(57)【要約】【課題】前記従来の課題を解決するもので、マイクロ流路内を電気泳動する生体物質のＳＮＰｓバンドやＤＮＡラダーバンドを高分解能で検出出来、且つマイクロ流路の位置ズレに影響されることなく励起光を照射出来る蛍光検出装置を提供する。【解決手段】生体物質を測定するための生体物質検出用基板を用いる装置において、平行光を出射する光源ユニットと、前記平行光を前記生体物質検出用基板上の検出用流路に照射する照射光学部と、前記照射光学部を経由した投射光が前記検出用流路の幅よりも広くなるように前記平行光中に配置したビーム整形手段と、を備えた蛍光検出装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質を測定するための生体物質検出用基板を用いる装置において、
平行光を出射する光源ユニットと、
前記平行光を前記生体物質検出用基板上の検出用流路に照射する照射光学部と、
前記照射光学部を経由した投射光が前記検出用流路の幅よりも広くなるように前記平行光中に配置したビーム整形手段と、
を備えた蛍光検出装置。
【請求項２】
前記生体物質は、蛍光標識を修飾したＤＮＡサンプルである請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記光源ユニットは、半導体レーザー光源とコリメートレンズとから成り、
前記コリメートレンズは、前記半導体レーザー光源からのレーザー光を平行光にするように配置されている請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記検出用流路は、
緩衝液を充填した後に前記生体物質を電気泳動させるように形成されている請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記照射光学部は、
前記平行光を集光点に収束する投光レンズと収束光を平行光にして前記検出用流路に照射する対物レンズとから成り、
前記対物レンズは、その前側焦点と前記投光レンズの集光点とが一致する位置に配置されている請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記ビーム整形手段は、
前記検出用流路に照射される照射光の大きさが、前記検出用流路の流路方向に対して直角方向では前記検出用流路の幅より大きく、且つ前記流路方向では前記直角方向の照射光の大きさより小さくなるように前記平行光を整形する請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
前記流路方向での前記照射光の大きさは、
前記検出用流路を流れる前記生体物質のＤＮＡバンドの半値幅よりも小である請求項６に記載の蛍光検出装置。
【請求項８】
前記流路方向に直角方向での前記照射光の大きさは、
前記蛍光検出装置と前記生体物質検出用基板との装着時の位置ずれ量と前記検出用流路の流路幅との和よりも大である請求項６に記載の蛍光検出装置。
【請求項９】
前記ビーム整形手段は、矩形型のスリットである請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項１０】
前記ビーム整形手段は、楕円型のスリットである請求項１に記載の蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡやタンパクその他の生体物質を緩衝剤中で移動させて得られる輸送反応を検出して生体物質を検出する蛍光検出装置に関する。
【０００２】
より詳細には、測定対象の位置ずれに影響されることなく、励起光を検体へむらなく照射することができ、且つ、生体物質の輸送反応を高分解能に解析する技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、生体物質を分析する研究が盛んに行われ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの解明における発展が著しい。その一方で、ＤＮＡ等のアッセイ分析を迅速に、かつ、正確に行える装置の開発が求められている。
【０００４】
この種の装置は、特定の生体物質の有無や、変異型の生体物質の発現を調べる目的に使用される。測定対象の生体物質をガラスやプラスチックなどの基板上に固定した、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ（以下、生体物質検出用基板と呼ぶ）を用いて、生体物質の検出を行う。この種の装置では、生体物質に蛍光標識を修飾することにより、蛍光検出測定が行われる。しかし、ここで検出する蛍光量は、非常に微弱なので、感度の高い蛍光検出装置が求められている。
【０００５】
