(57)【要約】【課題】屈折率の異なる溶液を数多く測定する必要なしに、結合以外の屈折率変化要因を排除した状態で、生理活性物質と被験物質との相互作用を測定できる方法を提供すること。【解決手段】生理活性物質を固定した膜を含むセル内部の屈折率を連続的に変化させることによって、生理活性物質が固定された表面（act）および生理活性物質が固定されていない表面(ref)の屈折率変化を連続的に測定し、これによってすることで、act/ref間のバルク補正を正確に行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質が固定された第一の表面および生理活性物質が固定されていない第二の表面を同一セル内に有するバイオセンサーに、前記生理活性物質と相互作用する被験物質を適用し、屈折率の変化を測定することによって前記生理活性物質と前記被験物質との相互作用を測定する方法において、
（１）生理活性物質と相互作用する物質を含まない溶液を用いて前記セルの内部の屈折率を連続的に変化させて、第一の表面及び第二の表面の信号変化を測定し、第一の表面と第二の表面における信号変化の関係式を得る工程；
（２）前記セルの内部に、生理活性物質と相互作用する物質を含む溶液を投入し、第一の表面及び第二の表面の信号変化を測定する工程；及び
（３）上記工程（２）で得た第二の表面の信号を、上記工程（１）で得た関係式に適用して、第一の表面の信号に変換し、次いでこの変換された第一の表面の信号を、上記（２）で得た第一の表面の信号から差し引くことによって、前記生理活性物質と前記被験物質との相互作用の信号を得る工程、
を含むことを特徴とする上記方法。
【請求項２】
工程（１）において、セル内部の溶液を蒸発によって濃厚化させることによって、セル内部の屈折率を連続的に変化させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
表面プラズモン共鳴用のバイオセンサーを用いて測定を行う、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーを用いて生理活性物質と被験物質との相互作用を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
例えば、特許文献１には、回折格子ベース導波路型センサ内に光ビームを導くための光源、及び前記回折格子ベース導波路型センサ内に導かれる前記光ビームの入射の平面と前記回折格子ベース導波路型センサ内の回折格子の格子線に垂直な格子ベクトルの間の角度として定義されるスキュー角を調節することによってあらかじめ定められたスペクトル位置に共鳴を有するように同調された前記回折格子導波路型センサからの反射光ビームを受け取るための検出器を備え、前記検出器が、前記回折格子ベース導波路型センサの表面上に生物学的物質があるか否かを示すあらかじめ定められた屈折率に対応する共鳴条件を検出するために前記反射光ビームを解析するために用いられることを特徴とする読取りシステムが記載されている。
【０００６】
一般に、リガンド固定した表面（以下表面１）にアナライトの溶液を流し、リガンド-アナライトの結合をその屈折率変化信号として検出する装置において、結合以外の屈折率変化要因を排除するため、同時にリガンドの固定されていない表面（以下表面２）の屈折率変化を測定し、その値を差し引きする方法が知られている。この場合、表面のリガンド固定による屈折率変化率への影響を予め見積もるため、表面１/表面２に同じ屈折率の溶液を数種類流し、その信号を測定する方法が知られている（ＢＩＡＣＯＲＥ社）。
【０００７】
屈折率が1×10-3のオーダーで変化する場合、表面１/表面２間の変化は、ほぼ直線関係であるが、装置の光学的要因により、1×10-4〜10-6の屈折率変化では直線からはずれることがある。特に、低分子のアナライト測定を行う場合、(1)結合信号が小さくなる(屈折率1×10-4〜10-6の変化)、(2)溶解に必要な有機溶剤(DMSOなど)は一般に屈折率が高いため、調液誤差による屈折率変化への影響が大きくなるという影響により、この問題が顕著になる。
【０００８】
また従来の方法では、屈折率の異なる溶液を数多く測定する必要があり、操作に必要な労力の割に精度が上がらない問題があった。
【０００９】
【特許文献１】特表２００７−５０９３５１号公報（米国特許第６,８２９,０７３号に対応）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、屈折率の異なる溶液を数多く測定する必要なしに、結合以外の屈折率変化要因を排除した状態で、生理活性物質と被験物質との相互作用を測定できる方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生理活性物質を固定した膜を含むセル内部の屈折率を連続的に変化させることによって、生理活性物質が固定された表面（act）および生理活性物質が固定されていない表面(ref)の屈折率変化を連続的に測定し、これによってすることで、act/ref間のバルク補正を正確に行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明によれば、生理活性物質が固定された第一の表面および生理活性物質が固定されていない第二の表面を同一セル内に有するバイオセンサーに、前記生理活性物質と相互作用する被験物質を適用し、屈折率の変化を測定することによって前記生理活性物質と前記被験物質との相互作用を測定する方法において、
（１）生理活性物質と相互作用する物質を含まない溶液を用いて前記セルの内部の屈折率を連続的に変化させて、第一の表面及び第二の表面の信号変化を測定し、第一の表面と第二の表面における信号変化の関係式を得る工程；
（２）前記セルの内部に、生理活性物質と相互作用する物質を含む溶液を投入し、第一の表面及び第二の表面の信号変化を測定する工程；及び
（３）上記工程（２）で得た第二の表面の信号を、上記工程（１）で得た関係式に適用して、第一の表面の信号に変換し、次いでこの変換された第一の表面の信号を、上記（２）で得た第一の表面の信号から差し引くことによって、前記生理活性物質と前記被験物質との相互作用の信号を得る工程、
