(57)【要約】【課題】精製された哺乳動物ＤＣ細胞表面タンパク質（ランゲリン（Ｌａｎｇｅｒｉｎ）と命名）、ランゲリンをコードする核酸、およびランゲリンに特異的に結合する抗体を提供することを、本発明の課題とする。【解決手段】上記課題は、ヒトおよびマウスのランゲリン遺伝子をクローニングすることによって、達成された。また、モノクローナル抗体を産生する、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２５７６を有するハイブリドーマ細胞もまた、提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物ポリペプチドに選択的に結合する、単離された抗体
であって、該ポリペプチドが、以下：
ａ）ＤＣＧＭ４モノクローナル抗体に選択的に結合する；
ｂ）該ポリペプチドの天然の形態が、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより約４０ｋＤの分
子量を有する；および
ｃ）ランゲルハンス細胞の細胞表面上で発現される、
により特徴付けられる、抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞（例えば、哺乳動物の免疫系の細胞）の生理、発生、
および分化を制御する際に機能する組成物に関する。特に、本発明は、種々の細
胞型（造血細胞、および特に樹状細胞（例えば、ランゲルハンス細胞）を含む）
の細胞の生理、発生、分化、または機能を調節する抗体（例えば、アゴニストお
よびアンタゴニスト）を提供する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は、特異的な免疫応答の開始に必要とされる抗原提示細胞で
ある。例えば、非特許文献１を参照のこと。ＤＣの１つの型は、非リンパ組織（
例えば、表皮）に存在するランゲルハンス細胞（ＬＣ）（未成熟なＤＣ細胞）に
よって例示され、そしてその主な機能は、抗原を捕捉することである。例えば、
Ｓｔｅｉｎｍａｎら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：２８３〜２８８
を参照のこと。
【０００３】
抗原捕捉は、主に、専門化された表面膜エンドサイトーシス（ｓｕｒｆａｃｅ
−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ）構造を通じて、またはマクロピノサ
イトーシスを通じて達成され、それによりランゲルハンス細胞が大容量の流体中
に存在する溶質を濃縮することを可能にする。例えば、Ｓａｌｌｕｓｔｏら（１
９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：３８９〜４００を参照のこと。エンドサ
イトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ）経路の専門化されたオルガネラにおける抗原
のプロセシングと同時に、ＤＣ（例えば、ランゲルハンス細胞）は、二次的なリ
ンパ組織に移動し、そして多数の表現型改変を受ける。これらの成熟事象は、最
終的には、Ｔ細胞に対するＤＣの適切なＭＨＣ分子によって、プロセスされた抗
原の非常に効率的な提示へと移る。
【０００４】
特に、ＤＣランゲルハンス細胞の成熟プロセスは、ＬＣに特徴的である、接着
レセプター（例えば、Ｅ−カドヘリン）の損失、およびバーベック顆粒（ＢＧ）
の消失を含む。反対に、抗原提示機能の獲得の際に、同時刺激性レセプター（例
えば、ＣＤ８０分子およびＣＤ８６分子）は、Ｔ細胞が活性化することを可能に
するようにＤＣにおいて上方制御される。ＤＣの成熟事象は、それぞれ、病原体
との接触後の前炎症性サイトカインに対する応答、および二次的リンパ組織にお
けるＴ細胞との接触に対する応答を模倣する、ＴＮＦ−αおよびＣＤ−４０リガ
ンドによって、インビトロで再構成され得る。例えば、Ｃａｕｘら（１９９６）
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：６９５〜７０６を参照のこと。
【０００５】
従って、ＤＣの非常に専門化された機能および解剖学的に局在した機能は、多
数の重要な分子の発現の密接な調節によって制御されることが明らかである。
【０００６】
近年、培養系は、サイトカインの存在下で培養される場合に、多数のＤＣを得
るために、利用可能になった。このような培養方法を使用して、ＤＣは、ＣＤ３
４+造血前駆細胞（ＨＰＣ）がＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦと同時培養される
場合に臍帯血に存在するＨＰＣから（このような培養物は、ＣＤ３４誘導ＤＣと
いわれる）、または末梢血単球がＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と同時培養される
場合に末梢血単球から（このような培養物は、単球誘導ＤＣといわれる）、イン
ビトロでの研究のために得られ得る。例えば、Ｃａｕｘら（１９９２）Ｎａｔｕ
ｒｅ  ３９２：２５８〜２６１；Ｃｈａｐｕｉｓら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．２７：４３１〜４４１；Ｒｏｍａｎｉら（１９９４）Ｊ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９３：６００〜６０９を参照のこと。
【０００７】
これらの方法は、表現型的または機能的に異なるＤＣ亜集団のインビトロ（例
えば、Ｃａｕｘら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：６９５〜７０６を
参照のこと）、またはエキソビボ（種々の器官から；例えば、Ｇｒｏｕａｒｄら
（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：３６４〜３６７；Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙら（
１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．８２：４８７〜４９３；Ｚｈｏｕ（１９９５）Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３８２１〜３８３５を参照のこと）のいずれかでの単
離を可能にする。
【０００８】
結果として、異なるＤＣ亜集団と共に発現されかつ異なるＤＣ亜集団と関連す
るマーカーを同定し得る新規な試薬を有することは、非常に有益である。これら
のマーカーは、抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル）を使用し
て検出可能である。このようなマーカーは、例えば、細胞選別および機能的研究
を容易にすることによって、未成熟ＤＣの規定されたサブセットのモニタリング
、特徴付け、および／または単離を可能にする。従って、ＤＣ成熟、抗原提示、
ならびに他の分子、細胞、および組織とのＤＣの相互作用の機構に関与する分子
のより良好な理解を可能にするツールについての必要性が、存在する。本発明は
、ＤＣ成熟および機能に関与する有用な試薬および組成物を提供することによっ
て、このような必要性を満たす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４２〜５２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、部分的に、樹状細胞（ＤＣ）およびランゲルハンス細胞（ＬＣ）上
に見出される新規な細胞抗原を規定しかつ認識する抗体の発見に基づく。このモ
ノクローナル抗体は、ＤＣＧＭ４と命名され、そしてそれが認識する抗原は、ラ
ンゲリン（Ｌａｎｇｅｒｉｎ）と命名されている。本発明は、この抗体およびそ
の使用のための方法を包含する。さらに、本発明は、この抗体によって認識され
る抗原、およびこれらのタンパク質の改変体（例えば、天然配列、種および対立
遺伝子改変体の変異（ムテイン））、融合タンパク質、化学模倣物、ならびに他
の構造的アナログまたは機能的アナログに関する。これらの異なる抗体およびタ
ンパク質組成物の種々の使用もまた、提供される。
【００１１】
本発明は、哺乳動物のランゲリンに特異的に結合する抗体を提供する。好まし
い実施態様では、この哺乳動物は、霊長類であるか；あるいはこの抗体は、モノ
クローナル抗体であるか、ランゲリンに対するＤＣＧＭ４の結合を妨げるか、ま
たは、例えば、蛍光標識または酵素標識を用いて検出可能に標識される。
【００１２】
本発明はまた、哺乳動物のランゲリンを検出する方法を提供し、この方法は、
ランゲリンにＤＣＧＭ４を結合させる工程を包含する。種々の実施態様では、抗
体は、標識抗体であるか、または固体基材に固定され；ランゲリンは、細胞表面
上に発現され；検出する工程は、ランゲリンを発現する、核酸を含む細胞の単離
を可能にするか；または検出する工程は、ランゲリンの精製をさらに可能にする
。本発明はまた、抗体を含む区画を備える、ランゲリンを検出するためのキット
を包含する。好ましい実施態様において、このキットは、蛍光免疫アッセイキッ
トである。
【００１３】
本発明はさらに、細胞によって調節される免疫機能を調節する方法を提供し、
この方法は、上記の細胞を、本明細書中に記載される抗体と接触させる工程を包
含する。例えば、この調節は、ＤＣ細胞の成熟または機能をブロックし得る。
【００１４】
ＤＣ細胞の集団を分析するための方法もまた、本明細書中に包含され、この方
法は、ランゲリンの存在を測定する工程を包含する。代表的には、この測定する
工程は、例えば、ランゲリンに対する抗体の結合を測定することによる、定量的
な判定である。
【００１５】
本発明はまた、実質的に純粋な哺乳動物のランゲリン抗原を提供する。ヒトラ
ンゲリンおよびマウスランゲリンは、詳細に記載される。ランゲリンは、例えば
、哺乳動物のランゲリンに特異的に結合する抗体を使用して、例えば、免疫アフ
ィニティーによって精製され得る。このようなものについて好ましい抗体は、Ｄ
ＣＧＭ４である。全長ランゲリンとともに、本発明は、上記のランゲリンの免疫
学的エピトープを発現するか、または免疫応答（例えば、ＤＣ細胞（ランゲリン
+細胞を含む）によって媒介される応答）を調節するフラグメントを提供する。
【００１６】
本発明はさらに、ヒトランゲリンのゲノムＤＮＡを提供する。
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）  哺乳動物ポリペプチドに選択的に結合する、単離された抗体
であって、該ポリペプチドが、以下：
ａ）ＤＣＧＭ４モノクローナル抗体に選択的に結合する；
ｂ）該ポリペプチドの天然の形態が、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより約４０ｋＤの分
子量を有する；および
ｃ）ランゲルハンス細胞の細胞表面上で発現される、
により特徴付けられる、抗体。
（項目２）  モノクローナル抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目３）  項目２に記載のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリ
ドーマ。
（項目４）  ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２５７６を有する、項目３に記
載のハイブリドーマ。
（項目５）  細胞集団を分析するための方法であって、項目１に記載の
抗体を用いてランゲリンの存在を検出または測定する工程を包含する、方法。
（項目６）  以下により特徴付けられる実質的に純粋な哺乳動物タンパク
質：
ａ）天然のグリコシル化を伴う、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる約４０ｋＤの分子量
；および
ｂ）項目１に記載の抗体に選択的に結合する。
（項目７）  配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、タンパク質。
（項目８）  配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する、タンパク質
。
（項目９）  項目７に記載のタンパク質のフラグメントであって、該フ
ラグメントは、以下：
ａ）前記ランゲリンの免疫原性エピトープを発現するフラグメント；または
ｂ）免疫応答を調節するフラグメント、
である、タンパク質のフラグメント。
（項目１０）  配列番号２に示されるタンパク質をコードする、核酸配列
。
（項目１１）  配列番号１に示されるコード領域を含む、項目１０に記
載の核酸配列。
（項目１２）  配列番号１１に示されるタンパク質をコードする、核酸配
列。
（項目１３）  配列番号１０に示されるコード領域を含む、項目１２に
記載の核酸配列。
（項目１４）  配列番号３に示される核酸配列、またはそのフラグメント
。
（項目１５）  配列番号４〜９のいずれか１つを含む、核酸配列。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記述される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文
献は、それらの全体（図、グラフ、および図面を含む）が参考として援用される
。
【００１８】
（概論）
本発明は、機能的に有意にＤＣに発現した分子に特徴的な特性を示す、哺乳動
物のタンパク質を認識する抗体を提供する。抗体は、ＤＣＧＭ４と命名されるモ
ノクローナル抗体によって、１つの実施態様において例示される。
【００１９】
抗体ＤＣＧＭ４によって規定される（例えば、選択的に認識される）哺乳動物
のタンパク質は、ランゲリンと命名される。天然のランゲリンタンパク質は、標
的細胞における生物学的応答または生理学的応答を導く、種々の生理学的応答を
媒介する。特に、ランゲルハンスＤＣ細胞は、抗原提示（例えば、過敏反応にお
いてハプテンの提示）を担う。ＤＣＧＭ４抗体は、ＤＣ成熟および抗原提示に影
響する種々の免疫学的応答を調節する。
【００２０】
ランゲリンは、４０ＫＤａのＮ−グリコシル化タンパク質である。ＤＣＧＭ４
を用いたＤＣ抽出物からの免疫沈降、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を
用いた溶出は、４０〜４２ＫＤａ分子量の均質なバンドを生じた。ＤＴＴが精製
工程の全てにわたって除去される場合、このプロフィールは、ゲル上では修飾さ
れず、このことは、ランゲリンが単鎖として、または非共有結合を有するホモダ
イマーとして細胞膜に存在することを示唆する。二次元分析は、この分子の分子
量を確認し、そして５．２〜５．５のｐＩを示した。最終的に、ランゲリンは、
糖タンパク質であり、そして糖類の構成成分のほとんどは、Ｎ−グリコシラーゼ
処理によって除去された。
【００２１】
ヒトランゲリンをコードする遺伝子は、ここで、クローニングされている。こ
のヌクレオチド配列を、配列番号１に示す。この推定アミノ酸配列を、配列番号
２に示す。この推定タンパク質は、カルシウム依存性糖類認識ドメインを有する
ＩＩ型膜レクチンである。マウス、ラットおよびニワトリのクップファーレセプ
ターとのアミノ酸相同性が見出されており、そしてランゲリンが抗原捕捉に対す
るランゲリン細胞特異的レセプターとして機能するという支持を提供する。糖類
認識ドメインモチーフＥＰＮは、糖部分がおそらくマンノースおよびグルコース
であることを支持する。
【００２２】
当業者が他のタンパク質からランゲリンを区別することを可能にする特徴の同
定は、以下に列挙される。
・ＤＣＧＭ４モノクローナル抗体に特異的に結合する
・Ｎ−グリコシル化形態のタンパク質（約４０ＫＤ）（還元型または非還元型の
両方で５．２〜５．５のｐＩを有し、かつ鎖間ジスルフィド結合を欠く）
・ＤＣ細胞のサブセットで発現される
・通常、ランゲルハンス細胞の細胞表面上に発現される。
・ＤＣＧＭ４との結合後に、ランゲリンは、エンドサイトーシス被覆小孔内に輸
送され、そして細胞膜サンドイッチに加わり；続いて、ランゲリンは、バーベッ
ク顆粒と会合する。
【００２３】
ｍＡｂ  ＤＣＧＭ４が精製された、ＤＣＧＭ４と命名された、クローン化に由
来するハイブリドーマ細胞株の細胞が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ、ＵＳＡに１９９８年９月２
２日に、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２５７６の下に寄託された。
【００２４】
本発明は、本明細書中に記載される特定の方法、組成物および抗体に限定され
ないことが理解されるべきである。なぜなら、このような方法、組成物および抗
体は、当然、変動し得るからである。本明細書中で使用される用語は、特定の実
施態様のみを記載する目的のためであると理解されるべきであり、そして添付の
特許請求の範囲によってのみ限定される、本発明の範囲を限定すると意図されな
い。
【００２５】
（ＩＩ．抗体）
抗体は、種々の哺乳動物（例えば、霊長類）のランゲリンタンパク質およびそ
のフラグメントに対して、天然に存在するネイティブ形態およびそれらの組換え
形態の両方（この差異は、活性ランゲリンに対する抗体は、ネイティブな高次構
造のみに存在するエピトープを認識するようであることである）において、惹起
され得る。変性した抗原の検出はまた、例えば、ウエスタン分析において有用で
ある。抗イディオタイプ抗体もまた、意図される。これは、天然ランゲリンタン
パク質または抗体のアゴニストまたはアンタゴニストとして有用である。
【００２６】
所定のフラグメントまたはこのタンパク質全体（例えば、配列番号２に示され
るアミノ酸配列を有するタンパク質）に対する抗体（結合フラグメントおよび単
鎖バージョンを含む）は、動物の免疫によって惹起され得る。モノクローナル抗
体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常タンパ
ク質または欠損タンパク質に対する結合についてスクリーニングされ得るか、あ
るいはアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性についてスクリーニングされ得
る。これらのモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約１ｍＭ、より通常には
、少なくとも約３００μＭ、代表的には、少なくとも約１００μＭでより代表的
には、少なくとも３０μＭ、好ましくは少なくとも約１０μＭ、およびより好ま
しくは、少なくとも約３μＭ以下のＫDで結合する。
【００２７】
ＤＣＧＭ４により例示される抗体（抗原結合フラグメントを含む）は、重要な
診断的または治療的価値を有し得る。それらは、ランゲリンに結合する強力なア
ンタゴニストであり得、そして結合パートナーの相互作用を阻害し得るか、また
は生物学的応答を媒介する相互作用の能力を阻害し得る。それらはまた、非中和
抗体として有用であり得、そして毒素または放射性核種に結合して、その結果、
抗体が抗原に結合する場合に、抗原を（例えば、その表面上に）発現している細
胞が殺傷され得る。さらに、この抗体は、直接的またはリンカーによって間接的
にかのいずれかで、薬物または他の治療剤に結合体化され得、そして薬物標的化
をもたらし得る。
【００２８】
本発明の抗体はまた、診断適用に有用であり得る。捕捉抗体または非中和抗体
として、それらは、免疫系の細胞（例えば、未成熟ＤＣ）上のランゲリン機能を
阻害することなく、ランゲリンを結合し得る。中和抗体として、それらは、競合
結合アッセイにおいて有用であり得る。それらはまた、ランゲリンタンパク質ま
たはその結合パートナーを検出または定量する際に有用である。それらは、ウエ
スタンブロット分析ついての、またはランゲリンタンパク質の免疫沈降もしくは
免疫精製についての試薬として使用され得る。それらはまた、例えば、免疫系の
生理学的状態を決定するために、細胞集団を評価する際に有用である。
【００２９】
抗原フラグメントは、免疫原として使用される融合ポリペプチドまたは共有結
合したポリペプチドのように、他の物質、特にポリペプチドに連結され得る。こ
の抗原は、以下に記載されるように（抗体（例えば、ＤＣＧＭ４）を使用する免
疫アフィニティー法を含む）、精製され得る。抗原およびそのフラグメントは、
種々のキャリア（例えば、キーホルリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミ
ン、破傷風トキソイドなど）に融合または共有結合され得る。例えば、Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｏｅｂｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｈａｒ
ｐｅｒおよびＲｏｗ、１９６９；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ（１９６２）Ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｄｏｖ
ｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ならびにＷｉｌｌｉａｍ
ｓら（１９６７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍ
ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（これらの各々が、ポリクローナル抗血清を調製する方法の記載につ
いて、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。代表的な方法は、抗
原を用いる、動物の超免疫を含む。次いで、動物の血液は、反復免疫の直後に収
集され、そしてγグロブリンが単離される。
【００３０】
いくつかの例では、種々の哺乳動物宿主（例えば、マウス、げっ歯類、霊長類
、ヒトなど）からモノクローナル抗体を調製することが所望される。このような
モノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら（
編）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）
、Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｏｓ  Ａｌｔｏ
ｓ、ＣＡ、およびその中で引用される参考文献；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（
１９９８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、
ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）
Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ならびに特に、Ｋｏｈｌｅ
ｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７
（これは、モノクローナル抗体を作製する１つの方法を議論している）中に見出
され得る。これらの参考文献の各々は、本明細書中に参考として援用される。簡
潔に要約すると、この方法は、動物に免疫原を注射することを包含する。次いで
、動物は屠殺され、次いで、その脾臓から採取された細胞は、骨髄腫細胞と融合
される。この結果は、インビトロで繁殖し得るハイブリッド細胞または「ハイブ
リドーマ」である。次いで、ハイブリドーマの集団は、個々のクローン（これら
の各々は、免疫原に対する単一の抗体種を分泌する）を単離するためにスクリー
ニングされる。この様式では、得られた個々の抗体種は、免疫原物質に対して認
識される特定の部位に応答して作製された免疫動物に由来する、不死化されかつ
クローン化された単一のＢ細胞の産物である。
【００３１】
他の適切な技術は、抗原ポリペプチドへのリンパ球のインビトロでの曝露、あ
るいはファージまたは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選択を含む
。Ｈｕｓｅら（１９８９）「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｒｇｅ  Ｃｏｍ
ｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂ
ｕｌｉｎ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ」、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１；およびＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔ
ｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６（これらの各々が、参考として本明細書によっ
て本明細書中に援用される）を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗体（
キメラ抗体またはヒト化抗体を含む）は、改変してか、または改変せずに使用さ
れ得る。しばしば、これらのポリペプチドおよび抗体は、共有結合的または非共
有結合的かのいずれかによって、検出可能なシグナルを提供する物質を連結する
