(57)【要約】【課題】本発明の課題はプロテアーゼ活性を迅速且つ高感度に測定できるとともに、薄膜上の組織や細胞の形態観察を容易に行うことができるプロテアーゼ検出材料、プロテアーゼ検出材料セット、及びプロテアーゼの測定方法を提供することである。【解決手段】支持体上に少なくとも色素前駆体を含有する層、及び該色素前駆体を含有する層の前記支持体より遠い側にプロテアーゼ基質を含有する層を有し、該プロテアーゼ基質を含有する層が現像中心物質を含有するプロテアーゼ検出材料。更に前記プロテアーゼ検出材料を用いたプロテアーゼ検出材料セット、及びプロテアーゼの測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上に少なくとも色素前駆体を含有する層、及び該色素前駆体を含有する層の前記支持体より遠い側にプロテアーゼ基質を含有する層を有し、該プロテアーゼ基質を含有する層が現像中心物質を含有するプロテアーゼ検出材料。
【請求項２】
前記現像中心物質が銀コロイド又は金コロイド又はハロゲン化銀である請求項１に記載のプロテアーゼ検出材料。
【請求項３】
前記プロテアーゼ基質を含有する層の厚みが３μｍ以下である請求項１又は請求項２に記載のプロテアーゼ検出材料。
【請求項４】
前記プロテアーゼ基質を含有する層が硬膜剤を含有することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のプロテアーゼ検出材料。
【請求項５】
さらに発色現像薬を含有することを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のプロテアーゼ検出材料。
【請求項６】
前記発色現像薬が下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする請求項５に記載のプロテアーゼ検出材料：
【化１】
2009240284.tif 000089
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を表し、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アシル基、又はスルホニル基を表し、Ｒ１とＲ２、Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ２とＲ５、又は／及びＲ４とＲ６とが互いに結合して５員、６員又は７員の環を形成してもよい。Ｒ７は、水素原子、Ｒ１１−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ１２−ＣＯ−ＣＯ−、Ｒ１３−ＮＨ−ＣＯ−、Ｒ１４−ＳＯ２−、Ｒ１５−Ｗ−Ｃ（Ｒ１６）（Ｒ１７）（Ｒ１８）−、Ｒ１９−ＳＯ２ＮＨＣＯ−、Ｒ２０−ＣＯＮＨＣＯ−、Ｒ２１−ＳＯ２ＮＨＳＯ２−、Ｒ２２−ＣＯＮＨＳＯ２−又は（Ｍ）１／ｎＯＳＯ２−を表し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を表し、Ｒ１５は水素原子又はブロック基を表し、Ｗは酸素原子、イオウ原子又は＞Ｎ−Ｒ１８を表し、Ｒ１６、Ｒ１７、及びＲ１８は水素原子又はアルキル基を表し、Ｍはｎ価のカチオンを表す。）。
【請求項７】
前記発色現像薬が、下記一般式（II）で表される化合物であることを特徴とする請求項５に記載のプロテアーゼ検出材料：
【化２】
2009240284.tif 000090
（一般式（II）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。Ｘは−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−ＣＯＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−、−ＣＯＣＯ−Ｏ−、−ＣＯＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−または−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ１３）−である。ここでＲ１３は水素原子または前記Ｒ１２として挙げた基より選ばれる基である。）。
【請求項８】
前記発色現像薬が、下記一般式（IV）で表される化合物であることを特徴とする請求項７に記載のプロテアーゼ検出材料：
【化３】
2009240284.tif 000091
（一般式（IV）におけるＲ１１とＲ１２は、それぞれ一般式（II）におけるものと同義である。）。
【請求項９】
前記色素前駆体が下記一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）および（Ｙ−３）よりなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載のプロテアーゼ検出材料：
【化４】
2009240284.tif 000092
（式中、Ｘ１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ１およびＹ２は電子求引性の置換基を表し、Ｒ１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【化５】
2009240284.tif 000093
（式中、Ｘ２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ３とＲ４が互いに連結して環を形成してもよい。）；
【化６】
2009240284.tif 000094
（式中、Ｘ３は水素原子または離脱基を表し、Ｒ５はカルバモイル基またはスルファモイル基を表し、Ｒ６は水素原子または置換基を表す。）；
【化７】
2009240284.tif 000095
（式中、Ｘ４は水素原子または離脱基を表し、Ｒ７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ８は置換基を表す。）；
【化８】
2009240284.tif 000096
（式中、Ｘ５は水素原子または離脱基を表し、Ｒ９はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ１０は置換基を表す。）；
【化９】
2009240284.tif 000097
（式中、Ｘ６は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１１はアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基を表し、Ｒ１２はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【化１０】
2009240284.tif 000098
（式中、Ｘ７は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１３はアルキル基、アリール基、又はインドレニル基を表し、Ｒ１４はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【化１１】
2009240284.tif 000099
（式中、Ｘ８は水素原子または離脱基を表し、Ｚは５〜７員の環を形成するのに必要な２価の基を表し、Ｒ１５はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【化１２】
2009240284.tif 000100
（式中、Ｘ９は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８はそれぞれ置換基を表し、ｎは０〜４の、ｍは０〜５のいずれかの整数を表す。ｎまたはｍが２以上のとき、複数のＲ１６およびＲ１７はそれぞれ同一の基であってもよいし、異なる基であってもよい。）。
【請求項１０】
支持体上に少なくとも色素前駆体を含有する層、及び該色素前駆体を含有する層の前記支持体より遠い側にプロテアーゼ基質を含有する層を有し、該プロテアーゼ基質を含有する層が現像中心物質を含有するプロテアーゼ検出材料を用いたプロテアーゼ測定方法であって、（１）被検査生体試料をプロテアーゼ検出材料の表面に接触させる工程、（２）該（１）工程を経た前記プロテアーゼ検出材料の表面に現像薬を作用させ、プロテアーゼ消化痕を検出する工程を有するプロテアーゼ測定方法。
【請求項１１】
支持体上に少なくとも色素前駆体を含有する層、及び該色素前駆体を含有する層の前記支持体より遠い側にプロテアーゼ基質を含有する層を有し、該プロテアーゼ基質を含有する層が現像中心物質を含有するプロテアーゼ検出材料と、支持体上に少なくとも色素前駆体を含有する層、及び該色素前駆体を含有する層の前記支持体より遠い側に検出対象物のプロテアーゼインヒビターを含有する層を有し、該プロテアーゼインヒビターを含有する層が現像中心物質を含有する参照用プロテアーゼ検出材料とを有するプロテアーゼ検出材料セット。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプロテアーゼ検出材料セットを用いたプロテアーゼ測定方法であって、（１）被検査生体試料の実質的に連続した２以上の切片の内の１切片をプロテアーゼ検出材料の表面に接触させる工程、（２）他方の切片を参照用プロテアーゼ検出材料の表面に接触させる工程；（３）該（１）及び（２）工程を経た前記プロテアーゼ検出材料及び参照用プロテアーゼ検出材料の表面に発色現像薬を作用させ、プロテアーゼ消化痕を発色パターンにより検出する工程、（４）前記プロテアーゼ検出材料の発色パターンと前記参照用プロテアーゼ検出材料の発色パターンとを対比する工程を有するプロテアーゼ測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ検出材料、プロテアーゼ検出材料セット、及びプロテアーゼの測定方法に関するものである。より具体的には、癌細胞の浸潤活性や転移活性などの癌の悪性度、歯周炎などの歯周病の進行度、リウマチ性関節炎などにおける破壊性病変などの正確な診断を可能にするプロテアーゼ検出材料、プロテアーゼ検出材料セット、及びプロテアーゼ測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞の浸潤や転移、歯周炎などの歯周病の進行、リウマチ性関節炎などにおける組織破壊の進行、創傷治癒過程、個体発生過程などにおいて、マトリックスメタロプロテアーゼ、プラスミノーゲンアクティベーターなど種々のプロテアーゼが関与することが知られており、それらのプロテアーゼの検出及び定量方法として、抗体を用いたイミュノアッセイ法、イミュノブロッティング法、電気泳動ザイモグラフィー法などが知られている。また、組織中におけるプロテアーゼの活性を測定する方法として、非特許文献１又は特許文献１に開示されたいわゆるｉｎ  ｓｉｔｕ  ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ法が知られている。特許文献２には、ゼラチンなどの薄膜の消化痕を赤色、橙色、及び黄色等の色に染色し、プロテアーゼ活性を有する細胞の特定することが開示されている。
【非特許文献１】ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．９，Ｊｕｌｙ，ｐｐ．９７４−９８０（１９９５）
【特許文献１】ＷＯ９７／３２０３５号公報
【特許文献２】特開２０００−３２５０９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ法とその応用について鋭意研究していたが、その研究過程で、プロテアーゼ活性の測定のためにゼラチンなどの薄膜の消化痕を赤色、橙色、及び黄色等の色に染色し、プロテアーゼ活性を有する細胞を特定する方法は、比較的容易に薄膜上にある組織や細胞が観察可能であるが、感度が十分とは言えず、初期症状のプロテアーゼ活性を有する細胞が微量段階での検出ができない問題を認識した。
【０００４】
従って、本発明の課題はこれらの問題を解決する手段を提供することにある。より具体的には、プロテアーゼ活性を迅速且つ高感度に測定できるとともに、薄膜上の組織や細胞の形態観察を容易に行うことができるプロテアーゼ検出材料、プロテアーゼ検出材料セット、及びプロテアーゼの測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の上記課題は、以下の手段により解決された。
＜１＞  支持体上に少なくとも色素前駆体を含有する層、及び該色素前駆体を含有する層の前記支持体より遠い側にプロテアーゼ基質を含有する層を有し、該プロテアーゼ基質を含有する層が現像中心物質を含有するプロテアーゼ検出材料。
＜２＞  前記現像中心物質が銀コロイド又は金コロイドである＜１＞に記載のプロテアーゼ検出材料。
＜３＞  前記プロテアーゼ基質を含有する層の厚みが３μｍ以下である＜１＞又は＜２＞に記載のプロテアーゼ検出材料。
＜４＞  前記プロテアーゼ基質を含有する層が硬膜剤を含有することを特徴とする＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のプロテアーゼ検出材料。
