(57)【要約】      （修正有）【課題】異種的に発現されるレセプターの発現を増大させる手段及び異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのＧ蛋白質サブユニットへの共役を増大させる手段を提供する。【解決手段】少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換されている内因性Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット。前記蛋白質は異種性レセプターを酵母細胞のフェロモンシグナリング経路に機能的に統合するように働き、発現する酵母細胞はＧ蛋白質共役型レセプターのモジュレーターのスクリーニングアッセイに有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換されている内因性Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
【請求項２】
前記のＧｐａ１の最後の５つのＣ末端アミノ酸が、異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換されている、請求項１に記載のキメラＧ蛋白質サブユニット。
【請求項３】
前記のＧｐａ１の最後の６つのＣ末端アミノ酸が、異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の６つのＣ末端アミノ酸で置換されている、請求項２に記載のキメラＧ蛋白質サブユニット。
【請求項４】
少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換されており且つＮ末端が第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最初の５つのＮ末端アミノ酸に操作可能に結合されている内因性Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット(該第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、同じであるか又は異なる)。
【請求項５】
前記のＧｐａ１の最後の５つのＣ末端アミノ酸が、第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換され且つ前記のＧｐａ１の最初の５つのＮ末端アミノ酸が第２の異種性Ｇ蛋白質の最初の１１のＮ末端アミノ酸で置換されている、請求項４に記載のキメラＧ蛋白質サブユニット。
【請求項６】
前記のＧｐａ１の最後の５つのＣ末端アミノ酸が、第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換され且つ前記のＧｐａ１の最初の２３つのＮ末端アミノ酸が第２の異種性Ｇ蛋白質の最初の２１のＮ末端アミノ酸で置換されている、請求項４に記載のキメラＧ蛋白質サブユニット。
【請求項７】
前記の第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットが、同じである、請求項４〜６のいずれかに記載のキメラＧ蛋白質サブユニット。
【請求項８】
配列表の配列番号１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１２３、１１４、１１５、１１８、又は１２３に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを含有してなるキメラＧ蛋白質サブユニット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の要約
本発明は、とりわけ、異種的に発現されるレセプターの発現を増大させる手段及び異種的に発現されるＧＰＣＲのＧ蛋白質サブユニットへの共役を増大させる手段を提供することにより、当分野で以前に知られている薬物スクリーニングの方法論における重要な進歩を提供する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、機能的異種ＧＰＣＲの発現に有用な新規な酵母細胞に関係する。ある具体例において、これらの主題の酵母細胞は、異種性ＧＰＣＲの酵母シグナリング経路への機能的インテグレーションを増大させる改変された及び／又は異種性のＧ蛋白質サブユニットを含む。これらの改変されたＧ蛋白質サブユニットは、突然変異により変えることができ且つ／又はキメラであってよく即ち酵母Ｇ蛋白質サブユニット由来のポリペプチドと異種のＧ蛋白質サブユニット由来の少なくとも一のポリペプチドとを含んでよい。本発明の酵母細胞は、ＧＰＣＲのモジュレーターのスクリーニングに用いることのできる新規なスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。
【０００３】
一面において、この発明は、以下を含む組換え酵母細胞である：
レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように当該酵母細胞の細胞膜中で発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)(該異種性ＧＰＣＲは、酵母細胞のフェロモン応答経路における内因性酵母フェロモンレセプターの代用物として作用する)；及び
下記よりなる群から選択するキメラＧ蛋白質サブユニット：
野生型配列と比べて少なくとも一のアミノ酸置換が導入された異種性Ｇ蛋白質サブユニットからの配列を含む非天然Ｇ蛋白質サブユニット；
異種性Ｇγサブユニットのポリペプチドに操作可能に結合された内因性Ｓｔｅ１８サブユニット；
少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも４つのＣ末端アミノ酸で置換されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニット；及び 少なくとも４つのＣ末端アミノ酸が第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも４つのＣ末端アミノ酸で置換されており且つＮ末端が第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最初の５つのＮ末端アミノ酸に操作可能に結合されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニット(ここに、該第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは同じであるか又は異なっており；それにより、該キメラＧ蛋白質サブユニットの発現は、機能的に、該異種性ＧＰＣＲを該酵母細胞のフェロモンシステム経路に統合する；及び
該異種性ＧＰＣＲのシグナル変換活性の細胞外シグナルによる調節が、検出可能なシグナルを与える)。
【０００４】
一面において、この発明は、異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター；異種性Ｇ蛋白質サブユニットからの配列を有するが野生型配列と比べて少なくとも一のアミノ酸置換が導入された非天然Ｇ蛋白質サブユニットを含む酵母細胞を提供する。非天然Ｇ蛋白質サブユニットの発現は、機能的に、異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターを酵母細胞のフェロモンシグナリング経路に統合する。
【０００５】
一具体例において、本発明の酵母細胞は、変異型哺乳動物Ｇαサブユニットである非天然Ｇ蛋白質サブユニットを有する。好適具体例において、この変異型哺乳動物Ｇαサブユニットは、下記よりなる群から選択する突然変異を有する異種性Ｇ蛋白質サブユニットからの配列を含む：Ｇα１６(Ｓ２７０Ｐ)；Ｇαｓ(Ｄ２２９Ｓ)；Ｇαｓ(Ｄ２２９Ｖ)；Ｇαｓ(Ｎ２５４Ｄ)；Ｇαｓ(Ｓ２８６Ｐ)；Ｇαｓ(Ｅ１０Ｋ)；Ｇαｉ２−ＧαｏＢ(Ｓ２８０Ｐ)；Ｇα１２(Ｑ２２９Ｌ)；Ｇα１２(Ｇ２２８Ａ)；及びＧαｉ２(Ｓ２８８Ｐ)。
【０００６】
他の具体例において、本発明の酵母細胞は、酵母Ｇ蛋白質サブユニットからの第１のポリペプチドと変異型哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニットからの第２のポリペプチドを含む酵母−哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニットキメラである非天然Ｇ蛋白質サブユニットを含む。好適具体例において、このキメラの第２のポリペプチドは、下記よりなる群から選択する変異型哺乳動物Ｇαサブユニットを含む：Ｇα１６(Ｓ２７０Ｐ)；Ｇαｓ(Ｄ２２９Ｓ)；Ｇαｓ(Ｄ２２９Ｖ)；Ｇαｓ(Ｎ２５４Ｄ)；Ｇαｓ(Ｓ２８６Ｐ)；Ｇαｓ(Ｅ１０Ｋ)；Ｇαｉ２−ＧαｏＢ(Ｓ２８０Ｐ)；Ｇα１２(Ｑ２２９Ｌ)；Ｇα１２(Ｇ２２８Ａ)；及びＧαｉ２(Ｓ２８８Ｐ)。
【０００７】
他の好適具体例において、本発明の酵母細胞は、酵母Ｇ蛋白質サブユニットからの第１のポリペプチドと異種性Ｇ蛋白質サブユニットからの第２のポリペプチドを含むキメラＧ蛋白質サブユニットを有する(ここに、第１のポリペプチドは、下記よりなる群から選択する：酵母ＧＰＡ１のアミノ末端からの約４０アミノ酸を含むポリペプチド；及び酵母ＳＴＥ１８からのポリペプチド)。
【０００８】
更に別の好適具体例において、本発明の酵母細胞は、キメラＧ蛋白質サブユニットを有する(このキメラの第１のポリペプチドは、酵母ＧＰＡのアミノ末端からの約４０アミノ酸を含み、該第２のポリペプチドは、異種性Ｇ蛋白質αサブユニットに由来する)。
【０００９】
更に別の具体例において、本発明の酵母細胞は、キメラＧ蛋白質サブユニットを有する(該サブユニットにおいて、第１のポリペプチドは、酵母ＳＴＥ１８に由来し、第２のポリペプチドは、異種性Ｇ蛋白質γサブユニットに由来する)。
【００１０】
好適具体例において、本発明の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、哺乳動物のものである。特に好適な具体例において、本発明の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、ヒトのものである。
【００１１】
一具体例において、本発明の酵母細胞は、第１及び第２のポリペプチドの少なくとも一方が天然のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニットを含む。更に別の具体例においては、キメラＧ蛋白質サブユニットの第１及び第２のポリペプチドの少なくとも一方は、非天然のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
好適具体例において、本発明の酵母細胞は、酵母細胞に機能的に統合された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターを包含する。
特に好適な具体例においては、本発明の改変された又はキメラのＧ蛋白質サブユニットは、酵母細胞により発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターに対する増大された共役を示す(内因性酵母Ｇ蛋白質サブユニットにより示されるものと比べて)。
【００１３】
一具体例において、本発明の酵母細胞は、第２のポリペプチドがヒトＧγ２サブユニットに由来するキメラＧ蛋白質サブユニットを含む。好適具体例において、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列ＡｒｇＧｌｕＬｙｓＬｙｓＰｈｅＰｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸１９〜２４）を含む。特に好適な具体例において、キメラＧ蛋白質サブユニットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に示した配列を含む。
【００１４】
好適具体例において、本発明の酵母細胞は、下記よりなる群から選択するキメラＧ蛋白質サブユニットを含む：ｐｇａｌ(４１)−Ｇαｉ２；ｇｐａｌ(４１)−Ｇα１６；及びｇｐａｌ(４１)−Ｇαｓ。一層好適な具体例において、本発明の酵母細胞は、キメラＧ蛋白質サブユニットを含む(このキメラＧ蛋白質サブユニットのＧαｉ２、Ｇα１６又はＧαｓ部分は、野生型Ｇαｉ２、Ｇα１６又はＧαｓと比べてアミノ酸置換を含む)。
【００１５】
更に別の具体例において、本発明の酵母細胞は、第２のキメラＧ蛋白質サブユニットを含む(ここに、この第２のキメラＧ蛋白質サブユニットは、酵母Ｇ蛋白質サブユニット由来の第１のポリペプチドと哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニット由来の第２のポリペプチドを有し、そしてこの第２のキメラＧ蛋白質サブユニットは、酵母細胞により発現される第１のキメラＧ蛋白質サブユニットと異なっている)。好適具体例において、この第２のキメラＧ蛋白質サブユニットの第２のポリペプチドは、下記よりなる群から選択する蛋白質に由来する：哺乳動物Ｇαサブユニット、哺乳動物Ｇβサブユニット及び哺乳動物Ｇγサブユニット。
【００１６】
好適具体例において、本発明の酵母細胞は、機能的形態の内因性酵母フェロモンシステムレセプター蛋白質を生成しない。
【００１７】
ある具体例においては、本発明の酵母細胞は、異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのＧ蛋白質への機能的共役に際して検出可能なシグナルを生成する指標遺伝子を含む。
【００１８】
好適具体例において、本発明の酵母細胞は、オーファンレセプターである異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターを含む。
【００１９】
他の具体例において、この発明は、異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター、改変Ｇ蛋白質サブユニット及び指標遺伝子を含む酵母細胞を用意し、その酵母を試験化合物に接触させ；そして酵母細胞における検出可能なシグナルの変化を誘導する化合物を同定するステップを含む、ＧαとＧβγの分離を調節することのできる化合物を同定するためのアッセイを提供する(ここに、該検出可能なシグナルは、ＧαとＧβγの分離を示す)。
【００２０】
ある具体例において、本発明のアッセイを用いて、非ペプチド性有機分子のライブラリーからの化合物を試験する。
【００２１】
他の面において、この発明は、それぞれＧ蛋白質を含む第１、第２、第３及び第４の酵母細胞を用意することを含む、異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターを調節する化合物を同定する方法を提供する、ここに；
１）第１の酵母細胞は、酵母Ｇ蛋白質サブユニット由来の第１のポリペプチドと哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニット由来の第２のポリペプチドを含む第１のキメラＧ蛋白質サブユニットを含み；２）第２の酵母細胞は、酵母Ｇ蛋白質サブユニット由来の第１のポリペプチドと哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニット由来の第２のポリペプチドを含む第２のキメラＧ蛋白質サブユニットを含み、この第２のＧ蛋白質サブユニットは、前記の第１のキメラＧ蛋白質サブユニットと異なり；３）第３の酵母細胞は、酵母Ｇ蛋白質サブユニット由来の第１のポリペプチドと哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニット由来の第２のポリペプチドを含む第３のキメラＧ蛋白質サブユニットを含み、この第３のキメラＧ蛋白質サブユニットは、前記の第１及び第２のキメラＧ蛋白質サブユニットと異なり；４）第４の酵母細胞は、内因性酵母ｇｐａ１Ｇ蛋白質サブユニット；及び酵母フェロモンシステム経路と共役する異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)をコードする発現可能な遺伝子構築物；及び異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのＧ蛋白質への機能的共役に際して検出可能なシグナルを生成する指標遺伝子を含む。このアッセイは、この第１、第２、第３及び第４の酵母細胞を試験化合物と接触させ；そしてこの試験化合物が少なくとも第１、第２、第３又は第４の酵母細胞において検出可能なシグナルの変化を誘導するかどうかを測定し、それにより、異種性ＧＰＣＲを調節する化合物を同定することを含む。
【００２２】
好適具体例において、このアッセイを、第２のポリペプチドが哺乳動物Ｇαｉサブユニットに由来するキメラＧ蛋白質サブユニットを含む酵母細胞を用いて行う。他の好適具体例において、このキメラＧ蛋白質サブユニットの第２のポリペプチドは、哺乳動物のＧα１６サブユニットに由来する。更に別の好適具体例において、このキメラＧ蛋白質サブユニットの第２のポリペプチドは、哺乳動物Ｇαｓサブユニット由来である。
【００２３】
このアッセイの更に別の具体例において、第１のキメラＧ蛋白質サブユニットは、哺乳動物Ｇα１２由来のポリペプチドを含み、第２のキメラＧ蛋白質サブユニットは、哺乳動物Ｇα１６由来のポリペプチドを含み、そして第３のキメラＧ蛋白質サブユニットは、哺乳動物Ｇαｓ由来のポリペプチドを含む。好適具体例において、第２のキメラＧ蛋白質サブユニットは、Ｇα１６(Ｓ２７０Ｐ)を含み、第３のキメラＧ蛋白質サブユニットは、Ｇαｓ(Ｓ２２９Ｓ)を含む。
【００２４】
他の好適具体例において、第１、第２及び第３の酵母細胞の各々は、更に、第４のキメラＧ蛋白質サブユニットを含み、該第４のキメラＧ蛋白質サブユニットは、酵母ＳＴＥ１８由来の第１のポリペプチド及び哺乳動物Ｇ蛋白質γサブユニット由来の第２のポリペプチドを含む。
【００２５】
主題のアッセイのある具体例においては、第１、第２、第３及び第４の酵母細胞を、試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させる。好適具体例において、該ライブラリーの各メンバーは、非ペプチド性有機分子である。
【００２６】
好適具体例において、この第１、第２、第３及び第４の酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ細胞である。
【００２７】
この発明の一具体例において、検出可能なシグナルを生じる指標遺伝子を、下記よりなる群から選択する：βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、エキソグルカナーゼ、ルシフェラーゼ、ＢＡＲ１、ＰＨＯ５、グリーン蛍光蛋白質及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ。
【００２８】
更に別の具体例において、検出可能なシグナルを生じる指標遺伝子は、ＨＩＳ３遺伝子である。
【００２９】
この発明の一具体例において、酵母細胞により発現される異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターは、オーファンレセプターである。
【００３０】
更に別の面において、この発明は、カルボキシ末端キメラＧ蛋白質サブユニット及びサンドイッチキメラＧ蛋白質サブユニットを指向する。従って、一具体例において、この発明の酵母細胞は、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換された内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニットを含む。
【００３１】
他の具体例において、この発明の酵母細胞は、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換され且つＮ末端が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも５つのＮ末端アミノ酸に操作可能に結合された内因性Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニットを含む(ここに、該異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、同じであるか又は異なる)。
【００３２】
他の具体例において、この発明の酵母細胞は、下記を含む：
当該酵母細胞の細胞膜中で、レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように発現される異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)(該異種性ＧＰＣＲは、酵母細胞のフェロモン応答経路における内因性酵母フェロモンレセプターの代用物として作用する)；及び
キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が該異種性ＧＰＣＲを該酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換された内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット(該異種性ＧＰＣＲのシグナル変換活性の細胞外シグナルによる調節が、検出可能なシグナルを与える)。
【００３３】
他の具体例において、この酵母細胞は、細胞膜中で発現されたレセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置に輸送される異種性ポリペプチド；及びレセプターのシグナル変換活性の異種性ポリペプチドによる調節が検出可能なシグナルを与えるだけ十分なレベルで発現される異種性ポリペプチドを含む。
【００３４】
更に別の具体例において、この酵母細胞は、フェロモン応答経路により活性化されるレポーター構築物を含み、ここに、異種性ポリペプチドは、レセプターのシグナル変換活性の異種性ポリペプチドによる調節がこのレポーター構築物により媒介される検出可能なシグナルを与えるだけ十分なレベルで発現される。
【００３５】
更に別の具体例において、この発明の酵母細胞は、ＦＡＲ１、ＳＳＴ２、ＢＡＲ１、ＳＶＧ１、ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＳＴＥ１４、ＭＦａ１、ＭＦａ２、ＭＦａ１及びＭＦａ２よりなる群から選択する少なくとも一つの遺伝子中に突然変異を含み；該異種性ＧＰＣＲのシグナル変換活性の細胞外シグナルによる調節は、検出可能なシグナルを与える。
【００３６】
この発明は又、組換え酵母細胞の混合物をも指向し、その各々の細胞は細胞膜を有し、各々の細胞は下記を含む：
該酵母細胞の細胞膜中で、レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように発現される異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)；
キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が異種性ＧＰＣＲを酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換された内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット；及び
細胞膜中で発現されたレセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置に輸送される異種性ポリペプチド(この細胞混合物は、集合的に、該異種性ポリペプチドのライブラリーを発現し、該ライブラリーは、該レセプターのシグナル変換活性のライブラリー内の異種性ポリペプチドによる調節が検出可能なシグナルを与えるするだけ十分なレベルで発現することができる)。
【００３７】
他の面において、この発明は、サンドイッチキメラＧ蛋白質サブユニットを指向する。一具体例において、この発明の酵母細胞は、下記を含む：
レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように、酵母細胞の細胞膜中で発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)(該異種性ＧＰＣＲは、酵母細胞のフェロモン応答経路における内因性酵母フェロモンレセプターの代用物として作用する)；及び
少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換され且つＮ末端が第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最初の５つのＮ末端アミノ酸に操作可能に結合されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット(ここに、該第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、該キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が該異種性ＧＰＣＲを該酵母のフェロモン応答経路に機能的に統合するように同じであるか又は異なり；そして該異種性ＧＰＣＲのシグナル変換活性の細胞外シグナルによる調節が、検出可能なシグナルを与える)。
【００３８】
他の具体例において、この発明は、組換え酵母細胞の混合物であり、その各々の細胞は細胞膜を有し且つ各々の細胞は下記を含む：
レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように、該酵母細胞の細胞膜中で発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)；
キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が該異種性ＧＰＣＲを該酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換され且つＮ末端が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最初の５つのＮ末端アミノ酸と操作可能に結合された内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット；及び
細胞膜中で発現された該レセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置へ輸送される異種性ポリペプチド(この細胞混合物は、集合的に、該異種性ポリペプチドのライブラリーを発現し、該ライブラリーは、該レセプターのシグナル変換活性のライブラリー内の異種性ポリペプチドによる調節が検出可能なシグナルを与えるだけ十分なレベルで発現することができる)。
【００３９】
他の具体例において、この発明の酵母細胞は、下記を含む：
レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように、該酵母細胞の細胞膜中で発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)(該異種性ＧＰＣＲは、酵母細胞のフェロモン応答経路における内因性酵母フェロモンレセプターの代用物として作用する)；及び
少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換され且つ少なくとも最初の４つのＮ末端アミノ酸が第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最初の６つのＮ末端アミノ酸で置換されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット(ここに、該第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、該キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が該異種性ＧＰＣＲを該酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように同じであるか又は異なり；そして該異種性ＧＰＣＲのシグナル変換活性の細胞外シグナルによる調節が、検出可能なシグナルを与える)。
【００４０】
好適具体例において、このキメラＧ蛋白質は、少なくとも５つのＣ末端アミノ酸が第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換され且つ最初の５つのＮ末端アミノ酸が第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最初の１１のＮ末端アミノ酸で置換された内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含み、ここに、該第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、同じである。
【００４１】
他の好適具体例において、このキメラＧ蛋白質サブユニットは、最後の５つのＣ末端アミノ酸が第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換され且つ最初の２３のＮ末端アミノ酸が第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最初の２１のＮ末端アミノ酸で置換された内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含み、ここに、該第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、同じである。
【００４２】
他の面において、この発明は、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換された内因性Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニットである。
【００４３】
好適具体例において、該Ｇｐａ１の最後の５つのＣ末端アミノ酸は、異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換される。
【００４４】
他の好適具体例において、該Ｇｐａ１の最後の６つのＣ末端アミノ酸は、異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の６つのＣ末端アミノ酸で置換される。
【００４５】
他の具体例において、この発明は、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換され且つＮ末端が第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最初の５つのＮ末端アミノ酸に操作可能に結合されている内因性Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニットであり、ここに、該第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、同じであるか又は異なる。
【００４６】
好適具体例において、該Ｇｐａ１の最後の５つのＣ末端アミノ酸は、該第一の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換されており且つ該Ｇｐａ１の最初の５つのＮ末端アミノ酸は、該第二の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最初の１１のＮ末端アミノ酸で置換されている。
【００４７】
他の好適具体例において、該Ｇｐａ１の最後の５つのＣ末端アミノ酸は、該第一の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換されており且つ該Ｇｐａ１の最初の２３のＮ末端アミノ酸は、該第二の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最初の２１のＮ末端アミノ酸で置換されている。
【００４８】
他の好適具体例において、この第一及び第二の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、同じである。
【００４９】
他の面において、この発明は、下記を含む、酵母細胞により発現される異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのモジュレーターを同定する方法である：
この発明の酵母細胞の混合物を試験化合物に接触させ；
この混合物中の細胞に検出可能なシグナルを生成させ；
そして
該レセプターのモジュレーターとしての試験化合物を同定する。
【００５０】
他の具体例において、この発明は、下記を含む、酵母細胞により発現される異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのモジュレーターを同定する方法である：
この発明の酵母細胞の混合物を該レセプターのリガンドと接触させ；
この混合物中の細胞に検出可能なシグナルを生成させ；
そして
この酵母細胞により発現される異種ポリペプチドを該レセプターのモジュレーターとして同定する。
【００５１】
他の具体例において、この発明は、下記を含む、酵母細胞により発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのモジュレーターを同定する方法である：
請求項７８に記載の酵母細胞の第一の混合物を酵母細胞の第二の混合物と接触させ、ここに、酵母細胞の第二の混合物は、集合的に、第一の混合物の酵母細胞の細胞膜中で発現された該レセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置に輸送される異種の試験ポリペプチドのライブラリーを発現し；
第一の混合物中の細胞に検出可能なシグナルを生成させ；そして
第二の混合物中の異種性試験ポリペプチドをこの酵母細胞により発現された該レセプターのモジュレーターとして同定する。
【００５２】
他の具体例において、酵母細胞により発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのモジュレーターを同定する方法は、下記を含む：
この発明の組換え酵母細胞の混合物を用意し、ここに、該酵母細胞の各々における異種性ポリペプチドは、異種性試験ポリペプチドであり；
この混合物中の細胞に検出可能なシグナルを生成させ；
そして
異種性試験化合物を該異種性レセプターのモジュレーターとして同定する。
【００５３】
更に別の具体例においては、下記を含む、この発明の酵母細胞により発現される異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのモジュレーターを同定する方法を提供する：
この発明の酵母細胞の混合物を該レセプターのリガンドと接触させ；
この混合物中の細胞に検出可能なシグナルを生成させ；
そして
この酵母細胞により発現された異種性ポリペプチドを該レセプターのモジュレーターとして同定する。
【００５４】
この発明は又、下記のキメラをも指向している：SEQ ID NO:１０７のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット；SEQ ID NO:１０８のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット；SEQ ID NO:１０９のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット；SEQ ID NO:１１０のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット；SEQ ID NO:１１１のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット；SEQ ID NO:１１２のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット；SEQ ID NO:１１３のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット；SEQ ID NO:１１４のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット；SEQ ID NO:１１５のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット；SEQ ID NO:１１８のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット；及びSEQ ID NO:１２３のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
【発明の概要】
【００５５】
本発明は、とりわけ、酵母細胞で発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)の活性を特異的に調節する医薬的に有効な化合物のスクリーニング及び同定のための迅速な、効果的なアッセイを提供する。これらの主題のアッセイは、多数の化合物(例えば、ライブラリー中の化合物)を迅速にスクリーニングして、レセプターアゴニスト又はアンタゴニストであるものを同定することを可能にする。重要な組成物例えば新規な組換え酵母細胞及び新規な遺伝子構築物も又、本発明に包含される。これらのアッセイは、細胞機能の調節並びに細胞のレセプターと特異的に相互作用する化合物の薬理学の理解に有用であり得る化合物の発見のための便利な形式を提供する。
【００５６】
本発明の実施においては、当分野で公知の標準的技術を用いることができる。例えば、Sherman,1991,Methods Enzymol.194:3; Sherman及びHicks,1991,Methods Enzymol.194:21; Sambrook等,Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版(Sambrook,Fritsch及びManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989又は1991年版)を参照されたい。
【００５７】
この発明の更なる説明の前に、この明細書、実施例及び添付の請求の範囲で用いた幾つかの用語を、便宜のために、ここに集める。
【００５８】
Ｉ．定義
用語「化合物」は、ここで用いる場合(例えば、「試験化合物」)、外因的に加えた試験化合物とペプチドライブラリーから内因的に発現されたペプチドの両方を包含することを意味する。例えば、ある幾つかの具体例においては、試薬細胞は、スクリーニングされる試験化合物をも生成する。例えば、試薬細胞は、例えば、異種性レセプター活性を調節する能力についてスクリーニングされる試験ポリペプチド、試験核酸及び／又は試験炭水化物を生成することができる。かかる具体例においては、かかる試薬細胞の培養物は、集合的に、潜在的エフェクター分子のライブラリーを与え、レセプター機能を作動し又は拮抗するこのライブラリーのメンバーを選択し又は同定することができる。その上、この試薬細胞を用いて、関心あるレセプターを介するシグナルを変換する作用因子を検出することができるということが明らかとなろう。
【００５９】
他の具体例においては、この試験化合物を、外因的に加える。かかる具体例においては、この試験化合物を試薬細胞と接触させる。活性についてスクリーニングされ得る典型的化合物には、ペプチド、核酸、炭水化物、小型有機分子及び天然物抽出ライブラリーが含まれるが、これらに限らない。かかる具体例においては、レセプター媒介のシグナリング機能を作動し又は拮抗する両化合物を選択して同定することができる。
【００６０】
用語「非ペプチド性化合物」は、少なくとも部分的に、自然のペプチド結合により結合された天然のＬ−アミノ酸残基と異なる分子構造よりなる化合物を包含することを意図している。しかしながら、「非ペプチド性化合物」は、完全に又は部分的に、擬似ペプチド構造例えばＤ−アミノ酸、非天然Ｌ−アミノ酸、改変されたペプチド主鎖等並びに、完全に又は部分的に、自然のペプチド結合により結合された天然のＬ−アミノ酸残基と関係のない分子構造からなる化合物を包含することを意図している。「非ペプチド性化合物」は又、天然生成物を包含することをも意図している。
【００６１】
ここで用いる場合、「組換え細胞」は、異種ＤＮＡの導入により改変された任意の細胞を包含する。対照用細胞は、組換え細胞と実質的に同じであるが、異種ＤＮＡによりコードされる少なくとも一の蛋白質を発現しない(例えば、レポーター遺伝子構築物、レセプター又は試験ポリペプチドを含まず又は発現しない)細胞を包含する。
【００６２】
ここで用いる場合、「異種ＤＮＡ」又は「異種核酸」は、ゲノムの部分として自然には存在しないＤＮＡ又は自然において存在する位置と異なるゲノム中の位置で見出されるＤＮＡを包含する。異種ＤＮＡは、自然にはその位置に存在せず又はそれが導入された細胞にとって内因性でなく他の細胞から得られたものである。一般に、必然的ではないが、かかるＤＮＡは、通常それが発現される細胞により生成される蛋白質をコードする。異種ＤＮＡは、異なる種に由来するのが好ましいが、同種由来であってもよい。特に好適な具体例においては、それは、哺乳動物例えばヒトのものである。異種ＤＮＡは、外来ＤＮＡとも呼ばれる。当業者が細胞にとって異種であり又は外来性であると認め又は考える任意のＤＮＡは、ここでは、用語異種ＤＮＡに包含される。異種ＤＮＡの例には、試験ポリペプチド、レセプター、レポーター遺伝子、転写及び翻訳調節配列、又は選択マーカー若しくは追跡用マーカー蛋白質例えば薬物耐性を付与する蛋白質をコードするＤＮＡが含まれるが、これらに限られない。
【００６３】
用語「異種蛋白質」、「組換え蛋白質」及び「外因性蛋白質」は、この明細書中で交換可能に用いられ、組換えＤＮＡ技術により生成されたポリペプチドをいう(該技術においては、一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡを適当な発現ベクター中に挿入し、それを用いて宿主細胞をトランスフォームして異種蛋白質を生成する)。即ち、このポリペプチドは、異種核酸から発現される。
【００６４】
「オーファンレセプター」は、特異的な天然のリガンドが未だ記載されていないレセプターに与えられる呼称である。
【００６５】
ここで用いる場合、用語「細胞外シグナル」は、直接又は間接に細胞外シグナルと相互作用する細胞表面蛋白質を介して細胞内に変換される環境中の分子及び変化を包含することを意図している。細胞外シグナル又はエフェクター分子には、ある仕方で細胞表面蛋白質の活性を変化させる任意の化合物又は物質が含まれる。かかるシグナルの例には、細胞表面レセプターに結合してかかるレセプターの活性を調節するアセチルコリン、成長因子及びホルモン等の分子、脂質、糖及びヌクレオチドが含まれるが、これらに限られない。用語「細胞外シグナル」には、細胞レセプターの活性を調節しそれにより細胞内機能に影響を及ぼす未だ同定されてない物質も含まれる。かかる細胞外シグナルは、特異的細胞表面レセプターの活性を調節することにより特定の病気を治療するために用いることのできる潜在的な薬理学的作用因子である。
【００６６】
ここで用いる場合、「細胞表面レセプター」は、細胞の表面に存在し、細胞外環境と相互作用して、その環境に関する情報を細胞内に、細胞内の第２のメッセンジャーの活性又は特異的プロモーターの転写(特異的遺伝子の転写を生じる)を調節する仕方で伝達し又は変換する分子をいう。「異種性レセプター」は、「異種蛋白質」の特別の具体例であり、異種性レセプターは、異種ＤＮＡによりコードされ、この異種ＤＮＡの組換え細胞中での発現に際して異種性レセプターがその組換え細胞中で発現される。好適なレセプターは、Ｇ蛋白質共役型レセプターであり、典型的ＧＰＣＲを、ここに詳細に記載する。
【００６７】
用語「シグナル変換」は、細胞外環境から細胞膜を通しての細胞内への物理的又は化学的シグナルの処理を包含することを意図しており、酵素(例えば、プロテアーゼ又は他のリン酸化パターン若しくは他の翻訳後修飾を変えることのできる酵素)の活性化／不活性化、イオンチャンネル若しくは細胞内イオン貯蔵の活性化、グアニンヌクレオチド結合蛋白質中間体を介するエフェクター酵素の活性化、イノシトールホスフェートの形成、アデニリルシクラーゼの活性化若しくは不活性化、転写因子の直接的活性化(又は阻害)及び／又は活性化等の幾つかの機構の内の少なくとも一つにより起こり得る。「シグナリング経路」は、特定のシグナルの細胞内への「シグナル変換」に関与する成分をいう。用語「内因性シグナリング経路」は、シグナリング経路の幾つかの又はすべての成分がその細胞の天然の成分であることを指す。かかる経路の例は、酵母の内因性フェロモンシステム経路である。
【００６８】
用語「機能的に統合された」(「細胞内のシグナリング経路に機能的に統合された」又は「内因性酵母シグナリング経路に機能的に統合された」レセプター等)は、レセプターの細胞表面で発現される能力及び発現されたレセプターのモジュレーター(例えば、レセプターのリガンド)に結合してシグナルをその細胞のシグナリング経路の成分を介して細胞内に変換する能力をいうことを意図している。例えば、酵母細胞の内因性フェロモン応答経路に機能的に統合されたＧ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)は、その酵母細胞の表面で発現され、その酵母細胞内のフェロモン応答経路のＧ蛋白質と共役し、そのレセプターへのモジュレーターの結合に際してその酵母内にシグナルを変換する。酵母細胞に機能的に統合されるべきＧ蛋白質サブユニットについて、かかるサブユニット例えばキメラの、変異型の又は異種性のサブユニットは、ＧＰＣＲ及び他のＧ蛋白質サブユニット(これも、酵母細胞にとって内因性であってよく、キメラであってよく又は異種性であってよい)の両方と共役することができなければならない。変換されたシグナルは、交配因子に対する幾つかの応答の何れか一つを測定することにより検出することができる(かかる応答は、酵母細胞で起きるものであり、例えば、成長停止又はフェロモンシステム経路の調節により生成されるシグナルに応答性の指標遺伝子の転写)。