蛍光検出装置としては、冷却ＣＣＤ検出、共焦点光学系などが挙げられる。
【０００６】
冷却ＣＣＤを用いた方式では、露光時間を長くすることにより、弱い蛍光を検出可能であるが、バックグラウンドノイズが高くなり、共焦点光学系の方が微弱検出に向いている。
【０００７】
共焦点光学系を用いた方式では、レーザー励起の共焦点光学系の検出方式が一般的である。共焦点光学系は、蛍光標識された生体物質から発せられる蛍光を、共役な位置に集光する光学系であり、集光点に設置したフォトダイオードや光電子増倍管などにより検出を行う。
【０００８】
図５を用いて、従来の蛍光検出装置を説明する。この方式の蛍光検出装置は、光源５０に半導体レーザーを用い、光源５０の光はレンズ５１を通過した後、ダイクロイックミラー５２で反射され、対物レンズ５３により集光され、生体物質検出用基板５６へ照射される。励起光を照射された生体物質検出用基板５６上の検体から発せられる蛍光は、対物レンズ５３、ダイクロイックミラー５２を通り、結像レンズ５４により結像され、検出器５５で検出される。さらに、オートフォーカス用ダイクロイックミラー５７で反射された光をオートフォーカス用受光器５８により受光し、オートフォーカス回路５９でフォーカス制御用の信号処理を行い、アクチュエータ６０により対物レンズ５３を駆動することによりフォーカスを合わせる（例えば、特許文献１参照。）。
【０００９】
このように、従来の蛍光検出装置においては、光源と、生体物質検出用基板へ照射するための対物レンズと、検体から発せられる蛍光を集光するための結像レンズと、検出するための検出器と、オートフォーカス機構とを一つの筐体に配置し、生体物質読み取り装置全体を小型化することができた。生体物質検出用基板上の検体へ励起光を集光させて照射するため、高感度に検出可能であった。
【特許文献１】特開２００１−２４２０８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、前記従来の構成では、静止した生体物質の測定には適しているが、マイクロ流路内を電気泳動する生体物質を測定する場合には問題が生じる。すなわち、この場合には、ＳＮＰｓバンドやＤＮＡラダーバンドを検出しなければならないが、高分解能で測定するには、励起光サイズをこれらのバンドサイズよりも小さくする必要がある。しかし、マイクロ流路が設けられている生体物質検出用基板と光学検出ユニットとの間には装着時の位置ズレがあるので、励起光サイズを小さくすると、マイクロ流路内を電気泳動する生体物質に励起光が当たらず目的の生体物質を検出できないという課題を有していた。
【００１１】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、マイクロ流路内を電気泳動する生体物質のＳＮＰｓバンドやＤＮＡラダーバンドを高分解能で検出出来、且つマイクロ流路の位置ズレに影響されることなく励起光を照射出来る蛍光検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記従来の課題を解決するために、本発明の蛍光検出装置は、生体物質を測定するための生体物質検出用基板を用いる装置において、平行光を出射する光源ユニットと、前記平行光を前記生体物質検出用基板上の検出用流路に照射する照射光学部と、前記照射光学部を経由した投射光が前記検出用流路の幅よりも広くなるように前記平行光中に配置したビーム整形手段と、を備えたことを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の蛍光検出装置によれば、マイクロ流路内を電気泳動する生体物質を測定する場合、生体物質のＳＮＰｓバンドやＤＮＡラダーバンドを高分解能に検出することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明の蛍光検出装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１５】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１における蛍光検出装置を示す図である。この蛍光検出装置は、緩衝液中を電気泳動する生体物質からの蛍光を測定するための装置である。光源ユニット１９は、波長６３５ｎｍの半導体レーザー２と、コリメートレンズ３により構成され、半導体レーザー２の光を平行光にして出射する。光源ユニット１９からの平行光は、励起用スリット４、照射光学部１８を通り、生体物質検出基板１４上の検出用流路１５へ投射される。励起用スリット４の形状は、矩形型の孔であり、検出用流路１５へ照射される投射光のビーム形状を制限する。投射光のビームが、検出用流路１５に沿う方向に短く、検出用流路１５を横切る方向に長い形状で照射されるように、励起用スリット４を配置する。照射光学部１８は、主に、励起用フィルタ５、投光レンズ６、対物レンズ８から構成される。
