(57)【要約】【課題】血清マーカーを用いた高安動脈炎の診断方法を提供すること。【解決手段】抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）抗体の量を指標として診断する。血清中の抗ＰＰＩＡ抗体の量を測定し、抗ＰＰＩＡ抗体の量が所定の値より多いとき、被験者は高安動脈炎を発病していると判定する。抗ＰＰＩＡ抗体の量を指標とすることで、高安動脈炎を迅速かつ容易に診断することができる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された生体試料中の抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ抗体の量を測定するステップを含む、高安動脈炎の診断方法。
【請求項２】
前記抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ抗体の量が所定の値より多いとき、前記被験者は高安動脈炎を発病している可能性が高いと判定するステップをさらに含む、請求項１に記載の診断方法。
【請求項３】
前記生体試料は血清である、請求項１に記載の診断方法。
【請求項４】
前記抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ抗体の量は、免疫測定法により測定される、請求項１に記載の診断方法。
【請求項５】
前記免疫測定法は、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ラテックス凝集法またはイムノクロマト法である、請求項４に記載の診断方法。
【請求項６】
前記生体試料中の抗ペルオキシレドキシン２抗体の量を測定するステップと、
前記抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ抗体の量が所定の値より多いか、または前記抗ペルオキシレドキシン２抗体の量が所定の値より多いとき、前記被験者は高安動脈炎を発病している可能性が高いと判定するステップと、
をさらに含む、請求項１に記載の診断方法。
【請求項７】
ペプチジルプロリルイソメラーゼＡまたはその断片を有する、高安動脈炎の診断キット。
【請求項８】
ペプチジルプロリルイソメラーゼＡまたはその断片が固定化されている担体と、
抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ抗体に結合する標識抗体と、
を有する、請求項７に記載の診断キット。
【請求項９】
抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ抗体に結合する抗体が固定化されている担体と、
標識されたペプチジルプロリルイソメラーゼＡまたはその断片と、
を有する、請求項７に記載の診断キット。
【請求項１０】
ペプチジルプロリルイソメラーゼＡまたはその断片が固定化されている担体粒子を有する、請求項７に記載の診断キット。
【請求項１１】
ペルオキシレドキシン２またはその断片をさらに有する、請求項７に記載の診断キット。
【請求項１２】
抗ペルオキシレドキシン２抗体に結合する抗体をさらに有する、請求項１１に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高安動脈炎の診断方法およびそれに用いられる診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血管炎症候群は、全身の各種血管に炎症が生じ、血液の流れが障害される病気の総称である。血管炎症候群には多数の疾患が含まれており、各疾患は障害を受ける血管の太さにより分類されている。そのような疾患の例には、高安動脈炎（大動脈炎症候群）、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、結節性多発動脈炎、川崎病などの大型・中型血管炎；ウェゲナー肉芽腫症、アレルギー性肉芽腫性血管炎、顕微鏡的多発血管炎などの小型血管炎；などが含まれる。血管炎の病因および病態は未解明であり、疾患特異的な治療法も開発されていない。
【０００３】
大型・中型血管炎の代表的疾患である高安動脈炎は、炎症が生じた血管の部位により様々な症状が出現する。好発年齢は１０〜２０歳代と若年者に好発するため、早期に診断を受けて治療を開始し、可能な限り虚血性の臓器障害を少なくすることが求められている。
【０００４】
ところで、ヒトの様々な疾患について、その疾患に特異的な血清マーカー（自己抗原または自己抗体）を指標とする診断方法が普及してきている。この方法は、大掛かりな設備を必要とせず、被験者への負担も少ないため、自覚症状のない多くの被験者に対しても広範囲に実施することが可能である。血管炎症候群においても、抗好中球細胞質抗体（Anti-neutrophil cytoplasmicantibody：以下「ＡＮＣＡ」と略記する）が、小型血管炎（ウェゲナー肉芽腫症、アレルギー性肉芽腫性血管炎および顕微鏡的多発血管炎）に特異的なマーカーとして報告されており、小型血管炎の診断に用いられている。一方、大型・中型血管炎に特異的なマーカーは、現在までに報告されていない。
【０００５】
大型・中型血管炎の代表的疾患である高安動脈炎の患者では、抗血管内皮細胞抗体（Anti-endothelial cell antibody：以下「ＡＥＣＡ」と略記する）の陽性率が９５％との報告がある（非特許文献１参照）。また、ＡＥＣＡが高安動脈炎の病態形成に関与している可能性があるとの報告もある（非特許文献２参照）。しかしながら、ＡＥＣＡに含まれる数多くの抗体のうち、どの抗体が高安動脈炎に特異的なマーカーとなりうるのかについては報告されていない。
【非特許文献１】Youinou P., "New target antigens for anti-endothelial cell antibodies", Immunobiology, 2005, vol. 210(10), p. 789-97.
