(57)【要約】【課題】各種試料に含まれる核酸増幅反応を阻害する物質を除去するために、試料中の微生物、特に抗酸菌の効果的な分離回収方法を提供すること。【解決手段】抗酸菌表面に結合するレクチンと、試料中の抗酸菌とを接触させ、抗酸菌とレクチンとの複合体を形成する工程、前記の複合体を担体と結合させて抗酸菌を試料から分離回収する工程、からなる抗酸菌の分離回収方法により前記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の抗酸菌を分離回収する方法であって、抗酸菌表面に結合するマンノース結合型レクチン及び該レクチンを結合する担体を同時又は順次に前記試料と接触させ、前記抗酸菌と前記レクチン及び前記担体からなる複合体を分離することにより前記抗酸菌を回収することを特徴とする、抗酸菌の分離回収方法。
【請求項２】
前記抗酸菌の分離回収方法が、（１）抗酸菌が含まれる試料にマンノース結合型レクチンを添加しインキュベートする工程、（２）該マンノース結合型レクチンを結合する磁性体を含む担体を添加しインキュベートする工程、（３）磁石により、前記抗酸菌と前記マンノース結合型レクチン及び前記磁性体を含む担体からなる複合体を分離して前記抗酸菌を回収する工程、からなることを特徴とする、請求項１に記載の抗酸菌の分離回収方法。
【請求項３】
分離した前記抗酸菌と前記マンノース結合型レクチン及び前記担体からなる複合体が、直接核酸抽出操作に使用でき、かつ、前記複合体中には試料由来の核酸増幅反応阻害物質が除去されていることを特徴とする、請求項１及び２に記載の抗酸菌の分離回収方法。
【請求項４】
前記試料由来の核酸増幅反応阻害物質が喀痰由来の阻害物質であることを特徴とする、請求項３に記載の抗酸菌の分離回収方法。
【請求項５】
試料から抗酸菌を分離回収するための試薬であって、少なくとも、（１）マンノース結合型レクチン、（２）該レクチンを結合する磁性体を含む担体、から構成されることを特徴とする、抗酸菌の分離回収試薬。
【請求項６】
前記マンノース結合型レクチンが、コンカナバリンＡであることを特徴とする、請求項１から５に記載の抗酸菌の分離回収方法及び分離回収試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中から微生物、特に抗酸菌（マイコバクテリウム属）を効率良く分離・回収する方法に関するものであり、感染症検査などの医療分野、分子生物学などの研究分野、食品安全管理などの産業分野に適用可能である。
【背景技術】
【０００２】
細菌やウイルスによる感染が疑われる病気に対しては、その病気の原因となっている細菌やウイルスを検出し同定することが、確定診断さらには治療方針決定のために必要である。従来の細菌検査では、試料中の検査対象である病原菌の濃縮処理や精製処理を行なわず検査に供しており、試料を希釈し寒天培地に塗布して培養後、出現したコロニーを計数する培養検査が標準的な方法であった。
【０００３】
結核菌検査を例にとると、現在、塗抹法と分離培養法が標準法として用いられている。塗抹法は結果が迅速に得られるものの、患者からの排菌量が少ないときは陰性となることが多く、検出感度に問題がある。一方、分離培養法の場合は高感度な検出が可能であるが、結核菌の増殖速度が遅いため、分離培養法で結果が得られるまでには、数日から数週間を要し、感染拡大対策等の緊急対応には不適であった。これらの問題を解決する手段として、迅速かつ高感度に結果が得られる遺伝子検査が導入され始めている。
【０００４】
遺伝子検査で用いられる試料としては、血液、尿、喀痰、膿、血液培養液、スワブ、コロニー等があげられる。これらの試料中に含まれる微生物から抽出した核酸に対し、直接測定を行なう場合もあるが、近年の微生物検査では、微量核酸の定性、定量を可能ならしめるため、種々の増幅反応を用いて試料から抽出した核酸を増幅した後、測定を行なうことが一般化してきている。このような核酸増幅反応には、例えば、ＤＮＡを増幅するＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法やＲＮＡを増幅するＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特許文献１及び２参照）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（特許文献３、非特許文献１参照）、及びＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特許文献４参照）などが挙げられる。前記核酸増幅反応によって、極微量の標的核酸を高感度に検出することが可能となったが、一方で試料由来の、ＤＮＡポリメレース等の酵素活性を阻害する物質等の核酸増幅反応阻害物質の存在が周知となっている。現在、種々の核酸抽出法が汎用されているが、これらの核酸抽出操作によっても前記反応阻害物質は完全に除去できない場合が多く、核酸増幅法による高感度検出の障壁となっている。特に喀痰試料は気道粘液や各種核酸、細胞などの生体成分に由来する核酸増幅反応を阻害する物質が存在する可能性が高いことが指摘されており、それらが核酸抽出物に残存すると核酸増幅反応が阻害され、結果的に正確な検査が行なえなくなってしまうことが懸念される。前記反応阻害物質の影響を除くためには、核酸抽出操作に先立って、試料から目的の微生物を高収率かつ簡便に分離・回収する方法が必要となる。
