(57)【要約】【課題】患者の急性肺損傷の症状、または患者の急性肺損傷の症状のリスクを治療するための組成物を提供する。【解決手段】患者の急性肺損傷の症状、または患者の急性肺損傷の症状のリスクを治療するための組成物であって、該組成物が治療的用量の抗体を含み、該抗体がαｖβ６のβ６サブユニットと特異的に結合する抗体である、当該組成物である。前記拮抗物質がβ６と特異的に結合する抗体である態様、前記抗体がモノクローナル抗体である態様、前記拮抗物質がアミノ酸配列ＲＧＤを含む態様、前記拮抗物質がアンチセンス核酸分子を含む態様、などが挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の急性肺損傷の症状、または患者の急性肺損傷の症状のリスクを治療するための組成物であって、該組成物が治療的用量の抗体を含み、該抗体がαｖβ６のβ６サブユニットと特異的に結合する抗体である、当該組成物。
【請求項２】
前記抗体が、前記β６サブユニットの細胞質領域を特異的に認識する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体が、１０Ｄ５（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３８２）である請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、急性肺損傷の症状をもつリスクを有する患者に投与される請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、急性肺損傷をもつ患者に投与される請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物がエーロゾルである請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が鼻内投与される請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
患者の線維症の症状、または患者の線維症の症状のリスクを治療する組成物であって、該組成物が治療的用量の抗体を含み、該抗体がαｖβ６のβ６サブユニットと特異的に結合する抗体である、当該組成物。
【請求項１０】
前記線維症が肺線維症である請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記肺線維症が急性肺損傷から引き起こされる請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体が、前記β６サブユニットの細胞質領域を特異的に認識する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗体が、１０Ｄ５（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３８２）である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、線維症の症状をもつリスクを有する患者に投与される請求項９に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、線維症をもつ患者に投与される請求項９に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物がエーロゾルである請求項９に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が鼻内投与される請求項９に記載の組成物。
【請求項１９】
前記線維症が腎臓線維症である請求項９に記載の組成物。
【請求項２０】
ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ１２３８２によって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項２１】
ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ１２３８２。
【請求項２２】
患者の転移性肺癌または転移性乳癌の発症を治療または抑制するための組成物であって、該組成物が治療用量の抗体を含み、該抗体がαｖβ６のβ６サブユニットに特異的に結合し、該患者の転移性癌細胞がインテグリンβ６を発現する、当該組成物。
【請求項２３】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗体が１０Ｄ５（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３８２）である請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記癌が乳癌である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記転移性肺癌の発症を抑制する、請求項２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者の急性肺損傷、線維症、転移性肺癌または転移性乳癌の症状、または患者の急性肺損傷の症状のリスクを治療するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本研究は、ＮＩＨグラント番号ＨＬ４７４１２およびＨＬ５３９４９によって部分的に支援を受けた。アメリカ合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００３】
