(57)【要約】【課題】生体分子の修飾を迅速に検出できる方法を提供すること。【解決手段】生体分子を固定化した導電性固体支持体上で、前記生体分子の修飾を検出することを含む、修飾を受けた生体分子の検出方法。前記方法に使用するための導電性固体支持体及びキットも提供される。【選択図】図9
2009014433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を固定化した導電性固体支持体上で、前記生体分子の修飾を検出することを含む、修飾を受けた生体分子の検出方法。
【請求項２】
導電性固体支持体上に固定化された生体分子がペプチドである請求項１記載の方法。
【請求項３】
(a) 導電性固体支持体上に固定化された生体分子と、修飾を受けた生体分子を認識して結合することができる物質とを接触させる工程、及び
(b)前記物質と修飾を受けた生体分子との特異的な結合を検出する工程を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
導電性固体支持体上に固定化された生体分子がペプチドであり、修飾を受けた生体分子を特異的に認識して結合することができる物質がレクチン、修飾を特異的に認識して結合するペプチド及び抗体からなる群より選択される請求項３記載の方法。
【請求項５】
レクチンが、ミヤコグサレクチン、ピーナッツレクチン、ダイズレクチン、ヒマレクチン、モクワンジュレクチン、インゲンマメレクチン、タチナタマメレクチン（別名コンカナバリンA）、レンズマメレクチン、エンドウマメレクチン、ソラマメレクチン、小麦胚芽凝集素、ジャガイモレクチン、ヨウシュチュウセンアサガオ（別名DSAレクチン）及びカブトガニレクチンからなる群より選択される請求項４記載の方法。
【請求項６】
修飾を受けた生体分子を特異的に認識して結合することができる物質が標識されている請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
様々な修飾を受けた生体分子を特異的に認識して結合することができる２種類以上の物質にそれぞれ異なる標識がなされている請求項６記載の方法。
【請求項８】
標識が、シアニン誘導体、ナノ結晶及びナノ粒子からなる群より選択される請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
修飾を受けた生体分子を同定する工程をさらに含む請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
修飾を受けた生体分子を質量分析により同定する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
質量分析が、レーザ脱離/イオン化−飛行時間型質量分析である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
修飾を受けた生体分子を同定する前に断片化する工程をさらに含む請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
修飾を受けた生体分子がペプチドであり、プロテアーゼで分解することにより断片化する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
導電性固体支持体が表面にカーボン層を有する請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
カーボン層がダイヤモンド様炭素被膜である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
カーボン層が化学修飾されている請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法において使用するための表面にカーボン層を有する導電性固体支持体。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法において使用するためのキットであって、表面にカーボン層を有する導電性固体支持体を含む前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体支持体において修飾を分析する方法、より詳細には、核酸、タンパク質等の生体分子を固定した導電性固体支持体上で修飾を検出し、修飾を受けた生体分子を同定する方法、そのための固体支持体及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中に含まれる多数のタンパク質を電気泳動で分離した後、個々のバンドに含まれる物質を基板の表面にカーボン層を有する固体支持体上に固定することができる方法が開発されている（特許文献１）。この支持体を用いれば、複数の物質を精製することなく、同時かつ直接に質量分析することが可能となるため、多数の試料を迅速に解析することができる。この支持体上では、支持体に固定化されたタンパク質だけでなく、相互作用させたタンパク質も検出・同定することができる（特許文献２及び３）。
一方、タンパク質の翻訳後修飾を解析する方法として、タンパク質間相互作用が利用されている。糖鎖を特異的に認識して結合することができるレクチンタンパク質を用いたレクチンブロット（非特許文献１）や抗体−抗原反応を利用した抗リン酸化アミノ酸抗体によるウェスタンブロット（非特許文献２）などが例としてあげられる。
【０００３】
レクチンブロットやウェスタンブロットでは電気泳動でタンパク質を分離した後、ニトロセルロース膜やポリビニリデンフルオリド膜を支持体としてタンパク質を転写し固定する。しかし、この支持体上で糖タンパク質やリン酸化タンパク質を検出することができても、その後同定をするためには改めて電気泳動をして、翻訳後修飾が検出されたバンドを切り出して同定作業をしなければならない。つまり、従来の技術では、翻訳後修飾を検出した後に、改めて別の実験系で同定作業を行う必要があり、時間と労力がかかっていた。
【０００４】
【特許文献１】特開2004-138596号公報
【特許文献２】特開2006-170857号公報
【特許文献３】特開2006-292680号公報
【非特許文献１】タンパク質実験ノート（下）羊土社、編集、岡田雅人・宮崎香p118-120
【非特許文献２】タンパク質実験ノート（下）羊土社、編集、岡田雅人・宮崎香p115-117
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、生体分子の修飾を迅速に検出できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、試料中に含まれる多数のタンパク質を電気泳動で分離した後、個々のバンドに含まれる物質を基板の表面にカーボン層を有する固体支持体上に固定し、その支持体上で蛍光標識したレクチンタンパク質や抗リン酸化アミノ酸抗体を相互作用させることで、タンパク質の修飾（翻訳後修飾）を支持体上で検出し、さらに同一の支持体を用いて質量分析により修飾（翻訳後修飾）を受けているタンパク質を同定する方法を考案した。
本発明の要旨は以下の通りである。
【０００７】
（１）生体分子を固定化した導電性固体支持体上で、前記生体分子の修飾を検出することを含む、修飾を受けた生体分子の検出方法。
（２）導電性固体支持体上に固定化された生体分子がペプチドである（１）記載の方法。
（３）(a) 導電性固体支持体上に固定化された生体分子と、修飾を受けた生体分子を認識して結合することができる物質とを接触させる工程、及び
(b)前記物質と修飾を受けた生体分子との特異的な結合を検出する工程を含む、（１）又は（２）記載の方法。
（４）導電性固体支持体上に固定化された生体分子がペプチドであり、修飾を受けた生体分子を特異的に認識して結合することができる物質がレクチン、修飾を特異的に認識して結合するペプチド及び抗体からなる群より選択される（３）記載の方法。
【０００８】
（５）レクチンが、ミヤコグサレクチン、ピーナッツレクチン、ダイズレクチン、ヒマレクチン、モクワンジュレクチン、インゲンマメレクチン、タチナタマメレクチン（別名コンカナバリンA）、レンズマメレクチン、エンドウマメレクチン、ソラマメレクチン、小麦胚芽凝集素、ジャガイモレクチン、ヨウシュチュウセンアサガオ（別名DSAレクチン）及びカブトガニレクチンからなる群より選択される（４）記載の方法。
（６）修飾を受けた生体分子を特異的に認識して結合することができる物質が標識されている（３）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）様々な修飾を受けた生体分子を特異的に認識して結合することができる２種類以上の物質にそれぞれ異なる標識がなされている（６）記載の方法。
【０００９】
（８）標識が、シアニン誘導体、ナノ結晶及びナノ粒子からなる群より選択される（６）又は（７）記載の方法。
（９）修飾を受けた生体分子を同定する工程をさらに含む（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）修飾を受けた生体分子を質量分析により同定する（９）記載の方法。
（１１）質量分析が、レーザ脱離/イオン化−飛行時間型質量分析である（１０）記載の方法。
（１２）修飾を受けた生体分子を同定する前に断片化する工程をさらに含む（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
【００１０】
（１３）修飾を受けた生体分子がペプチドであり、プロテアーゼで分解することにより断片化する（１２）記載の方法。
（１４）導電性固体支持体が表面にカーボン層を有する（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）カーボン層がダイヤモンド様炭素被膜である（１４）記載の方法。
（１６）カーボン層が化学修飾されている（１４）又は（１５）記載の方法。
（１７）（１）〜（１６）のいずれかに記載の方法において使用するための表面にカーボン層を有する導電性固体支持体。
（１８）（１）〜（１６）のいずれかに記載の方法において使用するためのキットであって、表面にカーボン層を有する導電性固体支持体を含む前記キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、生体分子の修飾を簡便に検出することができる。
また、様々な種類の翻訳後修飾を特異的に認識して結合する２種類以上の物質をそれぞれ異なる試薬（例えば、励起波長の異なる蛍光標識試薬）で標識し、それを同一の固体支持体上で相互作用させることにより、複数の修飾を１枚の固体支持体上で検出することができる。
さらに、修飾を検出した同一の固体支持体上で質量分析を行うことにより、支持体に固定化された修飾を受けている生体分子の同定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、生体分子を固定化した導電性固体支持体上で、前記生体分子の修飾を検出することを含む、修飾を受けた生体分子の検出方法を提供する。