ことによって標識される。広範な種々の標識技術および結合体化技術が公知であ
り、そして科学文献および特許文献の両方において広範に報告されている。適切
な標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学
発光部分、磁気粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許に
は、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９
３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第
４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。組換え
免疫グロブリンが、産生され得るか（Ｃａｂｉｌｌｙ、米国特許番号４，８１６
，５６７を参照のこと）；またはトランスジェニックマウスで作製され得る（Ｍ
ｅｎｄｅｚら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６〜１
５６を参照のこと）。これらの特許は、参考として本明細書中に援用される。
【００３２】
本発明の抗体はまた、タンパク質を単離する際のアフィニティークロマトグラ
フィーのために使用され得る。抗体が固体支持体（例えば、アガロース、Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘなどのような粒子）に結合されるカラムが、調製され得、ここで細胞
溶解物がこのカラムに通され得、このカラムを洗浄し、引き続く漸増濃度の穏や
かな界面活性剤により、この精製されたランゲリンタンパク質が放出される。あ
るいは、この抗体は、抗原を含む分画したサンプルを定量および同定するために
使用され得る。標準的なタンパク質精製手順（例えば、クロマトフラフィー）は
、ランゲリンが分離する画分を同定するために例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを用
いて、ランゲリンタンパク質を富化および精製するために使用され得る。
【００３３】
精製タンパク質は、配列決定される。この配列は、プライマーまたはプローブ
として有用なオリゴヌクレオチド配列の選択を可能にする。あるいは、この配列
は、さらなる抗体を作製するために、ポリペプチドセグメントの生成を可能にす
る。さらに、精製タンパク質は、免疫のために使用され得、これにより、ポリク
ローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生が可能になる。
【００３４】
これらの抗体はまた、特定の発現産物について、発現ライブラリーをスクリー
ニングするために使用され得る。通常、このような手順において使用されるこれ
らの抗体は、抗体結合により抗原の存在の容易な検出を可能にする部分を用いて
、標識される。このことは、抗原をコードする核酸（例えば、ベクター）を発現
する細胞を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析による単離、および富化を可
能にする。あるいは、本発明の抗体を使用するアフィニティー方法は、例えば、
ベクターにコードされたランゲリンを発現している細胞を固定し、そして分離す
るために使用され得る。
【００３５】
各々のランゲリンタンパク質に対して惹起された抗体は、抗イディオタイプ抗
体を惹起するのにもまた有用である。これらは、それぞれの抗原の発現に関連す
る種々の免疫学的状態を検出または診断する際に有用である。
【００３６】
（ＩＩＩ．精製されたランゲリンタンパク質）
ヒトランゲリンタンパク質は、標準的な生化学的精製技術を使用して、そして
／または特定の分画手順において抗原の存在を決定するための抗体の使用によっ
て、天然の供給源から単離され得る。精製されたタンパク質は、このようなセグ
メントを認識するためのさらなる抗体を生成するために、ペプチドの配列決定お
よび調製の両方を可能にする。本明細書中で使用されるように、タンパク質の文
脈で使用される場合、ランゲリンは、天然状態で、上記に列挙された特性を示す
か、またはこのようなタンパク質（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列
またはそのサブ配列を有するタンパク質）の有意なフラグメントを示すタンパク
質を含む。それはまた、類似の生物学的機能を示すか、またはランゲリンタンパ
ク質特異的結合成分と相互作用する、哺乳動物（例えば、霊長類）由来のポリペ
プチドをいう。これらの結合成分（例えば、抗体）は、代表的には、高い親和性
で（例えば、少なくとも約１００ｎＭで、通常約３０ｎＭよりもより良好に、好
ましくは約１０ｎＭよりもより良好に、およびより好ましくは約３ｎＭよりもよ
り良好に）、ランゲリンタンパク質に結合する。１つのこのような好ましい結合
成分は、抗体ＤＣＧＭ４である。
【００３７】
精製されたタンパク質またはペプチドフラグメントは、以下に記載されるよう
に、標準的な方法によって抗体を生成するために有用である。合成ペプチドまた
は精製されたタンパク質は免疫系に提示され、特異的な結合組成物（例えば、モ
ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）を生成し得る。例えば、Ｃｏｌｉ
ｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（
１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ
Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【００３８】
用語ポリペプチドは、本明細書中で使用される場合、有意なフラグメントまた
はセグメントを含み、そして、少なくとも約８アミノ酸、一般的には少なくとも
１０アミノ酸、より一般的には、少なくとも１２アミノ酸、しばしば少なくとも
１４アミノ酸、よりしばしば、少なくとも１６アミノ酸、代表的には少なくとも
１８アミノ酸、より代表的には、少なくとも２０アミノ酸、通常少なくとも２２
アミノ酸、より通常には、少なくとも２４アミノ酸、好ましくは少なくとも２６
アミノ酸、より好ましくは、少なくとも２８アミノ酸、および、特に好ましい実
施態様において、少なくとも約３０以上のアミノ酸の、アミノ酸残基のストレッ
チを含む。好ましくは、そのフラグメントは、全長ランゲリンと共通した生物学
特性を示す（例えば、エピトープの共有を含む免疫学的活性）。
【００３９】
実質的に純粋なとは、ポリペプチドの文脈において、代表的には、タンパク質
が他の夾雑タンパク質、核酸、およびもともとの供給源の生物に由来する他の生
物学的物質を含まないことを意味する。純度は、標準的な方法によってアッセイ
され得、そして通常少なくとも約４０％純粋、より通常には少なくとも約５０％
純粋、一般的には少なくとも約６０％純粋、より一般的には少なくとも約７０％
純粋、しばしば少なくとも約７５％純粋、よりしばしば少なくとも約８０％純粋
、代表的には少なくとも約８５％純粋、より代表的には少なくとも約９０％純粋
、好ましくは少なくとも約９５％純粋、より好ましくは約９８％純粋、および最
も好ましい実施態様において、少なくとも９９％純粋である。分析は、例えば、
ゲル染色、分光光度法、または末端標識によって評価された重量パーセンテージ
またはモル濃度パーセンテージであり得る。
【００４０】
結合組成物または薬剤とは、例えば、リガンド−レセプター型様式で、抗体−
抗原相互作用で、または化合物（例えば、ランゲリンタンパク質と特異的に結合
するタンパク質（例えば、共有結合的または非共有結合的のいずれかの、天然の
生理学的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用において））で、ランゲリ
ンタンパク質に特異的に結合する分子をいう。この分子は、ポリマーまたは化学
試薬であり得る。これは、結合親和性と、結合特異性または結合選択性との両方
を含む。機能的アナログは、構造的な修飾を有するタンパク質であり得るか、ま
たは全体として関連しない分子（例えば、適切な結合決定基と相互作用する分子
形状を有する）であり得る。タンパク質は、レセプターのアゴニストまたはアン
タゴニストとして役立ち得る。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎら（編、１９９０）Ｇｏ
ｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第８版）Ｐｅｒｇａｍｏｎ  
Ｐｒｅｓｓ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
【００４１】
抗体およびランゲリン抗原の両方の可溶性フラグメントは、本発明によって提
供される。ポリペプチドまたはフラグメントの可溶性は、その環境およびポリペ
プチドに依存する。多くのパラメーター（温度、電解質環境、ポリペプチドのサ
イズおよび分子的特性、ならびに溶媒の性質を含む）が、ポリペプチドの可溶性
に影響を与える。代表的には、ポリペプチドが使用される温度は、約４℃〜約６
５℃の範囲である。通常、使用の温度は約１８℃よりも高く、そしてより通常に
は、約２２℃よりも高い。診断目的のために、その温度は、通常、およその室温
以上であるが、しかしアッセイにおける成分の変性温度よりも低い。治療目的の
ために、その温度は、通常、体温であり、代表的にはヒトについては３７℃であ
るが、特定の状況下では、その温度はインサイチュまたはインビトロで上昇また
は低下され得る。
【００４２】
電解質は、通常、インサイチュの生理学的条件を模倣するが、有利である場合
、より高いイオン強度またはより低いイオン強度に改変され得る。実際のイオン
は、例えば、生理学的内容物または分析的内容物において使用される標準的緩衝
液に適合させるために改変され得る。
【００４３】
ポリペプチドのサイズおよび構造は、一般的に、実質的に安定な状態にあり、
そして通常、変性状態にはないのが当然である。ポリペプチドは、例えば、可溶
性を付与するために、四次構造において他のポリペプチドと結合され得るか、ま
たは天然の脂質二重層相互作用を模倣する様式で、脂質または界面活性剤と結合
され得る。
【００４４】
溶媒は、通常、生物学的活性の保存のために使用される型の生物学的に適合可
能な緩衝液であり、そして通常、生理学的な溶媒を模倣する。通常、その溶媒は
、中性のｐＨ、代表的には約５と１０との間のｐＨ、そして好ましくは約７．５
のｐＨを有する。いくつかの場合では、界面活性剤（穏やかな非変性性のもの、
例えば、ＣＨＳもしくはＣＨＡＰＳ、または抗原の構造的または生理学的特性の
有意な破壊を避けるに十分な低濃度）が添加される。
【００４５】
Ｓｖｅｄｂｅｒｇ単位で測定される沈降は、可溶性を反映し、この単位は、特
定の条件下での分子の沈降速度の尺度である。沈降速度の決定は、古典的には、
分析用超遠心分離において実行されたが、現在、代表的には標準的な超遠心分離
において実行される。Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ（１９８２）Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第２版）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ；およびＣａｎｔ
ｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ（１９８０）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、第１部〜第３部、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａ
ｎｃｉｓｃｏを参照のこと；これらの各々は、それによって本明細書中に参考と
して援用される。大まかな決定として、推定の可溶性ポリペプチドを含むサンプ
ルは、標準的なフルサイズの超遠心分離において、約１０分間、約５０ｋ  ｒｐ
ｍにおいて遠心分離され、そして可溶性分子は、上清に残存する。可溶性粒子ま
たはポリペプチドは、代表的には、約３０Ｓ未満、より代表的には、約１５Ｓ未
満、通常約１０Ｓ未満、より通常には約６Ｓ未満、および、特定の実施態様にお
いて、好ましくは約４Ｓ未満、およびより好ましくは、約３Ｓ未満である。
【００４６】
規定された免疫原に対して産生された抗体と特異的に結合するか、または特異
的に免疫反応性であるランゲリンタンパク質（例えば、本発明のランゲリンタン
パク質からなる免疫原）は、代表的には、イムノアッセイにおいて決定される。
このイムノアッセイは、代表的には、例えば、本発明のランゲリンに対して惹起
されたポリクローナル抗血清を使用する。この抗血清は、他の潜在的なランゲリ
ンファミリーメンバー（例えば、好ましくは、同じ種からのランゲリンタンパク
質の対立遺伝子改変体）に対して、低い交差反応性を有するように選択され、そ
して任意のそのような交差反応性は、イムノアッセイにおける使用の前に、免疫
吸着によって除去される。
【００４７】
イムノアッセイにおける使用のために、抗血清を産生するために、本発明のラ
ンゲリンタンパク質は、本明細書中に記載されるように単離される。例えば、本
明細書中に記載される方法を用いるランゲリン核酸配列の決定後に、組換えタン
パク質が、哺乳動物細胞系統において産生され得る。適切な宿主（例えば、Ｂａ
ｌｂ／ｃのような近交系のマウスの株）は、選択されたタンパク質を用いて、代
表的には、標準的なアジュバント（例えば、Ｆｒｅｕｎｄアジュバント）および
標準的なマウス免疫プロトコルを使用して免疫される（ＨａｒｌｏｗおよびＬａ
ｎｅ、前出を参照のこと）。あるいは、ランゲリン核酸配列由来の合成ペプチド
が、キャリアタンパク質に結合体化され得、そして引き続いて免疫原として使用
され得る。ポリクローナル血清は収集され、そしてイムノアッセイ（例えば、固
体支持体上に固定された免疫原を用いる固相イムノアッセイ）における免疫原タ
ンパク質に対して力価測定される。１０4以上の力価を有するポリクローナル抗
血清が選択され、そして、競合的結合イムノアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗお
よびＬａｎｅ、前出、５７０〜５７３頁において記載されるもの）を使用して、
他のランゲリン変異体（例えば、ランゲリン対立遺伝子改変体）に対する交差反
応性について試験される。好ましくは、少なくとも２つのランゲリン改変体が、
この決定において使用される。これらのランゲリンファミリーメンバーは、本明
細書中に記載される標準的な分子生物学的技術およびタンパク質化学技術を使用
して、組換えタンパク質として産生され得、そして単離され得る。
【００４８】
競合的結合様式におけるイムノアッセイは、交差反応性の決定のために使用さ
れ得る。例えば、本発明のランゲリンタンパク質は、固体支持体に固定化され得
る。このアッセイに添加されるタンパク質は、固定化された抗原への抗血清の結
合と競合する。固定化されたタンパク質への抗血清の結合と競合する上記のタン
パク質の能力は、ランゲリンタンパク質に匹敵する。上記のタンパク質について
の交差反応性パーセントが、標準的な計算を用いて算出される。上記に列挙され
るタンパク質のそれぞれと１０％より低い交差反応性を有する抗血清が選択され
、そしてプールされる。次いで、交差反応性の抗体が、上記に列挙されたタンパ
ク質を用いる免疫吸着によって、プールされた抗血清から除去される。
【００４９】
次いで、免疫吸着され、そしてプールされた抗血清は、第２のランゲリンタン
パク質を免疫原タンパク質（例えば、ランゲリン対立遺伝子改変体）と比較する
ために、上記のように競合的結合イムノアッセイにて使用される。この比較のた
めに、２つのタンパク質は、それぞれ、広範な濃度でアッセイされ、そして固定
化されたタンパク質に対する抗血清の結合を５０％阻害するのに必要な各タンパ
ク質の量が決定される。必要とされる第２のタンパク質の量が、必要とされる選
択されたタンパク質（単数または複数）のタンパク量の２倍より少なければ、第
２のタンパク質は、免疫源に対して生成された抗体に特異的に結合するといわれ
る。
【００５０】
本発明のランゲリンタンパク質は、本明細書中で特徴付けられたタンパク質で
あるだけではなく、また、対立遺伝子改変体、非対立遺伝子改変体、または種改
変体である他のランゲリンタンパク質であることが理解される。その用語は、通
常の組換え技術を使用する意図的な変異（例えば、単一部位変異）によって、ま
たは、それぞれのタンパク質をコードするＤＮＡの短い部分の切除によって、ま
たはランゲリン配列への新規なアミノ酸の置換、もしくは新規なアミノ酸の付加
によって導入された非天然の変異を含むこともまた、理解される。このようなマ
イナーな変化は、代表的には、もともとの分子の免疫同一性および／またはその
生物学的活性を実質的に維持する。従って、これらの変化は、指定された天然に
存在するランゲリンタンパク質と特異的に免疫反応性であるタンパク質を含む。
改変されたタンパク質の生物学的特性は、適切な細胞株においてタンパク質を発
現すること、および適切な効果（例えば、インビトロにおけるＤＣ細胞上で）を
測定することによって決定され得る。マイナーであると見なされる特定のタンパ
ク質改変には、類似の化学的特性を有するアミノ酸の保存的置換が含まれる。タ
ンパク質を、ランゲリンタンパク質と任意に整列することによって、そして免疫
同一性を決定するために本明細書中に記載されるような従来のイムノアッセイを
使用することによって、本発明のタンパク質組成物を決定し得る。
【００５１】
（ＩＶ．物理的改変体）
本発明はまた、上記の天然の哺乳動物ランゲリンタンパク質または抗体と実質
的なアミノ酸配列相同性を有するタンパク質またはペプチドを含む。その改変体
は、種改変体および対立遺伝子改変体を含む。当業者は、改変体の以下の議論の
多くが、ランゲリン抗原とそれを認識する抗体との両方の改変体に適用すること
を認識する。
【００５２】
アミノ酸配列相同性、または配列同一性は、残基の一致を最適化することによ
って、必要な場合には、必要とされるギャップを導入することによって決定され
る。これは、一致するような保存的置換を考慮した場合に変化する。保存的置換
は、代表的には、以下の基内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イ
ソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタ
ミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チ
ロシン。相同アミノ酸配列は、代表的には、各それぞれのタンパク質配列におけ
る天然の対立遺伝子変動および種間の変動を含むことが意図される。代表的な相
同タンパク質またはペプチドは、ランゲリンタンパク質のアミノ酸配列と、２５
〜１００％相同性（ギャップが導入され得る場合）から５０〜１００％相同性（
保存的置換が含まれる場合）までを有する。相同性の尺度は、少なくとも約３５
％、一般的に少なくとも４０％、より一般的には、少なくとも４５％、しばしば
少なくとも５０％、よりしばしば少なくとも５５％、代表的には少なくとも６０
％、より代表的には少なくとも６５％、通常少なくとも７０％、より通常には少
なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、およびより好ましくは少なくと
も８０％、ならびに、特定の実施態様において、少なくとも８５％以上である。
Ｎｅｅｄｌｅｈａｍら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５
３；Ｓａｎｋｏｆｆら（１９８３）Ｔｉｍｅ  Ｗａｒｐｓ，Ｓｔｒｉｎｇ  Ｅｄ
ｉｔｓ，ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎ
ｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ、第１
章、Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＭＡ；およびＩｎｔｅｌ
ｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；およびＵｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩからのソフトウェアパッケージもまた参照
のこと；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される。
【００５３】
ランゲリンタンパク質をコードする以下に記載のように単離される、単離され
たＤＮＡは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、および
ヌクレオチドストレッチの反転によって容易に改変され得る。これらの改変は、
これらの抗原、それらの誘導体、または類似の生理学的活性、免疫学的活性、も
しくは抗原性活性を有するタンパク質をコードする、新規なＤＮＡ配列を生じる
。これらの改変された配列は、変異体抗原を産生するために、または発現を増強
するために使用され得る。増強された発現は、遺伝子増幅、転写の増加、翻訳の
増加、および他の機構を含み得る。このような変異体ランゲリンタンパク質誘導
体は、それぞれのタンパク質またはそのフラグメントのあらかじめ決定された変
異または部位特異的変異を含む。「変異体ランゲリンタンパク質」は、欠失、置
換、または挿入を経由するにかかわらず、天然に見出されるようなランゲリンタ
ンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する以外は、上記に示した
ようなヒトランゲリンタンパク質の相同性の定義内に収まるポリペプチドを含む
。特に、「部位特異的変異体ランゲリンタンパク質」は、一般的に、本明細書中
に記載される特性を有する天然のタンパク質と有意な相同性を有するか、そして
／または、これらの配列と種々の生物学的活性（例えば、抗原性または免疫原性
）を共有するタンパク質を含み、ならびに、好ましい実施態様において、例えば
、単一置換の天然の形態のタンパク質を含む。同様のコンセプトは、異なるラン
ゲリンタンパク質（特に、種々の哺乳動物（例えば、ヒトを含む霊長類）中に見
出されるタンパク質）に適用する。以前に言及したように、記載は、一般的に、
すべての哺乳動物ランゲリンタンパク質を含むことを意味することが強調される
。
【００５４】
部位特異的変異部位は、あらかじめ決定されるが、変異は部位特異的である必
要はない。ランゲリンタンパク質変異誘発は、アミノ酸挿入または欠失を作製す
ることによって行われ得る。置換、欠失、挿入、または任意の組み合わせは、最
終構築物に到達するために生成され得る。挿入は、アミノ末端融合物またはカル
ボキシ末端融合物を含む。ランダム変異誘発が、標的コドンにおいて行われ、次
いで、発現された変異体が、所望の活性についてスクリーニングされ得る。既知
の配列を有するＤＮＡにおいてあらかじめ決定された部位で置換変異を作製する
方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発また
はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術による）。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８
９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７および補遺）もまた参照のこと。
【００５５】
ＤＮＡにおける変異は、通常、コード配列をリーディングフレーム外に配置す
るべきではなく、そして好ましくは、ハイブリダイズしてｍＲＮＡの二次構造（
例えば、ループまたはヘアピン）を産生し得る相補性領域を生成しない。
【００５６】
本発明はまた、組換えタンパク質（例えば、これらのタンパク質由来のセグメ
ントを使用する異種融合タンパク質）を提供する。異種融合タンパク質は、同じ
様式で、天然であるが通常ではなく融合する、タンパク質またはセグメントの融
合である。従って、ランゲリンポリペプチドと免疫グロブリンとの融合産物は、
典型的なペプチド結合で融合する配列を有する連続するタンパク質分子であり、
代表的には、単一の翻訳産物として作製され、そして各々の供給源ペプチド由来
の特性を示す。同様のコンセプトは、異種核酸配列に適用する。
【００５７】
さらに、新規な構築物が、他のタンパク質由来の類似の機能的ドメインを組み
合わせることから作製され得る。例えば、抗原結合セグメントまたは他のセグメ
ントは、異なる新規の融合ポリペプチドまたはフラグメントの間で、「交換」さ
れ得る。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３
：１３３０−１３３６；およびＯ’Ｄｏｗｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６３：１５９８５−１５９９２を参照のこと、これらのそれぞれは、本
明細書中に参考として援用される。従って、特異性の新規な組み合わせを示す新
規なキメラポリペプチドは、生物学的に関連するドメインおよび他の機能的ドメ
インの機能的結合から生じる。
【００５８】
ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅ
ｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２によって記載されるホスホルアミダイト法は
、適切な合成ＤＮＡフラグメントを産生する。二本鎖フラグメントは、しばしば
、相補鎖を合成することおよび適切な条件下で相補鎖を互いにアニーリングする
ことによって、または適切なプライマー配列を用いてＤＮＡポリメラーゼを使用
して相補鎖を付加することによって（例えば、ＰＣＲ技術）のいずれかで得られ
る。
【００５９】
（Ｖ．機能的改変体）
ランゲリンタンパク質によって媒介される生理学的応答のブロッキングは、そ
の天然の結合パートナーに対する抗原の結合の阻害から（例えば、競合的阻害を
通して）得られ得る。従って、本発明のインビトロアッセイは、しばしば、単離
されたタンパク質、組換え膜結合ランゲリンタンパク質を発現する細胞由来の膜
、結合セグメントを含む可溶性フラグメント、または固相基材に結合したフラグ
メントを使用する。これらのアッセイはまた、結合セグメントの変異および改変
、またはタンパク質変異および改変（例えば、アナログ）のいずれかの効果の診
断的決定を可能にする。特に、ランゲリンは、ＤＣクローン上で発現されるが、
抗原は、ＤＣ細胞成熟後に失われる。
【００６０】
本発明はまた、競合的薬物スクリーニングアッセイの使用を意図する（例えば
、抗原フラグメントまたは結合パートナーフラグメントに対する中和抗体が、タ
ンパク質に対する結合についての試験化合物と競合する場合に）。この様式にお
いて、抗体は、タンパク質の１つ以上の抗原結合部位を共有し、そしてさもなく
ば結合パートナーと相互作用し得るタンパク質上の結合部位を占めるためにもま
た使用され得る、任意のポリペプチドの存在を検出するために使用され得る。
【００６１】
さらに、ランゲリンタンパク質および高親和性結合部位を含むその抗原の可溶
性フラグメントに対する中和抗体を使用して、細胞または組織（例えば、異常な
生理または所望でない生理を経験している、細胞あるいは組織）における抗原機
能を阻害し得る。ランゲリン抗原および抗体の、「誘導体」は、アミノ酸配列変
異体、グリコシル化改変体、および他の化学部分との共有結合体または凝集結合
体を含む。共有結合性誘導体は、当該分野で周知の手段によって、ランゲリンア
ミノ酸側鎖中か、あるいはＮ末端またはＣ末端に見出される基に対する官能基の
連結によって調製され得る。これらの誘導体は、以下を含むが、これらに限定さ
れない：カルボキシル末端またはカルボキシル側鎖を含有する残基の脂肪族エス
テルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基のＯ−アシル誘導体、およびアミノ
末端アミノ酸またはアミノ基含有残基（例えば、リジンまたはアルギニン）のＮ
−アシル誘導体。アシル基は、Ｃ３〜Ｃ１８の通常のアルキルを含むアルキル部
分の基から選択され、それによってアルカノイルアロイル種を形成する。キャリ
アタンパク質への共有結合は、免疫原性部分がハプテンである場合に重要であり
得る。
【００６２】
特に、グリコシル化改変としては、例えば、ポリペプチドの合成およびプロセ
シングの間、またはさらなるプロセシング工程において、ポリペプチドのグリコ
シル化パターンを修飾することによって作製されるものが挙げられる。このこと
を達成するための特に好ましい手段は、このようなプロセシングを正常に提供す
る細胞由来のグリコシル化酵素（例えば、哺乳動物グリコシル化酵素）に対して
、ポリペプチドを曝露することによる。脱グリコシル化酵素もまた、意図される
。他の微小な改変（リン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセ
リンまたはホスホスレオニン）を含む）を有する同じ一次アミノ酸配列のバージ
ョンもまた、含まれる。
【００６３】
誘導体の主なグループは、ランゲリンタンパク質またはそのフラグメントの、
他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合体である。これらの誘導体は、
Ｎ末端融合体またはＣ末端融合体のように組換え培養物において、または反応性
側鎖を介するタンパク質の架橋においてその有用性が当該分野で公知である薬剤
の使用によって、合成され得る。架橋剤による好ましい抗原誘導体化部位は、遊
離アミノ基、糖部分、およびシステイン残基である。
【００６４】
ランゲリンタンパク質と他の同種タンパク質または異種タンパク質との間の融
合ポリペプチドもまた、提供される。同種のポリペプチドは、異なる表面マーカ
ー間の融合体であり得、例えば、レセプター結合特異性を示すハイブリッドタン
パク質を生じる。同様に、異種融合体が構築され得、これは、その誘導体タンパ
ク質の特性または活性を組み合わせて示す。代表的な例は、レセプターポリペプ
チド（例えば、ルシフェラーゼ）の、抗原のアミノ酸のセグメントまたはドメイ
ン（例えば、結合セグメント）との融合体であり、その結果、その融合抗原の存
在または位置が、容易に決定され得る。例えば、Ｄｕｌｌら、米国特許第４，８
５９，６０９号（本明細書中に参考として本明細書によって援用される）を参照
のこと。他の遺伝子融合パートナーとしては、細菌性β−ガラクトシダーゼ、ｔ
ｒｐＤ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロ
ゲナーゼおよび酵母α接合因子が挙げられる。例えば、Ｇｏｄｏｗｓｋｉら（１
９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：８１２−８１６を参照のこと。
【００６５】
ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｒｔｒａ．Ｌ
ｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２によって記載されるホスホラミダイト法は
、適切な合成ＤＮＡフラグメントを生成する。二本鎖フラグメントは、しばしば
、相補鎖を合成し、そして適切な条件下で相補鎖を共にアニーリングすることに
よって得られるか、またはＤＮＡポリメラーゼを用いて適切なプライマー配列を
相補鎖に付加することによって得られるかのいずれかである。
【００６６】
このようなポリペプチドはまた、リン酸化、スルホン化、ビオチン化、または
他の部分（特に、リン酸基と類似の分子形状を有する部分）の付加もしくは除去
によって化学的改変されているアミノ酸残基を有し得る。いくつかの実施態様に
おいて、この改変は、有用な標識試薬であるか、または精製標的（例えば、親和
性リガンド）として作用する。
【００６７】
融合タンパク質は、代表的には、組換え核酸方法か、または合成ペプチド方法
のいずれかによって作製される。核酸の操作および発現のための技術は、一般的
に、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｌら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｕｒ．．編）、第１〜３版
、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（これは、参
考として本明細書中に援用される）に記載される。ポリペプチド合成のための技
術は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８
５：２１４９−２１５６；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  
２３２：３４１−３４７；およびＡｔｈｅｒｔｏｎら（１９８９）Ｓｏｌｉｄ  
Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  
Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ；およびＤａｗｓｏｎら
（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９（これらの各々は、参考
として本明細書中に援用される）に記載される。
【００６８】
本発明はまた、ランゲリンタンパク質の、アミノ酸配列における改変またはグ
リコシル化以外の誘導体の使用を意図する。このような誘導体は、化学部分との
共有結合または凝集結合を含み得る。これらの誘導体は、一般的に、以下の３つ
のクラスに分類される：（１）塩、（２）側鎖および末端残基の共有結合的改変
、および（３）吸着複合体（例えば、細胞膜との）。このような共有結合誘導体
または凝集誘導体は、免疫原として、イムノアッセイの試薬として、あるいは抗
原または他の結合タンパク質のアフィニティー精製のためのような精製方法にお
いて、有用である。例えば、ランゲリン抗原は、抗ランゲリンタンパク質抗体ま
たは他の結合パートナーのアッセイまたは精製における使用のために、当該分野
で周知の方法によって、共有結合によって固体支持体（例えば、臭化シアン活性
化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に固定化され得るか、あるいはグルタルアルデヒド架橋
を用いて、または用いずに、ポリオレフィン表面上に吸着され得る。ランゲリン
抗原はまた、検出可能な基で標識され得、例えば、クロラミンＴ手順によって放
射ヨウ素標識されるか、希土類キレート剤に共有結合されるか、または診断アッ
セイにおける使用のための別の蛍光部分に結合体化される。ランゲリンタンパク
質の精製は、固定化された抗体または結合パートナーによってもたらされ得る。
【００６９】
本発明の可溶化されたランゲリン抗原またはフラグメントは、このタンパク質
またはそのフラグメントに特異的な抗血清または抗体の産生のための免疫原とし
て使用され得る。この精製された抗原は、このタンパク質を含む種々の形態の不
純調製物での免疫によって調製された、モノクローナル抗体または結合フラグメ
ントをスクリーニングするために使用され得る。詳細には、天然の抗体の抗原結
合フラグメントは、しばしば、その抗体自体と等価である。精製されたランゲリ
ンタンパク質はまた、このタンパク質またはこの抗原を含む細胞フラグメント（
これらの両方は、異常なまたは特定の、生理学的状態あるいは疾患状態の診断に
有用であり得る）の上昇レベルの存在に応答して産生された任意の抗体を検出す
るための試薬として使用され得る。さらに、抗原フラグメントはまた、すぐ以下
に記載されるように、本発明のさらなる抗体を産生するための免疫原として作用
し得る。例えば、本発明は、表１に記載される特性を有するタンパク質またはそ
のフラグメント由来のアミノ酸配列に対して惹起される抗体を意図する。詳細に
は、本発明は、脂質二重層の外側に存在すると予測される特定のフラグメント（
例えば、細胞外ドメイン構造または細胞内ドメイン構造）に対する結合親和性を
有するか、またはそれらのフラグメントに対して惹起される抗体を意図する。
【００７０】
本発明はまた、構造、発現および機能において、差示性および類似性の両方を
示す関連する抗原の群を単離するための手段を提供する。この抗原の多くの生理
学的効果の解明は、一般的に、異なる種の改変体の単離および特徴付けによって
格段に加速される。詳細には、本発明は、異なる種において、さらなる相同な遺
伝的実体の同定のための有用なプローブを提供する。
【００７１】
単離された遺伝子は、対応するランゲリンタンパク質の発現を欠失する細胞（
例えば、対応する抗原を欠失し、そしてネガティブなバックグラウンドの生物学
的活性を示すはずである、種型または細胞のいずれか）の形質転換を可能にする
。形質転換された遺伝子の発現は、規定された種改変体または単一の種改変体を
有する、抗原性的に純粋な細胞株の単離を可能にする。このアプローチは、ラン
ゲリンタンパク質の生理学的効果のより高感度の検出および区別を可能にする。
細胞成分フラグメント（例えば、細胞質体または膜のフラグメント）もまた、単
離および使用され得る。
【００７２】
このタンパク質によって提供される種々の生理学的機能または分化機能をもた
らす重要な構造エレメントの分析は、近代の分子生物学の標準的な技術（特に、
関連するクラスのメンバーの比較における）を使用して可能である。例えば、Ｃ
ｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１３３９−１３３
６に記載されるホモログスキャニング変異誘発技術；ならびにＯ’Ｄｏｗｄら（
１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｍ．２６３：１５９８５−１５９９２；およびＬ
ｅｃｈｌｅｉｔｅｒら（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９：４３８１−４３９０に使
用されるアプローチ（これらの各々は、参考として本明細書中に援用される）を
参照のこと。
【００７３】
詳細には、機能的ドメインまたはセグメントは、種改変体または関連するタン
パク質の間で置換されて、どの構造的特徴が、結合パートナーの親和性および特
異性の両方、ならびにシグナル伝達に重要であるかを決定し得る。一連の異なる
改変体は、結合パートナーの異なる種改変体との相互作用の組合せられた特性を
示す分子についてスクリーニングするために有用である。
【００７４】
抗原の内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の状況下で生じ
得、そして細胞内成分と相互作用に関与するタンパク質の「細胞外」セグメント
との間の相互作用が生じ得る。ランゲリンの他の細胞内成分との相互作用の特異
的なセグメントは、変異誘発または直接的な生化学的手段（例えば、架橋法また
はアフィニティー法）によって同定され得る。結晶学的方法または他の物理学的
方法による構造的分析もまた適用可能である。生物学的機能の機構のさらなる研
究は、アフィニティー法または遺伝的手段（例えば、変異体の相補分析）によっ
て単離可能であり得る、関連する成分の研究を含む。
【００７５】
ランゲリンの発現および制御のさらなる研究は続行する。抗原に関連する制御
エレメントは、差示的な発生パターン、組織特異的パターン、または他の発現パ
ターンを示し得る。上流または下流の遺伝子領域（例えば、制御エレメント）は
、関心深い。
【００７６】
抗原の構造研究は、新規な改変体、特に結合パートナーに対するアゴニストま
たはアンタゴニストの特性を示すアナログの設計を導く。これは、先に記載した
スクリーニング法と組合わせて、所望の活性のスペクトルを示す改変体を単離し
得る。
【００７７】
他の細胞型における発現は、しばしば、特定の抗原においてグリコシル化の差
異を生じる。種々の種改変体は、アミノ酸配列以外の構造的差異に基づく異なる
機能を示し得る。差示的な改変は、差示的な機能を担い得、そしてこれらの効果
の解明は、現在可能となる。
【００７８】
従って、本発明は、抗原結合パートナー相互作用に関連する重要な試薬を提供
する。前述の記載は、ヒトランゲリンタンパク質に対して主に焦点が当てられた
が、当業者は、本発明が他の密接に関連する抗原（例えば、他の霊長類種の改変
体または対立遺伝子改変体）、ならびにそのファミリーの改変体および他のメン
バーを包含することを直ちに認識する。
【００７９】
（ＶＩ．核酸）
本明細書中に開示される天然のランゲリンタンパク質の特性は、タンパク質の
精製を可能にする。これは、このようなタンパク質をコードする核酸を単離する
ための手段を提供し、そしてその配列の決定は、ランゲリンファミリーの他のメ
ンバーに対する操作を提供する。このようなヌクレオチド配列および関連する試
薬は、ランゲリンタンパク質を発現させるために有用であるＤＮＡクローンの構
築（例えば、別の天然の供給源（このファミリーの他のメンバーを含む）から相
同遺伝子の単離）において有用である。代表的に、この配列は、ヒトからの他の
遺伝子（例えば、対立遺伝子改変体あるいは選択的スプライシングされたアイソ
フォーム）の単離に有用である。
【００８０】
例えば、ＤＣＧＭ４のような特異的結合組成物は、ランゲリンタンパク質を発
現する細胞株から作製された発現ライブラリーのスクリーニングに使用され得る
。このスクリーニングは、表面に発現されたタンパク質の標準的な染色であり得
るか、またはパニングによる。細胞内発現のスクリーニングはまた、種々の染色
手順または免疫蛍光手順によって行われ得る。この結合組成物は、ランゲリンタ
ンパク質を発現する細胞のアフィニティー精製または選別に使用され得る。
【００８１】
本発明は、生物学的に活性なランゲリンタンパク質またはランゲリンポリペプ
チドをコードする、単離されたＤＮＡまたはフラグメントの使用を意図する。ヒ
トランゲリンをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。さらに
、本発明は、生物学的に活性なランゲリンタンパク質またはランゲリンポリペプ
チドをコードし、そしてそのＤＮＡ配列に適切な条件下でハイブリダイズし得る
、単離されたＤＮＡまたは組換えＤＮＡを包含する。この生物学的に活性なラン
ゲリンタンパク質またはランゲリンポリペプチドは、全長の抗原であり得るか、
またはそのフラグメントであり得る。さらに、本発明は、ランゲリンタンパク質
に相同なタンパク質をコードするか、またはランゲリンタンパク質をコードする
ｃＤＮＡを使用して単離された、単離されたＤＮＡまたは組換えＤＮＡ、あるい
はそのフラグメントのプローブとしての使用を包含する。この単離されたＤＮＡ
は、それぞれ、５’隣接および３’隣接する調節配列（例えば、プロモーター、
エンハンサー、ポリＡ付加シグナルなど）を有し得る。
【００８２】
「単離された」核酸は、天然でネイティブ配列に付随する他の成分（例えば、
リボソーム、ポリメラーゼ）、およびその元来の種由来の隣接するゲノム配列か
ら、実質的に分離されている核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマ
ー）である。用語「単離された」核酸は、その天然に存在する環境から取り出さ
れた核酸配列を包含し、そしてそれはまた、組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離
物、および化学合成されたアナログまたは異種系によって生物学的に合成された
アナログを含む。実質的に純粋な分子は、その分子の単離された形態を含む。あ
るいは、精製された種は、組換え発現系由来の宿主成分から分離され得る。
【００８３】
単離された核酸は、一般に、分子の同質な組成物であるが、いくつかの実施態
様において、わずかな異質性を含む。この異質性は、代表的には、ポリマー末端
または所望の生物学的機能または活性に重要ではない部分で見出される。
【００８４】
「組換え」核酸は、その産生方法またはその構造のいずれかによって定義され
る。その産生方法（例えば、あるプロセスによって作製される産物）に関して、
このプロセスは、例えば、そのヌクレオチド配列におけるヒトの介入（代表的に
は、選択または産生）を含む、組換え核酸技術の使用である。あるいは、それは
、天然で互いに近接していない２つのフラグメントの融合体を含む配列を生成す
ることによって作製される核酸であり得るが、天然の産物（例えば、天然に存在
する変異体）を排除することが意味される。従って、例えば、任意の合成オリゴ
ヌクレオチドプロセスを使用して誘導される配列を含む核酸が含まれるように、
任意の天然に存在しないベクターで細胞を形質転換することによって作製される
産物が含まれる。このようなことは、しばしば、コドンを同じアミノ酸または保
存的アミノ酸をコードする縮重コドンで置換するためになされ、それに伴い、代
表的に配列認識部位を導入または除外する。あるいは、合成オリゴヌクレオチド
を使用して、所望の機能の核酸セグメントを共に連結し、通常入手可能な天然の
形態で見出されない機能の所望の組み合わせを含む、単一の遺伝的実体を生成す
る。制限酵素認識部位は、頻繁には、このような人工操作の標的であるが、他の
部異特異的標的（例えば、プロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、制御配列
、または他の有用な特徴）を、設計して組み込み得る。同様の概念が、組換えポ
リペプチド（例えば、融合ポリペプチド）について意図される。遺伝コード縮重
による、これらの抗原のフラグメントに類似のポリペプチドをコードする合成核
酸、および種々の異なる種改変体由来の配列の融合体をコードする合成核酸が、
特に含まれる。
【００８５】
核酸の状況において有意な「フラグメント」とは、少なくとも約１７ヌクレオ
チド、一般的には、少なくとも２０ヌクレオチド、より一般的には、少なくとも
２３ヌクレオチド、通常には、少なくとも２６ヌクレオチド、より通常には、少
なくとも２９ヌクレオチド、頻繁には、少なくとも３２ヌクレオチド、より頻繁
には、少なくとも３５ヌクレオチド、代表的には、少なくとも３８ヌクレオチド
、より代表的には、少なくとも４１ヌクレオチド、通常は、少なくとも４４ヌク
レオチド、より通常は、少なくとも４７ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも
５０ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも５３ヌクレオチド、そして特に
好ましい実施態様において、少なくとも５６以上のヌクレオチドである連続する
セグメントである。
【００８６】
ランゲリンタンパク質をコードするＤＮＡは、関連タンパク質または相同なタ
ンパク質をコードする遺伝子、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ種、ならびに相同なタン
パク質をコードするＤＮＡを同定するために特に有用である。他の哺乳動物（例
えば、霊長類）においてホモログが存在するはずである。種々のランゲリンタン
パク質は、相同であるべきであり、そして本明細書中に包含される。しかし、そ
の抗原に対するより遠い進化的関係を有するタンパク質でさえ、これらの配列が
十分に相同である場合には、これらの配列を使用して適切な条件下で容易に単離
される。霊長類ランゲリンタンパク質は、特に関心深い。
【００８７】
本発明はさらに、本明細書中に示される単離されたＤＮＡに同一または高度に
相同なＤＮＡ配列を有する、組換えＤＮＡ分子およびフラグメントを包含する。
詳細には、この配列は、しばしば、転写、翻訳およびＤＮＡ複製を制御するＤＮ
Ａセグメントに作動可能に連結される。あるいは、そのゲノム配列（例えば、イ
ントロンを含む）から誘導される組換えクローンは、トランスジェニック研究（
例えば、トランスジェニック細胞および器官）、ならびに遺伝子治療に有用であ
る。例えば、Ｇｏｏｄｎｏｗ（１９９２）「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａ
ｌｓ」ｉｎ  Ｒｏｉｔｔ（編）Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ＯｆＩｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１５０２−１５
０４頁；Ｔｒａｖｉｓ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１３９２−１３９
４；Ｋｕｈｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：７０７−７１０；Ｃａｐ
ｅｃｃｈｉ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８；Ｒｏｂｅｒｔｓｏ
ｎ（編、１９８７）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏ
ｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  
ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９２）Ｊ．Ｃｌ
ｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １０：１８０−１９９；ならびにＣｏｕｒｎ
ｏｙｅｒおよびＣａｓｋｅｙ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
１：２９７−３２９（これらの各々は、参考として本明細書中に援用される）を
参照のこと。
【００８８】
相同な核酸配列は、比較される場合、有意な類似性を示す。核酸における相同
性についての標準は、配列比較による当該分野で一般的に使用される相同性の基
準か、ハイブリダイゼーション条件に基づく基準のいずれかである。ハイブリダ
イゼーション条件は、以下により詳細に記載される。
【００８９】
核酸配列比較の状況における実質的相同性は、そのセグメントまたはそれらの
相補鎖のいずれかが、比較される場合に、最適に整列化された場合に、適切なヌ
クレオチドの挿入または欠失を含んで、少なくとも約５０％のヌクレオチド、一
般的には、少なくとも５６％、より一般的には、５９％、通常には、少なくとも
６２％、より通常には、少なくとも６５％、頻繁には、少なくとも６８％、より
頻繁には、少なくとも７１％、代表的には、少なくとも７４％、より代表的には
、少なくとも７７％、通常は、少なくとも８０％、より通常は、少なくとも約８
５％、好ましくは、少なくとも約９０％、より好ましくは、少なくとも約９５〜
