(57)【要約】【課題】酸素結合定数（酸素親和性）を１つしか持たない組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体およびそれを用いた人工酸素運搬体を提供する。【解決手段】金属ポルフィリンと配位結合するヒスチジンが遺伝子組換え技術により１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１８６アルギニン、１３８チロシン、１１５ロイシンまたは１３９ロイシンのいずれか１つを置換して導入され、さらに１６１チロシンが遺伝子組換え技術によりチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換され、加えて金属ポルフィリンの配向を制御するための極性アミノ酸が遺伝子組換え技術により１４６ヒスチジンまたは１９０リシンの少なくとも１つを置換して導入された組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸素結合定数（酸素親和性）を１つのみ有する組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項２】
前記組換えヒト血清アルブミンにおいて、金属ポルフィリンと配位結合するヒスチジンが遺伝子組換え技術により１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１８６アルギニン、１３８チロシン、１１５ロイシンまたは１３９ロイシンのいずれか１つを置換して導入され、さらに１６１チロシンが遺伝子組換え技術によりチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換され、加えて金属ポルフィリンの配向を制御するための極性アミノ酸が遺伝子組換え技術により１４６ヒスチジンまたは１９０リシンの少なくとも１つを置換して導入された組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項３】
前記金属ポルフィリンが、金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、および金属ジホルミルポルフィリンから選ばれる少なくとも１種の金属ポルフィリンであることを特徴とする請求項１または２に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項４】
前記組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の分子表面に、ポリエチレングリコール基が共有結合されていることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項５】
前記金属が、鉄またはコバルトであることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項６】
前記金属が、鉄（II）またはコバルト（II）であることを特徴とする請求項５に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体と人工酸素運搬体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、人間の体内において血液、皮膚、細胞間液など多くの場所に分布する分子量６６，５００の単純蛋白質であり、１７個のジスルフィド結合を含む５８５個のアミノ酸から構成されている。血中ではコロイド浸透圧の維持のほか、各種内因性物質・外因性薬物を運搬、貯蔵、分配する重要な役割を担っている。
【０００３】
アルブミンに関する研究は古くから行われているが、Ｘ線結晶構造解析によりその三次元構造の全容が明らかにされたのは１９８９年のことであった（非特許文献１）。その後、１９９８年にカリーらにより、脂肪酸が７分子結合したアルブミン−脂肪酸複合体の結晶構造が詳細に解明された（非特許文献２）。ＨＳＡは三つのドメイン（Ｉ、II、III）からなり、それらはさらに二つのサブドメイン（Ａ、Ｂ）から構成されている。
【０００４】
血漿蛋白質の約６０％を占めるこのＨＳＡにヘモグロビン（Ｈｂ）のような酸素輸送能を付与することができれば、人工酸素運搬体としての利用価値はきわめて高く、例えば救急医療現場における救命措置に汎用されるだけでも、人類の医療福祉に大きな貢献をもたらすことは間違いない。
【０００５】
本発明者らの研究グループは、４つの疎水性置換基と軸塩基配位子を分子内に共有結合した鉄（II）テトラフェニルポルフィリン誘導体が、アルブミンに効率よく包接され、得られたアルブミン−ヘム複合体が、生理条件下（生理塩水中、ｐＨ７．３、３７℃）でＨｂやミオグロビン（Ｍｂ）と同じように酸素を可逆的に吸脱着できることを見出した（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。さらに、その生理食塩水分散液を生体内に投与すると、それが肺から末梢組織へと効率良く酸素輸送できる人工酸素運搬体として機能することが動物実験から実証された。また、赤外吸収、共鳴ラマン、磁気円偏光二色性スペクトルなどから、アルブミン−ヘム酸素配位錯体の電子状態が詳細に解析された（非特許文献３）。
【０００６】
しかし、酸素配位活性中心として作用する鉄（II）テトラフェニルポルフィリン誘導体の合成が多段工程からなるため量産が難しいほか、生体内へ投与した後の合成ヘム誘導体の代謝分解過程が不明である等の欠点があった。もし、天然の金属ポルフィリン、例えば鉄（II）プロトポルフィリン、またはその誘導体を血清アルブミンに固定して得たアルブミン−金属ポルフィリン錯体がＨｂやＭｂと同様な酸素配位能を発揮することができれば、その生体適合性、生産性は大幅に向上し、極めて有用な生体材料になるものと考えられる。
【０００７】
そこで、本発明者らは、軸塩基を金属ポルフィリンの分子内に共有結合させなくとも、アルブミンの鉄（III）プロトポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢに、近位塩基として作用するヒスチジンを遺伝子組換え技術により導入し、金属プロトポルフィリンにヒスチジンのイミダゾール基を軸配位させれば、５配位錯体が得られ、そこに酸素通気することにより、ＨｂやＭｂに見られる酸素配位錯体が生成するのではないかと考えた。
【０００８】
