(57)【要約】【課題】検出効率に優れた標的物質の検出方法、検出カートリッジ、検出キットを提供すること。【解決手段】検体中の標的物質を検出する方法であって、（１）第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子と標的物質とを接触させ、標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体を形成する工程と、（２）電場を印加することにより、前記複合体を集積領域に引き寄せる工程と、（３）集積領域に引き寄せられた磁性粒子の量を磁気センサにより検出する工程と、（４）前記磁性粒子の量により、標的物質の量を算出する工程とを含むことを特徴とする。【選択図】図２
2009128169.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の標的物質を検出する方法であって
（１）第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子と前記標的物質とを流体中で接触させ、前記標的物質を介して前記磁性粒子に前記非磁性粒子が保持された複合体を形成する工程と、
（２）電場を印加することにより、前記複合体を集積領域に引き寄せる工程と、
（３）前記集積領域に引き寄せられた前記複合体が有する磁性粒子の量を磁気センサにより検出する工程と、
（４）前記複合体が有する磁性粒子の量により、前記標的物質の量を算出する工程と、
を含むことを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項２】
検体中の標的物質を検出する方法であって、
（１）第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子と前記標的物質とを流体中で接触させ、前記標的物質を介して前記磁性粒子に前記非磁性粒子が保持された複合体を形成する工程と、
（２）電場を印加することにより、前記複合体を第一の集積領域に引き寄せる工程と、
（３）複合体を形成していない磁性粒子を除去する工程と、
（４）磁場を印加することにより、前記複合体を第二の集積領域に引き寄せる工程と、
（５）前記第二の集積領域に引き寄せられた前記複合体の有する磁性粒子の量を磁気センサにより検出する工程と、
（６）前記複合体の有する磁性粒子の量により、前記標的物質の量を算出する工程と、
を含むことを特徴とする標的物質の検出方法 。
【請求項３】
検体中の標的物質を検出する方法であって、
（１）第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子と前記標的物質とを流体中で接触させ、前記標的物質を介して前記磁性粒子に前記非磁性粒子が保持された複合体を形成する工程と、
（２）磁場を印加することにより、前記複合体を第一の集積領域に引き寄せる工程と、
（３）電場を印加することにより、前記複合体を第二の集積領域に引き寄せる工程と、
（４）前記第二の集積領域に引き寄せられた前記複合体の有する磁性粒子の量を磁気センサにより検出する工程と、
（５）前記複合体の有する磁性粒子の量により、前記標的物質の量を算出する工程と、
を含むことを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項４】
前記第一の標的物質捕捉体と第二の標的物質捕捉体が、空間的に標的物質の異なる領域を捕捉することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
検体中の標的物質を検出する検出カートリッジであって、
前記標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体が含まれる液体を保持する液体保持領域と、
前記複合体を集積する集積領域の少なくとも一つ以上とを備え、
少なくとも一つの前記集積領域が、磁気センサ検出素子により検出可能な空間に設けられる
ことを特徴とする検出カートリッジ。
【請求項６】
前記集積領域の近傍に、もしくは接して、電場発生手段もしくは磁場発生手段が備えられることを特徴とする請求項５に記載の検出カートリッジ。
【請求項７】
検体中の標的物質を検出する検出キットであって、
第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と、
第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子とを備え、
ｐＨが略前記磁性粒子の等電点である水溶液中において、前記非磁性粒子が電荷を帯びる
ことを特徴とする検出キット。
【請求項８】
前記磁性粒子および非磁性粒子の少なくとも一方が表面に被覆層を有することを特徴とする請求項７に記載の検出キット。
【請求項９】
前記被覆層がイオン性官能基を有することを特徴とする、請求項８に記載の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の標的物質を検出する標的物質の検出方法、検出カートリッジ、検出キットに関するものである。本発明は、特に、生体由来の物質又はその類似物質の特異的な分子認識能を利用したいわゆるバイオセンサに好適に応用できる標的物質の検出方法、検出カートリッジ、検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサは生体や生体分子の持つ、優れた分子認識能を活用した計測デバイスである。生体内には、互いに親和性のある物質の組み合わせとして例えば酵素‐基質、抗原‐抗体、ＤＮＡ‐ＤＮＡ等があり、バイオセンサはこれらの組み合わせの一方を基体に担持し、用いることによって、もう一方の物質を選択的に計測できるという原理を利用している。近年では、バイオセンサは医療分野のみならず、環境や食料品等への幅広い応用が期待され、その使用領域を広げるためにも、小型、軽量、高感度、高効率なバイオセンサが望まれている。
【０００３】
現在、このような生体分子間相互作用を検出する方法のひとつとして、標識物として磁性粒子を利用した磁気検出法の研究が盛んに進められている。
【０００４】
図１に、従来の磁性標識を用いた固相分析法の一例を示す。図１に示される方法においては、まずあらかじめ、基体表面に、標的物質の一方の領域（抗原抗体反応の場合はエピトープと呼ばれる）を特異的に認識し捕捉することができる第一の標的物質捕捉体（抗原抗体反応の場合は一次抗体と呼ばれる）を固定する。次に、標的物質を含む検体液を接触せしめる。この操作により、標的物質が第一の標的物質捕捉体に特異的に捕捉される。次に、第一の標的物質捕捉体により特異的に捕捉された標的物質の他方の領域を特異的に認識し、捕捉することができる第二の標的物質捕捉体（抗原抗体反応の場合は二次抗体と呼ばれる）を有する磁性粒子を液中に投入する。この操作により、第二の標的物質捕捉体が、基体表面に固定化された第一の標的物質捕捉体に特異的に捕捉された標的物質に捕捉され、結果的に図１のように、標的物質を介して、磁性粒子が基体表面に固定化される。
【０００５】
また、異なる方法として、あらかじめ、標的物質を含む検体液中に、第二の標的物質捕捉体を有する磁性粒子を加えて、“標的物質‐第二の標的物質捕捉体”複合体を形成させる。その複合体を基体上に固定化された第一の標的物質捕捉体と接触させることによって、結果的に、図１のように、標的物質を介して、磁性粒子を基体表面に固定化することも可能である。
【０００６】
そして、基体表面に固定化された磁性粒子の数を何らかの手法で測定する事で、目的とする標的物質の濃度を計算することが可能となる。
【０００７】
この基体表面に固定化された磁性粒子を検出する方法としては、SQUID（超電導量子干渉計）を用いる方法（特許文献１）、半導体ホール素子を用いる方法（特許文献２）、磁気抵抗効果素子方法（特許文献３）が開示されている。
【０００８】
また、磁性粒子の特性を、上述のように標識物として利用するのではなく、別の目的で利用する方法として以下の手法が提案されている。
【０００９】
特許文献４には、生体高分子に磁性体を貼付して、これに磁気吸引力を作用させ、基板に固定化されたプローブ生体高分子側に引っ張る方法が開示されている。かかる方法は、ハイブリダイゼーションの高速化を目的としている。
【００１０】
特許文献５には、プローブを具備した粒子が、捕捉手段によって、反応部に維持される装置が開示されている。この捕捉手段は、電極、電磁石であり、前記粒子は、印加により、前記プローブと標的物質との反応を行う反応部に維持される。かかる構成は、複数種類のプローブを、反応部の所望する位置に、種類別に配置することを可能とし、多種類の物質を一度に検出可能な装置を提供することを目的としている。
【特許文献１】特開2001-033455号公報
【特許文献２】国際公開第03/067258号パンフレット
【特許文献３】米国特許第5981297号明細書
【特許文献４】特開2003-159057号公報
【特許文献５】特開2002-281967号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特許文献１から３に開示される磁性粒子の検出による標的物質検出方法では、固相に予め固定された標的物質捕捉体と標的物質との固相上での結合反応の工程が含まれる。そのため、固相上で充分、反応を進行させるためには時間を要するという問題や、固相面積が限定され小さい場合は検出に対して十分な結合数が得られないという問題がある。
【００１２】
よって、本発明の目的は、磁性材料を用いる標的物質の検出方法において、さらなる反応時間短縮や高感度化、つまり検出効率向上を可能とする方法、該方法に用いるカートリッジおよび検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第一の検出方法は、検体中の標的物質を検出する方法であって
