(57)【要約】      （修正有）【課題】トランスフェラーゼ活性を検出するための基質及びトランスフェラーゼ活性の検出方法を提供する。【解決手段】ローダミンを含むペプチド基質。試料のトランスフェラーゼ活性を検出する方法は、基質、およびリン酸基ドナーとリン酸基アクセプタの少なくとも１つと試料との接触含む。基質は、レポーター化合物およびアミノ酸を含む。第１の速度で非リン酸化基質を切断し、第２の速度でリン酸化基質を切断するペプチダーゼが添加される。レポーター化合物のアウトプットは検出される。検出されるトランスフェラーゼ活性はキナーゼ活性及びホスファターゼ活性である。トランスフェラーゼ反応における変化のスクリーニングの方法にも利用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）レポーター化合物と、
（Ｂ）前記レポーター化合物の第１の側面上で前記レポーター化合物に結合された第１のトランスフェラーゼ基質と
を含むペプチド基質。
【請求項２】
前記第１のトランスフェラーゼ基質がホスホチロシンである、請求項１に記載のペプチド基質。
【請求項３】
前記レポーター化合物の第２の側面上で前記レポーター化合物に結合された第２のトランスフェラーゼ基質をさらに含むものであって、レポーター化合物がローダミン１１０であり、かつ前記第１および第２のトランスフェラーゼ基質がホスホチロシンである、請求項１に記載のペプチド基質。
【請求項４】
前記レポーター化合物の第２の側面上で前記レポーター化合物に結合された第２のトランスフェラーゼ基質をさらに含むものであって、レポーター化合物がローダミン１１０であり、かつ前記第１および第２のトランスフェラーゼ基質がＡＡＹ（ＰＯ３）ＡＸＡＡ（配列番号：３４）である、請求項１に記載のペプチド基質。
【請求項５】
前記レポーター化合物の第２の側面上で前記レポーター化合物に結合された第２のトランスフェラーゼ基質をさらに含むものであって、レポーター化合物がローダミン１１０であり、かつ前記第１および第２のトランスフェラーゼ基質がＬＲＲＡＳＬＧ（配列番号：１）である、請求項１に記載のペプチド基質。
【請求項６】
前記レポーター化合物の第２の側面上で前記レポーター化合物に結合された第２のトランスフェラーゼ基質をさらに含むものであって、レポーター化合物がローダミン１１０であり、かつ前記第１および第２のトランスフェラーゼ基質がＫＫＡＬＲＲＡＳＬＫＧ（配列番号：２）である、請求項１に記載のペプチド基質。
【請求項７】
前記レポーター化合物の第２の側面上で前記レポーター化合物に結合された第２のトランスフェラーゼ基質をさらに含むものであって、レポーター化合物がローダミン１１０であり、かつ前記第１および第２のトランスフェラーゼ基質がＫＫＡＬＲＫＡＳＶＲＧ（配列番号：３）である、請求項１に記載のペプチド基質。
【請求項８】
前記レポーター化合物の第２の側面上で前記レポーター化合物に結合された第２のトランスフェラーゼ基質をさらに含むものであって、レポーター化合物がローダミン１１０であり、かつ前記第１および第２のトランスフェラーゼ基質がＹＩＹＧＡＦＫＲＲＧ（配列番号：４）である、請求項１に記載のペプチド基質。
【請求項９】
前記レポーター化合物の第２の側面上で前記レポーター化合物に結合された第２のトランスフェラーゼ基質をさらに含むものであって、レポーター化合物がローダミン１１０であり、かつ前記第１および第２のトランスフェラーゼ基質がＲＲＡＴ（ＰＯ３）ＶＡ（配列番号：５）である、請求項１に記載のペプチド基質。
【請求項１０】
前記レポーター化合物の第２の側面上で前記レポーター化合物に結合された第２のトランスフェラーゼ基質をさらに含むものであって、レポーター化合物がローダミン１１０であり、かつ前記第１および第２のトランスフェラーゼ基質がＹＩＹ（ＰＯ３）ＧＡＦＫＲＲＧ（配列番号：６）である、請求項１に記載のペプチド基質。
【請求項１１】
前記レポーター化合物が７−アミノ−４−メチルクマリンであり、かつ前記第１のトランスフェラーゼ基質がＬＲＲＡＳＬＧ（配列番号：１）である、請求項１に記載のペプチド基質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は酵素アッセイに関する。より具体的には、本発明は、トランスフェラーゼ活性
、例えば、キナーゼ活性およびホスファターゼ活性などの検出に関する。さらに、本発明
は、有望な阻害剤、活性剤、およびトランスフェラーゼ、例えば、キナーゼおよびホスフ
ァターゼなどの他の修飾因子をスクリーニングするためのプロセスに関する。さらに、本
発明は、トランスフェラーゼ、例えば、キナーゼおよびホスファターゼなどの酵素活性を
検出し、かつトランスフェラーゼの阻害剤および活性剤を検出するために使用されるキッ
トに関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
酵素は、それらが触媒する反応の一般的な種類によってグループに分類されている。ト
ランスフェラーゼは、１つの基質から別の基質への基の転移を触媒し、キナーゼおよびホ
スファターゼを含む。タンパク質キナーゼは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはグア
ノシン三リン酸（ＧＴＰ）などのドナーからペプチドまたはタンパク質などのアクセプタ
へホスホ部分を転移し、それぞれ、リン酸化ペプチドまたはタンパク質、およびアデノシ
ン二リン酸（ＡＤＰ）またはグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）をもたらす。タンパク質ホス
ファターゼは、リン酸基をホスホペプチドまたはリンタンパク質ドナーから水などのアク
セプタへ転移する酵素である。
【０００３】
真核細胞ゲノムの約２ないし５パーセントは、タンパク質キナーゼおよびタンパク質ホ
スファターゼをコード化する。約８７０種類のタンパク質キナーゼがヒトゲノムにおいて
同定されているが、何千もの別個の酵素が存在するとみられる。また、これらの酵素のタ
ンパク質基質は、すべての細胞タンパク質の３分の１に達しうる。これらの酵素およびそ
のターゲットの理解は、細胞制御および細胞病理学の理解に重要である。
【０００４】
タンパク質キナーゼはしばしば、リン酸化されているアミノ酸残基に基づき２つの主要
なグループに分類される。第１のグループはセリン／スレオニンキナーゼであり、これは
サイクリックＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）、サイクリックＧＭＰ依存性タ
ンパク質キナーゼ（ＰＫＧ）、カルシウムおよびリン脂質依存性タンパク質キナーゼ（Ｐ
ＫＣ）、カルシウムおよびカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ（ＣａＭＫ）、カゼ
インキナーゼ、細胞サイクルタンパク質キナーゼ（ｃｄｃまたはｃｄｋ）、タンパク質キ
ナーゼＢ（Ａｋｔ）、などを含む。これらのキナーゼは通常、細胞質であり、またはおそ
らくタンパク質を固定することによって細胞の顆粒画分と関係がある。タンパク質セリン
／スレオニンキナーゼは、細胞質内キナーゼの最も一般的な種類であり、細胞におけるリ
ン酸化反応イベントの大部分に関与すると考えられている。また、セリン／スレオニン型
の一部の受容体キナーゼ、例えば、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）などがある。
全体的に、セリン／スレオニンキナーゼは、細胞タンパク質キナーゼの７０％超に相当す
る。
【０００５】
キナーゼの第２のグループは、チロシンキナーゼと呼ばれ、チロシン残基をリン酸化す
る。全体的に、キナーゼの１０％超がチロシンキナーゼである。チロシンキナーゼは少な
いが、細胞制御において同じく重要な役割を果たす。研究により、多くのチロシンキナー
ゼが膜貫通タンパク質であり、その受容体ドメインは細胞の外側に位置し、そのキナーゼ
ドメインは細胞の内側に配置されていることが示されている。５０超の受容体チロシンキ
ナーゼが知られている。これらのキナーゼは、いくつかの分子の受容体、例えば成長因子
およびホルモン、サイトカイン、および神経伝達物質などを含む。これらの例としては、
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン受容体（ＩＲ）、および血小板由来成長因
子受容体（ＰＤＧＦＲ）が挙げられる。細胞質内チロシンキナーゼ、例えば、src、src-N
l、fyn、lyk、lynA、lckなどもある。また、他のキナーゼは、ヒスチジンまたはアスパラ
ギン酸残基を含有するタンパク質またはペプチドをリン酸化する。
【０００６】
タンパク質ホスファターゼは、かかる修飾を含有するタンパク質またはペプチドからリ
ン酸部分の除去を触媒する酵素である。キナーゼと同様に、各クラスのホスファターゼは
、その基質特異性および活性化のための他の分子への依存性によって区別される。３つの
主要なクラスのホスファターゼが同定されている。第１のクラスは、１型タンパク質ホス
ファターゼ（タンパク質ホスファターゼ−１またはＰＰ１）および２型タンパク質ホスフ
ァターゼ（PP2A、PP2B、およびPP2C）を含む。第２のクラスは、チロシンホスファターゼ
、例えば、PTP-1B、およびYOP-51などを含む。このクラスにおける一部のホスファターゼ
は可溶性であるが、その他は大きな分子、例えば、受容体CD45などの一部を含む。第３の
主要なクラスのホスファターゼは、ホスホセリン／ホスホスレオニンおよびホスホチロシ
ンの両方からリン酸基質を除去する二重特異性タンパク質ホスファターゼを含む。
【０００７】
タンパク質キナーゼおよびタンパク質ホスファターゼは、多くの細胞機能においてきわ
めて重要な役割を果たし、それらは細胞代謝、シグナル伝達、転写制御、細胞運動性、細
胞分裂、細胞シグナル伝達プロセス、細胞増殖、細胞分化、アポトーシス、および分泌を
含むが、これらに限定されない。これらのプロセスは、酵素、タンパク質基質、転写因子
、ホルモンまたは成長因子受容体、および他の細胞タンパク質のリン酸化反応または脱リ
ン酸化反応によって介される。
【０００８】
また、タンパク質キナーゼおよびタンパク質ホスファターゼは、タンパク質のリン酸化
反応状態を変化させる自然発生の毒素および病原体に対する反応の仲介に関与する。また
、タンパク質キナーゼは、多くの疫学的に関連した癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子に関係
がある。
【０００９】
とりわけ、キナーゼが関係している４００超のヒト疾患がある。例としては、神経変性
疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症およびアルツハイマー病などが挙げられる。筋緊張性
ジストロフィー症においては、障害の一形態における遺伝的欠陥が、第１９染色体上のタ
ンパク質キナーゼ遺伝子の３’非翻訳領域における増幅トリヌクレオチドリピートによっ
て特徴づけられる。これらの修飾により、障害の異常な特徴の多くがいつか解明されると
みられる。
【００１０】
人体病理学におけるキナーゼおよびホスファターゼのこの役割のため、キナーゼおよび
ホスファターゼの調節剤は可能性のある薬物ターゲットである。目下、キナーゼおよびホ
スファターゼの多くの阻害剤が種々の疾患の治療用に利用可能であるが、その他はかかる
使用について試験されている。かかる阻害剤の１つがGleevecTM（メシル酸イマチニブ）
（ノバルティス（Novartis）、スイス、バーゼル）であり、これはBcr-Ab1チロシンキナ
ーゼのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である。このチロシンキナーゼの異常な構成性
発現は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）における「フィラデルフィア染色体」異常によって
生成される。GleevecTMは、Bcr-Ab1陽性細胞系およびフィラデルフィア染色体陽性ＣＭＬ
患者からの新鮮な白血病細胞における増殖を阻害し、アポトーシスを誘発する。
【００１１】
ファスジル（エリル（Eril）（登録商標）注Ｓ、旭化成株式会社）は、Ｒｈｏキナーゼ
