(57)【要約】【課題】アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を高い精度で判定することができる、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法及び判定装置を提供する。【解決手段】アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性に関する情報とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性に関する情報とに基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値を測定する第１測定ステップ、
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値を測定する第２測定ステップ、及び
第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値及び第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定ステップ
を含む、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法。
【請求項２】
がん細胞が、乳癌細胞である請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
アンスラサイクリン系抗がん剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキザウノマイシン又はイダルビシンである請求項１又は２に記載の判定方法。
【請求項４】
判定ステップが、アンスラサイクリン系抗がん剤の処理によるＣＤＫ１の活性値の変化度に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
【請求項５】
判定ステップが、変化度と閾値とを比較して、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである請求項４に記載の判定方法。
【請求項６】
変化度が、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値との差、又は第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値との比率である請求項４又は５に記載の判定方法。
【請求項７】
判定ステップが、第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値が、第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値よりも一定以上減少したときに、がん細胞がアンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性であると判定する、請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
【請求項８】
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する第１測定ステップ、
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する第２測定ステップ、
第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値及び発現量と、第２測定ステップそれぞれで得られたＣＤＫ１の活性値及び発現量とに基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値と、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とをそれぞれ算出する算出ステップ、及び
算出ステップで得られた比活性値に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定ステップ
を含む、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法。
【請求項９】
判定ステップが、アンスラサイクリン系抗がん剤によるＣＤＫ１の比活性値の変化度に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである請求項８に記載の判定方法。
【請求項１０】
判定ステップが、変化度と閾値とを比較して、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである請求項９に記載の判定方法。
【請求項１１】
変化度が、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値との差、又は第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値との比率である請求項９又は１０に記載の判定方法。
【請求項１２】
判定ステップが、第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値が第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値よりも一定以上減少したときに、がん細胞がアンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性であると判定するステップである、請求項８に記載の判定方法。
【請求項１３】
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性に関する第１情報とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性に関する第２情報とを取得する取得部と、
前記第１情報と前記第２情報に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定部と、
前記判定部の判定結果を出力する出力部と、
を備えてなる、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性に関する情報を提供するためのアンスラサイクリン系抗がん剤感受性判定装置。
【請求項１４】
前記判定部が、アンスラサイクリン系抗がん剤によるＣＤＫ１の活性に関する変化度を算出し、算出した変化度に基づいてアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
閾値を記憶する記憶部をさらに備え、
前記判定部が、算出した変化度と閾値を比較し、比較結果に基づいてアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する、請求項１４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法及び判定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗がん剤による治療の有効性、抗がん剤に対する細胞の感受性等を判定する方法として、例えば、サイクリン依存性キナーゼの発現量の値、活性値、及び発現量と活性値との比のうちの少なくとも１つをパラメータとして用いる方法が知られている（特許文献１〜４を参照のこと）。
【０００３】
例えば、特許文献１には、抗がん剤治療前の患者から採取した乳癌組織の、ＣＤＫ１比活性値、ＣＤＫ２比活性値及びＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の比に基づいて、タキサン系抗がん剤に対する患者の感受性を判定する方法が開示されている。
【０００４】
特許文献２には、腫瘍細胞を含む組織から調製した細胞可溶化液の、ＣＤＫ１比活性又は、ＣＤＫ２及びＣＤＫ４の発現量を測定し、所定の閾値と比較することで、ＣＭＦ（シクロフォスファミド、メトトレキセート、フルオロウラシルの３剤を併用して投与する療法）による治療の有効性を予測する方法が開示されている。また、ＣＤＫ２比活性及び／又はｐ２１発現量を測定し、所定の閾値と比較することで、ヒト乳がん細胞の担がんマウスのパクリタキセルの感受性を予測する方法が記載されている。
【０００５】
特許文献３には、パクリタキセルを投与したヒト乳がん細胞の担がんマウスの腫瘍組織のＣＤＫ１比活性、ＣＤＫ２比活性、又はｐ２１発現量を測定し、所定の閾値と比較することで、ヒト乳がん細胞の担がんマウスのパクリタキセルの感受性を予測する方法が記載されている。
【０００６】
特許文献４には、患者から摘出されたがん組織のＣＤＫ２比活性とｐ２１の発現量を測定し、所定の閾値と比較することで、タキサン系抗がん剤の感受性を判定する方法が開示されている。また、ＣＤＫ２比活性とサイクリンＥの発現量の比を所定の閾値と比較することで、ＣＥ（シクロフォスファミド、エピルビシンの２剤を併用して投与する療法）の感受性を判定する方法が開示されている。さらに、ＣＤＫ１比活性を所定の閾値と比較することで、ＣＭＦの感受性を判定する方法が開示されている。
【特許文献１】米国公開２００７／２３１８３７号公報
【特許文献２】米国公開２００６／１７３６３２号公報
【特許文献３】米国公開２００７／００３９６４号公報
【特許文献４】米国公開２００７／０７７６５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定することができる、新規なアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法及び判定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
（１）  アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値を測定する第１測定ステップ、
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値を測定する第２測定ステップ、及び
第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値及び第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定ステップ
を含む、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法、
（２）  がん細胞が、乳癌細胞である（１）に記載の判定方法、
（３）  アンスラサイクリン系抗がん剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキザウノマイシン又はイダルビシンである（１）又は（２）に記載の判定方法、
（４）  判定ステップが、アンスラサイクリン系抗がん剤の処理によるＣＤＫ１の活性値の変化度に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである（１）〜（３）のいずれかに記載の判定方法、
（５）  判定ステップが、変化度と閾値とを比較して、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである（４）に記載の判定方法、
（６）  変化度が、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値との差、又は第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値との比率である（４）又は（５）に記載の判定方法、
（７）  判定ステップが、第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値が、第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値よりも一定以上減少したときに、がん細胞がアンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性であると判定する、（１）〜（３）のいずれかに記載の判定方法、
（８）  アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する第１測定ステップ、
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する第２測定ステップ、
第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値及び発現量と、第２測定ステップそれぞれで得られたＣＤＫ１の活性値及び発現量とに基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値と、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とをそれぞれ算出する算出ステップ、及び
算出ステップで得られた比活性値に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定ステップ
を含む、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法、
（９）  判定ステップが、アンスラサイクリン系抗がん剤によるＣＤＫ１の比活性値の変化度に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである（８）に記載の判定方法、
（１０）  判定ステップが、変化度と閾値とを比較して、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである（９）に記載の判定方法、
