(57)【要約】【課題】赤血球が安定かつ均一に固相されたクロスマッチ試験用容器を提供すること。【解決手段】ヒト赤血球がバインダー物質を介して固相化されたクロスマッチ試験用容器の製造方法であって、固相化されるヒト赤血球の表面抗原に対するモノクローナル抗体を、ヒト赤血球を固相化するためのバインダー物質として選択する工程と、前記モノクローナル抗体が由来する生物種に対する抗体を、バインダー物質を固相化するための一次バインダーとして容器底面に固相化する工程と、一次バインダーを固相化した容器底面に、前記バインダー物質を更に固相化する工程と、バインダー物質を固相化した容器底面に、ヒト赤血球を固相化する工程とを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト赤血球がバインダー物質を介して固相化されたクロスマッチ試験用容器の製造方法であって、
固相化されるヒト赤血球の表面抗原に対するモノクローナル抗体を、ヒト赤血球を固相化するためのバインダー物質として選択する工程と、
前記モノクローナル抗体が由来する生物種に対する抗体を、バインダー物質を固相化するための一次バインダーとして容器底面に固相化する工程と、
一次バインダーを固相化した容器底面に、前記バインダー物質を更に固相化する工程と、
バインダー物質を固相化した容器底面に、ヒト赤血球を固相化する工程と
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により製造された、ヒト赤血球が固相化されたクロスマッチ試験用容器。
【請求項３】
ヒト赤血球がバインダー物質を介して固相化されたクロスマッチ試験用容器であって、
前記バインダー物質が、固相化されるヒト赤血球の表面抗原に対するモノクローナル抗体であり、
容器底面から、以下の（ａ）〜（ｃ）がこの順に固相化されていることを特徴とする容器：
（ａ）前記モノクローナル抗体を固相化するための一次バインダーとしての、前記モノクローナル抗体が由来する生物種に対する抗体、
（ｂ）前記モノクローナル抗体、
（ｃ）ヒト赤血球。
【請求項４】
ヒト赤血球を容器底面に固相化する方法であって、
固相化されるヒト赤血球の表面抗原に対するモノクローナル抗体を、ヒト赤血球を固相化するためのバインダー物質として選択する工程と、
前記モノクローナル抗体が由来する生物種に対する抗体を、バインダー物質を固相化するための一次バインダーとして容器底面に固相化する工程と、
一次バインダーを固相化した容器底面に、前記バインダー物質を更に固相化する工程と、
バインダー物質を固相化した容器底面に、ヒト赤血球を固相化する工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト赤血球が固相化されたクロスマッチ試験用容器の製造方法およびその容器、並びにヒト赤血球を容器底面に固相化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロスマッチ試験（交差適合試験）は、ドナーの赤血球とレシピエント（患者）の血漿中の抗体、あるいは逆の組合せによる致命的な溶血反応の可能性を回避するために、輸血前にドナーと患者の間の不適合性を検査するために用いられる。クロスマッチ試験により、輸血に使用する赤血球と患者の血清を反応させて、ＡＢＯ血液型を確認したり、患者血清中に、輸血血液に対する抗体が存在しないことを確認したりする。
【０００３】
このクロスマッチ試験を固相法で行う場合、ドナーの赤血球（主試験）または患者の赤血球（副試験）の何れかを担体に固相する必要がある。
【０００４】
従来、赤血球を固相する方法として、レクチンを用いる方法（特許文献１および２）、陽性荷電ポリマーを用いる方法（特許文献３）、塩基性染料を用いる方法（特許文献４）が知られている。
【０００５】
従来の方法、とりわけ、結合剤としてレクチンや陽性荷電ポリマーを用いる方法は、高濃度のタンパク質の存在下で、赤血球が担体に結合しないという問題がある。すなわち、固相化させる血球浮遊液に高濃度のタンパク質が存在すると、赤血球が担体に固相化されないか、あるいは均一に固相化されない。特に、血漿/血清タンパク質が、赤血球の固相化に対して大きな問題であり、従来の方法では、固相化させたい赤血球を含む血液は、採血後に、タンパク除去のために少なくとも１回は洗浄しなければならない。
【０００６】
また、クロスマッチ試験においては、非特異的な反応をブロッキングするためにウシ血清アルブミン（BSA）等のタンパク質を用いるが、かかるタンパク質は、赤血球の固相化に悪影響を及ぼすため、高濃度で使用することができない。
