(57)【要約】【課題】非特異的吸着が少なく安定したタンパク質固定化方法の提供。【解決手段】タンパク質のＣ末端側にＬＰＸＴＧで示されるアミノ酸配列を有するペプチドを導入し、該ペプチドが導入されたタンパク質を、ソルテースの存在下で固相担体と接触させ、該固相担体に結合させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＰＸＴＧ（Ｌはロイシン、Ｐはプロリン、Ｘは任意のアミノ酸、Ｔはスレオニン、Ｇはグリシンを表す）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、ソルテースの存在下で高分子多糖を含む固相担体と接触させ、該固相担体に結合させる工程を含むタンパク質の固定化方法。
【請求項２】
タンパク質の固定化方法であって、
該タンパク質のＣ末端側にＬＰＸＴＧ（Ｌはロイシン、Ｐはプロリン、Ｘは任意のアミノ酸、Ｔはスレオニン、Ｇはグリシンを表す）で示されるアミノ酸配列を導入する工程；および
該ペプチドが導入されたタンパク質を、ソルテースの存在下で高分子多糖を含む固相担体と接触させ、該固相担体に結合させる工程
を含む方法。
【請求項３】
ソルテースがStaphylococcus aureus由来ソルテースＡである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
Ｘがリジンを表する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が生物活性を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が酵素である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が酵素と他のタンパク質との融合タンパク質である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
他のタンパク質がマルトース結合タンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
酵素が糖転移酵素である、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
糖転移酵素がβ−１,４−ガラクトシルトランスフェラーゼまたはα−２,６−シアリルトランスフェラーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
高分子多糖を含む固相担体がその表面に１級アミノ基を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
高分子多糖を含む固相担体がアガロース誘導体またはセルロース誘導体からなる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法によって得られるタンパク質固定化担体。
【請求項１４】
式：Ｒ1−ＬＰＸＴ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ
（式中、Ｒ1は任意のアミノ酸配列を表し、Ｌはロイシン、Ｐはプロリン、Ｘは任意のアミノ酸、Ｔはスレオニンを表し、Ｙは高分子多糖を含む固相担体を表す）
で示される、タンパク質固定化担体。
【請求項１５】
Ｒ1が生物活性を有するタンパク質である、請求項１４に記載のタンパク質固定化担体。
【請求項１６】
Ｒ1が酵素である、請求項１５に記載のタンパク質固定化担体。
【請求項１７】
Ｒ1が酵素と他のタンパク質との融合タンパク質である、請求項１５に記載のタンパク質固定化担体。
【請求項１８】
他のタンパク質がマルトース結合タンパク質である、請求項１７に記載のタンパク質固定化担体。
【請求項１９】
酵素が糖転移酵素である、請求項１６〜１８のいずれかに記載のタンパク質固定化担体。
【請求項２０】
糖転移酵素がβ−１,４−ガラクトシルトランスフェラーゼまたはα−２,６−シアリルトランスフェラーゼである、請求項１９に記載のタンパク質固定化担体。
【請求項２１】
Ｘがリジンを表する、請求項１４〜２０のいずれかに記載のタンパク質固定化担体。
【請求項２２】
高分子多糖を含む固相担体がアガロース誘導体またはセルロース誘導体からなる、請求項１４〜２１のいずれかに記載のタンパク質固定化担体。
【請求項２３】
式：Ｒ2−ＬＰＸＴＧ−Ｚｎ
（式中、Ｒ2は酵素または酵素と他のタンパク質との融合タンパク質を含み、Ｌはロイシン、Ｐはプロリン、Ｘは任意のアミノ酸、Ｔはスレオニン、Ｇはグリシンを表し、Ｚはそれぞれ独立して任意のアミノ酸を表し、ｎは０または１以上の整数を表す）
で示される、化合物。
【請求項２４】
酵素が糖転移酵素である、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
