(57)【要約】【課題】酵素を電極に固定する際に、酵素活性の低下を引き起こすことなく、高い触媒電流値を得ることが可能な酵素固定化方法の提供。【解決手段】燃料電池に用いられる電極に酵素を固定化するための方法であって、前記電極に、熱処理により活性が上昇し得る酵素を、該活性を上昇させ得る温度範囲において固定化することを特徴とする酵素固定化方法を提供する。あわせて、この酵素固定化方法を用いた燃料電池及び燃料電池用電極、ならびにこれらの製造方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
燃料電池に用いられる電極に酵素を固定化するための方法であって、
前記酵素として、その野生型アミノ酸配列において少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは挿入された変異型酵素であり、かつ、熱処理により活性が上昇し得る特性を備えた変異型酵素を、
前記活性を上昇させ得る温度範囲において固定化することを特徴とする酵素固定化方法。
【請求項２】
前記電極は正極であり、前記変異型酵素は変異型ビリルビンオキシダーゼであることを特徴とする請求項１記載の酵素固定化方法。
【請求項３】
前記野生型アミノ酸配列は、配列番号１に示す不完全糸状菌Myrothecium verrucari由来ビリルビンオキシダーゼのアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２記載の酵素固定化方法。
【請求項４】
前記変異型ビリルビンオキシダーゼとして、前記野生型アミノ酸配列において、Ｎ末端から２２５番目のフェニルアラニンをバリンに置換（F225V）、３２２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（D322N）、４６８番目のメチオニンをバリンに置換（M468V）した配列番号２に示される変異型ビリルビンオキシダーゼを用いることを特徴とする請求項３記載の酵素固定化方法。
【請求項５】
前記変異型ビリルビンオキシダーゼとして、前記野生型アミノ酸配列において、Ｎ末端から２２５番目のフェニルアラニンをバリンに置換（F225V）、３７０番目のアスパラギン酸をチロシンに置換（D370Y）、４７６番目のロイシンをプロリンに置換（L476P）した配列番号３に示される変異型ビリルビンオキシダーゼを用いることを特徴とする請求項３記載の酵素固定化方法。
【請求項６】
前記変異型ビリルビンオキシダーゼとして、前記野生型アミノ酸配列において、Ｎ末端から２６４番目のアラニンをバリンに置換（A264V）、４１８番目のアラニンをスレオニンに置換（A418T）、４７６番目のロイシンをプロリンに置換（L476P）した配列番号４に示される変異型ビリルビンオキシダーゼを用いることを特徴とする請求項３記載の酵素固定化方法。
【請求項７】
前記変異型ビリルビンオキシダーゼとして、前記野生型アミノ酸配列において、Ｎ末端から２６４番目のアラニンをバリンに置換（A264V）、４３７番目のアルギニンをヒスチジンに置換（R437H）、４７６番目のロイシンをプロリンに置換（L476P）した配列番号５に示される変異型ビリルビンオキシダーゼを用いることを特徴とする請求項３記載の酵素固定化方法。
【請求項８】
前記変異型ビリルビンオキシダーゼとして、前記野生型アミノ酸配列において、Ｎ末端から１０３番目のアラニンをプロリンに置換（A103P）、Ｎ末端から２６４番目のアラニンをバリンに置換（A264V）、２７０番目のチロシンをアスパラギン酸に置換（Y270D）、４７６番目のロイシンをプロリンに置換（L476P）した配列番号６に示される変異型ビリルビンオキシダーゼを用いることを特徴とする請求項３記載の酵素固定化方法。
【請求項９】
前記温度範囲が、２０℃以上６５℃以下であることを特徴とする請求項４〜８のいずれか一項に記載の酵素固定化方法。
【請求項１０】
プロトン伝導体を介して電極が対向する構造を有する燃料電池の製造方法であって、
野生型アミノ酸配列において少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは挿入された変異型酵素であり、かつ、熱処理により活性が上昇し得る特性を備えた変異型酵素を、該活性を上昇させ得る温度範囲において前記電極に固定化する工程を含むことを特徴とする燃料電池の製造方法。
【請求項１１】
プロトン伝導体を介して電極が対向する構造を有する燃料電池であって、
野生型アミノ酸配列において少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは挿入された変異型酵素であり、かつ、熱処理により活性が上昇し得る特性を備えた変異型酵素が、該活性を上昇させ得る温度範囲において前記電極に固定化されていることを特徴とする燃料電池。
【請求項１２】
燃料電池に用いられる電極の製造方法であって、
野生型アミノ酸配列において少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは挿入された変異型酵素であり、かつ、熱処理により活性が上昇し得る特性を備えた変異型酵素を、該活性を上昇させ得る温度範囲において前記電極に固定化する工程を含むことを特徴とする燃料電池用電極の製造方法。
【請求項１３】
燃料電池に用いられる電極であって、
野生型アミノ酸配列において少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは挿入された変異型酵素であり、かつ、熱処理により活性が上昇し得る特性を備えた変異型酵素が、該活性を上昇させ得る温度範囲において前記電極に固定化されていることを特徴とする燃料電池用電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、燃料電池用電極への酵素固定化方法に関する。より詳しくは、熱処理により活性が上昇し得る酵素を、該活性を上昇させ得る温度範囲において電極に固定化する酵素固定化方法に関する。さらには、酵素固定化方法を用いる燃料電池及び燃料電池用電極、並びにこれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
燃料電池は、正極（酸化剤極） と負極（燃料極）とが電解質（ プロトン伝導体） を介して対向した構造を有する。従来の燃料電池では、負極に供給された燃料（水素）が酸化されて電子とプロトン（Ｈ+）とに分離し、電子は負極に渡され、Ｈ+は電解質を通って正極まで移動する。正極では、このＨ+が、外部から供給された酸素および負極から外部回路を通って送られた電子と反応して水（Ｈ 2 Ｏ）を生成する。
【０００３】
燃料電池は燃料の持つ化学エネルギーを直接電気エネルギーに変換する高効率な発電装置であり、天然ガス、石油、石炭などの化石燃料が持つ化学エネルギーを使用場所や使用時によらずに、しかも高い変換効率で電気エネルギーとして取り出すことができる。このため、現在、大規模発電や、自動車の駆動用電源、パーソナルコンピュータやモバイル機器などのポータブル電源などへの幅広い応用が試みられている。
【０００４】
しかしながら、特に燃料としてガスを用いる場合、取り扱いに注意が必要であり、特に燃料を高温に加熱して用いる場合には、安全上の問題が生じる。また、白金（Pt）などの高価な貴金属触媒を必要となり、製造コスト上の問題もある。
【０００５】
