(57)【要約】【課題】環状一本鎖DNAの製造過程における、単量体環状一本鎖DNAおよび多量体環状一本鎖DNAの形成比率を制御する方法。【解決手段】プレカーソルDNAとテンプレートDNAを用いて環状一本鎖DNAを製造する方法において、プレカーソルDNAとテンプレートDNAの塩基長を調節することによって、単量体環状一本鎖DNAおよび多量体環状一本鎖DNAの形成比率を制御する方法の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
線状一本鎖DNA（プレカーソルDNA）に対して、該プレカーソルDNAの5’末端および3’末端の塩基配列に相補的な配列を有する鋳型一本鎖DNA（テンプレートDNA）をハイブリダイズさせ、該プレカーソルDNAの5’末端と3’末端とを隣接させて結合することにより環状一本鎖DNAを製造する方法において、プレカーソルDNAとテンプレートDNAの塩基長を調節することによって、単量体環状一本鎖DNAおよび多量体環状一本鎖DNAの形成比率を制御する方法。
【請求項２】
プレカーソルDNAが24〜200塩基長の長さである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プレカーソルDNAが24〜49塩基長の長さである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
20〜100塩基長の長さを有するテンプレートDNAを用いることによって、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を上げる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
プレカーソルDNAの2分の1の塩基長＋2〜6塩基長の長さを有するテンプレートDNAを用いることによって、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を上げる、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
プレカーソルDNAが28塩基長の長さを有し、かつテンプレートDNAが20塩基長の長さを有する、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
12〜19塩基長の長さを有するテンプレートDNAを用いることによって、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を下げる、請求項３記載の方法。
【請求項８】
12塩基長〜プレカーソルDNAの2分の１以下の塩基長を有するテンプレートDNAを用いることによって、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を下げる、請求項３または７記載の方法。
【請求項９】
プレカーソルDNAが28塩基長の長さを有し、かつテンプレートDNAが14塩基長の長さを有する、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
50〜200塩基長の長さを有するプレカーソルDNAを用いることによって、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を下げる、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
テンプレートDNA全体とハイブリダイズすることが可能な塩基長を有するプレカーソルDNAを用いることによって、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を下げる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
プレカーソルDNAが50塩基長の長さを有し、かつテンプレートDNAが20塩基長または14塩基長の長さを有する、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
プレカーソルDNAとテンプレートDNAを用いて環状一本鎖DNAを製造する方法において、プレカーソルDNAとテンプレートDNAの塩基長を調節することによって、環状一本鎖DNAの形成効率を向上する方法。
【請求項１４】
プレカーソルDNAが24〜49塩基長の長さを有する場合に、テンプレートDNAの塩基長を長くすることによる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
テンプレートDNAが20〜100塩基長の長さを有する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
テンプレートDNAがプレカーソルDNAの2分の1の塩基長＋2〜6塩基長の長さを有する、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
プレカーソルDNAが28塩基長の長さを有し、テンプレートDNAが20塩基長の長さを有する、請求項１３〜１６のいずれか1項記載の方法。
【請求項１８】
形成された環状一本鎖DNAと用いたプレカーソルDNAとを電気泳動し、その電気泳動像を得て、該プレカーソルDNAの移動度を基準として形成された多量体環状一本鎖DNAおよび単量体環状一本鎖DNAの量を求めることにより、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を判定する、請求項１〜１２のいずれか1項記載の方法。
【請求項１９】