（１）第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子と前記標的物質とを流体中で接触させ、前記標的物質を介して前記磁性粒子に前記非磁性粒子が保持された複合体を形成する工程と、
（２）電場を印加することにより、前記複合体を集積領域に引き寄せる工程と、
（３）前記集積領域に引き寄せられた前記複合体が有する磁性粒子の量を磁気センサにより検出する工程と、
（４）前記複合体が有する磁性粒子の量により、前記標的物質の量を算出する工程と、
を含むことを特徴とする標的物質の検出方法である。
【００１４】
本発明の第二の検出方法は、検体中の標的物質を検出する方法であって、
（１）第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子と前記標的物質とを流体中で接触させ、前記標的物質を介して前記磁性粒子に前記非磁性粒子が保持された複合体を形成する工程と、
（２）電場を印加することにより、前記複合体を第一の集積領域に引き寄せる工程と、
（３）複合体を形成していない磁性粒子を除去する工程と、
（４）磁場を印加することにより、前記複合体を第二の集積領域に引き寄せる工程と、
（５）前記第二の集積領域に引き寄せられた前記複合体の有する磁性粒子の量を磁気センサにより検出する工程と、
（６）前記複合体の有する磁性粒子の量により、前記標的物質の量を算出する工程と、
を含むことを特徴とする標的物質の検出方法である。
【００１５】
本発明の第三の検出方法は、検体中の標的物質を検出する方法であって、
（１）第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子と前記標的物質とを流体中で接触させ、前記標的物質を介して前記磁性粒子に前記非磁性粒子が保持された複合体を形成する工程と、
（２）磁場を印加することにより、前記複合体を第一の集積領域に引き寄せる工程と、
（３）電場を印加することにより、前記複合体を第二の集積領域に引き寄せる工程と、
（４）前記第二の集積領域に引き寄せられた前記複合体の有する磁性粒子の量を磁気センサにより検出する工程と、
（５）前記複合体の有する磁性粒子の量により、前記標的物質の量を算出する工程と、
を含むことを特徴とする標的物質の検出方法である。
【００１６】
また、本発明の検出カートリッジは、検体中の標的物質を検出する検出カートリッジであって、
前記標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体が含まれる液体を保持する液体保持領域と、
前記複合体を集積する集積領域の少なくとも一つ以上とを備え、
少なくとも一つの前記集積領域が、磁気センサ検出素子により検出可能な空間に設けられる
ことを特徴とする検出カートリッジである。
【００１７】
さらに、本発明の検出キットは、検体中の標的物質を検出する検出キットであって、
第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と、
第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子とを備え、
ｐＨが略前記磁性粒子の等電点である水溶液中において、前記非磁性粒子が電荷を帯びる
ことを特徴とする検出キットである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、検出効率に優れた標的物質の検出方法、検出カートリッジ、検出キットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の好ましい実施の形態について、詳細に説明する。
【００２０】
まず、本発明における検出方法について述べた後に、各構成要素、及び、検出カートリッジ、検出キットの各形態について詳細に述べる。
【００２１】
＜検出方法＞
（第一の実施形態）
本発明による検出方法の第一の実施形態は、検体中の標的物質を検出する方法であって、
（１）第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子と標的物質とを流体中で接触させ、標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体を形成する工程と、
（２）電場を印加することにより、前記複合体を集積領域に引き寄せる工程と、
（３）集積領域に引き寄せられた複合体が有する磁性粒子の量を磁気センサにより検出する工程と、
（４）前記複合体が有する磁性粒子の量により、標的物質の量を算出する工程とを有する。
【００２２】
図２は本発明による検出方法の第一の実施形態を模式的に示した図である。
【００２３】
図２（ａ）は、第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子と標的物質とを流体中で接触させ、標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体を形成する工程（１）を模式的に示した図である。本工程では、第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子、第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子および標的物質を液中で混合し、混合液を調整する。反応時間は粒子や標的物質の濃度、液量、撹拌方法等に応じて適宜決められる。
【００２４】
本発明は、液相（流体中）で複合体を形成するため、固相で複合体形成反応を行う従来法と比較して、反応時間を短縮することが可能となる。混合液は、後述する検出カートリッジの液体保持領域に導入されることが望ましい。その結果、液体保持領域内に複合体が保持される。尚、前記混合液は検出カートリッジとは異なる容器、つまり、液体保持領域とは異なる領域内で混合調整した後に、液体保持領域に導入してもよいし、液体保持領域内で混合調整してもよい。尚、調整された混合液のｐＨは、後述する非磁性粒子の等電点とは離れ、磁性粒子の等電点に近い値であることが好ましい。そうすることで混合液中において、非磁性粒子が表面電荷を有し、磁性粒子が表面電荷を極力有さないように調製することができる。
【００２５】
図２（ｂ）は、電場を印加することにより、前記複合体を集積領域に引き寄せる工程（２）を模式的に示した図である。本工程では、複合体を含む前記混合液を集積領域に接触させ、電場を印加することにより、集積領域に複合体を引き寄せる。よって、集積領域は、液体保持領域に接して配置されることが望ましい。後述するように、電場印加とは、集積領域の表面電荷が、混合液中の非磁性粒子の表面電荷の極性と逆の極性になるように、電位、もしくは電流を印加することを意味する。よって、非磁性粒子が選択的に集積領域に引きよせられる。一方、複合体を形成していない磁性粒子のほとんどは、液中に残存することになる。これは、後述するように、集積を行う液中において、本発明による磁性粒子の表面電荷量は、非磁性粒子の表面電荷量に対して少ないことによる。尚、非磁性粒子と磁性粒子の選択性、粒子濃度等により、電場印加時間、電位、電流値等は適宜決められる。本操作後に、電場を印加したままの状態で、液中に残存する、複合体を形成していない磁性粒子を除去する工程を有してもよい。特に、以下で述べるような複合体を液中に分散させた状態で検出を行う場合は、工程（２）の後に、液中に残存する、複合体を形成していない磁性粒子を除去する工程を有することが好ましい。
除去方法は、溶媒による洗浄操作が最も簡便な方法であるが、磁場を使った除去等、複合体を形成していない磁性粒子を選択的に除去することが出来れば、これに限らない。
【００２６】
図２（ｃ）は、工程（１）、（２）を行うことにより、集積領域に保持される複合体を模式的に示した図である。ここで、集積領域に引き寄せられた磁性粒子の量を、磁気センサにより検出する工程（３）を行う。本検出工程は、磁気センサにより、磁性粒子の量を検出することが出来れば、電場を印加した状態で行ってもよいし、電場を解除した状態で行ってもよい。つまり、複合体を集積領域に保持した状態でも、液中に分散させた状態でもよい。但し、磁気センサが磁気抵抗効果素子のように、検出素子表面近傍における感度が高い場合は、検出素子表面近傍を集積領域とし、複合体を集積領域に保持したまま検出工程を行うことが望ましい。  さらに、前記磁性粒子の量により、標的物質の量を算出する工程（４）を行うことで、検体中の標的物質の検出が可能となる。ここで磁性粒子の量と標的物質の量（濃度）の関係については、あらかじめ、既知の複数濃度の標準検体を用いて、磁性粒子と濃度の関係を取得しておき、この関係をもとに検量線を求め、磁性粒子と濃度の関数を求めておけば、この関数を用いて、実際の計測時の磁性粒子の量から標的物質の量（濃度）を求めることが可能となる。
（第二の実施形態）
本発明による、第二の実施形態は、検体中の標的物質を検出する方法であって、
（１）第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子と標的物質とを流体中で接触させ、標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体を形成する工程と、
（２）電場を印加することにより、前記複合体を第一の集積領域に引き寄せる工程と、
（３）複合体を形成していない磁性粒子を除去する工程と、
（４）磁場を印加することにより、前記複合体を第二の集積領域に引き寄せる工程と、
（５）第二の集積領域に引き寄せられた前記複合体の有する磁性粒子の量を磁気センサにより検出する工程と、
（６）前記複合体の有する磁性粒子の量により、標的物質の量を算出する工程と、を有する。
【００２７】
図３は本発明による第二の実施形態を模式的に示した図である。
【００２８】
