(57)【要約】【課題】ADCC活性が増強された抗体及びその製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明者らは、Genentech Incらの研究者らが行ったFc部分のアミノ酸変異をさらに発展させて、コンピューター検索からは導き出せない大幅な構造変化を伴う可能性のあるアミノ酸であるシステイン(Cys)へ変異させることでADCC活性の増強ができないか、検討を行った。本発明は、H鎖定常領域において、286又は298位のアミノ酸残をCysへ変更したヒト抗体を提供するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
H鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに置換された抗体。
【請求項２】
H鎖定常領域がヒトCγ1、Cγ2、Cγ3、及びCγ4からなる群より選択されるいずれかの定常領域である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
置換前と比較しADCC活性が上昇している、請求項１又は２のいずれかに記載の抗体。
【請求項４】
改善された安定性、溶解性またはFc受容体への結合親和性を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。
【請求項５】
糖鎖が付与されている、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
エフェクター機能を改善するものである、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
FcγRI、FcγRII、FcγRIII、又はFcRnと結合する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
ＡＬＣＡＭ、ＩＣＡＭ１、及びＥＧＦＲからなる群より選択される標的抗原に特異性を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体。
【請求項９】
下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：９５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：９７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：９９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
【請求項１０】
下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１０３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：９９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
【請求項１１】
下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１０５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１０７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：３４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：３８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１０９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
【請求項１２】
下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１１１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１１３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：３４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：３８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１０９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
【請求項１３】
下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：５７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５９に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１１５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：５７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５９に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１１７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：４９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５０に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１１９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
【請求項１４】
下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：５７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５９に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１２１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：５７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５９に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１２３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：４９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５０に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１１９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
【請求項１５】
下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１２５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１２７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：６３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６５に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：６７に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１２９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
【請求項１６】
下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１３１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１３３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：６３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６５に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：６７に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１２９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
【請求項１７】
下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：８７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１３５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：８７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１３７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：７８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８０に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：８２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１３９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
【請求項１８】
下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：８７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１４１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：８７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１４３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：７８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８０に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：８２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１３９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
【請求項１９】
H鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程を含む、ADCC活性又は抗腫瘍活性が増強された抗体の製造方法。
【請求項２０】
以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、ADCC活性又は抗腫瘍活性が増強された抗体の製造方法；
（ａ）H鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたH鎖をコードするDNA、及びL鎖をコードするDNAを発現させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の発現産物を回収する工程。
【請求項２１】
H鎖定常領域がヒトCγ1、Cγ2、Cγ3、及びCγ4からなる群より選択されるいずれかの定常領域である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体および医薬的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１８のいずれかの抗体を対象に投与する工程を含む、非ヒト哺乳動物の治療方法。
【請求項２４】
請求項１〜１８のいずれかの抗体をコードする核酸。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターを有する宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２５に記載のベクターを有する宿主生物。
【請求項２８】
H鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程を含む、抗体のADCC活性又は抗腫瘍活性を増強する方法。
【請求項２９】
H鎖定常領域がヒトCγ1、Cγ2、Cγ3、及びCγ4からなる群より選択されるいずれかの定常領域である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ａ）の抗体のADCC活性又は抗腫瘍活性が増強されたか否かを判定する方法であって、工程（ｂ）で測定されたADCC活性又は抗腫瘍活性が、置換前の抗体のADCC活性又は抗腫瘍活性より高い場合に、工程（ａ）の抗体のADCC活性又は抗腫瘍活性が増強されたと判定される方法；
（ａ）ADCC活性又は抗腫瘍活性を有する抗体の変異体であって、H鎖定常領域における286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに置換された抗体を提供する工程、および、
（ｂ）工程（ａ）の抗体のADCC活性又は抗腫瘍活性を測定する工程。
【請求項３１】
以下の（ａ）から（ｄ）の工程を含む、ADCC活性又は抗腫瘍活性が増強された抗体のスクリーニング方法；
（ａ）ADCC活性又は抗腫瘍活性を有する抗体を提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）の抗体のH鎖定常領域における286又は298位の位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた抗体のADCC活性又は抗腫瘍活性が増強されたか否かを、請求項３０に記載の方法で判定する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で、ADCC活性又は抗腫瘍活性が増強されたと判定された抗体を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体のADCC活性を増強する方法およびADCC活性を増強させた抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体の可変領域をマウス型に定常領域をヒト型にしたキメラ抗体や、可変領域と定常領域の両方をヒト型にしたヒト化抗体は、癌や慢性関節リウマチの治療薬として期待されている。癌の治療において従来より用いられているシスプラチンなどの化学合成された治療薬は、癌細胞と正常細胞の識別能力が低く、毒性が高い。そのために癌の化学療法は、癌患者への体力的な負担が大きいのが現状である。一方、キメラ化あるいはヒト化された抗体は、癌細胞表面上に特異的の分子を認識して作用するためにその毒性は低く、治療を受ける患者にとっても体力的負担は軽い。慢性関節リウマチの治療に対しても、従来のステロイド薬を中心とした治療では、リウマチ症状の進行を遅くするにとどまるものであるが、インターロイキン6受容体に対するヒト化抗体は、骨破壊や炎症の原因因子を抑制することができるために著しい治療効果を発揮している。
【０００３】
これらの治療用抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体）の作製方法には、大きく分けて3通りある。一つ目は、遺伝子組み換え技術によってマウス抗体からキメラ抗体、ヒト化抗体へと抗体の抗原結合部位を残してヒト型の蛋白に置き換えてゆくことでヒト化していく方法である。二つ目は、ファージディスプレイを用いる方法である。この方法では、多種類のヒト由来の抗体可変領域をファージ表面に発現させたものから、目的蛋白を認識できる完全ヒト型可変領域を選び出すことができるので、選び出された完全ヒト型可変領域を材料に、遺伝子組み換え技術を利用して、ヒト型定常領域をさらに加えた完全ヒト化抗体を作製することが出来る。最後に、ヒトの抗体産生遺伝子を持つように遺伝子操作されたTCマウスを利用した方法がある（Nature Genetics, Vol.16, 113-114, 1997）。このTCマウスは、目的蛋白である抗原が免疫されると、マウスにより産生されてくる抗体はすべてヒト型となるように遺伝子操作されているので、TCマウスに抗原を免疫してから取り出したリンパ球細胞とマウスミエローマ細胞を融合させて得られるハイブリドーマ細胞からは、免疫した抗原を認識する完全ヒト化抗体が産生される。
【０００４】
上記の3つの方法によりキメラ抗体あるいはヒト化抗体を作製できるが、いずれの方法を用いても、治療抗体の製造コストは低分子化合物の治療薬に比べて非常に高いことが問題である。その高い製造コストのために、治療抗体の価格も非常に高く、癌やリウマチ患者にとっても大きな治療費負担となるのが現状である。
【０００５】
この問題を解決する一つの解決策として、単位質量あたりの治療抗体の癌細胞などへの治療効果を上昇させることが考えられた。つまり、少ない治療抗体量においても、従来の投与量と同様の治療効果が得られれば、患者への1回あたりの投薬量を低減させることができ、また、1回あたりの投薬費も低減させることができる。この治療抗体の治療効果を示す一つの指標として、Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity (ADCC)活性がある。このADCC活性は、治療抗体のFc部分が、癌細胞を殺傷できるキラー細胞上のFcγレセプターに結合し、さらに治療抗体の可変領域の認識作用で、癌細胞へキラー細胞を導くことにより、結果的に治療抗体を介してキラー細胞が癌細胞を殺傷する機構である。
【０００６】
ADCC活性を上昇させるために要求される治療抗体の性能としては、1）治療抗体の可変領域が癌細胞表面に特異的にある蛋白を強く認識できるということ、2）キラー細胞上のFcγレセプターに治療抗体のFc部分が強く結合できること、が挙げられる。この2）の項目を解決することでADCC活性を上昇させる研究が多くなされてきた。
【０００７】
Shinkawa Tらは、治療抗体IgG1のFc領域である297位のアミノ酸であるアスパラギン（Asn）に結合している二つの糖鎖（N-Linked oligosaccharide）構造に着目し、その糖鎖構造のフコースが欠損した糖鎖構造にすれば20倍〜100倍のADCC活性上昇になることを見出した（J. Biol. Chem. Vol.278, 3466-3473, 2003）。このフコース欠損構造によるADCC活性の報告は、Shields R Lらによっても行われた（J. Biol. Chem. Vol.277, 26733-26740, 2002）。また、Pablo Uらも同様の糖鎖構造に着目して、その糖鎖構造中のbisectingN-acetylglucosamine の結合量を制御することで数倍のADCC活性の上昇を行えることを発見した（Nature Biotechnology Vol.17, 176-180, 1999）。
【０００８】
このような、IgG1のFc領域に結合している糖鎖構造を改変することでその治療抗体のADCC活性を上昇させる方法以外に、米国Genentech Inc.らの研究者らは、治療抗体のFc構造そのもののアミノ酸に変異を加えることでFcレセプターとの結合を増強させる技術をコンピューター検索により検索し、S298A, E333A, K334Aのトリプル変異によりADCC活性を数十倍増強することに成功している（J. Biol. Chem. Vol.276, 6591-6604, 2001）。
なお、以下に本発明に関連する先行技術文献を示す。
【特許文献１】WO 2004/029207
【特許文献２】WO 2000/042072
【特許文献３】WO 2004/063351
【特許文献４】WO 2004/099249
【特許文献５】WO 2006/019447
【特許文献６】特表２００６−５１２４０７
【特許文献７】特表２００３−５１２０１９
【特許文献８】WO2006/104989
【特許文献９】WO2006/105062
【非特許文献１】Nature Genetics, Vol.16, 113-114, 1997
【非特許文献２】J. Biol. Chem. Vol.278, 3466-3473, 2003
【非特許文献３】J. Biol. Chem. Vol.277, 26733-26740, 2002
【非特許文献４】Nature Biotechnology Vol.17, 176-180, 1999
【非特許文献５】J. Biol. Chem. Vol.276, 6591-6604, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ADCC活性又は抗腫瘍活性が増強された抗体及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Genentech Incらの研究者らが行ったFc領域のアミノ酸変異をさらに発展させて、Fc領域にコンピューター検索からは導き出せない大幅な構造変化を伴う可能性のあるアミノ酸であるシステイン(Cys)を導入することでADCC活性又は抗腫瘍活性を増強させることができないか、検討を行った。システイン置換はチオール基（-SH）の導入を意味することから、ジスルフィド結合（-S-S-）を生じる。そのため、Fc構造のドラスチックな変化を呼ぶことが期待された。本発明者らは、ヒトCγ1（配列番号：１６４に記載のアミノ酸配列）において、Elvin A. KabatらがSequence of proteins of Immunological Interest (NIH Publication No.91-3242, 1991) において示したHuman IgG1 H鎖定常領域のEU indexの番号（以下本明細書では、「kabat番号」と記載する場合がある）の286又は298位のアミノ酸をシステイン(以下、Cysと略記する場合がある。)に置換することでADCC活性又は抗腫瘍活性を増強できないか、検討を行った。
【００１１】
その結果、ヒトCγ1の286又は298位のアミノ酸をCysに置換したヒト抗体が、野生型ヒト抗体と比較して非常に高いADCC活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、以下〔１〕〜〔３１〕を提供するものである。
〔１〕  H鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに置換された抗体。
〔２〕  H鎖定常領域がヒトCγ1、Cγ2、Cγ3、及びCγ4からなる群より選択されるいずれかの定常領域である、〔１〕に記載の抗体。
〔３〕  置換前と比較しADCC活性が上昇している、〔１〕又は〔２〕のいずれかに記載の抗体。
〔４〕  改善された安定性、溶解性またはFc受容体への結合親和性を有する、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の抗体。
〔５〕  糖鎖が付与されている、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の抗体。
〔６〕  エフェクター機能を改善するものである、請求項５に記載の抗体。
〔７〕  FcγRI、FcγRII、FcγRIII、又はFcRnと結合する、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗体。
〔８〕  ＡＬＣＡＭ、ＩＣＡＭ１、及びＥＧＦＲからなる群より選択される標的抗原に特異性を有する、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の抗体。
〔９〕  下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：９５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：９７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：９９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
〔１０〕  下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１０３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：９９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
〔１１〕  下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１０５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１０７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：３４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：３８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１０９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
〔１２〕  下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１１１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１１３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：３４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：３８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１０９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
〔１３〕  下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：５７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５９に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１１５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：５７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５９に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１１７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：４９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５０に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１１９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
〔１４〕  下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：５７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５９に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１２１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：５７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５９に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１２３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：４９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５０に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１１９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
〔１５〕  下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１２５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１２７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：６３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６５に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：６７に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１２９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
〔１６〕  下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１３１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１３３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：６３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６５に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：６７に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１２９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
〔１７〕  下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：８７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１３５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：８７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１３７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：７８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８０に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：８２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１３９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
