(57)【要約】【課題】多種多様な標的塩基配列を増幅する場合において、必要な標的塩基配列のみを過不足無く増幅することができるプライマーキットの提供。【解決手段】全ての種類のプライマーが、同一の反応条件において、それぞれの標的塩基配列を有する核酸を増幅し得るプライマーであり、少なくとも１の容器には、単一種類のプライマー又は１の標的塩基配列に対応するプライマーが収容されていることを特徴とする複数種類の標的塩基配列を有する核酸を増幅するための複数種類のプライマーを有するプライマーキット、及び、全ての種類のプライマーが、同一の反応条件において、それぞれの標的塩基配列を有する核酸を増幅し得るプライマーであり、１の標的塩基配列に対応するプライマーは、同一の容器に収容されていることを特徴とする複数種類の標的塩基配列を有する核酸を増幅するための複数種類のプライマーを有するプライマーキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類の標的塩基配列を有する核酸を増幅するための複数種類のプライマーを有するキットであって、
全ての種類のプライマーが、同一の反応条件において、それぞれの標的塩基配列を有する核酸を増幅し得るプライマーであり、
少なくとも１の容器には、単一種類のプライマー又は１の標的塩基配列に対応するプライマーが収容されていることを特徴とするプライマーキット。
【請求項２】
１の容器には、１の標的塩基配列に対応するプライマーが収容されていることを特徴とする請求項１記載のプライマーキット。
【請求項３】
１の容器には、単一種類のプライマーが収容されていることを特徴とする請求項１記載のプライマーキット。
【請求項４】
複数種類の標的塩基配列を有する核酸を増幅するための複数種類のプライマーを有するキットであって、
全ての種類のプライマーが、同一の反応条件において、それぞれの標的塩基配列を有する核酸を増幅し得るプライマーであり、
１の標的塩基配列に対応するプライマーは、同一の容器に収容されていることを特徴とするプライマーキット。
【請求項５】
前記増幅が、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）による増幅であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のプライマーキット。
【請求項６】
前記プライマーの塩基長が３０塩基以上であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のプライマーキット。
【請求項７】
前記反応条件が、アニーリング時間と伸長反応時間の和が３分間以上であることを特徴とする請求項５又は６記載のプライマーキット。
【請求項８】
前記反応条件が、変性温度、アニーリング温度、伸長反応温度の全てが６８℃以上であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか記載のプライマーキット。
【請求項９】
前記反応条件が、アニーリング温度と伸長反応温度が同一であることを特徴とする請求項８記載のプライマーキット。
【請求項１０】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む請求項５〜９のいずれか記載のプライマーキット。
【請求項１１】
反応用緩衝液を含む請求項５〜１０のいずれか記載のプライマーキット。
【請求項１２】
標的塩基配列と、前記標的塩基配列を有する核酸の増幅に用いられるプライマーの組み合わせが記載されている表が添付されている請求項１〜１１のいずれか記載のプライマーキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種類の標的塩基配列を有する核酸の増幅に用いられ、反応条件が標準化された複数種類のプライマーを有するプライマーキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分析による遺伝子解析は、主に、特有の塩基配列を認識し、検体中に該塩基配列を有する核酸が存在するか否かを検出することにより行われる。このような遺伝子解析は、遺伝子操作技術や遺伝子組換え技術等の進歩に伴い、医療、学術研究、産業等の多くの分野において広く応用されている。例えば、遺伝病、癌、感染症、生活習慣病等の疾患の診断、治療に応用されており、食肉や穀物等の食品検査においても用いられている。
【０００３】
臨床検査における検体等のように、検体が微量である場合や、試料中の核酸濃度が非常に低い場合には、解析対象となる標的塩基配列を有する核酸を増幅した後に解析を行うことが多い。このような塩基配列の増幅には、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）法が最も一般的に用いられている。ＰＣＲ法は、解析の目的である標的塩基配列を挟んだ２種類のプライマーとＤＮＡポリメラーゼを用いて、該標的塩基配列を指数関数的に増幅し得る方法である。ＰＣＲ法は基本的に、（１）変性工程、（２）アニーリング工程、及び（３）伸長工程の３つの工程１サイクルとし、該サイクルを繰り返すことにより特定の標的塩基配列を増幅していく（例えば、特許文献１参照。）。ＰＣＲでは、デオキシヌクレオチド三リン酸の存在下、耐熱性ポリメラーゼによって、標的塩基配列を有する核酸を、数回のサイクルで検出可能なレベルまで選択的に増幅することができる。