導電性固体支持体に固定化する生体分子は、修飾を受けるものであればいかなるものであってもよく、ペプチド、核酸、これらの誘導体などを例示することができる。
本明細書においてペプチドには、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、それらの複合体が含まれる。ペプチド誘導体としては、その他のペプチドと融合した融合ペプチド、ポリエチレングリコールなどのポリマーに結合させた化学修飾ペプチド、翻訳後修飾されたペプチドなどが含まれる。
【００１３】
本明細書において、核酸とは、RNAおよびDNA、ならびにcDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを包含する。核酸 は、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。核酸 が１本鎖の場合には、センス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。さらに、核酸 は環状であっても直線状であってもよい。核酸誘導体としては、シアニン誘導体、ナノ結晶及びナノ粒子などの蛍光標識の導入が可能なＣ５位置換シチジン誘導体又はＮ６位置換アデノシン誘導体が含まれる。
【００１４】
本明細書において、修飾とはペプチドや核酸が化合物を付加されて変化することを指し、翻訳後修飾とはmRNAが翻訳されて生成したペプチド鎖が、最終的に機能を発現する以前に受ける種々の修飾をいう。ペプチドの翻訳後修飾としては、アセチル化、アミド化、脱アミド化、プレニル化、ホルミル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、リン酸化 、ユビキチン化 、リボシル化、硫酸化、カルボキシル化、SUMO化、ニトロ化などを例示することができる。核酸の修飾としてはアルキル化、メチル化、メトキシエチル化などを例示することができる。
【００１５】
導電性固体支持体は、生体分子を固定化することができるものであればいかなるものであってもよく、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック等からなる基板などを例示することができる。また、ガラスまたはプラスチック等の表面にプラチナ、チタン等からなる金属層を形成させたものでもよい。金属層の形成は、スパッタリング、真空蒸着、イオンビーム蒸着、電気めっき、無電解めっき等により実施することができる。質量分析を行う場合には、導電性固体支持体の形状は平板状であることが好ましい。そのサイズは、特に制限されないが、通常は、幅１０〜２００ｍｍ×長さ１０〜２００ｍｍ×厚み０．１〜２０ｍｍ程度である。
【００１６】
導電性固体支持体は、表面にカーボン層を有することが好ましい。カーボン層としては、特に制限されないが、ダイヤモンド、ダイヤモンド様炭素、無定形炭素、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロムまたは炭化バナジウム等からなる層を挙げることができ、ダイヤモンド様炭素（ＤＬＣ）層が好ましい。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、ＵＶ吸収がないため検出系ＵＶに対して透明性である点、およびエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。カーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。カーボン層の厚さは、通常、単分子層〜１００μｍ程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは２ｎｍ〜1μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。なお、導電性固体支持体のすべてが炭素材料で構成されていてもよい。
【００１７】
生体分子を固定化するためには、カーボン層が形成された支持体の表面を化学修飾することが好ましい。このような化学修飾としては、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性化エステル基を導入することが挙げられる。また、ニッケルキレート、コバルトキレート等の金属キレートを導入することも有効である。これらの基の導入方法は公知であり、特開2006-292680号公報、特開2006-170857号公報、特開2004-138596号公報などを参照されたい。
ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基または活性化エステル基を導入するのが好ましい。
【００１８】
ペプチドを保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基、金属キレートまたは活性化エステル基（例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル基、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド 、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなど）を導入するのが好ましい。金属キレートを導入した導電性固体支持体を使用すると、ポリヒスチジン配列等の金属イオンと親和性のある標識を有するペプチドを効果的かつ安定に固定化することができる。活性化エステル基の導入は、例えば、塩素ガス中でカーボン層に紫外線を照射して表面を塩素化し、ついで、アンモニアガス中で紫外線を照射してアミノ化した後、適当な酸クロリドまたはジカルボン酸無水物を用いてカルボキシル化し、末端のカルボキシル基をカルボジイミドまたはジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと脱水縮合することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基等の活性化エステル基が結合した基を形成することができる（特開２００１−１３９５３２）。
【００１９】
また、上記化学修飾は、表面カーボン層上に静電層を形成することにより行ってもよい。該静電層は、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。
【００２０】
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、または炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、またはこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４,４’,４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００２１】
静電層は、基板またはカーボン層と共有結合させずに形成してもよく、基板またはカーボン層と共有結合させて形成してもよい。
静電層を基板またはカーボン層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、カーボン層を製膜する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。製膜装置内に導入する化合物として、アンモニアガスを用いてもよい。また、表面処理層は、密着層を形成した後にアミノ基を含有する皮膜を形成するといった、複層であってもよく、この場合もアンモニアガスを含んだ雰囲気で行ってもよい。製膜は、例えばプラズマ法によって実施できる。
【００２２】
また、静電層を基板またはカーボン層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基板またはカーボン層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物および炭素化合物を蒸着させることが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。
【００２３】
静電層を基板またはカーボン層と共有結合させて形成する場合には、例えば、基板またはカーボン層を施した基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記ｒアミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。
基板を、非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、生体分子の固定化量がより向上する。アミノ基含有化合物とともにシランカップリング剤が共存する溶液に基板を浸漬することにより、静電層を形成することもできる。
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
【００２４】
化学修飾されているカーボン層を表面に有する導電性固体支持体は以下のような利点を有する。
１．ドットブロットだけではなく、電気泳動をしたゲルからエレクトロブロッティングでタンパク質を溶出し、溶出されたタンパク質をプロテインチップ基板上に固定化できる。従って、固定化したいタンパク質の発現系の構築やクロマトグラフィーシステムによる精製をする必要がない．
２．チップ基板を質量分析（例えば、MALDI-TOF/MS）のターゲットプレートとして用いることができる．
生体分子を導電性固体支持体に固定するには、例えば、試料中の生体分子をゲル電気泳動で分離し、ゲル中に分離された生体分子を導電性固体支持体上に転写すればよい。あるいは、従来の方法であるドットプロットによる固定でもよい。
【００２５】
試料は、生体分子を含有するものであればいかなるものであってもよく、細胞抽出物、菌体抽出物、無細胞系合成産物、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）産物、酵素処理産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、合成ペプチド等を例示することができる。
試料中の生体分子を分離するために使用できるゲル電気泳動法としては、アガロースゲル電気泳動法、ｓｉｅｖｉｎｇアガロースゲル電気泳動法、変性アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法、等電点ゲル電気泳動法および二次元電気泳動法などを例示することができる。これらのゲル電気泳動法については、特開2006-292680号公報、特開2006-170857号公報、特開2004-138596号公報などを参照されたい。
