(57)【要約】      （修正有）【課題】肝細胞の繊維芽様細胞への変化に関与する新規遺伝子の提供および当該遺伝子にコードされるタンパク質の提供。【解決手段】特定配列を有する遺伝子が肝細胞の繊維芽様細胞への変化に伴って発現するタンパク質をコードしていることを見出したことで、肝細胞の繊維芽様細胞への変化に関与する新規遺伝子および当該遺伝子にコードされるタンパク質の提供を可能とした。新規遺伝子は全長が８３０１ｂｐであり、７８８７ｂｐの蛋白質翻訳領域を有し、該遺伝子から翻訳される蛋白質は２６２９個のアミノ酸から成る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３の塩基配列または当該塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１３の塩基配列または当該塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１４のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項５】
請求項１あるいは２に記載のポリヌクレオチドから翻訳されるタンパク質または請求項３あるいは４のポリペプチドからなるタンパク質。
【請求項６】
Ｂｌａｓｔ検索においてＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐｒｏｔｅｉｎと３８％の相同性、Ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎと２３％の相同性およびＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  （３ｄ／Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２と３０％の相同性を有する請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
ＳＯＳＵＩによる膜貫通領域の予測によって、膜２回貫通型のタンパク質であることが予測される請求項５または６に記載のタンパク質。
【請求項８】
魚類の肝細胞の繊維芽様細胞への変化に伴って発現する請求項５〜７のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項９】
魚類がサケ科魚類である請求項８に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肝臓由来の細胞（以下、肝細胞とする）の繊維芽様細胞への変化に関与する新規遺伝子に関する。また、当該遺伝子にコードされるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
養殖技術の発展に伴って、種苗生産や育種における魚病の診断、制御等を目的として、様々な魚類の遺伝子が単離されている。例えば、養殖サケ類の白子の入手を容易にすることを目的として、魚類の精子細胞の成熟を促進する魚類プロタミン遣伝子の転写調節因子をコードする遣伝子が単離されている（例えば、特許文献１参照）。魚類の成長促進を目的として、魚類成長ホルモン遺伝子の発現を増強する転写調節因子をコードする遺伝子が単離されている（例えば、特許文献２参照）。また、魚類免疫機構の解明および魚病の診断および制御に有用なガレクチン遺伝子が単離されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００３】
本発明者らは、ニジマスの肝細胞を培養し、その形態を観察したとところ、培養時間の経過に伴って繊維芽細胞様に形態が変化することを確認した。そこで、本発明者らはこの肝細胞の繊維芽様細胞への変化に関与する遺伝子を見出すために、培養に伴って発現量が増加する遺伝子の探索を行い、本発明の新規遺伝子を見出した。
本発明の新規遺伝子は７８８７ｂｐのタンパク質翻訳領域を含む全長８３０１ｂｐからなる遺伝子であり、魚類においてこのような長さの遺伝子が得られた例はない。従って、肝細胞の繊維芽様細胞への変化との関与も含めこの新規遺伝子の機能の解析等が望まれる。
〔先行文献〕
【特許文献１】特開平７−１０７９７８号公報
【特許文献２】特開平６−３０７７７号公報号公報
【特許文献３】特許第３２４３５２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、肝細胞の繊維芽様細胞への変化に関与する新規遺伝子の提供を課題とする。また、当該遺伝子にコードされるタンパク質の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、肝細胞の繊維芽様細胞への変化に伴って発現するタンパク質を調べ、このタンパク質をコードする遺伝子を単離してシークエンス等をすることで、肝細胞の繊維芽様細胞への変化に関与する新規遺伝子を見出し、本発明を完成するに至った。
本発明で得られた新規遺伝子は全長が８３０１ｂｐであり、１２８ｂｐの５’非翻訳領域、７８８７ｂｐのタンパク質翻訳領域、２８６ｂｐの３’非翻訳領域から構成されている。当該遺伝子から翻訳されるタンパク質は、２６２９個のアミノ酸から成り、推定分子量は２９０ｋＤａであり、当該タンパク質は肝細胞の繊維芽様細胞への変化に伴って発現することが確認された。
このタンパク質は、ＳＯＳＵＩによる膜貫通領域の予測によって、シグナルペプチド（１〜２４  Ｔｒｐ）を含む膜２回貫通型（４  Ａｌａ〜２４  Ｔｒｐ，５３５  Ｖａｌ〜５５７  Ｉｌｅ）のタンパク質であることが予測され、Ｂｌａｓｔ検索においてＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐｒｏｔｅｉｎと３８％、Ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎと２３％およびＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  （３ｄ／Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２と３０％というとても高い相同性があることが確認された。
【０００６】
すなわち、本発明は次の（１）〜（９）のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびタンパク質等に関する。
（１）配列番号１３の塩基配列または当該塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）配列番号１３の塩基配列または当該塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド。
（３）配列番号１４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（４）配列番号１４のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（５）上記（１）あるいは（２）に記載のポリヌクレオチドから翻訳されるタンパク質または上記（３）あるいは（４）のポリペプチドからなるタンパク質。
（６）Ｂｌａｓｔ検索においてＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐｒｏｔｅｉｎと３８％の相同性、Ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎと２３％の相同性およびＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  （３ｄ／Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２と３０％の相同性を有する上記（５）に記載のタンパク質。
（７）ＳＯＳＵＩによる膜貫通領域の予測によって、膜２回貫通型のタンパク質であることが予測される上記（５）または（６）に記載のタンパク質。
（８）魚類の肝細胞の繊維芽様細胞への変化に伴って発現する上記（５）〜（７）のいずれかに記載のタンパク質。
（９）魚類がサケ科魚類である上記（８）に記載のタンパク質。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の新規遺伝子は、肝細胞の繊維芽様細胞への変化に関与することから、肝臓障害マーカー遺伝子として利用できる可能性があると考えられる。また、この遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ等の有用な機能を有する複数の既知タンパク質と高い相同性があり、これらと同様の機能を有することが示唆される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の「ポリヌクレオチド」は、配列番号１３の塩基配列または配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドであればよく、これらの配列と９０％以上の相同性、好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ、配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと同一視できる性質を有するものも本発明のポリヌクレオチドに含まれるものとする。
【０００９】
本発明の「ポリペプチド」は、配列番号１３の塩基配列あるいは配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１４のアミノ酸配列からなるポリペプチドであればよい。
さらに本発明の「ポリペプチド」は、配列番号１３の塩基配列あるいは当該塩基配列と相補的な塩基配列から翻訳されるタンパク質または配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質と同様の機能を有し、配列番号１４のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸、例えば２６０個のアミノ酸若しくは１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【００１０】
本発明の「タンパク質」は、配列番号１３の塩基配列あるいは当該塩基配列と相補的な塩基配列から翻訳されるタンパク質または配列番号１４のアミノ酸配列あるいは配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質と同様の機能を有し、配列番号１４のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であればよい。
