(57)【要約】【課題】細胞接着能に優れる器材コーティングタンパク質、及びコーディング剤を提供する。【解決手段】大腸菌で発現可能なタンパク質に細胞接着配列を付加することにより細胞接着能を有する器材コート用タンパク質を供給する。【選択図】図１
2009051773.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着配列を有するＨＳＰ７０ファミリータンパク質。
【請求項２】
細胞接着配列がＲＧＤ配列、ＰＨＳＲＮ配列、ＬＤＶ配列及びＲＥＤＶ配列から成る群から選ばれる一種以上である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ＨＳＰ７０ファミリータンパク質が、ＨＳＰファミリータンパク質の基質結合ドメインである請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＨＳＰ７０ファミリータンパク質がＤｎａＫタンパク質である請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項５】
ＨＳＰ７０ファミリータンパク質がＤｎａＫの基質結合ドメインであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
ＤｎａＫの基質結合ドメインが欠損、挿入、及び／又は置換を受けていることを特徴とする請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
ＤｎａＫタンパク質のＮ末端から３８７番目のアミノ酸配列の全部又は一部が除去されていることを特徴とする、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項８】
ＤｎａＫタンパク質の少なくともＮ末端から３８７番目以上、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列が除去されていることを特徴とする請求項５に記載のタンパク質。
【請求項９】
ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなる請求項５に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載のタンパク質を含有することを特徴とする器材表面のコート剤。
【請求項１１】
請求項１〜９に記載のタンパク質を含有することを特徴とする細胞培養用もしくは医療用コート剤。
【請求項１２】
請求項１〜９の何れかに記載のタンパク質によってコーティングされたことを特徴とする細胞培養用器材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用の容器や担体等（以下、器材とする）への吸着能及び細胞接着能を有するＨＳＰ７０ファミリータンパク質由来の新規なタンパク質に関する。より詳しくは、細胞培養等に用いられるプラスチック等の樹脂性容器ないしプレートへの吸着能を有し、且つ前記容器やプレート上で培養する細胞に対する接着能を有するタンパク質に関する。更には、該タンパク質を含有する細胞接着用コート剤、医療用コーティング剤及び該タンパク質でコーティングされた細胞培養用器材に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、動物細胞培養技術が注目を集めており、特に動物組織より直接分離した初代細胞などはその有用性の高さから盛んに研究されるようになっている。その中でも、幹細胞は再生医療などの観点から特に注目を集めている。これらの細胞のうち、血球系以外の細胞は、シャーレ等のプラスチック表面に接着しつつ増殖する担体依存性であることが知られている。このような細胞の多くは、培養容器等の表面との接着を媒介する成分（例えば、コラーゲン）で培養容器のプラスチック表面をあらかじめコーティングしていないと正常に接着して増殖できない。コラーゲンはウシやブタなどの生体から分離・精製され供給されることがほとんどであり、品質が安定しないことが多く、また近年、狂牛病や種々の疾病の流行などにより、プリオンやウイルスなどの混入が懸念されている現状もある。また、ポリＬリジンなどのペプチドなども使われるが、コーティング能力や細胞接着能力は十分ではない。このような理由から、十分な培養容器ないしプレートへの吸着能力を有し、且つ細胞接着能力を有する大量生産可能な代替物質が求められている。
【０００３】
コラーゲンなどのタンパク質はプラスチックに吸着しやすい性質と細胞と親和性を示す性質があることが分かっている。コラーゲンの細胞親和性に関しては、様々な研究があり、１９８４年にＥ．  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉにより細胞接着活性部位としてテトラペプチドＲＧＤＳ配列（Ｒ：アルギニン、Ｇ：グリシン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｓ：セリン）が報告されている。その後、セリンがＶ（Ｖａｌ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ａ（Ａｌａ）などで代用できることが分かり、ＲＧＤが最小単位とされた。この配列はフィブロネクチンだけでなく、ビトロネクチン、テネシン、ラミニン、コラーゲン、オステオポンチン、トロンボポンジン、フォンビルブラント因子など１０種類の細胞接着性糖タンパク質に共通な細胞接着活性部位でとして知られるようになっている（非特許文献１）。ＲＧＤ配列の受容体は細胞表面のインテグリンファミリーであることも明らかとなっている。