【非特許文献２】Muller Kobold AC, et al., "In vitro up-regulation of E-selectin and induction of interleukin-6 in endothelial cells by autoantibodies in Wegener'sgranulomatosis and microscopic polyangiitis", Clin. Exp. Rheumatol., 1999, vol. 17(4), p. 433-40.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述の通り、高安動脈炎に特異的な血清マーカーは現在までに報告されておらず、特異的な診断方法が確立されていない。したがって、高安動脈炎の診断および治療が遅れてしまい、重度の後遺症や著しいＱＯＬの低下をきたす症例も少なくなかった。このような状況のため、高安動脈炎の診断方法に対する社会的要求が高まってきている。
【０００７】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、高安動脈炎の診断方法およびそれに用いられる診断キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ抗体が高安動脈炎に特異的なマーカーとなりうることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の高安動脈炎の診断方法に関する。
［１］被験者から採取された生体試料中の抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ抗体の量を測定するステップを含む、高安動脈炎の診断方法。
［２］前記抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ抗体の量が所定の値より多いとき、前記被験者は高安動脈炎を発病している可能性が高いと判定するステップをさらに含む、［１］に記載の診断方法。
［３］前記生体試料は血清である、［１］または［２］に記載の診断方法。
［４］前記抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ抗体の量は、免疫測定法により測定される、［１］〜［３］のいずれかに記載の診断方法。
［５］前記免疫測定法は、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ラテックス凝集法またはイムノクロマト法である、［４］に記載の診断方法。
［６］前記生体試料中の抗ペルオキシレドキシン２抗体の量を測定するステップと、前記抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ抗体の量が所定の値より多いか、または前記抗ペルオキシレドキシン２抗体の量が所定の値より多いとき、前記被験者は高安動脈炎を発病している可能性が高いと判定するステップと、をさらに含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の診断方法。
【００１０】
また、本発明は、以下の高安動脈炎の診断キットに関する。
［７］ペプチジルプロリルイソメラーゼＡまたはその断片を有する、高安動脈炎の診断キット。
［８］ペプチジルプロリルイソメラーゼＡまたはその断片が固定化されている担体と、抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ抗体に結合する標識抗体と、を有する、［７］に記載の診断キット。
［９］抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ抗体に結合する抗体が固定化されている担体と、標識されたペプチジルプロリルイソメラーゼＡまたはその断片と、
を有する、［７］に記載の診断キット。
［１０］ペプチジルプロリルイソメラーゼＡまたはその断片が固定化されている担体粒子を有する、［７］に記載の診断キット。
［１１］ペルオキシレドキシン２またはその断片をさらに有する、［７］〜［１０］のいずれかに記載の診断キット。
［１２］抗ペルオキシレドキシン２抗体に結合する抗体をさらに有する、［１１］に記載の診断キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、高安動脈炎の診断、疾患活動性の評価、治療効果の評価などを迅速かつ容易に行うことができる。したがって、本発明によれば、高安動脈炎の診断および治療を早期に行うことが可能となり、患者のＱＯＬを向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
１．本発明の高安動脈炎の診断方法
