(57)【要約】      （修正有）【課題】甲殻類用プロバイオティクス乳酸菌を提供する。【解決手段】宿主であるエビの腸管内から分離された、低温増殖能および耐熱性を示し、エビ病原細菌およびカビに対して抗菌活性を有し、またストレス軽減物質であるGABA産生能を有する、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillusplantarum）D2905株（受託番号：NITE P-681）D1837（ラクトコッカス・ラクチス）、D2452（ラクトコッカス・ラクチス）、D2455（ラクトコッカス・ラクチス）およびD2607（ラクトコッカス・ラクチス）よりなる群から選ばれる甲殻類宿主由来の新規プロバイオティクス乳酸菌。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロバイオティクス作用を有する、甲殻類から分離した乳酸菌。
【請求項２】
甲殻類の消化管から分離した請求項１に記載の乳酸菌。
【請求項３】
ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）である、請求項１または２に記載の乳酸菌。
【請求項４】
ラクトバチルス・プランタラムD2905株（受託番号：NITE P-681）である、請求項３に記載の乳酸菌。
【請求項５】
D671（ラクトコッカス・ラクチス）、D673（エンテロコッカス・シュードアビウム）、D708（エンテロコッカス・パレンス）、D732（ラクトコッカス・ラクチス）、D938（エンテロコッカス・フェカリス）、D1188（エンテロコッカス・ラフィノサス）、D1233（エンテロコッカス・ラフィノサス）、D1660（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D1813（ラクトコッカス・ラクチス）、D1835（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D1836（ラクトコッカス・ラクチス）、D1837（ラクトコッカス・ラクチス）、D1838（ラクトコッカス・ラクチス）、D2009（ラクトコッカス・ラクチス）、D2035（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D2037（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D2042（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D2135（ラクトコッカス・ラクチス）、D2310（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D2325（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D2326（エンテロコッカス・フェシウム）、D2339（ラクトバチルス種. ）、D2350（エンテロコッカス・フェシウム）、D2440（ラクトバチルス・プランタラム）、D2447（ラクトバチルス・プランタラム）、D2449（ラクトバチルス・プランタラム）、D2451（ラクトバチルス・プランタラム）、D2452（ラクトコッカス・ラクチス）、D2455（ラクトコッカス・ラクチス）、D2458（ラクトバチルス・プランタラム）、D2461（ラクトバチルス・プランタラム）、D2465（ラクトバチルス・プランタラム）、D2467（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D2468（ラクトバチルス・プランタラム）、D2479（バゴコッカス・カルニフィラス）、D2480（ラクトバチルス・プランタラム）、D2491（ラクトコッカス・ラクチス）、D2492（ラクトバチルス・プランタラム）、D2597（ラクトコッカス・ラクチス）、D2607（ラクトコッカス・ラクチス）、D2697（ラクトバチルス・プランタラム）、D2700（ラクトバチルス・プランタラム）、D2712（ペディオコッカス・ペントサセウス）およびD2714（ラクトバチルス・アミロフィラス）、D2818（バゴコッカス・フルビアリス）、D2819（バゴコッカス・フルビアリス）、D2852（バゴコッカス・フルビアリス） 、D2862（バゴコッカス・カルニフィラス）、D2902（ラクトバチルス・プランタラム）、D2903（ラクトバチルス・プランタラム）、D2905（ラクトバチルス・プランタラム）、D2906（ラクトバチルス・ナゲリイ）、D2908（ラクトバチルス・プランタラム）、D2910（バゴコッカス・フルビアリス）、D2917（バゴコッカス・フルビアリス）、D2918（バゴコッカス・フルビアリス）、D2920（バゴコッカス・フルビアリス）およびD3268（ペディオコッカス・ペントサセウス）よりなる群から選ばれる、請求項１または２に記載の乳酸菌。
【請求項６】
１５℃以下の低温で増殖可能な請求項１または２に記載の乳酸菌。
