(57)【要約】【課題】  哺乳動物における発生学研究あるいは疾患研究材料、再生医療材料、実験モデルとして有用であるが、生体内にわずかしか含まれていない間葉系幹細胞を、特に関節滑膜組織から高い収率で得ることが可能な濃縮方法および分離細胞を増幅する方法を提供する。【解決手段】  滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞、あるいはテロメラーゼ活性を有する細胞、ＣＤ３４陽性細胞、またはｃ-Ｋｉｔ陽性として特徴づけられる幹細胞を体外で濃縮し、分離操作後の幹細胞を選択的に培養する。細胞の濃縮培養には、無血清状態での使用を想定された培養液に少量の血清を添加した培養液を用いる。分離後の培養には、無血清培地に小量の血清を添加した物に加え、本来接着伸展性の低い幹細胞に対し特定の細胞接着因子を添加し、さらに特に幹細胞の増幅に効果的な２種類の成長因子を加えて培養する。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の幹細胞を含む画分を培養することを特徴とする培養方法。
【請求項２】
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、ＭＤＲタンパク質によって排出され得る細胞膜透過性色素に対して色素排出能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞、テロメラーゼ活性を有する細胞、ＣＤ３４陽性細胞、またはｃ-Ｋｉｔ陽性細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の細胞を含む画分を培養することを特徴とする培養方法。
【請求項３】
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅまたはＲｈｏｄａｍｉｎｅを排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞、テロメラーゼ活性を有する細胞、ＣＤ３４陽性細胞、またはｃ-Ｋｉｔ陽性細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の幹細胞を含む画分を培養することを特徴とする培養方法。
【請求項４】
哺乳動物の関節内から単離した滑膜組織より、細胞膜透過性色素を排出する細胞を含む画分を濃縮することを特徴とする培養方法。
【請求項５】
無血清培地と血清とを含む培養液を用いて画分を培養することを特徴とする請求項４記載の培養方法。
【請求項６】
濃縮された画分に含まれる細胞を、ＦＡＣＳおよび磁気ビーズ法の少なくとも一方によって分離し、分離した細胞を培養することを特徴とする請求項４または５記載の培養方法。
【請求項７】
分離した細胞を無血清培地と血清とを含む培養液を用いて培養することを特徴とする請求項６記載の培養方法。
【請求項８】
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有することを特徴とする幹細胞。
【請求項９】
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、テロメラーゼ活性を有することを特徴とする細胞。
【請求項１０】
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ受容体ｃ-Ｋｉｔを発現することを特徴とする細胞。
【請求項１１】
さらに造血幹細胞マーカー分化抗原ＣＤ３４を発現することを特徴とする請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】
請求項２〜５のいずれか１項に記載の培養方法で培養された画分に含まれる細胞に由来することを特徴とする分化細胞。
【請求項１３】
滑膜組織がウシの滑膜組織であることを特徴とする請求項２〜６のいずれか１項に記載する培養方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の培養方法によって培養された画分に含まれる細胞を用いて再構成されることを特徴とするクローンウシ。
【請求項１５】
ＣＡＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＡＡＴＧＣおよびＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴの塩基配列、ＣＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡおよびＡＧＴＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＴＧＴＣの塩基配列、または、ＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＣＣＧＣおよびＴＣＣＡＣＧＴＡＡＴＡＡＧＧＧＴＣＴＴＣＧＣの塩基配列を有し、ウシの滑膜に由来する細胞の評価に用いられることを特徴とするＰＣＲ用プライマー配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における発生工学研究、前臨床試験、安全性試験、疾患研究、免疫研究のモデルまたは再生医療のマテリアルとして有用な、関節滑膜由来幹細胞および細胞株、ならびに該幹細胞または細胞株を高い収率で高純度に得ることが可能な培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞とは、多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞である。また、幹細胞は、損傷後の組織修復力を有することが示唆されている。このため、かかる幹細胞は、各種疾患の治療用物質のスクリーニングおよび再生医療への応用が期待されている。
【０００３】
現在までに報告のある幹細胞ソースとしては、ヒト受精卵の胚体部分から樹立される胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）、堕胎胎児の生殖腺から樹立される胚性生殖幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ；ＥＧ細胞）、成体にもごく少数存在し、骨髄幹細胞に代表される組織幹細胞、成体マウスの精巣から樹立される多分化能性精源幹細胞（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ Ｇｅｒｍ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｍＧＳ細胞）、複数の遺伝子を同時に導入することで人為的に作成される誘導未分化幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ；ｉＰＳ細胞）があげられる。
【０００４】
しかし、ＥＳ細胞およびＥＧ細胞は、倫理的な問題に加え、本来的に受容者との間に免疫学的な障壁が存在すること、移植後に高頻度に良性の腫瘍（テラトーマ）を形成することが報告されている。また、ｍＧＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、現在のところマウスでのみ成功例が報告されているに過ぎず、さらにＥＳ細胞同様、移植によってテラトーマを形成することが報告されている。
【０００５】
一方、成体組織に由来する組織幹細胞は、由来する組織が損傷を受けた時にその細胞へ分化し、修復する作用を有していると考えられる。そのため、機能的に成熟した細胞を得られる可能性が高い。しかも、レシピエント自身から分離した細胞である限り、再移植に際して免疫学的な寛容が期待され、重篤な催腫瘍性も報告されていない。しかしながら、組織幹細胞は、ごく少数しか存在していない上、体外での培養は困難である。さらには、実際に分離された組織幹細胞の例は、少数の組織に限定されている。
【０００６】
近年、関節軟骨の欠損について間葉系幹細胞を使用する再生医療が開発されている（非特許文献１）。間葉系幹細胞は骨髄、臍帯血、脂肪、筋肉から採取することが可能であるが、骨髄中に含まれる間葉系幹細胞を使用する場合、存在率が０．０５％程度であるため、自己骨髄血由来の場合には極めて浸襲的となること、臍帯血由来の場合には、移植に際し提供者となる新生児との間で組織適合性が問題になること、脂肪組織の場合は、細胞成分が含まれる率が低率になるため、摘出組織質量あたりの集率が低率であること、筋組織の場合は、運動機能に対する浸襲性が高いことが問題となる。また、これら間葉系幹細胞の培養に特化した方法すなわち間葉系幹細胞のみが高率に含まれる集団を、本来の性質を損なうことなく培養する方法は確立されていない。
【０００７】
一方、関節内に含まれる滑膜組織にも同様に間葉系幹細胞が含まれているが、滑膜組織由来間葉系幹細胞は、他組織のものに比べて軟骨を形成する能力が高いことが報告されている（非特許文献２）。加えて、滑膜組織は採取後の再生が良好で、細胞成分を含む率も高い。以上のことから、特に関節軟骨の修復を目的とする再生医療の材料として、滑膜由来間葉系幹細胞は理想的な特性を備えていると言える。しかし、関節滑膜の異常増殖による疾病も知られており、再生医療に際しては目的の幹細胞成分のみを抽出し、必要な細胞に高純度に分化させて使用する必要がある。
【０００８】
【非特許文献１】脇谷滋之、「関節軟骨再生の現状と将来」、薬学雑誌、２００７年、第１２７巻、第４号、ｐ．８５７−８６３
【非特許文献２】関矢一郎ほか、「滑膜間葉幹細胞の軟骨分化」、再生医療（日本再生医療学会雑誌）、第５巻、第４号、ｐ．４６−５２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような現状に鑑みてなされたものであり、哺乳動物における発生学研究、疾患研究、臨床応用、実験モデルなどに有用な、関節滑膜組織に由来する幹細胞および細胞株、ならびに該細胞を高い収率で得ることが可能な濃縮方法および分離細胞を培養する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の幹細胞を含む画分を培養することを特徴とする培養方法である。
