(57)【要約】【課題】植物のリグナン類・リグニン類の生成能を向上させる。【解決手段】本発明によれば、植物に、435nm〜490nmの波長領域内の波長成分を含む光を照射することにより、植物の(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子および／または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進させることが可能であり、これら遺伝子の発現が、例えばp-クロマリン酸からp-ヒドロキシフェニルリグニンへの変換反応を促進することにより、リグナン類および／またはリグニン類ならびにそれらの代謝物の生産能を向上させることができる。よって、本発明は、リグナン類、リグニン類またはそれらの代謝物の効率的な製造に利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物に光を照射することを含む、植物のリグナン類またはリグニン類の合成に関与する、(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子および／または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進する方法。
【請求項２】
光が、435nm〜780nmの波長領域内の波長成分を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
435nm〜780nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
光が、450nm〜490nmまたは610nm〜780nmの波長領域内の波長成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
450nm〜490nmまたは610nm〜780nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、100μmol m-2s-1〜250μmol m-2s-1の範囲内である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
光を２日〜２週間照射する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
光を２日間照射する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記植物が双子葉植物または単子葉植物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記植物がシロイヌナズナ、ナタネ、キャベツ、ハクサイ、ダイコン、カリフラワーまたはブロッコリー、レッドキャベツ、マスタード、ルッコラまたはクレソである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物がシロイヌナズナである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子、または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子のうちの１つ以上の発現を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現が、対照と比較して２倍以上の発現量を示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子が、以下(1a)〜(1f)からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法：
（1a）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（1b）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（1c）配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ4-クマロイル-CoA-シンターゼ３の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（1d）配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ4-クマロイル-CoA-シンターゼ３の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（1e）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ4-クマロイル-CoA-シンターゼ３の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（1f）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ4-クマロイル-CoA-シンターゼ３活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子が、以下(2a)〜(2f)からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法：
（2a）配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（2b）配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（2c）配列番号：４のアミノ酸配において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつシンナモイル-CoA-レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（2d）配列番号：４のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつシンナモイル-CoA-レダクターゼシンナモイル-CoA-レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（2e）配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシンナモイル-CoA-レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（2f）配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシンナモイル-CoA-レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子が、以下(3a)〜(3f)からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法：
（3a）配列番号：５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（3b）配列番号：６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（3c）配列番号：６のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（3d）配列番号：６のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（3e）配列番号：５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（3f）配列番号：６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子が、以下(4a)〜(4f)からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法：
（4a）配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（4b）配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（4c）配列番号：８のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ21活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（4d）配列番号：８のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつペルオキシダーゼ21活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（4e）配列番号：７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペルオキシダーゼ21活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（4f）配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペルオキシダーゼ21活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法により、リグナン類またはリグニン類を製造する方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法により生産される、リグナン類またはリグニン類。
【請求項１９】
請求項１８に記載のリグナン類および／またはリグニン類を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１８に記載のリグナン類および／またはリグニン類を含む、飲食品または栄養補助食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光照射条件下において特定の遺伝子の発現を促進させる方法に関する。より具体的には、本発明は、特定の照射条件下において植物を生育させることにより、特定の遺伝子の発現を増強し、これにより有用な化合物（例えば、リグナン類またはリグニン類）の生産性を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は光に対して応答することが知られており、光照射により特定成分含量の増大が期待される。光照射による植物成分の変動として、青色光や紫外線の照射によりフラボノイド類、特にアントシアニンが合成され (非特許文献1)、赤色光や赤外光によりカロチノイド等が合成されることが報告されている (非特許文献2)。これまでの研究では光量子束密度10μmol m-2 s-1程度の青色光が用いられてきたが、より強い青色光の植物に対する効果についてはこれまで知見がない。
【０００３】
植物において、機能性・薬効性を有する生成物は、各種代謝経路に介在する酵素の働きにより合成される。植物には数十の代謝経路の存在が想定され、それぞれの代謝経路は、また数十の代謝酵素によって構成されている。これらの代謝酵素のうち９割以上は、すべての植物に共通であり、残りの１割弱の酵素の違いにより、植物に固有の成分が蓄積すると考えられる。したがって、発光ダイオード（LED）照射によりどの種の機能性・薬効成分が増大するかは、LED照射により何れの代謝経路に介在する酵素の発現が増大するかで推定することができる。
【０００４】
様々な照射条件下における遺伝子発現について、遺伝子レベルでの解析が最も進んでいるモデル植物はシロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana)であり、Arabidopsis ATH1 Genome Array (Affymetrix)のような遺伝子チップが市販されていることもあって、このシロイヌナズナは、この種の発現解析に最適な実験系と言える。シロイヌナズナはアブラナ科に属し、ナタネ、キャベツ、ハクサイ、ダイコン等の野菜と類縁である。
【０００５】
本発明は、高輝度LEDを搭載した人工気象機を用いてシロイヌナズナに高輝度青色光を照射し、このシロイヌナズナに対してDNAチップを駆使した発現遺伝子の網羅的解析 (マイクロアレイ) を実施したところ、リグナン・リグニン類合成系遺伝子の発現が増大したという知見に基づいている。これらリグナン類には、抗アレルギー作用、肝障害改善作用、抗潰瘍活性、血小板凝集阻害活性、または抗ガン剤を有する化合物が知られており、それらは医薬のリード化合物として活用可能である。さらに、リグニン類は、肌の収れん効果や食物繊維としての整腸作用を有することが報告されており、植物への光照射による高付加価値化が期待される。
【０００６】
リグナン類として、五味子のゴミシンには肝障害改善作用および抗アレルギー作用を有するピノレジノール、辛夷のマグノサリンおよび厚朴のホオノキオールには抗潰瘍・血小板凝集阻害活性、細辛のアサロンには抗アレルギー作用などが認められている。また、ポドフィロトキシンは抗ガン剤エトポシドのリード化合物として知られている。一方、リグニン類は、肌の収れん効果や食物繊維としての整腸作用が報告されている。例えば、植物ポリフェノール含有素材の開発  その機能性と安全性（非特許文献３）、モノグラフ生薬の薬効・薬理 (単行本) （非特許文献４）に記載される。
【非特許文献１】Bharti, A.K. and Khurana, J.P. (1997): Photochem. Photobiol., 65, 765-776.
