(57)【要約】【課題】チロシナーゼの自殺基質は皮膚脱色および食物褐変防止のように有用であるにもかかわらず、有効な自殺基質はほとんど発見されていない。【解決手段】本発明において、2種類のイソフラボン、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンが、分配率が低く、ミカエリス定数が低く、最大不活性化速度定数が高い、マッシュルームチロシナーゼの有効なおよび独自の自殺基質であることが証明された。これらの2種類の自殺基質を化粧品および医療産業にさらに適用することは有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2009001568.tif 000009
［前記式中、R1、R2、R3、またはR4はH、水酸基］
の化合物、あるいはそのエステル化またはグリコシル化またはアルキル化誘導体を含む組成物。
【請求項２】
式：
【化２】
2009001568.tif 000010
［前記式中、R1、R2、R3、またはR4はH、水酸基］
の化合物、あるいはそのエステル化またはグリコシル化またはアルキル化誘導体を有効量患者に投与すること含む、被験者でチロシナーゼ活性を不活性化する方法。
【請求項３】
前記被験者の皮膚を白色化することに適用される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験者がヒトである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒトが皮膚の高色素沈着を患う、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
チロシナーゼ0.1μΜを基準として前記化合物の有効量が0.1μΜから8.0μΜである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
チロシナーゼ0.1μΜを基準として前記化合物の有効量が0.55μΜから7.7μΜである、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシナーゼを不活性化するための化合物を含む組成物に関係する。本発明はまた、チロシナーゼ活性を不活性化する方法にも関係する。
【背景技術】
【０００２】
チロシナーゼ(EC 1.14.18.1)は、自然界に広く分布する銅含有モノオキシゲナーゼである。モデルチロシナーゼの構造が解明されている(Klabunde, T. et al., 1998, Nat. Struct. Biol., 5, 1084-1090.; Matoba, Y. et al., 2006, J. Biol. Chem., 281, 8981-8990.)。前記酵素は、L-チロシンを3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（L-ドーパ）に水酸化、およびL-ドーパをドパキノンに酸化する、メラニン合成における最初の2つの反応を触媒する。このo-キノンは高反応性化合物であり、自然発生的に重合してメラニンを形成することができる(Seo, S. Y. et al., 2003, J. Agric. Food Chem., 51, 2837-2853.)。前記酵素はまたポリフェノールオキシダーゼ(PPO)としても知られ、果物中にあるフェノール性化合物の酸化に起因する、収穫後の取り扱いおよび処理の間に損傷を受ける果物の酵素性褐変反応に関与する。皮膚の高色素沈着(hyperpigmentation)、および果物の酵素性褐変は両方とも望ましくなく、チロシナーゼ活性を阻害することが多くの研究の主題であった(Baurin, N. et al., 2002, J. Ethnopharmacol., 82, 155-158.; Chen, Q. et al., 2002, J. Agric. Food Chem., 50, 4108-4112.; Kim, Y. M. et al., 2002, J. Biol. Chem., 277, 16340-16344.; Shiino, M. et al., 2003, Bioorg. Chem., 31, 129-135.)。植物は生物学的活性化学物質の豊富な供給源を構成し、それらの多くが有害な副作用がほとんど無いことから(Lee, G. C. et al., 1997, Food Chem., 60, 231-235.)、植物から天然素材であるチロシナーゼ活性インヒビターを探索するための協力が存在する。
【０００３】
チロシナーゼの自殺不活性化(suicide inactivation)が早期の研究において報告されている。チロシナーゼの自殺基質(suicide substrate)は皮膚脱色および食物褐変防止のように有用であるにもかかわらず、有効な自殺基質はほとんど発見されていない。
【非特許文献１】Klabunde, T. et al., 1998, Nat. Struct. Biol., 5, 1084-1090.
【非特許文献２】Matoba, Y. et al., 2006, J. Biol. Chem., 281, 8981-8990.
【非特許文献３】Seo, S. Y. et al., 2003, J. Agric. Food Chem., 51, 2837-2853.
【非特許文献４】Baurin, N. et al., 2002, J. Ethnopharmacol., 82, 155-158.
【非特許文献５】Chen, Q. et al., 2002, J. Agric. Food Chem., 50, 4108-4112.
【非特許文献６】Kim, Y. M. et al., 2002, J. Biol. Chem., 277, 16340-16344.
