(57)【要約】【課題】さらなるケモカイン受容体を同定すること。【解決手段】本発明は、ケモカイン受容体88-2Ｂまたは88Ｃをコードするポリヌクレオチドならびにこれら２つのケモカイン受容体の組換え生産のための材料及び方法を提供する。さらに、ケモカイン受容体のリガンド及びモジュレーターの同定を容易ならしめる、ポリヌクレオチドを利用したアッセイも提供される。受容体断片、リガンド、モジュレーター、及び抗体は、アテローム性動脈硬化症、慢性関節リウマチ、腫瘍生長抑制、喘息、ウイルス感染、ＡＩＤＳ、及び他の炎症状態などの、ケモカイン受容体に関わる病態の検出及び処置において有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列または生物学的に活性なその断片で表されることを特徴とする、ケモカイン受容体８８Ｃに対して相互作用し得るリガンドを同定する方法であって、以下の工程、すなわち；
(１) 当該受容体または生物学的に活性なその断片を発現する宿主細胞、または、当該受容体または生物学的に活性なその断片を含む膜調製物を準備し、
(２) 当該受容体または生物学的に活性なその断片とリガンドとを接触させてから、インキュベーションし；および
(３) 当該受容体または生物学的に活性なその断片に対して特異的な相互作用を示すリガンドの存在を同定する、
工程を含む、方法。
【請求項２】
前記断片が、配列番号：２の第１位〜第３２位、第５６位〜第６７位、第８９位〜第１１２位、第１２５位〜第１４５位、第１６６位〜第１９１位、第２１３位〜第２３５位、第２５９位〜第２８０位、または、第３０１位〜第３５２位のアミノ酸を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リガンドが、標識付けされている請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンドが、アゴニストまたはアンタゴニストである請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
シグナルトランスダクション経路の成分の濃度または活性レベルを測定して、前記相互作用を同定する請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記シグナルトランスダクション経路を、カルシウム濃度、ＩＰ3濃度、ＧＴＰ加水分解、および、ホスフォリパーゼＣ活性からなるグループから選択される活性を測定して同定する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ケモカイン受容体８８Ｃが、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の類似体、または生物学的に活性なその断片であることを特徴とし、かつ、当該類似体が、以下のアミノ酸配列、すなわち；
【化１】
2009065976.tif 000026
のアミノ酸配列を有していない請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記受容体または生物学的に活性なその断片が、リガンドに加えて、試験化合物とも接触させてから、インキュベーションを行う請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記細胞または前記細胞膜調製物が、ＣＨＯ-Ｋ１、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、および、ＣＯＳ-７からなるグループから選択される請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
配列番号２で示される８８Ｃアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、抗体産物。
【請求項１１】
配列番号２０で示されるマカーク８８Ｃアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、抗体産物。
【請求項１２】
治療における使用のための、請求項１０または１１に記載の抗体産物。
【請求項１３】
ＨＩＶ感染およびＨＩＶに関連する疾患の状態の処置のための、請求項１０または１１に記載の抗体産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、1996年６月７日に出願せる米国特許出願第08/661,393号の一部継続出願であり、当該出願は、1995年12月20日に出願せる米国特許出願第08/575,967号の一部継続出願である。
【０００２】
本発明は、一般に、シグナルトランスダクション経路に関する。さらに詳細には、本発明は、ケモカイン受容体、ケモカイン受容体をコードする核酸、ケモカイン受容体リガンド、ケモカイン受容体活性のモジュレーター、ケモカイン及びケモカイン受容体を認識する抗体、ケモカイン受容体リガンド及びモジュレーターを同定するための方法、ケモカイン受容体を製造するための方法、ならびにケモカイン受容体を認識する抗体を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
分子生物学の近年の進歩によって、生物学的プロセスにおけるシグナルトランスダクション経路の中心的な役割の正当な認識がなされるようになっている。これらの経路は、多細胞生物の個々の細胞が交信し、それによって生物学的プロセスの整合を行う、中心的な手段を含むものである。１つのモデルとして、非特許文献１の表Ｉを参照されたい。シグナルトランスダクション経路の１つの分岐点は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇ−タンパク質）の細胞内での関与によって規定されており、これが広範囲にわたる生物学的プロセスに影響を及ぼすものである。
【０００４】
非特許文献２は、最小限で以下の成分すなわち、細胞外シグナル（例えば、神経伝達物質、ペプチドホルモン、有機分子、光、または臭気物質）、シグナルを認識する受容体（非特許文献３において概説されており、ＧＰＲまたはＧＰＣＲとして知られている、Ｇ−タンパク質にカップリングする受容体）、ならびに細胞内、ヘテロトリマー性ＧＴＰ−結合タンパク質、またはＧタンパク質を包含する、Ｇ−タンパク質シグナルトランスダクション経路について一般的に論じている。特に、これらの経路は、白血球細胞すなわちロイコサイトのトラフィッキング（trafficking）を調節する上での役割のゆえに、注目に値する興味を集めるものである。
【０００５】
白血球は、顆粒球（すなわち、好中球、好塩基球及び好酸球）、リンパ球、及び単球を包含する可動性の細胞型の一群を含んでなる。可動化され活性化されると、これらの細胞は第一に外来物質に対する生体防御に関与する。この任務は、白血球が関与する多岐にわたる正常及び病理学的プロセスによって複雑なものになっている。例えば、感染に対する正常の免疫応答において白血球は機能する。白血球はまた、様々な病理学的炎症にも関わっている。要約として、非特許文献４を参照されたい。さらに、これらプロセスの各々は、白血球細胞型の各々に由来する等級（degree）、種類、及び期間において独特な寄与形態に関わることができるのである。
【０００６】
これらの免疫反応を研究する上で、研究者は先ず、白血球に対して作用しているシグナルを集中的に調べた。これは、シグナルがあらゆる型の応答を引き出すために必要であると考えられるからである。非特許文献５は、白血球シグナルの重量な一群のメンバーであるペプチドシグナルを概説している。ペプチドシグナルの一つの型は、ケモカイン（化学（ケモ）誘引（attractant）サイトカイン）を含むペプチドシグナルであり、非特許文献６においてインタークライン（intercline）と命名されている。Oppenheimらに加えて、非特許文献７は、同定され、遺伝的及び生化学的分析に供されつつある、ケモカインを詳報しており、これらの数は増加傾向を辿っている。
【０００７】
既知のケモカインのアミノ酸配列の比較によって、ケモカインを２群に分かつ分類大系が導き出されており、かかる２群とは、最初の２つのシステインを分離している単一のアミノ酸によって特徴付けられるα群（ＣＸＣ、Ｎ−末端指示対照）、及びこれらのシステインが隣接しているβ群（ＣＣ）である。ケモカインと、それらのシグナルに対応する特定の白血球細胞型との間の相関性が、見出されている。Schallら、前出は、ＣＸＣケモカインは一般に好中球に影響を及ぼし、そしてＣＣケモカインは単球、リンパ球、好塩基球、及び好酸球に影響を及ぼす傾向があることを報告している。例えば、Baggioliniら、前出は、ＣＣケモカインであるＲＡＮＴＥＳが、単球、リンパ球（すなわち、記憶Ｔ細胞）、好塩基球、及び好酸球に対して化学誘引物質として機能するが、好中球に対しては機能せず、一方、好塩基球からのヒスタミン遊離を誘導することを述べている。
【０００８】
ケモカインは、ＨＩＶ増殖のサプレッサーであることが、非特許文献８によって最近示された。Cocchiらは、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−1α、及びＭＩＰ−1βが、ＰＭ１と称されるＣＤ4+細胞系及びヒト末梢血初代単核細胞系のＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶによる感染を抑制ことを立証した。
【０００９】
しかしながら、近年、細胞外ケモカインが無差別に細胞に接触し、従って、個々の白血球細胞型を調節するのに必要な特異性を欠くようであるために、ケモカインが結合する受容体へと注目の対象が移行してきている。
【００１０】
Murphyら、前出は、受容体のＧＰＣＲスーパーファミリーが、ケモカイン受容体ファミリーを含んでいることを報告した。典型的なケモカイン受容体構造は、Ｎ−末端近傍に位置する細胞外ケモカイン結合ドメインと、それに続く、膜貫通α−ヘリックスを形成することができる主として疎水性の、７つの間隔をあけた領域を包含している。α−ヘリックスドメインの各々の間に疎水性ドメインが、交互に、細胞内及び細胞外空間に位置している。これらの特徴によって、膜に埋没したケモカイン受容体に蛇行状のコンフォメーションが付与される。第３の細胞内ループは、典型的にＧ−タンパク質と相互作用する。加えて、Murphy、前出は、細胞内カルボキシル末端もＧ−タンパク質と相互作用できることを認めている。
【００１１】
分子クローニング技術によって分析すべき第１のケモカイン受容体は、ＣＸＣケモカインであるヒトＩＬ８に対する２つの好中球受容体であった。非特許文献９及び非特許文献１０は、ＩＬ８に対する２つの受容体のクローニングを報告した。非特許文献１１は、これらの受容体をコードするｃＤＮＡを分析し、かかるコードされた受容体が各受容体と77％のアミノ酸一致度を有し、Ｇ−タンパク質にカップリングする受容体ファミリーの特徴を呈することを見出した。これら受容体の１つは、ＩＬ−8に対して特異的であるが、一方、他の受容体は、ＩＬ−8、gro/ＭＧＳＡ、及びＮＡＰ−２に結合し、それに応答してシグナル伝達を行う。ＩＬ−8受容体をコードする遺伝子の遺伝的操作が、これらの受容体が携わる生物学的な役割の理解に貢献してきている。例えば、非特許文献１２は、マウスにおけるＩＬ−8受容体相同体の削除の結果、リンパ節障害及び脾腫を包含する多面発現性の表現型が生じることを報告した。加うるに、非特許文献１３に記載されたミスセンス変異によって、ＩＬ−8結合について重要なＩＬ−8受容体の酸性アミノ酸が明らかになった。Murphy、前出において論じられたドメイン交換実験では、結合特異性の決定因子として、アミノ末端細胞外ドメインが含意された。
【００１２】
ＣＣケモカインに対する様々な受容体もまた、同定及びクローニングされた。ＣＣＣＫＲ1は、ＭＩＰ−1α及びＲＡＮＴＥＳの双方に結合し、そして双方のリガンドに応答して細胞内カルシウムイオンの流出が惹起こされる。非特許文献１４は、他のＣＣケモカイン受容体であるＭＣＰ−Ｒ1（ＣＣＣＫＲ2）が、単一の遺伝子によってコードされ、カルボキシ末端が異なる２つのスプライシング変異体を産生することを報告した。この受容体は、ＭＣＰ−1に加えてＭＣＰ−3に結合及び応答する。
【００１３】
ＣＸＣ及びＣＣケモカインの双方に結合する特異性の低い受容体も同定されている。この受容体は、元々は赤血球細胞にて同定されたのであり、非特許文献１５は、ＩＬ−8、ＮＡＰ−2、ＧＲＯα、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−1に結合することを報告している。赤血球のケモカイン受容体は、他のケモカイン受容体と約25％の一致度を共有しており、循環系でのケモカインレベルの調節を助けたり、標的へのケモカインの呈示を補助したりするのかもしれない。ケモカインの結合に加えて、赤血球ケモカイン受容体はマラリアの主原因である三日熱(マラリア)プラスモジウムに対する受容体であることも示されている（同上）。ケモカイン受容体に密接に関係する他のＧ−タンパク質にカップリングする受容体である、血小板活性化因子受容体も、ヒトの病原たる細菌である肺炎レンサ球菌に対する受容体であることが示されている（非特許文献１６）。
【００１４】
哺乳類のケモカイン受容体に加えて、２種のウイルスケモカイン相同体も同定されている。非特許文献１７は、ＩＬ−8受容体と約30％の一致度を共有し、ＣＸＣケモカインに結合するHerpesvirus saimiri由来の遺伝子産物を記載している。非特許文献１８は、ヒトサイトメガロウイルスが、ＭＩＰ−1α、ＭＩＰ−1β、ＭＣＰ−1、及びＲＡＮＴＥＳに結合するＣＣケモカイン受容体と約30％の一致度を共有する受容体をコードする遺伝子を含んでいることを報告している。これらウイルスの受容体は、ケモカインの通常の役割に影響を及ぼし、ウイルスに対する選択的な病理学上の利点を供給するかもしれない。
【非特許文献１】Springer、Cell 76巻、301〜314頁(1994)
【非特許文献２】Lewin、GENES V 319〜348頁(1994)
【非特許文献３】Probstら、DNA and Cell Biology 11巻、1〜20頁[1992]
【非特許文献４】Schallら、Curr.Opin.Immun-ol. 6巻、865〜873頁(1994)
【非特許文献５】Murphy、Ann.Rev.Immunol. 12巻、593〜633頁(1994)
【非特許文献６】Oppenheimら、Ann.Rev.Immunol. 9巻、617〜648頁(1991)
【非特許文献７】Baggioliniら、Advences in Immunol. 55巻、97〜179頁(1994)