【非特許文献２】von Lintig, J., Welsch, R., Bonk, M., Giuliano, G., Batschauer, A., and Kleinig, H. (1997): Sinapis alba and Arabidopsis thaliana seedlings. Plant J., 12, 625-634.
【非特許文献３】植物ポリフェノール含有素材の開発  その機能性と安全性 (食品シリーズ)：シーエムシー出版 (2007年2月発行)
【非特許文献４】モノグラフ生薬の薬効・薬理、(著者)鳥居塚 和生、伊田喜光、寺澤 捷年、出版社: 医歯薬出版(2003年5月発行)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記状況において、植物から抽出したリグナン類・リグニン類を単離・精製することによりこれらリグナン類・リグニン類を製造する方法は広く行われているが、これらの植物中の含量は微量であるため、大量の植物が必要であるという問題があった。そこで、植物のリグナン類・リグニン類の生成能を向上させる方法が強く望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、植物に光を照射する条件を設定することにより、シロイヌナズナにおいてリグナン類・リグニン類の生合成に関係する遺伝子である、(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子（遺伝子番号At1g65060）、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子（遺伝子番号At4g30470）、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子（遺伝子番号At1g09500.2）、および(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子（遺伝子番号At2g22420）の発現を促進することを見出した。本発明者らは、この知見に基づいてさらに検討を行い、本発明を完成するに至った。
【０００９】
したがって、本発明は以下に示す、(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子、および(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進する方法、この方法により効率的に生産されるリグナン類・リグニン類の製造方法、この製造法により生産されたリグナン類・リグニン類を含む医薬組成物を提供する：
［１］  植物に光を照射することを含む、植物のリグナン類またはリグニン類の合成に関与する、(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子および／または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進する方法。
［２］  光が、435nm〜780nmの波長領域内の波長成分を含む、項目１に記載の方法。
［３］  435nm〜780nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、項目２に記載の方法。
［４］  光が、450nm〜490nmまたは610nm〜780nmの波長領域内の波長成分を含む、項目１記載の方法。
［５］  450nm〜490nmまたは610nm〜780nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、100μmol m-2s-1〜250μmol m-2s-1の範囲内である、項目４に記載の方法。
［６］  光を２日〜２週間照射する、項目２〜５のいずれか１項に記載の方法。
［７］  光を２日間照射する、項目２〜５のいずれか１項に記載の方法。
［８］  前記植物が双子葉植物または単子葉植物である、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
［９］  前記植物がシロイヌナズナ、ナタネ、キャベツ、ハクサイ、ダイコン、カリフラワー、ブロッコリー、レッドキャベツ、マスタード、ルッコラまたはクレソである、項目８に記載の方法。
［１０］  前記植物がシロイヌナズナである、項目９に記載の方法。
［１１］  (1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子、または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子のうちの１つ以上の発現を促進する、項目１に記載の方法。
［１２］  (1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現が、対照と比較して２倍以上の発現量を示す、項目１１に記載の方法。
［１３］  (1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子が、以下(1a)〜(1f)からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法：
(1a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(1b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(1c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ4-クマロイル-CoA-シンターゼ３の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(1d)配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ4-クマロイル-CoA-シンターゼ３の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(1e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ4-クマロイル-CoA-シンターゼ３の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
(1f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ4-クマロイル-CoA-シンターゼ３活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１４］  (2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子が、以下(2a)〜(2f)からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、項目１〜１２のいずれかに記載の方法：
(2a)配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(2b)配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(2c)配列番号：４のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつシンナモイル-CoA-レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(2d)配列番号：４のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつシンナモイル-CoA-レダクターゼシンナモイル-CoA-レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(2e)配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシンナモイル-CoA-レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
(2f)配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシンナモイル-CoA-レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１５］  (3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子が、以下(3a)〜(3f)からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、項目１〜１２のいずれかに記載の方法：