インテグリンは、２つのサブユニット、αおよびβで構成された異種二量体細胞粘着レセプターである。インテグリンαｖβ６は、主に上皮細胞で発現されるフィブロネクチンおよびテナシンレセプターである。健常な霊長類の成人組織では、β６ｍＲＮＡおよびタンパク質はほとんど検出されないが、β６は、胎児の発育時、創傷治癒時、およびいくつかの上皮性腫瘍で発現される。β６サブユニットが結腸癌細胞株で発現されるとき（ここには通常は存在しない）、このサブユニットの発現によって増殖能力が強化される。β６サブユニットに固有の１１アミノ酸のＣＯＯＨ末端領域がαｖβ６インテグリンの増殖強化活性に必要である（Agrez et al., J. Cell. Biol. 127:547-556(1994)）。β６の発現は、生菌の注射によって惹起される損傷時のＩＩ型肺胞上皮細胞で誘発され、β６の発現は、肺または腎の慢性または急性炎症をもつ患者の多様な臨床標本と同様に不顕性炎症の病巣部位で認められる（Breuss et al., J. Cell Sci. 108:2241-2251(1995）。
【０００４】
ホアンら（Huang et al., J. Cell Biol. 133:921-928(1996))は、β６サブユニットをコードする遺伝子のヌル変異について同型接合体のマウスは、マクロファージの皮膚への浸潤を伴う若年禿頭症を有し、肺の誘導気道周囲に活性化リンパ球を蓄積させることを開示した。
【０００５】
肺線維症は、白血球から遊離された生成物の有害作用によるものと考えられる一般的な疾患である（例えば以下を参照のこと：Marshall et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 29:107-120(1997))。ブレオマイシン誘発肺損傷および肺線維症はリンパ球の動員および活性に付随し、かつそれらに左右されるであろう（D.J. Schrier et al., Am. J. Pathol. 116:270-278(1984))。"抗サイトカイン"治療の使用は、肺実質の損傷および肺線維症の推奨される治療法である（Coker et al., Thorax 52(2):294-296(1997)）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、急性肺損傷および肺線維症のための現在の治療法は大部分は不適切である（例えば以下を参照されたい：King et al., "Idiopathic Pulmonary Fibrosis and other Interstitial Lung Diseases of Unknown Etiology", in Textbook of Respiratory Medicine, Murray & Nadel, eds., W.B. Saunders, Philadelphia, PA, pp.1827-1839(1994)）。したがって、急性肺損傷および肺線維症に向けた治療法の必要性が存在する。本発明はこの必要性および他の必要性を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の特徴の１つは、治療的用量のαｖβ６の拮抗物質を患者に投与することを含む患者の急性肺損傷を治療する方法である。本発明はまた、治療的用量のαｖβ６の拮抗物質を患者に投与することを含む肺転移を抑制する方法を提供する。本発明のまた別の特徴は、治療的用量のαｖβ６の拮抗物質を患者に投与することを含む患者の線維症の治療方法である。
本発明のまた別の特徴はハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ１２３８２によって産生される単一クローン性（モノクローナル）抗体である。
本発明のまた別の特徴はハイブリドーマＡＴＣＣ１２３８２である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、急性肺損傷（例えば細菌性敗血症による肺損傷、出血性ショック、毒物の吸入、並びにブレオマイシンおよび他の薬剤誘発肺損傷であるが、ただしこれらに限定されない）を治療する方法および組成物を提供する。さらに、本発明の組成物は、上皮性器官、例えば肺蔵、肝臓、腎臓、膀胱および食道における線維症の治療に有用である。
【０００９】
前記組成物は、急性肺損傷または線維症をもつ患者またはそのようなリスクを有する患者に治療的または予防的に提供できる。例えば、毒性吸入剤に暴露された患者はそのような暴露後におそらく治療できるであろうし、一方、ブレオマイシンを投与される患者は予防的および／または治療的に処置できる。典型的には、本発明の組成物は、毎日を基準として少なくとも１〜５日間投与されるが、既に肺線維症が定着した患者、進行している患者には数カ月または数年の期間治療的用量を投与できる。本明細書で用いられるように、"治療的用量"とは、患者の症状の重篤度を予防し、軽減し、減少し、あるいは低下させる用量である。
