(57)【要約】      （修正有）【課題】トマト果実におけるアントシアニン蓄積の形質を判別し、アントシアニン産生トマトを効率よく判別できる方法を提供する。【解決手段】アントシアニン産生トマトＳｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ＬＡ１９９６とアントシアニン非産生トマトとを掛け合わせて得られる交配トマトのＡＮＴ１ゲノム遺伝子の配列を解析し、該解析結果に基づいてアントシアニン産生トマトであるか否かを判別する、アントシアニン産生トマトの判別方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トマトのＡＮＴ１ゲノムＤＮＡの塩基配列が、配列番号１３に示す塩基配列の、
位置２２に対応する位置の塩基としてa、
位置２９に対応する位置の塩基としてt、
位置３０に対応する位置の塩基としてg、
位置３３に対応する位置の塩基としてt、
位置１１０に対応する位置の塩基としてa、
位置２１９に対応する位置の塩基としてt、
位置２６３に対応する位置の塩基としてc、
位置３４４に対応する位置の塩基としてt、
位置４０９に対応する位置の塩基としてt、
位置４１７に対応する位置の塩基としてc、
位置４１９に対応する位置の塩基としてg、
位置４３９に対応する位置の塩基としてc、
位置４４４〜４４５に対応する位置の塩基としてtg、
位置４５７に対応する位置の塩基としてa、
位置４６８に対応する位置の塩基としてt、
位置４６９に対応する位置の塩基としてt、
位置４７３に対応する位置の塩基としてc、
位置４７６に対応する位置の塩基としてt、
位置７０４に対応する位置の塩基としてa、
位置７４５に対応する位置の塩基としてa、
位置８２６に対応する位置の塩基としてt、
位置８３４に対応する位置の塩基としてc、
位置８８８に対応する位置の塩基としてc、
位置８９２に対応する位置の塩基としてa、
位置９２０に対応する位置の塩基としてa、
位置９３３に対応する位置の塩基としてt、
位置９７２に対応する位置の塩基としてa、
位置１０１７に対応する位置の塩基としてa、
位置１１２２に対応する位置の塩基としてa、
位置１２１２に対応する位置の塩基としてa、
位置１２８７に対応する位置の塩基としてg、
位置１３３７に対応する位置の塩基としてa、
位置１３８０に対応する位置の塩基としてg、
位置１４２７に対応する位置の塩基としてt、
位置１４３４に対応する位置の塩基としてc、
位置１４６９に対応する位置の塩基としてc、
位置１４８９に対応する位置の塩基としてc、
位置１４９６に対応する位置の塩基としてt、
位置１４９８〜１５０９に対応する位置の塩基としてtatttctaga、
位置１５３２に対応する位置の塩基としてa、
位置１５８９に対応する位置の塩基としてa、および
位置１５９８に対応する位置の塩基としてt、
から選択される少なくとも１つを有する場合、該トマトをアントシアニン産生トマトであると判別する、アントシアニン産生トマトの判別方法。
【請求項２】
トマトのＡＮＴ１ゲノムＤＮＡの塩基配列が、配列番号１３または２に示す塩基配列である場合、該トマトをアントシアニン産生トマトであると判別する、アントシアニン産生トマトの判別方法。
【請求項３】
トマトのＡＮＴ１ゲノムＤＮＡを得ること、
得られたＡＮＴ１ゲノムＤＮＡをシークエンシングして塩基配列を得ること、および
得られたＡＮＴ１ＤＮＡの塩基配列と配列番号１３に示す塩基配列をアライメントすること、
を含む、請求項１または２に記載のトマトの判別方法。
【請求項４】
トマトのＡＮＴ１ゲノムＤＮＡを得ること、および
配列番号１３に示す塩基配列の、
位置２２の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置２９の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置３０の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置３３の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１１０の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置２１９の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置２６３の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置３４４の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４０９の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４１７の塩基がｃである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４１９の塩基がｇである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４３９の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４４４〜４４５の塩基がtgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４５７の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４６８の塩基がｔである塩基配列に特異的オリゴヌクレオチド、
位置４６９の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４７３の塩基がｃである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４７６の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置７０４の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置７４５の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８２６の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８３４の塩基がｃである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８８８の塩基がｃである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８９２の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置９２０の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置９３３の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置９７２の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１０１７の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１１２２の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１２１２の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１２８７の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１３３７の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１３８０の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４２７の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４３４の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４６９の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４８９の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４９８〜１５０９の塩基がatatttctagaaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１５３２の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１５８９の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、および
位置１５９８の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド
から選択される少なくとも１つを、プライマーとして用いて該トマトのＡＮＴ１ゲノムＤＮＡを増幅させること
を含む、請求項１または２に記載のトマトの判別方法。
【請求項５】
さらに、配列番号１３に示す塩基配列の、
位置２２の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置２９の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置３０の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置３３の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１１０の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置２１９の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置２６３の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置３４４の塩基がｃである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４０９の塩基がｃである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４１７の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４１９の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４３９の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４４４〜４４５の塩基がtttctgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４５７の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４６８の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４６９の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４７３の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４７６の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置７０４の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置７４５の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８２６の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８３４の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８８８の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８９２の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置９２０の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置９３３の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置９７２の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１０１７の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１１２２の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１２１２の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１２８７の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１３３７の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１３８０の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４２７の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４３４の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４６９の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４８９の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４９８〜１５０９の塩基がaaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１５３２の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１５８９の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、および
