(57)【要約】【課題】本発明は、蓄電池でも駆動でき、小型、低価格で、屋外でも使用することができるマイクロプレートリーダー、及び測定対象物質の濃度を簡易に測定することができる濃度測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】上記課題を解決するために、ウェルに被測定液を充填するマイクロプレートがスライドする空間を設けた測定部と、前記被測定液に光りを照射する発光ダイオードと、前記被測定液を透過した透過光或いは被測定液からの励起光を受光するフォトダイオードと、前記フォトダイオードの電圧を表示する表示部を有する本体とからなることを特徴とするマイクロプレートリーダーの構成とした。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウェルに被測定液を充填するマイクロプレートがスライドする空間を設けた測定部と、前記被測定液に光りを照射する発光ダイオードと、前記被測定液を透過した透過光或いは被測定液からの励起光を受光するフォトダイオードと、前記フォトダイオードの電圧を表示する表示部を有する本体とからなることを特徴とするマイクロプレートリーダー。
【請求項２】
前記発光ダイオード及び前記フォトダイオードを前記測定部の枠中に埋設したことを特徴とする請求項１に記載のマイクロプレートリーダー。
【請求項３】
前記マイクロプレートと前記フォトダイオードの間に、特定の波長の光りのみを透過させるバンドパスフィルターを配置したことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のマイクロプレートリーダー。
【請求項４】
前記発光ダイオードの光りを光ファイバを介し被測定液に照射し、かつ透過光或いは励起光も光ファイバを通しフォトダイオードに照射されることを特徴とする請求項１〜請求項３の何れかに記載のマイクロプレートリーダー。
【請求項５】
前記マイクロプレートのウェルに対応した位置の外側に溝が形成された前記空間の幅に形成され、底部にスリットが設けられたホルダーの収納部にマイクロプレートを収納し、前記測定部の枠内部に、前記溝を係止するストッパー機構を有し、前記空間においてウェルの位置決めをさせながら前記ホルダーをスライドさせることを特徴とする請求項１〜請求項４の何れかに記載のマイクロプレートリーダー。
【請求項６】
前記ストッパー機構が、前記測定部の内部から突出し前記溝を係止するストッパーと、前記ストッパーの突出、陥入を調節するバネとからなることを特徴とする請求項５の何れかに記載のマイクロプレートリーダー。
【請求項７】
前記スライドが、手動であることを特徴とする請求項１〜請求項６の何れかに記載のマイクロプレートリーダー。
【請求項８】
前記発光ダイオード及び電圧表示部が蓄電池で駆動することを特徴とする請求項１〜請求項７の何れかに記載のマイクロプレートリーダー。
【請求項９】
前記本体に、外部コンピューターに測定データを出力するシリアル通信部を設けたことを特徴とする請求項１〜請求項８の何れかに記載のマイクロプレートリーダー。
【請求項１０】
前記発光ダイオードが青色で、かつ前記フォトダイオードの感度波長が４００〜５４０ｎｍの範囲であり、被測定液中の測定対象物質に反応する抗体に結合した酵素と反応した基質を、前記青色光で励起させ、或いは青色光の吸収を前記フォトダイオードの電圧値として測定することを特徴とする請求項１〜請求項９の何れかに記載のマイクロプレートリーダー。
【請求項１１】
前記測定対象物質が、ミクロシスチンであることを特徴とする請求項１０に記載のマイクロプレートリーダー。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１０の何れかに記載のマクロプレートリーダーで得られたフォトダイオードの電圧値と、測定対象物質の既知の濃度に対応した電圧値から予め求めた検量線とを比較し、被測定液中の測定対象物質の濃度を求めることを特徴とする物質の濃度測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被測定液（検体）中の特定の物質の濃度等を求める際に、測定物質に依存した光り（透過光、発光、励起光）の強度、経時的変化を測定する光検出器の１つであるマイクロプレートリーダー及びそれを用いた物質の濃度測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロプレートリーダーとは、マイクロプレート上の検体の透過光、微弱発光を光電子増倍管を用いた、生物・化学発光、蛍光、比色などをマイクロプレートを用いることで短時間で多検体の測定できる装置である。