【請求項７】
D2135（ラクトコッカス・ラクチス）、D2449（ラクトバチルス・プランタラム）、D2451（ラクトバチルス・プランタラム）、D2452（ラクトコッカス・ラクチス）、D2468（ラクトバチルス・プランタラム）、D2480（ラクトバチルス・プランタラム）、D2492（ラクトバチルス・プランタラム）、D2607（ラクトコッカス・ラクチス）、D2697（ラクトバチルス・プランタラム）、D2902（ラクトバチルス・プランタラム）、D2903（ラクトバチルス・プランタラム）、D2905（ラクトバチルス・プランタラム）およびD2908（ラクトバチルス・プランタラム）よりなる群から選ばれる、請求項６に記載の乳酸菌。
【請求項８】
エビ病原細菌およびカビに対して抗菌活性を示す、請求項１または２に記載の乳酸菌。
【請求項９】
ラクトバチルス・プランタラムおよびペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）に属する、請求項８に記載の乳酸菌。
【請求項１０】
耐熱性を示す、請求項１または２に記載の乳酸菌。
【請求項１１】
D2905（ラクトバチルス・プランタラム）である、請求項１０に記載の乳酸菌。
【請求項１２】
γ-アミノ酪酸（GABA）産生能を有する請求項１または２に記載の乳酸菌。
【請求項１３】
D1837（ラクトコッカス・ラクチス）、D2452（ラクトコッカス・ラクチス）、D2455（ラクトコッカス・ラクチス）およびD2607（ラクトコッカス・ラクチス）よりなる群から選ばれる、請求項１２に記載の乳酸菌。
【請求項１４】
請求項１ないし１３のいずれかに記載の乳酸菌を含む、甲殻類用飼料。
【請求項１５】
請求項１ないし１３のいずれかに記載の乳酸菌を含む、甲殻類用プロバイオティクス製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、甲殻類における宿主由来の新規プロバイオティクス乳酸菌およびその使用に関する。詳細には、本発明は、天然に生息するクルマエビの腸管内から分離した、プロバイオティクスとして利用可能な新規乳酸菌に関する。さらに詳細には、本発明は、エビ由来新規乳酸菌ならびにそれを含む飼料、エビ由来新規乳酸菌を用いた健全なエビ養殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クルマエビを始めとするエビ養殖は、主要産業として発展し続けているにもかかわらず、多発する病気等の問題で生産が安定しないのが現状である。生産性を追求するあまり、飼育密度を増加させた結果、エビにストレスを与えたのが大きな要因である。ストレスにより、エビ本来が持つ生体防御能が低下し、病原体に感染・発症し大量死を招いている。大量死を抑制するために、従来より抗生物質や合成抗菌剤などの薬剤が用いられている。しかしながら、病気の治療に用いる抗生物質の継続的な使用が抗生物質耐性菌を発生させ、さらに被害を大きくしているのが実情である（非特許文献１）。また、消費者の食の安全志向から、過去病気の治療・予防に用いられてきた薬などの使用を避ける方向にあり、これに代わる病気対策として、人や家畜で広く用いられているプロバイオティクスの開発が強く求められている。
【０００３】
プロバイオティクスとは、「摂取すると、生きたまま腸まで到達し、腸内細菌叢のバランスを改善することにより、宿主に有益な作用をもたらす微生物」と定義されている（非特許文献２）。1999年にゲーテソープ（Gatesoupe）は水産養殖に用いるプロバイオティクスについて、「健康を改善する目的で、消化管に生きたまま摂取される微生物」と再定義している（非特許文献３）。ヨーグルトなどの食品や乳酸菌飲料、家畜飼料として使用実績がある菌株を用いて、魚類やエビの病原体抑制効果を有する報告がなされている（非特許文献４、５）。現在、養殖で用いられるプロバイオティクスはもっぱら人や家畜、漬け物などの発酵食品から分離した細菌であり、宿主由来の菌株を用いている製品は皆無である。
【０００４】
近年、水産分野においても、魚類の消化管由来の菌株を用いたプロバイオティクスの研究が盛んになってきている。陸上哺乳類のプロバイオティクス研究に比べると少ないが、魚類のプロバイオティクス研究は多く報告されている（特許文献１、非特許文献６）。一方、エビを含む甲殻類からの乳酸菌の分離例はほとんど報告されていない。数少ない例として、カイらは、オニテナガエビの腸管内から乳酸菌を分離しており、ラクトコッカス・ガルビアエ（Lactococcus garvieae）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）を分離し、これらの中でもラクトコッカス・ガルビアエが優占種であると報告している（非特許文献７）。このように、エビを含む甲殻類の腸管からの乳酸菌の分離例はほとんどなく、特に海産甲殻類からの分離例は現在までに報告されていない。
【０００５】
