(57)【要約】 【課題】    ｓｈＲＮＡを生体内において安定に供給することのできる新たな核酸分子とその製造方法を提供することを目的とする【解決手段】  プロモーター配列及び該プロモーター配列に連結された標的核酸配列を含み、１種以上の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを含むｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセット。本発明のＤＮＡカセットは、標的遺伝子の発現抑制を長時間に渉って発揮できるという利点を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター配列及び該プロモーター配列に連結された標的核酸配列を含み、１種以上の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを含むｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセット。
【請求項２】
ｓｈＲＮＡ発現カセット核酸が、該カセットから転写されるＲＮＡがｓｈＲＮＡを形成することのできる塩基配列を有する、請求項１に記載のｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセット。
【請求項３】
ダンベル型構造を有する、請求項１又は２に記載のｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセット。
【請求項４】
プロモーター配列がＰｏｌＩＩＩ系Ｕ６プロモーターである、請求項１〜３の何れかに記載のｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセット。
【請求項５】
少なくとも２種の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを有する、請求項１〜４の何れかに記載のｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセット。
【請求項６】
４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むデオキシリボヌクレオシド三リン酸混合物と、プロモーター配列及び該プロモーター配列に連結された標的核酸配列を含む鋳型核酸と、ＤＮＡポリメラーゼとを混合してＰＣＲ反応を行う工程を含む、ｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセットの製造方法。
【請求項７】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸混合物が、少なくとも２種の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む混合物である、請求項６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持続的にショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ ）を産生するためのｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセットとその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）と呼ばれる遺伝子発現の制御が、短鎖二本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）を利用することで哺乳動物内においても効率的に行うことが可能であることが明らかにされて以来、ＲＮＡｉによる遺伝子制御や、さらには疾患の治療に利用しようとする試みが広く行われている。
【０００３】
一般に、ＲＮＡｉによる遺伝子発現の抑制は、１）ホスホロアミダイト法などの化学的手法によって合成したｓｉＲＮＡを細胞内に導入する方法と、２）ｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡベクターを細胞に導入して、細胞中でｓｈＲＮＡを発現させる方法が知られている。
【０００４】
前者の方法は、現在、ＲＮＡｉ法による遺伝子発現抑制法の主流となっているが、用いる短鎖ＲＮＡが細胞内あるいは生体内に存在するヌクレアーゼによって速やかに分解されてしまうために効果の持続性がないという問題を抱えている。
【０００５】
効果の持続性を獲得する方法として、核酸が生体に存在する種々のヌクレアーゼの作用を受けないようにリポソーム等を用いて包摂し、このリポソーム等を細胞内に導入しようとする核酸分子のデリバリー技術が盛んに開発されている。しかしながら、この様なリポソーム等を利用したデリバリー技術は、所望の細胞内輸送性あるいは細胞選択性をリポソームに付与すること自体の技術開発が難しい。また、核酸に化学修飾を施すことによる、ヌクレアーゼ抵抗性ｓｉＲＮＡ分子の開発も行われている。しかし化学修飾によってＲＮＡｉ効果自体が却って低下する場合も多々あり、化学修飾された核酸の開発においては、効果の持続性と活性の維持のバランスを調整する必要がある。また、ｓｈＲＮＡを発現し得る発現ベクターも種々開発されている。この様な発現ベクターは、１分子でも核内に導入されればｓｈＲＮＡを恒常的に発現させることが可能である点で有利であるが、発現ベクター自体の毒性（ウイルス性ベクターやＣｐＧモチーフによる毒性）が問題となる。
【０００６】
本発明者らの一部は、フラノース環の酸素原子が硫黄原子に置換された糖部を有する４’−チオヌクレオチドを開発し、該ヌクレオシドを含む核酸分子が種々のヌクレアーゼに対して抵抗性を示すこと、４’−チオリボヌクレオシド三リン体が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって認識されてＲＮＡ鎖に取り込まれること、及び４’−チオ−リボヌクオチドを含むＲＮＡ鎖は逆転写酵素によって認識され、ｃＤＮＡが形成されること、等を確認した（特許文献１）。さらに、４’−チオ−２−デオキシリボヌクレオシドを三リン酸化して得られる４’−チオ−２−デオキシリボヌクオシド三リン酸は、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼやＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ等によって認識され、ポリメラーゼ反応における基質分子となることも確認した（非特許文献１）
