(57)【要約】      （修正有）【課題】シス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを提供する。【解決手段】下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡからなるシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡである。（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。（ｂ）特定の塩基配列からなるＤＮＡ。（ｃ）ｂとは異なる特定の塩基配列からなるＤＮＡ。（ｄ）特定の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡからなるシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項３】
請求項２に記載のプラスミドが導入された宿主細胞。
【請求項４】
前記宿主細胞は酵母細胞である請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載の宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞が産生したシス−アコニット酸デカルボキシラーゼを回収する工程と、を含むシス−アコニット酸デカルボキシラーゼの製造方法。
【請求項６】
微生物を用いたイタコン酸の製造方法であって、請求項３又は請求項４に記載の宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞が生成したイタコン酸を回収する工程と、を含むイタコン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼの製造方法、及び、イタコン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イタコン酸は不飽和基を有する二価の水溶性有機酸であり、その構造から重合や共重合によって線状高分子を形成できる特性がある。また、その安全性も高いことから、合成樹脂や合成繊維、接着剤や印刷用インキ等、工業製品の原料や添加剤として幅広く利用されている。イタコン酸は、Aspergillus terreus、Aspergillus itaconicusのような糸状菌や、Candida tsukubaensisのような酵母において生産できることが知られている。イタコン酸の工業生産においてはもっぱら生育速度の観点からA. terreusが使用されている。より効率的なイタコン酸製造のため、イタコン酸高性生産菌の開発が求められているが、イタコン酸高生産菌の育種は、変異原性物質による処理や紫外線照射等の古典的なランダム変異導入法に頼っているのが現状である（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
Bentleyらは、A. terreusにおいて、クエン酸回路で生成するシス−アコニット酸からシス−アコニット酸デカルボキシラーゼによりイタコン酸が生合成されるという説を提唱した（例えば、非特許文献１参照）。また、その後、岡部らにより、A. terreus由来のシス−アコニット酸デカルボキシラーゼタンパク質が単離精製されている（例えば、非特許文献２参照）。
【特許文献１】特開平６−３８７７４号公報
【非特許文献１】Bentley, R. and Thiessen C.P., J. Biol. Chem. 226: 703-720 (1957)
【非特許文献２】Dwiarti L., Yamane K., Yamatani H., Kahar P., Okabe M., J. Biosci. Bioeng. 94: 29-33 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡについては、多数の研究者の努力にも関わらず、単離同定がなされておらず、又、その遺伝子情報は全く得られていなかった。これは、遺伝子の単離作業の最初の段階において必要とされるアミノ酸配列情報の取得が、その酵素の不安定さのために困難であったのも一因である。
本発明は、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ及びこれを用いたイタコン酸の効率的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の態様は、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡからなるシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡである。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０００６】
また本発明の第２の態様は、前記シス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドである。
また本発明の第３の態様は、前記プラスミドが導入された宿主細胞である。前記宿主細胞は酵母細胞であることが好ましい。
【０００７】
また本発明の第４の態様は、前記宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞が産生したシス−アコニット酸デカルボキシラーゼを回収する工程とを含むシス−アコニット酸デカルボキシラーゼの製造方法である。
更に本発明の第５の態様は、微生物を用いたイタコン酸の製造方法であって、前記宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞が生成したイタコン酸を回収する工程とを含むイタコン酸の製造方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子とこれを用いたイタコン酸の効率的な製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のシス−アコニット酸デカルボキシラーゼ（以下、ＣＡＤと略記することがある）をコードするＤＮＡは、下記表１に示す配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１０】
【表１】
2009027999.tif 000002
【００１１】
また、本発明のＣＡＤをコードするＤＮＡは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＣＡＤ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００１２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換の具体例としては、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１６番目のSerの他のアミノ酸（例えばAla）への置換、２３６番目のHisの他のアミノ酸（例えばTyr）への置換、２８９番目のLeuの他のアミノ酸（例えばTyr）への置換、２９０番目のTyrの他のアミノ酸（例えばLeu）への置換、３０５番目のAsnの他のアミノ酸（例えばLys）への置換、３０８番目のGlyの他のアミノ酸（例えばArg）への置換、３２６番目のHisの他のアミノ酸（例えばTyr）への置換、３７１番目のSerの他のアミノ酸（例えばAla）への置換、３９４番目のSerの他のアミノ酸（例えばPro）への置換、３９６番目のGlnの他のアミノ酸（例えばHis）への置換、４２２番目のIleの他のアミノ酸（例えばVal）への置換、４２５番目のSerの他のアミノ酸（例えばThr）への置換、４６７番目のGlyの他のアミノ酸（例えばSer）への置換、４７５番目のSerの他のアミノ酸（例えばThr）への置換、等を挙げることができる。