【０００５】
【特許文献１】特許第２６５０１５９号
【特許文献２】特許第３１５２９２７号
【特許文献３】特開２０００−１４４００号
【特許文献４】特許第３２４１７１７号
【特許文献５】特表２００１−５１５７８８号
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００３）  ３１４  ：７７−８６
【非特許文献２】Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５）  ６４  ：２９−６３
【非特許文献３】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｅ３−Ｅ４（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）
【非特許文献４】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ７．２３−７．２５（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の課題としては、微生物、特に抗酸菌の遺伝子検査における上記の問題点を解決するため、試料から微生物を効率良く分離回収することにより、核酸増幅反応の阻害物を除去する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、試料中の抗酸菌を効率良く分離回収する方法を見出した。
【０００８】
請求項１に記載の発明は試料中の抗酸菌を分離回収する方法であって、抗酸菌表面に結合するマンノース結合型レクチン及び該レクチンを結合する担体を同時又は順次に前記試料と接触させ、前記抗酸菌と前記レクチン及び前記担体からなる複合体を分離することにより前記抗酸菌を回収することを特徴とする。
【０００９】
請求項２に記載の発明は請求項１に係り、前記抗酸菌の分離回収方法が、（１）抗酸菌が含まれる試料にマンノース結合型レクチンを添加しインキュベートする工程、（２）該マンノース結合型レクチンを結合する磁性体を含む担体を添加しインキュベートする工程、（３）磁石により、前記抗酸菌と前記マンノース結合レクチン及び前記磁性体を含む担体からなる複合体を分離して前記抗酸菌を回収する工程、からなることを特徴とする。
【００１０】
請求項３に記載の発明は請求項１及び２に係り、分離した前記抗酸菌と前記マンノース結合型レクチン及び前記担体からなる複合体が、直接核酸抽出操作に使用でき、かつ、前記複合体中には試料由来の核酸増幅反応阻害物質が除去されていることを特徴とする。
【００１１】
請求項４に記載の発明は請求項３に係り、前記試料由来の核酸増幅反応阻害物質が喀痰由来の阻害物質であることを特徴とする。
【００１２】
請求項５に記載の発明は試料から抗酸菌を分離回収するための試薬であって、少なくとも、（１）マンノース結合型レクチン、（２）該レクチンを結合する磁性体を含む担体、から構成されることを特徴とする。
【００１３】
請求項６に記載の発明は請求項１から５に係り、前記マンノース結合型レクチンが、コンカナバリンＡであることを特徴とする。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明の抗酸菌とは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）及び  マイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、または、マイコバクテリウム・カンサシー（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）などが含まれるマイコバクテリウム属細菌のことを示す。
【００１６】