そこで、近年、生物内で行われている生体代謝が高効率なエネルギー変換機構であることに着目し、酵素を用いて燃料をＨ+と電子とに分離する燃料電池（「バイオ燃料電池」や「酵素電池」とも呼ばれる）の開発がなされてきている（特許文献１及び２参照）。
【０００６】
酵素電池では、燃料としてメタノールやエタノールのようなアルコール類あるいはグルコースのような糖類を用いることが可能であるため、上記のような安全上の問題を解決することができる。加えて、酵素の優れた触媒活性を利用することで、貴金属触媒を用いずに低コストに燃料電池を製造することが可能となる。
【０００７】
酵素電池の実用化に向けては、十分な出力を安定的に得るための技術が確立される必要があり、現在、特に電極に固定される酵素を環境の変化に対してより安定的に働かせ、高い活性を維持させるための技術開発が盛んに行われている。
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−７１５５９号公報
【特許文献２】特開２００５−１３２１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
酵素電池において高い出力を得るためには、電極上に酵素を高密度に固定化することで、酵素反応により発生する電子を効率よく電極に取り込むことが必要となる。
【００１０】
通常、酵素を電極に固定する際には、カーボン系材料などを酵素溶液に浸漬した後、乾燥により水分を蒸発させることで、酵素を電極材料上に固定化している。
【００１１】
一般に、酵素は溶液状態で最も安定性が低く、失活し易い。従って、電極材料を酵素溶液に浸漬した後には、迅速に乾燥を行い、水分を蒸発させることで、酵素の失活を防止する必要がある。一方で、酵素は熱によって容易に変性してしまうため、乾燥は、室温ないしは、乾燥機を使用する場合にも３０℃程度の低い温度条件下で行う必要があった。
【００１２】
このため、従来、酵素溶液への浸漬後の電極を迅速に乾燥させることは難しく、電極固定時の酵素活性の低下が、酵素電池において高い触媒電流値と高出力を得るための障害となっていた。
【００１３】
そこで、本発明は、酵素を電極に固定する際に、酵素活性の低下を引き起こすことなく、高い触媒電流値を示す電極を得ることが可能な酵素固定化方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題解決のため、本発明は、燃料電池に用いられる電極に酵素を固定化するための方法であって、前記酵素として、その野生型アミノ酸配列において少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは挿入された変異型酵素であり、かつ、熱処理により活性が上昇し得る特性を備えた変異型酵素を、前記活性を上昇させ得る温度範囲において固定化することを特徴とする酵素固定化方法を提供する。
この酵素固定化方法においては、正極に固定される酵素として、変異型熱耐性ビリルビンオキシダーゼ、特には、不完全糸状菌Myrothecium verrucari由来ビリルビンオキシダーゼの配列番号１の野生型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは挿入された変異型熱耐性ビリルビンオキシダーゼを用いることができる。
さらに、この場合には、前記野生型アミノ酸配列において、Ｎ末端から２２５番目のフェニルアラニンをバリンに置換（F225V）、３２２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（D322N）、４６８番目のメチオニンをバリンに置換（M468V）した配列番号２に示される変異型ビリルビンオキシダーゼ、Ｎ末端から２２５番目のフェニルアラニンをバリンに置換（F225V）、３７０番目のアスパラギン酸をチロシンに置換（D370Y）、４７６番目のロイシンをプロリンに置換（L476P）した配列番号３に示される変異型ビリルビンオキシダーゼ、Ｎ末端から２６４番目のアラニンをバリンに置換（A264V）、４１８番目のアラニンをスレオニンに置換（A418T）、４７６番目のロイシンをプロリンに置換（L476P）した配列番号４に示される変異型ビリルビンオキシダーゼ、Ｎ末端から２６４番目のアラニンをバリンに置換（A264V）、４３７番目のアルギニンをヒスチジンに置換（R437H）、４７６番目のロイシンをプロリンに置換（L476P）した配列番号５に示される変異型ビリルビンオキシダーゼ、及び／又は、Ｎ末端から１０３番目のアラニンをプロリンに置換（A103P）、Ｎ末端から２６４番目のアラニンをバリンに置換（A264V）、２７０番目のチロシンをアスパラギン酸に置換（Y270D）、４７６番目のロイシンをプロリンに置換（L476P）した配列番号６に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼを用い、２０℃以上６５℃以下の温度範囲において固定化を行なうことが好適となる。
【００１５】
また、本発明は、プロトン伝導体を介して電極が対向する構造を有する燃料電池の製造方法であって、野生型アミノ酸配列において少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは挿入された変異型酵素であり、かつ、熱処理により活性が上昇し得る特性を備えた変異型酵素を、該活性を上昇させ得る温度範囲において前記電極に固定化する工程を含むことを特徴とする燃料電池の製造方法及びこの製造方法によって得られる燃料電池を提供する。
さらに、燃料電池に用いられる電極の製造方法であって、野生型アミノ酸配列において少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは挿入された変異型酵素であり、かつ、熱処理により活性が上昇し得る特性を備えた変異型酵素を、該活性を上昇させ得る温度範囲において前記電極に固定化する工程を含むことを特徴とする燃料電池用電極の製造方法及びこの製造方法によって得られる燃料電池用電極をも提供するものである。
【００１６】
本発明において、「ビリルビンオキシダーゼ（Bilirubin oxidase）」とは、ビリルビンをビルベルジンに酸化する反応を触媒する酵素であり、マルチ胴オキシダーゼ（複数の銅イオンを活性中心に持つ酵素の総称）に属する酵素の一種である。この酵素は、従来から臨床検査の場面における肝機能等の検査試薬（血清中のビリルビンの測定試薬）として広く使用されているが、近年では、上記酵素電池の正極において、酸素の電気化学的４電子還元反応を実現する触媒としても注目されている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、酵素を電極に固定する際に、酵素活性の低下を引き起こすことなく、高い触媒電流値を示す電極を得ることが可能であり、かつ電極作製工程の大幅な時間短縮、効率化が可能な酵素固定化方法が提供される。また、この酵素固定化方法によれば、低純度あるいは未精製の酵素を固定化に用いたとしても、固定化の際の熱処理により目的酵素以外を失活させることができるため、痕跡量の不純物による酵素活性の阻害や安定性低下を防止して、高い触媒電流値を示す電極を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明に係る酵素固定化方法においては、以下に例示する酵素であって、熱処理により活性が上昇し得る特性を備える酵素が用いられる。