特に、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列としては、後述の表５（配列番号９）に記載のアミノ酸配列を好ましく挙げることができる。
【００１３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡは、既知のアミノ酸配列からそれをコードするＤＮＡを得る従来の方法をそのまま用いて得ることができる。例えば、前記アミノ酸配列からＤＮＡの塩基配列を決定して得ることができる。また、前記アミノ酸配列に対応する部分塩基配列に基づき、ＰＣＲにより全塩基配列を得ることができる。
【００１４】
また、本発明のシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡは下記表２に示す配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡである。
【００１５】
【表２】
2009027999.tif 000003
【００１６】
また、本発明のシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡは下記表３に示す配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡである。
【００１７】
【表３】
2009027999.tif 000004
【００１８】
配列番号３に記載の塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列からイントロン領域を除外した塩基配列である。配列番号３に記載の塩基配列は、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のｃＤＮＡ塩基配列である。
【００１９】
配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ＣＡＤをコードするゲノム配列であることから、アミノ酸配列に翻訳されないイントロン領域を含んでいる。このようなイントロン領域を含むＤＮＡをAspergillus terreus等の糸状菌以外の宿主細胞において発現させた場合には、正常に機能するＣＡＤを得ることができない可能性がある。従って糸状菌以外の宿主細胞において正常に機能するＣＡＤを得るためには、イントロン領域を除いた配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを発現させることが好ましい。
【００２０】
また、本発明のシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡは、配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、６５℃で４×ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーション、次いで６５℃で1時間０．１×ＳＳＣでの洗浄という条件をあげることができる。
【００２１】
配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、上記の配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列をもとにＰＣＲプライマーを設計し、種々のイタコン酸生産菌に由来する染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことで得ることができる。
適用可能なイタコン酸生産菌については特に制限はなく、種々のアスペルギルス属糸状菌や酵母を用いることができる。具体的には種々のAspergillus tereus株、Aspergillus itaconicus株、及び、Candida tsukubaensis等のイタコン酸生産菌を挙げることができる。
【００２２】
シス−アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＣＡＤ）をコードするＤＮＡを含むプラスミドは、上記のＣＡＤをコードするＤＮＡを、公知の方法でプラスミドに挿入することで得ることができる。本発明におけるプラスミドとしては特に制限なく公知のプラスミドを用いることができ、プラスミドを導入する宿主に応じて適宜選択することができる。例えば、宿主が大腸菌である場合にはｐＥＴ系発現ベクター等を用いることができ、宿主が酵母の場合にはＹＥｐ系プラスミド等を用いることができる。また、本発明においてはシャトルベクターを用いることもでき、具体的には、大腸菌と酵母で機能するｐＡＵＲ１２３、ｐＹＥＳ２等を挙げることができる。
特に、本発明のＣＡＤをコードするＤＮＡを大腸菌以外の微生物において発現させる場合には、ＤＮＡ組換えと発現の観点から、シャトルベクターを用いることが好ましい。
【００２３】
ＣＡＤをコードするＤＮＡを含むプラスミドを有する宿主細胞は、ＣＡＤをコードするＤＮＡを含むプラスミドを、宿主細胞に適した方法で宿主細胞に導入することで得ることができる。本発明における宿主細胞としては特に制限なく公知の宿主細胞を用いることができ、例えば、糸状菌、大腸菌、酵母、放線菌等を用いることができる。本発明における宿主細胞としては、安定した発現結果が得られる遺伝子発現系が確立されている真核微生物であることから、酵母細胞であることが好ましい。
【００２４】
本発明のシス−アコニット酸デカルボキシラーゼの製造方法は、ＣＡＤをコードするＤＮＡを含むプラスミドが導入された宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞が産生したＣＡＤを回収する工程とを含む。
宿主細胞を培養する工程においては、上述した各宿主細胞に適した方法で宿主細胞を培養すればよい。
ＣＡＤを回収する工程は、タンパク質画分を抽出する工程を少なくとも含むことができる。抽出したタンパク質画分は、そのままＣＡＤ粗酵素液として用いることができる。また、例えば、塩析、電気泳動、種々のクロマトグラフィー（例えば、アフィニティーカラム、イオン交換カラム、ゲル濾過カラム等）を用いた標準的な方法によりＣＡＤを精製することができる。
【００２５】
本発明においては、タンパク質画分を抽出する工程に先立って、宿主細胞を破壊する工程を設けてもよい。また、宿主細胞において産生されたＣＡＤが培養上清に分泌される場合には、宿主細胞を破壊することなく、培養上清からＣＡＤを含むタンパク質画分を抽出することができる
【００２６】
本発明の微生物を用いたイタコン酸の製造方法は、ＣＡＤをコードするＤＮＡを含むプラスミドが導入された宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞が生成したイタコン酸を回収する工程とを含む。
