(57)【要約】      （修正有）【課題】造血幹細胞の維持・増幅方法、その方法によって得られた造血幹細胞集団、及び当該造血幹細胞集団を生体内に投与することによる造血機能の改善剤等の提供する。【解決手段】特定の配列に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む本発明のＨＳＣ活性支持因子の存在下、あるいは該ＨＳＣ活性支持因子をコードする核酸を含む発現ベクターを導入した哺乳動物細胞、好ましくはストローマ細胞の共存下で、造血幹細胞を培養することを含む、造血幹細胞の維持・増幅方法、当該方法によって得られる、増幅した造血幹細胞含有細胞集団、該細胞集団を含有する造血機能改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質を含有する、造血幹細胞の維持・増幅剤。
【請求項２】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含有する、細胞への造血支持能付与剤。
【請求項３】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを導入した哺乳動物細胞を含有する、造血幹細胞の維持・増幅剤。
【請求項４】
哺乳動物細胞がストローマ細胞である、請求項３記載の剤。
【請求項５】
哺乳動物細胞が造血支持能を有しないものである、請求項３記載の剤。
【請求項６】
発現ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項３〜５のいずれかに記載の剤。
【請求項７】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを哺乳動物細胞に導入し、該核酸を発現する細胞を選択することを特徴とする、造血支持能の向上した哺乳動物細胞の製造方法。
【請求項８】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の存在下で、造血幹細胞を培養することを含む、造血幹細胞の維持・増幅方法。
【請求項９】
少なくとも１種のサイトカインの共存下で造血幹細胞を培養することを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを導入した哺乳動物細胞と、造血幹細胞とを共培養することを含む、造血幹細胞の維持・増幅方法。
【請求項１１】
哺乳動物細胞がストローマ細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物細胞が造血支持能を有しないものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
発現ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれかに記載の方法によって得られる、増幅した造血幹細胞を含有する細胞集団。
【請求項１５】
請求項１４記載の細胞集団を含有する造血機能改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞の維持・増幅を支持するタンパク質を用いる、造血幹細胞の維持・増幅方法、該方法により得られる増幅した造血幹細胞を含有する細胞集団、該細胞集団を用いた造血機能の改善方法等に関する。
【０００２】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、自己複製能及び多分化能を有し、個体の一生にわたって、全ての血球系細胞を供給し続ける細胞である。近年、大きな進展が見られる造血幹細胞移植は、造血系の疾患または癌治療によって正常な血球産生が困難になった患者に対して、造血幹細胞を移植して造血系を回復させることを可能とする治療である。造血幹細胞移植の主なものとしては、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、及び臍帯血移植が挙げられる。骨髄移植では、正常な自己の骨髄のほか、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型が適合する他人の骨髄を移植するが、ＨＬＡ型が一定以上一致しないと移植が不可能なため、ドナーが不足しているのが現状である。また、末梢血幹細胞移植は、ドナーの末梢血中の造血幹細胞を増加させる目的で、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を投与する必要があり、その副作用（例、痛み、心筋梗塞及び脳梗塞のリスクの上昇等）が問題になっている。臍帯血移植は、ドナーの負担がほとんど無く、移植可能なＨＬＡ型の範囲が広いのが特徴であるが、供給可能な量が限られている。したがって、ＨＳＣの体外増幅を容易にする培養条件を確立することができれば、造血幹細胞を利用した再生医療における上記のような問題点が解決できると考えられる。
【０００３】
現在まで、ＨＳＣの体外増幅の達成に向けて、複数のサイトカインの組合せを用いた多数の試みがなされているが、最適培養条件下においてもＨＳＣ数の数倍の上昇という限られた成功しかもたらされておらず（非特許文献１、２）、実用化のために必要なレベルまでは到達していない。さらに、現在の造血幹細胞の体外増幅における大きな問題点として、インビトロで造血幹細胞の増殖を既存のサイトカインで刺激するような、これまでに確立された培養条件では、ＨＳＣの分化に向かう増殖が促進されるために自己複製能が失われてしまうことが挙げられる（非特許文献３〜８）。したがって、ＨＳＣの体外増幅を達成するためには、ＨＳＣの自己複製及び分化を調節する機構に対するさらなる理解が必要である。
【０００４】
ＨＳＣは、成人の骨髄では、幹細胞の運命を決定するために重要な役割を果たすストローマ細胞から構成されるニッチとよばれる特定の微小環境に存在すると考えられている。いくつかのストローマ細胞株が、骨髄のみならず、胎児肝及び大動脈−生殖腺−中腎領域からも樹立されており、インビトロにおいてＨＳＣを維持することが示されている（非特許文献９〜１６）。したがって、ＨＳＣをストローマ細胞株と共培養することによって、ニッチにおける造血を研究するための有用な系が提供される。しかしながら、ＨＳＣとストローマ細胞株との間の物理的な接触が必須であることが実証されたものの、ストローマ細胞株によってＨＳＣを維持する詳細な細胞及び分子機構については、ほとんど知られていない。
【０００５】
ところで、ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６（ＰＡ６）は、新生仔マウス頭蓋冠由来の前脂肪ストローマ細胞株であり、インビトロにおいて長期的な造血を支持することが知られている（非特許文献１７）。また、ＨＳＣの生存を支持することができない３個のＰＡ６サブクローンが単離されている。さらに、ＰＡ６細胞の造血支持能は、ｃ−ｋｉｔリガンドである幹細胞因子（ＳＣＦ）の発現だけでは付与されず、他の何らかの因子が必要であることも知られている。しかしながら、ＨＳＣ活性を支持するのに必要な他の因子が何であるかは、これまで全く解明されていなかった。
【０００６】
【非特許文献１】G. Sauvageau, N. N. Iscove, and R. K. Humphries, In vitro and in vivo expansion of hematopoietic stem cells, Oncogene 23 (2004) 7223-7232.
【非特許文献２】B. P. Sorrentino, Clinical strategies for expansion of haematopoietic stem cells, Nat Rev Immunol 4 (2004) 878-888.
