(57)【要約】【課題】  免疫学的手法によらずに、微生物の生化学的性質に基づき、環境中の特定微生物をターゲットとした選択的な濃縮、精製を簡単に行うこと。【解決手段】  イオン交換能を有する物質からなる担体１１と、この担体１１が収容されるカラム１３と、緩衝液のｐＨを経時的に上げながら緩衝液をカラム１３に供給する緩衝液供給手段１５と、カラム１３から排出された緩衝液を経時的に所定量ずつ回収する緩衝液回収手段１８とを備えて濃縮精製装置１０が構成されている。この装置１０は、緩衝液のｐＨの変化に伴う微生物の表面電荷の変化の状態が、微生物の種類によって相違する点を利用し、緩衝液のｐＨを経時的に変えることで、担体１１に付着してから脱落する微生物の種類を時間毎に変えて当該微生物を回収することで、微生物の濃縮精製が行われる。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の微生物を含む微生物含有溶液が通過する流路と、当該流路に配置された担体と、前記微生物含有溶液が前記流路を通過した後で、前記流路に所定の緩衝液を供給する緩衝液供給手段と、前記流路を通過した前記緩衝液を回収する緩衝液回収手段とを備え、
前記担体は、表面が正又は負に帯電する物質により構成され、
前記緩衝液供給手段は、前記緩衝液のｐＨを経時的に変化させながら当該緩衝液を供給可能に設けられ、
前記緩衝液回収手段は、前記緩衝液を経時的に所定量ずつ回収可能に設けられていることを特徴とする微生物の濃縮精製装置。
【請求項２】
前記担体は、中性付近で表面が負に帯電する物質により構成され、
前記緩衝液供給手段は、前記緩衝液のｐＨを経時的に上げながら当該緩衝液を供給可能に設けられていることを特徴とする微生物の濃縮精製装置。
【請求項３】
表面が正又は負に帯電する担体が配置された流路に、複数の微生物が含まれる微生物含有溶液を通した後で、経時的にｐＨが変化する緩衝液を前記流路に供給し、当該流路から排出された前記緩衝液を経時的に所定量ずつ回収することを特徴とする微生物の濃縮精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、より多くの種類の微生物に対する濃縮、精製に有用となる微生物の濃縮精製装置及び濃縮精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然環境中には、多種多様な微生物が存在しているが、これら微生物は、複合微生物系を形成しており、この複合微生物系から、より多くの微生物を分離培養することで、有用な微生物の発掘や未利用遺伝子資源としての活用等が可能となる。
【０００３】
従来における微生物の培養方法としては、例えば、特許文献１等で紹介されている平板培養法がある。この平板培養法は、対象微生物が含まれたサンプルを希釈することにより、対象微生物の所定単位当たりの細胞数を少なくした上で、当該希釈後のサンプルを容器内の寒天培地に載せ、所定期間に亘って対象微生物を培養し、増殖させる方法である。
【０００４】
しかしながら、この平板培養法では、いわゆる難培養性微生物が多く存在し、環境中の９９パーセント以上の微生物の分離培養を行うことは困難である。このような難培養性微生物の分離培養を試みる場合には、前記平板培養法などを用い、多くのトライアル数を重ねる必要がある。従って、当然のことながら、サンプル中に存在するターゲットとなる微生物の割合（濃度）を短時間に上昇させることができれば、ターゲットとなる微生物を獲得する効率は飛躍的に向上することが確実である。また、前記平板培養法により対象微生物を分離培養することに一見成功しても、実は僅かに存在する共存微生物を除去しきれていない場合がある。従って、環境中からターゲットとなる微生物を分離培養する操作の前又は後で特異的に濃縮精製することは有効である。
【０００５】
ところで、ターゲットとなる細胞を選択的に濃縮精製する手法として、特許文献２に記載されている手法がある。この特許文献２では、蛍光抗体標識細胞分離法（ＦＡＣＳ）、免疫吸着分離法、免疫磁気分離法、遠心分離法が従来技術として紹介されている他、特許文献２の発明に係る特異的リガンドを用いた吸着分離法が開示されている。
