(57)【要約】【課題】ポルフィリン以外の色素を用いる光増感反応を利用した、癌や色素沈着等の生物学的材料に対する新規光線力学療法の提供。【解決手段】カロテノイドを有効成分として含有する光線力学療法剤、および当該光線力学療法剤に３５０〜６００ｎｍの波長を有する励起光を照射する工程を含む一重項酸素の発生方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイドを有効成分として含有する光線力学療法剤。
【請求項２】
カロテノイドがＣ４０Ｈ５６の基本構造を持つ化合物である請求項１記載の療法剤。
【請求項３】
カロテノイドがネオキサンチン、シホナキサンチンまたはフコキサンチンである請求項１または２に記載の療法剤。
【請求項４】
癌細胞を対象とするものである請求項１〜３いずれかに記載の療法剤。
【請求項５】
色素沈着細胞を対象とするものである請求項１〜３いずれかに記載の療法剤。
【請求項６】
請求項１〜５いずれかに記載の光線力学療法剤に３５０〜６００ｎｍの波長を有する励起光を照射する工程を含む、一重項酸素の発生方法。
【請求項７】
照射工程が青色発光ダイオードを用いて行われる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
光線力学療法剤を製造するためのカロテノイドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光線力学療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
光線力学療法は、光増感物質を体内に投与し、これに光線を照射し、その光毒性反応により生物学的材料の機能を破壊するもので、新しい化学療法として注目を集めている。これまで、光線力学療法の対象薬剤にはポルフィリン類やその前駆物質が使われてきた（特許文献１および２）。ポルフィリン類は、赤色光で励起すると、一重項第一励起状態（Ｓ１）になる（図１）。これは、大部分蛍光を発して基底状態（Ｓ０）に戻るが、一部は三重項第一励起状態（Ｔ１）に遷移する。Ｔ１状態にあるポルフィリン類は酸素分子と反応して、活性酸素の一種である一重項酸素（１Ｏ２）を生成する。このとき発生した一重項酸素が標的となる生物学的材料に障害を与えると考えられている。
【０００３】
光線力学療法におけるポルフィリン類の使用において課題となる点は、以下の通りである。
１）親油性が低いため組織との親和がよくない。
２）一重項酸素発生効率が必ずしもよくない（ポルフィリン類のＴ１と１Ｏ２のエネルギー準位はそれほど近接していない）。
３）ヘムに代謝されてしまう。
４）投薬後光線過敏症を起こすことがあるので、治療対象者に対して一定期間厳密な遮光措置を講じる必要がある。
【０００４】
カロテノイドは、植物などのつくる黄色ないし赤色または紫色の水不溶のポリエン色素であり、その多くは炭素数４０（Ｃ４０、ときにＣ３０、Ｃ４５、Ｃ５０など）で、左右対称に近い構造のテトラテルペノイドである。
【特許文献１】特表２００５−５００３３５号公報
【特許文献２】特開２００６−２３２８４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ポルフィリン以外の色素を用いる光増感反応を利用した、癌や色素沈着等の生物学的材料に対する新規光線力学療法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討した結果、カロテノイドの中に特定の波長の光を吸収することで、一重項酸素を生成させる作用を有するものがあることを見出し、本発明を完成するに至った。一般に、カロテノイドの中に抗酸化剤として活性酸素種を消去する作用を有するものがあることは知られているが、本発明で見出された反応は、かかる活性酸素消去反応とは逆の反応であり、これまでに報告されたことはない。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
【０００７】
（１）  カロテノイドを有効成分として含有する光線力学療法剤。
（２）  カロテノイドがＣ４０Ｈ５６の基本構造を持つ化合物である前記（１）記載の療法剤。
（３）  カロテノイドがネオキサンチン、シホナキサンチンまたはフコキサンチンである前記（１）または（２）に記載の療法剤。
