(57)【要約】【課題】被検査液中の検査対象物質をより広い測定濃度範囲で高精度に検査できるバイオセンサを提供する。【解決手段】被検査液を展開する展開層2に、標識試薬を保持した標識試薬部4と、検査対象物質を捕捉するための固定化試薬を保持した複数の固定化試薬部とを少なくとも設ける。複数の固定化試薬部の内の少なくとも１つは検査対象物質の検出を行わない非測定用固定化試薬部10とし、その他は検査対象物質の検出を行う測定用固定化試薬部5とする。【選択図】図１
2009294116.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検査液を展開する展開層に、前記被検査液中の検査対象物質を標識する標識試薬を保持した標識試薬部と、前記標識試薬保持部を通過した被検査液中の検査対象物質を捕捉するための固定化試薬を保持した固定化試薬部とが少なくとも設けられたバイオセンサにおいて、前記固定化試薬部は被検査液の展開方向に沿って複数に配置されており、その内の少なくとも１つは検査対象物質の検出を行わない非測定用固定化試薬部であることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
固定化試薬に、検査対象物質に対して特異的に結合するタンパク質が含まれていることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項３】
固定化試薬に、検査対象物質に対して免疫反応により特異的に結合する物質が含まれていることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項４】
免疫反応が抗原抗体反応であることを特徴とする請求項３記載のバイオセンサ。
【請求項５】
標識試薬が不溶性粒状マーカーを含んでいることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項６】
展開層が単層または複数層の多孔性担体で構成されていることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項７】
イムノクロマトグラフィ試験片であることを特徴とする請求項３記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検査液中の検査対象物質を定性的および定量的に検査するバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、在宅医療や地域医療の充実、早期診断の要求、緊急性の高い臨床検査の増加などに伴い、臨床検査の専門家でなくとも高精度の測定を簡易かつ迅速に実施できる機器が要望されている。そして、煩雑な操作を要さず短時間で信頼性の高い測定を行えるＰＯＣＴ（POINT OF CARE TESTING）向けの小型分析装置が脚光をあびている。
【０００３】
ＰＯＣＴとは一般に、診察室、病棟などの「患者の近いところ」で行われる検査の総称であり、医師が検査結果を即座に判断し、迅速な処置を施し、治療の過程や予後のモニタリングまでを行う、という診療の質の向上に大きく役立つものとして注目されている。
ＰＯＣＴでの小型分析装置による検査は、検査室での検査に比べて、検体の運搬や設備コストなどにかかる費用を抑え、トータルの検査費用の削減が可能になるといわれ、ＰＯＣＴ市場は、病院経営合理化の進む米国で急速に拡大してきており、世界的に成長市場となっていくことが予想される。
【０００４】
ＰＯＣＴの普及と共に、定量測定可能なイムノクロマトグラフィ試験片などが商品として市場に流通してきている。イムノクロマトグラフィ試験片に代表される乾式分析素子は、試薬の調整を必要とせず、血液や尿などの被検査液を当該分析素子上に滴下するなどの簡単な操作のみでその中の検査対象物質を分析することが可能なものであり、被検査液中の検査対象物質を簡便かつ迅速に分析するのに非常に有用であるため、ＰＯＣＴ向けに今日、多数実用化されている。
【０００５】
イムノクロマトグラフィ試験片は一般に、展開層の一部に固定化抗体が配置されるとともに、その抗体固定化部分よりも点着部寄りの位置に標識抗体が被検査液によって溶出可能な乾燥状態で保持された構成である。被検査液を点着部に必要量添加すると展開層を浸透していき、被検査液中に検査対象物質が含まれているときには、その検査対象物質が標識抗体に結合しさらに固定化抗体に結合するので、抗体固定化部分の標識抗体を検出することで検査対象物質を検出することが可能である。標識抗体を構成する標識物の一例は金コロイド粒子であり、金コロイド粒子による呈色反応によって目視可能ともなるので、その呈色度合いより、被検査液中における検査対象物質の有無および濃度を検出（測定）することができる。
