(57)【要約】【課題】効率的かつ確実な循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法を提供すること。【解決手段】循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法であって、循環水系におけるレジオネラ属菌の菌数を測定する菌数測定ステップと、該菌数測定ステップにおいて測定した菌数と前記循環水系の水温に基づいて、菌数が所定水準に達するまでの時間を算出する臨界時間算出ステップと、該臨界時間算出ステップにおいて算出した臨界時間に基づいて、殺菌処理条件を決定する殺菌処理条件決定ステップとを少なくとも行う循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法を提供する。【選択図】図１
2009220058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法であって、
循環水系におけるレジオネラ属菌の菌数を測定する菌数測定ステップと、
該菌数測定ステップにおいて測定した菌数と前記循環水系の水温に基づいて、菌数が所定水準に達するまでの時間を算出する臨界時間算出ステップと、
該臨界時間算出ステップにおいて算出した臨界時間に基づいて、殺菌処理条件を決定する殺菌処理条件決定ステップと
を少なくとも行う循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法。
【請求項２】
前記殺菌処理条件決定ステップでは、殺菌間隔を決定することを特徴とする請求項１記載の循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法。
【請求項３】
前記殺菌処理条件決定ステップでは、薬剤添加量を決定することを特徴とする請求項１又は２に記載の循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法。
【請求項４】
前記菌数測定ステップでは、イムノアッセイ法を用いてレジオネラ属菌数を測定することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法。
【請求項５】
前記菌数測定ステップでは、循環水系における堆積物及び／又は生物膜中のレジオネラ属菌数を測定することを特徴とする請求以降１から４のいずれか一項に記載の循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法。
【請求項６】
前記循環水系が、開放循環式冷却水系、蓄熱槽、循環式浴槽中から選択される一以上の循環水系であることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法。
【請求項７】
循環水系におけるレジオネラ属菌の殺菌方法であって、
循環水系におけるレジオネラ属菌の菌数を測定する菌数測定ステップと、
該菌数測定ステップにおいて測定した菌数と前記循環水系の水温に基づいて、菌数が所定水準に達するまでの時間を算出する臨界時間算出ステップと、
該臨界時間算出ステップにおいて算出した臨界時間に基づいて、殺菌処理条件を決定する殺菌処理条件決定ステップと
該殺菌処理条件決定ステップにおいて決定した殺菌処理条件に基づいて、殺菌処理を行う殺菌処理ステップと、
を少なくとも行う循環水系におけるレジオネラ属菌の殺菌方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、循環水系におけるレジオネラ属菌の管理方法に関する。より詳しくは、レジオネラ属菌の増殖速度に注目し、循環水系におけるレジオネラ属菌の制御及び殺菌を効率的に、かつ確実に行う技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラ属菌は、自然界の土壌中や淡水中に生息する好気性グラム陰性桿菌で、他の細菌類や藻類の代謝産物を利用し、アメーバなどの細菌捕食性原生動物等に寄生して増殖する細菌である。
【０００３】