＜５＞  さらに発色現像薬を含有することを特徴とする＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のプロテアーゼ検出材料。
＜６＞  前記発色現像薬が下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする＜５＞に記載のプロテアーゼ検出材料：
【０００６】
【化１】
2009240284.tif 000002
【０００７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を表し、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アシル基、又はスルホニル基を表し、Ｒ１とＲ２、Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ２とＲ５、又は／及びＲ４とＲ６とが互いに結合して５員、６員又は７員の環を形成してもよい。Ｒ７は、水素原子、Ｒ１１−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ１２−ＣＯ−ＣＯ−、Ｒ１３−ＮＨ−ＣＯ−、Ｒ１４−ＳＯ２−、Ｒ１５−Ｗ−Ｃ（Ｒ１６）（Ｒ１７）（Ｒ１８）−、Ｒ１９−ＳＯ２ＮＨＣＯ−、Ｒ２０−ＣＯＮＨＣＯ−、Ｒ２１−ＳＯ２ＮＨＳＯ２−、Ｒ２２−ＣＯＮＨＳＯ２−又は（Ｍ）１／ｎＯＳＯ２−を表し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を表し、Ｒ１５は水素原子又はブロック基を表し、Ｗは酸素原子、イオウ原子又は＞Ｎ−Ｒ１８を表し、Ｒ１６、Ｒ１７、及びＲ１８は水素原子又はアルキル基を表し、Ｍはｎ価のカチオンを表す。）。
＜７＞  前記発色現像薬が、下記一般式（II）で表される化合物であることを特徴とする＜６＞に記載のプロテアーゼ検出材料：
【化２】
2009240284.tif 000003
（一般式（II）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。Ｘは−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−ＣＯＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−、−ＣＯＣＯ−Ｏ−、−ＣＯＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−または−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ１３）−である。ここでＲ１３は水素原子または前記Ｒ１２として挙げた基より選ばれる基である。）。
＜８＞  前記発色現像薬が、下記一般式（IV）で表される化合物であることを特徴とする＜７＞に記載のプロテアーゼ検出材料：
【化３】
2009240284.tif 000004
（一般式（IV）におけるＲ１１とＲ１２は、それぞれ一般式（II）におけるものと同義である。）。
＜９＞  前記色素前駆体が下記一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）および（Ｙ−３）よりなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載のプロテアーゼ検出材料：
【０００８】
【化４】
2009240284.tif 000005
【０００９】
（式中、Ｘ１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ１およびＹ２は電子求引性の置換基を表し、Ｒ１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【００１０】
【化５】
2009240284.tif 000006
【００１１】
（式中、Ｘ２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ３とＲ４が互いに連結して環を形成してもよい。）；
【００１２】
【化６】
2009240284.tif 000007
【００１３】
（式中、Ｘ３は水素原子または離脱基を表し、Ｒ５はカルバモイル基またはスルファモイル基を表し、Ｒ６は水素原子または置換基を表す。）；
【００１４】
【化７】
2009240284.tif 000008
【００１５】
（式中、Ｘ４は水素原子または離脱基を表し、Ｒ７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ８は置換基を表す。）；
【００１６】
【化８】
2009240284.tif 000009
【００１７】
（式中、Ｘ５は水素原子または離脱基を表し、Ｒ９はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ１０は置換基を表す。）；
【００１８】
【化９】
2009240284.tif 000010
【００１９】
（式中、Ｘ６は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１１はアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基を表し、Ｒ１２はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【００２０】
【化１０】
2009240284.tif 000011
【００２１】
（式中、Ｘ７は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１３はアルキル基、アリール基、又はインドレニル基を表し、Ｒ１４はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【００２２】
【化１１】
2009240284.tif 000012
【００２３】
（式中、Ｘ８は水素原子または離脱基を表し、Ｚは５〜７員の環を形成するのに必要な２価の基を表し、Ｒ１５はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【００２４】
【化１２】
2009240284.tif 000013
【００２５】
（式中、Ｘ９は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８はそれぞれ置換基を表し、ｎは０〜４の、ｍは０〜５のいずれかの整数を表す。ｎまたはｍが２以上のとき、複数のＲ１６およびＲ１７はそれぞれ同一の基であってもよいし、異なる基であってもよい。）。
＜１０＞  支持体上に少なくとも色素前駆体を含有する層、及び該色素前駆体を含有する層の前記支持体より遠い側にプロテアーゼ基質を含有する層を有し、該プロテアーゼ基質を含有する層が現像中心物質を含有するプロテアーゼ検出材料を用いたプロテアーゼ測定方法であって、（１）被検査生体試料をプロテアーゼ検出材料の表面に接触させる工程、（２）該（１）工程を経た前記プロテアーゼ検出材料の表面に現像薬を作用させ、プロテアーゼ消化痕を検出する工程を有するプロテアーゼ測定方法。
＜１１＞  支持体上に少なくとも色素前駆体を含有する層、及び該色素前駆体を含有する層の前記支持体より遠い側にプロテアーゼ基質を含有する層を有し、該プロテアーゼ基質を含有する層が現像中心物質を含有するプロテアーゼ検出材料と、支持体上に少なくとも色素前駆体を含有する層、及び該色素前駆体を含有する層の前記支持体より遠い側に検出対象物のプロテアーゼインヒビターを含有する層を有し、該プロテアーゼインヒビターを含有する層が現像中心物質を含有する参照用プロテアーゼ検出材料とを有するプロテアーゼ検出材料セット。
＜１２＞  ＜１１＞に記載のプロテアーゼ検出材料セットを用いたプロテアーゼ測定方法であって、（１）被検査生体試料の実質的に連続した２以上の切片の内の１切片をプロテアーゼ検出材料の表面に接触させる工程、（２）他方の切片を参照用プロテアーゼ検出材料の表面に接触させる工程；（３）該（１）及び（２）工程を経た前記プロテアーゼ検出材料及び参照用プロテアーゼ検出材料の表面に過酸化物及び発色現像薬を作用させ、プロテアーゼ消化痕を発色パターンにより検出する工程、（４）前記プロテアーゼ検出材料の発色パターンと前記参照用プロテアーゼ検出材料の発色パターンとを対比する工程を有するプロテアーゼ測定方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の方法によれば、迅速且つ高感度で消化痕の観察が可能であり、また、同時に薄膜上の組織又は細胞の迅速且つ高感度での観察が可能になり、プロテアーゼ活性を発現する組織部分や細胞の特定が容易になる。例えば、薄膜の染色と共に細胞核染色を行うことにより、核の形態情報と消化痕とを同一の標本で観察することができるので、形態変化を起こした異常細胞がプロテアーゼ活性を発現するか否かを簡便に判定することができる。  
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明のプロテアーゼ検出材料は、支持体上に少なくとも色素前駆体を含有する層、及び該色素前駆体を含有する層の前記支持体より遠い側にプロテアーゼ基質を含有する層を有し、該プロテアーゼ基質を含有する層に現像中心物質を含有する。
好ましくは、現像中心物質が銀コロイド、金コロイド又はハロゲン化銀である。
被検査生体試料の切片をプロテアーゼ検出材料の表面に接触させ、プロテアーゼ基質を含有する層にプロテアーゼ消化痕を形成させた後、該表面に過酸化物及び発色現像薬を作用させると、現像中心物質が核となって酸化還元反応が進行し、発色現像薬の酸化体と色素前駆体との反応により色素が形成される。現像中心物質を核とした過酸化物による発色現像薬は連鎖反応で進行するため、消化痕は増幅されて、鮮明なコントラスト発色パターンが得られる。従って、従来は検出が困難であった微かな消化痕も迅速且つ高感度で検出することができる。
【００２８】
本発明に於いては、プロテアーゼ基質を含有する層の厚みは、３μｍ以下と薄層であり、１μｍ以下であることが更に好ましい。さらに好ましくは、プロテアーゼ基質を含有する層が硬膜剤を含有する。
本発明のプロテアーゼ検出材料は、更に発色現像薬を含有する層を有するのが好ましい。
好ましくは、発色現像薬が上記一般式（Ｉ）で表される化合物又である。より好ましくは、発色現像薬が、上記一般式（II）又は（III）で表される化合物である。
好ましくは、色素前駆体が上記一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）および（Ｙ−３）よりなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物である。
【００２９】
本発明の別の態様は、プロテアーゼ検出材料と参照用プロテアーゼ検出材料とのセットよりなるプロテアーゼ検出材料セットである。
プロテアーゼ検出材料は、支持体上に少なくとも色素前駆体を含有する層、及び該色素前駆体を含有する層の前記支持体より遠い側にプロテアーゼ基質を含有する層を有し、該プロテアーゼ基質を含有する層が現像中心物質を含有する。一方、参照用プロテアーゼ検出材料は、支持体上に少なくとも色素前駆体を含有する層、及び該色素前駆体を含有する層の前記支持体より遠い側に検出対象物のプロテアーゼインヒビターを含有する層を有し、該プロテアーゼインヒビターを含有する層が現像中心物質を含有する。
【００３０】
プロテアーゼ検出材料セットを用いたプロテアーゼ測定方法は、（１）被検査生体試料の実質的に連続した２以上の切片の内の１切片をプロテアーゼ検出材料の表面に接触させる工程、（２）他方の切片を参照用プロテアーゼ検出材料の表面に接触させる工程；（３）該（１）及び（２）工程を経た前記プロテアーゼ検出材料及び参照用プロテアーゼ検出材料の表面に過酸化物及び発色現像薬を作用させ、プロテアーゼ消化痕を発色パターンにより検出する工程、（４）前記プロテアーゼ検出材料の発色パターンと前記参照用プロテアーゼ検出材料の発色パターンとを対比する工程を有する。
【００３１】
プロテアーゼ・インヒビターとしては、キレート剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、又はセリンプロテアーゼ阻害剤であることが好ましい。
プロテアーゼ検出材料とセットで参照用プロテアーゼ検出材料を用いることにより、さらに高精度で検査対象とするプロテアーゼを検出することができる。
【００３２】
上記の発明の好ましい態様によれば、生体試料が、ヒトを含む哺乳類動物、好ましくは患者、疾患が疑われる哺乳動物、実験動物などから分離・採取した生体試料である上記方法が提供される。生体試料として、組織片などの固形試料のほか、組織から吸引により採取した細胞又は組織片を含む試料、血液、リンパ液、唾液などの非固形試料などを用いることができる。連続した切片を用いる方法では生体試料として組織切片を用いることができる。
【００３３】
消化痕の検出は、発色パターンを顕微鏡を用いた目視により判定する方法、あるいは画像処理装置を用いて定量又は数値化を行う方法が用いることができる。
