(57)【要約】      （修正有）【課題】マスト細胞の脱顆粒を有意に抑制するセラミドキナーゼ阻害作用を有する新規化合物、およびその医薬用途を提供する。【解決手段】下記一般式（Ａ）で示される４環性化合物またはその塩：2009051743.tif 000038（式中、Ｒ１は水酸基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基またはアミノ酸基；Ｒ３は炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ９は水素原子；並びに、Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ８およびＲ１０〜Ｒ１１は、同一または異なってよい。）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ａ）で示される４環性化合物またはその塩：
【化１】
2009051743.tif 000031
（式中、Ｒ１は水酸基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基またはアミノ酸基；Ｒ３は炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ９は水素原子；並びに、Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ８およびＲ１０〜Ｒ１１は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基を意味する。但し、Ｒ２が炭素数１〜４の低級アルキル基である場合、Ｒ１は水酸基ではない。）。
【請求項２】
一般式（Ａ）中、Ｒ１が水酸基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基またはアミノ酸基；Ｒ２が水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ３、Ｒ７およびＲ８が、同一または異なって、炭素数１〜４の低級アルキル基；並びにＲ４〜Ｒ６およびＲ９〜Ｒ１１が水素原子である、請求項１に記載する４環性化合物またはその塩（但し、Ｒ２が炭素数１〜４の低級アルキル基である場合、Ｒ１は水酸基ではない。）。
【請求項３】
一般式（Ａ）中、エーテル環が６若しくは７員環である、請求項１または２に記載する４環性化合物またはその塩。
【請求項４】
上記４環性化合物（Ａ）が、下式で示される鏡像異性体の混合物である、請求項３に記載する４環性化合物またはその塩：
【化２】
2009051743.tif 000032
【請求項５】
上記４環性化合物（Ａ）が、下式で示される鏡像異性体の混合物である、請求項３に記載する４環性化合物またはその塩：
【化３】
2009051743.tif 000033
【請求項６】
請求項１に記載する４環性化合物（但し、一般式（Ａ）中、Ｒ１は炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ２およびＲ３は炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ９は水素原子；並びに、Ｒ４〜Ｒ８およびＲ１０〜Ｒ１１は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基であり、エーテル環は６員環である。）の製造方法であって、
下式に示す
工程Ａ：アルデヒド基を有する化合物Ｆを、保護基で保護された水酸基を有する化合物Ｇと反応させて、アルコール性水酸基を有する化合物Ｈを生成する工程、
工程Ｂ：化合物Ｈのアルコール性水酸基を除去して、化合物Ｉを生成する工程、
工程Ｃ：化合物Ｉの水酸基の保護基（Ｘ１〜Ｘ４）を除去した後、酸化により化合物Ｊを生成する工程、および
工程Ｄ：化合物Ｊの水酸基をアルコキシ化して、化合物Ａ−１(1)を生成する工程、
を有する方法。
【化４】
2009051743.tif 000034
（式中、Ｒ２〜Ｒ１１は、前記と同じ。Ｒ１２は炭素数１〜４の低級アルキル基であり、Ｘ１〜Ｘ４は同一または異なって水酸基の保護基である。Ｘ１とＸ２およびＸ３とＸ４は、一緒になって環を形成してもよい。）
【請求項７】
請求項６で得られた化合物Ａ−１(1)のアルコキシ基をアミノ酸基に置換する工程を有する、化合物Ａ−１(2)を製造する方法：
【化５】
2009051743.tif 000035
（式中、Ｒ13はアミノ酸基を意味する。Ｒ２〜Ｒ８およびＲ１０〜Ｒ１１は、上記と同じ。）
【請求項８】
請求項１に記載する４環性化合物（但し、一般式（Ａ）中、Ｒ１は水酸基；Ｒ３は炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ２およびＲ９は水素原子；並びに、Ｒ４〜Ｒ８およびＲ１０〜Ｒ１１は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基であり、エーテル環は７員環である。）の製造方法であって、
下式に示す
工程Ｆ：化合物Ｈからヒドロキシメチル基を有する化合物Ｋを生成する工程、
工程Ｇ：化合物Ｋのヒドロキシメチル基を保護して化合物Ｌを生成する工程、
工程Ｈ：化合物Ｌの水酸基の保護基（Ｘ１〜Ｘ４）を除去した後、酸化により化合物Ｍを生成する工程、および
工程Ｉ：化合物Ｍを環化して、化合物Ａ−２(1)を生成する工程、
を有する方法：
【化６】
2009051743.tif 000036
（式中、Ｒ３〜Ｒ１１は、前記と同じ。Ｘ１〜Ｘ４は同一または異なって水酸基の保護基であり、Ｘ１とＸ２およびＸ３とＸ４は一緒になって環を形成してもよい。）
【請求項９】
請求項８で得られた化合物Ａ−２(1)の水酸基をアルキル化する工程を有する、化合物Ａ−２(2)を製造する方法：
【化７】
2009051743.tif 000037
（式中、Ｒ12は炭素数１〜４の低級アルキル基を意味する。Ｒ３〜Ｒ８およびＲ１０〜Ｒ１１は、上記と同じ。）
【請求項１０】
請求項１乃至５のいずれかに記載する４環性化合物、その薬学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分とする医薬組成物。
【請求項１１】
マスト細胞の脱顆粒が関与する疾患または病態を処置するための医薬組成物である、請求項１０に記載する医薬組成物。
【請求項１２】
アレルギーまたは炎症を処置するための医薬組成物である、請求項１１に記載する医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１乃至５のいずれかに記載する４環性化合物またはその塩を有効成分とするセラミドキナーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セラミドキナーゼに対して阻害活性を有する新規化合物およびその製造方法、ならびにそのセラミドキナーゼ阻害剤および医薬組成物としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
マスト細胞（肥満細胞）や好酸球の細胞内に蓄えられている顆粒が放出されることは「脱顆粒」と呼ばれ、この顆粒内にはアレルギー症状を発症させる分子が多く含まれていることが知られている。
【０００３】
脱顆粒を引き起こす原因としては、過剰な免疫反応に起因して生じるＩ型アレルギー（例えば、花粉症、アトピー、気管支喘息など）が挙げられる。生体内に侵入した抗原（花粉、食品のタンパク質成分など）が異物として認識されると、その抗原に特異的に反応する抗体が体内で生産され、この抗体が皮膚や粘膜に存在するマスト細胞や好塩基球の細胞膜上にある受容体と結合する。そして再び同じ抗原が侵入した際に、抗原と抗体が結合することによって抗体の架橋が生じ、体内から抗原を除去するための免疫反応として、ヒスタミンなどの化学物質が放出され、皮膚炎や鼻炎などのアレルギー症状が引き起こされる。
【０００４】
このようなアレルギー反応は脱顆粒現象を抑制することによって緩和される。このため、脱顆粒抑制作用を有する物質を用いた抗アレルギー薬の開発が期待される。
【０００５】
マスト細胞は、細胞内顆粒中に保存されている生物活性分子を放出することにより炎症やアレルギーなどの過敏症を媒介する。マスト細胞レセプターＦｃεＲＩに結合したＩｇＥの架橋を介する刺激によって、細胞内Ｃａ２＋上昇、ならびに非レセプタータンパク質チロシンキナーゼおよびホスホリパーゼの活性化などの細胞内での生化学的事象を引き起こす。これらの事象は顆粒内容物のエキソサイトーシスを増加させる。
【０００６】
マスト細胞の脱顆粒について種々の研究がなされているが、その多くはレセプター活性化に引き続く初期シグナリングについてであり、Ｃａ２＋シグナリングの下流である後期シグナリングに関しては十分に研究されているとはいえない。
【０００７】
マスト細胞の脱顆粒の後期シグナリングは、Ｃａ２＋シグナリングの下流に存在するが、Ｃａ２＋依存性の酵素（例えば、ホスホリパーゼＤ、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼIIなど）についての阻害剤またはアンタゴニストを用いても、マスト細胞の脱顆粒は完全には阻害されない。このことは、Ｃａ２＋依存的な脱顆粒において未知のメカニズムが存在することを示唆する。
【０００８】
セラミドキナーゼは、カルシウムによって活性化され、セラミドをリン酸化してＣ１Ｐを生成する酵素である。かかるセラミドキナーゼおよびその産生物であるＣ１Ｐの機能は永年不明であったが（非特許文献１）、本発明者らは、マスト細胞のモデル細胞としてＲＢＬ−２Ｈ３細胞を用いて、カルシウムイオノフォアによって誘起される脱顆粒に、セラミドキナーゼ活性、特にその活性化に伴うセラミド１リン酸（Ｃ１Ｐ）量の増加が関与していることを示した（非特許文献２）。このことは、セラミドキナーゼ活性を阻害することによってマスト細胞の脱顆粒を抑制することができること、すなわちセラミドキナーゼ活性を阻害することによって、炎症やアレルギーなどのマスト細胞の脱顆粒に起因する疾患や病態が改善できることを意味する。
【０００９】