の有力な阻害剤である。エリル（登録商標）は、日本では脳血管攣縮（cerebral vaspasm
）の治療用に認可されており、経口製剤が現在、アンギナの治療用に臨床試験されている
。
【００１２】
臨床的に適切なホスファターゼの代表的な阻害剤がサイクロスポリンＡ（ＣＳＡ）であ
り、これは移植臓器の進行中の急性拒絶反応を予防し、治療するために使用される。ＣＳ
Ａは、ヘルパーＴ細胞によるインターロイキンIL-2の産生を阻害し、それによってＴ細胞
の活性化および増殖を阻止する（かつ免疫応答の増幅を阻害する）。ＣＳＡの作用機序の
現行モデルは、これがカルシニューリン（PP2B）と呼ばれるホスファターゼを阻止するこ
とを示す。
【００１３】
さらに、ホスホチロシンホスファターゼ（PTP-1B）は目下、ＩＩ型糖尿病の治療のター
ゲットとして検討中である。
【００１４】
これらの例は、臨床的に関連した状況においてキナーゼおよびホスファターゼを調節す
る重要性を示す。
【００１５】
キナーゼおよびホスファターゼ活性を測定し、有望なキナーゼおよびホスファターゼ阻
害剤および活性剤を検出するために使用される現行の種類のアッセイとしては、蛍光共鳴
エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイ、蛍光偏光（ＦＰ）アッセイ、および放射活性に基
づくシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）などのアッセイが挙げられる。
【００１６】
キナーゼ活性を検出するために使用されるＦＲＥＴアッセイでは、２つの結合蛍光分子
を有するタンパク質基質を利用する。２つの分子は近接しており、固定距離によって分離
されている。１つの分子（ドナー）における励起電子のエネルギーは、共鳴によって隣接
分子（アクセプタ）に移動する。高エネルギードナーフロウロフォアが、エネルギーを直
接低エネルギーアクセプタ分子へ転移させる能力は、アクセプタ分子の感作蛍光を誘発し
、同時にドナー蛍光を消す。この場合、ドナーの蛍光は、アクセプタに近接することによ
って「消され」、ドナーのエネルギーは非発光性の方法でアクセプタに転移される。エネ
ルギー転移の効率は、フォルスター（Forster）方程式に従いドナー発色団とアクセプタ
発色団との間の距離に依存する。ほとんどの場合、ＦＲＥＴは１００オングストローム超
の距離で観察されず、したがってＦＲＥＴの存在は近接の優れた指標である。
【００１７】
ＦＲＥＴが有用であるために、アクセプタ分子の蛍光はドナーの蛍光と大幅に異なる必
要がある。有用なＦＲＥＴに基づくタンパク質基質は、２つのフルオロフォア間のペプチ
ドリンカーを切断する能力があるエンドペプチダーゼに対する特異性を維持するペプチド
リンカーによって２つの蛍光分子の分離を含みうる。ペプチドがリン酸化している場合は
、酵素はタンパク質を切断しえず、または低下した速度でこれを切断することができ、消
光が生じるように蛍光分子を近接して維持する。他方、タンパク質がリン酸化していない
場合は、エンドペプチダーゼはタンパク質基質を切断し、消光が軽減されるように２つの
蛍光分子を放出し、２つの蛍光分子は独立して蛍光を発する。ＦＲＥＴアッセイは、これ
らの要件に合致するように注意深く人工的に作り出されなければならないペプチド基質を
必要とする。すなわち、これらのペプチド基質はエンドペプチダーゼのために必要とされ
る酵素認識部位を含有する必要があり、２つのフルオロフォア間の距離は、ＦＲＥＴが生
じることを可能にする範囲内でなければならず、蛍光分子はドナー蛍光が大幅に消えるよ
うな方法で対をなし、ドナーからのバックグラウンド蛍光を最小限にしなければならない
。さらに、出発原料（「消光」基質））の蛍光は、生成物（「放出」非消光生成物）と大
幅に異なる必要がある。これらの要件は、ＦＲＥＴに基づくアッセイを扱いにくく、かつ
費用のかかるものにする。
【００１８】
ＦＰアッセイは、高アフィニティ結合試薬、例えば、抗体、キレート剤、または同様の
ものなどの、蛍光標識分子への結合に基づく。例えば、リン酸化蛍光標識ペプチドには結
合するが非リン酸化蛍光標識ペプチドには結合しない抗体は、キナーゼアッセイ用に用い
ることができる。蛍光標識が平面偏光で励起されている場合、これは蛍光標識が励起状態
の全体を通じて不動のままである限り同じ偏光面において発光する（励起状態の持続時間
はフルオロフォアによって変動し、フルオロセインで４ナノ秒である）。しかし、励起蛍
光標識が回転し、または励起状態時に偏光面から転がり出る場合は、光は初期励起状態の
ものと異なる面で放出される。偏光がフルオロフォアを励起させるために使用される場合
は、発光強度は偏光面（励起面）に対して平行な面および偏光面に対して垂直な面の両方
においてモニタリングされうる。発光強度が平行面から垂直面へ移動する程度は、蛍光標
識分子の移動性と関係がある。蛍光標識分子が大きい場合、例えば、それらが結合試薬に
結合している場合などは、蛍光標識分子は励起状態の間隔の間にほとんど移動せず、放出
光は励起面に対して高度に偏光したままである。蛍光標識分子が小さい場合、例えば、結
合試薬が蛍光標識分子に結合されていない場合などは、蛍光標識分子は迅速に回転または
転がり、結果として生じる放出光は励起面に対して偏光解消する。したがって、ＦＰアッ
セイは、高アフィニティ結合試薬、例えば、蛍光標識分子に対して高い特異性で結合する
能力がある抗体を必要とする。ペプチドなど特異的蛍光標識分子と結合する抗体の時間と
費用のかかる最適化が、抗体が使用される場合に必要である。また、ＦＰアッセイは、偏
光に干渉するリン酸化タンパク質および他の反応成分、例えば、脂質および界面活性剤の
可能性がある。
【００１９】
放射性標識を使用するキナーゼアッセイは、ＳＰＡを含む。ＳＰＡでは、修飾リガンド
特異的またはリガンド捕捉分子がフルオロミクロスフェアに結合しているが、これは放射
性標識分子によって励起されるとエネルギーを放出する物質で含浸された固相支持粒子ま
たはビーズである。修飾リガンド、例えば、非リン酸化ペプチドと混合した放射性標識化
ホスホペプチドなどに添加されると、ホスホペプチドのみがフルオロミクロスフェア上で
捕捉され、放射エネルギーを放射させるのに十分近くに放射性標識化ペプチドをもたらし
、フルオロミクロスフェアを活性化し、光エネルギーを放出する。フルオロミクロスフェ
アの濃度が最適化されている場合は、ターゲットに結合された放射性標識化リガンドから
のシグナルのみが検出され、結合および遊離リガンドの分離の必要が除去される。放出さ
れる光エネルギーのレベルは、液体シンチレーションカウンタで測定されうるとともに、
リガンドがターゲットに結合されている程度を示す。しかし、ＳＰＡは放射性標識化を必
要とするが、これは高い廃棄コストおよび健康を危険にさらす可能性を有する。また、Ｓ
ＰＡは、重力によって安定させ、または遠心分離されるフルオロミクロスフェアを必要と
し、追加のステップおよび時間がアッセイに加わる。
【００２０】
きわめて多くの細胞機能および疾患に関与するリン酸化反応および脱リン酸化反応の事
象により、キナーゼおよびホスファターゼ活性を同定することは大いに重要である。した
がって、トランスフェラーゼ活性、例えば、タンパク質キナーゼ活性およびタンパク質ホ
スファターゼ活性などを検出するために、高価な、またはきわめて特殊な大量の出発原料
を必要とせず、かつ完了するために大量の時間を必要としない、代わりの酵素アッセイが
必要である。また、キナーゼおよびホスファターゼの活性剤および阻害剤を同定するため
の代わりのアッセイが必要である。また、かかるアッセイを実施するためのキットを提供
することも望ましいであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
発明の概要
本開示の末尾に提示された請求の範囲によって規定されている本発明は、上記の問題の
少なくとも一部を解決することを目的としている。例えば、本発明の１つの態様では、試
料のトランスフェラーゼ活性を検出するための方法が提供される。この方法の好ましい実
施形態では、試料は、基質およびリン酸基ドナーとリン酸基アクセプタの少なくとも１つ
と接触される。基質はレポーター化合物およびアミノ酸を含む。非リン酸化ペプチド基質
を第１の速度で切断し、リン酸化ペプチド基質を第２の速度で切断するペプチダーゼが添
加される。２つの速度の差は、トランスフェラーゼ活性の尺度である。次いで、レポータ
ー化合物のアウトプットが検出される。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
好ましい実施形態では、トランスフェラーゼ活性を検出する方法はキナーゼ活性を検出
するために使用される。別の好ましい実施形態では、当該方法はホスファターゼ活性を検
出するために使用される。
【００２３】
トランスフェラーゼ反応の変化を検出するための方法も提供される。方法の好ましい実
施形態では、トランスフェラーゼが活性である条件下にレポーター化合物およびアミノ酸
を含む基質に被験物質が接触される。基質は、非リン酸化ペプチド基質を第１の速度で切
断し、リン酸化ペプチド基質を第２の速度で切断するペプチダーゼで切断される。次いで
、レポーター化合物のアウトプットが検出される。
【００２４】
好ましい実施形態では、トランスフェラーゼ活性の変化を検出する方法は、キナーゼ活
性の変化を検出するために使用される。別の好ましい実施形態では、方法はホスファター
ゼ活性の変化を検出するために使用される。
【００２５】
試料のトランスフェラーゼ活性を検出する方法も提供される。当該方法の好ましい実施
形態では、それに共役されたレポーター化合物を有する基質が提供される。多数の基質が
試料を含有する溶液に添加される。試料は、トランスフェラーゼ活性が起こるのに十分な
時間にわたり試料が活性である条件下に基質とインキュベートされる。ペプチダーゼが試
料を含有する溶液に添加される。次いで、レポーター化合物のアウトプットが検出される
。
【００２６】
トランスフェラーゼのためのペプチダーゼ基質も提供される。好ましい実施形態では、
ペプチド基質は、レポーター化合物およびレポーター化合物の第１の側面上でレポーター
化合物に結合された第１のトランスフェラーゼ基質を含む。
【００２７】
上記の方法の実施において使用されうるキットも提供される。好ましい実施形態では、
キットは、レポーター化合物、リン酸基ドナーとリン酸基アクセプタの少なくとも１つ、
およびトランスフェラーゼの酵素活性を維持するバッファーを含む基質を含む。さらに、
非リン酸化ペプチド基質を第１の速度で切断し、リン酸化ペプチド基質を第２の速度で切
断するペプチダーゼが含まれる。
【００２８】
本明細書中で述べられる方法は、均質、迅速、感度がよく、簡単、かつ非放射性である
。これらの方法は便利であり、任意の計装プラットホームで使用されうる。必要な試薬は
、比較的容易に設計され、容易に合成されうる。これらの方法は、迅速な開発時間と低コ
ストのアッセイをもたらす。
【００２９】
本発明の好ましい代表的な実施形態は、添付の図面において示されているが、同様の参
照数字は全体を通じて同様の部分を表す。
【００３０】
本発明の実施形態を詳しく説明する前に、本発明はその適用において以下の説明に記載
され、または図面に示された構成の詳細および成分の配置に限定されないことを理解すべ
きである。本発明は、他の実施形態が可能であり、または種々の方法で実施され、達成さ
れる。また、本明細書で使用される専門語および術語は、説明の目的であり、限定とみな
すべきではないことを理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
定義：
本発明の目的のために、以下の定義が適用される。すなわち、
アミノ酸：標準のポリペプチド命名法、J. Biol. Chem., 243:3557-59、（1969）に従
い、アミノ酸残基の略語は以下の対応表に示されている通りである。
【００３２】
【表１】
2009106294.tif 000002
【００３３】
本明細書で使用される、「アミノルシフェリン」なる用語は、ＮＨ２基を含むように修
飾されているルシフェリンを指す。
【００３４】
本明細書で使用される、「バックグラウンド蛍光」なる用語は、ペプチド基質のアミノ
酸に結合されている場合のレポーター化合物によってアウトプットされた蛍光を指す。
【００３５】