このような背景の下、本発明者らの研究グループは、ヒト血清アルブミンの鉄（III）プロトポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢ内に、近位塩基として作用するヒスチジンを遺伝子組換え技術により導入し、さらに中心鉄に結合している１６１チロシンを遺伝子組換え技術により疎水的なアミノ酸に置換すると、人工のヘムポケットが構築され、そこに金属プロトポルフィリン誘導体が軸配位結合して、安定な酸素錯体が生成することを見出した（非特許文献４、特許文献４）。活性中心は金属プロトポルフィリンのみならず、広く他の金属ポルフィリンに普遍化できるので、一群の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体が調製され、酸素の可逆的な結合解離が明らかにされた。
【０００９】
さらに、本発明者らの研究グループは、ポルフィリン結合部位近傍のアミノ酸構造により酸素親和性などの酸素結合パラメータを制御できることも明らかにした（非特許文献５、特許文献５）。
【００１０】
この組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の未解決課題は、酸素結合解離反応が二成分からなるため、酸素結合定数（酸素親和性）が常に２つ存在することにあった。これは、鉄プロトポルフィリンがポケット内で二種類の配向構造をとっていることに起因すると考えられる。鉄プロトポルフィリンの９、１３位にある２つのプロピオン酸側鎖は、ＨＳＡの１１４アルギニン、１４６ヒスチジン、１９０リシンと塩橋形成することにより、ＨＳＡ骨格との結合を安定化している。しかし、鉄プロトポルフィリン自身が３、１８位に２つのビニル基を持つ非対称な分子であるため、アルブミンの内部に二種類の異なる向きで結合することができる。つまり、各配向構造におけるヘム鉄−近位ヒスチジンの配位が二種類存在するので、二つの酸素親和性が観測されるのである。組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を人工酸素運搬体として応用する場合、１種類の製剤が２つの酸素親和性を有することは、２種類の酸素運搬効率を示すことになり、好ましくない。
【００１１】
すなわち、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体については、酸素結合解離過程を１成分に制御するための新しい技術の確立が待たれていた。
【非特許文献１】D. C. Carter et al., Science 244: 1195-1198 (1989)
【非特許文献２】S. Curry et al., Nature Struct. Biol. 5: 827-835 (1998)
【非特許文献３】E. Tsuchida et al., Bioconjugate Chem. 10: 797-802 (1999)
【非特許文献４】T. Komatsu et al., J. Am. Chem. Soc. 127: 15933-15942 (2005)
【非特許文献５】T. Komatsu et al., J. Am. Chem. Soc. 129: 11286-11295 (2007)
【特許文献１】特開平８−３０１８７３号公報
【特許文献２】特開２００３−０４０８９３号公報
【特許文献３】特表２００６−００８６２２号公報
【特許文献４】特開２００６−０４５１７２号公報
【特許文献５】特開２００７−３０２５６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、酸素結合定数（酸素親和性）を１つしか持たない組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体およびそれを用いた人工酸素運搬体を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の酸素結合過程を１つにするための分子環境設計について鋭意研究を重ねた結果、アルブミンのポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢに、金属ポルフィリンの近位塩基として作用するヒスチジンを遺伝子組換え技術により導入するとともに、金属ポルフィリン結合部位入口に、金属ポルフィリンとの結合をより強固にして、その配向を制御するための極性アミノ酸を導入すると、得られるヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の酸素結合解離過程を１成分に制御できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明によれば、酸素結合定数（酸素親和性）を１つのみ有する組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体が提供される。
【００１５】
また本発明によれば、前記組換えヒト血清アルブミンにおいて、金属ポルフィリンと配位結合するヒスチジンが遺伝子組換え技術により１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１８６アルギニン、１３８チロシン、１１５ロイシンまたは１３９ロイシンのいずれか１つを置換して導入され、さらに１６１チロシンが遺伝子組換え技術によりチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換され、加えて金属ポルフィリンの配向を制御するための極性アミノ酸が遺伝子組換え技術により１４６ヒスチジンまたは１９０リシンの少なくとも１つを置換して導入されたものである組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体が提供される。
【００１６】
好ましい態様において、前記金属ポルフィリンは、金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、および金属ジホルミルポルフィリンから選ばれる少なくとも１種の金属ポルフィリンである。
【００１７】
好ましい態様において、前記組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の分子表面には、ポリエチレングリコール基が共有結合されている。
【００１８】
好ましい態様において、前記金属は、鉄（II）などの鉄、またはコバルト（II）などのコバルトである。
【００１９】
また本発明によれば、上記の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体が提供される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、遺伝子組換え技術により、金属ポルフィリンがアルブミン内部に固定され、酸素錯体を形成できるばかりか、酸素親和性は１つしか示さない。
【００２１】