（１１）  変化度が、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値との差、又は第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値との比率である（９）又は（１０）に記載の判定方法、
（１２）  判定ステップが、第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値が第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値よりも一定以上減少したときに、がん細胞がアンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性であると判定するステップである、（８）に記載の判定方法、
（１３）  アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性に関する第１情報とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性に関する第２情報とを取得する取得部と、
前記第１情報と前記第２情報に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定部と、
前記判定部の判定結果を出力する出力部と、
を備えてなる、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性に関する情報を提供するためのアンスラサイクリン系抗がん剤感受性判定装置、
（１４）  前記判定部が、アンスラサイクリン系抗がん剤によるＣＤＫ１の活性に関する変化度を算出し、算出した変化度に基づいてアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する、（１３）に記載の装置、並びに
（１５）  閾値を記憶する記憶部をさらに備え、
前記判定部が、算出した変化度と閾値を比較し、比較結果に基づいてアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する、（１４）に記載の装置、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法によれば、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定することができる。また、本発明のアンスラサイクリン系抗がん剤の感受性判定装置によれば、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定し、がん患者に対して有効な抗がん剤を選択するに有用な情報を生成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．  アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法
本発明の一実施の形態（実施の形態１）に係るアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法は、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値を測定する第１測定ステップ、
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値を測定する第２測定ステップ、及び
第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値及び第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定ステップ
を含む方法である。
【００１１】
本実施の形態１に係る判定方法では、第１測定ステップにおいて、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値を測定する。
【００１２】
がん細胞としては、例えば、乳癌細胞、肺癌細胞、肝臓癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、子宮頸癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、皮膚癌細胞、脳腫瘍細胞、白血病細胞等が挙げられる。がん細胞は、種々のがんに罹患したがん患者から採取される。本発明の判定方法では、これらのがん細胞のなかでは、乳癌細胞が好適ある。これらのがん細胞は、乳癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、脳腫瘍、白血病等の患者から採取することができる。これらのなかでは、乳癌細胞が好ましい。
【００１３】
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞は、アンスラサイクリン系抗がん剤を含まない適切な培地が入った容器中でがん細胞を培養することで得ることができる。
【００１４】
培地としては、がん細胞を生育させるに適した培地であればよい。かかる培地としては、例えば、ダルベッコ改変培地、イーグル最少必須培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、リーボビッツＬ１５培地などを基本培地として含む培地が挙げられる。これらの培地は、所望により、Ｌ−グルタミン、ウシ胎仔血清、インシュリン、グルコース、炭酸水素ナトリウムなどの補添成分が補われている培地であってもよい。培地中におけるこれらの補添成分の濃度は、がん細胞が採取された組織の種類、がんの種類、補添成分の種類などに応じて適宜設定することができる。
【００１５】
培地におけるがん細胞の培養条件は、がん細胞が採取された組織の種類、がんの種類などにより異なるため、一概に決定されるものではない。かかる培地でのがん細胞の培養条件は、通常、５体積％二酸化炭素、３７℃で培養する条件である。
【００１６】
がん細胞を培地で培養した場合、容器中のがん細胞を洗浄し、つぎに、洗浄後のがん細胞を、容器から剥離させる。がん細胞の洗浄には、例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水、ＴｒｉｓやＨＥＰＥＳ等の緩衝液を含む生理食塩水等を用いることができる。また、容器からのがん細胞の剥離は、例えば、トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（組成：０．２５質量％トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）等の細胞分散用試薬を洗浄後のがん細胞を添加し、インキュベーションすることにより行なうことができる。剥離後のがん細胞は、例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水により洗浄し、回収すればよい。このように回収されたがん細胞について、ＣＤＫ１の活性値を測定する。
【００１７】
ＣＤＫ１の活性値は、特定のサイクリンと結合して、前記サイクリンをリン酸化する基質の量から算出されるキナーゼ活性のレベル（単位をＵ（ユニット）で表わす）である。なお、前記ＣＤＫ１がリン酸化する基質としては、例えば、ヒストンＨ１等が挙げられる。
【００１８】
ＣＤＫ１の活性値は、慣用のＣＤＫ活性測定方法で測定することができる。ＣＤＫ１の活性値の測定方法としては、放射性物質による標識を用いる方法や、放射性物質による標識を用いない方法が挙げられる。放射性物質による標識を用いる方法としては、具体的には、細胞溶解液から活性型ＣＤＫ１を含む試料を調製し、当該試料と32Ｐ標識したＡＴＰ（[γ−32Ｐ]ＡＴＰ）とを用いて、基質タンパク質に32Ｐを取り込ませ、32Ｐ標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、標準品で作成された検量線をもとに定量する方法などが挙げられる。また、放射性物質による標識を用いない方法としては、米国公開２００２／１６４６７３号公報に記載の方法が挙げられる。米国公開２００２／１６４６７３号公報に記載の方法は、測定試料の細胞可溶化液から、活性型ＣＤＫ１を含む試料を調製し、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰγＳ）と基質タンパク質を反応させて、該基質タンパク質のセリン残基又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に蛍光標識物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識されたチオリン酸基に基づく標識量（蛍光標識物質を用いた場合には蛍光量）を測定し、標準品で作成された検量線に基づいて定量する方法である。
【００１９】
ＣＤＫ１の活性値の測定に供する試料は、測定対象となるがん細胞の細胞溶解液からＣＤＫ１を特異的に採取することにより調製する。がん細胞の細胞溶解液は、界面活性剤を含む溶液等によりがん細胞を溶解させることにより得ることができる。ＣＤＫ１の活性値の測定に供する試料は、ＣＤＫ１に特異的な抗ＣＤＫ１抗体、ＣＤＫ１／サイクリンＡ複合体に特異的な抗ＣＤＫ１／サイクリンＡ複合体抗体、及びＣＤＫ１／サイクリンＢ複合体に特異的な抗ＣＤＫ１／サイクリンＢ複合体抗体などを用いた免疫沈降法により、調製することができる。試料には、活性型ＣＤＫ１以外のＣＤＫが試料に含まれていてもよい。試料には、例えば、サイクリンＡ・ＣＤＫ１複合体又はサイクリンＢ・ＣＤＫ１複合体にＣＤＫインヒビターがさらに結合した複合体も含まれる。さらに、試料には、ＣＤＫ１単独、ＣＤＫ１とサイクリン（サイクリンＡ又はサイクリンＢ）及び／又はＣＤＫインヒビターとの複合体、ＣＤＫ１とその他の化合物との複合体等が含まれる。したがって、活性値は、活性型ＣＤＫ１、不活性型ＣＤＫ１、各種競合反応が混在する状態下で、リン酸化された基質の量により算出される単位（Ｕ）として測定される。
【００２０】
本発明の判定方法の実施の形態１では、第２測定ステップにおいて、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値を測定する。
【００２１】
アンスラサイクリン系抗がん剤は、抗がん作用を有するアンスラサイクリン化合物であればよい。アンスラサイクリン系抗がん剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキザウノマイシン及びイダルビシンが好ましい。
【００２２】
また、アンスラサイクリン系抗がん剤によるがん細胞の処理は、がん細胞を、アンスラサイクリン系抗がん剤を添加した抗がん剤含有培地で培養することにより行なわれる。
【００２３】
抗がん剤含有培地中に含まれるアンスラサイクリン系抗がん剤の量は、がん細胞のアポトーシスや増殖阻害等の抗がん作用が認められる濃度であればよく、一概に決定されるものではない。抗がん剤含有培地中に含まれる抗がん剤の量は、通常、０．１ｎＭ〜１００００ｎＭ、好ましくは１０ｎＭ〜１０００ｎＭである。
【００２４】
アンスラサイクリン系抗がん剤によるがん細胞の処理の後、第１測定ステップと同様の操作により、がん細胞を回収し、回収されたがん細胞について、ＣＤＫ１の活性値を測定する。
【００２５】
その後、判定ステップにおいて、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値及び第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する。
【００２６】
本実施の形態１に係る判定方法では、判定ステップは、アンスラサイクリン系抗がん剤によるＣＤＫ１の活性値の変化度に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップであるのが好ましい。アンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性であるがん細胞と、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して非感受性であるがん細胞との間において、当該変化度が大きく異なる。したがって、かかる変化度に基づいて、感受性を判定する判定方法によれば、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定することができる。
【００２７】
なお、本明細書において、アンスラサイクリン系抗がん剤によるＣＤＫ１の活性値の変化度は、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値の変化の度合いを示すものであればよい。例えば、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値との差、及び第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値との比率を含む概念をいう。第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値との差としては、例えば、〔［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］−［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］〕及び〔［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］−［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］〕が挙げられる。また、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値との比率としては、〔［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］／［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］〕及び〔［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］／［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］〕が挙げられる。