位置１５９８の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド
から選択される少なくとも１つを、
プライマーとして用いてトマトのＡＮＴ１ゲノムＤＮＡを増幅させること
を含む、請求項４に記載のトマトの判別方法。
【請求項６】
トマトが、Solanum lycopersicum LA1996とアントシアニン非産生トマトとを掛け合わせて得られる交配トマトである、請求項１〜５のいずれか1項に記載のトマトの判別方法。
【請求項７】
アントシアニン非産生トマトが、Solanum lycopersicum Micro-Tom、Solanum lycopersicum M82、Solanum lycopersicum Ailsa Craig、Solanum lycopersicum nv-1、Solanum lycopersicum IRB301、Solanum lycopersicum Small Fry、Solanum lycopersicum Money Maker、Solanum lycopersicum Manapal、Solanum lycopersicum LS89、Solanum lycopersicum E6203、Solanum lycopersicum LA4013、Solanum lycopersicum LA3810、Solanum lycopersicum LA3771、Solanum lycopersicum ハウス桃太郎、Solanum lycopersicum 桃太郎コルト、Solanum lycopersicum トゥインクル、Solanum lycopersicum フルーツイエロー、Solanum lycopersicum 麗容、Solanum lycopersicum オレンジキャロル、Solanum lycopersicum スイートミニオレンジ、Solanum lycopersicum ふりこま、Solanum lycopersicum 桃太郎ヨーク、Solanum lycopersicum イエローキャロル、Solanum lycopersicum おどりこ、Solanum lycopersicum サンロード、Solanum lycopersicum ルネッサンス、Solanum lycopersicum 麗夏、Solanum lycopersicum、Solanum lycopersicum ボンデローザ、Solanum lycopersicum スーパーサンチェリー、Solanum lycopersicum Evergreenである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号７、配列番号１１、配列番号１４〜９７の塩基配列のオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、トマトのアントシアニン産生判別用プライマー。
【請求項９】
請求項８に記載のプライマーと、配列番号６、配列番号１０、配列番号９８〜１８１の塩基配列のオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つを含むプライマーセット。
【請求項１０】
請求項８記載のプライマーまたは請求項９に記載のプライマーセットを含む、アントシアニン産生トマト判別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トマト果実におけるアントシアニン蓄積の形質を判別するためのＤＮＡマーカーに関する。また、本発明は、該ＤＮＡマーカーを用いたアントシアニン産生トマトの判別方法に関する。また、本発明は、該ＤＮＡマーカーを用いてアントシアニン産生トマトSolanum lycopersicum LA1996とアントシアニン非産生トマトとを掛け合わせて得られる交配トマトの果実におけるアントシアニン蓄積の形質を判別するための方法に関する。また、本発明は、該方法に用いられるプライマーやキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アントシアニンは、シダ植物以上の高等植物に広く分布して存在しているフラボノイド系の色素である。アントシアニンは、退色や変色しやすいものの、合成着色料に比べて安全性が高いことや自然な色合いを有することから、古くから種々の食品に着色料として利用されている。また、最近になって抗酸化能を示すことが見出され、単に食品の着色機能だけでなく、生体内酸化ストレスを防止する食品因子としても再評価されている。さらに、抗変異原性、血圧降下作用、肝機能障害軽減効果、視覚改善作用、抗糖尿病作用などの機能があることが明らかにされるにつれ、その健康維持機能や生活習慣病などの疾患改善機能などが注目されている色素である。
【０００３】
食用されているトマトはアントシアニンを生成しないものであるが、野生種の中にはアントシアニンを生成するものも存在する。そこで、機能性食品として有用なアントシアニンを生成する食用トマトを作製するために品種の掛けあわせが試みられている。しかしながら、得られるトマトがアントシアニン産生トマトであるかを判別するにはトマトの果実が生育するまで待たねばならず、早期にアントシアニン産生トマトを判別することのできる判別法の開発が望まれていた。
【０００４】
非特許文献１にはActivation Taggingによる、アントシアニン非産生トマト由来のＡＮＴ１遺伝子の単離が報告されており、ＡＮＴ１遺伝子はアントシアニン非産生トマトでは発現していないものの、強制発現させるとアントシアニンが蓄積することが開示されている。また、特許文献１にもＡＮＴ１遺伝子の単離と強制発現が開示されている。
【０００５】
しかしながら、植物におけるアントシアニン蓄積という形質とＡＮＴ１遺伝子との関係は明らかにされておらず、アントシアニン生産株を判別するためのマーカーはこれまで同定されていない。
【０００６】
【特許文献１】特表２００４−５１７６２１号公報
【非特許文献１】Plant Cell. 2003 Aug;15(8):1689-703.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、トマト果実におけるアントシアニン蓄積の形質を判別するためＤＮＡマーカーを提供することを課題とする。また、本発明は、該ＤＮＡマーカーを用いたアントシアニン産生トマトの判別方法を提供することを課題とする。また、本発明は、該ＤＮＡマーカーを用いてアントシアニン産生トマトとアントシアニン非産生トマトとを掛け合わせて得られる交配トマトがアントシアニン産生トマトであるか否かを効率よく判別できる方法を提供することを課題とする。また、該方法に用いるプライマーやキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、アントシアニン産生トマトとアントシアニン非産生トマトのＡＮＴ１遺伝子には塩基配列に違い、すなわち多型が存在すること、そして、トマトに、アントシアニン産生トマトのＡＮＴ１遺伝子が存在する場合は、トマト果実にアントシアニンが蓄積し、アントシアニン産生トマトのＡＮＴ１遺伝子が存在しない場合は、トマト果実にアントシアニンが蓄積しないことを見出した。
【０００９】
このことから、トマトがアントシアニン産生トマトのＡＮＴ１遺伝子を有するか否かを調べることによって、該トマトがアントシアニン生産トマトであるか否かを効率よく判別できることが明らかなり、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）トマトのＡＮＴ１ゲノムＤＮＡの塩基配列が、配列番号１３に示す塩基配列の、
位置２２に対応する位置の塩基としてa、
位置２９に対応する位置の塩基としてt、
位置３０に対応する位置の塩基としてg、
位置３３に対応する位置の塩基としてt、
位置１１０に対応する位置の塩基としてa、
位置２１９に対応する位置の塩基としてt、
位置２６３に対応する位置の塩基としてc、
位置３４４に対応する位置の塩基としてt、
位置４０９に対応する位置の塩基としてt、
位置４１７に対応する位置の塩基としてc、
位置４１９に対応する位置の塩基としてg、
位置４３９に対応する位置の塩基としてc、
位置４４４〜４４５に対応する位置の塩基としてtg、
位置４５７に対応する位置の塩基としてa、
位置４６８に対応する位置の塩基としてt、
位置４６９に対応する位置の塩基としてt、
位置４７３に対応する位置の塩基としてc、
位置４７６に対応する位置の塩基としてt、
位置７０４に対応する位置の塩基としてa、
位置７４５に対応する位置の塩基としてa、
位置８２６に対応する位置の塩基としてt、
位置８３４に対応する位置の塩基としてc、
位置８８８に対応する位置の塩基としてc、
位置８９２に対応する位置の塩基としてa、
位置９２０に対応する位置の塩基としてa、
位置９３３に対応する位置の塩基としてt、
位置９７２に対応する位置の塩基としてa、
位置１０１７に対応する位置の塩基としてa、
位置１１２２に対応する位置の塩基としてa、
位置１２１２に対応する位置の塩基としてa、
位置１２８７に対応する位置の塩基としてg、
位置１３３７に対応する位置の塩基としてa、
位置１３８０に対応する位置の塩基としてg、
位置１４２７に対応する位置の塩基としてt、
位置１４３４に対応する位置の塩基としてc、
位置１４６９に対応する位置の塩基としてc、
位置１４８９に対応する位置の塩基としてc、
位置１４９６に対応する位置の塩基としてt、
位置１４９８〜１５０９に対応する位置の塩基としてtatttctaga、
位置１５３２に対応する位置の塩基としてa、
位置１５８９に対応する位置の塩基としてa、および
位置１５９８に対応する位置の塩基としてt
から選択される少なくとも１つを有する場合、該トマトをアントシアニン産生トマトであると判別する、アントシアニン産生トマトの判別方法。
【００１１】
（２）トマトのＡＮＴ１ゲノムＤＮＡの塩基配列が、配列番号１３または２に示す塩基配列である場合、該トマトをアントシアニン産生トマトであると判別する、アントシアニン産生トマトの判別方法。
【００１２】
（３）トマトのＡＮＴ１ゲノムＤＮＡを得ること、
得られたＡＮＴ１ゲノムＤＮＡをシークエンシングして塩基配列を得ること、および
得られたＡＮＴ１ＤＮＡの塩基配列と配列番号１３に示す塩基配列をアライメントすること、
を含む、（１）または（２）に記載のトマトの判別方法。
【００１３】
（４）トマトのＡＮＴ１ゲノムＤＮＡを得ること、および
配列番号１３に示す塩基配列の、
位置２２の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置２９の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置３０の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置３３の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１１０の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置２１９の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置２６３の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置３４４の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４０９の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４１７の塩基がｃである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４１９の塩基がｇである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４３９の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４４４〜４４５の塩基がtgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４５７の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４６８の塩基がｔである塩基配列に特異的オリゴヌクレオチド、
