(57)【要約】【課題】  安全性に優れ、かつ高いインターロイキン１２産生誘導作用を有する新規ペプチドを提供する。【解決手段】  式（Ｉ）：Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ式（ＩＩ）：Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（配列番号１）、または式（ＩＩＩ）：Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（配列番号２）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩。
【請求項２】
式（ＩＩ）：Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩。
【請求項３】
式（ＩＩＩ）：Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（配列番号２）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩からなるインターロイキン１２産生誘導剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩からなる免疫賦活剤または抗アレルギー剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を含有する組成物。
【請求項７】
請求項４に記載のインターロイキン１２産生誘導剤を含有する組成物。
【請求項８】
請求項５に記載の免疫賦活剤または抗アレルギー剤を含有する組成物。
【請求項９】
インターロイキン１２産生誘導のために用いられる、請求項６〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
免疫賦活または抗アレルギーのために用いられる、請求項６〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
経口用組成物または外用組成物である、請求項６〜１０のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩、特にインターロイキン１２産生誘導作用を有する新規ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩に関する。さらに本発明は、これらの新規ペプチドなどを含有する組成物、およびこれらの新規ペプチドなどの使用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫システムは、体外から侵入した異物や危険物から身を守るため、ヒト等の高等動物が持っている生体防御機構であり、病原体（細菌、ウイルス、カビなど）、有害な化学物質、癌細胞など非自己を認識し、排除する。この免疫システムが正常に働かないと、様々な疾患が引き起こされる。免疫システムが過剰に反応した場合、例えば、本来は免疫寛容される外来物質（花粉、埃、薬品、食品など）に対しても免疫応答が起こり、アレルギーを発症する。逆に免疫システムが低下した場合、例えば、ウイルスや細菌といった病原微生物に対して発揮されるべき免疫応答が起こらず、感染症を発症する。この免疫システムを正常に維持、または賦活することにより、例えば、（１）花粉症およびアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患を改善すること、（２）細菌もしくはウイルスなどの病原微生物の感染を防止すること、（３）自己免疫疾患の発症を抑制すること、ならびに（４）腫瘍に対する防御機能を高めることが可能となる。一方、近年、高齢化社会を迎え、医療費の高騰が深刻な問題となっているなかで、疾患を予防する予防医学が、注目されている。その一つとして、免疫システムを正常に維持または賦活することによって疾患を予防し、心身の健康増進を図ることが期待されている。
【０００３】
免疫のマーカーとしては、各種サイトカイン、ＮＫ活性、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ヒスタミンなどが挙げられる。これまで、これらを指標に、免疫システムを正常に維持または賦活できる素材（物質）の探索および開発が行われている。インターロイキン１２（以下、ＩＬ−１２と略すことがある）は免疫システムの上流で働き、ナイーブＴ細胞のＴｈ１への分化を促進することでＴｈ２側に偏ったＴｈ１／Ｔｈ２バランス（免疫バランス）をＴｈ１側へ誘導する。Ｔｈ１細胞は感染防御能を高めると同時に、Ｔｈ２細胞を弱めることでアレルギー反応を抑制する活性を有している。また、ＩＬ−１２はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化して自然免疫系にも作用する。したがって、ＩＬ−１２産生誘導作用を有する素材は、免疫システムを正常に維持または賦活することができ、ウイルスや細菌に対する生体防御能を高めたり、アレルギー反応を抑制したりなどするので、細菌感染やアレルギーなどの疾患の症状を緩和することに有用であることが期待される。
さらに、ＩＬ−１２は皮膚構成細胞によっても産生され、紫外線に起因する皮膚状態の悪化を緩和し、皮膚組織の防護にも作用する。したがって、ＩＬ−１２産生誘導作用を有する素材は、皮膚組織の防護に有用であることが期待される。
【０００４】
これまでも、ＩＬ−１２産生誘導作用を有する素材の開発が行われている。このような素材は、例えば、下記の文献に開示されている。