【非特許文献７】Shiino, M. et al., 2003, Bioorg. Chem., 31, 129-135.
【非特許文献８】Lee, G. C. et al., 1997, Food Chem., 60, 231-235.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、式：
【化１】
2009001568.tif 000002
［前記式中、R1、R2、R3、またはR4はH、水酸基］
の化合物、あるいはそのエステル化またはグリコシル化またはアルキル化誘導体を含む組成物を提供する。
【０００５】
本発明はまた、有効量の式：
【化２】
2009001568.tif 000003
［前記式中、R1、R2、R3、またはR4はH、水酸基］
の化合物、あるいはそのエステル化またはグリコシル化またはアルキル化誘導体を患者に処方することを含む被験者で、チロシナーゼ活性を不活性化する方法も提供する。
【０００６】
本発明において、2種類のイソフラボン、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンが、分配率が低く、ミカエリス定数が低く、最大不活性化速度定数が高い、マッシュルームチロシナーゼの有効なおよび独自の自殺基質であることが証明された。これらの2種類の自殺基質を化粧品および医療産業にさらに適用することは有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
＜マッシュルームチロシナーゼの自殺基質としての7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンの同定＞
7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンによるチロシナーゼ阻害（図１）を研究するために、マッシュルームチロシナーゼのモノフェノラーゼおよびジフェノラーゼ活性両方に対する2種類のイソフラボンの阻害効果を調査した。結果を図２に示す。基質としてL-チロシンと酵素反応を実行したとき、顕著な遅延時間、モノフェノラーゼ活性の特徴であるが、が観測され、同時にドパクロムが出現した（図２）。遅延時間は、o-ジフェノールの平衡状態濃度に達するために必要とされる時間である。遅延時間の長さを、L-ドーパのような還元剤またはo-ジフェノール基質の存在により、短くすること、およびなくすことができる。図２Ａより見ることができるように、2種類のイソフラボンそれぞれの存在下で、遅延時間無しにL-チロシンを酵素により酸化した。2種類の化合物はo-ジフェノール構造を含むため、2種類の化合物がマッシュルームチロシナーゼの基質として作用するかもしれないことを結果は示唆した。この状況で、酵素休止状態での主な形態である、酵素の酸化(met)形態を、o-ジフェノール基質を触媒することによりそのデオキシ(deoxy)形態に迅速に還元した。その後チロシナーゼのdeoxy形態が、L-チロシンと結合しうる唯一の形態であるoxy形態に自然発生的に変換される。一方、L-チロシンを基質として使用したとき、2種類のイソフラボンはドパクロムの形成を遅延させ、および停止し、それゆえマッシュルームチロシナーゼのモノフェノラーゼ活性のインヒビターとして作用した。さらに、L-ドーパを基質として使用することにより、チロシナーゼのジフェノラーゼ活性を調べたとき、反応は即座に平衡状態に達した（図２Ｂ）。アッセイ培地中における2種類のイソフラボンそれぞれの存在は、ジフェノラーゼ活性の減少という結果となる（図２Ｂ）。上記結果により、マッシュルームチロシナーゼのモノフェノラーゼおよびジフェノラーゼ活性両方を2種類のイソフラボンが阻害することが明らかにされた。
【０００８】
2種類のイソフラボンがマッシュルームチロシナーゼの基質として作用するか否かを確認するために、5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボン、および7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンとのチロシナーゼの酵素反応を、pH 6.8のリン酸バッファー中でイソフラボンとチロシナーゼを混合することにより研究した。反応混合物をHPLCにより分析し、結果を図３に示す。イソフラボン(tR＝17.3分)は減少し始め、活性チロシナーゼとの触媒反応中に新たなピーク(tR＝7.1分)が徐々に出現した。対照的に、熱分解チロシナーゼとの触媒反応の間イソフラボンは一定であり続けた。同様な結果が基質としての7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンでもまた得られた（データは示さず）。結果により、マッシュルームチロシナーゼの基質として2種類のイソフラボンが作用することが明らかにされた。
【０００９】