【００１６】
以上のように構成された蛍光検出装置の詳細を以下に説明する。励起用スリット４を通過した光は、励起フィルタ５を通る。この励起フィルタ５は、蛍光標識Ｃｙ５を励起し、蛍光を読み取るときに使用されるフィルタであり、蛍光標識Ｃｙ５の励起波長領域を透過し、蛍光波長領域をカットする性質を有している。
【００１７】
励起フィルタ５を透過した光は、投光レンズ６により収束される。投光レンズ６を通った光は、ダイクロイックミラー７で反射される。ダイクロイックミラー７は、半導体レーザー２の光（６３５ｎｍ）を反射し、蛍光標識Ｃｙ５の蛍光波長領域の光（６７０ｎｍ）を透過する特性を持つ。
【００１８】
ダイクロイックミラー７で反射された光は、対物レンズ８を通る。投光レンズ６を通った光の収束位置と、対物レンズ８の後側焦点距離が一致するように配置することにより、対物レンズ８を通った光は平行光となり、生体物質検出用基板１４上の検出用流路１５へ投射される。投射光のサイズは、０．５ｍｍ×１．８ｍｍである。
【００１９】
検出用流路１５内には検体が存在し、励起された検体から発した蛍光は、対物レンズ８により平行光に集束される。その平行光は、ダイクロイックミラー７、蛍光フィルタ１０を通過する。蛍光フィルタ１０は、蛍光標識Ｃｙ５の蛍光波長領域の光を透過し、半導体レーザー２の波長をカットする特性を持つフィルタを用いる。
【００２０】
蛍光フィルタ１０を透過した光は、結像レンズ１１で蛍光用スリット１２位置に集光され、蛍光用スリット１２を通過した光は検出器１３で受光される。蛍光用のスリットのサイズを０．５ｍｍ×１．８ｍｍとすることにより、迷光を遮光してバックグラウンドノイズを抑えることが出来る。
【００２１】
図２は、励起用スリット４、投光レンズ６、及び対物レンズ８と、それらを通過する光線を示した図である。投射光のビームサイズは、励起用スリット４の矩形孔のサイズによって決まり、矩形孔のサイズは、投光レンズ６と対物レンズ８の結像関係で決まる。本発明の実施の形態１の場合、投光レンズ６の焦点距離は５０ｍｍ、対物レンズの焦点距離は１４ｍｍである。結像関係により、矩形孔のサイズ、及び、投射光のサイズの比は、５０：１４である。即ち、矩形孔のサイズを２．０ｍｍ×７．２ｍｍとすることにより、投射光のサイズを約１４／５０（０．２８）倍の０．５ｍｍ×１．８ｍｍとすることが出来る。
【００２２】
図３（ａ）は、生体物質検出用基板１４を示す平面図であり、図３（ｂ）は、その一つの流路ユニット２１を拡大した図である。生体物質検出用基板１４の材料はアクリル系の樹脂であり、厚みは２ｍｍである。流路形成面には深さ５０μｍの流路やリザーバーとなる溝が掘られ、さらにその上面に厚さ５０μｍのアクリル製フィルムを接着することで密閉流路が形成されている。また、重心２２に、生体物質検出用基板１４を蛍光検出装置に固定するための孔が設けられている。本実施の形態において、８つの泳動ユニット２１が、生体物質検出用基板１４の円周上に等間隔に並んで構成している。
【００２３】
以下、図３（ｂ）を用いて、生体物質検出用基板１４の泳動ユニット２１の働きについて詳細に説明する。
【００２４】
生体物質は、判別したいＳＮＰｓ部位を含む約６０塩基長の１本鎖ＤＮＡであり、蛍光物質（Ｃｙ５）で標識されたＤＮＡである。サンプル注入部２３へ注入された生体物質は、流路２４を通りサンプル保持部２５まで移動し、一定量の生体物質がサンプル保持部２５に保持される。一定量を超える生体物質は、流路２６を通りバッファ部２７まで移動する。
【００２５】
緩衝剤としてＤＮＡコンジュゲートを準備する。ＤＮＡコンジュゲートとは、６〜１２塩基長1本鎖ＤＮＡの５'末端に高分子のリニアポリマーが共有結合したものである。さらにＤＮＡは、正常型に対しては相補であるが変異型に対しては相補ではない配列であり、正常型ＤＮＡに対しての結合力が強く、変異型ＤＮＡに対しての結合力が弱い特性がある。また、電気泳動した場合、５'末端に結合した。リニアポリマーがおもりとなり泳動速度がかなり遅いという特性もある。緩衝剤注入部２８へ注入された緩衝剤は、流路２９より正電極部３０及び負電極部３１へ移動し、さらに、流路３２及び検出用流路１５を満たす。
【００２６】
正電極部３０及び負電極部３１との間に電圧を印加する。電圧の印加は、正電極部３０及び負電極部３１より緩衝剤に接触するように電極シートを設けており、針状の電極を電極シートへ接触させた状態で行う。電圧印加により、流路３２及び検出用流路１５に電場が発生し、サンプル保持部２５に保持された生体物質は、検出用流路１５中を電気泳動する。
