(57)【要約】      （修正有）【課題】サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ）菌株からＦａｂＫ蛋白質（エノイル−ＡＣＰ還元酵素）を分離精製して結晶化し、３次元結晶構造を究明して、活性部位の個別アミノ酸の変異実験を通じて活性にメカニズム的に寄与するアミノ酸を定義し、既存のＦａｂＩとは異なるＦａｂＫの構造を究明して、新たな抗生剤の開発に使用される技術を提供する。【解決手段】ＦａｂＫ蛋白質溶液を緩衝液、塩および沈澱剤を含む貯水槽溶液と接触させて濃度平衡法を行う段階を含むＦａｂＫ蛋白質の結晶化方法。ＦａｂＫ−ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）複合体結晶。ＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の３次元結晶構造情報保存媒体。ＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の３次元結晶構造情報を使用する、ＦａｂＫ蛋白質活性阻害剤開発方法。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦａｂＫ蛋白質溶液を緩衝液、塩および沈澱剤を含む貯水槽溶液と接触させて濃度平衡法を行う段階を含み、
前記ＦａｂＫ蛋白質溶液の濃度は３〜３０ｍｇ／ｍｌであり、
前記緩衝液はｐＨ４〜９．５で、貯水槽溶液内濃度は０．００５〜１．５Ｍであり、
前記塩は金属塩およびアンモニウム塩からなる群から選択された１種以上のもので、貯水槽溶液内濃度は０．０５〜２Ｍであり、
前記沈澱剤は炭素数１〜４のアルコールおよびポリエチレングリコールからなる群から選択された１種以上のものであり、貯水槽溶液内濃度は１％（ｖ／ｖ）〜４０％（ｖ／ｖ）である、
ＦａｂＫ蛋白質の結晶化方法。
【請求項２】
前記濃度平衡法は、シッティングまたはハンギングドロップ蒸気平衡法、または透析法である、請求項１に記載のＦａｂＫ蛋白質の結晶化方法。
【請求項３】
前記濃度平衡法は、８．０〜９．０の反応ｐＨ、４〜２６℃の反応温度、及び１日〜２０日の反応期間の反応条件下で行われる、請求項１に記載のＦａｂＫ蛋白質の結晶化方法。
【請求項４】
前記濃度平衡法を行った後、高速窒素冷却法を追加的に行う、請求項１に記載のＦａｂＫ蛋白質の結晶化方法。
【請求項５】
前記高速窒素冷却法は、５０〜２００Ｋの温度範囲で行われる、請求項４に記載のＦａｂＫ蛋白質の結晶化方法。
【請求項６】
下記の表１のＸ線回折パターンデータ、または下記の表２に記載の２３８９個の原子座標で示された３次元結晶構造を有する、ＦａｂＫ−ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）複合体結晶。
【表１】
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【表２】
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【請求項７】
下記の表１のＸ線回折パターンデータ、または表２に記載の２３８９個の原子座標情報から選択された１つ以上のＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の３次元結晶構造情報またはこれらの全てを保存する、保存媒体。
【表１】
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【表２】
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【請求項８】
前記表２に記載の２３８９個の原子座標情報から選択された１つ以上の３次元結晶構造情報は、ＦａｂＫ蛋白質（配列番号１）のＴＩＭバレル上側に位置するループ部位；ＦａｂＫ蛋白質のＴＩＭバレルの上に結合されたＦＭＮ分子のヘッド水平面を平らな半球底面とする半径１５Å以内に位置する１つまたはそれ以上のアミノ酸；１９８から２０５までのアミノ酸配列を含むヒンジ部位；２０８番のチロシン（Ｙ２０８）、２０９番のリシン（Ｋ２０９）、２１１番のリシン（Ｋ２１１）、２１４番のリシン（Ｋ２１４）、２２９番のヒスチジン（Ｈ２２９）、２６１番のロイシン（Ｌ２６１）、２７６番のメチオニン（Ｍ２７６）、２０８番から２１５番までの８個のアミノ酸から構成されたへリックス；および２７８番から２８３番までの６個のアミノ酸から構成されたへリックス；からなる群から選択される、１以上の該当する原子座標情報を含む、請求項７に記載の保存媒体。
【請求項９】
下記の表２に記載の２３８９個の原子座標情報から選択された１つ以上のＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の３次元結晶構造情報を使用する、ＦａｂＫ蛋白質活性阻害剤開発方法。
【表２】
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【請求項１０】
前記表２に記載の２３８９個の原子座標で示される３次元結晶構造を有するＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体と候補化合物を反応させる段階；及び前記候補化合物から前記複合体と相互作用する化合物を選択して、ＦａｂＫ蛋白質の活性を阻害する化合物を決定する段階；を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記候補化合物及びＦａｂＫ蛋白質のＴＩＭバレルの上側に位置するループ部位；ＦａｂＫ蛋白質のＴＩＭバレルの上に結合されたＦＭＮ分子のヘッド水平面を平らな半球底面とする半径１５Å以内に位置する１つまたはそれ以上のアミノ酸；１９８から２０５までのアミノ酸配列を含むヒンジ部位；２０８番のチロシン（Ｙ２０８）；２０９番のリシン（Ｋ２０９）；２１１番のリシン（Ｋ２１１）；２１４番のリシン（Ｋ２１４）；２２９番のヒスチジン（Ｈ２２９）；２６１番のロイシン（Ｌ２６１）；２７６番のメチオニン（Ｍ２７６）；２０８番から２１５番までの８個のアミノ酸から構成されたへリックス；及び２７８番から２８３番までの６個のアミノ酸から構成されたへリックス；からなる群から選択された、１つ以上の部位の相互作用の有無を測定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項７に記載の保存媒体を使用して、ＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体と相互作用する化合物を選択する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記表２に記載のＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の２３８９個の原子座標情報から選択された１つ以上の３次元結晶構造情報を利用して、ＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体と結合可能な化合物を設計する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記２３８９個の原子座標から選択された１つ以上の３次元結晶構造情報が、ＦａｂＫ蛋白質のＴＩＭバレルの上側に位置するループ部位；ＦａｂＫ蛋白質のＴＩＭバレルの上に結合されたＦＭＮ分子のヘッド水平面を平らな半球底面とする半径１５Å以内に位置する１つ以上のアミノ酸；１９８から２０５までのアミノ酸配列を含むヒンジ部位；２０８番のチロシン（Ｙ２０８）；２０９番のリシン（Ｋ２０９）；２１１番のリシン（Ｋ２１１）；２１４番のリシン（Ｋ２１４）；２２９番のヒスチジン（Ｈ２２９）；２６１番のロイシン（Ｌ２６１）、２７６番のメチオニン（Ｍ２７６）；２０８番から２１５番までの８個のアミノ酸から構成されたへリックス；及び２７８番から２８３番までの６個のアミノ酸から構成されたへリックス；からなる群から選択された、１つまたはそれ以上の部位に相当する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項７に記載の保存媒体を使用して、ＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体と相互作用する化合物を設計する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記２３８９個の座標から選択された１つ以上のＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の３次元結晶構造情報、及び候補化合物の３次元結晶構造情報をマッチングさせる仮想スクリーニング法を使用して、ＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体と結合可能な化合物をスクリーニングする、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の３次元結晶構造情報が、ＦａｂＫ蛋白質のＴＩＭバレルの上側に位置するループ部位；ＦａｂＫ蛋白質のＴＩＭバレルの上に結合されたＦＭＮ分子のヘッド水平面を平らな半球底面とする半径１５Å以内に位置する１つ以上のアミノ酸；１９８から２０５までのアミノ酸配列を含むヒンジ部位；２０８番のチロシン（Ｙ２０８）；２０９番のリシン（Ｋ２０９）；２１１番のリシン（Ｋ２１１）；２１４番のリシン（Ｋ２１４）；２２９番のヒスチジン（Ｈ２２９）；２６１番のロイシン（Ｌ２６１）；２７６番のメチオニン（Ｍ２７６）；２０８番から２１５番までの８個のアミノ酸から構成されたヘリックス；及び２７８番から２８３番までの６個のアミノ酸から構成されたへリックス；からなる群から選択された、１つ以上の部位に相当する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項７に記載の保存媒体を使用して仮想スクリーニングする、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好熱性真正細菌サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）菌株に由来するＦａｂＫ（エノイル−ＡＣＰ還元酵素）蛋白質に関し、前記蛋白質の活性部位及び３次元結晶構造を究明し、これを利用して新たなＦａｂＫ蛋白質阻害物質をスクリーニングして、既存の抗生剤に耐性を示す菌株に対して優れた抗菌活性を示す新たな活性調節物質を開発する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリクロサンは、包括的な抗菌作用を有する抗微生物剤であって、約３０年間多様な製品に抗生及び抗菌活性を付与するために使用されてきた。例えば、トリクロサンは、石鹸、シャンプー、洗濯剤はもちろん、歯磨き粉や化粧品などに含まれているだけでなく、子供のおもちゃ、じゅうたんなどにも含まれている。そのような意味で、トリクロサンの使用範疇は、紫外線または漂白剤に相当するといっても過言でない。