位置４６９の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４７３の塩基がｃである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４７６の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置７０４の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置７４５の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８２６の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８３４の塩基がｃである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８８８の塩基がｃである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８９２の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置９２０の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置９３３の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置９７２の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１０１７の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１１２２の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１２１２の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１２８７の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１３３７の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１３８０の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４２７の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４３４の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４６９の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４８９の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４９８〜１５０９の塩基がatatttctagaaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１５３２の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１５８９の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、および
位置１５９８の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
から選択される少なくとも１つを、プライマーとして用いて該トマトのＡＮＴ１ゲノムＤＮＡを増幅させること
を含む、（１）または（２）に記載のトマトの判別方法。
【００１４】
（５）さらに、配列番号１３に示す塩基配列の、
位置２２の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置２９の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置３０の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置３３の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１１０の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置２１９の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置２６３の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置３４４の塩基がｃである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４０９の塩基がｃである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４１７の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４１９の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４３９の塩基がｔである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４４４〜４４５の塩基がtttctgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４５７の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４６８の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４６９の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４７３の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置４７６の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置７０４の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置７４５の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８２６の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８３４の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８８８の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置８９２の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置９２０の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置９３３の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置９７２の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１０１７の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１１２２の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１２１２の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１２８７の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１３３７の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１３８０の塩基がaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４２７の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４３４の塩基がtである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４６９の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４８９の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１４９８〜１５０９の塩基がaaである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１５３２の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、
位置１５８９の塩基がgである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド、および
位置１５９８の塩基がcである塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド
から選択される少なくとも１つを、
プライマーとして用いてトマトのＡＮＴ１ＤＮＡを増幅させること
を含む、（４）に記載のトマトの判別方法。
【００１５】
（６）トマトが、Solanum lycopersicum LA1996とアントシアニン非産生トマトとを掛け合わせて得られる交配トマトである、（１）〜（５）のいずれか1つに記載のトマトの判別方法。
【００１６】
（７）アントシアニン非産生トマトが、Solanum lycopersicum Micro-Tom、Solanum lycopersicum M82、Solanum lycopersicum Ailsa Craig、Solanum lycopersicum nv-1、Solanum lycopersicum IRB301、Solanum lycopersicum Small Fry、Solanum lycopersicum Money Maker、Solanum lycopersicum Manapal、Solanum lycopersicum LS89、Solanum lycopersicum E6203、Solanum lycopersicum LA4013、Solanum lycopersicum LA3810、Solanum lycopersicum LA3771、Solanum lycopersicum ハウス桃太郎、Solanum lycopersicum 桃太郎コルト、Solanum lycopersicum トゥインクル、Solanum lycopersicum フルーツイエロー、Solanum lycopersicum 麗容、Solanum lycopersicum オレンジキャロル、Solanum lycopersicum スイートミニオレンジ、Solanum lycopersicum ふりこま、Solanum lycopersicum 桃太郎ヨーク、Solanum lycopersicum イエローキャロル、Solanum lycopersicum おどりこ、Solanum lycopersicum サンロード、Solanum lycopersicum ルネッサンス、Solanum lycopersicum 麗夏、Solanum lycopersicum、Solanum lycopersicum ボンデローザ、Solanum lycopersicum スーパーサンチェリー、Solanum lycopersicum Evergreenである、（６）に記載の方法。
【００１７】
（８）配列番号７、配列番号１１、配列番号１４〜９７の塩基配列のオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つの、トマトのアントシアニン産生判別用プライマー。
【００１８】
（９）（８）に記載のプライマーと、配列番号６、配列番号１０、配列番号９８〜１８１の塩基配列のオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つを含むプライマーセット。
【００１９】
