(57)【要約】      （修正有）【課題】アブラナ科植物に含まれるGSL類は、基本構造中に硫酸基を有する。硫酸基を持つ化合物は一般的に高速液体クロマトグラフィー挙動が著しく悪いことが多いため、GSL類はミロシナーゼを作用させて変換されたイソチオシアネート類をガスクロマトグラフィー分析するか、またはスルファターゼで脱硫酸させたdesulfo体を液体クロマトグラフィー分析していた。しかし、アブラナ科植物に含まれるGSL類を十分に精製および分析することはできなかった。GSL類をＣ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを用いて精製する方法、さらにLC-MS分析により分析する方法を提供する。【解決手段】Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを用い、移動相としてギ酸、ギ酸アンモニウムまたは炭酸水素アンモニウムを用いる液体クロマトグラフィーによる、グルコシノレート類の精製方法並びにグルコシレート類のLC-MS分析方法。【選択図】図３
2009103680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アブラナ科植物由来の試料中に含まれるグルコシノレート（ＧＳＬ）類を液体クロマトグラフィーにより精製する方法であって、該液体クロマトグラフィーがＣ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
液体クロマトグラフィーの移動相にギ酸を用いる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
液体クロマトグラフィーの移動相にギ酸アンモニウムを用いる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムがDevelosil RPAQUEOUS-AR-5である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
液体クロマトグラフィーの移動相に炭酸水素アンモニウムを用いる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムが、Develosil RPAQUEOUSである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＧＳＬ類が、グルコイベリン（ＧＩ）、プロゴイントリン（ＰＧ）、シニグリン（ＳＧ）、グルコラファニン（ＧＲ）、グルコエルシン（ＧＥ）、グルコブラシキン（ＧＢ）、４−メトキシグルコブラシキン（４ｍＧＢ）および１−メトキシグルコブラシキン（１ｍＧＢ）からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
液体クロマトグラフィーが、Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムに代えてエチレン架橋カラムを用いることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項９】
エチレン架橋カラムが、Waters XBridge Shield RP18-5カラムである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
移動相として炭酸水素アンモニウムを使用する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ＧＳＬ類が、ＧＢ、４ｍＧＢおよび１ｍＧＢからなる群より選択される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
液体クロマトグラフィーによる精製の前に、試料を固相抽出によって処理する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
固相抽出がアミノプロピルまたはOasis(登録商標) WAX固相抽出である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
アミノプロピル固相抽出時の溶出アンモニウム濃度が、１〜１０％である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィーによりＧＳＬ類を精製した後に質量分析により分析する、ＧＳＬ類のＬＣ−ＭＳ分析方法。
【請求項１６】
質量分析におけるＣｏｎｅ電圧が４０Ｖである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
さらに、同じ条件下で分析標品を分析して作成された検量線を用いて試料中のＧＳＬ類を定量することを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
内部標準物質としてシナルビンを用いる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
さらに、質量分析の各ピークを分取して、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析法（CE-TOFMS）または核磁気共鳴（ＮＭＲ）に供すことを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アブラナ科植物およびその一部近縁植物に含まれるグルコシノレート（ＧＳＬ）類を、Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより精製する方法に関するものである。本発明は、さらにアブラナ科植物に含まれるグルコシノレート（ＧＳＬ）類を、Ｃ３０カラム逆相クロマトグラフィー用を用いたLC-MSにより分析する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アブラナ科植物に含まれるGSL類は、基本構造中に硫酸基を有するが、硫酸基を持つ化合物は一般的に高速液体クロマトグラフィー（HPLC）挙動が著しく悪いことが多い。そのため、従来的に、GSL類は、ミロシナーゼを作用させて変換されたイソチオシアネート（ITC）類をガスクロマトグラフィー分析するか（非特許文献１、非特許文献２を参照）、またはスルファターゼで脱硫酸させたdesulfo体を液体クロマトグラフィー分析していた（非特許文献３、非特許文献４を参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Chiangら、J. Agric. Food Chem 46: 1018-1021, 1998
【非特許文献２】Lambrixら、Plant Cell 13: 2793-2807, 2001
【非特許文献３】Brownら、Phytochemistry 62: 471-481, 2003
【非特許文献４】Barillariら、J. Nat. Prod. 68: 234-236, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来法では、アブラナ科植物に含まれるGSL類を十分に精製および分析することはできず、従って、GSL類を効率的に精製および分析できる新たな方法が望まれていた。そこで、本発明では、GSL類をＣ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを用いて精製する方法、さらにLC-MS分析により分析する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、GSL類の精製における液体クロマトグラフィーにおいて、カラムとしてＣ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを使用し、また移動相として、ギ酸、ギ酸アンモニウムまたは炭酸水素アンモニウムを使用することによって、アブラナ科植物体由来の試料中に含まれるGSL類を有効に精製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  アブラナ科植物由来の試料中に含まれるグルコシノレート（ＧＳＬ）類を液体クロマトグラフィーにより精製する方法であって、該液体クロマトグラフィーがＣ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とする、上記方法。
