(57)【要約】【課題】粒子分析装置において、被検粒子へのダメージを極力抑制しつつ、被検粒子の内部構造に基づく分析を可能にする。【解決手段】粒子分析装置１００は、励起光を発生する光源部１と、励起光を被検粒子である細胞８を含む試料液７１の流れに照射する照射光学系２と、励起光が照射されることにより細胞８から生じる非線形ラマン散乱光を検出する検出部４と、検出部４からの信号を処理して細胞８を分析する分析部５とを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光を発生する光源部と、
前記励起光を被検粒子を含む試料液の流れに照射する照射光学系と、
前記励起光が照射されることにより前記被検粒子から生じる非線形ラマン散乱光を検出する検出部と、
該検出部からの信号を処理して前記被検粒子を分析する分析部とを備えたことを特徴とする粒子分析装置。
【請求項２】
前記励起光が、ポンプ光と該ポンプ光よりも波長が長いストークス光とを含み、
前記ストークス光が、複数種類の分子を個別に分析するために定められた互いに異なる波長を持つ複数のピークを有するものであることを特徴とする請求項１記載の粒子分析装置。
【請求項３】
前記ストークス光が、互いに波長が隣り合う２つの前記ピーク間の波長範囲内に、該２つのピークのうちのより小さい光強度を持つピークの１／ｅ2以下の光強度となる波長範囲を有するものであることを特徴とする請求項２記載の粒子分析装置。
【請求項４】
前記光源部が、前記ストークス光の前記ピーク波長を変更するためのピーク波長変更手段を有するものであることを特徴とする請求項２または３記載の粒子分析装置。
【請求項５】
前記照射光学系が、前記試料液の流れの方向と交わる方向における複数の位置に前記励起光を照射するものであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の粒子分析装置。
【請求項６】
前記励起光を前記被検粒子上で走査させる走査光学系と、
前記検出部から出力された信号を用いて前記被検粒子の画像を生成する画像処理部とをさらに備えたことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の粒子分析装置。
【請求項７】
被検粒子を含む試料液の流れに励起光を照射し、
前記励起光が照射されることにより前記被検粒子から生じる非線形ラマン散乱光を検出し、
前記検出による信号を処理して前記被検粒子を分析することを特徴とする粒子分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子分析装置および粒子分析方法に関し、より詳しくは、フローサイトメーター等において非線形ラマン分光法を用いて被検粒子を分析する粒子分析装置および粒子分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞等の粒子を分析する装置として、フローサイトメトリーの手法を用いた装置（フローサイトメーター）が用いられている。従来知られているフローサイトメーターでは、通常、サンプルから採取された大量の細胞を試料液流中で一列に整列させて流し、試料液流中の各細胞にレーザ光等の光を照射し、細胞から発せられた蛍光や散乱光を細胞ごとに検出することにより、個々の細胞の同定や、正常・異常等の判別を行う。フローサイトメーターには、細胞を分類して回収する分取機能を有するソータータイプのもの（一般にセルソーターと呼ばれる）と、分析機能のみを有し分取機能を有しないアナライザタイプのものがある。フローサイトメーターを用いることにより、大量の細胞を高速に分析することが可能になり、統計的な情報を短時間で得ることが可能になる。
【０００３】
下記特許文献には、共焦点光学系を有するフローサイトメーターにおいて、細胞から２光子励起により発せられる蛍光を検出することにより、微小サイズの細胞を分析する方法が記載されている。
【特許文献１】特開２００４−３４７６０８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、従来のフローサイトメーターで分析に用いられている散乱光は、主に回折散乱光やミー散乱光であり、これらからは、細胞の大きさに関する情報しか得ることができない。細胞の同定や正常・異常等の判別を行うためには内部構造の情報が必要であり、従来ではその目的で蛍光が用いられてきた。一般に、細胞からの蛍光を観測するには、細胞を色素で染色しておくことが必要である。しかしながら、細胞にとって色素は有害物質であり、染色により細胞は少なからずダメージを受け、細胞本来の機能が阻害され、場合によっては死に至ることもある。フローサイトメーターで分取した細胞を用いて、培養実験や抗癌剤の効果検証実験等を行うことを考えると、細胞へのダメージが極力少ないことが望まれる。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、被検粒子へのダメージを極力抑制しつつ、被検粒子の内部構造に基づく分析が可能な粒子分析装置および粒子分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の粒子分析装置は、励起光を発生する光源部と、励起光を被検粒子を含む試料液の流れに照射する照射光学系と、励起光が照射されることにより被検粒子から生じる非線形ラマン散乱光を検出する検出部と、該検出部からの信号を処理して被検粒子を分析する分析部とを備えたことを特徴とするものである。
【０００７】
ここで、「被検粒子」は、細胞に限らず、粒子状で励起光の照射により非線形ラマン散乱光を発生するものであればよい。また、「被検粒子」は、医療・生物分野だけでなく工業分野におけるものでもよい。
【０００８】
本発明の粒子分析装置においては、励起光が、ポンプ光と該ポンプ光よりも波長が長いストークス光とを含み、該ストークス光が、複数種類の分子を個別に分析するために定められた互いに異なる波長を持つ複数のピークを有するものであるように構成してもよい。
【０００９】
その際に、ストークス光が、互いに波長が隣り合う２つのピーク間の波長範囲内に、該２つのピークのうちのより小さい光強度を持つピークの１／ｅ2以下の光強度となる波長範囲を有するものとすることが好ましい。すなわち、ストークス光が、互いに波長が隣り合う２つのピークの間の波長範囲内に、非線形ラマン散乱光を実質的に発生させない光強度となる波長範囲を有するものであることが好ましい。ここで、線形ラマン散乱光を実質的に発生させないストークス光の光強度とは、分子を分析するためのスペクトルの取得を可能とする光強度を有する非線形ラマン散乱光を発生させることができない光強度を意味するものである。
【００１０】
また、本発明の粒子分析装置においては、光源部が、ストークス光のピーク波長を変更するためのピーク波長変更手段を有するように構成してもよい。
【００１１】
さらに、本発明の粒子分析装置においては、照射光学系が、試料液の流れの方向と交わる方向における複数の位置に励起光を照射するものであるように構成してもよい。ここで、「複数の位置に励起光を照射」は、同時に照射するものでもよく、あるいは時間をずらして照射するものでもよい。
【００１２】
また、本発明の粒子分析装置においては、励起光を被検粒子上で走査させる走査光学系と、検出部から出力された信号を用いて被検粒子の画像を生成する画像処理部とをさらに備えるように構成してもよい。
【００１３】
また、本発明の粒子分析方法は、被検粒子を含む試料液の流れに励起光を照射し、励起光が照射されることにより被検粒子から生じる非線形ラマン散乱光を検出し、検出による信号を処理して被検粒子を分析するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の粒子分析装置および粒子分析方法は、非線形ラマン散乱光を用いて被検粒子を分析するものであるため、被検粒子を非染色で分析することが可能になり、染色によるダメージを回避することができる。また、非線形ラマン散乱光は、被検粒子を構成する分子の固有振動に基づいて発せられるものであり、分子やその分子の構造に固有のものであるため、本発明の粒子分析装置および粒子分析方法によれば、被検粒子の内部構造に基づいた分析が可能になる。
