(57)【要約】【課題】固相抗体の配向性がよく、より高感度で高精度な免疫学的測定が行える技術を提供する。【解決手段】融合タンパク質６は、フジツボ由来接着タンパク質７と抗体特異的結合タンパク質８とが連結された構造を有する。融合タンパク質６を担体１に接触させると、フジツボ由来接着タンパク質７側が担体１の表面に結合する。一方、抗体特異的結合タンパク質８側は担体１とは無関係な開放された状態となる。ここに固相抗体となる抗体２を添加すると、Ｆｃ領域５が抗体特異的結合タンパク質８に結合し、Ｆａｂ領域３が一律に外側を向いて配向される。この固相抗体を用いて固相免疫測定法を行うことにより、抗原タンパク質をより高感度かつ高精度に検出することができる。【選択図】図１
2009240235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質とが連結されてなり、かつ接着性と抗体特異的結合性とを有する融合タンパク質。
【請求項２】
フジツボ由来接着タンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質である請求項１に記載の融合タンパク質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ接着性を有するタンパク質。
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の一部からなり、かつ接着性を有するタンパク質。
【請求項３】
抗体特異的結合タンパク質は、プロテインＡ、プロテインＧ、又はこれらの一部からなりかつ抗体特異的結合性を有するタンパク質である請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ接着性と抗体特異的結合性とを有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の遺伝子が導入された組換え体を培養し、該組換え体の培養物から、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質とが連結された融合タンパク質を取得する融合タンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項４又は５に記載の遺伝子を無細胞抽出液中で発現させることにより、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質とが連結された融合タンパク質を取得する融合タンパク質の製造方法。
【請求項８】
担体に固定化された固相抗体をもって所望の抗原タンパク質を担体上に捕捉し、捕捉された抗原タンパク質を検出する抗原タンパク質の検出方法であって、固相抗体は請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質を介して前記担体に固定化されており、前記融合タンパク質のフジツボ由来接着タンパク質側が前記担体に結合し、抗体特異的結合タンパク質側が前記固相抗体に結合している抗原タンパク質の検出方法。
【請求項９】
捕捉された抗原タンパク質に標識抗体を結合させ、当該標識抗体の標識を指標として抗原タンパク質を検出する請求項８に記載の抗原タンパク質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質、遺伝子、融合タンパク質の製造方法、並びに、抗原タンパク質の検出方法に関し、さらに詳細には、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質とが連結された融合タンパク質、当該融合タンパク質をコードする遺伝子、当該融合タンパク質の遺伝子工学的製造方法、並びに、当該融合タンパク質を用いた抗原タンパク質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、担体に固定化された抗体（固相抗体）をもって所望の抗原タンパク質を捕捉し、捕捉された抗原タンパク質を検出する免疫学的測定法（固相免疫測定法）が行われている（例えば、特許文献１）。固相免疫測定法を行う際には、所望の抗原タンパク質に対する抗体が固定化された担体が必要である。これまで、抗体を担体に固定化する手法として、抗体と担体との間の疎水的相互作用を利用した物理的吸着法が広く採用されている。
【０００３】
固相免疫測定法においては、担体に固定化される固相抗体の配向性が、その精度や感度に大きな影響を与える。すなわち、抗体の定常領域側が担体に結合し、抗原結合部位側が開放されて外側を向くような配向性をもって抗体が担体に固定化され、固相抗体が構成されていることが理想的である。
【特許文献１】特開２０００−０６５８２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし実際には、従来の物理的吸着法による抗体の固定化方法では、抗体と担体との間で非特異的吸着が起こり、必ずしも上記した理想的な配向性をもって抗体が固定化されない。すなわち固相抗体がＩｇＧに属するものである場合を例にとると、図３（ａ）に示すように、抗体１２は抗原との特異的結合部位を含むＦａｂ領域１３と、定常領域で構成されるＦｃ領域１５とからなるが、担体１１の表面に固定化されるときに、その配向が無秩序に行われ、図３（ｂ）のようにＦａｂ領域１３が一律には外側を向かないことがしばしばある。このような固相抗体を用いて免疫測定を行うと、測定対象となる抗原タンパク質と固相抗体との結合性に支障が生じる。その結果、感度や精度の面で大きな問題となり、その改善策が求められている。
【０００５】
本発明の目的は、固相抗体の配向性がよく、より高感度で高精度な免疫学的測定が行える技術、並びに、当該技術に有用な各種のツールを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、海洋生物の一種であるフジツボ由来の接着性を有するタンパク質（フジツボ由来接着タンパク質）に着目し、当該接着タンパク質を抗体の固定化に応用するべく鋭意検討を行った。その結果、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質とが連結された融合タンパク質を介して抗体を担体に固定化すると、抗体が配向性よく担体に固定化され、より高感度かつ高精度に固相免疫測定を行うことができることを見出した。そして、当該融合タンパク質の遺伝子工学的な製造方法を確立し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００７】