【０００６】
以上は標識抗体を用いた抗原抗体反応のサンドイッチ反応を測定原理とした場合であるが、競合反応を測定原理としても同様に、抗体固定化部分への標識試薬の結合による呈色状態によって検査対象物質の有無および濃度を検出できる。標識物としては上記の金コロイドのほかにも種々に使用されており、標識物が酵素である場合などは、使用者が測定時に酵素基質や反応停止試薬を加える操作などが必要となることもある。これらの内、使用者が被検査液を点着する操作のみで測定がなされるイムノクロマトグラフィ試験片は、ワンステップイムノクロマトグラフィ試験片と総称されている。
【０００７】
ＰＯＣＴが普及するにしたがい、市場からは、いつでもどこでも誰でも測定できることに加え、より高精度な分析精度が要求されている。つまり、より高感度かつ簡単迅速に、更には広い濃度領域を測定できるようにすることが求められている。これに対処するものとして、検査対象物質への親和性が異なる固定化試薬を展開層上に複数段に配置することにより、広範囲の濃度を高精度で定量可能としたイムノクロマトグラフィ試験片が開発されている（たとえば特許文献１）。
【特許文献１】ＷＯ０３／０１４７４０公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、リガンドとレセプターとの結合を利用する分析、特に上述のようなイムノクロマトグラフィ試験片を用いる分析では、被検査液中に検査対象物質が過剰に存在する場合にプロゾーン現象が生じる。イムノクロマト法におけるプロゾーン現象とは、本来は標識抗体が検査対象物質を介して固定化抗体に捕捉されるのに、検査対象物質が多量に存在すると、標識抗体に反応しきれなかった遊離の検査対象物質が固定化抗体に対して競合し、結果として標識抗体で標識された検査対象物質の固定化抗体への結合が妨げられることをいう。
【０００９】
したがってプロゾーン現象が生じると、検査対象物質が多量に存在しているにもかかわらず、それに見合う「固定化抗体−検査対象物質−標識抗体」複合体が形成されず、見かけ上は僅かしか存在していないという結果、つまり偽陰性の結果がもたらされる。このことはまた、本来は「固定化抗体−検査対象物質−標識抗体」複合体の形成によって測定できるはずであった高濃度側領域での測定が不能になることを意味する。
【００１０】
本発明は上記問題を解決するもので、被検査液中の検査対象物質をより広い測定濃度範囲で高精度に検査できるバイオセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明のバイオセンサは、被検査液を展開する展開層に、前記被検査液中の検査対象物質を標識する標識試薬を保持した標識試薬部と、前記標識試薬保持部を通過した被検査液中の検査対象物質を捕捉するための固定化試薬を保持した固定化試薬部とが少なくとも設けられたバイオセンサにおいて、前記固定化試薬部は被検査液の展開方向に沿って複数に配置されており、その内の少なくとも１つは検査対象物質の検出を行わない非測定用固定化試薬部であることを特徴とする。非測定用固定化試薬部が標識試薬部と測定用の固定化試薬部との間に存在すればよい。
【００１２】
標識試薬部と、非測定用固定化試薬部と、測定用固定化試薬部とがこの順に並んでいることにより、標識試薬で標識された検査対象物質の一部は非測定用固定化試薬部で捕捉され、残部が測定用固定化試薬部で捕捉されここで検出が行われる。このときに、非測定用固定化試薬部の存在が、低濃度側で検出限界の高濃度化を引き起こすことがある一方で、プロゾーン現象を抑制して、高濃度側で、前記低濃度側での検出限界高濃度化を上回る検出限界高濃度化を起こすこととなり、結果として、固定化試薬部が１箇所のみの場合、つまり測定用固定化試薬部のみの場合に比べて、広い測定範囲を確保できる。
【００１３】
非測定用固定化試薬部は、それ以外の少なくとも１つの固定化試薬部と同じ検査対象物質を捕捉するものとする。つまり、１種類の検査対象物質に対して固定化試薬部（非測定用固定化試薬部、測定用固定化試薬部）を１組以上存在させる。ある検査対象物質に対する非測定用固定化試薬部・測定用固定化試薬部とからなる１組と、別のある検査対象物質に対する非測定用固定化試薬部・測定用固定化試薬部とからなる１組というように、異なる検査対象物質のための固定化試薬部の組合せが存在してもなんら問題はない。非測定用固定化試薬部は標識試薬部および被検査液導入部からの距離によって制限されず、非測定用固定化試薬部の数、大きさなども特に制限されない。
【００１４】
