(57)【要約】【課題】液体クロマトグラフのポンプにより能動的に輸送されてくる種々の液種の移動相液に対して安定して微小液滴を生成させる方法及び装置を提供する。【解決手段】微小液滴生成装置は、移動相を送出するポンプと、移動相中に試料を注入するインジェクタと、移動相中の試料を分離するための分離カラムとを備える液体クロマトグラフと、前記分離カラムの流出部細管１６に接続されるピエゾ素子駆動ディスペンサー２３を備え、前記ピエゾ素子ディスペンサーにユニポーラ矩形波のシングルパルス又はダブルパルスの駆動電圧を供給する駆動電圧供給部２６を備えることを特徴とする。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフから供給される液体試料から微小液滴を生成する方法であって、前記液体クロマトグラフの分離カラムの流出部細管にピエゾ素子駆動ディスペンサーを直結し、前記ピエゾ素子駆動ディスペンサーに駆動電圧を供給して液体試料を吐出させて微小液滴を生成する微小液滴生成方法。
【請求項２】
前記ピエゾ素子を駆動する駆動電圧をユニポーラ矩形波のシングルパルス又はダブルパルスとした請求項１に記載の微小液滴生成方法。
【請求項３】
前記微小液滴を質量分析装置におけるイオン化部において生成する請求項１に記載の微小液滴生成方法。
【請求項４】
前記微小液滴をＭＡＬＤＩ用試料プレートに供給する請求項１に記載の微小液滴生成方法。
【請求項５】
移動相を送出するポンプと、移動相中に試料を注入するインジェクタと、移動相中の試料を分離するための分離カラムとを備える液体クロマトグラフと、
前記分離カラムの流出部細管に接続されるピエゾ素子駆動ディスペンサーを備え、
前記ピエゾ素子ディスペンサーにユニポーラ矩形波のシングルパルス又はダブルパルスの駆動電圧を供給する駆動電圧供給部を備えることを特徴とする微小液滴生成装置。
【請求項６】
移動相を送出するポンプと、移動相中に試料を注入するインジェクタと、移動相中の試料を分離するための分離カラムとを備える液体クロマトグラフと、
前記分離カラムの流出部細管に接続されるピエゾ素子駆動ディスペンサーを備え、
前記ピエゾ素子ディスペンサーにユニポーラ矩形波のシングルパルス又はダブルパルスの駆動電圧を供給する駆動電圧供給部を備える微小液滴生成装置と、
前記微小液滴生成装置により生成された液滴にレーザー光発生装置によりレーザー光を照射して前記液滴をイオン化するイオン化部を備え、
前記ピエゾ素子ディスペンサーの駆動電圧の周波数と前記レーザー光発生装置の駆動周波数は所定の遅延時間をおいて同期されていることを特徴とする分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小液滴生成方法及びその装置に関する。本発明は、特に、液体クロマトグラフの分析カラムから移送される溶出液を微細液滴として取り出し、続いて使用される検出器や分析機器での分析・検出に供給するために適した微小液滴を生成する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は有機化合物の分離や定量のために最も幅広く使用されている分析手法である。液体クロマトグラフィーは、充填剤を詰め込んだカラム（固定相）に液体（移動相）を流しながら、移動相中に混ぜたサンプルを固定相に通過させて成分分離を行い、紫外線や蛍光などの検出器で分析する。
【０００３】
また、液体クロマトグラフとならんで材料分析に欠かせない、特に有機化学や生化学の分野で欠くことのできない分析装置として質量分析器（ＭＳ）がある。
【０００４】
ＭＳは、試料をイオン化し、イオン化した試料を静電力によって飛行させ、飛行しているイオンを電気的・磁気的な作用により質量・電荷比に応じて分離し、その後それぞれを検出することで質量・電荷比とそれぞれの検出強度との関係のマススペクトルを得るようにした装置で、既知物質の同定や、未知物質の構造解析を可能とするものである。
【０００５】