【００１１】
本発明はまた、哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、ＭＤＲタンパク質によって排出され得る細胞膜透過性色素に対して色素排出能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞、テロメラーゼ活性を有する細胞、ＣＤ３４陽性細胞、またはｃ-Ｋｉｔ陽性細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の細胞を含む画分を培養することを特徴とする培養方法である。
【００１２】
本発明はまた、哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）またはＲｈｏｄａｍｉｎｅを排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞、テロメラーゼ活性を有する細胞、ＣＤ３４陽性細胞、またはｃ-Ｋｉｔ陽性細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の幹細胞を含む画分を培養することを特徴とする培養方法である。
【００１３】
本発明はまた、哺乳動物の関節内から単離した滑膜組織より、細胞膜透過性色素を排出する細胞を含む画分を濃縮することを特徴とする培養方法である。
【００１４】
ここで、無血清培地と血清とを含む培養液を用いて画分を培養することを特徴とする。
さらに、濃縮された画分に含まれる細胞を、ＦＡＣＳおよび磁気ビーズ法の少なくとも一方によって分離し、分離した細胞を培養することを特徴とする。
【００１５】
さらにまた、分離した細胞を無血清培地と血清とを含む培養液を用いて培養することを特徴とする。
【００１６】
本発明はさらに、哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有することを特徴とする幹細胞である。
【００１７】
本発明はまた、哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、テロメラーゼ活性を有することを特徴とする細胞である。
【００１８】
本発明はまた、哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ受容体ｃ-Ｋｉｔを発現することを特徴とする細胞である。
【００１９】
ここで、さらに造血幹細胞マーカー分化抗原ＣＤ３４を発現することを特徴とする細胞でもある。
【００２０】
本発明はまた、上述の培養方法で培養された画分に含まれる細胞に由来することを特徴とする分化細胞である。
【００２１】
本発明は、上述の培養方法において、滑膜組織がウシの滑膜組織であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明は、上述の培養方法によって培養された画分に含まれる細胞を用いて再構成されることを特徴とするクローンウシである。
【００２３】
本発明はさらに、ＣＡＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＡＡＴＧＣおよびＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴの塩基配列、ＣＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡおよびＡＧＴＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＴＧＴＣの塩基配列、または、ＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＣＣＧＣおよびＴＣＣＡＣＧＴＡＡＴＡＡＧＧＧＴＣＴＴＣＧＣの塩基配列を有し、ウシの滑膜に由来する細胞の評価に用いられることを特徴とするＰＣＲ用プライマー配列である。
【発明の効果】
【００２４】
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の幹細胞を含む画分を培養する本発明の培養方法によれば、細胞を播種第一代目において濃縮しておくので、哺乳動物における発生学研究、臨床応用などに有用な幹細胞を、高純度で効率よく提供することができる。
【００２５】
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、ＭＤＲタンパク質によって排出され得る細胞膜透過性色素に対して色素排出能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞、テロメラーゼ活性を有する細胞、ＣＤ３４陽性細胞、またはｃ-Ｋｉｔ陽性細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の細胞を含む画分を培養する本発明の培養方法によれば、細胞を播種第一代目において濃縮しておくので、発生学研究、臨床応用などに有用な幹細胞、または幹細胞である可能性の高い細胞を、高純度で効率よく提供することができる。
【００２６】
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）またはＲｈｏｄａｍｉｎｅを排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有する幹細胞、テロメラーゼ活性を有する細胞、ＣＤ３４陽性細胞、またはｃ-Ｋｉｔ陽性細胞を、播種第一代目において濃縮し、分離操作後の幹細胞を含む画分を培養する本発明の培養方法によれば、細胞を播種第一代目において濃縮しておくので、発生学研究、臨床応用などに有用な、幹細胞である可能性の高い細胞を、高純度で効率よく提供することができる。
【００２７】
哺乳動物の関節内から単離した滑膜組織より、細胞膜透過性色素を排出する細胞を含む画分を濃縮する本発明の培養方法によれば、細胞膜透過性色素を排出するという幹細胞の性質を有する細胞を濃縮するので、発生学研究、臨床応用などに有用な、幹細胞である可能性の高い細胞を、高純度で効率よく提供することができる。
【００２８】
特に、無血清培地と血清とを含む培養液を用いて画分を培養することで、幹細胞または幹細胞である可能性の高い細胞の成育および分裂が促進され、細胞の高度な濃縮が可能になる。
【００２９】
さらに、濃縮された画分に含まれる細胞を、ＦＡＣＳまたは磁気ビーズ法によって分離し、分離した細胞を培養することで、純度がさらに高まる。
【００３０】
さらにまた、分離した細胞を無血清培地と血清とを含む培養液を用いて培養することによって、幹細胞または幹細胞である可能性の高い細胞を、さらに高純度で効率よく提供することができる。
【００３１】
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、分化多能性を有する本発明の幹細胞によれば、哺乳動物における発生学研究、疾患研究などに資することができ、関節疾患の治療をはじめとする臨床応用も期待される。
【００３２】
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、細胞膜透過性色素を排出する能力を有することで分離される、テロメラーゼ活性を有する本発明の細胞は、幹細胞である可能性の高い細胞なので、哺乳動物における発生学研究、疾患研究などに資することができる。
【００３３】
哺乳動物の関節内に存在する滑膜組織に由来し、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ受容体ｃ-Ｋｉｔを発現する本発明の細胞も、幹細胞である可能性の高い細胞なので、哺乳動物における発生学研究、疾患研究などに資することができる。
【００３４】
さらに造血幹細胞マーカー分化抗原ＣＤ３４を発現する本発明の細胞は、幹細胞である可能性がさらに高い細胞なので、哺乳動物における発生学研究、疾患研究などに資することができ、関節疾患の治療をはじめとする臨床応用も期待される。
【００３５】
上述の培養方法で培養された画分に含まれる細胞に由来する本発明の分化細胞は、疾患研究などに資することはもとより、臨床応用の期待が一層大きくなる。
【００３６】
上述の培養方法において、滑膜組織がウシの滑膜組織であると、ウシの疾患の治療に有用な細胞が得られ、またクローンウシの提供も可能になる。
【００３７】
上述の培養方法によって培養された画分に含まれる細胞を用いて再構成される本発明のクローンウシによれば、食料として品質のよい牛の複製を得ることが可能である。
【００３８】
ＣＡＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＡＡＴＧＣおよびＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴの塩基配列、ＣＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡおよびＡＧＴＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＴＧＴＣの塩基配列、または、ＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＣＣＧＣおよびＴＣＣＡＣＧＴＡＡＴＡＡＧＧＧＴＣＴＴＣＧＣの塩基配列を有し、ウシの滑膜に由来する細胞の評価に用いられる本発明のＰＣＲ用プライマー配列は、ｃ-Ｋｉｔ、Ａｂｃｇ２すなわちＢｃｒｐ１、またはＣＤ３４をコードする遺伝子の一部を複製するものであり、ウシ滑膜由来の幹細胞または幹細胞である可能性の高い細胞の迅速かつ適確な検出に好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明の実施の一形態の培養方法における重要な点は、次の［１］〜［３］の工程を含むことである。
