(57)【要約】【課題】標的物質のラマン散乱信号を十分に増強するこのできる標的物質検出素子を提供する。【解決手段】標的物質検出素子は、支持体１０１、支持体の表面に存在する金属ナノドット１０２、および金属ナノドット１０２の表面に存在し、検体中の標的物質を捕捉する捕捉分子１０３を有している。金属ナノドット１０２は、プラズモン共鳴のスペクトルピークをｎ個有し、検体中での標的物質のラマンバンドが有するピークのうちｎ番目までの大きなピークのピーク波長と、金属ナノドット１０２が有するｎ個のピークのピーク波長とが各々対応して近傍に存在する。【選択図】図１
2009014491.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の標的物質を検出する標的物質検出素子であって、
支持体と、
該支持体の表面に存在する金属ナノドットと、
該金属ナノドットの表面に存在し、前記検体中の標的物質を捕捉する捕捉分子とを有し、
前記金属ナノドットがプラズモン共鳴のスペクトルピークをｎ個有し、
前記検体中での前記標的物質のラマンバンドが有するピークのうちｎ番目までの大きなピークのピーク波長と、前記金属ナノドットが有するｎ個のピークのピーク波長が各々対応して近傍に存在することを特徴とする標的物質検出素子。
【請求項２】
前記金属ナノドットは、吸収波長の異なる複数の種類の金属ナノドットで構成されていることを特徴とする請求項１に記載の標的物質検出素子。
【請求項３】
前記金属ナノドットが異方性を有することを特徴とする請求項１または２に記載の標的物質検出素子。
【請求項４】
前記金属ナノドットは、形状の異なる複数の種類のロッド群で構成され、前記ロッドの主軸方向と前記ロッドを励起光の偏向方向との角度θが、次のような関係にあることを特徴とする請求項３に記載の標的物質検出素子。
【数１】
2009014491.tif 000006
（ｉはロッド群の種類、Ｘ（ｉ）は各種類のロッドの長軸方向の長さ、Ｙ（ｉ）を各種類のロッドの短軸方向の長さ、Ｘ１をプラズモンピークの波長が最も短いロッドの長軸方向の長さ、Ｙ１をプラズモンピークの波長が最も短いロッドの短軸方向の長さを示す）
【請求項５】
請求項１から４に記載の標的物質検出素子と、
前記標的物質検出素子が有する金属ナノドットの近傍にエバネッセント電場を誘起するための光を照射する第１の光源と、
前記金属ナノドットにラマン散乱を生じさせるための光を照射する第２の光源と、
前記金属ナノドットによって増強された前記ラマン散乱光を検出するための分光器と、を有する標的物質検出装置。
【請求項６】
前記第２の光源からの光の波長は、検体中に含まれる不純物の自己蛍光を励起させないような波長とすることを特徴とする請求項５に記載の標的物質検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の標的物質を高感度に検出する標的物質検出用の素子に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療分野において、疾患の要因となるマーカーをモニタリングする技術は、次世代の技術として期待されており、また、医療の質向上にも大きく貢献すると期待されている。
【０００３】
血液中には、特定の疾患例えばガン、肝炎、糖尿病、または骨粗鬆症に対するマーカーが複数存在している。罹患すると、平時よりマーカーとなる例えば特定のタンパク質の濃度が変化（増加もしくは減少）する。これらのタンパク質の濃度を平時からモニタしておくことにより、重大な病気を早期に発見することができる。また、腫瘍除去後の予後診断を行なう際にも、マーカーとなるタンパク質の濃度をモニタしておくことにより、腫瘍の転移や再発を早期に発見することができる。
【０００４】
未加工で未精製のタンパク質を分析する方法として、例えば蛍光免疫法、プラズモン共鳴法、または光干渉法がある。
【０００５】
いずれの方法も生物学的なリガンドーアナライト相互作用を利用する。リガンドーアナライト相互作用は、検体中の分析対象となるアナライトに特異的に結合するリガンドをセンサ表面に固定し、アナライトを選択性よく選別する。これにより、検体中の夾雑物は除かれ、分析対象となるアナライトがセンサ表面のリガンドと高効率的に結合することができる。
【０００６】
一方、上述の方法の他に、表面増強ラマン分光法（以下、「ＳＥＲＳ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）法」という）が近年注目されている。
【０００７】
ＳＥＲＳ法では、金属ナノ構造体例えば金属薄膜または金属コロイドがセンサ表面に固定しており、励起用レーザー光でセンサ表面が照射されると、金属ナノ構造体の周辺にエバネッセント電場が誘起される。エバネッセント電場が誘起されると、ラマン散乱断面積は１０3〜１０14倍程度にまで増強され、金属ナノ構造体に吸着した分子や材料のラマン散乱信号が増強される。
【０００８】
そのため、アナライトに標識されたラマン活性分子からのラマン散乱信号の強度を検出することにより、標的物質であるアナライトが同定され、またアナライトの濃度も測定される。また、付加的な情報として、リガンドとアナライトの結合により生じる結合ボンドの情報やリガンドとアナライトの結合に関する他の情報も検出することができる。
【０００９】
ここで、ＳＥＲＳ法の特徴をまとめると以下のようになる。
【００１０】
（１）非常に大きい電場増大
金属ナノ構造体の極近傍では、ラマン散乱断面積が１０3〜１０14倍程度まで増強する。そのため、ＳＥＲＳ法をイムノアッセイに適用した場合、検出感度が高く、また検出限界を大きく下げることができる。
