(57)【要約】【課題】担体粒子のパールチェーン化によって生物学的特異的反応を促進することにより、生物学的特異的反応性物質の存在を検出または測定する装置、および測定方法において、パールチェーン化による熱発生を抑制して、試料溶液の蒸発を抑制することを目的とする。【解決手段】前記担体粒子と生物学的特異的凝集反応しうる生物学的特異的反応物質の存在を、検出または測定する装置であって、電極対および前記電極対の間に配置された反応場を有する基体と、前記電極対に交流電圧を印加する電圧印加手段と、前記交流電圧によって前記反応場に印加される交流電界によりパールチェーン化する、前記反応場に配置された担体粒子とを有する。前記電圧印加手段が、少なくとも２つ以上の互いに異なる大きさの振幅の交流電圧を印加することを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極対および前記電極対の間に配置された反応場を有する基体と、前記反応場に配置された担体粒子をパールチェーン化させるように、前記電極対に交流電圧を印加する電圧印加手段とを有し、前記担体粒子上での生物学的特異的凝集反応により生物学的特異的反応物質の存在を、検出または測定する装置であって、
前記電圧印加手段は、少なくとも２つ以上の互いに異なる大きさの振幅の交流電圧を印加する装置。
【請求項２】
前記電圧印加手段は、第１の大きさの振幅の第１の交流電圧と、第２の大きさの振幅の第２の交流電圧とを交互に印加し、
前記第１の交流電圧により、電界強度が２０Ｖ／ｍｍ以上１００Ｖ／ｍｍ以下である第１の交流電界が、前記反応場に印加され、かつ前記第２の交流電圧により、第１の電界強度よりも小さい電界強度である第２の交流電界が、前記反応場に印加される、
請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第２の交流電圧の振幅の大きさが０Ｖである、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記第１の交流電圧の印加時間と第２の交流電圧の印加時間とを含む繰り返し周期が、３０ナノ秒以上５秒以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記繰り返し周期に対する、前記第１の交流電圧の印加時間の割合が、７５％から９５％である、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記基体が、前記反応場を構成する流路を備え、前記流路の少なくとも１面を構成する材料が樹脂である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
前記基体が、
前記流路の頂面を構成し、前記頂面側の基板形状は平板である上面基板と、
前記流路の底面を構成し、前記底面側の基板形状は平板である下面基板と、
前記流路の側面を構成し、前記流路の形状に相当する貫通領域を備える中間基板とを含み、
少なくとも、前記中間基板の材料が樹脂である、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記中間基板の前記流路を構成しない面は粘着性を有する、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記流路のすべての面を構成する材料が樹脂である、請求項６に記載の装置。
【請求項１０】
担体粒子と、前記担体粒子上で生物学的特異的凝集反応しうる生物学的特異的反応物質を含有する被測定溶液とを含む反応系に、交流電界を印加して、前記担体粒子をパールチェーン化させる工程を有する、前記生物学的特異的反応物質の存在を検出または測定する方法であって、
前記反応系は、少なくとも２つ以上の異なる大きさの電界強度を有する交流電界を印加される方法。
【請求項１１】
前記交流電界を印加したときに、前記被測定溶液に流れる電流の実効値が、０．７ｍＡ以上９６ｍＡ以下である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記被測定溶液の導電率は、０．１ｍＳ／ｃｍ以上３５ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記交流電界を印加したときに、前記被測定溶液の温度は４５℃以下に保たれる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記被測定溶液は血液または血漿である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫反応（抗原抗体反応）や遺伝子反応などの生物学的反応において生じる反応生成物を検出する検査用チップを用いた測定装置及びその測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な診断チップが開発されている。これら診断チップの殆どは、マイクロタス（μ−ＴＡＳ：Micro Total Analysis System）と呼ばれる微小流路構造を持つカード型のデバイスである。流路を微細化すると、生体から抽出するサンプルの必要量が微量となるので非常に有用である。また、流路の微細化により健康診断チップを含む装置全体を小型化できれば、比較的大規模の病院だけでなく、診療所や家庭での診断を行うＰＯＣＴ（Point of care test：その場診断）用途に用いることが可能となる。
【０００３】
医療分野や生化学分野においては、抗原抗体反応により生成された凝集物を検出して抗原や抗体の存在を検査し、病気の診断や解析が行われている（特許文献１〜３を参照）。
特許文献１に開示されている方法は、抗原や抗体などの反応性物質を担持された担体（スチレン系重合体粒子など）を含有する反応液に交流電圧を印加し、担体粒子を電場に平行な一方向に数珠繋ぎに配向させる（「パールチェーン化」とも称する）。さらに電圧印加を停止した後の担体粒子の凝集度合いで、抗原抗体反応を定量する。この測定で印加される交流電圧は、周期的に正・負の振幅値が交互に、かつ連続的であることを特徴とする。この交流電圧信号により、従来までの直流パルス信号に比べて、塩の存在下でも電気分解することなく担体粒子をパールチェーン化させることができるようになった。
【０００４】
しかしながら、担体粒子のパールチェーン化を促進させることは困難であった。
担体粒子のパールチェーン化を促進させるためには、担体粒子に作用する誘電泳動力を大きくすればよく、反応場の交流電界を大きくすればよい。交流電界の強度を大きくするための方法は、１）印加する交流電圧の大きさを大きくするか、２）電圧が印加される反応場を小さくするか、のいずれかが必要である。しかしながら、そのいずれかを実行すると、反応系において発生する熱が増大する。
つまり、交流電圧のエネルギーは熱エネルギーに変換され、熱エネルギーは溶液の導電率に比例して高まる。印加する交流電圧を大きくすると、反応系で発生する熱エネルギーが大きくなり、温度上昇が起こる。
一方、電圧が印加される反応場を小さくすると、反応系全体の導電率が高くなり、結果、反応系で発生する熱エネルギーが大きくなり、温度上昇が起こる。特に、導電率が高い溶液ではこの傾向は顕著となり、溶液が反応系で瞬時に蒸発して、粒子のパールチェーン化を試料溶液の成分測定に利用することができない場合が多かった。
【０００５】
担体粒子をパールチェーン化させるには、その反応場を構成する材料についても制限がある。特許文献１に開示されている反応場を構成する測定装置が図７に示される。スライドグラス１０１および１０２が反応場の頂／底面を構成し、導電体である電極１０３および１０４が反応場の側面を構成している。電極の厚さを０．０２ｍｍ、電極間の距離を０．５ｍｍと設定することにより、反応場の体積を規定している。この反応場を構成する部材はガラスまたは導電性電極であり、いずれも熱伝導率が高い材料とする必要がある。しかし、これらの材料を用いると、生産性に課題が生じることがある。一方、樹脂材料で反応場を構成すれば、安価にかつ容易に製造することができるが、樹脂材料の熱伝導性が低いので、パールチェーン化を行う反応場での反応系の温度が顕著に上昇する。
