(57)【要約】【課題】  ＭＩＦによって引き起こされる障害、及び血管系障害に対して効果が高く、副作用の少ない予防又は治療剤を提供すること。【解決手段】  抗チオレドキシン抗体のポリペプチドを有効成分とするマクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害、及び血管系障害の予防又は治療剤とする。特に、抗チオレドキシン抗体が、マクロファージ遊走阻止因子の細胞内への移行を抑制すること、又は、白血球の血管内皮細胞への接着を阻害することを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗チオレドキシン抗体のポリペプチドを有効成分とするマクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害、及び血管系障害の予防又は治療剤。
【請求項２】
前記抗チオレドキシン抗体が、マクロファージ遊走阻止因子の細胞内への移行を抑制することを特徴とする請求項１に記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
前記抗チオレドキシン抗体が、白血球の血管内皮細胞への接着を阻害することを特徴とする請求項１に記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
前記抗チオレドキシン抗体が、ヒトチオレドキシンに対する抗ヒトチオレドキシン抗体であることを特徴とする請求項２又は３に記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
前記抗ヒトチオレドキシン抗体が、ADF１１抗体又はＡＤＦ２１抗体であることを特徴とする請求項４に記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
前記マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害が、Ｔ細胞、単球・マクロファージ、樹状細胞、メサンギウム細胞、セルトリ細胞、ケラチノサイト、滑膜細胞、アストロサイト、癌細胞、粘膜及び脳下垂体からなる群より選択されるいずれか一つの細胞又は組織における炎症によるものである請求項２に記載の予防又は治療剤。
【請求項７】
前記マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害が、慢性リウマチ様関節炎、動脈硬化、子宮内膜症、急性呼吸急迫症候群、気管支喘息、腎臓移植による障害、急性心筋梗塞、糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、腎炎、肝炎、肺炎、関節炎、ＩｇＡ腎症、エンドドキシンショック、感染症による敗血症からなる群より選択されるいずれか１つである請求項２に記載の予防又は治療剤。
【請求項８】
前記血管系障害が、高脂血症、アテローム性疾患、心筋梗塞及び脳卒中からなる群より選択されるいずれか１つである請求項３に記載の予防又は治療剤。
【請求項９】
抗チオレドキシン抗体のポリペプチドを有効成分とし、マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害及び血管系障害の予防又は治療のための製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗チオレドキシン抗体のポリペプチドを有効成分とする予防又は治療剤に関し、詳しくは、抗チオレドキシン抗体のポリペプチドを有効成分とするマクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害、及び血管系障害の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
チオレドキシン（以下「ＴＲＸ」と略記する）は、その活性部位配列〔−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−〕の２つのシステイン残基間でのジスルフィド／ジチオール交換反応による酸化還元（レドックス）活性を有する１２ｋＤａの多機能ポリペプチドである（非特許文献１）。チオレドキシンは、大腸菌のデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）合成に必須な酵素であるリボヌクレオチドリダクターゼに水素イオンを供与する補酵素として、大腸菌から単離されて以来、多くの原核生物、真核生物から単離同定されてきた。
成人Ｔ細胞白血病誘導因子（ＡＤＦ）は、本発明者らがＨＴＬＶ−１に感染したＴリンパ球によって産生されるＩＬ−２受容体誘導因子として最初に同定したもので、ヒトチオレドキシン（以下「ｈＴＲＸ」と略記する）である。ｈＴＲＸは、１０５個のアミノ酸によって構成され、その３２及び３５残基にシステインを有する。なお、細胞内には、ＴＲＸ以外に、活性部位配列〔−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−〕（Ｘは任意のアミノ酸）を持つ一連のタンパク質群が存在し、チオレドキシンスーパーファミリーと呼ばれ、細胞内外のレッドクス制御に重要な役割を果たすと考えられている。
【０００３】
細胞内ＴＲＸはラジカル消去や、activator protein‐1（ＡＰ−１）、nuclear factor‐kappa Ｂ（ＮＦ−κＢ）などのレドックスに関する転写因子の制御に重要な役割を果たしている（非特許文献２）。