【００１５】
本発明の粒子分析装置において、励起光が、ポンプ光と該ポンプ光よりも波長が長いストークス光とを含み、該ストークス光が、複数種類の分子を個別に分析するために定められた互いに異なる波長を持つ複数のピークを有するとした場合には、分子を変質させることなく、従来よりも高速度で複数種類の分子を一度に分析することができる。すなわち、複数種類の分子を個別に分析するために定められた波長においてストークス光の光強度を高めるように複数のピークを設定できるので、ストークス光の光強度を広い波長範囲に亘って全体的に高めて被検粒子を変質させるような高い光強度にすることなく、複数種類の分子を同時に分析する際の測定を高速化することができる。
【００１６】
より詳しくは、複数種類の分子を個別に分析するために定められた各波長においてストークス光の光強度を高めるように複数のピークを設定し、一方で、上記分子の分析に不要な、互いに波長が隣り合う２つのピーク間の波長においてストークス光の光強度を低下させることにより、複数種類の分子を同時に分析する際の測定時間を短縮しつつ、ストークス光の持つ光強度の総量を抑制して被検粒子を変質させないようにすることができる。これにより、被検粒子を構成する複数種類の分子を一度に分析する際の測定効率を高めることができる。
【００１７】
また、本発明の粒子分析装置において、ストークス光を、互いに波長が隣り合う２つのピークの間の波長範囲内に、その２つのピークのうちのより小さい光強度を持つピークの１／ｅ2以下の光強度となる波長範囲を有するものとした場合には、測定対象とする分子を分析する測定に混入するノイズを低減することができ、かつ、ストークス光の光強度が低減されることにより測定対象とする分子に与える損傷をより少なくすることができるので、より確実に、被検粒子を構成する複数種類の分子の分析速度を高めることができる。
【００１８】
また、本発明の光源部が、ストークス光のピーク波長を変更するためのピーク波長変更手段を有するものとした場合には、複数種類の分子を個別に分析するために定められる複数のピークを有するストークス光をより容易に生成することができる。
【００１９】
本発明の照射光学系が、試料液の流れの方向と交わる方向における複数の位置に励起光を照射するものである場合は、１つの被検粒子の複数の部分について分析することが可能となるため、情報量が増加するとともに分析の信頼度を向上させることができる。
【００２０】
本発明の粒子分析装置が、励起光を被検粒子上で走査させる走査光学系と、検出部から出力された信号を用いて被検粒子の画像を生成する画像処理部とをさらに備える場合は、被検粒子の内部構造に基づいた構成を可視化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、図面を参照して本発明の実施形態にかかる粒子分析装置および粒子分析方法について詳細に説明する。
【００２２】
図１に、本発明の第１の実施形態にかかる粒子分析装置１００の構成図を示す。粒子分析装置１００は、被検粒子を含む試料液の流れに励起光を照射し、この励起光が照射されることにより被検粒子から生じる非線形ラマン散乱光を検出し、この検出による信号を処理して被検粒子を分析するフローサイトメーターである。ここでは、非線形ラマン散乱光としてＣＡＲＳ光（コヒーレントアンチストークスラマン散乱光）を用いており、以下の説明では、ＣＡＲＳ光を用いて分析する場合を例にとり説明する。
【００２３】
初めに、ＣＡＲＳ光について説明する。定性的なＣＡＲＳ光の発生原理は以下のように説明される。測定対象の分子が存在している領域に、振動数の異なる２つの光、振動数ω１の光と振動数ω２の光を入射させると（ω１＞ω２とする）、振動数ω１−ω２のうなりが生じる。このうなりの振動数が測定対象の分子の固有振動数Ωと一致しているとき、分子は共鳴振動を起こす。共鳴振動が起こっている状態で、さらに振動数ω３の光を入射させると、分子の共鳴振動と振動数ω３の光との相互作用により、ＣＡＲＳ光が発生する。
【００２４】
図２を参照しながら、エネルギー準位の観点から上記のＣＡＲＳ光の発生過程を辿る。光を入射させる前の分子は、図２で示すエネルギー準位がＥ１の初期状態にある。ここに振動数ω１の光と振動数ω２の光を入射させると、分子のエネルギー準位は、振動数ω１の光により励起されて仮想的なエネルギー準位Ｅ３まで上がり、振動数ω２の光に対応する仮想的な光子放出によりＥ３からＥ２に下がると考えられる。この振動数の差ω１−ω２が分子の固有振動数Ωと一致したとき、分子は共鳴振動を起こしてエネルギー準位がＥ２の励起状態となる。ここにさらに振動数ω３の光を入射させると、分子のエネルギー準位はＥ２から仮想的なエネルギー準位Ｅ４に上昇し、ＣＡＲＳ光が発生することにより分子のエネルギー準位はＥ４からＥ１に下がることになる。
【００２５】
上記のような３つの励起光、すなわち振動数ω１、ω２、ω３の光の入射により、いわゆる四光波混合過程が生じ、結果として振動数ωａｓ＝ω１−ω２＋ω３のＣＡＲＳ光が発生する。上記の過程は、振動数ω３の光の代わりに振動数ω１の光を用いて起こすことも可能である。この場合は振動数の異なる２種類の励起光でＣＡＲＳ光を発生でき、このときのＣＡＲＳ光の振動数ωａｓはωａｓ＝２ω１−ω２となる。励起光を２種類にした方が装置構成を簡易化できるため、図１に示す粒子分析装置１００も、振動数の異なる２つの励起光でＣＡＲＳ光を発生させる構成を採っている。なお、一般に、振動数ω１の光はポンプ光、振動数ω２の光はストークス光と呼ばれている。
【００２６】
ＣＡＲＳ光は、ω１−ω２が測定対象の分子の固有振動数Ωと一致したときに強く現れる光である。分子の固有振動数Ωは、分子の種類やその構造によって異なるため、ＣＡＲＳ光の観測により、非破壊的に測定対象の分子の同定を行うことができる。例えば、ポンプ光の振動数ω１を固定したまま、ストークス光の振動数ω２を掃引して観測することにより、分子の固有振動スペクトルを観察することができ、これにより分子の同定が可能になる。あるいは、検出したい分子の固有振動数Ωが既知の場合は、ω１−ω２＝Ωを満たすようにポンプ光、ストークス光の振動数を設定して観測することにより、目的を達成することができる。
【００２７】
ＣＡＲＳ光の発生する過程は非線形光学過程であり、基本的には２つの励起光の位相が一致した光強度の高い状態で発生する。また、空間的にもＣＡＲＳ光は、ポンプ光とストークス光が強く集光された部分からのみ発生するため、ＣＡＲＳ光による測定は、基本的に高い三次元空間分解能を実現することができる。観測されるＣＡＲＳ光の強度Ｉａｓは、下式（１）に示すように、ポンプ光の強度Ｉｐの二乗とストークス光の強度Ｉｓの積に比例する。
【００２８】
Ｉａｓ  ∝  Ｉｐ２・Ｉｓ      （１）
２種類の励起光でＣＡＲＳ光を発生させる場合は、ＣＡＲＳ光の振動数ωａｓ、ポンプ光の振動数ω１、分子の固有振動数Ωは、ωａｓ＝ω１＋Ωの関係にあるため、ＣＡＲＳ光の波長は励起光であるポンプ光の波長より短くなる。これに対して、自家蛍光の波長や、線形光学現象である自発ラマン散乱により生じるストークス散乱光の波長は、励起光の波長より長い。ストークス散乱光を検出する場合、ストークス散乱光と自家蛍光は重畳してしまい分離しにくいのに対して、ＣＡＲＳ光は、自家蛍光およびストークス散乱光との分離が容易であり、検出しやすいという利点がある。また、ＣＡＲＳ光による測定は、自発ラマン散乱を用いた場合よりも強い信号強度が得られるため、自発ラマン散乱を用いた場合よりも高いスループットを実現することができる。
【００２９】