また、その後の研究で、コラーゲンのＲＧＤ配列の他に、同じくコラーゲン中のＰＨＳＲＮ配列がインテグリンα５β１との相互作用の点で、ＬＤＶ配列とＲＥＤＶ配列がインテグリンα４β１との相互作用の点で重要であることが明らかとなっている。
【０００４】
しかしながら、今まで、コラーゲンの接着配列として知られるＲＧＤ配列を利用した細胞接着用コート剤の開発が進められてきたがあまり芳しい効果が得られていないのが現状である。それは、コーティングの能力と細胞接着の能力をうまく融合させることができなかったことに一部由来していると思われる。すなわち、コーティング剤にうまくＲＧＤ配列を付加できたとしても、器材の表面に効果的に接着配列を提示できなかったり、コーティングの効率が極端に低いなどの理由などにより、うまく細胞接着能を発揮できなかった例が多かったものと推察される。
【０００５】
一方、特許文献１には、大腸菌のＨＳＰ７０ファミリータンパク質の１つであるＤｎａＫの改変体が高いブロッキング能を有することが記載され、免疫アッセイに用いるブロッキング用タンパク質を作製した実験が例示されている。この報告によると、ＤｎａＫの基質結合ドメインは親水性部分（Ｃ末端側）と疎水性部分（Ｎ末端側）に分かれており、疎水性部分をさらに疎水性にすることにより疎水性部分がよりプラスチック表面へ吸着しやすくなるため、ブロッキング能が高まることが述べられている。既に、ＤｎａＫ３８４−６０７の立体構造は明らかとなっている。特に、ＤｎａＫタンパク質の４１９から６０７アミノ酸までを含むフラグメントは最もブロッキング能が高いことが分かっている（ＤｎａＫ  ４１９−６０７）。また、この改変によって、タンパク質分子がより均一に同じ方向を向いて配向しやすくなることも述べられている。このタンパク質は大腸菌で大量生産できるため、プリオンなどの混入の心配が無く、代替ＢＳＡとして有用であると考えられる。しかし、引用文献１はＤｎａＫを利用した培養細胞の器材への接着媒介に関しては何ら触れられておらず、その有効性は未知であった。
【特許文献１】ＷＯ／２００５／００３１５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述するように、本発明の目的は大腸菌等の組換え体で大量生産できる、優れた細胞接着能を有する代替タンパク質、当該タンパク質を含有する細胞培養用器材のコート剤及び当該タンパク質でコーティングされた培養器材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる現状の下、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、十分な細胞吸着能及び器材への吸着能を有する新規なタンパク質を見出し、本発明に至った。即ち、本発明は以下の構成により成る。
項１．  細胞接着配列を有するＨＳＰ７０ファミリータンパク質。
項２．  細胞接着配列がＲＧＤ配列、ＰＨＳＲＮ配列、ＬＤＶ配列及びＲＥＤＶ配列から成る群から選ばれる一種以上である、項１に記載のタンパク質。
項３．  ＨＳＰ７０ファミリータンパク質が、ＨＳＰファミリータンパク質の基質結合ドメインである項１又は２に記載のタンパク質。
項４．  ＨＳＰ７０ファミリータンパク質がＤｎａＫタンパク質である項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
項５．  ＨＳＰ７０ファミリータンパク質がＤｎａＫの基質結合ドメインであることを特徴とする項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
項６．  ＤｎａＫの基質結合ドメインが欠損、挿入、及び／又は置換を受けていることを特徴とする項５に記載のタンパク質。
項７．  ＤｎａＫタンパク質のＮ末端から３８７番目のアミノ酸配列の全部又は一部が除去されていることを特徴とする、項５に記載のタンパク質。
項８．  ＤｎａＫタンパク質の少なくともＮ末端から３８７番目以上、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列が除去されていることを特徴とする項５に記載のタンパク質。
項９．  ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなる項５に記載のタンパク質。
項１０．  項１〜９に記載のタンパク質を含有することを特徴とする器材表面のコート剤。