また、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体は、酸素運搬効率の低い成分が存在しないため、生体内で組織に酸素を効果的に輸送できるだけでなく、生体内に投与する場合も安全度が高いため、輸血用血液の代替物として利用できる。
【００２２】
加えて、移植臓器または組織の保存液、組織培養液、腫瘍の抗癌治療増感剤、術前血液希釈液、人工心肺など体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全など）、慢性貧血治療剤、液体換気の還流液としても利用できる。また酸素親和性が１つであることから、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒として利用した場合、従来の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体と比較して、精密に反応を制御できる特徴を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明のアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンと配位結合するヒスチジンが遺伝子組換え技術により１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１８６アルギニン、１３８チロシン、１１５ロイシンまたは１３９ロイシンのいずれか１つを置換して導入され、さらに１６１チロシンが遺伝子組換え技術によりチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換され、加えて金属ポルフィリンの配向を制御するための極性アミノ酸が遺伝子組換え技術により１４６ヒスチジンまたは１９０リシンの少なくとも１つを置換して導入された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを結合させることにより得られる。
【００２５】
上記極性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、およびプロリンが好ましい。
【００２６】
また、１６１チロシンを置換するヒスチジン以外の非配位性の疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、およびフェニルアラニンが好ましい。
【００２７】
金属ポルフィリンとしては、金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、金属ジホルミルポルフィリンが好ましい。その中心金属としては、鉄およびコバルトが好ましく、特に、鉄（II）およびコバルト（II）が好ましい。
【００２８】
本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の分子表面にポリエチレングリコール基を共有結合することにより、表面修飾組換え血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体が得られる。好ましくは、ポリエチレングリコール基はチオエーテル結合で導入される。特に、ヒト血清アルブミンの分子表面に存在するリシン残基のアミノ基をイミノチオランでチオレート基に変換し、それに末端マレイミド基を有するポリエチレングリコールを反応させることによりポリエチレングリコール基をチオエーテル結合で導入して得た表面修飾組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体が好ましい。
【００２９】
本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、水中でＨｂやＭｂのように酸素を結合解離できるので、完全合成系の人工酸素運搬体として機能する。もちろん体内へ投与した場合には、赤血球代替物としての役割を果たすばかりでなく、この組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体の水溶液中に、移植に適した臓器または組織を保存することで、移植前の臓器または組織の安全かつ長期の保存が可能となる。
【００３０】
また、この組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は組織の増殖を促進させる培養液として作用することもでき、腫瘍の低酸素部位へ投与すれば、赤血球の進入できない細い毛細血管内を通過できるので、腫瘍低酸素部位の酸素化が可能で、その後直ちに患部へ放射線を照射することにより、腫瘍を縮小または治癒することができる。この時、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の酸素親和性が１つであることから、従来の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体と比較して、酸素運搬効率が高くなる。
【００３１】
人工酸素運搬体の適用として、出血ショックの蘇生液（輸血用血液の代替物）はもちろんのこと、術前血液希釈液、人工心肺など体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全など）、慢性貧血治療剤、液体換気の環流液、さらに、稀少血液型患者への利用、宗教上の理由による輸血拒否患者への対応、動物医療への応用が期待される。
【００３２】
人工酸素運搬体は、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を生理食塩水に分散させることによって得られる。組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の濃度は、その用途によって異なるが、赤血球代替物としては、ヘム濃度で９．２ｍＭ程度、その他では、それ以上の濃度で用いることができる。
【００３３】
加えて、金属ポルフィリンが例えば第４〜５周期に属する金属イオンの錯体である場合、酸化還元反応、酸素酸化反応または酸素添加反応の触媒としての付加価値も高い。従って、本発明のポルフィリン金属錯体は、人工酸素運搬体のほか、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としての特徴を持つ。この時、酸素親和性を１つしか持たないことから、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒として利用した場合、従来の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体と比較して、精密に反応を制御できる特徴を有する。
【００３４】