【００２８】
本実施の形態１に係る判定方法では、変化度として、例えば、〔［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］−［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］〕を用いる場合、〔［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］−［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］〕が、小さい値であるか、マイナスの値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、非感受性であると判定することができる。逆に、大きい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、感受性であると判定することができる。
【００２９】
また、変化度として、例えば、〔［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］／［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］〕を用いる場合、〔［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］／［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］〕が大きい値であるほど、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、非感受性であると判定することができる。逆に、小さい値であるほど、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、感受性であると判定することができる。
【００３０】
本実施の形態１に係る判定方法では、判定ステップは、変化度と閾値とを比較して、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップであるのが好ましい。これにより、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定を、より客観的に行なうことができる。また、これにより、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定のシステム化が可能になる。
【００３１】
閾値は、前記変化度と、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性に関するデータの蓄積から、経験的に導き出すことができる。
【００３２】
例えば、抗がん剤含有培地中におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の濃度が１００ｎＭであって、変化度として〔［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］−［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］〕を用いる場合、閾値は、７０〜３７０の間に設定することができる。特に、１００〜３００の間に設定することが好ましい。このとき、〔［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］−［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］〕が、かかる閾値よりも小さい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、非感受性であると判定できる。逆に、閾値よりも大きい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、感受性であると判定できる。
【００３３】
また、抗がん剤含有培地中におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の濃度が１００ｎＭであって、変化度として〔［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］／［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］〕を用いる場合、閾値は、０．６５〜０．９の間に設定することができる。特に、０．７〜０．８の間に設定することが好ましい。このとき、〔［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］／［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値］〕が、かかる閾値よりも大きい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、非感受性であると判定できる。逆に、閾値よりも小さい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、感受性であると判定することができる。
【００３４】
なお、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性のがん細胞は、アンスラサイクリン系抗がん剤による処理で、ＣＤＫ１の活性値が大きく減少する。それに対し、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して非感受性のがん細胞は、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理しても、ＣＤＫ１の活性値が大きく減少することがない。従って、判定ステップは、第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値が、第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値よりも一定以上減少したときに、がん細胞がアンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性であると判定することもできる。ここで、一定以上減少は、アンスラサイクリン系抗がん剤の処理前後におけるがん細胞のＣＤＫ１の活性値と、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性に関するデータの蓄積から、経験的に導き出すことができる。
【００３５】
本発明の他の実施の形態（実施の形態２）に係るアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法は、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する第１測定ステップ、
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する第２測定ステップ、
第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値及び発現量と、第２測定ステップそれぞれで得られたＣＤＫ１の活性値及び発現量とに基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値と、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とをそれぞれ算出する算出ステップ、及び
算出ステップで得られた比活性値に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定ステップ
を含む方法である。
【００３６】
本実施の形態２に係る判定方法では、第１測定ステップにおいて、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する。
【００３７】
活性値の測定は、実施の形態１に係る判定方法と同様に行なうことができる。
【００３８】
ＣＤＫ１の発現量は、細胞可溶化液に含まれるＣＤＫ１の量（分子個数に対応する単位）であり、タンパク質混合物から目的のタンパク質の量を測定する従来公知の方法で測定できる。ＣＤＫ１の発現量は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法等を使用してもよく、米国公開２００４／２１４１８０号公報に開示の方法で測定してもよい。ＣＤＫ１は、抗ＣＤＫ１抗体を用いて捕捉することができる。したがって、抗ＣＤＫ１抗体により捕捉されたＣＤＫ１の量を決定することにより、細胞可溶化液に含まれるＣＤＫ１の発現量を測定する。
【００３９】
また、第２測定ステップにおいて、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する。アンスラサイクリン系抗がん剤によるがん細胞の処理は、実施の形態１にかかる判定方法の第２測定ステップと同様に行なうことができる。また、ＣＤＫ１の活性値及び発現量は、本実施の形態２の判定方法の第１測定ステップと同様の手法により測定することができる。
【００４０】
つぎに、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値及び発現量と、第２測定ステップそれぞれで得られたＣＤＫ１の活性値及び発現量とに基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値と、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とをそれぞれ算出する。ここで、比活性値とは、活性値と発現量との比を表す値である。例えば、活性値／発現量により、算出することができる。かかる比活性値は、細胞に存在しているＣＤＫ１のうち、活性を示すＣＤＫ１の割合に相当する。かかるＣＤＫ１の比活性値は、測定試料の調製方法に依存しない点で優れる。
【００４１】
その後、算出ステップで得られた比活性値に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する。
【００４２】
本実施の形態２に係る判定方法では、判定ステップが、アンスラサイクリン系抗がん剤によるＣＤＫ１の比活性値の変化度に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップであるのが好ましい。
【００４３】
本実施の形態２に係る判定方法における変化度は、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値の変化の度合いを示すものであればよい。例えば、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値との差、及び第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値との比率が挙げられる。第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値との差としては、〔［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］−［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］〕及び〔［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］−［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］〕が挙げられる。また、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値との比率としては、〔［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］／［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］〕及び〔［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］／［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］〕が挙げられる。
【００４４】
本実施の形態２に係る判定方法では、変化度として、例えば、〔［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］−［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］〕を用いる場合、〔［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］−［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］〕が、小さい値であるか、マイナスの値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、非感受性であると判定できる。逆に、大きい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、感受性であると判定することができる。
【００４５】