【００１１】
（２）自己蛍光の減少
生体由来の自己蛍光はラマン散乱信号と同じような波長帯域に出現してしまう。ＳＥＲＳ法では金属ナノ構造体をセンサ表面に用いるので、自己蛍光は金属ナノ構造体に吸収され、バックグラウンドを減じることができる。
【００１２】
（３）Ｂ／Ｆ分離不要
ＳＥＲＳ法では、金属ナノ構造体の周辺に固定化した分子または固定化した分子に吸着した分子からのラマン散乱信号が特異的に増強される。そのため、所望の分子のラマン散乱信号を得ることができる。
【００１３】
（４）ラマン活性分子の優位性
ＳＥＲＳ法では、蛍光分子などに比べて安定であり退色の可能性が低いラマン活性分子を用いて標識する手法を採用できる。また、複数種類のラマン活性分子を同時に使うことができる。
【００１４】
これらの特徴を生かし、ＳＥＲＳ法を利用した有機分子の分析やイムノアッセイが試みられてきた。
【００１５】
例えば、特許文献１に記載されたＳＥＲＳ法では、金属ナノ構造体を単粒子膜状態でセンサ表面に固定化し、ラマン散乱信号を増強する技術が開示されている。特許文献１では、入射電界の偏向方向に対して金属ナノ構造体をランダムに分布させ、生じるプラズモンピークにより、ラマン散乱信号を増強させる。プラズモンとは、光により金属中の自由電子が集団的に振動することをいい、金属により吸収される波長が異なっている。プラズモンピークとは、プラズモンが起きたときに光を最も強く吸収する波長のことである。
【００１６】
また、特許文献２に記載されたＳＥＲＳ法では、ナノ三角柱などのエッジ部分の領域で電場が強くなることを利用して、ラマン散乱信号を増強する技術が開示されている。
【００１７】
また、非特許文献１に記載されたＳＥＲＳ法では、ガン細胞表面のタンパク質を検出する技術が開示されている。金属コロイドをラマン活性分子の一種であるＭＧＩＴＣ（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識し、金属コロイドに抗体を結合させる。非特許文献１の方法は、細胞表面のタンパク質を検出するなど、可搬性に優れている。
【００１８】
また、非特許文献２に記載されたＳＥＲＳ法ではＲｈｏｄａｍｉｎｅ１２３の各ラマンバンドを測定する技術が開示されている。非特許文献２は、銀ナノ粒子の凝集状態を変化させることにより、プラズモンピークの位置を変化させている。ラマンバンドとは、原子の結合または原子団に現れる特有のバンドである。
【特許文献１】特開２００５−２３３６３７号公報
【特許文献２】特開２００５−２１９１８４号公報
【非特許文献１】Dominic O. Ansari, Douglas A. Stuart, and Shuming Nie  (2005), Proceedings of SPIE -- Volume 5699  pp. 82-90
【非特許文献２】吉田健一,伊藤民武,吉川泰生,尾崎幸洋（２００５）分子構造総合討論会  予稿集  ３Ｐ１３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
しかしながら、上述したような有機分子の分析やイムノアッセイにＳＥＲＳ法では、プラズモンのピークと標的物質のラマンバンドの波長位置が必ずしも一致するとは限らなかった。その場合、ラマン散乱信号が十分に増強されないという問題点があった。
【００２０】
本発明の目的は、標的物質のラマン散乱信号を十分に増強することのできる標的物質検出素子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、
検体中の標的物質を検出する標的物質検出素子であって、
支持体と、
該支持体の表面に存在する金属ナノドッドと、
該金属ナノドッドの表面に存在し、前記検体中の標的物質を捕捉する捕捉分子とを有し、
前記金属ナノドッドがプラズモンスペクトルのピークをｎ個有し、
前記標的物質のラマンバンドが有するピークのうちｎ番目までの大きなピークのピーク波長と、前記金属ナノドットが有するｎ個のピークのピーク波長が各々対応して近傍に存在することを特徴とする標的物質検出素子である。
【００２２】
前記金属ナノドットは、吸収波長の異なる複数の種類の金属ナノドッドで構成されていることが好ましい。
【００２３】
前記金属ナノドットが異方性を有することが好ましい。
【００２４】
前記金属ナノドットは、形状の異なる複数の種類のロッド群で構成され、前記ロッドの主軸方向と前記ロッドを励起光の偏向方向との角度θが、次のような関係にあることが好ましい。
【００２５】
【数１】
2009014491.tif 000003
【００２６】
（ｉはロッド群の種類、Ｘ（ｉ）は各種類のロッドの長軸方向の長さ、Ｙ（ｉ）を各種類のロッドの短軸方向の長さ、Ｘ１をプラズモンピークの波長が最も短いロッドの長軸方向の長さ、Ｙ１をプラズモンピークの波長が最も短いロッドの短軸方向の長さを示す）
また、別の本発明は、
前記標的物質検出素子と、
前記標的物質検出素子が有する金属ナノドットの近傍にエバネッセント電場を誘起するための光を照射する第１の光源と、
前記金属ナノドットにラマン散乱を生じさせるための光を照射する第２の光源と、
前記金属ナノドットによって増強された前記ラマン散乱光を検出するための分光器と、を有する標的物質検出装置である。
【００２７】
前記第２の光源からの光の波長は、検体中に含まれる不純物の自己蛍光を励起させないような波長とすることが好ましい。
【発明の効果】
【００２８】