本明細書で使用される、「生物発光」なる用語は、ルシフェラーゼを介した酸化反応の結
果として特定の生物において産生される光を指す。ルシフェラーゼ遺伝子、例えば、発光
甲虫（luminous beetle）からの遺伝子、および、特にフォチナス・ピラリス（Photinus 
pyralis）（北米の一般的なホタル）からのルシフェラーゼは目下、最も一般的に使用さ
れている発光性レポーター遺伝子である。
【００３６】
本明細書で使用される、「脱リン酸化反応」なる用語は、リン酸基の除去を指す。
【００３７】
本明細書で使用される、「エクソペプチダーゼ」なる用語は、ペプチド結合を切断する
ことによってペプチドまたはタンパク質の末端アミノ酸を除去する加水分解酵素を指す。
【００３８】
本明細書で使用される、「ルシフェラーゼ」なる用語は、特記されていない限り、自然
発生の、または人工的に作り出された鞘翅類ルシフェラーゼを指す。ルシフェラーゼは、
自然発生の場合は、甲虫自体、具体的にはその光器官から当業者によって容易に得ること
ができる。ルシフェラーゼが、自然発生し、または人工的に作り出されているものであり
、これが自然発生のルシフェラーゼのルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において活性を
保持する場合は、細菌、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または同種であって
、形質転換され、ルシフェラーゼをコード化するｃＤＮＡを発現するものの培養から容易
に得られ、またはこれをコード化する核酸からルシフェラーゼを製造するためのインビト
ロ細胞フリー系から容易に得られる。
【００３９】
本明細書で使用される、「ルシフェリン」なる用語は、鞘翅類ルシフェラーゼ酵素の基
質である。例えば、ホタルルシフェリンは、ポリへテロサイクリック有機酸、Ｄ−（−）
−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−？２−チアゾリン−４−カルボ
ン酸である。
【００４０】
本明細書で使用される、「調節剤（modulator）」なる用語は、トランスフェラーゼ活
性のアッセイを用いて同定される作用物質を指す。試料は候補作用物質で処理される。候
補作用物質で処理された試料と候補作用物質で処理されていない試料との間のトランスフ
ェラーゼ活性に変化がある場合は、この変化が調節剤の同定を示す。活性の変化は増大ま
たは減少しうる。
【００４１】
本明細書で使用される、「ペプチド基質」なる用語は、レポーター化合物に結合されて
いるペプチドを指す。好ましくは、ペプチド基質は、レポーター化合物の少なくとも１つ
の側に結合された少なくとも１つのアミノ酸を含む。
【００４２】
本明細書で使用される、「ペプチド」なる用語は、隣接残基のアルファ−アミノ基とカ
ルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに接続された少なくとも２つのアミノ酸残
基の線系列を指す。
【００４３】
本明細書で使用される、「リン酸化反応」なる用語は、リン酸の添加を指す。リン酸化
されているペプチド内のアミノ酸は、本明細書では、アミノ酸に先行する「ｐ」またはア
ミノ酸に続くもしくは付着している（ＰＯ３）のいずれか、で示される。
【００４４】
本明細書で使用される、「レポーター化合物」なる用語は、そのアウトプットが直接的
または間接的のいずれかによって検出されうる化合物を指す。アウトプットは、レポータ
ー化合物自体が検出されうる特性を有する場合に直接的に検出されうる。アウトプットは
、例えば、レポーター化合物が、別の基質によって作用するときに検出されうる特性を産
生する場合に間接的に検出されうる。
【００４５】
Ｉ．トランスフェラーゼ活性およびトランスフェラーゼ活性の変化について試料をアッセ
イする方法
好ましい実施形態では、試料のトランスフェラーゼ活性を検出するための方法は、基質
、およびリン酸基ドナーとリン酸基アクセプタの少なくとも１つと試料とを接触させるこ
とを含む。基質は、以下で詳しく説明されるように、レポーター化合物およびアミノ酸を
含む。非リン酸化ペプチド基質を第１の速度で切断し、リン酸化ペプチド基質を第２の速
度で切断するペプチダーゼが添加される。例えば、ペプチダーゼは、リン酸化ペプチド基
質よりも速い速度で非リン酸化ペプチド基質を切断する。次いで、レポーター化合物のア
ウトプットが検出される。この一般的なアッセイは、キナーゼおよびホスファターゼを含
むがこれらに限定されない種々のトランスフェラーゼをスクリーニングするように適合さ
れうる。また、一般的なアッセイを用いて、トランスフェラーゼ活性、例えば、キナーゼ
およびホスファターゼなどにおける変化をスクリーニングすることができる。例えば、こ
のアッセイを用いてトランスフェラーゼ（キナーゼおよびホスファターゼ等）のエンハン
サーおよび阻害剤をスクリーニングすることができる。
【００４６】
好ましい実施形態では、トランスフェラーゼが活性である条件下でレポーター化合物お
よびアミノ酸を含む基質の存在下に被験物質がトランスフェラーゼに接触される。基質は
、非リン酸化ペプチド基質を第１の速度で切断し、リン酸化ペプチド基質を第２の速度で
切断するアミノペプチダーゼで切断される。次いで、レポーター化合物のアウトプットが
検出される。
【００４７】
好ましい実施形態では、レポーター化合物は、キナーゼ（およびホスファターゼ）反応
およびペプチダーゼ反応が溶液相反応で行われうるように固体担体に結合されない。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、ペプチド基質は固体担体に結合され、キナーゼ（またはホ
スファターゼ）反応およびペプチダーゼ反応は固相で行われる。また、アウトプットは固
相で検出される。ペプチド基質は官能基によって固体担体に結合される。ペプチド基質上
の官能基は、固体担体に付着した別の官能基、または固体担体の別の一部に結合する能力
を有するべきである。このために、ペプチド基質は官能基をペプチド基質上に組み込むこ
とによって、かつペプチド基質および固体担体が共に結合されうるように固体担体上に対
応する官能基を有することによって固体担体に結合されうる。
【００４９】
有用な官能基の例としては、カルボキシ基を含有するものが挙げられる。ビオチンがか
かる官能基の例である。官能基のカルボキシ基は、レポーター化合物またはペプチド上の
のアミノ基に結合されている。ストレプトアビジンおよびアビジンは、アミノ基を有する
官能基の例である。官能基のアミノ基は、固体担体上のカルボキシ基に結合されている。
ビオチンは、ストレプトアビジンおよびアビジンの両方に対するアフィニティを有する。
官能基、例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンによって、ペプチド基質は固体担体
上に固定されうる。
【００５０】
官能基は、他の結合（linkage）によって、例えば、チオエーテル（または硫化物）結
合などによってペプチド基質にも付着されうる。例えば、ペプチド基質は遊離スルフヒド
リル基を含み、固体担体はマレイミド末端基を含有するように誘導されうる（ピアスバイ
オテクノロジー社（Pierce Biotechnology, Inc.）、イリノイ州、ロックフォード）。他
の結合、例えば、ジスルフィド結合が使用されうる。例えば、ペプチド基質は、遊離スル
フヒドリル基を含み、かつ当該基質はペプチド基質の遊離スルフヒドリル基を酸化させ、
ジスルフィド結合を形成する遊離スルフヒドロキシ基を含む。また、ペプチド基質が遊離
カルボキシ基および固体担体を含むアミド結合がアミノ基を含有する。遊離カルボキシ基
は、遊離アミノ基を酸化させ、ペプチド基質と固体担体との間にアミド結合を形成する。
注目すべきは、他の種類の結合も使用されうるとともに、上記の官能基の位置は逆にされ
うることである。例えば、ビオチン基は固体担体上に位置することができ、ストレプトア
ビジンまたはアビジン基はペプチド基質上に位置することができる。
【００５１】
好ましい実施形態では、ビス−レポーター化合物、すなわち、２つのアミノ基を有する
レポーター化合物が、第１のアミノ基上に官能基および第２のアミノ基上にペプチドを含
む。別の好ましい実施形態では、ビス−レポーター化合物が、遊離アミノ基の１つに結合
されたペプチドの遊離末端で官能基を含む。さらに別の好ましい実施形態では、ペプチド
基質はレポーター化合物自体上に官能基を含む。これらのそれぞれをこれからより詳しく
述べる。
【００５２】
２つの遊離アミノ基を有するビス置換レポーター化合物の場合、レポーター化合物は第
１のアミノ基によってペプチド基質に結合され、レポーター化合物の第２のアミノ基が官
能基に結合されている。例えば、カルボキシ基を含むビオチン基は、アミド結合によって
レポーター化合物の他のアミノ基に結合されうる。次いで、固体担体がストレプトアビジ
ンまたはアビジン誘導体を含有するように誘導されうるが、その両方はビオチンに対する
アフィニティ（またはアビディティ）を有する。また、アビジンもしくはストレプトアビ
ジンまたはその誘導体のいずれかで構成される基質（matrix）をビオチン化レポーター化
合物とともに用いることができる。ストレプトアビジンを含有する固体担体の例としては
、ストレプトアビジン結合膜（ＳＡＭ（登録商標））、ポリスチレン結合アビジン、スト
レプトアビジンプレート、ストレプトアビジンまたはアビジンコートマイクロタイタープ
レートが挙げられる。固相反応については、液相反応について本明細書中に記載されたキ
ナーゼ（またはホスファターゼ）およびペプチダーゼプロトコールに従うことができ、同
じ検出が液相アッセイについて既述されたように実施されうる。
【００５３】
２つのアミノ基がレポーター化合物上に存在する場合、第１のペプチドは第１のアミノ
基に付着され、第２のペプチドは第２のアミノ基に付着されうる。官能基は、上記の方法
のいずれかで第２のペプチドの遊離末端で付着されうる。この構成では、第２の基および
官能基に付着したペプチドはリンカーとして作用し、ペプチダーゼのための基質として使
用されることはない。また、官能基は、他の適切なリンカー、例えば、遊離アミノ基から
延び、例えば、アミノ基で終わる一連の炭素によってレポーター化合物に結合されうる。
この構成により、キナーゼ（またはホスファターゼ）反応およびペプチダーゼ反応両方に
おける基質として作用する第１のアミノ基上のペプチドの使用が可能である。
【００５４】
レポーターは、そのアミノ基の両方で問題の２つのペプチド（またはホスホペプチド）
にも結合され、レポーター化合物、例えば、ローダミン１１０のベンジル基などの上の選
択位置でも誘導されうる。好ましい実施形態では、官能基は直接、ベンジル基に付着され
る。他の好ましい実施形態では、官能基はリンカー、例えば、アミノ基を含有するＣ６ま
たはＣ１２などによって付着される。これによりレポーター化合物のアミノ基への同じペ
プチドの結合、またはレポーター化合物のアミノ基への異なるペプチドの結合が可能とな
る。アミノ基以外の位置で官能基を有する別の利点は、両方のアミノ基が、例えばレポー
ター化合物に付着したペプチドの切断によって遊離している場合に、蛍光の大きな増大が
得られることである。１つのアミノ基が遊離している場合のローダミン１１０については
、アミノ基が遊離していない場合に比べ蛍光の１０倍の増大が認められる。２つのアミノ
基が遊離している場合のローダミン１１０については、アミノ基が遊離していない場合に
比べ蛍光の１００倍の増大が認められる。したがって、ローダミン１１０がアミノ基以外
の位置で官能基を有する場合、これにより両方のアミノ基が遊離され、結果として上記の
通り蛍光の１００倍の増大が生じることになる。アミノ基以外の位置で官能基を有する利
点は、２つのペプチドがレポーター化合物に付着されうることである。
【００５５】
ＩＩ．タンパク質キナーゼ活性について試料をアッセイするための方法
ａ．一般
本発明の好ましい実施形態は、タンパク質キナーゼ活性をスクーリングするアッセイで
ある。試料中のタンパク質キナーゼ活性は、タンパク質キナーゼのためのリン酸ドナーお
よびペプチド基質と試料とを接触させることによって測定されうる。ペプチド基質は、タ
ンパク質キナーゼのためのレポーター化合物、アミノ酸、およびリン酸化反応部位を含む