【０００７】
通常、クロスマッチ試験では、一人の患者に対し、たとえば４〜６人のドナーに由来する複数種類の輸血用血液をクロスマッチする。固相させたい赤血球をそれぞれ、タンパク除去のために洗浄することは大変手間のかかることであり、短時間で試験結果を得ることが求められるクロスマッチ試験において問題である。
【０００８】
また、赤血球が担体に安定して均一に固相されていない場合、所望の試験結果を得られないという問題がある。たとえば、固相化された赤血球上の抗原と反応する抗体が、患者の血清中に存在していたとしても、赤血球の固相状態が不良である場合、クロスマッチ試験の結果は、赤血球の固相の仕方に依存することになる。このように、赤血球の固相状態は、直接クロスマッチ試験の結果に影響を及ぼすため、赤血球を、担体から剥がれ落ちることなく安定に、かつ均一な状態で固相化することは重要な意味を有する。
【特許文献１】特許第２５３２６７０号公報
【特許文献２】特開平２０００−３２１２６９号公報
【特許文献３】特公平８−２７２８５号公報
【特許文献４】特開平２−１５１７６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記事情に鑑み、本発明は、血漿/血清タンパク質等のタンパク質の存在下においても赤血球が安定かつ均一に固相化されたクロスマッチ試験用容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、赤血球を固相化する際に、固相化されるヒト赤血球の表面抗原に対するモノクローナル抗体を結合剤（バインダー物質）として使用し、当該結合剤を固相化するための一次バインダーを更に使用することにより、赤血球が、タンパク質の存在下においても、容器底面に安定かつ均一に固相化されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、一つの側面によれば、ヒト赤血球がバインダー物質を介して固相化されたクロスマッチ試験用容器の製造方法であって、
固相化されるヒト赤血球の表面抗原に対するモノクローナル抗体を、ヒト赤血球を固相化するためのバインダー物質として選択する工程と、
前記モノクローナル抗体が由来する生物種に対する抗体を、バインダー物質を固相化するための一次バインダーとして容器底面に固相化する工程と、
一次バインダーを固相化した容器底面に、前記バインダー物質を更に固相化する工程と、
バインダー物質を固相化した容器底面に、ヒト赤血球を固相化する工程と
を含む方法である。
【００１２】
別の側面によれば、本発明は、上記方法により製造されたクロスマッチ試験用容器である。また、別の側面によれば、本発明は、ヒト赤血球がバインダー物質を介して固相化されたクロスマッチ試験用容器であって、
前記バインダー物質が、固相化されるヒト赤血球の表面抗原に対するモノクローナル抗体であり、
容器底面から、以下の（ａ）〜（ｃ）がこの順に固相化されていることを特徴とする容器である：
（ａ）前記モノクローナル抗体を固相化するための一次バインダーとしての、前記モノクローナル抗体が由来する生物種に対する抗体、
（ｂ）前記モノクローナル抗体、
（ｃ）ヒト赤血球。
【００１３】
更に別の側面によれば、本発明は、クロスマッチ試験用容器の上記製造方法におけるすべての工程を含むヒト赤血球の固相化方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に従って、ヒト赤血球の表面抗原に対するモノクローナル抗体を、赤血球の固相化のための結合剤として使用し、当該結合剤を固相化するための一次バインダーを更に使用することにより、タンパク質の存在下においても、安定かつ均一に赤血球を固相化させることが可能である。これにより、本発明は、ヒト赤血球の固相化の際に、赤血球を含む血球浮遊液から、予めタンパクを除去する必要がなく、血球浮遊液を前処理する必要がないという利点を有する。加えて、赤血球が安定かつ均一に固相化された容器を用いてクロスマッチ試験を行うことにより、正確な試験結果を得ることができる。また、通常モノクローナル抗体は、培養上清や腹水産物として得られるため、固相するためには抗体成分のみを単離精製する必要があるが、本発明のように一次バインダーを使えば単離精製しなくても問題なく固相することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のクロスマッチ試験用容器において、ヒト赤血球は、「結合剤（以下、バインダー物質という）」、および結合剤を固相化するための「一次バインダー」を介して容器底面に固相化されている。