【００３４】
本明細書において用いられる測定方法という用語は、定性及び定量を含めて最も広義に解釈されるべきである。本発明のプロテアーゼの測定方法は、試料中に含まれるプロテアーゼによってプロテアーゼ基質が消化され、薄膜中に消化痕が形成されることによりプロテアーゼを測定する方法（いわゆるｉｎ  ｓｉｔｕ  ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ法：例えばＷＯ９７／３２０３５号明細書に開示されている）において、消化痕が形成された薄膜を特定の発色反応を利用して増幅された発色パターンに変換して観察することを特徴としている。本発明の方法によれば、薄膜上の消化痕を顕微鏡下で色素濃度の低い部分として検出することができ、試料中のプロテアーゼ活性の存在を確実に証明することができるとともに、薄膜上の生体試料の形態観察を容易に行えるという特徴がある。本発明の方法に用いる薄膜としては、ＷＯ９７／３２０３５に記載されたものを用いることができる。硬膜剤又はプロテアーゼインヒビターなども上記文献に記載のものを用いることができる。
【００３５】
本発明の対象となるプロテアーゼとしては、例えば、マトリックス・メタロプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼを挙げることができ、これらの酵素については、鶴尾隆編「癌転移の分子機構」、ｐｐ．９２−１０７、メジカルビュー社、１９９３年発行に詳細に説明されている。本発明の方法に特に好適なプロテアーゼとして、例えば、間質型コラーゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＡ  （ＭＭＰ−２）、及びゼラチナーゼＢ  （ＭＭＰ−９）などのマトリックス・メタロプロテアーゼ；及びプラスミノーゲン・アクティベーター（ＰＡ）などのセリンプロテアーゼを挙げることができるが、本発明の方法の対象は上記の特定のプロテアーゼに限定されることはない。  
【００３６】
プロテアーゼ基質は、プロテアーゼの基質として分解される高分子化合物であれば特に限定されない。例えばコラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、又はカゼインなどを用いることができる。好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、又はカゼインを用いることができ、より好ましくはゼラチン又はカゼインを用いることができる。ゼラチンを用いる場合には、ゼラチンの種類は特に限定されず、例えば、牛骨アルカリ処理ゼラチン、豚皮膚アルカリ処理ゼラチン、牛骨酸処理ゼラチン、牛骨フタル化処理ゼラチン、豚皮膚酸処理ゼラチンなどを用いることができる。プロテアーゼ基質は上記の１種を用いても良いが、２種以上を組み合わせて用いても良い。  
【００３７】
２種以上の異なるプロテアーゼ基質を組み合わせて用いることにより、生体試料中に含まれるプロテアーゼの種類を正確に特定できる場合がある。例えば、生体試料中の実質的に連続した切片のうちの一つをある種のプロテアーゼ基質を含む薄膜に接触させて消化痕を検出し、他の切片を異なるプロテアーゼ基質を含む薄膜に接触させて薄膜上の消化痕を検出し、それぞれの結果を対比することができる。比較のためにそれぞれ異なるプロテアーゼ基質を含む薄膜を２種以上用いてもよい。プロテアーゼ基質を含む層の厚みは、３μｍ以下、好ましくは１μｍ以下である。  
【００３８】
本発明の方法に用いる生体試料としては、ヒトを含む哺乳類動物から分離・採取された生体試料を用いることができる。例えば、罹患した哺乳類動物、疾患の存在が疑われる哺乳動物、又は実験動物などから分離・採取した生体試料を用いることができる。生体試料の形態は特に限定されないが、組織切片などの固形試料や体液などの非固形試料を用いることができる。非固形試料としては、例えば、組織から吸引により採取した細胞又は組織片を含む試料、血液、リンパ液、唾液などの体液を用いることができる。例えば、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、肝臓癌、口腔癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌などの癌組織から手術や組織検査などにより分離・採取した癌組織、リンパ節、歯周病組織、リウマチ性関節炎の滑膜や骨組織、動脈粥状硬化組織などの組織から手術や組織検査などにより分離・採取した組織、歯肉溝滲出液、破壊性病変組織に含まれる液（例えばリウマチ性病変の関節液又は歯槽膿漏組織抽出液）、胸水、腹水、脳脊髄液、乳腺異常分泌液、卵巣内貯留液、喀痰などを用いることができる。  
【００３９】
試料が組織の場合には、例えば、液体窒素で急速凍結した試料から凍結切片作製装置を用いて厚さ１μｍ〜１０μｍ、好ましくは４μｍ〜６μｍの切片を調製し、この切片を薄膜に貼付することによって試料と薄膜とを接触させることができる。穿刺吸引により採取した細胞又は組織片を含む非固形試料についても、コンパウンドなどの成形材料と混合して液体窒素で急速凍結し、同様に切片を作製して用いることができる。また、組織から穿刺吸引により採取した細胞又は組織片を含む非固形試料をそのまま用いる場合には、吸引した試料を薄膜上に吐出させ、細胞を分散状態で薄膜に接着させればよい。さらに、生体試料が組織片の場合は、採取した組織の水分を軽く拭った後、プロテアーゼ基質を含む薄膜の上に１分間から３０分間程度静置することで試料と薄膜とを接触させることができる。  
【００４０】
また、リウマチ性関節炎の患者から採取した滑膜液の様な非固形試料を用いる場合には、試料を適当な濃度に希釈し、及び／又は必要な前処理を行った後に、約１μＬ〜５０μＬ、好ましくは１μＬ〜２０μＬ程度を薄膜上に滴下すればよい。歯周病の歯肉溝滲出液を試料として用いる場合には、歯肉溝内に濾紙を挿入して約５μＬ〜１０μＬ程度の歯肉溝滲出液を採取し、該濾紙を薄膜に貼付する方法を採用することができる。歯肉溝滲出液の採取後、必要に応じて蒸留水や適宜の緩衝液（例えば、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭＣａＣｌ２，０．２ＭＮａＣｌなど）を用いて濾紙から歯肉溝滲出液を抽出し、抽出液を薄膜上に滴下してもよい。  
【００４１】
プロテアーゼ基質を含む組織切片を薄膜に貼付するか、あるいは液体試料を滴下するなどの手段によって薄膜とプロテアーゼを含む試料を接触させた後、プロテアーゼ活性の発現に適した温度、例えば３７℃の飽和湿度条件下で基質の消化に必要な時間薄膜をインキュベートする。必要な時間は試料や薄膜の種類によって異なるが、３７℃で１０分〜２４時間、好ましくは２０分〜６時間インキュベートし、試料中のプロテアーゼによって薄膜中に消化痕を形成させる。
【００４２】
その後、過酸化物と発色現像薬を作用させ、現像中心物質を核として、発色反応を起こし、酸化された発色現像薬と色素前駆体との反応により色素が形成される。該色素は消化されず残存する薄膜で形成されるので、消化痕は未発色であるので、発色した背景に中に未着色のパターンとして、消化痕が観察される。
【００４３】
さらに、特定の検査対象のプロテアーゼを高精度に観察するには、生体試料中の実質的に連続した２以上の切片のうちの一つをプロテアーゼ・インヒビターを含まない薄膜に貼付し、他の切片の１つをプロテアーゼ・インヒビターを含む薄膜に貼付して、両者の薄膜の消化痕を比較することにより、プロテアーゼの種類を特定することが可能になる。
【００４４】
次に、本発明の発色に用いられる現像中心物質、発色現像薬、及び色素前駆体について説明する。
【００４５】
１）現像中心物質
本発明に用いられる現像中心物質は、過酸化水素と発色現像薬の酸化還元反応の触媒となるものであり、触媒核とも称される。好ましくは、金属コロイド又はハロゲン化銀粒子が用いられる。
ハロゲン化銀粒子としては、ハロゲン化銀写真感光材料に用いられる塩化銀、臭化銀、沃化銀、塩臭化銀、沃臭化銀、塩沃臭化銀を用いることができる。
金属コロイドとしては、上記酸化還元反応の触媒核として作用し得るものである限り、特に限定されるものではなく、金属コロイド標識としては、例えば、金、銀、白金、パラジウム、鉛、亜鉛、カドミウム、錫、クロム、銅、またはコバルトのコロイド、好ましくは、金、銀、白金、およびパラジウムのコロイド、そして、それらの混合物を挙げることができ、特に好ましくは、金コロイド又は銀コロイドである。
【００４６】
金属コロイドの平均粒径は、１ｎｍ以上５００ｎｍ以下が好ましく、より好ましくは５ｎｍ以上１００ｎｍ以下である。
【００４７】
２）発色現像薬
本発明に用いられる発色現像薬の好ましい態様の１つは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【００４８】
【化１３】
2009240284.tif 000014
【００４９】
以下に、本発明の式（Ｉ）で表される化合物について詳しく説明する。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を表す。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４で表される置換基としては、ハロゲン原子、アルキル基（シクロアルキル基、ビシクロアルキル基を含む）、アルケニル基（シクロアルケニル基、ビシクロアルケニル基を含む）、アルキニル基、アリール基、ヘテロ環基、シアノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、カルボキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、シリルオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アシルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ、アミノ基（アニリノ基を含む）、アシルアミノ基、アミノカルボニルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、アルキル及びアリールスルホニルアミノ基、メルカプト基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、スルファモイル基、スルホ基、アルキル及びアリールスルフィニル基、アルキル及びアリールスルホニル基、アシル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、アリール及びヘテロ環アゾ基、イミド基、ホスフィノ基、ホスフィニル基、ホスフィニルオキシ基、ホスフィニルアミノ基、シリル基が挙げられる。更に詳しくは、ハロゲン原子（例えば、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、アルキル基〔直鎖、分岐、環状の置換もしくは無置換のアルキル基を表す。
【００５０】
アルキル基（好ましくは炭素数１から３０のアルキル基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−オクチル、エイコシル、２−クロロエチル、２−シアノエチル、２−エチルヘキシル）、シクロアルキル基（好ましくは、炭素数３から３０の置換又は無置換のシクロアルキル基、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、４−ｎ−ドデシルシクロヘキシル）、ビシクロアルキル基（好ましくは、炭素数５から３０の置換もしくは無置換のビシクロアルキル基、つまり、炭素数５から３０のビシクロアルカンから水素原子を一個取り去った一価の基である。例えば、ビシクロ［１，２，２］ヘプタン−２−イル、ビシクロ［２，２，２］オクタン−３−イル）、更に環構造が多いトリシクロ構造なども包含する。以下に説明する置換基の中のアルキル基（例えばアルキルチオ基のアルキル基）もこのような概念のアルキル基を表す。］、アルケニル基［直鎖、分岐、環状の置換もしくは無置換のアルケニル基を表す。アルケニル基（好ましくは炭素数２から３０の置換又は無置換のアルケニル基、例えば、ビニル、アリル、プレニル、ゲラニル、オレイル）、シクロアルケニル基（好ましくは、炭素数３から３０の置換もしくは無置換のシクロアルケニル基、つまり、炭素数３から３０のシクロアルケンの水素原子を一個取り去った一価の基である。例えば、２−シクロペンテン−１−イル、２−シクロヘキセン−１−イル）、ビシクロアルケニル基（置換もしくは無置換のビシクロアルケニル基、好ましくは、炭素数５から３０の置換もしくは無置換のビシクロアルケニル基、つまり二重結合を一個持つビシクロアルケンの水素原子を一個取り去った一価の基である。
【００５１】