〔１８〕  下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：８７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１４１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：８７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１４３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：７８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８０に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：８２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１３９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
〔１９〕  H鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程を含む、ADCC活性又は抗腫瘍活性が増強された抗体の製造方法。
〔２０〕  以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、ADCC活性又は抗腫瘍活性が増強された抗体の製造方法；
（ａ）H鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたH鎖をコードするDNA、及びL鎖をコードするDNAを発現させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の発現産物を回収する工程。
〔２１〕  H鎖定常領域がヒトCγ1、Cγ2、Cγ3、及びCγ4からなる群より選択されるいずれかの定常領域である、〔１９〕または〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕  〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の抗体および医薬的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
〔２３〕  〔１〕〜〔１８〕のいずれかの抗体を対象に投与する工程を含む、非ヒト哺乳動物の治療方法。
〔２４〕  〔１〕〜〔１８〕のいずれかの抗体をコードする核酸。
〔２５〕  〔２４〕に記載の核酸を含むベクター。
〔２６〕  〔２５〕に記載のベクターを有する宿主細胞。
〔２７〕  〔２５〕に記載のベクターを有する宿主生物。
〔２８〕  H鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程を含む、抗体のADCC活性又は抗腫瘍活性を増強する方法。
〔２９〕  H鎖定常領域がヒトCγ1、Cγ2、Cγ3、及びCγ4からなる群より選択されるいずれかの定常領域である、〔２６〕に記載の方法。
〔３０〕  工程（ａ）の抗体のADCC活性又は抗腫瘍活性が増強されたか否かを判定する方法であって、工程（ｂ）で測定されたADCC活性又は抗腫瘍活性が、置換前の抗体のADCC活性又は抗腫瘍活性より高い場合に、工程（ａ）の抗体のADCC活性又は抗腫瘍活性が増強されたと判定される方法；
（ａ）ADCC活性又は抗腫瘍活性を有する抗体の変異体であって、H鎖定常領域における286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに置換された抗体を提供する工程、および、
（ｂ）工程（ａ）の抗体のADCC活性又は抗腫瘍活性を測定する工程。
〔３１〕  以下の（ａ）から（ｄ）の工程を含む、ADCC活性又は抗腫瘍活性が増強された抗体のスクリーニング方法；
（ａ）ADCC活性又は抗腫瘍活性を有する抗体を提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）の抗体のH鎖定常領域における286又は298位の位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた抗体のADCC活性又は抗腫瘍活性が増強されたか否かを、請求項３０に記載の方法で判定する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で、ADCC活性又は抗腫瘍活性が増強されたと判定された抗体を選択する工程。
[発明の実施の形態]
【００１２】
本発明は、Elvin A. KabatらがSequence of proteins of Immunological Interest (NIH Publication No.91-3242, 1991) において示したHuman IgG1 H鎖定常領域のEU indexの番号（以下本明細書おいては、特に断りがない限りは、アミノ酸の位置はkabat番号に記載のEU indexに従い記載される）の286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに人為的に置換された抗体を提供する。ヒトCγ1の塩基配列を配列番号：１６４に、アミノ酸配列を配列番号：１６５に例示する。
【００１３】
ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラス(isotype)が知られている。本発明の抗体には、これらのisotypeのうちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が含まれる。
また本発明の抗体には、抗体のFc領域以外の部分が、抗原結合能を有する別のペプチドに置換されたものも含まれる。抗体のFc領域以外の部分としては、例えば可変領域、CH1領域、ヒンジ領域などが挙げられるが、これらに限定されない。抗体のisotypeは、定常領域の構造によって決定される。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4の各isotypeの定常領域は、それぞれ、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4と呼ばれている。本発明の抗体には、Cγ2、Cγ3、又はCγ4において、286又は298位の位置のアミノ酸がCysに置換された抗体も含まれる。ヒトCγ2、Cγ3、Cγ4の塩基配列を、配列番号：１６６、１６８、１７０に例示する。また、ヒトCγ2、Cγ3、Cγ4のアミノ酸配列を、配列番号：１６７、１６９、１７１に例示する。
【００１４】
なお、本明細書に添付の配列表に記載のCγ1（塩基配列 配列番号：１６４、アミノ酸配列 配列番号：１６５）、Cγ2（塩基配列 配列番号：１６６、アミノ酸配列 配列番号：１６７）、Cγ3（塩基配列 配列番号：１６８、アミノ酸配列 配列番号：１６９）、及びCγ4（塩基配列 配列番号：１７０、アミノ酸配列 配列番号：１７１）の各配列中のコドン及びアミノ酸と、kabatのEU indexとの関係を、表１〜表７に示す。表１〜７中のコドン及びアミノ酸は、上から下に向かって順番に、配列表のN末端側からC末端側のコドン及びアミノ酸に対応している。
また、定常領域の配列としては、［Sequence of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)］に開示されている配列を例示できるが、これに限定されるものではない。
【表１】
2009055899.tif 000002
【表２】
2009055899.tif 000003
【表３】
2009055899.tif 000004
【表４】
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【表５】
2009055899.tif 000006
【表６】
2009055899.tif 000007
【表７】
2009055899.tif 000008
【００１５】
本発明におけるシステインには、その誘導体も含まれる。本発明におけるシステイン誘導体としては、システイン分子にヒドロキシル基、メチル基、エチル基、カルボキシル基、アミノ基等が付加された化合物、システイン分子を構成する原子や官能基の一部が欠失した化合物、システイン分子を構成する原子や官能基の一部が別のそれに置換された化合物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
lactate dehydrogenase release assay系で評価したADCC活性に関して、本発明の抗体は、野生型抗体と比較し、ADCC活性が上昇した（野生型抗体と変異型抗体が同一濃度である2点間における、野生型抗体に対する変異型抗体の細胞障害の割合の比が上昇した）。また286Cys型抗体、298Cys型抗体は、ADCC活性が上昇した（野生型抗体と変異型抗体が同一の細胞障害の割合を示す2点間における、野生型抗体に対する変異型抗体の濃度の比が上昇した）。
また本発明の抗体は、改善された安定性、溶解性、Fcレセプターへの結合親和性、抗腫瘍活性又はCDC活性を有する。本発明の抗体は、野生型と比較してその安定性、溶解性、Fcレセプターへの結合親和性、又はCDC活性が変化していないか上昇していることが好ましい。しかしながら本発明の抗体は、少なくともADCC活性又は抗腫瘍活性が上昇していればよく、その安定性、溶解性、Fcレセプターへの結合親和性、又はCDC活性が減少している抗体も、本発明の抗体に含まれる。なお、Ｆｃレセプターとしては、FcγＩ、FcγII、FcγIII、ＦｃＲｎ、プロテインＡおよびプロテインＧ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また抗腫瘍活性とは、悪性の組織又は細胞に対する選択的な増殖抑制作用や傷害作用、腫瘍組織又は細胞の縮小や消失作用を含み、最も広義に解釈するものとする。
【００１７】
本発明の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が含まれる。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の調製および精製方法は、当分野で知られており、例えば Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)に記載されている。
【００１８】
本発明の抗体の一形態はヒト化抗体である。「ヒト化抗体」とは、ヒトの抗体に構造を類似させた抗体のことをいい、ヒト型キメラ抗体（例えば抗体の一部がヒト化された抗体、CH2領域がヒト化された抗体、Fc領域がヒト化された抗体、定常領域がヒト化された抗体）、及び定常領域及び可変領域に存在するCDR（相補性決定領域）以外の部分がヒト化されたヒト型CDR移植（CDR-grafted）抗体（P.T.Johons et al., Nature 321,522(1986)）、完全ヒト化抗体などが含まれる。ヒト型CDR移植抗体の抗原結合活性を高めるため、マウス抗体と相同性の高いヒト抗体FRを選択する方法、相同性の高いヒト化抗体を作製する方法、ヒト抗体にマウスCDRを移植した後さらにFRのアミノ酸を置換する方法の改良技術もすでに開発され（米国特許第5585089号、米国特許第5693761号、米国特許第5693762号、米国特許第6180370号、欧州特許第451216号、欧州特許第682040号、特許第2828340号などを参照）、本発明のヒト型CDR移植抗体の作製に利用することもできる。
【００１９】
ヒト型キメラ抗体は例えば、上記のH鎖可変領域の構造及び／又はL鎖可変領域の構造を有する抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。ヒト抗体の定常領域としては公知のものを採用することができる。以下に、ヒト型キメラ抗体の作製方法の一例を示す。
【００２０】
まず、特定の対象抗原に対するマウス抗体を産生するハイブリドーマよりmRNAを抽出し、常法に従ってcDNAを合成する。合成したcDNAをベクターに組み込みcDNAライブラリーを構築する。このcDNAライブラリーから、H鎖遺伝子フラグメント及びL鎖遺伝子フラグメントをプローブとして用いることにより、H鎖遺伝子及びL鎖遺伝子を含有するベクターを選択する。選択されたベクターの挿入配列のシークエンシングを行うことにより、H鎖可変領域及びL鎖可変領域の遺伝子の配列が決定される。このようにして得られた配列データを基にH鎖可変領域をコードするDNAを化学合成、生化学的切断／再結合等により作製する。得られたH鎖可変領域をコードするDNAを、ヒトH鎖定常領域をコードするDNAとライゲーションして発現用ベクターに組込むことによりH鎖発現ベクターを作製する。発現ベクターとしては例えばSV40 virus basedベクター、EB virus basedベクター、BPV（パピローマウイルス）basedベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。一方、同様の方法によりL鎖発現ベクターを作製する。これらH鎖発現ベクター及びL鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.5,512-519 (1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495-1502 (1990))などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。
【００２１】
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型キメラ抗体を分離する。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、プロテインＡカラムクロマトフィー、プロテインＧカラムクロマトフィー、プロテインＬカラムクロマトフィー、などの方法を適宜組み合わせて利用することができる。
【００２２】
一方、ヒト型CDR移植抗体は例えば以下の方法により作製することができる。まず、上記キメラ抗体の製造方法の欄で述べた方法により、特定の抗原に対する抗体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を決定する。併せて各CDR領域のアミノ酸配列及び塩基配列を決定する。
【００２３】
次に、CDR領域を挟んで存在するFR（フレームワーク領域）を選択する。FRの選択には、およそ三つの方法が採用できる。１つめの方法は、NEWM、REIなど既に三次元構造の明らかとなったヒト抗体フレームを用いる方法である（Riechmann L. et al., Nature 332,323-3Z7 (1988); Tempst, PR. et al., Protein Engineering 7, 1501-1507 (1994); Ellis JH. et al., J. Immunol 155, 925-937 (1995)）。２つめの方法は、目的のマウス抗体可変領域と最も高いホモロジーを持つヒト抗体可変領域をデータベースより選択し、そのFRを用いる方法である（Queen C. et al., Proc Natl Acad SciUSA 86, 10029-10033 (1989); Rozak MJ. et al., J Biol Chem 271, 22611-22618 (1996); Shearman CW. et al., J.Immunol 147, 4366-4373 (1991)）。３つめの方法は、ヒト抗体のFRで最も共通に用いられるアミノ酸を選択する方法である（Sato K. et al., Mol Immunol 31, 371-381 (1994); Kobinger F. et al., Protein Engineering 6, 971-980 (1993); Kettleborough CA. et al., Protein Engineering 4, 773-783 (1991)）。本発明ではこれらいずれの方法を用いることもできる。
【００２４】
尚、選択されたヒトFRのアミノ酸配列を改変したアミノ酸配列であっても、最終的に得られるヒト型CDR移植抗体が対象抗原に対する特異的結合性を有する限り、FRのアミノ酸配列として利用することができる。特に、選択されたヒトFRのアミノ酸の一部をCDRの由来となった抗体のFRのアミノ酸に変更した場合、抗体の特性が維持される可能性が高い。改変されるアミノ酸の数は好ましくはFR全体の３０％以下であり、更に好ましくはFR全体の２０％以下であり、更に好ましくはFR全体の１０％以下である。
【００２５】
次に、これらいずれかの方法により選択したFRと上記CDRとを組み合わせることによりH鎖可変領域及びL鎖可変領域をコードするDNAを設計する。この設計を基にH鎖可変領域をコードするDNAとL鎖可変領域をコードするDNAを化学合成、生化学的切断／再結合等によりそれぞれ作製する。そしてH鎖可変領域をコードするDNAを、ヒト免疫グロブリンH鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みH鎖発現ベクターを構築する。同様に、L鎖可変領域をコードするDNAを、ヒト免疫グロブリンL鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みL鎖発現ベクターを構築する。発現ベクターとしては例えばSV40 virus basedベクター、EB virus basedベクター、BPV（パピローマウイルス）basedベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
以上の方法で作製されたH鎖発現ベクター及びL鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans etal., Eur.J.Cancer Prev.5,512-519 (1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495-1502 (1990))などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。
【００２７】
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型CDR移植抗体を分離する。抗体の分離、精製は、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、プロテインＡカラムクロマトフィー、プロテインＧカラムクロマトフィー、プロテインＬカラムクロマトフィー、などの方法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００２８】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096,WO 96/33735参照）。
【００２９】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等(Nature, 348:552-554 (1990))に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから分離することができる。Clackson等(Nature, 352:624-628 (1991))及び Marks等(J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991))は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【００３０】
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリーを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるこれらライブラリーのメンバーを同定することを可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、様々なポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として提示されることによる技術である（Scott,J.K.及びSmith G. P. (1990) Science 249:386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（又はランダムクローンｃＤＮＡ）の大きなライブラリーを標的分子に高い親和性で結合するこれらの配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージでのペプチド（Cwirla,S.E.等 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378）又はタンパク質（Lowman,H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson,T.ら (1991) Nature, 352: 624; Marks,J.D.等 (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363）ライブラリーのディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて無数のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668）。ランダム突然変異体のファージライブラリーの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合増強の結果を評価する手段を必要とする（米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、及び同第５６６３１４３号を参照）。
【００３１】
ほとんどのファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用していたが、λファージディスプレイシステム（ＷＯ９５／３４６８３；米国特許第５６２７０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（RenJ.らGene 215:439 (1998); Zhuら Cancer Researc, 58(15):3209-3214 (1998); Jiang等 Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren等, Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci. 5:1833 (1996); Efimov等 VirusGenes 10:173(1995)及びＴ７ファージディスプレイシステム（Smith及びScott Methods in Enzymology,217, 228-257(1993); 米国特許第５７６６９０５号）も知られている。
【００３２】
現在、基礎的なファージディスプレイ法は多くの改良及び変形が開発されている。これらの改良により、選択された標的分子との結合性など、ペプチドライブラリーやタンパク質ライブラリーから特性、能力などに基づいてスクリーニングする方法が改善された。ファージディスプレイ法のための組み換え反応手段については、ＷＯ９８／１４２７７に記載がある。ファージディスプレイライブラリーは、二分子相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）及び拘束性へリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を分析及び制御するために使用されている。ＷＯ９７／３５１９６には、リガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、及び親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液とファージディスプレイライブラリーを接触させて結合リガンドを選択的に単離する、親和性リガンドの単離方法が記載されている。ＷＯ９７／４６２５１は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリーをバイオパニングし、次いで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌（Staphlylococcus aureus）タンパク質Ａの親和性タグとしての使用も報告されている（Li等, (1998) Mol Biotech., 9:187）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリーでもよいコンビナトリアルライブラリーを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤における使用に適した酵素を選択する方法はＷＯ９７／０９４４６に記載される。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第５４９８５３８号、同第５４３２０１８号、及びＷＯ９８／１５８３３に記載されている。ペプチドライブラリーの作製及びこれらのライブラリーのスクリーニングの方法は、米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５４９８５３０号、同第５７７０４３４号、同第５７３４０１８号、同第５６９８４２６号、同第５７６３１９２号、及び同第５７２３３２３号に記載される。
【００３３】
さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する適当な発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ ９２／０１０４７、ＷＯ ９２／２０７９１、ＷＯ ９３／０６２１３、ＷＯ ９３／１１２３６、ＷＯ ９３／１９１７２、ＷＯ ９５／０１４３８、ＷＯ ９５／１５３８８を参考に実施することができる。
【００３４】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553[1990])を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３ファージ又はｆｄのコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローニングし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として提示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
【００３５】
本発明の抗体には、本発明の抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C の断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。
【００３６】
また本発明の抗体においては、糖鎖を付与することも可能である。糖鎖の抗体への付与は、変異導入されたシステイン中の-SH基と糖鎖に導入したブロモアセチル基を結合させて抗体に糖鎖を導入することによって、あるいは、フコーストランスフェレース欠損細胞、あるいはフコーストランスフェレース・ノックダウン細胞を使用し行うことが可能である。糖鎖、ペプチドまたはポリペプチドの付与によって、抗体のエフェクター機能を向上させることが出来る。エフェクター機能としては、これらに限定されるものではないが、ADCC活性、CDC活性が挙げられる。
さらに本発明の抗体には、一部のアミノ酸がアセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化等の化学修飾を受けた抗体も含まれる。このような化学修飾は当業者に公知の方法によって行うことが可能である。
【００３７】
本発明の抗体は、エフェクター細胞表面のFcγRI、FcγRII、又はFcγRIIIと結合することをその特徴とする。エフェクター機能は、Fc受容体（FcR）と抗体のFc領域との相互作用によっても媒介される。Fc受容体は、造血細胞上に存在する分化した細胞表面受容体として知られている。Fc受容体のうち、IgG抗体に対するFc受容体はFcγR、IgEに対するFc受容体はFcεR、IgAに対するFc受容体はFcαRと呼ばれており、FcRは、免疫グロブリンアイソタイプによって定義される。Fcγ受容体に関しては、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、およびFcγRIII（CD16）の3つのサブクラスが確認されている。各FcγRサブクラスは2つまたは3つの遺伝子によってコードされ、かつ選択的RNAスプライシングが複数の転写物をもたらすため、FcγRアイソフォームにおいて広い多様性が存在する。FcγRIサブクラス（FcγRIA、FcγRIB、およびFcγRIC）をコードしている3つの遺伝子は、第1染色体長腕の領域1q21.1においてクラスター形成され、FcγRIIアイソフォーム（FcγRIIA、FcγRIIB、およびFcγRIIC）をコードしている遺伝子ならびにFcγRIll（FcγRIIIAおよびFcγRIIIB）をコードしている2つの遺伝子の全ては領域1q22においてクラスター形成される。FcRは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。
FcγRIが高い親和性で単量体のIgGに結合する一方、FcγRIIおよびFcγRIIIは低親和性の受容体であり、複合型または塊状のIgGと相互作用する。これらの低親和性受容体を検出するための古典的な方法として、IgGによって感作された抗体に覆われた赤血球（EA）を使用する「ロゼット形成」が知られている（Bredius et al. Immunology 83:624-630 (1994)。また、ロゼットアッセイに関して、Tax et al. J. Immunol. 133(3): 1185-1189 (1984); Nagarajan et al. J. Biol. Chem. 270(43): 25762-25770 (1995); およびWarmerdam et al. J. Immunol. 147(4): 1338-1343 (1991)も参照されたい）。
本発明において、エフェクター細胞としては、特に制限はないが、例えばPBMCが挙げられる。
【００３８】
さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。脱アミド化されるアミノ酸としてはアスパラギン、グルタミンを挙げることができるが、好ましくはアスパラギンである。アスパラギンに隣接するアミノ酸としては、特に限定されずどのようなアミノ酸でもよいが、アスパラギン−グリシン配列は特に脱アミド化されやすいことが知られているので、アスパラギンに隣接するアミノ酸としてはグリシンが好ましい。置換後のアミノ酸としては、アスパラギンおよびグルタミン以外であれば特に限定されず、如何なるアミノ酸でもよいが、好ましくはバリン、プロリン以外のアミノ酸であることが好ましい。従って、本発明においては、抗体の脱アミド化を目的とする場合には、アスパラギン、グルタミン、バリン、プロリン以外のアミノ酸に置換することが好ましい。アミノ酸置換による脱アミド化の抑制については、例えばＷＯ０３／０５７８８１を参考に行うことが可能である。脱アミド化抑制を目的にアミノ酸置換を行う場合には、置換前の抗原結合活性を維持していることが好ましい。
【００３９】
さらに、抗体安定化の他の態様として、グルタミン酸の他のアミノ酸への置換を挙げることができる。また、本発明では、抗体重鎖の６番目がグルタミン酸である場合、該グルタミン酸をグルタミンに置換することにより、顕著に抗体を安定化できることを見いだした。したがって、本発明は、抗体重鎖の６番目のグルタミン酸をグルタミンに置換することにより抗体を安定化する方法に関する。抗体中のアミノ酸番号は当業者に公知である（例えば、Kabat, E. A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services 1983）。