特にＢｌａｓｔ検索においてＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐｒｏｔｅｉｎと３８％の相同性、Ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎと２３％の相同性およびＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  （３ｄ／Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２と３０％の相同性を有するタンパク質であることが好ましい。また、ＳＯＳＵＩによる膜貫通領域の予測によって、シグナルペプチド（１〜２４  Ｔｒｐ）を含む膜２回貫通型（４  Ａｌａ〜２４  Ｔｒｐ，５３５  Ｖａｌ〜５５７  Ｉｌｅ）のタンパク質であることが予測されるタンパク質であることが好ましい。
【００１１】
本発明の「タンパク質」が、Ｂｌａｓｔ検索において３８％の相同性を示したＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐｒｏｔｅｉｎは、Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（Ｈｈ−Ｎ）とＡｕｔｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（Ｈｈ−Ｃ）という２つのｄｏｍａｉｎから構成されており、Ｈｈ−ＣはＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌを求核剤として用いて求核置換反応を行い、Ｈｈ−ＮのＣ末端にＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌを付加させＨｈ−Ｎを活性化させることが知られている。
本発明の新規遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列のＣ末端領域にＨｈ−Ｃと相同性があり、かつＨｈ−Ｃが機能するために必須のアミノ酸残基も保存されていることから、本発明の「タンパク質」はＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌを介した切断反応を起こし、タンパク自身の活性化あるいは細胞内へ何らかのシグナル伝達を行う機能を有している可能性が示唆される。
【００１２】
本発明の「タンパク質」が、Ｂｌａｓｔ検索において２３％の相同性を示したＣａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎは、主に病原細菌が産生する分泌タンパクで、カルシウムイオンが結合することで活性化し、赤血球に穴をあけ、溶血を引き起こすことが知られている。
本発明の新規遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列にはＣａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎのカルシウムイオンが結合するβ−ｒｏｌｌ構造の領域のアミノ酸配列と相同性があることから、本発明の「タンパク質」はカルシウムイオンによって活性化される可能性が示唆される。
【００１３】
本発明の「タンパク質」が、Ｂｌａｓｔ検索において３０％の相同性を示したＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  （３ｄ／Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２は、補体であるＣ３ｄやインターロイキンＩＩが結合することで、Ｔ細胞の増殖やＮＫ細胞の活性に関与することが知られている。
本発明の「タンパク質」はＣ３ｄやインターロイキンＩＩと結合し、免疫細胞の活性化を働きかけている可能性が示唆される。
【００１４】
本発明のタンパク質が「肝細胞の繊維芽様細胞への変化に伴って発現する」とは、肝細胞の初代培養開始時には発現がみられず、培養するにつれて発現が確認されるようになることをいう。本発明のタンパク質は、培養時間の経過によって発現量が徐々に増加するものであることが好ましい。
なお、本発明のタンパク質を繊維芽様細胞への変化に伴って発現する肝細胞は魚類由来であることが好ましく、特にニジマス等のサケ化魚類であることが好ましい。
【００１５】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
肝細胞の繊維芽様細胞への変化
＜ニジマス肝細胞初代培養＞
ニジマス（株式会社水祥矢部養魚場）から肝臓を摘出し、肝動脈にカテーテルを差し込み灌流法により肝細胞を取り出し、細胞数が約１０６となるようディッシュに播種して培養した。
即ち、４−アミノ安息香酸エチル（ＳＩＧＭＡ）で麻酔をかけたニジマスを開腹し、肝臓と幽門垂の一部を摘出し、肝動脈にカテーテルを差込んだ後にＣＦ  Ｒｉｎｇｅｒ（０．７％  ＮａＣｌ、０．０３５％  ＫＣｌ、０．０３％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１７％  ＫＨ２ＰＯ４、０．０２３Ｍ  ＮａＨＣＯ３）を流し込み、差込み部分をタコ糸で縛り、肝臓の脱血を行った。脱血後、コラゲナーゼ溶液［０．０４ｇ  コラゲナーゼ（和光純薬）、０．１ｇ  ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）／ＣＦ  Ｒｉｎｇｅｒ  １３０ｍＬ）を流し、結合組織を分解した。
その後、ＣＭＦ  Ｒｉｎｇｅｒ（０．７％  ＮａＣｌ、０．０３５％  ＫＣｌ、０．０１７％  ＫＨ２ＰＯ４、０．０２３Ｍ  ＮａＨＣＯ３、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を流し反応を停止させた後、肝臓以外の組織を取り除き、ＣＦ  Ｒｉｎｇｅｒで３回洗浄を行った。
【００１７】
次に、ハサミを用いてＣＦ  Ｒｉｎｇｅｒ中で肝臓を裁断後、ピペッティングでさらに細かくし、肝細胞液をメッシュで濾過した。濾過液を５００ｒｐｍで３分間遠心して上清を廃棄し、新しくＣＦ  Ｒｉｎｇｅｒを加え同様の操作をさらに２回行った後、適量のＣＦ  Ｒｉｎｇｅｒで懸濁し、３ｍＬのＭｅｄｉｕｍ［１．４７ｇ  Ｌ−１５ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ）、０．００７ｇ  ペニシリンＧカリウム（和光純薬）、０．０１ｇ  ストレプトマイシン硫酸塩（和光純薬）、１６６μＬ  １００μＭ  インスリン（ウシ膵臓由来  ナカライテスク）、０．２３８ｇ  ＨＥＰＥＳ（和光純薬）、１０ｍｌ  ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）／ＵＰＷ  １００ｍＬ  濾過滅菌して使用。］を添加したディッシュ（６０×１５ｍｍ  ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）に、約１０６の細胞数になるように肝細胞を撒き、１５℃で培養した。Ｍｅｄｉｕｍは２日おきに交換した。
図１にａ．培養開始時の細胞およびｂ．培養２１日後の細胞を示した。培養２１日後の細胞は、培養開始時の細胞と比べて繊維芽細胞のような形態を示しており、肝細胞が繊維芽様細胞へ変化していることが示された。
【実施例２】
【００１８】
肝細胞の繊維芽様細胞への変化に関与する遺伝子の単離
１．試料
上記１と同様の方法で取得し培養したニジマス肝細胞を用いた。
【００１９】
２．ニジマス肝細胞からのＲＮＡ抽出
ＲＮＡ抽出はＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。
培養したニジマス肝細胞０日目と８日目からＭｅｄｉｕｍを取り除いた後、７μＬの２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（和光純薬）を加えたＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  ７００μＬを加え、ピペッティングで細胞を剥離させ破砕した。
次に、破砕後の溶液に等量の７０％エタノール（ｖ／ｖ）を加えよくピペッティングし、この溶液７００μＬをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｃｏｌｕｍｎに入れ、常温  １００００ｒｐｍで１５秒間遠心した。
Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈを廃棄してこの操作を再度行った後、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＷ１を７００μＬ加え、常温  １００００ｒｐｍで１５秒間遠心した。そして、Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈを廃棄したＣｏｌｕｍｎにＤＮａｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ［ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ）中のＢｕｆｆｅｒ  ＲＤＤ  ７０μＬ＋ＤＮａｓｅＩ  １０μＬ］を加え常温で１５分間放置し、組織に混在するＤＮＡを分解した。
その後、ＣｏｌｕｍｎにＢｕｆｆｅｒ  ＲＷ１を５００μＬ加え、常温  １００００ｒｐｍで１５秒間遠心した。そして、Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈを廃棄してＣｏｌｕｍｎにＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥ  ５００μＬを加え、１００００ｒｐｍで１５秒間遠心した。Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈを廃棄して再度Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＰＥ  ５００μＬを加えて同様の操作を行った後、常温  Ｔｏｐ  ｓｐｅｅｄで２分間遠心してＣｏｌｕｍｎを完全に乾燥させた。
最後に、Ｃｏｌｕｍｎを新しいエッペンチューブにセットし、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  ５０μＬを加え１分間放置した後、常温  １００００ｒｐｍで１分間遠心し、ＲＮＡの溶出を行った。さらに、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを３０μＬ加え、同様の操作を行い、合計８０μＬのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液を得た。
【００２０】
３．発現遺伝子のサブトラクション
培養肝臓細胞０日目と８日目で著しく発現が変化している遺伝子を得るためにサブトラクション（ＳＳＨ：ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。なお、培養８日目で発現が強く促進している遺伝子を得るためにフォアードサブトラクションを、発現が強く抑制されている遺伝子を得るためにリバースサブトラクションを行った。
【００２１】
１）一本鎖ｃＤＮＡ合成（逆転写反応）
ｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡ  ２μｇに１０μＭ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１）１μＬを混ぜ、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒで１１μＬにした。この溶液を７０℃で１０分間加熱し、氷水で急冷した後、５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μＬ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  （１０ｍＭ  ｅａｃｈ）  １μＬ、４０Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １μＬを加えた。４２℃で２分間インキュベートした後にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μＬ加え、４２℃で９０分間インキュベートし、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００２２】
２）二本鎖ｃＤＮＡ合成
１本鎖ｃＤＮＡ  溶液２０μＬにＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ  ９１μＬ、５×Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３０μＬ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（１０ｍＭ  ｅａｃｈ）  ３μＬ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ（１０ｕｎｉｔｓ／μＬ）  ４μＬ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（１０ｕｎｉｔｓ／μＬ）  １μＬ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／μＬ）  １μＬを加え、１６℃で２時間反応させた。
反応後、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）を２μＬ加え、１６℃で５分間反応させた。次に、反応液に０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を１０μＬ加え反応を止めた後、等量のＰＣＩ溶液（ｐｈｅｎｏｌ：ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｈｏｌ＝２５：２４：１）を加えて、１８０００×ｇで遠心し、除タンパクを行った。上清をきれいな容器に移し、等量のクロロホルムを加え、遠心することによって、残留フェノールを除去した。その上清に１／１０倍量の３Ｍ  ＮａＯＡｃを添加し、２．５倍量のエタノールを加えよく混ぜて、−２０℃で３０分間保存した後、１８０００×ｇで２０分間遠心して、二本鎖ｃＤＮＡを沈殿させた。沈殿したｃＤＮＡを室温で１０分間程風乾させた後に、５０μＬのＤＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶解させた。
【００２３】
３）制限酵素処理
二本鎖ｃＤＮＡ  ４３．５μＬに１０×ＲｓａＩＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、ＲｓａＩ（１０ｕｎｉｔｓ／μＬ）を１．５μＬ添加した後、ピペットで混合し３７℃で一晩反応させた。反応液に０．２Ｍ  ＥＤＴＡを２．５μＬ加え反応を止めた後、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡの切断を確認した。等量（５０μＬ）のＰＣＩ溶液（ｐｈｅｎｏｌ：ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｈｏｌ＝２５：２４：１）を添加して激しく混ぜ、１８０００×ｇで遠心し、除タンパクを行った。上清をきれいな容器に移し、等量のクロロホルムを加え、遠心することによって残留フェノールを除去した。その上清に１／１０倍量の３Ｍ  ＮａＯＡｃを添加し、２．５倍量のエタノールを添加し、−２０℃で３０分間保存した後１８０００×ｇで２０分遠心してＲｓａＩ消化二本鎖ｃＤＮＡを沈殿させた。このｃＤＮＡを５．５μＬのＤＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶解させた後、Ａｄａｐｔｏｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎをおこなった。
【００２４】
４）Ａｄａｐｔｏｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ
サブトラクションはＣｌｏｎｔｅｃｈ  ＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて行った。なお、Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎの両方を行い、培養肝臓細胞の培養日数の増加により遺伝子発現が促進されているものと抑制されている遺伝子をスクリーニングした。そのために、１μＬのＲｓａＩ消化ｃＤＮＡを５μＬの滅菌超純水で希釈し、この希釈ｃＤＮＡ  ２μＬとＡｄａｐｔｏｒ  １  （上：配列番号２、下：配列番号３）（１０μＭ）  ２μＬ、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（５×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（４００ｕｎｉｔｓ／μＬ）  １μＬ、滅菌超純水  ３μＬ）６μＬを混合し、このサンプルをＴｅｓｔｅｒ１−１とした。
同様に、希釈したｃＤＮＡ  ２μＬとＡｄａｐｔｏｒ  ２Ｒ  （上：配列番号４、下：配列番号５）（１０μＭ）  ２μＬ、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ６μＬを混合し、このサンプルをＴｅｓｔｅｒ１−２とした。この溶液を１６℃で一晩反応させた後、１μＬの０．２Ｍ  ＥＤＴＡで反応を止め、７２℃  ５分の加熱でＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを失活させた。なお、Ａｄａｐｔｏｒの付加を行っていないｃＤＮＡはＤｒｉｖｅｒ  ｃＤＮＡとなった。
【００２５】
５）Ｆｉｒｓｔ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
Ｄｒｉｖｅｒ  ｃＤＮＡ  １．５μＬ、Ｔｅｓｔｅｒ１−１  １．５μＬ、４×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １．０μＬを混合する。これをＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓａｍｐｌｅ  １とし、同様にＤｒｉｖｅｒ  ｃＤＮＡ  １．５μＬ、Ｔｅｓｔｅｒ１−２  １．５μＬ、４×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １．０μＬを混合し、これをＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓａｍｐｌｅ  ２とした。これらを９８℃で２分間の加熱によって一本鎖にした後、６８℃で８時間インキュベートし、相補鎖をハイブリダイゼーションさせた。
【００２６】
６）Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
Ｄｒｉｖｅｒ  ｃＤＮＡ  １μＬ、４×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １．０μＬ、滅菌超純水  ２μＬを加え混合した後、ここから１μＬを取り、９８℃  １．５分間加熱した。この溶液と、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓａｍｐｌｅ  １、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓａｍｐｌｅ  ２をよく混合し、６８℃で一晩のインキュベートを行った。反応後、この溶液に２００μＬのＤｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを加え希釈し、６８℃  ７分間インキュベートの後、ＰＣＲの鋳型として用いた。
【００２７】
７）Ｆｉｒｓｔ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
上述のサンプル１μＬにＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ）０．１２５μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２μＬ、ＭｇＣｌ２  ２μＬ、ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ  １（配列番号６）（１０μＭ）１μＬ、滅菌超純水  １６．５μＬを混合し、ＰＣＲ装置（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、７５℃  ５分間の反応でアダプターサイトの伸張を行った。その後すぐに、９４℃  ３０秒のホットスタートを行い、９４℃  ２０秒、６６℃  ３０秒、７２℃  １．５分の反応を３２サイクル行った。
【００２８】
８）Ｓｅｃｏｎｄ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｆｉｒｓｔ  ＰＣＲ産物  ３μＬと滅菌超純水  ２７μＬを混ぜた溶液の１μＬをＳｅｃｏｎｄ  ＰＣＲの鋳型とした。これに０．１２５μＬのＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ）、１０×ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２μＬ、ＭｇＣｌ２  ２μＬ、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ  １（配列番号７）（１０μＭ）  １μＬ、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ  ２Ｒ（配列番号８）（１０μＭ）  １μＬ、滅菌超純水  １５．５μＬを加え９４℃  ２０秒、６８℃  ３０秒、７２℃  １．５分の反応を１５サイクル行った。
【００２９】
９）ＴＡクローニング