【００２６】
本発明においては、核酸を分離する場合は、アガロースゲル電気泳動法を使用するのが好ましく、ペプチドを分離する場合は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法および二次元電気泳動法を使用するのが好ましい。
電気泳動後、ゲルを、導電性固体支持体に載る大きさに切り出し、ゲルと導電性固体支持体とを密着させて、ゲル中に分離された生体分子を導電性固体支持体上に転写することができる。導電性固体支持体への転写方法としては、例えば、毛細管現象を利用したキャピラリー式ブロッティング、ポンプにより吸引するバキューム式ブロッティングおよび電気的手法を用いるエレクトロブロッティングが挙げられる。核酸を転写する場合は、キャピラリー式ブロッティングを使用するのが好ましく、ペプチドを転写する場合は、エレクトロブロッティングを使用するのが好ましい。
エレクトロブロッティングにおいては、タンク式、セミドライ式およびセミウェット式のいずれも使用することができるが、バッファー使用量の少なさや、反応時間の短さ等の観点からセミドライ式エレクトロブロッティングを使用するのが好ましい。ブロッティング装置としては、市販のエレクトロブロッティング装置を使用することができる。エレクトロブロッティングにおける通電条件は、定電圧、２００Ｖ以下、好ましくは０．１〜１０Ｖで、１〜５００分間、好ましくは５〜１００分間が好ましい。ただし、電圧を金属基板の酸化電位より高くすると金属の溶出がおこるため、基板金属の酸化電位より低い電圧で行うのが好ましい。
【００２７】
本発明の方法は、例えば、(a)導電性固体支持体上に固定化された生体分子と、修飾を受けた生体分子を特異的に認識して結合することができる物質とを接触させる工程、及び
(b)前記物質と修飾を受けた生体分子との特異的な結合を検出する工程を含んでもよい。
導電性固体支持体上に固定化された生体分子がペプチドである場合、修飾（翻訳後修飾）を受けた生体分子を特異的に認識して結合することができる物質としては、レクチン、修飾を特異的に認識して結合するペプチド、抗体（特にアセチル化、アミド化、脱アミド化、プレニル化、ホルミル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、リン酸化 、ユビキチン化 、リボシル化、硫酸化、カルボキシル化、SUMO化を認識する抗体）などを例示することができる。レクチンは、タンパク質に付加している糖鎖を認識して特異的に結合する。例えば、コンカナバリンＡは、α結合型マンノースと末端グルコース基を認識して特異的に結合する。コムギ胚芽凝集素は、Ｎ−アセチルグルコサミン(GlcNAc)及びシアル酸を認識して特異的に結合する。修飾を受けた場合のみに特異的に結合するペプチドについては、例えばユビキチン化修飾を特異的に認識する26SプロテアソームのRPN10サブユニット（Ref, Mol Cell Proteomics. 2005 Jun;4(6):741-51.）、ユビキチン結合ドメインを含むペプチド(Ref, Mol Cell Proteomics. 2007 Apr;6(4):601-10.)があげられる。抗体とは、抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に誘導されるタンパク質で、抗原と特異的に結合する活性をもつものを指し、翻訳後修飾を特異的に認識する抗体とは修飾残基ならびにその修飾残基を含む誘導体を抗原として産出された抗体をいう。翻訳後修飾を特異的に認識する抗体としては、抗アセチル化抗体Anti-acetyl-Histone H4(Upstate, cat#06-866), 抗グリコシル化抗体CTD110.6(Pierce, cat#1858781), 抗メチル化アルギニン抗体(Abcam, cat#ab49197), 抗リン酸化トレオニン抗体 p-Thr (BDI141) (Santa Cruz, cat#sc-57562), 抗リン酸化トレオニン抗体 p-Thr (4D11) (Santa Cruz, cat#sc-65490), 抗リン酸化チロシン抗体 p-Tyr (PY99) (Santa Cruz, cat#sc-7020), 抗リン酸化チロシン抗体p-Tyr (PY20) (Santa Cruz, cat#sc-508), 抗リン酸化チロシン抗体p-Tyr (PY350) (Santa Cruz, cat#sc-18182) , 抗リン酸化セリン抗体(Chemicon, cat#AB1603)、抗ユビキチン化抗体(Biomol, UW8995-0001), SUMO化(Biomol, UW8955-0001), 抗ニトロチロシン抗体(Sigma, N0409)などが知られている。
【００２８】
修飾を受けた生体分子を特異的に認識して結合することができる物質が標識されていると、前記物質と修飾を受けた生体分子との特異的な結合の検出が容易となり、迅速な検出が可能となる。様々な種類の修飾を受けた生体分子を特異的に認識して結合することができる２種類以上の物質を、それぞれ、異なる試薬（例えば、異なる励起波長の蛍光標識試薬）で標識をすれば、導電性固体支持体上で同時に前記物質と修飾を受けた生体分子との間の相互作用を検出できるため、迅速に様々な種類の修飾を検出することができる。標識試薬としては、シアニン誘導体、好ましくはシアニンのスルホン化誘導体、特にCy5 もしくはCy3 化合物、ナノ結晶、ナノ粒子（Anal Chem. 2006 Aug 15;78(16):5925-32.）などを例示することができる。
【００２９】
以下に、試料中のペプチドの糖鎖修飾（翻訳後修飾の一種）を検出する場合の電気泳動および転写の一態様を示す。まず、試料中のペプチドを可溶化する。すなわち、試料に存在するペプチド分解酵素を失活させるとともに、ＳＤＳとβ−メルカプトエタノールによってペプチドを効果的に変性させる目的で沸騰水中で一定時間熱処理する。次にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（例えば、厚さ1 mm以下、好ましくは3 mmのゲル）の各レーンに一定量注入し、ＳＤＳを含むグリシン−トリスバッファーを泳動用バッファーとして、一定電圧で一定時間泳動させる。泳動後、ゲルをあらかじめ冷却しておいたメタノールを含むグリシン−トリスバッファー（転写用バッファー）に一定時間浸漬し、平衡化する。
【００３０】
続いて、ゲルを陰極側、転写用導電性固体支持体を陽極側としてエレクトロブロッティング装置に装着する。転写槽には転写用バッファーを加え、氷冷下、定電圧（例えば、3V以上）で一定時間（例えば、１〜２時間）転写を行う。このとき、転写効率を上げる観点から、陰極とゲルの間、および陽極と導電性固体支持体の間に、バッファーやイオン交換水を含ませたろ紙を配置するのが好ましい。陰極側のろ紙に含ませるバッファーとしては、ホウ酸、Ｔｒｉｓ、ε−アミノカプロン酸、酢酸、ＥＤＴＡ、リン酸、酒石酸、ＳＤＳ等を含むものが挙げられる。ホウ酸、Ｔｒｉｓおよびε−アミノカプロン酸を含むバッファーを用いる場合、ε−アミノカプロン酸の濃度は通常、１０００ｍＭ以下、好ましくは１μＭ〜１０００ｍＭ、より好ましくは１〜３００ｍＭである。ホウ酸の濃度は通常、1M以下、好ましくは0.1〜1M、より好ましくは0.5〜1Mである。陽極側のろ紙には、イオン交換水を含ませるのが好ましい。また、陽極側のろ紙は、存在しなくてもよい。
【００３１】
ペプチドの糖鎖修飾を検出するには、上記のようにしてペプチドが固定された導電性固体支持体をレクチンに接触させる（例えば、レクチンを含むバッファーを添加してインキュベーションする）。レクチンを標識しておけば、標識のシグナルにより、ペプチドの糖鎖修飾を検出することができる。２種類以上のレクチン（それぞれ、異なる糖鎖を特異的に認識して結合できる）のそれぞれに異なる標識（例えば、励起波長の異なる蛍光標識）をしておけば、複数の糖鎖修飾を１枚の固体支持体上で検出することができる。ペプチドをレクチンと接触させた後は、導電性固体支持体を洗浄し、ペプチドと特異的な結合をしないレクチンを除去する。
【００３２】
本発明の方法は、ゲル中に分離された生体分子を導電性固体支持体上に直接転写する場合だけでなく、メンブレンを介して転写する場合も包含する。従って、本発明の方法の一実施形態においては、ゲル中に分離された生体分子をメンブレン上に転写し、該メンブレン上に転写された生体分子を導電性固体支持体上に転写することにより、試料中の生体分子を導電性固体支持体上に固定化することもできる。すなわち、生体分子のゲルから導電性固体支持体への転写において、導電性固体支持体に直接転写するのではなく、一度生体分子をメンブレン上に転写し、該メンブレン上に転写された生体分子を導電性固体支持体上に転写してもよい。
【００３３】
この場合に使用できるメンブレンの材質としては、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、ナイロンおよびポジティブチャージナイロン等が挙げられる。タンパク質の転写においては、タンパク質の結合能力が最も高いＰＶＤＦを使用するのが好ましく、核酸の転写においても核酸の非特異吸着が少ないＰＶＤＦを使用するのが好ましい。泳動物質のゲルからメンブレンへの転写およびメンブレンから導電性固体支持体への転写は、上記と同様の方法により実施できる。ゲルからメンブレンへの転写においては、エレクトロブロッティングを使用するのが好ましく、エレクトロブロッティングにおける通電条件は、０．１〜５０Ｖで、５〜１２０分間程度が好ましい。メンブレンから導電性固体支持体への転写においても、エレクロトブロッティングを利用するのが好ましい。
本発明の方法は、修飾を受けた生体分子を同定する工程をさらに含んでもよい。修飾を受けた生体分子を同定する前に、導電性固体支持体に固定化された生体分子を断片化（例えば、酵素で分解）し、断片化により得られた分解物を質量分析してもよい。
【００３４】
質量分析装置において分析できる生体分子の分子量には制限があるため、高分子量の生体分子を解析するには、酵素分解を行うのが好ましい。高分子量の生体分子、例えば高分子量ペプチド、すなわちタンパク質を特定のプロテアーゼで分解し、得られたペプチド断片を質量分析し、得られたデータと公知の断片データとを比較することによりペプチドを同定することができる。このような方法は、マスフィンガープリンティング法とも称される。当該方法は、高分子量の生体分子、例えば分子量５〜２００ｋＤａ、好ましくは５〜１００ｋＤａの生体分子の分析において特に好適である。また、相互作用させる生体分子が高分子である場合に特に好適である。
【００３５】