特許文献１には、あまのり属海藻類に由来する素材を含有する、活性型インターロイキン１２産生誘導剤が記載されている。
特許文献２には、ＩＬ−１２産生を誘導し、免疫賦活に有用なラクトコッカス属乳酸菌が記載されている。
特許文献３には、コンドロシン等を含み、ＩＬ−１２産生誘導性を有する、マクロファージ活性化剤が記載されている。
特許文献４には、コショウ科植物成分を含有し、ＩＬ−１２産生を誘導する免疫賦活剤が記載されている。
しかし、これらの文献には、本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩は記載されていない。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１９３８２８号公報
【特許文献２】特開２００３−８８３６２号公報
【特許文献３】特開２００６−５２１８８号公報
【特許文献４】特開２００７−１３１５６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、これまでにもＩＬ−１２産生誘導作用を有する素材が開発されている。しかし、なお、更なる素材の開発が望まれている。
したがって、本発明は、ＩＬ−１２産生誘導作用を有する新規素材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定のアミノ酸配列を有する新規ペプチドが、安全性に優れ、かつ高いＩＬ−１２産生誘導作用を有することを見出し、さらなる研究の結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］式（Ｉ）：Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩；
［２］式（ＩＩ）：Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩；
［３］式（ＩＩＩ）：Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（配列番号２）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩；
［４］上記［１］〜［３］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩からなるインターロイキン１２産生誘導剤；
［５］上記［１］〜［３］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩からなる免疫賦活剤または抗アレルギー剤；
［６］上記［１］〜［３］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を含有する組成物；
［７］上記［４］に記載のインターロイキン１２産生誘導剤を含有する組成物；
［８］上記［５］に記載の免疫賦活剤または抗アレルギー剤を含有する組成物；
［９］インターロイキン１２産生誘導のために用いられる、上記［６］〜［８］のいずれかに記載の組成物；
［１０］免疫賦活または抗アレルギーのために用いられる、上記［６］〜［８］のいずれかに記載の組成物；および
［１１］経口用組成物または外用組成物である、上記［６］〜［１０］のいずれかに記載の組成物；
等を提供するものである。
【０００９】
本発明はさらに、
［１２］前記[１]〜［３］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を対象に投与することを含む、インターロイキン１２の産生を誘導する方法；
［１３］前記[１]〜［３］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を対象に投与することを含む、免疫を賦活する方法；
［１４］前記[１]〜［３］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を対象に投与することを含む、アレルギーの治療または予防方法；
［１５］インターロイキン１２産生誘導剤の製造のための、前記[１]〜［３］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の使用；
［１６］免疫賦活剤または抗アレルギー剤の製造のための、前記[１]〜［３］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の使用；
［１７］インターロイキン１２産生誘導用の組成物の製造のための、前記[１]〜［３］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の使用；および
［１８］免疫賦活または抗アレルギー用の組成物の製造のための、前記[１]〜［３］のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の使用；
等を提供するものである。
【００１０】
本発明はさらに、
［１９］前記[１]〜［３］のいずれかに記載のペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；
［２０］前記[１]〜［３］のいずれかに記載のペプチドをコードする塩基配列に対するアンチセンス配列からなるポリヌクレオチド；
［２１］前記[１９]または[２０]記載のポリヌクレオチドを含有するプラスミド；
［２２］前記[１９]または[２０]記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター；および
［２３］前記[１９]または[２０]記載のポリヌクレオチドを含有する形質転換体