図３（ａ）は、第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子と標的物質とを接触させ、標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体を形成する工程（１）を模式的に示した図である。本工程は、第一の実施形態における工程（１）と同様に、混合液を調整する工程である。
【００２９】
図３（ｂ）は、電場を印加することにより、前記複合体を第一の集積領域に引き寄せる工程（２）を模式的に示した図である。本工程では、混合液を第一の集積領域に接触させ、電場を印加することにより、第一の集積領域に複合体を引き寄せる。電場の印加とは、第一の実施形態の工程（２）において説明したとおりである。また、本操作後に、電場を印加したままの状態で、液中に残存する、複合体を形成していない磁性粒子を除去する工程を有する。
【００３０】
図３（ｃ）は、工程（１）、（２）、（３）を行うことにより、第一の集積領域に保持される複合体を模式的に示した図である。次に第一の集積領域への電場印加を解除する。図３（ｄ）は電場印加を解除し、第一の集積領域への複合体保持力が弱まった状態を模式的に示した図である。この結果、複合体は液体保持領域内に再分散可能な状態となる。尚、再分散しにくい場合は、撹拌を行ってもよい。また、分散液を導入してもよい。後述するように、検出カートリッジが流路形状の場合は分散液を流し、再分散を促進することが有効となる。尚、分散液は、複合体形成、特には、磁性粒子に備えられた第二の捕捉体と標的物質の結合を好適に維持することが出来れば、前記混合液や洗浄液と同じ組成でも、異なる組成でも構わない。
【００３１】
図３（ｅ）は、磁場を印加することにより、前記複合体を第二の集積領域に引き寄せる工程（４）を模式的に示した図である。本工程では、磁場を印加することにより、第二の集積領域に複合体を引き寄せる。よって、第二の集積領域も、液体保持領域に接して配置されることが望ましい。後述するように、磁場印加とは、集積領域に向かって磁性粒子が移動するような力が働くような分布を持つ磁場を与えることを意味する。よって、磁性粒子が選択的に第二の集積領域に引き寄せられる。一方、複合体を形成していない非磁性粒子のほとんどは、液体保持部に残存することになる。尚、非磁性粒子と磁性粒子の選択性、粒子濃度等により、磁場印加時間、磁場の強度は適宜決められる。本操作後に、磁場を印加したままの状態で、液中に残存する、複合体を形成していない非磁性粒子を除去する工程を有してもよい。除去方法は、溶媒による洗浄操作が最も簡便な方法であるが、電場を使った除去等、複合体を形成していない非磁性粒子を選択的に除去することが出来れば、これに限らない。以上示したように、本工程により、複合体は選択的に第二の集積領域に引き寄せられる。
【００３２】
図３（ｆ）は、工程（１）、（２）、（３）、（４）を行うことにより、第二の集積領域に保持される複合体を模式的に示した図である。ここで、第二の集積領域に引き寄せられた磁性粒子の量を、磁気センサにより検出する工程（５）を行う。本検出工程は、磁気センサにより、磁性粒子の量を検出することが出来れば、磁場を印加した状態で行ってもよいし、磁場を解除した状態で行ってもよい。つまり、複合体を検出領域に保持した状態でも、液中に分散させた状態でもよい。但し、磁気センサが磁気抵抗効果素子のように、検出素子表面近傍における感度が高い場合は、検出素子表面近傍を第二の集積領域とし、複合体を第二の集積領域に保持したまま検出工程を行うことが望ましい。本発明によると、複合体は選択的に第二の集積領域に引き寄せられ、結果として、濃縮効果が得られる。よって、後述するように、検出素子表面を第二の集積領域とすれば、同じ検出素子面積の従来の検出素子を用いたセンサと比較して、感度を向上させることが可能となる。
【００３３】
さらに、第一の実施形態と同様に、前記磁性粒子の量により、標的物質の量を算出する工程（６）を行うことで、検体中の標的物質の検出が可能となる。
（第三の実施形態）
本発明による、第三の実施形態は、検体中の標的物質を検出する方法であって、
（１）第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子と標的物質とを流体中で接触させ、標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体を形成する工程と、
（２）磁場を印加することにより、前記複合体を第一の集積領域に引き寄せる工程と、
（３）電場を印加することにより、前記複合体を第二の集積領域に引き寄せる工程と、
（４）第二の集積領域に引き寄せられた前記複合体の有する磁性粒子の量を磁気センサにより検出する工程と、
（５）前記複合体の有する磁性粒子の量により、標的物質の量を算出する工程と、を有する。
【００３４】
図４は本発明による第三の実施形態を模式的に示した図である。
【００３５】
図４（ａ）は、第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子と標的物質とを接触させ、標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体を形成する工程（１）を模式的に示した図である。本工程は、第一、第二の実施形態における工程（１）と同様に、混合液を調整する工程である。
【００３６】
図４（ｂ）は、磁場を印加することにより、前記複合体を第一の集積領域に引き寄せる工程（２）を模式的に示した図である。本工程では、混合液を第一の集積領域に接触させ、磁場を印加することにより、第一の集積領域に複合体を引き寄せる。磁場の印加とは第二の実施形態の工程（４）で説明したとおりである。
【００３７】
また、本操作後に、磁場を印加したままの状態で、液中に残存する、複合体を形成していない非磁性粒子を除去する工程を有してもよい。
【００３８】
図４（ｃ）は、工程（１）、（２）を行うことにより、第一の集積領域に保持される複合体を模式的に示した図である。次に第一の集積領域への磁場印加を解除する。図４（ｄ）は磁場印加を解除し、第一の集積領域への複合体保持力が弱まった状態を模式的に示した図である。この結果、複合体は液体保持領域内に再分散可能な状態となる。尚、再分散しにくい場合は、撹拌を行ってもよい。また、分散液を導入してもよい。後述するように、検出カートリッジが流路形状の場合は分散液を流し、再分散を促進することが有効となる。尚、分散液は、複合体形成、特には、非磁性粒子に備えられた第一の捕捉体と標的物質の結合を好適に維持することが出来れば、前記混合液や洗浄液と同じ組成でも、異なる組成でも構わない。また、この分散液を液体保持領域に保持したまま工程（３）を行う場合は、分散液のｐＨを磁性粒子の等電点に近く、非磁性粒子が表面電荷を有しやすいｐＨにすることが望ましい。
【００３９】
図４（ｅ）は、電場を印加することにより、前記複合体を第二の集積領域に引き寄せる工程（３）を模式的に示した図である。本工程では、電場を印加することにより、第二の集積領域に複合体を引き寄せる。電場の印加とは、第一の実施形態の工程（２）において説明したとおりである。
よって、第二の集積領域も、液体保持領域に接して配置されることが望ましい。また、本操作後に、電場を印加したままの状態で、液中に残存する、複合体を形成していない磁性粒子を除去する工程を有してもよい。除去方法は、溶媒による洗浄操作が最も簡便な方法であるが、磁場を使った除去等、複合体を形成していない磁性粒子を選択的に除去することが出来れば、これに限らない。以上示したように、本工程により、複合体は選択的に第二の集積領域に引き寄せられる。
【００４０】
図４（ｆ）は、工程（１）、（２）、（３）を行うことにより、第二の集積領域に保持される複合体を模式的に示した図である。ここで、第二の実施形態と同様に、第二の集積領域に引き寄せられた磁性粒子の量を、磁気センサにより検出する工程（４）を行う。本検出工程は、磁気センサにより、磁性粒子の量を検出することが出来れば、電場を印加した状態で行ってもよいし、電場を解除した状態で行ってもよい。つまり、複合体を第二の検出領域に保持した状態でも、液中に分散させた状態でもよい。但し、磁気センサが磁気抵抗効果素子のように、検出素子表面近傍における感度が高い場合は、検出素子表面近傍を第二の集積領域とし、複合体を第二の集積領域に保持したまま検出工程を行うことが望ましい。本発明によると、複合体は選択的に第二の集積領域に引き寄せられ、結果として、濃縮効果が得られる。よって、後述するように、検出素子表面を第二の集積領域とすれば、同じ検出素子面積の従来の検出素子を用いたセンサと比較して、感度を向上させることが可能となる。
【００４１】
さらに、第一の実施形態と同様に、前記磁性粒子の量により、標的物質の量を算出する工程（５）を行うことで、検体中の標的物質の検出が可能となる。
（濃縮効果）
図５は、従来の固相反応における結合率と標的物質の濃度の関係を模式的に示した図である。本発明において、結合率とは、固相上の結合サイト（例えば固相抗体数）に対して、最終的に標的物質と結合した結合物数の割合である。模式図上、（Ａ）の領域は、結合サイト数が不足し始め、結合率が一定値に収束する領域である。（Ｃ）の領域は、測定方法等による感度の下限や、反応系内に存在する標的物質数の下限により、結合率が一定値に収束する領域である。よって、主には、この間の（Ｂ）の領域を用いて、標的物質の検出、濃度の算出が行われる。
【００４２】
一般的な生体反応を用いる場合、この（Ｂ）の領域において、標的物質濃度と結合率は比例関係である。つまり、同じ結合サイト数を有する検出素子であれば、標的物質濃度が低下すると、結合率も比例して低下する。これは、標的物質が結合していない結合サイトが増えることを意味し、絶対的な結合物数も比例して低下することを示す。よって、従来の固相反応を用いた方法で高感度化を達成するためには、検出素子面積を大きくし、結合サイトを増やして、絶対的な結合物数を確保する必要があった。
【００４３】