例えば、ビシクロ［２，２，１］ヘプト−２−エン−１−イル、ビシクロ［２，２，２］オクト−２−エン−４−イル）］、アルキニル基（好ましくは、炭素数２から３０の置換又は無置換のアルキニル基、例えば、エチニル、プロパルギル、トリメチルシリルエチニル基、アリール基（好ましくは炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリール基、例えばフェニル、ｐ−トリル、ナフチル、ｍ−クロロフェニル、ｏ−ヘキサデカノイルアミノフェニル）、ヘテロ環基（好ましくは５又は６員の置換もしくは無置換の、芳香族もしくは非芳香族のヘテロ環化合物から一個の水素原子を取り除いた一価の基であり、更に好ましくは、炭素数３から３０の５もしくは６員の芳香族のヘテロ環基である。例えば、２−フリル、２−チエニル、２−ピリミジニル、２−ベンゾチアゾリル）、シアノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、カルボキシル基、アルコキシ基（好ましくは、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のアルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−オクチルオキシ、２−メトキシエトキシ）、アリールオキシ基（好ましくは、炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリールオキシ基、例えば、フェノキシ、２−メチルフェノキシ、４−ｔ−ブチルフェノキシ、３−ニトロフェノキシ、２−テトラデカノイルアミノフェノキシ）、シリルオキシ基（好ましくは、炭素数３から２０のシリルオキシ基、例えば、トリメチルシリルオキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）、ヘテロ環オキシ基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換のヘテロ環オキシ基、１−フェニルテトラゾール−５−オキシ、２−テトラヒドロピラニルオキシ）、アシルオキシ基（好ましくはホルミルオキシ基、炭素数２から３０の置換もしくは無置換のアルキルカルボニルオキシ基、炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリールカルボニルオキシ基、例えば、ホルミルオキシ、アセチルオキシ、ピバロイルオキシ、ステアロイルオキシ、ベンゾイルオキシ、ｐ−メトキシフェニルカルボニルオキシ）、カルバモイルオキシ基（好ましくは、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のカルバモイルオキシ基、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイルオキシ、Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバモイルオキシ、モルホリノカルボニルオキシ、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−オクチルアミノカルボニルオキシ、Ｎ−ｎ−オクチルカルバモイルオキシ）、アルコキシカルボニルオキシ基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換アルコキシカルボニルオキシ基、例えばメトキシカルボニルオキシ、エトキシカルボニルオキシ、ｔ−ブトキシカルボニルオキシ、ｎ−オクチルカルボニルオキシ）、
【００５２】
アリールオキシカルボニルオキシ基（好ましくは、炭素数７から３０の置換もしくは無置換のアリールオキシカルボニルオキシ基、例えば、フェノキシカルボニルオキシ、ｐ−メトキシフェノキシカルボニルオキシ、ｐ−ｎ−ヘキサデシルオキシフェノキシカルボニルオキシ）、アミノ基（好ましくは、アミノ基、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のアルキルアミノ基、炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアニリノ基、例えば、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、アニリノ、Ｎ−メチル−アニリノ、ジフェニルアミノ）、アシルアミノ基（好ましくは、ホルミルアミノ基、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のアルキルカルボニルアミノ基、炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリールカルボニルアミノ基、例えば、ホルミルアミノ、アセチルアミノ、ピバロイルアミノ、ラウロイルアミノ、ベンゾイルアミノ、３，４，５−トリ−ｎ−オクチルオキシフェニルカルボニルアミノ）、アミノカルボニルアミノ基（好ましくは、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のアミノカルボニルアミノ、例えば、カルバモイルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノカルボニルアミノ、モルホリノカルボニルアミノ）、アルコキシカルボニルアミノ基（好ましくは炭素数２から３０の置換もしくは無置換アルコキシカルボニルアミノ基、例えば、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ、ｎ−オクタデシルオキシカルボニルアミノ、Ｎ−メチルーメトキシカルボニルアミノ）、アリールオキシカルボニルアミノ基（好ましくは、炭素数７から３０の置換もしくは無置換のアリールオキシカルボニルアミノ基、例えば、フェノキシカルボニルアミノ、ｐ−クロロフェノキシカルボニルアミノ、ｍ−ｎ−オクチルオキシフェノキシカルボニルアミノ）、スルファモイルアミノ基（好ましくは、炭素数０から３０の置換もしくは無置換のスルファモイルアミノ基、例えば、スルファモイルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニルアミノ、Ｎ−ｎ−オクチルアミノスルホニルアミノ）、アルキル及びアリールスルホニルアミノ基（好ましくは炭素数１から３０の置換もしくは無置換のアルキルスルホニルアミノ、炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリールスルホニルアミノ、例えば、メチルスルホニルアミノ、ブチルスルホニルアミノ、フェニルスルホニルアミノ、２，３，５−トリクロロフェニルスルホニルアミノ、ｐ−メチルフェニルスルホニルアミノ）、メルカプト基、アルキルチオ基（好ましくは、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のアルキルチオ基、例えばメチルチオ、エチルチオ、ｎ−ヘキサデシルチオ）、
【００５３】
アリールチオ基（好ましくは炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリールチオ、例えば、フェニルチオ、ｐ−クロロフェニルチオ、ｍ−メトキシフェニルチオ）、ヘテロ環チオ基（好ましくは炭素数２から３０の置換又は無置換のヘテロ環チオ基、例えば、２−ベンゾチアゾリルチオ、１−フェニルテトラゾール−５−イルチオ）、スルファモイル基（好ましくは炭素数０から３０の置換もしくは無置換のスルファモイル基、例えば、Ｎ−エチルスルファモイル、Ｎ−（３−ドデシルオキシプロピル）スルファモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイル、Ｎ−アセチルスルファモイル、Ｎ−ベンゾイルスルファモイル、Ｎ−（Ｎ’−フェニルカルバモイル）スルファモイル）、スルホ基、アルキル及びアリールスルフィニル基（好ましくは、炭素数１から３０の置換又は無置換のアルキルスルフィニル基、６から３０の置換又は無置換のアリールスルフィニル基、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、フェニルスルフィニル、ｐ−メチルフェニルスルフィニル）、アルキル及びアリールスルホニル基（好ましくは、炭素数１から３０の置換又は無置換のアルキルスルホニル基、６から３０の置換又は無置換のアリールスルホニル基、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、フェニルスルホニル、ｐ−メチルフェニルスルホニル）、アシル基（好ましくはホルミル基、炭素数２から３０の置換又は無置換のアルキルカルボニル基、炭素数７から３０の置換もしくは無置換のアリールカルボニル基、例えば、アセチル、ピバロイル、２−クロロアセチル、ステアロイル、ベンゾイル、ｐ−ｎ−オクチルオキシフェニルカルボニル）、アリールオキシカルボニル基（好ましくは、炭素数７から３０の置換もしくは無置換のアリールオキシカルボニル基、例えば、フェノキシカルボニル、ｏ−クロロフェノキシカルボニル、ｍ−ニトロフェノキシカルボニル、ｐ−ｔ−ブチルフェノキシカルボニル）、アルコキシカルボニル基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換アルコキシカルボニル基、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、ｎ−オクタデシルオキシカルボニル）、カルバモイル基（好ましくは、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のカルバモイル、例えば、カルバモイル、Ｎ−メチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−オクチルカルバモイル、Ｎ−（メチルスルホニル）カルバモイル）、アリール及びヘテロ環アゾ基（好ましくは炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリールアゾ基、炭素数３から３０の置換もしくは無置換のヘテロ環アゾ基、例えば、フェニルアゾ、ｐ−クロロフェニルアゾ、５−エチルチオ−１，３，４−チアジアゾール−２−イルアゾ）、
【００５４】
イミド基（好ましくは、Ｎ−スクシンイミド、Ｎ−フタルイミド）、ホスフィノ基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換のホスフィノ基、例えば、ジメチルホスフィノ、ジフェニルホスフィノ、メチルフェノキシホスフィノ）、ホスフィニル基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換のホスフィニル基、例えば、ホスフィニル、ジオクチルオキシホスフィニル、ジエトキシホスフィニル）、ホスフィニルオキシ基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換のホスフィニルオキシ基、例えば、ジフェノキシホスフィニルオキシ、ジオクチルオキシホスフィニルオキシ）、ホスフィニルアミノ基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換のホスフィニルアミノ基、例えば、ジメトキシホスフィニルアミノ、ジメチルアミノホスフィニルアミノ）、シリル基（好ましくは、炭素数３から３０の置換もしくは無置換のシリル基、例えば、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、フェニルジメチルシリル）が挙げられる。
【００５５】
Ｒ１〜Ｒ４で表される基が更に置換可能な基である場合、Ｒ１〜Ｒ４で表される基は更に置換基を有してもよく、その場合の好ましい置換基はＲ１〜Ｒ４で説明した置換基と同じ意味の基を表す。２個以上の置換基で置換されている場合には、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよい。
【００５６】
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アシル基、アルキルスルホニル基、又はアリールスルホニル基を表し、そのアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アシル基、アルキルスルホニル基、及びアリールスルホニル基の好ましい範囲については、前記のＲ１〜Ｒ４で表される置換基で説明したアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アシル基、アルキルスルホニル基、及びアリールスルホニル基と同じ意味の基を表す。Ｒ５及びＲ６で表される基が更に置換可能な基である場合、Ｒ５及びＲ６で表される基は更に置換基を有してもよく、その場合の好ましい置換基はＲ１〜Ｒ４で説明した置換基と同じ意味の基を表す。２個以上の置換基で置換されている場合には、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよい。
【００５７】
Ｒ１とＲ２、Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ２とＲ５、又は／及びＲ４とＲ６とが互いに結合して５員、６員又は７員の環を形成してもよい。
【００５８】
