(57)【要約】【課題】本発明は人工真皮シワモデルの提供を課題とする。【解決手段】本発明は、線維芽細胞を含む収縮コラーゲンゲルでシワ形成された人工真皮シワモデルであって、培養液中で少なくとも３日間にわたり連続屈曲ストレス負荷にかけられたことによりシワ形成を含む真皮の変形が誘導されたことを特徴とする、人工真皮シワモデル、その製造方法及び抗シワ薬剤評価方法を提供する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞を含む収縮コラーゲンゲルでシワ形成された人工真皮シワモデルであって、培養液中で少なくとも３日間にわたり連続屈曲ストレス負荷にかけられたことによりシワ形成を含む真皮の変形が誘導されたことを特徴とする、人工真皮シワモデル。
【請求項２】
培養液中で少なくとも５日間にわたり連続屈曲ストレス負荷にかけられたことによりシワ形成を含む真皮の変形が誘導されたことを特徴とする、請求項１記載の人工真皮シワモデル。
【請求項３】
シワ形成された人工真皮シワモデルの調製方法であって、
コラーゲンゲル中に線維芽細胞を含む真皮モデルを用意し、
当該真皮モデルを培養液中で少なくとも３日間にわたり連続屈曲ストレス負荷にかけることにより当該真皮モデルにおいてシワ形成を含む真皮の変形を誘導せしめる、
ことを含んでなる方法。
【請求項４】
前記連続屈曲負荷を少なくとも５日間にわたり行う、請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の人工真皮シワモデルを用い、シワ形成を含む真皮の変形に対する効果を指標とする抗シワ効果を示す薬剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養皮膚シワモデル、その製造方法及びそれを利用して抗シワ薬剤評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化は全身の臓器で進行しているが、その中でも目で見ることができる皮膚、とりわけ特に意識が集中しやすい顔面については、老化とともに発生するシワ及び小ジワが、世の多くの中高年齢者、とりわけ女性を悩ませている。従来、シワ改善用化粧料の必要性が叫ばれてきていたが、老化及びシワに関するメカニズムについて明らかではない部分が多かったため、従来の化粧料においては、ムコ多糖類やコラーゲンなどの生化学製品および合成高分子製品を配合してシワ改善のための水分保持に努めるという方法を選択してきたにすぎない。しかしながら、上記の方法だけでは、皮膚の老化及びシワの発生を充分に防止することができない。従って、シワ形成のメカニズムを解明し、より効果的なシワ防止・改善剤を見出すことが所望されている。
【０００３】
シワ形成のメカニズムの解明やシワ防止・改善剤のスクリーニングのため、マウス、ラットといった実験動物を乾燥雰囲気や紫外線暴露など、シワの形成し易いに環境に晒して人工的に皮膚にシワを形成させ、シワ部分の組織を解剖学的に調べたり、形成されたシワ部位に被験物質などを適用し、シワ防止・改善効果を観察する方法が行われている。しかしながら、この方法は動物愛護等の見地から見直しがせまられている。生体に近い性質・挙動を示すシワ形成皮膚モデルがあれば、このような実験動物の使用を回避しながら、シワ形成のメカニズムの解明や、シワ防止・改善に有効な薬剤をスクリーニングすることが可能となり、有利である。
【０００４】
【非特許文献１】Experimental Cell Research 247, 320-328(1999)
【非特許文献２】THE JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, vol 97 No.5 Novem-ber 1991, P898-P902
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
人の顔面を観察すると、表情変化によって皮膚の内部にある筋肉が収縮し、その変形が皮膚表面にシワとして刻まれることが知られている。そのシワは、筋肉の収縮により、皮膚が局所的に折り畳まれる屈曲刺激が繰り返されることが原因で起こっている。しかし、この連続的な屈曲刺激が皮膚にいかなる影響を及ぼし、シワ形成に繋がるかを解析するための適した装置がこれまでなく、連続屈曲刺激を培養皮膚等に負荷する装置の開発が必要であった。本発明者はこのような装置の考案に成功し、そしてそのような装置を用い、シワ形成を含む真皮の変形が誘導された人工真皮シワモデルを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願は以下の発明を包含する：
（１）線維芽細胞を含む収縮コラーゲンゲルでシワ形成された人工真皮シワモデルであって、培養液中で少なくとも３日間にわたり連続屈曲ストレス負荷にかけられたことによりシワ形成を含む真皮の変形が誘導されたことを特徴とする、人工真皮シワモデル。