本検出方法では、この結合物つまり、複合体をあらかじめ液相で形成し、この複合体を選択的に集積領域に引き寄せる。よって、検出素子表面を集積領域とすれば、検出素子表面に絶対的な結合物数を確保することになる。その結果として、同じ結合サイト数を有する、例えば同じ検出素子面積の従来の検出素子を用いたセンサと比較して、感度を向上させることが可能となる。
【００４４】
＜標的物質捕捉体＞
本発明において使用する標的物質捕捉体は、検体中の標的物質の選択に係わる物質であり、標的物質に応じて選択することができる。
【００４５】
ここで、本発明の標的物質捕捉体を説明する前に、本発明における標的物質について説明する。標的物質は検体中に含まれており、標的物質捕捉体によって捕捉される領域を有する。尚、本発明は、生体由来の物質又はその類似物質の特異的な分子認識能を利用したいわゆるバイオセンサに好適に応用できる発明である。よって、標的物質は糖、蛋白質、アミノ酸、抗体、抗原や疑似抗原、ビタミン、遺伝子などの生体物質、及び、その関連物質や人工的に合成された擬似生体物質であることが望ましい。
【００４６】
本発明では標的物質を用いて検出対象を検出することができれば良い。したがって、検出対象自体が標的物質であり、捕捉体によって直接検出対象を捕捉することで検出しても良い。また、標的物質と検出対象が異なり、捕捉体によって標的物質を検出することで間接的に検出対象の検出を行っても良い。後者の例としては、検出対象が存在することによって、標的物質が生じる場合などである。したがって、検出対象は生体物質に限るものではなく、またそのサイズも、特に限定されるものではない。
【００４７】
更に、検体は、検出対象物質を含む試料そのものであっても良く、試料に対して、標的物質の抽出処理、分離処理、希釈処理及び精製処理等の各種処理を経て調製したものであってもよい。検体は、標的物質の種類に応じた液媒体、例えば水や緩衝液、水と水溶性の有機溶媒との混合物などを用いて調製される。なお、分析対象物質から直接あるいは間接的に得られる分解物や生成物を標的物質として検出することで分析対象物質を間接的に検出する場合にも、本発明は好適に適用可能である。
【００４８】
本発明に使用される標的物質捕捉体の例としては、前述した標的物質の例を捕捉できるものであり、酵素、抗体および抗原などのタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖などが挙げられるが、これに限る物ではない。
【００４９】
本発明における標的物質−標的物質捕捉体の組み合わせの例としては、抗原−抗体、酵素−基質、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−タンパク質、ＲＮＡ−タンパク質、糖鎖−タンパク質等が挙げられるが、特異的な結合を有する関係のものであれば特に制限されるものではない。
【００５０】
本発明の検出方法では、非磁性粒子が備える標的物質捕捉体を第一の標的物質捕捉体とし、磁性粒子が備える標的物質捕捉体を第二の標的物質捕捉体とする。また、非磁性粒子や磁性粒子が標的物質捕捉体を備えるとは、検出方法において標的物質捕捉体がこれらの粒子と結合した状態を維持できる程度に固定化されていることをいう。そのような固定化の方法には、例えば、化学結合による固定化や物理的吸着などが挙げられる。
【００５１】
本発明による標的物質の検出方法においては、第一の標的物質捕捉体と第二の標的物質捕捉体が、空間的に標的物質の異なる領域を捕捉することを特徴とする。このような系として、標的物質が抗原であり、第一の標的物質捕捉体が一次抗体、第二の標的物質捕捉体が二次抗体である場合が挙げられる。この際、一次抗体、二次抗体はそれぞれ、抗原における別の領域を捕捉する。図６（ａ）のように、前記一次抗体が捕捉する抗原の領域と、二次抗体が捕捉する抗原の領域が、別の抗原決定基であれば、本発明に適用可能である。また、それぞれが捕捉する抗原の領域が同一の抗原決定基であっても良い。例えば、図６（ｂ）のように、抗原が多量体を形成している場合は、同一の抗原決定基であっても、本発明に適用可能である。即ち、抗原決定基によるものではなく、第一の標的物質捕捉体と第二の標的物質捕捉体が、空間的に標的物質の異なる領域を捕捉すれば、本発明の効果を得ることが可能となる。
【００５２】
＜非磁性粒子と磁性粒子＞
（非磁性粒子）
本発明は、混合液中において、集積領域へ引き寄せる方法の一つである電場印加により、非磁性粒子を集積領域に引き寄せる。これは、非磁性粒子が有する表面電荷を利用するものであり、非磁性粒子が混合液中で表面電荷を有し、標的物質捕捉体を備え、複合体の形成が可能であれば、如何なるものも用いることが可能である。そのため、非磁性粒子は、帯電性粒子であることが好ましい。
【００５３】
金属酸化物は、等電点より低いｐＨでは正に帯電し、等電点より高いｐＨでは負に帯電するという性質を有しており、非磁性粒子の材料として本発明にも好適に用いることができるものがある。よって、非磁性の金属酸化物は、本発明の非磁性粒子の材料として好ましく、酸化ケイ素や酸化アルミニウム等は微粒子化も容易であり、好適に用いられる。また、後述するよう任意の粒子の表面に被覆層を形成したものを非磁性粒子として用いてもよい。尚、ここで言う非磁性粒子とは、粒子そのものだけでなく、内含する粒子材料と被覆層合わせた構造体をも含む。
【００５４】
非磁性粒子の大きさは、集積領域の形状、大きさ、或いは用途によって様々に選択する事が可能であるが、一般的に数十ナノメートルから数百マイクロメートルの直径を有するものが好適である。
（磁性粒子）
本発明は磁気センサにより、磁性粒子の量を検出する。つまり、磁性粒子は検出のための標識としての物性や特性を満たすものである。また、集積領域へ引き寄せる方法の一つである磁性の印加により集積領域に引き寄せられることができるものである。したがって、通常用いられる常磁性、超常磁性を示す磁性微粒子から選択して用いることができる。
【００５５】
磁性粒子を構成する磁性体材料としては、例えば、金属酸化物を用いることができる。金属酸化物の中でも、磁性標識として一般的に使用されているフェライトやマグネタイトといった鉄酸化物は、生理活性条件下で十分な磁性を有し、溶媒中で酸化等の劣化が起こりにくいことから好ましい。フェライトは、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）、マグヘマイト（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、及びこれらのＦｅの一部を他の原子で置換した複合体から選択される。他の原子としては、Ｌｉ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｃａ、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｔａ、Ｗの少なくともいずれかが挙げられる。
【００５６】
また、上述の磁性体材料に樹脂が複合化物されているものも、一般的に磁性標識として使われており、本発明における磁性粒子にも使うことができる。複合化物の例としては、磁性体材料から成る基体をコアとして、該基体にシェル層（コーティング層）を形成することで積層構造とした粒子がある。このようなコアシェル形状の磁性粒子としては、例えば前記金属酸化物からなる粒子を基体として、金属酸化物からなる基体の粒子の表面にスチレン系、デキストラン系、アクリルアミド系等の樹脂から選択された樹脂層を被覆したコアシェル粒子が挙げられる。また、スチレン系樹脂、デキストラン系樹脂、アクリルアミド系樹脂を形成するそれぞれのモノマーのうち少なくとも２つを共重合させた樹脂も、スチレン系、デキストラン系、アクリルアミド系等の樹脂に含むものとする。またコアシェルタイプ以外にも、複合化物として、磁性体材料からなる粒子をスチレン系、デキストラン系、アクリルアミド系等の樹脂内に分散させた粒子や、樹脂からなる粒子の表面に磁性体材料からなる微粒子が担持された粒子等も挙げられる。これらの粒子も本発明の磁性粒子として用いることができる。このような磁性粒子として、市販されているものでは、例えば、Ｄｙｎａｌ社から市販されているダイナビーズ、ｍｉｃｒｏｍｏｄ社から市販されているｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ、ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ、メルク社から市販されているエスタポール等があり、これらを用いることもできる。
【００５７】
尚、このような磁性粒子の大きさは、集積領域の形状、大きさ、或いは用途によって様々に選択する事が可能であるが、一般的に数十ナノメートルから数百マイクロメートルの直径を有するものが好適である。
【００５８】
さらに、本発明は、後述するように、電場印加時の非磁性粒子と磁性粒子の表面電荷の違いにより、選択的な集積を実現するものである。よって、集積を行う液中において、非磁性粒子の表面電荷量に対して、磁性粒子の表面電荷量が少ないことが望ましい。さらには、集積を行う際の液体、特に水溶液のｐＨが磁性粒子の等電点に近く、このｐＨにおいて、非磁性粒子が電荷を帯びていることが望ましい。
【００５９】
このような水溶液中の磁性粒子の表面電荷の制御は、後述する、被覆層を形成することでも制御可能となる。尚、ここで言う磁性粒子とは、粒子そのものだけでなく、内含する粒子材料と被覆層とを合わせた構造体をも含む。
（被覆層）