次に、図１を参照しながら、本発明の第１の実施形態にかかる粒子分析装置１００について説明する。図１に示す粒子分析装置１００は、波長の異なる２つの励起光を発生する光源部１と、光源部１で発生した励起光を被検粒子を含む試料液の流れに照射する照射光学系２と、励起光が照射されることにより被検粒子から発せられる光を受光する受光光学系３と、励起光が照射されることにより被検粒子から生じる非線形ラマン散乱光を検出して信号を出力する検出部４と、検出部４から出力された信号を処理して被検粒子を分析する分析部５と、分析部５により分析された分析結果を表示する表示部６と、被検粒子を含む試料液を所定の流速で流すフロー部７とを備える。被検粒子として、本実施形態においては細胞８を用いている。
【００３０】
本実施形態の光源部１は、２つの励起光として、狭帯域のポンプ光と狭帯域のストークス光を発生するように構成されている。光源部１は、レーザ１１と、ＯＰＯ（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ：光パラメトリック発振器）１２と、ディレイライン１３と、分波または合波用のビームスプリッター１４ａ、１４ｂと、光路折り曲げ用のミラー１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄと、光減衰器１９ａ、１９ｂとを有する。
【００３１】
レーザ１１は、超短パルス光を発生できるレーザであることが好ましく、より詳しくは数十ｆｓ（フェムト秒）〜数十ｐｓ（ピコ秒）の時間範囲内でパルス光を発生できるレーザであることが好ましい。レーザ１１としては例えば、波長８００ｎｍ、パルス幅３ｐｓ、繰り返し周波数８０ＭＨｚ、ピークパワー８ＫＷ、平均パワー２Ｗのチタンサファイアレーザを用いることができる。
【００３２】
レーザ１１を出射した光はビームスプリッター１４ａにより２つに分岐されて、ポンプ光用の一方の光はＯＰＯ１２に入射し、ストークス光用の他方の光はミラー１５ａ、１５ｂで光路を曲げられた後、ディレイライン１３に入射する。
【００３３】
ＯＰＯ１２は、波長変換器として機能するものであり、例えば波長８００ｎｍのチタンサファイアレーザの光を入力すると、波長５５０〜７５０ｎｍの範囲で波長変換された光を出力することができる。なお、ＯＰＯ１２の代わりに異なる構成の波長変換器を使用することも可能である。ＯＰＯ１２からの出力光は、光減衰器１９ａによりポンプ光の平均パワーが細胞８において３０ｍＷ以下になるように調節された後、ミラー１５ｄで光路を曲げられ、ビームスプリッター１４ｂに入射する。
【００３４】
ディレイライン１３はポンプ光とストークス光を細胞８に照射する時間を調整するためのものである。ポンプ光およびストークス光は、異なる経路を辿って細胞８に到達するが、これらはパルス光であるため、同時に細胞８に照射されるとは限らない。ポンプ光およびストークス光の一方の光路にディレイライン１３を設けることにより、ポンプ光およびストークス光を同時に細胞８に照射することができる。
【００３５】
本実施形態のディレイライン１３は、互いに直交した２つの反射面を有するミラーからなり、このミラーを図１の両矢印の方向に移動させることにより、ミラー１５ｂ〜ディレイライン１３〜ミラー１５ｃの間の光路長を変更して、時間調整するように構成されている。なお、ディレイラインは、ポンプ光とストークス光を細胞８に照射する時間を調整できるものであればよく、上記構成に限定されず、別の構成を採用してもよく、また、ポンプ光の光路に設けられていてもよい。
【００３６】
ディレイライン１３により時間調整されたストークス光はミラー１５ｃで光路を曲げられ、光減衰器１９ｂによりストークス光の平均パワーが細胞８において３０ｍＷ以下になるように調節された後、ビームスプリッター１４ｂに入射する。ビームスプリッター１４ｂにおいて、ポンプ光とストークス光の２つの励起光は合波され、合波された光は同一光路を進行して照射光学系２に入射する。
【００３７】
照射光学系２は、２つの励起光を高密度に集光して細胞８内の微小領域に照射するものである。ここでは照射光学系２として、高ＮＡ（ＮＡ：Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ａｐｅｒｔｕｒｅ：開口数）の対物レンズ２１を用いている。対物レンズ２１としては、例えば、倍率６０×、ＮＡ１．２のものを用いることができ、この場合には照射領域のサイズをサブミクロンオーダーにまで絞ることができる。
【００３８】
受光光学系３は、励起光が照射された細胞８からの光を受光して検出部４へ導光するものである。受光光学系３は、対物レンズ３１と、ポンプ光を遮断するためのカットフィルタ３２と、ポンプ光より短波長側の光となるアンチストークス散乱光を選択的に透過させるためのショートパスフィルタ３３と、光路折り曲げ用のミラー３４とを有する。対物レンズ３１は、例えば、照射光学系２の対物レンズ２１と同じ仕様のものを用いることができる。
【００３９】
カットフィルタ３２により、ポンプ光が検出部４に入射するのを防止することができる。また、ショートパスフィルタ３３により、ストークス光、自家蛍光および自発ラマン散乱によるストークス散乱光が検出部４に入射するのを防止することができる。よって、受光光学系に入射した光のうち、ＣＡＲＳ光を選択的に検出部４へ入射させることができる。なお、さらに、細胞８内の観測対象となる分子に特有のＣＡＲＳ光を透過するように中心波長が設定された狭い透過波長帯域を有するバンドパスフィルタを用いてもよい。複数種類の分子を観測するときは、複数の透過波長帯域を有するバンドパスフィルタを用いたり、異なる透過波長帯域を有する複数のバンドパスフィルタを用いたり、あるいは透過波長帯域が可変のものを用いるようにしてもよい。
【００４０】
検出部４は、ＣＡＲＳ光を検出して電気信号を出力するものである。検出部４としては、例えば、フォトマルチプライヤーや、アバランシェフォトダイオード等を用いることができる。超高感度型の素子を用いることにより、ＣＡＲＳ光の検出時間を短縮することができる。
【００４１】
分析部５は、検出部４から出力された電気信号を非線形ラマン分光法に基づき信号処理を行い、細胞８内部の分子を同定し、細胞８の内部構造の情報を取得し、細胞８を分析するものである。分析部５としては、例えばパーソナルコンピュータ等のコンピュータシステムを用いることができる。ここで、細胞の内部構造とは、細胞を構成する成分（例えばタンパク質や脂質、無機質等）、各成分の分布、各成分の割合等である。各分子に存在する官能基や各分子の立体構造により発揮される機能も異なるため、内部構造の情報を得ることにより、細胞の機能に関する情報も得ることができる。分析部５は、分析の目的に応じ、内部構造や機能の情報を用いて細胞を分析することができる。
【００４２】
表示部６は分析部５の分析結果を表示するものであり、例えばモニタ装置等により構成できる。
【００４３】
フロー部７は、細胞８を含有する試料液７１を供給する試料液供給部７２と、試料液供給部７２の周囲に設けられてシース液７３を供給するシース液供給部７４と、試料液７１とシース液７３の合流地点に連結された細い管状のフローセル７５とを有する。試料液供給部７２から試料液７１を流すと同時に、試料液７１の周囲にシース液供給部７４からシース液７３を流す。このとき、試料液供給部７２にかける圧力をシース液供給部７４にかける圧力より若干低く設定することにより、流体力学的な絞り込みが生じ、シース液７３に包まれた試料液７１の流径が非常に細くなり、試料液７１に含まれる細胞８をフローセル７５内で一列に整列させてほぼ等間隔で流すことが可能になる。一例として、フローセル７５を流れる試料液流の速度は数〜２０ｍ／秒、フローセル７５の幅は５〜４０μｍにすることができる。
【００４４】