等を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、安全性に優れ、かつ高いＩＬ−１２産生誘導作用を有する新規ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本明細書中、ペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
本発明は、下記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を提供する。
式（Ｉ）：Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（一文字略記：ＫＨＰ）、
式（ＩＩ）：Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（一文字略記：ＫＩＨＰ、配列番号１）、または
式（ＩＩＩ）：Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（一文字略記：ＨＫＥＭＰＦＰＫＹ、配列番号２）
【００１３】
本明細書中において、「ペプチドの誘導体」とは、例えば、ペプチドが、アセチル化、パルミトイル化、ミリスチル化、アミド化、アクリル化、ダンシル化、ビオチン化、リン酸化、サクシニル化、アニリド化、ベンジルオキシカルボニル化、ホルミル化、ニトロ化、スルフォン化、アルデヒド化、環状化、グリコシル化、モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化、グアニジル化、アミジン化、マレイル化、トリフルオロアセチル化、カルバミル化、トリニトロフェニル化、ニトロトロポニル化、またはアセトアセチル化されたもの等が挙げられる。
本明細書中において「塩」として、薬理学的に許容される任意の塩（無機塩および有機塩を含む）が好ましく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、および硝酸塩等の無機塩、ならびに酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、およびベンゼンスルホン酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。なかでも、好ましくは、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩または酢酸塩であり、より好ましくはアンモニウム塩または酢酸塩である。
【００１４】
本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩は、水和物または無水和物であってよい。
本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩は、溶媒和物または無溶媒和物であってよい。
【００１５】
本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩は、当該分野で公知の方法により作製され得る。
例えば、本発明のペプチドは、化学合成方法（例えば、固相法（例えば、Ｆｍｏｃ法）、液相法等）により合成することができる。当該化学合成方法は、例えば、市販のペプチド自動合成装置を用いて、製造業者の指示書に従って実施すればよい。
また、本発明のペプチドは、遺伝子組換え発現等の方法により作製されてもよい。
【００１６】
遺伝子組換え発現による本発明のペプチドの作製は、下記のようにして得られた形質転換体を適当な条件下で培養して前記ペプチドを発現させ、これを所望により精製することにより実施できる。
なお本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ−体であってもＤ−体であってもよいが、好ましくはＬ−体である。
【００１７】
本発明は、さらに、前記ペプチドをコードする塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、前記ペプチドをコードする限り、特に限定されない。例えば、本発明のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとしては、遺伝暗号表に従い本発明のアミノ酸配列をコードすることが明らかな任意の配列が、コドン使用頻度等に応じて適宜選択され、使用され得る。
【００１９】
アミノ酸配列：ＫＨＰをコードするポリヌクレオチドとして具体的には、例えば下記の配列が挙げられる。
AAA CAT CCG
【００２０】
同様に、アミノ酸配列：ＫＩＨＰをコードするポリヌクレオチドとして具体的には、例えば下記の配列が挙げられる。
AAA ATT CAT CCG（配列番号３）
同様に、アミノ酸配列：ＨＫＥＭＰＦＰＫＹをコードするポリヌクレオチドとして具体的には、例えば下記の配列が挙げられる。
CAT AAA GAA ATG CCG TTT CCG AAA TAT（配列番号４）
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法により作製され得る。例えば、市販のDNA合成機(例えばApplied Biosystems 3400 DNA合成機、Applied Biosystems社製)を用いて作製することができる。
【００２２】
以上のようにして得られたポリヌクレオチドを使用することにより、以下に述べるプラスミドまたは発現ベクターを作製することができる。
【００２３】
本発明はさらに、前記ペプチドをコードする塩基配列に対するアンチセンス配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドを提供する。