宿主細胞を培養する工程は、ＣＡＤの製造方法と同様に行うことができる。
【００２７】
また、宿主細胞が生成したイタコン酸の回収工程は、微生物の培養によって生成する有機酸類をその培養物から分離するのに用いられる方法を特に制限なく用いることができる。例えば、遠心分離や濾過等による菌体の分離、上清の濃縮、各種のカラムクロマトグラフィー、活性炭処理、濾過、及び、再結晶等の手段を適宜組合せて用いることにより、分離、精製することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【００２９】
（実施例１）
精製されたシス−アコニット酸デカルボキシラーゼ標品は、J. Biosci. Bioeng. Vol.94, 29-33(2002)に記載の方法により、A. terreus TN484-M1株から得た。具体的には、菌体からタンパク質画分を抽出し、硫安分画、イオン交換カラム（ＤＥＡＥトヨパール、東ソー社製）処理を行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製を行った。シス−アコニット酸デカルボキシラーゼは通常の緩衝液中では不安定であるため、次のアミノ酸配列解析に供する直前まで、常に高濃度（終濃度３０％）のグリセリンを添加しておいた。
【００３０】
得られたシス−アコニット酸デカルボキシラーゼ標品に対して、一般的なアミノ酸シーケンサを用いてＮ末端から９残基分のアミノ酸配列を決定した。また、本標品をトリプシン処理した後、ＨＰＬＣにて分離・精製したペプチド断片についてアミノ酸シーケンサを用いて内部アミノ酸配列の部分配列を決定した。決定したアミノ酸配列を下記表４に示した。
尚、カッコ内は複数のアミノ酸残基候補があった場合のアミノ酸残基を示す。
【００３１】
【表４】
2009027999.tif 000005
【００３２】
決定されたアミノ酸配列と類似のアミノ酸配列を有するタンパク質を、Aspergillus terreus Database（Broad Institute）に登録されたタンパク質から抽出したところ、Ｎｏ．ＡＴＥＧ＿０９９７１として登録されたタンパク質がシス−アコニット酸デカルボキシラーゼに該当することが分かった。下記表５にデータベースに登録されたアミノ酸配列（配列番号９）を示した。
【００３３】
【表５】
2009027999.tif 000006
【００３４】
表５中、二重下線はＮ末端アミノ酸配列と、下線は内部アミノ酸配列と一致したアミノ酸配列を表す。また、完全一致していない部分はデータベース構築に用いられた株（ＮＩＨ２６２４）とシス−アコニット酸デカルボキシラーゼ標品を得た株（ＴＮ４８４−Ｍ１）とが異なるため、またはアミノ酸シーケンシングの技術的制限のためと考えられる。
【００３５】
配列番号９のアミノ酸配列に対応するＤＮＡのゲノム塩基配列を、上記データベースから取得し、その塩基配列を基にＣＡＤをコードする塩基配列に加えて、３’側及び５’側の非翻訳領域をも含むゲノム塩基配列に対応する下記表６に記載のＰＣＲプライマーセットを設計した。このＰＣＲプライマーセットを用いて、常法により調製したAspergillus terreus ＩＦＯ６３６５株およびＴＮ４８４−Ｍ１株の染色体ＤＮＡを鋳型として、それぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃、２分の後、９５℃  ３０秒、５５℃  ４０秒、６８℃  ２分２０秒を３０サイクル行い、そして最後に６８℃で５分であった。
【００３６】
【表６】
2009027999.tif 000007
【００３７】
ＩＦＯ６３６５株およびＴＮ４８４−Ｍ１株のいずれの株からも、非翻訳領域を含むＤＮＡ配列（配列番号１６）が得られた。また、このＤＮＡ配列のＯＲＦは、配列番号１６の塩基配列中で５１０番目から始まるＡＴＧから、２０３８番目で終了するＴＡＡまでであって、上記表２に示した配列番号２に記載の塩基配列であった。
ＯＲＦとして得られた塩基配列（配列番号２）はデータベースに収載された塩基配列と若干の相違が見られたが、これは由来する株の違いのためと考えられる。
【００３８】
上記で得られた配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡはイントロンを含むゲノム塩基配列であることから、次に、イントロンを含まないＤＮＡを得るために下記表７に記載のＰＣＲプライマーを設計し、上記で得られた配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、
９５℃  ２分の後、９５℃  ３０秒、５５℃  ４０秒、６８℃  ２分を３０サイクル、そして最後に６８℃で５分であった。
【００３９】
配列番号１２のフォワードプライマーと配列番号１３のリバースプライマーとでエキソン１を含むＤＮＡ領域を増幅した。配列番号１２のフォワードプライマーには制限酵素ＫｐｎＩの認識部位を付加し、配列番号１３のリバースプライマーの末端にはエキソン２の５’領域の一部を付加した。
また、配列番号１４のフォワードプライマーと配列番号１５のリバースプライマーとでエキソン２を含むＤＮＡ領域を増幅した。尚、配列番号１５のリバースプライマーには制限酵素ＸｈｏＩの認識部位を付加した。
【００４０】
得られたそれぞれのＰＣＲ産物をカラム精製（GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit、GEヘルスケア社製）して混合した後、配列番号１２のフォワードプライマーと配列番号１５のリバースプライマーとを用いて、９５℃  ２分の後、９５℃  ３０秒、５５℃  ４０秒、６８℃  ２分２０秒を３０サイクル、そして最後に６８℃で５分の条件でＰＣＲを行い、ＣＡＤをコードするゲノム塩基配列からイントロンを除いた塩基配列を含むシス−アコニット酸デカルボキシラーゼ発現ＤＮＡを得た。
【００４１】
【表７】
2009027999.tif 000008
【００４２】
上記でシス−アコニット酸デカルボキシラーゼ発現ＤＮＡを、制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩにて処理し、同制限酵素で処理したプラスミドｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社製）に常法により挿入し、ＣＡＤをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＡＵＲ−ＣＡＤ１を得た。
【００４３】
プラスミドｐＡＵＲ−ＣＡＤ１を、酵母細胞（Saccharomyces cerevisiae ＩＮＶＳｃ１）に、リチウム法により導入し、ｐＡＵＲ−ＣＡＤ１が導入された酵母細胞Ｓｃ−ＣＡＤ１を得た。
【００４４】
得られた酵母細胞Ｓｃ−ＣＡＤ１をＹＰＤ培地にて３日間培養した。次いで、
超音波処理により細胞を破砕し、遠心分離により水溶性画分を回収することにより粗酵素液を調製した。
【００４５】
上記により得られた粗酵素液を用いて、J. Bio. Chem. Vol.226, 703-720(1957)に記載の方法により、シス−アコニット酸デカルボシキラーゼの酵素活性をイタコン酸の生成活性として測定した。具体的には、粗酵素液にシス−アコニット酸を最終濃度が８ｍＭとなるように添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで遊離したイタコン酸をＨＰＬＣ（カラム： Shim-pack SCR-102H（8.0×300mm、島津製作所社製）、溶媒：０．１%リン酸溶液、温度：６０℃、流速：１．５ｍｌ／分、検出波長：２１０ｎｍ）で定量した。
