(57)【要約】      （修正有）【課題】試料中のタイプＩＶコラーゲンＮＣ１領域（以下ＮＣ１）を高感度に測定する簡便な方法と試薬を提供する。【解決手段】試料中のＮＣ１を抗ＮＣ１モノクロ−ナル抗体と、抗ＮＣ１モノクロ−ナル抗体もしくは抗ＮＣ１ポリクロ−ナル抗体とのサンドイッチ法により免疫反応で検出する試薬キットであって、抗ＮＣ１モノクロ−ナル抗体がＥＬＩＳＡ法でも、ウエスタンブロットでも、ＮＣ１と反応することを特徴とする試薬キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のタイプＩＶコラーゲンＮＣ１領域（以下ＮＣ１）を抗ＮＣ１モノクロ−ナル抗体と、抗ＮＣ１モノクロ−ナル抗体もしくは抗ＮＣ１ポリクロ−ナル抗体とのサンドイッチ法により免疫反応で検出する試薬キット。
【請求項２】
抗ＮＣ１モノクロ−ナル抗体がＥＬＩＳＡ法でも、ウエスタンブロットでも、ＮＣ１と反応することを特徴とする請求項１の試薬キット。
【請求項３】
抗ＮＣ１モノクロ−ナル抗体を固相化抗体とした請求項２の試薬キット。
【請求項４】
抗ＮＣ１ポリクロ−ナル抗体がモルモット由来である請求項１の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】試料中のタイプＩＶコラーゲンＮＣ１（以下ＮＣ１）を高感度に測定することで、一次性腎炎及び糖尿病、高血圧などの二次性の腎炎の初期を捉える。
【背景技術】
【０００２】従来、試料中のＮＣ１を測定する試薬キットは市場に無かった。従来の自験例では、バックグラウンドが高く、低濃度領域が測定できず、動物やヒト、培養液の試料の僅かな変化を捉えるには不便であった。例えば、試料を濃縮したり、きょう雑物を除く前処理が必要であった。
【発明の開示】
【発明が解決しょうとする課題】
【０００３】本発明者は、試料中のＮＣ１を高感度に測定する簡便な方法と試薬を提供しょうとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】本発明者は、ＮＣ１を非特異的反応を抑えて高感度に測定するには、適切な抗体の組合せで最適の結果が得られると考え、長い間、各種の動物からモノクロ−ナル抗体或いはポリクロ−ナル抗体を作製し、各種抗体の組合せ、濃度の適正化等々の実験を重ねて遂に高感度に測定する簡便な方法と試薬キットを完成するに至った。
【０００５】その結果、ＮＣ１の投与で惹起させた腎炎モデルや、従来からのマウスやラットの糖尿病ラットモデル、高血圧モデル動物でも腎臓に障害が起きると初期に血清や尿にＮＣ１が観察された。
又、ヒトの腎炎でも糸球体疾患に限れば、原発性糸球体疾患の病型として抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎を含む急性進行性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、溶連菌感染後急性糸球体腎炎、微小変化型ネフロ−ゼ症候群、巣状糸球体硬化症をあげられる。又、二次性腎症としては、高血圧性腎症、糖尿病性腎症等があげられるが初期にはやはりＮＣ１の検出が可能である。特に、糖尿病性腎症の初期を検出するには、早期の検体で、尿の微量ＮＣ１を測定するのが良い。
【０００６】腎糸球体の細胞外基質の主要成分は、タイプ４コラ−ゲンを主とするコラ−ゲン、ラミニン、プロテオグリカン、フィブロネクチンなどの糖蛋白質であり、メサンギウム基質と糸球体基底膜ではこれらの構成成分の割合が異なっているとされる（４１３頁、「細胞外マトリックス」メデイカルレビュ−社刊、１９９６）。
そこで、発明者は、腎糸球体のタイプ４コラーゲンを構成しているＮＣ１及びタイプ４コラーゲン三本鎖領域（Ｎ端の７Ｓ及び中央部螺旋域）は免疫系から隠された状態にあり露出することで抗原となり、原発性、二次性を問わず腎炎全ての隠蔽抗原（５３０頁、「標準免疫学」医学書院刊、１９９７）と成り得りと推定した。同時に露出したタイプ４コラーゲンはＭＭＰｓで分解されるので、断片としてＮＣ１、７Ｓ及び中央部螺旋域を捉えることが可能であった。
【０００７】非特異的反応のバックグラウンドを下げ、低濃度域まで高感度にＮＣ１を検出する最も望ましい方法と測定試薬キット。
試薬キットは、１）抗ＮＣ１モノクロ−ナル抗体を固相化したマイクロプレ−ト、２）標準ＮＣ１、３）ビオチン標識抗ＮＣ１抗体、４）アビジン標識ＨＲＰ（酵素）、３）発色基質液（ＴＭＢ）、４）反応停止液（１Ｎ硫酸）を用いたサンドイッチ形式のＥＬＩＳＡ法である。
【０００８】免疫反応として、最も望ましいのは、サンドイッチ形式のＡＢ法ＥＬＩＳＡ法であるが、それに限定されず、ＲＩＡ法，免疫発光法、沈降反応、凝集反応他でも良い。酵素免疫反応において標識の抗体としては、ポリクロ−ナル又はモノクロ−ナル抗体を問わないが、ポリクロ−ナル抗体の時は由来動物はモルモット由来が最も望ましく、ウサギやヤギ由来のものでも良い。抗体の精製はアフィニテ−精製が最も良いがプロテインＡやＧの精製でも良い。又それを放射性物質（ＲＩＡ法）、発光物質で標識した物（免疫発光法）、無標識物（沈降法、凝集法）でも良い。
【０００９】反応形式は、サンドイッチ法が特に望ましいが、競合法他でも良いが高濃度から低濃度まで高感度に測定するのは困難である。
測定試薬の構成として、抗ＮＣ１抗体の固相化にはプレ−トが望ましいが、ガラスや磁性物質にしても良く、無しにして固相法を用いないことでも良い。
【００１０】この時、標準ＮＣ１は、ヒト腎臓由来が最も望ましいが、サル腎臓から得たものでも良い。更には、ウシ腎糸球体から得たものでも良い。標準ＮＣ１の由来組織は腎臓が最も良く胎盤やその他の組織由来でも良い。