【００１９】
正極に固定される酵素には、酸化酵素であって、例えば、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどのマルチ銅オキシダーゼを用いる。
【００２０】
負極に固定される酵素は、使用する燃料に応じて選ばれるが、例えば、燃料としてグルコースのような単糖類を用いる場合には、単糖類の酸化を促進し分解する酸化酵素を用いる。通常は、これに加えて酸化酵素によって還元される補酵素を酸化体に戻す補酵素酸化酵素を使用する。この補酵素酸化酵素の作用により、補酵素が酸化体に戻るときに電子が生成され、補酵素酸化酵素から電子メディエーターを介して電極に電子が渡される。
【００２１】
酸化酵素としては、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）などのＮＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ、補酵素酸化酵素としては、例えば、ジアホラーゼなどのＮＡＤＨオキシドリダクターゼを用いる。
【００２２】
さらに、燃料として多糖類を用いる場合には、上記の酸化酵素及び補酵素酸化酵素に加えて、多糖類の加水分解などの分解を促進し、グルコースなどの単糖類を生成する分解酵素も固定化される。なお、ここで、多糖類とは、広義の多糖類を意味し、加水分解によって２分子以上の単糖を生じる全ての炭水化物を指し、二糖、三糖、四糖などのオリゴ糖を含むものとする。
【００２３】
分解酵素としては、例えば、アミラーゼ、グルコシダーゼ、デキストリナーゼ、スクラーゼ、ラクターゼ、セルラーゼを用いる。
【００２４】
これの酵素において、特に、熱処理により活性が上昇する特性を備える酵素は、各酵素タンパクをコードする遺伝子の塩基配列を人工的に変異させ、大腸菌等の細胞内で発現させることにより、人工的に野生型アミノ酸配列において少なくとも一つ以上のアミノ酸残基を、欠失、置換、付加若しくは挿入させた変異型酵素を作製し、スクリーニングを行うことによって得ることができる。遺伝子の塩基配列の改変は、エラープローンＰＣＲ等のランダムに遺伝子変異を導入可能な手法によって行うことができる。変異型酵素は、従来公知の方法により、改変後の遺伝子を宿主細胞に導入し、細胞からタンパク質を抽出した後、アフィニティーカラムによる精製を行うことにより得ることができる。そして、得られた変異型酵素について、耐熱化試験（実施例参照）によるスクリーニングを行うことにより、上記の特性を備えた変異型酵素を得ることが可能である。
【００２５】
本発明に係る酵素固定化方法では、スクリーニングによって得られた変異型酵素を、その酵素活性を上昇させ得る温度範囲において電極に固定する。温度範囲の上限値は、耐熱化試験の結果に基づき各変異型酵素（変異体）について適宜設定される。温度範囲の下限値は、通常の環境温度（室温）である２０℃以上とするが、より好適には３０℃、さらに好適には４０℃とする。
【００２６】
変異型酵素の電極への固定は、従来方法に従い、変異型酵素溶液を調製し、これに電極を浸漬した後、乾燥機等を用いて乾燥することにより行うことができる。本発明に係る酵素固定化方法では、この乾燥固定を上記温度範囲において行うことが可能である。温度範囲の下限値については上記の通りであるが、より高い温度で乾燥固定を行なう程、迅速に電極に付された酵素溶液中の水分を蒸発させることができる。乾燥を行う時間は、耐熱化試験により変異体の酵素活性が上昇し得ることが確認された熱処理時間内において、溶液中の水分を十分に蒸発させため適宜設定される。熱処理の温度及び時間は、例えば、実施
例に示す例によれば、６０℃で１時間以内又は６５℃で３０分以内が挙げられる。
【００２７】
変異型酵素は、溶液を電極に滴下、噴霧、塗布し、同様に乾燥固定を行って固定化してもよい。また、固定時には各種の固定化剤を用いてもよく、好適には、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）をはじめとしたポリカチオンまたはその塩とポリアクリル酸（例えば、ポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＡｃＮａ））をはじめとしたポリアニオンまたはその塩とを用いて形成されるポリイオンコンプレックスを用いることができる。
【００２８】
このように、本発明に係る酵素固定化方法によれば、酵素溶液中の水分を迅速に蒸発させることができるため、酵素が不安定な溶液状態にある時間を短縮し、酵素の失活を防止することが可能となる。加えて、通常用いられる酵素と異なり、本発明で用いる変異型酵素は、熱処理によって酵素活性が上昇するものであることから、乾燥固定後の酵素は、固定前に比して高い酵素活性を発現することとなる。従って、酵素固定後の電極では高い触媒電流値を得ることが可能となる。
【００２９】
具体的には、本発明者らは、不完全糸状菌Myrothecium verrucaria（以下、M. verrucaria）由来ビリルビンオキシダーゼの野生型アミノ酸配列（配列番号１参照）にランダムミューテーションを導入し、発現、精製して得た変異型ビリルビンオキシダーゼについて耐熱性試験によるスクリーニングを行い、熱処理により活性が上昇し得る変異型ビリルビンオキシダーゼとして、以下の変異体を得た。
・  上記野生型アミノ酸配列において、前記野生型アミノ酸配列において、Ｎ末端から２２５番目のフェニルアラニンをバリンに置換（F225V）、３２２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（D322N）、４６８番目のメチオニンをバリンに置換（M468V）した配列番号２に示される変異型ビリルビンオキシダーゼ。
・  Ｎ末端から２２５番目のフェニルアラニンをバリンに置換（F225V）、３７０番目のアスパラギン酸をチロシンに置換（D370Y）、４７６番目のロイシンをプロリンに置換（L476P）した配列番号３に示される変異型ビリルビンオキシダーゼ。
・  Ｎ末端から２６４番目のアラニンをバリンに置換（A264V）、４１８番目のアラニンをスレオニンに置換（A418T）、４７６番目のロイシンをプロリンに置換（L476P）した配列番号４に示される変異型ビリルビンオキシダーゼ。
・  Ｎ末端から２６４番目のアラニンをバリンに置換（A264V）、４３７番目のアルギニンをヒスチジンに置換（R437H）、４７６番目のロイシンをプロリンに置換（L476P）した配列番号５に示される変異型ビリルビンオキシダーゼ
・  Ｎ末端から１０３番目のアラニンをプロリンに置換（A103P）、Ｎ末端から２６４番目のアラニンをバリンに置換（A264V）、２７０番目のチロシンをアスパラギン酸に置換（Y270D）、４７６番目のロイシンをプロリンに置換（L476P）した配列番号６に示され変異型ビリルビンオキシダーゼ。
【００３０】
これらの変異型ビリルビンオキシダーゼは、６０℃ないしは６５℃の熱処理によっても酵素活性が高度に保持され、優れた耐熱性を示すと同時に、同温度での熱処理によって、野生型酵素に比して有意に高い酵素活性を発現した。
【００３１】