形成された環状一本鎖DNAを電気泳動し、その電気泳動像を得て、形成された環状一本鎖DNAの量を求めることにより、環状一本鎖DNAの形成効率を判定する、請求項１３〜１７のいずれか1項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線状一本鎖DNA（プレカーソルDNA）に対して、該プレカーソルDNAの5’末端および3’末端の塩基配列に相補的な配列を有する鋳型一本鎖DNA（テンプレートDNA）をハイブリダイズさせ、該プレカーソルDNAの5’末端と3’末端とを隣接させて結合することにより環状一本鎖DNAを製造する方法において、プレカーソルDNAとテンプレートDNAの塩基長を調節することによって、単量体環状一本鎖DNAおよび多量体環状一本鎖DNAの形成比率を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、DNAやタンパク質分子をナノマテリアル構造体として利用する研究が行われている。特にDNAは、構成される塩基が4種類と少ないこと、また、相補配列を設計可能であることにより、ヘアピンやループなどの二次構造をとらせたり、自己組織化によって複雑な構造(ナノスケールの立方体やタイル、チューブ、また、サブミクロンスケールの任意の二次元形状など)を構築させたりすることができるなど、ボトムアップ型のナノ構造形成に有用と考えられる。
【０００３】
微小構造を構成する要素の重要な基本単位として、環状一本鎖DNAが挙げられる。これは、プレカーソルDNAを、双方の末端塩基配列に相補的なテンプレートDNAを用いて隣接させたのち、ライゲーションによりつなぎ合わせることによって作製される。
【０００４】
従来的に、環状一本鎖DNAの作製方法について様々な方法が報告されている（特許文献１、非特許文献１，２）。
【０００５】
しかしながら、従来的に用いられている環状一本鎖DNAの製造方法においては、単一のプレカーソルDNAより構成される単量体環状一本鎖DNAと複数のプレカーソルDNAを含んでなる多量体環状一本鎖DNAが構成されるために、所望される分子量を有する環状一本鎖DNAの形成効率を低下させていた。
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２７８４６５号
【非特許文献１】Nucleic Acids Res. Vol.16, 4607-4618(1989)
【非特許文献２】Dolinnayaら、Nucleic Acids Res. Vol.21, 5403-5407(1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで当該分野において、環状一本鎖DNAの製造に際し、製造される環状一本鎖DNAのうちの単量体環状一本鎖DNAと多量体環状一本鎖DNAの形成比率を制御する方法が望まれていた。
【０００８】
本発明は、そのような単量体環状一本鎖DNAと多量体環状一本鎖DNAの形成比率を制御する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、所望される環状一本鎖DNAが単量体であるか多量体であるのかに応じて、プレカーソルDNAおよびテンプレートDNAの塩基長を最適化することによって、単量体環状一本鎖DNAまたは多量体環状一本鎖DNAの形成比率を制御できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本願発明は以下のとおりである。
［１］  線状一本鎖DNA（プレカーソルDNA）に対して、該プレカーソルDNAの5’末端および3’末端の塩基配列に相補的な配列を有する鋳型一本鎖DNA（テンプレートDNA）をハイブリダイズさせ、該プレカーソルDNAの5’末端と3’末端とを隣接させて結合することにより環状一本鎖DNAを製造する方法において、プレカーソルDNAとテンプレートDNAの塩基長を調節することによって、単量体環状一本鎖DNAおよび多量体環状一本鎖DNAの形成比率を制御する方法。
［２］  プレカーソルDNAが24〜200塩基長の長さである、［１］の方法。
［３］  プレカーソルDNAが24〜49塩基長の長さである、［２］の方法。
［４］  20〜100塩基長の長さを有するテンプレートDNAを用いることによって、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を上げる、［３］の方法。
［５］  プレカーソルDNAの2分の1の塩基長＋2〜6塩基長の長さを有するテンプレートDNAを用いることによって、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を上げる、［３］または［４］の方法。
［６］  プレカーソルDNAが28塩基長の長さを有し、かつテンプレートDNAが20塩基長の長さを有する、［４］または［５］の方法。
［７］  12〜19塩基長の長さを有するテンプレートDNAを用いることによって、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を下げる、［３］の方法。
［８］  12塩基長〜プレカーソルDNAの2分の１以下の塩基長を有するテンプレートDNAを用いることによって、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を下げる、［３］または［７］の方法。
［９］  プレカーソルDNAが28塩基長の長さを有し、かつテンプレートDNAが14塩基長の長さを有する、［７］または［８］の方法。
［１０］  50〜200塩基長の長さを有するプレカーソルDNAを用いることによって、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を下げる、［２］の方法。
［１１］  テンプレートDNA全体とハイブリダイズすることが可能な塩基長を有するプレカーソルDNAを用いることによって、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を下げる、［１０］の方法。
［１２］  プレカーソルDNAが50塩基長の長さを有し、かつテンプレートDNAが20塩基長または14塩基長の長さを有する、［１０］または［１１］の方法。