ｈＴＲＸは、p38 mitogen activating protein kinase（ＭＡＰＫ）やapoptosis signal regulating kinase−1（ＡＳＫ−１）のシグナル伝達を制御する。
ＴＲＸが細胞外に放出され、サイトカインまたはケモカイン作用を示すこと（非特許文献３）、更には細胞外ＴＲＸが細胞内へ移行すること（非特許文献４）が本発明者らによって報告されてきた。
炎症過程において、白血球は活性化された内皮細胞に接着し、血液循環から組織損傷領域へ移る。本発明者らは、血液循環するＴＲＸがマウスの空気嚢モデルにおける好中球の浸潤を阻止することを報告している（非特許文献５）。
【０００４】
また、上記チオレドキシンスーパーファミリーの１つに、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）があり、このＭＩＦは、炎症部位中にマクロファージがランダムに遊走するのを阻止する炎症性サイトカインで、全身／局所の炎症と免疫応答に重要な役割を果たす（非特許文献６、７）。
ＭＩＦは、（リンパ球、マクロファージ等の）免疫担当細胞や、脳下垂体などから生体侵襲（例えば、酸化ストレスを引き起こすエンドトキシン、活性酸素、紫外線などの刺激）に即応して産生され、炎症性サイトカインカスケードの上流に位置し、（ＭＩＦが他の炎症性サイトカインの発現を誘導することによって）炎症反応を制御することが報告されている（非特許文献８、９）。ＭＩＦはオートクライン、パラクライン作用により細胞内に取り込まれ、炎症性サイトカインＴＮＦ−ａｌｐｈａ（α）やＩＬ−１の産生を誘導する。
他にも、ＭＩＦが、グルココルチコイドの抗炎症作用を抑制し、炎症反応を促進させること、Ｔリンパ球の活性化促進因子であること、さらにはｐ５３の機能を抑制することや、脂肪細胞・癌細胞等の増殖・分化に関与すること等、様々な生体反応に重要な役割を果たしていることなどが報告されている（非特許文献７、１０、１１）。
【０００５】
しかしながら、ＭＩＦは炎症作用を有するため、その過剰な産生が過度の炎症反応を引き起こし、（炎症を伴う）各種障害の原因となる。
ＭＩＦによって引き起こされる障害（疾病）は多岐に渡り、代表的なものとして、慢性リウマチ様関節炎等の遅延型アレルギー（IV型：細胞免疫性反応）が挙げられるが、近年、その関連疾患は拡大を見せ、動脈硬化、子宮内膜症などへの寄与も明らかにされている。他にも、急性呼吸急迫症候群（ＡＲＤＳ）の肺胞洗浄液、腎臓移植を受けた患者の拒絶反応時における尿、及び急性心筋梗塞、糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎患者で、血清中のＭＩＦ濃度が健常人と比べて顕著に上昇していることを示した報告などが挙げられる。
【０００６】
加えて、腎炎、肝炎、肺炎、関節炎、エンドドキシンショック等の動物病態モデルでは、抗ＭＩＦ中和抗体の投与群で明らかな改善効果が認められた（非特許文献１２）。
このことはＭＩＦの炎症作用がこれら病態の悪化に関与することを示す。
これらの文献の他、多数の文献において、ＭＩＦと各種疾患との関係について、詳しく報告されている（非特許文献１３〜２１）。
【０００７】
このように、ＭＩＦの制御は諸疾患の症状緩和に有益であり、本発明者らはＴＲＸがＭＩＦに直接結合することによって、ＭＩＦの活性を抑え、抗炎症作用を発揮することを見出し、ＭＩＦを原因とする各種障害の治療又は予防薬として、ＴＲＸを有効成分とする治療又は予防薬を提案している。
【０００８】
このようなＴＲＸに対する抗ＴＲＸ抗体については、ＡＤＦ、即ちｈＴＲＸに特異的に反応するモノクローナル抗体が作成されており、このモノクローナル抗体を用いたヒト体液中等のｈＴＲＸを測定する方法が提案されている（特許文献１）。また、抗ヒトＴＲＸ抗体が気道上皮細胞における好中球の遊走を阻害することが報告されている（非特許文献２２）。
【０００９】
しかしながら、ＴＲＸやＴＲＸスーパーファミリーについては、それらの効果について種々の報告があるものの、ＴＲＸに密接に関係するにもかかわらず、ＴＲＸスーパーファミリーには属さない抗ＴＲＸ抗体について、その効果、例えばマクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害、及び血管系障害に対する効果は、現在に至るまで報告されていない。
【００１０】
【特許文献１】特許第３３２３２５８号公報
【００１１】
【非特許文献１】Redox regulation of cellular activation Ann.Rev.Immunol.1997;15:351-369
【非特許文献２】AP-1 transcriptional activity is regulated by a direct association between thioredoxin and Ref-1 PNAS.1997;94:3633-3638
【非特許文献３】Circulating thioredoxin suppresses lipopolysaccharide-induced neutrophil chemotaxis PNAS.2001; 98: 15143-15148
【非特許文献４】Redox-sensing release of thioredoxin from T lymphocytes with negative feedback loops J.Immunol.2004;172:442-448
【非特許文献５】Nakamura H., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:15143-15148,2001.
