(57)【要約】      （修正有）【課題】ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を含む発現ベクター、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を安定に発現する細胞系、およびそれらの発現ベクターおよび宿主細胞を用いてポリペプチドを作る方法の提供。【解決手段】ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を含む発現ベクター、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を安定に発現する細胞系、およびそれらの発現ベクターおよび宿主細胞を用いてポリペプチドを作る方法、およびメラノーマまたはＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍および種々の疾患を治療および軽減する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦ−Ｄ、または、ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを、安定に発現するヒト細胞系。
【請求項２】
前記細胞系によって産生されるＶＥＧＦ−Ｄが、エピトープタグに連結している、請求項１に記載の細胞系。
【請求項３】
前記エピトープタグが、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘキサヒスチジン（hexahistidine）、またはＩ−ＳＰＹ（商標）である、請求項２に記載の細胞系。
【請求項４】
２９３−ＥＢＮＡ胎児性腎臓細胞系である、請求項１、請求項２または請求項３に記載のヒト細胞系。
【請求項５】
発現されるＶＥＧＦ−Ｄが、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＣＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ、またはＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃである請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞系。
【請求項６】
ＶＥＧＦ−Ｄのフラグメントが、配列番号１のアミノ酸配列からなるＶＥＧＦ−Ｄの部分である請求項１に記載の細胞系。
【請求項７】
ＶＥＧＦ−Ｄのフラグメントが、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに連結した、配列番号１のアミノ酸配列からなるＶＥＧＦ−Ｄの部分である請求項１に記載の細胞系。
【請求項８】
哺乳類の発現ベクターに挿入された、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログをコードするヒトＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項９】
前記発現ベクターが、Ａｐｅｘ−３である請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記発現ベクターが、ｐＶＤＡｐｅｘ△Ｎ△Ｃである請求項８または請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
アフィニティータグをコードする配列を含む請求項８または請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記アフィニティータグが、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘキサヒスチジン(hexahistidine)、またはＩ−ＳＰＹ（商標）である請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか一項に記載のベクターでトランスフォーム(transform)またはトランスフェクト(transfect)された宿主細胞。
【請求項１４】
配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを作る方法であって、宿主細胞中で請求項８または請求項９に記載の発現ベクターを発現させる工程、および、宿主細胞から、または、宿主細胞の増殖培地からポリペプチドを単離する工程、を有する配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを作る方法。
【請求項１５】
前記発現ベクターが、アフィニティータグをコードする配列を含むものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アフィニティータグが、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘキサヒスチジン、またはＩ−ＳＰＹ（商標）である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
悪性のメラノーマの治療または軽減方法であって、
メラノーマの付近においてＶＥＧＦ−Ｄの発現または活性を阻害するために有効な阻害量（inhibitory amount）のＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストを投与する工程を含む、悪性のメラノーマの治療または軽減方法。
【請求項１８】
前記ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストが、アンチセンス核酸またはＶＥＧＦ−Ｄをコードする三本鎖ＤＮＡである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストが、ＶＥＧＦ−Ｄ変異体ポリペプチドである請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストが、ＶＥＧＦ−Ｄに特異的に反応する、抗体またはそのＦ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ’）若しくはＦ（ａｂ）フラグメントを含む組成物である請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、モノクローナル抗体、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）フラグメントまたはそのキメラ（chimeric）モノクローナル抗体である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍の治療または軽減方法であって、前記腫瘍の付近において有効な阻害量（inhibitory amount）のＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストを投与する工程を含む、ＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍の治療または軽減方法。
【請求項２３】
ＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍の治療または軽減方法であって、腫瘍阻害活性を有する毒素または薬剤に結合した（conjugated）有効な阻害量（inhibitory amount）の、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄ受容体結合活性（binding activity）に結合する能力のあるそのフラグメントまたはアナログを投与する工程を含む、ＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍の治療または軽減方法。
【請求項２４】
皮膚移植の受け入れ（acceptance）および／または治癒を増強する方法であって、血管新生およびリンパ脈管形成（lymphangiogenesis）を刺激するのに有効な量の、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを投与する工程を含む、皮膚移植の受け入れおよび／または治癒を増強する方法。
【請求項２５】
皮膚に対する外科または外傷の創傷の治癒を刺激する方法であって、血管新生およびリンパ脈管形成（lymphangiogenesis）を刺激するのに有効な量の、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを投与する工程を含む、皮膚に対する外科または外傷の創傷の治癒を刺激する方法。
【請求項２６】
ＶＥＧＦ−Ｄの受容体−結合特異性を調節する方法であって、プロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現させる工程、および、発現されたプロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄをプロセシングして、タンパク分解性にプロセシングされた形態のＶＥＧＦ−Ｄを産生するために、少なくとも１つのタンパク分解量（proteolytic amount）の酵素を供給する工程、を有する、ＶＥＧＦ−Ｄの受容体−結合特異性を調節する方法。
【請求項２７】
ＶＥＧＦ−Ｄのタンパク分解フラグメントを作成する方法であって、プロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現させる工程、および、発現されたプロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄをプロセシングして、タンパク分解性にプロセシングされたＶＥＧＦ−Ｄのフラグメントを産生するために、少なくとも１つのタンパク分解量（proteolytic amount）の酵素を供給する工程、を有する、ＶＥＧＦ−Ｄのタンパク分解フラグメントを作成する方法。
【請求項２８】
生物学的サンプルにおいてＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍を検出する方法であって、前記サンプルをＶＥＧＦ−Ｄに対する特異的結合性試薬に接触させる工程、前記特異的結合性試薬のＶＥＧＦ−Ｄに対する結合のために時間を与える工程、および前記結合を検出する工程、を有する、生物学的サンプルにおいてＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍を検出する方法。
【請求項２９】
前記特異的結合性試薬が、第１（first）抗体である請求項２８に記載の生物学的サンプルにおいてＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍を検出する方法。
【請求項３０】
前記結合を検出可能な標識を備えた第二抗体によって検出する、請求項２９に記載の生物学的サンプルにおいてＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍を検出する方法。
【請求項３１】
リンパ浮腫の治療または軽減方法であって、リンパ脈管形成を刺激するのに有効な量の、ＶＥＧＦ−Ｄ、または、ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを投与する工程を含む、リンパ浮腫の治療または軽減方法。
【請求項３２】
乾癬の治療または軽減方法であって、有効な阻害量のＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストを投与する工程を含む、乾癬の治療または軽減方法。
【請求項３３】
強皮症の治療または軽減方法であって、内皮の増殖を刺激するのに有効な量の、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを投与する工程を含む、強皮症の治療または軽減方法。
【請求項３４】
無汗性外胚葉性異形成の治療または軽減方法であって、血管新生を刺激するのに有効な量の、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを投与する工程を含む、無汗性外胚葉性異形成の治療または軽減方法。
【請求項３５】
血管透過性を誘導せずに、内皮細胞の増殖、遊走、生存および分化、および、リンパ脈管形成から選択される、ＶＥＧＦ−Ｄの少なくとも１つの生物活性を刺激する方法であって、生物活性を刺激する量の完全にプロセシングされたＶＥＧＦ−Ｄを投与する工程を含む、ＶＥＧＦ−Ｄの少なくとも１つの生物活性を刺激する方法。
【請求項３６】
配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを、安定に発現する哺乳類の細胞系。
【請求項３７】
前記細胞系によって産生されるポリペプチドがエピトープタグに連結している、請求項３６に記載の哺乳類の細胞系。
【請求項３８】
前記エピトープタグが、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘキサヒスチジン、またはＩ−ＳＰＹ（商標）である、請求項３７に記載の哺乳類の細胞系。
【請求項３９】
前記エピトープタグが、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドである、請求項３７または請求項３８に記載の哺乳類の細胞系。
【請求項４０】
発現するポリペプチドが、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃである、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の哺乳類の細胞系。
【請求項４１】
２９３−ＥＢＮＡヒト胎児性腎臓細胞系である、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の哺乳類の細胞系。
【請求項４２】
ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＣＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ、またはＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃを安定に発現する哺乳類の細胞系。
【請求項４３】
２９３−ＥＢＮＡヒト胎児性腎臓細胞系である請求項４２に記載の哺乳類の細胞系。
【請求項４４】
ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストが、ＶＥＧＦ−Ｄに特異的に反応するキメラ（chimeric）抗体である請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景および概要 
本発明は、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を含む発現ベクター、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を安定に発現する細胞系、および、これらの発現ベクターおよび宿主細胞を用いてポリペプチドを作る方法に関する。本発明はまた、メラノーマおよび種々の疾患を治療および軽減する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、組織の正常な成長および発達のために必要な基礎的なプロセスであり、既存の血管からの新しい毛細血管の増殖に関与する。血管新生は胚の発生および正常な組織の成長、修復、および再生に関わっているだけでなく、女性の生殖のサイクル、妊娠の確立および維持に、そして創傷および骨折の修復にも関与している。正常な個体において起こる血管新生の他に、血管形成の現象は、特に腫瘍増殖および転移、そしてとりわけ微小血管系の血管増殖が増加するようなその他の状態、例えば糖尿病性網膜症、乾癬および関節症などの多くの病理学的プロセスに関与している。血管新生の阻害はそのような病理学的プロセスを防止または軽減することにおいて有用である。
【０００３】
一方、血管新生(angiogenesis)の促進は、例えば、組織または器官の移植の後、あるいは、虚血性心疾患および閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis obliterans)などの組織梗塞または動脈狭窄において側副循環の確立を刺激するために、血管新生（vascularization）が確立または伸展されるべき状況において望ましい。