［１３］  プレカーソルDNAとテンプレートDNAを用いて環状一本鎖DNAを製造する方法において、プレカーソルDNAとテンプレートDNAの塩基長を調節することによって、環状一本鎖DNAの形成効率を向上する方法。
［１４］  プレカーソルDNAが24〜49塩基長の長さを有する場合に、テンプレートDNAの塩基長を長くすることによる、［１３］の方法。
［１５］  テンプレートDNAが20〜100塩基長の長さを有する、［１４］の方法。
［１６］  テンプレートDNAがプレカーソルDNAの2分の1の塩基長＋2〜6塩基長の長さを有する、［１４］または［１５］の方法。
［１７］  プレカーソルDNAが28塩基長の長さを有し、テンプレートDNAが20塩基長の長さを有する、［１３］〜［１６］のいずれかの方法。
［１８］  形成された環状一本鎖DNAと用いたプレカーソルDNAとを電気泳動し、その電気泳動像を得て、該プレカーソルDNAの移動度を基準として形成された多量体環状一本鎖DNAおよび単量体環状一本鎖DNAの量を求めることにより、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を判定する、［１］〜［１２］のいずれかの方法。
［１９］  形成された環状一本鎖DNAを電気泳動し、その電気泳動像を得て、形成された環状一本鎖DNAの量を求めることにより、環状一本鎖DNAの形成効率を判定する、［１３］〜［１７］のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明方法は、環状一本鎖DNAの形成において、プレカーソルDNAの連結数を制御することが可能であるために、単一種のプレカーソルDNAより、目的に応じた分子量（連結数）を有する環状一本鎖DNAを誘導することができるといった利点を有する。さらに、本発明方法は、単一種のプレカーソルDNAを連結させて繰り返し構造を有する環状一本鎖DNAを形成することができる。これは、繰り返し構造を持つようなナノマテリアル構造体（例えば、集積し協調して触媒機能を発揮するような分子を多数集積させた構造体）の製造において大きな利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本願発明を詳細に説明する。
【００１３】
本願発明は、プレカーソルDNAに対して、該プレカーソルDNAの5’末端および3’末端の塩基配列に相補的な配列を有するテンプレートDNAをハイブリダイズさせ、該プレカーソルDNAの5’末端と3’末端とを隣接させて結合することにより環状一本鎖DNAを製造する方法において、プレカーソルDNAとテンプレートDNAの塩基長のみを調節することによって、単量体環状一本鎖DNAおよび多量体環状一本鎖DNAの形成比率を制御する方法に関する。
【００１４】
本発明において、一本のプレカーソルDNAの5’末端と3’末端が結合することによって形成された環状一本鎖DNAを、単量体環状一本鎖DNAと称する。一方、複数のプレカーソルDNAの5’末端と3’末端が、同一プレカーソルDNA以外の対向する末端とそれぞれ結合し、連結することによって環状に形成された環状一本鎖DNAを、多量体環状一本鎖DNAと称する。また、多量体環状一本鎖において、連結されたプレカーソルDNAの数を連結数と称する。
【００１５】
テンプレートDNAは、プレカーソルDNAの環化を補助する一本鎖DNAであり、プレカーソルDNAの5’末端部、3’末端部の配列に相補的な配列からなる。各末端配列に相補的な配列は、5’末端側と3’末端側が隣接するように互いに対向して配置されている。各末端に相補的な配列の長さは、各相補配列がそれぞれの末端を認識しハイブリダイズし得るかぎり特に限定されないが、好ましくはそれぞれ６塩基以上の長さが好ましい。
【００１６】
プレカーソルDNAは、環状一本鎖DNAの環の本体となる一本鎖DNAであり、その長さは、数十〜約200塩基長からなるのが好ましい。
【００１７】
1個のテンプレートDNAと1個のプレカーソルDNAとがハイブリダイズすることによって、当該プレカーソルDNAの5’末端と3’末端とが隣接して環状構造を形成することができる（図１Ａ参照）。その後、プレカーソルDNAの5’末端と3’末端とをライゲーションによりつなぐことによって、単量体環状一本鎖DNAを製造することができる。
【００１８】
一方、２または複数個のテンプレートDNAと２または複数個のプレカーソルDNAとがハイブリダイズすることによって、別個のプレカーソルDNAの5’末端と3’末端とが隣接した環状構造を形成することができる（図１Ｂ参照）。その後、プレカーソルDNAの各末端を隣接するプレカーソルDNAの各末端とライゲーションによりつなぐことによって、多量体環状一本鎖DNAを製造することができる。
【００１９】
本発明方法において対象となるプレカーソルDNAの長さは、20〜200塩基長である。
【００２０】
本発明方法は、プレカーソルDNAおよびテンプレートDNAの塩基数のみを調節することによって、環状一本鎖DNAの製造過程における単量体環状一本鎖DNAおよび多量体環状一本鎖DNAの形成比率を制御することを可能とする。
【００２１】
本発明方法において、20〜49塩基長を有するプレカーソルDNA（以後、短いプレカーソルDNA）を用いた場合、テンプレートDNAの塩基長を調節することによって単量体環状一本鎖DNAおよび多量体環状一本鎖DNAの形成比率を制御することが可能である。
【００２２】
一実施形態において、短いプレカーソルDNAの塩基長は、テンプレートDNAの塩基長の2倍以下の塩基長が好ましい。この場合、1個の短いプレカーソルDNAと以下に記載されるテンプレートDNAの１個とをハイブリダイズさせた場合、ハイブリダイズ可能であるのは最大でも短いプレカーソルDNAの2分の１の領域のみであって、ハイブリダイズしていない一本鎖部分のDNA鎖は、ハイブリダイズしている部分の剛直性の影響を受け、テンプレートDNAとハイブリダイズし得ない（DNA鎖の剛直性を表す持続長は二重鎖状態では50nm程度（およそ150塩基長相当）である（Simmel, F. Cら、 DNA Nanodevices, Small, 2005, 1, No.3. 284-299））。
