(57)【要約】【課題】ＡＮＰ（心房性ナトリウム利尿ペプチド）やＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）の利尿ホルモンの発現を増強する薬剤及びその使用方法を提供すること。【解決手段】下記のいずれかを含有するＡＮＰ及びＢＮＰの利尿ペプチド発現促進剤を作製し、対象に投与する。（１）Zac1タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを有するペプチド、（２）前記ＤＮＡ結合ドメインにおいてＤＮＡ結合活性を損なわない変異を有する（１）のペプチド、（３）(1)または(2)のうち少なくとも一つのペプチドを発現するペプチド発現物質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のいずれかを含有するＡＮＰ（心房性ナトリウム利尿ペプチド）またはＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）の利尿ペプチド発現促進剤。
（１）Zac1タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを有するペプチド、
（２）前記ＤＮＡ結合ドメインにおいてＤＮＡ結合活性を損なわない変異を有する（１）のペプチド、
（３）（１）または（２）のうち少なくとも一つのペプチドを発現するペプチド発現物質。
【請求項２】
前記Zac1タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の利尿ペプチド発現促進剤。
【請求項３】
前記転写活性化ドメインが、Zac1タンパク質の転写活性化ドメインであることを特徴とする請求項１または２に記載の利尿ペプチド発現促進剤。
【請求項４】
前記Zac1タンパク質の転写活性化ドメインが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載の利尿ペプチド発現促進剤。
【請求項５】
前記ペプチドがNkx2.5タンパク質結合ドメインをさらに有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の利尿ペプチド発現促進剤。
【請求項６】
前記Nkx2.5タンパク質結合ドメインが、Zac1タンパク質のNkx2.5タンパク質結合ドメインであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の利尿ペプチド発現促進剤。
【請求項７】
前記Zac1タンパク質のNkx2.5タンパク質結合ドメインが、配列番号４または配列番号５に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項６に記載の利尿ペプチド発現促進剤。
【請求項８】
前記Zac1タンパク質のNkx2.5タンパク質結合ドメインにおいて、ＰＫＣのターゲット配列中のスレオニンがグルタミンまたはアスパラギンに置換していることを特徴とする請求項７または８に記載の利尿ペプチド発現促進剤。
【請求項９】
Nkx2.5タンパク質またはNkx2.5タンパク質活性化物質が共投与されることを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載の利尿ペプチド発現促進剤。
【請求項１０】
Nkx2.5タンパク質活性化物質が、Nkx2.5タンパク質の発現を増強することを特徴とする請求項９に記載の利尿ペプチド発現促進剤。
【請求項１１】
ＰＫＣタンパク質またはＰＫＣタンパク質活性化物質が共投与されることを特徴とする請求項６または７に記載の利尿ペプチド発現促進剤。
【請求項１２】
ＰＫＣタンパク質活性化物質が、ＰＫＣシグナル伝達系を増強することを特徴とする請求項１１に記載の利尿ペプチド発現促進剤。
【請求項１３】
前記ペプチドが、野生型Zac1タンパク質、またはそれらの一部であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の利尿ペプチド発現促進剤。
【請求項１４】
ペプチド発現物質が、当該ペプチドを発現するＤＮＡを含有することを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の利尿ペプチド発現促進剤。
【請求項１５】
下記のいずれかを含有する医薬組成物。
（１）Zac1タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを有するペプチド、
（２）前記ＤＮＡ結合ドメインにおいてＤＮＡ結合活性を損なわない変異を有する（１）のペプチド、
（３）（１）または（２）のうち少なくとも一つのペプチドを発現するペプチド発現物質。
【請求項１６】