式（Ｉ）におけるＲ７は、水素原子、Ｒ１１−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ１２−ＣＯ−ＣＯ−、Ｒ１３−ＮＨ−ＣＯ−、Ｒ１４−ＳＯ２−、Ｒ１５−Ｗ−Ｃ（Ｒ１６）（Ｒ１７）（Ｒ１８）−、Ｒ１９−ＳＯ２ＮＨＣＯ−、Ｒ２０−ＣＯＮＨＣＯ−、Ｒ２１−ＳＯ２ＮＨＳＯ２−、Ｒ２２−ＣＯＮＨＳＯ２−、又は（Ｍ）１／ｎＯＳＯ２−を表し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、及びＲ２２はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を表し、Ｒ１５は水素原子又はブロック基を表し、Ｗは酸素原子、イオウ原子又は＞Ｎ−Ｒ１８を表し、Ｒ１６、Ｒ１７、及びＲ１８は水素原子又はアルキル基を表す。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、及びＲ２２で表されるアルキル基、アリール基、及びヘテロ環基は前記のＲ１〜Ｒ４で表される置換基で説明したアルキル基、アリール基、及びヘテロ環基と同じ意味の基を表し、Ｍはｎ価のカチオンを表す。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、及びＲ２２で表される基が更に置換可能な基である場合、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、及びＲ２２で表される基は更に置換基を有してもよく、その場合の好ましい置換基はＲ１〜Ｒ４で説明した置換基と同じ意味の基を表す。２個以上の置換基で置換されている場合には、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよい。
Ｒ１６、Ｒ１７、及びＲ１８がアルキル基を表す場合、Ｒ１〜Ｒ４で表される置換基で説明したアルキル基と同じ意味の基を表す。Ｒ１５がブロック基を表す場合のブロック基としては、後述のＢＬＫで表されるブロック基と同じ意味の基を表す。
【００５９】
以下に、式（Ｉ）で表される化合物の好ましい範囲について説明する。Ｒ１〜Ｒ４は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アシルアミノ基、アルキル及びアリールスルホニルアミノ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、シアノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホ基、ニトロ基、スルファモイル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、及びアシルオキシ基が好ましく、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アシルアミノ基、アルキル及びアリールスルホニルアミノ基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、シアノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホ基、ニトロ基、スルファモイル基、アルキルスルホニル基、及びアリールスルホニル基が更に好ましい。特に好ましくは、Ｒ１〜Ｒ４の中で、Ｒ１又はＲ３のいずれか一方が水素原子である。
【００６０】
Ｒ５及びＲ６はアルキル基、アリール基、及びヘテロ環基が好ましく、アルキル基が最も好ましい。
【００６１】
式（Ｉ）で表される化合物のＲ７を水素原子にしたｐ−フェニレンジアミン誘導体のｐＨ１０の水中における酸化電位が５ｍＶ以下（ｖｓＳＣＥ）であることが発色性と保存性を両立できる点で好ましい。
【００６２】
Ｒ７は、水素原子、Ｒ１１−Ｏ−ＣＯ−及びＲ１４−ＳＯ２−、Ｒ１９−ＳＯ２−ＮＨ−ＣＯ−及びＲ１５−Ｗ−Ｃ（Ｒ１６）（Ｒ１７）（Ｒ１８）が好ましく、水素原子、Ｒ１１−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ１９−ＳＯ２−ＮＨ−ＣＯ−がより好ましく、水素原子、又はＲ１９−ＳＯ２−ＮＨ−ＣＯ−が最も好ましい。Ｒ１１はアルキル基が好ましく、米国特許第４，４０９，３２３号もしくは同４，４２１，８４５号に記載のある電子移動反応を利用して開裂反応を起こさせるタイミング基を含む基であることが好ましく、タイミング基の電子移動反応を引き起こす末端がブロックされた下記式（Ｔ−１）で表される基であることが好ましい。
式（Ｔ−１）ＢＬＫ−Ｗ−（Ｘ＝Ｙ）ｊ−Ｃ（Ｒ２１）Ｒ２２−＊＊
式中、ＢＬＫはブロック基を表し、＊＊は−Ｏ−ＣＯ−と結合する位置を表し、Ｗは酸素原子、イオウ原子又は＞Ｎ−Ｒ２３を表し、Ｘ及びＹは各々メチン又は窒素原子を表し、ｊは０、１又は２を表し、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３は各々水素原子又はＲ１〜Ｒ４で説明した置換基と同じ意味の基を表す。ここで、Ｘ及びＹが置換メチンを表すときその置換基、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３の各々の任意の２つの置換基が連結し環状構造（例えばベンゼン環、ピラゾール環）を形成する場合、もしくは形成しない場合のいずれであっても良い。
【００６３】
ＢＬＫで表されるブロック基としては公知のものが使用できる。すなわち、特公昭４８−９９６８号、特開昭５２−８８２８号、同５７−８２８３４号、米国特許第３，３１１，４７６号、及び特公昭４７−４４８０５号（米国特許第３，６１５，６１７号）等に記載されているアシル基、スルホニル基等のブロック基、特公昭５５−１７３６９号（米国特許第３，８８８，６７７号）、同５５−９６９６号（米国特許第３，７９１，８３０号）、同５５−３４９２７号（米国特許第４，００９，０２９号）、特開昭５６−７７８４２号（米国特許第４，３０７，１７５号）、同５９−１０５６４０号、同５９−１０５６４１号、及び同５９−１０５６４２号等に記載されている逆マイケル反応を利用するブロック基、特公昭５４−３９７２７号、米国特許第３，６７４，４７８号、同３，９３２，４８０号、同３，９９３，６６１号、特開昭５７−１３５９４４号、同５７−１３５９４５号（米国特許第４，４２０，５５４号）、同５７−１３６６４０号、同６１−１９６２３９号、同６１−１９６２４０号（米国特許第４，７０２，９９９号）、同６１−１８５７４３号、同６１−１２４９４１号（米国特許第４，６３９，４０８号）、及び特開平２−２８０１４０号等に記載されている分子内電子移動によりキノンメチド又はキノンメチド類似の化合物の生成を利用するブロック基、米国特許第４，３５８，５２５号、同４，３３０，６１７号、特開昭５５−５３３３０号（米国特許第４，３１０，６１２号）、同５９−１２１３２８号、同５９−２１８４３９号、及び同６３−３１８５５５号（欧州公開特許第０２９５７２９号）等に記載されている分子内求核置換反応を利用するブロック基、特開昭５７−７６５４１号（米国特許第４，３３５，２００号）、同５７−１３５９４９号（米国特許第４，３５０，７５２号）、同５７−１７９８４２号、同５９−１３７９４５号、同５９−１４０４４５号、同５９−２１９７４１号、同５９−２０２４５９号、同６０−４１０３４号（米国特許第４，６１８，５６３号）、同６２−５９９４５号（米国特許第４，８８８，２６８号）、同６２−６５０３９号（米国特許第４，７７２，５３７号）、同６２−８０６４７号、特開平３−２３６０４７号、及び同３−２３８４４５号等に記載されている、５員又は６員環の環解裂反応を利用するブロック基、特開昭５９−２０１０５７号（米国特許第４，５１８，６８５号）、同６１−４３７３９号（米国特許第４，６５９，６５１号）、同６１−９５３４６号（米国特許第４，６９０，８８５号）、同６１−９５３４７号（米国特許第４，８９２，８１１号）、
【００６４】
特開昭６４−７０３５号、同４−４２６５０号（米国特許第５，０６６，５７３号）、特開平１−２４５２５５号、同２−２０７２４９号、同２−２３５０５５号（米国特許第５，１１８，５９６号）、及び同４−１８６３４４号等に記載されている共役不飽和結合への求核剤の付加反応を利用するブロック基、特開昭５９−９３４４２号、同６１−３２８３９号、同６２−１６３０５１号及び特公平５−３７２９９号等に記載されているβ−脱離反応を利用するブロック基、特開昭６１−１８８５４０号に記載されているジアリールメタン類の求核置換反応を利用したブロック基、特開昭６２−１８７８５０号に記載されているロッセン転位反応を利用したブロック基、特開昭６２−８０６４６、同６２−１４４１６３、及び同６２−１４７４５７号等に記載されているチアゾリジン−２−チオンのＮ−アシル体とアミン類との反応を利用したブロック基、特開平２−２９６２４０号（米国特許第５，０１９，４９２号）、同４−１７７２４３号、同４−１７７２４４号、同４−１７７２４５号、同４−１７７２４６号、同４−１７７２４７号、同４−１７７２４８号、同４−１７７２４９号、同４−１７９９４８号、同４−１８４３３７号、同４−１８４３３８号、国際公開特許９２／２１０６４号、特開平４−３３０４３８号、
【００６５】
国際公開特許９３／０３４１９号、及び特開平５−４５８１６号等に記載されている、２個の求電子基を有して二求核剤と反応するブロック基、特開平３−２３６０４７号及び同３−２３８４４５号を挙げることができる。これらのブロック基のうち、特に好ましいものは特開平２−２９６２４０号（米国特許第５，０１９，４９２号）、同４−１７７２４３号、同４−１７７２４４号、同４−１７７２４５号、同４−１７７２４６号、同４−１７７２４７号、同４−１７７２４８号、同４−１７７２４９号、同４−１７９９４８号、同４−１８４３３７号、同４−１８４３３８号、国際公開特許９２／２１０６４号、特開平４−３３０４３８号、国際公開特許９３／０３４１９号、及び特開平５−４５８１６号等に記載されている、２個の求電子基を有して二求核剤と反応するブロック基である。
【００６６】
式（Ｔ−１）で示される基からＢＬＫを除いたタイミング基部分の具体例として例えば以下のものが挙げられる。下記において、＊はＢＬＫと結合する位置を表し、＊＊は−Ｏ−ＣＯ−と結合する位置をあらわす。
【００６７】
【化１４】
2009240284.tif 000015
【００６８】
Ｒ１２及びＲ１３はアルキル基及びアリール基が好ましく、Ｒ１４はアリール基が好ましい。Ｒ１５はブロック基が好ましく、好ましいブロック基は前記の式（Ｔ−１）で表される基中の好ましいＢＬＫと同じである。Ｒ１６、Ｒ１７、及びＲ１８は水素原子が好ましい。
【００６９】
本発明に用いる式（Ｉ）で表される化合物として、米国特許第５，２４２，７８３号、同４，４２６，４４１号、特開昭６２−２２７１４１号、特開平５−２５７２２５号、同５−２４９６０２号、同６−４３６０７号、及び同７−３３３７８０号に記載された化合物も好ましい。
【００７０】
以下に本発明における一般式（Ｉ）で表される化合物の具体例を示すが、本発明はこれらの化合物に限定される訳ではない。
【００７１】
【化１５】
2009240284.tif 000016
【００７２】
【化１６】
2009240284.tif 000017
【００７３】
【化１７】
2009240284.tif 000018
【００７４】
本発明に用いられる発色現像薬の別の好ましい態様は、下記一般式（II）で表される化合物である。
【００７５】
【化１８】
2009240284.tif 000019
【００７６】
一般式（II）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。Ｘは−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−ＣＯＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−、−ＣＯＣＯ−Ｏ−、−ＣＯＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−または−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ１３）−である。ここでＲ１３は水素原子または前記Ｒ１２として挙げた基より選ばれる基である。
【００７７】
一般式（II）の好ましい態様の１つは、下記一般式（III）で表される化合物である。
【００７８】
【化１９】
2009240284.tif 000020
【００７９】
一般式（III）においてＲ１２はアルキル基、ヘテロ環基を表し、Ｘ２１、Ｘ２３、及びＸ２５は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基を表し、Ｘ２２、Ｘ２４は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子、アシルオキシ基、アシルチオ基を表す。ただし、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５のハメットのσｐ値とＸ２２、Ｘ２４のハメットのσｍ値の和は１．５以上である。
【００８０】