【００２３】
好ましくは短いプレカーソルDNAの塩基長は、28塩基長であり得る。
【００２４】
短いプレカーソルDNAの塩基配列は、特に限定されることなく所望される配列よりなり、ステムループ構造、ヘアピン構造などの二次構造を有していても良い。
【００２５】
本方法において、短いプレカーソルDNAに対して、20〜100塩基長を有するテンプレートDNA(以後、長いテンプレートDNA)を用いて環化を行った場合、形成される環状一本鎖DNAにおいて多量体環状一本鎖DNAの比率を高めることが可能である。
【００２６】
長いテンプレートDNAの塩基配列は、一般的なハイブリダイゼーション条件下にて、プレカーソルDNAの5’末端および3’末端の配列を認識し、ハイブリダイズし得る限り、プレカーソルDNAの各末端配列の相補配列に１から数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列から形成されても良い。
【００２７】
一実施形態において、長いテンプレートDNAの塩基長は、短いプレカーソルDNAの塩基長の2分の1の塩基長+2〜6塩基長の長さを有し得る。この場合、以下の実施例にて詳細に記載されるように、1個の短いプレカーソルDNAに対して1個の長いテンプレートDNAをハイブリダイズさせた場合、上記二重鎖部分の剛直性によりハイブリダイズした二重鎖構造部分に隣接して、プレカーソルDNAとハイブリダイズし得ない１〜３塩基からなる遊離端がテンプレートDNAに生じ得る（図２Ａ参照）。また、一本鎖DNAの持続長は1nm程度（およそ3塩基に相当）である（Simmel, F. Cら、前掲）ため、当該遊離端は剛直性を有し得る。従って、この遊離端はプレカーソルDNAとはハイブリダイズし得ない。遊離端の長さは、1〜3塩基長より選択することが可能であり、好ましくは1塩基長、さらに好ましくは2塩基長、特に好ましくは3塩基長であり得る。また、遊離端の長さは、各末端について同じ長さであっても良いし、異なっていても良い。
【００２８】
好ましくは長いテンプレートDNAの塩基長は、20塩基長であり得る。
【００２９】
1個の短いプレカーソルDNAに対して、1個の長いテンプレートDNAがハイブリダイズした場合、上記テンプレートDNA上に存在する遊離端により自由エネルギーが高い状態となり得る。そのためハイブリダイゼーション反応は、複数の短いプレカーソルDNAと複数のテンプレートDNAとのハイブリダイゼーションにより遊離端が生じない方向へと進行する傾向があり得る。従って、本方法においては、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を高めることが可能となり得る。
【００３０】
本方法において、特に好ましくは短いプレカーソルDNAが28塩基長の長さであり、かつ長いテンプレートDNAが20塩基長の長さである場合に、形成される環状一本鎖DNAにおける多量体環状一本鎖DNAの比率を高めることが可能である。
【００３１】
一方、本発明方法において、短いプレカーソルDNAに対して、12〜19塩基長を有するテンプレートDNA（以後、短いテンプレートDNA）を使用して環化を行った場合、形成される環状一本鎖DNAにおける多量体環状一本鎖DNAの比率を下げることが可能である。
【００３２】
短いテンプレートDNAの塩基配列は、一般的なハイブリダイゼーション条件下にて、プレカーソルDNAの5’末端および3’末端の配列を認識し、ハイブリダイズし得る限り、プレカーソルDNAの各末端配列の相補配列に１から数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列から形成されても良い。
【００３３】
一実施形態において、短いテンプレートDNAの塩基長は12塩基長〜当該プレカーソルDNAの塩基長の2分の1以下の塩基長であり得、1個の短いプレカーソルDNAに対して1個の短いテンプレートDNAがハイブリダイズした場合、上記遊離端を生じることなく全てのテンプレートDNAがプレカーソルDNAにハイブリダイズし得る長さであり得る。
【００３４】
好ましくは短いテンプレートDNAの塩基長は、14塩基長であり得る。
【００３５】
1個の短いプレカーソルDNAに対して1個の短いテンプレートDNAがハイブリダイズした場合、上記遊離端を生じることがないため、上記のように複数のプレカーソルDNAと複数のテンプレートDNAを用いたハイブリダイゼーション反応に進行する傾向が比較的低下し得る。従って、本方法においては、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を下げることが可能となり得る。
【００３６】
本方法において、特に好ましくは短いプレカーソルDNAが28塩基長の長さであり、かつ短いテンプレートDNAが14塩基長の長さである場合に、形成される環状一本鎖DNAにおける多量体環状一本鎖DNAの比率を下げることが可能である。
【００３７】
本発明方法において、50〜200塩基長を有し得るプレカーソルDNA（以後、長いプレカーソルDNA）を用いた場合、多量体環状一本鎖DNAの形成比率を下げることが可能である。長いプレカーソルDNAは、テンプレートDNA全体とハイブリダイズするのに十分な塩基長を有し得る。
【００３８】
一実施形態において、長いプレカーソルDNAの塩基長は、任意の塩基長を有するテンプレートDNAに対して、2倍〜10倍の長さを有し得る。そのため上記遊離端を生じることなく、当該テンプレートDNA全体とハイブリダイズすることが可能である。この場合、形成される環状一本鎖DNAにおける多量体環状一本鎖DNAの比率を下げることが可能であり、テンプレートDNAの塩基数を変更しても当該比率に影響し得ない。
