(57)【要約】【課題】高出力化を実現し得る新規な酵素電極を提供すること。【解決手段】酵素を触媒として酸化還元反応が進行する電極であって、前記酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定された酵素電極を提供する。該酵素電極は、電極上での酸化還元反応が高効率で進行するため、得られる電気エネルギーの高出力化が実現できる。そのため、そのため、あらゆる燃料電池やバイオセンサー、電子機器に好適に用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素を触媒として酸化還元反応が進行する電極であって、
前記酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定された酵素電極。
【請求項２】
前記酵素は、静電的相互作用により前記反応基質又は前記電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度が高められている請求項１記載の酵素電極。
【請求項３】
前記アミノ酸残基は、前記反応基質又は電子伝達メディエータと相反する電荷を有する請求項１又は２記載の酵素電極。
【請求項４】
前記電子伝達メディエータは、酸化体もしくは還元体がアニオンであるメディエータであり、前記アミノ酸残基はリジン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基の中から選択されるいずれか一のアミノ酸である請求項３記載の酵素電極。
【請求項５】
前記酵素は、親水性又は疎水性相互作用により前記反応基質又は前記電子伝達メディエータとの親和性が高められている請求項１記載の酵素電極。
【請求項６】
前記反応基質又は前記電子伝達メディエータは親水性物質であり、前記アミノ酸は親水性アミノ酸である請求項５記載の酵素電極。
【請求項７】
前記反応基質又は前記電子伝達メディエータは疎水性物質であり、前記アミノ酸は疎水性アミノ酸である請求項５記載の酵素電極。
【請求項８】
電極上で酵素を触媒として酸化還元反応が進行する燃料電池であって、
正極又は負極の少なくとも一方の電極上に、前記酵素をコードする塩基配列に所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定された燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素電極に関する。より詳しくは、酵素を触媒として酸化還元反応が進行する電極であって、高出力化を実現させるために改良された酵素電極、及び該酵素電極を用いて高出力化が実現し得る燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、負極又は正極の少なくとも一方の電極上に触媒として酸化還元酵素を固定した燃料電池（以下、「バイオ燃料電池」という。）は、例えばグルコース及びエタノールのように通常の工業触媒では反応が困難な燃料から、効率よく電子を取り出すことができるため、高容量でかつ安全性が高い次世代の燃料電池として注目されている。
【０００３】
図５を用いて、一般的なバイオ燃料電池の反応スキームを説明する。図５に示すグルコースを燃料とするバイオ燃料電池においては、負極でグルコース（Glucose）の酸化反応が進行し、正極で大気中の酸素（Ｏ２）の還元反応が進行する。
【０００４】
電子の流れを詳しく説明すると、負極では、グルコース（Glucose）、グルコース脱水素酵素（Glucose Dehydrogenase）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋；Nicotinamide Adenine Dinucleotide）、ジアホラーゼ（Diaphorase）、電子伝達メディエータ、電極（カーボン）の順に電子が受け渡される。
【０００５】
一方、正極では、負極から放出された電子が、電極（カーボン）、電子伝達メディエータ、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の順に受け渡され、該電子と外部から供給される酸素を用いて還元反応が進行することにより電気エネルギーを発生させる。
【０００６】
このようなバイオ燃料電池は、安全性が高い燃料電池として注目されている一方で、他の燃料電池に比べて出力が小さいという問題点がある。そこで、最近では、高出力のバイオ燃料電池を得るための検討がなされている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００７】
例えば、特許文献１に記載のバイオ燃料電池では、電極を多孔質構造の導電性部材（金属、導電性高分子、金属酸化物、炭素材料等）で構成し、その孔内に酵素や電子伝達メディエータ等を固定することにより、実効面積あたりの酵素担持密度を高めて、電流密度の向上を図っている。