一般式（II）の好ましい別の態様は、下記一般式（IV）で表される化合物である。
【００８１】
【化２０】
2009240284.tif 000021
【００８２】
一般式（IV）におけるＲ１１とＲ１２は、それぞれ一般式（Ｉ）におけるものと同義である。
【００８３】
本発明に用いられる発色現像薬の酸化体はカプラーと反応し、色素を形成することを特徴とする化合物である。
【００８４】
以下に発色現像薬の構造について詳しく説明する。Ｒ１１は置換基を有してもよいアリール基またはヘテロ環基を示す。Ｒ１１のアリール基としては好ましくは炭素数６ないし１４のもので、例えば、フェニルやナフチルが挙げられる。Ｒ１１のヘテロ環基としては、好ましくは窒素、酸素、硫黄、セレンのうち少なくとも一つを含有する飽和または不飽和の５員環、６員環または７員環のものである。これらにベンゼン環またはヘテロ環が縮合していても良い。Ｒ１１のヘテロ環の例としては、フラニル、チエニル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピロリジニル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ピリジル、ピリダジル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノリニル、イソキノリニル、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、プリニル、プテリジニル、アゼピニル、ベンゾオキセピニル等が挙げられる。  
【００８５】
Ｒ１１の有する置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、アシルオキシ基、アシルチオ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アミド基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホンアミド基、スルファモイルアミノ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、アシルカルバモイル基、カルバモイルカルバモイル基、スルホニルカルバモイル基、スルファモイルカルバモイル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルコキシスルホニル基、アリールオキシスルホニル基、スルファモイル基、アシルスルファモイル基、カルバモイルスルファモイル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、スルホ基、ホスホノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、イミド基、アゾ基等が挙げられる。Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基を表わす。  
【００８６】
Ｒ１２のアルキル基としては好ましくは炭素数１ないし１６の直鎖、分岐または環状のもので、例えばメチル、エチル、ヘキシル、ドデシル、２−オクチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等が挙げられる。Ｒ１２のアルケニル基としては、好ましくは炭素数２ないし１６の鎖状または環状のもので、例えばビニル、１−オクテニル、シクロヘキセニルが挙げられる。  
【００８７】
Ｒ１２のアルキニル基としては、好ましくは炭素数２ないし１６のもので、例えば１−ブチニル、フェニルエチニル等が挙げられる。Ｒ１２のアリール基及びヘテロ環基としては、Ｒ１１で述べたものが挙げられる。Ｒ１２の有する置換基としてはＲ１１の置換基で述べたものが挙げられる。Ｘとして好ましくは−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−ＣＯＣＯ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−であり、さらに好ましくは、−ＳＯ２−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−である。特にＸが−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−であるとき、この化合物と反応するカプラーとして２当量カプラーを用いることができ、また未処理の感光材料の長期保存によるステインの上昇も本発明において特に効果的に低く抑えることができ、好ましい。  
【００８８】
またＲ１１としては好ましくは含窒素ヘテロ環基または一般式（Ｖ）で表される基であり、一般式（IV）で表される化合物については好ましくは６員環の含窒素ヘテロ環基または一般式（Ｖ）で表される基であり、一般式（II）で表される化合物については好ましくは一般式（Ｖ）で表される基である。
【００８９】
【化２１】
2009240284.tif 000022
【００９０】
一般式（Ｖ）において、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５は水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基を表し、Ｘ２２、Ｘ２４は水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子、アシルオキシ基、アシルチオ基を表す。ただし、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５のハメットのσｐ値とＸ２２、Ｘ２４のハメットのσｍ値の和は１．５以上である。本発明の還元剤は層中で非拡散性のものが好ましい。
以下に一般式（II）で表される化合物の具体的例を示すが、本願はこれらの化合物に限定される訳ではない。  
【００９１】
【化２２】
2009240284.tif 000023
【００９２】
【化２３】
2009240284.tif 000024
【００９３】
【化２４】
2009240284.tif 000025
【００９４】
【化２５】
2009240284.tif 000026
【００９５】
【化２６】
2009240284.tif 000027
【００９６】
【化２７】
2009240284.tif 000028
【００９７】
【化２８】
2009240284.tif 000029
【００９８】
【化２９】
2009240284.tif 000030
【００９９】
【化３０】
2009240284.tif 000031
【０１００】
【化３１】
2009240284.tif 000032
【０１０１】
【化３２】
2009240284.tif 000033
【０１０２】
【化３３】
2009240284.tif 000034
【０１０３】
【化３４】
2009240284.tif 000035
【０１０４】
【化３５】
2009240284.tif 000036
【０１０５】
【化３６】
2009240284.tif 000037
【０１０６】
【化３７】
2009240284.tif 000038
【０１０７】
【化３８】
2009240284.tif 000039
【０１０８】
【化３９】
2009240284.tif 000040
【０１０９】
【化４０】
2009240284.tif 000041
【０１１０】
【化４１】
2009240284.tif 000042
【０１１１】
【化４２】
2009240284.tif 000043
【０１１２】
【化４３】
2009240284.tif 000044
【０１１３】
本発明においては、発色現像薬は、水溶液あるいは有機溶剤に溶解した溶液、乳化分散物、あるいは固体状分散物で用いることができる。
【０１１４】
微粒子分散物で用いられる場合の数平均粒子サイズは、０．００１μｍ〜５μｍであることが好ましく、０．００１μｍ〜０．５μｍであることが更に好ましい。
【０１１５】
本発明における発色現像薬の使用量の好ましい範囲は、使用する色素前駆体１モルに対して同じモルから１０００倍モルが好ましく、より好ましくは同じモルから１００倍モルが好ましい。
【０１１６】
３）色素前駆体
本発明に用いることの出来る色素前駆体は、本発明の発色現像薬の酸化体と反応して色素を形成し得る化合物である。好ましくは、発色現像薬の酸化体とカップリングして可視部に吸収を持つ色素を形成できる化合物である。このような化合物はカラー写真系ではよく知られた化合物であり、その代表例としてピロロトリアゾール型カプラー、フェノール型カプラー、ナフトール型カプラー、ピラゾロトリアゾール型カプラー、ピラゾロン型カプラー、アシルアセトアニリド型カプラーなどが挙げられる。
【０１１７】
本発明において好ましいカプラーは一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）、または（Ｙ−３）で表される構造を有するカプラーである。
【０１１８】
【化４４】
2009240284.tif 000045
【０１１９】
式中、Ｘ１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ１およびＹ２は電子求引性の置換基を表し、Ｒ１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。
【０１２０】
【化４５】
2009240284.tif 000046
【０１２１】
式中、Ｘ２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ３とＲ４が互いに連結して環を形成してもよい。
【０１２２】
【化４６】
2009240284.tif 000047
【０１２３】
式中、Ｘ３は水素原子または離脱基を表し、Ｒ５はカルバモイル基またはスルファモイル基を表し、Ｒ６は水素原子または置換基を表す。
【０１２４】
【化４７】
2009240284.tif 000048
【０１２５】
式中、Ｘ４は水素原子または離脱基を表し、Ｒ７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ８は置換基を表す。
【０１２６】
【化４８】
2009240284.tif 000049
【０１２７】
式中、Ｘ５は水素原子または離脱基を表し、Ｒ９はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ１０は置換基を表す。
【０１２８】
【化４９】
2009240284.tif 000050
【０１２９】
式中、Ｘ６は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１１はアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基を表し、Ｒ１０はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。
【０１３０】
【化５０】
2009240284.tif 000051
【０１３１】
式中、Ｘ７は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１３はアルキル基、アリール基、インドレニル基を表し、Ｒ１４はアリール基またはヘテロ環基を表す。
【０１３２】
【化５１】
2009240284.tif 000052
【０１３３】
式中、Ｘ８は水素原子または離脱基を表し、Ｚは５員ないし７員の環を形成するのに必要な２価の基を表し、Ｒ１５はアリール基またはヘテロ環基を表す。
【０１３４】
【化５２】
2009240284.tif 000053
【０１３５】
式中、Ｘ９は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８はそれぞれ置換基を表し、ｎは０ないし４の、ｍは０ないし５のいずれかの整数を表す。ｎまたはｍが２以上のとき、複数のＲ１６およびＲ１７はそれぞれ同一の基であってもよいし、別々の基であってもよい。
【０１３６】
一般式（Ｃ−１）において、Ｘ１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ１およびＹ２は電子求引性の置換基を表し、Ｒ１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい。
Ｘ１は水素原子または離脱基で、好ましくは離脱基である。