【０００４】
このようなＰＣＲ法では、非特異的な核酸増幅を防止するために、プライマーが標的塩基配列以外にアニールするミスアニーリングや、プライマー同士がアニールすることによるプライマー二量体の形成等が生じ難いプライマーを用いることが好ましい。このため、プライマー設計が非常に重要であり、多くのプライマー設計ソフトが開発されている。しかしながら、これらのプライマー設計ソフトを用いた場合でも、設計の成功率、すなわち、非特異的核酸増幅を防止しつつ、標的である核酸を選択的かつ効率よく増幅し得るプライマーを設計し得る確率は、約７割程度であり、増幅効率を改善するために、それぞれのプライマーごとに塩濃度、反応温度、酵素濃度等の反応条件を最適化することが必要とされている。この結果、従来のＰＣＲキットでは、標的塩基配列ごとに反応条件が最適化されているため、混合して用いることができず、標的塩基配列が複数ある場合には、標的塩基配列ごとに別個にＰＣＲを行う必要があった。
【０００５】
一方で、疾患の診断等のための臨床検査においては、薬剤代謝能等の多くの検体で測定することが要求される検査項目もあるが、特定の疾患関連因子の検出等の検体ごとに測定の必要性が非常に異なる検査項目も多い。このため、一般的には、検体ごとに要求される検査項目が異なる。特に、遺伝子検査においては、検査項目が異なると標的塩基配列も異なることから、１の検体に対して、検査項目の数だけ別個にＰＣＲを行う必要があり、低コスト化やスループットの向上が困難であった。
【０００６】
このような場合に、マルチプレックスＰＣＲを適用することにより、スループットの向上を図ることができる。マルチプレックスＰＣＲでは、通常のＰＣＲとは異なり、１つの反応容器に、複数種類のプライマーセットを用いて、複数種類の標的塩基配列の増幅を行う。この手法により、多種類の検査項目に要するＰＣＲを一度に行うことが可能となる。
【特許文献１】特公平４−６７９６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
通常、複数種類の標的塩基配列に対するマルチプレックスＰＣＲを行うためのプライマー群を有するキットでは、これらのプライマー群を１の反応溶液中に用いてＰＣＲを行った場合にそれぞれの標的塩基配列を有する核酸が良好に増幅されることを目的として、プライマー設計や反応条件の最適化が行われている。特に、従来のマルチプレックスＰＣＲでは、各プライマーの濃度を調整することにより、増幅効率の均一化を図るものが多く、マルチプレックスＰＣＲキット中のプライマー群から、必要なプライマーを自由に選択して用いることは非常に困難である。このため、近年、遺伝子情報は重大な個人情報と捕らえられているにもかかわらず、マルチプレックスＰＣＲキットのプライマー群に検査に不必要な標的塩基配列を増幅するためのプライマーが含まれている場合には、不要な遺伝子情報までも検出してしまう、という問題があった。
【０００８】
また、マルチプレックスＰＣＲでは、それぞれのＰＣＲ産物量が、増幅する標的塩基配列の数に応じて減少する傾向があり、ＰＣＲ産物の測定方法の感度が低い場合には、標的塩基配列数によっては検出に充分な量のＰＣＲ産物が得られず、検査が困難になるという問題もあった。
【０００９】
本発明は、多種多様な標的塩基配列を増幅する場合において、必要な標的塩基配列のみを過不足無く増幅しつつ、スループットを向上させ、コストを低減することができるプライマーキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、マルチプレックスＰＣＲに用いることができるプライマー群において、該プライマー群を構成する全てのプライマーが、反応条件が標準化されたものであり、必要に応じて自由に取捨選択し得るように適当に分離保存されているものであれば、検体ごとに必要なプライマーを組み換えて使用することができるため、不要な遺伝情報の検出を回避し得ること、及び、いずれの組み合わせのプライマーを用いる場合であっても、同一の条件で増幅反応を行うことができるため、低コスト化及びスループットの向上が図れることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、複数種類の標的塩基配列を有する核酸を増幅するための複数種類のプライマーを有するキットであって、全ての種類のプライマーが、同一の反応条件において、それぞれの標的塩基配列を有する核酸を増幅し得るプライマーであり、少なくとも１の容器には、単一種類のプライマー又は１の標的塩基配列に対応するプライマーが収容されていることを特徴とするプライマーキットを提供するものである。
また、本発明は、１の容器には、１の標的塩基配列に対応するプライマーが収容されていることを特徴とするプライマーキットを提供するものである。
また、本発明は、１の容器には、単一種類のプライマーが収容されていることを特徴とするプライマーキットを提供するものである。