【００４０】
本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における抗体にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
【００４１】
又、本発明に使用する抗体は二種特異性抗体（bispecific antibody）でもよい（例えば、Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374、など）。二種特異性抗体は一方がALCAM、ICAM1、EGFRのいずれかを認識し、他方が他の抗原を認識してもよいし、ALCAM、ICAM1、EGFRのいずれかの分子上の異なるエピトープを認識してもよい。
【００４２】
また本発明の抗体は、そのN末端あるいはC末端に他のタンパク質を融合してもよい（Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281）。融合するタンパク質は当業者が適宜選択することができる。
【００４３】
また本発明は、本発明の抗体をコードする核酸、該核酸が挿入されたベクター、及び該ベクターが導入された形質転換細胞を提供する。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。
【００４４】
発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET（この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい）などが挙げられる。
【００４５】
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００４６】
大腸菌以外にも、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
【００４７】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418、ピューロマイシンなど）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
【００４８】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００４９】
ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
【００５０】
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108, 945）、COS、3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340）、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が知られている。本発明においては、CHO-DG44、CHO-DXB11、COS7細胞、BHK細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
【００５１】
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。
【００５２】
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。本発明のDNAにより形質転換された細胞をin vitroで培養し、当業者が通常行う方法によって精製することによって、本発明の抗体を得ることが可能である。
【００５３】
また本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を含むベクターを有する宿主生物を提供する。本発明の宿主生物は、組換え型抗体の産生に有用である。本発明における宿主生物としては、ヤギなどが挙げられる。例えば、本発明のトランスジェニックヤギの作成は次のようにして行うことが可能である。即ち、抗体遺伝子が乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入された融合遺伝子を構築する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入すれば、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、本発明の抗体を取得することができる。トランスジェニックヤギから産生される本発明の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンをトランスジェニックヤギに適宜使用することも可能である（Ebert, K.M. etal., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。
【００５４】
本発明の抗体は、細胞障害を与えたいターゲット細胞の表面に存在する分子を認識する抗体であることが好ましい。細胞障害を与えたいターゲット細胞の由来としては、ヒトであることが好ましいが、これに限定されるものではない。また、細胞障害を与えたいターゲット細胞としては、特に制限はなく、例えば、癌細胞、Raji、KG-1a、TL-1、HUT78、Jurkat、BALL-1、HEPG2、MKN-7、KB、又はHelaが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細胞障害を与えたいターゲット細胞の表面に存在する分子（抗原）としては、例えば、ＡＬＣＡＭ、ＩＣＡＭ１及びＥＧＦＲからなる群から選択される標的抗原が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
286Cys型Anti-ALCAM（066-174）抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：９５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：９７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：９９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
298Cys型Anti-ALCAM（066-174）抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１０３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：９９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
286Cys型Anti-ALCAM（035-234）抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１０５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１０７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：３４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：３８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１０９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
298Cys型Anti-ALCAM（035-234）抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１１１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１１３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：３４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：３８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１０９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
286Cys型Anti-ICAM1（053-059）抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：５７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５９に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１１５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：５７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５９に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１１７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：４９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５０に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１１９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
298Cys型Anti-ICAM1（053-059）抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：５７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５９に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１２１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：５７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５９に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１２３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：４９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５０に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１１９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
286Cys型Anti-ICAM1（053-085）抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１２５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１２７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：６３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６５に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：６７に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１２９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
298Cys型Anti-ICAM1（053-085）抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１３１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１３３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：６３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６５に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：６７に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１２９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
286Cys型Anti-EGFR（048-006）抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：８７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１３５に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：８７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１３７に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：７８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８０に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：８２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１３９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
298Cys型Anti-EGFR（048-006）抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：８７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１４１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：８７に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１４３に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のH鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：７８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８０に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：８２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１３９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖。
【００５５】
上述したように、本発明の抗体には、ヒト抗体、ヒト化（humanized）抗体などの組換え抗体も含まれる。ヒト化（humanized）抗体には、キメラ（chimeric）抗体（特にヒト型キメラ抗体）、CDR移植抗体（特にヒト型CDR移植抗体）が含まれる。これらの抗体の具体的な説明は上述の通りである。
【００５６】
また本発明は、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の286Cys型Anti-ALCAM（066-174）抗体を提供する。
（１）配列番号：９に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：１０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：９０に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：９４に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体、
（３）配列番号：９に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：１０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：９６に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：７に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：９８に記載の塩基配列からコードされるL鎖。
また本発明は、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の298Cys型Anti-ALCAM（066-174）抗体を提供する。
（１）配列番号：９に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：１０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：９２に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１００に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体、
（３）配列番号：９に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：１０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：１０２に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：７に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：９８に記載の塩基配列からコードされるL鎖。
また本発明は、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の286Cys型Anti-ALCAM（035-234）抗体を提供する。
（１）配列番号：３９に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：４０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：４１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：９０に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１０４に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体、
（３）配列番号：３９に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：４０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：４１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：１０６に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：３１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：３２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：３３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：３７に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１０８に記載の塩基配列からコードされるL鎖。
また本発明は、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の298Cys型Anti-ALCAM（035-234）抗体を提供する。
（１）配列番号：３９に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：４０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：４１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：９２に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１１０に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体、
（３）配列番号：３９に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：４０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：４１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：１１２に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：３１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：３２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：３３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：３７に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１０８に記載の塩基配列からコードされるL鎖。
また本発明は、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の286Cys型Anti-ICAM1（053-059）抗体を提供する。
（１）配列番号：５４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：５５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：９０に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１１４に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体、
（３）配列番号：５４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：５５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：１１６に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：４６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：４７に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：４８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：５２に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１１８に記載の塩基配列からコードされるL鎖。
また本発明は、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の298Cys型Anti-ICAM1（053-059）抗体を提供する。
（１）配列番号：５４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：５５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：９２に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１２０に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体、
（３）配列番号：５４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：５５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：１２２に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：４６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：４７に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：４８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：５２に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１１８に記載の塩基配列からコードされるL鎖。
また本発明は、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の286Cys型Anti-ICAM1（053-085）抗体を提供する。
（１）配列番号：６８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：６９に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：７０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：９０に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１２４に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体、
（３）配列番号：６８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：６９に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：７０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：１２６に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：６０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：６１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：６２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：６６に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１２８に記載の塩基配列からコードされるL鎖。
また本発明は、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の298Cys型Anti-ICAM1（053-085）抗体を提供する。
（１）配列番号：６８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：６９に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：７０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：９２に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１３０に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体、
（３）配列番号：６８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：６９に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：７０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：１３２に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：６０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：６１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：６２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：６６に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１２８に記載の塩基配列からコードされるL鎖。
また本発明は、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の286Cys型Anti-EGFR（048-006）抗体を提供する。
（１）配列番号：８３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：８４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：８５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：９０に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１３４に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体、
（３）配列番号：８３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：８４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：８５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：１３６に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：７５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：７６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：７７に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：８１に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１３８に記載の塩基配列からコードされるL鎖。
また本発明は、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の298Cys型Anti-EGFR（048-006）抗体を提供する。
（１）配列番号：８３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：８４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：８５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：９２に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１４０に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体、