【０００８】
特許文献２に記載のバイオ燃料電池では、カソード電極をカーボンなどの多孔質材料に酵素及び電子伝達メディエータを固定したものにより構成し、このカソード電極の少なくとも一部が気相の反応基質となる空気又は酸素と接触するようにすることで、優れた電極特性を充分に発揮できるように工夫している。
【０００９】
このように電極の構造を工夫して高出力化を実現する技術の他に、電極に固定する酵素自体を工夫することにより、バイオ燃料電池の高出力化を達成させる技術がある。例えば、特許文献３では、デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼ等を融合させたタンパク質を作製し、該融合タンパク質を負極に固定することにより、基質から電極までの電子伝達反応を効率的に進行させて、バイオ燃料電池の高出力化を実現させる技術が開示されている。
【００１０】
また、特許文献４には、異なる２種以上の酵素タンパク質を会合させた会合タンパク質を電極に固定化することにより、該会合タンパク質を構成する２種の酵素タンパク質の相対的距離が接近しているため、基質から電極までの電子伝達反応を効率的に進行させて、バイオ燃料電池の高出力化を実現させる技術が開示されている。
【００１１】
ところで、バイオ燃料電池の高出力化のためには、電極に固定化する酵素と反応基質（特に、電子伝達メディエータ）との反応効率を向上させることが必要である。酵素と反応基質との反応は、親和性（Ｋｍ）と反応速度（ｋcat）で表されるが、これら２つのパラメータは酵素と反応基質との組み合わせにより決定されるため、相性のよい酵素と反応基質（特に、電子伝達メディエータ）を探索する必要がある。
【００１２】
しかし、バイオ燃料電池の高出力化のためには、電子伝達メディエータ等によって決定される電位を高く保ちつつ、高電流を得る必要性があるため、酵素と反応基質との組み合わせは限られており、その出力値にも限界があるのが現状である。
【００１３】
【特許文献１】特開２００６−２３４７８８号公報。
【特許文献２】特開２００６−９３０９０号公報。
【特許文献３】特開２００７−１６３１８５号公報。
【特許文献４】特開２００７−１６３２６８号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
前記の通り、バイオ燃料電池の高出力化を実現する技術は様々な方向から開発されつつあるが、電気エネルギーを得るためのバイオ燃料電池の基本的原理は、電極上での酸化還元反応に基づくものであり、電極上の酵素と反応基質との反応効率を上昇させなければ、根本的解決にはならない。
【００１５】
そこで、本発明では、バイオ燃料電池の電極に固定化する酵素と反応基質との相性を、人為的に上昇させることにより、電極上の反応効率を上昇させ、ひいては、バイオ燃料電池の高出力化を実現することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本願発明者らは、前記目的を解決するために、電極上の酵素と反応基質との反応効率を上昇させるための方法を鋭意研究した結果、酵素と反応基質間の静電的相互作用及び親疎水的相互作用等に着目することにより、酵素と反応基質との相性を人為的に上昇させることに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
本発明では、まず、酵素を触媒として酸化還元反応が進行する電極であって、
前記酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定された酵素電極を提供する。
前記酵素の改変方法は、前記酵素をコードする塩基配列に所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高める方法であれば、その方法は特に限定されないが、例えば、静電的相互作用を利用することにより前記反応基質又は前記電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を上昇させることができる。
前記アミノ酸残基は特に限定されないが、例えば、前記反応基質又は前記電子伝達メディエータと相反する電荷を有するアミノ酸残基を用いることができる。
この場合の前記電子伝達メディエータ及びアミノ酸残基の具体的な種類も特に限定されないが、例えば、前記電子伝達メディエータとして、酸化体もしくは還元体がアニオンであるメディエータを用いた場合、前記アミノ酸残基はリジン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基の中から選択することも可能である。