【００１６】
本発明において「バインダー物質」は、固相化されるヒト赤血球の表面抗原に対するモノクローナル抗体である。バインダー物質としてのモノクローナル抗体は、ヒト赤血球の表面抗原と結合し、ヒト赤血球を結合可能なものであれば特に限定されない。バインダー物質としてのモノクローナル抗体は、ヒト由来のものに限定されず任意の生物種に由来し得るが、哺乳類由来のモノクローナル抗体が好ましく、たとえばマウス、ウサギ、ヒト由来のモノクローナル抗体が挙げられる。かかるモノクローナル抗体は、商業的に入手可能なものであってもよいし、ヒト赤血球の表面抗原を用いて、当該技術分野で公知の手法に従って作成してもよい。かかるモノクローナル抗体の例は、Ａ抗原、Ｂ抗原、グリコフォリン、H type1抗原、H type2抗原、BandIII抗原、Lewis抗原などの赤血球表面抗原に対するモノクローナル抗体が挙げられる。より具体的には、後述の実施例で用いられるとおり、抗Aモノクローナル抗体、抗Bモノクローナル抗体、抗グリコフォリンモノクローナル抗体、抗H type1モノクローナル抗体、抗H type2モノクローナル抗体などが挙げられる。
【００１７】
本発明において「一次バインダー」は、前述のバインダー物質を容器底面に固相化するためのものであり、バインダー物質であるモノクローナル抗体が由来する生物種に対する抗体である。たとえば、バインダー物質が、マウス由来のモノクローナル抗体である場合、一次バインダーとしては、抗マウス抗体が使用される。また、バインダー物質が、マウス由来のＩｇＧである場合、一次バインダーは、抗マウスＩｇＧが好ましいが、抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭでもよい。
【００１８】
本発明において固相用の「容器」は、底面が、固相可能な程度に平滑であれば、任意の容器を使用することができる。容器の底面は、平面、曲面の何れでもよい。また、材質はプラスチック、シリコン、ガラスなど任意のものであり得る。たとえば、半球状の収容部を有する容器、Ｕ字底マイクロプレートが挙げられる。なお、固相用の容器は、赤血球を固相化するための収容部を１つ有する容器であってもよいし、収容部を複数有する容器であってもよい。
【００１９】
「固相化」は、「一次バインダー」、「バインダー物質」、「ヒト赤血球」の順に行われる。「固相化」は、当該技術分野に公知の手法に従って行うことができ、たとえば、後述の実施例の（２−３）の欄に記載されるとおり、一次バインダーである抗体を容器に入れてインキュベートしてその底面に固相化し、更にその底面に、バインダー物質であるモノクローナル抗体を入れてインキュベートし、その後乾燥させて固相化し、その上に赤血球を添加することにより、行うことができる。
【実施例】
【００２０】
バインダー物質として、以下に記載の各種レクチンや抗体を使用して、ヒト赤血球を固相化した。
【００２１】
１．材料
１−１．レクチン（バインダー物質）
ＷＧＡ（コムギ胚芽レクチン）は、豊年株式会社製を使用した。ＡＰＰ（エゾボウフウ）、ＣＳＡ（エニシダレクチン）、ＤＳＡ（チョウセンアサガオレクチン）、ＶＦＡ（ソラマメレクチン）、ＬＣＨ−Ａ（レンズ豆レクチン）、ＬＣＨ−Ｂ、ＥＣＡ（ディゴマメレクチン）、ＰＮＡ（ピーナツレクチン）はいずれも、EYラボラトリーズの製品を使用した。
【００２２】
１−２．抗体（バインダー物質）
ウサギ抗グリコフォリン抗体は、Biogenesis社  4720-5010を使用した。
【００２３】
マウス抗グリコフォリンモノクローナル抗体は、Chemicon社  BRIC256を使用した。
【００２４】
マウス抗Bモノクローナル抗体、マウス抗Aモノクローナル抗体は、BioRad製のAffiGelを使用して、抗B抗体(和光純薬、Ortho社)、抗A抗体(Ortho社)から精製した（後述の２−２の欄参照）。
【００２５】
マウス抗Hモノクローナル抗体は、ARP社の抗H typeIIモノクロナール抗体(BRIC2321;IgG1)培養上清(08-9421-1)と、抗H TypeI+IIモノクロナール抗体(BRIC39; IgM)培養上清(08-9421-1)を使用した。
【００２６】
１−３．一次バインダー
抗ウサギIgGは、Jackson  Anti Rabbit IgG  111-005-046を使用した。
【００２７】
抗マウスIgGは、Jackson  Anti Mouse IgG  315-005-003を使用した。
【００２８】
抗マウスIgG+IgMは、抗マウス IgG+IgM(H&L)  (Jackson;315-005048)を使用した。