【非特許文献８】Cocchiら、Science、270巻、1811〜1815頁(1995)
【非特許文献９】Holmesら、Science、253巻、178〜1280頁(1991)
【非特許文献１０】Murphyら、Science、253巻、1280〜1283頁(1991)
【非特許文献１１】Leeら、J.Biol.Chem. 267巻、16823〜16287頁(1992)
【非特許文献１２】Cacalanoら、Science、265巻、682〜684頁(1994)
【非特許文献１３】Leongら、J.Biol.Chem. 269巻、19343〜19348頁(1994)
【非特許文献１４】Charoら、Proc.Natl.Acad.Sci. (USA)  91巻、2752〜2756頁(1994)
【非特許文献１５】Horukら、Science、261巻、1182〜1184頁(1993)
【非特許文献１６】Cundellら、Nature、377巻、435〜438頁(1995)
【非特許文献１７】Ahujaら、J.Biol.Chem. 268巻、20691〜20694頁(1993)
【非特許文献１８】Neoteら、Cell、72巻、415〜425頁(1993)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
ケモカイン及びその活性の広範なる多様性のゆえに、ケモカインに対して数多くの受容体が存在する。その特徴が明らかにされている受容体は、ケモカイン受容体の全体的な補集合の一画分のみを表しているにすぎない。かくして、当該技術分野においてさらなるケモカイン受容体の同定が希求され続けている。これら新規受容体の有用性により、ケモカインまたはケモカイン受容体機能の治療用モジュレーターの開発のための手段が提供されよう。アテローム性動脈硬化症、慢性関節リウマチ、腫瘍生長抑制、喘息、ウイルス感染、及び他の炎症性病態の処置のための療法における、かかるモジュレーターの有用性が本発明によって企図される。あるいは、ケモカイン受容体の断片もしくは変異体、またはそれら受容体を認識する抗体が、前記療法に関わるものとして企図される。
【００１６】
本発明は、上記課題を解決するために、以下を提供する。
（項目１） ＨＩＶ感染のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、以下の工程すなわち、
（ａ）化合物の存在下及び非存在下に、哺乳動物88Ｃ受容体を含む第１組成物とヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質を含む第２組成物とを接触させ、
（ｂ）該化合物の存在下及び非存在下での、哺乳動物88Ｃ受容体とＨＩＶエンベロープタンパク質との相互作用を測定し、ならびに
（ｃ）該化合物の非存在下に対して該化合物の存在下で、哺乳動物88Ｃ受容体とＨＩＶとの相互作用が低減または増大することを、該化合物がＨＩＶ感染のモジュレーターであることの指標として、ＨＩＶ感染のモジュレーターをスクリーニングする、
工程を含む方法。
（項目２） 前記哺乳動物88Ｃ受容体が、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するヒト88Ｃを含む、項目１記載の方法。
（項目３） 第１組成物が、哺乳動物88Ｃ受容体を表面上に発現するように組換え法によって改変されている細胞を含む項目１または２記載の方法。
（項目４） 第２組成物が、ヒト免疫不全ウイルスを含む項目１乃至３のいずれかに記載の方法。
（項目５） 前記測定を行なう工程が、細胞のＨＩＶ感染を測定することを含む項目４記載の方法。
（項目６） ＨＩＶ感染のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、以下の工程すなわち、
（ａ）化合物の存在下及び非存在下に、哺乳動物88-2Ｂ受容体を含む第１組成物とヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質を含む第２組成物とを接触させ、
（ｂ）該化合物の存在下及び非存在下での、哺乳動物88-2Ｂ受容体とＨＩＶエンベロープタンパク質との相互作用を測定し、ならびに
（ｃ）該化合物の非存在下に対して該化合物の存在下で、哺乳動物88-2Ｂ受容体とＨＩＶとの相互作用が低減または増大することを、該化合物がＨＩＶ感染のモジュレーターであることの指標として、ＨＩＶ感染のモジュレーターをスクリーニングする、
工程を含む方法。
（項目７） 前記哺乳動物88-2Ｂ受容体が、配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するヒト88-2Ｂを含む、項目６記載の方法。
（項目８） 第１組成物が、哺乳動物88-2Ｂ受容体を表面上に発現するように組換え法によって改変されている細胞を含む項目６または７記載の方法。
（項目９） 第２組成物が、ヒト免疫不全ウイルスを含む項目６乃至８のいずれかに記載の方法。
（項目１０） 前記測定を行なう工程が、細胞のＨＩＶ感染を測定することを含む項目９記載の方法。
（項目１１） 項目１乃至１０のいずれかに記載の方法によって、ＨＩＶ感染のモジュレーターとして同定された化合物。
（項目１２） 細胞のＨＩＶ感染を予防するための医薬組成物であって、項目１１記載の化合物を含む医薬組成物。
（項目１３） 細胞のＨＩＶ感染を予防する方法であって、ヒト以外の動物で項目１１記載の化合物を適用する工程を含む方法。
（項目１４） 細胞のＨＩＶ感染の予防のための医薬を製造する方法であって、項目１１記載の化合物を使用する工程を含む方法。
（項目１５） ＨＩＶ感染を検出するための方法であって、以下の工程すなわち、
（ａ）ヒトケモカイン受容体88Ｃ及び88-2Ｂの少なくとも一つを発現するように、組換え法により改変されている細胞を、ＨＩＶに接触させ、ならびに
（ｂ）細胞のＨＩＶ感染を検出する、
工程を含む方法。
【００１７】
本発明は、白血球のトラフィッキングに関与するケモカイン受容体をコードする、精製及び単離された核酸を提供する。本発明のポリヌクレオチド（センス鎖及びそのアンチセンス鎖の双方）には、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びＲＮＡが包含され、さらに完全にまたは部分的に合成された核酸も含まれる。本発明の好ましいポリヌクレオチドには、配列番号：３に示されるケモカイン受容体88-2ＢをコードするＤＮＡ、配列番号：１に示されるケモカイン受容体88ＣをコードするＤＮＡ、及び標準的なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でそれらのＤＮＡとハイブリダイズする、または遺伝コードの重複なしにハイブリダイズすると思われるＤＮＡが包含される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、以下の通りである。すなわち、42℃にて、50％ホルムアミド、5XSSC、20 mMリン酸ナトリウム、pH 6.8でハイブリダイゼーションを行い、そして55℃にて、0.2X SSCで洗浄する。当業者には、ハイブリダイズされるべき配列の長さ及びＧＣヌクレオチド含量に基づいてこれらの条件を変更することが想起されることは理解される。当該技術分野における標準の常則が、正確なハイブリダイゼーション条件を決定するためには適切である。Sambrookら、MolecularCloning: A Laboratory Manual、ColdSpring Harbor Laboratory Press、Cold SpringHarbor、ニューヨーク(1989)の、§§9.47〜9.51を参照のこと。さらにまた本発明によって企図されるのは、88-2Ｂまたは88Ｃのドメインをコードするポリヌクレオチドであり、例えば、いずれかのタンパク質の１以上の細胞外ドメインまたはその、生物学的活性を有する他の断片をコードするポリヌクレオチドである。88-2Ｂ細胞外ドメインは、配列番号：３及び配列番号：４で、アミノ酸残基1〜36、93〜107、171〜196、及び263〜284に対応する。88-2Ｂの細胞外ドメインは、配列番号：３で、ヌクレオチド362〜469、638〜682、872〜949、及び1148〜1213に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされている。88Ｃの細胞外ドメインは、配列番号：１及び配列番号：２で、アミノ酸残基1〜32、89〜112、166〜191、及び259〜280に対応する。88Ｃの細胞外ドメインは、配列番号：１で、ヌクレオチド55〜150、319〜390、550〜627、及び829〜894に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされている。本発明はまた、これらケモカイン受容体の細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドも企図している。88-2Ｂの細胞内ドメインには、配列番号：３及び配列番号：４のアミノ酸60〜71、131〜151、219〜240、及び306〜355が包含される。それらのドメインは、配列番号：３で、ヌクレオチド539〜574、752〜814、1016〜1081、及び1277〜1426にそれぞれ対応するポリヌクレオチド配列によってコードされている。88Ｃの細胞内ドメインには、配列番号：１及び配列番号：２のアミノ酸残基56〜67、125〜145、213〜235、及び301〜352が包含される。88Ｃの細胞内ドメインは、配列番号：１で、ヌクレオチド220〜255、427〜489、691〜759、及び955〜1110に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされている。細胞外もしくは細胞内ドメインの１つ以上に対応するペプチド、またはそれらペプチドに対して作製された抗体が、受容体活性、特に受容体のリガンド及びＧタンパク質結合活性のモジュレーターとして企図される。
【００１８】
本発明のヌクレオチド配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で88-2Ｂまたは88ＣをコードするゲノミックＤＮＡを単離するために標識付けしたプローブとして用いる（すなわち、サザン分析及びポリメラーゼ連鎖反応方法論による）ための、オリゴヌクレオチドを設計するために使用してもよい。さらに、これらのオリゴヌクレオチドプローブは、88-2Ｂまたは88Ｃをコードする遺伝子の、特定の対立遺伝子を検出するために使用することができ、それによって、かかる対立遺伝子に関わる病態の診断及び遺伝子療法による処置が容易ならしめられる。加えて、これらのオリゴヌクレオチドは、ケモカイン受容体のモジュレーターの同定を容易にすべく、ケモカイン受容体の遺伝的性質を改変するのにも使用することができる。さらに、そのヌクレオチド配列は、88-2Ｂまたは88Ｃの遺伝的性質及び発現を探索または改変する上で使用するアンチセンス遺伝要素を設計するためにも使用できる。本発明は、また、本発明のＤＮＡの生物学的複製物（すなわち、invivo または in vitro でつくられ、単離されたＤＮＡのコピー）も企図するものである。効率的に88-2Ｂまたは88Ｃポリヌクレオチドを組み込んでいる、プラスミド、ウイルス、及び染色体（例えば、ＹＡＣ）核酸ベクターなどの自己複製する組換え構築体、ならびに、特に88-2Ｂまたは88Ｃを有効にコードするＤＮＡが１以上の内在性または異種由来の発現制御配列に作動可能に連結されたベクターも提供される。
【００１９】
88-2Ｂ及び88Ｃ受容体は、天然に、組換えによって、または合成によって製造してもよい。標準法によって本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞（原核細胞性または真核細胞性）もまた、88-2Ｂ及び88Ｃケモカイン受容体を発現するために使用することができる。本来のままの88-2Ｂまたは88Ｃ遺伝子産物以上に、88-2Ｂまたは88Ｃの生物学的に活性を有する断片、88-2Ｂまたは88Ｃの類似体、及び配列番号：４に示される88-2Ｂ、または配列番号：２に示される88Ｃのアミノ酸配列由来の合成ペプチドが、本発明により企図される。さらに、真核細胞にて製造する場合、88-2Ｂもしくは88Ｃ遺伝子産物、またはいずれかの遺伝子産物の生物学的に活性を有する断片は、転写後に修飾（例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、リン酸化、ミリストイル化、パルミトイル化、アセチル化等による）してもよい。本発明はさらに、88-2Ｂ及び88Ｃ遺伝子産物、または生物学的に活性を有するそれらの断片の、モノマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマーの形態のものを企図する。
【００２０】
特に、本発明の１つの特徴は、88-2Ｂまたは88Ｃケモカイン受容体に特異的に結合することができる抗体産物に関わるものである。抗体産物は、組換え88-2Ｂもしくは88Ｃ受容体、88-2Ｂもしくは88Ｃ受容体の合成ペプチドもしくはペプチド断片、表面に88-2Ｂもしくは88Ｃを発現している宿主細胞、または天然の供給源から精製した88-2Ｂもしくは88Ｃ受容体を免疫原として使用して、当該技術分野における標準方法により作製される。抗体産物には、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が包含され、いかなる供給源のものでも、いかなるサブタイプのものでもかまわない。さらには、モノマー、ホモマルチマー、及びヘテロマルチマー抗体、ならびにそれらの断片が、本発明によって企図される。さらに本発明は、ＣＤＲ−組織移植抗体、「ヒト化」抗体、及びケモカイン受容体に特異的に結合する能力を保持する他の修飾された抗体産物を企図する。
【００２１】
本発明はさらに、88-2Ｂもしくは88Ｃ遺伝子産物、それらの類似体、またはそれらの生物学的に活性を有する断片を検出するための、抗体産物の使用も企図するものである。例えば、抗体産物は、88-2Ｂまたは88Ｃの発現と、様々な正常または病理学的状態との間の相関を明らかにするために計画される診断方法において使用してもよい。加えて、抗体産物は、88-2Ｂもしくは88Ｃ、それらの類似体、またはそれらの生物学的に活性を有する断片の発現における、組織特異的な変動を診断するために使用することができる。88-2Ｂ及び88Ｃケモカイン受容体に対して特異的な抗体産物は、受容体活性のモジュレーターとしても作用するかもしれない。他の特徴として、88-2Ｂまたは88Ｃ受容体に対する抗体は、治療上の目的のために有用である。