［１］関節滑膜組織より細胞を濃縮する工程。
［２］工程［１］で得られた培養細胞に細胞透過性色素による染色操作を行い、セルソーターによって細胞を弱陽性あるいは陰性細胞集団として分離する工程。
［３］分離細胞を培養する工程。
【００４０】
また、この実施の形態で得られる関節滑膜組織由来幹細胞または細胞株は、次の（ｉ）〜（ｖｉ）の特性の少なくとも１つを有する。
（ｉ）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-３４ＳＦＭにウシ胎児血清を添加した培養液で、接着、増殖することができる。
（ｉｉ）細胞透過性色素排出能力を有する。また、このことにより、Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ／Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色後のフローサイトメトリーで、Ｓｉｄｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）として分離される。
（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性を有する。
（ｉｖ）ＣＤ３４陽性細胞を含む。あるいはＣＤ３４陽性細胞に分化することができる。
（ｖ）ｃ-Ｋｉｔ陽性細胞を含む。あるいはｃ-Ｋｉｔ陽性細胞に分化することができる。
（ｖｉ）前記（ｉｖ）および（ｖ）に示す性質を持つ細胞以外に、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などの、他の性質を有する細胞に分化することができる。
【００４１】
本発明において「哺乳動物」とは、ヒト、ウシなどのように、脚部に関節構造を有する恒温性多細胞動物である。マウスやラットのように近交化された実験動物のほか、山羊、羊などの家畜も含まれる。したがって、本発明には、哺乳動物の種に関して、何の制約もない。
【００４２】
関節軟骨は外傷などで損傷を受けると、正常には再生しにくく、痛みや歩行障害の原因となる。軟骨損傷に対する治療法として、近年自家軟骨移植による治療法が開発され、実際に利用されるようになってきた。しかし、他の部位から軟骨を採取しなければならないという問題、採取した軟骨細胞を体外で増殖させることが困難であるという問題などがある。
【００４３】
滑膜組織は哺乳動物の関節内に存在する間葉系組織であるが、軟骨に比べ採取が容易で、骨髄に比べて侵襲性が低く、採取後の再生も良い。また、脂肪組織に比べて細胞成分を含む比率が高いことも有用な点であると言える。さらに近年では、滑膜細胞は骨髄、筋肉、脂肪のような他の間葉系組織の細胞に比べて軟骨への分化能力が高く、筋肉、脂肪細胞、筋細胞といった他の機能性細胞への幅広い分化能力を有していることが報告されている。
【００４４】
本発明では、再生医療の材料として上記のように優れた性質をもつ滑膜組織あるいは滑膜組織由来細胞より、幹細胞画分を分離、培養することを可能にする方法を提供する。
【００４５】
本発明の関節滑膜幹細胞は、（ａ）関節より滑膜組織を得て、酵素により細胞を乖離する工程、（ｂ）得られた細胞を培養する工程、（ｃ）工程（ａ）で得られた細胞集団から、幹細胞画分を濃縮培養する工程、（ｄ）工程（ｂ）または工程（ｃ）で得られた細胞から、フローサイトメーター（細胞分離装置）を用いて幹細胞画分を分取する工程、（ｅ）分取した幹細胞画分を培養する工程、および、（ｆ）分取した幹細胞画分または培養した細胞の未分化性、発現プロファイルを分子生物学的手法により評価する工程によって得ることが可能である。かかる幹細胞の生産方法や評価方法、またそれに使用した培養液、プライマー配列も本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
本発明におけるフローサイトメーターと蛍光色素を用いた幹細胞の分離方法は、１９９６年、米国で行われたＧｏｏｄｅｌｌ ＭＡ博士らの骨髄幹細胞を用いた研究に基づく（Ｇｏｏｄｅｌｌ ＭＡ ｅｔ ａｌ.，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ，Ｊ. Ｅｘｐ. Ｍｅｄ. １９９６；１８３；１７９７〜１８０６）。この方法は、幹細胞、またはそのうち未分化性の高い一部の画分が強い色素排出能を有しており、細胞透過性色素Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ染色後に赤色蛍光、青色蛍光の２色の波長で展開すると、色素で染色されない幹細胞が、主要画分とは異なる集団（ＳＰ）として観察されるという原理のもとに開発されている。
【００４７】
同方法を用いて、現在までに、筋組織（Ｊａｃｋｓｏｎ ＭＡ ｅｔ ａｌ.，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｏｔｅｎｃｉａｌ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｕｒｉｎｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ，ＰＮＡＳ １９９９；９６；１４４８２〜１４４８６）、肝臓（Ｓｈｉｍａｎｏ Ｋ ｅｔ ａｌ.，Ｈｅｐａｔｉｃ ｏｖａｌ ｃｅｌｌｓ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｄｉｆｉｎｅｄ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＴＰ-ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＡＢＣＧ２／ＢＣＲＰ１，Ａｍ. Ｊ. Ｐａｔｈｏｌ. ２００３；１６３；３〜９）、肺、角膜上皮組織（Ｕｅｍｏｔｏ Ｔ ｅｔ ａｌ.，Ｌｉｍｂａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｓｉｄｅ-Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ Ｈａｖｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ-ｌｉｋｅ Ｐｒｏｐａｔｉｅｓ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ Ｓｔｅｔｅ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００６；２４；８６〜９４）から、幹細胞が分離されている。
【００４８】
本発明者らは、ＳＰ分離の原理を基に、滑膜組織を対象とした分離方法を開発し、その結果、滑膜組織に由来する細胞集団から幹細胞を得る方法を開発した。
【００４９】
さらに、工程（ｃ）のために、米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より体外で造血幹細胞を培養する目的で市販されているＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-３４ＳＦＭを基本培地とし、改良培養液を作成することでＳＰ細胞画分を著しく増加させることが可能な方法を開発した。
【００５０】
滑膜組織は哺乳動物の関節内に存在する薄い層状の組織であり、滑液の産生、吸収などを行っている。軟骨組織とは異なり、採取後は速やかに増殖し、補填されるため、ヒトをはじめ多くの哺乳動物から容易に採取することが可能である。
【００５１】
（１）滑膜組織の採取（工程（ａ））
本発明における幹細胞の分離を行う工程は、なるべく若齢、例えばウシであれば３ヶ月齢前後、の哺乳動物を対象とするのが望ましい。発明には細胞培養の工程が含まれるため、無菌操作を行う目的で、関節包は無菌環境に至るまで開放されないことが重要である。
【００５２】
滑膜組織の採取は具体的には次のように行うことができる。ウシ脚部を流水にて洗浄し、約１００ｍＬの消毒液で除染操作を行う。消毒液は、イソジン（登録商標）液のような一般的なものでよい。続いて、滅菌済みメスと滅菌済みのピンセット、ハサミを用いて表皮を剥離し、関節部を露出する。再度約１００ｍＬの消毒液で除染後、滅菌済みメスを用いて関節包を開放し、包の内側に存在する滑膜組織を採取する。採取した滑膜組織は使用するまでＰＢＳ（−）に浸し、冷蔵庫あるいは氷上にて保存する。なお、滅菌済みメスとしては、ディスポーザブルのメスを使用してもよい。
【００５３】
（２）単離組織の処理（工程（ａ））
次に、滅菌メスを用いて滑膜組織を細切し、ＰＢＳ（−）で洗浄する。具体的には、＃１０のメスを２本摺り合わせるように使用し、組織が完全にペースト状になるまで処理を続ける。２５ｍＬ容量ピペットに１５ｍＬ程度ＰＢＳ（−）を吸引し、そのまま滑膜組織のペーストを吸引する。これを５０ｍＬ容量の遠心チューブに移し、回転速度１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心して脂肪組織とそれ以外の組織に分離する。脂肪細胞は比重が軽く、遠心によってペレットとならないので、脂肪細胞を含む上清を吸引除去する。次いで、ペレットを細胞乖離液２０ｍＬに懸濁し、１００ｍｍペトリディッシュに移した後、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２の条件で３０分間反応させる。細胞乖離液は、例えば０．２５％程度のトリプシンと、１ｍＭ濃度のＥＤＴＡの混合液でよい。また、Ａｃｃｕｔａｓｅのような市販品を用いることも可能である。
【００５４】
３０分後、ダルベッコ変法イーグル培地に最終濃度１０％以上になるようにウシ胎児血清を添加したものを加え、酵素反応を停止させる。対象がヒト関節滑膜組織であれば、ヒト（提供者）血清を調整し、使用することが望ましい。これを再度５０ｍＬ容量の遠心チューブに移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行う。この操作で、再度上清に脂肪細胞が遊離するので、吸引、除去する。