請求項１に記載の発明は、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質とが連結されてなり、かつ接着性と抗体特異的結合性とを有する融合タンパク質である。
【０００８】
本発明は融合タンパク質にかかるものであり、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質とが連結されてなり、かつ接着性と抗体特異的結合とを有する。本発明の融合タンパク質は、接着タンパク質部分が担体等の支持体に結合でき、一方、抗体特異的結合タンパク質部分が抗体に結合できる。そのため、本発明の融合タンパク質を介して所望の抗体を担体に固定化すると、抗体の抗原結合部位側が一律に外側を向くように配向される。その結果、固相抗体と抗原タンパク質とが効率的に結合でき、より高感度かつ高精度に固相免疫測定法を行うことが可能となる。すなわち本発明の融合タンパク質は、固相免疫測定法における固相抗体を固定化する際に有用である。
【０００９】
フジツボは、セメントと呼ばれる物質を基盤に分泌して、海水中で強く付着することができる。セメントの主成分は接着性を有するタンパク質である。当該タンパク質は難溶解性複合体であるが、その可溶化法がすでに開発されている(Kamino, K. et al. J. Biol. Chem. (2000) 275, 27360-27365)。本発明における「フジツボ由来接着タンパク質」とは、フジツボが分泌するセメントを構成する接着性を有するタンパク質をいう。フジツボ由来接着タンパク質については、タンパク質自体やコードする遺伝子がいくつか単離されており、例えば、特開平７−２６５０８１号公報、特開平９−４７２８８号公報、特開平９−２９９０８９号公報、特開平１０−３２７８６７号公報、特開平１１−３３２５７２号公報、特開平１１−３３２５７号公報、特開２００４−１０５１４３号公報、等に記載されている。
【００１０】
本発明の融合タンパク質においては、接着性と抗体特異的結合性とを有する限り、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質との連結方向に限定はない。すなわち、フジツボ由来接着タンパク質がＮ末端側に、抗体特異的結合タンパク質がＣ末端側に位置する融合タンパク質と、逆に、フジツボ由来接着タンパク質がＣ末端側に、抗体特異的結合タンパク質がＮ末端側に位置する融合タンパク質の両方が、本発明の融合タンパク質に含まれる。さらに、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質とが直接連結されている融合タンパク質のみならず、リンカー等を介して間接的に連結されている融合タンパク質も、接着性と抗体特異的結合性とを有する限り、本発明の融合タンパク質に含まれる。またさらに、そのＮ末端及び／又はＣ末端に適宜のタグや修飾が付加された融合タンパク質も、接着性と抗体特異的結合性とを有する限り、本発明の融合タンパク質に含まれる。
【００１１】
なお本明細書においては、複数のアミノ酸残基がペプチド結合を介して連結した化合物を全て「タンパク質」と称することとし、アミノ酸残基の数によってタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド等と必ずしも区別しない。
【００１２】
フジツボ由来接着タンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質である構成が推奨される（請求項２）。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ接着性を有するタンパク質。
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の一部からなり、かつ接着性を有するタンパク質。
なお、（ａ）はアカフジツボのセメントに含まれている１９ｋＤａの接着タンパク質である。（ｂ）は（ａ）と同一視できる接着タンパク質、（ｃ）は（ａ）又は（ｂ）の部分タンパク質でかつ接着性を有するタンパク質である。
【００１３】
請求項３に記載の発明は、抗体特異的結合タンパク質は、プロテインＡ、プロテインＧ、又はこれらの一部からなりかつ抗体特異的結合性を有するタンパク質である請求項１又は２に記載の融合タンパク質である。
【００１４】
本発明の融合タンパク質では、抗体特異的結合タンパク質がプロテインＡ、プロテインＧ、又はこれらの一部からなりかつ抗体特異的結合性を有するタンパク質である。本発明の融合タンパク質によれば、プロテインＡあるいはプロテインＧと抗体との強固な特異的結合性を利用して、抗体を担体に優れた配向性をもって固定化することができる。「プロテインＡ又はプロテインＧの一部からなりかつ抗体特異的結合性を有するタンパク質」の例としては、プロテインＡの部分ペプチドであるＺＺドメイン（ＺＺタグ）が挙げられる。
【００１５】
請求項４に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子である。
【００１６】
本発明は遺伝子にかかるものであり、上述の融合タンパク質をコードする。本発明の遺伝子を用いることにより、本発明の融合タンパク質を効率的に取得することができる。
【００１７】
請求項４に記載の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ接着性と抗体特異的結合性とを有するタンパク質をコードする遺伝子（請求項５）は、請求項４に記載の遺伝子と同一視できる遺伝子であり、同様の作用を有する。
【００１８】
請求項６に記載の発明は、請求項４又は５に記載の遺伝子が導入された組換え体を培養し、該組換え体の培養物から、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質とが連結された融合タンパク質を取得する融合タンパク質の製造方法である。
【００１９】