本発明で言う離脱基とは、還元剤の酸化体とカップリングし、色素を形成する際に母核から離脱可能な基を意味する。離脱基としてはハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルオキシ基、カルバモイルオキシ基、イミド基、メチロール基、ヘテロ環基等が挙げられる。Ｘ１としてはカルバモイルオキシ基またはベンゾイルオキシ基がより好ましい。Ｙ１およびＹ２は電子求引性基を表す。具体的には、シアノ基、ニトロ基、アシル基、オキシカルボニル基、カルバモイル基、スルホニル基、スルホキシド基、オキシスルホニル基、スルファモイル基、ヘテロ環基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子が挙げられる。その中でも好ましくはシアノ基、オキシカルボニル基、スルホニル基で、より好ましくはシアノ基、オキシカルボニル基である。Ｙ１とＹ２のいずれか一方がシアノ基であることがさらに好ましく、Ｙ１がシアノ基であることが特に好ましい。Ｙ２はオキシカルボニル基であることが好ましく、かさ高い基で置換されたオキシカルボニル基（例えば２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルピペラジニルオキシカルボニル基）が特に好ましい。Ｒ１は好ましくはアルキル基またはアリール基であり、これらの基は置換基を有していてもよい。アルキル基としては２級または３級のアルキル基が好ましく、より好ましくは３級のアルキル基である。アルキル基としては炭素数の和が３〜１２の範囲であることが好ましく４〜８の範囲であることがより好ましい。アリール基としてはフェニル基が好ましく、置換基を有していてもよいが、炭素数の和が６〜１６の範囲であることが好ましく、６〜１２の範囲であることがより好ましい。一般式（Ｃ−１）のカプラーは分子量が７００以下であることが好ましく、６５０以下であることがより好ましく、６００以下であることがさらに好ましい。
【０１３７】
一般式（Ｃ−２）において、Ｘ２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ３とＲ４が互いに連結して環を形成してもよい。
Ｘ２は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基であるが、Ｘ２として好ましいのはハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基、アリールチオ基またはアルキルチオ基で、ハロゲン原子またはアリールオキシ基がより好ましい。Ｒ２は好ましくはアシルアミノ基またはウレイド基である。Ｒ２としては炭素数の総和が２〜１２の範囲が好ましく、より好ましくは２〜８の範囲である。Ｒ３は好ましくは炭素数１〜４のアルキル基または炭素数２〜１２のアシルアミノ基であり、より好ましくは炭素数２〜４のアルキル基または炭素数２〜８のアシルアミノ基である。Ｒ４は好ましくはハロゲン原子、アルコキシ基、アシルアミノ基、アルキル基であり、より好ましくはハロゲン原子またはアシルアミノ基で、特に塩素原子が好ましい。一般式（Ｃ−２）のカプラーは分子量が５００以下であることが好ましく、４５０以下であることがより好ましく、４００以下であることがさらに好ましい。
【０１３８】
一般式（Ｃ−３）において、Ｘ３は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基であるが、Ｘ３として好ましいのはハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基、アリールチオ基またはアルキルチオ基で、アルコキシ基またはアルキルチオ基がより好ましい。Ｒ５はアシル基、オキシカルボニル基、カルバモイル基またはスルファモイル基が好ましく、カルバモイル基またはスルファモイル基がより好ましい。Ｒ５として炭素数の和が１〜１２の基が好ましく、より好ましくは炭素数が２〜１０である。Ｒ６は水素原子もしくは置換基であるが、置換基としては好ましくはアミド基、スルホンアミド基、ウレタン基またはウレイド基であり、アミド基またはウレタン基がより好ましい。置換位置としてはナフトール環の５位または８位が好ましく、５位がより好ましい。Ｒ６として炭素数の和が２〜１０の基が好ましく、より好ましくは炭素数が２〜６である。一般式（Ｃ−２）のカプラーは分子量が５５０以下であることが好ましく、５００以下であることがより好ましく、４５０以下であることがさらに好ましい。
【０１３９】
一般式（Ｍ−１）においてＸ４は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基あるが、Ｘ４として好ましいのはハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基、アリールチオ基、アルキルチオ基またはヘテロ環基で、ハロゲン原子、アリールオキシ基、アリールチオ基またはヘテロ環基がより好ましい。ヘテロ環基としてはピラゾール基、イミダゾール基、トリアゾール基、テトラゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾトリアゾール基等のアゾール基が好ましく、ピラゾール基がより好ましい。Ｒ７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基で、これらの基は置換基を有していてもよい。好ましくは２級もしくは３級のアルキル基またはアリール基である。アルキル基としては炭素数が２〜１４の基が好ましく、より好ましくは炭素数３〜１０の基である。アリール基としては好ましくは炭素数が６〜１８の基で、より好ましくは６〜１４の基である。Ｒ８は好ましくはアルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基またはヘテロ環であり、これらの基は置換基を有していてもよい。アルキル基としては２級または３級のアルキル基が好ましく、より好ましくは３級のアルキル基である。アルキル基としては炭素数の和が３〜１２の範囲であることが好ましく４〜８の範囲であることがより好ましい。アリール基としてはフェニル基が好ましく、置換基を有していてもよいが、炭素数の和が６〜１６の範囲であることが好ましく、６〜１２の範囲であることがより好ましい。アルコキシ基としては炭素数１〜８のアルコキシ基が好ましく、より好ましくは炭素数１〜４のアルコキシ基である。アリールオキシ基としては炭素数６〜１４のアリールオキシ基が好ましく炭素数６〜１０の基がより好ましい。アルキルチオ基、アリールチオ基もそれぞれアルコキシ基、アリールオキシ基と同様の炭素数の基が好ましい。一般式（Ｍ−１）のカプラーは分子量が６００以下であることが好ましく、５５０以下であることがより好ましく、５００以下であることがさらに好ましい。
【０１４０】
一般式（Ｍ−２）のカプラーのＸ５、Ｒ９およびＲ１０で表される基はそれぞれ一般式（Ｍ−１）のカプラーのＸ４、Ｒ７およびＲ８で表される基と同様の基で、それぞれの基の好ましい範囲も一般式（Ｍ−１）のカプラーと同様である。
【０１４１】
一般式（Ｍ−３）において、Ｘ６は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基あるが、Ｘ６として好ましいのはアルキルチオ基、アリールチオ基またはヘテロ環基で、より好ましくはアリールチオ基またはヘテロ環基である。アリールチオ基としてはフェニル基が好ましく、特に２位にアルコキシ基、アミド基が置換したアリールチオ基が好ましい。アリールチオ基の炭素数の和は６〜１６の範囲が好ましく、７〜１２の範囲がより好ましい。ヘテロ環基としてはピラゾール基、イミダゾール基、トリアゾール基、テトラゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾトリアゾール基等のアゾール基が好ましく、ピラゾール基がより好ましい。Ｒ１１としてはアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基が好ましく、アシルアミノ基またはアニリノ基がより好ましい。最も好ましいのはアニリノ基である。アルキル基としては炭素数１〜８のアルキル基が好ましく、アリール基としては炭素数６〜１４のアリール基が好ましい。アシルアミノ基としては炭素数２〜１４の基が好ましく２〜１０の基がより好ましい。アニリノ基としては炭素数６〜１６の基が好ましく６〜１２の基がより好ましい。アニリノ基の置換基としてはハロゲン原子、アシルアミノ基が好ましい。一般式（Ｍ−３）のカプラーは分子量が７００以下であることが好ましく、６５０以下であることがより好ましく、６００以下であることがさらに好ましい。
【０１４２】
一般式（Ｙ−１）において、Ｘ７は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基あるが、Ｘ７として好ましいのはアリールオキシ基、イミド基またはヘテロ環基である。アリールオキシ基としては電子求引性基で置換されたアリールオキシ基が好ましい。イミド基としては環状のイミド基が好ましく、ヒダントイン基、１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン基およびコハクイミド基が特に好ましい。イミド基の炭素数の総和は３〜１５の範囲が好ましく、より好ましくは４〜１１の範囲で、さらに好ましくは５〜９の範囲である。ヘテロ環基としてはピラゾール基、イミダゾール基、トリアゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾトリアゾール基が好ましく、イミダゾール基がより好ましい。アゾール基の炭素数の総和は３〜１２の範囲が好ましく、より好ましくは３〜１０の範囲で、さらに好ましくは３〜８の範囲である。Ｒ１３は好ましくは２級もしくは３級のアルキル基、アリール基またはヘテロ環基である。アルキル基はシクロアルキル基、ビシクロアルキル基であってもよく３級アルキル基がより好ましい。１−アルキルシクロプロピル基、ビシクロアルキル基、アダマンチル基は特に好ましい。Ｒ１４はアリール基もしくはヘテロ環基で、アリール基がより好ましい。そのなかでも２位にハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基またはアリールチオ基が置換したフェニル基が特に好ましい。Ｒ１４の炭素数の総和は６〜１８の範囲が好ましく、より好ましくは７〜１６の範囲、さらに好ましくは８〜１４の範囲である。一般式（Ｙ−１）のカプラーは分子量が７００以下であることが好ましく、６５０以下であることがより好ましく、６００以下であることがさらに好ましい。
【０１４３】
一般式（Ｙ−２）のカプラーのＸ８およびＲ１５で表される基はそれぞれ一般式（Ｙ−１）のカプラーのＸ７、Ｒ１４で表される基と同様の基で、それぞれの基の好ましい範囲も一般式（Ｙ−１）のカプラーと同様である。Ｚは５ないし７員の環を形成するために必要な２価の基を表し、この環には置換基があってもよいし、別の環が縮環していてもよい。
【０１４４】
一般式（Ｙ−２）のなかでも好ましいのは一般式（Ｙ−３）で表されるカプラーである。
一般式（Ｙ−３）のカプラーにおいて、Ｘ９は一般式（Ｙ−１）のＸ７と同義で、好ましい範囲も同じである。Ｒ１６は好ましくはハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニル基、スルホンアミド基、シアノ基、スルホニル基、スルファモイル基、カルバモイル基またはアルキルチオ基で炭素数１〜４の置換基であることがより好ましい。ｎは好ましくは０〜３の整数で、より好ましくは０〜２、さらに好ましくは０〜１、最も好ましくは０である。Ｒ１７は好ましくはＲ１６と同様の基で、より好ましくはハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アシルアミノ基、スルホンアミド基、アルコキシカルボニル基、スルファモイル基、スルホニル基である。特にＮＨ基に対してオルト位にハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基であるＲ１７が置換されていることがより好ましい。最も好ましいのはアルキルチオ基である。一般式（Ｙ−３）のカプラーは分子量が７５０以下であることが好ましく、７００以下であることがより好ましく、６５０以下であることがさらに好ましい。
以下に本発明のカプラーの具体例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１４５】
【化５３】
2009240284.tif 000054
【０１４６】
【化５４】
2009240284.tif 000055
【０１４７】
【化５５】
2009240284.tif 000056
【０１４８】
【化５６】
2009240284.tif 000057
【０１４９】
【化５７】
2009240284.tif 000058
【０１５０】
【化５８】
2009240284.tif 000059
【０１５１】
【化５９】
2009240284.tif 000060
【０１５２】
【化６０】
2009240284.tif 000061
【０１５３】
【化６１】
2009240284.tif 000062
【０１５４】
【化６２】
2009240284.tif 000063
【０１５５】
【化６３】
2009240284.tif 000064
【０１５６】
【化６４】
2009240284.tif 000065
【０１５７】
【化６５】
2009240284.tif 000066
【０１５８】
【化６６】
2009240284.tif 000067
【０１５９】
【化６７】
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【０１６０】
