(57)【要約】      （修正有）【課題】造血幹細胞に関する遺伝子発現の制御方法および造血幹細胞の分化・増幅方法を提供する。【解決手段】造血幹細胞に定常磁場曝露を行うことを特徴とする遺伝子発現の制御方法。定常磁場が、１〜１５テスラであることを特徴とする遺伝子発現の制御方法。当該制御方法によると、造血幹細胞の遺伝子発現を細胞増殖因子によらずに制御することが可能となり、C-KIT、GATA2、RUNX1、TEL、CDC25B及びERN1から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が制御される。そして、造血幹細胞の分化・増幅が可能となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞に、定常磁場曝露を行うことを特徴とする遺伝子発現の制御方法。
【請求項２】
遺伝子が、C-KIT、GATA2、RUNX1、TEL、CDC25B及びERN1から選ばれる少なくとも１つである請求項１に記載の遺伝子発現の制御方法。
【請求項３】
定常磁場が、１〜１５テスラであることを特徴とする請求項１〜２のいずれか１項に記載の遺伝子発現の制御方法。
【請求項４】
曝露時間が１〜２４時間であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子発現の制御方法。
【請求項５】
定常磁場曝露下で培養を行うことを特徴とする造血幹細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞に関する遺伝子発現の制御方法および造血幹細胞の分化・増幅方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
造血システムは、一定の寿命を有する各種血球を絶えず産生する再生能の高い系であり、多能性造血幹細胞の自己複製能と多分化能に支えられている。
このシステムは、サイトカインなどの外的因子と遺伝子などの内的因子によって制御され、特定の血球系へ方向付けられた造血前駆細胞を経て、各種血球が産生される。巨核球の分化・成熟に関する遺伝子発現レベルでの分子機構については、転写因子GATA-1,NF-E2,AML1(Runx1)などのいくつかの遺伝子が関与していることが明らかにされている。
この遺伝子発現を制御することにより、幹細胞を効率良く増幅する方法が知られている（例えば、特許文献１）。この方法は、転写因子結合物質を用いて、転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合を阻害し、転写因子の活性を制御することにより幹細胞を効率良く増幅している。
【特許文献１】特開２００７−０３７４０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
特許文献１は、転写因子結合物質を用いて、転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合を阻害し、転写因子の活性を制御することにより幹細胞を効率良く増幅しているが、転写因子結合物質であるペプチドを細胞内へ導入しなければならないという問題があった。
本発明の課題は、造血幹細胞に関する遺伝子発現の制御方法および造血幹細胞の分化・増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は以下の発明に係る。
１．造血幹細胞に、定常磁場曝露を行う遺伝子発現の制御方法。
２．遺伝子が、C-KIT、GATA2、RUNX1、TEL、CDC25B及びERN1から選ばれる少なくとも１つである１の遺伝子発現の制御方法。
３．定常磁場曝露下で培養を行うことを特徴とする造血幹細胞の培養方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の造血幹細胞に関する遺伝子発現の制御方法および造血幹細胞の分化・増幅方法は、造血幹細胞の遺伝子発現を細胞増殖因子によらずに制御することが可能となり、造血幹細胞の分化・増幅が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は、造血幹細胞に、定常磁場曝露を行う遺伝子発現の制御方法である。