糖転移酵素がβ−１,４−ガラクトシルトランスフェラーゼまたはα−２,６−シアリルトランスフェラーゼである、請求項２４に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質の固定化方法、特に酵素の固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素の固定化の手法として、従来より、酵素の反応性官能基を担体表面の反応し得る官能基と化学的に反応させて共有結合により結合することは行われているが、担体に対する酵素の結合部位が非特異的であるため、十分な活性発現率が得られないという問題があった。
【０００３】
一方、タンパク質の部位特異的固定化の手法として、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−アミロースやビオチン−アビジンなどのタンパク質のアフィニティーを利用した方法が知られているが、担体との結合は共有結合ではなく、より安定した固定化方法が望まれていた。
【０００４】
タンパク質の安定した部位特異的固定化を志向して、酵素を利用したタンパク質の修飾法が検討されている。そのような修飾法として、グルタミン残基に特異的に修飾可能なトランスグルタミナーゼ（非特許文献１）、スプライシングタンパク質であるインテイン（非特許文献２）、翻訳後修飾のひとつであるC末端システイン残基へのプレニル化を触媒するファルネシル転移酵素（非特許文献３）などを用いた手法が報告されている。しかし、これらの手法では十分な特異性が得られなかったり、複雑な基質の合成を必要としたりしていた。
【０００５】
ソルテース（Sortase）は、グラム陽性菌の表面に存在するトランスペプチダーゼであり、細胞内より分泌されてきた特定のタンパク質を細胞壁に担持する役割を担っている。ソルテースは分泌タンパク質のC末端領域にある共通配列を認識し、特定の部位で切断した後、基質タンパク質とアシル中間体を形成する。次に細胞壁前駆体であるRipid IIに含まれるペンタグリシンがアシルアクセプターとなってアミド結合を形成することにより、基質タンパク質が細胞壁に担持される（非特許文献４）。
【０００６】
最近、Staphylococcus aureus由来ソルテースＡの反応メカニズムを利用し、部位特異的にペプチド−ペプチド、タンパク質−ペプチドおよびタンパク質−タンパク質を結合する手法が報告された（非特許文献５）。しかし、これらの結合にはアシルアクセプターとして天然型のグリシンが１残基以上必要であった。また、最近、ソルテースを用いたグリシン残基を含まない非天然のアクセプターを利用した固定化方法が報告された（非特許文献６）。ここでは、ソルテースを利用して部位特異的に共有結合による固定化がなされていたが、固定化効率の評価はなく、使用した担体への非特異的な吸着が多いなどの問題点があった。
【０００７】
【非特許文献１】Biochemistry 35 13072 1996, JACS 126 14013 2004
【非特許文献２】Angew.Chem.int.Ed 45 4286 2006
【非特許文献３】JACS 128 9274 2006
【非特許文献４】Microbiol.Mol.Biol.Rev. 70 192 2006
【非特許文献５】JACS 126 2670 2004
【非特許文献６】Bioconjugate Chem., 18 (2), 469−476, 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、非特異的吸着が少なく、より安定したタンパク質の固定化方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、
（１）ＬＰＸＴＧ（Ｌはロイシン、Ｐはプロリン、Ｘは任意のアミノ酸、Ｔはスレオニン、Ｇはグリシンを表す）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、ソルテースの存在下で高分子多糖を含む固相担体と接触させ、該固相担体に結合させる工程を含むタンパク質の固定化方法；
（２）タンパク質の固定化方法であって、
該タンパク質のＣ末端側にＬＰＸＴＧ（Ｌはロイシン、Ｐはプロリン、Ｘは任意のアミノ酸、Ｔはスレオニン、Ｇはグリシンを表す）で示されるアミノ酸配列を導入する工程；および
該ペプチドが導入されたタンパク質を、ソルテースの存在下で高分子多糖を含む固相担体と接触させ、該固相担体に結合させる工程
を含む方法；
（３）ソルテースがStaphylococcus aureus由来ソルテースＡである、上記（１）または（２）記載の方法；
（４）Ｘがリジンを表する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法；
（５）前記タンパク質が生物活性を有する、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法；
（６）前記タンパク質が酵素である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法；