（１０）（８）記載のプライマーまたは（９）に記載のプライマーセットを含む、アントシアニン産生トマト判別用キット。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の方法によれば、トマトがアントシアニン生産トマトであるか否かを効率よく正確に判別できる。特に、アントシアニン産生トマトとアントシアニン非産生トマトとを掛け合わせて得られる交配トマトがアントシアニン生産トマトであるか否かを効率よく正確に判別できる。また、苗の段階で選別できるため、アントシアニン生産株を選択的に育成して効率的に機能性トマトを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の方法は、トマトのＡＮＴ１ゲノム遺伝子の配列を解析し、該解析結果に基づいてアントシアニン産生トマトであるか否かを判別することを特徴とする。また本発明は、アントシアニン産生トマトSolanum lycopersicum LA1996とアントシアニン非産生トマトとを掛け合わせて得られる交配トマトのＡＮＴ１ゲノム遺伝子の配列を解析し、該解析結果に基づいてアントシアニン産生トマトであるか否かを判別することを特徴とする、アントシアニン産生トマトの判別方法である。
【００２２】
ＡＮＴ１遺伝子とは、myb転写調節因子のひとつであるＡＮＴ１転写調節因子（anthocyanin 1）をコードする遺伝子を意味する。例えば、トマトのＡＮＴ１遺伝子のｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡデータベースGenBankにaccession no AY348870として登録されている。アミノ酸配列は、AAQ55181として登録されている。
【００２３】
また、Solanum lycopersicum LA1996のＡＮＴ１転写調節因子のアミノ酸配列は、以下の配列番号１８２の配列である。
MNSTSMSSLGVRKGSWTDEEDFLLRKCIDKYGEGKWHLVPIRAGLNRCRKSCRLRWLNYLRPHIKRGDFEQDEVDLILRLHKLLGNRWSLIAGRLPGRTANDVKNYWNTNLLRKLNTTKIVPREKTNNKCGEISTKIEIIKPQPRKYFSSTMKNITNNIVILDEEEHCKEIKSEKQTPDASMDNVDQWWINLLENCNDDIEEDEEVVINYEKTLTSLLHEEKSPPLNIGEGNSMQQGQISHENWGEFSLNLQPMQQGVQNDDFSAEIDLWNLLD（配列番号１８２）
【００２４】
ＡＮＴ１遺伝子には、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）およびゲノム（染色体）ＤＮＡが含まれる。好ましくは、ゲノム（染色体）ＤＮＡである。
【００２５】
ＡＮＴ１遺伝子が、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）に由来する場合、ＡＮＴ１遺伝子には、ＡＮＴ１転写調節因子たんぱく質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、５’−非翻訳領域、終止コドンとポリＡテイルなどが含まれる３’−非翻訳領域が含まれる。ｍＲＮＡに由来する場合のＡＮＴ１遺伝子は、オープンリーディングフレーム、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のすべてであっても、その一部であっても良い。
【００２６】
また、ＡＮＴ１遺伝子が、ゲノム（染色体）に由来する場合、ＡＮＴ１ゲノムＤＮＡ（またはＡＮＴ１ゲノム遺伝子）と呼び、ＡＮＴ１ゲノムＤＮＡには、３つのエクソン、２つのイントロン、プロモーター領域などが含まれる５’−非翻訳領域、終止コドンとポリアデニレーションシグナル配列などが含まれる３’−非翻訳領域が含まれる。ここで、５’−非翻訳領域とは、翻訳開始コドンの上流約１ｋｂの領域を意味し、３’−非翻訳領域は、終止コドンの下流約１ｋｂの領域を意味する。ＡＮＴ１ゲノムＤＮＡは、エクソン、イントロン、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のすべてであっても、その一部であっても良い。
【００２７】
トマトには、Solanum lycopersicum、およびSolanum lycopersicumと交配可能な近縁野生種が含まれる。ここで、Solanum lycopersicumと交配可能な近縁野生種とは、例えばSolanum cheesmaniae、Solanum chilense、Solanum chmielewskii、Solanum galapagense、Solanum habrochaites、Solanum juglandifolium、Solanum lycopersicoides、Solanum neorickii、Solanum ochranthum、Solanum pennellii、Solanum peruvianum、Solanum pimpinellifolium、Solanum sitiensなどが挙げられる。好ましくはSolanum lycopersicumまたはSolanum chilenseを意味する。特に好ましいトマトは、アントシアニン産生トマトSolanum lycopersicum LA1996とアントシアニン非産生トマトとを掛け合わせて得られる交配トマトである。
【００２８】
交配トマトとは、アントシアニン産生トマトSolanum lycopersicum LA1996とアントシアニン非産生トマトとを花粉を用いて自然交配させて得られたトマト（Ｆ１世代）およびその子孫（Ｆ２世代以降）を意味する。
【００２９】
子孫（Ｆ２世代以降）とは、Ｆ２世代を含むＦ２世代より後の世代を意味し、アントシアニン産生トマトSolanum lycopersicum LA1996とアントシアニン非産生トマトを先祖とする子孫であれば限定されない。
【００３０】
本発明においてアントシアニン産生トマトSolanum lycopersicum LA1996とは、アントシアニンをトマトの果実に蓄積するトマトSolanum lycopersicum LA1996を意味する。アントシアニン産生トマトSolanum lycopersicum LA1996は、Tomato Genetics Resource Center (TGRC)（http://tgrc.ucdavis.edu/）から入手できる。
【００３１】
Solanum lycopersicum LA1996とは、Solanum lycopersicum とSolanum chilenseとの交配によりアントシアニン生産能が付与されたトマトであり、ＡＮＴ１ゲノム遺伝子として、配列番号２および１３の塩基配列を有するトマトである。配列番号１３の塩基配列は、ＡＮＴ１転写調節因子全体をカバーしており、３つのエクソン、２つのイントロン、５’−非翻訳領域、および３’−非翻訳領域を含む配列である（図２）。配列番号２の塩基配列は、プライマーＡＮＴ１ Ｆ２（配列番号４）とＡＮＴ１  Ｒ２（配列番号５）で増幅されたＡＮＴ１ゲノム遺伝子断片であり、エクソン１の一部、イントロン１、エクソン２、イントロン２、エクソン３の一部からなる配列である。プライマーＡＮＴ１  Ｆ２（配列番号４）とＡＮＴ１  Ｒ２（配列番号５）の位置は図２において示されている。
【００３２】
アントシアニン非産生トマトとは、アントシアニンをトマトの果実に蓄積しないトマトを意味する。アントシアニン非産生トマトは、アントシアニンをトマトの果実に蓄積しないトマトであれば限定されないが、例えば、Solanum lycopersicum Micro-Tom、Solanum lycopersicum M82、Solanum lycopersicum Ailsa Craig、Solanum lycopersicum nv-1、Solanum lycopersicum IRB301、Solanum lycopersicum Small Fry、Solanum lycopersicum Money Maker、Solanum lycopersicum Manapal、Solanum lycopersicum LS89、Solanum lycopersicum E6203、Solanum lycopersicum LA4013、Solanum lycopersicum LA3810、Solanum lycopersicum LA3771、Solanum lycopersicum ハウス桃太郎、Solanum lycopersicum 桃太郎コルト、Solanum lycopersicum トゥインクル、Solanum lycopersicum フルーツイエロー、Solanum lycopersicum 麗容、Solanum lycopersicum オレンジキャロル、Solanum lycopersicum スイートミニオレンジ、Solanum lycopersicum ふりこま、Solanum lycopersicum 桃太郎ヨーク、Solanum lycopersicum イエローキャロル、Solanum lycopersicum おどりこ、Solanum lycopersicum サンロード、Solanum lycopersicum ルネッサンス、Solanum lycopersicum 麗夏、Solanum lycopersicum、Solanum lycopersicum ボンデローザ、Solanum lycopersicum スーパーサンチェリー、Solanum lycopersicum Evergreenなどが挙げられる。好ましくは、Solanum lycopersicum Micro-Tom、Solanum lycopersicum M82、Solanum lycopersicum Ailsa Craig、Solanum lycopersicum nv-1、Solanum lycopersicum IRB301、Solanum lycopersicum Small Fry、Solanum lycopersicum Money Maker、Solanum lycopersicum Manapal、Solanum lycopersicum LS89、Solanum lycopersicum E6203、Solanum lycopersicum LA4013、Solanum lycopersicum LA3810、Solanum lycopersicum LA3771、Solanum lycopersicum ハウス桃太郎、Solanum lycopersicum 桃太郎コルト、Solanum lycopersicum トゥインクル、Solanum lycopersicum フルーツイエロー、Solanum lycopersicum 麗容、Solanum lycopersicum オレンジキャロル、Solanum lycopersicum スイートミニオレンジ、Solanum lycopersicum ふりこまであり、より好ましくは、Solanum lycopersicum Micro-Tomである。
これらのアントシアニン非産生トマトは、Tomato Genetics Resource Center (TGRC)（http://tgrc.ucdavis.edu/）、タキイ種苗（http://www.takii.co.jp/index.html）、日本デルモンテ（http://www.delmonte.co.jp/index.html）、サカタのタネ、（http://www.sakataseed.co.jp/index.html）、カネコ種苗、（http://www.kanekoseeds.jp/）野菜・茶業試験場（現：独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  野菜茶業研究所）、（http://www.vegetea.affrc.go.jp/）から入手できる。
【００３３】
Solanum lycopersicum Micro-Tomは、ＡＮＴ１ゲノム遺伝子として、配列番号１および１８の塩基配列を有するトマトである。配列番号１２の塩基配列は、ＡＮＴ１転写調節因子全体をカバーしており、３つのエクソン、２つのイントロン、５’−非翻訳領域、および３’−非翻訳領域を含む配列である（図２）。配列番号１の塩基配列は、プライマーＡＮＴ１  Ｆ２（配列番号４）とＡＮＴ１  Ｒ２（配列番号５）で増幅されたＡＮＴ１ゲノム遺伝子断片であり、エクソン１の一部、イントロン１、エクソン２、イントロン２、エクソン３の一部からなる配列である。プライマーＡＮＴ１  Ｆ２（配列番号４）とＡＮＴ１  Ｒ２（配列番号５）の位置は図２において示されている。
【００３４】
Solanum lycopersicum M82は、ＡＮＴ１ゲノム遺伝子として、配列番号３の塩基配列を有するトマトである。配列番号３の塩基配列は、プライマーＡＮＴ１＿１２Ｆ（配列番号８）とＡＮＴ１＿９９２Ｒ（配列番号９）で増幅されたＡＮＴ１遺伝子断片であり、エクソン１の一部、イントロン１、エクソン２、イントロン２、エクソン３の一部からなる配列である。プライマーＡＮＴ１＿１２Ｆ（配列番号８）とＡＮＴ１＿９９２Ｒ（配列番号９）の位置は図２で示されている。
【００３５】