【００３９】
本方法において特に好ましくは長いプレカーソルDNAが50塩基長の長さであり、テンプレートDNAが14塩基長または20塩基長である場合に、形成される環状一本鎖DNAにおける多量体環状一本鎖DNAの比率を下げることが可能である。
【００４０】
本発明方法において、形成された多量体環状一本鎖DNAの形成比率は、電気泳動を用いて判定することが可能である。形成された環状一本鎖DNAと用いたプレカーソルDNAとを電気泳動し、公知の方法により各DNAを示すバンドを検出する。得られた電気泳動像において、該プレカーソルDNAを示すバンドを基準として、それより高分子量側は多量体の環状一本鎖DNA、それより低分子量側は単量体の環状一本鎖DNAを示すバンドとみなすことができる。これは環状一本鎖DNAは、同じ長さの直鎖一本鎖DNAよりも電気泳動による移動度が大きいことに基づく（G.W. Ashley, D. M. Kushlan, Biochemistry 1991, 30, 2927-2933）。ImageJなどの公知の画像解析ソフトを用いて各バンドの強度を数値化し、多量体環状一本鎖DNAを示すバンド数値の積分値を単量体の環状一本鎖DNAを示すバンド数値の積分値で除すことによって多量体環状一本鎖DNAの形成比率を求めることが可能である。
【００４１】
本方法において、形成された環状一本鎖DNAは電気泳動を行う前に、環化されていない一本鎖DNAを除く処理を行うのが好ましい。当該処理方法は特に限定されないが、Exonuclease Iなどの酵素を用いた処理が好ましい。
【００４２】
本発明方法は、所望される多量体環状一本鎖DNAの形成比率に応じて、上記した塩基長を有するプレカーソルDNAおよびテンプレートDNAを準備する工程、
プレカーソルDNAおよびテンプレートDNAを混合してハイブリダイゼーションさせ、プレカーソルDNAの5’末端と3’末端とを隣接させる工程、
ライゲースを添加して、ライゲーションによりプレカーソルDNAの5’末端と3’末端を結合させて環化する工程、
を含んでなる。
【００４３】
本発明方法は、プレカーソルDNAとテンプレートDNAを用いて環状一本鎖DNAを製造する方法において、プレカーソルDNAとテンプレートDNAの塩基長を調節することによって、環状一本鎖DNAの形成効率を向上する方法に関する。
【００４４】
本方法において、プレカーソルDNAとして24〜49塩基長を有する短いプレカーソルDNAを用いた場合、その環化効率は、長いテンプレートDNA（20〜100塩基長）を用いた方が、短いテンプレートDNA（12〜19塩基長）を用いた場合よりも単量体環状一本鎖DNAおよび多量体環状一本鎖DNAを含めた環状一本鎖DNAの形成効率を向上することができる。
【００４５】
本方法において、特に好ましくは短いプレカーソルDNAが28塩基長の長さであり、かつ長いテンプレートDNAが20塩基長の長さである場合に、環状一本鎖DNAの形成効率を高めることが可能である。
【００４６】
本発明方法において、形成された環状一本鎖DNAの形成効率は、電気泳動を用いて判定することが可能である。本発明方法において形成された環状一本鎖DNAを、環化されていない一本鎖DNAを除去処理した試料と、未処理の試料とに分けて電気泳動し、公知の方法により各DNAを示すバンドを検出する。得られた電気泳動像より、ImageJなどの公知の画像解析ソフトを用いて各バンドの強度を数値化し、処理を施した試料におけるバンド数値の積分値を未処理の試料におけるバンド数値の積分値で除すことによって形成された環状一本鎖DNAの形成効率を求めることが可能である。
【００４７】
一本鎖DNAを除去する方法としては、特に限定されないがExonuclease Iなどの酵素を用いた処理が好ましい。
【００４８】
形成された多量体環状一本鎖DNAおよび単量体環状一本鎖DNAは、当業者に公知である一般的な方法（例えば、電気泳動法、分子ふるいクロマトグラフィなど）によって選別・精製することが可能であり、所望される分子量（連結数）を有する環状一本鎖DNAのみを得ることが可能であり、ナノマテリアルを構成する微小構造単位の基本単位として使用することができる。
【００４９】
選別および精製に際しては、酵素（Exonuclease Iなど）を使用して一本鎖のプレカーソルDNAおよびテンプレートDNAを除去しても良い。
【００５０】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
【実施例】
【００５１】
１．プレカーソルDNAおよびテンプレートDNAの設計・合成
プレカーソルDNAおよびテンプレートDNAについて、それぞれ2種類の一本鎖DNAを設計した。Dolinnayaら（Nucleic Acids Res., 1993, Vol.21, 5403−5407）の方法に基づき、プレカーソルDNAの5’末端部および3’末端部のそれぞれ6塩基以上がテンプレートDNAと相補的な配列を有し、テンプレートDNAとハイブリダイゼーションするよう設計した。テンプレートDNA としては、Dolinnayaら（前掲）が用いたテンプレートDNA（T14と呼称）：5’−GCAGTCAGTACGCG−3’（配列番号1）と、その他にT20：5’−GGCAGTCAGTACGCGAAAAG−3’（配列番号2）を設計した。プレカーソルDNAとしては、P28：5’−TGACTGCCCCTCAGCGCTTTTCGCGTAC−3’ （配列番号3）および P50 ：5’− ACTGACTGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCTTTTCGCGT−3’ （配列番号4）を設計した。プレカーソルDNAは5’末端のみをリン酸化し、テンプレートDNAは両末端とも未修飾として、合成・HPLC精製した(SIGMA Genosys)。