フローセル７５内の試料液流の所定位置に励起光を照射できるように、照射光学系２の対物レンズ２１が配置されている。また、フローセル７５を挟んで対物レンズ２１と対向するように受光光学系３の対物レンズ３１が配置されている。
【００４５】
フローセル７５の下流側の端部は開口しており、この端部から細胞８を１つずつ含有する液滴５７が吐出される。粒子分析装置１００はセルソーター型の構成を採用しており、フロー部７は、細胞８を分取するための分取制御部７６、およびフローセル７５の下流側に配置された偏向板７７ａ、７７ｂを有している。
【００４６】
分取制御部７６は、分析部５と接続され、分析部５からの情報に基づき、吐出された液滴７８に正または負の電荷を選択的に帯電させる。液滴７８の進行方向の両側にはそれぞれ正、負の所定電圧が印加され、分取用の異なるラインに接続された偏向板７７ａ、７７ｂが配設されている。帯電した液滴７８が偏向板７７ａ、７７ｂの間を通過するときに、帯電の正負に応じて電場の力を受けて偏向板７７ａあるいは偏向板７７ｂの方向へ偏向されることにより、所望の細胞を分取することができる。分取用のラインとは、例えば、培養実験用に細胞８を回収するライン、分析後の細胞を廃棄するためのライン等である。
【００４７】
なお、図１では、偏向板７７ａ、７７ｂの２方向へ分取する粒子分析装置１００を図示しているが、正にも負にも帯電されない液滴を分取するためのラインをさらに設け、計３つのラインを備えた構成としてもよい。
【００４８】
次に、上記構成を有する粒子分析装置１００の動作例について説明する。まず、フロー部７において、細胞８を含有する試料液７１がシース液７３に包まれてフローセル７５内を流れるシースフローを形成する。シースフローにおいて、細胞８はフローセル７５内を一列に整列した状態で流れていく。
【００４９】
光源部１からは同軸上を進行する２つの励起光（ポンプ光およびストークス光）が出射されて、照射光学系２に入射する。２つの励起光は対物レンズ２１により集光されて、フローセル７５内の試料液７１の流れに照射され、各細胞８に照射される。この照射により、細胞８からはＣＡＲＳ光が発せられる。受光光学系３の対物レンズ３１は、細胞８から発せられた前方散乱光を受光し、平行光に変換する。前方散乱光にはＣＡＲＳ光以外の光も含まれているが、カットフィルタ３２およびショートパスフィルタ３３を通過することにより、ほぼＣＡＲＳ光以外の光が排除される。
【００５０】
検出部４は、ＣＡＲＳ光を検出し、電気信号として出力する。出力された電気信号を分析部５で信号処理することにより、細胞８に含まれる分子が同定され、細胞８の内部構造の情報が取得され、細胞８の同定や正常・異常等の判別が行われ、その結果が表示部６に表示される。また、必要に応じて、分析部５から分取制御部７６へ分取を指示する信号が送信され、分取制御部７６は分取指示の出された細胞８を含む液滴７８に正あるいは負の電荷を帯電させて、分取を行う。
【００５１】
上記構成を有する粒子分析装置１００によれば、非線形ラマン散乱光を用いて細胞８を分析するため、蛍光を用いて分析する従来の装置と異なり、染色の必要が無くなり、染色により細胞にダメージを与えることはない。粒子分析装置１００では、非破壊的な分析が可能であるため、細胞等の生体の分析に好適である。また、非線形ラマン散乱光は、分子の固有振動に基づくものであり、多光子過程のため高い空間分解能を有するものであるため、粒子分析装置１００によれば、細胞内の分子の同定が可能であり、これにより、細胞の局所的な内部構造や機能に関する情報を取得できる。粒子分析装置１００は、単に細胞の大きさの情報しか得られない従来の散乱光を用いた分析装置では奏することのできない優れた効果を奏するものである。以上述べた非線形ラマン散乱光を用いることによる粒子分析装置１００の効果は、後述の実施形態の粒子分析装置も同様に奏するものである。
【００５２】
次に、本発明の別の実施形態にかかる粒子分析装置について説明する。なお、以降の実施形態の説明および図面においては、前述の実施形態の構成要素と実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。
【００５３】
図３および図４を参照しながら、本発明の第２の実施形態にかかる粒子分析装置２００について説明する。図１に示す粒子分析装置１００では、励起光として、狭帯域のポンプ光と狭帯域のストークス光を用いていたのに対し、粒子分析装置２００では、狭帯域のポンプ光と広帯域のストークス光を用いる方法、いわゆるマルチプレックス分光法を採用している点が基本的に異なる。そのため、粒子分析装置２００では主に光源部と検出部において、粒子分析装置１００のものと異なる構成を有している。
【００５４】
図４はマルチプレックス分光法を説明するための概念図であり、縦軸にパワーＰ（光強度）、横軸に波長λを示す座標上に、広帯域ストークス光Ｌｓｗ、ポンプ光Ｌｐ、および上記広帯域ストークス光Ｌｓｗとポンプ光Ｌｐの照射を受けた被検粒子から発生したＣＡＲＳ光Ｌｃｗの各スペクトルの例を示す図である。なお、粒子分析装置２００ではポンプ光Ｌｐおよび広帯域ストークス光Ｌｓｗを合波した合波光Ｌｇｗが励起光となる。
【００５５】
マルチプレックス分光法では、ポンプ光とストークス光を入射させたときに様々な振動数のうなりが同時に生じ、複数の共鳴振動の情報を有するＣＡＲＳ光が同時に発生する。このＣＡＲＳ光を分光することにより、観測領域に含まれる分子の振動を一度に測定することができる。マルチプレックス分光法は、波長掃引することなく、ＣＡＲＳ光のスペクトルを一度に取得できるため、分析のスループットを向上させることができる。
【００５６】
粒子分析装置２００が備える光源部２０１は、図１の光源部１と比べて、ＯＰＯ１２の代わりにＰＣＦ（Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｆｉｂｅｒ：フォトニック結晶ファイバ）２１２を用い、ミラー１５ｃとビームスプリッター１４ｂの間にバンドパスフィルタ２１６が追加され、ＰＣＦ２１２とミラー１５ｄの間にロングパスフィルタ２１７が追加されている点が異なる。
【００５７】
ＰＣＦ２１２は、パルス光のパルス幅を広げることなく波長帯域を広帯域化できる。例えば、チタンサファイアレーザから出射された波長８００ｎｍの光を、ＰＣＦ２１２により波長５００〜１５００ｎｍの広帯域光に変換することができる。なお、ＰＣＦ２１２の代わりに、同様の機能を有するものを用いてもよく、例えば同様の機能を有する非線形ファイバを用いてもよい。
【００５８】
また、光源部２０１が備えるレーザ１１は、数十ｆｓ（フェムト秒）〜数十ｐｓ（ピコ秒）の時間範囲でパルス光を発生するレーザであることが好ましい。レーザ１１としては例えば、波長８００ｎｍ、パルス幅１００ｆｓ、繰り返し周波数８０ＭＨｚ、ピークパワー２５０ＫＷ、平均パワー２Ｗのチタンサファイアレーザを用いることができる。
【００５９】
粒子分析装置２００においては、ＰＣＦ２１２で広帯域化された光がストークス光用の光となり、ディレイライン１３を経由した光がポンプ光用の光となる。バンドパスフィルタ２１６は、ポンプ光用の光を狭帯域化するものであり、透過させる波長幅は例えば２ｎｍとすることができる。また、本実施形態では、光減衰器１９ｂにより、ポンプ光の平均パワーが被検粒子において３０ｍＷ以下になるように調節される。
【００６０】
ロングパスフィルタ２１７は、広帯域化された光からポンプ光の波長より長波長側の光だけを取り出すものである。例えばポンプ光が波長８００ｎｍの場合において、ロングパスフィルタ２１７は波長８１０ｎｍより長波長側の光を透過させるものとすることができる。また、本実施形態では、光減衰器１９ａにより、ストークス光の平均パワーが被検粒子において３０ｍＷ以下になるように調節される。
【００６１】
