(57)【要約】【課題】特定のＤ−アミノ酸に対する特異性が高く、かつ、他の類似構造を有する化合物に対する選択性も高いＤ−アミノ酸の分析方法であって、臨床検体等の多試料分析に適したＤ−アミノ酸の分析方法を開発すること。【解決手段】特定の１種類のＤ−アミノ酸のみと反応し、該Ｄ−アミノ酸に類似する他の化合物とは交差反応しない、抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、該モノクローナル抗体を用いるＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法を提供する。前記Ｄ−アミノ酸の免疫学的分析方法には、競合ＥＬＩＳＡ法又は表面プラズモン共鳴法を利用する場合がある。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の１種類のＤ−アミノ酸のみを抗原として認識し、他の化合物とは交差反応しないことを特徴とする抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記特定の１種類のＤ−アミノ酸は、Ｄ−アスパラギン酸又はＤ−ロイシンであることを特徴とする請求項１に記載の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を産生することを特徴とする細胞株。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を用いてＤ−アミノ酸を検出・定量することを特徴とするＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、該モノクローナル抗体の抗原であるＤ−アミノ酸が固定された固体支持体との反応を、試料中の前記Ｄ−アミノ酸が競合阻害することを利用することを特徴とするＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。
【請求項６】
前記抗原であるＤ−アミノ酸はキャリア高分子と結合したＤ−アミノ酸複合体として固体支持体に固定されることを特徴とする請求項５に記載のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。
【請求項７】
（１）前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、前記Ｄ−アミノ酸複合体が固定された固体支持体と、前記試料とを用意するステップと、（２）前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と前記試料との混合溶液を調製するステップと、(３)前記混合溶液を前記固体支持体に接触させるステップと、（４）前記固体支持体に結合した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を検出・定量するステップとを含むことを特徴とする請求項６に記載のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。
【請求項８】
前記固体支持体に結合した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を検出・定量するステップは、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴法又はラテックス凝集法を利用することを特徴とする請求項７に記載のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体の作成の際の免疫原はＤ−アミノ酸とキャリア高分子とが結合したＤ−アミノ酸複合体であり、該免疫原のＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子は、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子とは異なることを特徴とする請求項６ないし８のいずれかに記載のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体の作成に用いた動物の免疫に用いたＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子はウシ血清アルブミンであり、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子は卵白アルブミンであることを特徴とする請求項９に記載のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。
【請求項１１】
請求項４ないし１０のいずれかに記載のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法を実行することを特徴とするＤ−アミノ酸の免疫学的分析装置。
【請求項１２】
（１）請求項１又は２に記載の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、（２）請求項５ないし１０のいずれかに記載の免疫学的分析方法に用いる固体支持体と、請求項６ないし１０のいずれかに記載の免疫学的分析方法に用いる固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体と、請求項８ないし１０のいずれかに記載の免疫学的分析方法に用いる固体支持体を含むＥＬＩＳＡ法用マルチウェルプレート、表面プラズモン共鳴法用センサーチップ又はラテックス凝集法用微粒子とのうち少なくとも１つとを含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の分析用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、該抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を用いるＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法及び分析用キットとに関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸の多くは、α位の不斉炭素原子についてＤ体とＬ体という２種類の立体異性体が存在する。通常の化学合成においてはＬ体とＤ体の等量混合物であるラセミ体が得られるが、タンパク質の構成単位をはじめとして自然界に存在するアミノ酸のほとんどが、Ｌ−アミノ酸である（非特許文献１参照）。しかし、近年かつて非天然型アミノ酸と呼ばれていたＤ−アミノ酸が、細菌だけでなく環形動物、昆虫、植物、及び脊椎動物体内に至るまで幅広く存在し、種々の重要な役割を有していることが明らかにされている（非特許文献２参照）。また、クロマトグラフィー法をはじめとする微量分析法及び光学分割法の目覚しい技術革新により、ヒト、ラット、マウス等で遊離アミノ酸として、あるいは、ペプチド中に取り込まれたアミノ酸残基として、哺乳類体内に様々なＤ−アミノ酸が存在することが１９８０年代から明らかにされた。現在までに、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ロイシン等が知られている。
【非特許文献１】Ｊ．Ｊ．Ｃｏｒｒｉｇａｎ，Ｄ−Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６４，１４２−１４９（１９６９）
【非特許文献２】左右田健次：Ｄ−アミノ酸の生化学(Ｉ)、化学３２，５１７−５２６（１９７７）
【０００３】
Ｄ−セリンやＤ−アスパラギン酸はＤ体の割合が高いことから比較的研究が進んでいるＤ−アミノ酸である。Ｄ−セリンは大脳、海馬に局在し、脳内のＮＭＤＡ受容体の調節因子であることが明らかにされている。Ｄ−アスパラギン酸は精巣や松果体に局在が認められ、ホルモン分泌の制御に関与していることが示されている。その他にも、Ｄ−アラニンが下垂体前葉や膵臓のβ細胞に局在し、概日変動を示すこと、Ｄ−プロリンがＤ−アミノ酸オキシダーゼ欠損マウスの尿中に多量存在すること、Ｄ−ロイシンがマウス脳内の特定部位に局在すること等が報告されている（特許文献１参照）。さらに、一部Ｄ−アミノ酸と疾患との関連も報告されている。例えば、統合失調症やアルツハイマー病等の神経性疾患においてＤ−アミノ酸の血中含量や脳内含量変化が認められる。統合失調症患者にＤ−セリンを投与した結果、症状の改善が見られたとの報告もある。
【特許文献１】特開２００５−３５５８号公報
【０００４】
このように、Ｄ−アミノ酸は哺乳類体内において生理的役割や臨床診断上の意義を有していると考えられており、新たなＤ−アミノ酸の生理機能の解明が、Ｄ−アミノ酸をリード化合物とする新規薬効分子の探索を可能にし、新たな医薬品創生の基盤になることが期待されている。そこで、Ｄ−アミノ酸の詳細な機能解析のため様々な生理条件下や疾病下における試料分析が望まれている。
【０００５】
従来のＤ−アミノ酸の分析法としては、酵素を用いる方法、キラルな試薬を用いるジアステレオマー法、キラル移動相法、ガスクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法（特許文献２参照）、キャピラリー電気泳動法及びカラムスイッチングキラルＨＰＬＣ法（非特許文献２及び３）等を利用する方法が知られている。特に、カラムスイッチングキラルＨＰＬＣ法は、高感度かつ選択的で、生体内微量Ｄ−アミノ酸分析法の中で最も優れた分析法のひとつである。カラムスイッチングキラルＨＰＬＣ法は、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン及びＤ−プロリンがそれぞれ異なった組織分布を示すことを明らかにした。これらの高感度分析法の確立によって、極微量Ｄ−アミノ酸の定量が可能になり、生体内における種々のＤ−アミノ酸の生理機能の発見を始め、臓器局在、体内動態、疾病時の含量変化解析等が行われてきた。しかしこれらの方法は、単一のシステムで一度に１種類のアミノ酸しか分析できないため、１回の分析に長時間を要し、かつ複雑な装置を必要とする。そこで、従来技術では臨床検体等の多試料分析には限界がある。詳細なＤ−アミノ酸の生理機能や疾患との関連解明のために、迅速かつ簡便な分析法の開発が切望されている。
【特許文献２】特開２００２−２６７６４９号公報
【非特許文献３】長田洋子：生体に存在するＤ−アミノ酸―哺乳類を中心として―、札幌医誌、５８，２７１−２７８（１９８９）
【０００６】
現在、迅速性と簡便性を兼ね備えた測定法として、臨床検査の分野では主に免疫学的原理に基づく方法が利用されている。免疫学的測定法は、抗原抗体反応を利用するために特異性に優れ、目的物質の分離、精製、濃縮等の煩雑な操作を伴わず簡便であるという利点を有している。抗Ｄ−アミノ酸抗体を用いる免疫学的測定法の開発は多検体の迅速分析を可能とし、Ｄ−アミノ酸の生理機能解明に大きく貢献できると考えられる。Ｄ−アミノ酸に対する抗体はこれまでに多数報告され、市販もされているがほとんどがポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、複数のＢ細胞に由来する多数のイムノグロブリンを含有するために免疫動物の個体差を大きく反映し、一定品質の抗体を継続的に得ることは困難である。一方、モノクローナル抗体は半永久的に同質の抗体を得ることが可能であり、長期間にわたり同一性が求められる免疫測定法には適していると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、モノクローナル抗体が認識するエピトープ構造は特定の化学構造に必ずしも限定されない。例えば、あるＤ−アミノ酸に対して特異的に結合する抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体であっても、該Ｄ−アミノ酸の立体異性体であるＬ−アミノ酸その他の類似構造を有する他の化合物とも結合する場合がある。そこでＤ−アミノ酸の生理機能解明のためには、特定のＤ−アミノ酸に対する特異性が高く、かつ、類似構造を有する他の化合物に対する選択性も高いモノクローナル抗体を作成する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、特定の１種類のＤ−アミノ酸のみを抗原として認識し、他の化合物とは交差反応しない、抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を提供する。本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体は、Ｄ−アスパラギン酸又はＤ−ロイシンのみと抗原として反応し、他の化合物とは交差反応しないモノクローナル抗体の場合がある。本発明は、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を産生する細胞株を提供する。
