(57)【要約】【課題】  クリキュラトリフェネストラータの繭の薬理用途を提供すること。【解決手段】  本発明は、クリキュラトリフェネストラータの繭の抽出物を有効成分とする抗腫瘍剤、抗酸化剤、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤である。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリキュラトリフェネストラータ（Ｃｒｉｃｕｌａ ｔｒｉｆｅｎｅｓｔｒａｔａ）の繭の抽出物を有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤。
【請求項２】
クリキュラトリフェネストラータ（Ｃｒｉｃｕｌａ ｔｒｉｆｅｎｅｓｔｒａｔａ）の繭の抽出物を有効成分とすることを特徴とする抗酸化剤。
【請求項３】
クリキュラトリフェネストラータ（Ｃｒｉｃｕｌａ ｔｒｉｆｅｎｅｓｔｒａｔａ）の繭の抽出物を有効成分とすることを特徴とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クリキュラトリフェネストラータの繭の薬理用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
クリキュラトリフェネストラータ（Ｃｒｉｃｕｌａ ｔｒｉｆｅｎｅｓｔｒａｔａ）は、東南アジアに生息するヤママユ蛾科に属する野蚕の１種で、幼虫はカシューナッツなどの木につく害虫であるが、繭は荒い網の目状の黄金色であり、その美しさから、アクセサリーや織物の原材料として利用されている。また、蚕の繭の薬理用途としては、例えば特許文献１に、繭由来の平均分子量が２０万以上のタンパク成分が創傷治癒剤や化粧料として利用できることが記載されている。しかしながら、クリキュラトリフェネストラータが産生する繭が有する薬理活性に関する報告はこれまでに存在しない。
【特許文献１】特開２００４−３００１４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで本発明は、クリキュラトリフェネストラータの繭の薬理用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上記の点に鑑みて鋭意研究を進めた結果、クリキュラトリフェネストラータの繭の抽出物が、抗腫瘍作用、抗酸化作用、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有することを見出した。
【０００５】
上記の知見に基づいてなされた本発明の抗腫瘍剤は、請求項１記載の通り、クリキュラトリフェネストラータの繭の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
また、本発明の抗酸化剤は、請求項２記載の通り、クリキュラトリフェネストラータの繭の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
また、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、請求項３記載の通り、クリキュラトリフェネストラータの繭の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、クリキュラトリフェネストラータの繭の薬理用途を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において、クリキュラトリフェネストラータの繭の抽出物は、例えば乾燥させた繭を粉砕して粉末にした後、これを抽出溶媒としての水や各種の有機溶媒、例えばメタノールやエタノールやイソプロピルアルコールなどのアルコール、アセトン（水を例えば１０〜５０％含んでいてもよい）、エーテル、ヘキサン、酢酸エチルなどに投入し、３℃〜１００℃で１時間〜１週間震盪させて成分抽出してからろ過することで、ろ液として得ることができる。使用する繭は、蛹が入っている繭でもよいが、蛹が羽化した後の繭や羽化する前の蛹を抜き取った繭が好適である。なお、蛹が入っている繭を使用しても、主にタンパク質から構成される蛹成分が本発明の薬理作用に及ぼす影響は少ない。抽出溶媒は、単一の溶媒を用いてもよいし複数の溶媒を混合して用いてもよい。得られたろ液は、そのまま液状抽出物として用いてもよいし、凍結乾燥や減圧濃縮を行って固形物や粉末にして用いてもよい。なお、ろ液をさらにゲルろ過やイオンクロマトグラフィーや硫安分画などによって精製し、得られた画分を液状抽出物として用いてもよい。また、例えば最初にヘキサンを用いて抽出操作を行った後、順次、酢酸エチル、アセトン、水といったように、用いる溶媒の極性をだんだんと高くして抽出操作を行い、いずれかの溶媒を用いることで得られたろ液を液状抽出物として用いてもよい。抗腫瘍作用に優れる抽出物を得るためには、抽出溶媒として酢酸エチルを少なくとも含む溶媒を用いることが望ましい。抗酸化作用に優れる抽出物およびプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用に優れる抽出物を得るためには、抽出溶媒としてアセトンを少なくとも含む溶媒を用いることが望ましい。