ＭＳは試料中の成分をそれらの質量の差異により分離検出させることができる。ただし、構造が異なるが質量が同じものについてはそれらを識別することができない。また、多成分が同時に注入された場合、マススペクトルの解析が困難になり、さらにイオン化抑制により感度も低下してしまう。分離原理がＭＳと全く異なるＬＣとＭＳをオンラインで結合して用いるＬＣ−ＭＳは、２次元の分離モードであり、ＬＣのみ、あるいはＭＳのみでは分離困難なものに対しても極めて高い分離が可能となる。また、ＭＳの前段階として適用するＬＣ分離により、ＭＳにおける多成分同時注入によるイオン化抑制を避けることができるので検出感度も向上する。
【０００６】
ＬＣとＭＳを結合する場合、ＬＣで分離された試料をＭＳに導入するにあたり、試料をイオン化する必要がある。
【０００７】
図１はＬＣ−ＭＳシステムの一例を概略的に示す図であり、ＬＣ部１をイオン化部２を介してＭＳ３に接続した状態を示している。移動相容器１１、デガッサ１２、ポンプ１３、インジェクタ１４、分離カラム１５によって構成されるＬＣ部１はイオン化部２を介してＭＳ部３に接続されている。ＭＳ装置は目的成分を気相中にイオンとして取り出し、このイオンを高真空下で検出するため、液体である移動相を扱うＬＣをそのままＭＳに直結しても目的イオンを検出部まで導くことはできない。そこで、移動相（溶媒）を取り除いて目的成分をイオン化するためのいわゆるインターフェース部としてのイオン化手段がいくつか開発されている。
【０００８】
近年、イオン化手段として大気圧イオン化法（ＡＰＩ）が主流となっており、この大気イオン化は大気圧下においてイオン化するものであり、溶媒を真空の外で除くという点で有効である。この大気圧イオン化法には更に大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）とエレクトロスプレー法（ＥＳＩ）の二つ方法があるが、現在ＬＣ−ＭＳで採用されているイオン化法のほとんどがＥＳＩ法である。
【０００９】
ＥＳＩでは試料溶液は、先端に３〜５ｋＶ程度の高電圧を印加したキャピラリに導かれ、ここでキャピラリの外側から霧化ガス（ネブライザーガス）を流してスプレーすることで印加した電圧と同符号の帯電液滴が作られ、帯電液滴は移動の過程で蒸発と分裂を繰り返すことにより，微細な液滴になり，最終的には試料イオンが気相中に放出される。
【００１０】
このＥＳＩ法は、溶液中の化合物を大気圧下でそのまま気相中のイオンとして取り出すことができるという特徴を有する。
【００１１】
しかし、ＥＳＩ法では気化し易い・表面張力が小さい・粘性が低い・電気伝導度の低い溶媒しかエレクトロスプレーさせることができないので、測定対象もそのような溶媒に可溶のものに限られる。また、そのような溶媒に可溶の化合物であってもイオン化させることができないものあるいはさせにくいものが多数存在する。
【００１２】
また、ＬＣとＭＳを直結する場合、ＬＣから出される試料溶液をいかなる条件でＭＳに供給するかという問題がある。ＬＣにおいて移動相の移送に最も頻繁に用いられるプランジャー式ポンプは、低流量（毎分数nLから数mL）の液体を精度よく安定的に送液させることが可能であり、単一の液体の送液（アイソクラティック送液）だけでなく、複数の異なる液体を送液中に任意かつ連続的に混合させることも可能である（グラジエント送液）。しかしながら、ＬＣ−ＭＳにおいて、ＬＣから能動的に送られてくる試料をＭＳに導くために液滴を安定生成させることは不可能であった。
【００１３】
また、質量分析するための微量試料の取り扱いとして、液滴をピエゾ素子駆動のノズルにより大気中に生成し、この液滴に赤外線レーザーを照射し、蒸発した溶液分子を紫外レーザー光を照射するイオン化して質量分析装置に導く液滴レーザー蒸発質量分析装置が開発されている（非特許文献１）。
【００１４】
しかしながら、ＬＣからの溶出試料をピエゾ素子駆動のノズルを用いて液滴を生成しようとしても、ピエゾ素子を駆動する電子パルス条件を液種によって最適化する必要があり、任意の混合比の溶液が送液管末端に連続的に送られてくるＬＣと接続し、液滴を安定生成させることは不可能であった。