【０００９】
本発明は、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を用いてＤ−アミノ酸を検出・定量する、Ｄ−アミノ酸の免疫学的分析方法を提供する。本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法は、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、該モノクローナル抗体の抗原であるＤ−アミノ酸が固定された固体支持体との反応を、Ｄ−アミノ酸含量を測定する試料中のＤ−アミノ酸が競合阻害することを利用する場合がある。本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法においては、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と反応するＤ−アミノ酸が、キャリア高分子と結合したＤ−アミノ酸複合体として、固体支持体に固定される場合がある。
【００１０】
本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法は、（１）抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、Ｄ−アミノ酸複合体が固定された固体支持体と、試料とを用意するステップと、（２）前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と前記試料との混合溶液を調製するステップと、(３)前記混合溶液を前記固体支持体に接触させるステップと、（４）前記固体支持体に結合した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を検出・定量するステップとを含む場合がある。前記固体支持体に結合した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を検出・定量するステップは、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集法等を利用する場合がある。
【００１１】
本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法において、前記モノクローナル抗体の作成の際の免疫原は、Ｄ−アミノ酸とキャリア高分子とが結合したＤ−アミノ酸複合体である場合がある。その場合には、前記免疫原のＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子は、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子とは異なる場合がある。前記モノクローナル抗体の作成に用いた動物の免疫に用いたＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子はウシ血清アルブミンで、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子は卵白アルブミンの場合がある。
【００１２】
本発明は、本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法を実行する、Ｄ−アミノ酸の免疫学的分析装置を提供する。
【００１３】
本発明は、（１）本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、（２）該モノクローナル抗体の抗原のＤ−アミノ酸と、本発明の免疫学的分析方法に用いる固体支持体と、該固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体と、前記固体支持体を含むＥＬＩＳＡ法用マルチウェルプレート、表面プラズモン共鳴法用センサーチップ又は凝集法用微粒子とのうち少なくとも１つとを含む、Ｄ−アミノ酸の分析用試薬キットを提供する。
【００１４】
本発明におけるアミノ酸とは、不斉炭素を含まないグリシンのようなアミノ酸と、α位に不斉炭素を含み、Ｄ−体及びＬ−体の立体異性体を有するアミノ酸と、α位以外に不斉炭素を含むアミノ酸とを含む。本発明のＬ−アミノ酸は、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−チロシンからなる１９種類のＬ−アミノ酸を含むがこれらに限定されない。本発明におけるＤ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リジン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファンのＤ−チロシンからなる１９種類のＤ−アミノ酸を含むがこれらに限定されない。本発明のＤ−アミノ酸は、Ｄ−アスパラギン酸又はＤ−ロイシンの場合がある。
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体が交差反応しない「他の化合物」とは、本発明のモノクローナル抗体が反応する特定の１種類のＤ−アミノ酸以外の全ての化合物をいう。前記「他の化合物」には、前記特定の１種類のＤ−アミノ酸と類似する化合物が含まれる。ここで前記特定の１種類のＤ−アミノ酸と類似する化合物には、該特定のＤ−アミノ酸以外のＤ−アミノ酸と、生体の主要な構成要素であるグリシン及び前記１９種類のＬ−アミノ酸とを含むが、これらに限られない。例えば、Ｄ−ロイシンと類似する化合物は、イソロイシンのエピマーである、Ｌ−アロイソロイシン（Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ）及びＤ−アロイソロイシン（Ｄ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ）を含む。したがって本発明のモノクローナル抗体がＤ−ロイシンのみと反応する場合には、該モノクローナル抗体は、Ｄ−ロイシン以外のＤ−アミノ酸と、グリシン及び前記１９種類のＬ−アミノ酸と反応しないばかりか、Ｌ−アロイソロイシン及びＤ−アロイソロイシンとも反応しない。
【００１６】
本発明のＤ−アミノ酸は、キャリア高分子と結合した複合体として、本発明のモノクローナル抗体の作成、及び／又は、本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法の実施に用いられる場合がある。本明細書では、Ｄ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸とキャリア高分子との複合体を、それぞれ、（Ｄ−ＡＡ）−ＰＯＬ又はＡＡ−ＰＯＬと表す。単にアミノ酸−ＰＯＬと表す場合には、いずれかのアミノ酸とキャリア高分子との複合体を意味する。ここでアミノ酸が特定のアミノ酸の場合には、ＡＡ又はＤ−ＡＡの代わりに慣用の３文字表記で表される。例えば、Ｄ−アスパラギン酸とキャリア高分子とが結合した複合体は、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＰＯＬと表される。また、複数のアミノ酸がハイフンで結ばれている場合には、左側のアミノ酸のカルボキシル基と右側のアミノ酸のアミノ基とがペプチド結合した化合物であることを表す。例えば、Ｇｌｙ−（Ｄ−Ａｓｐ）は、グリシンのカルボキシル基とＤ−アスパラギン酸のアミノ基とがペプチド結合したジペプチドである。ここでキャリア高分子は、ハプテンに免疫原性を付与することのできるいずれかの高分子をいい、タンパク質、多糖類等の生体高分子でも、ポリリジン等の合成高分子でもかまわない。本発明の複合体のキャリア高分子に用いられるタンパク質は、ウシ血清アルブミン、ニワトリオバルブミン及びスカシ貝ヘモシアニンを含むがこれらに限られない。本発明の複合体にウシ血清アルブミン、ニワトリオバルブミン又はスカシ貝ヘモシアニンを用いるときには、本発明の複合体はそれぞれ（Ｄ−ＡＡ）−ＢＳＡ、（Ｄ−ＡＡ）−ＯＶＡ又は（Ｄ−ＡＡ）−ＫＨＬと表される。
【００１７】
本発明の複合体におけるＤ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸とキャリア高分子とは、アミノ酸のいかなる官能基とキャリア高分子との間で結合されてもかまわない。例えば、アミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基とキャリア高分子のいずれかの側鎖との間を適当な架橋剤を介して共有結合する場合がある。前記架橋剤は、グルタルアルデヒド（ＧＡ）、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含むがこれらに限られない。本発明のＤ−アミノ酸とキャリア高分子との複合体は、Ｄ−アミノ酸の免疫原性を高めるためにさまざまな保護、修飾等が行われる場合がある。また、前記架橋剤による架橋反応の後で、アミノ酸とキャリア高分子との連結部分の免疫原性を低下させることによりＤ−アミノ酸に対する免疫原性を高める場合もある。例えば、前記Ｄ−アミノ酸とキャリアタンパク質とのグルタルアルデヒドによる架橋反応では、第一級アミンとアルデヒド又はケトンとの縮合反応により生成する窒素と炭素との二重結合を含む化合物であるシッフ塩基を生じることが知られている。前記シッフ塩基の二重結合を還元せずに前記Ｄ−アミノ酸複合体で動物を免疫した場合、二重結合部位に対する非特異的な抗体が多く産生されることが知られている。したがって前記Ｄ−アミノ酸複合体は、前記Ｄ−アミノ酸と前記キャリアタンパク質との結合後に水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）等の還元剤で還元させ前記二重結合を単結合とし、Ｄ−アミノ酸以外の部分の免疫原性を低減させる場合がある。本発明のアミノ酸とキャリアタンパク質とがグルタルアルデヒドによって架橋され、その後架橋部分が水素化ホウ素ナトリウムにより還元された複合体は、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＯＶＡ、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＫＨＬ等と表される場合がある。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体とは、動物の単一の抗体産生細胞クローンに由来する抗体をいう。発明のモノクローナル抗体は、Ｄ−アミノ酸とキャリア高分子との複合体を免疫原として免疫された動物の抗体産生細胞に由来する場合がある。前記動物には、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ等の哺乳動物が含まれるがこれらに限られない。前記抗体産生細胞は脾細胞の場合がある。本発明のモノクローナル抗体は、免疫された動物の抗体産生細胞と、同種又は異種の動物由来のミエローマ細胞との細胞融合の結果得られるハイブリドーマ細胞株から産生される場合がある。また本発明のモノクローナル抗体は、免疫された動物の抗体産生細胞から調製したｃＤＮＡライブラリから単離した抗体遺伝子ｃＤＮＡの抗原結合部分に由来する組換え抗体の場合もある。前記組換え抗体は、Ｄ−アミノ酸とのみ反応するものであれば、軽鎖又は重鎖のいずれかの抗原結合部分のみに由来する組換え抗体であってもよく、他の抗原に対する抗原結合部分との融合抗体であってもよい。したがって、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を産生する細胞株は、前記ハイブリドーマ細胞株と、抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の組換え抗体を発現するように該組換え抗体遺伝子の形質転換又はトランスフェクションを施された細菌、酵母、菌類、植物又は動物の細胞とを含む。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体が特定の１種類のＤ−アミノ酸を抗原として認識するとは、該Ｄ−アミノ酸の試料中の濃度を競合ＥＬＩＳＡ法で定量することができることをいう。すなわち、抗原のＤ−アミノ酸とキャリア高分子との複合体を吸着させた固相に前記モノクローナル抗体を接触させた後、洗浄し、固相の前記Ｄ−アミノ酸と結合したモノクローナル抗体に、該モノクローナル抗体に対する酵素標識２次抗体を接触させ、酵素の発色反応の結果を吸光度で測定する際に、前記Ｄ−アミノ酸が遊離状態で存在する試料を競合に用いると、０．１ｍＭないし１０ｍＭ、好ましくは０．０５ｍＭないし１０ｍＭ、最も好ましくは０．０１６ｍＭないし１６ｍＭの濃度範囲内で濃度依存的な吸光度の減少が認められ、これらの範囲内で試料中での前記Ｄ−アミノ酸の濃度を定量することが可能であることをいう。