心臓病治療薬または抗腫瘍薬であることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記心臓病が、心不全、心筋梗塞、または不整脈であることを特徴とする請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＮＰ（心房性ナトリウム利尿ペプチド）及びＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）の利尿ペプチド発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓は循環器である以外に、内分泌器としての役割を有する。  
例えば静脈還流量が増加して右心房が伸展すると、心房からＡＮＰ（心房性ナトリウム利尿ペプチド；Atrium natriuretic peptide） が分泌される。また、心臓の負荷が増えたり、心筋が伸展したりすると、心筋からＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド；Brain natriuretic peptide） が分泌される。
【０００３】
これらの利尿ペプチドは、ナトリウム利尿ペプチド（Natriuretic peptide）であり、心臓などに発現するＮＰＲ−Ａ（ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ；Natriuretic peptide receptor A）に結合し、腎臓においてナトリウム排泄を促進することによる強力な利尿作用を有する。
【０００４】
最近、これらの利尿ペプチドは、心臓疾患の分子マーカー（例えば、非特許文献１参照）のみならず、急性心不全（例えば、非特許文献２〜３参照）、心筋梗塞（例えば、非特許文献４参照）、腫瘍（例えば、非特許文献５参照）などの疾患に対する医薬として利用できることが明らかにされている。
【非特許文献１】Curr. Opin.Nephrol. Hypertens. vol.15, p.14-21, 2006
【非特許文献２】Burnett, J Cardiol vol.48, p.235-241, 2006
【非特許文献３】Lee and Burnett, Heart Fail Rev vol.12, p.131-142, 2007
【非特許文献４】北風政史”J-WIND結果発表”[平成19年9月14日検索]インターネット〈http://carenet.com/cardiology/j-wind/images/J-wind20061128.pdf〉
【非特許文献５】Vesely, J Investig Med vol.53, p.360-365, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、ＡＮＰやＢＮＰの利尿ホルモンの発現を増強する薬剤及びその使用方法を開発することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、zincフィンガーモチーフを有する核タンパクであるmZac1が、ＡＮＰ遺伝子やＢＮＰ遺伝子の転写活性を増強することを見出し、さらに、Nkx2.5タンパク質が、mZac1タンパク質と協調してこれらの遺伝子の転写を増強すること、ＰＫＣがmZac1タンパクの１６７番目のスレオニンをリン酸化して活性化すること、などを見出し、本発明の完成に至った。すなわち、本発明は以下の１７項からなる。
【０００７】
〈１〉下記のいずれかを含有するＡＮＰ（心房性ナトリウム利尿ペプチド）またはＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）の利尿ペプチド発現促進剤。  
(1)Zac1タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを有するペプチド、
(2)前記ＤＮＡ結合ドメインにおいてＤＮＡ結合活性を損なわない変異を有する(1)のペプチド、
(3)(1)または(2)のうち少なくとも一つのペプチドを発現するペプチド発現物質。  
〈２〉前記Zac1タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする〈１〉に記載の利尿ペプチド発現促進剤。  
〈３〉前記転写活性化ドメインが、Zac1タンパク質の転写活性化ドメインであることを特徴とする〈１〉または〈２〉に記載の利尿ペプチド発現促進剤。  
〈４〉前記Zac1タンパク質の転写活性化ドメインが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする〈３〉に記載の利尿ペプチド発現促進剤。  
〈５〉前記ペプチドがNkx2.5タンパク質結合ドメインをさらに有することを特徴とする〈１〉〜〈４〉のいずれかに記載の利尿ペプチド発現促進剤。  