これらのレジオネラ属菌を含有する人工環境水に、ヒトが直接接触したり（接触感染）、或いは、レジオネラ属菌を含有する人工環境水がエロゾルを形成してヒトに空気感染することにより、レジオネラ属菌はヒトに侵入して、レジオネラ症を発症することがある。
【０００４】
このレジオネラ症は、その臨床的症状から、重症肺炎であるレジオネラ肺炎と、一過性の発熱が見られるポンティアック熱に分けられ、特に、レジオネラ肺炎は、傾眠、昏睡、幻覚などの中枢神経症状を初期から合併する場合も多く、死亡率の高い疾患である。そのため、これらの人工環境水中のレジオネラ属菌等の微生物の徹底した管理が求められている。
【０００５】
現在、レジオネラ症の防止対策としては、非特許文献１の厚生省生活衛生局企画課監修の「新版  レジオネラ症防止指針」において、具体的なレジオネラ属菌の管理方法がまとめられている。例えば、浴槽水、シャワー水等を人が直接吸引するおそれがある場合には、「レジオネラ属菌数の目標値を１０ＣＦＵ／１００ｍＬ（ＣＦＵ：Colony Forming Unit）未満とし、レジオネラ属菌が検出された場合、直ちに清掃・消毒等の対策を講じる。また、対策実施後は検出菌数が検出限界以下（１０ＣＦＵ／１００ｍＬ未満）であることを確認する。」という対応方法が記載されている。
【０００６】
ところで、レジオネラ属菌の増殖速度は、季節によって変化する。特に、２０〜４５℃程度の場合、図４に示すように、温度上昇に伴い、レジオネラ属菌の増殖速度が速くなるという報告がある（非特許文献２参照）。従って、循環水系中にレジオネラ属菌を検出した場合に、一律の対策を講じても、季節等の環境変化に伴いレジオネラ属菌の増殖速度が変化するため、確実にレジオネラ属菌を管理することができない。
【０００７】
また、レジオネラ属菌の分析には、約１０日程度要することから、レジオネラ属菌を検出した水系を実際に殺菌処理する頃には、分析結果から求められる殺菌方法（例えば、殺菌剤の添加量など）と現実にレジオネラ属菌を殺菌できる方法には、差が生じてしまい、確実にレジオネラ属菌を殺菌することが難しい。
【０００８】
特許文献１には、レジオネラ属菌がアメーバなどの内部で増殖することに着目し、アメーバを殺滅することにより、レジオネラ属菌を除菌する方法が開示されているが、アメーバ自体の分析時間も約１週間以上かかるため、レジオネラ属菌を確実に殺菌するには十分な方法ではないのが現実である。
【０００９】
【特許文献１】特開平１１−５７７３７号公報
【非特許文献１】財団法人ビル管理教育センター発行  厚生省生活衛生局企画課監修  新版  レジオネラ症防止指針
【非特許文献２】APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, June 1982, Vol.43, No.6; p.1330-1334
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前述の通り、死亡率の高い疾患を含むレジオネラ症の感染を予防するためには、人工環境水中のレジオネラ属菌等の微生物の徹底した管理が必要不可欠である。
【００１１】
しかし、レジオネラ属菌の増殖速度は温度変化に伴い変化してしまうこと、レジオネラ属菌の分析には所定の時間を有すること等から、循環水系におけるレジオネラ属菌の制御は、確実に行うことが難しいのが現状である。
【００１２】
そこで、本発明では、循環水系におけるレジオネラ属菌の制御をより効率的に、より確実に行うことが可能な技術を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく、循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法について鋭意研究を行った。その結果、レジオネラ属菌の増殖速度が、温度に依存することに着目し、温度条件毎のレジオネラ属菌の増殖速度式を独自に見出し、本発明に係るレジオネラ属菌の制御方法を完成させるに至った。
【００１４】
本発明では、まず、循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法であって、
循環水系におけるレジオネラ属菌の菌数を測定する菌数測定ステップと、