本発明は上述した本発明の融合タンパク質の遺伝子工学的な製造方法に係り、組換え体の培養物から融合タンパク質を取得する。かかる構成により、本発明の融合タンパク質を大量かつ簡便に製造することができる。
【００２０】
請求項４又は５に記載の遺伝子を無細胞抽出液中で発現させることにより、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質とが連結された融合タンパク質を取得することもできる（請求項７）。
【００２１】
請求項８に記載の発明は、担体に固定化された固相抗体をもって所望の抗原タンパク質を担体上に捕捉し、捕捉された抗原タンパク質を検出する抗原タンパク質の検出方法であって、固相抗体は請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質を介して前記担体に固定化されており、前記融合タンパク質のフジツボ由来接着タンパク質側が前記担体に結合し、抗体特異的結合タンパク質側が前記固相抗体に結合している抗原タンパク質の検出方法である。
【００２２】
本発明は抗原タンパク質の検出方法に係り、担体に固定化された固相抗体をもって捕捉された所望の抗原タンパク質を検出する、いわゆる固相免疫測定法に属するものである。そして、本発明の抗原タンパク質の検出方法では、固相抗体が本発明の融合タンパク質を介して固定化された担体を用い、かつ当該担体においては、融合タンパク質のフジツボ由来接着タンパク質側が担体に結合し、抗体特異的結合タンパク質側が前記固相抗体に結合している。換言すれば、本発明において、固相抗体は「担体−フジツボ由来接着タンパク質−抗体特異的結合タンパク質−抗体」の順に結合することにより構成されている。本発明の抗原タンパク質の検出方法では、固相抗体が前述のような構成をもって担体に固定化されているので、抗体の定常領域側が抗体特異的結合タンパク質に結合し、抗原結合部位側が開放されて一律に外側を向くように配向している。その結果、固相抗体と抗原タンパク質とが効率的に結合でき、より高感度かつ高精度に抗原タンパク質の検出を行うことができる。
【００２３】
請求項９に記載の発明は、捕捉された抗原タンパク質に標識抗体を結合させ、当該標識抗体の標識を指標として抗原タンパク質を検出する請求項８に記載の抗原タンパク質の検出方法である。
【００２４】
かかる構成により、より高感度かつ高精度なサンドイッチ法による抗原タンパク質の検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の融合タンパク質によれば、抗体を担体に固定化する際に抗体の抗原結合部位側が一律に外側を向くように配向される。その結果、固相抗体と抗原タンパク質とが効率的に結合でき、より高感度かつ高精度に固相免疫測定法を行うことが可能となる。
【００２６】
本発明の遺伝子によれば、本発明の融合タンパク質を効率的に取得することができる。
【００２７】
本発明の融合タンパク質の製造方法によれば、本発明の融合タンパク質を大量かつ簡便に製造することができる。
【００２８】
本発明の抗原タンパク質の検出方法によれば、固相抗体の抗原結合部位が一律に外側を向くように配向しているので、固相抗体と抗原タンパク質とが効率的に結合でき、より高感度かつ高精度に抗原タンパク質の検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の第１の様相は、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質とが連結されてなり、かつ接着性と抗体特異的結合性とを有する融合タンパク質である。すなわち、本発明の融合タンパク質は、「フジツボ由来接着タンパク質」と「抗体特異的結合タンパク質」の２つの主要な構成を有する。
【００３０】
接着タンパク質の由来となるフジツボとしては特に限定はなく、接着タンパク質を主成分とするセメントを分泌するものであればよい。例えば、アカフジツボ（Megabalanus rosa）、タテジマフジツボ（Balanus amphitrite）、シロスジフジツボ（Balanus albicostatus）が挙げられる。その他の例として、Megabalanus volcano、Balanus rostratus、Balanu eburneus、Balanus improvisus、Balanus reticulates、Balanus improvisus、Balanus reticulates、Balanus kondakovi、Balanus trigonus、Semibalanus cariosus、Tetraclita japonica、Tetraclita squamosa、Tetraclita formosana、Chthamalus challengeri、Chthamalus dalli、Chthamalus malayensis、Euraphia pilsbryi、Euraphia intertexa、などの各フジツボが挙げられる。
【００３１】
好ましい実施形態では、フジツボ由来接着タンパク質が配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。この接着タンパク質はアカフジツボのセメントに含まれている１９ｋＤａの接着タンパク質（Ｍｒｃｐ１９ｋ）であり、特に接着性に優れている。なお、配列番号１は当該接着タンパク質のアミノ酸配列と遺伝子のＤＮＡ配列、配列番号２はアミノ酸配列のみを示している。
【００３２】
さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ接着性を有するタンパク質も、好ましく採用される。当該タンパク質は、アカフジツボ由来１９ｋＤａ接着タンパク質と同一視できる接着タンパク質である。そのような接着タンパク質は、自然界で普通に起こる突然変異によって得られることもあるし、部位特異的変異導入法によって人為的に遺伝子の変異を導入することによって得ることもできる。
【００３３】
またさらに、上記したフジツボ由来接着タンパク質の全長のみならず、その一部からなり、かつ接着性を有するタンパク質も好ましく採用される。そのような接着タンパク質は全長からなる接着タンパク質よりも分子量が小さいので、融合タンパク質の分子量も小さくなる。その結果、融合タンパク質を遺伝子工学的に生産することが容易となる。また、精製等を行う際にも分子量が小さいので取扱いが容易となる。