乳酸菌エンテロコッカス・フェシウムSHO-31（微工研菌寄第12153号）を噴霧した飼料をエビ養殖に用い、養殖エビの歩留りならびに飼料効率の上昇が報告されている（特許文献２）。しかしながら、この乳酸菌はエビ由来のものではない。また、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）の死菌体による魚介類様感染防御剤が報告されているが、この菌株L-137株は魚介類の腸管由来ではなく、フィリピンの発酵食品ブロングイスダから分離されたものである（特許文献３）。
【０００６】
上記のような乳酸菌の使用例があるものの、本来の宿主であるエビ由来の乳酸菌を用いた実例はない。また、温度やpHなど陸上生物とは生息環境が異なる海洋や腸内環境下であることを考慮すれば、本来の宿主でない人畜由来のプロバイオティクスがクルマエビに有効に働いているとは言い難い。実際、養殖現場において有効に働いているプロバイオティクスは皆無であるのが現状である。
【０００７】
近年、γ-アミノ酪酸（以下、「GABA」ともいう）の機能性が注目されている。GABAは、動植物に広く分布しているアミノ酸の一種であり、ヒト体内では、脳内に局在し、抑制系の神経伝達物質として働くことがわかっている。GABAの摂取による血圧降下作用、動脈硬化予防、肝機能改善、腎機能向上などの作用が報告されている。特に、GABAの抗ストレス作用やリラックス作用などの機能性が注目されてきており、GABAを含有する製品も多く市場に出ている。GABAは、水溶性タンパク質で、大量に摂取しても尿中に排泄されてしまうため、安全性が高い。また、一部の乳酸菌が産生するグルタミン酸脱炭酸酵素の作用により、L-グルタミン酸からGABAが産生できる。
【０００８】
ストレス軽減効果を高める、GABAを含む糖蜜を投与する動物飼料が開示されている（特許文献４）。一方、養殖分野において、GABAの利用が数例報告されている。ヒラメにGABAの投与を行った結果、成長に有意な差は認めらなかったという報告がある（非特許文献８）。一方、無脊椎動物のヤコウガイにGABAを投与すると変態促進する効果があったと報告されている（非特許文献９）。しかしながら、現在までに、GABA産生菌を水産用プロバイオティクスとして用いる報告はない。
【特許文献１】特開２００６−２６５１８１
【特許文献２】特許公報第２７２７５１７号
【特許文献３】ＷＯ２００４／０８４９２２
【特許文献４】特開２００５−３３３８０４
【非特許文献１】カルナサガー（Karunasagar, I.）ら、Aquaculture, 1994,128: p.203-209
【非特許文献２】フラー（Fuller, R.）、Journal of Applied Bacteriology, 1989, 66: p.365-378
【非特許文献３】ゲーテソープ（Gatesoupe, F. J.）、Aquaculture, 1999,180: p.147-165
【非特許文献４】アジシャ（Ajitha, S.）ら、Asian Fisheries Science, 2004, 17: p.71-80
【非特許文献５】ニコスケライネン（Nikoskelainen, S.）ら、Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67: p.2430-2435
【非特許文献６】リンゴおよびゲーテソープ（Ringo, E. and Gatesoupe F. J.）、Aquaculture, 1998,160: p.177-203
【非特許文献７】カイ（Cai, Y.）ら、Journal of general and applied microbiology, 1999, 45: p.177-184
【非特許文献８】キム（Kim, S.）ら、Fisheries Science, 2003, 69: p.242-248
【非特許文献９】下池、みどりいし、1998, 9: p.26-29
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、抗生物質などの薬剤で病気を抑制するのではなく、薬剤に代わる健全な養殖を実現するためにプロバイオティクスが注目されている。プロバイオティクスとして世界に広く利用されている細菌は、人や家畜由来のラクトバチルス属乳酸菌などに限られている。現在、エビ養殖で用いられているプロバイオティクスも、ヒトや家畜、発酵食品由来の微生物を転用したものである。通常、哺乳類の腸内環境は嫌気度が高くかつ腸内温度が４０℃近くである。一方、クルマエビを始めとする甲殻類の腸内環境は、腸の長さが短いため嫌気度が比較的低いと考えられており、また腸内温度は周囲の環境に依存している。これらの理由から、哺乳類とは全く異にするエビの腸管内で、哺乳類由来の乳酸菌が定着・増殖し、宿主であるエビに有益な作用を及ぼしている確証はない。
【００１０】
プロバイオティクスの定義として、「摂取すると、生きたまま腸まで到達し、腸内細菌叢のバランスを改善することにより、宿主に有益な作用をもたらす微生物」とされており、プロバイオティクスはその宿主生物から探索することが盛んに行われている。従って、宿主であるクルマエビの腸内細菌の中から、プロバイオティクス作用を示す乳酸菌株が分離できれば、それを用いた養殖エビ用のプロバイオティクスとして利用できる可能性が高い。