該菌数測定ステップにおいて測定した菌数と前記循環水系の水温に基づいて、菌数が所定水準に達するまでの時間を算出する臨界時間算出ステップと、
該臨界時間算出ステップにおいて算出した臨界時間に基づいて、殺菌処理条件を決定する殺菌処理条件決定ステップと
を少なくとも行う循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法を提供する。
前記殺菌処理条件決定ステップでは、前記臨界時間に基づいて、種々の殺菌処理条件を決定することができる。例えば、殺菌間隔や薬剤添加量を決定することが可能である。
前記菌数測定ステップでは、循環水系におけるレジオネラ属菌の菌数が測定できれば、その測定方法は特に限定されないが、一例としては、イムノアッセイ法を用いてレジオネラ属菌数を測定する方法が挙げられる。
また、前記菌数測定ステップでは、循環水系における堆積物及び／又は生物膜中のレジオネラ属菌数を測定することで、より確実なレジオネラ属菌数を測定することも可能である。
本発明に係るレジオネラ属菌の制御方法は、あらゆる循環水系に用いることができるが、一例を挙げると、開放循環式冷却水系、蓄熱槽、循環式浴槽中のレジオネラ属菌の管理に、好適に用いることが可能である。
【００１５】
本発明では、次に、循環水系におけるレジオネラ属菌の殺菌方法であって、
循環水系におけるレジオネラ属菌の菌数を測定する菌数測定ステップと、
該菌数測定ステップにおいて測定した菌数と前記循環水系の水温に基づいて、菌数が所定水準に達するまでの時間を算出する臨界時間算出ステップと、
該臨界時間算出ステップにおいて算出した臨界時間に基づいて、殺菌処理条件を決定する殺菌処理条件決定ステップと
該殺菌処理条件決定ステップにおいて決定した殺菌処理条件に基づいて、殺菌処理を行う殺菌処理ステップと、
を少なくとも行う循環水系におけるレジオネラ属菌の殺菌方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係るレジオネラ属菌の制御方法は、温度の変化に対応するレジオネラ属菌の増殖速度からレジオネラ属菌数が所定水準に達する臨界時間を算出し、該臨界時間に基づいて、殺菌処理条件を決定するため、季節等により温度等が変化する環境においても、効率的に、かつ、確実に循環水系におけるレジオネラ属菌の制御を行うことが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１８】
＜循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法＞
図１中符号１で示すフロー図は、本発明に係るレジオネラ属菌の制御方法の概要を示す。本発明に係るレジオネラ属菌の制御方法は、菌数測定ステップ（Ｉ）と、臨界時間算出ステップ（II）と、殺菌処理条件決定ステップ（III）と、を少なくとも行う方法である。以下、各ステップについて、詳細に説明する。
【００１９】
（Ｉ）菌数測定ステップ
菌数測定ステップ（Ｉ）では、循環水系におけるレジオネラ属菌の菌数を測定する。
【００２０】
菌数測定ステップ（Ｉ）では、循環水系におけるレジオネラ属菌の菌数が測定できれば、その測定方法は特に限定されず、公知のあらゆる方法を自由に選択することができる。一例としては、培養法、イムノアッセイ法、ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等を挙げることができる。本発明に係る制御方法では、この中でも特に、イムノアッセイ法が好適である。イムノアッセイ法は、簡便な方法であり、時間もコストも軽減できるからである。また、イムノアッセイ法のような抗原抗体反応を用いた方法では、生菌のみならず死菌の測定も行うことができるため、過去のレジオネラ属菌の混入の可能性までも判断することが可能である。
【００２１】