を含むことを特徴とする上記方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、工程（１）において、セル内部の溶液を蒸発によって濃厚化させることによって、セル内部の屈折率を連続的に変化させる。
好ましくは、表面プラズモン共鳴用のバイオセンサーを用いて測定を行う。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の測定方法によれば、屈折率の異なる溶液を数多く測定する必要なしに、結合以外の屈折率変化要因を排除した状態で、生理活性物質と被験物質との相互作用を測定することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の方法は、生理活性物質が固定された第一の表面および生理活性物質が固定されていない第二の表面を同一セル内に有するバイオセンサーに、前記生理活性物質と相互作用する被験物質を適用し、屈折率の変化を測定することによって前記生理活性物質と前記被験物質との相互作用を測定する方法において、
（１）生理活性物質と相互作用する物質を含まない溶液を用いて前記セルの内部の屈折率を連続的に変化させて、第一の表面及び第二の表面の信号変化を測定し、第一の表面と第二の表面における信号変化の関係式を得る工程；
（２）前記セルの内部に、生理活性物質と相互作用する物質を含む溶液を投入し、第一の表面及び第二の表面の信号変化を測定する工程；及び
（３）上記工程（２）で得た第二の表面の信号を、上記工程（１）で得た関係式に適用して、第一の表面の信号に変換し、次いでこの変換された第一の表面の信号を、上記（２）で得た第一の表面の信号から差し引くことによって、前記生理活性物質と前記被験物質との相互作用の信号を得る工程、
を含むことを特徴とする方法である。
【００１６】
「同一セル内」とは、生理活性物質と相互作用する物質を含む溶液を投入した際に溶液で連続的に満たされる容積範囲を指す。
本発明に使用される信号変化の関係式を得るための生理活性物質と相互作用する物質を含まない溶液とは通常、生理活性物質の活性を損なうことなく、相互作用する物質を溶解する組成の溶液であることが好ましい。そのため、生理活性物質の活性を保つpH領域の緩衝液、および低濃度の有機溶剤の混合溶液が用いられる。有機溶剤の種類は、生理活性物質の活性を損なうものでなければ何でも良いが、DMSO(ジメチルスルホキシド)、DMF(ジメチルホルムアミド)が好ましい。
【００１７】
「第一の表面と第二の表面における信号変化の関係式」とは、図１に示すとおり、同じ屈折率の液が満たされた時の第一の表面（表面１）と第二の表面（表面２）の信号をプロットし、近似曲線(直線)で結ぶことで得られる関係式を意味する。近似曲線の近似とは、少なくとも２点以上の測定点から最小自乗法等を用いて誤差が最小になる式を求めることである。通常は比較例のように、予め屈折率の異なる数種の液を準備しておき、セル内を各液に置換して測定するが、本発明では、セル内の屈折率(すなわち液組成)を連続的に変化させることで、表面１及び表面２の信号をより細かく測定することを特徴とする。本発明の測定点数は多いほど好ましいが、２０点以上が好ましく、５０点以上が更に好ましく、１００点以上が最も好ましい。
【００１８】
セル内の屈折率を連続的に変化させる方法としては、（１）１種の液で満たしておき、その蒸発による屈折率変化を利用する、（２）２種又はそれ以上の液を連続的に注入量を連続的に変化させて混合し、その組成変化による屈折率変化を利用する、（３）１種の液で満たしておき、その連続的な温度変化による屈折率変化を利用する、などの方法などが挙げられる。上記（１）に記載した蒸発を行うための手段としては、開放状態で放置し蒸発濃厚化させる方法の他に、風、減圧などが挙げられる。なお、上記（１）において「満たす」とは、同一セル内に分布なく同じ組成の溶液が入った状態にすることを言う。上記（２）の組成変化の例としては、例えば、ランニングバッファがDMSO10％/リン酸バッファ(pH7.4)である場合、溶液１(DMSO9.5％/リン酸バッファ(pH7.4))と溶液２(DMSO10.5％/リン酸バッファ)を準備し、マイクロミキサーを用いて溶液1：溶液２の混合比を100：0〜0：100の間で連続的に変化させて測定する方法が挙げられる。また、上記（３）の温度変化の具体例としては、例えば、ランニングバッファがDMSO10％/リン酸バッファ(pH7.4)を用いて25℃で測定する場合、前記のランニングバッファを15℃から35℃の間で連続的に変化させて測定する方法が挙げられる。
【００１９】
連続的な測定とは、測定点の間隔が屈折率として10-4以下であることであり、好ましい測定間隔は測定に掛かる時間と精度の両立の観点から、10-7以上10-4以下であり、さらに好ましくは、10-6以上3×10-5以下の範囲である。
【００２０】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００２１】
本発明で用いる生理活性物質を固定するための基板は、金属表面又は金属膜を有することが好ましい。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記担体への付着性を考慮して、担体と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２２】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０.１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０.１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２３】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２４】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２５】