本発明においてアントシアニン（anthocyanin）とは、抗酸化物質として知られるポリフェノールの一種で、アントシアニジン（anthocyanidin）をアグリコンとする配糖体のことを意味する。トマトのアントシアニンとは、アントシアニジンとしてペチュニジン（petunidin）、マルビジン（malvidin）またはデルフィニジン（delphinidin）をアグリコンにする配糖体を意味し、好ましくは、ペチュニジン（petunidin）、マルビジン（malvidin）およびデルフィニジン（delphinidin）の3-(p-coumaryl-rutinoside)-5-glucosideを意味する（C. M. Jones, P. Mes, and J. R. Myers, Jounal of Heredity 2003: 94(6):449-456）。
【００３６】
本発明においては、ＡＮＴ１遺伝子の多型とアントシアニン産生形質が連鎖することを見出したので、ＡＮＴ１遺伝子の配列の違い（例えば、図２、５参照）に基づいてトマトがアントシアニン産生形質を有するか否かを判別できる。
【００３７】
すなわち、解析対象のトマトのＡＮＴ１遺伝子の配列が親であるアントシアニン産生トマトのＡＮＴ１遺伝子の配列と一致する場合、そのトマトはアントシアニンを産生する。ここで、一致とは、トマトが、アントシアニン産生トマトのＡＮＴ１遺伝子をホモまたはヘテロ接合型で有することを意味し、一致しないとは、トマトが、アントシアニン非産生トマトのＡＮＴ１遺伝子をホモ接合型で有することを意味する。
【００３８】
好ましい、アントシアニン産生トマトのＡＮＴ１遺伝子は、配列番号２または１３に示す塩基配列からなるSolanum lycopersicum LA1996のＡＮＴ１ゲノム遺伝子である。
【００３９】
したがって、トマトが配列番号１３または２に示す塩基配列からなるＡＮＴ１ゲノムＤＮＡを有する場合、すなわち該トマトのＡＮＴ１ゲノム遺伝子の配列が、配列番号２または１３に示す塩基配列と一致する場合、該トマトはアントシアニン産生トマトであると判別することができる。
【００４０】
トマトのＡＮＴ１ゲノム遺伝子の配列が、配列番号２または１３に示す塩基配列と一致するか否かは、トマトからＡＮＴ１ゲノム遺伝子を単離し、シークエンシングを行い、塩基配列を決定し、配列番号２または１３に示す塩基配列とアライメントを行うことで判別することができる。これらトマトからＡＮＴ１ゲノム遺伝子の単離方法、シークエンシング方法、アライメント方法は、すべて当業者に周知な方法である（J. Sambrook and D. W. Russell, 2001, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。
【００４１】
例えば、トマトからＡＮＴ１ゲノム遺伝子の単離は、配列番号２または１３に示す塩基配列に基づいて設計したプライマーとトマトから単離されたゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲなどの遺伝子増幅により得ることが出来る。シークエンシングは、市販のシークエンシングキットや自動シークエンサーを用いて行うことができる。アライメントは、インターネット上で無料で利用できるコンピューターソフトウェアーCLUSTALW（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）や遺伝子情報処理ソフトウェアーGENETYX（ゼネティクス社製）を用いて行うことができる。なお、塩基配列のアライメントとは、複数の配列の位置をあわせることを意味する。
【００４２】
トマトが配列番号２または１３からなるＡＮＴ１ゲノム遺伝子を有するか否かは、配列番号２または１３のすべての塩基配列を決定しなくとも、表１に示す位置のＡＮＴ１ゲノム遺伝子の塩基の型（ＳＮＰ）を決定することにより判別することができる。
【００４３】
表１は、アントシアニン産生トマトSolanum lycopersicum LA1996（配列番号１３）とアントシアニン非産生トマトSolanum lycopersicum Micro-Tom（配列番号１２）、M82（配列番号３）、nv-1、IRB301、Small Fry、ハウス桃太郎、桃太郎コルト、麗容、トゥインクル、フルーツイエロー、オレンジキャロル、スイートミニオレンジ、ふりこま、Ailsa Craig、Money Maker、Manapal、LS89、E6203、LA4013、LA3810、LA3771間でのＡＮＴ１ゲノム遺伝子の塩基配列の異なる箇所を、配列番号１３の塩基配列の位置に基づいて示したものである。
【００４４】
【表１】
2009055855.tif 000002
【００４５】
例えば、得られたトマトのＡＮＴ１ゲノム遺伝子の塩基配列が、配列番号１３に示すLA1996のＡＮＴ１遺伝子の塩基配列の位置４０９に対応する位置の塩基としてtを有する場合は、トマトのＡＮＴ１ゲノム遺伝子は、アントシアニン産生トマトLA1996のＡＮＴ１ゲノム遺伝子を有し、このトマトはアントシアニン産生トマトであると判別できる。
【００４６】
なお、本発明における塩基がtの場合とは、ＡＮＴ１遺伝子の対立遺伝子の型がt/tのホモ接合型またはt/cのヘテロ接合型であることを意味し、塩基がcの場合とは、対立遺伝子の型がc/cのホモ接合型であることを意味する。
【００４７】
すなわち、この表１に示された少なくとも１つの位置の、トマトの塩基の型を知ることで、トマトが、アントシアニン産生トマトSolanum lycopersicum LA1996のＡＮＴ１ゲノム遺伝子を有し、アントシアニン産生トマトであるか否かを判別できる。
【００４８】
表１に示した位置における塩基の型（ＳＮＰ）を知る方法には、例えば、先に記載したようにトマトから単離されたＡＮＴ１ゲノムＤＮＡを用い、配列解読（シークエンシング）を行う方法、表１に示した位置における塩基の型（ＳＮＰ）に特異的なプローブを用意し、ＤＮＡチップなどを用いてトマトから単離されたゲノムＤＮＡまたはＡＮＴ１ゲノムＤＮＡとハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーションの有無によって解析する方法、または表１に示した位置における塩基の型（ＳＮＰ）に特異的なプライマーとトマトから単離されたゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを行い増幅の有無によって解析する方法が例示される。
【００４９】
配列解読（シークエンシング）を行う方法では、例えば、トマトから単離されたゲノムＤＮＡと実施例で示すＡＮＴ１Ｆ２プライマーとＡＮＴ１Ｒ２プライマーを用いてＰＣＲ等によりトマトのＡＮＴ１遺伝子の増幅を行う。なお、シークエンシングに用いるＤＮＡ断片の長さや増幅に用いるプライマーは、配列を決定しようとする表１に示した位置によって、当業者は任意に設定できる。
【００５０】
増幅されたＤＮＡのシークエンシングを行い、塩基配列を決定する。決定された塩基配列と、配列番号１３または２に示す塩基配列とアライメントを行う。場合によっては、Micro-Tomの配列番号１８に示す塩基配列ともアライメントを行ってもよい。アライメントの結果、表１に示す位置のすくなくとも１つにおいて、トマトの塩基配列中にLA1996の塩基の型が認められたならば、トマトはアントシアニン産生トマトであると判別する。
【００５１】
また、上記表１に示した位置における塩基の型（ＳＮＰ）に特異的プライマーを用いたＡＮＴ１遺伝子の増幅の有無によって、トマトが、アントシアニン産生トマトであるか否かを判別してもよい。
【００５２】
判別するためのプライマーとしては、上記表１に示した位置におけるSolanum lycopersicum LA1996のＡＮＴ１ゲノム遺伝子の塩基の型（ＳＮＰ）に特異的プライマー、場合によりアントシアニン非産生トマト由来のＡＮＴ１遺伝子に特異的プライマーを設計する。
【００５３】
例えば、Solanum lycopersicum LA1996特異的プライマーとしては、表２−１のように、配列番号１３の塩基配列に基づいて、オリゴヌクレオチドの３’末端に上記表１に示したLA1996の塩基の型（ＳＮＰ）を含む１５merのオリゴヌクレオチドを設計することができる。一方、アントシアニン非産生トマト特異的プライマーも、表２−２のように、オリゴヌクレオチドの３’末端に上記表１に示したMicro-Tomの塩基の型（ＳＮＰ）を含む１５merのオリゴヌクレオチドを、配列番号１２の塩基配列に基づいて設計することができる。
【００５４】
【表２−１】
2009055855.tif 000003
【００５５】
【表２−２】
2009055855.tif 000004
【００５６】
表２−１に示すLA1996に特異的オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目の塩基は、非特異的増幅を減らすために、わざと配列番号１３に示される塩基以外の塩基を選択している。また、これは、表２−２に示すアントシアニン非産生トマトに特異的オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目の塩基は、非特異的増幅を減らすために、わざと配列番号１２に示される塩基以外の塩基を選択している。これは、３’末端から２番目の代わりに、３’末端から３番目の塩基においてなされても良い。また、表２（表２−１と表２−２）に示す特異的オリゴヌクレオチドは、さらに５’側に任意の１〜４０塩基が付加されてもよい。
【００５７】
フォワードプライマーとリバースプライマーのいずれか一方が表２に示す特異的プライマーであればよく、特異的プライマーとともに使用するプライマー（対プライマー）は、Solanum lycopersicum LA1996のＡＮＴ１ゲノム遺伝子とアントシアニン非産生トマトMicro-TomおよびM82のＡＮＴ１ゲノム遺伝子間で共通する塩基配列を有する領域に設定してもよい。
【００５８】
例えば、表１における位置７４５の塩基の型を、LA1996のＡＮＴ１ゲノム遺伝子の特異的増幅で判別しようとするならば、表１に示す位置７４５のLA1996の塩基aに対応する
配列番号７：5'-gtcacttatt gctggtagac ttcda-3'
の配列からなるオリゴヌクレオチドをLA1996特異的プライマーとして用いることができる。なお、dはa（アデニン）、g（グアニン）、t（チミン）を表す。dの位置は、配列番号１３に示す塩基配列に基づけば、c（シトシン）となるが、非特異的増幅を減らすために、わざとシトシン以外の塩基を選択している。配列番号７のオリゴヌクレオチドは、表２に示す配列番号３３のオリゴヌクレオチドの５’側が、配列番号１３に示す塩基配列に基づいて１０mer長くなっている。
【００５９】
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとして、具体的には実施例で示す配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００６０】
また、表１における位置４０９の塩基の型をアントシアニン非産生トマトのＡＮＴ１ゲノム遺伝子の特異的増幅で判別しようとするならば、特異的プライマーとしては、表１に示す位置４０９のアントシアニン非産生トマトの塩基cに対応する
配列番号６：5'-ataaaaataa cgtgatagtt aatttaatbg-3'
の配列からなるオリゴヌクレオチドをアントシアニン非産生トマト特異的プライマーとして用いることができる。なお、bはg（グアニン）、c（シトシン）、t（チミン）を表す。また、ｂの位置は、配列番号１２に示す塩基配列に基づけば、a（アデニン）となるが、非特異的増幅を減らすために、わざとアデニン以外の塩基を選択している。配列番号６のオリゴヌクレオチドは、表２に示す配列番号１４８のオリゴヌクレオチドの５’側が、配列番号１２に示す塩基配列に基づいて１５mer長くなっている。
【００６１】
配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとして具体的には実施例で示す配列番号１０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００６２】
特異的プライマーを用いたＡＮＴ１遺伝子の増幅の有無によるアントシアニン産生トマトであるか否かの判別は、次のように行うことができる。
【００６３】
例えば、配列番号７のLA1996特異的プライマーと対プライマー、およびトマトのゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いて遺伝子増幅を行い、予定の長さのＤＮＡが増幅されたとき、そのトマトのＡＮＴ１ゲノム遺伝子は、LA1996のＡＮＴ１ゲノム遺伝子であると判断できるので、そのトマトはアントシアニン産生トマトであると判別することができる。このとき、例えば、配列番号６のアントシアニン非産生トマト特異的プライマーと対プライマーで同様に遺伝子増幅を行い、遺伝子増幅を確認しておくことが好ましい。配列番号６のアントシアニン非産生トマト特異的プライマーと対プライマーで、予定の長さのＤＮＡが増幅されなかったときは、そのトマトは、LA1996のＡＮＴ１ゲノム遺伝子をホモ接合体で有していることを意味しており、逆に、配列番号６のアントシアニン非産生トマト特異的プライマーと対プライマーで、予定の長さのＤＮＡが増幅されたときは、そのトマトは、LA1996とアントシアニン非産生トマトのＡＮＴ１ゲノム遺伝子をヘテロ接合体で有していることを意味している。
【００６４】