菌数測定ステップ（Ｉ）でイムノアッセイ法を選択する場合、その具体的方法は特に限定されず、イムノアッセイで採用されている公知の方法を自由に選択することができる。例えば、ＥＩＡ法（Enzyme Immunoassay）、イムノクロマト法（immtnochromatography）、ＥＬＩＳＡ法（Enzyme-linked immunosorbent assay）ＦＩＡ法（Fluoroimmunoassay）、ＴＲ−ＦＩＡ法（Time-resolved fluoroimmunoassay）、ＩＲＭＡ法（Immunoradiometic Assay）、ＴＲ−ＩＦＭＡ法（Time-resolved immunofluorometic assay）、ＩＦＭＡ法（Immunoflurometric assay）など、いずれを採用することも可能である。迅速性を考慮すれば、この中でも特にイムノクロマト法（immtnochromatography）が好ましい。
【００２２】
菌数測定ステップ（Ｉ）では、循環水系におけるレジオネラ属菌の菌数が測定できればよいが、より確実なレジオネラ属菌数を測定するために、循環水系における堆積物及び／又は生物膜中のレジオネラ属菌数を測定することが望ましい。後述する実施例２及び３で示すように、堆積物及び／又は生物膜中のレジオネラ属菌と水中のレジオネラ属菌に相関関係があること、また、水中で検出できない微量のレジオネラ属菌であっても、堆積物及び／又は生物膜中では検出することができることから、堆積物及び／又は生物膜中のレジオネラ属菌の検出に基づいて制御を行った方が、より確実にレジオネラ属菌を制御できると考えられるからである。
【００２３】
菌数測定ステップ（Ｉ）において、堆積物及び／又は生物膜中のレジオネラ属菌数を測定することを採用する場合、堆積物及び／又は生物膜中から採取されたサンプルを用いてレジオネラ属菌を検出すれば、そのサンプルの形態は特に限定されないが、１％以上の懸濁物質（Suspended Solid：ＳＳ）を少なくとも含むサンプルを用いるとより好適である。また、懸濁物質（Suspended Solid：ＳＳ）の２０％以上が、有機物であることが好ましい。堆積物や生物膜の採取量が少ない場合や、堆積物や生物膜中の生物汚れが少ない場合に、リスク診断できない可能性が生じる場合があるからである。
【００２４】
また、菌数測定ステップ（Ｉ）において、堆積物及び／又は生物膜中のレジオネラ属菌数を測定することを採用する場合、イムノアッセイ法を用いると、より好適である。水中からレジオネラ属菌を検出する場合には、イムノアッセイを行う際、サンプルの濃縮等の操作が必要であるが、堆積物及び／又は生物膜中からイムノアッセイ法を用いてレジオネラ属菌の検出を行う場合には、濃縮等の操作を必要とせずに、更なる作業時間の短縮を図ることができるからである。
【００２５】
（II）臨界時間算出ステップ
臨界時間算出ステップ（II）では、菌数測定ステップ（Ｉ）において測定した菌数と循環水系の水温に基づいて、菌数が所定水準に達するまでの時間を算出する。
【００２６】
菌数の水準値は、その循環水系の使用目的によって、適宜、設定することができる。例えば、前記非特許文献１の厚生省生活衛生局企画課監修の「新版  レジオネラ症防止指針」においては、以下のように基準が設けられている。
１）人が直接吸入する可能性のない場合
１０２ＣＦＵ／１００ｍＬ以上のレジオネラ属菌が検出された場合、直ちに清掃・消毒等の対策を講じる。
２）浴槽水、シャワー水等を人が直接吸引するおそれがある場合
レジオネラ属菌数の目標値を１０ＣＦＵ／１００ｍＬ未満とし、レジオネラ属菌が検出された場合、直ちに清掃・消毒等の対策を講じる。
【００２７】
即ち、人が直接吸入する可能性のない工業用水等の場合には、例えば、１０２ＣＦＵ／１００ｍＬを所定水準値と設定し、この水準値に達するまでの時間を算出することができる。なお、工業用水等のように人が直接吸入する可能性のない場合であっても、万全を期すために、より厳しい水準値を設定することは自由である。
【００２８】
臨界時間の算出は、以下に示すレジオネラ属菌の増殖速度式１〜４を用いることにより算出する。数式１は２３℃未満、数式２は２３℃以上２８℃未満、数式３は２８℃以上３３℃未満、数式４は３３℃以上の場合の増殖速度式を示す。また、数式中、Ｃはレジオネラ属菌数（ＣＦＵ／１００ｍＬ）、Ｃ０は初期レジオネラ属菌数（ＣＦＵ／１００ｍＬ）、ｔは経過時間（ｈｒ）を示す。
【００２９】
【数１】
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【００３０】