本発明における基板は、好ましくは、反応基を有する親水性高分子で被覆された担体である。反応基を有する親水性高分子は、上記したような金属表面又は金属膜に対して、直接又は中間層を介して結合することができる。
【００２６】
＜親水性高分子化合物＞
親水性高分子化合物としては、例えば多糖類（例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロース）、または合成高分子化合物（例えばポリビニルアルコール）などを挙げることができる。本発明においては、カルボキシル基を含有する高分子が好ましい。
本発明で用いるカルボキシル基を含有する高分子としては、カルボキシル基含有合成高分子およびカルボキシル基含有多糖類を用いることが可能である。カルボキシル基含有合成高分子としては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびこれらの共重合体、例えば特開昭５９−５３８３６号明細書３頁２０行〜６頁４９行、特開昭５９−７１０４８号明細書３頁４１行〜７ページ５４行明細書に記載されているようなメタクリル酸共重合体、アクリル酸共重合体、イタコン酸共重合体、クロトン酸共重合体、マレイン酸共重合体、部分エステル化マレイン酸共重合、水酸基を有する高分子に酸無水物を付加させたものなどが挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等が挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるＣＭＤ、ＣＭＤ−Ｌ、ＣＭＤ−Ｄ４０（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。
【００２７】
カルボキシル基を含有する高分子は、好ましくはカルボキシル基を含有する多糖類であり、より好ましくはカルボキシメチルデキストランである。
【００２８】
本発明に用いるカルボキシル基を含有する高分子の分子量は特に制限されないが、平均分子量が１０００〜５００００００であることが好ましく、平均分子量が１００００〜２００００００であることがより好ましく、この範囲より平均分子量が小さい場合には生理活性物質の固定量が小さくなってしまい、この範囲より平均分子量が大きい場合には高い溶液粘度のため取り扱いが困難となる。
親水性高分子化合物としては、例えば多糖類（例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロース）、または合成高分子化合物（例えばポリビニルアルコール）などを挙げることができる。本発明においては、多糖類が好ましく用いられ、デキストランが最も好ましい。
【００２９】
本発明においては、好ましくは、平均分子量１万以上２００万以下の親水性高分子が用いられる。好ましくは２万以上２００万以下、さらに好ましくは３万以上１００万以下、最も好ましくは２０万以上８０万以下の親水性高分子を用いることができる。
【００３０】
センサー表面に固定する親水性高分子化合物は、水溶液中の膜厚が１ｎｍ以上300ｎｍ以下であることが好ましい。膜厚が薄いと生理活性物質固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の親水性高分子化合物固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の親水性高分子化合物膜厚はＡＦＭ、エリプソメトリーなどで評価することができる。
【００３１】
親水性高分子の一例であるポリヒドロキシ化合物は、例えば塩基性条件下でブロモ酢酸と反応させることでカルボキシ化できる。反応条件の制御により、ポリヒドロキシ化合物が初期状態で含有するヒドロキシ基の一定の割合をカルボキシ化できる。本発明においては例えば、１〜９０％のヒドロキシ基をカルボキシ化することができる。なお、任意のポリヒドロキシ高分子化合物で表面被覆された表面について、例えば、以下の方法でカルボキシ化率を算出することができる。膜表面をジ−tert−ブチルカルボジイミド／ピリジン触媒を用いてトリフルオロエタノールで50℃、16時間、気相修飾し、ＥＳＣＡ（electron spectroscopy for chemical analysis）でトリフルオロエタノール由来のフッ素量を測定し、膜表面の酸素量との比率（以下、Ｆ／Ｏ値と呼ぶ）を算出する。全てのヒドロキシ基がカルボキシ化された場合の理論的なＦ／Ｏ値をカルボキシ化率１００％とし、任意の条件でカルボキシ化した時のＦ／Ｏ値を測定することで、その時のカルボキシ化率を算出することができる。
【００３２】
カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法、EDC単独で活性化する方法を好ましく用いることができる。この手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを、アミノ基を有する基板と反応させることで、本発明のバイオセンサーを製造することが可能となる。
【００３３】
生理活性物質の固定化基として、ポリマーに導入する反応基は、カルボキシル基やアミノ基の他に、例えば、ビオチン結合性タンパク（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）、プロテインA、プロテインG、抗原、抗体（例えば、抗GST抗体等の公知のtag抗体）などの生理活性物質をあらかじめ固定した態様が可能である。また、ポリマーにアルカンを導入した固定化層を用いれば、脂質などの膜構造を有した生理活性物質を固定することが可能になる。また、用途に応じて、ポリマー鎖の長さ、ポリマーの厚み、ポリマーの密度、あるいは、ポリマーに導入する反応基の量を調整することにより、多様な蛋白に対応することが可能になる。またポリマーに固定基として、NTA（nitrilotriacetic acid）等などを導入すれば、金属キレートを介してHis-tagリガンド等を固定することができる。
【００３４】
本発明において、反応基を有する親水性高分子は、金属表面又は金属膜に、直接又は中間層を介して結合することができる。ここで言う中間層としては、疎水性高分子化合物又は自己組織化膜から成る層などを使用することができる。以下、疎水性高分子化合物、及び自己組織化膜について説明する。