【００１０】
本発明のいくつかの実施態様ではαｖβ６の拮抗物質が提供される。前記拮抗物質には、β６に特異的に結合する抗体；αｖβ６リガンドに特異的に結合する抗体；αｖβ６に対するリガンド；アンチセンス核酸；並びにそのようなリガンドのペプチド類似体、非ペプチド類似体、およびペプチド様類似体が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００１１】
抗体は合成でもモノクローナル抗体でも多クローン性（ポリクローナル）抗体でもよく、当技術分野で周知の技術で製造できる。好ましい実施態様では、β６サブユニットの細胞質領域を特異的に認識する抗体である（例えば以下を参照のこと：Weinacker et al., J. Cell Biol. 269:1-9(1994))。治療的利用には、ヒトの定常および可変領域をもつ"ヒト"モノクローナル抗体が、抗体に対する患者の免疫反応を最小限にするためにしばしば好まれる。そのような抗体は、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を含む遺伝子導入動物を免疫することによって作製できる（以下を参照のこと：Jakobovits et al., Ann. NY Acad Sci. 764:525-535(1995)）。合成および半合成抗体に関しては、そのような用語は、抗体フラグメント、アイソタイプスウィチド抗体（isotype switched antibodies)、ヒト化抗体（例えばマウス−ヒト、ヒト−マウスなど）、ハイブリッド、複数の特異性を有する抗体、完全合成抗体様分子などが包含される。
【００１２】
下記で考察するように、抗体は、αｖβ６に対するリガンドの結合を遮断する能力および他の特性（例えばブレオマイシン誘発線維症をin vivo で防御する能力）についてスクリーニングすることができる。典型的な抗β６モノクローナル抗体は１０Ｄ５（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３８２、１９９７年８月６日寄託）である。
【００１３】
本発明の他の実施態様では、細胞粘着ドメインアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）の存在を基準にαｖβ６に対するリガンドとしてデザインされたペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはペプチド模倣物である拮抗物質が用いられる。インテグリンに対するリガンドのような分子のデザインは、例えば以下の文献で実証されている：Pierschbacher et al., J. Cell. Biochem. 56:150-154(1994)；Ruoslahti, Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 12:697-715(1996)；Chorev et al., Biopolymers 37:367-375(1995); Pasqualini et al., J. Cell. Biol. 130:1189-1196(1995)；およびSmith et al., J. Biol. Chem. 269:32788-32795(1994)）。
【００１４】
本発明のいくつかの実施態様では、アンチセンス核酸分子がαｖβ６の拮抗物質として用いられる。アンチセンス核酸分子は、特定のヌクレオチド配列と結合し標的タンパク質の産生を抑制するようにデザインされた相補性核酸ヌクレオチド鎖である。β６インテグリンサブユニットのヌクレオチド配列はＵＳＳＮ０７／７２８２１５号（１９９１年７月１１日出願）で開示されている（この文献は参照により本明細書に含まれる）。これらの物質は単独または他の拮抗物質と併用して用いることができる。アンチセンス拮抗物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＲＮＡとして提供できる（例えば以下を参照のこと：Murayama et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:109-114(1997))。アンチセンス遺伝子はまた、ウイルスベクターに入れて（例えばＢ型肝炎ウイルスに入れて（例えば以下を参照のこと：Ji et al., J. Viral Hepat. 4:167-173(1997)）；アデノ付随ウイルスに入れて（例えば以下を参照のこと：Xiao et al., Brain Res. 756:76-83(1997))；またはＨＶＪ（センダイウイルス）−リポソーム遺伝子供給系（例えば以下を参照のこと：Kaneda et al., Ann. NY Acad. Sci. 811:299-308(1997))を含む（ただしこれに限定されないが）他の系に入れて）；"ペプチドベクター"の状態で（例えば以下を参照のこと：Vidal et al., CR Acad. Sci. III32:279-287(1997))；エピソームベクターまたはプラスミドベクター中の遺伝子として（例えば以下を参照のこと：Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:6450-6455(1997); Yew et al., Hum. Gene Ther. 8:575-584(1997)）；ペプチド−ＤＮＡ凝集物中の遺伝子として（例えば以下を参照のこと：Niidome et al., J. Biol. Chem. 272:15307-15312(1997)）；"裸のＤＮＡ"として（例えば米国特許第５５８０８５９号および米国特許第５５８９４６６号を参照のこと）；および脂質ベクター系に入れて（例えば以下を参照のこと：Lee et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:173-206(1997)）提供できる。