(3a)配列番号：５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(3b)配列番号：６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(3c)配列番号：６のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(3d)配列番号：６のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(3e)配列番号：５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
(3f)配列番号：６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１６］  (4)ペルオキシダーゼ21遺伝子が、以下(4a)〜(4f)からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、項目１〜１２のいずれかに記載の方法：
(4a)配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(4b)配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(4c)配列番号：８のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ21活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(4d)配列番号：８のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつペルオキシダーゼ21活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(4e)配列番号：７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペルオキシダーゼ21活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
(4f)配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペルオキシダーゼ21活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１７］  項目１〜１６に記載の方法により、リグナン類またはリグニン類を製造する方法。
［１８］  項目１７に記載の方法により生産される、リグナン類またはリグニン類。
［１９］  項目１８に記載のリグナン類および／またはリグニン類を含む、医薬組成物。
［２０］  項目１８に記載のリグナン類および／またはリグニン類を含む、飲食品または栄養補助食品。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法にしたがって、リグナン類・リグニン類の生合成に関係する遺伝子である、(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子、および／または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進させることができる。したがって、本発明は、植物を利用したリグナン類・リグニン類またはその代謝物の効率的な生産に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
先ず、本発明は、植物に光を照射することを含む、植物のリグナン類またはリグニン類の合成に関与する、(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進する方法を提供する。以下に、本発明で使用する植物、光照射方法、生合成される代謝系産物などについて記載する。
【００１２】
１．本発明において使用され得る植物について
本発明で使用される植物としては、光に応答してリグナン類、リグニン類を生合成する植物であればよく、特に制限されない。このような植物としては、例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana )、チョウセンニンジン(Panax Binseng)、ワタ(Gossypium indicum )、アサ(Cannabis sativa )、アブラナ(Brassica campestris )、カブラ(Brassica campestris )、キャベツ(Brassica oleracea )、ダイコン(Raphanus sativus )、セイヨウカボチャ(Cucurbita Pepo )、カボチャ(Cucurbita moschata )、キウリ(Cucumis sativus )、メロン(Cucumis Melo )、スイカ(Citrullus Battich )、オランダイチゴ(Fragaria chiloensis )、アラスカエンドウ(Pisum sativum Alaska )、アズキ(Phaseolus angularis )、ナンキンマメ(Arachis hypogaea )、ダイズ(Glycine max )、インゲンマメ(Phaseolusvulgaris )、ソラマメ(Vicia Faba )、エンドウ(Pisum sativum )、ミカン(Citrus deliciosa )、ブドウ(Vitis vinifera )、ゴマ(Sesamum indicum )、サツマイモ(Ipomoea Batatas )、ナス(Solanum melongena )、ジャガイモ(Solanum tuberosum )、トマト(Lycopersicon esculentum )、トウガラシ(Capsicum annuum )、タバコ(Nicotiana tabacum )、ツクバネアサガオ(Petunia hybrida )、ヒマワリ(Helianthus annuus )、ゴボウ(Arctium Lappa )、キク(Chrysanthemum morifolium )、ホウレンソウ(Spinacia oleracea )、カリフラワー（Brassica oleracea var. botrytis）、ブロッコリー（Brassica oleracea var. italica）、レッドキャベツ（Brassica oleracea var. capitata f. rubra）、マスタード（Brassica juncea）、ルッコラ（Eruca vesicaria）またはクレソ（Nasturtium officinale）などの双子葉植物；イネ(Oryza sativa )、コムギ(Triticum aestivum )、オオムギ(Hordeum vulgare )、トウモロコシ(Zea mays )、エンバク(Avena sativa )、ヒエ(Panicum Crus-galli L. var. frumentaceum )、モロコシ(Sorghum bicolor )、アワ(Setaria italica )、キビ(Panicum miliaceum )、チューリップ(Tulipa Gesneriana )、サトイモ(Colocasia antiquorum )、アオウキクサ(Lemna paucicostata )またはサトウキビ(Saccharum officinarum )などの単子葉植物；テーダマツ(Pinus taeda)、カイガンショウ(Pinus pinaster)、カナダトウヒ(Picea glauca)、シトカトウヒ(Picea sitchensis)などのその他の種子植物などが挙げられる。好ましくは、当該分野で通常栽培される双子葉植物または単子葉植物であり、さらに好ましくはシロイヌナズナ、ナタネ、キャベツ、ハクサイ、ダイコン、カリフラワー、ブロッコリー、レッドキャベツ、マスタード、ルッコラまたはクレソなどである。
【００１３】
２．本発明で使用される光照射について
２−１．本発明で使用される光の波長について
