(57)【要約】      （修正有）【課題】抗癌剤の副作用の危険性を予測するための検査方法の提供。【解決手段】特定の塩基配列の特定の塩基の一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて抗癌剤の副作用の危険性を検査する方法。特定の塩基配列の抗癌剤の副作用の危険性を検査するためのプローブ。特定の塩基配列において、特定の塩基を含む領域を増幅することのできる、抗癌剤の副作用の危険性を検査するためのプライマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における一塩基多型、配列番号２の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における一塩基多型、または前記いずれかの塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて抗癌剤の副作用の危険性を検査する方法。
【請求項２】
配列番号１〜９のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、抗癌剤の副作用の危険性を検査するためのプローブ。
【請求項３】
配列番号１〜９のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる、抗癌剤の副作用の危険性を検査するためのプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗癌剤の副作用の危険性を検査する方法およびそれに使用するプローブやプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ドセタキセル（商品名タキソテール）は難治性乳癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、頭頸部癌などの治療に使用されている。しかしながら、白血球や好中球の減少症などの副作用を呈することが知られており、好中球減少症の発症は患者の約３６％にも及ぶ。ドセタキセルなどの抗癌剤について、副作用が起こりやすい患者を予測できれば、抗癌剤の投与を控える、あるいは抗癌剤の投与量を減らすことができ、治療方針の決定に大変有用である。
ドセタキセルの副作用を予測する従来法としては、副作用の発現は薬剤の全身的曝露量に依存するという観点から、薬剤投与後の血中ドセタキセル濃度をモニタリングする方法
(therapeutic drug monitoring：TDM) が挙げられる。しかしながら、TDMは手技的に煩雑であり、また、薬剤投与開始前に副作用発症リスクを予測することができない。
これまで、抗癌剤の副作用と遺伝子多型との相関を調べた報告としては、ドセタキセルやドキソルビシンなどの抗癌剤による副作用とHNF4αやCARなどの転写因子の遺伝子型について調べた報告がある（非特許文献１）が、これらの遺伝子多型と抗癌剤の副作用との相関は十分なものではなかった。
【０００３】
SLCO1B3遺伝子はOATP1B3とも呼ばれ、血液中から肝臓に薬剤を取り込む肝臓の薬剤トランスポーターとして機能することが報告されている（非特許文献２）。
また、ABCC２遺伝子はMRP2とも呼ばれ、肝細胞から胆汁中に薬剤を排出する肝臓の薬剤トランスポーターとして機能することが報告されている（非特許文献３）。
しかしながら、これらの遺伝子における一塩基多型と抗癌剤の副作用との関連は示されていない。
【非特許文献１】Hor SY, Lee SC, Wong CI, Lim YW, Lim RC, Wang LZ, Fan L, Guo JY, Lee HS, Goh BC, Tan T. PXR, CAR and HNF4alpha genotypes and their association with pharmacokinetics and pharmacodynamics of docetaxel and doxorubicin in Asian patients. Pharmacogenomics J 2007
【非特許文献２】Smith NF, Acharya MR, Desai N, Figg WD, Sparreboom A. Identification of OATP1B3 as a high-affinity hepatocellular transporter of paclitaxel. Cancer Biol Ther 2005; 4: 815-8.
【非特許文献３】Huisman MT, Chhatta AA, van Tellingen O, Beijnen JH, Schinkel AH. MRP2 (ABCC2) transports taxanes and confers paclitaxel resistance and both processes are stimulated by probenecid. Int J Cancer 2005; 116: 824-9.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、抗癌剤の副作用の危険性を正確に予測するための検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、SLCO1B3遺伝子およびABCC2遺伝子上に存在する特定の塩基の一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型が抗癌剤の副作用に関連することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）配列番号１の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における一塩基多型、配列番号２の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における一塩基多型、または前記いずれかの塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて抗癌剤の副作用の危険性を検査する方法。
（２）配列番号１〜９のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、抗癌剤の副作用の危険性を検査するためのプローブ。
（３）配列番号１〜９のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる、抗癌剤の副作用の危険性を検査するためのプライマー。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の検査方法により、抗癌剤の副作用の危険性を簡便かつ正確に予測することができ、抗癌剤の投与の可否、投与量の決定など癌の治療方針を決定するための優れた指標となりうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
＜１＞本発明の検査方法
本発明の検査方法は、染色体上の、配列番号１の６１番目の塩基または配列番号２の６１番目の塩基に相当する塩基の一塩基多型（SNP；single nucleotide polymorphism）または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析に基づいて抗癌剤の副作用の危険性を検査する方法である。