【特許文献１】特開平７−８３９２８号公報
【特許文献２】特開２００３−７５４４１号公報
【特許文献３】特開昭５９−１７３７６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
さらに、生体試料の一例である、血液試料や血漿試料の成分測定に、前述の担体粒子のパールチェーン化を利用する測定方法を適用しようとすると、適切に測定することができないことがあった。血液試料や血漿試料は、概ね生理食塩水と同程度の塩濃度（１２０ｍＭ程度）を有し、導電率が高い溶液である。そのため、パールチェーン化により反応系に生じた熱によって試料中のタンパク質が変性して反応系中で固着化するか、または被測定対象物であるタンパク質自体が変性して、抗原−抗体反応などの特異反応を示さなくなるなどの弊害が生じた。これらを避けるため、血漿試料を無塩溶液で事前に希釈するなどの追加操作が必要となる。
【０００７】
本発明は、担体粒子のパールチェーン化によって生物学的特異的反応を促進することにより、生物学的特異的反応性物質の存在を検出または測定する装置、および測定方法において、パールチェーン化による熱発生を抑制して、試料溶液の蒸発を抑制することを目的とする。さらに、測定溶液を血液試料や血漿試料などに代表される導電率が高い溶液とすることができる装置、および測定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち本発明の第一は、以下に示す装置に関する。
［１］  電極対および前記電極対の間に配置された反応場を有する基体と、前記反応場に配置された担体粒子をパールチェーン化させるように、前記電極対に交流電圧を印加する電圧印加手段とを有し、前記担体粒子上での生物学的特異的凝集反応により生物学的特異的反応物質の存在を、検出または測定する装置であって、
前記電圧印加手段は、少なくとも２つ以上の互いに異なる大きさの振幅の交流電圧を印加する装置。
［２］前記電圧印加手段は、第１の大きさの振幅の第１の交流電圧と、第２の大きさの振幅の第２の交流電圧とを交互に印加し、
前記第１の交流電圧により、電界強度が２０Ｖ／ｍｍ以上１００Ｖ／ｍｍ以下である第１の交流電界が、前記反応場に印加され、かつ前記第２の交流電圧により、第１の電界強度よりも小さい電界強度である第２の交流電界が、前記反応場に印加される、［１］に記載の装置。
［３］前記第２の交流電圧の振幅の大きさが０Ｖである、［１］または［２］に記載の装置。
［４］前記第１の交流電圧の印加時間と第２の交流電圧の印加時間とを含む繰り返し周期が、３０ナノ秒以上５秒以下である、［１］〜［３］のいずれかに記載の装置。
［５］前記繰り返し周期に対する、前記第１の交流電圧の印加時間の割合が、７５％から９５％である、［４］に記載の装置。
［６］前記基体が、前記反応場を構成する流路を備え、前記流路の少なくとも１面を構成する材料が樹脂である、［１］〜［５］のいずれかに記載の装置。
［７］前記基体が、前記流路の頂面を構成し、前記頂面側の基板形状は平板である上面基板と、前記流路の底面を構成し、前記底面側の基板形状は平板である下面基板と、前記流路の側面を構成し、前記流路の形状に相当する貫通領域を備える中間基板とを含み、
少なくとも、前記中間基板の材料が樹脂である、［６］に記載の装置。
［８］前記中間基板の前記流路を構成しない面は粘着性を有する、［７］に記載の装置。
［９］前記流路のすべての面を構成する材料が樹脂である、［６］に記載の装置。
【０００９】
さらに本発明の第二は、以下に示す方法に関する。
［１０］担体粒子と、前記担体粒子上で生物学的特異的凝集反応しうる生物学的特異的反応物質を含有する被測定溶液とを含む反応系に、交流電界を印加して、前記担体粒子をパールチェーン化させる工程を有する、前記生物学的特異的反応物質の存在を検出または測定する方法であって、
前記反応系は、少なくとも２つ以上の異なる大きさの電界強度を有する交流電界を印加される方法。
［１１］前記交流電界を印加したときに、前記被測定溶液に流れる電流の実効値が、０．７ｍＡ以上９６ｍＡ以下である、［１０］に記載の方法。
［１２］前記被測定溶液の導電率は、０．１ｍＳ／ｃｍ以上３５ｍＳ／ｃｍ以下である、［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］前記交流電界を印加したときに、前記被測定溶液の温度は４５℃以下に保たれる、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］前記被測定溶液は血液または血漿である、［１０］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の装置はその電圧印加手段が、反応場に、第１の交流電界と第２の交流電界とを含む、２種以上の交流電界を印加する。第１の交流電界は担体粒子に、パールチェーン状に配向（パールチェーン化）するための泳動力を付与する。一方、第２の交流電界は、第１の交流電界の電界強度よりも小さい電界強度を有するので、パールチェーン化により反応系で生じた熱を外部へ放熱することができる。
【００１１】
そのため、担体粒子のパールチェーン化による熱の発生が抑制され、導電率が高い試料溶液でも溶液が蒸発することなく、しかも担体粒子を迅速にパールチェーン化させることができる。
よって、導電率が高い生体試料の一例である血液や血漿を、事前に希釈することなく、本発明により成分測定ができる。したがって、事前希釈手段を供える必要のない、簡便な構成の測定装置を提供することができる。あるいは、操作者に事前に血漿を希釈する操作を要求しないため、簡単で間違いがなく測定できる。
【００１２】
前述の通り、パールチェーン化を引き起こすための第１の交流電界に加えて、第２の交流電界を印加することで、反応系での熱の発生自体が抑制される。よって、反応場を構成する装置の材質を、熱伝導がよいガラスだけでなく、ガラスに比べ１桁ほど熱伝導が悪い樹脂とすることができる。これにより、装置を安価に製造でき、製造が容易になるため、生産効率も大幅に向上させることができる。
【００１３】
さらに、第１の交流電界と第２の交流電界の電界強度と印加時間を適切に調整すれば、担体粒子のパールチェーン化が完了するまでの時間をさほど延長させることがないので、迅速な測定ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．本発明の装置
本発明の検出または測定装置は、１）電極対および前記電極対の間に配置された反応場を有する基体と、２）前記反応場に配置された担体粒子をパールチェーン化させるように、前記電極対に交流電圧を印加する電圧印加手段とを有する。
【００１５】
図１には、本発明の装置の一例（装置１）の構成の概略が示される。装置１は、基体２と、電圧印加手段１２を有する。
図２は、基体２の上面図である。基体２は一対の電極３Ａおよび電極３Ｂ（電極対）を有し、それぞれ端子９と接続している。電極対の間が反応場となる。基体２の反応場は、液体５が配置されるための流路４である。
【００１６】
一方、電圧印加手段１２は、コネクタ１４を有する。電圧印加手段１２のコネクタ１４と、基体２の端子９とを接続することで、電極３Ａと電極３Ｂとの間に所定の電圧を印加することができる。電極対に印加される交流電圧によって、基体２の反応場に交流電界が印加される。
【００１７】
基体２の電極３Ａと電極３Ｂとの距離５５は不変である。そのため、電極３Ａと電極３Ｂとに印加される電圧によって、反応場に印加する交流電界の電界強度が制御される。したがって、電界強度を容易に可変することができる。
【００１８】
さらに図１に示される装置１には、撮像手段１０、制御解析手段１３を有する。
撮像手段１０は、基体２の流路４内に配置される担体粒子６（後述）の挙動を観察・撮像することができる。基体２の上面基板２１または下面基板２２の少なくともいずれか一方に透明性を付与すれば、撮像手段１０によって流路４内の様子を容易に撮像することができる。さらに対物レンズ１１を、撮像手段１０と基体２との間に設置すれば、流路４内の様子が拡大されて撮像される。撮像は動画であっても、静止画であってもよい。さらに不図示の光源等を配置して、撮像の解像度を上げることもできる。