〈６〉前記Nkx2.5タンパク質結合ドメインが、Zac1タンパク質のNkx2.5タンパク質結合ドメインであることを特徴とする〈１〉〜〈５〉のいずれかに記載の利尿ペプチド発現促進剤。  
〈７〉前記Zac1タンパク質のNkx2.5タンパク質結合ドメインが、配列番号４または５に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする〈６〉に記載の利尿ペプチド発現促進剤。  
〈８〉前記Zac1タンパク質のNkx2.5タンパク質結合ドメインにおいて、ＰＫＣのターゲット配列中のスレオニンがグルタミンまたはアスパラギンに置換していることを特徴とする〈７〉または〈８〉に記載の利尿ペプチド発現促進剤。  
〈９〉Nkx2.5タンパク質またはNkx2.5タンパク質活性化物質が共投与されることを特徴とする〈５〉〜〈８〉のいずれかに記載の利尿ペプチド発現促進剤。  
〈１０〉Nkx2.5タンパク質活性化物質が、Nkx2.5タンパク質の発現を増強することを特徴とする〈９〉に記載の利尿ペプチド発現促進剤。  
〈１１〉ＰＫＣタンパク質またはＰＫＣタンパク質活性化物質が共投与されることを特徴とする〈６〉または〈７〉に記載の利尿ペプチド発現促進剤。  
〈１２〉ＰＫＣタンパク質活性化物質が、ＰＫＣシグナル伝達系を増強することを特徴とする〈１１〉に記載の利尿ペプチド発現促進剤。  
〈１３〉前記ペプチドが、野生型Zac1タンパク質、またはそれらの一部であることを特徴とする〈１〉〜〈１２〉のいずれかに記載の利尿ペプチド発現促進剤。  
〈１４〉ペプチド発現物質が、当該ペプチドを発現するＤＮＡを含有することを特徴とする〈１〉〜〈１３〉のいずれかに記載の利尿ペプチド発現促進剤。  
〈１５〉下記のいずれかを含有する医薬組成物。  
(1)Zac1タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを有するペプチド、
(2)前記ＤＮＡ結合ドメインにおいてＤＮＡ結合活性を損なわない変異を有する(1)のペプチド、
(3)(1)または(2)のうち少なくとも一つのペプチドを発現するペプチド発現物質。  
〈１６〉心臓病治療薬または抗腫瘍薬であることを特徴とする〈１５〉に記載の医薬組成物。  
〈１７〉前記心臓病が、心不全、心筋梗塞、不整脈、または心房細動であることを特徴とする請求項１６に記載の医薬組成物。
【０００８】
なお、本明細書でペプチドまたはタンパク質を活性化するとは、細胞内で全体的に活性を高めることを言い、リン酸化などの修飾によってペプチドまたはタンパク質それ自体が固有に有する活性を増強させることだけでなく、細胞内でペプチドまたはタンパク質の量を増やすことや、そのペプチドまたはタンパク質と結合してその活性を増強する因子を導入すること、あるいはその因子を活性化することなどによって、活性を高めてもよい。  
また、mZac1はマウスZac1を表し、hZac1はヒトZac1表し、Zac1は種に関わらずZac1ホモログ全体を表すものとする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ＡＮＰやＢＮＰの利尿ホルモンの発現を増強する薬剤及びその使用方法を提供することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されている。従って、本発明は記載された実施例に限定されるものではなく、当業者が当然のこととして把握する態様は、全て本発明に含まれる。また、本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかであり、それらの改変態様や修飾態様も本発明に含まれる。
【００１２】
〈利尿ペプチド発現促進剤〉
本発明は、真核生物の転写活性化因子がＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインという、物理的に分離した２つのモジュラードメインを含み、これらのドメインが相互に置換可能であることを利用している。  
すなわち、本発明に係る利尿ペプチド発現促進剤は、ＡＮＰ（心房性ナトリウム利尿ペプチド）またはＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）の利尿ペプチド発現促進剤であって、
(1)Zac1タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを有するペプチド、
(2)前記ＤＮＡ結合ドメインにおいてＤＮＡ結合活性を損なわない変異を有する(1)のペプチド、
(3)(1)または(2)のうち少なくとも一つのペプチドを発現するペプチド発現物質
のいずれかの物質を含有する。
【００１３】