【０００８】
上記のようにして得たクリキュラトリフェネストラータの繭の抽出物は、例えば医薬部外品、医薬品、飲食品などの形態で人体に対して経口的に投与することができる。これらの形態における製剤組成は特段限定されるものではなく、自体公知の一般的なものを採用することができる。人体へのその投与量は、適用対象者の年齢や性別、症状の程度などに基づいて適宜決定することができ、適切な投与量を投与することにより、その抗腫瘍作用によって抗腫瘍効果を、抗酸化作用によって心筋梗塞や動脈硬化をはじめとする生活習慣病などに対する予防効果や治療効果を、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用（認知改善作用）によって痴呆症などに対する予防効果や治療効果をもたらすことができる。
【実施例】
【０００９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１０】
参考例１：クリキュラトリフェネストラータの繭の抽出物の調製
図１に示すフローチャートに従って４種類の抽出物を得た。
（工程１）
クリキュラトリフェネストラータの繭（株式会社ジョグジャカルタロイヤルシルクより入手した蛹が羽化した後の繭）の乾燥物３６．３ｇを粉砕機で粉砕し、篩にかけて粉末化した。得られた粉末にｎ−ヘキサン６００ｍＬを添加し、室温で２４時間震盪させて成分抽出してからろ紙を用いてろ過することでろ液を得た。得られたろ液を減圧濃縮することで、淡い黄土色で粘性があるｎ−ヘキサン抽出物を得た（収量：４５．０１ｍｇ、収率：０．１２４％）。
（工程２）
次に、ｎ−ヘキサンを用いた抽出操作の残渣に酢酸エチル６００ｍＬを添加し、室温で２４時間震盪させて成分抽出してからろ紙を用いてろ過することでろ液を得た。得られたろ液を減圧濃縮することで、黄色で粘性がある酢酸エチル抽出物を得た（収量：２１．２５ｍｇ、収率：０．０５８５％）。
（工程３）
さらに、酢酸エチルを用いた抽出操作の残渣に７０％アセトン（含水率：３０％）６００ｍＬを添加し、室温で２４時間震盪させて成分抽出してからろ紙を用いてろ過することでろ液を得た。得られたろ液を凍結乾燥することで、朱色で微粒子状粉末である７０％アセトン抽出物を得た（収量：２６２．８ｍｇ、収率：０．７２４％）。
（工程４）
最後に、７０％アセトンを用いた抽出操作の残渣に超純水（ＭＱ水）６００ｍＬを添加し、室温で２４時間震盪させて成分抽出してからろ紙を用いてろ過することでろ液を得た。得られたろ液を凍結乾燥することで、黄土色で粉状の水抽出物を得た（収量：２７０．５ｍｇ、収率：０．７４５％）。
【００１１】
実施例１：抗腫瘍作用（細胞増殖抑制活性試験）
（実験方法）
MTT法（Oka, M., Maeda, S., Koga, N., Kato, K. and Saito, T. (1992) A Modified Colorimetric MTT Assay Adapted for Primary Cultured Hepatocytes: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Biosci. Biotech. Biochem., 56, 1472-1473.）に従って行った。MTT｛3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide｝は細胞内脱水素酵素により還元され、ホルマザンを生成する。生細胞数と生成するホルマザンの量は直線的な比例関係にある。ホルマザンは550ｎｍから600ｎｍに極大吸収波長を持つので、その付近の吸光度を測定することにより容易に生細胞数を計測することができる。細胞はラット肝がん細胞（dRLh84）を用いた。培地は10％ウシ新生児血清（NCS）、4ｍＭのグルタミン、50Ｕ/ｍＬのペニシリン、50μｇ/ｍＬのストレプトマイシン、100μｇ/ｍＬのカナマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM、日水製薬）を用いた。組織培養用ディッシュ（100×20ｍｍ、グライナー社製）を用い、5％ＣＯ２存在下、37℃湿潤条件のＣＯ２インキュベーター内で細胞の培養を行った。対数増殖期で培地を取り除き、細胞をPBS(-)［リン酸バッファー(-)］（137ｍＭのNaCl，2.7ｍＭのKCl，2ｍＭのNa2HPO4・12H2O，1.5ｍＭのKH2PO4）で洗浄した。