すなわち、レーザ１１を出射してビームスプリッター１４ａにより分岐された２つの光のうち、一方の光は、ミラー１５ａ、ディレイライン１３、バンドパスフィルタ２１６、光減衰器１９ｂを経由してポンプ光となり、ビームスプリッター１４ｂに入射する。また、上記２つの光うち、他方の光は、ＰＣＦ２１２、ロングパスフィルタ２１７、光減衰器１９ａ、ミラー１５ｄを経由してストークス光となり、ビームスプリッター１４ｂに入射する。
【００６２】
粒子分析装置２００が備える検出部２０４は、複数発生したアンチストークス光を分けるための分光器と、分光器で分光されたアンチストークス光を検出するための検出器を備える。検出器としては超高感度分光用のＥＭ−ＣＣＤ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ  ＣＣＤ）等の、低ノイズで高増幅型の検出器を用いることが好ましく、この場合にはＣＡＲＳ光の検出時間を短縮することができる。
【００６３】
次に、図５および図６を参照しながら、上記第２の実施形態の変形例である粒子分析装置２２０について説明する。粒子分析装置２２０は、いわば上記の粒子分析装置２００の改良型であり、粒子分析装置２００で用いられた広帯域のストークス光の代わりに複数のピークを有するストークス光を用いる点が特徴である。
【００６４】
図６は粒子分析装置２２０における分光法を説明するための概念図であり、縦軸にパワーＰ（光強度）、横軸に波長λを示す座標上に、複数のピークを有する狭帯域ストークス光Ｌｓｎ、ポンプ光Ｌｐ、および上記狭帯域ストークス光Ｌｓｎとポンプ光Ｌｐの照射を受けた被検粒子から発生したＣＡＲＳ光Ｌｃｎの各スペクトルの例を示す図である。粒子分析装置２２０ではポンプ光Ｌｐおよび狭帯域ストークス光Ｌｓｎを合波した合波光Ｌｇｎが励起光となる。
【００６５】
ここで、粒子分析装置２２０における上記狭帯域ストークス光は、ポンプ光よりも波長が長く、複数種類の分子を個別に分析するために定められた互いに異なる波長を持つ複数のピークを有するものであり、ストークス光の個々のピークにおける光強度はポンプ光のピークの光強度よりも小さい。また、狭帯域ストークス光は、互いに波長が隣り合う２つの前記ピーク間の波長範囲内に、該２つのピークのうちのより小さい光強度を持つピークの１／ｅ2以下の光強度となる波長範囲を有するものであることが好ましく、本実施形態ではそのように設定されている。
【００６６】
粒子分析装置２２０は、粒子分析装置２００と比べて、光源部の構成が異なる。粒子分析装置２２０が有する光源部２２１は、図３に示した粒子分析装置２００の光源部２０１のロングパスフィルタ２１７と光減衰器１９ａの間の光路に狭帯域化部１８を挿入した構成となる。粒子分析装置２２０における狭帯域化部１８は、広帯域の光から、複数種類の分子を個別に分析するために定められた互いに異なる波長を持つ複数のピークを有するストークス光（ここでは狭帯域ストークス光）を生成するためのものである。ここでは、狭帯域化部１８はさらに、狭帯域ストークス光のピーク波長を変更するためのピーク波長変更手段として機能する制御部１８Ｈを備えている。
【００６７】
狭帯域化部１８の具体的な種々の構成例について、図７〜図９を用いて説明する。図７は第１の狭帯域ストークス光の作成方式を示す図、図８は第２の狭帯域ストークス光の作成方式を示す図、図９は第３の狭帯域ストークス光の作成方式を示す図である。なお、各図において、同様の機能を有する構成要素には同じ符号を用いている。例えば、異なる性能を有する空間光変調器であっても各狭帯域ストークス光の生成方式毎に繰り返し同じ符号を用いている。
【００６８】
図７に示す第１の狭帯域ストークス光の生成方式は以下のような方式である。すなわち、超短パルス光である広帯域の光Ｌｗを、複数のビームスプリッターＢｓａ、Ｂｓｂ・・・に通して分岐させて複数の広帯域の光Ｌｗａ、Ｌｗｂ・・・を得、広帯域の光Ｌｗａ、Ｌｗｂ・・・それぞれを互いに波長特性の異なるバンドパスフィルタＦａ、Ｆｂ・・・へ通して複数の互いに異なる波長を持つ狭帯域の光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・を生成する。各バンドパスフィルタＦａ、Ｆｂ・・・の半値幅は２〜１０ｎｍとすることができる。
【００６９】
なお、バンドパスフィルＦａ、Ｆｂ・・・を周囲に配置してなるフィルタホイールを備えるようにし、制御部１８Ｈにより、フィルタホイールの中心を通る回転中心軸の回りにこのフィルタホイールを回転させてバンドパスフィルＦａ、Ｆｂ・・・を回転移動させることにより、バンドパスフィルタの交換を行い、狭帯域化部１８により得られる狭帯域ストークス光のピーク波長を変更するようにしてもよい。
【００７０】
そして、超短パルス光である狭帯域の光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・の一部または全部を光遅延部Ｄｅａ、Ｄｅｂ・・・（ディレイライン）および減衰器Ａｔａ、Ａｔｂ・・・（ＡＴＴ：アッテネータ）に通して、各光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・の被検粒子への照射タイミングを同期させるとともにそれらの光強度を調節する。
【００７１】
その後、各光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・を複数のビームスプリッターＢｐａ、Ｂｐｂ・・・へ通して合波させ、第１の狭帯域ストークス光Ｌｓｎを生成する。
【００７２】
なお、広帯域の光Ｌｗとしては、上記広帯域ストークス光Ｌｓｗ等を用いることができる。
【００７３】
すなわち、上記のように狭帯域化部１８を構成し、広帯域ストークス光Ｌｓｗの波長領域中の一部分を切り出すことにより、広帯域のストークス光Ｌｓｗの波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた、互いに異なる波長を持つ複数のピークを有する狭帯域ストークス光を生成することができる。これにより、互いに波長が隣り合う２つのピーク間の各波長範囲内に、その２つのピークのうちのより小さい光強度を持つピークの１／ｅ2以下の光強度となる波長範囲を有する狭帯域ストークス光を生成することができる。
【００７４】
図８に示す第２の狭帯域ストークス光の生成方式は以下のような方式である。すなわち、超短パルス光である広帯域の光Ｌｗを、複数のビームスプリッターＢｓａ、Ｂｓｂ・・・に通して分岐させて複数の広帯域の光Ｌｗａ、Ｌｗｂ・・・を得、広帯域の光Ｌｗａ、Ｌｗｂ・・・それぞれを互いに波長特性の異なるチューナブルフィルタＴａ、Ｔｂ・・・へ通して複数の互いに異なる波長を持つ狭帯域の光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・を生成する。この際に、制御部１８Ｈにより、チューナブルフィルタＴａ、Ｔｂ・・・における波長選択を行い、狭帯域化部１８により得られる狭帯域ストークス光のピーク波長を変更するようにしてもよい。
【００７５】
そして、超短パルス光である狭帯域の光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・の一部または全部を光遅延部Ｄｅａ、Ｄｅｂ・・・（ディレイライン）および減衰器Ａｔａ、Ａｔｂ・・・（ＡＴＴ：アッテネータ）に通して、各光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・の被検粒子への照射タイミングを同期させるとともにそれらの光強度を調節する。
【００７６】
その後、各光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・を複数のビームスプリッターＢｐａ、Ｂｐｂ・・・へ通して合波させ、第２の狭帯域ストークス光Ｌｓｎを生成する。
【００７７】
なお、広帯域の光Ｌｗとしては、上記広帯域ストークス光Ｌｓｗ等を用いることができる。
【００７８】