【００１５】
αｖβ６の候補拮抗物質は、当技術分野で既知の技術および／または本出願内で開示した多様な技術によって機能についてスクリーニングすることができる。これらの技術は、例えばマウスモデルにおけるブレオマイシン誘発線維症に対する防御、腫瘍細胞の増殖抑制（Agrez et al., J. Cell Biol. 127:547-556(1994))；および細胞移動抑制および／または細胞粘着抑制（実験例の節を参照されたい）である。
【００１６】
本発明の拮抗物質の多数の適切な製剤は、いずれの薬化学者にも知られている以下の処方集で見出すことができる：Remington's Pharmaceutical Sciences(15th Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania(1975))、特にその中のBlaug, Seymourによる８７章。これらの処方には、例えば粉末、ペースト、軟膏、ジェリー、ワックス、オイル、脂質、無水吸収基剤、水中油滴または油中水滴乳剤、カーボワックス（多様な分子量のポリエチレングリコール）乳剤、半固形ゲル、およびカーボワックスを含む半固形混合物が含まれる。
【００１７】
有効な治療に必要な活性成分の量は異なる多くの因子に左右される。これら因子には投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、および他の投与中の医薬が含まれる。したがって、処置投薬量は安全性および効能を最適にするために定量されるべきである。典型的には、in vitroで用いられる投与量は、活性成分のin situ 投与で有用な量について役立つ手引を提供するであろう。さらに、具体的な疾患の治療について有効量を決定する動物試験はヒトの投薬量の予想を提供するであろう。例えば種々の考察が以下の文献に記載されている:Goodman & Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Edition(1985), MacMillan Publishing Company, New YorkおよびRemington's Pharmaceutical Sciences(18th Edition(1990)), Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania。投与方法はその中で考察されているが、これら投与方法には経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、鼻、イオン導入投与などが含まれる。
【００１８】
本発明の組成物は投与方法に応じて種々のユニット製剤として投与できる。例えば、経口投与に適したユニット製剤には、固形製剤（例えば粉末、錠剤、ピル、カプセル、および糖衣丸）および液状製剤（例えばエリキシル、シロップ、および懸濁液）が含まれる。活性成分はまた滅菌液状製剤として非経口的に投与してもよい。ゼラチンカプセルは、活性成分および不活性成分として粉末化担体（例えばブドウ糖、乳糖、蔗糖、マンニトール、澱粉、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウムなど）を含む。所望の色、味、安定性、緩衝能、分散性または他の既知の所望の特徴を付加することができる付加的不活性成分の例には、べんがら、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用ホワイトインクなどである。同様な希釈剤を圧縮錠剤の製造に用いることができる。錠剤もカプセルも、数時間にわたる医薬の持続的放出を提供するために持続放出製品として製造できる。圧縮錠剤は、不快な味を隠蔽し、かつ錠剤を大気から保護するために糖衣とするか、またはフィルム被覆してもよいし、また胃腸管における選択的崩壊のために腸溶皮で被覆してもよい。経口投与のための液状製剤は、患者が受け入れ易くするために着色料および香料を含むことができる。
医薬製剤中の本発明の組成物の濃度は大きく変動することが可能で、すなわち重量で約０．１％未満から（通常約２％または少なくとも２％）２０％、５０％またはそれ以上で、さらに選択した具体的な投与態様にしたがって主として溶液の体積、粘度によって選択できる。
【００１９】