【非特許文献６】Nishihira J., J Interferon Cytokine Res,(2000)20:751-762
【非特許文献７】Bucala R., FASEB J (1996) 7:19-24
【非特許文献８】Annual Reports in Medicinal Chemistry,第33巻,24頁,1998年
【非特許文献９】Advances in Immunology,第66巻,197頁,1997年
【非特許文献１０】Bernhagen J., et al Nature 365: 756-759,1993
【非特許文献１１】Calandra T., et al Nature 377: 68-71,1995
【非特許文献１２】International Journal of Molecular Medicine, 第2巻,17頁,1998年
【非特許文献１３】Makita H., et al. Am J Respir Crit Care Med 158:573-579,1998
【非特許文献１４】Kobayashi S., et al. Hepatology 29:1752-1759, 1999
【非特許文献１５】Mikulowaska A., et al. J Immunol 158:5514-5517, 1997
【非特許文献１６】Ichiyama H., et al. Cytokine 26:187-194, 2004
【非特許文献１７】Donnelly S.C., et al. Nat. Med. 3:320-323, 1997
【非特許文献１８】Mizue Y, et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:14410-14415,2005
【非特許文献１９】Yang N., et al. Mol. Med. 4:413-424, 1998
【非特許文献２０】Lan H.Y., et al. J Exp. Med. 185:1455-1465, 1997
【非特許文献２１】Leung J.C., et al. Nephrol. Dial Transplant 19:36-45, 2003
【非特許文献２２】Miller L.A., et al. J. Leukoc. Biol. 68: 201-208, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ＭＩＦによって引き起こされる障害、及び血管系障害に対して効果が高く、副作用の少ない予防又は治療剤の提供を主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究の結果、抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドが、ＭＩＦの細胞内への取り込みを抑制し、また、白血球の血管内皮細胞への接着を阻害することを見い出した。
このことから、抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドが、ＭＩＦによって引き起こされる障害、及び血管系障害に有効であるとの結論に達したため、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、請求項１に係る発明は、抗チオレドキシン抗体のポリペプチドを有効成分とするマクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害、及び血管系障害の予防又は治療剤に関する。
請求項２に係る発明は、前記障害が、マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害であることを特徴とする請求項１に記載の予防又は治療剤に関する。
請求項３に係る発明は、前記障害が、血管系障害であることを特徴とする請求項１に記載の予防又は治療剤に関する。
請求項４に係る発明は、前記抗チオレドキシン抗体が、マクロファージ遊走阻止因子の細胞内への移行を抑制することを特徴とする請求項１又は２に記載の予防又は治療剤に関する。
請求項５に係る発明は、前記抗チオレドキシン抗体が、白血球の血管内皮細胞への接着を阻害することを特徴とする請求項１又は３に記載の予防又は治療剤に関する。
請求項６に係る発明は、前記抗チオレドキシン抗体が、ヒトチオレドキシンに対する抗ヒトチオレドキシン抗体であることを特徴とする請求項４又は５に記載の予防又は治療剤に関する。
請求項７に係る発明は、前記抗ヒトチオレドキシン抗体が、ADF１１抗体又はＡＤＦ２１抗体であることを特徴とする請求項６に記載の予防又は治療剤に関する。
請求項８に係る発明は、前記マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害が、Ｔ細胞、単球・マクロファージ、樹状細胞、メサンギウム細胞、セルトリ細胞、ケラチノサイト、滑膜細胞、アストロサイト、癌細胞、粘膜及び脳下垂体からなる群より選択されるいずれか１つの細胞又は組織における炎症によるものである請求項２に記載の予防又は治療剤に関する。
請求項９に係る発明は、前記マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害が、慢性リウマチ様関節炎、動脈硬化、子宮内膜症、急性呼吸急迫症候群、気管支喘息、腎臓移植による障害、急性心筋梗塞、糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、腎炎、肝炎、肺炎、関節炎、ＩｇＡ腎症、エンドドキシンショック、感染症による敗血症からなる群より選択されるいずれか１つである請求項２に記載の予防又は治療剤に関する。
請求項１０に係る発明は、前記血管系障害が、高脂血症、アテローム性疾患、心筋梗塞及び脳卒中からなる群より選択されるいずれか１つである請求項３に記載の予防又は治療剤に関する。
請求項１１に係る発明は、抗チオレドキシン抗体のポリペプチドを有効成分とし、マクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害及び血管系障害の予防又は治療のための製剤に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る予防又は治療剤は、抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドを有効成分とするので、ＭＩＦの細胞内への取り込みを抑制することによって、ＭＩＦによって引き起こされる炎症反応、及び該炎症反応に起因する組織の線維化を抑制する効果を発揮することができ、白血球の血管内皮細胞への接着を阻害することによって、血管において白血球による炎症等を抑制する効果を発揮することができる。
従って、本発明に係る予防又は治療剤は、ＭＩＦによって引き起こされる障害、及び血管系障害に有効である。