【特許文献１】特開平６−２７７０９５号公報
【特許文献２】特開平６−２６９４９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献２に開示されている各手法は、体液又は血液などの細胞混合液からターゲット細胞を分離する目的で用いられており、従来、分離培養ができなかった微生物の濃縮精製に用いることはできない。すなわち、自然環境中には、多種多様な微生物（細菌・古細菌など）が存在しているが、前述したように、そのうち９９％以上の微生物は、従来、分離培養できていないことから、未知の微生物が数多くあり、当該微生物の性状が殆ど不明である。従って、前記ＦＡＣＳ、前記免疫吸着分離法、前記免疫磁気分離法等の免疫学的手法では、分離目的細胞に特異的に結合する抗体を用いる必要があるが、当該抗体を作成するためには純粋な培養株が必要であり、環境中の未知・未培養の微生物に対しては、当該培養株を得られず、これら手法を利用することができない。また、前記遠心分離法にあっては、細胞の密度や比重の違いで細胞を分離するが、物理的な差の小さい微生物では有用な濃縮精製手法とならない。更に、前記特異的リガンドを用いた吸着分離法にあっては、目的細胞を認識する抗体にヌクレオチドを結合させる必要があるが、環境中の未知・未培養の微生物に対しては、その性状が未知である故に、前記抗体を見つけることが難しく、この手法の利用も実用的でない。
【０００７】
そこで、本発明者らは、環境中の未知・未培養の微生物に対しても、微生物細胞表面の生化学的、物理化学的な性質に基づいて濃縮、精製できるように、鋭意、実験研究を行った結果、微生物の表面電荷は、当該微生物を含む溶液のｐＨに応じて変化し、当該変化の度合いが微生物の種類によって異なるという事象を知見した。この事象は、微生物の生化学的性質によるものであり、未知の微生物についても、当然に、同様の事象が発生するものと考えられる。
【０００８】
本発明は、このような発明者の知見に基づいて創出されたものであり、その目的は、免疫学的手法によらずに、微生物細胞表面の生化学的、物理化学的な性質に基づき、環境中の特定微生物をターゲットとした選択的な濃縮、精製を簡単に行うことができる微生物の濃縮精製装置及び濃縮精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（１）前記目的を達成するため、本発明の濃縮精製装置は、複数の微生物を含む微生物含有溶液が通過する流路と、当該流路に配置された担体と、前記微生物含有溶液が前記流路を通過した後で、前記流路に所定の緩衝液を供給する緩衝液供給手段と、前記流路を通過した前記緩衝液を回収する緩衝液回収手段とを備え、
前記担体は、表面が正又は負に帯電する物質により構成され、
前記緩衝液供給手段は、前記緩衝液のｐＨを経時的に変化させながら当該緩衝液を供給可能に設けられ、
前記緩衝液回収手段は、前記緩衝液を経時的に所定量ずつ回収可能に設けられる、という構成を採っている。
【００１０】
（２）ここで、前記担体は、中性付近で表面が負に帯電する物質により構成され、
前記緩衝液供給手段は、前記緩衝液のｐＨを経時的に上げながら当該緩衝液を供給可能に設けられる、という構成を採ることが好ましい。
【００１１】
（３）また、本発明の濃縮精製方法は、表面が正又は負に帯電する担体が配置された流路に、複数の微生物が含まれる微生物含有溶液を通した後で、経時的にｐＨが変化する緩衝液を前記流路に供給し、当該流路から排出された前記緩衝液を経時的に所定量ずつ回収する、という手法を採っている。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、緩衝液のｐＨの変化に伴う微生物の表面電荷の変化の状態が、微生物の種類によって相違する点を利用し、緩衝液のｐＨを経時的に変えることで、担体に付着してから脱落する微生物の種類を時間毎に変えながら当該微生物を回収することにより、ターゲットとなる微生物の濃縮、精製が可能になる。従って、免疫学的手法によらずに、微生物細胞表面の生化学的、物理化学的性質に基づき、環境中の特定微生物をターゲットとした選択的な濃縮、精製を簡単に行うことができ、従来の未知・未培養の微生物のうち、新たに分離培養可能となる微生物の発現が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。