本発明の目的は、抗酸菌の属するグラム陽性菌の細胞壁構成成分であるペプチドグリカンをレクチンによって捕捉することであり、標的とする抗酸菌の細胞表面に存在する糖鎖、またはそれに類似する化合物を認識するレクチンを使用する。標的とする抗酸菌に対応するレクチンの選定については、本発明の目的を達成するものであれば特に限定されないが、抗酸菌を対象とした場合、マンノース結合型レクチンを使用することが好ましい。このことは、抗酸菌類に特徴的なリポ多糖である、リポアラビノマンナン（非特許文献２）が前記レクチンに認識されることに由来すると推定される。リポアラビノマンナンはマンノース残基に富むリポ多糖であり、マンノース残基を認識するマンノース結合レクチンがこのリポ多糖を認識し結合することが考えられる。なお、レクチンと糖鎖との結合は公知の事実であり、レクチンを固定化したアフィニティー担体等による標的物質の精製法についての適用例はあるが（特許文献５）、マンノース結合型レクチンを固定化した担体等による抗酸菌の精製法についての適用例はなく、特に喀痰や糞便といった核酸増幅反応阻害物質が多く含まれる試料から核酸抽出に供するに適した簡便かつ高収率な抗酸菌の分離回収方法は本発明の方法によって初めて想起、達成されたものである。
【００１７】
本発明における試料には、喀痰、胃液、尿、気管支洗浄液、膿、肺胞洗浄液、腹水、胸水、心嚢水、糞便、組織、血液、血清、コロニー、スワブ若しくは他の体液等の生体試料の試料懸濁液、食物試料のホモジェナイズ等の試料懸濁液があげられるが、本発明の分離回収方法は、特に喀痰や糞便といった核酸増幅反応阻害物質が多く含まれる試料に対して適用したときにより好ましい結果が得られる。なお、試料が喀痰の場合は、ＮＡＬＣ処理やスプタザイム（極東製薬工業製）のようなセミアルカリプロテアーゼ処理により、試料の粘性を落す前処理を行なうとさらに好ましい結果が得られる。また、本発明の分離回収方法は環境分析等における環境水や排水、土壌の懸濁液等に対しても適用可能である。
【００１８】
本発明におけるレクチンは、マンノース結合型レクチンであることが好ましいと前述したが、マンノース結合型レクチンの中でも、コンカナバリンＡ（ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ（ＣｏｎＡ））がさらに好ましい。
【００１９】
本発明における、レクチンと担体との結合手段は特に限定されず、レクチンと担体が直接結合しても良く、レクチンまたは担体のどちらか一方、または両方に相互に結合させるための結合手段を標識させることで達成しても良い。ただし、本発明の抗酸菌の分離回収方法における各工程によって解離しないものであることが必要であり、このことを満たすならば、化学的な共有結合による結合でも、疎水性相互作用やアフィニティによる物理的吸着によるものでもよい。
【００２０】
前記結合手段の例としては、ビオチン、デキストラン等の多糖、アビジン、抗体、レクチン等の蛋白質、ポリリジン等のポリペプチド、金属等が挙げられ、これらの群から選ばれた物質でレクチンを標識し、該標識物質に特異的に結合する物質を担体表面に保持させることで達成可能である。レクチンと標識物質の結合方法には、レクチンのアミノ基を介した方法、チオール基を介した方法、カルボキシル基を介した方法等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。例えば、標識物質のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシミドで活性エステル体としレクチンのアミノ基とアミド結合を形成させて結合させる。また、レクチンと標識物質は直接結合されていても良いが、リンカーを介して結合していることが好ましい。担体と標識物質との結合方法もレクチン同様、特に限定されるものではなく、担体の種類に応じて適宜選択すれば良い。
【００２１】
本発明においてレクチンは、試料に接触させる際にあらかじめ担体と結合させておくことも可能であるが、レクチンと試料を先に接触し、レクチンと試料中の抗酸菌との複合体を形成させた後、担体を添加し、前記複合体を担体に結合させることが好ましい。これによって、抗酸菌とレクチンが結合する工程ではレクチンが担体に結合していないため、レクチンの自由度が高く、抗酸菌の分離・回収効率が向上する。
【００２２】
担体の使用量は、抗酸菌検査における検出下限界よりも多くの抗酸菌を結合できる量であれば良いが、過剰に添加したレクチンが全て結合可能な量を用いることが好ましい。
本発明における担体は、通常アフィニティークロマトグラフィーを作製するために用いられるゲル担体や蛋白質結合能を有する担体であればよく、例えばＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（東ソー製）やセファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）及びポリスチレンビーズがあげられるが、磁石により簡便に回収可能な磁性ビーズが好ましい。