また、変化度として、例えば、〔［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］／［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］〕を用いる場合、〔［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］／［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］〕が大きい値であるほど、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、非感受性であると判定できる。逆に、小さい値であるほど、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、感受性であると判定することができる。
【００４６】
本実施の形態２に係る判定方法では、判定ステップが、変化度と閾値とを比較して、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップであるのが好ましい。これにより、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定を、より客観的に行なうことができる。
【００４７】
例えば、抗がん剤含有培地中におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の濃度が１００ｎＭであって、変化度として〔［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］−［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］〕を用いる場合、閾値は、４〜２１の間に設定することができる。特に、５〜１５の間に設定することが好ましい。このとき、〔［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］−［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］〕が、かかる閾値よりも小さい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、非感受性であると判定することができる。逆に、閾値よりも大きい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、感受性であると判定することができる。
【００４８】
また、抗がん剤含有培地中におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の濃度が１００ｎＭであって、変化度として〔［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］／［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性］〕を用いる場合、閾値は、０．６〜０．９の間に設定することができる。特に、０．７〜０．８の間に設定することが好ましい。このとき、〔［第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］／［第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値］〕が、かかる閾値よりも大きい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、非感受性であると判定することができる。逆に、閾値よりも小さい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、感受性であると判定することができる。
【００４９】
なお、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性のがん細胞は、アンスラサイクリン系抗がん剤による処理で、ＣＤＫ１の比活性値が大きく減少する。それに対し、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して非感受性のがん細胞は、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理しても、ＣＤＫ１の比活性値が大きく減少することがない。従って、判定ステップは、第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値が、第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の比活性値よりも一定以上減少したときに、がん細胞がアンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性であると判定することもできる。ここで、一定以上減少は、アンスラサイクリン系抗がん剤の処理前後におけるがん細胞のＣＤＫ１の比活性値と、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性に関するデータの蓄積から、経験的に導き出すことができる。
【００５０】
２．  アンスラサイクリン系抗がん剤の感受性判定装置
つぎに、本発明の判定方法を実施するのに好適な装置として、本発明のアンスラサイクリン系抗がん剤の感受性判定装置を添付の図面に基づき説明する。
【００５１】
図１０は、本実施形態における判定装置の概略構成を示すブロック図である。本実施形態における判定装置１は、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する装置であって、図１０に示すように、情報処理装置１０と、測定装置２０とを備えて構成されている。情報処理装置１０は、測定装置２０から出力された測定データを解析してアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定し、判定結果を出力するための装置である。測定装置２０は、がん細胞のＣＤＫ1の活性値及び発現量を測定して測定データを情報処理装置１０へ出力するための装置である。
【００５２】
情報処理装置１０は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）からなり、情報処理部１０１と、キーボード１０３と、表示部１０５とを備えている。情報処理部１０１は、ＣＰＵ１０１ａと、ＲＯＭ１０１ｂと、ＲＡＭ１０１ｃと、ハードディスク１０１ｄと、入出力インタフェース１０１ｅと、通信インタフェース１０１ｆと、画像出力インタフェース１０１ｇと、バス１０１ｈとを備え、各部はバス１０１ｈを介して接続されており、相互にデータの送受信が可能である。
【００５３】
ＣＰＵ１０１ａは、ＲＯＭ１０１ｂに記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ１０１ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＲＯＭ１０１ｂには、ＣＰＵ１０１ａによって実行されるコンピュータプログラムおよびＣＰＵ１０１ａがコンピュータプログラムを実行するためのデータなどが記録されている。ＲＡＭ１０１ｃは、ＲＯＭ１０１ｂおよびハードディスク１０１ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ１０１ａの作業領域として利用される。
【００５４】
ハードディスク１０１ｄには、オペレーティングシステム（ＯＳ）やアプリケーションプログラムなど、ＣＰＵ１０１ａに実行させるための種々のコンピュータプログラムおよびそのコンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
ハードディスク１０１ｄにインストールされているアプリケーションプログラム１０１ｉには、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法を実現するためのアプリケーションプログラムが含まれている。また、ハードディスク１０１ｄには、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法を実現するためのアプリケーションプログラムの実行に用いるデータとして、閾値が記憶されている。
【００５５】
入出力インタフェース１０１ｅには、キーボード１０３やマウス（図示せず）が接続されている。通信インタフェース１０１ｆには測定装置２０が接続されており、情報処理部１０１は、通信インタフェース１０１ｆを介して測定装置２とデータの送受信が可能である。
【００５６】
画像出力インタフェース１０１ｇは、表示部１０５に接続されており、ＣＰＵ１０１ａから与えられた画像データに応じた映像信号を表示部１０５に出力する。表示部１０５は、入力された映像信号にしたがって、画像（画面）を表示する。
【００５７】
情報処理装置１０と通信インタフェース１０１ｆを介して接続される測定装置２０は、生体組織からＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定するための装置である。このような、測定装置として、米国公開２００７／００７７６５８号公報に記載されている装置を用いることができる。
【００５８】
なお、本実施形態において、判定装置１は、測定装置２０によって得られた測定データから、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するように構成されているが、このような構成に限られない。例えば、予めＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定しておき、キーボード１０３から測定データを入力する構成であってもよい。
【００５９】
図１１は、本実施形態に係る判定装置１によるアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定処理を示すフローチャートである。
まず、ステップＳ１において、測定装置２０が、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理していないがん細胞のＣＤＫ１の活性に関する情報と、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理したがん細胞のＣＤＫ１の活性に関する情報とを取得する。より具体的には、測定装置２０は、ＣＤＫ１の活性に関する情報として、ＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定し、その測定データを取得する。以下、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理していないがん細胞のＣＤＫ１の活性に関する情報を第１情報、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理したがん細胞のＣＤＫ１の活性に関する情報を第２情報と言う。なお、測定装置２０で取得された第１情報及び第２情報は、通信インタフェース１０１ｆを通じて、情報処理部１０１に送信される。
【００６０】
つぎに、ステップＳ２において、情報処理部１０１のＣＰＵ１０１ａは、ハードディスク１０１ｄにインストールされている、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法を実現するためのアプリケーションプログラムを実行し、第１情報と第２情報に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する。より具体的には、第１情報と第２情報から、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞とのＣＤＫ１の活性に関する変化度が算出される。算出された変化度は、ハードディスク１０１ｄに記憶されている閾値と比較される。そして、比較結果に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性が判定される。
【００６１】
ここで、ＣＤＫ１の活性に関する変化度としては、（１）第１情報から得られるＣＤＫ１の活性値又は比活性値と、第２情報から得られるＣＤＫ１の活性値又は比活性値との差、及び（２）第１情報から得られるＣＤＫ１の活性値又は比活性値と、第２情報から得られるＣＤＫ１の活性値又は比活性値との比率が挙げられる。なお、ＣＤＫ１の活性値及び比活性値は、測定装置２０で測定されたＣＤＫ１の活性値及び発現量の測定データから求めることができる。また、閾値は、判定に用いられる変化度に応じて、適宜設定することができる。
【００６２】
その後、ステップＳ３において、判定結果は、情報処理部１０１の画像出力インタフェース１０１ｇから表示部１０５に送信され、表示部１０５に判定結果が表示される。
【００６３】
図１２は、図１０に示される判定装置１の表示部１０５に表示される画面（ウィンドウ画面）を示す図である。図１２の画面７０１は、抗がん剤（アンスラサイクリン系抗がん剤）処理なしのがん細胞におけるＣＤＫ１の活性に関する情報７０２と、抗がん剤（アンスラサイクリン系抗がん剤）処理ありのがん細胞におけるＣＤＫ１の活性に関する情報７０３と、変化度の情報７０４と、判定結果の情報７０５とを表示する。
【００６４】
情報７０２は、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値、発現量及び比活性値を示す。また、情報７０３は、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値、発現量及び比活性値を示す。情報７０４は、変化度として比活性値の差、及び比活性値の比を示す。なお、情報７０４には、比活性値の差として、〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていない細胞におけるＣＤＫ１の比活性値］−［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の比活性値］〕の値が表示されている。また、比活性値の比として〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の比活性値］／［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていない細胞におけるＣＤＫ１の比活性値］〕