（２）培養液中で少なくとも５日間にわたり連続屈曲ストレス負荷にかけられたことによりシワ形成を含む真皮の変形が誘導されたことを特徴とする、（１）の人工真皮シワモデル。
（３）シワ形成された人工真皮シワモデルの調製方法であって、
コラーゲンゲル中に線維芽細胞を含む真皮モデルを用意し、
当該真皮モデルを培養液中で少なくとも３日間にわたり連続屈曲ストレス負荷にかけることにより当該真皮モデルにおいてシワ形成を含む真皮の変形を誘導せしめる、
ことを含んでなる方法。
（４）前記連続屈曲負荷を少なくとも５日間にわたり行う、（３）の方法。
（５）（１）又は（２）の人工真皮シワモデルを用い、シワ形成を含む真皮の変形に対する効果を指標とする抗シワ効果を示す薬剤の評価方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、実験動物の使用を回避しながら、シワ形成のメカニズムの解明や、シワ防止・改善に有効な薬剤をスクリーニングすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
人工真皮にシワを形成して人工真皮シワモデルを形成するためには、前述のような既存の連続屈曲ストレス負荷装置等を用いて、シワを形成したい人工真皮に連続した屈曲力学的ストレスを負荷する。これら動作の際には、シワの形成を促進するために人工真皮を培養液に浸すことが好ましい。そのため、培養液を溜めておくための器具として、図２に示すような全体がシリコンでできている既存のシリコンチャンバー６を用いることが好ましい。
【０００９】
シリコンチャンバー６は、図において左右の側壁８と、この左右方向に伸縮し易いように側壁８に比べて薄く形成された側壁９と、人工真皮を観察し易いように略透明なシリコン薄膜でできた、底を塞ぐ据置面７とからなり、それによって培養液を溜めるチャンバーを形成していてよい。さらに、左右の側壁８には、連続屈曲ストレス負荷装置の固定ピン（図示略）への取り付け用に据置面７に対して垂直方向に貫通孔１０が設けられてよい。
【００１０】
人工真皮モデル保持器具は、上記のようなシリコンチャンバー６に取り付け、培養液に浸しながら人工真皮モデルに連続した屈曲力学的ストレスを負荷する際に、人工真皮モデルがずれて移動してしまわないように保持するものである。この装置は、シワ形成にのみ用いるものではなく、生体組織で連続的に屈曲刺激が負荷されたときに起こる生体反応を解析するために用いることができる。以下、本発明に係る人工真皮モデルの作成に好適な人工真皮モデル保持器具について説明する。
【００１１】
図１を参照すると、当該人工真皮モデル保持器具１は、同様の形状であって離間して配置された２つの本体部２と、人工真皮モデルがずれて移動してしまわないように係止する保持手段である複数の係止針３と、２つの本体部２を連結する略透明なシリコン薄膜等からなる弾力性のある可撓性シート４とを有している。係止針３は本体部２の上面縁部付近に一列に配置され、可撓性シート４は係止針３が配置された本体部２の縁部が向かい合うように２つの本体部２を連結している。
【００１２】
本体部２は、好ましくは、ステンレスである金属製のメッシュからできており、連続した屈曲力学的ストレスの負荷動作中であっても、メッシュの間及び本体部２間の略透明な可撓性シート４を通して、人工真皮モデルを観察等することが可能となっている。係止針３は好ましくは、本体部２と同じ材質から成る。２つの本体部２の係止針３の配置されたそれぞれの表面及び可撓性シート４は、人工真皮モデルを支持するよう一連の略同一の平面を形成し、本体部２の一部はシリコンチャンバー６の側壁８に後述するよう嵌合するコの字型の屈曲部５が形成されている。
【００１３】
図３は、人工真皮モデル保持器具１をシリコンチャンバー６に固定クリップ１１を用いて取り付けた状態の上面図であり、図３の線Ａ−Ａにおける断面図を図４に示す。
【００１４】
人工真皮モデル保持器具１のシリコンチャンバー６への取り付け方法は、各本体部２の屈曲部４をシリコンチャンバー６の対応する側壁８に嵌るように被せ、さらに、好ましくはステンレス製の固定クリップ１１によって、その弾性を利用し、人工真皮モデル保持器具１が屈曲力学的ストレスの負荷動作中にシリコンチャンバー６から外れたりずれたりしないように挟んで止めている。この状態で人工真皮モデル１２を、２つの本体部２間に跨って配置されるよう、それぞれの係止針３に突き刺すようにセットし、そして場合によっては培養液等でシリコンチャンバー６内を満たす。
【００１５】
上記のように人工真皮モデル保持器具１及び人工真皮モデル１２が取り付けられた状態で、シリコンチャンバー６の貫通孔１０に、人工真皮モデルの連続屈曲ストレス負荷装置の固定ピン（図示略）に通してシリコンチャンバー６をセットする。この状態で連続屈曲ストレス負荷装置が連続した屈曲力学的ストレスの負荷動作を開始すると、シリコンチャンバー６の屈曲動作に応じて２つの本体部２が互いに対して接近及び離反を繰り返す。