【非特許文献３】K. M. Knobel, M. A. McNally, A. E. Berson, D. Rood, K. Chen, L. Kilinski, K. Tran, T. B. Okarma, and J. S. Lebkowski, Long-term reconstitution of mice after ex vivo expansion of bone marrow cells: differential activity of cultured bone marrow and enriched stem cell populations, Exp Hematol 22 (1994) 1227-1235.
【非特許文献４】S. O. Peters, E. L. Kittler, H. S. Ramshaw, and P. J. Quesenberry, Murine marrow cells expanded in culture with IL-3, IL-6, IL-11, and SCF acquire an engraftment defect in normal hosts, Exp Hematol 23 (1995) 461-469.
【非特許文献５】C. M. Traycoff, K. Cornetta, M. C. Yoder, A. Davidson, and E. F. Srour, Ex vivo expansion of murine hematopoietic progenitor cells generates classes of expanded cells possessing different levels of bone marrow repopulating potential, Exp Hematol 24 (1996) 299-306.
【非特許文献６】M. Bhatia, D. Bonnet, U. Kapp, J. C. Wang, B. Murdoch, and J. E. Dick, Quantitative analysis reveals expansion of human hematopoietic repopulating cells after short-term ex vivo culture, J Exp Med 186 (1997) 619-624.
【非特許文献７】H. Glimm, I. H. Oh, and C. J. Eaves, Human hematopoietic stem cells stimulated to proliferate in vitro lose engraftment potential during their S/G(2)/M transit and do not reenter G(0), Blood 96 (2000) 4185-4193.
【非特許文献８】H. Ema, H. Takano, K. Sudo, and H. Nakauchi, In vitro self-renewal division of hematopoietic stem cells, J Exp Med 192 (2000) 1281-1288.
【非特許文献９】L. S. Collins, and K. Dorshkind, A stromal cell line from myeloid long-term bone marrow cultures can support myelopoiesis and B lymphopoiesis, J Immunol 138 (1987) 1082-1087.
【非特許文献１０】H. J. Sutherland, C. J. Eaves, P. M. Lansdorp, J. D. Thacker, and D. E. Hogge, Differential regulation of primitive human hematopoietic cells in long-term cultures maintained on genetically engineered murine stromal cells, Blood 78 (1991) 666-672.
【非特許文献１１】C. M. Baum, I. L. Weissman, A. S. Tsukamoto, A. M. Buckle, and B. Peault, Isolation of a candidate human hematopoietic stem-cell population, Proc Natl Acad Sci U S A 89 (1992) 2804-2808.
【非特許文献１２】C. Issaad, L. Croisille, A. Katz, W.  Vainchenker, and L. Coulombel, A murine stromal cell line allows the proliferation of very primitive human CD34++/CD38- progenitor cells in long-term cultures and semisolid assays, Blood 81 (1993) 2916-2924.
【非特許文献１３】H. Kodama, M. Nose, S. Niida, S. Nishikawa, and S. Nishikawa, Involvement of the c-kit receptor in the adhesion of hematopoietic stem cells to stromal cells, Exp Hematol 22 (1994) 979-984.
【非特許文献１４】K. A. Moore, H. Ema, and I. R. Lemischka, In vitro maintenance of highly purified, transplantable hematopoietic stem cells, Blood 89 (1997) 4337-4347.
【非特許文献１５】O. Ohneda, C. Fennie, Z. Zheng, C. Donahue, H. La, R. Villacorta, B. Cairns, and L. A. Lasky, Hematopoietic stem cell maintenance and differentiation are supported by embryonic aorta-gonad-mesonephros region-derived endothelium, Blood 92 (1998) 908-919.
【非特許文献１６】M. J. Xu, K. Tsuji, T. Ueda, Y. S. Mukouyama, T. Hara, F. C. Yang, Y. Ebihara, S. Matsuoka, A. Manabe, A. Kikuchi, M. Ito, A. Miyajima, and T. Nakahata, Stimulation of mouse and human primitive hematopoiesis by murine embryonic aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cell lines, Blood 92 (1998) 2032-2040.
【非特許文献１７】H. A. Kodama, Y. Amagai, H. Koyama, and S. Kasai, A new preadipose cell line derived from newborn mouse calvaria can promote the proliferation of pluripotent hemopoietic stem cells in vitro, J Cell Physiol 112 (1982) 89-95.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、造血幹細胞をエクスビボで未分化性を維持したまま大量に増幅させるのに必要な新規因子を同定し、該因子を用いた造血幹細胞の維持・増幅方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、当該方法によって得られる造血幹細胞集団、及び当該造血幹細胞集団を含有してなる造血機能改善剤等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者らは、ＰＡ６細胞および造血支持能のないＰＡ６サブクローン細胞のマイクロアレイ解析を行い、該サブクローン細胞において特異的にダウンレギュレートされた１１個の遺伝子を、ＰＡ６細胞の造血支持能を担う遺伝子の候補として選択した。次いで、これら各遺伝子のｃＤＮＡを該サブクローン細胞に導入、過剰発現させることによって、ＨＳＣの未分化性維持および増幅を支持する能力が回復するか否かを評価した。その結果、内在性膜タンパク質をコードすると予測される機能未知の遺伝子、１１１０００７Ｆ１２Ｒｉｋ（Ｔｍｅｍ１４０ともよぶ）、がＰＡ６サブクローン細胞におけるＨＳＣ支持活性の欠損を部分的に回復させ得ることが示され、発現されたタンパク質が造血幹細胞の維持・増幅に有用であることを見出して（以下、該タンパク質を「本発明のＨＳＣ活性支持因子」ともいう）、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、以下に示す通りである：