【０００４】
血管新生は非常に多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて重大な役割を持つことから、血管新生の調節に関与する因子について集中的に研究されてきた。多くの増殖因子が血管新生の調節に関与していることが示されている。これらには、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が含まれる。例えば、概説として、フォークマン（Folkman）他, J. Biol. Chem., 1992 267 10931-10934を参照されたい。
【０００５】
特定のファミリーの内皮細胞−特異的増殖因子およびそれらに対応する受容体は、主に内皮細胞の増殖および分化の刺激について、そして分化細胞のある機能についての原因であるということが示唆されている。これらの因子はＰＤＧＦファミリーのメンバーであり、第一に内皮の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を介して作用するようである。今までにいくつかの血管内皮増殖因子ファミリーメンバーが同定されている。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、複数のソースから単離されているホモダイマーの糖タンパク質である。ＶＥＧＦは内皮細胞に対して高度に特異的な分裂促進活性を示し、血管新生に通じる全ての一連の現象を刺激することができる。さらにそれは、単球に対する強い化学誘引物質活性を有しており、内皮細胞におけるプラスミノーゲンアクチベーターおよびプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターを誘導することができ、また、微小血管の透過性にも影響することができる。後者の活性のために、それは血管透過因子（ＶＰＦ）と称されることもある。ＶＥＧＦの単離および性質について概説されている；ファーララ（Ferrara）他, J. Cellular Biochem., 1991 47 211-218およびコノリー（Connolly）, J. Cellular Biochem., 1991 47 219-223を参照されたい。
【０００６】
より最近では、ＶＥＧＦファミリーの６つのさらなるメンバーが同定された。これらは以下のように命名されている。即ち、ＶＥＧＦ−Ｂ、これはLudwig Institute for Cancer Research および The University of Helsinki によって、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７（ＷＯ９６／２６７３６）において、そして、米国特許５，８４０，６９３号および５，６０７，９１８号において記載されている；ＶＥＧＦ−Ｃ、これはヨウコフ（Joukov）他, The EMBO Journal, 1996 15 290-298において記載されている；ＶＥＧＦ−D、これは国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）において記載されている；胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、これはマグリオーネ（Maglione）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991 88 9267-9271 において記載されている；ＶＥＧＦ２、これはHuman Genome Sciences, Inc によって国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２９１（ＷＯ９５／２４４７３）において記載されている；そしてＶＥＧＦ３、これはHuman Genome Sciences, Inc によって国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７２８３（ＷＯ９６／３９４２１）において記載されている。それぞれが３０％から４５％のＶＥＧＦとのアミノ酸配列アイデンティティを示す。ＶＥＧＦファミリーメンバーは、システインノットモチーフを形成する６つのシステイン残基を含むＶＥＧＦホモロジードメインを共有している。ＶＥＧＦファミリーの機能の特性には、異なる程度の、内皮細胞に対する分裂促進性、血管透過性の誘導、そして、血管形成およびリンパ脈管形成(lymphangiogenic)の性質が含まれる。
【０００７】
ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦと類似の血管形成およびその他の性質を有しているが、ＶＥＧＦとは異なる組織において分布および発現している。特に、ＶＥＧＦ−Ｂは、心臓において非常に強く発現しており、肺においては弱くしか発現していないが、ＶＥＧＦの場合は逆である。これは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｂは、多くの組織において共発現している(co-expressed)という事実にもかかわらず、機能の差を有している可能性があるということを示唆するものである。
【０００８】
ＶＥＧＦ−Ｂは、酵母共ハイブリッド(co-hybrid)相互作用トラップスクリーニング技術を用いて、細胞のレチノイン酸−結合タンパク質タイプＩ（ＣＲＡＢＰ−Ｉ）と相互作用する可能性のある細胞のタンパク質をスクリーニングすることによって単離された。その単離および特性は、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２５９７およびオロフソン（Olofsson）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996 93 2576-2581において詳細に記載されている。
【０００９】
ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３を発現するようにトランスフェクト(transfect)された細胞を用いて、内皮細胞−特異的受容体チロシンキナーゼＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）のチロシンリン酸化を引き起こす培地の能力についてスクリーニングすることによって、ＰＣ−３前立腺癌細胞系（ＣＲＬ１４３５）のならし培地(培養上清conditioned medium)から単離された。ＶＥＧＦ−Ｃは組換えＶＥＧＦＲ−３を用いたアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され、そしてＰＣ−３ ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。その単離および特性は、ヨウコフ（Joukov）他, The EMBO Journal, 1996 15 290-298において詳細に記載されている。
【００１０】
ＶＥＧＦ−Ｄは、Clontechから販売されているヒト乳房ｃＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーションプローブとして“Soares Breast 3NbHBst”と命名されているヒトｃＤＮＡライブラリーから得たＥＳＴ（expressed sequence tag）を用いてスクリーニングすることによって単離された（アーヘン（Achen）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 95 548-553）。その単離および特性は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６において詳細に記載されている。
【００１１】
ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６において、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと命名された、ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的に活性のフラグメントの単離についても記載されている。このフラグメントは、アフィニティータグペプチドＦＬＡＧ（登録商標）に連結した、ＶＥＧＦ−Ｄアミノ酸残基９３から２０１からなる。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）の全体の開示を参考文献として本出願に合体させる。
【００１２】
ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦファミリーのその他のメンバーに対する構造的な類似性を有している。しかし、そのような構造的な類似性にもかかわらず、それは、構造的および機能的にＶＥＧＦファミリーのその他のメンバーから区別される。ヒトＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦ−Ｃに対して４８％しか同一ではなく、ＶＥＧＦ−ＣはＶＥＧＦ−Ｄと最も密接に関連している、ファミリーのメンバーである。
【００１３】
ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子は成人のヒトにおいて広く発現しているが、必ず至るところに発現しているという訳ではない。ＶＥＧＦ−Ｄは、心臓、肺および骨格筋において強く発現している。中度のレベルのＶＥＧＦ−Ｄが、脾臓、卵巣、小腸および大腸において発現しており、腎臓、膵臓、胸腺、前立腺および精巣においてはより低い発現が起こっている。脳、胎盤、肝臓または末梢血白血球からのＲＮＡにおいてはＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡは検出されなかった。
【００１４】
ＰｌＧＦは、末期 （term）胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離された。その単離および特性は、マグリオーネ（Maglione）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991 88 9267-9271において詳細に記載されている。現在その生物学的機能についてはあまり理解されていない。
【００１５】
ＶＥＧＦ２は、高度に腫瘍形成性の（tumorgenic）、エストロゲン−非依存性ヒト乳癌細胞系から単離された。この分子はＰＤＧＦに対して約２２％のホモロジーを、そしてＶＥＧＦに対して３０％のホモロジーを有するといわれているが、ＶＥＧＦ２をコードする遺伝子の単離方法は不明暸であり、生物学的活性の特徴づけについては開示されていない。
【００１６】
ＶＥＧＦ３は、大腸組織に由来するｃＤＮＡライブラリーから単離された。ＶＥＧＦ３はＶＥＧＦに対して約３６％のアイデンティティおよび６６％の類似度を有するといわれている。ＶＥＧＦ３をコードする遺伝子の単離方法は不明暸であり、生物学的活性の特徴づけについては開示されていない。
【００１７】
血管内皮増殖因子は第一に受容体チロシンキナーゼに結合することによって作用すると思われる。５つの内皮細胞−特異的受容体チロシンキナーゼ、すなわち、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）、ＴｉｅおよびＴｅｋ／Ｔｉｅ−２、が同定されている。これらのすべてはシグナル伝達に必要な固有のチロシンキナーゼ活性を有している。ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＴｉｅおよびＴｅｋ／Ｔｉｅ−２の血管形成および血管新生における、重要な特異的な役割が、マウス胚においてこれらの受容体を不活性化する標的化(targeted) 突然変異によって実証されている。
【００１８】
ＶＥＧＦ類に結合することが知られている受容体チロシンキナーゼは、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３のみである。ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２とは、ＶＥＧＦに高いアフィニティーで結合し、ＶＥＧＦＲ−１は、ＶＥＧＦ−Ｂにも結合する。ＶＥＧＦ−ＣはＶＥＧＦＲ−３に対するリガンドであることが示されており、ＶＥＧＦＲ−２も活性化する（ヨウコフ（Joukov）他、The EMBO Journal, 1996 15 290-298）。ＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦ−Ｃと受容体特異性を共有する（アーヘン（Achen）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 95 548-553）。Ｔｅｋ／Ｔｉｅ−２に対するリガンドは記載されている（Regeneron Pharmaceuticals, Inc. による国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２９３５（ＷＯ９６／１１２６９））；しかしながら、Ｔｉｅに対するリガンドは同定されていない。
【００１９】
ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦ−Ｃの一次翻訳産物は、中心のＶＥＧＦホモロジードメイン（ＶＨＤ）に加えて、長いＮ−末端およびＣ−末端ポリペプチド延長を有している。ＶＥＧＦ−Ｃの場合、これらのポリペプチド延長はプロペプチドであり、プロペプチドはタンパク分解性に切断されて、ＶＨＤのみからなりＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３に対して結合する能力のある分泌される形態を生じる（ヨウコフ（Joukov）他, The EMBO Journal, 1996 15 290-298； ヨウコフ（Joukov）他, EMBO J., 1997 16 3898-3911)。同様に、ＶＨＤのみからなる組換え型のＶＥＧＦ−Ｄは、これらの受容体に結合して活性化すること、および内皮細胞に対して分裂促進的であることが示されたが、ＶＥＧＦ−Ｄプロセシングについては特徴づけられていない（アーヘン（Achen）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 95 548-553）。
【００２０】
最近、新規な１３０−１３５ｋＤａのＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム特異的受容体が精製およびクローニングされた（ソーカー（Soker）他, Cell, 1998 92 735-745)。このＶＥＧＦ受容体は、エキソン７にコードされる配列を介して、ヘパリンに対して弱いアフィニティーを示すＶＥＧＦ−Ａ165アイソフォームに特異的に結合することが判明した（ソーカー（Soker）他, Cell, 1998 92 735-745)。驚いたことに、この受容体は初期の神経形態形成（neuromorphogenesis）に関与する受容体である、ヒトニューロピリン（neuropilin）−１（ＮＰ−１）と同一であることが示された。ＰｌＧＦ−２もＮＰ−１と相互作用すると思われる（ミッドガル（Midgal）他, J. Biol. Chem., 1998 273 22272-22278）。
【００２１】
遺伝子ターゲッテッイング研究により、胚の発生のために、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３が絶対的に必要であることが実証された。これらの研究は、ＶＥＧＦＲ−１は血管内皮管形成において役割を果たすということ、ＶＥＧＦＲ−２は内皮／造血細胞の分化および有糸分裂誘発のために重要であること、そしてＶＥＧＦＲ−３は血管の再構築の調節、大血管の形成およびリンパ脈管形成（lymphangiogenesis）に関与しているということを示すものである。これらの受容体の機能は、ムストネン（Mustonen）およびアリタロ（Alitalo）, J. Cell Biol., 1995 129 895-898において概説されている。
【００２２】