【００２０】
また、本発明のモノクローナル抗体がある化合物と交差反応しないとは、前記ＥＬＩＳＡ法を行う際に、抗原のＤ−アミノ酸とキャリア高分子との複合体を固相に吸着させた場合の吸光度が、当該化合物とキャリア高分子との複合体を固相に吸着させた場合の吸光度より少なくとも１０倍、好ましくは２０倍以上大きいこという。この交差反応の有無を判断するためのＥＬＩＳＡ法の実験は、前記Ｄ−アミノ酸について０．１ｍＭないし１０ｍＭ、好ましくは０．０５ｍＭないし１０ｍＭ、最も好ましくは０．０１６ｍＭないし１６ｍＭの濃度範囲内で濃度依存的な吸光度の減少が認められる条件で行われるものとする。
【００２１】
本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を用いてＤ−アミノ酸を検出・定量する、Ｄ−アミノ酸の免疫学的分析方法は、免疫組織化学的方法、光学顕微鏡又は電子顕微鏡による免疫細胞化学的方法、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法の他、微粒子又はナノ微粒子の凝集による比濁度の変化に基づく分析方法が含まれるが、これらに限られない。本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法には、競合的な結合に基づく方法と非競合的な結合に基づく方法とが含まれる。Ｄ−アミノ酸を検出・定量するために、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体が、ビオチンのような低分子リガンド、酵素、放射性同位元素、色素等で標識される場合があり、前記モノクローナル抗体に対する２次抗体か、前記ビオチンのような低分子リガンドと特異的に結合するアビジンのような生体高分子かが、酵素、放射性同位元素、色素等で標識される場合がある。
【００２２】
本発明Ｄ−アミノ酸の免疫学的分析方法は、前記Ｄ−アミノ酸複合体が固定された固体支持体を用いる場合がある。前記固体支持体は、前記Ｄ−アミノ酸複合体のＤ−アミノ酸の免疫原性を失わせず固定できるものであればよく、さまざまな材料又は形状の固体を利用することができる。前記固体支持体は、ポリマー材料、ガラス、セラミック、ゲル、膜、天然繊維、シリコーン、金属およびこれらの複合材料を含むがこれらに限定されない材料から加工される場合がある。前記固体支持体は、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、マルチアレイチップ、センサーチップ、ラテックス凝集法用微粒子又はナノ微粒子のような、自動診断システムによって取り扱うのに適する形状が含まれる。
【００２３】
本発明のＤ−アミノ酸複合体は、静電気による吸着により前記固体支持体上に固定される場合のほか、前記Ｄ−アミノ酸複合体のアミノ基と前記固体支持体のカルボキシル基とのアミド結合により前記固体支持体上に固定される場合がある。前記Ｄ−アミノ酸複合体の前記固体支持体上への固定を促進するために、前記Ｄ−アミノ酸複合体は、前記固体支持体上への固定の前に予めアミノ基が導入される場合がある。アミノ基の導入のための１つの手法は、Ｄ−アミノ酸とキャリアタンパク質との架橋反応時にヒドラジン（ＮＨ２ＮＨ２）を共存させることによりアミノ基で修飾されたＤ−アミノ酸複合体を作製することである。前記アミノ基で修飾されたＤ−アミノ酸複合体は、アミノ基導入型Ｄ−アミノ酸複合体ともいい、（Ｄ−ＡＡ）−ＰＯＬ複合体（＋ＮＨ２）、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＰＯＬ複合体（＋ＮＨ２）、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）等と表される。
【００２４】
本発明の競合的な結合を利用する方法の（１）前記固体支持体を用意するステップは、前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、前記Ｄ−アミノ酸キャリア高分子複合体が固定された固体支持体と、前記試料とが、手作業により、あるいは、自動的に用意される。
【００２５】
本発明の競合的な結合を利用する方法の（２）Ｄ−アミノ酸を含む試料と前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体との混合溶液を調製するステップでは、試料中のＤ−アミノ酸と前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体とが抗原抗体反応を行う。したがって、ステップ（２）には、試料中のＤ−アミノ酸と前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体との間の抗原抗体反応が完了するのに十分な条件で前記混合溶液をインキュベーションすることを含む。
【００２６】
本発明の競合的な結合を利用する方法の（３）前記混合溶液を前記固体支持体に接触させるステップでは、前記固体支持体に固定されたＤ−アミノ酸複合体のＤ−アミノ酸と、ステップ（２）で試料中のＤ−アミノ酸と反応しなかった抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体とが抗原抗体反応を行う。したがって、ステップ（３）には、前記固体支持体に固定されたＤ−アミノ酸複合体のＤ−アミノ酸と、試料中のＤ−アミノ酸と反応しなかった抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体との間の抗原抗体反応が完了するのに十分な条件で前記混合溶液をインキュベーションすることを含む。
【００２７】
本発明の競合的な結合を利用する方法の（４）前記固体支持体に結合した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を検出・定量するステップは、前記固体支持体に結合しなかった抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を洗浄により除去するステップを含む場合がある。また、前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体は、該モノクローナル抗体又は２次抗体等の標識により検出・定量される。定量するステップ（４）は、既知の濃度のＤ−アミノ酸を含む試料を用いて固体支持体のＤ−アミノ酸と反応した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の量を数値化してプロットした検量線を作成するステップと、未知の濃度のＤ−アミノ酸を含む試料についてステップ（１）ないし（３）を行って、前記固体支持体に結合した前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体量から前記検量線を用いて試料中のＤ−アミノ酸濃度を算出するステップとを含む。
【００２８】
本発明の検量線とは、試料中のＤ−アミノ酸濃度と、固体支持体のＤ−アミノ酸と反応した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の量とを対応づけるグラフ又は関係式をいう。検量線の作成に用いる濃度既知のＤ−アミノ酸を含む試料は少なくとも２点あればよいが、定量精度確保の観点から３点又は４点以上であることが望ましい。
【００２９】
前記固体支持体のＤ−アミノ酸と反応した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の量を数値化する手法は特に限定されないが、以下に説明するＥＬＩＳＡ法及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法のほか、ラテックス凝集法が含まれる。
【００３０】
ＥＬＩＳＡ法は、抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体に対する酵素標識２次抗体を前記モノクローナル抗体に結合させ、前記標識酵素の基質を添加し、酵素反応産物を検出することにより前記目的の抗体を検出・定量する手法である。２次抗体を用いる代わりに、前記モノクローナル抗体にビオチンのような低分子リガンドを結合させておいて、該低分子リガンドと特異的に結合するアビジンのような生体高分子を用いる場合がある。前記標識に用いられる酵素標識には、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ベータガラクトシダーゼ（β-ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等があり、適当な基質を用いる発色反応や化学発光反応によって検出される。
【００３１】
ＳＰＲ法は、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）とよばれる光学現象を利用して、固体支持体上に固定化した分子と相互作用の相手となる分子との、固体支持体上における特異的相互作用を微細な質量変化として測定する手法である。この手法を適用することで、固体支持体に固定化されたＤ−アミノ酸複合体に結合した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の量を、固体支持体の質量変化として数値化することができる。ＳＰＲ法を実施するためのシステムとしては、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（ＢＩＡｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）が市販されている。
【００３２】
ラテックス凝集法では、固体支持体であるラテックス等の微粒子又はナノ微粒子に結合したモノクローナル抗体の量に応じた微粒子の凝集反応の程度を比濁度の変化として分光光度計で測定する。
【００３３】
ハプテン分子をキャリアタンパク質に結合させて免疫した場合、キャリアタンパク質に対する抗体も産生される。したがって本発明の競合的な結合を利用する方法では、キャリアタンパク質に反応する抗体の存在によりＤ−アミノ酸の検出・定量の精度が低下する可能性を排除するために、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質は、前記哺乳動物の免疫に用いるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質と異なる場合がある。好ましくは、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質は卵白アルブミンであり、前記哺乳動物の免疫に用いるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質はウシ血清アルブミンである場合がある。
【００３４】