上記のように、本発明は、植物に光を照射することを含む、植物のリグナン類またはリグニン類の合成に関与する(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進する方法を提供する。ここで、本発明で使用される光としては、植物の(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子および／または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進できるものであればよく、特に制限はない。例えば光合成においては、青色帯（435nm〜480nm）および赤色帯（610nm〜750nm）において効率的であることが公知である。したがって、上記遺伝子の発現促進効率の観点からは、好ましくは約435nm〜約780nmの波長領域内、より好ましくは約435nm〜約490nmまたは約610nm〜約780nmの波長領域内、特に好ましくは約460nm〜約490nmまたは約650nm〜約670nmの波長領域内、特に好ましくは約470nmまたは約660nmの波長の波長成分を含む光が挙げられる。
【００１４】
２−２．本発明で使用される光の光量子束密度について
光量子束密度としては、植物の(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進できる光量子束密度であればよく、特に制限はない。これら遺伝子の発現促進効率の観点からは、上記波長領域または波長の波長成分の光量子束密度は、好ましくは50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内、さらに好ましくは75μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1または100μmol m-2s-1〜250μmol m-2s-1の範囲内である。
【００１５】
２−３．本発明で使用される光の照射時間について
光照射時間は、照射する光の光量子束密度によっても異なるが、植物の(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子および／または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進できる光照射時間であればよく、特に制限はないが、連続照射であるのが好ましい。これら遺伝子の発現促進効率の観点からは、光量子束密度が50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である場合には、光照射時間は、通常１時間以上、好ましくは６時間〜８週間、より好ましくは１２時間〜６週間、さらに好ましくは２４時間から４週間程度である。光量子束密度が50μmol m-2s-1〜200μmol m-2s-1の範囲内である場合には、光照射時間は、通常１日以上、好ましくは１日〜８週間、より好ましくは1.5日〜６週間、さらに好ましくは２日から４週間程度である。光量子束密度が200μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である場合には、光照射時間は、通常１時間〜14日、好ましくは２時間〜10日、より好ましくは６時間〜１週間、さらに好ましくは12時間から４日間程度である。
【００１６】
２−４．本発明で使用される光の光源について
本発明で用いられる光源としては、人工光源を用いる場合には、なるべく(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子および／または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現促進効率の高い波長成分の光のみを用いるのが、エネルギー効率の観点からは好ましい。好ましくは、上記に示される特定の波長を発する光源が挙げられる。
【００１７】
本発明で用いられる光源としては、上記の例示的な条件の光照射に用いることができるものであればよく、特に制限はない。例えば、発光ダイオード（LED）、白色蛍光灯、放電ランプ（例、水銀灯、キセノンランプなど）、さらに、回折格子、プリズムなどとの組み合わせにより取り出された特定の波長の光などを適宜用いることができる。過剰な光による植物の障害（光合成能の低下、組織傷害など）を抑制するために目的以外の波長成分、例えば200nm〜435nmの波長領域内の波長成分または755nm〜3000nmの波長領域内の波長成分を減少させるためには、所望の波長選択性を有するフィルター（例、色ガラスフィルター、ゼラチンフィルター、干渉フィルターなど）を使用することができる。また、LEDやレーザーは、不要な波長領域の波長成分を含まず、かつ、好ましい光量子束密度を有する光を得るために好ましく用いることができる。
【００１８】
本発明において光照射するための手段としては、好ましくはLEDを用いた手段である。LEDは一般に、従来の他の照明器具と比較して、
（１） 電力消費量が少なく、かつ効率がよい
（２） 発熱がほとんど無い
（３） 発光ダイオード単体が小さいため、光源としての発光機器はその形状を自由に変化させることできる
（４） 発光ダイオードはそれぞれの種類によって光の波長域が狭く（スペクトル幅が小さく）、その組み合わせによって自由に目的の波長域を得ることができるので、植物の栽培に適した波長域を容易に設定して照射を行なうことができる、
などの特徴および効果を有している。すなわち、LEDは、スペクトル幅の小さな単色光／低電圧で駆動可能／コンパクト／発熱が少ないという特性を有しており、植物に必要な波長の光を組み合わせて照射を行なうことにより、小さなエネルギで効率よく特定の植物生理機能や形態形成を促すことが可能になるとともに、植物の要部に対する近接照射を容易に行なうことが可能である。さらに、高輝度LEDを利用することによって、より強い光量子束密度を提供することが可能であり、このことによって、より強い生合成を植物に誘導させることが可能である。
【００１９】
したがって、好ましくは本発明において使用される光源は、青色LED (435〜480 nm)、赤色LED (610〜750 nm)、または青色LED＋赤色LEDの組合わせであり、より好ましくは、使用される光源は青色LEDである。高輝度LEDを使用して比較的強い光量子束密度を提供することがさらに好ましい。
【００２０】
３．遺伝子発現
３−１．本発明に関係する遺伝子について
上記のように、本発明は、植物に光を照射することを含む、植物のリグナン類またはリグニン類の合成に関与する(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進する方法を提供する。すなわち、上記の(1)、（2）、（3）および／または（4）の遺伝子の発現の促進によって、リグナン類・リグニン類およびその代謝物の生産能を向上させることができる。植物におけるリグナン類・リグニン類についての例示の生合成経路については、図１に示される。この過程において、(1)に由来する4-クマロイル-CoA-シンターゼ３は、p-クマリン酸→p-クマロイルCoAの反応過程を促進し、(2)に由来するシンナモイル-CoA-レダクターゼはp-クマロイルCoA→p-クマルアルデヒドの反応過程を促進し、(3)に由来するシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーはp-クマルアルデヒド→p-クマリルアルコールの反応過程を促進し、そして(4)に由来するペルオキシダーゼ21はp-クマリルアルコール→p-ヒドロキシフェニルリグニンの反応過程を促進させる。例えば、本発明において使用されるシロイヌナズナにおいて、これらの遺伝子は、(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子（遺伝子番号At1g65060）（配列番号：１）、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子（遺伝子番号At4g30470）（配列番号：３）、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子（遺伝子番号At1g09500.2）（配列番号：５）、および(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子（遺伝子番号At2g22420）（配列番号：７）が関係しており、それらの遺伝子産物はそれぞれ、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、および配列番号：８に示される。それぞれの配列に関しては、以下URLなどを参照のこと：At1g65060:http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=aa_sequence&id=1009105083、