本発明の診断方法は、被験者から採取された生体試料中の抗ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（peptidylprolyl isomerase A または cyclophilinA；以下「ＰＰＩＡ」と略記する）抗体の量を測定するステップを含む。
【００１３】
本発明の診断方法は、自己抗体である抗ＰＰＩＡ抗体の量を指標とすることを特徴とする。「抗ＰＰＩＡ抗体」とは、ヒトＰＰＩＡに特異的に結合しうるヒト抗体を意味する。本発明者は、高安動脈炎に特異的なマーカーをプロテオミクスを用いて網羅的に探索したところ、抗ＰＰＩＡ抗体がマーカーになりうることを見出した。抗ＰＰＩＡ抗体は、抗血管内皮細胞抗体（ＡＥＣＡ）の１つであり、高安動脈炎の患者の血清中でその量が特異的に上昇する。実施例に示されるように、抗ＰＰＩＡ抗体を測定する本発明の診断方法は、適切なカットオフ値を設定することで高感度かつ高特異度の診断方法となりうる。
【００１４】
生体試料は特に限定されないが、血液、血漿、血清、これらの希釈液などを用いることができる。生体試料が血清である場合は、生体試料の採取が容易であり、かつ生検などに比べて侵襲を伴わずに短時間で診断を行うことができる。
【００１５】
生体試料中の抗ＰＰＩＡ抗体の量を測定する方法は、免疫測定法などの当業者に公知の測定法から選択することができる。免疫測定法の例には、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法などが含まれる。例えば、後述する本発明の診断キットを用いれば、ＥＬＩＳＡ法やラテックス凝集法などで抗ＰＰＩＡ抗体の量を測定することができる（実施の形態参照）。
【００１６】
免疫測定法で用いられる抗原は、抗ＰＰＩＡ抗体が結合しうるタンパク質またはペプチドであれば特に限定されない。そのような抗原の例には、ヒトＰＰＩＡ（ＧＩ４８１４５５３１）、ヒトＰＰＩＡの断片（エピトープ部分を含むペプチド）、これらと他のタンパク質（ペプチド）との融合タンパク質などが含まれる。これらの抗原は、当業者に公知の遺伝子工学技術および分子生物学的技術を用いて調製することができる。これらの抗原は、担体に固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。また、これらの抗原は、酵素、放射性同位体、蛍光色素、アビジン、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００１７】
例えば、生体試料中の抗ＰＰＩＡ抗体の量を測定した結果、抗ＰＰＩＡ抗体の量が所定のカットオフ値よりも多いときは、当該患者は高安動脈炎を発病している可能性が高いと判定し、抗ＰＰＩＡ抗体の量が所定のカットオフ値よりも少ないときは、当該患者は高安動脈炎を発病していない可能性が高いと判定する。抗ＰＰＩＡ抗体のカットオフ値は、診断の目的に応じて、健常者から採取した生体試料中の抗ＰＰＩＡ抗体の測定値などから設定すればよい（実施例参照）。
【００１８】
ＰＰＩＡは、カルモジュリンとカルシニューリンとの複合体に結合して、カルシニューリン活性の発現を早めることが報告されている。カルシニューリンは、Ｔ細胞活性化のシグナル伝達において重要な役割を果たしている、カルモジュリン依存性のタンパク質脱リン酸化酵素である。カルシニューリン活性が発現すると、ＩＬ−２遺伝子などの転写因子であるＮＦＡＴが脱リン酸化されて細胞質内から核内に移行し、ＩＬ−２などのサイトカインが産生される。また、ＰＰＩＡは、血管炎症候群を含む様々な疾患の治療に使用されている免疫抑制剤シクロスポリン（cyclosporin；以下「ＣｙＡ」と略記する）の細胞内結合タンパク質でもある。ＣｙＡはＰＰＩＡと複合体を形成し、この複合体はカルシニューリンに結合する。その結果、ＮＦＡＴのカルシニューリンによる脱リン酸化が阻害され、ＩＬ−２などのサイトカインの産生が抑制される。これらのことから、抗ＰＰＩＡ抗体がカルシニューリンの活性に何らかの影響を及ぼしている可能性、および抗ＰＰＩＡ抗体が高安動脈炎の病態形成に関与している可能性が推測されるが、詳細は不明である。
【００１９】
本発明の診断方法は、被験者から採取された生体試料中の抗ペルオキシレドキシン２（peroxiredoxin 2；以下「ＰＲＤＸ２」と略記する）抗体の量を測定するステップをさらに含んでいてもよい。すなわち、本発明の診断方法は、一つの生体試料について、抗ＰＰＩＡ抗体の量を測定するとともに、抗ＰＲＤＸ２抗体の量を測定してもよい。「抗ＰＲＤＸ２抗体」とは、ヒトＰＲＤＸ２に特異的に結合しうるヒト抗体を意味する。抗ＰＲＤＸ２抗体が血管炎（高安動脈炎など複数の疾患を含む）に特異的なマーカーであることは、本発明者らにより開示されている（例えば、国際公開第２００４／０９４６３８号パンフレット参照）。