【非特許文献１】「１Ｐ０３０  液滴レーザー蒸発質量分析装置の開発」（コンポ研、豊田工大）  河野  淳也、近藤  保）  （http://www2.tky.3web.ne.jp/-bkinfo/2004/prog1p.html）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本願発明は上記の従来の液滴生成装置の持つ問題点を解決することを課題としてなされたものであり、本発明の一つの目的は液体クロマトグラフのポンプにより能動的に輸送されてくる種々の液種の移動相液に対して安定して微小液滴を生成させることである。また、本発明の更なる目的は、ＬＣで汎用されるグラジエント送液されてくる移動相液、すなわちその組成が時間と共に刻々と混合組成比が変化する移動相液に対してもディスペンサーの駆動電圧波形を変化させることなく安定的に微小液滴を吐出させることである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の上記課題は、以下の本発明により解決することができる。
【００１７】
本発明は、液体クロマトグラフから供給される液体試料から微小液滴を生成する方法であって、前記液体クロマトグラフの分離カラムの流出部細管にピエゾ素子駆動ディスペンサーを直結し、前記ピエゾ素子駆動ディスペンサーに駆動電圧を供給して液体試料を吐出させて微小液滴を生成する微小液滴生成方法である。
【００１８】
本発明は、また、前記微小液滴生成方法において、前記ピエゾ素子を駆動する駆動電圧をユニポーラ矩形波のシングルパルス又はダブルパルスとすることを特徴としている。
【００１９】
また、本発明の課題は、以下の装置によって達成することができる。
【００２０】
本発明の微小液滴生成装置は、移動相を送出するポンプと、移動相中に試料を注入するインジェクタと、移動相中の試料を分離するための分離カラムとを備える液体クロマトグラフと、
前記分離カラムの流出部細管に接続されるピエゾ素子駆動ディスペンサーを備え、
前記ピエゾ素子ディスペンサーにユニポーラ矩形波のシングルパルス又はダブルパルスの駆動電圧を供給する駆動電圧供給部を備えることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２１】
（１）本願発明は、圧電効果を利用した微小液滴生成装置と微小量送液が可能なポンプを接続し、適切な制御を行うことで、空間の特定の位置に安定して球形の微小液滴を生成させることが可能となる。
（２）本願発明においては、能動的に輸送されてくる液体の種類および混合組成比に依存しない連続的液滴生成が可能であるため、ＬＣと上記液滴イオン化法をオンラインで接続させることが可能となり、新規イオン化法を有するＬＣ−ＭＳシステムの構築およびそれを用いた広範な化合物を対象とした一斉分析と高感度な計測を期待することができる。
（３）MALDI（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）−TOFMS（飛行時間型測定ＭＳ）測定用に、ＬＣで分離された成分をMALDI試料プレートに分取配置させるにあたり、本願発明におけるピエゾ駆動による液滴生成装置を用いれば完全非接触のポストＬＣスポティングが可能となる。
（４）ＬＣでは通常送液ラインの途中で光学的検出を行うが、本ＬＣ−ピエゾ吐出技術を用いればポストチューブでも同様の検出法を適用することが可能となる。送液ライン途中では照射できないような極めて高い強度のレーザー光を照射し蛍光検出を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本願発明を実施するための最良の形態を示す。
【００２３】
先ず、本発明の微小液滴生成装置をＬＣ−ＭＳに適用した例を図２、図３に基づいて説明する。
【００２４】
図２は、本発明の微小液滴生成装置をＬＣ−ＭSシステムに適用した例を示す。尚、説明の便宜上、図１に示したＬＣ−ＭＳシステムと共通する構成要素については、同一の符号を付して説明する。
【００２５】
ＬＣ−ＭＳシステムは、基本的にＬＣ部１，イオン化部２，質量分析部３から構成され、ＬＣ部１は、イオン化部２を介してＭＳ３に接続される。ＬＣ部１は、二種類の移動相を収容する移動相容器１１（Ａ、Ｂ）、デガッサ１２、ポンプ１３、インジェクタ１４、分離カラム１５によって構成されている。ＬＣ部１の分離カラム１５は細管１６を介してイオン化部２に接続される。
【００２６】
イオン化部２は分離カラム１５に接続された細管１６から排出される溶液を本発明による微小液滴生成装置２１により液滴化し、これをＭＳ３に供給するたにレーザー光源２２によるレーザー光によりイオン化する部分である。
【００２７】