本発明による非磁性粒子は表面に被覆層を有し、非磁性粒子の表面電荷はこの被覆層に由来するものであってもよい。よって、被覆層の材質は、電場印加により集積を行う液中で適当な表面電荷を有するものであれば、ガラス等無機材料、樹脂等有機材料、シリコン等半導体材料、金属材料等いかなる材料を用いることも可能である。特に、金属酸化物は、前述のように、等電点より低いｐＨでは正に帯電し、等電点より高いｐＨでは負に帯電するという性質を有しており、被覆層に適している。また、イオン性官能基を表面に付与することでも、非磁性粒子に表面電荷を付与することが出来る。例えば、カルボキシル基を多く付与すると、一般に等電点は低くなり、中性領域では負に帯電しやすくなる。一方、アミノ基を多く付与すると、一般に等電点は高くなり、中性領域では正に帯電しやすくなる。これらの官能基は、イオン性界面活性剤による被覆、イオン性官能基を有するポリマーの被覆等により付与することができる。また、粒子が酸化物の場合はイオン性官能基を有するシラン剤による被覆、粒子が金、銀、銅、白金等の場合は、イオン性官能基を有するチオール化合物やアミノ化化合物による被覆が可能となる。粒子表面に重合開始基を導入し、イオン性官能基を有するポリマー膜を重合する方法も有効である。
【００６０】
このように被覆層を形成すれば、表面電荷を有さない、もしくは弱い材料を用いる場合であっても、本発明による効果を得ることが可能となる。
【００６１】
また、本発明による磁性粒子も表面に被覆層を有し、磁性粒子の表面電荷もこの被覆層に由来するものであってもよい。よって、被覆層の材質は、電場印加により、非磁性粒子の集積を行う液中で、表面電荷が小さくなるようなものであれば、ガラス等無機材料、樹脂等有機材料、シリコン等半導体材料、金属材料等いかなる材料を用いることも可能である。前述のように、金属酸化物は等電点を有する。よって、電場印加により集積を行う際の液体のｐＨと近い等電点を有する金属酸化物を利用することで、磁性粒子の表面電荷を小さくすることが可能となる。また、イオン性官能基を表面に付与することで、磁性粒子の等電点を制御し、表面電荷を小さくすることも可能である。イオン性官能基の量を制御して直接導入する、アニオン性官能基とカチオン性官能基の量比が制御された材料を被覆するといった方法も利用可能である。
【００６２】
また、これらの被覆層は親水層であることが望ましい。一般的にタンパク質等の生体物質は、様々な物質に対して、非特異的に吸着する現象が知られている。本発明においても、検出素子表面への非特異吸着、粒子間の生体物質を介した凝集は問題となる可能性がある。例えば、標的物質を介した形成された複合体以外の磁性粒子が、検出素子表面に非特異的に吸着した場合、ノイズとなる。また、標的物質を介さずに、非磁性粒子と磁性粒子が擬似複合体を形成した場合、この複合体によるシグナルもノイズとなり、検出感度や精度を下げる要因となりえる。しかし、被覆層を親水層とすれば、生体物質の非特異的な吸着の原因のひとつである「疎水性相互作用」を低減することができ、この生体物質の非特異吸着を低減することが可能となる。さらには、水溶液中における分散能をあげることになり、凝集を低減することが可能となる。
（複合体）
磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体とは、第一および第二の標的物質捕捉体が標的物質を捕捉することで、これらの捕捉体にそれぞれ結合する磁性粒子および非磁性粒子が一体となった複合体を指す。
【００６３】
＜液体保持領域＞
本発明において、液体保持領域とは、標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体が含まれる液体を保持する領域を意味する。本発明における検出方法は、前記複合体を形成する工程を含む。この工程では、非磁性粒子、磁性粒子、標的物質を液中で混合し、混合液を調整する。この混合液が、液体保持領域に導入され、その結果、液体保持領域内に複合体が保持される。尚、前記混合液は検出カートリッジとは異なる容器、つまり、液体保持領域とは異なる領域内で混合調整した後に、液体保持領域に導入してもよいし、液体保持領域内で混合調整してもよい。また、本発明による検出方法においては、集積領域に集積された複合体等を液体保持部内に再分散させることも可能である。よって、液体保持部は、いわゆるウェル形状の容器であっても、流路形状の容器であってもよく、混合液、洗浄液、分散液等の液体を良好に保持することが可能であればよい。特に、分散液を導入することにより、洗浄、再分散等を行う場合は、流路形状であることが望ましい。
【００６４】
＜集積領域＞
本発明において、集積領域とは、複合体を集積する領域を意味する。集積領域は液体保持領域内、又は液体保持領域と接触して設けられる。本発明における検出方法は、電場印加や磁場印加により、複合体を集積領域に引き寄せる工程を含む。よって、電場印加により集積する場合は、集積領域は電場発生手段表面からなる、もしくは近傍に電場発生手段が配置される領域である。また、磁場により集積する場合は、集積領域は磁場発生手段からなる、もしくは近傍に磁場発生手段が配置され領域である。これら電場発生手段からの電場印加、磁場発生手段からの磁場印加により、複合体が好適に集積できれば、集積領域は固相表面はもちろん、液/液界面、任意の液相内の空間等でも構わない。また、集積領域の面積を大きく取りたい場合は、多孔質体表面や、表面近傍を集積領域としてもよく、形状は限定されない。
【００６５】
二つの集積領域を設けることにより、それぞれの集積領域に複合体を引き寄せる各工程を検出方法が有する場合、当該二つの工程の順序において先に複合体を引き寄せる集積領域を第一の集積領域とし、その後に複合体を引き寄せる集積領域を第二の集積領域とする。
【００６６】
＜電場印加＞
本発明では、複合体を集積領域に引き寄せる方法の一つとして電場の印加を行う。つまり、電場印加とは、集積領域の表面電荷が、混合液中の非磁性粒子の表面電荷の極性と逆の極性になるように、電位、もしくは電流を印加することを意味する。例えば、広い面積をもつ平行平板間に形成される均一な電場E中に、電荷qを持つ非磁性粒子が置かれた場合、この非磁性粒子に働く力FEは電荷量と電場の積q Eで与えられる。距離dで並べられた平行平板に電圧Ｖを印加すると平行平板間に作られる電場EはV/dで与えられる。したがって、電荷qを持つ非磁性粒子に働く力FEは、q V/dとなる。非磁性粒子の電荷の極性と逆の極性の平板と、非磁性粒子の間に集積領域を形成することで、非磁性粒子を集積領域へ集めることが可能である。もし、集積領域から遠ざける方向に非磁性粒子に磁力や重力等の他の力が印加されているならば、その力よりも大きな力を印加して集積領域へ非磁性粒子を集めなければならない。この場合、上述のように、平行平板間に印加する電圧を適宜調整することで容易に実現可能である。あるいは電荷量の大きな非磁性粒子を使用しても良いし、平行平板の間隔を調整しても良い。以上の説明においては平行平板を例にとって説明したが、電場を形成するための電極の形状は、これに限られるものではなく、例えば、円筒形のものなど非磁性粒子に電場を印加できるものであればどのような物でも使用可能である。
【００６７】
電場の印加は、非磁性粒子が十分に集積領域へ集められるまで続けて行われる。したがって、電場を印加する時間は、非磁性粒子に印加される種々の力と溶液の粘性等によって決められる。非磁性粒子を短時間の内に集積領域へ集める場合には、大きな電場を印加することで実現される。
【００６８】
＜磁場印加＞
本発明では、複合体を集積領域に引き寄せる方法の一つとして磁場の印加を行う。磁化Mを持つ磁性粒子には磁場の強度の傾きに依存して力が働き、磁場強度の大きな方へ磁性粒子が移動しようとする。磁場をHとすると磁性粒子に印加される力FHは次式で表される。
【００６９】
【数１】
2009128169.tif 000003
【００７０】
つまり、磁場印加とは、集積領域に向かって磁性粒子が移動するような力が働くような分布を持つ磁場を与えることを意味する。例えば、円形コイルに電流を流し、このコイルから磁場を発生させることで、磁性粒子に磁場を印加することが可能である。この場合、集積領域は、円形コイルと磁性粒子の間に形成し、円形コイルの中心軸近傍に磁性粒子が位置することが好ましい。円形コイルの半径をa、円形コイルの中心点から磁性粒子までの距離をz、コイルに流す電流の大きさをI、コイルの巻き数をNとすると、この円形コイルから発生し、磁性粒子に印加される磁界の大きさは次式で表される。
【００７１】
【数２】
2009128169.tif 000004
【００７２】
ここで、磁性粒子が超常磁性を示す場合、この磁性粒子の磁化Mの大きさは印加する磁界の大きさに依存する。特に印加磁界が大きくない場合には、磁化Mの大きさは、印加磁界Hに対して比例し、M = χHで表される。ここでχは磁化率と呼ばれ、磁性体の材質等によって異なる値を示す。また、この関係式が成り立つ磁界の大きさも、磁性体の材質等によって異なるが、例えば、80[kA/m]以下であることが多い。
【００７３】
上記の様に、磁性粒子の磁化の大きさが印加磁界の大きさに比例している範囲においては、上記円形コイルで磁界を印加すると次式のような磁力FHが磁性粒子に働く。
【００７４】
【数３】
2009128169.tif 000005
【００７５】
ここで、磁性粒子と非磁性物質を有する複合体に、平行平板によって電場が印加され、かつ円形コイルによって磁場が印加され、複合体に働くそれぞれの力は反平行な向きであるとする。このような状態で、磁場による力が働く向きにある集積領域に複合体を集める場合には、FH > FEとすれば良く、逆に、電場による力が働く向きにある集積領域に複合体を集める場合には、FE > FHとなるようにすれば良い。
【００７６】
磁場の印加は、非磁性粒子が十分に集積領域へ集められるまで続けて行われる。したがって、磁場を印加する時間は、磁性粒子に印加される種々の力と溶液の粘性等によって決められる。磁性粒子を短時間の内に集積領域へ集める場合には、大きな磁場を印加することで実現される。
【００７７】
磁場は磁場発生手段により印加される。よって、磁場発生手段は電磁石であることが好ましい。また、集積領域との距離を変化させる機構を設ければ、永久磁石により磁場印加を制御することも可能である。よって、磁場印加、解除を好適に制御できれば、磁場発生手段にはどちらも使用可能である。