セラミドキナーゼ活性を阻害する作用を有する化合物としては、Ｃ２−セラミドが知られている。しかしＣ２−セラミドは、強い細胞毒性を有しているため、哺乳動物に適用することは難しいと考えられる。またセラミドキナーゼ活性を阻害する作用を有する化合物として、非特許文献１には、N,N-dimethylsphingosineおよびF-12509Aが記載されている。しかしその阻害活性は極めて低く、これをセラミドキナーゼ阻害剤や医薬組成物として実用化することは難しい。また特許文献１および非特許文献３には、上記F-12509Aよりも高いセラミドキナーゼ阻害活性を有するF-12509A類縁体が記載されている。しかしながら、これらのセラミドキナーゼ阻害活性を利用して、炎症やアレルギーなどの疾患を改善する医薬組成物を開発するためには、まだまだ改善が必要である。
【非特許文献１】Sugiuraら、J.Biol.Chem., 277:23294-23300 (2002)
【非特許文献２】Mitsutakeら、J.Biol.Chem., 279:17570-17577 (2004)
【非特許文献３】Jin-Wook Kimら、Biochemica et Biophysica Acta 1738 (2005) 82-90
【特許文献１】特開2006-298849号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、生理的な条件下で高いセラミドキナーゼ阻害活性を示し、セラミドキナーゼ阻害剤として有用な新規化合物およびその製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該新規化合物を有効成分とするセラミドキナーゼ阻害剤、ならびにセラミドキナーゼ阻害活性を利用したマスト細胞の脱顆粒の抑制方法、言い換えれば、炎症やアレルギーなどのマスト細胞の脱顆粒に起因する疾患や病態の改善に好適に使用される医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねていたところ、下記の一般式（Ａ）で示される４環性化合物が、生理的な条件で優れたセラミドキナーゼ阻害活性を有していることを見出し、かかる化合物がそのセラミドキナーゼ阻害活性に基づいて、炎症やアレルギーなどのマスト細胞の脱顆粒に起因する疾患や病態の改善に有効であることを確信して本発明を完成するにいたった。
【００１２】
すなわち、本発明は下記の構成を有するものである。
（Ｉ）新規４環性化合物
（I-1）下記一般式（Ａ）で示される４環性化合物またはその塩：
【００１３】
【化１】
2009051743.tif 000002
【００１４】
（式中、Ｒ１は水酸基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基またはアミノ酸基；Ｒ３は炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ９は水素原子；並びに、Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ８およびＲ１０〜Ｒ１１は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基を意味する。但し、Ｒ２が炭素数１〜４の低級アルキル基である場合、Ｒ１は水酸基ではない。）
（I-2）一般式（Ａ）中、Ｒ１が水酸基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基またはアミノ酸基；Ｒ２が水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ３、Ｒ７およびＲ８が、同一または異なって、炭素数１〜４の低級アルキル基；並びにＲ４〜Ｒ６およびＲ９〜Ｒ１１が水素原子である、（I-1）に記載する４環性化合物またはその塩（但し、Ｒ２が炭素数１〜４の低級アルキル基である場合、Ｒ１は水酸基ではない。）。
【００１５】
（I-3）一般式（Ａ）中、エーテル環が６または７員環である、（I-1）または（I-2）のいずれかに記載する４環性化合物またはその塩。
【００１６】
（I-4）上記４環性化合物（Ａ）が、下式で示される鏡像異性体の混合物である、（I-3）に記載する４環性化合物またはその塩：
【００１７】
【化２】
2009051743.tif 000003
【００１８】
（I-5）上記４環性化合物（Ａ）が、下式で示される鏡像異性体の混合物である、  （I-3）に記載する４環性化合物またはその塩：
【００１９】
【化３】
2009051743.tif 000004
【００２０】
（I-6）一般式（Ａ）中、Ｒ１が炭素数１〜４の低級アルコキシ基またはアミノ酸基；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ７およびＲ８が、同一または異なって、炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ４〜Ｒ６およびＲ９〜Ｒ１１が水素原子；ならびにエーテル環が６員環である、（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する４環性化合物またはその塩。
【００２１】
（I-7）一般式（Ａ）中、Ｒ１が水酸基；Ｒ３、Ｒ７およびＲ８が、同一または異なって、炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ６およびＲ９〜Ｒ１１が水素原子；ならびにエーテル環が７員環である、（I-1）〜（I-3）または(I-5）のいずれかに記載する４環性化合物またはその塩。
【００２２】
（II）新規４環性化合物の製造方法
（II-1）（I-1）に記載する４環性化合物（但し、一般式（Ａ）中、Ｒ１は炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ２およびＲ３は炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ９は水素原子；並びに、Ｒ４〜Ｒ８およびＲ１０〜Ｒ１１は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基であり、エーテル環は６員環である。）の製造方法であって、
工程Ａ：アルデヒド基を有する化合物Ｆを、保護基で保護された水酸基を有する化合物Ｇと反応させて、アルコール性水酸基を有する化合物Ｈを生成する工程、
工程Ｂ：化合物Ｈのアルコール性水酸基を除去して、化合物Ｉを生成する工程、
工程Ｃ：化合物Ｉの水酸基の保護基（Ｘ１〜Ｘ４）を除去した後、酸化により化合物Ｊを生成する工程、および
工程Ｄ：化合物Ｊの水酸基をアルコキシ化して、化合物Ａ−１(1)を生成する工程、
を有する方法：
【００２３】
【化４】
2009051743.tif 000005
【００２４】
（式中、Ｒ２〜Ｒ１１は、前記と同じ。Ｒ１２は炭素数１〜４の低級アルキル基であり、Ｘ１〜Ｘ４は同一または異なって水酸基の保護基である。Ｘ１とＸ２およびＸ３とＸ４は、一緒になって環を形成してもよい。）。
【００２５】
（II-2）（II-1）で得られた化合物Ａ−１(1)のアルコキシ基をアミノ酸基に置換する工程を有する、化合物Ａ−１(2)を製造する方法：
【００２６】
【化５】
2009051743.tif 000006
【００２７】
（式中、Ｒ13はアミノ酸基を意味する。Ｒ２〜Ｒ８およびＲ１０〜Ｒ１１は、上記と同じ。）
（II-3）（I-1）に記載する４環性化合物（但し、一般式（Ａ）中、Ｒ１は水酸基；Ｒ３は炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ２およびＲ９は水素原子；並びに、Ｒ４〜Ｒ８およびＲ１０〜Ｒ１１は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基であり、エーテル環は７員環である。）の製造方法であって、
下式に示す
工程Ｆ：メチレン基を有する化合物Ｆからヒドロキシメチル基を有する化合物Ｋを生成する工程、
工程Ｇ：化合物Ｋのヒドロキシ基を保護して、化合物Ｌを生成する工程、
工程Ｈ：化合物Ｌの水酸基の保護基（Ｘ１〜Ｘ４）を除去した後、酸化により化合物Ｍを生成する工程、および
工程Ｉ：化合物Ｍを環化して、化合物Ａ−２(1)を生成する工程、
を有する方法：
【００２８】
【化６】
2009051743.tif 000007
【００２９】
（式中、Ｒ３〜Ｒ１１は、前記と同じ。Ｘ１〜Ｘ４は同一または異なって水酸基の保護基であり、Ｘ１とＸ２およびＸ３とＸ４は一緒になって環を形成してもよい。）  
（III）新規４環性化合物の用途
（III-2）（I-1）乃至（I-7）のいずれかに記載する４環性化合物、その薬学的に許容される塩またはその溶媒和物を有効成分とする医薬組成物。
（III-3）マスト細胞の脱顆粒が関与する疾患または病態を処置するための医薬組成物である、（III-2）に記載する医薬組成物。
（III-4）マスト細胞の脱顆粒が関与する疾患または病態がアレルギーまたは炎症である、（III-3）に記載する医薬組成物。
（III-1）（I-1）乃至（I-7）のいずれかに記載する４環性化合物またはその塩を有効成分とするセラミドキナーゼ阻害剤。
【発明の効果】
【００３０】
本発明が提供する４環性化合物（Ａ）は、優れたセラミドキナーゼ阻害活性を有する文献未収載の新規化合物である。前述するように、セラミドキナーゼ活性はマスト細胞の脱顆粒と関連し、セラミドキナーゼ活性が阻害されるとマスト細胞の脱顆粒が抑制されることが知られている（非特許文献２参照）。このことから、本発明の４環性化合物（Ａ）は、そのセラミドキナーゼ阻害作用に基づいて、セラミドキナーゼ阻害剤としてだけでなく、マスト細胞の脱顆粒に起因して生じる炎症やアレルギーなどの疾患や病態を処置する医薬組成物として有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（１）４環性化合物（Ａ）
本発明が提供する化合物は、下記一般式（Ａ）で示されるエーテル環を有する４環性化合物（Ａ）である。
【００３２】
【化７】
2009051743.tif 000008
【００３３】
（式中、Ｒ１は水酸基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基またはアミノ酸基；Ｒ３は炭素数１〜４の低級アルキル基；Ｒ９は水素原子；並びに、Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ８およびＲ１０〜Ｒ１１は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基を意味する。また、●を付した炭素原子は不斉炭素を意味する。）。
【００３４】