逆に、配列番号７のLA1996特異的プライマーと対プライマーでは、予定の長さのＤＮＡが増幅されないときには、そのトマトのＡＮＴ１ゲノム遺伝子は、LA1996のＡＮＴ１ゲノム遺伝子ではないと判断できるので、そのトマトはアントシアニン産生トマトではないと判別することができる。このとき、例えば、配列番号６のアントシアニン非産生トマト特異的プライマーと対プライマーで同様に遺伝子増幅を行い、予定の長さのＤＮＡが増幅され、そのトマトが、アントシアニン非産生トマトのＡＮＴ１ゲノム遺伝子をホモ接合体で有していることを確認しておくことが好ましい。
【００６５】
特異的プライマーとともに使用する対プライマーは、ＡＮＴ１ゲノム遺伝子上に設定され（センス鎖、アンチセンス鎖いずれでもよい）、特異的プライマーと同時に使用したときにＡＮＴ１ゲノム遺伝子断片を増幅できるものであれば特に制限されないが、LA1996特異的プライマーで増幅されるＤＮＡとアントシアニン非産生トマト特異的プライマーで増幅されるＤＮＡが、電気泳動上で分離されたとき、区別できる程度に長さが異なるように対プライマーは設計されることが好ましい。例えば、実施例で示す配列番号４または５の塩基配列を有するプライマーなどが挙げられる。
【００６６】
特異的プライマーを用いたＡＮＴ１遺伝子の増幅の有無によるアントシアニン産生トマトであるか否かの判別は、トマトがLA1996とアントシアニン非産生トマトとを掛け合わせて得られる交配トマトである場合が好ましい。
【００６７】
本発明のキットは、上記プライマーを含む、アントシアニン産生トマト判別用キットである。本発明のキットはさらに、ＰＣＲ用試薬を含むものであってもよい。
【実施例】
【００６８】
通常のトマト品種（Solanum lycopersicum）は果実にアントシアニンを蓄積しないが、近縁の野生種には果実にアントシアニンを蓄積するものがある。トマト系統LA1996（注）は、野生種Solanum chilenseとSolanum lycopersicumを交配して作られた系統で、果実にアントシアニンを蓄積する。野生種でアントシアニン蓄積が生ずる原因として、栽培種トマトでは機能が失われている、もしくは栽培種トマトでは存在しないアントシアニン合成関連の遺伝子を野生種が保有していることが考えられる。アントシアニン合成には多数の遺伝子が関わっているが、いくつかの候補と考えられる遺伝子の中から、myb転写調節因子のひとつであるＡＮＴ１遺伝子を選び、LA1996とトマト品種Micro-TomからＡＮＴ１遺伝子配列の一部を単離し、両者の間のＤＮＡ多型を調べた。
（注）LAとそれに続く数字は、Tomato Genetics Resource Center (TGRC)で付けられた系統名である。
【００６９】
１．ゲノムＤＮＡの抽出
LA1996とMicro-Tomの葉を、それぞれ凍結条件下で粉砕した。すなわち、約３００mgの葉とジルコニアボールを１．５ml容量のプラスチックチューブに入れ、−８０℃の冷凍庫中で凍結し、多検体細胞破砕装置「ShakeMaster」（バイオメディカルサイエンス社製）で粉砕した。粉末に６００μlの２％ＣＴＡＢ液（２％w/w  臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、０．１Ｍ  トリスバッファー、２０mM  ＥＤＴＡ、１．４Ｍ  塩化ナトリウム）と６μlの２−メルカプトエタノールを加えて混合し、５６℃で１０分間インキュベートした。その後、６００μlのクロロホルム−イソアミルアルコールを加えて混合し、さらに、２２℃で、２００００ｇ、１０分間の遠心分離を行った。上層を新しいチューブに移し、６００μlのイソプロパノールを加え、混合した。室温で５分間放置した後、２２℃で、２００００ｇ、１０分間の遠心分離を行い、ＤＮＡの沈殿を得た。沈殿は、７０％エタノールで洗浄した後、５０μlのＴＥバッファー（１０μg／mlのＲＮａｓｅ  Ａを含む）に溶解し、ＰＣＲ反応時の鋳型ＤＮＡとした。
【００７０】
２．ＡＮＴ１ゲノム遺伝子配列の一部を増幅するためのＰＣＲプライマーの設計
ＤＮＡデータベース「GenBank」から、Solanum lycopersicum（Micro-Tom）のＡＮＴ１ ｍＲＮＡの配列GenBank accession AY348870 を得、その配列を元にＡＮＴ１ゲノム遺伝子配列の一部を増幅するためのＰＣＲプライマーを設計した。設計したプライマーは、
ＡＮＴ１  Ｆ２：5'-TTCATTGGGAGTGAGAAAAGGTTC-3'（配列番号４）、
ＡＮＴ１  Ｒ２：5'-CATTGTGCTTGAGAAATACTTGCG-3'（配列番号５）である。
ＡＮＴ１  Ｆ２とＡＮＴ１  Ｒ２のゲノム上における位置を図２に示す。
【００７１】
３．ＡＮＴ１ゲノム遺伝子の一部の塩基配列の決定
Micro-TomとLA1996のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーＡＮＴ１  Ｆ２とＡＮＴ１  Ｒ２を用いてＰＣＲを行った。反応溶液は、１０ng／μlに調製した鋳型ＤＮＡ５μl、３μＭプライマー各５μl、１０×ＰＣＲバッファー５μl、２．５mM  ｄＮＴＰｓ  ４μl、ＤＮＡポリメラーゼとして５Ｕ／μl  TaKaRa Ex Taq HS（タカラバイオ社製）０．２５μl、および滅菌蒸留水２８．２５μlを混合したものとした。反応温度条件は、９５℃２分間の熱変性後、９５℃３０秒間・５５℃３０秒間・７２℃２分３０秒間を３５サイクル繰り返し、７２℃１０分間の伸長反応を行うものとした。ＰＣＲ産物のうち２μlをアガロース電気泳動に用い、産物の有無とおおよそのＤＮＡ断片長を測定した（図１）。その結果、Micro-TomとLA1996から、約６５０bpの一本の明確なＰＣＲ産物を得られたことを確認した。残りのＰＣＲ産物は、NucleoSpin Extract II（MACHEREY-NAGEL社製）を用いて精製した。シーケンス反応は、精製したＰＣＲの増幅産物を鋳型にし、ＰＣＲに使用したプライマーとBigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用い、キットのプロトコールに従って行った。シーケンス反応産物を用い、ＤＮＡシーケンサーABI3110（アプライドバイオシステムズジャパン社製）によって塩基配列を決定した。決定されたMicro-TomのＡＮＴ１ゲノム遺伝子の一部配列が、配列番号１：
5'-
gatgaagaag attttcttct aagaaaatgt attgataagt atggtgaagg aaaatggcat     60
cttgttccca taagagctgg taactattaa attaactatc acgttatttt tatttgtctt    120
tctgtctcat tttatttgac gttattacga atatcatctg aaaatgtacg tgcaggtctg    180
aatagatgtc ggaaaagttg tagattgagg tggctgaatt atctaaggcc acatatcaag    240
agaggtgact ttgaacaaga tgaagtggat ctcattttga ggcttcataa gctcttaggc    300
aacaggcatg caagtttatg ttttgacaaa atttgattag tatatattat atatacgtgt    360
gactatttca tctaaatgtt acgttatttt acgtagatgg tcacttattg ctggtagact    420
tcccggaagg acagctaacg atgtgaaaaa ctattggaac actaatcttc taaggaagtt    480
aaatactact aaaattgttc ctcgcgaaaa gattaacaat aagtgtggag aaattagtac    540
taagattgaa attataaaac ctcaacgacg caagtatttc tcaagcacaa tgaagaatgt    600
tacaaacaat aatgtaattt tggacgagga ggaacattgc aaggaaataa taagtgagaa    660
acaaactcca gatgcatcga tggacaacgt agatccatgg tggataaatt tactggaaaa    720
ttgcaatgac gatattgaag aagatgaaga ggttgtaatt aattatgaaa aaacactaac    780
aagtttgtta catgaagaaa tatcaccacc attaaatatt ggtgaaggta actccatgca    840
acaaggacaa ataagtcatg aaaattgggg tgaattttct cttaatttac cacccatgca    900
acaa                                                                 904
-3'
に示す配列であり、決定されたLA1996のＡＮＴ１ゲノム遺伝子の一部配列が、配列番号２：
5'-
gatgaagaag attttctttt aagaaaatgt attgataagt atggtgaagg aaaatggcat     60
cttgttccca taagagctgg taattattaa actgactatc acgttatttt tatctgtctg    120
tctcatttta tatgacgtta ttttgaacat tatctgaaaa tgtacgtgca ggtctgaata    180
gatgtcggaa aagttgtaga ttgaggtggc tgaattatct aaggccacat atcaagagag    240
gtgactttga acaagatgaa gtggatctca ttttgaggct tcataagctc ttaggcaaca    300
ggcatgcaag tttatgtttt gacaaaattt gattagtata tattatatat acgtgtgact    360
atttcatcta aatgttacat tattttacgt agatggtcac ttattgctgg tagacttcca    420
ggaaggacag ctaacgatgt gaaaaactat tggaacacta atcttctaag gaagttaaat    480
actactaaaa ttgttcctcg tgaaaagact aacaataagt gtggagaaat tagtactaag    540
attgaaatta taaaacctca accacgaaag tatttctcaa gcacaatgaa gaatattaca    600
aacaatattg taattttgga cgaggaggaa cattgcaagg aaataaaaag tgagaaacaa    660
actccagatg catcgatgga caacgtagat caatggtgga taaatttact ggaaaattgc    720
aatgacgata ttgaagaaga tgaagaggtt gtaattaatt atgaaaaaac actaacaagt    780
ttgttacatg aagaaaaatc accaccatta aatattggtg aaggtaactc catgcaacaa    840
ggacaaataa gtcatgaaaa ttggggtgaa ttttctctta atttacaacc catgcaacaa    900
-3'
に示す配列である。
【００７２】
これら配列番号１と２それぞれには、GenBank accession AY348870 のｍＲＮＡとの比較からエクソン１の一部、イントロン１、エクソン２、イントロン２、エクソン３の一部が認められた。
【００７３】
さらに、配列番号１と２のそれぞれについて、上流側と下流側の塩基配列を決定した。得られた、Micro-TomのＡＮＴ１ゲノム遺伝子の配列が、配列番号１２：
5'-
aaaaaaatta aaaattattt cgaaaaatca aaattttttt ttgattgaaa tgaaagatgg  60
gtttcccaat cgaggctggc aggataggta cattgggaaa tttggatttg tgtgttgaaa  120
atgattgttc aatttggctt ttataacatt tgtcgtttat aatttgtaga aggctctcta  180
caagttggta gttacaattt aatacactct tttaggcacg tgtataagta tatatagaca  240
ataaaaaagt agtataatat attatcaaat tattatgaac agtacatcta tgtcttcatt  300
gggagtgaga aaaggttcat ggactgatga agaagatttt cttctaagaa aatgtattga  360
taagtatggt gaaggaaaat ggcatcttgt tcccataaga gctggtaact attaaattaa  420