９８％以上、そして特定の実施態様において、約９９％以上程度のヌクレオチド
において同一であることを意味する。あるいは、実質的相同性は、そのセグメン
トが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、鎖またはその相補体に対して、代
表的には記載されるような配列を使用して、ハイブリダイズする場合に、存在す
る。代表的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約１４ヌクレオ
チドのストレッチに対して、少なくとも５５％相同性、好ましくは少なくとも約
６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、そして最も好ましくは少なくとも
約９０％の相同性が存在する場合に、生じる。Ｋａｎｅｈｉｓａ（１９８４）Ｎ
ｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：２０３〜２１３（これは、本明細書中に参考
として援用される）を参照のこと。相同性比較の長さは、記載したように、より
長いストレッチにわたってであり得、そして特定の実施態様においては、少なく
とも約１７ヌクレオチド、通常少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少
なくとも２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より代
表的には少なくとも約４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオ
チド、そしてより好ましくは少なくとも約７５〜１００以上のヌクレオチドのス
トレッチにわたる。
【００９０】
ストリンジェントな条件は、このハイブリダイゼーションの状況において相同
性をいう際は、塩、温度、有機溶媒、および他のパラメーター（代表的には、ハ
イブリダイゼーション反応において制御されるもの）のストリンジェントな混合
した条件である。ストリンジェントな温度条件は、通常は、約３０℃を超える、
より通常は約３７℃を超え、代表的には約４５℃を超え、より代表的には約５５
℃を超え、好ましくは約６５℃を超え、そしてより好ましくは約７０℃を超える
、温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、普通は約１０００ｍＭ未満、通常
は約５００ｍＭ未満、より通常は約４００ｍＭ未満、代表的には約３００ｍＭ未
満、好ましくは約２００ｍＭ未満、そしてより好ましくは約１５０ｍＭ未満であ
る。しかし、パラメーターの組み合わせは、どの単一パラメーターの基準よりも
大いに重要である。例えば、ＷｅｔｍｕｒおよびＤａｖｉｓｏｎ（１９６８）Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９〜３７０；Ｗａｌｋｅｒ（１９８８編）Ｎｅ
ｗ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．；Ｒｏｓｓ（１９９８編）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａ
ｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照の
こと；または例えば、インターネット上の最近のハイブリダイゼーションプロト
コル「Ａ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ−−Ａ  Ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｓｉｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ」Ｇｒｉｆｆｉｎ（１９９６）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、２３９：１２０〜１２２を参照のこと。
【００９１】
（ＶＩＩ．ランゲリンタンパク質の作製；模倣物）
ランゲリンは、タンパク質生化学の標準的方法を使用して、天然の供給源から
単離され得る。ＤＣＧＭ４抗体が使用されて、精製プロセスまたは種々のイムノ
アフィニティー法を追跡し得る。単離されたタンパク質は、誘導体化または修飾
についての開始材料として使用され得る。このタンパク質は、ネイティブ形態ま
たは変性形態で使用され得る。
【００９２】
このランゲリンタンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡは、化
学合成、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、または広範な種々の細胞株ま
たは組織サンプルから調製されたゲノムライブラリーのスクリーニングによって
、入手され得る。特に、ＤＣＧＭ４抗体が、このタンパク質抗原をコードする核
酸を発現クローニングするために使用され得る。
【００９３】
このＤＮＡは、広範な種々の宿主細胞において、全長タンパク質またはフラグ
メントの合成のために発現され得る。この全長タンパク質またはフラグメントは
、例えば、次に、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生するため
；結合研究のため；改変した分子の構築および精度のため；そして構造／機能研
究のために、使用され得る。各抗原またはそのフラグメントは、適切な発現ベク
ターを用いて形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞において発現され
得る。これらの分子は、その組換え宿主に由来するもの以外の、タンパク質また
は細胞性莢雑物を含まないように実質的に精製され得、従って、薬学的に受容可
能なキャリア、緩衝剤、および／または希釈剤と組み合わされる場合に、薬学的
組成物において特に有用である。抗原またはその部分は、他のタンパク質との融
合物として発現され得る。
【００９４】
発現ベクターは、代表的には、所望の抗原遺伝子またはそのフラグメントを含
む、自己複製するＤＮＡ構築物またはＲＮＡ構築物であり、この遺伝子またはそ
のフラグメントは、通常は、適切な宿主細胞において認識される適切な遺伝子制
御エレメントに作動可能に連結されている。これらの制御エレメントは、適切な
宿主内で発現をもたらし得る。発現をもたらすために必要な制御エレメントの特
定の型は、使用される最終的な宿主に依存する。一般的に、この遺伝子制御エレ
メントは、原核生物プロモーター系または真核生物プロモーター発現制御系を含
み得、そして代表的には、転写プロモーター、転写の開始を制御するための必要
に応じたオペレーター、ｍＲＮＡ発現のレベルを上昇させるための転写エンハン
サー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳を終
結させる配列を含む。発現ベクターはまた、通常は、そのベクターがその宿主細
胞から独立して複製することを可能にする複製起点を含む。
【００９５】
本発明のベクターは、ランゲリンタンパク質またはそのフラグメントをコード
するＤＮＡを含み、好ましくは生物学的に活性なポリペプチドをコードする。配
列番号１に示される配列は、ランゲリンタンパク質を調製するために有利に使用
され得る。このＤＮＡは、ウイルス性プロモーターの制御下にあり得、そして選
択マーカーをコードし得る。本発明はさらに、原核生物宿主または真核生物宿主
においてランゲリンタンパク質をコードする真核生物ＤＮＡを発現し得るこのよ
うな発現ベクターの使用を意図する。この宿主中で、このベクターはこの宿主に
適合性であり、そして抗原をコードする真核生物ｃＤＮＡがこのベクター中に挿
入され、その結果、このベクターを含む宿主の増殖により、問題のｃＤＮＡが発
現される。通常、発現ベクターは、その宿主細胞における安定な複製または増幅
のために、１細胞あたりの望ましい遺伝子の総コピー数を大いに増加させるよう
に設計される。発現ベクターが宿主細胞において複製することは、常に必要とい
うわけではなく、例えば、種々の宿主において、その宿主細胞により認識される
複製起点を含まないベクターを使用して、抗原またはそのフラグメントの一過性
発現をもたらすことが可能である。組換えにより宿主ＤＮＡにランゲリン遺伝子
またはそのフラグメントの組込みを引き起こすベクターを使用すること、あるい
は内因性遺伝子の発現を制御するプロモーターを組込むこともまた可能である（
例えば、このような技術を記載するＷＯ９６／２９４１１（すべての図および図
面を含み、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）。
【００９６】
ベクターは、本明細書中で使用される場合、プラスミド、ウイルス、バクテリ
オファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、宿主のゲノムへのＤＮＡフラグ
メントの組み込みを可能にする他のビヒクルを含む。発現ベクターは、作動可能
に連結された遺伝子の発現をもたらす遺伝子制御エレメントを含む、専門のベク
ターである。プラスミドが、もっとも一般的に使用される形態のベクターである
が、等価な機能を提供し、かつ当該分野で公知であるか、または公知になるすべ
ての他の形態のベクターが、本明細書中での使用に適切である。例えば、Ｐｏｕ
ｗｅｌｓら（１９８５および補遺）Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．；およびＲｏｄ
ｒｉｑｕｅｚら（１９８８編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓ
ｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ（これらは参考として本
明細書中に援用される）を参照のこと。
【００９７】
形質転換された細胞は、代表的には組換えＤＮＡ技術を使用して構築された、
ランゲリン核酸配列を含むベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトさ
れた細胞（好ましくは哺乳動物）を含む。形質転換された宿主細胞は、通常は、
抗原またはそのフラグメントを発現するが、そのＤＮＡをクローニング、増幅、
および操作する目的のためには、そのタンパク質を発現する必要はない。本発明
はさらに、形質転換された細胞を栄養培地中で培養し、それによりその培養物中
にそのタンパク質を蓄積させることを可能にすることを意図する。このタンパク
質は、その培養物または培養培地のいずれかから、回収され得る。
【００９８】
本発明の目的のために、ＤＮＡ配列は、それらが互いに機能的に関連する場合
には、作動可能に連結される。例えば、プレ配列または分泌リーダーについての
ＤＮＡが、ポリペプチドがプレタンパク質として発現されるか、あるいはそのポ
リペプチドを細胞膜へと指向させるか、またはそのポリペプチドの分泌に関与す
る場合に、そのポリペプチドに作動可能に連結される。プロモーターは、それが
ポリペプチドの転写を制御する場合に、コード配列に作動可能に連結され；リボ
ソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように配置される場合に、コード配
列に作動可能に連結される。通常は、作動可能に連結される、とは、連続しかつ
読み取り枠があっていることを意味するが、しかし、特定の遺伝子エレメント（
例えば、リプレッサー遺伝子）は、連続的に連結されていないが、なお次には発
現を制御する、オペレーター配列に結合する。
【００９９】
適切な宿主細胞は、原核生物、下等真核生物、および高等真核生物を含む。原
核生物は、グラム陰性生物およびグラム陽性生物の両方（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ
およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含む。下等真核生物は、酵母（例えば、Ｓ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ）、ならびにＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕ
ｍ属の種を含む。高等真核生物は、動物細胞（非哺乳動物起源（例えば、昆虫細
胞および鳥類）ならびに哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類、および齧歯類）
の両方）由来の樹立された組織培養細胞株を含む。
【０１００】
原核生物宿主−ベクター系は、多くの異なる種のための広範な種々のベクター
を含む。本明細書中で使用される場合、Ｅ．ｃｏｌｉおよびそのベクターが、他
の原核生物において使用される等価なベクターを含むように一般的に使用される
。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２またはその誘導体
の多くである。ランゲリンタンパク質またはそのフラグメントを発現するために
使用され得るベクターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ｌａｃプロモーターを含むベクター（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーターを
含むベクター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモーターを含むベクター（
ｐＩＮシリーズ）；λ−ｐＰまたはλ−ｐＲプロモーターを含むベクター（ｐＯ
ＴＳ）；あるいはｐｔａｃのようなハイブリッドプロモーターを含むベクター（
ｐＤＲ５４０）。Ｂｒｏｓｉｕｓら（１９８８）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅ
ｃｔｏｒｓ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎ
ｄ  Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚおよび
Ｄｅｎｈａｒｄｔ（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、
Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、第１０章、２０５〜２３６頁（これ
は本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１０１】
下等真核生物（例えば、酵母およびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）は、ランゲ
リンタンパク質をコードするベクターを用いて形質転換され得る。本発明の目的
のために、最も一般的な下等真核生物宿主は、パン酵母であるＳａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。これは、一般的に下等真核生物を表
すために使用されるが、他の多くの株および種もまた利用可能である。酵母ベク
ターは、代表的には、複製起点（組込み型以外）、選択遺伝子、プロモーター、
所望のタンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ、ならびに翻訳終
結のための配列、ポリアデニル化のための配列、および転写終止のための配列か
らなる。酵母の適切な発現ベクターは、構成的プロモーター（例えば、３−ホス
ホグリセリン酸キナーゼプロモーターおよび他の種々の解糖系酵素遺伝子プロモ
ーター）または誘導性プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ２プ
ロモーターまたはメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモ
ーター）を含む。適切なベクターは、以下の型の誘導体を含む：自己複製低コピ
ー数型（例えば、ＹｐＲシリーズ）；自己複製高コピー数型（例えば、ＹＥｐシ
リーズ）；組込み型（例えば、ＹＩｐシリーズ）、またはミニ染色体型（例えば
、ＹＣｐシリーズ）。
【０１０２】
高等真核生物組織培養細胞は、機能的に活性なランゲリンタンパク質の発現に
好ましい宿主細胞である。原則的に、どの高等真核生物培養細胞株も（例えば、
昆虫バキュロウイルス発現系）無脊椎動物供給源由来であろうと、または脊椎動
物供給源由来であろうと、利用可能である。しかし、哺乳動物細胞は、翻訳と同
時、および翻訳後の両方の、プロセシングという点で、好ましい。このような細
胞の形質転換またはトランスフェクション、および増殖は、慣用的手順となって
いる。有用な細胞株の例としては、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞株、ベビーラット腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞
株、およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。このような細胞株のための発現
ベクターは通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部
位（ゲノムＤＮＡを使用する場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位
を含む。これらのベクターはまた、通常、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。
適切な発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または例えば、アデノウイルス
、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイル
スのような供給源由来の、レトロウイルス保有ベクターであり得る。適切な発現
ベクターの代表的な例は、ｐＣＤＮＡ１；ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら（１９８５
）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１１３６〜１１４２を参照のこと）；ｐＭ
Ｃ１ｎｅｏ  Ｐｏｌｙ−Ａ）Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０
３〜５１２を参照のこと）；およびｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０のようなバ
キュロウイルスベクターを含む。
【０１０３】
特定の、または規定されたグリコシル化パターンを提供する系において、ラン
ゲリンタンパク質ポリペプチドを発現することが、しばしば望ましい。この場合
、通常のパターンは、この発現系により自然に提供されるパターンである。しか
し、このパターンは、このポリペプチド（例えば、非グリコシル化形態）を、異
種発現系に導入された適切なグリコシル化タンパク質に曝露することによって修
飾され得る。例えば、このランゲリンタンパク質遺伝子は、哺乳動物グリコシル
化酵素または他のグリコシル化酵素をコードする、１つ以上の遺伝子を用いて同
時系質転換され得る。このアプローチを使用して、特定の哺乳動物グリコシル化
パターンが、原核生物細胞または他の細胞において、達成可能であるかまたは近
似される。
【０１０４】
このランゲリンタンパク質またはそのフラグメントは、細胞膜にホスファチジ
ルイノシトール（ＰＩ）結合するように操作され得るが、ホスファチジルイノシ
トール切断酵素）例えば、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ）での
処理により、膜から除去され得る。これは、生物学的に活性な形態の抗原を放出
し、そしてタンパク質化学の標準的手順による精製が可能である。例えば、Ｌｏ
ｗ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９８８：４２７〜
４５４；Ｔｓｅら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１００３〜１００８；
およびＢｒｕｎｎｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１４：１２７
５〜１２８３を参照のこと。
【０１０５】
ランゲリンのフラグメントまたは誘導体は、ペプチドを合成するための従来の
プロセスにより調製され得る。固相合成および溶液相合成が、ともに上述のプロ
セスに適用可能である。これらはには、以下に記載されるようなプロセスが挙げ
られる：Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｂｏｄａｎ
ｓｚｋｙ（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｊｏｎｅｓ（１９９２）Ａ
ｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｏｘｆｏ
ｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅ
ｐｐａｒｄ（１９８９）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；ＩＲＳ  Ｐｒｅｓｓ  
Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（１９８４）Ｓｏｌｉｄ  
Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ  Ｃｏ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ；ならびに化学的連結、例えば、Ｄａｗ
ｓｏｎら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６〜７７９（ペプチド結合
により長い合成ペプチドを連結する方法）；（これらは各々、本明細書中で参考
として援用される）。例えば、アジドプロセス、酸無水物プロセス、酸無水物プ
ロセス、混合無水物プロセス、活性エステルプロセス（例えば、ｐ−ニトロフェ
ニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはシアノメチルエ
ステル）、カルボジイミダゾールプロセス、酸化−還元プロセス、またはジシク
ロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）／付加的プロセスが、使用され得る。固
相合成および溶液相合成が、ともに上述のプロセスに適用可能である。
【０１０６】
ランゲリンタンパク質、フラグメント、または誘導体は、ペプチド合成におい
て代表的に使用されるような上述のプロセスに従って、一般的には、アミノ酸を
その末端アミノ酸に１つずつ連続して縮合させることを含むいわゆる段階的プロ
セス、またはペプチドフラグメントをその末端アミノ酸にカップリングさせるこ
とのいずれかにより、適切に調製される。このカップリング反応において使用さ
れていないアミノ基は、代表的には、不正確な位置での結合を阻止するように保
護される。
【０１０７】
固相合成が採用される場合、そのＣ末端アミノ酸は、そのカルボキシル基を介
して、不溶性キャリアまたは支持体に結合される。この不溶性キャリアは、それ
が反応性カルボキシル基への結合能を有する限り、特には制限されない。このよ
うな不溶性キャリアの例は、ハロメチル樹脂（例えば、クロロメチル樹脂または
ブロモメチル樹脂）、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、ｔｅｒｔ−アル
キルオキシカルボニル−ヒドラジド樹脂などが挙げられる。
【０１０８】
アミノ基が保護されたアミノ酸は、その活性化したカルボキシル基と、以前に
形成されたペプチドまたは鎖の反応性アミノ基との縮合を介して、連続して結合
され、このペプチドが段々と合成される。完全な配列を合成した後、このペプチ
ドは、不溶性キャリアから分離されて、ペプチドを生成する。この固相合成アプ
ローチは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（１９６３）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ
．８５：２１４９〜２１５６（これは、本明細書中で参考として援用される）に
より一般的に記載される。
【０１０９】
調製されたタンパク質およびそのフラグメントは、ペプチド分離の手段、例え
ば、抽出、沈殿、電気泳動および種々の形態のクロマトグラフィーなどによって
、反応混合物から単離および精製され得る。本発明のランゲリンは、その所望の
用途に依存して、種々の程度の純度で得られ得る。精製は、本明細書中に開示さ
れたタンパク質精製技術の使用、または免疫吸着アフィニティークロマトグラフ
ィーにおいて記載される本明細書中の抗体の使用によって、達成され得る。この
免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーは、まず抗体を固相支持体に連結し
、次いでこの連結された抗体を、適切な供給源細胞の可溶化した溶解物、このタ
ンパク質を発現する他の細胞の溶解物、またはＤＮＡ技術の結果としてランゲリ