【００３４】
一方、抗体特異的結合タンパク質としては特に限定はなく、抗体分子としてのイムノグロブリンに特異的に結合するタンパク質であれば全て採用できる。好ましい実施形態では、抗体特異的結合タンパク質がプロテインＡ又はプロテインＧである。この好ましい実施形態によれば、クラスがＩｇＧである抗体のＦｃ領域に結合することができる。また、ＺＺドメイン（ＺＺタグ）のような、プロテインＡやプロテインＧの一部からなりかつ抗体特異的結合性を有するタンパク質も好ましく採用される。そのような抗体特異的結合タンパク質は全長からなる抗体特異的結合タンパク質よりも分子量が小さいので、融合タンパク質の分子量も小さくなる。その結果、融合タンパク質を遺伝子工学的に生産することが容易となる。また、精製等を行う際にも分子量が小さいので取扱いが容易となる。
【００３５】
なお上述したように、本発明の融合タンパク質においては、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質の結合方向については特に限定はない。また、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質との間にリンカー等が介在してもよい。さらに、融合タンパク質の末端に適宜のタグや標識が付与されていてもよい。
【００３６】
本発明の第２の様相は、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子である。本発明の遺伝子を作製する方法としては、例えば、フジツボ由来接着タンパク質をコードする遺伝子と抗体特異的結合タンパク質をコードする遺伝子とをライゲーション反応により連結すればよい。フジツボ由来接着タンパク質をコードする遺伝子や抗体特異的結合タンパク質をコードする遺伝子については、常法により取得することができる。例えば、精製したタンパク質のアミノ酸配列情報からプローブを作成し、ハイブリダイゼーションによりクローニングすることができる。また同様のアミノ酸配列情報からプライマーを作成し、ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術によってクローニングすることもできる。その他、公知の類似遺伝子の塩基配列情報を元にプローブやプライマーを設計し、同様の手法を用いてクローニングすることもできる。化学合成により遺伝子を作製することも可能である。
【００３７】
本発明の遺伝子には、上記した遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ接着性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、「０．１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、１％ＳＤＳ、６５℃、２４時間」の条件をいう。
【００３８】
本発明の第３の様相は、本発明の遺伝子が導入された組換え体を培養し、該組換え体の培養物から、フジツボ由来接着タンパク質と抗体特異的結合タンパク質とが連結された融合タンパク質を取得する融合タンパク質の製造方法である。組換え体の作製については高知の方法がそのまま適用でき、例えば、本発明の遺伝子が組み込まれた適宜のベクターを宿主細胞に導入して作製することができる。組換え体の培養についても、公知の方法がそのまま適用でき、例えば、作製した組換え体に適した液体培地を選択し、通気撹拌して培養すればよい。遺伝子がベクター上の誘導可能なプロモーター下流に組み込まれている場合には、培養途中で所望の誘導操作（誘導物質の添加、培養温度の変更など）を行ってもよい。
【００３９】
培養物から融合タンパク質を取得する方法についても公知の方法がそのまま適用できる。宿主細胞が大腸菌のような菌体内に発現産物を蓄積するものである場合には、回収した菌体を超音波処理等により破砕して細胞抽出液を得て、タンパク質精製の工程に供すればよい。一方、枯草菌、酵母、動物細胞のような細胞外に発現産物を分泌するものである場合には、細胞分離した後の培地をタンパク質精製の工程に供すればよい。
【００４０】
大腸菌等を宿主細胞として選択した場合には、発現産物が不溶性の封入体として得られることがある。このような場合でも、封入体を界面活性剤等で可溶化し、リフォールディングすることにより融合タンパク質を可溶性の状態で得ることができる。
【００４１】
融合タンパク質の精製についても、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知のタンパク質精製技術をそのまま適用することができる。そして、これらの技術を単独あるいは組み合わせて使用することにより、本発明の融合タンパク質を精製することができる。
【００４２】
一方、本発明の融合タンパク質の製造方法は、組換え体を用いるのではなく、無細胞翻訳系によって融合タンパク質の遺伝子を発現させ、融合タンパク質を取得する方法も含む。無細胞翻訳系で用いる無細胞抽出液は、大腸菌、小麦胚芽、昆虫細胞、ウサギ網状赤血球等から調製することができる。そして、これらの無細胞抽出液に本発明の遺伝子を添加し、さらに、ＲＮＡポリメラーゼ、各種ヌクレオチド三リン酸（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ）、各種アミノ酸、各種ｔＲＮＡ、リボゾームフラクション、各種リン酸化酵素等を添加して、本発明の遺伝子を発現させればよい。その後の精製については、組換え体を使用する場合と同様である。
【００４３】
本発明の第４の様相は、担体に固定化された固相抗体をもって所望の抗原タンパク質を担体上に捕捉し、捕捉された抗原タンパク質を検出する抗原タンパク質の検出方法であって、固相抗体は本発明の融合タンパク質を介して前記担体に固定化されており、前記融合タンパク質のフジツボ由来接着タンパク質側が前記担体に結合し、抗体特異的結合タンパク質側が前記固相抗体に結合している抗原タンパク質の検出方法である。本発明の抗原タンパク質の検出方法では、固相抗体が本発明の融合タンパク質を介して担体に固定化されている。そして、融合タンパク質のフジツボ由来接着タンパク質側が担体に結合し、抗体特異的結合タンパク質側が固相抗体に結合している。ここで、図１を参照しながら、本発明の抗原タンパク質の検出方法における固相抗体の状態を配向性の観点から説明する。