【００３５】
疎水性高分子化合物とは、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００３６】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００３７】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００３８】
疎水性高分子化合物の担体へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００３９】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。
【００４０】
次に、自己組織化膜について説明する。チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。即ち、本発明においては、親水性高分子は、有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1を介して金属膜に付着させることができる。有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1について詳細に説明する。
【００４１】
Ｘ1は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−SSR11Ｙ11、−SSR1Y1）、スルフィド（−SR11Ｙ11、−SR1Y1）、ジセレニド（−SeSeR11Ｙ11、−SeSeR1Y1）、セレニド（SeR11Ｙ11、−SeR1Y1）、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO2）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられる。
【００４２】
Ｒ1（とＲ11）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
【００４３】
Ｙ1とＹ11はポリヒドロキシ高分子化合物を結合させるための基である。Ｙ1とＹ11は好ましくは同一であり、ポリヒドロキシ高分子化合物に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。
【００４４】
本発明では、例えば、自己組織化化合物として、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。
【００４５】
本発明において金属膜は、アミノ基を有する有機層で被覆された後、活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを上記有機層と反応させることにより、生理活性物質を固定化し得るヒドロゲルを作製することができる。
【００４６】
本発明においてアミノ基を有する有機層で金属膜を被覆する方法は、公知の方法を使用することができるが、操作が簡便なことから、自己組織化膜（SAMs）を用いた被覆法が好ましい。自己組織化膜（SAMs）を用いた金属膜の被覆法は、ハーバード大のWhitesides教授らにより精力的に展開されており、その詳細は例えばChemical Review, 105, 1103-1169 (2005)に報告されている。金属として金を用いた場合、有機層形成化合物として一般式Ａ−１（一般式Ａ−１において、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を用いることにより、Au-S結合とアルキル鎖同士のvan der Waals力に基づき、配向性を持つ単分子膜が自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作成される。一般式Ａ−１においてX=NH2である化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基を有する有機層で金表面を被覆することが可能となる。
【００４７】
【化１】
2009014622.tif 000002
【００４８】
末端にアミノ基を有するアルカンチオールは、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物（一般式Ａ−２）（一般式Ａ−２において、ｎは３から２０の整数を示す）でもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−３、Ａ−４）（一般式Ａ−３においてｎは３から２０の整数を示し、一般式４においてｎはそれぞれ独立に１から２０の整数を示す）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた化合物でもよい。末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。
【００４９】
【化２】
2009014622.tif 000003
【００５０】
A-2〜A-4のアルキル基の繰返し数は、3以上20以下が好ましく、さらに3以上16以下が好ましく、4以上8以下が最も好ましい。アルキル鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキル鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。
【００５１】