尚、コントロールにはＣＡＤをコードするＤＮＡを挿入していないｐＡＵＲ１２３が導入された酵母細胞を用いた。結果を表８に示した。
【００４６】
【表８】
2009027999.tif 000009
【００４７】
表８から、酵母細胞Ｓｃ−ＣＡＤ１から得られた粗酵素液においては、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼの酵素活性が大幅に上昇していることが分かる。すなわち、酵母細胞Ｓｃ−ＣＡＤ１において発現したＤＮＡはシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡであることが分かる。
【００４８】
以上より、本発明によりシス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡが得られた。また、該ＤＮＡを発現させた酵母細胞によりイタコン酸をより効率的に製造することができる。
[配列表]
SEQUENCE LISTING
<110>  Shizuoka University
<120>  cis-aconitic acid decarboxylase gene, cis-aconitic acid 
decarboxylase , method of producing cis-aconitic acid 
decarboxylase, and method of producing itaconic acid
<130>  7008K-PK08
<160>  16    
<170>  PatentIn version 3.4
<210>  1
<211>  490
<212>  PRT
<213>  Aspergillus terreus
<400>  1
Met Thr Lys Gln Ser Ala Asp Ser Asn Ala Lys Ser Gly Val Thr Ser 
1               5                   10                  15      
Glu Ile Cys His Trp Ala Ser Asn Leu Ala Thr Asp Asp Ile Pro Ser 
20                  25                  30          
Asp Val Leu Glu Arg Ala Lys Tyr Leu Ile Leu Asp Gly Ile Ala Cys 
35                  40                  45              
Ala Trp Val Gly Ala Arg Val Pro Trp Ser Glu Lys Tyr Val Gln Ala 
50                  55                  60                  
Thr Met Ser Phe Glu Pro Pro Gly Ala Cys Arg Val Ile Gly Tyr Gly 
65                  70                  75                  80  
Gln Lys Leu Gly Pro Val Ala Ala Ala Met Thr Asn Ser Ala Phe Ile 
85                  90                  95      
Gln Ala Thr Glu Leu Asp Asp Tyr His Ser Glu Ala Pro Leu His Ser 
100                 105                 110         
Ala Ser Ile Val Leu Pro Ala Val Phe Ala Ala Ser Glu Val Leu Ala 
115                 120                 125             
Glu Gln Gly Lys Thr Ile Ser Gly Ile Asp Val Ile Leu Ala Ala Ile 
130                 135                 140                 
Val Gly Phe Glu Ser Gly Pro Arg Ile Gly Lys Ala Ile Tyr Gly Ser 
145                 150                 155                 160 
Asp Leu Leu Asn Asn Gly Trp His Cys Gly Ala Val Tyr Gly Ala Pro 
165                 170                 175     
Ala Gly Ala Leu Ala Thr Gly Lys Leu Leu Gly Leu Thr Pro Asp Ser 
180                 185                 190         
Met Glu Asp Ala Leu Gly Ile Ala Cys Thr Gln Ala Cys Gly Leu Met 
195                 200                 205             
Ser Ala Gln Tyr Gly Gly Met Val Lys Arg Val Gln His Gly Phe Ala 
210                 215                 220                 
Ala Arg Asn Gly Leu Leu Gly Gly Leu Leu Ala His Gly Gly Tyr Glu 
225                 230                 235                 240 
Ala Met Lys Gly Val Leu Glu Arg Ser Tyr Gly Gly Phe Leu Lys Met 
245                 250                 255     
Phe Thr Lys Gly Asn Gly Arg Glu Pro Pro Tyr Lys Glu Glu Glu Val 
260                 265                 270         
Val Ala Gly Leu Gly Ser Phe Trp His Thr Phe Thr Ile Arg Ile Lys 
275                 280                 285             
Leu Tyr Ala Cys Cys Gly Leu Val His Gly Pro Val Glu Ala Ile Glu 
290                 295                 300                 