【００２３】
本発明で使用する担体の形状は限定されるものではなく、粒子状、多孔質フィルター状、ファイバー状、シート状であってもよい。担体が球状粒子である場合、粒子径は均一でなくてもよい。直径は実用上問題なければ小さい方が好ましいが、粒子径が小さい場合は試料と分離する場合に分離方法によっては分離が困難になる場合や時間がかかり過ぎるという問題点が生じる。担体が磁性ビーズ等の、磁性体あるいは磁性体を含む担体である場合は、磁力により分離ができるので粒子径は小さくても良い。また、粒子径が大きすぎる場合は単位体積あたりの担体表面積が小さくなり、抗酸菌を結合する能力が低下する。そのため、磁性ビーズや比重の大きなビーズやあるいは低速遠心分離で沈殿可能なビーズの様に、試料との分離が容易に行なうことのできるビーズであれば、担体の粒子径は小さい方が好ましい。
【００２４】
担体と試料中の抗酸菌と結合したレクチンとの接触は、バッチ法あるいはカラム法のどちらでもよいが、試料中に不溶性の懸濁物が存在する場合はバッチ法が好ましい。接触させる時間はレクチンと抗酸菌の反応が完了する時間であれば制限はないが、臨床検査、診断時の操作性を考慮すると短時間であるほうが好ましい。
【００２５】
抗酸菌が結合した担体の洗浄は、通常使用される緩衝液で行なえばよく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等があげられる。そのｐＨは５から９付近であればよく、好ましくは６から８である。
【００２６】
試料中の抗酸菌を結合した担体の、試料または洗浄液からの分離方法は、バッチ法の場合は自然沈降、遠心分離、磁気分離等によって行なえばよい。カラム法の場合は試料をカラムに通過させ、必要であれば洗浄液をカラムに通過させた後、カラムから担体を回収してもよいし、溶出液により抗酸菌をカラムから溶出させてもよい。この場合に使用される溶出液には、過剰の標識物質によりレクチンと担体の結合を解離させる物質や、過剰の糖やｐＨの変動によりレクチンと抗酸菌の結合を解離させるもの、プロテアーゼを含みレクチン等を分解することで抗酸菌を溶出させるもの等があげられる。
【００２７】
本発明により分離回収された抗酸菌は、核酸増幅検査、免疫診断等に供される。核酸増幅検査は、ＰＣＲ、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等のＤＮＡ増幅法、ＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡあるいはＴＲＣ等のＲＮＡ増幅法があげられる。また、抗酸菌を担体に結合したまま行なうことが可能である。本発明の方法により得られた抗酸菌は、核酸抽出操作に先立って、試料成分を十分かつ簡便に除去することが可能であり、引き続いて実施される核酸抽出操作で残存する核酸増幅反応阻害物質の影響を最小限とすることができる。また、本発明の方法は、大量な試料あるいは極微量の抗酸菌を含む試料の濃縮に使用可能であることはいうまでもない。
【００２８】
核酸の抽出方法は特に限定されるものではなく、酵素や界面活性剤で細胞膜や細胞壁、または外皮蛋白質を破壊し、複合体の蛋白質を分解して核酸を遊離させた後、フェノール／クロロホルムを添加して遊離した核酸を抽出する、いわゆるフェノール／クロロホルム法（非特許文献３）、塩酸グアニジンまたはチオシアン酸グアニジンで処理して細胞膜や細胞壁、または外皮蛋白質を破壊し、核酸との複合体を形成している蛋白質を変性して核酸を遊離させた後、エタノール等を添加して遊離した核酸を抽出する、いわゆるグアニジン法（非特許文献４）、あるいは市販されている核酸抽出試薬を用いて行なえばよい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明においては、レクチンを用いて試料から微生物、特に抗酸菌を分離回収することで、結果的に微生物が精製されるため、核酸抽出に供するのに好適な試料が得られる。また、濃縮することが可能であるため、試料中の微生物が極微量であって通常の検出方法では検出不可能な場合においても検出することが可能となる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
はじめに、抗酸菌及び大腸菌を固相に結合させたＥＬＬＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｌｅｃｔｉｎ  Ａｓｓａｙ）により、レクチンの選定を行なった。