一般式（Ａ）中、Ｒ２〜Ｒ８およびＲ１０〜Ｒ１１で示される低級アルキル基は、炭素原子を１乃至４個有する直鎖状または分岐鎖状のアルキル基であり、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基を挙げることができる。好ましくは炭素原子を１または２個有するメチル基およびエチル基であり、なかでも好ましくはメチル基である。
【００３５】
一般式（Ａ）中、Ｒ１で示される炭素数１〜４の低級アルコキシ基は、水酸基の水素原子が上記の炭素数１〜４の低級アルキル基で置換された基であり、例えばメトキシ基、エトキシ基、１−プロポキシ基、２−プロポキシ基、１−ブトキシ基、２−ブトキシ基、２−メチル−１−プロポキシ基、２−メチル−２−プロポキシ基等を挙げることができる。好ましくは炭素原子を１または２個有するメトキシ基およびエトキシ基であり、なかでも好ましくはメトキシ基である。
【００３６】
一般式（Ａ）中、Ｒ１で示されるアミノ酸基は、アミノ酸を構成する第一級アミンの窒素から水素を一つ除去した官能基を意味する。アミノ酸基として使用されるアミノ酸としては、具体的には、グリシンやアラニンなどを挙げることができる。好ましくはグリシンである。
【００３７】
一般式（Ａ）中、エーテル環は、好ましくは６員環または７員環である。
【００３８】
なお、本発明が対象とする４環性化合物（Ａ）には、黒丸●を付した炭素原子をキラル中心とする鏡像異性体が含まれる。すなわち、本発明が対象とする化合物（Ａ）は、当該炭素原子をキラル中心とする鏡像異性体のいずれであってもよく、またこれらを任意の割合で含有する混合物、例えばラセミ体であってもよい。
【００３９】
本発明の４環性化合物（Ａ）は、好ましくは下式で示される化合物である。
【００４０】
【化８】
2009051743.tif 000009
【００４１】
（式中、Ｒ１とＲ２及び●は前記と同じ。Ｒ’3、Ｒ’７およびＲ’８は、炭素数１〜４の低級アルキル基を示す。）
当該化合物（Ａ’）は、上記一般式（Ａ）において、Ｒ３、Ｒ７およびＲ８が、同一または異なって炭素数１〜４の低級アルキル基であり、Ｒ４〜Ｒ６およびＲ９〜Ｒ１１が水素原子である４環性化合物に相当する。ここでＲ’３、Ｒ’７およびＲ’８で示される低級アルキル基は、好ましくは炭素数１または２のメチル基およびエチル基であり、より好ましくはメチル基である。また、式（Ａ’）中、エーテル環は好ましくは６員環または７員環である。
【００４２】
かかる化合物（Ａ’）には、具体的には下記の化合物Ａ-１が含まれる。
化合物Ａ-１
【００４３】
【化９】
2009051743.tif 000010
【００４４】
（式中、Ｒ’１は炭素数１〜４の低級アルコキシ基またはアミノ酸基；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ７およびＲ８は、同一または異なって、炭素数１〜４の低級アルキル基を示す。●は不斉炭素を意味する。）
かかる化合物Ａ-１には、黒丸●を付した炭素原子をキラル中心とする鏡像異性体が含まれる。すなわち、本発明が対象とする化合物Ａ−１は、当該炭素原子をキラル中心とする鏡像異性体のいずれであってもよく、またこれらを任意の割合で含有する混合物、例えばラセミ体であってもよい。好ましくは、下式で示される鏡像異性体、またはその混合物、ラセミ体である。
【００４５】
【化１０】
2009051743.tif 000011
【００４６】
（式中、Ｒ’１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ７およびＲ８は、前記と同じ。）
かかる化合物Ａ-１には、具体的には、下式で示される化合物Ａ−１(1)および化合物Ａ−１(2)が含まれる。これらの化合物にも、上記と同様に、●印を付した炭素原子をキラル中心とする鏡像異性体が含まれる。好ましくは上記式で示される鏡像異性体、またはその混合物であるラセミ体である。
【００４７】
化合物Ａ−１(1)
【００４８】
【化１１】
2009051743.tif 000012
【００４９】
化合物Ａ−１(2)
【００５０】
【化１２】
2009051743.tif 000013
【００５１】
また化合物（Ａ’）には、下記の化合物Ａ-２も含まれる。
【００５２】
化合物Ａ-２
【００５３】
【化１３】
2009051743.tif 000014
【００５４】
（式中、Ｒ１は水酸基、炭素数１〜４の低級アルコキシ基またはアミノ酸基；Ｒ３、Ｒ７およびＲ８は、同一または異なって、炭素数１〜４の低級アルキル基を示す。●は不斉炭素を意味する。）
かかる化合物Ａ-２にも、黒丸●を付した炭素原子をキラル中心とする鏡像異性体が含まれる。すなわち、本発明が対象とする化合物Ａ−２は、当該炭素原子をキラル中心とする鏡像異性体のいずれであってもよく、またこれらを任意の割合で含有する混合物、例えばラセミ体であってもよい。好ましくは、下式で示される鏡像異性体、またはその混合物、ラセミ体である。
【００５５】
【化１４】
2009051743.tif 000015
【００５６】
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ７およびＲ８は、前記と同じ。）
かかる化合物Ａ-２には、具体的には、下式で示される化合物Ａ−２(1)が含まれる。この化合物にも、上記と同様に、●印を付した炭素原子をキラル中心とする鏡像異性体が含まれる。好ましくは上記式で示される鏡像異性体、またはその混合物であるラセミ体である。
【００５７】
化合物Ａ−２（１）
【００５８】
【化１５】
2009051743.tif 000016
【００５９】
本発明の４環性化合物（Ａ）は、例えば上記化合物Ａ−２（１）のように、塩基性基を有する場合には、定法に従って酸付加塩にすることができる。好ましくは薬理学的に許容される酸付加塩である。このような塩としては、例えばフッ化水素酸、塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸のようなハロゲン化水素酸の塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩のような無機酸塩；メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、エタンスルホン酸のような低級アルカンスルホン酸の塩；ベンゼンスルホン酸、Ｐ−トルエンスルホン酸のようなアリールスルホン酸の塩；グルタミン酸、アスパラギン酸のようなアミノ酸の塩；酢酸、フマール酸、酒石酸、蓚酸、マレイン酸、リンゴ酸、琥珀酸、安息香酸、マンデル酸、アスコルビン酸、乳酸、グルコン酸、クエン酸のようなカルボン酸の塩を挙げることができる。
【００６０】
また本発明の４環性化合物（Ａ）は、例えば上記化合物Ａ−１(2)のように、カルボキシル基を有する場合には、定法に従って金属塩にすることができる。好ましくは薬理学的に許容される金属塩である。このような塩としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウムのようなアルカリ金属塩；カルシウム、バリウム、マグネシウムのようなアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩などを挙げることができる。
【００６１】
さらに本発明の４環性化合物（Ａ）は、定法に従って薬理学的に許容されるエステルにすることもできる。かかるエステルとしては、薬学的に使用されるものであれば特に制限されない。
【００６２】
（２）４環性化合物（Ａ）の製造方法
本発明の４環性化合物（Ａ）のうち、前述する化合物Ａ−１(1)は、下式に記載するスキーム（工程Ａ〜Ｄ）を経て製造することができる。
【００６３】
【化１６】
2009051743.tif 000017
【００６４】
（式中、Ｒ２およびＲ３は炭素数１〜４の低級アルキル基、Ｒ４〜Ｒ８、Ｒ１０〜Ｒ１１は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基、Ｒ１１は炭素数１〜４の低級アルキル基である。Ｘ１〜Ｘ４は同一または異なって水酸基の保護基であり、Ｘ１とＸ２およびＸ３とＸ４は一緒になって環を形成してもよい。）
＜工程A＞
ここで工程Ａは、アルデヒド基を有する化合物Ｆを、保護基で保護された水酸基を有する化合物Ｇと反応させてアルコール性水酸基を有する化合物Ｈを生成する工程である。
【００６５】
ここで化合物Ｇの水酸基の保護基としては、アセタール、メチルエーテル、メトキシメチルエーテル、メトキシエトキシメチルエーテル、各種のシリルエーテルなどのエーテル性保護基を挙げることができる。好ましくは、アセタールである。かかる化合物G（アセトナイド体）は、下式に示すように、1,2,4,5-テトラヒドロキシベンゼンを、酸の存在下、アセタール化剤で処理することによって調製することができる。
【００６６】
【化１７】
2009051743.tif 000018
【００６７】
アセタール化剤としては、ホルムアルデヒド、ベンゾフェノン、シクロヘキサノン、アセトン、2,2-ジメトキシプロパン、2-メトキシプロペンなどを挙げることができる。好ましくは2,2-ジメトキシプロパンである。アセタール化に使用される酸としては、制限されないが、p-トルエンスルホン酸、ピリジウムパラトルエンスルホンネート、カンファースルホン酸等の有機酸；塩酸、硫酸、燐酸などの鉱酸；三フッ化ホウ素などのルイス酸を挙げることができる。またこのときに使用される溶媒としては、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの非プロパン性極性溶媒；テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン、1,2-ジメトキシエタン、ジエチルエーテル、ジグライム、トリグライム、ジエチレングリコールモノメチルエーテルなどのエーテル系溶媒；ならびにこれらの混合溶媒を挙げることができる。
【００６８】