【０００３】
トリクロサンは、エノイル−ＡＣＰ還元酵素（エノイル−［アシルキャリアー蛋白質］レダクターゼ（Ｅ．Ｃ．１．３．１．９）ＮＡＤＨ−依存性  トランス−２−エノイル−ＡＣＰ還元酵素、ＥＮＲ）またはＦａｂＩといわれる酵素の活性を抑制する作用がある。前記ＦａｂＩは、ほぼ全てのバクテリア及び真菌類に存在して、バクテリアの細胞膜形成に必須の脂肪酸の生合成に関与する酵素のうちの１つであって、微生物の生存に必須の酵素である。したがって、トリクロサンは、ＦａｂＩの活性を阻害する活性を有するので、広範囲の殺菌剤として使用することができる。
【０００４】
好気性細菌であるマイコバクテリア類（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の場合には、ＩｎｈＡという酵素が脂肪酸の生合成中にＦａｂＩのようにエノイル−ＡＣＰ還元酵素として作用して反応段階を活性化し、この場合、結核の治療剤であるイソニアジドがトリクロサンと同一の方法でＩｎｈＡの活性を抑制する役割を担うということが知られている。これら２つの酵素であるＩｎｈＡ及びＦａｂＩを比較する時、これらのアミノ酸配列の相同性は、異なる種類のＦａｂＩ間のアミノ酸配列の相同性より相対的に低いが、活性に必要な主要アミノ酸は同一であることが明らかになった。
【０００５】
一方、脂質は、細胞膜を構成する主成分であって、脂質の生合成に関与する酵素は、バクテリアはもちろん、すべての生物体になくてはならない必須の酵素である。哺乳類での脂質の生合成は、ＦＡＳ（脂肪酸合成酵素）といわれる巨大分子ホモダイマーが複数の段階の反応を各々異なる部位で順次に循環して行うＩ型脂肪酸合成経路を通じて行われる反面、バクテリアなどの微生物での脂質の生合成は、哺乳類とは異なったＩＩ型脂肪酸合成経路を通じて行われる。前記ＩＩ型脂肪酸合成経路は、各段階の反応が各々異なる独立した酵素によって行われるという特徴がある。ＦａｂＩは、前記段階のうちの最後の段階に相当するエノイル−ＡＣＰを還元させてアシル−ＡＣＰに転換させる段階を担当する。
【０００６】
前記のように、ＦａｂＩは、脂質の生合成の最後の段階で、脂質の伸長を触媒する作用をすることによって、脂肪酸の生合成における必須の役割を担っている。ＦａｂＩは、ＳＤＲ（短鎖アルコール脱水素酵素/還元酵素）スーパーファミリーに属して、他のファミリーメンバーと共に４量体を形成しており、大腸菌から分離されたＦａｂＩはＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）という補酵素を使用する。（Ｅｇａｎ，Ａ．Ｆ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｒ．Ｒ．Ｂ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．，２１，３６０３−３６１１（１９７３））。最近明らかになったＦａｂＩ−トリクロサン複合体構造によれば、トリクロサンは、ＮＡＤＨ及びＮＡＤ上に位置し、酵素の活性部位を占めて非共有性であるが、非常に強い相互作用で基質が入ってこられなくする方法で酵素の活性を阻害する（Ｈｅａｔｈ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１１１１０−１１１１４（１９９９））。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の場合、ＦａｂＩがＮＡＤＨでなくＮＡＤＰＨという補酵素を使用することが明らかになり、この場合にも、トリクロサンが同様に相互作用して、酵素の活性を阻害することが明らかになった。したがって、現在、製薬会社はもちろん、大学及び各種研究団体で開発しているＦａｂＩ阻害剤は、トリクロサンと類似したメカニズムを有する化合物である。
【０００７】
しかし、最近、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの一部の主要病原菌がトリクロサンに耐性を示すことが報告された（Ｈｅａｔｈ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｒｏｃｋ，Ｃ．Ｏ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０６，１４５−１４６（２０００））。これら耐性を示す菌株にはＦａｂＩ酵素が存在しないが、遺伝子群にＦａｂＫという遺伝子が存在して、この遺伝子が発現して生成されるＦａｂＫ蛋白質がＦａｂＩ酵素の役割を代わりに担うことが明らかになった。フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）及びサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）も、脂肪酸の生合成経路にＦａｂＩ蛋白質の代わりにＦａｂＫ蛋白質が関与すると報告された。これらＦａｂＫ蛋白質は、現在まで知られているＦａｂＩ蛋白質とはコード遺伝子配列が全く異なり、ＳＤＲスーパーファミリーの他の蛋白質ともコード遺伝子配列に類似性がない。フェカリス菌及びサーモトガ・マリティマなどの菌株に存在するＦａｂＫは、そのアミノ酸配列において、肺炎球菌のＦａｂＫと各々６８％及び４８％の同一性を示している（Ｍａｒｒａｋｃｈｉ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３７０，１０５５−１０６２（２００３））。ＦａｂＫはフラビン蛋白質であり、活性のために補酵素であるＮＡＤＨを必要として、トリクロサンによって不活性化されない特性を有する蛋白質である。
【０００８】
現在の結核治療剤は、大部分がＦａｂＩ／ＩｎｈＡと関連したものであるため、前記ＦａｂＩ蛋白質を使用せずに前記結核治療剤に対して耐性を示す菌株が次から次へ発見されている。このような耐性を示す菌株は、ＦａｂＩの代わりにＦａｂＫを使用するものである。例えば、結核治療剤に対して耐性を示す呼吸器疾患の主要菌株である肺炎球菌またはバンコマイシンに耐性を示すフェカリス菌の場合も、ＦａｂＩの代わりにＦａｂＫを使用することが明らかになった。つまり、これら耐性を示す菌株に対して抗菌活性を有するためには、ＦａｂＩでなくＦａｂＫの活性を阻害する新たな化合物が必要である。現在までに報告されたところによれば、ＦａｂＫは、その作動メカニズムが比較的よく知られているＦａｂＩとは異なっていることが明らかになり、その構造及び機能に対する研究が切実に要求されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような要求に応じるために、本発明の発明者は、サーモトガ・マリティマからＦａｂＫ蛋白質を分離精製して結晶化して、３次元結晶構造を究明して、活性部位の個別アミノ酸の変異実験を通じて活性にメカニズム的に寄与するアミノ酸を定義し、既存のＦａｂＩとは異なるＦａｂＫの構造を究明して、新たな抗生剤の開発に有用に使用される技術を提供することによって、本発明を完成した。
【００１０】
そのために、本発明の目的は、前記ＦａｂＫ蛋白質の活性部位を究明することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記ＦａｂＫ蛋白質の３次元結晶構造を究明することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記で究明されたＦａｂＫ蛋白質の活性部位及び／または３次元結晶構造情報を利用して、ＦａｂＫ蛋白質と相互作用して阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するために、本発明は、サーモトガ・マリティマ菌株に由来するＦａｂＫ蛋白質の活性部位及び３次元結晶構造の究明に関する。
【００１４】