。
【００５６】
ペプチド基質は、リン酸化ペプチド基質を切断するのとは異なる速度で非リン酸化ペプ
チド基質を切断するペプチダーゼとインキュベートされる。好ましくは、リン酸化ペプチ
ド基質を切断するよりも速い速度で非リン酸化ペプチド基質を切断するペプチダーゼであ
る。次いで、レポーター化合物のアウトプットが検出される。レポーター化合物は、ペプ
チド基質の少なくとも１つのアミノ酸と結合されている場合、ペプチド基質のアミノ酸と
結合していない場合とは異なるアウトプット特性を示す。リン酸化アミノ酸が存在してい
ない場合、ペプチダーゼはアミノ酸を基質から切断し、レポーター化合物を遊離すること
ができる。周囲のアミノ酸の加水分解によるなど、ペプチド基質から遊離されると、レポ
ーター化合物は、それがペプチド基質と結合されている場合と比べるとアウトプットを増
大させた。とりわけ、リン酸化アミノ酸の存在は、ペプチダーゼによるアミノ酸の除去を
阻止し、または遅くする。レポーター化合物がペプチド基質のアミノ酸に結合されると、
アウトプットは認められず、または減少しなかった。したがって、レポーター化合物のア
ウトプットを用いて、ペプチド基質がリン酸化しているかどうを測定することができる。
【００５７】
本発明のアッセイは、単一のチューブまたはウェル中で実施されうる。また、本発明の
アッセイは、ハイスループットスクリーニングに敏感に反応する。例えば、アッセイは９
６穴、３８４穴、およびさらに多くのウェルを有するプレート中で実行されうる。
【００５８】
タンパク質キナーゼ活性をスクリーニングするアッセイの好ましい実施形態が、以下の
式で概略的に示されうる。
【００５９】
Ｉ．キナーゼ反応
ステップＡ
タンパク質
キナーゼ
ペプチド−RC−ペプチド＋NTP/M ----------＞PO3−ペプチド−RC−ペプチド＋NDP/M
ステップＢ
タンパク質
キナーゼ
PO3-ペプチド-RC-ペプチド＋NTP/M----------＞PO3-ペプチド-RC-PO3-ペプチド＋NDP/M
【００６０】
ＩＩ．ペプチダーゼ反応
ペプチダーゼ
ペプチド−ＲＣ−ペプチド----------＞アミノ酸＋ＲＣ（アウトプットの上昇）        
迅速反応
ペプチダーゼ
PO3−ペプチド−RC−PO3−ペプチド----------＞少ないＲＣ放出（アウトプットの最小
の変化または変化なし）
緩慢反応
【００６１】
上記の式中、ＲＣはレポーター化合物であり、ＰＯ3はリン酸基であり、Ｍは金属また
は二価陽イオンであり、ＮＴＰがヌクレオチド三リン酸である。
【００６２】
ｂ．キナーゼ反応：
好ましい実施形態では、キナーゼ反応物は、バッファー、金属または二価陽イオン源、
ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を含み、これらはリン酸ドナー、ペプチド基質、および
、場合によっては、キナーゼの活性剤として作用しうる。バッファー、陽イオン、ＮＴＰ
、およびペプチド基質は、以下で説明されるように、検討中のタンパク質キナーゼに基づ
き選択される。必要に応じて、キナーゼの活性剤も添加することができる。試料は反応物
に添加される。
【００６３】
試料がタンパク質キナーゼを含有する場合は、タンパク質キナーゼはＮＴＰからのリン
酸基の転移を触媒し、ペプチド基質をリン酸化することができる。キナーゼ反応物は、酵
素が活性である温度でインキュベートされうる。好ましくは、その温度は約２１℃以上で
ある。３７℃以下の温度も好ましい。インキュベーション時間は、好ましくは５秒以上で
ある。１時間以下のインキュベーション時間も好ましい。しかし、インキュベーション時
間は、トランスフェラーゼがアッセイ条件下に活性のままであるよりも反応時間が長くな
い限り、１時間よりも長い場合もありうる。インキュベーション時間は、例えば、インキ
ュベーション温度、検討中のキナーゼの安定性および量、並びに、ペプチド基質の量に依
存して最適化されうる。反応は瞬間的であり、したがって測定は実行されるとすぐに得る
ことができる。
【００６４】
キナーゼ反応において有用なバッファーとしては、検討中の特定の酵素に対して最適で
ある濃度およびｐＨレベルでのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸（Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸
）（ＨＥＰＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）
（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）が挙げられるが、
これらに限定されない。好ましくは、バッファー濃度は１０ｍＭ以上である。１００ｍＭ
以下のバッファー濃度も好ましい。キナーゼ反応物のｐＨは好ましくは７．０以上である
。９．０以下のｐＨも好ましい。
【００６５】
キナーゼ反応のための好ましい二価陽イオンはマグネシウムである。他の二価陽イオン
、例えば、マンガン、カルシウム、ニッケルなどがマグネシウムの代わりになりうる。ま
た、これら他の二価陽イオンをマグネシウムと組み合せることができる。とりわけ、他の
二価陽イオンの一部をキナーゼの最適な活性のために添加することができる。好ましくは
、二価陽イオンは１ｍＭ以上の濃度で添加される。濃度５０ｍＭ以下の濃度でマグネシウ
ムを添加することも好ましい。他の二価陽イオンをマイクロモルからミリモルの範囲で添
加することができる。
【００６６】
キナーゼ反応物に添加されるＮＴＰは通常、ＡＴＰまたはＧＴＰである。当技術分野で
周知のように、キナーゼ反応物に添加されるＮＴＰの選択は、アッセイにおいて使用され
るキナーゼに依存する。キナーゼ反応におけるＮＴＰの好ましい濃度は、約１μＭ以上で
あり、好ましくは１ｍＭ以下であり、より好ましくは１００μＭである。
【００６７】
キナーゼのためのペプチド基質は、キナーゼによってリン酸化されうるものである。す
なわち、タンパク質キナーゼの可能なペプチド基質は、リン酸基アクセプタとして作用し
うるアミノ酸を有する必要がある。例えば、セリン／スレオニンキナーゼのペプチド基質
は、セリンまたはスレオニンを有する。種々のタンパク質キナーゼのコンセンサス配列が
知られている。（Methods in Enzymology 200: 62-81 (1991)）。表１は、種々のタンパ
ク質キナーゼのコンセンサスリン酸化反応部位モチーフを示す。星印は、リン酸化可能残
基を示す。「Ｘ」は任意のアミノ酸を示す。
【００６８】
【表２】
2009106294.tif 000003
【００６９】
アッセイのための可能なペプチド基質の有用性は、キナーゼが活性であることが知られ
ている条件下にキナーゼと可能なペプチド基質とをインキュベートすることによって測定
されうる。キナーゼアッセイのための好ましいペプチド基質は、レポーター化合物および
少なくとも１つのアミノ酸を含み、キナーゼ反応において有用であり、レポーター化合物
および少なくとも２つのアミノ酸を含み、キナーゼ反応において有用であり、レポーター
化合物および少なくとも４つのアミノ酸を含み、キナーゼ反応において有用であるペプチ
ド基質である。キナーゼ反応において有用であるこれらのペプチド基質は、問題のキナー
ゼによってリン酸化されうるものである。他の好ましいペプチド基質は実施例に記載され
ている。
【００７０】
ペプチド基質におけるレポーター化合物は、放出されると、検出可能にアウトプットさ
れる特性を有し、または検出可能にアウトプットされる特性を産生する反応物における基
質である任意の化合物である。例えば、蛍光発生レポーター化合物が使用されると、アウ
トプットは検出可能な蛍光である。蛍光発生レポーター化合物は好ましくは、ペプチド基
質のアミノ酸に結合されると蛍光は有さず、または減少している。しかし、ペプチド基質
から遊離されると、蛍光発生レポーター化合物の蛍光は増大している。
【００７１】
レポーター化合物は、蛍光発生化合物、例えば、アミノメチルクマリン（ＡＭＣ）もし
くはローダミン１１０（Ｒ−１１０）、または検討中のキナーゼまたはホスファターゼの
認識部位に干渉することなくペプチドに結合されうる他の蛍光発生化合物でありうる。ロ
ーダミン１１０が好ましい蛍光発生基質であり、ハイスループットスクリーニング用途に
おける有用性が証明されている。
【００７２】
好ましい実施形態では、レポーター化合物は、アミド結合によってペプチド基質に共有
結合されている。ＡＭＣは、アミノ酸鎖が結合されうる単一部位を有するが、ローダミン
１１０は２つ有する。ローダミン１１０がレポーター化合物として使用される場合、２つ
の結合部位の１つは、単一部位のみがペプチドへの結合のために利用可能であるように、
適切な阻止化合物によって阻止されうる。また、両方の部位がローダミン１１０上で利用
可能である場合、同じペプチドはそれに結合され、または異なるペプチドがそれに結合さ
れうる。異なるペプチドが使用される場合、２種類のキナーゼが同じ修飾ペプチド基質を
用いてアッセイされうる。
【００７３】
別の好ましい実施形態では、レポーター化合物は、ペプチド基質に結合されると、生物
発光酵素の基質ではない、光発生化合物である。例としては、アミノルシフェリンまたは
ルシフェリンの他の誘導体が挙げられる。例えば、アミノルシフェリンが酵素的にペプチ
ド基質から放出されると、これはルシフェラーゼの基質として利用可能である。ルシフェ
ラーゼは、アミノルシフェリンとＡＴＰとの間の反応における光の産生を触媒する生物発
光酵素である。この結果として生じる光またはルミネセンスは、かかる光発生化合物が使
用される場合に検出可能なアウトプットである。
【００７４】
好ましくは、ペプチド基質は、マイクロモル濃度、例えば、少なくとも１μＭの濃度な
どで添加される。２５μＭ以下の濃度でペプチド基質を添加することも好ましい。
【００７５】
活性剤が、必要に応じて、例えば、検討中のキナーゼが活性剤を必要とする場合に、キ
ナーゼ反応物に添加されうる。活性剤を添加して最適なキナーゼ活性を得ることも望まし
いとみられる。キナーゼ反応において有用な活性剤としては、カルシウム、リン脂質およ
び他の脂質、およびホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）またはカ
ルシウム−リン脂質依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＣ）のための同様の活性剤、カルモ
ジュリン依存性タンパク質キナーゼ（CaM K）のためのカルシウムおよびカルモジュリン
、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）ホロ酵素のためのｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ依
存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＧ）のためのｃＧＭＰ、ＤＮＫ−ＰＫのためのＤＮＡが挙
げられるが、これらに限定されない。活性剤は、検討中のキナーゼに応じてナノモル以上
の濃度、およびマイクロモル以下の濃度で添加されうる。終了試薬を場合により、例えば
、タンパク質キナーゼの活性を測定し、定量するための評価項目が望まれる場合、キナー
ゼ反応が生じている系に添加することができる。終了試薬は通常、キナーゼから金属を隔
離するのに十分である濃度で添加される金属キレート化試薬である。また、キナーゼによ
って触媒されるリン酸化反応を終了する他の試薬を用いてリン酸化反応を終了させること
ができる。例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、および１，１０−フェナントロリンが、それぞ
れ、マグネシウム、カルシウム、および亜鉛のための優れたキレート剤である。他のイオ
ンキレート剤を用いることができる。また、キナーゼは加熱不活性化されうる。
【００７６】
キナーゼ反応は、リン酸ドナーとしてホスホペプチドおよびリン酸アクセプタとしてヌ
クレオシド二リン酸（ＮＤＰ）を用いて、すなわち、既述された反応の逆も実行されうる
。この構成では、キナーゼ反応は上述されている同じ方法で実行される。しかし、一般に
検出されるアウトプットは、ホスホペプチドがリン酸ドナーであるキナーゼ反応のアウト