【００６９】
用語「指標遺伝子」は、一般に、標的レセプター又はイオンチャンネルにより調節されるシグナル変換経路に応答して発現される発現可能な(例えば、転写され得て且つ(適宜)翻訳され得る)ＤＮＡ配列をいう。典型的な指標遺伝子には、宿主細胞の未改変の内因性遺伝子、改変された内因性遺伝子、又は異種性構築物のレポーター遺伝子(例えば、レポーター遺伝子構築物の部分)が含まれる。
【００７０】
用語「内因性遺伝子」は、自然において細胞のゲノムの部分である細胞内の遺伝子をいうことを意図しており、最も好ましくは、そのゲノム中での自然の位置に存在する(細胞に導入された「異種」ＤＮＡに対して)。同様に、用語「内因性蛋白質」は、細胞の内因性遺伝子によりコードされる細胞の蛋白質を包含することを意図している。
【００７１】
指標遺伝子として用いるべき内因性遺伝子は、その遺伝子の天然の調節エレメント(例えば、その遺伝子の発現を自然に調節する天然のプロモーター／エンハンサーエレメント)又はを含むことができ、又は内因性遺伝子は、「異種性プロモーター」(又は他の異種性調節エレメント)に「機能的に結合」(即ち、機能的に共役)され得る。「異種性プロモーター」は、この異種性プロモーターが機能的に結合された遺伝子を自然においては調節しないプロモーターをいう。例えば、通常フェロモン応答性でない内因性酵母遺伝子を、酵母フェロモンシステムにより生成されるシグナルに応答性の異種性プロモーターに機能的に結合しそれによりフェロモン応答性をその内因性酵母遺伝子に付与することができる。内因性酵母遺伝子の指標遺伝子としての利用方法は、米国特許出願第＿＿＿＿号(表題「Methods and Compositions for Identifying Receptor Effectors」、１９９７年９月２４日出願、弁理士帳簿番号ＣＰＩ−０３１ＣＰ２)に更に記載されている(この内容を明白に本明細書中に参考として援用する)。
【００７２】
用語「内因性シグナリング経路により生成されるシグナルの変化の検出」(例えば、内因性酵母シグナリング経路)は、内因性シグナリング経路の成分の活性化に際して生じる内因性の第２メッセンジャーの変化、内因性シグナリング経路の成分の活性化に際して誘導される内因性遺伝子転写の変化、及び／又は内因性シグナリング経路の成分の活性化に際しての内因性蛋白質の活性の変化の検出を包含することを意図している。ある具体例において、用語「内因性シグナリング経路により生じるシグナルの変化の検出」は又、細胞に対する一般的な、全体的な変化例えば細胞成長又は細胞形態の変化の検定をも包含することができる。
【００７３】
ここで用いる場合、「レポーター遺伝子構築物」は、転写調節配列に機能的に結合された「レポーター遺伝子」を含む核酸をいう。このレポーター遺伝子の転写は、これらの配列により制御される。これらの制御配列の少なくとも一つの活性は、標的レセプター蛋白質により直接又は間接に調節される。これらの転写調節配列には、プロモーター及び他の調節領域例えばプロモーター活性を調節するエンハンサー配列、又はプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼの活性若しくは効率を調節する調節配列、又はエフェクター分子(細胞外シグナルと標的レセプターとの相互作用により特異的に誘導されるものを含む)により認識される調節配列が含まれる。例えば、プロモーターの活性の調節は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域への結合を変えることにより、或は、転写の開始又はｍＲＮＡの伸長を邪魔することにより達成され得る。かかる配列は、ここでは、集合的に、転写調節エレメント又は配列と呼ぶ。更に、この構築物は、生じたｍＲＮＡの翻訳を変化させ、それによりレポーター遺伝子産物の量を変化させるヌクレオチド配列を含むことができる。本発明のレポーター遺伝子構築物は、異種的に発現されたレセプターの調節に応じて変換されたシグナルに応答して検出可能な読出しを与える。
【００７４】
「(異種性)レセプターの調節」及び「レセプター蛋白質のシグナル変換活性の調節」等における用語「調節」は、様々な文法形態において、レセプター活性の誘導及び／又は増強作用並びに阻害及び／又はダウンレギュレーション及び／又はレセプターの少なくとも一のシグナル変換経路のダウンレギュレーションを包含することを意図している。
【００７５】
アゴニスト及びアンタゴニストは、レセプターを介するシグナル変換を調節する「レセプターエフェクター」分子である。レセプターエフェクター分子は、レセプターに結合することができ(必ずしも天然のリガンドの結合部位ではない)、或は、例えばレセプターを調節する成分か又はそのレセプターにより開始されたシグナル変換経路において機能する成分の活性に影響を及ぼすことによりレセプターの活性を調節することができる。レセプターエフェクターは、単独で用いてシグナル変換を調節することができる(即ち、代用リガンドたり得る)し、又は天然のリガンド若しくは他の公知のアクチベーターの存在下でシグナル変換を変化させることができる(この天然のリガンドは、シグナリングを促進し又は阻害する)。例えば、「アンタゴニスト」は、レセプターのシグナル変換活性をブロックし又は減じる分子であり、例えば、それらは、競争的に、非競争的に及び／又はアロステリックに、レセプターからのシグナル変換を阻害するが、他方、「アゴニスト」は、レセプターのシグナル変換活性を増強し、誘導し又は増大させる。用語「代用リガンド」は、レセプターからのシグナル変換を誘導するアゴニストをいう。
【００７６】
用語「自己分泌細胞」は、ここで用いる場合、物質を生成する同一細胞上又は内部に位置するレセプターを刺激し得る物質を生成する細胞をいう。例えば、野生型ＭＡＴα及びＭＡＴａ細胞は、自己分泌性でない。しかしながら、α因子とα因子レセプターの両方又はａ因子とａ因子レセプターの両方を機能的形態で生成する酵母細胞は、自己分泌性である。拡大により、レセプターを活性化する能力に関して(例えば、Ｇ蛋白質共役型レセプターの活性化により)スクリーニングされたペプチドを生成し且つレセプターも発現する細胞は、「自己分泌細胞」と呼ばれる。幾つかの場合には、かかる細胞は、幾つかの細胞は、発現されたレセプターを活性化しないであろうライブラリー由来のペプチドを発現するであろうから、「推定上の自己分泌細胞」とも呼ばれ得る。多数の異なるペプチドが生成されるかかる細胞のライブラリーにおいては、少なくとも一の細胞がこの用語の一層厳密な意味において「自己分泌性」であることは、ありそうなことである。
【００７７】
ここで用いる場合、用語「キメラの」Ｇ蛋白質サブユニットは、少なくとも２つの別個のポリペプチド(酵母Ｇ蛋白質サブユニット由来の第１のポリペプチド及び異種性Ｇ蛋白質サブユニット由来の第２のポリペプチド)からなるＧ蛋白質サブユニットをいう。これらの第１及び第２のポリペプチドの各々は、核酸構築物によりコードされ、この構築物の発現に際して機能的なキメラＧ蛋白質サブユニット(即ち第２のポリペプチドに結合された第１のポリペプチドを含む融合蛋白質)が生成されるように機能的に結合される。好適具体例において、この異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、哺乳動物のものである。特に好適な具体例において、この異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、ヒトのものである。例えば、本発明のキメラＧ蛋白質サブユニットは、Ｇαに結合されたＧＰＡ、Ｇγに結合されたＳＴＥ１８、又はＧβに結合されたＳＴＥ４からのポリペプチドを含むことができる。好適具体例において、特にキメラＧαサブユニットに関して、酵母ＧＰＡ１からのキメラサブユニットの部分は、ＧＰＡ１のアミノ末端の一部分を含み、３３０アミノ酸長未満である。特に好適な具体例において、ＧＰＡ１に由来するキメラサブユニットの部分は、約４０アミノ酸である。他の具体例においては、ＧＰＡ１由来のキメラサブユニットの部分は、約２０アミノ酸である。
【００７８】
ここで用いる場合、内因性酵母蛋白質に関して用語「機能的形態で生成されない」は、幾つかの理由により、例えばこの蛋白質をコードする遺伝子の突然変異又はこの蛋白質をコードする遺伝子の欠失例えば破壊の故に、機能的形態で生成されない蛋白質を包含することを意図している。用語「機能的形態で生成されない」は又、条件的突然変異(例えば、ある条件下では蛋白質が機能的形態で生成されない温度感受性突然変異)を包含することも意図している。
【００７９】
ここで用いる場合、アミノ酸突然変異を示すために用いられる用語、例えば「Ｓ２７０Ｐ」等は、野生型アミノ酸残基(標準的一文字コード)を表し、その後アミノ酸位置を表し、その後置換されたアミノ酸(標準的一文字コード)を表している。従って、Ｓ２７０Ｐは、２７０位の野生型セリンのプロリンでの置換を示している。これらの用語例えば「Ｇαｓ(Ｓ２７０Ｐ)」等は、示された置換を有するＧ蛋白質を表す。従って、用語Ｇαｓ(Ｓ２７０Ｐ)は、野生型の２７０位のセリンに置き換わったプロリンを有するＧαｓサブユニットを表す。
【００８０】
句「最後の例えば４つのＣ末端アミノ酸」及び「最初の例えば６つのＮ末端アミノ酸」は、ポリペプチドに関して、ここで用いる場合、そのアミノ酸は、左から右へ順次的に読まれる(Ｎ末端は、ずっと左にあり、Ｃ末端は、ずっと右にある)。例えば、５０アミノ酸のポリペプチドにおいて、「最後の５つのＣ末端アミノ酸」は、アミノ酸４６〜５０をいう。同様に、「最初の６つのＮ末端アミノ酸」は、アミノ酸１〜６をいう。
【００８１】
用語「位置への輸送」は、ここで用いる場合、酵母細胞の一領域で生成されるがその酵母細胞の別の領域に移動する異種ポリペプチドをいう。
【００８２】
用語「十分なレベルで発現される」は、ここで用いる場合、レセプターのシグナル変換活性を調節することのできる量で生成される異種ポリペプチドをいう。
【００８３】
用語「第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニット」は、用語「第１の異種性Ｇαサブユニット」交換可能に用いられ、Ｇｐａ１蛋白質のＣ末端又はＮ末端アミノ酸を置換するのに用いられるＧαサブユニットのファミリーのメンバーをいう。この「第１のＧ蛋白質サブユニット」は又、Ｇｐａ１蛋白質のＮ末端に操作可能に結合することもできる。Ｇαサブユニットの例には、Ｇα１６；Ｇαｓ；Ｇαｓ；Ｇαｓ；Ｇαｓ；Ｇαｓ；Ｇαｉ２；ＧαｏＢ；Ｇα１２；Ｇα１２；及びＧαｉ２が含まれる。用語「第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニット」は、用語「第２の異種性Ｇαサブユニット」と交換可能に用いられ、Ｇｐａ１蛋白質のＣ末端又はＮ末端アミノ酸を置換するのに用いられるＧαサブユニットのファミリーのメンバーである。キメラＧ蛋白質において、Ｇｐａ１蛋白質は、第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットによりＣ末端で置換され得る。「サンドイッチキメラＧ蛋白質」において、Ｇｐａ１蛋白質のＣ末端アミノ酸は、第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットにより置換することができ、Ｎ末端は、第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットで置換し又は該サブユニットに操作可能に結合することができる。これらの第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、同じであってよく(例えば、Ｇｑ−Ｇｐａ１−Ｇｑ、Ｇｓ−Ｇｐａ１−Ｇｓ等)、又はこれらの第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、異なってよい(例えば、Ｇｑ−Ｇｐａ１−Ｇｓ、Ｇα−Ｇｐａ１−Ｇｑ等)。
【００８４】
ポリペプチドに関して、用語「機能的に結合された」及び「操作可能に結合された」は、ここでは交換可能に用いられ、２つのポリペプチドが各々意図された機能を果たすことができる仕方で繋がれることを意味することを意図している。典型的には、これらの２つのポリペプチドは、ペプチド結合により共有結合で結合される。この融合蛋白質は、好ましくは、標準的組換えＤＮＡ技術により生成される。例えば、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を第２のポリペプチドをコードする他のＤＮＡ分子に連結し、生成したハイブリッドＤＮＡ分子を宿主細胞中で発現させてその融合蛋白質を生成する。これらのＤＮＡ分子を、互いに、５’から３’の向きで、連結後にコードされているポリペプチドの翻訳用フレームが変化しないように連結する(即ち、これらのＤＮＡ分子を、互いに、イン・フレームで連結する)。
【００８５】
ＩＩ．アッセイの概観
上記のように、本発明は、レセプター蛋白質の又はレセプター蛋白質複合体のエフェクターを同定する方法に関係する。本アッセイは、レセプターアゴニスト又はアンタゴニストに関する試験化合物を試すための組換え酵母細胞の混合物の利用により特徴付けられる。以下に一層詳細に記載する通り、試薬細胞は、細胞に機能的に統合されて酵母細胞中で検出可能なシグナルを変換することのできる異種性ＧＰＣＲ蛋白質を発現する。典型的なＧＰＣＲを、以下で議論する。レセプター機能を作動し又は拮抗する化合物を選択し、次いで、そのレセプターにより生成される生化学的シグナルに基づいて又は何らかの一層遠いレセプター媒介された刺激の結果(例えば、内因性ｍＲＮＡ発現の増加等)に基づいて同定することができる(幾つかの具体例においては、かかるシグナルに応答性のレポーター遺伝子の利用による)。ある具体例においては、試験すべき化合物のライブラリーは、酵母細胞により発現されて自己分泌様式での刺激を引き起こすペプチドライブラリーである。
【００８６】
標的レセプターのシグナル変換活性を調節する化合物の能力は、検出シグナルのアップ又はダウンレギュレーションを検出することにより評価することができる。例えば、レセプターにより刺激されるＧＴＰアーゼ活性、リン脂質加水分解又は蛋白質リン酸化を直接測定することができる。或は、レポーター遺伝子の利用は、読出しを与えることができる。何れにせよ、検出シグナルにおける統計的に有意な変化を用いて、標的レセプターのエフェクターである試験ポリペプチドをコードする核酸を含む混合物に由来する細胞の関心ある化合物の単離を容易にすることができる。
【００８７】
ある具体例においては、本アッセイにおいて用いるためのこれらの酵母細胞は、異種性ＧＰＣＲ及びそのレセプターと共役する内因性Ｇ蛋白質サブユニットを発現する。好ましくは、本発明の酵母細胞は、ＧＰＣＲの酵母フェロモンシグナリング経路への共役が増大されるように改変されている。例えば、好適具体例において、これらの酵母細胞は、異種性ＧＰＣＲ及びこのレセプターの酵母細胞への機能的統合を容易にする変異した内因性Ｇ蛋白質サブユニットを発現する。他の好適具体例において、これらの酵母細胞は、異種性ＧＰＣＲ及び異種性Ｇ蛋白質サブユニットを発現する。特に好適な具体例においては、異種性ＧＰＣＲ及び異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、同一起源例えば哺乳動物起源である。更に別の好適具体例においては、これらの酵母細胞は、変異した異種性Ｇ蛋白質サブユニットを発現する。
【００８８】
更に別の好適具体例において、これらの酵母細胞は、キメラＧ蛋白質サブユニットを発現する。特に好適な具体例において、異種性ＧＰＣＲ及びキメラＧ蛋白質サブユニットの異種性セグメントは、同じ起源に由来する。一層好適な具体例において、このＧ蛋白質サブユニットキメラ中の第二のアミノ鎖配列は、哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニットに由来する。特に好適な具体例において、この第二のアミノ酸配列は、ヒトＧ蛋白質サブユニット配列に由来する。
【００８９】
上記の具体例は、互いに排他的ではないということは、更に理解されよう。例えば、ある好適具体例において、酵母細胞は、第一の変異した又はキメラのＧ蛋白質サブユニットと第二の別の変異した又はキメラのＧ蛋白質サブユニットを発現して異種性レセプターに対する共役を増大させることができる。
【００９０】
ある具体例において、これらの酵母細胞は又、異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのＧ蛋白質への機能的共役に際して検出可能なシグナルを生成する指標遺伝子をも発現する。ある具体例においては、この指標遺伝子は、標的レセプターのシグナル変換活性に応答性の少なくとも一つの転写調節エレメントに機能的に結合されたレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物であり、このレポーター遺伝子の発現レベルがレセプター依存性の検出シグナルを与える。レポーター遺伝子からの転写の量は、当業者に公知の任意の方法を用いて測定することができる。例えば、特異的なｍＲＮＡ発現をノーザンブロットを用いて検出することができ、特異的な蛋白質産物を特徴的な染色又は固有の活性によって同定することができる。好適具体例において、レポーターの遺伝子産物を、その産物と結合した固有の活性によって検出する。例えば、レポーター遺伝子は、酵素活性により、色、蛍光又はルミネセンスに基づく検出シグナルを生じる遺伝子産物をコードすることができる。
【００９１】
指標遺伝子の活性化例えばレポーター遺伝子の発現の量を、次いで、同じ細胞における試験化合物の不在時の発現の量と比較し、又は特異的レセプターを欠く実質的に同じ細胞における転写の量と比較することができる。対照用細胞は、組換え細胞を調製したのと同じ細胞(異種ＤＮＡ例えば試験ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡの導入により改変されていないもの)に由来してよい。或いは、それは、特異的レセプターが除去された細胞であってよい。転写の量の如何なる差異(例えば統計的に有意の差異)も、試験化合物が何らかの仕方で特異的レセプターの活性を変化させたことを示す。
【００９２】
他の好適具体例において、レポーター遺伝子は、この化合物がレセプターに対するエフェクターである細胞が成長における利点を有するように選択方法を与える。例えば、レポーターは、細胞生存力を増大させ、細胞の栄養要求性を軽減しそして／又は薬物に対する耐性を与えることができた。
【００９３】
これらの読出しの何れか一つを用いることにより、異種性レセプターを介するシグナリングを調節する化合物を選択することができる。もしこの化合物がレセプター蛋白質を介するシグナリングを調節するようでなければ、アッセイを反復することができ又、組換え細胞を最初に標的レセプターの公知のアクチベーターと接触させてそのレセプターからのシグナル変換を誘導し且つ例えばレセプターアンタゴニストを同定するためにこの化合物をそのレセプター活性を阻害する能力についてアッセイするステップの導入により改変することができる。更に別の具体例においては、化合物を、レセプターの公知のアクチベーターに対する応答を強化するメンバーについてスクリーニングすることができる。
【００９４】
ＩＩＩ．宿主細胞
本発明の宿主細胞は、培養することができ且つ外因性レセプターを宿主細胞の適当なシグナル変換機構に組み合わせることのできる酵母の任意の種であってよい。典型的な種には、Kluyverei lactis、Schizosaccharomyces pombe及びUstilaqo maydisが含まれるが、サッカロミセス・セレビシエが好適である。本発明の実施に用いることのできる他の酵母は、Neurospora crassa、Aspergillus niger、Aspergilus nidulans、Pichia pastoris、Candida tropicalis及びHansenula polymorphaである。用語「酵母」は、ここで用いる場合、厳密な分類学的意味における酵母即ち単細胞生物のみならず、酵母様の多細胞のカビ又は糸状菌も含む。
【００９５】
適当な宿主細胞の選択も又、検出シグナルの選択により影響を受けるであろう。例えば、上記のようなレポーター構築物は、標的レセプターに共役したシグナル変換経路に応答性の転写活性化(又は不活性化)に際して選択可能な又はスクリーニング可能な特徴を与える。指標遺伝子は、宿主細胞経路で前に未改変の遺伝子例えば酵母における成長停止の原因である遺伝子であってよい。ある具体例において、宿主細胞遺伝子は、「レセプター応答性」プロモーターに操作可能に結合されていてよい。或いは、それは、そのように結合された異種遺伝子であってよい。適当な遺伝子及びプロモーターは、以下で議論する。
【００９６】
最適の選択又はスクリーニングを達成するためには、宿主細胞の表現型が考慮されよう。例えば、フェロモン応答性のキメラＨＩＳ３遺伝子の野生型ＨＩＳ３遺伝子を有する酵母への導入は、遺伝的選択を失敗させるであろう。従って、栄養による選択を達成するためには、栄養要求性の株が好ましい。ヒスチジンに対する栄養要求性である酵母株(ＨＩＳ３)が、知られており、Struhl及びHill,(1987)Mol.Cell.Biol.,7:104； Fasullo及びDavis,Mol.Cell.Biol.,(1988)8:4370を参照されたい。このＨＩＳ３(イミダゾールグリセロールホスフェートデヒドラターゼ)遺伝子が酵母における選択マーカーとして用いられた。Sikorski及びHeiter,(1989)Genetics,122:19； Struhl等,P.N.A.S.(1979)76:1035を参照されたい；ＦＵＳ１−ＨＩＳ３融合物については、Stevenson等,(1992)Genes Dev.,6:1293を参照されたい。
【００９７】
ある具体例においては、宿主酵母細胞は、別の方法で改変されていてよい。例えば、相同なレセプターを介するシグナリングによる影響を最小にするために、突然変異又は欠失等によって、細胞内に存在する相同なレセプター例えばフェロモンレセプターを不活性化することは望ましい。宿主細胞の遺伝子に関して、「不活性化」は、機能的遺伝子産物の生成が阻止され又は阻害されることを意味する。不活性化は、遺伝子の欠失、発現が起こらないようなプロモーターの突然変異又は遺伝子産物が不活性となるようなコード配列の突然変異により達成することができる。不活性化は、部分的であっても全体的であってもよい。
【００９８】
主題のアッセイの好適具体例において、これらの酵母細胞は、下記の特徴の少なくとも一つを有する：(ａ)内因性ＦＵＳ１遺伝子が不活性化されており；(ｂ)内因性ＳＳＴ２遺伝子及び／又は脱感作に関与する他の遺伝子が不活性化されており；(ｃ)もし相同な内因性のレセプター遺伝子があるならば、それは不活性化されており；そして(ｄ)もし酵母が外因性レセプターに対する内因性リガンドを生成するならば、そのリガンドをコードする遺伝子は不活性化されている。
【００９９】
外因性レセプターが連続的にペプチドにさらされることは望ましい。幾つかの場合には、これは、刺激に対するフェロモン経路の脱感作を生じ得る。例えば、交配シグナル変換経路は、フェロモンの分解及びフェロモンシグナル変換のレセプター、Ｇ蛋白質及び／又は下流エレメントの機能のＳＳＴ２、ＳＴＥ５０、ＡＦＲ１(Konopka,J.B.(1993)Mol.Cell.Biol.13:6876-6888)及びＳＧＶ１、ＭＳＧ５及びＳＩＧ１遺伝子の産物による改変を含む幾つかの機構により脱感作されることが知られている。これらの遺伝子における選択された突然変異は、フェロモンに対する過敏及びフェロモンの存在に対する適応不能へと導く。例えば、機能を邪魔する突然変異を、異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターを発現している株へ導入することは、野生型株に対する有意の改善を構成し、これらのレセプターと相互作用する化合物についての極めて鋭敏なバイオアッセイの開発を可能にする。他の突然変異例えばＳＴＥ５０、ｓｇｖ１、ｂａｒ１、ｓｔｅ２、ｓｔｅ３、ｐｉｋ１、ｍｓｇ５、ｓｉｇ１及びａｆｔ１は、このバイオアッセイの感度を増加させる同様の効果を有する。従って、脱感作は、ＳＳＴ遺伝子を、もはや機能的蛋白質を生成しないように突然変異させること(欠失を含み得る)により又は上記の他の遺伝子の一つを突然変異させることにより回避することができる。
【０１００】
ある具体例においては、宿主酵母細胞を補完することが望ましいであろう(例えば、宿主細胞の不活性化遺伝子の最小の部分的機能を外因性核酸により供給することができる)。例えば、酵母細胞は、レセプター及びシグナル変換蛋白質の哺乳動物の相同物による補完により、「哺乳動物化」されそして「ヒト化」さえされ得る。説明のために、酵母のＢｙｒ２／Ｓｔｅ１１遺伝子の不活性化を、ヒトのＭＥＫＫ遺伝子の発現により補完することができる。
【０１０１】
主題のアッセイで用いるための補完は、如何なる過度の実験も要せずに構築することができる。実際、多くの酵母の哺乳動物のシグナル変換蛋白質による遺伝的補完が、当分野においては記載されている。例えば、Mosteller等(1994)Mol Cell Biol 14:1104-12は、ヒトのＲａｓ蛋白質がS.cerevisiaeにおけるｒａｓ突然変異の喪失を補完し得ることを示している。その上、Toda等(1986)Princess Takamatsu Symp 17:253-60は、ヒトのｒａｓ蛋白質が酵母におけるＲＡＳ１及びＲＡＳ２蛋白質の喪失を補完することができ、それ故、機能的に相同であることを示している。ヒト及び酵母のＲＡＳ蛋白質の両者は、酵母膜に存在するマグネシウム及びグアニンヌクレオチド依存性アデニレートシクラーゼ活性を刺激することができる。Ballester等(1989)Cell 59:681-6は、哺乳動物のＧＡＰ蛋白質を酵母S.cerevisiae中で発現するベクターを記載している。酵母中で発現された場合、ＧＡＰは、ヒトのｒａｓ蛋白質の機能を阻害し、ＩＲＡ１の喪失を補完する。ＩＲＡ１は、ＧＡＰに対する相同性を有する蛋白質をコードする酵母遺伝子であり、ＲＡＳの上流で作用する。哺乳動物のＧＡＰは、それ故、酵母において機能して酵母ＲＡＳと相互作用する。Wei等(1994)Gene 151:279-84は、ヒトのＲａｓ特異的なグアニンヌクレオチド交換因子Ｃｄｃ２５ＧＥＦがS.cerevisiaeにおけるＣＤＣ２５機能の喪失を補完することができることを記載している。Martegani等(1992)EMBO J 11:2151-7は、ＣＤＣ２５、S.cerevisiaeＲＡＳアクチベーターの相同物をコードするマウスｃＤＮＡの機能的補完によるクローン化を記載している。Vojtek等(1993)J Cell Sci 105:777-85及びMatviw等(1992)Mol Cell Biol 12:5033-40は、マウスＣＡＰ蛋白質例えばｒａｓ媒介のシグナル変換に関係するアデニリルシクラーゼ関連蛋白質が、如何にしてS.cerevisiaeの欠陥を補完することができるのかを記載している。Papasavvas等(1992)Biochem Biophys Res Commun 184:1378-85も又、不活性化された酵母のアデニルシクラーゼが哺乳動物のアデニルシクラーゼ遺伝子によって補完され得ることを示唆している。Hughes等(1993)Nature 364:349-52は、分裂酵母におけるｂｙｒ１の哺乳動物ＭＡＰキナーゼキナーゼ(ＭＥＫ)による補完を記載している。Parissenti等(1993)Mol Cell Endocrinol 98:9-16は、ウシのプロテインキナーゼＣ(ＰＫＣ)の酵母における再構成を記載している。Ｃａ(２＋)及びリン脂質依存性のＳｅｒ／ＴｈｒキナーゼＰＫＣは、哺乳動物細胞における細胞性シグナルの変換において重要な役割を演じている。Marcus等(1995)PNAS 92:6180-4は、S.pombeにおけるｓｈｋ１ヌル突然変異の構造的に関係するS.cerevisiaeのＳｔｅ２０又は哺乳動物のｐ６５ＰＡＫプロテインキナーゼによる補完を示唆している。
【０１０２】
ＩＶ．発現系
一般に、発現ベクターが宿主細胞内で複製できることは望ましい。異種ＤＮＡは、宿主ゲノムに組み込まれ得て、その後染色体ＤＮＡの一部として複製されるか、又はそれは、プラスミドの場合のように自律的に複製するＤＮＡであってもよい。後者の場合においては、ベクターは、宿主において機能的な複製起点を含む。組込み型ベクターの場合には、そのベクターは、組込みを容易にする配列例えば宿主の配列に相同な配列又はインテグラーゼをコードする配列を含むことができる。
【０１０３】
細菌、カビ、酵母及び哺乳動物細胞宿主で用いるための適当なクローニングベクター及び発現ベクターは、当分野で公知であり、例えば、Powels等(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)に記載されている。哺乳動物用発現ベクターは、非転写エレメント例えば複製起点、発現すべき遺伝子に結合された適当なプロモーター及びエンハンサー及び５’又は３’隣接非転写配列、並びに５’又は３’非翻訳配列例えば必須のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、及び転写終結配列を含むことができる。
【０１０４】
酵母における組換え蛋白質の発現のための多くのベクターが存在する。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、及びＹＲＰ１７は、遺伝的構築物をS.cerevisiaeに導入するのに有用なクローニング及び発現用ビヒクルである(例えば、Broach等(1983)[Experimental Manipulation of Gene Expression (M.Inouye編)Academic Press,p.83](参考として本明細書中に援用する)を参照されたい)。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２の複製起点が存在するので大腸菌中で複製することができ且つ酵母の２ミクロンプラスミドの複製デターミナントの故にS.cerevisiae中で複製することができる。更に、薬物耐性マーカー(例えば、アンピシリン)を利用することができる。酵母における機能に適したプロモーターには、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ(Hitzeman等,J.Biol.Chem.255,2073(1980))又は他の解糖系酵素(Hess等,J.Adv.Enzyme Req.7,149(1968)；及びHolland等Biochemistry 17,4900(1978))例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ用のプロモーターが含まれる。酵母での発現に用いるための適当なベクター及びプロモーターは、更に、R.Hitzeman等,EPO Publn.No.73,657に記載されている。成長条件により制御される転写の更なる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関係する分解酵素及び上記のメタロチオネイン及びグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ並びにマルトース及びガラクトース利用の原因となる酵素のためのプロモーター領域である。最後に、２つの一倍体交配型の一方でのみ活性なプロモーターは、ある環境では適当であり得る。これらの一倍体
特異的プロモーターの内で、フェロモンプロモーターＭＦａ１及びＭＦα１は、特に興味深い。
【０１０５】
Ｖ．レセプター
多くの異なるレセプター型が、本発明で用いるための酵母細胞において発現され得る。
本発明の「異種性レセプター」は、本発明の目的のために、遺伝子工学処理される細胞にとって外因性である任意のＧ蛋白質共役型レセプターであってよい。このレセプターは、例えば、植物細胞レセプターであっても動物細胞レセプターであってもよい。植物細胞レセプターへの結合に関するスクリーニングは、例えば除草剤の開発において有用であり得る。動物レセプターの場合には、それは、無脊椎動物起源であっても脊椎動物起源であってもよい。無脊椎動物レセプターは、例えば、殺虫剤の開発を容易にするであろう。酵母の様々な種に由来するレセプターの発現も又、用語「異種性」に含まれ、防カビ剤の開発において利用することができよう。このレセプターは又、脊椎動物の、一層好ましくは哺乳動物の、更に一層好ましくはヒトのレセプターであってもよい。この外因性レセプターも又、好ましくは、７回膜貫通セグメントレセプターである。
【０１０６】
ＧＰＣＲの公知のリガンドには、プリン及びヌクレオチド例えばアデノシン、ｃＡＭＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＡＤＰ、メラトニン等；生体アミン(及び関連天然リガンド)例えば５−ヒドロキシトリプトアミン、アセチルコリン、ドーパミン、アドレナリン、アドレナリン、アドレナリン、ヒスタミン、ノルアドレナリン、ノルアドレナリン、ノルアドレナリン、チラミン／オクトパミン及び他の関連化合物；ペプチド例えば副腎皮質刺激ホルモン(ａｃｔｈ)、メラノサイト刺激ホルモン(ｍｓｈ)、メラノコルチン、ニューロテンシン(ｎｔ)、ボンベシン及び関連ペプチド、エンドセリン、コレシストキニン、ガストリン、ニューロキニンｂ(ｎｋ３)、無脊椎動物タキキニン様ペプチド、サブスタンスｋ(ｎｋ２)、サブスタンスｐ(ｎｋ１)、ニューロペプチドｙ(ｎｐｙ)、状腺刺激ホルモン放出因子(ｔｒｆ)、ブラジキニン、アンギオテンシンｉｉ、べータ−エンドルフィン、ｃ５ａアナフィラトキシン、カルシトニン、ケモカイン(インタークリンとも呼ばれる)、副腎皮質刺激ホルモン放出因子(ｃｒｆ)、ダイノルフィン、エンドルフィン、ｆｍｌｐ及び他のホルミル化ペプチド、フォリトロピン(ｆｓｈ)、カビ交配フェロモン、ガラニン、胃抑制性ポリペプチドレセプター(ｇｉｐ)、グルカゴン様ペプチド(ｇｌｐｓ)、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン(ｇｎｒｈ)、成長ホルモン放出ホルモン(ｇｈｒｈ)、昆虫利尿ホルモン、インターロイキン−８、リウトロピン(ｌｈ／ｈｃｇ)、ｍｅｔ−エンケファリン、オピオイドペプチド、オキシトシン、副甲状腺ホルモン(ｐｔｈ)及びｐｔｈｒｐ、下垂体アデニリルシクラーゼ活性化ペプチド(ｐａｃａｐ)、セクレチン、ソマトスタチン、トロンビン、甲状腺刺激ホルモン(ｔｓｈ)、血管作動性腸管ペプチド(ｖｉｐ)、バソプレシン、バソトシン；エイコサノイド例えばｉｐ−プロスタサイクリン、ｐｇ−プロスタグランジン、ｔｘ−トロンボキサン；レチナールに基づく化合物例えば脊椎動物の１１−シスレチナール、無脊椎動物の１１−シスレチナール及び他の関連化合物；脂質及び脂質ベースの化合物例えばカンナビノイド、アナンドアミド、リゾホスファチジン酸、血小板活性化因子、ロイコトリエン等；興奮性アミノ酸及びイオン例えばカルシウムイオン及びグルタメートが含まれる。
【０１０７】
好適なＧ蛋白質共役型レセプターには、α１Ａ−アドレナリン作動性レセプター、α１Ｂ−アドレナリン作動性レセプター、α２−アドレナリン作動性レセプター、α２Ｂ−アドレナリン作動性レセプター、β１−アドレナリン作動性レセプター、β２−アドレナリン作動性レセプター、β３−アドレナリン作動性レセプター、ｍ１アセチルコリンレセプター(ＡＣｈＲ)、ｍ２ＡＣｈＲ、ｍ３ＡＣｈＲ、ｍ４ＡＣｈＲ、ｍ５ＡＣｈＲ、Ｄ１ドーパミンレセプター、Ｄ２ドーパミンレセプター、Ｄ３ドーパミンレセプター、Ｄ４ドーパミンレセプター、Ｄ５ドーパミンレセプター、Ａ１アデノシンレセプター、Ａ２ｂアデノシンレセプター、５−ＨＴ１ａレセプター、５−ＨＴ１ｂレセプター、５ＨＴ１様レセプター、５−ＨＴ１ｄレセプター、５ＨＴ１ｄ様レセプター、５ＨＴ１ｄべータレセプター、サブスタンスＫ(ニューロキニンＡ)レセプター、ｆＭＬＰレセプター、ｆＭＬＰ様レセプター、アンギオテンシンＩＩ型１レセプター、エンドセリンＥＴＡレセプター、エンドセリンＥＴＢレセプター、トロンビンレセプター、成長ホルモン放出ホルモン(ＧＨＲＨ)レセプター、血管作動性腸管ペプチドレセプター、オキシトシンレセプター、ソマトスタチンＳＳＴＲ１及びＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、カンナビノイドレセプター、濾胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)レセプター、リウトロピン(ＬＨ／ＨＣＧ)レセプター、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)レセプター、トロンボキサンＡ２レセプター、血小板活性化因子(ＰＡＦ)レセプター、Ｃ５ａアナフィラトキシンレセプター、インターロイキン８(ＩＬ−８)ＩＬ−８ＲＡ、ＩＬ−８ＲＢ、デルタオピオイドレセプター、カッパーオピオイドレセプター、ｍｉｐ−１／ＲＡＮＴＥＳレセプター、ロドプシン、レッドオプシン、グリーンオプシン、ブルーオプシン、代謝共役型グルタメートｍＧｌｕＲ１−６、ヒスタミンＨ２レセプター、ＡＴＰレセプター、ニューロペプチドＹレセプター、アミロイド蛋白質前駆体レセプター、インシュリン様成長因子ＩＩレセプター、ブラジキニンレセプター、ゴナドトロピン放出ホルモンレセプター、コレシストキニンレセプター、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、抗利尿ホルモンレセプター、グルカゴンレセプター、及び副腎皮質刺激ホルモンＩＩレセプターが含まれる。
【０１０８】
他の適当なレセプターは、当分野で公知である。用語「レセプター」は、ここで用いる場合、天然の及び変異されたレセプターの両方を包含する。
【０１０９】
これらのＧ蛋白質共役型レセプターの多くは、酵母のａ及びα因子レセプターと同様に、７つの疎水性アミノ酸リッチな領域を含み、これらは、原形質膜内に位置すると想定される。従って、酵母における発現のために、その遺伝子を、処理される細胞内のプロモーター機能に及びやはりその細胞内で機能するシグナル配列に操作可能に結合することができる。例えば、適当なプロモーターには、Ｓｔｅ２、Ｓｔｅ３及びｇａｌ１０が含まれる。適宜、遺伝子のコドンを、酵母における発現に最適化する。Hoekema等(1987)Mol.Cell.Biol.,7:2914-24；Sharp等(1986)14:5125-43を参照されたい。
【０１１０】
幾つかの場合には、酵母で発現される外来レセプターは、その酵母膜中に機能的に統合され、そこで、内因性酵母Ｇ蛋白質と相互作用する。別の場合には、レセプターを改変するか、又は適合性のＧ蛋白質若しくはキメラの(即ち、一部酵母／一部哺乳動物)Ｇ蛋白質サブユニット(外因性レセプターＧ蛋白質と適当に相互作用するもの)を用意することができる。ＳＴＲの相同性は、Dohlman等,Ann.Rev.Biochem.(1991)60:653-88において議論されている。ＳＴＲを比較すると、相同性の明確な空間的パターンが識別され得る。膜貫通ドメインは、しばしば、最も類似しているが、他方、Ｎ末端及びＣ末端領域並びに膜貫通セグメントＶ及びＶＩを繋ぐ細胞質ループは、一層異なっている。種々のＳＴＲ領域の機能的な重要性は、点突然変異(置換及び欠失の両方)を導入することにより及び異なるが関連するＳＴＲのキメラを構築することにより研究されてきた。個々のセグメントに対応する合成ペプチドも又、活性について試験された。アフィニティーラベリングがリガンド結合部位を同定するために用いられてきた。かかる情報は、機能性を増大するためにＧＰＣＲ中に突然変異を造るのに有用であり得る。
【０１１１】
天然の外因性ＧＰＣＲが酵母中で機能的にされ得ないならば、それを、この目的のために突然変異させることができる。外因性レセプターと酵母のレセプターのアミノ酸配列の比較をすることができ、高い相同性の領域と低い相同性の領域を同定することができる。次いで、試行的突然変異を行って、リガンド又はＧ蛋白質の結合に関与する領域をこの膜における機能的統合に必要なものから区別する。外因性レセプターを、次いで、後者の領域において、機能的統合が達成されるまで、一層酵母レセプターに似るように変異させる。もしこれが機能性を達成するのに十分でないならば、次に、突然変異を、Ｇ蛋白質結合に関与する領域で行う。
【０１１２】
好ましくは、酵母ゲノムを、アッセイの解釈を容易にするために、機能的形態の外因性レセプターに相同な酵母レセプターを生成できないように改変する。例えば、内因性Ｇ蛋白質又はＧ蛋白質サブユニットを突然変異させて例えば温度感受性変異体を生成する。
【０１１３】
レセプターをクローニングするために用いた一般的技術は、核酸ハイブリダイゼーション技術により他の公知のレセプターに相同なレセプターを同定する。例えば、レセプターのクローニングは、対応する蛋白質の単離と配列決定により、又はこれらのレセプター間の配列相同性に基づく発現クローニング技術の利用により達成することができる。この技術は、レセプターのリガンドの以前の知識を必要としないので、公知のリガンドを有さずしばしば生物学的機能がはっきりしない多数の「オーファンレセプター」のクローニングを生じた。
【０１１４】
多くのオーファンレセプターは、ＧＰＣＲであるが、すべての型のレセプターがこの大きいファミリーを含む。公知のオーファンレセプターには、核レセプターＣＯＵＰ−ＴＦ１／ＥＡＲ３、ＣＯＵＰ−ＴＦ２／ＡＲＰ１、ＥＡＲ−１、ＥＡＲ−２、ＴＲ−２、ＰＰＡＲ１、ＨＮＦ−４、ＥＲＲ−１、ＥＲＲ−２、ＮＧＦ１Ｂ／Ｎｕｒ７７、ＥＬＰ／ＳＦ−１及びＭＰＬ(Parker等、前出、及びPower等(1992)ＴＩＢＳ13:318-323)が含まれる。多数のオーファンレセプターが、ＥＰＨファミリーにおいて同定されてきた(Hirai等(1987)Science 238:1717-1720)。ＨＥＲ３及びＨＥＲ４は、上皮成長因子レセプターファミリーにおけるオーファンレセプターである(Plowman等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1746-1750)。ＩＬＡは、ヒト神経成長因子／腫瘍壊死因子レセプターファミリーの新規に同定されたメンバーである(Schwarz等(1993)Gene 134:295-298)。ＩＲＲＲは、膜貫通チロシンキナーゼであるオーファンインシュリンレセプター関連レセプターである(Shier等(1989)J.Biol.Chem.264:14606-14608)。幾つかのオーファンチロシンキナーゼレセプターがキイロショウジョウバエにおいて見出されている(Perrimon(1994)Curr.Opin.Cell Biol.6:260-266)。
【０１１５】
一面において、本発明は、ＧＰＣＲ(特に、オーファンＧＰＣＲ)のアゴニスト及びアンタゴニストについて試験するために最適化された新規なアッセイを提供する。これらのアッセイは、酵母の４つの異なる株の利用を含む(各株は、Ｇ蛋白質サブユニットの異なる相補性を含むように処理されている)。このＧ蛋白質サブユニットの様々な組合せの発現は、どのＧ蛋白質サブユニットのキメラ(又はサブユニットの組合せ)がスクリーニングアッセイにおいて最もよく機能するかを知らなくても機能的共役を得る見込みを増大させる。オーファンレセプターのリガンドを同定することの重要性は明らかであり、それは、薬物発見の領域において研究のための広い領域を開く。
【０１１６】
ＶＩ．Ｇ蛋白質サブユニット及び複合体
ある場合には、天然型の酵母又は哺乳動物のＧ蛋白質サブユニットを改変するのが望ましいであろう。例えば、異種性ＧＰＣＲが内因性酵母Ｇ蛋白質サブユニットと十分に共役しない場合、かかるサブユニット例えばＧＰＡ１を改変して共役を改善することができる。かかる改変は、当分野で公知の又は以下に一層詳細に記載する方法を用いて、突然変異例えば位置指定突然変異又はランダム突然変異によってなされ得る。
【０１１７】
或は、異種性サブユニットを発現させることができる。ヘテロ三量体のＧ蛋白質に対するレセプターの共役の特異性は、主として、Ｇ蛋白質のαサブユニットにより決定される。従って、好適具体例において、異種性Ｇαサブユニットは、酵母細胞において発現される。酵母のＧα、ＧＰＡ１の優勢な役割は、このヘテロ三量体のエフェクターシグナリングβγ成分に結合し、封鎖することである。従って、酵母フェロモンシグナリング経路中への機能的統合を達成するために、異種性Ｇαサブユニットは、無活動状態の酵母βγに結合し、レセプターの活性化に際してそれを遊離しなければならない。
【０１１８】
もし機能的統合が達成されないか又は最適でないならば、異種性サブユニットを突然変異させることができる。例えば、一般に、哺乳動物Ｇαサブユニットは、酵母細胞のβγサブユニットと僅かしか共役しない。自身の内因性Ｇαサブユニットを欠く酵母においては、共役に対するこの欠落は、未結合の酵母βγのエフェクター活性のためにフェロモン経路の構成的活性化を生じる。従って、もし天然の異種性Ｇ蛋白質サブユニットが共役を増大させないならば、改変を行うことができる。かかる改変は、このＧ蛋白質サブユニットの酵母Ｇ蛋白質サブユニットに対する類似性を増す一方で異種性レセプター会合Ｇ蛋白質サブユニットに対する類似性を減じるようにデザインされた突然変異の形態を取ることができる。
【０１１９】
例えば、ある残基を、対応する酵母Ｇ蛋白質の残基と同じになるように変化させ、又はその残基の同一交換グループに属するように変化させることができる。改変後に、その改変Ｇ蛋白質サブユニットは、異種性及び／又は酵母Ｇ蛋白質サブユニットと「実質的に相同」であってもなくてもよい。