【００１１】
本発明の目的は、エビの腸内から抗菌活性や低温増殖能などの特異的な性状を有し、宿主であるエビの健康や成長に寄与する乳酸菌を探索し、養殖エビに利用可能なプロバイオティクスを開発することである。
【００１２】
クルマエビなどの甲殻類は、魚類とは異なり、与えた飼料をすぐに摂餌しない。また、その摂餌様式は非常にロスが多く、飼料効率が悪い。従って、高価なGABAなどの有用物質をせっかく投与しても、水溶性のGABAが水中で拡散してしまう可能性が大きく、期待すべき有効な効果を示せない可能性がある。このため、高価なGABAを水産養殖で用いることは技術的にも費用的にも困難である。
【００１３】
本発明は、天然クルマエビの腸内細菌から、低温増殖能を示し、養殖エビの病原菌を抑制し、またストレス軽減物質であるGABA産生能を有する、宿主であるエビに有益な新規乳酸菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記のような課題を解決するため、本発明者らは天然環境に生息するクルマエビの腸やその内容物から腸内細菌を分離し、その中からこれまで報告のない新規乳酸菌を単離することに成功した。これらエビの腸管由来の乳酸菌が、水温などの環境の変化が激しい養殖エビの腸内においても増殖し、またエビの健康を脅かすビブリオなどの病原体を抑制する効果を有し、またγ-アミノ酪酸（GABA）の産生能を有する性状を持つことを見出し、本発明に至った。
【発明の効果】
【００１５】
本発明による甲殻類宿主由来の新規プロバイオティクス乳酸菌は、宿主であるエビの腸管内から分離されたものであるため、低温増殖能を示し、養殖エビの病原菌を抑制し、またストレス軽減物質であるGABA産生能を有する等の点で従来の人畜由来の乳酸菌よりも優れており、宿主であるエビに一層適合した、かつ安全なプロバイオティクスとして使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のプロバイオティクス作用を有する新規なエビ由来の乳酸菌は、以下の方法によって取得することができる。本発明の乳酸菌は、プロバイオティクス作用として、抗菌活性、低温増殖能、GABA産生能などを指標として選抜することができる。乳酸菌の取得源としては、天然や養殖などのクルマエビがあげられるが、養殖場によっては、すでに哺乳類由来の乳酸菌を投与しているところもあるため、エビ由来の乳酸菌を得るためには天然に生息するクルマエビを用いるのが好ましい。
【００１７】
天然クルマエビの表面を70%エタノールで消毒したのちに、消化管を無菌的に摘出する。消化管としては、食道、胃、中腸腺、中腸、後腸などを用いることができるが、腸内細菌数が多い中腸を利用するのが好ましい。摘出した中腸を腸管と内容物に分け、それぞれを１０倍量の滅菌海水で希釈する。希釈した試料液を100μlずつ、乳酸菌分離培地に塗布する。用いる乳酸菌の培地は、海水で作製した、GYP培地、MRS培地、M17培地などであってよい。また、乳酸を産生していることを確認するため、培地に炭酸カルシウムを添加する。培養には、アネロパックシステム（三菱ガス化学）を用い、嫌気状態で７日間培養する。培養終了後、乳酸産生により炭酸カルシウムが溶解するなどの乳酸菌に特徴のあるコロニーを単離する。単離を確認するために、分離に用いた培地で再培養を行う。
【００１８】
単離した株は、乳酸菌の指標である、１）グラム染色が陽性であること、２）カタラーゼ非産生であること、３）芽胞を形成しないこと、４）運動性がないこと、を確認したのち、糖の資化性を調査する。糖の資化性を調べるためには、API50CHL（ビオメリュー）を培地として、基質プレートとしてAP50CHを用いる。48時間後、得られたプロファイルをAPIweb（ビオメリュー）で入力し、菌株の同定を行う。さらに、16S rRNA遺伝子の一部の塩基配列の決定を行い、DNAデータベース（BLASTなど）に登録されている既知の細菌の16S rRNA遺伝子と比較し、菌種の同定を行う。また、望ましくは、標準菌株とDNA-DNAハイブリダイゼーションを行い、70%以上の相同性を確認したのちに菌種を同定するのがよい。乳酸菌と同定された株を液体培養し、対数増殖期の状態にある培養液に10%(v/v)となるようにグリセロールを添加したのちに、-80℃で保存する。
【００１９】