［２］  液体クロマトグラフィーの移動相にギ酸を用いる、［１］の方法。
［３］  液体クロマトグラフィーの移動相にギ酸アンモニウムを用いる、［１］の方法。
［４］  Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムがDevelosil RPAQUEOUS-AR-5である、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］  液体クロマトグラフィーの移動相に炭酸水素アンモニウムを用いる、［１］の方法。
【０００７】
［６］  Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムが、Develosil RPAQUEOUSである、［５］の方法。
［７］  ＧＳＬ類が、グルコイベリン（ＧＩ）、プロゴイントリン（ＰＧ）、シニグリン（ＳＧ）、グルコラファニン（ＧＲ）、グルコエルシン（ＧＥ）、グルコブラシキン（ＧＢ）、４−メトキシグルコブラシキン（４ｍＧＢ）および１−メトキシグルコブラシキン（１ｍＧＢ）からなる群より選択される、［１］〜［６］のいずれかの方法。
［８］  液体クロマトグラフィーが、Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムに代えてエチレン架橋カラムを用いることを特徴とする、［１］の方法。
［９］  エチレン架橋カラムが、Waters XBridge Shield RP18-5カラムである、［８］の方法。
［１０］  移動相として炭酸水素アンモニウムを使用する、［８］または［９］の方法。
【０００８】
［１１］  ＧＳＬ類が、ＧＢ、４ｍＧＢおよび１ｍＧＢからなる群より選択される、［８］〜［１０］のいずれかの方法。
［１２］  液体クロマトグラフィーによる精製の前に、試料を固相抽出によって処理する、［１］〜［１１］のいずれかの方法。
［１３］  固相抽出がアミノプロピルまたはOasis(登録商標) WAX固相抽出である、［１２］の方法。
［１４］  アミノプロピル固相抽出時の溶出アンモニウム濃度が、１〜１０、さらに好ましくは５％である、［１３］の方法。
［１５］  ［１］〜［１４］のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーによりＧＳＬ類を精製した後に質量分析により分析する、ＧＳＬ類のＬＣ−ＭＳ分析方法。
【０００９】
［１６］  質量分析におけるＣｏｎｅ電圧が４０Ｖである、［１５］の方法。
［１７］  さらに、同じ条件下で分析標品を分析して作成された検量線を用いて試料中のＧＳＬ類を定量することを含む、［１５］または［１６］の方法。
［１８］  さらに、質量分析の各ピークを分取して、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析法（CE-TOFMS）またはＮＭＲに供すことを含む、［１５］または［１６］の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明による方法によって、アブラナ科植物由来の試料中に含まれるGSL類を有効に精製および分析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、アブラナ科植物由来の試料中に含まれるグルコシノレート（ＧＳＬ）類を液体クロマトグラフィーにより精製する方法に関する。
【００１２】
GSL類は主にブロッコリー、キャベツ、ダイコン、ワサビ、カラシナなどのアブラナ科植物に含まれる成分として知られており、例えば、グルコイベリン（ＧＩ）、プロゴイントリン（ＰＧ）、シニグリン（ＳＧ）、グルコラファニン（ＧＲ）、グルコエルシン（ＧＥ）、グルコブラシキン（ＧＢ）、４−メトキシグルコブラシキン（４ｍＧＢ）および１−メトキシグルコブラシキン（１ｍＧＢ）などが挙げられる。
【００１３】
液体クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、オクタデシリシリル基を有するC18カラムおよびトリアコンチル基を有するC30カラムなどの逆相液体クロマトグラフィー（HPLC）用カラムを用いることができるが、C30カラムを用いることが好ましい。C30カラムは逆相HPLCで汎用されるODS（C18）樹脂を改良し、より極性が高い物質を保持できるようにされたカラムであり、移動相を水のみにしてもHPLCを実施できるという優れた特性を持つために有効である。
【００１４】
本方法においては、移動相として酸性であるギ酸またはギ酸アンモニウムを用いる場合は、酸耐性の強いDevelosil（商標）RPAQUEOUS-AR-5（φ4.6×250 mm）（野村化学）またはDevelosil（商標）RPAQUEOUS-AR-3（φ3.0×150 mm）（野村化学）を用いるのが好ましい。特に好ましくは、Develosil（商標）RPAQUEOUS-AR-3（φ3.0×150 mm）（野村化学）を用いる。このカラムを用いた場合、液体クロマトグラフィー分析時間を短縮できると共に、流速を遅くすることによりスプリットレス化が可能となり、MS検出器にインジェクト試料全量を導くことができるために、MS検出器においてGSL類の検出感度を高めることが可能である。一方、移動相としてアルカリ性である炭酸水素アンモニウムを用いる場合は、アルカリ耐性の強いDevelosil（商標）RPAQUEOUS（φ4.6×250 mm）（野村化学）を用いるのが好ましい。これらのＣ３０カラムのうち、Develosil RPAQUEOUSを用いた場合に、より良好なクロマトグラムが得られ、分取目的で精製する場合Develosil RPAQUEOUSが好適である。LC-MSを用いて分析を行う場合、いずれのカラムも好適に用いることができる。
【００１５】
また、精製するGSL類が極性の低いGB類（例えば、GB、4mGB、1mGBなど）である場合、高pHの移動相を用いる必要があるので、よりアルカリ耐性の強いカラムを用いることが望ましい。このようなカラムとして、C30カラムに代えてアルカリ耐性の強いエチレン架橋カラムを用いることができる。エチレン架橋カラムは、シリカゲル担体がエチレンで架橋されており、アルカリによるシリカゲル担体の加水分解を受けにくいように設計されており、アルカリ耐性が非常に強いというメリットを有する。例えば、XBridge（商標）ブランド（Waters社）のカラムを用いることが好ましい。用いるXBridgeブランド（Waters社）のカラムとして、特に好ましくはWaters XBridge Shield RP18-5（φ10 mm×250 mm）である。XBridgeブランドカラムの使用に合わせて、移動相である炭酸水素アンモニウムのpHも、好ましくはpH 9.0〜11.0、さらに好ましくはpH 10.0にすることが可能である。移動相のpHを10.0とすることによって、炭酸水素アンモニウムの緩衝能がより高まり、さらに滴定アンモニウム量が増すことによって、GB類を安定なアンモニウム塩として確実に単離することを可能とする。
【００１６】