At4g30470:http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=aa_sequence&id=1009127500、
At1g09500.2:http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=aa_sequence&id=1009105879、
At2g22420:http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=aa_sequence&id=1009117091。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子発現」とは、ゲノム遺伝子を鋳型として、プロモーター配列の制御下でｍＲＮＡを発現する過程（転写）、および／またはこのｍＲＮＡを鋳型としてタンパク質を合成する過程（翻訳）を含む。本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」はそれぞれと交換可能に使用され得る。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号：１の塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号：１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【００２２】
３−２．本発明に関係するポリヌクレオチドおよびその等価物について
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００２３】
また、本発明において発現を促進する遺伝子には、例えば、(1) 4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子の塩基配列（配列番号：１）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ4-クマロイル-CoA-シンターゼ３活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子；及び4-クマロイル-CoA-シンターゼ３のアミノ酸配列（配列番号：２）からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ4-クマロイル-CoA-シンターゼ３活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子も含まれる。
【００２４】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNA）」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、DNA）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
【００２５】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％ SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％ SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％ SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド(例えば、DNA)が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２６】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、DNA）を検出することができる。
【００２７】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
【００２８】
３−３．本発明に関係するポリペプチドおよびその等価物について
一実施形態において、本発明の方法において対象とする遺伝子は、ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換、または付加された変異体であってもよい。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的または非保存的なアミノ酸の欠失、挿入、置換および／または付加を含み得る。本明細書中で使用される場合、例えば、4-クマロイル-CoA-シンターゼ３のアミノ酸配列（配列番号：２）において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ4-クマロイル-CoA-シンターゼ３活性を有するタンパク質などが挙げられる。
【００２９】
このようなタンパク質としては、例えば配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個（1〜数個）、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ4-クマロイル-CoA-シンターゼ３活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、例えば配列番号：２のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつもとのアミノ酸配列の有する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００３０】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。
【００３１】
４．代謝系産物
４−１．代謝、代謝経路について
上記のように、本発明は、植物に光を照射することを含む、植物のリグナン類またはリグニン類の合成に関与する(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進する方法を提供する。ここで、本明細書において、「代謝」には、同化（合成）および異化（分解）のいずれも含まれる。植物における各種代謝経路を媒介する酵素の働きにより、有用性の高い機能性・薬効性成分が生合成される。植物には数十種に及ぶ代謝経路の存在が予想されており、それぞれの代謝経路は、さらに数十種の代謝酵素によって構成されている。これらの代謝酵素のうち９割以上はすべての植物に共通であり、残りの１割弱の酵素の違いにより植物に固有の成分が蓄積すると考えられる。
【００３２】
本発明において関係する代謝経路としては、リグニン合成系といった、いわゆる高機能性成分の生合成に関係する系が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な系および遺伝子としては、実施例の表２〜４に記載される。
【００３３】
４−２．リグナン類について
本明細書中で使用されるリグナン類は、維管束植物の二次代謝物（例えば、セサミンおよびセサモリンなど）であり、植物に広く分布している。リグナン類は、植物の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根等に含まれている事がこれまでに報告されており、主として植物における生体防御機構に寄与していると考えられている。このリグナン類は強力な抗酸化性などを有しており、この機能によって、植物以外においても広範囲にわたる生理学的および薬理学的機能を有することが注目されている。
【００３４】
リグナン類と関係した生理学的活性としては、五味子のゴミシンには肝障害改善作用、ピノレジノールには抗アレルギー作用、辛夷のマグノサリンおよび厚朴のホオノキオールには抗潰瘍・血小板凝集阻害活性、細辛のアサロンには抗アレルギー作用などが認められている。また、ポドフィロトキシンは抗ガン剤エトポシドのリード化合物として知られている。すなわち、リグナン類には、抗アレルギー作用、肝障害改善作用、抗潰瘍活性、および血小板凝集阻害活性、また抗ガン剤リード化合物としての利用が知られている。さらに、心疾患および特定の癌からの予防の可能性、LDLコレステロール値、総コレステロール値、トリグリセリド値を低下させる可能性も示されている（International Food Information Council (IFIC)2002より）。