【００２４】
かかるポリヌクレオチドもまた、前述と同様にして作製することができる。
【００２５】
さらに、かかるポリヌクレオチドを使用することにより、以下に述べる本発明のプラスミドまたは発現ベクターを作製することができる。
【００２６】
本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプラスミドを提供する。
【００２７】
本発明のプラスミドは、特に限定されないが、例えばpBR系プラスミド、pUC系プラスミド等の公知のプラスミドに、一般的な分子生物学的実験手法を使用して本発明のポリヌクレオチドを組込んで作製できる。
【００２８】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクターを提供する。
【００２９】
本発明の発現ベクターは、特に限定されないが、例えばpcDNA3、pSD64、λファージベクター等の公知のベクターに、一般的な分子生物学的実験手法を使用して本発明のポリヌクレオチドを発現可能な状態で組込んで作製できる。
【００３０】
以上のようにして得られたプラスミドまたは発現ベクターを使用することにより、以下に述べる形質転換体を作製することができる。
【００３１】
本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする形質転換体を提供する。
【００３２】
本発明の形質転換体は、前記プラスミドまたは発現ベクターを所望の宿主に導入すること、または前記ポリヌクレオチドを直接宿主の染色体に組込むこと等により得ることができる。宿主としては特に限定されず、例えば大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を使用することができる。発現ベクターを宿主へ導入する方法としては、例えばカルシウム処理法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法を用いればよい。
【００３３】
さらに本発明のペプチドは、目的のアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列中から、目的のアミノ酸配列からなるペプチドをプロテアーゼ処理等の公知の手段によって切り出すことによっても調製され得る。
プロテアーゼは、その配列特異性等を考慮して、目的のアミノ酸配列を含むタンパク質のアミノ酸配列中から、目的のアミノ酸配列からなるペプチドを切り出すために適切なものを適宜選択し得る。またタンパク質をプロテアーゼで加水分解する場合に用いられる反応条件は、特に制限されず、技術常識に従って適宜選択され得る。プロテアーゼ加水分解後には、必要に応じ、当該分野で公知の手段によって精製することにより、目的のペプチドを精製することができる。
天然のタンパク質をプロテアーゼで加水分解して得られるペプチドは、化学合成方法で製造する場合よりもコスト面から有利となる。さらに、天然のタンパク質をプロテアーゼで加水分解して得られるペプチドは、生体に対してより安全であると考えられる。従って、このようにして得られたペプチドは、生体への適用に対しより高い安全性が求められる組成物、例えば、医薬組成物（医薬品および医薬部外品を含む）や食品、化粧料（敏感肌用化粧料を含む）、飼料などに好適に使用され得る。
【００３４】
このようにして得られた本発明のペプチドから、所望により、その誘導体を得る事ができる。
本発明のペプチドの誘導体は、当該技術分野において慣用の方法により、作製することができる。
【００３５】
本発明のペプチドもしくはその誘導体の塩もまた、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に作製され得る。
【００３６】
以上のようにして得られた本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩は、安全性が高く、かつ高いＩＬ−１２産生誘導作用を有するので、例えば、（１）免疫賦活、（２）Ｔｈ２側に偏った免疫バランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス）のＴｈ１側への誘導、（３）ＮＫ細胞の活性化、または（４）皮膚組織の保護のために、使用することができ、ひいては［１］ＩＬ−１２産生促進が有効な疾患［例、アレルギー（例、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、金属アレルギー、食物アレルギー、ハウスダストによるアレルギー、アトピー性皮膚炎、気管支喘息など）、またはウイルスもしくは細菌などの感染（例、風邪症候群、インフルエンザ、ものもらい（麦粒腫）など）、腫瘍］などの治療、改善もしくは予防、またはこれらの疾患に罹患しがちな体質の改善、
［２］免疫機能の発達が未熟な乳幼児または免疫機能の低下した高齢者もしくは患者の免疫賦活、または
［３］アレルギー（例、金属アレルギー、食物アレルギー、ハウスダストによるアレルギー、アトピー性皮膚炎など）、紫外線もしくは細胞の酸化などによる皺（しわ）もしくは皮膚の老化、または敏感肌などの症状の予防、または症状の緩和のために使用することができる。
本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩は、そのまま、または本発明のペプチド等を含有する組成物として、上記の用途に用いる事ができる。
特に、本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩は、水溶性が高く、熱安定性も高いので、上記の用途に使用する際に、好適に使用され得る。