ctatcacgtt atttttattt gtctttctgt ctcattttat ttgacgttat tacgaatatc  480
atctgaaaat gtacgtgcag gtctgaatag atgtcggaaa agttgtagat tgaggtggct  540
gaattatcta aggccacata tcaagagagg tgactttgaa caagatgaag tggatctcat  600
tttgaggctt cataagctct taggcaacag gcatgcaagt ttatgttttg acaaaatttg  660
attagtatat attatatata cgtgtgacta tttcatctaa atgttacgtt attttacgta  720
gatggtcact tattgctggt agacttcccg gaaggacagc taacgatgtg aaaaactatt  780
ggaacactaa tcttctaagg aagttaaata ctactaaaat tgttcctcgc gaaaagatta  840
acaataagtg tggagaaatt agtactaaga ttgaaattat aaaacctcaa cgacgcaagt  900
atttctcaag cacaatgaag aatgttacaa acaataatgt aattttggac gaggaggaac  960
attgcaagga aataataagt gagaaacaaa ctccagatgc atcgatggac aacgtagatc  1020
catggtggat aaatttactg gaaaattgca atgacgatat tgaagaagat gaagaggttg  1080
taattaatta tgaaaaaaca ctaacaagtt tgttacatga agaaatatca ccaccattaa  1140
atattggtga aggtaactcc atgcaacaag gacaaataag tcatgaaaat tggggtgaat  1200
tttctcttaa tttaccaccc atgcaacaag gagtacaaaa tgatgatttt tctgctgaaa  1260
ttgacttatg gaatctactt gattaaaaga tatgttattg taaacttgta ttagggatac  1320
atttgttctt tataatttgt gtcccaacta caagttgtta gggaagtaat taatgttgtt  1380
agaatgggtt accatccaca tacattcatt agggaatgga ccggtggtaa cttattttta  1440
cggacttgga taaatttatc ttcacgaact aatttctgga gttgagttag attcaagttc  1500
caatcaataa gtgcatatgc actatgatat tgttcatgtg atttttaggt tacttatgtt  1560
attatatatt tgcaacgtct ttgtgttact tcctttagtc tatattaagt gaaacgtaag  1620
aaattttt       1628
-3'
の配列であり、LA1996のＡＮＴ１ゲノム遺伝子の配列が、配列番号１３：
5'-
aaaaaaatta aaaattattt caaaaaattg aatttttttt ttgattgaaa tgaaagatgg  60
gtttcccaat cgaggctggc aggataggta cattgggaaa tttggattta tgtgttgaaa  120
atgattgttc aatttggctt ttataacatt tgtcgtttat aatttgtaga aggctctcta  180
caagttggta gttacaattt aatacactct tttaggcatg tgtataagta tatatagaca  240
ataaaaaagt agtataatat atcatcaaat tattatgaac agtacatcta tgtcttcatt  300
gggagtgaga aaaggttcat ggactgatga agaagatttt cttttaagaa aatgtattga  360
taagtatggt gaaggaaaat ggcatcttgt tcccataaga gctggtaatt attaaactga  420
ctatcacgtt atttttatct gtctgtctca ttttatatga cgttattttg aacattatct  480
gaaaatgtac gtgcaggtct gaatagatgt cggaaaagtt gtagattgag gtggctgaat  540
tatctaaggc cacatatcaa gagaggtgac tttgaacaag atgaagtgga tctcattttg  600
aggcttcata agctcttagg caacaggcat gcaagtttat gttttgacaa aatttgatta  660
gtatatatta tatatacgtg tgactatttc atctaaatgt tacattattt tacgtagatg  720
gtcacttatt gctggtagac ttccaggaag gacagctaac gatgtgaaaa actattggaa  780
cactaatctt ctaaggaagt taaatactac taaaattgtt cctcgtgaaa agactaacaa  840
taagtgtgga gaaattagta ctaagattga aattataaaa cctcaaccac gaaagtattt  900
ctcaagcaca atgaagaata ttacaaacaa tattgtaatt ttggacgagg aggaacattg  960
caaggaaata aaaagtgaga aacaaactcc agatgcatcg atggacaacg tagatcaatg  1020
gtggataaat ttactggaaa attgcaatga cgatattgaa gaagatgaag aggttgtaat  1080
taattatgaa aaaacactaa caagtttgtt acatgaagaa aaatcaccac cattaaatat  1140
tggtgaaggt aactccatgc aacaaggaca aataagtcat gaaaattggg gtgaattttc  1200
tcttaattta caacccatgc aacaaggagt acaaaatgat gatttttctg ctgaaattga  1260
cttatggaat ctacttgatt aaaagagatg ttattgtaaa cttgtattag ggatacattt  1320
gttctttata atttgtatcc caactacaag ttgttaggga agtaattaat gttgttagag  1380
tgggttacca tccacataca ttcattaggg aatggaccgg tggtaattta tttctacgga  1440
cttggataaa tttatcttca cgaactaact tctggagttg agttagatcc aagtttcata  1500
tttctagaat caataagtgc atatgcacta taatattgtt catgtgattt ttaggttact  1560
tatgttatta tatatttgca acgtctttat gttactttct ttagtctata ttaagtgaaa  1620
cgtaagaaat tttt      1634
-3'
に示す配列である。
【００７４】
これら配列番号１２と１３それぞれは、GenBank accession AY348870のｍＲＮＡとの比較からＡＮＴ１たんぱく質全体をカバーしていることが明らかとなった。その結果、ＡＮＴ１ゲノム遺伝子は、３つのエクソン（図２に囲っている領域）と２つイントロンから構成されていることが明らかとなった。また、配列番号１２と１３それぞれには、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域も含まれている。
【００７５】
また、これらの結果からは、ＡＮＴ１  Ｆ２プライマーが、ＡＮＴ１ゲノム遺伝子のエクソン１に、ＡＮＴ１  Ｒ２プライマーが、エクソン３に位置することが明らかとなった。
【００７６】
４．LA1996とMicro-TomのＡＮＴ１遺伝子を判別するプライマーの設計
遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX（ゼネティックス社製）を用いて、得られたMicro-Tom（配列番号１２）の塩基配列とLA1996（配列番号１３）の塩基配列の比較を行った（図2）。その結果、LA1996（配列番号１３）とMicro-Tom（配列番号１２）のＡＮＴ１遺伝子配列間で複数のＤＮＡ多型を検出できた。
【００７７】
このＤＮＡ多型を判別できるプライマーＡＮＴ１  Ｆ２ MitR2とＡＮＴ１  Ｆ２ LA1996Fを設計した（図２）。
【００７８】
Micro-TomのＡＮＴ１遺伝子配列を特異的に増幅できるプライマーとしては、
ＡＮＴ１  Ｆ２ MitR2：5'-ataaaaataacgtgatagttaatttaatcg-3'（配列番号１０）
を設計した。ＡＮＴ１  Ｆ２ MitR2は、ＡＮＴ１遺伝子の翻訳開始点から１３５塩基の位置（図２ではLA1996の４０９番目、Micro−Tomの４０９番目で、イントロン１に位置する）にあるMicro-Tomではc、LA1996ではtの一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism: ＳＮＰ）を検出するため、３’末端の塩基をGとし、３’末端から２番目の塩基をミスマッチになるcとしたものである。このミスマッチを入れることでLA1996のＡＮＴ１遺伝子の非特異的増幅を防ぐことができる。なお、ミスマッチはgまたはtでもよい。
【００７９】
ＡＮＴ１  Ｆ２ MitR2は、配列番号１と２の増幅に用いたＡＮＴ１  Ｆ２と組み合わせることで、１４４bpのＤＮＡ断片を増幅できる。
【００８０】
LA1996のＡＮＴ１遺伝子配列を特異的に増幅できるプライマーとしては、
ＡＮＴ１  Ｆ２ LA1996F：5'-gtcacttattgctggtagacttcta-3'（配列番号１１）
を設計した。ＡＮＴ１  Ｆ２ LA1996は、LA1996のＡＮＴ１遺伝子の翻訳開始点から４７１塩基の位置、Micro−TomのＡＮＴ１遺伝子の翻訳開始点から４７５塩基の位置（図２ではLA1996の７４５番目、Micro−Tomの７４９番目、エクソン３に位置する）にあるMicro-Tomではc、LA1996ではaの一塩基多型を利用するため、３’末端の塩基をaとし、３’末端から２番目の塩基をミスマッチになるtとしたものである。このミスマッチを入れることでMicro-TomのＡＮＴ１遺伝子の非特異的増幅を防ぐことができる。なお、ミスマッチはＧまたはＡでもよい。
【００８１】
ＡＮＴ１  Ｆ２ LA1996Fは、配列番号１と２の増幅に用いたＡＮＴ１  Ｒ２と組み合わせることで、１９３bpのＤＮＡ断片を増幅できる。
【００８２】
なお、ＡＮＴ１  Ｒ２とＡＮＴ１  Ｒ２からは、配列番号１と２の約６５０bpの断片が増幅され、このバンドは、図３において共通として示されている、
【００８３】
４種のプライマーＡＮＴ１  Ｆ２、ＡＮＴ１  Ｆ２ LA1996F、ＡＮＴ１  Ｆ２ MitR2、ＡＮＴ１  Ｒ２を混合してＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡは、Micro−Tom 、LA1996F、Micro−TomとLA1996の交配種（Ｆ１世代）を用いた。Micro−TomとLA1996の交配種からの鋳型ＤＮＡの調製は、１．に示すMicro−TomとLA1996FからのゲノムＤＮＡの抽出の場合と同様に行った。
【００８４】
結果、Micro−Tom（図３のレーン２）では、ＡＮＴ１  Ｆ２ MitR2とＡＮＴ１  Ｆ２による１４４bpのＤＮＡ断片（図３において「Micro−Tom」と矢印で示す）の増幅が確認できたが、ＡＮＴ１  Ｆ２ LA1996FとＡＮＴ１  Ｒ２による１９３bpのＤＮＡ断片（図３において「LA1996」と矢印で示す）の増幅が確認できなかった。一方、LA1996（図３のレーン３）では、ＡＮＴ１  Ｆ２ LA1996FとＡＮＴ１  Ｒ２による１９３bpのＤＮＡ断片の増幅が確認できたが、ＡＮＴ１  Ｆ２ MitR2とＡＮＴ１  Ｆ２による１４４bpのＤＮＡ断片の増幅が確認できなかった。そして、Micro−Tom とLA1996の交配種（Ｆ１世代）（図３のレーン４）では、１４４bpと１９３bpの両方を確認できた。これらの結果より、これらのプライマーを用いることで、ＡＮＴ１遺伝子が、Micro-TomタイプであるかLA1996タイプであるかを判別できることがわかった。
【００８５】