一実施形態として、本発明はＦａｂＫ蛋白質溶液を緩衝液、塩および沈澱剤を含む  貯水槽溶液と接触させて濃度平衡法を行う段階を含み、前記ＦａｂＫ蛋白質溶液の濃度は３〜３０ｍｇ／ｍｌであり、前記緩衝液はｐＨ４〜９．５で、貯水槽溶液内濃度は０．００５〜１．５Ｍであり、前記塩は全ての金属塩およびアンモニウム塩からなる群から選択された１種以上のもので、貯水槽溶液内濃度は０．０５〜２Ｍであり、前記沈澱剤は炭素数１〜４のアルコールおよびポリエチレングリコールからなる群から選択された１種以上のものであり、貯水槽溶液内濃度は１％（ｖ／ｖ）〜４０％（ｖ／ｖ）である、ＦａｂＫ蛋白質の結晶化方法に関する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は後述の表１のＸ線回折パターンデータ、または後述の表２に記載の２３８９個の原子座標で示された３次元結晶構造を有する、ＦａｂＫ−ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）複合体結晶に関する。
【００１６】
他の実施形態では、本発明は後述の表１のＸ線回折パターンデータ、または後述の表２に記載の２３８９個の原子座標情報から選択された１つ以上のＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の３次元結晶構造情報またはこれらの全てを保存する、保存媒体に関する。
【００１７】
さらに別の実施形態では、本発明は後述の表２に記載の２３８９個の原子座標情報から選択された１つ以上のＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の３次元結晶構造情報を使用する、ＦａｂＫ蛋白質活性阻害剤開発方法に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、抗生剤の標的蛋白質として知られているＦａｂＫ蛋白質の活性部位及び３次元結晶構造に関するもので、本発明によるサーモトガ・マリティマ菌株に由来したＦａｂＫ蛋白質結晶は、結晶化程度が優れているだけでなく、Ｘ線回析が容易であり、類似した蛋白質であるＦａｂＩ蛋白質とは異なる構造的特徴を有しているので、このような結晶の３次元構造は、現在まで開発されたＦａｂＩ阻害剤とは異なる新たな活性調節物質の開発に有用に使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
まず、本発明は、サーモトガ・マリティマから分離及び精製されたＦａｂＫ蛋白質を提供する。前記蛋白質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質であって、本発明では、前記アミノ酸配列がＦａｂＫ蛋白質の酵素の機能を有するものであるということを最初に究明した。前記のように、ＦａｂＫ蛋白質は、多くのバクテリア及び真菌類でＦａｂＩに代わって使用される酵素であって、ＦａｂＩ阻害剤に対して耐性を示す菌株に対する新たな抗生剤の開発において、標的蛋白質として非常に有用である。本発明によるＦａｂＫ蛋白質は水溶性であって、適切な方法で結晶性を有することができるため、その３次元構造の分析が容易で、新たな抗生剤の開発のための新たな標的蛋白質として有用である。
【００２１】
また、本発明は、前記配列番号１のアミノ酸配列を有するサーモトガ・マリティマから分離及び精製されたＦａｂＫ蛋白質のコード塩基配列；及び前記コード塩基配列と作動可能に連結されたプロモーター及びターミネーター；を含むＦａｂＫ蛋白質の発現ベクターを提供する。前記発現ベクターは、カナマイシン抵抗遺伝子、アンピシリン抵抗遺伝子、テトラサイクリン抵抗遺伝子、クロラムフェニコール抵抗遺伝子などの通常の選別マーカーを追加的に含むことができる。また、本発明は、前記ＦａｂＫ蛋白質の発現ベクターによって形質転換された形質転換体を提供する。前記形質転換体に使用される宿主としては、原生細菌であり、複製起源がｐＢＲ３２２を有し、Ｔ７  ポリメラーゼを生成することができるものであればいずれも使用することができ、例えば大腸菌などを使用することができる。また、本発明は、前記ＦａｂＫ蛋白質の発現ベクターを使用して宿主を形質転換させて、前記発現ベクターを含む形質転換体を製作して、前記製作された形質転換体を培養してＦａｂＫ蛋白質を生成する段階を含むＦａｂＫ蛋白質の製造方法を提供する。
【００２２】
本発明の発現ベクターの製造のために、アミノ酸の欠失が全くなく、配列番号１に記載されたように１番のメチオニン末端（Ｎ−末端）から３１４番のアミノ酸であるグルタミン酸までのアミノ酸配列を有するサーモトガ・マリティマ由来のＦａｂＫ蛋白質のコード塩基配列を利用して、生成された蛋白質の精製を容易にするために、Ｎ−末端に６個のヒスチジンタグを結合させて使用することができる。
【００２３】
本発明による発現ベクター、形質転換体、及びこれを利用したＦａｂＫ蛋白質の製造方法をより具体的に説明すると下記の通りであるが、下記の内容は、本発明の内容を例示して説明するための具体例にすぎず、本発明の範囲はこれに限定されない。
【００２４】
まず、サーモトガ・マリティマのゲノムＤＮＡからＦａｂＫ蛋白質をコードする遺伝子を増幅するために、ＦａｂＫ蛋白質をコードする遺伝子の５´−末端及び３´−末端に対応するＰＣＲ反応用プライマーを考案して合成する。この時、前記５´−末端及び３´−末端に対応するプライマーは、各々に対応するクローニングされるベクターに存在する制限酵素認知部位と同一な制限酵素認知部位が存在するように考案して、前記ベクターのクローニングを容易にする。
【００２５】
サーモトガ・マリティマのゲノムＤＮＡを鋳型として、前記のように製造されたプライマーを使用してＰＣＲ反応を行って、ＦａｂＫ遺伝子を増幅する。増幅されたＦａｂＫ遺伝子を適切な制限酵素で切断して得られた遺伝子断片を適切な発現ベクター、例えば大腸菌ベクターに挿入して、再組み合わせＦａｂＫ遺伝子を含む発現ベクターを製造する。使用可能な制限酵素部位はＮｃｏＩ  ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、及びＸｈｏＩである。本発明の具体的な例としては、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を使用した。前記のように、前記発現ベクターは、宿主ゲノムへの挿入の有無の確認を容易にするために、カナマイシン抵抗遺伝子、アンピシリン抵抗遺伝子、テトラサイクリン抵抗遺伝子、クロラムフェニコール抵抗遺伝子などの通常の選別マーカーを含むことができる。このように製造された組換え発現ベクターを使用して、適切な宿主、例えば大腸菌を形質転換させた後、前記形質転換体を遺伝子の発現に適切な条件で培養する。この時、培養条件は、使用された宿主によって異なり、約１５から４０℃で、３から１５時間培養することができ、前記条件は、比較的高い温度では培養時間を短くし、比較的低い温度では培養時間を長くして調節することができる。
【００２６】
目的とする蛋白質の生成有無は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはウエスタンブロッティング法などの通常の蛋白質同定方法によって確認することができる。組換えＦａｂＫ遺伝子を含む発現ベクターに形質転換された形質転換体をアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの選別マーカーに対応する抗生剤が含まれている培地（例えばＬＢ培地）で振盪培養し、前記培養した培地の光学密度（Ｏ．Ｄ．）が一定の細胞濃度（例えば６００ｎｍでのＯ．Ｄ．が０．５から０．７）になった時、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を添加して、組換えＦａｂＫ遺伝子の発現を誘導する。前記培養液を遠心分離して形質転換体を沈殿させ、これを適切な緩衝液に懸濁させた後で破砕する。前記破砕物を遠心分離して蛋白質が溶解している上層液を分離した後、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの通常の蛋白質分離及び精製手段によって製造された組換えＦａｂＫ蛋白質を分離及び精製する。この時、前記組換えＦａｂＫ蛋白質は、精製を容易にするために、ヒスチジンタグ融合蛋白質形態で生成される。
【００２７】
また、他の側面から、本発明は、前記ＦａｂＫ蛋白質の３次元構造及び活性部位を究明して、ＦａｂＫ蛋白質を標的とする抑制化合物のスクリーニングにより有用な情報を提供することを特徴とする。
【００２８】
また、他の側面から、本発明は、後述する表１または表２の原子座標情報から選択された１以上の原子座標情報で表現される３次元構造を有するＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体結晶を提供する。ＦＭＮはＦａｂＫ蛋白質の活性に必須の補助因子であり、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）実験でＦａｂＫと複合体を形成することが観察され、生体内でもＦａｂＫ蛋白質とＦＭＮ分子が複合体形態で作用することと考えられる。したがって、本発明で提供されるＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の結晶構造はＦａｂＫ抑制剤探索および開発に非常に効果的に適用される。
【００２９】
また、本発明は、下記のように究明されたＦａｂＫ蛋白質の３次元結晶構造及び／またはＦａｂＫ及びＦＭＮが結合する特異的位置的特性及び前記活性部位で活性に影響を与える個別アミノ酸の役割に基づいて、ＦａｂＫ蛋白質の活性を阻害するＦａｂＫ蛋白質阻害剤をスクリーニングすることおよび新たな抑制化合物を設計することを特徴とする、ＦａｂＫ蛋白質の阻害活性を有するＦａｂＫ阻害剤開発方法を提供する。
【００３０】