実施例に示すように、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するmZac1タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、ＡＮＰ遺伝子やＢＮＰ遺伝子のプロモーターに特異的に結合する。このＤＮＡ結合ドメインに、mZac1タンパク質の転写活性化ドメインを結合すると、ＡＮＰ遺伝子やＢＮＰ遺伝子の発現を増強できるようになる。また、このＤＮＡ結合ドメインは、Zac1タンパク質において、種を超えて保存されている。従って、Zac1タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを有するペプチドは、ＡＮＰまたはＢＮＰの利尿ペプチド発現促進剤として有効である。
【００１４】
ここで、Zac1タンパク質は、マウスZac1タンパク質あるいはヒトZac1タンパク質に相同なタンパク質であれば、その生物の由来は限定されないが、脊椎動物であることが好ましく、哺乳類であることがより好ましい。
【００１５】
ＤＮＡ結合ドメインは、Zac1タンパク質のＮ端にある４つのzincフィンガーモチーフを含めば特に限定されないが、アミノ酸配列１〜１５０番の領域であることが好ましく、配列番号１または配列番号２を有することがより好ましい。
【００１６】
転写活性化ドメインは、独立して機能するドメインであれば限定されず、例えば、ＧＡＬ４やＶＰ１６由来の転写活性化ドメインであってもよいが、Zac1タンパク質の転写活性化ドメインであることが好ましく、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００１７】
Zac1タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを有するペプチドは、当該ドメインを有すればよく、当該ドメインだけを有するペプチドであっても、当該ドメイン以外に他の機能を有するドメインやタグなど他の配列を有していても構わない。
【００１８】
このペプチドが、ＡＮＰやＢＮＰの活性化能を有する限り、変異を有しても構わず、変異は欠失・置換・挿入のいずれであっても構わない。変異しているアミノ酸数は少ない方が好ましく、１〜数個であることがより好ましい。特に、同じ性質を有するアミノ酸（例えば、酸性アミノ酸、芳香族アミノ酸、疎水性アミノ酸、アルカリ性アミノ酸など）同士の置換は、ペプチドの性質を変えないことが知られており、上記の変異は、このような置換を含む。
【００１９】
ペプチド発現物質とは、当該ペプチドを発現する物質のことであり、例えば、当該ペプチドをコードする遺伝子を発現するＤＮＡや発現ベクターなどが挙げられる。
【００２０】
利尿ペプチド発現促進剤は、ペプチドあるいはペプチド発現物質を含めばよく、それら以外に、それらを溶解する緩衝溶液、リピッドなどのキャリア、保護剤、などを含んでもよく、剤形は特に限定されない。また、ペプチド発現物質を、アデノウイルスなどのウイルス粒子などにパッケージしたり、リポソームに封入したりして、そのウイルスやリポソームなどを発現促進剤として投与してもよい。また、ペプチド発現物質を、in vitroで細胞内に導入し、当該ペプチドを発現する細胞を投与したり移植したりしてもよい。
【００２１】
〈付加的ドメイン〉
Nkx2.5タンパク質は、ＡＮＰ遺伝子のプロモーター上でZac1と相互作用して、ＡＮＰ遺伝子の転写活性化能を増強することができる。従って、本発明に係る利尿ペプチド発現促進剤に含有されるペプチドに、Nkx2.5タンパク質結合ドメインを付加してもよい。Nkx2.5タンパク質結合ドメインの由来は特に限定されず、GATA4やTbx5などが例として挙げられるが、Zac1タンパク質のNkx2.5タンパク質結合ドメインであることが好ましく、配列番号４または配列番号５に記載のアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００２２】
付加する部位は、各ドメインの構造や機能を破壊しなければ特に限定されないが、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインの間に挿入することが好ましい。  
この場合、Nkx2.5タンパク質結合ドメインを含むペプチドあるいは当該ペプチド発現物質とともに、Nkx2.5タンパク質またはNkx2.5タンパク質活性化物質などの付加的因子が投与されてもよい。Nkx2.5タンパク質活性化物質としては、例えばNkx2.5タンパク質発現物質などを挙げることができ、具体的には、Nkx2.5タンパク質をコードする遺伝子を発現するＤＮＡや発現ベクターなどが挙げられる。
【００２３】
また、発明者らは、mZac1タンパク質が、Nkx2.5タンパク質結合ドメインにＰＫＣのターゲット配列を有し、その配列中の１６７番目のアミノ酸のスレオニンがＰＫＣによってリン酸化されることにより、活性化されることを明らかにした。このＰＫＣのターゲット配列及びスレオニンは、哺乳類で保存されている。従って、Zac1タンパク質のNkx2.5タンパク質結合ドメインを付加した場合には、ＰＫＣタンパク質またはＰＫＣタンパク質活性化物質などの付加的因子が共投与されてもよい。