の値が表示されている。情報７０５は、比較結果に基づくアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定結果を示す。
【００６５】
医師等に代表される使用者は、この画面７０１に表示される情報７０２、情報７０３、情報７０４及び情報７０５に基づいて、患者に対して使用する抗がん剤の選択を行なうことができる。
【００６６】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００６７】
（参考例１）
ヒト乳癌細胞株であるＨｓ５７８Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２６Ｒ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２９）、ＢＴ２０細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１９）、ＣＡＭＡ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２１）、Ｔ４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３３）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２７）、ＵＡＣＣ８９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９０２）、ＢＴ４７４細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２０）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、ＡＴＣＣ推奨の培養条件にしたがって、以下のように、培養を行なった。
【００６８】
ＨＳ  ５７８Ｔ細胞は、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、１０質量％ウシ胎仔血清と０．０１ｍｇ／Ｌウシインシュリンとを含み、グルコースの最終濃度が４．５ｇ／Ｌで、炭酸水素ナトリウムの最終濃度が１．５／Ｌであるダルベッコ改変イーグル培地中、５体積％二酸化炭素で、３７℃で培養した。
【００６９】
ＭＤＡ−ＭＤ−４３５Ｓ細胞は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、１０質量％ウシ胎仔血清と０．０１ｍｇ／Ｌインシュリンとを含むリーボビッツ（Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ）Ｌ１５培地中、空気雰囲気下、３７℃で培養した。
【００７０】
ＢＴ−２０細胞は、Ｅａｒｌｅ’ｓ  ＢＳＳと２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムと０．１ｍＭ非必須アミノ酸と１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムと、１０質量％ウシ胎仔血清とを含むイーグル最少必須培地中、５体積％二酸化炭素中、３７℃で培養した。
【００７１】
ＣＡＭＡ−１細胞は、Ｅａｒｌｅ’ｓ  ＢＳＳと２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムと０．１ｍＭ非必須アミノ酸と１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムと、１０質量％ウシ胎仔血清とを含むイーグル最少必須培地中、５体積％二酸化炭素中、３７℃で培養した。
【００７２】
Ｔ−４７Ｄ細胞は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳと１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムと４．５ｇ／Ｌグルコースと１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムと、１０質量％ウシ胎仔血清と０．２単位／ｍＬウシインシュリンとを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中、５体積％二酸化炭素中、３７℃で培養した。
【００７３】
ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞は、２０質量％ウシ胎仔血清を含むリーボビッツ（Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ）Ｌ１５培地中、空気雰囲気下、３７℃で培養した。
【００７４】
ＵＡＣＣ−８９３細胞は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、１０質量％ウシ胎仔血清と０．０１ｍｇ／Ｌインシュリンとを含むリーボビッツ（Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ）Ｌ１５培地中、空気雰囲気下、３７℃で培養した。
【００７５】
ＢＴ−４７４細胞は、１０質量％ウシ胎仔血清を含む改変ダルベッコ培地中、５体積％二酸化炭素、３７℃で培養した。
【００７６】
（参考例２）
Ｈｓ５７８Ｔ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞、ＢＴ２０細胞、ＣＡＭＡ−１細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、ＵＡＣＣ８９３細胞及びＢＴ４７４細胞の各乳癌細胞株を、７系列の細胞数となるように段階的に希釈した。得られた各細胞の段階希釈物を培地に播種し、参考例１に示される培養条件で２４時間培養した。
【００７７】
得られた各培養物中における生細胞数を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミドを用いたＭＴＴ法により測定した。段階希釈物の播種時の細胞数と、前記生細胞数の測定値との間において、一次相関が高い範囲を測定レンジとし、この範囲内で薬剤の影響を評価できるように、細胞ごとに播種時の細胞数を設定した。かかる細胞数の条件となるように、細胞を培地に播種し、インキュベーターを用いて参考例１に示される培養条件で、各細胞を２４時間培養した。
【００７８】
１μＭドキソルビシンを段階的に希釈し、８系列の濃度の段階希釈物を調製し、得られたドキソルビシンの段階希釈物を、各細胞の培地に添加し、参考例１に示される培養条件で、各細胞を３日間培養した。対照として、ドキソルビシンの段階希釈物に代えて、同量の培地を用いたことを除き、前記と同様に各細胞を培養した。
【００７９】
その後、得られた各培養物中における生細胞数を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミドを用いたＭＴＴ法により測定した。なお、測定は、４回行なった。
【００８０】
測定された生細胞数に基づき、ドキソルビシンで処理していない培養物中における生細胞数／ドキソルビシンで処理して得られた培養物中における生細胞数×１００＝５０となるドキソルビシンの濃度（ＩＣ５０）を求めた。その結果を、図１に示す。
【００８１】
一般的に抗癌剤治療で用いられるドキソルビシンは、有効血中濃度として２００ｎＭ前後であることが知られている。そこで、ドキソルビシンの血中濃度である２００ｎＭ以上を示す乳癌細胞株を非感受性株とし、２００ｎＭ未満を示す乳癌細胞株を感受性株とした。
【００８２】
（実施例１）
（１）ドキソルビシン処理
参考例１に示される培養条件で培養した乳癌細胞株を、１×１０7細胞／Ｔ−２２５フラスコとなるように、Ｔ−２２５フラスコ中の培地にそれぞれ播種し、２４時間培養した。その後、得られた培養物の培地を、１００ｎＭドキソルビシンを添加した培地４０ｍＬに交換し、細胞をさらに２４時間培養した。その後、フラスコから培地を除去し、リン酸緩衝化生理的食塩水１５ｍＬをフラスコに入れ、当該リン酸緩衝化生理的食塩水でフラスコ内の細胞を洗浄した。その後、フラスコ内の細胞に、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５質量%トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）３ｍＬを添加し、３７℃で５分インキュベーションし、細胞をフラスコから剥がした。このフラスコに、１０ｍＬ以上の培地を添加して、トリプシンによる反応を停止させ、細胞を回収した。回収した細胞を、１９０×ｇ、５分間の遠心分離に供し、上清を除去した。得られた細胞を、適量のリン酸緩衝化生理的食塩水に懸濁した。得られた細胞懸濁物を、１９０×ｇ、５分間の遠心分離に供し、上清を除去した。得られた細胞におけるＣＤＫ１の活性値及び発現量を、以下のように測定した。なお、得られた細胞は、ＣＤＫ１の活性値及び発現量の測定まで、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。
【００８３】
得られた細胞を、約１５０ｍｇ／ｍＬとなるように、緩衝液Ａ〔組成：０．１ｗ／ｖ％ノニデットＰ−４０（カルビオケム社製）、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１００ｕＬ／ｍＬプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社製）〕に懸濁し、細胞懸濁物を得た。その後、ホモジナイザーを用いて、細胞懸濁物中の細胞を破砕して細胞可溶化液を調製した。つぎに、細胞可溶化液を、４℃で１５０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離に供し、上清を得た。得られた上清をドキソルビシン処理試料とした。
【００８４】
１００ｎＭドキソルビシンを添加した培地に代えて、ドキソルビシン無添加培地を用いたことを除き、前記と同様に、ドキソルビシン非処理試料を得た。
【００８５】
ドキソルビシン処理試料及びドキソルビシン非処理試料をＣＤＫ１測定用試料として用いた。
【００８６】
（３）ＣＤＫ１の活性値の測定
ＣＤＫ１の活性値は、以下のように測定した。５ｍＬ容マイクロチューブ（エッペンドルフ社製）に緩衝液Ａ５００μＬに入れ、さらに、ＣＤＫ測定用試料を全タンパク質量が１００μｇとなるように添加した。
【００８７】
得られた混合物に抗ＣＤＫ１抗体２μｇと２０μＬのプロテインＡをコートしたセファロースビーズ（バイオラッド社）を加えて４℃、１時間静置してＣＤＫ１と抗ＣＤＫ１抗体とを反応させた。
【００８８】
反応後、ビーズをビーズ洗浄用緩衝液〔組成：０．１ｗ／ｖ％ノニデットＰ−４０、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）〕で３回洗浄し、溶解緩衝液Ａ  １５μＬ中に再懸濁させて、抗ＣＤＫ１抗体を介してＣＤＫ１が結合したセファロースビーズを含む試料を得た。
【００８９】
この試料に、ＣＤＫ１の基質溶液〔組成：ヒストンＨ１  １０μｇ、５ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ（シグマ社製）、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、０．１ｗ／ｖ％  Ｔｒｉｒｏｎ  Ｘ−１００〕を、得られる混合物の総量が５０μＬとなるように添加した。得られた混合物を３７℃で１０分間振盪させて、キナーゼ反応を行ない、ヒストンＨ１にモノチオリン酸基を導入した。
【００９０】
キナーゼ反応後、混合物を２０００ｒｐｍで２０秒間の遠心分離に供し、ビーズを沈殿させ、上清１８μＬを採取した。得られた上清に、結合緩衝液〔組成：１５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．２）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ〕１５μＬと、１０ｍＭヨードアセチルビオチン溶液〔１０ｍＭヨードアセチルビオチン、１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕とを添加した。得られた混合物を、９０分間、室温、暗所で静置することにより、モノチオリン酸基を導入された基質（モノチオリン酸化基質）の硫黄原子にヨードアセチルビオチンを結合させた。
【００９１】
ヨードアセチルビオチンが結合したモノチオリン酸化基質０．４μｇを含む試料を、スロットブロッターを用いてＰＶＤＦメンブレン上にブロットした。ブロット後のＰＶＤＦメンブレンを１ｗ／ｖ％  ＢＳＡを含む溶液でブロッキングし、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ベクター社製）を添加して３７℃で１時間インキュベーションした。その後、ＰＶＤＦメンブレンを５０ｍＭ洗浄液Ｂで３回洗浄した。洗浄後、蛍光イメージアナライザーＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（バイオラッド社）を用いてＰＶＤＦメンブレンの蛍光分析を行なった。ＣＤＫ１の活性値を、検量線に基づいて算出した。なお、検量線は、２種類の濃度のタンパク質（ビオチン標識免疫グロブリン）を含む溶液を、ＰＶＤＦメンブレンにブロットし、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、タンパク質の蛍光強度を蛍光イメージアナライザーで測定することによって作成した。測定されるＣＤＫ１の活性１Ｕ（ユニット）は、前記タンパク質１ｎｇの時の蛍光量と同等の蛍光強度を示す値をいう。