ＶＥＧＦＲ−３は、胎児においては静脈およびリンパの内皮において発現しており、成体においては主にリンパの内皮において発現している（カイパイネン（Kaipainen）他, Cancer Res, 1994 54 6571-6577; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995 92 3566-3570）。ＶＥＧＦＲ−３は、リンパ管の出現の前の胚の心臓血管系の発達において重要な役割を有する（デュモン（Dumont）他, Science, 1998 282 946-949）。ＶＥＧＦ−Ｃはリンパ内皮において第一の機能を有しており、血管新生および透過性の調節において、ＶＥＧＦと共有される第二の機能を有している可能性があるということが示唆されている（ヨウコフ（Joukov）他, The EMBO Journal, 1996 15 290-298）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】国際公開第９６／２６７３６号（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７号）
【特許文献２】米国特許５，８４０，６９３号
【特許文献３】米国特許５，６０７，９１８号
【特許文献４】国際公開第９８／０７８３２号（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６号）
【特許文献５】国際公開第９５／２４４７３号（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２９１号）
【特許文献６】国際公開第９６／３９４２１号（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７２８３号）
【特許文献７】国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２５９７号
【特許文献８】国際公開９８／０７８３２号（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６号）
【特許文献９】国際公開９６／１１２６９号（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２９３５号）
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Folkman et al., J. Biol. Chem., 1992 267 10931-10934
【非特許文献２】Ferrara et al., J. Cellular Biochem., 1991 47 211-218
【非特許文献３】Connolly et al., J. Cellular Biochem., 1991 47 219-223
【非特許文献４】Joukov et al., The EMBO Journal, 1996 15 290-298
【非特許文献５】Maglione et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991 88 9267-9271
【非特許文献６】Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996 93 2576-2581
【非特許文献７】Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 95 548-553
【非特許文献８】Joukov et al., EMBO J., 1997 16 3898-3911
【非特許文献９】Soker et al., Cell, 1998 92 735-745
【非特許文献１０】Midgal et al., J. Biol. Chem., 1998 273 22272-22278
【非特許文献１１】Mustonen and Alitalo, J. Cell Biol., 1995 129 895-898
【非特許文献１２】Kaipainen et al., Cancer Res, 1994 54 6571-6577
【非特許文献１３】Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995 92 3566-3570
【非特許文献１４】Dumont et al., Science, 1998 282 946-949
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を含む発現ベクター、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を安定に発現する細胞系、およびそれらの発現ベクターおよび宿主細胞を用いてポリペプチドを作る方法の確立を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、概して、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を含む発現ベクター、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を安定に発現する細胞系、およびそれらの発現ベクターおよび宿主細胞を用いてポリペプチドを作る方法を提供する。本発明はまた、概して、メラノーマまたはＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍および種々の疾患を治療および軽減する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】２９３−ＥＢＮＡ細胞におけるヒトＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の発現のためのＡｐｅｘ−３プラスミドコンストラクトの概略のマップを示す図である。
【図２】ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の、２９３−ＥＢＮＡ細胞による発現を示す図である。
【図３】可溶性のＶＥＧＦ受容体−免疫グロブリン融合タンパク質による、ＶＥＧＦ−Ｄの沈降を示す図である。
【図４】市販のマウス肺ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニングによって単離された、マウスＶＥＧＦ−Ｄ１をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す図である。
【図５】ＶＥＧＦ−ＤアンチセンスおよびセンスＲＮＡとハイブリダイズさせた、交尾後１５．５日のマウス組織切片の露出２日後に得たオートラジオグラフを示す図 である。
【図６Ａ】交尾後１５．５日のマウス胚におけるＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡの分布の、in situハイブリダイゼーションによる分析の結果を示す図である。
【図６Ｂ】交尾後１５．５日のマウス胚におけるＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡの分布の、in situハイブリダイゼーションによる分析の結果を示す図である。
【図６Ｃ】交尾後１５．５日のマウス胚におけるＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡの分布の、in situハイブリダイゼーションによる分析の結果を示す図である。
【図６Ｄ】交尾後１５．５日のマウス胚におけるＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡの分布の、in situハイブリダイゼーションによる分析の結果を示す図である。
【図７Ａ】ＶＥＧＦ−Ｄモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学による、ヒトの悪性のメラノーマの分析を示す図である。
【図７Ｂ】ＶＥＧＦ−Ｄモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学による、ヒトの悪性のメラノーマの分析を示す図である。
【図７Ｃ】ＶＥＧＦ−Ｄモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学による、ヒトの悪性のメラノーマの分析を示す図である。
【図７Ｄ】ＶＥＧＦ−Ｄモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学による、ヒトの悪性のメラノーマの分析を示す図である。
【図７Ｅ】ＶＥＧＦ−Ｄモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学による、ヒトの悪性のメラノーマの分析を示す図である。
【図８】ＶＥＧＦ−ＤおよびいくつかのＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の、構造上のドメインの概略表示を提供する図である。
【図９Ａ】ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ（Ａ、ＢおよびＣ）およびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃ（ＤおよびＥ）を発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞によって分泌されるＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の分析を示す図である。
【図９Ｂ】ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ（Ａ、ＢおよびＣ）およびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃ（ＤおよびＥ）を発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞によって分泌されるＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の分析を示す図である。
【図９Ｃ】ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ（Ａ、ＢおよびＣ）およびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃ（ＤおよびＥ）を発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞によって分泌されるＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の分析を示す図である。
【図９Ｄ】ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ（Ａ、ＢおよびＣ）およびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃ（ＤおよびＥ）を発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞によって分泌されるＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の分析を示す図である。
【図９Ｅ】ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ（Ａ、ＢおよびＣ）およびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃ（ＤおよびＥ）を発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞によって分泌されるＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の分析を示す図である。
【図１０Ａ】サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの分析を示す図である。
【図１０Ｂ】サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの分析を示す図である。
【図１１】ＶＥＧＦ−Ｄプロセシングの機序の概略表示を提供する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
第一の側面によると、本発明は、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを安定に発現する哺乳類の細胞系を提供する。本発明の細胞系によって産生されるＶＥＧＦ−Ｄは随意に、アフィニティー精製およびＶＥＧＦ−Ｄの局在化を補助するために、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘキサヒスチジン（hexahistidine）、またはＩ−ＳＰＹ（商標）などのエピトープタグ（tag）に連結される。好ましくは哺乳類の細胞系は、２９３−ＥＢＮＡヒト胎児性（embryonal）腎臓細胞系である。好ましくは、発現されるＶＥＧＦ−Ｄは、本明細書において記載されるような、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＣＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ、またはＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃである。
【００２９】
“ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性”という語句は、内皮細胞増殖、分化、遊走、生存（残存）または血管透過性のうち一以上を刺激する能力を意味するものと理解されるべきものである。
【００３０】
ＶＥＧＦ−Ｄの好適なフラグメントは、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６の配列番号５の、アミノ酸残基９３からアミノ酸残基２０１のＶＥＧＦ−Ｄの部分（すなわち、ＶＥＧＦホモロジードメイン（ＶＨＤ））（配列番号１）であり、随意にＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに連結したものである。フラグメントがＦＬＡＧ（登録商標）に連結している場合、そのフラグメントを、本明細書では、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと称する。
【００３１】
本明細書で用いられる、“ＶＥＧＦ−Ｄ”という語は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６において定義されている、配列番号３、配列番号５、配列番号８、および配列番号９のポリペプチドのすべて、および本明細書において定義されているＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを集合的に指す。
【００３２】
第二の側面によると、本発明は、哺乳類の発現ベクターＡｐｅｘ−３に挿入された、ＶＥＧＦ−ＤをコードするヒトｃＤＮＡの配列を含む発現ベクターを提供する。好ましくは、発現ベクターは、本明細書において記載する、ｐＶＤＡｐｅｘＦｕｌｌＮＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＣＦｌａｇ、ｐＶＤＡｐｅｘ△Ｎ△Ｃ、またはｐＶＤＡｐｅｘ△Ｃである。
【００３３】
好ましくは、発現ベクターは、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘキサヒスチジン、またはＩ−ＳＰＹ（商標）などのアフィニティータグをコードする配列も含む。
【００３４】
本発明は更に、本発明によるポリペプチドを作る方法を提供する。この方法は、宿主細胞において本発明の発現ベクターを発現させる工程、および、宿主細胞から、または、宿主細胞の増殖培地からポリペプチドを単離する工程、を有する。本発明のこの側面の１つの好適な態様において、発現ベクターはさらに、アフィニティークロマトグラフィーによるポリペプチドの精製を促進するために、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘキサヒスチジン、またはＩ−ＳＰＹ（商標）などの、アフィニティータグをコードする配列を含む。
【００３５】