本発明の具体例において、前記ＦａｂＫ阻害剤開発方法は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＦａｂＫ蛋白質、またはＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体、及び候補化合物を反応させる段階、及び前記候補化合物から前記ＦａｂＫ蛋白質またはＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体と相互作用する化合物を選択して、ＦａｂＫ蛋白質の活性を阻害する化合物をスクリーニングする段階を含む。
【００３１】
また、他の具体例において、本発明のＦａｂＫ阻害剤開発方法は、使用されたＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の後述の表１に記載のＸ線回折パターン、または後述の表２に記載の２３８９個の原子座標から選択された１つ以上の３次元結晶構造情報を利用して、ＦａｂＫ蛋白質またはＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体と結合可能な新たな化合物を新規設計することを特徴とする。
【００３２】
また、他の具体例において、本発明のＦａｂＫ阻害剤開発方法は、使用されたＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の後述の表１に記載のＸ線回折パターン、または後述の表２に記載の２３８９個の原子座標から選択された１つ以上の３次元結晶構造情報及び候補化合物の３次元結晶構造情報に基づく仮想スクリーニング法を使用して、ＦａｂＫ蛋白質またはＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体と結合可能な化合物をスクリーニングすることを特徴とする。
【００３３】
前記ＦａｂＫ蛋白質と相互作用（結合）する化合物の選択時に、下記のような３次元結晶構造及び／または活性部位に対する情報を使用して、より容易で正確にＦａｂＫ蛋白質の活性を阻害する化合物を選択することができる。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法によって選択されたＦａｂＫ蛋白質阻害剤は、抗生剤として作用し、前記抗生剤が抗生活性を有する菌株は、ＦａｂＫ蛋白質及びこれと類似した活性部位を有する蛋白質を必須で必要とする全ての微生物であり、例えば肺炎球菌、フェカリス菌、サーモトガ・マリティマ、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ネオリケッチャ・センネツ（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｅｎｎｅｔｓｕ）、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、好熱性一酸化炭素酸化細菌（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、及びクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からなる群から選択されたものである。
これをより詳細に説明すると、下記の通りである。
【００３５】
まず、本発明は、ＦａｂＫ蛋白質の結晶化方法を提供する。新たな抗生剤の開発のための標的蛋白質の３次元結晶構造の究明においては、前記標的蛋白質が水溶性であって結晶性であることが重要である。本発明によるＦａｂＫ蛋白質は水溶性であるので、その３次元結晶構造の究明のためには、結晶性を有するようにするための結晶化段階が必要である。このような結晶化段階には、一般に、Ｘ線結晶化法が使用され、このようなＸ線結晶化法を使用するための前処理段階として多様な結晶化方法が行われなければならない。本発明の具体例において、このような結晶化方法として通常の濃度平衡を利用した方法を使用でき、例えば、蒸気平衡法（例えば、シッティングまたはハンギングドロップ蒸気平衡法（Ｓｉｔｔｉｎｇ−ｏｒ  Ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ  ｖａｐｏｕｒ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ：Ｊａｎｃａｒｉｋ  Ｊ．ｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．，２４，４０９−４１１（１９９１）参照）または透析法（連続式または回分式：Ｂｕｎｉｃｋ  Ｃ．  ａｎｄ  Ｓｔｕｂｂｓ  Ｇ．，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ｄ５６，  １４３０−１４３１（２０００））などが使用される。
【００３６】
シッティングまたはハンギングドロップ蒸気平衡法の結晶化の原理及び過程は、下記の通りである。密閉された空間に母液の小さい滴及びこれよりはるかに大きい規模の貯水槽溶液が分離されたまま共存する時、これらの間で水または他の揮発性物質の移動が起こるようになる。一方、蛋白質の溶液条件のうち、熱力学的に準安定状態である過飽和状態で沈澱剤の種類によって蛋白質の沈澱が起こり、沈澱速度が遅くなって安定した結晶化状態となる。これに使用可能な沈澱剤はよく知られており、それらは濃縮状態の蛋白質溶液の溶解度を減少させる役割を担う。この時、蛋白質分子の周囲の相対的な吸着層を減少させるために、蛋白質分子が互いに凝集して結晶を生成するようになる。したがって、貯水槽溶液は、このような沈澱剤をはじめとして、緩衝液、塩、界面活性剤などが多様な濃度で混合され、蛋白質溶液及びこのような多様な条件の貯水槽溶液が通常の場合は約１：１の比率で混合されて滴を形成するようになる。このように得られた滴をシリコンでコーティングされたガラススライドに載せてひっくり返した状態で、準備されたプレートに載せて密封する。初期状態では、滴内の蛋白質の濃度が貯水槽溶液の濃度と異なるために蛋白質が結晶状態で存在しないが、密封された状態で置いておくと徐々に平衡が保たれるようになり、この時に前記で説明した原理によって特定の状態の条件で結晶が生成されるのである。このようなシッティングまたはハンギングドロップ蒸気平衡法において、貯水槽溶液内の沈澱剤だけでなく、塩、緩衝液、及び界面活性剤の種類、適正濃度、溶液のｐＨ、及び実験温度は蛋白質の種類によって異なって選択され、場合によっては蛋白質結晶の生成においてとても重要な要素となる。
【００３７】
本発明で、水溶性ＦａｂＫ蛋白質を結晶化させるためにＦａｂＫ蛋白質溶液および貯水槽溶液を濃度平衡法、例えばシッティングまたはハンギングドロップ蒸気平衡法、透析法などを使用して反応させて結晶化を行う。
【００３８】
前記貯水槽溶液は緩衝液、塩および沈澱剤を含むものを使用する。前記緩衝液としては、ｐＨを調節して蛋白質を安定化させるためのものであって、ｐＨ４〜９．５、好ましくはｐＨ４．６〜９、さらに好ましくは６．２〜８．５である全ての緩衝液が使用可能であり、例えば、ＰＩＰＥＳ(ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）)、ビシン、トリス、酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ビス−トリス緩衝液からなる群から選択された１種以上のものを使用することができる。
【００３９】
前記塩は構造分析が容易な結晶形態を有するようにする役割を果たすものであって、全ての金属塩およびアンモニウム塩からなる群から選択されたものを使用することができる。前記アンモニウム塩は硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなどからなる群から選択されたものを使用することができる。前記金属塩は全てのアルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウムなど）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウムなど）塩、および遷移金属（例えば、マンガン、亜鉛など）塩からなる群から選択された１種以上のものを使用することができ、好ましくは塩化物、シアン化物、チオシアン酸化物、酸化物、硝酸化物、水酸化物、硫酸化物などから選択された１種以上を使用することができ、例えば、塩化リチウム、塩化マグネシウム、チオシアン酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどを使用することができる。
【００４０】
前記沈澱剤は結晶化のために沈澱を形成する物質であって、炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルコールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（重量平均分子量２００以上、好ましくは４００〜２０，０００、さらに好ましくは５５０〜１０，０００）からなる群から選択された１種以上のものを使用することができる。
【００４１】
貯水槽溶液全体での緩衝液、塩および沈澱剤の濃度は、使用される蛋白質溶液の濃度によって適切に調節することができる。具体的に、貯水槽溶液全体でのＰＩＰＥＳ、ビシン、トリスなどの緩衝液の濃度は０．００５〜１．５Ｍ、好ましくは０．０１〜０．２Ｍであることができ、塩化リチウム、塩化マグネシウム、チオシアン酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどの塩濃度は０．０５〜２Ｍ、より好ましくは０．０５〜０．５Ｍであることができ、ポリエチレングリコールなどの沈澱剤の濃度は１〜４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５〜３０％（ｖ／ｖ）であるのが好ましい。貯水槽溶液内での沈殿剤及び塩の濃度が前記範囲より高い場合には、蛋白質が沈殿する現象が起こることがあり、前記範囲より低い場合には、結晶が生成されないので好ましくない。また、前記緩衝液は主に貯水槽溶液内での蛋白質の安定性に関連するものであり、その濃度が前記範囲を逸脱する場合には、貯水槽溶液内で適切な蛋白質の安定性を得ることができず、所望の結晶を得るのも困難である。前記貯水槽溶液は、このような成分以外にも、通常使用可能な塩、緩衝液、及び界面活性剤などを追加的に含むことができる。