【０１２０】
Ｇαの場合には、好ましくは、改変を、Ｇβγ結合に関与することがありそうなＧαの領域に集中させる。
【０１２１】
他の具体例においては、改変は、レセプター会合Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも一つのアミノ酸の、対応する酵母Ｇ蛋白質サブユニットのアミノ酸での置換の形態を取り、それにより、キメラＧ蛋白質サブユニットを形成する。好適具体例においては、３つ以上の連続するアミノ酸を置換する。他の具体例においては、点突然変異は、十分であり得る。
【０１２２】
この発明のキメラＧ蛋白質サブユニットは、異種性レセプターの内因性酵母シグナリング経路に対する共役を増大させる。例えば、キメラのＧαサブユニットは、異種性レセプター及び酵母のＧβγ複合体と相互作用し、それによりシグナル変換を可能にする。
【０１２３】
本発明の酵母細胞は、示されたＧ蛋白質構造の少なくとも一つを発現する。例えば、酵母細胞は、キメラのＧαサブユニットと内因性酵母Ｇβγ、哺乳動物Ｇβγ、変異させた哺乳動物Ｇβγ又はキメラのＧβγを発現することができる。
【０１２４】
好適具体例において、レセプターと異種性サブユニットの両者は、同一起源例えば哺乳動物に由来する。特に好適な具体例においては、両者は、ヒト起源である。
【０１２５】
他の好適具体例においては、異種性又はキメラのＧ蛋白質サブユニットを発現する酵母細胞を、内因性の相同なＧ蛋白質サブユニット遺伝子が破壊されるように改変した。
【０１２６】
ある具体例においては、フェロモンレセプターを欠き且つフェロモン応答経路に共役し得る異種性レセプターを有しない酵母株を用いて、内因性酵母Ｇ蛋白質サブユニット、変異させたＧ蛋白質サブユニット又はキメラのＧ蛋白質サブユニットの他の酵母サブユニットに対する親和性を評価することができる。例えば、ｇｐａ１ｐ、キメラｇｐａ−Ｇαｓ又はＧαサブユニットの酵母βγ又は他のキメラβγサブユニットに対する親和性を評価することができる。かかる株は、成長停止へ導くフェロモン応答経路を介するシグナリングのために遊離のβγに依存する。変異型Ｇαサブユニットをかかる系において試験することができ、一層効果的にβγと結合するものはβγを封鎖してシグナリングを減じ又はブロックする。好ましくは、かかるキメラ及びｇｐａ１サブユニットは、ｇｐａ１とβγについて競争することを避けるように、ｇｐａ１-バックグラウンドで評価することができる。例えば、Ｄ２２９Ｓ、Ｅ１０Ｋ、Ｎ２５４Ｄ、又はＳ２８６Ｐを有するＧαｓキメラの変異体(下記参照)は、野生型配列を有するキメラより一層効果的にｂｇを封鎖することが見出された。二重変異体は、やはり、単一変異体より更に一層効果的であった。同様に、高度に効率的なＰＧＫプロモーターからの転写を駆動することによるＧαｓの過剰発現は、レセプターの共役の低下を生じたが、これは、二重変異型Ｇαｓ(Ｄ２２９Ｓ、Ｅ１０Ｋ)の導入により相殺され得る。
【０１２７】
Ｇ蛋白質サブユニット中の及びキメラＧ蛋白質サブユニットの構築中の突然変異の作成についてのガイダンスは、下記に与えられている。
【０１２８】
位置指定突然変異導入対ランダム突然変異導入
Ｇ蛋白質ヘテロ二量体を構成するサブユニットの会合の媒介に関与する決定基を限定する試みにより提出された構造−機能の問題を解くための多くの技術的に認められた方法がある。例えば、ハイブリッド構築物について上で議論した一つのアプローチにおいて、特異的な突然変異又は変化を、利用できる実験的証拠に基づいて、分子に導入する。第２のアプローチにおいて、ランダム突然変異導入技術を、選択又はスクリーニングシステムと一緒に用いて、多数の突然変異を分子に導入し、次いで、ランダムに変異させた分子の集合を所望の表現型についての選択にかけ又は所望の表現型が所望しない表現型のバックグラウンドと対照して認められるスクリーニングにかける。
【０１２９】
ランダム突然変異誘発を用いて、全体分子に突然変異を起こさせることができる又はカセット突然変異誘発により進めることができる。前者の場合には、分子の全体のコード領域をいくつかの方法のうちの１つにより突然変異を誘発する（化学的、ＰＣＲ、ドープされたオリゴヌクレオチド合成）及びランダムに突然変異を生じた分子のそのコレクションを、セレクション又はスクリーニング手順にかける。ランダム突然変異誘発をこの方法で適用することができ、この場合においては研究されている分子は比較的小さく、強力なストリンジェントセレクション又はスクリーニング（これは、必然的に生ずる突然変異ヘテロタイプの異なったクラス間を区別するのに利用可能である。）が存在する。第２のアプローチにおいて、所定の構造（即ち、α−へリックス、β−シート、ターン、サーフィスループ）又は機能的デテルミナント（例えば、キャタリティッククレフト又はバインディングデテルミナント、トランスメンブレンセグメント）にサチュレイティング又はセミランダム突然変異を受けさせて、これらの突然変異を生じさせたカセットは他の野生型の対立遺伝子のコンテクストの中へ再導入される。
【０１３０】
カセット突然変異誘発は、分子の領域に対する特定の機能を示唆するのに有用な実験的証拠が存在して興味のある突然変異体と興味のない突然変異体とを区別するのに有用である強力なストリンジェントセレクション又はスクリーニングが存在する場合に最も有用である。カセット突然変異誘発はまた、親分子が比較的大きくて、所望のものが逐次的に分子に突然変異を起こさせることにより分子の機能的ドメインをマップする（即ち、一度に線状のカセット残基に突然変異を起こさせて、次いで機能についてアッセイする）ことである場合にも有用である。
【０１３１】
本発明は、Ｇα−Ｇβγ又はサブユニット−レセプター会合に含まれるデテルミナントを更に詳細に示すためにランダム突然変異誘発を適用することを提供する。ランダム突然変異誘発を、多くの手段により達成することができる。この多くの手段は、
１．エラーを起こしやすいＴａｑポリメラーゼを利用する蛋白質サブユニットの突然変異体の対立遺伝子を生成して、酵母において共役する可能性について直接アッセイを行うＰＣＲ突然変異誘発、
２．Ｇ−蛋白質をコードする表現カセットを突然変異原に暴露させて、突然変異体の蛋白質生成物を酵母において共役する可能性について直接アッセイを行う化学的突然変異誘発、
３．Ｇ−蛋白質サブユニット遺伝子の部分をコードしているオリゴヌクレオチドのドープ合成、
４．インビボ突然変異誘発において、Ｅ．ｃｏｌｉのミューテーター株、ＸＬＩ−Ｒｅｄ（ｍｕｔＤ５ ｍｕｓＳ ｍｕｔＴ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｍｅｎａｓａ、ＷＩ）を通過させることにより遺伝子のランダム突然変異をＧ−蛋白質サブユニットのコード領域に導入することを含む。
【０１３２】
ある具体例では、例えば、ランダム突然変異誘発をＧα−Ｇβγ会合において含まれると推測される領域に絞ることができる。ランダム突然変異誘発アプローチは、２つの理由にのために実行可能となる。第１に、酵母において、哺乳動物システムでは容易には利用できないストリンジェントスクリーン及び容易な選択（生育対死、転写対転写欠乏）を構成することができる。第２に、酵母を用いる場合に、幾千の形質転換株を介して迅速に効率的にスクリーンすることが可能である。例えば、Ｇαサブユニットの比較的小さい領域が、カセット突然変異誘発についての妥当な標的を表している。カセット突然変異誘発の影響を受けやすい可能性のある別の領域はＧαｉ及びトランスデューシンの結晶構造において溶媒に暴露され形質導入、Ｇαサブユニットのスイッチ領域の表面の範囲を明確にしている。以下に記載されたデータから、この表面は、酵母Ｇβγサブユニットと直接接触している残基を含むと考えられる。それ故、この表面は、突然変異誘発についての妥当な標的であると考えられる。
【０１３３】
Ａ．Ｇαの改変
Ｇα構造のある面は、改変されたＧαサブユニットのデザインに関係している。配列の類似性を測定するために、Ｇα及びＧＰＡ１のアラインメントを生成することができる。Ｇαｓ、Ｇαｉ及びＧα０、Ｇαｑ及びＧαｚを有するＧＰＡ１の全コード領域のアラインメントについては、Ｄｉｅｔｚｅｌ及びＫｕｒｊａｎ（１９８７、Ｃｅｌｌ ５０：５７３）並びにＬａｍｂｒｉｇｈｔら（１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６２１−６２８）を見よ。追加的な配列情報が、Ｍａｔｔｅｒａら（１９８６，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ２０６：３６−４１）、Ｂｒａｙら（１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３：８８９３−８８９７）及びＢｒａｙら（１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：５１１５−５１１９）により提供されている。ＧＰＡ１及び４つの他のＧα蛋白質のアラインメントは、Ｓｔｏｎｅ及びＲｅｅｄ（１９９０．ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０：４４３９）により提供されている。図１に示されているアラインメントもまた見よ。
【０１３４】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧ蛋白質同族体は、Ｄｉｅｔｚｅｌ及びＫｕｒｊａｎ（上記）（彼らは、その遺伝子をＳＣＧＩと呼んだ。）並びにＮａｋａｆｕｋｕら（１９８７ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：２１４０−２１４４）（彼らは、その遺伝子をＧＰＡ１と呼んだ。）により独立にクローン化された。配列解析により、この遺伝子及び哺乳類によりコードされている蛋白質の間の高度の相同性が明らかになった。４つの記載された族、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ及びＧα１２／１３における大部分の哺乳動物Ｇαサブユニットについて約３４０−３５０アミノ酸であるのと比べて、ＧＰＡ１は、４７２個のアミノ酸からなる蛋白質をコードしている。それにもかかわらず、ＧＰＡ１は、今まで同定された全Ｇα蛋白質と全体の配列及び構造的な相同性を共有している。ＧＰＡ１における最高の全体の相同性は、Ｇαｉ族（４８％の同一性、又は保存的置換を伴って６５％）についてのものであり、最低のものは、Ｇαｓ族（３３％の同一性、又は保存的置換を伴って５１％） （Ｎａｋａｆｕｋｕら、上記）についてのものである。
【０１３５】
Ｇαサブユニット間の高配列相同性の領域は、プライマリ配列に全体にわたり分散されており、その領域は、グアニンヌクレオチド結合／ＧＴＰａｓｅドメインを含む配列と最高度の相同性マッピングを共有している。このドメインは、ｒａｓ蛋白質及び蛋白質合成伸長因子ＥＦ−Ｔｕのαβ折りたたみと構造的に類似する。この高度に保存されたグアニンヌクレオチド−結合ドメインは、１組の５つのα−へリックスにより取り巻かれた６鎖のβシートからなる。全てのＧα蛋白質（ＧＰＡ１を含む）中で、最高度の保存が観察されるのは、これらのβシート及びαへリックス内においてである。最小の配列及び構造上の相同性は、コアＧＴＰａｓｅドメインを明確に示すβシート及びαへリックス間の介在ループに見いだされる。全Ｇαサブユニットにおいては、合計で４つの「介在ループ」又は「挿入」が存在する。ウシ桿状体トランスデューシン(bovin rod transducin)のＧＤＰ及びＧＴＰγＳでリガンドされた形態について今日まで報告された結晶構造（Ｎｏｅｌら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６：６５４−６６３）；（Ｌａｍｂｒｉｇｈｔら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６９：６２１−６２８）においては、ループ残基は、コアＧＴＰａｓｅ構造の外部に見いだされている。これらのループ構造についての機能的役割は、ほんの２，３の例で確立された。ホスホジエステラーゼ−γへの共役における直接的な役割は、Ｇαｔの挿入３及び４内の残基について示されているが（Ｒａｒｉｃｋら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１０３１−１０３３）；（Ａｒｔｅｍｙｅｖら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５０６７−２５０７２）、「ＧＡＰにような」活性は、Ｇαｓの広域α−ヘリカル挿入１ドメインに起因するとされている（Ｍａｒｋｂｙら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１８０５−１９０１）。
【０１３６】
Ｇαサブユニットのアミノ−及びカルボキシ−末端は、プライマリ、セコンダリ又はターシャリレベルのいずれにおいても顕著な相同性を共有することはないが、それらについてなすことのできるいくつかの帰納的結果が存在する。第１に、Ｇαサブユニットのアミノ端末を、ＧαのＧβγ複合体との会合及びＮ−末端のミリストイル化を経由する膜会合に関係していた。更に、カルボキシ末端は、Ｇαβγヘテロ三量体複合体のＧ−蛋白質共役レセプターとの会合に関係していた（Ｓｕｌｌｉｖａｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３３０：７５８−７６０）；（Ｗｅｓｔら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１４４２８−１４４３０）；（Ｃｏｎｋｌｉｎら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６３：２７４−２７６）；（Ｋａｌｌａｌ及びＫｕｒｊａｎ．１９９７．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：２８９７）。Ｎ−末端の機能についてのこれらの帰納的結果を支持するデータは、生化学及び遺伝学の研究の両方を含むいくつかの出典から得られるものである。
【０１３７】
図１は、ヒトＧαｓ、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇα１６及びトランスデューシンの同源のドメインと調整されたＧＰＡ１のアミノ末端側の６６残基を示している。ＧＰＡ４１Ｇα４１Ｇαハイブリッドにおいて、アミノ末端４１残基（ＧＰＡ１由来のもの）は、配列ＬＥＫＱＲＤＫＮＥ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）と同一であってその配列で終わっている。位置４１でのグルタメート（Ｅ）残基の次に来る全ての残基は、ヒトＧαサブユニットにより与えられるものである。そのサブユニットは、アミノ酸配列−ＧｘＧｘｘＧ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）で示されるコンセンサスヌクレオチド結合モチーフを含んでいる。配列におけるピリオドは、この領域におけるアラインメントを最大化するのに生じたギャップを示している。コドンバイアスは、哺乳類のものである。Ｇαｓ、Ｇαｉ及びＧα０、Ｇαｑ及びＧαｚを有するＧＰＡ１の全コード領域のアラインメントについては、Ｄｉｅｔｚｅｌ及びＫｕｒｊａｎ（１９８７、Ｃｅｌｌ ５０：５７３）並びにＬａｍｂｒｉｇｈｔら（１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６２１−６２８）を見よ。追加的な配列情報が、Ｍａｔｔｅｒａら（１９８６，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ２０６：３６−４１）、Ｂｒａｙら（１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３：８８９３−８８９７）及びＢｒａｙら（１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：５１１５−５１１９）により提供されている。
【０１３８】
上記に示したように、Ｇαサブユニットのアミノ末端中に共有される配列相同性はあってもほとんどない。第１のβ−シート（配列モチーフ−ＬＬＬＬＧＡＧＥＳＧ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）を含む；Ｇαサブユニットの構成要素のナンバーリングついてはＮｏｅｌら（上記）をみよ）より先にあるＧαサブユニットのアミノ末端ドメインは、４１個アミノ酸（ＧＰＡ１）から３１個アミノ酸（Ｇαｔ）まで長さにおいて変化する。大部分のＧαサブユニットは、アミノ末端（ＭＧＸａａＳ−）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）においてミリスチン酸の付加についてコンセンサス配列を共有する、しかし、このモチーフを有する全てのＧαサブユニットが、ミリスチン酸に位置２（Ｓｐｉｅｇｅｌら（１９９１）ＴＩＢＳ１６：３３８−３４４１）においてグリシンと共有結合させるわけではない。この翻訳後改変はの役割は、ミリストイル化についてのコンセンサス配列を付加又は削除した突然変異体のＧαサブユニット活性をアッセイする研究（Ｍｕｍｂｙら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７；７２８−７３２（Ｌｉｎｄｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６６：４６５４−４６５９）；Ｇａｌｌｅｇｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９６９５−９６９９）から推量したものである。これらの研究は、Ｎ−末端ミリストイル化についての２つの役割を示唆している。第１に、アミノ末端ミリスチン酸の存在が、Ｇαサブユニットの膜との会合のために要求されるものであり、第２に、この改変は、ＧαサブユニットのＧβγ複合体との会合を調節する役割を果たしていることが示されている。
【０１３９】
Ｇα及びＧβγサブユニットとの会合を促進するＧαのアミノ末端の役割を試験する目的としてなされた他の生化学的研究において、ＧαＧαサブユニットの蛋白質分解により又は遺伝子的に短縮されたものを、Ｇβγ複合体と会合するそのサブユニットの能力、グアニンヌクレオチドを結合するそのサブユニットの能力及び（又は）エフェクター分子を活性化するそのサブユニットの能力についてアッセイした。全ての場合において、短縮されたアミノ末端を有するＧαサブユニットは、全ての３つの機能において不十分であった（Ｇｒａｆら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４３０７−２４３１４）；（Ｊｏｕｒｎｏｔら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：９００９−９０１５）；及び（Ｎｅｒｒら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：８９９６−９０００）。Ｓｌｅｐａｋら（１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４１４−１４２３）が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて発現された哺乳類のＧαｏのＮ末端の５５個のアミノ酸の突然変異分析を報告している。外来の付加された哺乳類のＧβγとの相互作用する能力が明らかに減じられた分子は、突然変異ライブラリーにおいて同定された。しかしながら、著者が指摘したように、そのアッセイは、百日咳毒素により突然変異ＧαのＡＤＰリボシル化の範囲で突然変異体をスクリーニングするのに用いたアッセイはＧαとＧβγとの相互作用のプローブとしては完全に満足のいくものではなかった。サブユニットの相互作用を阻害するものとして同定された突然変異体は、このアッセイを用いて、ＧαとＧβγとの複合体形成をなおもすることができたが、毒素によりＧαのリボシル化を立体的に妨害した。他の研究により、ＧＰＡ１の機能において重要なＧＰＡ１の特定のアミノ酸残基が明らかになった。例えば、Ｅ３０７Ｋ突然変異体は、Ｇβサブユニットについての広くなった特異性を有するサブユニットを産生すると思われる（Ｗｈｉｔｅｗａｙら、１９９４．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：３２２３）。興味があるのは、Ｅ３０７位置と等価の哺乳類Ｇαサブユニットにおける残基は、哺乳類のαサブユニットの特定のクラスについて特徴的である。例えば、Ｇｓαサブユニットはこの位置においてリシンを含み、この位置において、Ｇｏ及びＧｉαサブユニットはヒスチジンを含み、トランスデューシンαサブユニットはグルタミンを有し、Ｇｑαサブユニットはプロリンを有し、Ｇ１３αサブユニットはアスパラギン酸を有する（Ｗｈｉｔｅｗａｙら、上記）。
【０１４０】
遺伝子的研究により、ヘテロ三量体サブユニット会合におけるＧαのアミノ端末デテルミナントの役割がＧＰＡ１−哺乳類Ｇαハイブリッドを用いた酵母系（Ｋａｎｇら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２５８２−２５９０）及びＧαｉ／Ｇαｓハイブリッドを用いた哺乳類系（Ｒｕｓｓｅｌｌ及びＪｏｈｎｓｏｎ（１９９３）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４４：２５５−２６３）を試験した。前者の研究において、酵母ＧＰＡ１及び哺乳類のＧα配列からなる遺伝子の融合は、Ｋａｎｇら（上記）により構成された、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｇｐａｌナル表現型（即ち、フェロモン応答経路の構成的活性化）を補完する能力についてアッセイした。Ｋａｎｇらは、野生型哺乳類Ｇαｓ、Ｇαｉ（Ｇαｏではなく）蛋白質が酵母Ｇαと会合するのに有用でありｇｐａｌナル表現型を抑制した。しかし、これは、過剰発現の場合のみに限られた。ＧＰＡ１配列のアミノ末端３３０残基を含む融合蛋白質は、哺乳類Ｇαｓ、Ｇαｉ及びＧαｏカルボキシ末端領域の１６０、１４３、又は１４２に各々リンクしている。これらはまた、強力な誘導性（ＣＵＰ）又は構成性（ＰＧＫ）プロモーターを有する高コピープラスミドについて過剰発現の場合に酵母接合応答経路に共役している。これらのハイブリッド分子の３つ全ては、成長阻止アッセイにおいてｇｐａｌナル突然変異を相補ることができ、更にα−因子応答性及び検定系統における接合を阻害することができた。これらの後者の２つの観察は、ハイブリッド酵母−ヒトＧαサブユニットは直接酵母Ｇβγと相互作用することができ、それにより酵母ヘテロ三量体の通常の機能を阻害する。しかしながら、Ｇαｓ、Ｇαｉ又はＧαｏのアミノ末端ドメインを含む融合は、ｇｐａ１ナル突然変異表現型を補完せず、酵母Ｇβγ複合体の会合及びゼクエストレーション(sequestration)のためのＧＰＡ１のアミノ末端の３３０個のアミノ酸残基におけるデターミントについての要求を示した。更に、これらのデータは、Ｇαサブユニットのアミノ末端領域におけるてデテルミナントが一般にＧβγサブユニットとの会合する能力だけでなく種制限的方法で特定のＧβγサブユニットと会合する能力を決定することを示唆している。
【０１４１】
ハイブリッドＧαｉ／Ｇαｏサブユニットを、哺乳類表現システムにおいてアッセイした（Ｒｕｓｓｅｌｌ及びＪｏｈｎｓｏｎ（上記）。これらの研究では、多数のキメラＧαサブユニットを、アデニリルシクラーゼを活性化する能力についてアッセイした。それ故、間接的にＧβγと相互作用する能力についてアッセイしたことになる（即ち、ＧβγへのＧαの共役＝不活性シクラーゼ、ＧβγからのＧαの非共役＝活性シクラーゼ））。これらの研究から、複合体の実情は、ハイブリッドの２５から９６残基の間の領域におけるデテルミナントがグアニンヌクレオチドの交換対ＧＴＰの加水分解の割合と生体内でアデニリルシクラーゼを活性する程度に反映されるこれらの対立遺伝子の活性化状態を決定することが明らかになった。これらのデータは、アミノ末端メチオニンとＧαｔの結晶構造において同定されるβシート（上記Ｎｏｅｌら及び上記Ｌａｍｂｒｉｇｈｔを見よ）との間の領域における構造的要素が(1)Ｇα及びＧβγサブユニットの間の会合／解離することを駆動すること、(2)ＧＤＰ／ＧＴＰ交換を駆動することによりヘテロ三量体の活性状態を決定することと関係のあるという仮説を支持するものである。Ｇαのこの領域における残基及びＧβγサブユニットにおける残基が相互に接触するという考えを支持する、これらの研究により提供される直接の証拠はないが、それでもなお、そのデータは機能を保持するハイブリッドＧαサブユニットの構造について肯定的な表示を提供している。しかしながら、いくつかのそのハイブリッド構造のうちに本研究から生ずる否定的な表示は、キメラ蛋白質の構成的活性（即ち、Ｇβ解離及びエフェクター活性の受容体依存性刺激の低下）に帰する。
【０１４２】
Ｂ．キメラＧαサブユニットの構成
好ましい具体例において、キメラＧαサブユニットは、可能な限り天然の哺乳類の蛋白質の配列を保持し、特に好ましくは、それらの内生的な同類の対応するものレベル同様、異種の成分についての表現レベルが可能な限り等しくあるべきである。Ｋｉｎｇら（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５０：１２１−１２３）により記載されたヒトβ−２アドレナリン作動性の受容体及び酵母におけるＧαの表現型についての結果は、（この結果は、ＫａｎｇらによりＧα以外の十分な長さの哺乳類のＧαを用いて得られた否定的な結果（上記）とともに記載してある）哺乳類のＧ蛋白質共役受容体をフェロモン応答経路に結びつけることができる酵母株の開発についての以下の好ましい具体例となった。
【０１４３】
１つの具体例において、哺乳類のＧαサブユニットを、各サブユニットの天然の配列を用いて又はその代わりに相同な残基を哺乳類のＧαサブユニットと置き換えたＧＰＡ１のアミノ末端由来の配列を用いた最小遺伝子融合としてを発現した。他の具体例においては、哺乳類のＧαサブユニットを、低コピープラスミド上で又は単コピー遺伝子として酵母ゲノムに組み込んだ後にＧＰＡ１プロモーターから発現させる。ある具体例においては、内生Ｇβγサブユニットを酵母ＳＴＥ４及びＳＴＥ１８座により提供され、他方との具体例において、キメラ又は異種Ｇβサブユニット及び（又は）Ｇγサブユニットもまた提供される。
【０１４４】
Ｃ．キメラＧαサブユニットの理想的な設計
理想的に設計されたＧＰＡ１−哺乳類Ｇαハイブリッドサブユニットを、酵母βγへの共役可能性について試験した。ハイブリッドの最初で最大のクラスは、哺乳類Ｇαサブユニットの相同な領域の代わりにＧＰＡ１アミノ末端ドメインの異なった長さをコードしているものである。このクラスのハイブリッド分子は、以下に述べるＧＰＡＢＡＭＨ１、ＧＰＡ４１、ＧＰＡＩＤ及びＧＰＡＬＷハイブリッドを含む。これらのハイブリッドＧα蛋白質を構成する原理は、上記の結果に基づいており、Ｇβγとの相互作用の媒介する場合にＧαのアミノ末端残基の重要性に関係がある。
【０１４５】
酵母ＧαサブユニットをキメラＧαサブユニット（このキメラＧαサブユニットにおいて酵母Ｇαのアミノ末端由来の一部、例えば少なくとも約２０個、より好ましくは少なくとも４０個のアミノ酸が哺乳類（又は他の外来性の）Ｇα由来の配列と融合する）により置き換えるのが好ましい。約４０アミノ酸は、示唆された開始点であるが、より短い又はより長い部分を試験して酵母Ｇβγに共役するために要求される最小長さ及び外来性の受容体に共役するすることを維持するのに両立できる最大長さを決定することもできる。Ｇαサブユニットのカルボキシ末端における最後の１０又は２０個のアミノ酸のみが、受容体と相互作用するために要求される。
【０１４６】
ｉ．ＧＰＡＢＡＭＨ１ハイブリッド
上記Ｋａｎｇらが、各々ＧαＳ、Ｇαｉ２及びＧαｏのカルボキシル末端１６０，１４３，及び１４２残基に融合させたＧＰＡ１のアミノ末端３１０残基をコードするハイブリッドＧαを記述している。Ｋａｎｇらが試験した全ての場合において、ハイブリッド蛋白質は、ｇｐａ１株の成長阻害表現型を補完することができる。ＧＰＡ１及びＧαｉ３、Ｇαｑ及びＧα１６間のハイブリッドが構成されて、機能的にｇｐａ１株の成長阻害表現型を補完した。
【０１４７】
ＧＰＡ４１ハイブリッド。ＧＰＡ１の４１個のアミノ酸のみをコードしている最小のハイブリッドを構成するための原理は、以下の観察とともに上述のＧαサブユニットのアミノ酸末端の役割についての生化学的証拠によるものである。Ｇβ及びＧγサブユニットは、α−ヘリカルドメインを介してそれらのアミノ酸端末に相互作用することは公知である（Ｐｒｏｎｉｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６２２０−６２２４）；Ｇａｒｒｉｔｓｅｎら１９９３）。Ｇαサブユニットのアミノ酸末端は、ヘリカルコイルを形成し、このヘリカルコイルは、ＧαのＧβγとの会合に関係している可能性があるとの示唆（Ｍａｓｔｅｒｓら（１９８６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１：４７−５４）；Ｌｕｐａｓら（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３１４：１０５−１０８）は、Ｇ蛋白質ヘテロ三量体がアミノ末端ヘリカル領域のワインディング(winding)及びアンワインディング(unwinding)を介して可逆的に相互作用するという仮説に至っている。このタイプのメカニズムは、ＧＣＮ４転写因子のロイシンジッパー突然変異体の分析からも更に示唆されている（Ｈａｒｂｕｒｙら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１４０１−１４０７）。Ｋａｎｇら（上記）により記載されたものと同様なハイブリッド（酵母配列の大部分及び最小限の哺乳類の配列のみを含む）を構成するための原理は、Ｇα及びＧβγサブユニット間の共役のアッセイにおいてそれらが機能することができるということに由来している。しかしながら、これらのキメラは、哺乳類Ｇ蛋白質共役受容体及び酵母Ｇβγサブユニットの両方に共役する可能性のためにアッセイされたことはなかった。これ故、酵母におけるハイブリッドシグナリング経路を再構成する可能性のためにアッセイされたことはなかった。
【０１４８】
構成されて試験されたＧＰＡ４１ハイブリッドは、Ｇαｓ、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｑ、Ｇαｏａ、Ｇαｏｂ及びＧα１６を含む。Ｇαｓ、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３及びＧα１６は、機能的にｇｐａ１株の成長阻害表現型を補完するが、一方Ｇαｏａ及びＧαｏｂのハイブリッドは、そのようなことはない。成長阻害アッセイにおいて試験されたことに加えて、これらの構成をｆｕｓｌｐ−ＨＩＳ３遺伝子の活性についてのより高感度転写アッセイにおいてアッセイした。これらのアッセイの両方において、ＧＰＡ４１−Ｇαｓハイブリッドは、、ＧＰＡ４１−ｉ２、ｉ３及び１６ハイブリッドよりも良好に共役しないが、一方ＧＰＡ４１−ｏａ、及び−ｏｂハイブリッドは何れのアッセイにおいても機能しない。
【０１４９】
いくつかの予測アルゴリズムは、高度に保存された配列モチーフ−ＬＬＬＬＧＡＧＥＳＧ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）（このモチーフにおける最初のＬは、ＧＰＡ１における残基４３である。）までのアミノ末端が、両親媒特性を有するヘリカル構造を形成する。ヘプタヘリカルリピート(heptahelical repeat unit)、酵母ＧＰＡ１及び哺乳類ＧαＳの間の以下のハイブリッドを用いてハイブリッド機能：
ＧＰＡ１−７／Ｇαｓ８−３９４
ＧＰＡ１−１４／Ｇαｓ１５−３９４
ＧＰＡ１−２１／Ｇαｓ２２−３９４
ＧＰＡ１−２８／Ｇαｓ２２−３９４
ＧＰＡ１−３５／Ｇαｓ３６−３９４
ＧＰＡ１−４２／Ｇαｓ４３−３９４
に必要なこのモチーフにおけるヘリカルリピートの数を規定することができる。
【０１５０】
これらのハイブリッドにおいて、予測されるのは、テトラロイシンモチーフまでのアミノ末端ドメインにおける構造の繰り返し単位は７であり、７単位におけるスワッピング(swapping)配列がこのドメインを含むヘリカル構造のターンのユニットターンのスワップ(swap)に実質的に等しいであろうということである。
【０１５１】
このクラスの「ダブルクロスオーバー(double crossover)」ハイブリッドの第２グループは、ＧＰＡ１における残基Ｇ１１とともに始まる第１推定の７個の繰り返し上に整列されたものである。これらのハイブリッドにおいて、ヘリカルリピートをＧＰＡ１からＧａｓバックボーンの１つの７個の繰り返し単位中に一度に交換する。
ＧＰＡ１−７／ＧＰＡ１１−１７／Ｇαｓ８−３９４
ＧＰＡ１−１７／ＧＰＡ１８−２４／Ｇαｓ２５−３９４
ＧＰＡ１−１７／ＧＰＡ２５−３１／Ｇαｓ３２−３９４
ＧＰＡ１−１７／ＧＰＡ３２−３８／Ｇαｓ３９−３９４
【０１５２】
ＧαＳ配列における残基９と１０との間に導入されるギャップ(gap)は、−ＬＬＬＬＧＡＧＥ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置１〜８）配列モチーフのアラインメントを保護することになっている。このクラスのハイブリッドを、標準カップリングアッセイにおける「７個」のライブラリのこれらのコレクションのスクリーニングの前に行われる各々の７個の繰り返しのカセット突然変異生成により補完する。
【０１５３】
アミノ末端がヘプタヘリカルリピートユニットを有するヘリカルドメインを形成するという予測に基づきハイブリッドの第３クラスは、予測されたヘリカル構造に対向する側の全体的な疎水的又は親水的な特性に変化を及ぼすものである（上記Ｌｕｐａｓらを見よ）。このモデルにおいて、７個の繰り返しａｂｃｄｅｆｇのうちａ及びｄ部は、へリックスの１つの面を明確にする保存された疎水性残基であり、一方ｅ部及びｇ部はへリックスの荷電面を明確にすることを見いだした。ハイブリッドのこのクラスにおいて、ＧαＳ親サブユニットの配列は、以下の臨界残基の１以上における特定の置換を除いて維持されてＧαＳの異なるヘリカル面はより「ＧＰＡ１のようなもの」となり、
Ｋ８Ｑ
＋Ｉ−１０
Ｅ１０Ｇ
Ｑ１２Ｅ
Ｒ１３Ｓ
Ｎ１４Ｄ
Ｅ１５Ｐ
Ｅ１５Ｆ
Ｋ１７Ｌ
Ｅ２１Ｒ
Ｋ２８Ｑ
Ｋ３２Ｌ
Ｖ３６Ｒ
【０１５４】
酵母Ｇβγに効率性を結びつけるために単一の突然変異のこのコレクションをスクリーニングすることができて、次いで（二重に及び必要ならそれ以上）組み合わせて構成することができる。
【０１５５】
ＧＰＡ１−Ｇαハイブリッドのこの領域にわたるハイブリッド分子の第４のクラスは、３つのプライマーＰＣＲにより導入されるＧＰＡ１とＧαサブユニットとの間にジャンクション部を有するものである。このアプローチでは、２つの外側のプライマーを、５’側についてはＧＰＡ１のイニシエーターメチオニンにおける配列及び３’側についてはＧαＳのテトラロイシンモチーフ（例えば）における配列にコードしている。異なったジャンクション点にわたる一連のジャンクショナルプライマー(junctional primer)を外側のプライマーと混合して一連の分子を各々ＧＰＡ１及びＧαＳ配列の異なった量を有する一連の分子を生成することができる。
【０１５６】
ii．ＧＰＡＩＤ及びＧＰＡＬＷハイブリッド
配列アラインメントにより同定されたＧβγサブユニット中の高い相同性を有する領域は、分子全体にわたって散在している。高度に保存された−ＧＳＧＥＳＧＤＳＴ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）モチーフを含むＧ１領域は、そのすぐ後にとても低い配列保存の領域、「ｉｌ」又は挿入１領域が続く。配列及び長さの両方とも、Ｇαサブユニット中のｉｌ領域中においてかなり多様である。Ｇαサブユニットの配列を整列させることにより、ｉｌ領域を結合させている保存領域を同定してＧＰＡ１−Ｇαハイブリッドの２つの付加的クラスを構成した。ＧＰＡＩＤハイブリッドは、ＧＰＡ１のアミノ末端１０２残基（配列−ＱＡＲＫＬＧＩＱ−まで）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）をコードしており、哺乳類Ｇαにフレームで融合しているが、一方ＧＰＡＬＷハイブリッドは、ＧＰＡ１のアミノ末端２４４残基（ＧＰＡ１における配列−ＬＩＨＥＤＩＡＫＡ−まで）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をコードしている。ＧＰＡＩＤ及びＧＰＡＬＷハイブリッドを構成する理由は、ＧＰＡ１のｉｌ領域をＧＰＡ１の酵母Ｇβγとの相互作用を媒介するため、ハイブリッド分子の安定した発現のため、又はハイブリッド分子の機能のために要求するという仮説を試すことである。ＧＰＡＩＤハイブリッドは、哺乳類サブユニットのｉｌ領域に融合するＧＰＡ１のアミノ末端ドメインを含み、それ故ＧＰＡ１のｉｌ領域を含まないが、一方ＧＰＡＬＷハイブリッドは、完全なｉｌ領域（配列アラインメントにより規定されるように）を含むＧＰＡ１のアミノ末端２４４残基を含む。ＧＰＡＩＤ及びＧＰＡＬＷの両方のハイブリッドをＧαｓ、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｑ、Ｇαｏａ及びＧα１６のために構成する。これらのハイブリッドのうちいずれもｇｐａ１成長阻害表現型を補完しない。
【０１５７】
ＧＰＡＩＤ及びＧＰＡＬＷハイブリッドクラスの構成及び試験の後、ＧＤＰ及びＧＴＰγＳの両方の配位形態においてＧｔｒａｎｓｄｕｃｉｎの結晶構造及びＧＴＰγＳ配位及びＧＤＰ−ＡｌＦ４形態においていくらかのＧαｉｌの結晶構造が報告されている（Ｎｏｅｌら（上記）；Ｌａｍｂｒｉｇｈｔら（上記）及びＣｏｌｅｍａｎら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５：１４０５−１４１２）。結晶構造により、配列アラインメントにより規定されたｉｌ領域が、固定した配列において６個のαへリックスからなる保存構造を有して並びにＧＰＡＩＤ及びＧＰＡＬＷのハイブリッドの構造のために選択されたジャンクションが結晶において観察されるｉｌ領域の構造特性の保存とは両立し得ないものであることが明らかになった。ＧＰＡＩＤハイブリッドについて選択されるジャンクションが、長いαＡへリックスの中心に落ちる；おそらく一般に、このへリックスのキメラ化がそれ及びその蛋白質構造を不安定なものにしているのであろう。同じことが、ＧＰＡＬＷハイブリッド（このハイブリッドでは、ＧＰＡ１及び哺乳類Ｇαサブユニット間のクロスオーバーポイントが短いαＣへリックスの末端に落ちて、それ故それを変形させ蛋白質を不安定化させるものと考えられる。）について選択されるジャンクションにおいてあてはまる。
【０１５８】
ＧＰＡＩＤ及びＧＰＡＬＷハイブリッドの不具合は、上述のｉｌ領域における臨界構造要素の分解のためと予測されている。Ｎｏｅｌら（上記）、Ｌａｍｂｒｉｇｈｔら（上記）及びＣｏｌｅｍａｎら（上記）において示された新しいアラインメント及びデータに基づくと、この問題はｒａｓ様コアドメインを用いて回避することができ、ｉｌヘリカルドメインをαヘリックス様の公知の構造要素の外側から導入させる。
ハイブリッド Ａ ＧαＳ１−６７／ＧＰＡ６６−２９９／ＧαＳ２０３−３９４
このハイブリッドは、ＧαＳ配列中に介在させるＧＰＡ１の完全なｉｌインサートを含む。
ハイブリッド Ｂ ＧＰＡ１−４１／ＧαＳ４４４３−６７／ＧＰＡ６６−２９９／ＧαＳ２０３−３９４
このハイブリッドは、ハイブリッドＡで見いだされたＧαＳの４２アミノ末端の代わりにＧＰＡ１のアミノ末端４１残基を含む。
【０１５９】
iii．ＧαＳハイブリッド
Ｇαトランスデューシンの１７１−２３７残基（Ｎｏｅｌら（上記）のナンバリングを用いる、これはまたＧβγ共役において役割を果たす。）によりコードされた「スイッチ領域」の証拠が存在する。最初に、ＧαＳにおけるＧ２２６Ａ突然変異はリガンドによる受容体活性化時にＧＤＰのＧＴＰへの交換とともに起こるＧＴＰ誘導性コンフォメーションの変化を防止する。この残基は、全Ｇαサブユニットに存在する高度に保存された配列−ＤＶＧＧＱ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）をマップして、ＧＴＰ加水分解に関係するものである。Ｇαｔ及びＧαｉｌの両方の結晶構造において、この配列モチーフ残基は、グアニンヌクレオチド結合コアにおけるβ３シート及びαへリックスをループにおいて結合させる。ＧＴＰ結合時に起こるコンフォメーション変化を阻止するのに加えて、この突然変異はまた、ＧβγからＧＴＰ配位ＧαＳの解離を防止する。第２に、架橋データにより、α２ヘリックス（ＧαｏにおけるＣ２１５、ＧαｔにおけるＣ２１０）において高度に保存されたシステイン残基がＧβサブユニットのカルボキシル末端領域に架橋していることが明らかになった。ついに、遺伝的証拠（Ｗｈｉｔｅｗａｙら（１９９３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４：３２３３−３２３９）がβγと直接接触していると考えられるコア構造のβ２でのＧＰＡ１（Ｅ３０７）における重要な単一残基を同定した。この位置でのＧＰＡ１における突然変異は、Ｇα−Ｇβγ会合（より通常的な遺伝的試験によるのと同様に酵母において２ハイブリッドアッセイでアセスするように）における欠点であるとも知られているＳＴＥ４（Ｇβ）優性ネガティブ突然変異の構造的シグナリング表現型の多様性を示唆している。
【０１６０】
ＧＰＡ１スイッチ領域は、酵母Ｇβγ（ＳＧＳ）に共役を抑制するが、一方でＧＰＡ１アミノ末端のコンテクストにおいて、ＧＰＡ１スイッチ領域はＧβγ（ＧＰβγ−ＳＧＳ）を用いた共役を安定化させる。このことは、ＧＰＡ１のこれらの２つの領域が共同してＧαサブユニット及びＧβγサブユニット間の相互作用を可能なものとしていることを示唆している。この結論は、ＧＰＡ１スイッチ領域を含まないＧＰＡ４１−ＧαＳハイブリッドがｇｐａ１株の成長阻害表現型を補完することができるとの観察によりにより幾分弱められた。
【０１６１】
この領域の表面露出残基の役割は、酵母Ｇβγに効率的に共役することにとり決定的なことであると考えられ、ハイブリッド分子中に以下のように取り込まれる。
ＧαＳ−ＧＰＡ−スイッチ ＧαＳ１−２０２／ＧＰＡ２９８−３５０／ＧαＳ２５３−３９４
このハイブリッドは、ＧαＳのコンテクストにおいてＧＰＡ１の完全なスイッチ領域をコードしている。
ＧαＳ−ＧＰＡ−α２ ＧＱＳ−ＧＰＡ３２２−３３２／ＧＱＳ２３８−３９４
このハイブリッドは、ＧαＳのコンテクストにおいてＧＰＡ１のα２ヘリックスをコードしている。
ＧＰＡ４１−ＧαＳ−ＧＰＡ−α２ＧＰＡ１−４１／ＧＱＳ４３−２２６／ＧＰＡ２３８−３９４
このハイブリッドは、ＧＰＡ１の４１残基アミノ末端ドメイン及びＧαＳのコンテクストにおいてＧＰＡ１のα２ヘリックスをコードしている。
【０１６２】
更に、αＳ２のβ２及びβ３シートの表面露出残基を変えてＧＰＡ１ＱＳヘリックスのそれと似たものとするハイブリッドを生成することができる。これらの変化したα２ヘリカルドメインは、以下の構造を有する。（変化した残基の位置はＧαＳに対応している。）
Ｌ２０３Ｋ
Ｋ２１１Ｅ
Ｄ２１５Ｇ
Ｋ２１６Ｓ
Ｄ２２９Ｓ
【０１６３】
これらの単一の突然変異を、ＧαＳを主とするものに導入できて単一かつ一対の組み合わせとすることができる。更に、それらを、上記十分な長さのＧαＳ及びＧＰＡ４１−ＧαＳハイブリッドの両方のコンテクスト中に導入することができる。すべては、Ｗｈｉｔｅｗａｙと協力者により規定されたこの領域とＧβ領域との間の改良された静電気的かつ疎水的接触によりＧαサブユニットを酵母Ｇβγサブユニットへの共役を改善することを予測する（ＧＰＡ１と接触する部位を明らかにしたＷｈｉｔｅｗａｙら（上記））
【０１６４】
要するに、酵母フェロモン経路に共役するハイブリッドＧαサブユニットの同定は、以下の一般的観察となった。第１に、ＧＰＡＢＡＭＨＩハイブリッドは、酵母Ｇβγと会合して、それ故最小限、これらのハイブリッドは、フェロモン応答経路と共役するのに必要なＧＰＡ１におけるデテルミナントを含む。第２に、ＧＰＡ１のアミノ末端４１残基は、いくつかの例（すべてではないが）でＧαハイブリッドの酵母Ｇβγへの共役を容易にする十分なデテルミナントを含む。たとえば、Ｇαサブユニットは、ＧＰＡ１において最初の４１残基の外側の領域を含み、これらはＧＰＡ１のそれらと十分に類似しているので、それらと同様なＧＰＡ１のアミノ末端４１残基の欠損している場合でさえもＧＰＡ１との相互作用を容易にする。第３に、Ｇαサブユニットを酵母Ｇβγサブユニットに共役させるのに関係するＧＰＡ１の最初の３１０残基においてたのデテルミナントが存在する。
【０１６５】
上記のハイブリッドの種々のクラスは、相互に排除されるのではない。たとえば、ＧＰＡ１−４１を含むＧＰＡ１は、Ｌ２０３Ｋ突然変異が特徴的である。
【０１６６】
単純化のために、酵母ＧＰＡ１及び哺乳類ＧαＳのハイブリッドがここにおいて記載されてきたが、ハイブリッドは、他の酵母Ｇαサブユニット及び（又は）哺乳類Ｇαサブユニット、注目に値することには哺乳類Ｇαｉサブユニットから生成することもできることは評価できよう。更に、上述のハイブリッドは、２つの親蛋白質から構成されるが、３つ以上の親蛋白質のハイブリッドも可能である。
【０１６７】
例に示されているように、キメラＧαサブユニットは、特にＧαｉ種への受容体を共役させることにおいて特に有用である。
【０１６８】
iv．Ｇαの表現