【００４４】
図１（ａ）に示すように、本発明の融合タンパク質６は、フジツボ由来接着タンパク質７と抗体特異的結合タンパク質８とが連結された構造を有する。この融合タンパク質６を担体１に接触させると、フジツボ由来接着タンパク質７側が担体１の表面に結合する。これは、フジツボ由来接着タンパク質７が有する強い接着性によるものである。一方、抗体特異的結合タンパク質８側は担体１とは無関係な開放された状態となる。ここに固相抗体となる抗体２を添加すると、図１（ｂ）に示すような状態となる。なお、この例では抗体２としてＩｇＧに属するものを採用しており、抗体２は抗原との特異的結合部位を含むＦａｂ領域３と、定常領域で構成されるＦｃ領域５とからなる。図１（ｂ）に示すように、Ｆｃ領域５が抗体特異的結合タンパク質８に結合し、Ｆａｂ領域３が一律に外側を向くように、抗体２が担体１に融合タンパク質６を介して固定化される。従来技術では固相抗体の配向が無秩序に行われてＦａｂ領域が一律には外側を向かないことがあった（図３参照）。しかし本発明の抗原タンパク質の検出方法における固相抗体においては、そのような状態とはならず、抗体２が配向性よく担体１に固定化され、抗体結合性部位を含むＦａｂ領域３が一律に外側を向いた状態となる。そのため、本発明の抗原タンパク質の検出方法によれば、固相抗体と抗原タンパク質とが効率的に結合でき、より高感度かつ高精度に抗原タンパク質の検出が行える。
【００４５】
好ましい実施形態では、捕捉された抗原タンパク質に標識抗体を結合させ、当該標識抗体の標識を指標として抗原タンパク質を検出する。当該標識の例としては、酵素標識、放射性標識、色素標識等の公知の標識が挙げられる。さらに、ビオチン標識によれば、アビジン−ビオチン複合体の系を利用して抗原タンパク質を検出することができる。
【００４６】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
本実施例では、融合タンパク質をコードする遺伝子を作製し、該遺伝子を発現させて融合タンパク質を製造した。
【００４８】
１．フジツボ由来１９ｋＤａ接着タンパク質（Ｍｒｃｐ１９ｋ）とＺＺタグとの融合タンパク質を発現するプラスミドの構築（１）
配列番号３に示すアミノ酸配列を有するリンカーを付加するためのオリゴヌクレオチドプライマーＭｒ１９ｆＥｃＲＶｒ（配列番号４）を合成した。Ｍｒ１９ｆＥｃＲＶｒにはＢａｍＨＩサイトも含めた。配列番号１に示す７５０ｂｐのＤＮＡ断片を含むＭｒｃｐ１９ｋクローニングベクター（フェブス・ジャーナル（ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ），２００７年，第２７４巻，ｐ４３３６−４３４６に記載）を鋳型、ＲｅｘＭｒｃｐ１９Ｐ−１プライマー（配列番号５）とＭｒ１９ｆＥｃＲＶｒプライマー（配列番号４）をプライマー対とし、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社）を使用して、常法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動に供し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いてゲルを切り出し、増幅ＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化し、予めＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化したｐＥＴ３２ａプラスミドに挿入した。得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に導入し、形質転換を行った。得られた形質転換体のコロニーからプラスミドを調製し、そのＤＮＡ配列を解析したところ、所望の配列が挿入されていることが確認された。得られたプラスミドをｐＥＴ３２−Ｍｒ１９ｋＩｍと命名した。
【００４９】
一方、IgG-binding domain of staphyrococcal protein A (ZZ-domain)の遺伝子（ＺＺドメイン遺伝子）を増幅するために、以下の操作を行った。まず、ｐＥＺＺ１８Ｒ（ＧＥヘルスサイエンス社）を鋳型、ＺＺｆ−ＥｃｏＲＶプライマー（配列番号６）とＺＺｒ−ＥｃｏＲＩプライマー（配列番号７）をプライマー対として、常法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を３％アガロースゲルにて電気泳動に供し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いてゲルを切り出し、増幅ＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片をｐＥＴ３２ａに挿入した。得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に導入し、形質転換を行った。得られた形質転換体のコロニーからプラスミドを調製し、そのＤＮＡ配列を解析したところ、所望の配列が挿入されていることが確認された。得られたプラスミドをｐＴ７−ＺＺと命名した。
【００５０】
ｐＴ７−ＺＺをＥｃｏＲＶとＥｃｏＲＩで消化し、ＺＺドメイン遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出した。このＤＮＡ断片を、予めＥｃｏＲＶとＥｃｏＲＩで消化したｐＥＴ３２−Ｍｒ１９ｋＩｍに挿入した。得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に導入し、形質転換を行った。得られた形質転換体のコロニーからプラスミドを調製し、そのＤＮＡ配列を解析したところ、所望の配列が挿入されていることが確認された。得られたプラスミドをｐＥＴ３２−Ｍｒ１９ｋＩｍ−ＺＺと命名した。ｐＥＴ３２−Ｍｒ１９ｋＩｍ−ＺＺによれば、Ｍｒｃｐ１９ｋがＮ末端側に、ＺＺドメイン（ＺＺタグ）がＣ末端側に位置し、これらがリンカー（配列番号３）を介して連結された融合タンパク質（以下、「Ｍｒｃｐ１９ｋ−ＺＺ」と略記する。）を発現させることができる。