【００４２】
本発明に使用されるＦａｂＫ蛋白質溶液はＦａｂＫ蛋白質を適切な緩衝液に溶解したものであって、ＦａｂＫ蛋白質可溶性の全ての緩衝液を使用することができ、例えば、ＰＩＰＥＳ、ビシンおよびトリス、酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ビス−トリス、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸））、イミダゾール、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＭＥＳ（２−モルホリノ  エタンスルホン酸）、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ酢酸）、カコジル酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウムなどからなる群から選択された１種以上のものを使用することができる。蛋白質結晶を容易に得て構造分析が容易な結晶を得るために、ＦａｂＫ蛋白質溶液濃度は３〜３０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜２０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは  ８〜１５ｍｇ／ｍｌであるのが良い。
【００４３】
本発明に使用されるＦａｂＫ蛋白質溶液と貯水槽溶液内の沈澱剤濃度は大体反比例するように使用するのが良い。つまり、ＦａｂＫ蛋白質溶液の濃度が高い場合には比較的に結晶化が容易であるので、貯水槽溶液内の沈澱剤の濃度は相対的に低くして使用し、ＦａｂＫ蛋白質溶液の濃度が高い場合には結晶化のために相対的に沈澱剤（例えば、ポリエチレングリコール）濃度が高い貯水槽溶液を使用するのが良い。例えば、蛋白質溶液の濃度が約１０ｍｇ／ｍｌである時には沈澱剤濃度を約１５〜２０％（ｖ／ｖ）として使用することができる。
【００４４】
また、前記濃度平衡法は、ｐＨ８．０〜９．０で行われるのが好ましい。前記範囲は実験的に決定されたものであり、前記範囲のｐＨ条件下で反応する時に、最も優れた結晶を得ることができる。シッティングまたはハンギングドロップ蒸気平衡法による結晶生成反応の反応温度は、４〜２６℃であるのが好ましく、約２０〜２４℃であるのがより好ましく、反応時間は、１日〜２０日であるのが好ましく、１週間〜２週間であるのがより好ましい。前記反応温度及び反応時間範囲は、Ｘ線分析が容易な最適のデータを有する結晶を得ることができる条件として、実験的に決定された範囲である。
【００４５】
製造された結晶性ＦａｂＫ蛋白質の構造を分析するためには、Ｘ線分析を利用することができる。しかし、蛋白質結晶がＸ線の高いエネルギーに露出されると、その寿命が短くなり、データ強度も弱くなって、構造分析に良くない結果が発生する。このような欠点を防止するために、Ｘ線分析前にＦａｂＫ蛋白質結晶を高速で窒素冷却する高速窒素冷却法を行うのが好ましい。高速窒素冷却時に、効果的なＦａｂＫ蛋白質結晶の保護のために、結晶性条件に加えてエチレングリコール及びパラトン−Ｎを使用するのが好ましい。エチレングリコールを使用する場合、２０〜３５％（ｖ／ｖ）、好ましくは２５〜３０％（ｖ／ｖ）の濃度で使用するのが好ましい。パラトン−Ｎは、結晶に上載せして使用するのが好ましい。前記高速窒素冷却法を行う温度は、５０〜２００Ｋ、好ましくは８０〜１２０Ｋである。前記濃度及び温度範囲は、ＦａｂＫ蛋白質がその結晶性に影響なく、窒素ストリームに耐えられて、高速窒素内で保管が容易な範囲として、実験的に決定されるものである。
【００４６】
また、本発明は、Ｘ線結晶化方法によって得られた前記のような方法で結晶化されたＦａｂＫ蛋白質の３次元結晶構造を提供する。本発明の具体例において、前記結晶の３次元構造を知るために、Ｘ線映像プレートを使用して回折パターンを得て、多波長異常分散法（ＭＡＤ：ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ａｎｏｍａｌｏｕｓ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）で位相情報を得ることができる。前記のように得られたＦａｂＫ蛋白質結晶のＸ線回折パターン及び位相情報から電子密度地図を作成し、これから再び原子座標を導き出すことによって、３次元構造情報を得ることができる。
【００４７】
Ｘ線を使用した回折パターンのデータ収集方法は、Ｘ線の供給源によって一般実験室で得る方法及びシンクロトロンを利用する方法に分けられる。このうちのシンクロトロンを利用する方法は、結晶サイズが５０μｍ程度の小さい結晶まで可能であり、１つの波長だけでなく多様な波長でデータを収集することができるため、迅速な構造を得ることができる。したがって、本発明の好ましい具体例では、シンクロトロンを利用して回折パターンのデータを収集することができ、このように得られた本発明によるＦａｂＫ蛋白質結晶の回折パターンは、下記の表１に示した通りである。
【００４８】
【表１】
2009159939.tif 000003
【００４９】
位相情報は、多重重原子同型置換法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｓｏｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、多波長異常分散法、構造置換法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）などによって得ることができ、本発明の好ましい具体例では、多波長異常分散法を利用して、ＦａｂＫ蛋白質結晶の位相情報を得ることができる（Ｍｏｄｅｒｎ  Ｘ−ｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ，Ｐｅｔｅｒ  Ｌｕｇｅｒ参照）。具体的には、前記多波長異常分散法は、重金属を有する蛋白質結晶で互いに異なる三個の波長を通じて異常回折パターン（ａｎｏｍａｌｏｕｓ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ）を利用して位相を計算するのである。このような多波長異常分散法を利用するために、位相を計算してこれによる初期モデルの計算を行わなければならず、このような計算に使用することができる全てのプログラムを使用することができる。本発明の好ましい具体例では、ＳＯＬＶＥ及びＲＥＳＯＬＶＥ（ロスアラモス研究所、米国）を使用することができ、その後の精密化段階及び標準化段階のために、ＣＮＳ（エール大学）、ＣＣＰ４（ケンブリッジ大学）などのプログラムを使用することができる。
【００５０】
精密化段階は、Ｘ線回折パターンから得られた電子密度をＯ（Ａｌｗｙｎ  Ｊｏｎｅｓ，ｈｔｔｐ:／／ｗｅｂ．ｍａｃ．ｃｏｍ／ａｌｗｙｎ_４７／ＯＩｎＴｈｅＷｏｒｋｓ／ＯＩｎＴｈｅＷｏｒｋｓ．ｈｔｍｌを参照）及びＣＯＯＴ（Ｐａｕｌ  Ｅｍｓｌeｙ， ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ．ｙｓｂｌ．ｙｏｒｋ．ａｃ．ｕｋ／~ｅｍｓｌｅｙ／ｃｏｏｔ／を参照）プログラムでコンピュータモニターに表示して、そこに最も適した構造に修正することによって行われる。精密化段階を行った結果、本発明によるＦａｂＫ蛋白質結晶は、ＦＭＮ及び２４個の水分子を含み、下記の表２に記載の３次元結晶構造を有する原子モデルで表現されることが明らかになった。ＦａｂＫ蛋白質を標的とするＦａｂＫ阻害剤開発において、ＦａｂＫ蛋白質を単独で使用したり、このようなＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の形態で使用し、特に、このような複合体の形態で３次元構造の結晶性が優れていて、ＦａｂＫ阻害剤開発に非常に有用である。
【００５１】
ＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の３次元上の原子座標
【表２】
2009159939.tif 000004
2009159939.tif 000005
2009159939.tif 000006
2009159939.tif 000007
2009159939.tif 000008
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2009159939.tif 000013
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2009159939.tif 000024
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2009159939.tif 000029
2009159939.tif 000030
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2009159939.tif 000041
2009159939.tif 000042
2009159939.tif 000043
2009159939.tif 000044
2009159939.tif 000045