検体中の標的物質を高感度に検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明を実施するための形態について図面を参照して詳細に説明する。図１を参照して素子形成用の基板および標的物質検出用の標的物質検出素子について説明する。本標的物質検出素子は、支持体１０１、金属ナノドット１０２、および捕捉体１０３を有している。
【００３０】
素子形成用の基板は支持体１０１および金属ナノドット１０２で構成されており、平面形状の金属ナノドット１０２が支持体１０１の表面に規則的に配置されている。
【００３１】
更に、標的物質検出素子は素子形成用の基板および標的物質に対する捕捉体１０３で構成されおり、捕捉体１０３は金属ナノドット１０２に固定される。標的物質検出素子を作製するための標的物質検出用キットは、この素子形成用の基板と捕捉体１０３とを有しており、必要に応じて金属ナノドット１０２に捕捉体１０３を固定するための試薬も備える。例えば、試薬はＩｇＧ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｒｉｎ  Ｇ）やＩｇＥ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｒｉｎ  Ｅ）を含む溶液であり、水溶液や各種緩衝液として提供することができる。
【００３２】
金属ナノドット１０２は、プラズモン共鳴のスペクトルを有し、ｎ個（ｎは自然数）のスペクトルピークを有する。ここで、スペクトルピークとは、スペクトルにフィッティングをかけて得られる補正スペクトルの極大値を示すものとする。
【００３３】
また、金属ナノドットが有するｎ個のプラズモン共鳴のスペクトルピークのピーク波長と、前記検体中での前記標的物質のラマンバンドが有するピークのうちｎ番目までの大きなピークのピーク波長とが各々対応して近傍に存在する。
【００３４】
ここで、プラズモン共鳴のスペクトルピークのピーク波長と標的物質のラマンバンドのピークのピーク波長が近傍に存在するとは、プラズモン共鳴のスペクトルの半値幅の波長域に標的物質のラマンバンドのピークのピーク波長が存在することとする。より好ましくは、３/４幅の波長域に標的物質のラマンバンドのピークのピーク波長が存在する。
【００３５】
なお、ｎ個のプラズモン共鳴のスペクトルピークのピーク波長と検体中での前記標的物質のラマンバンドが有するピークのうちｎ番目までの大きなピークのピーク波長とが各々対応して近傍に存在するとは、以下の意味である。
【００３６】
すなわち、ｎ個のプラズモン共鳴のスペクトルピークのうちの一つのピークと、標的物質のラマンバンドが有するｎ番目までに大きいピークのうち一つとが近傍に存在するというように、ｎ個のプラズモン共鳴のピークとｎ番目までのラマンバンドのピークが１対１で近傍に存在する。
【００３７】
このような性質を有していれば、金属ナノドット１０２はどのような形状であっても良い。好ましくは、赤外帯域でプラズモン共鳴波長を有する構造体であり、赤外帯域の励起光で照射したときに、試料の自己蛍光を抑制してラマン散乱信号をＳ／Ｎ（信号対雑音比Ｓｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ）よく測定できる形状とする。
【００３８】
また、金属ナノドットの種類としては、一種類でもいいし、複数種類から構成されていても構わない。好ましくは、金属ナノドットが複数種類から構成され、異なる吸収波長を有するようにする。これによれば、広い帯域でラマン散乱ピークを一様に増強させることができる。
【００３９】
捕捉体１０３は、標的物質と特異的な結合対を形成でき、金属ナノドット１０２に固定化可能なものであれば、特に制約はない。ここでは抗体や核酸を用いることが好ましい。
【００４０】
捕捉体１０３の検出対象となる標的物質は非生体物質と生体物質に分類できる。非生体物質は環境ホルモンと呼ばれる内分泌撹乱物質である。内分泌撹乱物質には、環境汚染物質、例えば塩素置換数と位置の異なるＰＣＢ（ＰｏｌｙＣｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ  Ｂｉｐｈｅｎｙｌ）類やダイオキシン類が含まれている。
【００４１】
生体物質は、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体である。生体物質には、ＤＮＡ（ＤｅｏｘｙｒｉｂｏＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＲＮＡ（ＲｉｂｏＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプター、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質が含まれる。また、生体物質を産生する細菌や細胞そのものも標的物質となり得る。
【００４２】
次に、図２を参照して標的物質検出装置の構成を説明する。本標的物質検出装置は、支持体１０１、金属ナノドット１０２、光源２０２，２０６、フィルタ２０３、集光レンズ２０４、コリメートレンズ２０７、ダイクロイックミラー２０８、対物レンズ２０９、全反射ミラー２１０、レンズ２１１、アパーチャー２１２、レンズ２１３、アパーチャー２１４、ノッチフィルター２１５、および分光器２１８を有している。
【００４３】
光源２０２は、フィルタ２０３および集光レンズ２０４を介して支持体１０１上の金属ナノドット１０２に励起光２０５を照射し、金属ナノドット１０２の周辺にエバネッセント電場を誘起させる。
【００４４】