【００５５】
（３）組織を処理することにより得られた細胞の培養（工程（ｂ）、（ｃ））
細胞培養を行うにあたり、上記操作で得られた組織を、細胞塊のない状態まで完全に消化する必要がある。この操作は、例えばＩ型コラゲナーゼを用いて行うことができる。０．１〜０．２ｇ程度のコラゲナーゼ粉末を量りとり、血清を含む培養液約１０ｍＬに溶解する。これをポアサイズ０．２〜０．２２μｍの滅菌用フィルターで濾過滅菌し、最終濃度が０．０２ｇ／ｍｌ〜０．０４ｇ／ｍｌとなるようにトリプシン処理済み滑膜組織ペーストに加える。反応を均一に行わせるため、処理中は常にスターラーバーで撹拌する。反応は３７℃、５％ＣＯ２、湿度飽和下のインキュベーター内で５時間〜１５時間行う。
【００５６】
反応後、不要な分化を誘起する可能性がある細胞塊および組織片を除去するため、ポアサイズ４０〜１００ｕｍのフィルターで濾過してもよい。反応後の細胞液あるいは濾過後の細胞液は１５ｍＬ容量の遠心チューブに移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行う。上清を除去後、得られた細胞ペレットを培養液たとえば血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地、あるいはＰＢＳ（−）１０ｍＬ程度に懸濁し、再度１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行う。
【００５７】
培養の開始にあたっては、プラスチック製シャーレあるいは細胞培養用フラスコを使用する。特に接着面にコーティングを行う必要はないが、より多くの細胞を得たい場合などには、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチンなどでコーティングしてから使用してもよい。あるいは、メーカーからコーティング済みのものを購入して使用することも可能である。
【００５８】
培養液に細胞を懸濁し、上記プラスチック製シャーレに播種する。一般的な細胞培養では、ダルベッコ変法イーグル培地、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンなど）、ピルビン酸ナトリウム、およびウシ胎児血清あるいはヒト血清（最大１５％）から組成され、フィルター滅菌した培養液Ａが使用されるが、本発明では、幹細胞の高度な濃縮のために、次の培養液Ｂを使用する。
【００５９】
培養液Ｂは、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-３４ＳＦＭに、培養液総量に対して１〜１０％好ましくは１〜５％の濃度となるウシ胎児血清、Ｌ-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンなど）を加え、フィルター滅菌したものである。このような濃度の血清を含む培養液Ｂを使用することで、幹細胞画分の割合を著しく向上させることが可能である。
【００６０】
なお、培養液の液量は、プラスチックシャーレの径によって変更し、例えば直径３５ｍｍであれば液量は２〜４ｍＬが望ましく、直径６０ｍｍであれば４〜８ｍＬが望ましい。直径１００ｍｍのものを使用する場合は約８〜１２ｍＬが適当量である。また、培養液に懸濁する細胞の数も使用するシャーレの径に応じて変更する。例えばウシ滑膜細胞の場合、１ｃｍ２あたり１５，０００〜５０，０００細胞が播種されるように調整することが望ましい。
【００６１】
培養液に懸濁し、シャーレに播種した細胞は３７℃、５％ＣＯ２、湿度飽和下のインキュベーター内で３〜６日間培養する。培養期間は６日を超えてはならない。培養期間の超過は、幹細胞画分の減少または消失を招く可能性が高い。培養に際しては、培養経過の観察による温度および培養液ｐＨの急激な変化などの不要なストレスを避ける観点から、分離、培養開始から２日間は培養器の扉の開閉を止め密閉することが望ましい。
【００６２】
培養期間終了後、酵素、キレート剤あるいはその混合液を用いて細胞を乖離する。たとえば、一般的な細胞培養に使用されるトリプシンとＥＤＴＡとの混合液を使用することができる。Ａｃｃｕｔａｓｅのような幹細胞用乖離酵素を使用してもよい。酵素反応は３７℃、５％ＣＯ２、湿度飽和下のインキュベーター内で、細胞の境界が明瞭になり、シャーレ底面から遊離するまで継続する。たとえばウシ滑膜細胞の場合、約５分間の処理時間で十分である。
【００６３】
次いで、血清を含む培養液を酵素液の等量添加し、ピペットにより混合する。この時加える培養液としては、培養液Ａのような１０％以上の濃度で血清を含んでいるものが望ましい。これを１５ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブに移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行う。上清を除去後、得られた細胞ペレットを培養液Ｃに懸濁し、ピペットにより混合した後、一部を取り分け、等量のトリパンブルー液と混和する。これを血球計算版に置き、正立顕微鏡下で生存細胞数を数える。
【００６４】
この培養液Ｃは、インキュベーター外での操作を目的とした培養液であり、大気との接触によるｐＨの変化を防ぐような物質が添加されていることが望ましい。また、過剰量の血清は分析機器の汚染や細胞の変質を招く可能性があるので、最終濃度が１〜５％程度のものが望ましい。培養液Ｃとしては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンなど）、ウシ胎児血清あるいはヒト血清、およびＨＥＰＥＳから組成されたものを、フィルター滅菌後に使用する。
【００６５】
トリパンブルー液は生細胞の細胞膜を透過できないが、死細胞の膜を透過し、細胞質を青色に染める。これにより、生細胞であれば透明ないし白色、死細胞であれば青色として顕微鏡下で区別することが可能である。細胞を数えた後、得られた数値をもとに全体の細胞数を算出する。次いで、培養液Ｂを用いて、細胞濃度が５ｘ１０５〜５ｘ１０６細胞／ｍＬとなるように調整する。
【００６６】
（４）ＦＡＣＳによる細胞の分離（工程（ｄ））
１５ｍＬ容量の遠心チューブに細胞懸濁液を１ｍＬずつ分注し、蛍光色素Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅを加える。Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅの濃度は１．５〜５μｇ程度が最適範囲であることが多いが、色素の生産ロット変更時および動物種を変更する際には、常に最適化する必要がある。
【００６７】
次いで、別のチューブに細胞液を等量取り分け、同様に、Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅおよびＶｅｒａｐａｍｉｌを加える。ＶｅｒａｐａｍｉｌはＢｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅを細胞外に排出するポンプタンパク質を阻害する化学物質であり、添加によりＳＰ画分が消失することが知られている。そのため、幹細胞領域となるＳＰ画分の範囲を正確に設定する上で必須である。
【００６８】
細胞の展開、分離はフローサイトメーターを用いて行う。使用する機器は、３５０ｎｍ波長のＵＶレーザーを照射できるものが最適であるが、４０７ｎｍ波長のＶｉｏｌｅｔレーザーを照射する機器も使用することが可能である。３５０ｎｍ波長のＵＶレーザーを使用する場合、検出は４５０／２０ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｂｌｕｅ）および６７０／４０ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｒｅｄ）の２種類のフィルターを通したドットプロットを用いて行う。また、４０７ｎｍ波長のＶｉｏｌｅｔレーザーを照射する場合、４５０／４０ｎｍおよび６９５／４０ｎｍのフィルターを使用する。
【００６９】
Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ添加区では認められるが、Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅおよびＶｅｒａｐａｍｉｌ添加区では消失している集団をＳＰ画分とし、ゲーティングを行い、ソーティングを行う。細胞は、例えば培養液Ｃを入れた１．５ｍＬ遠心チューブに受ける。
【００７０】
なお、ＦＡＣＳによる分離に代えて、または、ＦＡＣＳによる分離と組み合わせて、磁気ビーズ法によって細胞を分離してもよい。
【００７１】
（５）分離した細胞の培養（工程（ｅ））
得られた細胞は５００Ｇ（Ｇは重力加速度、１Ｇ＝９．８０６６５ｍ／ｓ２）、４℃で１０分間遠心を行う。細胞ペレットを幹細胞培養用培養液に懸濁し、プラスチックディッシュに播種する。この際使用する培養液としては、幹細胞の培養に適した組成のものが望ましく、例えば、培養液Ｄを用いる。培養液Ｄは、ダルベッコ変法イーグル培地、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンなど）、ピルビン酸ナトリウム、およびウシ胎児血清あるいはヒト血清から組成されたものをフィルター滅菌し、これにインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、塩基性繊維芽細胞成長因子（Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ｂＦＧＦ）、幹細胞成長因子（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦ）を添加した培養液である。
【００７２】