【００３７】
本発明の組成物としては、例えば、経口用組成物（例、医薬組成物、食品組成物、飼料組成物）および外用組成物（例、医薬組成物、化粧料）などが挙げられる。
【００３８】
本発明の組成物の一態様である医薬組成物としては、例えば、ＩＬ−１２の産生促進が有効である疾患の治療剤または予防剤などが挙げられる。具体的には、本発明の組成物は、アレルギー（例、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、金属アレルギー、食物アレルギー、ハウスダストによるアレルギー、アトピー性皮膚炎、気管支喘息など）、またはウイルスもしくは細菌の感染（例、風邪症候群、インフルエンザ、ものもらい（麦粒腫）など）、腫瘍などの治療剤または予防剤として好適に使用され得る。
【００３９】
本発明の組成物の一態様である食品組成物としては、例えば、ＩＬ−１２の産生促進が望ましい状態を改善または予防するための健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、栄養調整食品、特別用途食品などが挙げられる。これらの食品は、例えば、アレルギー（例、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、金属アレルギー、食物アレルギー、ハウスダストによるアレルギー、アトピー性皮膚炎、気管支喘息など）、またはウイルスもしくは細菌の感染（例、風邪症候群、インフルエンザ、ものもらい（麦粒腫）など）、腫瘍などを予防するため、これらの疾患の症状を緩和するためまたはこれらの疾患に罹患しがちな体質を改善するための食品、免疫機能の発達が未熟な乳幼児用の食品（育児用調製粉乳、フォローアップミルク、離乳食など）、免疫機能の低下した高齢者向けまたは患者向けの食品などとして好適に使用され得る。
【００４０】
本発明の組成物の一態様である飼料組成物としては、ヒト以外の哺乳類または鳥類（例、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ等の家畜；イヌ、ネコ等のペット動物）におけるＩＬ−１２の産生促進が有効な疾患を予防するため、またはこのような疾患の症状を改善するための飼料が挙げられる。具体的には、本発明の組成物は、免疫賦活用または抗アレルギー用の飼料として好適に使用され得る。
【００４１】
本発明の組成物の一態様である化粧料としては、例えば、ＩＬ−１２の産生促進が望ましい状態を改善または予防するための基礎化粧品などが挙げられる。これらの化粧料は、例えば、アレルギー（例、金属アレルギー、食物アレルギー、ハウスダストによるアレルギー、アトピー性皮膚炎など）、紫外線もしくは細胞の酸化などによる皺（しわ）もしくは皮膚の老化、または敏感肌などの症状を予防するため、またはこれらの症状を緩和するための化粧料として、好適に使用され得る。
本発明の外用組成物は、顔、手、足、体など皮膚であればいずれにも適用でき、上下眼瞼皮膚およびその周辺（まぶた、目尻など）、唇、陰部周辺部、肛門部、太腿の付根など、皮膚の角質が薄く、デリケートな部位においても問題なく使用することができる。
【００４２】
本発明の組成物中の本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の含有量は、ペプチド等の種類、組成物の剤型等によっても異なるが、高いＩＬ−１２産生誘導効果を得る観点から、通常、下記の量が好ましい。
当該含有量の下限は、好ましくは0.000003重量％、より好ましくは0.00001重量％、さらに好ましくは0.00003重量％、さらにより好ましくは0.0001重量％、0.0003重量％、さらにより好ましくは0.001重量％である。
当該含有量の上限は、好ましくは30重量％、より好ましくは10重量％、さらに好ましくは3重量％、さらにより好ましくは1重量％、さらにより好ましくは0.3重量％、さらにより好ましくは0.1重量％、さらにより好ましくは0.01重量％である。
中でも、本発明の組成物中が、外用剤である場合、当該含有量は、好ましくは0.000003〜30重量％、より好ましくは0.00001〜10重量％である。
また、本発明の組成物中が、経口組成物の場合、当該含有量は、好ましくは0.00001〜30重量％、より好ましくは0.00001〜10重量％、さらに好ましくは0.00003〜3重量％、さらにより好ましくは0.00003〜1重量％、さらにより好ましくは0.0001〜0.3重量％、さらにより好ましくは0.0001〜0.1重量％ある。
【００４３】
本発明の組成物は、本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の他に製剤分野や食品分野等において通常使用される担体、基剤、および添加剤等の成分を本発明の目的を達成する範囲内で適宜添加して製造することができる。
【００４４】
担体としては、例えば、糖類(例えば、マンニトール、乳糖、デキストラン等)、セルロース類(例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、結晶性セルロース等)、水難溶性ガム類(例えば、アラビアガム、トラガントガム等)、架橋ビニル重合体、脂質類等が１種または２種以上組み合わせて用いられ得る。
【００４５】
基剤としては、例えば、水、油脂類、鉱物油類、ロウ類、脂肪酸類、シリコーン油類、ステロール類、エステル類、金属石鹸類、アルコール等が１種または２種以上組み合わせて用いられ得る。
【００４６】