本発明は、前記のいずれかのＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法を実施できるように構成される、Ｄ−アミノ酸の免疫学的分析装置を提供する。前記装置には、固体支持体に結合したモノクローナル抗体の量を検出・測定するための分光光度計、蛍光分光光度計、表面プラズモン共鳴測定器等の測定ユニット、試薬、洗浄液及び／又は試料の注入及び又は除去のためのディスペンサユニット、ＥＬＩＳＡ用マルチウェルプレートや表面プラズモン共鳴用センサーチップのハンドリングのためのロボットアームユニット、これらの制御のための制御ユニット等が含まれる。
【００３５】
本発明は、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を含むＤ−アミノ酸の分析用試薬キットも提供する。前記キットには、前記モノクローナル抗体のほか、該モノクローナル抗体の抗原Ｄ−アミノ酸と、該Ｄ−アミノ酸とキャリア高分子とが結合したＤ−アミノ酸複合体と、該Ｄ−アミノ酸複合体が固定された固体支持体とのうち少なくとも１つを含む場合がある。前記Ｄ−アミノ酸複合体が固定された固体支持体は、前記Ｄ−アミノ酸複合体がコーティングされた基質を有するＥＬＩＳＡ法用マルチウェルプレート、前記Ｄ−アミノ酸複合体が固定された表面プラズモン共鳴法用センサーチップ及び／又は前記Ｄ−アミノ酸複合体が固定された凝集法用の微粒子又はナノ微粒子の場合がある。
【００３６】
キャリアタンパク質に反応する抗体の存在によりＤ−アミノ酸の検出・定量の精度が低下する可能性を排除するために、前記分析用キットでは、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質は、前記哺乳動物の免疫に用いるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質と異なる場合がある。さらに好ましくは前記分析用キットでは、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質は卵白アルブミンであり、前記哺乳動物の免疫に用いるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質はウシ血清アルブミンである場合がある。
【発明の効果】
【００３７】
本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体は極めて特異性が高いだけでなく、抗原のＤ−アミノ酸以外の他の化合物との交差反応が非常に低いため、該抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を用いるＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法によれば、迅速かつ簡便に、また高精度でＤ−アミノ酸を分析することができ、多検体の分析も可能となる。前記免疫学的分析方法はＥＬＩＳＡ法、ＳＰＲ法等さまざまな手法を適用して実施可能であり、完全自動化への応用も可能である。したがって本発明は、Ｄ−アミノ酸の生理的意義及び機能の解明を含むＤ−アミノ酸研究に大きく貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下に具体的な実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの具体例により何ら制限されるものではない。
【００３９】
実施例で使用する実験動物及び動物細胞は以下のように準備した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＰＦ、メス）及びウィスターラット（ＳＰＦ、オス）は、九動株式会社（熊本）より購入し、１週間以上九州大学薬学部内の動物舎において飼育した後で、実験に供した。飼育条件は明期７：００〜１９：００、暗期１９：００〜７：００とし、水及び食餌は自由摂取させた。食餌はＮＭＦダイエット（オリエンタル酵母、東京）を使用した。なお、各動物実験は九州大学大学院薬学研究院等動物実験委員会の承諾を受けて遂行された。ミエローマ細胞は、理研バイオリソースセンター（つくば、日本）より供与されたｓｐ２／０−Ａｇ１４株を使用した。
【実施例１】
【００４０】
本実施例では、Ｄ−アミノ酸複合体、ハイブリドーマ細胞株及び抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の作製について示す。
【００４１】
材料及び方法
１−１  Ｄ−アミノ酸複合体の作製及びマウスへの免疫
１−１−１  マウスの免疫に使用する（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体の作製
種々のＤ−アミノ酸を用いた（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体を以下のように作製した。２０ｍＬ遮光硝子バイアルにＢＳＡ１２ｍｇを秤量し、６２．５ｍＭ  Ｄ−アミノ酸含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１．６ｍＬ加え溶解させた。この溶液に２．５％グルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液０．４ｍＬを加え、室温で２時間振盪撹拌した後、４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）水溶液２．０ｍＬを加え、室温で１時間振盪撹拌した。反応液を透析膜（ＷＭＣＯ  ３，５００、スペクトラムメディカルインダストリーズ、インク．、米国  カリフォルニア州  ランチョドミンゲズ）に入れ、ＰＢＳに対して４°Ｃ下一晩透析して（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体溶液を得た。前記複合体溶液は分注して使用時まで−２０°Ｃで保存した。一例として、図１に（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体の作製方法と、作製の際に起こる反応の模式図とを示す。
【００４２】
１−１−２  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体の分子量の測定
１−１−１で調製した反応液を透析膜（ＷＭＣＯ  ３，５００、スペクトラムメディカルインダストリーズ，インク．）に入れ、ミリＱ水で４°Ｃ下一晩透析した。得られた透析内液１０μＬをマトリックス溶液（飽和量のシナピン酸をＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ＝５０／５０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）に加え、１分間撹拌した後５０００ｇで遠心分離して得られた上清）４０μＬと混合して撹拌した後、１μＬをＭＳプレートに塗布し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。測定はレーザー強度２３００で行った。
【００４３】
１−１−３  マウスへの免疫
免疫は２週間間隔で計３回行った。１−１−１で調製した（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体溶液０．７ｍＬにＰＢＳ０．７ｍＬ及びフロイント完全アジュバント（ＡＣＦ）１．４ｍＬを加え撹拌し、油中水滴型エマルジョンを得た。このエマルジョン２００μＬを６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＰＦ、メス）にペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与）麻酔下で背部皮下に複数箇所に分けて投与した。２回目の免疫は、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）を用いて、初回と同様の方法でエマルジョンを作製し、２００μＬをマウス背部皮下に投与した。抗体の産生をＥＬＩＳＡ法により確認した後、３回目の免疫を行った。前記（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体溶液５０μＬ（無希釈）を無麻酔下で腹腔内投与した。
【００４４】
１−１−４  ＥＬＩＳＡ法用アミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体の作製
ＥＬＩＳＡ法に供試するための、種々のアミノ酸を用いたアミノ酸−グルタルアルデヒド架橋−卵白アルブミン複合体（以下、「アミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体」という。）を以下のように作製した。ＯＶＡ６ｍｇを１０ｍＬの遮光硝子バイアルに秤量し、６２．５ｍＭアミノ酸含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．８ｍＬ及び２．５％ＧＡ水溶液０．２ｍＬを加えて室温で２時間振盪撹拌した後、４ｍｇ／ｍＬ  ＮａＢＨ４水溶液１．０ｍＬを加えて１時間振盪撹拌し、アミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体溶液とした。なお、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｔｙｒについては０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を用いて３１．２５ｍＭ溶液を調製し、この溶液０．８ｍＬにＯＶＡ３ｍｇ及び１．２５％ＧＡ水溶液０．２ｍＬを加えて２時間振盪撹拌した後、２ｍｇ／ｍＬ  ＮａＢＨ４水溶液１．０ｍＬを加えて１時間振盪撹拌することにより作製した。
【００４５】
１−２  抗体産生細胞株の樹立と抗体の特異性評価
１−２−１  細胞融合による抗体産生細胞株の樹立
図４に、抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の作製方法の概略図を示す。免疫後のマウスをエーテル麻酔下で断頭し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液に全身を浸して殺菌した後、クリーンベンチ内で脾臓を摘出した。脾臓は３７°Ｃに加温したＤＭＥＭ５ｍＬ（３７°Ｃ）を入れたペトリ皿４枚中で順次脂肪片、組織片等を除去し洗浄した。５枚目のペトリ皿中でスライドガラスを用いて脾臓を磨りつぶし、脾細胞の懸濁液を得た。得られた懸濁液を１５ｍＬの遠沈管に移し５分間静置することで大きな組織片等を沈殿させた後、上清を５０ｍＬ遠沈管に移した。１２００ｒｐｍで５分間遠心後上清を除去し、ＤＭＥＭ（３７°Ｃ）を１０ｍＬ添加して懸濁し、再び５分間遠心（１２００ｒｐｍ）した。この操作を３回繰り返して碑細胞を洗浄した後、上清を除去した。血球計測装置を用いて碑細胞数及び対数増殖期のミエローマ細胞（ｓｐ２／０−Ａｇ１４）数を測定し（各細胞の懸濁液０．１ｍＬをＰＢＳで５０倍して測定した。）、ミエローマ細胞懸濁液を碑細胞：ミエローマ細胞＝４：１になるように加えた。さらにＤＭＥＭ（３７°Ｃ）を加えて全量１０ｍＬとして懸濁し、５分間遠心（１２００ｒｐｍ）後上清を除去した。ペレットを崩して層状にした後、遠沈管の壁を伝わらせながら１ｍＬの５０％ＰＥＧ１５００（７５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０、（ｗ／ｖ）、ロシュ）を１分間かけて滴下した。遠沈管を１分間掌の中で静置した後、９ｍＬのＤＭＥＭ（３７°Ｃ）を５分間かけて滴下した。５分間遠心（１２００ｒｐｍ）して上清を除去した後、１５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（ｖ／ｖ、３７°Ｃ）１００ｍＬに懸濁させ、ピペットを用いて９６穴培養プレートに各ウェル１滴（Ｄ−Ｌｅｕ）又は２滴（Ｄ−Ａｓｐ）ずつ分注しＣＯ２インキュベーター（３７°Ｃ、５％ＣＯ２）で培養した。
【００４６】