【００２０】
生体試料中の抗ＰＲＤＸ２抗体の量を測定する方法は、免疫測定法などの当業者に公知の測定法から選択することができるがこれに限定されない。免疫測定法の例には、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法などが含まれる。例えば、後述する本発明の診断キットを用いれば、ＥＬＩＳＡ法やラテックス凝集法などで抗ＰＲＤＸ２抗体の量を測定することができる。
【００２１】
免疫測定法で用いられる抗原は、抗ＰＲＤＸ２抗体が結合しうるタンパク質またはペプチドであれば特に限定されない。そのような抗原の例には、ヒトＰＲＤＸ２（ＧＩ３３８７５４６２）、ヒトＰＲＤＸ２の断片（エピトープ部分を含むペプチド）、これらと他のタンパク質（ペプチド）との融合タンパク質などが含まれる。これらの抗原は、当業者に公知の遺伝子工学技術および分子生物学的技術を用いて調製することができる。これらの抗原は、担体に固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。また、これらの抗原は、酵素、放射性同位体、蛍光色素、アビジン、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００２２】
例えば、生体試料中の抗ＰＰＩＡ抗体および抗ＰＲＤＸ２抗体の量を測定した結果、抗ＰＰＩＡ抗体の量が所定のカットオフ値よりも多いか、または抗ＰＲＤＸ２抗体の量が所定のカットオフ値よりも多いときは、当該患者は高安動脈炎を発病している可能性が高いと判定する。このようにすることで、偽陰性率を低減させることができる（実施例参照）。抗ＰＲＤＸ２抗体のカットオフ値は、診断の目的に応じて、健常者から採取した生体試料中の抗ＰＲＤＸ２抗体の測定値などから設定すればよい。
【００２３】
２．本発明の高安動脈炎の診断キット
本発明の診断キットは、生体試料中の抗ＰＰＩＡ抗体の量を免疫測定法により測定するためのキットであり、本発明の診断方法に用いることができる。
【００２４】
本発明の診断キットは、抗ＰＰＩＡ抗体に対応する抗原を有することを特徴とする。本発明の診断キットは、この抗原と抗ＰＰＩＡ抗体との抗原抗体反応を検出して、生体試料中の抗ＰＰＩＡ抗体の量を測定する。
【００２５】
抗ＰＰＩＡ抗体に対応する抗原は、抗ＰＰＩＡ抗体が結合しうるタンパク質またはペプチドであれば特に限定されない。そのような抗原の例には、ヒトＰＰＩＡ（ＧＩ４８１４５５３１）、ヒトＰＰＩＡの断片（エピトープ部分を含むペプチド）、これらと他のタンパク質（ペプチド）との融合タンパク質などが含まれる。これらの抗原は、当業者に公知の遺伝子工学技術および分子生物学的技術を用いて調製することができる。これらの抗原は、担体に固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。抗原を担体に固定化する方法は、当業者に公知の方法から選択することができる。また、これらの抗原は、酵素、放射性同位体、蛍光色素、アビジン、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００２６】
本発明の診断キットは、適用する免疫測定法に応じて、抗ＰＰＩＡ抗体に結合しうる抗体または前記抗原に特異的に結合しうる抗体を有していてもよい。これらの抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。抗体の例には、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆｖフラグメントなどの抗体の一部断片も含まれる。これらの抗体は、当業者に公知の抗体作製法を用いて作製することができるし、市販のものを購入してもよい。これらの抗体は、担体に固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。抗体を担体に固定化する方法は、当業者に公知の方法から選択することができる。また、これらの抗体は、酵素、放射性同位体、蛍光色素、アビジン、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００２７】
本発明の診断キットは、抗ＰＲＤＸ２抗体に対応する抗原をさらに有していてもよい。抗ＰＲＤＸ２抗体に対応する抗原は、抗ＰＲＤＸ２抗体が結合しうるタンパク質またはペプチドであれば特に限定されない。抗原の例には、ヒトＰＲＤＸ２（ＧＩ３３８７５４６２）、ヒトＰＲＤＸ２の断片（エピトープ部分を含むペプチド）、これらと他のタンパク質（ペプチド）との融合タンパク質などが含まれる。これらの抗原は、当業者に公知の遺伝子工学技術および分子生物学的技術を用いて調製することができる。これらの抗原は、担体に固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。抗原を担体に固定化する方法は、当業者に公知の方法から選択することができる。また、これらの抗原は、酵素、放射性同位体、蛍光色素、アビジン、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００２８】