培養の際、以下に組成される培養液Ｅを使用すると、幹細胞の性質を維持したまま培養することが可能である。培養液Ｅは、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-３４ＳＦＭに、培養液総量に対し１〜５％の濃度となるようにウシ胎児血清、Ｌ-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンなど）を加え、フィルター滅菌した後、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、ｂＦＧＦおよびＳＣＦを添加したものである。また、１〜５μｇ／ｃｍ２濃度でヒトフィブロネクチンをコーティングしたペトリディッシュを用いると、幹細胞画分を選択的に、極めて高率よく増殖させることが可能である。
【００７３】
（６）得られた細胞の評価（工程（ｆ））
工程（ｄ）または工程（ｅ）において得られた幹細胞の性質を検定する方法としては、細胞が発現するＲＮＡを用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、幹細胞で特異的に発現している遺伝子を測定するＲＴ-ＰＣＲが有効であり、これを用いる。
【００７４】
逆転写反応は、例えばＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｄＮＴＰ混合液、ランダムプライマー、およびＤＥＰＣ処理水に幹細胞から抽出した全ＲＮＡを加え、サーマルサイクラーを使用して３７℃、１２０分、８５℃、５分といった条件で行えばよい。ＰＣＲの条件は、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合液、プライマー、オートクレーブ水の混合液中に目的とするＤＮＡを加え、サーマルサイクラーを使用して、９４℃、２分の変性反応に引き続き、９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、３０秒の増幅反応を３０回繰り返す、といった一般的なものでよい。
【００７５】
またこの時、ＰＣＲ産物が１００ｂｐ前後となるように設計したプライマーを用い、ＳＹＢＲ-Ｇｒｅｅｎあるいは蛍光色素を付加したプローブをＰＣＲ系に混合することで、転写産物を定量的に観察する（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）ことができる。
用いるプライマーには、次の３種が含まれる。
【００７６】
プライマー１
遺伝子(ＮＣＢＩ ＩＤ)：Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ ｃ-Ｋｉｔ(２８０８３２)
順方向：ＣＡＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＡＡＴＧＣ；エキソン１９上
逆方向：ＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴ；エキソン２０上
増幅反応産物：７４ｂｐ
【００７７】
プライマー２
遺伝子(ＮＣＢＩ ＩＤ)：Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ Ａｂｃｇ２（Ｂｃｒｐ１）(５３６２０３)
順方向：ＣＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡ；エキソン１４上
逆方向：ＡＧＴＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＴＧＴＣ；エキソン１５上
増幅反応産物：９８ｂｐ
【００７８】
プライマー３
遺伝子(ＮＣＢＩ ＩＤ)：Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ ＣＤ３４(２８１０５１)
順方向：ＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＣＣＧＣ；エキソン７上
逆方向：ＴＣＣＡＣＧＴＡＡＴＡＡＧＧＧＴＣＴＴＣＧＣ；エキソン８上
増幅反応産物：７４ｂｐ
【００７９】
次に、樹立された幹細胞の評価基準について説明する。
細胞形状
Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅを排出できない画分をＭＰ（Ｍａｊｏｒ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）として採取しておき、これを幹細胞と比較することで形態的、生理学的な特徴の違いを明らかにすることができる。具体的には、ＭＰには大きな細胞質を持ち、同心状に広がるものが多いのに対し、幹細胞は紡錘状で、島状のコロニーを形成しながら増殖する場合が多い。図１に、分離後のＭＰおよびＳＰの細胞形状を示す。
【００８０】
細胞表面マーカー
ＣＤ３４抗原；骨髄造血幹細胞のマーカーとして知られている。本発明で分離した幹細胞の一部はこれを強く発現している。
ｃ-Ｋｉｔ；生殖幹細胞や骨髄造血幹細胞で発現するレセプタータンパク質。ＣＤ１１７抗原と分類される。前記ＳＣＦの受容体であり、本発明で分離、培養した幹細胞で強く発現する。
【００８１】
細胞内／核内マーカー
Ｂｃｒｐ-１；Ａｂｃｇ２ともいう。本発明で使用するＢｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅなどの細胞膜透過性色素を、細胞外へ排出するタンパク質。骨髄間葉系幹細胞で発現する。分化した体細胞では発現あるいは機能を認めないことから、この特性を利用して幹細胞を抽出することができる。
【００８２】
ＴＥＲＴ；テロメラーゼ。幹細胞や一部の腫瘍細胞、生殖細胞、株化細胞などで発現し、活性の低下が細胞老化と関連するとされる酵素。
【００８３】
本発明の滑膜由来幹細胞、および滑膜幹細胞の濃縮培養法は、具体的には下記の性質を有する。
（ｉ）Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅの染色に対し色素の排出能力を有し、ＳＰとして分離される。また、対照区として取得したＭＰとは明らかに細胞形態を異にする。本発明には、特にウシ以外の滑膜組織に由来する幹細胞の樹立法も含まれる。
（ｉｉ）分離、培養した滑膜幹細胞に関して、骨髄間葉系幹細胞に類似する性質を有する。具体的には、ＣＤ３４を発現する細胞を派生し、ｃ-Ｋｉｔ、ＴＥＲＴを発現する。
（ｉｉｉ）幹細胞濃縮培養液Ｂで有意に濃縮される。本発明には同濃縮培養法も含まれる。
（ｉｖ）分離、培養した滑膜幹細胞は自発的な分化により、ＳＰ、ＭＰを含む多様な細胞集団に分化する。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例によってなんら限定されるものではない。なお、以下の実施例において、液体または固体についての「％」は、特に記載しない場合は重量％を示すものとする。また、ＣＯ２、Ｏ２などの気体についての「％」は体積％を示すものとする。
【００８５】
［実施例］ウシ関節滑膜幹細胞の分離と培養
（１）滑膜組織の採取（工程（ａ））
ウシ脚部は、阪南畜産株式会社で屠殺、処理され、無償で提供されたものを使用した。外皮に付着した土などの汚れを流水で洗浄し、約１００ｍＬのイソジン（登録商標）液（明治製菓株式会社）で消毒を行った。続いて、＃１０のディスポーザブルメス（ＦＥＡＴＨＥＲ（登録商標）Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ｓｃａｌｐｅｌ＃１０）と滅菌済みのピンセット、ハサミを用いて表皮を剥離し、関節部を露出した。これに再度約１００ｍＬのイソジン（登録商標）液をスプレーし、クリーンベンチ内に導入した。
【００８６】
次いで新しい＃１０のディスポーザブルメスを用いて関節包を開放し、包の内側に存在する滑膜組織を採取した。採取した滑膜組織は抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンカクテル；Ｌｏｎｚａ，Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ-Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ-Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ １００Ｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ，１７-７４５Ｈ）５００μＬを添加したＰＢＳ（−）（ＧＩＢＣＯ，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ，２１６００-０１０）５０ｍＬに浸し洗浄した。
【００８７】
（２）単離組織の処理（工程（ａ））
次に、＃１０のメスを２本摺り合わせるように使用し、組織が完全にペースト状になるまで細切した。２５ｍＬ容量ディスポーザブルピペット（ＦＡＬＣＯＮ，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｉｐｅｔ ３５７５２５）に１５ｍＬのＰＢＳ（−）を吸引し、そのまま滑膜組織のペーストを吸引した。これを５０ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブ（アシスト，６２.５４８.００４Ｓ）に移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心した後、上清を吸引除去した。次いで、形成されたペレットを０．２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ，Ｔｒｙｐｓｉｎ １：２５０，２７２５０-０１８）-１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ，Ｅｔｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，Ｅ６７５８-１００Ｇ）液２０ｍＬに懸濁し、１００ｍｍペトリディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ，細胞培養ディッシュ，３５３００３）に移した後、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２の条件で３０分間反応させた。