上記Ｋａｎｇらは、天然の哺乳類Ｇαのいくつかのクラスが、Ｇαの表現型が構成的に活性で強力なプロモーター（ＰＧＫ）又は強力な誘導プロモーター（ＣＵＰ）から駆動された場合に酵母のαサブユニットと機能的に相互作用することができることを報告した。これらの著者は、高レベルで発現したラットのＧαＳ、Ｇαｉ２又はＧαｏが酵母βγに共役することを報告した。哺乳類Ｇαの高レベルの発現（即ち、酵母βγに関して非化学量論的である）は、この出願において記載されているもののような使用にとって好ましくない。酵母におけるＧ蛋白質共役受容体信号トランスデユーションの再構築は、ヘテロ三量体複合体（Ｇβγ）のシグナリング成分がＧαサブユニットとともに化学量論的に存在することを要求する。過剰のＧαサブユニットがシステムにおけるシグナリングバックグラウンドレベルよりも高くなる。Ｇα及びＧβγサブユニットのレベルが平衡していることが好ましい。たとえば、ヘテロなＧαサブユニットが内生酵母ＧＰＡ１プロモーター及びＧＰＡ３’非翻訳領域を含む低複製性（ＣＥＮ ＡＲＳ）ベクターから発現させることができる。最小限の指標は、（これは酵母フェロモン経路に機能的に共役することができるということに関して、ヘテロなＧαサブユニットに適用される）低複製性プラスミド上のＧＰＡ１プロモーターから又は組み込まれた単一複製遺伝子から発現された場合にｇｐａ１遺伝型を補完することである。この出願で記載された研究において、すべてのヘテロなＧαサブユニットを、生化学的２つの生物学的システムでアッセイした。第１のアッセイにおいて、ヘテロなＧαサブユニットを、ｇｐａ１株の成長阻害表現型を機能的に補完する可能性について試験した。第２のアッセイにおいては、ｆｕｓｌ−ＨＩＳ３レポーター遺伝子の転写を使用して、フェロモン応答経路を活性化する程度を測定した。これ故、この程度は、ヘテロなＧαサブユニットが内生酵母Ｇβγ複合体を引き離す程度である。ラット、ｍｕｒｉｎｅ及びヒト由来のＧαｓ、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１６、Ｇαｏａ、Ｇαｏｂ及びＧαｚは、ＧＰＡ１プロモーターを含む低複製性、ＣＥＮ ＡＲＳベクターから発現された。Ｇｐａ１株の機能的な複製は、ラット及びヒトＧαＳを除いたこれらの十分な長さのＧα構造のいずれを用いたアッセイシステムにおいても観察されなかった。
【０１６９】
Ｄ．キメラ酵母βγサブユニット
Ｇ蛋白質Ｇαサブユニットに加えて又は代わりに、酵母又は異種のＧβ又はＧγサブユニットを改変することができる。Ｇαに関する上記の方法を用いて、同様にこれらのサブユニットのいずれか又は両方を変えることができる。例えば、酵母配列及び異種配列のアラインメントを生成し、重要な機能的ドメインに関する情報と組み合わせることができる。次いで、そのような情報を用いて酵母又は異種配列における突然変異を生成することにおける手引きを提供することができる。同様に、キメラＧβ又はＧγ分子を構成することができ異種ＧＰＣＲの酵母フェロモンシグナリング経路への共役を増大することができる。
【０１７０】
酵母ＳＴＥ４及びＳＴＥ１８は、後生動物Ｇ蛋白質β及びγサブユニットと各々関係がある（Ｗｈｉｔｅｗａｙら １９８９．Ｃｅｌｌ．５６：４６７）。β及びγサブユニットは、αサブユニット及びエフェクターと同様に相互作用できるものでなければならない。以前の研究は、哺乳類β及びγサブユニットは、酵母同族体から十分に分岐したものであるので、それらを機能的にＳＴＥ４又はＳＴＥ１８に置き換えることはできないと示唆していた。かくして、好ましい具体例においては、改変を酵母において発現する異種Ｇβ又はＧγサブユニットに行う及び（又は）異種受容体共役を増大するために行う。
【０１７１】
Ｇ−蛋白質βサブユニットの一次構造は、酵母からヒトに高度に保存されている；Ｓｔｅ４は、ヒトＧβアイソホームと約４０％同一のものを共有している（Ｌｅｂｅｒｅｒら １９９２ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １１：４０８５）。ＳＴＥ４及びＧβは各々４２０及び３４０若しくは３４１アミノ酸長さであり、ＷＤ−４０モチーフを有する蛋白質を有する蛋白質ファミリーに属する（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｎ及びＰｌｏｅｇｈ １９９２．ＦＥＢｓ Ｌｅｔｔ．３０７：１３１）。これらのモチーフを用いて、Ｇβ及びＳＴＥ４を８個のブロック中に分散させることができる（Ｃｏｒｉａら Ｙｅａｓｔ １９９６．１２：４１）。哺乳類Ｇβの中には、Ｇγサブユニット選択性を呈するものも見いだされている（Ｐｒｏｎｉｎ及びＧａｕｔｈａｍ．１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６２２０；Ｓｃｈｍｉｄｔら １９９２．J.Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３８０７；Ｋｌｅｕｓｓら １９９２．Ｎａｔｕｒｅ．３５８：４２４）。後生動物及び酵母Ｇ蛋白質βサブユニットのアラインメントは、Ｃｏｒａｉらにより提供された（１９９６．Ｙｅａｓｔ．１２：４１）。そのようなアラインメントを用いて上記でＧαについて記載したようなＧ蛋白質βサブユニットへの突然変異を行う手引きを提供することができる。更に、ＳＴＥ４のある領域が、重要なものであることを見出し、従ってポリペプチドの他の部分より操作しずらいと考えられる。例えば、ＳＴＥ４産物のｃ−末端は、ダウンストリームシグナリングについて必須のものである（Ｃｏｒｉａら １９９５．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ３６７：１２２）。Ｓｔｅ４のアミノ末端半分における小さな２つの領域への突然変異もまた、シグナリングを阻害することが示された（Ｌｅｂｅｒｅｒら 上記）。ＳＴＥ４及びＧＰＡ１の相互作用に影響する突然変異が同定されている。ＷＤ４０リピートの２次複製物への突然変異を改変して、ＳＴＥ４及びＧＰＡ１間の相互作用を減ずることができる（この場合にはＳＴＥ４機能の他の面には影響を与えない）（Ｗｈｉｔｅｗａｙら１９９４．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：３２２３）。
【０１７２】
ＳＴＥ１８を含むＧγは、Ｇβよりも相互に非常に分岐している。哺乳類Ｇ蛋白質γサブユニット中でさえ、かなりの量の分岐がある。γサブユニットは、βγサブユニットの機能的特異性を規定すると考えられる。ウシ網膜由来のγ１サブユニット（Ｈｕｒｌｅｙら Ｐｒｏｃ．ＮＡＴ’ｌ ＡＣＡＤ．ＳｃｉＵＳＡ．１９８４．８１：６９４８）、ウシ脳由来のγ１、γ３及びγ７サブユニット（Ｒｏｂｉｓｈａｗら．J.Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９．２６４：１５７５８；Ｇａｕｔａｍら Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８９．２４４：９７１；ＧａｕｔａｍらＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９０ ８７：７９７３；Ｃａｌｉら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２ ２６７：２６４０２３）及びウシ及びラット肝由来のγ５サブユニット（Ｇｉｓｈｅｒら １９９２．２６７：２４０２３）についての完全なｃＤＮＡが報告されている。
【０１７３】
酵母のＳＴＥ１８遺伝子は、ＣＡＡＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）ボックスで終わっている（ここでＡは脂肪族アミノ酸であり、Ｘは任意の非電荷アミノ酸である）。この配列は、Ｇγのプレニレーションに関係があり、膜へのＧγの局在化におそらく重要なものであり、このため配列の他の部分よりも操作しずらいものと考えられる（Ｋｕｒｊａｎ １９９２．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：１０９７）。飽和突然変異誘発は、ＳＴＥ１８機能において重要なＳＴＥ１８領域への洞察を提供してきた。ＳＴＥ４における突然変異を補償するＳＴＥ１８における突然変異は、セリン６５、スレオニン７１及びバリン８０において同定された。ＳＴＥ１８遺伝子の優性なネガティブ対立遺伝子もまた、同定された（Ｗｈｉｔｅｗａｙら１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１２３０）。これらの短くされた蛋白質は、ＣＡＡＸボックスを含むＳＴＥ１８のカルボキシル末端を欠いていることが見出された（Ｗｈｉｔｅｗａｙら 上記）。
【０１７４】
酵母Ｇγ、ＳＴＥ１８及びＧβγのアラインメントは、他のＧ蛋白質サブユニットについて示されているように生成することができる。そのようなアラインメントを、突然変異体Ｇγ又はキメラＧγを構成するのに用いることができる。キメラＧγサブユニットの特定の例（例えば具体例３）を追加の具体例において提供する。好ましい具体例において、哺乳類Ｇγ２を、Ｇ蛋白質γサブユニットキメラの生成において用いることができる。
【０１７５】
Ｅ．異種ＧＰＣＲに強化された共役を示す突然変異体の同定
【０１７６】
多くの方法のうち任意のものを、異種発現されたＧＰＣＲに強化された共役を示す突然変異誘発された又はキメラＧ蛋白質サブユニットためのスクリーニングに用いる。
【０１７７】
例えば、突然変異体ＧαＳサブユニットが酵母βγとしっかりと会合しているだけでなく、受容体が刺激を受けた際にβγから解離して、エピソームｆｕｓｌ−ｌａｃＺレポータープラスミドを異種受容体とともに導入することができる。アゴニストを添加することは、β−ガラクトシダーゼユニットの増加の原因となる。突然変異体ＧαＳが受容体と生産的に相互作用してリガンド添加時にβγから解離することができることを示す。更に、第２メッセンジャー又はメイティングファクター(mating factor)の生成が応答する（例えば、成長阻害又はシュモー (shmoo)形成を測定することができた。）。
【０１７８】
他の例では、スクリーニングは、野生型ＧαＳを発現するｇｐａ１ｆｕｌｓ−ＨＩＳ３コロニーは、ヒスチジンが欠乏し１ｍＭ３−アミノトリアゾール（ＡＴ）を含む培地にプレーティングするレプリカ上で生育できる。この株の成長は、ｆｕｌｓ−ＨＩＳ３レポーター遺伝子の一部減少を導くフェロモン経路の一部構成的状態のために起こる。ＡＴは、ＩＧＰデヒドラターゼの活性を阻害する。低いが一定のレベルのＨＩＳ３の発現を有している細胞は、薬剤に対して感受性がある。ＡＴの量を選択して基礎レベルのＨＩＳ３の発現を（そのレベルが何であれ）細胞の成長を阻害するが誘導レベルの発現を有する細胞の成長を許すようにすることもできる。所望のβγカップリングＧαＳ突然変異体を含むコロニーは、しっかりとしたαβγ会合により媒介されるフェロモン経路の不活性化のためにこの培地ではたぶん成長しないであろう。しかしながら、ＧαＳ耐性プラスミドについての選択が緩和される場合には、アデニンの量を制限することを追加することによるこの場合には、所望の突然変異体コロニーが、ＧαＳプラスミドを失ったコロニー（たいてい５〜１０％）における細胞の画分由来の生育因子を生産するであろう。そのようなコロニーは、アデニン経路の中間体の蓄積のために赤色を呈するであろう。非突然変異のＧαＳ含有コロニーは、アデニン制限プレート上で白色を呈するが、これはＧαＳ−ＡＤＥ２プラスミドの存在が、１ｍＭ３−ＡＴにおける細胞の成長を可能にするはっきりとした負の効果を示さないが、アデニン制限状態下で選択的利点が付与されるからである。スクリーンの視覚的外観は、潜在的突然変異の容易な同定を可能にし、潜在的に不必要な突然変異体（例えばＳｔｅ−のような）を除去する。この理由は、スクリーンはプラスミド−依存性表現型を要求するからである。
【０１７９】
次いで、プラスミドＤＮＡを、推定突然変異体耐性細胞から回収してＳＣＡＨ１上で増幅し再試験し、突然変異のプラスミド連鎖を確認することができる。更に、突然変異体を酵母中へサブクローンして非コード配列における突然変異がＨｉｓ＋表現型を与える可能性を除外する。
【０１８０】
VII．リーダー配列
哺乳動物の細胞外の分泌タンパク質は、酵母で発現されたときは、僅かに分泌されるにすぎない。しかし、多くの場合、それらの生来のシグナル配列を、より効率的にＥＲ輸送複合体と作用し合う酵母タンパク質のシグナル配列と置き換えたとき、それらの分泌レベルは、顕著に上昇する。詳しくは、酵母のインベルターゼ及び酸性ホスファターゼのシグナル配列は、異種タンパク質の分泌発現を扱うバイオテクノロジーに広く用いられている。しかし、多くの外来タンパク質が、酵母のシグナル配列によってＥＲを標的としているものの、それらのすべてが分泌経路を更に前進するわけではないことが、充分に確立されている。主な問題は、酵母細胞の品質管理装置によってＥＲでのその保持を招く、異種タンパク質の誤った折畳み、及び／又は不適正な糖鎖形成にある。
【０１８１】
多くの場合、酵母接合フェロモンであるα因子の前駆体のリーダー配列が、この問題を克服するために成功裡に用いられている［1. Brake, A.J. (1989) in Yeast Genetic Engineering (Barr, P.J., Brake, A.J., & Valenzuela, P., eds.) pp. 269-280, Butterworths, London；Brake, A.J., (1990) Meth. Enzymol. 185, 408-441、及びその中で引用された参考文献］。この配列は、１７残基のＮ末端シグナルペプチドに加えて、７２残基を含み、Ｎ結合糖鎖形成の３部位を有する、疎水性プロ領域を含む。プロ領域は、ＥＲ及びゴルジ体内で大規模にグリコシル化され、後期ゴルジ体区画内でＫｅｘ２エンドペプチダーゼによって切断される。Ｎ末端でのプロ領域の存在は、何らかの異種タンパク質が、ＥＲ内の品質管理に合格し、周辺細胞質に到達するのを許すと考えられている。プロ領域は、タンパク質の正しい折畳みを多少とも容易にできる可能性がある。これに代えて、それは、品質管理装置によって、適正に折り畳まれた構造的単位として認識され、こうして、融合タンパク質全体がＥＲを離れるのを許すこともあり得る。
【０１８２】
インベルターゼのリーダーを用いることもできる。このリーダー配列は、小胞体に進入すると、形成中のインベルターゼペプチド、又は形成中の異種タンパク質から切断されることが立証されており、受容体の見掛け分子量は、この解釈と一致する。プレ配列であるＫｅｘ２の切断を担当する酵素は、トランス−ゴルジ体網状構造に常在する。
【０１８３】
Ａ．ペプチド発現
一定の実施態様では、そのようなリーダー配列は、本発明のペプチドライブラリーを発現するのに用いることができる。酵母細胞は、原形質膜とよばれる脂質二重層によって結合する。この原形質膜と細胞壁との間には、周辺腔がある。酵母細胞が分泌したペプチドは、様々な機序を通じて原形質膜を横断し、それによって周辺腔に進入する。次いで、分泌されたペプチドは、周辺細胞質内に存在するか、又は原形質膜の外面上に表示されている他の分子と自由に作用し合う。次いで、ペプチドは、細胞内への再摂取を受けるか、又は細胞壁から培地内に拡散するか、又は周辺腔内で分解されるかする。
【０１８４】
試験ポリペプチドライブラリーは、それらが関連付けられた発現系の性質に応じて、例示した多数の機序のいずれかによって周辺細胞質中に分泌され得る。一実施態様では、ペプチドは、小胞体及びゴルジ装置を通じての分泌を支配する、酵母シグナル配列、例えば、α因子前駆体中に存在するそれに構造的に関連付けられる。これは、受容体タンパク質が原形質膜へのその旅程で追うのと同じ経路であるため、特定のペプチドが、分泌経路内の移動の際に受容体と作用し合う好機が、受容体とペプチドライブラリーとの双方を発現する細胞内に存在する。これは、オートクリン活性化を示す哺乳動物細胞に発生すると考えられている。そのような相互作用は、移動の際の応答経路の活性化を生じる可能性があり、ペプチド作用薬を発現するような細胞の特定を依然として可能にすると思われる。外部から与えられた受容体作用薬に対する、ペプチド拮抗薬を探すという状況に対しては、この系は、依然として効果的であるが、それは、ペプチド拮抗薬と受容体との双方が、細胞の外部へと一斉に送達されると思われるからである。したがって、拮抗薬を生産するこれらの細胞は、ペプチド拮抗薬が、外部から与えられた作用薬によって受容体が刺激されるのを防ぐ状況に、適正かつ適時にあることになるために、選別できることになる。
【０１８５】
ペプチドを周辺腔に送達するための代替的機序は、ＳＴＥ６／ＭＤＲＩ群のＡＴＰ依存輸送体を用いることである。この輸送経路、及びタンパク質又はペプチドをこの経路に仕向けるシグナルは、小胞体に基づく分泌経路ほどには充分特徴付けられていない。にもかかわらず、これらの輸送体は、明らかに、一定のペプチドを、ペプチドがＥＲ／ゴルジ体経路を通過する必要なしに、原形質膜を越えて直接、効率的に輸送することができる。ペプチドの少なくとも一つのサブセットが、α因子プロ配列及び末端テトラペプチドに関するライブラリーを発現することによって、この経路を通じて分泌されることができるものと期待される。この系のあり得る利点は、受容体及びペプチドが、双方とも細胞の外表面に送達されるまで、接触しないことである。したがって、この系は、通常は細胞の外部から送達される作用薬及び拮抗薬を厳密に模倣する。記載された経路のいずれかを用いることは、本発明の対象範囲内にある。
【０１８６】
本発明は、ペプチドの周辺細胞質分泌、又はそのような分泌が与えられたならば、いかなるシグナル若しくは輸送経路も必要としない。一定の実施態様では、シグナル配列で発現されたペプチドは、細胞表面へのそれらの輸送の前に、受容体と結合し、活性化する可能性がある。
【０１８７】
Ｂ．ＧＰＣＲの発現
もう一つの実施態様では、酵母の分泌タンパク質のリーダー配列を用いて、受容体、例えばＧタンパク質結合受容体の原形質膜への輸送を、付記した実施例に詳述したとおりに支配することができる。以前の研究は、α因子のリーダーを用いて、酵母細胞内の外来分泌タンパク質の発現を立証した。しかし、そのような系を用いて、異種の膜結合受容体、すなわちラットＭ５受容体を発現したときは、異種のＧＰＣＲは、酵母細胞のシグナリング経路に機能的に組み込まれなかった［Huang et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1992, 182:1180］。分泌タンパク質及び貫膜タンパク質双方の酵母の小胞体への輸送は、Sec61、Sec62及びSec63タンパク質を包含する同じタンパク質輸送複合体によって促進される。すべての分泌タンパク質は、そのＮ末端に、輸送複合体によって認識され、かつＥＲ標的化シグナルとして働くシグナル配列を有する。代表的なシグナル配列は、Ｎ末端のいくつかの正に荷電した残基、その後の疎水性のコア、及びＣ末端の、シグナルペプチダーゼによるプロセシングの部位で構成される。いくつかの貫膜タンパク質、例えば、代謝刺激性グルタミン酸受容体、及び血管作動性腸ポリペプチド受容体は、Ｎ末端シグナル配列も有するのに対し、いくつかは、保有しない。後者の場合、最初の貫膜ドメインは、ＥＲ輸送機構と作用し合う。したがって、α因子リーダー配列を用いることは、一定の受容体の機能的発現に特に望ましいことがある。
【０１８８】
一定の実施態様では、本発明の酵母細胞を更に改変することが望ましいと思われる。例えば、一実施態様では、酵母のカルネキシン樣遺伝子であるＣＮＥ１を開裂して、小胞体からゴルジ体への受容体輸送を改良することが望ましいと思われる。他の実施態様では、ＳＴＰ２２を開裂して、ゴルジ体から原形質膜への輸送を改良することが望ましいと思われる。更に他の実施態様では、AstIをコードする遺伝子を過剰発現させて、ゴルジ体から原形質膜への輸送を増大させるのが望ましいと思われる。更に他の実施態様では、ＥＮＤ３及び／又はＥＮＤ４を開裂して、受容体のインターナリゼーションを妨げるのが望ましいと思われる。
【０１８９】
VIII．試験化合物
Ａ．外部から加えた化合物
医化学における最近の傾向は、ライブラリーとよばれる、化合物の混合物の生成を包含する。ペプチドのライブラリーを用いることは、当技術では充分に確立されているが、新たな手法も開発されていて、他の化合物、例えばベンゾジアゼピン類［Bunin et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114:10987；DeWirt et al., 1993, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909］、ペプトイド［Zuckermann, 1994, J. Med. Chem. 37:2678］、オリゴカルバミン酸塩［Cho et al., 1993, Science 261:1303］及びヒダントイン［Dewirt et al.、前掲］の混合物の生成を許す。Rebekらは、１０４〜１０５の多様性を有する小さな有機分子の、分子ライブラリーの合成のための取組み方を記載している［Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059；Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061］。
【０１９０】
本発明の化合物は、当技術に公知の組合せライブラリー法での無数の取組み方のいずれを用いても得ることができ、それらは、生物学的ライブラリー；空間的に指定できる平行固相又は液相ライブラリー、脱回旋を要する合成ライブラリー法、「一ビーズ−一化合物」ライブラリー法、及びアフィニティークロマトグラフィー選別を用いる合成ライブラリー法を包含する。生物学的ライブラリーの取組み方は、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の四つの取組み方は、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の小分子ライブラリー［Lam, K.S., Anticancer Drug Des. 1997, 12:145］に適用できる。
【０１９１】
一実施態様では、試験化合物は、ペプチド又はペプチド模倣体である。もう一つの、好適な実施態様では、化合物は、小さな有機非ペプチド化合物である。
【０１９２】
分子ライブラリー合成のためのその他の例示的方法は、当技術、例えばErb et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:11422；Horwell et al., 1996, Immunopharmacology 33:68及びGallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233に見出すことができる。加えて、公衆に所有される特許願である米国特許願第08/864,241号、同第08/864,240号及び同第08/835,623号明細書に記載されたようなライブラリーは、本発明で試験するための化合物を与えるのに用いることができる。これらの特許願のそれぞれの内容は、この引用によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１９３】
化合物のライブラリーは、溶液として［例えばHoughten (1992) Biotechniques 13:412-421］、又はビーズ［Lam (1991) Nature 354:82-84］、チップ［Fodor (1993) Nature 364:555-556］、細菌［Ladner米国特許第5,223,409号明細書］
、胞子［Ladner前記特許］、プラスミド［Cull et al. (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:1865-1869］若しくはファージ上に［Scott & Smith (1990) Science 249:386-390；Devlin (1990) Science 249:404-406；Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382；Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310；Ladner、前掲］表してもよい。
【０１９４】
一定の実施態様では、試験化合物は、組換え受容体を発現する酵母細胞に外から加え、受容体を通じてのシグナル導入を調整する化合物を選ぶ。他の実施態様では、酵母細胞は、試験しようとする化合物を発現する。例えば、ＰＣＴ刊行物の国際公開特許第94/23025号公報（その内容は、この引用によって本明細書に明示的に組み込まれる）に更に詳述されるとおり、被験酵母細胞の培養を、ペプチドライブラリーを集合的に発現するよう、更に改変することができる。
【０１９５】
他の形式のペプチドライブラリーも発現させてよく、例えば、米国特許第5,270,181号及び第5,292,646号明細書；並びにＰＣＴ刊行物の国際公開特許第94/02502号公報を参照されたい。更にもう一つの実施態様では、ｃＤＮＡライブラリーから組合せポリペプチドを生成する。
【０１９６】
活性についてスクリーニングすることができる例示的化合物は、ペプチド、核酸、炭水化物、有機小分子、及び天然生成物エキスのライブラリーを包含するが、これらに限定されない。そのような実施態様では、受容体若しくはチャンネル仲介シグナリング機能を促進又は阻害する化合物をともに選別かつ特定することができる。
【０１９７】
Ｂ．ペプチドライブラリー
一定の実施態様では、酵母細胞を加工して、試験しようとする化合物を生成することができる。この検定系は、試験しようとする化合物の有効濃度を上昇させるという利点を有する。一実施態様では、国際公開特許第94/23025号公報に記載されたような方法を利用することができる。
【０１９８】
その他の方法も用いることができる。例えば、ペプチドライブラリーは、標的との相互作用を許す形態で、ペプチドの非常に多様かつ多数のコレクションを同時に表示する系である。これらのペプチドは、溶液として［Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421］、又はビーズ［Lam (1991) Nature 354:82-84］、チップ［Fodor (1993) Nature 364:555-556］、細菌［Ladner米国特許第5,223,409号明細書］、胞子［Ladner前記特許］、プラスミド［Cull et al. (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:1865-1869］若しくはファージ上に［Scott & Smith (1990) Science 249:386-390；Devlin (1990) Science 249:404-406；Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382；Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310；Ladner、前掲］表してもよい。これらの系の多くは、ペプチドの最大長、又はペプチドの組成に関しては限定されている（例えばCysは除外）。立体的因子、例えば支持体に近いことは、結合に干渉し得る。通常、スクリーニングは、人為的に提示された標的とのin vitroでの結合についてであって、生細胞内の細胞性シグナル導入経路の活性化又は阻害についてではない。細胞表面受容体を標的として用いることができるが、スクリーニングは、ペプチドの結合が、受容体の配座のアロステリックな変化を生じたか否かを明らかにすることはない。
【０１９９】
Ladnerら（米国特許第5,096,815号明細書）は、望みのＤＮＡ結合活性を有する新規なタンパク質又はポリペプチドを特定する方法を記載している。異なる多数の潜在的結合タンパク質をコードする、セミランダムな（「斑入りの」）ＤＮＡを、発現できる形態で、適切な酵母細胞に導入する。標的ＤＮＡ配列を、タンパク質又はポリペプチドの結合が、選別的性条件下では遺伝子に有害である遺伝子産物の発現を妨げるよう、遺伝的に加工したオペロンに組み込む。そのため、選別的条件に生存する細胞は、標的ＤＮＡに結合するタンパク質を発現する細胞である。酵母細胞は、試験に用いてよいと考えられるが、細菌細胞が好適である。タンパク質と標的ＤＮＡとの間の相互作用は、周辺細胞質又は細胞質ではなく、細胞内でのみ（したがって核内でのみ）発生するにすぎず、標的は、受容体タンパク質ではなく、核酸である。ランダムなペプチド配列を、細胞タンパク質の機能的ドメインと置き換えることは、機能の達成に特異的な配列要件のいくつかの決定を許す。細胞内でのタンパク質の定位の際に機能する認識現象の詳細は、大部分は不明であるが、ミトコンドリアの標的化配列とタンパク質分泌シグナル配列との配列変異に対する制約は、ランダムペプチドを用いて解明されている［それぞれLemire et al., J. Biol. Chem. (1989) 264, 20206及びKaiser et al. (1987) Science 235:312］。
【０２００】
本発明の一定の実施態様では、試験した化合物は、ペプチドライブラリーからのペプチドの形態である。本発明のペプチドライブラリーは、細胞培養の形態を取り、基本的には、各細胞が、ライブラリーの一つの、そして通常は唯一である、ペプチドを発現する。各細胞が、異なる配列のペプチドを生産するならば、ライブラリーの多様性は最大化されるが、通常は、多少の過剰が存在するように、ライブラリーを構築するのが賢明である。大きさに応じて、ライブラリーの組合せペプチドは、そのとおりに発現することができるか、又はより大きな融合タンパク質に組み込むことができる。融合タンパク質は、例えば、分解又は変性に対する安定性はもとより、分泌された場合の分泌シグナルも与えることができる。例えば、細胞内標的受容体と併用するための、細胞内発現のためのライブラリーの例示的実施態様では、ポリペプチドライブラリーを、チオレドキシン融合タンパク質として発現する（例えば、米国特許第5,270,181号及び第5,292,646号明細書；並びにＰＣＴ刊行物の国際公開特許第04/02502号公報を参照されたい）。組合せペプチドは、チオレドキシンタンパク質の末端に付着させるか、又は短いペプチドのライブラリーについては、いわゆる活性ループに挿入することができる。
【０２０１】
一実施態様では、ペプチドライブラリーを、公知のいかなる配列にも基づかず、ｃＤＮＡに由来することもないポリペプチドの組合せライブラリーを発現するよう、誘導する。すなわち、このライブラリーの配列は、大部分がランダムである。好適実施態様では、組合せポリペプチドは、長さが３〜１００アミノ酸、より好ましくは５〜５０アミノ酸以上の範囲であり、はるかに好ましくは、長さが１０、１３、１５、２０又は２５アミノ酸残基以上である。好ましくは、ライブラリーのポリペプチドは、均一な長さのものである。組合せペプチドの長さは、発現を容易にするために存在してよい、いかなる外来配列、例えば融合タンパク質のシグナル配列又は不変部分も反映しないことが理解されると思われる。
【０２０２】
もう一つの実施態様では、ペプチドライブラリーは、公知のポリペプチド配列、又はその一部に少なくとも部分的に基づく、ポリペプチドの組合せライブラリーである（ｃＤＮＡライブラリーではない）。すなわち、該ライブラリーの配列は、セミランダムであって、公知の配列の組合せ突然変異形成によって誘導される。例えば、LadnerらのＰＣＴ刊行物である国際公開特許第90/02909号公報；GarrardらのＰＣＴ刊行物の国際公開特許第92/09690号公報；Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:16007-16010；Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734；Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628；及びBarbas et al. (1992) PNAS 89:4457-4461を参照されたい。したがって、標的受容体のための、公知リガンドであるポリペプチドは、標準的手法によって突然変異原化して、ポリペプチド配列の斑入りライブラリーすることができ、これを更に、作用薬及び／又は拮抗薬についてスクリーニングすることができる。例えば、ＦＰＲＬ−１について特定された代理リガンド、例えばSer-Leu-Leu-Trp-Leu-Thr-Cys-Arg-Pro-Trp-Glu-Ala-Metというペプチドは、本来のトリデカペプチドと何らかの関係を有するペプチドのライブラリーを生成するよう、突然変異原化することができる。このライブラリーは、本発明の試薬細胞内で発現させることができ、該ライブラリーからは、他の受容体活性化因子を単離することができる。これは、はるかに強力なＦＰＲＬ−１という代理リガンドの特定を許す。
【０２０３】
更にもう一つの実施態様では、組み合わせポリペプチドは、ｃＤＮＡライブラリーから生成する。
【０２０４】
本発明の好適実施態様では、酵母細胞は、少なくとも１０３〜１０７の異なるペプチドを好ましくは包含する「ペプチドライブラリー」を集合的に生産するため、多様なペプチドを、外来受容体と作用し合える能力について同時に検定し得る。特に好適な実施態様では、ペプチドライブラリーの少なくともいくつかのペプチドが、周辺細胞質に分泌され、ここで外来受容体の「細胞外の」結合部位と作用し合うことがある。それらは、こうして、細胞受容体との薬物の臨床的相互作用を、より密接に模倣する。この実施態様は、場合により、フェロモン分泌を更に妨げることによって、（フェロモン分泌を必要としない検定中で）さらに改良して、それによって、ペプチドと、シグナルペプチダーゼその他の、分泌系の構成要素についての現象との間の競争を回避してよい。
【０２０５】
本発明の一定の実施態様では、ライブラリーのペプチドは、異なる配列のＤＮＡ分子の混合物によってコードされる。ペプチドコーディングＤＮＡ分子は、それぞれ、ベクターＤＮＡ分子と結合し、得られる組換えＤＮＡ分子を酵母細胞に導入する。どのペプチドコーディングＤＮＡ分子が特定の細胞に導入されるかは、機会の問題であるから、その細胞がどのペプチドを生産するかは、予測できない。しかし、混合物が調製された方式の知識に基づいて、ペプチドライブラリー内のペプチドの混合物について、一定の統計的予測を行ない得る。
【０２０６】
ライブラリーのペプチドは、不変及び可変残基で構成することができる。ｎ番目の残基が、ライブラリーのすべてのペプチドについて同じであるならば、不変であると云われる。ｎ番目の残基が、問題のペプチドに応じて変動するならば、該残基は可変のそれである。ライブラリーのペプチドは、少なくとも一つの、かつ通常は一つ以上の、可変残基を有することになる。可変残基は、遺伝的にコードされる全部で２０のアミノ酸のいずれの間でも、変動し得る；ペプチドの可変残基は、同じであるか、又は異なる方式で変動し得る。その上、特定の残基の位置での許されたアミノ酸の出現頻度は、同じであるか、又は異なり得る。該ペプチドは、一つ又はそれ以上の不変残基も有し得る。
【０２０７】
要求されるＤＮＡ混合物を調整するには、二つの主な方法がある。一つの方法では、一時に一塩基としてＤＮＡを合成する。遺伝暗号が命ずる塩基位置で、変動が望まれるときは、ヌクレオチドの適切な混合物を、慣用のポリヌクレオチド合成の純粋なヌクレオチド試薬ではなく、形成中のＤＮＡと反応させる。
【０２０８】
第二の方法は、アミノ酸の変動に対して、より厳密な制御を与える。初めに、トリヌクレオチドの試薬を調製するが、各トリヌクレオチドは、ペプチドライブラリー内で特徴付けようとするアミノ酸の一つの（かつ唯一の）コドンである。特定の可変残基を合成しようとするときは、適切なトリヌクレオチドで混合物を作り、形成中のＤＮＡと反応させる。必要な「縮重」ＤＮＡが完成したならば、より詳しく下記に考察するとおり、ペプチドの発現を保証するのに必要なＤＮＡ配列と結合しなければならず、完成したＤＮＡ構築体を、酵母細胞に導入しなければならない。
試験化合物がペプチドである実施態様では、そのようなペプチドを、リーダー配列に関連して発現するのが望ましいことがある。酵母細胞を、原形質膜とよばれる脂質二重層によって結合する。この原形質膜と細胞壁との間には、周辺腔が存在する。酵母細胞が分泌したペプチドは、様々な機序を通じて原形質膜を横断し、それによって周辺腔に進入する。次いで、分泌されたペプチドは、周辺細胞質内に存在するか、又は原形質膜の外面上に表示されている他の分子と自由に作用し合う。次いで、ペプチドは、細胞内への再摂取を受けるか、又は細胞壁から培地内に拡散するか、又は周辺腔内で分解されるかする。
【０２０９】
試験ポリペプチドライブラリーは、それらが関連付けられた発現系の性質に応じて、例示した多数の機序のいずれかによって周辺細胞質中に分泌され得る。一実施態様では、ペプチドは、小胞体及びゴルジ装置を通じての分泌を支配する、酵母シグナル配列、例えば、α因子前駆体中に存在するそれに構造的に関連付けられる。これは、受容体タンパク質が原形質膜へのその旅程で追うのと同じ経路であるため、特定のペプチドが、分泌経路内の移動の際に受容体と作用し合う好機が、受容体とペプチドライブラリーとの双方を発現する細胞内に存在する。これは、オートクリン活性化を示す哺乳動物細胞に発生すると考えられている。そのような相互作用は、移動の際の応答経路の活性化を生じる可能性があり、ペプチド作用薬を発現するような細胞の特定を依然として可能にすると思われる。外部から与えられた受容体作用薬に対する、ペプチド拮抗薬を探すという状況に対しては、この系は、依然として効果的であるが、それは、ペプチド拮抗薬と受容体との双方が、細胞の外部へと一斉に送達されると思われるからである。したがって、拮抗薬を生産するこれらの細胞は、ペプチド拮抗薬が、外部から与えられた作用薬によって受容体が刺激されるのを防ぐ状況に、適正かつ適時にあることになるために、選別できることになる。
【０２１０】
ペプチドを周辺腔に送達するための代替的機序は、ＳＴＥ６／ＭＤＲＩ群のＡＴＰ依存輸送体を用いることである。この輸送経路、及びタンパク質又はペプチドをこの経路に仕向けるシグナルは、小胞体に基づく分泌経路ほどには充分特徴付けられていない。にもかかわらず、これらの輸送体は、明らかに、一定のペプチドを、ペプチドがＥＲ／ゴルジ体経路を通過する必要なしに、原形質膜を越えて直接、効率的に輸送することができる。ペプチドの少なくとも一つのサブセットが、α因子プロ配列及び末端テトラペプチドに関するライブラリーを発現することによって、この経路を通じて分泌されることができるものと期待される。この系のあり得る利点は、受容体及びペプチドが、双方とも細胞の外表面に送達されるまで、接触しないことである。したがって、この系は、通常は細胞の外部から送達される作用薬及び拮抗薬を厳密に模倣する。記載された経路のいずれかを用いることは、本発明の対象範囲内にある。本発明は、ペプチドの周辺細胞質分泌、又はそのような分泌が与えられたならば、いかなるシグナル若しくは輸送経路も必要としない。
【０２１１】
IX．スクリーニング及び選別：第二メッセンジャー生成の検定
化合物の生物活性についてスクリーニングするとき、細胞内第二メッセンジャー生成を直接測定することができる。様々な細胞内エフェクターが、Ｇタンパク質に調節されるとして特定されていて、アデニリルシクラーゼ、サイクリックＧＭＰ、ホスホジエステラーゼ、ホスホイノシチダーゼＣ及びホスホリパーゼＡ２を包含する。加えて、Ｇタンパク質は、ある範囲のイオンチャンネルと作用し合い、一定の電圧感受性Ｃａ＋＋過渡的物質を阻害できるばかりでなく、心臓のＫ＋チャンネルを刺激する。
一実施態様では、当技術に公知である手法を用いてγ３２ＰＧＴＰの分解を決定することによって、Ｇタンパク質によるＧＴＰアーゼの酵素活性を、原形質膜標本で測定することができる［例えば、Signal Transduction: A Practical Approach, G. Milligan, Ed. Oxford University Press, Oxford、英国を参照されたい］。ｃＡＭＰを調整する受容体を試験するときは、ｃＡＭＰ検出のための標準的手法、例えば、非標識化ｃＡＭＰの存在下で［３Ｈ］ｃＡＭＰを定量する、競争的検定を用いることが可能であると思われる。
【０２１２】
一定の受容体は、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸の１，４，５−ＩＰ３（細胞内Ｃａ＋＋を動態化）及びジアシルグリセロール（ＤＡＧ：タンパク質キナーゼを活性化）への分解を刺激する、ホスホリパーゼＣの活性を刺激する。イノシトール脂質は、標準的な脂質抽出手法を用いて、抽出かつ分析することができる。ＤＡＧも、薄層クロマトグラフィーを用いて測定することができる。３種類のイノシトール脂質すべて（ＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３）の水溶性誘導体も、放射性標識化手法又はＨＰＬＣを用いて定量することができる。
【０２１３】
細胞内カルシウムの動態化、又は細胞外からのカルシウムの流入は、標準的手法を用いて測定することができる。適切なカルシウム指示薬、すなわち蛍光性、生物発光性、金属発色性又はＣａ＋＋感受性微小電極の選択は、細胞型及び強さ、並びに研究中の事象の時間的定数に依存する［Borle (1990) Environ Health Perspect. 84:45-56］。Ｃａ＋＋検出の例示的方法として、標準的方法を用いて、Ｃａ＋＋感受性蛍光染料のフラ−２又はインド−１を、細胞に負荷をかけ得ると思われ、Ｃａ＋＋のいかなる変化も、蛍光計を用いて測定する。
【０２１４】
ＰＩＰ２分解の他方の生成物であるＤＡＧは、ホスファチジルコリンからも生成することができる。このリン脂質の、受容体仲介シグナリングに応答しての分解も、様々な放射性標識化の手法を用いて、測定することができる。
【０２１５】
ホスホリパーゼＡ２の活性化は、例えば、細胞内でのアラキドン酸塩の生成を包含する、公知の手法を用いて、容易に定量することができる。
【０２１６】
一定の受容体の場合、細胞性リン酸化の際の変化について、スクリーニングすることが望ましいことがある。そのような検定様式は、問題の受容体が受容体チロシンキナーゼであるときに、役立ち得る。例えば、ＦＧＦ受容体、及びＦＧＦ受容体に結合するリガンドで形質転換された酵母は、抗ホスホチロシンを用いるコロニー免疫ブロット法［Lyons & Nelson (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7426-7430］を用いてスクリーニングできると思われる。加えて、リン酸化についての試験は、それ自体はチロシンキナーゼではなくてよい受容体が、シグナル導入経路の下流で機能するタンパク質キナーゼを活性化するときに、役立つと思われる。同様に、タンパク質のリン酸化は、受容体で生成されたシグナルを増幅するよう働くカスケードでも、決定的な役割を果たすことが注目される。マルチキナーゼカスケードは、シグナル増幅ばかりでなく、細胞型特異的であることが多くて、成長因子が、一方の細胞の有糸分裂、及びもう一つの分化を刺激するのを許す、多数のエフェクターへのシグナル分岐も許す。
【０２１７】
一つのそのようなカスケードは、異なる細胞型での、ともに分裂促進性の分化及びストレス応答を仲介すると思われる、ＭＡＰキナーゼ経路である。成長因子受容体の刺激は、Ｒａｓの活性化と、その後のｃ−Ｒａｆ、ＭＥＫ、並びにｐ４４及びｐ４２のＭＡＰキナーゼの逐次活性化とを招く（ＥＲＫ１及びＥＲＫ２）。次いで、活性化されたＭＡＰキナーゼは、多くの枢要な調節タンパク質をリン酸化するが、これには、ＭＡＰキナーゼが核へと転位するときにリン酸化される、ｐ９０ＲＳＫおよびＥｌｋ−１が包含される。相同経路は、哺乳動物及び酵母の細胞に存在する。例えば、サッカロミセス・セレビシエのフェロモンシグナリング経路の基本部分は、ＳＴＥ１１、ＳＴＥ７及びＦＵＳ３／ＫＳＳ１遺伝子（後者の対は、別個であり、機能的に冗長である）の産物で構成されるタンパク質キナーゼカスケードからなる。したがって、このキナーゼカスケードの成員のリン酸化及び／又は活性化は、検出し、受容体の噛み合いを定量するのに用いることができる。ホスホチロシン特異性抗体は、チロシンリン酸化の増大を測定するのに利用することができ、リン特異性抗体は、商業的に入手できる（New England Biolabs, Beverly, MA）。
【０２１８】
受容体仲介シグナル導入を検出する改変された方法が存在し、当業者は、列挙された例示的方法と置き換えるのに用いてよい。
【０２１９】
一実施態様では、指標遺伝子は、検出に用いることができる。一実施態様では、指標遺伝子は、改変されていない内在遺伝子である。例えば、本発明の方法は、Bar1若しくはFus１、Fus2、接合因子、Ste3、Ste13、Kex1、Ste2、Ste6、Ste7、sSst2、又はChs1のような、フェロモン系経路応答性の内在遺伝子の転写レベルの検出に依拠することができる［Appletauer & Zchstetter, 1989, Eur. J. Biochem. 181:243］。
【０２２０】
その他の実施態様では、内在指標遺伝子の感受性を、この指標遺伝子に対する天然の座でのプロモーター配列を操作することによって、高めることができる。そのような操作は、内在調節要素に対する点突然変異から、調節要素のすべてのか、又は実質的な部分の大規模な置き換えまでにわたり得る。Ｇタンパク質、及びＧタンパク質結合受容体に関する突然変異の以前の考察を、ここで反復する。
【０２２１】
例えば、Bar1遺伝子の場合、遺伝子のプロモーターを改変して、酵母のフェロモン系経路の活性化の際に、Bar1の転写を増進することができる。Bar1遺伝子の転写は、酵母細胞を接合因子に接触させた際に不活性化される。Bar1遺伝子の配列は、当技術に公知である［例えば米国特許第4,613,572号明細書を参照されたい］。その上、Bar1のα因子で促進される発現に要求される配列、及びその他のフェロモン応答遺伝子が特定されている［Appletauer & Achstetter 1989, Eur. J. Biochem. 181:243；Hagen et al. 1991, Mol. Cell. Biol. 11:2952］。例示的実施態様では、酵母Bar1プロモーターは、突然変異誘発によって加工して、酵母フェロモン経路の刺激の際に、例えば、より強力なプロモーター遺伝子転写に対して、より応答性にすることができる。プロモーターを突然変異原化する標準的手法を、用いることができる。そのような実施態様では、Appletauerらが記載した、保存されたオリゴヌクレオチドモチーフを保存するのが望ましい。