項１１．  項１〜９に記載のタンパク質を含有することを特徴とする細胞培養用もしくは医療用コート剤。
項１２．  項１〜９の何れかに記載のタンパク質によってコーティングされたことを特徴とする細胞培養用器材。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の新規タンパク質は、細胞培養用の容器や担体などへの優れた吸着能を有し、且つ優れた細胞接着能を有する。よって、本発明の新規タンパク質を細胞培養器材にコーティングすることにより、細胞、特に担体依存性の細胞を容易に前記器材上で培養することができる。また、本発明の新規タンパク質は、大腸菌などを用いた大量且つ安定した生産が可能であり、さらに動物由来の成分タンパク質とは異なり、プリオンなどによる汚染を完全に否定できるという点からも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳説する。
ＨＳＰ７０ファミリータンパク質
ＨＳＰ７０ファミリータンパク質とは、シャペロンタンパク質としても知られるＨＳＰ７０ファミリーに属する一群のタンパク質をいう。ＨＳＰファミリータンパク質は、熱ショックなどによって変性したタンパク質をＤｎａＪやＧｒｐＥと協調して正常に巻き戻す（リフォールディングする）役割を果たしていることが明らかにされている。ＨＳＰファミリータンパク質は、ＡＴＰａｓｅドメインと基質結合ドメインを有する。ＨＳＰ７０ファミリータンパク質は、プラスチック等の器材に吸着する性質を有する。その機構は基質結合ドメインに存在する疎水性部分よってプラスチック等の器材表面に吸着し、親水性部分がその上にかぶさるような形態をとることによって安定的に器材に吸着すると考えられる。このように、ＨＳＰファミリータンパク質が器材表面に吸着する際、当該タンパク質は親水性部分を露呈する配向性があると考えられる。
【００１０】
本発明においてＨＳＰ７０ファミリータンパク質とは、上記のようにプラスチック等の器材表面への吸着能を有するＨＳＰ７０ファミリーに属するタンパク質であり、前記吸着能を有する限りにおいて、天然のＨＳＰファミリータンパク質だけでなく、さらにアミノ酸配列に置換、付加、欠失等の変異を有する改変体も含まれる。上述するように、ＨＳＰ７０ファミリータンパク質は、疎水性の比較的強い配列部分によって器材に吸着すると考えられるため、疎水性部分を保持していることが好ましい。また、基質結合ドメインのβシート構造部分に変異を加えることでβシート部分の疎水性を向上させ、器材への吸着能を向上させたものも好適使用することができる。このような改変は、例えばβシートのＮ末端の一部を除去することで、βシートのより疎水的な部分を露出させることや、βシート上の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換することによって行うことができる。
【００１１】
ＨＳＰ７０ファミリーに属するタンパク質としては、例えば大腸菌のＤｎａＫ、酵母細胞質に存在するＳｓａ１ｐ、酵母ミトコンドリアに存在するＳｓｃ１ｐ、酵母小胞体に存在するＫａｒ２ｐ、哺乳類細胞質に存在するＨＳＰ７０、哺乳類小胞体に存在するＢｉｐ、哺乳類ミトコンドリアに存在するｍＨｓｐ７０、および熱ショックの有無に関わらず恒常的に発現しているＨＳＰ７０のホモログ（相当タンパク質）であるＨＳＣ７０などを挙げることができる。この他にもＨＳＰ７０ファミリーには数多くのホモログが知られており、これらは上述する器材への吸着能を有する限り、いずれのＨＳＰ７０ファミリータンパク質を用いてもよい。
【００１２】
ヒトのＨＳＰ７０はショウジョウバエのものとアミノ酸レベルで７３％と大変高いホモロジーを示し、大腸菌との間においても４７％という比較的高いホモロジーが報告されている（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２：  ６４５５−６４５９  （１９８５））。また、疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸の分布に関しても類似していることが分かっている。特に基質結合ドメインに関しては、Ｎ末端側のβシート構造と、Ｃ末端側のαへリックス構造が高度に保存されていることが示唆されている（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７７：  ４１０６０−４１０６９  （２００２））。このような構造的な類似性からも、本発明のＨＳＰ７０ファミリータンパク質としては、ＨＳＰ７０ファミリータンパク質のいずれをも用いることができると考えられる。好ましいＨＳＰファミリータンパク質は大腸菌由来のＤｎａＫタンパク質であり、より好ましくは、ＤｎａＫタンパク質の基質結合ドメインである。
【００１３】