【００５２】
２．プレカーソルDNAの環状化
上記テンプレートDNAおよびプレカーソルDNAについて、以下の(a)〜(d)の4通りの組合せを用いて環状化を行った：(a) T14−P28；(b) T20−P28；(c) T14−P50；(d)T20−P50）。プレカーソルDNAおよびテンプレートDNAを、それぞれ5μMおよび10μMの濃度で反応溶液に加え、反応溶液の総量を24.0μlとした。反応溶液を95℃で5分間インキュベートし、−1℃ /分の速度で20℃まで徐冷しハイブリダイゼーションさせた。次に、T4 DNA Ligase (Promega) 1.90μl (5.69ユニット)および2×Rapid ライゲーション Buffer 25.9μl (Promega)を加え、20℃にてオーバーナイトでインキュベートし、ライゲーションした。その後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈殿により反応溶液からDNAを抽出した。
【００５３】
３．Exonuclease Iによる直鎖DNAの分解
上記エタノール沈殿により抽出したDNAを20.0μlの超純水に溶解し、95℃で3分間熱変性を加えた後、×10 Reaction Buffer (Takara Bio) 3.56μlを加え、11.8μlずつに2本に分注した。次に、一方の溶液にはExonuclease I (Takara Bio) 6μl (30ユニット)を、他方の溶液には滅菌水6μlを加え、37℃で16時間、95℃で15分間インキュベートした。その後、双方に対しフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈殿を行い、反応溶液からDNAを抽出した。
【００５４】
４．Denaturing PAGEによるDNAの検出
得られた最終反応物およびプレカーソルDNA溶液、テンプレートDNA溶液を、8.3M 尿素 15% Denaturing PAGE (200V、180分間)に供した後、SYBR Green II (Cambrex)を用いて30分間浸透攪拌し、イルミネータで観察した。
【００５５】
５．環状化の効率の解析
上記４．にて検出された電気泳動画像より、画像処理ソフトウェアImageJ（NKH）を用いて、各組合せにおけるExonuclease I処理前後の試料を泳動したレーンの各輝度情報を取得した。そして当該輝度分布から、特定のバンドが検出されない無蛍光領域の輝度の平均値を減算し、バックグラウンドを除いた輝度分布を作成し、得られた輝度分布を積分した。同一の電気泳動で得られた結果について、Exonuclease I処理後の試料を泳動したレーンの輝度の積分値をExonuclease I処理前の試料を泳動したレーン輝度の積分値で除し、この値をExo I ratioと定義した。Exo I ratioは、テンプレートDNAによる輝度の影響を含んでいるため、厳密には環状化効率ではないが、環状化の効率と相関関係にあると言える。
【００５６】
６．環状一本鎖DNAの単量体および多量体の解析
形成される環状一本鎖DNAには、単量体環状一本鎖DNAと多量体環状一本鎖DNAとが含まれる。形成された環状一本鎖DNAにおける単量体環状一本鎖DNAと多量体環状一本鎖DNAの形成比率を、各組合せにおいて調べた。上記ImageJによって取得したプレカーソルDNA単体のみを泳動したレーンの輝度分布のうち最も強いピークの頂点を基準にして、Exonuclease I処理後試料を泳動したレーンの輝度分布を短鎖側領域と長鎖側領域に分け、それぞれについて積分を行った（図３参照）。得られた短鎖側領域の積分値を得られた長鎖側領域の積分値で除し、この値をmultimer / monomer ratioと定義した。一般に、同じ塩基長の環状一本鎖DNAと直鎖DNAを電気泳動した場合、直鎖DNAよりも環状一本鎖DNAの移動度が大きくなることが知られている（G.W. Ashleyら、 Biochemistry 1991, 30, 2927 - 2933）。したがって、単量体の環状一本鎖DNAは、直鎖のプレカーソルDNA単体よりも短鎖側まで移動し、短鎖側領域の積分値に反映されると考えられる。本実験におけるmultimer / monomer ratioは、厳密な単量体と多量体の構成比には一致しないが、単量体の比率と逆の相関を示すと言える。
【００５７】
７．結果
本実施例では、上記4通りのプレカーソルDNA−テンプレートDNAの組合せで環状化実験を行い、最終産物に対するプレカーソルDNAおよびテンプレートDNAの塩基長の影響について比較検討を行った。プレカーソルDNA−テンプレートDNAの各組合せで反応を行った溶液を電気泳動（15% Denaturing PAGE）に供した際の代表的な結果を図４に示す。
【００５８】
この結果より、全ての組合せにおいて以下の傾向が共通して認められた：
（１）プレカーソルDNAおよびテンプレートDNAを単体で電気泳動したレーン（各パネルにおけるレーン３または４）において、階段状のバンドが検出された。これらの階段状のバンドは、いずれも、非常に強い一本のバンドと、その短鎖側および長鎖側に広がるやや弱い数本のバンドからなっていた。
（２）プレカーソルDNAとテンプレートDNAを混合し、ライゲーションを行った試料を電気泳動したレーン（各パネルにおけるレーン５）において、いずれの組合せにおいても、プレカーソルDNAやテンプレートDNAとは異なる位置に複数のバンドが検出された。
（３）上記ライゲーション反応溶液をExonuclease I処理した試料を電気泳動したレーン（各パネルにおけるレーン６）において、いずれの組合せにおいても、幾つかのバンドは消失したものの依然として複数のバンドが検出された。
【００５９】