【００８８】
３０分後、１０％ＦＣＳ-ＤＭＥＭ［ダルベッコ変法イーグル培地（日水製薬株式会社，ダルベッコ変法イーグル培地２，０５９１９）４．７５ｇを５００ｍＬの蒸留水に溶解し、オートクレーブ処理した後、０．２９２ｇ Ｌ-グルタミン（ＧＩＢＣＯ，２１０５１-０２４）、１０％炭酸水素ナトリウム（和光純薬，ＮａＨＣＯ３，１９１-０１３０５）水溶液６ｍＬ，および５０ｍＬウシ胎児血清（Ｐｅｒｂｉｏ，Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標），ＳＨ３０３９６.０３）を添加し撹拌した後、ポアサイズ０．２２μｍのボトルトップフィルター（Ｉｗａｋｉ，ボトルトップフィルター５００ｍＬ，８０２２-０３３）にて滅菌を行ったもの］を加え、トリプシン反応を停止させた。これを再度５０ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブに移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心した。
【００８９】
上記の工程の間、０．１２５ｇのコラゲナーゼ粉末（ＳＩＧＭＡ，Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｒｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ ｔｙｐｅ Ｉ，Ｃ０１３０-１Ｇ）を量りとり、血清を含む培養液１０ｍＬに溶解した。これをポアサイズ０．２μｍの滅菌用フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｍｉｎｉｓａｒｔ（登録商標），１６５３４）で濾過滅菌し、遠心後に上清を除去した滑膜組織ペーストに加えた。２５ｍＬ容量ディスポーザブルピペットを用いて１００ｍＬ容量アシストチューブ（アシスト，７５.５６２.３００Ｓ）にスターラーバーと共に移し、３７℃、５％ＣＯ２、湿度飽和下のインキュベーター内で撹拌しながら１２時間反応させた。
【００９０】
反応後、細胞液をポアサイズ１００ｕｍのフィルター（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ，３５２３６０）を設置した５０ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブ内に濾過し、次いで１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行った。上清を除去後、得られた細胞ペレットを培養液１０ｍＬに懸濁し、１５ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）１５ｍＬ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ，４３０７６６）に移した後再度１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行った。
【００９１】
（３）細胞の一次培養（濃縮培養）（工程（ｂ）、（ｃ））
ディスポーザブルピペットにより培養液と混合した後、細胞液の一部を取り分け、等量のトリパンブルー液と混和した。これを血球計算版に置き、正立顕微鏡下で生存細胞数を数えた。生存細胞が１ｃｍ２あたり５０，０００個となるように、幹細胞濃縮培養液（培養液Ｂ）［ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-３４ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ，１０６３９-０１１）４８０ｍＬに、ウシ胎児血清５ｍＬ、０．２９２ｇ Ｌ-グルタミン（ＧＩＢＣＯ， ２１０５１-０２４）、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ，Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，１１３６０-０７０）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンカクテル）を加え、ポアサイズ０．２２μｍのボトルトップフィルターで滅菌したもの］で調整し、予め０．１％ゼラチン（ＭＰ ｂｉｏ ｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｇｅｌａｔｉｎ ｔｙｐｅＡ，９０１７７１）で処理した１００ｍｍ径プラスチックディッシュに播種した。なお、培養液の量は１０ｍＬ／枚とした。
【００９２】
培養期間終了後、２ｍＬ／枚の０．２５％トリプシン-１ｍＭ ＥＤＴＡを加え、３７℃、５％ＣＯ２、湿度飽和下のインキュベーター内で５分間培養した。次いで１０％ＦＣＳ-ＤＭＥＭを２ｍＬ添加し、ディスポーザブルピペットにより混合した。これを１５ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブに移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行った。上清を除去後、得られた細胞ペレットをＦＡＣＳバッファ［ダルベッコ変法イーグル培地(日水製薬株式会社，ダルベッコ変法イーグル培地１，０５９１５）５ｇ、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンカクテル）５ｍＬ、ウシ胎児血清１０ｍＬ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ＳＩＧＭＡ，Ｈ４０３４-２５Ｇ）１ｍＬに、総量５００ｍＬとなるよう蒸留水を加え、ポアサイズ０．２２μｍのボトルトップフィルターで滅菌を行ったもの］に懸濁した後、１０μＬを取り分け、等量のトリパンブルー液と混和し、生存細胞数を数えた。次いで、ＦＡＣＳバッファを用いて細胞濃度が１ｘ１０６細胞／ｍＬとなるように調整した。
【００９３】
（４）ＦＡＣＳによる細胞の分離（工程（ｄ））
１５ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブに細胞懸濁液を１ｍＬずつ分注し、蛍光色素Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ，２'-（４-Ｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）-５-（４-ｍｅｔｈｙｌ-１-ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）-２，５'-ｂｉ-１Ｈ-ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｂ２２６１-２５ＭＧ）を１．８〜２．０μｇ加えた。次いで別のチューブに細胞液を等量取り分け、同様に１．８〜２．０μｇのＢｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅおよびＶｅｒａｐａｍｉｌ（ＳＩＧＭＡ，Ｒ（＋）-Ｖｅｒａｐａｍｉｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｖ４６２９-１Ｇ）を加えた。ディスポーザブル遠心チューブの蓋部をシールした後、３７℃に設定したウォーターバスに沈め、９０分間培養した。なお、染色にムラが出来ないように、３０分毎に撹拌した。
【００９４】
染色終了後、氷冷したＦＡＣＳバッファ１０ｍＬを遠心チューブに加え、４℃で１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行った。上清を吸引除去した後、再度１ｍＬのＦＡＣＳバッファに懸濁し、氷上にて保存した。
【００９５】
細胞の展開、分離は３５０ｎｍ波長のＵＶレーザーを照射できるＦＡＣＳ ＶａｎｔａｇｅＳＥを使用した。検出は４５０／２０ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｂｌｕｅ）、６７０／４０ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｒｅｄ）２種類のフィルターを通したドットプロットを用いて行い、Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ添加区では認められるが、Ｂｉｓ-ｂｅｎｚｉｍｉｄｅおよびＶｅｒａｐａｍｉｌ添加区では消失している集団をＳＰ画分とし、ソーティングを行った。細胞は、ＦＡＣＳバッファを入れた１．５ｍＬ遠心チューブ（アシスト，滅菌サンプリングチューブ，７２.６９０５）に採取した。
【００９６】
採取した細胞は一部を液体窒素で凍結し、解析用サンプルとして−８０℃ディープフリーザーに保管した。一部は細胞培養に供試した。
【００９７】
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色を用いて展開した生細胞画分Ｐ０全体のドットプロットを図２に示す。図中、Ｐ１で示した画分がＳＰ画分であり、Ｐ２で示した画分はＭＰ画分の一部である。ＦＡＣＳにおいては、定法に従い、予め全イベントを前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）で展開し、細胞の大きさを前方散乱から、内部構造を側方散乱から判断して、生細胞画分Ｐ０を抽出した。ＳＰ画分および生細胞画分Ｐ０全体の前方散乱および側方散乱で展開したドットプロットを、図３（ａ）および図３（ｂ）にそれぞれ示す。なお、図２および図３は、培養液Ｂ中の血清濃度が１％のときのものである。