【００７８】
＜磁気センサ＞
磁気センサとしては、磁性標識を検出するセンサであれば、如何なるセンサを用いても良い。中でも、検出領域表面に磁性標識が存在する際の磁界効果を利用する方式が好ましく、特に、磁気抵抗効果素子、ホール効果素子、超電導量子干渉計素子が好適に用いることができる。
【００７９】
磁気抵抗効果素子は、異方性磁気抵抗効果素子、巨大磁気抵抗効果素子、スピントンネル磁気抵抗効果素子の何れを用いても構わないが、大きな検出信号が期待できるスピントンネル磁気抵抗効果素子がより好ましい。中でもトンネル膜にMgO薄膜を用いた物が大きな検出信号を得られるのでより好ましい。そのようなスピントンネル磁気抵抗効果素子は特開2006-80116号公報等に記載されている。
【００８０】
磁気抵抗効果素子に用いられる磁性体は、遷移金属元素が主として用いられる。また、耐酸化性を向上させるために、あるいは構造をアモルファスとするために、V、W、Cr、B、Ti等の元素を添加した材料も用いられる。特に、トンネル障壁膜をMgO薄膜とした場合には、MgO薄膜に接する磁性膜はCoFeBであることが好ましい。巨大磁気抵抗効果素子やスピントンネル磁気抵抗効果素子の基本的な膜構成は、磁化フリー層、非磁性層、磁化固定層の３層が挙げられる。非磁性層がCuやCr等の伝導体からなる素子を巨大磁気抵抗効果素子と呼び、非磁性層がAl2O3やMgO等の誘電体膜からなる素子をスピントンネル磁気抵抗効果素子と呼ぶ。これらの磁化固定層は、磁化フリー層を構成する磁性膜の保磁力よりも大きな保磁力を持つ磁性体を用いても良いが、磁化固定層の磁化方向を固定するために磁性膜に反強磁性膜を接して形成し、磁気的に交換結合させたスピンバルブ膜としても良い。反強磁性膜には、例えばMnPt、MnIrなどの導電体やNiO等の絶縁体等が使用可能である。
【００８１】
ホール効果素子には、Si、Bi、GaAsなどの材料が使用可能である。さらにAlGaN/GaNなどのHEMT（高電子移動度トランジスタ：High Electron Mobility Transistor）構造をもつ多層膜を用いても良い。
【００８２】
＜検出カートリッジ＞
本発明による、検出カートリッジは、検体中の標的物質を検出する検出カートリッジであって
標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体が含まれる液体を保持する液体保持領域と、前記複合体を集積する集積領域を少なくとも一つ以上を備え、少なくともひとつの集積領域が、磁気センサ検出素子表面に配置されることを特徴とする。
【００８３】
前述のように、本発明は液相で複合体を形成するため、反応時間を短縮することが可能となる。本発明による検出カートリッジは、この複合体が含まれる液体を保持する液体保持領域を備える。そして、前記複合体を集積する集積領域を少なくとも一つ以上を備えることで、液体保持領域に保持された複合体を直接集積することが可能となる。本発明では、検出素子表面近傍を集積領域とすることで、複合体を集積領域に保持したまま検出工程を行うことが可能である。特に、磁気抵抗効果素子のように、検出素子表面近傍における感度が高い磁気センサ素子を用いる場合に効果が大きい。よって、本発明による、検出カートリッジも少なくともひとつの集積領域が磁気センサ検出素子表面に配置されることが望ましい。尚、集積領域は検出カートリッジに備えられるが、磁気センサ素子は、カートリッジ内に備えられても、外部に配置されてもよく、検出時に少なくともひとつの集積領域が、磁気センサ検出素子表面に配置されればよい。
【００８４】
また、本発明による検出カートリッジは、前記集積領域の近傍に、もしくは接して、電場発生手段、もしくは磁場発生手段が備えられることが好ましい。
【００８５】
＜検出キット＞
本発明による検出キットは、検体中の標的物質を検出する検出キットであって、第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子と、第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子とを備え、ｐＨが略前記磁性粒子の等電点である水溶液中において、前記非磁性粒子が電荷を帯びていることを特徴とする。
【００８６】
非磁性粒子と、磁性粒子の関係が上記関係であれば、ｐＨが略前記磁性粒子の等電点である水溶液中において、非磁性粒子は電荷を帯びる。よって、電場印加により集積領域に集積することが可能となる。一方、磁性粒子の表面電荷は小さく、液中に残存することになる。つまり、非磁性粒子を含むものを電場印加により選択的に集積領域に集積し、複合体を形成していない磁性粒子を除去することが可能となる。
【実施例】
【００８７】
以下、実施例を用いてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有する検出方法、検出カートリッジ、検出キットが得られる範囲で自由に変えることができる。
【００８８】
以下、本発明について実施例を用いて更に詳細に本発明を説明する。
【００８９】
（実施例１）
本実施例では、第一の標的物質捕捉体を備えた非磁性粒子として、PSA (Prostate specific antigen：前立腺特異抗原)を捕捉する一次抗体を備えたシリカ粒子を用い、さらに第二の標的物質捕捉体を備えた磁性粒子として、PSAを捕捉する二次抗体を備えたマグネタイト粒子を組み合わせて、PSAを検出する。
（１）非磁性粒子の作製
まず、第一の標的物質捕捉体として、PSAを捕捉する一次抗体を有する非磁性粒子を作製する。
【００９０】
シリカ粒子を乾燥N2雰囲気下、加熱処理した後、無水トルエンに分散させる。このシリカ粒子/トルエン分散液に、シランカップリング剤であるアミノプロピルトリメトキシメトキシシランを添加し、シリカ粒子表面にアミノ基を導入する。但し、シリカ粒子に対してアミノ基の導入量が多すぎるとシリカとしての等電点が大きく変化してしまうので、アミノ基の導入量はシリカ粒子の前処理（乾燥条件等）や、シランカップリング処理における条件（濃度、混合比等）を適宜制御する。さらにグルタルアルデヒド等の架橋剤を用いて、前記アミノ基とペプチド鎖間を化学結合させ、一次抗体を固定化する。
【００９１】
この結果、第一の標的物質捕捉体として、PSAを捕捉する一次抗体が備えられたシリカ粒子を得ることができる。このシリカ粒子をｐＨ6.5のリン酸緩衝液に分散させて、非磁性粒子分散液を作製する。尚、シリカの等電点は、2.0付近であるため、ｐＨが中性付近の水溶液中では、本実施例による非磁性粒子は、負に帯電する。
（２）磁性粒子の作製
次に、第二の標的物質捕捉体としてPSAを捕捉する二次抗体を有する磁性粒子を作製する。
【００９２】
マグネタイト粒子を乾燥N2雰囲気下、加熱処理した後、無水トルエンに分散させる。このマグネタイト粒子/トルエン分散液に、シランカップリング剤であるアミノプロピルトリメトキシメトキシシランを添加し、マグネタイト粒子表面にアミノ基を導入する。但し、マグネタイト粒子に対してアミノ基の導入量が多すぎるとマグネタイトとしての等電点が大きく変化してしまうので、アミノ基の導入量はマグネタイト粒子の前処理（乾燥条件等）や、シランカップリング処理における条件（濃度、混合比等）を適宜制御する。さらにグルタルアルデヒド等の架橋剤を用いて、前記アミノ基とペプチド鎖間を化学結合させ、二次抗体を固定化する。
【００９３】
この結果、第二の標的物質捕捉体として、PSAを捕捉する二次抗体が備えられたマグネタイト粒子を得ることができる。このマグネタイト粒子をｐＨ6.5のリン酸緩衝液に分散させて、磁性粒子分散液を作製する。尚、マグネタイトの等電点は、6.5付近であるため、ｐＨが中性付近の水溶液中では、本実施例による磁性粒子の帯電量は小さい。
（３）検出カートリッジの作製
次に、液体保持領域、集積領域を有する検出用カートリッジを作製する。尚、本実施例では、集積領域は磁気センサ検出素子表面に備えられ、さらに電場印加により、集積領域に非磁性粒子を集積することが可能な検出カートリッジを作製する。
【００９４】
図７はスピントンネル磁気抵抗効果素子を模式的に示した図である。本実施例では、このスピントンネル磁気抵抗効果素子を検出素子として用いる。そして、その素子表面に絶縁層と電極１を設け、その表面を集積領域として用いる（図８）。図９は本実施例による検出カートリッジの断面を模式的に示した図である。電極１、電極２が液体保持領域に接して配置され、さらに電源供給部と接続される。電極１と電極２は混合液に接する。ただし、図示しないが、電極表面には絶縁層が形成されていることが好ましく、この絶縁層を介して電極は混合液に接する。この電極１が電場発生手段に相当する。図示しないが、検出素子に、測定部が接続されていてもよい。また、混合液に対する撹拌機構が備えられていることが望ましい。
（４）PSAの検出
前記（１）、（２）、（３）において作製される非磁性粒子、磁性粒子、検出カートリッジを用い、以下の操作を行うことで、前立腺癌のマーカーとして知られているＰＳＡの検出することが可能となる。
（ａ）抗原（標的物質）であるPSAを含むｐＨ6.5のリン酸緩衝液に前記非磁性粒子分散液、磁性粒子分散液を混合、反応させて混合液を調整する。前記混合液を検出カートリッジの液体保持領域に導入する。その結果、液体保持領域内に標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体が保持される。
（ｂ）電極１の表面電位が正電位になるように、電源供給部より、電流、もしくは電圧を印加し、集積領域に複合体を引き寄せる。
（ｃ）未反応のＰＳＡ、磁性粒子をリン酸緩衝液で洗浄する。
（ｄ）集積領域に引き寄せられた複合体の磁性粒子の量を磁気センサにより検出する。
（ｅ）前記磁性粒子の量により、標的物質の量を算出する。
【００９５】