【００１１】プレ−トへの固相化抗体には抗ＮＣ１モノクロ−ナル抗体が最も望ましく、固相化抗ＮＣ１モノクロ−ナル抗体には、ヒト、サル、ウシ、ラット、マウスの各種動物由来のＮＣ１の２つ以上と、固相化したＮＣ１とＥＬＩＳＡ法で反応し、かつウエスタンブロット法で反応する抗ＮＣ１モノクロ−ナル抗体が最も望ましい。固相化する時、間接コートにしコ−ト物質をアビジン、ビオチン、又はこれらの結合した成分でも良い。又、抗ＮＣ１モノクロ−ナル抗体を作製する抗原は、生体抽出物やリコンビナントのみでなく、構成ペプタイド（特定分画、合成品を含む）でも良い。抗原の動物種としては、ヒトが望ましく、サル、ウシ、ブタ、ニワトリ、羊、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス他の動物でも良くこれに限定されない。更に、抗原は、複数動物種を混合したものでも良い。抗原の由来臓器は、腎臓が望ましいが、これに限定されない。
【００１２】更に第二抗体は、抗ヒトＩｇＡ抗体が特に望ましく、抗ヒトＩｇＧ抗体も望ましいが、これに限定されず、抗ヒトＩｇＭ抗体、その他の抗ヒトイムノグロブリン抗体でも良く混合でも良い。測定対象がラットやマウスなどヒト以外の動物の時は、前述のヒト用試薬成分を対象動物に合わせて測定することができる。しかしサルの場合は、ヒト用をそのまま用いる事ができる。
【発明の効果】
【００１３】本発明の試薬キットは、バックグラウンドを低くし、かつ低濃度域のＮＣ１を高感度に測定することを可能とする。高感度なので試料を希釈しても測定でき、試料中に共存する反応阻害物も希釈されるので悪影響を抑制できる。例えば、腎細胞の培養などの低濃度のＮＣ１の測定も可能である。血清や尿中のＮＣ１測定は、糖尿病性腎症や高血圧性腎症の腎炎モデルで薬剤の治療評価や副作用評価に、ヒトの一次性や二次性の腎炎及び腎臓癌など腎疾患の初期検出を可能とする。
【実施例】
【００１４】１）測定試薬キットの構成と測定手順
Ａｎｔｉ−ＮＣ１／ＭｏｎｏＡｂｓ（２ｕｇ／ｍｌ）１００ｕｌ／ｗｅｌｌ（ＰＢＳ）１夜４〜１２Ｃ
−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ（２５％ブロックエース＋０．０５％プロクリン）
−使用時ｗａｓｈ（ＰＢＳ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）×４回，
標準ＮＣ１  １００ｕｌ／ｗｅｌｌ
（希釈液；１０％ブロックエース／ＰＢＳ＋０．０５％プロクリン（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０））ＲＴ×２ｈｒ
−ｗａｓｈ×４回，
Ａｎｔｉ−ＮＣ１  ＧＰ  ＩｇＧ−Ｂｉｏｔｉｎ  １００ｕｌ／ｗｅｌｌ
（０．９５ｍｇ／ｍｌ×１０００（２段階希釈×１０×１００））ＲＴ×２ｈｒ
−ｗａｓｈ×４回，
Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ  １００ｕｌ／ｗｅｌｌ
（１ｍｇ／ｍｌ×４０００（２段階希釈×４０×１００））ＲＴ×３０ｍｉｎ
−ｗａｓｈ×４回，
基質液（ＴＭＢ＋）１００ｕｌ／ｗｅｌｌ，ＲＴ×２０ｍｉｎ
停止液（１Ｍ−Ｈ２ＳＯ４）１００ｕｌ／ｗｅｌｌ
−Ａ４５０ｎｍ
２）測定結果１；
Ｌｏｔ．７Ａ２５：製造年月日２００７  １  ２５    製造後１か月目以降に測定
→実験Ｎｏ７０２０２（Ｌｏｔ．７Ａ２５）１０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ２．５３３，５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ１．４０３，１ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．３５８，０．５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．２２４，０．２５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１６７，０．０６ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１１６，０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．０９１
→実験Ｎｏ７０２０９（Ｌｏｔ．７Ａ２５）１０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ２．７０９，５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ１．５１８，１ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．４４８，０．５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．２７１，０．２５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．２０１，０．０６ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１４０，０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１０９
→実験Ｎｏ７０２２３（Ｌｏｔ．７Ａ２５）１０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ２．４３６，５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ１．４０１，１ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．４１４，０．５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．２７５，０．２５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．２１４，０．０６ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１７１，０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１２０