【０００３】
マイクロプレートとは、測定液、反応液を注ぐ複数のウェル（穴）が連なった、少量の複数の検体を短時間で測定する光検出器（吸光度計、マイクロプレートリーダー）用のプレートである。
【０００４】
マイクロプレートリーダーとして、特許文献１に記載の光検出器がある。該光検出器は、組成物からの光を検出する装置であって、 試験領域において組成物を支持するステージと、 少なくとも二つの光源、及び、これら光源のうち一つの光源からの光を前記組成物に向ける第一の光学リレー構造体と、 検出器、及び、前記組成物からの光を該検出器に向ける第二の光学リレー構造体と、 前記第一の光学リレー構造体のアライメントを一の光源から別の光源に変更し、それにより、異なる応用のために異なる光源を選択して前記試験領域に向けることを可能とする第一のスイッチ機構と、を備えることを特徴とする（請求項１）。
【０００５】
また、前記光検出器は光源として発光ダイオード（請求項７５）、光検出器としてフォトダイオード（請求項７９）が採用されている。
【特許文献１】特表２００２−５０９２３５号公報
【０００６】
また、簡易な光検出器として、特許文献２に記載の簡易吸光度測定器がある。該簡易吸光度測定器は、波長域３５０〜８００ｎｍに複数の吸収ピークのある連続的な吸収スペクトルを有するピリジルアゾ−２−ナフトールまたはジメチルフェニルアゾ−２−ナフトール色素含浸フィルムの吸収スペクトルを計測するための光源部と受光部とを備えた簡易吸光度測定器において、波長４５０ｎｍ付近に相対発光強度のピークを有する発光ダイオードと、フタロシアン系青顔料及び／又は有機系紫顔料をバインダー樹脂に微分散した塗料を塗布した樹脂フィルム又はガラス板より成り、光透過率のピークが４０％以上で、３３０〜４８０ｎｍにあり、かつ２６０ｎｍ以下と５２０ｎｍ以上の光透過率が１％以下のバンドパスフィルターとを有し、上記発光ダイオードの光を上記フィルターに通して光源部からの照射光としたことを特徴とする（請求項１）。また受光部に、照射光の波長に感応し得るフォトダイオード、増幅器及びデジタル電圧表示器を備える請求項１記載の吸光度測定器（請求項２）の構成とする。
【特許文献２】特開平８−２１９８７５号公報
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載の光検出器は、大掛かりな装置であり、一般に電源は交流１００Ｖなど屋内に据え付けで使用することが前提である。従って、屋外、電源事情の悪い発展途上国で使用することは困難である。さらに、とても高価なものである。
【０００８】
また、特許文献２に記載の簡易吸光度測定器は、小型、簡易吸光度測定装置ではあるが、測定部分の構成は明らかではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、蓄電池でも駆動でき、小型、低価格で、屋外でも使用することができるマイクロプレートリーダー、及び測定対象物質の濃度を簡易に測定することができる濃度測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記の課題を解決するために、被測定液（検体９）を充填するウェル７ａが複数あるマイクロプレート７がスライドする空間２ｂを有する測定部２と、前記被測定液に光りを照射する発光ダイオード３と、前記被測定液を透過した透過光３ｄ或いは被測定液からの発光・励起光を受光するフォトダイオード４と、前記フォトダイオード４の電圧を表示するデジタル式表示部５ｆを有する本体５とからなることを特徴とするマイクロプレートリーダーの構成、