本実施例は、操作（ａ）において、液相反応で複合体形成を行うため、センサ素子表面において固相反応を行う従来の方法と比較して、反応時間の短縮化が可能となる。特に、標的物質濃度が低い場合は、その効果は大きい。本方法を用いれば、標的物質が低濃度である場合でも、十分な複合体形成を行うまでの反応時間を１/１０以下にすることが可能である。
【００９６】
（実施例２）
本実施例では、実施例１と同様な非磁性粒子、磁性粒子を組み合わせて、PSAを検出する。また、本実施例は、検出カートリッジが流路形状であり、ふたつの集積領域である第一の集積領域と第二の集積領域が、異なる領域に形成される例である。第一の集積領域には電場印加により複合体を集積し、第二の集積領域には磁場印加により複合体を集積する。
（１）非磁性粒子の作製
まず、実施例１と同様な方法で、第一の標的物質捕捉体として、PSAを捕捉する一次抗体を備えるシリカ粒子を作製し、さらにシリカ粒子分散液を作製する。
（２）磁性粒子の作製
次に、実施例１と同様な方法で、第二の標的物質捕捉体としてPSAを捕捉する二次抗体を備えるマグネタイト粒子を作製し、さらにマグネタイト粒子分散液を作製する。
（３）検出用カートリッジの作製
次に、液体保持領域、第一の集積領域、第二の集積領域を有する検出カートリッジを作製する。尚、本実施例では、第二の集積領域が磁気センサ検出素子により検出可能な空間に設けられる検出カートリッジを作製する。
【００９７】
図１０は本実施例による検出カートリッジの断面を模式的に示した図である。電極１、電極２が液体保持領域に接して配置され、さらに電源供給部と接続される。電極１と電極２は混合液に接する。ただし、図示しないが、電極表面には絶縁層が形成されていることが好ましく、この絶縁層を介して電極は混合液に接する。この電極１が電場発生手段に相当する。この電極１表面に第一の集積領域が形成される。
【００９８】
尚、充分な量の複合体を効率よく集積するために、電極１の面積は大きい方がよい。さらには、非磁性粒子が充分集積される面積であることが望ましい。例えば、直径100nmの非磁性粒子を1×1010粒子/mlの濃度で、200μｌ導入し、集積領域に集積する場合、その占有面積は20mm2と予想される。よって、電極１の面積は20mm2以上とすることが望ましい。また、集積効率を上げるために、電極１を多孔質形状にしても構わない。
【００９９】
さらに、検出素子近傍に、磁石が配置される。この磁石が磁場発生手段に相当する。この磁場発生手段の付近に第二の集積領域が形成される。また、図示しないが、検出素子に、測定部が接続されていてもよい。また、混合液に対する撹拌機構が備えられていることが望ましい。
（４）PSAの検出
前記（１）、（２）、（３）において作製される非磁性粒子、磁性粒子、検出カートリッジを用い、以下の操作を行うことで、前立腺癌のマーカーとして知られているＰＳＡを検出することが可能となる。
（ａ）抗原（標的物質）であるPSAを含むｐＨ6.5のリン酸緩衝液に、前記非磁性粒子分散液、磁性粒子分散液を混合、反応させて混合液を調整する。前記混合液を検出カートリッジの液体保持領域に導入する。その結果、液体保持領域内に標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体が保持される。
（ｂ）電極１の表面電位が正電位になるように、電源供給部より、電流、もしくは電圧を印加し、複合体を第一の集積領域に引き寄せる。
（ｃ）複合体を形成していないＰＳＡ、磁性粒子をリン酸緩衝液で洗浄する。
（ｄ）電極１の電流、もしくは電圧印加を停止する。すると、第一の集積領域に集積されていた複合体の再分散が始まる。尚、再分散しにくい場合は、ここで再び分散液として、リン酸緩衝液を流し、再分散を促進させる。
（ｅ）磁石により磁場を印加し、複合体を検出素子表面（第二の集積領域）に引き寄せる。尚、前記操作（ｄ）と本操作（ｅ）を同時に行うとよい。また、分散液を流しながら、両操作を行ってもよい。本実施例では、液体導入口側に第一の集積領域、液体排出口側に第二の集積領域を配置している。よって、液体導入口から導入された分散液により、第一の集積領域から再分散した複合体を、効率よく第二の集積領域に再集積することが可能である。
（ｆ）複合体を形成していない非磁性粒子をリン酸緩衝液で洗浄する。
（ｇ）第二の集積領域に引き寄せられた複合体の磁性粒子の量を磁気センサにより検出する。
（ｈ）前記磁性粒子の量により、標的物質の量を算出する。
【０１００】
本実施例は、実施例１と同様に、操作（ａ）において、液相反応で複合体形成を行うため、検出素子表面において固相反応を行う従来の方法と比較して、反応時間の短縮化が可能となる。さらに、操作（ｂ）（ｃ）において、第一の集積領域に複合体をいったん集積し、操作（ｄ）（ｅ）（ｆ）において、第二の集積領域、すなわち、検出素子表面に複合体をさらに選択的に集積する。よって、同じ検出素子面積の従来の検出素子を用いたセンサと比較して、感度を向上させることが可能となる。特に、標的物質濃度が低い場合は、その効果は大きい。本方法を用いれば、標的物質が低濃度である場合でも、検出感度を１０倍以上にすることが可能である。
【０１０１】
（実施例３）
本実施例では、実施例一と同様な非磁性粒子、磁性粒子を組み合わせて、PSAを検出する。また、本実施例は、検出カートリッジが流路形状であり、ふたつの集積領域である第一の集積領域と第二の集積領域が、異なる領域に形成される例である。第一の集積領域には磁場印加により複合体を集積し、第二の集積領域には電場印加により複合体を集積する。
（１）非磁性粒子の作製
まず、実施例１と同様な方法で、第一の標的物質捕捉体として、PSAを捕捉する一次抗体を備えるシリカ粒子を作製し、さらにシリカ粒子分散液を作製する。
（２）磁性粒子の作製
次に、実施例１と同様な方法で、第二の標的物質捕捉体としてPSAを捕捉する二次抗体を備えるマグネタイト粒子を作製し、さらにマグネタイト粒子分散液を作製する。
（３）検出用カートリッジの作製
次に、液体保持領域、第一の集積領域、第二の集積領域を有する検出カートリッジを作製する。尚、本実施例では、第二の集積領域が磁気センサ検出素子表面に備えられる検出カートリッジを作製する。
【０１０２】
図１１は本実施例による検出カートリッジの断面を模式的に示した図である。第一の集積領域近傍に磁石が配置され。この磁石が磁場発生手段に相当する。尚、実施例２と同様に、充分な量の複合体を効率よく集積するために、磁石の面積は大きい方がよい。また、集積効率を上げるために、磁石を多孔質形状にしても構わない。電極１、電極２は液体保持領域に接して配置され、さらに電源供給部と接続される。電極１と電極２は混合液に接する。ただし、図示しないが、電極表面には絶縁層が形成されていることが好ましく、この絶縁層を介して電極は混合液に接する。さらに、電極１は検出素子表面に配置される。この電極１が電場発生手段に相当する。この電極１表面に第二の集積領域が形成される。また、図示しないが、検出素子に、測定部が接続されていてもよい。また、混合液に対する撹拌機構が備えられていることが望ましい。
（４）PSAの検出
前記（１）、（２）、（３）において作製される非磁性粒子、磁性粒子、検出カートリッジを用い、以下の操作を行うことで、前立腺癌のマーカーとして知られているＰＳＡを検出することが可能となる。
（ａ）抗原（標的物質）であるPSAを含むリン酸緩衝液に、前記非磁性粒子分散液、磁性粒子分散液を混合、反応させて混合液を調整する。前記混合液を検出カートリッジの液体保持領域に導入する。その結果、液体保持領域内に標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体が保持される。
（ｂ）磁石により磁場を印加し、複合体を第一の集積領域に引き寄せる。
（ｃ）複合体を形成していないＰＳＡ、非磁性粒子をリン酸緩衝液で洗浄する。
（ｄ）磁石からの磁場印加を停止する。すると、第一の集積領域に集積されていた複合体の再分散が始まる。尚、再分散しにくい場合は、ここで再び分散液として、ｐＨ6.5のリン酸緩衝液を流し、再分散を促進させる。
（ｅ）電極１の表面電位が正電位になるように、電源供給部より、電流、もしくは電圧を印加し複合体を検出素子表面（第二の集積領域）に引き寄せる。尚、前記操作（ｄ）と本操作（ｅ）を同時に行うとよい。また、分散液を流しながら、両操作を行ってもよい。本実施例では、液体導入口側に第一の集積領域、液体排出口側に第二の集積領域を配置している。よって、液体導入口から導入された分散液により、第一の集積領域から再分散した複合体を、効率よく第二の集積領域に再集積することが可能である。
（ｆ）複合体を形成していない磁性粒子をリン酸緩衝液で洗浄する。
（ｇ）第二の集積領域に引き寄せられた複合体の磁性粒子の量を磁気センサにより検出する。
（ｈ）前記磁性粒子の量により、標的物質の量を算出する。
【０１０３】
本実施例は、実施例１と同様に、操作（ａ）において、液相反応で複合体形成を行うため、検出素子表面において固相反応を行う従来の方法と比較して、反応時間の短縮化が可能となる。さらに、操作（ｂ）（ｃ）において、第一の集積領域に複合体をいったん集積し、操作（ｄ）（ｅ）（ｆ）において、第二の集積領域、すなわち、検出素子表面に複合体をさらに選択的に集積する。
よって、同じ検出素子面積の従来の検出素子を用いたセンサと比較して、感度を向上させることが可能となる。特に、標的物質濃度が低い場合は、その効果は大きい。本方法を用いれば、標的物質が低濃度である場合でも、検出感度を１０倍以上にすることが可能である。
【０１０４】
（実施例４）
本実施例では、非磁性粒子、磁性粒子表面に被覆層を形成することにより、粒子表面の帯電性を制御し、PSAを検出する。
【０１０５】
（１）非磁性粒子の作製
まず、第一の標的物質捕捉体として、PSAを捕捉する一次抗体を有し、かつ、表面に被覆層を有する非磁性粒子を作製する。
【０１０６】