固定化試薬には、検査対象物質に対して特異的に結合するタンパク質を含ませる。このタンパク質は、検査対象物質に対して特定の親和性を持っていればよく、タンパク質に対する親和性を持つタンパク質、基質に対する酵素、ホルモンに対する受容体、ビタミンや毒素などの低分子物質に親和性を持つタンパク質、ＤＮＡ結合性タンパク質やＲＮＡ結合性タンパク質等の核酸結合性タンパク質などがある。
【００１５】
またたとえば、固定化試薬に、検査対象物質に対して免疫反応により特異的に結合する物質を含ませる。補体とその捕捉物質、Ｔ細胞受容体とそれが特異性を持った物質、サイトカインとその受容体など、免疫反応に関与する物質であればなんら制限されない。
【００１６】
免疫反応は抗原抗体反応であってよい。検査対象物質と固定化試薬のいずれが抗原であってもよいし抗体であってもよい。抗原にはたとえば、検査対象物質としての細菌、ウイルス、真菌類、マイコプラズマ、寄生虫、それらの産物や成分などの感染性物質；治療薬、乱用薬物などの薬物；腫瘍マーカー；ビタミンや毒素などの低分子物質などのほか、免疫グロブリン、ホルモン、酵素、ペプチドなどのタンパク質、及びタンパク質誘導体がある。抗体は、一本鎖抗体やＦａｂ、Ｆ(ａｂ’)２などの修飾された抗体、さらにｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｍＳＥＡ−ｄｉａｂｏｄｙ及びｍｉｎｉｂｏｄｙなどの組み換え抗体など、抗原に対して特異性を有していればどのような形状であってもよい。
【００１７】
標識試薬として、不溶性粒状マーカーを含むもの、たとえば不溶性粒状マーカーで標識した標識抗体を使用することができる。不溶性粒状マーカーは、金属コロイド、ラテックス粒子などの着色重合体ビーズ、重合染料粒子、磁性粒子など、溶液中で不溶な粒子であればなんら制限されない。金属コロイドは金、銀、銅、白金などの金属や合金で構成された粒子であり、溶液中にコロイド状に分散しておればなんら制限されない。
【００１８】
展開層は単層または複数層の多孔性担体で構成することができる。多孔性担体は、被検査液により湿潤可能な材料であればよく、濾紙、不織布、メンブレン、布、ガラス繊維などを用いることができる。
【００１９】
免疫反応を利用するバイオセンサは、イムノクロマトグラフィ試験片として構成することができる。試験片への被検査液の導入前に使用者による希釈や前処理等の操作が必要なイムノクロマトグラフィ試験片であっても、ワンステップイムノクロマトグラフィ試験片であっても、イムノクロマトグラフフィの原理を用いた試験片であれば構わない。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のバイオセンサは、非測定用固定化試薬部が存在することで、低濃度側で検出限界の高濃度化を引き起こすことがあるものの、プロゾーン現象を抑制して、高濃度側で、偽陰性を低減し、前記低濃度側での検出限界高濃度化を上回る検出限界高濃度化を起こすため、結果として、固定化試薬部が１箇所、つまり測定用固定化試薬部のみの場合に比べて、広い測定範囲を確保できる。簡易、迅速で、尚かつ正確性、汎用性も高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
図１（ａ）（ｂ）はそれぞれ、本発明の一実施形態のバイオセンサであるイムノクロマトグラフィ試験片の分解図および斜視図である。
【００２２】
図１において、２は展開層を示し、ニトロセルロースを主材とするメンブレンフィルタ（合成高分子膜）で構成されている。ニトロセルロースメンブレンに限らず、被検査液により湿潤可能な材料であれば、他のメンブレン、濾紙、不織布、布、ガラス繊維等、任意の多孔質な材料で構成できる。単層であっても多層であっても構わない。
【００２３】
４は標識試薬部を示し、被検査液中の検査対象物質を標識可能な標識試薬、ここでは金コロイドで標識した標識抗体が、乾燥状態で被検査液により溶出可能な状態で保持してある。標識試薬は、後述する固定化試薬部５での検査対象物質の固定を検出するために選択される。
【００２４】
５は測定用固定化試薬部を示し、被検査液中の検査対象物質を捕捉可能な固定化試薬Ａ、たとえば検査対象物質に対する特異的反応物質が、前記検査対象物質，標識試薬と複合体が形成できるよう、乾燥状態で固定化してある。ここでの特異的反応物質は、抗原、抗体、リガンド、レセプターなど、前記の標識試薬および検査対象物質と３元複合体を形成できればよく、抗体を用いる場合は、検査対象物質に対するエピトープが標識抗体と同じであっても異なっていてもよい。
【００２５】