本発明に用いるジアミンとしては、任意の化合物を用いることが可能であるが、バイオセンサー表面に用いる場合、水溶性ジアミンが好ましい。水溶性ジアミンとしては具体的に、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１．４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４’−ジアモノビフェニル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルケトン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミンが挙げられる。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式５）を用いることも可能である。本発明に用いるジアミンとしては、好ましくはエチレンジアミンまたは一般式Ａ−５（一般式Ａ−５において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）で表される化合物であり、より好ましくは、エチレンジアミンまたは1,2-ビス(アミノエトキシ)エタン（一般式Ａ−５において、n=2,m=1）である。
【００５２】
【化３】
2009014622.tif 000004
【００５３】
アミノ基を有するアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他のアルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のWhitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Langmuir,17,2841-2850, 5605-5620, 6336-6343 (2001)）。本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールとしては、水酸基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−６）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式Ａ−７）（一般式Ａ−６において、ｎは３から２０の整数を示し、一般式Ａ−７において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）を用いることが好ましい。
【００５４】
【化４】
2009014622.tif 000005
【００５５】
アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合、A-2〜A-4のアルキル基の繰返し数は、4以上20以下が好ましく、さらに4以上16以下が好ましく、4以上10以下が最も好ましい。また、A-6,A-7のアルキル基の繰返し数は、3以上16以下が好ましく、さらに3以上12以下が好ましく、3以上8以下が最も好ましい。
【００５６】
本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、アミノ基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には活性化されたカルボキシル基含有ポリマーの結合量が低下し、親水性基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールの混合比は、１／１〜１／１，０００，０００の範囲であることが好ましく、１／４〜１／１０，０００の範囲であることがより好ましく、１／１０〜１／１，０００の範囲であることがさらに好ましい。活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水性基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。
【００５７】
本発明で用いるアルカンチオールは、Northwestern大学のGrzybowski教授らによる総説（Curr. Org. Chem., 8, 1763-1797(2004).）およびその引用文献に基づいて合成された化合物を用いても良く、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Aldrich社、SensoPath Technologies社、Frontier Scientific Inc.社等から購入可能である。本発明においてアルカンチオールの酸化生成物であるジスルフィド化合物は、アルカンチオールと同様に用いることが可能である。
【００５８】
本発明において基板に固定化される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであり、生理活性反応を行うことができる物質であれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００５９】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００６０】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００６１】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００６２】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００６３】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、基板上の反応基に共有結合させることで行うことができる。
【００６４】
被験分子としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する分子であれば特に限定されない。被験分子としては、好ましくは、生理活性物質と相互作用し、該生理活性物質の活性を活性化する作用を有する分子、又は該生理活性物質の活性を阻害する分子を使用することができる。
【００６５】
本発明において、第二の反応部に固定化されている「生理活性反応によって生じた反応生成物に特異的に結合する分子」の種類は、特に限定されないが、例えば、反応生成物に対する抗体などを挙げることができる。
【００６６】
＜安定化剤添加工程＞