前記発光ダイオード３及び前記フォトダイオード４を前記測定部２の枠２ａ中に埋設したことを特徴とする前記マイクロプレートリーダーの構成、前記マイクロプレート７と前記フォトダイオード４の間に、特定の波長の光りのみを透過させるバンドパスフィルター２ｌを配置したことを特徴とする前記何れかに記載のマイクロプレートリーダーの構成、
前記発光ダイオード３の光りを光ファイバ２ｊを介し被測定液に照射し、かつ透過光３ｄ或いは発光・励起光も光ファイバ２ｊを通しフォトダイオード４に照射されることを特徴とする前記何れかに記載のマイクロプレートリーダーの構成、
前記マイクロプレート７のウェル７ａに対応した位置の外側に溝６ｃが形成された前記空間２ｂの幅に形成され、底部にスリット６ｂが設けられたホルダー６の収納部６ａにマイクロプレート７を収納し、前記測定部２の枠２ａ内部に、前記溝６ｃを係止するストッパー機構２ｎを有し、前記空間２ｂにおいてウェル７ａの位置決めをさせながら前記ホルダー６をスライドさせることを特徴とする前記何れかに記載のマイクロプレートリーダーの構成、
前記ストッパー機構２ｎが、前記測定部２の枠２ａ内部から突出し前記溝６ｃを係止するストッパー２ｆと、前記ストッパー２ｆの突出、陥入を調節するバネ２ｇとからなることを特徴とする前記記載のマイクロプレートリーダーの構成、
前記スライドが、手動であることを特徴とする前記何れかに記載のマイクロプレートリーダーの構成、
前記発光ダイオード３及び電圧表示部５ｆが蓄電池で駆動することを特徴とする前記何れかに記載のマイクロプレートリーダーの構成、前記本体５に、外部コンピューター８に測定データを出力するシリアル通信部５ｇを設けたことを特徴とする前記何れかに記載のマイクロプレートリーダーの構成、
前記発光ダイオード３が青色光で、かつ前記フォトダイオード４の感度波長が４００〜５４０ｎｍの範囲であり、被測定液中の測定対象物質に反応する抗体に結合した酵素と反応した基質を、前記青色光で励起させ、或いは青色光の吸収を前記フォトダイオード４の電圧値として測定することを特徴とする前記何れかに記載のマイクロプレートリーダーの構成、前記測定対象物質が、ミクロシスチンであることを特徴とする前記記載のマイクロプレートリーダーの構成とした。
また、前記何れかに記載のマクロプレートリーダーで得られたフォトダイオード４の電圧値と、測定対象物質の既知の濃度に対応した電圧値から予め求めた検量線とを比較し、被測定液中の測定対象物質の濃度を求めることを特徴とする物質の濃度測定方法の構成とした。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、以上の構成であるから以下の効果が得られる。マイクロプレートを用いて、簡易に、ＥＬＩＳＡ法によって、検体中の目的物質濃度を測定することができる。発光ダイオード、フォトダイオードを測定部中に埋設することで、微弱な光りも太陽光、蛍光灯等の外部光源により影響がない。さらに、バンドパスフィルターをマイクロプレートとフォトダイオードの間に配置させることにより、外部の光りに影響されることなく、目的の範囲の波長をフォトダイオードに照射させることができる。
【００１２】
測定部内の発光ダイオードの光り及び透過光が通るに貫通孔に光ファイバを装填することで、外部光源の光りの影響を一層低減させ、かつゴミ、塵等の被測定液へ混入、フォトダイオードへの付着を防止することができる。
【００１３】
溝を設けたマイクロプレートのストッパー機構を設けることで、マイクロプレート上のウェルを発光ダイオードの照射光下に確実に位置決めさせることができる。
【００１４】
前記スライドを手動とし、電源を蓄電池とすることで、小型で低廉、携帯性に優れたマイクロプレートリーダーを提供することができ、屋外、電源供給の不安定な地域においても、現地で物質濃度、吸光度等を測定することができる。採取直後から劣化する物質等の測定に特に有効なマイクロプレートリーダーを提供できる。
【００１５】