【特許文献１】特許第３６７７５１０号公報
【非特許文献１】猪上  尚徳ら、第１５回 アンチセンスシンポジウム、アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ研究会主催、２００５年、講演要旨集第２３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡベクターの長所であるＲＮＡｉ効果の持続性を維持した、新たな核酸分子とその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法によって４’−チオ−２−デオキシリボヌクレオチドを含む化学修飾されたＤＮＡを簡便に製造できること、及び該方法によって製造される化学修飾されたＤＮＡが細胞内で安定に保持され、その結果該ＤＮＡから発現されるｓｈＲＮＡによる標的遺伝子に対する発現抑制効果が長期間にわたって維持されることを見いだし、下記の各発明を完成した。
【０００９】
（１）プロモーター配列及び該プロモーター配列に連結された標的核酸配列を含み、１種以上の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを含むｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセット。
【００１０】
（２）ｓｈＲＮＡ発現カセット核酸が、該カセットから転写されるＲＮＡがｓｈＲＮＡを形成することのできる塩基配列を有する、（１）に記載のｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセット。
【００１１】
（３）ダンベル型構造を有する、（１）又は（２）に記載のｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセット。
【００１２】
（４）プロモーター配列がＰｏｌＩＩＩ系Ｕ６プロモーターである、（１）〜（３）の何れかに記載のｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセット。
【００１３】
（５）少なくとも２種の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを有する、（１）〜（４）の何れかに記載のｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセット。
【００１４】
（６）４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むデオキシリボヌクレオシド三リン酸混合物と、プロモーター配列及び該プロモーター配列に連結された標的核酸配列を含む鋳型核酸と、ＤＮＡポリメラーゼとを混合してＰＣＲ反応を行う工程を含む、ｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセットの製造方法。
【００１５】
（７）デオキシリボヌクレオシド三リン酸混合物が、少なくとも２種の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む混合物である、（６）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のＤＮＡカセットは、標的遺伝子の転写を抑制することのできるｓｈＲＮＡを生体内において持続的に発現、供給することができる。また、本発明のＤＮＡカセットは、実質的にｓｈＲＮＡを発現させるために必要とされる最小単位の配列構造からなり、ウイルス性ベクター等で指摘される毒性が軽減された、安全性の高いベクターとして利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、プロモーター配列及び該プロモーター配列に連結された標的核酸配列からなり、４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを含むｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセットに関する。
【００１８】
４’−チオ−２−デオキシリボヌクレオシドは、下記式Ｉで表される化学構造を有する化合物である。
【００１９】
2009118804.tif 000002
（Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル及びヒポキサンチンよりなる群から選ばれる核酸塩基である）
この化合物の製造方法は特許文献１、特に実施例１３と１４に詳細に記載されている通りであり、本明細書はここに特許文献１の記載を取り込むものである。また、４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシドは、当業者に周知の方法に従ってホスホロアミダイト体に変換され、ＤＮＡ合成機用の核酸原料として使用される。また、４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシドを三リン酸化して得られる４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、ＤＮＡポリメラーゼ、特にファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＤＮＡポリメラーゼあるいはＫＯＤ  ＤａｓｈＤＮＡポリメラーゼによって基質として認識され、同酵素反応によって生成されるＤＮＡ分子に取り込まれる性質を有している。
【００２０】