2009159939.tif 000046
【００５２】
前記表２のうち、Ａ：原子、Ｂ：原子数、Ｃ：原子名、Ｄ：残基名、Ｅ：残基数、Ｆ：ｘ軸情報、Ｇ：ｙ軸情報、Ｈ：ｚ軸情報、Ｉ：占有因子、Ｊ：温度因子である。また、ＷＡＴは水分子を表す。
【００５３】
精密化段階後、前記得られた原子モデルから多様な情報を得るために分析段階を追加的に行うことができる。例えば、グラフィック上に３次元空間のＦａｂＫ蛋白質の原子モデルを表示しておいて活性部位の形態を観察することによって各原子間の距離及び空間を測定したり、重要残基の空間的位置と異なる残基との相互作用を観察して、適切な阻害剤を見つけるモデリング段階を経ることができる。前記分析段階を行った結果得られたＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体の構造を図９、図１１ａおよび１１ｂに示した。これら図面から確認できるように、ＦａｂＫ蛋白質でＦＭＮが結合している部位は、ＴＩＭバレル（ＴＩＭ  ｂａｒｒｅｌ；Ｇ．Ｋ．Ｆａｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｇ．Ａ．Ｐｅｔｓｋｏ：Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ／ｂ  ｂａｒｒｅｌ  ｅｎｚｙｍｅｓ，ＴＩＢＳ１９９０；２２８−２３４参照）の上側に位置するループで構成されたところであり、これよりこの部位がＦａｂＫ蛋白質の活性部位であるといえる。より具体的に、ＦＭＮ分子（５）は前記表２の原子番号２３３４から２３６４までの原子からなり、そのうちの原子番号２３３４から２３５２までがヘッド（ＨＥＡＤ）部分を構成し、原子番号２３５３から２３６４までがテール（ＴＡＩＬ）部分を構成する。このような構造を有するＦＭＮ分子はＦａｂＫ蛋白質のＴＩＭバレル（１）の上側のループ部位（２）（ループ１：表２の原子番号１０１５から１１０３まで、ループ２：原子番号１４１から２０６まで）に結合しており、その結合部位上側にＦａｂＫ活性に必要な補酵素であるＮＡＤＰおよび基質が結合する。ＦａｂＫ蛋白質のＴＩＭバレルと残りの部分（以下、蓋部位（４））を連結するヒンジ部位（３）（原子番号１４２８から１４８５；すなわち１９８から２０５までのアミノ酸配列）が存在し、流動性を付与する。つまり、前記ヒンジ部位が動いてＮＡＤＰおよび基質が結合する空間を形成してＦａｂＫが作用するようにする。したがって、前記ヒンジ部位はＦａｂＫ活性部位のうちの一つであり得る。また、ＮＡＤＰおよび基質が結合する空間を提供するＴＩＭバレルの上のＦＭＮ分子が位置している部位の上側部分、つまり、ＦａｂＫ蛋白質に結合されたＦＭＮのヘッド部分水平面を半球の平らな底面とし、ヒンジ（部位および蓋部分を含む半球部分もＦａｂＫ活性部位である。より具体的に、前記ＴＩＭバレル上側活性部位はＴＩＭバレルの上に結合されたＦＭＮ分子のヘッド水平面を半球底面とする半径１５Å以内、好ましくは半径６〜１２Åの半球内に位置する部位であり得る。前記半球部分はループ１部分、ヒンジ部分を含む原子番号１３８０から２１３７までを含む。
【００５４】
また、突然変異実験を通じてＦａｂＫ蛋白質の活性に影響を与えるアミノ酸配列を確認し、このために、配列番号１のアミノ酸配列のうちの１つを標的となるアミノ酸として選定した後、前記アミノ酸のコード塩基配列を他のアミノ酸、例えばアラニンをコードするように変異させて、プライマーを製造する。この時、５´末端プライマー及び３´末端プライマーを全て使用し、これらプライマーの中間に変異させるアミノ酸をコードする塩基配列を有するように構成して、前記ＰＣＲ方法で所望の組換えクローンを得る。このように得られた組換えクローンは、ＤｐｎＩなどの制限酵素の処理を通じて大腸菌から得られた元のベクターを完全に分解するようにする。この時、制限酵素（ＤｐｎＩ）の反応時間は３０分〜２時間であるのが好ましい。その後、組換えクローンだけを大腸菌に導入して、所望の形質を有する突然変異ＦａｂＫ蛋白質を形成する。
【００５５】
このような方法で行われた突然変異実験を通じて、本発明によるＦａｂＫ蛋白質（配列番号１）の２０８番のチロシン（Ｙ２０８）および２０９番のリシン（Ｋ２０９）をアラニンに置換させた場合、その活性は各々増加し、一方で前記ＦａｂＫ蛋白質（配列番号１）の２１１番のリシン（Ｋ２１１）、２１４番のリシン（Ｋ２１４）、２２９番のヒスチジン（Ｈ２２９）および２６１番のロイシン（Ｌ２６１）をアラニンに置換させた場合、その活性は各々減少し、特に前記ＦａｂＫ蛋白質（配列番号１）の２２９番のヒスチジン（Ｈ２２９）及び２７６番のメチオニン（Ｍ２７６）をアラニンに置換させた場合、活性が大幅に減少することが明らかになり、前記アミノ酸がＦａｂＫ蛋白質の活性に影響を与える重要なアミノ酸であると考えられる。また、本発明によるＦａｂＫ蛋白質（配列番号１）の２０８番から２１５番までの８個のアミノ酸から構成されたへリックス及び２７８番から２８３番までの６個のアミノ酸から構成されたへリックスの欠失がＦａｂＫ蛋白質の活性の大幅な減少を招くことが観察され、前記２個のへリックス部位も、本発明によるＦａｂＫ蛋白質の活性に影響を与える重要な部位であることが明らかになった。
【００５６】
したがって、本発明によるＦａｂＫ蛋白質（配列番号１）のＴＩＭバレルの上側に位置するループ部位；ＦａｂＫ蛋白質のＴＩＭバレルの上に結合されたＦＭＮ分子のヘッド）水平面を平らな半球底面とする半径１５Å以内、好ましくは半径６から１２Åの半球内に位置する１つ以上のアミノ酸；１９８から２０５までのアミノ酸配列を含むヒンジ部位；２０８番のチロシン（Ｙ２０８）；２０９番のリシン（Ｋ２０９）；２１１番のリシン（Ｋ２１１）；２１４番のリシン（Ｋ２１４）；２２９番のヒスチジン（Ｈ２２９）；２６１番のロイシン（Ｌ２６１）；２７６番のメチオニン（Ｍ２７６）；２０８番から２１５番までの８個のアミノ酸から構成されたへリックス、；及び２７８番から２８３番までの６個のアミノ酸から構成されたへリックス；からなる群から選択された１つまたはそれ以上の部位及び候補物質の相互作用の有無を検出して、より効果的なＦａｂＫ蛋白質阻害剤を選択することができる。
【００５７】
したがって、本発明によるＦａｂＫ蛋白質の阻害活性を有するＦａｂＫ阻害剤開発において、前記表２に記載の２３８９個の原子座標のうちの前記活性部位に相当する原子座標を選択的に使用してＦａｂＫ蛋白質阻害剤をスクリーニングしたり、ＦａｂＫ蛋白質の阻害活性を有する化合物を設計したり仮想スクリーニングして、より容易で効果的にＦａｂＫ阻害剤開発を行うことができる。
【００５８】
また、本発明は、前記で究明されたＦａｂＫ蛋白質の３次元結晶構造に対する情報がコンピュータ読取可能に保存された保存媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスクなどを提供する。前記媒体に保存された３次元結晶構造情報は、前記表２に記載の原子座標の全部または一部（特に、前記活性部位に相当する原子座標）を含み、前記活性部位のアミノ酸及び前記突然変異アミノ酸の残基を含む部位に対する情報を含む。
【００５９】
前記で究明されたＦａｂＫ蛋白質の３次元結晶構造、及びＦａｂＫ及びＦＭＮが結合した特異な位置的特性及び前記活性部位で活性に影響を与える個別アミノ酸の役割に基づいて、本発明はＦａｂＫ蛋白質の活性を阻害するＦａｂＫ蛋白質阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。本発明によるＦａｂＫ蛋白質阻害剤のスクリーニング方法は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＦａｂＫ蛋白質及び候補化合物を反応させる段階、及び前記候補化合物から前記ＦａｂＫ蛋白質と相互作用する化合物を選択する段階を含む。
【００６０】
前記ＦａｂＫ蛋白質は、前記のような結晶化方法によって結晶化されたものである。前記ＦａｂＫ蛋白質と相互作用する化合物の選択時に、前記記載されたような３次元結晶構造及び／または活性部位に対する情報を使用して、より容易で正確にＦａｂＫ蛋白質の活性を阻害する化合物を選択することができる。また、本発明のスクリーニング方法は、このような保存媒体を使用するものである。
【００６１】
以下、本発明を下記の実施例によって詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するためのもので、本発明が下記の実施例によって限定されるのではない。
【実施例】
【００６２】
実施例１：サーモトガ・マリティマ  ＦａｂＫ蛋白質の発現及び精製
サーモトガ・マリティマ  ＦａｂＫ（配列番号１）の１番アミノ酸のメチオニン（Ｎ−末端）から３１２番アミノ酸のグルタミン酸（Ｃ−末端）までのＦａｂＫをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＥ０００５１２）を、ＰＣＲ反応を通じて増幅した。ＰＣＲ反応に使用されるプライマーとして、配列番号２及び３のオリゴヌクレオチドを使用した。配列番号２及び３のプライマーは、各々ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素認識部位を有する。
【００６３】