【００２２】
本発明のケモカイン受容体と相互作用することができるリガンドのためアッセイも提供される。これらのアッセイは、例えば、標識付けしたリガンドへの受容体の結合をモニターすることによるなどといった、ケモカイン受容体活性の直接的な検出を包含しうる。加えて、これらのアッセイは、ケモカイン受容体とのリガンドの相互作用を間接的に評価するために使用しうる。本明細書中において、「リガンド」なる語は、88-2Ｂまたは88Ｃのアゴニスト及びアンタゴニストである分子、ならびに受容体に結合する他の分子を含むものである。
【００２３】
ケモカイン受容体へのリガンド結合の直接的な検出は、以下のアッセイを使用して成し遂げられうる。供試化合物（すなわち、リガンドと推定される物質）は、検出可能となるように標識付け（例えば、放射性同位体ヨウ素付加）される。検出可能に標識付けされた供試化合物は、次いで、本発明のケモカイン受容体を含む膜調製物と接触させられる。好ましくは、かかる膜は、組換えベクターから本発明のケモカイン受容体を発現している宿主細胞より調製される。膜に埋込まれたケモカイン受容体と、検出可能に標識付けされた供試化合物との間の接触を促すインキュベーション期間に続き、減圧濾過を使用してフィルター上に膜物質が採集される。次いで、フィルターに会合した検出可能な標識を定量する。例えば、液体シンチレーションスペクトル光学測定法を使用して、放射性同位体の標識を定量する。この技術を使用して、ケモカイン受容体へのリガンド結合を同定する。リガンドの同定を確証するために、標識付けされていない状態にある供試化合物の量を増加して存在させた下で、検出可能に標識付けされた供試化合物を、ケモカイン受容体を呈示する膜調製物に曝す。標識付けしていない供試化合物の添加量を増加するに従って、フィルターに会合している標識のレベルが漸減すれば、リガンドの同定が確証される。
【００２４】
アゴニストは受容体に結合するリガンドであり、細胞内シグナルトランスダクションを導き出し、そしてアンタゴニストは、受容体に結合するリガンドであるが、細胞内シグナルトランスフェクトを導き出すことはない。特定のリガンドがアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかどうかは、例えば、Ｇタンパク質に関わるシグナルトランスダクション経路をアッセイすることによって定量することができる。これらの経路の活性化は、他のアッセイに加えて、細胞内Ｃａ++流出、ホスフォリパーゼＣ活性またはアデニル酸シクラーゼ活性を測定することによって定量することができる（実施例５及び６を参照されたい）。
【００２５】
本明細書における実施例において詳説しているように、88Ｃ受容体に結合するケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−1α、及びＭＩＰ−1βが包含され、そして88-2Ｂ受容体に結合するケモカインには、ＲＡＮＴＥＳが包含される。
【００２６】
他の特徴において、88Ｃ及び88-2Ｂ受容体とそれらのリガンドとの間の相互作用のモジュレーターが、本発明によって特に企図される。ケモカイン受容体機能のモジュレーターは、リガンドを同定するために使用されたものと類似のアッセイを使用して同定しうる。ケモカイン受容体を呈示している膜調製物が、一定且つ既知量の検出可能に標識付けされた機能性リガンドに曝される。加えて、膜に結合したケモカイン受容体は、そのケモカイン受容体の活性をモジュレートすることが推測される供試化合物にその量を増加させて曝される。フィルターに会合した標識のレベルが供試化合物の量に呼応するならば、その供試化合物は、ケモカイン受容体の活性のモジュレーターである。フィルターに会合した標識のレベルが、供試化合物の増加量に伴って増加すれば、活性化物質が同定される。反対に、フィルターに会合した標識のレベルが、供試化合物の量と逆に変化するのであれば、ケモカイン受容体活性の阻害物質が同定される。このようにして受容体結合のモジュレーターを試験することによって、同じ反応で同時に多くのモジュレーターの可能性がある物質を含有するプールを試験することができるので、多くのモジュレーターと推定される物質を迅速にスクリーニングすることが可能となる。
【００２７】
受容体結合のための間接的なアッセイには、関連するシグナルトランスダクション経路に見出される成分のうちのいずれかの活性の濃度またはレベルの測定が包含される。ケモカイン受容体の活性化は、細胞内Ｃａ++流出に関係していることがある。ケモカイン受容体を発現している細胞に、カルシウム感受性の染料を付してもよい。発現された受容体の活性化に伴って、Ｃａ++流出が染料によりスペクトル光学測定で検出可能になるであろう。あるいは、かかるＣａ++流出を顕微鏡で検出することができる。いずれかの技術を用いて、リガンドと推定される物質の存在下及び非存在下に平行したアッセイを実施してもよい。例えば、Ｃａ++流出についての顕微鏡でのアッセイを使用して、ＣＣケモカインであるＲＡＮＴＥＳが、88-2Ｂケモカイン受容体のリガンドとして同定された。当業者であれば、それらのアッセイが受容体活性のモジュレーターの精製を同定及びモニターするためにも有用であることを認めるであろう。受容体活性化物質及び阻害物質は、これらのアッセイにおいて受容体とそのリガンドとの相互作用を、それぞれ活性化または阻害するであろう。
【００２８】
あるいは、ケモカイン受容体とＧタンパク質との会合によって、Ｇタンパク質活性をモニターすることによる受容体活性を評価する機会が与えられる。Ｇタンパク質の特徴的な活性であるＧＴＰ加水分解を、例えば、32Ｐ−標識付けＧＴＰを使用してモニターしてもよい。
【００２９】
Ｇタンパク質は、シグナルトランスダクション経路における関与を通じて、様々な他の分子にも影響を及ぼしている。Ｇタンパク質エフェクター分子には、アデニル酸シクラーゼ、ホスフォリパーゼＣ、イオンチャンネル、及びホスフォジエステラーゼが包含される。これらのエフェクターのいずれかに焦点をおくアッセイを使用して、興味の対照であるケモカイン受容体を発現しており、且つ適切なリガンドに接触せしめられている宿主細胞にて、リガンド結合によって誘導されるケモカイン受容体活性をモニターしてもよい。例えば、ケモカイン受容体の活性を検出しうる一つの方法として、ホスフォリパーゼＣ活性の測定が挙げられる。このアッセイにおいて、アゴニストの存在下で、ケモカイン受容体を発現している宿主細胞による、放射性同位体で標識付けしたイノシトールホスフェートの生産が検出される。ホスフォリパーゼ活性の検出は、外来性のＧタンパク質をコードするＤＮＡと共にトランスフェクション（コトランスフェクション）することを必要とするかもしれない。コトランスフェクションが必要である場合には、このアッセイは、キメラＧタンパク質ＤＮＡ、例えば、Ｇqi5（Conklinら、Nature、363巻、274〜276頁(1993)）を、88-2Ｂまたは88ＣのＤＮＡとコトランスフェクトし、そのコトランスフェクトされた細胞が88-2Ｂまたは88Ｃ受容体のアゴニストに曝された際のホスフォイノシトール生産を検出することによって行うことができる。当業者であれば、Ｇタンパク質エフェクター分子に焦点をおいたアッセイもまた、受容体活性の精製を同定及びモニターするために有用であることを認めるであろう。受容体の活性化物質及び阻害物質は、これらのアッセイにおいて、受容体とそれらのリガンドの相互作用をそれぞれ、活性化または阻害するであろう。
【００３０】
ケモカインは、乾癬、関節炎、肺線維症及びアテローム性動脈硬化症などの多くの炎症性疾患に関わっている。Baggioliniら、前出を参照されたい。ケモカイン作用の阻害物質は、これらの病態を処置する上でも有用かもしれない。一例として、Broaddusら、J.of Immunol.、152巻、2960〜2967頁(1994)は、ウサギ肺における急性炎症のモデルである、内毒素誘導性の胸膜炎での好中球補充（recruitment）を阻害できるＩＬ−8に対する抗体を記載している。88Ｃ受容体に結合する、またはこれを活性化するリガンドまたはモジュレーターが、ＨＩＶ感染及びＨＩＶ関連病態の処置に有用であるかもしれないことも、本発明において企図するところである。本発明にて企図される特異的受容体へのケモカインの結合のモジュレーターは、ケモカインもしくは受容体に対して作製された抗体、生物学的もしくは化学的小分子、またはケモカインもしくは受容体の断片に対応する合成ペプチドが包含されうる。
【００３１】
正常または病理学的免疫反応ならびに、ＨＩＶ−1、ＨＩＶ−2及びＳＩＶなどのレトロウイルスによる感染を包含するウイルス感染をモニターまたは治療改善することを目的として、哺乳類被験者に88-2Ｂまたは88Ｃモジュレーターを含有する組成物を投与することが、本発明によって企図される。特に、本発明は、製薬的に容認しうる量の88-2Ｂまたは88Ｃケモカイン受容体モジュレーターを輸送することによる、炎症性応答、異常な造血プロセス、及びウイルス感染の鎮静を企図している。本発明はさらに、担体、希釈剤、または薬物を含んでなる製薬上容認しうる組成物にて、これらの活性物質を輸送することを企図する。本発明はまた、様々な投与経路も企図している。例えば、活性物質は、以下の経路、すなわち、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、経口、肛門（すなわち、座剤に調剤して）、または経肺（すなわち、吸入、アトマイザー、ネブライザー等）によって投与しうる。
【００３２】
他の特徴において、本発明により提供されるＤＮＡ配列の情報によって、相同組換えまたは「ノックアウト」戦略［例えば、Kapecchiら、Science、244巻、1288〜1292頁(1989)を参照されたい］による、機能を有する88Ｃもしくは88-2Ｂケモカイン受容体を発現しない齧歯類、または受容体の変異体を発現する齧歯類の開発が可能となる。あるいはクローン化された88-2Ｂまたは88Ｃ受容体を発現するトランスジェニックマウスを、周知の実験技術（マウス胚の操作（Manipulatingthe Mouse Embryo）、A Laboratory Manual、Brigid Hohan、Frank Costantini及びElizabethLacy編(1986) Cold Spring Harbor Laboratory ISBN 0-87969-175-I）によって調製することができる。かかる齧歯類は、88Ｃまたは88-2Ｂのinvivoの活性を研究するためのモデルとして有用である。
【００３３】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例を考慮すれば、当業者に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下の実施例が、本発明を例証するものである。実施例１には、88-2Ｂ及び88
Ｃケモカイン受容体をコードするゲノミックＤＮＡの単離を記載する。実施例２
には、ヒト88-2Ｂ及び88Ｃならびにマカーク88ＣをコードするｃＤＮＡの単離及
び配列決定を表す。実施例３では、様々な組織における88-2Ｂ及び88Ｃ受容体の
発現パターンを明らかにするノザン分析を記載する。実施例４では、88-2Ｂ及び
88Ｃ受容体の組換え発現を詳説する。実施例５には、Ｃａ++流出アッセイ、ホス
フォイノシトール加水分解アッセイ、ならびに様々なリガンドである可能性を有
する物質に応答した88-2Ｂ及び88Ｃ受容体活性についての結合アッセイを記載す
る。ＨＩＶに対する共受容体としての88Ｃ及び88-2Ｂの役割を記載する実験を、
実施例６及び７に記載する。88Ｃと免疫反応性を有するモノクローナル及びポリ
クローナル抗体の調製及び特徴付けを、実施例８に記載する。実施例９には、88
-2Ｂまたは88Ｃリガンドまたはモジュレーターを同定するために計画したさらな
るアッセイを記載する。
【００３５】
［実施例１］
本発明の新規ケモカイン受容体遺伝子をコードする部分的なゲノミッククローンを、以前に同定された遺伝子に見出される保存配列に基づき、且つヒトゲノム内でのこれらケモカイン受容体遺伝子のクラスター形成（clustering）に基づいて、ＰＣＲによって単離した。縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標準ＰＣＲ法によってゲノミックＤＮＡを増幅した。
【００３６】
ＰＣＲ増幅のための鋳型は、酵母人工染色体（Yeast Arti-ficial Chromosomes、すなわち、ＹＡＣ）（Research Gene-tics, Inc.、Huntsville、アラバマ、ＹＡＣLibrary Pools、カタログ番号第95011 Ｂ）にクローニングした組換えヒトゲノミックＤＮＡの市販されている供給源の一つであった。ＹＡＣベクターは、500〜1000kbpのインサートに適応できるものである。最初に、ＹＡＣクローンＤＮＡのプールを、ＣＣＣＫＲ1をコードする遺伝子に対して特異的なプライマーを使用したＰＣＲによってスクリーニングした。詳細には、センス鎖プライマー（ＣＣＣＫＲ1のセンス鎖に対応する）である、ＣＣＣＫＲ(2)-5'は配列番号：１５に示される。プライマーＣＣＣＫＲ(2)-5'は、5'-CGTAAGCTTAGAGAAGCCGGGATGGGAA-3'の配列からなり、配列で下線を付したヌクレオチドは、ＣＣＣＫＲ1に対する翻訳開始コドンである。アンチセンス鎖プライマーは、ＣＣＣＫＲ-3'（ＣＣＣＫＲ1のアンチセンス鎖に対応する）であり、その配列は、配列番号：１６に示される。ＣＣＣＫＲ-3'の配列である5'-GCCTCTAGAGTCAGAGACCAGCAGA-3'は、ＣＣＣＫＲ1翻訳終止コドン（下線を付した）の逆相補的配列を含んでいる。検出可能なＰＣＲ産物（すなわち、ゲル電気泳動でのＤＮＡのバンド）を生じるＹＡＣクローンＤＮＡのプールで、商標権を有する同定スキーム（ResearchGenetics, Inc.、Huntsville、アラバマ）に基づいてＹＡＣクローンの適切なサブプールを同定した。ＰＣＲ反応は、94℃にて４分間のインキュベーションを行うことをもって開始した。配列の増幅は、94℃にて１分間の変性、55℃にて１分間のアニーリング、そして72℃にて２分間の伸長の３３サイクルを使用して成し遂げた。
【００３７】
ＹＡＣクローンＤＮＡのサブプールは、次いで第１回のＰＣＲにおいて使用した条件及びプライマーを使用して、第２回のＰＣＲ反応に供した。サブプールのスクリーニングの結果によって、ＣＣＣＫＲに特異的なプライマーでのＰＣＲ反応を支持することができる個々のクローンが同定された。１つのクローンである881Ｆ10は、ＰＣＲ及びハイブリダイゼーションによって調べると、ＣＣＣＫＲ1及びＣＣＣＫＲ2に対する遺伝子を含む染色体3p21由来のヒトゲノミックＤＮＡの640kbを含んでいた。重複するＹＡＣクローンである941Ａ7は、ヒトゲノミックＤＮＡの700 kbを含んでおり、やはりＣＣＣＫＲ1及びＣＣＣＫＲ2に対する遺伝子を含んでいた。それゆえに、これら２つのＹＡＣクローンを使用して、さらなるマッピング実験を行った。サザン分析により、ＣＣＣＫＲ1とＣＣＣＫＲ2とは互いにおよそ100kb以内に位置していることが明らかになった。