【０２２２】
更に他の実施態様では、第二のメッセンジャー生産、又は転写の変更ではなく、内在酵母タンパク質の活性を検定することができる。例えば、一実施態様では、受容体のシグナル導入経路が、発現をアップレギュレートするか、さもなければ細胞に加え得る基質を改変できる酵素を活性化する。シグナルは、検出できる基質を用いることによって、この場合、基質のシグナルの喪失を追跡するか、又はこれに代えて、検出できる産物を生成する基質を用いることによって検出することができる。一定の実施態様では、基質は、天然に産する。これに代えて、基質は、天然に産しないこともできる。好適実施態様では、ＢＡＲ１の活性を測定することができる。
【０２２３】
他の実施態様では、試験化合物による受容体の調節は、遺伝子の転写の変化を招くが、これは、必ずしもフェロモン応答性ではない。好適実施態様では、遺伝子は、容易に検出可能である。例えば、好適実施態様では、主たる検定は、Ｐｈｏ５という分泌された酸性ホスファターゼを測定するのに用いることができる。酸性ホスファターゼ活性は、標準的手法を用いて測定することができる。
【０２２４】
他の実施態様では、リポーター遺伝子構成体を用いることができる。リポーター遺伝子構成体は、リポーター遺伝子を、少なくとも一つの転写調節要素と機能的に結合することによって調製する。一転写調節要素のみ含まれるにすぎないならば、それは調節できるプロモーターでなければならない。選ばれた転写調節要素のうち少なくとも一つは、選ばれた細胞表面受容体の活性によって間接又は直接調節され、それによって、受容体の活性が、リポーター遺伝子の転写を介して追跡することができなければならない。
【０２２５】
多くのリポーター遺伝子、及び転写調節要素は、当業者に公知であり、その他は、当業者には公知である方法によって、特定又は合成し得る。リポーター遺伝子は、ＲＮＡ又はタンパク質であってよい、検出できる遺伝子産物を発現するいかなる遺伝子も包含する。好適なリポーター遺伝子は、容易に検出できるそれである。リポーター遺伝子は、望みの転写調節配列を含むか、又はその他の望ましい特性を示す遺伝子との融合遺伝子の形態で、構成体に含まれてもよい。
【０２２６】
リポーター遺伝子の例は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチル転移酵素）［Alton & Vapnek (1979), Nature 282:864-869］、ルシフェラーゼ、その他の酵素検出系、例えばβ−ガラクトシダーゼ；ホタルルシフェラーゼ［deWet et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7:725-737］；細菌ルシフェラーゼ［Engebrecht & Silverman (1984), PNAS 1:4154-4158；Baldwin et al. (1984), Biochemistry 23:3663-3667］；アルカリ性ホスファターゼ［Toh et al. (1989), Eur. J. Biochem. 182:231-238；Hall et al. (1983), J. Mol. Appl. Gen. 2:101］；ヒト胎盤性分泌アルカリ性ホスファターゼ［Cullen & Malim (1992) Methods in Enzymol. 216:362-368］、及び緑色蛍光タンパク質［米国特許第5,491,084号明細書；国際公開特許第96/23898号公報］を包含するが、これらに限定されない。
【０２２７】
好適なリポーター遺伝子構成体は、Fus1p-LacZ及びFus1p-GFPを包含するが、ここで、フェロモン応答性であるFus1プロモーターは、β−ガラクトシダーゼ（LacZ）又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のいずれかをコードする配列に機能的に結合されている。ＧＦＰ配列は、野生型であり得るか、又は変化若しくは増大した蛍光を示す突然変異配列（当技術では「増大ＧＦＰ」ともよばれる）であり得る。そのようなFus1pリポーター遺伝子構成体の構築及び使用は、実施例で更に詳しく説明する。Fus1p−ＧＦＰ構成体は、リポーター遺伝子発現の迅速、簡単かつ鋭敏な検出を許し、細胞の集団内でのシグナルの視覚的均一性又は変異に対して制御するのに用い得るため、特に好適である。
【０２２８】
転写制御要素は、プロモーター、エンハンサー、並びにリプレッサー及び活性化因子結合部位を包含するが、これらに限定されない。適切な転写調節要素は、その発現が、迅速に、一般的には、細胞表面タンパク質と、細胞表面タンパク質の活性を調整するエフェクタータンパク質との接触の数分以内に誘導される、遺伝子の転写調節領域に由来し得る。そのような遺伝子の例は、中間初期遺伝子［Sheng et al. (1990) Neuron 4:477-485を参照されたい］、例えばc-fosを包含するが、これらに限定されない。中間初期遺伝子は、細胞表面タンパク質とのリガンドの結合に際して、急速に誘導される遺伝子である。遺伝子構成体に用いるのに好適である転写制御要素は、中間初期遺伝子、中間初期遺伝子の特徴のうちいくつか若しくはすべてを示す、その他の遺伝子に由来する要素、又はそれとの機能的な結合の際に、遺伝子がそのような特徴を示すよう構築された、合成要素を包含する。転写制御要素が由来する好適な遺伝子の特徴は、休止細胞での低いか、又は検出できない発現、転写レベルでの、細胞外刺激の数分以内の迅速な誘導、一過性であり、新たなタンパク質合成とは無関係であり、その後の転写の停止が新たなタンパク質合成を必要とし、かつこれらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡが短い半減期を有する誘導を包含するが、これらに限定されない。
【０２２９】
その他のプロモーター及び転写制御要素は、上記のそれに加えて、血管作動性腸内ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子プロモーター［ｃＡＭＰ応答性；Fink et al. (1988), Proc. Natl.Acad. Sci. 85:6662-6666］；ソマトスタチン遺伝子プロモーター［ｃＡＭＰ応答性；Montminy et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. 8.3:6682-6686］；プロエンケファリンプロモーター［ｃＡＭＰ、ニコチン酸作動薬及びホルボールエステルに応答性；Comb et al. (1986), Nature 323:353-356］；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子プロモーター［ｃＡＭＰ応答性；Short et al. (1986), J. Biol. Chem.261:9721-9726］；ＮＧＦ１−Ａ遺伝子プロモーター［ＮＧＦ、ｃＡＭＰ及び血清に応答性；Changelian et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86:377-381］；及び当業者には公知であるか、又は当業者によって調製されるその他を包含する。
【０２３０】
一定の検定では、スクリーニング手順に成長の変化を用いるのが望ましいことがある。例えば、野生型酵母でのフェロモンシグナル経路の活性化の成り行きの一つは、成長の抑止である。Ｇタンパク質結合受容体の拮抗薬について試験しているならば、成長抑止というこの正常な応答は、フェロモン応答経路が阻害された細胞を選別するのに用いることができる。すなわち、公知の作動薬と未知の活性を有するペプチドとの双方に接触させた細胞は、ペプチドが中立又は作動薬であるならば、成長抑止されるが、ペプチドが拮抗薬であるならば、正常に成長することになる。したがって、成長抑止の応答は、好都合にも、拮抗薬として機能するペプチドを発見するのに用いることができる。
【０２３１】
しかし、Ｇタンパク質結合受容体、又は他のフェロモン系タンパク質の作動薬として機能できる化合物を探索するとき、フェロモン応答経路の活性化の結果としての成長抑止は、作動薬と結合する細胞は、成長を停止するが、作動薬と結合できない周囲の細胞は、成長し続けることから、望ましくない効果である。そうして、問題の細胞は、過剰成長するか、その検出が、背景細胞によって不明瞭にされることになり、問題の細胞の特定を混乱させる。この問題を克服するために、本発明は、細胞を、（１）成長抑止が、外部のシグナル経路活性化の結果として発生せず（例えば、ＦＡＲ１遺伝子の不活性化による）；及び／又は（２）選別的成長の利点が、経路を活性化することによって与えられる（例えば、フェロモン応答プロモーターの制御下で、栄養要求性突然変異体をＨＩＳ３で形質転換し、選別的条件を適用することによる）ように加工することを教示する。
【０２３２】
これに代えて、プロモーターは、受容体経路によって抑制され、そのため、細胞に有害である産物の発現を妨げるそれであってもよい。受容体で抑制されたプロモーターを用いて、プロモーターを有害な遺伝子に結合することによって作動薬について、また有益な遺伝子に結合することによって拮抗薬についてスクリーニングする。抑制は、受容体で誘導されたプロモーターを、マーカー遺伝子が（コーディング領域又はフランキング領域のいずれかで）コードするｍＲＮＡの少なくとも一部に対してアンチセンスであるために、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する、ｍＲＮＡをコードする遺伝子に機能的に結合することによって達成してよい。抑制は、受容体誘導プロモーターを、ＤＮＡ結合リプレッサータンパク質をコードする遺伝子に結合し、適当なオペレーター部位をプロモーターその他のマーカー遺伝子の適切な領域に組み込むことによって、得てもよい。
【０２３３】
酵母の場合、肯定的に選別できる（有益な）遺伝子は、下記を包含する：URA3、LYS2、HIS3、LEU2、TRP1;ADE1、2、3、4、5、7、8；ARG1、3、4、5、6、8；HIS1、4、5；ILV1、2、5；THR1、4；TRP2、3、4、5；LEU1、4；MET2、3、4、8、9、14、16、19；URA1、2、4、5、10、HOM3、6；ASP3；CHO1；ARO 2、7；CYS3；OLE1；INO1、2、4；PRO1、3。その他無数の遺伝子が、潜在的な選別マーカーである。上記は、充分に特徴付けられた生合成経路に含まれる。イミダゾールグリセロールリン酸脱水酵素（ＩＧＰ脱水酵素）の遺伝子（HIS3）は、非常に鋭敏であり、かつ広い範囲の発現レベルにわたって選別できるため、好適である。最も単純な事例では、細胞は、活性化の不在下ではヒスチジンに対して栄養要求性である（成長のためにヒスチジンを要する）。活性化は、酵素の合成へと導き、細胞は、ヒスチジンに対して原栄養要求性になる（ヒスチジンを要しない）。そのため、選別は、ヒスチジンの不在下での成長についてなされる。細胞あたり数分子のＩＧＰ脱水酵素が、ヒスチジン原栄養要求性のために必要とされるにすぎないことから、検定は非常に鋭敏である。
【０２３４】
検定のもう一つのバージョンでは、ＩＧＰ脱水酵素の活性を阻害する薬物である、アミノトリアゾール（ＡＴ）に対する耐性について、細胞を選別することができる。低い、固定したレベルのＨＩＳ３の発現を有する細胞は、該薬物に対して感受性であるが、より高いレベルの細胞は、耐性である。ＡＴの量は、基底レベルのＨＩＳ３発現（そのレベルが何であれ）を有する細胞を阻害するが、低下したレベルの発現を有する細胞の増殖を許すように選ぶことができる。この場合、選別は、ヒスチジンの不在下、及び適切なレベルのＡＴの存在下での増殖についてなされる。
【０２３５】
適切な検定では、いわゆる逆選別できるか、又は否定的に選別できる遺伝子を用いてよい。適切な遺伝子は、URA3（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ；５−フルオロオロチン酸での増殖を阻害）、LYS2（２−アミノアジピン酸還元酵素；唯一の窒素源としてのα−アミノアジピン酸塩での増殖を阻害）、CYH2（リボソームタンパク質Ｌ２９をコードする；シクロヘキサイミド感受性対立遺伝子が耐性対立遺伝子に対して優性）、CAN1（アルギニン透過酵素をコードする；無効対立遺伝子がアルギニン類似体であるカナバニンに対する耐性を賦与）、その他の劣性耐性マーカーを包含する。
【０２３６】
一実施態様では、リポーター遺伝子は、酵母細胞の増殖に有効である。酵母フェロモン系応答経路を通じてのシグナル導入に対する自然な応答は、細胞が増殖抑止を受けることである。これは、該経路を刺激するリガンド／受容体対の拮抗薬について選別する好適な方法である。拮抗薬は、該経路の活性化を阻害すると思われ；そのため、細胞は、増殖することができると思われる。したがって、FAR1遺伝子は、内在性の逆選別できるマーカーであると考え得る。FAR1遺伝子は、好ましくは、作動薬活性についてスクリーニングするときに不活性化される。
【０２３７】
リポーター遺伝子も、スクリーニングできる遺伝子であってよい。スクリーニングされる特徴は、細胞の形態学、代謝などのスクリーニングできる特徴の変化であってよい。適切なマーカーは、β−ガラクトシダーゼ（Xgal、C12FDG、サケgal、マジェンタgal（後二者は、Biosynth AGより））、アルカリ性ホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、エキソグルカナーゼ（酵母exbl遺伝子の産物；非必須、分泌）；ルシフェラーゼ；細菌緑色蛍光タンパク質；（ヒト胎盤性）分泌アルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）；及びクロラムフェニコール転移酵素（ＣＡＴ）を包含する。上記のうちいくつかは、分泌されるように加工することができる（β−ガラクトシダーゼはできないが）。好適なスクリーニング可能マーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼであって；この酵素を発現する酵母細胞は、無色の基質であるXgalを青色の色素に転換する。やはり、プロモーターは、受容体により誘導されるか、受容体により阻害されてよい。
【０２３８】
XI．カルボキシル末端キメラＧタンパク質サブユニット
適正なシグナル導入は、各ＧＰＣＲが、いくつかの構造的に類似するＧタンパク質の特異的なサブクラスとのみ作用し合うにすぎないことを要する［例えば、Conklin et al., (1993) Cell 73:631-641；Savarese et al., (1992) Biochem. 283, 1-19；Headin et al., (1993) Cell signalling 5, 505-518を参照されたい］。細胞内シグナルの正しい選別は、ＧＰＣＲ／Ｇタンパク質相互作用の特異性に依存する。酵母で発現される異種Ｇタンパク質に結合した受容体の結合特異性を改良するため、カルボキシル末端キメラＧタンパク質を生成かつ試験した。キメラＧαタンパク質は、Ｇｐａ1配列の大部分、及び異種（例えば哺乳動物の）Ｇタンパク質サブユニットの、Ｇｐａ1のＣ末端に取って代わる一部を含むよう設計した。
【０２３９】
キメラＧαタンパク質の構築は、Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸を異種（例えば哺乳動物の）Ｇαタンパク質サブユニットのＣ末端アミノ酸で置き換えることを要する。標準的な分子生物学の手法を用いて、Ｇｐａ1その他の異種Ｇαサブユニットをコードする核酸分子を得、例えば、標準的なＰＣＲ増幅及び突然変異形成の後、適切な酵母発現ベクターにクローニングすることによって、キメラＧαタンパク質を構築することができる。Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｏ、Ｇαｑ及びＧαｚと整合するＧＰＡ１のコーディング領域全体は、Dietzel及びKurjan［1987, Cell 50:573］、並びにLambrightら［1994, Nature 369:621-628］に記載されている。追加のＧαサブユニットの情報は、Matteraら［1986, FEBS Lett. 206:36-41］、Brayら［1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8893-8897］及びBrayら［1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5115-5119］によって提供される。ＧＰＡ１及び４種類の他のＧαタンパク質の整合は、Stone及びReed［1990, Mol. Cell Biol. 10:4439］によって提供される。キメラＧタンパク質を生成する一般的な方法及び手順は、例えば、Conklin et al., (1995) Nature 363, 274-276及びLiu et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 111642-116460に記載されている。
【０２４０】
Ｇｐａ1タンパク質は、１〜４７２のアミノ酸位置を含む［Dietzel & Kurjan (1987)、前掲］。Ｇｐａ1タンパク質のＣ末端アミノ酸は、欠失させ、異種（例えば哺乳動物の）ＧαサブユニットのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができ、例えば、Ｇｐａ1の最後の４個のＣ末端アミノ酸残基、すなわち４６９〜４７２位を除去し、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができる。もう一つの実施態様では、Ｇｐａ1の最後の５個のＣ末端アミノ酸残基、すなわち４６８〜４７２位を除去し、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができる。もう一つの実施態様では、Ｇｐａ1の最後の６個のＣ末端アミノ酸残基、すなわち４６７〜４７２位を除去し、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができる。もう一つの実施態様では、Ｇｐａ1の最後の２８アミノ酸残基、すなわち４４５〜４７２位を除去し、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができる。もう一つの実施態様では、Ｇｐａ1の最後の３０アミノ酸残基、すなわち４４３〜４７２位を除去し、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができる。更にもう一つの実施態様では、Ｇｐａ1の最後の５０アミノ酸残基、すなわち４２３〜４７２位を除去し、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができる。他の様々な実施態様では、４〜５０アミノ酸のうちいかなる数のＣ末端Ｇｐａ1アミノ酸残基も、例えば４〜５０、４〜４０、４〜３０、４〜２８、４〜６、より好ましくは５又は６アミノ酸残基を置き換えることができる。
【０２４１】
Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸を、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸と置き換える。例えば、Ｇｐａ1の最後の５個のＣ末端アミノ酸、すなわち４６８〜４７２位を除去し、異種Ｇαサブユニットの最後の５個のＣ末端アミノ酸と置き換える。Ｇｐａ1アミノ酸のＣ末端アミノ酸は、基本的にいかなる異種Ｇタンパク質αサブユニットと置き換えることもできるが、最も好ましくは、哺乳動物の配列、最も好ましくはマウス、ラット又はヒトの配列と置き換える。異種Ｇαサブユニットは、いかなる数のＧαサブユニット群、例えばＧαｓ、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｑ、Ｇαｏａ、Ｇαｏｂ及びＧα１６から選ぶこともできる。好ましくは、Ｇαサブユニットは、Ｇαｓ、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｑ及びＧα１６から選ぶ。
【０２４２】
一実施態様では、異種Ｇαサブユニットの最後の５個〜最初の最後の５０個のＣ末端アミノ酸が、Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸に取って代わる。もう一つの実施態様では、異種Ｇαサブユニットの最後の４個〜最後の４０個のＣ末端アミノ酸が、Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸に取って代わる。更にもう一つの実施態様では、異種Ｇαサブユニットの最後の４個〜最後の２８個のＣ末端アミノ酸が、Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸に取って代わる。好適実施態様では、異種Ｇαサブユニットの最後の４個〜最後の６個のＣ末端アミノ酸が、Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸に取って代わる。より好適な実施態様では、異種Ｇαサブユニットの最後の５個のＣ末端アミノ酸が、Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸に取って代わる。他の様々な実施態様では、異種Ｇαサブユニットの４〜５０アミノ酸のうちいかなる数のＣ末端アミノ酸残基も、例えば４〜５０、４〜３０、４〜４０、４〜２８、４〜６、より好ましくは５又は６アミノ酸残基が、Ｇｐａ1配列に取って代わることができる。
【０２４３】
Ｇｐａ1配列は、好ましくは、異種Ｇαサブユニットの野生型配列と、例えばＧｐａ1の最後の５個のＣ末端アミノ酸を野生型哺乳動物のＧαサブユニットの、対応する最後の５個のＣ末端アミノ酸と置き換えることによって、置き換える。しかし、Ｇｐａ1配列は、例えば、Ｇαサブユニットの最後の５個のＣ末端アミノ酸配列での一つ又はそれ以上の同類置換を含む、突然変異Ｇαサブユニットの配列と置き換えてもよい。突然変異Ｇαサブユニット配列は、それらが受容体特異性を保持又は改良できる能力に基づいて選ぶ。したがって、異種ＧαサブユニットのＣ末端アミノ酸は、野生型配列と、受容体特異性を保つ同類置換とを含むことが意図される。
【０２４４】
キメラＧαタンパク質の結合特異性は、異種Ｇタンパク質結合受容体も発現する、キメラＧαタンパク質を酵母細胞内で発現することによって試験することができる。異種ＧＰＣＲとのキメラＧαタンパク質の結合は、例えば、実施例１１に記載のとおり、Fus1-LacZスクリーニングによって決定することができる。Ｇｐａ1の最後の５個、又は最後の６個のＣ末端アミノ酸が、異種Ｇαサブユニットの、それぞれ、最後の５個、又は最後の６個のＣ末端アミノ酸で置き換えられたキメラＧαタンパク質は、いくつかの異種Ｇタンパク質結合受容体との改良された結合を立証する（実施例１１の表３及び４を参照されたい）。これらのキメラＧタンパク質は、オーファン受容体を結合かつ刺激することもできる（実施例１１の表５を参照されたい）。
【０２４５】
XII．「サンドイッチ」キメラＧタンパク質
酵母で発現される異種受容体の結合特異性に対するそれ以上の改良は、Ｇｐａ1配列が、異種Ｇα配列によって、アミノ及びカルボキシル双方の末端で挟まれた、「サンドイッチキメラ」を生成することによってなされる。本明細書に用いられる限りでの用語「サンドイッチキメラ」とは、第一の異種Ｇタンパク質αサブユニットの少なくとも一つのＣ末端アミノ酸、及び第二の異種Ｇタンパク質αサブユニットの少なくとも一つのＮ末端アミノ酸を有するキメラＧｐａ1サブユニットを意味する。第一及び第二の異種Ｇαサブユニットは、同じであるか、又は異なる、例えば、Ｇαｓ−Ｇｐａ1−Ｇαｓ又はＧαｓ−Ｇｐａ1−Ｇαｑであることができる。サンドイッチキメラＧタンパク質を、Ｇｐａ1配列の大部分と、Ｇｐａ1タンパク質のＣ末端及びＮ末端にＧαサブユニットの一部とを有するよう設計した。
【０２４６】
サンドイッチキメラＧタンパク質の構築は、代表的には、Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸を異種ＧαサブユニットのＣ末端アミノ酸と置き換え、そしてＧｐａ1のＮ末端アミノ酸を異種ＧαサブユニットのＮ末端アミノ酸と置き換えるか、又は異種ＧαサブユニットのＮ末端アミノ酸をＧｐａ1のアミノ末端の端に付加するかのいずれかを実施することを要する。標準的な分子生物学的手法を用いて、Ｇｐａ1及び異種Ｇαサブユニットタンパク質をコードする核酸分子を得ることができる。サンドイッチキメラＧタンパク質の構築は、例えば、標準的なＰＣＲ増幅及び突然変異形成の後、適切な酵母発現ベクターにクローニングすることによって実施することができる。
【０２４７】
Ｇｐａ1タンパク質のＣ末端アミノ酸は、欠失させ、異種（例えば哺乳動物の）ＧαサブユニットのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができ、例えば、Ｇｐａ1の最後の４個のＣ末端アミノ酸残基、すなわち４６９〜４７２位を除去し、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができる。もう一つの実施態様では、Ｇｐａ1の最後の５個のＣ末端アミノ酸残基、すなわち４６８〜４７２位を除去し、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができる。もう一つの実施態様では、Ｇｐａ1の最後の６個のＣ末端アミノ酸残基、すなわち４６７〜４７２位を除去し、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができる。もう一つの実施態様では、Ｇｐａ1の最後の２８アミノ酸残基、すなわち４４５〜４７２位を除去し、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができる。もう一つの実施態様では、Ｇｐａ1の最後の３０アミノ酸残基、すなわち４４３〜４７２位を除去し、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができる。更にもう一つの実施態様では、Ｇｐａ1の最後の５０アミノ酸残基、すなわち４２３〜４７２位を除去し、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができる。他の様々な実施態様では、４〜５０アミノ酸のうちいかなる数のＣ末端Ｇｐａ1アミノ酸残基も、例えば４〜５０、４〜４０、４〜３０、４〜２８、４〜６、より好ましくは５又は６アミノ酸残基を置き換えることができる。
【０２４８】
Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸を、異種ＧαサブユニットからのＣ末端アミノ酸と置き換える。例えば、Ｇｐａ1の最後の５個のＣ末端アミノ酸、すなわち４６８〜４７２位を除去し、異種Ｇαサブユニットの最後の５個のＣ末端アミノ酸と置き換える。Ｇｐａ1アミノ酸のＣ末端アミノ酸は、基本的にいかなる異種Ｇタンパク質αサブユニットと置き換えることもできるが、最も好ましくは、哺乳動物の配列、最も好ましくはマウス、ラット又はヒトの配列と置き換える。異種Ｇαサブユニットは、いかなる数のＧαサブユニット群、例えばＧαｓ、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｑ、Ｇαｏａ、Ｇαｏｂ及びＧα１６から選ぶことができる。好ましくは、Ｇαサブユニットは、Ｇαｓ、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｑ及びＧα１６から選ぶ。
【０２４９】
一実施態様では、異種Ｇαサブユニットの最後の４個〜最後の５０個のＣ末端アミノ酸が、Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸に取って代わる。もう一つの実施態様では、異種Ｇαサブユニットの最後の４個〜最後の４０個のＣ末端アミノ酸が、Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸に取って代わる。更にもう一つの実施態様では、異種Ｇαサブユニットの最後の４個〜最後の２８個のＣ末端アミノ酸が、Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸に取って代わる。好適実施態様では、異種Ｇαサブユニットの最後の４個〜最後の６個のＣ末端アミノ酸が、Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸に取って代わる。より好適な実施態様では、異種Ｇαサブユニットの最後の５個のＣ末端アミノ酸が、Ｇｐａ1のＣ末端アミノ酸に取って代わる。他の様々な実施態様では、異種Ｇαサブユニットの４〜５０アミノ酸のうちいかなる数のＣ末端アミノ酸残基も、例えば４〜５０、４〜４０、４〜３０、４〜２８、４〜６、より好ましくは５又は６アミノ酸残基が、Ｇｐａ1配列に取って代わることができる。
【０２５０】
加えて、サンドイッチキメラのためには、異種ＧαサブユニットのＮ末端アミノ酸を、Ｇｐａ1のＮ末端アミノ酸から置き換えるか、又はこれに付加する。こうして、Ｇｐａ1のＮ末端は、異種ＧαサブユニットのＮ末端アミノ酸に「機能的に結合」される。Ｎ末端アミノ酸は、Ｃ末端配列と同じ異種Ｇαサブユニットに由来するか、又は異なるＧαサブユニットに由来することができる。最も好ましくは、異種Ｎ末端アミノ酸は、哺乳動物の配列、最も好ましくはマウス、ラット又はヒトの配列からのものである。異種Ｇαサブユニットは、いかなる数のＧαサブユニット群、例えばＧαｓ、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｑ、Ｇαｏａ、Ｇαｏｂ及びＧα１６から選ぶこともできる。好ましくは、Ｇαサブユニットは、Ｇαｓ、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｑ及びＧα１６から選ぶ。
【０２５１】
Ｇｐａ1タンパク質のＣ末端アミノ酸は、欠失させ、異種（例えば哺乳動物の）ＧαサブユニットのＣ末端アミノ酸残基と置き換えることができ、例えば、Ｇｐａ1の第１〜第５０Ｎ末端アミノ酸を除去し、異種ＧαサブユニットからのＮ末端アミノ酸と置き換えることができる。もう一つの実施態様では、Ｇｐａ1の第１〜第３０Ｎ末端アミノ酸を除去し、異種ＧαサブユニットからのＮ末端アミノ酸と置き換えることができる。好適実施態様では、Ｇｐａ1の第１〜第２２Ｎ末端アミノ酸を除去し、異種ＧαサブユニットからのＮ末端アミノ酸と置き換えることができる。もう一つの実施態様では、Ｇｐａ1の第１〜第１１Ｎ末端アミノ酸を除去し、異種ＧαサブユニットからのＮ末端アミノ酸と置き換えることができる。
【０２５２】
一実施態様では、異種Ｇαサブユニットの最初の５０個のＮ末端アミノ酸を、Ｇｐａ1のＮ末端アミノ酸から置き換えるか、又はこれに付加する。もう一つの実施態様では、異種Ｇαサブユニットの最初の４０個のＮ末端アミノ酸を、Ｇｐａ1のＮ末端アミノ酸から置き換えるか、又はこれに付加する。もう一つの実施態様では、異種Ｇαタンパク質サブユニットの最初の３０個のＮ末端アミノ酸を、Ｇｐａ1のＮ末端アミノ酸から置き換えるか、又はこれに付加する。もう一つの実施態様では、異種Ｇαタンパク質サブユニットの最初の２１個のＮ末端アミノ酸を、Ｇｐａ1のＮ末端アミノ酸から置き換えるか、又はこれに付加する。更にもう一つの実施態様では、異種Ｇαタンパク質サブユニットの最初の１１個のＮ末端アミノ酸を、Ｇｐａ1のＮ末端アミノ酸から置き換えるか、又はこれに付加する。他の様々な実施態様では、異種Ｇαサブユニットの５〜５０アミノ酸のうちいかなる数のＣ末端アミノ酸残基も、例えば１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２１、又は１〜１１アミノ酸残基を、Ｎ末端Ｇｐａ1配列から置き換えるか、又はこれに付加することができる。
【０２５３】
一実施態様では、Ｇｐａ1のＣ末端及びＮ末端アミノ酸に対する置換は、同じ異種Ｇαサブユニットを用いて実施することができる。一実施態様では、この異種Ｇαサブユニットは、Ｇαｑである。技量を有する当業者は、いかなる数のＧαサブユニット群を用いても置換を実施できることを認識するものと思われる。やはり本発明の対象範囲内で、Ｎ及びＣ末端での置換は、異なるＧαサブユニットを用いてＧｐａ1のＣ及びＮ末端で実施することができる。Ｃ末端及びＮ末端置換の組合せの例は、Ｇαｓ−Ｇｐａ1−Ｇαｑ；Ｇαｑ−Ｇｐａ1−Ｇαｓ；Ｇαｓ−Ｇｐａ1−Ｇαｉ２；Ｇαｉ２−Ｇｐａ1−Ｇαｓ；Ｇαｓ−Ｇｐａ1−Ｇαｉ３；Ｇαｉ３−Ｇｐａ1−Ｇαｓなどを包含するが、これらに限定されない。
【０２５４】
Ｇｐａ1配列は、好ましくは、異種Ｇαサブユニットの野生型配列と、例えばＧｐａ1の最後の５個のＣ末端アミノ酸を野生型哺乳動物のＧαサブユニットの、対応する最後の５個のＣ末端アミノ酸と置き換えることによって、置き換える。しかし、Ｇｐａ1配列は、例えば、Ｇαサブユニットの最後の５個のＣ末端アミノ酸配列での一つ又はそれ以上の同類置換を含む、突然変異Ｇαサブユニットの配列と置き換えてもよい。突然変異Ｇαサブユニット配列は、それらが受容体特異性を保持又は改良できる能力に基づいて選ぶ。したがって、異種ＧαサブユニットのＣ末端アミノ酸は、野生型配列と、受容体特異性を保つ同類置換とを含むことが意図される。
【０２５５】
キメラＧαタンパク質の結合特異性は、異種Ｇタンパク質結合受容体も発現する、キメラＧαタンパク質を酵母細胞内で発現することによって試験することができる。異種受容体とのサンドイッチキメラＧタンパク質の結合は、例えば、実施例１２に記載のとおり、Fus1-pHIS3スクリーニングによって決定することができる。Ｇｐａ1のＣ末端及びＮ末端アミノ酸が、異種Ｇαサブユニットの配列で置き換えられたサンドイッチキメラＧタンパク質は、様々な異種Ｇタンパク質結合受容体で試験したとき、改良された結合を立証する（実施例１２を参照されたい）。
【０２５６】
本明細書に開示されたすべての特許、刊行された特許出願その他の引用文献は、ここに、引用によって明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２５７】
【図１】ＧαサブユニットのＮ末端領域とＧＰＡ４１−Ｇαハイブリッド蛋白質のＮ末端配列との配列アラインメントである。
【図２】哺乳動物のＧαｓサブユニットの酵母Ｇβγへの共役に対する哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニットＧαｓの突然変異の効果の説明である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０２５８】
以上、本発明を概括的に説明したが、下記の実施例を参照することによって本発明はより容易に理解される。しかし実施例は、本発明のある特徴及び態様を単に例証することが目的であって、本発明を制限するものではない。
【０２５９】
実施例１：酵母菌／哺乳類キメラＧαサブユニット
この実施例は、酵母菌Ｇ蛋白質サブユニット由来の第一のポリペプチドと哺乳類Ｇ蛋白質サブユニット由来の第二のポリペプチドから作成される、Ｇ蛋白質サブユニットのキメラの構築に関する。異質三量体Ｇ蛋白質のＧαサブユニットは、βγ複合体及び受容体の両方と相互作用する。従ってキメラαサブユニットの構築は、受容体結合を促進する。この実施例では、酵母菌ＧＰＡ１由来のポリペプチドと数種類の異なる哺乳類Ｇαサブユニットを用いて、様々なＧ蛋白質サブユニットキメラを構築した。ＧＰＡ１のヌクレオチド配列は公知である。例えば、サッカロミセス・セレビシエと同種のＧ蛋白質をコードする遺伝子を、単独でクローンした［Ｄｉｅｔｚｅｌ及びＫｕｒｊａｎ（上述；遺伝子はＳＣＧ１と称されている）及びＮａｋａｆｕｋｕ他（１９８７Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ８４：２１４０−２１４４（遺伝子はＧＰＡ１と称されている）参照］。ヒトＧαサブユニットであるＧαｓ、Ｇαｉ２及びＧαｉ３のヌクレオチド配列も公知である。以下の記述は、Ｇ蛋白質サブユニットＧαのキメラ構築の特異な形態の実施例である。
【０２６０】
使用するプラスミドを下記のように構築した。
ｐＲＳ４１６−ＧＰＡ１（Ｃａｄｕｓ１０６９）：全長ＧＰＡ１のプロモーター領域、コード領域、および約２５０ヌクレオチドの３’末端非翻訳領域をコードするＸｂａＩ−ＳａｃＩ断片を、１０ＹＣｐｌａｃ１１１−ＧＰＡ１（Ｓ．Ｒｅｅｄ、スクリップス研究所より入手）から切り出し、ＸｂａＩ及びＳａｃＩで切断したＹＥｐベクターｐＲＳ４１６（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ及びＨｉｅｔｅｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２：１９（１９８９））内にクローンした。
【０２６１】
部位により誘発されるＧＰＡ１突然変異（Ｃａｄｕｓ１０７５、１１２１及び１１２２）：全ＧＰＡ１コード領域及び２００ヌクレオチドの５’非翻訳領域を含む１．９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩ切断しホスファターゼ処理したｐＡＬＴＥＲ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローンし、電気穿孔法によりＤＨ５αＦ’バクテリア内で形質転換させてＣａｄｕｓ１０７５を得た。組替えプラスミドをＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージで回収し、一本鎖組替えＤＮＡを業者の説明書に従って抽出した。下記の合成ヌクレオチドを用いて誘発した突然変異によって、新規ＮｃｏｌＩ部位をＧＰＡ１の開始メチオニンに導入した。
５’ＧＡＴＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＡＧＧＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＧ３’ （配列番号１３）
アンピシリンで正のクローンを分離し、数種類の異なるクローンを＋１位置における新規なＮＭｃｏＩ部位に沿って両方向、配列決定した。正しい配列を含む２種のクローンを、Ｃａｄｕｓ１１２１及び１１２２として保持した。
【０２６２】
ＧＰＡ１に基づく発現ベクター（Ｃａｄｕｓ１１２７）の構築：酵母菌中で全長及びハイブリッド哺乳類Ｇα蛋白質を発現するのに用いられるベクター（Ｃａｄｕｓ１１２７）を、以下のように構築した。ＧＰＡ１の３’非翻訳領域に渡る３５０ヌクレオチドの断片を、オリゴヌクレオチドプライマーＡ（５’ＣＧＡＧＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＡＣＧＴＡＴＡＡＴＴＡＡＡＧＴＡＧＴＧ３’（配列番号１４））及びＢ（５’ＧＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＴＴＣＧＡＧＡＴＡＡＴＡＣＣＣ３’（配列番号１５））を用いるＴａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で増幅した。３５０ヌクレオチドの産物をＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（Ｂｉｏ１０１）を用いるゲル電気泳動によって精製し、単ヌクレオチド重複ＴＡクローニング（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）によって、ｐＣＲＩＩベクター内に直接クローンした。組替えクローンを、制限酵素地図及びジデオキシヌクレオチド配列決定によって特徴付けした。組替え遺伝子は、通常のＧＰＡ１配列の５’側に新規なＸｈｏＩ部位を、通常のＧＰＡ１配列の３’側に新規なＫｐｎＩ部位を含んでいた（それぞれプライマーＡ及びプライマーＢと称する）。
【０２６３】
Ｃａｄｕｓ１０１３（ｐＲＳ４１４）のポリリンカーのＮｏｔＩ及びＳａｃＩ部位をこれらの制限酵素で除去し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を挿入してブラントエンド結合してＣａｄｕｓ１０９２を得た。ＧＰＡ１プロモーター及びＧＰＡ１の５’非翻訳領域を含むＹＣｐｌａｃ１１１−ＧＰＡ１から得た１．４ｋｂのＧＰＡ１のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ５’断片をＧｅｎｅＣｌｅａｎ（Ｂｉｏ１０１）を用いるゲル電気泳動によって精製し、ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ制限酵素切断Ｃａｄｕｓ１０１３内にクローンし、Ｃａｄｕｓ１０８７を得た。ＰＣＲ増幅した、ＧＰＡ１の３’非翻訳領域をコードするＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片を、Ｃａｄｕｓ１０８９から切り出し、ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ制限酵素切断Ｃａｄｕｓ１０８７内にクローンしてＣａｄｕｓ１０９２を得た。Ｃａｄｕｓ１０９２のポリリンカーのＮｏｔＩ及びＳａｃＩ部位をこれらの制限酵素で除去し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を挿入してブラントエンド結合してＣａｄｕｓ１１１０を得た。ＥｃｏＲＩの−２００〜＋１２０位置から得た、Ｃａｄｕｓ１１２２をコードするＧＰＡ１の領域をＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー）及び下記のプライマーを用いて増幅した。
５’ＣＣＣＧＡＡＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＣＧ３’（配列番号１６）及び
５’ＧＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＡＡＣＡＧＴ３’（配列番号１７）
５’末端にＥｃｏＲＩ部位を有し、３’末端に新規なＳａｃＩ、ＮｏｔＩ及びＳａｌＩ部位を有する増幅産物を、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで制限酵素切断し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（ＢｉｏｌＯｌ）を用いてゲル精製し、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで制限酵素切断したＣａｄｕｓ１１１０内にクローンしてＣａｄｕｓ１１２７を得た。−２００のＥｃｏＲＩと、３’非翻訳領域の３’端におけるＫｐｎＩ部位との間に位置するベクターのＤＮＡ配列を、制限酵素地図及びジデオキシヌクレオチドＤＮＡ配列分析によって確認した。
【０２６４】
ＧＰＡ４１−Ｇα蛋白質のＰＣＲ増幅及びＣａｄｕｓ１１２７内へのクローニング：ヒトＧαサブユニットであるＧαｓ、Ｇαｉ２及びＧαｉ３、並びにサッカロミセス・セレビシエＧＰＡ１をコードするｃＤＮＡクローンを、Ｖｅｎｔ熱安定性ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー）を用いて増幅した。増幅に用いたプライマー対は下記である。
ＧαＳ用：プライマー１：５’ＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧ３’（配列番号１８）（ＳａｃＩ５’）
プライマー２：５’ＣＴＧＣＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡＧＣ３’（配列番号１９）（ＳａｌＩ３’）
プライマー３：５’ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＧＴＡＣ３’（配列番号２０）（ＸｈｏＩ３’）
Ｇαｉ２用：プライマー１：５’ＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＧＧ３’（配列番号２１）（ＳａｃＩ５’）
プライマー２：５’ＣＴＧＣＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＣＧＧＴ ＣＣ３’（配列番号２２）（ＳａｌＩ３’）
プライマー３：５’ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣ３’（配列番号２３）（ＸｈｏＩ３’）
Ｇαｉ３用：プライマー１：５’ＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧ３’（配列番号２４）（ＳａｃＩ５’）
プライマー２：５’ＣＴＧＣＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＴＡＡＣＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＣＴＣＡＡＴ ＡＡＡＧＴＣ３’（配列番号２５）（ＳａｌＩ３’）
プライマー３：５’ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＴＴＣＴＣＡＡＴＡＡＡＧＴＣＣＡＣ３’（配列番号２６）（ＸｈｏＩ３’）