一般に蛋白質などの生理活性物質は水溶液中で水分子が配位することで三次元構造を維持しているが、乾燥されると三次元構造を保持できず失活する。また、基板表面の親水性高分子中に担持されている場合には、乾燥されることで生理活性物質同士が接近し凝集が発生する。本発明の水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水分子に代って生理活性物質の三次元構造を保持することで失活を抑制、または生理活性物質を被覆して立体効果で凝集を抑制する目的で使用することができる。
【００６７】
本発明において水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水溶液で基板上の生理活性物質を固定した層に添加することが好ましい。添加方法としては、生理活性物質との混合溶液として基板表面に塗布しても良く、生理活性物質を基板表面に固定した後オーバーコートなどによりして添加しても良い。化合物Ｓと生理活性物質との混合溶液として塗布した場合、生理活性物質の固定量ばらつきを抑えることもできる。化合物Ｓ水溶液は薄膜状態で基板に添加することが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【００６８】
化合物Ｓの塗布液濃度は塗布性、生理活性物質を含む層への浸透の問題がない範囲で特に限定されないが、０．１重量％以上５重量％以下であることが好ましい。また、塗布液は、塗布性、ｐＨ調整の観点で界面活性剤、緩衝剤、有機溶剤、塩などを添加してもよい。
【００６９】
水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、常温常圧で不揮発性のものが好ましく、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さいものが好ましく、さらに好ましくは１２００以上２００万以下であり、最も好ましくは１２００以上７万以下である。分子内に水酸基を含む化合物Ｓは糖類が好ましく、糖類は、単糖、多糖類でも良い。ｎ糖類の場合ｎが４以上１２００以下であることが好ましく、さらに好ましくはｎが２０以上６００以下である。
【００７０】
化合物Ｓの平均分子量が低いと基板表面で結晶化して、生理活性物質を固定した親水性高分子層の破壊および生理活性物質の三次元構造の破壊の原因となり、反対に平均分子量が高いと生理活性物質の基板への固定の障害となったり、生理活性物質を含む層に含浸できない、層分離を発生するなどの問題が発生する。
【００７１】
基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、デキストラン骨格、又はポリエチレンオキシド骨格を有することが好ましく、本発明の目的を達成する範囲において、どの置換基を使用してもよい。また、基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、解離性基を有しないノニオン性化合物であることが好ましい。また、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは水分子との親和性の高い化合物が好ましく、水とｎ-オクタノールとの分配係数Ｌｏｇ
Ｐ値が１以上であることが好ましい。ＬｏｇＰ値は、ＪＩＳ規格のＺ７２６０−１０７（２０００）「分配係数（1-オクタノール/水）の測定―振とう法」などに記載の方法で測
定することができる。
【００７２】
具体的な水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、ポリエチレングリコールなど多価アルコース類、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、デンプン、セルロース、アルギン酸、デキストランなど多糖類、ポリエチレンオキシド、プルロニックなどポリエチレンキシ-ポリプロピレンオキシド縮合物などのポリエーテル類、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０などの２種以上の残基から成る化合物、またはこれら化合物の誘導体および重合体などが挙げられる。特に、デキストラン、セルロース、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０が好ましい。また、これらの化合物Ｓは使用している親水性高分子の基本骨格と実質同一であることが好ましい。ここで、基本骨格とは、例えば、糖の環構造のことをいい、官能基や長さが異なっていても、環構造が同一であれば、実質同一であるという。
【００７３】
基板上の、水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓの含有量としては、平均分子量の比で、親水性高分子の平均分子量に対する前記化合物Ｓの平均分子量の割合が０．００５以上０．２以下であることが好ましい。割合がこれよりも低い場合は化合物Ｓが結晶化しやすく、高い場合は親水性高分子層への浸透が困難であり、この範囲内に設定することでこれらの問題を解消し、生理活性物質の失活抑制効果、凝集抑制効果をより高く得ることができる。
【００７４】
本発明のバイオセンサーは、市販の測定装置を用いて行うことができる。例えばSPR解析の場合、GEヘルスケア社（Biacore社）製、Biacore3000, 2000, 1000, A100, T100, S51, X, Jや株式会社モリテックス社製、SPR-670、SPR-MACS、東洋紡績株式会社製MulriSPRinter、GWC Technologies社製SPR Imagerなどを挙げることができる。また、コーニング社製Epic System、Farfield Scientific社製AnaLight、株式会社アルバック社（株式会社イニシアム社）製AFFINIXなどを利用することができる。また、特許公報特開2006-194624 段落25〜段落62に記載の装置を利用することもできる。
【００７５】
本発明において、第一の反応部における結合反応と、第二の反応部における結合反応は、非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。好ましくは、本発明においては、第一の反応部における結合反応と前記第二の反応部における結合反応の変化を、誘電率の変化として測定することができる。