アオコ毒であるミクロシスチンの測定においては、ＬＣ−ＭＳを用いた測定が主流である。しかし、開発途上国においてＬＣ−ＭＳを用いたミクロシスチンの分析を行うことは、困難であり代替の方法としてＥＬＩＳＡ法の普及が検討されている。ＥＬＩＳＡ法では、吸光度を測定するためにマイクロプレートリーダーを用いるが、マイクロプレートリーダーは安定した商用電源を必要とし、高価であるため広く普及させることはやはり難しい。そこで、野外調査の現場にも持ち込め、どこにでもある乾電池で動作する吸光度計が望まれた。本発明であるマイクロプレートリーダーを用いることで、ミクロシスチンの分析をする際に、乾電池など蓄電池で作動する吸光度計を用いてＥＬＩＳＡ法による簡易分析を行うことで、調査現場において数時間で簡単に結果を知ることができる。このような用途は、分析機器の導入や分析技術が遅れている開発途上国において特に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
マイクロプレート７を収納し、前記マイクロプレート７のウェル７ａに対応した位置の外側に溝６ｃが形成され、底部にスリット６ｂが設けられ、測定部２の枠２ａの空間２ｂの幅に形成されたホルダー６と、被測定液を充填したホルダー６がスライドする空間２ｂを有し、前記測定部２の枠２ａ内部から突出し前記溝６ｃを係止するストッパー２ｆと、前記ストッパー２ｆの突出、陥入をバネ２ｇにより調節するストッパー機構２ｎを備えた測定部２と、
前記被測定液に光りを光ファイバ２ｊを介して照射する測定部２の枠２ａ内部に埋設された発光ダイオード３と、前記被測定液を透過した光りを光ファイバ２ｊを介して受光する測定部２の枠２ａ内部に埋設されたフォトダイオード４と、前記マイクロプレート７と前記フォトダイオード４の間に配置され前記発光ダイオード３の特定の波長の光りを透過させるバンドパスフィルター２ｌと、前記フォトダイオード４の電圧を表示する表示部５ｆを有する本体５とからなり、
前記空間２ｂにおいてウェル７ａの位置決めをさせながら前記ホルダー６を手動でスライドさせ、蓄電池で駆動することを特徴とするマイクロプレートリーダー１。
【００１７】
以下、添付図面に基づき、本発明であるマイクロプレートリーダーについて詳細に説明する。
【実施例１】
【００１８】
図１は、本発明であるマイクロプレートリーダーの平面図である。本発明の一例であるマイクロプレートリーダー１は、マイクロプレート７がスライドする空間を有する測定部２と、光源である発光ダイオード３と、光検出部であるフォトダイオード４と、電圧を表示する表示部５ｆを有する本体５からなる。
【００１９】
発光ダイオード３は、順方向に電圧を加えた際に発光する半導体素子のことで、ＬＥＤとも呼ばれる。発光色は用いる材料によって異なり、赤外線領域から可視光域、紫外線領域で発光するものまで様々あり、目的の波長を適宜選択する。ＥＬＩＳＡ法には、青色ダイオード、例えばＯｐｔｏＳｕｐｐｌｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、（型番ＯＳＵＢ３１３１Ａ） が好適である。
【００２０】
フォトダイオード４は、ＰＮ接合に光が入射すると、Ｐ領域に正孔・Ｎ領域に電子が集まり電圧が生じる（光起電力効果）。その電圧または電流を測定し光センサとして利用するものである。例えば、浜松ホトニクス株式会社製、ＲＧＢカラーセンサＳｉフォトダイオード、Ｓ６４２８−０１（λｐ＝４６０ｎｍ）、Ｓ６４２９−０１（λｐ＝５４０）、Ｓ６４３０−０１（λｐ＝６６０ｎｍ）、Ｓ７５０５−０１（ＲＧＢ３ｃｈ）が採用できる。これらのなかから適宜目的の波長の最適な感度のものを選択することができる。特に、ＥＬＩＳＡ法において、青色の発光を受光する必要があることから、Ｓ６４２８−０１（λｐ＝４６０ｎｍ）がよい。
【００２１】
図２は測定部の斜視図である。図３は測定部のＡーＡ断面模式図である。測定部２は、略正方形状で、中央部にマイクロプレート７がスライドする空間２ｂを設けた枠２ａと、マイクロプレート７を収納するホルダー６と、前記空間２ｂ内に突設したホルダー６の上下方向の振動を防止する左右の突部２ｃ、２ｃと、マイクロプレート７の位置決めをするストッパー機構２ｎと、フォトダイオード４の前に配置されたバンドパスフィルター２ｌとからなる。
【００２２】