（４）  癌細胞を対象とするものである前記（１）〜（３）いずれかに記載の療法剤。
（５）  色素沈着細胞を対象とするものである前記（１）〜（３）いずれかに記載の療法剤。
（６）  前記（１）〜（５）いずれかに記載の光線力学療法剤に３５０〜６００ｎｍの波長を有する励起光を照射する工程を含む、一重項酸素の発生方法。
（７）  照射工程が青色発光ダイオードを用いて行われる、前記（６）記載の方法。
（８）  光線力学療法剤を製造するためのカロテノイドの使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の光線力学療法剤によれば、有効成分としてカロテノイドを含有することから、ポルフィリンを用いた従来の光線力学療法剤に比べて、以下の利点を有する。
１）親油性が高く、組織との親和性がよい。
２）一重項酸素発生効率がよいと考えられる。その理由は、ポルフィリンと比較して、一般にＴ１準位が一重項酸素（１Ｏ２）の準位に近いからである（図１を参照）。
３）多種のカロテノイドがすでに知られており、構造に含まれる共役鎖長からエネルギーが容易に推測できるため、様々な用途に応用しやすい。
４）植物等に大量に含まれる分子であり、入手および精製が容易である。
【０００９】
本発明の一重項酸素の発生方法によれば、一重項酸素の発生効率のよいカロテノイドを用いることから、青色光を照射することにより、有効量の一重項酸素の生成が見込まれる。本方法を用いることにより、癌細胞または色素沈着細胞に対して障害を与え、死滅に導くことができる。また、本発明の方法は、一重項酸素を用いる基礎的研究においても、一重項酸素の簡便な供給手段として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の光線力学療法剤は、カロテノイドを有効成分として含有することを特徴とする。
【００１１】
本発明において、カロテノイドとは、現在その存在および構造が知られ、あるいは将来その存在が知られる、あらゆるカロテノイドを含む概念である。具体的には、カロテノイドは、カロテノイドハンドブック（Britton, G., Liaaen-Jensen, S., and Pfander, H. eds. Carotenoids Handbook. Birkhauser, Basel, 2004）に記載されたすべての化合物を含むものであり、Ｃ４０Ｈ５６の基本構造を持つ化合物とそのヒドロキシ化合物、エポキシ化合物、ケト化合物、エステル化合物などの修飾体もしくは派生物質（ときにＣ３０、Ｃ４０、Ｃ４５、Ｃ５０等の炭素数を有する化合物になる）を含む天然または非天然の化合物である。一重項酸素の発生効率の観点から、カロテノイドは、共役二重結合の結合鎖長が１０以下であるものが好ましい。
【００１２】
共役二重結合の結合鎖長が１０以下のカロテノイドとしては、ネオキサンチン、シホナキサンチン、ビオラキサンチン、ルテイン、ロロキサンチン、シホナキサンチンエステル、アンセラキサンチン、フコキサンチン、ペリディニン、ディアディノキサンチン、ディノキサンチン、スフェロイデン、クロロキサンチン、ニューロスポレン、ツナキサンチン、ハロシンチアキサンチンなどがあげられる。ネオキサンチンおよびシホナキサンチンの構造を図２に示す。
【００１３】
カロテノイドは、植物などに天然に存在するカロテノイドを常法により単離、精製して得ることができ、市販品を利用することも可能である。あるいは、カロテノイドは、自体公知の方法により合成することができる。
【００１４】
本発明の光線力学療法剤中に含まれるカロテノイドの含有量は、特に限定されるものでないが、通常０．０００１〜９９．９９重量％であり、０．００１〜９９．９重量％が好ましく、０．０１〜９９重量％がより好ましい。
【００１５】
本発明の光線力学療法剤は、前記有効成分以外に、薬理学的に許容可能な担体を含有していてもよい。かかる担体としては、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、粘稠剤、溶解補助剤またはその他の添加剤等があげられる。
【００１６】