従って、これらの変異型酵素を電極に固定するに際し、６５℃以下、より好適には６０℃以下の温度範囲において固定を行うことにより、野生型酵素に比して高い触媒電流値を得ることが可能となる。なお、固定は、変異型酵素の活性を上昇させ得る限りにおいて、６０℃ないしは６５℃より高い温度条件下で行うことも可能である。
【００３２】
上記の酵素固定方法により、電極及び燃料電池を製造するための電極材料には、カーボン系材料などの従来公知の材料を用いることができる。この他、多孔体材料からなる骨格と、この骨格の少なくとも一部の表面を被覆する、カーボン系材料を主成分とする材料とを含む多孔体導電材料を用いることができる。
【００３３】
この多孔体導電材料は、多孔体材料からなる骨格の少なくとも一部の表面に、カーボン系材料を主成分とする材料をコーティングすることにより得ることができる。この多孔体導電材料の骨格を構成する多孔体材料は、多孔率が高くても骨格を安定に維持することができるものであれば、基本的にはどのようなものであってもよく、導電性の有無も問わない。多孔体材料としては、好適には、高多孔率および高導電性を有する材料が用いられる。このような高多孔率および高導電性を有する多孔体材料としては、具体的には、金属材料（金属または合金）や、骨格を強固にしたカーボン系材料などを用いることができる。多孔体材料として金属材料を用いる場合、金属材料は溶液のｐＨや電位などの使用環境との兼ね合いにより状態安定性が異なることから様々な選択肢が考えられるが、例えば、ニッケル、銅、銀、金、ニッケル−クロム合金、ステンレス鋼などの発泡金属あるいは発泡合金は入手しやすい材料の一つである。多孔体材料としては、上記の金属材料やカーボン系材料以外に樹脂材料（例えば、スポンジ状のもの）を用いることもできる。この多孔体材料の多孔率および孔径（孔の最小径）は、この多孔体材料からなる骨格の表面にコーティングする、カーボン系材料を主成分とする材料の厚さとの兼ね合いで、多孔体導電材料に要求される多孔率および孔径に応じて決められる。この多孔体材料の孔径は一般的には１０ｎｍ〜１ｍｍ、典型的には１０ｎｍ〜６００μｍである。
【００３４】
一方、骨格の表面を被覆する材料は、導電性を有し、想定される作動電位において安定なものを用いる必要がある。ここでは、このような材料としてカーボン系材料を主成分とする材料を用いる。カーボン系材料は一般に電位窓が広く、しかも化学的に安定なものが多い。このカーボン系材料を主成分とする材料は、具体的には、カーボン系材料のみからなるものと、カーボン系材料を主成分とし、多孔体導電材料に要求される特性などに応じて選ばれる副材料を微量含む材料とがある。後者の材料の具体例を挙げると、カーボン系材料に金属などの高導電性材料を添加することにより電気伝導性を向上させた材料や、カーボン系材料にポリテトラフルオロエチレン系材料などを添加することにより表面撥水性を付与するなど、導電性以外の機能を付与した材料である。カーボン系材料にも様々な種類が存在するが、いかなるカーボン系材料であってもよく、カーボン単体のほか、カーボンに他の元素を添加したものであってもよい。このカーボン系材料は、特に、高導電性・高表面積を有する微細粉末カーボン材料が好ましい。このカーボン系材料としては、具体的には、例えば、ＫＢ（ケッチェンブラック）などの高導電性を付与したものや、カーボンナノチューブ、フラーレンなどの機能性カーボン材料などを用いることができる。
【００３５】
このカーボン系材料を主成分とする材料のコーティング方法は、必要に応じて適当な結着剤を用いるなどして多孔体材料からなる骨格の表面にコーティング可能であれば、いかなるコーティング方法を用いてもよい。この多孔体導電材料の孔径は、その孔を通して基質などを含む溶液が容易に出入り可能な程度の大きさに選ばれ、一般的には９ｎｍ〜１ｍｍ、より一般的には１μｍ〜１ｍｍ、さらに一般的には１〜６００μｍである。多孔体材料からなる骨格の少なくとも一部の表面がカーボン系材料を主成分とする材料により被覆された状態、あるいは、多孔質材料からなる骨格の少なくとも一部の表面をカーボン系材料を主成分とする材料によりコーティングした状態では、孔が全て互いに連通し、あるいは、カーボン系材料を主成分とする材料による目詰まりが発生しないようにするのが望ましい。
【００３６】
電極に固定される電子メディエーターは、負極には２−メチル−１，４−ナフトキノン（ＶＫ３）、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）などを、正極にはヘキサシアノ鉄酸カリウムなどを、必要に応じて一種または二種以上用いることができる。
【００３７】
燃料としては、多糖類を用いる場合、例えば、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、マルトース、スクロース、ラクトースなどを使用することができる。これらは単糖類が二つ以上結合したものであり、いずれの多糖類においても結合単位の単糖類としてグルコースが含まれている。なお、アミロースとアミロペクチンとはデンプンに含まれる成分であり、デンプンはアミロースとアミロペクチンとの混合物である。多糖類の分解酵素としてグルコアミラーゼを用い、単糖類を分解する酸化酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた場合には、グルコアミラーゼによりグルコースにまで分解することができる多糖類、例えばデンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、マルトースのいずれかを含むものであれば、これを燃料として使用できる。なお、グルコアミラーゼはデンプンなどのα−グルカンを加水分解しグルコースを生成する分解酵素であり、グルコースデヒドロゲナーゼはβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化する酸化酵素である。
【００３８】
プロトン伝導体には、緩衝物質を含む電解質として、例えば、リン酸二水素イオン（Ｈ2 ＰＯ4 - ）、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（略称トリス）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、カコジル酸、炭酸（Ｈ2 ＣＯ3 ）、クエン酸水素イオン、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（略称トリシン）、グリシルグリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（略称ビシン）などを含む電解質を用いることができる。緩衝物質は、一般的には、ｐＫa が６以上９以下のものであれば、どのようなものを用いてもよい。高出力動作時に十分な緩衝能を得ることができ、酵素が本来持っている能力を十分に発揮することができるようにするために、電解質に含まれる緩衝物質の濃度を０．２Ｍ以上２．５Ｍ以下にすることが有効であり、好適には０．２Ｍ以上２Ｍ以下、より好適には０．４Ｍ以上２Ｍ以下、さらに好適には０．８Ｍ以上１．２Ｍ以下とする。電解質のｐＨは、好適には７付近であるが、一般的には１〜１４のいずれであってもよい。
【００３９】
本発明に係る電極製造方法及び燃料電池製造方法においては、これらの各構成において例示した具定例を、上述の酵素固定化方法を用いた上で任意に選択することにより電極及び燃料電池を得ることができる。この電極及び燃料電池においては、固定化された酵素の高い酵素活性に基づく高い触媒電流値及び高出力を得ることが可能である。