細胞融合の翌日、各ウェルに３倍濃度のＨＡＴ培地（１０％ＦＣＳ、３００μＭヒポキサンチン、１．２μＭアミノプテリン、４８μＭチミジン含有ＤＭＥＭ）を１滴ずつ（Ｄ−Ａｓｐ）、１．５倍濃度ＨＡＴ培地（１０％ＦＣＳ含有）２滴（Ｄ−Ｌｅｕ）ずつを加え、さらに培養した。融合から約２週間後に各ウェルから培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法によりＤ−Ａｓｐ又はＤ−Ｌｅｕに対する抗体を産生する細胞のスクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡ法は（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体又は（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を固定化したプレートを用い、採取した培養上清中の抗体結合を１−２−５と同様の方法で評価した。発色が強いウェルを陽性とし、これら陽性ウェルの細胞培養液を９６穴培養プレートから２４穴培養プレートにスケールアップした（Ｄ−Ａｓｐ：２１ウェル、Ｄ−Ｌｅｕ：２７ウェル）。数日培養した後、プレートに固定化された各種ＡＡ−ＧＡ−ＯＶＡ複合体又は（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に対する交叉反応性をＥＬＩＳＡ法により検討した。さらに遊離体に対する抗体の反応性を検討するために、競合法による吸光度変化を測定した。測定の結果（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体又は（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体のみに特異的結合を認め、遊離体を認識すると示唆されたウェルを選択して限界希釈法による細胞のクローニングを行った。限界希釈は２４穴プレートの培養液の５ｎ倍（ｎ＝１−８）希釈系列を作製し、各希釈系列を９６穴培養プレートにピペットを用いて１滴ずつ分注した。２週間培養後、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体又は（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に対する結合を指標とするスクリーニングをＥＬＩＳＡ法により行い、前記複合体に対して結合が認められるウェルの中で単コロニーからなるウェルを選択し、再度限外希釈法によりクローニングを行った。２回目のクローニングの際にＨＡＴ培地からＨＴ培地（１０％ＦＣＳ、１００μＭヒポキサンチン、１６μＭチミジン含有ＤＭＥＭ）に変更した。２週間培養した後、単コロニーからなるウェルを２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬの培養プレートに順次スケールアップし、モノクローナル抗体産生株を得た。なお、培地はスケールアップの際にＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ含有）に変更した。
【００４７】
１−２−２  抗体精製
１−２−１で得た細胞株を５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（ｖ／ｖ）を用いて継代培養し、培養液量を約３６０ｍＬとした。培地を無血清培地（細胞培養用培地添加剤ＲＤ−１（極東製薬工業、東京）をＤＭＥＭ１Ｌに溶解；１０μｇ／ｍＬインシュリン、３５μｇ／ｍＬ、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭセレン含有ＤＭＥＭ）に置換して７−１０日間無継代培養した。得られた培養上清をフィルター（ＭＦ（商標）−メンブレンフィルター、０．４５μｍ  ＨＡ、ミリポア、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）濾過し、プロテインＧカラム（ハイトラッププロテインＧ  ＨＰカラム、５ｍＬ、アマシャムバイオサイエンスコーポレーション、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて４°Ｃ下でアフィニティー精製した。プロテインＧカラムは１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で安定化した後、濾過した培養上清を一晩かけて送液した。溶出液の吸光度（２８０ｎｍ）が０．０５以下になるまで１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄し、その後０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．７）を用いて抗体を溶出した。溶出液は１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１．４ｍＬを入れた遠沈管に５ｍＬずつ分取し、分取した画分の吸光度（２８０ｎｍ）が、０．０３以上の画分を限外濾過膜（５０，０００ＭＷＣＯ、ザルトリウス（東京））を用いて濃縮後、ミリＱ水３０ｍＬで洗浄し、凍結乾燥させた。
【００４８】
１−２−３  抗体量の定量
精製した抗体のタンパク質濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ試薬（ナカライテスク、京都）を用いて、ＢＳＡを用いて作成した検量線を使用して定量した。抗体溶液又は、ＢＳＡ溶液１０μＬをＥＬＩＳＡプレートに添加した後、水で５倍希釈したＣＢＢ試薬２００μＬを加え、１０分間撹拌した後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００４９】
１−２−４  抗体アイソタイピング
抗体のアイソタイプはマウスタイパーサブアイソタイピングキット（バイオラッド、米国  カリフォルニア州  ハーキュルズ）を用いて決定した。１５ｍＬの遠沈管にキット附属のアイソタイピングスティックを１本入れ、作製した抗体溶液（約１μｇ／ｍＬ）とペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体溶液をキットの指示に従い混合し、そのうち３ｍＬを遠沈管に入れ、１５分間室温で撹拌した。５ｍＬのＴ−ＰＢＳで２回撹拌洗浄した後、キット附属の基質溶液（４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水素水との混合液）３ｍＬを加え、１５分反応させた。５ｍＬの水で２回撹拌洗浄した後、アイソタイプを判定した。
【００５０】
１−２−５  抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の特異性評価（アミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に対する認識能評価）
図６に、抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体の交叉反応性の評価のための直接ＥＬＩＳＡ法の手順を示す。１−１−４で作製したアミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体の５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）溶液（１．５μｇ／ｍＬ）１００μＬをＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間静置することでプレート上に固定化した。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後、５％スキムミルクＰＢＳ溶液を３００μＬ加え、２５°Ｃで１時間ブロッキングした。洗浄後、精製した抗体（１．０μｇ／ｍＬ）のＴ−ＰＢＳ溶液１００μＬを添加した。１時間後洗浄し、Ｔ−ＰＢＳで１０００倍希釈した、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ山羊抗体溶液を１００μＬを添加し、２５°Ｃで１時間静置した。洗浄後、基質溶液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）０．３ｍｇ／ｍＬ  ＡＢＴＳと０．００３％Ｈ２Ｏ２を含有）を添加し、１５分後の吸光度（４０５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーにより測定した。
【００５１】
１−２−６  抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の特異性評価（遊離アミノ酸に対する認識能評価）
１−１−４で作製したアミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体の５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）溶液（１．５μｇ／ｍＬ）１００μＬをＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間静置することでプレート上に固定化した。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後、５％スキムミルクＰＢＳ溶液を３００μＬ加え、室温で１時間ブロッキングした。洗浄後、アミノ酸のＴ−ＰＢＳ溶液（０．５ｍＭ、２０μＬ）、精製した抗体（１．２５μｇ／ｍＬ）のＴ−ＰＢＳ溶液８０μＬを添加して撹拌した。１時間後洗浄し、Ｔ−ＰＢＳで１０００倍希釈した、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ山羊抗体溶液を１００μＬを添加し、１時間静置した。洗浄後、基質溶液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）０．３ｍｇ／ｍＬ  ＡＢＴＳと０．００３％Ｈ２Ｏ２を含有）を添加し、１５分後の吸光度（４０５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーにより測定した。
【００５２】
結果及び考察
１−３  抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の作製
１−３−１  （Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体の作製
Ｄ−Ａｓｐについての図１に示す方法を各種のアミノ酸に適用して、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体を作製した。Ｄ−アミノ酸のＢＳＡへの結合は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて確認した。図２に示すようにＧＡ−ＢＳＡ複合体は７５ｋＤａ、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体は７７ｋＤａであり、約２０個のＤ−Ａｓｐ分子がＢＳＡに結合していると考えられた。また、同様の方法により（Ｄ−Ｓｅｒ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体は約６０個、（Ｄ−Ｐｒｏ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体は約５０個、（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体は約６０個（図３）のＤ−アミノ酸分子が各々ＢＳＡに結合していると考えられた。
【００５３】
１−３−２  マウスへの免疫