光源２０６は、ラマン散乱を生じさせるためのレーザー光２１６をコリメートレンズ２０７を介してダイクロイックミラー２０８に照射する。ダイクロイックミラー２０８は、光源２０６で照射された光を入射すると、対物レンズ２０９を介して支持体１０１に配置された金属ナノドット１０２に照射し、弾性散乱または非弾性散乱のラマン散乱を生じさせる。
【００４５】
分光器２１８は、金属ナノドット１０２によってラマン散乱されたラマン散乱光を光学系２１０〜２１５を経て入射すると、入射光に基づく波長のスペクトルを測定する。スペクトルは原子の結合または原子団とそのバンドから固有の波数の位置にピークが現れたものとなり、このピーク波数から標的物質を同定し、また光強度に基づいて標的物質の濃度を測定できる。
【００４６】
次に、図３を参照して標的物質検出素子を作製する方法について説明する。まず、標的物質検出素子は、石英ウェハーの支持体４０１に、接着（バインダ）層としてＴｉ層（不図示）を５ｎｍ成膜し、連続してＡｕ層４０２を５０ｎｍ成膜する（図３（ａ）参照）。
【００４７】
続いて、ネガ型レジスト（シプレイファーイースト社、ＳＡＬ６０１）をスピンコートし、レジスト層４０３を設ける（図３（ｂ）参照）。プリベークした後、レジスト層４０３を設けた支持体４０１を電子線描画装置のチャンバーに導入すると、所望のパターンがレジスト層４０３に描画される（図３（ｃ）参照）。続いて、ポストエクスポージャーベークを行なって支持体４０１を急冷する。その後、現像液によって支持体４０１を現像し、レジスト層４０３のパターニングを行なう（図３（ｄ）参照）。
【００４８】
パターニングしたレジスト層をマスクとして、ドライエッチングを行なう。そして、Ａｕ層４０２にパターンを転写すると、ナノドットが得られる。最後に、リムーバー等の処理を行なうと、ナノドット上のレジスト層４０３が除去される（図３（ｅ）参照）。
【００４９】
以上のプロセスを経ることにより、図４ＡのようなＳＥＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）像に示すような直方体の金属ナノドットが形成され、入射電場の偏向方向と並行に配置している。そして、金属ナノドットの表面にＡｎｔｉ−ＤＮＰ（Ａｎｔｉ−Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）の捕捉体を固定することにより、標的物質検出素子が作製される。
【００５０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。ここでは、ラマン活性分子を用いて免疫応答を測定する例と、ラマン活性分子を用いずに免疫応答を測定する例について説明する。まず、ラマン活性分子を用いて免疫反応を測定する例について詳細に説明する。
【００５１】
（実施例１）
図１を参照して本実施例における標的物質検出素子の構成について説明する。標的物質検出素子は、支持体１０１、金属ナノドット１０２、および捕捉体１０３、を有している。
【００５２】
支持体１０１は高さ５２５μｍの石英ウェハーを用いる。
【００５３】
金属ナノドット１０２は、長辺２００ｎｍ、短辺５０ｎｍ、高さ２００ｎｍの直方体の素子であり、金属ナノドットの材料は金である。金属ナノドット１０２の長辺の長さと短辺の長さは、プラズモンのピークと標的物質のラマンバンドの波長位置が一致する長さである。
【００５４】
また、金属ナノドット１０２は、主軸が入射光と略同一方向になるように、入射光と垂直な支持体１０１の表面に配置する。これによれば、プラズモンの共鳴が最も強く起こるので、ラマン散乱信号が増強され、標的物質のラマンバンドを感度よく測定することができる。
【００５５】
また、金属ナノドット１０２は、入射光との角度を規定するための異方性を有している。これによれば、入射光との角度を変化させることにより、ラマン散乱信号の強度も変化するので、標的物質のラマンバンドを必要な強度で測定することができる。
【００５６】
捕捉体１０３は抗体である。
【００５７】
次に、本実施例におけるイムノアッセイについて説明する。金属ナノドットの表面にＡｎｔｉ−ＤＮＰを固定化し、標的物質検出素子を作製する。作製した標的物質検出素子に、１．５ｘ１０5ＭのＤＮＢＡ（２，４−Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）の含まれた検体溶液をインキュベートして２時間の結合反応を行なう。その後、検体溶液をリン酸緩衝液に置換すると、図５で示されるＤＮＢＡとＡｎｔｉ−ＤＮＢＡの複合体が金属ナノ構造体の表面に固定化される。
【００５８】
次に、標的物質の測定方法について説明する。図２で示す標的物質検出装置はａｎｔｉＤＮＰ−ＤＮＢＡの複合体のラマン散乱信号のスペクトルを測定する。
【００５９】
まず、光源２０２から金属ナノドット１０２に励起光２０５が照射されると、金属ナノドットの周辺に強いエバネッセント電場が誘起される。
【００６０】
続いて、光源２０６から金属ナノドット１０２に金属ナノドット１０２の吸収波長（近赤外帯域）付近のレーザー光が照射されると、金属ナノドット１０２でラマン散乱が生じる。分光器２１８は、金属ナノドット１０２によりラマン散乱された光のスペクトルを測定する。なお、検体中に含まれる不純物の自己蛍光を励起させないような波長とする。これによれば、検体溶液中に含まれる夾雑不純物による自己蛍光を実用上問題のないレベルにまで抑制し、ラマン散乱された光を測定することができる。
【００６１】
