(57)【要約】【課題】外来性タンパク質の高生産酵母形質転換体及び当該変異に関与する遺伝子を提供する。【解決手段】１種又は２種以上の外来性タンパク質をコードするＤＮＡを保持し、宿主の以下の遺伝子；ADA2、ADE1、ADE3、ADE5,7等から選択される１種又は２種以上が不活性化されている、酵母形質転換体とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種又は２種以上の外来性タンパク質をコードするＤＮＡを保持し、宿主の以下の遺伝子；
ADA2、ADE1、ADE3、ADE5,7、ADE8、ADH1、ADO1、ARV1、ATP15、BUD19、BUD23、BUL1、BUR2、CHO2、CSG2、DYN3、ERG3、ERG6、FAR8、FSF1、FYV6、GCN5、GDH1、GND1、HMO1、HTL1、IES6、KAP120、MDM34、MMM1、MON2、MRPL20、MRPL38、MSK1、MTM1、MTQ2、NBP2、NGG1、NPR2、OPI3、OPI9、PAT1、PER1、PET309、RAV1、RMD11、ROX3、RPL13B、RPL19B、RPL1B、RPL27A、RPL36A、RPL39、RPS6A、RRD1、RSA1、SAC1、SFP1、SNF7、SNF8、SPC72、SPT7、SRC1、SWI3、TAF14、TPS2、URM1、VMA2、VMA4、VMA7、VPS16、VPS25、VPS27、VPS28、VPS3、VPS33、VPS36、VPS4、VPS41、VPS45、VRP1、YDR065W、YDR433W、YDR532C、YGL218W、YGR102C、YGR272C、YKL118W、YNL120C、YNL228W、YNL296W、YOL138C、YOR331C、YPT7、YVH1及びZUO1から選択される１種又は２種以上が不活性化されている、酵母形質転換体。
【請求項２】
液体培養における前記外来性タンパク質の分泌生産が、前記遺伝子が不活性化されていないときよりも促進されている、請求項１に記載の酵母形質転換体。
【請求項３】
前記遺伝子は、ARV1、 DYN3、 FAR8、 NBP2、 RMD11、 RPS6A、 RPL19B、 RPL36A、 RRD1、 SNF7、 SNF8、 VPS3、 VPS4、 VPS25、 VPS27、 VPS28、 VPS33、 VPS36、 VPS41、 VPS45及び YOL138Cからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１又は２に記載の酵母形質転換体。 
【請求項４】
前記遺伝子は、RAV1、 RPS6A、 SNF7、 SNF8、 RPL36A、 VPS3、 VPS4、 VPS25、 VPS27、 VPS28、 VPS33、 VPS36、 VPS41及び VPS45から選択される１種又は２種以上である、請求項１又は２に記載の酵母形質転換体。
【請求項５】
宿主が、サッカロマイセス属酵母である、請求項１〜４のいずれかに記載の酵母形質転換体。
【請求項６】
前記外来性タンパク質は、セルラーゼを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の酵母形質転換体。
【請求項７】
前記セルラーゼは、エンドグルカナーゼである、請求項６に記載の酵母形質転換体。
【請求項８】
酵母において外来性タンパク質を発現させるためのベクターであって、
以下の遺伝子：
ADA2、ADE1、ADE3、ADE5,7、ADE8、ADH1、ADO1、ARV1、ATP15、BUD19、BUD23、BUL1、BUR2、CHO2、CSG2、DYN3、ERG3、ERG6、FAR8、FSF1、FYV6、GCN5、GDH1、GND1、HMO1、HTL1、IES6、KAP120、MDM34、MMM1、MON2、MRPL20、MRPL38、MSK1、MTM1、MTQ2、NBP2、NGG1、NPR2、OPI3、OPI9、PAT1、PER1、PET309、RAV1、RMD11、ROX3、RPL13B、RPL19B、RPL1B、RPL27A、RPL36A、RPL39、RPS6A、RRD1、RSA1、SAC1、SFP1、SNF7、SNF8、SPC72、SPT7、SRC1、SWI3、TAF14、TPS2、URM1、VMA2、VMA4、VMA7、VPS16、VPS25、VPS27、VPS28、VPS3、VPS33、VPS36、VPS4、VPS41、VPS45、VRP1、YDR065W、YDR433W、YDR532C、YGL218W、YGR102C、YGR272C、YKL118W、YNL120C、YNL228W、YNL296W、YOL138C、YOR331C、YPT7、YVH1及びZUO1から選択される１種又は２種以上を不活性化するためのベクター。
【請求項９】
外来性のタンパク質を発現させるための宿主酵母であって、
宿主の以下の遺伝子：
ADA2、ADE1、ADE3、ADE5,7、ADE8、ADH1、ADO1、ARV1、ATP15、BUD19、BUD23、BUL1、BUR2、CHO2、CSG2、DYN3、ERG3、ERG6、FAR8、FSF1、FYV6、GCN5、GDH1、GND1、HMO1、HTL1、IES6、KAP120、MDM34、MMM1、MON2、MRPL20、MRPL38、MSK1、MTM1、MTQ2、NBP2、NGG1、NPR2、OPI3、OPI9、PAT1、PER1、PET309、RAV1、RMD11、ROX3、RPL13B、RPL19B、RPL1B、RPL27A、RPL36A、RPL39、RPS6A、RRD1、RSA1、SAC1、SFP1、SNF7、SNF8、SPC72、SPT7、SRC1、SWI3、TAF14、TPS2、URM1、VMA2、VMA4、VMA7、VPS16、VPS25、VPS27、VPS28、VPS3、VPS33、VPS36、VPS4、VPS41、VPS45、VRP1、YDR065W、YDR433W、YDR532C、YGL218W、YGR102C、YGR272C、YKL118W、YNL120C、YNL228W、YNL296W、YOL138C、YOR331C、YPT7、YVH1及びZUO1から選択される１種又は２種以上が不活性化されている、宿主酵母。
【請求項１０】
セルロース含有材料の分解産物の製造方法であって、
請求項６又は７に記載の酵母形質転換体を準備する工程と、
前記セルロース含有材料を炭素源として含有する液体培地で前記酵母形質転換体を培養する工程と、
を備える、製造方法。
【請求項１１】
セルロース含有材料からエタノールを製造する方法であって、
請求項６又は７に記載の酵母形質転換体を準備する工程と、
前記セルロース含有材料を炭素源として含有する液体培地で前記酵母形質転換体を培養してアルコール発酵させる工程と、
を備える、製造方法。
【請求項１２】
タンパク質の製造方法であって、
請求項１〜７に記載の酵母形質転換体を準備する工程と、
前記酵母形質転換体を液体培地を用いて培養する工程と、
を備える、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来性タンパク質の高生産形質転換体及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、有限である石油資源を代替するものとして、植物の光合成作用に由来するバイオマスへの期待が高まってきており、バイオマスをエネルギーや各種材料に利用するための各種の試みがなされている。バイオマスを、エネルギー源やその他の原料として有効利用するためには、バイオマスを動物や微生物が容易に利用可能な炭素源に糖化することが必要である。