（７）前記タンパク質が酵素と他のタンパク質との融合タンパク質である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法；
（８）他のタンパク質がマルトース結合タンパク質である、上記（７）記載の方法；
（９）酵素が糖転移酵素である、上記（６）〜（８）のいずれかに記載の方法；
（１０）糖転移酵素がβ−１,４−ガラクトシルトランスフェラーゼまたはα−２,６−シアリルトランスフェラーゼである、上記（９）記載の方法；
（１１）高分子多糖を含む固相担体が、その表面に１級アミノ基を有する、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）高分子多糖を含む固相担体がアガロース誘導体またはセルロース誘導体からなる、上記（１１）記載の方法；
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法によって得られる、タンパク質固定化担体；
（１４）式：Ｒ1−ＬＰＸＴ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ
（式中、Ｒ1は任意のアミノ酸配列を表し、Ｌはロイシン、Ｐはプロリン、Ｘは任意のアミノ酸、Ｔはスレオニンを表し、Ｙは高分子多糖を含む固相担体を表す）
で示される、タンパク質固定化担体（ここで、式中の「−ＣＯ−」は、Ｔ由来のカルボニル基であり、式中の「−ＮＨ−」はＹのアミノ基に由来する）；
（１５）Ｒ1が生物活性を有するタンパク質である、上記（１４）記載のタンパク質固定化担体；
（１６）Ｒ1が酵素である、上記（１５）記載のタンパク質固定化担体；
（１７）Ｒ1が酵素と他のタンパク質との融合タンパク質である、上記（１５）記載のタンパク質固定化担体；
（１８）他のタンパク質がマルトース結合タンパク質である、上記（１７）記載のタンパク質固定化担体；
（１９）酵素が糖転移酵素である、上記（１６）〜（１８）のいずれかに記載のタンパク質固定化担体；
（２０）糖転移酵素がβ−１,４−ガラクトシルトランスフェラーゼまたはα−２,６−シアリルトランスフェラーゼである、上記（１９）記載のタンパク質固定化担体；
（２１）Ｘがリジンを表する、上記（１４）〜（２０）のいずれかに記載のタンパク質固定化担体；および
（２２）高分子多糖を含む固相担体がアガロース誘導体またはセルロース誘導体からなる、上記（１４）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質固定化担体
である。
（２３）式：Ｒ2−ＬＰＸＴＧ−Ｚｎ
（式中、Ｒ2は酵素または酵素と他のタンパク質との融合タンパク質を含み、Ｌはロイシン、Ｐはプロリン、Ｘは任意のアミノ酸、Ｔはスレオニン、Ｇはグリシンを表し、Ｚはそれぞれ独立して任意のアミノ酸を表し、ｎは０または１以上の整数を表す）
で示される、化合物。
（２４）酵素が糖転移酵素である、上記（２３）に記載の化合物。
（２５）糖転移酵素がβ−１,４−ガラクトシルトランスフェラーゼまたはα−２,６−シアリルトランスフェラーゼである、上記（２４）に記載の化合物。
（２６）ＺｎがＨｉｓ−Ｔａｇである、上記（２３）〜（２５）のいずれかに記載の化合物。
【発明の効果】
【００１０】
通常の化学的固定化方法では活性回収率、活性発現率が低いタンパク質においても部位特異的で、非特異吸着が少なく、安定な固定化酵素を調製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本明細書中、ＬＰＸＴＧで示されるアミノ酸配列とは、ロイシン、プロリン、任意のアミノ酸、スレオニンおよびグリシンからなるアミノ酸配列（以下、「ＬＰＸＴＧモチーフ」と称する場合もある）を意味する。Ｘで示されるアミノ酸としてはタンパク質を構成する任意のアミノ酸が挙げられ、具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンからなる群から選択される。
【００１２】
本発明の方法において用いられるソルテースは、ＬＰＸＴＧモチーフを認識してスレオニン残基とグリシン残基との間を切断し、そこへＧｌｙ−Ｇｌｙ末端を有する別のタンパク質／ペプチドを連結する反応を触媒する。本発明の方法において用いられる好ましいソルテースとしては、例えば、Staphylococcus aureus由来のソルテースＡ（J. Biol. Chem. 2004 279: 31383−31389）が挙げられる。
【００１３】