ンタンパク質を生成する細胞の溶解物もしくは上清と接触させることによって、
実行される。以下を参照のこと。
【０１１０】
（ＶＩＩＩ．有用性）
本発明は、本明細書中の他の場所に記載されるような診断適用において、例え
ば、生理学的異常または発生学的異常についての一般的記載においてか、または
以下のキットの説明において用途を見出す。この抗原は、診断法において、種々
の細胞型（例えば、ランゲルハンス細胞）を単離するため、または生物学的サン
プルの種々の種供給源を決定するための法医学方法の両方のために、有用である
。  本発明は、有意な治療的価値を有する試薬を提供する。ランゲリン（天然に
存在するか、または組換え）、そのフラグメント、ムテイン、および抗体は、ラ
ンゲリンまたは抗体への結合親和性を有すると同定された化合物を伴って、その
リガンドまたは結合薬剤のランゲリンの異常な発現を示す状態の
処置において、用途を見出す。このような異常は、代表的に、免疫学的障害によ
り表される。さらに、本発明は、そのリガンドまたは結合薬剤への応答の異常な
発現または異常な誘発と関連する種々の疾患または障害において、治療的価値を
提供する。このランゲリンリガンドまたは結合薬剤は、ＤＣの成熟発生に関与す
ると推測される。ランゲリンはまた、治療的に関連する免疫応答を惹起するため
に、樹状細胞へ抗原を標的化するためのレセプターとして使用され得る。
【０１１１】
組換えランゲリン、ムテイン、あるいはそれらに対するアゴニスト抗体または
アンタゴニスト抗体、あるいは抗体が精製され得、次いで、患者に投与され得る
。これらの試薬は、さらなる活性な成分と、例えば、従来の薬学的に受容可能な
キャリアまたは希釈剤において、生理学的に無害の安定剤および賦形剤とともに
、治療的用途のために組み合わされ得る。これらの組み合わせ物は、滅菌され得
（例えば、濾過済み）、そして凍結乾燥により投薬バイアル中で投薬形態に、ま
たは、安定化された水性調製物中の貯蔵物に、配置される。本発明はまた補体結
合ではない抗体またはその結合フラグメントの使用を意図する。
【０１１２】
ランゲリンまたはそのフラグメントを使用してランゲリン抗原への結合親和性
を有する結合パートナーまたは化合物についてスクリーニングすること（結合し
た化合物の単離を含む）が、実施され得る。次いで、続く生物学的アッセイが、
推定リガンドまたは結合薬剤が競合結合を提供し得、これが内因性刺激活性を阻
止し得るか否かを決定するために利用され得る。ランゲリンフラグメントは、そ
れがリガンドまたは結合薬剤の活性を阻止するという点で、ブロッカーまたはア
ンタゴニストとして使用され得る。本発明はさらに、アンタゴニストとして、ラ
ンゲリンに対する抗体の治療的用途を意図する。このアプローチは、他のランゲ
リンタンパク質の種改変体およびそのファミリーの他のメンバーを用いて特に有
用である。
【０１１３】
有効な治療に必要な試薬の量は、投与の手段、標的部位、試薬の生理学的持続
期間、薬理学的持続期間、患者の身体的状態、および他に投与された医薬を含む
、多くの異なる因子に依存する。従って、処置投薬量は、安全性および有効性を
最適化するために滴定されるべきである。代表的には、インビトロで用いられる
投薬量は、これらの試薬のインサイチュ投与のために有用な量の有用なガイダン
スを提供し得る。特定の障害の処置のための有効用量の動物試験は、ヒト投薬量
のさらなる予測的指標を提供する。試薬の実際の投与量、処方、または組成物（
免疫学的障害を調節する）は、生物の大きさおよび健常さを含む多くの因子に依
存する。しかし、当業者は、臨床投与量を決定するために方法および技術を記載
する教示を用い得る。例えば、以下を参照のこと：Ｓｐｉｌｋｅｒ（１９８４）
Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｂｏｏｋｓ、Ｌｔｄ
．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｅｓｐ、７〜１３頁、５４〜６０頁；Ｓｐｉｋｅｒ（１
９９１）Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ、Ｒａｖｅｎ  Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｅｓｐ．ｐｐ．１０１；Ｃｒａｉｇお
よびＳｔｉｔｚｅｌ（１９８６編）Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、
第２版、Ｌｉｔｔｌｅ、ＢｒｏｗｎおよびＣｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，特に第１２７
〜３３頁；Ｓｐｅｉｇｈｔ（１９８７編）Ａｖｅｒｙ’ｓ  Ｄｒｕｇ  Ｔｒｅａ
ｔｍｅｎｔ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｅｐｅｕｔｉｃｓ、
第３版、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、特に第
５０〜５６頁；Ｔａｌｌａｒｉｄａら（１９８８）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ
Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、特に第１８〜２０頁；Ｇｉｌｍａｎら（編）Ｇｏｏｄｍ
ａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  
Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、最新編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐ
ｒｅｓｓ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ、最新編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏ
ｎ，Ｐｅｎｎ．；およびＲｉｃｈら（１９９８）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｖｏｌｓ  Ｉ
＆ＩＩ、Ｍｏｓｂｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，（これら各々は、全ての図お
よび図面を含むその全体が参考として本明細書において援用されている）。投与
の方法は、その文献中および以下に考察されており、そして、例えば、以下であ
る：経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、または筋肉内投与、経皮拡散など。薬
学的に受容可能なキャリアは、水、生理食塩水、緩衝液、および他の化合物（例
えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎｅ
ｗ  Ｊｅｒｓｅｙに記載される）を含む。おそらく、推定リガンドもしくは結合
因子とその結合パートナーとの間の高い親和性結合、またはターンオーバー数に
より、これらの試薬の低投与量が最初、有効であると予期される。従って、投与
量範囲は、適切なキャリアとともに、通常、１ｍＭ未満の濃度、代表的には、約
１０μＭ未満の濃度、通常、約１００ｎＭ未満、好ましくは、約１０ｐＭ（ピコ
モル）未満、そして最も好ましくは約１ｆＭ（フェトモル）未満の量であること
が、予期される。徐放性処方物または徐放性装置が、持続投与のためにしばしば
利用される。
【０１１４】
ランゲリン（ランゲリン）抗原を保有することが示される細胞型、例えば、Ｄ
Ｃ細胞および扁桃の上皮細胞において、他の異常な発生状態が既知である。Ｂｒ
ｅｗ（編）Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａ
ｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．；お
よびＴｈｏｒｎら、Ｈａｒｒｉｓｏｎ‘ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎ
ｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．を参照の
こと。これらの問題は、本明細書において提供される組成物を用いて予防または
処置するのに容易であり得る。
【０１１５】
ランゲリン、そのフラグメント、ならびに抗体またはそのフラグメント、アン
タゴニストおよびアゴニストは、処置されるべき宿主に直接投与され得るか、ま
たは、それらの投与の前に、化合物のサイズに依存して、キャリアタンパク質（
例えば、オボアルブミンまたは血清アルブミン）にそれらを結合体化することが
所望され得る。治療用処方物は、多くの従来の投与処方物中で投与され得る。活
性成分は単独で投与され得るが、それは薬学的処方物として存在することが好ま
しい。処方物は、上記で規定される、少なくとも１つの活性成分を、その受容可
能な１つ以上のキャリアとともに、含む。それぞれのキャリアは、他の成分と適
合するという意味で、薬学的におよび生理学的にの両方で受容可能であり、かつ
患者に無害でなければならない。処方物は、経口投与、直腸投与、経鼻投与、ま
たは非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、および皮内投与を含む）
に適切な処方物を含む。この処方物は、単位投与量形態で便利に示され得、そし
て薬物の当該分野で周知の方法により調製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（
１９９０編）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版
、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、現行版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎ．；Ａｖｉｓら（１９９３編）Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅ
ｄｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（１９９０編
）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ
Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；ならびにＬｉｅｂｅｒｍａｎら（１９９０編）Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ．を参照のこと。本発明の治療は、他の治療剤と
組み合わせられ得るかまたは一緒に用いられ得る。
【０１１６】
本発明のランゲリン特異的抗体およびランゲリンタンパク質の天然に存在する
形態および組換え形態の両方は、結合活性について化合物をスクリーニングし得
る、キットおよびアッセイ方法において特に有用である。短時間で何万もの化合
物をスクリーニングすることを可能にするために、いくつかの自動アッセイの方
法が近年開発されてきている。例えば、Ｆｏｄｏｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ  ２５１：７６７〜７７３を参照のこと。これは、参考として本明細書におい
て援用されており、そして固体基板上で合成される複数の規定のポリマーによる
結合親和性の試験のための手段を記載している。適切なアッセイの開発は、本発
明により提供される大量の精製された可溶性のランゲリンタンパク質が利用可能
であることにより大きく促進され得る。
【０１１７】
本発明は、任意の種々の薬物スクリーニング技術において、組換え抗原を用い
ることによる化合物スクリーニングのために特に有用である。特定のリガンドま
たは結合剤のスクリーニングにおいて組換えタンパク質を用いることの利点とし
ては、以下が挙げられる：（ａ）特定の供給源から抗原の再生可能な供給源への
改善；（ｂ）アッセイにおいてより良好なシグナル対ノイズ比を与える、１細胞
あたりの抗原分子の潜在的により多数の抗原；および（ｃ）種改変体特異性（理
論的には、より大きい生物学的特異性および疾患特異性を与える）。精製したタ
ンパク質は、多数のアッセイ、代表的にはインビトロアッセイ（生物学的に関連
する応答を評価する）において試験され得る。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｈｏｏｄら、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ；Ｐａｕｌ（１９９
６編）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第３版、Ｒａｖｅｎ  
Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。これはまた、例えば、相互作用する細
胞からの、ランゲリンに結合するリガンドのスクリーニングにおいて有用である
。
【０１１８】
薬物スクリーニングの１つの方法は、ランゲリン抗原を発現する組換えＤＮＡ
分子で安定に形質転換されている真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利
用する。他の機能的に等価の抗原からの単離において、抗原を発現する細胞は、
単離され得る。このような細胞は、生存可能な形態または固定形態のいずれかで
、標準的なタンパク質−タンパク質結合アッセイに用いられ得る。例えば、以下
を参照のこと：Ｐａｒｃｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：２４３〜２
４７；およびＯｗｉｃｋｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４００７〜４０１１；これらは、本明細書において参考と
して援用され、そして細胞性応答を検出するための感度の良い方法を記載する。
競合アッセイは、特に有用である、ここで細胞（ランゲリンタンパク質の供給源
）は、標識した結合パートナーまたはリガンドへの公知の結合親和性を有する抗
体（例えば、125Ｉ−抗体）、および結合組成物への結合親和性が測定される試
験サンプルと接触され、そしてともにインキュベートされる。次いで、結合した
標識結合組成物および遊離の標識結合組成物は、抗原結合の程度を評価するため
に分離される。結合した試験化合物の量は、既知の供給源への、標識したレセプ
ター結合の量に反比例する。多くの技術が、遊離の抗原からの結合を分離し、結
合の程度を評価するために用いられ得る。この分離工程は、代表的に、フィルタ
ーへの接着後の洗浄、プラスチックへの接着後の洗浄、または細胞膜の遠心分離
ののような手順を含む。ランゲリンタンパク質媒介性機能（例えば、第二メッセ
ンジャーレベル（すなわち、Ｃａ++）；細胞増殖；イノシトールリン酸プール変
化；など）への薬物の効果についてスクリーニングするために、生存可能な細胞
がまた用いられ得る。いくつかの検出方法（例えば、近接感受性検出システム（
ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ
））により分離工程の排除が可能になる。Ｃａ++レベルを検出するために、カル
シウム感受性色素が有用である。これには蛍光定量計（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ
）または蛍光細胞ソーティング装置をともなう。
【０１１９】
別の方法は、ランゲリンタンパク質の供給源として、形質転換した真核生物宿
主細胞または原核生物宿主細胞由来の膜を利用する。これらの細胞は、膜会合ラ
ンゲリンタンパク質（例えば、操作された膜結合形態）の発現を指向するＤＮＡ
ベクターで安定に形質転換される。本質的に、この膜は、細胞から調製され、そ
してレセプター／リガンド型結合結合アッセイ（例えば、上記の競合アッセイ）
において用いられる。
【０１２０】
なお別のアプローチは、形質転換された真核生物宿主細胞または原核生物宿主
細胞由来の、可溶化された未精製のランゲリンタンパク質または可溶化された精
製ランゲリンタンパク質を用いることである。これは、特異性の増大した利点、
自動化能力の利点、および高い薬物試験処理能力の利点を有する「分子」結合ア
ッセイを可能にする。
【０１２１】
薬物スクリーニングのための別の技術は、ランゲリンに対して適切な結合親和
性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供するアプローチを含む、そ
してその詳細は、１９８４年９月１３日公開のＧｅｙｓｅｎの欧州特許出願８４
／０３５６４（参考として本明細書に援用される）に記載されている。第一に、
多数の異なる小ペプチド試験化合物は、固体基板（例えば、プラスチックピン）
または他のいくつかの適切な表面上で合成される（Ｆｏｄｏｒら（１９９１）を
参照のこと）。次いで、すべてのピンが可溶化した未精製のランゲリン結合組成
物、または可溶化した精製ランゲリン結合組成物と反応され、そして洗浄される
。次の工程は、結合した結合組成物を検出する工程を含む。
【０１２２】
合理的な薬物設計はまた、ランゲリンタンパク質および他のエフェクターまた
はアナログの分子形状の構造的研究に基づき得る。エフェクターは、抗原結合に
応答して他の機能を媒介する他のタンパク質、または抗原（例えば、ランゲリン
リガンド）と通常、相互作用する他のタンパク質であってもよい。どの部位が特
定の他のタンパク質と相互作用するかを決定する手段の１つは、物理的構造決定
（例えば、Ｘ線結晶学または２次元ＮＭＲ法）である。それらは、どのアミノ酸
残基が分子接触領域を形成するかに関するガイダンスを提供する。タンパク質構
造決定の詳細な説明については、例えば、ＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏ
ｎ（１９７６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（参考として、本明細書において援用さ
れる）を参照のこと。
【０１２３】
精製したランゲリンタンパク質は、前述の薬物スクリーニング技術における使
用のためにプレート上に直接被膜され得る。しかし、これらのリガンドに対する
非中和抗体は、固相上のそれぞれのリガンドを固定する捕獲抗体として用いられ
得る。
【０１２４】
（ＩＸ．キットおよび定量化／検出）
本発明のランゲリン分子の天然に存在する形態および組換え形態は、特にキッ
トおよびアッセイ方法において有用である。例えば、これらの方法は、これらの
タンパク質についての結合活性（例えば、リガンドまたは結合因子）についてス
クリーニングするために適用される。１年に何万もの化合物をスクリーニングす
るために、いくつかの自動アッセイの方法が近年開発されてきている。例えば、
ＢＩＯＭＥＫ自動化ワークステーション、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、およびＦｏｄｏｒら（１９
９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７〜７７３（本明細書において参考として
援用される）を参照のこと。後者は、固体基板上で合成される複数の規定のポリ
マーによる因子の結合親和性の試験のための手段を記載している。リガンドもし
くは結合因子またはアゴニスト／アンタゴニスト相同体タンパク質についてスク
リーニングするための適切なアッセイの開発は、本発明により提供されるような
活性状態の、大量の精製された可溶性のランゲリンが利用可能であることにより
大きく促進され得る。
【０１２５】
精製したランゲリンは、前述のリガンドまたは結合因子スクリーニング技術に
おける使用のためにプレート上に直接被膜され得る。しかし、これらのタンパク
質に対する非中和抗体は、固相上のそれぞれのランゲリンタンパク質を固定する
捕獲抗体（例えば、診断的使用において有用）として用いられ得る。
【０１２６】
本発明はまた、ランゲリンタンパク質またはそのリガンドもしくは結合因子の
存在を検出するための種々の診断キットおよび方法における、ランゲリン、その
フラグメント、ペプチドおよびそれらの融合産物の使用を意図する。あるいは、
またはさらに、ランゲリン分子の対する抗体が、このキットおよび方法に組み込
まれ得る。代表的には、このキットは、ランゲリンのタンパク質、フラグメント
、ペプチドもしくは遺伝子セグメント、またはそれらの１方または他方を認識す
る試薬のいずれかを含む仕切りを有する。代表的には、認識試薬は、タンパク質
またはそのフラグメントの場合、レセプターまたは抗体であり、遺伝子セグメン
トの場合は、通常、ハイブリダイゼーションプローブである。
【０１２７】
サンプル中のランゲリンの濃度を決定するために好ましいキットは、代表的に
、標識した化合物（例えば、ランゲリンに対する結合親和性が既知のリガンド、
結合因子、または抗体）、陽性コントロールとしてのランゲリン（天然に存在す
るかまたは組換えのランゲリン）の供給源、および遊離の標識した化合物から結
合した標識化合物を分離するための手段（例えば、試験サンプル注のランゲリン
を固定するための固相）を含む。試薬および指示書を含む仕切りが通常提供され
る。
【０１２８】
本発明はまた、結合組成物の存在を検出するための種々の診断キットおよび方
法における、ランゲリン、そのフラグメント、ペプチドそれらの融合産物および
結合組織物の使用を意図する。代表的には、このキットは、規定されたランゲリ
ンペプチドもしくは遺伝子セグメント、またはそれらの１方または他方（例えば
、抗原フラグメントまたは抗体）を認識する試薬のいずれかを含む仕切りを有す
る。例えば、Ｃｈｅｎ（編）（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ  Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ、
ＦＬ；ＰｒｉｃｅおよびＮｅｗｍａｎ（編）（１９９１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｔｏｃｋｔｏ
ｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ならびにＮｇｏ（編）（１９８８）Ｎｏｉ
ｓｏｔｏｐｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを
参照のこと。
【０１２９】
試験化合物のランゲリンタンパク質に対する結合親和性を決定するためのキッ
トは、代表的に、以下を含む：試験化合物；標識化合物（例えば、抗原に対する
結合親和性が既知の抗体）；ランゲリンタンパク質（天然に存在するかまたは組
換え）の供給源；および抗原固定のための固相のような、遊離の標識化合物から
結合した標識化合物を分離するための手段。一旦、化合物がスクリーニングされ
れば、抗原に対する適切な結合親和性を有する化合物は、当業者に周知のように
、適切な生物学的アッセイにおいて評価され、それが天然の抗原に対して類似の
生物学的活性を示すか否かが決定され得る。組換えランゲリンタンパク質ポリペ
プチドのアベイラビリティーはまた、このようなアッセイを較正するための規定
の標準物を十分に提供し得る。
【０１３０】
サンプル中のランゲリンタンパク質の濃度を決定するための方法の１つは、代
表的に以下の工程を含む：（１）ランゲリンタンパク質供給源に結合する膜から
なるサンプルから膜を調製する工程；（２）膜を洗浄し、そしてそれを緩衝液中
で懸濁する工程；（３）適切な界面活性剤が添加された培養培地において膜をイ
ンキュベートすることにより抗原を可溶化する工程；（４）可溶化抗原の界面活
性剤濃度を調節する工程；（５）放射線標識した抗体と接触させ、そしてこの希
釈液をインキュベートし、複合体を形成する工程；（６）ポリエチレンイミン処
理フィルターを通す濾過によるような複合体を回収する工程；および（７）回収
した複合体の放射活性を測定する工程。
【０１３１】
ランゲリンタンパク質またはフラグメントに特異的な抗原結合フラグメントを
含む抗体は、ランゲリンタンパク質および／またはそのフラグメントのレベル増
加の存在を検出するための診断適用において有用である。このような診断アッセ
イは、溶解物、生細胞、固定細胞、免疫蛍光検査、細胞培養物、組織サンプル、
体液を使用し得、そしてさらに、血清におけるタンパク質に関連する抗原の検出
などを含み得る。診断アッセイは、同種（遊離の試薬とタンパク質−タンパク質
複合体との間の分離工程なし）であっても、または異種（分離工程あり）であっ
てもよい。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬ
ＩＳＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素増加イムノアッセイ技術（ＥＭＩ
Ｔ）、基質標識蛍光イムノアッセイ（ＳＬＦＩＡ）などのような種々の商業的ア
ッセイが存在する。例えば、標識され、そしてランゲリンタンパク質またはその
特定のフラグメントに対する抗体を認識する第２の抗体を用いることにより非標
識抗体が、使用され得る。類似のアッセイは、また文献において広く考察されて
いる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨおよびＣｏｌｉｇａｎ（１
９９１編）および定期的補遺、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこ
と。
【０１３２】
抗イディオタイプ抗体は、ランゲリンタンパク質に対する抗体の存在を診断す
るための類似の用途を有し得、それ自体、種々の異常状態を診断し得る。例えば
、ランゲリンタンパク質の過剰産生は、ランゲルハンス細胞に関連する異常な生
理学的状態（例えば、アトピー性皮膚炎、好酸球性肉芽腫、組織球増殖症、全身
性硬化症、およびランゲルハンス細胞肉芽腫症）を診断し得る、種々の免疫学的
反応の生成を生じ得る。また、例えば、Ｒｉｃｈら（１９９８）Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ
第Ｉ巻および第ＩＩ巻、Ｍｏｓｂｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏを参照のこと。
【０１３３】
しばしば、診断アッセイのための試薬が、このアッセイの感受性を最適化する
ためにキットに供給される。本発明のために、アッセイ、プロトコールおよび標
識の特徴に依存して、標識した抗体もしくは未標識の抗体、または標識したラン
ゲリンタンパク質のいずれかが提供される。これは、通常、他の添加剤、例えば
、緩衝剤、安定化剤、シグナル産生に必要な材料（例えば、酵素のための基質な
ど）と組み合わされる。好ましくは、このキットは、適切な使用および使用後の
含量の廃棄のための指示書を含む。代表的には、このキットは、それぞれの有用
な試薬のための仕切りを有する。望ましくは、この試薬は、凍結乾燥粉末として
提供される。ここでこの試薬は、水性媒体で再構成（溶解）され得、アッセイを
実施するのに適切な濃度の試薬を提供する。
【０１３４】
薬物スクリーニングおよび診断アッセイの多数の前述の構成要素は、改変なし
に用いられ得るか、または種々の方法で改変され得る。例えば、標識は、検出シ
グナルを直接かまたは間接的に提供する部分を共有結合または非共有結合により
達成され得る。これらのアッセイにおいて、抗原、試験化合物、ランゲリンタン
パク質、またはそれらに対する抗体は、直接または間接的のいずれかで標識され
得る。直接標識するための可能性としては、以下の標識群が挙げられる：放射標
識（例えば、125Ｉ）、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのよう
な酵素（米国特許番号３，６４５，０９０号）、ならびに蛍光強度、波長偏向、
または蛍光分極をモニタリングし得る蛍光標識（米国特許番号３，９４０，４７
５号）。両方の特許は、参考として本明細書に援用される。間接的標識のための
可能性としては、１つの構成要素のビオチン化、その後の上記の標識群の１つに
結合したアビジンへの結合が挙げられる。
【０１３５】
遊離の抗原から結合した抗原を分離する多くの方法、あるいは遊離の試験化合
物から結合した試験化合物を分離する多くの方法もまた存在する。ランゲリンタ
ンパク質は、種々のマトリクス上に固定化され得、次いで洗浄され得る。適切な
マトリクスとしては、プラスチック、例えば、ＥＬＩＳＡプレート、フィルター
、およびビーズが挙げられる。ランゲリンタンパク質をマトリクスに固定化する
方法としては、プラスチックへの直接的な接着、捕捉抗体の使用、化学的カップ
リング、およびビオチン−アビジンが挙げられるが、これらに限定されない。こ
のアプローチにおける最終工程は、例えば、有機溶媒（例えば、ポリエチレング
リコール）または硫酸アンモニウムのような塩を利用する方法を含む、任意のい
くつかの方法によるタンパク質−タンパク質複合体の沈殿を包含する。他の適切
な分離技術としては、フルオレセイン抗体磁化（ｍａｇｎｅｔｉｚａｂｌｅ）粒
子方法（Ｒａｔｔｌｅら（１９８４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３０：１４５７−１
４６１に記載される）、および二重抗体磁気粒子分離（米国特許第４，６５９，
６７８号に記載される）（これらの各々は、本明細書において参考として援用さ
れる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
タンパク質またはそれらのフラグメントを種々の標識に連結するための方法は
、文献において広範に報告されており、本明細書で詳細な議論を必要としない。
多くの技術は、ペプチド結合を形成するためのカルボジイミドまたは活性なエス
テルのいずれかの使用を通じて活性化したカルボキシル基の使用、連結のために
メルカプト基と、活性化ハロゲン（例えば、クロロアセチル）または活性化オレ
フィン（例えば、マレイミド）との反応によるチオエーテルの形成などを包含す
る。融合タンパク質はまた、これらの適用における使用を見出す。
【０１３７】
本発明の別の診断的局面は、ランゲリンタンパク質の配列から得られたオリゴ
ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の使用を含む。これらの配列は、
異常な状態（例えば、免疫学的障害）を有すると疑われる患者由来のサンプルに
おける抗原メッセージのレベルを検出するためのプローブとして使用され得る。
ＲＮＡヌクレオチド配列およびＤＮＡヌクレオチド配列の両方の調製、これらの
配列の標識化、ならびにこれらの配列の好ましいサイズは、文献に十分に記載お
よび議論されている。通常、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも約１４
ヌクレオチド、通常少なくとも約１８ヌクレオチドを有するべきであり、そして
ポリヌクレオチドプローブは、数キロベースまでであり得る。種々の標識（最も
通常は放射性核種、特に32Ｐ）が、使用され得る。しかし、他の技術（例えば、
ポリヌクレオチドへの導入のためにビオチン改変ヌクレオチドを使用する）もま
た、使用され得る。次いで、ビオチンは、アビジンまたは抗体（これは、広範な
種々の標識（例えば、放射性核種、蛍光剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、酵素など
）を用いて標識され得る）への結合のための部位として作用する。
【０１３８】
あるいは、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡハイ
ブリッド二重鎖、またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識し得る抗体が
、使用され得る。同様に、抗体が標識され得、そして二重鎖が表面に結合されて
、アッセイが実施され、その結果、表面上の二重鎖の形成に際して、この二重鎖
に結合される抗体の存在が、検出され得る。新規なアンチセンスＲＮＡに対する
プローブの使用は、従来の任意の技術（例えば、核酸ハイブリダイゼーション、
プラスおよびマイナスのスクリーニング、組換えプロービング、ハイブリッド放
出翻訳（ｈｙｂｒｉｄ  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）（ＨＲＴ
）、ならびにハイブリッド停止翻訳（ｈｙｂｒｉｄ  ａｒｒｅｓｔｅｄ  ｔｒａ
ｎｓｌａｔｉｏｎ）（ＨＡＲＴ））において実施され得る。これはまた、ポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を含む。
【０１３９】
他のマーカーの定性的存在または定量的存在についても試験する診断キットも
また、意図される。診断または予後は、マーカーとして使用される複数の指標の
組合せに依存し得る。従って、キットは、マーカーの組合せについて試験し得る
。例えば、Ｖｉａｌｌｅｔら（１９８９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｇｒｏｗｔ
ｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．１：８９−９７を参照のこと。
【０１４０】
（Ｘ．ランゲリン特異的結合パートナーの単離）
本明細書におけるランゲリンタンパク質の説明は、上記のように、ランゲリン
リガンドまたはランゲリン結合因子を同定するための手段を提供する。このよう
なリガンドまたは結合因子は、かなり高親和性で、特異的に（例えば、選択的に
）ランゲリンまたはそのフラグメントに結合するべきである。代表的なリガンド
または結合因子の結合定数は、少なくとも約３０ｍＭ、例えば、一般に少なくと
も約３ｍＭ、より一般には少なくとも約３００μＭ、代表的には少なくとも約３
０μＭ、３μＭ、３００ｎＭ、３０ｎＭなどである。リガンドまたは結合因子の
いずれかを検出するためのランゲリンの標識化を可能にする種々の構築物が利用
可能にされる。例えば、ランゲリンの直接標識化、二次標識化についてのマーカ
ー（例えば、ＦＬＡＧまたは他のエピトープタグなど）への融合は、結合因子ま
たはリガンドの検出を可能にする。これは、生化学的精製、または発現クローニ
ングアプローチにおける標識化もしくは選択のためのアフィニティー方法として
組織学的であり得る。利用可能なランゲリン配列を用いて適切な構築物を作製す
るツーハイブリッド選択系もまた、適用され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓおよび
Ｓｏｎｇ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６を参照のこと。
【０１４１】
ランゲリンタンパク質は、例えば、発現の発生特異性および細胞型特異性を示
す他の細胞マーカーに対する構造および機能におけるその類似性に基づいて、リ
ガンドと相互作用するべきである。リガンドを単離するための方法は、スクリー
ニングプログラムのために精製ランゲリンを作製する能力によって利用可能にさ
れる。本明細書中に提供されるランゲリン配列を用いた可溶性構築物または他の
構築物は、ランゲリン特異的リガンドのスクリーニングまたは単離を可能にする
。
【０１４２】
一般に、ランゲリンの説明は、ランゲリンならびに／またはランゲリン試薬お
よびランゲリン組成物に関する個々の特定の実施態様に対して、類似して適用可
能である。
【０１４３】
さらなる推敲なく、当業者は、前述の説明を使用してその最大の程度まで本発
明を利用し得ると考えられる。以下の実施例は、本発明を作製および使用するよ
うに例示の目的のために単に示されており、本発明者らが本発明者らの発明とみ
なす範囲を制限することを意図もしないし、解釈されるべきでもない。以下で他
に示されない限り、部は、重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度
はセ氏温度であり、そして圧力は大気圧またはその近傍である。
【実施例】
【０１４４】
（一般的方法）
いくつかの標準的方法は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒ
ｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２
版），第１〜３巻，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｒｏｏ
ｋｌｙｎ，ＮＹ；またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７および補遺）Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅ
ｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｎｎｉｓら（編、１９９０）ＰＣＲ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．に記載される
かまたは参照され；これらの全ては、各々、本明細書において参考として援用さ
れる。タンパク質精製のための方法としては、硫酸アンモニウム沈殿、カラムク
ロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化などのような方法が挙げられる
。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７および定期的な補遺）；Ｄｅｕｔｓｃｈ
ｅｒ（１９９０）「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８２巻，ならびに
このシリーズの他の巻；Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９５および補遺）Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  
Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｍａｔｓｕｄａｉｒ
ａ（編、１９９３）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ；ならびにタンパク質精製産物の使用に際しての製造業者の文献（例えば、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ、またはＢｉｏ−Ｒａｄ，Ｒ
ｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を参照のこと。組換え技術との組合せは、適切なセグメ
ントへの（例えば、ＦＬＡＧ配列またはプロテアーゼ除去可能配列を介して融合
され得る等価物への）融合を可能にする。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ（１９８９）
Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ  １２：６９−７０；Ｈｏｃｈｕｌｉ
（１９９０）「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ  Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ
」、Ｓｅｔｌｏｗ（編）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃ
ｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２：８７−９８，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｎ．Ｙ．；およびＣｒｏｗｅら（１９９２）ＯＩＡｅｘｐｒｅｓｓ：Ｔｈ
ｅ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＱＵＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡを参照のこと：これらは、本明細書において参考として援用さ
れる。
【０１４５】
ＦＡＣＳ分析は、以下に記載される：Ｍｅｌａｍｅｄら（１９９０）Ｆｌｏｗ
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｓｈａｐｉｒｏ（１９８８）Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；およ
びＲｏｂｉｎｓｏｎら（１９９３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔ
ｏｍｅｔｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ
Ｙ。
【０１４６】
（実施例１）
（樹状細胞クローン）
（臍帯血ＣＤ３４+ＨＰＣの収集および精製）
臍帯血サンプルを、ヒトサンプルについて標準の学会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏ
ｎａｌ）指針に従って得た。ＣＤ３４抗原を保有する細胞を、抗ＣＤ３４ｍＡｂ
（Ｉｍｍｕ−１３３．３，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａ
ｎｃｅ）およびヤギ抗マウスＩｇＧコートマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  
Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、Ｍｉｎｉｎａｃｓ分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  
Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる
ポジティブ選択によって単核画分から単離した。全ての実験において、単離した
細胞は、抗ＣＤ３４ｍＡｂを用いて染色することによって判断されるように、８
０〜９９％  ＣＤ３４+であった。
【０１４７】
（造血因子）
組換えヒト（ｒｈ）ＧＭ−ＣＳＦ（比活性：２×１０6Ｕ／ｍｇ；Ｓｃｈｅｒ
ｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｋｅｎｉｌｗ
ｏｒｔｈ，ＮＪ）を、１００ｎｇ／ｍｌ（２００Ｕ／ｍｌ）で使用し；ｒｈＴＮ
Ｆ−α（比活性：２×１０7Ｕ／ｍｇ；Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）
を、２．５ｎｇ／ｍｌ（５０Ｕ／ｍｌ）で使用し；ｒｈＳＣＦ（比活性：４×１
０5Ｕ／ｍｇ；Ｒ＆Ｄ，Ａｂｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を、２５ｎｇ／ｍｌで使用し
；ｒｈＩＬ−４（比活性：１０7Ｕ／ｍｇ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、５ｎｇ／ｍｌで使用し；そしてｒ
ｈＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ）を、１ｎｇ／ｍｌで使用した。
【０１４８】
（ＣＤ３４+ＨＰＣからの樹状細胞生成）
ＣＤ３４+ＨＰＣの培養物を、１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｆｌｏ
ｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＵＫ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ
、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５×１０-5Ｍ  ２−メルカプトエタノールおよびゲ
ンタマイシン（８０μｇ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ  
ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）からなる無エンドトキシン培地（完
全培地といわれる）中、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦおよびＴＮＦ−αの存在下で、Ｃ
ａｕｘら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５８−２６１に記載されるとお
りに樹立した。
【０１４９】
ＣＤ３４+細胞を、２×１０4細胞／ｍｌで２５〜７５ｃｍ2培養フラスコ（Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＮＹ）中に接種した。最適条件を、新鮮なＧ
Ｍ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αを含む培地で４日目に培養物を分割することによっ
て維持した。いくつかの実験において、ＴＮＦ−αを、７日目に、ＴＧＦ−βに
よって置換した。他の実験において、ＤＣを、ヒトＣＤ４０リガンド（Ｌ）遺伝
子（Ｃ．ｖａｎ  Ｋｏｏｔｅｎ博士によって樹立された細胞株（ｖａｎ  Ｋｏｏ
ｔｅｎら（１９９４）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４：７８７−９２））で
安定にトランスフェクトしたマウスＬｔｋ-線維芽細胞Ｌ細胞を用いて９日目ま
たは１２日目に活性化した。簡潔には、１０5の照射ＣＤ４０Ｌ  Ｌ細胞（７，
５００ラド）を、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で、５  １０5のＣＤ３４由来のＤＣと
ともに接種した。
【０１５０】
（表皮細胞の単離）
表皮細胞懸濁物を、乳房の再建形成外科（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐ
ｌａｓｔｉｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ）を受けた患者の正常皮膚から得た。皮膚を、角
膜切開刀セット（ｋｅｒａｔｏｍｅ  ｓｅｔ）で切断し、そして皮膚−表皮スラ
イスを、Ｃａ2+およびＭｇ2+を含まないＨａｎｋの平衡塩溶液中で、０．０５％
トリプシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて４℃にて１８時間処理した（Ｓｅｒｏｍｅｄ
，Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＫＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，ＦＲＧ）。表皮を、微小鉗子を用い
て皮膚から分離した。表皮シート細胞懸濁物を、引き続く組織転置（ｄｉｓｌｏ
ｃａｔｉｏｎ）および滅菌ガーゼ（ｇａｚｅ）による濾過によって得た。ランゲ
ルハンス細胞の濃縮を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ
，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）上の密度勾配遠心分離によって得た。
【０１５１】
（実施例２）
（抗体およびフローサイトメトリー）
単一細胞染色のために、細胞を、以下のｍＡｂを使用して標識した：抗Ｅ−カ
ドヘリン（ＳＨＥ  ７９．７；Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）、抗−
ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、お
よび抗Ｌａｇ。この全ては、ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスイムノグロブリン（
Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって現れた。二重染色のた
めに、細胞を、フィコエリトリン（ＰＥ）結合体化ヤギ抗マウスイムノグロブリ
ン（Ｄａｋｏ）によって現れるｍＡｂ  ＤＣＧＭ４で標識し、そして５％マウス
血清中での飽和後、ＦＩＴＣ結合体化抗ＣＤ１ａ（Ｏｒｔｈｏ，Ｒａｒｉｔａｎ
，ＮＪ）で標識した。ネガティブコントロールを、無関連のマウスｍＡｂを用い
て実施した。蛍光を、ＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて決定した。細胞質内の表現型分類（ｉｎｔｒａｃｙ
ｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）のために、細胞を、同じ手順を
使用して、ＰＢＳ、０．３％サポニン（Ｓｉｇｍａ）および５％ＢＳＡ中で染色
した。
【０１５２】
（実施例３）
（生化学）
タンパク質を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏ
ｎ  Ｘ１００およびプロテアーゼインヒビター（完全Ｍｉｎｉ、Ｂｏｅｒｉｎｇ
ｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）緩
衝液の、１００μｌ／１０7細胞の凍結ペレットへの添加によってＴＧＦ−βを
補充した、ＣＤ３４由来のＤＣから抽出した。４℃にて１時間後、サンプルを遠
心分離して細胞細片を除去した。次いで、上清を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４
５０ヒツジ抗マウス磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）に共有
結合したＤＣＧＭ４とともに４℃で１時間インキュベートした。ビーズを、Ｄｙ
ｎａｌ磁気粒子濃縮機の使用によって抽出緩衝液で洗浄し、そして５０μｌ  Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液の存在下で煮沸するか、または１００μｌの、０
．５Ｍ  グリシン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ２．３）中で４分間再懸濁した
。次いで、上清を、３．５μｌの飽和Ｔｒｉｓ溶液で中和した。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析を、１０〜１５％勾配ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にお
いてＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍを用いて実施し、そしてゲルをクーマーシーＲ２５
０で染色した。２−Ｄ分析を、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ  ｐＨ