【０００３】
典型的なバイオマスであるセルロースやヘミセルロースを利用するには、大量のセルラーゼが必要である。こうしたバイオマスをグルコースやキシロース等に糖化するために用いられる酵素製剤費のコスト比率は相当高いものとなっている。セルロースを低コストで糖化し、有用物質に変換するには、セルラーゼをどれだけ低減できるかに大きく依存している。
【０００４】
1つの解決策としては、グルコースからエタノールや有機酸などの有用物質を発酵生産する酵母などの微生物に直接セルラーゼを生産させ、糖化させることにより添加すべきセルラーゼ量を抑制することが考えられる。酵母はセルラーゼ遺伝子を有しておらず、外来遺伝子としてセルラーゼ遺伝子を導入し形質転換体を得る必要がある。セルラーゼを高生産する変異株を古典的な変異誘発剤による変異導入法により取得されたことが報告されている（非特許文献１）。しかしながらこうした変異体の取得には大変な時間と労力を要する。
【０００５】
一方、酵母での異種タンパク質の高生産変異株及びそれに関与する遺伝子が開示されている（特許文献１）。この文献には、サッカロマイセス セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の遺伝子破壊株ライブラリーに異種遺伝子であるラッカーゼ遺伝子を導入して、ラッカーゼを高発現する遺伝子を網羅的に探索して、合計１８株の変異株を選抜し、１８種のラッカーゼの分泌生産を促進する遺伝子が記載されている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−５８１４３号公報
【非特許文献１】Aho S., Arffman A., Korhola M., Saccharomyces cerevisiae mutants selected for increased production of Trichoderma reesei cellulases., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996, 46 (1), 36-45.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記特許文献１に記載の方法では、増殖に影響を与えないタンパク質を高生産させる遺伝子破壊株を調べるために、外来遺伝子を導入した遺伝子破壊株を固体培地上で培養しつつ培地内の基質分解量を指標として高生産変異株を取得し、タンパク質の分泌生産を促進する遺伝子を特定している。こうした遺伝子としては、BUB2、BUB3、BUL1、END3．FYV10、IKI3、MAD1、MAD2、MAD3、NCL1、PER1、PFK26、RPS24A、VHS2、VIK1、VRP1、YKL053W、YML094C-A等が挙げられている。こうした遺伝子の破壊が、酵母を液体培地で培養したときにおいても異種タンパク質の分泌を促進する方向に作用する可能性もあった。一方、タンパク質の分泌に関し固体培養と液体培養とにおける環境は全く相違するものとも考えられ、液体培養では全く異なる遺伝子の破壊が分泌促進に関与する可能性があると考えられた。
【０００８】
本発明は、外来性タンパク質の高生産酵母形質転換体及び当該高生産に関与する遺伝子並びにこれらの利用を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、液体培養を用いた生産プロセスに適した外来性タンパク質の高生産酵母形質転換体及び当該高生産に関与する遺伝子並びにこれらの利用を提供することを他の一つの目的とする。セルラーゼの高生産酵母形質転換体及び当該変異に関与する遺伝子並びにこれらの利用を提供することをさらに他の一つの目的とする。さらにまた、本発明は、バイオマスを糖化して有用物質に変換するのに適した酵母形質転換体及びその利用を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記した課題を解決するべく、S. cerevisiaeの遺伝子破壊株に外来性遺伝子であって分泌性タンパク質であるセルラーゼの遺伝子を導入し、これらの形質転換体を液体培養でセルラーゼを高生産する変異株のスクリーニングを行った。さらに、その液体培養の培養上清のセルラーゼ活性を評価することで、分泌タンパク質を高生産する遺伝子破壊株のスクリーニングを行った。この結果、スクリーニングされた高生産変異体は、従来とは大きく異なる遺伝子の破壊株であった。これらの知見に基づき、本発明者らは本発明を完成した。本発明によれば以下の手段が提供される。
【００１０】
本発明によれば、１種又は２種以上の外来性タンパク質をコードするＤＮＡを保持し、宿主の以下の遺伝子；ADA2、ADE1、ADE3、ADE5,7、ADE8、ADH1、ADO1、ARV1、ATP15、BUD19、BUD23、BUL1、BUR2、CHO2、CSG2、DYN3、ERG3、ERG6、FAR8、FSF1、FYV6、GCN5、GDH1、GND1、HMO1、HTL1、IES6、KAP120、MDM34、MMM1、MON2、MRPL20、MRPL38、MSK1、MTM1、MTQ2、NBP2、NGG1、NPR2、OPI3、OPI9、PAT1、PER1、PET309、RAV1、RMD11、ROX3、RPL13B、RPL19B、RPL1B、RPL27A、RPL36A、RPL39、RPS6A、RRD1、RSA1、SAC1、SFP1、SNF7、SNF8、SPC72、SPT7、SRC1、SWI3、TAF14、TPS2、URM1、VMA2、VMA4、VMA7、VPS16、VPS25、VPS27、VPS28、VPS3、VPS33、VPS36、VPS4、VPS41、VPS45、OPI9、YDR065W、YDR433W、YDR532C、YGL218W、YGR102C、YGR272C、YKL118W、YNL120C、YNL228W、YNL296W、YOL138C、YOR331C、YPT7、YVH1及びZUO1
から選択される１種又は２種以上が不活性化されている、酵母形質転換体が提供される。
【００１１】
本発明の酵母形質転換体において、液体培養における前記外来性タンパク質の分泌生産が、前記遺伝子が不活性化されていないときよりも促進されていることが好ましい。また、本発明の酵母形質転換体において、前記遺伝子は、ARV1、 DYN3、 FAR8、 NBP2、 RMD11、 RPS6A、 RPL19B、 RPL36A、RRD1、 SNF7、 SNF8、 VPS3、 VPS4、 VPS25、 VPS27、 VPS28、 VPS33、 VPS36、 VPS41、 VPS45及び YOL138Cからなる群から選択される１種又は２種以上であることが好ましく、また、前記遺伝子は、RAV1、 RPS6A、 SNF7、 SNF8、 RPL36A、VPS3、 VPS4、 VPS25、 VPS27、 VPS28、 VPS33、 VPS36、 VPS41及びVPS45から選択される１種又は２種以上であることも好ましい。
【００１２】
本発明の酵母形質転換体においては、宿主が、サッカロマイセス属酵母であることが好ましい。また、本発明の酵母形質転換体においては、前記外来性タンパク質は、セルラーゼを含むことが好ましく、エンドグルカナーゼとすることができる。
【００１３】
本発明によれば、酵母において外来性タンパク質を発現させるためのベクターであって、