本明細書中、「固相担体」とは、本発明の方法により固定化されるタンパク質を担持するための反応媒体に不溶な固体の支持体である。本発明の固相担体は、ビ−ズ、チュ−ブ、ファイバーまたはプレ−ト等の任意の形状をとることができる。本発明の固相担体は、本発明の方法によって固定化されるタンパク質と反応し得る活性な基を表面に有する。そのような活性な基としては、例えばアミノ基、より好ましくは一級アミノ基、が挙げられる。本発明の固相担体は、例えば、高分子多糖（例えば、アガロースやセルロースなど）、無機材料（例えば、磁気ビーズ、シリカ、ガラス、セラミックなど）、合成樹脂（例えば、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、これらの共重合体または修飾体など）、天然樹脂（ラテックスなど）などの材料から、当分野において周知の方法によって誘導することができる。本発明の方法において好ましい固相担体としては、高分子多糖を含む固相担体が挙げられる。当分野で一般に使用されている市販品は本発明の固相担体として使用することができ、また、必要に応じてこれら市販品の担体表面に存在する官能基に適当な修飾を加えることもできる。
【００１４】
本発明において用いることができる市販で入手可能な固相担体の例としては、例えば、アミノーセルロファイン（セルロース、生化学工業）、EAH−セファロース（アガロース、GEヘルスケア バイオサイエンス）、アフィゲル102（アガロース、バイオラッド）、MagnaBind（磁気ビーズ、PIERCE）、B−2021（シリカ、オルガノ）、LCA−CPG（シリカガラス、ミリポア）、BioMag（磁気ビーズ、Polysciences）、200−A（セラミックス、東洋電化）、Therma−Max Lam Amine（磁気ビーズ、マグナビート社）、WA−20（架橋ポリスチレン、三菱化学）、CR−20（架橋ポリスチレン、三菱化学）、ＥＬＩＳＡ用プレート（住友ベークライト）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
本発明の方法は、任意のタンパク質を固相担体に固定化することができる。本発明の方法により固定化されるタンパク質としては、例えば、酵素、抗原、抗体、生体内の情報伝達に関与するタンパク質ホルモンや受容体等、生物活性を有するタンパク質またはそれらの断片が挙げられる。
【００１６】
本発明の一態様では、本発明の方法により固定化されるタンパク質は酵素である。そのような酵素としては、例えば、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、リガーゼ、糖転移酵素等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１７】
さらなる態様では、本発明のタンパク質は、酵素と他のタンパク質との融合タンパク質であってよい。他のタンパク質としては、チオレドキシン、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、およびマルトース結合タンパク質等が挙げられる。本発明においては、大腸菌由来のタンパク質であるマルトース結合タンパク質との融合タンパク質が特に好ましい。マルトース結合タンパク質は、大腸菌における高発現が期待でき、アミロースを保持した担体に結合しマルトースで溶出することにより容易に精製できるので、タンパク質発現用のタグとして市販され広く用いられている（NEW ENGLAND BioLabs）。
【００１８】
本発明の方法において、ＬＰＸＴＧで示されるアミノ酸配列を有するペプチドを導入する工程は、固定化するタンパク質に該ペプチドを化学的ライゲーションにより連結させるか、あるいは遺伝子クローニング等の手法を用いて該タンパク質と該ペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを調製し適当な発現系において発現させた後、得られた組換えタンパク質を単離することによって行うことができる。ＬＰＸＴＧで示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくは、タンパク質の活性部位に影響を及ぼさない位置、例えばＣ末端側に導入する。固定化されるタンパク質が既にＬＰＸＴＧモチーフを有している場合は、ＬＰＸＴＧモチーフを導入する工程を省略し、本発明の方法にそのまま使用することができる。
【００１９】
上記のとおりＬＰＸＴＧモチーフが導入されたタンパク質は、ソルテースの存在下で固相担体と接触させて該固相担体に結合させることができる。ＬＰＸＴＧモチーフを導入したタンパク質と固相担体は、水性媒体中、ソルテースの酵素活性に適した条件下、例えばpＨ３〜１０、０〜５０℃にて、少なくとも０．５時間接触させる。「水性媒体」とは、ソルテースの酵素活性に必要なカルシウムイオンを供給するための適当なカルシウム源（例えば、塩化カルシウム、炭酸カルシウム等）を含む水溶液である。また、ソルテースの酵素活性に適当な条件を達成、維持するため、適宜、緩衝液、安定化剤等の成分を添加してもよい。
【実施例】
【００２０】
以下に記載する実施例により、本発明をさらに詳細に記載する。
【００２１】
実施例１
ＬＰＸＴＧモチーフを有するタンパク質（ＭＢＰ−ＧａｌＴ）の調製