（３）配列番号：８３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：８４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：８５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：１４２に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：７５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：７６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：７７に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：８１に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するL鎖、
（ｉｉ）配列番号：１３８に記載の塩基配列からコードされるL鎖。
【００５７】
また本発明は、286又は298位の位置のアミノ酸がシステインに置換されたCγ1、Cγ2、Cγ3、及びCγ4を提供する。このようなCγ1、Cγ2、Cγ3、及びCγ4は、ADCC活性が増強された抗体の製造において有用である。
【００５８】
当業者であれば、例えば、上記286又は298位の位置のアミノ酸がCysに置換されたCγ1、Cγ2、Cγ3、又はCγ4と任意の抗体可変領域を組み合わせることによって、ADCC活性が増強された任意の抗原を認識する抗体を製造することが可能である。また当業者であれば、例えば、上記286又は298位の位置のアミノ酸がCysに置換されたCγ1、Cγ2、Cγ3又はCγ4のFc領域と任意の抗体Fab領域を組み合わせることによって、ADCC活性が増強された任意の抗原を認識する抗体を製造することが可能である。上述したように、本発明の抗体は、細胞障害を与えたいターゲット細胞の表面に存在する分子を認識する抗体であることが好ましい。また、細胞障害を与えたいターゲット細胞の由来としては、ヒトであることが好ましいが、これに限定されるものではない。細胞障害を与えたいターゲット細胞の表面に存在する分子（抗原）としては、例えばＡＬＣＡＭ、ＩＣＡＭ１、及びＥＧＦＲからなる群から選択される標的抗原が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
「ALCAM（Activaed leukocyte cell adhesion molecule）」は別名CD166抗原、KG-CAM、CD6 Ligand、Neurolinとも呼ばれる膜貫通タンパクである。10箇所のN結合型糖鎖附加部位を含む、免疫グロブリンスーパーファミリー分子である。分子量100〜105kDaで、5個の細胞外Ig様ドメインと32アミノ酸の細胞内末端、短い膜貫通領域で構成されている。ALCAMは接着分子の一つで、活性化された白血球上にあり、CD6分子（T細胞でシグナル受容体として働く）に対するリガンド分子として同定された。ALCAMは、homophylic (ALCAM-ALCAM)もしくはheterophylic (ALCAM-CD6)な相互作用で接着因子としても働く。細胞間接着部位で、ALCAMが膜に近い3個のC2様ドメインを介してオリゴマーを形成しうることが示唆されている。ALCAMの分布には細胞系統による限定はみられず、造血系細胞、内皮細胞、胸腺皮質及び髄質の上皮細胞、骨髄の間葉系幹細胞、線維芽細胞、肝細胞など様々な細胞種に発現している。末梢血では、活性化T及びB細胞、単球、循環樹状細胞、そして顆粒球に弱く発現している。広範な組織分布を示す一方で、ALCAMの発現は通常は増殖や遊走に関与する細胞集団に限定されている。胸腺では、CD6胸腺細胞や胸腺上皮細胞にALCAMが発現することから、CD6分子との相互作用がT細胞の分化成熟に役立っていると考えられている。他にも、ALCAM接着分子が胎児造血や血管芽細胞の分化、毛細血管形成に関与している可能性が示唆されている。ALCAMの癌化に於ける役割として様々な推定(MMP活性の制御、internalizationとrecylingが起こる、ADM17やADAM10 (a disintegrin and metalloproteaseの略)の基質となっている、apoptosisやautophasyからの防御)されているが、決定的なものはない。ALCAM-CD6の相互作用は相方向性のものと考えられる。
【００６０】
「ICAM1（Intercellular adhesion molecule-1）」は別名Intercellular Adhesion Molecule 1又はCD54 Antigenと呼ばれ、膜貫通糖タンパクであり、N-結合型糖鎖の結合部位が7箇所存在する。分子量は90kDaである。ICAM1は、Ig-superfamilyに属し、主として白血球の接着に係わることが知られる。抗原提示細胞（APC）へのTリンパ球接着を媒介し、T細胞とT細胞、またはT細胞とB細胞の相互作用にも関与している。また単球やリンパ球、好中球が活性化した内皮細胞に接着する際にも関与する。LFA-1（CD11ａ／CD18）およびMac-1（CD11b／CD18）のインテグリンに結合する。またライノウィルスのレセプターでもある。内皮細胞の他、活性化した様々な種類の細胞に発現している。例えば単球に発現し、BおよびTリンパ球、胸腺細胞、樹状細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、角化細胞、軟骨細胞および上皮細胞で発現増強する。上皮細胞が癌化するプロセスで獲得する必要がある性質は、細胞間に侵入（invasion）すること、更には転移に際して遊送（migration）し、定着する能力を挙げられる。そこで接着因子の発現が発癌に寄与すると考えられている。接着因子は大きく、セレクチン(E-、P-、L-)、免疫グロブリン様ドメインを持つ分子(Ig-superfamily)、インテグリン、カドヘリンそしてCD44と5群に分けられている。癌化に際して、Eカドヘリンの発現が抑制されていることは広く認められている。幾つかの癌で異常発現していることが報告されている。
【００６１】
「EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor）」は別名erbB1、c-erbB-1、HER1、又はv-erbBとも呼ばれる。
上皮成長因子（EGF）の受容体ファミリーのメンバーは、上皮細胞の腫瘍形成に関連する特に重要な成長因子受容体チロシンキナーゼである。発見されることになるEGF受容体ファミリーの一番目のメンバーは、多くの種類の腫瘍細胞上で発現するEGFRであった。EGFRは、腫瘍細胞の分裂と成長、修復と生存、脈管形成、浸襲、および腫瘍転移の制御に関与していることが分かっている。
【００６２】
EGFRは、細胞外リガンド結合ドメイン、トランスメンブラン領域、および細胞質タンパク質チロシンキナーゼドメインを有する170 kDの膜貫通糖タンパク質である。EGFRを刺激するリガンドの例には、上皮成長因子（EGF）、トランスフォーミング成長因子α（TGR-α）、ヘパリン結合成長因子（HBGF）、βセルリン（β-cellulin）、およびクリプト−１（Cripto-1）が挙げられる。特異的リガンドの結合は、EGFR自己リン酸化、受容体の細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、および腫瘍の成長と生存を制御する複数情報伝達経路の起動を引き起こす。このEGFR経路はまた、腫瘍におけるVEGFおよび塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）などの様々な他の脈管新生促進因子の産生に影響を及ぼす。
【００６３】
EGFRを活性化する成長因子はまた、腫瘍脈管形成の役割を演じると考えられる。胚および成人の生体中の既存の脈管から毛細血管を形成することを意味する脈管形成は、腫瘍の成長、生存、および転移における重要な要素であることが知られている。腫瘍細胞のEGFR仲介性の刺激が、脈管新生促進因子、すなわち脈管内皮成長因子（VEGF）、インターロイキン-８（IL-8）、および塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）の発現の増加につながることが報告されており、これが腫瘍伴性脈管内皮細胞の活性化につながる可能性がある。腫瘍伴性脈管内皮細胞の刺激はまた、TGF-αおよびEGFなどの腫瘍が産生する成長因子によるそれら自体のEGF受容体の活性化によって起こることもある。
【００６４】
多くのヒトの腫瘍がEGFRを発現または過剰発現することが報告されている。EGFRの発現は、不満足な予後、低い生き残り、および／または転移の増加と相関がある。この腫瘍形成への関わりのためにEGFRは、特に抗癌療法の目標とされてきた。これらの療法は、リガンドが受容体の細胞外ドメインと結合するのを遮断するモノクローナル抗体か、または情報伝達を妨げるように細胞内領域に直接作用する合成チロシンキナーゼ阻害剤のどちらかを主に含んでいた。
【００６５】
例えばセツキシマブMAb（ERBITUX（登録商標））は、ヒトEGFRの細胞外ドメインと特異的に結合する組換えヒト／マウスキメラモノクローナル抗体である。セツキシマブは、リガンドがEGFRと結合するのを遮断し、受容体活性化を妨げ、EGFRを発現させる腫瘍細胞の成長を阻害するEGFR拮抗薬である。セツキシマブは、難治性であるかまたはイリノテカンによる化学療法に耐えることができない、上皮成長因子受容体発現性の転移性結腸直腸癌を有する患者の治療において場合によってはイリノテカンと組み合わせた使用を認可されている。セツキシマブはまた、乾癬の治療に効果があることが示されている。
【００６６】
本発明の抗EGFR抗体は、脈管化した腫瘍または新生物、あるいは脈管形成性疾患を有する患者の治療に効果的である。このような腫瘍および新生物には、例えば芽細胞腫、癌腫、または肉腫などの悪性腫瘍と新生物、および重大な脈管性腫瘍と新生物が挙げられる。本発明の方法により治療することができる癌には、例えば脳、尿生殖路、リンパ系、胃、腎臓、結腸、咽頭と肺、および骨の癌が含まれる。非限定的な例には、さらに類表皮腫、頭部と頸部の腫瘍などの扁平上皮腫、結腸直腸の腫瘍、前立腺の腫瘍、乳房の腫瘍、肺腺癌と小細胞および非小細胞肺腫瘍を含めた肺の腫瘍、膵臓の腫瘍、甲状腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、および肝臓の腫瘍が挙げられる。この方法はまた、鱗状細胞の癌腫、基底細胞の癌腫、およびヒト悪性角化細胞などの悪性角化細胞の成長を抑制することによって治療することができる皮膚癌を含めた脈管化皮膚癌の治療に用いられる。治療することができる他の癌には、カポジ肉腫、CNS新生物（神経芽細胞腫、毛管芽細胞腫、髄膜腫、および脳転移）、黒色腫、胃腸および腎臓の癌腫と肉腫、横紋筋肉腫、多形神経膠芽腫を含めた神経膠芽腫、および平滑筋肉腫が挙げられる。
【００６７】
本発明のさらに他の態様では、本発明の薬剤には抗ALCAM抗体が有効成分として含有される。本発明の薬剤の好ましい一態様では、ADCC活性を有する抗ALCAM抗体が有効成分として含有される。この態様の薬剤では、ADCC活性を利用した細胞傷害によって治療効果を得ることができる。ADCC活性を有する抗ALCAM抗体として、後述の実施例に示す066-174抗体、または035-234抗体（ALCAMに対する特異的結合性及びADCC活性を維持する限りにおいて一部改変したものであってもよい）、又はこれを基に構築されたタイプの異なる抗体（例えばIgG型）を用いることができる。この抗体はALCAMに対する特異的結合性とADCC活性を併せ持つ。従って、ALCAMを発現する癌細胞に特異的に結合し、その後ADCC活性を発揮し、癌細胞に傷害を与えることが可能である。この態様の薬剤の標的癌細胞は特に限定されないが、例えば造血系細胞、内皮細胞、胸腺皮質及び髄質の上皮細胞、骨髄の間葉系幹細胞、線維芽細胞、肝細胞など、様々なを標的とすることができる。特に好ましくは、肺腺癌細胞などである。
【００６８】
本発明はまた、H鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程を含む、ADCC活性又は抗腫瘍活性が増強された抗体の製造方法を提供する。
該製造方法の一つの態様としては、当業者に公知のADCC活性を有する抗体のH鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基をシステインに置換する。当業者に公知のADCC活性を有する抗体の取得方法に制限はない。例えば、本発明の製造方法を実施する者が自ら製造することもできるし、他者より購入することもできる。アミノ酸残基をシステインに置換する方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, andFritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）が挙げられる。該方法を用いて、抗体の所望のアミノ酸をシステインに置換することができる。
該製造方法の別の態様としては、まず、当業者に周知な方法によって、所望の抗原に結合する抗体を得る。取得された抗体が非ヒト動物抗体であれば、ヒト化することもできる。次いで、取得された抗体がADCC活性を有するか否かを当業者に周知な方法によって判定する。抗体のADCC活性は、例えば実施例に記載のlactate dehydrogenase release assay系で測定することができるが、この方法に限定されず、例えば、Cr51-release assayによっても測定可能である。次いで、ADCC活性を有すると判定された抗体のH鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基をシステインに置換する。
抗腫瘍活性の評価方法としては、実施例に記載した腫瘍の増殖抑制効果を確認することで評価できるが、この方法に限定されず、例えば、SCID Huマウスを用いても測定可能であり、また、腫瘍の転移抑制効果でも評価可能である（Clynes RA, Towers TL, Presta LG, Ravetch JV (2000) Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets. Nat Med. 6(4), 443-446.）
より具体的には、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、ADCC活性又は抗腫瘍活性が増強された抗体の製造方法を提供する。
（ａ）H鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたH鎖をコードするDNA、及びL鎖をコードするDNAを発現させる工程
（ｂ）工程（ａ）の発現産物を回収する工程
本発明の製造方法においては、まず、ADCC活性を有する抗体の変異体のH鎖をコードするDNAであって、286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたH鎖をコードするDNA、およびADCC活性を有する抗体のL鎖をコードするDNAを発現させる。H鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたH鎖をコードするDNAは、例えば、野生型のH鎖をコードするDNAのH鎖定常領域部分を取得し、該H鎖定常領域中の特定のアミノ酸をコードするコドンがシステインをコードするよう、適宜置換を導入することによって得ることが出来る。なお、システインをコードするコドンは、TGT又はTGCである。
また、あらかじめ、野生型H鎖の定常領域部分のアミノ酸がシステイン置換されたタンパク質をコードするDNAを設計し、該DNAを化学的に合成することによって、H鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたH鎖をコードするDNAを得ることも可能である。
また、Fc領域のH鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたH鎖をコードするDNAは、部分DNAに分けて製造することができる。部分DNAの組み合わせとしては、例えば、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNA、あるいはFab領域をコードするDNAとFc領域をコードするDNAが挙げられるが、これら組み合わせに限定されるものではない。L鎖をコードするDNAもまた、同様に部分DNAに分けて製造することができる。
【００６９】
例えば、286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに置換されたH鎖定常領域をコードするDNA、H鎖可変領域をコードするDNA、L鎖定常領域をコードするDNA、H鎖定常領域をコードするDNAを発現させる方法としては、以下の方法が挙げられる。即ち、H鎖可変領域をコードするDNAを、H鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みH鎖発現ベクターを構築する。同様に、L鎖可変領域をコードするDNAを、L鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みL鎖発現ベクターを構築する。発現ベクターとしては例えばSV40 virus basedベクター、EB virus basedベクター、BPV（パピローマウイルス）basedベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
上記４つのDNAをベクターに導入する方法としては、４つのDNAを１つのベクターへ導入する方法、４つのDNAを２つのベクターに分けて導入する方法、４つのDNAを３つのベクターに分けて導入する方法（１つのベクターに１つのDNAを導入し、もう１つのベクターに１つのDNAを導入し、残りのベクターに２つのDNAを導入する方法）、４つのDNAを４つのベクターに導入する方法（４つのDNAを各々別々のベクターに導入する方法）が含まれる。ここで、４つのDNAを２つのベクターに分けて導入する場合、及び、３つのベクターに分けて導入する場合において、４つのDNAのグループ分けはなんら制限されるものではない。
【００７０】
以上の方法で作製された抗体発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)等上述の細胞などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。
【００７１】
本発明の抗体の製造方法においては、次に、工程（ａ）で得られた発現産物を回収する。発現産物の回収は、例えば、形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液より分離することによって行うことが出来る。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、プロテインA、プロテインG、プロテインＬカラム、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて行うことができる。
上記の方法によって、抗体のADCC活性を増強することができる。すなわち、本発明は、H鎖定常領域において、286又は298位の位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程を含む、抗体のADCC活性を増強する方法もまた提供するものである。
【００７２】
本発明は、本発明の抗体および医薬的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を提供する。また本発明は、本発明の抗体を投与することを含む、哺乳動物の治療方法を提供する。哺乳動物としては、ヒト、非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、サルなど）が挙げられる。また、抗体がEGFRを認識する抗体である場合、肺癌などの治療において有用である。また、抗体がHer2を認識する抗体である場合、乳癌などの治療において有用である。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、抗体に加えて医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００７４】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。
【００７５】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００７６】
投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
【００７７】
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【００７８】
また、本発明は、被験抗体のADCC活性が増強されたか否かを判定する方法を提供する。具体的には、以下の工程（ｂ）で測定されたADCC活性が、置換前のADCC活性より高い場合に、以下の工程（ａ）の抗体のADCC活性が増強されたと判定される方法を提供する。
（ａ）ADCC活性を有する抗体の変異体であって、H鎖定常領域における286又は298位の位置のアミノ酸残基がシステインに置換された抗体を提供する工程、および、
（ｂ）工程（ａ）の抗体のADCC活性を測定する工程。
また、本発明は、上記判定方法を使用して、ADCC活性が増強された抗体をスクリーニングする方法を提供する。具体的には、以下の（ａ）から（ｄ）の工程を含む、ADCC活性が増強された抗体のスクリーニング方法を提供する。
（ａ）ADCC活性を有する抗体を提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）の抗体のH鎖定常領域における286又は298位の位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた抗体のADCC活性が増強されたか否かを、上記方法で判定する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で、ADCC活性が増強されたと判定された抗体を選択する工程。
これら判定方法、およびスクリーニング方法において、ADCC活性を有する抗体は、ADCC活性を有する限り特に制限はない。ADCC活性を有する抗体の取得方法は、上記の通りである。
【００７９】
なお、本明細書で開示した抗体の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号に従って配列表に記載されている。
<286Cys型Anti-ALCAM（066-174）抗体>
配列番号９：H鎖CDR1の塩基配列
配列番号１２：H鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号１０：H鎖CDR2の塩基配列
配列番号１３：H鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号１１：H鎖CDR3の塩基配列
配列番号１４：H鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号９０：H鎖定常領域の塩基配列（286Cys型）
配列番号９１：H鎖定常領域のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号９４：H鎖全長の塩基配列（286Cys型）
配列番号９５：H鎖全長のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号９６：H鎖Fc領域の塩基配列（286Cys型）
配列番号９７：H鎖Fc領域のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号１：L鎖CDR1の塩基配列
配列番号４：L鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号２：L鎖CDR2の塩基配列
配列番号５：L鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号３：L鎖CDR3の塩基配列
配列番号６：L鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号７：L鎖定常領域の塩基配列
配列番号８：L鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号９８：L鎖全長の塩基配列
配列番号９９：L鎖全長のアミノ酸配列
【００８０】
<298Cys型Anti-ALCAM（066-174）抗体>
配列番号９：H鎖CDR1の塩基配列
配列番号１２：H鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号１０：H鎖CDR2の塩基配列
配列番号１３：H鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号１１：H鎖CDR3の塩基配列
配列番号１４：H鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号９２：H鎖定常領域の塩基配列（298Cys型）
配列番号９３：H鎖定常領域のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号１００：H鎖全長の塩基配列（298Cys型）
配列番号１０１：H鎖全長のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号１０２：H鎖Fc領域の塩基配列（298Cys型）
配列番号１０３：H鎖Fc領域のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号１：L鎖CDR1の塩基配列
配列番号４：L鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号２：L鎖CDR2の塩基配列
配列番号５：L鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号３：L鎖CDR3の塩基配列
配列番号６：L鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号７：L鎖定常領域の塩基配列
配列番号８：L鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号９８：L鎖全長の塩基配列
配列番号９９：L鎖全長のアミノ酸配列
【００８１】
<286Cys型Anti-ALCAM（035-234）抗体>
配列番号３９：H鎖CDR1の塩基配列
配列番号４２：H鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号４０：H鎖CDR2の塩基配列
配列番号４３：H鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号４１：H鎖CDR3の塩基配列
配列番号４４：H鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号９０：H鎖定常領域の塩基配列（286Cys型）
配列番号９１：H鎖定常領域のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号１０４：H鎖全長の塩基配列（286Cys型）
配列番号１０５：H鎖全長のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号１０６：H鎖Fc領域の塩基配列（286Cys型）
配列番号１０７：H鎖Fc領域のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号３１：L鎖CDR1の塩基配列
配列番号３４：L鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号３２：L鎖CDR2の塩基配列
配列番号３５：L鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号３３：L鎖CDR3の塩基配列
配列番号３６：L鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号３７：L鎖定常領域の塩基配列
配列番号３８：L鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号１０８：L鎖全長の塩基配列
配列番号１０９：L鎖全長のアミノ酸配列
【００８２】
<298Cys型Anti-ALCAM（035-234）抗体>
配列番号３９：H鎖CDR1の塩基配列
配列番号４２：H鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号４０：H鎖CDR2の塩基配列
配列番号４３：H鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号４１：H鎖CDR3の塩基配列
配列番号４４：H鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号９２：H鎖定常領域の塩基配列（298Cys型）
配列番号９３：H鎖定常領域のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号１１０：H鎖全長の塩基配列（298Cys型）
配列番号１１１：H鎖全長のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号１１２：H鎖Fc領域の塩基配列（298Cys型）
配列番号１１３：H鎖Fc領域のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号３１：L鎖CDR1の塩基配列
配列番号３４：L鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号３２：L鎖CDR2の塩基配列
配列番号３５：L鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号３３：L鎖CDR3の塩基配列
配列番号３６：L鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号３７：L鎖定常領域の塩基配列
配列番号３８：L鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号１０８：L鎖全長の塩基配列
配列番号１０９：L鎖全長のアミノ酸配列
【００８３】
<286Cys型Anti-ICAM1（053-059）抗体>
配列番号５４：H鎖CDR1の塩基配列
配列番号５７：H鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号５５：H鎖CDR2の塩基配列
配列番号５８：H鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号５６：H鎖CDR3の塩基配列
配列番号５９：H鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号９０：H鎖定常領域の塩基配列（286Cys型）
配列番号９１：H鎖定常領域のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号１１４：H鎖全長の塩基配列（286Cys型）
配列番号１１５：H鎖全長のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号１１６：H鎖Fc領域の塩基配列（286Cys型）