また、前記酵素の改変方法は、親水性又は疎水性相互作用を利用することにより、前記反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を上昇させる方法を用いることも可能である。
この場合、前記反応基質又は前記電子伝達メディエータが親水性物質の場合には、前記アミノ酸残基には親水性アミノ酸を用い、前記反応基質又は前記電子伝達メディエータが疎水性物質の場合には、前記アミノ酸には疎水性アミノ酸を用いることで親和性及び／又は反応速度の上昇が実現できる。
【００１８】
本発明では、次に、電極上で酵素を触媒として酸化還元反応が進行する燃料電池であって、正極又は負極の少なくとも一方の電極上に、前記酵素をコードする塩基配列に所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定された燃料電池を提供する。
【００１９】
ここで本発明で用いる技術用語を説明する。
【００２０】
本発明で用いる「酵素の改変」とは、アミノ酸残基をコードするコドンの１若しくは数個を付加若しくは挿入することによって、酵素タンパク質の機能を変化させることなく、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度、若しくは安定性などの性質を変化させることを意味する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る酵素電極は、電極上での酸化還元反応が高効率で進行するため、得られる電気エネルギーの高出力化が実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２３】
＜酵素電極＞
本発明に係る酵素電極は、酵素を触媒として酸化還元反応が進行する電極であって、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定された電極である。
【００２４】
前記酵素の改変は、該酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより行う。この場合の「改変」とは、酵素としての性質の変化を伴わず、所定のアミノ酸残基を少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を上昇させることをいう。
【００２５】
前記酵素の改変方法は、該酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高める方法であれば、その具体的方法は特に限定されないが、例えば、静電的相互作用、親水性又は疎水性相互作用を利用することにより前記反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を上昇させることができる。
【００２６】
静電的相互作用を利用した親和性及び／又は反応速度上昇の具体的方法としては、例えば、用いる反応基質又は電子伝達メディエータと相反する電荷を有するアミノ酸残基をコードするコドンを、前記酵素をコードする塩基配列に付加若しくは挿入することで、固定化する酵素と反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度の上昇を実現させることができる。
【００２７】
より具体的に説明すると、負電荷を有する反応基質又は電子伝達メディエータを用いる場合には正電荷を有するアミノ酸残基をコードするコドンを、正電荷を有する反応基質又は電子伝達メディエータを用いる場合には負電荷を有するアミノ酸残基をコードするコドンを、前記酵素をコードする塩基配列に付加若しくは挿入することにより、発現する酵素の反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度の上昇が実現できる。
【００２８】
また、電荷を有するアミノ酸残基をコードするコドンを、前記酵素をコードする塩基配列に付加若しくは挿入することにより、静電的作用を利用した酵素の電極への固定化を行うことができ、酵素電極の安定化を図ることができる。
【００２９】
更に、酵素の電極への固定化のために必要な材料を減らすこともでき、その結果、酵素電極の製造過程におけるコストの削減にも繋がる。
【００３０】
静電的相互作用を利用する場合に用いることができる電子伝達メディエータは特に限定されないが、例えば、負電荷を有する電子伝達メディエータ（酸化体もしくは還元体がアニオンであるメディエータ）としては、ＡＢＴＳ(2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate))などの色素系、ヘキサシアノ鉄酸イオン、オクタシアノタングステン酸イオンなどのシアノ金属錯体等、正電荷を有する電子伝達メディエータ（酸化体もしくは還元体がカチオンであるメディエータ）としては、 [Os(trpy3)]3+/2+，[Os(py)2(bpy)2]3+/2+，[Fe(dpy)]3+/2+などのピリジン、ビピリジン等が配意した金属錯体を挙げることができる。