すなわち、上記のように狭帯域化部１８を構成し、広帯域ストークス光Ｌｓｗの波長領域中の一部分を切り出すことにより、広帯域のストークス光Ｌｓｗの波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた、互いに異なる波長を持つ複数のピークを有する狭帯域ストークス光を生成することができる。これにより、互いに波長が隣り合う２つのピークの間の各波長範囲内に、その２つのピークのうちのより小さい光強度を持つピークの１／ｅ2以下の光強度となる波長範囲を有する狭帯域ストークス光を生成することができる。
【００７９】
図９に示す第３の狭帯域ストークス光の生成方式は以下のような方式である。すなわち、超短パルス光である小径の広帯域の光ＬｗをミラーＭ１で反射させグレ−ティングＧ１へ入射させ、この広帯域の光Ｌｗが波長に応じて空間的に分離されるように発散させる。
【００８０】
グレ−ティングＧ１により空間的に波長分散された広帯域の光Ｌｗは、コリメートレンズＣｏ１を通って大径の平行光束となる。
【００８１】
大径の平行光束となった広帯域の光Ｌｗは空間光変調器Ｓｍ１を通って波長が選択され、互いに異なる波長にピークを持つ２種類の光成分Ｌｎａ１、Ｌｎｂ１が抽出される。
【００８２】
なお、空間光変調器Ｓｍ１としては、例えば液晶パネル型変調器を用いることができ、その液晶パネルの変調パターン（光を空間変調させるためのパターン）を制御部１８Ｈを用いて電気的な制御によって変更することにより、抽出する光成分のピーク波長を選択することができ、また、後述するように、選択する波長範囲や、切り出す光成分の数を変更することができる。
【００８３】
空間光変調器Ｓｍ１から射出され波長が選択された大径の光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂは、集光レンズＣｏ２を通して集光され、さらにグレーティングＧ２を経由して小径の平行光束からなる同一光路を通る光成分Ｌｎａ１、Ｌｎｂ１である第３の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ１が生成される。この第３の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ１はミラーＭ２で反射され伝播せしめられる。以上のようにして、広帯域の光の波長領域中の一部分を切り出した光成分を合成して、互いに異なる波長を持つ２つのピークを有する狭帯域のストークス光を生成することができる。
【００８４】
なお、空間光変調器による波長選択は種々の態様の選択が可能である。例えば、大径の平行光束となった広帯域の光Ｌｗ中へ、空間光変調器Ｓｍ１の代わりに空間光変調器Ｓｍ１とは異なる透過率分布を有する空間光変調器Ｓｍ２が配された場合には、例えば図９に示すような互いに異なる波長にピークを持つ２種類の光成分Ｌｎａｂ２、Ｌｎｃ２が抽出され、これらの成分を合成してなる第３の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ２が生成される。
【００８５】
光成分Ｌｎａｂ２、Ｌｎｃ２のピーク波長は光成分Ｌｎａ１、Ｌｎｂ１のものと異なる。また、光成分Ｌｎａｂ２の波長範囲は、光成分Ｌｎｃ２の波長範囲よりも広い。すなわち、波長範囲が広い光成分Ｌｎａｂ２を用いると、波長範囲が狭い光成分Ｌｎｃ２よりも多くの分子を一度に分析することができる。
【００８６】
さらに、大径の平行光束となった広帯域の光Ｌｗの光路中へ、空間光変調器Ｓｍ１の代わりに空間光変調器Ｓｍ１とは異なる透過率分布を有する空間光変調器Ｓｍ３が配された場合には、例えば図９に示すような互いに異なる波長にピークを持つ３種類の光成分Ｌｎａ３、Ｌｎｂ３、Ｌｎ３が抽出され、これらの光成分を合成してなる第３の狭帯域ストークス光Ｌｓｎ３を生成することができる。空間光変調器Ｓｍ３が配された場合には、ピークの数が３つとなり、光成分Ｌｎｂ３、Ｌｎｃ３のピーク波長は光成分Ｌｎｂ１のものと異なる。すなわち、広帯域の光の波長領域中の一部分を切り出した光成分を合成して、互いに異なる波長を持つ３つのピークを有する狭帯域のストークス光を生成することができる。
【００８７】
なお、広帯域の光Ｌｗとしては、上記広帯域ストークス光Ｌｓｗ等を用いることができる。
【００８８】
すなわち、上記のように狭帯域化部１８を構成し、広帯域ストークス光Ｌｓｗの波長領域中の一部分を切り出すことにより、広帯域のストークス光Ｌｓｗの波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた、互いに異なる波長を持つ複数のピークを有する狭帯域ストークス光を生成することができる。これにより、互いに波長が隣り合う２つのピークの間の各波長範囲内に、非線形ラマン散乱光を実質的に発生させない光強度となる波長範囲を有する狭帯域ストークス光を生成することができる。
【００８９】
なお、空間光変調器Ｓｍ１、Ｓｍ２、およびＳｍ３は、１つの空間光変調器を光路中に配置したままの状態で、この空間光変調器を制御部１８Ｈで制御することにより形成することが可能である。すなわち、１つの空間光変調器について変調パターンを制御することにより、所望のピークの波長、波長範囲、光強度が得られるように変調パターンが形成された空間光変調器Ｓｍ１、Ｓｍ２、およびＳｍ３を得ることができる。
【００９０】
狭帯域化部１８の具体例を挙げて説明したが、狭帯域化部１８の構成は上記例に限定されず、種々の変形が可能である。例えば、上記の第３の狭帯域ストークス光の生成方式においては、空間光変調器の代わりに所定位置に開口部を有するスリットを用いたり、グレーティングの代わりにプリズムを用いたりしてもよい。また、ストークス光のピーク波長を変更する必要がない場合は、制御部１８Ｈを省略した構成も可能である。
【００９１】
上記例は、広帯域の光の波長領域中の一部分を切り出して複数のピークを有する狭帯域のストークス光を生成するものであったが、これとは異なる方法で複数のピークを有する狭帯域のストークス光を生成してもよい。例えば、複数の光源を用いて狭帯域ストークス光Ｌｓｎを生成してもよく、この方式を第４の狭帯域ストークス光の生成方式として、図１０を参照しながら説明する。
【００９２】
すなわち、互いに異なる波長の超短パルス光を射出する複数種類のレーザ光源Ｌｅａ、Ｌｅｂ・・・と、各レーザ光源Ｌｅａ、Ｌｅｂ・・・から超短パルス光を射出させるタイミングを定める同期信号Ｓｇを発生する同期信号発生部Ｓｙとを用意する。
【００９３】
同期信号発生部Ｓｙの同期信号Ｓｇに同期させて各レーザ光源Ｌｅａ、Ｌｅｂ・・・から超短パルス光を射出させる。
【００９４】
複数のレーザ光源Ｌｅａ、Ｌｅｂ・・・から射出させた超短パルス光である、互いに異なる波長を持つ各光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・の一部または全部を光遅延部Ｄｅａ、Ｄｅｂ・・・（ディレイライン）および減衰器Ａｔａ、Ａｔｂ・・・（ＡＴＴ：アッテネータ）に通して、各光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・の被検粒子への照射タイミングを同期させるとともにそれらの光強度を調節する。
【００９５】
その後、各光成分Ｌｎａ、Ｌｎｂ・・・を複数のビームスプリッターＢｐａ、Ｂｐｂ・・・へ通して合波させ、第３の狭帯域ストークス光Ｌｓｎを生成する。
【００９６】
すなわち、上記のように光源部を構成し、複数のレーザ光源から射出させた超短パルス光を合成することにより、互いに異なる波長を持つ複数のピークを有する狭帯域ストークス光を生成することができる。なお、上記複数のレーザ光源それぞれは、広帯域のストークス光Ｌｓｗの波長範囲内のより狭い波長範囲に定められた超短パルス光を射出するものである。これにより、互いに波長が隣り合う２つのピークの間の各波長範囲内に、非線形ラマン散乱光を実質的に発生させない光強度となる波長範囲を有する狭帯域ストークス光を生成することができる。