【００３５】
代表的なリグナン類としては、ゴマ（Sesamum indicum）に含まれる（＋）−ピノレジノール、（＋）−セサミン、（＋）−セサミノール、（＋）−セサモリンおよび（＋）−セサモリノール；レンギョウ（Forsythia intermedia）に含まれる（＋）−ピノレジノール、（−）−アルクチゲニンおよび（−）−マタイレジノール；ソシマ（Daphne tangutica）に含まれる（−）−ピノレジノールおよび（−）−ラリシレジノール；アマ（Linum usitatissimum）に含まれる（＋）−セコイソラリシレジノールなどが挙げられる（Phytochemistry Rev. (2003)2:257-288参照）。また、エストロゲン類似物として、エンテロジオールおよびその酸化物のエンテロラクトンが着目される（Adlercreutz H.ら、Diet and breast cancer. Acta Oncol., 31: 175-181, 1992）。好ましくは、本発明においてエンテロジオールが生産される。
【００３６】
４−３．リグニン類について
本発明に係るリグニン類は、植物の維管束組織に多量に存在する主要なポリフェノールの一つであり、多糖が結合して細胞壁を強固にし、植物体の支持に機能する。リグニン類は、フェニルプロペノイドポリマーの不定形の構造をとり（Methods Enzymol., 161: 87-101, 1988）、抗腫瘍活性、抗菌活性、抗ウイルス（エイズウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス）活性（直接的にウイルスの細胞への付着を阻止することによる）（In Vivo, 13: 155-171, 1999）、または肌の収れん効果や食物繊維としての整腸作用が報告されるなど、多彩な生物活性を示す有用性の高い生成物である。さらにリグニン類は、単球や多形核白血球等の貪食細胞のヨード化（放射性ヨードの酸不溶性画分への取り込み）を促進したが、これは、ミエロペルオキシダーゼ・ハロゲン・過酸化水素抗菌システムの活性化を示唆する。リグニンはまた、マクロファージや単球による腫瘍壊死因子（TNF）やインターロイキン-1 （IL-1）の産生を促進することが観察される（Int. J. Oncol., 1: 283-287, 1992）。
【００３７】
代表的なリグニン類としては、シロイヌナズナ、カリフラワーまたはブロッコリーに含まれるp-ヒドロキシフェニルリグニン、シリンギルリグニン、グアイアシルリグニンなどが挙げられる。好ましくは、本発明においてp-ヒドロキシリグニンを生産する。
【００３８】
５．本発明のリグナン類・リグニン類に係る製造方法
【００３９】
本発明により生産されるリグナン類・リグニン類またはその代謝物に係る製造方法（「本発明の製造方法」と略記することがある）は、上記した植物体に、上記した方法により光を照射することにより(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進させて、植物によるリグナン類、リグニン類またはそれらの代謝物の生産能を向上させ、それらの含有量を増加させた植物体を原材料とする。
【００４０】
リグナン類・リグニン類の抽出は、植物における有効成分の抽出において当業者に一般に用いられる方法によって行うことができる。具体的な一例としては、抽出は、例えば水とエタノールと酢酸の混合溶液、例えば水とエタノールと酢酸を10:9:1で混合したものを用いて行う。光、温度、空気などによる外的要因に起因する変性を避けるため、抽出は手袋をし、実験台で素早く行う。抽出する際の温度としては例えば室温、より好ましくは10℃以上25℃以下、特に好ましくは15℃以上20℃以下の温度で行われる。得られた抽出液は、抽出に用いた植物由来の不要物を取り除くため、一般的には濾過を行うのが好ましい。濾過方法としては例えば遠心濾過、吸引濾過等が用いられる。この様にして得られた抽出液の濃縮方法としては、例えば陰圧条件で遠心を行う等の公知の濃縮方法が用いられ、好ましくは例えばロータリーバキュームエバポレーターを用いた濃縮方法が用いられる。
【００４１】
６．医薬組成物
６−１．本発明に関する医薬組成物およびその形態について
上記のように、本発明は、植物に光を照射することを含む、植物のリグナン類またはリグニン類の合成に関与する(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進する方法を提供する。さらに本発明は、上記の方法により生産された、リグナン類またはリグニン類を提供する。本発明により高効率生産されたリグナン類、リグニン類は、種々の医薬組成物において利用可能である。本発明の医薬組成物は、生体、すなわち、哺乳動物（例、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、投与することができる。本発明において、当該生体は、上記に列挙された疾患または障害、すなわち、腫瘍、微生物などの感染、肝障害、アレルギー、潰瘍、血小板凝集、癌などを患う生体に投与され得る。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、疾患の症状を軽減すること、疾患の症状の進行を抑制すること、疾患の症状を除去すること、疾患の予後を改善することおよび疾患の再発を予防することなどが含まれる。
【００４３】
本発明において、上記の医薬組成物は様々な添加剤を含み得る。この添加剤としては、一般に医薬に使用される、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤等を挙げることができ、所望により、これらを適宜組み合わせて使用することもできる。また、必要に応じて、ビタミン類、アミノ酸等の成分を配合してもよい。
【００４４】
また、上記医薬組成物の剤形としては、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤等の経口剤；坐剤、軟膏剤、眼軟膏剤、テープ剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の外用剤または注射剤を挙げることができる。
【００４５】
６−２．本発明に関する医薬組成物のキットについて
本発明のキットに含まれる製剤は、前記医薬組成物を含む限り、その剤形は特に限定されない。本発明の医薬組成物またはキットを使用する場合には、経口もしくは非経口的に投与することができる。
【００４６】
本発明のキットにおいて、キットに含まれる製剤は、混合されていてもよいし、あるいは、別個に収納されて一体に包装されていてもよい。また、これらの製剤は、同時に投与されてもよいし、いずれか一方を先に投与してもよい。
【００４７】
本発明の医薬組成物またはキットにおいて、さらに一以上の他の治療剤を組み合わせてもよい。他の治療剤は、目的とする治療作用を有するか、補助・増強などの有益な効果を示する製剤であれば、特に限定されない。
【００４８】
本発明の医薬組成物またはキットはさらに、包装容器、取扱説明書、添付文書等を含んでいてもよい。包装容器、取扱説明書、添付文書等には、化合物を併用して用いるための組み合わせを記載することができ、また、別々の物質を投与時に併用する形態または混合物としての形態について、用法、用量などを記載することができる。
【００４９】
７．飲食品・栄養補助食品
７−１．本発明に関する飲食品・栄養補助食品の一般的形態について
本発明の方法によって生産されるリグナン類・リグニン類またはこれを含む植物体を、生鮮食料品、各種飲食品、飼料、ペットフードなどに利用することができる。また本発明の方法によって生産されるリグナン類・リグニン類またはこれを含む植物体を、例えば、果物、野菜、ハーブ、任意のビタミン、ミネラルなど、およびそれらの材料の栄養の偏りを補助する栄養補助食品に利用できる。
【００５０】
７−２．本発明に関する飲食品・栄養補助食品の効果について