図４Ｂは、金属ナノ構造体における大気中での吸収スペクトルを測定した図である。図４Ｂでは、横軸を波長（ｎｍ）とし、縦軸を吸光度（Ｏ．Ｄ．）とする。金属ナノ構造体である金属ナノドット１０２は、大気中で９２０ｎｍ付近に吸収ピークを持つ構造体である。金属ナノドット１０２は、ほぼ３５０ｎｍ／ｉｎｄｅｘの特性を持つことが各種実験および検討から知られている。また、大気の屈折率は１．０であり、検体の溶液に導入したときの屈折率は１．４である。そのため、実際に検体の溶液に導入した場合、金属ナノドット１０２の吸収ピーク波長は、９２０＋３５０ｘ（１．４−１．０）＝１０６０ｎｍと算出される。
【００６２】
図６は、本実施例におけるラマン散乱スペクトルを示す図である。図６では、横軸をスペクトルのシフト（ｃｍ-1）とし、縦軸を強度とする。図６では、１５４９ｃｍ-1、１５２５ｃｍ-1付近のベンゼン環の伸縮振動、１３３８ｃｍ-1付近のＮＯ２の伸縮振動、８３９ｃｍ-1付近の伸縮振動を確認できる。この場合、励起光、半導体レーザー：９８０ｎｍで励起しているので、波長で記述すると、１１５５ｎｍ，１１５２ｎｍ，１１２８ｎｍ，１０６７ｎｍ付近にピークを有することになる。
【００６３】
検体溶液がナノ構造体表面に存在すると、プラズモン共鳴の吸収スペクトルは、１０６０ｎｍ程度に吸収ピークを有するので、８３９ｃｍ-1付近の伸縮振動が最良なＳ／Ｎとなる。
【００６４】
本実施例よれば、金属ナノドットのプラズモンピークと標的物質のラマンバンドの波長位置が一致することにより、標的物質のラマン散乱信号を十分に増強することができる。
【００６５】
（実施例２）
まず、図７Ａを参照して標的物質検出用素子の構成について説明する。金属ナノドットは、入射光との角度を規定するための異方性をもつ２つの直方体の素子を用いており、金属ナノドット１０２０は、長辺２００ｎｍ、短辺５０ｎｍ、高さ２０ｎｍの素子であり、金属ナノドット１０２１は、長辺２２０ｎｍ、短辺５０ｎｍ、高さ２０ｎｍの素子である。
【００６６】
図７Ｂには、空気中での金属ナノドット１０２０，１０２１の吸収スペクトルが示されており、金属ナノドット１０２０のピーク波長と金属ナノドット１０２１のピーク波長を比較すると、金属ナノドット１０２０のピーク波長の方が低い。また、金属ナノドット１０２０と金属ナノドット１０２１のスペクトルのパターンから図７Ｃに示すような吸収スペクトルが得られる。標的物質検出素子は金属ナノドットの表面にＡｎｔｉ−ＤＮＰの捕捉分子を固定化する。
【００６７】
次に、本実施例におけるイムノアッセイについて説明する。金属ナノドットの表面にＡｎｔｉ−ＤＮＰを固定化し、固定化した標的物質検出素子に、１．５ｘ１０5ＭのＤＮＢＡの含まれた検体溶液をインキュベートして２時間の結合反応を行なう。その後、検体溶液をリン酸緩衝液に置換すると、図５で示されるＤＮＢＡとＡｎｔｉ−ＤＮＰの複合体が金属ナノ構造体の表面に固定化される。
【００６８】
次に、標的物質の測定方法について説明する。図２で示す標的物質検出装置はａｎｔｉＤＮＰ−ＤＮＢＡの複合体のラマン散乱信号のスペクトルを測定する。
【００６９】
まず、光源２０２から金属ナノドット１０２０，１０２１に励起光２０５が照射されると、金属ナノドット１０２０，１０２１の周辺に強いエバネッセント電場が誘起される。
【００７０】
続いて、光源２０６から金属ナノドット１０２０，１０２１に金属ナノドット１０２０，１０２１の吸収波長（近赤外帯域）付近のレーザー光が照射されると、金属ナノドット１０２０，１０２１でラマン散乱が生じる。分光器２１８は、金属ナノドット１０２０，１０２１でラマン散乱されたラマン散乱光のスペクトルを測定する。本発明の構成によると、検体溶液中に含まれる夾雑不純物による自己蛍光を実用上問題のないレベルにまで抑制し、ラマン散乱された光を得ることができる。
【００７１】
図７Ｃの金属ナノドット１０２０，１０２１における大気中で吸収スペクトルを測定した図を参照すると、金属ナノドット１０２０，１０２１の吸収スペクトルは大気中で１０００ｎｍ付近に吸収ピークを持つ。金属ナノドット１０２０，１０２１は、ほぼ３５０ｎｍ／ｉｎｄｅｘの特性を持つことが各種実験および検討から知られている。また、大気の屈折率は１．０であり、検体の溶液に導入したときの屈折率は１．４である。そのため、実際に検体の溶液に導入した場合、金属ナノドット１０２０，１０２１の吸収ピーク波長は、１０００＋３５０ｘ（１．４−１．０）＝１１４０ｎｍと算出される。
【００７２】
図８は、本実施例におけるラマン散乱スペクトルを示す図である。図８では、横軸をスペクトルのシフト（ｃｍ-1）とし、縦軸を強度とする。図８では、１５４９ｃｍ-1、１５２５ｃｍ-1付近のベンゼン環の伸縮振動、１３３８ｃｍ-1付近のＮＯ２の伸縮振動、８３９ｃｍ-1付近の伸縮振動をよいＳ／Ｎで確認することが出来る。この場合、励起光、半導体レーザー：９８０ｎｍで励起しているので、波長で記述すると、１１５５ｎｍ，１１５２ｎｍ，１１２８ｎｍ，１０６７ｎｍ付近にピークを有することになる。これらのピークを分析することにより分子同士の結合やピークの積分強度を分析することにより結合の量を測定できる。
【００７３】
本実施例によれば、異なる吸収波長を有する複数の金属ナノ構造体を基板上に配置することで、ナノ構造固有のプラズモンピークにより、ラマンバンドの帯域を、ほぼカバーすることが可能となる。これにより、広い帯域に亘りラマン散乱信号を測定することができる。
【００７４】
（実施例３）
まず、図９Ａを参照して標的物質検出用素子の構成について説明する。
【００７５】
金属ナノドットは、入射光との角度を規定するための異方性をもつ４つの直方体の素子であり、支持体上に配置する。