本発明の組換えアルブミンの調製は、アルブミンをコードするＤＮＡを慣用の部位特異的突然変異誘発を使用して変異させることによって行うことができる。本変異は、アルブミン本来の立体構造、物性、特徴に影響を及ぼさない程度の小さな変異である。また、遺伝子組換えアルブミンは、酵母を利用した慣用の培養法を使用して産生できる。例えば、変異導入はQuick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用いて行うことができ、発現はPichia Expression Kit（Invitrogen社）を使用して、C. E. Peterson et al., Biochemistry36: 7012-7017 (1997)に記載された方法に従って行うことができる。得られた組換えヒト血清アルブミンは、慣用の方法、例えばブルーセファロース６ファーストフローを充填したカラムクロマトグラフィー、続いて、ＳＵＰＥＲＤＥＸ ｐｇ７５を充填したカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００３５】
本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、例えば前述のT. Komatsu et al., J. Am. Chem. Soc. 127: 15933-15942 (2005)、T. Komatsu et al., J. Am. Chem. Soc. 129: 11286-11295 (2007)に記載の通常の方法により調製することができる。なお、金属ポルフィリンが鉄（III）錯体の形を有する場合は、適当な還元剤（亜二チオン酸ナトリウム、アスコルビン酸など）を用い、常法により中心金属を３価から２価へ還元すれば、酸素結合活性が付与できる。いずれの場合も酸素と接触すると速やかに安定な酸素錯体を生成する。また、これらの錯体は酸素分圧に応じて酸素を吸脱着できる。この酸素結合解離は可逆的に繰り返し行うことができ、酸素運搬体として作用する。
【００３６】
組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の分子表面をポリエチレングリコール基で修飾することは、例えば特開２００６−４５１７３号公報に記載の方法により実施できる。アルブミン１分子当りのポリエチレングリコールの平均結合本数は１〜１５が好ましく、ポリエチレングリコールの平均分子量は２，０００〜５，０００が好ましい。
【００３７】
酸素以外にも、金属に配位性である気体の場合、相当する配位錯体を形成できる（例えば、一酸化炭素、一酸化窒素、二酸化窒素など）。これらの理由から、本発明の組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、特に鉄（II）またはコバルト（II）錯体の場合、人工酸素運搬体として上記した多くの用途に有効な機能を発揮することはもちろん、均一系、不均一系での酸化還元反応触媒、およびガス吸着剤としての応用が可能となる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
＜実施例１＞ Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ−鉄プロトポルフィリン
ヒト血清アルブミンの１４６ヒスチジンをアルギニンに置換し、１６１チロシンをロイシンに置換し、さらに１８５ロイシンをヒスチジンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した。すなわち、変異導入は、Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用いて実施し、発現はPichia Expression Kit（Invitrogen社）を使用し、C. E. Peterson et al., Biochemistry, 36, 7012-7017 (1997)に記載された方法に従って行った。
【００３９】
得られた組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ）をブルーセファロース６ファストフローを充填したカラムクロマトグラフィーにより、続いて、ＳＵＰＥＲＤＥＸ ｐｇ７５を充填したカラムクロマトグラフィーにより精製した。この組換えアルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ）（２０μＭ）のリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．０、５０ｍＭ）へ鉄（III）プロトポルフィリンのＤＭＳＯ溶液をポルフィリン／アルブミンのモル比が１．１／１になるように添加し、１２時間、暗所で回転攪拌しながら混合した。得られた混合溶液を限外濾過装置（限外分子量：１０ｋＤａ）で洗浄し、ＤＭＳＯ濃度が０．１％以下になるまで、５０ｍＭリン酸緩衝水溶液で濃縮・希釈を繰り返した。得られた水溶液の紫外可視吸収スペクトルから、１８５ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位したＦｅ（III）高スピン錯体の形成が示唆された。
【００４０】
この水溶液をアルゴンで十分に置換して脱酸素した後、亜ニチオン酸ナトリウム水溶液を添加して、中心鉄を鉄（II）に還元して、組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２８、５５９ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体（デオキシ体）の形成が明らかとなった。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型（オキシ体）のスペクトルへ移行（λmax：４０８、５４０、５７７ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４２２、５４０、５６９ｎｍ）が得られた。
＜実施例２＞ Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ−鉄プロトポルフィリンの酸素結合定数
実施例１で調製した組換えアルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体水溶液に、レーザーフラッシュ（Ｎd：ＹＡＧレーザー、５３２ｎｍ、パルス幅６ｎｓ）を照射し、瞬時に起こる非平衡状態から平衡状態への可視吸収スペクトル変化の時間分解解析から、酸素親和性の指標となるＰ50値及び酸素結合解離速度定数（ｋon、ｋoff）を算出した。実際の測定は前記T. Komatsu et al., J. Am. Chem. Soc. 127: 15933-15942 (2005)、T. Komatsu et al., J. Am. Chem. Soc. 129: 11286-11295 (2007)に記載の方法で行った。その結果、酸素の結合解離反応はそれぞれ１成分であることが明らかとなった。Ｐ50は６Torr（２２℃）、ｋonは４．３×１０7Ｍ-1ｓ-1、ｋoffは３７０ｓ-1であった。