【００３１】
正電荷を有するアミノ酸残基は、リジン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基を挙げることができ、これらは、単独で用いても複数種を組み合わせて用いることも可能である。
【００３２】
この中でも特に、リジン残基がより好適である。一般に、電極に酵素を固定する場合にポリ−Ｌ−リジンを用いて固定する方法が行われているが、リジン残基をコードするコドンを、酵素をコードする塩基配列に付加若しくは挿入することにより、ポリ−Ｌ−リジンを用いることなく電極に酵素を固定化できるという効果も生じ、ポリ−Ｌ−リジン材料のコスト削減にも繋がる。
【００３３】
負電荷を有するアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基を挙げることができ、これらは、単独で用いても複数種を組み合わせて用いることも可能である。
【００３４】
親水性又は疎水性相互作用を利用した親和性向上の具体的方法としては、親水性の反応基質又は電子伝達メディエータを用いる場合には親水性のアミノ酸残基をコードするコドンを、疎水性の反応基質又は電子伝達メディエータを用いる場合には疎水性のアミノ酸残基をコードするコドンを、前記酵素をコードする塩基配列に付加若しくは挿入することにより、発現する酵素の反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度の上昇が実現できる。
【００３５】
親水性又は疎水性相互作用を利用する場合に用いることができる電子伝達メディエータは特に限定されないが、例えば、親水性の電子伝達メディエータとしては、ヘキサシアノ鉄酸イオン、オクタシアノタングステン酸イオンなどのシアノ金属錯体もしくはキノン系であるＱ０、2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate)などの色素系などの一般的に新油性/親水性のパラメータであるLogP値が０より小さいものが上げられる。まだ疎水性の電子伝達メディエータとしては、ＶＫ１、ＶＫ３、ベンゾキノン、アントラキノンなどLogP値が０より大きいものを挙げることができる。
【００３６】
親水性のアミノ酸残基は、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基を挙げることができ、これらは、単独で用いても複数種を組み合わせて用いることも可能である。
【００３７】
疎水性のアミノ酸残基は、グリシン残基、セリン残基、トレオニン残基、システイン残基、チロシン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基を挙げることができ、これらは、単独で用いても複数種を組み合わせて選択することも可能である。
【００３８】
本発明に係る酵素電極に固定化し得る酵素の種類は特に限定されず、公知のあらゆる酵素を自由に選択することができる。例えば、本発明に係る酵素電極を正極として用いる場合、ラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）、アスコルビン酸オキシダーゼ等の酸素を反応基質とするオキシダーゼ活性を有する酵素を固定化することができる。
【００３９】
また、本発明に係る酵素電極を負極として用いる場合に固定化し得る酵素も特に限定されないが、例えば、反応基質として糖類を含む基質を用いる場合には、糖類を酸化分解する酸化酵素を固定化するとよい。酸化酵素の一例としては、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコネート５デヒドロゲナーゼ、グルコネート２デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシパルベートレダクターゼ、グリセレートデヒドロゲナーゼ、フォルメートデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
【００４０】
また、本発明に係る酵素電極を負極として用いる場合には、上記の酸化酵素に加え、酸化型補酵素および補酵素酸化酵素を固定化してもよい。酸化型補酵素としては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD＋）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP＋）フラビンアデニンジヌクレオチド（flavin adenine dinucleotide；FAD＋）、ピロロキノリンキノン（pyrrollo-quinoline quinone；PQQ2＋）などが挙げられる。補酵素酸化酵素としては、例えば、ジアフォラーゼが挙げられる。