配列番号１１７：H鎖Fc領域のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号４６：L鎖CDR1の塩基配列
配列番号４９：L鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号４７：L鎖CDR2の塩基配列
配列番号５０：L鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号４８：L鎖CDR3の塩基配列
配列番号５１：L鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号５２：L鎖定常領域の塩基配列
配列番号５３：L鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号１１８：L鎖全長の塩基配列
配列番号１１９：L鎖全長のアミノ酸配列
【００８４】
<298Cys型Anti-ICAM1（053-059）抗体>
配列番号５４：H鎖CDR1の塩基配列
配列番号５７：H鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号５５：H鎖CDR2の塩基配列
配列番号５８：H鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号５６：H鎖CDR3の塩基配列
配列番号５９：H鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号９２：H鎖定常領域の塩基配列（298Cys型）
配列番号９３：H鎖定常領域のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号１２０：H鎖全長の塩基配列（298Cys型）
配列番号１２１：H鎖全長のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号１２２：H鎖Fc領域の塩基配列（298Cys型）
配列番号１２３：H鎖Fc領域のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号４６：L鎖CDR1の塩基配列
配列番号４９：L鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号４７：L鎖CDR2の塩基配列
配列番号５０：L鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号４８：L鎖CDR3の塩基配列
配列番号５１：L鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号５２：L鎖定常領域の塩基配列
配列番号５３：L鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号１１８：L鎖全長の塩基配列
配列番号１１９：L鎖全長のアミノ酸配列
【００８５】
<286Cys型Anti-ICAM1（053-085）抗体>
配列番号６８：H鎖CDR1の塩基配列
配列番号７１：H鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号６９：H鎖CDR2の塩基配列
配列番号７２：H鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号７０：H鎖CDR3の塩基配列
配列番号７３：H鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号９０：H鎖定常領域の塩基配列（286Cys型）
配列番号９１：H鎖定常領域のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号１２４：H鎖全長の塩基配列（286Cys型）
配列番号１２５：H鎖全長のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号１２６：H鎖Fc領域の塩基配列（286Cys型）
配列番号１２７：H鎖Fc領域のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号６０：L鎖CDR1の塩基配列
配列番号６３：L鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号６１：L鎖CDR2の塩基配列
配列番号６４：L鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号６２：L鎖CDR3の塩基配列
配列番号６５：L鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号６６：L鎖定常領域の塩基配列
配列番号６７：L鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号１２８：L鎖全長の塩基配列
配列番号１２９：L鎖全長のアミノ酸配列
【００８６】
<298Cys型Anti-ICAM1（053-085）抗体>
配列番号６８：H鎖CDR1の塩基配列
配列番号７１：H鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号６９：H鎖CDR2の塩基配列
配列番号７２：H鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号７０：H鎖CDR3の塩基配列
配列番号７３：H鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号９２：H鎖定常領域の塩基配列（298Cys型）
配列番号９３：H鎖定常領域のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号１３０：H鎖全長の塩基配列（298Cys型）
配列番号１３１：H鎖全長のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号１３２：H鎖Fc領域の塩基配列（298Cys型）
配列番号１３３：H鎖Fc領域のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号６０：L鎖CDR1の塩基配列
配列番号６３：L鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号６１：L鎖CDR2の塩基配列
配列番号６４：L鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号６２：L鎖CDR3の塩基配列
配列番号６５：L鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号６６：L鎖定常領域の塩基配列
配列番号６７：L鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号１２８：L鎖全長の塩基配列
配列番号１２９：L鎖全長のアミノ酸配列
【００８７】
（286Cys型Anti-EGFR（048-006）抗体）
配列番号８３：H鎖CDR1の塩基配列
配列番号８６：H鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号８４：H鎖CDR2の塩基配列
配列番号８７：H鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号８５：H鎖CDR3の塩基配列
配列番号８８：H鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号９０：H鎖定常領域の塩基配列（286Cys型）
配列番号９１：H鎖定常領域のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号１３４：H鎖全長の塩基配列（286Cys型）
配列番号１３５：H鎖全長のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号１３６：H鎖Fc領域の塩基配列（286Cys型）
配列番号１３７：H鎖Fc領域のアミノ酸配列（286Cys型）
配列番号７５：L鎖CDR1の塩基配列
配列番号７８：L鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号７６：L鎖CDR2の塩基配列
配列番号７９：L鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号７７：L鎖CDR3の塩基配列
配列番号８０：L鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号８１：L鎖定常領域の塩基配列
配列番号８２：L鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号１３８：L鎖全長の塩基配列
配列番号１３９：L鎖全長のアミノ酸配列
【００８８】
（298Cys型Anti-EGFR（048-006）抗体）
配列番号８３：H鎖CDR1の塩基配列
配列番号８６：H鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号８４：H鎖CDR2の塩基配列
配列番号８７：H鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号８５：H鎖CDR3の塩基配列
配列番号８８：H鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号９２：H鎖定常領域の塩基配列（298Cys型）
配列番号９３：H鎖定常領域のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号１４０：H鎖全長の塩基配列（298Cys型）
配列番号１４１：H鎖全長のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号１４２：H鎖Fc領域の塩基配列（298Cys型）
配列番号１４３：H鎖Fc領域のアミノ酸配列（298Cys型）
配列番号７５：L鎖CDR1の塩基配列
配列番号７８：L鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号７６：L鎖CDR2の塩基配列
配列番号７９：L鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号７７：L鎖CDR3の塩基配列
配列番号８０：L鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号８１：L鎖定常領域の塩基配列
配列番号８２：L鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号１３８：L鎖全長の塩基配列
配列番号１３９：L鎖全長のアミノ酸配列
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００８９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に記載された態様に限定されるものではない。
〔実施例１〕
野生型、286Cys型、295Cys型、298Cys型のAnti-ALCAM（066-174）ヒト抗体を作製し、これらのAnti- ALCAM（066-174）ヒト抗体のADCC活性を評価した。その結果、野生型と、Anti-ALCAM（066-174）ヒト抗体のADCC活性とを比較して、286Cys型、295Cys型、及び298Cys型のAnti-ALCAM（066-174）ヒト抗体は高いADCC活性を示した。
以下に、Anti-ALCAM（066-174）ヒト抗体の野生型、286Cys型、295Cys型、298Cys型の作製方法ならびにそのADCC活性測定を記載する。
【００９０】
1）Anti-ALCAM（066-174）ヒト抗体の作製
ヒト抗体は、以下のA)〜E)の工程を経て、精製ヒト抗体として得られる。
A) Fc領域遺伝子の変異導入、
B) Fc領域および変異導入したFc領域遺伝子を組み合わせたヒト抗体発現ベクターの構築、
C) ヒト抗体発現ベクターのCHO細胞への遺伝子導入とヒト抗体を高発現するCHO細胞のスクリーニング、
D)ヒト抗体高発現CHO細胞の培養、
E)ヒト抗体高発現細胞の培養上清からのカラム精製。
以下にA)〜E)の工程を順に記載する。
【００９１】
ヒト抗体を作製するためには、4種の遺伝子が必要になる。この4種の遺伝子は、ヒト抗体L鎖可変領域遺伝子、ヒト抗体H鎖可変領域遺伝子、ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子、ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子である。ALCAMを認識する抗体クローンであるAnti-ALCAM（066-174）のL鎖可変領域および定常領域遺伝子、H鎖可変領域および定常領域遺伝子は抗体研究所（株）から提供された。提供されたAnti- ALCAM（066-174）のヒトL鎖可変領域のDNA配列を図１（配列番号：１４４）に、ヒトH鎖可変領域のDNA配列を図２（配列番号：１４６）に示す。
また、Anti-ALCAM（066-174）のヒトL鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の塩基配列を配列番号：１〜３に示す。また、Anti-ALCAM（066-174）のヒトL鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：４〜６に示す。提供されたヒトIgG1 L鎖定常領域の遺伝子はλ鎖で、その塩基配列を配列番号：７に、アミノ酸配列を配列番号：８に示す。
また、Anti-ALCAM（066-174）のヒトH鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の塩基配列を配列番号：９〜１１に示す。また、Anti-ALCAM（066-174）のヒトH鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列を配列番号：１２〜１４に示す。提供されたヒトIgG1 H鎖定常領域の塩基配列を配列番号：１５に、アミノ酸配列を配列番号：１６に示す。
【００９２】
A) Fc領域遺伝子の変異導入
286Cysヒト抗体、295Cysヒト抗体、298Cysヒト抗体を得るためには、ヒトIgG1 H鎖定常領域の特定箇所に変異を導入しなければならない。Elvin A. KabatらがSequence of proteins of Immunological Interest (NIH Publication No.91-3242, 1991) において示したヒトIgG1 H鎖定常領域の番号に従い、286番 のAsnをCysに、295番 のGluをCysに、298番のSerをCysに変更するために、ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子をpCR2.1ベクター（Invitrogen）に挿入した。このベクターは、pCR2.1- HC (野生型)と名前を付けた。
PCRの反応条件は以下の通りである。
Anti-ALCAM（066-174）H鎖(25 ng/μL)   2 μL
2.5 mM dNTPs                           4 μL
hIgG1 HCF primer(20μM)              2.5 μL
hIgG1 HCR primer(20μM)              2.5 μL 
DMSO                                 2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer             5 μL 
pfu polymerase                         1 μL
滅菌水                              30.5 μL 
total                                 50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
hIgG1 HCF primer：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC（配列番号：１７）
hIgG1 HCR primer：TTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCT（配列番号：１８）
【００９３】
ヒトIgG1 H鎖定常領域が挿入されたpCR2.1ベクター：pCR2.1-HC（野生型）を鋳型として、PCR法により順次変異導入した。この変異導入法の詳細を以下に記述する。
286（Asn→Cys）変異
pCR2.1-HC (野生型)  (25 ng/μL)        2 μL
2.5 mM dNTPs                           4 μL
286 Cys1 primer (20 μM)            1.25 μL
286 Cys2 primer (20 μM)            1.25 μL
×10 pfu polymerase Buffer             5 μL
pfu DNA polymerase                     1 μL
滅菌水                              35.5 μL 
total                                50 μL
（PCR増幅反応）
95℃    30 sec
95℃    30 sec  55℃  1 min   68℃  13 min (12サイクル)
68℃    4 min
4℃    無制限時間
Primerの塩基配列は以下の通りである。
286 Cys1プライマー：GTGGAGGTGCATTGTGCCAAGACAAAG（配列番号：１９）
286 Cys2プライマー：CTTTGTCTTGGCACAATGCACCTCCAC（配列番号：２０）
上記のPCR反応終了後、DpnI (New England BioLabs)を1 μL添加して、2時間37℃でインキュベーションした。インキュベーション終了した液を用いて、大腸菌JM109を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのDNAシークエンスを確認することで、286（Asn→Cys）変異導入されたヒトIgG1 H鎖定常領域を挿入したｐCR2.1ベクターpCR2.1-HC（286Cys）と名前を付けた。
295（Glu→Cys）変異
pCR2.1-HC (野生型)  (25 ng/μL)       2 μL
2.5 mM dNTPs                          4 μL
295 Cys1 primer (20 μM)           1.25 μL
295 Cys2 primer (20 μM)           1.25 μL
×10 pfu polymerase Buffer            5 μL
pfu DNA polymerase                    1 μL
滅菌水                             35.5 μL  
total                                50 μL
（PCR増幅反応）
95℃    30 sec
95℃    30 sec  55℃  1 min   68℃  13 min (12サイクル)
68℃    4 min
4℃    無制限時間
Primerの塩基配列は以下の通りである。
295 Cys1プライマー：ACAAAGCCGCGTGAGGAGTGCTACAACAGCACGTACCGT（配列番号：２１）
295 Cys2プライマー：ACGGTACGTGCTGTTGTAGCACTCCTCACGCGGCTTTGT（配列番号：２２）
上記のPCR反応終了後、DpnI (New England BioLabs)を1 μL添加して、2時間37℃でインキュベーションした。インキュベーション終了した液を用いて、大腸菌JM109を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのDNAシークエンスを確認することで、295（Glu→Cys）変異導入されたヒトIgG1 H鎖定常領域を挿入したｐCR2.1ベクターpCR2.1-HC（295Cys）と名前を付けた。
298（Ser→Ala）変異
pCR2.1-HC (野生型)  (25 ng/μL)        2 μL
2.5 mM dNTPs                           4 μL
298 Cys1 primer (20 μM)            1.25 μL
298 Cys2 primer (20 μM)            1.25 μL
×10 pfu polymerase Buffer             5 μL
pfu DNA polymerase                     1 μL
滅菌水                              35.5 μL  
total                                 50 μL
（PCR増幅反応）
95℃    30 sec
95℃    30 sec  55℃  1 min   68℃  13 min (12サイクル)
68℃    4 min
4℃    無制限時間
Primerの塩基配列は以下の通りである。
298 Cys1プライマー：GAGCAGTACAACTGCACGTACCGTGTG（配列番号：２３）
298 Cys2プライマー：CACACGGTACGTGCAGTTGTACTGCTC（配列番号：２４）
上記のPCR反応終了後、DpnI (New England BioLabs)を1 μL添加して、2時間37℃でインキュベーションした。インキュベーション終了した液を用いて、大腸菌JM109を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのDNAシークエンスを確認することで、298（Ser→Cys）変異導入されたヒトIgG1 H鎖定常領域を挿入したｐCR2.1ベクターpCR2.1-HC（298Cys）と名前を付けた。
【００９４】
B) Fc領域および変異導入したFc領域遺伝子を組み合わせたヒト抗体発現ベクターの構築
Anti-ALCAM（066-174）ヒト抗体を発現させるには、Anti-ALCAM（066-174）ヒト抗体のL鎖とH鎖の2種類の発現ベクターをCHO細胞にTransfectionさせることで達成される。ここで、Anti-ALCAM（066-174）ヒト抗体のL鎖の発現ベクターとは、Anti-ALCAM（066-174）L鎖可変領域遺伝子+ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものであり、Anti-ALCAM（066-174）のH鎖の発現ベクターとは、Anti-ALCAM（066-174）H鎖可変領域遺伝子+ ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものである。野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型のAnti-ALCAM（066-174）抗体を作製するにあたり、Anti-ALCAM（066-174）ヒト抗体のL鎖の発現ベクターは、これら4種のヒト抗体を発現させるために共通に使用するものであるが、Anti-ALCAM（066-174）ヒト抗体のH鎖の発現ベクターは、野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型ヒト抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターを必要とする。ここでは、はじめに各ヒト抗体の発現に共通に使用できるAnti-ALCAM（066-174）ヒト抗体L鎖の発現ベクターの構築について詳細を記述し、その後に286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型ヒト抗体の発現に必要な専用のAnti-ALCAM（066-174）ヒト抗体H鎖発現ベクターの構築について記述する。
【００９５】
Anti-ALCAM（066-174）ヒト抗体L鎖の発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMG-neoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-ALCAM（066-174）ヒトL鎖可変領域遺伝子+ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-ALCAM（066-174）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子は、抗体研究所から提供されたAnti-ALCAM（066-174）L鎖遺伝子を鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。
【００９６】
Anti-ALCAM（066-174）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子の増幅反応
Anti-ALCAM（066-174）L鎖(25 ng/μL)           2 μL
2.5 mM dNTPs                                   4 μL
EGFR-L1 primer(20μM)                        2.5 μL
EGFR-L2 primer(20μM)                        2.5 μL 
DMSO                                         2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer                     5 μL 
pfu polymerase                                 1 μL
滅菌水                                      30.5 μL 
total                                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
EGFR-L1 primer：ACCGCTCGAGATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC（配列番号：２５）
EGFR-L2 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTACGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT（配列番号：２６）
【００９７】
上記のPCR反応で得られたAnti-ALCAM（066-174）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）と制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMG-neoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti-ALCAM（066-174）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子断片を混同してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti-ALCAM（066-174）ヒト抗体L鎖の発現ベクターは、ALCAM（066-174）LCと名前が付けられた。
【００９８】
Anti-ALCAM（066-174）ヒト抗体H鎖発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMG-neoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-ALCAM（066-174）ヒトH鎖可変領域遺伝子+ HヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-ALCAM（066-174）ヒトH鎖可変領域遺伝子は、抗体研究所から提供されたAnti-ALCAM（066-174）H鎖遺伝子を鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。
野生型、286Cys型、295Cys型あるいは295Cys型ヒト抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターは、ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子をPCR増幅させる際の鋳型となるプラスミドは異なるが、操作自体は全く同様に行われて各種ヒトIgG1 H鎖遺伝子断片を得た。以下にPCR反応を含む詳細を記述する。
【００９９】
Anti-ALCAM（066-174）ヒト抗体H鎖可変領域遺伝子の増幅反応
Anti-ALCAM（066-174）H鎖(25 ng/μL)      2 μL
2.5 mM dNTPs                             4 μL
EGFR-H1 primer(20μM)                  2.5 μL
ALCAM-heavy-variable-R primer(20μM)   2.5 μL 
DMSO                                   2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer               5 μL 
pfu polymerase                           1 μL
滅菌水                                30.5 μL 
total                                   50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
EGFR-H1 primer：ACCGCTCGAGATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTC（配列番号：２７）
ALCAM-heavy-variable-R primer：CGACGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCC(5’-リン酸化されている)（配列番号：２８）
【０１００】
ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子の増幅反応
＃各種鋳型プラスミド (25 ng/μL)  2 μL
2.5 mM dNTPs                      4 μL
H3 primer(20μM)                  2.5 μL
H4 primer(20μM)                  2.5 μL 
DMSO                              2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer        5 μL 
pfu polymerase                    1 μL
滅菌水                            30.5 μL 
total                             50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