Asn Leu Gln Gly Arg Tyr Pro Glu Leu Leu Asn Arg Ala Asn Leu Ser 
305                 310                 315                 320 
Asn Ile Arg His Val His Val Gln Leu Ser Thr Ala Ser Asn Ser His 
325                 330                 335     
Cys Gly Trp Ile Pro Glu Glu Arg Pro Ile Ser Ser Ile Ala Gly Gln 
340                 345                 350         
Met Ser Val Ala Tyr Ile Leu Ala Val Gln Leu Val Asp Gln Gln Cys 
355                 360                 365             
Leu Leu Ser Gln Phe Ser Glu Phe Asp Asp Asn Leu Glu Arg Pro Glu 
370                 375                 380                 
Val Trp Asp Leu Ala Arg Lys Val Thr Ser Ser Gln Ser Glu Glu Phe 
385                 390                 395                 400 
Asp Gln Asp Gly Asn Cys Leu Ser Ala Gly Arg Val Arg Ile Glu Phe 
405                 410                 415     
Asn Asp Gly Ser Ser Ile Thr Glu Ser Val Glu Lys Pro Leu Gly Val 
420                 425                 430         
Lys Glu Pro Met Pro Asn Glu Arg Ile Leu His Lys Tyr Arg Thr Leu 
435                 440                 445             
Ala Gly Ser Val Thr Asp Glu Ser Arg Val Lys Glu Ile Glu Asp Leu 
450                 455                 460                 
Val Leu Gly Leu Asp Arg Leu Thr Asp Ile Ser Pro Leu Leu Glu Leu 
465                 470                 475                 480 
Leu Asn Cys Pro Val Lys Ser Pro Leu Val 
485                 490 
<210>  2
<211>  1529
<212>  DNA
<213>  Aspergillus terreus
<400>  2
atgaccaaac aatctgcgga cagcaacgca aagtcaggag ttacgtccga aatatgtcat     60
tgggcatcca acctggccac tgacgacatc ccttcggacg tattagaaag agcaaaatac    120
cttattctcg acggtattgc atgtgcctgg gttggtgcaa gagtgccttg gtcagagaag    180
tatgttcagg caacgatgag ctttgagccg ccgggggcct gcagggtgat tggatatgga    240
caggtaaatt ttattcactc tagacggtcc acaaagtata ctgacgatcc ttcgtataga    300
aactggggcc tgttgcagca gccatgacca attccgcttt catacaggct acggagcttg    360
acgactacca cagcgaagcc cccctacact ctgcaagcat tgtccttcct gcggtctttg    420
cagcaagtga ggtcttagcc gagcagggca aaacaatttc cggtatagat gttattctag    480
ccgccattgt ggggtttgaa tctggcccac ggatcggcaa agcaatctac ggatcggacc    540
tcttgaacaa cggctggcat tgtggagctg tgtatggcgc tccagccggt gcgctggcca    600
caggaaagct cctcggtcta actccagact ccatggaaga tgctctcgga attgcgtgca    660
cgcaagcctg tggtttaatg tcggcgcaat acggaggcat ggtaaagcgt gtgcaacacg    720
gattcgcagc gcgtaatggt cttcttgggg gactgttggc ccatggtggg tacgaggcaa    780
tgaaaggtgt cctggagaga tcttacggcg gtttcctcaa gatgttcacc aagggcaacg    840
gcagagagcc tccctacaaa gaggaggaag tggtggctgg tctcggttca ttctggcata    900
cctttactat tcgcatcaag ctctatgcct gctgcggact tgtccatggt ccagtcgagg    960
ctatcgaaaa ccttcagggg agataccccg agctcttgaa tagagccaac ctcagcaaca   1020
ttcgccatgt tcatgtacag ctttcaacgg cctcgaacag tcactgtgga tggataccag   1080
aggagagacc catcagttca atcgcagggc agatgagtgt cgcatacatt ctcgccgtcc   1140
agctggtcga ccagcaatgt cttttgtccc agttttctga gtttgatgac aacctggaga   1200
ggccagaagt ttgggatctg gccaggaagg ttacttcatc tcaaagcgaa gagtttgatc   1260
aagacggcaa ctgtctcagt gcgggtcgcg tgaggattga gttcaacgat ggttcttcta   1320
ttacggaaag tgtcgagaag cctcttggtg tcaaagagcc catgccaaac gaacggattc   1380
tccacaaata ccgaaccctt gctggtagcg tgacggacga atcccgggtg aaagagattg   1440