【００７６】
金属ナノドット１０２１は、長辺２２０ｎｍ、短辺５０ｎｍ、高さ２０ｎｍの素子であり、金属ナノドット１０２０は、長辺２００ｎｍ、短辺５０ｎｍ、高さ２０ｎｍの素子である。また、金属ナノドット１０２２は、長辺１８０ｎｍ、短辺５０ｎｍ、高さ２０ｎｍの素子であり、金属ナノドット１０２３は、長辺１６０ｎｍ、短辺５０ｎｍ、高さ２０ｎｍの素子である。
【００７７】
金属ナノドットの主軸方向と入射電場の偏向方向との角度θは、（１）の式で関係付けられる。なお、ｉは金属ナノドットのロッド群の種類を表しており、Ｘ１は長辺の長さが短いロッドの長さであり、Ｘ（ｉ）はロッドの主軸の長さである。例えば、金属ナノドット１０２２の角度θを算出する場合、長さが短いロッド（金属ナノドット１０２３）の長さは１６０ｎｍであり、金属ナノドット１０２２のロッドの長辺の長さは１８０ｎｍである。それぞれの値を式（１）に代入すると、角度θが２７．３°と算出される。
【００７８】
【数２】
2009014491.tif 000004
【００７９】
図９Ａに示した標的物質検出用素子の場合、長軸方向の長さが最も短い金属ナノドット１０２３を、入射電場の偏向方向と並行に配置する。長軸方向の長さが次に短い金属ナノドット１０２２を、偏向方向から２７．３°回転させ配置する。さらに、金属ナノドット１０２０を、偏向方向から３６．９°回転させて配置し、長軸方向の流さが最も長い金属ナノドット１０２１を偏向方向から４３．３°回転させて配置する。標的物質検出素子は金属ナノドットの表面にＡｎｔｉ−ＤＮＰの捕捉分子を固定化する。
【００８０】
また、金属ナノドットの主軸方向と励起光の偏向方向との角度θは、短軸方向の長さを考慮すると（２）の式のように表すことができる。その場合、Ｘ（ｉ）をロッドの長軸方向の長さとし、Ｙ（ｉ）をロッドの短軸方向の長さとし、Ｘ１はプラズモンピークの波長が最も短いロッドの長軸方向の長さとし、Ｙ１はプラズモンピークの波長が最も短いロッドの短軸方向の長さである。
【００８１】
【数３】
2009014491.tif 000005
【００８２】
次に、イムノアッセイについて説明する。金属ナノドットの表面にＡｎｔｉ−ＤＮＰを固定化し、固定化した標的物質検出素子に、１．５ｘ１０5ＭのＤＮＢＡの含まれた検体溶液をインキュベートして２時間の結合反応を行なう。その後、検体溶液をリン酸緩衝液に置換すると、金属ナノ構造体の表面は、図５で示されるようにＤＮＢＡとＡｎｔｉ−ＤＮＰの複合体が固定化される。
【００８３】
次に、標的物質の測定について説明する。図２に示す標的物質検出装置はａｎｔｉＤＮＰ−ＤＮＢＡの複合体のラマン散乱スペクトルを測定する。
【００８４】
まず、光源２０２から金属ナノドット１０２０，１０２１，１０２２，１０２３に励起光２０５が照射されると、金属ナノドット１０２０，１０２１，１０２２，１０２３の周辺に強いエバネッセント電場が誘起される。
【００８５】
続いて、光源２０６から金属ナノドット１０２０，１０２１，１０２２，１０２３に金属ナノドット１０２０，１０２１，１０２２，１０２３の吸収波長（近赤外帯域）付近のレーザー光が照射されると、金属ナノドット１０２０，１０２１，１０２２，１０２３でラマン散乱が生じる。分光器２１８は、金属ナノドット１０２０，１０２１，１０２２，１０２３によりラマン散乱されたラマン散乱光のスペクトルを測定する。金属ナノドット１０２０，１０２１，１０２２，１０２３はそれぞれ異なる吸収波長を有しており、検体溶液中に含まれる夾雑不純物による自己蛍光を実用上問題のないレベルにまで抑制するため、ラマン散乱信号をより確実に測定することができる。
【００８６】
図９Ｂは、本実施例におけるラマン散乱スペクトルを示す図である。図９Ｂでは、１５４９ｃｍ-1、１５２５ｃｍ-1付近のベンゼン環の伸縮振動、１３３８ｃｍ-1付近のＮＯ２の伸縮振動、８３９ｃｍ-1付近の伸縮振動が最良なＳ／Ｎとなる。この場合、励起光、半導体レーザー：９８０ｎｍで励起しているので、波長で記述すると、１１５５ｎｍ，１１５２ｎｍ，１１２８ｎｍ，１０６７ｎｍ付近にピークを有することとなる。これらのピークを分析することにより分子同士の結合やピークの積分強度を分析することにより結合の量を測定できる。
【００８７】
本実施例によれば、複数の金属ナノドットの長軸の長さと短軸の長さを変化させると、金属ナノドットのプラズモンピークの波長も変化する。そのため、標的物質のラマンバンドの波長が複数ある場合に、金属ナノドットの長軸の長さと短軸の長さを調整することにより、標的物質のラマンバンドの波長のそれぞれの位置と、金属ナノドットのプラズモンのピークの一つを一致できる。その際、金属ナノドットの長軸や短軸の長さを変化させると、プラズモンピークの強度が変化してしまう。その場合、それぞれの金属ナノドットのプラズモンの強度を一定になるように、入射光の偏光の向きと金属ナノドットの長軸の向きの角度を変化させればよい。これによれば、長軸方向や短軸方向の長さの異なる複数の金属ナノドットを使用したときでも、標的物質の複数のラマンバンドを均一なＳ／Ｎで増強することができる。
【００８８】
（実施例４）
まず、図１０Ａを参照して標的物質検出用素子の構成ついて説明する。
【００８９】
金属ナノドットは、入射光との角度を規定するための異方性をもつ２つの直方体の素子を用いている。金属ナノドット１０２０は、長辺２００ｎｍ、短辺５０ｎｍ、高さ２０ｎｍであり、金属ナノドット１０２２は、長辺１８０ｎｍ、短辺５０ｎｍ、高さ２０ｎｍである。
【００９０】