生体分子を分解するための酵素は、マスフィンガープリンティング法で使用できるものであれば特に制限されず、当業者であれば、分析対象となる生体分子に応じて選択することができる。核酸を分析する場合は、酵素としてヌクレアーゼ、特に制限酵素（例えば、ＲＥＢＡＳＥのデータベースに記載のもの）を使用する。ヌクレアーゼとしては、例えば、Ｓ１ ヌクレアーゼ、蛇毒ヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、マングマメヌクレアーゼ、アカパンカビヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｈ、膵臓ＤＮａｓｅI、Ｂａｌ３１、ＥｘｏI、ＥｘｏIII、ＥｘｏVII、λエキソヌクレアーゼ、ＡａｒI、ＡａｔII、ＡｃｃI、ＡｃｅIII、ＡｃｉI、ＡｃｌI、ＡｃｙI、Ｈｉｎ１I、ＡｆｌII、ＡｆｌIII、ＡｇｅI、ＡｈａIII、ＡｌｆI、ＡｌｏI、ＡｌｕI、ＡｌｗＮI、ＡｐａI、ＡｐａＢI、ＡｐａＬI、ＡｐｏI、ＡｓｃI、ＡｓｐＣＮI、ＡｓｕI、Ｃｆｒ１３I、ＡｓｕII、ＢｓｐＴ１０４I、ＡｖａI、ＡｖａII、ＶｐａＫ１１ＢI、ＥｃｏＴ２２I、ＢｌｎI、ＢｂｖII、ＢｂｖＣI、ＢｃｃI、ＢｃｅｆI、Ｂｃｅ８３I、ＢｃｇI、ＢｃｉＶI、ＦｂａI、ＢｅｔI、ＢｆｉI、ＢｇｌI、ＢｇｌII、ＢｉｎI、ＢｍｇI、ＢｐｌI、Ｂｐｕ１０I、ＢｓａＡI、ＢｓａＢI、ＢｓａＸI、ＢｓｂI、ＢｓｃＧI、ＢｓｅＭII、ＢｓｅＰI、ＢｓｅＲI、ＢｓｅＳI、ＢｓｅＹI、ＢｓｇI、ＢｓｉＹI、ＢｓｍI、ＢｓｍＡI、ＢｓｐＧI、ＢｓｐＨI、ＢｓｐＬＵ１１I、ＢｓｐＭI、ＢｓｐＧII、ＢｓｐＮＣI、Ｂｓｐ２４I、Ｂｓｐ１４０７I、ＢｓｒI、ＢｓｒＢI、ＢｓｒＤI、ＢｓｔＥII、ＢｓｔＰI、ＥｃｏＯ６５I、ＢｓｔＸI、ＢｔｇＺI、ＢｔｒI、ＢｔｓI、Ｃａｃ８I、ＣａｕII、ＢｃｎI、ＣｄｉI、ＣｆｒI、ＥａｅI、Ｃｆｒ１０I、ＣｊｅI、ＣｊｅＰI、ＣｌａI、ＣｖｉＪI、ＣｖｉＲI、ＣｄｅI、ＤｐｎI、ＤｒａII、ＤｒａIII、ＤｒｄI、ＤｒｄII、ＤｓａI、Ｅａｍ１１０５I、ＥｃｏＮI、ＥｃｉI、ＥｃｏＮI、ＥｃｏＲI、ＥｃｏＲII、ＭｖａI、ＥｃｏＲＶ、Ｅｃｏ３１I、Ｅｃｏ４７III、Ａｏｒ５１ＨI、Ｅｃｏ５７I、Ｅｃｏ５７ＭI、ＥｓｐI、Ｂｐｕ１１０２I、Ｅｓｐ３I、ＦａｌI、ＦａｕI、ＦｉｎI、ＦｎｕＤII、ＡｃｃII、Ｆｎｕ４ＨI、ＦｏｋI、ＦｓｅI、ＦｓｐＡI、ＧｄｉII、ＧｓｕI、ＨａｅI、ＨａｅII、ＨａｅIII、ＨａｅIV、ＨｇａI、ＨｇｉＡI、ＨｇｉＣI、ＢｓｐＴ１０７I、ＨｇｉＥII、ＨｇｉＪII、ＢａｎII、ＨｈａI、ＨｉｎｄII、ＨｉｎｃII、ＨｉｎｄIII、ＨｉｎｆI、Ｈｉｎ４I、Ｈｉｎ４II、ＨｐａI、ＨｐａII、ＨａｐII、ＭｓｐI、ＨｐｈI、Ｈｐｙ９９I、Ｈｐｙ１７８III、Ｈｐｙ１８８I、ＫｐｎI、Ｋｓｐ６３２I、ＭａｅI、ＸｓｐI、ＭａｅII、ＭａｅIII、ＭｂｏI、Ｓａｕ３ＡI、ＭｂｏII、ＭｃｒI、ＭｆｅI、ＭｕｎI、ＭｊａIV、ＭｌｕI、ＭｍｅI、ＭｎｌI、ＭｓｔI、ＮｓｂI、ＭｗｏI、ＮａｅI、ＮａｒI、ＢｂｅI、ＮｃｏI、ＮｄｅI、ＮｈｅI、ＮｌａIII、ＮｌａIV、ＮｏｔI、ＮｒｕI、ＮｓｐI、ＮｓｐＢII、ＯｌｉI、ＰａｃI、ＰｆｌＭI、Ｐｆｌ１１０８I、ＰｆｏI、ＰｌｅI、ＰｍａＣI、ＰｍｅI、ＰｐｉI、ＰｐｕＭI、ＰｓｈＡI、ＰｓｉI、ＰｓｒI、ＰｓｔI、ＰｖｕI、ＰｖｕII、ＲｌｅＡI、ＲｓａI、ＡｆａI、ＲｓｒII、ＣｐｏI、ＳａｃI、ＳａｃII、ＳａｌI、ＳａｎＤI、ＳａｐI、ＳａｕI、Ｅｃｏ８１I、ＳｃａI、ＳｃｒＦI、ＳｄｕI、Ｂｓｐ１２���６I、ＳｅｃI、ＳｅｘＡI、ＳｆａＮI、ＳｆｅI、ＳｆｉI、ＳｇｆI、ＳｇｒＡI、ＳｉｍI、ＳｍａI、ＳｍｌI、ＳｎａI、ＳｎａＢI、ＳｐｅI、ＳｐｈI、ＳｐｌI、ＳｒｆI、Ｓｓｅ８３８７I、Ｓｓｅ８６４７I、ＳｓｐI、Ｓｔｈ１３２I、ＳｔｕI、ＳｔｙI、ＥｃｏＴ１４I、ＳｗａI、ｔａｑI、ｔａｑII、ｔａｔI、ＴａｕI、ＴｆｉI、ＴｓｅI、ＴｓｐＤＴI、ＴｓｐＥI、ＴｓｐＧＷI、ＴｓｐＲI、Ｔｓｐ４ＣI、Ｔｓｐ４５I、Ｔｔｈ１１１I、Ｔｔｈ１１１II、ＵｂａＤI、ＵｂａＥI、ＵｂａＧI、ＵｂａＨI、ＵｂａＮI、ＵｂａＰI、ＶｓｐI、ＰｓｈＢI、ＸｂａI、ＸｃｍI、ＸｈｏI、ＸｈｏII、ＭｆｌI、ＸｍａIII、Ｅｃｏ５２IおよびＸｍｎI等が挙げられる。
【００３６】
ペプチド、特にタンパク質を分析する場合は、酵素としてプロテアーゼを使用する。プロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、ＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒプロテアーゼI（ＡＰI、リジルエンドペプチダーゼ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｖ８ プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、トロンビン、アミノペプチダーゼＭ、ブロメライン、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＹ、カテプシンＣ、キモトリプシンＡ、クロストリパイン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｎｅｕｔｒａｌ）、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（プロテアーゼＶ８）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、Ｘａ因子、フィシン、ロイシンアミノペプチダーゼ、パパイン、ペプシン、プラスミン、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、ピログルタメートアミノペプチダーゼ、スブチリシン、サーモリシン、トロンビンを使用することができる。タンパク質をプロテアーゼで分解する場合、通常２５〜４２℃、より好ましくは３５〜３９℃で、１〜２４時間反応を行う。
【００３７】
ここで分解物とは、生体分子を断片化（例えば、酵素で分解）することによって得られる小分子を意味し、長鎖核酸分子を酵素分解して得られる核酸断片、およびポリペプチド、オリゴペプチドまたはタンパク質を酵素分解して得られるペプチド断片が包含される。
酵素分解では、塩はイオン化を阻害するため、塩濃度を薄くするか、揮発性の塩を使用するのが好ましい。また、酵素分解反応中の溶液乾燥は切断反応を停止させるため、湿度を保って乾燥を防ぐのが好ましい。
生体分子の断片化は、導電性固体支持体上で行ってもよいし、生体分子を分離するゲル中で行ってもよい。
【００３８】
本発明では、マスフィンガープリント法により、導電性固体支持体上に固定化された生体分子を同定することができる。すなわち、生体分子の酵素分解物に含まれる多数の消化断片に由来するイオンの質量を測定し、既知のデータベースと比較することにより、生体分子を同定することができる。さらに、低分子化処理により、ＭＡＬＤＩ特有のポストソースディケイ（ＰＳＤ）解析ができるようになるためＭＳ／ＭＳ解析で容易にアミノ酸配列等を決定できる。このため、データベースサーチにＭＳ／ＭＳ解析のデータを使ったデータベース検索ができる。
ペプチドを同定するためのデータベースとしては、例えば、Ｍａｓｃｏｔ、ＭＳ−Ｔａｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅａｒｃｈ、ＰｅｐＦｒａｇ、ＳＥＱＵＥＳＴなどが挙げられる（実験医学別冊、ポストゲノム時代の実験講座２、プロテオーム解析法、羊土社（２０００））。
【００３９】
本発明の別の態様においては、生体分子の相互作用を分析することを目的として、溶液中で相互作用する生体分子の複合体（例えば、糖鎖修飾ペプチドとレクチンの複合体）を形成した後、これを電気泳動に付し、電気泳動によって分離された複合体を導電性固体支持体上に固定化し、導電性固体支持体上の複合体をイオン化することによって質量分析を行うこともできる。このような分析方法は、溶液中で複合体形成を行うものであるため、タンパク質の分析など、分析対象分子の立体構造を高度に保持する必要がある解析に有利である。
質量分析方法として、電気的相互作用を利用して原子・分子のイオンを質量の違いによって分析する手法を使用できる。このような質量分析方法は、イオンの生成・分離・検出の３つの工程を含む。
【００４０】
導電性固体支持体上に固定化された生体分子の酵素分解物を質量分析する方法としては、特に制限されず、当技術分野で公知のものを使用できる。質量分析する際に使用できるイオン化法の様式としては、レーザー脱離法、特にマトリックス補助レーザ脱離（ＭＡＬＤＩ）法、電子衝撃によるイオン化（ＥＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、光イオン化法、放射性同位体から放射されるＬＥＴの大きなαまたはβ線を使用するイオン化法、２次イオン化法、高速原子衝突イオン化法、電界電離イオン化法、表面電離イオン化法、化学イオン化（ＣＩ）法、フィールドイオン化（ＦＩ）法、火花放電によるイオン化法等が挙げられ、マトリックス補助レーザ脱離（ＭＡＬＤＩ）法が好ましい。また、分離様式としては、線形または非線形反射飛行時間型（ＴＯＦ）、単一または多重四重極型、単一または多重磁気セクター型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）型、イオン捕獲型、高周波型ならびにイオン捕獲／飛行時間型等が挙げられ、線形または非線形反射飛行時間（ＴＯＦ）型、高周波およびイオン捕獲／飛行時間型を用いるものが好ましい。上記のようなイオン化法と分離様式、電気的記録ならびに写真記録のような検出様式とを組み合わせることにより質量分析を実施することができる。具体的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＥＳＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ、ＭＡＬＤＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ等が挙げられる。生体分子などの高分子物質をイオン化し、導電性固体支持体上の複数の分子を分析するという観点からは、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析、特にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを利用するのが好ましい。
【００４１】
以下に本発明の一態様として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いたペプチドの質量分析の手順を説明する。