また、本発明は、複数種類の標的塩基配列を有する核酸を増幅するための複数種類のプライマーを有するキットであって、全ての種類のプライマーが、同一の反応条件において、それぞれの標的塩基配列を有する核酸を増幅し得るプライマーであり、１の標的塩基配列に対応するプライマーは、同一の容器に収容されていることを特徴とするプライマーキットを提供するものである。
また、本発明は、前記増幅が、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）による増幅であることを特徴とするプライマーキットを提供するものである。
また、本発明は、前記プライマーの塩基長が３０塩基以上であることを特徴とするプライマーキットを提供するものである。
また、本発明は、前記反応条件が、アニーリング時間と伸長反応時間の和が３分間以上であることを特徴とするプライマーキットを提供するものである。
また、本発明は、前記反応条件が、変性温度、アニーリング温度、伸長反応温度の全てが６８℃以上であることを特徴とするプライマーキットを提供するものである。
また、本発明は、前記反応条件が、アニーリング温度と伸長反応温度が同一であることを特徴とするプライマーキットを提供するものである。
また、本発明は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む前記いずれか記載のプライマーキットを提供するものである。
また、本発明は、反応用緩衝液を含む前記いずれか記載のプライマーキットを提供するものである。
また、本発明は、標的塩基配列と、前記標的塩基配列を有する核酸の増幅に用いられるプライマーの組み合わせが記載されている表が添付されているプライマーキットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のプライマーキットを用いることにより、検体ごとに必要なプライマーを自由に組み換えて使用することが可能となる。このため、検体ごとにそれぞれ異なる検査項目が要求される遺伝子検査等においても、不要な遺伝情報の検出を回避しつつ、必要な標的塩基配列のみを過不足なく増幅することができる。また、各プライマーの反応条件が標準化されているため、いずれの組み合わせのプライマーを用いた場合であっても、同一の反応条件で、それぞれの標的塩基配列を効率よく増幅することができる。したがって、本発明のプライマーキットを用いることにより、検査項目が異なる複数の検体を検査する場合であっても、必要に応じたプライマーセットの組み換えと、同一反応条件における検査により、検査全体の低コスト化とスループットの向上を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明における標的塩基配列とは、増幅反応の対象となる塩基配列であって、遺伝子組換え技術等により増幅が可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列であってもよく、ｍＲＮＡ等の生物のＲＮＡに存在する塩基配列であってもよい。
【００１４】
本発明における標的塩基配列を有する核酸（以下、標的核酸ということがある。）は、標的塩基配列を有しており、核酸増幅における鋳型となり得る核酸であれば、特に限定されるものではない。例えば、血液や体液等の生体試料（検体）中に含有される核酸や、これらの生体試料等から抽出された核酸であってもよく、これらの核酸を鋳型として増幅された核酸であってもよい。また、生体試料中に含有されるＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡであってもよい。
【００１５】
本発明において、核酸を増幅する方法は、プライマーと標的核酸とがハイブリダイゼーションすることを利用する方法であれば、特に限定するものではなく、遺伝子解析等の分野で通常行われている種々の核酸増幅方法を用いることができる。核酸増幅の精度が高く、かつ汎用されているために、本発明のプライマーキットは、ＰＣＲにより核酸を増幅するためのプライマーキットであることがより好ましい。
【００１６】
本発明のプライマーキットは、複数種類の標的核酸を増幅するための複数種類のプライマーを有するキットであって、全ての種類のプライマーが、同一の反応条件において、それぞれの標的核酸を増幅し得るプライマーであり、少なくとも１の容器には、単一種類のプライマー又は１の標的塩基配列に対応するプライマーが収容されていることを特徴とする。プライマーキットに含まれるプライマー群が、全て混合された状態で保存されているのではなく、一部又は全部の種類のプライマーが容器により分離された状態で保存されていることにより、プライマー群の中から、プライマーを選択して増幅反応に用いることができる。
【００１７】