化合物Ｆと化合物Gとの反応は、化合物Gをアニオン化させて行うことができる。化合物Gのアニオン化には、通常、水素化ナトリウム、水素化カリウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水素化物；ｎ−ブチルリチウム、sec−ブチルリチウム、ｔ−ブチルリチウムなどのアルキルリチウム；リチウムジイソプロピルアミド、リチウム2,2,6,6−テトラメチルピペリジドなどのリチウムアミド、ナトリウムヘキサメチルジシラジド、カリウムヘキサメチルジシラジド、リチウムヘキサメチルジシラジドなどのアルカリ金属ジシラジドなどのアニオン化剤が使用される。好ましくはｎ−ブチルリチウムが用いられる。反応溶媒としては、アセタール化と同様に、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの非プロパン性極性溶媒；テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン、1,2-ジメトキシエタン、ジエチルエーテル、ジグライム、トリグライム、ジエチレングリコールモノメチルエーテルなどのエーテル系溶媒；ならびにこれらの混合溶媒を用いることができる。すなわち、当該反応は、実施例の反応条件に限られるものでない。
【００６９】
＜工程Ｂ＞
工程Ｂは、上記工程Ａで得られた化合物Ｈからアルコール性水酸基を除去する工程である。当該工程は、基本的に、(i)まずアルコール性水酸基をキサンテート基に誘導し、(ii)次いでこのキサンテート基を除去する、下記の２ステップにより実施できる。
【００７０】
【化１８】
2009051743.tif 000019
【００７１】
（式中、各符号は前述の通り）
アルコール性水酸基をキサンテート基に誘導する方法としては、実施例１（1-8）の工程7-1に記載する方法を好適に挙げることができるが、当該方法やその反応条件に限られるものでない。
【００７２】
またキサンテート基を除去する方法としては、実施例１（1-8）の工程7-2に記載する方法を好適に挙げることができるが、当該方法やその反応条件に限られるものでない。
【００７３】
＜工程C＞
工程Cは、上記工程Bで得られた化合物Ｉの水酸基の保護基を除去し、エーテル環を形成する工程である。当該工程は、好適には実施例１（1-9）の工程８に記載する方法に従って実施することができる。但し、当該方法ならびに反応条件に限定されるものではない。
【００７４】
＜工程Ｄ＞
工程Ｄは、上記工程Ｃで得られた化合物Ｊの水酸基を低級アルキル化して、本発明の化合物Ａ−１(1)を生成する工程である。当該工程は、好適には実施例１（２）の工程９に記載する方法に従って実施することができる。但し、当該方法ならびに反応条件に限定されるものではない。
【００７５】
上記の反応終了後、必要に応じて、得られた反応液を減圧濃縮し、次いでシリカゲル等を利用したクロマトグラフィー、蒸留、再結晶等の任意の精製操作に供してもよい。斯くして本発明の化合物Ａ−１(1)を得ることができる。
【００７６】
＜工程Ｅ＞
また本発明の４環性化合物（Ａ）のうち、化合物Ａ−１(2)は、上記で得られた化合物Ａ−１(1)のアルコキシ基を、アミノ酸基に置換することによって製造することができる。当該工程は、好適には実施例２の工程１０に記載する方法に従って実施することができる。但し、当該方法ならびに反応条件に限定されるものではない。
【００７７】
またここでも反応終了後、必要に応じて、得られた反応液を減圧濃縮し、次いでシリカゲル等を利用したクロマトグラフィー、蒸留、再結晶等の任意の精製操作に供してもよい。斯くして本発明の化合物Ａ−１(2)を得ることができる。
【００７８】
なお、上記化合物Ａ−１(1)および化合物Ａ−１(2)の製造に際して、原料として使用される化合物Ｆは、例えば下式で示すように、二環性β−ケトエステルをWittig反応に供し、得られた化合物のエステル基を還元して水酸基とし、生成した水酸基を酸化してアルデヒドとすることによって調製することができる。
【００７９】
【化１９】
2009051743.tif 000020
【００８０】
具体的な調製方法については、実施例１（1-1）の工程１および(1-2)の工程２に記載する方法を挙げることができる。但し、これに制限されない。
【００８１】
さらに本発明の４環性化合物（Ａ）のうち、化合物Ａ−２(1)は、下式に記載するスキーム（工程Ｆ〜Ｉ）に従って製造することができる。
【００８２】
【化２０】
2009051743.tif 000021
【００８３】
（式中、Ｒ３〜Ｒ１１およびＸ１〜Ｘ４は、前記と同じ。Ｘ１とＸ２およびＸ３とＸ４は一緒になって環を形成してもよい。）
＜工程Ｆ＞
工程Ｆは、化合物Hのメチレン基をヒドロキシメチル基とし、化合物Kを生成する工程である。当該工程は、好適には実施例３（１）の工程１１に記載する方法に従って実施することができる。但し、当該方法ならびに反応条件に限定されるものではない。
【００８４】
＜工程Ｇ＞
工程Ｇは、上記工程Fで得られた化合物Kのヒドロキシメチル基を保護して、化合物Lを生成する工程である。当該工程は、好適には実施例３（２）の工程１２に記載する方法に従って実施することができる。但し、当該方法ならびに反応条件に限定されるものではない。
【００８５】
＜工程H＞
工程Hは、上記工程Ｇで得られた化合物Lの水酸基の保護基を除去し、次いで酸化して化合物Mを生成する工程である。当該工程は、好適には実施例３（３）の工程１３に記載する方法に従って実施することができる。但し、当該方法ならびに反応条件に限定されるものではない。
【００８６】
＜工程I＞
工程Iは、上記工程Ｈで得られた化合物Ｍを環化して化合物Ａ−２(1)を生成する工程である。当該工程は、好適には実施例３（４）の工程１４に記載する方法に従って実施することができる。但し、当該方法ならびに反応条件に限定されるものではない。
【００８７】
反応終了後、必要に応じて、得られた反応液を減圧濃縮し、次いでシリカゲル等を利用したクロマトグラフィー、蒸留、再結晶等の任意の精製操作に供してもよい。斯くして本発明の化合物Ａ−２(1)を得ることができる。
【００８８】
またここで得られた化合物Ａ−２(1)の水酸基をアルコキシ化することによって、化合物Ａ−２(2)を製造することができる：
【００８９】
【化２１】
2009051743.tif 000022
【００９０】
（式中、Ｒ12は炭素数１〜４の低級アルキル基を意味する。Ｒ３〜Ｒ８およびＲ１０〜Ｒ１１は、上記と同じ。）
工程Ｊの反応終了後、必要に応じて、得られた反応液を減圧濃縮し、次いでシリカゲル等を利用したクロマトグラフィー、蒸留、再結晶等の任意の精製操作に供してもよい。斯くして本発明の化合物Ａ−２(2)を得ることができる。
【００９１】
（３）セラミドキナーゼ阻害剤
本発明のセラミドキナーゼ阻害剤は、前述する４環性化合物（Ａ）またはその塩を有効成分とすることを特徴とする。
【００９２】
セラミドキナーゼ（ＣＥＲＫ）は、セラミドをリン酸化し、セラミド１−リン酸（Ｃ１Ｐ）を生成する酵素である。本発明の４環性化合物（Ａ）は、当該酵素のセラミドキナーゼ活性を阻害する作用を有している。本発明の好適な４環性化合物（Ａ）は、生理的条件下で、セラミドキナーゼ阻害活性を示す。かかるセラミドキナーゼ阻害活性は、具体的には試験例で説明するように、マウスのセラミドキナーゼを一過性に発現させた細胞の溶解液を酵素液として用いて、これを被験化合物の存在下でセラミドと反応させ、生成するセラミド１−リン酸の量を測定することによって評価することができる。被験化合物の非存在下でセラミドと反応させて得られるセラミド１−リン酸の量（対照量）に比して、被験化合物の存在下で反応させて得られるセラミド１−リン酸の量が低減する場合、当該被験化合物にはセラミドキナーゼ活性を阻害する作用があると判断することができる。また、本発明の４環性化合物（Ａ）は細胞毒性がないか、またはあっても低いことが好ましい。
【００９３】
本発明のセラミドキナーゼ阻害剤は、前述する４環性化合物（Ａ）１００％からなるものであってもよいし、またセラミドキナーゼ阻害活性を保持する限りにおいて他の成分を含有するものであってもよい。
【００９４】
（４）医薬組成物
本発明は、前述するセラミドキナーゼ阻害剤を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。言い換えれば、本発明の医薬組成物は、前述する４環性化合物（Ａ）またはその塩を有効成分として含有するものである。なお、４環性化合物（Ａ）が溶媒和物（例えば水和物）を形成する場合には、これらの溶媒和物も本発明の医薬組成物の有効成分として使用できる。また、生体内において代謝されて上記で表される化合物（A）、その塩又はエステルに変換される化合物（例えばアミド誘導体のような、いわゆるプロドラッグ）も、本発明の医薬組成物の有効成分として使用できる。
【００９５】
本発明の医薬組成物は、４環性化合物（Ａ）を有効量含むことによって、セラミドキナーゼ活性を特異的に抑制させることができ、カルシウムまたは抗原刺激に伴うセラミドキナーゼ活性化を阻害してセラミド１−リン酸の生成を抑制する作用を有している。前述するように、セラミドキナーゼ活性はマスト細胞の脱顆粒と関連し、セラミドキナーゼ活性が阻害されるとマスト細胞の脱顆粒が抑制されることが知られている（非特許文献２参照）。このため４環性化合物（Ａ）を有効成分とする本発明の医薬組成物は、そのセラミドキナーゼ阻害作用に基づいて、マスト細胞の脱顆粒に起因して生じる疾患や病態を処置するために有効に使用することができる。
【００９６】
かかる疾患または病態として、炎症、およびアトピー性皮膚炎や花粉症を含むＩ型アレルギーなどのアレルギーを挙げることができる。
【００９７】
なお、本発明において「処置」とは、主として症状や病態の軽減または改善を意図するものであるが、かかる治療的（発症後）処置のみならず、予防的（発症前）処置も含まれる。
【００９８】
本発明の４環性化合物（Ａ）のなかでも、化合物１（一般式（Ａ）中、Ｒ１が水酸基；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ７およびＲ８がメチル基；Ｒ４〜Ｒ６およびＲ９〜Ｒ１１が水素原子；ならびにエーテル環が６員環である化合物）は、細胞毒性が低いためヒトを対象とした医薬組成物の成分として有効に利用することができる。また、本発明の化合物３（一般式（Ａ）中、Ｒ１がアミノ酸基（グリシル基）；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ７およびＲ８がメチル基；Ｒ４〜Ｒ６およびＲ９〜Ｒ１１が水素原子；ならびにエーテル環が６員環である化合物）および化合物４（一般式（Ａ）中、Ｒ１が水酸基；Ｒ３、Ｒ７およびＲ８がメチル基；Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ６およびＲ９〜Ｒ１１が水素原子；ならびにエーテル環が７員環である化合物）は、化合物１よりもセラミドキナーゼ阻害活性が高いため、少量で所望の薬理効果を得ることができる。