鋳型ゲノムＤＮＡを１μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰ溶液を５μｌ、各１００ｐｍｏｌの配列番号２及び配列番号３のプライマーを各々０．３μｌ、ＰｆｕＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素（５Ｕ／μｌ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）を１μｌ、及び１０倍濃度ＰＣＲ反応溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）を５μｌ混合し、さらに蒸溜水を最終的に５０μｌになるように加えて反応溶液を作成した後、この反応溶液を９５℃で５分、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１分の反応を３０回繰り返した。その後、ＰＣＲ反応溶液を０．８％アガロースゲルで電気泳動して、約９７０塩基長のＦａｂＫ遺伝子を分離した。分離されたＦａｂＫ遺伝子をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで処理した後、電気泳動して、ＦａｂＫ遺伝子の切片を抽出した後、５０μｌの蒸溜水溶液に溶存させ、これをＦａｂＫＮ／Ｘと命名した。
【００６４】
プラスミドｐＥＴ−２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ社、米国）は、Ｎ−末端に６個のヒスチジン残基を発現するが、これをＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で処理した後、電気泳動して、約５４００ｂｐの大きさのＤＮＡ切片を分離して、これをｐＥＴ−２８ａＮ／Ｘと命名した。０．５μｇのＦａｂＫＮ／Ｘを０．１μｇのｐＥＴ−２８ａＮ／Ｘと共に反応チューブに入れた後、２μｌの１０倍連結反応溶液（５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１００ｍＭの塩化マグネシウム、１００ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイオール）、及び１０ｍＭのＡＴＰ（アデノシン三リン酸））、１０ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを入れて総体積が２０μｌになるように蒸溜水を加えた後、１６℃で１２時間反応させた。この反応溶液を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎｅ  社，米国）に添加して形質転換させた後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（１％  バクトトリプトン、０．５％酵母抽出物、１％塩化ナトリウム）にプレーティングして、大腸菌形質転換体を選別した。この形質転換体からプラスミドを抽出し、制限酵素及び塩基配列分析によって組換えプラスミドｐＥＴ−２８ａ−ＦａｂＫを得た。
【００６５】
前記で得られた再組み合わせプラスミドにクローニングされたＦａｂＫ遺伝子の塩基配列は、Ｂｉｇ−Ｄｙｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｉｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社、米国）を利用して、ＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡ塩基配列分析器によって確認した。
【００６６】
前記形質転換された大腸菌菌株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが含まれているＬＢ培地で１２時間振盪培養した後、１ｍｌの培養液を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが含まれている１００ｍｌのＬＢ培地に移して、３７℃で培養液のＯ．Ｄ．が６００ｎｍで約０．６程度になった時点で、ＩＰＴＧを最終濃度が０．５ｍＭになるように添加した。ＩＰＴＧ添加４時間後に、１０，０００ｇで３０分間遠心分離して、各々細胞沈殿物を回収した。細胞沈殿物を２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．１Ｍの塩化ナトリウム、１ｍＭ  のＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸）溶液に懸濁させて、氷上で超音波で細胞を破砕した。細胞破砕液を遠心分離して、上層液をニッケル親和性カラムで、（ファーマシア社、スウェーデン）に通過させ、その後、ＢＬＵＥカラムファーマシア社、スウェーデン）に通過させて、通過溶液をスーパーデックス−７５（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５）ゲルろ過クロマトグラフィーカラム（ファーマシア社、スウェーデン）を使用して精製して、ＦａｂＫ蛋白質を得た。
【００６７】
実施例２：シッティングまたはハンギングドロップ蒸気平衡法によるＦａｂＫ蛋白質の結晶化
前記実施例１で得られたＦａｂＫ蛋白質を下記のようなシッティングまたはハンギングドロップ蒸気平衡法によって結晶化した。
【００６８】
２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、３００ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのジチオトレイオール、５０ｍＭの塩化アンモニウムを含む溶液内のＦａｂＫの濃度が１１ｍｇ／ｍｌである蛋白質溶液を製造した。最終蛋白質濃度は、ブラッドフォード法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３．４．１０）によって決定した。１１ｍｇ／ｍｌに濃縮された蛋白質溶液に補助因子であるＮＡＤＨ及びＦＭＮを添加して、最終蛋白質溶液を製造し、この時、ＦａｂＫ蛋白質に対する、前記補助因子のモル当量比は１：５になるようにした。
【００６９】
前記ＦａｂＫ蛋白質溶液の結晶条件を検索するために、初期スクリーン溶液（Ｈａｍｐｔｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）を使用し、自動化されたスクリーニングのために、Ｈｙｄｒａ  ＩＩ−ｐｌｕｓ  ｏｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｔｒｉｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を利用した。０．２μｌの蛋白質溶液及び０．２μｌの貯水槽溶液を混合した後、２２℃で２日から２０日が経過した後で結晶の生成有無を確認した。その結果、０．１Ｍのビシン緩衝液（ｐＨ９．０）、及び１Ｍ塩化リチウム及び２０％（ｖ/ｖ）ポリエチレングリコール６，０００沈澱剤を含む貯水槽溶液、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、及び０．２Ｍの塩化マグネシウム、及び２０％（ｖ/ｖ）ポリエチレングリコール２０，０００沈澱剤を含む貯水槽溶液を使用した場合に、Ｘ線回折能力が最も優れた結晶が得られた。
【００７０】
１μｌの最終蛋白質溶液及び１μｌの前記貯水槽溶液を混合した滴をシリコンでコーティングされたガラススライドの表面に滴下し、このスライドを貯水槽溶液０．５ｍｌが入っているプレート上に覆って、２２℃の恒温状態に置いた。一日で種結晶が生じ、一週間後にその結晶の大きさが０．１×０．１×０．２ｍｍに成長した。
【００７１】
実施例３：高速窒素冷却法を追加的に行ったＦａｂＫ蛋白質の結晶化
前記実施例２で得られたＦａｂＫ蛋白質結晶を直接高エネルギーのＸ線に露出させる場合に発生する問題点を解決するために、得られたＦａｂＫ蛋白質結晶のＸ線分析前に、下記のような高速窒素冷却法による冷却を行った。
【００７２】
グリセロール、ギ酸ナトリウム、エチレングリコール、スクロース、パラトン−Ｎなどの多様な冷却溶液を多様な濃度で検索した後、高速窒素冷却法の最適条件を得た。その結果、２５％（ｖ/ｖ）エチレングリコール、０．１Ｍのビシン緩衝液（ｐＨ９．０）、１Ｍの塩化リチウム、２０％（ｖ/ｖ）ポリエチレングリコール６，０００を含む高速冷却用溶液に結晶を数秒以内で浸漬して取り出すと、ＦａｂＫ蛋白質結晶に全く害を及ぼさず、１００Ｋの液体窒素ストリームに最もよく耐えることが明らかになった。
【００７３】
冷却溶液に浸漬した結晶を約０．３ｍｍのナイロン結晶回収ツール（Ｈａｍｐｔｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国）を利用して取り出して直ちに１００Ｋの窒素ストリームに入れた。
【００７４】
本実施例では、実験中によく発生する水枠現象（高速窒素冷却が完全でない場合に水が凍って現れる現象）も見られなかった。
【００７５】
実施例４：放射光加速器を通じたＦａｂＫ蛋白質結晶のＸ線回折パターンのデータ収集及び分析
前記実施例３で得られたＦａｂＫ蛋白質結晶を利用して、フォトンファクトリー（茨城県つくば市大穂1-1）の放射光加速器のＡＲ−ＮＷ１２ラインで回折パターンのデータを収集する実験を行った。結晶データの限界は２．３Åであり、データはＤＥＮＺＯ及びＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．ａｎｄ  Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２７６，４６１−４７２（１９９７））で処理した。結晶データの収集及び精密化の結果を表３に示した。
【００７６】
【表３】
2009159939.tif 000047
【００７７】
実施例５：ＦａｂＫ蛋白質結晶のＸ線回折パターンのデータ解釈及び構造計算