本発明のプライマーキットにおいて、プライマーは容器に収容されているが、その収容の形態は、単一種類のプライマー又は１の標的塩基配列に対応するプライマーが収容されている容器が少なくとも１存在している限り、特に限定されるものではなく、それぞれのプライマーが組み合わせて使用される頻度等を考慮して、適宜容器に収容することができる。ここで、「１の標的塩基配列に対応するプライマー」とは、１の標的塩基配列の増幅に必要なものであって、該標的塩基配列を有する核酸又は該標的塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸にハイブリダイズすることが可能なプライマーを意味する。具体的には、標的核酸の増幅がＰＣＲにより行われる場合には、ＰＣＲにより標的核酸を増幅し得るフォワードプライマーとリバースプライマーを意味する。
【００１８】
例えば、本発明のプライマーキットの全ての容器において、１の容器には、１の標的塩基配列に対応するプライマーが収容されていてもよく、単一種類のプライマーが収容されていてもよい。１の容器に１の標的塩基配列に対応するプライマーが収容されている場合には、一度の分注操作で、各標的核酸を増幅するためのプライマーを反応溶液に添加することができるため、操作を簡便にすることができる。一方、１の容器に単一種類のプライマーが収容されている場合には、プライマーの組み合わせの自由度を最大限に高くすることができる。
【００１９】
例えば、標的塩基配列Ｎ１に対応するプライマーがフォワードプライマーＦ１とリバースプライマーＲ１であり、標的塩基配列Ｎ２に対応するプライマーがフォワードプライマーＦ２とリバースプライマーＲ２であり、標的塩基配列Ｎ３に対応するプライマーがフォワードプライマーＦ３とリバースプライマーＲ３であり、標的塩基配列Ｎ４に対応するプライマーがフォワードプライマーＦ４とリバースプライマーＲ４である場合に、フォワードプライマーＦ１とリバースプライマーＲ１を１の容器に、フォワードプライマーＦ２とリバースプライマーＲ２を他の１の容器に、フォワードプライマーＦ３とリバースプライマーＲ３をまた他の１の容器に、フォワードプライマーＦ４とリバースプライマーＲ４をさらに他の１の容器に、それぞれ収容することができる。
【００２０】
また、標的塩基配列Ｎ１に対応するプライマーがフォワードプライマーＦ１とリバースプライマーＲ１であり、標的塩基配列Ｎ２に対応するプライマーがフォワードプライマーＦ１とリバースプライマーＲ２であり、標的塩基配列Ｎ３に対応するプライマーがフォワードプライマーＦ３とリバースプライマーＲ２であり、標的塩基配列Ｎ４に対応するプライマーがフォワードプライマーＦ１とリバースプライマーＲ４である場合に、各プライマーをそれぞれ別個の８個の容器に収容することができる。
【００２１】
本発明のプライマーキットは、複数種類の標的核酸を増幅するための複数種類のプライマーを有するキットであって、全ての種類のプライマーが、同一の反応条件において、それぞれの標的核酸を増幅し得るプライマーであり、１の標的塩基配列に対応するプライマーは、同一の容器に収容されていることを特徴とするものであってもよい。例えば、標的塩基配列Ｎ１とＮ２が、多くの検体で検出することが要求されるものであり、標的塩基配列Ｎ３とＮ４が、検体ごとに検出の要求度が異なるものである場合には、標的塩基配列Ｎ１に対応するプライマーと標的塩基配列Ｎ２に対応するプライマーを１の容器に、標的塩基配列Ｎ３に対応するプライマーを他の１の容器に、標的塩基配列Ｎ４に対応するプライマーをさらに他の１の容器にそれぞれ収容することにより、必要なプライマー選択の自由度を維持しつつ、分注操作の煩雑さを低減することができる。また、標的塩基配列Ｎ１とＮ２を同時に検出する頻度が高く、標的塩基配列Ｎ３とＮ４を同時に検出する頻度も高い場合には、標的塩基配列Ｎ１に対応するプライマーと標的塩基配列Ｎ２に対応するプライマーを１の容器に、標的塩基配列Ｎ３に対応するプライマーと標的塩基配列Ｎ４に対応するプライマーを他の１の容器にそれぞれ収容してもよい。
【００２２】
本発明において、プライマーが収容されている容器は、核酸を分離して収容し保存することができる容器であれば、特に限定されるものではなく、例えば、０．６ｍＬチューブや１．５ｍＬチューブ等の遺伝子組換え技術等の分野において通常核酸の収容に使用されているものを用いることができる。また、各容器は、収容したプライマーを分離した状態で維持できるものであればよく、各容器自体が別個独立した容器である必要はない。例えば、ＰＣＲ等で汎用されているキャップ付８連チューブやキャップ付１２連チューブであってもよい。
【００２３】
本発明において、容器に収容されているプライマーは、凍結乾燥されたものであってもよく、超純水やＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ）バッファー等の適当な緩衝液に溶解した状態であってもよい。
【００２４】
本発明のプライマーキットを構成するプライマーは、全て、同一の反応条件において、それぞれの標的塩基配列を有する核酸を増幅し得るものである。ここで、反応条件とは、反応溶液中に添加する検体やプライマーの量、反応用緩衝液の組成、反応温度、反応時間等の、標的核酸の増幅反応における諸条件をいう。例えば、標的核酸の増幅がＰＣＲにより行われる場合には、塩濃度等の反応用緩衝液の組成、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの種類、検体やプライマーの添加量、変性・アニーリング・伸長の各工程における温度と時間、サイクル数等の条件が同一であることを意味する。