H3 primer：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC(5’-リン酸化されている)（配列番号：２９）
H4 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT（配列番号：３０）
【０１０１】
野生型のAnti-ALCAM（066-174）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためには、pCR2.1-HC(野生型)を鋳型として用いた。286Cys型のAnti-ALCAM（066-174）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(286Cys)を鋳型として用いた。295Cys型のAnti-ALCAM（066-174）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(295Cys)を鋳型として用いた。298Cys型のAnti-ALCAM（066-174）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(298Cys)を鋳型として用いた。
【０１０２】
上記のPCR反応で得られたAnti-ALCAM（066-174）H鎖可変領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）で切断されてから精製した。また、鋳型の異なる各種PCR反応で得られたヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMG-neoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti-ALCAM（066-174）H鎖可変領域遺伝子断片と精製ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子断片を混合してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このALCAM（066-174）ヒト抗体H鎖の発現ベクターは、pヒト ALCAM（066-174）HC(野生型)、pヒトALCAM（066-174）HC(286Cys型)、pヒト ALCAM（066-174）HC（295Cys）あるいはpヒトALCAM（066-174）HC(298Cys型)とそれぞれ名前が付けられた。
【０１０３】
C)ヒト抗体発現ベクターのCHO細胞への遺伝子導入とヒト抗体を高発現するCHO細胞のスクリーニング
構築された各種発現ベクターは、以下の組み合わせでTransIT-CHO Transfection kit（Mirus, MIR2170）を使用してCHO細胞へ遺伝子導入された。
野生型ヒト抗体：pヒト Anti-ALCAM（066-174）LC+ pヒト Anti-ALCAM（066-174）HC（野生型）
286Cys型ヒト抗体：ｐヒトAnti-ALCAM（066-174）LC+pヒトAnti-ALCAM（066-174）HC (286Cys型)
295Cys型ヒト抗体：ｐヒトAnti-ALCAM（066-174）LC+pヒト Anti-ALCAM（066-174）HC (295Cys型)
298Cys型ヒト抗体：ｐヒトAnti-ALCAM（066-174）LC+pヒト Anti-ALCAM（066-174）HC (298Cys型)
【０１０４】
遺伝子導入されたCHO細胞は、10％Fetal Bovine Serum(EQITEC-BIO)と1 mg/mLのGeneticin(GIBCO, 10131-035)を補足したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（Sigma, D5796）で37℃5％二酸化炭素の条件下で培養することで増殖した。この増殖してコロニーを形成したCHO細胞の中からヒト抗体を高発現しているCHO細胞を選択するのであるが、はじめに各コロニーの一部を96 wellプレートに移植して、さらに10日間培養した。その培養上清の一部を取り出し、以下に示すELISA測定をすることで高発現CHO細胞クローンを決定した。
（ELISA測定）
1)Anti-Human IgG (γ-chain) (MBL, 103AG)をコートした96Wellプレートに、TansfectionされたCHO細胞の培養上清を100 μL/wellで添加し、室温で1時間放置した。
2)培養上清液を96 wellプレートから捨てて、0.05%のTween20を含むPBS (PBS-0.05%Tween20)でwellを十分洗浄した。
3)Anti-Human IgG（γ-chain）Peroxidase conjugated (MBL, 208)をPBS-0.05％Tween20で2000倍希釈した溶液を100 μL/well添加して、室温で1時間放置した。
4)溶液を96 wellプレートから捨てて、PBS-0.05%Tween20でwellを十分洗浄した。
5)TMB Peroxidase Substrate (Moss, TMBE-1000ｓ)を100 μL/well添加して、発色反応させた。
6)10〜15分の発色反応後、1N硫酸を100 μL/well添加して、発色反応を停止させた。
7)450 nm吸光度を測定した。
このELISA測定で、高い発色値を示すコロニーが、ヒト抗体を高発現するクローンである。
【０１０５】
D)ヒト抗体高発現CHO細胞の培養
ELISA測定により選択されたヒト抗体高発現CHO細胞は、10％Fetal Bovine Serumと0.1 mg/mLのGeneticinを補足したDulbecco’s Modified Eagle’s Mediumで37℃5％二酸化炭素の条件下で培養することで増殖させた。十分に増殖したヒト抗体の高発現CHO細胞は、0.1 mg/mLのGeneticinを補足した無血清培地であるCHO-S-SFMII（GIBCO,12052-098）での培養に置き換えられ、継続して1000ｍL程度培養された。
【０１０６】
E)ヒト抗体高発現細胞の培養上清からのカラム精製
無血清培地であるCHO-S-SFMIIで培養されたヒト抗体高発現CHO細胞の培養上清は、回収された。ヒト抗体の精製は、抗体精製に通常用いられるProtein Aカラム精製により実施された。
ヒト抗体のProtein Aカラム精製
1)1000 ｍL のCHO-S-SFMIIでヒト抗体高発現CHO細胞を培養して得られた培養上清は、Amicon Ultrafiltration Membranes (Millipore, Code YM10)を取り付けたAmicon Stirred Uitrafiltration Cell (Millipore, Model 8400)を用いて、1000 ｍLから100 ｍLまで濃縮された。
2)培養上清濃縮液に、Protein A-SepharoseであるrProteinA Sepharose Fast Flow (Amersham Bioscience, 17-1279-03) 8ｍLを添加し、2日間4℃で攪拌させてProteinAにヒト抗体を吸着させた。
3)ヒト抗体を吸着したProteinA-Sepharoseは、直径1.5 cm、長さ8 cmのカラムに充填させた。
4)ProteinA-Sepharoseが充填されたカラムは、PBS 100 mLで洗浄された後、Elution Buffer (0.17M Glycine-HCl, pH2.3) でカラムからヒト抗体を溶出した。
5)溶出されたヒト抗体溶液は、すぐに1M Tris-HCl pH8.5を適量加えてｐHを中性にした。
6)ヒト抗体溶出液は、透析チューブであるCell Sep T2 (Membrane filtration products Inc, 8030-23)に入れて4℃でPBS 5 Lに透析された。透析後に回収したヒト抗体を、精製品とした。
【０１０７】
各種ヒト抗体のADCC活性評価
各種ヒト抗体のAntibody-dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC)活性評価は、lactate dehydrogenase release assayにより行った。このAssayでは、Target細胞としてALCAM分子を細胞膜表面に持つNCI-H1373（H1373と略記する場合がある）細胞を用い、Effector細胞として、Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC)を用いた。このHuman PBMCは、Lymphoprep (Axis Shield)を使って、ヒトの血液から調整された。
H1373細胞（1×104個/50 μL）は、96-well U-bottomedプレートの各wellに入れ、Effector細胞であるHuman PBMCが、E/T ratioが20/1となるように2×105個加えられた。この細胞液にさらに、各種Anti-ALCAM（066-174）ヒト抗体を連続的な希釈系列となるように添加して、37℃で20時間保温された。保温後に、96-well U-bottomedプレートは、遠心分離され、その上清中のlactate dehydrogenase activityをCytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit (Promega, G1780)を用いて測定された。抗体依存的かつ特異的な細胞障害(Cytotoxicity)％は、以下の式を用いて算出された。
% Cytotoxicity = 100×（E−SE−ST）/(M−ST)
【０１０８】
ここで、EとはExperimental releaseを表し、抗体とEffctor細胞が、Target細胞と共に保温された時のTarget細胞からrelaeseされたlactate dehydrogenase活性である。SEとは、Effector細胞からの自然発生的に放出されたlactate dehydrogenase活性である。STとは、Target細胞からも自然発生的に放出されたlactate dehydrogenase活性である。Mとは、Target細胞の最大に放出されるlactate dehydrogenase活性を表し、これはLysis Solution (9％ Triton X-100)の添加により、Target細胞から放出されたlactate dehydrogenase活性である。
【０１０９】
以上のような評価方法を用いて行われた、野生型、295Cys型、298Cys型のAnti-ALCAM（066-174）ヒト抗体のADCC活性評価の結果を図１１及び表８に示す。298Cys型ヒト抗体は、野生型と比べて高濃度条件下（0.0001μg/mL以上）で野生型と比べて、高いADCC活性を示した。
【０１１０】
【表８】
2009055899.tif 000009
【０１１１】
さらに、野生型ヒト抗体と変異型ヒト抗体の細胞障害の割合を、lactate dehydrogenase release assayによって比較した。その結果、添加した抗体の濃度が0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mLの場合における細胞障害の割合は、野生型ヒト抗体の場合それぞれ2.22％、2.65％、4.31％、18.68％、37.35％、36.73％、30.82％、295Cys型ヒト抗体の場合はそれぞれ1.62％、3.14％、8.78％、25.46％、42.49％、43.69％、44.58％、298Cys型ヒト抗体の場合はそれぞれ2.13％、3.66％、4.60％、30.76％、44.87％、45.64％、52.45％であった。
よって、ADCC活性の比（野生型ヒト抗体に対する298Cys型ヒト抗体の細胞障害の割合の比）は、それぞれ1.0倍、1.4倍、1.1倍、1.6倍、1.2倍、1.2倍、1.7倍となることがわかった（表８）。
また表８より、野生型ヒト抗体と298型ヒト抗体との間で細胞障害の割合が同程度である2点を選択し、ADCC活性の比較を試みた。例えば、野生型ヒト抗体は0.1μg/mLで約37％、298型ヒト抗体は0.01μg/mLで約31％の細胞障害を示している。この2点を用いて比較した場合、同じADCC活性を得るために必要な抗体濃度が約10分の1に減少した。このことから、ADCC活性が約10倍上昇した（野生型ヒト抗体と298型ヒト抗体が同一の細胞障害の割合を示す2点間における、野生型ヒト抗体に対する298型ヒト抗体の濃度の比が1/10倍になった）と判断することが出来る。
当業者であれば、上記の方法に倣い、図および表よりADCC活性の上昇を算出することが可能である。
【０１１２】
〔実施例２〕
実施例１と同様の方法で、野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型のAnti-ALCAM（035-234）抗体を作製し、これら各種変異型のAnti-ALCAM（035-234）ヒト抗体のADCC活性を評価した。その結果、野生型と、Anti-ALCAM（035-234）ヒト抗体のADCC活性とを比較して、295Cys型及び298Cys型のAnti-ALCAM（035-234）ヒト抗体は高いADCC活性を示した。
以下に、Anti-ALCAM（035-234）ヒト抗体の野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型の作製方法ならびにそのADCC活性測定を記載する。
【０１１３】
1）Anti-ALCAM（035-234）抗体の作製
ヒト抗体は、以下のA)〜E)の工程を経て、精製ヒト抗体として得られる。
A) Fc領域遺伝子の変異導入、
B) Fc領域および変異導入したFc領域遺伝子を組み合わせたヒト抗体発現ベクターの構築、 
C) ヒト抗体発現ベクターのCHO細胞への遺伝子導入とヒト抗体を高発現するCHO細胞のスクリーニング、
D) ヒト抗体高発現CHO細胞の培養、
E) ヒト抗体高発現細胞の培養上清からのカラム精製。
以下にA)〜E)の工程を順に記載する。
これらの工程のうち、A),B),D),E)は実施例１と同様である。従って本実施例では、工程C)について説明する。
【０１１４】
ヒト抗体を作製するためには、4種の遺伝子が必要になる。この4種の遺伝子は、ヒト抗体L鎖可変領域遺伝子、ヒト抗体H鎖可変領域遺伝子、ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子、ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子である。ALCAMを認識する抗体クローンであるAnti-ALCAM（035-234）のL鎖可変領域および定常領域遺伝子、H鎖可変領域および定常領域遺伝子は抗体研究所（株）から提供された。提供されたAnti- ALCAM（035-234）のヒトL鎖可変領域のDNA配列を図３（配列番号：１４８）に、ヒトH鎖可変領域のDNA配列を図４（配列番号：１５０）に示す。
また、Anti-ALCAM（035-234）のヒトL鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の塩基配列を配列番号：３１〜３３に示す。また、Anti-ALCAM（035-234）のヒトL鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３４〜３６に示す。提供されたヒトIgG1 L鎖定常領域の遺伝子はλ鎖で、その塩基配列を配列番号：３７に、アミノ酸配列を配列番号：３８に示す。
また、Anti-ALCAM（035-234）のヒトH鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の塩基配列を配列番号：３９〜４１に示す。また、Anti-ALCAM（035-234）のヒトH鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列を配列番号：４２〜４４に示す。提供されたヒトIgG1 H鎖定常領域の塩基配列およびアミノ酸配列は、Anti-ALCAM（066-174）と同一である。
【０１１５】
C)クローニングされた遺伝子及びその変異導入した遺伝子を組み合わせたヒト抗体発現ベクターの構築
Anti-ALCAM（035-234）ヒト抗体を発現させるには、Anti-ALCAM（035-234）ヒト抗体のL鎖とH鎖の2種類の発現ベクターをCHO細胞にTransfectionさせることで達成される。ここで、Anti-ALCAM（035-234）ヒト抗体のL鎖の発現ベクターとは、Anti-ALCAM（035-234）L鎖可変領域遺伝子+ ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものであり、Anti-ALCAM（035-234）のH鎖の発現ベクターとは、Anti-ALCAM（035-234）H鎖可変領域遺伝子+ ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものである。野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型のAnti-ALCAM（035-234）抗体を作製するにあたり、Anti-ALCAM（035-234）ヒト抗体のL鎖の発現ベクターは、これら4種のヒト抗体を発現させるために共通に使用するものであるが、Anti-ALCAM（035-234）ヒト抗体のH鎖の発現ベクターは、野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型ヒト抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターを必要とする。ここでは、はじめに各ヒト抗体の発現に共通に使用できるAnti-ALCAM（035-234）ヒト抗体L鎖の発現ベクターの構築について詳細を記述し、その後に286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型ヒト抗体の発現に必要な専用のAnti-ALCAM（035-234）ヒト抗体H鎖発現ベクターの構築について記述する。
【０１１６】
Anti-ALCAM（035-234）ヒト抗体L鎖の発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMG-neoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-ALCAM（035-234）ヒトL鎖可変領域遺伝子+ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-ALCAM（035-234）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子は、抗体研究所から提供されたAnti-ALCAM（035-234）L鎖遺伝子を鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。
【０１１７】
Anti-ALCAM（035-234）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子の増幅反応
Anti-ALCAM（035-234）L鎖(25 ng/μL)           2 μL
2.5 mM dNTPs                                   4 μL
EGFR-L1 primer(20μM)                        2.5 μL
EGFR-L2 primer(20μM)                        2.5 μL 
DMSO                                         2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer                     5 μL 
pfu polymerase                                 1 μL
滅菌水                                      30.5 μL 
total                                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
EGFR-L1 primer：ACCGCTCGAGATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC（配列番号：２５）
EGFR-L2 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTACGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT（配列番号：２６）
【０１１８】
上記のPCR反応で得られたAnti-ALCAM（035-234）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）と制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMG-neoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti-ALCAM（035-234）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子断片を混同してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti-ALCAM（035-234）ヒト抗体L鎖の発現ベクターは、pヒトALCAM（035-234）LCと名前が付けられた。
【０１１９】
Anti-ALCAM（035-234）ヒト抗体H鎖発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMG-neoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-ALCAM（035-234）ヒトH鎖可変領域遺伝子+ HヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-ALCAM（035-234）ヒトH鎖可変領域遺伝子は、抗体研究所から提供されたAnti-ALCAM（035-234）H鎖遺伝子を鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。
野生型、286Cys型、295Cys型あるいは295Cys型ヒト抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターは、ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子をPCR増幅させる際の鋳型となるプラスミドは異なるが、操作自体は全く同様に行われて各種ヒトIgG1 H鎖遺伝子断片を得た。以下にPCR反応を含む詳細を記述する。
【０１２０】
Anti-ALCAM（035-234）ヒト抗体H鎖可変領域遺伝子の増幅反応
Anti-ALCAM（066-174）H鎖(25 ng/μL)          2 μL
2.5 mM dNTPs                                 4 μL
EGFR-H1 primer(20μM)                      2.5 μL
ALCAM-heavy-variable-234-R primer(20μM)   2.5 μL 
DMSO                                       2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer                   5 μL 
pfu polymerase                               1 μL
滅菌水                                    30.5 μL 
total                                       50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
EGFR-H1 primer：ACCGCTCGAGATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTC（配列番号：２７）
ALCAM-heavy-variable-234-R primer：CGACGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG (5’-リン酸化されている)（配列番号：４５）
【０１２１】
ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子の増幅反応
＃各種鋳型プラスミド (20 ng/μL)  2 μL
2.5 mM dNTPs                      4 μL
H3 primer(20μM)                  2.5 μL
H4 primer(20μM)                  2.5 μL 
DMSO                              2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer        5 μL 
pfu polymerase                    1 μL
滅菌水                            30.5 μL 
total                             50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
H3 primer：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC(5’-リン酸化されている)（配列番号：２９）
H4 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT（配列番号：３０）
【０１２２】
野生型のAnti-ALCAM（035-234）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためには、pCR2.1-HC(野生型)を鋳型として用いた。286Cys型のAnti-ALCAM（035-234）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(286Cys)を鋳型として用いた。295Cys型のAnti-ALCAM（035-234）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(295Cys)を鋳型として用いた。298Cys型のAnti-ALCAM（035-234）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(298Cys)を鋳型として用いた。
【０１２３】
上記のPCR反応で得られたAnti-ALCAM（035-234）H鎖可変領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）で切断されてから精製した。また、鋳型の異なる各種PCR反応で得られたヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMG-neoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti-ALCAM（035-234）H鎖可変領域遺伝子断片と精製ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子断片を混合してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti-ALCAM（035-234）ヒト抗体H鎖の発現ベクターは、pヒト ALCAM（035-234）HC(野生型)、pヒト ALCAM（035-234）HC(286Cys型)、pヒト ALCAM（035-234）HC（295Cys）あるいはpヒト ALCAM（035-234）HC(298Cys型)とそれぞれ名前が付けられた。
【０１２４】
各種ヒト抗体のAntibody-dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC)活性評価を、実施例１に記載の方法と同様の方法に従って行った。野生型、286Cys型、295Cys型、298Cys型のヒト抗体のADCC活性結果を図１２に示す。図から、286Cys型ヒト抗体は、野生型と比べて高濃度条件下（0.1μg/mL以上）で、298Cys型ヒト抗体は、全濃度域で野生型と比べて、高いADCC活性を示した。
【０１２５】
さらに、野生型ヒト抗体と変異型ヒト抗体の細胞障害の割合を、lactate dehydrogenase release assayによって比較した（表９）。
【表９】
2009055899.tif 000010
その結果、添加した抗体の濃度が0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mLの場合における細胞障害の割合は、野生型ヒト抗体の場合それぞれ2.36％、2.99％、4.70％、11.66％、8.99％、12.06％、286Cys型ヒト抗体の場合はそれぞれ2.59％、3.30％、4.35％、13.93％、14.97％、15.06％、であった。295型ヒト抗体の場合はそれぞれ2.97％、3.63％、5.24％、11.51％、11.77％、14.40％、であった。298型ヒト抗体の場合はそれぞれ4.46％、4.76％、6.00％、13.39％、19.48％、24.13％、であった。
よって、ADCC活性の比（野生型ヒト抗体と変異型ヒト抗体が同一濃度である2点間における、野生型ヒト抗体に対する変異型ヒト抗体の細胞障害の割合の比）は、それぞれ286C/野生型では1.1倍、1.1倍、0.9倍、1.2倍、1.7倍、1.2倍、295C/野生型では1.3倍、1.2倍、1.1倍、1.0倍、1.3倍、1.2倍、298C/野生型では1.9倍、1.6倍、1.3倍、1.1倍、2.2倍、2.0倍、となることがわかった（表９）。
また表９より、野生型ヒト抗体と298型ヒト抗体との間で細胞障害の割合が同程度である2点を選択し、ADCC活性の比較を試みた。例えば、野生型ヒト抗体は10μg/mLで約12％、298型ヒト抗体は0.1μg/mLで約13％の細胞障害を示している。この2点を用いて比較した場合、同じADCC活性を得るために必要な抗体濃度が約100分の1に減少した。このことから、ADCC活性が約100倍上昇した（野生型ヒト抗体と298型ヒト抗体が同一の細胞障害の割合を示す2点間における、野生型ヒト抗体に対する298型ヒト抗体の濃度の比が1/100倍になった）と判断することが出来る。
また表９より、野生型ヒト抗体と286型ヒト抗体との間で細胞障害の割合が同程度である2点を選択し、ADCC活性の比較を試みた。例えば、野生型ヒト抗体は10μg/mLで約12
％、286型ヒト抗体は0.1μg/mLで約13％の細胞障害を示している。この2点を用いて比較した場合、同じADCC活性を得るために必要な抗体濃度が約100分の1に減少した。このことから、ADCC活性が約100倍上昇した（野生型ヒト抗体と286型ヒト抗体が同一の細胞障害の割合を示す2点間における、野生型ヒト抗体に対する286型ヒト抗体の濃度の比が1/100倍になった）と判断することが出来る。
当業者であれば、上記の方法に倣い、図および表よりADCC活性の上昇を算出することが可能である。
【０１２６】
〔実施例３〕
実施例１と同様の方法で、野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型のAnti-ICAM1（053-059）抗体を作製し、これら各種変異型のAnti-ICAM1（053-059）ヒト抗体のADCC活性を評価した。その結果、野生型と、Anti-ICAM1（053-059）ヒト抗体のADCC活性とを比較して、286Cys型、295Cys型、及び298Cys型のAnti-ICAM1（053-059）ヒト抗体は高いADCC活性を示した。