【００１６】
動作開始前は図４に示すように可撓性シート４に支持されていた柔らかい人工真皮モデル１２が、本体部２が互いに接近すると、重力によって図５に示すように本体部２間で下方に撓んで屈曲又は湾曲する。この時、可撓性シート４も同様に下方に撓んで屈曲又は湾曲するが、可撓性シート４の方が人工真皮モデル１２よりも弾性が高いため、変形後の形状が常に一定で安定しており、従ってその形状に沿った一定の形状変化を人工真皮モデル１２に繰り返し与えることができる。一方、本体部２が互いに離反すると、人工真皮モデル１２の屈曲又は湾曲が元に戻る。これらを繰り返すことで、屈曲又は湾曲した部位周辺にシワが形成される。これら動作の間、人工真皮モデル１２は係止針３によって突き刺されているため、大きな変位を与えてもずれて移動することなく保持される。
【００１７】
係止針３は一列に配置したがその配置に限定されることはない。また、保持手段として係止針を用いているが、このように固定可能であればフック等その他のものを用いてもよい。さらに、本実施形態においては、２つの本体部２を可撓性シート４によって連結したが、人工真皮モデル１２を屈曲又は湾曲させる目的を達成するためには、可撓性シート４によって連結されていなくても目的は達せられる。逆に、予め定められた位置でより正確に繰り返し屈曲させたい場合には、可撓性シートに切り目を入れて湾曲せずに屈曲するようにするか、その代わりにヒンジ等を用いることによって鋭角に屈曲するようにすることも可能である。そして、前述したようなシリコンチャンバー６に本発明による人工真皮モデル保持器具１を取り付け、その上に人工真皮モデル１２をセットしたこの組合せを複数個用意し、これら複数セットを連続屈曲ストレス負荷装置に同時に取り付けられるよう固定ピンの数を増やすなど改良することで、同時にいくつもの人工真皮モデル１２に連続した屈曲力学的ストレスを負荷し、シワを形成することが可能となる。
【００１８】
線維芽細胞を含む収縮コラーゲンゲルは、線維芽細胞を含むコラーゲン溶液を例えばデッシュ内においてゲル化させ、その後収縮させるといった周知の方法で作製できる（J.Biol.Chem.1994, Nov.11; 269（45）: 28193-9）。コラーゲン溶液中のコラーゲン濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは0.01〜１％、より好ましくは0.1％程度とする。コラーゲンとしてはゲル化する精製Ｉ型コラーゲンであれば、由来する動物種や採取された場所に限定されない。また、酸抽出されたコラーゲンの方がより適するが、ペプシン処理されたコラーゲンでも使用可能である。線維芽細胞はコラーゲン溶液10ｍｌ当たり１×104〜106個、より好ましくは１×106個程度を含ませるとよい。線維芽細胞としては真皮由来のヒト線維芽細胞が特に好ましいが、その他の哺乳動物細胞、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシの真皮由来の線維芽細胞などであってもよい。
【００１９】
このようにして調製した収縮コラーゲンゲルを上記真皮モデル保持器具に載せ、上記連続屈曲ストレス負荷装置に搭載し、連続屈曲ストレス負荷にかける。連続屈曲ストレス負荷の際、収縮コラーゲンゲルの乾燥かつ線維芽細胞の死滅を防ぐため、収縮コラーゲンゲルを培養液に浸しておく。培養液としては特に限定されるものではないが、ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地などが使用できる。連続屈曲ストレス負荷の作業は上記連続屈曲ストレス負荷装置にて、0.5〜10サイクル／分、好ましくは１〜５サイクル／分、より好ましくは２サイクル／分の往復運動速度で、３日以上、好ましくは５日以上、より好ましくは７〜10日間にわたり行なってよい。かかる連続屈曲ストレス負荷により収縮コラーゲンゲルに折り目が形成され、かくてシワを含む真皮の変形が誘導された人工真皮シワモデルが形成できる。
【００２０】
このようにして調製した人工真皮シワモデルは、抗シワ効果を示す薬剤の評価、例えばそのような薬剤のスクリーニングに使用できる。例えば、抗シワ薬剤の候補薬剤を、このシワモデルのシワなどの変形の誘導された部位に適用し、コントロールと比較して、シワ等の変形の改善度を検討したり、あるいは上記連続屈曲ストレス負荷をかかる候補薬剤の存在下でかけ、コントロールと比較して、人工真皮シワモデルのシワ等の変形の形成が防止されるかどうかを検討したりすることができる。本発明の人工真皮シワモデルを使用すれば、動物試験などを行なうことなく抗シワ効果を示す薬剤を評価・スクリーニングすることが可能となる。