【００４１】
更に、本発明に係る酵素電極には、酸化還元反応により発生した電子の電極への受け渡しをスムーズにするために、電子伝達メディエータを固定化してもよい。本発明に係る酵素電極に固定化し得る電子伝達メディエータ種類は特に限定されず、公知のあらゆる電子伝達メディエータを自由に選択することができる。例えば、本発明に係る酵素電極を正極として用いる場合は、電子伝達メディエータとして、ＡＢＴＳ(2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate))、K3[Fe(CN)6]などを固定化することが可能である。
【００４２】
また、例えば、本発明に係る酵素電極を負極として用いる場合には、電子伝達メディエータとして、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、ビタミンＫ３、２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）、２−アミノ−３−メチル−１，４−ナフトキノン（ＡＭＮＱ）、２、３−ジアミノ−１，４−ナフトキノン、オスミウム（Ｏｓ）、ルテニウム（Ｒｕ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）などの金属錯体、ベンジルビオローゲンなどのビオローゲン化合物、キノン骨格を有する化合物、ニコチンアミド構造を有する化合物、リボフラビン構造を有する化合物、ヌクレオチド−リン酸構造を有する化合物などを固定化することが可能である。
【００４３】
なお、本発明に係る酵素電極に用いる材料は公知のあらゆる素材を用いることができ、外部と電気的に接続可能な素材であれば特に限定されず、例えば、Pt、Ag、Au、Ru、Rh、Os、Nb、Mo、In、Ir、Zn、Mn、Fe、Co、Ti、V、Cr、Pd、Re、Ta、W、Zr、Ge、Hfなどの金属、アルメル、真ちゅう、ジュラルミン、青銅、ニッケリン、白金ロジウム、ハイパーコ、パーマロイ、パーメンダー、洋銀、リン青銅などの合金類、ポリアセチレン類などの導電性高分子、グラファイト、カーボンブラックなどの炭素材、HfB2、NbB、CrB2、B4Cなどのホウ化物、TiN、ZrNなどの窒化物、VSi2、NbSi2、MoSi2、TaSi2などのケイ化物、及びこれらの合材等を用いることができる。
【００４４】
＜燃料電池＞
本発明に係る燃料電池は、電極上で酵素を触媒として酸化還元反応が進行する燃料電池であって、正極又は負極の少なくとも一方の電極上に、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定化された燃料電池である。
【００４５】
前記酵素の改変は、該酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより行う。なお、本発明に係る燃料電池の電極の詳細は、前述した酵素電極の詳細と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
【００４６】
本発明に係る燃料電池の電極以外の構造、機能などは特に限定されず、本発明に係る酵素電極を少なくとも用いていれば、自由に設計することができる。
【００４７】
本発明に係る燃料電池の電極上では、酸化還元反応が高効率で進行するため、得られる電気エネルギーの高出力化が実現できる。また、電極自体の安定性が高いため、耐久性の優れた燃料電池を提供できる。
【００４８】
＜電子機器＞
本発明に係る燃料電池は、大きな出力電流及び電圧を得ることができるとともに、耐久性が優れているため、公知のあらゆる電子機器に好適に用いることができる。
【００４９】
該電子機器は、本発明に係る燃料電池を少なくとも使用できるものであれば、構造、機能等は特に限定されず、電気的に作動する機器を全て含有する。例えば、携帯電話、モバイル機器、ロボット、パーソナルコンピューター、ゲーム機器、車載機器、家庭電気製品、工業製品等の電子機器、自動車、二輪車、航空機、ロケット、宇宙船等の移動体、検査機器、ペースメーカー用の電源、バイオセンサーを含む生体内機器の電源等の医療機器、生ごみを分解し電気エネルギーを発電させるシステム等の発電システムおよびコジェネレーションシステム、等を挙げることができる。
【実施例１】
【００５０】
実施例１では、本発明に係る酵素電極に固定化し得る酵素の改変を行うために、酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを組み込んだ遺伝子を作成した。
【００５１】
具体的には、本発明に係る酵素電極に固定化し得る酵素の一例としてビリルビンオキシダーゼ（以下「ＢＯＤ」と称する。）を用い、アミノ酸残基としてリジン残基を用い、ＢＯＤの末端にリジン残基を組み込んだ遺伝子を作製した。