【数２】
2009220058.tif 000004
【００３１】
【数３】
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【００３２】
【数４】
2009220058.tif 000006
【００３３】
（III）殺菌処理条件決定ステップ
殺菌処理条件決定ステップ（III）では、臨界時間算出ステップ（II）において算出した臨界時間に基づいて、殺菌処理の条件を決定する。
【００３４】
殺菌処理条件決定ステップ（III）において決定する殺菌処理条件は、循環水系におけるレジオネラ属菌を所定水準に制御できれば特に限定されず、殺菌処理方法等に合わせて、適宜、決定することができる。
【００３５】
例えば、レジオネラ属菌を確実に殺菌できる一定量の薬剤を、所定間隔で添加する殺菌処理を採用する場合には、薬剤投入による殺菌間隔を、臨界時間に基づいて、決定することができる。即ち、臨界時間を経過する前に殺菌間隔を設定することにより、確実に、循環水系におけるレジオネラ属菌を制御することができる。
【００３６】
また、臨界時間に達する前に、所定量の薬剤を添加するように、薬剤添加量や薬剤添加時間を決定することも可能である。
【００３７】
あるいは、紫外線等を用いて殺菌処理を行う方法を採用する場合には、臨界時間に達する前に確実に殺菌できるように、照射時間（殺菌時間）を決定することも可能である。
【００３８】
このように、本発明に係るレジオネラ属菌の制御方法は、温度の変化に対応するレジオネラ属菌の増殖速度からレジオネラ属菌数が所定水準に達する臨界時間を算出し、該臨界時間に基づいて、殺菌処理条件を決定するため、季節等により温度等が変化する環境においても、臨界時間前に確実にレジオネラ属菌の殺菌を行うことができる。
【００３９】
また、必要以上の薬剤等の添加や紫外線等の照射を防止することができ、循環水系におけるレジオネラ属菌の制御を、効率的に行うことが可能である。
【００４０】
以上説明した本発明に係る循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法は、あらゆる循環水系に用いることができる。例えば、開放循環式冷却水系、蓄熱槽、循環式浴槽中のレジオネラ属菌の管理に、好適に用いることが可能である。
【００４１】
＜循環水系におけるレジオネラ属菌の殺菌方法＞
図１中符号２で示すフロー図は、本発明に係るレジオネラ属菌の殺菌方法の概要を示す。本発明に係るレジオネラ属菌の殺菌方法は、菌数測定ステップ（Ｉ）と、臨界時間算出ステップ（II）と、殺菌処理条件決定ステップ（III）と、殺菌処理ステップ（IV）と、を少なくとも行う方法である。以下、各ステップについて、詳細に説明する。なお、菌数測定ステップ（Ｉ）、臨界時間算出ステップ（II）、及び殺菌処理条件決定ステップ（III）については、前記制御方法と同様であるため、ここでは説明を割愛する。
【００４２】
（IV）殺菌処理ステップ
殺菌処理ステップ（IV）では、殺菌処理条件決定ステップ（III）において決定した殺菌処理条件に基づいて、実際に循環水系のレジオネラ属菌の殺菌処理を行う。
【００４３】
循環水系の殺菌処理は、レジオネラ属菌の殺菌ができれば、その方法は特に限定されず、公知の殺菌処理方法のいずれも自由に採用することが可能である。例えば、グルタルアルデヒド、２−ブロモ２−ニトロプロパン１，３−ジオール、塩素、過酸化水素、イソチアゾリン化合物、などのレジオネラ属菌に対する殺菌剤を単独もしくは併用して添加する方法、これらの殺菌剤とスライムコントロール剤、防食剤、防スケール剤等を併用して添加する方法、或いは、紫外線を用いて殺菌処理を行う方法などを挙げることができる。
【００４４】
以上説明した本発明に係るレジオネラ属菌の殺菌方法も、制御方法と同様に、あらゆる循環水系に用いることができる。例えば、開放循環式冷却水系、蓄熱槽、循環式浴槽中のレジオネラ属菌の管理に、好適に用いることが可能である。
【実施例１】
【００４５】
実施例１では、本発明に係るレジオネラ属菌制御方法を用いて殺菌方法を行った場合と、従来からの殺菌方法を行った場合の循環水系のレジオネラ属菌数を調べた。循環水系の一例として、空調用冷却水を用い、８０日間、水温２５〜３５℃で変化する環境下で本実施例を行った。