J.Biosci. Bioeng 91 85 2001に記載の方法に従い、ヒト腎臓ｃＤＮＡよりβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）をクローニングし、ｐＭａｌ−ｐ２Ｘベクターに導入した。プライマー１：ggagaattccggaccggagggg（配列番号１）およびプライマー２：tagctcgaggccggtttccggaaggtcgacgctcggtgtcccgatgtc（配列番号２）を用い、ＧａｌＴ遺伝子を増幅後、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、ｐＥＴ−２３ｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ間に導入した。さらに、上記プライマー１、およびプライマー３：acgaagctttcagtggtggtggtggtggtgctcgaggccggtttcc（配列番号３）を用い、ＧａｌＴ遺伝子を増幅後、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＭａｌ−ｐ２ＸのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間に導入し、ＬＰＸＴＧモチーフを有するマルトース結合蛋白質とＧａｌＴとの融合蛋白質（ＭＢＰ−ＧａｌＴ）の発現プラスミドを構築した。構築したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ培地にて培養し、ＯＤ６５０の値が約０．７になった時点でＩＰＴＧを添加し、タンパク質の発現を誘導した。その後、２０℃で一晩培養した。菌体を破砕後、上清液をＮｉアフィニティークロマトグラフィー、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、ＭＢＰ−ＧａｌＴを単離した（図１参照）。
【００２２】
実施例２
ＭＢＰ−ＧａｌＴと担体との反応（１）
実施例１で得たＭＢＰ−ＧａｌＴと、表面に１級アミノ基を有する固相担体（ＥＡＨ−セファロース；ＧＥバイオサイエンス）とを、ソルテースの存在下で反応させた（１．７ｍｇ／ｍL ＭＢＰ−ＧａｌＴ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１５ｍｇ／ｍｌ ソルテース、３７℃）。反応の間、上清液をサンプリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、上清中のＭＢＰ−ＧａｌＴが経時的に減少し（図２）、ＭＢＰ−ＧａｌＴが担体に結合していることを示した。
【００２３】
実施例３
ＭＢＰ−ＧａｌＴとアミノ基を有する担体との反応（２）
ＭＢＰ−ＧａｌＴとＥＡＨ−セファロースをソルテースの存在下で反応させ（１．７ｍｇ／ｍL ＭＢＰ−ＧａｌＴ、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１５ｍｇ／ｍｌ ソルテース、３７℃、１４時間）、反応終了後の固相担体と上清液の活性を測定し、活性の分布を調べた。その結果、約３０％の活性が担体に認められた（図３）。ソルテース活性不在下で反応を行った場合（ソルテース無添加あるいはＥＤＴＡ添加）は、固相担体上にほとんど活性が認められなかった。
【００２４】
実施例４
ＭＢＰ−ＧａｌＴと各種担体との反応
ＭＢＰ−ＧａｌＴと市販のアミノ基を有する各種担体をソルテースの存在下で反応させた（１．７ｍｇ／ｍL ＭＢＰ−ＧａｌＴ、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１５ｍｇ／ｍL ソルテース、３７℃、１４時間）。担体への活性回収率と活性発現率を調べた。結果を以下の表に示す。
【表１】
2009055837.tif 000002
ＥＡＨ−セファロース、アフィゲル１０２、アミノセルロースファインを用いた場合、回収率も高く、非特異的吸着も少なかった。
【００２５】
実施例５
長期安定性
ＭＢＰ−ＧａｌＴとＥＡＨ−セファロースをソルテースの存在下で反応させ（１．７ｍｇ／ｍL ＭＢＰ−ＧａｌＴ、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１５ｍｇ／ｍL ソルテース、３７℃、１４時間）、担体を回収した。担体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄後、２５ｍＭ ＨＦＰＥＳ バッファー（ｐＨ７．５）、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に懸濁し、懸濁液のＧａｌＴ活性を測定した結果、１１８ｍＵ／ｍｌであった。約３ヶ月間、冷蔵保存後、測定した結果、活性は１０５ｍＵ／ｍｌであり、ほぼ活性を維持していた。
【００２６】
実施例６
繰り返し使用