【００５１】
２．フジツボ由来１９ｋ接着タンパク質（Ｍｒｃｐ１９ｋ）とＺＺタグとの融合タンパク質を発現するプラスミドの構築（２）
Ｍｒｃｐ１９ｋクローニングベクターを鋳型、Ｍｒ１９ｋｆＥｃｏＲＩプライマー（配列番号８）とＥｘＭｒｃｐ１９ｋ:Ｐ−２−ｒプライマー（配列番号９）をプライマー対とし、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社）を使用して、常法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いてゲルを切り出し、増幅ＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、予めＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したｐＥＺＺ１８Ｒ（ＧＥヘルスサイエンス社）に挿入した。これにより、ｐＥＺＺ１８ＲのマルチクローニングサイトにＭｒｃｐ１９ｋ遺伝子が挿入された。得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に導入し、形質転換を行った。得られた形質転換体のコロニーからプラスミドを調製し、そのＤＮＡ配列を解析したところ、所望の配列が挿入されていることが確認された。得られたプラスミドをｐＥＺＺ−Ｍｒ１９ｋと命名した。ｐＥＺＺ−Ｍｒ１９ｋによれば、Ｍｒｃｐ１９ｋとＺＺドメイン（ＺＺタグ）との融合タンパク質であって、ＺＺタグがＮ末端側に、Ｍｒｃｐ１９ｋがＣ末端側に位置する融合タンパク質（以下、「ＺＺ−Ｍｒｃｐ１９ｋ」と略記する。）を発現させることができる。
【００５２】
３．ＺＺドメインを発現するプラスミドの構築
ｐＥＺＺ１８Ｒ（ＧＥヘルスサイエンス社）を鋳型、ＺＺｆ−ＮｃｏＩプライマー（配列番号１０）とＺＺｒ−ＢａｍＨＩＲＲプライマー（配列番号１１）をプライマー対とし、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社）を使用して、常法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いてゲルを切り出し、増幅ＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化し、予めＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化したｐＥＴ３２ａに挿入した。得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に導入し、形質転換を行った。得られた形質転換体のコロニーからプラスミドを調製し、そのＤＮＡ配列を解析したところ、所望の配列が挿入されていることが確認された。得られたプラスミドをｐＥＴ３２−ＺＺと命名した。ｐＥＴ３２−ＺＺによれば、ＺＺドメインを単独で発現させることができる。
【００５３】
４．Ｃｙｓリンカーが付加したＺＺドメインを発現するプラスミドの構築
ｐＥＺＺ１８Ｒ（ＧＥヘルスサイエンス社）を鋳型、ＺＺｆ−ＮｃｏＩプライマー（配列番号１０）とＺＺＧＧＣｒ−ＢａｍＨＩプライマー（配列番号１２）をプライマー対とし、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社）を使用して、常法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いてゲルを切り出し、増幅ＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化し、予めＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化したｐＥＴ３２ａに挿入した。得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に導入し、形質転換を行った。得られた形質転換体のコロニーからプラスミドを調製し、そのＤＮＡ配列を解析したところ、所望の配列が挿入されていることが確認された。得られたプラスミドをｐＥＴ３２−ＺＺ−ＧＧＣと命名した。ｐＥＴ３２−ＺＺ−ＧＧＣによれば、ｐＥＴ３２を用いた発現系で、ＺＺドメイン（ＺＺタグ）のＣ末端側にトリペプチドリンカーＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓが付加したタンパク質を発現させることができる。
【００５４】
５．Ｈｉｓタグが付加したＺＺドメインを発現するプラスミドの構築
ｐＥＺＺ１８Ｒ（ＧＥヘルスサイエンス社）を鋳型、ＺＺｈｉｓｆ−ＮｄｅＩプライマー（配列番号１３）とＺＺｒ−ＢａｍＨＩＲＲプライマー（配列番号１１）をプライマー対とし、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社）を使用して、常法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲルにて電気泳動に供し、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いてゲルを切り出し、増幅ＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化し、予めＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化したｐＥＴ１９プラスミドに挿入した。得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に導入し、形質転換を行った。得られた形質転換体のコロニーからプラスミドを調製し、そのＤＮＡ配列を解析したところ、所望の配列が挿入されていることが確認された。得られたプラスミドをｐＥＴ１９−ＺＺと命名した。ｐＥＴ１９−ＺＺによれば、ｐＥＴ１９を用いた発現系で、ＺＺドメイン（ＺＺタグ）のＮ末端側にＨｉｓタグが付加したタンパク質を発現させることができる。
【００５５】
６．融合タンパク質の精製