aggatcttgt cctcggcctg gacaggctca ccgacattag cccattgctg gagctgctga   1500
attgccccgt gaaatcgcca ctggtataa                                     1529
<210>  3
<211>  1473
<212>  DNA
<213>  Aspergillus terreus
<400>  3
atgaccaaac aatctgcgga cagcaacgca aagtcaggag ttacgtccga aatatgtcat     60
tgggcatcca acctggccac tgacgacatc ccttcggacg tattagaaag agcaaaatac    120
cttattctcg acggtattgc atgtgcctgg gttggtgcaa gagtgccttg gtcagagaag    180
tatgttcagg caacgatgag ctttgagccg ccgggggcct gcagggtgat tggatatgga    240
cagaaactgg ggcctgttgc agcagccatg accaattccg ctttcataca ggctacggag    300
cttgacgact accacagcga agccccccta cactctgcaa gcattgtcct tcctgcggtc    360
tttgcagcaa gtgaggtctt agccgagcag ggcaaaacaa tttccggtat agatgttatt    420
ctagccgcca ttgtggggtt tgaatctggc ccacggatcg gcaaagcaat ctacggatcg    480
gacctcttga acaacggctg gcattgtgga gctgtgtatg gcgctccagc cggtgcgctg    540
gccacaggaa agctcctcgg tctaactcca gactccatgg aagatgctct cggaattgcg    600
tgcacgcaag cctgtggttt aatgtcggcg caatacggag gcatggtaaa gcgtgtgcaa    660
cacggattcg cagcgcgtaa tggtcttctt gggggactgt tggcccatgg tgggtacgag    720
gcaatgaaag gtgtcctgga gagatcttac ggcggtttcc tcaagatgtt caccaagggc    780
aacggcagag agcctcccta caaagaggag gaagtggtgg ctggtctcgg ttcattctgg    840
cataccttta ctattcgcat caagctctat gcctgctgcg gacttgtcca tggtccagtc    900
gaggctatcg aaaaccttca ggggagatac cccgagctct tgaatagagc caacctcagc    960
aacattcgcc atgttcatgt acagctttca acggcctcga acagtcactg tggatggata   1020
ccagaggaga gacccatcag ttcaatcgca gggcagatga gtgtcgcata cattctcgcc   1080
gtccagctgg tcgaccagca atgtcttttg tcccagtttt ctgagtttga tgacaacctg   1140
gagaggccag aagtttggga tctggccagg aaggttactt catctcaaag cgaagagttt   1200
gatcaagacg gcaactgtct cagtgcgggt cgcgtgagga ttgagttcaa cgatggttct   1260
tctattacgg aaagtgtcga gaagcctctt ggtgtcaaag agcccatgcc aaacgaacgg   1320
attctccaca aataccgaac ccttgctggt agcgtgacgg acgaatcccg ggtgaaagag   1380
attgaggatc ttgtcctcgg cctggacagg ctcaccgaca ttagcccatt gctggagctg   1440
ctgaattgcc ccgtgaaatc gccactggta taa                                1473
<210>  4
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Aspergillus terreus
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400>  4
Ala Lys Ser Gly Val Thr Ser Xaa Ile 
1               5                   
<210>  5
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Aspergillus terreus
<400>  5
Val Pro Trp Ser Glu Lys 
1               5       
<210>  6
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Aspergillus terreus
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400>  6
Val Xaa Gly Tyr Xaa Gln Lys 
1               5           
<210>  7
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Aspergillus terreus
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400>  7
Glu Glu Phe Asp Gln Asp Xaa Asn 
1               5               
<210>  8
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Aspergillus terreus
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400>  8
Val Xaa Glu Ile Glu Xaa Leu Val Leu Gly Leu Xaa 
1               5                   10          
<210>  9
<211>  490
<212>  PRT
<213>  Aspergillus terreus
<400>  9
Met Thr Lys Gln Ser Ala Asp Ser Asn Ala Lys Ser Gly Val Thr Ala 
1               5                   10                  15      