また、本発明の診断キットが抗ＰＲＤＸ２抗体に対応する抗原を有する場合、本発明の診断キットは、適用する免疫測定法に応じて、抗ＰＲＤＸ２抗体に結合しうる抗体または前記抗原に特異的に結合しうる抗体を有していてもよい。これらの抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。抗体の例には、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆｖフラグメントなどの抗体の一部断片も含まれる。これらの抗体は、当業者に公知の抗体作製法を用いて作製することができるし、市販のものを購入してもよい。これらの抗体は、担体に固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。抗体を担体に固定化する方法は、当業者に公知の方法から選択することができる。また、これらの抗体は、酵素、放射性同位体、蛍光色素、アビジン、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００２９】
このように、抗ＰＲＤＸ２抗体に対応する抗原を有する診断キットを用いることで、抗ＰＰＩＡ抗体だけでなく抗ＰＲＤＸ２抗体の量も測定することができるようになる。この場合、抗ＰＰＩＡ抗体の反応場と抗ＰＲＤＸ２抗体の反応場とは同じであってもよいし異なっていてもよい。例えば、本発明の診断キットが９６ウェルプレートである場合、抗ＰＰＩＡ抗体に対応する抗原を固定化されているウェルと抗ＰＲＤＸ２抗体に対応する抗原を固定化されているウェルとは同じであってもよいし異なっていてもよい。
【００３０】
自己抗体を検出するための診断キットは、自己抗体の種類に応じて様々なものが市販されている。本発明の診断キットも、抗ＰＰＩＡ抗体に対応する抗原や、前記抗原に特異的に結合しうる抗体、抗ＰＰＩＡ抗体に結合しうる抗体などを用いることを除き、当業者に公知の診断キットに用いられている各要素によって構成することができる。
【００３１】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。本発明はこれらの実施の形態により限定されない。
【００３２】
（実施の形態１）
図１は、実施の形態１の診断方法および診断キットを説明するための模式図である。本実施の形態では、ＥＬＩＳＡ法で抗ＰＰＩＡ抗体の量を測定する例を示す。
【００３３】
図１（Ａ）において、診断キット１００は、抗原１１０が固定化された担体１２０と、抗ＰＰＩＡ抗体に結合しうる標識抗体１３０（不図示）とを有する。
【００３４】
抗原１１０は、検出対象の抗ＰＰＩＡ抗体１４０が結合しうるタンパク質またはペプチドであり、担体１２０に固定化されている。抗原１１０は、例えば、ヒトＰＰＩＡやその断片などである。担体１２０は、例えば、樹脂プレートやメンブレンなどである。
【００３５】
標識抗体１３０は、検出対象の抗ＰＰＩＡ抗体１４０に結合しうる抗体であり、例えば抗ヒトＩｇＧ抗体である。標識抗体１３０は、ＨＲＰなどの酵素や、放射性同位体、蛍光色素などで標識されている。
【００３６】
次に、この診断キットを用いた診断方法の手順を説明する。
【００３７】
まず、被験者から採取した生体試料（例えば、血清）を担体１２０上に滴下する。図１（Ｂ）に示されるように、生体試料に含まれる検出対象の抗ＰＰＩＡ抗体１４０は、抗原１１０に結合する。
【００３８】
担体１２０表面を洗浄した後、標識抗体１３０を含む溶液を担体１２０上に滴下する。図１（Ｃ）に示されるように、標識抗体１３０は、抗ＰＰＩＡ抗体１４０に結合する。
【００３９】
担体１２０表面を再度洗浄した後、標識抗体１３０のシグナルを検出して抗ＰＰＩＡ抗体１４０の量を測定する。例えば、標識抗体１３０がＨＲＰなどの酵素で標識されている場合は、酵素作用によって発色する基質を担体１２０上に滴下し、基質の分解量を光学的に測定して酵素活性を測定し、結合抗体量に換算すればよい。また、標識抗体１３０が放射性同位体で標識されている場合は、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンターなどにより測定すればよい。また、標識抗体１３０が蛍光色素で標識されている場合は、蛍光プレートリーダーなどにより測定すればよい。
【００４０】
最後に、抗ＰＰＩＡ抗体１４０の測定値と所定のカットオフ値とを比較して、被験者が高安動脈炎を発病している可能性が高いかどうかを判定する。