【００３８】
ＣＣＣＫＲ1とＣＣＣＫＲ2との遺伝子が極めて近接していることにより、新規の関連遺伝子がＣＣＣＫＲ1及びＣＣＣＫＲ2に連接しているかもしれないことが示唆された。ＹＡＣクローンの881Ｆ10及び941Ａ7を含む酵母由来のＤＮＡを鋳型として使用して、何らかの関連受容体遺伝子を増幅するためにＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲプライマーとして、縮重オリゴデオキシリボヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、ＣＣＣＫＲ1、ＣＣＣＫＲ2、及びＶ28のアラインメントでの配列比較から推定して、ＣＣケモカイン受容体の第２の細胞内ループ及び第６の膜貫通ドメインをコードする領域に対応するものであった。Ｖ28は、ケモカイン受容体の特徴を呈示するオーファン受容体であるので使用した。Ｖ28もまた、ヒト第３染色体にマッピングされている。Raportら、Gene、163巻、295〜299頁(1995)。さらに注目すべきは、ＣＣＣＫＲ2の２つのスプライシング変異体であるＣＣＣＫＲ2Ａ及びＣＣＣＫＲ2Ｂは、分析に使用した第２の細胞内ループ及び第６の膜貫通ドメイン領域にて同じであることである。Ｖ28degf2と称される5'プライマーは、内部BamHI制限部位（下記参照）を含み、その配列は配列番号：５に示す。プライマーＶ28degf2の配列は、規範的な受容体構造の第２の細胞内ループ領域をコードするＤＮＡに対応している。Probstら、前出を参照されたい。3'プライマーであるＶ28degr2は、内部HindIII制限部位（下記参照）を含み、その配列は配列番号：６に示す。プライマーＶ28degr2の配列は、規範的な受容体構造の第６の膜貫通ドメインをコードするＤＮＡに対応している。
【００３９】
増幅されたＰＣＲ ＤＮＡを、次に、BamHI及びHindIIIで消化し、規範配列を調べた結果から予測される断片のサイズに一致するおよそ390bpの断片を作製した。エンドヌクレアーゼで消化した後、これらＰＣＲ断片をpBluescript（Staragene Inc.、La Jolla、カリフォルニア）へとクローニングした。合計で５４のクローニングされた断片を、自動ヌクレオチド配列分析に供した。ＣＣＣＫＲ1及びＣＣＣＫＲ2由来の配列に加えて、本発明の２つの新規ケモカイン受容体遺伝子由来の配列が同定された。これらの２つの新規ケモカイン受容体遺伝子を、88-2Ｂ及び88Ｃと命名した。
【００４０】
制限エンドヌクレアーゼマッピング及びハイブリダイゼーションを利用して、受容体88Ｃ、88-2Ｂ、ＣＣＣＫＲ1、及びＣＣＣＫＲ2をコードする遺伝子の相対的な位置をマッピングした。88Ｃに対する遺伝子は、ヒト染色体3p21でＣＣＣＫＲ2遺伝子からおよそ18KBPに位置するので、これら４つの遺伝子は近くに連接している。
【００４１】
［実施例２］
以下の方法によって、マクロファージｃＤＮＡライブラリーから全長の88-2Ｂ及び88Ｃ ｃＤＮＡを単離した。先ず、Tjoelkerら、Nature、374巻、549〜553頁(1995)に記載されるｃＤＮＡライブラリーを、ヒトマクロファージｍＲＮＡからのpMcＲＣＭＶ（InvitrogenCorp.、San Diego、カリフォルニア）にて構築した。当該ｃＤＮＡを、88-2Ｂまたは88Ｃに対応する独特なプライマー対を使用したＰＣＲによって、88-2Ｂ及び88ＣｃＤＮＡクローンの存在についてスクリーニングした。ＰＣＲのプロトコルは、94℃にて４分間、最初に変性を行う工程を含むものであった。次いで、以下の条件の下でＰＣＲを３３サイクル行なってポリヌクレオチドを増幅した：94℃にて１分間変性、55℃にて１分間アニーリング、そして72℃にて２分間伸長。88-2Ｂに対して特異的な第１のプライマーは、プライマー88-2Ｂ-f1であり、配列番号：１１に示される。これは、配列番号：３のヌクレオチド844〜863のセンス鎖に対応する。88-2Ｂをコードする遺伝子に対して特異的な第２のＰＣＲプライマーは、プライマー88-2Ｂ-r1であり、配列番号：１２に示され、この88-2Ｂ-r1配列は配列番号：３のヌクレオチド1023〜1042のアンチセンス鎖に対応する。同様に、88Ｃをコードする遺伝子に対して特異的な第１のプライマーであるプライマー88Ｃ-f1の配列は、配列番号：１３に示され、配列番号：１のヌクレオチド453〜471のセンス鎖に対応する。88Ｃをコードする遺伝子に対して特異的な第２のプライマーは、プライマー88Ｃ-r3であり、配列番号：１４に示されており、88Ｃ-r3の配列は、配列番号：１のヌクレオチド744〜763のアンチセンス鎖に対応する。
【００４２】
スクリーニングによって、88-2ＢのｃＤＮＡクローンであるクローン777を同定した。クローン777は、以下の特徴によって判定したところ88-2Ｂの全長のコード配列を包含する1915bpのＤＮＡインサートを含んでいた：当該クローンは、ＡＴＧコドンで開始する長い読み取り枠を含み、Kozak配列を呈し、そして枠内の上流終止コドンを有していた。クローン777のＤＮＡ及びインサートの導き出されたアミノ酸配列を、配列番号：３及び配列番号：４にそれぞれ表す。88-2Ｂの転写物は、マクロファージのｃＤＮＡライブラリー中には、比較的稀少であった。ライブラリーのスクリーニングに際し、合計３００万と見積もられるクローンからわずか３つの88-2Ｂクローンのみが同定された。
【００４３】
88Ｃケモカイン受容体をコードするｃＤＮＡクローンに対するスクリーニングによって、開始コドンと推定されるコドンを包含する、88Ｃの全コード領域を含むと考えられるクローン101及び134が同定された。しかしながら、これらのクローンは、開始コドンの実体を確証するのに必要なさらなる5'配列を欠いていた。88Ｃの転写物は、マクロファージｃＤＮＡライブラリーにおいて比較的豊富に存在していた。ライブラリーのスクリーニングに際して、３０００の転写物当たり１つ（ライブラリー中、合計でおよそ３００万のクローンのうち）の88Ｃが存在すると見積もられた。
【００４４】
手元にある88Ｃクローン配列を伸長するためにＲＡＣＥＰＣＲ（ｃＤＮＡ端部の迅速増幅(Rapid Amplification of cDNA Ends)）を実施し、それによって88ＣｃＤＮＡの5'端の正確な特徴付けをすすめた。ヒト脾臓5'-ＲＡＣＥ-ready ｃＤＮＡは、Clontech Laboratories, Inc.、PaloAlto、カリフォルニアより購入し、製造業者の推奨事項に従って使用した。ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ断片の5'端にアンカー配列を連結することによって「5'-ＲＡＣＥ-ready」とした。アンカー配列は、ClontechLaboratories, Inc.、Palo Alto、カリフォルニアにより供給されたアンカープライマーに相補的なものである。アンカー配列とアンカープライマーの二重のポリヌクレオチドには、EcoRI制限部位が含まれている。ヒト脾臓ｃＤＮＡを、鋳型ＤＮＡとして選択した。これは、この組織に88Ｃが発現されていることがノザンブロットによって明らかになっていたためである。ＰＣＲ反応は、94℃にて４分間、試料を変性させることをもって開始した。次いで、94℃にて１分間変性、60℃にて４５秒間アニーリング、そして72℃にて２分間伸長する工程を含む３５サイクルを用いて配列を増幅した。ＰＣＲの第１回目は、50μlの総反応液容量に2μlの5'-ＲＡＣＥ-ready脾臓ｃＤＮＡ、1μlのアンカープライマー、及び1μlのプライマー88c-r4（100ng/μl）を含有する反応混合液にて実施した。88Ｃに特異的なプライマーである88c-r4（5'-GATAAGCCTCACAGCCCTGTG-3'）は、配列番号：７に示されている。プライマー88c-r4の配列は、配列番号：１のヌクレオチド745〜765のアンチセンス鎖に対応する。第２回のＰＣＲは、1μlのアンカープライマー及び、以下の配列（5'-GCTAAGCTTGATGACTATCTTTAATGTC-3'）（配列番号：８に示される）を含むプライマー88Ｃ-rlb（100ng/μl）の1μlと共に1μlの第１ＰＣＲ反応液を含む反応混合液について実施した。プライマー88Ｃ-rlbの配列は、内部HindIIIクローニング部位（下線部）を含んでいる。そのHindIII部位の3'側の配列は、配列番号：１のヌクレオチド636〜654のアンチセンス鎖に対応している。このようにして得られたＰＣＲ産物は、EcoRI及びHindIIIを用いて消化し、1％アガロースゲルにて分画した。およそ700bpの断片が単離され、pBluescriptにクローニングされた。最も大きなインサートを有するクローンを配列決定に供した。あるいは、市販のＴＡクローニングキット（InvitrogenCorp.、San Diego、カリフォルニア）を使用して、その後のヌクレオチド配列決定用に、ＰＣＲ産物をそのままｐＣＲベクターに連結した。
【００４５】
88-2Ｂ及び88ＣｃＤＮＡは、ＰＲＩＳＭ（登録商標）ReadyReaction DyeDeoxy（登録商標）Terminator Cycle SequencingKit（PerkinElmer Corp.、Foster City、カリフォルニア）及びApplied Biosystems 373A ＤＮＡ Sequencerを使用して配列決定した。88-2ＢcＤＮＡ配列を決定するために使用される、配列決定反応用の二本鎖の鋳型が、クローン777のインサートより提供された。クローン777のインサートの全配列を決定し、そして88-2ＢcＤＮＡ配列及びアミノ酸配列として配列番号：３に示している。その配列は1915 bpの長さであり、5'非翻訳ＤＮＡの361 bp（配列番号：３のヌクレオチド1〜361に対応する）、1065bpのコード領域（配列番号：３のヌクレオチド362〜1426に対応する）、及び3'非翻訳ＤＮＡの489 bp（配列番号：３のヌクレオチド1427〜1915に対応する）を含む。前記実施例１にて述べた88-2ＢのゲノミックＤＮＡは、配列番号：３のヌクレオチド746〜1128に対応する。88ＣｃＤＮＡ配列、及び導き出されたアミノ酸配列は、配列番号：１に示される。88Ｃ cＤＮＡ配列は、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ ｃＤＮＡのクローン134、及びクローン101から得られた配列を合わせたものである。ＲＡＣＥ−ＰＣＲｃＤＮＡを、配列番号：１のヌクレオチド1〜654を決定するための配列決定用鋳型として使用したが、それには、配列番号：１のヌクレオチド1〜9における9 bpの5'非翻訳ｃＤＮＡ配列が独自に同定されていた。ＲＡＣＥＰＣＲ cＤＮＡから得られた配列によって、配列番号：１のヌクレオチド55〜57に最初のメチオニンコドンが位置することが確認され、しかして、クローン134及びクローン101が88Ｃコード領域の全長のコピーを含んでいるという結論が支持された。クローン134は、5'非翻訳ｃＤＮＡの45bp（配列番号：１のヌクレオチド10〜54に対応する）、1056 bpの88Ｃコード領域（配列番号：１のヌクレオチド55〜1110に対応する）、及び3'非翻訳ｃＤＮＡの492bp（配列番号：１のヌクレオチド1111〜1602に対応する）を含んでいた。クローン101は、5'非翻訳ｃＤＮＡの25 bp（配列番号：１のヌクレオチド30〜54に対応する）、1056bpの88Ｃコード領域（配列番号：１のヌクレオチド55〜1110に対応する）、及び3'非翻訳ｃＤＮＡの2273 bp（配列番号：１のヌクレオチド1111〜3383に対応する）を含んでいた。前記実施例１にて述べた88ＣのゲノミックＤＮＡは、配列番号：１のヌクレオチド424〜809に対応する。
【００４６】
88-2Ｂ及び88Ｃの導き出されたアミノ酸配列によって、ＧＰＣＲ膜貫通ドメインに対応する７つの疎水性ドメインを含む、ＧＰＣＲに特異的な疎水性についての概観が明らかになった。他のＧＰＣＲとの配列の比較によって、一致度の程度も明らかになった。意義深いことに、88-2Ｂ及び88Ｃの双方の導き出されたアミノ酸配列は、ケモカイン受容体の配列と最も高い一致度を有していた。表１に、これらのアミノ酸配列の比較の結果を表す。
【００４７】
【表１】
2009065976.tif 000002
【００４８】
表１により、88-2ＢはＣＣＣＫＲ1に最も類似しており（アミノ酸レベルで62％一致）、そして88Ｃは、ＣＣＣＫＲ2に最も類似している（アミノ酸レベルで72％一致）ことが示される。
【００４９】
88-2Ｂ及び88Ｃの導き出されたアミノ酸配列によって、ＧＰＣＲに特異的な細胞内及び細胞外ドメインも明らかになっている。88-2Ｂの細胞外ドメインは、配列番号：３及び配列番号：４にて提供されるアミノ酸配列のアミノ酸残基1〜36、93〜107、171〜196、及び263〜284に対応する。88-2Ｂの細胞外ドメインは、配列番号：３で、ヌクレオチド362〜469、638〜682、872〜949、及び1148〜1213に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされている。88Ｃの細胞外ドメインは、配列番号：１及び配列番号：２における、アミノ酸残基1〜32、89〜112、166〜191、及び259〜280を包含する。88Ｃの細胞外ドメインは、配列番号：１で、ヌクレオチド55〜150、319〜390、550〜627、及び829〜894に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされている。88-2Ｂの細胞内ドメインには、配列番号：３及び配列番号：４のアミノ酸60〜71、131〜151、219〜240、及び306〜355が包含される。それらのドメインは、配列番号：３で、ヌクレオチド539〜574、752〜814、1016〜1081、及び1277〜1426にそれぞれ対応するポリヌクレオチド配列によってコードされている。88Ｃの細胞内ドメインには、配列番号：１及び配列番号：２のアミノ酸残基56〜67、125〜145、213〜235、及び301〜352が包含される。88Ｃの細胞内ドメインは、配列番号：１で、ヌクレオチド220〜255、427〜489、691〜759、及び955〜1110に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされている。