【実施例】
【００４０】
（実施例１）：M. verrucaria由来ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯ）のｃＤＮＡクローニング
１-１：M. verrucariaの培養及びメッセンジャーＲＮＡの単離
本実施例で使用したM. verrucaria NBRC(IFO)6113株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部から分譲を受けた。入手した乾燥菌体を、復水液（ポリペプトン：0.5％、酵母エキス：0.3％、MgSO4・7H2O：0.1％）に懸濁させ、この懸濁液をポテトデキストロース寒天（PDA）プレート（ポテトデキストロース：2.4％、アガロース：1.5％）に接種した。これを５〜７日間、室温で培養を行ったところ、PDAプレートの表面は白色の菌糸により覆われた。これをスパチュラでかき集めて-80℃で保存した。菌体の収量はPDAプレート１枚（直径９cm）当たり50〜60 mg（湿重量）であった。
【００４１】
メッセンジャーＲＮＡ（以下、ｍＲＮＡ）は、トータルＲＮＡ（mRNA、リボソームRNA、転移RNAの混合物）として抽出した。約100 mgのM. verrucariaの凍結菌体粉末から100μｇ（UV吸収により定量）のトータルＲＮＡが得られ、その１／４量を次の逆転写PCRの一反応分の鋳型RNAとして用いた。
【００４２】
１-２：逆転写PCRによるＢＯ遺伝子断片の作製。
逆転写PCRは、OneStep RT-PCR Kit（キアゲン）を用いて、上記トータルＲＮＡを鋳型として行った。逆転写PCRに用いるPCRプライマーは、既報のＢＯのcDNAの塩基配列を基に、以下の「表１」に示すように設計した。
【００４３】
【表１】
2009158480.tif 000002
【００４４】
得られたPCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、1700bp付近に強いバンドが確認できた。この1700bpというサイズから目的のＢＯ遺伝子を含む増幅断片であると推察されたので、この断片をアガロースゲルスラブより切り出して、次の工程に用いた。
【００４５】
１-３：pYES2/CTベクターへのＢＯ遺伝子断片の組み込み
得られた1700bpの増幅断片は制限酵素HindIII、XbaIにより消化した後、同酵素で消化したpYES2/CTプラスミドベクター（インビトロジェン）と連結した。この際、制限酵素処理によるpYES2/CTベクターの5’突出末端の脱リン酸化処理にはCalf intestine由来アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ）を、挿入断片とpYES2/CTベクターの連結反応にはT4 DNAリガーゼ（タカラバイオ）をそれぞれ用いた。
【００４６】
ここで得られる反応産物によりE. coli TOP10株（インビトロジェン）を形質転換して、LB/Amp寒天平板培地（組成は「表２」参照）に接種した。一晩培養後、アンピシリンに対する薬剤耐性を有する形質転換体のコロニーが得られた。これを3mlのLB/Amp培地で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドベクターを単離した。
【００４７】
【表２】
2009158480.tif 000003
【００４８】
得られたプラスミドベクターのＢＯ遺伝子を含む挿入部分の塩基配列を調べたところ、配列番号７であった。
【００４９】
配列番号７に示した塩基配列は１７１９ｂｐであり、５７２残基分のアミノ酸に相当する。一方、成熟型のM. verrucaria由来ＢＯは、５３４残基のアミノ酸から構成される（配列番号１参照）。ここで、この差分にあたる３８残基のアミノ酸はＮ末端側に存在し、そのC末端側に存在するタンパクの分泌を司るシグナルペプチドである。この部分は翻訳後、分泌に際して切断される。
【００５０】
１−４:AAA配列の挿入
次に、１-３で作製したプラスミドベクターに対して、組換えタンパクの発現量を増加させるように、その塩基配列の一部に改良を施した。具体的には、開始コドン(ATG)より上流側（5’-側）の3塩基を「表３」のように変更した。3塩基の変更には、「表４」に示すPCRプライマーを用いて、Quick-change Mutagenesis Kit（ストラタジーン）によって行った。詳細な実験手順は付属のマニュアルに従った。
【００５１】
【表３】
2009158480.tif 000004
【００５２】
【表４】
2009158480.tif 000005
【００５３】
塩基配列の確認は、変更箇所を含むＢＯ遺伝子の全領域において行い、設計したとおりに変更されていることを確認した。以降、配列変更後のプラスミドベクターを「pYES2/CT-BOベクター」と称する。
【００５４】
（実施例２）：S. cerevisiaeによる組換えＢＯの分泌発現系の構築
２−１：pYES2/CT-BOベクターによるS. cerevisiaeの形質転換。
次に、上記pYES2/CT-BOベクターを用いて、S. cerevisiaeの形質転換を行った。S. cerevisiaeは、pYES2/CTベクターと共に市販されているINVSc1株（インビトロジェン）を用いた。ここでは、酢酸リチウム法によりS. cerevisiaeの形質転換を行った。詳細な実験手順はpYES2/CTベクターに付属のマニュアルを参考にした。形質転換酵母の選択には、SCGlu寒天平板培地(組成は「表５」を参照)を用いた。
【００５５】
【表５】
2009158480.tif 000006
【００５６】
２−２：組換えＢＯの分泌発現。
pYES2/CT-BOベクターによるS. cerevisiaeの形質転換体のコロニーを15 ml のSCGlu液体培地に接種し、14〜20時間、30℃で震とう培養を行った。得られた菌体は一旦、遠心分離（1500×g、室温、10分）により沈澱させた。
【００５７】
ここで、SCGlu液体培地を捨てた後、得られた菌体はSCGal培地（組成は「表６」を参照）50 mlに濁度（OD600）が約0.5になるように加えた。これを10−14時間、25℃で震盪培養を行った。培養後は遠心分離により菌体を除き、残りの培養液を5 ml程度まで濃縮して、20 mM リン酸Naバッファー（pH 7.4）に対して透析を行った。
【００５８】
【表６】
2009158480.tif 000007
【００５９】
組換えＢＯの精製は、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー（His-trap HP（1 ml）、アマシャムバイオサイエンス）により行った。精製の方法は付属のマニュアルに従った。得られた精製後の組換えBOはSDS-PAGE等により純度１００%であることを確認した。これの収量は１Ｌ培養に換算するとそれぞれ0.36 mgであった。
【００６０】
（実施例３）：分子進化工学的手法による組換えＢＯの耐熱化スクリーニング
次に、分子進化工学的手法による組換えＢＯの耐熱化スクリーニングを行った。具体的には、Error-prone PCRを用いたランダム変異の挿入、変異体のＢＯ遺伝子ライブラリの作製、変異体遺伝子ライブラリによるS. cerevisiaeの形質転換、96ウェルプレートを用いた耐熱化スクリーニングを行った。