【００９７】
なお、光源部２２１においても、光減衰器１９ｂによりポンプ光の平均パワーが被検粒子で３０ｍＷ以下となるように調節され、光減衰器１９ａにより複数のピークを有するストークス光の総和の平均パワーが被検粒子で３０ｍＷ以下となるように調節される。
【００９８】
次に、図１１を参照しながら、本発明の第３の実施形態にかかる粒子分析装置３００について説明する。基本的に、粒子分析装置３００は、走査光学系を備えて励起光を細胞８上で走査させ、細胞８の画像を生成可能にした点が、粒子分析装置２２０と異なる。粒子分析装置３００は、粒子分析装置２２０と比べて、照射光学系と分析部の構成が異なる。
【００９９】
粒子分析装置３００の照射光学系３０２は、対物レンズ２１と、対物レンズ２１より上流側に配置されたポリゴンミラー３４２とを有する。ポリゴンミラー３４２は走査光学系を構成するものであり、所定軸の周りに配置された複数の反射面を回転することにより光を偏向して走査を行う。光源部２０１からの光はポリゴンミラー３４２により偏向されて対物レンズ２１により細胞８上に集光されて、細胞８上を走査する。なお、使用可能な走査光学系は、ポリゴンミラーに限定されず、例えばガルバノミラー等、別の構成を用いることも可能である。
【０１００】
図１２Ａ、図１２Ｂは、走査により細胞８上に形成される照射スポット９を例示したものである。図１２Ａに示すように、一連の照射スポット９により細胞８上に形成される走査線１０は１本でもよく、あるいは図１２Ｂに示すように複数本でもよい。または、照射スポット９間の間隔を狭くして、細胞８の画像を取得可能なように２次元的に走査するようなものでもよい。走査は、試料液７１の流れの方向（図１２Ａ、図１２Ｂの矢印方向）と交わる方向に複数の照射スポット９が位置するように行われる。なお、図１２Ａ、図１２Ｂに示す細胞８、照射スポット９のサイズは必ずしも実際のものと一致するものではない。
【０１０１】
走査光学系を有しない粒子分析装置１００、２００においても、照射時間の間隔と試料液７１の流速を設定することにより、試料液７１の流れ方向において１つの細胞８について複数の照射スポットを形成することは可能である。しかし、粒子分析装置１００、２００では、試料液７１の流れ方向の一次元的な観測となる。これに対して、本実施形態の粒子分析装置３００では、試料液７１の流れの方向と交わる方向に走査するものであるため、２次元的な観測が可能となる。
【０１０２】
粒子分析装置３００の分析部３０５は、画像処理部３５２を備えている。画像処理部３５２は、検出部３０４から出力された信号を用いて細胞８の画像を生成し、表示部６に表示させる。なお、画像処理部３５２を分析部３０５とは別に設けて、両者を接続する構成としてもよい。
【０１０３】
上記構成の粒子分析装置３００によれば、細胞８内の複数点観測が可能になり、情報量が増加するとともに検出の信頼度が向上する。また、２次元的に走査した場合は、細胞８内における各分子の分布状態が観測可能になり、画像処理部３５２により、この分布状態を可視化することができる。
【０１０４】
従来、位相差顕微鏡を用いて非染色で細胞の画像を取得する方法もあるが、これでは位相差に寄与するものの情報しか得られない。例えば、異なる分子であっても、照明光に対して同じ位相差を有するものであれば、観察像には同じものとして現れる。これに対して、本実施形態の粒子分析装置３００は、分子レベルで細胞を分析しているため、異なる分子は異なるものとして発現される。さらに、異なる分子は異なる機能を有するため、粒子分析装置３００によれば、機能に基づいた画像の取得が可能である。
【０１０５】
次に、図１３を参照しながら、本発明の第４の実施形態にかかる粒子分析装置４００について説明する。基本的に、粒子分析装置４００は、粒子分析装置３００と比べて、照射光学系と検出部の構成が異なる。粒子分析装置４００の照射光学系は、粒子分析装置３００の走査光学系の代わりに複数のビームを発生させるビーム変換素子を用いたものである。
【０１０６】
粒子分析装置４００の照射光学系４０２は、対物レンズ２１と、対物レンズ２１より上流側に配置されてビーム変換素子として機能するマイクロレンズアレイ４２２とを有する。マイクロレンズアレイ４２２は、複数の微小レンズが並設された構成を有する。光源部２０１から一本のビームとして出射された２つの励起光は、このマイクロレンズアレイ４２２を通過することにより、複数のビームに変換される。
【０１０７】
そして、このようにして生成された複数のビームは、対物レンズ２１によって収束された後に細胞８上に同時に照射されて、図１４に示すように複数の照射スポット４０９を同時に形成する。これにより、細胞８の複数の部分からＣＡＲＳ光が同時に発せられる。なお、複数の照射スポット４０９は、試料液７１の流れの方向と交わる方向（図１４の矢印方向）に位置し、より好ましくは試料液７１の流れの方向と直交する方向に位置する。
【０１０８】
粒子分析装置４００の検出部４０４は、複数の照射スポットに関する軸と、分光された波長軸との２軸が必要なため、平面ディテクタである２次元検出器により構成される。
【０１０９】
上記構成の粒子分析装置４００によれば、細胞８の複数点観測が同時に可能となるため、分析のスループットを向上させることができる。
【０１１０】
次に、図１５を参照しながら、本発明の第の５実施形態にかかる粒子分析装置５００について説明する。基本的に、粒子分析装置５００は、粒子分析装置４００と比べて、照射光学系の構成が異なり、走査光学系の代わりに略線状のビームを発生させるビーム変換素子を用いたものである。
【０１１１】
粒子分析装置５００の照射光学系５０２は、対物レンズ２１と、対物レンズ２１より上流側に配置されてビーム変換素子として機能するシリンドリカルレンズ５２２とを有する。シリンドリカルレンズ５２２は、光軸に垂直な面内の一方向にのみ収束作用を有し、これに直交する方向にはパワーを持たないレンズである。光源部２０１から一本のビームとして出射された２つの励起光は、このシリンドリカルレンズ５２２を通過することにより、線状のビームに変換される。
【０１１２】
そして、このようにして生成された線状のビームは、対物レンズ２１によって収束された後に細胞８上に照射されて、図１６に示すように略線状の照射領域５０９を形成する。照射領域５０９は、長軸方向が試料液７１の流れの方向と交わる方向（図１６の矢印方向）にあり、より好ましくは試料液７１の流れの方向と直交する方向である。また、細胞８の全域を照射するためには、照射領域５０９の長軸方向の長さが細胞８の最長部の長さより長いことが好ましい。
【０１１３】
上記構成の粒子分析装置５００によれば、細胞８がフローセル７５内を流れることにより、細胞８上を２次元的に走査することができる。また、略線状の照射領域５０９を形成する粒子分析装置５００は、照射スポットを走査させる粒子分析装置３００よりも短時間で細胞８を走査することができるので、細胞の画像を取得する時間を短縮化することができる。
【０１１４】
なお、第３〜第５の実施形態において説明したような、走査光学系やビーム変換素子を用いた構成は、第１の実施形態や第２の実施形態の粒子分析装置にも同様に適用可能である。なお、第４、第５の実施形態のビーム変換素子を第１の実施形態に適用する場合は、検出部として１次元検出器（ラインディテクタ）を用いることが好ましい。
【０１１５】
図１７に、本発明の第２の実施形態にかかる粒子分析装置２００において取得されるラマンスペクトルの一例を示す。図１７の横軸は波数（＝１ｃｍ／波長、すなわち、１センチメートルあたりの波の数。単位はカイザー）、縦軸は相対信号強度である。横軸の波数は、励起光の振動数とＣＡＲＳ光の振動数との差に対応し、一般にラマンシフトと呼ばれる量である。縦軸の相対信号強度はＣＡＲＳ光の光強度に対応する。
【０１１６】