【００１４】
図１には、本実施形態に係る濃縮精製装置の概略構成図が示されている。この図において、濃縮精製装置１０は、イオン交換能を有する物質からなる担体１１と、この担体１１が収容されるカラム１３と、カラム１３内に緩衝液（バッファー）を供給する緩衝液供給手段１５と、カラム１３内から排出された緩衝液を回収する緩衝液回収手段１８とを備えている。
【００１５】
前記担体１１は、正又は負に帯電する物質、或いは、陰イオン交換体又は陽イオン交換体を持つ物質であれば何でも良い。本実施形態では、中性付近で負に帯電するガラスビーズが用いられている。なお、当該ガラスビーズの直径は、微生物の数十倍の大きさとなる５０〜１５０μｍ程度となっている。その他、担体１１としては、ガラスウール、セラミックス類等を例示できる。
【００１６】
前記カラム１３は、上下両側が開放する筒状をなしており、その内部空間Ｓに担体１１が充填されている。カラム１３の上端側は、複数の微生物を含む微生物含有溶液と緩衝液供給手段１５からの緩衝液とを内部空間Ｓに注入するための液注入口１３Ａとなっている。一方、カラム１３の下端側は、前記微生物含有溶液及び緩衝液が緩衝液回収手段１８に排出される液排出口１３Ｂとなっている。これにより、前記微生物含有溶液及び緩衝液は、液注入口１３Ａから内部空間Ｓに流入し、各担体１１間の隙間を抜けて液排出口１３Ｂからカラム１３の外側に流出することになるため、内部空間Ｓは、前記微生物含有溶液及び緩衝液の流路となる。なお、内部空間Ｓにおける液排出口１３Ｂ側には、カラム１３の外側への担体１１の流出防止用のフィルタＦが設けられている。
【００１７】
前記緩衝液供給手段１５は、緩衝液のｐＨを経時的に上げながら緩衝液をカラム１３に供給するようになっている。ここで、本実施形態の緩衝液としては、クエン酸バッファー、すなわち、クエン酸溶液と、当該クエン酸溶液よりもｐＨの大きい重リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）溶液との混合溶液が用いられる。なお、本発明において適用可能な緩衝液としては、前記クエン酸バッファーに限定されず、微生物に対する毒性のないものであれば何でも良い。
【００１８】
この緩衝液供給手段１５は、所定濃度のクエン酸溶液が収容された第１の液槽２０と、所定濃度の重リン酸ナトリウム溶液が収容された第２の液槽２１と、これら第１及び第２の液槽２０，２１内の各溶液を所定割合で混合してカラム１３に連続的に供給するグラジエントポンプ２４とを備えている。このグラジェントポンプ２４は、第１の液槽２０からのクエン酸溶液の抽出量を経時的に一定割合で減少させながら、第２の液槽２１からの重リン酸ナトリウム溶液の抽出量を経時的に一定割合で増大させるようになっている。従って、カラム１３に供給される緩衝液は、ｐＨが時間に対して比例的（直線的）に上がるように変化する。なお、緩衝液のｐＨの上昇は、所定時間単位で段階的に行っても良い。
【００１９】
前記緩衝液回収手段１８は、カラム１３から排出された緩衝液を経時的に所定量ずつ回収する回収装置２７と、カラム１３から回収装置２７に緩衝液を送り込むポンプ２８とを備えて構成されている。前記回収装置２７は、図示しない試験管に緩衝液を経時的に所定量ずつ分画する公知のフラクションコレクターである。
【００２０】
以上の構成の濃縮精製装置１０により、次の手順で微生物の濃縮或いは精製が行われる。
【００２１】