【００２１】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００２２】
真皮モデルの作製方法
線維芽細胞の培養方法
真皮由来の線維芽細胞は三光純薬株式会社等から市販されており、包皮または胸皮膚由来のものが購入できる。細胞は、バイアルで供給されるが、そのまま使用せず、細胞のストックを作製して繰り返し実験が可能となるように準備する必要がある。細胞のストックは、購入後、細胞を増殖させ、106個ずつ凍結保存し、作製する。試験には、その一本を溶かし、牛胎児血清（fetal bovine serum; FBS）を10%濃度に含有するDMEM培地を用いて培養し、必要な細胞数を確保する。線維芽細胞は、通常、コンフルエントになった直後ぐらいに実験に用いる。細胞をトリプシン-EDTA処理によって浮遊させ、滅菌ガーゼまたは専用の培養用ろ過フィルターを用いて、ごみや細胞の凝集物を除去し、均一な細胞懸濁液を調製した。
【００２３】
収縮コラーゲンゲル（真皮モデル）の作製方法
収縮コラーゲンゲルは１個あたり１×106cells の線維芽細胞を含む0.1%コラーゲン溶液10mLを60mmデッシュ内でゲル化させ、その後収縮させて作製した。以下に10個分（100mL）の作製方法を示す。[0.3%コラーゲン酸性溶液；高研]33.3mL、[10×PBS溶液] 3.3mL、[1000×アスコルビン酸溶液] 100μLを氷冷しながら混合し、中性で等張のコラーゲン溶液を調製した。コラーゲン溶液は粘度が高いので、ピペッティング等の操作で泡が立つと消えにくいので注意する必要がある。この溶液にさらに、線維芽細胞１×105cellsを含む[10%FBS含有DMEM] 63.3mLを混合して線維芽細胞含有コラーゲン溶液100mLを作製した。60mmデッシュに10mLずつ分注して、37℃ CO2インキュベーター内で１時間静置してゲル化させた。ゲル化した後、ゲルをデッシュの壁面より剥離した。ゲル化と同時にゲル収縮が始まるので、ゲルの周囲には培地が離水し始めるので、簡単に剥離できる。ゲルを同心円状に収縮させるため、インキュベーター内で回転台にのせて30〜40 rpmで回転させながら培養した。培地交換ができる程度までゲルが収縮したら、離水した培地を、アスコルビン酸を含有する（final 250μM）[10% FBS含有DMEM]に交換し、培養を継続し、１円玉ぐらいまで収縮させた。
実験には、ゲル収縮の安定化するゲル作製後48-72時間後にスタートした。
【００２４】
線維芽細胞を死滅させた収縮コラーゲンの作製方法
作製から４８時間後、細胞を死滅させるため、収縮コラーゲンゲルを滅菌milli Q水に浸潤させ、１時間毎に３回交換した。その後、37℃で２１時間低張処理して細胞を死滅させた。
【００２５】
連続屈曲試験によるシワ形成
シワ形成を誘導することを目的として、連続伸屈曲ストレス負荷培養装置を用い、2 cycles/minの頻度で、培養を開始した。連続屈曲を7日間また10日間継続負荷した。
【００２６】
図６に７日間、細胞を生存させた状態で連続屈曲ストレス負荷にかけることで折じわの形成された人工真皮シワモデル（細胞（＋））を示す。細胞（−）は細胞を死滅させた状態で連続屈曲ストレス負荷にかけることで折じわの形成された人工真皮シワモデルである。この図から、ゲル内の細胞を死滅させると、連続屈曲によるゲルの収縮変化が起きにくいことがわかる。また、細胞を死滅させても折じわは形成されるが、細胞が生存していると、折じわとは異なる周囲の変形を伴う深いシワの形成が確認された。このように、細胞が生存している状態の方がシワの形成を誘導する真皮の変形が促進され、深い折じわが形成できるため、人工真皮シワモデルの形成には、細胞を死滅させないことが好ましいことが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明による人工真皮モデル保持器具１の斜視図である。
【図２】公知のシリコンチャンバー６の斜視図である。
【図３】本発明による人工真皮モデル保持器具１をシリコンチャンバー６に固定クリップ１１を用いて取り付けた状態での上面図である。
【図４】人工真皮モデルを屈曲させる前の図３の線Ａ−Ａにおける断面図である。
【図５】人工真皮モデルを屈曲させた後の図３の線Ａ−Ａにおける断面図である。
【図６】連続屈曲ストレス負荷にかけることで折じわの形成された人工真皮シワモデル。
【符号の説明】
【００２８】
１    保持器具
２    本体部
３    係止針
４    可撓性シート
６    シリコンチャンバー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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