【００１６】
さらに本発明に係る予防又は治療剤は、体内でも発現する内因性チオールタンパク質であるＴＲＸの抗体であるポリペプチドを有効成分とするため、副作用の心配がない、安全性の高い予防又は治療剤であるといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、活性化Ｔ細胞においては、その細胞表面に存在するＴＲＸを介してＭＩＦが細胞内に取り込まれるため、このＴＲＸに抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドが作用することによって、ＭＩＦの細胞内への取り込みを抑制することを見い出した。また、血管内皮細胞の膜表面に存在するＴＲＸによって白血球がこの血管内皮細胞へ接着するため、このＴＲＸに抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドが作用することによって、白血球の血管内皮細胞への接着を阻害することを見い出した。
このことから、抗ＴＲＸ抗体が、ＭＩＦによって引き起こされる炎症反応、及び該炎症反応に起因する組織の線維化を抑制する効果を発揮することができ、また、血管内皮に白血球が接着することによる炎症等を抑制する効果を発揮することができるので、ＭＩＦによって引き起こされる障害、及び血管系障害に有効であるとの結論に達し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明に係る抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドを有効成分とするマクロファージ遊走阻止因子によって引き起こされる障害、及び血管系障害の予防又は治療剤の実施形態について詳説する。
【００１８】
［抗チオレドキシン抗体］
本発明における抗ＴＲＸ抗体は、ＴＲＸに対する抗体である。
そのＴＲＸとしては、ヒトチオレドキシン（ｈＴＲＸ）やその他の「チオレドキシンファミリー」に属するものを挙げることができ、その活性中心である３２残基から３５残基に−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有するポリペプチド類を有するものが例示される。
これらのＴＲＸとしては、前記ＴＲＸの中でも活性中心に配列−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有する「ｈＴＲＸ」又は「ＴＲＸ２（ミトコンドリア特異的チオレドキシン）」が好ましく、特に「ｈＴＲＸ」が好ましい。
【００１９】
上記の活性中心を有するものであれば、チオレドキシンの由来は特に限定されず、ヒトを含む動物のチオレドキシン（ヒトを含む動物のＡＤＦ）、大腸菌などの細菌のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン；ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチド（ヒトＡＤＦＰ）；ヒト，大腸菌等のグルタレドキシン等が含まれる。特にヒトチオレドキシン及び酵母チオレドキシンが好ましい。
【００２０】
従って、抗ＴＲＸ抗体としては、活性中心に配列−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有するｈＴＲＸ又はＴＲＸ２に対する抗体、即ち抗ｈＴＲＸ抗体又は抗ＴＲＸ２抗体が好ましく、特に抗ｈＴＲＸ抗体が好ましい。
抗ＴＲＸ抗体は、ポリクローナル抗体を排除するものではないが、ＴＲＸと特異的に反応するモノクローナル抗体が好ましい。
また、本発明における抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドは、活性化Ｔ細胞において、その細胞表面に存在するＴＲＸを介してＭＩＦが細胞内に取り込まれるため、このＴＲＸに作用することによって、ＭＩＦの細胞内への取り込みを抑制し、また、血管内皮細胞の膜表面に存在するＴＲＸによって白血球がこの血管内皮細胞へ接着するため、このＴＲＸに作用することによって、白血球の血管内皮細胞への接着を阻害すると考えられる。よって、抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドは、ＴＲＸと特異的に反応することができれば、Ｆａｂ部分及びＦｃ部分を含む全体抗体であってもよいし、ＴＲＸのエピトープを認識するＦａｂ部分等を有する部分抗体であってもよい。
【００２１】
抗ｈＴＲＸ抗体としては、ｈＴＲＸであるＡＤＦに特異的に反応するモノクローナル抗体を挙げることができ、例えば受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１３０２５のハイブリドーマＡＤＦ１１株が産生するモノクローナル抗体ＡＤＦ１１、及び受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１３０２６のハイブリドーマＡＤＦ２１株が産生するモノクローナル抗体ＡＤＦ２１が例示される（特許第３３２３２５８号公報参照）。
なお、ＡＤＦ１１及びＡＤＦ１２のサブクラスは、いずれもＩｇＧ１（κ）であるが認識するエピトープが異なる。
上記抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドは、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することも可能である。
【００２２】
本発明に係る予防又は治療剤の投与経路としては、経口及び非経口のいずれでも投与することができ、臨床医によって適宜選択される。また有効成分である抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドを単独又は通常使用される担体と共に投与することができる。
【００２３】
本発明の予防又は治療剤を経口投与する場合は、薬剤の形態として、錠剤、丸剤、散剤、被覆錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の液状製剤、エアゾール剤、アトマイザー、ネブライザー等の吸入剤、及びリポソーム封入剤等が挙げられる。
【００２４】
本発明に係る予防又は治療剤は、上記の有効成分と共に薬学的に許容される製剤担体を用いて、医薬製剤の形態として実用される。該製剤担体としては、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、吸収促進剤、保湿剤、吸着剤、滑沢剤、充填剤、増量剤、付湿剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩、緩衝剤等の希釈剤又は賦形剤を例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