【００７６】
本発明の好ましい態様によれば、バイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００７７】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００７８】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００７９】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報の段落番号００１１参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００８０】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００８１】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００８２】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報の段落番号００２５〜００３７に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００８３】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００８４】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００８５】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００８６】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００８７】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００８８】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００８９】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特開２００３−１７２６９４号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００９０】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００９１】
本発明のバイオセンサーは、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーとして用いることができる。この場合、基板表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフィルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。
【００９２】
この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平６−２７７０３号公報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図に記載されている。
【００９３】
例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス（登録商標）・ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（ＳｉＯ2，ＳｎＯ2、Ｔａ2Ｏ5，ＴｉＯ2，ＴｉＯ2-ＳｉＯ2，ＨｆＯ2，ＺｒＯ2，Ａｌ2Ｏ3，Ｓｉ3Ｎ4，ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって基板内に形成することができる。
次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生理活性物質を固定化し得る層を用いることができる。
【００９４】
別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。
【００９５】
回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生理活性物質検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、ＣＣＤカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がＣＣＤカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。
【００９６】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９７】
実施例１
水溶解性の高いSAM化合物を用いて蛋白を固定できるヒドロゲル膜を作成し、蛋白質の固定量、および非特異吸着性能を評価した。
【００９８】
（１）基板の作成
6-Amino-1-octanethiol, hydrochloride（同仁化学社製）の1mM水溶液を作成した。この溶液をA液と呼ぶ。次に、ゼオネックス（日本ゼオン社製）を射出成型して得られたプラスチックプリズムの上面に以下の方法で金薄膜を製膜した。スパッタ装置の基板ホルダにプリズムを取付け、真空（ベースプレッシャー1×10−３-3Pa以下）に引いてからArガスを導入し（1Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、基板ホルダにRFパワー（0.5kW）を約9分間印加してプリズム表面をプラズマ処理（基板エする。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（10〜40rpm）させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー（0.2kW）を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に。Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し、（0.5Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー（1kW）を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。上記で得られたAu薄膜を成膜したＢセンサースティックを、A液に40℃１時間浸漬し、超純水で5回洗浄した。