上記の結果は、マッシュルームチロシナーゼに対する基質およびインヒビター両方の特徴を2種類の化合物が有することを示した。チロシナーゼが、L-ドーパおよびカテコールのような、そのo-ジフェノール基質により不可逆的に阻害されうることが知られている。これらの基質はまた、自殺基質または作用機序に基づいた(mechanism-based)インヒビターとも名づけられた。それゆえ本出願人は、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンがチロシナーゼを不可逆的に阻害しうるか否かをさらに調査した。結果を図４に示す。2種類のイソフラボンを添加しないプレインキュベーション混合物中の酵素活性は、30分の反応の間一定のままであった。しかし、2種類のイソフラボンそれぞれを有するチロシナーゼのプレインキュベーションにより、プレインキュベーションにおける最初の2分間に酵素は迅速に不活性化された。プレインキュベーション混合物中に10μMのイソフラボンを添加することにより、プレインキュベーションの7分後に酵素は完全に不活性化された。さらに、プレインキュベーション混合物中の酵素活性は、透析または分子排除クロマトグラフィー(molecular exclusion chromatography)を使用して2種類のイソフラボンのような低分子量の化合物を除去することによっても回復されなかった（データは示さず）。これらの結果より、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンが不可逆性インヒビターとして同定され、それらはマッシュルームチロシナーゼに対する自殺基質または作用機序に基づいたインヒビターに所属した。
【００１０】
それゆえ、本発明はまた式：
【化３】
2009001568.tif 000004
［前記式中、R1、R2、R3、またはR4はH、水酸基］
の化合物、あるいはそのエステル化またはグリコシル化またはアルキル化誘導体を有効量患者に処方することを含む主題において、チロシナーゼ活性を不活性化する方法も提供する。本発明の提示においてR1、R2、およびR4が水酸基である化合物が好ましく；R1、R2、R3、およびR4が水酸基である化合物が好ましい。
【００１１】
加えて、エステル化により前記化合物を安定化するためにリパーゼを使用する。上記反応を通して、エステル化合物を化粧品の活性成分として適切にし、皮膚の高色素沈着を患うヒトの皮膚を白色化するために適用することができた。
【００１２】
好ましい実施態様において、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンの有効量は、チロシナーゼ0.1μΜを基準として0.1μΜから8.0μΜであり；7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンの好ましい有効量は、チロシナーゼ0.1μΜを基準として0.55μΜから7.7μΜである。5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンの有効量は、チロシナーゼ0.1μΜを基準として0.1μΜから3.5μΜである。
【００１３】
＜2種類の自殺基質の分配率の決定＞
自殺基質を伴う定量的仕事の全てにおいて第一に重要である最初の工程は、不活性化のためのモル比、すなわち酵素の1分子を完全に不活性化するために必要なインヒビターの分子の数を決定することである。自殺基質の機構は、以下のような、中間反応物Yが活性酵素および生成物を与えるかもしれない、または酵素を不活性化するかもしれない、単純な分枝反応経路を提案した、Waleyにより広範囲にわたり研究されている。
【化４】
2009001568.tif 000005
上記式中、EおよびEiはそれぞれ酵素および不活性化酵素であり；Pは生成物であり；Xは最初の中間反応物であり、Yは別の中間反応物である。中間反応物Yは、分配比r［ここでr= k+3/k+4］により決定され、反応の選択権を有する。上記で定義されるように、不活性化のためのモル比を、酵素の濃度に対するインヒビターの最初の濃度の比に対して残留する分画活性をプロットすることにより決定して良い。r > 1である場合、横座標上の切片はプロット中で1 + rである。結果を図５に示す。7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンまたは5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンそれぞれの種々の量とチロシナーゼをプレインキュベートした際に、残留する分画活性は酵素に対する添加イソフラボンのモル比に比例した。外挿法により、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンそれぞれの、82.7 ± 5.9個および36.5 ± 3.8個の分子が酵素の1分子を不活性化するために必要であった。7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンそれぞれの83モル比率および37モル比率より少ないモル比率を使用した際、全ての自殺基質が消費されたため自殺反応は停止し、インキュベーションの持続時間を数分から数時間に変化させた際、残留する分画活性ははっきりとは異ならない。それゆえ、2種類の自殺基質の分配率は、1+rである図５の横軸上の切片より、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンそれぞれに対して81.7 ± 5.9および 35.5 ± 3.8であると計算された。
【発明の効果】
【００１４】
＜2種類の自殺基質のミカエリス定数および最大不活性化速度定数(Maximal Inactivation Rate Constant)＞
7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンによる阻害の動態を、Frereらの方法を使用することにより、および2種類の自殺基質それぞれの存在下でマッシュルームチロシナーゼによるL-ドーパの酸化を計測することにより研究した。アッセイの間、試験された自殺基質の濃度は、酵素の濃度よりもはるかに高かった。酵素の不活性化が進行するのを高自殺基質/酵素比で観察した際、自殺基質の濃度([I])を、反応を通して一定であるとみなすことができ、擬一次速度定数(ki)を、式１を使用して決定することができた。ここでki-maxおよびKIは、最大不活性化速度、および不活性化物のミカエリス定数を表す。