【００２９】
１−４．赤血球
Ortho社の市販血球試薬アファーマジェン、またはDiaMed社の試験管法用赤血球DiaCellA1,Bを使用した。
【００３０】
１−５．容器
Maxisorp(Nalgen-Nunc)Ｕ底プレートを使用した。
【００３１】
２．方法
２−１．レクチン（バインダー物質）の固相化
レクチンは、10μg/mLになるように炭酸バッファーpH9.6で希釈し、Maxisorp(Nalgen-Nunc)Ｕ底プレートに50μL/wellずつ分注した。冷蔵庫でOverNightインキュベートし、その後、生理食塩液で3回洗浄し、更にプレート乾燥溶液(10%Sucrose, 0.1%BSA, 0.05%Zonen)100μLで1回洗浄し、水切りして、30℃の乾燥機で風乾30分間実施した。後、シリカゲルと共にアルミパックを行った。
【００３２】
２−２．抗体（バインダー物質）の直接の固相化
マウス抗Ｂモノクローナル抗体は、BioRad社のAffiGel の添付文書に従って、「Ortho社の抗B抗体」から精製を行った。
【００３３】
すなわち、15mLのプラスチック遠心チューブにProteinAゲルを3mL分取して、Binding Buffer 5mL(キット同包)で2回洗浄した。次にBinding Bufferで2倍希釈した「Ortho社の抗B抗体」10mL をProteinAゲルに添加し、30分間シェーカーで攪拌した。遠心し、上清除去してProteinAゲルにElution Buffer 5mLを加えて、10分間攪拌し、遠心して上清を分取した。この上清に1M PB pH7.2を少しずつpH試験紙でpHを見ながら、pH=6-7に調整した。この上清のOD280nmを測定し、A280 1mg/mL=1.35からIgG濃度として抗体濃度を算出した。
【００３４】
同様に、「和光純薬の抗B抗体」、「Ortho社の抗A抗体」についても精製を行い、それぞれ、マウス抗Ｂモノクローナル抗体、マウス抗Ａモノクローナル抗体を精製した。
【００３５】
精製した抗B抗体または抗A抗体を10μg/mLになるように炭酸バッファーpH9.6で希釈し、Maxisorp(Nalgen-Nunc)Ｕ底プレートに50μL/wellずつ分注した。冷蔵庫でOverNightインキュベートし、その後、生理食塩液で3回洗浄し、更にプレート乾燥溶液(10%Sucrose, 0.1%BSA, 0.05%Zonen)100μLで1回洗浄し、水切りして、30℃の乾燥機で風乾30分間実施した。後、シリカゲルと共にアルミパックを行った。
【００３６】
その他の抗体（バインダー物質）も同様に固相化を行った。
【００３７】
２−３．抗体（バインダー物質）の一次バインダーを介しての固相化
「ウサギ抗マウスIgG+IgM(H&L)」を10μg/mLになるように炭酸バッファーpH9.6で希釈し、Maxisorp(Nalgen-Nunc)Ｕ底プレートに50μL/wellずつ分注した。冷蔵庫でOverNightインキュベートし、生理食塩液で3回洗浄し、「Ortho社の抗B抗体」を生理食塩液で2倍希釈したものを50μL/well分注して、30分間インキュベートした。プレート乾燥溶液(10%Sucrose, 0.1%BSA, 0.05%Zonen)100μLで2回洗浄し、水切りして、30℃の乾燥機で風乾  30分間実施した。後、シリカゲルと共にアルミパックを行った。
【００３８】
同様にOrtho社の抗A抗体、和光純薬の抗A, B抗体についても、抗マウスIgG+IgM抗体（一次バインダー）を介してプレートに固相した。
【００３９】
また、その他の抗体（バインダー物質）も同様に一次バインダーを介して固相化を行った。
【００４０】
２−４．レクチン固相化プレートへの赤血球の固相化
ＷＧＡ（コムギ胚芽レクチン）固相化プレート(上記２−１で作成)に、試薬赤血球1滴(3% 50μL/well)を分注して、10分間放置後、生理食塩液で3回洗浄して、血球結合を観察した（この結果は、下記表１において「タンパクフリー」の場合の結果として示される）。また、AB型血清5%添加3%赤血球50μLを分注して、血清蛋白存在下での血球結合も試みた（この結果は、下記表１において「タンパク存在下」の場合の結果として示される）。
【００４１】
２−５．抗体固相化プレートへの赤血球の固相化
・抗B抗体固相化プレートへの赤血球の固相化
抗B抗体固相化プレート(上記２−２で作成)あるいは、抗マウスIgG+IgM抗体を介して、抗B抗体を結合したプレート(上記２−３で作成)に、試薬赤血球1滴(3% 50μL/well)を分注して、10分間放置後、生理食塩液で3回洗浄して、血球結合を観察した。また、AB型血清5%添加3%赤血球50μLを分注して、血清蛋白存在下での血球結合も試みた。