以下の遺伝子；ADA2、ADE1、ADE3、ADE5,7、ADE8、ADH1、ADO1、ARV1、ATP15、BUD19、BUD23、BUL1、BUR2、CHO2、CSG2、DYN3、ERG3、ERG6、FAR8、FSF1、FYV6、GCN5、GDH1、GND1、HMO1、HTL1、IES6、KAP120、MDM34、MMM1、MON2、MRPL20、MRPL38、MSK1、MTM1、MTQ2、NBP2、NGG1、NPR2、OPI3、OPI9、PAT1、PER1、PET309、RAV1、RMD11、ROX3、RPL13B、RPL19B、RPL1B、RPL27A、RPL36A、RPL39、RPS6A、RRD1、RSA1、SAC1、SFP1、SNF7、SNF8、SPC72、SPT7、SRC1、SWI3、TAF14、TPS2、URM1、VMA2、VMA4、VMA7、VPS16、VPS25、VPS27、VPS28、VPS3、VPS33、VPS36、VPS4、VPS41、VPS45、VRP1、YDR065W、YDR433W、YDR532C、YGL218W、YGR102C、YGR272C、YKL118W、YNL120C、YNL228W、YNL296W、YOL138C、YOR331C、YPT7、YVH1及びZUO1から選択される１種又は２種以上を不活性化するためのベクターが提供される。
【００１４】
本発明によれば、外来性のタンパク質を発現させるための宿主酵母であって、宿主の以下の遺伝子；ADA2、ADE1、ADE3、ADE5,7、ADE8、ADH1、ADO1、ARV1、ATP15、BUD19、BUD23、BUL1、BUR2、CHO2、CSG2、DYN3、ERG3、ERG6、FAR8、FSF1、FYV6、GCN5、GDH1、GND1、HMO1、HTL1、IES6、KAP120、MDM34、MMM1、MON2、MRPL20、MRPL38、MSK1、MTM1、MTQ2、NBP2、NGG1、NPR2、OPI3、OPI9、PAT1、PER1、PET309、RAV1、RMD11、ROX3、RPL13B、RPL19B、RPL1B、RPL27A、RPL36A、RPL39、RPS6A、RRD1、RSA1、SAC1、SFP1、SNF7、SNF8、SPC72、SPT7、SRC1、SWI3、TAF14、TPS2、URM1、VMA2、VMA4、VMA7、VPS16、VPS25、VPS27、VPS28、VPS3、VPS33、VPS36、VPS4、VPS41、VPS45、VRP1、YDR065W、YDR433W、YDR532C、YGL218W、YGR102C、YGR272C、YKL118W、YNL120C、YNL228W、YNL296W、YOL138C、YOR331C、YPT7、YVH1及びZUO1
から選択される１種又は２種以上が不活性化されている、宿主酵母が提供される。
【００１５】
本発明によれば、セルロース含有材料の分解産物の製造方法であって、セルラーゼを外来性のタンパク質とする上記酵母形質転換体を準備する工程と、前記セルロース含有材料を炭素源として含有する液体培地で前記酵母形質転換体を培養する工程と、を備えることができる。
【００１６】
本発明によれば、セルロース含有材料からエタノールを製造する方法であって、セルラーゼを外来性のタンパク質とする上記酵母形質転換体を準備する工程と、前記セルロース含有材料を炭素源として含有する液体培地で前記酵母形質転換体を培養してアルコール発酵させる工程と、を備える、製造方法が提供される。
【００１７】
本発明によれば、タンパク質の製造方法であって、上記いずれかの酵母形質転換体を準備する工程と、前記酵母形質転換体を液体培地を用いて培養する工程と、を備える、製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、外来性タンパク質を高生産可能な酵母形質転換体、そのための宿主酵母、ベクター及び酵母形質転換体を利用した製造方法に関する。本発明は、酵母において以下の９６種の遺伝子；ADA2、ADE1、ADE3、ADE5,7、ADE8、ADH1、ADO1、ARV1、ATP15、BUD19、BUD23、BUL1、BUR2、CHO2、CSG2、DYN3、ERG3、ERG6、FAR8、FSF1、FYV6、GCN5、GDH1、GND1、HMO1、HTL1、IES6、KAP120、MDM34、MMM1、MON2、MRPL20、MRPL38、MSK1、MTM1、MTQ2、NBP2、NGG1、NPR2、OPI3、OPI9、PAT1、PER1、PET309、RAV1、RMD11、ROX3、RPL13B、RPL19B、RPL1B、RPL27A、RPL36A、RPL39、RPS6A、RRD1、RSA1、SAC1、SFP1、SNF7、SNF8、SPC72、SPT7、SRC1、SWI3、TAF14、TPS2、URM1、VMA2、VMA4、VMA7、VPS16、VPS25、VPS27、VPS28、VPS3、VPS33、VPS36、VPS4、VPS41、VPS45、VRP1、YDR065W、YDR433W、YDR532C、YGL218W、YGR102C、YGR272C、YKL118W、YNL120C、YNL228W、YNL296W、YOL138C、YOR331C、YPT7、YVH1及びZUO1（以下、この遺伝子群を第１の遺伝子群という。）から選択される１種又は２種以上が不活性化されることにより、外来性タンパク質の分泌生産が促進されることに基づいている。
【００１９】
本発明者らは、不活性化されることにより、酵母の遺伝子破壊株ライブラリーを利用して液体培養において外来性の分泌性タンパク質の分泌生産を促進する遺伝子を探索したところ、従来、酵母について固体培地でのスクリーニングにより得られていたこの種の遺伝子とは全く相違する多数の遺伝子を見出した。液体培養でのスクリーニングにより見出される遺伝子は、固体培養でのスクリーニングにより見出される遺伝子とはある程度は一致するものと考えられていたところ、本発明者らが分泌性タンパク質の分泌促進を再確認できた９６種の遺伝子のうち、１遺伝子のみが固体培養でのスクリーニングにより得られた遺伝子と重複しているに過ぎなかった。このような遺伝子の相違は予想を超えるものであった。
【００２０】
本発明者らが見出した外来性タンパク質高生株は、使用した遺伝子破壊株において特定の遺伝子が破壊されたことにより異種分泌性タンパク質が高生産されたと考えられる。特定遺伝子が破壊される前の正常な状態では、その遺伝子によって外来性タンパク質の細胞外への生産量が直接または間接的に抑えられていたと考えられる。外来性タンパク質高生産株の中には、vacuolar protein mis-sorting（vps）遺伝子破壊株の一部が含まれた。これらの遺伝子破壊株は、通常細胞内の液胞へソーティングされる内在性タンパク質が細胞外へミスソーティングされ細胞外へ分泌される株である。内在性のタンパク質でも本来の機能を果たせない異常なタンパク質は、液胞内で分解される。本発明を拘束するものではないが、外来性タンパク質が異常なタンパク質と認識され、液胞で処理されるところが、遺伝子が破壊されたために細胞外へ分泌されているのではないかと考えられる。また、vma2, vma4, vma7やsnf7, snf8など液胞の機能に関わる遺伝子破壊株が数多く取得されている。よって液胞の機能が外来タンパク質の高生産に大きく寄与していると考えられる。
【００２１】
本発明によれば、本発明者らが見出した、液体培養において、不活性化されることにより外来性タンパク質の分泌生産を促進する遺伝子を利用することで、異種分泌性タンパク質を高生産する酵母形質転換体のほか、このような形質転換体に利用する宿主、ベクターも提供される。さらに、こした酵母形質転換体を利用することでタンパク質を高効率で生産することができるほか、セルロース含有材料の分解、利用も効率的に実施することができる。