本発明の組成物はまたリポソームを介して投与できる。リポソームには乳液、泡沫、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、層板などが含まれる。これらの調製物では、供給されるべき本発明の組成物は、単独または所望の標的と結合する分子（例えば抗体）もしくは他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と合わせて、リポソームの一部分として包含される。したがって、本発明の所望の組成物を充填または添加したリポソームを全身的に供給してもよいし、また問題の組織にリポソームを誘導し、続いて前記組織でリポソームが選択した治療用ペプチド／免疫原性ペプチド組成物を供給することができる。
【００２０】
本発明で使用されるリポソームは標準的な小液泡形成性脂質から生成できる。これらの脂質には一般に中性および陰性荷電リン脂質およびステロール（例えばコレステロール）が含まれる。一般に、脂質の選択は、例えばリポソームのサイズ、酸不安定性および血流中でのリポソームの安定性を考慮して行われる。例えば以下の文献に記載されているような多様な方法がリポソームの調製で利用可能である（Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467(1980)；米国特許４２３５８７１号、４５０１７２８号、４８３７０２８号および５０１９３６９号（これらの文献は参照により本明細書に含まれる))。
【００２１】
本発明の組成物を含有するリポソーム懸濁液は、静脈内、局部的、局所的等で投与できるが、その投与量はとりわけ投与態様、供給される本発明の組成物および処置される疾患の段階にしたがって変動させることができる。
固形組成物の場合は、通常の無毒な固形担体を用いることができるが、これらには例えば医薬等級のマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、ブドウ糖、蔗糖、炭酸マグネシウムなどが含まれる。経口投与の場合は、通常用いられる賦形剤（例えば先に列挙したような担体）のいずれか、および一般に１０〜９５％の活性成分（すなわち本発明の１つまたは２つ以上の組成物）をより好ましくは２５％〜７５％の濃度で包含させることによって、医薬的に許容できる無毒な組成物を形成することができる。
【００２２】
エーロゾル投与の場合は、好ましくは本発明の組成物は、界面活性剤および噴射剤とともに微細分割形状で供給される。典型的な本発明組成物の百分率は０．０１％〜２０重量％、好ましくは１％〜１０％である。もちろん、界面活性剤は無毒でなければならず、好ましくは噴射剤中で可溶性である。前記薬剤の代表例は、６から２２の炭素原子を含む脂肪酸（例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック酸およびオレイン酸）と脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分エステルである。混合エステル、例えば混合または天然のグリセリドを用いることができる。界面活性剤は組成物の重量で０．１％〜２０％、好ましくは０．２５〜５％を構成できる。組成物の残りは通常は噴射剤である。所望する場合は、例えば鼻内供給のためにレシチンのような担体もまた含むことができる。
【００２３】
本発明の構築物はさらに、デポット型システム、被包化形、または移植物として当技術分野で周知の技術で供給できる。同様に、前記構築物は問題の組織へポンプによって供給することができる。
前述の製剤のいずれも、製剤中の活性薬剤がこの製剤によって不活性化されないこと、および製剤が生理的に適合することを条件に、本発明の治療および療法に適しているであろう。
【００２４】
以下の実験例は本発明の若干の特徴を詳述するために提供されるもので、本発明を制限しようとするものではない。
【００２５】
Ｉ．序
肺線維症は、白血球から遊離される生成物の有害作用によるものと考えられる一般的疾患である。呼吸系上皮は線維症の発生時に損傷を受けるが、上皮細胞自体がこの過程の一因であることは以前には示されなかった。我々は、ただ１つのインテグリンサブユニット（β６）遺伝子のヌル変異を発現しているマウスに対するブレオマイシン（肺線維症を惹起することが知られている薬剤）の作用を調べた（この遺伝子は完全に上皮細胞に限定されている）。β６−／−マウスは、ブレオマイシン誘発線維症から劇的に防御された。したがってこのインテグリンを標的とする治療法は、大部分が治療不能のこの疾患について新規な治療方針を提供する。
【００２６】
インテグリンαｖβ６は、もっぱら上皮細胞で主に器官発生時および損傷に反応して発現される。β６−／−マウスは皮膚および気道の損傷に対する炎症反応を増幅させるが、正常に発育し繁殖する（X.Z. Huang et al., J. Cell Biol 133:921-928(1996))。
【００２７】
ＩＩ．β６インテグリンサブユニット遺伝子の不活化はブレオマイシン誘発肺線維症からマウスを防御する
気管内注射によって投与したブレオマイシン（６０μｌ食塩水中の０．０３単位（ｕ))または食塩水賦形剤（６０μｌ）の肺毒性を、月齢と性別が一致した１２９ＳＶＥＭＳ／ｔｅｒ株の野性型（β６＋／＋）およびβ６−／−マウスで調べた。肺線維症は、処置後１５、３０および６０日の肺の形態調査およびヒドロキシプロリン含有量（コラーゲン蓄積指標）の測定によって検定した。線維症は、ブレオマイシン処置野性型マウスで３０日で顕著で、６０日まで進行した（図１Ａ−１Ｂ）。対照的に、β６−／−のマウスの肺形態は実験を通してほぼ正常を維持し、線維症の小部分が認められただけであった。さらに肺のヒドロキシプロリン含有量は、いずれの時点においても食塩水処理動物で測定されたものと顕著な違いはなかった。同様な結果が１２９マウスとＣ５７Ｂ１／６との交配の子でも得られたので、この所見は純系の１２９マウスに固有ではなかった。これらの予期せぬ結果は、インテグリンαｖβ６の発現が肺線維症の誘発に必要であることを示した。