【００２５】
ここで、プライマーの添加量とは、反応溶液中に添加される全種類のプライマーの総量を意味する。つまり、例えば、プライマーの添加量が１０μＭであり、添加するプライマーが２種類である場合には、各プライマーを５μＭずつ添加すればよく、添加するプライマーが１０種類である場合には、各プライマーを１μＭずつ添加すればよい。
【００２６】
すなわち、本発明のプライマーキットを構成するプライマーは、反応条件が同一であれば、同時に添加されるプライマーがいかなる種類のものであっても、反応溶液中に存在する標的核酸を増幅することができる。このため、本発明のプライマーキットが有する複数種類のプライマーの中から、必要なプライマーを自由に選択して組み合わせた場合であっても、反応条件を変えることなく、それぞれ標的核酸を効率よく増幅することができる。
【００２７】
本発明のプライマーキットは、マルチプレックスＰＣＲに用いてもよく、通常のＰＣＲを行ってもよい。例えば、６種類の標的核酸を検出・測定するために増幅する場合において、ＰＣＲ産物の測定方法の感度が低い場合には、標的核酸ごとに別個の反応溶液でＰＣＲを行うことにより、測定に充分なＰＣＲ産物量を得ることができる。一方、ＰＣＲ産物の測定方法の感度が高い場合や検体量が非常に微量である場合には、６種類の標的核酸に対応するプライマーを全て１の反応溶液に添加して、マルチプレックスＰＣＲを行ってもよい。
【００２８】
このような同一の反応条件でそれぞれの標的核酸を増幅し得るプライマー群は、各プライマーの反応条件を標準化することにより、得ることができる。例えば、ＰＣＲにおいては、反応条件はプライマーと鋳型となる標的核酸とのアニーリング効率に大きく影響を受けており、各プライマーのアニーリング効率をほぼ均一にすることにより、核酸増幅の反応条件を標準化することができる（例えば、特開２００６−３２０２１７号公報参照。）。
【００２９】
具体的には、プライマーの標的核酸とハイブリダイズする領域を３０塩基長以上、Ｔｍ値を７０〜１００℃としてプライマーを設計し、反応条件として、特にアニーリング時間と伸長反応時間の和を３分間以上とすることにより、アニーリング効率すなわちハイブリダイゼーション効率を９０％以上とほぼ均一にすることができる。このような条件では、標的核酸の数や標的核酸の二次構造の影響を受け難い均一な反応条件で増幅できるプライマーを設計できる可能性が非常に高くなる。塩基長を長くすることにより、プライマーの特異性も向上されるため、クロスハイブリダイゼーションが抑制され、標的核酸を特異的に増幅することができる。プライマーの標的核酸とハイブリダイズする領域の塩基長は、３０〜６０塩基であることが好ましく、３２〜５０塩基であることがより好ましく、３５〜４５塩基であることが特に好ましい。
【００３０】
通常、塩基長が長くなるほど、プライマーのＴｍ値も高くなる。このため、３０塩基長以上とすることにより、プライマーのＴｍ値が伸長温度よりも高くなる場合も多いが、アニーリング温度は、伸長温度程度であることが好ましい。伸長温度が、Ｔｍ値よりも有意に低い温度であっても、伸長温度程度でアニーリングさせることにより、標的核酸の種類にかかわらず、アニーリング効率を高くすることができると推察される。特に、アニーリング温度と伸長温度を一致させ、アニーリングと伸長反応を同時に進行させるシャトルＰＣＲを行うことが好ましい。なお、伸長温度は、用いる耐熱性ポリメラーゼの種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００３１】
また、アニーリング時間と伸長反応時間の和を３分間以上とすることにより、３０塩基長以上の長いプライマーを用いても、標的核酸の増幅効率を高くすることができる。アニーリング時間と伸長反応時間の和を長くすることにより、長いプライマーを用いた場合であっても、正確なアニーリングや伸長に必要な充分な時間が確保できるためと推察される。アニーリング時間と伸長反応時間の和は、３〜１０分間であることが好ましく、５〜１０分間であることがより好ましく、５〜８分間であることがさらに好ましく、６分間程度であることが特に好ましい。さらに、伸長時間が長いため、塩基対長が長い標的核酸であっても、充分に増幅させることができる。
【００３２】
その他、変性工程や増幅のサイクル数は、通常のＰＣＲと同様に行うことができる。また、耐熱性ポリメラーゼ、ヌクレオチド、反応用緩衝液等のＰＣＲに用いられる試薬は、特に限定されるものではなく、通常ＰＣＲを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。検体とプライマーの量も、通常用いられる量であれば、特に限定されるものではない。
【００３３】