本発明に従って、以下の乳酸菌株が天然クルマエビの腸管から単離された：D671（ラクトコッカス・ラクチス）、D673（エンテロコッカス・シュードアビウム）、D708（エンテロコッカス・パレンス）、D732（ラクトコッカス・ラクチス）、D938（エンテロコッカス・フェカリス）、D1188（エンテロコッカス・ラフィノサス）、D1233（エンテロコッカス・ラフィノサス）、D1660（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D1813（ラクトコッカス・ラクチス）、D1835（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D1836（ラクトコッカス・ラクチス）、D1837（ラクトコッカス・ラクチス）、D1838（ラクトコッカス・ラクチス）、D2009（ラクトコッカス・ラクチス）、D2035（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D2037（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D2042（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D2135（ラクトコッカス・ラクチス）、D2310（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D2325（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D2326（エンテロコッカス・フェシウム）、D2339（ラクトバチルス種. ）、D2350（エンテロコッカス・フェシウム）、D2440（ラクトバチルス・プランタラム）、D2447（ラクトバチルス・プランタラム）、D2449（ラクトバチルス・プランタラム）、D2451（ラクトバチルス・プランタラム）、D2452（ラクトコッカス・ラクチス）、D2455（ラクトコッカス・ラクチス）、D2458（ラクトバチルス・プランタラム）、D2461（ラクトバチルス・プランタラム）、D2465（ラクトバチルス・プランタラム）、D2467（ラクトコッカス・ガルビアエ）、D2468（ラクトバチルス・プランタラム）、D2479（バゴコッカス・カルニフィラス）、D2480（ラクトバチルス・プランタラム）、D2491（ラクトコッカス・ラクチス）、D2492（ラクトバチルス・プランタラム）、D2597（ラクトコッカス・ラクチス）、D2607（ラクトコッカス・ラクチス）、D2697（ラクトバチルス・プランタラム）、D2700（ラクトバチルス・プランタラム）、D2712（ペディオコッカス・ペントサセウス）、D2714（ラクトバチルス・アミロフィラス）、D2818（バゴコッカス・フルビアリス）、D2819（バゴコッカス・フルビアリス）、D2852（バゴコッカス・フルビアリス）、D2862（バゴコッカス・カルニフィラス）、D2902（ラクトバチルス・プランタラム）、D2903（ラクトバチルス・プランタラム）、D2905（ラクトバチルス・プランタラム）、D2906（ラクトバチルス・ナゲリイ）、D2908（ラクトバチルス・プランタラム） 、D2910（バゴコッカス・フルビアリス）、D2917（バゴコッカス・フルビアリス）、D2918（バゴコッカス・フルビアリス）、D2920（バゴコッカス・フルビアリス）、D3268（ペディオコッカス・ペントサセウス）。
【００２０】
後述する実施例に示すとおり、エビ由来の乳酸菌は、標準菌株に比べて、低温増殖能を示すものが多かった。また。乳酸菌の培養上清がビブリオ・ペナエイシダ（Vibrio penaeicida）の増殖を抑制することが見出された。とりわけ、ラクトバチルス・プランタラムは、ビブリオ・ペナエイシダに対する抗菌活性が強く、エビ病原カビのフザリウム・ソラニ（Fusarium solani）の生育を抑制した。中でも、ラクトバチルス・プランタラムD2905株は、抗菌・抗カビ活性が高く、15℃で最も早く増殖し、かつ50℃、10分間の熱処理においても生存数が変わらなかった。
【００２１】
本発明による好ましいラクトバチルス・プランタラム株である、ラクトバチルス・プランタラムD2905株（受託番号：NITE P-681）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許寄託センター（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番8号）に2008年12月1日に寄託してある。
【００２２】
エビ由来乳酸菌の一部に、GABA産生能が認められたことから、ストレス抑制などのGABAが持つ機能性をプロバイオティクスによって供給できることを示した。
【００２３】
また、これら菌株の変異株を用いることもできる。変異株の取得方法としては、上記菌株が自然変異したものに加えて、人為的に突然変異を起こす方法がある。具体的には、菌株培養時に紫外線処理をして突然変異を誘発する方法、N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）やエチルメタンスルホン酸（EMS）などの変異誘起剤を用いて処理する方法がある。また、形質転換や細胞融合などの方法で外来遺伝子を導入し、望ましい形質を持つ菌株を育種することもできる。
【００２４】