添加剤としては、例えば、界面活性剤、可溶化成分、乳化剤、油分、安定化剤、増粘剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、キレート剤、経皮吸収促進剤、抗酸化剤、崩壊剤、可塑剤、緩衝剤、ビタミン類、アミノ酸類、着色剤、香料等が１種または２種以上組み合わせて用いられ得る。
【００４７】
さらに本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩は、その効果の増強、または他の有用な作用を付加するために、他の有効成分と組み合わせて用いてもよい。
当該有効成分としては、抗アレルギー成分、抗炎症成分、抗菌成分、殺菌成分、収斂成分、抗酸化成分、ビタミン類、アミノ酸類、血行促進成分、鎮痛成分、老化防止成分、美白成分、紫外線防御成分、保湿成分、冷感成分、温感成分、創傷治癒促進成分、刺激緩和成分、ニキビ改善成分、生体成分合成促進成分（例、コラーゲン）、細胞賦活成分、および酵素等から選択される1種または2種以上の有効成分を用いることができる。
さらに、本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩は、他の免疫賦活剤と併用してもよい。この場合、本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の使用量は、単独で使用する場合よりも、減量してもよい。
【００４８】
本発明の組成物は、経口投与剤（経口投与される、医薬組成物、食品組成物および飼料組成物を含む）、外用剤(外用に供される、医薬組成物および化粧料を含む)等の任意の剤型であり得る。ＩＬ−１２産生促進作用の観点からは経口投与剤、外用剤が好ましい。
【００４９】
外用剤としては、例えば、液状、乳液状、クリーム状、ローション状、ペースト状、ムース状、ジェル状、シート状(基材担持)、エアゾール状、スプレー状等の任意の形態で使用され得る。
【００５０】
化粧料としては、例えば、ローション、乳液、クリーム、オイル、パック等の基礎化粧料、またファンデーション、頬紅、口紅等のメーキャップ化粧料、さらに洗顔料、クレンジング、ボディ洗浄料等の洗浄料、入浴剤等の任意の形態で使用され得る。
【００５１】
経口投与剤（経口投与される、医薬組成物、食組成物品および飼料組成物を含む）としては、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤(ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤、用時溶解剤を含む)、ゲル剤、リポソーム剤、エキス剤、チンキ剤、レモネード剤、ゼリー剤等の任意の形態で使用され得る。
【００５２】
また食品組成物とする場合には、パン、麺、惣菜、食肉加工食品（例えば、ハム、ソーセージなど）、水産加工食品、調味料（例えば、ドレッシングなど）、乳製品、加工乳、粉ミルク、菓子（例えば、ビスケット、キャンディー、ゼリー、アイスクリームなど）、スープ、ジュースなどの任意の一般の食品形態としても提供され得る。このような形態にする場合、本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を、目的とする食品の性質等に依存して、当業者に公知の方法により適宜添加して、目的の形態の食品組成物を製造する。
【００５３】
飼料としては、本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩をそのまま使用する等の、任意の形態で使用され得る。
【００５４】
本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩の使用量はＩＬ−１２産生誘導の作用が得られる量であればよいが、通常、外用の場合には、成人１人体重約50kgあたり好ましくは約0.1μg〜２g/日である。また、経口投与の場合における当該使用量は通常、成人1人体重約50kgあたり好ましくは約0.001〜10000mg/日、より好ましくは約0.01〜1000mg/日、さらに好ましくは約0.01〜100mg/日である。
【００５５】
本発明のペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩を皮膚に適用する場合の、その適用量は、好ましくは約1ng〜500μg/cm2、より好ましくは約0.01〜50μg/cm2、さらに好ましくは約0.1〜10μg/cm2である。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例、比較例および試験例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等により何ら限定されるものではない。
【００５７】
実施例１：ＫＨＰの合成
１）ペプチドの合成
ペプチドを、ペプチド自動合成装置(アプライドバイオ社製：４３３Ａ)を用いて、Ｆｍｏｃ法による固相合成法により合成した。具体的な手順は以下の通りである。まず固相合成用樹脂にＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＰＥＧ−ＰＳのＣ末端を結合させてから、保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、次いでこの樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨをＰｒｏのＮ末端に導入した。次いで保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｔＢｏｃ）−ＯＨをＨｉｓのＮ末端に導入した。次いで、保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去した後、トリフルオロ酢酸、エタンジチオールにより、ペプチド鎖と樹脂との結合、ＰｒｏのＰＥＧ基、ＨｉｓのＴｒｔ基及びＬｙｓのｔＢｏｃ基を切断することにより脱保護した。最後に、分取ＨＰＬＣで未反応物を除去して精製することによりＫＨＰを得た。