先ず、複数の微生物を含む微生物含有溶液をカラム１３の液注入口１３Ａから注入する。この際の微生物含有溶液としては、培養溶液、海水、湖水等を例示でき、当該微生物含有溶液のｐＨは、緩衝液の最低ｐＨよりも小さく設定されており、本実施形態では、ｐＨ３程度の弱酸性に設定されている。そして、微生物含有溶液は、カラム１３の内部空間Ｓを通って、回収装置２７にて経時的に試験管（図示省略）に回収される。この際、本発明者らの知見によれば、ｐＨ３程度の弱酸性溶液中に存在する微生物のうちの多くは、その表面側に正電荷が存在しており、当該多くの微生物は、表面が負に帯電している担体１１に付着する。そして、ここで付着されない残りの微生物が、微生物含有溶液とともにカラム１３の液排出口１３Ｂから排出される。
【００２２】
次に、グラジエントポンプ２４の作用により、緩衝液が、そのｐＨを経時的に上昇させながらカラム１３の液注入口１３Ａから注入され、内部空間Ｓを通過して回収装置２７側に排出される。このとき、本発明者らの知見によれば、微生物の中には、当該微生物がさらされる液体のｐＨが上昇すると、あるｐＨを境界にして当該微生物の表面側に負電荷が存在するように変わるものがあり、この境界となるｐＨは、微生物によって一様ではない。従って、担体１１を通過する緩衝液のｐＨの経時的な上昇に伴い、先の工程で担体１１に付着した微生物のうち、表面が負電荷になるものが次第に増え、時間の経過に伴い、担体１１から脱落する微生物の種類が増え、これら微生物が緩衝液とともに回収装置２７で回収される。このため、回収装置２７での回収時間によって、前記試験管内で回収される微生物の組み合わせが異なって、結果的にターゲットとなる微生物の濃縮、精製が可能になる。
【００２３】
なお、カラム１３から回収された緩衝液中の微生物は、吸光度測定によって存在状況が確認され、必要に応じ、ＦＩＳＨ（蛍光  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）により、ターゲット微生物の定量が行われる。
【００２４】
次に、前記濃縮精製装置１０による微生物の濃縮精製効果を確認するための実験を行った。
【００２５】
本実験は、次の条件及び手順で行った。
【００２６】
先ず、担体１１として粒径０．１ｍｍのガラスビーズを用意し、当該ガラスビーズを充填高さ１５ｃｍとしてカラム１３内に充填した。そして、クエン酸溶液の比率が８０％となるｐＨ３．８のクエン酸バッファーからなる原液に、所定の微生物の菌体を含ませてなる微生物含有溶液を用意し、当該微生物含有溶液をカラム１３に１０ｍｌ注入した。この微生物含有溶液は、担体１１を通過してカラム１３から排出されて回収された。
【００２７】
ここでの微生物としては、既存のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉの三種類の微生物を用い、本実験は、これら三種類の微生物をそれぞれ単独で前記原液に含有させた場合と、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓの二種類の微生物を混合して前記原液に含有させた場合との合計四種類について行った。また、これら各原液中の微生物の総濃度であるが、波長６００ｎｍでの吸光度が１Ａｂｓとなるように調整した。
【００２８】
次に、１ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸溶液と２ｍｍｏｌ／ｌの重リン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）を混合してなるクエン酸バッファーを流量５ｍｌ／ｍｉｎで３５分間、カラム１３内に注入した。この際、クエン酸バッファーにおけるクエン酸溶液の混合割合を３５分間で６５％（ｐＨ４．２）から０％（ｐＨ８．５）に減少するように、直線的に変化させた。そして、クエン酸溶液の混合割合が０％（ｐＨ８．５）すなわち重リン酸ナトリウムが１００％となるクエン酸バッファーを流量５ｍｌ／ｍｉｎで３分間、カラム１３内に注入した。
【００２９】
同時に、カラム１３から流量５ｍｌ／ｍｉｎでクエン酸バッファーを排出し、回収装置２７により、クエン酸バッファーを試験管に一本ずつ各５ｍｌ注入した（以下、このときの試験管を「フラクション」と称する）。そして、回収した各フラクション内のバッファーについて、６００ｎｍの吸光度測定をし、必要であれば、ＦＩＳＨでターゲット微生物の定量を行った。
【００３０】