ＦａｂＫ蛋白質の構造は、多波長異常分散法を通じて究明した。多重波長分析法は、初期位相情報を求めるために、ＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ  Ｔ．Ｃ．ａｎｄ  ＢｅｒｅｎｄｚｅｎＪ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．．５５，８４９−８６１（１９９９））プログラムを利用し、電子密度の修正のために、ＲＥＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ  Ｔ．Ｃ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．．５６，９６５−９７２（２０００））プログラムを利用した。使用した回折パターンのデータは、２．３Åの解像度を有して行った。
【００７８】
精密化段階では、ＣＮＳプログラム（Ｂｒｕｎｇｅｒ，ＡＴ．ｅｔ  ａｌ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔ．Ｄ．，５４，９０５−９２１（１９９８））を使用した。精密化段階は、ＣＮＳプログラムのシミュレーションアニーリング方法を利用して行った。シミュレーション開始温度は１５００℃であり、各段階で１００℃ずつ冷却して、２５℃まで冷却させて行い、最終Ｒ因子及びＲｆｒｅｅ因子は各々２４．３％及び２４．２％であった。その後、Ｏプログラムを使用して最適構造を導き出した。最適構造を導き出すために、精密化段階を行ったが、これはＸ線回折パターンのデータから導き出された電子密度をＯプログラムでコンピュータモニターに表示して、そこに最も適した構造に修正する作業を繰り返すことによって行った。
【００７９】
精密化段階を行った結果、本発明によるＦａｂＫ蛋白質の３次元結晶構造は、以前までのＦａｂＩ蛋白質の構造とは明確に異なるＴＩＭバレル形態の構造及びＴＩＭバレルの上側のループが構成する活性部位を示し、ここにＦＭＮが結合していることが明らかになった。
【００８０】
実施例６：ＦａｂＫ蛋白質の活性部位を中心とする個別アミノ酸残基の突然変異体の作成
前記実施例５でＦａｂＫ蛋白質の３次元結晶構造を得た後、ＦａｂＫ蛋白質の活性部位の個別アミノ酸の役割を調べるために、突然変異体を作成して活性に対する影響を観察した。
【００８１】
個別残基の突然変異体は、チロシン２０８番残基をアラニン（Ｙ２０８Ａ：配列番号：４及び５）に、リシン２０９番残基をアラニン（Ｋ２０９Ａ：配列番号：６及び７）に、リシン２１１番残基をアラニン（Ｋ２１１Ａ：配列番号：８及び９）に、リシン２１４番残基をアラニン（Ｋ２１４Ａ：配列番号：１０及び１１）に、ヒスチジン２２９番残基をアラニン（Ｈ２２９Ａ：配列番号：１２及び１３）に、ロイシン２６１番残基をアラニン（Ｌ２６１Ａ：配列番号：１４及び１５）に、メチオニン２７６番残基をアラニン（Ｍ２７６Ａ：配列番号１６：及び１７）にした。
【００８２】
ＦａｂＫ蛋白質の活性部位に影響を与えるへリックスの欠失に対する効果を観察するために、２０８番から２１５番残基まで（８個のアミノ酸：配列番号：１８及び１９、以下ではＤ２０８とする）及び２７８番から２８３番まで（６個のアミノ酸：配列番号：２０及び２１、以下ではＤ２７８とする）のアミノ酸が欠損した突然変異蛋白質を前記ＰＣＲ方法を利用して形成した。
【００８３】
個別アミノ酸突然変異体及びＤ２０８及びＤ２７８突然変異蛋白質を形成するために、配列番号４から配列番号２１までのヌクレオチドオリゴマーを合成した後、前記ＰＣＲ方法で増幅した。ｐＥＴ−２８ａ−ＦａｂＫクローン化されたプラスミドを１０ｎｇ、２．５ｍＭのｄＮＴＰを５μｌ、前記配列プライマーを０．２μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ反応溶液（１００ｍＭ  塩化カリウム、１００ｍＭ  硫酸アンモニウム、２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ  硫酸マグネシウム）を５μｌを入れ、反応液が全体で５０μｌになるように蒸溜水を入れた。９５℃で１分、９５℃で５０秒、６０℃で５０秒、６８℃で６分の反応を１８回繰り返した。その後、ＤｐｎＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）を０．５μｌ（１０Ｕ）を入れて３７℃の恒温器で１時間反応させた。ＤｐｎＩ制限酵素によって大腸菌から由来したｐＥＴ−２８ａ−ＦａｂＫプラスミドは分解され、前記ＰＣＲ反応を通じて生成された突然変異ｐＥＴ−２８ａ−ＦａｂＫプラスミドだけが残るようになる。このような反応生成物を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に添加して形質転換させた後、実施例１で既述の５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングして、大腸菌の形質転換体を選別した。これらからプラスミドを抽出して、塩基配列分析を通じて突然変異ｐＥＴ−２８ａ−ＦａｂＫプラスミドを得た。
【００８４】
得られた突然変異ｐＥＴ−２８ａ−ＦａｂＫプラスミドは、発現宿主である大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、実施例１の精製方法を通じて精製した。
【００８５】
生成された突然変異体は、図７で、ＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動で分離程度を示す。
【００８６】
実施例7：ＦａｂＫ蛋白質の活性部位を中心とする個別アミノ酸残基の突然変異研究を通じた重要残基及び活性の影響
実施例６で精製された蛋白質は、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性測定方式を通じて各突然変異体の活性を測定した。
【００８７】
具体的には、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）中に、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを終濃度１７５μＭ、ＦａｂＫ蛋白質を終量５μｇ、酵素基質（トランス−２−オクテノイル−Ｎ−アセチルシステラミン（ｔｒａｎｓ−２−ｏｃｔｅｎｏｌｙ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｒａｍｉｎｅ））のＤＭＳＯ溶液を１０μｌ加え、蒸留水を加えて最終体積を２００μｌにした。室温で０−６０分反応後、溶液の３４０ｎｍの吸光度を測定して、酵素活性を測定した。酵素活性は、野生型ＦａｂＫの活性を１００とした時の各変異体の比活性（％）で測定した。
【００８８】
活性の加減を図１０に示す。Ｙ２０８Ａ及びＫ２０９Ａの場合、活性の増加を示しており、これら残基はＦａｂＫ蛋白質の活性を阻害する残基として現れ、その他のＦａｂＫ変異体Ｋ２１１Ａ、Ｋ２１４Ａ、Ｈ２２９Ａ、Ｌ２６１Ａ、Ｍ２７６Ａ、Ｄ２０８、Ｄ２７８の場合、活性の減少を示している。特に、Ｈ２２９Ａ及びＭ２７６Ａの場合、大幅な活性の減少を示し、Ｄ２０８及びＤ２７８のへリックスを除去した突然変異体は、活性の減少がより著しいことが分かる。これは、ヒスチジン２２９番及びメチオニン２７６番、そして構造を支持するへリックスである２０８番から２１５番、２７８番から２８３番がＦａｂＫの蛋白質の活性を維持するのに重要な作用をすることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ＦａｂＫ発現ベクター及びクローニング情報を示した図面である。
【図２】ＦａｂＫ蛋白質の発現程度のテスト結果を示した図面である。図中、Ｍは分子量マーカー、Ｃは粗抽出物、Ｔは全細胞溶解液、Ｓは可溶性画分、Ｐは不溶性画分（封入体）をそれぞれ表す。
【図３】蛋白質発現細胞を破砕した上清をニッケル親和性カラムで精製したサンプルのゲル電気泳動図である。
【図４】図３の精製サンプルを、ＢＬＵＥカラムに通過させたサンプルのゲル電気泳動図である。
【図５】図４の精製サンプルを、スーパーデックス−７５ゲルろ過クロマトグラフィーカラムで精製したサンプルのゲル電気泳動図である。
【図６】ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ依存によるＦａｂＫ蛋白質の活性度を示した図面である。
【図７】ＦａｂＫ蛋白質の活性部位のアミノ酸突然変異体の精製結果を示した図面である。
【図８】ＦａｂＫ蛋白質結晶構造を示した図面である。
【図９】ＦａｂＫ蛋白質の骨格構造をＣアルファ（Ｃａｌｐｈａ）リボンで示した図面である。
【図１０】ＦａｂＫ変異体の活性度を示した図面である。
【図１１ａ】ＦＭＮの構造を模式的に示したものである。
【図１１ｂ】ＦａｂＫ−ＦＭＮ複合体でのＦＭＮ位置を示したものである。
【符号の説明】
【００９０】
（１）      ＴＩＭバレル部位
（２）      ループ部位
（３）      ヒンジ部位
（４）      蓋部位
（５）      ＦＭＮ分子
【図１】
2009159939.tif 000179
【図２】
2009159939.tif 000180
【図３】
2009159939.tif 000181
【図４】
2009159939.tif 000182
【図５】
2009159939.tif 000183
【図６】
2009159939.tif 000184
【図７】
2009159939.tif 000185
【図８】
2009159939.tif 000186
【図９】
2009159939.tif 000187
【図１０】
2009159939.tif 000188
【図１１ａ】
2009159939.tif 000189
【図１１ｂ】
2009159939.tif 000190