測定部２の枠２ａには、中央付近にホルダー６に収納されたマイクロプレート７がスライドする空間２ｂが貫通され、前記空間２ｂに接続する発光ダイオード３からの照射光３ｃを通す照射路２ｉと、検体９を透過した光、或いは検体９中からの発光・励起光が通る貫通孔２ｋが前記空間２ｂから穿設され、貫通孔２ｋの他端部に透過光３ｄ、発光・励起光を受光するフォトダイオード４を設置する空間がある。なお、枠２ａは上下に分割成型し、枠２ａを形成することもできる。
【００２３】
発光ダイオード３は、衝突等による破損を防ぐため、保護筒３ａ内部に収納し、照射路２ｉに陥入し、ネジ３ｅで固定され、本体５にコード３ｆを介して接続する。保護筒３ａ内部には、発光ダイオード３前方に、発光ダイオード３から照射された光りを絞るレンズ３ｂを設置する。これにより、外部の光りを遮断し、照射光３ｃを細く形成し、光強度を高めることができる。
【００２４】
なお、発光ダイオード３は、図中上方向から枠２ａに埋設することもできるが、図３のように示したように配置することで、発光ダイオード３及びフォトダイオード４の配線を枠２ａの一面にまとめることができ、よりコンパクトにすることができ、有効である。従って、枠２ａの側壁に、発光ダイオード３を埋設する場合は、照射光を９０°屈折させる必要があるため、プリズム２ｄをプリズムホルダー２ｅに固定し、照射路２ｉに配置させる。
【００２５】
また。照射路２ｉ、貫通孔２ｋには、光ファイバ２ｊを充填し、光りの散乱防止と、ゴミの測定部２内への侵入を防止している。
【００２６】
ストッパー機構２ｎは、枠２ａの内部から突出し、マイクロプレート７のウェル７ａに対応した位置の溝６ｃを係止する球状のストッパー２ｆと、前記ストッパー２ｆの突出、陥入を調節するバネ２ｇと、バネ２ｇが固定され、枠２ａの側壁に取り付けるネジ２ｈとからなる。
【００２７】
なお、ホルダー６が空間２ｂに挿入されていないとき、球状のストッパー２ｆが脱落しないよう、ストッパー２ｆとバネ２ｇを連結すること、或いはストッパー２ｆを収納する孔の空間２ｂ側を球状のストッパー２ｆの直径より、僅かに狭くすることが望ましい。
【００２８】
このようにストッパー機構２ｎを設けることで、マイクロプレート７を空間２ｂ内で位置決めしながらスライドさせることができる。また、手動でスライドしたとしても、常に所定の位置に、容易かつ確実にウェル７ａを位置決めさせることができる。
【００２９】
バンドパスフィルター２ｌは、マイクロプレート７とフォトダイオード４の間に配置し、特定の波長の光りを透過させる。これにより、外部からの光りの影響を低減させ、野外においても測定可能とする。なお、マイクロプレート７自体が所定の色で着色された場合は、バンドパスフィルター２ｌを用いなくてもよい。フォトダイオード４は、貫通孔２ｋに連設する空間に収納し、底蓋２ｍで封をされ、コード４ａを介して本体５に接続する。
【００３０】
図４は、マイクロプレート（Ａ）及びホルダー（Ｂ）の斜視図である。マイクロプレート７は、複数の被測定液を充填し、反応穴である複数のウェル７ａが一列に配置されたプレートで、一般に市販されているものが使用できる。
【００３１】
ホルダー６は、前記マイクロプレート７を収納する収納部６ａを有する容器で、マイクロプレート７のウェル７ａに対応した位置の外側に溝６ｃが形成され、測定部２の空間２ｂの幅とし、底部に被測定液を透過した透過光３ｄ或いは被測定液で発光・励起光を通すスリット６ｂが設けられている。
【００３２】
前記溝６ｃは、前記枠２ａの内部に設置されたストッパー機構２ｎによって、ウェル７ａの位置決めするための溝である。これにより、空間２ｂにおいてウェル７ａの照射光下に位置決めをさせ、かつ前記ホルダー６をスライドさせることができる。
【００３３】