【００６１】
３-１：Error-prone PCRを用いたランダム変異の挿入。
pYES2/CT-BOベクターを鋳型としてError-prone PCRによるランダム変異の挿入を行った。ここで用いるN末端側のPCRプライマーは開始コドンより２１８塩基対下流に存在する唯一のBglIIサイト（AGATCT）を含むように設計した。また、C末端側はXbaIサイト（TCTAGA）を含むよう以下のように設計した（「表７」参照）。
【００６２】
【表７】
2009158480.tif 000008
【００６３】
これらのプライマーを用いて、GeneMorph PCR Mutagenesis Kit（ストラタジーン）によりError-prone PCRを行った。反応条件は同キットに付属のマニュアルを参考にして設定した。
【００６４】
得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分析したところ、約15 00bpのPCR断片を得ることができた。得られたPCR産物の収量から計算される変異の頻度は、1000bp当たり1.5 箇所であった。計算方法は同キットに付属のマニュアルを参照した。
【００６５】
３−２：変異体のＢＯ遺伝子ライブラリの作製。
上記３-１で作製した、ランダムに変異が挿入されたＢＯ遺伝子断片は、１−３で示した方法と同様の方法でpYES2/CT-BOベクターのBglII-XbaIサイトへの組み込み、E. coliTOP10株の形質転換を行った。ここでは約6600個の形質転換体のコロニー、即ち、約6600種の変異体遺伝子を含むプラスミドのライブラリを得た。
【００６６】
３-３：変異体BO遺伝子ライブラリによるS. cerevisiaeの形質転換。
上記３−２で示した方法によって、変異体遺伝子ライブラリによるS. cerevisiae  INVSc1株（インビトロジェン）の形質転換を行った。S. cerevisiae  INVSc1のコンピテントセルは、酢酸リチウム法によって作製した。得られた形質転換体のライブラリに対して96ウェルプレートを用いた耐熱化スクリーニングを行う。
【００６７】
３-４：96ウェルプレートを用いた耐熱化スクリーニング実験。
SCGlu培地を96ウェルプレートに150mlずつ分注する。上記で作製した形質転換酵母ライブラリのコロニーを個々のウェルに１つずつ接種した。これを20〜23時間、27℃で震盪培養を行った。この培養後、それぞれのウェルの濁度は目視によるとほぼ一定となった。
【００６８】
この段階で一度96ウェルプレートごと遠心分離（1500×g, 20℃, 10分）を行い、菌体を一旦沈殿させた。それぞれのウェルの底に沈澱した菌体をかき乱さないように、SCGlu培地を完全に取り除いた。ここへSCGal培地を180 ml分注して、さらに8時間、27℃で震盪培養を行った。この培養後、再び遠心分離（1500×g, 20℃, 10分）を行い、菌体を沈澱させた。この上澄み液100 mlを別の新しい96ウェルプレートに移し変えた。ここで熱処理を行う場合は、この96ウェルプレート上のサンプル溶液をセロファンテープでシールした後、80℃のドライオーブンで15分間放置した。熱処理後は5分間、氷浴上で急冷した後、室温で15分放置した。これに等量の20 mM ABTS溶液（100 mM Tris-HCl pH 8.0）を混合した。ウェル内の溶液がABTSの反応に伴って緑色に呈色する様子を反応開始1時間後まで観察した。比較とした野生型に比較してABTSの呈色が強いものをピックアップして、それに相当する菌体を20%グリセロールストックとして-80℃で保存した。
【００６９】
図１に耐熱化スクリーニングの一例を示す。図１は、反応開始１時間後のABTSの呈色の様子を示している。中央の２列（左から６，７列目）のすべては比較としての野生型の組換えＢＯであり、６列目は他のウェルと同様に熱処理を行ったものである。７列目は野生型の組換えＢＯの熱処理のない場合の比較である。
【００７０】
図１によると、四角囲い部分のウェルが6列目の野生型のどれよりも強くABTSが呈色していることがわかる。これらのウェルでは、野生型組換えBOに比較して熱安定性が向上した変異体BOが発現していると考えられる。
【００７１】
本実施例では３−４で示した耐熱化スクリーニングを96ウェルプレートで50枚、計4000検体について行い、耐熱化変異体ＢＯを発現したと考えられる形質転換酵母を２６個選出した。
【００７２】
得られた２６個の形質転換酵母からプラスミドベクターを抽出し、ＢＯ遺伝子領域の塩基配列の解析を行った結果、以下の２６種の変異がＢＯ遺伝子に挿入されていることが判明した。すなわち、野生型アミノ酸配列においてＮ末端から４９番目のグルタミンをリジンに置換した変異（Q49K）、以下同様に、７２番目のグルタミンがグルタミン酸に置換した変異（Q72E）、８１番目のバリンがロイシンに置換した変異（V81L）、１０３番目のアラニンがプロリンに置換した変異（A103P）、１２１番目のチロシンがセリンに置換した変異（Y121S）、１４７番目のアルギニンがプロリンに置換した変異（R147P）、１８５番目のアラニンがセリンに置換した変異（A185S）、２１０番目のプロリンがロイシンに置換した変異（P210L）、２２５番目のフェニルアラニンがバリンに置換した変異（F225V）、２５８番目のグリシンがバリンに置換した変異（G258V）、２６４番目のアラニンがバリンに置換した変異（A264V）、２７０番目のチロシンがアスパラギン酸に置換した変異（Y270D）、２９９番目のセリンがアスパラギンに置換した変異（S299N）、３２２番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換した変異（D322N）、３３５番目のアスパラギンが
セリンに置換した変異（N335S）、３５６番目のアルギニンがロイシンに置換した変異（R356L）、３５９番目のプロリンがセリンに置換した変異（P359S）、３７０番目のアスパラギン酸がチロシンに置換した変異（D370Y）、３７１番目のバリンがアラニンに置換した変異（V371A）、３８１番目のバリンがロイシンに置換した変異（V381L）、４１８番目のアラニンがスレオニンに置換した変異（A418T）、４２３番目のプロリンがロイシンに置換した変異（P423L）、４３７番目のアルギニンがヒスチジンに置換した（R437H）、４６８番目のメチオニンがバリンに置換した変異（M468V）、４７６番目のロイシンがプロリンに置換した変異（L476P）、５１３番目のバリンがロイシンに置換した変異（V513L）が確認された。
【００７３】
（実施例４）：耐熱化変異体のPichia methanolicaによる大量発現
以下では、耐熱化スクリーニングによって発見した２６種の耐熱化変異体候補を大量に発現するために、新たに酵母Pichia methanolica(以下、P. methanolica)を用いた組換えＢＯの分泌発現系の構築を行い、野生型および耐熱化変異体候補の大量発現を試みた。
【００７４】
４−１：pMETaB-BOベクターの作製及びそれによるP. methanolicaの形質転換