【００４６】
（１）レジオネラ属菌数の測定
まず、空調用冷却水、１５０ＲＴ、保有水量３ｍ３の系におけるレジオネラ属菌数の測定を行った。レジオネラ属菌数の測定は、培養法を用いて行った。
【００４７】
具体的には、まず、５００ｍＬ滅菌瓶（栄研化学株式会社製）にサンプルを採取し、６〜１８℃で分析施設へ搬送した。そして、滅菌遠心管にサンプル１００〜２００ｍＬを入れ、５０００〜７０００ｒｐｍ、１５〜２５℃にて３０分間遠心を行った。遠心後、上澄みを捨て、０．５ｍＬまたは１ｍＬの滅菌蒸留水で管内壁を洗浄し、残渣を懸濁して濃縮サンプルを調製した。
【００４８】
前記で調製した濃縮サンプルとｐＨ２．２±０．２の０．２ＭＨＣｌ（キシダ化学株式会社製）・ＫＣｌ（キシダ化学株式会社製）緩衝液を当量混合し、室温に５〜２０分放置した。これを０．１ｍＬ、ＷＹＯα寒天培地（栄研化学株式会社製）に塗布し、３６±１℃において、８日間培養した。培養５日目に、レジオネラ属菌と思われるコロニーを数え、菌数（ＣＦＵ／１００ｍＬ）を算出した。なお、レジオネラ属菌の算出では、Ｂ−ＣＹＥα寒天培地（栄研化学株式会社製）とＬ−システイン不含有培地（栄研化学株式会社製）に植菌し、Ｂ−ＣＹＥα寒天培地にのみ発育したグラム陰性桿菌をレジオネラ属菌と推定することにより行った。
【００４９】
（２）臨界時間の算出
レジオネラ属菌数の所定水準値を１００ＣＦＵ／１００ｍＬと定め、前記で測定した菌数と空調用冷却水の水温に基づいて、菌数が所定水準値１００ＣＦＵ／１００ｍＬに達するまでの臨界時間を算出した。なお、４２日目までは、水温が２５℃以上２８℃未満であったため、前記数式２を用い、４３〜５６日目、７１日目以降は、水温が２８℃以上３３℃未満であったため、前記数式３を用い、５７〜７０日目までは、水温が３３℃以上であったため、前記数式４を用いて臨界時間を算出した。算出した臨界時間を、表１に示す。
【００５０】
【表１】
2009220058.tif 000007
【００５１】
（３）殺菌処理条件の決定
前記で算出した臨界時間に基づいて、下記の表２に示すように、殺菌処理条件を決定した。具体的に、本実施例では、レジオネラ属菌の殺菌剤の一例として、５−クロロ−２−メチルイソチアゾリン−３−オン（以下「ＣＩ−ＭＩＴ」と称する。）を５ｍｇ／Ｌになるように用いた場合の殺菌間隔条件を決定した。なお、ＣＩ−ＭＩＴは、５ｍｇ／Ｌ添加する処理を行うことで、レジオネラ属菌が９９．９％殺菌できる殺菌剤である。
【００５２】
【表２】
2009220058.tif 000008
【００５３】
（４）殺菌処理
前記で決定した殺菌処理条件に基づいて、殺菌処理を行った。即ち、４２日目までは３週間に１度、４３〜５６日目までは２週間に１度、５７〜７０日目までは１週間に１度、７１日目以降は２週間に１度、ＣＩ−ＭＩＴを５ｍｇ／Ｌとなるように添加した。その間、前記（１）と同様の方法を用いて、レジオネラ属菌数の測定を定期的に行った。経過日数に対する水温の変化とレジオネラ属菌数の推移を、図２のグラフに示す。
【００５４】
（５）比較例
比較例として、前記と同使用の空調用冷却水に対し、同環境下において、ＣＩ−ＭＩＴを５ｍｇ／Ｌとなるように、水温に関わらず一律２週間に１度の頻度で添加を行った。その間、前記（１）と同様の方法を用いて、レジオネラ属菌数の測定を定期的に行った。比較例についての経過日数に対する水温の変化とレジオネラ属菌数の推移を、図３のグラフに示す。
【００５５】
（６）結果
図２及び図３に示す通り、本発明に係る制御方法を用いて循環水系におけるレジオネラ属菌の殺菌を行った場合には、シーズンを通じて、レジオネラ属菌数の上昇は見られなかった（図２参照）。しかし、従来の方法のように、シーズンを通じて一定条件下での殺菌を行った場合、水温が低い間はレジオネラ属菌の上昇は見られなかったが、水温が上昇と共に、レジオネラ属菌数も上昇する傾向が見られ、循環水系におけるレジオネラ属菌の制御を十分に行うことができなかった。
【００５６】
実施例１の結果から、本発明に係る制御方法を用いれば、季節等により温度等が変化する環境においても、循環水系におけるレジオネラ属菌の制御を、確実に、行うことができることが分かった。