上記１で調製したプラスミドｐＥＴ３２−Ｍｒ１９ｋＩｍ−ＺＺを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で一昼夜培養し、その培養液８ｍＬを４００ｍＬの同じ組成のＬＢ培地に植菌した。そのまま３７℃で２時間培養した後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で４時間培養した。培養終了後、菌体を回収した。
【００５６】
得られた菌体を１０ｍＬの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）に懸濁し、氷上で超音波破砕した。破砕物を１５，０００×ｇで４０分間遠心し、上清画分を回収して無細胞抽出液を得た。
【００５７】
Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ ｋｉｔ（ノバジェン社）を用いて、得られた無細胞抽出液から目的の融合タンパク質を精製した。具体的には、まず１．５ｍＬのＨｉｓ−Ｂｉｎｄ ｒｅｓｉｎに７．５ｍＬのＣｈａｒｇｅ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＮｉＳＯ4）を加え、ニッケルイオンを固定化させた。４．５ｍＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ イミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）でカラムを平衡化した後、無細胞抽出液をアプライした。さらに、１５ｍＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒと９ｍＬのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（６０ｍＭ イミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）にてカラムを洗浄した。最後に９ｍＬのＥｌｕｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ イミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）を添加した。溶出画分を回収し、Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2）に対して透析した。透析後のタンパク質溶液を濃縮した。
【００５８】
Ｈｉ−ｔｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰ（ファルマシア社）にＣｈａｒｇｅ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＮｉＳＯ4）を加え、ニッケルイオンを固定化させた（ニッケル固定化カラム）。一方、濃縮したタンパク質溶液の一部を取り、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ（ノバジェン社）を添加して、２０℃で２時間インキュベートした。インキュベート終了後、１０ｍＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ イミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したニッケル固定化カラムにアプライした。３ｍＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでカラムを洗浄し、非吸着画分を回収した。この非吸着画分を１倍濃度のＰＢＳで平衡化したゲルろ過カラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷXL（東ソー社）に供し、Ｍｒｃｐ１９ｋ−ＺＺ融合タンパク質を含む画分を回収した。これにより、精製されたＭｒｃｐ１９ｋ−ＺＺ融合タンパク質が得られた。
【００５９】
同様の手順により、精製されたＺＺ−Ｍｒｃｐ１９ｋ融合タンパク質を得た。
【００６０】
７．ＺＺドメインの精製
ｐＥＴ３２−Ｍｒ１９ｋＩｍ−ＺＺの代わりに上記３で構築したｐＥＴ３２−ＺＺを使用し、上記６と同じ手順で、形質転換体の作製と培養、無細胞抽出液の調製、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ ｋｉｔ（ノバジェン社）による精製、透析、およびＨｉ−ｔｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰ（ファルマシア社）へのアプライを行った。３ｍＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでカラムを洗浄し、非吸着画分を回収した。回収した非吸着画分をＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに対して透析し、同緩衝液で平衡化したカラムに供した。２ｍＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでカラムを洗浄し、非吸着画分を回収した。この非吸着画分を１倍濃度のＰＢＳで平衡化したゲルろ過カラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷXL（東ソー社）に供し、ＺＺドメインを含む画分を回収した。これにより、精製されたＺＺドメインが得られた。
【実施例２】
【００６１】
本実施例では、実施例１で調製した融合タンパク質を用いた固相免疫測定の系（サンドイッチＥＩＡの系）を構築し、その作用効果を調べた。検出対象となるモデル抗原タンパク質として、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を採用した。
【００６２】
まず、本実施例で用いた試薬類、機器類を以下にまとめて示す。
（１）融合タンパク質
実施例１で調製したＭｒｃｐ１９ｋ−ＺＺ融合タンパク質を含む画分
（２）標準抗原
α-Fetoprotein Human Serum Standard（ＤＡＫＯ社、Lot.Ch-B.020(801)）
（３）固相抗体
α-Fetoprotein Rabbit Polyclone Anti-α-Fetoprotein Human（ＤＡＫＯ社、Lot.Ch-B.051(101)）