まず、P. methanolica の発現系で用いる発現ベクターの作製を行った。ここで用いるpMETaBベクター（インビトロジェン）にはS. cerevisiae由来の分泌シグナル：α因子が含まれるので、その下流に成熟ＢＯに相当する遺伝子を挿入した。成熟ＢＯ遺伝子領域のPCRによる増幅には、鋳型としてpYES2/CT-BOベクターを、プライマーとして以下の「表８」に示すものを用いて行った。
【００７５】
【表８】
2009158480.tif 000009
【００７６】
得られた1500bpの増幅断片は制限酵素EcoRI、SpeIにより消化した後、同酵素で消化したpMETaBベクターと連結した。この連結反応の際、１−３で示した処理と同様の処理を反応物に施した。作製したＢＯ遺伝子領域を含むpMETaBベクター（以降、pMETaB-BOベクターとする）は、挿入したＢＯ遺伝子部分の塩基配列の確認を行った。変異体ＢＯの場合は、ここで作成したpMETaB-BOベクターに対してQuickChangeMutagenesis Kits（インビトロジェン）により変異を挿入した。以降の操作は野生型、変異体に関わらずすべて同様に行った。
【００７７】
上記の野生型及び２６種の耐熱化変異体候補のpMETaB-BOベクターに加え、２６種の耐熱化変異体候補の２つまたは３つまたは４つを組み合わせた多重変異体のpMETaB-BOベクターも同様に作製し、塩基配列の確認を行った。
【００７８】
作製したすべてのpMETaB-BOベクター によるP. methanolicaの形質転換を行った。P. methanolicaは、PMAD11株（インビトロジェン）を用いた。形質転換はpMETaBベクターに付属のマニュアルに記載された方法に従って行った。形質転換酵母の選択はMD寒天平板培地（組成は「表９」を参照）により行った。この反応のコンピテンシーは、いずれも〜10/1μgDNAであり、マニュアルに記載の値とほぼ一致した。
【００７９】
【表９】
2009158480.tif 000010
【００８０】
４−２：P. methanolicaによる組換えＢＯの大量発現
形質転換後5〜7日で得られたMD培地上の形質転換酵母のコロニーは3 mLのBMDY培地（組成は「表１０」を参照）で一晩培養した。得られた培養液の一部を再度、MD寒天平板培地に展開した。この２〜３日後に得られる白色の精製コロニーは、次項の大量発現に用いた。  
【００８１】
【表１０】
2009158480.tif 000011
【００８２】
次に、P. methanolicaによる組換えＢＯの大量発現作業に移行した。形質転換酵母の精製コロニーを５０ｍLのBMDY液体培地に接種して、一晩、30℃で震とう培養を行った。このときOD600は2〜5となった。ここで、得られた菌体を一旦遠心分離（1500×g、室温、10分）により沈澱させ、BMDY液体培地を除いた後、菌体のみをBMMY液体培地（組成は「表１１」を参照）50〜100 mlに懸濁した。これを24時間、27℃で震とう培養を行った。その後、終濃度0.5%メタノールを添加して、さらに24時間、同条件で培養を行った。これを96時間まで行った後、遠心分離により菌体を除き、残りの培養液を5〜10 ml程度まで濃縮して、50 mM Tris-HClバッファー（pH 7.6）に対して透析を行った。
【００８３】
【表１１】
2009158480.tif 000012
【００８４】
４−３．組換えＢＯの精製
続いて、アニオン交換クロマトグラフィーによる組換えＢＯの精製を行った。前工程で調製した組換えＢＯを含む粗製液は、アニオン交換カラム（HiTrap Q HP；ベッド体積：5 ml；GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて精製を行った。精製条件は既報（Biochemistry, 38, 3034-3042(1999)）を参考にして行った。
【００８５】
次に、疎水クロマトグラフィーによる組換えＢＯの精製を行った。疎水クロマトグラフィーに使用したカラムはToyopearlButyl-650 Mカラム（100 ml；22 mm x 20 cm；東ソー）である。精製条件は既報（Biochemistry, 44, 7004-7012(2005)）を参考にして行った。精製後に得られた組換えＢＯ（A264V）のUV-visスペクトルを図２に示す。
【００８６】
図２に示したA264Vのスペクトルパターンは既報（Protein Expression Purif., 41, 77-83 (2005)）のP. pastrisによる組換えＢＯのそれに完全に一致していた。
【００８７】
P. methanolicaによる大量培養の最終的な収量は、最大で11.7 mg / 1L培養であった。
【００８８】
４−４：耐熱性の評価
次に、P. methanolicaによる組換えＢＯ及び市販品のＢＯ(アマノエンザイム)の耐熱性の評価を行った。耐熱性の評価は熱処理後の残存活性率の比較によって行った。ここで、「熱処理後の残存酵素活性率（residual activity）」とは、「酵素活性残存率」、あるいは「酵素活性維持率」と称してもよく、酵素に対して所定の熱処理を施したときに、その前後で活性がどのように変化するかを表した値である。すなわち、熱処理の前後において、同一条件で酵素活性測定を行い、熱処理後の活性値が処理前に比べてどれだけ存在するかを百分率で表した値である。本発明において基準とする「熱処理」の条件は、緩衝液中６０℃で１時間又は６５℃で３０分静置処理であり、この熱処理前後における、前記酵素活性値の比を百分率で表している。
【００８９】
ＢＯ活性測定はABTSを基質として用い、反応進行に伴う730 nmの吸光度変化（ABTSの反応物の増加に由来する）を追跡した。測定条件は「表１２」のとおりとした。なお、ＢＯ濃度は活性測定の際、730 nmの吸光度変化が1分間当たり0.01 〜 0.2 程度となるように調製した。反応はABTSを含むリン酸緩衝液（2980 〜 2995μＬ）に酵素溶液（5〜20μＬ）を加えることで開始した。
【００９０】
【表１２】
2009158480.tif 000013
【００９１】
P. methanolicaで発現させた計２６種の耐熱化ＢＯ変異体候補（Q49K, Q72E, V81L, A103P, Y121S, R147P, A185S, P210L, F225V, G258V, A264V, Y270D,   S299N, D322N, N335S, R356L, P359S, D370Y, V371A, V381L, A418T, P423L, R437H, M468V, L476P, V513L）及びこれらの２つまたは３つまたは４つを組み合わせた多重変異体について、耐熱性実験を行った。各酵素溶液の熱処理は氷浴中の500 mlチューブに分注した150 mlの酵素溶液（100 mM リン酸Kバッファー(pH 6.0)）を６０℃に設定したヒートブロック上にすばやく移動させ、１時間放置後、再び氷浴中にすばやく戻すという方法を採用した。この耐熱化確認実験の結果を「表１３」にまとめた。
【００９２】
耐熱性の評価を行った５５種の耐熱化ＢＯ変異体候補の変性温度Ｔｍを示差走査マイクロカロリメトリー（以下、ＤＳＣ：Differenctialscanning calorimetryと略す）により測定した。ＤＳＣはMicroCal社のVP-DSCを用いた。酵素溶液は2.0〜2.5 mg/mlとし、昇温は１時間に６０℃の速度で行った。この結果を、耐熱化確認実験の結果と共に「表１３」にまとめた。