図１０Ｂを参照すると、金属ナノドット１０２０の表面にＡｎｔｉ−ＩｇＧ１３０１の捕捉分子を固定化し、また金属ナノドット１０２２の表面にＡｎｔｉ−ＩｇＥ１３０２の補足分子を固定化している。
【００９１】
次に、本実施例におけるイムノアッセイについて説明する。図１０Ｂを参照して標的物質検出素子に、非特異吸着防止用のコーティング材料、例えばＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎｅ）を吸着させる。バッファー溶液として、ｐＨを７付近に調整したリン酸緩衝液（ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ））を使用し、ＩｇＧ抗原１３０３ならびにＩｇＥ抗原１３０４の入った検体溶液を導入する。検体溶液の導入後、２時間の結合反応を行なうと、図１１Ａのような抗原抗体反応が生じる。その後、検体溶液をリン酸緩衝液に置換し、さらにラマン活性分子で標識した抗ＩｇＧ抗体１３０５および抗ＩｇＥ抗体１３０６を導入してサンドイッチアッセイを行なう（図１１Ｂ参照）。
【００９２】
次に、標的物質の測定方法について説明する。図２で示す標的物質検出装置は、ＤＮＢＡで標識化された抗体抗原複合体のラマン散乱スペクトルを測定する。
【００９３】
まず、光源２０２から金属ナノドット１０２０，１０２２に励起光２０５が照射されると、金属ナノドットの周辺に強いエバネッセント電場が誘起される。
【００９４】
続いて、光源２０６から金属ナノドット１０２０，１０２２に金属ナノドット１０２０，１０２２の吸収波長（近赤外帯域）付近のレーザー光が照射されると、金属ナノドット１０２０，１０２２でラマン散乱が生じる。分光器２１８は、金属ナノドット１０２０，１０２２によりラマン散乱されたラマン散乱光のスペクトルを測定する。本発明の構成によると、検体溶液中に含まれる夾雑不純物による自己蛍光を実用上問題のないレベルにまで抑制し、ラマン散乱された光を得ることができる。
【００９５】
図１２は本実例におけるラマン散乱信号のスペクトルを示す図である。図１２では、プラズモン吸収スペクトルのピークに対応した１５４９ｃｍ-1、１５２５ｃｍ-1付近のベンゼン環の伸縮振動および８３９ｃｍ-1付近の伸縮振動が最良のＳ／Ｎとなる。本実施例によれば、プラズモンピークを測定することにより、抗体に結合する抗原の量を定量的に測定できる。
【００９６】
（実施例５）
次に、ラマン活性分子を用いずに免疫応答を測定する例について詳細に説明する。
【００９７】
図７Ａを参照して標的物質検出用素子の構成について説明する。金属ナノドットは、入射光との角度を規定するための異方性をもつ２つの直方体の素子を用いている。金属ナノドット１０２０は、長辺２００、短辺５０ｎｍ、高さ２０ｎｍの素子であり、金属ナノドット１０２１は、長辺２２０、短辺５０ｎｍ、高さ２０ｎｍの素子である。
【００９８】
図７Ｂには、空気中での金属ナノドット１０２０，１０２１の吸収スペクトルが示されており、金属ナノドット１０２０のピーク波長と金属ナノドット１０２１のピーク波長を比較すると、金属ナノドット１０２０のピーク波長の方が低い。また、金属ナノドット１０２０と金属ナノドット１０２１のスペクトルのパターンから図７Ｃに示すような吸収スペクトルが得られる。金属ナノドット１０２０，１０２１の表面には、濃度が２．０ｘ１０-10ｍｏｌ／ＬのＡｎｔｉ−ＩｇＧ１３０１が固定化される。
【００９９】
次に、本実施例におけるイムノアッセイについて説明する。捕捉体を表面に固定化した標的物質検出素子に非特異吸着防止用のコーティング材料としてＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎｅ）を吸着させておく。バッファー溶液として、ｐＨを７付近に調整したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用い、ＩｇＧ抗原１３０３の入った溶液を導入し、２時間結合反応を行なう。
【０１００】
次に、図１３を参照して本実施例における検出装置の構成について説明する。本検出装置は、支持体１０１、金属ナノドット１０２０，１０２１、光源６０１，６１０、フィルタ６０２、コリメートレンズ６０３、プリズム６０４、対物レンズ６０７、ダイクロイックミラー６０８、コリメートレンズ６０９、全反射ミラー６１１、レンズ６１２、アパーチャー６１３、レンズ６１４、アパーチャー６１５、ノッチフィルター６１６、分光器６１７と、を有している。このような検出装置でａｎｔｉ−ＩｇＧとＩｇＧの複合体のラマン散乱スペクトルが測定される。
【０１０１】
まず、光源６０１から金属ナノドット１０２０，１０２１に励起光２０５が照射されると、金属ナノドット１０２０，１０２１の周辺に強いエバネッセント電場が誘起される。
【０１０２】
続いて、光源６１０から金属ナノドット１０２０，１０２１に金属ナノドット１０２０，１０２１の吸収波長（近赤外帯域）付近のレーザー光が照射されると、金属ナノドット１０２０，１０２１でラマン散乱が生じる。分光器６１７は、金属ナノドット１０２０，１０２１によりラマン散乱したラマン散乱光のスペクトルを測定する。本発明の構成によると、検体溶液中に含まれる夾雑不純物による自己蛍光を実用上問題のないレベルにまで抑制し、ラマン散乱された光を得ることができる。
【０１０３】