１０は非測定用固定化試薬部を示し、標識試薬部４と測定用固定化試薬部５との間に、被検査液中の検査対象物質を捕捉可能な固定化試薬Ｂ、たとえば検査対象物質に対する特異的反応物質が、乾燥状態で固定化してある。この非測定用固定化試薬部１０は、標識試薬部４で「標識試薬−検査対象物質」複合体を形成しなかった遊離の検査対象物質を捕捉するために設置する。遊離の検査対象物質は、上述のプロゾーン現象を誘発するものであるが、「標識試薬−検査対象物質」複合体よりも時間的に早く非測定用固定化試薬部１０に到達するため、ここで捕捉することが可能である。この非測定用固定化試薬部１０に使用する特異的反応物質は、たとえば抗体であり、感度を保持するために、検査対象物質に対するエピトープが標識試薬の抗体のものと同じであることが望ましいが、期待する測定濃度範囲が得られるのであればエピトープが異なっていても構わない。
【００２６】
６は液体不透過性シートを示し、たとえばＰＥＴで構成される。この液体不透過性シート６は、展開層２の表面を被検査液の展開方向に沿った始端部分と終端部分とを除いて密着被覆することにより、被覆部分を被検査液の接触から遮断し保護すると共に外部からの汚染を防止する。外部からの汚染とは、被検査液の不用意な接触や、被験者が手などで直接に接触することなどを指す。より高精度な測定を必要とする場合には、液体不透過性シート６が、展開層２の上面、特に標識試薬部４から固定化試薬部５にわたる上面を密着密閉し、かつ、被検査液の浸透方向に沿う両側面を密着密閉する構造をとればよい。液体不透過性シート６の材料は、上述のＰＥＴに限らず、展開層２を覆うことができ且つ液体不透過性であれば任意に選択できる。測定用固定化試薬部５を覆う部分は少なくとも、測定用固定化試薬部５の状態を透過して確認できるように透明材料を用いるのが好ましい。３は展開層２における開放部、つまり液体不透過性シート６によって被覆していない終端部分を示している。
【００２７】
７は展開層２を支持する基板を示す。この基板７は展開層２を補強する役割を持つとともに、血液、唾液、尿など、感染の危険性のある被検査液を用いる場合にそれを遮断する役割を持つもので、シートあるいはフィルムと呼ばれる厚みであってよい。展開層２が湿潤すると光透過性を帯びるものである場合などは、この基板７に、光を遮断する効果を持たせることも可能である。白色ＰＥＴを材料とするのが好ましいが、上記の効果を持つものであれば特に制限はない。
【００２８】
８は微細空間形成材を示し、液体不透過性シート６によって被覆していない展開層２の始端部分上に、被検査液が毛細管現象により一定量だけ流入する微細空間１を形成する役割、および、被検査液の点着後の取り扱い時に外部を汚染から保護する役割を持つ。ここでの保護とは被検査液の不用意な飛散や付着を言う。この微細空間形成材８は、ＡＢＳ、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の合成樹脂材料、金属、ガラスなど、液体不透過性の任意の材料で構成することができる。透明もしくは半透明が好ましいが、有色、不透明でも構わない。
【００２９】
９は細胞収縮試薬（細胞成分収縮剤）であり、微細空間１に配置している。細胞収縮試薬９は、細胞を収縮する効果があればよく、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩類や、グリシン、グルタミン酸等のアミノ酸、プロリン等のイミノ酸、グルコース、スクロース、トレハロースなどの糖類、グルシトール等の糖アルコールなど用いることができる。このような細胞収縮試薬９を含む系は、全血を被検査液とする場合に特に有効であり、細胞成分を含まない被検査液を意図する場合には特に必要ではない。
【００３０】
上記バイオセンサによる検査方法について説明する。
微細空間１の端部１１（以下導入部１１という）に被検査液を接触させると、一定量の被検査液が毛細管現象によって自然に微細空間１内に流入し、被検査液中の細胞成分が細胞収縮試薬９の細胞収縮試薬により収縮されつつ展開層２を浸透していく。
【００３１】
被検査液が標識試薬部４に到達すると標識試薬が溶出し、被検査液中に検査対象物質が存在する場合は、溶出した標識試薬と反応して「標識試薬−検査対象物質」複合体を形成する。被検査液中に過剰量の検査対象物質が存在するときは、「標識試薬−検査対象物質」複合体を形成しない「遊離した検査対象物質」のまま残る。そして、「標識試薬−検査対象物質」複合体および「遊離した検査対象物質」被検査液を含んだ被検査液がさらに展開層２を浸透していく。
【００３２】