分析対象が固定化された導電性固体支持体にマトリックス溶媒を添加し、乾燥させる。マトリックス溶媒としては、α-シアノヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸などを含むものを使用できる。本発明においては、０．５〜８０％、好ましくは１〜５０％のα-シアノヒドロキシ桂皮酸、１〜８０％、好ましくは２０〜７０％のアセトニトリルを含むマトリックス溶媒を用いるのが好ましい。マトリックス溶媒はさらにトリフルオロ酢酸を含んでいてもよい。このようなマトリックスを用いることによりマトリックス溶媒がレーザーのエネルギーを効果的に吸収して、そのエネルギーが間接的にペプチドに伝わり、イオン化が起こる。次ぎに該導電性固体支持体を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのフラットターゲットに設置する。そして、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウエア等を用いて質量分析を開始する。ＭａｓｓＬｙｎｘによって測定と解析の全てをコントロールすることができる。測定時に、自動測定のパラメーターファイルと、測定後に行うデータプロセスおよびデータベース解析のプロセスファイル、ならびに試料リストなどを作成する。データプロセシングは、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘソフトウエアを用いてＭａｓｓＬｙｎｘ上で行うことができる。取り込まれたデータから質量スペクトルを作成し、作成されたスペクトルは、ＭａｘＥｎｔ ３ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）により、精度を高めた後、モノアイソトピック・ピークデータに変換する。続いてキャリブレーションを行い質量誤差約５０ｐｐｍの最終データとする。
【００４２】
導電性固体支持体にペプチドが固定化され、該ペプチドにさらなるペプチドが相互作用で結合している場合、質量分析に続いてペプチドのアミノ酸配列分析および同定を行うことができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの分析モードをポストソースディケイ(ＰＳＤ)スペクトルを検出できるモードにし、ペプチドのアミノ酸配列を分析する。続いて、アミノ酸配列データを基にＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースを検索し、ペプチドを同定する。あるいは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳやＭＡＬＤＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳにペプチドが固定化された導電性固体支持体を設置してアミノ酸配列を分析し、ペプチドを同定することができる。
【００４３】
本発明はまた、上記の生体分子の分析方法において使用するためのキットであって、表面にカーボン層を有する導電性固体支持体を含むキットに関する。本発明のキットは、表面にカーボン層を有する導電性固体支持体を含み、本発明の方法に使用するためのものであることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。表面にカーボン層を有する導電性固体支持体に加え、例えば、生体分子を分解するための酵素、緩衝液、マトリックス溶媒、洗浄バッファー、試料希釈液、反応停止液、標準物質、取扱説明書等を含みうる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
〔実施例１〕
序論
プロテインチップは、疾患関連タンパク質等のタンパク質をプロファイルし、そしてタンパク質間相互作用（抗体-抗原相互作用1-5、タンパク質-小分子相互作用1,6および酵素-基質相互作用7,8を含む）を分析するのに有用な道具である。分析用プロテインチップの最も一般的な形態は抗体マイクロアレイで、特定の抗原に結合する抗体を固相表面に整列させたものである。多くの研究グループが、ガラスまたはシリコンスライドの表面に直に抗体を配置して、抗体-抗原相互作用を定量的に検出してきた1,4,5,9-11。例えば、Sreekumar et al.11は1枚のガラススライド上に146個の抗体をスポットし、タンパク質発現レベルをモニターして放射線誘発タンパク質を検出した。抗体のほかに、組換えタンパク質等の種々の精製タンパク質が、プロテインチップの化学修飾された表面に固定化された。MacBeath and Schreiber1は、アルデヒド含有シランで処理したガラススライドの表面に組換えタンパク質を共有結合により固定化し、タンパク質間相互作用を分析した。Houseman et al12は、金皮膜ガラススライド上に高密度ペプチドチップを構築し、キナーゼ-基質特異性およびキナーゼ反応の動力学を分析した。この金皮膜ガラススライドは、表面プラズモン共鳴(SPR)により相互作用をモニターするのに利用可能である。彼らは、SPRおよびホスホイメージング(phosphoimaging)を用いて固定化ペプチドのリン酸化を特徴付けた。
【００４５】
近年、プロテインチップ技術は翻訳後修飾の大規模な分析に用いられてきた12-17。Zhu et al.17は、119個の酵母プロテインキナーゼを調製し、ナノウエル(nanowell)チップ上に共有結合により固定化した。これらのチップを、33Pγ-ATPおよび17種類の異なる基質と共にインキュベートした。チップ上のタンパク質を、ホスホイメージングによりリン酸化された基質について分析した。このナノウエルプロテインチップを用いて、彼らは予測されなかったチロシンキナーゼ活性を含む多くの新しいキナーゼ活性を特徴付けた。Gelperin et al.16は、同じプロテインチップに組換え酵母タンパク質を固定化して、糖タンパク質を分析した。このチップを作製するため、彼らはHisタグを有する5854個の酵母発現プラスミドからなる「可動性ORF」ライブラリー由来のMORFタンパク質を精製した。このチップを特定のグリカン鎖に結合する抗体と共に用いて、彼らは、酵母プロテオーム中に109個の新たに確認されたN結合型糖タンパク質および345個の候補糖タンパク質を同定した。
【００４６】
このように、プロテインチップはタンパク質の同定、タンパク質間相互作用の分析、および翻訳後修飾の分析に有用である。ロボットによりスポッティングを行うマイクロアレイヤーを用いて、高密度プロテインチップの作製が達成された。しかし、自動的なスポッティングシステムは、いろいろ活用できるというものではない。さらに、多数のタンパク質をチップ上に固定化するためには、個々のタンパク質を精製する必要がある。多数のタンパク質を精製するには多大な労力と時間を要し、しばしば不可能でさえある。これは、高密度プロテインチップの作製を制限する。この問題を克服するため、本発明者らはダイヤモンド様炭素皮膜処理（diamond-like carbon coated）ステンレス基板（DLC基板）を開発した。この基板は、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルで化学修飾されている。NHSエステルはタンパク質上で第一級アミンと反応し、タンパク質をDLC基板の表面に共有結合させる。DLC基板は導電性なので、ゲル電気泳動による分離の後、タンパク質をゲルからエレクトロブロッティングするのに用いることができる（例えば、ポリビニリデンジフルオリド膜より）。一次元目は等電点電気泳動を用い、二次元目はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を用いる二次元電気泳動(2-DE)は、細胞、組織または他の生物学的サンプルから抽出された複雑なタンパク質混合物の分析に広く使用されている強力な方法である18。高密度プロテインチップを短時間で作製するため、本発明者らはクロマトグラフィー精製の代わりにゲル電気泳動によってタンパク質を分離し、このタンパク質をエレクトロブロッティングによりDLC基板に固定化した。
【００４７】
さらに、このDLC基板は、MALDI-TOF MSのターゲットプレートとして用いることができる。DLC基板およびMALDI-TOF MSを用いて、本発明者らはDLC基板上でタンパク質消化を行い、そしてペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）分析によってチップ上に固定化されたタンパク質の同定を行った。プロテオーム分析のためには、タンパク質のゲル内消化が広く用いられている。2-DEゲル上でタンパク質を同定するためにゲル中のタンパク質スポットをプロテアーゼで消化し、得られた消化物を質量分析により測定する。PMFまたはマススペクトルから得たアミノ酸配列に基づいて、ゲルで分離したタンパク質を同定する。本研究において、DLC基板上でのタンパク質消化を含むオンチップ消化法（on-chip digestion）は、ゲル内消化法とほぼ同じシーケンスカバー率(sequence coverage)を達成した。また、リガンドタンパク質とチップ上に固定化されたタンパク質の間の相互作用も、DLC基板上で検出することができた。これらの相互作用するタンパク質は、チップのMS分析により同定された。さらに、本発明者らは、ゲルで分離したタンパク質をゲルからエレクトロブロッティングすることによりチップ上で糖タンパク質を検出し、そしてMS分析によりそれらを同定した。
【００４８】
本実施例の記述は、ゲルで分離したタンパク質を化学修飾したステンレス基板にエレクトロブロッティングしてプロテインチップを作製し、次にこれを質量分析にかけてタンパク質を同定する技法の開発を示す最初の報告である。
【００４９】
材料および方法
タンパク質
低分子量マーカータンパク質、ペプチドマーカーキット、CyDye reactive Dye、およびペプチドマーカーキットはGE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)より購入した。ホスホリラーゼb、ウシ血清アルブミン(BSA)、炭酸脱水酵素、トリプシンインヒビター、イムノグロブリンG (IgG)、インスリン、プロテインA、およびカルモジュリン(CaM)は、Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)より購入した。コンカナバリンA (ConA)は、和光純薬（大阪、日本）より入手した。4 kDaのホルモン様ペプチドは、Hanada et al.19,20に記載の方法にしたがってダイズから精製した。カルモジュリン結合性ペプチド(CBP)（配列 KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGALC（配列番号１））は、東レ・リサーチセンター（神奈川、日本）によって合成された。酵母タンパク質は、酵母野生株 (Fred Sharman氏から供与; 所属  Department of Biochemistry and Biophysics, University of Rochester Medical Center, Rochester, New York 14642.)より抽出した。抽出物を40,000 x gで20分間遠心し、得られた上清を0.22μｍのメンブレーンフィルターにかけた。乳棒およびモルタルを用いてダイズタンパク質を子葉から2-DE用溶解バッファー21に抽出した。これらのタンパク質サンプルを、GE Healthcareのマニュアルにしたがって、Cy3もしくはCy5マレイミドまたはNHSエステル標識試薬で標識した。