サブトラクションのＳｅｃｏｎｄ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ産物を１．４１μＬ、ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を０．５μＬ、１０ｎｇ／μＬのｖｅｃｔｏｒ  ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ  ４．０ｋｂｐ（ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））０．３４μＬを混合し、室温で１５分程度放置し、ベクターにクローニングした。ベクターに入れた後に、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、５０μＬのＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ＴＯＰ１０にエレクトロポレーションにてトランスフォーメーションした。なお、アンピシリン（Ａｐ）が５０μｇ／ｍＬ、Ｘ−ｇａｌが２０μｇ／ｍＬ、ＩＰＴＧが１０μＭの濃度入っている平板培地を用いてＢｌｕｅ／Ｗｈｉｔｅセレクションを行い、遺伝子が組み込まれた白いコロニーの菌体を選抜し、液体培養によって培養してＰｌａｓｍｉｄを抽出した。これらの全Ｐｌａｓｍｉｄの塩基配列を決定した後、同じクローン数の多い遺伝子からＮｏｒｔｈｅｒｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った。以下、詳細を４．〜１０．に示した。
【００３０】
４．ＰＣＲ
ＰＣＲはＩｎｓｅｒｔ  ｃｈｅｃｋ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎのＰｒｏｂｅ作製、組換えＰｌａｓｍｉｄの構築など、実験項目に応じて使用する酵素を使い分けた。Ａｎｎｅａｌｉｎｇ温度（Ｘ℃）は、ＰｒｉｍｅｒのＴｍ値（ＡとＴは２℃、ＧとＣは４℃として計算）を参考にして決定した。
【００３１】
１）Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
０．１２５μＬ（１．２５Ｕ）のＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２．５μＬの１０×Ｂｕｆｆｅｒ、２μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬの１０μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ、１μＬの１０μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ、１μＬ  のＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ、ＤＷで合計２５μＬにして、９４℃で１分間反応させ（１サイクル）、９４℃で３０秒間反応、Ｘ℃で３０秒間反応、７４℃で１分間／ｋｂ反応後（３０〜３５サイクル）、氷冷するという反応条件でＰＣＲを行った。尚、このＰＣＲに使用するＴａｑポリメラーゼは目的に応じて以下の２）〜６）の酵素を適宜使用した。
【００３２】
２）Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）
０．１２５μＬ（１．２５Ｕ）のＥｘ  Ｔａｑ、  ２．５μＬの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、  ２μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、  １μＬ  の１０μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ、  １μＬの１０μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ、  １μＬ  のＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ、  ＤＷで合計２５μＬにして、９４℃で１分間反応させ（１サイクル）、９４℃で３０秒間、Ｘ℃で３０秒間、７２℃で１分間／ｋｂ反応後（３０〜３５サイクル）、氷冷するという反応条件でＰＣＲを行った。
【００３３】
３）ＬＡ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）
０．２５μＬ（２．５Ｕ）のＬＡ  Ｔａｑ、  １２．５μＬの  ２×ＧＣ  ＢｕｆｆｅｒＩ（またはＩＩ）、  ４μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、  ０．５μＬの１０μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ、  ０．５μＬの１０μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ、  ０．５μＬ  のＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ、  ＤＷで合計２５μＬにして、９４℃で１分反応させ（１サイクル）、９４℃で３０秒間、Ｘ℃で３０秒間、７２℃で１分間／ｋｂ反応させ（３０サイクル）、７２℃で５分間反応後（１サイクル）、氷冷するという反応条件でＰＣＲを行った。
【００３４】
４）Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（ＴＯＹＯＢＯ）
０．１２５μＬ（１．２５Ｕ）のＢｌｅｎｄ  Ｔａｑ、  ２．５μＬの１０×Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ、  ２μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、  １μＬ  の１０μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ、  １μＬの１０μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ、  ０．５μＬのＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ、  ＤＷで合計２５μＬにして、９４℃で２分間反応させ（１サイクル）、９４℃で３０秒間、Ｘ℃で３０秒間、７２℃で１分間／ｋｂ反応後（３０サイクル）、氷冷するという反応条件でＰＣＲを行った。
【００３５】
５）ＫＯＤ  ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）
０．５μＬ（０．５Ｕ）のＫＯＤ  ＦＸ、１２．５μＬの２×Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸ、４μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．７５μＬ  の１０μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ、０．７５μＬの１０μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ、１μＬ  のＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ、ＤＷで合計２５μＬにして、９４℃で２分間反応させ（１サイクル）、９８℃で１０秒間、６８℃で１分間／ｋｂ反応後（３０サイクル）、氷冷するという反応条件でＰＣＲを行った。
【００３６】
６）ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）
０．５μＬ（０．５Ｕ）のＫＯＤ  Ｐｌｕｓ、２．５μＬの１０×Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ、２μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．７５μＬ  の１０μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ、０．７５μＬの１０μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ、１μＬ  のＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ、ＤＷで合計２５μＬにして、９４℃で２分間反応させ（１サイクル）、９４℃で１５秒間、６８℃で１分間／ｋｂ反応後（３０サイクル）、氷冷するという反応条件でＰＣＲを行った。
【００３７】
５．本遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる全長クローニング
１）３’−ＲＡＣＥ
＜逆転写反応＞
１〜５μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡに、２５μＭ  Ｔ１７ＡＤＰ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号９）１μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を加え合計１１μＬにして、７２℃で２分間、６５℃で５分間反応後、５分間氷冷した。
氷冷後、５×ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μＬ、ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ  １μＬ（２０Ｕ  和光純薬）、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（１００Ｕ  ＴＯＹＯＢＯ）１μＬ、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００Ｕ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  １μＬで合計２０μＬとし、４２℃で５０分間、６０℃で２分間、７０℃で１５分間反応後氷冷し、これをＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）とした。
サーマルサイクラーはＡＭＰＬＩＴＲＯＮＩＩを用い、４２℃から６０℃に上げる際、Ｇｒａｄｉｅｎｔを０．１℃／ｓに設定した。
【００３８】
＜ＰＣＲ＞
ＰＣＲは上記４．３）ＬＡ  Ｔａｑのプロトコールに従い、Ｐｒｉｍｅｒは１０μＭ  ＡＤＰ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１０）１μＬ、１０μＭ  Ｇｅｎｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ  １μＬを用いて行った。ＰＣＲ産物は０．８〜１．２％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００３９】
２）５’−ＲＡＣＥ
＜逆転写反応＞