２）合成ペプチドの純度検定
得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００ＯＤＳ−ＨＧ−５(内径： 4.6mm、長さ： 250mm) 、野村化学社製、；移動相：溶媒Ａ（0.１％トリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（0.１％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル）のグラジエント（０分（溶媒Ｂ＝０％）〜３０分（溶媒Ｂ＝１００％））；流速：1 ml／分；検出法：波長 220nmにおける吸光度］に付したところ、8.5分に単一の鋭いピークが示され、純度は99％であった。
【００５８】
実施例２：ＫＩＨＰの合成
１）ペプチドの合成
実施例１と同様に、ペプチド自動合成装置(アプライドバイオ社製：４３３Ａ)を用いて合成した。
２）合成ペプチドの純度検定
得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００ＯＤＳ−ＨＧ−５(内径： 4.6mm、長さ： 250mm) 、野村化学社製、；移動相：溶媒Ａ（0.１％トリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（0.１％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル）のグラジエント（０分（溶媒Ｂ＝０％）〜３０分（溶媒Ｂ＝１００％））；流速：1 ml／分；検出法：波長 220nmにおける吸光度］に付したところ、15.5分に単一の鋭いピークが示され、純度は99％であった。
【００５９】
実施例３：ＨＫＥＭＰＦＰＫＹの合成
１）ペプチドの合成
実施例１と同様に、ペプチド自動合成装置(アプライドバイオ社製：４３３Ａ)を用いて合成した。
２）合成ペプチドの純度検定
得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ３００ＯＤＳ−ＨＧ−５(内径： 4.6mm、長さ： 250mm) 、野村化学社製、；移動相：溶媒Ａ（0.１％トリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（0.１％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル）のグラジエント（０分（溶媒Ｂ＝０％）〜３０分（溶媒Ｂ＝１００％））；流速：1 ml／分；検出法：波長 220nmにおける吸光度］に付したところ、24.8分に単一の鋭いピークが示され、純度は99％であった。
【００６０】
試験例１：マクロファージにおけるＩＬ−１２の産生誘導
マウス腹腔由来マクロファージ細胞株（TIB-71；ATCC）を96ウェルプレート中で培養した。より詳細には、1×105細胞／ウェルの濃度でプレートに播種し、37℃で、5%炭酸ガスおよび95%空気の環境下で約16時間培養を行った。培養液は、牛胎児血清（FCS）を10重量%の濃度で含有したDulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM)培地を各ウェル200μLずつ使用した。その後、培養液を除去し、FCSを10重量%濃度で含有したD-MEM培地に実施例１〜３で合成したKHP、KIHP、またはHKEMPFPKYをそれぞれ加えたもの（ペプチドの終濃度：3mg/mL）を、各ウェル200μLずつ添加した。なお、ペプチドを添加しない培地を200μL添加したものをコントロールとして用いた。24時間培養した後、培養液を採取し、培養液中のＩＬ−１２の濃度を測定キット（Quantikine（商標）  Mouse IL-12/IL-23p40 Immunoassay; R&D Systems社製）を用いて、酵素免疫測定法で定量した。結果を表1に示す。
ＫＨＰ、ＫＩＨＰ、およびＨＫＥＭＰＦＰＫＹのいずれにおいても、高濃度のIL-12が検出され、これらのペプチドにより、IL-12産生が誘導されることが示された。
【表１】
2009263255.tif 000002
【００６１】
試験例２：細胞毒性
試験例１で培養液を採取した後の細胞に対してD-MEM培地を100μL添加した後、Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所製）を用いて生細胞の数を計測した。結果を表２に示す。
ペプチドの有無により、生細胞数に有意な差はなく、ペプチド（実施例1〜3）の細胞毒性は低いことが示された。
【表２】
2009263255.tif 000003
【００６２】
＜配列表フリーテキスト＞
配列表の配列番号１は、本発明のペプチドのアミノ酸配列である。
配列表の配列番号２は、本発明のペプチドのアミノ酸配列である。
配列表の配列番号３は、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列である。
配列表の配列番号４は、Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（配列番号２）で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列である。
【配列表】
2009263255000001.app