【００５２】
まず、ＢＯＤ遺伝子のベクターとして、表１に示すように、リジン残基をそれぞれ４、６、８、１０つ組み込んだpMETαBベクターLys4、Lys6、Lys8、Lys10、を作製した。
【００５３】
【表１】
2009272179.tif 000002
【００５４】
上記で作製したpMETαBベクターLys４、Lys６、Lys８、Lys１０を用い、ＰＣＲ法にてＢＯＤ遺伝子を含む遺伝子（以下、「Lys4-BOD遺伝子」、「Lys6-BOD遺伝子」「Lys8-BOD遺伝子」「Lys10-BOD遺伝子」と称する。）を作製した。次にこれらの遺伝子（Lys4-BOD遺伝子、Lys6-BOD遺伝子、Lys8-BOD遺伝子、Lys10-BOD遺伝子）を、ライゲーションによりプラスミドへ取り込んだ。このプラスミドを大腸菌へトランスフォーメーションし、制限培地にて展開した。
【００５５】
その結果、コントロール（プラスミドがないもの）、Lys4、Lys6、Lys8、Lys10についてそれぞれのコロニーを得た。それぞれについて、コロニーを拾い、SpeＩおよびEcoRIにて切断し、ゲル電気泳動を行うことで、目的ベクター（pMETαBベクターLys4、Lys6、Lys8、Lys10）がトランスフォーメーションされたかを確認した。
【００５６】
続いて、Lys6、Lys8、Lys10の遺伝子それぞれについてＤＮＡシーケンスを行い、目的のLys配列を確認した。なお、ＤＮＡシーケンスの結果をそれぞれ図１〜図３に示す（Lys6：図１、Lys8：図２、Lys10：図３）。
【実施例２】
【００５７】
実施例２では、実施例１で作製したプラスミドを、酵母Pichia Methanolicaへトランスフォーメーションすることにより、ＢＯＤ活性の有無の検討を行った。
【００５８】
pMAD11のコンピテントセルに、制限酵素Asc1にて切り出したLys4-BOD遺伝子、Lys6-BOD遺伝子、Lys8-BOD遺伝子、Lys10-BOD遺伝子をそれぞれ酵母Pichia Methanolicaへトランスフォーメーションした。これを、ＭＤ培地に展開し、それぞれについてコロニーを２つずつ得た。
【００５９】
これらのコロニーをＢＭＤＹで培養し、さらにＢＭＭＹに移すことでＢＯＤの発現誘導を行った。この溶液にＡＢＴＳ(2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate))を加え、緑色に呈色する様子を観察することで、ＢＯＤ活性があるかについて発現チェックを行った。それぞれの結果を図４に示す。なお、図４中符号ＤＭ１及びＤＭ２は、リジン残基を組み込んでいないＢＯＤを示す。
【００６０】
図５に示す通り、全ての酵素についてＢＯＤ活性を有することが確認できた。従って、実施例２では、ＢＯＤをコードする塩基配列の末端にリジン残基を組み込んだ遺伝子から発現した改変タンパクが、ＢＯＤ活性を維持していることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明に係る酵素電極は、電極上での酸化還元反応が高効率で進行するため、得られる電気エネルギーの高出力化が実現できる。そのため、あらゆる燃料電池やバイオセンサー、電子機器に好適に用いることができる。
【００６２】
また、本発明に係る酵素電極は、電極自体の安定性が高いため、該酵素電極を燃料電池やバイオセンサー、電子機器に用いれば、耐久性の優れた燃料電池やバイオセンサー、電子機器を提供することが可能となる。
【００６３】
更に、本発明に係る酵素電極は、電極への酵素固定化のために必要な材料を軽減することができるため、酵素電極自体、及び、該酵素電極を用いた燃料電池、バイオセンサー、電子機器等の製造コストの削減にも貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】実施例１におけるLys6遺伝子のＤＮＡシーケンスの結果を示す図面代用グラフである。
【図２】実施例１におけるLys8遺伝子のＤＮＡシーケンスの結果を示す図面代用グラフである。
【図３】実施例１におけるLys10遺伝子のＤＮＡシーケンスの結果を示す図面代用グラフである。
【図４】実施例２において、Lys6-BOD遺伝子、Lys8-BOD遺伝子、Lys10-BOD遺伝子から発現した酵素のＢＯＤ活性の有無を示す図面代用写真である。
【図５】一般的なバイオ燃料電池の反応スキームを示す概念図である。
【図１】
2009272179.tif 000003
【図２】
2009272179.tif 000004
【図３】
2009272179.tif 000005
【図４】
2009272179.tif 000006
【図５】
2009272179.tif 000007
【配列表】
2009272179000001.app