本発明のエビ由来乳酸菌は、そのまま、飼料添加物、微生物製剤、プロバイオティクスなどとして使用することができる。乳酸菌を製造するには、液体培養の場合は、培養した菌を回収し、凍結乾燥、スプレードライなどで生菌のまま粉末化することができる。この際、スキムミルク等の保護剤を用いることが望ましい。固体培養の場合は、適切な培養基材に乳酸菌を接種し、そのまま粉末化するか、もしくは培養基材から菌体を回収し、粉末化することもできる。この場合、用いる培養基材としては、豆腐粕などが利用できる。
【００２５】
本発明の乳酸菌を飼料に混合する場合、（１）配合飼料の作製の過程で添加する、もしくは（２）水、油、卵白などの添着剤を用い、成形した配合飼料に添着コーティングさせることもできる。
【００２６】
本発明の乳酸菌の使用方法として、エビ養成期に飼料に混合または添着させたのち投与、または養成池に直接散布することで、エビにプロバイオティクス作用を持った乳酸菌を投与することができる。また、プロバイオティクス効果を示すには、生菌を与えることが望ましい。
【００２７】
プロバイオティクスとしての本発明の乳酸菌は、特に、エビの腸管が未発達な幼生期に投与することが望ましい。エビの幼生は、ゾエア期から餌を取り始めるため、エビの腸内細菌叢はゾエア期以降に形成される。腸内細菌叢は周囲の海水の細菌叢に大きく影響を受けるため、口器形成が始まるゾエア期から乳酸菌を投与し、乳酸菌を主体とする腸内細菌叢を形成することが望ましい。投与方法として、（１）エビの幼生タンクに直接投与する、（２）回収した幼生を高濃度の乳酸菌液に浸漬する、（３）配合飼料に乳酸菌液を噴霧し、投与する、（４）乳酸菌を混合または添着させた配合飼料を投与する、（５）初期飼料となる、アルテミアやワムシなどの動物ブランクトンに乳酸菌を取り込ませ、富裕化したのちに投与する（Bioencapsulation）、などがある。特に、Bioencapsulation法は、１）アルテミアやワムシの培養槽はエビ幼生養成タンクと異なり小さいため、無駄なく高濃度の乳酸菌を取り込ませることができる、２）乳酸菌を取り込んだアルテミアなどの生物飼料をエビ幼生に投与することで、効率よく乳酸菌を経口投与できる、などの利点がある。
【００２８】
また、エビの種苗の輸送時に用いることもできる。国内のエビ養殖業者は、エビ種苗業者または種苗センターなどから、種苗を入手していることが多い。このため、種苗の輸送時に用いるビニール袋などの容器に本発明の乳酸菌を添加することで、輸送中に効率よく本発明の乳酸菌を投与できる。
【００２９】
本発明の乳酸菌は、生態が類似している、クルマエビの同類の甲殻類にも使用できる。特にクルマエビ科のエビ、例えば、ブルーシュリンプ（Litopenaeus stylirostris）、ホワイトシュリンプ（Litopenaeus vannamei）、タイショウエビ（Fenneropenaeus chinensis）、インドエビ（Fenneropenaeus indicus）、バナナシュリンプ（Fenneropenaeus merguiensis）、レッドテールシュリンプ（Fenneropenaeus penicillatus）、ウシエビ（Penaeus monodon）、クマエビ（Penaeus semisulcatus）、フトミゾエビ（Melicertus latisulcatus）、ヨシエビ（Metapenaeus ensis）などに用いてもよい。
【００３０】
使用する際には、本発明の乳酸菌から選ばれる１種類または２種類以上の組み合わせで用いるのがよい。更にビタミン、消化酵素、免疫賦活剤、生菌剤、死菌剤などを併用して用いることも可能である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実証例に限定されるものではない。
【００３１】
実施例１：乳酸菌の分離
天然クルマエビを採取したのち、すぐに低温下で研究室まで運んだ。クルマエビを無菌的に解剖し、腸管を摘出した。摘出時には内容物が漏れないように腸の両端を糸で縛った。内容物を試験管に取り出し、10倍量の滅菌海水で希釈したのちに、ホモジナイザーを用いて内容物を破砕し、腸内細菌を遊離させた。破砕液を滅菌海水で10段階希釈し、100μlずつ乳酸菌選択培地に滴下し、スプレッダーで全面に広げた。乳酸菌の分離には、海水で作製した乳酸菌分離培地（GYP寒天培地、MRS寒天培地、M17培地）に0.5％量となるように炭酸カルシウムを加えた。乳酸菌以外の菌の増殖を抑制するために、アジ化ナトリウムとシクロヘキシミドを添加した。培養は、アネロパックシステム（三菱ガス化学株式会社）を用い、嫌気下、27℃で7日間培養した。周囲の炭酸カルシウムを溶解するなど乳酸菌に特徴のあるコロニーを釣菌し、新たな培地で純粋培養を行った。
【００３２】