【実施例２】
【００５７】
実施例２では、水中のレジオネラ属菌数と循環水系におけるスラッジ中のレジオネラ属菌数を、それぞれ培養法にて測定し、その関係を調べた。
【００５８】
（１）水中のレジオネラ属菌数の測定
まず、５００ｍＬ滅菌瓶（栄研化学株式会社製）にサンプルを採取し、６〜１８℃で分析施設へ搬送した。そして、滅菌遠心管にサンプル１００〜２００ｍＬを入れ、５０００〜７０００ｒｐｍ、１５〜２５℃にて３０分間遠心を行った。遠心後、上澄みを捨て、０．５ｍＬまたは１ｍＬの滅菌蒸留水で管内壁を洗浄し、残渣を懸濁して濃縮サンプルを調製した。
【００５９】
前記で調製した濃縮サンプルとｐＨ２．２±０．２の０．２ＭＨＣｌ（キシダ化学株式会社製）・ＫＣｌ（キシダ化学株式会社製）緩衝液を当量混合し、室温に５〜２０分放置した。これを０．１ｍＬ、ＷＹＯα寒天培地（栄研化学株式会社製）に塗布し、３６±１℃において、８日間培養した。培養５日目に、レジオネラ属菌と思われるコロニーを数え、菌数（ＣＦＵ／１００ｍＬ）を算出した。なお、レジオネラ属菌の算出では、Ｂ−ＣＹＥα寒天培地（栄研化学株式会社製）とＬ−システイン不含有培地（栄研化学株式会社製）に植菌し、Ｂ−ＣＹＥα寒天培地にのみ発育したグラム陰性桿菌をレジオネラ属菌と推定することにより行った。
【００６０】
（２）スラッジ中のレジオネラ属菌数の測定
シリンジ（テルモ株式会社製）を用いて冷却塔ピットより、スラッジを１ｍＬサンプルチューブに０．５〜１ｍＬ採取した。この際、スラッジ中の生物汚れが少ない場合に備え、サンプル中の懸濁物質（Suspended Solid：ＳＳ）を１〜２％含む様に注意した。そして、採取したサンプルを、ペストルで約１分間ホモジナイズしてスラッジ中サンプルを調製した。
【００６１】
前記で調製したスラッジ中サンプルを用いて、前記（１）環境水中のレジオネラ属菌数の測定と同様の方法で培養を行い、レジオネラ属菌数の測定を行った。
【００６２】
（３）測定結果
水中のレジオネラ属菌数とスラッジ中のレジオネラ属菌数の測定結果を表３に示す。
【００６３】
【表３】
2009220058.tif 000009
【００６４】
表３に示すように、水中からレジオネラ属菌が検出された場合には、スラッジ中からもレジオネラ属菌が検出され（サンプル１、３、及び４参照）、スラッジ中からレジオネラ属菌が検出されなかった場合には、水中からもレジオネラ属菌が検出されない（サンプル２、８、９、１１、１２、及び１４参照）ことが分かった。即ち、循環水系のスラッジ中にレジオネラ属菌が検出されない場合には、ほぼ確実に水中からもレジオネラ属菌が検出されないことが分かった。これは、レジオネラ属菌が、堆積物や生物膜内部で増殖し、水中に放出されるという性質に起因すると考えられる。
【００６５】
実施例２では、堆積物や生物膜中のレジオネラ属菌を測定することにより、水中のレジオネラ属菌の存在の可能性を判断することができることが分かった。
【実施例３】
【００６６】
実施例３では、堆積物中のレジオネラ属菌をイムノアッセイを用いて検出した結果と、水中のレジオネラ属菌を培養法を用いて検出した結果との関係を調べた。
【００６７】
（１）堆積物中のレジオネラ属菌の検出
シリンジ（テルモ株式会社製）を用いて冷却塔ピットより、堆積物を１ｍＬサンプルチューブに０．５〜１ｍＬ採取した。この際、堆積物中の生物汚れが少ない場合に備え、サンプル中の懸濁物質（Suspended Solid：ＳＳ）を１〜２％含む様に注意した。そして、採取したサンプルを、ペストルで約１分間ホモジナイズした。
【００６８】
分析キット（BinaxＮＯＷレジオネラ：第一三共株式会社製）に附属の綿棒を、前記堆積物に接触させ、この綿棒を分析キットのパネルの所定場所に挿入した。その後、分析キットに附属の添加試薬を挿入部に２〜３滴滴下し、分析キットのパネルを張り合わせた。５〜６０分後、ＣＯＮＴＲＯＬ及びＳＡＭＰＬＥにラインが出た場合を陽性、ＣＯＮＴＲＯＬのみにラインが出た場合は陰性としてレジオネラ属菌の検出を行った。
【００６９】