【００２５】
錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。
さらに錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができる。この剤皮の層の数によって二重錠、多層錠とすることができる。
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
【００２６】
本発明の予防又は治療剤を非経口投与する場合は、薬剤の形態として静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射及び腹腔内注射などに使用される注射剤（例えば、液剤、乳剤、懸濁剤）、液剤（例えば、点眼剤、点鼻薬）、懸濁剤、乳剤、点滴剤、吸入剤（例えば、エアロゾル剤、粉末吸入剤）等が挙げられる。
【００２７】
本発明の予防又は治療剤が液剤、乳剤、懸濁剤等の注射剤として調製される場合、これらは殺菌され且つ血液と等張であるのが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。
尚、この場合、等張性の溶液を調整するに充分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを本発明薬剤中に含有させてもよい。
また、通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
【００２８】
本発明の予防又は治療剤が液状製剤である場合は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存してもよい。凍結乾燥製剤は、使用時に注射用蒸留水等を加え、再度溶解して使用される。
【００２９】
本発明の予防又は治療剤を吸入剤として用いる場合、一般的に使用される従来公知の吸入剤用添加剤を使用して調製すればよい。この様な添加剤としては、例えば、噴射剤；白糖、乳糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の固形賦形剤：プロピレングリコール等の不活性液体のような液状賦形剤；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、白糖等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定化剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、レシチン、トリオレイン酸ソルビタン等の懸濁化剤；界面活性剤等の分散剤；水等の溶剤；塩化ナトリウム等の等張化剤；硫酸、塩酸等のｐＨ調整剤；エタノール等の可溶化剤等が挙げられる。
【００３０】
さらに、本発明に係る予防又は治療剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させて調製することもできる。
【００３１】
抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドの有効量は、当業者が従来の技術を参考に容易に決定することができるが、例えば、成人１人１日あたり０．１〜５ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．５〜１ｍｇ／ｋｇ程度である。
これを１日あたり１回又は数回に分けて投与することができるが、各種製剤の形態、患者の性別、年齢、疾患の程度に合わせて適宜調節することが好ましい。
【００３２】
また、本発明の抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドを有効成分とする製剤を、飲食品の形態で使用することもできる。飲食品の形態で使用する場合には、上記の抽出物に、原料である植物を加えて調製してもよい。
飲食品としては、例えば、健康食品、栄養補助食品（バランス栄養食、サプリメント等）、栄養機能食品、特定保健用食品、病者用食品等が挙げられる。これらの食品の製造方法は、特に限定されず、各用途で当業者によって使用されている方法に従えばよい。
【００３３】
飲食品としては、例えば、ガム、キャンディー、グミ、錠菓、クッキー、ケーキ、チョコレート、アイスクリーム、ゼリー、ムース、プリン、ビスケット、コーンフレーク、チュアブルタブレット、ウエハース、煎餅等の菓子類；炭酸飲料、清涼飲料、乳飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、果汁飲料、栄養飲料、アルコール飲料、ミネラルウォーター等の飲料類；粉末ジュース，粉末スープ等の粉末飲料；バランス栄養食；粉末、カプセル、錠剤等の形態を有するサプリメント；ドレッシング、ソース等の調味料；パン類；麺類；かまぼこ等の練り製品；ふりかけ等が挙げられる。
【００３４】
［マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）］
ＭＩＦは、ヒトをはじめ様々な動物種に存在し、１１４個のアミノ酸残基からなる分子量１２．３ｋＤａタンパク質で、分子内にレドックス活性領域であるＣｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓモチーフを有することから、チオレドキシンスーパーファミリーに属する。
ＭＩＦは、リンパ球のみならず、脳や腎臓など種々の臓器で発現し、特に腎臓では尿細管上皮細胞、皮膚や角膜では細胞増殖の盛んな基底膜細胞等で発現が強い。
ＭＩＦを発現する細胞・組織としては、Ｔ細胞、単球・マクロファージ、樹状細胞、メサンギウム細胞、尿細管上皮細胞、角膜上皮細胞、肝細胞、卵細胞、セルトリ細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、アストロサイト、癌細胞、粘膜、脳下垂体などを例示することができる。
【００３５】
本発明における抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドは、活性化Ｔ細胞において、その細胞表面に存在するＴＲＸを介してＭＩＦが細胞内に取り込まれるため、このＴＲＸに作用することによって、ＭＩＦの細胞内への取り込みを抑制することにより、ＭＩＦによる炎症及び炎症による線維化を抑えることができる。
また、抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドは、血管内皮細胞の膜表面に存在するＴＲＸによって白血球がこの血管内皮細胞へ接着するため、このＴＲＸに作用することによって、白血球の血管内皮細胞への接着を阻害することにより、血管内皮に白血球が接着することによる炎症等を抑制することができる。