液体クロマトグラフィーに用いる酸性の移動相としては、トルフルオロ酢酸（TFA）、ギ酸、ギ酸アンモニウムを用いることができるが、TFAはカラムや装置に与えるダメージが大きく、取り扱いにも細心の注意が必要というデメリットを有するため、本発明においてはギ酸またはギ酸アンモニウムを用いるのが好ましい。より好ましくは、ギ酸アンモニウムを用いる。従来的に酢酸アンモニウムを移動相に用いた文献がいくつか存在するが（West, L.ら、J. Chromatogr. A 966: 227-232, 2002およびSkutlarek, D.ら、Eur. Food Res. Technol. 219: 643-649, 2004を参照）、酢酸アンモニウムの緩衝能域はpH 4.76±1であり、ギ酸アンモニウムの方がより低いpHで緩衝能を発揮できる。また、アンモニウムイオンは常時解離性の硫酸基とイオンペアを形成する能力があり、そこにさらに水分子が水和し、複雑な集合体としてカラムを通過し得る。したがって、移動相に水とアンモニウムを採用することで、解離硫酸基がソフトに包容され、カラム挙動が良好になり得る。ギ酸の濃度は、0.1〜1％、好ましくは0.1%である。ギ酸のpHは2.2〜2.7、好ましくは2.7である。ギ酸アンモニウムの濃度は、1〜20mM、好ましくは５〜15mM、さらに好ましくは10mMである。ギ酸アンモニウムのpHは、pH 2.5〜5、さらに好ましくはpH 2.75〜4.75、特に好ましくはpH 3.75である。この際、有機溶媒の濃度を徐々に変化させていく濃度勾配溶出により溶出してもよい。有機溶媒としては、例えばアセトニトリル（MeCN）を用いることができる。
【００１７】
また、液体クロマトグラフィーに用いるアルカリ性の移動相として、炭酸水素アンモニウムを用いることができる。炭酸水素アンモニウムは水溶液中、常圧70℃でアンモニア、水、二酸化炭素に熱分解される。よって分取溶液を減圧濃縮乾固するだけで目的化合物だけが単離できるというメリットがある。炭酸アンモニウムの濃度は、1〜20mM、好ましくは５〜15mM、さらに好ましくは10mMである。炭酸水素アンモニウムのpHは、pH 7〜10、さらに好ましくはpH 7.80〜9.80、特に好ましくはpH8.80である。この際、有機溶媒の濃度を徐々に変化させていく濃度勾配溶出により溶出してもよい。有機溶媒としては、例えばアセトニトリル（MeCN）を用いることができる。
【００１８】
液体クロマトグラフィーは市販のHPLC装置を用いて行うことができ、カラムの平衡化や流速はカラムサイズや試料の容量によって適宜設定することができる。
【００１９】
液体クロマトグラフィーを行い、得られた画分は、後述の質量分析やUVまたは多波長検出器等を用いて分析することができる。所望のGSL類を含む分画を回収し、精製したGSL類を得ることができる。
【００２０】
アブラナ科植物由来の試料は、液体クロマトグラフィーに付す前に、予め以下の前処理を行うことが好ましい。
【００２１】
GSL類は、すりおろしたり噛んだりすることでこれら野菜の細胞内に含まれる酵素（ミロシナーゼ）と接触して、イソチオシアネート（ITC）類に変換される（図１を参照）。
【００２２】
したがって、GSL類を精製および分析するために、植物体に由来する試料中に含まれる酵素、特にミロシナーゼを失活させる必要がある。酵素の失活方法としては、当業者にとって一般的な方法、例えば、熱処理、エタノール、メタノール処理などを用いることができる。
【００２３】
酵素を失活させながら、および／または失活させた後に、植物体に由来する試料をすりつぶし、抽出液を固相抽出処理に付す。
【００２４】
試料を効率的にすりつぶすために、ジルコニアビーズ、ミキサーミルなどの一般的な破砕手段を用いても良い。
【００２５】
固相抽出には、逆相クロマトグラフィー用固定相、イオン交換クロマトグラフィー用固定相などを広く用いることができる。固定相として、オクダデシルシリル基（C18）、オクチル基（C8）、ブチル基（C4）、トリメチル基（C3）、フェニル基（Ph）、トリアコンチル基（C30）、アミノプロピル基（NH2）を有する充填剤を用いることができ、これらの複数の充填剤を組合せて用いてもよい。固定相としては、弱陰イオン交換性の樹脂が好ましく、例えば、アミノプロピル基を有する充填剤が好ましい。あるいは、同じく弱陰イオン交換性樹脂であるOasis(登録商標) WAXを用いても良い。Oasis(登録商標) WAXは、図３５に記載の基を有する充填剤である。Oasis(登録商標) WAXを使用する際には、エリューションプレートとして当該WAX が充填された96ｗellプレート（Waters）を使用することができ、９６連で前処理（固相抽出）ができるために従来法に比べずっと効率よく、ごく普通の溶出方法で生体サンプルを前処理することができるといった利点を有する。逆に、強陰イオン交換性の樹脂は、GSL類が非常に強く吸着され、溶出することができないために用いることはできない。固相抽出処理については、Rochfort, S.ら、J. Chromatogr. A 1120: 205-210, (2006)に記載されるC18樹脂及びアミノプロピル基を有する樹脂を組合せる方法で行うこともできるが、カロテノイド、フラボノイド、クロロフィル等の極性が低い夾雑物は、アプライおよび洗浄の工程で除去可能であるため、上記文献記載のC18樹脂による固相抽出のステップを省略しても良い。固相抽出時の溶出液としてはアンモニウム溶液を用いることができ、そのアンモニウム濃度は、１〜１０％、好ましくは２〜５％、より好ましくは２％または５％のものを用いることができるが、５％のものを用いるのが特に好ましい。
【００２６】
溶出し得られたGSL類画分を上記の条件で液体クロマトグラフィーにより精製すればよい。本発明においては、例えばアミノプロピル基を有する充填剤を用いた固相抽出をアミノプロピル固相抽出と呼び、得られたGSL類画分をアミノプロピル吸着画分（APAF）と呼ぶ。
【００２７】
液体クロマトグラフィーにより精製した画分をさらに質量分析に付すことができる。この場合、液体クロマトグラフィーと質量分析を連結した手法であるLC-MS法により行えばよい。本発明は上記の条件で液体クロマトグラフィーによりGSL類を精製した後、質量分析を行う、GSL類のLC-MS分析法を包含する。
【００２８】
質量分析の条件については、通常、定量条件で行う場合には、ターゲットとするm/z値のみをそれぞれ単独にモニターする方法（SIM）を用いるのが一般的であるが、本方法においては、GSL類を広く分析できるように、m/z値300〜500のスキャンモードに設定して行うことが望ましい。GSLの分子種によってはその側鎖構造により特徴的なMS開裂を起こすことがあり、これもスキャンモードにより得られる有意義な情報となり得る。また、m/zがこの範囲であれば、数百種類あるGSL類全てを検出でき得る。GSL類は構造中に硫酸基を持ち（図１を参照）、硫酸基は常時解離性であるため、ESIネガティブイオンでのみのモニタリングとし得る。Cone電圧は、20、30、40、50、60、70または80 Vの電圧を用いることができるが、30 V〜50 Vの電圧が好ましく、さらに好ましくは40 Vである。その他のMS条件については、以下の実施例に具体的に記載するが、これらの条件に限定されるものではない。
【００２９】
質量分析は、単収束扇形磁場型質量分析法、二重収束扇形磁場型質量分析法、四重極型質量分析法、四重極イオントラップ型質量分析法、飛行時間型質量分析法、イオンサイクロトロン型質量分析法(フーリエ変換型質量分析法)などを用いて行うことができる。
【００３０】
質量分析において試料をイオン化させる方法としては、EI(electron ionization:電子イオン化)法、CI(chemical ionization:化学イオン化)法、DEI(desorption electron ionization:脱離電子イオン化)法、DCI(desorption chemical ionization:脱離化学イオン化)法、FAB(fast atom bombardment:高速原子衝撃)法、FRIT-FAB(FRIT-fast atom bombardment:フリット高速原子衝撃)法、ESI(electrospray ionization:エレクトロスプレーイオン化)法、MALDI(matrix-assisted laser desorption ionization:マトリックス支援レーザー脱離イオン化)法を用いることができる。
【００３１】
さらに、標品GSL類または本発明による精製方法により得られたGSL類を分析標品として、本方法の条件を用いて分析し、当業者にとって一般的な方法に従って検量線を作成することが可能である。そして作成した検量線を用いて試料中に含まれるGSL類を定量分析することが可能である。