増幅後、産物をＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（ＢｉｏｌＯ１）を用いたゲル電気泳動で精製し、適当な制限酵素で切断してＣａｄｕｓ１１２７内にクローンした。
【０２６５】
増幅した遺伝子の５’末端付近の望ましい位置に導入したＳａｃＩ部位並びに３’非翻訳領域に導入したＳａｌＩ又はＸｈｏｌ部位を通じて、ＧＰＡ４１−Ｇαサブユニットをクローンした。結合遺伝子混合物をコンピテントバクテリアに電気穿孔導入し、アンピシリン耐性バクテリアの５０種の培養からプラスミドＤＮＡを調製した。
【０２６６】
ＧＰＡ４１−Ｇαサブユニットをコードする融和ベクターの構築：各ＧＰＡ４１−Ｇαハイブリッドのコード領域を、融和ベクター（ｐＲＳ４０６＝ＵＲＡ３ ＡｍｐＲ）内に、このベクターのポリリンカークローン部位に隣接するＢｓｓＨＩＩ部位を用いてクローンした。Ｃａｄｕｓ１０１１（ｐＲＳ４０６）をＢｓｓＨＩＩで制限酵素切断し、業者の説明書に従ってエビアルカリフォスファターゼで処理し、線型化されたヴェクターをゲル電気泳動で精製した。各ＧＰＡ４１−Ｇαハイブリッドから得た挿入物を親ブラスミドからＢｓｓＨＩＩを用いて切断し、ゲル精製したＣａｄｕｓ１０１１内にサブクローンした。
【０２６７】
ＧＰＡ４１−Ｇα構造体の構築：鋳型としてのＣａｄｕｓ１１７９（開始メチオニンにおいて新規なＮｃｏｌ部位を有する野生型ＧＰＡ１対立遺伝子をコードする）、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、及び下記のプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって、新規なＢＳ５ＨＩＩ部位を、ＧＰＡ１コード領域内のフレームに導入した。
プライマーＡ：５’ＧＣＡＴＣＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＣＣＡＧ３’（配列番号２７）及びプライマーＢ：５’ＧＡＡＡＣＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＴＣＴＴＡＣ３’（配列番号２８）
１．１ｋｂのＰＣＲ産物をＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（ＢｉｏｌＯ１）でゲル精製し、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素切断し、ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断及びフォスファターゼ処理したＣａｄｕｓ１１２２内にクローンしてＣａｄｕｓ１６０５を得た。Ｃａｄｕｓ１６０５の配列を、制限酵素分析及び２本鎖鋳型のジデオキシ配列決定によって確認した。Ｇαｓ、Ｇαｉ２及びＧαｌ６の組替えＧＰＡＢａｍ−Ｇαハイブリッドを作成した。組替えＧＰＡＢａｍ−Ｇαｌ６をコードするＣａｄｕｓ１８５５の構築をここで主に述べるが、他のハイブリッドの構築も同様なクローニング法に従う。天然Ｇαｌ６をコードする親プラスミドＣａｄｕｓ１６１７を、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素切断し、業者の説明書に従ってエビアルカリフォスファターゼで処理し、線型化したベクターをゲル電気泳動で精製した。Ｃａｄｕｓ１６０５をＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素切断し、ＧＰＡ１の６０％のアミノ末端をコードしかつ３’末端に新規なＢａｍＨＩ部位を有する１．１ｋｂの断片を、ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素処理Ｃａｄｕｓ１６１７内にクローンした。ＧＰＡBam−Ｇαｌ６ハイブリッドをコードする、得られるプラスミドの配列を、制限酵素分析で確認し、酵母菌Ｇβγに結合する能力について試験用株を分析し、ｇｐａｌについて負の表現型を抑制した。更に、本出願に説明される２種のＧＰＡＢａｍ−Ｇαハイブリッドである、ＧＰＡＢａｍ−Ｇαｓ及びＧＰＡＢａｍ−Ｇαｉ２を同様の方法で調製した。ＧＰＡBam−Ｇαｉ２ハイブリッドの構築にはＣａｄｕｓ１６０６を、ＧＰＡＢａｍ−Ｇαｓハイブリッドの構築にはＣａｄｕｓ１１８１を、親プラスミドとして用いた。
【０２６８】
実施例２：Ｇαの棄却域の同定、及びイーストβγを有する哺乳類Ｇαｓの突然変異による相互作用の向上
本実施例では、様々な哺乳類Ｇαサブユニットの棄却域を下記の一連の突然変異によって同定する。
ラットＧαｓのＤ２２９５、ヒトＧαｌ６のＳ２７０Ｐ、Ｇｐａｌ−Ｇαｉ２−ＧαｏＢのＳ２８０Ｐ、及びＧＰＡ１−Ｇαｌ２のＳ２８８Ｐ
異質三量体G蛋白質の受容体に対する結合の特異性を、G蛋白質のαサブユニットによって決定する。この事実は酵母菌内におけるヒト７経膜受容体の発現、（薬物発見の経路としての）酵母菌フェロモン応答経路内への機能的結合に利用されてきた。この目的を達成するために、哺乳類Ｇαサブユニットを、フェロモン応答性Ｇαサブユニット（ＧＰＡ１）を破壊した酵母菌細胞内で発現させた。ＧＰＡ１の主要な役割は、異質三量体のエフェクター信号発信βγ成分に結合し隔離することなので、哺乳類Ｇαのエフェクター活性を調べることは見当違いである。ここで調べるべき活性は、静止状態において酵母菌βγに結合し、受容体の活性時に解放する能力である。
一般に、哺乳類Ｇαサブユニットの、サッカロミセス・セレビシエのβγサブユニットに対する結合能は低い。内生Ｇαサブユニットを有さない酵母菌内でこれらのＧαが発現されると、上記したように結合能が低い結果、未結合の酵母菌βγのエフェクター活性によって、フェロモン経路の構成的活性化がおこる。哺乳類Ｇαの、酵母菌βγに対する相互作用は、様々な遺伝子選択とスクリーン法を組合せた様々なランダム及びセミランダム突然変異によって向上させることができる。そのような分析によって、α−βγ結合の棄却域を明確にするだけでなく、βγには直接結合しないがこの結合を媒介するＧα残基を同定する。
【０２６９】
酵母菌株
実験には下記の酵母菌株を用いた。
ＣＹ７７５７（ＭＡＴα ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２ｇｐａｌ：：ＬＥＵ２ ｆｕｓｌ−ＨＩＳ３ ｆａｒｌ−１ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｌｙｓ２ ａｄｅ２−１）、及びＣＹ１３１６（ＭＡＴα ｇｐａｌΔ１１６３ ｆａｒｌΔ１４４２ ｔｂｔｌ−１ ｆｕｓｌ−ＨＩＳ３ ｃａｎ１ ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２ ｓｔｅ３Δ１１５６ ｌｙｓ２ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３）を、標準的遺伝子操作法によって構築した。ｓｔｅ１４：：ＴＲＰ１、ｇｐａ１：：ＬＥＵ２、ｆａｒ１−１及びｆｕｓ１−ＨＩＳ３対立遺伝子は、それぞれＧＭＺ８０９（Ｈｒｙｃｙｎａ他、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：１６９９）、Ｄ１１１（Ｋｕｒｊａｎ他、１９８７、Ｃｅｌｌ５０：１００１）、ＩＨ２５１２（Ｃｈａｎｇ他、１９９０、６３：９９９）及びＳＹ１３９０（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ他、１９９２、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ６：１２９３）に由来する。ｇｐａΔ１１６３（ＧＰＡ１の内部Ｓｐｈ１断片の欠損）、ｓｔｅ３Δ１１５６（ＳＴＥ３の開始コドンから停止コドンに渡る欠損）、及びｆａｒｌΔ１４４２（ＦＡＲＩのコドン５０〜６９６に渡る欠損）の対立遺伝子を、５−フルオロオロチン酸を用いた２段階遺伝子破壊によって導入した（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１９４参照）。ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２障害を、ｐＲＳ６２４を用いて構築した（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ及びＨｉｅｔｅｒ、１９８９、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ参照）。
【０２７０】
プラスミド
様々なＧα構造体の発現には、動原体プラスミドＣｐ１１２７由来の発現プラスミドを用いた。このプラスミドは、５’及び３’クローン部位として作用するＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ部位によって分断される、選択性マーカーとしてのＴＲＰ１遺伝子、並びにＧＰＡ１プロモーター及びターミネーターを含む。Ｃｐ３０９８は、ｐＹＳＫ１３６からサブクローンされたラットＧαｓサブユニットを含む（Ｄｉｅｔｚｅｌ及びＫｕｒｊａｎ、１９８７、Ｃｅｌｌ５０：１００１参照）。このサブクローンは、そこに含まれる５’ＮｃｏＩ部位；並びにオリゴヌクレオチド「ｇｓｘｈｏｒｅｖ」（５’−ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＣＣＣＴＴＣＴＴＡＧＡＧＣＡＧＣＴ−３’）（配列番号４５）を用いたＰＣＲにより導入された３’ＸｈｏＩ部位を用いて行う。Ｃｐ３２２２は、ＴＲＰ１遺伝子を含む９１７ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片と、ＡＤＥ２遺伝子をコードする２．４ｋｂのＢｂｓＩ−消化ＰＣＲ断片と置き換えることによって構築される。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド「ＡＤＥ２ＦＷＤ」（５’−ＣＣＣＧＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＡＣＣＡＧＧＴＴＡＴＴＡＴＡ−３’）（配列番号４６）及び「ＡＤＥ２ＲＥＶ」（５’−ＡＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＡＧＣＴＴＴＡＴＡＡＴＴＴＧＧＧＣＴＴＴＡＧＴＴ−３’）（配列番号４７）を用いてゲノム野生株酵母菌ＤＮＡを増幅して得られる。このプラスミド中のＡＤＥ２遺伝子は、Ｇαｓカセットとは反対の方向に転写される。
【０２７１】
野生型ラットＧαｓにおける突然変異Ｄ２２９Ｓは、ラットＧαｓ鋳型Ｃｐ３０９８から得た２種の断片を、オリゴ対５２３（ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＣＣＧ  ＴＴＴ  ＣＴＡ  ＡＣ）（配列番号４８）及び逆方向Ｄ２２９Ｓ（ＣＣＣＣＧＴＣＴＣＡＡＧＡＧＣＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＣＡＣＡＴＣ）（配列番号４９）；並びに正方向Ｄ２２９Ｓ（ＣＣＣＣＧＴＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＣＧＣＣＧＣＡＡＧＴＧＧＡＴＣＣ）（配列番号５０）及び７５９（ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  Ｇ）（配列番号５１）を用いて増幅した。前者のオリゴ対を用いて得られた断片をＮｃｏＩ及びＢｓｍＢＩで消化し、後者のオリゴ対を用いて得られた断片をＢｇＩＩＩ及びＢｓｍＢＩで消化し、ＮｃｏＩ及びＢｇＩＩＩで消化したＣｐ３０９８内にそれらを連結させ、Ｃｐ３３９０を得た。このプラスミドは下記の配列を有していた。
ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＣＧＣ
ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  （配列番号５２）
Ｄ      Ｖ      Ｇ      Ｇ      Ｑ      Ｒ      Ｓ      Ｅ      Ｒ
Ｒ      Ｋ      Ｗ      Ｉ  （配列番号５３）
これにより、野生型の２２９位置におけるアスパラギン酸をセリンに置換したラットＧａｓをコードするようになった。
【０２７２】
Ｓ２７０Ｐ突然変異を有するＧｐａｌ−Ｇαｌ６キメラをコードするプラスミドＣｐ３６９９を、以下のように構築した。ＫＳ５７１４（５’−ＴＣＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧ  ＧＡＡＧＡＧＣ−３’）（配列番号５４）及びＫＳ４６６１（５’−ＣＴＧＣＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＴＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＴＧＡＴ  ＣＴＣＧＴＣＣＡＧ−３’）（配列番号５５）を用いて、ヒトＧαｌ６遺伝子の第４５￣３７４コドンを増幅し、この断片をＳａｃＩ及びＳａｌＩで消化し、同じ酵素で消化したＣｐ１１２７に連結して、Ｇｐａｌ（１−４３）−Ｇαｌ６（４５−３７４）キメラをコードするＣｐ３２３３を得た。このプラスミドをプライーマー対Ｇ１６−２７１Ｆ（ＧＴＣＡＧＧＴＣＴＣＡＡＣＣＡＧＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＣ）（配列番号５６）及び５２４（ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＡＣ  ＧＡＴ  ＴＴＡ  ＡＣＧ  ＡＧ）（配列番号８４）；並びにＧ１６−２７１Ｒ（ＡＣＧＴＧＧＴＣＴＣＡＴＧＧＴＧＴＧＣＴＴＴＴＧＡＡＣＣＡＧＧＧＴＡＧＴ）（配列番号５７）及び７１３（ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＴＣ）（配列番号５８）を用いて増幅することによって突然変異させた（Ｓ２７０Ｐ）。得られた断片をそれぞれＢｓａＩ及びＸｈｏＩ又はＢｓａＩ及びＮｈｅＩで消化し、Ｎｈｅｌ及びＸｈｏｌで消化したＣｐ３２３３内に連結させ、Ｃｐ３６９９を得た。このプラスミドは下記の突然変異配列を有していた。
ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＴＣ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＧＴＣ
ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  （配列番号５９）
Ｌ      Ｐ      Ｗ      Ｆ      Ｋ      Ｓ      Ｔ      Ｐ      Ｖ
Ｉ      Ｌ      Ｆ      Ｌ      Ｎ      Ｋ  （配列番号６０）
これにより、野生型の２７０位置におけるセリンをプロリンに置換したヒトＧαｌ６をコードするようになった。
【０２７３】
Ｓ２８０Ｐ突然変異を有するＧｐａｌ−Ｇαｉ２−ＧαｏＢキメラをコードするプラスミドＣｐ３６３５を、以下のように構築した。正方向のプライマーｏｂ（ＧＧＧＣＧＴＣＴＣＡＣＡＴＧＧＧＡＴＧＴＡＣＧＣＴＧＡＧＣＧ）（配列番号６１）及び逆方向ｏｂ（ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＡＡＣＡＧＣＣＣ）（配列番号６２）を用いて、Ｃｐ１１３１からＧαｏＢを増幅し、得られた断片をＢｓｍＢＩ及びＳａｌＩで消化し、ＮｃｏＩ及びＳａｌＩで消化したＣｐ１１２７に連結して、Ｃｐ３３３２を得た。Ｓ２８０Ｐ突然変異体をプライマー対５６５（ＧＡＴ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＣＴＡ  ＣＣ）（配列番号８５）及び逆方向ｏｂｓｐ（ＣＣＣＣＣＧＴＣＴＣＡＴＡＧＧＧＧＴＡＴＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＧＴＴＧＴＴＡ）（配列番号６３）；並びに５２４（上述）及び正方向ｏｂｓｐ（ＣＣＣＣＣＧＴＣＴＣＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＡＡＧ）（配列番号６４）を用いて増幅することによって導入した。得られた断片をそれぞれＡａｔＩＩ及びＢｓｍＢＩ又はＢｓｍＢＩ及びＳａｌＩで消化し、ＡａｔｌＩ及びＳａｌＩで消化したＣｐ３３３２内に連結させ、Ｃｐ３７０９を得た。このプラスミドは下記の突然変異配列を有していた。
ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＡＣＣ  ＣＣＴ
ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＡＡＧ  （配列番号６５）
Ｎ      Ｎ      Ｋ      Ｆ      Ｆ      Ｉ      Ｄ      Ｔ      Ｐ
Ｉ      Ｉ      Ｌ      Ｆ      Ｌ      Ｎ      Ｋ  （配列番号６６）
上記のヌクレオチド及びアミノ酸のうちイタリック体で書かれたものは、ＧαｏＡ由来の多型であることを意味する。（相当するＧαｏＢアミノ酸はＦ及びＩではなく、Ｗ及びＴである。）Ｃｐ３７０９から得たＳｐｈＩ−ＸｈｏＩ断片を、同じ酵素で消化したＣｐ１１８３に連結して、上記の変化を含む、Ｇｐａｌ（１−４３）−Ｇαｉ２（３６−２４２）−ＧαｏＢ（２４３−３５４）キメラをコードするＣｐ３６３５を得た。
【０２７４】
ＧＰＡ１−Ｇα１２キメラをコードするプラスミドを、以下のように構築した。Ｃｐ１１２７の単ＰｓｔＩ部位を、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化することによって除去し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで突出部をブラントエンドとし、得られた線型ＤＮＡを連結した。得られたプラスミド（Ｃｐ３３２６）をＮｃｏＩ及びＳａｃＩで消化し、ＧＰＡ１ｐのＮ末端４１アミノ酸をコードする合成ヌクレオチドの挿入を可能にした。ＧＡＰ１のコドン１８及び１９においてＰｓｔＩ部位を有する合成オリゴヌクレオチドは、リン酸化オリゴヌクレオチドｏ２０７（ＡＡＡＡＧＡＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＡＴＣＧＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＡＡＣＧＴＧＡＣＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＴ）（配列番号６７）をオリゴヌクレオチドｏ２０８（ＣＡＴＴＣＴＴＧＴＣＡＣＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＧＡＴＴＧＣＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＴＴＴＧＴＴＣ）（配列番号６８）で、及びオリゴヌクレオチドｏ２０９（ＣＡＴＧＧＧＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＡＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＣ）（配列番号６９）をリン酸化オリゴヌクレオチドｏ２１０（ＴＧＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＧＴＡＣＴＣＡＣＴＧＴＡＣＡＣＣＣ）（配列番号７０）でアニーリングし次いで連結することによって、作成した。この約１２０ｂｐの合成ＤＮＡ断片の挿入によって得られたプラスミドＣｐ３３６３を、ＳａｃＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＰＣＲで増幅してＳａｃＩ及びＸｈｏＩで消化した断片（野生型Ｇα１２のアミノ酸４３から停止コドンをコードする）の挿入を可能にした。得られたプラスミドＣｐ３４３５は、ＧＰＡ１のＮ末端４１残基が野生型Ｇα１２のＮ末端４２アミノ酸と置き換わっている、キメラＧＰＡ１−Ｇα１２蛋白質をコードする。同様に、ＰＣＲで増幅してＳａｃＩ及びＸｈｏＩで消化した断片（Ｇα１２のＧＴＰアーゼ欠損突然変異体のアミノ酸４３から停止コドンをコードする）をＣｐ３３６３に挿入した。得られたプラスミドＣｐ３４３６は、ＧＰＡ１のＮ末端４１残基がＧα１２のＱ２２９Ｌ突然変異体のＮ末端４２アミノ酸と置き換わっている、キメラ蛋白質をコードする。
【０２７５】
Ｃｐ３４３５を鋳型として用い、オリゴヌクレオチドｏ２８６（ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＧＴＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣ）（配列番号７１）及びｏ２８７（ＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧ）（配列番号７２）を用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社の早変えプロトコルによって突然変異誘発を行って、Ｃｐ３８２２を得た。Ｃｐ３８２２は、野生型Ｇα１２の残基２８８に相当するセリンをプロリンに置き換えた、ＧＰＡ１−Ｇα１２キメラをコードする。Ｃｐ３４３５を又鋳型として用い、オリゴヌクレオチドｏ２９３（ＧＧＡＴＧＴＧＧＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＧ）（配列番号７３）及びｏ２９４（ＣＴＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＡＣＡＴＣＣ）（配列番号７４）によって突然変異誘発を行って、野生型Ｇα１２の残基２２８に相当するグリシンをアラニンに置き換えた。この突然変異体は、活性化した配座になる能力がないと思われるキメラGαをコードする（Ｅ．Ｌｅｅ、Ｒ．Ｔａｕｓｓｉｇ及びＡ．Ｇ．Ｇｉｌｍａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、１２１２（１９９２）；Ｒ．Ｔ．Ｍｉｌｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ３３４、７１２（１９８８））。
【０２７６】
最後に、ＡＤＥ８遺伝子を含む１．９ｋｂの断片を、Ｃｐ３４３５のＨｐａＩ部位にクローンし、Ｃｐ３５０６を作成した。Ｃｐ３５０６のユニーク部位ＰｓｔＩ及びＳａｃＩを用いて、可変アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドライブラリーを導入した。すなわち、Ｃｐ３５０６をＰｓｔＩ及びＳａｃＩで消化し、下記構成のセミランダムオリゴヌクレオチドライブラリーを挿入した。オリゴヌクレオチドｏ２２１（ＧＣＧＧＡＧＣＴＣＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＣＴＴＴＴＣＴＡＡＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＴＧＴＴＣＧＡＴＡＡＣＧＴＣＡＴＴＡＧＣＴＣＴＣＴＴＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧＧ、ここでＭはＣ又はＡ；ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ）（配列番号７５）及びｏ２２２（ＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＣＴＡＡＴＧＡＣＧＴＴＡＴＣＧＡＡＣＡＡＴＣＣＴＴＧＣＡＡＴＴＡ）（配列番号７６）をアニールし、部分的に２本鎖になったオリゴヌクレオチドをシークエナーゼで穴埋めし、得られた完全な二本鎖産物をＳａｃＩ及びＰｓｔＩで切断した。得られたライブラリーは、以下の配列を有するＧαキメラをコードする。Ｎ末端の３５アミノ酸はＧＰＡ１のものであり、次いでＧＰＡ１の残基３６−４０位置に５個の完全にランダムなアミノ酸が続き、ＧＰＡ１の残基４１−４４、Ｇα１２の残基５９−３８０（停止）が続く。ランダム領域は、予測されるＮ末端αへリックスのＣ末端境界に相当する。このライブラリーをキメラの供給源として用いた。このキメラは、残りのＧαサブユニットに対してＮ末端αへリックスが最適な位置をとる結果、ＳＴＥ４／ＳＴＥ１８との結合に向上を示すと思われる。
【０２７７】
ＳＴＥ４／ＳＴＥ１８との結合能に関して、野生型Ｇα１２は何も有さないベクターと変わらない。しかしＧＰＡ１−Ｇα１２は、２．５ｍＭアミノトリアゾールで分析した場合、明らかに結合が向上していた（１ｍＭでは向上はかろうじて検知される）。従って、Ｇα１２のＮ末端ＧαへリックスをＧＰＡ１の同等領域に置き換えることによって、ＧαサブユニットとＳＴＥ４／ＳＴＥ１８との結合が増加する。ＧＰＡ１−Ｇα１２ Ｓ２８８Ｐ突然変異体においては、０．５ｍＭアミノトリアゾールで結合が検知され、更に向上した結合が見られた。これに対し、ＧＴＰアーゼ欠損ＧＰＡ１−Ｇα１２ Ｑ２２７Ｌキメラ及びＧＰＡ１−Ｇα１２ Ｇ２２８Ａキメラは野生型Ｇα１２より向上した結合を示すことはない。
予測されるＮ末端αへリックスのＣ末端境界において様々に異なるアミノ酸を有するＧＰＡ１−Ｇα１２キメラライブラリーを、ＳＴＥ４／ＳＴＥ１８との結合において向上を示す蛋白質についてスクリーンした。そのような蛋白質は得られなかった。
【０２７８】
培養基：キメラＧ蛋白質サブユニットを内在させる酵母菌細胞の増殖用として、標準的な酵母菌培養基用の配合を用いた。培養基ＳＣＡａｎｄはアミノ酸の混合物とウラシルを含み（例えばＲｏｓｅ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９０参照）、アデニンを含まない。１リットル当たり、４．５ｍｌの１Ｍ ＫＯＨ及び２５ｍｌの１Ｍ Ｋ−Ｐｉｐｅｓ（ｐＨ６．８）を用いてｐＨを６．８に調節した。培養基ＳＣＡＨ１は、ヒスチジンを含まず１ｍＭ（１，２，４）３−アミノトリアゾール（Ｈｉｓ３遺伝子産物の競合的阻害剤）を含むことを除いては、上記と同じである。培養基ＳＣＨ１（ｌｏＡ）は、６．２５μｇ／ｍｌのアデニンを含むことを除いては、ＳＣＡＨ１と同じである。
【０２７９】
突然変異体ライブラリー：ｄＩＴＰの存在下でＴａｑポリメラーゼがエラーを起こすという傾向を利用して、ラットＧαｓ蛋白質に突然変異を起こさせた。プライマーとしての７０５（５’−ＧＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＣＣＡＧ）（配列番号７７）及び３８６（５’−ＡＡＣＣＣＧＧＡＡＣＧＡＴＴＴＡＡＣＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣ）（配列番号７８）（これらのオリゴヌクレオチドはそれぞれＧＰＡ１プロモーター及びターミネーターに相当する）；２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＩＴＰ、並びに４０ｐＭのｄＣＴＰ；及び業者（Ｆｉｓｈｅｒ）により提供される緩衝剤を用いて、サイクル（９４℃を３０秒；５０℃を３０秒；７２℃を９０秒）を３０回繰り返し、ラットGαｓをｐ３０９８から増幅した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化し、上記したＡＤＥ２ベクターに連結した。約２０，０００のＤＨ１０Ｂ形質転換体がプールされ、ラットGαｓ突然変異体のライブラリーが得られた。
【０２８０】
スクリーニングによる結果：
酵母菌Ｇβγへの向上した結合を示すＧαｓ突然変異体のスクリーンは、野生型Ｇαｓを発現するｇｐａｌ ｆｕｓ１−ＨＩＳ３コロニーがレプリカ法によってヒスチジン欠乏かつ１ｍＭ ３−ＡＴ含有培地上で成長できる（これはフェロモン経路が部分的構成状態（ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｓｔａｔｅ）にある結果、ｆｕｓ１−ＨＩＳ３レポーター遺伝子が部分的に抑制されるためである）ことを利用している。望ましいβγ結合性Ｇαｓ突然変異体を含むコロニーは、緊密なαβγ結合により媒介されるフェロモン経路を不活化するため、この培養基上で成長できないと考えられる。しかし、Ｇαｓを発生するプラスミドに対する選択条件が緩くなったとき、この場合は量を制限されたアデニンを添加するとき、望ましい突然変異体のコロニーは、Ｇαｓプラスミドを失ったコロニー内の細胞画分（一般に５−１０％）から得たものについてのみ成長がみられる。そのようなコロニーはアデニン経路中間物の蓄積によって赤色を呈している。Ｇαｓ−ＡＤＥ２プラスミドの存在は１ｍＭ ３−ＡＴ上で成長する能力に目に見えるほどの負の効果を与えないので、突然変異誘発していないＧαｓ−ＡＤＥ２プラスミドはアデニン制限培養基上で白色を呈するが、アデニン制限条件下で選択性の利点を与える。スクリーニングにはプラスミド依存性表現型を用いるので、スクリーニングによって視覚的に容易に潜在的突然変異を同定でき、Ｓｔｅ−等の望まれない突然変異を排除できる。
【０２８１】
ＧＰＡ１プロモーターの制御下に突然変異誘発したラットＧαｓ遺伝子のライブラリーを、ｇｐａｌ ｆｕｓｌ−ＨＩＳ３ ｆａｒ１ ａｄｅ２株（ＣＹ７７５７）に導入し、約１０，０００コロニーを４０ＳＣＡ培養基上で選択した。３０℃で２日間培養したのち、コロニーのレプリカをＳＣＨＩ（ｌｏＡ）上に作成し、内性酵母菌βγとの緊密な相互作用を通じてフェロモン経路を抑制することのできる突然変異体Ｇαｓ蛋白質を産生するものを同定した。そのようなコロニーはＡｄｅ−細胞の成長により赤色を呈している。というのは、コロニーのＡｄｅ＋細胞はＨｉｓ＋についての選択に負けてしまい、少なくとも部分的に抑制解除されたフェロモン経路を必要とするからである。予想されるように、ＳＣＨＩ（ｌｏＡ）上に赤色のレプリカを産生するコロニーは、ＳＣＡＨＩ上では成長できず、ＡＤＥ２−Ｇαｓプラスミドが絶対的に必要とされる。
【０２８２】
プラスミドＤＮＡを推定突然変異産生細胞から回収し、大腸菌ＤＨＩＯＢ内で増幅し、ＣＹ７７５７内に形質転換し、ＳＣＡＨＩ上で突然変異体のプラスミド連鎖について確認した。突然変異体の配列決定により、１点又は２点突然変異であることが分かった（下記表１参照）。突然変異が非コード領域で起きている可能性を除外するために、突然変異体の野生型Ｇαｓ−ＴＲＰ１プラスミド（ｐ３０９８）へのサブクローニングを行ったが、全ての場合において、Ｈｉｓ＋表現型であった。これらサブクローンされたプラスミドは異なるｇｐａｌ ｆｕｓｌ−ＨＩＳ３株、ＣＹ１３１６において試験された。
【０２８３】
【表１】
2009143932.tif 000002
【０２８４】
２個の突然変異を有する突然変異体において、ボールドで示したものは、Ｇαｓに対する結合の向上（Ｃｐ３０９８におけるサブクローニングによって決定）を賦与する突然変異である。図２はGαｓ突然変異の作用を示す。Ｓ２８６Ｐを除くその他全ては、ｇｐａｌ ｆｕｓｌ−ＨＩＳ３株のうち０．２ｍＭ ３−ＡＴ上で成長するものを除外する。これはフェロモン経路の効果的な抑制が行われていることを意味する。この効果は、（ＧＴＰ親和性の減少やＧＴＰアーゼ活性の増加といった要因も他に考えられるが）Ｇαｓ−ＧＤＰの酵母菌Ｇβγに対する親和性を高めたことに由来する。
【０２８５】
異なるＧαサブユニット中の「スイッチ２」領域において高度に配列が保たれているにもかかわらず、位置２２９においてはＧαｓはアスパルテートを有し、他の全てのＧαはセリンを有することが、様々なＧαサブユニット群間での整合性についての研究からわかってきた。突然変異の一つではこのアスパルテートがバリンに置き換わっている（これはβγ結合における重要性を示唆する）ので、アスパルテートをより一般的なセリン残基に単に置き換えることで、「天然の」スイッチ２構造を保持しつつαβγ相互作用が向上するかどうかという疑問が起こる。図２はＤ２２９Ｓ対立遺伝子が、元になったＤ２２９Ｖ突然変異によって与えられる表現型と同程度に表現型を与えることを示している。この位置においてＧαｓがアスパルテートを有することを除いては、全てのＧαサブユニットにおいて、突然変異の一つであるＮ２５４Ｄが、Ｄ２２９Ｓと類似であることも注目に値する。
【０２８６】
αβγ相互作用を更に向上させるために、標準的な分子生物学法を用いて、二重突然変異体Ｅ１０Ｋ Ｄ２２９Ｓを構築した。図２から明らかなように、２個の突然変異が相互依存的に作用した結果、二重突然変異体の表現型がどちらの単突然変異体の表現型に比べても程度が増し、内性酵母菌Ｇｐａｌと比較できるほどの程度になった。
【０２８７】
酵母菌内でのエピソームプラスミドの生来の不安定性（細胞分割あたり〜５％）を避けるために、突然変異Ｇαｓ遺伝子をＣＹ１３１６のｇｐａｌ座に組み込んで（Ｅ１０Ｋ、Ｄ２２９Ｓ、Ｓ２８６Ｐ及びＮ２５４Ｄ並びに二重突然変異体Ｅ１０Ｋ Ｄ２２９Ｓ）、エピソームの変形（ｖｅｒｓｉｏｎ）に用いられるプロモーター及びターミネーターを保存した。得られた株はエピソーム上に突然変異Ｇαｓを有する類似の株を模倣する動作を示した。
【０２８８】
突然変異Ｇαｓサブユニットが酵母菌βγに密接に結合するだけでなく、受容体刺激によってβγから解離することを示すために、ＰＧＫプロモーターの制御下に、ヒトアデノシンＡ２ａ受容体を、エピソームｆｕｓｌ−ｌａｃＺレポータープラスミドと共に様々なＧαｓ突然変異体背景に導入した。予想されるように、外因性のアデノシン類似物ＮＥＣＡを添加したところ、β−ガラクトシダーゼユニットが１０倍増加した。これは突然変異Ｇαｓに、受容体と生産的に相互作用し、リガンドの添加によりβγから解離する能力があることを立証している。
【０２８９】
Ｓ２８６Ｐ突然変異は、酵母菌Ｇβγと相互作用するＧαサブユニットの範囲を拡張する潜在的な方法があることを示唆している。というのは、全ての哺乳類Ｇαサブユニットはこの位置にセリンを有し、プロリンがＧｐａｌに見られるので、Ｓ２８６Ｐ置換を他の哺乳類Ｇαサブユニットに外挿することによって見かけのＧβγ親和性を向上させられるであろうからである。アミノ末端αへリックス領域に相当する、酵母菌Ｇｐａ１の最初の４３アミノ酸を、Ｇαｉ２の対応する部分に置換することによって、酵母菌Ｇβγサブユニットに対するＧαｉ２の見かけの親和性が劇的に増加する（これは構成的Ｇβγフェロモン信号（「４ｌ−ｉ２」の抑制により明らかになる）ことが示されている。Ｇα１６及びＧα１２への改変を行うことによって酵母菌βγ封鎖能が向上し、この親和性は、適当なセリン残基（Ｇαｓ中の位置２８６２相当）をプロリンと置換することによって更に向上する。加えて、３重キメラＧｐａｌ（１−４３）−Ｇαｉ２（３６−２４２）−ＧαｏＢ（２４３−３５４）のβγに対する見かけの親和性を、適当なＳ→Ｐ置換によって有意に向上させた。
【０２９０】
実施例３：ＳＴＥ１８／哺乳類Ｇγキメラ蛋白質の構築
酵母菌の野生型Ｇγサブユニット、ＳＴＥ１８を包含するキメラ蛋白質を作成した。野生型ＳＴＥ１８ヌクレオチド配列は公知のものである。ＳＴＥ１８カルボキシル末端の３４アミノ酸配列は以下の通りである。
ＧＹＰＶＡＧＳＮＨＦＩＥＧＬＫＮＡＱＫＮＳＱＭＳＮＳＮＳＶＣＣＴＬＭ（配列番号２９）
野生型ヒトＧγヌクレオチド配列は公知のものである。ヒトＧγカルボキシル末端の２４アミノ酸配列は以下の通りである。
ＤＰＬＬＴＰＶＰＡＳＥＮＰＦＲＥＫＫＦＦＣＡＩＬ（配列番号３０）
下線をつけた残基は全ての哺乳類Ｇγサブユニットに保持されている。
ＳＴＥ１８−哺乳類Ｇγキメラを、標準的な分子生物学法によって構築した。以下は作成したＧγキメラのリストであるが、これらは全て酵母菌ＳＴＥを改変したものであり、Ｇγサブユニットの部分を包含する。以下に示す配列は、カルボキシル末端の配列を並べたものである。下記表において、各配列の第一アミノ酸の前にある２個の点は、野生型ＳＴＥ１８アミノ酸末端配列が、第一アミノ酸の前に存在することを示している。酵母菌ＳＴＥ１８由来の残基は正常株であるのが、哺乳類Ｇγ由来のものはボールドで示した。
最後に示されるアミノ酸は、各キメラのカルボキシル末端のアミノ酸である。
【０２９１】
2009143932.tif 000003
【０２９２】
実施例４：Ｇ蛋白質活性のモジュレーターについてのスクリーニング
Ｇ蛋白質（この場合はＧα）活性のモジュレーターについてのスクリーニングを、例証を目的として下記の実施例中で行ったが、本発明はこれに限定されるものではない。
株ＣＹ４８７４及びＣＹ４８７７は、プラスミド１中にクローンしたＧαｉ２遺伝子中にＱ２０５Ｌ突然変異が存在することを除いては同質遺伝子型株である。株ＣＹ４９０１及びＣＹ４９０４はそれぞれ、ヒトＧαｉ２遺伝子のＮ末端におけるｇｐａｌの４１アミノ酸を含有する、染色体が一体となったキメラＧα融合体であり、構成的に活性化された突然変異体がＣＹ４９０１のＣ５ａ受容体遺伝子に存在することを除いては同質遺伝子型株である。株ＣＹ５０５８は酵母菌Ｇβγサブユニットのみを有し、Ｇαサブユニットを有さないｇｐａｌ突然変異体である。この株はＧαサブユニットの特異的活性を実証する対照株である。
【０２９３】
Ｇαの突然変異による活性の抑制
Ｑ２０５Ｌ突然変異は、ヒトＧαｉ２遺伝子の、構成的に活性化されたＧＴＰアーゼ欠損突然変異体である。Ｇαｉ２に作用するアンタゴニスト化合物、化学物質及び他の物質は、活性レベルを減少させる作用によって認識される。従ってこれらの物質は、ｆｕｓｌ−ｌａｃＺレポーター遺伝子からの第二のプラスミド（プラスミド２）への信号を減少させる。
【０２９４】
Ａ．ＧＴＰアーゼＧαｉ２突然変異体
試験成分＝ｇｐａ４Ｉ−Ｇαｉ２（Ｑ２０５Ｌ）
対照成分＝ｇｐａ４Ｉ−Ｇαｉ２上に詳述したＣＹ４８７４及びＣＹ４８７７構造体、並びにＨｉｓ３又はｆｕｓ２−ＣＡＮ１成長の読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）を行った類似の株を用いた。ｆｕｓｌ−Ｈｉｓ３株はアゴニストのスクリーニングに好ましく、ｆｕｓ２−ＣＡＮ１株はアンタゴニストのスクリーニングに好ましい。
【０２９５】
2009143932.tif 000004
【０２９６】
それぞれの場合において、アンタゴニストは試験株を対照株のように作用させなければならない。
【０２９７】
Ｂ．ＧＴＰアーゼＧαｓ突然変異体 （Gα特異性）
試験成分＝Ｇαｓ（Ｑ２２７Ｌ）
対照成分＝Ｇαｓ
【０２９８】
2009143932.tif 000005
それぞれの場合において、非特異的アンタゴニストは試験株を対照株のように作用させなければならない。
【０２９９】
追加の培養基必要条件：ｆｕｓ１−ＨＩＳ３及びｆｕｓ２−ＣＡＮ１スクリーンにおけるＧαプラスミドの保持用に−ＴＲＰ、そしてｆｕｓ１−ｌａｃＺスクリーンにおけるＧα及びｆｕｓ１−ｌａｃＺプラスミドの保持用に−ＴＲＰ−ＵＲＡ
【０３００】
ＩＩ．受容体による活性の抑制
構成的に活性化されたＣ５ａ受容体
試験成分＝Ｃ５ａＲ＊（Ｐ１８４Ｌ，活性化Ｃ５ａ受容体）
対照成分＝Ｃ５ａＲ
Ｃ５ａＲ＊突然変異では野生型のアミノ酸配列位置１８４のプロリンがロイシン残基に置き換わっている。
【０３０１】
2009143932.tif 000006
それぞれの場合において、アンタゴニストは試験株を対照株のように作用させなければならない。
【０３０２】
追加の培養基必要条件：ｆｕｓ１−ＨＩＳ３及びｆｕｓ２−ＣＡＮ１スクリーンにおける受容体プラスミドの保持用に−ＬＥＵ、そしてｆｕｓ１−ｌａｃＺスクリーンにおける受容体及びｆｕｓ１−ｌａｃＺプラスミドの保持用に−ＬＥＵ−ＵＲＡ、非緩衝酵母菌培養基（ｐＨ５．５）
【０３０３】
下記のデータは酵母菌と結合する様々なＧα群の概要である。
2009143932.tif 000007
【０３０４】
実施例５：Ｓγ６突然変異体の、哺乳類Ｇ蛋白質結合受容体の結合における効果
Ｓγ６突然変異体の、哺乳類ＧＰＣＲの結合における効果を調べた。野生型ＳＴＥ１８及びＳγ６突然変異体の能力を、４つの異なるＧαｓに関連して比較した結果を示す。ここでＧＰＡ４１Ｇα１２は、酵母菌ＧＰＡ１のアミノ末端の４１アミノ酸とＧα１２とを連結したものを含むキメラであり；ＧＰＡ４１Ｇα１６（Ｓ２７Ｐ）は、酵母菌ＧＰＡ１のアミノ末端の４１アミノ酸と、位置２７でＳｅｒをＰｒｏに置き換えたＧα１６とを連結したものを含むキメラであり；そしてＧαｓ（Ｄ２２９Ｓ）は、位置２２９でＡｓｐをＳｅｒに置き換えた哺乳類Ｇαｓである。
【０３０５】
2009143932.tif 000008
（Ｌ）はリガンド依存性信号を不明確にすることのない、低いレベルのリガンド非依存性受容体活性（ＬＩＲＭＡ）を示す。
ＬＩＲＭＡはリガンド依存性効果を完全に不明確にする、高いレベルのＬＩＲＭＡを示す。
＋はリガンド依存性成長を示す。
−はリガンド非依存性成長を示す。
【０３０６】
以下の略号を表に用いた。ＶＩＰ(血管作動性腸管ペプチド);ＭＬ１ｂ（メラトニン受容体）；Ｃ５ａ（補体活性化経路成分）；ＦＰＲＬ（ホルミルペプチド関連受容体）；ＩＬ−８（インターロイキン８）；Ａ２ａ（アデノシン２ａ受容体）
【０３０７】
実施例６：オーファン受容体発現用の酵母菌４株の作成
この実施例は、薬物スクリーニングアッセイ用の、それぞれ異なるキメラＧ蛋白質サブユニットを発現する、４種の酵母菌株の作成を例証する。酵母菌細胞内で４種の異なるＧ蛋白質サブユニットを用いることで、少なくとも１種の酵母菌株内で、最適なＧ蛋白質受容体結合を達成する機会が得られる。例証用の４種の酵母菌株の遺伝子型を下記表に例証する。
【０３０８】
2009143932.tif 000009
上記したように、Ｇα及びＧγキメラはそれぞれｇｐａ１及びｓｔｅ１８座で融合している。Ｆｕｓ１−ＨＩＳ３はｆｕｓ１座で融合しており、表現型はｆｕｓ１−である。上に列挙した遺伝子型に関連する一連の表現型を下に記す。
【０３０９】
2009143932.tif 000010
【０３１０】
実施例７：α因子リーダーに基づく発現ベクターの構築
哺乳類Ｇ蛋白質結合受容体を発現する酵母菌ベクターで、プリプロα因子のリーダーシークエンスに融合したものを、以下のように構築した。酵母菌遺伝子ＰＨ０５の転写ターミネーターを含む０．３８ｋｂ断片を、プラスミドｐＴＥＲを鋳型とするＰＣＲによって増幅した。後者のプラスミドは、ＰＨ０５遺伝子のＳａｕ３Ａ−ＰｓｔＩ断片（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ０７１７３）を、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化したベクターｐＵＣ１９内にサブクローンすることによって構築した。ＰＣプライマーはＴＥＲ１、５’−ＧＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧＴＴＣＣＴＣ−３’（配列番号６）及びＴＥＲ２、ＧＴＣＧＣＴＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号７）（ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を用いた。プライマーは増幅断片の５’及び３’末端にそれぞれＸｂａＩ及びＮｈｅＩ制限酵素部位を有する。計３０回のＰＣＲサイクルを行った。各サイクルは９４℃での変性を４５秒、５３℃でのアニーリングを１分、７２℃での重合化を１．５分である。増幅した断片をＸｂａＩ及びＮｈｅＩで消化して、プラスミドＣａｄｕｓ１２８９（ｐＬＰＸｔ）（ＬＥＵ２ ＰＧＫｐ ２ｍｕ−ｏｒｉ ＲＥＰ３ ＡｍｐＲ）のＸｂａＩ部位に適当な方向でサブクローンした。これによってプラスミドＣａｄｕｓ４２５７（ｐＰＰ５）（ＬＥＵ２ ＰＧＫｐ ＰＨＯ５ｔ ２ｍｕ−ｏｒｉ ＲＥＰ３ ＡｍｐＲ）が得られた。
【０３１１】
全長プリプロ領域及びα因子前駆体の第一のスペーサーペプチドＫＲＥＡＥＡ（配列番号８６）をコードする０．２７ｋｂの酵母菌遺伝子ＭＦα１断片をＰＣＲで増幅した。このＰＣＲでは、鋳型としてのプラスミドｐＡＣ１０９（Ｏｓｔａｎｉｎ他、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６９：８９７１）、並びに一対のオリゴヌクレオチドプライマーＭＦ５、５’−ＧＣＡＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＣ−３’（配列番号８）及びＭＦ３、５’−ＣＡＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣ−３’（配列番号９）を用いた。ＰＣＲはＰＨＯ５ターミネーターの増幅について述べたのと同じ条件で行った。その結果、ＢｓｐＨＩ及びＮｃｏＩ制限部位が増幅した断片のそれぞれ５’及び３’末端に形成された。断片をＢｓｐＨＩ及びＮｃｏＩで処理してプラスミドＣａｄｕｓ４２５７のＮｃｏＩ部位内に適当な方向でサブクローンした。
【０３１２】
得られたプラスミドＣａｄｕｓ４２５８（ｐＰＭＰ１５）（ＬＥＵ２ ＰＧＫｐ Ｍｆα１プリプロＰＨＯ５ｔ ＲＥＰ３ ＡｍｐＲ）はＰＧＫ遺伝子の強度の構成性プロモーターを有し、α因子リーダーコード配列と、ＰＨＯ５転写ターミネーターがそれに続いた。リーダー配列の３’末端に位置するこのユニーク制限部位ＮｃｏＩ、並びにターミネーターの５’末端に位置するＸｂａＩ及びＢａｍＨＩを用いて、Ｇ蛋白質結合受容体をコードする配列のサブクローンに用いた。転写ターミネータが発現ベクター内に存在するので、受容体特異性ｍＲＮＡの異質性の抑制が期待され、従って安定性が得られる。
【０３１３】