【００５０】
CyDyeで標識したタンパク質の検出
Cy3標識タンパク質は、Typhoon 9410 (GE Healthcare)を用いて、励起波長532 nmおよび放出フィルター580 nmで検出した。同様に、Cy5標識タンパク質は励起波長633 nmおよび放出フィルター670 nmで検出した。蛍光強度はImageQuant (GE Healthcare)を用いて定量した。
【００５１】
DLC基板の作製
ダイヤモンド様炭素膜は、イオン支援成膜法(ion-assisted deposition method)22によってステンレス基板(SUS410, 東洋鋼鈑株式会社、山口、日本)上に形成した。すなわち、ターボ分子ポンプにより8 x 10-3 Pa下で真空化した反応器にステンレス基板を入れ、次にフィードガスとして水素を用いてプラズマ洗浄した。水素ガスの流速は40 sccmにコントロールし、基板に対する自己バイアスRFパワーは 100 Wであった。処理後、メタンガスおよび水素ガスを反応器に導入し、常温で基板上にダイヤモンド様炭素膜を形成した。メタンガスおよび水素ガスの流速は、それぞれ47.5 sccmおよび2.5 sccmであった。反応器内の作動圧力および基板に対するRFパワーは、それぞれ3 Paおよび200 Wに保持した。ダイヤモンド様炭素膜の表面は、塩素ガスを用いて塩素化し、そしてフィードガスとしてアンモニアを流速18 sccmおよび作動圧力3 Paで用いてプラズマによりアミノ化した。ダイヤモンド様炭素膜のアミノ化された表面にカルボキシル基を導入するために、0.14 M無水コハク酸および0.1 Mホウ酸ナトリウムを含有する1-メチル-2-ピロリドン溶液に25℃で10分間基板を浸漬した。次に、基板を脱イオン水ですすぎ、真空乾燥した。ダイヤモンド様炭素膜の表面に結合させたカルボキシル基を活性化するため、0. 2 M N-エチル-N’-1-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドハイドロクロライド、0.2 M N-ヒドロキシスクシンイミドおよび0.1 M K2HPO4/KH2PO4を含有する水溶液中に基板を25℃で20分間浸漬した。次に、基板を脱イオン水ですすぎ、100℃で真空乾燥した。このDLC基板は、日本パーカライジング株式会社(東京、日本)より市販されている。
【００５２】
SDSゲル電気泳動
SDS-PAGEは、Laemmli23の方法に以下の改変を加えて実施した。すなわち、薄いスラブゲル(80 x 60 x 0.3 mm)を用いて、電気泳動は5 mAで実施した。トリシンSDS-PAGEは、Schagger and von Jagow24が記載する方法に以下の改変を加えて実施した。すなわち、薄いスラブゲル(80 x 60 x 0.3 mm)を用いて、電気泳動は5 mAで実施した。
【００５３】
ゲルで分離したタンパク質のDLC基板へのエレクトロブロッティング
ゲル電気泳動後、ゲルを10% (v/v)メタノールに30秒間、次に新たに調製した10%メタノールに3分間浸し、脱イオン水ですすいだ。半乾式ブロッティング装置を用いて、タンパク質をゲルからDLC基板にエレクトロブロッティングした。本発明者らはブロッティング溶液として1 Mホウ酸バッファー(pH 8.0)を用いた。2枚のフィルターペーパー(3MM; Whatman, Florham Park, NJ, USA)をブロッティング溶液に浸し、ゲルまたはフィルターペーパー上の余分な溶液を除去した。DLC基板を半乾式ブロッティング装置の陰極炭素層上に置き、その上にゲルおよび2枚の湿ったフィルターペーパーを重ねた。R.T.で 2 Vで1時間エレクトロブロッティングを行った後、DLC基板を脱イオン水ですすいだ。
【００５４】
固定化pH勾配電気泳動
Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA)のReadyStrip IPG Strips (7 cm, pH 3-10, NL)およびPROTEAN IEF Cellを用いて、酵母タンパク質(50μg)およびダイズタンパク質(20μg)を分離した。製造業者によって提供された処理プログラムを使用した。半乾式ブロッティング装置（SUS、東京、日本）を用いて、ゲルで分離したタンパク質をDLC基板にエレクトロブロッティングした25。
【００５５】
オンチップ消化
タンパク質同定のため、エレクトロブロッティングによってDLC基板上に固定化したタンパク質を、該チップに添加したプロテアーゼにより消化した。すなわち、リシルエンドペプチダーゼ（和光純薬；1μg/ml）またはトリプシン（Promega, Madison, WI, USA; 15μg/ml）を含有する1 μlのプロテアーゼ溶液[5 mM NH4HCO3 (pH 8.0)に溶解]をDLC基板に添加した。オンチップ消化は、ペトリ皿を用いて、湿潤環境下で、37℃で、少なくとも5時間実施した。消化後、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸で飽和したマトリックス溶液[50% (v/v)アセトニトリル/0.1% (v/v)トリフルオロ酢酸に溶解]をチップに分注した。消化物を、MALDI-TOF MS (TofSpec-2E, Micromass, Manchester, UK)を用いて分析した。チップ上に固定化されたタンパク質を、Mascotサーバー(http://www.matrixscience.com/)を用いてペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）法により同定した。
【００５６】
タンパク質間相互作用の検出
チップ上にタンパク質を固定化した後、表面に残っている活性基をブロック試薬N102 (NOFコーポレーション、東京、日本)でブロックした。IgG、インスリン、またはダイズ4-kDaホルモン様ペプチドとの相互作用を分析するためには、10 μg/mlのIgG、インスリンまたは4-kDaペプチドを含有するTBSバッファー(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl)中でプロテインチップを1時間インキュベートした。次にプロテインチップをTBSバッファーで洗浄し、脱イオン水ですすいだ。CaMとCBP間の相互作用を分析するためには、TBSバッファーの代わりに、10 μg/mlのCaMを含有するTBSCバッファー(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaClおよび 2 mM CaCl2)を用いた。Cy3またはCy5蛍光を用いて、これらのプロテインチップをイメージ化した。イメージマッチングは、ImageQuantを用いて分析した。オンチップ消化は、上記「材料および方法」に記述するように実施した。消化物をMALDI-TOF MSにより測定した。
【００５７】
プロテインチップ上の糖タンパク質の検出
Cy3標識ダイズタンパク質(20μg)を2-DEで分離し、DLC基板にエレクトロブロッティングした。ブロッキング後、10 μg/mlのCy5標識ConAを含有するTBSバッファー中でこのチップをインキュベートした。Cy3およびCy5蛍光についてチップをスキャンした。次に、上記「材料および方法」に記述するようにオンチップ消化を実施した。消化物をMALDI-TOF MSにより測定した。
【００５８】
結果および考察
DLC基板の作製およびプロテインチップの調製
ダイヤモンド様炭素膜を、非導電性ガラスまたはシリコン基板の代わりに導電性ステンレス基板上に、イオン支援成膜法により形成した。次に、このDLC基板の表面をNHSエステルにより活性化した（図1-A）。その結果得られる化学修飾されたDLC基板は、共有結合によりタンパク質を固定化することができる。このDLC基板は導電性なので、本発明者らは、高密度プロテインチップを作製するために、ゲルで分離したタンパク質を半乾式ブロッティング装置を用いたエレクトロブロッティングによってゲルから基板上に固定化できるであろうと予測した（図1-B）。
【００５９】
本発明者らは、プロテインチップを効率的に作製するために、電気泳動およびエレクトロブロッティングの実験条件を検討した。ダイヤモンド様炭素膜は、ダイヤモンド膜に類似しているが、分子構造において同一ではない。ダイヤモンド様炭素膜は無定形であって、ダイヤモンド膜よりも化学的にもろい。したがって、3 V以上の電圧でタンパク質をゲルからDLC基板にエレクトロブロッティングすると、DLC基板の表面に形成されたダイヤモンド様炭素膜は、水性溶液中で容易に電気分解される（図2-A）。本発明者らは、エレクトロブロッティングを非常に低い電圧で迅速に実施すべきであることを見い出した。しかし、SDS-PAGEに通常用いられる厚さ1 mmのゲルはエレクトロブロッティングに適していなかった。なぜなら、それは2 Vでタンパク質をゲルから迅速にかつ効率よく転写させるには厚すぎるからである。厚さ0.3 mmのゲルのブロッティング効率は、厚さ1 mmのゲルのそれよりも50-200倍高い（データ不記載）。よって、より薄いゲルがより高いタンパク質転写効率を示した。厚さ0.3 mm未満のゲルは扱いにくいので、本発明者らは本研究に厚さ0.3 mmのゲルを使用した。
【００６０】
転写時間を長くするほど転写効率が増大した。しかし、本発明者らは、2時間以上エレクトロブロッティングを実施するとダイヤモンド様炭素膜が電気分解されることを見い出した（図2-B）。したがって、本発明者らは1時間というブロッティング時間を採用した。一般に、半乾式ブロッティング装置を用いたウエスタンブロッティングには25 mM Trisまたは40 mM Tris 6-アミノカプロン酸が用いられる。しかし、DLC基板にタンパク質をエレクトロブロッティングするためには、1 Mホウ酸バッファーを用いた。ホウ酸バッファーは、Trisおよび Tris 6-アミノカプロン酸溶液よりも2.5-5倍良好なブロッティング効率を示した。Trisおよび Tris 6-アミノカプロン酸溶液を用いた場合のブロッティング効率の低下は、Trisおよび6-アミノカプロン酸のアミノ基によるものかもしれない。なぜなら、それらのアミノ基はDLC基板表面のNHSエステルに結合可能だからである。本発明者らは1 Mホウ酸バッファーを用いて0.1 Mおよび0.5 Mホウ酸バッファーよりも良好な結果を得た。電気泳動後に、10%メタノールおよび脱イオン水の混合物を用いてゲルを30秒および3分の2回洗浄した場合、ブロッティング効率はさらに向上した。ゲルの膨潤を防ぐために、洗浄液に10%メタノールを添加した。