その中で、「遊離した検査対象物質」は、「標識試薬−検査対象物質」複合体に比較して展開層２での物理的移動速度が速いため、時間的に先行して非測定用固定化試薬部１０に到達し、ここで「固定化試薬Ｂ−検査対象物質」複合体を形成して捕捉される。
【００３３】
「標識試薬−検査対象物質」複合体は、「遊離した検査対象物質」に遅れて非測定用試薬固定部１０に到達し、そのまま通過し、測定用固定化試薬部５に到達して「固定化試薬Ｂ−検査対象物質−標識試薬」複合体を形成して捕捉され、捕捉量に応じた、標識試薬の金コロイドによる呈色反応を示す。
【００３４】
一方、被検査液中に検査対象物質が存在しない（あるいは検出感度以下の量である）場合には、上述のいずれの複合体も形成されず、被検査液は標識試薬を含んだ状態で非測定用固定化試薬部１０および測定用固定化試薬部５を通過する。検査対象物質が存在しない場合も存在する場合も、展開層２を浸透して開放部３に到達した被検査液はここで次第に揮発もしくは蒸発する。
【００３５】
検査結果は、測定用固定化試薬部５での標識試薬の結合による呈色状態を確認することで得る。検査対象物質の有無を調べる定性目的であれば目視による判定も可能である。精度の高い測定が必要な場合は、拡散電磁放射線の反射光や透過光、画像による光学的手段によって、呈色度合いや標識物の結合量を測定することで、定量的な結果を得ることができる。
【００３６】
ここでの電磁放射線は可視領域もしくは近可視領域であることが好ましく、電磁放射線源としては、ＬＥＤ（Light Emitting Diode；発光ダイオード）、ＬＤ（Laser Diode；レーザーダイオード）など、使用者の必要に応じて選択可能である。画像による光学的手段とは、ＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサなどにより画像を取り込んでの任意の解析手段をいう。
【００３７】
以上のバイオセンサ、検査方法によれば、非測定用固定化試薬部１０の存在が、プロゾーン現象を抑制して、高濃度側で、前記低濃度側での検出限界高濃度化を上回る検出限界高濃度化を起こすこととなり、結果として、固定化試薬部が１箇所のみの場合、つまり測定固定化試薬部のみの場合に比べて、広い測定範囲を確保できる。
【００３８】
特に、検査対象物質が単量体であり、且つ、標識試薬部４に用いる抗体と非測定用固定化試薬部１０に用いる抗体とでエピトープが同じである場合には、非測定用固定化試薬部１０を設けることによる低濃度測定範囲を犠牲にすることなく、理想的に高濃度測定範囲を広げることが可能である。しかしそうでない場合でも、非測定用固定化試薬部１０に用いる抗体の濃度、量、範囲の調整や、親和性の相違する抗体を用いるなどによって、非測定用固定化試薬部１０を設けることによる低濃度測定範囲の犠牲を上回る高濃度測定範囲を得ることが可能である。
【００３９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
［イムノクロマトグラフィ試験片の作製］
ａ）測定用固定化試薬部および非測定用固定化試薬部の形成
リン酸緩衝液にて希釈して濃度調整をした抗ＣＲＰ抗体Ａを準備した。またリン酸緩衝液にて希釈して濃度調整をした抗ＣＲＰ抗体Ｂを準備した。
【００４０】
抗ＣＲＰ抗体Ａを吐出装置にてニトロセルロース膜上にライン状に塗布して測定用固定化試薬部とした。この測定用固定化試薬部から２ｍｍだけ導入部寄りの位置に抗ＣＲＰ抗体Ｂを塗布して非測定用固定化試薬部とした。
【００４１】
次いでニトロセルロース膜を乾燥させ、１％スキムミルク含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に浸漬して３０分間緩やかに振った後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に入れて１０分間緩やかに振る洗浄を２回行い、最後に０．０５％スクロースモノラウレート含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に入れて１０分間穏やかに振る界面活性剤処理を行い、室温で乾燥させた。
【００４２】
ｂ）標識試薬部の形成
０．０１％塩化金酸水溶液に還流下（１００℃）で１％クエン酸溶液を終濃度０．０３％になるように加え、還流を２５分間続け、室温放置にて冷却して、金コロイドを得た。この金コロイドは、動的光散乱計（ゼーターナノＺＳ、シスメックス株式会社）によると粒度分布のピークは２０ｎｍであった。
【００４３】
ｐＨ９に調整した金コロイドに、抗ＣＲＰ抗体Ｂを加えて５分間攪拌し、さらにｐＨ９に調整した１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液を最終１％になるように加えて攪拌して、金コロイド- 抗体の複合体である「標識抗体」を生成させた。