【００５０】
加えて、ヒト88ＣｃＤＮＡの5'及び3'フランキング領域に対応するプライマーを使用して、マカークのゲノミックＤＮＡからＰＣＲによってマカーク88Ｃ ＤＮＡを増幅した。5'プライマーは、開始のMetコドンを含み、そのコドンの直ぐ上流の領域に対応していた。3'プライマーは、終止コドンの直ぐ下流の領域に相補的なものであった。プライマーは、発現ベクターへのクローニング用の制限酵素部位を含んでいた。5'プライマーの配列は、GACAAGCTTCACAGGGTGGAACAAGATG（HindIII制限部位に下線を付した）（配列番号：１７）であり、3'プライマーの配列は、GTCTCTAGACCACTTGAGTCCGTGTCA（XbaI制限部位に下線を付した）（配列番号：１８）であった。ＰＣＲ増幅の条件は、94℃にて８分間、続いて、94℃にて１分間、55℃にて４５秒間、そして72℃にて１分間の４０サイクルであった。増幅産物は、pcＤＮＡ3のHindIII及びXbaI制限部位へとクローニングし、そしてクローンを得て配列決定した。マカークの全長のｃＤＮＡ及び導き出されたアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：１９及び２０に表す。マカークの88Ｃのヌクレオチド配列は、ヒト88Ｃ配列と98％の一致度を有している。導き出されたアミノ酸配列は、97％の一致度を有するものである。
【００５１】
［実施例３］
88-2Ｂ及び88ＣのｍＲＮＡ発現パターンをノザンブロット分析によって調べた。
【００５２】
様々なヒト組織からのポリＡ+ＲＮＡを固定化した状態で含むノザンブロットは、Clontech Laboratories,Inc.、Palo Alto、カリフォルニアより購入した。詳細には、以下の組織すなわち、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸及び末梢血白血球を試験に供した。
【００５３】
88-2Ｂヌクレオチド配列に対して特異的なプローブを、ｃＤＮＡクローン478から作製した。クローン478のｃＤＮＡインサートは、配列番号：３のヌクレオチド641〜1915に対応する配列を含んでいる。プローブを作製するために、クローン478を消化し、そのインサートＤＮＡ断片をゲル電気泳動によって単離した。単離されたインサート断片は、次いで当該技術分野において知られている技術を使用して、32Ｐで標識付けしたヌクレオチドで、放射性同位体による標識付けを行った。
【００５４】
88Ｃヌクレオチド配列に対して特異的なプローブを、クローン493に認められるインサートＤＮＡ断片を単離し、そして放射性同位体による標識付けを行うことによって作製した。クローン493由来のインサート断片は、配列番号：１のヌクレオチド421〜1359に対応する配列を含んでいる。再度、32Ｐで標識付けしたヌクレオチドに関わる旧来の技術を使用して、プローブを作製した。
【００５５】
88-2Ｂをプローブとして用いて行ったノザンブロットには、およそ1.8kbのｍＲＮＡが末梢血白血球に現れた。88Ｃのノザン分析では、様々なヒト組織におよそ4 kbのｍＲＮＡが示され、それらのうち、脾臓または胸腺組織をプローブで探索したものは強いシグナルが認められ、そして末梢血白血球及び小腸からのｍＲＮＡを分析した場合には、もっと強度の低いシグナルが認められた。肺組織及び卵巣組織では、88Ｃに対するシグナルは比較的弱かった。
【００５６】
ヒトＴ細胞及び造血細胞系における88Ｃの発現も、ノザンブロット分析によって調べた。ＣＤ4+及びＣＤ8+ Ｔ細胞における88Ｃのレベルは非常に高かった。転写物は、骨髄細胞系のＴＨＰ1及びＨＬ−60に比較的高レベルに存在しており、そしてＢ細胞系のJijoyeにも認められた。加えて、このｃＤＮＡは、ライブラリーサブ画分のＰＣＲ増幅に基づくと、ヒトマクロファージｃＤＮＡライブラリーにて比較的多く転写されていた。
【００５７】
［実施例４］
88-2Ｂ及び88ＣｃＤＮＡを、組換え法によって哺乳動物細胞にて発現させた。
【００５８】
一過性のトランスフェクション実験のためには、88Ｃを哺乳動物細胞発現ベクターpＢＪ1へとサブクローニングした（Ishi, K.ら、J.Biol.Chem.、270巻、16435〜16440頁(1995)）。構築体には、効率的な細胞表面発現のためのプロラクチンシグナル配列、及び発現されたタンパク質の検出を容易にするために88Ｃのアミノ末端にＦＬＡＧエピトープをコードする配列が含まれていた。ＦＬＡＧエピトープは、「DYKDDDD」の配列からなるものである。ＣＯＳ−7細胞を、Lipofectamine（LifeTechnology, Inc.、Grand Island、ニューヨーク）を使用して製造業者のプロトコルに従って、88Ｃ発現プラスミドでトランスフェクトした。手短に説明すると、細胞は、24ウェルのプレートに、ウェル当たり4x 104 細胞の密度で播種し、終夜生育した。次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、各ウェルに1.5μlのリポフェクタミンに混合した0.3 mgのＤＮＡを含むOpti−ＭＥＭ0.25 mlを添加した。37℃にて５時間経過した後、培地を10％ＦＣＳを含有する培地に交換した。ＦＬＡＧエピトープに対して特異的なＭ1抗体（EastmanCo.、New Haven、コネチカット）を使用して定量的ＥＬＩＳＡ法によって、一過性にトランスフェクトされたＣＯＳ−細胞において、その細胞表面に88Ｃが発現されていることが確認された。
【００５９】
ＦＬＡＧでタグ付けした88Ｃ受容体は、さらにトランスフェクション用試薬ＤＯＴＡＰ（N-[1-[(2,3-ジオレオイロキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルサルフェート、Boehringer-Mannheim,Inc.、Indianapolis、インディアナ）を製造業者の推奨事項に従って使用して、ヒト胎児腎臓細胞系であるＨＥＫ−293にも安定にトランスフェクトした。薬剤Ｇ418の存在下で、安定な系を選択した。トランスフェクトされたＨＥＫ−293細胞を、ＦＬＡＧエピトープに対するＭ1抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって細胞表面での88Ｃの発現について評価した。ＥＬＩＳＡにより、安定に形質転換されたＨＥＫ−293細胞の細胞表面に、ＦＬＡＧエピトープを有するタグ付けした88Ｃが発現していることが示された。
【００６０】
88-2Ｂ及び88ＣｃＤＮＡを、安定なＨＥＫ−293トランスフェクト体をつくるために使用した。88-2Ｂ受容体ｃＤＮＡは、ＰＣＲに基づく戦略を使用して、pＲc/ＣＭＶ（InvitrogenCorp.、San Diego、カリフォルニア）にてサイトメガロウイルスプロモーターの後にクローニングした。ＰＣＲ反応のための鋳型は、クローン777中のｃＤＮＡインサートであった。ＰＣＲプライマーは、88-2Ｂ-3（内部XbaI制限部位を含む）及び88-2Ｂ-5（内部HindIII制限部位を含む）であった。プライマー88-2Ｂ-3のヌクレオチド配列は、配列番号：９に示され、プライマー88-2Ｂ-5のヌクレオチド配列は、配列番号：１０に示される。ｃＤＮＡの1104bpの領域を増幅した。増幅の後、ＤＮＡをXbaI及びHindIIIを用いて消化し、そして同様に消化されたpＲc/ＣＭＶへとクローニングした。この結果得られたプラスミドは、777ＸＰ2と名付けられ、これは18bpの5'非翻訳配列、88-2Ｂの全コード領域、及び3 bpの3'非翻訳配列を含んでいる。88Ｃの配列については、ＨＥＫ−293細胞にトランスフェクトするに先駆けてクローン134における全長のｃＤＮＡインサートにさらに修飾を施すことはしなかった。
【００６１】
安定に形質転換された細胞系を作出するために、pＲc/ＣＭＶ組換えクローンを、トランスフェクション用試薬ＤＯＴＡＰ（N-[1-[(2,3-ジオレオイロキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルサルフェート、Boehringer-Mannheim,Inc.、Indianapolis、インディアナ）を製造業者の推奨事項に従って使用して、ヒト胎児腎臓細胞系であるＨＥＫ−293にトランスフェクトした。薬剤Ｇ418の存在下で、安定な系を選択した。88-2Ｂ及び88ＣｍＲＮＡを最高のレベルで発現している安定な細胞系を同定するために、標準的なスクリーニング方法（すなわち、ノザンブロット分析）を実施した。
【００６２】
［実施例５］
Ａ．  Ｃａ++流出アッセイ
ポリペプチドの発現を分析するために、ケモカイン受容体活性についての機能性アッセイを用いた。既知のケモカイン受容体を通じたシグナル伝達の一般的な特徴は、シグナルトランスダクションが細胞内カルシウム陽イオンの遊離に関わっていることである。従って、トランスフェクトされたＨＥＫ−293細胞での細胞内Ｃａ++濃度をアッセイし、88-2Ｂまたは88Ｃ受容体が既知のケモカインのいずれかのものに応答するか否かを調べた。
【００６３】
88-2Ｂ、88Ｃ（ＦＬＡＧエピトープ配列は含まない）、または対照のコード領域（ＩＬ８ＲまたはＣＣＣＫＲ2をコードするもの、下記参照のこと）で前記のごとくに安定に形質転換されたＨＥＫ−293細胞を、ＭＥＭ＋10％血清中でおよそ90％の周密度までＴ75フラスコにて生育した。次いで細胞を洗浄し、バーセン（versene）（0.6mM ＥＤＴＡ、10 mM Ｎａ2ＨＰＯ4、0.14 M  ＮａＣｌ、3 mM ＫＣｌ、及び1 mM グルコース）を用いて回収し、そしてＭＥＭ＋10％血清＋1μMFura-2 ＡＭ（Molecular Probes,Inc.、Eugene、オレゴン）中で、室温にて３０分間インキュベートした。Fura-2 ＡＭは、Ｃａ++に感受性を有する染料である。細胞は、0.9mM ＣａＣｌ2及び0.5 mM ＭｇＣｌ2を含有するダルベッコのリン酸緩衝性生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）におよそ107細胞/mlの濃度で再度懸濁し、蛍光分光光度計（HitachiModel Ｆ-4010）を用いて蛍光の変化をモニターした。およそ106の細胞を、キュベット中で1.8 mlのＤ−ＰＢＳに懸濁し、37℃に維持した。励起波長を４秒間隔で340から380nmの間で変化させ、検出波長は510 nmとした。供試化合物は、投入口を介してキュベットに加え、イオノマイシン添加に伴うＣａ++流出の最高値を測定した。
【００６４】
ＩＬ−8ＲＡを発現している細胞でＩＬ−8を用いて刺激した際に、及びＭＣＰ−1またはＭＣＰ−3を用いてＣＣＣＫＲ2を刺激した際には、陽性の応答が観察された。しかしながら、88-2Ｂまたは88Ｃのいずれかを発現しているＨＥＫ−293細胞は、以下のケモカイン：ＭＣＰ−1、ＭＣＰ−2、ＭＣＰ−3、ＭＩＰ−1α、ＭＩＰ−1β、ＩＬ８、ＮＡＰ−2、gro/ＭＧＳＡ、ＩＰ−10、ＥＮＡ−78、またはＰＦ−4のいずれに曝された場合においても細胞内Ｃａ++濃度の流出が示されることはなかった。（Peprotech,Inc.、Rocky Hill、ニュージャージー）。
【００６５】
さらに感度の高いアッセイを使用して、ＲＡＮＴＥＳに対するＣａ++流出の応答を、88-2Ｂを発現している、Fura-2 ＡＭを付した細胞で顕微鏡によって観察した。アッセイには、前記の通りに調製した細胞及び試薬が包含されていた。ＲＡＮＴＥＳ（活性化調節、正常Ｔ発現及び分泌（Regulatedon Activati-on, Normal T Expressed and Secreted））は、好酸球の化学誘引物質及び活性化物質として同定されているケモカインである。Neoteら、前出を参照されたい。このケモカインは、好塩基球によるヒスタミンの遊離も媒介し、invitroで記憶Ｔ細胞に対する化学誘引物質として機能することも示されている。88-2Ｂ受容体活性のモジュレーションは、従って、白血球活性化をモジュレートする上で有用であることが含意される。
【００６６】
ＦＬＡＧでタグを付けた88Ｃ受容体をＨＥＫ−293細胞において発現させ、そしてＣａ++流出アッセイにて、ケモカイン相互作用について試験した。88Ｃの細胞表面での発現は、Ｍ1抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって、及びＦＡＣＳcan分析によって確認した。ケモカインであるＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−1α、及びＭＩＰ−1βがすべて100nMの濃度で添加された場合に、88Ｃがトランスフェクトされた細胞におけるＣａ++流出を誘導した。
【００６７】
Ｃａ++流出はさらに、ケモカイン受容体結合のモジュレーターを同定するためにもデザインされうる。供試化合物の存在下で、前記した蛍光分析または顕微鏡による分析に基づくアッセイを実施する。もしＣａ++流出が供試化合物の存在下で増加すれば、その供試化合物はケモカイン受容体結合の活性化物質である。反対に、Ｃａ++流出の低減によって、当該供試化合物がケモカイン受容体結合の阻害物質であるとの同定がなされる。
【００６８】
Ｂ．  ホスファチジルイノシトール加水分解
リガンドまたはモジュレーターのための別のアッセイとして、Hungら、J.Biol.Chem.、116巻、827〜832頁(1992)に記載されるように、ホスフォリパーゼＣ活性をモニターすることが挙げられる。先ず、ケモカイン受容体を発現している宿主細胞を、２４時間、3Ｈ−イノシトールに負荷する。次いで、供試化合物（すなわち、リガンドの可能性があるもの）を細胞に添加し、37℃にて１５分間インキュベートする。次に細胞を20mMのギ酸に曝して、加水分解されたホスファチジルイノシトール代謝の代謝物（すなわち、ホスフォリパーゼＣによって媒介された加水分解の産物）を安定化及び抽出する。抽出物は、ＡＧ1Ｘ8陰イオン交換カラム（フォルメート型）を使用した、陰イオン交換クロマトグラフィーに供する。イノシトールホスフェートを、2Mギ酸アンモニウム塩／0.1 Mギ酸で溶出し、その化合物に会合した3Ｈを液体シンチレーションスペクトル光学測定法を使用して定量する。このホスフォリパーゼＣアッセイは、ケモカイン受容体活性のモジュレーターを同定するためにも利用することができる。このアッセイは、モジュレーターの可能性がある物質を添加すること以外は上述通りに実施される。検出可能な標識のレベルが上昇すれば、そのモジュレーターがケモカイン受容体活性の活性化物質であることを示唆するであろうし、検出可能な標識のレベルが低下すれば、そのモジュレーターがケモカイン受容体活性の阻害物質であることを示唆するであろう。