【数１】
2009001568.tif 000006
L-ドーパの存在下で、L-ドーパの酸化速度における指数関数的減少は、tに対するln(νt/ν0)のプロットより計算された明確な一次速度定数を与え、ここでν0およびνtは、それぞれ時間0および時間tにおける475nmの吸光が増加する速度である。酵素に対する、添加イソフラボンおよびL-ドーパの間の競合反応を仮定すると、イソフラボン([I])およびL-ドーパ([S])の濃度を伴うkobsの変動は、式２により与えられる。
【数２】
2009001568.tif 000007
式中KSおよびKIはそれぞれ、L-ドーパおよびイソフラボンに対するミカエリス定数である。式２が
【数３】
2009001568.tif 000008
のように書き表されるとき、[I]に対する[I]/kobsのプロットが直線状であること、ならびにki-maxおよびKIを切片と傾きより見出すことができることは明確である。結果を図６に示す。同一実験条件下で、KSは0.25 ± 0.01mMであると決定された。それゆえ、L-ドーパを酵素基質として使用した際、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンそれぞれに対して、ki-maxおよびKIは、0.79 ± 0.08min-1および1.01 ± 0.04 min-1、ならびに18.70 ± 2.31μMおよび7.81 ± 0.05μMであると計算された。2種類の自殺基質の高いki-maxおよび低いKIは、二次速度定数(ki-max/KI)が大きいことを意味した。それゆえ、2種類のイソフラボンは、マッシュルームチロシナーゼの「高反応性、高親和性」自殺基質である。
【００１５】
＜自殺基質の有効性に対する構造解析＞
マッシュルームチロシナーゼの自殺基質における化学構造と有効性との間の関係を検証するために、最初の指針として不可逆的阻害能力を本出願人は使用した。試験された7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンの構造類似物は、5,7,4’-トリヒドロキシイソフラボン、6,7,4’-トリヒドロキシイソフラボン、7,4’-ジヒドロキシイソフラボン-8-グルコシド、7,8-ジヒドロキシクマリン、および7,8-ジヒドロキシフラボンを含む（図１）。不可逆的阻害アッセイを、マッシュルームチロシナーゼによる化合物の前占有(preoccupation)の反応により実行した。結果として、試験された類似化合物にマッシュルームチロシナーゼのジフェノラーゼ活性を不可逆的に阻害するものはなかったことを本出願人は見出した。それゆえ、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボン中にあるA環のC8部位にある水酸基を、C5（5,7,4’-トリヒドロキシイソフラボン）またはC6（6,7,4’-トリヒドロキシイソフラボン）部位の基と交換、あるいはグルコシド（7,4’-ジヒドロキシイソフラボン-8-グルコシド）と交換した際に、不可逆的阻害活性の有効性は完全に消滅した。これにより、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボン両方の7,8-ジヒドロキシル基がマッシュルームチロシナーゼに対する基質の自殺特性において重要な役割を果たしていることが示された。一方、イソフラボン骨格がフラボン(7,8-ジヒドロキシフラボン)またはクマリン(7,8-ジヒドロキシクマリン)と置換された際にも、A環のC7およびC8部位にある2個の水酸基が保持されていても、不可逆的阻害活性はまた消滅した。それゆえ上記結果より、7,8-ジヒドロキシル基のみならず、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボン両方のイソフラボン骨格が、マッシュルームチロシナーゼの有効な自殺基質として機能する化合物に絶対的に必要であることが結論づけられた。結果はまた、2種類の自殺基質が独自のものであることも明らかにした。
【００１６】
加えて、エステル化により前記化合物を安定化するためにリパーゼを使用する。上記反応を通してエステル化化合物を、化粧品の活性成分として適切にし、皮膚の高色素沈着を患うヒトの皮膚を白色化するために適用することができた。
【００１７】
好ましい実施態様において、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンの有効量は、チロシナーゼ0.1μΜを基準として0.1μΜから8.0μΜであり；7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンの好ましい有効量は、チロシナーゼ0.1μΜを基準として0.55μΜから7.7μΜである。5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンの有効量は、チロシナーゼ0.1μΜを基準として0.1μΜから3.5μΜである。
【００１８】
＜7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンの修飾および保護＞
化粧用製品中における7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンの実用において、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンの（水酸基のような）官能基を、（エステル化またはグリコシル化の使用のような）既知の方法により保護し、関連誘導体を形成することができる。そのような誘導体を、市販製品中に添加することができる。そのような誘導体を細胞中に導入した際、それらは細胞中で（リパーゼまたは解糖系酵素のような）酵素により、活性7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンに加水分解されるであろう。これらの化合物に対するそのような保護は、製品中で化合物が酸化するのを回避させ、安定性を増強し、および皮膚刺激を軽減する。