保存的な（conservative）置換、挿入、または欠失を含むがそれでもなおＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を保持するポリペプチドは、明らかに本発明の枠内に含まれるということが理解されるべきである。当業者であれば、例えば部位特異的突然変異誘発の利用、または、特異的な酵素での切断および連結（ライゲーション）などの、そのようなポリペプチドを産生するために容易に用いることができる方法についてよく知っているであろう。また、当業者であれば、ペプチド疑似の（peptidomimetic）化合物、または、１または複数のアミノ酸残基が、非−自然発生アミノ酸またはアミノ酸アナログによって置換された化合物が、ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性の必要とされる側面を保持することができるであろうということも知っているであろう。そのような化合物は、当業者に周知の方法によって容易に作ることおよびテストすることができ、それらはまた、本発明の枠内に含まれる。
【００３６】
さらに、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｂについて起こることが知られているような、選択的スプライシングの結果として起こる、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの変異体形態、および、ＶＥＧＦ−Ｄをコードする核酸配列の自然に発生する対立遺伝子の変異体も、本発明の枠内に含まれる。対立遺伝子の変異体は当業者に周知であり、コードされるポリペプチドの代替の（オルターナティブな）形態を表す。
【００３７】
ＶＥＧＦ−Ｄのそのような変異体形態は、修飾のためにＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの非−必須領域をターゲッティングすることによって調製することができる。これらの非−必須領域は、強く保存された領域の外側になると予想される。特に、ＶＥＧＦを含む、ＰＤＧＦファミリーの増殖因子は二量体であり、そして、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂは、ＰＤＧＦ−様ドメインにおける８つのシステイン残基の完全な保存を示す（オロフソン（Olofsson）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996 93 2576-2581; ヨウコフ（Joukov）他, The EMBO Journal, 1996 15 290-298）。これらシステインは分子内および分子間のジスルフィド結合に関与すると考えられている。分子内のジスルフィド結合によって形成される、各サブユニットのループ１、２および３は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子の受容体に対する結合に関与している（アンダーソン（Andersson）他, Growth Factors, 1995 12 159-164）。上述のように、以前に知られているＶＥＧＦファミリーのメンバーにおいて保存されているシステインは、ＶＥＧＦ−Ｄにおいても保存されている。
【００３８】
したがって当業者であれば、提案されるあらゆる変異体形態においてこれらのシステイン残基が保存されるべきであるということ、およびループ１、２および３にある活性部位も保存されるべきであるということについてよく知っているであろう。しかし、この分子のその他の領域は、生物学的機能にとってより重要性が低いということを予想することができ、そしてそれゆえ修飾のための適切なターゲットを提供することができる。修飾されたポリペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を示すそれらの能力について、細胞増殖テストなどのルーチン活性アッセイ手順によって容易にテストすることができる。
【００３９】
修飾されたＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドには、内皮細胞、すなわちＶＥＧＦ−Ｄ受容体に対して結合する能力を有するが、内皮細胞増殖、分化、遊走、または生存（残存）を刺激することができない、または、血管透過性を誘導することができないものがあると予想される。これらの修飾されたポリペプチドは、競合的または非−競合的なＶＥＧＦ−Ｄの阻害剤として作用することができ、ＶＥＧＦ−Ｄ作用の防止または低下が望ましい状況において有用であると予想される。したがって、そのような受容体−結合性であるが非−分裂促進的、非−分化誘導性、非−遊走誘導性、または非−生存（残存）促進性の、ＶＥＧＦ−Ｄの変異体もまた、本発明の枠内に含まれ、そして本明細書において、“受容体−結合性の、しかしその他の点では不活性または妨害性の変異体”と称される。
【００４０】
同様に修飾されたＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドには、ＶＥＧＦ−Ｄに結合する能力を有し、二量体（ダイマー）の、内皮細胞におけるＶＥＧＦ−Ｄ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３）に対する結合を妨げるものがあると予想される。したがってこれら二量体は、内皮細胞増殖、分化、遊走、または生存（残存）を刺激することができず、または、血管透過性を誘導することができない。これらの修飾されたポリペプチドは、競合的または非−競合的なＶＥＧＦ−Ｄの阻害剤として作用することができ、ＶＥＧＦ−Ｄ作用の防止または低下が望ましい状況において有用であると予想される。したがって、そのようなＶＥＧＦ−Ｄ−結合性であるが非−分裂促進的、非−分化誘導性、非−遊走誘導性、または非−生存（残存）促進性の、ＶＥＧＦ−Ｄの変異体もまた、本発明の枠内に含まれ、そして本明細書において、“ＶＥＧＦ−Ｄ−結合性の、しかしその他の点では不活性または妨害性の変異体”と称される。
【００４１】
第三の側面によると、本発明は、悪性のメラノーマまたはＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍の治療または軽減方法を提供する。この方法は、メラノーマまたは腫瘍の付近においてＶＥＧＦ−Ｄの発現または活性を阻害する工程を有する。ＶＥＧＦ−Ｄ発現の局所的な阻害は、例えばアンチセンス核酸またはＶＥＧＦ−Ｄをコードする三本鎖ＤＮＡの使用によって達成することができる。代わりに、上述のような、ＶＥＧＦ−Ｄに対して結合してＶＥＧＦ−Ｄ受容体に対する結合を妨げる能力を有するか、あるいは、ＶＥＧＦ−Ｄ受容体に結合するが、内皮細胞増殖、分化、遊走、または生存（残存）を刺激することができない、ＶＥＧＦ−Ｄ変異体ポリペプチドを、競合的または非−競合的なＶＥＧＦ−Ｄの阻害剤として利用することができる。ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３に対する小分子阻害剤、およびＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３に対する抗体も利用することができる。
【００４２】
上記の方法の利用はまた、乾癬におけるように、ＶＥＧＦ−Ｄの発現が増加しているか持続的であるような非−悪性の状態においても考えられる。発生中のマウス胚の皮膚におけるＶＥＧＦ−Ｄの分布に基づくと、上部真皮（upper dermis）における血管の増殖が一貫した、そして顕著な組織病理学的な特徴である、乾癬などの高い表皮細胞ターンオーバー皮膚疾患（high epidermal cell turnover dermatoses）の開始または存続において、ＶＥＧＦ−Ｄが役割を果たしているということがありうる。
【００４３】
本発明のさらなる側面において、ＶＥＧＦ−Ｄは内皮細胞阻害活性を有する毒素または薬剤と結合され、それは、例えばＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３などのＶＥＧＦ−Ｄ受容体を発現する、増殖している血管およびリンパの内皮細胞に標的化される（targeted）。したがって、腫瘍増殖などの多くの病理学的状態にとって重要なものである血管の増殖をブロックすることができる。
【００４４】
第五の側面によると、本発明は皮膚移植の受け入れおよび／または治癒を増強する方法を提供する。この方法は、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログによって、血管新生およびリンパ脈管形成（lymphangiogenesis）を刺激する工程を有する。
【００４５】
第六の側面によると、本発明は皮膚に対する外科または外傷の創傷の治癒を刺激する方法を提供する。この方法は、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログによって、血管新生およびリンパ脈管形成を刺激する工程を有する。
【００４６】
前記した本発明の最後の２つの側面は、火傷の治療において、および形成外科において、特に有用であろうと考えられる。
【００４７】
本発明の別の側面において、リンパ浮腫の治療または軽減のためにリンパ脈管形成を刺激するための方法が提供される。この方法は、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログによって、リンパ脈管形成を刺激する工程を有する。リンパ浮腫ほど醜くなる疾患はあまりない。リンパ浮腫は、組織を満たす体液の排出に関与するリンパ管の閉塞（妨害物）がある場合に起こる。この閉塞の結果、組織の中にリンパ液または脂肪性の体液が蓄積し、そしてその結果として肢および組織の怒張が起こる。最終的な結果は、局所性の感染症、不快感および変形（奇形）のためにしばしばグロテスクであり、そして激しく無力化する。リンパ浮腫にはいくつかの原因がある。最も注目すべきは、リンパ節閉塞または手術中の除去に関連する乳癌である。再発性の感染症およびその他の形態の手術もリンパ浮腫に関連する。有意な割合のリンパ浮腫の患者は、同一とみなしうるもの（identifiable precitant）を有さない。ＶＥＧＦ−Ｄの量を増加させることによって、リンパ脈管形成が誘導され、そしてリンパ液および脂肪性の体液の蓄積が軽減するであろう。
【００４８】
胚形成の間のＶＥＧＦ−Ｄ合成の不適当なダウンレギュレーションは、無汗性外胚葉性異形成を含む付属器構造異常発育においても重要である可能性がある。通常は真皮における汗腺は、血管新生化した（vascularized）脂肪性の結合組織によって囲まれている。おそらくはＶＥＧＦ−Ｄの欠乏によって、血管の供給が損なわれるか、または補充することができない場合、汗腺低酸素血症および機能不全が起こるであろう。これらの病変はおそらく、発生のなんらかの段階における分化細胞のＶＥＧＦ−Ｄを産生する能力の欠如、または、遮断剤を産生する分化している付属器細胞の近くの血管におけるＶＥＧＦ−Ｄ受容体に対する遮断剤の産生によるものであろう。したがって、本発明は脂肪性の結合組織の血管新生（vascularization）を刺激することによって、無汗性外胚葉性異形成を治療または軽減するための方法を提供する。この方法は、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを投与する工程を有する。
【００４９】
ＶＥＧＦ−Ｄの欠乏またはＶＥＧＦ−Ｄに対する応答の欠乏に関連する可能性がある更に別の疾患は、強皮症である。強皮症は、血管新生および／または線維芽細胞機能における変化によると考えられる、皮膚の肥厚およびコラーゲン化（collagenization）の増加によって特徴づけられる結合組織の珍しい障害である。ＶＥＧＦ−Ｄの欠乏またはＶＥＧＦ−Ｄに対する応答の不足による内皮細胞への障害（ダメージ）は、おそらく血管が修復できないことに寄与する要因であろう。血管が修復できないため、連続性の血小板凝集が観察され、そして引き続いて線維芽細胞に対して分裂促進的な作用を有する増殖因子が放出される。この結果、コラーゲン産生が増加する。強皮症における全身的な器官の関与にも同様の考慮があてはまる。したがって、本発明は、血管内皮細胞の増殖を刺激することによって強皮症を治療または軽減する方法を提供する。この方法は、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを投与する工程を有する。
【００５０】
第七の側面によると、本発明は、血管透過性を誘導せずに、内皮細胞の増殖、遊走、生存（残存）および分化、そしてリンパ脈管形成から選択される、ＶＥＧＦ−Ｄの少なくとも１つの生物活性を刺激する方法を提供する。この方法は、生物活性を刺激する量の完全にプロセシングされたＶＥＧＦ−Ｄを投与する工程を有する。
【００５１】
本発明のさらなる側面では、ＶＥＧＦ−Ｄの受容体−結合特異性を調節する方法を提供する。この方法は、プロセシングされていない（unprocessed） ＶＥＧＦ−Ｄをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現させる工程、および、コードされるＶＥＧＦ−Ｄをプロセシングしてタンパク分解性にプロセシングされた形態のＶＥＧＦ−Ｄを産生するために、少なくとも１つのタンパク分解量（proteolytic amount）の酵素を供給する工程を有する。
【００５２】
本明細書での目的のため、“完全にプロセシングされたＶＥＧＦ−Ｄ”という語句はＮ−末端およびＣ−末端プロペプチドを有さないＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドを意味し、“タンパク分解性にプロセシングされた形態のＶＥＧＦ−Ｄ” という語句はＮ−末端および／またはＣ−末端プロペプチドを有さないＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドを意味し、そして、“プロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄ”という語句はＮ−末端およびＣ−末端プロペプチドの両方を備えたＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドを意味するということが、明らかに理解されるであろう。
【００５３】
本発明はまた、生物学的サンプルにおいてＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍を検出する方法も提供する。この方法は、前記サンプルをＶＥＧＦ−Ｄに対する特異的結合性試薬に接触させる工程、ＶＥＧＦ−Ｄに対する前記特異的結合性試薬の結合のために時間を与える工程、および前記結合を検出する工程を有する。好適な態様において、ＶＥＧＦ−Ｄに対する特異的結合性試薬は抗体であり、結合および／または結合の程度は、検出可能な標識を備えた抗体によって検出される。癌バイオプシー標本におけるＶＥＧＦ−Ｄの定量化は将来の転移のリスクの指標として有用であろう。
【００５４】
本発明による抗体を検出可能な標識で標識して、診断の目的のために利用することができる。抗体は、イメージングのために、適当な超磁性（supermagnetic）、パラ磁性（paramagnetic）、高電子密度、エコジェニック（ecogenic）、または放射性剤と共有結合的または非−共有結合的に結合させるとよい。診断上のアッセイにおける使用のために、放射性標識または非−放射性標識を用いてもよい。放射性標識の例には、125Ｉまたは32Ｐなどの放射性の原子または基が含まれる。非−放射性標識の例には、西洋わさびペルオキシダーゼなどの酵素標識、またはフルオレセイン−５−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）などの蛍光定量的標識が含まれる。標識化は、直接的であっても間接的であってもよく、また、共有結合性であっても非−共有結合性であってもよい。
【００５５】
ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を誘導するポリペプチドまたは抗体は、適当な製薬の担体と組み合わせて使用することができる。ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を阻害するポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストまたは抗体も、適当な製薬の担体と組み合わせて使用することができる。そのような組成物は、治療的に有効な量の抗体および薬学で受け入れられる担体またはアジュバントを含む。そのような担体の例には、塩類溶液、緩衝食塩水、鉱物油、タルク、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、増粘剤、安定剤、懸濁剤、およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されるものではない。そのような組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル剤、クリーム、こう薬（salve）、軟膏剤（ointment）の形態、またはその他の従来の形態とすればよい。製剤形態は投与方法に適するように選択される。ポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストまたは抗体が治療の目的のために使用される場合、適用用量および経路は患者の性質および治療される状態に依存するであろうし、主治医または獣医師の考え次第のものとなるであろう。適当な経路には、皮下の、筋肉内の、腹腔内の、または静脈内の注射、局所適用、インプラントなどが含まれる。ＶＥＧＦ−Ｄの局所適用はＶＥＧＦと類似の方法において行えばよい。