ＤｎａＫタンパク質は、６３８個のアミノ酸から構成され、１〜３８５番目のアミノ酸より構成されるＡＴＰａｓｅドメインと３８６〜６３８番目のアミノ酸より構成される基質結合ドメインからなる。ＤｎａＫの３８４〜６０７番目のアミノ酸配列の立体構造を図１に示す。配列番号１にＤｎａＫのアミノ酸配列を、また配列番号２にその遺伝子配列を示す。ＤｎａＫの基質結合ドメインはＮ末端側に疎水性の強い部分があるため、ＤｎａＫの基質結合ドメインは、Ｎ末端側を下側に、Ｃ末端側を上側にしてプラスチック表面に吸着していると考えられる。ＤｎａＫタンパク質の中でも、ＡＴＰ結合ドメイン全体と基質結合ドメインの一部を除いた部分配列であるＤｎａＫ４１９−６０７はプラスチックなどの器材表面に対する高い吸着力を有する。また特に、ＤｎａＫ４１９−６０７ではその配向性が顕著である。よって、ＤｎａＫタンパク質由来のタンパク質の中でもＤｎａＫ４１９−６０７を用いることが好ましい。また、ＤｎａＫタンパク質及びその一部のフラグメント（例えば、基質結合ドメイン）のアミノ酸配列に変異を加えることによって得られるさらに器材吸着性の向上したＤｎａＫタンパク質由来のタンパク質を用いることもできる。例えば特許文献１では、基質結合ドメインのＮ末端側のドメインの親水性のアミノ酸（アスパラギン酸）を疎水性アミノ酸（バリン）に置き換えた変異体（ＤｎａＫ  ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ，  Ｄ４８１Ｖ）で更にプラスチック表面への吸着能が向上することが報告されている。
【００１４】
細胞接着配列
本発明において細胞接着配列とは、細胞との接着能を有するアミノ酸配列を意味し、細胞と接着する性質を有する限り如何なるアミノ酸配列であってもよく、糖鎖などによって修飾されていてもよい。好ましくは、フィブロネクチン由来のＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）配列やＰＨＳＲＮ（Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ）配列、ＬＤＶ（Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）配列、ＲＥＤＶ（Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）配列などが用いられ、より好ましくはコラーゲンの細胞接着シグナルでもあるＲＧＤ配列が好適に用いられる。
【００１５】
細胞接着配列を有するＨＳＰ７０ファミリータンパク質
本発明の細胞接着配列を有するＨＳＰ７０ファミリータンパク質とは、前記細胞接着配列とＨＳＰ７０ファミリータンパク質とを組み合せることによって得られる、細胞への接着能及び器材への吸着能を有し、細胞の培養基への接着を媒介するタンパク質である。ここで、ＨＳＰ７０ファミリータンパク質は、上述するように、一部のアミノ酸を欠失する等の変異を有していてもよい。細胞接着配列は、細胞接着能を有する限りＨＳＰ７０ファミリータンパク質のどの領域に存在してもよい。細胞接着配列がＨＳＰ７０ファミリータンパク質中に含まれる場合、タンパク質の立体構造を破壊しないように特定のアミノ酸を置換して、細胞接着配列を形成することができる。また、細胞接着配列を既存のＨＳＰファミリータンパク質を構成するアミノ酸配列に挿入することもできる。好ましくは、細胞接着配列はＨＳＰファミリー由来タンパク質の親水性ドメインに存在する。更に好ましくは、ＨＳＰ７０ファミリータンパク質、特にＤｎａＫの基質結合ドメインに細胞接着配列を、親水性の強い、すなわち器材をコーティングした場合に細胞接着面となる、Ｃ末端側に融合させるのが好ましい。
【００１６】
融合の手段としては、細胞接着配列をコードする配列からなるＤＮＡ断片をＨＳＰ７０ファミリータンパク質遺伝子のＣ末端側にフレームが繋がるように挿入することが最も好適に用いられる。細胞接着配列の前後には、スペーサーとなる配列を挿入しても良い。スペーサー配列としては特に限定されないが、一般的にグリシンやセリンなどの電荷のないものが好適に用いられる。
【００１７】
細胞接着配列は単一の配列のみを単独で用いることもできるが、同一又は異なる細胞接着配列を２つ以上組み合わせてもよく、複数のコピーをＨＳＰ７０ファミリー由来タンパク質に導入しても良い。細胞接着配列の繰り返し回数は、１〜１０回程度が好ましく、より好ましくは１〜６回である。同一又は異なる細胞接着配列が２つ以上含まれる場合、各細胞接着配列は連続的に導入されても、間にスペーサー配列を有してもよい。また、異なる接着配列を有するコーティングタンパク質を調製した後、使用する段階で混合して用いても良い。
【００１８】
ＨＳＰ７０ファミリータンパク質は、前後に余分な配列を含んでも良い。部分配列を発現させる際は、当然Ｎ末端側に開始コドンに相当するメチオニンンが必須であるし、制限酵素配列でベクターに遺伝子を挿入するような場合は、制限酵素配列に相当するアミノ酸が挿入される。更には、精製のためにタグ配列を付加しなくてはならない場合も多い。例えば実施例で用いたＤｎａＫタンパク質は、ＤｎａＫタンパク質のＮ末端側にヒスチジンタグ（ヒスチジンを６回繰り返した配列）を融合し、ニッケルキレートカラムを用いて簡便に精製を行い、評価を行っている。このＮ末端のヒスチジンタグは、ＤｎａＫ４１９−６０７のプラスチック表面のブロッキング効果に影響を及ぼさないことが特許文献１に記載されている。