【０００９】
本発明の方法によって副作用の危険性を調べることのできる抗癌剤の種類としては、その輸送にABCC2やSLCO1B3が関与するものが挙げられ、具体的には、ドセタキセル、および、パクリタキセル、アクチノマイシンD、ミトキサントロン、イリノテカン（Cancer Lett
2007 Dec 13）、エトポシド、シスプラチン、ドキソルビシン、エピルビシン（Mol Pharmacol 1999; 55:929-37.）、イリノテカン（Clin Pharmacol Ther 2007; 81:42-9.）、メトトレキセート（Pharmacogenet Genomics 2005; 15:277-85.）などが挙げられる。
【００１０】
本発明の方法によって危険性を予測する抗癌剤の副作用としては、これまでに報告されている副作用を含め特に制限されないが、特に白血球減少または好中球減少が挙げられる。
白血球減少または好中球減少の程度は、NCI-CTC (National Cancer Institute - Common Toxicity Criteria) ver.2 (癌と化学療法、第28巻 第13号：1993-2027、2001) に定められており、本発明の方法によれば、遺伝子多型の種類によって、ドセタキセル投与期間内にグレード3または4の白血球減少または好中球減少が起こる可能性が高いなどと予測することができる。
なお、「検査」とは将来、副作用が生じるかどうかを予測するための検査、及び副作用の程度が悪化するかどうかを予測するための検査を含む。
【００１１】
配列番号１はABCC2（MRP2）遺伝子のゲノム配列（10q24）の一部であり、配列番号１の61番目の塩基はABCC2遺伝子の3'flanking+9190に相当し、G（グアニン：メジャーアレル）>C（シトシン：マイナーアレル）の多型（SNP）が存在する。このSNP（SNP-1）は、National Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）にrs12762549として登録されている。
配列番号１において、６１番目の塩基がCである場合は抗癌剤の副作用の危険性が高い
。また、アレルを考慮して解析した場合は、配列番号１の６１番目がCC＞CG＞GGの順で抗癌剤の副作用の危険性が高い。
【００１２】
配列番号２はSLCO1B3（OATP1B3）遺伝子のゲノム配列（12p12）の一部であり、配列番号２の61番目の塩基はSLCO1B3遺伝子のintron 11-5676に相当し、A（アデニン：メジャーアレル）>G（グアニン：マイナーアレル）の多型（SNP）が存在する。このSNP（SNP-2）は、dSNPデータベースにrs11045585として登録されている。
配列番号２において、６１番目の塩基がGである場合は抗癌剤の副作用の危険性が高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、配列番号２の６１番目がGG＞GA＞AAの順で抗癌剤の副作用の危険性が高い。
【００１３】
これらの塩基に相当する塩基を本発明においては解析する。ここで、「相当する」とは、ヒトABCC2またはSLCO1B3遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。
【００１４】
上記ＳＮＰの塩基の種類を調べることによって、抗癌剤の副作用の危険性を検査することができる。検査するＳＮＰの数は、一種類でもよいし、上記２種類のＳＮＰｓを合わせて解析してもよい。なお、上記遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
【００１５】
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．８の関係を満たす塩基をいう。
SNP-1と連鎖不平衡にあるSNPsとしては、rs7090705（配列番号３の61番目の塩基（C/T））, およびrs11190298（配列番号４の61番目の塩基（A/G））が挙げられる。
SNP-2と連鎖不平衡にあるSNPsとしては、rs4149160（配列番号５の61番目の塩基（A/G））、rs16923270（配列番号６の61番目の塩基（G/T））、rs12579674（配列番号７の61番目の塩基（A/T））、rs12582527（配列番号８の61番目の塩基（G/T））、rs4149155（配列番号９の61番目の塩基（A/C））が挙げられる。rs 番号はdbSNPデータベースの登録番号である。
【００１６】
上記遺伝子の一塩基多型の解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、細胞、毛髪等の体毛、爪などが挙げられる。一塩基多型の解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００１７】
上記遺伝子の一塩基多型の解析は、通常の一塩基多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
シークエンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンスを行う場合、あらかじめ多型を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００１９】
また、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによっても解析することができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、各多型に対応するプライマー
をそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００２０】
また、多型を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９２  Ｊａｎ  １；  １２（１）：  １３９−１４６．）が挙げられる。具体的には、まず、上記遺伝子の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００２１】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料をＰＣＲで増幅し、それを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってSNPがいずれの塩基であるかを調べることもできる。
【００２３】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、抗癌剤の危険性を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、ABCC2またはSLCO1B3遺伝子における上記多型部位を含み、ハイブリダイズの有無によって多型部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜９のいずれかの塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さはより好ましくは、１５〜３５塩基であり、２０〜３５塩基がさらに好ましい。