〔１〕配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質を含有する、造血幹細胞の維持・増幅剤。
〔２〕配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含有する、細胞への造血支持能付与剤。
〔３〕配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを導入した哺乳動物細胞を含有する、造血幹細胞の維持・増幅剤。
〔４〕哺乳動物細胞がストローマ細胞である、〔３〕の剤。
〔５〕哺乳動物細胞が造血支持能を有しないものである、〔３〕の剤。
〔６〕発現ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、〔３〕〜〔５〕のいずれかの剤。
〔７〕配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを哺乳動物細胞に導入し、該核酸を発現する細胞を選択することを特徴とする、造血支持能の向上した哺乳動物細胞の製造方法。
〔８〕配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の存在下で、造血幹細胞を培養することを含む、造血幹細胞の維持・増幅方法。
〔９〕少なくとも１種のサイトカインの共存下で造血幹細胞を培養することを含む、〔８〕の方法。
〔１０〕配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを導入した哺乳動物細胞と、造血幹細胞とを共培養することを含む、造血幹細胞の維持・増幅方法。
〔１１〕哺乳動物細胞がストローマ細胞である、〔１０〕の方法。
〔１２〕哺乳動物細胞が造血支持能を有しないものである、〔１０〕の方法。
〔１３〕発現ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、〔１０〕〜〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕〔８〕〜〔１３〕のいずれかの方法によって得られる、増幅した造血幹細胞を含有する細胞集団。
〔１５〕〔１４〕の細胞集団を含有する造血機能改善剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法を用いることによって、エクスビボで効率よく造血幹細胞を維持・増幅させることが可能となる。また、該方法によって得られた造血幹細胞含有細胞集団は、生体に投与することによって、造血幹細胞移植に応用することができる。さらに、本発明の造血幹細胞の維持・増幅剤は、造血幹細胞を体内又は体外で増幅させることができるので、体外で造血幹細胞の維持・増幅に用いることができるほか、生体に投与することによって正常に血球を作ることが困難となる疾患の治療に適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、本発明のＨＳＣ活性支持因子を含有する、造血幹細胞の維持・増幅剤を提供する。ここで「造血幹細胞（ＨＳＣ）」とは、自己複製能とあらゆる血球系およびリンパ球系細胞に分化可能な多分化能とを有する幹細胞をいい、造血幹細胞の「維持」とは、自己複製能、未分化性および多分化能を維持することをいい、造血幹細胞の「増幅」とは、上記性質（能力）を有する細胞数が細胞分裂により増加することをいう。
【００１２】
本発明のＨＳＣ活性支持因子は、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
本発明のＨＳＣ活性支持因子は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、チンパンジー、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］等から単離・精製される蛋白質であってもよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
【００１３】
「配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」としては、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と約80％以上、好ましくは約90％以上、さらに好ましくは約95％以上、特に好ましくは約97％以上、最も好ましくは約98％以上の類似性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「類似性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247： 1306-1310 (1990)を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の類似性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。
より好ましくは、「配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と約80％以上、好ましくは約90％以上、さらに好ましくは約95％以上、特に好ましくは約97％以上、最も好ましくは約98％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００１４】
あるいは、「配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」は、(1)配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列のうち1〜30個、好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個、特に好ましくは1〜2、3、4もしくは5個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列に1〜30個、好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個、特に好ましくは1〜2、3、4もしくは5個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(3)配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列に1〜30個、好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個、特に好ましくは1〜2、3、4もしくは5個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4)配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列のうち1〜30個、好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個、特に好ましくは1〜2、3、4もしくは5個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5)それらを組み合わせたアミノ酸配列である。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。
【００１５】
「配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質」とは、前記の「配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」を含有し、かつ配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質を意味する。
ここで「実質的に同質の活性」とは、造血幹細胞の自己複製能、未分化性およびあらゆる血球系およびリンパ球系細胞への分化能（これらを包括して「ＨＳＣ活性」ともいう）を支持する活性を意味する。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的に同一であることを示す。したがって、ＨＳＣ活性支持活性は同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例：約0.5〜約2倍）や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
ＨＳＣ活性の支持活性（造血支持能）の測定は、自体公知の方法（例、J Exp Med 192 (2000) 1281-1288、詳細は実施例にて後述）に準じて行なうことができる。
【００１６】
あるいは、「配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質」は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるヒトＴＭＥＭ１４０蛋白質（GenBankアクセッション番号：NP_060765）又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるマウスＴＭＥＭ１４０蛋白質（GenBankアクセッション番号：NP_932103）の、他の哺乳動物におけるオルソログ（例えば、GenBankにそれぞれアクセッション番号NP_001009709およびXP_001143821として登録されている、ラットおよびチンパンジーのオルソログ等）である。