更に、ベクターＣａｄｕｓ４４３１（ｐＰＭＰ１５−ＨＡ）を構築した。これをＣ末端に血球凝集素（ＨＡ）エピトープをつけた受容体の発現に用いることができる。２種のオリゴヌクレオチド、ＨＡｔｏｐ、５’−ＧＡＴＣＣＧＣＴＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡ−３’（配列番号１０）及びＨＡｂｏｔ、５’−ＧＡＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡ−３’（配列番号１１）からなる合成アダプターを、プラスミドＣａｄｕｓ４２５８のＢａｍＨＩ部位に、リーダーコード配列に近接する側のみでこの部位が再生する方向で導入した。停止コドン欠損の受容体コード配列を得られたベクターのＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ部位に挿入した結果、Ｃ末端延長部ＳＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＡ（配列番号１２）を有する受容体をコードするものが得られた。
【０３１４】
実施例８：ヒトノーシセプチン（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ）受容体の機能的アッセイの作成
酵母菌α因子のプリプロ配列をＰＧＫプロモーターの３’側及び標準的酵母菌発現ベクターｐＬＰＸｔ（ＰＧＫプロモーター発現ベクター、ＮｃｏＩ及びＸｂａＩ部位使用）の受容体クローニング部位の５’側に挿入し、ベクターｐＭＰ１５を作成した。これにより成熟するとゴルジ内でα因子配列欠損の受容体となる、キメラ受容体が合成される。
このベクターを用いて酵母菌に基づくヒトノーシセプチン受容体アッセイを作成した。プリプロα因子−ノーシセプチン受容体発現プラスミドを、キメラＳＴＥ１８−ヒトＧγ蛋白質について異なった発現をする数種の同質遺伝子型株に、下記に説明するように導入した。
α因子リーダーとの融合体として発現されたノーシセプチン受容体は、細胞表面に呈示され、Ｓｔｅ２受容体について観察されたのと同様な染色パターンを示す。この事実と一致して、融合受容体は、外鎖グリコシレーション及びゴルジ内で起こるＫｅｘ２プロテアーゼによる加工を経ていることが示された。従って、α因子前駆体のリーダー配列は、受容体の細胞表面への効率的な運搬を支配しているようである。
追加のＣａｄｕｓ酵母菌株ＣＹ２１２０内で、受容体活性についても調べた。ＣＹ２１２０は内生酵母菌Ｇα蛋白質ＧＰＡ１を欠失しているが、損傷のない酵母菌Ｇγを有する。他のＣａｄｕｓ酵母菌株と同じように、内生ＨＩＳ３遺伝子は不完全であり、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３をゲノム内に融合した。この株はＳＳＴ２遺伝子に新規な突然変異を有する。ＳＳＴ２は、ＧＰＡ１がＧＴＰ加水分解される速度を増加させる蛋白質をコードする。従って、ＳＳＴ２の非存在下では、ＧＰＡ１は長期間にわたってＧＴＰと結合した状態にある。これは機能的に、ＧＰＡ１が長期にわたって活性であることを意味し、従って（特定の７種の経膜受容体がＧＰＡ１と相互作用できる場合には）７種の経膜受容体からの信号を長期に渡って伝達できることを意味する。この発見は、機能的成長経路の結果によってもさらに確認された。α因子リーダーノーシセプチン受容体融合タンパク質及びＧｐａ１Ｇαサブユニットを共発現する株ＣＹ２１２０（ＭＡＴα  ｓｓｔ２＊２ｆａｒ１＊１４４２  ｔｂｔ１−１  ｆｕｓ１−ＨＩＳ３  ｃａｎ１  ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２  ｓｔｅ３＊１１５６  ｌｙｓ２  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３）は、ノーシセプチンに誘発される成長を有し、並びにノーシセプチンに応答して起こるβガラクトシダーゼ発現の約１０倍の活性化を有することが示された。非リガンド誘発性成長が、非融合受容体を発現する同じ株に観察された。
【０３１５】
実施例９：ヒトメラノコルチン４受容体の成長アッセイの改良
ヒトメラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）は、非融合タンパク質として発現されるとき、酵母菌内で機能することがわかっている。この受容体はＧαｓＤ２２９Ｓサブユニットを介して交配フェロモン応答経路と結合する。この事実は、６種の異なるＭＣ４Ｒ特異的アゴニストに応答して起こる、株ＣＹ９４３８（ＭＡＴα  ｓｔｅ１８γ６−３８４３  ｆａｒ１＊１４４２  ｔｂｔ１−１  ｆｕｓ１−ＨＩＳ３  ｃａｎ１  ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２  ｓｔｅ３＊１１５６  ｌｙｓ２  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３）の成長活性化によって実証されている。しかし成長アッセイの感度は、この受容体がα因子リーダーとの融合として発現されるとき、大幅に向上する。これはおそらく細胞表面での受容体レベルが上昇するためだと思われる。
ヒトメラノコルチン４受容体ｃＤＮＡを、ＰＧＫプロモーターの制御下に、３種の酵母菌発現ベクター内にクローンした。プラスミドｐＬＰＸｔにより発現される全長受容体ｃＤＮＡを、全ての生物学的応答アッセイにおいて用いた。更に、受容体Ｎ末端にα因子のプリプロ配列を付加したプラスミドｐＭＰ１５を、生物学的応答性実験のサブセットに用いた。最後に、プラスミドｐＬＰＸｔ−ＦＬＵを用いて、血球凝集素エピトープを受容体のＣ末端に付加した。この最終構築体を用いて、ウエスタンブロット分析によってＭＣ４受容体発現を立証した。
メラノコルチン受容体は、副オピオメラノコルチンの処理から生ずる複数のリガンドに相互作用することが実証されている。これらの天然リガンドは全て比較的小さいペプチドである。α−ＭＳＨは、アミノ末端でアシル化され、カルボキシル末端でアミド化された１３アミノ酸ペプチドである。蛋白質分解に対する耐性を向上させた、α−ＭＳＨの合成類似体は［Ｎｌｅ４、Ｄ−Ｐｈｅ７］−α−ＭＳＨ（ＮＤＰ−ＭＳＨ）である。効力の低いアゴニストとしては、長さ２２アミノ酸のβ−ＭＳＨ、長さ１１〜２７アミノ酸のγ−ＭＳＨペプチド群（１１アミノ酸のγ１、１２アミノ酸のγ２、２７アミノ酸のγ３）が挙げられる。
ＭＣ４受容体は、Ｇαｓを介する信号としてその多くの特徴が判明している。従って、ウエスタンブロットによる受容体発現の確認に際して、全長ＭＣ４受容体を幾つかのＧαｓ発現プラスミドと共に、Ｇγキメラの構成だけが異なる一連の同質遺伝子型株に導入した。同様に、プリプロ−α因子リーダーと共に発現されるＭＣ４受容体を、一連のＧαｓ発現プラスミドと共に、Ｇγキメラ株の１つに導入した。
リガンドを細胞単層に導入し、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３成長アッセイによって受容体の活性化を調べた。リガンドの添加に際して、未改変の受容体がＣＹ９８００内で最も活性があることが示された。しかし２種のリガンドα−ＭＳＨ及びＮＤＰ−ＭＳＨだけが、受容体刺激を行うことができた。これに対して、α因子プリプロリーダー配列が受容体のＮ末端に付加されている場合は、アッセイを行った単一株ＣＹ９４３８において、全てのリガンドが受容体を活性化した。酵母菌交配経路のリガンド依存性活性化の定量を、非最適化マイクロ力価フォーマットを用いるＦＵＳＩ−β−ガラクトシダーゼ導入によって行った。このアッセイにおいて最大刺激は、約１２ｎＭのＥＣ５０で約５倍であった。
【０３１６】
実施例１０：ラット代謝生成物産生グルタミン酸塩受容体２（ｍＧｌｕＲ２）の酵母菌による発現
他の７種の経膜受容体とは対照的に、代謝性生物産生グルタミン酸塩受容体は一般に、長い第一の細胞外領域を有している。特に、ラットｍＧｌｕＲ２Ｎ末端領域は、５６７個のアミノ酸残基からなる。
ラットｍＧｌｕ２受容体ｃＤＮＡを配列決定した結果、公知の刊行物記載のもの（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ１６８１７）と一致することが分かった。ｃＤＮＡを８種の酵母菌発現ベクター内にサブクローンした。
ＰＧＫプロモーターからｍＧｌｕ２受容体を発現するように、プラスミドｐＬＰＸｔを改変した。このベクターにおける受容体の転写は、ｃＤＮＡ挿入物の３’末端側から通常約４００ヌクレオチドで停止する。しかし、ｃＤＮＡのカルボキシル末端に隣接する部位に転写ターミネーターを挿入することによって、定常状態の転写レベルを増加させることが可能であるということを、数々の実験結果が示唆している。従って、ＰＨＯ５遺伝子から得た転写ターミネーターを挿入してｐＬＰＸｔを改変した。この構築体をｍＧｌｕ２と称する。上記したプリプロα因子リーダーを用いて、更に２種の構築体を調製した。ｐｐαＦ−ｍＧｌｕＲ２と称する構築体においては、受容体のＮ末端に隣接する部位にリーダー配列を挿入した。これに対し、ｐｐαＦ−ｍＧｌｕＲ２Δでは、ｍＧｌｕ２受容体の信号配列を仮定されるものを除去し、プリプロα因子リーダーに置き換えた。最後に、構築体ｉｎｖｍＧｌｕＲ２は、Ｎ末端にインベルターゼのリーダーを付加したｍＧｌｕ２受容体の合成を引き起こす。α因子リーダーのように、このリーダーは酵母菌分泌経路への異種蛋白質の導入を促進することが実証されている。これら４種の構築体を用いて、酵母菌におけるｍＧｌｕ２受容体の生物学的活性を調べた。ウエスタンブロットにおける発現を向上させるために、血液凝集素エピトープをカルボキシル末端に付加して、ｍＧｌｕ２受容体を上記したのと同一のベクター組内にクローンした。
血液凝集素を付加した受容体を発現するプラスミドを酵母菌にトランスフェクトし、受容体レベルを、全膜蛋白質調整物のウエスタンブロット分析によって調べた。酵母菌リーダーの非存在下では、ニトロセルロース膜へ長く接触させたにもかかわらず、受容体は検出されなかった。これに対して、プリプロα因子又はインベルターゼリーダーと共に発現される場合には、濃い二重の高分子量バンドが検出された。これらの結果は、受容体の発現が酵母菌配列の存在に依存することを示唆している。
しかしこれには別の解釈もありうる。大きくて高度にグリコシル化した蛋白質は、効率よくニトロセルロースに転移されない。従って、酵母菌のリーダーを有さない受容体は、高度にグリコシル化されており、ウエスタンブロットによって検出されないという可能性がある。この可能性を調べるために、Ｎ連結したオリゴ糖上の高マンノース構造を切断するエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）で蛋白質試料を処理した。その結果、オリゴ糖を除去してもリーダー受容体の可視化に向上は見られなかった。このことは、ベクター内でｍＧｌｕ２Ｒが合成されなかったことを意味している。更に、ＥｎｄｏＨによる結果は、受容体上にオリゴ糖が存在すると、リーダーとの構造体を形成し、分泌経路に運搬されることを示唆している。これらの結果はｍＧｌｕ２受容体発現において酵母菌リーダーが重要な役割を担っているという考えを支持している。
数種類のアゴニストを、ｍＧｌｕ２受容体の研究に利用できる。例えばＬ−ＣＣＧ−Ｉ、１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤ及びＬ−グルタミン酸（ＥＣ５０はそれぞれ０．７５μＭ、７．７μＭ及び１１．８μＭ）を用いることができる。ｍＧｌｕ受容体を刺激するとアデニリルシクラーゼの阻害が促進されることが実証されており、従って、受容体結合の初期研究ではＧαｉ群の蛋白質を用いることに焦点を置いた。
ＣＹ９４３７はユニークＳｔｅ１８−Ｇγ２キメラを発現する。今日、アッセイに利用されている受容体の多くは、適当なＧαサブユニットと共に用いた場合、リガンド依存性受容体活性（ＬＩＲＭＡ）表現型を示している。従って、受容体結合が存在しない場合、ＣＹ９４３７は、酵母菌内における受容体の結合能の診断指標として漠然と用いることができる。他のｍＧｌｕ２受容体構造物と比較した場合、ｐｐαＦ−ｍＧｌｕＲ２ΔのみがＬＩＲＭＡを促進する。しかしこれはＬＩＲＭＡではなく、実際には酵母菌から成長培養内に放出されたグルタミン酸塩による、リガンド依存性活性化である可能性もある。グルタミン酸塩レベルを減少させることを目的に、グルタミン酸塩をαケトグルタル酸塩に変えるグルタミン酸オキシダーゼを用いた。それとは別に、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ及びＬ−グルタミン酸脱水素酵素などの、グルタミン酸塩代謝酵素（酵母菌成長条件化ではより強い効力を示す）を利用することができる。
【０３１７】
実施例１１：Ｇｐａｌカルボキシル末端キメラの構築
Ｇ蛋白質αサブユニットのＣ末端は、受容体−Ｇ蛋白質特異性の決定に重要な役割を果たすことが示されている。（例えばＣｏｎｋｌｉｎ他（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ３６３、２７４−２７６；Ｌｉｕ他（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２、１１１６４２−１１１６４６０；Ｈａｍｍ他（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：６６９−６７２；Ｃｏｎｋｌｉｎ他（１９９６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０：８８５−８９０参照）。酵母菌内で発現される異種受容体を通じた特異的結合の能力を調べるために、Ｇｐａｌのキメラ蛋白質を構築した。ＧｐａＩＣ末端の最後のアミノ酸５−６個を、哺乳類Ｇαサブユニットの最後のアミノ酸５−６個と置換した。キメラ構造体を作成するために、野生型Ｇｐａ１をコードするＣａｄｕｓ１１７９を鋳型としてＰＣＲ増幅をおこなった。増幅用の特異的プライマー対として下記のものを用いた。
【０３１８】
GPA1-Gαs(5)プライマー1:5'TTT GAA GGG CCG TAT AAA GAC3' (配列番号８７)
プライマー2:5'ACG TCT CGA GGT CGA CTC ATA GAA GCT CAT ATT GTT TAA GG3' (配列番号88)
GPA1-Gαi2(5)プライマー1:5'TTT GAA GGG CCG TAT AAA GAC3 (配列番号８７)
プライマー3:5'ACG TCT CGA GAT CGA CTC AAA ATA GAC CAC AGT CTT TAA GGT TTT GCT GGA TG3'(配列番号８９)
GPA1-GαZ(5)プライマー1:5'TTT GAA GGG CCG TAT AAA GAC3' (配列番号８７)
プライマー４:5'ACG TCT CGA GGT CGA CTC AAC AAA GAC CAA TAT ATT TAA GGT TTT GCT GGA TG3' (配列番号９０)
GPA1-Gαq(5)プライマー1:5'TTT GAA GGG CCG TAT AAA GAC3' (配列番号８７)
プライマー5:5'ACG TCT CGA GGT CGA CTC ATA CAA GAT TAT ATT CTT TAA GGT TTT GCT GGA TG3,(配列番号９１)
GPA1-Gα12(5)プライマー1:5'TTT GAA GGG CCG TAT AAA GAC3' (配列番号８７)
プライマー6:5'ACG TCT CGA GGT CGA CTC ATT GAA GCA TAA TGT CTT TAA GGT TTT GCT GGA TG3' (配列番号９２)
GPA1-Gα13(5)プライマー1:5'TTT GAA GGG CCG TAT AAA GAC3' (配列番号８７)
プライマー7:5'ACG TCT CGA GGT CGA CTC ATT GAA GCA TAA GTT GTT TAA GGT TTT GCT GGA TG3 (配列番号９３)
GPA1-Gα16(6)プライマー1:5'TTT GAA GGG CCG TAT AAA GAC3' (配列番号８７)
プライマー8:5'ACG TCT CGA GGT CGA CTC AAA GAA GAT TAA TTT CAT CAA GGT TTT GCT GGA TGA TT3' (配列番号９４)
GPA1-Gαs(6)プライマー1:5'TTT GAA GGG CCG TAT AAA GAC3' (配列番号８７)
プライマー9:5'ACG TCT CGA GGT CGA CTC ATA GAA GCT CAT ATT GTC TAA GGT TTT GCT GGA TG3' (配列番号９５)
GPA1-Gαo(5)プライマー1:5'TTT GAA GGG CCG TAT AAA GAC3' (配列番号８７)
プライマー10:5'ACG TCT CGA GAT CGA CTC AAT ATA GAC CAC ATC CTT TAA GGT TTT GCT GG3' (配列番号９６)
【０３１９】
増幅に次いで、約５５０ｐｂのＰＣＲ産物を、ＱｕｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットを用いてカラム精製した。精製した増幅産物をＢｓｔＢＩ及びＸｈｏＩで消化し、Ｃａｄｕｓ１１７９内にクローンした。Ｃａｄｕｓ１１７９をＢｓｔＢＩ及びＸｈｏＩで消化し、エビアルカリフォスファターゼで処理してゲル電気泳動で精製した。ＰＣＲ産物及び線形化したベクターを連結し、コンピテントバクテリアに電気穿孔導入した。アンピシリン培養基で成長するコロニーを選択して増幅した。ＤＮＡをバクテリア細胞から単離し、配列決定して下記のＣ末端キメラを得た。
【０３２０】
ＧＰＡ１及び哺乳類Ｇαサブユニットの整列比較
Ｇｐａ１：．．．ＡＶＴＤＬＩＩＱＱＮＬＫＫＩＧＩＩ（配列番号９７）
ａｉ２：  ．．．ＡＶＴＤＶＩＩＫＮＮＬＫＤＣＧＬＦ（配列番号９８）
（ａｉ１では最後の５ａａが同じ）
ａｑ：    ．．．ＡＶＫＤＴＩＬＱＬＮＬＫＥＹＮＬＶ（配列番号９９）
（ａ１１では最後の５ａａが同じ）
ａ１２：  ．．．ＡＶＫＤＴＩＬＱＥＮＬＫＤＩＭＬＱ（配列番号１００）
ａｓ：    ．．．ＤＣＲＤＩＩＱＲＭＨＬＲＱＹＥＬＬ（配列番号１０１）
ａ１３：  ．．．ＤＶＫＤＴＩＬＨＤＮＬＫＱＬＭＬＱ（配列番号１０２）
ａｚ：    ．．．ＡＶＴＤＶＩＩＱＮＮＬＫＹＩＧＬＣ（配列番号１０３）
ａ１６：  ．．．ＤＶＲＤＳＶＬＡＲＹＬＤＥＩＮＬＬ（配列番号１０４）
ａｓ：    ．．．ＤＣＲＤＩＩＱＲＭＨＬＲＱＹＥＬＬ（配列番号１０５）
ａｏ：    ．．．ＡＶＴＤＩＩＩＡＮＮＬＲＧＣＧＬＹ（配列番号１０６）
【０３２１】
サッカロミセス・セレビシエＧＰＡ１及び哺乳類Ｇαサブユニットのアミノ酸Ｃ末端を上に示す。各哺乳類Ｇαサブユニットにおいて、ＧＰＡ１Ｃ末端のアミノ酸と置換されているアミノ酸を、ボールド及び下線で示した。
ＧＰＡ１の最後のアミノ酸５個を、対応する哺乳類Ｇαサブユニットの５アミノ酸で置換して、下記のＧＰＡ１−Ｇα（５）キメラを作成した。
ＧＰＡ１−Ｇαｉ２（５）、（配列番号１０７）
ＧＰＡ１−Ｇαｑ（５）、（配列番号１０８）
ＧＰＡ１−Ｇα１２（５）、（配列番号１０９）
ＧＰＡ１−Ｇαｓ（５）、（配列番号１１０）
ＧＰＡ１−Ｇα１３（５）、（配列番号１１１）
ＧＰＡ１−Ｇαｚ（５）、（配列番号１１２）
ＧＰＡ１−Ｇαｏ（５）、（配列番号１１３）
ＧＰＡ１の最後のアミノ酸６個を、対応する哺乳類Ｇαサブユニットの５アミノ酸で置換して、下記のＧＰＡ１−Ｇα（６）キメラを作成した。
ＧＰＡ１−Ｇα１６（６）、（配列番号１１４）
ＧＰＡ１−Ｇαｓ（６）、（配列番号１１５）
【０３２２】
キメラＧ蛋白質の概要を表１に示す。サンドイッチキメラＧ蛋白質も表１に示すが、これは実施例１２にて詳述する。
【０３２３】
【表２】
2009143932.tif 000011
【０３２４】
融合Ｇ蛋白質を有する酵母菌株の構築
天然ＧＰＡ１のオープンリーディングフレームがキメラのオープンリーディングフレームと置き換わるように、ＧＰＡ１キメラを酵母菌ゲノム内に融合した。ＧＰＡ１−Ｇαｉ２（５）、ＧＰＡ１−Ｇαｓ（５）、ＧＰＡ１−Ｇα１２（５）及びＧＰＡ１−Ｇαｑ（５）を、ＣＹ１３１６（ＭＡＴα ｇｐａｌΔ１１６３ ｆａｒｌΔ１４４２ ｔｂｔｌ−１ ｆｕｓｌ−ＨＩＳ３ ｃａｎ１ ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２ ｓｔｅ３Δ１１５６ ｌｙｓ２ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３）及びＣＹ２１２０（ＭＡＴα ｓｓｔ２Δ２ ｇｐａ１Δ１１６３ ｆａｒ１Δ１４４２ ｔｂｔ１−１ ｆｕｓ１−ＨＩＳ３ ｃａｎ１ ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２ ｓｔｅ３Δ１１５６ ｌｙｓ２ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３）内に２段階で融合した（Ｂｏｅｋｅ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：１６４−１７５）。ＧＰＡ１−Ｇαｚ（５）、ＧＰＡ１−Ｇα１３（５）、ＧＰＡ１−Ｇα１６（６）、ＧＰＡ１−Ｇαｓ（６）、Ｇαｑ（１−１１）−ＧＰＡ１（６−４６７）−Ｇαｑ（３５５−３５９）及びＧαｑ（１−２１）−ＧＰＡ１（２４−４６７）−Ｇαｑ（３５５−３５９）を、ＣＹ１４０１４（ＭＡＴα ｓｓｔ２Δ２ ｇｐａ１：：ｋ１ＵＲＡ３ ｆａｒ１Δ１４４２ ｔｂｔ１−１ ｆｕｓ１−ＨＩＳ３ ｃａｎ１ ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２ ｓｔｅ３Δ１１５６ ｌｙｓ２ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３）及びＣＹ１４０６６（ＭＡＴα ｓｔｅ１８ｇ６−３８４１ ｓｓｔ２Δ２ ｇｐａ１：：ｋ１ＵＲＡ３ ｆａｒ１Δ１４４２ ｔｂｔ１−１ ｆｕｓ１−ＨＩＳ３ ｃａｎ１ ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２ ｓｔｅ３Δ１１５６ ｌｙｓ２ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３）内に２段階で融合した（Ｅｒｄｅｎｉｚ他、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：１１７４−８３；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：２８１−３０１）。
【０３２５】
【表３】
2009143932.tif 000012
【０３２６】
メラトニン１ａ及びＦＰＲＬ１受容体のＬａｃＺアッセイ
ＣＹ１１４１（ＭＡＴα ｆａｒ１Δ１４４２ ｔｂｔ１−１ ｆｕｓ１−ＨＩＳ３ ｃａｎ１ ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２ ｓｔｅ３Δ１１５６ ｇｐａｌ（４１）−Ｇαｉ２ ｌｙｓ２ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３）、ＣＹ１０９８１（ＭＡＴα ＧＰＡ＋３９０７ ｓｓｔ２Δ２ ｆａｒ１Δ１４４２ ｔｂｔ１−１ ｆｕｓ１−ＨＩＳ３ ｃａｎ１ ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２ ｓｔｅ３Δ１１５６ ｌｙｓ２ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３）、及びＣＹ１２９４６（ＭＡＴα ｓｓｔ２Δ２ ＧＰＡｌ−Ｇαｉ２（５） ｆａｒ１Δ１４４２ ｔｂｔ１−１ ｆｕｓ１−ＨＩＳ３ ｃａｎ１ ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２ ｓｔｅ３Δ１１５６ ｌｙｓ２ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３）を、下記のプラスミドで形質転換し、株ＣＹ１５５０２、ＣＹ１５４９０、ＣＹ１５４９４、ＣＹ６５３９、ＣＹ１５４３８、ＣＹ１５４４０、ＣＹ６５４５、ＣＹ１５４３７及びＣＹ１５４３９を作成した。
ＣＡＤＵＳ１５８４＋ＣＡＤＵＳ２３１１  ＬａｃＺ＋  ＦＰＲＬ１受容体＋
ＣＡＤＵＳ１５８４＋ＣＡＤＵＳ２６９５  ＬａｃＺ＋  メラトニン１ａ受容体＋
ＣＡＤＵＳ１５８４＋ＣＡＤＵＳ１２８９  ＬａｃＺ＋  受容体＋
【０３２７】
形質転換体のプールを各形質転換から採取し、トリプトファン及びロイシン欠乏培養基（ｐＨ６．８、２５ｍＭ ＰＩＰＥＳ含有）内で一晩培養した。一晩たった培養を１／１０希釈して６００ｎｍにおける光学濃度を測定し、新鮮な培養基内で最終ＯＤ６００が０．２になるように培養を希釈した。メラトニン受容体を有する株を更に１．５時間培養し、ＯＤ６００が０．２になるように再度培養を希釈した。濃度を段階的に増加させたリガンドを用いてＬａｃＺ酵素活性を測定した。ＬａｃＺ酵素アッセイを９６ウェル板で行った。各反応は、合計体積１００μｌになるように３回反復した。各反応において、９０μｌの培養と１０ｍμｌのリガンドを用いた。各ウェル中のＤＭＳＯ最終濃度はＦＰＲＬ１受容体については１％に保持し、メラトニン１ａ受容体については５％に保持した。
ＦＰＲＬ１受容体の存在又は非存在下におけるＬａｃＺ活性を、０ｎＭ、１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭ、１μＭ、及び２５μＭのＦＰＲＬ１濃度にて測定した。リガンドの添加に次いで、９６ウェル板を３０℃で４時間保温した。２０μｌの０．５ｍＭフルオレセイン・ジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）を反応の基質として添加した。ウェル板を３７℃で９０分間保温した。保温に次いで、各ウェルに２０ｍｌの１ＭＮａ2ＣＯ3を添加して反応を停止させた。蛍光計を用いて励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３５ｎｍでウェル板を測定した。
【０３２８】
メラトニン受容体の存在又は非存在下におけるＬａｃＺ活性を、０ｐＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ及び４．３ｍＭのメラトニン濃度にて測定した。その結果、Ｇｐａ１、αｉ２サブユニットとＣ末端αｉ２（５）蛋白質キメラが結合し、ＦＰＲＬ１受容体を刺激することが示された。メラトニン受容体について、キメラＧ蛋白質が、野生型Ｇｐａ１と同様に受容体を刺激することが観察された。又、キメラ蛋白質による受容体の刺激はあまり効果的ではなかったが、Ｇｐａ１−４１αｉ２キメラ蛋白質について結合が観察された。これらの結果は、キメラＧ蛋白質が幾つかの異種受容体に結合し刺激できることを実証している。
他の様々な異種受容体を通じた刺激を、キメラＧ蛋白質を用いて調べた。結果の概要を表３に示す。表３のデータは、Ｇｐａ１のみでは起きなかった異種受容体の刺激が、幾つかのキメラＧ蛋白質を用いた場合に観察されたことを示している。
【０３２９】
【表４】
2009143932.tif 000013
【０３３０】
Ｆｕｓ１ ｐ−ＨＩＳ３アッセイにおいて、異種受容体の刺激はＧ蛋白質キメラ又はサンドイッチキメラＧ蛋白質を用いた場合にも観察された。結果を表４に示す。表４のデータは、野生型Ｇｐａ１では起きなかった異種受容体の刺激が、多くのキメラＧ蛋白質を用いた場合に起きたことを示している。
【０３３１】
【表５】
2009143932.tif 000014
【０３３２】
Ｃ末端キメラＧ蛋白質又はサンドイッチキメラを用いた異種オーファン受容体の結合を、ｌａｃＺアッセイによって調べた。アッセイの結果を表５に示す。表のデータは、キメラＧ蛋白質（表５においては「テール」と表現）を用いた場合にオーファンベクターを介した刺激が観察されたことを実証する。刺激は、Ｇαｑ（１−１１）−ＧＰＡ１（６−４６７）−Ｇαｑ（３５５−３５９）サンドイッチキメラを用いた場合にも観察された。
【０３３３】
【表６】
2009143932.tif 000015
【０３３４】
実施例１２：「サンドイッチ」キメラＧ蛋白質の構築
Ｇ蛋白質αユニットのＣ末端が受容体−Ｇ蛋白質特異性の決定に重要な役割を果たしているが、Ｇ蛋白質αサブユニットのＮ末端も受容体接触に関与しているようである（例えばＨａｍｍ他（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：６６９−６７２参照）。受容体特異性における効果を調べるために、Ｇｐａ１のＣ末端及びＮ末端領域を蛋白質Ｇαユニットで置換したサンドイッチキメラ蛋白質を構築した。
【０３３５】
Ｇαｑ（１−１１）−ＧＰＡ１（６−４６７）−Ｇαｑ（３５５−３５９）の構築
Ｇαｑの最初の１１アミノ酸及びＧＰＡ１の６−３８１残基を含むＧαｑ（１−１１）−ＧＰＡ１（６−４６７）−Ｇαｑ（３５５−３５９）サンドイッチキメラを、Ｃｐ１１７９を鋳型として用いて構築した。以下のプライマーをＰＣＲ増幅に用いた。
プライマー１１：ＡＣＧＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＴＧＡＣＴＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＡＴＧＧＣＴＴＧＴＴＧＴＣＴＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＡＣＧ（配列番号１１６）
プライマー１２：ＧＴＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＣＡＣＴＴＡＧＡＧ（配列番号１１７）
Ｇαｑの最初の１１アミノ酸及びＧＰＡ１の６−３８１残基を含むＰＣＲ産物を精製し、ＢｓｔＢＩ及びＢｓａＩで消化した。消化した産物をＣｐ５０４２（ＧＰＡ１ｐ−ＧＰＡ１−Ｇαｑ（５） ＣＥＮ６ ＡＲＳ４ ＡｍｐＲ ＴＲＰ１）内に連結した。連結混合物を電気穿孔でコンピテントバクテリア内に導入した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性バクテリアコロニーから調製し、Ｇ蛋白質配列をＤＮＡ配列分析によって確認した。Ｇαｑの１１アミノ酸を含むクローン１種を同定し、Ｃｐ５９０２（ＧＰＡ１ｐ−Ｇαｑ（１−１１）−ＧＰＡ１（６−４６７）−Ｇαｑ（３５５−３５９） ＣＥＮ６ ＡＲＳ４ ＡｍｐＲ ＴＲＰ１（配列番号１１８））と称した。
【０３３６】
Ｇαｑ（１−２１）−ＧＰＡ１（２４−４６７）−Ｇαｑ（３５５−３５９）の構築
Ｇαｑの最初の１３−２１残基及びＧＰＡ１の２３−３８１残基を含むＧαｑ（１−２１）−ＧＰＡ１（２４−４６７）−Ｇαｑ（３５５−３５９）サンドイッチキメラを、Ｃｐ５９０２を鋳型として用いて構築した。ＰＣＲ増幅には２種のプライマーセットを用いた。第一のプライマーセットは以下の配列を有する。プライマー１３：ＧＴＣＴＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＡＧ（配列番号１１９）
プライマー１４：ＧＡＴＣＣＧＴＣＴＣＡＣＴＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＧＣＣＡＴＡＡＴＡＧ（配列番号１２０）
第一のプライマーセットを用いて、ＥｃｏＲＩ部位下流のＰＧＡ１プロモーター配列とＧαｑの最初の１２アミノ酸を含むＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物を精製し、ＥｃｏＲＩ及びＢｓｍＢＩで消化した。
第二のプライマーセットと、鋳型としてのＣｐ５９０２をを用いて、Ｇαｑの１３−２１残基及びＧＰＡ１の２３−３８１残基を増幅した。第二のプライマーセットは以下の配列を有する。
プライマー１５：ＧＡＴＣＣＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＡＴＴＡＡＴＧＡＴＧＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＡＴＣＧＴＴＧＣ（配列番号１２１）
プライマー１２：ＧＴＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＣＡＣＴＴＡＧＡＧ（配列番号１２２）
Ｇαｑの１３−２１残基及びＧＰＡ１の２３−３８１残基を含むＰＣＲ産物を精製し、ＢｓｍＢＩ及びＢｓｔＢＩで消化した。
２種の消化したＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ及びＲｓｔＢＩで消化したＣｐ５０４２（ＧＰＡ１ｐ−ＧＰＡ１−Ｇαｑ（５） ＣＥＮ６ ＡＲＳ４ ＡｍｐＲ ＴＲＰ１）内に連結した。連結混合物を電気穿孔でコンピテントバクテリア内に導入した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性バクテリアコロニーから調製し、Ｇ蛋白質配列をＤＮＡ配列分析によって確認した。Ｇαｑの２１アミノ酸を含むクローン１種を同定し、Ｃｐ６０７９（ＧＰＡ１ｐ−Ｇαｑ（１−２１）−ＧＰＡ１（２４−４６７）−Ｇαｑ（３５５−３５９） ＣＥＮ６ ＡＲＳ４ ＡｍｐＲ ＴＲＰ１（配列番号１２３））と称した。ＧＰＡ１−Ｇα（５）、ＧＰＡ１−Ｇα（６）及びサンドイッチキメラ構造体の概要は実施例１１の表１に示した。酵母菌細胞に融合したサンドイッチキメラＧ蛋白質は、実施例１１の表２に示した。実施例１１の表４及び５の、Ｆｕｓ１−ｐＨＩＳ３アッセイを用いた結果は、サンドイッチキメラが異種受容体に結合して刺激できることを示している。
【０３３７】
ＧＰＡ１−Ｇｑサンドイッチによる、ブラジキニン応答性受容体の機能的活性の向上：
Ｇ蛋白質を融合した酵母菌株の構築は実施例１１に述べた。ＰＧＫプロモーター、ＦＵＳ１ｐ−ｌａｃＺレポーター及びプラスミド［Ｃｐ１１７９（ＧＰＡ１）、Ｃｐ５０４２（ＧＰＡ１−Ｇαｑ（５））又はＣｐ５９０２（Ｇαｑ（１−１１）−ＧＰＡ１（６−４６７）−Ｇαｑ（３５５−３５９））のうち１種］の制御下において、ヒトブラジキニン受容体２でＣＹ２１２０を形質転換して、異種受容体を介する刺激についてサンドイッチキメラを調べた。形質転換体は、ロイシン、ウラシル及びトリプトファン欠乏培養基（ｐＨ６．８）内で、指数増殖中期まで成長した。１００μｌの培養基分取を、濃度を段階的に増加させたブラジキニンを用いて９６ウェル板内に３０℃で４時間保温した。１０ｍＭクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトシド（ＣＰＲＧ）及び２．５％トライトンＸ−１００を含む２０μｌの６Ｘ Ｚ緩衝液（０．６Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、６０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．６％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール）を、各分取に加え、室温で６０分保温した。６０μｌの１Ｍ炭酸ナトリウムを加えて酵素反応を停止させ、Ｂｉｏｍｅｋ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いてＡ５７５値を測定した。リガンドで処理した場合、Ｃｐ１１７９の形質転換体についてはβ−ガラクトシダーゼ活性は増加しなかった。Ｇαｑ（１−１１）−ＧＰＡ１（６−４６７）−Ｇαｑ（３５５−３５９）の形質転換体については２６倍、ＧＰＡ１−Ｇαｑ（５）の形質転換体については１３倍のβ−ガラクトシダーゼ活性増加が見られた。
【０３３８】
実施例１３：Ｆｕｓ１ｐ−ＧＦＰを用いた検出
迅速で効率的な検出方法を提供するために、ＧＦＰをレポーター遺伝子として用いた。
プラスミドの構築
Ｃｐ２６１５（ｎＦｕｓ１−ｌａｃｚ ＡｍｐＲ ＴＲＰ１ ２ｍｕ）からＳａｌＩ及びＥａｇＩでｌａｃＺ遺伝子を切り出し、野生型ＧＦＰ遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で置き換えて、ＧＦＰレポーター遺伝子を含む構造体、Ｃｐ２７５９（ｎＦｕｓ１−ＧＦＰｗｔ ２ｍｕ ＡｍｐＲ ＴＲＰ１）を得た。
Ｃｐ２７５９（ｎＦｕｓ１−ＧＦＰｗｔ ２ｍｕ ＡｍｐＲ ＴＲＰ１）を鋳型として用いて早替え突然変異誘発プロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従って野生型遺伝子（Ｃｐ２７５９）内に突然変異を導入した。得られたプラスミドＣｐ４５６７（ｎＦｕｓ１−ＧＦＰ Ｆ１００Ｓ Ｍ１５４Ｔ Ｖ１６４Ａ ２ｍｕ ＡｍｐＲ ＴＲＰ１）は１５４位置においてトレオニンを有するが、酵母菌コドンに偏向したトレオニンに変わっていた。突然変異はＣｒａｍｅｒｉ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ１９９６ １４：３１５−３１９に記載のものと同じであった。
Ｃｐ５６００のＧＦＰ遺伝子内の部位をＮｃｏＩ及びＢｓｔＢＩで消化して、Ｃｐ５６８１（ｎｆｕｓ１ｐ−ＧＦＰＳ６５Ｔ ２ｍｕ ＡｍｐＲ ＴＲＰ１）を作成した。４５０塩基対の断片を同じ酵素を用いてＣｐ４５６７内に連結した。Ｃｐ５６８１をＢｇｌＩＩ及びＥａｇＩで消化して、ＦｕｓＩｐ−ＧＦＰＳ６５Ｔを含む１．１ｋｂ断片を、ＢａｍＨＩ／ＥａｇＩで消化した酵母菌組み込みベクター［Ｃｐ１００７（ＨＩＳ３ ＡｍｐＲ）；Ｃｐ１００９（ＴＲＰ１ ＡｍｐＲ）；Ｃｐ１０１０（ＬＥＵ２ ＡｍｐＲ）；及びＣｐ１０１１（ＵＲＡ３ ＡｍｐＲ）］の多重クローン部位内にサブクローンし、Ｃｐ５７７２（ｎＦｕｓｌＧＦＰＳ６５Ｔ ＨＩＳ３ ＡｍｐＲ）；Ｃｐ５７７３（ｎＦｕｓｌＧＦＰＳ６５Ｔ ＴＲＰ１ ＡｍｐＲ）；Ｃｐ５７７４（ｎＦｕｓｌＧＦＰＳ６５Ｔ ＬＥＵ２ ＡｍｐＲ）；及びＣｐ５７７５（ｎＦｕｓｌＧＦＰＳ６５Ｔ ＵＲＡ３ ＡｍｐＲ）を得た。
【０３３９】
酵母菌株
Ｃｐ５７７４及びＣｐ５７７５を（ＬＥＵ２遺伝子内で切断する）ＢｂｓＩで線形化し、ＣＹ１８２９（ｂａｒ１：：ｈｉｓＧ  ｆｕｓ１−ＨＩＳ３  ｔｂｔ−１  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｌｅｕ２  ｈｉｓ３  ＳＵＣ＋）内に形質転換し、ＵＲＡ  ＬＥＵ欠乏プレートに植え、３種の形質転換体を得た。３種の形質転換体のＧＦＰ蛍光発光を顕微鏡及び蛍光計で調べ、最も強い蛍光発光をしたものをＣＹ１６３６３（ｂａｒ１：：ｈｉｓＧ  ｆｕｓ１−ＨＩＳ３  ｔｂｔ１−１  ｕｒａ３：：ＵＲＡ３：：ｆｕｓ１−ＧＦＰＳ６５Ｔ  ｔｒｐ１  ｌｅｕ２：：ＬＥＵ：：ｆｕｓ１−ＧＦＰＳ６５Ｔ  ｈｉｓ３  ＳＵＣ＋）と称した。
同様に、Ｃｐ５７７３をＢｓｕ３６Ｉで線形化し、Ｃｐ５７７５をＢｂｓＩで線形化し、これら２種を同時にＣＹ１０９８１（ＧＰＡ＋ｓｓｔ２＊２ｆａｒ１＊１４４２  ｔｂｔ１−１ｆｕｓ１−ＨＩＳ３  ｃａｎ１  ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２  ｓｔｅ３＊１１５６  ｌｙｓ２  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３）内に形質転換した。１０種の形質転換体を単離し、ＧＦＰＳ６５Ｔの機能的発現について、哺乳類受容体ＭＬ１ａＲ（Ｃｐ２６９５）を形質転換して調べた。蛍光発光を顕微鏡；及びＦＡＣｓ又は蛍光計によって観察した。最も強い蛍光発光をしたものをＣＹ１６６３７と称した。
Ｃｐ５７７３を（ＴＲＰ１遺伝子内で切断する）Ｂｓｕ３６Ｉで線形化し、ＣＹ１０９８１内に形質転換した。形質転換体を単離し、ＧＦＰＳ６５Ｔの機能的発現について、哺乳類受容体を形質転換して調べた。蛍光発光を顕微鏡；及びＦＡＣｓ又は蛍光計によって観察した。最も強い蛍光発光をしたものをＣＹ１６６３８と称した。
【０３４０】
標準的な緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）アッセイ
酵母菌株を上記したように適当な培養基内において３０℃で一晩育成し、定常期とした。酵母菌株を０．２ＯＤ／ｍｌに希釈し、光学濃度ＯＤが０．４〜０．５になるまで成長させた。リガンドを、２時間半誘発した細胞に添加した。細胞が最も高い蛍光発光を見せる約１．０〜１．２ＯＤ／ｍｌで酵母菌細胞を採取した。
【０３４１】
蛍光計及びＧＦＰを用いた測定
ＹＥＰＤ中に３０℃で一晩育成したＣＹ１６３６３を用いて、Ｓｔｅ２に対する用量応答を調べた。一晩培養した酵母菌細胞を０．２５ＯＤ／ｍｌに希釈し、更に２時間半培養した。濃度を段階的に増加させたα因子を用いてＧＦＰ蛍光発光を調べた。α因子を６ｍｌのＹＥＰＤに以下の濃度で（３回反復で）添加した。１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ及び１μＭ。培養をリガンド共に３０℃で２時間保温した。１．１〜１．５ＯＤ／ｍｌで細胞を採取した。６．５ＯＤ（６．５×１０７個／ｍｌ）の酵母菌細胞を遠心分離にかけ、滅菌した水で１回洗浄した。酵母菌細胞を１００μｌの滅菌した水に再懸濁し、９６ウェル板に移し、蛍光計を用いて励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３５ｎｍ、一定ゲイン５０でウェル板を測定した。
【０３４２】
ＦＡＣ機構及びＧＦＰを用いた測定
ＹＥＰＤ中に３０℃で一晩育成したＣＹ１６３６３を用いて、Ｓｔｅ２に対する用量応答を調べた。一晩培養した酵母菌細胞を０．２ＯＤ／ｍｌのＯＤ６００に希釈した。酵母菌細胞を、更に２時間半又はＯＤ６００が０．４〜０．６になるまで培養した。α因子を６ｍｌのＹＥＰＤに以下の濃度で（３回反復で）添加した。１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ及び１μＭ。培養をリガンド共に３０℃で２時間保温した。ＯＤ６００が約０．８〜１．０ＯＤ／ｍｌになるまで３０℃で２時間半、酵母菌細胞にリガンドによる刺激を与えた。酵母菌細胞を採取し、水で１回洗浄した。酵母菌細胞を水に再懸濁し、最終濃度ＯＤを０．１Ｄ／ｍｌとした。とした。一般に、１０，０００〜５０，０００個の細胞が標準的ＦＡＣ分析法を用いた分析に使われる。
【０３４３】
ＬａｃＺアッセイを用いた測定
比較を目的として、ｌａｃＺアッセイを用いて、Ｓｔｅ２に対する用量応答を調べた。ＣＹ１６３６３をＹＥＰＤ中に３０℃で一晩育成した。一晩培養した酵母菌細胞をＯＤ６００＝０．２ＯＤ／ｍｌに希釈した。酵母菌細胞を、更に２時間半又はＯＤ６００が０．５になるまで培養した。酵母菌細胞を０．１ＯＤ／ｍｌに希釈して、１００μｌの細胞を９６ウェル板に移した。１μｌのα因子を各ウェルに添加し、最終濃度を次のようにした。０ｐＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ及び１μＭ。３０℃で２時間半、酵母菌細胞にリガンドによる刺激を与えた。２０μｌのトライトン／ＣＰＲＧ基質を各ウェルに添加し、３０℃で２５分及び４５分保温した。
ｆｕｓ１−ＧＦＰ６５Ｔを用いた、ＦＡＣ及び蛍光計によるＳｔｅ２分析の両方において、ｆｕｓ１−ＬａｃＺに比較して感度が有意に向上することが実証された。
【０３４４】
蛍光計及びＧＦＰを用いた、ＭＬ１ａ受容体に対する用量応答の測定
ＬＥＵ欠乏培養基中に３０℃で一晩育成したＣＹ１６６３９を用いて、ＭＬ１ａ受容体に対する用量応答を調べた。一晩培養した酵母菌細胞を０．２５ＯＤ／ｍｌのＯＤ６００に希釈し、６ｍｌのＬＥＵ６．８とした。酵母菌細胞を、更に２時間半（ＯＤ＝０．４〜０．５）培養した。ＭＬ１ａリガンドを以下のように段階的に増加する濃度で添加した。０ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ及び１μＭ。培養をリガンド共に３０℃で２時間半保温し刺激を与えた。６×１０7個の密度で酵母菌細胞を採取し、水で１回洗浄した。酵母菌細胞を水に再懸濁し、９６ウェル板に移し、蛍光計を用いて励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３５ｎｍ、一定ゲイン５０でウェル板を測定した。
【０３４５】
ＦＡＣ機構及びＧＦＰを用いた、ＭＬ１ａ受容体に対する用量応答の測定
ＬＥＵ欠乏培養基中に３０℃で一晩育成したＣＹ１６６３９を用いて、ＭＬ１ａ受容体に対する用量応答を調べた。一晩培養した酵母菌細胞を０．２ＯＤ／ｍｌに希釈し、２ｍｌのＬＥＵ６．８とした。ＭＬ１ａリガンドを上記した蛍光計分析における濃度と同じ濃度で添加した。培養をリガンド共に３０℃で２時間半（ＯＤ＝０．７〜１．２）保温し刺激を与えた。酵母菌細胞を採取し、水で１回洗浄した。酵母菌細胞を滅菌水に再懸濁して最終ＯＤ６００＝０．１ＯＤ／ｍｌとし、標準的ＦＡＣ分析法を用いて分析した。
【０３４６】
ＬａｃＺアッセイを用いた、ＭＬ１ａ受容体に対する用量応答の測定
比較を目的として、ｌａｃＺアッセイを用いて、ＭＬ１ａ受容体に対する用量応答を調べた。ＣＹ１５４３８（ＧＰＡ１＋３９０７  ｓｓｔ２＊ｆａｒ１＊１４４２  ｔｂｔ１−１  ｆｕｓ１−ＨＩＳ３  ｃａｎ１  ｓｔｅ１４：：ｔｒｐ１：：ＬＹＳ２  ｓｔｅ３＊１１５６  ｌｙｓ２  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３）を３０℃で一晩育成した。一晩培養した酵母菌細胞を０．２ＯＤ／ｍｌに希釈した。酵母菌細胞を、更に３時間培養して０．４ＯＤ／ｍｌとした。酵母菌細胞を０．１ＯＤ／ｍｌに希釈して、１００μｌの細胞を９６ウェル板に移した。１．２μｌのリガンドを各ウェルに添加し、ＤＭＳＯの最終濃度を各ウェルにつき０．２４％とした。ＭＬ１ａ受容体を次の濃度で添加した。０ｐＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０μＭ及び１００μＭ。３０℃で３時間、酵母菌細胞にリガンドによる刺激を与えた。２０μｌのトライトン／ＣＰＲＧ基質を各ウェルに添加し、３７℃で１時間保温した。６０μｌの１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を添加して反応を停止させ、ＯＤ５７における吸収を測定した。
【０３４７】
野生型ＧＦＰの２変異体について調べ、ｎＦｕｓ１−ＧＦＰｗｔ（Ｃｐ２７５９）と比較した。変異体ＧＦＰ Ｆ１００Ｓ Ｍ１５４Ｔ Ｖ１６４Ａ（Ｃｐ４５６７）及びＧＦＰ Ｓ６５Ｔ（Ｃｐ５６８１）は双方とも、野生型ＧＦＰと比較して高い相対蛍光発光を示した。ＧＦＰ Ｓ６５Ｔが最も高い蛍光発光を示した。ＧＦＰレポーター遺伝子を用いて、感度を向上させることができる。これを利用して、細胞群内での同一又は異質信号の可視化を制御することができる。ＦＡＣ及び蛍光計によるＭＬ１ａ分析の両方において、ｆｕｓ１−ＬａｃＺに比較して感度が有意に向上することが実証された。