【００９８】
ＳＰ画分に含まれる細胞の全イベントに対する割合は、図４および以下に示すとおりであった。
培養液Ｂ中の血清濃度  ＳＰ画分割合平均値  標本数
１％                  ８．９％        ６
５％                  ６．３％        ５
１０％                  ４．１％        ４
１５％                  ２．８％        ４
【００９９】
異なる血清濃度間でＳＰ画分の細胞の割合に有意差があるか否かを調べるために、等分散を仮定したｔ検定（両側）を行ったところ、濃度１％と濃度１５％の比較ではｔ＝４．４１７１９５（Ｐ（危険率）＝０．００２２３）、濃度１％と濃度１０％の比較ではｔ＝３．４３９０８（Ｐ＝０．００８８３６）、濃度５％と濃度１５％の比較ではｔ＝２．７４５７４（Ｐ＝０．０２８７）であった。このように、血清濃度が１〜５％であるときと１５％であるときとでは、ＳＰ画分の細胞の割合に有意な差がある。
【０１００】
工程（ａ）の処理後の単離組織、つまり培養を行っていない単離組織について、上記と同様の方法でＳＰ画分の細胞の割合を求めたところ、２．３８％であった。すなわち、ＳＰ画分の細胞は、培養液Ｂ中の血清濃度を５％にすることによって約２．６倍に、血清濃度を１％にすることによって約３．７倍に濃縮された。
【０１０１】
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色を用いて展開したドットプロットにおける、Ｖｅｒａｐａｍｉｌの添加によって消失しない領域と、Ｖｅｒａｐａｍｉｌの添加によって消失する領域とを図５に示す。図５において、（ａ）および（ｃ）は、Ｖｅｒａｐａｍｉｌ添加前、（ｂ）および（ｄ）はＶｅｒａｐａｍｉｌ添加後のプロットである。（ａ）における領域ＲＢは、（ｂ）に示すようにＶｅｒａｐａｍｉｌ添加後も消失せず、幹細胞ではないと考えられる。一方、（ｃ）における領域ＲＡは（ｄ）に示すようにＶｅｒａｐａｍｉｌの添加によって消失しており、幹細胞の可能性が高い。本発明ではこの領域ＲＡをＳＰ画分としている。
【０１０２】
領域ＲＡおよび領域ＲＢは、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色でのドットプロットにおいては、重なりがちである。しかし、領域ＲＡおよび領域ＲＢに属する細胞は、前方散乱および側方散乱でのドットプロットにおいては分離する。図６に、前方散乱および側方散乱で展開したドットプロットにおける領域ＲＡおよび領域ＲＢを示す。
【０１０３】
（５）分離細胞の培養（工程（ｅ））
上記の方法で分離した幹細胞画分１０，０００個を、幹細胞培養液（培養液Ｅ）［ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-３４ＳＦＭ ４８０ｍＬに、ウシ胎児血清５ｍＬ、０．２９２ｇ Ｌ-グルタミン、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンカクテル）を加え、ポアサイズ０．２２μｍのボトルトップフィルターにて滅菌した後、１０μｇ／ｍＬインスリン、５．５μｇ／ｍＬトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸カクテル（ＧＩＢＣＯ，Ｉｎｓｕｌｉｎ-Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ-Ｓｅｒｅｎｉｕｍ-Ｇ，４１４００-０４５）、１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、および２５ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＳＣＦ，３００-０７）を添加したもの］１ｍＬに懸濁し、１．５μｇ／ｃｍ２濃度でヒトフィブロネクチン（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ，Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，３５４００８）をコーティングした２４ｗｅｌｌ ｄｉｓｈ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）２４ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ ｗｉｔｈ Ｌｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ，Ｎｏｎ-ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ）に播種した。これをＣＯ２インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養を行った。
【０１０４】
約４日間で２４ｗｅｌｌ ｄｉｓｈ一杯まで細胞が増殖するため、ＰＢＳ（−）で洗浄し、０．２５％トリプシン-１ｍＭ ＥＤＴＡで乖離した後、１０％ＦＣＳ-ＤＭＥＭ ２ｍＬを混合して１５ｍＬ容量のディスポーザブル遠心チューブに移し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心を行った。上清除去後、細胞ペレットを上記幹細胞培養液４ｍＬに懸濁し、１．５μｇ／ｃｍ２濃度でヒトフィブロネクチンをコーティングした３５ｍｍ径細胞培養用プラスチックディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ，イージーグリップ細胞培養ディッシュ，３５３００１）に継代した。幹細胞は約４日かけて３５ｍｍ径細胞培養用プラスチックディッシュ一杯にまで増殖するため、同様の方法でヒトフィブロネクチンをコーティングした１００ｍｍ径細胞培養用プラスチックディッシュに継代した。
【０１０５】
培養液への血清およびｂＦＧＦの添加による細胞への影響を図７に示す。図７において、（ａ）は、血清を添加せずｂＦＧＦを添加したときの、（ｂ）は血清を添加しｂＦＧＦを添加しなかったときの、（ｃ）は、血清を添加しｂＦＧＦも添加したときの、得られた細胞の形状を示す。（ａ）に示すように、培養液に血清を添加しない場合はＳＰ細胞は速やかに分化細胞となり、（ｂ）に示すように、血清を添加した場合は幹細胞と分化細胞が混在する状態となり、（ｃ）に示すように、血清およびｂＦＧＦの双方を添加した場合は幹細胞が大部分を占めている。このように、分離細胞の培養液に血清およびｂＦＧＦを添加することが有効である。
【０１０６】
接着面へのフィブロネクチンのコーティングによる細胞の増殖速度への影響を図８に示す。図８において、横軸は細胞培養の回数を表し、縦軸は分離後、培養開始時を基準とした細胞数の相対値（対数）を表す。図８より明らかなように、フィブロネクチンのコーティングによって、細胞の増殖速度は著しく向上する。
【０１０７】
分離後の細胞をさらに培養して得られた細胞集団を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色で展開したドットプロットを図９に示す。図９において、（ａ）は分離後の幹細胞を培養した結果を示しており、得られた細胞集団には、幹細胞である領域ＲＣと、幹細胞から派生した分化細胞である領域ＲＤが少数含まれている。（ｂ）は分離したＭＰ細胞をさらに培養した結果を示しており、領域ＲＣに属する細胞は殆ど含まれておらず、領域ＲＤに属する分化細胞が多い。（ｃ）は分離したＳＰ細胞をさらに培養したものである（ａ）にＶｅｒａｐａｍｉｌを添加した結果を示しており、領域ＲＣに属する細胞が（ａ）に比べて著しく減少している。図９に示した結果は、本発明の培養方法および分離方法が、幹細胞の選択的分離に適していることを表している。
【０１０８】
（６）分離細胞の評価（工程（ｆ））
細胞の性状検査は定量ＲＴ-ＰＣＲを用いて行った。ＲＴ-ＰＣＲは細胞内で発現している遺伝子を検出する方法であり、定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）は発現している遺伝子を定量的に測定する方法である。これにより、目的とする遺伝子が微量でも確実に発現していること、またサンプル間での発現量の比較を行うことが可能となっている。
【０１０９】
ＦＡＣＳにより分離した細胞は、液体窒素で瞬間的に凍結し、検査に使用するまで−８０℃の超低温庫に保管した。検査に際して、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１５５９６-０２６）を１ｍＬ加え、氷上に５分間静置した。次いでクロロフォルム（和光純薬工業、０３８-０２６０６）を２００μＬ加え、激しく混和した後、室温に５分間静置した。その後１５，０００ｒｐｍ、４℃の条件にて１０分間遠心を行い、ＴＲＩｚｏｌ層の上部に形成される水層を１．５ｍＬチューブに回収した。
【０１１０】
次いで２-ｐｒｏｐａｎｏｌを５００μＬ加え、再度激しく混和した後、室温に１０分間静置した。これを１５，０００ｒｐｍ、４℃の条件にて１０分間遠心し、底部に形成されたＲＮＡペレットを７５％エタノール（ＤＥＰＣ ｔｒｅａｔｅｄ ｗａｔｅｒ，和光純薬工業，３１４-９０２０５；２５ｍＬに、Ｅｔｈａｎｏｌ，和光純薬工業，０５７-００４５６；７５ｍＬを加える）にて洗浄した。さらに、１５，０００ｒｐｍ、４℃の条件にて５分間遠心し、上清を除去した後、ＲＮＡペレットを自然乾燥させ、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ，ＤＮａｓｅ，ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ，和光純薬工業，１０９７７-０１５）５μＬに溶解した。
【０１１１】