【００２４】
ＰＫＣタンパク質活性化物質としては特に限定されず、ジアシルグリセロールやホルボールエステルなど直接ＰＫＣタンパク質に働きかけて活性化するものだけでなく、シグナル伝達系の活性化を通じてＰＫＣタンパク質を活性化するインシュリンや甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンなどのホルモン、アドレナリンなどの神経伝達物質や、それらシグナル伝達系の経路の途中にある因子でもよい。
【００２５】
なお、Zac1タンパク質のNkx2.5タンパク質結合ドメインにおいて、１６７番目のスレオニンをグルタミン酸やアスパラギン酸に置換すると、Zac1タンパク質の活性が恒常的に亢進すると考えられるので、１６７番目がグルタミン酸やアスパラギン酸に置換された変異を有するNkx2.5タンパク質結合ドメインを付加することは特に好ましい。
【００２６】
〈利尿ペプチド発現促進方法〉
細胞内でＡＮＰまたはＢＮＰの活性を増強するために、その細胞に本発明に係る利尿ペプチド発現促進剤を作用させる。その際、利尿ペプチド発現促進剤の有効物質は核で機能するため、細胞内に導入する必要がある。
【００２７】
従って、利尿ペプチド発現促進剤がペプチドを含む場合、インジェクションや膜透過性ペプチドベクターを用いた導入法によってそのペプチドを細胞に導入する。利尿ペプチド発現促進剤がＤＮＡを含む場合、エレクトロポレーション、トランスフェクション、インジェクションなどを用いることができる。この場合、ＤＮＡがコードするペプチドをゲノム外で一過的に発現させても、ゲノムに挿入させて発現させても構わない。また、これらペプチドやＤＮＡがウイルスやリポソームに包含されている場合は、そのウイルスやリポソームを細胞に接触させればよい。その他、利尿ペプチド発現促進剤の剤形に従って、当業者は適切な投与方法を選択することが可能である。
【００２８】
また、上述した付加的因子が、利尿ペプチド発現促進剤と共投与されてもよい。ここで共投与とは、それぞれが前後して投与されてもよく、同時に投与されても良い。また、それぞれの単剤として投与されてもよく、両者を含む複合剤として投与されてもよい。付加的因子の投与方法は、利尿ペプチド発現促進剤と同様に、その形状に従って、当業者によって適切な投与方法が選択される。
【００２９】
〈医薬組成物〉
ＡＮＰやＢＮＰなどの利尿ペプチドは、これまで心不全、心筋梗塞、不整脈など様々な心臓病の治療薬または抗腫瘍薬として利用できることが報告されている（例えば、Saba S. R. and Vesely D. L., Histology and histopathology 21(7): 775-783, 2006参照）。従って、本発明の利尿ペプチド発現促進剤は、ＡＮＰやＢＮＰの発現を亢進することができ、心臓病治療薬または抗腫瘍薬として有効である。この場合、投与方法としては、利尿ペプチド発現促進剤で記載した方法を含む公知の手段を用いればよい。
【実施例】
【００３０】
〈１〉mZac1タンパク質による利尿ペプチド遺伝子の転写活性増強
mZac1タンパク質の発現ベクターとＡＮＰ遺伝子、ＢＮＰ遺伝子、α-ＭＨＣ遺伝子の各プロモーターの下流にレポーター遺伝子を挿入したレポータープラスミドを培養細胞に共導入し、mZac1タンパク質が、上記遺伝子の転写活性を増強することができることを示す。
【００３１】
まず、下記のプライマーを用いてmZac1 cDNA全長をPCRで増幅し、両端に導入したBamHI及びNotI部位を用いてpcDNA3.1のBamHI-NotI部位に挿入することで、mZac1発現ベクターを構築した。  
プライマーmZac1F: GGATCCACCATGGCTCCATTCGCTGTCA  （配列番号６）
プライマーmZac1R: GCGGCCGCCTAAACTGTCCATTTCTTAT  （配列番号７）
【００３２】
レポータープラスミドは、ANP-luciferase、BNP-luciferase、及びαMHC-luciferase（Wang et al., Cell vol.105, p.851-863, 2001）を用いた。なお、mZac1活性と比較するコントロールとして、ＭＥＦ２Ｃタンパク質、ＧＡＴＡ４タンパク質、ＳＲＦタンパク質を発現する各発現ベクターを用いた。
【００３３】