プットの逆のものとなる。すなわち、このアッセイ構成でキナーゼ活性が認められる場合
、アウトプットは、ホスホペプチド基質の脱リン酸化反応およびＮＤＰのリン酸化反応が
生じる場合に増大することになる。
【００７７】
ｃ．ペプチダーゼ 反応:
ペプチド基質のアミド結合に作用する加水分解酵素であるペプチダーゼがペプチド基質
に添加される。本発明において特に有用であるペプチダーゼは、エンドペプチダーゼ活性
がない、または実質的にないものを含む。また、非リン酸化ペプチド基質を第１の速度で
切断し、リン酸化ペプチド基質を第２の速度で切断するペプチダーゼを有することが好ま
しい。例えば、好ましいペプチダーゼは、リン酸化反応によって修飾されていないアミノ
酸を結合するアミド結合を切断する場合、リン酸化反応によって修飾されているアミノ酸
を結合するアミド結合を切断するよりも比較的高い活性を示す。同じ濃度のプロテアーゼ
で処理されたリン酸化ペプチドのものと比べた、プロテアーゼで処理された非リン酸化ペ
プチドから生成される蛍光の比のこの差異を、キナーゼの指標におけるように使用するこ
とができ、ペプチド基質がリン酸化されているかどうの判定が可能である。好ましいペプ
チダーゼは、ペプチド基質の非リン酸化アミノ酸を連続的に加水分解し、次いでリン酸化
アミノ酸に達すると加水分解を劇的に減速させるものである。この加水分解の減速により
、リン酸化アミノ酸の分子の大部分において放出されるレポーター化合物の不足が生じる
。これによりバックグラウンド蛍光、または非リン酸化アミノ酸が存在する場合よりも相
当に低い蛍光が生じる。リン酸化アミノ酸の部分的加水分解は以下で概略的に示されてい
る。
【化１】
2009106294.tif 000004
【００７８】
好ましい実施形態では、キナーゼ酵素の活性の増大は、酵素の濃度の上昇とともに検出
可能なアウトプットの減少に比例している。逆に言えば、ホスファターゼ酵素の活性は、
アウトプット、例えば、ホスファターゼの濃度の上昇とともに記録される蛍光と比較する
と、アウトプット、例えば蛍光測定値の増大に比例している。
【００７９】
非リン酸化ペプチド基質については、ペプチダーゼ活性は１つの速度を有する。リン酸
化ペプチド基質については、ペプチダーゼ活性は第２の速度を有する。例えば、所定の酵
素／基質のペアおよびアミノペプチダーゼＭによる処理については、アウトプット、例え
ば、蛍光単位が、リン酸化ペプチド基質についてよりも非リン酸化ペプチド基質について
高いｒである。
【００８０】
好ましくは、ペプチダーゼは、ペプチド基質の末端でアミノ酸の加水分解を開始するエ
クソペプチダーゼである。１つの好ましい実施形態では、ペプチダーゼは、ペプチドのア
ミノ末端からペプチドを切断するアミノぺプチダーゼである。アミノペプチダーゼが使用
される場合、ペプチド基質は、ペプチドのアミノ末端が遊離しているようにレポーター化
合物に結合されたカルボキシ末端を有する。アミノペプチダーゼとともに使用されるペプ
チド基質は、ＮＨ2−ペプチド−ＣＯ−［レポーター化合物］−ＣＯ−ペプチド−ＮＨ2で
表すことができる。他に特に示されていない限り、アミノペプチダーゼとともに使用され
るペプチド基質が本明細書中に記載されている場合、ペプチド基質はこの構成を有するこ
とが理解されるべきである。
【００８１】
アミノペプチダーゼは、ペプチド、アミド、またはアリルアミドからＮ末端アミノ酸、
Ｘ−｜−Ｙの放出を触媒し、ここでＸはＰｒｏを含むほとんどのアミノ酸でありうるが、
加水分解の速度は変動する。末端疎水性残基の後にプロリル残基がある場合、この２つは
無傷Ｘ−Ｐｒｏジペプチドとして放出されうる。非リン酸化ペプチド基質については、ア
ミノペプチダーゼは連続的にアミノ酸をペプチド基質のアミノ末端から切断し、レポータ
ー化合物を自由にする。また、ペプチドをペプチドのアミノ末端から切断するジぺプチジ
ルペプチダーゼを使用することができる。
【００８２】
好ましいアミノペプチダーゼとしては、アミノペプチダーゼＭ（Ｅ．Ｃ．３．４．１１
．２）、およびアミノペプチダーゼＩＩが挙げられる。アミノペプチダーゼＭは、膜アミ
ノペプチダーゼである。アミノペプチダーゼＭの他の名称としては、膜アラニルアミノペ
プチダーゼ、ミクロソームアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼＮ、粒子結合アミノ
ペプチダーゼ、アミノ−オリゴペプチダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、粒子結合ア
ミノペプチダーゼ、膜アミノペプチダーゼＩ、偽ロイシンアミノペプチダーゼ、ＣＤ１３
、Ｃｙｓ−Ｇｌｙジペプチダーゼ、およびペプチダーゼＥが挙げられるが、これらに限定
されない。
【００８３】
アミノペプチダーゼＩＩは、コウジカビ（Aspergillus oryzae）株（ATCC20386）から
単離されるペプチダーゼであり、金属酵素であり、かつ非特異的アミノぺプチダーゼ（EC
3．4．11）である。酵素はほとんどのペプチド結合を切断し、酸性、塩基性中性、疎水性
または親水性残基を切断する能力を有するが、酵素は、最後から２番目のＮ末端アミノ酸
として存在するときのプロリンによる活性はほとんどない。リン酸化ペプチド基質とは比
較的異なる速度で非リン酸化ペプチド基質を切断し、エンドペプチダーゼ活性がない、ま
たは実質的にない他のペプチダーゼを本発明のために使用することができる。
【００８４】
とりわけ、バッファーを変更することなく完了したキナーゼ反応物にペプチダーゼを添
加し、キナーゼ反応の成分、または他のステップを除去することができる。したがって、
スクリーニングアッセイが単一のチューブまたはウェル中で達成されうる。好ましくは、
少なくとも６．５ミリ単位のアミノペプチダーゼが添加される。１００ミリ単位以下のア
ミノペプチダーゼを添加することも好ましい。アミノペプチダーゼの単位は、３７℃およ
びｐＨ７．０〜７．５で毎分１マイクロモルのＬｅｕ−ｐＮＡを加水分解する酵素の量と
定義されている。低くかつ高い量のペプチダーゼを、例えば、ペプチド基質濃度およびペ
プチド切断の反応時間に応じて使用することができる。ペプチダーゼ反応は、酵素が活性
である任意の温度で実行されうる。好ましくは、ペプチダーゼ反応物は少なくとも１０℃
の温度でインキュベートされる。４０℃未満の温度も好ましい。好ましくは、ペプチダー
ゼ反応は５秒間以上にわたり行われる。１８０分以下の反応が行われることも好ましい。
より長い反応時間は、例えば、酵素およびペプチド基質濃度に応じて用いることができる
。より短い反応時間は、例えば、低いペプチド基質濃度および高い単位のアミノペプチダ
ーゼとともに用いることができる。
【００８５】
ペプチダーゼはカルボキシペプチダーゼでもありうるが、これはペプチドからカルボキ
シ末端アミノ酸を切断する。利用されうるカルボキシペプチダーゼとしては、アミノ酸を
除去するカルボキシペプチダーゼＡ、および末端リシンまたはアルギニンに特異的である
カルボキシペプチダーゼＢが挙げられるが、これらに限定されない。カルボキシペプチダ
ーゼが使用される場合、ペプチド基質は、ペプチドのカルボキシ末端が遊離しているよう
にレポーター化合物に結合されているペプチドのアミノ末端を有する。カルボキシペプチ
ダーゼとともに使用されるペプチド基質は、ＣＯＯＨ−ペプチド−ＮＨ−［レポーター化
合物］−ＮＨ−ペプチド−ＣＯＯＨで表すことができる。他に特に示されていない限り、
カルボキシペプチダーゼとともに使用されるペプチド基質が本明細書中に記載されている
場合、ペプチド基質はこの構成を有することが理解されるべきである。
【００８６】
必要に応じて、ペプチダーゼのターミネーターが含まれる。代表的な活性剤としては、
アクチノニン、ベスタチン、およびアマスタチンが挙げられるが、これらに限定されない
。ペプチダーゼターミネーターの包含は、アウトプットの検出または測定がペプチダーゼ
反応の終了よりも後の時点で行われる場合に特に有用である。亜鉛キレート剤、例えば、
１，１０−フェナントロリンなど他の試薬も使用できる。ペプチダーゼターミネーターは
、マイクロモル以上の濃度で添加されうる。ペプチダーゼターミネーターは、ミリモル以
下の濃度でも添加されうる。
【００８７】
ｄ．アウトプットの検出
使用されるレポーター化合物のアウトプットは、ペプチド基質のペプチダーゼ処理の後
に検出される。蛍光発生レポーター化合物が使用される場合、蛍光はアウトプットとして
使用されうる。蛍光光度計を用いて蛍光を検出することができる。単一チューブ機器であ
る蛍光光度計またはマルチウェルプレート蛍光リーダーである蛍光光度計を用いて蛍光を
検出することができる。例えば、クオーツキュベットを装備したフルオロログ−２スペク
トロ蛍光光度計（ＳＰＥＸインダストリーズ社（SPEX Industries, Inc.）、ニュージャ
ージー州、エジソン）を単一チューブアッセイ用に用いることができる。Cytofluor（登
録商標）ＩＩマルチウェル蛍光プレートリーダー（パーセプティブバイオシステムズ社（
PerSeptive Biosystems, Inc.）、マサチューセッツ州、フラミンガム）およびフルオロ
スキャンアセントＣＦ（Fluoroscan Ascent CF）（ラブシステムズ（LabSystems）ＯＹ、
フィンランド、ヘルシンキ）は、いずれも適切なフィルタが装備されているが、これらを
用いて蛍光を検出することができる。蛍光単位または測定値を記録することができる。ロ
ーダミン１１０がレポーター化合物として使用される場合、ペプチダーゼ処理後にキナー
ゼ反応は好ましくは４８５ｎｍでの励起および５２０〜５３０ｎｍでの発光を読むことに
よって測定される。ＡＭＣが使用される場合、反応は好ましくは３６０ｎｍで励起し、４
２０ｎｍでの発光を読むことによって測定される。
【００８８】
光発生レポーター化合物が使用される場合、ルミネセンスをアウトプットとして使用す
ることができる。照度計装置または他の適切な装置（ベクター１４２０マルチウェルカウ
ンタ、ワラック（Wallac）Ｏｙ、パーキンエルマー（Perkin Elmer）、フィンランド、ト
ゥルクなど）を用いて、ペプチダーゼ処理からの結果として生じるルミネセンスを検出す
ることができる。
【００８９】
キナーゼアッセイからの一般的なアウトプットが図１に示されているが、これは少ない
キナーゼが添加される場合に高い蛍光を、多くのキナーゼが添加される場合に低い蛍光単
位を示す。滴定曲線の形状は、ペプチド基質を切断し、レポーター化合物を放出するアミ
ノペプチダーゼの能力が、存在するキナーゼの濃度が増大すると減少するように、ペプチ
ド基質をリン酸化するキナーゼによって説明されうる。
【００９０】
好ましい実施形態では、両方のペプチドが同じ濃度のペプチダーゼで処理されている場
合、非酸化ペプチド基質のアウトプットをリン酸化ペプチド基質のアウトプットと比較す
ることによって相対アウトプットが測定される。例えば、アッセイでは、蛍光発生化合物
が使用される場合に相対蛍光の変化、またはルミネセンス発生化合物が使用される場合に
相対ルミネセンスの変化を使用することができる。レポーター化合物の検出可能なアウト
プットの相対変化は、好ましくは、対照試料アウトプットに対する被験試料アウトプット
の比である。この比は相対蛍光強度（ＲＦＵ）として表すことができる。例えば、アウト
プット比は、キナーゼで処理された試料およびキナーゼで処理されていない試料について
計算されうる。
【００９１】
ＩＩＩ．ホスファターゼ活性のアッセイのための方法
本発明の別の好ましい実施形態は、ホスファターゼ活性をスクリーニングするアッセイ
である。一般に、ホスファターゼ活性のスクリーニングは、キナーゼ活性のスクリーニン
グと同様に達成されるが、主な例外は、ホスファターゼの基質、通常はホスホペプチド基
質をキナーゼにおけるペプチド基質の代わりに使用することである。キナーゼ活性アッセ
イとホスファターゼ活性アッセイとの間の他の差異は以下およびその後の実施例において
述べられている。
【００９２】
試料のホスファターゼ活性を検出するために好ましい実施形態では、試料はホスホペプ
チド基質およびリン酸アクセプタと接触される。ペプチド基質としては、レポーター化合
物、ホスファターゼの脱リン酸化反応部位、およびアミノ酸が挙げられる。タンパク質ホ