【００１９】
制御解析手段１３は、装置１による測定の制御とともに、撮像手段１０で撮像された画像を処理することができる。例えば制御解析手段１３は、画像の中の粒子の数をカウントすることができる。
【００２０】
前述の通り、基体２は電極対を有し、電極対の間に反応場である流路４が形成されている。基体２は、例えば、１）凹部２６を有する上面基板２１と、電極３Ａおよび電極３Ｂが配置された下面基板２２とを有し、上面基板２１と下面基板２２によって電極３Ａおよび電極３Ｂが挟まれるか（図３Ａの基体２Ａ参照）、２）上面基板２１と、電極３Ａおよび電極３Ｂが配置された下面基板２２と、電極３Ａおよび電極３Ｂと上面基板２１とで挟まれる中間基板２５を有する（図３Ｂの基板２Ｂ参照）。図３Ａおよび図３Ｂは、図２に示される基体２のＡ−Ａ’線での断面図である。
【００２１】
図３Ａに示されるように、基体２Ａの流路４は、上面基板２１の凹部２６の空間と、電極３Ａと電極３Ｂとの間の空間とからなる。一方、図３Ｂに示されるように、基体２Ｂの流路４は、中間基板２５同士の間の空間と、電極３Ａと電極３Ｂとの間の空間とからなる。基板２Ｂでは、中間基板２５が、流路４の内面の一つを構成している。
いずれにしても、基板２の流路４は、その頂面を上面基板２１、底面を下面基板２２としており、電極３Ａおよび電極３Ｂが流路４の内部に露出している。
【００２２】
基体２Ｂは、中間基板２５の厚みが流路の深さとほぼ等しくなるため、上面基板２１に凹部２６を形成する必要がなく、上面基板２１を平板形状とすることができる。したがって基体２Ｂは、製造面からも好ましい。さらに中間基板２５の両面が接着性あるいは粘着性を有すると、中間基板２５と上面基板２１または下面基板２２とを容易に貼り合せることができ、製造効率が高まる。
【００２３】
基体２の電極３Ａおよび３Ｂの膜厚５４Ｂは、１ｎｍ〜１０μｍに調整されることが好ましい。特にスパッタを用いて電極を形成するときは、製造時間の観点から、電極の膜厚５４Ｂは５０ｎｍ〜５００ｎｍ、好適には１００ｎｍに調整されることが好ましい。
電極３Ａおよび３Ｂの幅５６は任意であるが、通常、約０．５ｍｍ〜５ｍｍである。さらに、電極３Ａおよび３Ｂは電圧印加手段１２と連通するよう、配線や電気的接触を実現する端子９を有する。
【００２４】
電極３Ａと３Ｂとの距離５５は、２０〜１０００μｍに調整される。間隔が２０μｍ未満であると、直径が数μｍである粒子がパールチェーン化（粒子が数珠繋ぎ状に連結すること）するための領域を十分に確保できない。また、間隔が１０００μｍ以上であると、有効な電界強度が得られないか、もしくは有効な電界強度を得るために５０Ｖ以上の大きな電圧印加が必要となるため、好ましくない。距離５５は、１００〜５００μｍであることがより好ましく、約５００μｍであるとさらに好ましい。
【００２５】
電極３Ａおよび３Ｂの材料は、導電性を有し、かつ溶液中での交流電圧の印加で溶解・剥離しない特性を有すればよい。電極材料の例には、金、銀、白金、銅、アルミ、クロム、ニッケル、タングステンやその合金が含まれる。電極材料を金とすると、スパッタ技術によって下面基板２２に強固に成膜でき、交流電圧印加に対する膜の安定性が高まるので好ましい。
【００２６】
基体２の上面基板２１と下面基板２２の大きさは、流路４と電極３Ａおよび電極３Ｂを配置できる寸法であれば任意である。
【００２７】
基体２の上面基板２１と下面基板２２の材料は、絶縁材料または半導体材料で構成されている。絶縁材料の例としては、有機材料またはガラスなどの無機絶縁材料から選ばれる。基体２の上面基板２１と下面基板２２の少なくとも一方の基板は透明性を有することが必要なので、通常は上面基板２１と下面基板２２のともに半導体材料で構成させることはできないが、一方の基板を半導体材料で構成することがある。
【００２８】
有機材料の例には、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホンなどが含まれる。
【００２９】
無機絶縁材料の例には、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などが含まれる。ガラスは、アルカリガラス、アルカリソーダガラス、ホウケイ酸ガラス、石英ガラスなどである。半導体材料は、単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などである。
【００３０】
一般的にガラスは熱伝導性がよいので、基体２の材質として適している。粒子をパールチェーン化させるために印加した電界によって発生する熱を、速やかに放散することによって、反応系の温度上昇を抑制することができるからである。
しかしながら本発明では、粒子をパールチェーン化させるために電界を印加しても反応系の温度が上昇しにくいので、基体２の材質をガラスよりも熱伝導性の低い材質とすることができる。したがって、基体２の上面基板２１と下面基板２２の材料を有機材料、好適にはＰＥＴ樹脂とすることができる。ＰＥＴ樹脂の熱伝導性は、ガラスに比べて１桁ほど熱伝導が悪いにもかかわらず、本発明の装置の基体の材質とすることができる。
基材２の材質をＰＥＴ樹脂なだの有機材料とすると、基材２の製造コストを抑制することができ、また製造プロセスも容易になるため、生産効率も大幅に向上させることができる。
【００３１】
また、基体２の上面基板２１と下面基板２２の少なくとも一方の基板の一部が、透明性を有していることが好ましい。流路４内の様子を観察するためである。特に深さを適切に規定すれば、流路４内での担体粒子６（後述）の挙動を焦点ぼけすることなく認識できる。例えば、抗原抗体反応により生じる担体粒子６の凝集を検出して、抗原や抗体の存在を検出したり、その量を測定したりすることができる。
【００３２】
基体２の反応場である流路４には、数μｍの直径の担体粒子６が提供される。その担体粒子６を、一層に配置させ、重なりを抑制すれば、流路４の上方からの撮像した画像において粒子像が重畳せず、画像ボケがない。そのため、流路４の深さ５３は、５μｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。
【００３３】
流路４の流路幅および長さは任意に設定されるが、流路４の容積は、注入すべき生体試料溶液５の必要量以上の容積を有する。通常、流路４の幅は０．１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であり、好適には０．２ｍｍ以上１ｍｍ以下であり、代表的には０．７５ｍｍである。流路４の長さは、５ｍｍ程度である。
【００３４】
流路４に、電極３Ａと電極３Ｂの一部が露出している。その電極露出幅５８は、０ｍｍ超、３ｍｍ以下であり、０．１ｍｍ〜０．２ｍｍ程度である。
【００３５】
流路４の内部表面は、親水性であっても、疎水性であってもよい。また、いずれの表面の一部または全部を、親水性または疎水性にしてもよい。また、粒子の吸着を抑制する表面処理が施されていてもよい。
【００３６】
上面基板２１または下面基板２２には、流路４内に液体５を注入するための注入口や、流路４内の気体などを排出するための排出口を設けてあってもよい（不図示）。注入口と排出口は、流路４とつながっていればよく、その位置や大きさは特に限定されない。
【００３７】
基体の作製方法
基体２の作製方法は、特に限定されない。例えば、基体２Ａは、以下の工程で作製されうる。
１）下面基板２２の一面に、電極３Ａおよび電極３Ｂを形成させる工程
２）上面基板２１に流路４の形状に応じた凹部２６、あるいは必要に応じて、溶液５を注入するための注入口および空気穴などを形成する工程
３）上面基板２１と下面基板２２を貼り合せる工程
【００３８】
工程１）において、電極３Ａおよび３Ｂは、スパッタや蒸着に代表される薄膜堆積技術、または印刷技術など、当業者に公知の技術を用いて下面基板に形成される。スパッタで形成される電極３Ａおよび３Ｂは、その膜厚を薄くしやすいので、工程３）で貼り合せわせた上面基板２１と下面基板２２との間に、電極段差によるスキマが生じにくいので、好ましい。
【００３９】