その後、2.5％トリプシン溶液で細胞を浮遊させ、細胞数が3×104個/ｍＬになるように培地で希釈し、懸濁状態にある細胞を96ウェルマイクロプレート（IWAKI）の各ウェルに200μＬずつ分注し、5％ＣＯ２インキュベーター（37℃）内で24時間培養した。その後、Dimethyl Sulufoxide（DMSO）を用いて各検定濃度に調整したサンプル溶液1μＬを各ウェルに加えた。ＣＯ２インキュベーター内で48時間培養後、ウェル内の培地を除去し、0.55ｍｇ/ｍＬのMTTを含む培地を100μＬ加えて撹拌し、さらに4時間培養した。その後、ウェル内の培地を除去し、生成したホルマザン結晶を200μＬのDMSOで溶解した。各ウェルの590ｎｍおよび620ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（Immuno-Mini NJ-2300、日本インターメッド）で測定し、細胞増殖抑制活性を検定した。
（実験結果）
酢酸エチル抽出物をサンプルとした場合の試験結果を図２に示す。図２から明らかなように、クリキュラトリフェネストラータの繭の酢酸エチル抽出物は、濃度依存的にラット肝がん細胞の生存率を低下させたことから、その抗腫瘍作用を確認することができた。
【００１２】
実施例２：抗酸化作用（ＤＰＰＨラジカル消去活性試験）
（実験方法）
DPPH分光測定法（Yamaguchi, F., Ariga, T., Yoshimura, Y. and Nakazawa, H. (2000) Antioxidantativeand anti-glycation activity of Garcinolfrom Garcinia indica Furuit Rind. J. Agric. Food Chem. 48, 180-185.）に従って行った。DPPH（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）は自らが安定なフリーラジカルで黒紫色を呈しているため、黒紫色の退色を分光学的に分析することによりラジカル消去能を測定することができる。陽性対照区としては、高い抗酸化活性を持つことが確認されているアスコルビン酸を用いた（Arabshahi-Delouee, S. and Urooj, A. (2006) Antioxidant propaties of various solvent extract of mulberry(Morus indica L.)leaves. Food Chem., in press.）。96ウェルマイクロプレート（IWAKI）の各ウェルに抽出溶媒を用いて各検定濃度に調整したサンプル溶液20μＬ、0.1ＭのTris-HCl緩衝液（pH7.4）80μＬ、エタノールに溶解した500μＭのDPPH溶液（和光社製）100μＬを分注し、室温で20分間放置後、多目的マイクロプレートリーダー（Power scan HT、大日本住友製薬）によって517ｎｍにおける吸光度を測定し、残存DPPHラジカル量を定量することで検定した。
（実験結果）
７０％アセトン抽出物をサンプルとした場合の試験結果を図３に示す。図３から明らかなように、クリキュラトリフェネストラータの繭の７０％アセトン抽出物は、濃度依存的にＤＰＰＨラジカルを消去したことから、その抗酸化作用を確認することができた。
【００１３】
実施例３：プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用（認知改善活性試験）
（実験方法）
バソプレシンやサブスタンスPなどの脳内情報伝達物質（神経ペプチド）を分解する酵素であるプロリルエンドペプチダーゼ（Prolylendopeptidase；以後PEP）に対する阻害活性を指標とし、Yoshimoto, T., Kado, K., Matsubara, F., Koriyama, N., Kaneto, H. and Tsuru, D.（1987）Specific inhibitors for prolyl endopeptidase and their antiamnesic effect. J Pharmacobiodyn., 10,730-735.に記載の方法を改変して阻害活性の測定を行った。プロリンのC末端側にp-ニトロアニリンが結合した形の合成基質がPEPによる分解を受けると、反応液中に遊離したp-ニトロアニリンを生じ黄色を呈する。PEP阻害活性を有するサンプルを添加した上で酵素を反応させれば、遊離のp-ニトロアニリンの量は減少する。その際の吸光度を測定し、比較することで酵素阻害活性を求めることができる。合成基質であるZ-Gly-Pro-pNa（Bachem Feinchemikaline）は40％ジオキサンで2ｍＭに調整して用いた。