（ａ）通常反応における逆転写反応はＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した。
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １〜５μｇに、１０μＭ  Ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  １μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを加えて合計１１μＬとし、７０℃で１０分間反応させ、５分間氷冷した。
氷冷後、５×Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２μＬ、Ｐｏｗｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １μＬを加え合計２０μＬにして、４２℃で９０分間反応させた。
次に、ＲＮａｓｅ  Ｈ（２Ｕ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μＬ加え３７℃で１０分間反応させ、逆転写した１本鎖ｃＤＮＡとした。
【００４０】
（ｂ）高次構造を有するＲＮＡの逆転写反応にはＴｈｅｒｏｓｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １〜５μｇに、１０μＭ  Ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  １μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを加えて合計１３μＬとし、６５℃で５分間反応させ、５分間氷冷した。氷冷後、５×ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  １μＬ、ＲＮａｓｅ  ＯＵＴ（４０Ｕ）１μＬ、Ｔｈｅｒｏｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（１５Ｕ）１μＬを加え合計２０μＬにして、５０〜６５℃で６０分間反応させた。
次に、８５℃で５分間反応させ酵素を失活させた後、ＲＮａｓｅ  Ｈを１μＬ（２Ｕ）加え３７℃で１０分間反応させ、逆転写した１本鎖ｃＤＮＡとした。
【００４１】
＜ｃＤＮＡ精製（ＰＣＩ・クロロホルム抽出、エタノール沈殿）＞
逆転写産物にＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、合計５０μＬとし、等量のＰＣＩ〔ＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）２５：クロロホルム（和光純薬）２４：イソアミルアルコール（和光純薬）１〕を加えｖｏｒｔｅｘ後、常温  １４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。
残ったＰＣＩ層に再度ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０μＬを加えｖｏｒｔｅｘ後、常温  １４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、全体で約１００μＬの上清を回収した。
その上清に等量のクロロホルムを加えｖｏｒｔｅｘ後、常温  １４０００  ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。残ったクロロホルム層に再度ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  １００μＬを加えｖｏｒｔｅｘ後、常温  １４０００  ｒｐｍで１０分間遠心し、全体で約２００μＬの上清を回収した。
【００４２】
この上清に１／１０量の３Ｍ  酢酸ナトリウム（ナカライテスク）、グリコーゲン（２０ｍｇ／ｍＬ  ＳＩＧＭＡ）１μＬ、２．５倍量の１００％エタノール（ナカライテスク）を加え、−８０℃で１５分以上静置した後、４℃  １４０００ｒｐｍで２５分間遠心してエタノールを取り除いた。
次に、７０％エタノールを１００μＬ加え、４℃  １４０００ｒｐｍで５分間遠心を行い、エタノールを完全に取り除きペレットを風乾させた。風乾後、  １５μＬのＤＷに溶かし、これをＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）とした。ＲＴ−ＰＣＲの場合はこの溶液をＴｅｍｐｌａｔｅとしてＰＣＲを行ったが、５’−ＲＡＣＥの場合はＴｄＴ反応を行った後ＰＣＲを行った。
【００４３】
＜ＴｄＴ反応＞
ＰＣＩ・クロロホルム抽出、エタノール沈殿後のサンプル１５μＬを９０℃で１分間熱変性を行い、３分間氷冷後、５×ＴｄＴ  ｂｕｆｆｅｒ  １０μＬ、１ｍＭ  ｄＣＴＰ  １０μＬ、Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（１０Ｕ  ＴｄＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．６μＬ、ＤＷを加え合計５０μＬにして３７℃で６０分間反応させ、ｃＤＮＡの５’端にｄＣＴＰを付加させた。
この溶液をＰＣＩ・クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製して、その沈殿物を１５μＬのＤＷに溶かし、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）とした。
【００４４】
＜ＰＣＲ＞
ＰＣＲは３−３）ＬＡ  Ｔａｑのプロトコールに従い、Ｐｒｉｍｅｒは１０μＭ  Ａｂｒｉｄｇｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１１）０．５μＬ、または１０μＭ  ＡＵＡＰ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１２）０．５μＬと１０μＭ  Ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ０．５μＬを用いて行った。ＰＣＲ産物は０．８％〜１．２％  アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００４５】
６．ＤＮＡ溶液の精製
ＰＣＲで得られた複数のバンドから目的のバンドを抽出する際はＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。又、制限酵素処理後のｄＮＴＰおよびオリゴヌクレオチドの除去にはＳＵＰＲＥＣ−０２（ＴａＫａＲａ）を用いた。
【００４６】
１）ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ゲル抽出による精製）
ＳＥＡＫＥＭ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）で作製した０．８％〜１．２％アガロースゲルを５０Ｖで電気泳動した後、ＵＶを照射し検出されたバンドを切り出した。
次に、切り出したゲル１０ｍｇに対しＣａｐｔｕｒｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １０μＬを入れ、６０℃でゲルを溶解した。この溶解液をＧＦＸ  Ｃｏｌｕｍｎに移し１分間放置した後、常温  １６０００×ｇで３０秒間遠心した。Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈを廃棄し、ＧＦＸ  ＣｏｌｕｍｎにＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  ５００μＬを加え、常温  １６０００×ｇで３０秒間遠心後、再度Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈを廃棄した。そして、ＧＦＸ  Ｃｏｌｕｍｎを新しいエッペンチューブに移し、ＤＷ  ５０μＬを入れ１分間放置後、常温  １６０００×ｇで１分間遠心した。さらに、ＤＷ  ３０μＬを入れ３分間放置後、常温  １６０００×ｇで１分間遠心し、  合計８０μＬのＤＮＡ溶液を回収した。
【００４７】
７．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
１）通常サイズ（２Ｋｂｐまで）の遺伝子のクローンニング
ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｄｕａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングを行った。
ＰＣＲ産物または上記６．１）のプロトコールに従いゲル抽出したＤＮＡ溶液にアデニン（Ａ）を付加させたサンプル（ＤＮＡ溶液７．９μＬ、１ｍＭ  ｄＡＴＰ  １μＬ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  １μＬ、Ｅｘ  Ｔａｑ  ０．１μＬを加え合計１０μＬにして、７２℃で２０分間反応）１．４１μＬに希釈Ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）０．５μＬ、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ  ０．３４μＬを加え、室温で５分間ライゲーション後氷冷した。５０μＬのＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ＴＯＰ１０にライゲーションしたサンプル２μＬを加え、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてＥｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ（１．７〜１．８ｋｖ  ３ｍ  ｓｅｃ前後）を行った。
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ後のサンプルに５倍量の抗生物質フリーのＬＢ液体培地を加え、４５〜６０分間３７℃で振盪培養後、抗生物質（アンピシリン、またはカナマイシン  終濃度５０ｐｐｍ）、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ入りのＬＢ寒天培地に菌を播き、３７℃で一晩培養した。
【００４８】
２）２Ｋｂｐ以上の遺伝子のクローンニング
ＴＯＰＯ  ＸＬ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングを行った。
１×ＴＡＥ  ５０ｍＬにＳＥＡＫＥＭ  Ａｇａｒｏｓｅ  ０．４ｇを溶解させた後、Ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ（２ｍｇ／ｍＬ）を２０〜４０μＬ入れたアガロースゲルを作製し、サンプルに６×Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを１×になる量を加え、電気泳動を行い、上記６．１）のプロトコールに従いゲル抽出したサンプルに上記７．１）同様、アデニンを付加させた。このサンプル４μＬにＴＯＰＯ  ＸＬ  ｖｅｃｔｏｒ  １μＬを加え、室温で５分間ライゲーション反応を行った後、６×ＴＯＰＯ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０６Ｍ  ＭｇＣｌ２）１μＬを混ぜ、氷冷した。