【００３２】
またさらに、本実施形態では、安定同位体からのみ構成されるピークの精密質量数を求めるミリマスという手法を用いて、検出したGSL類の分子式を一義的に定めることができる。ミリマス測定のために質量分析における各ピークを分取して、キャピラリー電気泳動−質量分析法（CE-MS）に付すことができる。
【００３３】
CEに用いられるキャピラリーチューブは、例えば、ガラス、溶融シリカ、金属（例えば、ステンレススチール）及びプラスチック（例えば、PEEKポリマー）などの材料からなるものを用いることができる。用いるキャピラリーチューブの内径は、約0.1μm〜約100μm、好ましくは50μmである。またキャピラリーチューブの長さは約0.1mm〜約2m、好ましくは1mである。キャピラリーチューブ内に適当な緩衝液を満たし、両端に高電圧（１０〜３０ｋｖ、好ましくは３０ｋｖ）をかけることによって、各GSL類はそれぞれの移動度に基づいた速度でキャピラリー内を移動し分離が達成される。
【００３４】
CE-MSは、CEの検出器として質量分析計を用いて行う。CEはその高い分離能により検出される成分のピークが非常にシャープになるケースがあり、かつ、その分析対象成分が微量であるため、スペクトルを高速かつ高感度で取得可能な飛行時間型質量分析法（Time of Flight Mass Spectrometry ：TOF-MS）を用いるのが好ましい。
【００３５】
本方法においては、HPLCに汎用されるサイズのカラムを用いることができるため、本条件はこのままUVまたは多波長検出器による分析にも使用することができる。
【実施例】
【００３６】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１：グルコシノレート（GSL）類のLC-MS分析系
１．GSL類画分の調製
植物体中に含まれるGSL類を分析するHPLC条件を検討するために、GSL類画分を調製した（調製方法については図２を参照）。ブロッコリースーパースプラウト（BS）（株式会社村上農園）２パック分（F.W. 108 g）をミリQ水400 mLが入ったビーカーに入れ、600 Wの電子レンジで10分間加熱、沸騰させ、ミロシナーゼ等の変換酵素を失活させた（ブランチング処理）。放熱後、ホモジネイトし、7,000 rpmで20分間遠心分離を行ない、上清をミリQ水で500 mLにフィルアップした。その一部を真空凍結乾燥し、抽出液の乾燥重量を求めた（4.1 g）。これに500μLのギ酸を添加し、0.1%（v/v）ギ酸溶液とした。
【００３７】
抽出液のうち300 mL（2.5 g）を５回に分けてSep-Pak（登録商標） Vacアミノプロピル（Waters社）固相抽出（10 g樹脂）に供し、0.82 gのGSL類画分（アミノプロピル吸着画分：APAF）を得た。アプライ試料とAPAFに含まれるGRについて、A226モニターによるHPLC（次項２（II）の条件）で比較した結果（ピーク同定法については次項を参照）、回収率は99.6%と非常に良好であった。
【００３８】
ここで得られたAPAFを、次項のLC-MS条件検討用試料として用いた。
【００３９】
２．LC条件
LC系には、C30樹脂を使ったカラム（Develosil RPAQUEOUS-AR-5（φ4.6×250 mm）（野村化学））を採用した。移動相としては、以下の２つの条件を検討した。
2009103680.tif 000003
【００４０】
３．MS条件
MS条件については以下のとおりである。
スキャンモード：m/z値300〜500
モニタリング：ESIネガティブイオンのみ
MS検出装置: Waters micromass ZQ 2000
Sorce (ES-)
Capillary: 3.00 kV
Cone: 40 V
Extractor: 5.00 V
RF lens: 0.0 V
Source temperature: 120℃
Desolvation temperature: 400℃
Cone gas flow: 50 L/hr
Desolvation gas flow: 600 L/hr
Analyser
LM 1 resolution: 15.0
HM 1 resolution: 15.0
Ion energy 1: 0.5
Multiplier: 650 V
【００４１】
４．移動相の比較結果
上記２のLC移動相条件２つを上記３のMS検出装置でモニタリングし、評価を行なった。なおクロマトグラムについてはシニグリン（SG）のUVmax 226 nm、およびベンゼン環特異的UVmax 280 nmでのモニタリングもあわせて行なった。
【００４２】
上記２の条件（I）（ギ酸条件、以下条件２（I）とする）でのLC-MSを図３に示した。保持時間が短い成分は極性が高いGSL類であり、m/z値より、グルコイベリン（GI）、プロゴイトリン（PG）、SG、およびGRの４本のピークを推定した。図３のクロマトグラムにおいて25分以降にブロードなピーク形状で溶出されるピークは、GSL類の中でも極性が低い成分であり、m/z値より、グルコエルシン（GE）、グルコブラシキン（GB）、およびGBメトキシ付加体２成分（4mGB, 1mGB）の４本のピークを推定した。ベンゼン環特異的なUV吸収を持つのはGB、4mGB、1mGBの３成分であり、これらは側鎖にインドール環を持つと推定され、矛盾のない結果となった。
【００４３】
各々のピークのMSスペクトルを図４および図５に示した。GIおよびGRについては、側鎖のメチルスルフィニル開裂が見られ、また1mGBについてはメトキシの開裂が観測された。
【００４４】
これらの結果により、各GSLがノミナル（整数値）MSとして推定された。各GSLの構造式を図６に示した。
【００４５】
上記２の条件（II）（ギ酸アンモニウム（pH 3.75）条件、以下条件２（II）とする）でのLC-MSを図７に示した。ギ酸アンモニウム移動相はpH 3.75±1で緩衝能を発揮し、その結果、GSL類のカラム挙動を安定化させることができた。一方、移動相A, Bはギ酸でpH 3.75に滴定しており、特に移動相Bについては添加ギ酸量が多いので、A226でのクロマトグラムのベースライン上昇を招いている（図７を参照）。
【００４６】
条件２（I）では、条件２（II）と比べ、後半に溶出される４成分のピークがブロードであり、また保持時間にも変動が見られること、またDevelosil RPAQUEOUS-AR-5カラムは耐久性にも優れていることから、条件２（II）をGSL類のLC-MS条件として以下の実施例に用いた。
【００４７】
実施例２：GSL類分析供試試料の調製（抽出および前処理）
１．ミロシナーゼの失活（ブランチング）
F.W. 100 mg程度の試料をサンプリングし、秤量した後に、内在性のあらゆる酵素を失活させるために、あらかじめφ5 mmのジルコニアビーズを入れた2 mL容エッペンチューブに入れ、速やかに抽出液（80%（v/v）のメタノール／水、0.1%（v/v）のギ酸）1 mLを添加した（図８を参照）。抽出液中に含まれるメタノールとの接触によってミロシナーゼ等が失活する。図８に示したように、多検体を効率よく粉砕するためにミキサーミルを使用し、遠心分離後、上清800μLを次項のアミノプロピル処理に供した。
【００４８】
２．アミノプロピル固相抽出処理
本処理方法は、実施例１のスケールダウンである（図８を参照）。まずアミノプロピル固相抽出における試料アプライ、洗浄工程において、GSL類のリークがないことをHPLCで確認した（条件２（II））。次に、溶出溶液のアンモニア濃度、液量について詳細な検討を行なった。すなわちアンモニア濃度を2%と5％、液量を5、9、15 mLとし、n=3で固相抽出の条件検討を行なった。１回につき100 mg（F.W.）のブロッコリースプラウト（実施例１を参照）が必要なので、2 gの試料に図８抽出溶媒を20 mL添加し、ホモジネイトしたものを供試試料とした。アプライ試料はアミノプロピル固相抽出を経ていないのでHPLCにおいて夾雑物が見られたが、このピーク面積値を100として、GI、GR、GE、GB、4mGB、そして1mGBの回収率を算出した。その結果、回収率はアンモニア濃度5%、液量9 mLが最適で、100%となった。アミノプロピル樹脂とGSL類硫酸基の保持、溶出機構を考慮すると、アンモニア濃度が高いほど溶出力は高まり、文献値（Rochfortら、J. Chromatogr. A 1120: 205-210, (2006)）の2%では充分ではないことが分かった。溶出液は定容後、一部をdry upするので、9 mLという液量も好適と判断した。