工程２）において、凹部２６や、さらに注入口や空気穴が、当業者に公知の技術で形成される。一例を示すと、切削技術やレーザーによる除去技術、あるいはインプリント技術やフォトリソグラフィーなどが選択される。
【００４０】
工程３）において、上面基板２１と下面基板２２を当業者に公知の技術を用いて貼り合せる。これらの工程を経て、基体２Ａは作製されて使用される。
【００４１】
また基体２Ｂは、工程２）において凹部２６を形成せず、工程３）において上面基板２１と下面基板２２とを、中間基板２５を挟んで貼り合わせること以外は、基板Ａと同様の方法で製造されうる。
【００４２】
基体２の反応場である流路４には担体粒子６が提供される。担体粒子６は、試料溶液が注入される前にあらかじめ流路４に配置されていてもよいが、試料溶液とともに流路４に供給されてもよい。担体粒子６は、反応場に印加される交流電界によって、パールチェーン化する。
【００４３】
本発明の担体粒子６の例には、ラテックス粒子、ベントナイト、カオリン、金コロイド、赤血球細胞、ゼラチン、リポソームなどが含まれるが、好ましくはラテックス粒子である。凝集反応において一般に用いられているラテックス粒子が使用でき、例えば、ポリスチレン系ラテックス、ポリビニルトルエン系ラテックス、ポリメタクリレート系ラテックスなどが使用できる。ラテックス粒子には、官能基モノマー（−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＯ３などを有するモノマー）が共重合して導入されていてもよい。
【００４４】
担体粒子６の平均粒径は、例えばラテックス粒子の場合、０．５〜１０μｍが好ましい。平均粒径が０．５μｍ未満の担体粒子には、十分な誘電泳動力が付与されず、パールチェーン化しにくい。また、平均粒径が１０μｍを超える担体粒子は、電圧印加を停止した後も、パールチェーン化した担体粒子の分散が起こりにくい。担体粒子６の平均粒径は、例えばラテックス粒子の場合、さらに好ましくは１〜５μｍ、最も好適には２〜３μｍである。
【００４５】
反応場における反応系（担体粒子６と試料溶液５を含む）中の担体粒子６の濃度が高いほど、パールチェーンが形成されやすく、凝集反応も促進されやすい。一方、担体粒子６の濃度が高いほど、生物学的特異的反応性物質が存在しない場合に再分散したときの担体粒子６の凝集率が大きくなる傾向がある。さらに、担体粒子６の濃度が高すぎると反応系で担体粒子６同士が重なりやすく、成分測定のために凝集した担体粒子６を画像解析する上で好ましくない。これらの観点から、反応系中における担体粒子６の濃度は、例えばラテックス粒子の場合、好ましくは０．０１〜１重量％、より好ましくは０．１〜０．５重量％、さらに好適には約０．４重量％である。
【００４６】
本発明の好ましい態様では、測定または検出対象である生物学的特異的反応性物質が、抗原および／または抗体である。本発明の更に好ましい態様では、測定または検出対象である生物学的特異的反応性物質を抗原として、その抗原に対する抗体を感作させたラテックス粒子を担体粒子６とする。ラテックス粒子への抗体の感作は、例えば、従来周知の方法でラテックス粒子に抗体を吸着又は結合させることにより実施することができる。
【００４７】
電圧印加手段１２が印加する交流電圧は、２種以上の、互いに異なる大きさの振幅の交流電圧を印加する。例えば電圧印加手段１２は、反応場に配置された担体粒子６（後述）をパールチェーン化させるための第１の交流電圧と、第１の交流電圧の振幅よりも小さい振幅を有する第２の交流電圧を印加する。第１の交流電圧により、反応場に第１の交流電界が印加され、第２の交流電圧により、反応場に第２の交流電界が印加される。
【００４８】
図４Ａおよび図４Ｂには、電圧印加手段１２が印加する交流電圧の波形の例（交流電圧波形６０Ａおよび６０Ｂ）が示される。交流電圧波形６０Ａおよび６０Ｂは、第１の振幅値６３を有する第１の交流電圧波形群６２と、第２の振幅値７３を有する第２の交流電圧波形群７２とを含み、第１の交流電圧波形群６２と第２の交流電圧波形群７２とが繰り返されている。つまり、第１の群周期６６と第２の群周期７６からなる全体周期８１が繰り返される。
【００４９】
第１の交流電圧波形群６２は、第１の群周期６６の間、第１の交流電圧波形６１を１周期の波形として繰り返されている。つまり、第１の群周期６６は、第１の交流電圧波形６１の周期６４と、繰り返し印加数６８との乗数となる。
【００５０】
第１の振幅値６３は、反応場に印加される交流電界の電界強度が２０Ｖ／ｍｍ以上１００Ｖ／ｍｍ以下になるように調整されることが好ましい。つまり、基板２の電極３Ａと電極３Ｂとの間隔が５００μｍのとき、第１の振幅値６３は１０Ｖｐ−ｐ以上５０Ｖｐ−ｐ以下であることが好ましい。ここで、第１の振幅値６３は全幅振幅値を意味する。
【００５１】
第１の周期６４は、第１の交流電圧波形６１の周波数（第１の周波数）が１ｋＨｚ以上１００ＭＨｚ以下となるように調整されるが、好適には約１００ｋＨｚである。
【００５２】
第１の群周期６６は、３０ｎ秒以上５秒以下から選択される。３０ｎ秒以下では、有効な泳動力が粒子６に伝わらず、５秒以上では反応系における温度上昇が顕著になる。第１の交流電圧波形６１の周波数（第１の周波数）が１００ｋＨｚのとき、第１の群周期６６が３０μ秒以上１００ｍ秒以下であるとより好適である。よって、第１の交流電圧波形群６２の周波数は０．２Ｈｚ以上１ＭＨｚ以下であり、繰り返し印加数６８は３以上５×１０６以下であることが好ましい。
【００５３】
一方、第２の交流電圧波形群７２は、第２の群周期７６の間、第２の交流電圧波形７１を１周期の波形として繰り返されている。第２の群周期７６は、第２の交流電圧波形７１の第２の周期７４と、繰り返し印加数７８との乗数となる。ただし図４Ｂでは、第２の交流電圧波形群７２の第２の振幅値が０である。
【００５４】
第２の振幅値７３は、第１の振幅値６３より小さいことを特徴とする。第２の振幅値７３は、電界強度０Ｖ／ｍｍ以上２０Ｖ／ｍｍ未満になるように調整されることが好ましい。したがって、電極３Ａと電極３Ｂとの間隔が５００μｍのときの第２の振幅値７３は、０Ｖ以上１０Ｖ未満であることが好ましい。１０Ｖ以上では担体粒子６に十分な泳動力が与えられパールチェーン化が引き起こされるが、反応系に熱が発生する。すると、反応系の温度が上昇して、所望の成分測定ができないことがある。第２の振幅値７３は、好適には熱の発生が最も少ない０Ｖである（図４Ｂを参照）。
【００５５】
第２の周期７４、および第２の交流電圧波形７１の周波数（第２の周波数）は任意である。
【００５６】
前述の通り、交流電圧波形６０（図４Ａにおける６０Ａ、図４Ｂにおける６０Ｂ）は、群周期６６と群周期７６の合計周期８１ごとに、第１の交流電圧波形群６２と、第２の交流電圧波形群７２との組み合わせが繰り返された波形である。本明細書において、合計周期８１に対する、第１の交流電圧波形群６１の群周期６６の割合を「印加割合」と称する。印加割合は、０．７５以上０．９５以下に調整されることが好ましい。印加割合が０．７５未満であると、担体粒子６に十分な泳動力を与えられない第２の交流電圧の印加時間が長くなるので、担体粒子６がパールチェーン化するために必要な電圧印加時間が長くなる。一方、印加割合が０．９５以上であると、担体粒子６に十分な泳動力を与える第１の交流電圧印加時間が長くなりすぎ、パールチェーン化によって反応系に発生した熱を十分に逃がすことができない。そのため、反応系の温度が上昇し、所望の成分測定ができない場合がある。
【００５７】
第１の交流電圧波形６１および第２の交流電圧波形７１の形状は任意であり、矩形波、正弦波、余弦波、三角波等から適宜選択される。好適には、第１の交流電圧波形６１は矩形波であることが望ましい。
【００５８】
２．本発明の検出または測定方法
本発明の検出または測定方法（「本発明の方法」ともいう）は、担体粒子と試料溶液とを含む反応系に、交流電界を印加するステップを含む。試料溶液は、前記担体粒子と生物学的特異的凝集反応する生物額的特異的反応物質を含有する。前記反応系に交流電界を印加することによって、前記担体粒子をパールチェーン化させる。パールチェーン化することにより、担体粒子上での生物額的特異的反応物質の生物学的特異的凝集反応が促進される。