【化６８】
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【０１６１】
【化６９】
2009240284.tif 000070
【０１６２】
【化７０】
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【０１６３】
【化７１】
2009240284.tif 000072
【０１６４】
【化７２】
2009240284.tif 000073
【０１６５】
【化７３】
2009240284.tif 000074
【０１６６】
【化７４】
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【０１６７】
【化７５】
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【０１６８】
【化７６】
2009240284.tif 000077
【０１６９】
【化７７】
2009240284.tif 000078
【０１７０】
【化７８】
2009240284.tif 000079
【０１７１】
【化７９】
2009240284.tif 000080
【０１７２】
【化８０】
2009240284.tif 000081
【０１７３】
【化８１】
2009240284.tif 000082
【０１７４】
【化８２】
2009240284.tif 000083
【０１７５】
【化８３】
2009240284.tif 000084
【０１７６】
上記の他に、特開２００４−４４３９に記載の化合物Ｎｏ．ＣＰ１０１〜ＣＰ１１７、ＣＰ２０１〜ＣＰ２２０、およびＣＰ３０１〜ＣＰ３３１なども本発明に用いることが出来る。
【０１７７】
本発明の色素前駆体は、オイル乳化物あるいは固体微粒子分散物として、例えばゼラチンやポリマーラテックスをバインダーとした塗布膜として用いることができる。このときの塗布量は、好ましくは１×１０−６モル／ｍ２〜１×１０−２モル／ｍ２が好ましく、さらに好ましくは１×１０−５モル／ｍ２〜１×１０−３モル／ｍ２で使用することである。
【０１７８】
本発明におけるプロテアーゼ基質を含有する層は、色素前駆体を含有する層に比べて薄層であり、３μｍ以下が好ましく、より好ましくは１μｍ以下である。
【０１７９】
本発明における色素前駆体を含有する層は、プロテアーゼ基質を含有する層に比べて厚く、１μｍ以上３０μｍ以下が好ましく、より好ましくは３μｍ以上２０μｍ以下である。
【０１８０】
４）発色方法
本発明において、発色現像薬は、色素前駆体を含有する層、又はプロテアーゼ基質を含有する層に含有させてもよく、あるいは支持体の色素前駆体を含有する層、又はプロテアーゼ基質を含有する層と同一面側に発色現像薬を含有する別層を設けても良い。あるいは、消化痕形成後に、発色現像薬を含有する処理液を塗布する方法を採用することもできる。
【０１８１】
（硬膜剤）
本発明におけるプロテアーゼ基質を含有する層がバインダーとしてゼラチンを含有し、さらにゼラチン硬膜剤を含有するのが好ましい。
硬膜剤として、写真用途でゼラチンの硬膜剤として知られている材料を用いることができる。プロテアーゼ基質含有層のゼラチン塗布量に対して項膜剤を０．２質量％〜３．０質量％添加するのが好ましく、さらに０．５質量％〜１．０質量％添加するがより好ましい。
【０１８２】
（細胞染色）
本発明は、細胞染色を併用することができる。細胞染色する場合、発色色素とは区別できるように色相の異なる染料を用いるのが好ましい。さらに、薄膜上の生体試料を別の色調の色素で組織染色し、消化痕と染色組織とを対比してもよい。例えば、生体試料に含まれる細胞の細胞核をヘマトキシリン又はメチルグリーンで染色すると、核の形態変化と消化痕とを光学顕微鏡下で別の色調の信号として同時に観察することができる。さらに、この組織染色法とプロテアーゼ・インヒビターを用いる方法とを組み合わせることにより、個々の細胞中に局在するプロテアーゼの存在とその種類の同定とを同時に行うこともできる。  
【０１８３】
本発明の方法で試料に含まれるプロテアーゼ活性を測定することによって、試料を分離した生体の状況、例えば癌の転移やリウマチの進行度などを調べることができるので、本発明の方法は、疾病の診断、臨床検査、動物実験など、種々の目的に利用することができる。消化痕における消化の強さの判定には、光学顕微鏡下で目視で判定する方法、分光器により消化痕の光学濃度を測定する方法、光学顕微鏡で得られる画像をコンピューターに取り込み、画像解析の方法により消化痕における各種の数値化を行う方法などを利用することができる。  
【実施例】
【０１８４】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１８５】
実施例１
１．色素前駆体を含有する層（発色層）の作製
カプラー（ＣＰ−１）４．５ｇ、色像安定剤（ＳＴ−１）１．３ｇ、色像安定剤（ＳＴ−２）０．２２ｇ及び色像安定剤（ＳＴ−３）１．４ｇを溶媒（ＳＯＬ−１）６．７ｇ、溶媒（ＳＯＬ−２）６．７ｇおよび溶媒（酢酸エチル）１９ｇに溶解し、この液を１．０ｇのドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含む２５質量％の牛骨アルカリ処理ゼラチン水溶液８４ｍＬと混合して、高速攪拌乳化機（ディゾルバー）で乳化分散し、さらに水を加えて２３０ｇの乳化分散物Ａを作製した。
乳化分散物Ａに牛骨アルカリ処理ゼラチン水溶液を加えて、以下の組成となるように塗布溶液を調製し、これをトリアセチルセルロース（ＴＡＣ）支持体上に塗布し乾燥することで、発色層を作製した。
【０１８６】
（ｇ／ｍ２）
ＣＰ−１                                    ０．２７  
ＳＴ−１                                    ０．０７９
ＳＴ−２                                    ０．０１３３
ＳＴ−３                                    ０．０８５
ＳＯＬ−１                                  ０．４１
ＳＯＬ−２                                  ０．４１
牛骨アルカリ処理ゼラチン                    ２．２  
【０１８７】
【化８４】
2009240284.tif 000085
【０１８８】
【化８５】
2009240284.tif 000086
【０１８９】
２．プロテアーゼ基質を含有する層（基質層）の作製
プロテアーゼ基質となる豚皮膚酸処理ゼラチン、硬膜剤（Ｈ−１）、現像中心となるＢＢＩ社製銀粒子ＥＭＳＣ−６０を以下の組成となるように塗布溶液を調製し、これを上記発色層が塗設されたシートに塗布乾燥することで、基質層が設けられたプロテアーゼ検出材料を作製した。また、基質層の厚みを０．５・１．０・２．０・３．０・４．０μｍとなるようにプロテアーゼ検出材料を作製した。
【０１９０】
＜基質層０．５μｍ＞
（ｇ／ｍ２）
豚皮膚酸処理ゼラチン                        ０．６７２
Ｈ−１                                      ０．０１６２
銀微粒子                                    ０．００１２
【０１９１】
＜基質層１．０μｍ＞
（ｇ／ｍ２）
豚皮膚酸処理ゼラチン                        １．３４３
Ｈ−１                                      ０．０３２４
銀微粒子                                    ０．００１２
【０１９２】
＜基質層２．０μｍ＞
（ｇ／ｍ２）
豚皮膚酸処理ゼラチン                        ２．６８６
Ｈ−１                                      ０．０６４８
銀微粒子                                    ０．００１２
【０１９３】
＜基質層３．０μｍ＞
（ｇ／ｍ２）
豚皮膚酸処理ゼラチン                        ４．０２９
Ｈ−１                                      ０．０９７２
銀微粒子                                    ０．００１２
【０１９４】
＜基質層４．０μｍ＞
（ｇ／ｍ２）
豚皮膚酸処理ゼラチン                        ５．３７２
Ｈ−１                                      ０．１３０
銀微粒子                                    ０．００１２
【０１９５】
上記プロテアーゼ検出材料にプロテアーゼであるパパインを０．５Ｍリン酸バッファー溶液に溶解した溶液を１０μＬ滴下し、３７℃湿度１００％環境で３０分および５時間インキュベートした。パパインの濃度は、１，０．５，０．２５，０．１３，０．０６  ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした。
一定時間経過した後、純水にて滴下したパパイン溶液を洗浄した。
【０１９６】
発色液の作製
８Ｎ水酸化カリウム０．４ｍＬ、炭酸水素カリウム２６．４ｇからなるバッファー水溶液８００ｍＬに亜硫酸カリウム４ｇおよび一般式（Ｉ）の還元剤（１−１２）３．２ｇを添加し、溶解後、全液量が１０００ｍＬとなるように水で希釈し、発色液を作製した。
【０１９７】
【化８６】
2009240284.tif 000087
【０１９８】
この発色液４８ｍＬに３０質量％の過酸化水素水を１．６ｍｌ加えた液に、上記インキュベート済みのプロテアーゼ検出材料を１０分間浸し現像した。プロテアーゼにより基質層が分解されている部分は白く抜け、その他の部分はシアン色に発色した。
【０１９９】
（比較例）
プロテアーゼ基質となる豚皮膚酸処理ゼラチン、硬膜剤（Ｈ−１を以下の組成となるように塗布溶液を調製し、これをＴＡＣ支持体上に塗布乾燥することで、プロテアーゼ検出材料を作製した。また、層の厚みを４．０・５．０・６．０・７．０・８．０μｍとなるようにプロテアーゼ検出材料を作製した。
【０２００】
＜塗布膜４．０μｍ＞
（ｇ／ｍ２）
豚皮膚酸処理ゼラチン                        ５．３７２
Ｈ−１                                      ０．１３０
【０２０１】
＜塗布膜５．０μｍ＞
（ｇ／ｍ２）
豚皮膚酸処理ゼラチン                        ６．７１５
Ｈ−１                                      ０．１６２
【０２０２】
＜塗布膜６．０μｍ＞
（ｇ／ｍ２）
豚皮膚酸処理ゼラチン                        ８．０５８
Ｈ−１                                      ０．１９４
【０２０３】
＜塗布膜７．０μｍ＞
（ｇ／ｍ２）
豚皮膚酸処理ゼラチン                        ９．４０１
Ｈ−１                                      ０．２２６８
【０２０４】
＜塗布膜８．０μｍ＞
（ｇ／ｍ２）
豚皮膚酸処理ゼラチン                        １０．７４４
Ｈ−１                                      ０．２５９２
【０２０５】
上記プロテアーゼ検出材料にプロテアーゼであるパパインを０．５Ｍリン酸バッファー溶液に溶解した溶液を１０μＬ滴下し、３７℃湿度１００％環境で３０分および５時間インキュベートした。パパインの濃度は、１，０．５，０．２５，０．１３，０．０６  ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした。
一定時間経過した後、純水にて滴下したパパイン溶液を洗浄した。
【０２０６】
染色液として６％のトリクロロ酢酸水溶液に濃度０．８％になるようにポンソー３Ｒを溶解させた液を用い、上記インキュベートしたプロテアーゼ検出材料を室温で６０秒間浸漬して染色した。これを１０分間水に漬け、洗浄した。
【０２０７】
評価
＜検出感度評価＞
現像および染色済みサンプルの各濃度のパパイン滴下部を目視観察し、下記評価基準で判断した。
○：明瞭に色が抜け区別できる。
×：色抜けが不明瞭もしくはまったく色が抜けていない。
【０２０８】
＜画質評価＞
また、光学顕微鏡で観察する際は、一般に透過光学濃度（ビジュアル）が１．０以上なければ、明瞭なコントラストが得られない。発色部の色の濃さとして、下記評価基準で判断した。
良：発色部の透過光学濃度が１．０以上ある。
悪：発色部の透過光学濃度が１．０より低い。
【０２０９】
【表１】
2009240284.tif 000088
【０２１０】
上記評価結果より、本発明により、プロテアーゼによる基質の分解を極めて短時間かつ高感度に検出できることがわかった。