Glu Ile Cys His Trp Ala Ser Asn Leu Ala Thr Asp Asp Ile Pro Ser 
20                  25                  30          
Asp Val Leu Glu Arg Ala Lys Tyr Leu Ile Leu Asp Gly Ile Ala Cys 
35                  40                  45              
Ala Trp Val Gly Ala Arg Val Pro Trp Ser Glu Lys Tyr Val Gln Ala 
50                  55                  60                  
Thr Met Ser Phe Glu Pro Pro Gly Ala Cys Arg Val Ile Gly Tyr Gly 
65                  70                  75                  80  
Gln Lys Leu Gly Pro Val Ala Ala Ala Met Thr Asn Ser Ala Phe Ile 
85                  90                  95      
Gln Ala Thr Glu Leu Asp Asp Tyr His Ser Glu Ala Pro Leu His Ser 
100                 105                 110         
Ala Ser Ile Val Leu Pro Ala Val Phe Ala Ala Ser Glu Val Leu Ala 
115                 120                 125             
Glu Gln Gly Lys Thr Ile Ser Gly Ile Asp Val Ile Leu Ala Ala Ile 
130                 135                 140                 
Val Gly Phe Glu Ser Gly Pro Arg Ile Gly Lys Ala Ile Tyr Gly Ser 
145                 150                 155                 160 
Asp Leu Leu Asn Asn Gly Trp His Cys Gly Ala Val Tyr Gly Ala Pro 
165                 170                 175     
Ala Gly Ala Leu Ala Thr Gly Lys Leu Leu Gly Leu Thr Pro Asp Ser 
180                 185                 190         
Met Glu Asp Ala Leu Gly Ile Ala Cys Thr Gln Ala Cys Gly Leu Met 
195                 200                 205             
Ser Ala Gln Tyr Gly Gly Met Val Lys Arg Val Gln His Gly Phe Ala 
210                 215                 220                 
Ala Arg Asn Gly Leu Leu Gly Gly Leu Leu Ala Tyr Gly Gly Tyr Glu 
225                 230                 235                 240 
Ala Met Lys Gly Val Leu Glu Arg Ser Tyr Gly Gly Phe Leu Lys Met 
245                 250                 255     
Phe Thr Lys Gly Asn Gly Arg Glu Pro Pro Tyr Lys Glu Glu Glu Val 
260                 265                 270         
Val Ala Gly Leu Gly Ser Phe Trp His Thr Phe Thr Ile Arg Ile Lys 
275                 280                 285             
Tyr Leu Ala Cys Cys Gly Leu Val His Gly Pro Val Glu Ala Ile Glu 
290                 295                 300                 
Lys Leu Gln Arg Arg Tyr Pro Glu Leu Leu Asn Arg Ala Asn Leu Ser 
305                 310                 315                 320 
Asn Ile Arg His Val Tyr Val Gln Leu Ser Thr Ala Ser Asn Ser His 
325                 330                 335     
Cys Gly Trp Ile Pro Glu Glu Arg Pro Ile Ser Ser Ile Ala Gly Gln 
340                 345                 350         
Met Ser Val Ala Tyr Ile Leu Ala Val Gln Leu Val Asp Gln Gln Cys 
355                 360                 365             
Leu Leu Ala Gln Phe Ser Glu Phe Asp Asp Asn Leu Glu Arg Pro Glu 
370                 375                 380                 
Val Trp Asp Leu Ala Arg Lys Val Thr Pro Ser His Ser Glu Glu Phe 
385                 390                 395                 400 
Asp Gln Asp Gly Asn Cys Leu Ser Ala Gly Arg Val Arg Ile Glu Phe 
405                 410                 415     
Asn Asp Gly Ser Ser Val Thr Glu Thr Val Glu Lys Pro Leu Gly Val 
420                 425                 430         
Lys Glu Pro Met Pro Asn Glu Arg Ile Leu His Lys Tyr Arg Thr Leu 