【００９３】
【表１３】
2009158480.tif 000014
【００９４】
「表１３」において、三重変異体または四重変異体の中には、残存酵素活性率が100％を超えるものがいくつか観測された。そこで、次に、熱処理温度を６５℃に上昇させて同様の耐熱化確認実験を行った。この結果を「表１４」にまとめた。なお、「表１４」では、熱処理時間を３０分とした。
【００９５】
【表１４】
2009158480.tif 000015
【００９６】
「表１３」及び「表１４」にまとめたように、野生型及び市販品のＢＯでは、熱処理により顕著な残存酵素活性率の低下が認められた。これに対して、耐熱化ＢＯ変異体候補の多くは、熱処理によっても酵素活性を高度に維持し、優れた耐熱性を示すことが確認された。
【００９７】
さらに、「表１４」に示すように、変異体F225V/D322N/M468V，変異体F225V/D370Y/L476P，変異体A264V/A418T/L476P，変異体A264V/R437H/L476P及び変異体A103P/A264V/Y270D/L476Pの５つの耐熱化ＢＯ変異体では、６５℃，３０分の熱処理によって逆に残存酵素活性率が上昇した。このことは、これらの５変異体が耐熱性に加え、熱処理により酵素活性が上昇するという際立った特性を有することを明らかにするものである。
【００９８】
（実施例５）：耐熱化ＢＯ変異体の電極への固相化と電極の性能評価
本実施例では、熱処理によって酵素活性が上昇した５つの耐熱化ＢＯ変異体のひとつ（変異体A103P/A264V/Y270D/L476P）をメディエータ（K3[Fe(CN)6]）とともに固定化して電極を作製した。回転電極装置を用いて、作製した電極の触媒電流値を測定し、燃料電池用電極としての性能評価を行った。耐熱化ＢＯ変異体の固定化は、本発明に係る方法と従来方法の２通りによって行い、それぞれの方法によって得られた電極の性能を比較した。また、市販品ＢＯについても、同様に２通りの方法によって固定化を行い、得られた電極の性能比較を行った。
【００９９】
５−１：電極の作製
（１）電極１（市販品ＢＯ・従来固定化方法）
1cm角のカーボンフェルトを２枚重ねたもの(CF2)に、市販品（アマノエンザイム）のＢＯ溶液（緩衝液は46.5mMリン酸Na溶液）を80μl、固定化剤ポリ−Ｌ−リシン（PLL）2wt%溶液を80μl、K3[Fe(CN)6]（以下、「FeCN」と略記）200mM溶液を80μl、浸み込ませた。市販品ＢＯは、凍結乾燥品（酵素活性2.5 U/mg）を、50mg/ml溶液に調製して用いた（酵素の活性定義についてはメーカー添付書を参照）。
【０１００】
溶液を浸み込ませたCF2を、乾燥機で３０℃、２時間乾燥させて水分を蒸発させた。乾燥後、直径6ｍｍの大きさに切り出したCF2を、6ｍｍ径のPFC電極（カーボン部分は3mm径）の先端にナイロン製ネットとＯリングを用いて物理的に固定し、電極１を得た。
【０１０１】
（２）電極２（市販品ＢＯ・本発明に係る固定化方法）
電極１と同様にして各溶液を浸み込ませたCF2を、乾燥機で３０℃、１時間乾燥させた後、さらに６０℃、１時間乾燥させて水分を蒸発させた。乾燥後、CF2を切り出し、PFC電極の先端に固定して、電極２を得た。
【０１０２】
（３）電極３（耐熱化ＢＯ変異体・従来固定化方法）
1cm角のカーボンフェルトを２枚重ねたもの(CF2)に、変異体ＢＯ溶液を80μl、固定化剤ポリ−Ｌ−リシン（PLL）2wt%溶液を80μl、FeCN200mM溶液を80μl、浸み込ませた。変異体ＢＯ溶液は、市販品ＢＯ溶液と600nmの吸光度が同程度になるように調製して用いた。
【０１０３】
溶液を浸み込ませたCF2を、乾燥機で３０℃、２時間乾燥させて水分を蒸発させた。乾燥後、CF2を切り出し、PFC電極の先端に固定して、電極３を得た。
【０１０４】
（４）電極４（耐熱化ＢＯ変異体・本発明に係る固定化方法）
電極３と同様にして各溶液を浸み込ませたCF2を、乾燥機で３０℃、１時間乾燥させた後、さらに６０℃、１時間乾燥させて水分を蒸発させた。乾燥後、CF2を切り出し、PFC電極の先端に固定して、電極４を得た。
【０１０５】
５−２：触媒電流値の測定
電極１〜４について、回転電極装置を用いてサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を測定した。ＣＶ測定は、初期電位0.6V(vs. Ag|AgCl)から-0.35V(vs. Ag|AgCl)までの電位領域を、速度10mV/sで電位走査して行った。緩衝液には、46.5mMリン酸Na緩衝液（2ml）を用い、これに純酸素をバブリングさせることで酸素飽和溶液とした。また、電極の回転数は、1000rpmとした。
【０１０６】
図３に、電極１で得られたボルタモグラムを示す。図中、点線は、アルゴン下で測定されたボルタモグラムを、実線は、酸素飽和下で測定されたボルタモグラムを示す。ＢＯの触媒反応が進行しないアルゴン下での電流値と、触媒反応が進行する酸素飽和下での電流値との差分を触媒電流値とし、-0.2V(vs. Ag|AgCl)における定常電流値の差分を電極性能評価のための触媒電流値とした。
【０１０７】
電極１〜４で得られた触媒電流値（mA/cm2）を「表１５」に示す。
【０１０８】
【表１５】
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【０１０９】
電極１（市販品ＢＯ・従来固定化方法）の触媒電流値は、6.60±0.57mA/cm2であった。一方、市販品ＢＯを本発明に係る固定化方法によって固定した電極３では、触媒電流値は2.96±0.33mA/cm2となった。電極１に対する電極２の触媒電流比は44.8％であり、耐熱性の低い市販品ＢＯを用いた場合には、固定化温度を６０℃とすることによって顕著に電極性能が低下することが確認された。
【０１１０】
電極３（耐熱化ＢＯ変異体・従来固定化方法）の触媒電流値は、3.81±0.22mA/cm2であった。一方、耐熱化ＢＯ変異体を本発明に係る固定化方法によって固定した電極４では、触媒電流値は4.56±0.46mA/cm2となり、電極３に比べて触媒電流値が１１９％程度に増加した。これは、耐熱化ＢＯ変異体を用いた場合には、固定化温度を６０℃とすることでＢＯの酵素活性が上昇し、これによって従来の固定化方法に比べて優れた性能を有する電極が得られることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明に係る燃料電池、燃料電池用電極及びこれらの製造方法、並びに燃料電池用電極への酵素固定化方法は、例えば、電子機器、移動体、動力装置、建設機械、工作機械、発電システム、コージェネレーションシステム等、電力を必要とする様々な機器、装置、システムに広く用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】耐熱化スクリーニングの一例を示し、ABTSの発色の様子を示している図（反応開始１時間）である。
【図２】変異型組換えＢＯのUV-visスペクトルを示す図である。
【図３】実施例５において測定されたボルタモグラムの一例（電極１）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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