従って、ホスホロアミダイト体に変換された４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシドを用いた化学合成法を採用すれば、任意の塩基を４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドとしたＤＮＡカセットを製造することができる。また、ＤＮＡポリメラーゼを用いた酵素学的合成法を用いても、任意の塩基を４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドとしたＤＮＡカセットを製造することができる。ＤＮＡポリメラーゼ反応を利用した方法では、酵素反応効率の点から、２種の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドまでを含むＤＮＡカセットを製造することが好ましい。２種の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドの組合せには、特に制限はない。
【００２１】
本発明のＤＮＡカセットにおける４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドの総塩基対数における含有率、又は塩基の種類には特に制限はないが、ＤＮＡカセット全体の塩基数に対して４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドの総含有率は２５％以上、さらに５０％以上であることが好ましい。また、少なくとも一種の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを１塩基以上有するｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセットである限り、本発明のｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセットに該当するが、本発明のｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセットは、２種以上の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを含むＤＮＡであることが好ましい。
【００２２】
４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを含むＤＮＡは、同じ塩基配列からなる天然型ＤＮＡと比較して、生体内に含まれるエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼに対して抵抗性を示す。例えば、１５ｍｅｒの天然型ＤＮＡの、エンドヌクレアーゼであるＤＮＡｓｅＩや３’−エキソヌクレアーゼである蛇毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）に対する半減期はそれぞれ１．５分と２．５分であるのに対して、４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを含む１５ｍｅｒの１本鎖ＤＮＡの半減期は８時間以上である。また、２本鎖の天然型ＤＮＡはＤＮＡｓｅＩによって数分で分解されるのに対して、４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを含む２本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡｓｅＩを２４時間作用させても全く分解されない。
【００２３】
したがって、４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを含むｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセットは、生体内に投与されてもヌクレアーゼによる分解を受けにくく、長期かつ安定的なｓｈＲＮＡの発現を可能にする。特に、天然型のＤＮＡカセットは、時間の経過と共に標的遺伝子に対する発現抑制効果が減少するのに対して、２種以上の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを有するＤＮＡカセットは、同じ時間を経過しても、その標的遺伝子に対する発現抑制効果は殆ど低下しないか、上昇するという特徴を有している。従って、本発明のＤＮＡカセットは、４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを有するＤＮＡカセットが備えるヌクレアーゼ耐性とは異なる理由により、標的遺伝子の発現抑制の持続性は発揮していると考えられる。
【００２４】
本発明のＤＮＡカセットは、ｓｈＲＮＡを発現するために必要なプロモーター配列と、該プロモーター配列に連結された標的核酸配列からなる。プロモーター配列の種類には特別な制限はないが、比較的短鎖のＲＮＡの転写効率に優れたプロモーター配列、特にｐｏｌＩＩＩ系のＵ６プロモーターの利用が好ましい。標的核酸配列は、任意の遺伝子を対象にして設計することができる。また、本発明のＤＮＡカセットは、転写されるＲＮＡがｓｈＲＮＡの形態を取るように、その塩基配列が設計される。具体的には、転写されたＲＮＡ鎖自身がステム＆ループを形成するように、逆向きの塩基配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＩＳ）を、数残基〜数十残基の間隔を持って配置されるよう、設計すればよい。この場合、転写されたＲＮＡのＩＳ配列が数残基〜数十残基の間隔をループアウトさせて相補的塩基対を形成し、ショートヘアピン構造を有するｓｈＲＮＡが形成される。
【００２５】
また、本発明のｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセットは、２つのステム＆ループを左右両端に有するダンベル構造を有することが好ましい。ダンベル型のＤＮＡカセットは、例えば、５’末端にステム＆ループを形成し得る塩基配列を付加したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行うことで作成することができる。この様なダンベル型ＤＮＡ分子は、生体内に投与されたときに、安定性及び／又は発現抑制効果が向上することが知られている。また、ＤＮＡの末端に、ＤＮＡの安定性を向上させるための、あるいは細胞内における部位指向性を付与させるための、種々の化学修飾分子を担持させてもよい。
【００２６】