図１７のＮは正常部位から得られたラマンスペクトルであり、図１７のＡＮは癌部位から得られたラマンスペクトルである。癌細胞に関連した細胞の構成要素としては、アミドＩ、アミドＩＩＩ、脂質由来物質が下記のラマンシフトを有することが知られている。
【０１１７】
アミドＩ    ：１６５５〜１６７０ｃｍ−１
アミドＩＩＩ：１２６５〜１２８０ｃｍ−１
脂質由来物質：１４４０〜１４５０ｃｍ−１
：２８００〜２８８０ｃｍ−１
：２８９０〜２９７０ｃｍ−１
図１７では、ガイドのため、上記ラマンシフトに見られる各ピークに縦軸、横軸に平行な点線を付している。図１７のＡＮでは、上記のアミドＩ、アミドＩＩＩ、脂質由来物質に対応する波数において強度の大きい鋭いピークが見られるが、図１７のＮではこれらの波数におけるピークは強度が小さく鈍った形状となっている。上記の癌細胞に関連した構成要素は癌細胞にも正常細胞にも存在するが、細胞が癌化すると細胞内で構成バランスが崩れ、ラマンスペクトル強度が相対的に変化する。この相対的な変化を検出することにより癌細胞と正常細胞を区別することができる。
【０１１８】
上記実施形態で示したような粒子分析装置は、例えば、組織に含まれる正常細胞と癌細胞を分離する際に使用可能である。医療現場等においては、癌細胞が含まれると思われる組織をその周辺領域とともに摘出し、細胞分離試薬により組織から単体の細胞に分離することが行われている。分離された細胞群には正常細胞と癌細胞の両方が存在する。正常細胞と癌細胞では、上述したようにラマンスペクトルが異なるため、本発明の粒子分析装置によれば、非染色で正常細胞と癌細胞を分離することができる。従来の蛍光を用いた分析装置に比べて細胞へのダメージは軽減されるため、分取した癌細胞を培養して株化細胞の作製や、抗癌剤の効果検証等の実験に用いることができる。例えば、培養した細胞を分析して、細胞の大きさや構造に関する情報を得ることにより、細胞の周期を測定することができる。
【０１１９】
また、本発明の粒子分析装置は、癌腫瘍を摘出する際の判断材料を提供することも可能である。癌腫瘍の摘出手術では、癌細胞が患者の身体に残存すると再発の可能性が高まり好ましくないが、再発を恐れるあまり、過剰に組織を切除するのも患者の身体の負担が増大し好ましくない。そこで、摘出腫瘍が接していた領域の組織を微少量切り取り、細胞分離試薬により単体の細胞に分離した後、本発明の粒子分析装置を用いて、癌細胞の有無を調べる。癌細胞が検出された場合はさらなる切除が必要と判断し、癌細胞が検出されなかった場合は摘出が十分であったと判断することができる。
【０１２０】
上記の株化細胞の作製や、抗癌剤の効果検証は、細胞が新鮮なうちに培養を始める必要がある。また、上記の癌腫瘍の摘出の判断は手術中に短時間で行う必要がある。すなわち、大量の細胞の分析や分取を短時間で行う必要があり、スループットが高い粒子分析装置は有用である。
【０１２１】
また、上述した実施形態の粒子分析装置の用途としては、赤血球、白血球等の血球細胞の分類にも用いることができる。その際には、赤血球に含まれるヘモグロビン量の分析や、５種類の白血球（好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球）の分類を行うことができる。この５種類の白血球は、形状が異なるだけでなく、独自の機能を有し、病気により増減する種類が違うため、各種類の増減数を調べて診断材料とすることができる。
【０１２２】
以上、本発明による粒子分析装置および方法の好ましい実施の形態について説明したが、本発明は上記実施の形態に限定されるものではなく、発明の要旨を変更しない限りにおいて、種々変更することが可能である。
【０１２３】
例えば、上記実施形態では、測定対象を分取するセルソーター型のフローサイトメーターを例にとり説明したが、本発明は分取機能を持たないアナライザ型のフローサイトメーターにも適用可能である。また、上記実施形態では、フローセル内を流れる被検粒子に光を照射して分析する例について説明したが、フローセルで覆われてない試料液流中の被検粒子に光を照射して分析するジェット・イン・エア方式のフローサイトメーターにも適用可能である。
【０１２４】
上記実施形態では、１つのレーザから２つの励起光を発生させる例について説明したが、２つの励起光用にそれぞれ個別のレーザを用いてもよい。また、励起光は２つに限らず、３以上の励起光を用いてもよい。また、上記実施形態では、励起光を被検粒子に同時に入射させる例について説明したが、測定対象の分子の固有振動の周期によっては、複数の励起光を時間遅延させて入射させるようにしてもよい。
【０１２５】
なお、上記実施形態では、非線形ラマン散乱光として、ＣＡＲＳ光を例にとり説明したが、別の散乱光、例えば、誘導ラマン散乱光やハイパーラマン散乱光等を用いることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】本発明の第１の実施形態による粒子分析装置の概略構成図
【図２】ＣＡＲＳ光の発生過程のエネルギー準位図
【図３】本発明の第２の実施形態による粒子分析装置の概略構成図
【図４】広帯域ストークス光、ポンプ光、およびＣＡＲＳ光の各スペクトルの一例を示す図
【図５】本発明の第２の実施形態の変形例による粒子分析装置の概略構成図
【図６】狭帯域ストークス光、ポンプ光、およびＣＡＲＳ光の各スペクトルの一例を示す図
【図７】第１の狭帯域ストークス光の作成方式を説明するための図
【図８】第２の狭帯域ストークス光の作成方式を説明するための図
【図９】第３の狭帯域ストークス光の作成方式を説明するための図
【図１０】第４の狭帯域ストークス光の作成方式を説明するための図
【図１１】本発明の第３の実施形態による粒子分析装置の概略構成図
【図１２Ａ】本発明の第３の実施形態にかかる照射スポットの一例を示す図
【図１２Ｂ】本発明の第３の実施形態にかかる照射スポットの別の例を示す図
【図１３】本発明の第４の実施形態による粒子分析装置の概略構成図
【図１４】本発明の第４の実施形態にかかる照射スポットの一例を示す図
【図１５】本発明の第５の実施形態による粒子分析装置の概略構成図
【図１６】本発明の第５の実施形態にかかる照射領域の一例を示す図
【図１７】ラマンスペクトルの一例を示す図
【符号の説明】
【０１２７】
１、２０１、２２１    光源部
２、３０２、４０２、５０２    照射光学系
３    受光光学系
４、２０４、４０４    検出部
５、３０５    分析部
６    表示部
７    フロー部
９、４０９    照射スポット
１０    走査線
１１    レーザ
１２    ＯＰＯ
１３    ディレイライン
１４ａ、１４ｂ    ビームスプリッター
１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ    ミラー
１８    狭帯域化部
１８Ｈ    制御部
１９ａ、１９ｂ    光減衰器
２１、３１    対物レンズ
３２    カットフィルタ
３３    ショートパスフィルタ
３４    ミラー
７１    試料液
７２    試料液供給部
７３    シース液
７４    シース液供給部
７５    フローセル
７６    分取制御部
７７ａ、７７ｂ    偏向板
７８    液滴
１００、２００、２２０、３００、４００、５００    粒子分析装置
２１２    ＰＣＦ
２１６    バンドパスフィルタ
２１７    ロングパスフィルタ
３４２    ポリゴンミラー
３５２    画像処理部
４２２    マイクロレンズアレイ
５０９    照射領域
５２２    シリンドリカルレンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図７】
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【図９】
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