シリカ粒子を乾燥N2雰囲気下、加熱処理した後、無水トルエンに分散させる。このシリカ粒子/トルエン分散液に、シランカップリング剤である2-(4-クロロメチルフェニル)エチルトリメトキシシランを添加し、シリカ粒子にクロロメチル基を導入する。この反応はXPSによりCl原子を検出して確認することができる。クロロメチル基を導入したシリカ粒子を水で分散し、ジチオカルバミン酸ナトリウムを添加してクロロメチル基と反応させることで、シリカ粒子表面にUVグラフト重合の開始点を導入する。この反応はXPSによりN原子、S原子を検出して確認することができる。次に、シリカ粒子とアセトンを反応容器にはかりとり、超音波処理によりシリカ粒子をアセトン中に分散させる。次に、反応容器にグリシジルメタクリレートを計り取り、反応容器内を窒素置換する。次いで室温にて波長312nm〜577nmのUVランプを２時間照射することによりUVグラフト重合を進行させ、シリカ粒子表面にポリグリシジルメタクリレートをグラフト化する。この反応は動的光散乱法に基づく粒子径増大で確認することができる。
【０１０７】
以上の操作により、被覆層を形成することができる。この被覆層はポリグリシジルメタクリレートのグラフト層からなる親水層であり、多くのタンパク質に対する非特異吸着防止能に優れ、且つアミノ基を有するために水溶液中で正に帯電する。
【０１０８】
次に、上述の被覆層を備えた非磁性粒子表面にPSAを捕捉する一次抗体を導入する。まず、非磁性粒子を水に分散させ、アミノエタンチオールとジチオトレイトールを加えて、塩酸水溶液あるいは水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ5に調製し、反応させることによって、非磁性粒子表面（被覆層表面）にアミノ基とチオール基を導入する。次に、N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionateを加え、室温にて５時間反応させることにより非磁性粒子表面に活性エステル基を導入する。前記活性エステル基と抗体のアミノ基を反応させ、第一の標的物質捕捉体として、PSAを捕捉する一次抗体を固定化することができる。尚、未反応の活性エステル基はエタノールアミンの添加により、キャッピング処理を行うとよい。このシリカ粒子をｐＨ6.5のリン酸緩衝液に分散させて、非磁性粒子分散液を作製する。
【０１０９】
（２）磁性粒子の作製
次に、第二の標的物質捕捉体として、PSAを捕捉する二次抗体を有し、かつ、表面に被覆層を有する磁性粒子を作製する。
【０１１０】
まず、無水トルエンにマグネタイト粒子を十分に分散させる。その後、窒素雰囲気下で下記の原子移動ラジカル重合開始基の前駆体（ｎ＝６）を加え、マグネタイト粒子の水酸基と前駆体のトリクロロシリル基とを反応させて、マグネタイト粒子の表面に原子移動ラジカル重合開始基を導入する。
【０１１１】
【化１】
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【０１１２】
次に、原子移動ラジカル重合開始基を導入したマグネタイト粒子をメタノールに分散させる。その後、フリーな重合開始剤として２−ブロモイソ酪酸エチルを加え、ＣｕＢｒ、２，２’−ビピリジルを加える。凍結真空脱気により反応系内の酸素を除去した後、窒素で置換し、ＨＥＭＡ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）モノマーを原子移動ラジカル重合により所定時間反応させる。反応系内にメルカプト酢酸：メルカプトエタノール＝１：１００（モル比）の割合で大量に加えることにより、マグネタイト粒子上にグラフト化された高分子鎖（ＰＨＥＭＡ）末端にカルボキシル基とヒドロキシル基が混在した状態とする。
【０１１３】
Ｘ線光電子分光法を用いてＳ原子を検出することで連鎖移動剤が導入されていることを確認できる。飛行時間型二次イオン質量分析計を用いて、ポリマー末端に結合したメルカプト酢酸とメルカプトエタノールに由来するイオンを検出することで２種類のポリマー末端が形成されていることが確認できる。また、フリーな重合開始種として加えておいた２−ブロモイソ酪酸エチルから生成したＰＨＥＭＡの分子量と分子量分布を測定すると、数平均分子量が５０００で、分子量分布が１．０５である。マグネタイト粒子の表面にグラフト化された高分子鎖の膜厚と重量を測定すると、高分子鎖のグラフト密度は、０．４分子／ｎｍ2であることがわかる。
【０１１４】
以上の操作により、被覆層を形成することができる。この被覆層はＰＨＥＭＡ層からなる親水層であり、多くのタンパク質に対する非特異吸着防止能に優れ、且つヒドロキシル基を有するため、中性付近の水溶液中で帯電量は小さい。
【０１１５】
前記マグネタイト粒子の表面に水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）を反応させ、ＰＨＥＭＡ層の末端のカルボキシル基を活性エステル基に変換する。二次抗体を溶解したリン酸緩衝溶液中に前記マグネタイト粒子を加え、抗体のアミノ基と前記マグネタイト粒子の活性エステル基とを反応させて、PSAを捕捉する二次抗体を固定化する。尚、未反応の活性エステル基はエタノールアミンの添加により、キャッピング処理を行うとよい。
このマグネタイト粒子をｐＨ６．５のリン酸緩衝液に分散させて、磁性粒子分散液を作製する。
【０１１６】
（３）検出用カートリッジの作製
次に、液体保持領域、第一の集積領域および第二の集積領域を有する検出カートリッジを作製する。尚、本実施例では、第二の集積領域が磁気センサ検出素子表面に備えられる検出カートリッジを作製する。
【０１１７】
図１２は本実施例による検出カートリッジの断面を模式的に示した図である。電極１、電極２が液体保持領域に接して配置され、さらに電源供給部と接続される。電極１と電極２は混合液に接する。ただし、図示しないが、電極表面には絶縁層が形成されていることが好ましく、この絶縁層を介して電極は混合液に接する。この電極１が電場発生手段に相当する。
【０１１８】
尚、実施例２と同様に、充分な量の複合体を効率よく集積するために、電極１の面積は大きい方がよい。また、集積効率を上げるために、電極１を多孔質形状にしても構わない。
【０１１９】
さらに、検出素子近傍に、コイルが配置される。このコイルに電流を流すことで、磁場を印加することが可能となる。つまり、このコイルが電場発生手段に相当する。
また、図示しないが、検出素子に、測定部が接続されていてもよい。また、混合液に対する撹拌機構が備えられていることが望ましい。
【０１２０】
（４）PSAの検出
前記（１）、（２）、（３）において作製される非磁性粒子、磁性粒子、検出カートリッジを用い、以下の操作を行うことで、前立腺癌のマーカーとして知られているＰＳＡの検出することが可能となる。
（ａ）抗原（標的物質）であるPSAを含むｐＨ６．５のリン酸緩衝液に前記非磁性粒子分散液、磁性粒子分散液を混合、反応させて混合液を調整する。前記混合液を検出カートリッジの液体保持領域に導入する。その結果、液体保持領域内に標的物質を介して磁性粒子に非磁性粒子が保持された複合体が保持される。
（ｂ）電極１の表面電位が負電位になるように、電源供給部より、電流、もしくは電圧を印加し、第一の集積領域に複合体を引き寄せる。
（ｃ）複合体を形成していないＰＳＡ、磁性粒子をリン酸緩衝液で洗浄する。
（ｄ）電極１の電流、もしくは電圧印加を停止する。すると、第一の集積領域に集積されていた複合体の再分散が始まる。尚、再分散しにくい場合は、ここで再び分散液として、リン酸緩衝液を流し、再分散を促進させる。
（ｅ）コイルに電流を流すことにより磁場を印加し、複合体を検出素子表面（第二の集積領域）に引き寄せる。尚、前記操作（ｄ）と本操作（ｅ）を同時に行うとよい。また、分散液を流しながら、両操作を行ってもよい。
（ｆ）複合体を形成していない非磁性粒子をリン酸緩衝液で洗浄する。
（ｇ）第二の集積領域に引き寄せられた複合体の磁性粒子の量を磁気センサにより検出する。
（ｈ）前記磁性粒子の量により、標的物質の量を算出する。
【０１２１】
本実施例は、実施例１と同様に、操作（ａ）において、液相反応で複合体形成を行うため、検出素子表面において固相反応を行う従来の方法と比較して、反応時間の短縮化が可能となる。さらに、操作（ｂ）（ｃ）において、第一の集積領域に複合体をいったん集積し、操作（ｄ）（ｅ）（ｆ）において、第二の集積領域、すなわち、検出素子表面に複合体をさらに選択的に集積する。よって、同じ検出素子面積の従来の検出素子を用いたセンサと比較して、感度を向上させることが可能となる。特に、標的物質濃度が低い場合は、その効果は大きい。本方法を用いれば、標的物質が低濃度である場合でも、検出感度を１０倍以上にすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】従来の磁性標識を用いた固相分析法の一例を示した図である。
【図２】本発明による検出方法の第一の実施形態を模式的に示した図である。
【図３】本発明による検出方法の第二の実施形態を模式的に示した図である。
【図４】本発明による検出方法の第三の実施形態を模式的に示した図である。
【図５】従来の固相反応における結合率を模式的に示した図である。
【図６】標的物質捕捉体が標的物質を捕捉する状態を模式的に示した図である。
【図７】磁気抵抗効果素子の断面を模式的に示した図である。
【図８】電極を表面に備えた磁気抵抗効果素子の断面を模式的に示した図である。
【図９】実施例１における検出カートリッジの断面を模式的に示した図である。
【図１０】実施例２における検出カートリッジの断面を模式的に示した図である。
【図１１】実施例３における検出カートリッジの断面を模式的に示した図である。
【図１２】実施例４における検出カートリッジの断面を模式的に示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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