【０３４８】
本発明の態様を示せば、以下のとおりとなる。
（１）キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が異種性ＧＰＣＲを酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように下記を含み且つ該異種性ＧＰＣＲのシグナル変換活性の細胞外シグナルによる調節が検出可能なシグナルを与える組換え酵母細胞： 当該酵母細胞の細胞膜中で、レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)(該異種性ＧＰＣＲは、この酵母細胞のフェロモン応答経路において内因性酵母フェロモンレセプターの代用物として作用する)；及び 下記よりなる群から選択するキメラＧ蛋白質サブユニット： 野生型配列と比べて少なくとも一つのアミノ酸置換が導入された異種性Ｇ蛋白質サブユニットに由来する配列を含む非天然Ｇ蛋白質サブユニット；
異種性Ｇγサブユニットのポリペプチドに操作可能に結合された内因性ＳＴＥ１８サブユニット；
少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換された内因性酵母Ｇｐａ１サブユニット；及び 少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が第一の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換され且つＮ末端が第二の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最初の５つのＮ末端アミノ酸に操作可能に結合されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニット(ここに、該第一及び第二の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、同じであるか又は異なるものである)。
（２）前記のキメラＧ蛋白質サブユニットが、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換された内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含む、前記（１）に記載の酵母細胞。
（３）前記のキメラＧ蛋白質サブユニットが、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換され且つＮ末端が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の５つのＮ末端アミノ酸に操作可能に結合されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含み、該異種性Ｇ蛋白質サブユニットが同じであるか又は異なる、前記（１）に記載の酵母細胞。
（４）前記のＧ蛋白質サブユニットが、野生型配列と比較して少なくとも一のアミノ酸置換が導入された異種性Ｇ蛋白質サブユニットからの配列を含む非天然Ｇ蛋白質サブユニットを含む、前記（１）に記載の酵母細胞。
（５）前記のキメラＧ蛋白質サブユニットが、異種性Ｇγサブユニットのポリペプチドに操作可能に結合された内因性ＳＴＥ１８サブユニットを含む、前記（１）に記載の酵母細胞。
（６）前記の非天然Ｇ蛋白質サブユニットが、Ｇα１６(Ｓ２７０Ｐ)；Ｇαｓ(Ｄ２２９Ｓ)；Ｇαｓ(Ｄ２２９Ｖ)；Ｇαｓ(Ｎ２５４Ｄ)；Ｇαｓ(Ｓ２８６Ｐ)；Ｇαｓ(Ｅ１０Ｋ)；Ｇαｉ２−ＧαｏＢ(Ｓ２８０Ｐ)；Ｇα１２(Ｑ２２９Ｌ)；Ｇα１２(Ｇ２２８Ａ)；及びＧαｉ２(Ｓ２８８Ｐ)よりなる群から選択する変異型哺乳動物Ｇαサブユニットである、前記（４）に記載の酵母細胞。
（７）前記の非天然Ｇ蛋白質サブユニットが、酵母Ｇ蛋白質サブユニットからの第一のポリペプチドと変異型哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニットからの第二のポリペプチドを含む酵母−哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニットキメラである、前記（４）に記載の酵母細胞。
（８）前記の第二のポリペプチドが、Ｇα１６(Ｓ２７０Ｐ)；Ｇαｓ(Ｄ２２９Ｓ)；Ｇαｓ(Ｄ２２９Ｖ)；Ｇαｓ(Ｎ２５４Ｄ)；Ｇαｓ(Ｓ２８６Ｐ)；Ｇαｓ(Ｅ１０Ｋ)；Ｇαｉ２−ＧαｏＢ(Ｓ２８０Ｐ)；Ｇα１２(Ｑ２２９Ｌ)；Ｇα１２(Ｇ２２８Ａ)；及びＧαｉ２(Ｓ２８８Ｐ)よりなる群から選択する変異型哺乳動物Ｇαサブユニットを含む、前記（７）に記載の酵母細胞。
【０３４９】
（９）キメラＧ蛋白質サブユニットを含む酵母細胞であって、該キメラＧ蛋白質サブユニットが酵母Ｇ蛋白質サブユニットからの第一のポリペプチドと異種性Ｇ蛋白質サブユニットからの第二のポリペプチドを含み、該第一のポリペプチドが酵母ＳＴＥ１８からのポリペプチドである、上記の酵母細胞。
（１０）前記の第一のポリペプチドが、酵母ＳＴＥ１８に由来し且つ前記の第二のポリペプチドが異種性Ｇ蛋白質γサブユニットに由来する、前記（９）に記載の酵母細胞。
（１１）前記の異種性Ｇ蛋白質サブユニットが哺乳動物のものである、前記（１０）に記載の酵母細胞。
（１２）前記の異種性Ｇ蛋白質サブユニットがヒトのものである、前記（１１）に記載の酵母細胞。
（１３）前記の第一及び第二のポリペプチドの少なくとも一方が、天然のアミノ酸配列を含む、前記（１２）に記載の酵母細胞。
（１４）前記の第一及び第二のポリペプチドの少なくとも一方が、非天然のアミノ酸配列を含む、前記（１２）に記載の酵母細胞。
（１５）酵母細胞に機能的に統合された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターを更に含む、前記（９）に記載の酵母細胞。
（１６）前記のキメラＧ蛋白質サブユニットが、内因性酵母Ｇ蛋白質サブユニットと比べて、異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターに対する増大された共役を示す、前記（１５）に記載の酵母細胞。
（１７）前記の第二のポリペプチドが、ヒトＧγ２サブユニットに由来する、前記（１０）に記載の酵母細胞。
（１８）前記の第二のポリペプチドが、アミノ酸配列ＡｒｇＧｌｕＬｙｓＬｙｓＰｈｅＰｈｅ(SEQ ID NO:３３のアミノ酸１９〜２４)を含む、前記（１７）に記載の酵母細胞。
（１９）前記の第二のポリペプチドがSEQ ID NO:３３に示した配列を含む、前記（１８）に記載の酵母細胞。
（２０）第二のキメラＧ蛋白質サブユニットを更に含み、該第二のキメラＧ蛋白質サブユニットが酵母Ｇ蛋白質サブユニットに由来する第一のポリペプチドと哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニットに由来する第二のポリペプチドを含み、該第二のキメラＧ蛋白質サブユニットが該第一のキメラＧ蛋白質サブユニットと異なる、前記（９）に記載の酵母細胞。
（２１）前記の第二のキメラＧ蛋白質サブユニットの前記の第二のポリペプチドが、哺乳動物Ｇαサブユニット、哺乳動物Ｇβサブユニット及び哺乳動物Ｇγサブユニットよりなる群から選択する蛋白質に由来する、前記（２０）に記載の酵母細胞。
（２２）内因性酵母フェロモンシステムのレセプター蛋白質が、機能的形態で生成されない、前記（１５）に記載の酵母細胞。
（２３）異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのＧ蛋白質への機能的共役に際して検出可能なシグナルを生成する指標遺伝子を更に含む、前記（１５）に記載の酵母細胞。
（２４）細胞が、Saccharomyces cerevisiae細胞である、前記（９）に記載の酵母細胞。
（２５）前記の異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターが、オーファンレセプターである、前記（１５）に記載の酵母細胞。
（２６）異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのＧ蛋白質への機能的共役に際して検出可能なシグナルを生成する指標遺伝子を更に含む、前記（４）に記載の酵母細胞。
【０３５０】
（２７）下記のステップを含む、ＧαとＧｂｇの解離を調節することのできる化合物を同定するアッセイ： (ｉ)前記（１５）又は前記（２６）に記載の酵母細胞を用意し、 (ｉｉ)その酵母を試験化合物と接触させ；そして (ｉｉｉ)この酵母細胞において検出可能なシグナルの変化を誘導する化合物を同定し、該検出可能なシグナルはＧαとＧβγの解離を示す。
（２８）前記の試験化合物が、非ペプチド性有機分子のライブラリーからのものである、前記（２７）に記載のアッセイ。
【０３５１】
（２９）下記を含む、異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターを調節する化合物を同定する方法： (ｉ)各細胞が下記を含む第一、第二、第三及び第四の酵母細胞を用意し： (ａ)下記の特徴を有するＧ蛋白質 １）第一の酵母細胞は、酵母Ｇ蛋白質サブユニット由来の第一のポリペプチドと哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニット由来の第二のポリペプチドを含む第一のキメラＧ蛋白質サブユニットを含み；
２）第二の酵母細胞は、酵母Ｇ蛋白質サブユニット由来の第一のポリペプチドと哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニット由来の第二のポリペプチドを含む第二のキメラＧ蛋白質サブユニットを含み、該第二のキメラＧ蛋白質サブユニットは、第一のキメラＧ蛋白質サブユニットと異なり；
３）第三の酵母細胞は、酵母Ｇ蛋白質サブユニット由来の第一のポリペプチドと哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニット由来の第二のポリペプチドを含む第三のキメラＧ蛋白質サブユニットを含み、該第三のキメラＧ蛋白質サブユニットは、該第一及び第二のキメラＧ蛋白質サブユニットと異なり；そして ４）第四の酵母細胞は、内因性酵母Ｇｐａ１Ｇ蛋白質サブユニットを含む；
(ｂ)酵母フェロモン応答経路に共役する異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)をコードする発現可能な遺伝子構築物；及び (ｃ)異種性ＧＰＣＲのＧ蛋白質との機能的共役に際して検出可能なシグナルに変化を生じる指標遺伝子；
(ｉｉ)第一、第二、第三及び第四の酵母細胞を試験化合物と接触させ；そして (ｉｉｉ)試験化合物が、第一、第二、第三又は第四の酵母細胞の少なくとも一つにおいて検出可能なシグナルの変化を誘導するかどうかを測定し、それにより異種性ＧＰＣＲを調節する化合物を同定する。
【０３５２】
（３０）前記の第一、第二又は第三の酵母細胞の少なくとも一つが、第四のキメラＧ蛋白質サブユニットを含み、該第四のキメラＧ蛋白質サブユニットが、それぞれ、第一、第二又は第三の酵母細胞により発現された第一、第二又は第三のキメラＧ蛋白質サブユニットと異なる、前記（２９）に記載のアッセイ。
（３１）前記の第一、第二又は第三のキメラＧ蛋白質の少なくとも一つが、酵母Ｇｐａ１に由来する第一のポリペプチドと哺乳動物Ｇ蛋白質αサブユニットに由来する第二のポリペプチドを含む、前記（２９）に記載のアッセイ。
（３２）前記の第二のポリペプチドが、哺乳動物のＧαｉサブユニットに由来する、前記（３１）に記載のアッセイ。
（３３）前記の第二のポリペプチドが、哺乳動物のＧα１６サブユニットに由来する、前記（３１）に記載のアッセイ。
（３４）前記の第二のポリペプチドが、哺乳動物のＧαｓサブユニットに由来する、前記（３０）に記載のアッセイ。
（３５）第一のキメラＧ蛋白質サブユニットが、哺乳動物Ｇα１２由来のポリペプチドを含み、第二のキメラＧ蛋白質サブユニットが、哺乳動物Ｇα１６由来のポリペプチドを含み、そして第三のキメラＧ蛋白質サブユニットが、哺乳動物Ｇαｓ由来のポリペプチドを含む、前記（２９）に記載のアッセイ。
（３６）第二のキメラＧ蛋白質サブユニットがＧα１６(Ｓ２７０Ｐ)を含み且つ第三のキメラＧ蛋白質サブユニットがＧαｓ(Ｄ２２９Ｓ)を含む、前記（３５）に記載のアッセイ。
（３７）前記の第一、第二及び第三の酵母細胞の各々が、更に、第四のキメラＧ蛋白質サブユニットを含み、該第四のキメラＧ蛋白質サブユニットが酵母ＳＴＥ１８由来の第一のポリペプチドと哺乳動物Ｇ蛋白質サブユニット由来の第二のポリペプチドを含む、前記（２９）に記載のアッセイ。
（３８）第一、第二、第三及び第四の酵母細胞を、試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させる、前記（２９）に記載のアッセイ。
（３９）前記のライブラリーの各メンバーが非ペプチド性有機分子である、前記（３７）に記載のアッセイ。
（４０）前記の第一、第二、第三及び第四の酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae細胞である、前記（２９）に記載のアッセイ。
（４１）検出可能なシグナルを生じる指標遺伝子を、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、エキソグルカナーゼ、ルシフェラーゼ、ＢＡＲ１、ＰＨＯ５、グリーン蛍光蛋白質、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼよりなる群から選択する、前記（２９）に記載のアッセイ。
（４２）検出可能なシグナルを生じる指標遺伝子を、ＨＩＳ３、βガラクトシダーゼ、及びグリーン蛍光蛋白質よりなる群から選択する、前記（２９）に記載のアッセイ。
（４３）前記の異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターが、オーファンレセプターである、前記（２９）に記載のアッセイ。
【０３５３】
（４４）下記を含み、異種性ＧＰＣＲのシグナル変換活性の細胞外シグナルによる調節が検出可能なシグナルを与える組換え酵母細胞： 当該酵母細胞の細胞膜中で、レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)(該異種性ＧＰＣＲは、この酵母細胞のフェロモン応答経路において内因性フェロモンレセプターの代用物として作用する)；及び キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が異種性ＧＰＣＲを酵母のフェロモン応答経路に機能的に統合するように、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
（４５）下記を含む、組換え酵母細胞： 当該酵母細胞の細胞膜中で、レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)(該異種性ＧＰＣＲは、この酵母細胞のフェロモン応答経路において内因性酵母フェロモンレセプターの代用物として作用する)；
キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が異種性ＧＰＣＲを酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット；及び 細胞膜中で発現されたレセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置に輸送され；且つこのレセプターのシグナル変換活性の異種性ポリペプチドによる調節が検出可能なシグナルを与えるように十分なレベルで発現される異種性ポリペプチド。
（４６）下記を含む、組換え酵母細胞： 当該酵母細胞の細胞膜中で、レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)(該異種性ＧＰＣＲは、この酵母細胞のフェロモン応答経路において内因性酵母フェロモンレセプターの代用物として作用する)；
キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が該異種性ＧＰＣＲを該酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット；
この細胞膜中で発現されたレセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置に輸送された異種性ポリペプチド；及び フェロモン応答経路により活性化されるレポーター構築物；(異種性ポリペプチドは、レセプターのシグナル変換活性の異種性ポリペプチドによる調節がこのレポーター構築物により媒介される検出可能なシグナルを与えるように十分なレベルで発現される)。
（４７）下記を含む組換え酵母細胞： 当該酵母細胞の細胞膜中で、レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)(該異種性ＧＰＣＲは、この酵母細胞のフェロモン応答経路において内因性酵母フェロモンレセプターの代用物として作用する)；
キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が該異種性ＧＰＣＲを該酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット；及び ＦＡＲ１、ＳＳＴ２、ＢＡＲ１、ＳＶＧ１、ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＳＴＥ１４、ＭＦａ１、ＭＦａ２、ＭＦａ１及びＭＦａ２よりなる群から選択する少なくとも一つの遺伝子中の突然変異；そしてここに、該異種性ＧＰＣＲのシグナル変換活性の細胞外シグナルによる調節は、検出可能なシグナルを与える。
（４８）下記を含む組換え酵母細胞： 当該酵母細胞の細胞膜中で、レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)(該異種性ＧＰＣＲは、この酵母細胞のフェロモン応答経路において内因性酵母フェロモンレセプターの代用物として作用する)；
キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が該異種性ＧＰＣＲを該酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット；
この細胞膜中で発現されたレセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置に輸送された異種性ポリペプチド；
フェロモン応答経路により活性化されるレポーター構築物；
及び ＦＡＲ１、ＳＳＴ２、ＢＡＲ１、ＳＶＧ１、ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＳＴＥ１４、ＭＦａ１、ＭＦａ２、ＭＦａ１及びＭＦａ２よりなる群から選択する少なくとも一つの遺伝子中の突然変異；(ここに、異種性ポリペプチドは、レセプターのシグナル変換活性の異種性ポリペプチドによる調節がレポーター構築物により媒介される検出可能なシグナルを与えるように十分なレベルで発現される)。
【０３５４】
（４９）各細胞が細胞膜を有し且つ各細胞が下記を含む、組換え酵母細胞の混合物： 当該酵母細胞の細胞膜中で、レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)；
キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が該異種性ＧＰＣＲを該酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのアミノ酸で置換されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット；及び この細胞膜中で発現された該レセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置に輸送された異種性ポリペプチド；
(ここに、集合的にこの細胞混合物は、該異種性ポリペプチドのライブラリーを発現し、該ライブラリーは、このライブラリー中の異種性ポリペプチドによる該レセプターのシグナル変換活性の調節が検出可能なシグナルを与えるように十分なレベルで発現することができる)。
（５０）各細胞が細胞膜を有し且つ各細胞が下記を含む、組換え酵母細胞の混合物： 当該酵母細胞の細胞膜中で、レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)；
キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が該異種性ＧＰＣＲを該酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット；
この細胞膜中で発現された該レセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置に輸送された異種性ポリペプチド；
フェロモン応答経路により活性化されるレポーター構築物；
及び ＦＡＲ１、ＳＳＴ２、ＢＡＲ１、ＳＶＧ１、ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＳＴＥ１４、ＭＦａ１、ＭＦａ２、ＭＦａ１及びＭＦａ２よりなる群から選択する少なくとも一つの遺伝子中の突然変異；
(ここに、異種性ポリペプチドは、レセプターのシグナル変換活性の異種性ポリペプチドによる調節がレポーター構築物により媒介される検出可能なシグナルを与えるように十分なレベルで発現される)。
【０３５５】
（５１）下記を含む、組換え酵母細胞： 当該酵母細胞の細胞膜中で、レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)(該異種性ＧＰＣＲは、この酵母細胞のフェロモン応答経路において内因性酵母フェロモンレセプターの代用物として作用する)；及び キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が該異種性ＧＰＣＲを該酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのアミノ酸で置換されており且つＮ末端が第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最初の５つのＮ末端アミノ酸に操作可能に結合されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット(該第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、同じであるか又は異なる)；そしてここに、該異種性ＧＰＣＲのシグナル変換活性の細胞外シグナルによる調節が、検出可能なシグナルを与える。
【０３５６】
（５２）各細胞が細胞膜を有し且つ各細胞が下記を含む組換え酵母細胞の混合物： 当該酵母細胞の細胞膜中で、レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)；
キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が該異種性ＧＰＣＲを該酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端蛋白質で置換されており且つＮ末端が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最初の５つのＮ末端アミノ酸に操作可能に結合されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット；及び この細胞膜中で発現された該レセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置に輸送された異種性ポリペプチド；
(ここに、集合的に、この細胞混合物は、該異種性ポリペプチドのライブラリーを発現し、該ライブラリーは、このライブラリー中の異種性ポリペプチドによる該レセプターのシグナル変換活性の調節が検出可能なシグナルを与えるように十分なレベルで発現することができる)。
【０３５７】
（５３）下記を含む組換え酵母細胞： 当該酵母細胞の細胞膜中で、レセプターを介するシグナル変換活性がそのレセプターの細胞外領域と細胞外シグナルとの相互作用により調節されるように発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプター(ＧＰＣＲ)(該異種性ＧＰＣＲは、この酵母細胞のフェロモン応答経路において内因性酵母フェロモンレセプターの代用物として作用する)；及び キメラＧ蛋白質サブユニットの発現が該異種性ＧＰＣＲを該酵母細胞のフェロモン応答経路に機能的に統合するように、少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換されており且つ少なくとも最初の５つのＮ末端アミノ酸が第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最初の５つのＮ末端アミノ酸で置換されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット(該第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、同じであるか又は異なる)；そしてここに、該異種性ＧＰＣＲのシグナル変換活性の細胞外シグナルによる調節は、検出可能なシグナルを与える。
（５４）前記のＧ蛋白質サブユニットが、最後の５つのＣ末端アミノ酸が第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換されており且つ最初の５つのＮ末端アミノ酸が第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最初の１１のＮ末端アミノ酸で置換されている内因性Ｇｐａ１サブユニットを含み、該第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットが同じである、前記（５３）に記載の酵母細胞。
（５５）前記のキメラＧ蛋白質サブユニットが、最後の５つのＣ末端アミノ酸が第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換されており且つ最初の２３のＮ末端アミノ酸が第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最初の２１のＮ末端アミノ酸で置換されている内因性酵母Ｇｐａ１サブユニットを含み、該第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットが同じである、前記（５４）に記載の酵母細胞。
【０３５８】
（５６）少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換されている内因性Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
（５７）前記のＧｐａ１の最後の５つのＣ末端アミノ酸が、異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換されている、前記（５６）に記載のキメラＧ蛋白質サブユニット。
（５８）前記のＧｐａ１の最後の６つのＣ末端アミノ酸が、異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の６つのＣ末端アミノ酸で置換されている、前記（５７）に記載のキメラＧ蛋白質サブユニット。
（５９）少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸が第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最後の４つのＣ末端アミノ酸で置換されており且つＮ末端が第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの少なくとも最初の５つのＮ末端アミノ酸に操作可能に結合されている内因性Ｇｐａ１サブユニットを含むキメラＧ蛋白質サブユニット(該第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットは、同じであるか又は異なる)。
（６０）前記のＧｐａ１の最後の５つのＣ末端アミノ酸が、第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換され且つ前記のＧｐａ１の最初の５つのＮ末端アミノ酸が第２の異種性Ｇ蛋白質の最初の１１のＮ末端アミノ酸で置換されている、前記（５９）に記載のキメラＧ蛋白質サブユニット。
（６１）前記のＧｐａ１の最後の５つのＣ末端アミノ酸が、第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換され且つ前記のＧｐａ１の最初の２３つのＮ末端アミノ酸が第２の異種性Ｇ蛋白質の最初の２１のＮ末端アミノ酸で置換されている、前記（５９）に記載のキメラＧ蛋白質サブユニット。
（６２）前記の第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットが、同じである、前記（５９）、（６０）又は（６１）に記載のキメラＧ蛋白質サブユニット。
【０３５９】
（６３）前記の異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターを、ヒトメラトニンレセプター１ａ、ヒトメラトニンレセプター１ｂ、ヒトノシセプチンレセプター、ヒトソマトスタチンレセプター２、ヒトホルミルペプチドレセプター１、ヒトガラニンレセプター１、ウサギＣＸＣＲ１、ヒトＣ５ａレセプター、ヒトアデノシンレセプター２ａ、ラット血管作動性腸管レセプター、ヒトメラノコルチンレセプター４、ラットニューロテンシンレセプター、ヒトホルミルペプチド様レセプター１、ヒトＣＸＣＲ２(変異体)、ヒトＣＸＣＲ４、ヒトアデノシン２ｂレセプター、ヒトボンベシンレセプター亜型３(ＢＲＳ３)、ヒトブラジキニンレセプター２及びオーファンレセプターよりなる群から選択する、前記（４４）、（４８）、（５１）、（５４）又は（５５）に記載の酵母細胞。
（６４）前記の異種性Ｇ蛋白質サブユニットを、Ｇαｓ、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｑ、Ｇαｏa、Ｇαｏb及びＧα１６よりなる群から選択する、前記（４４）、（４８）、（５１）、（５４）又は（５５）に記載の酵母細胞。
（６５）前記の異種性Ｇ蛋白質サブユニットが非哺乳動物性である、前記（４４）、（４８）、（５１）、（５４）又は（５５）に記載の酵母細胞。
（６６）前記のＧｐａ１の最後の４〜最後の４０のＣ末端アミノ酸が、前記の異種性Ｇ蛋白質ユニットの最後の４〜最後の４０のＣ末端アミノ酸で置換されている、前記（２）、（４４）、（４６）、（４７）、（４８）、（４９）又は（５０）、に記載の酵母細胞。
（６７）前記のＧｐａ１の最後の５〜最後の６つのＣ末端アミノ酸が前記の異種性Ｇ蛋白質ユニットの最後の５〜最後の６つのＣ末端アミノ酸で置換されている、前記（６６）に記載の酵母細胞。
（６８）前記のＧｐａ１の最後の５つのＣ末端アミノ酸が、前記の異種性Ｇ蛋白質ユニットの最後の５つのＣ末端アミノ酸で置換されている、前記（６７）に記載の酵母細胞。
（６９）前記のＧｐａ１の最後の６つのＣ末端アミノ酸が、前記の異種性Ｇ蛋白質ユニットの最後の６つのＣ末端アミノ酸で置換されている、前記（６７）に記載の酵母細胞。
（７０）前記のＧｐａ１の最後の４〜最後の４０のＣ末端アミノ酸が、前記の第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の４〜最後の４０の末端アミノ酸で置換され且つ前記のＧｐａ１のＮ末端が、前記の第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５〜最後の４０のＮ末端アミノ酸に操作可能に結合されている、前記（５１）に記載の酵母細胞。
（７１）前記のＧｐａ１の最後の５〜最後の６つのＣ末端アミノ酸が、前記の第１の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最後の５〜最後の６つのＣ末端アミノ酸で置換されており且つ前記のＧｐａ１の最初の１〜５０のＮ末端アミノ酸が、前記の第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最初の６〜４０のＮ末端アミノ酸で置換されている、前記（７０）に記載の酵母細胞。
（７２）前記のＧｐａ１の最初の５つのＮ末端アミノ酸が、前記の第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最初の１１のＮ末端アミノ酸で置換されている、前記（７１）に記載の酵母細胞。
（７３）前記のＧｐａ１の最初の２３のＮ末端アミノ酸が、前記の第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットの最初の２１のＮ末端アミノ酸で置換されている、前記（７１）に記載の酵母細胞。
（７４）前記の第１及び第２の異種性Ｇ蛋白質サブユニットが、同じである、前記（７０）、（７１）、（７２）又は（７３）に記載の酵母細胞。
（７５）前記の異種性Ｇ蛋白質サブユニットが、哺乳動物性である、前記（７４）に記載の酵母細胞。
（７６）前記の異種性Ｇ蛋白質サブユニットが、Ｇαｑサブユニットである、前記（７５）に記載の酵母細胞。
【０３６０】
（７７）前記の細胞が、異種性ポリペプチドを更に含み、その異種性ポリペプチドが、細胞膜で発現されたレセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置に輸送され；且つその異種性ポリペプチドが、レセプターのシグナル変換活性の異種性ポリペプチドによる調節が検出可能なシグナルを与えるように十分なレベルで発現される、前記（１）、（２）、（３）、（４）、（４４）、（４７）、（５１）又は（５３）に記載の酵母細胞。
（７８）前記の異種性ポリペプチドが、前記の異種性ＧＰＣＲのリガンドである、前記（４５）、（４６）、（４８）、（４９）、（５０）。（５２）又は（７７）に記載の酵母細胞。
（７９）前記の細胞が、第２の異種性ポリペプチドを更に含み、該第２の異種性ポリペプチドも又、細胞膜中で発現された前記の異種性ＧＰＣＲの細胞外領域との相互作用を可能にする位置に輸送される、前記（７８）に記載の酵母細胞。
（８０）異種性ポリペプチドが、レセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置へのそのポリペプチドの輸送を容易にするシグナル配列を含む、前記（７８）に記載の酵母細胞。
（８１）シグナル配列が、Saccharomyces cerevisiaeのα因子又はａ因子のリーダーペプチドに対応する、前記（８０）に記載の酵母細胞。
（８２）ＦＡＲ１、ＳＳＴ２、ＢＡＲ１、ＳＶＧ１、ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＳＴＥ１４、ＭＦａ１、ＭＦａ２、ＭＦａ１及びＭＦａ２よりなる群から選択する少なくとも一つの遺伝子中に突然変異を更に含む、前記（１）、（２）、（３）、（４４）、（４５）、（４６）、（４９）、（５１）、（５２）又は（５３）に記載の酵母細胞。
（８３）前記の酵母細胞が、ＳＴＥ１４変異を有する、前記（４６）、（４７）、（４９）又は（８２）に記載の酵母細胞。
（８４）前記の細胞が、ＳＴＥ２又はＳＴＥ３変異を有する、前記（８３）に記載の酵母細胞。
（８５）前記の細胞が、フェロモン応答経路により活性化されそれにより検出可能なシグナルを与えるレポーター構築物を更に含む、前記（１）、（２）、（３）、（４）、（９）、（４３）、（４６）、（５０）又は（５２）に記載の酵母細胞。
（８６）前記の細胞が、フェロモン応答経路により活性化されるレポーター構築物を更に含み、異種性ポリペプチドが、レセプターのシグナル変換活性の異種性ポリペプチドによる調節がこのレポーター構築物により媒介される検出可能なシグナルを与えるように十分なレベルで発現される、前記（４４）、（４８）又は（５１）に記載の酵母細胞。
（８７）レポーター構築物が、レポーター遺伝子に操作可能に結合されたフェロモン応答性プロモーターを含む、前記（４６）、（４８）、（５０）、（８６）又は（８７）に記載の酵母細胞。
（８８）前記のレポーター遺伝子を、β−ガラクトシダーゼ(ＬａｃＺ)、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、エキソグルカナーゼ、ルシフェラーゼ、ＢＡＲ１、ＰＨＯ５、ＨＩＳ３、グリーン蛍光蛋白質(ＧＦＰ)及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼよりなる群から選択する、前記（８７）に記載の酵母細胞。
（８９）フェロモン応答性プロモーターが、ＦＵＳ１プロモーターである、前記（８８）に記載の酵母細胞。
（９０）前記のＦＵＳ１プロモーターが、ＬａｃＺ及びＧＦＰよりなる群から選択するレポーター遺伝子に操作可能に結合されている、前記（８９）に記載の酵母細胞。
（９１）前記のＦＵＳ１プロモーターが、ＧＦＰに機能的に結合されている、前記（９０）に記載の酵母細胞。
（９２）前記の検出可能なシグナルが、ＧＦＰの生成により生成される、前記（９１）に記載の酵母細胞。
（９３）Saccharomyces cerevisiae種に属する、前記（１）、（２）、（３）、（４）、（４４）、（４５）、（４６）、（４７）、（４８）、（４９）、（５０）、（５１）、（５２）又は（５３）に記載の酵母細胞。
【０３６１】
（９４）下記を含む、酵母細胞により発現される異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのモジュレーターを同定する方法： 前記（１）、（２）、（３）、（４４）、（４７）、（５１）又は（５３）に記載の酵母細胞の混合物を試験化合物と接触させ；
この混合物中の細胞に検出可能なシグナルを生成させ；そして 試験化合物を上記のレセプターのモジュレーターとして同定する。
（９５）下記を含む、酵母細胞により発現される異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのモジュレーターを同定する方法： 前記（４５）、（４６）、（４７）、（４８）、（４９）又は（５２）に記載の酵母細胞の混合物を上記のレセプターのリガンドと接触させ；
この混合物中の細胞に検出可能なシグナルを生成させ；そして これらの酵母細胞により発現される異種性ポリペプチドを上記のレセプターのモジュレーターとして同定する。
（９６）下記を含む、酵母細胞により発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのモジュレーターを同定する方法： 前記（７９）に記載の酵母細胞の混合物を用意し；
この混合物中の細胞に、検出可能なシグナルを生成させ；そして 第２の異種性ポリペプチドを上記のレセプターのモジュレーターとして同定する。
（９７）下記を含む、酵母細胞により発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのモジュレーターを同定する方法： 前記（７８）に記載の酵母細胞の第１の混合物を、酵母細胞の第２の混合物と接触させ(集合的に、酵母細胞の第２の混合物は、第１の混合物の酵母細胞の細胞膜中で発現された該レセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置に輸送される異種性試験ポリペプチドのライブラリーを発現する)；
第１の混合物中の細胞に、検出可能なシグナルを生成させ；そして 第２の混合物中の異種性試験ポリペプチドをこの酵母細胞により発現された該レセプターのモジュレーターとして同定する。
（９８）下記を含む、酵母細胞により発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのモジュレーターを同定する方法： 前記（４６）、（４７）、（４８）、（４９）、（５０）、（５１）又は（７７）に記載の組換え酵母細胞の混合物を用意し(ここに、該酵母細胞の各々における異種性ポリペプチドは、異種性試験ポリペプチドである)；
この混合物中の細胞に、検出可能なシグナルを生成させ；そして 異種性試験ポリペプチドを、該異種性レセプターのモジュレーターとして同定する。
（９９）下記を含む、酵母により発現された異種性Ｇ蛋白質共役型レセプターのモジュレーターを同定する方法： 前記（４５）、（４６）、（４８）、（４９）、（５０）、（５２）又は（７７）に記載の酵母細胞の混合物を該レセプターのリガンドと接触させ；
この混合物中の細胞に、検出可能なシグナルを生成させ；そして これらの酵母細胞により発現された異種性ポリペプチドを該レセプターのモジュレーターとして同定する。
【０３６２】
（１００）前記の混合物の各酵母細胞が、フェロモン応答経路により活性化されそれにより検出可能なシグナルを与えるレポーター構築物を更に含む、前記（９３）に記載の方法。
（１０１）レポーター構築物が、レポーター遺伝子に操作可能に結合されたフェロモン応答性プロモーターを含む、前記（９９）に記載の方法。
（１０２）フェロモン応答性プロモーターが、ＦＵＳ１プロモーターである、前記（１００）に記載の方法。
（１０３）前記のＦＵＳ１プロモーターが、ＬａｃＺ及びＧＦＰよりなる群から選択するレポーター遺伝子に操作可能に結合された、前記（１０１）に記載の方法。
（１０４）前記のＦＵＳ１プロモーターが、ＧＦＰに機能的に結合されている、前記（１０３）に記載の方法。
（１０５）前記の検出可能なシグナルが、ＧＦＰの生成により生成される、前記（１０４）に記載の方法。
（１０６）異種性ポリペプチドが、レセプターの細胞外領域との相互作用を可能にする位置へのそのポリペプチドの輸送を容易にするシグナル配列を含む、前記（９４）、（９５）、（９６）又は（９７）に記載の方法。
（１０７）シグナル配列が、Saccharomyces cerevisiaeのα因子又はａ因子のリーダーペプチドに対応する、前記（１０５）に記載の方法。
（１０８）前記の酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae種に属する、前記（９３）、（９４）、（９５）、（９６）、（９７）又は（９８）に記載の方法。
【０３６３】
（１０９）  SEQ ID NO:１０７のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
（１１０）  SEQ ID NO:１０８のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
（１１１）  SEQ ID NO:１０９のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
（１１２）  SEQ ID NO:１１０のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
（１１３）  SEQ ID NO:１１１のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
（１１４）  SEQ ID NO:１１２のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
（１１５）  SEQ ID NO:１１３のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
（１１６）  SEQ ID NO:１１４のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
（１１７）  SEQ ID NO:１１５のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
（１１８）  SEQ ID NO:１１８のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
（１１９）  SEQ ID NO:１２３のアミノ酸配列を含むキメラＧ蛋白質サブユニット。
【０３６４】
2009143932.tif 000016
2009143932.tif 000017
2009143932.tif 000018
2009143932.tif 000019
2009143932.tif 000020
2009143932.tif 000021
2009143932.tif 000022
2009143932.tif 000023
2009143932.tif 000024
2009143932.tif 000025
2009143932.tif 000026
2009143932.tif 000027
2009143932.tif 000028
2009143932.tif 000029
2009143932.tif 000030
2009143932.tif 000031
【図１】
2009143932.tif 000032
【図２】
2009143932.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成21年2月3日(2009.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
配列表の配列番号１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１８、又は１２３に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを含有してなるキメラＧ蛋白質サブユニット。