（１）ポリスチレン製マイクロタイタープレートに、７０℃で１５分間熱処理したＢＣＧ菌液（濃度：Ｏ．Ｄ．６００＝１１）の原液、または当該原液を７Ｈ９液体培地で４倍から１６倍希釈した液を加え、４℃で一晩固定化反応させた。これを、ＴＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水）にて３回洗浄後、１％牛血清アルブミンを用いて、室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴにて再度３回洗浄した。
（２）前記プレートを１０μｇ／ｍＬのビオチン標識レクチン（レクチンスクリーニングキット、フナコシ製）と、室温で１時間反応させ、ＴＢＳＴにて３回洗浄した。次に、１０００倍に希釈したストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼを室温で１時間反応させ、ＴＢＳＴにて３回洗浄した。
（３）前記プレートに結合したストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼをＴＭＢ基質で発色させた後、１Ｍリン酸で反応を停止し、ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍで測定した。
（４）上記（１）から（３）までの操作を、大腸菌（ＪＭ１０９株）でも実施した。ただし、マイクロタイタープレートに加えた大腸菌液の原液濃度はＯ．Ｄ．６００＝３であり、菌液の希釈にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。
【００３１】
ＥＬＬＡデータの評価結果を図１（ＢＣＧの場合）及び図２（大腸菌の場合）に示した。なお、図１及び２のうち、ＣｏｎＡはコンカナバリンＡ、ＳＢＡは大豆レクチン、ＷＧＡは小麦胚レクチン、ＤＢＡはドリコスマメレクチン、ＵＥＡ  Ｉはハリエニシダレクチン、ＲＣＡ１２０はヒママメレクチン、ＰＮＡはピーナッツレクチン、ＧＳＬ  Ｉはバンディラマメレクチン、ＰＳＡはエンドウマメレクチン、ＬＣＡはレンズマメレクチン、ＰＨＡ−ＥとＰＨＥ−Ｌはインゲンマメレクチン、ＳＪＡはシダレエンジュレクチン、Ｓ−ＷＧＡはサクシニル化したＷＧＡをそれぞれ指す。評価したレクチンのうち、マンノース結合型レクチンであるＣｏｎＡ、ＰＳＡ、ＬＣＡが、ＢＣＧに対して親和性を有することが示された。また、大腸菌に対してはＣｏｎＡのみが親和性を有していた。
実施例２
実施例１にて選定したレクチンを用い、本発明の分離回収方法を行なった。
（１）１０３ＣＦＵ／ｍＬのＢＣＧ、１０２ＣＦＵ／ｍＬのマイコバクテリウム・アビウム及びマイコバクテリウム・イントラセルラーを、２．０ｍＬ容チューブに０．５ｍＬずつ分注し、１５０μＬのビオチン標識レクチン溶液（レクチンを終濃度で５〜１０００μｇ／ｍＬ、ＢＳＡを終濃度で１ｍｇ／ｍＬ含んだ、０．１Ｍ  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．５））をそれぞれに添加し、３７℃で３０分間、回転撹拌させながら反応させた。
（２）３０分経過後、１６，０００×Ｇで５分間遠心分離して上清を除去し、５００μＬのストレプトアビジン固定化磁性微粒子（ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ、タカラバイオ製）のＰＢＳ懸濁液（粒子重量２５０μｇ）を添加後、室温で１５分間回転撹拌させながら反応させた。
（３）１５分経過後、磁石によりストレプトアビジン固定化磁性微粒子を回収し、５００μＬのＰＢＳに再懸濁した。
（４）それぞれの再懸濁液を１００μＬずつ、７Ｈ１１寒天培地に塗布し、３７℃でコロニーが出現するまで培養した。同時に、上記（１）において濃度調製しただけの菌液も培地に塗布し、菌の回収率を測定する際の基準値とした。
（５）菌のコロニー数を測定し、回収物と基準値の値から菌の回収率を測定した。
（６）上記（１）から（５）までの操作を、大腸菌（ＪＭ１０９株）で実施した。ただし、大腸菌濃度は１０３ＣＦＵ／ｍＬであり、培養は１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬＢ培地を用いて、３７℃で一晩行なった。
【００３２】
対象がＢＣＧの場合の実験結果を図３に示した。レクチン濃度が５００μｇ／ｍＬ以上では、実施例１で選定したいずれのレクチンを用いても、液体培地からの菌の回収率が２５から５０％とある程度の回収率を示した。特にＣｏｎＡを用いたときはレクチン濃度が５μｇ／ｍＬと低い条件でも約３０％の回収率を示しており、最適値であるレクチン濃度が５００μｇ／ｍＬの条件では回収率５５％を達成した。なお、図３には示していないが、レクチンを用いないコントロール実験での回収率は０％であった。
【００３３】