【００５９】
具体的に本発明の方法は、前述の基体２を含む装置１を用いて行うことができる。以下に、担体粒子のパールチェーン化と、免疫反応とを利用する方法を、図５を参照して概説する。免疫反応とは、抗体を吸着させた担体粒子６の凝集率で、抗体に特異的に結合する抗原の量を検出する原理に基づく。
【００６０】
まず、基体２の流路４に、被検査試料を含む試料溶液５が投入される（工程Ａ）。工程Ａにより流路４内に充たされた試料溶液５は、電極３Ａおよび３Ｂと接触する。流路４内において、担体粒子６は溶液中で所定の濃度で分散された状態となる。適切な分散状態を得るために、分散した担体粒子６を含む試料溶液５を流路４に投入してもよいし、試料溶液５を投入する前に基体２の流路４に担体粒子６を担持しておいてもよい。
【００６１】
次に、電圧印加手段１２によって、電極３Ａおよび電極３Ｂに、交流電圧波形６０の電圧を、第１の時間印加する（工程Ｂ）。工程Ｂにより、担体粒子６は流路４内で誘電泳動を受けて、電界の方向に沿って数珠つなぎ状に並んだ挙動を示す（パールチェーン化）。
【００６２】
さらに、交流電圧波形６０の電圧の印加を停止し、第２の時間を経た時の担体粒子６の凝集率を計算する（工程Ｃ）。凝集率は、撮像手段１０によって得た担体粒子６の様態を解析手段１３で処理することで計算される。凝集率は例えば、画像における、全ての単体粒子の面積に対する２個以上に凝集した担体粒子の面積の比率で求められる。凝集率は、担体粒子６に結合させた抗体と特異的に反応する、試料溶液５中の被検査試料の濃度に応じて高まるため、試料溶液５中の被検査試料の濃度を検出したり、測定したりすることができる。
【００６３】
工程Ｂにおいて、電圧印加手段１２によって印加される電圧の交流電圧波形６０は、担体粒子６に、パールチェーン状に配向するための泳動力を付与する第１の交流電圧群６２（第１の振幅値６３を有する）と、第１の振幅値６３より小さい第２の振幅値７３を有する第２の交流電圧群７２とが、交互に繰り返す波形とすることが好ましい。第１の交流電圧群６２を連続させずに、第２の交流電圧群７２を挟むことで、反応系で生じた熱を外部へ効果的に放熱することができる。また、印加割合（第１の交流電圧群６２の印加時間と第２の交流電圧群７２の印加時間の合計に対する、第１の交流電圧群６２の印加時間の割合）を適切に調整すれば、第１の交流電圧群６２を連続させた場合と同等の泳動力を担体粒子６に付与することができる。
このため、導電率が高い溶液でも溶液が蒸発することなく、担体粒子６をパールチェーン化させて、成分測定に適用することができる。
【００６４】
よって、生体試料の一例であり、導電率が高い血液試料や血漿試料も、事前に希釈する（予備処理）ことなく試料溶液とすることができる。したがって本発明の装置１は、事前希釈手段を備えていなくてもよく、簡便な構成となりうる。また、操作者に予備処理操作を要求しないため、簡単で間違いがなく測定できる。
【００６５】
さらに、第１の交流電圧と第２の交流電圧の振幅値と印加時間を適切に調整することで、パールチェーン化が完了するまでの時間を大きく減じることなく、導電率が高い溶液でも担体粒子をパールチェーン化させることができる。そのため本発明により、生物学的特異的反応物質を迅速に測定できる。
【００６６】
また、電圧印加手段１２が第２の交流電圧を印加するため、反応系を構成する基体２の材質を、熱伝導が高いガラスだけでなく、ガラスに比べて１桁ほど熱伝導が悪い樹脂とすることができる。これにより、基体２を安価に製造でき、製造が容易になるため、生産効率も大幅に向上させることができる。
【００６７】
電界印加手段１２は、交流電圧６０の印加６０秒後における、流路４内の温度を４５℃以下に保つことが好ましい。４５℃を超えると、反応系に生じた熱により、試料中のタンパク質が変性して反応系中で固着化したり、被測定対象物であるタンパク質自体が変性したりして、抗原−抗体反応などの特異反応を示さなくなるなどの弊害が生じることがある。
【００６８】
電界印加手段１２によって電極３Ａと電極３Ｂ間に印加される交流電流の実効値は、０ｍＡ以上９６ｍＡ以下であることが好ましい。特に、電流の実効値が０．７ｍＡ未満であれば熱が発生せず、通常通り測定が行えるので好ましい。一方、電流の実効値が９６ｍＡを超えると、顕著に熱が発生し、好ましくない。特に、熱伝導性の低い材質（例えば、ＰＥＴなどの樹脂）で流路４を構成した基体２での流路４の内部温度は、電圧印加により上昇しやすい。例えば流路４の内部温度が、印加開始６０秒間で４５℃以上となることがある（実施例参照）。
【００６９】
電極３Ａ、３Ｂ間に印加される交流電流を９６ｍＡ以下に抑えるためには、溶液の導電率と、流路の形状（深さ・長さ）および電極の幅も重要となる。交流電流値は、印加する交流電圧と、溶液が発揮する抵抗値とで決定されるからである。溶液が発揮する抵抗値は、溶液が有する導電率に対して流路の深さと長さに反比例し、電極の幅に比例する。これらの関係から、本発明の溶液５の導電率は、一例として、流路の深さが１０μｍで、流路の長さが４ｍｍ、電極の幅が０．５ｍｍのとき、０．１ｍＳ／ｃｍ以上３５ｍＳ／ｃｍ以下であることが好ましい。
【００７０】
流路４内は、試料溶液５で満たされる。試料溶液５は、塩を所定の濃度で含む電解質溶液、または生体内試料である血液・血漿試料でありうる。試料溶液５が塩を含むと、抗原−抗体に代表される生物学的特異反応は安定化する一方、過剰な塩を含むと試料溶液５の導電率が上昇し、電圧印加に伴う熱エネルギーも大きくなる。導電率が０．１ｍＳ／ｃｍ以下では、熱は発生せず、通常通り測定が行える。また、導電率が３５ｍＳ／ｃｍ以上では、顕著に熱が発生する可能性が高くなり、好ましくない。
【００７１】
上記の流路の例では、塩濃度 ２００ｍＭまでの電解質溶液を試料溶液５にすることができる。生体試料の一例である血漿試料溶液は、塩を生理食塩水と同程度（濃度換算で１２０ｍＭ）含み、その導電率は個人差があるものの約１５ｍＳ／ｃｍである。よって、本発明の方法にて、血漿試料溶液の成分検出または成分測定をすることができる。
【実施例】
【００７２】
以下において、実施例および比較例を参照して本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
【００７３】
［基体２−１の調製］
以下の実施例または比較例に用いる基体２−１は、図３Ｂに示されるような中間基板を有する基体とした。
まず、下面基板２２を作製した。下面基板２２の材質として、清浄されたポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基板（１５０ｍｍ角、厚み０．１ｍｍ）（東洋紡社製コスモシャインＡ４３００）を用意した。電極対のパターンに合わせて貫通させたステンシルマスク（ステンレス製）を通してスパッタすることで、ＰＥＴ基板に金を１０００Å堆積させて、電極３Ａおよび電極３Ｂならびに端子９を形成した。電極３Ａおよび電極３Ｂの電極幅は１ｍｍ、電極対の間隔は０．５ｍｍ、電極長さ５ｍｍとして、一対の矩形電極を作製した。
【００７４】
次に、上面基板２１を作製した。同様のＰＥＴ基板を上面基板２１として用意した。上面基板２１には、注入口と排出口として１ｍｍ角の貫通孔を形成した。
【００７５】
次に、中間基板２５を作製した。中間基板２５は、総厚１０μｍの両面粘着シート（日東電工Ｎｏ．５６０１）であり、ポリエステル製の基材の両面にアクリル系の粘着剤が塗布されている。流路４の形状（矩形形状）に対応する貫通穴を形成した。流路４の流路幅は０．７５ｍｍ、長さは１０ｍｍとした。
【００７６】
作製された下面基板２２と上面基板２１の間に、中間基板２５を挟みこみ、それぞれを貼り合わせて、基体２を作製した。
【００７７】
［基体２−２の調製］
以下の実施例または比較例に用いる基体２−２は、図３Ａに示されるような、凹部２６を設けた上面基板２１と、下面基板２２との２枚構造の基体とした。
【００７８】
下面基板２２を、ほう珪酸ガラス（ＳＣＨＯＴＴ社製  Ｄ−２６３）（板厚０．１ｍｍ）とした。下面基板２２に、金からなる電極３Ａおよび電極３Ｂをスパッタにて形成した。ガラスと金の密着性を向上させる目的で、クロム５０Åを堆積してから、続けて金９５０Åを堆積させた。電極の幅および長さ、電極対の間隔は基板２−１と同様とした。