【００４１】
（実施の形態２）
図２は、実施の形態２の診断方法および診断キットを説明するための模式図である。本実施の形態では、ＥＬＩＳＡ法（実施の形態１とは異なる）で抗ＰＰＩＡ抗体の量を測定する例を示す。
【００４２】
図２（Ａ）において、診断キット２００は、抗ＰＰＩＡ抗体に特異的に結合しうる抗体２１０が固定化された担体２２０と、標識抗原２３０（不図示）とを有する。
【００４３】
抗体２１０は、検出対象の抗ＰＰＩＡ抗体１４０に結合しうる抗体であり、担体２２０に固定化されている。担体２２０は、例えば、樹脂プレートやメンブレンなどである。
【００４４】
標識抗原２３０は、検出対象の抗ＰＰＩＡ抗体１４０が結合しうるタンパク質またはペプチドである。標識抗原２３０は、ＨＲＰなどの酵素や、放射性同位体、蛍光色素などで標識されている。
【００４５】
次に、この診断キットを用いた診断方法の手順を説明する。
【００４６】
まず、被験者から採取した生体試料を担体２２０上に滴下する。図２（Ｂ）に示されるように、抗体２１０は、生体試料に含まれる検出対象の抗ＰＰＩＡ抗体１４０に結合する。
【００４７】
担体２２０表面を洗浄した後、標識抗原２３０を含む溶液を担体２２０上に滴下する。図２（Ｃ）に示されるように、抗ＰＰＩＡ抗体１４０は、標識抗原２３０に結合する。
【００４８】
担体２２０表面を再度洗浄した後、実施の形態１と同様に標識抗原２３０のシグナルを検出して抗ＰＰＩＡ抗体１４０の量を測定する。
【００４９】
最後に、抗ＰＰＩＡ抗体１４０の測定値と所定のカットオフ値とを比較して、被験者が高安動脈炎を発病している可能性が高いかどうかを判定する。
【００５０】
（実施の形態３）
図３は、実施の形態３の診断方法および診断キットを説明するための模式図である。本実施の形態では、ラテックス凝集法で抗ＰＰＩＡ抗体の量を測定する例を示す。
【００５１】
図３（Ａ）において、診断キット３００は、抗原１１０が固定化された担体粒子３１０を有する。
【００５２】
抗原１１０は、検出対象の抗ＰＰＩＡ抗体１４０が結合しうるタンパク質またはペプチドであり、担体粒子３１０に固定化されている。担体粒子３１０は、例えば、ラテックス粒子などである。
【００５３】
次に、この診断キットを用いた診断方法の手順を説明する。
【００５４】
まず、被験者から採取した生体試料（例えば、血清）と抗原１１０が固定化された複数の担体粒子３１０とを混合する。生体試料に含まれる検出対象の抗ＰＰＩＡ抗体１４０は抗原１１０に結合する。結果として、担体粒子３１０は、図３（Ｂ）に示されるように凝集する。
【００５５】
免疫凝集物を形成させた後、混合液に光を照射し、散乱光または透過光を測定して、抗ＰＰＩＡ抗体１４０の量を測定する。
【００５６】
最後に、抗ＰＰＩＡ抗体１４０の測定値と所定のカットオフ値とを比較して、被験者が高安動脈炎を発病している可能性が高いかどうかを判定する。
【００５７】
以上のように、本発明の診断方法は、抗ＰＰＩＡ抗体を高安動脈炎のマーカーとすることで、高安動脈炎を迅速かつ容易に診断することができる。本発明の診断方法は、高安動脈炎であるかどうかを診断する際の補助的な血液検査として有用である。また、本発明の診断方法は、高安動脈炎の疾患活動性の評価、治療効果の確認、臨床経過のモニタリングなどにおいても適用可能である。
【００５８】
従来、高安動脈炎の診断にはＭＲＩなどの高額な画像診断装置が使用されている。本発明の診断方法は、高額な装置を必要としないため、従来の方法に比べて低費用で行うことができる。
【００５９】
わが国において、川崎病をはじめとする原発性血管炎患者が約１４万人、血管炎を併発しうる続発性血管炎患者が約８０万人、さらに不明熱などの血管炎の有無の診断が必要とされる患者も多数いることから、本発明の診断方法は非常に有用である。
【００６０】
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００６１】
［実施例１］
実施例１では、抗ＰＰＩＡ抗体を指標として高安動脈炎を診断した例を示す。
【００６２】
１．ＡＥＣＡ対応抗原の同定
ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell；以下「ＨＵＶＥＣ」と略記する）およびＨｅＬａ細胞（対照）から抽出したタンパク質をそれぞれ２次元ゲル電気泳動法で分離した。血管炎（高安動脈炎を含む）の患者の血清（１次抗体）およびＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（２次抗体）を用いたウェスタンブロット法により、ＨＵＶＥＣのみで認められるスポットを同定した。
【００６３】