＜実施例３＞ Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ−鉄プロトポルフィリン
実施例１において、組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ）の代りに、ヒト血清アルブミンの１６１チロシンをロイシンに置換し、１８５ロイシンをヒスチジンに置換し、さらに１９０リシンをアルギニンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、全く同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２８、５５９ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１８５ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１１、５４１、５７７ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４２２、５４１、５６９ｎｍ）が得られた。
＜実施例４＞ Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ−鉄プロトポルフィリンの酸素結合定数
実施例２において、組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体の代わりに、組換えヒト血清アルブミン（Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を用いた以外は、全く同様な方法に従って、Ｐ50及びｋon、ｋoffを算出した。その結果、酸素の結合解離反応はそれぞれ１成分であることが明らかとなった。Ｐ50は９Torr（２２℃）、ｋonは２．４×１０7Ｍ-1ｓ-1、ｋoffは３５０ｓ-1であった。
＜実施例５＞ Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ−鉄プロトポルフィリン
実施例１において、組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ）の１９０リシンをさらにアルギニンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｈ１４６Ｒ／Ｋ１９０Ｒ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、全く同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２７、５５９ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１８５ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１１、５４０、５７６ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４２２、５４０、５６９ｎｍ）が得られた。
＜実施例６＞ Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ−鉄プロトポルフィリンの酸素結合定数
実施例２において、組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体の代わりに、組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を用いた以外は、全く同様な方法に従って、Ｐ50及びｋon、ｋoffを算出した。その結果、酸素の結合解離反応はそれぞれ１成分であることが明らかとなった。Ｐ50は６Torr（２２℃）、ｋonは４．２×１０7Ｍ-1ｓ-1、ｋoffは４１０ｓ-1であった。
＜実施例７＞ Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｆ／Ｒ１８６Ｈ−鉄プロトポルフィリン
実施例１において、ヒト血清アルブミンの１４６ヒスチジンをアルギニンに置換し、１６１チロシンをフェニルアラニンに置換し、さらに１８６アルギニンをヒスチジンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｆ／Ｒ１８６Ｈ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｆ／Ｒ１８６Ｈ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２７、５５９ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１８６ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１０、５４０、５７０ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４２２、５４０、５６９ｎｍ）が得られた。組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｆ／Ｒ１８６Ｈ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体の酸素結合解離反応はそれぞれ１成分であった。
＜実施例８＞ Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｋ１９０Ｒ−鉄プロトポルフィリン
実施例１において、ヒト血清アルブミンの１４２イソロイシンをヒスチジンに置換し、１６１チロシンをロイシンに置換し、さらに１９０リシンをヒスチジンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｋ１９０Ｒ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｋ１９０Ｒ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２６、５５９ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１８５ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１０、５３９、５７７ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４２２、５４１、５６９ｎｍ）が得られた。組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｋ１９０Ｒ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体の酸素結合解離反応はそれぞれ１成分であった。