【００１７】
本明細書において、蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をはじめとする、本発明のＨＳＣ活性支持因子は、Ｃ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート(-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチルなどのC1-6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α-ナフチルなどのC6-12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1-2アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα-ナフチル−C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のＨＳＣ活性支持因子がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のＨＳＣ活性支持因子には、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイルなどのC1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば-OH、-SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００１８】
本発明のＨＳＣ活性支持因子は遊離体であってもよいし、塩の形態であってもよい。本発明のＨＳＣ活性支持因子の塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１９】
本発明のＨＳＣ活性支持因子は、前述した哺乳動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することができる。具体的には、哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズし、低速遠心により細胞デブリスを除去した後、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させ（必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製し）、該画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことにより本発明のＨＳＣ活性支持因子を調製することができる。
【００２０】
あるいは、本発明のＨＳＣ活性支持因子は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。ＨＳＣ活性支持因子を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)〜(5)に記載された方法に従って行われる。
(1) M. BodanszkyおよびM.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
(2) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド (The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
(3)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株) （1975年）
(4)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、蛋白質の化学IV 205 (1977年)
(5)矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
【００２１】
このようにして得られた蛋白質は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られる蛋白質が遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に蛋白質が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２２】
さらに、本発明のＨＳＣ活性支持因子は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から本発明のＨＳＣ活性支持因子を分離精製することによって製造することもできる。本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードする核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードするDNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターなど）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］由来のcDNA、合成DNAなどが挙げられる。本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNA画分および全RNAもしくはmRNA画分をそれぞれ鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「PCR法」と略称する）およびReverse Transcriptase-PCR（以下、「RT-PCR法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNAおよび全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
【００２３】
本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードするDNAは、上記「配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質」をコードするDNAである限り、特に制限はないが、好ましくは、配列番号１若しくは３に示される塩基配列を含むDNA、または配列番号１若しくは３に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の活性（即ち、ＨＳＣ活性支持活性（造血支持能））を有する蛋白質をコードするDNAである。
「配列番号１若しくは３に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNA」は、配列番号１若しくは３に示される塩基配列と約80％以上、好ましくは約90％以上、さらに好ましくは約95％以上、特に好ましくは約97％以上、最も好ましくは約98％以上の類似性を有する塩基配列を含むDNAである。本明細書における塩基配列の類似性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。
【００２４】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約19〜約40mM、好ましくは約19〜約20mMで、温度が約50〜約70℃、好ましくは約60〜約65℃の条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が好ましい。
【００２５】
あるいは、本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードするDNAは、配列番号１に示されるヒトＴＭＥＭ１４０蛋白質をコードする塩基配列を含むDNA（GenBankアクセッション番号：NM_018295）又は配列番号３に示されるマウスＴＭＥＭ１４０蛋白質をコードする塩基配列を含むDNA（GenBankアクセッション番号：NM_197986）の、他の哺乳動物におけるオルソログ（例えば、GenBankにそれぞれアクセッション番号NM_001009709およびXM_001143821として登録されている、ラットおよびチンパンジーのオルソログ等）である。
【００２６】
本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードするDNAは、該タンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだDNAを、該蛋白質の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（前述）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２７】
DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