３〜１０を有するＭｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩフラットベッドシステムおよび２次
元のためのＥｘｃｅｌｇｅｌ  ＳＤＳ  ８〜１８％（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ）上で実施し、そしてゲルを銀染色した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓに連結
したＩｇＧから溶出したタンパク質の透析サンプルを、Ｎ−グリコシダーゼＦ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３７℃で一晩消化した。元
々のサンプルの５マイクロリットルまたは消化したサンプルの１０マイクロリッ
トルを、ニトロセルロース上に置き、そしてＤＩＧグリカン検出キット（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて処理した。
【０１５３】
（実施例４）
（ランゲリンの精製）
ＤＣＧＭ４発現細胞を、大規模タンパク質抽出のために使用する。このタンパ
ク質を穏やかに可溶化し、そして得られたランゲリンを、タンパク質精製の標準
的な方法を使用して精製する。クロマトグラフィー方法を使用し、そしてイムノ
アフィニティー技術を適用し得る。ランゲリンタンパク質に、引き続きＳＤＳ  
ＰＡＧＥおよび／またはイムノアッセイを行う。診断方法を使用して、このタン
パク質が実質的に純粋であることを確認する。
【０１５４】
精製したタンパク質を、タンパク質の微小配列決定のために使用する。例えば
、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ（編、１９９３）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，
Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照のこと。配列データを使用して配列データベー
ス（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ）を検索し、ランゲリンをコードする天然遺伝子を
見出す。あるいは、この配列データは、例えば、縮重ＰＣＲプライマーなどを使
用してランゲリンをコードする核酸を単離するために有用である。
【０１５５】
タンパク質はまた、さらなる抗体を惹起するために使用される。このような抗
体は、ポリクローナルであってもよいし、モノクローナルであってもよい。この
タンパク質を使用して、力価および親和性をアッセイおよび測定し得る。免疫の
標準的方法は、上記のように利用可能である。
【０１５６】
（実施例５）
（インターナリゼーションアッセイ）
ＴＧＦ−βを補充したＣＤ３４由来のＤＣを、上記で詳説されるとおりに生成
し、そして、インターナリゼーションを、Ｃｅｌｌａら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ
．Ｍｅｄ．１８５：１７４３−５１に記載されるとおりに実施した。１アリコー
トの細胞を、ＲＰＭＩ、０．１％グルタルアルデヒドを用いて５分間、室温で固
定し、そして別のアリコートを固定することなく使用した。両方のサンプルを、
氷上で４０分間、ｍＡｂ  ＤＣＧＭ４またはｍＡｂ  ＤＣＧＭ１を用いて染色し
、そして氷上で１時間、ビオチン標識Ｆ（ａｂ’）2ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａ
ｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ
）とともにインキュベートした。次いで、細胞を、種々の時間の間、３７℃の水
浴中に置き、氷上で冷却し、そしてＰＥ結合体化ストレプトアビジン（Ｂｅｃｔ
ｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて染色した。洗浄後、細胞を、ＦＡＣＳによ
って分析した。インターナリゼーションの測定を、４℃で保存したコントロール
サンプルと比較した細胞表面メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）の減少割合によって与
える。固定細胞において観察されたＭＦＩの減少割合を、３７℃での抗体の解離
速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の尺度とした。ｌｏｇ１０のプロットの線形回帰分析
（メジアン蛍光の割合）対時間を実施し、そして膜結合複合体の摂取速度（ｋ）
および半減期（ｔ1/2）を、ｋ（％／分）＝−２．３０３ｍ×１００、およびｔ1
/2（分）＝ｌｏｇ２／ｍの関係を使用して、得られた直線の傾き（ｍ）から算出
した（Ｌｅｓｌｉｅ，ＥＪＩ  １９８０）。ここでは、マクロファージのマンノ
ースレセプターを認識するこのｍＡｂ  ＤＣＧＭ１は、出願人によって生成され
、そしてレセプター媒介エンドサイトーシスについてのポジティブコントロール
として使用した。
【０１５７】
（実施例６）
（ＤＣＧＭ４モノクローナル抗体の生成および特徴付け）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｉｆｆａ  Ｃｒｅｄｏ，Ｌｅｓ  Ｏｎｃｉｎｓ，Ｆｒａ
ｎｃｅ）を、フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．
，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、ＣＤ３４由来のＤＣ（１０6細胞）の３
回の腹腔内注射によって免疫した。最終注射の３日後、脾細胞を、ポリエチレン
グリコール−１０００（Ｓｉｇｍａ）を使用してマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２と融
合した。ハイブリッド細胞を、９６ウェルＦａｌｃｏｎ組織培養プレート（Ｆａ
ｌｃｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）中に置き、そしてストレプトマイ
シン（１００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、グルタミン（２ｍ
Ｍ）、１０％ウマ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％培養培地
添加物（ＣＲＴＳ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、１０-5Ｍ  アザセリン（Ｓｉｇ
ｍａ）および５×１０-5Ｍヒポキサンチンを補充したＤＭＥＭ  Ｆ１２（Ｌｉｆ
ｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を与えた。
上清を、ＣＤ３４由来のＤＣおよび３つの無関連の細胞型（すなわち、末梢血多
核細胞、ＰＨＡで活性化したＴリンパ球、および骨髄細胞株ＫＧ１（ＡＴＣＣ；
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））との反応性についてスクリーニングした。選択し
たハイブリドーマを、限界希釈によってクローン化し、そして腹水を、ＢＡＬＢ
／ｃマウスにおいて生成した。ＭＡｂ  ＤＣＧＭ４を、ＤＥＡＥ  Ａ５０（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でのアニオ
ン交換クロマトグラフィーによって精製し、そして標準的手順を使用して、フル
オレセインおよびビオチンと結合した。Ｉｇアイソタイプを、マウスハイブリド
ーマサブタイプ分類（ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ）キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＥＬＩＳＡに
よって決定した。
【０１５８】
（実施例７）
（免疫組織学）
アセトン固定化凍結切断（ａｃｅｔｏｎ−ｆｉｘｅｄ  ｃｒｙｏｃｕｔ）組織
切片または細胞サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製物の顕微鏡スライドを、
ｍＡｂとともに６０分間、そして続いてビオチン化ヒツジ抗マウスＩｇ（Ｔｈｅ
Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）とともに３０分間
インキュベートした。アルカリホスファターゼ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＣＡ，Ｕ
ＳＡ）に結合したストレプトアビジンとの３０分のインキュベーション後、酵素
活性を、Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ基質（Ｄａｋｏ）を使用して発現（ｄｅｖｅｌｏｐ）
させた。マウスＩｇＧ１抗体ＤＣＧＭ４およびＩｇＧ２ｂ抗ＣＤ１ａ（Ｉｍｍｕ
ｎｏｔｅｃｈ）を用いる二重染色を、ヒツジ抗マウスＩｇＧ１（Ｔｈｅ  Ｂｉｎ
ｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）、続いてマウス抗アルカリホスファターゼ−アルカリホス
ファターゼ複合体（Ｄａｋｏ）（ＡＰＡＡＰ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、およびビ
オチン化ヒツジ抗マウスＩｇＧ２ｂ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）、続
いてＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）によって示した。
ヤギ抗ｓＩｇＤ−ビオチンおよびＤＣＧＭ４−ビオチン（Ｌａｇを用いる二重染
色について）の結合を、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼによって直接
的に示した。アルカリホスファターゼ活性およびペルオキシダーゼ活性は、Ｆａ
ｓｔ  Ｂｌｕｅ基質（Ｓｉｇｍａ）および３−アミノ−エチルカルバゾール（Ｓ
ｉｇｍａ）を使用してそれぞれ実証された。
【０１５９】
（実施例８）
（電子顕微鏡観察）
ランゲルハンス細胞を富化した上皮細胞懸濁物を、コントロールのマウスＩｇ
Ｇ１（Ｓｉｇｍａ）、抗ＣＤ１ａ（ＤＭ］Ｃ１  ｍＡｂ；ＲＥＦ）、またはＤＣ
ＧＭ４とともに１時間４℃でインキュベートした。洗浄後、細胞を、５ｎＭのコ
ロイド金粒子と結合体化したヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＡＭ−ｎＭ）（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ、住所、Ｆｒａｎｃｅ）とともに３０分間４℃でインキュベートした。細
胞を、直ぐに１８時間、カコジル酸緩衝液中の２％グルタルアルデヒドで固定し
、続いて少なくとも２４時間スクロースを有するカコジル酸緩衝液中で洗浄した
か、または固定前に３７℃もしくは室温に暖めた。サンプルを、スクロースを有
するカコジル酸緩衝液中の１％オスミウムとともに１時間後固定し、脱水し、そ
してエポキシ樹脂中に包埋した。超薄片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で後染
色し、そしてＪＥＯＬ  １２００  ＥＸ電子顕微鏡（ＣＭＥＡＢＧ、Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｅ’  ｄｅ  Ｌｙｏｎ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）上で検査した。細胞
表面抗原密度の定量的な評価を、Ｌａｆｆｅｒｔｙ、ら（１９８１）Ｊ．Ｈｉｓ
ｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ２９：４９−５６）に従って行った。細胞膜
に沿って結合した金顆粒の数を計数し、そしてその細胞の総合的な周囲をミニモ
ップ（ｍｉｎｉｍｏｐ）形態測定分析機（Ｚｅｉｓｓ）を装着した顕微鏡写真上
で測定した。結果を１００μｍの細胞膜あたりの金顆粒の数として表す。各群の
細胞につき、少なくとも２０〜３０細胞片から計数を得た。次いで、平均および
標準偏差を決定した。
【０１６０】
（実施例９）
（共焦点顕微鏡観察）
細胞間免疫蛍光染色を、Ｗｉｎｚｌｅｒ、ら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ
．１８５：３１７−２８によって以前に記載されるように行った。ポリリジンコ
ーティングし、そして１５分間４％パラホルムアルデヒドで固定したカバースリ
ップ上の細胞を、１０ｍＭグリシン中で洗浄し、次いで０．５％サポニン、０．
２％ＢＳＡで３０分間透過化した。カバースリップを３０分間室温で、透過化培
地中で最終濃度５μｇ／ｍｌの、抗ＬＡＭＰ−１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａ
ｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
）または抗Ｌａｇ（Ｋａｓｈｉｓｈａｒａ、ら  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａ
ｔｏｌ  ８７：６０２−６０７）とともにインキュベートした。３回の洗浄後、
細胞を、二次標識抗体（テキサスレッドと結合体化したロバ抗マウス（Ｖｅｃｔ
ｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ））とともに３
０分間インキュベートし、洗浄し、そして３０分間マウス免疫前血清とともにイ
ンキュベートし、再び洗浄し、２％パラホルムアルデヒドとともに後固定し、そ
して最後に３０分間フルオレセインと結合体化したｍＡｂ  ＤＣＧＭ４（ＦＩＴ
Ｃ）とともにインキュベートした。洗浄後、カバースリップをフルオロマウント
（ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を備えたガ
ラススライドにはめた。共焦点顕微鏡観察を、アルゴン／クリプトンイオンレー
ザと接続し、かつ蛍光フィルターおよび検出器を備えたＣｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａ
ｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ＴＣＳ  ４Ｄ（Ｌｅｉｃａ
Ｌａｓｅｒｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）を用いて行い、ＦＩＴＣおよびテキサスレッドマーカーを同時記録すること
を可能とした（Ｒｏｖｅｒｅ、ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０６７−１０７２）。
【０１６１】
（実施例１０：ランゲリンに対して反応性のモノクローナル抗体ＤＣＧＭ４の
選択）
８５４のハイブリドーマからの上清を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αにおい
て１２日間培養した、ＣＤ３４+ＨＰＣから得たＤＣに対する反応性についてス
クリーニングした。並行して、その上清を、３つの無関連の細胞型（すなわち、
末梢血多核細胞、ＰＨＡで活性化されたＴリンパ球および骨髄細胞株ＫＧ１）に
対する反応性についてアッセイした。１つのハイブリドーマ（ＤＣＧＭ４と命名
される）からの上清がＤＣのマイナーなサブセットとのみ反応し、そしてディフ
ァレンシャルスクリーニングの他の細胞型とは反応しないことが見出された。
【０１６２】
このハイブリドーマを、限界希釈することによってクローニングした。この抗
体を、腹水中で産生させ、そして続いてＤＥＡＥクロマトグラフィーを使用して
精製した。ＭＡｂ  ＤＣＧＭ４は、ＥＬＩＳＡによって決定したところ、ＩｇＧ
１／κアイソタイプであると見出された。ＤＣサブセットに対して制限された、
観察された反応性が、特に興味深いようであったことから、ｍＡｂ  ＤＣＧＭ４
をさらなる研究のために選択した。最後に、初期の実験がＬＣが陽性に染色され
たことを示すことから、本発明者らは、ｍＡｂ  ＤＣＧＭ４によって認識される
抗原をランゲリンと名づけた。
【０１６３】
（実施例１１：ランゲリンは、ランゲルハンス型未熟樹状細胞において選択的
に発現する）
ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αの組みあわせとともに１２日間培養したＣＤ３
４+ＨＰＣは、ＣＤ１ａ+  ＤＣへと分化した（Ｃａｕｘ、ら（１９９６）Ｊ  Ｅ
ｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：６９５−７０６）。そのような培養の間のランゲリンの
発現を、調査した。ランゲリンは、臍帯血ＣＤ３４+  ＨＰＣに由来するＣＤ１
ａ+樹状細胞のサブセットによって発現する。ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αに
おけるＣＤ３４+  ＨＰＣの培養の間のＣＤ１ａおよびランゲリン発現の反応速
度論を、種々の時点で決定し、細胞を回収し、そして抗ＣＤ１ａ−ＦＩＴＣなら
びにＤＣＧＭ４および抗マウスＩｇＧ−ＰＥを用いて二重標識した。結果は、５
つの実験の代表である。
【０１６４】
染色は、０日目にも６日目にも検出されなかった。このことは、ＣＤ３４+ 
ＨＰＣおよびそのすぐの子孫がランゲリンを発現しないことを示す。この抗原は
、ＣＤ１ａ+細胞の小さなサブセット上に７日目に現れた。７日目と１２日目と
の間に、ランゲリンの発現は最大に達し、１５〜３５％のＣＤ１ａ+細胞が染ま
った。培養物におけるランゲリン発現細胞の樹状性の性質を、ＤＣＧＭ４+  Ｆ
ＡＣＳ選別した細胞のサイトスピン調製によって確認した。
【０１６５】
Ｃａｕｘ、ら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：６９５−７０６は、
さらに、ＣＤ３４+  ＨＰＣが異なる前駆体サブセットに由来する独立した２つ
の経路に沿って分化することを示した。このサブセットは、培養の間の初期（５
日目〜７日目）にＣＤ１ａおよびＣＤ１４の相互に排他的な発現によって同定さ
れる。そのような前駆体を、ＦＡＣＳ選別によって、６日目に分離し、そしてＧ
Ｍ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αでさらに６日にわたり培養した場合、ランゲリンは
、ほとんど、ＣＤ１４由来のＤＣ（１６％）に比して、ＣＤ１ａ由来のＤＣ（４
０％）上で発現していることが見出された。ＣＤ１ａ由来のＤＣは、ランゲルハ
ンス細胞と関連する特徴を表すことが示されており、これには、バーベック顆粒
球の存在が含まれる。
【０１６６】
次に、ランゲリンのインサイチュ分布を、種々のヒト組織の免疫組織学的分析
によって試験した。ランゲリンは、ＬＣ様ＤＣによって選択的に発現される。ラ
ンゲリン発現の免疫組織学的分析を皮膚、扁桃および肺の切片において行った。
上皮内では、ランゲリンはＬＣにおいてのみ見出され、これはまた、抗Ｌａｇ抗
体および抗ＣＤ１ａ抗体でも染色される。皮膚では、ｍＡｂ  ＤＣＧＭ４または
ｍＡｂ  ＤＣＧＭ４および抗Ｌａｇ抗体もしくは抗ＣＤ１ａでの染色は、ＬＣに
よって陽性のランゲリン発現を示した。扁桃では、ランゲリン陽性の細胞は、上
皮内に見出された（例えば、小胞性外套Ｂ細胞）。数個の細胞が、ときおり、Ｔ
細胞領域において染色されたが、胚中心のランゲリン+細胞においては全く観察
されなかった。この細胞はまた、肺上皮において顕著に存在する。肺では、ｍＡ
ｂ  ＤＣＧＭ４およびヘマトキシリンでの対比染色は、気管支上皮においてのみ
ＬＣ様のランゲリン+細胞を示した。ランゲリン+  ＤＣは、樹状性形態を示した
。コントロールＡｂにおいては染色されなかった。これらの結果は、５つの実験
の代表である。
【０１６７】
ＣＤ３４由来のＤＣとは対照的に、ｍＡｂ  ＤＣＧＭ４は、ＧＭ−ＣＳＦおよ
びＩＬ−４の組合せとともに６日間培養した末梢血単球から得られたＤＣとは反
応しなかった。従って、このことは、さらに、ランゲリン発現の制限を確認する
。同様に、ランゲリンは、末梢血から単離した、エキソビボで精製したＤＣから
も、扁桃から単離した生殖中心ＤＣにおいても、いずれにおいても検出されなか
った。
【０１６８】
最後に、ｍＡｂ  ＣＣＧＭ４を、異なる造血由来細胞型のパネルに対する反応
性について分析した。ランゲリンは、エキソビボで単離したＴリンパ球、Ｂリン
パ球、単球、または顆粒球においても、骨髄系細胞株（ＨＬ６０、ＫＧ１、Ｕ９
３７、ＴＨＰ１）においてもリンパ系細胞株（Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ、ＰＲＥＡＬ
Ｐ）においても見出されなかった。
【０１６９】
まとめると、上記のデータは、ランゲリン発現が、未熟なＤＣ区画に制限され
ており、そしてＤＣ成熟において次第に欠失することを示唆する。
【０１７０】
（実施例１２：ランゲリン発現は、ＴＧＦ−βによって上方制御され、そして
ＣＤ４０活性化の後に減少する）
ｍＡｂ  ＤＣＧＭ４がＬＣ様未熟ＤＣと選択的に発現することが見出されたこ
とから、ＤＣ成熟に影響を与える因子がランゲリンの発現レベルに影響を与える
か否かを試験した。
【０１７１】
インビトロおよびインビボでの研究は、ＴＧＦ−βが、ＬＣ発生における必須
の役割を果たすことが示された。従って、インビトロ由来のＤＣによる、ＴＧＦ
−βのランゲリン発現に対する効果を評価した。
【０１７２】
評価を行うために、臍帯血ＣＤ３４+ＨＰＣを、７日目〜１２日目にＴＧＦ−
βの非存在または存在下で、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−α中で１２日間培養し
た。続いて、このＤＣを、２日間、ＣＤ４０ＬでトランスフェクトしたＬ細胞と
ともに培養した。細胞を、０．１％サポニンを用いた前処理なしの、またはその
後の染色のために、ＦＩＴＣ結合体化した抗マウスＩｇによって明らかとなった
ｍＡｂを用いて処理した。この結果は、５を超える実験の代表である。
【０１７３】
ＣＤ３４由来のＤＣに、ＴＧＦ−βを培養の最後の３日間（９日目〜１２日目
）補充した。これによって、ランゲリン発現の強力な上方制御がもたらされた。
ランゲリン+細胞の割合を増すことに加えて、ＴＧＦ−βは、１細胞あたりの表
面膜分枝の平均数を増加させた（ＴＧＦ−βなしで３３×１０3の代わりに９３
×１０3）。ＴＧＦ−βの効果は、ランゲリンマーカー（例えば、バーベック顆
粒球関連抗原Ｌａｇ）を通常欠いている、ＣＤ１２由来のＤＣサブセット上で主
に発揮された。ランゲリン発現は、形質膜に限定されないが、これはまた、膜透
過性の後に細胞間で検出される。細胞間のランゲリンのレベルはまた、ＴＧＦ−
βによって顕著に増強した。ＴＧＦ−βはまた、ＬＣマーカーＬａｇおよびＥ−
カドヘリンの発現を増加させたが、Ｌａｇは、細胞表面上では検出されなかった
こともまた見出された。
【０１７４】
ＤＣ成熟を誘導することが知られるサイトカインであるＴＮＦ−αを培養の最
後の３日間除去することによって、ＴＧＦ−βの存在または非存在にかかわりな
く、ランゲリン発現が上方制御された。この結果に一致して、ランゲリン表面膜
発現における強力な減少は、ＣＤ４０Ｌ（同時刺激分子の上方制御を含むＤＣの
成熟を惹起するシグナル）での活性化の後にＨＬＡ−ＤＲの増加を伴うことが見
い出された。まとめると、これらの結果は、ＬＣ表現型を誘導するＴＧＦ−βは
、ランゲリン発現を上方制御するが、ＤＣ成熟を惹起するシグナルは、ランゲリ
ン発現を減少させることを確認する。
【０１７５】
（実施例１３：細胞間ランゲリンおよびＬａｇは、未熟ＤＣに同時局在化する
が、活性化の際に解離する）
ランゲルハンス細胞の独特の特徴は、細胞質間のバーベック顆粒球（ＢＧ）の
存在である。ランゲリンがランゲルハンス型ＤＣにおいて選択的に発現すること
が見出されたことから、Ｌａｇ抗原とのランゲリンの関係をさらに試験した。従
って、ＴＧＦ−βを補充し、そして高い比率の、電子顕微鏡観察によって検出さ
れるＢＧ+細胞を含むＣＤ３４由来のＤＣを、二連蛍光染色および共焦点顕微鏡
観察によって分析した。ＣＤ３４由来のＤＣにＴＧＦ−βを、培養の７日目〜９
日目に補充した。二重色共焦点レーザー走査顕微鏡観察を９日目およびＣＤ４０
Ｌの活性化後のその２日後に実施した。ランゲリン陽性およびＬａｇ陽性のベシ
クルは、９日目に未熟ＤＣを同時局在化したことが見出された。ＣＤ４０Ｌ活性
化後、ランゲリン+Ｌａｇ-染色が、核付近に観察された。同時局在化は、ランゲ
リンとＨＬＡ−ＤＲまたはＬＡＭＰ−１との間で、ＣＤ４０Ｌ活性化に拘らず検
出された。ランゲリンおよびＬａｇは、顕著な細胞間同時局在化を示すことが見
出された。しかし、驚くべきことに、２つのマーカーの局在化は、ＣＤ４０Ｌで
の活性化の際に分離した。従って、ランゲリンは、核の非常に近傍ではＬａｇの
日存在下で見出されるが、２つのマーカーの同時局在化された発現は、表面膜の
直ぐ下に残っていたのみであったことが見出された。
【０１７６】
これらの結果は、ランゲリンが、Ｌａｇとは異なり、そしてランゲリンが、Ｄ
Ｃ活性化の間の細胞の深い区画に向けて経路が採られることを示す。最後に、ラ