【００７９】
上面基板２１を、ほう珪酸ガラス（ＳＣＨＯＴＴ社製  Ｄ−２６３）（板厚０．１ｍｍ）とした。フォトリソグラフィーとウェットエッチングにより凹部を作製した。流路の深さおよび幅、長さは、基板２−１と同等とした。
【００８０】
上面基板２１と下面基板２２を、ＵＶ硬化性接着剤を用いて貼り合せて、基体２−２を作製した。
【００８１】
［基体２−３の調製］
以下の実施例または比較例に用いる基体２−３は、図３Ｂに示されるような中間基板を有する基体とした。上面基板２１と下面基板２２を比較例２と同様の成分のガラス板を用いた点を除き、基体２−１と同様に作製した。
【００８２】
以下の表１に、基体２−１〜２−３の構造をまとめた。基板２−１は、流路４の全側面がＰＥＴで構成されている基体２Ａである。具体的には、上面基板２１−中間基板２５−下面基板２２の材質は、それぞれ、ＰＥＴ−ポリエステル―ＰＥＴである。基板２−２は、流路４の全側面がガラスで構成されている。基体２−３は、上面基板２１−中間基板２５−下面基板２２の材質は、ガラス−ポリエステル−ガラスである。表１の括弧内の数値は、各成分熱伝導率λＷ／（ｍＫ）である。
【００８３】
【表１】
2009103519.tif 000003
【００８４】
［実施例１］
実施例１では、図４Ｂに示される、間欠的に第１の交流電圧波形６１を発振させた交流電圧波形６０Ｂの交流電圧を、基板２−１の電極対に印加した。交流電圧波形６０Ｂの交流電圧を印加したときの、基板２−１の流路４の内部の温度を測定し、かつ流路４の内部に提供された担体粒子６の挙動を観測した。
【００８５】
実施例１にて印加する交流電圧波形６０Ｂを以下のように設定した。
第１の交流電圧波形６１Ａについて、第１の周波数を１００ｋＨｚ、第１の振幅値を２０Ｖｐ−ｐとし、第２の交流電圧波形について、第２の振幅値を０Ｖｐ−ｐ（よって、第２の周波数７５Ａは０Ｈｚとなる）と設定した。
【００８６】
さらに、印加割合（交流電界を印加する時間の合計に対する第１の交流電界を印加する時間の割合）は、実施例１ａ〜実施例１ｄの４通りとした。実施例１ａから１ｄの交流電圧全体の周期８１は、いずれも１００ミリ秒である。
実施例１ａでは、印加割合を０．９とした。第１の交流電圧波形群の１周期を９０ミリ秒、第２の交流電圧波形群の１周期を１０ミリ秒とした。
実施例１ｂでは、印加割合を０．８とした。第１の交流電圧波形群の１周期を８０ミリ秒、第２の交流電圧波形群の１周期を２０ミリ秒とした。
実施例１ｃでは、印加割合を０．７５とした。第１の交流電圧波形群の１周期を７５ミリ秒、第２の交流電圧波形群の１周期を２５ミリ秒とした。
実施例１ｄでは、印加割合を０．５とした。第１の交流電圧波形群の１周期を５０ミリ秒、第２の交流電圧波形群の１周期７６を５０ミリ秒とした。
【００８７】
［比較例１］
比較例１では、実施例１における第１の交流電圧波形のみを、連続的に発振させた交流電圧波形の交流電圧を基体２−１の電極対に印加した。実施例１と同様に、流路４の内部の温度を測定し、かつ流路４の内部に提供された担体粒子６の挙動を観測した。
［比較例２］
比較例２では、実施例１における第１の交流電圧波形のみを、連続的に発振させた交流電圧波形の交流電圧を基体２−２（ガラス基板を用いた基体）の電極対に印加した。実施例１と同様に、流路４の内部の温度を測定し、かつ流路４の内部に提供された担体粒子６の挙動を観測した。
【００８８】
比較例１と比較例２にて印加する交流電圧を以下のように設定した。
第１の交流電圧波形について、実施例１と同様、第１の周波数を１００ｋＨｚ、第１の振幅値を２０Ｖｐ−ｐとし、第１の交流電圧波形を連続的に発振した。したがって印加割合は１である。実施例１と比較例１で印加する交流電圧の波形は、共に正弦波とし、交流電圧を印加する第１の時間を６０秒とした。
【００８９】
実施例１および比較例１〜２の条件を、表２にまとめた。表１において基体２の材質の括弧内の数値は、各材質の熱伝導率（Ｗ／（ｍＫ））を示す。
【００９０】
【表２】
2009103519.tif 000004
【００９１】
［電圧印加による担体粒子挙動／温度測定実験］
作製した基体２−１および基体２−２の電極対に電圧を印加した時の、流路４の内部温度８５および担体粒子６の挙動を観測する実験を行った。
抗ＣＲＰポリクローナル抗体を吸着させた、平均直径２μｍのラテックスビーズ（バングス社）を、担体粒子６とした。担体粒子６に吸着させた抗体に対して特異的に結合する抗原を、１×１０−１２Ｍ含む溶液を試料溶液５とした。抗体の種類は特に限定されず、例えば抗ミオグロビン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体などでもよい。溶液５の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、２０ｍＭグリシン  ｐＨ８．６、０．１％  ＢＳＡである。担体粒子６の終濃度が０．４％となるように、バッファー溶液で希釈した。
試料溶液５に含まれる特異的反応を示す抗原濃度は極めて低い。したがって、パールチェーン化によって担体粒子６の凝集反応を促進しても、再分散により担体粒子６の凝集率は低くなると予想される。
【００９２】
第一に、注入口から担体粒子溶液を１μＬ供給した。電圧印加手段１２（波形発生器：ＨＥＷＬＥＴＴＰＡＣＫＥＲＤ社 ３３１２０Ａ）を使って、基体２の電極対に、各交流電圧波形の交流電圧を、６０秒間印加した。必要に応じて、電圧は、波形発生器の次段に電力増幅アンプ（ＮＦＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ社 ４０５５ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄ  Ｐｏｗｅｒ Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）などを接続して増幅した。
【００９３】
電圧印加を６０秒間続けた後に印加を停止した直後、および印加停止から６０秒間放置後の、流路４の内部温度、および担体粒子６の凝集率を測定した。
【００９４】
流路４の内部温度の測定は、サーモビューワ（ＮＥＣ三栄社  ＴＨ９１００）を上方に配置して、非接触に内部温度８５Ａを測定した。一方、担体粒子６の挙動を、オリンパス社製倒立顕微鏡を用いて、透過光観察した。
【００９５】
流路４の深さが１０μｍで規定されているので、担体粒子６は２層に重なることなく、また、観測している顕微鏡の焦点から外れることもなく、担体粒子の輪郭がはっきりと観測された。担体粒子６が流路４内で誘電泳動を受けた場合には、流路４内で数珠つなぎ様に並ぶ挙動（パールチェーン化）が観測できた。
【００９６】
撮像手段１０によって撮像された画像から、凝集率を以下の式により算出した。撮像手段１０によって撮像された３画面の平均を凝集率として表３に記載した。
【００９７】
凝集率（％）＝（２個以上に凝集した粒子総数の面積）／（総粒子数の面積）×１００
【００９８】
実施例１ならびに比較例１および比較例２における、流路４の内部温度と、凝集率を表３および図６に示す。内部温度および凝集率の括弧内の数値は、それぞれ、電圧印加前の内部温度および凝集率に対する変化値を示す。
【００９９】
【表３】
2009103519.tif 000005
【０１００】
実施例１と比較例１を比較すると、電圧印加直後における流路４の内部温度に差異が生じた。比較例１では、電圧印加に伴い、内部温度は５４度まで上昇した。流路４内で粒子６がパールチェーン状に配列したが、同時に溶液の蒸発や突沸様の気泡の発生が観測され、電圧印加から２０秒経過後、粒子６がパールチェーン状のまま流路４中に固着してしまった。そのため、電圧印加を停止してもパールチェーン状の担体粒子６はまったく動かず、印加終了から６０秒経過後も、凝集率は高いままとなった。
一方、実施例１ａ〜実施例１ｄでは、電圧印加に伴う内部温度の上昇が、比較例１に比べて顕著に抑制された。流路４内では、粒子６が同様にパールチェーン状に配列し、電圧印加を停止すると、粒子６は正常に分散した。つまり、電圧印加停止から６０秒後における凝集率は低くなった。