ライゲーションしたサンプル２μＬを５０μＬのＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ＴＯＰ１０に加え、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎを行った。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ後のサンプルに５倍量の抗生物質フリーのＬＢ液体培地を加え、４５〜６０分間３７℃で振盪培養後、抗生物質（カナマイシン  終濃度５０ｐｐｍ）、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ入りのＬＢ寒天培地に菌を播き、３７℃で一晩培養した。
【００４９】
８．Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地
１）ＬＢ寒天培地
終濃度１％  ＮａＣｌ、１％  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．５％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＯＸＯＩＤ）、１．５％  粉末寒天（関東化学）となるようＵＰＷに溶かし、１．２気圧  １２１℃  ２０分間のオートクレーブを行った後、必要に応じて抗生物質〔アンピシリン（和光純薬）、  カナマイシン（和光純薬）、  カルベニシリン（ナカライテスク）、または、テトラサイクリン（和光純薬）など〕を無菌操作で終濃度が１２．５〜１００ｐｐｍとなるように加えよく混合し、滅菌シャーレ（ＩＷＡＫＩ）に適当量分注して平板培地を作製した。Ｂｌｕｅ／Ｗｈｉｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎを行う場合は抗生物質に加え、Ｘ−ｇａｌ（和光純薬）、ＩＰＴＧ（和光純薬）それぞれの終濃度を２０μｇ／ｍＬ、１０μＭとしたものを滅菌シャーレに分注した。余熱が冷めたら、培地を逆さにして４℃で保存した。
【００５０】
２）ＬＢ液体培地
終濃度１％  ＮａＣｌ、１％  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％  Ｙｅａｓｔ  ＥｘｔｒａｃｔとなるようＵＰＷに溶かし、オートクレーブを行った後、適当な抗生物質を終濃度が１２．５〜１００ｐｐｍとなるように加え、−２０℃以下で保存した。
【００５１】
９．トランスフォーメーションした菌体からのＰｌａｓｍｉｄ抽出
Ｉｎｖｉｓｏｒｂ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｅｋ）を用いてＰｌａｓｍｉｄを抽出した。まず、３ｍＬのＬＢ液体培地で一晩振盪培養した培養液を常温  １４０００ｒｐｍで１分間遠心し菌体を回収した。その菌体に２００μＬの氷冷Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを入れて懸濁し、２００μＬのＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて５回転倒混和させて氷中に置いた。
次に、２００μＬの氷冷Ｎｅｕｔｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて５回転倒混和させた後、常温  １４０００  ｒｐｍで５分間遠心し上清を回収した。この上清にＲＮａｓｅ  Ａ（２０ｍｇ／ｍＬ）２μＬを加え３７℃で１０分間放置し、ＲＮＡの除去を行った。その後、２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えよく混和させた後Ｓｐｉｎ  Ｆｉｌｔｅｒに移し、常温  ８０００  ｒｐｍで１分間遠心した。Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈを廃棄し、Ｓｐｉｎ  Ｆｉｌｔｅｒに７５０μＬのＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＰＬを加え、常温  ８０００  ｒｐｍで１分間遠心後、再度Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈを廃棄し、１４０００  ｒｐｍで３分間遠心してＳｐｉｎ  Ｆｉｌｔｅｒを乾燥させた。
最後に、Ｓｐｉｎ  Ｆｉｌｔｅｒを新しいエッペンチューブに移し、５０μＬ〜１００μＬのＥｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを加え２分間放置した後、常温  ８０００ｒｐｍで１分間遠心し、Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ溶液を得た。
【００５２】
１０．プラスミドＤＮＡのｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ＢＩＧ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｅｒ  ３．１  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて遺伝子の塩基配列の決定を行った。反応は、５×Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １．５μＬ、Ｐｒｅｍｉｘ  １μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  １．６ｐｍｏｌ、Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  １２５〜２５０ｎｇ、ＤＷで合計１０μＬにして、９６℃で２分間反応させ（１サイクル）、９６℃で１０分間、５０℃で５秒間、６０℃で２分間反応後（２５サイクル）、氷冷するという反応条件でＰＣＲを行った。
反応後、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、１μＬのグリコーゲン、１／１０量の１２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５倍量の１００％エタノールを入れ、−８０℃で１５分以上静置した後、４℃  １４０００ｒｐｍで２５分間遠心してエタノールを取り除き、７０％エタノールを５０μＬ加え、４℃  １４０００ｒｐｍで５分間遠心を行い、エタノールを取り除きペレットを風乾させた。風乾後、１５μＬのＴＳＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に溶解させ、９５℃で２分間熱変性させた後氷冷し、シークエンサー（ＡＢＩ３１００  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にセットして塩基配列の解析を行った。
【００５３】
塩基配列の解析の結果、タンパク質翻訳領域（ＯＲＦ）７８８７ｂｐを含む、全体で８３０１ｂｐの塩基配列を得ることができた。この遺伝子のＯＲＦの塩基配列をアミノ酸に変換すると２６２９個のアミノ酸で、推定分子量は２９０ｋＤａになることが判った。得られた塩基配列を配列番号１３、この塩基配列から翻訳されたアミノ酸配列を配列番号１４に示した。
【００５４】
１１．Ｂｌａｓｔ検索
ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）の相同性検索プログラム  ＢｌａｓｔｎまたはＢｌａｓｔｐを使用して、得られた塩基配列およびをアミノ酸に変換し、相同性検索を行った。その結果、この遺伝子は、Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐｒｏｔｅｉｎと３８％、Ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎと２３％およびＨｕｍａｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ２、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒと３０％のとても高い相同性があることが確認された。また、ＳＯＳＵＩによる膜貫通領域の予測を行った結果、４番目のＡｌａから２４番目のＴｒｐまでと、５３５番目のＶａｌから５５７番目のＩｌｅまでのシグナルペプチド（１〜２４  Ｔｒｐ）を含む膜２回貫通型のタンパク質であることが予測された。図２にＢｌａｓｔ検索によって予測された本発明のタンパク質の構造を示した。
【００５５】
１２．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｏｕｔｈｅｒｎ
新規遺伝子がＧｅｎｏｍｅ上に存在する遺伝子であるか否かをニジマスの肝臓から抽出したＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを用いて調べた。
１）Ｇｅｎｏｍｅ抽出
Ｇｅｎｏｍｅ抽出は、組織をＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ処理することで抽出した。まず、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  Ｂｕｆｆｅｒ［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ナカライテスク）］７５０μＬに３０ｍｇの組織を入れ、３７℃で１晩振盪し、組織の分解を行った。
翌日、ＲＮａｓｅ  Ａ（２０ｍｇ／ｍＬ）２μＬを加え、３７℃で１時間振盪後、等量のＰＣＩを加えて転倒混和し、常温  １５０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収した。
そして、その上清に対して１／１０量の３Ｍ  酢酸ナトリウム、等量の２−ｐｒｏｐａｎｏｌ（ナカライテスク）を加え、常温  １５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を廃棄し、７０％エタノール  １００μＬを加え、常温  １５０００ｒｐｍで５分間遠心を行い、エタノール除去を行い風乾後、ＤＷに溶かしてＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ溶液とした。
【００５６】
２）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎはＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  ＫｉｔＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。