【００９９】
本発明の医薬組成物は、通常、セラミドキナーゼ阻害作用を発揮する有効量の化合物（Ａ）またはその塩に加えて、薬学的に許容される担体または添加剤を配合して調製される。医薬組成物中の化合物（Ａ）またはその塩の配合量は、対象とする疾患や病態の種類や投与形態に応じて適宜選択されるが、通常、全身投与製剤の場合には、医薬組成物の全体重量（１００重量％）の０.００１〜５０重量％、特に０.０１〜１０重量％とすることができる。
【０１００】
本発明の医薬組成物の投与方法として、経口投与、ならびに静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経粘膜投与、経皮投与、および直腸内投与等の非経口投与を挙げることができる。好ましくは経口投与および静脈内投与であり、より好ましくは経口投与である。本発明の医薬組成物は、かかる投与方法に応じて、種々の形態の製剤（剤型）に調製することができる。以下に、各製剤（剤型）について説明するが、本発明において用いられる剤型はこれらに限定されるものではなく、医薬製剤分野において通常用いられる各種剤型を用いることができる。
【０１０１】
経口投与を行う場合の剤型として、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤を挙げることができ、これらの中から適宜選択することができる。また、それらの製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。
【０１０２】
また、静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与を行う場合の剤型として、注射剤または点滴剤（用時調製の乾燥品を含む）等があり、適宜選択することができる。
【０１０３】
また、経粘膜投与、経皮投与、または直腸内投与を行う場合の剤型として、咀嚼剤、舌下剤、パッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤等があり、適応場所に応じて適宜選択するここができる。また、それらの製剤についても徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、易吸収化等の修飾を施すことができる。
【０１０４】
本発明の医薬組成物にはその剤形（経口投与または各種の非経口投与の剤形）に応じて、薬学的に許容される担体および添加剤を配合することができる。薬学的に許容される担体及び添加剤としては、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤が挙げられる。以下に、医薬上許容される担体および添加剤の具体例を列挙するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【０１０５】
溶剤としては、精製水、滅菌精製水、注射用水、生理食塩液、ラッカセイ油、エタノール、グリセリン等を挙げることができる。賦形剤としては、デンプン類（例えばバレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン）、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトール等を挙げることができる。
【０１０６】
結合剤としては、デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体（たとえばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチ等を挙げることができる。
【０１０７】
滑沢剤としては、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸およびその塩類（たとえばステアリン酸マグネシウム）、タルク、ワックス類、コムギデンブン、マクロゴール、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、シリコン油等を挙げることができる。
【０１０８】
崩壊剤としては、デンプンおよびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロースおよびその誘導体、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロース等を挙げることができる。
【０１０９】
溶解補助剤としては、シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリピニルピロリドン、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、クエン酸、各種界面活性剤等を挙げることができる。
【０１１０】
粘稠剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリピニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。
【０１１１】
乳化剤は、アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、レシチン、各種界面活性剤（たとえば、ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム）等を挙げることができる。
【０１１２】
安定剤としては、トコフェロール、キレート剤（たとえばＥＤＴＡ、チオグリコール酸）、不活性ガス（たとえば窒素、二酸化炭素）、還元性物質（たとえば亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ロンガリット）等を挙げることができる。
【０１１３】
緩衝剤としては、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸等を挙げることができる。
【０１１４】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等を挙げることができる。無痛化剤こしては、局所麻酔剤（塩酸プロカイン、リドカイン）、ペンジルアルコール、ブドウ糖、ソルビトール、アミノ酸等を挙げることができる。
【０１１５】
矯味剤としては、白糖、サッカリン、カンゾウエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリン等を挙げることができる。芳香剤としては、トウヒチンキ、ローズ油等を挙げることができる。着色剤としては、水溶性食用色素、レーキ色素等を挙げることができる。
【０１１６】
保存剤としては、安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フェノール、チロメサール、デヒドロ酢酸、ホウ酸、等を挙げることができる。
【０１１７】
コーティング剤としては、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、メチルメタアクリレート−メタアクリル酸共重合体および上記記載した高分子等を挙げることができる。
【０１１８】
基剤としては、ワセリン、流動パラフィン、カルナウバロウ、牛脂、硬化油、パラフィン、ミツロウ、植物油、マクロゴール、マクロゴール脂肪酸エステル、ステアリン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ベントナイト、カカオ脂、ウイテップゾール、ゼラチン、ステアリルアルコール、加水ラノリン、セタノール、軽質流動パラフィン、親水ワセリン、単軟膏、白色軟膏、親水軟膏、マクロゴール軟膏、ハードファット、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性碁剤等を挙げることができる。
【０１１９】
なお、上記の各剤型について、公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術を採用することができる。本明細書にいうＤＤＳ製剤とは、徐放化製剤、局所適用製剤（トローチ、バッカル錠、舌下錠等）、薬物放出制御製剤、腸溶性製剤および胃溶性製剤等、投与経路、バイオアベイラビリティー、副作用等を勘案した上で、最適の製剤形態にした製剤である。
【０１２０】
本発明の医薬組成物を、マスト細胞の脱顆粒に関連する疾患や病態に対する処置に用いる場合、その経口投与量として、化合物（Ａ）の量に換算して０．０３〜３００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましく、より好ましくは０.１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。静脈内投与をする場合、化合物（Ａ）の有効血中濃度が０．２〜５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５〜２０μｇ／ｍＬの範囲となるような投与量を挙げることができる。なお、これらの投与量は、年齢、性別、体型等により変動し得る。
【０１２１】
本発明の医薬組成物は、マスト細胞の脱顆粒に関連する疾患や病態の改善または治療を目的として、上記疾患と判断された患者に対して有効量投与して用いられる。従って、本発明の医薬組成物を含む製剤には、かかる疾患や病態の改善または治療に使用する場合の用法を記載した仕様書または説明書が添付されていてもよい。
【０１２２】
尚、発明を実施するための最良の形態の項ならびに実施例における記載は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものである。よって、本発明はそのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献は、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【０１２３】
実施例１  化合物１および２の製造
（１）図１に示すスキーム（工程１〜８）に従って、化合物１を製造した。
【０１２４】
（1-1）化合物ａから化合物ｂの合成（工程１）