得られた単一コロニーのうち、乳酸菌の特徴である、１）グラム陽性菌、２）カタラーゼ陰性、３）運動性なし、４）芽胞形成しない、という性状を有する菌株の糖の資化性と16S rRNA遺伝子の塩基配列を調査した。糖の資化性には、APIテスト（ビオメリュー）のAPI50 CHLを用いた。判定結果をAPI webで調べた。16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した後、既存のDNAデーターベース（BLAST: http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）で検索し、同定を行った。DNA-DNAハイブリダイゼーションは、マイクロプレート法を用いて行った。
【００３３】
その結果、分離した乳酸菌の種類を表１に示す。クルマエビの腸管からは、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・パレンス（E. pallens）、エンテロコッカス・シュードアビウム（E. pseudoavium）、エンテロコッカス・ラフィノサス（E. raffinosus）、ラクトコッカス・ガルビアエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッカス・ラクチス（Lc. lactis subsp. lactis）、ラクトバチルス・アミロフィラス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバチルス・ナゲリイ（Lb. nagelii）、ラクトバチルス・プランタラム（Lb. plantarum）、ラクトバチルス種（Lactobacillus sp.）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、バゴコッカス・カルニフィラス（Vagococcus carniphilus）、バゴコッカス・フルビアリス（V. fluvialis）の5属14種が分離できた。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
実施例２：乳酸菌培養上清によるビブリオ菌の生育阻止
エビ由来の乳酸菌培養上清の存在下における、クルマエビの病原細菌ビブリオ・ペナエイシダ（Vibrio penaeicida）の増殖を調査した。96穴マイクロプレートにビブリオ・ペナエイシダと乳酸菌培養上清の希釈液を一定量加え、1時間毎の吸光度を測定した。対照として、培養上清を含まない試験区（増殖抑制なし）を100%、ビブリオ・ペナエイシダを含まない試験区（完全な増殖抑制）を0%として、相対値（%）を求めた。また、対照区として、ラクトバチルス・プランタラムの標準菌株NBRC15891株を用いた。
【００３６】
図１に代表例としてラクトバチルス・プランタラムの結果を示した。乳酸菌の培養上清のビブリオ・ペナエイシダに対する抗菌活性を測定した。その結果、ラクトバチルス・プランタラムのすべて菌株がビブリオ・ペナエイシダに対して抗菌活性を示すことが明らかとなった。
【００３７】
実施例３：エビ由来乳酸菌の抗カビ活性
コルクボーラで穴を空けたMRS培地を作製した。エビ由来乳酸菌を一晩培養液ならびにフザリウム・ソラニの分生子液を穴に100μlずつ加え、27℃、1週間培養を行った。抗カビ活性の強さは阻止円の大きさで調査した。
【００３８】
図２に結果の一部を示した。ラクトバチルス・プランタラム菌株ならびにペディオコッカス・ペントサセウス菌株のフザリウム・ソラニに対する抗カビ活性を調べたところ、供試菌株すべてが菌糸の生育を抑制した（図２）。
【００３９】
実施例４：エビ由来乳酸菌の熱耐性試験
エビ由来乳酸菌の菌株を1,000 CFU/mlとなるように調整したのち、50℃で10分間の熱処理を行った。MRS寒天培地を入れたシャーレに、100μlずつ入れ、スプレッダーで広げた。培養したのちに、出現したコロニー数を数えた。対照区として、無処理区のコロニーを計数した。熱処理のコロニー数/無処理のコロニー数の割合（％）を求めた。対照区として、ラクトバチルス・プランタラムの標準菌株NBRC15891株を用いた。
【００４０】
図３に示す結果から明らかなように、一部の乳酸菌が熱処理に耐性があることが明らかとなった。特に、ラクトバチルス・プランタラムD2905株は、調査した株の中で最も熱耐性があった。
【００４１】
実施例５：エビ由来乳酸菌の低温増殖試験
エビ由来乳酸菌を、塩化ナトリウム濃度を3%となるように調整したMRS寒天培地に画線し、10℃、15℃および27℃で24時間培養した。対照として、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）の標準菌株NBRC100933株とラクトバチルス・プランタラムの標準菌株NBRC15891株の増殖能を同様に調べた。
【００４２】
表２に15℃、24時間培養の結果を示した。ラクトコッカス・ラクティスの標準菌株、ラクトバチルス・プランタラムの標準菌株は生育できなかったが、エビ由来の乳酸菌では生育が認められた。特に、D2449株、D2135株、D2452株では、培地に混ぜた炭酸カルシウムを溶解していることが確認できた。すべての菌株は10℃、24時間では増殖が認められなかったが、培養3日後にD2452株のみ増殖が認められた。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