【００６９】
ホスフォリパーゼＣアッセイを実施して、ＦＬＡＧでタグ付けした88Ｃ受容体のケモカインリガンドを同定した。トランスフェクション後およそ２４時間で、88Ｃを発現しているＣＯＳ−7細胞を、透析したＦＣＳを10％含有するイノシトール不含の培地中で、myo-[2-3Ｈ]イノシトール（1μCi/ml）を用いて２０〜２４時間標識付けした。標識付けされた細胞を、10mMＬｉＣｌを含有するイノシトール不含のＤＭＥＭで洗浄し、そして10 mMＬｉＣｌ及び以下のケモカイン、すなわち、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−1β、ＭＩＰ−1α、ＭＣＰ−1、ＩＬ−8、またはネズミＭＣＰ−1相同体のＪＥのうちの１つを含有する、イノシトール不含のＤＭＥＭと37℃にて１時間インキュベートした。イノシトールホスフェート（ＩＰ）形成は、前節に記載の通りにアッセイした。ケモカインと共にインキュベートした後、培地を吸引除去し、細胞は、20mMの氷冷したギ酸を0.75 ml添加することによって溶解した（３０分間）。上清画分は、Ａｇ1−Ｘ8 Dowexカラム（Biorad、Hercules、カリフォルニア）に付し、続いて即座に50mM   Ｈ4ＯＨを3 ml加えた。次いで、カラムを4 mlの40 mM ギ酸アンモニウム塩で洗浄し、続いて2 Mのギ酸アンモニウム塩で溶出した。イノシトールホスフェートの総量を、β線放射を計数することによって定量した。
【００７０】
ＩＬ8ＲＡ及びＩＬ8ＲＢなどの、特定のケモカイン受容体は、ＣＯＳ−7細胞にてシグナル伝達を検出することができるに先駆けて外来性のＧタンパク質と共にトランスフェクトする必要があることが示されているので、88Ｃ受容体は、キメラＧタンパク質のＧqi5と共に発現させた（Conklinら、Nature、363巻、274〜276頁(1993)。Ｇqi5は、スプライシングを受けてＧαqになるＧi（受容体に結合する）のカルボキシル末端の５つのアミノ酸を有するＧタンパク質である。Ｇqi5と共にトランスフェクションを行って88ＣがＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−1β、及びＭＩＰ−1αに応答して良好なシグナル伝達を行うが、ＭＣＰ−1、ＩＬ−8、またはネズミＭＣＰ−1相同体のＪＥには応答しないことが明らかになった。用量依存性曲線によって、ＲＡＮＴＥＳについては1nM、ＭＩＰ−1βについては6 nM、そしてＭＩＰ−1αについては22 nMの、ＥＣ50値であることが明らかになった。
【００７１】
88Ｃは、ＭＩＰ−1βに応答したシグナル伝達を行うヒトの受容体で最初にクローニングされたものである。他のＣＣケモカイン受容体に比べて、ＭＩＰ−1βは、明らかに独特な細胞での活性化パターンを有している。それは、Ｔ細胞を活性化するようであるが、単球は活性化しないらしく（Baggioliniら、前出）、これは受容体刺激試験の結果に一致している。例えば、ＭＩＰ−1βは、ＣＣＣＫＲ1に結合するが、カルシウム流出を誘導しない（Neoteら、前出）。対照的に、ＭＩＰ−1α及びＲＡＮＴＥＳは、ＣＣＣＫＲ1及びＣＣＣＫＲ5に結合して、シグナル伝達を惹き起こす（ＲＡＮＴＥＳは、ＣＣＣＫＲ3の活性化も惹き起こす）。ＭＩＰ−1βは、かくのごとくＣＣケモカインファミリーの他のケモカインよりも随分選択性が高いようである。一般的な前炎症性活性を惹き起こす複数の白血球個体集団なしで、特定の有益な活性が刺激されうるので（ＨＩＶ感染の抑制など）、かかる選択性は、治療的に重要なものである。
【００７２】
Ｃ．  結合アッセイ
ケモカインとの受容体の相互作用にかかる他のアッセイは、Ernstら、J.Immunol.、152巻、3541〜3549頁(1994)によって記載されている結合アッセイを改変したものであった。ＭＩＰ−1βは、Bolton及びHunter試薬（二ヨウ素剤、ＮＥＮ、Wilmington、デラウェア）を使用して、製造業者の指示に従って標識付けした。接合しなかったヨウ素は、ＰＢＳ及びＢＳＡ（1％重量／容量）で平衡化されたＰＤ−10カラム（Pharmacia）を使用して溶出することにより、標識付けされたタンパク質から分離した。比活性は、典型的には2200Ci/mmoleであった。ポリプロピレンチューブ中にて、総容量で300μl（50 mM ＨＥＰＥＳ、ｐＨ 7.4、1 mM ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、0.5％ＢＳＡ）とした、ＦＬＡＧエピトープでタグ付けした88Ｃをトランスフェクトした、5x 105のＨＥＫ−293細胞に、125Ｉで標識付けしたリガンドを単独で、または100倍量の過剰の標識付けしていないリガンドと共に添加し、150rpmで攪拌しながら27℃にて９０分間インキュベートすることによって、平衡結合（equilib-rium binding）を実施した。細胞は、Skatronセルハーベスター（SkatronInstruments Inc.、Sterling、バージニア）を使用して、0.3％ポリエチレンイミン及び0.2％ＢＳＡに予め浸しておいたガラス繊維フィルターの上に集めた。洗浄後、フィルターを取り出し、ガンマ線放射を計数することによって結合していたリガンドを定量した。標識付けしていないリガンドとの競合によるリガンド結合性は、5x 105のトランスフェクトされた細胞（前記の通り）を、1.5 nMの放射性同位体で標識付けしたリガンド及び示唆された濃度の標識付けしていないリガンドとインキュベートすることによって定量した。前記のごとくに試料を集め、洗浄し、計数した。データは、曲線適合（curve-fitting）プログラムであるPrism（GraphPadInc.、San Diego、カリフォルニア）及び反復非回帰曲線プログラムであるＬＩＧＡＮＤ（ＰＭ220）を使用して分析した。
【００７３】
平衡結合アッセイにおいて、88Ｃ受容体は、放射性同位体により標識付けしたＭＩＰ−1βに、特異的且つ飽和可能な態様で結合した。Scatchardの方法によるこの結合の分析によって、1.6nMの解離定数（Ｋｄ）が明らかにされた。標識付けしたＭＩＰ−1βを使用した競合結合アッセイによって、ＭＩＰ−1β（ＩＣ50＝7.4 nM）、ＲＡＮＴＥＳ（ＩＣ50＝6.9nM）、及びＭＩＰ−1α（ＩＣ50＝7.4 nM）の高親和性結合が明らかになり、これは、前記Ｂセクションにおいて議論したごとき、一過性にトランスフェクトされたＣＯＳ−7細胞にて得られたシグナル伝達にかかるデータに一致していた。
【００７４】
［実施例６］
ケモカインであるＭＩＰ−1α、ＭＩＰ−1β及びＲＡＮＴＥＳは、ヒト末梢血単核球細胞及びＰＭ1細胞においてＨＩＶ−1及びＨＩＶ−2の複製を阻害することが示されている（Cocchiら、前出）。この発見に鑑みて、そして実施例５に記載した結果に鑑みて、本発明は、88Ｃ受容体の活性化、またはそのリガンド結合によってＨＩＶ感染における防衛的役割を提供しうることを企図するものである。
【００７５】
近年、Ｇタンパク質にカップリングするオーファン受容体であるフシン（fusin）が、ＨＩＶの進入に対して共受容体として作用できることが報告されている。フシン／ＣＸＣＲ4は、本来の（primary）ＨＩＶの受容体であるＣＤ4と組み合わされて、培養Ｔ細胞にＨＩＶ感染を明らかに促進する（Fengら、Science、272巻、872〜877頁(1996)）。フシンとケモカイン受容体の相同性ならびに88Ｃのケモカイン結合の概観に基づいて、そして、88ＣがＴ細胞で構成的に発現されており、マクロファージにて豊富に発現されているので、88Ｃは、ウイルス及びＨＩＶ感染に関わっているらしいと考えられる。
【００７６】
ＨＩＶに対する共受容体としての88Ｃ及び88-2Ｂの機能は、ＣＤ4と共に88Ｃまたは88-2Ｂを発現する細胞をトランスフェクトし、そしてそのコトランスフェクトされた細胞をＨＩＶで攻撃することによって調べた。ＣＤ4及び機能性を有するＨＩＶに対する共受容体の双方を発現する細胞のみが、感染されるようになった。ＨＩＶの感染は、様々な方法によって調べることができる。ＨＩＶ抗原の発現について試験するＥＬＩＳＡ、例えば、CoulterＨＩＶ−1 p24抗原アッセイ（米国特許第4,886,742号）、Coulter Corp.、11800 ＳＷ 147th Ave.、Miami、フロリダ33196が市販されている。あるいは、供試細胞を、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターに付けたＬＡＣＺなどのレポーター遺伝子を発現するように作出することができる［Kimptonら、J.Viol.、66巻、2232〜2239頁(1992)］。この方法において、ＨＩＶで感染された細胞は、比色分析アッセイによって検出される。
【００７７】
88Ｃは、ヒトＣＤ4を発現するように安定に形質転換しておいたネコ細胞系であるＣＣＣ［Claphemら、181巻、703〜715頁(1991)］に一過性にトランスフェクトした（ＣＣＣ−ＣＤ4）。これらの細胞は、88Ｃを内在的に発現していないので、ＨＩＶ−1のいずれの株による感染に対しても正常状態では耐性である。これらの実験において、ＣＣＣ/ＣＤ4細胞はリポフェクタミン（GibcoBRL、Gaithersburg、メリーランド）を使用して発現ベクターpcＤＮＡ3.1（Invitrogen Corp.、San Diego、カリフォルニア）へとクローニングした88Ｃを、一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトを行った後２日目に、細胞をＨＩＶで攻撃した。４日間インキュベートした後、細胞を固定し、ＨＩＶ感染の指標としてp24抗原についての染色を行った。これらの細胞による88Ｃ発現によって、かかる細胞がＨＩＶ−1の様々な株による感染に対して感受性を有するようになった。これらの株には、共受容体としてフシンではなく88Ｃのみを使用することが示された初代の（primary）非シンシチウム誘導性ＨＩＶ−1分離株（Ｍ23、Ｅ80、ＳＬ−2及びＳＦ−162）が含まれていた。初代のＨＩＶ−1の様々なシンシチウム誘導性ＨＩＶ−1分離株（2006、Ｍ13、2028及び2076）は、共受容体として88Ｃまたはフシンのいずれかを使用した。また、２つの樹立されたクローンのＨＩＶ−1ウイルス（ＧＵＮ−1及び89.6）は、88Ｃまたはフシンのいずれかを共受容体として使用した。
【００７８】
ＨＩＶ−2のある株は所定のＣＤ4陰性細胞系に感染でき、しかしてＣＤ4以外の受容体とのＨＩＶ−2の直接的な相互作用が含意されることが報告されている［Claphamら、J.Viol.、66巻、3531〜3537頁(1992)］。ＨＩＶ−2のある株については、この感染は可溶性ＣＤ4（sＣＤ4）の存在によって促進される。88-2ＢはＨＩＶ共受容体（すなわち、88Ｃ及びフシン）として作用する他のケモカイン受容体と高い配列の類似性を共有しているので、88-2ＢはＨＩＶ−2の共受容体であるらしいと考えられた。ＨＩＶ−2共受容体としての88-2Ｂの役割を、ＨＩＶ−2株であるＲＯＤ/Ｂを使用して立証した。ＣＤ4を内在的に発現していないネコのＣＣＣ細胞を88-2Ｂでトランスフェクトした。これらの実験において、細胞はリポフェクタミンを使用して88-2Ｂを含むpcＤＮＡ3.1でトランスフェクトし、そしてＨＩＶ−2で４８時間感染させた。感染後３日目に、細胞はＨＩＶ−2エンベロープの糖タンパク質の存在について免疫染色した。ＨＩＶ−2ROD/Bによる攻撃の間にsＣＤ4が存在することで、これらの細胞の感染は１０倍増加した。88-2Ｂがトランスフェクトされた細胞へのＨＩＶ−2の進入は、88-2Ｂに対するリガンドの１つであるエオタキシン（eotaxin）400〜800ng/mlの存在によって阻害することができた。ＣＣＣ/88-2Ｂの感染性の基線レベル（可溶性ＣＤ4を含まない場合）は、88-2ＢでトランスフェクトされなかったＣＣＣ細胞と同等であった。
【００７９】
88-2Ｂ及び88ＣのＨＩＶに対する共受容体としての役割は、88Ｃまたは88-2Ｂを発現するように安定に形質転換した細胞系を調製し、様々なＨＩＶ及びＳＩＶの株で攻撃することによって確認した。これらの結果は実施例７に記載する。
【００８０】
あるいは、88Ｃ及び88-2Ｂの共受容体としての役割は、生存ウイルスの使用を必要としない実験方法によって立証することができる。この方法では、88Ｃまたは88-2Ｂ、ＣＤ4及びＬＡＣＺレポーター遺伝子を共に発現している細胞系を、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質（ＥＮＶ）及び受容体遺伝子構築体のための転写因子を共に発現している細胞系と混合する（Nussbaumら、J.Virol.、68巻、5411頁(1994)）。機能を有する、ＨＩＶに対する共受容体を発現している細胞は、ＥＮＶを発現している細胞と融合し、それによってレポーター遺伝子の発現が許容されるであろう。この方法において、比色分析アッセイによるレポーター遺伝子産物の検出によって、ＨＩＶに対する共受容体としての88Ｃまたは88-2Ｂの機能が示唆される。
【００８１】
ケモカインがウイルス感染を阻害する機構は、未だ解明されていない。可能性が考えられる１つの機構としては、ケモカインの結合による受容体の活性化が挙げられる。ケモカインの結合によって、ウイルス感染に対して細胞が耐性になり、及び／または、細胞内でのウイルスの複製が防止されるシグナルトランスダクションの事象が細胞内に惹起こされる。インターフェロン誘導の場合と同様に、細胞がウイルス感染に対して耐性となるように、または抗ウイルス状態が確立されるように、細胞が分化するのかもしれない。あるいは、第２の機構としては、ケモカイン結合によって共受容体にウイルスエンベロープ糖タンパク質が接近することが阻害され、これによる細胞内へのウイルスの侵入の直接的な干渉がなされることが挙げられる。この機構において、Ｇ−タンパク質シグナル伝達は、ＨＩＶ感染のケモカイン抑制には必要でない。
【００８２】
ウイルスまたはＨＩＶ感染に対する共受容体として機能しうる、88Ｃまたは88-2Ｂによる２つの機構を区別するために、受容体へのケモカイン結合をシグナルトランスダクションから分け、そしてウイルス感染の抑制へのケモカインの効果を調べる。
【００８３】