本発明は更に、１種以上の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むデオキシリボヌクレオシド三リン酸混合物と、プロモーター配列及び該プロモーター配列に連結された標的核酸配列からなる鋳型核酸と、ＤＮＡポリメラーゼとを混合してＰＣＲ反応を行う工程を含む、ｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセットの製造方法を提供する。
【００２７】
４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシドにサリチルホスホクロリダイト等を作用させて三リン酸化することで簡便に製造することができ、かかる製造方法は特許文献１に記載されているとおりである。本発明は、ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ合成反応において、１種以上の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むデオキシリボヌクレオシド三リン酸混合物をｄＮＴＰｓとして用いることで、１種以上の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを含むｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセットを酵素学的に製造する方法である。
【００２８】
本発明の方法で使用されるｄＮＴＰｓは、４’−チオ−２’−デオキシリボアデニンヌクレオシド三リン酸（ｄｔＡＴＰ）、４’−チオ−２’−デオキシリボチミンヌクレオシド三リン酸（ｄｔＴＴＰ）、４’−チオ−２’−デオキシリボグアニンヌクレオシド三リン酸（ｄｔＧＴＰ）、又は４’−チオ−２’−デオキシリボシトシンヌクレオシド三リン酸（ｄｔＣＴＰ）から選択される１種以上のｄｔＮＴＰと、前記選択されたｄｔＮＴＰ以外の塩基を有する天然型のｄＮＴＰとの混合物であり、ｄｔＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの混合物、ｄＡＴＰ、ｄｔＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄｔＣＴＰの混合物などが例示される。ｄｔＮＴＰとｄＮＴＰの組合せは任意であるが、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の効率を維持するために、混合物中のｄｔＮＴＰは１種又は２種であることが好ましい。
【００２９】
本発明で使用されるＤＮＡポリメラーゼは、ｄｔＮＴＰを基質としてＤＮＡを合成する活性を有するポリメラーゼであればよいが、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、例えば広範囲のヌクレオチドを組み込むように設計された、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ由来の変異ＤＮＡポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）、超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性を欠失させた変異酵素をベースにした混合型酵素であるＫＯＤ−Ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）などを利用することが好ましく、特にＫＯＤ−Ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼを利用することがより好ましい。上記のｄｔＮＴＰとＤＮＡポリメラーゼとの反応は、使用するＤＮＡポリメラーゼ毎に知られている公知の反応用バッファー中で行えばよい。また、当該反応はいわゆるＰＣＲ法として、広く市販されているサーマルサイクラーを用いて行うことができるが、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成効率を高めるために、反応サイクルの各工程をｄＮＴＰｓを用いたＰＣＲ反応よりも長めに設定することが好ましい。特にＤＮＡ鎖伸長反応工程に相当する反応時間は、１０分以上、又は２０分以上、さらに３０分以上に設定することが好ましい。
【００３０】
上記のポリメラーゼ反応によって生成されるＤＮＡは、一般的な方法で回収し、そのままあるいは必要に応じて精製し、ｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセットとして生体に直接導入すればよい。また、核移行性などの特別な性質を有するベクターないしデリバリーシステムと本発明のＤＮＡカセットとを組み合わせて、生体に導入してもよい。ＤＮＡカセット、ベクターあるいはデリバリーシステムを生体に導入する方法は、当業者に知られた方法であれば何れも利用することができる。
【００３１】
以下に、非限定的な実施例を示して本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３２】
＜実施例１＞
配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴＤＮＡの５’末端と３’末端にそれぞれ相補する下記のプライマー１と２を用意した。
【００３３】
プライマー１：５’−taatacgactcactataaactctaggtcggagtgctc−３’  （配列番号２）
プライマー２：５’−gacggaatataagctggtgg−３’  （配列番号３）
核酸混合物として、２００μＭのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの混合物）、ｄＮＴＰｓのｄＴＴＰをｄｔＴＴＰに換えたｄｔＮＴＰｓ（ｄｔＮＴＰｓ−１）、ｄＣＴＰをｄｔＣＴＰに換えたｄｔＮＴＰｓ（ｄｔＮＴＰｓ−２）、及びｄＴＴＰとｄＣＴＰをそれぞれｄｔＴＴＰとｄｔＣＴＰに換えたｄｔＮＴＰｓ（ｄｔＮＴＰｓ−１，２）を用意した。
【００３４】