【００２８】
ブレオマイシン誘発線維症の初期段階におけるαｖβ６の役割を決定するために、ブレオマイシンまたは食塩水投与後１、５および１５日の肺水含有量（血管透過性亢進により発生する肺浮腫のマーカー）を測定した。野性型マウスでは、肺水はブレオマイシン処置後５日までに最大に増加し、１５日まで増加し続けた（図２）。肺線維症に関しては、β６−／−マウスはブレオマイシンのこの初期作用を大部分防御し、ブレオマイシン誘発血管漏出発生前の上皮性αｖβ６の役割を示唆した。
【００２９】
我々は、β６−／−マウスは皮膚および気道における単核細胞炎症反応の増幅を示すことを以前に報告した（X.Z. Huang et al., J. Cell. Biol. 133:921-928(1966))。ブレオマイシン誘発肺損傷および肺線維症は、リンパ球の動員および活性化に付随するが、さらにそれらに左右される可能性がある（D.J. Schrier et al., Am. J. Pathol. 116:270-278(1984))。β６−／−マウスのブレオマイシン誘発損傷および線維症に対する抵抗性はリンパ球動員または活性化の変化によるものか否かを決定するために、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球を計数し、さらに処置後５日および１５日の食塩水またはブレオマイシン処置マウスの細切肺から得た細胞のインターロイキン２−レセプター（ＣＤ２５）の発現を測定することによってリンパ球の活性化を検定した。我々の初期の報告と一致して、野性型動物の場合よりも多くのＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ２５＋細胞がβ６−／−マウスの肺に存在した。ブレオマイシンは、野性型およびβ６−／−マウスの両方でＣＤ４およびＣＤ８発現リンパ球数の大きな増加を誘発し、さらにＣＤ２５を発現するリンパ球の百分率を増加させた（図３）。野性型およびβ６−／−マウスの両方で、肺リンパ球の動員および活性化はブレオマイシン投与後５日が最大で、１５日までに低下し始めた。いずれの理論にも拘束されないが、これらのデータは、β６−／−マウスでのリンパ球動員および活性化の不足が、ブレオマイシンの有害な肺への影響の防御をもたらしたのではないであろうということを示唆している。
【００３０】
インテグリンとそれらのマトリックスリガンドとの相互作用は、増殖（M. Agrez et al., J. Cell Biol. 127:547-556(1994)）、生存（N.W. Lukacs et al., Eur. J. Immunol. 25:245-251(1995))、並びにサイトカイン（S. Miyake et al., J. Exp. Med. 177:863-868(1993)）および金属結合タンパク分解酵素の発現（Z. Erab et al., J. Cell Biol. 109:877-889(1989))を含む重要な細胞機能を調節する。β６サブユニットはただ１種のインテグリン異種二量体、αｖβ６を形成すると報告されただけであるが、さらに上皮細胞に限定される。上皮の損傷に続くαｖβ６発現の迅速な誘発と一致して、このインテグリンに対する少なくとも２つのリガンド（フィブロネクチンおよびテナシン）の局所濃度が増加する。我々は、αｖβ６の発現は、皮膚および肺の誘導気道における単核細胞炎症反応を終了させる役割を果たすことを以前に報告した（X.Z. Huang et al., J. Cell Biol. 133:921-928(1996)）。ここに報告した結果は、このインテグリンはまたブレオマイシンに反応して肺損傷および肺の線維症が誘発される際にも重要な役割を果たすことを示した。
【００３１】
呼吸系上皮細胞は、吸入される大気の潜在的有毒成分から他の肺細胞を分離する主として受動的な障壁成分であると永い間考えられてきた。この接触面では、これらの細胞は損傷に対する局所反応を開始させ調節するために申し分なく配置されている。最近得られた証拠は、呼吸系上皮細胞は、損傷に対する反応を開始させ調節する多数のタンパク質を合成し分泌する能力を有することを示唆している。これらのタンパク質には、ケモカイン（例えばインターロイキン−８、ＧＲＯα、ＧＲＯγ、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭＣＳＦ、ＭＩＰ−１αおよびＭＣＰ−１）、他のサイトカイン（例えばＩＬ−６、ＩＬ−１１およびＩＬ−１５）および増殖因子（例えばＴＧＦβ）が含まれる。いずれの理論にも拘束されないが、上皮のαｖβ６が肺損傷および肺の線維症の発生の一因となる可能な１つのメカニズムは、これらのタンパク質の１つまたは２つ以上の発現を調節することによる。
【００３２】