対象がマイコバクテリウム・アビウム及びマイコバクテリウム・イントラセルラーの場合の実験結果を図４に示した。対象がマイコバクテリウム・アビウムの場合、実施例１で選定したレクチンのうち、ＣｏｎＡを用いた場合における液体培地からの菌の回収率は８０％と高い回収率を達成しており、他の２種類のレクチンを用いたときも、ＣｏｎＡよりは低い回収率であるものの２０から３０％とある程度の回収率を示した。一方、対象がマイコバクテリウム・イントラセルラーの場合、実施例１で選定したレクチンのうち、ＣｏｎＡを用いたときは約６０％と高い回収率を示したが、他の２種類のレクチンを用いたときは殆ど回収できなかった。なお、図４には示していないが、レクチンを用いないコントロール実験での回収率はＢＣＧの時と同様０％であった。
【００３４】
対象が大腸菌（ＪＭ１０９株）の場合の実験結果を図５に示した。抗酸菌での結果とは対照的に、実施例１で大腸菌と親和性を有すると判定されたＣｏｎＡを用いた場合でも、液体培地からの菌の回収率は最大で約２０％であった。
【００３５】
以上の結果より、本発明の分離回収方法において、マンノース結合型レクチン、特にＣｏｎＡを用いることで試料中から抗酸菌を効率的に分離回収でき、かつ大腸菌のような抗酸菌でない菌をある程度除くことが可能であることが示された。
実施例３
本発明の抗酸菌の分離回収方法を用いて、阻害物含有試料からのマイコバクテリウム・アビウムの分離回収を行ない、核酸増幅検査への適用を検討した。
（１）本検討では、実検体のモデルとして結核菌検査陰性喀痰を使用した。結核菌検査陰性喀痰とは、結核菌検査のために患者から採取された喀痰であり、結核菌検査（塗抹検査と遺伝子検査）で陰性と判定された喀痰をプールした試料である。前記試料には核酸増幅反応を阻害する物質が含まれており、抗酸菌の添加回収試験（スパイク試験）に好適な試料である。
（２）前記結核菌陰性喀痰を、ＮＡＬＣ処理（ＢＢＬマイコプレップ、日本ベクトン・ディッキンソン製）し、結核菌陰性喀痰ＮＡＬＣ処理物を調製した。
（３）前記ＮＡＬＣ処理物で希釈した１０３ＣＦＵ／ｍＬのマイコバクテリウム・アビウムを１．５ｍＬ容スクリューキャップチューブ（アシストチューブ、アシスト製）に０．５ｍＬずつ分注し、１５０μＬのビオチン標識レクチンのＰＢＳ溶液（レクチン終濃度：５μｇ／ｍＬ、ＢＳＡ終濃度：１ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれに添加し、３７℃で３０分間、回転撹拌させながら反応させた。
（４）３０分経過後、１６，０００×Ｇで５分間遠心分離して上清を除去し、５００μＬのストレプトアビジン固定化磁性微粒子（ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ、タカラバイオ製）のＰＢＳ懸濁液（粒子重量１２５μｇ）を添加後、室温で１５分間回転撹拌させながら反応させた。
（５）１５分経過後、磁石によりストレプトアビジン固定化磁性微粒子を回収し、マイコバクテリウム・アビウムの濃縮物を得た。
（６）上記（５）で得られたマイコバクテリウム・アビウムの濃縮物のうち、濃縮前の菌液換算２００μＬ分（濃縮物を５００μＬの７Ｈ９液体培地に懸濁し、そのうちの２００μＬを使用した）と、（３）において前記ＮＡＬＣ処理物で濃度調製しただけの菌液２００μＬを、それぞれ核酸抽出試薬（ＥＸＴＲＡＧＥＮ  ＭＢ、東ソー製）を用いて核酸抽出物を得た。
（７）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容のＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに得られた核酸抽出物を５μＬずつ添加した。
【００３６】
反応液の組成：酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度または量
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化カリウム
６Ｕ  リボヌクレアーゼインヒビター（タカラバイオ製）
１ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
１．０μＭ  第１のオリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｆ−４０、５’末端側にＴ７プロモーター配列を付加：配列番号１）
１．０μＭ  第２のオリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−３ＲＡ１６−４：配列番号２）