０．５μＭの各プライマー、０．０５μＭのＤＮＡ１０４、上記核酸混合物、及び０．０２５Ｕ／μＬのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、０．０１０Ｕ／μＬのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．０１３Ｕ／μＬのＫＯＤ−Ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、９４℃で１分静置後、［９４℃で１５秒間、５０℃で１５秒間、７２℃で１５秒間］×３０サイクル、最後に７２℃で５分間静置する反応条件１と、９６℃で１分間静置後、［９６℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、６５℃で３０分間］×３０サイクル、最後に６５℃で５分間静置する反応条件２でＰＣＲ反応を行った。
【００３５】
ＰＣＲ反応後の生成物を２．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルから回収後、Ｑｕａｎｔ−ＩＴＴＭ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＲ ｄｓＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて定量した。定量結果を表１に、またＫＯＤ−ＤａｓｈポリメラーゼのＰＣＲ反応の反応生成物に関するアガロースゲル電気泳動図を図１に、それぞれ示す。表中の数値は核酸量（ｎｇ）である。
【表１】
2009118804.tif 000003
【００３６】
＜実施例２＞
ＫＯＤ ＤａｓｈＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応により、ｄＮＴＰｓ、ｄｔＮＴＰｓ−１、−２、−１，２から得られた各生成物２９ｎＭを鋳型として、２００μＭのｄＮＴＰｓ、２ｍＭのｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、８ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴを含む４０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で、３７℃で１時間０．４２Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を反応させて、インビトロ転写を行った。
【００３７】
反応生成物を２．５％アガロースゲル電気泳動で分析したところ、８７ｍｅｒの位置にバンドが確認された（図２）。また、ゲルから反応生成物を回収後、Ｑｕａｎｔ−ＩＴＴＭ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＲ ｄｓＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて定量（μｇ）したところ、ｄＮＴＰｓから得られた反応生成物から０．４７μｇ／ｍＬ、ｄｔＮＴＰｓ−１から得られた反応生成物から０．２３μｇ／ｍＬ、ｄｔＮＴＰｓ−２から得られた反応生成物から０．２１μｇ／ｍＬ、ｄｔＮＴＰｓ−１，２から得られた反応生成物から０．１８μｇ／ｍＬのＲＮＡが転写されたことが確認された。
【００３８】
＜実施例３＞
１）ｓｈＲＮＡ発現ベクターであるｐＳＩＲＥＮ−Ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｌｕｃ及びｐＳＩＲＥＮ−Ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｎｅｇ（いずれもＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、模式図を図３に示す）に含まれる、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターのＵ６プロモーターからｓｈＲＮＡオリゴ領域までのＤＮＡを増幅するための下記の一組のプライマーを用意した。
【００３９】
プライマー３：５’−ctcagatctgggcaggaaga−３’（配列番号４）
プライマー４：５’−aatacgcaaaccgcctctcc−３’（配列番号５）
ｐＳＩＲＥＮ−Ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｌｕｃ又はｐＳＩＲＥＮ−Ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｎｅｇを鋳型とし、上記のプライマーセット、０．０１Ｕ／μＬのＫＯＤ−Ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼ及び２００ｍＭのｄＮＴＰｓ、ｄｔＮＴＰｓ−１、ｄｔＮＴＰｓ−２、及びｄｔＮＴＰｓ−１，２を用い、［９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で３０分間］×３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。反応生成物を回収、定量し、４’−チオヌクレオチドを含まないＳＥＣ、４’−チオ−２’−デオキシチミンヌクレオチドを含むＳＥＣ、４’−チオ−２’−デオキシシトシンヌクレオチドを含むＳＥＣ、及び４’−チオ−２’−デオキシチミンヌクレオチドと４’−チオ−２’−デオキシシトシンヌクレオチドとを含むＳＥＣを作製した。
【００４０】
２）ＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、ルシフェラーゼを発現するレポーターベクターとして利用した。また、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするＭｌｕＩ−ＳａｌＩ断片をｐＳＥＡＰ２ベクター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）から切り出し、ＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＭｌｕＩ−ＳａｌＩサイトに連結して、ＳＥＡＰを発現するレポーターベクターを構築した。
【００４１】