【００４４】
標識抗体を含んだ液を４℃、２０１００Ｇで５０分間遠心し、分離された標識抗体を１％ＢＳＡ・５％スクロース（ｐＨ８．９）液に懸濁し遠心することで洗浄し、０．４５μｍのフィルタにて濾過した後、５２０ｎｍの吸光度が１５０になるように１％ＢＳＡ・５％スクロース液で希釈し、４℃で保存した。
【００４５】
この標識抗体を含んだ液を吐出装置にセットし、上述の測定用固定化試薬部および非測定用固定化試薬部を形成したニトロセルロース膜に両固定化試薬部のいずれよりも被検査液導入部寄りとなるように塗布し、塗布後のニトロセルロース膜を真空凍結乾燥させた。これにより、ニトロセルロース膜上に標識試薬部と非測定用固定化試薬部と測定用固定化試薬部とがこの順に並んだ展開層を得た。
【００４６】
ｃ）組立て
上述のｂ）で得た展開層を厚さ０．５ｍｍの白色ＰＥＴからなる基板上に貼り付け、２．０ｍｍの幅で裁断し、裁断後の各片について、標識試薬部よりも始端部寄りの位置から測定用固定化試薬部よりも終端部寄りの位置までの所定範囲を厚さ１００μｍの透明テープを巻き付けて覆い、透明テープで覆わない始端部に微細空間を形成する微細空間形成材を貼り付けることにより、複数のイムノクロマトグラフィ試験片を得た。微細空間形成材は、厚さ１００μｍの透明ＰＥＴを積層して作製したもので、あらかじめ１．５Ｍに調整した塩化カリウム水溶液を点着した後に、液体窒素にて直ちに凍結し、凍結乾燥を行うことにより、塩化カリウムを乾燥状態で保持させた。このイムノクロマトグラフィ試験片を以下、本発明のイムノクロマトグラフィ試験片という。
【００４７】
比較のために、非測定用固定化試薬部を形成しないこと以外は上記と同様にしてイムノクロマトグラフィ試験片を作製した。このイムノクロマトグラフィ試験片を以下、比較例のイムノクロマトグラフィ試験片という。
【００４８】
［試験］
ａ）試料の調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ・２Ｋを加えたヒト血液をヘマトクリット値４０％になるように調整し、調整後の血液（血漿）にＣＲＰ溶液を加えて、ＣＲＰ濃度が０．０３ｍｇ／ｄＬ、０．０６ｍｇ／ｄＬ、０．１ｍｇ／ｄＬ、０．３ｍｇ／ｄＬ、０．６ｍｇ／ｄＬ、１．０ｍｇ／ｄＬ、３．０ｍｇ／ｄＬ、６．０ｍｇ／ｄＬ、１０．０ｍｇ／ｄＬである血液試料を調製した。各血液試料のＣＲＰ濃度は、ラテックス免疫凝集法を用いた市販装置（７０２０型生化学自動分析装置  日立製作所製）及び同装置について指定された試薬を用いて確認した。
【００４９】
ｂ）測定
本発明および比較例のイムノクロマトグラフィ試験片の各々の導入部に、上述の血液試料５μＬを添加し、添加から５分後に、測定用固定化試薬部の呈色状況を反射吸光度測定器（ＣＳ９３００  島津製作所製）で走査して各位置での６３５ｎｍの反射吸光度を測定した。イムノクロマト試験片を走査するのでなく光源側を走査するなど、測定手法は制限されない。
【００５０】
ｃ）結果
図３および図４に本発明および比較例のイムノクロマトグラフィ試験片での測定結果の一例を示す。
【００５１】
図３（ａ）は本発明の試験片（図１参照）で得た波形図である。吸光度のピークは２箇所存在しており、上流側は非測定用固定化試薬部、下流側は測定用固定化試薬部における呈色に対応している。図３（ｂ）は比較例の試験片（図２参照）で得た波形図である。吸光度のピークは１箇所、測定用固定化試薬部の位置に見られる。図３（ａ）と図３（ｂ）とを対比すると、測定用固定化試薬部のみでは測定できない、ある一定濃度以上の検査対象物質が存在したことが明らかである。
【００５２】
図４は各濃度の血液試料について測定用固定化試薬部でのピーク値を読み取った結果を示す。各濃度とも５回の測定を行い平均値をとっている。横軸はＣＲＰ濃度を対数で示しており、縦軸は吸光度（平均値）を対数で示している。本発明の試験片と比較例の試験片とでは、ＣＲＰに対するレスポンスが明らかに異なっている。
【００５３】
比較例の試験片ではＣＲＰ濃度０．０３ｍｇ／ｄＬ以上の血液試料の全てについてシグナルが得られている。ただし、０．０３〜０．６ｍｇ／ｄＬまでの血液試料についてのプロットは、回帰できる直線上に存在していて定量演算が可能であるが、０．６ｍｇ／ｄＬ以上の試料になると徐々にシグナルが低下している。このシグナルの低下はプロゾーン現象が発生していることを示している。ＣＲＰ濃度１．０ｍｇ／ｄＬと０．６ｍｇ／ｄＬとで反射吸光度はほぼ一致しており、また６.０ｍｇ／ｄＬと０．３ｍｇ／ｄＬとで反射吸光度はほぼ一致しており、誤判定する可能性が高い。比較例の試験片によって定量可能な測定範囲は０．０３〜０．６ｍｇ／ｄＬまでの範囲であると言える。