０℃に冷却したDihydro-β-ionone（化合物ａ）(10.0 g, 51.5 mmol)のトルエン溶液(100 mL)に、水素化ナトリウム(60% 鉱油分散液, 3.71 g, 92.6 mmol)及び炭酸ジメチル (7.8 mL, 92.6 mmol)を加えた後、還流条件下で２時間攪拌した。次いで得られた反応混合液に、４規定の塩酸水溶液を加えて、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を行った。得られた残留物を、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、化合物ｂ(9.80 g, 収率75%)を得た。
【０１２５】
（1-2）化合物ｃの合成（工程２）
上記で得られた化合物ｂ(7.44 g, 29.5 mmol)の塩化メチレン溶液(150 mL)を、−1０℃に冷却した。ここに塩化スズ(IV)(9.7 mL, 53.0 mmol)を加え、１５時間室温で攪拌した。得られた反応混合液に４規定の塩酸水溶液を加えて酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を行った。得られた残留物を、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、化合物ｃ(6.11 g, 収率82%)を得た。
【０１２６】
（1-3）化合物ｄの合成（工程３）
臭化メチルトリフェニルホスホニウム(23.069 g, 64.494 mmol)のテトラヒドロフラン溶液(200 mL)に、ナトリウムアミド(2.516 g, 64.494 mmol)を加え、５０℃で２時間攪拌した。得られた反応混合液を１時間静置し、ここ得られた上澄みを、予め０℃に冷却しておいた化合物ｃ(3.255 g, 12.899 mmol)のテトラヒドロフラン溶液(20 mL)に加えた。これを室温で１時間攪拌し、水を加えて、ヘキサンで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を行った。得られた残留物を、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、化合物ｄを得た。
【０１２７】
（1-4）化合物ｅの合成（工程４）
水素化リチウムアルミニウム(2.018 g, 53.180 mmol)のジエチルエーテル溶液(25 mL)を０℃に冷却し、上記で得られた化合物ｄのジエチルエーテル溶液(25mL)を滴下した。得られた反応混合液を室温で２０時間攪拌し、水及びジエチルエーテルを加えた。これを濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残留物を、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、化合物ｅ(2.366 g, 収率100%)を得た。
【０１２８】
（1-5）化合物ｆの合成（工程５）
上記で得られた化合物ｅ(1.00 g, 4.50mmol)の塩化メチレン溶液(20 mL)に、ゼオライト（molecular sieves 4Å）(100 mg)を加え０℃に冷却した。ここにN-メチルモルホリンN-オキサイド(1.05 g, 8.96 mmol)及び過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム (158 mg, 0.450 mmol)を加え、０℃で３０分攪拌した。これを濾過し、得られた濾液を減圧濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物ｆ(932 mg, 収率94 %)を得た。化合物ｆの物性を下記に示す。
【０１２９】
IR (NaCl neat, cm-1) 2932, 2733, 1721, 1644, 1460, 891;
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d 9.87 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 4.92 (s, 1H), 4.50 (s, 1H), 2.44 (dd, J = 4.1, 2.1 Hz, 1H), 2.41 (dd, J = 4.4, 2.1 Hz, 1H), 2.07 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.57 (m, 1H), 1.45 (m, 1H), 1.40 (m, 2H), 1.25 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 1.20 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 1.15 (s, 3H), 1.01 (dd, J = 12.4, 2.6 Hz, 1H), 0.88 (s, 3H), 0.86 (s, 3H);
13C NMR (CDCl3, 75 MHz) d 205.8, 145.1, 109.3, 67.9, 54.0, 41.9, 39.9, 39.0, 36.7, 33.5, 33.4, 23.1, 21.9, 18.7, 16.0。
【０１３０】
（1-6）化合物ｇの合成
ジヒドロキシキノン(20.0 g, 142.8 mmol)のテトラヒドロフラン溶液(240 mL)に、パラジウム（活性炭上に10% wt.担持, 266 mg, 0.150 mmol)を加え、室温で８時間攪拌した。これを濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残留物をベンゼンに溶解し、このベンゼン溶液(1.0 L)に、2,2-ジメトキシプロパン(73 mL, 591.8 mmol)及びdl-10-カンファースルホン酸の無水物(2.23 g, 9.87 mmol)を加え攪拌し、２時間還流を行った。得られた反応混合液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を行った。得られた残留物を、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、化合物ｇ(12.2 g, 77%)を得た。
【０１３１】
（1-7）化合物ｈの合成（工程６）
上記で得られた化合物ｇ(6.19 g, 27.83 mmol)のテトラヒドロフラン溶液(134 mL)を−１０℃に冷却した。ここにn-ブチルリチウム（1.6 M ヘキサン溶液, 24.4 mL, 38.96 mmol)を滴下した後、−１０℃で３０分攪拌した。得られた反応混合液の液温を徐々に室温まで上げ、室温でさらに２時間攪拌した後、化合物ｆ(3.07 g, 13.92 mmol)のテトラヒドロフラン溶液(67mL)を加え、４５分攪拌した。得られた反応混合液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を行った。得られた残留物を、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、化合物ｈ(4.00 g, 収率65 %)を得た。化合物ｈの物性を下記に示す。
【０１３２】
IR (KBr disk, cm-1) 3594, 2930, 2866, 1466, 1211, 1161, 837; 
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d 6.23 (s, 1H), 5.22 (dd, J = 6.4, 4.6 Hz, 1H), 4.69 (s, 1H), 4.62 (s, 1H), 2.70 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 2.47 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 2.37 (m, 1H), 2.05-2.15 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.72 (m, 2H), 1.61 (s, 12H), 1.45 (m, 1H), 1.42 (m, 1H), 1.40 (m, 2H), 1.30 (m, 1H), 1.03 (s, 3H), 1.00 (s, 3H), 0.81 (s, 3H); 
13C NMR (CDCl3, 100 MHz) d 147.6, 140.3, 137.8, 117.8, 108.2, 91.4, 66.6, 60.4, 59.9, 42.1, 39.0, 38.7, 33.6, 25.7, 25.6, 25.1, 24.7, 22.8, 22.3, 21.8, 19.3; 
ESI HRMS m/z calcd for C27H38O5[M + Na]+ 465.2617, found 465.2615。
【０１３３】
（1-8）化合物ｉの合成（工程7-1、工程7-2）
上記で得られた化合物ｈ(2.479 g, 5.601 mmol)のテトラヒドロフラン溶液(28 mL)を−７８℃に冷却した後、ナトリウム ビス(トリメチルシリル)アミド (1.0 M テトラヒドロフラン溶液, 16.8 mL, 16.803 mmol)を滴下し−７８℃で３０分攪拌した。ここに二硫化炭素(2.36 mL, 39.207 mmol)を加えた後、反応混合液の液温を１時間かけて−４０℃まで上げた。再び反応混合液を−７８℃に冷却し、ヨウ化メチル(3.53 mL, 56.010 mmol)を加え、反応混合液の液温を１時間かけて−４０℃まで上げた。飽和亜硫酸ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を行った（以上、工程7-1）。斯くして得られたキサンテート化合物を含む残留物をベンゼンに溶解し、このベンゼン溶液(50 mL)に、水素化トリブチルスズ(6.7 mL, 24.910 mmol)及び2,2-アゾビスイソブチロニトリル(82 mg, 0.498 mmol)を加え、還流条件下で３時間攪拌し、得られた反応混合液を減圧濃縮した。残留物を、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、化合物ｉ(2.091 g, 収率87%)を得た。化合物ｉの物性を下記に示す。
【０１３４】
IR (KBr disk, cm-1) 2936, 2866, 1719, 1647, 1462, 1211, 1161, 841; 