また、プライマーとしては、ABCC2またはSLCO1B3遺伝子における上記多型部位を増幅するためのPCRに用いることのできるプライマー、又は上記多型部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜９のいずれかの塩基配列の６１番目の塩基含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１５〜５０塩基が好ましく、２０〜３５塩基がより好ましい。
上記多型部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは30〜100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは30〜100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２５】
BioBank Japan（//biobankjp.org/）に登録されたサンプルから、2003年6月から2006年3月までの間に登録された、ドセタキセルを投与されてグレード３または４の白血球減少症／好中球減少症を呈した28人の患者群（ADR group：副作用群）と、ドセタキセルを投
与されて白血球減少症／好中球減少症を呈することのなかった56人の患者群（non-ADR group：正常群）を選択し、1st  studyを行った。
また、2nd  studyでは、BioBank Japanに登録されたサンプルから、2006年4月から2006年12月までの間に登録された、ドセタキセルを投与されてグレード３または４の白血球減少症／好中球減少症を呈した11人の患者群（ADR group）と、ドセタキセルを投与されて白血球減少症／好中球減少症を呈することのなかった18人の患者群（non-ADR group）を選択して評価した。
なお、グレード３または４はNCI-CTC (National Cancer Institute - Common Toxicity
Criteria) ver.2 (癌と化学療法、第28巻 第13号：1993-2027、2001)の分類による。
【００２６】
1st  studyと2nd  studyの合計113人の被検者において、癌の種類は、肺癌（３２人)、乳癌（３８人)、食道癌（１１人)、その他の癌（３２人)であった。
性別は、ADR groupで男性17人女性21人、non-ADR groupで男性29人女性45人であった。ADR groupとnon-ADR groupにおいて、年齢、他の抗癌剤の使用の有無は有意差が無かった。
なお、BioBank Japanでは全ての被検者から書面によるインフォームド・コンセントを得ており、本研究は、東京大学医科学研究所および理化学研究所の倫理審査委員会の承認を得たものである。
【００２７】
1st  studyでは、まず、CYP3A4、CYP3A5、ABCB1、ABCC2、SLCO1B3、NR1l2、NR1l3の7種類の遺伝子に着目し、haplotype-tagging SNPs （htSNPs）により、ｒ2＝０．８、マイナーアレル頻度（MAF）＞１０%という基準で一塩基多型（SNPｓ）を選んだ。また、文献（J
Pharmacol Exp Ther 2001; 297: 1137-43；Clin Pharmacol Ther 2001; 70: 189-99；Drug Metab Dispos 2002; 30: 363-4；Pharmacogenetics 2004; 14: 441-52）で報告されたＳＮＰｓも評価に加えた。
すなわち、合計で、LDがｒ2≧０．８である６９種類のhtSNPsと、上記遺伝子の機能を変化させる可能性のある10種類の機能的SNPsを選択した。
上記79種類のＳＮＰｓに対してインベーダープローブ（Third Wave Technologies, Madison, WI）を合成し、multiplex-PCRとインベーダーアッセイの組合せによる方法（Ohnishi Y, Tanaka T, Ozaki K, Yamada R, Suzuki H, Nakamura Y. A high-throughput SNP typing system for genome-wide association studies. J Hum Genet 2001;46:471-477）、または直接シークエンスによって、合計８４人分の患者におけるＳＮＰｓをジェノタイピングした。
【００２８】
その結果、ABCB1遺伝子上のrs2188524、ABCC2遺伝子上のrs11190291、rs3740065、rs12762549 およびrs11190303、SLCO1B3遺伝子上のrs7311358、rs11045585、rs2174012およびrs4149117ならびに、NR1I2遺伝子上のrs12633127の合計10種類のSNPｓが、P<0.05でグレード３または４の白血球減少症／好中球減少症の発症と相関を示した。
なお、統計解析はFisherの正確確率検定で行い、P値はBonferroniの補正を行った。
【００２９】
1st  studyで選択した１０種類のうち、rs4149117はrs7311358と強い連鎖不平衡の関係にあったため、rs4149117以外の９種類について、さらに2nd  studyを行った。
その結果、2nd  studyでは、rs12762549のみがP<0.05でグレード３または４の白血球減少症／好中球減少症の発症と相関を示した。
2nd  studyではサンプルの数が少なかったため、1st  studyに用いた84人分のサンプルと、2nd  studyに用いた29人分のサンプルとをあわせて、上記9種類のＳＮＰｓについて評価した。
その結果、表１に示されるように、rs12762549（SNP-1：P=0.00022）とともに、rs11045585もグレード３または４の白血球減少症／好中球減少症の発症と相関を示した。(SNP-２：P =0.00017)
【００３０】
【表１】
2009240232.tif 000002
【００３１】
さらに、SNP1とSNP2の遺伝子型のcombination studyにおける関連解析を実施した。
すなわち、SNP1について、allele 2のホモ接合型（CC）を有する場合を１、それ以外を有する場合（CGまたはGG）を０、SNP２について、allele2のヘテロ接合型（AG）を有する場合を１、allele１のホモ接合型（AA）を有する場合を０として、副作用群と、正常群（非副作用群）について、各患者のスコア付けを行った。
その結果、表２に示されるように、副作用群ではスコアが1以上である患者が27人（６９．２％）に対し、正常群ではスコアが1以上である患者が１８人（２４．４％）であり、合計スコアが1点以上の患者をリスク型と判定した場合、白血球または好中球減少症の発症と強い関連が見られた（P = 0.0000057）。
この結果から、多型を組み合わせて解析することにより、より正確に副作用の危険性を調べることができることが示唆された。
【００３２】
【表２】
2009240232.tif 000003
【配列表】
2009240232000001.app