本発明の光線力学療法剤を標的組織または細胞に到達させるためには、カロテノイドを任意のターゲッティング剤に結合させた形態で含有することも可能である。ターゲッティング剤としては、抗体、受容体、受容体−リガンド複合体、リポソーム、分子ミセルなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
本発明の光線力学療法剤の投与方法としては、当該療法剤中に含まれるカロテノイドが最終的に標的組織または細胞に到達するのであれば、特に限定はされない。投与経路として、経口または非経口があげられる。好ましくは、非経口である。非経口的投与形態としては、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経粘膜投与、経皮投与（皮膚パッチ、軟膏等による）などがあげられる。
【００１８】
本発明の光線力学療法剤は、必要に応じて、製薬学的に許容され得る添加剤と共に、投与に適した剤型に製剤化される。経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などがあげられ、非経口投与に適した剤型としては、例えば、注射剤、貼付剤、ローション剤、軟膏、クリーム剤などがあげられる。これらは当該分野で汎用されている通常の技術を用い、調製することができる。
【００１９】
本発明の光線力学療法剤の適用対象としては、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）があげられる。
【００２０】
本発明の光線力学療法剤の投与量は、対象の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該剤に含有される有効成分の種類などにより異なるが、通常成人（体重６０ｋｇとして）一人当たり、一回につき１０μｇから１０００ｍｇの範囲、好ましくは、１００μｇから５００ｍｇの範囲で投与することができる。なお、他の哺乳動物の場合も、当該哺乳動物の体重で換算した量を投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
【００２１】
本発明の光線力学療法剤が対象とする生物材料は、生体内または生体外のあらゆる細胞または組織であってもよい。好ましくは、癌細胞または色素沈着細胞である。癌細胞としては、治療効果が期待できる固形癌由来の細胞が好ましく、肺癌細胞、食道癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、皮膚癌等があげられるが、これらに限定されるものではない。色素沈着細胞としては、ニキビ、アザ、シミによる色素沈着細胞があげられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の光線力学療法剤は、有効成分であるカロテノイドが正常細胞に比べて癌細胞に取り込まれやすい性質を有する。したがって、癌治療を目的とする場合に正常細胞に対するダメージが低いので好ましい。
【００２３】
本発明の光線力学療法剤は、生体内または生体外で酸素の存在下、励起光を照射することにより、一重項酸素を発生させることができる。本発明は、かかる一重項酸素の発生方法を提供する。
【００２４】
前記励起光とは、有効成分であるカロテノイドのエネルギー準位を基底状態（Ｓ０）から一重項第二励起状態（Ｓ２）に励起可能な光線をいう。一重項第二励起状態（Ｓ２）に励起したカロテノイドが内部変換によって一重項第一励起状態（Ｓ１）に緩和した後、内部変換によって基底状態（Ｓ０）に戻る過程で、その一部は三重項第一励起状態（Ｔ１）に遷移して、Ｔ１状態にあるカロテノイドは酸素分子と反応して、活性酸素の一種である一重項酸素（１Ｏ２）を生成する（図１参照）。これら一連の反応を光増感反応という。多光子吸収によってカロテノイドをＳ０からＳ２に励起する場合の長波長光も励起光に含める。
【００２５】
励起光は、カロテノイドの種類に応じて適する波長の光を選択すればよいが、３５０〜６００ｎｍの波長の光が好ましく、より好ましくは４００〜５５０ｎｍの波長である。なお、多光子吸収によってカロテノイドのＳ２状態を作り出す場合はさらに長い波長の光線を使うこともあるが、その際も同時に照射された光子のエネルギーの合計は、これらの波長に対応するエネルギー値の範囲に収まっている必要がある。すなわち、３５０〜６００ｎｍに対応するエネルギー値として２．１〜３．５ｅＶが例示され、４００〜５５０ｎｍに対応するエネルギー値として２．３〜３．１ｅＶが例示される。かかる条件を有し、本発明の目的に適する励起光としては、電球や重水素ランプの光を青色フィルターで単色化したもの、青色発光ダイオードが発する光（以下、「青色ＬＥＤ光」と称する）、赤外線レーザー（多光子吸収に用いる）などがあげられる。