【００６１】
【表１】
2009014433.tif 000003
表１に示す条件下におけるゲルからDLC基板へのエレクトロブロッティング効率を推定するため、マーカータンパク質を含有するCy3標識タンパク質を、厚さ0.3 mmのゲル(80 x 60 x 0.3 mm)のゲルを用いてSDS-PAGEにより分離した。電気泳動後、ゲルを10%メタノールに浸し、タンパク質をゲルからDLC基板にエレクトロブロッティングした。2枚のフィルターペーパーおよびゲルを1 Mホウ酸バッファー中で平衡化し、余分なブロッティングバッファーを除去した。DLC基板を半乾式ブロッティング装置の陰極炭素層上に置き、その上にゲルおよび2枚の湿ったフィルターペーパーを重ねた。2 Vで1時間エレクトロブロッティングを行った後、DLC基板を脱イオン水ですすぎ、乾燥させた。DLC基板上に固定化されたCy3標識タンパク質をCy3蛍光により検出した。
【００６２】
上記実験の結果により、本発明者らはプロテインチップを作製するための電気泳動およびエレクトロブロッティングにとっての最良の条件を決定した（表1）。これらの条件を用いて、本発明者らはブロッティング前のゲル中の蛍光強度とブロッティング後のDLC基板上の蛍光強度を比較することによりエレクトロブロッティング効率を推定した。イムノグロブリンの場合に最高収率(71%)が得られた；最低収率(28%)を示したのは炭酸脱水酵素の場合であった(表2)。
【表２】
2009014433.tif 000004
【００６３】
プロテインチップを用いたタンパク質の同定
本発明者らは、DLC基板上にエレクトロブロッティングしたタンパク質を同定する方法を開発した。すなわち、本発明者らは、その中でCy3標識酵母タンパク質を分離した2種類の2-DEゲルを調製した。１つのゲル中のタンパク質をクーマシー・ブリリアント・ブルー(CBB)染色により可視化した（図3-A）。他方のゲル中のタンパク質をDLC基板にエレクトロブロッティングし、Cy3蛍光を用いてDLC基板上で検出した（図3-B）。ゲル中およびDLC基板上のCy3蛍光を比較することにより、ブロッティング効率は約50%と推定されたが、これはタンパク質の特性により変動した。低分子量タンパク質はゲルから容易に溶出した。分子量に加えて、スポット中のタンパク質の量がブロッティング効率に影響した。多くの場合、タンパク質の量が少ないほどブロッティングで高収率を示した。ブロッティング後、Cy3シグナルを検出するのに用いたDLC基板にプロテアーゼ溶液を添加し、タンパク質のオンチップ消化を実施した。次に、チップ上で得られた消化物にマトリックス溶液を添加し、このチップをMALDI-TOF MSターゲットプレートとしてセットして消化物の質量を測定した。全ての生のマススペクトルを自動的に処理し、そして選択されたモノアイソトピック質量をSWISS-PROTデータベースを用いて検索した。20個のタンパク質スポット（図3に示す）を分析し、オンチップ消化を用いてPMFによりうまく同定した（表3）。オンチップ消化により生成したペプチドのシーケンスカバー率は15-60%であった。これは、タンパク質データベースおよびPMFを用いてタンパク質を同定するのに十分であった。オンチップ消化および従来のゲル内消化によって得られるシーケンスカバー率は殆ど同等であって、DLC基板を用いて作製したプロテインチップがゲルで分離したタンパク質の同定に有用であることを示していた。
【００６４】
【表３】
2009014433.tif 000005
【００６５】
タンパク質相互作用の分析
１）タンパク質間相互作用
本発明者らは、DLC基板上でタンパク質間相互作用分析を実施することの可能性を研究した。DLC基板表面のNHSエステル活性基は、溶液中で2〜3時間後に共有結合活性を失う。この不活性化は好都合である。なぜなら、リガンドタンパク質のインキュベーション中に起こる非特異的結合および汚染を減少させるからである。しかし、リガンドタンパク質とのインキュベーション後にブロックしないと、ゼータ電位による非特異的タンパク質結合がDLC基板上に観察される。この非特異的結合は非共有結合であり、高濃度の有機溶媒(例えば、メタノール)の添加によって抑制することが可能であった。しかし、有機溶媒はタンパク質間相互作用を阻害する。したがって、表面上でタンパク質と結合していない部位(protein-unbinding sites) をブロックする必要があった。タンパク質性ブロッキング試薬はオンチップ消化を用いるMS分析には適さないので、本発明者らは合成ポリマーブロッキング試薬であるN102を用いた。この試薬はタンパク質と結合していない部位をブロックすることができ、かつMALDI-TOF MSによるDLC基板上でのタンパク質質量測定になんら影響を及ぼさなかった。
【００６６】
4種類のタンパク質（BSA、炭酸脱水酵素、トリプシンインヒビターおよびCy5標識プロテインA）をSDS-PAGEで分離し（図4-A）、DLC基板にエレクトロブロッティングした。プロテインAのCy5蛍光強度をモニターすることにより、チップへのタンパク質固定化効率を評価した。ブロッキング後、プロテインチップをCy3標識IgG 含有TBSバッファーでインキュベートした。プロテインAおよびCy3標識IgGを含むタンパク質混合物中の相互作用を、Cy3蛍光強度を測定することにより検出した（図4-B）。プロテインAに対応する位置のみがIgGのCy3蛍光シグナルを示した。次に、プロテアーゼ溶液を一定の時間間隔をおいてチップに添加し、チップ上に固定化されたタンパク質を消化した。得られた消化物をMALDI-TOF MSにより測定した。図4-Cは消化物のMSスペクトルを示す。図4-CのMSスペクトル(b)は、プロテインA消化物およびIgG消化物のMSスペクトルを含んでいた。プロテインAを除くどの固定化タンパク質の位置においても、IgG消化物由来のシグナルは検出されなかった(図4-C)。本発明者らは、プロテインチップ上に固定化されたプロテインAがIgGと特異的に相互作用することを確認した。これらの結果は、プロテインチップ上でタンパク質間相互作用を特異的に検出し、そして相互作用しているタンパク質をMSによって同定できることを示している。
【００６７】
２）タンパク質-ペプチド相互作用
ダイズ由来の43-kDaホルモン受容体様タンパク質は、ダイズ由来4-kDaホルモン様ペプチド(Kd=1.80 x 10-8 M)および哺乳動物由来インスリンと結合する19,20。Cy3で標識したダイズ子葉タンパク質を2-DEで分離し、DLC基板にエレクトロブロッティングした（図5-A）。ブロッキング後、Cy5標識4-kDaペプチドおよびインスリンをそれぞれ含むTBSバッファーを用いてプロテインチップをインキュベートした。Cy5蛍光により相互作用するペプチドを検出した（図5-B）。Cy3およびCy5で検出したスポットをチップ上でトリプシン消化し、このプロテインチップをMALDI-TOF MS分析にかけた。本発明者らは、43-kDaタンパク質とインスリン（図5-C）および43-kDaタンパク質と4-kDaペプチド(図5-D)の対になったシグナルを検出した。
【００６８】
本発明者らはまた、ゲルで分離されたペプチドと相互作用するタンパク質のチップ上における同定にDLC基板技術を利用した。本発明者らは、カルモジュリン結合モチーフを含む合成ペプチド（カルモジュリン結合性ペプチド；CBP）を、トリシンSDS-PAGEを用いて分離した（図6-A）。ゲルで分離したCBPをDLC基板にエレクトロブロッティングした（図6-B）。これらのプロテインチップを、Ca2+を含むTBSCバッファーまたはCa2+を含まないTBSバッファー中でCy5標識カルモジュリン(CaM)と共にインキュベートした（図6-C）。Cy5標識CaMは、Ca2+の存在下でのみCBPと相互作用した。これは、本発明者らがCaM-CBP相互作用をプロテインチップ上でカルシウム依存性に検出      できることを示し、かつCyeによる標識がCBPとCaMの相互作用になんら影響しないことを示している（図6-C、左）。Cy5標識CaMが検出された位置をチップ上でトリプシン消化し、消化物をMALDI-TOF MSにより測定した。これらのスペクトルは、該消化物がCaM消化物およびCBP消化物の混合物を含むことを示した；すなわち、CaMおよびCBPの相互作用がMSによって検出されたのである（図6-D）。
【００６９】
プロテインチップ上の糖タンパク質の検出
本発明者らは、α-マンノース基およびα-グルコース基を含むN結合型オリゴ糖鎖に特異的に結合する一種のレクチンであるコンカナバリンA (Con A)を用いて、プロテインチップ上におけるグリコシル化タンパク質の翻訳後修飾の検出を試みた。本研究において、本発明者らは、Con Aを用いてDLC基板上でダイズ子葉中の糖タンパク質を分析した。Cy3で標識したダイズ子葉タンパク質を2-DEにより分離し、DLC基板にエレクトロブロッティングした（図7-A）。このプロテインチップを、Cy5標識Con Aを含むTBSバッファー中でインキュベートし、蛍光によりイメージ化した（図7-B）。Cy5標識Con A由来シグナルを2つの主要スポットで検出した。これらのスポットをチップ上でトリプシン消化し、次にMALDI-TOF MSにより測定した（図7-C）。これらのタンパク質(スポット１および２)は、SWISS-PROTおよびEntrezデータベースを用いたPMFによって、β-コングリシニンβサブユニット(BAA23361）および43-kDa受容体様タンパク質 (BAA03681)と同定された。β-コングリシニンβサブユニットは、Con Aと相互作用する糖鎖を有する26。本研究において、本発明者らはプロテインチップ上におけるタンパク質間相互作用分析を用いて、β-コングリシニンの他に、43-kDa受容体様タンパク質のグリコシル化をも示した。
【００７０】
本研究において、本発明者らは、NHSエステルで修飾された表面を有するDLCステンレス基板で作られた新規なプロテインチップを開発した。このDLC基板を用いて、エレクトロブロッティングによって本発明者らは簡単かつ迅速に有用なプロテインチップを作成することができる。本発明者らは、プロテインチップ上に固定化されたタンパク質を同定するため、固定化タンパク質と相互作用するタンパク質を検出するため、およびプロテインチップ上の糖タンパク質を分析するための、MALDI-TOF MSを用いた3つの技法を確立した。
【００７１】
〔実施例２〕
本発明者らは、α-マンノース基およびα-グルコース基を含むN結合型オリゴ糖鎖に特異的に結合するレクチンであるコンカナバリンA (Con A)と、N-アセチルグルコサミン（ GlcNAc ）およびシアル酸に特異的に結合するレクチンであるWGA（小麦胚芽凝集素）を用いて、1枚のプロテインチップを作成し、チップ上での複数の翻訳後修飾の同時検出を行った。