【００９２】
ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値との差を、〔［ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値］−［ドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値］〕により算出した。その結果を、図２に示す。
【００９３】
図２に示される結果から、ＩＣ５０により感受性株とされた乳癌細胞株であるＨｓ５７８Ｔ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞、ＢＴ２０細胞及びＣＡＭＡ−１細胞では、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値との差が大きくなっているのに対して、ＩＣ５０により非感受性株とされた乳癌細胞株であるＴ４７Ｄ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、ＵＡＣＣ８９３細胞及びＢＴ４７４細胞では、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値との差が小さいか、あるいは差がマイナスの値となっていることがわかる。かかる結果から、ドキソルビシンに代表されるアンスラサイクリン系抗がん剤で処理していないがん細胞のＣＤＫ１の活性値とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理したがん細胞のＣＤＫ１の活性値との差に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定することができることが示唆される。
【００９４】
（実施例２）
実施例１と同様に、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値とを測定した。つぎに、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値との比率を、〔［ドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値］／［ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値］〕により算出した。その結果を、図３に示す。
【００９５】
図３に示される結果から、ＩＣ５０により感受性株とされた乳癌細胞株であるＨｓ５７８Ｔ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞、ＢＴ２０細胞及びＣＡＭＡ−１細胞では、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値との比率が小さくなっているのに対して、ＩＣ５０により非感受性株とされた乳癌細胞株であるＴ４７Ｄ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、ＵＡＣＣ８９３細胞及びＢＴ４７４細胞では、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値との比率が大きくなっていることがわかる。かかる結果から、ドキソルビシンに代表されるアンスラサイクリン系抗がん剤で処理していないがん細胞のＣＤＫ１の活性値とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理したがん細胞のＣＤＫ１の活性値との比率に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定することができることが示唆される。
【００９６】
（実施例３）
（１）ＣＤＫ１の活性値の測定
実施例１と同様に、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値とを測定した。
【００９７】
（２）ＣＤＫ１の発現量の測定
ＣＤＫ１の発現量は、以下のように、測定した。ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）をセットしたブロッターの各ウェルに、ＣＤＫ１測定用試料５０μＬずつ入れた。つぎに、ウェルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約２５０ｍｍＨｇ（３３．３Ｐａ）で約３０秒間吸引して、ＰＶＤＦメンブレンにＣＤＫ１測定試料中のタンパク質を吸着させた。
【００９８】
ウェルに洗浄液Ｂ〔組成：２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム〕１００μＬを入れ、メンブレンの裏面から負圧５００ｍｍＨｇ（６６．６Ｐａ）で洗浄液Ｂを１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
【００９９】
つぎに、ブロッキング試薬Ｂ〔４質量％  ＢＳＡ、２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム〕４０μＬを各ウェルに入れ、メンブレンを１５分間静置した。その後、メンブレンの裏面から負圧５００ｍｍＨｇ（６６．６Ｐａ）でブロッキング試薬Ｂを１５秒間吸引することにより、メンブレンをブロッキングした。
【０１００】
ウェルにウサギ抗ＣＤＫ１抗体（一次抗体）溶液４０μＬを入れ、メンブレンを室温で約３０分間静置して、メンブレン上のＣＤＫ１と一次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引した。その後、ウェルに、洗浄液Ｂ  １００μＬを入れ、負圧５００ｍｍＨｇ（６６．６Ｐａ）で１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
【０１０１】
ウェルにビオチン化した抗ウサギＩｇＧ抗体（二次抗体）溶液４０ｕＬを入れ、室温で約３０分間静置してメンブレン上の一次抗体と二次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇ（６６．６Ｐａ）で１５秒間吸引した。
【０１０２】
その後、ウェルに洗浄液Ｂ１００μＬを入れ、負圧５００ｍｍＨｇ（６６．６Ｐａ）で１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。つぎに、ウェルにＦＩＴＣで標識したストレプトアビジンを含む標識溶液５０μＬを入れ、室温で約３０分間静置して、メンブレン上の二次抗体をＦＩＴＣで標識した後、メンブレンの裏面から負圧５００ｍｍＨｇ（６６．６Ｐａ）で１５秒間吸引した。
【０１０３】
その後、ウェルに洗浄液Ｂ１００μＬを入れ、負圧５００ｍｍＨｇ（６６．６Ｐａ）で１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。洗浄液Ｂによるメンブレンの洗浄を５回繰り返して行なった。
【０１０４】
洗浄後のメンブレンをブロッターから取り外し、当該メンブレンを２０体積％メタノール水溶液で約５分間濯いだ。その後、メンブレンを約２０分間室温で乾燥させた後、メンブレンに吸着したタンパク質に基づく蛍光強度を、蛍光イメージアナライザーＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（バイオラッド社）によって測定した。ＣＤＫ１の活性値は、検量線をもとに算出した。なお、検量線は、０．００５ｗ／ｖ％ノニデットＰ−４０と５０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡとを含む洗浄液Ｂ中に組み換えＣＤＫ１を溶解させた５種類の濃度の溶液を、上記と同様に処理したウェルに５０μＬずつ入れ、上記と同様の実験手順でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して、蛍光強度とＣＤＫ１発現量との関係を表すことにより作成した。
【０１０５】
（３）比活性値の算出
【０１０６】
測定されたＣＤＫ１活性値及び発現量から、下記式：
【０１０７】
ＣＤＫ１比活性＝ＣＤＫ１活性値／ＣＤＫ１発現量
【０１０８】
によりＣＤＫ１比活性値（ｍＵ／ｎｇ）を算出した。
【０１０９】
ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値との差を、〔［ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値］−［ドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値］〕により算出した。その結果を、図４に示す。
【０１１０】
図４に示される結果から、ＩＣ５０により感受性株とされた乳癌細胞株であるＨｓ５７８Ｔ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞、ＢＴ２０細胞及びＣＡＭＡ−１細胞では、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値との差が大きくなっているのに対して、ＩＣ５０により非感受性株とされた乳癌細胞株であるＴ４７Ｄ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、ＵＡＣＣ８９３細胞及びＢＴ４７４細胞では、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値との差が小さいか、あるいは差がマイナスの値となっていることがわかる。かかる結果から、ドキソルビシンに代表されるアンスラサイクリン系抗がん剤で処理していないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理したがん細胞のＣＤＫ１の比活性値との差に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定することができることが示唆される。
【０１１１】
（実施例４）
実施例３と同様に、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値及び発現量とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値及び発現量とを測定した。つぎに、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値との比率を、〔［ドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値］／［ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値］〕により算出した。その結果を、図５に示す。
【０１１２】
図５に示される結果から、ＩＣ５０により感受性株とされた乳癌細胞株であるＨｓ５７８Ｔ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞、ＢＴ２０細胞及びＣＡＭＡ−１細胞では、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値との比率が小さくなっているのに対して、ＩＣ５０により非感受性株とされた乳癌細胞株であるＴ４７Ｄ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、ＵＡＣＣ８９３細胞及びＢＴ４７４細胞では、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値との比率が大きくなっていることがわかる。かかる結果から、ドキソルビシンに代表されるアンスラサイクリン系抗がん剤で処理していないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理したがん細胞のＣＤＫ１の比活性値との比率に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定することができることが示唆される。
【０１１３】
（比較例１）
実施例１と同様の操作を行なうことにより、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値を測定した。その結果を、図６に示す。
【０１１４】
図６に示される結果から、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値のみでは、感受性株と非感受性株とを区別することができないことがわかる。
【０１１５】
（比較例２）
実施例１と同様の操作を行なうことにより、ドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値を測定した。その結果を、図７に示す。
【０１１６】
図７に示される結果から、ドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値のみでは、感受性株と非感受性株とを区別することができないことがわかる。
【０１１７】
（比較例３）
実施例３と同様に、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定し、比活性値を算出した。その結果を図８に示す。
【０１１８】
図８に示される結果から、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値のみでは、感受性株と非感受性株とを明確に区別することができないことがわかる。
【０１１９】
（比較例３）
実施例３と同様に、ドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定し、比活性値を算出した。その結果を図９に示す。