Lipofectamine（InVitrogen社）を用いて、６ウェルのプラスティックディッシュに播種した2x106個のCOS7細胞に対し、100ngの各レポータープラスミド及び10ng、30ng、または100ngのmZac1発現ベクターを導入した。トランスフェクション効率を標準化するための内部コントロールとして、10ng のCMV-Renilla-luciferase（Promega社）を導入した。また、ネガティブコントロール（図ではControlと記載）として、mZac1の挿入されていないpcDNA3.1を用いた。２４時間後細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定し、各タンパク質による転写活性レベルを比較したところ、図１に示すように、mZac1タンパク質は、ＡＮＰ遺伝子、ＢＮＰ遺伝子、α-ＭＨＣ遺伝子の各プロモーターに対し、dose-dependentにその転写活性を増強した。
【００３４】
このように、mZac1タンパク質は、ＡＮＰ遺伝子、ＢＮＰ遺伝子、α-ＭＨＣ遺伝子の転写活性を増強し、発現を高めることができる。
【００３５】
〈２〉mZac1タンパク質のＡＮＰ遺伝子プロモーターへの結合
ＡＮＰ遺伝子のプロモーターにはmZac1タンパク質結合配列が存在する。以下、その結合配列にmZac1タンパク質が結合することにより、ＡＮＰ遺伝子の転写を活性化することを示す。
【００３６】
まず、ANP-luciferaseを基にして、図２Ａに示すようなＡＮＰ遺伝子のプロモーターの欠失シリーズを作製し、それらをレポーターとして〈１〉と同様にルシフェラーゼアッセイを行った。ここでは、2x106個のCOS7細胞に対し、100ngの各レポータープラスミド及び100ngのmZac1発現ベクターを用いた。ルシフェラーゼ活性を測定し、各レポーターに対する転写活性レベルを比較したところ、-９３〜-１１１の領域を有するレポーターに対して転写の活性化が検出されたことから、この領域にmZac1タンパク質が結合することがわかる。さらに、この領域内のGCCGCCG配列をGTATATG配列に置換したレポータープラスミドを用いると、図２Bに示すように、mZac1タンパク質による活性化が消失した。
【００３７】
次に、-９３〜-１１１の領域内の配列GCATCTTCTGCTGGCCGCCG(配列番号８)を用いてゲルシフトアッセイを行った。具体的には、mZac1タンパク質を強制発現させたCOS7細胞の核抽出物を調製し、３２Pでラベルした上記配列を有する２重鎖オリゴヌクレオチド500ngを、結合バッファー中で、５μLの各抽出物と２μgのpoly(dI-dC)とともに室温で３０分インキュベートし、５％アクリルアミドゲルで解析したところ、図２C左図レーン１のように、シグナルが観察された。COS7細胞の核抽出物を0.1μL、0.3μL、1.0μL、と増加させると、レーン２から４に示すように、シグナルも強くなった。また、competorとして、GCCGCCG配列を有し、ラベルしていない２重鎖オリゴヌクレオチド500ngを加えてインキュベートすると、レーン５に示すように、シグナルが消失し、GCCGCCG配列がmZac1タンパク質のターゲット配列であることがわかる。また、mZac1タンパク質に対する抗体1μgを加えてインキュベートすると、シグナルがスーパーシフトする（図２C右図）ことから、このシグナルがmZac1タンパク質によるものであることがわかる。
【００３８】
このように、Zac1タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、ＡＮＰ遺伝子のプロモーター内の-９３〜-１１１の領域にあるGCCGCCG配列に結合することができる。
【００３９】
〈３〉mZac1タンパク質のドメイン解析
mZac1タンパク質は、６つのzincフィンガーモチーフ、２つのアメロジェニン様ドメイン、及びＰＡＲＰ様ドメインがあることが知られていた。ここでは、mZac1タンパク質において、転写活性化ドメインがアミノ酸２７０-３６０番目の領域にあることを示す。
【００４０】
図３に示すmZac1変異タンパク質をコードするＤＮＡは、ＰＣＲを用いて作製し、pCDNA3.1に挿入した。なお、ＤＮＡ断片の挿入部位は、野生型mZac1発現ベクターと同じである。〈１〉と同様にレポーターアッセイを行ったところ、図３に示したように、ＤＮＡ結合領域であるZincフィンガードメインに、２７０-３６０番目の領域を付加した時に強い転写活性が検出され、この領域を欠失させると、転写活性が顕著に低下した。なお、mZac1発現ベクターは100ng導入し、レポーターとしてANP-luciferaseを用いた。
【００４１】
このように、mZac1タンパク質において、転写活性化ドメインがアミノ酸２７０-３６０番目の領域にある。従って、アミノ酸１-１５０番目のＤＮＡ結合領域とアミノ酸２７０-３６０番目の転写活性領域を有するペプチドは、下流の遺伝子を活性化できる。
【００４２】
〈４〉mZac1タンパク質のNkx2.5タンパク質との協調効果
ＡＮＰ遺伝子のプロモーターにおいて、mZac1タンパク質がNkx2.5タンパク質と協調して転写活性を促進することを示す。
【００４３】