【００１９】
様々な条件を検討した結果、実施例に示すように、Ｃ末端側にＲＧＤ配列を付加するように改変されたＤｎａＫ４１９−６０７タンパク質を用いてコートされたポリスチレン容器は、ＲＧＤ配列を融合していないＤｎａＫ４１９−６０７タンパク質を用いてコートされたポリスチレン容器を用いたものに比べ高い細胞接着能を示すことが明らかとなった。
【００２０】
本発明の細胞接着配列を有するＨＳＰ７０ファミリータンパク質は、細胞接着配列及びＨＳＰ７０ファミリータンパク質のアミノ酸配列ないし塩基配列を基に、公知の遺伝子組み換え技術を用いて容易に製造可能である。当該タンパク質の発現の宿主としては、特に限定されないが、大腸菌が最も好適に用いられる。特にＤｎａＫタンパク質は大腸菌に由来するタンパク質であり、大腸菌を宿主として用いることで大量発現が可能であることが確かめられている。
【００２１】
細胞接着配列を有するＨＳＰ７０ファミリータンパク質の精製は、タンパク質の一般的な精製方法に従えばよく、特に限定されない。精製用のタグを融合させて発現させても良い。タグの種類は特に限定されないが、ヒスチジンタグなどの比較的分子量の小さなタグが好適に用いることができる。
【００２２】
精製は、場合によって粗精製でもよい。例えば、熱処理などを挙げることができる。ＨＳＰ７０ファミリータンパク質は熱ショックタンパク質として知られており、７０℃以上の温度でも変性しにくい性質を有していることから、加温処理によっても凝集しないことを利用して精製することが可能である。
【００２３】
精製したタンパク質は、水や緩衝液、細胞培養用の培地などに溶解して用いることができる。緩衝液、および細胞培養用の培地は特に種類は限定されない。器材をコーティングするときの妨げとなるため、溶液は、別のタンパク質成分を含まないことが好ましい。
また本発明は、本発明の細胞接着配列を有するＨＳＰ７０ファミリータンパク質由来のタンパク質を含む細胞培養用器材コート剤である。本発明のコート剤は、２種以上の細胞接着配列を有するＨＳＰ７０ファミリータンパク質由来のタンパク質の組み合せを含んでもよく、当該タンパク質の器材吸着能及び細胞接着能を阻害しない範囲で適宜他の成分を含んでもよい。
【００２４】
本発明の細胞接着配列を有するＨＳＰ７０ファミリータンパク質由来のタンパク質を適用する器材としては、細胞や生体に悪影響を及ぼさないものであれば制限無く使用でき、特に限定されないが、プラスチックなど疎水的な表面を持つ器材のコーティングに好適に用いることができる。特に、ポリスチレンやポリプロピレン製の器材のコーティングに用いると良い。本発明の細胞接着配列を有するＨＳＰ７０ファミリータンパク質を用いて培養用器材や医療用器具をコーティングする場合、通常０．１μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである。
本発明は、上に記載したＨＳＰ７０ファミリータンパク質を含有する細胞培養用もしくは医療用コート剤である。当該コート剤は、粉末、もしくは溶液として供給される。
【００２５】
細胞培養用としては、通常の培養時による表面コートが必要な細胞の培養時に用いることができる。適応可能な細胞としては、主に接着性の細胞を挙げることができる。特に、近年、研究が盛んとなっている初代細胞の培養、特に幹細胞の培養にも用いることができる。哺乳動物由来の細胞としては、皮膚に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、血管に関与する細胞（血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等）、筋肉に関与する細胞（筋肉細胞等）、脂肪に関与する細胞（脂肪細胞等）、神経に関与する細胞（神経細胞等）、肝臓に関与する細胞（肝実質細胞等）、膵臓に関与する細胞（膵ラ島細胞等）、腎臓に関与する細胞（腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等）、肺・気管支に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、目に関与する細胞（視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等）、前立腺に関与する細胞（上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞等）、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯に関与する細胞（歯根膜細胞及び骨芽細胞等）、血液に関与する細胞（白血球及び赤血球等）、及び幹細胞｛例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞（oval cell、small hepatocyte等）、脂肪組織幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、精子幹細胞、胚生殖幹細胞、膵臓幹細胞（膵管上皮幹細胞等）、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、角膜系幹細胞、前駆細胞（脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞等）等｝等を挙げることができる。さらに好ましくは、リンパ球系細胞を除く、接着して増殖する性質を有する上記細胞を挙げることができる。