上記結果（１）より、プレカーソルDNAおよびテンプレートDNAの存在が確認された。階段状のバンドが認められたのは、試料保存中に劣化が進行し、一部DNA中のホスホジエステル結合が分解したためであると考えられる。
【００６０】
上記結果（２）より、いずれの組合せにおいても、ライゲーションによりプレカーソルDNAが複数個連結された出発物質とは異なるDNAが生成したことが確認された。
【００６１】
上記結果（３）より、いずれの組合せにおいても、ライゲーションによって生成するDNAには、Exonuclease Iの作用を受けるものと受けないものが含まれることが確認された。Exonuclease Iは一本鎖状態のDNAを5’末端から順番に分解する酵素である。したがって、Exonuclease Iの添加によって消化されなかったバンドは、5’末端を有さない環状一本鎖DNAであると考えられる。いずれの組合せにおいても複数のバンドが残存していることから、本実験の操作では、プレカーソルDNAが単体で環を形成する単量体のみではなく、多数のプレカーソルDNAが連結されて環を形成する多量体も生成することが示唆される。
【００６２】
各組合せにおいて、以下の特徴的な傾向が認められた。
【００６３】
Exonuclease I処理した試料を電気泳動したレーン（各パネルにおけるレーン６）について、P28−T14の組合せ（a）では、短鎖側（図下方）から長鎖側（図上方）に至る全領域において、複数の強いバンドが認められた（バンドA, B, Cなど）が、一方、P28−T20の組合せでは、強いバンドは長鎖側のみに認められた（バンドD, Eなど）。P28−T14では単鎖側に認められたバンド（バンドC）が、P28−T20には認められないことは、プレカーソルDNA P28が単体で環を形成する単量体がP28−T20では生成していないことを示唆する。また、長鎖側領域においては、写真（a）中のバンドA, Bおよび写真（b）中のバンドD, Eなどのように類似した大きさを示すバンドも存在したが、P28−T14にのみ認められるバンドも存在した（バンドFなど）。階段状のバンドが、連結されているプレカーソルDNA P28単体の個数のみを反映しているとすれば、テンプレートDNAの塩基長を変えることによって特定数のプレカーソルDNA P28単体が連結されてなる多量体の生成が抑制され得ることを示唆する。
【００６４】
一方、P50−T14およびP50−T20の組合せ（（c）および（d））におけるExonuclease I処理した試料を電気泳動したレーンでは、プレカーソルDNA P50単体を電気泳動したレーン（各パネルにおけるレーン３）にて最も強く検出されるバンドより長鎖側の領域において、双方の組合せで階段状のバンド（バンドG, H, G’, H’など）が検出された。しかし、プレカーソルDNA P28を用いた場合と比べ、検出されるバンドの本数は全体的に少なく、テンプレートDNAの塩基長の差異による影響も小さかった。なお、短鎖側の領域において、テンプレートDNA単体に相当する位置付近に一本の強いバンド（バンドI）が検出されるたが、これはExonuclease Iの作用が不十分であったことにより残留したテンプレートDNAであると思われる。
【００６５】
Exonuclease I処理前後の試料を泳動したレーン（各パネルにおけるレーン5および６）についてImageJを用いて各レーンの輝度を取得し、各組合せにおけるExo I ratioを解析した。得られた結果を図５に示す。同図に示すようにプレカーソルDNA P28に対してテンプレートDNA T14を用いた場合（a）には、Exo I ratioは0.40±0.11（Mean±S.D.）であったが、プレカーソルDNA P28に対しテンプレートDNA T20を用いた場合（b）には、Exo I ratioは0.67±0.15であった。これらについてウェルチのt検定を行ったところ、両者のExo I ratioには有意な差異が認められた（p＜0.01）。このことから、プレカーソルDNA P28に対して、テンプレートDNA T20はテンプレートDNA T14に比べて優れた環状化能力を有することが示唆された。一方、プレカーソルDNA P50を用いた場合のExo I ratioは、テンプレートDNA T14を用いた場合（c）が0.40±0.12であり、テンプレートDNA T20を用いた場合（d）が0.41±0.10であった。これらの組合せ間には有意な差異は認められず、したがって、プレカーソルDNA P50に対する環状化能力は、テンプレートDNA T14とテンプレートDNA T20との間で差異は無いことが示唆された。
【００６６】
この結果より、短いプレカーソルDNAの環状化効率は、テンプレートDNAが長くなるにつれて改善される傾向が見られるが、長いプレカーソルDNAの環状化効率は、テンプレートDNAの長さに影響されないことが示唆される。
【００６７】
Exonuclease I処理前後の試料を泳動したレーン（各パネルにおけるレーン5および６）についてImageJを用いて各レーンの短鎖側領域および長鎖側領域の輝度をそれぞれ取得し、各組合せにおけるmultimer / monomer ratioを解析した。得られた結果を図６に示す。同図に示すように、プレカーソルDNA P28を用いた場合のmultimer / monomer ratioは、テンプレートDNA T14を用いた場合（a）が4.00±0.69であり、テンプレートDNA T20を用いた場合（b）が6.96±4.17であった。これらの間に有意な差異が認められた（p＜0.05）。したがって、プレカーソルDNA P28に対しては、テンプレートDNA T14を用いた場合よりもテンプレートDNA T20を用いた場合のほうが、生成される環状一本鎖DNAに含まれる多量体の比率が大きいことが示された。一方、プレカーソルDNA P50を用いた場合のmultimer / monomer ratioは、テンプレートDNA T14を用いた場合（c）が3.61±6.98であり、テンプレートDNA T20を用いた場合（d）が1.74±0.94であった。これらの間に有意差は認められなかった。したがって、プレカーソルDNA P50に対してはテンプレートDNA T14またはテンプレートDNA T20のいずれを用いても生成される環状一本鎖DNAに含まれる多量体の比率に影響が無いことが示された。