本発明で使用する造血幹細胞は、例えば、ヒトの臍帯血、末梢血または骨髄から採取されたものを挙げることができる。
【０００７】
造血幹細胞の採取は、例えば、母親からインフォームド・コンセントが得られた正期産、正常妊娠分娩を対象とし、臍帯血バンクにて採取した移植対象外サンプル（採取量40ml 未満）、若しくは同ガイドラインに基づく方法で助産所にて娩出後の胎盤及び臍帯から、抗凝固剤citratephosphate-dextrose液入りの採血バッグを用いて採取する。採取後48時間以内の臍帯血を5mM EDTA-PBSを用いて約2倍に希釈後、Ficoll-Paque 15ml上に希釈試料を積層し、遠心分離する。Buffy coatを回収し、5mM EDTA-PBS を用いて2回洗浄遠心し、血小板を除去する。得られるlight-density 細胞より、MACS磁気ビーズカラム法（Miltenyi Biotec, Germany）によりCD34陽性細胞を分離・精製する。
【０００８】
Light-density細胞懸濁液にブロッキング試薬、CD34抗体を添加し、4℃, 15分間インキュベートする。0.5％ BSA-5mM EDTA-PBSを用いて洗浄遠心、再懸濁後、マイクロビーズを添加し4℃, 15分間インキュベートする。終了後、同様に洗浄、再懸濁し磁気ビーズカラムにかけ非吸着細胞を溶出する。プランジャーを用いて吸着細胞を回収し、CD34陽性細胞を得ることができる。生細胞数は、トリパンブルーを用い血球算定盤にて計数できる。CD34細胞陽性率は、フローサイトメーターを用いて測定できる。陽性率は、例えば、85-95％のものを挙げることができる。
【０００９】
本発明の造血幹細胞に定常磁場を曝露する方法は、特に限定されないが、例えば、定常磁場を発生する手段を備えた培養装置内等で曝露する方法を挙げることができる。定常磁場を発生する手段を備えた培養装置としては、例えば、Effects of Exposure of CHO-K1 Cells to a 10-T Static Magnetic Field （Radiology 2002 224:
817-822）に記載の装置を挙げることができる。
【００１０】
具体的には、ヘリウムフリー型超伝導磁石のボア中にウオータージャケット型恒温槽を挿入した装置内で、望ましい磁束密度ポイントに、造血幹細胞懸濁液を含むプラスチックシャーレを置き、曝露する。造血幹細胞は、培地に懸濁する。または、温度コントロール装置を装備し、炭酸ガス培養装置を装置内に含む定常磁場発生装置などを挙げることができる。また、定常磁場曝露の影響を正確に測定するために、擬似曝露実験を行なえる装置を準備することが好ましい。擬似曝露とは、定常磁場を発生しない以外は、定常磁場を発生する装置と同じ環境を再現できる装置をいう。
【００１１】
定常磁場の大きさに特に制限はないが、好ましくは１〜１５テスラ（Ｔ）、より好ましくは５〜１０テスラを挙げることができる。１テスラより小さい場合、効果が十分得られない虞がある。１５テスラを超えると、装置が大掛かりになる虞がある。また、磁場勾配があってもよい。
曝露する時間は特に制限はないが、好ましくは、１〜２４時間、より好ましくは４〜１６時間曝露する。
【００１２】
本発明で使用する培地としては、例えば、イスコフ改変ダルベッコ培地、イスコフ培地、RPMI培地、ダルベッコMEM培地、MEM培地、F12培地等の血清を含まない培地を挙げることができる。
【００１３】
本発明によれば、造血幹細胞に、定常磁場曝露を行うことにより遺伝子発現を制御することができる。制御される遺伝子は、例えば、C-KIT、GATA2、RUNX1、TEL、CDC25B及びERN1を挙げることができる。造血幹細胞に定常磁場曝露を行うと造血幹細胞内でこれらの遺伝子発現が増加する。
【００１４】
C-KITとは、前がん遺伝子で、steel遺伝子座によってコードされるStem-Cell Factor（SCF、またはSteel Locus Factor; SLF）のレセプタをコードする。このレセプターであるCD117抗原はごく少数の正常骨髄細胞にしか発現していません。ほとんどのCD117陽性骨髄細胞はCD34を共発現します。CD117は肥満細胞にも発現する。