上記実施例で得た固定化酵素（０．９ｍＵ）を添加して酵素反応を行い（０．５ｍＭ ４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、２．５ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ2、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００μｌ）、経時変化をＨＰＬＣで分析した。反応後、担体をよく洗浄し、同様の組成で再び反応を行った。同様に計５回反応させた。その結果、５回の反応中に活性の大幅な低下は認められなかった。
【００２７】
実施例７
ＬＰＸＴＧモチーフを有するタンパク質（ＭＢＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１）の調製
ヒト腎臓ｃＤＮＡよりα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６Ｇａｌ１）をプライマー：cctgtggacctgaagggcctg（配列番号４）およびプライマー：gcctgatggagaagagtgaggagcc（配列番号５）を用い増幅後、引き続きプライマー：aggaattccaggtgttaaagagtctggg（配列番号６）およびプライマー：aggtcgacgcagtgaatggtccggaagccag（配列番号７）を用い増幅した。得られた断片をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し、上記、ＭＢＰ−ＧａｌＴ発現プラスミドのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ間に挿入し、ＬＰＸＴＧモチーフを有するマルトース結合蛋白質とＳＴ６Ｇａｌ１との融合蛋白質（ＭＢＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１）の発現プラスミドを構築した。構築したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴＢ培地にて培養し、培養５．５時間後にＩＰＴＧを添加し、タンパク質の発現を誘導した。その後、２８℃で一晩培養した。菌体を破砕後、上清液をＮｉアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ＭＢＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１を単離した（図４参照）。
【００２８】
実施例８
ＭＢＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１と担体との反応
実施例７で得たＭＢＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１と、ＥＡＨ−セファロースを、ソルテースの存在下で反応させ（０．４ｍｇ／ｍL ＭＢＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１５ｍｇ／ｍｌ ソルテース、３７℃）、反応終了後の固相担体と上清液の活性を測定し、活性の分布を調べた。その結果、４２％の活性が担体に認められた。ソルテース阻害剤であるＥＤＴＡ存在下で反応を行った場合、固相担体上にはほとんど活性が認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明の方法は、例えば固定化酵素の製造に利用することができる。また、抗原や抗体、あるいは特定の機能性タンパク質などをスクリーニングするための分析用キットの製造にも利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＭＢＰ−ＧａｌＴの精製結果を示す。矢印はＭＢＰ−ＧａｌＴの存在を示す。Ｎｉ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ＵＦ＝Ｎｉアフィニティークロマトグラフィー後の遠心上清濃縮液、ＤＥＡＥ−ＵＦ＝ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー後の遠心上清濃縮液。
【図２】反応上清中のＭＢＰ−ＧａｌＴ量の経時的変化を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図３】反応終了後のＭＢＰ−ＧａｌＴの活性の分布を示す。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＭＢＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１の精製結果を示す。矢印はＭＢＰ−ＳＴ６Ｇａｌ１の存在を示す。
【図１】
2009055837.tif 000003
【図２】
2009055837.tif 000004
【図３】
2009055837.tif 000005
【図４】
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【配列表】
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