【００２８】
クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。
【００２９】
本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、該DNAから目的とするDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322，pBR325，pUC12，pUC13）；枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110，pTP5，pC194）；酵母由来プラスミド（例、pSH19，pSH15）；昆虫細胞発現プラスミド（例：pFast-Bac）；動物細胞発現プラスミド（例：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例：BmNPV、AcNPV）；レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス等の動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、EF-1α（エロンゲーション因子）プロモーター、UbC（ユビキチンC）プロモーターなどが用いられる。
【００３０】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、SV40複製起点などを含有しているものを用いることができる。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（dhfr、メソトレキセート（MTX）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（G418耐性）等の薬剤耐性遺伝子や栄養要求性変異を相補する遺伝子などが挙げられる。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ等をコードする遺伝子が挙げられる。
【００３１】
上記したＨＳＣ活性支持因子をコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、ＨＳＣ活性支持因子を製造することができる。宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。例えば、宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI 1640培地、199培地などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30℃〜約40℃で、約15〜約60時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外に本発明のＨＳＣ活性支持因子を製造せしめることができる。
【００３２】
前記形質転換体を培養して得られる培養物から本発明のＨＳＣ活性支持因子を自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、低速遠心で細胞デブリスを沈澱除去し、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させる（必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製する）などの方法が用いられる。このようにして得られた膜画分中に含まれる本発明のＨＳＣ活性支持因子の単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
【００３３】
さらに、本発明のＨＳＣ活性支持因子は、該タンパク質をコードするDNAに対応するRNAを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ合成することができる。あるいは、さらにRNAポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードするDNAを鋳型としても合成することができる。
【００３４】
本発明の造血幹細胞の維持・増幅剤は、上記のようにして得られる本発明のＨＳＣ活性支持因子を、そのまま、あるいは必要に応じて細胞生理学的に許容し得る担体とともに混合して組成物とした後に、上記薬剤として用いることができる。例えば、本発明の造血幹細胞の維持・増幅剤は、本発明のＨＳＣ活性支持因子を、水もしくは適当な緩衝液（例、リン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液など）中に適当な濃度となるように溶解することにより調製することができる。また、必要に応じて、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。
【００３５】
本発明の造血幹細胞の維持・増幅剤は、例えば、本発明のＨＳＣ活性支持因子の有効量を培地に添加して、造血幹細胞を培養することにより、造血幹細胞の維持・増幅のために用いることができる。したがって、本発明はまた、本発明のＨＳＣ活性支持因子の存在下で造血幹細胞を培養することを含む、造血幹細胞の維持・増幅方法を提供する。
造血幹細胞は、ヒト、マウス等の哺乳動物の骨髄、胎児肝臓、臍帯血、及び末梢血等から自体公知の方法（例、Science 273 (1996) 242-245、実施例において後述）によって採取することができる。また、本発明で用いられる造血幹細胞は、幹細胞単独であってもよいし、幹細胞を高頻度で含む不均一な細胞集団であってもよい。
【００３６】
造血幹細胞の培養に用いる培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI 1640培地、199培地などが用いられる。必要に応じて、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３（Ｆｌｔ−３）リガンド（ＦＬＴ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）などのサイトカイン類、インスリンなどのホルモン類、トランスフェリンなどの輸送タンパク質等を、培地にさらに含有させることができる。特にサイトカインを含むことが好ましく、培地に含まれるサイトカインは、１種類であっても、２種類以上であってもよい。とりわけSCFは必須である。培地に添加されるサイトカインの濃度としては、１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５〜３００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍＬである。培地のｐＨは、好ましくは約６〜約８である。
【００３７】
本発明の造血幹細胞の維持・増幅剤は、本発明のＨＳＣ活性支持因子の濃度として、１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５〜３００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍＬとなるように、上記培地に添加することができる。また、造血幹細胞は、当分野で通常用いられる細胞密度となるように、上記培地に添加することができる。培養は、通常約３０℃〜約４０℃、約５〜約１０％ＣＯ２の雰囲気下で、所望の増幅が達成される時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
【００３８】
本発明の別の好ましい実施態様においては、本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードする核酸を含む発現ベクターを導入した哺乳動物細胞と、造血幹細胞とを共培養することにより、造血幹細胞の維持・増幅を達成することができる。したがって、本発明はまた、（１）本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードする核酸を含む発現ベクターを含有する細胞への造血支持能付与剤、（２）該発現ベクターを哺乳動物細胞に導入し、該核酸を発現する細胞を選択することを特徴とする、造血支持能の向上した哺乳動物細胞の製造方法、（３）該発現ベクターを導入した哺乳動物細胞を含有する造血幹細胞の維持・増幅剤をも提供する。
【００３９】
「本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードする核酸を含む発現ベクター」としては、上記した、本発明のＨＳＣ活性支持因子の組換え生産に使用され得る発現ベクターが、同様に好ましく用いられる。発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターとしては、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス等のウイルスベクターが挙げられるが、レトロウイルス、レンチウイルスベクターが好ましく、レンチウイルスベクターがさらに好ましい。
【００４０】
該発現ベクターが導入される宿主哺乳動物細胞は特に制限されないが、好ましくはストローマ細胞である。ストローマ細胞は、自体公知の方法により、哺乳動物の骨髄、骨、胎児肝、大動脈−生殖腺−中腎領域等から単離することができる。