本発明の方法によって生産されるリグナン類・リグニン類または植物体は、本質的な健康に寄与し得る。例えば、一実施態様においては、栄養的に不十分な食事を消費する人々の健康を維持することができ、抗酸化や栄養の状況を改善することができ、ある種の変性疾患状態のリスクの減少と関連しているレベルに対して不十分な食事の結果として血清栄養素や植物化学レベルを補充することができ、正常な老化現象や環境ストレスに曝さらされる結果として起こるフリーラジカル損傷を最小限に抑えることができ、そして／または最適健康、即ち、ホモシステイン、脂質副産物、無機質状態及びグルタチオンペルオキシダーゼを表す特定のバイオマーカー等の状態を改善することができる。
【００５１】
７−３．本発明に関する飲食品・栄養補助食品の具体的な形態について
本発明において飲食品とは、植物体そのものの未加工である生鮮食料品などの形態、または加工された溶液、懸濁物、粉末、固体成形物などの経口摂取可能な形態であれば良く特に限定されない。例えば、本発明の方法にしたがって収穫前に所定の期間光照射して、より効率的にリグナン類・リグニン類を生産させた植物体は、その植物体の商品価値を大いに向上させ得る。本発明の方法によって生産されるリグナン類・リグニン類または植物体を加工した飲食品としては、より具体的には、即席麺、レトルト食品、缶詰、、フリーズドライ食品等の即席食品類、清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料等の飲料類、パン、パスタ、麺等の小麦粉製品、飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ等の菓子類、ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス等の調味料、加工油脂、バター、マーガリン等の油脂類、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類等の乳製品、冷凍食品、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品等の水産加工品、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品、農産缶詰、ジャム・マーマレード類、漬け物、煮豆、シリアル等の農産加工品、栄養食品、流動食、経口・経管栄養剤、ベビーフード、錠剤、カプセル等が例示される。
【００５２】
７−３．本発明に関する飲食品・栄養補助食品の製造に関して
本発明の方法によって生産されるリグナン類・リグニン類または植物体を各種飲食品、飼料、ペットフード等に加工する際、殺菌をともなっても良い。殺菌としては、常圧蒸気殺菌、過熱蒸気殺菌、ＵＨＴ殺菌、マイクロ波殺菌、レトルト殺菌、ボイル殺菌、ガス殺菌、通電殺菌、放射線殺菌等が挙げられる。
【００５３】
本発明のリグナン類・リグニン類を含む組成物または植物体を各種飲食品、飼料、ペットフード等に加工する際、各種栄養成分等を添加することができる。栄養成分等としては、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、脂質、界面活性剤、糖類、糖アルコール、多糖類、ビタミンＡ、ビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、ビタミンＢ12、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ナイアシン（ニコチン酸）、パントテン酸、葉酸等のビタミン類、リジン、スレオニン、トリプトファン等の必須アミノ酸類や、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅等のミネラル類及び、例えば、α−リノレン酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ、月見草油、オクタコサノール、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）、カゼインカルシウムペプチド（ＣＣＰ）、食物繊維、オリゴ糖等の人の健康に寄与する物質類、その他の食品や食品添加物として認可されている有用物質の一種又は二種以上が使用できる。
【００５４】
なお、本発明において、詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、モレキュラー・クローニング第３版、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法などの公知の方法により、または市販のキットの取扱い説明書に記載の方法により行うことができる。
【実施例】
【００５５】
（材料と方法）
実験植物：
当研究室で継代されているモデル植物シロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana) の野生系統Columbia (Col-0) を用いた。
【００５６】
生育条件：
人工気象機 (Biotron NC220, NKsystem) を用い，22℃，湿度40-60％，MS培地 (後述) において、白色蛍光灯 (100μmol m-2 s-1) 下で生育させた植物を「対象」とし、以下の条件で３週間生育後、分析に供した。
光質  青色LED (470 nm)，赤色LED (660 nm)，青色LED＋赤色LED，青色LED (パルス光)
照射時間／光量子束密度  ２週間 (白色蛍光灯で1週間生育後２週間照射)／110μmol m-2 s-1，2日 (白色蛍光灯で19日間生育後２日間照射)／240μmol m-2 s-1
【００５７】
種子の滅菌・播種：
1.5-mlチューブに種子を分注し、70％ エタノール 1 mlを加え、1分間振盪した。遠心し、上清を捨て、滅菌溶液 (0.25％ 次亜塩素酸，0.1％ Tween 20) 1 mlを加えて、10-15分振盪した。クリーンベンチ内で軽く遠心し、上清を捨て、純水1 mlを加えて洗浄した。洗浄を5回繰り返し、純水1 mlを加えた状態でアルミホイルに包み、4℃で約1週間春化処理を行った。再び、クリーンベンチ内で軽く遠心し、上清を捨て、別にオートクレーブ処理（121℃，20分）した0.3％ アガロース溶液1 mlに懸濁した。ピペットのチップに取りシャーレに播種した。
【００５８】
無菌培地の調製：
【表１−１】
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培地溶液を調製後オートクレーブ処理(121℃ 20分)し、約50℃程度まで冷やしてからシャーレに分注した。
【表１−２】
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調製後、4℃で遮光保存した。
【００５９】
マイクロアレイ：
シロイヌナズナ葉50 mgよりRNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) を用い、標準プロトコルに従って全 RNAを回収した。全RNA 15 μgを初期量とし、One-Cycle cDNA Synthesis Kit (Affymetrix) を用いてcDNA合成を行った。GeneChip Sample Cleanup Module (Affymetrix) を用いてcDNAを精製後、GeneChip IVT Labeling Kit (Affymetrix) を用いてビオチン標識されたcRNAを合成した。GeneChip Sample Cleanup Module (Affymetrix) を用いてcRNAを精製した。cDNA合成からの作業手順はGene Chip Expression Analysis Technical Manualに従って行った。引き続き、GeneChip Arabidpsis ATH1 Genome Array (Affymetrix) に対し標準プロトコルに従って16時間ハイブリダイズを行った。Fluidics Station 450 (Affymetrix) を用いて49 Format用のプログラムにより自動で洗浄と染色を行い、Affymetrix GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix) によりデータの取り込みを行った。シグナルの数値化および補正にはGeneChip Operating Software (Affymetrix) を用い、その後の解析にはExcel (Microsoft) を使用した。
【００６０】