【００４９】
３．LC-MS供試試料
前項の溶出液をメタノールで10 mLに定容し、その2 mLを4 mL容スクリューバイアルに分注した（図８を参照）。水を共沸留去させる目的で1-プロパノールを約1 mL添加し、40℃に設定したヒートブロックにバイアルを入れ、窒素気流で溶媒乾固した。これを0.1%（v/v）ギ酸水500μLに再溶し、LC-MS供試試料とした。LC-MSの条件は実施例１を参照。なお前項溶出液の残りは10 mL容スクリューバイアルに入れてマイナス30℃で保存した。
【００５０】
実施例３：GSL類の精製条件
ミリマスによる精密質量数の測定
１．炭酸アンモニウム移動相条件
GSL類のLC-MSにおける各ピークの分取条件を検討した。LC系には、移動相として、炭酸水素アンモニウムを用いたアルカリ性の移動相を採用した。カラムはDevelosil RPAQUEOUS（φ4.6×250 mm）（野村化学）を採択した。条件は以下のとおりである。
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【００５１】
本条件におけるLC-MSクロマトグラムを図９に示した。各GSLの溶出順は実施例１と全く同じであり、またピーク形状も実施例１図７と同様にシャープであった。A226のクロマトグラムを図７と比較すると、移動相グラジェントに伴うベースラインの上昇が見られず、非常にクリアであった。これは移動相A, BをアンモニアでpH 8.80に滴定しているためであり、水、MeCN共にUV末端吸収が非常に小さいことによる。各ピークを分取し、ミリマス測定のためにCE-TOFMSに供した。
【００５２】
２．キャピラリー電気泳動（CE）-TOFMS条件
機器はアジレントテクノロジーズ社G1600A CE、及びG1969A TOF-MSを用いた。測定はヒューマンメタボローム・テクノロジーズ社のプロトコールに従い行なった。分離は内径50μm、長さ１mのフューズドシリカキャピラリーカラムを使用した。移動相はヒューマンメタボローム・テクノロジーズ社ヌクレオチド分析用キットを使用した。分離は30 kVで行い、キャピラリーカラムの温度は20℃で行った。ESI-MSはネガティブイオンモードで行い、TOF-MSのキャピラリー電圧を3500Vにセットして測定した。マス軸校正用としてリファレンス物質１（(M-H)-精密質量数: 119.0350）とリファレンス物質２（(M-H)-精密質量数: 667.2872）を使用した。定量、及び時間補正用の内部標準物質として内部標準物質１（(M-H)-精密質量数: 231.0697）、内部標準物質２（(M-H)-精密質量数: 209.0092）を使用した。データの評価は付属のアプライド・バイオシステムズ社のアナリスト・ソフトウェアを使用した。この方法はSogaら、J. Chromatogr. A 1159: 125-133, (2007)に基づくものである。
【００５３】
各GSLの精密質量数を測定した結果、以下の表１に示したように、理論値に極めて近い実測値が得られ、それぞれの分子式が一義的に定められた。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
実施例４：標品GSL類を使っての検量線作成
１．試料液調製
実施例１においてブロッコリースプラウトから検出され、実施例３において分子式が同定されたGI、PG、GR、GEおよび市販リストにあったエピプロゴイトリン（EP）、glucotropaeolin（Gtr）、gluconasturtiin（Gnas）、sinalbin（Sin）、グルコナピン（GN）、グルコラフェニン（GRe）、そしてグルコシバリン（Gsi）を入手し（Department of Natural Sciences, Faculty of Life Sciences University of Copenhagen, Denmark）、精密に秤量して分析標品とした。それぞれを0.1%（v/v）ギ酸水溶液として以下のように調製した。SGについては和光純薬工業株式会社から購入したものを用いた。
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【００５６】
以上12種類のGSL類について、濃度範囲1,000倍の間で10点の溶液をオートサンプラー用バイアル内に調製した。オートサンプラーは10℃で冷却し、実施例１の酢酸アンモニウム条件（条件２（II））でLC-MSを実施した。得られた結果の解析は、Waters社LC-MS解析ソフト「MassLynx」に付属の「QuanLynx」により自動で行ない（図１０を参照）、各GSLのm/z値で得られたピークの面積値を、Microsoft社Excelにエクスポートして検量線を作成した。実施例３で分子式が確定していたGI、PG、SG、GR、GEについては標品のカラム溶出時間がそれぞれの推定ピークと一致したことから、これをもって完全同定とした。
【００５７】
２．検量線について
各GSLについて、作成した検量線を図１１、１２および１３に示した。市販標品はいずれもカリウム塩・１水和物であったので、x値（物質量）をプロトン型・無水物に換算して検量線を作成した。定量可能範囲（ダイナミックレンジ）すなわちx軸の範囲が３桁に及ぶ物質量に対して、いずれも良好な直線性が得られ、信頼係数R2値は0.99という極めて高い水準に達した。定量分析にあたり、試料は検量線の直線範囲に入るように調製することが必要だが、ダイナミックレンジ３桁という広い範囲で直線性が保証されたことは、今回構築したLC-MS分析系が非常に使いやすいものであることを意味する。GIおよびGRは側鎖のメチルスルフィニル特異的開裂により親イオンのシグナル強度が減弱することが予想されたが（実施例１図４を参照）、実際に検量線の傾きはSGが121,236であるのに対し、GIおよびGRはそれぞれ83,903および69,926と、低い値になった（図１１を参照）。
【００５８】
BS中には顕著なピークとして検出されなかったGSL類、すなわちGtr、Gnas、Sinの検量線を図１２に、そしてGN、GRe、Gsiの検量線を図１３に示した。分析対象の植物中に含まれていない成分であれば、内部標準に選定することが可能である。
【００５９】
実施例５：SGを外部標準としたGRの定量
１．BSとブロッコリー花蕾（青果物）中に含まれるGRの定量
ブロッコリースーパースプラウト（BS）（株式会社村上農園）と、国産で新鮮なブロッコリー花蕾（青果）を購入し、実施例２に従って分析試料を調製し、実施例１のLC-MS条件で分析を行なった。外部標準としてSGの0.1%（v/v）ギ酸水溶液3.2μg/50μLをインジェクトした。結果を図１４に示した。分析シリーズに都度に供試しているSGのMS強度（m/z 358）で補正を行ない（外部標準法）、GRのMS強度（m/z 436）が検量線のy軸範囲に含まれることを確認した上で、GR量を定量した。試料生重量100 mgあたりに換算すると、含有GR量はBSおよび花蕾青果でそれぞれ321μgおよび422μgと算出された（図１４を参照）。
【００６０】
実施例６：SGを外部標準としたGSL類の分析
１．BSとブロッコリー花蕾（青果）中に含まれるGSL類の分析
実施例５で得られた各GSL類のMS強度実測値そのものについて、試料生重量100 mgあたりに換算した。この場合、各GSL類の検量線の傾きが同じであるかのような仮定が盛り込まれるので、注意が必要であるが、標品が存在しないGSL類も含めて比較、評価する際に、有用なグラフが得られる（図１５を参照）。
【００６１】