マウスへの２回目の（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体投与後、抗血清の各種アミノ酸に対する結合性を、免疫原とは異なるキャリアタンパク質（ＯＶＡ）と結合させたアミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を抗原として用いたＥＬＩＳＡ法を用いて評価した。その結果、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体を免疫原として投与したマウスでは、Ｄ−ＡｓｐとＬ−Ａｓｐとを明確に識別し、他のアミノ酸に対してほとんど交叉反応性を示さない抗体を産生していると考えられた。Ｄ−ＬｅｕについてはＤ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｉｌｅ等の構造類似アミノ酸と交叉反応性を有していたが、Ｄ−ＬｅｕとＬ−Ｌｅｕとを明確に区別する抗体の産生が強く示唆された。一方Ｄ−Ｓｅｒに関しては、（Ｄ−Ｓｅｒ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体と反応する抗体は認められたが、（Ｄ−Ｓｅｒ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体と反応する抗体はほとんど産生されていなかった。またＤ−Ｐｒｏに関しては反応性が低いことに加え、Ｄ−Ａｌａに対して強い交叉反応性を有していた。以上の結果より、十分な抗体産生が認められ、Ｄ体とＬ体とを明確に区別すると考えられるＤ−Ａｓｐ及びＤ−Ｌｅｕについてモノクローナル抗体の作製を試みた。
【００５４】
１−３−３  抗体産生細胞株の樹立
細胞融合法による抗体産生細胞株の樹立を試みた。最終免疫から３日後にマウスから脾臓を摘出し、脾細胞とミエローマ細胞（ｓｐ２／０−Ａｇ１４）とを融合した。ＨＡＴ選択培地を用いて培養した後、ＥＬＩＳＡ法を用いてスクリーニングを行い、目的の抗体を産生している細胞を選抜した。（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体又は（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を固定化したプレートに培養上清を加え、各々約９００個又は１４００個のウェルについて抗体のプレートへの結合を評価した結果、Ｄ−Ａｓｐでは２１個、Ｄ−Ｌｅｕでは２７個の陽性ウェルが認められた。さらに陽性ウェルについて、構造の類似するアミノ酸に対する認識能を同様のＥＬＩＳＡ法を用いて検討した。Ｄ−Ａｓｐについては、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体と（Ｌ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体とを明確に区別している７系統の細胞について評価した結果、１系統でＤ−Ａｓｎとの交叉反応性が認められたものの、６系統についてはほとんど交叉反応性を示さないことが明らかになった。Ｄ−Ｌｅｕについては（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体と（Ｌ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体とを明確に区別する抗体を産生していると考えられた６系統の細胞について、Ｄ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを含む構造類似アミノ酸を抗原として選択性を評価した。
【００５５】
これらのアミノ酸について交叉性を検討した結果、図５に示すように５系統ではＤ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅをはじめとする構造類似アミノ酸に対して交叉反応性を有していたが、１系統はほとんど交叉反応を示さなかった。交叉反応性を示さなかった細胞系統について遊離Ｄ−Ａｓｐ又はＤ−Ｌｅｕに対する認識能の評価を行った。（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体又は（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を固定化したプレートを用い、競合ＥＬＩＳＡ法により遊離Ｄ−Ａｓｐ及びＤ−Ｌｅｕに対する反応性を検討した。その結果、Ｄ−Ａｓｐ又はＤ−Ｌｅｕの添加により、抗体のプレートへの結合阻害に基づく吸光度減少が観察されたことから、これらの細胞が遊離体を認識する抗体を産生していることが明らかになった。当該細胞について、３９種のアミノ酸に対する交叉反応性を検討した後、２度のクローニングを行い抗遊離Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体産生細胞株を得た。抗体は、樹立した抗体産生細胞培養液からプロテインＧアフィニティーカラムを用いて精製した。
【００５６】
１−３−４  抗体アイソタイピング
アイソタイプをマウス・タイパー・サブアイソタイピング・キット（バイオ−ラッド、米国  カリフォルニア州  ハークルズ）を用いて決定した。その結果、抗Ｄ−Ａｓｐ抗体、抗Ｄ−Ｌｅｕ抗体共に重鎖がγ１、軽鎖がκであった。
【００５７】
１−４  抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の特異性評価
１−４−１  抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体
作製した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の特異性を、種々のアミノ酸を用いて作成したアミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を用いて図６に示す直接ＥＬＩＳＡ法により評価した。アミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を結合させたＥＬＩＳＡプレートに精製した各抗体を添加し、抗体結合量を吸光度により評価した。その結果、図７に示すように抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体は、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に対して高い発色が認められた一方で、Ｌ−Ａｓｐを始めとする他のアミノ酸によるアミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に対してはほとんど発色が認められなかった。このことから、本抗体はＤ−Ａｓｐのみを強く認識する特異性の高い抗体であると考えられた。さらに、競合ＥＬＩＳＡ法により３９種の遊離型アミノ酸に対する反応性を検討した結果、本抗体は遊離Ｄ−Ａｓｐのみを特異的に認識することが明らかになった。本抗体を産生するハイブリドーマ細胞株（マウス-マウス  ハイブリドーマ  ＤＡＳＰＺＨ−０７０３）は２００７年１２月７日付けで独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託された（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４６０）。
【００５８】
１−４−２  抗Ｄ−Ｌｅｕモノクローナル抗体
抗Ｄ−Ｌｅｕモノクローナル抗体についても同様に、アミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に対する認識能を検討した。その結果、図８に示すように（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に高い発色を示した一方で、３９種のアミノ酸にイソロイシンのエピマーであるａｌｌｏ−Ｉｌｅを加えた４１種に対してはほとんど発色が認められなかった。このことから、作製した抗Ｄ−Ｌｅｕモノクローナル抗体は構造類似アミノ酸を始めとする他のアミノ酸に対してほとんど交叉反応性を有さない、極めて特異性の高い抗体であると考えられた。さらに遊離アミノ酸に対する認識能を検討した結果、本抗体は遊離Ｄ−Ｌｅｕのみを特異的に認識していることが明らかになった。
【００５９】
以上の様に、今回作製した抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体及び抗Ｄ−Ｌｅｕモノクローナル抗体は、他のアミノ酸に対する交叉反応性をほとんど有さず、特異性が高い抗体であることが明らかになった。これらの抗体は遊離体のＤ−アミノ酸も良好に認識することから、作製した抗体を用いるＤ−Ａｓｐ及びＤ−Ｌｅｕの免疫測定が可能であると考えられる。
【００６０】
今回作製した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体は、キャリアタンパク質に結合したＤ−アミノ酸と、遊離のＤ−アミノ酸を極めて特異的に認識する抗体であり、迅速分析法による多検体分析を始め、免疫染色による細胞局在解明へと応用可能であり、Ｄ−アミノ酸の生理機能を解明する上で極めて有用である。
【実施例２】
【００６１】
本実施例では、ＥＬＩＳＡ法を利用するＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法について示す。
【００６２】
材料及び方法
２−１  遊離Ｄ−アミノ酸に対する競合ＥＬＩＳＡ法
図９に、遊離Ｄ−アミノ酸の一例としての遊離Ｄ−Ａｓｐの競合ＥＬＩＳＡ法の手順を示す。ＥＬＩＳＡプレート上に１．５μｇ／ｍＬの（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体の５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）溶液１００μＬを添加し１時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後に、５％スキムミルク／ＰＢＳ（ｗ／ｖ）３００μＬを添加して１時間静置後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した。ラット血清２０μＬ及び抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体Ｔ−ＰＢＳ溶液（１．０μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し軽く撹拌した後１時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後１０００倍希釈したＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ山羊抗体のＴ−ＰＢＳ溶液１００μＬを添加し１時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後、基質溶液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）と、０．３ｍｇ／ｍＬ  ＡＢＴＳと、０．００３％Ｈ２Ｏ２とを含有）を添加し、１５分後の吸光度（４０５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーにより測定した。
【００６３】
２−２  ラット血中におけるＤ−アミノ酸動態解析
２−２−１  ラット血中へのＤ−アミノ酸投与
７週齢のウィスターラット（オス、ＳＰＦ）をペントバルビタール５０ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内投与して麻酔した後、咽頭部より切開を行い左右頸動脈を露出させた。１ｍＬのシリンジ（２６Ｇの注射針を使用）を用いて右頸静脈から１ｍｍｏｌ／ｋｇ体重（１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））のＤ−Ａｓｐを添加した。１、３、５、１０、２０、３０分後に左頚静脈から１ｍＬのシリンジ（２６Ｇの注射針を使用）を用いて順次採血した。得られた血液を１時間室温で放置した後、４°Ｃ下で１０分、５０００ｇで遠心分離して血清を得た。血清は使用まで−２０°Ｃで保存した。
【００６４】
２−２−２  ＯＰＡ蛍光誘導体化ＨＰＬＣによるＤ−アミノ酸分析