【実施例】
【００１９】
以下の実施例は非限定的であり、単に本発明の種々の態様および特徴の典型にすぎない。
【００２０】
＜実施例１：材料＞
マッシュルームチロシナーゼ(2870単位/mg)、L-チロシン、L-ドーパ、ジメチルスルホキシド(DMSO)、および5,7,4’-トリヒドロキシイソフラボン（ゲニステイン）を、Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)より購入した。マッシュルームチロシナーゼの1単位は、L-チロシンを含む反応混合物3mL中、pH 6.5、25°Cで、1分あたり0.001ΔA280を生じさせることができる酵素の量として定義される。7,4’-ジヒドロキシイソフラボン-8-グルコシド（プエラリン）を、Fluka Chemical Co. (Buchs, Switzerland)より取得した。7,8-ジヒドロキシクマリンおよび7,8-ジヒドロキシフラボンを、東京化成工業株式会社(東京、日本)より取得した。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)グレードのアセトニトリルおよび酢酸を、J. T. Baker (Phillipsburg, NJ)より取得した。使用される他の試薬および溶媒は、分析グレードであり、受け取ったままの状態で使用された。
【００２１】
＜実施例２：大豆胚こうじ(Soygerm Koji)由来の6,7,4’-トリヒドロキシイソフラボン、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボン、および5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンの単離＞
大豆胚こうじ中の6,7,4’-トリヒドロキシイソフラボン、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボン、および5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンの精製方法を、指針として抗チロシナーゼ活性アッセイを使用することにより実行した。大豆胚こうじ(500g)を、メタノール5Lと3時間還流し、メタノール抽出物(102g)が与えられた。抽出物を水(0.1 L)中に懸濁し、ヘキサンおよびエチルアセテートと再抽出した。各溶質画分を真空下で濃縮し、ヘキサン(54g)、エチルアセテート(5.43g)、および水(37g)画分が与えられた。エチルアセテート画分(DMSO中100mg/mL)は、最も高い抗チロシナーゼ活性(IC50=0.19mg/mL)を示した。その後エチルアセテート抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(50×2.6 cm i.d.)により、溶離剤としてヘキサン/エチルアセテート(3:1)、ヘキサン/エチルアセテート(1:1)、エチルアセテート、エチルアセテート/メタノール(1:1)、およびメタノールそれぞれ0.5 Lと分画した。エチルアセテート画分は最も強い抗チロシナーゼ活性を示し、250 × 10 mm i.d., ODS 2 Spherisorb半分取(semipreparative)C18逆相カラム(Phase Separation Ltd., Deeside Industrial Park, Clwyd, U.K.)を使用するHPLCを繰り返すことにより精製された。0.1% (容量/容量)酢酸を含む水(A)およびアセトニトリル(B)を使用する勾配溶離は、14%のBとの10分間の定組成溶離、および3mL/分の流速で20%から40%のBと50分間の直線勾配からなる。ピークの溶出を収集し、乾燥し、抗チロシナーゼ活性をアッセイした。精製6,7,4’-トリヒドロキシイソフラボン、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボン、および5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンの化学構造をマスおよびNMR分光分析により同定した。
【００２２】
＜実施例３：6,7,4’-トリヒドロキシイソフラボン、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボン、および5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンの機器分析＞
DMSO中で、1H NMRスペクトルを400 MHzでVarian Gemini NMR分光計により記録し、13C NMRスペクトルを100 MHzでVarian Gemini NMR分光計により記録した。FAB MSスペクトルをJEOL TMSD-100により取得した。6,7,4’-トリヒドロキシイソフラボン、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボン、および5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンの物理化学的特性が次に与えられる。
【００２３】