【００５６】
本明細書での目的において、“からなる”という語は“含むが限定されるものではない”ことを意味することが明らかに理解されるであろう。それに対応する意味が“からなる”という語にあてはまる。
【実施例】
【００５７】
実施例の詳細な説明
例１
ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体を安定に発現する細胞系 ＶＥＧＦ−Ｄの誘導体を構成的に発現する細胞系を産生するために、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ ｃＤＮＡの領域を哺乳類の発現ベクターＡｐｅｘ−３（エヴァンス（Evans）他, Mol. Immunol., 1995 32 1183-1195)に挿入した。このベクターを２９３−ＥＢＮＡヒト胎児性（embryonal）腎臓細胞にトランスフェクトした（transfected）場合、エピソームとして（episomally）維持した。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの発現のために、ＩＬ−３シグナル配列、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドおよびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃをコードする配列を含む、ｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの領域をＡｐｅｘ−３のＸｂａＩ部位に挿入した（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６における例９を参照）。その結果得られたプラスミドをｐＶＤＡｐｅｘ△Ｎ△Ｃと命名した。これは図１において図式的に図示されている。Ｎ−末端にＦＬＡＧ（登録商標）がタグ付加された（tagged）全長ヒトＶＥＧＦ−Ｄの誘導体である、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇの発現のため、また、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃと命名された、アミノ酸残基２から２０２からなるヒトＶＥＧＦ−Ｄの切形の(truncated)誘導体の発現のために、同様のタイプのコンストラクトを作成した。これらのＶＥＧＦ−Ｄ誘導体のための発現コンストラクトを、それぞれｐＶＤＡｐｅｘＦｕｌｌＮＦｌａｇおよびｐＶＤＡｐｅｘ△Ｃと命名した。これらもまた、図１において図式的に示されている。ＩＬ−３ ＳＳは、インターロイキン−３シグナル配列を表し、矢印は、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）から発現カセットへと進行する、転写の方向を表す。これらのベクターをヒト胎児(embryo)腎臓細胞系２９３−ＥＢＮＡの細胞に、リン酸カルシウム法によってトランスフェクトし、そして安定なトランスフェクタントをハイグロマイシンの存在下で選抜した。高レベルのＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを発現する細胞系を、引き続いて、図２に示すように、代謝標識、免疫沈降およびウエスタンブロット分析によって同定した。
【００５８】
図２において、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃを発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞系を代謝的に標識し、ならし培地（培養上清conditioned medium）サンプルにおけるタンパク質を、抗−ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）またはＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦホモロジードメインに対して特異的な抗血清（Ａ２）によって、免疫沈降した。沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇおよびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの場合にはオートラジオグラフィーによって可視化し、また、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃの場合にはＭ２抗体によるウエスタンブロット分析で検出した。矢印はＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の位置を示す。これらの誘導体は親の（parental） ２９３−ＥＢＮＡ細胞に由来するコントロール上清からは検出されなかった（データは示さない）。分子量マーカーの（ｋＤａにおける）位置を各パネルの右側に示す。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃのウエスタンブロット分析によって検出されたおよそ５０ｋＤａのバンドは、免疫グロブリン重鎖に対応する。
【００５９】
多数のＶＥＧＦ−Ｄ誘導体が、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇおよびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃを発現する細胞の上清において検出された。これらの誘導体は、ＶＥＧＦ−Ｄの生合成の一部として起こるタンパク分解性プロセシングの結果として形成される。ＶＥＧＦ−ＤＮＦｕｌｌＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを発現する細胞系は、少なくとも２０回継代する間、ハイグロマイシン選抜下で維持し、そしてＶＥＧＦ−Ｄ誘導体を発現させ続けた。
【００６０】
例２
ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの可溶性のＶＥＧＦ受容体への結合 ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦ受容体との間の相互作用をさらに評価するため、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを、ヒトＶＥＧＦＲ−１、ヒトＶＥＧＦＲ−２およびヒトＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインを含む可溶性の免疫グロブリン融合タンパク質に対して結合するその能力についてテストした。対応するＶＥＧＦ−Ｃのフラグメント、ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃを比較のために使用した。結合実験のために、２９３Ｔヒト胎児性腎臓細胞を、リン酸カルシウム（Ｃａ−ホスフェイト）法を用いて、可溶性の受容体−免疫グロブリン融合タンパク質であるＶＥＧＦＲ−１−Ｉｇ、ＶＥＧＦＲ−２−ＩｇまたはＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇをコードするプラスミドによってトランスフェクトした。これらの融合タンパク質において、関連するＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインを、ヒトＩｇＧ1のＦｃ部分に融合させた。トランスフェクションの後、細胞を２４時間インキュベートし、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ：Dulbecco's Modified Eagle's Medium）で洗浄し、そして２４時間飢餓させた。次に培地を収集し、遠心分離によって清澄にし、そして融合タンパク質をプロテインＡセファロースビーズを用いて沈降させた。このセファロースビーズを次に、Ｃａ−ホスフェイト法を用いてヒトＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△ＣまたはヒトＶＥＧＦ165をコードする発現プラスミドによってトランスフェクトされた２９３−ＥＢＮＡ細胞からの、９００μｌの代謝的に35Ｓ−標識された培地とともに、室温で３時間インキュベートした。２９３−ＥＢＮＡ細胞の代謝標識は基本的に記載されているようにして行った（ヨウコフ（Joukov）他, 1997）。セファロースビーズを次に結合緩衝液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．５％ ＢＳＡ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０、１μｇ／ｍｌ ヘパリン）で４℃で２回、そしてＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中でボイルし、そして次にタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。結果を図３に示す。
【００６１】
図３において、標識されたＶＥＧＦ165、ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの、ＶＥＧＦＲ−１−Ｉｇ、ＶＥＧＦＲ−２−ＩｇおよびＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇによる沈降を上記のように行った。沈降のために用いた融合タンパク質を右に示す。“ベクター”は、ＶＥＧＦ類をコードする配列を欠く発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞に由来する培地からの沈降の結果を示す。分子量マーカーは、ｋＤａにて示されている。
【００６２】
ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃについて予想されるサイズ（およそ２２ｋＤａ）のポリペプチドが、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを発現する細胞の培地から、ＶＥＧＦＲ−２−ＩｇおよびＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇによって沈降した。対照的に、同じ培地から、ＶＥＧＦＲ−１−Ｉｇによってはこのサイズのタンパク質は沈降しなかった。ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃの沈降についても基本的に同じ結果が観察された。予想されたように、およそ２４ｋＤａの主なポリペプチドが、ＶＥＧＦ165を発現する細胞の培地から、ＶＥＧＦＲ−１−ＩｇおよびＶＥＧＦＲ−２−Ｉｇによって沈降したが、ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇによっては沈降しなかった。ＶＥＧＦ類をコードする配列を欠く発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞の培地からは、３つの融合タンパク質によって、いずれの標識されたタンパク質も沈降しなかった。これらのデータは、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△ＣはＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３には結合することができるがＶＥＧＦＲ−１には結合することができないということを示している。したがって、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃは、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３に対する受容体−結合特異性において、ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃと似ている。
【００６３】
例３
マウス胚におけるＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子発現のin situハイブリダイゼーション研究 マウスＶＥＧＦ−Ｄ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド１から３４０に対応する放射能標識したアンチセンスＲＮＡプローブを用いたin situハイブリダイゼーションによって、ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子発現のパターンを研究した。マウスＶＥＧＦ−Ｄ１ ｃＤＮＡの配列を図４に示す。アンチセンスＲＮＡは、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよび［35Ｓ］ＵＴＰαｓを用いたインビトロの転写によって合成した。マウスＶＥＧＦ−Ｄは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６において完全に記載されている。このアンチセンスＲＮＡプローブを、交尾後１５．５日のマウス胚のパラフィン−包埋した組織切片にハイブリダイズさせた。標識された切片を２日間オートラジオグラフィーにかけた。その結果得られた、アンチセンスＲＮＡおよび（ネガティブコントロールとして）相補的なセンスＲＮＡに対してハイブリダイズした切片についてのオートラジオグラフを、図５に示す。図５において、“Ｌ”は肺を表し、“Ｓｋ”は皮膚を表す。そして図示されたこれら２つの組織切片は連続的な切片である。ＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡに対する強いシグナルが、発生中の肺において検出され、そして、皮膚に付随していた。コントロールセンスＲＮＡを用いた場合は、シグナルは検出されなかった。
【００６４】
図６において、矢状の（sagittal）組織切片をＶＥＧＦ−ＤアンチセンスＲＮＡプローブにハイブリダイズさせ、そして引き続いて写真乳剤とともにインキュベートし、現像および染色した。顕微鏡的な分析によってＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡは発生中の肺の間葉細胞において大量にあるということが明らかにされた（図６Ａ−Ｃ）。対照的に、気管支および細気管支（気管支梢）の上皮細胞、そして気管支を囲む発生中の平滑筋細胞は、ネガティブであった。気管支動脈の内皮細胞もネガティブであった。図６Ａにおいて、顕微鏡写真の暗い領域は、肺（Ｌｕ）におけるＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡに対する強いシグナルを示す。肝臓（Ｌｉ）および肋骨（Ｒ）も示されている。図６Ｂは、より高い拡大率における肺を示す。顕微鏡写真の明るい領域は、気管支（Ｂｒ）および気管支動脈（ＢＡ）を示す。黒い長方形の輪郭は、図６Ｃに示される切片の領域を示すものであるが、図６Ｃはより高い拡大率のものである。図６Ｃは、気管支の上皮細胞（Ｅｐ）、上皮細胞層を囲む発生中の平滑筋細胞（ＳＭ）および間葉細胞（Ｍｅｓ）を示す。間葉細胞に付随する銀粒子が大量であることが明らかである。図６Ｄにおいて、顕微鏡写真の暗い領域は、肢芽を示す。線維芽細胞および発生中のメラノサイトに富む組織の領域における皮膚のすぐ下に、強いシグナルが位置していた。図６ＡおよびＤについての拡大率は×４０であり、図６Ｂについての拡大率は×２００であり、図６Ｃについての拡大率は×５００であった。
【００６５】