２−２−１で得た血清２０μＬに４００μＬのＭｅＯＨ（ＨＰＬＣグレード、和光純薬）を添加し、ボルテックスミキサーを用いて１分間撹拌した後、５０００ｇで５分間遠心分離した。上清１０μＬを４０°Ｃで減圧乾固し、０．４Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を４０μＬ添加して再溶解させた。ここにＯＰＡ試薬（１％ＯＰＡ、１％Ｂｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓのメタノール溶液（ｗ／ｗ／ｖ））を１０μＬ添加して撹拌した後、室温で２分間反応させたもの５μＬを次に示すＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  ＱＡ（２５０ｍｍ  ｘ  ４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．、４０°Ｃ、東ソー）、移動相：Ａ；９％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ／０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、Ｂ；１６％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ／０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、勾配：時間；０分〜２４．５分、Ａ；１００％〜３０％、Ｂ；０％〜７０％、流速：１．４ｍＬ／分、検出：蛍光検出；励起３４４ｎｍ、発光４４３ｎｍ。
【００６５】
結果及び考察
２−３  遊離Ｄ−アミノ酸に対する競合ＥＬＩＳＡ法
Ｄ−アミノ酸の迅速測定法の一例として、実施例１で作製した抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ法について検討を行った。（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を結合させたプレートに試料と抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体とを加え、抗体の競合的なプレートへの結合を指標にＤ−Ａｓｐ定量を試みた。
【００６６】
図９に示した手順に従い測定した結果、Ｄ−Ａｓｐの添加濃度依存的な抗体結合量減少が認められた。一方でＬ−Ａｓｐをはじめとするタンパク構成アミノ酸及びそのＤ−体を用いて同様の検討を行った結果、添加に伴う吸光度変化はほとんど認められなかった。
【００６７】
また、Ｄ−Ａｓｐはタンパク質中にアミノ酸残基としても存在するため、生体試料中のＤ−Ａｓｐ分析に際しては抗体のタンパク中Ｄ−Ａｓｐ残基に対する反応性の検討は重要であると考えられた。そこでモデルペプチドとしてＧｌｙ−（Ｄ−Ａｓｐ）を用い、遊離Ｄ−Ａｓｐ測定に与える影響を競合ＥＬＩＳＡ法により検討した。その結果、Ｇｌｙ−（Ｄ−Ａｓｐ）の添加に伴う吸光度変化はほとんど認められなかったことから、Ｇｌｙ−Ｄ−ＡｓｐはＤ−Ａｓｐ測定に影響を与えないことが示された。以上の結果から作製した抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体を用いる競合ＥＬＩＳＡ法により、遊離Ｄ−Ａｓｐの選択的定量が可能であると考えられた。
【００６８】
２−４  ラット血中におけるＤ−アミノ酸動態解析
２−４−１  血中Ｄ−アミノ酸の定量可能性評価
次に生体試料中における本法の適用性を評価するため、ウィスター系ラット（オス、７週齢、ＳＰＦ）から得た血清に濃度既知のＤ−Ａｓｐを添加し、検量線を作製した。その結果、図１０（ａ）に示すように０．０１６−１６ｍＭの範囲においてＤ−Ａｓｐ濃度依存的な吸光度減少が認められ、本範囲においてラット血中Ｄ−Ａｓｐの定量が可能であることが示された。
【００６９】
また本測定法の再現性をＤ−Ａｓｐ含有血清（１ｍｍｏｌ／ｋｇ体重のＤ−Ａｓｐをラット静脈内に投与した後、３０分後に得られた血清）を用いてプレート内、及びプレート間について評価した。その結果、プレート内誤差がＲＳＤにして４．８％（５ウェル）、プレート間誤差が４．５％（４プレート）であり、本測定法はラット血清中Ｄ−Ａｓｐを再現的に測定可能であることが明らかになった（図１０（ｂ））。
【００７０】
次に、定量の正確性を当研究室で開発したＯＰＡ誘導体化蛍光ＨＰＬＣ法との比較により評価した。ｘ軸にＥＬＩＳＡ法、ｙ軸にＨＰＬＣ法の定量値をプロットした結果、図１１に示す様に回帰直線はｙ＝１．０９ｘ＋０．４４であり、相関係数ｒ＝０．９６３の良好な相関関係が得られた。以上の結果より今回開発した競合ＥＬＩＳＡ法は、ラット血清中Ｄ−Ａｓｐを正確かつ再現的に定量可能であることが示された。さらに、本法は得られた血清をそのまま用いることで煩雑な前処理を必要とせず、測定時間が約２時間半であることから、簡便性と迅速性を兼ね備えた分析法であると考えられる。
【００７１】
２−４−２  ラット血中のＤ−アミノ酸動態解析
開発した競合ＥＬＩＳＡ法を用いてＤ−Ａｓｐ投与ラットにおける血中濃度の経時変化を解析した。ラットの右頸静脈へＤ−Ａｓｐを投与し、１、３、５、１０、２０、３０分後にそれぞれ左頸動脈より血液を採取し、Ｄ−Ａｓｐの濃度を図９に示す競合ＥＬＩＳＡ法により測定した。図１２にＤ−Ａｓｐ血中濃度の経時変化を示す。Ｄ−Ａｓｐ濃度は投与１分後に最高値９．３±２．８μｍｏｌ／ｍＬ（ｎ＝３）に達した後、二相性の減少過程を経て３０分後に１．７±０．２７μｍｏｌ／ｍＬまで減少した。またＨＰＬＣ法を用いて同試料を分析した結果、ほぼ同じ体内動態が得られたことから、開発したＥＬＩＳＡ法はラット血中Ｄ−Ａｓｐ体内動態解析に十分適用可能であると考えられた。
【００７２】
今回開発したＥＬＩＳＡ法は、ラット血清中Ｄ−Ａｓｐを０．０１６−１６ｍＭの範囲において正確かつ再現的に定量可能である。さらに試料の前処理を必要とせず、約２時間半で数百個の検体を処理可能であり、迅速性と簡便性を兼ね備えた方法であると考えられる。これらのことより、本法は様々な疾患や生理条件下における多試料解析に大きく貢献できると考えられる。
【実施例３】
【００７３】
本実施例は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を利用するＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法について示す。
【００７４】
材料及び方法
３−１  直接法による定量性検討
３−１−１  プレコンセントレーション条件の決定
プレコンセントレーション効果の測定は、未使用のＳｅｎｓｏｒ  ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＢＩＡｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン、２５°Ｃ）を用いて行った。Ｓｅｎｓｏｒ  ｃｈｉｐ  ＣＭ５をＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ（ＢＩＡｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）に挿入し、抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０，５．０，４．０）溶液（２０μｇ／ｍＬ）各５μＬをインジェクトした時のセンサーグラム変化量をモニターした。なお、ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を用い、流速５μＬ／分で行った。
【００７５】
３−１−２  アミンカップリング法による抗体固定化
Ｓｅｎｓｏｒ  ｃｈｉｐ  ＣＭ５への抗体の固定化はアミンカップリングキット（ＢＩＡｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）を用いて行った。固定化方法の概略を図１３に示す。０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）水溶液と０．２５Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）水溶液の等量混合物５０μＬを送液し、センサーチップ上のカルボキシル基を活性化した。次いで１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解した抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体（１００μｇ／ｍＬ）５０μＬを送液し、センサーチップ上に固定した。残存活性化エステルは１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．５）５０μＬを添加することで不活性化した。対照セルにはピュアマウスＩｇＧ（ＩＣＮファーマケミカルズ、米国  オハイオ州  オーロラ）を同様の方法にて固定化した。
【００７６】
３−１−３  Ｄ−Ａｓｐの定量
３−１−２で抗体を固定化したセンサーチップを用いてＤ−Ａｓｐの測定を行った。２０×（１／２）ｎｍＭ（ｎ＝０−５）のＤ−Ａｓｐ又はＬ−Ａｓｐ／ＨＥＰＥＳ溶液（０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）２０μＬを添加した時のセンサーグラムの変化をモニターした。ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰを用い、流速２０μＬ／分、２５°Ｃで測定した。なお、抗体の固定化量の差を補正して評価した。（対照セルの共鳴角変化値を固定化量の比（１８：５／１２．４）で除した値で補正した。）
３−２  間接法による定量性検討
３−２−１  アミノ基導入型Ｄ−アミノ酸複合体の調製
間接法による定量性検討に供試するためのアミノ基導入型（Ｄ−アミノ酸）−グルタルアルデヒド架橋−卵白アルブミン複合体（以下、「（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）」という。）を以下のように作製した。作製方法の概略を図１６に示す。２０ｍＬの遮光硝子バイアルにＯＶＡ１２ｍｇを秤量し、６２．５ｍＭ  Ｄ−Ａｓｐ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．６ｍＬに溶解させた。５０ｍＭヒドラジン水溶液０．２ｍＬ及び２．５％グルタルアルデヒド水溶液０．２ｍＬを添加し、１時間撹拌した。次いで１６ｍｇ／ｍＬ  ＮａＢＨ４水溶液０．５ｍＬを添加して１時間撹拌した。反応液を透析膜（ＷＭＣＯ３，５００）に入れて４°Ｃで水に対して透析し、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）を得た。アミノ基導入型グルタルアルデヒド卵白アルブミン複合体（以下、「ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）」という。）は、Ｄ−Ａｓｐ非含有緩衝液を用いて同様に調製した。
【００７７】
３−２−２  抗原濃度の測定
作製した（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）、ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ試薬（ナカライテスク）を用いて、ＢＳＡを用いて作成した検量線を使用して定量した。前記複合体溶液又はＢＳＡ溶液１０μＬをＥＬＩＳＡプレートに添加した後、水で５倍希釈したＣＢＢ試薬２００μＬを加え、１０分間撹拌した後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、濃度を求めた。
【００７８】
３−２−３  プレコンセントレーション条件の決定
未使用のＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（２５°Ｃ）をＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘに挿入し、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０、５．０、４．５、４．０）溶液（２０μｇ／ｍＬ）各５μＬをインジェクトした時のセンサーグラム変化量をモニターした。なお、ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ、流速５μＬ／分で測定を行った。
【００７９】
３−２−４  アミンカップリング法による抗原固定化