（４）酵素標識抗体
α-Fetoprotein Rabbit Polyclone Anti-Human パーオキシダーゼ標識（ＤＡＫＯ社、Lot.Ch-B.068(601)）
（５）酵素基質
TMB Substrate-Chromogen S1599（ＤＡＫＯ社、Lot.122175）
（６）緩衝液・洗浄液
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
（７）ＥＬＩＳＡ用プレート（担体）
９６穴マイクロタイタープレート（住友ベークライト社）
（８）プレート洗浄装置
Columbus Washer（ＴＥＣＡＮ社）
（９）プレートリーダー
Microplate Reader Model550（バイオラッド社）
【００６３】
１．融合タンパク質のプレートへの固定化
融合タンパク質を１０μＬの緩衝液に溶解させて１００μｇ／ｍＬの溶液を調製し、これを元に、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、および０μｇ／ｍＬの希釈列を作製した。これらの融合タンパク質溶液をＥＬＩＳＡ用プレートの各穴に１００μＬずつ分注し、水浴槽にて３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、プレートを取り出し、プレート洗浄装置を用いて洗浄液３００μＬで３回洗浄した。これにより、融合タンパク質がプレートに固定化された。
比較例として、融合タンパク質の固定化を行わないプレートも設定した。
【００６４】
２．固相抗体の固定化
固相抗体を緩衝液で２００倍に希釈し、上記１で作製した融合タンパク質固定化プレートの９６穴それぞれに１００μＬずつ分注し、水浴槽にて３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、プレートを取り出し、プレート洗浄装置を用いて洗浄液３００μＬで３回洗浄した。これにより、固相抗体が融合タンパク質を介してプレートに固定化された。
【００６５】
３．抗原タンパク質の添加
標準抗原を緩衝液にて５００００倍に希釈し、それを元に、各濃度の抗原タンパク質溶液を調製した。各抗原タンパク質溶液を上記２で作製したプレートに１００μＬずつ分注し、水浴槽にて３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、プレートを取り出し、プレート洗浄装置を用いて洗浄液３００μＬで３回洗浄した。
【００６６】
４．標識抗体の添加
酵素標識抗体を緩衝液にて３０００倍に希釈し、上記３のプレートの９６穴それぞれに１００μＬずつ分注し、水浴槽にて３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、プレートを取り出し、プレート洗浄装置を用いて洗浄液３００μＬで３回洗浄した。
【００６７】
５．酵素反応
各穴の駅を完全に除去した後、酵素基質液１００μＬを分注し、水浴槽にて３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベート後、１Ｎ硫酸１００μＬを分注して反応を停止させた。ただちにプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお測定はｎ＝４で行い、その平均値を測定値として採用した。
【００６８】
６．測定結果
第１表に得られた測定値を示す。
【００６９】
【表１】
2009240235.tif 000003
【００７０】
図２に測定結果をグラフで示す。図２の４つの群（１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、および０μｇ／ｍＬ。０μｇ／ｍＬは比較例。）は固定化に用いた融合タンパク質の濃度、各群の２００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、および０ｎｇ／ｍＬは、添加した抗原タンパク質溶液の濃度、縦軸は吸光度である。すなわち、いずれの群においても、０〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲のＡＦＰ濃度で直線性が保たれており、少なくともこの範囲で抗原タンパク質（ＡＦＰ）の定量が可能であった。また、各群同士を比較すると、融合タンパク質を用いた方（１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、および２．５μｇ／ｍＬ）が比較例（０μｇ／ｍＬ）よりも高い吸光度を示しており、感度が高かった。なお、抗原タンパク質濃度が０ｎｇ／ｍＬのときの吸光度には大きな差がないことから、バックグラウンドの上昇は抑えられていた。さらに、融合タンパク質濃度が１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、および２．５μｇ／ｍＬの３群同士を比較すると、より高い濃度の融合タンパク質溶液を用いた方が吸光度が高く、融合タンパク質の濃度を高感度で測定できることが示された。
【００７１】
以上より、実施例１で調製したＭｒｃｐ１９ｋ−ＺＺ融合タンパク質が接着性と抗体特異的結合性とを有しており、ＥＬＩＳＡにおいて、固相抗体をプレートに固定化する前にＭｒｃｐ１９ｋ−ＺＺ融合タンパク質を予めプレートに固定化しておくことにより、より高感度な固相免疫測定を行えることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】（ａ）は本発明の融合タンパク質の構造を模式的に表す説明図、（ｂ）は本発明における固相抗体の配向状態を模式的に表す説明図である。
【図２】実施例２のＥＬＩＳＡの結果を表すグラフである。
【図３】（ａ）は抗体の構造を模式的に表す説明図、（ｂ）は従来技術における固相抗体の配向状態を模式的に表す説明図である。
【符号の説明】
【００７３】
１  担体
２  抗体
６  融合タンパク質
７  フジツボ由来接着タンパク質
８  抗体特異的結合タンパク質
【図１】
2009240235.tif 000004
【図２】
2009240235.tif 000005
【図３】
2009240235.tif 000006
【配列表】
2009240235000001.app