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d 6.14 (s, 1H), 4.70 (s, 1H), 4.69 (s, 1H), 2.68 (dd, J = 13.9, 2.9 Hz, 2H), 2.51 (m, 2H), 2.31 (ddd, J = 13.9, 4.2, 2.4 Hz, 1H), 1.92 (dt, J = 12.7, 4.9 Hz, 1H), 1.79 (br-d, J = 14.0 Hz, 1H), 1.65-1.77 (m, 2H), 1.61 (s, 12H), 1.56 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 1.50 (dt, J= 14.0, 3.6 Hz, 1H), 1.38 (m, 1H), 1.30 (m, 1H), 1.25 (m, 1H), 1.15 (dd, J = 12.7, 2.9 Hz, 1H), 0.86 (s, 3H), 0.83 (s, 3H), 0.77 (s, 3H); 
13C NMR (CDCl3, 100 MHz) d 148.4, 139.8, 139.2, 117.0, 108.9, 106.6, 90.0, 55.6, 54.2, 42.2, 38.9, 38.9, 38.3, 33.6, 27.8, 26.8, 25.6, 24.5, 21.8, 19.5, 17.5, 14.1, 13.6; 
ESI HRMS m/z calcd for C27H38O4[M]+ 426.2770, found 426.2780。
【０１３５】
（1-9）化合物１の合成（工程８）
化合物ｉ(20 mg, 0.0469 mmol)の塩化メチレン溶液(1.0 mL)を０℃に冷却した後、1,3-プロパンジチオール (24μL, 0.234 mmol)及びメタンスルホン酸トリメチルシリル (42μL, 0.234 mmol)を加え０℃で５分間攪拌した。ここにフッ化テトラブチルアンモニウム(1 M テトラヒドロフラン溶液, 60μL, 0.0576 mmol)を加え、さらに１分間攪拌した。得られた反応混合液に水を加えてジエチルエーテルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を行った。得られた残留物を、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、化合物１ (14 mg, 収率64%)を得た。
なお、化合物１は下式で示される鏡像異性体のラセミ体である。
【０１３６】
【化２２】
2009051743.tif 000023
【０１３７】
化合物１の物性を下記に示す。
【０１３８】
IR (KBr disk, cm-1) 3353, 2926, 2866, 1657, 1609, 1358, 1123, 965;
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d 5.91 (s, 1H), 2.51 (dd, J = 17.8, 4.6 Hz, 1H), 2.22 (m, 1H), 2.12 (dd, J = 17.6, 12.7 Hz, 1H), 1.81 (m, 1H), 1.77 (m, 1H), 1.62 (ddt, J= 13.4, 13.4, 3.4 Hz, 1H), 1.47 (m, 1H), 1.42 (m, 1H), 1.25 (m, 1H), 1.25 (s, 3H), 1.20 (m, 1H), 1.16 (m, 1H), 0.97 (m, 1H), 0.92 (m, 1H), 0.90 (s, 3H), 0.89 (s, 3H), 0.84 (s, 3H); 
13C NMR (CDCl3, 100 MHz) d 182.3, 182.2, 155.2, 154.5, 114.0, 104.7, 82.7, 55.9, 51.1, 41.6, 40.0, 39.2, 37.1, 33.3, 33.2, 21.5, 20.6, 19.7, 18.4, 15.9, 15.0; 
ESI HRMS m/z calcd for C21H28O4[M - H]- 343.1908, found 343.1900。
【０１３９】
（２）下式に示すスキーム（工程９）に従って、化合物２を製造した。
【０１４０】
【化２３】
2009051743.tif 000024
【０１４１】
実施例１で製造した化合物１(110 mg, 0.319 mmol)の酢酸エチル溶液(4 mL)を０℃に冷却し、これにジアゾメタン(500 mg, 4.85 mmol)のジエチルエーテル溶液(10ml)を滴下し、０℃で５分間攪拌した。得られた反応混合液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を行った。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物２(90 mg, 収率79%)を得た。当該化合物２も下式で示される鏡像異性体のラセミ体である。
【０１４２】
【化２４】
2009051743.tif 000025
【０１４３】
この化合物２の物性を下記に示す。
【０１４４】
IR (KBr disk, cm-1) 2948, 2866, 1657, 1603, 1246, 1229;1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d 5.74 (s, 1H), 3.78 (s, 3H), 2.49 (dd, J = 18.4, 4.8 Hz, 1H), 2.21 (m, 1H), 2.12 (dd, J = 18.0, 12.8 Hz, 1H), 1.81-1.68 (m, 3H), 1.67-1.49 (m, 1H), 1.48-1.23 (m, 4H), 1.20 (s, 3H), 1.13 (td, J = 13.6, 4.0 Hz, 1H), 0.98-0.90 (m, 2H), 0.88 (s, 3H), 0.85 (s, 3H), 0.81 (s, 3H);13C NMR (CDCl3, 100 MHz) d 182.1, 181.3, 159.4, 152.6, 116.3, 104.7, 81.8, 56.3, 55.9, 51.1, 41.6, 40.1, 39.2, 37.1, 33.3, 33.1, 21.4, 20.5, 19.7, 18.3, 16.2, 15.0。
【０１４５】
実施例２  化合物３の製造
下式に示すスキーム（工程１０）に従って、化合物３を製造した。
【０１４６】
【化２５】
2009051743.tif 000026
【０１４７】
実施例３で調製した化合物２(30 mg, 0.0837 mmol)のエタノール溶液(6.0 mL)に、炭酸水素ナトリウム (63 mg, 0.839 mmol)及びグリシン(220 mg, 2.62 mmol)を加え、４０℃で４８時間攪拌した。得られた反応混合液を濾過し、得られた濾液を減圧濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物３(6 mg, 収率18 %)を得た。当該化合物３は、下式で示される鏡像異性体のラセミ体である。
【０１４８】
【化２６】
2009051743.tif 000027
【０１４９】
この化合物３の物性を下記に示す。
【０１５０】
IR (KBr disk, cm-1) 3449, 2928, 1653, 1593;1H NMR (CD3OD, 400 MHz) d 5.24 (s, 1H), 3.97 (s, 2H), 2.45 (dd, J = 17.6, 4.4 Hz, 1H), 2.23-2.07 (m, 2H), 1.87-1.66 (m, 4H), 1.55-1.18 (m, 8H), 1.12-0.99 (m, 2H), 0.96 (s, 3H), 0.94 (s, 3H), 0.90 (s, 3H); 13C NMR (CD3OD, 100 MHz) d 182.9, 182.0, 171.8, 155.9, 149.9, 115.4, 95.9, 83.0, 57.2, 52.6, 44.4, 42.9, 41.3, 40.3, 38.3, 34.1, 33.8, 21.9, 20.9, 20.7, 19.5, 17.0, 15.5。
【０１５１】
実施例３  化合物４の製造
下式に示すスキーム（工程１１〜１４）に従って、化合物４を製造した。
【０１５２】
【化２７】
2009051743.tif 000028
【０１５３】
（１）化合物ｊの合成（工程１１）
実施例４で製造した化合物ｉ(700 mg, 1.64 mmol)のテトラヒドロフラン溶液(16.0 mL)を０℃に冷却した後、ボラン-ジメチルスルフィド複合体(1.54 mL, 16.4 mmol)を加え、室温で４時間攪拌した。次に、得られた反応混合液を０℃に冷却した後、２規定の水酸化ナトリウム水溶液(2.45 mL, 4.91 mmol)及び過酸化水素水(30 wt % 水溶液, 5.40 mL, 4.91 mmol)を加え、室温で３０分攪拌した。これに水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を行った。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物ｊ(730 mg, 収率100%)を得た。化合物ｊの物性を下記に示す。
【０１５４】
IR (KBr disk, cm-1) 3449, 2936, 2870, 1460, 1211, 839; 
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d 6.18 (s, 1H), 3.94 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 3.49 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 2.65 (dd, J = 14.2, 3.2 Hz, 1H), 2.47 (t, J = 11.7 Hz, 1H), 1.98 (br-d, J = 9.8 Hz, 1H), 1.78 (br-d, J = 12.7 Hz, 1H), 1.66 (s, 6H), 1.61 (s, 6H), 1.60 (m, 2H), 1.55 (m, 1H), 1.50 (m, 1H), 1.48 (m, 1H), 1.45 (m, 1H), 1.40 (m, 1H), 1.20-1.40 (m, 2H), 1.21 (dd, J= 13.4, 3.9 Hz, 1H), 1.07 (dt, J = 12.9, 3.4 Hz, 1H), 0.87 (s, 3H), 0.83 (s, 3H), 0.79 (s, 3H); 