＜実施例９＞ ＰＥＧ修飾（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ−鉄プロトポルフィリン）
実施例５において合成された（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ）−鉄（III）プロトポルフィリン錯体（アルブミン濃度：０．１ｗｔ％）のリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．０）にイミノチオラン（ピアスケミカル製、イミノチオラン／アルブミン：２０(モル／モル)）を加え、室温でゆっくりと４時間攪拌した。続いてアルブミンに対して小過剰モルの片末端マレイミド片末端メチル−ポリエチレングリコール（サンブライトメマール５０−Ｈ、Ｍｗ：５，０００、日本油脂製）を添加し、同条件で２時間反応させた。得られた混合物を限外濾過装置（アドバンテック製、ＵＨＰ−７６Ｋ、限外分子量膜：５ｋＤａ）を用い、１Ｌのリン酸緩衝水溶液で濃縮・洗浄を繰り返し、所望の濃度に調整した。得られた赤色の表面修飾組換えヒト血清アルブミン−鉄（III）ポルフィリン錯体水溶液を０．４５μｍの除菌フィルター（アドバンテック製、ＤＩＳＭＩＣ ２５ＣＳ０４５ＡＳ）を通過させて最終調整した。
【００４１】
得られた表面修飾組換えヒト血清アルブミン−鉄（III）ポルフィリン錯体のマトリックス支援レーザー脱離イオン化法−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）（島津製作所製、ＫＲＡＴＯＳ ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）により、分子量を測定したところ、アルブミン表面に結合したポリエチレングリコール鎖の本数は平均６本であることがわかった。
【００４２】
この水溶液をアルゴンで十分に置換して脱酸素した後、亜ニチオン酸ナトリウム水溶液を添加して、中心鉄を鉄（II）に還元、表面修飾組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２８、５５８ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１８５ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１１、５４０、５７７ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４２１、５４０、５６８ｎｍ）が得られた。表面修飾組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体の酸素結合解離反応はそれぞれ１成分であった。
＜実施例１０＞ Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ−鉄デューテロポルフィリン
実施例１において、鉄（III）プロトポルフィリンの代わりに、鉄（III）デューテロポルフィリンを用いた以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ）−鉄(II)デューテロポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４１３、５１７、５４６ｎｍを示し、これはＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１８５ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４０１、５２８、５６３ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４０９、５２８、５５６ｎｍ）が得られた。組換えヒト血清アルブミン（Ｈ１４６Ｒ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ）−鉄(II)デューテロポルフィリン錯体の酸素結合解離反応はそれぞれ１成分であった。
＜実施例１１＞ Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ−コバルトプロトポルフィリン
実施例３において、鉄（III）プロトポルフィリンの代わりに、コバルト（II）プロトポルフィリンを用いた以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ）−コバルト（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４０６、５５８ｎｍを示し、これはコバルトＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｃｏ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１８５ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行した（λmax：４２６、５３９、５７８ｎｍ）。組換えヒト血清アルブミン（Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ／Ｋ１９０Ｒ）−コバルト（II）プロトポルフィリン錯体の酸素結合解離反応はそれぞれ１成分であった。
＜実施例１２＞
実施例１、３、５の組換えアルブミン−鉄プロトポルフィリン錯体、および本発明者らが既に報告している各種の組換えアルブミン−鉄プロトポルフィリン錯体の酸素親和性（P50値）を測定した結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
実施例１、３、５の組換えアルブミン−鉄プロトポルフィリン錯体では、酸素結合解離反応はそれぞれ１成分であった。これに対して本発明者らが既に報告しているＩ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ−鉄プロトポルフィリン、Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ−鉄プロトポルフィリン、Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｈ−鉄プロトポルフィリンはそれぞれ２成分であった。