本発明に係る予防又は治療剤は、抗ＴＲＸ抗体のポリペプチドを有効成分とするので、ＭＩＦによる炎症を抑制し、また、白血球の血管内皮細胞への接着を阻害することにより、ＭＩＦによって引き起こされる障害、及び血管系障害の予防又は治療に有効である。
【００３６】
本発明に係る予防又は治療剤が適用可能な疾患（障害）群、即ち、ＭＩＦによって引き起こされる障害について説明する。ＭＩＦによって引き起こされる障害とは、ＭＩＦによって起きる「炎症反応」、及び炎症反応に引き続く「組織の線維化」を引き起こすものであれば、特に限られるものではないが、後述する疾患を列挙することができる。
【００３７】
［障害］
本発明の予防又は治療剤が適用される障害は、ＭＩＦによって引き起こされる障害、及び血管系障害である。なお、本発明において、障害は疾患を含む広い概念で用いる。
ＭＩＦによって引き起こされる障害としては、ＭＩＦを発現する細胞・組織である、Ｔ細胞、単球・マクロファージ、樹状細胞、メサンギウム細胞、尿細管上皮細胞、角膜上皮細胞、肝細胞、卵細胞、セルトリ細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、アストロサイト、癌細胞、粘膜、脳下垂体などにおける炎症等が挙げられる。
このような障害には、上述したＭＩＦを発現する細胞・組織においてＭＩＦの炎症作用によって直接的に引き起こされる障害、及びＭＩＦによる間接的作用によって各種細胞・組織等において間接的に引き起こされる障害が含まれるものとする。
【００３８】
ＭＩＦによって引き起こされる障害の代表的なものとしては、遅延型アレルギー、慢性リウマチ様関節炎、動脈硬化、子宮内膜症、急性呼吸急迫症候群（ＡＲＤＳ）、気管支喘息、腎臓移植による障害、急性心筋梗塞、糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、腎炎（特に急速進行性糸球体腎炎）、ＩｇＡ腎症、肝炎（特に急性肝炎）、肺障害（例えば、好中球や単球の肺胞への浸潤、気管支肺胞洗浄液中への誘導や肺出血による肺障害）、肺炎（例えば、ＢＣＧ−ＬＰＳ誘導急性肝炎）、関節炎、関節リウマチ（特に typeII collagen関節炎及びadjuvant関節炎）、エンドドキシンショック、血小板減少に伴う感染症による敗血症などを列挙することができる。
【００３９】
また、血管系障害としては、高脂血症、アテローム性疾患、心筋梗塞、脳卒中等を列挙することができる。また、高脂血症による糖尿病性腎症も含まれる。
【００４０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
〔活性化Ｔ細胞表面に存在するＴＲＸの確認実験〕
活性化Ｔ細胞表面にＴＲＸが存在することを調べた。
【００４２】
〔実験材料〕
ＡＴＬ２細胞：ヒト成人型Ｔ白血病細胞株
Jurkat Ｔ細胞 :ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞株  （ウイルス研究所淀井淳司教授譲渡分）
抗ＴＲＸ抗体（ＡＤＦ１１抗体）：レドックス・バイオサイエンス社製
ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ４８８ラベルキット：インビトロゲン社製
ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製
Ｆｌｏｗｊｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ：Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社製
【００４３】
〔実験方法〕
ＡＴＬ２細胞１×１０６／ｃｅｌｌに、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ４８８ラベルキットで蛍光ラベルした抗ＴＲＸ抗体１００ｎｇ／ｍｌを添加し、４℃で３０分間静置した。その後、細胞を回収し、ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで洗浄してＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒにて測定し、Ｆｌｏｗｊｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって解析した。コントロール実験には活性化していないＴ細胞としてJurkat Ｔ細胞を用い、同様に実験した。
結果を図１に示す。
【００４４】
図１（Ａ）から、活性化Ｔ細胞であるＡＴＬ２細胞の表面には、抗ＴＲＸ抗体が作用（結合）するＴＲＸが局在することが確認された。一方、活性化していないＴ細胞であるJurkat Ｔ細胞には抗ＴＲＸ抗体は作用（結合）せずＴＲＸが局在していないことが確認された（図１（Ｂ））。
【実施例２】
【００４５】
〔抗ＴＲＸ抗体によるＭＩＦの細胞内への取り込み抑制確認実験〕
抗ＴＲＸ抗体によるＭＩＦの細胞内取り込みに対する影響を調べた。
【００４６】
〔実験材料〕
ＡＴＬ２細胞：ヒト成人型Ｔ白血病細胞株
組換え型ＭＩＦ（ＭＩＦ）：発現ベクターpQE30（キアゲン社製）を用いてHis tag付き組換え型ＭＩＦを大腸菌内で発現し、MagneHisTM Protein Purification System（プロメガ社製）によってカラム精製した。
抗ＴＲＸ抗体（ＡＤＦ１１抗体）：レドックス・バイオサイエンス社製
抗His tag抗体：プロメガ社製
マウスＩｇＧ：ＢＤ  ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ社製
【００４７】
〔実験方法〕
ＡＴＬ２細胞は、７５ｃｍ２フラスコで１０％ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン，１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。
２４穴プレートにＡＴＬ２細胞を１×１０６／ｃｅｌｌ加え、終濃度０，１及び１０μｇ／ｍｌの抗ＴＲＸ抗体と２５μｇ／ｍｌ組換え型ＭＩＦを加え、３７℃、０．５%ＣＯ２条件下で２４時間培養した。
培養後細胞を回収し、沈殿にＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を加え、１５%ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動後、ウエスタンブロット法を行い、抗His tag抗体によって細胞内に取り込まれたＭＩＦを検出した。
コントロールには、抗ＴＲＸ抗体に代えてマウスＩｇＧを用い、上記方法と同様にして実験を行った。
結果を図２に示す。
【００４８】
図２（Ａ）から、抗ＴＲＸ抗体存在下で、ＭＩＦのＡＴＬ２細胞内への取り込みが抑制され、図２（Ｂ）から、コントロールとして用いたマウスＩｇＧ存在下では、ＭＩＦのＡＴＬ２細胞内への取り込みが抑制されなかったことが判る。