【０１２０】
図９に示される結果から、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値のみでは、感受性株と非感受性株とを明確に区別することができないことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】参考例２において、乳癌細胞におけるドキソルビシンのＩＣ５０を調べた結果を示すグラフである。
【図２】実施例１において、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値との差を調べた結果を示すグラフである。
【図３】実施例２において、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値との比率を調べた結果を示すグラフである。
【図４】実施例３において、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値との差を調べた結果を示すグラフである。
【図５】実施例４において、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値とドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値との比率を調べた結果を示すグラフである。
【図６】比較例１において、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値を調べた結果を示すグラフである。
【図７】比較例２において、ドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値を調べた結果を示すグラフである。
【図８】比較例３において、ドキソルビシンで処理していない乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値を調べた結果を示すグラフである。
【図９】比較例４において、ドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の比活性値を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】判定装置の概略構成を示すブロック図である。
【図１１】図１０に示される判定装置１によるアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定処理を示すフローチャート。
【図１２】図１０に示される判定装置１の表示部１５０に表示される画面（ウィンドウ画面）を示す図である。
【符号の説明】
【０１２２】
１        判定装置
１０      情報処理装置
２０      測定装置
１０１    情報処理部
１０１ａ  ＣＰＵ
１０１ｂ  ＲＯＭ
１０１ｃ  ＲＡＭ
１０１ｄ  ハードディスク
１０１ｅ  入出力インタフェース
１０１ｆ  通信インタフェース
１０１ｇ  画像出力インタフェース
１０１ｈ  バス
１０１ｉ  アプリケーションプログラム
１０３    キーボード
１０５    表示部  
７０１    画面
７０２    情報
７０３    情報
７０４    情報
７０５    情報
【図１０】
2009240238.tif 000002
【図１１】
2009240238.tif 000003
【図１２】
2009240238.tif 000004
【図１】
2009240238.tif 000005
【図２】
2009240238.tif 000006
【図３】
2009240238.tif 000007
【図４】
2009240238.tif 000008
【図５】
2009240238.tif 000009
【図６】
2009240238.tif 000010
【図７】
2009240238.tif 000011
【図８】
2009240238.tif 000012
【図９】
2009240238.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月26日(2009.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値を測定する第１測定ステップ、
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値を測定する第２測定ステップ、及び
第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値及び第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定ステップ
を含む、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法。
【請求項２】
がん細胞が、乳癌細胞である請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
アンスラサイクリン系抗がん剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキザウノマイシン又はイダルビシンである請求項１又は２に記載の判定方法。
【請求項４】
判定ステップが、アンスラサイクリン系抗がん剤の処理によるＣＤＫ１の活性値の変化度に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
【請求項５】
判定ステップが、変化度と閾値とを比較して、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである請求項４に記載の判定方法。
【請求項６】
変化度が、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値との差、又は第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値との比率である請求項４又は５に記載の判定方法。
【請求項７】
判定ステップが、第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値が、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値よりも一定以上減少したときに、がん細胞がアンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性であると判定するステップである、請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
【請求項８】
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する第１測定ステップ、
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する第２測定ステップ、
第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値及び発現量と、第２測定ステップそれぞれで得られたＣＤＫ１の活性値及び発現量とに基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値と、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とをそれぞれ算出する算出ステップ、及び
算出ステップで得られた比活性値に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定ステップ
を含む、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法。
【請求項９】
判定ステップが、アンスラサイクリン系抗がん剤によるＣＤＫ１の比活性値の変化度に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである請求項８に記載の判定方法。
【請求項１０】
判定ステップが、変化度と閾値とを比較して、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである請求項９に記載の判定方法。
【請求項１１】
変化度が、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値との差、又はアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値との比率である請求項９又は１０に記載の判定方法。
【請求項１２】
判定ステップが、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値がアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値よりも一定以上減少したときに、がん細胞がアンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性であると判定するステップである、請求項８に記載の判定方法。
【請求項１３】
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性に関する第１情報とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性に関する第２情報とを取得する取得部と、
前記第１情報と前記第２情報に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定部と、
前記判定部の判定結果を出力する出力部と、
を備えてなる、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性に関する情報を提供するためのアンスラサイクリン系抗がん剤感受性判定装置。
【請求項１４】
前記判定部が、アンスラサイクリン系抗がん剤によるＣＤＫ１の活性に関する変化度を算出し、算出した変化度に基づいてアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
閾値を記憶する記憶部をさらに備え、
前記判定部が、算出した変化度と閾値を比較し、比較結果に基づいてアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する、請求項１４に記載の装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明は、
（１）  アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値を測定する第１測定ステップ、
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値を測定する第２測定ステップ、及び
第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値及び第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定ステップ
を含む、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法、
（２）  がん細胞が、乳癌細胞である（１）に記載の判定方法、
（３）  アンスラサイクリン系抗がん剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキザウノマイシン又はイダルビシンである（１）又は（２）に記載の判定方法、
（４）  判定ステップが、アンスラサイクリン系抗がん剤の処理によるＣＤＫ１の活性値の変化度に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである（１）〜（３）のいずれかに記載の判定方法、
（５）  判定ステップが、変化度と閾値とを比較して、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである（４）に記載の判定方法、
（６）  変化度が、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値との差、又は第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値と第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値との比率である（４）又は（５）に記載の判定方法、
（７）  判定ステップが、第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値が、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値よりも一定以上減少したときに、がん細胞がアンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性であると判定するステップである、（１）〜（３）のいずれかに記載の判定方法、
（８）  アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する第１測定ステップ、
アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定する第２測定ステップ、
第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値及び発現量と、第２測定ステップそれぞれで得られたＣＤＫ１の活性値及び発現量とに基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値と、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とをそれぞれ算出する算出ステップ、及び