【００５４】
本発明の試験片ではＣＲＰ濃度０．０３ｍｇ／ｄＬを除く血液試料の全てについてシグナルが得られている。０．０６〜３．０ｍｇ／ｄＬまでの血液試料についてのプロットは回帰できる直線上に存在していて定量演算が可能であるが、３．０ｍｇ／ｄＬ以上でプロゾーン現象が発生しシグナルが低下している。本発明の試験片によって定量可能な測定範囲は０．０６〜３．０ｍｇ／ｄＬまでの範囲であると言える。
【００５５】
図５に本発明および比較例の試験片の測定範囲を示す。横軸は図４において対数で示したＣＲＰ濃度を真数に返して表示している。この図５においてより明らかになったように、本発明の試験片の測定範囲（０．０６〜３．０ｍｇ／ｄＬまで）は、比較例の試験片の測定範囲に比べて、低濃度側（０．０３ｍｇ／ｄＬ）を測定できないものの、その犠牲を大幅に上回る測定範囲の拡大が高濃度側にある。本発明の試験片では、比較例の試験片に比べて、大幅な測定範囲拡大が実現されている。
【００５６】
本発明の試験片のように、非測定用固定化試薬部を存在させることにより、低濃度側で検出限界の高濃度化を引き起こす一方で、プロゾーン現象を抑制し、高濃度側で、前記低濃度側での検出限界高濃度化を上回る検出限界高濃度化を起こすため、結果として、比較例の試験片のように固定化試薬部が１箇所（測定用固定化試薬部のみ）の場合に比べて、広い測定範囲を確保できる。試験片の製造は容易で、安価でもある。
【００５７】
なお、検査対象物質としたＣＲＰ（分子）は血液中では５量体で存在しており、固定化試薬部（測定用固定化試薬部、非測定用固定化試薬部）の固定化試薬に用いた抗体がモノクローナル抗体である場合には、抗体に対するエピトープは少なくとも５つ存在する。このため、「検査対象物質（ＣＲＰ）−標識試薬（標識抗体）」複合体についてもＣＲＰのエピトープが露出している場合があり、検査対象物質が低濃度のときに、「検査対象物質−標識試薬」複合体が非測定用固定化試薬部の抗体と反応して捕捉される影響が表れ、低濃度側の測定範囲の低下が起こると考えられる。検査対象物質が単量体であって、尚且つ標識試薬に用いた抗体と非測定用固定化試薬部に用いた抗体とで認識するエピトープが同一であれば、上述の理由で低濃度側の測定範囲が犠牲になることはなく、濃度測定範囲を理想的に広げることが可能となる。
【００５８】
上述のイムノクロマトグラフィ試験片では、抗原抗体反応におけるサンドイッチ反応を利用し、非測定用固定化試薬部と標識試薬部とに同一の抗体を使用したが、抗体の種類は任意であり、使用する濃度についても、使用者の目的等に応じて設定することが可能である。更には必ずしも抗体を使用することは要さず、検査対象物質に対して特異的結合能を持つものであれば使用可能である。検査対象物質と競合的に反応する試薬系を選択すれば競合反応とすることもできる。
【００５９】
また上述のイムノクロマトグラフィ試験片では、標識試薬部は一カ所、固定化試薬部は２箇所（測定用固定化試薬部、非測定用固定化試薬部）としたが、必ずしも１カ所ずつである必要はなく、１カ所以上であればその目的に応じて自在に選択すればよい。使用者の目的等に応じて、固定化試薬部のさらなる複数化や、使用する抗体の親和力に基づいて各固定化試薬部の関係を変更するなども可能である。標識試薬部も必ずしも一カ所でなくてもよく、複数の標識試薬部と複数の固定化試薬部との組合せにより構成することもできる。例えば複数の固定化試薬部の各々の上流側に標識試薬部を配置するなど、任意の位置に任意の数で設置できる。
【００６０】
たとえば、２つの測定対象物を測定する場合、それぞれの測定対象物に対応する２つの異なった固定化試薬部を設置することになるが、１つの測定対象物についての測定固定化試薬部での測定範囲は必要十分であるが、他方の測定対象物についての測定固定化試薬部での測定範囲が必要範囲でないとき、後者の測定対象物に対してだけ、非測定用固定化試薬部を設置すればよい。この場合、非測定用固定化試薬部が１つ、測定用固定化試薬部が２つになる。
【００６１】
また１つの測定対象物についての測定範囲を広げるために、測定対象物に対する反応性（結合の強さ）の相違する２つの測定用固定化試薬部を設置する場合も、プロゾーンを発生させる過剰な測定対象物を取り除く目的で、前記２つの測定用固定化試薬部とは全く別の反応性を持つ非測定用固定化試薬部を設置することにより、両方の測定用固定化試薬部それぞれで測定範囲を広げることが可能となる。この場合も、非測定用固定化試薬部が１つ、測定用固定化試薬部が２つになる。
【００６２】