【００２２】
以下、本発明の各種実施形態について詳細に説明する。これらの各種実施形態について詳細に説明する。
【００２３】
(形質転換体)
本発明の酵母形質転換体は、１種又は２種以上の外来性タンパク質をコードするＤＮＡを保持し、宿主の第１の遺伝子群から選択される１種又は２種以上が不活性化されている。以下、宿主、異種分泌性タンパク質及び不活性化対象である遺伝子群につき、順次説明する。
【００２４】
（宿主）
本発明の形質転換体の宿主酵母は、特に限定されないで公知の各種酵母を利用できる。後述するエタノール発酵等を考慮すると、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピヒア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。
【００２５】
（外来性のタンパク質をコードするＤＮＡ）
外来性のタンパク質とは、宿主酵母にとって外来性であればよい。したがって、同じ酵母に属する他の酵母に由来するタンパク質であっても外来性タンパク質に包含される。外来性タンパク質とは、好ましくは、酵母以外の微生物を含む生物に由来するタンパク質である。
【００２６】
外来性タンパク質は、酵母において分泌性を有していることが好ましい。本明細書においてタンパク質の分泌性とは、宿主酵母において膜タンパク質（細胞表層提示タンパク質を含む）又は分泌タンパク質として生産されるタンパク質であることを意味する。分泌性を有する外来タンパク質としては、それ自体が酵母においても膜タンパク質又は分泌タンパク質となりうるものを用いることができるほか、そのような分泌性を有していなくとも、公知の分泌シグナルを連結した融合タンパク質であってもよい。また、それ自体分泌性を有していても、宿主酵母に合わせて分泌シグナルが改変されていてもよい。分泌シグナル等については後段にて説明する。なお、本明細書において、細胞表層提示タンパク質における表層提示形態は特に限定されない。酵母の細胞表層に直接的であっても間接的であっても保持され提示されていればよい。
【００２７】
このような外来性の分泌性タンパク質としては、適宜選択できるが、例えば、セルロース含有材料を分解する観点からは、エンドグルカナーゼ、セロビロヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼなどの各種セルラーゼのほか、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ及びラッカーゼなどのリグニン分解酵素が挙げられる。また、例えば、セルロース緩和タンパク質であるスウォレニンやエクスパンシン、セルロソームやセルラーゼの構成部分であるセルロース結合ドメイン（タンパク質）が挙げられる。また、キシラナーゼやヘミセルラーゼ等のその他のバイオマス分解酵素も挙げられる。これらのタンパク質は、いずれもセルロースへのセルラーゼのアクセシビリティを向上させることができる。
【００２８】
外来性分泌性タンパク質としては好ましくは、エンドグルカナーゼ（EC 3.2.1.74）、セロビオヒドロラーゼ（EC 3.2.1.91）及びβ−グルコシダーゼ（EC23.2.4.1、EC 3.2.1.21）が挙げられる。これらを酵母に大量に分泌生産させることで、セルロース含有材料を効率的に分解できるようになる。なかでも、結晶性セルロースを分解するほか、セルロースを効率的に低分子化するためにエンドグルカナーゼを発現させることが好ましい。なお、セルラーゼは、そのアミノ酸配列の類似性に基づきＧＨＦ（Glycoside Hydrolase family）(http://www.cazy.org/fam/acc.gh.html)の１３（５，６，７，８，９，１０，１２，４４，４５，４８，５１，６１，７４）のファミリーに分類されている。異なるファミリーに分類される同種又は異種のセルラーゼを組み合わせてもよい。
【００２９】
セルラーゼとしては、特に限定しないが、それ自体活性の高いセルラーゼであることが好ましい。このようなセルラーゼとしては、例えば、ファネロケーテ（Phanerochaete）属菌、Trichoderma reeseiなどのトリコデルマ属（Trichoderma）菌、フザリウム属（Fusarium）菌、トレメテス属（Tremetes）菌、ペニシリウム属（Penicillium）菌、フミコーラ属（Humicola）菌、アクレモニウム属（Acremonium）菌、アスペルギルス属（Aspergillus）菌等の糸状菌の他に、クロストリジウム属（Clostridium）菌、シュードモナス属（Pseudomonas）菌、セルロモナス属（Cellulomonas）菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）菌、バチルス属（Bacillus）菌等の細菌、スルフォロバス属（Sulfolobus）菌等の始原菌、さらにストレプトマイセス属（Streptomyces）菌、サーモアクチノマイセス属（Thermoactinomyces）菌などの放射菌由来のセルラーゼが挙げられる。なお、こうしたセルラーゼは、人工的に改変されていてもよい。
【００３０】
本発明の形質転換体は、外来性のタンパク質をコードするＤＮＡを保持している。このコード化ＤＮＡは、宿主酵母内においてタンパク質として発現可能に保持されている。具体的には、宿主酵母で作動可能なプロモーター（典型的には酵母プロモーター）の制御下に連結されるとともに適切なターミネーターをその下流に有した状態で保持されている。プロモーターは、構成的プロモーターであっても誘導的プロモーターであってもよい。このような状態のＤＮＡは、宿主染色体内に組み込まれた形態であってもよいし、宿主核内に保持される２μプラスミドや核外に保持されるプラスミドのような形態であってもよい。一般には、こうした外来ＤＮＡの導入に伴って、宿主において利用可能な選択マーカー遺伝子も同時に保持されている。
【００３１】
（不活性化対象となる遺伝子）
本発明の形質転換体において不活性化されていることが好ましい遺伝子、不活性化により外来性の分泌性タンパク質の分泌生産を促進する活性を有する遺伝子を、以下の表に示す。
【００３２】
【表１】
2009240185.tif 000002
【００３３】
表１中Ａ欄の計９６種の遺伝子は、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）のＧＨＦ８に属するセルラーゼ（エンドグルカナーゼ）であるCel8A（以下、Ctcel8Aという。）を外来性の分泌生産性タンパク質として特定遺伝子が不活性化された酵母に導入し、液体培養して得られた培養上清のエンドグルカナーゼ活性に基づいてスクリーニングされたものである。
【００３４】
これら９６種の遺伝子は、不活性化により外来性分泌性タンパク質の分泌生産を促進する活性の程度に応じて３群（表１Ｂ欄〜Ｄ欄）に分けることができる。表１Ｂ欄に記載の遺伝子は、９６種のうち不活性化による分泌生産促進活性が最も高いものであり、表１Ｃ欄に記載の遺伝子は、次に分泌生産促進活性が高いものであり、表１Ｄ欄に記載の遺伝子は、次いで分泌生産促進活性が高いものである。
【００３５】
また、表１Ａ欄に示す９６種の遺伝子のうち、不活性化によりＧＨＦ８に属するセルラーゼの富栄養培地での分泌生産を促進する遺伝子を一つのサブグループ（表１Ｅ欄）に分類できる。さらに、不活性化によりＧＨＦ５に属するクロストリジウム・セルロヴォランス（Clostridium cellulovorans）の富栄養培地でのセルラーゼ（エンドグルカナーゼ）（Cccel5A）の分泌生産を促進する遺伝子を一つのサブグループ（表１Ｆ欄）に分類できる。ＧＨＦ８及び１５に共通する遺伝子は、表１のＥ欄及びＦ欄において下線を施した遺伝子である。これらの遺伝子は、双方のファミリーのセルラーゼを活性化できるため、これら２種類のセルラーゼを同時に分泌生産させるのに好ましく用いることできる。
