗浄し、ウェル中の溶液を完全に除去する。発色基質であるテトラメチルベンジジン溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１００μｌ分注して軽く混合し、室温で２０分間静置する。ＴＭＢ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１００μｌ加えて発色反応を停止し、室温で５分間静置した後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５７】
結果を図５に示した。実施例５で調製した変異ポリペプチドはいずれも、実施例４で調製したポリペプチドとほぼ同等の、ＩＬ−１受容体に対する結合活性を有していた。
【００５８】
（実施例７）凝集性の評価
実施例５および６で調製した各ポリペプチドの凝集性を、以下のように評価した。
【００５９】
まず、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて、各ポリペプチドを５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。これを９６穴マイクロプレート（岩城硝子株式会社）のウェルに１５０μｌずつ分注し、３７℃で８日間静置した。途中、各ポリペプチド溶液の波長４１０ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ；Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を用いて測定した。結果を図６に示した。
【００６０】
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０のアミノ酸配列からなるポリペプチドはいずれも、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して吸光度の増加が小さく、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドより抗凝集性が向上していた。
【００６１】
（実施例８）形質転換体の培養温度
実施例３で作製した形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＫ９ＲＡ）を、５００ｍｌ容の振盪培養フラスコ中に調製したトリプトン２．４％、イーストエキス２．４％、リン酸水素二カリウム１．２％、リン酸二水素カリウム０．２％からなる液体培地（ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、２２℃、２５℃、２８℃、３１℃、３４℃、３７℃の各温度で３６時間振盪培養した。培養開始から１２時間、２４時間、３６時間後の培養液を１ｍｌ採取し、遠心分離により菌体を集め、１ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、１００００×Ｇで５分間の遠心分離により不溶性画分を除去し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液のＩＬ−１受容体に対する結合活性を測定し、無細胞抽出液１ｍｌ中の活性量（ｋＵ）を算出した結果を表１に示した。
【００６２】
ＩＬ−１受容体に対する結合活性は以下の方法で算出した。まず、各被験サンプルについて、実施例６と同様にして４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。この時、被験サンプルおよびヒトＩＬ−１Ｒを添加せずに得られる吸光度値をブランクとし、被験サンプルを添加しない場合に得られる吸光度値を５０％減少させるサンプル中の活性量を１Ｕと定義した。
【００６３】
【表１】
2009107968.tif 000002
（実施例９）イヌＩＬ−１阻害作用の確認
実施例４で調製した精製ポリペプチドのイヌＩＬ−１阻害作用を、イヌの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて、以下のように確認した。
【００６４】
まず、ＮｙｃｏＰｒｅｐ  １．０７７Ａｎｉｍａｌ（第一化学薬品製）を用いて、その取扱い説明書に従い、５８月齢のビーグル犬（雄）より採取した３ｍＬの末梢血からＰＢＭＣ画分を分取した。分取したＰＢＭＣを、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ製）、２５０Ｕ／ｍＬのペニシリン（和光純薬工業製）、および２５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（和光純薬工業製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ製）に再懸濁し、５００００細胞／１００μＬ／ウェルとなるよう９６ウェルプレートに分注した。同培地で段階希釈したイヌＩＬ−１ｒａ溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で３時間培養することにより前処理を行った。さらに、同培地で１．０μｇ／ｍＬの濃度に調製したコンカナバリンＡ溶液５０μＬを各ウェルに添加し、同条件下で７２時間培養した。
【００６５】
培養終了後、各ウェル中の増殖細胞数を、細胞増殖ＥＬＩＳＡ，ＢｒｄＵ発色キット（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いて次のように評価した。すなわち、各ウェルにＢｒｄＵ標識溶液を２０μｌ添加し、培養時と同条件下で２時間静置した後、培地を除いた。続いて、各ウェルにＦｉｘＤｅｎａｔを加えて室温で３０分間静置後、ＦｉｘＤｅｎａｔを除き、Ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ反応液を加えて室温で約９０分間静置した。上記反応液を除去してウェルを３回洗浄した後、基質反応液を添加した。４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度を測定（対照波長は６９０ｎｍ）した結果を図７に示した。本評価系では、高い吸光度を示すウェルほど増殖細胞数が多かったことを意味する。
【００６６】
培地にコンカナバリンＡを添加すると、添加しない場合と比較して、吸光度は高い値を示した。これは、コンカナバリンＡによりＰＢＭＣの増殖が惹起された結果と考えられる。しかし、コンカナバリンＡの添加前に実施例５で調製した精製ポリペプチドを添加し、前処理したＰＢＭＣでは、処理していないものと比較して、吸光度は低い値を示した。また、添加した同ポリペプチドの量が多いほど、吸光度の値は低かった。これらの結果から、同ポリペプチドは、コンカナバリンＡにより惹起されるＰＢＭＣの増殖を、用量依存的に抑制する作用があると考えられる。即ち、本発明のポリペプチドには、イヌＩＬ−１を阻害する作用があると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ベクターｐＵＣＮＴ２の構築方法を示す図である。
【図２】プラスミドｐＫ９ＲＡの構造を示す図である。
【図３】実施例４および５で調製した精製ポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果を示す図である。
【図４】実施例５で調製した精製ポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果を示す図である。
【図５】実施例４および５で調製した精製ポリペプチドのＩＬ−１受容体に対する結合活性を評価した結果を示す図である。
【図６】実施例４および５で調製した精製ポリペプチドの凝集性を評価した結果を示す図である。
【図７】本発明のポリペプチドで前処理したイヌの末梢血単核球を、さらにコンカナバリンＡで刺激した際の増殖結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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