０．１６μＭ  第３のオリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｓ−４０、３’末端をアミノ基修飾：配列番号３）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＭＹＲ−Ｐ５−Ｓ−Ｇ、５’末端から７番目のＧと８番目のＣとの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローが結合、３’末端をアミノ基修飾：配列番号４）
１３％  ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（８）上記の反応液を４３℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００３７】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度または量
２．０％  ソルビトール
３．６μｇ  牛血清アルブミン
１４２Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
容量調整用蒸留水
（９）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで、反応溶液を経時的に３０分間測定した。
【００３８】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表１に示した。
【００３９】
【表１】
2009055812.tif 000002
核酸抽出前に本発明の抗酸菌の分離回収法を実施することにより、検出時間の平均が約１５分から約１３分へと約２分短縮した。なお、検出時間２分の短縮は図６の検量線から、ＲＮＡコピー数換算で約１０倍の差に相当するため、本発明の抗酸菌の分離回収法を実施することで、従来の核酸抽出法よりも約１０倍の高感度化が可能になったといえる。
実施例４
本発明の抗酸菌の分離回収方法を用いて、阻害物含有試料からのマイコバクテリウム・イントラセルラーの分離回収を行ない、核酸増幅検査への適用を検討した。
（１）実施例３の（２）で調製したＮＡＬＣ処理物で希釈した１０３ＣＦＵ／ｍＬのマイコバクテリウム・イントラセルラーを１．５ｍＬ容スクリューキャップチューブ（アシストチューブ、アシスト製）に０．５ｍＬずつ分注し、１５０μＬのビオチン標識レクチンのＰＢＳ溶液（レクチン終濃度：５μｇ／ｍＬ、ＢＳＡ終濃度：１ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれに添加し、３７℃で３０分間、回転撹拌させながら反応させた。
（２）３０分経過後、１６，０００×Ｇで５分間遠心分離して上清を除去し、５００μＬのストレプトアビジン固定化磁性微粒子（ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ、タカラバイオ製）のＰＢＳ懸濁液（粒子重量１２５μｇ）を添加後、室温で１５分間回転撹拌させながら反応させた。
（３）１５分経過後、磁石によりストレプトアビジン固定化磁性微粒子を回収し、マイコバクテリウム・イントラセルラーの濃縮物を得た。
（４）上記（５）で得られたマイコバクテリウム・イントラセルラーの濃縮物のうち、濃縮前の菌液換算２００μＬ分（濃縮物を５００μＬの７Ｈ９液体培地に再懸濁し、そのうちの２００μＬを使用した）と、（１）において前記ＮＡＬＣ処理物で濃度調製しただけの菌液２００μＬを、それぞれ核酸抽出試薬（ＥＸＴＲＡＧＥＮ  ＭＢ、東ソー製）を用いて核酸抽出物を得た。
（５）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容のＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに得られた核酸抽出物を５μＬずつ添加した。
【００４０】
反応液の組成：酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度または量
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化カリウム
６Ｕ  リボヌクレアーゼインヒビター（タカラバイオ製）
１ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
１．０μＭ  第１のオリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｆ−４０、５’末端側にＴ７プロモーター配列を付加：配列番号１）
１．０μＭ  第２のオリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−３ＲＩ１８：配列番号５）
０．１６μＭ  第３のオリゴヌクレオチド（ＭＹＲ−１Ｓ−４０、３’末端をアミノ基修飾：配列番号３）