→実験Ｎｏ７０３０２（Ｌｏｔ．７Ａ２５）１０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ２．７３０，５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ１．５３０，１ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．４３８，０．５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．２８７，０．２５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．２１４，０．０６ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１５２，０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１３０
Ｎ＝４
１０ｎｇ／Ａｖｅ  ２．６０２    ＳＤ  ０．１４２    ＣＶ    ５．５
５              １．４６３          ０．０７１            ４．９
１              ０．４１５          ０．０４０            ９．６
０．５          ０．２６４          ０．０２８          １０．６
０．２５        ０．１９９          ０．０２２          ２１．１
０．０６        ０．１４５          ０．０２３          １５．９
０．００        ０．１１３          ０．０１７          １５．０
０濃度のＡｖｅ＋２ＳＤ＝０．１４７
０．２５のＡｖｅ−２ＳＤ＝０．１５５
結論
１）製造後１か月で、１０〜０．２５ｎｇ／ｍｌの低濃度を安定して測定できる。
２）キットの最低検出標準は０．２５ｎｇ／ｍｌとする。
３）測定結果２；
Ｌｏｔ．７Ｃ２０；製造年月日２００７  ３  ２０    製造後３か月目以降に測定
→実験Ｎｏ７０６０５▲１▼（Ｌｏｔ．７Ｃ２０）１０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ２．３７９，５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ１．２５８，１ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．３４０，０．５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．２２２，０．２５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１７３，０．０６ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１３１，０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．０９８
→実験Ｎｏ７０６１２▲１▼（Ｌｏｔ．７Ｃ２０）１０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ１．８０８，５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ１．０１２，１ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．３０９，０．５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．２０９．０．２５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１７１，０．０６ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１２６，０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．０８６
→実験Ｎｏ７０６１５▲１▼（Ｌｏｔ．７Ｃ２０）１０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ２．０１９，５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ１．０６１，１ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．２６２，０．５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１５３，０．２５ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．１１０，０．０６ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．０６７，０ｎｇ／ｍｌ；ＯＤ０．０４２
Ｎ＝３
１０ｎｇ／Ａｖｅ  ２．０６８    ＳＤ  ０．２８９    ＣＶ  １４．０
５              １．１１０          ０．１３０          １１．７
１              ０．３０４          ０．０３９          １２．８
０．５          ０．１９５          ０．０３７          １９．０
０．２５        ０．１５１          ０．０３６          ２３．８
０．０６        ０．１０１          ０．０３６          ３５．６
０．００        ０．０８３          ０．０１６          １９．２
結論
１）製造後３か月で、１０〜０．２５ｎｇ／ｍｌの低濃度を安定して測定できる。