以下に、Anti-ICAM1（053-059）ヒト抗体の野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型の作製方法ならびにそのADCC活性測定を記載する。
【０１２７】
1）Anti-ICAM1（053-059）抗体の作製
ヒト抗体は、以下のA)〜E)の工程を経て、精製ヒト抗体として得られる。
A) Fc領域遺伝子の変異導入、
B) Fc領域および変異導入したFc領域遺伝子を組み合わせたヒト抗体発現ベクターの構築、
C) ヒト抗体発現ベクターのCHO細胞への遺伝子導入とヒト抗体を高発現するCHO細胞のスクリーニング、
D) ヒト抗体高発現CHO細胞の培養、
E) ヒト抗体高発現細胞の培養上清からのカラム精製。
以下にA)〜E)の工程を順に記載する。
これらの工程のうち、A),B),D),E)は実施例１と同様である。従って本実施例では、工程C)について説明する。
【０１２８】
ヒト抗体を作製するためには、4種の遺伝子が必要になる。この4種の遺伝子は、ヒト抗体L鎖可変領域遺伝子、ヒト抗体H鎖可変領域遺伝子、ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子、ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子である。ALCAMを認識する抗体クローンであるAnti-ICAM1（053-059）のL鎖可変領域および定常領域遺伝子、H鎖可変領域および定常領域遺伝子は抗体研究所（株）から提供された。提供されたAnti-ICAM1（053-059）のヒトL鎖可変領域のDNA配列を図５（配列番号：１５２）に、ヒトH鎖可変領域のDNA配列を図６（配列番号：１５４）に示す。
また、Anti-ICAM1（053-059）のヒトL鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の塩基配列を配列番号：４６〜４８に示す。また、Anti-ICAM1（053-059）のヒトL鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：４９〜５１に示す。提供されたヒトIgG1 L鎖定常領域の遺伝子はλ鎖で、その塩基配列を配列番号：５２に、アミノ酸配列を配列番号：５３に示す。
また、Anti-ICAM1（053-059）のヒトH鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の塩基配列を配列番号：５４〜５６に示す。また、Anti-ICAM1（053-059）のヒトH鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列を配列番号：５７〜５９に示す。提供されたヒトIgG1 H鎖定常領域の塩基配列およびアミノ酸配列は、Anti-ALCAM（066-174）と同一である。
【０１２９】
C)クローニングされた遺伝子及びその変異導入した遺伝子を組み合わせたヒト抗体発現ベクターの構築
Anti-ICAM1（053-059）ヒト抗体を発現させるには、Anti-ICAM1（053-059）ヒト抗体のL鎖とH鎖の2種類の発現ベクターをCHO細胞にTransfectionさせることで達成される。ここで、Anti-ICAM1（053-059）ヒト抗体のL鎖の発現ベクターとは、Anti-ICAM1（053-059）L鎖可変領域遺伝子+ ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものであり、 Anti-ICAM1（053-059）のH鎖の発現ベクターとは、Anti-ICAM1（053-059）H鎖可変領域遺伝子+ ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものである。野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型のAnti-ICAM1（053-059）抗体を作製するにあたり、Anti-ICAM1（053-059）ヒト抗体のL鎖の発現ベクターは、これら4種のヒト抗体を発現させるために共通に使用するものであるが、Anti-ICAM1（053-059）ヒト抗体のH鎖の発現ベクターは、野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型ヒト抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターを必要とする。ここでは、はじめに各ヒト抗体の発現に共通に使用できるAnti-ICAM1（053-059）ヒト抗体L鎖の発現ベクターの構築について詳細を記述し、その後に286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型ヒト抗体の発現に必要な専用のAnti-ICAM1（053-059）ヒト抗体H鎖発現ベクターの構築について記述する。
【０１３０】
Anti-ICAM1（053-059）ヒト抗体L鎖の発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMG-neoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-ICAM1（053-059）ヒトL鎖可変領域遺伝子+ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-ICAM1（053-059）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子は、抗体研究所から提供されたAnti-ICAM1（053-174）L鎖遺伝子を鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。
【０１３１】
Anti-ICAM1（053-059）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子の増幅反応
Anti-ICAM1（053-059）L鎖(25 ng/μL)            2 μL
2.5 mM dNTPs                                   4 μL
EGFR-L1 primer(20μM)                        2.5 μL
EGFR-L2 primer(20μM)                        2.5 μL 
DMSO                                         2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer                     5 μL 
pfu polymerase                                 1 μL
滅菌水                                      30.5 μL 
total                                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
EGFR-L1 primer：ACCGCTCGAGATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC（配列番号：２５）
EGFR-L2 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTACGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT（配列番号：２６）
【０１３２】
上記のPCR反応で得られたAnti-ICAM1（053-059）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）と制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMG-neoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti-ICAM1（053-059）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子断片を混同してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti-ICAM1（053-059）ヒト抗体L鎖の発現ベクターは、pヒトICAM1（053-059）LCと名前が付けられた。
【０１３３】
Anti-ICAM1（053-059）ヒト抗体H鎖発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMG-neoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-ICAM1（053-059）ヒトH鎖可変領域遺伝子+ HヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-ICAM1（053-059）ヒトH鎖可変領域遺伝子は、抗体研究所から提供されたAnti-ICAM1（035-059）H鎖遺伝子を鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。
野生型、286Cys型、295Cys型あるいは295Cys型ヒト抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターは、ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子をPCR増幅させる際の鋳型となるプラスミドは異なるが、操作自体は全く同様に行われて各種ヒトIgG1 H鎖遺伝子断片を得た。以下にPCR反応を含む詳細を記述する。
【０１３４】
Anti-ICAM1（053-059）ヒト抗体H鎖可変領域遺伝子の増幅反応
Anti-ICAM1（053-059）H鎖(25 ng/μL)        2 μL
2.5 mM dNTPs                               4 μL
EGFR-H1 primer(20μM)                    2.5 μL
ALCAM-heavy-variable-R primer(20μM)     2.5 μL 
DMSO                                     2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer                 5 μL 
pfu polymerase                             1 μL
滅菌水                                  30.5 μL 
total                                     50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
EGFR-H1 primer：ACCGCTCGAGATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTC（配列番号：２７）
ALCAM-heavy-variable-R primer：CGACGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCC (5’-リン酸化されている)（配列番号：２８）
【０１３５】
ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子の増幅反応
＃各種鋳型プラスミド (20 ng/μL)    2 μL
2.5 mM dNTPs                        4 μL
H3 primer(20μM)                  2.5 μL
H4 primer(20μM)                  2.5 μL 
DMSO                              2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer          5 μL 
pfu polymerase                      1 μL
滅菌水                           30.5 μL 
total                              50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
H3 primer：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC(5’-リン酸化されている)（配列番号：２９）
H4 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT（配列番号：３０）
【０１３６】
野生型のAnti-ICAM1（053-085）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためには、pCR2.1-HC(野生型)を鋳型として用いた。286Cys型のAnti-ICAM1（053-059）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(286Cys)を鋳型として用いた。295Cys型のAnti-ICAM1（053-059）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(295Cys)を鋳型として用いた。298Cys型のAnti-ICAM1（053-059）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(298Cys)を鋳型として用いた。
【０１３７】
上記のPCR反応で得られたAnti-ICAM1（053-059）H鎖可変領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）で切断されてから精製した。また、鋳型の異なる各種PCR反応で得られたヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMG-neoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti-ICAM1（053-059）H鎖可変領域遺伝子断片と精製ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子断片を混合してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti-ICAM1（053-059）ヒト抗体H鎖の発現ベクターは、pヒトICAM1（053-059）HC(野生型)、pヒトICAM1（053-059）HC(286Cys型)、pヒトICAM1（053-059）HC（295Cys）あるいはpヒト ICAM1（053-059）HC(298Cys型)とそれぞれ名前が付けられた。
【０１３８】
各種ヒト抗体のAntibody-dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC)活性評価を、実施例１に記載の方法と同様の方法に従って行った。野生型、286Cys型、295Cys型、298Cys型のヒト抗体のADCC活性結果を図１３に示す。286Cys型、298Cys型ヒト抗体は、野生型と比べて高濃度条件下（0.01μg/mL以上）で高いADCC活性を示した。
【０１３９】
さらに野生型ヒト抗体と変異型ヒト抗体の細胞障害の割合を、lactate dehydrogenase release assayによって比較した（表１０）。
【表１０】
2009055899.tif 000011
その結果、添加した抗体の濃度が0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mLの場合における細胞障害の割合は、野生型ヒト抗体の場合それぞれ8.90％、8.76％、11.91％、20.70％、23.11％、22.17％、、286Cys型ヒト抗体の場合はそれぞれ7.85％、7.61％、13.55％、27.52％、32.15％、31.30％、295Cys型ヒト抗体の場合はそれぞれ3.71％、5.08％、13.15％、23.65％、25.61％、29.03％、298Cys型ヒト抗体の場合はそれぞれ8.10％、6.21％、13.89％、26.02％、27.99％、32.76％であった。
よって、ADCC活性の比（野生型ヒト抗体と変異型ヒト抗体が同一濃度である2点間における、野生型ヒト抗体に対する変異型ヒト抗体の細胞障害の割合の比）は、286C/野生型それぞれ、0.9倍、0.9倍、1.1倍、1.3倍、1.4倍、1.4倍、295C/野生型それぞれ、0.4倍、0.6倍、1.1倍、1.1倍、1.1倍、1.3倍、298C/野生型それぞれ、0.9倍、0.7倍、1.2倍、1.3倍、1.2倍、1.5倍、となることがわかった（表１０）。
【０１４０】
また表より、野生型ヒト抗体と286Cys型ヒト抗体との間で細胞障害の割合が同程度である2点を選択し、ADCC活性の比較を試みた。例えば、野生型ヒト抗体は10μg/mLで約22％、286Cys型及び298Cys型ヒト抗体は0.1μg/mLで約26％の細胞障害を示している。この2点を用いて比較した場合、同じADCC活性を得るために必要な抗体濃度が約100分の1に減少した。このことから、ADCC活性が約100倍上昇した（野生型ヒト抗体と286Cys型、または298Cys型ヒト抗体が同一の細胞障害の割合を示す2点間における、野生型ヒト抗体に対する変異型ヒト抗体の濃度の比が100倍になった）と判断することが出来る。
当業者であれば、上記の方法に倣い、図および表よりADCC活性の上昇を算出することが可能である。
【０１４１】
〔実施例４〕
実施例１と同様の方法で、野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型のAnti-ICAM1（053-085）抗体を作製し、これら各種変異型のAnti-ICAM1（053-085）ヒト抗体のADCC活性を評価した。その結果、野生型と、Anti-ICAM1（053-085）ヒト抗体のADCC活性とを比較して、286Cys型、295Cys型、及び298Cys型のAnti-ICAM1（053-085）ヒト抗体は高いADCC活性を示した。
以下に、Anti-ICAM1（053-085）ヒト抗体の野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型の作製方法ならびにそのADCC活性測定を記載する。
【０１４２】
1）Anti-ICAM1（053-085）抗体の作製
ヒト抗体は、以下のA)〜E)の工程を経て、精製ヒト抗体として得られる。
A) Fc領域遺伝子の変異導入、
B) Fc領域および変異導入したFc領域遺伝子を組み合わせたヒト抗体発現ベクターの構築、 
C) ヒト抗体発現ベクターのCHO細胞への遺伝子導入とヒト抗体を高発現するCHO細胞のスクリーニング、
D) ヒト抗体高発現CHO細胞の培養、
E) ヒト抗体高発現細胞の培養上清からのカラム精製。
以下にA)〜E)の工程を順に記載する。
これらの工程のうち、A),B),D),E)は実施例１と同様である。従って本実施例では、工程C)について説明する。
【０１４３】
ヒト抗体を作製するためには、4種の遺伝子が必要になる。この4種の遺伝子は、ヒト抗体L鎖可変領域遺伝子、ヒト抗体H鎖可変領域遺伝子、ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子、ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子である。ALCAMを認識する抗体クローンであるAnti-ICAM1（053-085）のL鎖可変領域および定常領域遺伝子、H鎖可変領域および定常領域遺伝子は抗体研究所（株）から提供された。提供されたAnti-ICAM1（053-085）のヒトL鎖可変領域のDNA配列を図７（配列番号：１５６）に、ヒトH鎖可変領域のDNA配列を図８（配列番号：１５８）に示す。
また、Anti-ICAM1（053-085）のヒトL鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の塩基配列を配列番号：６０〜６２に示す。また、Anti-ICAM1（053-085）のヒトL鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：６３〜６５に示す。提供されたヒトIgG1 L鎖定常領域の遺伝子はλ鎖で、その塩基配列を配列番号：６６に、アミノ酸配列を配列番号：６７に示す。
また、Anti-ICAM1（053-085）のヒトH鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の塩基配列を配列番号：６８〜７０に示す。また、Anti-ICAM1（053-059）のヒトH鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列を配列番号：７１〜７３に示す。提供されたヒトIgG1 H鎖定常領域の塩基配列およびアミノ酸配列は、Anti-ALCAM（066-174）と同一である。
【０１４４】
C)クローニングされた遺伝子及びその変異導入した遺伝子を組み合わせたヒト抗体発現ベクターの構築
Anti-ICAM1（053-085）ヒト抗体を発現させるには、Anti-ICAM1（053-085）ヒト抗体のL鎖とH鎖の2種類の発現ベクターをCHO細胞にTransfectionさせることで達成される。ここで、 Anti-ICAM1（053-085）ヒト抗体のL鎖の発現ベクターとは、Anti-ICAM1（053-085）L鎖可変領域遺伝子+ ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものであり、 Anti-ICAM1（053-085）のH鎖の発現ベクターとは、Anti-ICAM1（053-085）H鎖可変領域遺伝子+ ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものである。野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型のAnti-ICAM1（053-085）抗体を作製するにあたり、Anti-ICAM1（053-085）ヒト抗体のL鎖の発現ベクターは、これら4種のヒト抗体を発現させるために共通に使用するものであるが、Anti-ICAM1（053-085）ヒト抗体のH鎖の発現ベクターは、野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型ヒト抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターを必要とする。ここでは、はじめに各ヒト抗体の発現に共通に使用できるAnti-ICAM1（053-085）ヒト抗体L鎖の発現ベクターの構築について詳細を記述し、その後に286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型ヒト抗体の発現に必要な専用のAnti-ICAM1（053-085）ヒト抗体H鎖発現ベクターの構築について記述する。
【０１４５】
Anti-ICAM1（053-085）ヒト抗体L鎖の発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMG-neoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-ICAM1（053-085）ヒトL鎖可変領域遺伝子+ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-ICAM1（053-085）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子は、抗体研究所から提供されたAnti-AICAM1（053-085）L鎖遺伝子を鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。  
【０１４６】
Anti-ICAM1（053-085）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子の増幅反応
Anti-AICAM1（053-085）L鎖(25 ng/μL)           2 μL
2.5 mM dNTPs                                   4 μL
EGFR-L1 primer(20μM)                        2.5 μL
EGFR-L2 primer(20μM)                        2.5 μL 
DMSO                                         2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer                     5 μL 
pfu polymerase                                 1 μL
滅菌水                                      30.5 μL 
total                                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
EGFR-L1 primer：ACCGCTCGAGATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC（配列番号：２５）
EGFR-L2 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTACGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT（配列番号：２６）
【０１４７】
上記のPCR反応で得られたAnti-ICAM1（053-085）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）と制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMG-neoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti- ICAM1（053-059）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子断片を混同してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti- ICAM1（053-085）ヒト抗体L鎖の発現ベクターは、pヒトICAM1（053-085）LCと名前が付けられた。
【０１４８】
Anti-ICAM1（053-085）ヒト抗体H鎖発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMG-neoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-ICAM1（053-085）ヒトH鎖可変領域遺伝子+ HヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-ICAM1（053-085）ヒトH鎖可変領域遺伝子は、抗体研究所かた提供されたAnti-AICAM1（053-085）H鎖遺伝子を鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。
野生型、286Cys型、295Cys型あるいは295Cys型ヒト抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターは、ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子をPCR増幅させる際の鋳型となるプラスミドは異なるが、操作自体は全く同様に行われて各種ヒトIgG1 H鎖遺伝子断片を得た。以下にPCR反応を含む詳細を記述する。
【０１４９】
Anti-ICAM1（053-085）ヒト抗体H鎖可変領域遺伝子の増幅反応
Anti-ICAM1（053-085）(25 ng/μL)           2 μL
2.5 mM dNTPs                               4 μL
EGFR-H1 primer(20μM)                    2.5 μL
ICAM-heavy-variable-85-R primer(20μM)   2.5 μL 
DMSO                                     2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer                 5 μL 
pfu polymerase                             1 μL
滅菌水                                  30.5 μL 
total                                     50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
EGFR-H1 primer：ACCGCTCGAGATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTC（配列番号：２７）
ICAM-heavy-variable-85-R primer：CGACGAGACGGTGACCATTGTCCCTTG (5’-リン酸化されている)（配列番号：７４）
【０１５０】
ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子の増幅反応
＃各種鋳型プラスミド (20 ng/μL)  2 μL
2.5 mM dNTPs                      4 μL
H3 primer(20μM)                  2.5 μL
H4 primer(20μM)                  2.5 μL 
DMSO                              2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer        5 μL 
pfu polymerase                    1 μL
滅菌水                            30.5 μL 
total                             50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
H3 primer：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC(5’-リン酸化されている)（配列番号：２９）
H4 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT（配列番号：３０）
【０１５１】
野生型のAnti-ICAM1（053-085）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためには、pCR2.1-HC(野生型)を鋳型として用いた。286Cys型のAnti- ICAM1（053-085）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(286Cys)を鋳型として用いた。295Cys型のAnti- ICAM1（053-085）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(295Cys)を鋳型として用いた。298Cys型のAnti-ICAM1（053-085）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(298Cys)を鋳型として用いた。