まず、mZac1発現ベクターとNkx2.5発現ベクターを細胞に共導入し、ＡＮＰ遺伝子のプロモーターに対する転写活性能を調べた。その際、（１）3ng、10ng、30ng、または100ngのNkx2.5発現ベクターのみ（２）3ng、10ng、30ng、または100ngのmZac1発現ベクターのみ（３）3ng、10ng、30ng、または100ngのNkx2.5発現ベクターと3ngのmZac1発現ベクター（４）3ng、10ng、30ng、または100ngのmZac1発現ベクターと3ngのNkx2.5発現ベクター、という４種類の場合を設定し、〈３〉と同様に実験を行ったところ、図４Ａに示すように、mZac1発現ベクターは、Nkx2.5発現ベクターに、dose-dependentに転写活性が増強された。
【００４４】
次に、〈３〉で使用したmZac1変異タンパク質のうち、一方向からの欠失突然変異体を用い、100ng のNkx2.5遺伝子発現ベクターを共導入した以外は、〈３〉と同様に実験を行ったところ、図４Ｂに示すように、Nkx2.5タンパク質との相互作用には、C端側の２つのzincフィンガーモチーフを含むアミノ酸１５０-２７０番目の領域が必要であった。
【００４５】
また、図４Ｃに示したmZac1変異タンパク質及びNkx2.5タンパク質を用いたpull-downアッセイの結果は、図４Ｃの結果と一致し、図４Ｃで転写活性の観察されたアミノ酸１-３６０を有するmZac1変異タンパク質及び１-２７０を有するmZac1変異タンパク質はNkx2.5タンパク質と結合したが、転写活性の観察されなかったアミノ酸１-１５０を有するmZac1変異タンパク質はNkx2.5タンパク質と結合しなかった。図４Ｄにその結果を示す。
【００４６】
このように、mZac1タンパク質は、アミノ酸１５０-２７０番目の領域でNkx2.5タンパク質と結合し、協調して転写活性化を行う。従って、mZac1タンパク質のアミノ酸１５０-２７０番目の領域を有するペプチドに対しては、Nkx2.5タンパク質は共投与するための付加的因子として有効である。
【００４７】
〈５〉ＰＫＣによるmZac1タンパク質の活性化
mZac1タンパク質の１６７番目のスレオニンが、ＰＫＣによってリン酸化され、mZac1タンパク質が活性化されることを示す。
【００４８】
まず、QuickChange kit（Stratagene）を用いて、site-directed mutagenesisの原理によって、１６７番目のスレオニンがアスパラギンに置換されたmZac1変異タンパク質を発現するmZac1(T167N)発現ベクターを作製した。このベクターは、１６７番目のアミノ酸のコドンがスレオニンからアスパラギンになっている以外は、mZac1発現ベクターと同じ塩基配列を有する。
【００４９】
このmZac1(T167N)発現ベクターを用い、100nＭのＰＭＡの存在下で〈３〉と同様にして、mZac1(T167N)タンパク質の転写活性化能を調べたところ、図５に示すように、ＰＭＡによってmZac1タンパク質の活性が亢進したが、mZac1(T167N)タンパク質の活性は野生型ほど亢進しなかった。
【００５０】
このように、mZac1タンパク質の活性の一部は、ＰＫＣによる１６７番目のスレオニンのリン酸化によって調節されていることから、mZac1タンパク質のアミノ酸１５０-２７０番目の領域を有するペプチドに対しては、ＰＫＣは共投与するための付加的因子として有効である。
【００５１】
〈６〉マウスmZac1タンパク質とヒトhZac1タンパク質の比較
図６にマウスmZac1タンパク質とヒトhZac1タンパク質のアミノ酸配列を比較した。  
mZac1タンパク質のzincフィンガーモチーフを含むドメインのうち、１５０番目のアミノ酸までは、ヒトhZac1タンパク質においても非常に良く保存されており（８２．７％の相同性）、これらの領域は、ＤＮＡ結合ドメインとして、認識配列の特異性も含め、同じ機能を有していると考えられる。
【００５２】
また、１５０番目から２７０番目のアミノ酸も良く保存されており（７０％の相同性）、Nkx2.5タンパク質と相互作用する機能も保存されていると考えられる。特に、１６７番目のスレオニンも保存されており、両者でＰＫＣのターゲットになっていると考えられる。
【００５３】
このように、マウスmZac1タンパク質とヒトhZac1タンパク質では、各機能を有する領域において、高い相同性が認められ、哺乳類でZac1タンパク質は広くその機能が保存されていると考えられる。
【００５４】
〈７〉mZac1+/-マウスにおけるインターフェロン誘導性遺伝子の発現解析
ここでは、mZac1+/-マウスにおいてインターフェロン誘導性遺伝子（Ifi202b）の発現が抑制されることを示す。
【００５５】
本実施例に用いたmZac1+/-ヘテロ接合マウスは、ジーントラップ法によって、mZac1遺伝子に挿入変異が生じたES細胞（Lexicon Pharmaceuticals社  クローン番号Ost181461）を用いて、生殖系列キメラマウスを作製し、戻し交配することにより作製された。