このとき、ＰＣＲの反応溶液は、鋳型ＤＮＡ１．５μl、３μＭプライマー各１μl、１０×ＰＣＲバッファー１μl、２．５mM  ｄＮＴＰｓ  ０．８μl、ＤＮＡポリメラーゼとして５Ｕ／μl  TaKaRa Taq HS（タカラバイオ社製）０．０５μl、および滅菌蒸留水２．６５μlを混合したものとした。反応温度条件は、９５℃２分間の熱変性後、９５℃３０秒間・５５℃３０秒間・７２℃１分間を３５サイクル繰り返し、７２℃５分間の伸長反応を行うものとした。
【００８６】
５．果実へのアントシアニン蓄積形質とＡＮＴ１遺伝子型の関係の調査
Micro-Tomを子房親、LA1996を花粉親として交配を行い、Micro-TomとLA1996のF1個体を得、Ｆ１個体を自殖してＦ２世代の種子を得た。Ｆ２世代１８５個体をポット栽培し、果実における黒色色素の有無を目視で調査した（図４）（LA1996のもつ黒色の色素がアントシアニンであることは、確認されている。（Jones et al. J Hered. 94(6), p449-56. 2003））。また、各個体から葉をサンプリングし、上記の方法と同様にＤＮＡの抽出を行い、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。ＰＣＲは上記４の方法と同様の方法で行った。個体番号１５０番と１８５番は栽培中に枯死したため、果実の調査を行うことができなかった。果実を調査した１８３個体において、１３９個体で果実への黒色色素の蓄積が認められた（表３）。黒色色素の蓄積が認められた個体と認められなかった個体の割合は１３９：４４と、ほぼ３：１となり、黒色色素を蓄積する形質が優性の１因子であることが推定された。黒色色素の蓄積が認められた個体のうち、４６個体はＡＮＴ１遺伝子をLA1996型のホモで、９３個体はLA1996型とMicro-Tom型のヘテロで保有していた。また黒色色素の蓄積が認められなかった44個体は全てMicro-Tom型のＡＮＴ１遺伝子をホモで保有していた。以上のことから、アントシアニン産生トマトであるSolanum lycopersicum LA1996のＡＮＴ１遺伝子を有していれば、そのトマトはアントシアニン産生トマトになるが、アントシアニン産生トマトであるSolanum lycopersicum LA1996のＡＮＴ１遺伝子を有しておらず、アントシアニン非産生トマトであるSolanum lycopersicum Micro-TomのＡＮＴ１遺伝子のみ有している場合、そのトマトはアントシアニン非産生トマトとなることが明らかとなった。また、本プライマーセットを用いて、ＡＮＴ１遺伝子型を決めることで果実へのアントシアニンを蓄積する個体を効率的に選抜できることが確認できた。
【００８７】
【表３】
2009055855.tif 000005
【００８８】
トマト果実にアントシアニンの蓄積がある場合＋、ない場合−で示す。
ヘテロは、LA1996とMicro-Tomの両方のＡＮＴ１遺伝子を有することを、LA1996は、LA1996のＡＮＴ１遺伝子のみを有することを、Micro-Tomは、Micro-TomのＡＮＴ１遺伝子のみを有することを示す。
ndは、測定されなかったことを示す。
【００８９】
６．アントシアニン非産生トマトのＡＮＴ１遺伝子の一部の塩基配列の決定
アントシアニンを蓄積しない別の加工用トマト「Ｍ８２」（配列番号３）のＡＮＴ１遺伝子の一部を増幅した。1の方法でＤＮＡを抽出し、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。ＰＣＲプライマーには、新たに設計したＡＮＴ１＿１２Ｆ：5'-ATCTATGTCTTCATTGGGAGTGAGA-3'（配列番号８）とＡＮＴ１＿９９２Ｒ：5'-CCATAAGTCAATTTCAGCAGAAAAATCATC-3'（配列番号９）を使用した（これらのプライマーの位置は図２に示されている）。３の方法でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物は、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社製）で精製した。精製したＰＣＲの増幅産物を鋳型にし、３の方法で塩基配列を決定した。さらに、同様にアントシアニンを蓄積しない別のトマトnv-1、IRB301、Small Fry、ハウス桃太郎、桃太郎コルト、麗容、トゥインクル、フルーツイエロー、オレンジキャロル、スイートミニオレンジ、ふりこま、Ailsa Craig、Money Maker、Manapal、LS89、E6203、LA4013、LA3810、LA3771のＡＮＴ１遺伝子の一部を増幅し、表１に示す位置３４４、位置４０９、位置４１７、位置４１９、位置４３９、位置４４４〜４４５、位置４５７、位置４６８、位置４６９、位置４７３、位置４７６、位置７０４、位置７４５、位置８２６、位置８３４、位置８８８、位置８９２、位置９２０、位置９３３、位置９７２、位置１０１７、位置１１２２、位置１２１２の塩基の型を決定した。その結果、調べたすべてのアントシアニン非産生トマトの塩基の型はMicro-Tomの型と一致し、LA1996の型とは異なることが確認された。これより、表１に示す位置の塩基の型を決定するだけで、トマトがアントシアニン産生トマトであるか、あるいはアントシアニン非産生トマトであるかの判別が可能となることが明らかとなった。
【００９０】
Solanum lycopersicum M82のＡＮＴ１遺伝子（配列番号３）
5'-
gatgaagaag attttcttct aagaaaatgt attgataagt atggtgaagg aaaatggcat     60
cttgttccca taagagctgg taactattaa attaactatc acgttatttt tatttgtctt    120
tctgtctcat tttatttgac gttattacga atatcatctg aaaatgtacg tgcaggtctg    180
aatagatgtc ggaaaagttg tagattgagg tggctgaatt atctaaggcc acatatcaag    240
agaggtgact ttgaacaaga tgaagtggat ctcattttga ggcttcataa gctcttaggc    300
aacaggcatg caagtttatg ttttgacaaa atttgattag tatatattat atatacgtgt    360
gactatttca tctaaatgtt acgttatttt acgtagatgg tcacttattg ctggtagact    420
tcccggaagg acagctaacg atgtgaaaaa ctattggaac actaatcttc taaggaagtt    480
aaatactact aaaattgttc ctcgcgaaaa gattaacaat aagtgtggag aaattagtac    540
taagattgaa attataaaac ctcaacgacg caagtatttc tcaagcacaa tgaagaatgt    600
tacaaacaat aatgtaattt tggacgagga ggaacattgc aaggaaataa taagtgagaa    660
acaaactcca gatgcatcga tggacaacgt agatccatgg tggataaatt tactggaaaa    720
ttgcaatgac gatattgaag aagatgaaga ggttgtaatt aattatgaaa aaacactaac    780
aagtttgtta catgaagaaa tatcaccacc attaaatatt ggtgaaggta actccatgca    840
acaaggacaa ataagtcatg aaaattgggg tgaattttct cttaatttac cacccatgca    900
acaa                                                                 904
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【００９１】
遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX（ゼネティックス社製）を用いて、得られた塩基配列の比較を行った（図５）。その結果、各配列間にＤＮＡ多型を確認できた。これらのＤＮＡ多型（ＳＮＰ）の一部を表１に示す。
【００９２】
［その他］
国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成17年度独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構「生物系産業創出のための異分野融合研究支援事業」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）」
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】Micro-Tom（レーン１）とLA1996（レーン２）のＤＮＡ断片の増幅結果を示す図（写真）。
【図２−１】Micro-TomのＡＮＴ１遺伝子（配列番号１２）とLA1996のＡＮＴ１遺伝子（配列番号１３）の配列アラインメントとプライマーの位置を示す図。プライマーＡＮＴ１  Ｆ２、プライマーＡＮＴ１  Ｒ２、プライマーＡＮＴ１  Ｆ２ MitR2 、プライマーＡＮＴ１  Ｆ２ LA1996F、プライマーＡＮＴ１＿１２Ｆ、プライマーＡＮＴ１＿９９２Ｒの位置を矢印で示した。なお、プライマーＡＮＴ１＿１２ＦとプライマーＡＮＴ１  Ｆ２は上流側に設定されたMicro-TomとLA1996に共通の配列を有するフォワードプライマーであり、プライマーＡＮＴ１  Ｒ２、プライマーＡＮＴ１＿９９２Ｒは下流側に設定されたMicro-TomとLA1996に共通の配列を有するリバースプライマーである。−は、ギャップを表す。＊は、両配列で塩基が一致していることを表す。□（囲い）がエクソンを表す。矢印がプライマーの結合部位とＤＮＡの合成方向を表す。配列番号１２において、開始コドンは２７５〜２７７番目、終止コドンは１２８３〜１２８５番目である。配列番号１３において、開始コドンは２７５〜２７７番目、終止コドンは１２７９〜１２８１番目である。
【図２−２】Micro-TomのＡＮＴ１遺伝子（配列番号１２）とLA1996のＡＮＴ１遺伝子（配列番号１３）の配列アラインメントとプライマーの位置を示す図。プライマーＡＮＴ１  Ｆ２、プライマーＡＮＴ１  Ｒ２、プライマーＡＮＴ１  Ｆ２ MitR2 、プライマーＡＮＴ１  Ｆ２ LA1996F、プライマーＡＮＴ１＿１２Ｆ、プライマーＡＮＴ１＿９９２Ｒの位置を矢印で示した。なお、プライマーＡＮＴ１＿１２ＦとプライマーＡＮＴ１  Ｆ２は上流側に設定されたMicro-TomとLA1996に共通の配列を有するフォワードプライマーであり、プライマーＡＮＴ１  Ｒ２、プライマーＡＮＴ１＿９９２Ｒは下流側に設定されたMicro-TomとLA1996に共通の配列を有するリバースプライマーである。−は、ギャップを表す。＊は、両配列で塩基が一致していることを表す。□（囲い）がエクソンを表す。矢印がプライマーの結合部位とＤＮＡの合成方向を表す。配列番号１２において、開始コドンは２７５〜２７７番目、終止コドンは１２８３〜１２８５番目である。配列番号１３において、開始コドンは２７５〜２７７番目、終止コドンは１２７９〜１２８１番目である。
【図３】本発明のプライマーセット（プライマーＡＮＴ１  Ｆ２、プライマーＡＮＴ１  Ｆ２ LA1996F、プライマーＡＮＴ１  Ｆ２ MitR2、プライマーＡＮＴ１  Ｒ２）を使用したＰＣＲの結果を示す図。レーン１がＤＮＡマーカー、レーン２がMicro-TomのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲの結果、レーン３がLA1996のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲの結果、レーン４がMicro-TomとLA1996の掛けあわせによって得られたＦ１世代のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲの結果を示す。
【図４】Micro-TomとLA1996の掛けあわせによって得られたＦ２世代のトマトの果実の写真。Ａがアントシアニン産生トマト、Ｂがアントシアニン非産生トマトを示す。
【図５−１】各種トマトのＡＮＴ１遺伝子の配列アラインメントを示す図。−は、ギャップを表す。＊は、両配列で塩基が一致していることを表す。
【図５−２】各種トマトのＡＮＴ１遺伝子の配列アラインメントを示す図。−は、ギャップを表す。＊は、両配列で塩基が一致していることを表す。
【図２−１】
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【図２−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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