ンゲリンは、ＣＤ４０架橋による活性化に拘らず、リソソームマーカーのＬＡＭ
Ｐ−１とも、ＨＬＡ−ＤＲとも同時局在化はしていないことが見出された。
【０１７７】
（実施例１４：ランゲリンは、エンドサイトーシス構造およびバーベック顆粒
球と関連する）
ランゲリンは、細胞表面において発現される（膜透過性の非存在下におけるＦ
ＡＣＳによって検出されるように）ことから、電子顕微鏡観察を、上皮細胞懸濁
物において行って、その正確な分布を分析した。ランゲルハンス細胞は、そのよ
うな懸濁物において、折り畳まれた核、ケラチン繊維の欠如、デスモソームおよ
びメラノソームの欠如、および特徴的なＢＧの存在によって容易に認識可能であ
る。
【０１７８】
上皮細胞懸濁物を、上記のように入手した。ｍＡｂは、５ｎｍ金標識したヤギ
抗マウス  ＩｇＧ１によって明らかになった。ＣＤ１ａは、細胞表面において均
一の分配されているが、ランゲリンは、しばしば、膜厚領域に会合している。細
胞膜サンドイッチ構造およびコーティングされたピットを、ＤＣＧＭ４を用いて
、４℃で染色することで可視化した。３７℃でのインキュベーションの際、細胞
膜金粒子染色含有ベシクルおよびバーベック顆粒が見られた。ＤＣＧＭ４染色お
よび金粒子は、ＢＧの内腔側に現れた。これらの結果は、異なる皮膚サンプルに
おける３つの実験の代表である。
【０１７９】
ＤＣＧＭ４および５ｎｍの金粒子での４℃での染色は、ランゲリンが、ＬＣに
おいて細胞表面と明らかに会合しているが、ＣＤ１ａより低密度で（１６１．５
±９７．１対１５８９．１±４１８．８金粒子／１００μｍ膜）あったことが確
認された。単一の金粒子に加えて、自然なクラスター化が、その抗体を超遠心分
離したにもかかわらずＤＣＧＭ４を用いて観察された。イソ型適合コントロール
８マウスＩｇＧｌは、ＬＣには結合しなかった（１．３±３．４顆粒／１００μ
ｍ）。ＤＣＧＭ４の標識は、上皮細胞懸濁物に存在するケラチノサイトでもメラ
ノサイトでも観察されなかった。
【０１８０】
ＣＤ１ａのやや均一な分布と比較すると、ランゲリンは、細胞表面でランダム
に分布されていなかったが、しばしば、膜肥厚の特定の領域と関連した。さらに
、ＤＣＧＭ４は、典型的なエンドサイトーシス被覆小窩を、細胞膜で４℃にて誘
導した。被覆小窩の数は、抗ＣＤ１ａまたはコントロールマウスＩｇＧ１を用い
る染色と比較して、ＤＣＧＭ４によって有意に増大（平均３．６倍）した。特に
、ＤＣＧＭ４染色の間に誘導した被覆小窩は、金粒子を含んでいた。さらに、細
胞を固定の前に暖めさせた場合、ＤＣＧＭ４染色が、３７℃にて２分後に、すで
に被覆小胞の内側で観察された。これらのデータは、ランゲリンが、レセプター
媒介エンドサイトーシスの初期の工程の構造特性と関連することを実証する。
【０１８１】
４℃にてＤＣＧＭ４で染色することはまた、細胞表面での細胞膜サンドイッチ
（ｓａｎｄｗｉｃｈｉｎｇ）構造の形成を生じた。一貫して、４℃でのＤＣＧＭ
４の後に、金標識化ＢＧは、細胞膜に密接して見られ、そして細胞を３７℃にて
２分間暖めた場合、細胞質の内側に見出された。このＢＧを、それらの中心線条
（ｃｅｎｔｒａｌ  ｓｔｒｉａｔｅｄ）ラメラまたはそれらの球（ｂｌｕｂ）に
おいて標識した。
【０１８２】
まとめると、これらの結果は、ランゲリンがエンドサイトーシス構造と関係し
、そしてまた、細胞膜からバーベック顆粒に接近し得ることを示す。
【０１８３】
（実施例１５）
（ランゲリンは、ＤＣにおいて急速な内部移行を媒介する）
エンドサイトーシスにおけるランゲリンの役割をさらに試験するために、本発
明者らは、リガンドとしてＤＣＧＭ４を内部移行するその能力を分析した。
【０１８４】
ＴＧＦ−βを補充したＣＤ３４由来ＤＣを、４℃にてｍＡｂで標識し、次いで
Ｆ（ａｂ’）2ビオチン化二次抗体で標識した。細胞を、３７℃にて示した時間
インキュベートし、そして内部移行は、ＰＥ−結合体化ストレプトアビジンを用
いるＦＡＣＳ分析によって決定した細胞表面結合抗体の減少として測定した。ｍ
Ａｂ  ＤＣＧＭ４を、３７℃にて急速に内部移行させた。これは、抗マンノース
レセプターｍＡｂ（陽性コントロール）と類似の動態を有していた。固定した細
胞において、細胞表面蛍光の減少は、検出されなかった。結果を、４℃で保った
コントロールサンプルと比較した平均蛍光強度（ＭＦＩ）の減少の割合として分
析した。
【０１８５】
この抗体が、４℃ではなく、３７℃にて、ＤＣにより非常に急速に内部移行さ
れたことを見出した。表面膜結合ＤＣＧＭ４の約７５％は、３７℃にて１分以内
で、すでに内部移行された。これは、レセプター媒介エンドサイトーシスについ
ての陽性コントロールとした用いた抗マンノースレセプターｍＡｂ  ＤＣＧＭ１
動態と類似の動態を伴った。代表的な実験において、細胞膜でのＤＣＧＭ４の半
減期（ｔ1/2）を、３７℃にて４．５分であると算出した。これは、ｋ＝１５．
３％／分の内部移行速度を有する。細胞表面からのｍＡｂ  ＤＣＧＭ４の急速な
消失は、抗体解離が原因ではない。なぜならば、蛍光の減少は、３７℃にてイン
キュベートしたグルタルアルデヒド固定化ＤＣにおいて観察されなかったからで
ある。最終的に、ランゲリンは、マンノース型レセプター特異性を表示しなかっ
た。なぜならば、ＤＣＧＭ４は、３７℃にてＤｅｘｔｒａｎ−ＦＩＴＣの取り込
み阻害することに失敗し、そして抗体の結合を、４℃にてマンナンによって、阻
害しなかったからである。
【０１８６】
これらの結果は、上記の電子顕微鏡観察分析と一致しており、そしてランゲリ
ンが、ＤＣによる、急速なエンドサイトーシスプロセスに関与することを実証す
る。
【０１８７】
（実施例１６）
（細胞表面ランゲリンの誘発（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）は、バーベック顆粒形
成を生じる）
細胞表面ランゲリンの誘発は、電子顕微鏡観察により可視化した場合、ＣＭＳ
の形成および金標識化ＢＧの検出を生じたので、ＢＧ形成におけるランゲリン細
胞表面の潜在的な役割を、さらに調査した。上皮細胞懸濁液を、上記のように得
た。細胞を、４℃にて過剰のｍＡｂ  ＤＣＧＭ４または抗ＣＤ１とインキュベー
トし、そして電子顕微鏡観察のために直ちにプロセスするか、または固定化の前
に５分間室温に置いた。ＤＣＧＭ４とインキュベートしたＬＣは、核周囲の領域
においてバーベック顆粒の著しい蓄積を示した。この効果は、４℃で主に観察さ
れた。なぜならば引き続いて暖めることは、空胞形成を生じるからである。抗Ｃ
Ｄ１ａ  ｍＡｂでの処理は、細胞を４℃に保ったか、または室温まで上げたかに
かかわらず、ＬＣ細胞質において有意な変化を引き起こすことに失敗した。
【０１８８】
この処置は、ＬＣ細胞質における高密度に充填したＢＧのかなりの増加を生じ
た。これは、ゴルジ体の周りの核周囲領域における著しい沈着を伴った。このＢ
Ｇは、それらの代表的な棒の形をした（ｒｏｄ−ｓｈａｐｅｄ）部分に加えて、
細長い、丸い、または不規則な形をした幅広い部分を表した。さらに、ＤＣＧＭ
４処理したＬＣの細胞質は、多数の丸いまたは細長い小胞で満たされた。
【０１８９】
ＬＣを室温まで温めた（５分）後に、過剰のＤＣＧＭ４とインキュベートした
場合、融合の増加を、単一の短い棒の形をしたＢＧ成分と大きな小胞成分との間
で観察した。さらに、種々の大きさおよび形の多数の小胞が、ＬＣ細胞質のかな
りの体積を占有した。
【０１９０】
ＤＣＧＭ４と対照的に、過剰の抗ＣＤ１ａ  ｍＡｂとの上皮細胞懸濁液のイン
キュベーションは、いくつかの小胞の形成のみを導いたが、ＬＣ細胞質における
他の有意な変化を導かなかった。特に、たとえ細胞を、固定の前に暖めさせても
、核周囲のＢＧの沈着は観察されなかった。同様に、コントロールマウスＩｇＧ
１または抗ＥカドヘリンｍＡｂとのインキュベーションは、ＢＧ顆粒を改変しな
かった。
【０１９１】
まとめると、これらのデータは、細胞表面ランゲリンが、ＢＧ形成に能動的に
関与して、それらの核周囲の沈着を生じることを実証する。
【０１９２】
（実施例１７）
（ランゲリンは、４０ｋＤａのＮグリコシル化タンパク質である）
ＤＣ抽出物からのＤＣＧＭ４での免疫沈降、そして引き続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ
サンプル緩衝液での溶出は、４０〜４２ｋＤａの分子量の均質のバンドを得た。
非還元条件下および還元条件下での免疫精製ランゲリンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
を実行した。ＤＴＴが精製工程の初めから除かれる場合、このプロファイルは、
ゲル上で改変されない。このことは、ランゲリンが、単鎖としてか、または非共
有結合を有するホモ二量体として細胞膜に存在することを示唆する。
【０１９３】
免疫精製ランゲリンの二次元分析を行い、分子の分子量を確立し、そしてラン
ゲリンが５．２〜５．５のｐＩを有することを示した。最終的に、（１）非グリ
コシル化コントロールとしてＥ．ｃｏｌｉ由来のクレアチナーゼ、（２）陽性グ
リコシル化コントロールとしてトランスフェリン、（３）Ｎ−グリコシダーゼ、
（４）ランゲリン、および（５）Ｎ−グリコシダーゼ処理したランゲリンを用い
るランゲリンのドット−ブロット分析は、ランゲリンが糖タンパク質であり、そ
してほとんどの糖質成分が、Ｎ−グリコシダーゼ処理によって取り除かれたこと
を実証した。
【０１９４】
（実施例１８）
（ランゲリンをコードする核酸の単離）
精製タンパク質（特に、ここではタンパク質の存在を認識する抗体）をコード
する遺伝子を単離するために、多数の方法が利用可能である。一つの方法は、タ
ンパク質の精製のための方法を決定すること、次いでペプチド配列を決定するこ
とである。所定の十分な配列情報、および縮重オリゴヌクレオチドの使用、ＰＣ
Ｒまたはハイブリダイゼーション技術は、ランゲリンタンパク質をコードする遺
伝子の単離を可能にする。
【０１９５】
別の代替法は、ランゲリンタンパク質に対するさらなる抗体を作製することで
ある。これは、ＤＣＧＭ４抗体を用いるイムノアフィニティー法によって単離さ
れ得る。上記を参照のこと。これらの抗体は、ＳｅｅｄおよびＡｒｕｆｆｏ（１
９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３３６５−
３３６９により記載されるような「パニング」技術において適用可能である。フ
ァージ発現技術もまた、ランゲリン発現について富化された適切なＤＣ細胞また
はＴ細胞の部分集団に由来するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため
に適用可能である。抗体認識を用いるグリコシル化の妨害は、一般に、ファージ
選択系においては問題が少ない。哺乳動物発現ライブラリーにける細胞選別技術
もまた、適用可能である。
【０１９６】
発現ライブラリーをスクリーニングするための別の方法は、抗体を使用して、
ライブラリーの連続的な部分集団をスクリーニングすることである。以下に、特
異的な標識組成物（例えば、抗体）によって染色したスライド上の細胞の小集団
を使用してスクリーニングする一つの方法を提供する。
【０１９７】
例えば、０日目に、２−チャンバペルマノックス（ｐｅｒｍａｎｏｘ）スライ
ドを、チャンバあたり１ｍｌのフィブロネクチン（ＰＢＳ中１０ｎｇ／ｍｌ）で
３０分間、室温にてプレコートする。１度ＰＢＳですすぐ。次いで、ＣＯＳ細胞
を、１．５ｍｌの増殖培地中でチャンバあたり２〜３×１０5細胞にてプレート
する。３７℃で一晩インキュベートする。
【０１９８】
１日目に各サンプルについて、無血清ＤＭＥ中、６６μｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥー
デキストラン、６６μＭ  クロロキン、および４μｇＤＮＡの０．５ｍｌの溶液
を調製する。各組みについて、例えば、１および１／２００の希釈のヒトＩＬ−
１０−ＦＬＡＧ  ｃＤＮＡ構築物の陽性コントロールを調製し、そして陰性モッ
クを調製する。細胞を無血清ＤＭＥですすぐ。ＤＮＡ溶液を添加し、そして３７
℃にて５時間インキュベートする。培地を取り除き、そしてＤＭＥ中の０．５ｍ
ｌ  １０％  ＤＭＳＯを２．５分間添加する。これを取り除き、そしてＤＭＥで
１度洗浄する。１．５ｍｌの増殖培地を添加し、そして一晩インキュベートする
。
【０１９９】
２日目に、培地を交換する。３または４日目に、この細胞を固定し、そして染
色する。細胞を、Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｌｕｔ
ｉｏｎ（ＨＢＳＳ）で２度すすぎ、そして４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）
／グルコース中で５分間固定する。ＨＢＳＳで３度洗浄する。スライドを全ての
液体の除去後に−８０℃で保存してもよい。各チャンバについて、０．５ｍｌの
インキュベーションを以下のように行う。ＨＢＳＳ／サポニン（０．１％）を３
２μｌ／ｍｌの１Ｍ  ＮａＮ3と共に２０分間、添加する。次いで、細胞をＨＢ
ＳＳ／サポニンで１度洗浄する。可溶性抗体（例えば、ＤＣＧＭ４）を、細胞に
添加し、そして３０分間インキュベートする。細胞をＨＢＳＳ／サポニンで２度
洗浄する。二次抗体（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ抗マウス抗体）を、１／２００希釈
で添加し、そして３０分間インキュベートする。ＥＬＩＳＡ溶液（例えば、Ｖｅ
ｃｔｏｒ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液）を調製し、
そして３０分間プレインキュベートする。例えば、２．５ｍｌ  ＨＢＳＳ／サポ
ニンあたり１滴の溶液Ａ（アビジン）、および１滴の溶液Ｂ（ビオチン）、用い
る。細胞を、ＨＢＳＳ／サポニンで２度洗浄する。ＡＢＣ  ＨＲＰ溶液を添加し
、そして３０分間インキュベートする。細胞を、ＨＢＳＳで２度洗浄する（２回
目の洗浄を２分間する（これにより細胞を密閉する））。次いで、Ｖｅｃｔｏｒ
ジアミノ安息香酸（ＤＡＢ）を５〜１０分間添加する。５ｍｌのグラス蒸留水あ
たり、２滴の緩衝液、および４滴のＤＡＢ、ならびに２滴のＨ2Ｏ2を用いる。慎
重にチャンバーを取り出し、そしてスライドを水ですすぐ。数分間風乾し、次い
で、１滴のＣｒｙｓｔａｌ  Ｍｏｕｎｔ添加し、そしてカバーガラスをする。５
分間、８５〜９０℃で焼く。
【０２００】
あるいは、ランゲリンタンパク質を用いて、リガンドを発現する細胞を、アフ
ィニティー精製するか、または分類する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（前出
）またはＡｕｓｕｂｅｌら、（前出）（これらの両方は本明細書で参考として援
用される）を参照のこと。
【０２０１】
（実施例１９）
（ヒトゲノムランゲリン）
ゲノム配列（配列番号３）およびヒトランゲリンのエキソン−イントロン構成
（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）は、今や決定された。このゲノム配列は、５つの
イントロンで隔てられた６つのエキソンとして、ランゲリンｃＤＮＡ配列（配列
番号１）を含む。エキソン１〜６のヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号４
〜９に提供する。この１０，６６３ヌクレオチドゲノム配列は、エキソン１およ
び６の５’および３’末端に、それぞれ３２５１ヌクレオチドおよび１８０８ヌ
クレオチドを含み、そしてヒトランゲリンプロモーターの配列を含むと予測され
る。
【０２０２】
エキソン１（配列番号４）は、配列番号３の３２５２〜３３７１位に対応する
。エキソン２（配列番号５）は、配列番号３の３４６７〜３５８３位に対応する
。エキソン３（配列番号６）は、配列番号３の５０５１〜５４２５位に対応する
。エキソン４（配列番号７）は、配列番号３の６０２０〜６１７１位に対応する
。エキソン５（配列番号８）は、配列番号３の７２５２〜７３７０位に対応する
。エキソン６（配列番号９）は、配列番号３の７８７１〜８８５５位に対応する
。
【０２０３】
ヒトランゲリンは、３２８アミノ酸ＩＩ型膜貫通Ｃａ＋＋依存性レクチンであ
る。６つのエキソンのアミノ酸翻訳は、エキソン１が、分子内ドメインのＮＨ２
−末端部分（２４アミノ酸）をコードし、一方、膜近位部分の分子内ドメイン（
１９アミノ酸）および膜貫通ドメイン全体（２０アミノ酸）の両方は、エキソン
２によりコードされることを示す。エキソン３は、細胞外ドメイン（１２５アミ
ノ酸）の膜近位非糖質認識部分全体をコードする。細胞外糖質認識部位（ＣＲＤ
）は、エキソン４（５１アミノ酸）、エキソン５（３９アミノ酸）、およびエキ
ソン６の初め（５０アミノ酸）（後の方は、分子のＣＯＯＨ−部分を終結させる
）によって、共同でコードされる。特に、ランゲリンのＣＲＤは、他のＩＩ型膜
貫通レクチン（Ｋｕｐｐｆｅｒ細胞レセプター、ラット肝細胞レクチン（ｈｅｐ
ａｔｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ）、およびＣＤ２３低アフィニティーＩｇＥレセプター
を含む）の３つのエキソン構造を、類似の位置でイントロンにより妨げられるコ
ード配列と共有する。
【０２０４】
ゲノムランゲリン配列の有効性は、ヒトランゲリンのプロモーターエレメント
の同定を、ここで可能にする。このエレメントは、エキソン１の４８位でＡＴＧ
開始コドンの５’側の５００〜６００ヌクレオチド内に位置されると予想される
。類推によって、ラットＫｕｐｐｆｅｒ細胞レセプター（ヒトランゲリンに相同
）において、転写開始部位は、ＡＴＧ翻訳開始コドンから５１塩基上流に位置さ
れる。２つのヌクレオチド配列が、転写の開始点に対して５’側に同定された。
これらは、遺伝子発現の調節のための候補である。一方は、ヌクレオチド−１５
１〜−９８および−９７〜−４４に由来する５４塩基タンデムリピート配列であ
り、そして他方は、開始部位に対して５’側に３８０塩基で４回反復されるヘプ
タヌクレオチド配列（ＧＡＧＧＣＡＧ）である。
【０２０５】
ヒトランゲリンは、ランゲルハンス細胞において特異的に発現される抗原の捕
捉およびプロセシングに特定化された、未成熟な樹状細胞のサブタイプである。
従って、ランゲリンプロモーターエレメントの制御下での、ランゲルハンス細胞
における選択的発現を標的化するための、選り抜きの抗原をコードするＤＮＡ配
列を構築することが可能である。
【０２０６】
ヒトランゲリン配列は、マウスホモログランゲリンゲノム配列の同定を可能に
する。この情報は、ランゲリン遺伝子におけるマウス欠損の構築の鍵となり、ラ
ンゲリンの機能およびバーベック顆粒（ランゲリンのエンゲージメントにより誘
導されるランゲルハンス細胞の固有のエンドサイトーシスの細胞小器官）の機能
をさらに探索する。
【０２０７】
ヒトランゲリン配列はまた、未知の病因の免疫学的障害に罹患した患者におけ
るランゲリン遺伝子において、起こり得る変異の配列決定を可能にする。
【０２０８】
（実施例２０）
（ヒトランゲリンの染色体マッピング）
染色体局在を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｇ３  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄ
パネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌ
ｅ，ＡＬ）を用いて、放射性ハイブリット（ＲＨ）マッピング（Ｄ．Ｒ．Ｃｏｘ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２５０：２４５−２５０）によって行った。簡
単には、ＰＣＲ反応によりランゲリンｃＤＮＡを増幅するために用いられる２つ
のオリゴヌクレオチド（Ｕ８６３およびＬ１１８０）は、それらがヒトゲノムＤ
ＮＡの伸長もまた増幅させるように選択された。ＰＣＲ反応を、ヒトゲノムを網
羅する８３クローンのＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｇ３パネル上でＵ８６３／Ｌ１１８０
を用いて実行した。ＲＨＭＡＰ統計プログラム（ＲＨＭＡＰ）を用いてマッピン
グするために、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  
ＲＨｓｅｒｖｅｒ（ＬＩＥＮＨＹＰＥＲＴＥＸＴＥ  ｍａｉｌｔｏ：ｒｈｓｅｒ
ｖｅｒ＠ｐａｘｉｌ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ  ｒｈｓｅｒｖｅｒ＠ｐａｘｉ
ｌ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ）にＰＣＲデータをかけた。
【０２０９】
ＲＨ  Ｓｅｒｖｅｒからの結果は、マーカーＳＨＧＣ−５８９２２（ＬＯＤス
コア：８．６７）およびＳＨＧＣ−１２７１４（ＬＯＤスコア：７．７４）に最
も近い一致を示した。両マーカーを、第２染色体上に位置づける。これらを、Ｇ
ＤＢ遺伝子座Ｄ２Ｓ２９２
【０２１０】
【数１】
2009280620.tif 000002
に連鎖させる。Ｄ２Ｓ２９２遺伝子座付近の遺伝子マッピングは、以下：
【０２１１】
【数２】
2009280620.tif 000003
この結果は、ヒトランゲリンの遺伝子を、Ｄ２Ｓ２９２遺伝子座の近傍の染色体
の２ｐ１３に局在化させる。
【０２１２】
ヒトランゲリンの局在は、染色体の２ｐ１３領域と潜在的に関連する免疫学的
遺伝的障害を調査することを可能にする。
【０２１３】
（実施例２１）
（マウスランゲリンの同定）
ヒトランゲリンのヌクレオチド配列を使用して、ＮＣＢＩデータベースにおい
て検索を行った。これは、ヒト配列にかなりの相同性を示す２つのマウスＥＳＴ
（ＡＡ７６４５４０およびＡＡ４２３３０４）を同定することを可能にした。次
いで、これらのＥＳＴを使用して、以下のマウス肺ｃＤＮＡライブラリーでのＲ
ＡＣＥ−ＰＣＲを用いて、配列を伸張した：５’の末端端を決定したのを除いて
、コード領域全体。次いで、マウスコスミドクローンを配列決定することにより
この配列を完成させる９つのヌクレオチドを、同定した。１７５６ヌクレオチド
のコンティグを得た。これを配列番号１０に示す。
【０２１４】
９７８ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（配列番号１０のコンテ
ィグの２６６〜１２４３位）を同定した。これは、３２６アミノ酸の予想したＩ
Ｉ型膜貫通Ｃａ＋＋依存性レクチン（配列番号１１）をコードする。マウスアミ
ノ酸配列は、ヒトランゲリンとかなりの相同性（６６．６％）を示す（表１に示
すアライメント）。これは、この分子の鍵となる構造特性（すなわち、潜在的シ
グナル伝達部位としての細胞質内のプロリンリッチモチーフ、ならびにヒトラン
ゲリンに見出され、かつマンノース結合特異性を示す、ＥＰＮモチーフを有する
細胞外糖質−認識ドメイン（ＣＲＤ））の保存を伴う。これらのデータは、上記
で同定したマウス分子が、ヒトランゲリンのホモログであることを示す。
【０２１５】
マウスランゲリンタンパク質を、哺乳動物細胞（マウスＣＯＰ５線維芽細胞）
において首尾良く発現した。これを、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する
ためのマウスの免疫化に用いた。マウスランゲリンタンパク質を認識する多くの
ｍＡｂを、ヒトランゲリンにおいて交叉反応性を示す、これらのｍＡｂの７つを
単離した。交叉反応性ｍＡｂにより認識されるエピトープを、短縮形態の組換え
ヒトランゲリンタンパク質を用いて細胞質内ドメインに対してすべてマッピング
した。これは、ヒトおよびマウスのランゲリンの細胞質内尾部（最初の３０残基
）において著しく高い保存性と一致する（表１を参照のこと）。
【０２１６】
【表１】
2009280620.tif 000004
マウスランゲリンをコードする配列の利用性は、種々の組織におけるランゲリ
ンの発現パターンを決定するための研究（ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザン、インサイチ
ュハイブリダイゼーション）の実行を可能にする。さらに、現在の配列を伸張し
て、ランゲリン遺伝子においてマウス欠損を構築するためにゲノムＤＮＡを同定
し得る。このような動物は、免疫応答の調節におけるランゲリンの役割をさらに
理解するために非常に価値があるはずである。マウスランゲリンに対するＭＡｂ
は、マウス組織におけるタンパク質の発現を研究するために有用である。また、
ｍＡｂを、インビボでの樹状細胞系に対するランゲリンの誘発（ｔｒｉｇｇｅｒ
ｉｎｇ）の影響を分析するために、マウスに注射し得る。これらの研究は、防御
抗腫瘍免疫を誘導する目的で、樹状細胞の細胞表面ランゲリンを介して、インビ
ボで樹状細胞に抗原（すなわち、腫瘍抗原）を標的化する努力を完了させるため
に重要である。標的化実験を、例えば、腫瘍抗原が化学的に結合したマウスラン
ゲリンに対するｍＡｂを、マウスに注射する（腫瘍でのチャレンジの後の前に）
ことにより、行い得る。
【０２１７】
本発明の多くの改変および変更は、本発明の精神および範囲を逸脱することな
く、当業者に理解されるようになされ得る。本明細書中に記載される特定の実施
態様は、例示のみを提供し、そして本発明は、特許請求の範囲に権利がある全て
の範囲の等価物と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定される。
【配列表】
2009280620000001.app