実施例７：側鎖にインドール環構造を有するGSL類の精製
１．GSL類画分の調製
側鎖にインドール環構造を有するGSL類であるGB、4mGB、1mGB（図６を参照）は、ブロッコリーを含むBrassica oleraceaに広く含有される成分であるが、市販標品が存在しない。特に4mGBと1mGBは構造異性体の関係にあり、分子式が同じなので精密MSでも区別できない（表１を参照）。そこでNMRに供するために、３成分をケール（B. oleracea）葉から精製することとした。実施例１と同様に、F.W. 1 kg程度のケール葉をサンプリングし、オートクレーブでブランチング処理した後、ジューサーミキサーで抽出を行い、抽出原液を200 mL得た（図１６を参照）。さらに、残渣を回収し、再度熱水で抽出を行ない、3,000 rpmで10分間遠心分離し、上清を洗液として回収した。各画分の一部を真空凍結乾燥することで、乾燥重量を求めた（図１６を参照）。凍結乾燥によりGB類が自己触媒的に反応を起こし、水に不溶性の物質に変化してしまうことが予備試験で分かったので、以降の工程には凍結乾燥を使わないこととした。
【００６２】
極性が低い夾雑物を除去するために、等容の酢酸エチルで３回洗浄した（図１６を参照）。得られた抽出原液（GSL類移行画分）にギ酸を添加して0.1%（v/v）ギ酸溶液とし、そのD.W. 617 mgずつをSep-Pak（登録商標） Vacアミノプロピル（Waters社）固相抽出（10 g樹脂）に供して、実施例１と同様にAPAFを調製した（図１７を参照）。合計7.4g（F.W.）の抽出原液を供し、得られた溶出液を減圧濃縮し、APAF水溶液を約5 mL得た（図１７を参照）。
【００６３】
２．GB類の精製
GB、4mGB、1mGBはGSL類の中でも極性が低く、逆相カラムでより強く保持される（図３、７、９を参照）。そこでC30ではない逆相カラムであっても保持されると予想し、アルカリ耐性が非常に強いXBridgeブランド（Waters社）のカラムを採用した。HPLC条件は以下の通りである。
カラム：Waters XBridge Shield RP18-5（φ10 mm×250 mm）
温度：40℃
流速：2 mL/min
移動相A：10 mM炭酸水素アンモニウム水（pH 10.0）
移動相B：10 mM炭酸水素アンモニウムin 50% (v/v) MeCN／水（pH 10.0）
【００６４】
実施例３と同様のコンセプトで、分取精製物の乾燥を容易にするために、移動相として炭酸水素アンモニウム系を用いた。本カラムはC30よりも強いアルカリ耐性を持つので、炭酸水素アンモニウムの緩衝能を最大限に発揮させるためにpHを10.0に調整し、カラムオーブン温度を40℃に引き上げた。精製クロマトグラムを図１８に示した。３成分はインドール構造を有することから、A226に加えて、A280でもモニター可能であった。移動相としてはグラジェントまたはイソクラティック条件が好ましく、まず３成分を分取できるイソクラティック条件（75％A、25%B）で精製を行なった（図１８を参照）。APAF水溶液を一度に500μLもインジェクトしているので、カラムにとってはかなり高負荷であると考えられたが、３成分は問題なく分離された。
【００６５】
ピーク形状をよりシャープにするために、以下のグラジェントを組んだ。この条件でも３成分を効率的に分取精製でき得る。特にHPLCを開始後16分以内で３成分を分取精製できることは、グラジェント条件の大きなメリットであった。本条件での典型的クロマトグラムを図１９に示した。
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【００６６】
分取液の一部をグラジエント条件でのHPLCに供した。それぞれの純度検定結果を図２０、２１および２２に示した。A280はベンゼン環に特徴的なものなので、純度検定はより短波長側のA226で行なった。純度はいずれも良好であり、GB、4mGBおよび1mGBのA226モニターでのHPLCで求めた値は、それぞれ92.4、95.2および96.8%となった。
【００６７】
分取した３成分をそれぞれ減圧濃縮し、水を共沸させる目的で1-プロパノールを加えて、乾固させた。それぞれを4 mL容スクリューバイアルに洗い込み、40℃のヒートブロックにバイアルを入れて、窒素気流で乾固させた。GB、4mGBおよび1mGBはそれぞれ8.7 mg, 3.6 mg, 6.8 mg得られた。
【００６８】
３．1H NMRによる物質同定
GB、4mGBおよび1mGBは市販標品がないもののいずれも既知物質である。そこで1H NMRを測定し、そのスペクトルデータを既報の値（Presteraら、Anal. Biochem. 239: 168-179, 1999, Agerbirkら、Anal. Biochem. 49: 1502-1507, 2001, Truscottら、J. Agric. Food Chem. 31: 863-867, 1983を参照）と比較して一致を確認し、実施例３で既得の精密質量数のデータ（表１）と合わせれば、３成分を完全同定することができる。そこで上項で分取した３成分について、それぞれD2Oに溶解し、1H NMRを測定した（Bruker社、Bruker AMX-400（400 MHz）、17℃）。
【００６９】
得られたスペクトルを図２３、２４および２５に示した。それぞれの側鎖プロトンのケミカルシフト値が文献値と一致し、精密質量数から分子式が一義的に定められていることから（表１）、GB、4mGB、1mGBをそれぞれグルコブラシキン、4-メトキシGB、1-メトキシGB（ネオグルコブラシキン）と同定した。
【００７０】
実施例８：GB, 4mGB, 1mGBの検量線作成
１．試料液調製
実施例４と同様に、精製した３成分から試料液を調製した。溶液中の物質の安定性、および溶解性を考慮し、2 mLの2.5%アンモニア水／MeOHで溶解させた。GBのみ一部不溶化物を生じたので、バイアルを2,000 rpmでスピンダウンし、上清を用いた。上清の100μLを分取し、窒素ガスで乾固させ、上清のGB量を秤量した。上清の一部を実施例７と同様にグラジエント条件でのHPLCに供し、純度検定を行なった。結果、上清に溶けているGBは5.4 mgであり、純度はA226モニターで91.6%と良好で（図２６）、図２６のクロマトグラムのパターンは図２０と一致したので、上清には夾雑物の混入がないことが確認された。よってGB溶液の真の濃度は2.5μg/μLとなった。
【００７１】
試料液は以下のように調製した。
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【００７２】
以上のインドール系GSL類について、濃度範囲1,000倍の間で調製した10点の溶液をオートサンプラー用バイアル内に調製した。オートサンプラーは10℃で冷却し、実施例１の酢酸アンモニウム条件（条件２（II））でLC-MSを実施した。得られた結果の解析は、Waters社LC-MS解析ソフト「MassLynx」に付属の「QuanLynx」により自動で行ない（図１０を参照）、各GSLのm/z値で得られたピークの面積値を、Microsoft社Excelにエクスポートして検量線を作成した。
【００７３】
２．検量線について
GB, 4mGB, 1mGBについて、作成した検量線を図２７に示した。なおこれらのGSL類はいずれもアンモニウム塩として単離しているので、検量線はそれぞれプロトン型に換算して作成した。実施例４（図11、12、および13を参照）と同様にインドール系GSL類についても、定量可能範囲（ダイナミックレンジ）すなわちx軸の範囲が３桁に及ぶ物質量に対して、いずれも良好な直線性が得られ、信頼係数R2値は0.99という極めて高い水準に達した。1mGBは側鎖のメトキシ基が特異的に開裂するので、親イオンのシグナル強度が減弱することが予想されたが（実施例１図５を参照）、実際に検量線の傾きはGBおよび4mGBが約550,000であるのに対し、1mGBは245,550と、低い値になった（図２７を参照）。外部標準SGの検量線の傾きは実施例４で算出された値の約３倍になっており、これは定期メンテナンスでMS検出器の感度が非常に良好になったことに起因する。MS検出器のコンディションは常に変わりうるので、SGを外部標準に定めるのには大きな意味がある。