青色ＬＥＤ光は、熱放出が少ない、消費電力が少ない、小型、軽量、安価、回路の簡便性という特性を有するため、好ましく用いられる。
【００２６】
励起光の照射エネルギー密度は、対象とする生物材料の種類、生物材料の生体内での位置、動物の種類、治療目的などにより異なり、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、生体外で一重項酸素を発生する目的の場合、約１０〜５００Ｊ/ｃｍ2が例示される。また、ヒトを対象とする色素沈着の治療目的の場合、約２〜１０Ｊ/ｃｍ2（例えば５Ｊ/ｃｍ2）を１〜１０回（例えば８回程度）照射が例示される。ヒトを対象とする癌の治療目的の場合、２００Ｊ/ｃｍ2以上の照射が必要と考えられるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
本発明の方法により生成した一重項酸素および一重項酸素を起点に発する種々の活性酸素種は、カロテノイドが到達した周辺の癌細胞や色素沈着細胞等に障害を与えたり死滅させたりする作用を有する。これにより、癌（皮膚癌を含む）または皮膚疾患（皮膚癌を除く）の治療のみならず、美容目的にも効果が期待される。
【実施例】
【００２８】
次に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。なお、本実施例において市販のキットまたは試薬を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。
【００２９】
[実施例１]
カロテノイド光増感反応による細胞死
本実施例では、カロテノイドを培養中の癌細胞に添加し、同時にカロテノイドに対する励起光を照射した後、培養を続けて癌細胞の生育を観察した。カロテノイドの培地中の濃度は２μＭで、２００μmol photons・m-2・s-1の青色光（青色ＬＥＤによる）照射下で、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の環境下で培養した。カロテノイドとしてネオキサンチンおよびシホナキサンチンを用いた（ＥおよびＦ）。ネオキサンチンおよびシホナキサンチンは、ホウレンソウおよび緑藻（ミル）からそれぞれ抽出し、精製した。比較実験として、Ａ)カロテノイド添加なし・青色光照射なし、Ｂ)ネオキサンチン添加あり・青色光照射なし、Ｃ)シホナキサンチン添加あり・青色光照射なし、ならびにＤ)カロテノイド添加なし・青色光照射ありの各条件でも培養した。癌細胞としてヒト悪性黒色腫（A375、ATCCCRL-1619）を使用し、９６ウエルプレート上でＤＭＥＭ培地を用いて培養した。細胞の生育観察は、光学顕微鏡を用いて行った（図３）。また、細胞活性はalamarBlueＴＭ法(Sorotec, Oxford, UK)を用いて測定した（図４）。
【００３０】
図３より、比較実験（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）では細胞は仮足をのばし、活発に増殖しているのに対し、カロテノイド添加および青色光照射を行った細胞では著しく形態が変化し、仮足が定着しない球状体になっていた（Ｅ、Ｆ）。図４より、alamarBlueＴＭ法による細胞活性測定の結果から、比較実験（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）に比べ、カロテノイド添加および青色光照射を行った細胞では細胞活性が明らかに下がっていた（Ｅ、Ｆ）。比較実験Ａでの細胞生存率を１００％としたとき、カロテノイドを添加し青色光照射を行った細胞（ＥおよびＦ）では顕著に細胞生存率が低下している（両側Ｔ検定p<0.001）が、比較実験（Ａ、Ｄ）では細胞生存率の有意差はなかった。また、カロテノイドを添加し青色光照射を行った細胞（ＥおよびＦ）での細胞生存率の低下は、比較実験（Ｂ、Ｃ）に対し有意に大きかった（両側Ｔ検定p<0.001）。このことから、カロテノイド類に対する光照射により、光増感反応が起こり、これにより細胞が障害を受けたことが明らかである。なお、図４において、カロテノイドを添加しただけでも細胞生存率の低下が見られた（Ａに対するＢはｐ＜0.001、Ａに対するＣはｐ＜0.05）が、カロテノイド添加のみの細胞よりも、カロテノイド添加後青色光照射の細胞の方が、さらに細胞生存率が低下していた（Ｂに対するＥ、Ｃに対するＦはともにｐ＜0.001）。