実施例６：エビ由来乳酸菌のGABA産生能
エビ由来乳酸菌を、27℃、72時間、静置培養を行った。遠心分離（10,000g、10分、室温）を行ったのち、培養上清を回収した。使用時まで-20℃の冷凍庫で保管した。対照として、ラクトコッカス・ラクティスの標準菌株NBRC100933株とラクトバチルス・プランタラムの標準菌株NBRC15891株の培養上清を同様に得た。GABAの分析は薄層クロマトグラフィーで行った。用いた薄層クロマトプレートには、シリカゲルプレート（Silica gel 60 F254）を用いた。展開溶媒は、酢酸：エタノール：水（3：2：1）の組成で作製した。プレートに培養上清を2μlずつスポットし展開した。GABAの検出は、ニンヒドリン反応で行った。ニンヒドリンスプレー（和光純薬工業）を展開プレートに噴霧したのちに、60℃で数分間加温した。展開プレート上のGABAの相対移動度を求め、エビ由来乳酸菌の培養上清サンプルのGABAの有無の確認を行った。
【００４５】
薄層クロマトグラフィーの結果、エビ由来の乳酸菌にGABA産生能があることが認められた（図４）。GABA産生株はすべてラクトコッカス・ラクティスであった。一方、対照として用いたいずれの標準菌株の培養液からもGABAは検出されなかった。
【００４６】
実施例７：クルマエビ幼生へのエビ由来乳酸菌の投与
海水5リットルを加えた円形飼育水槽5L（半径15cm、高さ15cm）にクルマエビ幼生（体重：平均0.7g）50尾を入れた。エビ由来乳酸菌の培養液を終濃度106cfu/mlとなるように添加した。添加前、添加後1、3、6、12時間後に5尾ずつ取り上げ、腸管内の乳酸菌数を計数した。再分離にはMRS培地を用いた。
【００４７】
その結果を表３に示す。投与後1時間から乳酸菌を取り込み始め、エビ体重gあたり3.6x104cfuが検出できた。3時間で3.4x104cfuになり、6、12時間後では、それぞれ1.7x105cfu、1.2x105cfuとなった。これらの結果から、投与した乳酸菌がクルマエビに取り込まれていることが明らかとなった。
【００４８】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明である、宿主であるクルマエビの腸内から分離した乳酸菌を用いることにより、従来のヒトや家畜由来の乳酸菌とは異なり、宿主であるエビに有益な乳酸菌を提供できる。本発明のエビ由来の乳酸菌は、プロバイオティクスとして、健康に寄与するプロバイオティック効果を有し、クルマエビを始めとするエビ養殖で用いることができる。エビ由来乳酸菌の中には、ストレス軽減作用が報告されているγ-アミノ酪酸（GABA）を産生する菌や、、ビブリオ・ペナエイシダ（Vibrio penaeicida）などのエビ病原菌の増殖を抑制するものもあり、プロバイオティクスとして養殖エビの安定生産に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】乳酸菌培養上清によるビブリオ・ペナエイシダ（Vibrio penaeicida）の増殖抑制効果を示す。横軸は培養時間を、縦軸はO.D.600 nmの吸光度を示す。
【００５１】
【図２】フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）に対する乳酸菌の抗カビ活性の結果を示す。パネル（Ａ）は、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)の結果を、パネル（Ｂ）ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)の結果をそれぞれ示す。Controlには、フザリウム・ソラニの分生子液と培地を加えた。
【００５２】
【図３】エビ由来乳酸菌の熱耐性試験の結果を示す。菌液を50℃、10分間の熱処理を行ったのちに生菌数を調査した。縦軸は、熱処理後のコロニー数/熱処理を行わない（無処理）コロニー数の割合（％）を示す。
【００５３】
【図４】薄層クロマトグラフィーによる、エビ由来乳酸菌が産生するGABAの検出の結果を示す。レーン１：培地（１％Ｌ−グルタミン酸添加GYP培地）；レーン２：Ｌ−グルタミン酸；レーン３：γ−アミノ酪酸（GABA）；レーン４：D1837株；レーン５：D2452株；レーン６：D2455株；レーン７：D2607株；レーン８：ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）NBRC15891株（標準菌株）；レーン９：ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）NBRC100933株（標準菌株）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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