【００３６】
表１の遺伝子群は、ＧＨＦ８に属するエンドグルカナーゼを外来性分泌性タンパク質として分泌生産させたときの活性で評価して得られたものであるが、表１Ｅ欄及びＦ欄に示すように、異なる培養条件及び異なるＧＨＦのセルラーゼについても表１Ａ欄記載の遺伝子の不活性化が有効であることがわかる。このことは、表１Ａ欄に記載の遺伝子の不活性化が、アミノ酸類似性を超えて外来性分泌性タンパク質の分泌生産に広く有用であることを支持している。
【００３７】
表１に示す酵母の各遺伝子の塩基配列等については、特にS. cerevisiaeなどのサッカロマイセス属に関しては、サッカロマイセスゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/）から取得することができる。また、サッカロマイセス属を含め、これらの遺伝子については、米国国立衛生研究所ＨＰ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のブラストサーチサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）等において取得できる。
【００３８】
本発明の形質転換体においては、上記遺伝子のいずれかあるいは２種類以上が不活性化されている。ここで、遺伝子が不活性化されているとは、少なくとも、宿主酵母内で、（１）当該遺伝子の転写又は翻訳が完全に抑制又は部分的に抑制されている状態、（２）当該遺伝子に変異が導入されており、本来の機能を全く発揮できない程度に不完全なタンパク質を発現する状態が含まれる。こうした不活性化状態は、典型的には、当該遺伝子のプロモーターなどの調節領域又はコード領域に変異が導入されることにより実現される。具体的には、相同組換えによりこうした不活性化体を得ることができる。表１において示す各酵母遺伝子が破壊された株は、Open Biosystems社（米国）より入手することができる。
【００３９】
本発明の形質転換体は、液体培養における外来性タンパク質の分泌生産が、表１に示す遺伝子から選択される１種又は２種以上の遺伝子が不活性化されていないときよりも促進されているという特徴を有することができる。すなわち、宿主が野生型（表１に示す遺伝子が不活性化されていない）である以外は、同様に外来性分泌性タンパク質をコードするＤＮＡを導入して得られた形質転換体よりも外来性分泌性タンパク質の分泌生産が促進されている。
【００４０】
液体培養の条件は特に限定しないで、例えば、実施しようとしている液体培養プロセスを考慮して適宜設定できる。したがって、富栄養培地であっても貧栄養培地であってもよいし、使用する酵母に合わせてｐＨも適宜設定することができるほか、培地にｐＨ緩衝能を付与してもしなくてもよい。通常、酵母の一般的な培地であるＹＰＤ培地やＳＤ培地及びこれらに対して適宜改変した培地を用いることができる。
【００４１】
外来性分泌性タンパク質の分泌生産が促進されているかどうかは、当該外来性分泌性タンパク質の分泌生産量又は当該分泌性タンパク質の活性により評価することができる。好ましくは、本発明の形質転換体と対比すべき野生型形質転換体とを一定期間液体培養して得られた培養上清につき、当該タンパク質量等を評価する。
【００４２】
タンパク質量及びタンパク質の活性測定方法は、タンパク質の種類に応じて適宜選択することができる。当該タンパク質が酵素等であれば、公知の手法で酵素活性を測定してもよい。例えば、外来性分泌性タンパク質がエンドグルカナーゼなどのセルラーゼである場合には、採取した培養上清につき、適当なセルラーゼ基質（カルボキシメチルセルロース、リン酸セルロース、結晶性セルロース等）と反応させて反応生成物量や基質量等を測定することで酵素活性を評価できる。反応温度、ｐＨ及び時間は、酵素の種類等において適宜設定することができる。なお、酵素反応の結果生じる還元糖量の定量法としてはSomogyi法、Tauber-Kleiner法、Hanes法（滴定法）、Park-Johnson法、3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）法、ＴＺ法（Journal of Biochemical Methods, 11(1985)109-115）等の公知の方法を適宜採用すればよい。
【００４３】
また、エンドグルカナーゼなどのセルラーゼ活性は、カルボキシルメチルセルロースなどのセルロースを含有する固相体からなる評価領域に本発明としての可能性のある被験タンパク質を供給し、当該領域の固相体中のセルロースを分解させて、固相体中でセルロースが分解されて消失した領域（ハロー：固相体においてバイオマスの分解により淡色化又は無色化する領域）の大きさでエンドグルカナーゼ活性を評価することもできる。固相体におけるセルロース消失に基づくハローは、目視等により視認することができるほか、ハロー検出時にコンゴーレッドなどで、セルロースを染色することで明瞭にハローを検出することができる。また、バイオマスとして色素結合セルロース（例えば、Cellulose Azure、Sigma社製など）を用いた場合、セルロースの分解により色素が固相体中に拡散しハローを形成するため、容易にセルロース分解活性を検出することができる。同様に蛍光色素を結合したセルロースもバイオマスとして利用することでハローを容易に検出することができる。さらに、酸処理セルロースなどをバイオマスとして用いた場合にもセルロースの分解により透明なハローを形成するため、セルロース分解活性を容易に検出することができる。
【００４４】
ハロー形成用の固相体は、例えば、バイオマスを担持するゲルやフィルムが挙げられる。ゲルやフィルムの構成材料は特に限定しないで、天然又は人工の高分子材料を好ましく用いることができる。このような高分子材料としては、アガロース（寒天）を好ましく用いることができる。
【００４５】
（酵母形質転換体の作製）
以上説明した本発明の形質転換体は、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて作製することができる。好ましくは、表１に示す遺伝子の１種又は２種以上が予め不活性化された宿主酵母に対して、外来性の分泌性タンパク質をコードするＤＮＡを有する発現ベクター等を導入し、宿主酵母を形質転換することにより得ることができる。
【００４６】
宿主酵母としては、Open Biosystems社（米国）より入手することができるほか、破壊しようとする遺伝子のプロモーターなどの調節領域又はコード領域に変異を導入することで取得できる。特定遺伝子の不活性化は、例えば、相同組換え法を利用して、特定の遺伝子に変異を導入したり、別の遺伝子を導入したりすること等により可能である。
【００４７】
本発明の酵母において外来性タンパク質を発現させるためのベクターの一つの形態は、表１に記載の遺伝子から選択される１種又は２種以上を不活性化するためのベクターが挙げられる。このベクターは、不活性化する遺伝子又はその近傍と相同領域を有しており、この相同領域を介して当該ベクターが保持するＤＮＡ領域で当該遺伝子又はその近傍を置換することで当該遺伝子を不活性化するものである。このような相同組換えのためのベクター及びその作製は、当業者において周知であって、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に開示されている。