【００５６】
交配して得られた野生型マウス胚、ヘテロ接合マウス胚、ホモ接合マウス胚のそれぞれの心臓から抽出したタンパク質に対し、一次抗体として抗マウスZac1ウサギ抗体（G-18, Santa Cruz Biotechnology社、１０００倍希釈）を用い、二次抗体としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼでラベルされた抗ウサギIgG（7074, Cell Signaling社  1000倍希釈）を用いて、ウエスタン・ブロッティングを行った。なお、可視化は、SuperSignal West Pico Chemiluminescent reagent (Pierce社)を用いて行った（図７）。また、ポジティブコントロールには、抗GAPDHF抗体（SC-20357、Santa Cruz社、500倍希釈）を用いた。
【００５７】
mZac1遺伝子は、imprintingを受ける遺伝子で、母親側から受け継いだ対立遺伝子は不活性化される。従って、図７に示すように、父親がヘテロ接合で、母親が野生型の場合、ヘテロ接合の仔には活性がある遺伝子が存在せず、Zac1遺伝子の発現がなくなる。
【００５８】
次に、父親がヘテロ接合であるmZac1+/-マウスの心臓からTrizol(Invitrogen社)を用いて全RNAを抽出し、下記プライマーを用いた定量RT-PCRによって、Ifi202b（プライマーはIfi202bFとIfi202bR）、レチノブラストーマ（Rb）（プライマーは、RbFとRbR）、p53（プライマーはp53Fとp53R）の発現を調べ、野生型マウスと比較した。なお、内部標準として、GAPDH（プライマーはGAPDHFとGAPDHR）を用いた。  
プライマーIfi202bF: AAGGTCCCAAACAAGTGGTG（配列番号９）
プライマーIfi202bR: TTGGCTCTTCACCTCAGACA（配列番号１０）
プライマーRbF: AGCAGTCCAAGGATGGAGAA（配列番号１１）
プライマーRbR: ACGGGCAAGGGAGGTAGAT（配列番号１２）
プライマーp53F: GCCATCTACAAGAAGTCACAGCA（配列番号１３）
プライマーp53R: AGGCACAAACACGAACCTCAAA（配列番号１４） 
プライマーGAPDHF: TTCAACGGCACAGTCAAGG (配列番号１５)
プライマーGAPDHR: CATGGACTGTGGTCATGAG（配列番号１６）
【００５９】
図８に示すように、mZac1+/-マウスでは、野生型マウスに比べて、Ifi202bの発現が低下していたが、その他の遺伝子Rbやp53の発現は差がなかった。この結果は、mZac1遺伝子の発現低下によって、インターフェロン誘導性遺伝子Ifi202bの発現が特異的に抑制されることを示す。
【００６０】
すなわち、Zac1タンパク質（あるいは、mZac1タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを有するペプチド）は、インターフェロン誘導性遺伝子Ifi202bの活性化を介してインターフェロンを誘導する作用を有するため、抗腫瘍剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明にかかる一実施例において、mZac1タンパク質による利尿ペプチド遺伝子の転写活性増強を示す図である。
【図２】本発明にかかる一実施例において、mZac1タンパク質のＡＮＰ遺伝子プロモーターへの結合を示す図である。
【図３】本発明にかかる一実施例において、mZac1タンパク質のドメイン解析の結果を示す図である。
【図４】本発明にかかる一実施例において、mZac1タンパク質のNkx2.5タンパク質との協調効果を示す図である。
【図５】本発明にかかる一実施例において、ＰＫＣによるmZac1タンパク質の活性化を示す図である。
【図６】ヒトmZac1タンパク質（human）とマウスhZac1タンパク質（mouse）の、１〜２７８番目のアミノ酸領域における相同性を示す図である。＋は類似アミノ酸、−は非類似アミノ酸、＝はアミノ酸の欠失を表す。
【図７】野生型マウス胚、mZac1+/-ヘテロ接合マウス胚、mZac1-/-ホモ接合マウス胚のそれぞれにおいて、mZac1タンパク質の発現を調べた結果を示す図である。
【図８】Zac1+/-マウスにおいて、インターフェロン誘導性遺伝子Ifi202bの発現が特異的に抑制されていることを示す図である。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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