ストローマ細胞の中には、ＰＡ６細胞や後記実施例に使用されるＯＰ９細胞などのように、生来、造血幹細胞の維持・増幅を支持し得る細胞が知られているが、本発明に用いられるストローマ細胞は、自体造血支持能を有するものであっても、有しないものであってもよい。即ち、本発明の造血支持能付与剤は、造血支持能を有しない細胞に対して造血支持能を付与するのみならず、生来造血支持能を有する細胞に対しても該能力をさらに向上させる効果がある。しかし、自体優れた造血支持能を有する細胞を単離・取得することは容易ではないことから、本発明の造血支持能付与剤は、生来造血支持能を有しないストローマ細胞に導入することにより、該細胞に新たに造血支持能を付与し得ることに大きな意義があるといえる。
【００４１】
哺乳動物細胞への発現ベクターの導入は、自体公知の手法により行うことができる。例えば、レンチウイルスベクターを用いる場合、Exp. Hematol., 30 (2002), 11-17に記載の方法等を用いることができる。導入された本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードする核酸の発現は、例えば発現ベクター中に挿入された選択マーカー遺伝子を用いて薬剤耐性を指標に選択することもできるが、可視化可能なレポーター遺伝子を発現ベクター中に挿入しておけば、選択圧をかけることなく顕微鏡学的に遺伝子導入効率を測定することができる。
【００４２】
上記のようにして得られる、本発明のＨＳＣ活性支持因子をコードする核酸を含む発現ベクターを導入された哺乳動物細胞、好ましくはストローマ細胞は、例えば、上記したような適当な維持培地中に懸濁して、造血幹細胞の維持・増幅剤として提供され得る。
該造血幹細胞の維持・増幅剤は、例えば、本発明のＨＳＣ活性支持因子の有効量を産生するのに十分な量の哺乳動物細胞を培地に添加して、造血幹細胞と共培養することにより、造血幹細胞の維持・増幅のために用いることができる。
【００４３】
用いられる造血幹細胞、該細胞の培養に用いる培地、培地に添加されるサイトカイン類、ホルモン類、その他のタンパク質などについては、上記と同様であってよい。
本発明の造血幹細胞の維持・増幅剤は、当分野で通常支持細胞として用いられる細胞密度となるように、上記培地に添加することができる。また、造血幹細胞は、当分野で通常用いられる細胞密度となるように、上記培地に添加することができる。培養は、通常約３０℃〜約４０℃、約５〜約１０％ＣＯ２の雰囲気下で、所望の増幅が達成される時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
【００４４】
本発明はまた、上記方法によって得られる、増幅した造血幹細胞を含有する細胞集団、並びに該造血幹細胞含有細胞集団を含有してなる、哺乳動物における造血機能の改善剤を提供する。本発明の造血機能改善剤は、好ましくは、造血機能の障害を伴う疾患、例えば、再生不良性貧血、先天性免疫不全症、先天性代謝異常症、骨髄異形成症候群、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄線維症等の予防および／または治療剤として使用され得る。
【００４５】
ここで「造血幹細胞含有細胞集団」とは、本発明の増幅方法によって得られる、増幅した造血幹細胞を含む細胞集団を意味し、増幅した造血幹細胞のみを単離・精製することを必ずしも要しない。一般に、造血幹細胞をエクスビボで増殖させると、造血幹細胞のみを純粋に増幅することはできず、得られる細胞集団には血球系およびリンパ球系細胞のすべての分化段階の細胞が含まれることが知られている。しかしながら、それらの細胞も生体にとって必要な細胞であり、増殖した細胞集団全体を生体に投与することで造血機能の改善が期待できる。特に、造血機能が障害された哺乳動物の治療を目的とする細胞移植においては、迅速な造血機能改善効果が要求されることから、均一な未分化の造血幹細胞を移植するよりむしろ、ある程度分化した多系統の血球系細胞群を含む不均一な細胞集団を移植する方が、優れた治療効果を期待できる。もちろん、未分化性を維持した造血幹細胞のみを含む均一な造血幹細胞集団もまた、「造血幹細胞含有細胞集団」に包含される。このような均一な細胞集団は、上記不均一な細胞集団から、ＦＡＣＳなどを用いた自体公知の手法を用いて取得することができる。
【００４６】
本発明の造血機能改善剤は、上記造血幹細胞含有細胞集団を、必要に応じて薬理学的に許容し得る担体とともに混合して医薬組成物とした後に用いることができる。
ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、例えば、懸濁液剤における懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、増粘剤、安定化剤などの製剤添加物を用いることもできる。
このようにして得られる製剤は低毒性であるので、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタなど）、好ましくはヒトに対して安全に投与することができる。投与対象である哺乳動物と同種の動物由来の造血幹細胞含有細胞集団を使用することが望ましく、投与対象である哺乳動物個体自身から採取した造血幹細胞に由来する造血幹細胞含有細胞集団を使用することが特に望ましい。
本発明の造血機能改善剤の投与方法は、特に限定されないが、非経口的な投与（例、静脈注射、局所注入等）が好ましい。好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤が挙げられる。
本発明の造血機能改善剤の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１回あたり造血幹細胞の量として１０６細胞／ｋｇ以上、好ましくは１０６細胞／ｋｇ〜１０１０細胞／ｋｇ、さらに好ましくは、２×１０６細胞／ｋｇ〜１０９細胞／ｋｇである。
【００４７】
本発明のＨＳＣ活性支持因子を含有する、本発明の造血幹細胞の維持・増幅剤は、該タンパク質を、必要に応じて薬理学的に許容し得る担体とともに混合して医薬組成物とした後に哺乳動物に投与することにより、該動物体内での造血幹細胞の維持・増幅を促進することができる。したがって、本発明の造血幹細胞の維持・増幅剤は、好ましくは、造血機能の障害を伴う疾患、例えば、再生不良性貧血、先天性免疫不全症、先天性代謝異常症、骨髄異形成症候群、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄線維症等の予防および／または治療剤として使用され得る。
【００４８】
ここで、薬理学的に許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、グルコース、セルロース等の賦形剤、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００４９】
経口投与に好適な製剤としては、水、生理食塩水、若しくはオレンジジュースのような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、及び乳剤等が挙げられる。
【００５０】
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与等）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤等が挙げられ、これらには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００５１】
本発明の造血幹細胞の維持・増幅剤の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分（本発明のＨＳＣ活性支持因子）量として０．０００１〜５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０００５〜５０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．００１〜５ｍｇ／ｋｇである。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００５３】
（実施例１）
１．マウスの作出
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６−Ｌｙ５．２）マウスは、日本チャールズ・リバー株式会社（横浜市、日本）から購入した。Ｌｙ５ローカスがコンジェニックなＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ６−Ｌｙ５．１）は、ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣから得た。Ｂ６−Ｌｙ５．１／Ｌｙ５．２  Ｆ１マウスは、Ｂ６−Ｌｙ５．１及びＢ６−Ｌｙ５．２マウスのペアを交配させることによって取得した。
２．ストローマ細胞の培養及びレンチウイルスによる形質導入