ここに示した結果は、ＶＥＧＦ−Ｄは血管およびリンパ管の増殖を、発生中の肺および皮膚のすぐに下側の領域へと誘引している可能性があることを示唆するものである。皮膚の近くでＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子が発現していることにより、ＶＥＧＦ−Ｄは悪性のメラノーマに関連する血管新生を誘導することにおいて役割を果たしている可能性があると考えられる。悪性のメラノーマは非常に高度に血管新生化された（vascularized）腫瘍である。このことは、例えばＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄ受容体−２またはＶＥＧＦ−Ｄ受容体−３に対する抗体を用いた、ＶＥＧＦ−Ｄ発現の局所的な阻害が、悪性のメラノーマの治療において有用であることを示唆するものである。アンチセンス核酸または三本鎖ＤＮＡなどのその他の好適なＶＥＧＦ−Ｄ活性の阻害剤も利用することができる。
【００６６】
例４
ヒトＶＥＧＦ−Ｄに結合するモノクローナル抗体の産生 ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対するモノクローナル抗体をマウスにおいて産生させた。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃは、ＶＥＧＦ−ＤのＶＨＤのアミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦファミリーの他のすべてのメンバーと配列において似ている。それゆえ、ＶＥＧＦ−Ｄの生理活性の部分はおそらくＶＨＤにおいて存在すると考えられている。ヒトＶＥＧＦ−Ｄの残基９３から２０１の切形の（truncated）部分、すなわち、Ｎ−末端領域およびＣ−末端領域が除去された部分をコードするＤＮＡフラグメントを、テンプレートとして全長ヒトＶＥＧＦ−Ｄ ｃＤＮＡを含むプラスミドを使用した、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。増幅されたＤＮＡフラグメントの配列をヌクレオチドシークエンシングによって確認し、そして発現ベクターｐＥＦＢＯＳＳＦＬＡＧ（The Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research （WEHI）、Melbourne、Australiaの Dr. Clare McFarlane から寄贈）に挿入し、ｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと命名したプラスミドを生じさせた。ｐＥＦＢＯＳＳＦＬＡＧベクターは、インターロイキン−３（ＩＬ−３）遺伝子からのタンパク質分泌のためのシグナル配列およびＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド（Sigma-Aldrich）をコードするＤＮＡを含むものである。ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドはＭ２モノクローナル抗体（Sigma-Aldrich）などの市販の抗体によって認識され得る。ＶＥＧＦ−Ｄ ＰＣＲフラグメントをこのベクターに、ＩＬ−３シグナル配列がＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドのすぐに上流になり、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドが切形のＶＥＧＦ−Ｄ配列のすぐに上流になるように挿入した。これら３つのすべての配列は同じ読み枠になっており、したがってｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの哺乳類の細胞へのトランスフェクションの結果としておこるｍＲＮＡの翻訳により、そのＮ−末端にＩＬ−３シグナル配列を、続いてＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド、および切形のＶＥＧＦ−Ｄ配列を有するタンパク質が生じることになる。シグナル配列の切断およびそれに引き続く細胞からのタンパク質の分泌により、Ｎ−末端に隣接してＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドがタグ付加された（tagged）、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドが生じることになる。このタンパク質をＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと命名した。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを、プラスミドｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃによって一過性にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞の培地から、抗−ＦＬＡＧ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６における例９を参照）。
【００６７】
精製したＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを用いて雌のＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した。免疫されるマウスから脾臓細胞を収集する８５日前（腹腔内）、７１日前（腹腔内）および４日前（静脈内）に免疫し、引き続いてこれら脾臓細胞をマウスミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＮＳ−１）細胞に融合させた。最初の２回の免疫化には、ＰＢＳとTiterMaxアジュバント（＃R-1 Research adjuvant; CytRx Corp., Norcross, GA）との１：１混合物中で、およそ１０μｇのＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを注射し、３回目の免疫化にはＰＢＳ中の、３５μｇのＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを用いた。
【００６８】
エンザイムイムノアッセイ（酵素免疫測定法）を用いて精製したＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃについてハイブリドーマをスクリーニングすることによって、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対するモノクローナル抗体を選抜した。簡単に説明すると、９６ウェルマイクロタイタープレートを、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃでコーティングし、そしてハイブリドーマ上清を添加し、４℃で２時間インキュベートした。続いて、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中で６回洗浄した。次に西洋わさびペルオキシダーゼ結合（conjugated）抗−マウスＩｇ（Bio-Rad, Hercules, CA）とともに４℃で１時間インキュベーションを行った。洗浄後、２，２’−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ;2,2'-azino-di-(3-ethylbenz-thiazoline sulfonic acid)基質システム（Zymed, San Francisco, CA）によってアッセイを明らかにし、そしてマルチウェルプレートリーダー（multiwell plate reader）（Flow Laboratories MCC/340, McLean, VA）で４０５ｎｍの吸光度を判断することによってアッセイを数量化した。６つの抗体をさらなる分析のために選択し、限界希釈（法）によって２回サブクローニングした。これらの抗体を、２Ｆ８、３Ｃ１０、４Ａ５、４Ｅ１０、４Ｈ４および５Ｆ１２と命名した。これら抗体のアイソタイプを、Ｉｓｏｓｔｒｉｐ（商標）アイソタイピング（isotyping）キット（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を用いて判定した。抗体２Ｆ８、４Ａ５、４Ｅ１０および５Ｆ１２はＩｇＧ1クラスであり、４Ｈ４および３Ｃ１０はＩｇＭクラスのものであった。６つのすべての抗体がκ軽鎖を含んでいた。
【００６９】
ハイブリドーマ細胞系を、５％ ｖ／ｖ ＩｇＧ−除去（depleted）血清（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）、５ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシンおよび１０μｇ／ｍｌ 組換えＩＬ−６を含有するＤＭＥＭ中で培養した。ダービー（Darby）他, J. Immunol. Methods, 1993 159 125-129 の技法にしたがって、プロテインＧ−セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、抗体２Ｆ８、４Ａ５、４Ｅ１０および５Ｆ１２を精製し、そして収率を２８０ｎｍにおける吸収を測定することによって評価した。
【００７０】
例５
ヒト腫瘍の免疫組織化学的分析のための、ヒトＶＥＧＦ−Ｄに対するモノクローナル抗体の使用 腫瘍形成におけるＶＥＧＦ−Ｄの役割を評価するために、上述のＭＡｂをヒトの悪性のメラノーマの免疫組織化学的分析のために使用した。この分析のために、４つのＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂ、２Ｆ８、５Ｆ１２、４Ａ５および４Ｅ１０を使用した。ＬＭＭ７７４と命名された、顆粒球コロニー刺激因子の受容体に対して産生されたＭＡｂ（レイトン（Layton）他, Growth Factors, 1997 14 117-130）をネガティブコントロールとして使用した。これら（４つ）のＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂと同様に、ＬＭＭ７７４は、マウスＩｇＧ1アイソタイプのものであり、それゆえアイソタイプ−一致（matched）コントロール抗体として役立った。これらのＭＡｂを、２つのランダムに選ばれた浸潤性の悪性のメラノーマに対して免疫組織化学によってテストした。皮膚の悪性のメラノーマの、ホルマリン固定およびパラフィン包埋した組織からの厚さ５マイクロメーターの切片を、テスト組織として用いた。切片を脱ろう（dewaxed）および再水和（rehydrated）し、そしてＰＢＳで洗浄した。１：５０に希釈された正常なウサギ血清を、各切片に対して２０分間与えた（applied）。過剰の血清を取り除き（blotted off）、そして一次抗体、すなわちクルードに（crudely）至適化された１：１００および１：２００の希釈度のＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂおよびＬＭＭ７７４を、切片に与え、そして室温で一晩、湿室においてインキュベートした。切片を再びＰＢＳ中で５分間洗浄し、続いてＰＢＳ中の１：４００の希釈度の、ビオチン標識したウサギ抗−マウス抗体（DAKO Corp., Carpinteria, CA）を室温で３５分間与えた。切片を次にｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）中で５分間洗浄し、そしてＴＢＳ中、１：５００の希釈度にて、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Silenus, Australia）を与えた。切片をＴＢＳ中で５分間洗浄し、そして高速赤色基質（the fast red substrate）（Sigma, St. Louis, MO）を室温で２０分間与えた。切片を水中で洗浄し、そしてマウントした（mounted）。赤色の反応産物を用いたのは、メラニンを産生する腫瘍の解釈における混同を回避するためである。ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂを省略したステップ省略コントロール、およびＬＭＭ７７４抗体を用いたアイソタイプ−一致（mathed）コントロールを、実験に含ませた。
【００７１】
図７Ａ−Ｃは、同じメラノーマサンプルでの結果を示し、図７Ｄおよび７Ｅは、同じバッチにおいて染色した異なる腫瘍についての結果を示す。免疫反応性のメラノーマ細胞の島が、（１）図７Ａおよび７Ｂにおける矢印で示された部分の内側によって示され、免疫反応性の血管が、（２）７Ｃにおける矢印で示された部分の内側によって示されている。７Ｅにおいて、異なるレベルのＶＥＧＦ−Ｄを有するメラノーマ細胞が明らかとなっている。図７Ａ、７Ｄおよび７Ｅにおける拡大率はおよそ×６０であり、図７Ｂおよび７Ｃにおける拡大率はおよそ×３００である。
【００７２】
陽性の（ポジティブな）反応が４つのすべてのＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂについてみられ、それらは基本的に同じ染色パターンであった。図７Ａ−Ｃおよび７Ｅに示す結果は、ＭＡｂ ２Ｆ８によるものである。光学顕微鏡的な検査による染色パターンの評価によって、メラノーマの大部分にわたってむらがある染色が示された。大きい方の腫瘍では、浸潤性の部分の周囲における腫瘍細胞の小さい島において（図７Ａおよび７Ｂ）、および表皮内の腫瘍細胞の巣（nest）において、染色がより明白であり、腫瘍の中心の浸潤性の部分においては、染色はより薄いかまたは検出不可能であった。陽性（ポジティブ）に反応する腫瘍細胞の近くの乳頭および網状の真皮における小さい毛細血管サイズの血管では、内皮細胞の細胞質において抗体に対するむらがある粒状の反応が示された（図７Ｃ）。小さい方の腫瘍についての反応は、腫瘍塊（tumor mass） 全体を通じて、分布においてより均等であった（図７Ｅ）。腫瘍の外側の不定な距離にある、免疫反応性の腫瘍細胞から離れている中部および深部の網状の真皮および皮下の組織における血管は、ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂとの反応を示さなかった。ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂによる結果とは対照的に、同じ腫瘍におけるＬＭＭ７７４コントロールは陰性（ネガティブ）であり（図７Ｄ）、ステップ省略コントロールも陰性（ネガティブ）であった。
【００７３】
いくつかの腫瘍について、ＶＥＧＦ合成および分泌は低酸素の腫瘍細胞において開始されうること、および、腫瘍は血管の近くの内皮細胞におけるＶＥＧＦＲ−２の発現も誘導することができることが示されている（プレート（Plate）他, Cancer Res., 1993 53 5822-5827）。このように、腫瘍血管新生を誘導するためのパラクリンシステムが確立しており、それによって腫瘍において分泌されるＶＥＧＦは、間質に拡散して標的内皮細胞におけるＶＥＧＦＲ−２に結合し、そしてその結果、内皮細胞増殖を誘導する。メラノーマにおいてＶＥＧＦ−Ｄが局在しているという結果は、ＶＥＧＦ−Ｄが悪性のメラノーマにおいて同様の機能を果たしている可能性があることを示すものである。テストされた両方の臨床サンプルにおいて、ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂはメラノーマ細胞におけるＶＥＧＦ−Ｄを検出した。これら腫瘍細胞はＶＥＧＦ−Ｄを産生している可能性が非常に高い。さらに、ＶＥＧＦ−Ｄは、プロデューサー腫瘍細胞の付近における血管の内皮細胞において検出されたが、より遠い血管では検出されなかった。ＶＥＧＦ−Ｄは、おそらく腫瘍血管においてしばしば発現しているＶＥＧＦ−Ｄに対する受容体であるＶＥＧＦＲ−２との相互作用のために、これらの内皮細胞に局在しているのであろう（プレート（Plate）他, Cancer Res., 1993 53 5822-5827）。ＶＥＧＦ−Ｄが腫瘍の付近におけるリンパ管においても局在しているかどうかを評価するために、さらなる免疫組織化学的分析が必要であろう。そのようなシナリオはありうる。というのは、リンパ内皮細胞は、ＶＥＧＦ−Ｄに対する高アフィニティー受容体であるＶＥＧＦＲ−３を発現しているからである（ヨウコフ（Joukov）他, The EMBO Journal, 1996 15 290-298）。