以上の実験結果は、図２及び図３のグラフに示される通りである。なお、これらグラフにおいて、Ｘ軸の「フラクションＮｏ．」に付されている番号は、回収時間順に付されており、Ｘ軸の左から右に向って、回収までの経過時間が次第に長くなるフラクションを意味する。
【００３１】
図２は、前記三種類の微生物をそれぞれ単独で前記原液に含有させた場合の各フラクションの吸光度変化を示している。また、図３は、前記二種類の微生物を混合して前記原液に含有させた場合の各フラクションの吸光度変化を示している。
【００３２】
図２によれば、カラム１３から流出した後の菌体濃度は、各微生物で固有のピークを持つことが分かる。このことは、クエン酸バッファーのｐＨを段階的に変化させたときでも同様である。以上から、未知の環境サンプルにおいても、様々な微生物固有のピークを持ち、当該ピークの相違に基づいて、ターゲットの微生物を濃縮、精製可能となることが十分に考えられる。
【００３３】
また、図３によれば、グラフ上、二箇所のピークが確認され、これらピークは、図２の結果を参酌すると、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来のものと思われる。そこで、各フラクションの中のそれぞれの微生物の割合をＦＩＳＨにより測定した。つまり、ここでは、特定の微生物をその遺伝子型に基づいて顕微鏡下で直接計数し、全体の微生物に対する割合を算出した。その結果を図４に示す。図４は、図３における符号ａ〜ｉのフラクションにおけるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓの各割合を示す図表である。この図表から、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓについて述べると、カラム１３に注入される前の原液中には、２２．４％存在していたが、図３中で一つ目のピークが得られるフラクションｂでは、２．５％まで減少し、同図中で二つ目のピーク付近のフラクションｇでは、５２．７％となっていることが確認できる。また、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓについて述べると、カラム１３に注入される前の原液中には、７７．６％存在していたが、前記フラクションｂでは、９７．５％と高濃度に濃縮されている。
【００３４】
従って、以上の結果から、複数の微生物種が混合された状態でも、ターゲットとなる微生物種を特異的に濃縮可能であることが実証された。このことは、緩衝液となるクエン酸バッファーのｐＨを段階的に変化させたときでも同様である。
【００３５】
なお、前記実施形態では、担体として負に帯電する物質を用いているが、濃縮、精製のターゲットとなる微生物によっては、担体１１として正に帯電する物質を用いることもでき、また、緩衝液のｐＨを経時的に下げるようにしてもよい。要するに、カラム１３内の担体１１として正又は負に帯電する物質を用い、カラム１３に注入される緩衝液のｐＨを経時的に変化させる限りにおいて、種々の構成を採ることができる。
【００３６】
その他、本発明における装置各部の構成は図示構成例に限定されるものではなく、実質的に同様の作用を奏する限りにおいて、種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本実施形態に係る濃縮精製装置の概略構成図。
【図２】三種類の微生物をそれぞれ単独で原液に含有させた場合における各フラクションの吸光度変化を示すグラフ。
【図３】二種類の微生物を混合して原液に含有させた場合における各フラクションの吸光度変化を示すグラフ。
【図４】図３における符号ａ〜ｉのフラクションにおける各微生物の割合を示す図表。
【符号の説明】
【００３８】
１０  濃縮精製装置
１１  担体
１５  緩衝液供給手段
１８  緩衝液回収手段
Ｓ  内部空間（流路）
【図１】
2009065915.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
2009065915.tif 000006