スファターゼの可能なペプチド基質は、リン酸基ドナーとして作用しうるホスホアミノ酸
を有する必要がある。例えば、セリン／スレオニンホスファターゼのペプチド基質はリン
酸化セリン／スレオニンを有し、チロシンホスファターゼのペプチド基質はリン酸化チロ
シンを有する。ホスホペプチド基質は、上記の通り、レポーター化合物に結合される。
【００９３】
試料のホスファターゼ活性を検出するための好ましい実施形態では、試料はホスホペプ
チド基質およびリン酸アクセプタと接触される。ペプチド基質としては、レポーター化合
物、ホスファターゼの脱リン酸化反応部位、およびアミノ酸が挙げられる。タンパク質ホ
スファターゼの可能なペプチド基質は、リン酸基ドナーとして作用しうるホスホアミノ酸
を有する必要がある。例えば、セリン／スレオニンホスファターゼのペプチド基質はリン
酸化セリン／スレオニンを有し、チロシンホスファターゼのペプチド基質はリン酸化チロ
シンを有する。アッセイのための可能なペプチド基質の有用性は、酵素が活性であること
が知られている条件下に酵素と可能なホスホペプチド基質をインキュベートすることによ
って測定されうる。ホスホペプチド基質は、上記の通り、レポーター化合物に結合される
。
【００９４】
ホスファターゼ基質選好はキナーゼ基質選好よりも厳しくはないが、種々のタンパク質
ホスファターゼが実際には既知の基質選好を有する。（例えば、Eur. J.Biochem 219: 10
9-117 (1994)を参照）。例えば、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ特異的酵素のファミリーに属するだけで
はなくホスホチロシン残基に活性でもあるホスファターゼ−２Ｂ（PP-2B）については、
高次構造がその基質特異性に重要な決定因子であると考えられている。しかし、多くの短
いペプチドもPP-2Bによって適切に脱リン酸化され、基質としてのその効率は局所の構造
的特徴に依存する。例えば、PP-2Bによって適切に脱リン酸化されるペプチドのすべては
、アミノ末端側で塩基性残基を含有する。リン酸化残基に対して３位に位置する塩基性残
基は、短いホスホペプチドの脱リン酸化反応を測定することにおける特に適切な好ましい
役割を果たす。ホスホアミノ酸のカルボキシ末端側に隣接した酸性残基は、反対に強いマ
イナスの決定因子であり、別に適切なペプチド基質の脱リン酸化反応を阻止する。しかし
、PP-2Bは、ホスホスレオニルペプチドにごく適度の選好を示すが、反対にＳｅｒ／Ｔｈ
ｒ特異的タンパク質ホスファターゼの他のクラスによって、そのホスホセリル対応物が著
しく好まれる。さらに、PP-2Bは、ペプチドにおけるモチーフＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏを
強いマイナスの決定因子として感知することはないが、このモチーフはＳｅｒ／Ｔｈｒタ
ンパク質ホスファターゼの他のクラスによる脱リン酸化反応を阻止する。ホスホチロシル
ペプチドで試験されるときは、PP-2Bは、真正のタンパク質チロシンホスファターゼであ
るＴ細胞タンパク質チロシンホスファターゼのものと著しく異なる特異性を示す。具体的
には、後者の酵素は、そのアミノ末端部分が主に酸性であるPP-2Bおよびｓｒｃ産物のホ
スホアクセプタ部位を再現する多くのホスホペプチドに対して特に活性であるが、２位に
アルギニン残基を有する人工的な基質ホスホ−アンギオテンシンＩＩは、同様のサイズの
すべてのホスホチロシルペプチドに対してPP-2Bによってはるかに好ましい。まとめると
、これらの結果は、PP-2Bの特異性が、所定のコンセンサス配列に依存するのではなく、
他の既知のタンパク質ホスファターゼのものと異なる全体的な選択性をそれに付与する種
々の一次および高次構造的特徴によって決定されることを示す。
【００９５】
ホスファターゼアッセイの好ましいペプチド基質としては、レポーター化合物および少
なくとも１つのアミノ酸を含み、ホスファターゼ反応において有用であり、レポーター化
合物および少なくとも２つのアミノ酸を含み、ホスファターゼ反応において有用であり、
レポーター化合物および少なくとも４つのアミノ酸を含み、ホスファターゼ反応において
有用であるペプチド基質が挙げられる。ホスファターゼ反応において有用であるペプチド
基質は、問題のホスファターゼによって脱リン酸化されうるものである。好ましいペプチ
ド基質としては、Ｙ（ＰＯ3）（配列番号：３３）−レポーター化合物−Ｙ（ＰＯ3）［こ
こでレポーター化合物は任意のレポーター化合物である］、Ｙ（ＰＯ3）−Ｒ−１１０−
Ｙ（ＰＯ3）、およびＡＡＹ（ＰＯ3）ＡＸＡＡ（配列番号：３４）−Ｒ−１１０−ＡＡＸ
ＡＹ（ＰＯ3）ＡＡ［ここでＸは任意のアミノ酸である］が挙げられる。他の好ましいペ
プチド基質は実施例に記載されている。
【００９６】
ホスファターゼ反応には、詳しく上述されているように、リン酸化ペプチド基質を切断
するよりも速い速度で非リン酸化ペプチド基質を切断するペプチダーゼが添加される。こ
れによりホスホペプチド基質の脱リン酸化反応の評価が可能となる。レポーター化合物の
検出可能なアウトプットは、詳しく上述されているように、検出されうる。ホスファター
ゼ活性アッセイの代表的なアウトプット結果は、例えば、図６に示されている。
【００９７】
タンパク質ホスファターゼ活性アッセイは、以下の式で概略的に示されうる。
【００９８】
Ｉ．ホスファターゼ反応
ステップＡ
タンパク質
ホスファターゼ
PO3-ペプチド-RC-PO3-ペプチド＋NDP/M----------＞PO3-ペプチド-RC-ペプチド＋NTP/M
ステップＢ
タンパク質
ホスファターゼ
PO3-ペプチド-RC-ペプチド＋NDP/M----------＞ペプチド-RC-ペプチド＋NTP/M
【００９９】
ＩＩ．ペプチダーゼ反応
ペプチダーゼ
ペプチド-RC-ペプチド----------＞アミノ酸＋RC（アウトプットの上昇）
迅速反応
ペプチダーゼ
PO3-ペプチド-RC-PO3-ペプチド----------＞少ないRC放出（アウトプット最小変化）
緩慢反応
【０１００】
上記の式中、ＲＣはレポーター化合物であり、ＰＯ3はリン酸基であり、Ｍは金属また
は二価陽イオンである。
【０１０１】
ホスホペプチド基質の脱リン酸化反応およびその加水分解は以下に概略的に示されてい
る。
【化２】
2009106294.tif 000005
【０１０２】
セリン／スレオニンホスファターゼの好ましい実施形態では、ホスファターゼ反応物は
、ホスホペプチド基質、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５などのバッファー、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）、金属または二価陽イオン、例えば、MgCl2またはMnCl2などを含む。また
、当技術分野で周知のように、他の活性剤、例えば、カモルジュリンなどを添加し、最適
な酵素活性を達成することができる。反応物は、ホスファターゼが活性である任意の温度
でインキュベートされうる。好ましくは、反応物は３０分間、室温でインキュベートされ
る。
【０１０３】
必要に応じて、ホスファターゼ反応は、オカダ酸、ＥＤＴＡおよび／またはＥＧＴＡを
添加することによって終了させることができる。終了後（使用される場合）、ペプチダー
ゼが添加され、反応物は、好ましくは少なくとも６０分間、２５℃でインキュベートされ
る。レポーター化合物が蛍光発生化合物、例えば、ローダミン１１０などの場合、蛍光が
４８０ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光で測定されうる。
【０１０４】
ＩＶ．キナーゼ活性における、またはこれに対する変化のスクリーニング方法
本発明の別の実施形態は、キナーゼ反応における、またはこれに対する変化についてス
クリーニングするアッセイである。変化として、キナーゼ反応の活性化または阻害が挙げ
られるが、これらに限定されない。このために、キナーゼの有望な活性剤または阻害剤で
ある被験物質が、キナーゼといっしょにアッセイに添加される。アッセイは通常、バッフ
ァー、陽イオン、ＮＴＰ、ペプチド基質、および０．０５単位以上の問題のキナーゼを含
む。
【０１０５】
有望な阻害剤または活性剤は反応物に添加され、化合物がリン酸化反応を阻害または刺
激するかどうかを判定する。また、詳しく上述されているように反応物にペプチダーゼが
添加される。有望な阻害剤または活性剤は、レポーター化合物からの検出可能なアウトプ
ットの変化をひき起こしうる。例えば、有望な阻害剤がアッセイに含まれる場合、通常、
レポーター化合物からの検出可能なアウトプットの増大はキナーゼの阻害を示す。この増
大はおそらくキナーゼの阻害によるものであり、キナーゼの阻害はペプチド基質のリン酸
化反応の減少をもたらすだろう。リン酸化されたペプチド基質のアミノ酸が少ないことに
より、ペプチダーゼはペプチド基質のより多くの分子を切断し、非阻害キナーゼ反応より
も多くのレポーター化合物を遊離させうる。反対に、有望なエンハンサーがアッセイに含
まれる場合、有望なエンハンサーを含まない対照反応と比べると、レポーター化合物から
のアウトプットの減少はキナーゼの増強を示す。
【０１０６】
好ましい実施形態では、被験物質と接触した被験試料からのアウトプットが、被験物質
と接触されていない対照試料のアウトプットと比較される。好ましくは、これら検出され
たアウトプットから比が計算される。この比は、キナーゼによるレポーター化合物のリン
酸化反応（またはその欠如）の尺度である。
【０１０７】
Ｖ．ホスファターゼ活性における、またはこれに対する変化をスクリーニングのための方
法
本発明のさらなる実施形態は、ホスファターゼ反応における、またはこれに対する変化
についてスクリーニングするアッセイである。変化としては、ホスファターゼ反応の活性
化または阻害が挙げられるが、これらに限定されない。このために、ホスファターゼの有
望な阻害剤である被験物質が、ホスファターゼといっしょにアッセイに添加される。アッ
セイは通常、バッファー、陽イオン、ホスホペプチド基質、および０．１単位以上の問題
のホスファターゼを含む。
【０１０８】
有望な阻害剤または活性剤は反応物に添加され、化合物が脱リン酸化反応を阻害または
刺激するかどうかを判定する。また、詳しく上述されているように反応物にペプチダーゼ
が添加される。有望な阻害剤または活性剤は、レポーター化合物からの検出可能なアウト
プットの変化をひき起こしうる。例えば、有望な阻害剤がアッセイに含まれる場合、通常
、レポーター化合物からの検出可能なアウトプットの減少はホスファターゼの阻害を示す
。この減少はおそらくホスファターゼの阻害によるものであり、ホスファターゼの阻害は
ペプチド基質の脱リン酸化反応の減少をもたらすだろう。リン酸化された残りのペプチド
基質のアミノ酸が多いことにより、ペプチダーゼはペプチド基質のより少ない分子を切断
し、非阻害ホスファターゼ反応よりも少ないレポーター化合物を遊離させうる。反対に、
有望なエンハンサーがアッセイに含まれる場合、有望なエンハンサーを含まない対照反応
と比べると、レポーター化合物からのアウトプットの増大はホスファターゼの増強を示す
。
【０１０９】
好ましい実施形態では、被験物質と接触した被験試料からのアウトプットが、上述され
ている通り被験物質と接触されていない対照試料のアウトプットと比較される。
【０１１０】
ＶＩ．キット
本発明は、上述された方法を実施するためのキットにも関する。好ましい実施形態では
、キットは、レポーター化合物を含む基質、トランスフェラーゼの酵素活性を維持するバ
ッファー、リン酸ドナーとリン酸アクセプタの少なくとも１つ、および基質と適合するペ
プチダーゼを含む。検討中のトランスフェラーゼをキットに含めることができ、または使
用者によって供給されうる。トランスフェラーゼは、キナーゼ、ホスファターゼ、または
検討中の別のトランスフェラーゼでありうる。トランスフェラーゼがキナーゼである場合
、基質は好ましくはリン酸基アクセプタとして作用するペプチド基質であり、リン酸ドナ
ーは好ましくはキナーゼが使用可能であるＮＴＰである。トランスフェラーゼがホスファ
ターゼである場合、基質は好ましくはリン酸基ドナーとして作用するホスホペプチド基質
である。他の成分、例えば、そのすべてが既述されている、検討中のトランスフェラーゼ