【００７４】
前記の諸結果は、メラノーマ細胞がＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子を発現することができるということを示すものである。交尾後１５．５日のマウス胚の、in situハイブリダイゼーションによる分析は、発生中のメラノサイトおよび線維芽細胞に富む領域における、発生中の皮膚のすぐ下でのＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子の発現を示すものであった（例３および図５および図６）。したがって、胚発生における場合のように、トランスフォームされたメラノサイトは、ＶＥＧＦ−Ｄに対する遺伝子を発現する能力を再獲得している可能性がある。もし発癌トランスフォーメーション以外の現象が、メラノサイトにおけるＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子発現を誘導することができるとすれば、このタンパク質は、炎症または血管および／またはリンパ管の増殖によって特徴づけられる、他のタイプの皮膚障害においても関与している可能性がある。治療的な設定において、組織損傷に応じてＶＥＧＦ−Ｄを適用することは、再生中の皮膚の近くの血管およびリンパ管の増殖を刺激するために有用であろう。同様に、血管新生およびリンパ脈管形成を刺激するためにＶＥＧＦ−Ｄを適用することは、皮膚移植法の成功性を高めるために有用であろう。これらは、火傷およびその他の外傷の傷害などの多様な状態の治療、外科的な瘢痕の回避または減少、美容整形など、において利用される。
【００７５】
例６
ＶＥＧＦ−Ｃに対して結合する能力についての抗体のテスト 前述のエンザイムイムノアッセイ（酵素免疫測定法）を用いて、ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃに結合する能力について、６つのＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂをテストした。ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃは、ＶＥＧＦ−ＣのＶＥＧＦホモロジードメイン（残基１０３から２１５）からなり、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに最も似ているＶＥＧＦ−Ｃの領域である。Ｃ−末端に６×ヒスチジンタグを加えたＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃを、発現ベクターｐＩＣ９（Invitrogen, San Diego, CA）を用いて製造業者の指示に従って、酵母ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの菌株ＧＳ１１５中で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ スーパーフロー（Superflow）樹脂（QIAGEN, Valencia, CA）を用いて精製した。このイムノアッセイによってテストした６つの抗体の内、４Ｅ１０のみがＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃに結合した。
【００７６】
例７
ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦ−Ｃと類似の様式でタンパク分解性にプロセシングされる ＶＥＧＦ−Ｄのタンパク分解性プロセシングを研究するために、２９３−ＥＢＮＡ細胞を、ｐＶＤＡｐｅｘ△Ｃ、ｐＶＤＡｐｅｘＦｕｌｌＮＦｌａｇ、ｐＶＤＡｐｅｘ△Ｎ△Ｃ（例１および図１）、およびｐＶＤＡｐｅｘＦｕｌｌＣＦｌａｇによって安定にトランスフェクトした。これらの発現コンストラクトはそれぞれ、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ（例１および図１）およびＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＣＦｌａｇをコードするものである（図８）。ＶＥＧＦ−Ｄの構造上のドメインを、図８の最上部に示す。“ＳＳ”は、タンパク質分泌のためのシグナル配列を示し、Ｎ−末端プロおよびＣ−末端プロは、プロペプチドを示し、そしてＶＨＤは、ＶＥＧＦホモロジードメインを示す。その下方に、ＶＥＧＦ−Ｄにおける特徴づけされた推定上のタンパク分解性（proteolytic）切断部位が矢印によってしるしを付けられて示されている。可能性のあるＮ−結合型グリコシル化部位は、星印によってしるしを付けられている。Ａ２抗血清（下記）を産生するために免疫原として使用されたＶＥＧＦ−Ｄの領域は、黒いバーによって示されている。図の下側半分は、２９３−ＥＢＮＡ細胞において発現された、ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の一次翻訳産物を示している。簡明さのために、タンパク質分泌のためのシグナル配列は省略してある。ＦＬＡＧオクタペプチドエピトープは、丸で囲まれた“Ｆ”によって示されている。プラスミドｐＶＤＡｐｅｘＦｕｌｌＣＦｌａｇは、タンパク質分泌のための内因性のＶＥＧＦ−Ｄシグナル配列に対するＤＮＡが保持されており、翻訳開始のための“Ｋｏｚａｋ”コンセンサス配列が至適化され、ＶＥＧＦ−Ｄの開始コドンのすぐ後に、３つのアミノ酸“Ａ−Ｒ−Ｌ”の挿入が必要となっているという点をのぞいては、ｐＶＤＡｐｅｘＦｕｌｌＮＦｌａｇ（例１）と類似の方法によって構築された。このコンストラクトは、タンパク質のＣ−末端において、アミノ酸“Ａ−Ｒ−Ｑ”、それに続いてＦＬＡＧオクタペプチド配列もコードするものであった。２９３−ＥＢＮＡ細胞系は、ＶＥＧＦ−Ｃをタンパク分解性にプロセシングする能力を有しており（ヨウコフ（Joukov）他、EMBO J., 1997 16 3898-3911）、このことのよって、これらトランスフェクトされた細胞に由来するＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の分析を、細胞の生合成およびプロセシングの間に行うことが可能になる。
【００７７】
ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体を、安定にトランスフェクトされた２９３−ＥＢＮＡ細胞のならし培地（培養上清）から、Ｍ２（抗−ＦＬＡＧ）ゲル（Sigma-Aldrich）でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、製造業者の指示に従って、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドを用いて溶出した。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドを、遠心濃縮機（Amicon, Beverly, MA）を用いて除去した。Ｍ２アフィニティーカラムから溶出されたフラクションのアリコットを、精製された種の正体を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析するか、あるいはＭ２抗体（Sigma-Aldrich）によってイムノブロットした。
【００７８】
種々のＶＥＧＦ−Ｄ誘導体を発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドがタンパク分解性にプロセシングされていることを示すものである。ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇを発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞からの培地を用いた精製により、Ｎ−末端にＦＬＡＧオクタペプチドを備えたＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドのみの、または、ＦＬＡＧ（登録商標）−タグ付加された(tagged)ポリペプチドに共有結合的にあるいは非−共有結合的に結合した誘導体の、特異的な分析が可能になった（図８および図１１）。
【００７９】
ＶＨＤ内にある、ヒトＶＥＧＦ−Ｄの残基１９０から２０５の領域に対応する合成ペプチド、ＫＣＬＰＴＡＰＲＨＰＹＳＩＩＲＲ（配列番号３）（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６の配列番号５）に対する、Ａ２と命名されたポリクローナル抗血清をウサギにおいて産生させた。
【００８０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析のために、精製ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体を含有するサンプルを、２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液と１：１の割合で混合し、ボイルし、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した（レームリ（Laemmli）、Nature, 1970 227 680-685）。タンパク質を次にＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブラン（Millipore, Bedford, MA）にトランスファーし、そして非−特異的な結合部位を、３％ ＢＳＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０中でインキュベーションすることによってブロッキングした。ブロットを次に１：２０００の希釈度のＡ２抗血清とともに室温で２時間インキュベートするか、あるいはその代わりに、製造業者によって記載されているようにしてＭ２（抗−ＦＬＡＧ）抗体とともにインキュベートした。緩衝液（３％ ＢＳＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄した後、ブロットを抗−ウサギＩｇ西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体または抗−マウスＩｇ ＨＲＰ結合体（Biorad, Hercules, CA）によってプローブ（探索）し、化学発光（ECL, Amersham, UK）を用いて現像した。
【００８１】
ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇを発現する細胞によって分泌されるタンパク質の、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色による分析によって、プロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄの予想されるサイズである、およそ５３ｋＤａの種、および、およそ３１および２９ｋＤａの２つのポリペプチドが明らかにされた（図９Ａ）。（ｋＤａにおける）分子量マーカーのサイズは、各パネルの左側に示され、ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の位置は（ｋＤａにおける分子量とともに）、右側に矢印によってしるしを付けられている。この結果はＶＨＤのＣ−末端近くで起こる、タンパク分解性切断現象と一致している。このモデルによると、およそ５３ｋＤａのポリペプチドは、プロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄを表すものであり、およそ３１ｋＤａのポリペプチドは、Ｎ−末端プロペプチドおよびＶＨＤからなる（すなわち、Ｃ−末端プロペプチドを欠いている）ものであろう。Ｎ−末端プロペプチドおよびＶＨＤからなるポリペプチドの予想されるサイズは確かにおよそ３１ｋＤａである。というのは、グリコシル化されているＶＨＤはおよそ２１ｋＤａであることが以前に示されており（アーヘン（Achen）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 95 548-553; ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６の図１２ｂ）、ＦＬＡＧ−タグ付加された（tagged） Ｎ−末端延長の予想されるサイズはおよそ１０ｋＤａであるからである。もしＶＥＧＦ−Ｄのプロセシングに、ＶＨＤのＣ−末端の近くでの切断に加えて、ＶＨＤのＮ−末端の近くでの切断が関与しているとすれば、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇを発現する細胞は、Ｎ−末端延長のみからなる１０ｋＤａのＦＬＡＧ−タグ付加されたポリペプチドも分泌するはずである。銀染色によって評価した場合（図９Ａ）、これら細胞によって分泌されるＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の中に１０ｋＤａのポリペプチドは検出されなかったが、それは、Ｍ２抗体を用いた同じ材料のウエスタンブロット分析によって明瞭に検出された（図９Ｂ）。銀染色によって検出されたおよそ２９ｋＤａのポリペプチドは、同じサンプルにおいてＡ２ポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロットによっては検出されなかった（図９Ｃ）。したがってこれはＣ−末端プロペプチドを表すものであろう。このことを、このポリペプチドのＮ−末端アミノ酸によって確認した。すなわち、このポリペプチドのＮ−末端配列は“ＳＩＱＩＰＥＥＤ”（配列番号４）であると確認され、この配列は、ＶＥＧＦ−Ｃとの比較に基づいて予想されるＶＨＤのＣ−末端切断部位のすぐに近くのものである。したがって、ＶＥＧＦ−ＤにおけるＣ−末端切断部位は、アルギニン２０５のすぐ後に位置する（“Ｒ↓ＳＩＱＩＰＥＥＤ”）（配列番号５）。このおよそ２９ｋＤａのポリペプチドは、おそらく、Ｎ−末端およびＣ−末端プロペプチドの間の鎖間ジスルフィド結合のために、アフィニティー−精製された物質中に存在していたのであろう（ＶＥＧＦ−Ｄプロセシングのスキーム（模式図）については図１１を参照）。
【００８２】
ＶＨＤのＮ−末端の近くでのＶＥＧＦ−Ｄのタンパク分解性切断の可能性をさらに調べるために、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃを発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞によって分泌されるタンパク質を精製し、上記のように分析した。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃのためのコンストラクトは、Ｃ−末端延長が欠失しておりＦＬＡＧによって置換されている、ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体を発現させる（図８）。これら細胞からの  ならし培地（培養上清）は、銀染色によって評価した場合、およそ３１および２１ｋＤａの、２つのＦＬＡＧ−タグ付加されたポリペプチドを含んでいた（図９Ｄ）。この結果は、ＶＨＤのＮ−末端近く、即ちプロセシングされていないＶＥＧＦ−ＤのＮ−末端からおよそ１０ｋＤａのところで起こる、Ｎ−末端切断現象と一致したものである。したがって、およそ３１ｋＤａのポリペプチドは、Ｎ−末端延長とＶＨＤとからなり、一方、およそ２１ｋＤａのポリペプチドは、ＶＨＤのみからなるものであろう。およそ３１およびおよそ２１ｋＤａのバンドの両方が、Ｍ２抗体によるウエスタンブロット分析によって検出されたという知見は、このモデルと一致している（図９Ｅ）。また、予想されたように、これら両方のバンドは、Ａ２抗血清によるウエスタンブロット分析によっても検出された（データは示さない）。
【００８３】