【００７４】
実施例９：SGを外部標準としたGSL類の定量
実施例６で用いたブロッコリー試料のMSのDATAを、実施例４および実施例８の検量線に当てはめ、各GSLの定量を行なった。その際、SGを外部標準として用いた。結果を図２８に示した。図２８上がMS強度をy軸にしたグラフ（図15と同じ）、図２８下がμgをy軸にしたグラフである。両者を比較すると、含有GSL類のイメージプロファイルは酷似しているが、実測値（下図）では、GEとGBが低く算出された。その傾向を踏まえた上であれば、y軸にMS強度を指定したグラフ（図２８上）も非常に有用である。
【００７５】
実施例１０：GSL類LC-MS分析系の改変
１．GSL類画分の調製
上記実施例１の１．GSL類画分の調製で調製したAPAFを次項のLC-MS検討用試料として用いた。
２．LC条件
LC系には、野村化学のDevelosil（商標）RPAQUEOUS-AR-3（φ3.0×150 mm）を用いた。これはC30樹脂を使ったカラムであり、カラムボリュームは1.06 mLとなる（図２９）。実施例１で用いたカラムは4.15 mLのボリュームなので、カラムを約1/4にスケールダウンしたこととなる（図２９）。移動相の流速は、0.5 mL/minに設定した。MS検出器にスプリットレスで導入させるためである。
【００７６】
移動相条件を以下に記した。
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【００７７】
図２９に典型的クロマトグラムを示した。カラムボリューム1/4、流速1/2の改変により、HPLCの時間を従来法（実施例１、図7）のおよそ半分にすることができると考えられ、予想通りの結果が得られた。上に示したグラジェントの平衡化時間10分は必要で、これを5分にすると各GSL類の溶出時間が少しずつ早くなる不具合が発生した。
【００７８】
３．MS検出感度の向上
スプリットレス化により、MS検出器にインジェクト試料全量が導かれるので、MS検出感度の向上が期待された。図３０にAPAF溶液を50, 20, 10, 5μLインジェクトした時のLC-MSクロマトグラム（TIC）を示した。従前の50μLインジェクトではGRのサチュレートが見られ、インジェクト量を減じていくに従ってピーク形状は良好となり、5μLのインジェクトで適切なクロマトグラムが得られた（図３０）。
【００７９】
さらに、MS検出器の信号取り込み間隔を改変した。従前は0.1 s /１ポイントであり、GSL類のうち最もシャープなピークとなるGEでも、１ピークを210ポイントで形成していた（図３１）。それではS/N比が悪くなり、またDATAとしても過重となる。そこで取り込み間隔を0.6 s/１ポイントに改変した。これによってGEピークが35ポイント、最も太いGRピークが90ポイントとなる（図３２）。実際に0.6 s/１ポイントで取ったクロマトグラムを図３３に示した。従来と比べてピークは滑らかになった。S/N比がよくなった分、各GSL類の検出感度が約1.2倍に向上した（図３４）。
【００８０】
実施例１１：前処理法の効率化、多検体対応
実施例２および図８記載の処理法では、弱陰イオン交換樹脂としてアミノプロピル（AP）を用いている。実施例１０に記載した検討により、MS検出感度が約１０倍になったので、AP固相抽出のステップをスケールダウンし、多検体に対応できるように改変した。
【００８１】
APと同じく弱陰イオン交換モードを有し、操作中に空気が入っても問題なく、さらに96-well製品があるのがOasis（登録商標） WAX樹脂（Waters社）である（図３５）。AP 500 mg樹脂とWAX 225 mg樹脂の固相抽出効果を比較するために、図３６に示したプロトコルで実験を行なった。供試試料は「ハイクロップ」葉とした。AP樹脂500 mgに対してWAX樹脂は225 mgと半分なので、WAX樹脂には400μL試料をアプライした。洗浄、溶出操作は同じとし、２者のクロマトグラムを直接比較できるように、LC-MSへのインジェクト量をAPで5μL、WAXで10μLとした（図３６）。結果を図３７に示した。両者のクロマトグラムは同じパターンを呈した。各GSLのMS強度を比較すると、両者はほぼ同じ数値になった（図３８）。これをもってAP樹脂はWAX樹脂で代替え可能と判断した。
【００８２】
次にWAX樹脂量のスケールダウン、96-well製品対応の検討を行なった。96-wellタイプのWAXの樹脂量は30 mgなので、まず樹脂量30 mgのカートリッジで検討を行なった（図３９）。WAX 30 mg樹脂にどれくらいの試料をアプライでき得るかを定めるために、「ハイクロップ」葉抽出液の100, 200μLをアプライした（図３９）。溶出液を900μLとした場合の溶出液量は943μLであり、そこからそれぞれ500μLを分取し、ドライアップ後、LC-MSに供した（図３９）。GSL類の分析結果を図４０に示した。200μLアプライでは数値がわずかに低くなっており、これはアプライ試料がWAX 30 mg樹脂のイオン交換容量を超えた、すなわちリークと考えられた。それに対して100μLアプライでは上段で検討したWAX 225 mgでの値に一致した（図４０）。これをもって最適アプライ量を100μLと定めた。
【００８３】
続いて図４１に示したプロトコルに従って、96-wellタイプのWAX樹脂（30 mg）の検討を行なった。AP樹脂500 mgカートリッジを対象とし、B. oleracea 16品種の展開最若葉を供試した。AP樹脂でのプロトコルは実施例２および図８記載のプロトコルと同じだが、ただ１点、溶出液を9 mLとした場合の溶出液量を10.7 mLと定めた（図４１）。フィルアップ工程を簡略化するためである。WAXでのGSL類分析結果を図４２、APでの分析結果を図４３に示した。図４２と図４３のy軸単位はそれぞれのGSL類のMS強度であり、供試した16品種において、含有GSL類の分析値は、ほぼ一致していた。これをもって96-wellタイプのWAX樹脂を用いた前処理法が確立された。
【００８４】
実施例１２：標品および精製GSL類を使っての検量線作成
実施例４および実施例８と同様に各GSL類の希釈液を調製し、実施例１０で確立した改変LC-MS分析に供試し、検量線を作成した。結果を図４４−１〜３に示した。いずれもダイナミックレンジ３桁という広い範囲で良好な直線性が得られ、信頼係数R2値は0.98から0.999という極めて高い水準に達した。
【００８５】
GEのみ、その0.1％ (v/v) ギ酸溶液が冷蔵保存中に分解してしまったので、改めて秤量して水に溶かし、希釈列を作り直した。GEの検量線を図４５に示した。極めて良好な直線性が得られ、これで１５種類のGSL類の定量分析系が整った。
【００８６】
実施例１３：シナルビン（Sin）、SGの添加回収試験
Sin（実施例４および図１２の構造式を参照）は、これまでB. oleraceaから検出されたことがないので、これを用いてLC-MS分析系での添加回収試験を行なった。Sin添加試料は実施例２および図８記載のプロトコルに従って調製した。供試試料はサボイタイプのケール「カーボロネーロ」の葉を用いた。
【００８７】
19.2 ngのSin（K塩1水和物）を添加した結果、回収率は89.9％と良好であった。「カーボロネーロ」葉にはSGが含まれていないので（検出限界以下）、133 ngのSGを添加して分析した結果、回収率は80.9％となり、こちらも良好な値となった。
【００８８】
LC-MS分析ではMS検出器の感度が変動しやすい傾向があるので、実施例９に記載したように、外部標準物質が必要である。また、試料に含まれるGSL類の抽出効率は都度に異なるので、内部標準物質を設けるのがより望ましく、B. oleracea分析に際してはSinを用いればよい。またSGはSinよりも入手が容易なので、SGが含まれない試料については、SGを内部標準と定めてもよい。
【００８９】
実施例１４：Sinを内部標準としたGR定量分析