図７Ｃは、金属ナノ構造体における大気中での吸収スペクトルを測定した図である。図７Ｃでは、横軸を波長（ｎｍ）とし、縦軸を吸光度（Ｏ．Ｄ．）とする。金属ナノドット１０２０，１０２１の吸収スペクトルは１０００ｎｍ付近に吸収ピークを持つ。金属ナノ構造体である金属ナノドット１０２０，１０２１は、ほぼ３５０ｎｍ／ｉｎｄｅｘの特性を持つことが各種実験および検討から知られている。また、大気の屈折率は１．０であり、検体の溶液に導入したときの屈折率は１．４である。そのため、実際に検体溶液を導入すると、金属ナノドット１０２０，１０２１の吸収ピークの波長は、１０００＋３５０ｘ（１．４−１．０）＝１１４０ｎｍと算出される。
【０１０４】
図１４は本実施例におけるラマン散乱スペクトルを示す図である。ラマン散乱スペクトル７００は、ａｎｔｉ−ＩｇＧのみが金属ナノドットの表面に存在する場合のラマン散乱スペクトルである。ラマン散乱スペクトル７０１はａｎｔｉ−ＩｇＧとＩｇＧの複合体から得られるラマン散乱スペクトルである。反応前後でスペクトルが大きく変化しており、これらスペクトルを用いることで、抗原の濃度を測定できる。
【０１０５】
本発明によれば、血清中の病気に関連するマーカーの濃度、あるいは、投薬した薬の血中濃度、あるいは、代謝産物の血中濃度を調べることで、病気の診断や診療方針の決定に役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】素子形成用の基板および標的物質検出素子を示す図である。
【図２】標的物質検出装置の構成を説明する図である。
【図３】標的物質検出素子を作製するプロセスについて説明する図である。
【図４Ａ】ＳＥＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）像による金属ナノドットを示す図である。
【図４Ｂ】金属ナノ構造体における大気中での吸収スペクトルを測定した図である。
【図５】ＤＮＢＡとＡｎｔｉ−ＤＮＢＡの複合体が金属ナノ構造体の表面に固定化されるときの図である。
【図６】実施例１におけるラマン散乱スペクトルを示す図である。
【図７Ａ】標的物質検出用素子の構成について説明する図である。
【図７Ｂ】空気中での金属ナノドット１０２０，１０２１の吸収スペクトルを示す図である。
【図７Ｃ】空気中での金属ナノドット１０２０，１０２１の吸収スペクトルを重ね合わせた図である。
【図８】実施例２におけるラマン散乱スペクトルを示す図である。
【図９Ａ】標的物質検出用素子の構成について説明する図である。
【図９Ｂ】実施例３におけるラマン散乱スペクトルを示す図である。
【図１０Ａ】標的物質検出用素子の構成について説明する図である。
【図１０Ｂ】金属ナノドットの表面に捕捉体を固定化したときの状態を示す図である。
【図１１Ａ】抗原抗体反応が生じたときの状態を示す図である。
【図１１Ｂ】サンドイッチアッセイを行ったときの状態を示す図である。
【図１２】本実例４におけるラマン散乱信号のスペクトルを示す図である。
【図１３】本実施例５における検出装置の構成について説明する図である。
【図１４】本実施例５におけるラマン散乱スペクトルを示す図である。
【符号の説明】
【０１０７】
１０１    支持体
１０２，１０２０，１０２１，１０２２，１０２３    金属ナノドット
１０３    捕捉体
２０２    光源
２０３    フィルタ
２０４    集光レンズ
２０５    励起光
２０６    光源
２０７    コリメートレンズ
２０８    ダイクロイックミラー
２０９    対物レンズ
２１０    全反射ミラー
２１１    レンズ
２１２    アパーチャー
２１３    レンズ
２１４    アパーチャー
２１５    ノッチフィルター
２１８    分光器
４０１    支持体
４０２    Ａｕ層
４０３    レジスト層
６０１    光源
６０２    フィルタ
６０３    コリメートレンズ
６０４    プリズム
６０７    対物レンズ
６０８    ダイクロイックミラー
６０９    コリメートレンズ
６１０    光源
６１１    全反射ミラー
６１２    レンズ
６１３    アパーチャー
６１４    レンズ
６１５    アパーチャー
６１６    ノッチフィルター
６１７    分光器
７００，７０１  ラマン散乱スペクトル
１３０１    Ａｎｔｉ−ＩｇＧ
１３０２    Ａｎｔｉ−ＩｇＥ
１３０３    ＩｇＧ抗原
１３０４    ＩｇＥ抗原
１３０５    ラマン活性分子で標識した抗ＩｇＧ抗体
１３０６    ラマン活性分子で標識した抗ＩｇＥ抗体
【図１】
2009014491.tif 000007
【図２】
2009014491.tif 000008
【図３】
2009014491.tif 000009
【図４Ａ】
2009014491.tif 000010
【図４Ｂ】
2009014491.tif 000011
【図５】
2009014491.tif 000012
【図６】
2009014491.tif 000013
【図７Ａ】
2009014491.tif 000014
【図７Ｂ】
2009014491.tif 000015
【図７Ｃ】
2009014491.tif 000016
【図８】
2009014491.tif 000017
【図９Ａ】
2009014491.tif 000018
【図９Ｂ】
2009014491.tif 000019
【図１０Ａ】
2009014491.tif 000020
【図１０Ｂ】
2009014491.tif 000021
【図１１Ａ】
2009014491.tif 000022
【図１１Ｂ】
2009014491.tif 000023
【図１２】
2009014491.tif 000024
【図１３】
2009014491.tif 000025
【図１４】
2009014491.tif 000026