の活性剤、トランスフェラーゼのターミネーター、ペプチダーゼのターミネーター等など
も含めることができる。好ましい実施形態では、トランスフェラーゼ活性のスクリーニン
グのためのキットも、制御反応のために使用されうるトランスフェラーゼを任意に含む。
トランスフェラーゼを含むキットは、被験物質がトランスフェラーゼの活性を変化させる
かどうかを判定するためにも使用されうる。例えば、キットは、被験物質が試験中のトラ
ンスフェラーゼを増強または阻害するかどうを判定するために使用されうる。
【０１１１】
１つの好ましい実施形態においては、基質はキナーゼ基質である。別の好ましい実施形
態においては、基質はホスファターゼ基質である。好ましくは、キットのペプチダーゼは
アミノペプチダーゼであるが、別のペプチダーゼ、例えば、カルボキシペプチダーゼなど
でありうる。好ましいアミノペプチダーゼとしては、アミノペプチダーゼＭおよびアミノ
ペプチダーゼＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。基質のための好ましいレポー
ター化合物は蛍光発生または光発生化合物であり、上述されている通りである。
【０１１２】
実施例
以下の実施例は、例示目的のみに提供されている。これらの実施例は、本明細書では、
現在記述された発明をより完全に理解するのに単に役立てるために含まれている。これら
の実施例は、任意の方法で本明細書で記述され請求された発明の範囲を限定することはな
い。
【実施例１】
【０１１３】
Ｒ１１０修飾ペプチド基質およびアミノペプチダーゼＭを用いたＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ
の検出：
ＬＲＲＡＳＬＧ−（Ｒ１１０）−ＧＬＳＡＲＲＬによるＰＫＡアッセイ。プロメガ社（
Promega Corp.）（ウィスコンシン州、マディソン）製のｃＡＭＰ依存性タンパク質キナ
ーゼ（ＰＫＡ）の触媒サブユニットのキナーゼ活性について以下の反応成分を用いて９６
穴プレートにおいてトリプリケートで試験した。すなわち、４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、
ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．ｌｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
５０μＭ ＡＴＰ、および５μＭのＬＲＲＡＳＬＧ（配列番号：１）−Ｒ１１０−ＧＬＳ
ＡＲＲＬ、「ビス−ケムプチド（kemptide）」としても知られるビス−ローダミンペプチ
ドキナーゼ基質。最終反応体積は５０μＬであった。各反応に添加されるＰＫＡの量は、
０．００１単位から１単位の範囲で、２倍の単位増分で滴定された。０単位による対照反
応も実行された。すべてのキナーゼ反応物が２０分間、室温でインキュベートされた。
【０１１４】
キナーゼ反応は、１００ｍＭ ＥＤＴＡおよび２５ｍＵ アミノペプチダーゼＭ（カルビ
オケム（Calbiochem）社、カリフォルニア州、サンディエゴ）を含有する終了／検出試薬
（２５μｌ）を添加することによって終了された。
【０１１５】
終了反応物を３０分間、室温でインキュベートし、次いでアミノペプチダーゼ活性を最
終濃度２．５μＭ アクチノニン／ウェルの添加によって終了した。キナーゼの酵素活性
は、アクチノニンの添加時および３時間後に蛍光の測定値を取ることによって測定され、
４８０ｎｍでの励起によるシグナルの安定性、および５２０〜５３０ｎｍでの蛍光放出を
試験した。
【０１１６】
図１に示されているように、反応における酵素の濃度または単位に増大とともに蛍光ア
ウトプットの対応する減少が認められる。また、ＰＫＡのより大きな単位の酵素サブユニ
ットがより低い蛍光アウトプットをもたらすことも判定された。これは、アミノぺプチタ
ーゼＭによって切断の速度を低下させ、ローダミン１１０の放出の減少をもたらすペプチ
ド基質のリン酸化反応によって説明されうる。さらに、シグナルは、アミノペプチダーゼ
活性の終了後３時間に得られたほぼ同一のプロファイルによって示されているように、長
時間にわたってきわめて安定であった。
【０１１７】
他のタンパク質キナーゼ源（例えば、キャルザイムラボラトリーズ社（Calzyme Labora
tories）（カリフォルニア州、サンルイスオビスポ）も試験され、実質的に同様の結果を
示した。
【実施例２】
【０１１８】
Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質キナーゼの阻害：
阻害剤によるＰＫＡアッセイ。ＰＫＡキナーゼの種々の阻害剤の効果を試験した。ＰＫ
Ａの既知かつ特異的阻害剤（ＰＫＩ−「タンパク質キナーゼ阻害剤」）、ＰＫＡの一般か
つ非特異的阻害剤（スタウロスポリン（（９Ｓ−（９ａ，１０β，１１β，１３ａ）−２
，３，１０，１１，１２，１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１１−（
メチルアミノ）−エポキシ−１Ｈ，９Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｇｈ：３’，２’，
１’−１ｍ］ピロロ｛３，４−ｊ］］［１，７］ベンゾジアゾニン−１−オン）））、Ｐ
ＫＡの弱い不十分（poor）阻害剤（Ｈ７）（１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−
メチルピペラジン）、およびＰＫＡを阻害しない化合物（Ｕ０１２６）（１，４−ジアミ
ノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス−（２−アミノフェニルチオ）ブタジエン）をＰＫ
Ａのキナーゼ活性に対するその効果について試験した。キナーゼ反応およびアミノペプチ
ダーゼ反応を、阻害剤を上昇濃度で含み、かつ０．５単位のＰＫＡを使用したことを除き
、実施例１に記載されたものと同様の条件下に実行した。いかなる阻害剤も含有しない対
照を含めた。
【０１１９】
４８０ｎｍの励起および５２０〜５３０ｎｍの蛍光放出で蛍光を検出した。図２に示さ
れているように、ＰＫＩおよびスタウロスポリンの濃度を上昇されることにより蛍光アウ
トプットの増大が生じ、ＰＫＡ酵素活性の阻害を示した。化合物Ｈ７およびＵ０１２６は
、蛍光アウトプットが変化しなかったため効果なしであった。ＰＫＩがスタウロスポリン
よりも有力な阻害剤であることも明らかであり、低い濃度の前者は後者よりも酵素活性を
５０％阻害（ＩＣ50）する能力があった（図２）。
【０１２０】
２つの追加のペプチド基質、すなわち、ペプチド基質ビス−ＳＰＫ−２（ＫＫＡＬＲＲ
ＡＳＬＫＧ（配列番号：２）−Ｒ１１０−ＧＫＬＳＡＲＲＬＡＫＫ）およびビス−ＳＰＫ
−４（ＫＫＡＬＲＫＡＳＶＲＧ（配列番号：３）−Ｒ１１０−ＧＲＶＳＡＫＲＬＡＫＫ）
によるキナーゼ反応も上記と同様の条件下に実行した。この試験では、ペプチド基質ビス
−ＳＰＫ−２が、ペプチド基質ビス−ＳＰＫ−４よりもＰＫＡに対して優れた基質である
ことが示された。また、モノアミドペプチド基質をビスアミドペプチド基質と比較し、同
様のプロファイルを得たが、例外として、バックグラウンドは、ビス置換ローダミン１１
０誘導体と比べ、モノ置換ローダミン１１０についてより高かった。ローダミン１１０誘
導体のこの特性は当技術分野で公知である（結果は示さず）。
【０１２１】
反応は、単一チューブ、９６穴、および３８４穴フォーマットで行われ、白と黒の両方
のプレートを使用した。黒のプレートは、低い反射率により、機器関連バックグラウンド
が低くなるため、これが好ましい。他のセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ、例えば
、ＰＫＧ、ＰＫＣ、ＡＫＴなども基質ＳＰＫ−２を用いて試験し、各アッセイにおけるア
ウトプット蛍光の変化は、反応における酵素の量に反比例した（結果は示さず）。
【実施例３】
【０１２２】
ＡＭＣ修飾ペプチド基質およびアミノペプチダーゼＭを用いたＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ活
性の検出：
ＬＲＲＡＳＬＧ−ＡＭＣによるｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）アッセイ
。他の蛍光発生レポーター、例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）をＰＫ
Ａと使用するためにその安定性について試験した。ＡＭＣは遊離アミノ基によってアミド
結合でペプチドＬＲＲＡＳＬＧに結合され、ペプチド基質ケムプチド−ＡＭＣを産生した
。この基質をローダミン１１０修飾ペプチド基質とともに使用したものと同一であるアッ
セイ条件下に使用したが、例外として、４０μＭの濃度で基質を添加した。反応物を３０
分間、室温でインキュベートし、アミノペプチダーゼＭを５０ｍＵ／ウェルの最終濃度で
添加し、６０分間、室温でインキュベートした。反応は５０μＭ ＡＴＰの存在下および
非存在下に行い、ＰＫＡのホスホトランスフェラーゼ活性がＡＴＰを必要とすることを示
した。蛍光データは、アクトニンの添加なしに６０分で得られた。蛍光は、３６０ｎｍの
励起および４２０ｎｍでの蛍光放出で検出された。
【０１２３】
図３における結果は、ＡＴＰの非存在下には、酵素濃度の増大とともに蛍光アウトプッ
トの変化がないことを示す。ＡＴＰの存在下には、蛍光アウトプットは酵素の量の増大に
比例して減少した。これらのデータは、蛍光発生レポーター化合物が本発明において使用
されうることを示す。
【実施例４】
【０１２４】
Ｒ１１０修飾ペプチド基質およびアミノペプチダーゼＭを用いたチロシンキナーゼの検出
：
チロシンキナーゼアッセイ。チロシンキナーゼのキナーゼ活性は、リン酸化可能アミノ
酸残基としてチロシンを含有するペプチド基質を用いて示された。タンパク質チロシンキ
ナーゼのＳｒｃファミリー、例えば、Fyn、Lyn A、Lyk、Src、Src N1などの一部の酵素の
キナーゼ活性、および成長因子受容体チロシンキナーゼ（インスリン受容体）のキナーゼ
活性について試験した。
【０１２５】
チロシンキナーゼ反応の条件としては、５０μｌ／ウェル体積中、トリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．５、０．１mg/ml BSA、２０ｍＭ MgCl2、1mM MnCl2、０．２mM EGTA、１００μＭ 
バナジン酸ナトリウム、８ｍＭ ベータグリセロホスフェート、２μＭ ビス−ＰＴＫ−５
（ＹＩＹＧＡＦＫＲＲＧ（配列番号：４）−Ｒ１１０−ＧＲＲＫＦＡＧＹＩＹ）が挙げら
れる。０．０７ｍＵから４０ｍＵの２倍の増分の酵素、および酵素を含有しない対照とと
もにチロシンキナーゼｌｃｋの酵素滴定を実行した。反応は、３０分間、室温で１００μ
Ｍ ＡＴＰの有無で実行した。試料は、ダイネックス（Dynex）（登録商標）マイクロフル
オル（Microfluor）（登録商標）２、黒、９６穴プレート（ダイネックステクノロジーズ
社（Dynex Technologies, Inc.）、バージニア州、チャンティリー）で実行した。
【０１２６】
キナーゼ反応は、１００ｍＭ ＥＤＴＡを２５μｌ添加することによって終了させた。
アミノペプチダーゼＭ（５０ｍＵ）を添加し、９０分間、２５℃でインキュベートした。
次いで、実施例１におけるように、４８０での励起および５２０〜５３０ｎｍでの発光を
用いて蛍光を測定した。図４に示されている結果は、１００μＭ ＡＴＰが含まれていた
場合、蛍光アウトプットの減少は反応における酵素の量の増大に比例し、ＡＴＰの非存在
下に変化がほとんど、またはまったく確認されなかったことを示す。
【０１２７】
別の実験では、キナーゼを阻害しない化合物（Ｕ０１２６）ではなく、チロシンキナー
ゼｌｃｋの非特異的阻害剤（スタウロスポリン）が、蛍光の変化を逆転しうることが示さ
れ、蛍光の変化がｌｃｋの酵素活性に起因することを確認した（図５）。
【実施例５】
【０１２８】
Ｒ１１０修飾ペプチド基質およびアミノペプチダーゼＭを用いたＳｅｒ／Ｔｈｒホスファ
ターゼ活性の検出：
ＳＴＰ−Ｒ−１１０によるＰＰ２Ａ活性。ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）のホスファ