＜制限酵素処理＞
制限酵素処理は、Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  １０μｇ、１０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｋ、Ｍ、Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）３μＬ、制限酵素５μＬ［ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ）］、ＤＷで合計３０μＬにして、３７℃で一晩反応させた。
翌日、サンプル２μＬを０．８％アガロースゲル電気泳動により、Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡが断片化されていることを確認し、残りのサンプルに制限酵素２μＬを加え３７℃でさらに２時間反応させたものをメンブレンへの転写用サンプルとした。
【００５７】
＜メンブレンへの転写＞
制限酵素処理したＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを０．８％アガロースゲルで、１５Ｖ  ２０時間電気泳動した。電気泳動を行ったアガロースゲルを、脱プリン溶液（０．２５Ｍ  ＨＣｌ）で１５分間振盪させ、ＵＰＷで５分洗浄を３回繰り返した後、変性溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ）で２０分間振盪させた。
再度ＵＰＷで５分洗浄を３回繰り返した後、中和溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５）で１５分間振盪を２回行い、２０×ＳＳＣ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム・二水和物）で２０分間振盪させた。
次に、２０×ＳＳＣを入れたバットにガラス板を置き、２０×ＳＳＣに浸るように濾紙をセットし、ゲルを裏返しにしてのせ、その上にナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、濾紙、ペーパータオルを順に重ね、最後に約１ｋｇの重りを置いて一晩かけてメンブレンに核酸を転写した。翌日、転写したメンブレンを０．１Ｍ  ＮａＯＨで５分間洗浄し、２×ＳＳＣで５分間中和を２回行った後、メンブレンを１２０℃で３０分間乾燥させ、ハイブリパックに入れて使用するまで４℃で保存した。
【００５８】
＜ＤＩＧ（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｏｂｅの作製＞
Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎで使用するＰｒｏｂｅは、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて作製した。
５μＬのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｂｕｆｆｅｒ  １０×ｃｏｎｃ．  Ｗｉｔｈ  １５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５μＬのＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ，１０×ｃｏｎｃ．、１．５μＬの１０μＭ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｐｒｉｍｅｒおよびｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｉｍｅｒ、２５０ｎｇのｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ、０．７５μＬ（２．６Ｕ）のＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ、ＤＷで合計５０μＬとして、９４℃で２分間反応させ（１サイクル）、９４℃で１５秒間、４５〜６８℃で３０秒間、７２℃で４５秒間反応させ（２０サイクル）、７２℃で７分間反応後、氷冷するという反応条件でＰＣＲを行い、ＤＩＧ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｏｂｅを作製した。
【００５９】
＜ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液の調製＞
２回滅菌したＤＷ６４ｍＬを２回に分けてＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ  Ｇｒａｎｕｌｅｓに加え、  ３７℃で振盪させながら完全に溶解させた。
【００６０】
＜Ｐｒｅ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ＞
予め５５℃に加温したＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液をメンブレンの入ったハイブリパックに加え、５５℃で３０分間  Ｐｒｅ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った後、ＤＩＧ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｏｂｅ（２μＬ／ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液１ｍＬ）を５分間ボイル後、５分間氷冷を行った。
次に、６５〜６８℃に加温させておいたＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液にＤＩＧ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｏｂｅを加え、Ｐｒｅ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ液を廃棄し、準備したＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液を加え、５５℃で一晩Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った。
【００６１】
＜メンブレンの洗浄とシグナルの検出＞
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ後のメンブレンを、２×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳで常温  ５分間振盪を２回行い、０．５×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳで６５〜６８℃  １５分間振盪を２回行った後、洗浄用Ｂｕｆｆｅｒ［０．１Ｍ  マレイン酸（和光純薬）、  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（和光純薬）、ｐＨ７．５］で常温  ５分間振盪させた。
次に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ［１０×ｃｏｎｃ．をマレイン酸Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  マレイン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で１×にして使用］で常温  ３０分間振盪を２回行い、Ａｎｔｉ  ｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｎｔｉ  ＤＩＧ−ＡＰ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １μＬ／１０ｍＬ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で常温  ３０分間振盪させた後、洗浄用Ｂｕｆｆｅｒで常温  １５分間振盪を４回行った。
そして、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５）で常温  ５分間振盪させ、発色剤（ＣＳＰＤ）をメンブレンに広げ、ハイブリパックで密封し遮光して３７℃で１０分間放置した。
最後に、それをＨｙｐｅｒｃａｓｓｅｔｔｅに入れ、暗室でＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬをセットして感光させた。現像は、現像液（Ｒｅｎｄｏｌ）、停止液（０．１％酢酸）、水道水、  定着液（Ｒｅｎｆｉｘ）の順に行った後、水洗した。
【００６２】
次に、この遺伝子をＰｒｏｂｅとして、ニジマスの肝臓から抽出したＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを用いてＧｅｎｏｍｉｃ  ｓｏｕｔｈｅｒｎを行った。その結果、ニジマスのＧｅｎｏｍｅに対してシグナルが検出されたことから、この新規遺伝子はニジマスのＧｅｎｏｍｅに存在していることが示された。
【実施例３】
【００６３】
肝細胞の繊維芽様細胞への変化における新規遺伝子の発現
実施例１と同様の方法で培養した細胞からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを回収し、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行い、培養したニジマス肝細胞における新規遺伝子の発現解析を行った。
【００６４】
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
一連の操作で使用する器具は全てＲＮａｓｅ  Ａｗａｙで拭き、試薬の調製には洗浄で使用するもの以外はＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ（０．５ｍＬ  Ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ／ＵＰＷ１Ｌ  よく撹拌し一晩放置後、オートクレーブ）を用いた。
１．１．２％変性ゲルの作成
ゲル作成は１００ｍＬのメジュウム瓶に、Ａｇａｒｏｓｅ  ０．９４ｇ、  ＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ  ４８ｍＬ、５×Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ  ＭＯＰＳ、０．０５Ｍ  ＮａＯＡｃ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）１５ｍＬを加えＡｇａｒｏｓｅを完全に溶かし、６０℃以下になったらＦｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  １５．８ｍＬを加えよく攪拌後、電気泳動用のゲル作成ケースに注いだ。