２５ｎＭ  インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＭＹＲ−Ｐ５−Ｓ−Ｇ、５’末端から７番目のＧと８番目のＣとの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローが結合、３’末端をアミノ基修飾：配列番号４）
１３％  ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（６）上記の反応液を４３℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４１】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度または量
２．０％  ソルビトール
３．６μｇ  牛血清アルブミン
１４２Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
容量調整用蒸留水
（７）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで、反応溶液を経時的に３０分間測定した。
【００４２】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表２に示した。なお、表２においてＮ．Ｄ．とは酵素を添加して３０分後の蛍光強度比が１．２未満（陰性判定）であった試料を意味する。
【００４３】
【表２】
2009055812.tif 000003
核酸抽出前に本発明の抗酸菌の分離回収法を実施することにより、１０３ＣＦＵ／ｍＬでの検出率が０％から７５％に向上した。よって、本発明の抗酸菌の分離回収法を実施することにより、試料に由来する阻害物質が原因で低濃度でのマイコバクテリウム・イントラセルラーの検出が不可能であった試料でも、高い確率で検出できるようになったといえる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＥＬＬＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｌｅｃｔｉｎ  Ａｓｓａｙ）を用いて、ＢＣＧに対するレクチンの親和性を評価した結果を示した。評価したレクチンの中では、マンノース結合型レクチンであるＣｏｎＡ、ＰＳＡ、ＬＣＡが親和性を有していた。
【図２】ＥＬＬＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｌｅｃｔｉｎ  Ａｓｓａｙ）を用いて、大腸菌に対するレクチンの親和性を評価した結果を示した。評価したレクチンの中では、ＣｏｎＡのみが親和性を有していた。
【図３】本発明における、液体培地からのＢＣＧの分離回収結果を示した。ＢＣＧ濃度は１０３ＣＦＵ／ｍＬである。試験した３種類のレクチンの中では、ＣｏｎＡが最も適していることが分かる。また、ＢＣＧの分離回収におけるレクチン濃度の最適値は５００μｇ／ｍＬであることを示す。
【図４】本発明における、液体培地からのマイコバクテリウム・アビウム及びマイコバクテリウム・イントラセルラーの分離回収結果を示した。菌濃度は共に１０２ＣＦＵ／ｍＬであり、レクチン濃度は共に５μｇ/ｍＬである。試験した３種類のレクチンの中では、ＣｏｎＡが最も適していることが分かる。
【図５】本発明における、液体培地からの大腸菌（ＪＭ１０９株）の回収結果を示した。大腸菌濃度は１０３ＣＦＵ／ｍＬである。試験した３種類の何れのレクチンでも、高い回収率は得られなかった。大腸菌を固相化したＥＬＬＡでは、ＣｏｎＡに親和性が認められたが、本発明の方法では大腸菌を殆ど分離回収しないことが分かった。
【図６】実施例３に記載した組成の核酸検出試薬で、マイコバクテリウム・アビウム標準ＲＮＡ（マイコバクテリウム・アビウムｒＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｘ５２９１８）のうち１−１４６５の領域を含むＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写で調製したもの）を増幅したときの検量線を示した。検出時間約２分の相違は、ＲＮＡコピー数換算で約１０倍の差に相当する。
【図１】
2009055812.tif 000004
【図２】
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【図３】
2009055812.tif 000006
【図４】
2009055812.tif 000007
【図５】
2009055812.tif 000008
【図６】
2009055812.tif 000009
【配列表】
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