このようなプライマーは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても設計することができる。例えば、公知のゲノム配列データと汎用されているプライマー設計ツールを用いて、簡便にプライマーを設計することができる。該プライマー設計ツールとして、例えば、Ｗｅｂ上で利用可能なＰｒｉｍｅｒ３（Ｒｏｚｅｎ, Ｓ., Ｈ.Ｊ. Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ、１９９６年、ｈｔｔｐ: //ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ.ｗｉ.ｍｉｔ.ｅｄｕ/ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ/ｏｔｈｅｒ/ｐｒｉｍｅｒ３. h t m l）や、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（ＤＮＡ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）等がある。特に反応溶液の核酸濃度や塩濃度、温度等を入力すれば、簡便にアニーリング効率を計測することができる。このようなプライマー設計ツールにより、複数のプライマー候補が得られた場合には、プライマーや標的核酸の二次構造予測等の他のパラメーターを考慮して、よりアニーリング効率が高いプライマーを選択することが好ましい。また、公知のゲノム配列データは、通常、国際的な塩基配列データベースである、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）や、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）等において入手することができる。
【００３４】
このようにして設計したプライマーは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても合成することができる。例えば、オリゴ合成メーカーに合成をされ依頼してもよく、市販の合成機を用いて独自に合成してもよい。また、各プライマーは、標的核酸とハイブリダイズする領域以外にも、標的核酸の増幅を阻害しない程度において、付加的な配列を有することができる。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列や、核酸の標識に供される配列等がある。
【００３５】
つまり、プライマーのアニーリング効率をほぼ均一化し、増幅効率のばらつきを抑制することにより、同時に複数種類の標的核酸の増幅を行うマルチプレックスＰＣＲへ応用し得るだけではなく、プライマーセットの組み換えを許容するプライマー群を作製することが可能となる。このようなプライマー群は、構成するプライマー同士の増幅効率の依存関係が抑制されているため、必要に応じて使用するプライマーセットを組み換えて用いることができる。さらに、どのような組み合わせのプライマーセットを用いた場合であっても、反応条件を調整する必要はなく、全て同一の反応条件で使用することができる。
【００３６】
また、本発明のプライマーキットを構成するプライマーは、増幅された標的核酸の検出や解析を容易にするために、標識されたものであってもよい。該標識をするための物質は、核酸の標識に用いることができるものであれば、特に限定されるものではなく、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン等がある。例えば、塩基対長が同一である複数の標的核酸を増幅する場合であっても、標識を用いて修飾されたプライマーを用いることにより、どの標的核酸であるかを識別することもできる。
【００３７】
また、本発明のプライマーキットは、プライマーに加え、核酸増幅に用いられる試薬等を有していてもよい。例えば、耐熱性ポリメラーゼを有していることが好ましく、反応用緩衝液を有していてもよい。その他、標的塩基配列と、該標的塩基配列を有する核酸の増幅に用いられるプライマーの組み合わせが記載されている表が添付されていることがより好ましい。
【実施例】
【００３８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、用いたＳＮＰの塩基配列は、東大医科学研究所の整備した日本人のＳＮＰのデータベースＪＳＮＰ（ｈｔｔｐ：//ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ/ｉｎｄｅｘ＿ｊａ.ｈｔｍｌ）から得た。
【００３９】
（実施例１）
表１に記載の日本人のＳＮＰ３〜１２を有するヒトゲノム上の塩基配列を標的塩基配列とし、これらの増幅を試みた。それぞれのアクセション番号を、表１に示す。
【００４０】
【表１】
2009055815.tif 000002
【００４１】
まず、ＳＮＰ３〜１２の各標的塩基配列をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットＰ３〜１２を有するプライマーキットを作製した。プライマーキットの各プライマーは、塩基長が３０塩基以上、Ｔｍ値が７０〜１００℃、アニーリング効率が９０％以上となるように、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰを用いて設計し、得られたプライマーを表２に示した。なお、表２中、「ｂｐ」はＰＣＲ増幅の対象である標的核酸の塩基対長を、「Ｆｗ」と「Ｒｖ」は、各ＳＮＰを含む標的塩基配列をＰＣＲ増幅するために用いられるフォワードプライマー（Ｆｗ）とリバースプライマー（Ｒｖ）を、それぞれ意味する。