アミンカップリングキットを用いて３−２−１で作製した抗原の固定化を行った。０．０５Ｍ  ＮＨＳ水溶液と０．２５Ｍ  ＥＤＣ水溶液の等量混合物３５μＬを送液し、センサーチップ上のカルボキシル基を活性化した。次いで１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解したＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）（２０μｇ／ｍＬ）３５μＬを送液し、センサーチップ上に固定した。残存活性化エステルは１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．５）３５μＬを添加して不活性化した。（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）はＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の結合量と同等になるように固定化した。５０μＬのＮＨＳ／ＥＤＣ溶液を送液しセンサーチップを活性化した後、２０μｇ／ｍＬの（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）／１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を、センサーグラムをモニターしながら７０μＬ送液した。次いでエタノールアミン溶液５０μＬを添加して活性化エステルを不活化した。なお、ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰを用い、流速５μＬ／分、２５°Ｃで行った。
【００８０】
３−２−５  Ｄ−Ａｓｐの競合ＳＰＲ測定
３−２−４で（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）を固定化したセンサーチップを用いて競合法によるＤ−Ａｓｐの測定を行った。２０×（１／２）ｎｍＭ（ｎ＝０−５）のＤ−Ａｓｐ又はＬ−Ａｓｐ／ＨＥＰＥＳ溶液（０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）と１０μｇ／ｍＬ抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体のＨＥＰＥＳ溶液を１：１の割合で混合し、このうち２０μＬを測定した。測定後、結合した抗体は１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ１．５）を１０μＬ添加することにより解離させチップを再生した。なお、測定はランニング緩衝液ＨＢＳ−ＥＰを用い、流速２０μＬ／分、２５°Ｃで行った。
【００８１】
結果及び考察
３−３  直接法による定量性検討
３−３−１  プレコンセントレーション条件の決定
実施例１で作製した抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体を用いて、直接法による遊離Ｄ−Ａｓｐの濃度測定を試みた。センサーチップへの抗体固定化に先立ち、抗Ｄ−Ａｓｐ抗体のプレコンセントレーション条件として、固定化時に使用する緩衝液のｐＨを決定した。本実験では、ｐＨ６．０、５．０、４．０の１０ｍＭ酢酸塩緩衝液を用いて検討した。その結果、抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体はｐＨ５．０と４．０で同様の濃縮効果が認められたことから、よりカップリング反応が進行しやすいｐＨ５．０を採用した。
【００８２】
３−３−２  アミンカップリング法による抗体固定化
図１４に抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体及びマウスＩｇＧの固定化にかかるセンサーグラムを示す。抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体は１２．４ｎｇ／ｍｍ２の結合が認められ、対照であるマウスＩｇＧは１８．５ｎｇ／ｍｍ２の結合が認められた（１０００ＲＵ＝１ｎｇ／ｍｍ２）。
【００８３】
３−３−３  直接法による遊離Ｄ−Ａｓｐの測定
抗Ｄ−Ａｓｐ抗体を固定化させたチップを用いて、直接法によるＤ−Ａｓｐの定量性を検討した。ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて作製したＤ−Ａｓｐの希釈系列を順次インジェクトし、センサーグラムのレスポンスを測定した。但し、マウスＩｇＧの固定化量は抗Ｄ−Ａｓｐ抗体の１．５倍であることから（図１４）、得られたレスポンスは固定化量で補正し、Ｄ−Ａｓｐに対する応答を評価した。図１５はＡｓｐ溶液添加時に得られたレスポンス変化を示したものである。その結果、Ｄ−Ａｓｐ、Ｌ−Ａｓｐ共に添加濃度増加に伴うレスポンス上昇が認められた。抗体の固定化量及びＤ−Ａｓｐの分子量から算出した最大応答量は約１１と推測されるが、本検討ではこれを遙かに超えるレスポンス変化が認められたことから、Ａｓｐがセンサーチップに対して非特異的に吸着する、チップ上でクラスター分子を形成している等、他の要因によるレスポンス上昇が生じていると考えられた。以上の結果より、直接法を用いるＤ−Ａｓｐ測定は困難であると考え間接法の適用を試みた。
【００８４】
３−４  間接法による定量性検討
３−４−１  アミノ基導入型Ｄ−アミノ酸複合体の調製
図１６に示すようにＧＡ添加時にヒドラジン（ＮＨ２ＮＨ２）を共存させて、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）を作製した。この修飾により抗原のアミンカップリング法によるセンサーチップへの固定が容易になると考えられる。（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）と対照として作製したＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）との抗原性はＥＬＩＳＡ法を用いて検討した。その結果、抗Ｄ−Ａｓｐ抗体が（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）のみに選択的に結合することを確認した。
【００８５】
３−４−２  プレコンセントレーション条件の決定
センサーチップへの固定化に先立ち、ｐＨ６．０、５．０、４．５、４．０の１０ｍＭ酢酸塩緩衝液を用いて（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）のプレコンセントレーション条件として、固定時に使用する緩衝液のｐＨを決定した。その結果、ｐＨの減少に伴う（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の濃縮量増加が認められ、最大の濃縮が認められたｐＨ４．０を採用した。
【００８６】
３−４−３  アミンカップリング法による抗体固定化
図１７に（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）及びＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の固定化にかかるセンサーグラムを示す。（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の固定化量は４．９３ｎｇ／ｍｍ２、対照であるＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の固定化量は４．９８ｎｇ／ｍｍ２となり同程度の結合が認められた。
【００８７】
３−４−４  Ｄ−Ａｓｐの競合ＳＰＲ測定
競合ＳＰＲ測定のセンサーグラムのレスポンス変化を図１８に示す。Ｄ−Ａｓｐの濃度上昇に伴いセンサーグラム上の応答減少が認められた。一方、Ｌ−Ａｓｐを用いて同様に検討した結果、センサーグラムの変化はほとんど認められなかった。試料添加前後のレスポンス変化量を、Ａｓｐ無添加時を０としてグラフ化した結果、図１９に示すようにＤ−Ａｓｐ添加濃度依存的なレスポンス変化が認められ、Ｌ−Ａｓｐを添加した場合においてはほとんど認められなかった。さらにＧｌｙを用いて同様の検討を行った結果、Ｌ−Ａｓｐと同様に変化は認められなかった。レスポンス変化はＤ−Ａｓｐ濃度０．０２−５ｍＭの範囲において認められたことから、本範囲においてＤ−Ａｓｐの定量が可能であると考えられる。さらに今回の測定時間は２分以内であることから、本法は迅速分析法として有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】実施例１における、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体の作製方法を示すフローチャート。
【図２】実施例１において測定した、ＢＳＡ、ＢＳＡ−ＧＡ、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体のマス・スペクトルを示すグラフ。
【図３】実施例１において測定した、ＢＳＡ、ＢＳＡ−ＧＡ、（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体のマス・スペクトルを示すグラフ。
【図４】実施例１における、抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体の作製方法を示す概略図。
【図５】実施例１における、構造類似アミノ酸に対する抗Ｄ−Ｌｅｕモノクローナル抗体産生細胞株（６系統）の選択性の評価を示すグラフ。
【図６】実施例１において作製した抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体の交叉反応性の評価のための直接ＥＬＩＳＡ法の手順を示すフローチャート。
【図７】実施例１における、ＯＶＡ複合体アミノ酸に対する抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体の免疫反応性の評価を示すグラフ。
【図８】実施例１における、ＯＶＡ複合体アミノ酸に対する抗Ｄ−Ｌｅｕモノクローナル抗体の免疫反応性の評価を示すグラフ。
【図９】実施例２における、遊離Ｄ−Ａｓｐの競合ＥＬＩＳＡ法の手順を示すフローチャート。
【図１０】実施例２において測定した、ラット血清における遊離Ｄ−Ａｓｐの競合ＥＬＩＳＡ法の（ａ）キャリブレーションカーブを示すグラフ、及び（ｂ）プレート間あるいはプレート内精度を表す表。
【図１１】実施例２における、ラット血清における競合ＥＬＩＳＡ法とＯＰＡ誘導体化蛍光ＨＰＬＣ法との相関関係を示すグラフ。
【図１２】実施例２における、Ｄ−Ａｓｐの静脈内投与後のラット血清におけるＤ−Ａｓｐ量の経時変化を示すグラフ。
【図１３】実施例３における、抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体のＳＰＲ測定用センサーチップへの固定化方法を示すフローチャート。
【図１４】実施例３における、（ａ）抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体及び（ｂ）マウス純血ＩｇＧ固定化のセンサーグラム。
【図１５】実施例３における、遊離Ｄ−Ａｓｐ及び遊離Ｌ−Ａｓｐの直接ＳＰＲ測定を示すグラフ。
【図１６】実施例３における、ＳＰＲ測定のための（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の作製方法を示すフローチャート。
【図１７】実施例３における、（ａ）（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）及び（ｂ）ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）固定化のセンサーグラム。
【図１８】実施例３における、競合ＳＰＲ測定のレスポンス変化を示すセンサーグラム。
【図１９】実施例３における、遊離Ｄ−Ａｓｐ及び遊離Ｌ−Ａｓｐの競合ＳＰＲ測定を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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