6,7,4’-トリヒドロキシイソフラボン： 1H NMR (DMSO-d6), δ 6.78 (2H, d, J＝8.8 Hz, H-3’, 5’), 6.84 (1H, s, H-8), 7.34 (2H, d, J＝8.8 Hz, H-2’, 6’), 7.36 (1H, s, H-5), 8.21 (1H, s, H-2), 9.57 (3H, br s, OH-6,7,4’); 13C NMR (DMSO-d6), δ 174.8 (C-4), 157.3 (C-4’), 152.8 (C-7), 152.6 (C-2), 151.2 (C-9), 145.0 (C-6), 130.4 (C-2’, 6’), 123.2 (C-1’), 123.1 (C-3), 116.9 (C-10), 115.3 (C-3’, 5’), 108.4 (C-5), 103.0 (C-8). FAB MS, m/z 271 [M + H]+。
【００２４】
7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボン：1H NMR (DMSO-d6), δ 6.79 (2H, d, J＝8.3 Hz, H-3’, 5’), 6.94 (1H, d, J＝8.7 Hz, H-6), 7.37 (2H, d, J＝8.3 Hz, H-2’ 6’), 7.45 (1H, d, J＝8.7 Hz, H-5), 8.30 (1H, s, H-2), 9.46 (1H, br s, OH-7), 9.58 (1H, br s, OH-4’), 10.37 (1H, br s, OH-8); 13C NMR (DMSO-d6), δ 175.6 (C-4), 157.4 (C-4’), 153.0 (C-2), 150.2 (C-7), 147.0 (C-9), 133.2 (C-8), 130.4 (C-2’, 6’), 123.2 (C-1’), 123.0 (C-3), 117.7 (C-10), 116.0 (C-5), 115.3 (C-3’, 5’), 114.5 (C-6); FAB MS, m/z 271 [M + H]+。
【００２５】
5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボン： 1H NMR (DMSO-d6), δ 6.29 (1H, s, H-6), 6.81 (2H, d, J＝9.0 Hz, H-3’, 5’), 7.36 (2H, d, J＝9.0 Hz, H-2’, 6’), 8.31 (1H, s, H-2), 8.86 (1H, br s, OH-7), 9.70 (1H, br s, OH-4’), 10.71 (1H, br s, OH-8); 13C NMR (DMSO-d6), δ 180.5 (C-4), 157.2 (C-4’), 153.8 (C-2), 153.3 (C-5), 153.0 (C-7), 145.7 (C-9), 130.1 (C-2’, 6’), 124.8 (C-8), 121.7 (C-1’), 121.3 (C-3), 115.0 (C-3’, 5’), 103.9 (C-10), 98.6 (C-6); FAB MS, m/z 287 [M + H]+。
【００２６】
＜実施例４：チロシナーゼの酵素アッセイ＞
（DMSO中に溶解した）試験試料10μLを、25°Cで2分間、0.112mM基質（50mMリン酸バッファー(pH 6.8)中に溶解したL-チロシンまたはL-ドーパ）970μLと混合した。その後、反応を開始するためにチロシナーゼ（リン酸バッファー中1000単位/mg）20μLを添加した。ドパクロムの形成による475nmにおける吸光の増加を分光光度計で測定した。
【００２７】
不可逆阻害活性アッセイにおいて、チロシナーゼ20単位を、25°Cで、50mMリン酸バッファー(pH 6.8)1mL中で、（DMSO中に溶解した）3μMまたは10μM濃度の試験イソフラボンとプレインキュベートした。0, 2, 7, 12, および30分の間隔で、プレインキュベーション混合物200μLを2.5mM L-ドーパ800μLと混合し、25°Cで10分間インキュベートした。各反応におけるドパクロムの形成を、分光光度計で測定した。各反応の475nmにおける吸光を、添加イソフラボンをDMSOで置換した対照反応の475nmにおける吸光で割ることにより、相対的活性を計算した。回復実験のために、30分間インキュベートされたプレインキュベーション混合物を、撹拌しながら1時間4°Cでリン酸バッファー200mLに対して透析するか、またはSephadex G-25スピンカラム(Sigma)を通して遠心した。その後、2種類の処理からの混合物における残留チロシナーゼ活性を、上記のようにアッセイした。
【００２８】
0.1μMチロシナーゼ、および0.55μMから7.7μMの7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンまたは0.1μMから3.5μMの5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンを含むプレインキュベーション混合物500μLを25°Cで30分間インキュベートすることによるWaleyの方法により、自殺基質の分配比を決定した。その後、プレインキュベーション混合物200μLを、2.5mM L-ドーパ800μLと混合した。475nmにおける反応混合物の吸光を、1秒ごとに分光光度計で測定した。最初の反応速度を、反応曲線の時間経過における最初の2分間の傾きより測定した。各反応の相対的活性を、自殺基質を伴う反応の初速度を、自殺基質なしの反応の初速度で割ることにより計算した。自殺基質の分配比を、酵素の初濃度に対する自殺基質の初濃度の比率に対して残留する分画活性をプロットすることにより決定することができた。
【００２９】