【００２７】
蛍光標識を修飾したＤＮＡに励起光を照射して発している蛍光を検出することで、検出用流路１５中を電気泳動するＤＮＡを定量的に測定できる。さらに、生体物質検出用基板１４を駆動部１６で回転させ、検出用流路１５に沿って蛍光を検出することにより、ＤＮＡの分布を解析することが出来る。
【００２８】
図４を用いて、本発明の励起用スリット４の効果について説明する。図４（ａ）と図４（ｂ）は、いずれも流路ユニット２１の検出用流路１５の一部４０の拡大図を示す。図４（ａ）は、励起用スリット４が無い場合を示し、図４（ｂ）は、本発明の励起用スリット４がある場合を示す。本実施例での検出用流路１５内を電気泳動するＳＮＰｓバンド４１のバンド幅４４は約１．０ｍｍなので、投射光のビームサイズを０．５ｍｍ×１．８ｍｍに制限した。そのための励起用スリット４の矩形孔は、２．０ｍｍ×７．２ｍｍとした。
【００２９】
励起用スリット４が無い場合では、図４（ａ）の左図に示すように、投射光のビームサイズがＳＮＰｓバンドより大きいので、ＳＮＰｓバンドがビームに埋もれてしまい、図４（ａ）の右図に示すように検出の分解能は低下する。
【００３０】
一方、図４（ｂ）のように励起用スリット４がある場合には、投射光のビームサイズがＳＮＰｓバンドより小さいので、ＳＮＰｓバンドがビームに埋もれることはない。したがって、図４（ｂ）の右図に示すように、ＳＮＰｓバンドを高分解能に検出することが出来る。なお、本実施の形態１で用いたスリットのサイズは、一例であり、これに限るもではない。照射光の形状は、矩形に限るものではなく、楕円でも同様の効果がある。
【００３１】
また、検出用流路１５の流路幅が０．２ｍｍに対して、投射光のビームサイズは１．８ｍｍであり、検出用流路１５の流路幅よりも大きい。従って、生体物質検出用基板１４と光学部１の位置が検出用流路１５を横切る方向に±０．８ｍｍずれたとしても、検出用流路１５へ確実に投射光を照射することが出来る。
【００３２】
以上のように、本発明の実施の形態１において、マイクロ流路内を電気泳動する検体をスキャンする際に、ビーム形状を矩形とすることにより、マイクロ流路内を電気泳動するＳＮＰｓバンドを高分解能に検出することが可能である。また、マイクロ流路の位置ずれに影響されることなく、励起光を確実に照射することが可能である。さらに、本発明の実施の形態１に示す光源の種類、蛍光標識の種類、レンズの焦点距離は、本発明を説明するための一例であり、本発明の技術的範囲はこれに限るものではない。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明に係る蛍光検出装置は、光源の平行光中に配置したビーム整形手段により矩形形状のビームを照射する特徴を有し、照射範囲を限定することにより、測定対象物を高分解能に検出することが出来る点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の実施の形態１における蛍光検出装置の構成図
【図２】本発明の実施の形態１における投光レンズ６及び対物レンズ８の結像関係を示す図
【図３】本発明の実施の形態１における生体物質検出用基板の構成図及び泳動ユニット模式図
【図４】本発明の実施の形態１における泳動ユニットの検出用流路１５の一部４０の拡大図及び検出結果を示す図
【図５】従来の蛍光検出装置の模式図
【符号の説明】
【００３５】
１  光学部
２  光源
３  コリメートレンズ
４  励起用スリット
５  励起フィルタ
６  投光レンズ
７  ダイクロイックミラー
８  対物レンズ
１０  蛍光フィルタ
１１  結像レンズ
１２  蛍光用スリット
１３  検出器
１４  生体物質検出用基板
１５  検出用流路
１７  矩形孔
１８  照射光学部
１９  光源ユニット
２１  泳動ユニット
２２  重心
２３  サンプル注入部
２４  流路
２５  サンプル保持部
２６  流路
２７  バッファ部
２８  緩衝剤注入部
２９  流路
３０  正電極
３１  負電極
３２  流路
４０  流路ユニット２１の検出用流路１５の一部
４１  ＳＮＰｓバンド
４２  円形投射光
４３  矩形投射光
４４  バンド幅
５０  光源
５１  レンズ
５２  ダイクロイックミラー
５３  対物レンズ
５４  結像レンズ
５５  検出器
５６  生体物質検出用基板
５７  オートフォーカス用ダイクロイックミラー
５８  オートフォーカス用検出器
５９  オートフォーカス回路
６０  アクチュエータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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