【０１５２】
上記のPCR反応で得られたAnti-ICAM1（053-085）H鎖可変領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）で切断されてから精製した。また、鋳型の異なる各種PCR反応で得られたヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMG-neoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti-ICAM1（053-085）H鎖可変領域遺伝子断片と精製ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子断片を混合してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti-ICAM1（053-085）ヒト抗体H鎖の発現ベクターは、pヒト ICAM1（053-085）HC(野生型)、pヒト ICAM1（053-085）HC(286Cys型)、pヒト ICAM1（053-085）HC（295Cys）あるいはpヒトICAM1（053-085）HC(298Cys型)とそれぞれ名前が付けられた。
【０１５３】
各種ヒト抗体のAntibody-dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC)活性評価を、実施例１に記載の方法と同様の方法に従って行った。野生型、286Cys型、295Cys型、298Cys型のヒト抗体のADCC活性結果を図１４、表１１、及び図１５、表１２に示す。図１４、表１１と図１５、表１２では、図１４では、抗体クローンは同一だが、エフェクター細胞を採取した者が異なっている。
図１４より、286Cys型ヒト抗体は、野生型と比べて高濃度条件下（1μg/mL以上）で、298Cys型ヒト抗体は、野生型と比べて高濃度条件下（0.1μg/mL以上）で高いADCC活性を示した。
図１５より、286Cys型ヒト抗体は、全濃度域で野生型と比べて、高いADCC活性を示した。また、298Cys型ヒト抗体は、野生型と比べて高濃度条件下（0.01μg/mL以上）で高いADCC活性を示した。
【０１５４】
さらに、野生型ヒト抗体と変異型ヒト抗体の細胞障害の割合を、lactate dehydrogenase release assayによって比較した。
【表１１】
2009055899.tif 000012
【表１２】
2009055899.tif 000013
その結果、表１１より、添加した抗体の濃度が0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mLの場合における細胞障害の割合は、野生型ヒト抗体の場合それぞれ7.19％、8.72％、12.84％、28.99％、27.88％、30.11％、286Cys型ヒト抗体の場合はそれぞれ6.53％、8.38％、11.37％、27.56％、43.28％、52.95％、295Cys型ヒト抗体の場合はそれぞれ8.77％、7.15％、11.38％、31.62％、37.71％、32.42％、298Cys型ヒト抗体の場合はそれぞれ8.26％、7.34％、9.23％、31.30％、53.98％、55.07％であった。
よって、ADCC活性の比（野生型ヒト抗体と変異型ヒト抗体が同一濃度である2点間における、野生型ヒト抗体に対する変異型ヒト抗体の細胞障害の割合の比）は、それぞれ286C/野生型では0.9倍、1.0倍、0.9倍、1.0倍、1.6倍、1.8倍、295C/野生型では1.2倍、0.8倍、0.9倍、1.1倍、1.4倍、1.1倍、298C/野生型では1.1倍、0.8倍、0.7倍、1.1倍、1.9倍、1.8倍となることがわかった。
また、表１２より、添加した抗体の濃度が0.001、0.01、0.1、1、10μg/mLの場合における細胞障害の割合は、野生型ヒト抗体の場合それぞれ1.29％、1.28％、1.85％、3.20％、3.11％、286Cys型ヒト抗体の場合はそれぞれ2.36％、2.68％、7.50％、33.22％、40.17％、であった。298Cys型ヒト抗体の場合はそれぞれ1.19％、3.51％、18.41％、46.16％、46.54％、であった。
よって、ADCC活性の比（野生型ヒト抗体と変異型ヒト抗体が同一濃度である2点間における、野生型ヒト抗体に対する286Cys型ヒト抗体の細胞障害の割合の比）は、それぞれ、1.8 倍、2.1倍、4.1倍、10.4倍、12.9倍、となることがわかった。野生型ヒト抗体に対する298Cys型ヒト抗体の細胞障害の割合の比）は、それぞれ、0.9倍、2.7倍、10.0倍、14.4倍、15.0倍、となることがわかった。
【０１５５】
表１１に示す実験結果と、表１２に示す実験結果では、抗体クローンは同一だが、血中のエフェクター細胞を提供した者が異なっているため、表１２に示した野生型の抗体では、ADCC活性がほとんど見られない。
ところが、驚くべきことに、このADCC活性がほとんど見られない野生型の抗体に対し、286Cys変異、または、298Cys変異を導入した結果、ADCC活性は、同一の濃度の抗体を滴加したにもかかわらず、１０倍から１５倍となった。
【０１５６】
また表１１より、野生型ヒト抗体と286型ヒト抗体との間で細胞障害の割合が同程度である2点を選択し、ADCC活性の比較を試みた。例えば、野生型ヒト抗体は10μg/mLで約30％、286型及び298型ヒト抗体は0.1μg/mLで約31％の細胞障害を示している。この2点を用いて比較した場合、同じADCC活性を得るために必要な抗体濃度が約100分の1に減少した。このことから、ADCC活性が約100倍上昇した（野生型ヒト抗体と286型、または298型ヒト抗体が同一の細胞障害の割合を示す2点間における、野生型ヒト抗体に対する型ヒト抗体の濃度の比が100倍になった）と判断することが出来る。
【０１５７】
また表１２より、野生型ヒト抗体と298型ヒト抗体との間で細胞障害の割合が同程度である2点を選択し、ADCC活性の比較を試みた。例えば、野生型ヒト抗体は10μg/mLで約3
％、298型ヒト抗体は0.01μg/mLで約３％の細胞障害を示している。この2点を用いて比較した場合、同じADCC活性を得るために必要な抗体濃度が約1000分の1に減少した。このことから、ADCC活性が約1000倍上昇した（野生型ヒト抗体と298型ヒト抗体が同一の細胞障害の割合を示す2点間における、野生型ヒト抗体に対する298型ヒト抗体の濃度の比が1/1000倍になった）と判断することが出来る。
また表１２より、野生型ヒト抗体と298型ヒト抗体との間で細胞障害の割合が同程度である2点を選択し、ADCC活性の比較を試みた。例えば、野生型ヒト抗体は10μg/mLで約3
％、286型ヒト抗体は0.01μg/mLで約2％の細胞障害を示している。この2点を用いて比較した場合、同じADCC活性を得るために必要な抗体濃度が約1000分の1に減少した。このことから、ADCC活性が約1000倍上昇した（野生型ヒト抗体と286型ヒト抗体が同一の細胞障害の割合を示す2点間における、野生型ヒト抗体に対する286型ヒト抗体の濃度の比が1/1000倍になった）と判断することが出来る。
当業者であれば、上記の方法に倣い、図および表よりADCC活性の上昇を算出することが可能である。
【０１５８】
〔実施例５〕
実施例１と同様の方法で、野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型のAnti-EGFR（048-006）抗体を作製し、これら各種変異型のAnti-EGFR（048-006）ヒト抗体を用いてin vivoでの抗腫瘍効果を評価した。
以下に、Anti-EGFR（048-085）ヒト抗体の野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型の作製方法ならびにその抗腫瘍効果測定およびEGFR分子に対する反応性を記載する。
【０１５９】
1）Anti-EGFR（048-006）抗体の作製
ヒト抗体は、以下のA)〜E)の工程を経て、精製ヒト抗体として得られる。
A) Fc領域遺伝子の変異導入、
B) Fc領域および変異導入したFc領域遺伝子を組み合わせたヒト抗体発現ベクターの構築、 
C) ヒト抗体発現ベクターのCHO細胞への遺伝子導入とヒト抗体を高発現するCHO細胞のスクリーニング、
D) ヒト抗体高発現CHO細胞の培養、
E) ヒト抗体高発現細胞の培養上清からのカラム精製。
以下にA)〜E)の工程を順に記載する。
これらの工程のうち、A),B),D),E)は実施例１と同様である。従って本実施例では、工程C)について説明する。
【０１６０】
ヒト抗体を作製するためには、4種の遺伝子が必要になる。この4種の遺伝子は、ヒト抗体L鎖可変領域遺伝子、ヒト抗体H鎖可変領域遺伝子、ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子、ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子である。EGFRを認識する抗体クローンであるAnti-EGFR（048-006）のL鎖可変領域および定常領域遺伝子、H鎖可変領域および定常領域遺伝子は抗体研究所（株）から提供された。提供されたAnti-EGFR（048-006）のヒトL鎖可変領域のDNA配列を図９（配列番号：１６０）に、ヒトH鎖可変領域のDNA配列を図１０（配列番号：１６２）に示す。
また、Anti-EGFR（048-006）のヒトL鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の塩基配列を配列番号：７５〜７７に示す。また、Anti-EGFR（048-006）のヒトL鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：７８〜８０に示す。提供されたヒトIgG1 L鎖定常領域の遺伝子はλ鎖で、その塩基配列を配列番号：８１に、アミノ酸配列を配列番号：８２に示す。
また、Anti-EGFR（048-006）のヒトH鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の塩基配列を配列番号：８３〜８５に示す。また、Anti-EGFR（048-006）のヒトH鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列を配列番号：８６〜８８に示す。提供されたヒトIgG1 H鎖定常領域の塩基配列およびアミノ酸配列は、Anti-ALCAM（066-174）と同一である。
【０１６１】
C)クローニングされた遺伝子及びその変異導入した遺伝子を組み合わせたヒト抗体発現ベクターの構築
Anti-EGFR（048-006）ヒト抗体を発現させるには、Anti-EGFR（048-006）ヒト抗体のL鎖とH鎖の2種類の発現ベクターをCHO細胞にTransfectionさせることで達成される。ここで、 Anti-EGFR（048-006）ヒト抗体のL鎖の発現ベクターとは、Anti-EGFR（048-006）L鎖可変領域遺伝子+ ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものであり、 Anti-EGFR（048-006）のH鎖の発現ベクターとは、Anti-EGFR（048-006）H鎖可変領域遺伝子+ ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものである。野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型のAnti-EGFR（048-006）抗体を作製するにあたり、Anti-EGFR（048-006）ヒト抗体のL鎖の発現ベクターは、これら4種のヒト抗体を発現させるために共通に使用するものであるが、Anti-EGFR（048-006）ヒト抗体のH鎖の発現ベクターは、野生型、286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型ヒト抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターを必要とする。ここでは、はじめに各ヒト抗体の発現に共通に使用できるAnti-EGFR（048-006）ヒト抗体L鎖の発現ベクターの構築について詳細を記述し、その後に286Cys型、295Cys型あるいは298Cys型ヒト抗体の発現に必要な専用のAnti-EGFR（048-006）ヒト抗体H鎖発現ベクターの構築について記述する。
【０１６２】
Anti-EGFR（048-006）ヒト抗体L鎖の発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMG-neoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-EGFR（048-006）ヒトL鎖可変領域遺伝子+ヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-EGFR（048-006）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子は、抗体研究所かた提供されたAnti-EGFR（048-006）L鎖遺伝子を鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。
【０１６３】
Anti-EGFR（048-006）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子の増幅反応
Anti-EGFR（048-006）L鎖(25 ng/μL)            2 μL
2.5 mM dNTPs                                   4 μL
EGFR-L1 primer(20μM)                        2.5 μL
EGFR-L2 primer(20μM)                        2.5 μL 
DMSO                                         2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer                     5 μL 
pfu polymerase                                 1 μL
滅菌水                                      30.5 μL 
total                                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
EGFR-L1 primer：ACCGCTCGAGATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC（配列番号：２５）
EGFR-L2 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTACGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT（配列番号：２６）
【０１６４】
上記のPCR反応で得られたAnti-EGFR(048-006)ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）と制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMG-neoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti- EGFR（048-006）ヒトL鎖可変領域およびヒトIgG1 L鎖定常領域遺伝子断片を混同してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti- EGFR（048-006）ヒト抗体L鎖の発現ベクターは、pヒト EGFR（048-006）LCと名前が付けられた。
【０１６５】
Anti-EGFR（048-006）ヒト抗体H鎖発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMG-neoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-EGFR（048-006）ヒトH鎖可変領域遺伝子+ HヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-EGFR（048-006）ヒトH鎖可変領域遺伝子は、抗体研究所かた提供されたAnti-EGFR（048-006）H鎖遺伝子を鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。
野生型、286Cys型、295Cys型あるいは295Cys型ヒト抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターは、ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子をPCR増幅させる際の鋳型となるプラスミドは異なるが、操作自体は全く同様に行われて各種ヒトIgG1 H鎖遺伝子断片を得た。以下にPCR反応を含む詳細を記述する。
【０１６６】
Anti-EGFR（048-006）ヒト抗体H鎖可変領域遺伝子の増幅反応
Anti-EGFR（048-006）(25 ng/μL)           2 μL
2.5 mM dNTPs                               4 μL
EGFR-H1 primer(20μM)                    2.5 μL
EGFR-H2 primer(20μM)                    2.5 μL 
DMSO                                     2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer                 5 μL 
pfu polymerase                             1 μL
滅菌水                                  30.5 μL 
total                                     50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
EGFR-H1 primer：ACCGCTCGAGATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTC（配列番号：２７）
EGFR-H2 primer：CGAGACGGTGACCATTGTCCCTTG (5’-リン酸化されている)（配列番号：８９）
【０１６７】
ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子の増幅反応
＃各種鋳型プラスミド (20 ng/μL)  2 μL
2.5 mM dNTPs                      4 μL
H3 primer(20μM)                  2.5 μL
H4 primer(20μM)                  2.5 μL 
DMSO                              2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer        5 μL 
pfu polymerase                    1 μL
滅菌水                            30.5 μL 
total                             50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
H3 primer：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC(5’-リン酸化されている)（配列番号：２９）
H4 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT（配列番号：３０）
【０１６８】
野生型のAnti-EGFR（048-006）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためには、pCR2.1-HC(野生型)を鋳型として用いた。286Cys型のAnti-EGFR（048-006）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(286Cys)を鋳型として用いた。295Cys型のAnti- EGFR（048-006）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(295Cys)を鋳型として用いた。298Cys型のAnti- EGFR（048-006）ヒト抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(298Cys)を鋳型として用いた。
【０１６９】
上記のPCR反応で得られたAnti-EGFR（048-006）H鎖可変領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）で切断されてから精製した。また、鋳型の異なる各種PCR反応で得られたヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMG-neoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti- EGFR（048-006）H鎖可変領域遺伝子断片と精製ヒトIgG1 H鎖定常領域遺伝子断片を混合してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti- EGFR（048-006）ヒト抗体H鎖の発現ベクターは、pヒト EGFR（048-006）HC(野生型)、pヒト EGFR（048-006）HC(286Cys型)、pヒト EGFR（048-006）HC（295Cys）あるいはpヒトEGFR（048-006）HC(298Cys型)とそれぞれ名前が付けられた。
【０１７０】
次に、癌細胞移植マウスを用いて、作製した抗体がin vivoで抗腫瘍活性を示すか否かを確認した。
使用した動物及び細胞株
4週齢の雌BALB/cヌードマウス（日本チャールス・リバー（株））を１週間馴化飼育したのちに実験に用いた。飼育はSPF環境下でおこない、滅菌した水と飼料を与えた。
ヒト腎癌細胞CCF-RC-1は37℃、5%CO2存在下、10%FBS含有RPMI1640培地にて培養維持継代したものを用いた。
抗腫瘍実験の方法
ヌードマウス側背部皮下にヒト腎癌細胞CCF-RC-1細胞を1×107個移植し、5日後より抗体の投与を開始した。腫瘍径および体重は週2回計測し、推定腫瘍体積をＷ＝ａ×ｂ２／２（Ｗ：推定腫瘍体積(mm3)、ａ：長径(mm)、ｂ：短径(mm)）の式より求めた。実験群は、コントロール群（PBS投与）と048-006 (286C)IgG投与群（0.1mgおよび0.5mg/個体）、048-006(295C) IgG投与群（0.1mgおよび0.5mg/個体）、048-006 IgG(298C)投与群（0.1mgおよび0.5mg/個体）、048-006(wild) IgG投与群（0.1mg/個体）の4群または5群とし、投与経路は腹腔内投与とした。週２回のペースで6回投与し、その抗腫瘍効果を検討した。
【０１７１】
0.5mg/個体投与群の結果
通常、マウスに移植された腫瘍の体積は、細胞塊として成長するために血管形成などが必要となり、直線状ではなく、指数関数状の増殖を示す。本実施例でも、PBS投与群では、15day-19dayにおいて、380.53（mm3）から718.20（mm3）（1.88倍）へと大幅な増加が観察される。しかし、298Cys型抗体を投与したマウスでは、腫瘍体積が、15day-19dayにおいて、294.02（mm3）から291.76（mm3）（0.99倍）と減少し、増殖の抑制が顕著に観察される。また、286Cys型抗体を投与した群では、初回（5day-8day）の投与によって、腫瘍体積が、75.3（mm3）から、34.76（mm3）へ６５％もの体積の減少が見られた。このことは、286Cys型抗体の有用性を示すものである。
次に、投与後１９日の体積を比較すると、PBS群、286Cys型抗体投与群、298Cys型抗体投与群、295Cys型抗体投与群では、それぞれ体積が718.20（mm3）、400.69（mm3）、291.76（mm3）、532.67（mm3）となっている。286Cys型抗体投与群、298Cys型抗体投与群、295Cys型抗体投与群を、PBS群と体積比で比較すると、56％、41％、74％に抑制され、各種変異抗体の腫瘍の増殖抑制効果は顕著である。
【表１３】
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【０１７２】
0.1mg/個体投与群の結果
投与後１９日の体積を比較すると、807.8（mm3）、577.1（mm3）、477.0（mm3）、721.3（mm3）、718.2（mm3）となっている。286Cys型抗体投与群、298Cys型抗体投与群、295Cys型抗体投与群、野生型抗体投与群を、PBS群と体積比で比較すると、80％、66％、112％、100％ に抑制された。286Cys型抗体投与群、298Cys型抗体投与群で顕著な効果が得られた。
【表１４】
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【０１７３】
〔実施例６〕
＜精製された各種ヒト抗体のフローサイト分析＞
カラム精製により得られた各種ヒト抗体のALCAM分子への反応性が同一であることを確かめるために、フローサイト分析が行われた。H1373細胞は、その細胞膜表面に多数のALCAM分子を持つことが知られている。このフローサイト分析は、H1373細胞上のALCAM分子を各種Anti-ALCAMヒト抗体が認識できるかどうかについて検証された。以下に、測定方法を詳細に記述する。
１）10％のFetal Bovine Serum補足したRPMI-1640 (Sigma, R8758)培地で培養したH1373細胞10mL(細胞数：2×107個)を遠心分離（1200 rpm, 5 min）して、その上清を除去して、H1373細胞ペレットを取り出した。
２）H1373細胞ペレットにWash Buffer (PBS+10％FCS) 10 mLを加えて懸濁し、再び遠心分離（1200 rpm, 5 min）してから、上清を除去した。
３）H1373細胞ペレットを2mLのWash Bufferで懸濁してから、各チューブへ0.3mLずつ細胞懸濁液を入れ、各チューブにさらに0.5 mLのWash Bufferを加えて懸濁した後、遠心分離（2000 rpm, 5 min）して上清を捨てた。
４）H1373細胞ペレットに、各種精製Anti-ALCAMヒト抗体を5μLを加えて、30分間室温で反応させた。
（i）Wash Buffer 1 mLを加えて懸濁した後、遠心分離（2000 rpm, 5 min）して上清を捨てた。
（ii）H1373細胞に、Wash Bufferで50倍希釈したAnti-Human IgG(γ-chain) FITC conjugated (MBL, code 214)を30μL加えて、15分間室温で反応させた。
（iii）Wash Buffer 1 mLを加えて懸濁した後、遠心分離（2000 rpm, 5 min）して上清を捨てた。
（iv）H1373細胞ペレットにWash Buffer 0.5 mLを加えて懸濁し、フローサイト分析をFACS  Calibur (Becton Dickinson)で行った。
以上のフローサイト分析結果を図１７に示す。この結果より、野生型ヒト抗体及び２種類のCys型ヒト抗体のALCAMへの反応性は同じであることがわかる。
上記と同様に、抗ICAM1抗体、及び抗EGFR抗体についても、抗原との反応性に変化がないことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
本発明により、ADCC活性が増強された抗体及びその製造方法が提供された。lactate dehydrogenase release assay系で評価したADCC活性に関して、本発明の抗体は、野生型抗体と比較し、ADCC活性が上昇した（野生型抗体と変異型抗体が同一濃度である2点間における、野生型抗体に対する変異型抗体の細胞障害の割合の比が上昇した）。従って、本発明の変異型抗体を用いることによって、野生型抗体と比較して、より多くの細胞障害を引き起こすことが出来る。
また本発明の抗体は、特に低濃度において、ADCC活性が上昇した（野生型抗体と変異型抗体が同一の細胞障害の割合を示す2点間における、野生型抗体に対する変異型抗体の濃度の比が上昇した）。従って、本発明の抗体を治療抗体として用いることによって、単位質量あたりの癌細胞などへの治療効果を上昇させることが可能である。また本発明の抗体を用いれば、患者への1回あたりの投薬量を低減させることができるため、投薬費を低減することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】Anti-ALCAM（066-174）抗体のL鎖可変領域遺伝子の配列を示す図である。
【図２】Anti-ALCAM（066-174）抗体のH鎖可変領域遺伝子の配列を示す図である。
【図３】Anti-ALCAM（035-234）抗体のL鎖可変領域遺伝子の配列を示す図である。
【図４】Anti-ALCAM（035-234）抗体のH鎖可変領域遺伝子の配列を示す図である。
【図５】Anti-ICAM1（053-059）抗体のL鎖可変領域遺伝子の配列を示す図である。
【図６】Anti-ICAM1（053-059）抗体のH鎖可変領域遺伝子の配列を示す図である。
【図７】Anti-ICAM1（053-085）抗体のL鎖可変領域遺伝子の配列を示す図である。
【図８】Anti-ICAM1（053-085）抗体のH鎖可変領域遺伝子の配列を示す図である。
【図９】Anti-EGFR（048-006）抗体のL鎖可変領域遺伝子の配列を示す図である。
【図１０】Anti-EGFR（048-006）抗体のH鎖可変領域遺伝子の配列を示す図である。
【図１１】野生型、295Cys、298CysのAnti-ALCAM（066-174）ヒト抗体のADCC活性結果を示す図である。
【図１２】野生型、286Cys、295Cys、298CysのAnti-ALCAM（035-234）ヒト抗体のADCC活性結果を示す図である。
【図１３】野生型、286Cys、295Cys、298CysのAnti-ICAM1（053-059）ヒト抗体のADCC活性結果を示す図である。
【図１４】野生型、286Cys、295Cys、298CysのAnti-ICAM1（053-085）ヒト抗体のADCC活性結果を示す図である。
【図１５】野生型、286Cys、298CysのAnti-ICAM1（053-085）ヒト抗体のADCC活性結果を示す図である。
【図１６】286Cys、295Cys、298CysのAnti-EGFR（048-006）ヒト抗体のin vivoでの抗腫瘍効果を示す図である。（Ａ）は0.5mg/個体投与群の結果であり、（Ｂ）は0.1mg/個体投与群の結果である。
【図１７】フローサイトの結果を示す図である。（Ａ）ALCAM 066-174、（Ｂ）ALCAM 035-234、（Ｃ）ICAM1 053-059）、（Ｄ）ICAM1 053-085、に関する結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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