【００２６】
医療用コート剤としては、細胞保存用バッグやカテーテル、インプラントなどの表面のコーティングに用いるものが挙げられる。
【００２７】
さらに、本発明は、上記タンパク質を含有する試薬・キットにも関する。
【００２８】
さらに本発明は、本発明の細胞接着配列を有するＨＳＰ７０ファミリータンパク質由来のタンパク質でコーティングされた細胞培養用器具及び医療用器具に関する。
【実施例】
【００２９】
以下に本発明の実施例を挙げることにより、本発明による効果をより一層明瞭なものとする。ただし、これらの実施例によって本発明の範囲は限定されるものではない。
実施例１：  ＲＧＤ配列を含むＤｎａＫフラグメントのクローニング、発現
ＤｎａＫフラグメントは大腸菌Ｋ−１２株より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いて目的遺伝子断片を増幅し、クローニングした。遺伝子のＰＣＲ増幅には東洋紡製のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用いた。具体的にＤｎａＫ  ４１９−６０７の増幅には、５０μｌの反応液中、反応用バッファー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、配列番号３および４、３および５、３および６、３および７、３および８、もしくは３および９に示すプライマーを１５ｐｍｏｌｅ、ポリメーラーゼ１ｕｎｉｔおよび大腸菌ＤＮＡ  １００ｎｇとなるように調製し、９４℃・２分間の後、９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを２５回行った。増幅したＤＮＡ断片は制限酵素ＢａｍＨＩにて消化し、ｐＱＥ３０のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩサイトへクローニングした（ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−によって増幅されたＤＮＡ断片は平滑化されているため、増幅断片の下流側についてはそのまま使用した）。クローニングした遺伝子の配列はシーケンス解析により確認した。このベクターにクローニングすることにより目的タンパク質のＮ末端に６×Ｈｉｓ配列（Ｈｉｓタグ）を付加することができる。このようにして、発現プラスミドｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７（配列番号３・４のプライマーで調製）、Ｃ末端にＲＧＤ（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）配列を有するｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７−ＲＧＤ（配列番号３・５のプライマーで調製）、Ｃ末端にＲＧＤ配列を３回繰り返して含むｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７−ＲＧＤ×３（配列番号３・６のプライマーで調製）、及びＰＨＳＲＮ（Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ）配列を含むｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７−ＰＨＳＲＮ（配列番号３・７のプライマーで調製）、ＬＤＶ（Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）配列を含むｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７−ＬＤＶ（配列番号３・８のプライマーで調製）、およびＲＥＤＶ（Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）配列を含むｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７−ＲＥＤＶ（配列番号３・９のプライマーで調製）を調製した。
【００３０】