再度、ＨＵＶＥＣから抽出したタンパク質を２次元ゲル電気泳動法で分離し、先に同定されたスポットに対応する箇所のゲルを切り出した。切り出したゲルに対してトリプシン処理を行い、断片化したペプチドを抽出した。このペプチドの質量を質量分析器を用いて測定し、ペプチドマスフィンガープリンティング法を用いて切り出したゲルに含まれるタンパク質を同定した。その結果、同定されたスポットに含まれるタンパク質がＰＰＩＡ（ＧＩ４８１４５５３１）であることが判明した。
【００６４】
２．ＰＰＩＡの調製
ＨＵＶＥＣのｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法でＰＰＩＡ遺伝子のコード領域を増幅した。ｐＥＴ Ｂｌｕｅ２ベクターにＰＰＩＡ遺伝子のコード領域を組み込み、発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを大腸菌ＤＨ５αに導入し、大腸菌を形質転換させた。単一コロニー由来のプラスミドＤＮＡをミニプレップ法により抽出し、塩基配列を決定して、プラスミドＤＮＡにＰＰＩＡ遺伝子のコード領域が組み込まれていることを確認した。
【００６５】
抽出したプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＥ３に導入し、形質転換させた。最終濃度が０.３ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（isopropyl-1-thio-β-D-galactoside）を培地中に加えてＰＰＩＡ（ヒスチジンタグが付加されている）の発現を誘導し、カラムを用いてＰＰＩＡを精製した。ウェスタンブロット法により、精製したタンパク質にヒスチジンタグが付加されていることを確認した。また、精製したタンパク質の分子量は、ＰＰＩＡと一致していた。
【００６６】
３．ＥＬＩＳＡ法による診断
ＰＰＩＡの２.５μｇ／ｍＬ溶液を調製した。この溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに提供して、各ウェルをＰＰＩＡでプレコートした。各ウェルに血管炎患者（３３人）の血清（１次抗体）の４００倍希釈液を提供し、反応させた。血管炎患者の内訳は、高安動脈炎７人、巨細胞性動脈炎３人、結節性多発動脈炎１人、顕微鏡的多発血管炎１５人、ウェゲナー肉芽腫症３人、アレルギー性肉芽腫性血管炎４人である。洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（２次抗体）の４０００倍希釈液を提供し、反応させた。洗浄後、ＨＲＰの基質を加えて発色させ、ＰＰＩＡと血清に含まれる自己抗体との結合反応を検出した。対照実験として、血管炎患者の血清の代わりに健常人（２７人）の血清を用いて同じ実験を行った。
【００６７】
図４は、疾患別のＰＰＩＡに対する自己抗体の陽性率を示すグラフである。縦軸の「結合単位」は、健常人（２７人）のＯＤ値の平均値に標準偏差の３倍の値（０.２５６）を加えた値を１００として定義した単位である。本実施例では、結合単位が１００以上のとき陽性と判定し、１００未満のとき陰性と判定した。
【００６８】
図４のグラフに示されるように、高安動脈炎の患者におけるＰＰＩＡに対する自己抗体の陽性率は８５.７％（６／７）であった。一方、血管炎の患者全体におけるＰＰＩＡに対する自己抗体の陽性率は３０.３％（１０／３３）であり、健常人におけるＰＰＩＡに対する自己抗体の陽性率は０％（０／２７）であった。このことから、抗ＰＰＩＡ抗体は、高安動脈炎に特異性の高いマーカーであることがわかる。
【００６９】
［実施例２］
実施例２では、抗ＰＰＩＡ抗体を指標として高安動脈炎を診断した例を示す。
【００７０】
１．ＰＰＩＡの調製
ＰＰＩＡは、実施例１と同様の手順により調製した。
【００７１】
２．ＥＬＩＳＡ法による診断
実施例１の手順と同様にして各ウェルをＰＰＩＡでプレコートした９６ウェルプレートを作製した。各ウェルに高安動脈炎の患者（７人）または健常人（２７人）の血清（１次抗体）の希釈液を提供し、反応させた。洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（２次抗体）の希釈液を提供し、反応させた。洗浄後、ＨＲＰの基質を加えて発色させ、ＰＰＩＡと血清に含まれる自己抗体との結合反応を検出した。実施例１と同様に、結合単位が１００以上のとき陽性と判定し、１００未満のとき陰性と判定した。
【００７２】
表１は、高安動脈炎以外の血管炎の患者および健常人の血清についての検査結果を示す表である。
【表１】
2009294096.tif 000003
【００７３】
表１に示されるように、本発明の診断方法の感度は８５.７％（６／７）であった。また、本発明の診断方法の特異度は１００％（２７／２７）であった。このことから、本発明の診断方法は、高感度かつ高特異度であることがわかった。