本発明による微小液滴生成装置２１はピエゾ駆動のディスペンサー２３によって構成される。図３は、本発明によるピエゾ駆動のディスペンサー２３の詳細を示し、ディスペンサー２３はガラス製キャピラリ２４と、キャピラリ２４の周囲に装着された圧電セラミック２５とこの圧電セラミック２５へ駆動電圧を供給するための駆動信号生成装置２６を備えている。
【００２８】
キャピラリ２４は管内径800μm、長さ50mm程度であり、先端部は内径50μmのノズル２７が形成されている。ガラス製の細管の外側に圧電セラミックス２５が接着されている。
【００２９】
圧電セラミックス２５の電極には0V〜300V程度の電圧パルスを印可可能な駆動信号生成装置２６が接続されている。生成される液滴は30μmから70μm程度であり、生成頻度は1〜2kHzまで可能である。駆動パルスは、通常は、ユニポーラ矩形波形のシングルパルス又はダブルパルスで、数Ｖ〜３００Ｖの範囲の電圧で駆動される。
【００３０】
図４は、圧電セラミックス２５に供給する駆動パルスの一例を示す。
【００３１】
図示の駆動パルスは電圧が略１００Ｖ、パルス幅が略４０μｓのものを示している。ここで、電圧はピエゾ素子に加わる圧力を決定し、また、パルス幅は、その圧力の加わる時間を決める。したがって、印加するパルスの電圧及びパルス幅を調整することにより、液滴のサイズ、個数を制御することが可能となる。
【００３２】
微小液滴の安定的な生成を左右するのは、ピエゾ駆動のディスペンサーに印加するパルス電圧波形である。本発明者らは種々検討した結果、以下の電圧波形条件で行うことにより、ＬＣから送液されてくる各種液体に対して安定的に液滴を生成することができることを見いだした。なお、ここでは、Microdrop社（独国）のピエゾ駆動のマイクロドロップディスペンサーが使用された。
【００３３】
電圧波形条件
電圧：８０−１５０Ｖ
パルス時間幅：４０−１００μｓ
周波数：３０−１２０Ｈｚ
本実施例のＬＣ−ＭＳシステムの稼働にあたっては、ポンプ１３によって移動相容器１１から移動相溶液が分離カラム１５へ移送され、その過程においてインジェクタ１４より分析試料が注入される。移動相によって搬送され、分離カラム１５によって分離された試料溶液（溶出液）は、細管１６を経てディスペンサー２３に供給される。
【００３４】
ＬＣにはDionex社のクロマトグラフを用い、水、メタノール、アセトニトリル、５％ギ酸などの液体を単独で送液するか（アイソクラティック送液）、あるいは水／メタノールや水／アセトニルなどの混合液を時間と共にその組成を変えながら送液（グラジエント送液）した。流速は0.5-2.0μL/min の範囲で適宜調整したが、通常は1.5μL/minにおいて実験した。
【００３５】
ディスペンサー２３において、駆動信号生成装置２６から供給される駆動電圧パルスにより、微小液滴（30μmから70μm程度）が生成され、ノズル２７より放出される。
【００３６】
本システムにおいては、生成された微小液滴にレーザー光が照射され、液滴が蒸発するとともに試料分子がレーザーエネルギーによりイオン化される。
【００３７】
生成されたイオンは次段のＭＳ装置３に導かれ、ここで質量分析がなされる。
【００３８】
本発明によるピエゾ駆動のディスペンサー２３を使用することにより、空間の特定の位置に安定して球形の微小液滴を生成させることができる。
【００３９】
図５は、本発明の液滴生成装置を飛行時間型質量分析装置３に導入する試料イオンの生成に使用した具体例を示す。
【００４０】
イオン化部２はスクロールポンプにより大気圧〜１０２Pa程度の圧力に調整され、ここにピエゾ駆動のディスペンサー２３により微小液滴を放出するようしている。そして、前述のように、生成された微小液滴にレーザー光が照射され、試料イオンが生成される。試料イオンは微小開口（d=0.3mm程度）２８を通して10−３Pa程度の圧力に調整されたイオンガイド部３１に導かれる。イオンガイド部３１を通過したイオンはＴＯＦ部３２において分析がなされる。
【００４１】
液滴試料は溶媒に試料及びリチウムを溶かした溶液を用いる。液滴生成装置であるディスペンサー２３により、径７０μｍの液滴を生成した。
【００４２】
液滴３０に照射するレーザー光は、以下の条件でＹＡＧレーザーを使用した。
【００４３】
レーザーの使用条件
波長：１０６４nm（ＹＡＧレーザー基本波）