算出ステップで得られた比活性値に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定ステップ
を含む、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性の判定方法、
（９）  判定ステップが、アンスラサイクリン系抗がん剤によるＣＤＫ１の比活性値の変化度に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである（８）に記載の判定方法、
（１０）  判定ステップが、変化度と閾値とを比較して、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定するステップである（９）に記載の判定方法、
（１１）  変化度が、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値との差、又はアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値との比率である（９）又は（１０）に記載の判定方法、
（１２）  判定ステップが、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値がアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値よりも一定以上減少したときに、がん細胞がアンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性であると判定するステップである、（８）に記載の判定方法、
（１３）  アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞におけるＣＤＫ１の活性に関する第１情報とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞におけるＣＤＫ１の活性に関する第２情報とを取得する取得部と、
前記第１情報と前記第２情報に基づいて、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する判定部と、
前記判定部の判定結果を出力する出力部と、
を備えてなる、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性に関する情報を提供するためのアンスラサイクリン系抗がん剤感受性判定装置、
（１４）  前記判定部が、アンスラサイクリン系抗がん剤によるＣＤＫ１の活性に関する変化度を算出し、算出した変化度に基づいてアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する、（１３）に記載の装置、並びに
（１５）  閾値を記憶する記憶部をさらに備え、
前記判定部が、算出した変化度と閾値を比較し、比較結果に基づいてアンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性を判定する、（１４）に記載の装置、
に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
がん細胞としては、例えば、乳癌細胞、肺癌細胞、肝臓癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、子宮頸癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、皮膚癌細胞、脳腫瘍細胞、白血病細胞等が挙げられる。がん細胞は、がん患者から採取される。本発明の判定方法では、これらのがん細胞のなかでは、乳癌細胞が好適ある。これらのがん細胞は、乳癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、脳腫瘍、白血病等の患者から採取することができる。これらのなかでは、乳癌細胞が好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
閾値は、前記変化度と、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性に関するデータの蓄積から、導き出すことができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
なお、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性のがん細胞は、アンスラサイクリン系抗がん剤による処理で、ＣＤＫ１の活性値が大きく減少する。それに対し、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して非感受性のがん細胞は、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理しても、ＣＤＫ１の活性値が大きく減少することがない。従って、判定ステップでは、第２測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値が、第１測定ステップで得られたＣＤＫ１の活性値よりも一定以上減少したときに、がん細胞がアンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性であると判定することもできる。ここで、一定以上減少は、アンスラサイクリン系抗がん剤の処理前後におけるがん細胞のＣＤＫ１の活性値と、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性に関するデータの蓄積から、導き出すことができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本実施の形態２に係る判定方法における変化度は、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値の変化の度合いを示すものであればよい。例えば、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値との差、及びアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値との比率が挙げられる。アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値との差としては、〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］−［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］〕及び〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］−［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］〕が挙げられる。また、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値とアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値との比率としては、〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］／［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］〕及び〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］／［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］〕が挙げられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
本実施の形態２に係る判定方法では、変化度として、例えば、〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］−［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］〕を用いる場合、〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］−［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］〕が、小さい値であるか、マイナスの値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、非感受性であると判定できる。逆に、大きい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、感受性であると判定することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
また、変化度として、例えば、〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］／［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］〕を用いる場合、〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］／［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］〕が大きい値であるほど、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、非感受性であると判定できる。逆に、小さい値であるほど、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、感受性であると判定することができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
例えば、抗がん剤含有培地中におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の濃度が１００ｎＭであって、変化度として〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］−［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］〕を用いる場合、閾値は、４〜２１の間に設定することができる。特に、５〜１５の間に設定することが好ましい。このとき、〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］−［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］〕が、かかる閾値よりも小さい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、非感受性であると判定することができる。逆に、閾値よりも大きい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、感受性であると判定することができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
また、抗がん剤含有培地中におけるアンスラサイクリン系抗がん剤の濃度が１００ｎＭであって、変化度として〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］／［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性］〕を用いる場合、閾値は、０．６〜０．９の間に設定することができる。特に、０．７〜０．８の間に設定することが好ましい。このとき、〔［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］／［アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値］〕が、かかる閾値よりも大きい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、非感受性であると判定することができる。逆に、閾値よりも小さい値である場合、がん細胞が、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して、感受性であると判定することができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
なお、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性のがん細胞は、アンスラサイクリン系抗がん剤による処理で、ＣＤＫ１の比活性値が大きく減少する。それに対し、アンスラサイクリン系抗がん剤に対して非感受性のがん細胞は、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理しても、ＣＤＫ１の比活性値が大きく減少することがない。従って、判定ステップでは、アンスラサイクリン系抗がん剤で処理されたがん細胞のＣＤＫ１の比活性値がアンスラサイクリン系抗がん剤で処理されていないがん細胞のＣＤＫ１の比活性値よりも一定以上減少したときに、がん細胞がアンスラサイクリン系抗がん剤に対して感受性であると判定することもできる。ここで、一定以上減少は、アンスラサイクリン系抗がん剤の処理前後におけるがん細胞のＣＤＫ１の比活性値と、アンスラサイクリン系抗がん剤に対するがん細胞の感受性に関するデータの蓄積から、導き出すことができる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
（比較例４）
実施例３と同様に、ドキソルビシンで処理した乳癌細胞のＣＤＫ１の活性値及び発現量を測定し、比活性値を算出した。その結果を図９に示す。