ＯＰ９ストローマ細胞株は、ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋから得た。ＰＡ６及びＯＰ９細胞は、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＭＥＭ−α（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）中、３７℃で、５％のＣＯ２環境において維持した。本研究において用いられる遺伝子に対応するＦＡＮＴＯＭ  ｃＤＮＡクローンを、レンチウイルスベクタープラスミドｐＣＳＩＩ−ＥＦ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓ中へとサブクローニングした。組換えレンチウイルスベクターを、Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．３０（２００２），１１−１７に説明されている方法で作製した。ＰＡ６サブクローン細胞に、感染多重度２００にてｃＤＮＡを発現しているレンチウイルスベクターで形質導入し、Ｖｅｎｕｓ発現の蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）解析によって＞９０％の形質導入効率を確認した。
３．ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の精製及びストローマ細胞との共培養
ＣＤ３４−／ｌｏｗｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋分化特異的抗原マーカー（ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）−（ＣＤ３４−ＫＳＬ）細胞を、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３（１９９６），２４２−２４５に説明されている方法にわずかな改良を加えて、精製した。具体的には、１０〜１６週齢のＢ６−Ｌｙ５．２マウスから単離した骨髄細胞を、ビオチン化抗Ｇｒ−１、抗Ｍａｃ−１、抗Ｂ２２０、抗ＩｇＭ、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、及び抗Ｔｅｒ１１９抗体からなる分化特異的抗原マーカー抗体混合物（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）社製）で染色した。分化特異的抗原マーカー＋細胞を、ストレプトアビジン結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）社製）を用いて除去した。残りの細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ＣＤ３４、フィコエリスリン（ＰＥ）結合抗Ｓｃａ−１、及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗ｃ−Ｋｉｔ抗体（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）社から取得）で染色した。ビオチン化抗体は、ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で検出した。ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ  ＳＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）でＦＡＣＳを行った。ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、１．５Ｇｙで照射したストローマ細胞を含む９６ウェルプレートの個々のウェル（１×１０４細胞／ウェル）の中へとソーティングし、２０％  ＦＢＳを含む１５０μＬのＭＥＭ−α中で共培養した。
４．コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイ
１０日間の共培養後、ウェルに含まれるすべての細胞を採取し、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｍＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍＬ  ｒｍＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−６、及び３ユニット／ｍＬ  ｒｈＥＰＯを含む０．６ｍＬのメチルセルロース培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  ＧＦ  Ｍ３４３４）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を含む１２ウェルプレート中に蒔いた。１２日間のインキュベーション後、コロニーを回収し、ガラススライド上へとサイトスピンし、次いで形態学的な検査のためにＨｅｍａｃｏｌｏｒ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社製）染色へと供した。コロニー形成単位−顆粒球、赤血球、単核球、巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）、ＣＦＵ−顆粒球、赤血球、単核球（ＣＦＵ−ＧＥＭ）、ＣＦＵ−顆粒球、単核球（ＣＦＵ−ＧＭ）、ＣＦＵ−顆粒球（ＣＦＵ−Ｇ）、ＣＦＵ−単核球（ＣＦＵ−Ｍ）、及びバースト形成単位−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）を、標準的なスコアリング基準を用いてスコアした。全コロニー数を、ＣＦＣとして表現した。
５．競合的骨髄再構築アッセイ
Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２（２０００），１２８１−１２８８に説明されているように、コンジェニックＬｙ５マウスの系を用いることによって、競合的骨髄再構築アッセイを行った。共培養後、ウェルに含まれるすべての細胞を、Ｂ６−Ｌｙ５．１マウスからの合計２×１０５個の骨髄競合細胞と混合し、致死的（９．５  Ｇｙ）に放射線照射したＢ６−Ｌｙ５．１マウス（レシピエントマウス）中へと移植した。移植の１２〜１６週後、レシピエントマウスの末梢血を眼球後出血によって採血した。塩化アンモニウムバッファーでの赤血球細胞の溶血後、残りの有核細胞をＦＩＴＣ結合抗Ｌｙ５．２、ＰＥ結合抗Lｙ５．１、ビオチン化抗Ｍａｃ１、及びビオチン化抗Ｇｒ１抗体で染色し、次いでストレプトアビジン−ＰｅｒＣＰを添加した。細胞を、同時にＡＰＣ結合抗Ｂ２２０抗体又はＡＰＣ結合抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体の混合物で染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでＦＡＣＳ解析を行った。ドナーキメリズムを、Ｌｙ５．２＋細胞の割合として決定した。全ての骨髄系、Ｂリンパ系、及びＴリンパ系のキメリズムの割合が＞１．０%のとき、レシピエントマウスの造血がドナー細胞により再構築されたとみなした。
６．マイクロアレイ解析
ＩＳＯＧＥＮ試薬（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ（日本）社製）を用いて、ＦＡＣＳでソーティングした細胞から全ＲＮＡを単離した。1μｇの全ＲＮＡと、1サイクルｃＤＮＡ合成キット及びＩＶＴ標識用の３’増幅試薬（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）社製）を用いて、ビオチン標識ｃＲＮＡを調製し、３４，０００個以上のマウス遺伝子の発現レベルを解析するためのおよそ４５，０００個のプローブセットを含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）へハイブリダイズさせた。ウォッシュ後、抗体増幅手法で染色し、マイクロアレイをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇでスキャンした。これらの全ての手法は、製造者の説明書にしたがって行った。各プローブセットの発現値（Ｓｉｇｎａｌ）及び検出信号（存在（Ｐｒｅｓｅｎｔ）（Ｐ）、非存在（Ａｂｓｅｎｔ）（Ａ）、又は微量（Ｍａｒｇｉｎａｌ）（Ｍ））を、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて算出した。Ｓｉｇｎａｌ値は、それらの各実験における平均値が１００となるように標準化し、実験間のわずかな差異を調節した。各プローブセットの変化値（Ｓｉｇｎａｌ対数比）及び変化信号（増加、微増、変化なし、微減、又は減少）を、ソフトウェアのＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓによって算出した。全ての実験は、２連で行った。差次的に発現した遺伝子を同定するために、我々は２つの個別の実験の各々において、増加の変化信号及びＳｉｇｎａｌ対数比値≧１（２倍より大きいアップレギュレーション）、又は減少の変化信号及びＳｉｇｎａｌ対数比値≦１（２倍より大きいダウンレギュレーション）を示したプローブセットを選択した。