図５は、本発明であるマイクロプレートリーダーのブロック図である。本体５のケース５ａ内部には、蓄電池（乾電池、単３）２本の電源５ｂと、発光ダイオード３を安定的に発光させるＬＥＤ用電源５ｃと、フォトダイオードからの電圧シグナルを増幅し、データ処理部５ｅへ送る安定化電源及びアンプからなる信号増幅部５ｄと、信号増幅部５ｄから送られた電圧信号を表示部５ｆ、シリアル通信部５ｇ、記憶部５ｉに送るデータ処理部５ｅと、データ処理部５ｅから送られた電圧値を４、５桁の文字として表示する液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）である表示部５ｆと、ＥＩＡ−５７４プロトコルにより外部コンピューター（ＰＣ８）へ電圧データを送信するシリアル通信部５ｇと、データ処理部５ｅに、計算式等のプログラムを設定するために、外部コンピューター（ＰＣ８）と接続するコネクタ（ＪＴＡＧ用コネクタ５ｈなど）が収納されている。
【００３４】
図６は、本発明であるマイクロプレートリーダーと従来のマイクロプレートリーダーによるミクロシスチン濃度の測定結果の比較である。
【００３５】
横軸が、従来のマイクロプレートリーダーとして株式会社モリテックス社製フルオスターによる測定結果である。縦軸が実施例１に示した本発明であるマイクロプレートリーダー１による測定結果である。
【００３６】
測定対象であるミクロシスチンは、和光純薬工業（株）販売のミクロシスチン測定キット（コード番号３００−０５１９１）に付録のミクロシスチン標準溶液（５０、１００、２００、４００、１６００ｐｇ／ｍｌ）である。測定のための前処理は、前記キットの取扱い説明書に記載の手順に従った（間接競合法ＥＬＩＳＡ）。
【００３７】
本発明であるマイクロプレートリーダー１の測定結果は、表示部５ｆに表示された電圧値をミクロシスチン標準溶液（５０、１００、２００、４００、１６００ｐｇ／ｍｌ）を用いて予め求めた電圧値とミクロシスチン濃度の関係からすでに求めてある回帰式によりミクロシスチン濃度に換算した。
【００３８】
本発明の測定結果と従来のマイクロプレートリーダーの測定結果を比較すると、本発明であるマイクロプレートリーダー１によって得られたミクロシスチン濃度値は、従来の高価なマイクロプレートリーダーの測定結果と同等で、高精度で測定できていることが判る。従って、本発明のマイクロプレートリーダー１は、低価格で、小型で、乾電池で駆動し、高精度かつ携帯性に優れた屋外で使用できるマイクロプレートリーダーであると言える。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明であるマイクロプレートリーダーの平面図である。
【図２】測定部の斜視図である。
【図３】測定部のＡーＡ断面模式図である。
【図４】マイクロプレート及びホルダーの斜視図である。
【図５】本発明であるマイクロプレートリーダーのブロック図である。
【図６】本発明であるマイクロプレートリーダーと従来のマイクロプレートリーダーによるミクロシスチン濃度の測定結果の比較である。
【符号の説明】
【００４０】
１      マイクロプレートリーダー
２      測定部
２ａ    枠
２ｂ    空間
２ｃ    突部
２ｄ    プリズム
２ｅ    ホルダー
２ｆ    ストッパー
２ｇ    バネ
２ｈ    ネジ
２ｉ    照射路
２ｊ    光ファイバ
２ｋ    貫通孔
２ｌ    バンドパスフィルター
２ｍ    底蓋
２ｎ    ストッパー機構
３      発光ダイオード
３ａ    保護筒
３ｂ    レンズ
３ｃ    照射光
３ｄ    透過光
３ｅ    ネジ
３ｆ    コード
４      フォトダイオード
４ａ    コード
５      本体
５ａ    ケース
５ｂ    電源
５ｃ    ＬＥＤ用電源
５ｄ    信号増幅部
５ｅ    データ処理部
５ｆ    表示部
５ｇ    シリアル通信部
５ｈ    ＪＴＡＧ用コネクタ
５ｉ    記憶部
６      ホルダー
６ａ    収納部
６ｂ    スリット
６ｃ    溝
７      マイクロプレート
７ａ    ウェル
８      ＰＣ
９      検体
【図１】
2009103480.tif 000003
【図２】
2009103480.tif 000004
【図３】
2009103480.tif 000005
【図４】
2009103480.tif 000006
【図５】
2009103480.tif 000007
【図６】
2009103480.tif 000008