GATA2とは、造血幹細胞の初期造血に関与する転写因子の一つ。これは、造血幹細胞や前駆細胞に発現しており、造血や泌尿生殖器形成に重要な役割を果たしている。
RUNX1（AML1）とは、造血システムに関与する重要な制御因子であり、幾つかの白血病にも関与している。
TEL（ETV6）とは、ETSファミリ−に属する転写因子の一つであり、t(12;21)転座により形成されたキメラ蛋白が白血病の発症に関係しているといわれている。
CDC25Bとは、特に癌等の増殖性疾患に関わっている。Cdc25の3種類のホモログA,B,Cは細胞周期の別時期に発現し、異なるサイクリン-Cdk複合体を形成する。Cdc25Bは主にG2/M移行を促進する。
ERN1とは、遺伝子であり、この遺伝子によってコード化されたタンパク質は、固有のキナーゼ活性およびendoribonuclease活性を所有します。また、小胞体に基づいたストレス信号に対する反応として遺伝子発現を変える上において重要なタンパク質です。
【００１５】
遺伝子発現の測定は、例えば、CD34陽性細胞からRNAを抽出し、リアルタイムPCRで各遺伝子発現を測定することができる。
【００１６】
RNA抽出は、例えば、Quiagen-RNeasyカラムキット等を使用することができる。
抽出したtotal RNAよりmRNAを逆転写し(Bio-Rad, iScript cDNA合成キット使用)、cDNAを合成する。その後、primer(perfect
realtime)、PCR反応酵素を含むサイバーグリーンスーパーミックス(Bio-Rad)を懸濁し、リアルタイムPCR装置(Chrom 4: Bio-Rad)を使用して解析を行うことができる。統計処理は「Gene
Expression Analysis for iCycler iQ」(Bio-Rad)マクロソフトを使用して行うことができる。
【００１７】
また、本発明によれば、造血幹細胞に、定常磁場曝露を行い培養することにより赤血球系前駆細胞（BFU-E）、巨核球系前駆細胞（CFU-Meg）への分化を促進することができる。
培養方法は、従来公知の方法により造血幹細胞を培養することができる。培地としては、  例えば、イスコフ改変ダルベッコ培地、イスコフ培地、RPMI培地、ダルベッコMEM培地、MEM培地、F12培地等の血清を含まない培地を挙げることができる。
また、必要により、サイトカイン等を添加し培養しても良い。
【００１８】
造血前駆細胞の測定は、例えば、白血球系前駆細胞（CFU-GM）、赤血球系前駆細胞（BFU-E）及び混合系前駆細胞（CFU-Mix）は、SCF, IL-3, G-CSF, GM-CSF及びEPOを含むメチルセルロース法により測定することができる。また、巨核球系前駆細胞（CFU-Meg）は、TPO及びSCF存在下プラズマクロット法により測定することができる。
【００１９】
実施例１
（臍帯血採取）
試験細胞：ヒト臍帯血由来CD34陽性造血前駆細胞
弘前大学医学部倫理委員会の承認を受け採取した臍帯血より磁気ビーズ法によって分離した。
母親からインフォームド・コンセントが得られた正期産、正常妊娠分娩を対象とした。東京臍帯血バンクにて採取した移植対象外サンプル（採取量４０ml未満）、抗凝固剤citrate-phosphate-dextrose液入りの採血バッグ（CBC-20，ニッショー、大阪）を用いて採取した。
【００２０】
（CD34陽性細胞）
採取後４８時間以内の臍帯血を５mM EDTA-PBSを用いて約２倍に希釈後、Ficoll-Paque（Amersham Pharmacia Biotech
AB, Uppsala, Sweden）１５ml上に希釈試料２０mlを積層し、遠心分離（３００g，３０min）した。Buffy coatを回収し、５mM EDTA-PBSを用いて２回洗浄遠心（４℃，２５０g，１０min）し、血小板を除去した。得られたLight-density細胞より、MACS磁気ビーズカラム法（Miltenyi Biotec, Germany）によりCD34陽性細胞を分離・精製した。Light-density細胞懸濁液にブロッキング試薬、抗CD34抗体を添加し、４℃、 １５分間インキュベートした。０．５％BSA-5mM