逆転写反応はＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，４３６８８１４）を用いて行った。添付説明書に従い逆転写を行った後、反応済み液１０μＬに４０μＬのＴＥを加え、そのうち１μＬをＲｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ解析に使用した。本実施例では、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ）に公開されているウシＣＤ３４、ｃ-Ｋｉｔ、ＴＥＲＴ、Ａｃｔｉｎ遺伝子の配列を元に、それぞれに特異的なプライマー配列（前述のプライマー１〜プライマー３を含む）を作成し、Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。
【０１１２】
ＰＣＲ反応液はＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡバイオ，ＲＲ０４１Ａ）を元に添付説明書に従って作成し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ８-ｔｕｂｅ ｓｔｒｉｐ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，４３１６５６７）に分注した。ＰＣＲ反応はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、９５℃、１０秒の変性反応の後、９５℃、５秒、６０℃、３０秒の増幅反応を４０回繰り返し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）にて結果を解析した。
【０１１３】
異なる個体１〜３から採取した３サンプルについて解析を行ったところ、個体１のＳＰ画分は、ＭＰ画分（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ２；Ｐ２画分）に対し、ＣＤ３４遺伝子の発現量が３６．９倍、ｃ-Ｋｉｔ遺伝子が４．７６倍、Ｂｃｒｐ１遺伝子が１８．９倍、ＴＥＲＴ遺伝子が２６．２倍であった。個体２のＳＰ画分は、ＭＰ画分（Ｐ２画分）に対し、ＣＤ３４遺伝子の発現量が１６７．８倍、ｃ-Ｋｉｔ遺伝子が５３．６倍、Ｂｃｒｐ１遺伝子が４２．８倍、ＴＥＲＴ遺伝子が１４．３倍であった。また、個体３のＳＰ画分は、ＭＰ画分（Ｐ２画分）に対し、ＣＤ３４遺伝子の発現量が２６１．５倍、ｃ-Ｋｉｔ遺伝子が１２８．２倍、Ｂｃｒｐ１遺伝子が９３．４倍、ＴＥＲＴ遺伝子が２４．６倍であった。このように、ＳＰ画分の細胞は幹細胞である。
【０１１４】
［比較例］
濃縮培養に用いる培養液Ｂの有用性を検証するため、細胞培養で一般に使用されている培養液Ａ（ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地）を用いて、比較試験を行った。培養液Ｂに代えて培養液Ａを使用したこと以外、処理は上記実施例と同様ある。培養液Ａ中の血清の濃度は、実施例に合わせて、１％、５％、１０％および１５％とした。
【０１１５】
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色を用いて展開した生細胞画分Ｐ０全体のドットプロットを図１０に示す。図中、Ｐ１で示した画分がＳＰ画分である。ＳＰ画分および生細胞画分Ｐ０全体の前方散乱および側方散乱で展開したドットプロットを、図１１（ａ）および図１１（ｂ）にそれぞれ示す。なお、図１０および図１１は、培養液Ａ中の血清濃度が１０％のときのものである。
【０１１６】
比較例におけるＳＰ画分に含まれる細胞の全イベントに対する割合は、以下に示すとおりであった。
培養液Ａ中の血清濃度  ＳＰ画分割合平均値  標本数
１％                  １．８％        ３
５％                  １．８８％      ４
１０％                  １．５％        ３
１５％                  ０．６３％      ３
【０１１７】
このように、ＳＰ画分に含まれる細胞は２％未満にとどまっている。一方、前述のように、本発明の方法においては、ＳＰ画分に含まれる細胞は平均８．８８％（最大１１．１％）である。生体内に存在するＳＰ細胞の割合が、骨髄で約０．０４〜０．０７％、我々の知見による滑膜組織が２．３８％であることを考慮すると、本発明の培養方法は、ＳＰ細胞の濃縮に非常に有効な方法であるといえる。
【０１１８】
以上説明したように、本発明の滑膜幹細胞は、分化細胞とすることによって、軟骨再生などに対する新規再生医療材料として非常に有用である。さらに滑膜炎などの疾患のモデルとしても非常に重要なツールである。幹細胞は体外で安定して増殖させることが可能であることから、クローン技術におけるドナー細胞としても注目されており、本発明における幹細胞を利用することによってクローンウシを提供することも可能であり、食料としての質に優れた牛を選択的に提供することもできる。また、本発明における幹細胞画分を濃縮する方法、および培養する方法は、従来非常に微小であると考えられてきた体性幹細胞画分を選択的に増幅するという優れた効果を奏する。また、本発明の方法は滑膜幹細胞以外の組織幹細胞にも応用できる可能性のある極めて有効な方法であり、滑膜幹細胞以外、たとえば脂肪組織、筋組織の幹細胞から本発明の方法によって得られる間葉系幹細胞も、本発明に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】分離後のＭＰおよびＳＰの細胞形状を示す写真であり、（ｂ）および（ｄ）はそれぞれ（ａ）および（ｃ）を拡大したものである。
【図２】本発明の実施例におけるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色を用いて展開した生細胞画分Ｐ０全体のＦＡＣＳドットプロットである。
【図３】本発明の実施例における前方散乱および側方散乱で展開したＦＡＣＳドットプロットであり、(ａ）は生細胞画分Ｐ０中のＳＰ画分のプロット、（ｂ）は生細胞画分Ｐ０全体のプロットである。
【図４】本発明の実施例におけるＳＰ画分に含まれる細胞の全イベントに対する割合を示す図である。
【図５】滑膜組織中の細胞を、培養工程に供する前に、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色を用いて展開したＦＡＣＳドットプロットにおける、Ｖｅｒａｐａｍｉｌの添加によって消失しない画分（（ａ）は添加前、（ｂ）は添加後）と、Ｖｅｒａｐａｍｉｌの添加によって消失する画分（（ｃ）は添加前、（ｄ）は添加後）と示す図である。培養前、すなわち生体滑膜組織には幹細胞を含む集団と含まない集団の２つの集団が存在することが分かる。
【図６】滑膜組織中の細胞を、培養工程に供する前に、前方散乱および側方散乱で展開したＦＡＣＳドットプロットにおける、（ａ）Ｖｅｒａｐａｍｉｌの添加によって消失しない画分（ＲＢ）と、（ｂ）Ｖｅｒａｐａｍｉｌの添加によって消失する画分（ＲＡ）と示す図である。
【図７】培養液への血清およびｂＦＧＦの添加による細胞への影響を示す写真であり、（ａ）はｂＦＧＦのみを、（ｂ）は血清のみを、（ｃ）は血清およびｂＦＧＦの双方を添加したときの、得られた細胞の形状を示す。
【図８】培養皿細胞接着面へのフィブロネクチンのコーティングによる細胞の増殖速度への影響を示す図である。
【図９】幹細胞あるいは対象区としての分化細胞をそれぞれ分離、純化培養を行い、約２週間後に得られた細胞集団全体を再度Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色で展開したＦＡＣＳドットプロットであり、（ａ）はＳＰ細胞の培養により幹細胞（ＲＣで示される）が増殖していることを示す図である。また、（ｂ）は対象区として同時に分離したＭＰ細胞を培養して得られる細胞集団（ＲＤで示される）である。（ｃ）は（ａ）の細胞集団にＶｅｒａｐａｍｉｌを加えてＲＣで示される集団が消失すること、すなわち幹細胞である可能性が高いことを確認している。
【図１０】比較例におけるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色を用いて展開した生細胞画分Ｐ０全体のＦＡＣＳドットプロットである。
【図１１】比較例における前方散乱および側方散乱で展開したＦＡＣＳドットプロットであり、(ａ）は生細胞画分Ｐ０中のＳＰ画分のプロット、（ｂ）は生細胞画分Ｐ０全体のプロットである。
【符号の説明】
【０１２０】
Ｐ０  全解析産物中の生細胞画分
Ｐ１  ＳＰ（Ｓｉｄｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）画分
Ｐ２  ＭＰ（Ｍａｊｏｒ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）画分
ＲＡ  Ｖｅｒａｐａｍｉｌ添加消失領域
ＲＢ  Ｖｅｒａｐａｍｉｌ添加不消失領域
ＲＣ  幹細胞領域
ＲＤ  分化細胞領域
【図８】
2009055866.tif 000003
【図９】
2009055866.tif 000004
【図１０】
2009055866.tif 000005
【図１１】
2009055866.tif 000006
【図１】
2009055866.tif 000007
【図２】
2009055866.tif 000008
【図３】
2009055866.tif 000009
【図４】
2009055866.tif 000010
【図５】
2009055866.tif 000011
【図６】
2009055866.tif 000012
【図７】
2009055866.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月12日(2008.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009055866000001.app