【０１０１】
比較例２では、比較例１ほどは、電圧印加により内部温度が上昇しなかった。流路４内で担体粒子６がパールチェーン状に配列し、電圧印加を停止すると、担体粒子６が正常に分散し、電圧印加停止から６０秒後の凝集率は低くなった。
【０１０２】
この結果に見られるように、比較例１では、流路４内の温度上昇により担体粒子６が固着化して、抗原―抗体反応などの特異的反応の測定ができなかったのに対して、実施例１では、担体粒子６の固着化は起こらず、特異的反応の測定ができる状態であった。担体粒子６の固着化は、内部温度が４５℃以上になると観測され、実施例１の交流電圧波形の交流電圧によっては内部温度を４５℃以下に保てた。
【０１０３】
また、印加割合によって、電圧印加停止直後における凝集率は相違した。
つまり実施例１ａおよび実施例１ｂにおける電圧印加停止直後における凝集率は、比較例１とほぼ同等であった。実施例１ｃおよび実施例１ｄにおける電圧印加停止直後における凝集率は、比較例１に比べて低かった。ただし、電圧印加時間を延長すれば、最終的に同等程度の凝集率まで上昇することが確認された。これらの結果から、印加割合を０．８〜０．９に設定することで、十分なパールチェーン化を短時間（２分程度）で行い、特異的反応の迅速な測定ができることがわかる。
【０１０４】
［実施例２］
基体２−１〜２−３を用いて、交流電圧の印加割合と、第１の交流電圧波形の振幅値６３を調整したときの、流路４の内部温度および担体粒子６の凝集率を測定した。
【０１０５】
表４には、基体２−１を用いた場合に、交流電圧の印加割合を０．８、０．５、０．３に調整し、かつ第１の交流電圧波形の振幅値を２０Ｖ〜４０Ｖｐ−ｐに調整した場合の結果を示す。
【０１０６】
【表４】
2009103519.tif 000006
【０１０７】
表４に示されるように、基体２−１では、１）印加割合が０．８のときは、第１の振幅値を２５Ｖｐ−ｐ以下とし、２）印加割合が０．５のときは、第１の振幅値６３を３０Ｖｐ−ｐ以下とし、３）印加割合が０．３のときは、第１の振幅値を４０Ｖｐ−ｐ以下とすれば、それぞれ内部温度が４５℃以下となり、担体粒子６の固着化が抑制され、抗原―抗体などの特異的反応の測定ができる状態となった。
【０１０８】
さらに、基体２−１では、１）印加割合が０．８、第１の振幅値を２５Ｖｐ−ｐとしたとき、電圧印加直後の凝集率が７８％となり、２）印加割合が０．５、第１の振幅値を３０Ｖｐ−ｐとしたとき、電圧印加直後の凝集率が７２％となり、３）印加割合が０．３、第１の振幅値を４０Ｖｐ−ｐとしたとき、電圧印加直後の凝集率が８１％となった。約２分間程度の短時間で、抗原−抗体などの特異的反応の測定ができる状態となることがわかった。
【０１０９】
表５には、基体２−２を用いて、交流電圧の印加割合を１、０．８に調整し、かつ第１の交流電圧波形の振幅値を２０Ｖ〜５０Ｖｐ−ｐに調整した場合の結果を示す。
【０１１０】
【表５】
2009103519.tif 000007
【０１１１】
基体２−２の流路４の全面は、ガラスで構成されている。連続発振である交流電圧波形の交流電圧を印加しても、基体２−１と比較して温度上昇は抑制されたが、第１の振幅値６３が５０Ｖｐ−ｐ以上になると、内部温度が４５℃以上（５０℃）となり、担体粒子４の固着化が起こり、測定できない不具合が生じた。
一方、印加割合を０．８に設定すると、内部温度は上がらず、抗原―抗体などの特異的反応の測定ができた。
【０１１２】
表６には、基体２−３を用いて、交流電圧の印加割合を１、０．８に調整し、かつ第１の交流電圧波形の振幅値を２０Ｖ〜４０Ｖｐ−ｐに調整した場合の結果を示す。
【０１１３】
【表６】
2009103519.tif 000008
【０１１４】
基体２−３の流路４は、２面（天面および底面）がガラスで構成される。連続発振である交流電圧波形の交流電圧を印加すると、基体２−２と比べて温度上昇が見られ、第１の振幅値が４０Ｖｐ−ｐ以上で内部温度が４５℃以上（４８℃）となり、粒子４の固着化が起こり、測定できない不具合が生じた。
一方、印加割合を０．８に設定した交流電圧波形の交流電圧を印加した場合は、内部温度は上がらず、抗原―抗体などの特異的反応の測定ができた。
【０１１５】
以上の結果に見られるように、本発明の測定装置１における基体２は、樹脂（ＰＥＴ）で作製することができること、その工法として、図３Ｂに示した中間基板２５を用いる簡易な工法が適用できることがわかる。
【０１１６】
［実施例３］
基体２−１または基体２−２を用いて、パールチェーン化反応と、抗原―抗体反応に代表される生物学的特異反応を利用した測定を検証した。
血液中に含まれ、各種炎症のマーカータンパクとされるＣ反応性タンパク（以下「ＣＲＰ」）を異なる濃度で、前述のバッファー溶液に溶解した溶液を、試料溶液５とした。担体粒子６には、ＣＲＰと特異的に結合する抗体である、抗ＣＲＰポリクローナル抗体（以下、「抗ＣＲＰ抗体」）を感作させた。試料溶液５の抗原濃度（Ｍ）は、それぞれ１×１０＾Ｘ（Ｘ＝−５、−７、−９、−１１）とした。担体粒子６の濃度は、実施例１と同様である。
【０１１７】
まず、ＣＲＰを含む試料溶液５と担体粒子６を、室温で９０秒間混合して反応させた。第二に、反応後の担体粒子６を含む試料溶液５を流路４に１μＬ注入した。表７に示される条件の交流電圧を６０秒間印加した。最後に、電圧印加を終了後、６０秒間経過した時の凝集率を求めた。交流電圧の印加割合は０．８、第１の振幅値を２５Ｖｐ−ｐとした。基体２−１および基体２−２を用いた場合の測定結果も表７に示される。
【０１１８】
【表７】
2009103519.tif 000009
【０１１９】
基体２−１を用いた場合も基体２−２を用いた場合と同様に、抗原濃度に依存して凝集率が変化した。図６は、抗原濃度（Ｍ）を横軸、凝集率（％）を縦軸とするグラフであり、●は基体２−１を用いた場合のプロット、□は基体２−２を用いた場合のプロットである。これらの結果により、基体２−１を用いて、抗原―抗体反応に代表される生物学的特異反応を測定できることが示された。このように、本発明の装置１の基体２は、ＰＥＴ（樹脂）で構成されていても、抗原―抗体反応に代表される生物学的特異反応を測定できる。
【０１２０】
［実施例４］
実施例４では、生体試料の一例である、血漿試料を試料溶液５とした。具体的には、樹脂で流路４を構成した基体２−１を用いて、流路４の内部温度の測定および担体粒子６の挙動の観察、生物学的特異反応の検出を行った。実施例１の間欠的に発振させる交流電圧波形を印加した場合と、連続的に発振させる交流電圧波形を印加した場合とを比較した。これらの測定条件と、測定結果を表８にまとめた。
【０１２１】
【表８】
2009103519.tif 000010
【０１２２】
表８に示されるように、交流電圧波形の電圧を印加することで、無希釈の血漿試料からも成分測定できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明の生物学的特異的反応性物質の存在の検出または測定する装置は、生体試料、特に血液等に含まれるタンパク質等の生体構成成分を分析するデバイスとして有用である。このため、血液試料中に含まれるタンパクや健康指標物質を分離、精製、反応、検出するＰＯＣＴ（Point of care test その場診断）診断バイオセンサ等の用途にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】本発明の装置１を示す構成図である。
【図２】本発明の装置１に含まれる基体２の部分上面図である。
【図３Ａ】図２に示される基体２の一例である。図２におけるＡ−Ａ’線での部分断面図である。
【図３Ｂ】図２に示される基体２の別の例である。図２におけるＡ−Ａ’線での部分断面図である。
【図４Ａ】本発明の装置１の電圧印加手段が印加する交流電圧の交流電圧波形の一例を模式的に示す図である。
【図４Ｂ】本発明の装置１の電圧印加手段が印加する交流電圧の交流電圧波形の別の例を模式的に示す図である。
【図５】本発明の方法の例を説明するためのフローチャートである。
【図６】実施例３の結果を示すグラフである。
【図７】従来の基板構成を示す図である。
【符号の説明】