【００４８】
なお、２以上の特定遺伝子が不活性化された宿主酵母も、公知の各種方法による遺伝子導入や入手可能な破壊株を利用することによって取得することができる。
【００４９】
また、酵母において外来性の分泌性タンパク質を発現させるためのベクターの他の一つの形態は、所望の外来性分泌性タンパク質のコード化領域を有している。発現させようとするタンパク質は、酵母において細胞外への分泌性を備えていることが好ましい。こうした分泌性は意図するタンパク質が本来的に有する場合のほか、分泌シグナル等を用いて人工的に付与することができる。例えば、すなわち、分泌性を付与するアミノ酸配列のコード化ＤＮＡを外来性タンパク質のコード化領域に連結することができる。分泌シグナルとしては、例えば、Rhizopus oryzaeのグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナルなどが挙げられる。また、凝集性タンパク質あるいはその一部を用いることでタンパク質を酵母の表層に提示した状態に分泌させることができる。例えば、凝集性タンパク質であるα−アグルチニンをコードするSAG1遺伝子の５’領域の３２０アミノ酸残基からなるペプチドがある。また、所望のタンパク質を細胞表層に提示するためのポリペプチドや手法は、ＷＯ０１／７９４８３号公報や、特開２００３−２３５５７９号公報、ＷＯ２００２／０４２４８３号パンフレット、ＷＯ２００３／０１６５２５号パンフレット、特開２００６−１３６２２３号公報、藤田らの文献（藤田ら，2004. Appl Environ Microbiol 70:1207-1212および藤田ら, 2002. Appl Environ Microbiol 68:5136-5141.）、村井ら, 1998. Appl Environ Microbiol 64:4857-4861.に開示されている。
【００５０】
本発明のベクターは、上記したタンパク質のコード化ＤＮＡとともに調節領域（プロモーター及びターミネーター等）を備えるほか、適宜選択マーカー遺伝子の発現カセットを備えることができる。ベクターは、形質転換の手法や宿主細胞における当該コード化ＤＮＡの保持形態（染色体に導入する形態や染色体外に保持する形態等）に応じて、上記コード領域以外の構成要素（相同組換えにより染色体への導入を意図する場合には、酵母染色体ＤＮＡとの相同性領域が必要となる。）が適宜決定される。また、ベクターの形態は、使用形態に応じて様々な形態を採ることができる。例えば、ＤＮＡ断片の形態を採ることができるほか、２マイクロプラスミドなどの適当な酵母用ベクターの形態を採ることもできる。
【００５１】
このようなベクターで適当な酵母宿主を適宜形質転換することによって本発明の酵母形質転換体を得ることができる。形質転換にあたり、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることができる。
【００５２】
（セルロース含有材料の分解産物の製造方法）
本発明のセルロース含有材料の分解産物の製造方法は、セルラーゼを外来性タンパク質として分泌生産する本発明の酵母形質転換体を準備する工程と、セルロース含有材料を炭素源として含有する液体培地で前記酵母形質転換体を培養する工程と、を備えることができる。本発明の製造方法によると、セルロース含有材料を糖化するためのセルラーゼの添加をすることなく又はその添加量を抑制してセルロース含有材料を酵母により直接利用できる。このため、効率的にセルロース含有材料を利用できる。
【００５３】
（形質転換体の準備）
酵母形質転換体が分泌生産するセルラーゼとしては、既に説明した各種セルラーゼのうち１種又は２種以上組み合わせて用いることができる。好ましくは２種類以上のセルラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼ等）とすることができる。なお、２種類以上のセルラーゼは、１種の形質転換体が分泌生産するものであってもよいが、それぞれのセルラーゼを分泌生産する２種類以上の形質転換体であってもよい。そのほか、本発明の製造方法で用いる形質転換体については、既に説明した本発明の形質転換体についての各種態様を適用することができる。
【００５４】
（液体培養）
上記のような酵母形質転換体を液体培地で液体培養するには、セルロース含有材料を炭素源の少なくとも１種類として用いる以外は、公知の液体培地を利用しあるいは適宜改変して用いることができる。培地組成、温度、ｐＨ、通気条件等は必要に応じて適宜設定することができる。
【００５５】
セルロース含有材料は、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合により重合した重合体及びその誘導体を含んでいる。グルコースの重合度は特に限定しない。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体が挙げられる。セルロース は、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよい。また、セルロースは、その部分分解物である、セロオリゴ糖、セロビオースであってもよい。セルロース含有材料は、配糖体であるβグルコシド、リグニン及び／又はヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチンなどとの複合体であってもよい。セルロース含有材料はその由来も特に限定しない。植物由来のものでも、真菌由来のものでも、細菌由来のものであってもよい。セルロース含有材料は、綿や麻などの天然繊維品、レーヨン、キュプラ、アセテート、リヨセルなどの再生繊維品、稲ワラ、籾殻、木材チップなどの農産廃棄物などが挙げられる。
【００５６】
本発明方法で得られるセルロースの分解産物は、グルコースのほか、セロビオース及びセロオリゴ糖が挙げられる。こうして得られるセルロースの分解産物は、通常のグルコースと同様、有用物質の発酵原料等に利用できる。なお、本発明の製造方法で用いる形質転換体としては、酵母本来のアルコール発酵性を有している場合には、後述するように、培養工程を実施することでアルコール（エタノール）を製造することができる。また、使用する形質転換体が遺伝子工学的に乳酸などの有機酸を製造するよう改変されている場合には、当該有機酸を製造することができる。
【００５７】
（セルロース含有材料からエタノールを製造する方法）
本発明のエタノールの製造方法は、セルラーゼを外来性タンパク質として分泌生産する本発明の酵母形質転換体を準備する工程と、セルロース含有材料を炭素源として含有する液体培地で酵母形質転換体を培養してアルコール発酵させる工程と、を備えることができる。本発明の製造方法によると、セルロース含有材料を糖化するためのセルラーゼの添加をすることなく又はその添加量を抑制してセルロース含有材料を酵母により直接利用してエタノールを製造できる。このため、従来に比してセルラーゼコストを低減してエタノールを製造することができる。本発明のエタノール製造方法は、本発明のセルロース含有材料の分解産物の製造方法において、酵母形質転換体としてアルコール発酵性を有しているものであればよい。
【００５８】
（タンパク質の製造方法）