【００６８】
以上の結果より、プレカーソルDNA P28に対してテンプレートDNA T14またはテンプレートDNA T20を用いた場合、いずれも様々な個数のプレカーソルDNA P28からなる環状一本鎖DNAを生成するが、単量体と多量体の生成比率はテンプレートDNAの塩基長の差異による影響を受け、テンプレートDNAの塩基長が長い方が多量体を産出する傾向が強いことが示された。一方、プレカーソルDNA P50に対してテンプレートDNA T14またはテンプレートDNA T20を用いた場合、いずれも様々な個数のプレカーソルDNA P50からなる環状一本鎖DNAを生成するが、単量体と多量体の生成比率はプレカーソルDNA P28を用いた場合と比べてテンプレートDNAの塩基長の差異による影響は小さく、単量体が生成する傾向にあることが示唆された。
【００６９】
プレカーソルDNA P28を用いた場合とプレカーソルDNA P50を用いた場合で、このような結果の相違がもたらされた原因として、DNA鎖の剛直性が二本鎖状態と一本鎖状態で著しく異なることが考えられる。上記したようにDNA鎖の持続長は、二本鎖状態では50nm程度（およそ150塩基に相当）であるのに対し、一本鎖状態では1nm程度（およそ3塩基に相当）である。したがって、本実験で用いた28塩基長および50塩基長のプレカーソルDNAは、一本鎖状態では紐のように柔軟であるが、テンプレートDNAと二重らせん構造を形成すると、その部分のみが剛直な棒のように振舞うと考えられる。この点を踏まえると、単体のプレカーソルDNAが、両端が閉じた構造をとりながらテンプレートDNAと形成できる二重らせん構造の長さは、最大でもプレカーソルDNAの塩基長の1/2程度であり、テンプレートDNAの塩基長がそれよりも長い場合（例えば、プレカーソルDNA P28に対してテンプレートDNA T20を用いた場合など）には、図２Ａに示すようにテンプレートDNAの両端はプレカーソルDNAと結合できずに遊離すると考えられる。しかし、自由エネルギーを最小にするためには、遊離端が存在する図２Ａのような状態よりも、多数のプレカーソルDNAを介して環を形成する図２Ｂのような状態のほうがより好ましい。したがって、二重らせん構造部分が剛直に振舞う数十塩基程度のプレカーソルDNAの塩基長に対しては、十分長いテンプレートDNAを用いることで、単量体の生成を抑制し多量体を多く生成することができる。逆に、プレカーソルDNAの塩基長を長じれば、相対的にテンプレートDNAによる幾何的拘束の影響を軽減でき、単量体を多く生成することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明により、プレカーソルDNAおよびテンプレートDNAを用いた環状一本鎖DNAの製造において、単量体環状一本鎖DNAまたは多量体環状一本鎖DNAの形成比率をプレカーソルDNAおよびテンプレートDNAの塩基長のみを調節することによって容易に制御することが可能となる。したがって、本発明は、単一種のプレカーソルDNAより目的に応じた分子量（連結数）を有する環状一本鎖DNAを容易に誘導することを可能とし、ナノマテリアルとしての利用が期待される環状一本鎖DNAを効率的に安定して供給することに重要な貢献をすることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１Ａ】図１Ａは、単量体環状一本鎖DNAの模式図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、多量体環状一本鎖DNAの模式図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、単体のプレカーソルDNAからなる単量体環状一本鎖DNAの概略図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、複数のプレカーソルDNAからなる多量体環状一本鎖DNAの概略図を示す。
【図３】図３は、単量体環状一本鎖DNAおよび多量体環状一本鎖DNAの解析方法を示す。
【図４】図４は、各組合せにおける生成物の比較結果を示す図である。左より、(a) P28-T14、(b) P28-T20、(c) P50-T14、(d) P50-T20の各組合せを示す。各パネル中、1：10bpごとのマーカー、2：25bpごとマーカー、3：プレカーソルDNA、4：テンプレートDNA、5：Exonuclease I処理前の試料、6：Exonuclease I処理後の試料
【図５】図５は、各組合せにおけるExo I ratioの結果を示す図である。
【図６】図６は、各組合せにおけるmultimer / monomer ratioの結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
配列番号１〜４は、合成オリゴヌクレオチド配列を示す。
【図１Ａ】
2009240254.tif 000002
【図１Ｂ】
2009240254.tif 000003
【図２Ａ】
2009240254.tif 000004
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
2009240254.tif 000007
【図５】
2009240254.tif 000008
【図６】
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【配列表】
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