肺線維症の現今の治療法は大部分が不適切である。本実験の結果は、呼吸系上皮細胞および上皮インテグリン、αｖβ６は、肺実質の損傷および肺線維症の病理発生において重要な役割を果たすこと、さらにこのインテグリンの機能に干渉するように特別にデザインした治療法が大部分は治療不能のこれら肺疾患の治療に有用であることを示している。
【００３３】
ＩＩＩ．遮断抗体の作製
Ａ．モノクローナル抗体の作製
αｖβ６に対する抗体を製造するために、野性型マウスから得たケラチノサイトまたはフロイントアジュバント中の組換え体分泌ヒトαｖβ６（Weinacker et al., J. Cell Biol. 269:6940-6948(1994))のどちらかでβ６−／−マウスを免疫した。標準的な手順にしたがって、マウス脾臓細胞を採集し、ＳＰ２／０マウスミエローマ細胞と融合させた。生じた上清をフローサイトメトリーでスクリーニングするためにβ６核酸感染（トランスフェクト）および擬似トランスフェクトＳＷ４８０細胞を使用した。β６核酸感染ＳＷ４８０細胞を認識するが擬似トランスフェクトＳＷ４８０細胞は認識しないことが分かった抗体を後の実験に用いた。
【００３４】
Ｂ．モノクローナル抗体の性状決定
ネズミのαｖβ６に対する抗体を作製するために、分泌ヒトαｖβ６およびネズミのケラチノサイトを１２９／Ｃ５７由来のβ６−／−マウスでの免疫原として用いた。作製したハイブリドーマの上清を、擬似トランスフェクトＳＷ４８０細胞およびβ６トランスフェクトＳＷ４８０細胞で分染についてスクリーニングした。得られた抗体ＣＳβ６および１０Ｄ５は、ＳＷ４８０細胞上で発現されているヒトβ６および野性型ケラチノサイト上のマウスβ６の両方を染色した。（35Ｓ）標識ネズミケラチノサイト溶解物の免疫沈澱によって、ＣＳβ６の性状をさらに調べた。この抗体は、β６＋／＋ケラチノサイト由来のαｖβ６である適切な分子量の異種二量体は沈澱させたが、β６−／−ケラチノサイト由来のものは沈澱させず、これらの抗体はインテグリンαｖβ６に特異的であることを示した。
【００３５】
我々はまた、β６トランスフェクトＳＷ４８０細胞およびネズミケラチノサイトを用いてフィブロネクチン上で細胞粘着アッセイを実施することによって、遮断能力についてＣｓβ６および１０Ｄ５の両方を調べた。しかしながら、１０Ｄ５のみがネズミ細胞上で遮断能力を示した。１０Ｄ５は、β６−／−ケラチノサイトで認められたものと同じ程度でフィブロネクチン上で野性型ケラチノサイトの移動を抑制した。
【００３６】
Ｃ．細胞粘着アッセイ
非組織培養用処理を施された９６穴（ウェル）のポリスチレン多穴マイクロタイタープレート（Linbro/Titertek, Flow Laboratories, McLean, VA）にビトロネクチン、フィブロネクチンまたはコラーゲンを被覆した。種々の量のマトリックスを含有する１００μｌの溶液をウェルに加え、３７℃で１時間保温した。保温後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、続いて血清非含有ＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡで３７℃で３０分ブロッキングした。コントロールウェルにはＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡを満たした。細胞は移動アッセイと同じ方法で採集し、血清非含有ＫＧＭ中に再懸濁し、続いてＰＭＡの存在下または非存在下で各タンパク質で被覆したウェルに加えた。遮断実験の場合は、細胞はプレートに播く前に４℃で５分抗体とともに保温した。このプレートは、湿潤な７％ＣＯ2中で３４℃で１時間保温する前に１０ｘｇで５分遠心（上部を上に向けて）した。非粘着細胞は上部を下に向けて４８ｘｇで５分遠心して除去した。粘着細胞は１％ホルムアルデヒドで固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色し、続いてＰＢＳでウェルを洗浄した。マイクロプレート読み取り装置（Bio-Rad)で５９５ｎｍの吸収を測定することによって、各ウェルの相対細胞数を検定した。
【００３７】
Ｄ．移動アッセイ
細胞移動アッセイは、マトリックス被覆トランスウェル型プレート（８μｍ孔、Costar, Cambridge, MA)で実施した。ＰＢＳ中のコラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）、フィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）またはビトロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）で膜の下面を３７℃で１時間被覆し、さらに１％ＢＳＡでブロッキングした。初代培養ケラチノサイトをトリプシン／ＥＤＴＡで採集し、トリプシンはダイズトリプシン抑制物質で不活化した。細胞を血清非含有ＫＧＭ中に懸濁させ、さらにフォルボルミリステートアセテート（ＰＭＡ、１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、非存在下でウェル当たり１００μｌの培養液中３．６ｘ１０4の密度で上部小室で平板培養した。抑制実験の場合は、上部小室および下部小室に抗体をＰＭＡの存在下で添加した。６時間保温した後、細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、１％ホルムアルデヒド中の０．５％クリスタルバイオレットで染色した。上部小室の細胞を除去し、下面の細胞を高倍率（４０ｘ）で１０ｘグリッドを用いて計数した。多数の視野を数え、各被験条件について平均した。