出力：４０mJ/puls
パルス幅：２０ns
周波数：３０−１２０Ｈｚ（タイミングジェネレータにより制御）
なお、ここで重要なことは、マイクロディスペンサーの駆動とレーザーの周波数のタイミングを同期させることであり、本実施例においては、タイミングジェネレータ（Stanford Research社製）を使用し、マイクロディスペンサーに電圧を印加した後、３００〜１０００μｓ（通常５００μｓ）の時間の遅延時間を持たせてレーザーにトリガをかけた。これにより、特定位置において安定して生成された微小液滴のイオン化が可能となった。
【００４４】
図６は生成された液滴にＹＡＧレーザー光を照射したときの液滴の状態変化を示す。レーザー光によって液滴が爆発蒸発する過程と液滴がイオン化し発光している様子が示されている。
【００４５】
本発明の液滴生成装置を使用するため、特定位置に安定した球形の微小液滴を生成することが可能となるため、レーザー光を的確に液滴に照射することが可能となり、イオン化試料の濃度を高め、以降の測定におけるＳ／Ｎ比を高めることができる。
【００４６】
以上は、本発明による液滴生成装置をＬＣ−ＭＳシステムに適用した例について述べた。本発明のピエゾ駆動のディスペンサーを使用した液滴生成装置は、ＭＳ装置に限らず、他の種々の分析装置のための試料調整に使用することができる。
【００４７】
図７はＬＣから送出された試料溶液からＭＡＬＤＩ用の試料の作成に適用する例を示している。図２にて説明したように、分離カラム１５を経て送出される試料溶液は図３に示されるディスペンサー２３により液滴として放出される。
【００４８】
MALDI−TOFMS測定用に、LCで分離された成分をMALDI試料プレート４０に分取配置させるには、例えば、スポッティング用ニードルを使用し、このニードルの先端を試料プレートに接近させてスポッティングするものであるが、その際、ニードルの先端とプレートの間には溶出してきた溶液が介在するのは避けられず、完全に液滴を試料プレート上に排出するのにある程度の時間を要し、迅速な試料の作成という観点から解決が望まれていた。本願発明におけるLC−ピエゾ吐出技術を用いれば完全非接触のポストLCスポティングが可能となり、迅速にMALDI試料プレートに分取配置することが可能となる。
【００４９】
図８は、通常使用されるＬＣと蛍光検出器の組み合わせにおいて、本発明のピエゾ駆動ディスペンサーを用いる例を示す。LCでは通常送液ラインの途中で光学的検出を行うが、上述の例と同様に本発明によるピエゾ駆動ディスペンサーを使用することにより、送液ライン途中では照射できないような極めて高い強度のレーザー光を照射し蛍光検出器５０にて蛍光検出を行うことが可能となる。
【００５０】
以上、本発明による微小液滴生成方法及び生成装置について、質量分析装置用、ＭＡＬＤＩ測定用、蛍光分析用の試料作成について述べたが、本発明は、他の分析用試料作成に適用できることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】汎用のＬＣ−ＭＳシステムを示す図である。
【図２】本発明の微小液滴生成装置を適用したＬＣ−ＭＳシステムの概要を示す図である。
【図３】本発明に使用するピエゾ駆動ディスペンサーを示す図である。
【図４】ピエゾ駆動ディスペンサーに供給する駆動パルスの一例を示す図である。
【図５】本発明の微小液滴生成方法を飛行時間型質量分析装置のイオン化部に適用した例を示す図である。
【図６】本発明の微小液滴生成装置を使用して生成した液滴の状態変化を示す図である。
【図７】本発明の微小液滴生成方法をＭＡＬＤＩ測定用試料作成に適用する例を示す図である。
【図８】本発明の微小液滴生成方法をＬＣ−蛍光検出システムに適用した例を示す図である。
【符号の説明】
【００５２】
１  ＬＣ部
２  イオン化部
３  ＭＳ部
２１  微小液滴生成装置
２３  ディスペンサー
２５  圧電セラミックス
２６  駆動信号発生装置
２７  ノズル
３２  ＴＯＦ部
４０  ＭＡＬＤＩ用試料プレート
５０  蛍光検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図６】
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