【０１２５】
１  装置
２  基体
３Ａ、３Ｂ  電極
４  流路
５  試料溶液
６  担体粒子
９  端子
１０  撮像手段
１１  対物レンズ
１２  電圧印加手段
１３  制御解析手段
１４  コネクタ
２１  上面基板
２２  下面基板
２５  中間基板
２６  凹部
５３  流路深さ（厚み）
５４Ｂ  電極高さ（厚み）
５５  電極間の距離
５６  電極幅
５８  電極の露出幅
６０Ａ，６０Ｂ  交流電圧波形
６１  第１の交流電圧波形
６２  第１の交流電圧波形群
６３  第１の振幅値（全幅振幅値）
６４  第１の交流電圧波形の周期
６６  第１の交流電圧波形群の群周期
７１  第２の交流電圧波形
７２  第２の交流電圧波形群
７３  第２の振幅値（全幅振幅値）
７４  第２の交流電圧波形の周期
７６  第２の交流電圧波形群の群周期
８１  交流電圧全体の周期（第１の交流電圧波形群の群周期と第２の交流電圧波形群の群周期の和）
１０１，１０２  スライドグラス
１０３，１０４  電極
【図１】
2009103519.tif 000011
【図２】
2009103519.tif 000012
【図３Ａ】
2009103519.tif 000013
【図３Ｂ】
2009103519.tif 000014
【図４Ａ】
2009103519.tif 000015
【図４Ｂ】
2009103519.tif 000016
【図５】
2009103519.tif 000017
【図６】
2009103519.tif 000018
【図７】
2009103519.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月17日(2008.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
前記第２の交流電圧の振幅の大きさが０Ｖである、請求項２に記載の装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
前記第１の交流電圧の印加時間と第２の交流電圧の印加時間とを含む繰り返し周期が、３０ナノ秒以上５秒以下である、請求項２または３に記載の装置。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
すなわち本発明の第一は、以下に示す装置に関する。
［１］  電極対および前記電極対の間に配置された反応場を有する基体と、前記反応場に配置された担体粒子をパールチェーン化させるように、前記電極対に交流電圧を印加する電圧印加手段とを有し、前記担体粒子上での生物学的特異的凝集反応により生物学的特異的反応物質の存在を、検出または測定する装置であって、
前記電圧印加手段は、少なくとも２つ以上の互いに異なる大きさの振幅の交流電圧を印加する装置。
［２］前記電圧印加手段は、第１の大きさの振幅の第１の交流電圧と、第２の大きさの振幅の第２の交流電圧とを交互に印加し、
前記第１の交流電圧により、電界強度が２０Ｖ／ｍｍ以上１００Ｖ／ｍｍ以下である第１の交流電界が、前記反応場に印加され、かつ前記第２の交流電圧により、第１の電界強度よりも小さい電界強度である第２の交流電界が、前記反応場に印加される、［１］に記載の装置。
［３］前記第２の交流電圧の振幅の大きさが０Ｖである、［２］に記載の装置。
［４］前記第１の交流電圧の印加時間と第２の交流電圧の印加時間とを含む繰り返し周期が、３０ナノ秒以上５秒以下である、［２］または［３］に記載の装置。
［５］前記繰り返し周期に対する、前記第１の交流電圧の印加時間の割合が、７５％から９５％である、［４］に記載の装置。
［６］前記基体が、前記反応場を構成する流路を備え、前記流路の少なくとも１面を構成する材料が樹脂である、［１］〜［５］のいずれかに記載の装置。
［７］前記基体が、前記流路の頂面を構成し、前記頂面側の基板形状は平板である上面基板と、前記流路の底面を構成し、前記底面側の基板形状は平板である下面基板と、前記流路の側面を構成し、前記流路の形状に相当する貫通領域を備える中間基板とを含み、
少なくとも、前記中間基板の材料が樹脂である、［６］に記載の装置。
［８］前記中間基板の前記流路を構成しない面は粘着性を有する、［７］に記載の装置。
［９］前記流路のすべての面を構成する材料が樹脂である、［６］に記載の装置。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
図３Ａに示されるように、基体２Ａの流路４は、上面基板２１の凹部２６の空間と、電極３Ａと電極３Ｂとの間の空間とからなる。一方、図３Ｂに示されるように、基体２Ｂの流路４は、中間基板２５同士の間の空間と、電極３Ａと電極３Ｂとの間の空間とからなる。基体２Ｂでは、中間基板２５が、流路４の内面の一つを構成している。
いずれにしても、基体２の流路４は、その頂面を上面基板２１、底面を下面基板２２としており、電極３Ａおよび電極３Ｂが流路４の内部に露出している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
基体２の上面基板２１と下面基板２２の材料は、絶縁材料または半導体材料で構成されている。絶縁材料の例としては、有機材料またはガラスなどの無機絶縁材料から選ばれる。基体２の上面基板２１と下面基板２２の少なくとも一方の基板は透明性を有することが必要なので、通常は上面基板２１と下面基板２２をともに半導体材料で構成させることはできないが、一方の基板を半導体材料で構成することがある。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
有機材料の例には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホンなどが含まれる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
一般的にガラスは熱伝導性がよいので、基体２の材質として適している。粒子をパールチェーン化させるために印加した電界によって発生する熱を、速やかに放散することによって、反応系の温度上昇を抑制することができるからである。
しかしながら本発明では、粒子をパールチェーン化させるために電界を印加しても反応系の温度が上昇しにくいので、基体２の材質をガラスよりも熱伝導性の低い材質とすることができる。したがって、基体２の上面基板２１と下面基板２２の材料を有機材料、好適にはＰＥＴ樹脂とすることができる。ＰＥＴ樹脂は、ガラスに比べて１桁ほど熱伝導が悪いにもかかわらず、本発明の装置の基体の材質とすることができる。
基体２の材質をＰＥＴ樹脂などの有機材料とすると、基体２の製造コストを抑制することができ、また製造プロセスも容易になるため、生産効率も大幅に向上させることができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
２．本発明の検出または測定方法
本発明の検出または測定方法（「本発明の方法」ともいう）は、担体粒子と試料溶液とを含む反応系に、交流電界を印加するステップを含む。試料溶液は、前記担体粒子と生物学的特異的凝集反応する生物学的特異的反応物質を含有する。前記反応系に交流電界を印加することによって、前記担体粒子をパールチェーン化させる。パールチェーン化することにより、担体粒子上での生物学的特異的反応物質の生物学的特異的凝集反応が促進される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
以下の表１に、基体２−１〜２−３の構造をまとめた。基体２−１は、流路４の全側面がＰＥＴで構成されている基体２Ａである。具体的には、上面基板２１−中間基板２５−下面基板２２の材質は、それぞれ、ＰＥＴ−ポリエステル―ＰＥＴである。基板２−２は、流路４の全側面がガラスで構成されている。基体２−３は、上面基板２１−中間基板２５−下面基板２２の材質は、ガラス−ポリエステル−ガラスである。表１の括弧内の数値は、各成分熱伝導率λＷ／（ｍＫ）である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2009103519.tif 000020