ターゼ活性は、５μＭ ホスホペプチド基質ビス−ＳＴＰ−Ｒ１１０（ＲＲＡＴ（ＰＯ3）
ＶＡ（配列番号：５）−Ｒ１１０−ＡＶ（ＰＯ3）ＴＡＲＲ）、４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
、ｐＨ７．５、および0.1mg／ml BSAを含有する５０μｌ体積中で実行された。ホスファ
ターゼ反応は、プロメガ（Promega）（ウィスコンシン州、マディソン）製の酵素セリン
／スレオニンホスファターゼＰＰ２Ａを添加することによって開始された。各反応物に添
加されるＰＰ２Ａの量は、０．００７５ｎｇ（０．０１５ｍ単位）から７．５ナノグラム
（１５ｍ単位）の範囲で、１／２増分、および酵素を含有しない対照反応物で滴定した。
ホスファターゼ反応は、９６穴プレート中で室温に１０分間、実行された。
【０１２９】
ホスファターゼ反応は、ＰＰ２Ａの既知の阻害剤である、２μＭ オカダ酸（（９，１
０−デエピチオ（Deepithio）−９，１０−ジデヒドロアカンティホリシン） (ナトリウ
ム塩) )２５μｌで終了させた。終了後、２５ｍＵ／ウェルのアミノペプチダーゼＭを４
０ｍＭ トリスバッファー、ｐＨ７．５、0.1mg／ml BSA中に添加した。アミノペプチダー
ゼ反応物を９０分間、室温、２５℃でインキュベートした。実施例１におけるように蛍光
を測定した。図６における結果は、ＰＰ２Ａが基質を効果的に脱リン酸化し、蛍光が反応
における酵素の量に比例して増大したことを示す。
【０１３０】
アッセイ系におけるこの基質を用いるホスファターゼ活性の特異性もＰＰ２Ａの特異的
阻害剤（オカダ酸）を用いて、かつＰＰ２ＡではなくＰＰ１を阻害することが知られてい
るＰＰ１阻害剤−２、およびこれもＰＰ２Ａを阻害しないスタウロスポリンを用いて検証
された。本明細書中で述べられた同じアッセイプロトコールを、２ナノグラムのＰＰ２Ａ
（４ｍ単位）および５μＭのホスホペプチド基質ＳＴＰ５の存在下に用いた。阻害剤ゼロ
から１００ｎＭまでの範囲の濃度で阻害剤を反応物に含めた。図７から明らかなように、
ＰＰ２Ａによる基質の脱リン酸化反応は、濃度を上昇させたオカダ酸の存在下によっての
み阻害され、ＰＰ１阻害剤−２またはスタウロスポリンの存在下には阻害されず、ＰＰ２
Ａに対するアッセイの特異性が確認された。ＰＰ２Ａ活性を５０％阻害するために必要と
されるオカダ酸の濃度（ＩＣ50）は１ｎＭ未満であり、これはＰＰ２Ａのオカダ酸阻害に
対する既知の値と合致する。
【０１３１】
ホスファターゼＰＰ２Ａも３８４穴フォーマットで試験した。３８４プレートにおける
再現性は優れていることがわかった。
【０１３２】
ＰＰ１、ＰＰ２Ｂ、およびＰＰ２Ｃの酵素活性も同じ基質を用いて、ただし各酵素に添
加された適切な既知の共同因子とともに試験し、アッセイにおける最適な酵素活性を得た
。得られた結果は、基質の蛍光アウトプットと脱リン酸化反応との間で優れた比例を示す
。反応における酵素の量および各酵素の活性は、対応する活性剤の存在に依存した。さら
に、特異的阻害剤の添加は、対応する酵素のホスファターゼ活性を無効にした。
【実施例６】
【０１３３】
ローダミン１１０修飾ペプチド基質およびアミノペプチダーゼＩＩを用いたホスファター
ゼ活性の検出：
ＳＴＰ−Ｒ１１０によるＰＰ２Ａ活性。ＰＰ２Ａのホスファターゼ活性を、上記の実施
例５において述べられた同じ条件を用いて試験したが、例外として、ＰＰ２Ａを０．００
０００１ｍＵから０．０１ｍＵの範囲の濃度で試験し、酵素を含有しない対照反応をプラ
スした。反応は、１０分間、９６穴プレート中で室温で行い、オカダ酸（９，１０−デエ
ピチオ（Deepithio）−９，１０−ジデヒドロアカンティホリシン）で終了させた。アミ
ノペプチダーゼＭの代わりに、２５ｍＵのアミノペプチダーゼＩＩを添加し、反応物を９
０分間、室温でインキュベートした。蛍光アウトプットを既述したように測定した。図８
は、ホスファターゼ活性の増大により蛍光の増大が生じたことを示す。これらのデータは
、任意のアミノペプチダーゼを本発明において使用できることを示す。
【実施例７】
【０１３４】
Ｒ１１０修飾ペプチド基質およびアミノペプチダーゼＭを用いたチロシンホスファターゼ
活性の検出：
ＰＴＫ５−Ｒ１１０によるＣＤ４５およびＰＴＰ−１Ｂアッセイ。ホスファターゼ反応
は、組換えヒト受容体タンパク質チロシンホスファターゼであるＣＤ４５、または可溶性
チロシンホスファターゼであるＰＴＰ−１Ｂのいずれかを用いて行われた。反応は、１μ
Ｍのホスホペプチド基質ビス−ＰＴＫ５ｐ−Ｒ１１０（ＹＩＹ（ＰＯ3）ＧＡＦＫＲＲＧ
（配列番号：６）−Ｒ１１０−ＧＲＲＫＦＡＧ（ＰＯ3）ＹＩＹ）、４０ｍＭ トリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．５、0.1mg／ml BSAを含有する５０μｌ体積中で行われた。反応は、９６
穴プレート中、室温で１０分間、増大させた濃度のホスファターゼ（０〜２単位のＣＤ４
５、または０〜０．０２５単位のＰＴＰ−１Ｂ）の存在下に行われた。
【０１３５】
ホスファターゼ反応を、４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、0.1mg／ml BSA、３０
０μＭ Na3VO4、および１ｍＵ／μｌのアミノペプチダーゼＭを含有する２５μｌの溶液
で終了させた。反応物を室温でさらに９０分間インキュベートした。蛍光を実施例１で既
述されているように測定した。図９における結果は、蛍光アウトプットの増大が反応につ
き添加されたホスファターゼの量に比例していることを示す。このアッセイは、低濃度の
ホスファターゼに対してもきわめて感受性であった。同様のプロファイルが、ＹＯＰ５１
を含む他のチロシンホスファターゼにより得られた。
【実施例８】
【０１３６】
Ｒ１１０修飾ペプチド基質およびアミノペプチダーゼＭを用いたチロシンホスファターゼ
活性の検出：
ＰＴＫ５−Ｒ１１０によるＰＴＰ  １Ｂ活性。酵素チロシンホスファターゼＰＴＰ−１
Ｂによるビス−ＰＴＫ５ｐ−Ｒ１１０の脱リン酸化反応に対する種々の阻害剤の効果を試
験した。バナジン酸ナトリウム、（Na3VO4、ＰＴＰ−１Ｂの特異的阻害剤）、およびスタ
ウロスポリン（ＰＴＰ−１ＢではなくＰＫＡの既知の阻害剤）を試験した。阻害剤は、阻
害剤ゼロから５０μＭまでの範囲の濃度で反応において含めた。ホスファターゼ反応は、
ＰＴＢ−１Ｂを添加することによって開始されたが、これは各反応物に２５ｍＵ／ウェル
で添加された。酵素を含有しない対照反応も実行した。ホスファターゼ反応は一般にＰＴ
Ｐ−１Ｂについて実施例７で述べられているように行われた。
【０１３７】
ホスファターゼ反応を、Na3VO4、および２５ｍＵ／ウェルのアミノペプチダーゼＭの溶
液２５μｌで終了させた。反応物を室温で６０分間インキュベートした。蛍光を既述され
ているように測定した。図１０における結果は、ＰＴＢ−１Ｂによる基質の脱リン酸化反
応は、濃度を上昇させたNa3VO4存在下においてのみ阻害され、スタウロスポリンの存在下
には阻害されなかったことを示す。Na3VO4の濃度を上昇させることにより蛍光アウトプッ
トの減少が生じ、ＰＴＰ  １Ｂ酵素活性の阻害を示したが、スタウロスポリンの量の増大
とともに蛍光アウトプットが無変化であったため、スタウロスポリンには効果がなかった
。
【実施例９】
【０１３８】
ルシフェリン修飾ペプチド基質およびアミノペプチダーゼＭを用いたＳｅｒ／Ｔｈｒキナ
ーゼの検出：
ＬＲＲＡＳＬＧ−（ルシフェリン）によるＰＫＡアッセイ。タンパク質キナーゼアッセ
イは、室温、９６穴プレート中の５０μｌ体積中、５０μＭでのペプチド基質ＬＲＲＡＳ
ＬＧ−ルシフェリン、および実施例１において述べられたように反応バッファーにおける
タンパク質キナーゼＡの異なる酵素濃度（０．００１から１単位）で行われる。反応は、
２０分後に５分間、７０℃で加熱不活性化によって終了される。反応混合物は室温に冷却
され、４０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、および０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ中５０ｍＵ
／μｌのアミノペプチダーゼＭを含有する２５μｌの検出バッファーである。反応は、２
．５μＭの最終濃度でアクチノニンを添加することによって最適な終了の前にさらに６０
分間室温に維持される。２５μｌの安定グロー（steady glow）バッファー（プロメガ社
（Promega Corp.））中１００μｇ／ｍｌでルシフェラーゼ（プロメガ社（Promega Corpo
ration））が添加され、次いでルミネセンスが３０分時点でオリオンプレート照度計、ベ
ルトホールドディテクションシステムズ（Berthold Detection Systems）（ドイツ、フォ
ルツハイム(Pforzheim)）で測定される。酵素活性の発現は、実施例１に示されている蛍
光標識基質で述べられているものと同様であること、すなわち、酵素濃度または活性の増
大に応じてルミネセンスアウトプットの減少が予想される。
【０１３９】
本発明の異なる可能な特徴およびこれらの特徴を組合わせることができるさまざまな方
法を例示するために種々の好ましい実施形態が示され、上述されていることが理解される
。さまざまな方法で上記実施例の異なる特徴を組合わせることは別として、他の変形も本
発明の範囲内で考えられる。本発明は、上述された好まれる実施形態に限定されることは
意図されず、以下に詳述された特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図されて
いる。したがって、本発明は、文字どおりに、または同様な意味合いでこれら特許請求の
範囲の範囲内にあるすべてのほかの実施形態を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】反応物に添加されるキナーゼが滴定されたセリン／スレオニンタンパク質キナーゼアッセイからの検出アウトプットを示すグラフである。検出アウトプットは相対蛍光強度単位（ＲＦＵ）で示されている。
【図２】特定の阻害剤の存在下のセリン／スレオニンタンパク質キナーゼアッセイからのＲＦＵでの検出アウトプットを示すグラフである。
【図３】アミノメチルクマリン標識ペプチド基質を用いたセリン／スレオニンタンパク質キナーゼアッセイからのＲＦＵでの検出アウトプットを示すグラフである。
【図４】タンパク質チロシンキナーゼアッセイからのＲＦＵでの検出アウトプットを示すグラフである。
【図５】特定の阻害剤の存在下のタンパク質チロシンタンパク質キナーゼアッセイからのＲＦＵでの検出アウトプットを示すグラフである。
【図６】反応物に添加されるホスファターゼが滴定されたセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼアッセイからのＲＦＵでの検出アウトプットを示すグラフである。
【図７】特定の阻害剤の存在下のセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼアッセイからのＲＦＵでの検出アウトプットを示すグラフである。
【図８】図１−７で使用されているアミノぺプチダーゼとは異なるアミノぺプチダーゼ（アミノぺプチダーゼＩＩ）を用いたセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼアッセイからのＲＦＵでの検出アウトプットを示すグラフである。
【図９】反応物に添加されるホスファターゼが滴定されたタンパク質チロシンホスファターゼアッセイからのＲＦＵでの検出アウトプットを示すグラフである。
【図１０】特定の阻害剤の存在下のタンパク質チロシンホスファターゼアッセイからのＲＦＵでの検出アウトプットを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009106294.tif 000013
【図９】
2009106294.tif 000014
【図１０】
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【配列表】
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