自殺基質のミカエリス定数(KI)および最大不活性化速度定数(ki-max)を、Frereらの方法により決定した。0.03μM マッシュルームチロシナーゼ、2.5mM L-ドーパ、および50μMから300μMの範囲である濃度の自殺基質の存在下で、不活性化反応を実行し、ドパクロムを2分間の間毎秒、分光光度計で測定した。これらの条件下で、L-ドーパを酸化する速度が徐々に減少し、不活性化に対する明確な一次速度定数(kobs)を、tに対するln(νt/ν0)のプロットより計算した［ここでν0およびνtは、それぞれ時間0および時間tにおける475nmでの吸光の増加速度である］。添加イソフラボンとL-ドーパの間の競合を仮定すると、KIおよびki-max両方をそのように計算することができた。
【００３０】
マッシュルームチロシナーゼの阻害効果に対する2種類のイソフラボンの構造解析のために、チロシナーゼ20単位を、25°Cで30分間、50mMリン酸バッファー(pH 6.8)200μL中で、試験化合物（7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンに対して10μM；他に対して100μM）とプレインキュベートした。その後、2.5mM L-ドーパ800μLを添加し、反応混合物を25°Cで10分間インキュベートした。比較のために、試験化合物、チロシナーゼ、およびL-ドーパを、25°Cで10分間、リン酸バッファー1mL中で、即座に混合することにより、他の一連の実験を実行した。各反応におけるドパクロムの形成を、分光光度計で測定した。各反応の475nmにおける吸光を、試験化合物をDMSOで置換した対照反応の475nmにおける吸光で割ることにより、相対的活性を計算した。上記の酵素反応全てを、独立に少なくとも3回実行し、平均値が示される。
【００３１】
＜実施例５：HPLC分析＞
L-7400 UV検出器および250 × 4.6mm i.d.のODS 2 Spherisorb C18逆相カラム(Phase Separation Ltd.)を装備した日立D-7000 HPLC (日立製作所、東京、日本)でHPLC分析を実行した。操作条件は以下のとおりである：溶媒、1%酢酸を含む30%アセトニトリル/水；流速、0.8mL/分；検出、262nm；注入量、イソフラボン100μMおよびマッシュルームチロシナーゼ1000単位を50mMリン酸バッファー(pH 6.8)中に含む、1mLアッセイシステムより20μL。
【００３２】
＜実施例６：自殺基質のエステル化およびエステル化生成物の精製＞
200mLスクリューキャップガラスバイアル中で反応を実行した。Novozyme 435固定化リパーゼ0.68gおよび分子篩1g存在下で、4mmolパルミチン酸、ならびにアセトン15 mlと、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンまたは5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボン2 mmolを反応させた。40°Cで24時間、180rpmでサーモスタットシェーカー中において反応を実行した。エステル化反応の最後に、ろ過により固定化リパーゼおよび分子篩を除去した。ろ過物を収集し、それらの中のアセトンを減圧下で蒸発させた。エステル化生成物を回収し、250 × 10 mm i.d., ODS 2 Spherisorb半分取C18逆相カラム(Phase Separation Ltd., Deeside Industrial Park, Clwyd, U.K.)を使用する半分取HPLCにより精製した。溶出には、流速3mL/分のメタノール/水/酢酸(89.9:10:0.1;容量/容量)を使用した。ピークの溶出を収集し、乾燥し、安定性活性をアッセイした。
【００３３】
＜実施例７：安定性解析＞
精製エステル化生成物およびそれらの始原基質を、50mMリン酸バッファー(pH 6.8)中に溶解した(10mM)。反応を25°Cに固定した。毎日、各試験化合物の残留物を分析するために試料を取り出した。溶液中にある試験試料の量が減少することをHPLC分析により計測した。
【００３４】
＜実施例８：7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンの安定化＞
Novozyme 435固定化リパーゼを使用することにより、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンをエステル化7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンに転換した。最初に、5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボン、Novozyme 435、およびパルミチン酸を混合し、メチルエチルケトン溶液バッファー中で25時間、撹拌させ続けた。反応させた後、空気中の異なる温度で安定性解析を実行した。7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンを同じ手順で処理した。反応させた2種類の混合物を異なる温度に設置し、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボン、5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボン、およびそれらのエステル化生成物を異なる時間にHPLCを使用して分析した。図７は40°Cにおける安定性試験の結果を示す。前記結果は、エステル化7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンは、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボンおよび5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンよりも安定であることを示した。従って、エステル化イソフラボンは化粧品の活性成分として適切であった。