なお、本実施例で使用したBinaxＮＯＷレジオネラ（第一三共株式会社製）は、レジオネラニューモフィラ血清型１ＬＩＳ抗原を特異的に認識するポリクロナール抗体を利用したイムノクロマト法（immtnochromatography）を原理とする検査キットであり、約１５分で迅速・簡便にレジオネラ属菌の検出が可能なキットである。付属の綿棒を検体に浸し綿棒挿入口に挿入し添加試薬を滴下することで、検体中のジオネラニューモフィラ血清型１ＬＰＳ抗原を抽出する。この抽出された抗１ＬＰＳ原はテストパネルを張り合わせることで、メンブレン試薬のコンジュゲートパッドに移動し、コンジュゲートパッドに乾燥含有されている抗レジオネラニューモフィラ血清型１ＬＰＳポリクローナルウサギ抗体感作金コロイド粒子と抗原−抗体反応を起こして抗原−抗体複合体となり、毛細管現象によってメンブレン試薬上を展開する。抗原−抗体複合体がサンプル検出部に達すると、サンプル検出部に固定化されている抗レジオネラニューモフィラ血清型１ＬＰＳポリクローナルウサギ抗体に捕捉され、抗体−抗原−抗体のサンドイッチ状の結合体を作り、サンプル検出部に赤紫色の線（サンプルライン）が出現する。
【００７０】
（２）水中のレジオネラ属菌の検出
前記堆積物中のレジオネラ属菌の検出で陽性であった１００例と、陰性であった４２例について、それぞれの水中のレジオネラ属菌を、培養法を用いて検出した。培養法の具体的な方法は、実施例２と同様の方法を用いた。
【００７１】
（３）検出結果
循環水系における堆積物中のレジオネラ属菌の検出結果（イムノアッセイ法）と、水中のレジオネラ属菌の検出結果（培養法）を表４に示す。
【００７２】
【表４】
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【００７３】
表４に示す通り、イムノアッセイを用いて堆積物中のレジオネラ属菌を検出したときに「陰性」であった場合に、培養法を用いて水中のレジオネラ属菌を検出したいときに「陽性」となったのは、全体１４２件中、僅か３件（２％）であった。
【００７４】
実施例３では、堆積物や生物膜中のレジオネラ属菌をイムノアッセイを用いて検出することにより、水中のレジオネラ属菌の存在の可能性を判断することが可能であることが分かった。
【００７５】
また、水中では検出不能な微量のレジオネラ属菌も、堆積物や生物膜中であれば検出される可能性が高いため、本発明の制御方法における菌数測定ステップにおいて、堆積物や生物膜中のレジオネラ属菌数を測定することにより、確実に、環境水中のレジオネラ属菌を制御することができることも分かった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明に係るレジオネラ属菌の制御方法は、温度の変化に対応するレジオネラ属菌の増殖速度からレジオネラ属菌数が所定水準に達する臨界時間を算出し、該臨界時間に基づいて、殺菌処理条件を決定するため、季節等により温度等が変化する環境においても、循環水系におけるレジオネラ属菌の制御を確実に行うことができる。そのため、人工環境水からのレジオネラ属菌感染によるレジオネラ症の予防に大きく貢献することが可能である。
【００７７】
また、必要以上の薬剤等の添加や紫外線等の照射を防止することができ、循環水系におけるレジオネラ属菌の制御を、効率的に行うことが可能である。従って、循環水系におけるレジオネラ属菌の殺菌処理にかかるコストや時間の削減も実現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明に係る循環水系におけるレジオネラ属菌の制御方法及び殺菌方法の概要を示すフロー図である。
【図２】実施例１において、経過日数に対する水温の変化とレジオネラ属菌数の推移を示す図面代用グラフである。
【図３】実施例１において、比較例についての経過日数に対する水温の変化とレジオネラ属菌数の推移を示す図面代用グラフである。
【図４】２５℃、３２℃、３７℃、４２℃における時間に対する生菌数の推移を示す図面代用グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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