【００４２】
【表２】
2009055815.tif 000003
【００４３】
１の反応溶液にプライマーセットＰ３〜１２の全てを添加して、様々な伸長時間でシャトルＰＣＲを行った。検体として、ヒトゲノムＧｅｎｏｍｅ  Ｍｉｘ（ＮｏｖａＧｅｎｅ社製）を用いた。
具体的には、１０μＬの２×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ II  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に対して、５ｎｇのＧｅｎｏｍｅ  Ｍｉｘと、プライマーセットＰ３〜１２の全種類のプライマーを最終濃度が０．１μＭとなるようにそれぞれ添加し、２０μＬの反応溶液を調製した。該反応溶液を、９４℃で２分間処理した後、９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間分間〜８分間の熱サイクルを４０サイクル行い、最後に６８℃で１０分間の伸長反応を行うことにより、ＰＣＲを行った。その後、得られた反応溶液からそれぞれ１μＬを回収して、電気泳動法により、１０種類の標的核酸が増幅されたか否かを確認した。
【００４４】
図１は、ＰＣＲ増幅後の反応溶液を電気泳動で確認したバンドパターンを示したものである。図１（ａ）はアガロースゲル電気泳動像であり、レーン上部の数値は、各反応溶液の伸長時間（分）を表している。また、図中、両端のレーンは塩基対長マーカーを泳動したものである。図１（ｂ）は伸長時間を６分間とした反応溶液を２１００ＢＩＯＡＮＡＬＹＺＥＲ（Ａｇｉｌｎｅｔ社製）で確認したバンドパターンを、縦軸をバンドの蛍光強度、横軸を泳動時間（秒）として示した図である。矢印アがＳＮＰ３、矢印イがＳＮＰ４、矢印ウがＳＮＰ５、矢印エがＳＮＰ６、矢印オがＳＮＰ７、矢印カがＳＮＰ８、矢印キがＳＮＰ９、矢印クがＳＮＰ１０、矢印ケがＳＮＰ１１、矢印コがＳＮＰ１２のバンドである。伸長時間が１．５分間以下である場合には、幾つかの標的核酸は増幅が確認できなかったが、伸長時間が３分間以上では、１０種類全ての標的核酸の増幅が確認できた。つまり、実施例１の結果から、塩基対長が３０塩基以上、Ｔｍ値が７０〜１００℃、アニーリング効率が９０％以上となるように、反応条件を標準化したプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行うことにより、全ての標的核酸を良好に増幅し得ることが明らかである。
【００４５】
（実施例２）
実施例１で用いたＳＮＰ３〜１２に、さらに８６種類のＳＮＰ（ＳＮＰ１３〜９８）を加えて、ヒトゲノム中の９６箇所の部位を標的塩基配列とし、これらの増幅を試みた。なお、ＳＮＰ１３〜９８のアクセション番号を、表３に示す。
【００４６】
【表３】
2009055815.tif 000004
【００４７】
ＳＮＰ１３〜９８の各標的塩基配列をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットＰ１３〜９８を作製し、実施例１で用いたプライマーセットＰ３〜１２に加えて、プライマーセットＰ３〜９８有するプライマーキットを作製した。プライマーセットＰ１３〜９８の各プライマーは、実施例１と同様に塩基長が３０塩基以上、Ｔｍ値が７０〜１００℃、アニーリング効率が９０％以上となるように、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰを用いて設計し、得られたプライマーを表４及び５に示した。なお、表４及び５中、「ｂｐ」、「Ｆｗ」及び「Ｒｖ」は、表２と同様である。
【００４８】
【表４】
2009055815.tif 000005
【００４９】
【表５】
2009055815.tif 000006
【００５０】
１の反応溶液に１のプライマーセットを添加して、全て同一の反応条件でシャトルＰＣＲを行い、これらのプライマーセットが実際に標的核酸を増幅し得ることを確認した。
具体的には、１０μＬの２×ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に対して、５ｎｇのＧｅｎｏｍｅ  Ｍｉｘと、各プライマーセットのフォワードプライマーとリバースプライマーを最終濃度が０．１μＭとなるようにそれぞれ添加し、２０μＬの反応溶液を調製した。該反応溶液を、９５℃で１５秒間処理した後、９４℃で３０秒間、６８℃で６分間の熱サイクルを４０サイクル行い、最後に６８℃で１０分間の伸長反応を行うことにより、ＰＣＲを行った。その後、得られた９６種類の反応溶液からそれぞれ１μＬを回収して電気泳動することにより、増幅された標的核酸を分離して検出した。
【００５１】