さらに、２つの測定対象物を測定するために、それぞれの測定対象物に対応する異なった測定用固定化試薬部を設置する場合に、これら２つの測定用固定化試薬部のそれぞれに対応する別途の非測定用固定化試薬部を設置することで、両方の測定用固定化試薬部の測定範囲を広げることが可能となる。この場合、非測定用固定化試薬部が２つ、測定用固定化試薬部が２つになる。
【００６３】
特殊な場合であるが、１つの非測定用固定化試薬部ではプロゾーンを発生させる過剰な測定対象物を取り除けない場合に、同じ測定対象物を捕捉できるが反応性（例えばエピトープなど）の異なる複数の非測定用固定化試薬部（抗体等）を設置することで、測定用固定化試薬部での測定範囲を広げることが可能になる。この場合、非測定用固定化試薬部が２つ、測定用固定化試薬部が１つになる。
【００６４】
いずれの場合も、同じ測定対象物に対する固定化試薬部（測定用、非測定用）が１対以上存在することになる。
標識試薬は、測定対象物によって対応を変える。例えば、全く異なる測定対象物をサンドウィッチ法で検出したい場合は一般に、測定対象物のそれぞれに対応した反応物（抗体など）がカップリングされた全く異なる標識試薬を混合して用いる。しかし１つの標識試薬で複数の測定対象物を測定できる場合（例えばアレルギーＩｇＥ抗体測定などの特異抗体測定手法など）は、その１つの標識試薬を用いればよい。固定化試薬部（測定用、非測定用）の設置は上述の通りである。
【００６５】
なお上述のイムノクロマトグラフィ試験片では、標識試薬部４、測定用固定化試薬部５、非測定用固定化試薬部１０を単一のニトロセルロース膜上に設けたが、たとえば標識試薬部４をニトロセルロース膜とは異なる材質の例えば不織布のような多孔質性担体に設け、それをニトロセルロース膜上に配置しても構わない。また、標識試薬部４、測定用固定化試薬部５、非測定用固定化試薬部１０はそれぞれライン状（帯状）としているが、必ずしもライン状である必要はなく、スポット状、文字形、鍵型など、自在に選択できる。標識試薬に用いた金コロイドはほんの一例に過ぎず、他の金属コロイド、合金、ラテックス粒子などの着色重合体ビーズ、重合染料粒子、磁性粒子などの不溶性粒状マーカーを使用者の必要に応じて任意に選択可能である。
【００６６】
被検査液としては、尿、血液、血漿、血清、唾液などの体液、水、固体（粉体）や気体を溶かした溶液などが挙げられる。したがって検査には、尿検査、血液検査、便検査、水質検査や土壌分析などの環境分析、食品分析などがある。
【００６７】
検査対象物質としては、上述のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のほか、抗体、免疫グロブリン、ホルモン、酵素、ペプチドなどのタンパク質、及びタンパク質誘導体や、細菌、ウイルス、真菌類、マイコプラズマ、寄生虫、及びそれらの産物及び成分などの感染性物質や、治療薬及び乱用薬物などの薬物及び腫瘍マーカーが挙げられる。
【００６８】
たとえば、絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン、濾胞形成ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン、副腎脂質刺激ホルモン、エストラジオール、前立腺特異抗原、Ｂ型肝炎表面抗原、ミオグロビン、ＣＲＰ、心筋トロポニン、ＨｂＡ１ｃ、アルブミン等がある。これらについて、簡便かつ迅速で、高感度・高性能の検査を十分に広い濃度測定範囲で行うことが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のバイオセンサは、臨床分野等の医療診断現場に限らず、食品衛生関連分野、環境計測分野などの様々な分野において、簡易、正確、かつ迅速な測定を行うのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明の一実施形態のバイオセンサの構成図
【図２】従来のバイオセンサの構成図
【図３】本発明および従来のバイオセンサによる測定波形図
【図４】本発明および従来のバイオセンサによる他の測定波形図
【図５】図４の測定波形図に基づく測定範囲概略図
【符号の説明】
【００７１】
１  被検査液導入部（微細空間）
２  展開層
３  開放部
４  標識試薬部
５  測定用固定化試薬部
７  基板
８  微細空間形成材
９  細胞収縮試薬
１０  非測定用固定化試薬部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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