EDTA-PBSを用いて洗浄遠心（４℃、２５０g，１０min）、再懸濁後、マイクロビーズを添加し４℃、１５分間インキュベートした。終了後、同様に洗浄、再懸濁し磁気ビーズカラムにかけ非吸着細胞を溶出した。プランジャーを用いて吸着細胞を回収し、別のカラムを用いて同様の操作を繰り返し、CD34陽性細胞とした。生細胞数は、トリパンブルーを用い血球算定盤にて計数した。CD34細胞陽性率は、フローサイトメーターを用いて測定した。陽性率は、８５−９５％であった。
【００２１】
（強定常磁場曝露）
ヘリウムフリー型超伝導磁石のボア中にウオータージャケット型恒温槽を挿入した装置内で、最大磁束密度ポイント（10T）及び最大磁束勾配ポイント（5T）それぞれに、細胞懸濁液を含むプラスチックチューブを置き、4時間もしくは16時間曝露処理を行った。細胞はBIT9500/IMDM無血清培地に懸濁した。
【００２２】
（遺伝子発現解析）
10-T定常磁場環境下で、16時間処理したCD34陽性細胞からRNAを抽出し（Quiagen RNeasyミニカラムキット）、リアルタイムPCRで各遺伝子の発現を測定した。
RNA抽出はQuiagen-RNeasyカラムキットを使用した。
RNA
quality 及びconcentration
チェックは、Agilent
Technologiesのバイオアナライザー(RNA 6000 Nano assay, 弘前大学附属病院臨床検査部)を使用した。
マイクロアレイ解析はIllumina社の機器を使用した。
PCRによる遺伝子発現解析は、サイバーグリーンを用いたインターカレーター法によるrealtime RT- PCRをおこなった。
【００２３】
抽出したtotal RNAよりmRNAを逆転写し(Bio-Rad, iScript cDNA合成キット使用)、cDNAを合成した。その後、TAKARAで設計したprimer(perfect
realtime)、PCR反応酵素を含むサイバーグリーンスーパーミックス(Bio-Rad)を懸濁し、リアルタイムPCR装置(Chrom 4: Bio-Rad)を使用して解析をおこなった。統計処理は「Gene
Expression Analysis for iCycler iQ」(Bio-Rad)マクロソフトを使用しておこなった。
【００２４】
（RT-PCR実験方法）
Total RNAの抽出
各臍帯血検体より精製した造血幹細胞(HSCs)は、RNeasyミニキット(キアゲン、USA)を用いてTotal RNAを抽出した。この抽出したTotal RNAサンプルに混入したゲノム由来のDNAは、RNase-free DNase I (タカラバイオ, 日本) にて処理をおこなった。RNAの品質確認は、バイオアナライザ解析システム(アジレント, USA)を使用した。
cDNAへの合成
【００２５】
mRNAから一本鎖cDNAへの合成は、バイオラッドiScript cDNA合成キット(Bio-rad Lab. Inc., USA) を使用しておこなった。50 ng のTotal RNAに、4 μl
の5x iScript
Reaction Mix buffer (oligo (dT)と random hexamer primerを含む)、1
μlのiScript reverse
transcriptase (RNase 阻害剤を含むMMLV-derived 酵素)、nuclease-free
水を加え、50 μlの反応液に調整した。mRNA逆転写反応の熱処理条件は、25°C を5分、42°C を30分、85°Cを5分とした。
リアルタイムRT-PCRアッセイ
【００２６】
合成した一本鎖cDNAの遺伝子発現解析は、リアルタイムPCRアッセイにておこなった。テンプレートは、iQ SYBR Green Supermix (バイオラッド, USA)を含むRNase-free水に懸濁し、PCR反応液とした。サーマルサクラー装置は、Chrome 4(バイオラッド, USA)を用いた。熱処理条件は、酵素活性化のための95°Cを180秒処理の後、95°Cを30秒、62°Cを30秒、72°C を30秒の処理を40サイクルとした。強定常磁場10Tを16時間曝露したサンプル及びshamコントロールのPCR産物量は、ハウスキーピング遺伝子(GAPDH)にてノーマライゼーション後、各サンプルにおけるPCR産物が指数関数的に増幅されるサイクル数(Ct値)の差(ΔCt値)によって遺伝子発現量を比較した。リアルタイムRT-PCRアッセイに使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、表１に示した(タカラバイオ、日本)。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