図２は、９６種類のＰＣＲ後の反応溶液をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色して得られたバンドパターンを示したものである。全４段の両端のレーンは全て塩基対長マーカーを泳動したものである。Ｐ３〜９８の９６種類のプライマーセットのうち、Ｐ３９、Ｐ６２、Ｐ８９、及びＰ９５の４種以外の全９２種類のプライマーセットを用いた反応溶液において、目的の標的核酸が増幅されていることが確認できた。つまり、実施例２の結果から、反応条件が標準化されたプライマーセットは、同一の反応条件でそれぞれの標的核酸を増幅し得ることが明らかである。
【００５２】
（実施例３）
実施例２で増幅が確認された９２種類のプライマーセットのうち、増幅された標的核酸の塩基対長がそれぞれ異なる１５種類のプライマーセットＰ４１、Ｐ３１、Ｐ２８、Ｐ２６、Ｐ１３、Ｐ８８、Ｐ２１、Ｐ４４、Ｐ３２、Ｐ３０、Ｐ１７、Ｐ８７、Ｐ４２、Ｐ５２、Ｐ１４を選択し、２４通りの組み合わせ（セットＡ〜Ｘ）によりＰＣＲ増幅を行った。表６〜８は、各プライマーセットの標的塩基配列の塩基対長とセットＡ〜Ｘの組み合わせを表したものである。表中「ｂｐ」はＰＣＲ増幅の対象である標的核酸の塩基対長を、「○」は各セットに含まれているプライマーセットを、それぞれ表している。
【００５３】
【表６】
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【００５４】
【表７】
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【００５５】
【表８】
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【００５６】
１の反応溶液に、セットＡ〜Ｘのうちの１のセットを添加して、全て同一の反応条件でシャトルＰＣＲを行った。具体的には、５μＬの２×ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に対して、５ｎｇのＧｅｎｏｍｅ  Ｍｉｘと、各セットの全種類のプライマーを最終濃度が０．１μＭとなるようにそれぞれ添加し、１０μＬの反応溶液を調製した。該反応溶液を、実施例２と同じ反応条件によりＰＣＲを行い、得られた２４種類の反応溶液からそれぞれ１μＬを回収して電気泳動することにより、増幅された標的核酸を分離して検出した。
【００５７】
図３は、ＰＣＲ増幅後の反応溶液を２１００ＢＩＯＡＮＡＬＹＺＥＲで確認したバンドパターンを示したものである。図３（ａ）はセットＡ〜Ｌを添加した反応溶液のバンドパターンであり、（ｂ）はセットＭ〜Ｘを添加した反応溶液のバンドパターンである。図中、左端のレーンは塩基対長マーカーを泳動したものである。また、全てのレーンに存在する１５００ｂｐと１５ｂｐのバンドは泳動色素のパターンである。これらの結果から、反応条件が標準化されたプライマーからなるプライマーキットは、反応条件を変更することなく、様々な組み合わせでＰＣＲを行うことにより、それぞれの標的核酸を良好に増幅し得ることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明のプライマーキットを用いることにより、必要な標的核酸のみを過不足無く増幅することができるため、多項目少量検体を対象として標的核酸を増幅する医療機関等における遺伝子解析等の分野において利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】実施例１において、ＰＣＲ増幅後の反応溶液を電気泳動で確認したバンドパターンを示したものである。図１（ａ）はアガロースゲル電気泳動像であり、レーン上部の数値は、各反応溶液の伸長時間（分）を表している。また、図中、両端のレーンは塩基対長マーカーを泳動したものである。図１（ｂ）は伸長時間を６分間とした反応溶液を２１００ＢＩＯＡＮＡＬＹＺＥＲで確認したバンドパターンを、縦軸をバンドの蛍光強度、横軸を泳動時間（秒）として示した図である。矢印アがＳＮＰ３、矢印イがＳＮＰ４、矢印ウがＳＮＰ５、矢印エがＳＮＰ６、矢印オがＳＮＰ７、矢印カがＳＮＰ８、矢印キがＳＮＰ９、矢印クがＳＮＰ１０、矢印ケがＳＮＰ１１、矢印コがＳＮＰ１２のバンドである。
【図２】実施例２において、９６種類のＰＣＲ後の反応溶液をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色して得られたバンドパターンを示したものである。全４段の両端のレーンは全て塩基対長マーカーを泳動したものである。
【図３】実施例３において、ＰＣＲ増幅後の反応溶液を２１００ＢＩＯＡＮＡＬＹＺＥＲで確認したバンドパターンを示したものである。図３（ａ）はセットＡ〜Ｌを添加した反応溶液のバンドパターンであり、（ｂ）はセットＭ〜Ｘを添加した反応溶液のバンドパターンである。図中、左端のレーンは塩基対長マーカーを泳動したものである。また、全てのレーンに存在する１５００ｂｐと１５ｂｐのバンドは泳動色素のパターンである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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