実験例１及び２の結果から、活性化Ｔ細胞において、その細胞表面に存在するＴＲＸを介してＭＩＦが細胞内に取り込まれると考えられ、抗ＴＲＸ抗体がこのＴＲＸに作用することによって、ＭＩＦの細胞内取り込みを抑制したと考えられる。
さらに、Jurkat Ｔ細胞では組換え型ＭＩＦの取込みは確認できなかった（図２（Ｃ））。
このように細胞表面にＴＲＸが存在している細胞では組換え型ＭＩＦの取込みが確認され、抗ＴＲＸ抗体が細胞表面に存在するＴＲＸに作用することによって、ＭＩＦの細胞内取り込みを抑制することとなり、炎症応答を抑制することが示唆された。
【実施例３】
【００４９】
〔抗ＴＲＸ抗体によるＭＩＦ活性阻害確認実験〕
抗ＴＲＸ抗体によるＭＩＦの活性阻害について、炎症性サイトカインＴＮＦ−αの濃度を測定することによって確認した。
【００５０】
〔実験材料〕
ＲＡＷ  ２６４．７細胞：マウス由来マクロファージ細胞株（理化学研究所免疫・アレルギー科学総合研究センター  石井保之博士譲渡分）
組換え型ＭＩＦ（ＭＩＦ）：ＡＴＧＥＮ社製
ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）:ＳＩＧＭＡ社製
ＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡキット：Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社製
【００５１】
〔実験方法〕
ＲＡＷ  ２６４．７細胞は、７５ｃｍ２フラスコで１０％ ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン，１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。２４穴プレートにＲＡＷ ２６４．７細胞を１×１０６／ｃｅｌｌになるように加え、終濃度０及び５ｎｇ／ｍｌ ＭＩＦを加え、０，５００及び１０００ｎｇ／ｍｌの抗ＴＲＸ抗体を添加し、３７℃，５％ＣＯ２条件下で４時間静置した。
さらに、０及び１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを加え、３７℃，５％ＣＯ２条件下で４時間静置した後、培養液を回収した。
産生するＴＮＦ−ａｌｐｈａ（α）の量は、Ｄｕｏ Ｓｅｔ ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｍｏｕｓｅ ＴＮＦ−αキットにより測定した。
測定方法はキットに添付のプロトコールに従った。測定結果を図３に示す。
【００５２】
図３から、抗ＴＲＸ抗体は、ＭＩＦ由来のＴＮＦ−α産生を、５００ｎｇ／ｍｌ濃度では有意に抑制しなかったが、１０００ｎｇ／ｍｌ濃度では有意に抑制し、濃度依存的に抑制することが確認された。
【００５３】
実施例１〜３の結果から、抗ＴＲＸ抗体は、活性化Ｔ細胞表面に存在するＴＲＸに作用することによって、ＭＩＦの細胞内への移行を抑制することが確認された。
よって、抗ＴＲＸ抗体が結果的にＭＩＦの細胞内への移行を抑制することによって、ＴＮＦ−ａｌｐｈａの産生を抑制し、炎症応答を抑制することが確認された。
従って、抗ＴＲＸ抗体は、ＭＩＦによって引き起こされる障害に有効であると考えられる。
【実施例４】
【００５４】
〔ＴＲＸとＭＩＦの表面プラズモン共鳴法を用いた分子間相互作用解析〕
ＴＲＸとＭＩＦのアフィニティー（親和性）を解析するために、組換え型ＴＲＸ及びＭＩＦを用い、表面プラズモン共鳴法によるＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いて測定した。
【００５５】
〔実験材料〕
組換え型ＴＲＸ：味の素社製
組換え型ＭＩＦ：実験例２において作製したもの
緩衝液：１０ｍＭ HEPES, pH７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００５% Ｔｗｅｅｎ２０
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製
Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＮＴＡ：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製
【００５６】
〔実験方法〕
解析にはＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いた。組換え型ＭＩＦはＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＮＴＡに、流速１０μＬ／ｍｉｎ、測定温度２５℃にて１１００ＲＵ結合させた。この組換え型ＭＩＦを結合させたセンサーチップを用い、０．５〜４μＭの組換え型ＴＲＸを供し、流速２０μＬ／ｍｉｎ、測定温度２５℃にて結合解析を行った。コントロール実験は、組換え型ＭＩＦを結合させていないセンサーチップを用い、０．５〜４μＭの組換え型ＴＲＸを供し、上記と同様にして結合解析を行った。アフィニティー解析はBIAevaluation  softwere３．１で行った。
結果を図４に示す。
【００５７】
図４に示すように、ＴＲＸは濃度依存的にＭＩＦと結合した。解析結果としては、１：１ binding with drifting baseline model解析方法により、kａ＝１．２×１０２ Ｍ−１Ｓ−１、kｄ＝１．１９×１０−６ Ｍ−１Ｓ−１、ＫＤ＝９．９６×１０−９ Ｍが得られた。
これまでの報告において、ＭＩＦのレセプターとされているＣＤ７４とＭＩＦとの結合解析の結果はＫＤ＝９×１０−９ Ｍであり、これと近い値が得られたことから、ＴＲＸはＭＩＦのレセプター様に作用している可能性が考えられる。
【実施例５】
【００５８】
〔抗ＴＲＸ抗体による白血球の血管内皮細胞への接着阻害確認実験〕
白血球の血管内皮細胞への接着における抗ＴＲＸ抗体の効果を調べた。
【００５９】
〔実験材料〕
抗ＴＲＸ抗体（ＡＤＦ１１抗体）：レドックス・バイオサイエンス社製
ヒト臍帯脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）：Ｃａｍｂｒｅｘ社製
ＥＧＭ−２培地：Ｃａｍｂｒｅｘ社製
モノポリー分離培地：大日本住友製薬社製
ＡＬＥＸＡコンジュゲート抗ＴＲＸモノクローナル抗体：インビトロゲン社製ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ４８８タンパク標識キットを用いて調製した。
細胞洗浄用緩衝液：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製