【００３８】
ＩＶ．β６ノックアウトマウスは肺転移率を減少させた。
自然に転移性乳癌を発症する遺伝子導入マウス系統（ＭＭＴＶ−ｍＴＡｇマウス）をβ６ノックアウトマウスと交配した。β６を欠いている子マウスは急速に増殖する原発性乳腺腫瘍を発症したが、β６を発現している同腹の子マウスと比較して肺転移率および転移の程度は大きく減少した。免疫組織化学的に、β６は転移病巣端周囲で強く発現されることが示された。このことは、β６はこのモデルで最大の転移に必要であることを提唱している。
【００３９】
β６ノックアウトマウスは慢性の肺炎症を有するので、転移の減少は、転移性増殖に干渉する肺の炎症の存在による可能性がある。この問題に向けて以下の２つの実験を実施した。
【００４０】
１：原発性腫瘍に由来するβ６発現細胞株を、野性型またはβ６ノックアウトのどちらかの同系マウスに注射した。肺転移は両群のマウスで急速に生じ、ノックアウトマウスの炎症の存在は肺における腫瘍細胞の増殖に干渉しないことを示唆した。
【００４１】
２：β６ノックアウトまたは野性型マウスのどちらかの腫瘍に由来する細胞株を同系の野性型のマウスに注射した。野性型細胞株は例外なく肺腫瘍を生じ、一方ノックアウト細胞株はそうではなかった。この実験は、腫瘍細胞β６はこの系で最大の転移に必要であることを提唱している。
【００４２】
本明細書で引用した全ての参考文献（単行本、記事、論文、特許および特許出願を含む）は、参照により完全に本明細書に含まれる。
本発明をこれまで具体的な実施態様と関連させて記載してきたが、更なる改変が可能であることは理解されよう。本出願は、一般に本発明の原理に従う試み、および本発明が属する技術分野で既知または習慣的な実施の範囲内に含まれ、前述の本質的な特徴に適用され、本発明の範囲内および添付の請求の範囲内に含まれる試みを含む本発明の一切の変更、使用または応用を包含するものである。
【００４３】
本発明の実施形態の例には以下のようなものがある。
＜１＞ 患者に治療用量のαｖβ６拮抗物質を投与することを含む患者の急性肺損傷を治療する方法。
＜２＞ 前記拮抗物質がβ６と特異的に結合する抗体である＜１＞に記載の方法。
＜３＞ 前記抗体がモノクローナル抗体である＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 前記拮抗物質がアミノ酸配列ＲＧＤを含む＜１＞に記載の方法。
＜５＞ 前記拮抗物質がアンチセンス核酸分子を含む＜１＞に記載の方法。
＜６＞ 前記拮抗物質が治療的に投与される＜１＞に記載の方法。
＜７＞ 前記拮抗物質が予防的に投与される＜１＞に記載の方法。
＜８＞ 患者に治療用量のαｖβ６拮抗物質を投与することを含む患者の線維症を治療する方法。
＜９＞ 前記線維症が肺の線維症である＜８＞に記載の方法。
＜１０＞ 前記肺線維症が急性肺損傷から生じる＜９＞に記載の方法。
＜１１＞ 前記拮抗物質がβ６と特異的に結合する抗体である＜８＞に記載の方法。
＜１２＞ 前記抗体がモノクローナル抗体である＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞ 前記拮抗物質がアミノ酸配列ＲＧＤを含む＜８＞に記載の方法。
＜１４＞ 前記拮抗物質がアンチセンス核酸分子を含む＜８＞に記載の方法。
＜１５＞ 前記拮抗物質が治療的に投与される＜８＞に記載の方法。
＜１６＞ 前記拮抗物質が予防的に投与される＜８＞に記載の方法。
＜１７＞ ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ１２３８２によって産生されるモノクローナル抗体。
＜１８＞ ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ１２３８２。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】β６インテグリンサブユニットのヌル変異を発現しているマウスの肺ヒドロキシプロリン含有量をブレオマイシン（ｂｌｍ）または食塩水（ｓａｌ）の存在下でコントロールマウスと比較したグラフである。
【図１Ｂ】低倍率肺切片の三色染色の写真で、ブレオマイシン処理野性型マウス（β６＋／＋）の肺ではコラーゲン細胞外マトリックスの厚い蓄積が示されるが、β６−／−のマウスでは処理後３０日でも蓄積が認められないことを示している。
【図２】ブレオマイシン（ｂｌｍ）または食塩水（ｓａｌ）の存在下でβ６−／−マウスと野性型（β＋／＋）マウスの肺水の増加を比較したグラフである。
【図３】ブレオマイシン（ｂｌｍ）または食塩水（ｓａｌ）の投与後のβ６−／−マウスと野性型（β＋／＋）マウスでリンパ球の動員を比較したグラフである。
【図１Ａ】
2009001587.tif 000002
【図１Ｂ】
2009001587.tif 000003
【図２】
2009001587.tif 000004
【図３】
2009001587.tif 000005