（造血前駆細胞測定法）
白血球系前駆細胞（CFU-GM）、赤血球系前駆細胞（BFU-E）及び混合系前駆細胞（CFU-Mix）はSCF, IL-3, G-CSF, GM-CSF及びEPOを含むメチルセルロース法により評価した。CFU-GM、BFU-EおよびCFU-Mixの合計をCFC（colony-forming cell）とした。巨核球系前駆細胞（CFU-Meg）は、TPO及びSCF存在下プラズマクロット法により行った。
【００２９】
（メチルセルロース法）
遺伝子組換ヒトgranulocyte colony-stimulating factor（G-CSF, KIRIN, 10 ng/ml）、granulocyte-macrophage
colony-stimulating factor（GM-CSF, Bio Source, 10 ng/ml）、interleukin-3（IL-3, KIRIN, 100 ng/ml）、stem cell factor（SCF, KIRIN, 100 ng/ml）、erythropoietin（EPO, KIRIN, 10 ng/ml）を含むメチルセルロース培地（Metho Cult, StemCell Technologies）に、BIT9500（StemCell Technologies）- Iscove’s Modified
Dulbecco’s Medium（Invitrogen）に懸濁した細胞溶液を加え、24穴のプレート（FALCON）に0.3 ml/wellになるように播き、37 ℃、5 % CO2環境下で14日間培養した。細胞50個以上からなるコロニーを倒立顕微鏡下で計数した。
【００３０】
（プラズマクロット法）
イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM，Gibco BRL）に100 U/mlペニシリン（GibcoERL，NY）、100 μg/mlストレプトマイシン（Gibco BRL）、1 mM MEMピルビン酸ナトリウム（Gibco BRL）、1 ％
MEMビタミン混液（Gibco
BRL）、１％ MEM
non-essentialアミノ酸（Sigma，MO）、1×10-3Mチオグリセロール（Sigma）、0.2 g/ml L-アスパラギン（和光純薬，東京）、7.4 mg/ml塩化カルシウム（和光純薬）、0.2 ％ウシ血清アルブミン（bovin serum
albumin，BSA，Sigma）を加えたIMDM混液に、造血因子として50 ng/ml TPOを加え、さらに2 ％アプロチニン（Trasylol，バイエル薬品，大阪）及び10 ％ヒト血漿を含む培地を調製し、CD34陽性細胞を1×103個/mlになるように懸濁した。この混合液を、ヒトスロンビン（5
U/ml）を5 μl/wellとなるように添加した24穴のプレート（Falcon，Becton Dickinson Labware，NJ）に0.3 ml/wellになるように播き、37 ℃、5 ％CO2存在下14日間培養した。細胞50個以上からなるコロニーを倒立顕微鏡下で計数した。
実施例１のCD34陽性細胞における遺伝子発現に対する定常磁場の影響を図１に示す。
実施例１のCD34陽性造血前駆細胞由来コロニー形成に対する定常磁場の影響を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明のCD34陽性細胞における遺伝子発現に対する定常磁場の影響を示す。
【図２】本発明のCD34陽性造血前駆細胞由来コロニー形成に対する定常磁場（５テスラ）の影響を示す。
【図３】本発明のCD34陽性造血前駆細胞由来コロニー形成に対する定常磁場（１０テスラ）の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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