本発明のタンパク質の製造方法は、本発明の形質転換体を準備する工程と、前記形質転換体を液体培地を用いて培養する工程と、を備える、ことができる。本発明の酵母形質転換体によれば、所望の外来性タンパク質を効率的に分泌生産させることができるため、タンパク質の製造にも有利である。培養工程において用いる液体培地の組成、温度、ｐＨ等の条件は、適宜設定することができる。培養工程で得られる培養上清には、本発明の形質転換体によって分泌生産されたタンパク質が含まれている。当該タンパク質が酵素等の場合には、これを精製してもよいが、培養上清をそのまま酵素液として用いてもよい。
【００５９】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下に述べる遺伝子組換え操作はMolecular Cloning： A Laboratory Manual (T. Maniatis, et al., Cold Spring Harbor Laboratory) に従い行った。
【実施例１】
【００６０】
セルラーゼ発現プラスミドの構築
TDH3プロモーター、CYC1ターミネーター、マーカーURA3を持つ酵母発現用2ミクロンベクターのSacII-SpeI間にRhizopus Oryzae由来グルコアミラーゼのシグナルペプチドを導入した。本シグナルペプチドの下流SphI-SpeI間にClostridium thermocellum（以下C.thermocellum）のエンドグルカナーゼCel8A(以下Ctcel8A)、またはClostridium cellulovorans  (以下C.cellulovorans)のエンドグルカナーゼcel5A(以下Cccel5A)の導入を行った（図１）。作製したプラスミドDNAはCtcel8AはpRSA436GAPcelA, Cccel5AはpRS436GAPCccel5Aと名付けた。
【実施例２】
【００６１】
酵母菌でのエンドグルカナーゼ活性の確認
Saccharomyces cerevisiaeのS288C株由来の２倍体酵母菌BY4743（遺伝型：MATa/αhis3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0 lys2Δ0/LYS2 MET15/met15Δ0 ura3Δ0/ura3Δ0）へpRS436GAPcelAを酢酸リチウム法によって形質転換した。YPDプレートに酵母をストリークし、30℃で1日培養後、形質転換液（35μlの６０％ポリエチレングリコール平均分子量3350＋2.5μlの４M酢酸リチウム＋5μlの１M ジチオスレイトール＋5μlの10mg/ml 鮭精子DNAにpRS436GAPcelAを1μlを混ぜ、全量50μlになるように滅菌水を加える）に酵母を培養したYPDプレートからかきとり混ぜた。形質転換液を42℃で2時間熱を加え、SD-uracil（0.67% YNB w/o a. a. +2% グルコース＋アミノ酸ミックス（-uracil））培地にまいた。アミノ酸ミックス(-uracil)は、アデニン０．５ｇ、トリプトファン２ｇ、ヒスチジン塩酸塩２ｇ、メチオニン２ｇ、ロイシン４ｇ、リシン塩酸塩２ｇを１リットル当たり０．６ｇ加えた。培地のpHを制御した場合にエンドグルカナーゼ活性に変化が起こるかどうかを調べた。YPD培地（1% yeast extract, 2% peptone+2% glucose）、SD-uracil培地、SD-uracilに0.1 M KPO4を加えpH緩衝した培地で培養した培養上清を、エンドグルカナーゼ活性を検出することができる0.1% カルボキシメチルセルロース入りの2％ 寒天培地 (以下、CMC培地)にスポットし、40℃で１日反応させた。0.1% CongoRed /1 M Tris (pH9)(以下、コンゴーレッド液)でプレートを染色し、1 M NaClで脱色後、エンドグルカナーゼ活性がある染色されないハロ（円）を確認した（図２）。培養pHの低下によってcelAのエンドグルカナーゼ活性は大きく低下した。以上のことから、以後のエンドグルカナーゼ活性の評価にあたっては、ｐＨ低下を抑制した状態を確保することとした。
【実施例３】
【００６２】
酵母遺伝子破壊株ライブラリーへの形質転換
「実施例１」で構築したプラスミドpRS436GAPcelAを2倍体酵母遺伝子破壊株ライブラリーへ形質転換した。方法は、YPDプレートに保存した破壊株ライブラリーをYPD 25μlを入れた96ウェルマイクロプレートに植菌し、30℃で１日静地培養後、培養液を混ぜ、文献５に記載の形質転換液に鮭精子DNAを加えた形質転換液（3500μlの60% ポリエチレングリコール平均分子量3350＋250μlの1 M ジチオスレイトール＋ 250μlの4 M 酢酸ナトリウム＋250μｌの10 mg/ml鮭精子DNA＋250μlのpRS436GAPcelAのDNA溶液）と混ぜた後、42℃で2時間熱を加え、SD-uracil培地へスポットした（図３）。
【実施例４】
【００６３】
Ctcel8A高生産酵母変異株のスクリーニング
Ctcel8A高生産する酵母変異株をスクリーニングするために、Ctcel8Aの形質転換したプレートから株をSD-uracilが50μl入った96ウェルマイクロプレートで30℃で1日振とう培養し、培養上清を5μlを8レーンピペットでCMC培地にスポットし、40℃で1日反応させ、コンゴーレッド液で染色し、1 M NaClで脱色した。エンドグルカナーゼ活性のあるハロが他の遺伝子破壊株よりも大きい株を226株取得した（図４）。
【実施例５】
【００６４】
Ctcel8A高生産酵母変異株の再確認
スクリーニングで得られたCtcel8A高活性株226株の再現性を得るために、取得した高活性株をひと株ずつ試験管でSD-uracil培地で振とう培養し、実施例２と同様の操作で野生型のBY4743よりも高活性な株として147株の再現性を得た。Ctcel8A高生産株147株の栄養要求性を確認するためにSD-U-M-K (0.67% YNB w/o a. a. +2% グルコース＋アミノ酸ミックス（-U-M-K）)培地へストリークし、増殖できない株を高生産株から除き、117株になった。SD-U-M-K培地のアミノ酸ミックス(-U-M-K)は、アデニン０．５ｇ、トリプトファン２ｇ、ヒスチジン塩酸塩２ｇ、ロイシン４ｇを１リットル当たり０．４ｇをSD培地に混ぜた。使用した破壊株ライブラリーは2倍体なので、取得した高活性株に1倍体が混ざっていると1倍体とmatingするはずである。一倍体を除くために、N435-1A (遺伝型：MATa his7 lys7 met6 arg1 gal4 MAL2 SUC)、N435-2A (遺伝型：MATα his7 lys7 met6 arg1 gal4 MAL2 SUC)と高生産株をYPDプレート上で混ざるようにストリークし、30℃で1日培養した。培養したプレートを最小培地（0.67% YNB w/o a. a. +2% グルコース）へレプリカした。7株が最小培地で増殖したので除き、110株となった。もう一度野生型（BY4743株）と活性の差がほとんどない株を除くために、再度試験管でSD-uracil培地で培養し、実施例２と同様の方法で再実験を行い96株の再現性が確認できた。96株をCtcel8A高活性株とし、活性の強さを+++、++、+の3段階に分類した（図５〜図７）。
【００６５】
これら９６株については、外来性タンパク質を分泌生産するのに好ましい変異を有しているといえる。すなわち、これらの株において破壊されている遺伝子は、外来性タンパク質を分泌生産させるのに不活性化することが好ましい遺伝子であることがわかった。
【実施例６】
【００６６】
Ctcel8A高活性株の富栄養培地での活性