【００３１】
[実施例２]
カロテノイド光増感反応によって生じる活性酸素の検出
本実施例では、光励起したカロテノイドによる活性酸素種発生を明らかにするために、活性酸素種に特異的に反応する蛍光プローブ(Hyper, Evrogen社)を発現する細胞株（Hyper発現HeLa細胞：HeLa Hyper cell、MARINPHARM社）を用いて活性酸素種発生状況を調査した。
Hela Hyper cellを２μＭネオキサンチン含有ＤＭＥＭ培地（invitrogen社）で３時間培養し、
１)ネオキサンチンを含まない培地に交換（Ｄ１）、または
２)培地交換なし（Ｄ２）
のそれぞれについて２時間青色光（青色ＬＥＤによる、実施例１と同様）照射した後、蛍光顕微鏡観察を行った。また、比較実験として、
Ａ）カロテノイド添加なし・青色光照射なし、
Ｂ１）カロテノイド添加あり・青色光照射なし、
Ｃ）カロテノイド添加なし・青色光照射あり
の各条件でも培養した。結果を図５に示す。
【００３２】
図５より、Ｄ１およびＤ２のいずれの場合も比較実験（Ａ、Ｂ１、Ｃ）に比べて細胞質において強い蛍光が見られた。これは、青色光励起したカロテノイドによる活性酸素種生成を示すのみならず、カロテノイドが細胞膜親和性を持ち細胞によく取り込まれていることを示している。このような励起カロテノイドによる光増感反応は、カロテノイド類を用いた光線力学療法への応用に発展するものと期待される。
【００３３】
[実施例３]
カロテノイドの癌細胞集積性
カロテノイドの癌集積性を、培養細胞を用いて調べた。カロテノイドとして、フコキサンチンを用いた。フコキサンチンは、褐藻（カヤモノリ）から抽出し、精製した。実験には、癌細胞（A375：ヒト悪性黒色腫）および正常細胞（Met-5A：中皮細胞）を用いた。細胞をそれぞれ９x106個回収し、３０ｍＬの２μＭカロテノイド含有ＤＭＥＭ培地に懸濁した。懸濁した細胞を３７℃、３時間振とうしながらカロテノイドを取り込ませた後、遠心分離し、細胞を回収した。回収した細胞をアセトンで溶解し、再び遠心分離して上清を色素抽出液として得た。色素抽出液を吸光度測定し、カロテノイド濃度を求めた。また、それぞれの細胞につき同時にタンパク質量を求めた。結果を図６に示す。図６より、癌細胞（A375）では、正常細胞(Met-5A)に比べ、カロテノイドの細胞集積量が多いことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によれば、新規な光線力学療法剤を提供し、癌、皮膚疾患を始めとする様々な疾患を非侵襲的に治療または改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ポルフィリン、カロテノイドおよび酸素分子のエネルギー準位を模式的に示した図である。
【図２】図２は、ネオキサンチンおよびシホナキサンチンの構造を示す。
【図３】図３は、培養癌細胞にカロテノイドを加え、青色ＬＥＤ光で照射した後の細胞の形態を示す光学顕微鏡写真である。
【図４】図４は、カロテノイドの光増感作用による癌細胞死を、カロテノイド未添加で青色光照射なしのコントロール（Ａ）を１００％として相対的に示したグラフである。
【図５】図５は、活性酸素種に特異的に反応する細胞株を用いてネオキサンチンと青色光照射の効果を調べた蛍光顕微鏡写真である。
【図６】図６は、癌細胞のカロテノイド集積性を示すグラフである。
【図２】
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【図４】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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