【００４２】
同様にA血球についても固相をこころみた。
【００４３】
・抗H抗体固相化プレート、抗A抗体固相化プレートへの赤血球の固相化
抗マウスIgG+IgM抗体を介して抗A, 抗H抗体を固相化したプレート(上記２−３で作成)に、試薬赤血球1滴(3% 50μL/well)を分注して、10分間放置後、生理食塩液で3回洗浄して、血球結合を観察した。また、AB型血清5%添加3%赤血球50μLを分注して、血清蛋白存在下での血球結合も試みた。
【００４４】
３．結果
血球結合の結果を、以下の表１に示す。
【表１】
2009014572.tif 000002
【００４５】
レクチンは、一次抗体が入手できないため、一次バインダーを使用することなく、直接固相化した。レクチンをバインダー物質として用いた場合、タンパク質の存在により赤血球の結合が阻害された。
【００４６】
抗体をバインダー物質として用いた場合、全体的に、タンパク質の存在下でも赤血球の結合は阻害されなかった。特に、一次バインダーを使用してバインダー物質としてモノクローナル抗体を固相化した場合、赤血球の安定かつ均一な固相化が達成され、タンパク質存在下においても、赤血球の安定かつ均一な固相化は維持された。
【００４７】
また、血球結合の結果の例を、顕微鏡写真により図１〜図５に示す。
【００４８】
図４および図５は、バインダー物質としてコムギ胚芽レクチンを使用した場合の赤血球の固相状態を示す。図４は、血清タンパク質を添加しなかった場合を示し、図５は、血清タンパク質を添加した場合を示す。図４および５の結果より、バインダー物質としてコムギ胚芽レクチンを使用した場合、血清タンパク質が存在しない条件下では赤血球の固相は安定かつ均一であるが、血清タンパク質の存在により赤血球の結合が阻害されることが分かる。
【００４９】
図１および２は、バインダー物質としてマウス抗Ａモノクローナル抗体を使用した場合の赤血球の固相状態を示す。図１は、一次バインダーを使用しなかった場合を示し、図２は、一次バインダーとして抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭを使用した場合を示す。図１および２の結果より、一次バインダーが存在しない場合、赤血球は固相化されているがその結合は不安定かつ不均一であり、一次バインダーの存在により赤血球の結合が安定かつ均一化されることが分かる。
【００５０】
また、図３は、バインダー物質としてマウス抗グリコフォリンモノクローナル抗体を使用し、一次バインダーとして抗マウスＩｇＧを使用し、タンパク質存在下で赤血球を固相化した場合の赤血球の固相状態を示す。図２および３の結果より、一次バインダーを使用した場合、血清タンパク質が存在しない条件下での赤血球の固相は安定かつ均一であり（図２参照）、この良好な固相は、血清タンパク質の存在により阻害されない（図３参照）ことが分かる。
【００５１】
本実施例により、ヒト赤血球の表面抗原に対するモノクローナル抗体を結合剤として使用し、当該結合剤を固相化するための一次バインダーを更に使用することにより、タンパク質の存在下においても、安定かつ均一に赤血球を固相化することが可能であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】一次バインダーを使用することなく、バインダー物質としてマウス抗Ａモノクローナル抗体を使用し、赤血球を固相化した場合の顕微鏡写真。
【図２】バインダー物質としてマウス抗Ａモノクローナル抗体を使用し、一次バインダーとして抗マウスIgG＋IgMを使用して、赤血球を固相化した場合の顕微鏡写真。
【図３】バインダー物質としてマウス抗グリコフォリンモノクローナル抗体を使用し、一次バインダーとして抗マウスIgGを使用して、タンパク質存在下で赤血球を固相化した場合の顕微鏡写真。
【図４】一次バインダーを使用することなく、バインダー物質としてコムギ胚芽レクチンを使用し、赤血球を固相化した場合の顕微鏡写真。
【図５】一次バインダーを使用することなく、バインダー物質としてコムギ胚芽レクチンを使用し、タンパク質存在下で赤血球を固相化した場合の顕微鏡写真。
【図１】
2009014572.tif 000003
【図２】
2009014572.tif 000004
【図３】
2009014572.tif 000005
【図４】
2009014572.tif 000006
【図５】
2009014572.tif 000007