まず、サンプルとしてダイズ抽出タンパク質を準備し、Cy2でラベルした。糖鎖を持つオブアルブミン（OVA）をポジティブコントロールとし、糖鎖をもたないウシ血清アルブミン(BSA)をネガティブコントロールとして、それぞれCy2でラベルした。
SDS-PAGEでCy2-ダイズ抽出タンパク質、Cy2-OVA、Cy2-BSAを分離したゲルを2枚準備し、1枚をCBB染色した（図8-A）。残りの1枚をエレクトロブロッティングしてプロテインチップを作成して、作成したプロテインチップ上でのCy2蛍光で分離したタンパク質を検出した（図8-B）。
【００７２】
その後、2種類のレクチン（ConAとWGA）を異なる蛍光波長(Cy5,Cy3)で標識して、Cy5-ConAとCy3-WGAを含むバッファーでインキュベーションし相互作用させたあと、Cy3(右)とCy5（左）の蛍光でそれぞれ検出した。ダイズ抽出タンパク質をアプライしたレーンではCy5-ConAとCy3-WGAが相互作用した共通のバンド(band1)と、Cy5-ConAのみで検出されたバンド(band2)が検出された。また、ポジティブコントロールであるOVAでもConAもWGAも相互作用することが示された。ダイズ抽出タンパク質をアプライしたレーンのband1,2の位置にマトリックスを添加し、オンチップ消化後、MALDI-TOF MSで測定してデータベースサーチを行ったところ、band１はβ-コングリシニンβサブユニットであることが明らかになった(図8-D)。同様にConAのみが反応したBand2を同定したところ、β-コングリシニンαサブユニットであることが明らかになった。
【００７３】
これらの結果から、βサブユニットはα結合型マンノースと末端グルコース基を含む糖鎖と、GlcNAcおよびシアル酸を含む糖鎖が結合しており、αサブユニットにはα結合型マンノースと末端グルコース基を含む糖鎖のみが結合していることが明らかになり、1枚のプロテインチップで複数の翻訳後修飾を検出できることが示された。
次に、SDS-PAGEよりも分離能が高い二次元電気泳動のゲルからプロテインチップを作成し、複数の翻訳後修飾の検出を行った。Cy2-ダイズ抽出タンパク質を二次元電気泳動で分離し、プロテインチップを作成した（図9-A）。プロテインチップ上で、2種類のレクチン（ConAとWGA）を異なる蛍光波長(Cy5,Cy3)で標識して、プロテインチップ上で相互作用させたあと、Cy5(上)とCy3（下）の蛍光でそれぞれ検出した（図9-B）。SDS-PAGEの結果と同様に、Cy5-ConAは2つのスポット上（Spot1,2）で相互作用が検出され、Cy3-WGAは１つのスポット上（Spot1）で相互作用が検出された（図9-B）。オンチップ消化とMALDI-TOF MS測定により、これらのスポットはβ-コングリシニンβサブユニット(Spot1)とβ-コングリシニンαサブユニット(Spot2)であることが明らかになった。このように、SDS-PAGEよりも分離が良い二次元電気泳動でタンパク質を分離した場合、明瞭なスポットとして1枚のプロテインチップで複数の翻訳後修飾を同時に検出できて、迅速に同定できることが示された。
【００７４】
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【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明により、生体分子の修飾の分析を簡単かつ迅速に実施することができる。従って、本発明は、核酸及びタンパク質等の生体分子の機能解析において非常に有用な手段となる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】(A) NHSエステルによるDLC基板の化学修飾。修飾されたDLC基板はゲルで分離したタンパク質と共有結合する。(B) DLC基板を用いたタンパク質同定およびタンパク質間相互作用分析の概要。ゲル電気泳動で分離したタンパク質を、半乾式ブロッティング装置を用いてDLC基板にエレクトロブロッティングする。オンチップ消化により消化物を生成させ、MALDI-TOF MSにより測定してタンパク質を同定する(a)。または、タンパク質もしくはペプチドプローブをチップ上でインキュベートし、次に相互作用するプローブをMALDI-TOF MSにより検出する(b)。
【図２】(A)ゲルからDLC基板へのブロッティング効率に及ぼす異なるブロッティング電圧の影響。厚さ0.3 mmのゲルを用いたSDS-PAGEによりCy3標識タンパク質を分離し、ゲルからDLC基板へ異なる電圧（1、2、3 および4 V）で1時間エレクトロブロッティングした。ブロッティングバッファーは1 Mホウ酸バッファーを含んでいた。(B) ゲルからDLC基板へのブロッティング効率に及ぼすブロッティング時間の影響。Cy3標識タンパク質を2 Vで異なる時間（0.5、1および2時間）エレクトロブロッティングした。レーン１：Cy3標識アビジン0.3μg；レーン２：Cy3標識アビジン0.15μgおよびCy3標識IgG 0.3μg；レーン３：Cy3標識IgG 0.6μg。
【図３】プロテインチップ上における酵母タンパク質の同定。Cy3標識酵母タンパク質(50μg)を2-DEにより分離した。ゲル中のタンパク質をCBBで検出した(A)。Cy3標識タンパク質をゲル（CBB染色なし）からDLC基板へエレクトロブロッティングした。チップ上のタンパク質をCy3蛍光により検出した(B)。DLC基板上でタンパク質をトリプシン消化し、PMFにより同定した。プロテインチップからのタンパク質同定の結果を表3に示す。
【図４】プロテインAとIgGの相互作用の検出。BSA (66-kDa)(a)、Cy5標識プロテインA (43-kDa)(b)、炭酸脱水酵素 (30-kDa)(c) およびトリプシンインヒビター (20-kDa)(d)をSDS-PAGEで分離し、CBBで染色した（A)。ゲル（CBB染色なし）からDLC基板へエレクトロブロッティングした後、チップをTBSバッファー中でCy3標識IgGと共にインキュベートし、そしてCy3標識IgGとの相互作用をCy3蛍光により検出した(B)。次に、これらのタンパク質をチップ上でリシルエンドペプチダーゼにより消化し、消化物をMALDI-TOF MSにより測定して同定した(C)。パネル(a)、(c)および(d)上のマススペクトルは、PMFによりそれぞれBSA、炭酸脱水酵素およびトリプシンインヒビターと同定された。パネル(b)上のMSスペクトルは、プロテインAおよびプロテインAと相互作用しているCy3標識IgGに由来するシグナルを含んでいた。プロテインA由来シグナルを星印で示す。IgG由来シグナルを矢印で示す。
【図５】4-kDaペプチドまたはインスリンとダイズ子葉タンパク質の間の相互作用。(A) 2-DEゲルからDLC基板にエレクトロブロッティングしたCy3標識ダイズ子葉タンパク質の検出。(B) Cy5標識インスリンと共にインキュベートした後のチップ上のCy5蛍光の検出。チップのCy5蛍光スキャンによって相互作用しているインスリン（矢印）を検出した。(C) Cy5-インスリンシグナルによって検出したタンパク質のマススペクトル。43-kDaタンパク質由来シグナルを星印で示す。インスリン由来シグナル[M+H]=4863.2を矢印で示す。(D)スペクトルは43-kDaタンパク質と4-kDaペプチドとの相互作用を示している。43-kDaタンパク質由来シグナルを星印で示す。4-kDaペプチド由来シグナル[M+H]=3918.2を矢印で示す。
【図６】(A) トリシンSDS-PAGEゲル上におけるCBBで染色されたCBPの検出。レーン１：Cy5標識ペプチドマーカー；レーン２：Cy5標識CBP  5μg; レーン３：非標識CBP  5μg。(B) ゲル（CBB染色なし）からDLC基板へエレクトロブロッティングした後、これらのペプチドをCy5によりチップ上で検出した。(C) Ca2+の存在下（左）または不存在下（右）でCy3標識CaMと共にインキュベートした後、Cy3蛍光により相互作用を検出した。(D) オンチップ消化後Cy3シグナルにより検出された位置のマススペクトル。このスペクトルはCBPとCaMの相互作用を示している。CBP由来シグナルを星印で示す。CaM由来シグナルを矢印で示す。
【図７】(A) 分離したCy3標識ダイズ子葉タンパク質を2-DEゲルからエレクトロブロッティングしたプロテインチップ上におけるCy3蛍光の検出。(B) Cy5標識Con Aと共にインキュベートした後のCy5蛍光の検出。(C) Con Aと相互作用するチップ上の2つのスポットのマススペクトル。スポット1 (a)およびスポット2 (b)は、PMFによってβ-コングリシニンβサブユニット(BAA23361）および43-kDa受容体様タンパク質 (BAA03681)と同定された。Con A由来シグナルを矢印で示す。固定化タンパク質由来シグナルを星印で示す。
【図８】(A)Cy2-ダイズ抽出タンパク質をSDS-PAGEで分離したゲルをCBB染色した。Lane1:Cy2-ダイズ抽出タンパク質、Lane2:Cy2-ovalbumin (糖鎖を持つPositive Controlタンパク質)、Lane3:Cy2-BSA (糖鎖をもたないNegative Controlタンパク質)(B)Cy2-ダイズ抽出タンパク質を分離したSDS-PAGEゲルからエレクトロブロッティングをして、プロテインチップを作成し、Cy2蛍光でダイズタンパク質を検出した。(C)2種類のレクチン（ConAとWGA）を異なる蛍光波長(Cy3,Cy5)で標識して、1枚のプロテインチップ上で相互作用させたあと、Cy5-ConA(左)とCy3-WGA（右）の蛍光でそれぞれ検出した。（D）プロテインチップ上でのMALDI-TOF/MS測定で得られたMSスペクトラム。
【図９】(A)Cy2-ダイズ抽出タンパク質を二次元電気泳動で分離したゲルをCBB染色した。(B)Cy2-ダイズ抽出タンパク質を分離したSDS-PAGEゲルからエレクトロブロッティングをして、プロテインチップを作成し、2種類のレクチン（ConAとWGA）を異なる蛍光波長(Cy3,Cy5)で標識して、1枚のプロテインチップ上で相互作用させたあと、Cy5-ConA(上)とCy3-WGA（下）の蛍光でそれぞれ検出した。
【配列表フリーテキスト】
【００８２】
＜配列番号１＞
カルモジュリン結合性ペプチド(CBP)のアミノ酸配列を示す。（Oryctolagus cuniculus (rabbit)由来、 PDB database, ACCESSION  2BBM_B）
【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【配列表】
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