ＶＥＧＦ−ＤにおけるＮ−末端タンパク分解性切断部位の正確な位置を判定するために、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃを発現する細胞の上清から精製された、およそ２１ｋＤａのポリペプチドに対してＮ−末端アミノ酸シークエンシングを行った。アフィニティー−精製されたタンパク質のＮ−末端アミノ酸シークエンシングは、Hewlett-Packardタンパク質シークエンサー、モデルＧ１０００Ａ（Hewlett-Packard Palo Alto, CA）を用いて行った。このポリペプチドのＮ−末端配列は不均一であった。材料のおよそ８０％を代表する主な配列は、“ＦＡＡＴＦＹ”（配列番号６）で始まっており、材料の１０−１５％を代表する少ない方の配列は、“ＫＶＩＤＥＥ”（配列番号７）で始まっていた。したがって、予想されたように、およそ２１ｋＤａのポリペプチドのＮ−末端は、ＶＨＤのＮ−末端とほぼ同じ位置に位置している。ＶＥＧＦ−Ｄの主な（メジャー）Ｎ−末端切断部位はアルギニン８８のすぐ後に位置しており（“Ｒ↓ＦＡＡＴＦＹ”）（配列番号８）、そして少ない方の（マイナー）切断部位はロイシン９９のすぐ後にある（“Ｌ↓ＫＶＩＤＥＥ”）（配列番号９）（図８）。
【００８４】
例８
ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃは主に非−共有結合性の二量体の形態で存在する 一般に、ＶＥＧＦファミリーメンバーはジスルフィド−結合したホモ二量体として存在する。しかし、ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃは、主に非−共有結合性の二量体の形態で存在する（ヨウコフ（Joukov）他, EMBO J., 1997 16 3898-3911）。ＶＥＧＦ−Ｄの成熟した形態である、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎｐｒｏ△Ｃｐｒｏも、ジスルフィド−結合した二量体ではない。というのは、このポリペプチドはＳＤＳ−ＰＡＧＥで、還元条件下および非−還元条件下においてほとんど全く同じに移動するからである。成熟した形態のＶＥＧＦ−Ｄの性質をテストするために、アフィニティー−精製したＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃをサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。サイズ排除クロマトグラフィーは、アフィニティー−精製したタンパク質をＴＳＫＧ２０００ＳＷ（７．５ｘ６０ｍｍ Ｉｄ）カラム（LKB Bromo, Sweden）にローディングすることによって行った。カラムをＰＢＳで平衡化した。タンパク質を流速０．２５ｍｌ／分で溶出し、１分間のフラクションを収集した。タンパク質の溶出は２１５ｎｍでモニターした。見かけ上の分子量（各ピークの上に括弧内で示す）が、７３ｋＤａ（ピーク１）、４９ｋＤａ（ピーク２）および２５ｋＤａ（ピーク３）である３つの主なピークがカラムから溶出した。そしてこれらのピークにおける全タンパク質の比を分光光度的に評価したところ、およそ、１：２．１：０．９であった（図１０Ａ）。見かけ上の分子量は、既知のタンパク質：ウシ血清アルブミン二量体、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミンおよびトリプシンインヒビター（Sigma Aldrich Pty Ltd, Australia）から作成した検量線を用いて判定した。これらのピークに対応するフラクションをプールし、遠心濃縮機を用いて１００μｌまで濃縮し、そして還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、銀染色した（図１０Ｂ）。トラック１、２および３は、それぞれピーク１、２および３からのタンパク質に対応する。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃサブユニットの位置は図１０Ｂにおいて左側に示されており、（ｋＤａにおける）分子量マーカーの位置は右側に示されている。
【００８５】
ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃサブユニット（およそ２１ｋＤａ）は、ピーク２において最も大量であり、ピーク３においては容易に検出可能であり、そしてピーク１からは検出不可能であった（図１０Ｂ）。ピーク１における主な種は、Ｍ２アフィニティークロマトグラフィーによって精製されたタンパク質のサンプルにおいてしばしば検出される混入物であり、Ｍ２抗体またはＡ２抗血清によるウエスタンブロット分析によっては検出することのできない（データは示さない）、７３ｋＤａのタンパク質であった。この７３ｋＤａのタンパク質は、ＶＥＧＦ−Ｄをコードする配列を欠くＡｐｅｘ−３プラスミドによってトランスフェクトされた２９３−ＥＢＮＡ細胞からの上清を用いたコントロールＭ２アフィニティー精製においても観察された（データは示さない）。サイズ排除クロマトグラフィーから判定された見かけ上の分子量は、ピーク２および３におけるタンパク質はそれぞれＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ二量体およびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ単量体であることを示すものであった。したがって、そのサブユニットが還元条件下または非−還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離する、非−共有結合性の二量体が、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃのアフィニティー−精製された調製物における主な分子種であった。
【００８６】
ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの二量体の形態および単量体の形態が、ＶＥＧＦＲ−２に結合する能力を、カラムから溶出したフラクションを用いて評価し、ＶＥＧＦＲ−２に結合する能力について、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６７５５に記載のＢａ／Ｆ３細胞バイオアッセイを用いてアッセイした。ピーク３におけるＶＥＧＦＲ−２−結合活性は、ピーク２におけるもののおよそ２％であり、このことは、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ非−共有結合性ホモ二量体は単量体よりも生理活性が大きいことを示している。ピーク１におけるＶＥＧＦＲ−２結合活性は、ピーク２におけるもののおよそ１％であり、このことは、おそらくこのピークにおける少量のＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ非−共有結合性ホモ二量体を反映している。明らかに二量体の形態のＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの方が、単量体の形態のものより、はるかによくＶＥＧＦＲ−２に結合する。
【００８７】
例６において示されるデータは、ＶＥＧＦ−Ｄがタンパク分解性にプロセシングされること、および、タンパク分解性切断の部位が、ＶＥＧＦ−Ｃにおけるものと位置において同じではないが、類似していることを実証するものである。タンパク分解性プロセシングはおそらくかなりの生物学的な重要性を有するものである。というのは、異なるＶＥＧＦ−Ｄ誘導体は、ＶＥＧＦ受容体を活性化することに関して異なる能力を有しているからである。完全にプロセシングされたＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３との両方に結合してそれらを活性化する（アーヘン（Achen）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 95 548-553） 一方、プロセシングされていない形態のＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−３を活性化するが、ＶＥＧＦＲ−２は活性化しない（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６の図１４および図１５）。したがって、段階的なタンパク分解性プロセシングは、インビボでＶＥＧＦ−Ｄの受容体−結合特異性を調節する方法である可能性がある。
【００８８】
サイズ排除クロマトグラフィーはまた、アフィニティー−精製されたＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃは主に非−共有結合性の二量体であるが、小部分は単量体であることを実証するものであった。二量体の形態のみがＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインを含むキメラの受容体を強く活性化することができた。この知見は、細胞表面受容体チロシンキナーゼの活性化が受容体二量体化に関与するとすれば、予想されたものであった。おそらく、二量体のリガンドは１分子あたり２つの受容体結合部位を提供する一方、単量体の形態は１つしか提供しない。したがって、二量体のリガンドは受容体の二量体化を引き起こすことができるが、単量体のリガンドはそれができないのである。
【００８９】
２９３−ＥＢＮＡ細胞によって行われ、単量体および二量体を生じさせる、ＶＥＧＦ−Ｄのプロセシングについてのスキームを図１１に示す。２つの異なる形態のプロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄが細胞から分泌される：１つは単量体であり（左側）、もう１つは逆平行の（anti-parallel）ジスルフィド−結合した二量体であってＮ−末端およびＣ−末端プロペプチドの間にジスルフィド架橋を有するものである（右側）。矢印は、細胞内の形態から、ＶＨＤのＮ−末端およびＣ−末端における段階的なタンパク分解性プロセシングの産物へと導くものであり、最後にはＶＨＤの非−共有結合性の二量体および単量体からなるＶＥＧＦ−Ｄの成熟した形態が生じる。ここに記載された細胞系からのＶＥＧＦ−Ｄの誘導体の分析は、ＶＨＤからのＣ−末端プロペプチドの切断の方が、Ｎ−末端プロペプチドの切断よりも効率的におこるということを示唆するものである。簡明さのため、タンパク分解性プロセシングから生じるすべてのありうる誘導体を示してはいない。図１１において、Ｎ−プロはＮ−末端プロペプチドを示す；Ｃ−プロは、Ｃ−末端プロペプチド；ＶＨＤは、ＶＥＧＦホモロジードメイン；灰色の箱は、ドメイン間の非−共有結合性の相互作用；−Ｓ−は、サブユニット間のジスルフィド架橋；Ｎ−は、ポリペプチドのＮ−末端；そして、矢印は、タンパク分解性切断部位のおよその位置を表す。
【００９０】
例９
ＶＥＧＦ−Ｄおよび血管透過性 アフィニティー−精製したヒトＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを、Ｍｉｌｅｓアッセイを用いて血管透過性を誘導する能力についてテストした。Ｍｉｌｅｓアッセイ（マイルズ，エイ・エイ（Miles, A. A.）およびマイルズ，イー・エム（Miles, E. M.）, J. Physiol., 1952 118 228-257）は、麻酔したモルモットを用いて行った。透過性因子によって誘導される血管外遊出の定量化のために、サンプル注射の領域を切除し、そしてホルムアミド中、４２℃で３日間のインキュベーションによってエバンスブルー色素を抽出した。抽出された色素の量を、６２０ｎｍでのサンプルの吸光度を判断することによって分光光度的に定量化した。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを用いたのは、ヒトＶＥＧＦ−ＣのＶＨＤ（ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃ）が血管透過性を誘導することが知られていたためである（ヨウコフ（Joukov）他, EMBO J., 1997 16 3898-3911）。精製したマウスＶＥＧＦ164をポジティブコントロールとして含めた。予想されたように、マウスＶＥＧＦ164は血管透過性を強く誘導した。検出可能な血管透過性を誘導した、マウスＶＥＧＦ164の最も低い濃度は６０ｎｇ／ｍｌであった。同様に、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃも血管透過性を誘導したが、検出可能な活性を示す最も低い濃度は２５０ｎｇ／ｍｌであった。対照的に、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃは、１μｇ／ｍｌという高さのタンパク質濃度においてさえも、活性を示さなかった。これらの結果はヒトＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃは、モルモットにおける血管透過性の誘導物質ではないということを示すものである。
【００９１】
ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦ−Ｃとは、一次構造および受容体−結合特異性における類似性のために、ＶＥＧＦファミリーのサブファミリーのメンバーであるとみなされている（アーヘン（Achen）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 95 548-553）。これら２つの分子のプロセシングのメカニズムは似ているが、同じではない。しかし、これら２つの増殖因子は、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃは血管透過性を誘導しないという知見によって例証されるように、生物活性において相違を示す。対照的に、ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃは、ＶＥＧＦほど強力ではないが血管透過性を誘導する（ヨウコフ（Joukov）他, EMBO J., 1997 16 3898-3911）。
【００９２】
上述の記載および諸例は、単に本発明を例示するために記載されたものであり、限定されることを意図するものではない。本発明の精神及び本質を組み込んだ開示された実施態様を改変することが当業者になされうるものであり、本発明は請求の範囲およびその均等物の枠内に入るすべての改変を含むものであると広く解釈されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を含む発現ベクター、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を安定に発現する細胞系、および、これらの発現ベクターおよび宿主細胞を用いてポリペプチドを作る方法を提供し、例えば、メラノーマおよび種々の疾患を治療および軽減する方法に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月30日(2009.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のＶＥＧＦ−Ｄアミノ酸配列からなるポリペプチドの生物学的活性を有するフラグメントを安定に発現するヒト細胞系であって、前記フラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列の第９〜１０４番目のアミノ酸残基からなり、そして任意に前記ＶＥＧＦ−Ｄのフラグメントに付着されたエピトープタグを含む、細胞系。
【請求項２】
配列番号１のＶＥＧＦ−Ｄアミノ酸配列からなるポリペプチドの生物学的活性を有するフラグメントを安定に発現するヒト細胞系であって、前記フラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列の第１９〜９９番目のアミノ酸残基からなり、そして任意にＶＥＧＦ−Ｄフラグメントに付着されたエピトープタグを含む、細胞系。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸、
前記核酸に作動可能に連結され、ヒト細胞において前記核酸がコードするタンパク質の発現を促進できるプロモーター、及び
シグナル配列をコードする配列を含む発現ベクター。
【請求項４】
前記シグナル配列が、ＩＬ−３配列である請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記発現ベクターが、Ａｐｅｘ−３である請求項３又は４に記載の発現ベクター。 
【請求項６】
エピトープタグをコードする配列を含む請求項３〜５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記エピトープタグが、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘキサヒスチジン、またはＩ−ＳＰＹ（商標）である請求項６に記載の発現ベクター。