タンパク質の発現・精製は、遺伝子を導入したＪＭ１０９をＬＢ培地にて、３７℃、１６時間振とう培養し、菌体を遠心分離法により回収し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）  へ懸濁、超音波破砕を行った後、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１０分間微量高速遠心機を用いて遠心して得られた上清を用いて行った。具体的には、ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ  ＨＣ  Ｎｉｃｋｅｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ  （ＳＩＧＭＡ社製）を用いて、精製し、最終的に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）  に対して一晩透析し、実験に用いた。タンパク質濃度の測定は、紫外吸収（Ａ２１５ｎｍ、Ａ２２５ｎｍ）を指標として、以下の計算式に基づき行った。
・蛋白質濃度（μｇ／ｍｌ）＝（２１５ｎｍでの吸収−２２５ｎｍでの吸収）×１４４
【００３１】
実施例２：細胞接着能の確認
細胞接着活性配列であるＲＧＤ配列をＣ末端に組込んだＤｎａＫ４１９−６０７（ＤｎａＫ４１９−６０７＋ＲＧＤ）を細胞の足場として用いて、細胞接着能の評価を行った。具体的には、ＤｎａＫ４１９−６０７＋ＲＧＤを９６  ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにコーティングした後、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を蒔種し、その接着能を検鏡、およびＭＴＴアッセイ法（正確にはＭＴＴではなくＷＳＴ−８を使用）にて生細胞数を比較した。まず、ＤｎａＫ４１９−６０７及びＤｎａＫ４１９−６０７＋ＲＧＤを２ｍｇ／ｍＬ，２００μｇ／ｍＬ，２０μｇ／ｍＬ，２μｇ／ｍＬとなるように２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．０）で希釈し、９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  （ｎｕｎｃ社製，材質：ポリスチレン）に分注し、４℃で５時間静置した後、ＰＢＳ（−）２００  μＬでウェルを３回洗浄した。その後、各ウェルにＮＩＨ３Ｔ３細胞懸濁液を１００  μｌ（５×１０３  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）加え、５％ＣＯ２，３７℃の条件下で２４時間培養した。培地は、５％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。２４時間細胞培養後、プレートのウェル内の培養液を捨て、各ウェルをＰＢＳ（−）２００  μＬで３回洗浄した後、ＤＭＥＭで５倍希釈したＷＳＴ−８キット（キシダ化学株式会社製）を各ウェルに５０μｌずつ添加した。その後、５％ＣＯ２，３７℃の条件下で４時間呈色を行い、その後０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌを１０μＬ添加して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３２】
２４時間培養後のＮＩＨ３Ｔ３細胞の位相差顕微鏡による観察像を図２に示す。写真より、ＤｎａＫ４１９−６０７＋ＲＧＤはＤｎａＫ４１９−６０７に比べて、低濃度でコーティングした場合においても明らかに細胞の接着数は多く、また伸展していることが明らかである。
【００３３】
また、ＭＴＴアッセイにおいては、２ｍｇ／ｍＬ  ＤｎａＫ４１９−６０７＋ＲＧＤをコーティングすることで、コントロールに比べて値は約１１倍に増加した（図３）。また、２００μｇ／ｍＬ，２０μｇ／ｍＬではそれぞれ、約８倍、約４倍に増加した。このことからも、ＤｎａＫ４１９−６０７＋ＲＧＤは細胞足場として有用であるのではないかと考えられる。
【００３４】
また、Ｃ末端にＲＧＤ配列を３回繰り返して含むＤｎａＫ４１９−６０７＋ＲＧＤ×３、及びＰＨＳＲＮ配列を含むＤｎａＫ４１９−６０７＋ＰＨＳＲＮ、ＤＥＶ配列を含むＤｎａＫ４１９−６０７＋ＤＥＶ、およびＲＥＶＤ配列を含むＤｎａＫ４１９−６０７＋ＲＥＤＶに関してもほぼ同様な有意な傾向が得られた。また、コラーゲンとの比較も行い、同等、もしくはそれ以上の効果を得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明により、細胞接着能を向上させた器材コーティング用のタンパク質を、より大量に、大腸菌を用いて生産することができるようになり、従来の家畜等の動物から分離する方法と比べ、使用にあたりプリオンやウイルス等の混入を憂慮する必要が無くなることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＤｎａＫ３８４−６０７の立体構造を示す図
【図２】ＲＧＤ配列を付加したＤｎａＫ４１９−６０７の細胞接着試験結果（ＭＴＴアッセイ）
【図３】ＲＧＤ配列を付加したＤｎａＫ４１９−６０７の細胞接着試験結果（顕微鏡観察）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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