７．定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＩＳＯＧＥＮ試薬を用いて１×１０６個のストローマ細胞から全ＲＮＡを単離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩリバーストランスクリプターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。２個の個別の細胞サンプルのリアルタイムＰＣＲ増幅を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉキット（Ｒｏｃｈｅ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社製）を用いて、製造者の説明書にしたがって行った。本研究に用いられたプライマーセットを、表１に示す。データは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルを用いて標準化した。ＰＣＲ産物の融解曲線を調べ、アガロースゲル電気泳動における期待されるサイズの単一バンドによって、遺伝子特異的な増幅を確認した。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
（試験例１）
ＰＡ６サブクローンのＨＳＣ支持能力の評価
インビトロで長期造血を支持する能力がない点に関して、ＰＡ６サブクローン２、１２、及び１４（以後、Ｓ−２、Ｓ−１２、及びＳ−１４と表す）が単離されているものの、そのＨＳＣ支持能力は具体的には評価されていなかった（J Exp Med 176 (1992) 351-361）。そこで本発明者らは、ＰＡ６サブクローン細胞（Ｓ−２及びＳ−１２）との共培養後のＨＳＣ機能の維持を、高度に精製されたＨＳＣとしてＣＤ３４−ＫＳＬ細胞（Science 273 (1996) 242-245）を用いて、インビトロのＣＦＣアッセイを実施例１．４の方法にしたがって、インビボの競合的骨髄再構築アッセイを実施例１．５の方法にしたがって評価した。ＨＳＣを支持し得るマウス骨髄由来ＯＰ９ストローマ細胞株（Exp Hematol 22 (1994) 979-984）を、コントロールとして用いた。表２に示すように、ＣＦＣ頻度は、ＰＡ６細胞と比較して、ＰＡ６  Ｓ−２及びＳ−１２細胞との１０日間の共培養後に有意に減少し、移植されたマウスにおいてより低いレベルの生着率及びキメリズムが観察された。これらの結果から、ＰＡ６サブクローン細胞は、短期的な共培養後においても、ＨＳＣの支持において、実質的な欠陥を有することが示された。
【００５６】
【表２】
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【００５７】
（試験例２）
ＰＡ６サブクローン細胞において特異的にダウンレギュレートされた遺伝子の同定及びその特徴づけ
（１）ＰＡ６サブクローン細胞において特異的にダウンレギュレートされた遺伝子の同定
ＨＳＣを支持する原因である遺伝子は、ＰＡ６サブクローン細胞において、ダウンレギュレートされているであろうという仮定のもと、ＰＡ６サブクローン細胞において、特異的にダウンレギュレートされる遺伝子を同定するために、３４，０００個以上のマウス遺伝子を表すおよそ４５，０００個のプローブセットを含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイを用いて、ＰＡ６細胞、ＰＡ６  Ｓ−２及びＳ−１２細胞、並びにＯＰ９細胞でマイクロアレイ解析を実施例１．６の方法にしたがって行った。遺伝子発現プロファイルは、ＰＡ６細胞及びＰＡ６サブクローン細胞間の遺伝子発現において、わずかな差異を示した。１４４個の遺伝子が、両方のＰＡ６サブクローン細胞において、ＰＡ６細胞と比較して、２倍以上ダウンレギュレートされていた。これらのダウンレギュレートされた遺伝子のうち、４１個の遺伝子は、機能未知であった。Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ解析によって、既知遺伝子の６５％が、膜及び細胞外間隙タンパク質であることが明らかになった。ＯＰ９細胞においても発現しており、機能が既知または推定される遺伝子８個、及び機能未知の遺伝子３個を、さらなる解析のために選択した（表３）。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
（２）候補遺伝子の特徴づけ
ＰＡ６細胞のＨＳＣ支持活性を供すると推測される候補遺伝子を解析するため、対応するｃＤＮＡを含むレンチウイルスベクターをＰＡ６  Ｓ−２細胞に感染させた。全ての実験において、ＦＡＣＳ解析によるＶｅｎｕｓ陽性細胞の割合から判断すると、遺伝子導入効率は９０％以上であった。ＣＤ３４−ＫＳＬ  ＨＳＣを、候補遺伝子を発現しているＰＡ６  Ｓ−２細胞と１０日間共培養し、次いでＣＦＣアッセイに供した。図１に示すように、ＰＡ６  Ｓ−２細胞と比較して、Ｈｇｆ以外の候補遺伝子を過剰発現しているＰＡ６  Ｓ−２細胞と共培養した場合に、ＣＦＣ頻度は上昇した。コロニーの形態学的解析により、ＣＦＣアッセイにおいて観察される最も未分化なコロニータイプであるＣＦＵ−ＧＥＭＭの数が、Ｃｃｌ２及びＣｃｌ９以外で増加したことを明らかにした。注目すべきは、ＩＬ−６の過剰発現は、ＰＡ６細胞と同等のレベルまでコロニーの数を増加させたものの、コロニーの大部分（約８０％）はＣＦＵ−Ｍであったことである。
本発明者らは次に、Ｃｃｌ９、ＩＬ−６、Ｐｐａｐ２ｂ、Ｃｘｃｌ５、及び３個の未知遺伝子を含む７個の候補遺伝子を過剰発現させ、その効果を決定するために、競合的骨髄再構築アッセイを実施例１．５にしたがって行った。表４に示すように、１２００００９Ｏ２２Ｒｉｋ又はＩＬ−６を過剰発現するＰＡ６  Ｓ−２細胞並びにＰＡ６細胞と共培養したＨＳＣを移植した全てのマウスにおいて、ドナー細胞由来の造血の再構築が観察された。しかしながら、キメリズムの比較では、ＰＡ６  Ｓ−２細胞と有意な差を示さず、１２００００９Ｏ２２Ｒｉｋ又はＩＬ−６のいずれもの過剰発現が、ＰＡ６  Ｓ−２細胞のＨＳＣ支持活性の欠損を完全には回復しないことが示唆された。マイクロアレイ解析は、ＩＬ−６の発現が、ＰＡ６  Ｓ−２及びＳ−１２細胞において、ＯＰ９細胞と比較した場合に、約２倍アップレギュレートされていることを示し、これは定量的リアルタイムＰＣＲ解析によって確認された（表３）。ＩＬ−６はまた、単独で又はＳＣＦと組み合わせても、ＣＤ３４−ＫＳＬ  ＨＳＣを維持することができないことが実証されている（J Exp Med 192 (2000) 1281-1288）。ＩＬ−６は、造血の様々な過程に関与しており、ＨＳＣのエクスビボの増幅にも用いられてきたものの（Annu Rev Immunol 15 (1997) 797-819）、ストローマ細胞によるＨＳＣの維持については、ＩＬ−６は重要ではないかもしれない。
【００６０】
【表４】
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【００６１】
２９０００６４Ａ１３Ｒｉｋ、ＣＣｌ９、Ｐｐａｐ２ｂ、又はＣｘｃｌ５を過剰発現するＰＡ６  Ｓ−２細胞は、ＨＳＣ支持活性に明確な効果を示さなかった。対照的に、１１１０００７Ｆ１２Ｒｉｋの過剰発現は、生着したマウスの頻度及びキメリズムの両方で上昇傾向を示した。ＰＡ６細胞の支持活性に対する１１１０００７Ｆ１２Ｒｉｋ発現の効果を確認するために、本発明者らは以下の実験を行った。第一に、ＰＡ６及びＯＰ９細胞と比較して、ＰＡ６  Ｓ−２及びＳ−１２細胞における１１１０００７Ｆ１２Ｒｉｋ発現のダウンレギュレーションを、定量的リアルタイムＰＣＲ解析によって確認した（表３）。次に、ＰＡ６  Ｓ−２細胞に、ｍｙｃタグを付加した１１１０００７Ｆ１２Ｒｉｋ発現レンチウイルスベクターを感染させ、その発現を、抗ｍｙｃ抗体によりウェスタンブロット及び免疫蛍光染色によって検出した。ｍｙｃタグを付加した１１１０００７Ｆ１２Ｒｉｋを過剰発現しているＰＡ６  Ｓ−２細胞との共培養は、図１に示したものと類似のレベルでＣＦＣ頻度を上昇させる結果をもたらした（データ示さず）。
以上より、１１１０００７Ｆ１２Ｒｉｋタンパク質による、ＰＡ６  Ｓ−２細胞のＨＳＣ維持活性における欠損の部分的な回復が実証され、該タンパク質がＨＳＣの維持・増幅に必要であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明によれば、造血幹細胞をエクスビボで維持・増幅させることができ、造血幹細胞移植において必要な幹細胞を効率的に供給可能となり、現在抱えているドナー不足や、ドナーのリスク等の問題点の克服が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、ＣＦＣ頻度に対する候補遺伝子の過剰発現の効果を示す。全８０個のＣＤ３４−ＫＳＬ  ＨＳＣ（１０細胞／ウェル）を、ＰＡ６細胞、ＰＡ６  Ｓ−２細胞、又は示された遺伝子を発現するＰＡ６  Ｓ−２細胞と１０日間共培養し、次いでＣＦＣアッセイに供した。個々のコロニーを、それらの形態によってスコアした。示されたデータは、２回の個別の実験の平均値を表す。
【図１】
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【配列表】
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