神奈川県産ブロッコリー市販青果（花蕾）、およびレッドキャベツスプラウト（村上農園）について、Sinを内部標準として加え、GRの定量分析を行なった（３連）。試料は図４６のプロトコルに従って調製した。
【００９０】
Sinの回収率は、それぞれ99.3±12.7％、91.0±10.0％と極めて良好であった。内部標準で補正を行ない、GRを定量した結果、それぞれ120±12μg/100 mg（FW）、153±10μg/100 mg（FW）と算出された。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明のＣ３０カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより、アブラナ科植物由来の試料中に含まれるGSL類を精製および分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】グルコシノレート（GSL）からイソチオシアネート（ITC）への変換を示す模式図である。
【図２】ブロッコリースプラウトからのＧＳＬ類画分の調製法を示す図である。
【図３】Ｃ３０ギ酸ＭｅＣＮ条件でのLC-MSの結果を示す図である。
【図４】ＧＳＬ分子種のＭＳスペクトルを示す図である。ノミナル（整数値）ＭＳで各ピークを推定した。Ａ：グルコイベリン（ＧＩ）、Ｂ：プロゴイトリン（ＰＧ）、Ｃ：グルコラファニン（ＧＲ）、Ｄ：グルコエルシン（ＧＥ）、のＭＳスペクトルを示す。
【図５】ＧＳＬ分子種のＭＳスペクトルを示す図である。ノミナル（整数値）ＭＳで各ピークを推定した。Ａ：グルコブラシキン（ＧＢ）、Ｂ：４−メトキシＧＢまたは１−メトキシＧＢのＭＳスペクトルおよび構造式を示す。
【図６】ブロッコリースプラウトから検出されたGSL類の構造式を示す図である。
【図７】Ｃ３０ギ酸アンモニウムＭｅＣＮ（ｐＨ３．７５）条件でのLC-MSの結果を示す図である。
【図８】GSL類分析試料の調製方法を示す図である。
【図９】Ｃ３０炭酸水素アンモニウムＭｅＣＮ（ｐＨ８．８０）条件でのLC-MSの結果を示す図である。
【図１０】MSデータ自動解析ツール「QuanLynx」を示す図である。
【図１１】標品GSL類の検量線（LC-MS分析系）を示す図である。Ａ：シニグリン（ＳＧ）、Ｂ：グルコラファニン（ＧＲ）、Ｃ：グルコイベリン（ＧＩ）、Ｄ：グルコエルシン（ＧＥ）、Ｅ：プロゴイトリン（ＰＧ）、Ｆ：エピプロゴイトリン（ＥＰ）の検量線を示す。
【図１２】標品GSL類の検量線（LC-MS分析系）を示す図である。Ａ：glucotropaeolin（Ｇｔｒ）、Ｂ：gluconasturtiin（Ｇｎａｓ）、Ｃ：sinalbin（Ｓｉｎ）の検量線および構造式を示す。
【図１３】標品GSL類の検量線（LC-MS分析系）を示す図である。Ａ：グルコナピン（ＧＮ）、Ｂ：グルコラフェニン（ＧＲｅ）、Ｃ：グルコシバリン（Ｇｓｉ）の検量線および構造式を示す。
【図１４】ブロッコリー中のＧＲ定量分析結果（ＦＷ １００ｍｇ中）を示す図である。Ａ：シニグリン（ＳＧ）、Ｂ：グルコラファニン（ＧＲ）のLC-MS検量線を示す。Ｃ：Ａ，Ｂの検量線を基に試料ＦＷ１００ｍｇあたりのＧＲを算出した。
【図１５】ブロッコリー中のGSL類分析結果（ＦＷ １００ｍｇ中）を示す図である。
【図１６】ケール葉からのＧＢ類精製法を示す図である。
【図１７】ＧＢ類精製のためのアミノプロピル固相抽出法（ラージスケール）を示す図である。
【図１８】最終精製ＨＰＬＣ：ＡＰＡＦ ５００μＬインジェクト（ＵＶ２２６ｎｍモニター）、液相：イソクラ（７５％Ａ、２５％Ｂ）、ｐＨ８．８０から１０.０の条件を用いた、GB類の精製ＨＰＬＣの結果を示す図である。Ａ：グルコブラシキン（ＧＢ）、Ｂ：４−メトキシＧＢ（４ｍＧＢ）、Ｃ：１−メトキシＧＢ（１ｍＧＢ）を示す。
【図１９】GB類の精製ＨＰＬＣ（Ａ２２６ｎｍモニター）の結果を示す図である。Ａ：グルコブラシキン（ＧＢ）、Ｂ：４−メトキシＧＢ（４ｍＧＢ）、Ｃ：１−メトキシＧＢ（１ｍＧＢ）を示す。
【図２０】GBの純度検定ＨＰＬＣ（２２６ｎｍモニター）の結果および構造式を示す図である。GBの純度は92.4％であった。
【図２１】４ｍGBの純度検定ＨＰＬＣ（２２６ｎｍモニター）の結果および構造式を示す図である。４ｍGBの純度は95.2％であった。
【図２２】１ｍGBの純度検定ＨＰＬＣ（２２６ｎｍモニター）の結果および構造式を示す図である。１ｍGBの純度は96.8％であった。
【図２３】GBの1H NMRスペクトル（４００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）の結果および構造式を示す図である。
【図２４】４ｍGBの1H NMRスペクトル（４００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）の結果および構造式を示す図である。
【図２５】１ｍGBの1H NMRスペクトル（４００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）の結果および構造式を示す図である。
【図２６】検量線供試ＧＢ（上清）の純度検定ＨＰＬＣ（２２６ｎｍモニター）の結果および構造式を示す図である。検量線供試ＧＢ（上清）の純度は91.6％であった。
【図２７】ＧＢ類の検量線（LC-MS定量分析系）を示す図である。Ａ：シニグリン（ＳＧ）、Ｂ：４−メトキシＧＢ（４ｍＧＢ）、Ｃ：グルコブラシキン（ＧＢ）、Ｄ：１−メトキシＧＢ（１ｍＧＢ）のLC-MS検量線を示す。
【図２８】ＧＳＬ類の定量値（LC-MS定量分析系）を示す図である。
【図２９】カラムのサイズダウンと移動相グラジェントの最適化によるクロマトグラムを示す図である。改変法はスプリットレスであり、従前法は１/４スプリットである。
【図３０】インジェクト量の検討の結果を示す図である。改変法はスプリットレスであり、従前法は、１/４スプリットである。
【図３１】MS検出器シグナル取り込み時間の最適化の結果を示す図である。
【図３２】MS検出器シグナル取り込み時間の最適化の結果を示す図である。
【図３３】MS検出器シグナル取り込み時間の比較の結果を示す図である。
【図３４】MS検出器シグナル取り込み時間の比較の結果を示す図である。
【図３５】アミノプロピル樹脂とWAX樹脂（弱陰イオン交換樹脂）の構造を示す図である。
【図３６】GSL類分析試料の調製（APとWAXの比較検討）方法を示す図である。
【図３７】APとWAXの比較の結果（LC-MSクロマトグラム）方法を示す図である。
【図３８】APとWAXの比較（GSL類定量値）を示す図である。
【図３９】GSL類分析試料の調製（WAXのスケールダウン）方法を示す図である。
【図４０】WAXアプライ試料量の検討（GSL類定量値）の結果を示す図である。
【図４１】GSL類分析試料の調製（WAX 96-well導入の検討）方法を示す図である。
【図４２】GSL類分析結果（WAX 96-well使用）を示す図である。
【図４３】GSL類分析結果（AP使用）を示す図である。
【図４４−１】各GSLのLC-MS検量線を示す図である。A: SG, B: GR, C: GI, D: PG, E: GN, F: GB。
【図４４−２】各GSLのLC-MS検量線を示す図である。G: 4mGB, H: 1mGB, I: EP, J: GRe, K: SG, L: Sin。
【図４４−３】各GSLのLC-MS検量線を示す図である。M: Gtr, N: Gnas, O:Gsi。
【図４５】GEのLC-MS検量線を示す図である。
【図４６】Sinを内部標準としたGRの定量分析方法を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４４−３】
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【図４５】
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【図４６】
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