【００７４】
［実施例３］
実施例３では、抗ＰＰＩＡ抗体だけでなく抗ＰＲＤＸ２抗体も指標として高安動脈炎を診断した例を示す。
【００７５】
１．ＰＰＩＡおよびＰＲＤＸ２の調製
ＰＰＩＡは、実施例１と同様の手順により調製した。ＰＲＤＸ２（ＧＩ３３８７５４６２）は、国際公開第２００４／０９４６３８号パンフレットに記載の手順により調製した。
【００７６】
２．ＥＬＩＳＡ法による診断
（１）抗ＰＰＩＡ抗体を指標とする診断
実施例１の手順と同様にして各ウェルをＰＰＩＡでプレコートした９６ウェルプレートを作製した。各ウェルに高安動脈炎の患者、高安動脈炎以外の血管炎の患者または健常者の血清（１次抗体）の希釈液を提供し、反応させた。洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（２次抗体）の希釈液を提供し、反応させた。洗浄後、ＨＲＰの基質を加えて発色させ、ＰＰＩＡと血清に含まれる自己抗体との結合反応を検出した。実施例１と同様に、結合単位が１００以上のとき陽性と判定し、１００未満のとき陰性と判定した。
【００７７】
（２）抗ＰＲＤＸ２抗体を指標とする診断
ＰＲＤＸ２の１０μｇ／ｍＬ溶液を調製した。この溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに提供して、各ウェルをＰＲＤＸ２でプレコートした。各ウェルに高安動脈炎の患者、高安動脈炎以外の血管炎の患者または健常者の血清（１次抗体）の希釈液を提供し、反応させた。洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（２次抗体）の希釈液を提供し、反応させた。洗浄後、ＨＲＰの基質を加えて発色させ、ＰＲＤＸ２と血清に含まれる自己抗体との結合反応を検出した。実施例１と同様に、結合単位が１００以上のとき陽性と判定し、１００未満のとき陰性と判定した。
【００７８】
表２は、高安動脈炎の患者（７人）および高安動脈炎以外の血管炎の患者（２６人）の血清についての抗ＰＰＩＡ抗体の検査結果を示す表である。
【表２】
2009294096.tif 000004
【００７９】
表２に示されるように、抗ＰＰＩＡ抗体のみを指標とする診断の感度は８５.７（６／７）であった。また、抗ＰＰＩＡ抗体のみを指標とする診断の特異度は８４.６％（２２／２６）であった。
【００８０】
表３は、高安動脈炎の患者（７人）および高安動脈炎以外の血管炎の患者（３３人）の血清についての抗ＰＲＤＸ２抗体の検査結果を示す表である。
【表３】
2009294096.tif 000005
【００８１】
表３に示されるように、抗ＰＲＤＸ２抗体のみを指標とする診断の感度は８５.７％（６／７）であった。また、抗ＰＲＤＸ２抗体のみを指標とする診断の特異度は４５.５％（１５／３３）であった。このことから、抗ＰＲＤＸ２抗体のみを指標とする診断は、感度は高いが特異度が低いことがわかる。
【００８２】
表４は、高安動脈炎の患者（７人）の血清についての抗ＰＰＩＡ抗体および抗ＰＲＤＸ２抗体の検査結果を示す表である。
【表４】
2009294096.tif 000006
【００８３】
抗ＰＰＩＡ抗体陽性または抗ＰＲＤＸ２抗体陽性のときに、その患者は高安動脈炎を発病している可能性が高いと判定する。このようにすることで、抗ＰＰＩＡ抗体のみを指標とする診断に比べて偽陰性率を低減させることができる。実際に、本実施例では、偽陰性率を１４.３％（１／７）から０％（０／７）に低減させることができた。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の高安動脈炎の診断方法は、大掛かりな設備を必要とせず、被験者への負担も少ないため、例えば高安動脈炎の診断補助血液検査として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】実施の形態１の診断方法および診断キットを説明するための模式図
【図２】実施の形態２の診断方法および診断キットを説明するための模式図
【図３】実施の形態３の診断方法および診断キットを説明するための模式図
【図４】実施例１の結果を示すグラフ
【符号の説明】
【００８６】
１００，２００，３００  診断キット
１１０  抗ＰＰＩＡ抗体に対応する抗原
１２０，２２０  担体
１３０  抗ＰＰＩＡ抗体に結合しうる標識抗体
１４０  抗ＰＰＩＡ抗体
２１０  抗ＰＰＩＡ抗体に結合しうる抗体
２３０  抗ＰＰＩＡ抗体に対応する標識抗原
３１０  担体粒子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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