【００９９】
（２）CMD(カルボキシメチルデキストラン)の活性エステル化
1重量%のCMD（名糖産業製：分子量100万、置換度0.65）溶液10gを溶解した後、0.02M EDC（1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride）、40mM HOBt(1-Hydroxybenzotriazole)の混合水溶液10mlを加え、室温で1分間撹拌後、1時間静置した。
【０１００】
（３）CMDの基板への結合反応
（１）で作成された基板の上に、（２）で作成された活性エステル化されたCMD溶液を1ml滴下し、1000 rpmで45 秒スピンコートすることで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で15分間反応させた後、1 N NaOH水溶液に30分浸漬し、超純水で5回洗浄することで、CMD固定基板を得た。
【０１０１】
（４）CMD固定基板へのCAの結合反応
（３）で作成された基板を表面プラズモン共鳴装置にセットした。装置内部は、基板を底面とした底面積20mm2、内容積200mm3の円柱状のセルを2箇所有し、各セルでプラズモン共鳴が測定できる。両セルの間隔は中心地同士でおよそ5.5mmである。以下一方のセル中の表面を表面１、もう一方の表面を表面２と呼ぶ。表面１及び表面２のセル中に1×PBS(pH7.4)を入れ、固定処理前のベースライン共鳴角を測定した。次に、セル内部を0.2M EDC、0.05M NHS(N-Hydroxysuccinimide)の混合水溶液に入れ換え、7分間静置した。セル内部をAcetate5.0(BIACORE製)で洗浄した後、表面１のセルのみ0.25mg/ml Carbonic Anhydrase(以下CAと略す。SIGMA製)のAcetate5.0溶液に入れ換え、15分静置した。静置後、表面１,２のセルを1M Ethanolamine水溶液(pH8.5に調整したもの)に入れ換え、そのまま7分静置した。さらに両セル内部を(10mM NaOH水溶液で１分静置後、1×PBS(pH7.4)で洗浄)という入れ換え操作を2回繰返し、CAが固定された基板を得た。
【０１０２】
CAの固定前後の信号を表面プラズモン共鳴装置で測定したところ、CAの固定量は9000RVであった。ここでは、DMSO1%あたりの共鳴角の差を1500RVと表す。
【０１０３】
（５）測定
（５−１）蒸発による補正曲線の作成
（４）で作成されたセルを一旦外し、新たに表面１及び表面２を含み、セル内で表面１及び表面２でのプラズモン共鳴が測定できる、底面積40mm2、内容積400mm3の長円柱状のセルを作成した。セル内部を1×PBS(pH7.4)/9.5% DMSO混合液で満たして静置し、セル内部の液が徐々に蒸発することで濃厚化し、屈折率が連続的に上昇して共鳴角が変化する値を表面１及び表面２でそれぞれで測定し、測定結果を表面２の値に対する表面１の値の変化としてプロットし、測定値の間は直線で結ぶことで補正曲線を得た。測定点の間隔は屈折率として平均約10-5であった。
【０１０４】
（５−２）CA固定基板への化合物の結合反応
（５−１）で作成されたセルの内部を1×PBS(pH7.4)/10% DMSOで満たしてふたをし、結合反応前のBaseline値となる表面１及び表面２の共鳴角を十分安定したところで測定した。次にふたをはずしてセルの内部を10uMのFurosemide(1×PBS(pH7.4)/10% DMSO溶液)に入れ換え、再びふたをし、結合反応後の値となる表面１及び表面２の共鳴角を十分安定したところで測定した。この測定をFurosemide溶液の調製から合計20回繰り返して測定を行った。測定間は1×PBS(pH7.4)/10% DMSOで十分洗い、Furosemideが完全に解離してから次の測定を行った。
【０１０５】
（５−３）結合量の算出
表面２の値は、（５−１）によって得られた補正曲線から、表面１に相当する値に変換し、これを表面１の値から差し引くことで、それぞれFurosemideの結合量を算出した。
【０１０６】
比較例１  液の交換による補正式の作成、および化合物結合量の算出
（５−１）で作成されたセルの内部を
１．1×PBS(pH7.4)/9.5% DMSO
２．1×PBS(pH7.4)/9.75% DMSO
３．1×PBS(pH7.4)/10% DMSO
４．1×PBS(pH7.4)/10.25% DMSO
５．1×PBS(pH7.4)/10.5% DMSO
の順に入れ換えてふたをし、十分安定したところで表面１,２の共鳴角を測定した。測定結果を表面２の値に対する表面１の値の変化としてプロットし、一次関数で近似して補正式を得た。この補正式を用いて結合反応の値を補正し、20回の測定における結合量を算出した。
【０１０７】
各補正方法におけるFurosemide結合量の平均値、CV値を表１に示す。CV値とは、変動係数(Coefficient of  Variation)のことであり、標準偏差(分散の平方根)を平均で割った値を表す。CV値が小さいほどそのバラツキ度合いが小さく好ましい。
本発明の補正を行った信号量は、比較例に比べバラツキが少ない。本発明により、表面１/表面２間の屈折率の関係に直線性が低くてもバラツキの少ないデータを得ることができることが分かる。
【０１０８】
【表１】
2009014622.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、本発明の実施例と比較例の実測値を示す。
【図１】
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