３）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）で、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で８０％コンフルエントまで培養し、２４ウェルプレートに分注した。各ウェルに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、１００ｆｍｏｌの２）で用意したレポーターベクター、及び１）で作製した各ＳＥＣ、２ｐｍｏｌを加えてコトランスフェクトした。
【００４２】
トランスフェクション後の細胞におけるルシフェラーゼ活性をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定した。またトランスフェクション後の細胞におけるＳＥＡＰ活性を、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＳＥＡＰ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて測定した。相対蛍光強度をＡＲＶＯｓｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて１０秒間測定し、ＳＥＡＰ活性値を用いてルシフェラーゼ活性値をノーマライズした。この結果を図４に示す。４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを有するｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡカセットは、天然型のＤＮＡカセットと同等の発現抑制活性を示すことが確認された。
【００４３】
＜実施例４＞
実施例３の１）において、１種の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むｄｔＮＴＰｓ４種類（ｄｔＮＴＰｓ−ｄｔＴＴＰ、ｄｔＮＴＰｓ−ｄｔＡＴＰ、ｄｔＮＴＰｓ−ｄｔＧＴＰ、ｄｔＮＴＰｓ−ｄｔＣＴＰ）、２種類の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオシド３リン酸を含むｄｔＮＴＰｓ４種（ｄｔＮＴＰｓ−ｄｔＴＴＰ，ｄｔＧＴＰ、ｄｔＮＴＰｓ−ｄｔＡＴＰ，ｄｔＧＴＰ、ｄｔＮＴＰｓ−ｄｔＴＴＰ，ｄｔＣＴＰ、ｄｔＮＴＰｓ−ｄｔＡＴＰ，ｄｔＣＴＰ）それぞれについてＰＣＲ反応を行い、１種類の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを有するＳＥＣ４種と２種の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを有するＳＥＣ４種を作製し、実施例３の３）に記載の方法でＮＩＨ／３Ｔ３細胞にレポ−ターベクターと共にコトランスフェクションし、９６時間まで培養してルシフェラーゼ活性発現の抑制効果を測定した。この結果を図５と図６に示す。
【００４４】
図５に示されるように、１種類の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを有するＳＥＣは、天然型のＤＮＡカセットと同様の標的遺伝子に対する発現抑制率の低下パターンを示したが、２種類の４’−チオ−２’−デオキシリボヌクレオチドを有するＳＥＣは、図６に示されるように、天然型のＤＮＡカセットが示す標的遺伝子に対する発現抑制率の低下パターンとは明らかに異なるパターンを示し、時間の経過と共に発現抑制率が低下しない（上昇する）ことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＫＯＤ−ＤａｓｈＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応の反応生成物をアガロース電気泳動にかけた後のゲルの写真である。Ｍは分子量マーカーを、レーン１はｄＮＴＰ、レーン２はｄｔＮＴＰ−１、レーン３はｄｔＮＴＰｓ−２、レーン４はｄｔＮＴＰｓ−１，２からの各反応生成物のバンドである。
【図２】図２は、ＫＯＤ−ＤａｓｈＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応の反応生成物を鋳型としてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写させた後の、転写物（８７ｍｅｒ ＲＮＡ）に関するゲルの写真である。レーン１はｄＮＴＰの反応生成物、レーン２はｄｔＮＴＰ−１の反応生成物、レーン３はｄｔＮＴＰｓ−２の反応生成物、レーン４はｄｔＮＴＰｓ−１，２の反応生成物から、それぞれ転写されたＲＮＡのバンドである。
【図３】図３は、ｐＳＩＲＥＮ−Ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｌｕｃ及びｐＳＩＲＥＮ−Ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｎｅｇの構造を模式的に表した図である。
【図４】図４は、本発明のＤＮＡカセットとルシフェラーゼ遺伝子とを導入した細胞におけるルシフェラーゼの発現を蛍光強度で表した図である。レーン１は標的配列に対する発現抑制機能を持たないコントロールＳＥＣ、レーン２はｄＮＴＰから生成したＳＥＣ、レーン３〜５はそれぞれ、ｄｔＮＴＰ−１、ｄｔＮＴＰｓ−２、ｄｔＮＴＰｓ−１，２から生成したＳＥＣをそれぞれ導入した細胞における発現抑制率（％抑制）を示す。
【図５】図５は、１種類の４’−チオ−２−デオキシリボヌクレオチドを含むＳＥＣによる、ルシフェラーゼの発現抑制の経時変化を示す。図中、●は４’−チオ−２−デオキシリボヌクレオチドを含まない天然型のＳＥＣ、▼はｄｔＴを含むＳＥＣ、■はｄｔＡを含むＳＥＣ、◆はｄｔＧを含むＳＥＣ、△はｄｔＣを含むＳＥＱをそれぞれ導入した細胞の蛍光強度の変化パターンを示す
【図６】図６は、２種類の４’−チオ−２−デオキシリボヌクレオチドを含むＳＥＣによる、ルシフェラーゼの発現抑制の経時変化を示す。図中、●は４’−チオ−２−デオキシリボヌクレオチドを含まない天然型のＳＥＣ、▼はｄｔＴとｄｔＧを含むＳＥＣ、■はｄｔＡとｄｔＧを含むＳＥＣ、◆はｄｔＴとｄｔＧを含むＳＥＣ、△はｄｔＡとｄｔＣを含むＳＥＣをそれぞれ導入した細胞の蛍光強度の変化パターンを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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