435                 440                 445             
Ala Gly Ser Val Thr Asp Glu Ser Arg Val Lys Glu Ile Glu Asp Leu 
450                 455                 460                 
Val Leu Ser Leu Asp Arg Leu Thr Asp Ile Thr Pro Leu Leu Glu Leu 
465                 470                 475                 480 
Leu Asn Cys Pro Val Lys Ser Pro Leu Val 
485                 490 
<210>  10
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  PCR primer
<400>  10
caccgatggc tatcgcaatc gtccctg                                         27
<210>  11
<211>  28
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  PCR primer
<400>  11
ctccagtcgc cgaatgtggg agtacgtg                                        28
<210>  12
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  PCR primer
<400>  12
tcataggtac catgaccaag caatctgcgg acagcaac                             38
<210>  13
<211>  48
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  PCR primer
<400>  13
tgctgcaaca ggccccagtt tctgcccata tccaatcacc ctgcaggc                  48
<210>  14
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  PCR primer
<400>  14
aaactggggc ctgttgcagc agccatg                                         27
<210>  15
<211>  46
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  PCR primer
<400>  15
tgatctcgag ttataccagt ggcgatttca cgggacaatt aagcag                    46
<210>  16
<211>  2261
<212>  DNA
<213>  Aspergillus terreus
<400>  16
caccgatggc tatcgcaatc gtccctggtg ggtcttgaaa tcgtatgcca cacttgctcc     60
ggatgaaaca cattccggag cgcgcatcga tattgctaca cagtatagac ccaatggtct    120
gcagatgccc taaatggtag ttctcactgg cctgcattaa gttctggttg cagatcattg    180
tcggcctaac atcagtgtag gttacggtgt gagatttact tgcatagaag attccagacc    240
acaaggttct agatcctttg acggcggact cccctcgagg tgccgggcgc cgacgtgtgc    300
gttgctccgg gatttgtagg acgcagctcg gatacctagc cgttatggga atcggaggtt    360
gtagcagcgt aaacacatgg atagttaaat aatcggatgt acacccactg ttggaaatga    420
cgggggccta caacacgaga ttatctgatc caatttctgt tcgttggcat tctatcattc    480
gcagcgaaaa ttgtcctatt aaattgacca tgaccaaaca atctgcggac agcaacgcaa    540
agtcaggagt tacgtccgaa atatgtcatt gggcatccaa cctggccact gacgacatcc    600
cttcggacgt attagaaaga gcaaaatacc ttattctcga cggtattgca tgtgcctggg    660
ttggtgcaag agtgccttgg tcagagaagt atgttcaggc aacgatgagc tttgagccgc    720
cgggggcctg cagggtgatt ggatatggac aggtaaattt tattcactct agacggtcca    780
caaagtatac tgacgatcct tcgtatagaa actggggcct gttgcagcag ccatgaccaa    840
ttccgctttc atacaggcta cggagcttga cgactaccac agcgaagccc ccctacactc    900
tgcaagcatt gtccttcctg cggtctttgc agcaagtgag gtcttagccg agcagggcaa    960
aacaatttcc ggtatagatg ttattctagc cgccattgtg gggtttgaat ctggcccacg   1020
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gtatggcgct ccagccggtg cgctggccac aggaaagctc ctcggtctaa ctccagactc   1140
catggaagat gctctcggaa ttgcgtgcac gcaagcctgt ggtttaatgt cggcgcaata   1200
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ggtggctggt ctcggttcat tctggcatac ctttactatt cgcatcaagc tctatgcctg   1440
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gttttctgag tttgatgaca acctggagag gccagaagtt tgggatctgg ccaggaaggt   1740
tacttcatct caaagcgaag agtttgatca agacggcaac tgtctcagtg cgggtcgcgt   1800
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