スクリーニングで得られた96株のCtcel8A高活性株を富栄養培地であるYPD培地で培養し、100倍希釈した培養上清の活性を実施例２と同様の方法（CMC培地にスポットし、40℃で１日反応させた後、0.1% CongoRed /1 M Tris (pH9)(以下、コンゴーレッド液)でプレートを染色し、1 M NaClで脱色した。）で調べたところ、25株が野生型のBY4743よりも高活性であった。これらの遺伝子破壊株に対してCtcel8Aを再形質転換し、増殖の悪かった2株は除き、21株が野生型のBY4743よりも高活性であった（図８）。2株は再現性が得られなかった。以上のことから、この実施例で取得できた株は、培地の組成に関わらず、高活性を示すことがわかった。
【実施例７】
【００６７】
Cccel5Aでの富栄養培地での活性
実施例６で再形質転換して得られた23株に対して、Clostridium cellulovoransのエンドグルカナーゼCccel5Aを発現する実施例１記載のプラスミドpRS436GAPCccel5A（図１）を形質転換した。YPD培地で培養し、50倍希釈した培養上清の活性を実施例２と同様の方法で調べたところ、14株が野生型のBY4743よりも高活性であった（図９）。残り9株は、BY4743と活性は変わらなかった 。以上のことから、本実施例で高活性の確認された変異株は、ＧＨＦ５及び８の双方を分泌生産するのに有用であること、すなわち、これらの変異株において破壊されている遺伝子の不活性化が外来性タンパク質の分泌生産に有効であることがわかった。
【実施例８】
【００６８】
Ctcel8A及びCccel5Aの染色代導入用ベクターの作製
セルラーゼを染色体に導入するためのベクターpAH-HORp-Ctcel8A, pAH-HOR7p-Cccel5Aを作製した（図１０）。AAP1遺伝子の上流-3000bpから-2000bpまでの配列（以下AAP1Uと呼ぶ）をS288CのゲノムDNAからPCR反応により、クローニングした。AAP1遺伝子の上流-2000bpから-1000bpまでの配列（以下AAP1D）をS288CのゲノムDNAからPCR反応により、クローニングした。遺伝子導入の確認用マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を連結した。C.thermocellum (ATCC27405), C.cellulolyticum (ATCC35319)の培養菌体からゲノムを抽出後、分泌シグナル配列を除くセルラーゼ遺伝子C.thermocellum由来Cel8A (ABN51508)約1.3kb及びC.cellulolyticum由来Cel5A(AAA51444)約1.3kbをPCR法により取得した。取得した遺伝子断片をCel8Aは制限酵素KpnI-BglII、Cel5AはKpnI-BamHI部位にて染色体導入用ベクター内Rhizopus Oryzae由来グルコアミラーゼのシグナルペプチド下流に挿入した。
【実施例９】
【００６９】
vps3遺伝子破壊株でのCtcel8A及びCccel5A染色体導入株の効果
実施例８で作製したプラスミドpAH-HOR7p-Ctcel8A、pAH-HOR7p-Cccel5Aを形質転換した。形質転換方法はBY4743及び、vps3破壊株をYPD培地で30℃、1日培養し、YPD培地で再度5時間30℃で培養した。培養液は遠心して回収し、再度滅菌水で洗浄後、遠心して回収した。60%ポリエチレングリコール平均分子量3350を120μl、4M 酢酸リチウムを5μl、1M ジチオスレイトールを10μl、制限酵素Sse8387IでプラスミドDNAの染色体導入部を線上DNAにした後、DNA溶液を5μl加え、細胞懸濁液を50μl加え、懸濁後、42℃で1時間反応させた。反応液を遠心後、YPD培地を加え、30℃で一晩回復培養を行った。培養液はYPDに最終濃度が150μg/mlのハイグロマイシンBが入ったプレートにまき、30℃で増殖させた。  ハイグロマイシン耐性になったコロニーを再びシングルコロニー化した。コロニーをYPDプレートで再度増殖させた。YPD培地で30℃1日培養後、培養液を遠心し、培養上清をx1, x2, x4, x8, x16, x32倍希釈した。上清8μlをCMC培地へスポットし、40℃で1日反応させた。コンゴーレッド液で染色し１M NaClで脱色し、活性を確認した（図１１）。BY4743と比べて、vps3破壊株はCtcel8Aでは８倍以上、Cccel5Aでは３２倍以上の活性上昇が認められた。
【００７０】
上記のCtcel8A及びCccel5A染色体導入株をSD+complement培地（0.67% YNB w/o a. a. +2% グルコース+アミノ酸ミックス（complement）、 pHをNaOHで６に調整した）培地とSD+complemnent+0.1M NaAc培地（0.67% YNB w/o a. a. +2% グルコース+アミノ酸ミックス(complement)＋0.1M 酢酸ナトリウムを加えｐHをHClで６に調整）培地で培養した。アミノ酸ミックス(complement)は、アデニン０．５ｇ、ウラシル２ｇ、トリプトファン２ｇ、ヒスチジン塩酸塩２ｇ、メチオニン２ｇ、ロイシン４ｇ、リシン塩酸塩２ｇを混ぜ、１リットル当たり０．６ｇを加えた。培養後、培養上清をCMC培地へ8μlスポットした。プレートを40℃で1日反応後、コンゴーレッド液で染色し1M NaClで脱色した（図１２）。酢酸ナトリウムで培地のｐHを下げないように緩衝した場合（SD+complement+0.1M NaAc培地）では、野生型（BY4743株）よりもvps3破壊株のほうが活性が約2倍程度上昇した。一方ｐHを緩衝しない培地（SD+complement）では、培地ｐHの低下によりBY4743は活性が確認できなかったが、vps3破壊株では活性が確認できた。よって、YPD培地と同様に、SD培地のような貧栄養培地でもvps3破壊株はセルラーゼを高生産できることが確認できた。
【００７１】
以上のことから、vps3遺伝子を不活性化した酵母においては、外来性タンパク質のコード化ＤＮＡが染色体導入形態であっても外来性タンパク質の高度な分泌生産活性が得られることがわかった。すなわち、安定して外来タンパク質を高活性で分泌生産できることがわかった。また、貧栄養及び低ｐＨに対する耐性も野生型よりも向上していることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】セルラーゼを酵母で発現させるためのプラスミドの構造を示す図である。
【図２】各種培地の培養上清についてのCtcel8Aのエンドグルカナーゼ活性の評価結果を示す図である。
【図３】Ctcel8A発現プラスミドの酵母遺伝子破壊ライブラリーへの形質転換を示す図である。
【図４】Ctcel8A形質転換体の高活性株のスクリーニング結果を示す図である。
【図５】Ctcel8Aの高生産酵母変異株（活性程度＋＋＋）を示す図である。
【図６】Ctcel8Aの高生産酵母変異株（活性程度＋＋）を示す図である。
【図７】Ctcel8Aの高生産酵母変異株（活性程度＋）を示す図である。
【図８】富栄養培地（YPD）でのCtcel8Aの活性を示す図である。
【図９】富栄養培地（YPD）でのCccel5Aの活性を示す図である。
【図１０】Ctcel8A及びCccel5Aの染色体導入用プラスミドの構造を示す図である。
【図１１】富栄養培地で培養したセルラーゼ染色体導入株でのvps3破壊株の活性の評価結果を示す図である。
【図１２】貧栄養培地で培養したセルラーゼ染色体導入株でのvps3破壊株の活性の評価結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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