Ｇ−タンパク質によって媒介されるシグナル伝達を阻害する化合物を添加することによって、リガンド結合をシグナルトランスダクションから分かつことができる。これらの化合物には、例えば、百日咳毒及びコレラ毒が含まれる。加えて、下流のエフェクターポリペプチドは、ウォートマンニン（wortmannin）などの他の化合物によって阻害されうる。もしウイルス感染の抑制にＧ−タンパク質シグナル伝達が関わっているのであれば、かような化合物を添加することでケモカインによるウイルス感染の抑制は妨げられるであろう。あるいは、Ｇ−タンパク質のカップリングに必要な、88Ｃまたは88-2Ｂ受容体の鍵となる残基または受容体ドメインを、Ｇ−タンパク質のカップリングを改変または破壊させるが、ケモカイン結合には影響を及ぼさないように改変または欠失させることができる。
【００８４】
これらの条件の下に、ケモカインがウイルスまたはＨＩＶ感染を抑制できなければ、Ｇ−タンパク質を通じたシグナル伝達がウイルスまたはＨＩＶ感染の抑制に必要なのである。しかしながら、もしケモカインがウイルス感染を抑制することができれば、その場合はＧ−タンパク質シグナル伝達経路はウイルス感染のケモカインによる抑制には不要なのであり、ケモカインの保護的効果は、ウイルスに対する受容体の利用可能性のケモカインによる阻害に起因するかもしれないと考えられる。
【００８５】
他の研究手段として、88Ｃまたは88-2Ｂに対して作製した抗体の使用が挙げられる。Ｇ−タンパク質シグナル伝達を導き出さないことが示されうる、88Ｃまたは88-2Ｂに結合する抗体は、ケモカインまたは受容体のウイルス結合部位への接近を阻害するかもしれない。88Ｃまたは88-2Ｂに対する抗体の存在下にウイルス感染が抑制されれば、その場合にはケモカインの保護的効果の機構は、その受容体へのウイルスの接近を阻害することにある。Fengらは、フシン受容体のアミノ末端に対する抗体は、ＨＩＶ感染を抑制すると報告した（Fengら、1996）。
【００８６】
［実施例７］
ＨＩＶ感染における88Ｃ及び88-2Ｂの役割の輪郭をさらに明らかにするために、88Ｃまたは88-2Ｂで細胞を安定に形質転換させた。Kimpton及びEmermen、「Detectionof Replication-Competent and Pseudotyped Human Immunodeficiency Virus with aSensitive Cell Line on the Basis of Activation ofan IntegratedBeta-Galactosidase Gene」J.Virol、66巻5号、3026〜3031頁(1992)は、以前に指標（indicator）細胞系を記載しており、当該細胞は、本明細書にてＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞とする。ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞は、核に局在したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を駆動する、統合されたＨＩＶ−1ＬＴＲのみならず、ＣＤ4も発現するように安定に形質転換されているＨｅＬａ細胞である。細胞でのＨＩＶプロウイルスの統合によって、ウイルスのトランス活性化物質であるＴａｔの生産が導かれ、次にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現が開始される。insitu でβ−ガラクトシダーゼ活性に対してＸ−ｇａｌで陽性に染まる細胞の数は、感染細胞数に直接比例するものである。
【００８７】
これらのＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞は、実験室で馴化したＨＩＶ−1の分離株を検出することができるが、初代分離株についてはごくわずかしか検出できず［Kimpton及びEmermen、前出］、そしてほとんどのＳＩＶ分離株は検出できない［Chackerianら、「Characterizationof a CD4-Expressing Macaque Cell Line that can Detect Virus After A SingleReplication Cycle and can be infected by Diverse Simian Immunodefi-ciency VirusIsolates」Virology、213巻2号、6499〜6505頁(1995)］。
【００８８】
加えて、Harrington及びGeballe、「Co-FactorRequirement for Human Immunodeficiency Virus Type 1 Entry into a CD4-ExpressingHuman Cell Line」J.Virol、67巻、5939〜5947頁(1993)は、ＣＤ4及び同じＬＴＲ−β−ガラクトシダーゼ構築体を発現するように作出されていたＵ373細胞に基づく細胞系を記載していた。この細胞系（本明細書中では、Ｕ373−ＭＡＧＩとしする）は以前に、ＨＩＶのいずれのＨＩＶ（ＭまたはＴ向性（tropic））株でも感染できないが、ＨｅＬａ細胞との融合によって感受性とすることができることが示されていた［Harrington及びGeballe、前出］。
【００８９】
マクロファージまたはＴ細胞向性ウイルスのいずれかを検出できる指標細胞系を構築するために、エピトープでタグ付けをした88Ｃまたは88-2ＢをコードするＤＮＡを、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩまたはＵ373−ＭＡＧＩ細胞にレトロウイルスベクターを用いた感染によってトランスフェクトし、それぞれＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88ＣまたはＵ373−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞系をつくった。細胞表面での共受容体の発現は、抗ＦＬＡＧＭ1抗体及びＲＴ−ＰＣＲを使用して生存細胞を免疫染色することによって立証した。
【００９０】
ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ及びＵ373−ＭＡＧＩ−88Ｃを構築するために利用した88Ｃ及び88-2Ｂ遺伝子は、プロラクチンシグナルペプチドと、それに続く、実施例４に記載したようなＦＬＡＧエピトープをコードする配列を含んでいた。この遺伝子を、レトロウイルスベクターのpBabe-Puro［Morgenstern及びLand、NucleicAcids Research、18巻12号、3587〜3596頁(1990)］に挿入した。ＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽分類した（pseudo-typed）タイターの高いレトロウイルスベクターのストックを、Bartxら、J.Virol、70巻、2324〜2331頁(1996)に記載のごとくに一過性トランスフェクションによってつくり、そしてＨｅＬａ−ＭＡＧＩ及びＵ373−ＭＡＧＩ細胞を感染させるために使用した。0.6μg/mlのピューロマイシン（ＨｅＬＡ）または1μg/mlのピューロマイシン（Ｕ373）に対して耐性の細胞を集めた。各プールには、少なくとも1000の別個のトランスダクションの事象が含まれていた。元のＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞の早期継代（第２継代）のストック［Kimpton及びEmerman、前出］を使用して、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞を作出した。
【００９１】
指標細胞系のＨＩＶによる感染は、１２ウェルのプレートにて、前記の通りＤＥＡＥ−Dextranの30μg/ml存在下に300μlのウイルスを連続的に10倍に希釈して実施した［Kimpton及びEmerman、前出］。
【００９２】
すべてのＨＩＶ株及びＳＩＶmac239は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Reference and ReagentProgramから入手した。初代のＨＩＶ−27312A［Gaoら、「Genetic Diversity of HumanImmunodefi-ciency Virus Type 2: Evidence for Distinct Sequence Subtypes withDifferences in Virus Biology」、J.Virol、68巻11号、7433〜7447頁(1992)］及びＳＩＶsmPbj1.9［Dewhurstら、「SequenceAnalysis and Acute Pathogenici-ty of Molecular Cloned SIVs1nm-PBj14」Nature、345巻、636〜640頁(1990)］の分子クローンは、B.Hahn（ＵＡＢ）から入手した。他のＳＩＶmne分離株はすべてJulieOverbaugh（U. Washington、Seattle）から入手した。クローニング化したプロウイルス由来のストックは、293細胞の一過性トランスフェクションによって作製した。他のウイルスのストックは、ヒト末梢血単核細胞にてまたはＣＥＭｘ174細胞（ＳＩＶストック用）にて、ウイルスを継代することで作製した。ウイルスストックの標準化は、ＨＩＶ−1及びＨＩＶ−2/ＳＩＶについてそれぞれ、ＥＬＩＳＡまたはp24gag（CoulterImmunology）またはp27gag（Coulter Immunology）によって、製造業者によって提供された標準技術を用いて行った。
【００９３】
Ｕ373−ＭＡＧＩ-88Ｃ細胞及びＵ373−ＭＡＧＩ細胞（対照）は、ＨＩＶ−1のＴ向性株（ＨＩＶLAI）、Ｍ向性株（ＨＩＶYU-2）、及びＳＩＶ分離株であるＳＩＶMAC239を限界希釈して感染させた。感染性は、ウイルスの単位容量当たりウェル当たりの青色細胞数を計数することによって測定した（表２）。
【００９４】
【表２】
2009065976.tif 000003
【００９５】
感染後２日目に、細胞を固定し、Ｘ−galでβ−ガラクトシダーゼ活性に対する染色を行った。Ｕ373由来のＭＡＧＩ細胞は、37℃にて１２０分間染色し、ＨｅＬａ由来のＭＡＧＩ細胞は、37℃にて５０分間染色した。バックグラウンドたる非感染細胞の染色は、ウェル当たりおよそ３つの青色細胞を越えることはなかった。濃青色の細胞のみを計数し、複数の核を有するシンシチウムは、単一の感染細胞として計数した。感染のタイターは、ウェル当たりの青色細胞の数にウイルスの希釈率をかけて1mlに標準化したものである。Ｕ373−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞へのＨＩＶYU-2のタイターは、2 x 106であった。これに対して、Ｕ373−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞へのＨＩＶLAIのタイターは、100未満であった。しかして、88Ｃに対する特定のＨＩＶ株の特異性は、４桁の大きさで変動するものであった。
【００９６】
ＳＩＶMAC239の感染は、Ｕ373−ＭＡＧＩ−88Ｃで4 x 105に増大したが、このウイルスは明らかにＵ373−ＭＡＧＩ細胞を感染した（表２）。
【００９７】
次に、一連のクローン化されていない初代ＨＩＶ株及びクローン化されたＨＩＶ−1のＭ向性株を、88Ｃを発現している指標細胞系の感染能力について分析した。
【００９８】
前記したように、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ及びＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞を、様々なＨＩＶ株を限界希釈して感染させた。２つのクローン化されたＭ向性ウイルスである、ＨＩＶJR-CSF及びＨＩＶYU-2は、双方ともＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃを感染したがＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞は感染せず、双方の株が88Ｃを共受容体として使用することが示された（表３、注記ｃを参照のこと）、しかしながら、これら２つのウイルス株の各々がＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞を感染する能力には大きな格差が観察され、すなわち、ＨＩＶYU-2については6.2x 105 IU/mlであり、ＨＩＶJR-CSFについては1.2 x 104 IU/mlであった。ウイルスストックの感染性（表３）は、物理的粒子数（ここでは、ウイルスコアタンパク質の量で表す）当たりの感染単位数である。加えて、これらの２つのクローン化されたウイルス株の感染性は、別々に調製されたウイルスストックで５０倍を越える相違があることが観察された。
【００９９】
本来のウイルスの分離株の感染性の多様性について、３つの異なるクレード由来のクローン化されていないウイルスストックの異なる１２種を収集したものを分析することによってさらに実験した（表３）。地理学的に別種の起源より由来する、３つのクレードＡ初代分離株、３つのクレードＥ分離株、及び３つのさらなるクレードＢ分離株を使用した。すべての９つの株で、ＨＩＶの初代株は、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞で検出できたが、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞では検出できなかった（表３）。しかしながら、感染効率は、ngのp24gag当たり５感染単位から、ngのp24gag当たり１００感染単位を越えるまで、様々であった（表３）。これらの結果から、Ｍ向性株の絶対的な感染性はかなり変動するものであり、クレードとは無関係であることが示唆される。このような不一致を説明しうる仮説は、ＣＤ4結合の後の88Ｃに対する各ウイルス株のＶ3ループの親和性に関するものでありうる［Trkolaら、Nature、384巻6605号、184〜187頁(1996)；Wuら、Nature、384巻6605号、179〜183頁(1996)］。
【０１００】
【表３】
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【０１０１】
ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞のＨＩＶ−2及び他のＳＩＶ株検出能力も調べた。ＨＩＶ−2Rodは、ＣＤ4が存在しなくても受容体としてフシンを使用することが報告されている［Endresら、Cell、87巻4号、745〜756頁(1996)］。ＨＩＶ−2Rodは、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞に感染することができるのであるが、その感染性は、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞で少なくとも10倍増強される（表４）。ＨｅＬａ細胞は、内在的にフシンを発現している。しかして、ＨＩＶ−2Rodの分子クローンは双向性であり、ＣＸＣＲ4に加えて、その共受容体の１つとして88Ｃを使用することができる。同様に、ＨＩＶ−27312Aの初代株は、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞に感染したが、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞は感染せず、ＨＩＶ−1の初代株と同様に、受容体として88Ｃを使用していることが示唆される。
【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
試験を行ったＳＩＶ株のいずれも、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞に感染せず（表４）、また、88-2Ｂを発現しているＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞に感染したものもなかった。このことから、Ｕ373細胞でＳＩＶによって使用される択一的共受容体は、ＨｅＬａ細胞では発現されておらず、またそれは88-2Ｂではないことが示唆される。試験を行ったすべてのＳＩＶ株は、ある程度ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞に感染した（表３）ので、かかる試験されたＳＩＶ株のすべてが、それらの共受容体のうちの１つとして少なくとも88Ｃを使用することが示唆されるものである。
【０１０４】
ＨＩＶのＭ向性及びＴ向性株の分類は、従来より、他の命名に従う「非シンシチウム誘導性」（ＮＳＩ）及び「シンシチウム誘導性」（ＳＩ）にそれぞれ関連付けられることがよくある。本明細書に記載の細胞系に基づくアッセイは、シンシチウム形成に対して感受性である。感染された細胞は、複数の核を含んだ、大小の感染巣を形成することができる［Kimpton及びEmerman、前出］。
【０１０５】
複数の異なるウイルス株及びＵ373−ＭＡＧＩ−88ＣまたはＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃを使用した実験によって、正しい共受容体が存在していればすべてのウイルス株がシンシチウムを形成したので、ＳＩ/ＮＳＩの命名は意味をなさないことが示唆される。これらの実験から、向性による示唆よりむしろシンシチウム形成が、感染細胞における適切な供受容体の存在の指標であるらしいことが示される。文献で、非シンシチウム形成株であると報告されている、特にＳＩＶMAC239、ＳＩＶMNEc18、及びＳＩＶMNE170のＳＩＶ株でのＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞については、単層に誘導されたシンシチウムのサイズが、他のいかなるＨＩＶ株によって誘導されたもののサイズよりも随分大きかったので、その感染が顕著であった。
【０１０６】
［実施例８］
88Ｃを特異的に認識するモノクローナル抗体を調製した。抗体は、88Ｃのアミノ末端の２０のアミノ酸に対応するペプチドでマウスを免疫付けすることによって製造した。ペプチドは、製造業者の指示（Pierce、Imjectマレイミド活性化ＫＬＨ）に従って、Keyhole Limpet Cyanin（ＫＬＨ）に接合し、完全フロインドアジュバントに懸濁して５匹のマウスに注射した。３週間の間隔で不完全フロインドアジュバントに懸濁した接合ペプチドのさらなる注射を２回行った。最後の注射から１０日後に、５匹の各々のマウスからの血清を、ＥＬＩＳＡによって前記２０アミノ酸のペプチドとの免疫反応性について試験した。加えて、血清の免疫反応性は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）により、293細胞の表面上に発現される完全な88Ｃ受容体に対して試験した。最高の抗88Ｃ活性を有するマウスを脾臓細胞融合用及び標準実験法によるモノクローナル抗体の製造用に選択した。ＥＬＩＳＡによってペプチドを認識し、ＦＡＣＳによって293細胞上の88Ｃタンパク質を認識する抗体を製造する、５つのモノクローナル細胞系（227Ｋ、227Ｍ、227Ｎ、227Ｐ、227Ｒ）を樹立した。各抗体は、88Ｃを発現している293細胞のみと反応し、密接に関連したＭＣＰ受容体（ＣＣＣＫＲ−2）を発現している293細胞とは反応しないことが示された。各抗体は、ＣＯＳ細胞で一過性に発現される88Ｃを認識することも示された。
【０１０７】
88Ｃに対して、ウサギポリクローナル抗体も作製した。２羽のウサギに、前記の接合されたアミノ末端ペプチドを注射した。さらにウサギは、接合アミノ末端ペプチドで４回の免疫付けを行った。各ウサギ（2337Ｊ及び2470Ｊ）からの血清を、88Ｃを発現している293細胞のＦＡＣＳによって調べた。血清は、293細胞の表面上にある88Ｃを特異的に認識した。
【０１０８】
５つの抗88Ｃモノクローナル抗体を、ＳＩＶ（ＨＩＶに密接に関連する、サル免疫不全ウイルス）による細胞の感染をそれら抗体が阻害する能力について試験した［Lehnerら、NatureMedicine、2巻、767頁(1996)］。正常時にはＳＩＶによる感染に対して感受性を有するサルＣＤ4+ Ｔ細胞を、１：５に希釈した抗88Ｃモノクローナル抗体上清の存在下にＳＩＶmac32HJ5クローンとインキュベートした。逆転写酵素（ＲＴ）検出及び定量方法（Quan-Ｔ-ＲＴアッセイキット、Amersham、ArlingtonHeights、イリノイ）を使用して、９日目に逆転写酵素（ＲＴ）を定量することによってＳＩＶ感染を測定した。抗体のうち４つが、ＳＩＶ感染を阻害することができた。すなわち、227Ｋは53％、227Ｍは59％、227Ｎは47％、そして227Ｐは81％阻害できた。抗体227Ｒは、ＳＩＶ感染を阻害しなかった。
【０１０９】
ヒト88Ｃアミノ末端ペプチドに対して作製した５つのモノクローナル抗体は、マカーク88Ｃ（配列番号：Ｘ）（アミノ末端ペプチド領域でヒト88Ｃと異なる２つのアミノ酸を有する）に対する反応性についても試験した。ヒト88Ｃ及びマカーク88Ｃのコード領域を、発現ベクターpcＤＮＡ3（Invitrogen）にクローニングした。これらの発現プラスミドを、ＤＥＡＥを使用してＣＯＳ細胞にトランスフェクトするために使用した。陰性の対照として、空のベクターを使用した。トランスフェクションから３日後に、細胞を回収して、５つの抗88Ｃモノクローナル抗体とインキュベートし、そしてＦＡＣＳ用に調製した。その結果、５つの抗体のうち４つ（227Ｋ、227Ｍ、227Ｎ、227Ｐ）は、マカーク88Ｃを認識したが、１つ（227Ｒ）は認識しなかった。５つの抗体はすべて、トランスフェクトされたヒト88Ｃを認識し、ベクター単独でトランスフェクトした細胞と交叉反応するものはなかった。
【０１１０】
［実施例９］
本発明のケモカイン受容体のリガンド及びモジュレーターを同定するために、さらなる方法を使用してもよい。１つの実施態様において、本発明はリガンドのための直接アッセイを企図する。検出可能に標識付けされた供試化合物を、機能性のコンフォメーションにあるケモカイン受容体を呈示している膜調製物に曝す。例えば、ＨＥＫ−293細胞、または組織培養細胞を、ケモカイン受容体をコードする発現媒体を用いてトランスフェクトする。次いで、ケモカイン受容体を発現しているかかるトランスフェクトされた細胞から、膜調製物を得る。膜調製物は、125Ｉで標識付けされた供試化合物（例えば、ケモカイン）に曝し、好適な条件（例えば、37℃にて１０分間）下でインキュベートする。次に、いくらか結合した供試化合物とともに、真空濾過によってフィルター上に膜を集め、結合していない供試化合物を除去するために洗浄する。その後、フィルターを液体シンチレーションスペクトル光学測定に供することによって、結合した供試化合物に会合している放射性活性を定量する。供試化合物結合の特異性は、標識付けしていない供試化合物をアッセイ系に増加量存在させて実験を繰り返し、受容体への結合についての競合のレベルを知見することによって確認しうる。これらの結合アッセイによって、ケモカイン受容体結合のモジュレーターも同定することができる。先に述べた結合アッセイに、以下の改変を加えて実施してもよい。検出可能に標識付けされた供試化合物に加えて、モジュレーターの可能性がある物質を膜調製物に曝す。膜に会合した標識の量の増加によってモジュレーターの可能性を有する物質は活性化物質であることが示唆され、膜に会合した標識の量の減少によってモジュレーターの可能性を有する物質は阻害物質であることが示唆される。
【０１１１】
別の実施態様において、本発明は、Ｇタンパク質へのケモカイン受容体のカップリングを利用する受容体リガンドを同定するための間接アッセイを企図する。Linderら、Sci.Am.、267巻56〜65頁(1992)に概説されるように、シグナルトランスダクションに際して、活性化された受容体はＧタンパク質と相互作用し、次に、Ｇタンパク質を活性化する。Ｇタンパク質は、ＧＤＰをＧＴＰに交換することによって活性化される。次いで起こるＧタンパク質が結合したＧＴＰの加水分解によってＧタンパク質は不活性化される。従って、Ｇタンパク質のための１つのアッセイでは、［γ-32Ｐ］−ＧＴＰからの32Ｐの遊離がモニターされる。例えば、本発明にかかるプラスミドを収容しているおよそ5x 107のＨＥＫ−293細胞が、ＭＥＭ＋10％ ＦＣＳ中で生育される。生育培地には、均一にヌクレオチドプールを標識付けするために、２時間にわたって5mCi/mlの［32Ｐ］−リン酸ナトリウムが追加される。続いて細胞を、リン酸塩の低い等張性緩衝液で洗浄する。洗浄後の細胞の一アリコートは、次いで供試化合物に曝され、他方細胞の第二のアリコートは、供試化合物に曝されないことを除いて同様に処理される。インキュベーション時間（例えば、１０分間）を経過した後、細胞をペレット化し、溶解して1M ＬｉＣｌでの展開による薄層クロマトグラフィーを使用して、ヌクレオチド化合物を分画する。標識付けしたＧＴＰ及びＧＤＰを、既知の標準物質と共に展開することによって同定する。標識付けされたＧＴＰ及びＧＤＰは、次いで当該技術分野における標準技術であるオートラジオグラフィー技術によって定量する。32Ｐで標識付けされたＧＤＰが比較的高レベルであれば、供試化合物がリガンドとして同定される。このタイプのＧＴＰ加水分解アッセイは、ケモカイン受容体結合のモジュレーターの同定のためにも有用である。前記のアッセイは、モジュレーターの可能性がある物質の存在下に実施される。32Ｐで標識付けされたＧＤＰを生産する、ＧＴＰ加水分解が相対的に増加することによって惹起こされるシグナルの増強によって、受容体活性の相対的な増加が示唆される。従って、シグナルが増強することによって、モジュレーターの可能性を有する物質が活性化物質として同定される。逆に、受容体活性の減少の指標たる、32Ｐで標識付けされたＧＤＰに対するシグナルが相対的に低減することによって、ケモカイン受容体結合の阻害物質として、モジュレーターの可能性を有する物質が同定される。
【０１１２】
Ｇタンパク質エフェクター分子（例えば、アデニル酸シクラーゼ、ホスフォリパーゼＣ、イオンチャンネル、及びホスフォジエステラーゼ）の活性もまた、アッセイに適用できる。これらエフェクター分子の活性のためのアッセイは、以前に述べられている。例えば、環状アデノシンモノホスフェート（cＡＭＰ）の合成を触媒するアデニル酸シクラーゼは、Ｇタンパク質によって活性化される。従って、Ｇタンパク質を活性化するケモカイン受容体へのリガンド結合が、次にアデニル酸シクラーゼを活性化し、よって、本発明の組換え宿主細胞におけるcＡＭＰレベルをモニターすることによって当該リガンド結合を検出することができる。当該技術分野において理解される適切な対照実験を実行して、細胞内cＡＭＰレベルの上昇を、リガンドで誘導された受容体活性の増大に帰することができ、それによってリガンドが同定される。また、当該技術分野において理解される対照を使用して、cＡＭＰの濃度が相対的に低下することで、受容体活性の阻害物質が間接的に同定されよう。cＡＭＰの濃度は、市販の酵素免疫アッセイによって測定することができる。例えば、BioTrakキットは、競合的免疫アッセイ用の試薬を提供するものである。（Amersham,Inc.、Arlington Heights、イリノイ）。製造業者の推奨事項に従ってこのキットを使用して、標識付けしていないcＡＭＰと、西洋ワサビペルオキシダーゼを接合したcＡＭＰとの競合を含むように、反応を設計する。標識付けしていないcＡＭＰは、例えば、本発明のケモカイン受容体発現している活性化細胞から得てもよい。２つの化合物を、固定化された抗cＡＭＰ抗体への結合について競合させる。競合反応の後に、固定化された西洋ワサビペルオキシダーゼ−cＡＭＰ接合体をテトラメチルベンジディン/Ｈ2Ｏ2単一ポット基質を使用した酵素アッセイによって、450nmに生じる呈色反応産物の検出を用いて定量する。この結果によって、当該技術分野における標準的な技術を使用して、標識付けされていないcＡＭＰのレベル算出の基礎が提供されるのである。ケモカイン受容体へのリガンド結合を同定することに加えて、cＡＭＰアッセイは、ケモカイン受容体結合のモジュレーターを同定するためにも使用することができる。本発明の組換え宿主細胞を使用し、ケモカイン受容体結合のモジュレーターの可能性を有する物質を添加して前記の通りにアッセイを実施する。当該技術分野において理解される対照を使用することによって、細胞内cＡＭＰレベルの相対的な増加または減少が、アデニル酸シクラーゼ活性の活性化または阻害を反映する。代わってアデニル酸シクラーゼ活性のレベルは、興味の対象であるケモカイン受容体の相対的な活性を反映する。相対的にケモカイン受容体活性のレベルが上昇していれば活性化物質が同定され、相対的に受容体活性のレベルが低下していればケモカイン受容体活性の阻害物質が同定される。
【０１１３】
本発明を、特定の実施態様に関して記載しているが、当業者にあっては変更及び修飾が想起されるであろうことは理解される。従って、本発明は請求の範囲によってしか限定を受けるべきではない。
【０１１４】
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