PEP（第一化学工業）は0.1ＭのTris-HCl緩衝液（pH7.0）で0.1unit/ｍＬに調整して用いた。陽性対照区としては、Z-Pro-Pro-CHO（BIOMOL）を用いた。1.5ｍＬのマイクロチューブ（Treff）に0.1ＭのTris-HCl緩衝液（pH7.0）890μＬを分注し、2ｍＭのZ-Gly-Pro-pNa溶液50μＬ、抽出溶媒を用いて各検定濃度に調整したサンプル溶液10μＬを添加してタッチミキサで撹拌した。なお、コントロールはサンプル溶液のかわりに抽出溶媒を10μＬ添加したものとした。その後、PEP溶液50μＬをマイクロチューブに滴下し、速やかにタッチミキサで撹拌し、30℃のウォーターバス中で30分間インキュベートした。反応終了後、速やかに分光光度計を用いて410ｎｍにおける吸光度を測定した。PEP阻害活性は、サンプル溶液が有色であるため、0.1ＭのTris-HCl緩衝液（pH7.0）990μＬにサンプル溶液を10μＬ添加して同様に攪拌・インキュベートしたものの吸光度を測定し、この吸光度の値をPEP反応後の吸光度の値から差引いた値でもって検定した。
（実験結果）
７０％アセトン抽出物をサンプルとした場合の試験結果を図４に示す。図４から明らかなように、クリキュラトリフェネストラータの繭の７０％アセトン抽出物は、濃度依存的にプロリルエンドペプチダーゼ活性を阻害したことから、そのプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用（認知改善作用）を確認することができた。
【００１４】
製剤例１：錠剤
以下の成分組成からなる抗腫瘍作用を有する錠剤を自体公知の方法で製造した。
クリキュラトリフェネストラータの繭の水抽出物（粉末）              １
乳糖                                                            ８０
ステアリン酸マグネシウム                                        １９
（単位：重量％）
【００１５】
製剤例２：カプセル剤
以下の成分組成からなる抗酸化作用を有するカプセル剤を自体公知の方法で製造した。
クリキュラトリフェネストラータの繭の７０％アセトン抽出物（粉末）  ５
乳糖                                                            ４０
馬鈴薯澱粉                                                      ５０
ヒドロキシプロピルメチルセルロース                                ３
ステアリン酸マグネシウム                                          ２
（単位：重量％）
【００１６】
製剤例３：ビスケット
以下の成分組成からなるプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有するビスケットを自体公知の方法で製造した。
クリキュラトリフェネストラータの繭の７０％アセトン抽出物（粉末）  １
薄力粉                                                          ３２
全卵                                                            １６
バター                                                          １６
砂糖                                                            ２４
水                                                              １０
ベーキングパウダー                                                １
（単位：重量％）
【産業上の利用可能性】
【００１７】
本発明は、クリキュラトリフェネストラータの繭の薬理用途を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】クリキュラトリフェネストラータの繭の抽出物の調製方法の一例を示すフローチャートである。
【図２】実施例１における本発明の抗腫瘍剤の効果を示すグラフである。
【図３】実施例２における本発明の抗酸化剤の効果を示すグラフである。
【図４】実施例３における本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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