どのようなLED照射でどのような機能性・薬効成分含量が増大するかの見通しをつけるため、遺伝子発現の包括的解析 (マイクロアレイ) を行った。シロイヌナズナを実験材料に用いることにより、マイクロアレイは威力を発揮する。使用したArabidopsis ATH1 Genome Array (Affymetrix) は、約24,000の遺伝子配列に対応する22,500以上のプローブセットが1枚のアレイに含まれており、データベースで入手できる遺伝子としては、26,200個に対応する。光源としては、青色LED (470 nm)，赤色LED (660 nm)，青色LED＋赤色LED，青色LED (パルス光) を用い、２週間あるいは２日間照射し、白色蛍光灯照射「対照」植物と比較した。
【００６１】
（結果）
「青色２週」では237種の遺伝子、「青色２日」では203種の遺伝子について、「対照」と比較して2倍以上発現が増大していることが明らかになった。また、それら遺伝子はKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) により、「青色２週」では29種の遺伝子 (表２)、「青色２日」では26種の遺伝子 (表３) がシロイヌナズナにおける代謝系関連遺伝子として分類された。具体的には、「青色２週」の29種の遺伝子は34種の代謝系において23種の酵素番号に分類され、「青色２日」の26種の遺伝子は29種の代謝系において22の酵素番号に分類された。分類された代謝系にはフラボノイド合成系、スチルベン・クマリン・リグニン合成系、フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン合成系といった、いわゆる機能性成分の合成につながると考えられる系や、アスコルビン酸代謝系、アルカロイド合成系といったビタミン類の代謝・合成に関連すると考えられる系が含まれていた (表２，表３)。さらに、KEGG未収録分から、リグニン類合成系の２種の酵素の遺伝子発現が「青色２日」で２倍以上に増大していた (表４)。
【表２】
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「青色２週」のシロイヌナズナで「対象」に対し2倍以上遺伝子発現の上昇していたタンパク質のうち代謝系に関連すると予測された酵素。左から代謝系名、シロイヌナズナ遺伝子番号、酵素番号、酵素名を示す。各代謝系への分類はKEGGデータベースに従う。
【表３】
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「青色２日」のシロイヌナズナで「対象」に対し2倍以上遺伝子発現の上昇していたタンパク質のうち代謝系に関連すると予測された酵素。左から代謝系名、シロイヌナズナ遺伝子番号、酵素番号、酵素名を示す。各代謝系への分類はKEGGデータベースに従う。
【表４】
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【００６２】
「対照」に対し、「赤色２週」および「赤色２日」では、それぞれ、17種および38種の代謝系の酵素の遺伝子発現が２倍以上上昇していた。つぎに、「『青色+赤色』２週間」および「『青色+赤色』２日」の場合は、それぞれ、32種および39種の代謝系の酵素の遺伝子発現が２倍以上増加していた。サポニンを含むステロイド合成系では、青色LED照射に加え、「赤色２日」で特異的な酵素の増大が見られた。青色LED (パルス光) では、「青色パルス２週間」および「青色パルス２日」において、38種の代謝系の酵素のうちそれぞれ18種および4種の遺伝子発現が２倍以上上昇していた。
【００６３】
青色LED照射において発現が2倍以上増大している遺伝子をMap Man Bin (MMB：アミノ酸配列からタンパク質の機能を予測分類するデータベース) により機能別に分類した。RNA transcriptionに分類されたものは「青色２日」で13種、「青色２週」で43種存在していた。これらはフラボノイド関連遺伝子や他の青光依存した有効成分の代謝系遺伝子の転写調節に重要なタンパク質である。また、両者とも翻訳後修飾に関与するタンパク質やタンパク質分解遺伝子が上昇していた。これらもまた同様フラボノイド関連遺伝子や他の青光依存した有効成分の代謝系遺伝子の活性制御に重要なタンパク質である。さらに、細胞壁、脂質合成、植物ホルモン性合成、ストレス、レドックスに対する防御機構に関与する遺伝子発現も高輝度青光LEDで上昇しており、本実験で使用した光によって植物の免疫機能が増強される可能性が示唆された。
【００６４】
発現が増大した遺伝子の数と増大の程度において、青色LEDが最も良好な結果を与えた。赤色LEDでは、青色LED照射では効果が認められなかったいくつかの遺伝子が含まれていた。青色LED＋赤色LEDは、それぞれの単独照射の結果を合算した結果であった。青色LED (パルス光) は、発現が増大した遺伝子の数と増大の程度において、再下位の成績であった。
【００６５】
（考察）
本発明において、特定の波長の青色光を照射する条件により、(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子および／または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進させることに成功した。これらの酵素によって、植物においてリグナン類およびリグニン類の生合成が促進されることが期待される。リグナン類として、五味子のゴミシンには肝障害改善作用および抗アレルギー作用を有するピノレジノール、辛夷のマグノサリンおよび厚朴のホオノキオールには抗潰瘍・血小板凝集阻害活性、細辛のアサロンには抗アレルギー作用などが認められている。また、ポドフィロトキシンは抗ガン剤エトポシドのリード化合物として知られている。一方、リグニン類は、肌の収れん効果や食物繊維としての整腸作用が報告されている。本発明の条件によるLEDの照射により、これらの成分の効率的な量的増加が期待できる (図１)。
【００６６】
本明細書および特許請求の範囲に記載される本発明の本質および範囲から逸脱することなしに、特定の実施形態に示されるように、多くの改変および／または修飾が本発明になされ得ることが、当業者に理解される。従って、本発明の実施形態は、全ての点において単なる例示であって限定ではないとみなされるべきである。
【００６７】
本明細書中に示される全ての刊行物は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明によれば、(1)4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子、(2)シンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子、(3)シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子および／または(4)ペルオキシダーゼ21遺伝子の発現を促進させることが可能であり、これら遺伝子の発現が、例えばp-クロマリン酸からp-ヒドロキシフェニルリグニンへの変換反応を促進することにより、リグナン類および／またはリグニン類、ならびにそれらの代謝物の生産能を向上させることができる。よって、本発明は、リグナン類、リグニン類またはそれらの代謝物の効率的な製造に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、青色LEDによるリグナン類・リグニン類生合成経路遺伝子の発現促進の模式図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
（配列番号：１）シロイヌナズナにおける4-クマロイル-CoA-シンターゼ３遺伝子（遺伝子番号At1g65060）
（配列番号：２）配列番号：１のアミノ酸配列
（配列番号：３）シロイヌナズナにおけるシンナモイル-CoA-レダクターゼ遺伝子（遺伝子番号At4g30470）
（配列番号：４）配列番号：３のアミノ酸配列
（配列番号：５）シロイヌナズナにおけるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの遺伝子（遺伝子番号At1g09500.2）
（配列番号：６）配列番号：５のアミノ酸配列
（配列番号：７）シロイヌナズナにおけるペルオキシダーゼ21遺伝子（遺伝子番号At2g22420）
（配列番号：８）配列番号：７のアミノ酸配列
【図１】
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【配列表】
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