ソフトウェア（Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ）：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製
2‘,7’-bis-(2-carboxyethyl)-5‐(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester：インビトロゲン社製
６穴プレート：アサヒテクノガラス社製
ＢＺ−８０００蛍光顕微鏡：ＫＥＹＥＮＣＥ社製
カルセインＡＭ：インビトロゲン社製
蛍光マイクロプレートリーダー：Ｇｅｍｉｎｉ  ＥＭ社製
【００６０】
〔実験方法〕
（細胞調製）
ＨＵＶＥＣｓは、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿環境下、ＥＧＭ−２培地で保存した。
ヒト末梢血多形核球細胞（ＰＭＮｓ）は、モノポリー分離培地を用い、健常者から得たヘパリン添加血から分離した。
【００６１】
（血管内皮細胞表面に発現する内因性ＴＲＸの確認実験）
ＨＵＶＥＣｓは、飽和濃度のＡＬＥＸＡコンジュゲート抗ＴＲＸモノクローナル抗体とともに、細胞洗浄用緩衝液中に懸濁し、暗中、氷上で３０分間インキュベートした。その後、過剰のＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーで分析してソフトウェア（Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ）によってデータ収集した。フローサイトメトリー分析の結果を図５に示す。
【００６２】
図５から、正常ＨＵＶＥＣｓ表面にＴＲＸが発現することが確認された。
【００６３】
（内皮細胞への白血球結合実験）
本実験は公知の方法（Nakamura H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:15143-15148, 2001.）を改良して行った。
実験開始前、ＨＵＶＥＣｓ及びＰＭＮｓを２０μｇ／ｍｌ 抗ＴＲＸ抗体で３０分間処理した。
ＰＭＮｓは、２’，７’-bis-(２-carboxyethyl)-５‐(and-６)-carboxyfluorescein acetoxymethyl esterで標識し、３７℃、１時間、無血清ＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。
標識したＰＭＮｓ ５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌを、過剰の１０％血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄し、３時間、１μｇ／ｍｌ ＬＰＳを加えて培養した。その後、過剰の２％血清含有ＨＢＳＳで洗浄した。
ガラス底の６穴プレート中で、ＰＭＮｓと正常ＨＵＶＥＣ単分子層を共培養した。
その共培養後、接着していないＰＭＮｓを、過剰の１０％血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地で注意深く洗浄して捨てた。そのプレートを、ＢＺ−８０００蛍光顕微鏡を用いて撮影した。
コントロールは、抗ＴＲＸ抗体で処理せず、上記方法と同様にして実験を行った。
結果を図６に示す。倍率は５０μｍである。
【００６４】
図５及び図６から、ＨＵＶＥＣｓ（血管内皮細胞）の膜表面に存在するＴＲＸによってＰＭＮｓ（白血球）がこの血管内皮細胞へ接着すると考えられ、抗ＴＲＸ抗体がこのＴＲＸに作用することによって、ＬＰＳによって活性化されたＰＭＮｓの正常ＨＵＶＥＣｓへの接着を阻害したと考えられる。
【００６５】
（細胞結合分析実験）
本実験は公知の方法（Nakamura H., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:15143-15148, 2001及びRoy S., et al. Methods Enzymol 300:395-401, 1999）を改良して行った。
実験前に、ＨＵＶＥＣｓ及びＰＭＮｓを抗ＴＲＸ抗体で３０分間処理した。
ＰＭＮｓ ５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌを、５μＭ カルセインＡＭを用いてメーカーの指示書に従って標識した。
標識されたＰＭＮｓは、３時間、１μｇ／ｍｌ ＬＰＳで前処理した後、過剰の２％血清含有ＨＢＳＳで洗浄した。
これを、マイクロタイタープレート中で正常ＨＵＶＥＣ単分子層と共培養した。
その共培養後、結合していないＰＭＮｓは、過剰の１０％血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地で注意深く洗浄して捨てた。
結合した細胞は、蛍光マイクロプレートリーダーを用いた蛍光定量法（４８５ｎｍでの励起及び５３８ｎｍでの発光）によって分析した。
コントロールは、抗ＴＲＸ抗体で処理せず、上記方法と同様にして実験を行った。
結果を図７に示す。ｎ＝３で、コントロールとの差異は、比較用スチューデントｔ-検定で評価し、ｐ＜０．０５であった。
【００６６】
図７から、抗ＴＲＸ抗体がＬＰＳによって活性化されたＰＭＮｓの正常ＨＵＶＥＣｓへの接着を有意に阻害することが確認された。
【００６７】
上記血管内皮細胞表面に発現する内因性ＴＲＸの確認実験、内皮細胞への白血球結合実験、及び細胞結合分析実験の結果から、抗ＴＲＸ抗体が、血管内皮細胞表面に存在するＴＲＸに作用することによって、白血球の血管内皮細胞への接着を阻害することが確認された。
従って、抗ＴＲＸ抗体は、血管系障害に有効であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＡＴＬ２細胞表面に局在するＴＲＸを確認したフローサイトメトリー分析結果である。
【図２】抗ＴＲＸ抗体によるＭＩＦの細胞内への取り込み抑制を確認した結果である。
【図３】抗ＴＲＸ抗体によるＭＩＦの活性阻害をＴＮＦ−α濃度で確認した結果である。
【図４】ＴＲＸとＭＩＦの結合解析を表面プラズモン共鳴法によるＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いて解析した結果である。
【図５】ＨＵＶＥＣｓ表面に発現する内因性ＴＲＸの存在を確認したフローサイトメトリー分析結果である。
【図６】抗ＴＲＸ抗体によるＰＭＮｓのＨＵＶＥＣｓへの接着阻害を蛍光顕微鏡にて確認した結果である。
【図７】抗ＴＲＸ抗体によるＰＭＮｓのＨＵＶＥＣｓへの接着阻害を蛍光定量法にて確認した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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