【００６５】
２．泳動サンプルの調製、電気泳動
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ１０μｇをエタノール沈殿でペレットにし、ＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ  ５μＬで溶かした後、５×Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  １．３μＬ、Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ２．３μＬ、Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ  ６．７μＬを加えピペッティングし、６５℃で１０分間反応させた。次に、１００％グリセリン  １．３μＬを泳動サンプルに加え、ゲルにアプライした。最後に、別のレーンにＲＮＡ  ｍａｒｋｅｒ（２μｇ  Ｎｏｖａｇｅｎ）をアプライし、１×Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで５０Ｖ  ５時間電気泳動を行った。
【００６６】
３．メンブレンへの転写
電気泳動後、ゲルを１×Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ＋５０ｍＭ  ＮａＯＨ、４０ｎｇ  エチジウムブロマイドに入れ２０分間振盪させ、中和・脱色溶液（２００ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ４．０）で１０分間振盪を２回行った。次に、ＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒで５分間洗浄を３回繰り返した後、イメージアナライザーで泳動結果を確認した。その後、２０×ＳＳＣで１０分間振盪を２回行い、２０×ＳＳＣを入れたバットにガラス板を置き、２０×ＳＳＣに浸るよう濾紙をセットし、ゲルを裏返しにしてのせ、その上にナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、濾紙、ペーパータオルを順に重ね、最後に約１ｋｇの重りを置いて一晩かけてメンブレンに核酸を転写した。
翌日、転写したメンブレンを０．１Ｍ  ＮａＯＨで５分間アルカリ固定を行った後、２×ＳＳＣで５分間中和を２回行った。最後に、メンブレンは８０℃で２時間乾燥させ、ハイブリパックに入れて使用するまで４℃で保存した。
【００６７】
４．ＤＩＧ−ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＲＮＡ  ｐｒｏｂｅの合成
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎに用いるＰｒｏｂｅにはＡｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ＲＮＡを用いた。このＲＮＡ合成のＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡは、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列を付加させたプライマーでＰＣＲを行い、上記実施例２のプロトコールに従い精製したものを用いた。
２μＬの１０×Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、２μＬの５０ｍＭ  ＤＴＴ、２μＬのＤＩＧ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ  １０×ｃｏｎｃ．（Ｒｏｃｈｅ）、１μＬ  のＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０Ｕ）、１μｇのＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ、１μＬのＴ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５０Ｕ  Ｔａｋａｒａ）、ＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒで合計２０μＬにして、４２℃で２時間反応させた。
反応後、合成産物を１μＬ取り、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅＩ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）１μＬ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １μＬを加え、３７℃で１０分間反応させた。そして、ＤＮａｓｅ処理前と処理後のサンプルおよび、基質をＮＴＰにしてＲＮＡ合成したサンプルの電気泳動を行い、ＲＮＡ合成の成否、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡの分解、ＤＩＧの取り込み（基質をＮＴＰで合成したＲＮＡよりも分子量が大きくなる）がされていることを確認し、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎに用いた。
また、ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎのＰｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌとして、合成したＲＮＡ  ｐｒｏｂｅに対するＡｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ＲＮＡを合成し、メンブレンにブロットした。
【００６８】
５．Ｐｒｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
予め６５℃に加温したＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液１５ｍｌをメンブレンの入ったハイブリパックに加え、６５℃で３０分間Ｐｒｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った。ＤＩＧ−ｌａｂｅｌｅｄ  ＲＮＡ  ｐｒｏｂｅ  ２０μＬを５分間ボイル、５分間氷冷を行い、Ｐｒｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ終了後のハイブリパックに入れ、６５℃で一晩Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った。
【００６９】
６．メンブレンの洗浄、現像
ハイブリダイゼーション後のメンブレンを、２×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳで１０分間振盪を常温で２回行い、０．５×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳで２０分間振盪を６５℃で２回行った。以下の作業は全て常温で行った。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液で５分間振盪させ、洗浄用Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  マレイン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．３％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．５）で５分間振盪し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０×ｃｏｎｃ．をマレイン酸Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  マレイン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で１×にして使用）で１時間振盪させた。Ａｎｔｉ  ｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｎｔｉ  ＤＩＧ−ＡＰ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ２μＬ／２０ｍＬ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で３０分振盪し、洗浄用Ｂｕｆｆｅｒで１５分間振盪を２回行った。Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５）で３分間振盪させ、発色剤（ＣＳＰＤ）をメンブレンに広げ、ハイブリパックで密封し遮光して３７℃で１０分放置した。それをＨｙｐｅｒｃａｓｓｅｔｔｅに入れ、暗室でＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬをセットして感光させた。現像は、現像液（Ｒｅｎｄｏｌ）、停止液（０．１％酢酸）、水道水、定着液（Ｒｅｎｆｉｘ）の順に行った後、水洗した。
【００７０】
培養時間の経過に伴う新規遺伝子の発現量の変化を図３に示した。培養時間の経過に伴って新規遺伝子の発現量が増加しており、培養時間の経過に伴って肝細胞の繊維芽様細胞への変化が進むことから、新規遺伝子は肝細胞の繊維芽様細胞への変化に関与することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の新規遺伝子は、肝細胞の繊維芽様細胞への変化に関与し、肝臓障害マーカー遺伝子として利用できる可能性が考えられる。この場合、この遺伝子が魚類のみならずヒトにも存在するのであれば医療分野において、肝臓障害の診断や治療の指標として用いることができる。
また、この遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ等の有用な機能を有する複数の既知タンパク質と高い相同性があり、同様な機能を有することが示唆される。このように本発明の新規遺伝子は、有用な機能を有する可能性が高く、その機能の解析を行うことは有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ａ．培養開始時の肝細胞およびｂ．培養２１日後の肝細胞を示した図である（実施例１）。
【図２】Ｂｌａｓｔ解析によって予測された構造および相同性を有するタンパク質とその相同性を示した図である（実施例２）。
【図３】肝細胞の培養時間の経過に伴う新規遺伝子の発現量の変化を示した図である（実施例３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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