【００３５】
本発明は、当業者がそれを作製および使用するために十分詳細に記述および例示されている一方で、種々の代替案、変更、および改善は本発明の精神と範囲から逸脱しないことは明らかであろう。
【００３６】
目的を実行し、最終目的物および言及される有利性、ならびにそれらに固有なそれらのものを取得するために、本発明を十分に適用することを、当業者は容易に理解する。動物、ならびにそれらを生産するための手順および方法は、好ましい実施態様の典型であり、例示的なものであり、および本発明の範囲における制限を意図されていない。それらの改変および他の使用を当業者は行うであろう。これらの改変は、本発明の精神に包含され、請求の範囲により定義される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】調査される化合物の化学構造を示す。
【図２】0.05mM 7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボン(▲)、または5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボン(■)により阻害される、マッシュルームチロシナーゼ(100単位/mL)を伴うチロシナーゼ反応の時間経過(◇)を示す。0.1mMのL-チロシン(A)またはL-ドーパ(B)を基質として使用した。
【図３】50mMリン酸バッファー(pH 6.8)1mL中における、100μM 5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンおよびチロシナーゼ(1000単位/mL, A-C)または熱分解チロシナーゼ(1000単位/mL, D)を含む反応混合物のHPLCクロマトグラムを示す。試料は0秒(A)、10秒(B)、30秒(C)、および10秒(D)で回収された。
【図４】種々のプレインキュベーションの期間を伴う、マッシュルームチロシナーゼ(◇)に対する、7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボン(3μM, △; 10μM, ▲)、および5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボン(3μM, □; 10μM, ■)の阻害効果を示す。
【図５】7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボン(A)、または5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボン(B)のいずれかとのマッシュルームチロシナーゼの滴定を示す。酵素(0.1μM)およびイソフラボン(パネルA中0.55μM-7.7μM、およびパネルB中 0.1μM-3.5μM)を、25 °Cで30分間、50mMリン酸バッファー(pH 6.8)1mL中でプレインキュベートした。
【図６】7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボン(A)、または5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボン(B)のミカエリス定数および最大不活性化速度定数の決定を示す。
【図７】エステル化7,8,4’-トリヒドロキシイソフラボン、または5,7,8,4’-テトラヒドロキシイソフラボンに対する安定性試験を示す。
【図１】
2009001568.tif 000011
【図２】
2009001568.tif 000012
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月11日(2008.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2009001568.tif 000018
［前記式中、R1、R2、R3、またはR4はH、水酸基］
の化合物、あるいはそのエステル化またはグリコシル化またはアルキル化誘導体を含む組成物。
【請求項２】
式：
【化２】
2009001568.tif 000019
［前記式中、R1、R2、R3、またはR4はH、水酸基］
の化合物、あるいはそのエステル化またはグリコシル化またはアルキル化誘導体を有効量含む被験者でチロシナーゼ活性を不活性化する組成物。
【請求項３】
チロシナーゼ活性の不活性化が前記被験者の皮膚を白色化することに関する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記被験者がヒトである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ヒトが皮膚の高色素沈着を患う、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
チロシナーゼ0.1μΜを基準として前記化合物の有効量が0.1μΜから8.0μΜである、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
チロシナーゼ0.1μΜを基準として前記化合物の有効量が0.55μΜから7.7μΜである、請求項２に記載の組成物。
【外国語明細書】
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