13C NMR (CDCl3, 100 MHz) d 140.1, 139.4, 117.4, 108.5, 90.6, 62.0, 56.7, 52.8, 42.2, 41.1, 39.0, 38.2, 33.6, 33.5, 29.9, 25.8, 25.6, 25.5, 21.7, 21.2, 18.8, 17.9, 15.6; 
ESI HRMS m/z calcd for C27H40O5[M + Na]+ 467.2773, found 467.2766。
【０１５５】
（２）化合物ｋの合成（工程１２）
上記で得られた化合物ｊ(730 mg, 1.64 mmol)のテトラヒドロフラン溶液(9.0 mL)を、０℃に冷却した後、トリエチルアミン(0.69 mL, 4.91 mmol)及び塩化メタンスルホニル (190 mL, 2.47 mmol)を加え、室温で３０分間攪拌した。これに水を加え、ジエチルエーテルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を行った。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物ｋ(849 mg, 99%)を得た。化合物ｋの物性を下記に示す。
【０１５６】
IR (KBr disk, cm-1) 2940, 2870, 1462, 1175, 839; 
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d 6.19 (s, 1H), 4.32-4.42 (m, 3H), 2.93 (s, 3H), 2.71 (dd, J = 15.6, 5.4 Hz, 2H), 2.39 (dd, J = 14.2, 11.4 Hz, 1H), 1.88 (m, 4H), 1.77 (br-d, J = 12.4 Hz, 1H), 1.65 (s, 6H), 1.61 (s, 6H), 1.48 (dt, J = 10.2, 3.2 Hz, 1H), 1.42 (m, 1H), 1.35 (m, 1H), 1.25 (m, 1H), 1.18 (dd, J = 13.4, 3.9 Hz, 1H), 0.88 (s, 3H), 0.84 (s, 3H), 0.83 (s, 3H); 
13C NMR (CDCl3, 100 MHz) d 139.9, 139.4, 117.5, 106.9, 90.6, 69.5, 56.5, 51.5, 41.9, 38.8, 38.0, 37.1, 35.7, 33.3, 29.7, 28.6, 25.6, 25.5, 21.5, 21.0, 18.6, 17.4, 15.8; 
ESI HRMS m/z calcd for C28H42O7S [M + Na]+ 545.2549, found 545.2550。
【０１５７】
（３）化合物ｌの合成（工程１３）
上記で得られた化合物ｋ(849 mg, 1.62 mmol)の塩化メチレン溶液(30.0 mL)を、０℃に冷却した後、1,3-プロパンジチオール(1.47 mL, 8.12 mmol)及びメタンスルホン酸トリメチルシリル(814μL, 8.12 mmol)を加え５分間攪拌した。０℃の状態でフッ化テトラブチルアンモニウム (1Ｍ テトラヒドロフラン溶液, 2.43 mL, 2.43 mmol)を加え１分間攪拌した。得られた反応混合液に水を加え、ジエチルエーテルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を行った。得られた残留物を、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、化合物ｌ (486 mg, 収率68%)を得た。化合物ｌの物性を下記に示す。
【０１５８】
IR (KBr disk, cm-1) 3418, 2934, 1707, 1632 ,1512, 1478, 1339, 1224, 937; 
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d 6.02 (s, 1H), 4.51 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 2.00 (s, 3H), 2.62 (dd, J = 13.4, 3.7 Hz, 1H), 2.46 (dd, J = 13.7, 11.5 Hz, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.82 (m, 2H), 1.77 (dd, J = 11.5, 3.4 Hz, 1H), 1.58 (m, 2H), 1.50 (m, 1H), 1.38 (m, 2H), 1.22 (m, 1H), 1.14 (dd, J = 12.9, 4.4 Hz, 1H), 0.90-1.00 (m, 2H), 0.87 (s, 3H), 0.83 (s, 3H), 0.81 (s, 3H); 
13C NMR (CDCl3, 100 MHz) d 147.0, 115.6, 107.5, 69.8, 56.3, 51.4, 41.8, 38.7, 37.2, 36.4, 33.3, 28.7, 21.4, 19.4, 18.6, 17.3, 15.6; 
ESI HRMS m/z calcd for C22H32O7S [M - H]- 439.1790, found 439.1771。
【０１５９】
（４）化合物４の合成（工程１４）
上記で得られた化合物ｌ(17 mg, 0.0386 mmol)のジメチルホルムアミド溶液(0.39 mL)を、０℃に冷却し、1,8-diazabicyclo[5.4.0]- undec-7-ene (60 mL, 0.3859 mmol)を加えた後、室温で２０分間攪拌した。得られた反応混合液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を行った。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物４(13 mg, 収率77%)を得た。当該化合物４は、下式で示される鏡像異性体のラセミ体である。
【０１６０】
【化２８】
2009051743.tif 000029
【０１６１】
化合物４の物性を下記に示す。
【０１６２】
IR (KBr disk, cm-1) 3383, 2922, 2868, 1649, 1604, 1223, 1176; 
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d 7.40 (br-s, 1H), 5.93 (s, 1H), 4.23 (t, J = 11.7 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 11.7, 3.4 Hz, 1H), 2.78 (dd, J = 16.6, 3.4 Hz, 1H), 2.53 (m, 1H), 2.52 (dd, J = 16.6, 12.7 Hz, 1H), 1.85 (dt, J = 12.2, 3.4 Hz, 1H), 1.63-1.80 (m, 2H),1.50 (m, 2H), 1.42 (m, 2H), 1.25 (m, 2H), 1.15 (m, 2H), 0.99 (m, 1H), 0.95 (s, 3H), 0.90 (s, 3H), 0.88 (s, 3H); 
13C NMR (CDCl3, 100 MHz) d 192.8, 183.7, 155.0, 118.8, 104.6, 75.4, 49.4, 48.5, 42.3, 38.5, 37.3, 36.4, 33.3, 33.2, 28.5, 24.6, 22.9, 22.1, 19.4, 18.5, 16.4; 
ESI HRMS m/z calcd for C21H28O4[M - H]- 343.1909, found 343.1924。
【０１６３】
試験例１  in vitroセラミドキナーゼ活性の測定（その１）
実施例１で製造した化合物１（以下、単に「Ｋ１」と称する）、およびその鏡像異性体（以下、単に「ＫＤ」と称する）のセラミドキナーゼ阻害作用（CERK阻害作用）を、Inagakiらの方法（Y.Inagaki et al., Biochem Biophys Res Commun, 343,982-987 (2006）)に準じて、下記に示すin vitro測定系を用いて測定した。また、比較化合物として、下式に示すF12509A（非特許文献１参照）およびその鏡像異性体（以下、化合物「ＫＢ」と称する）、F12509Aのメチレン基をメチル基に置換した化合物（以下、化合物「ＫＣ」と称する）、およびベンゾキノン基を有するシクロヘキサン誘導体（以下、化合物「Ｋ２」と称する）についても同様にセラミドキナーゼ阻害作用を測定した。これらの比較化合物はいずれもエーテル環を有しない点で、本発明の化合物と相違するものである。
【０１６４】
【化２９】
2009051743.tif 000030
【０１６５】
（１）酵素（セラミドキナーゼ）の調製
Human embryonic kidney（HEK）293細胞を、FLAG-タグ付きヒトCERKをコードするpcDNA-FRAG hCERKで形質転換し、24時間培養した。この細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（10mM HEPES、2mM EGTA、40mM KCl、およびCompleteＴＭ protease inhibitor mixture（ロシュ製）、pH7.4）で溶菌させた。この細胞溶解物から、セラミドキナーゼ（CERK）を、抗-FRAG M2ビーズ（SIGMA製）を用いて免疫沈降させて精製した。
【０１６６】
（２）セラミドキナーゼ活性の測定
上記で精製したCERKを、蛋白含量が7.2mg/mlとなるように、CERK反応液（40mM HEPES、100mM KCl、3mM CaCl2、1mM DTT、CompleteＴＭ protease inhibitor mixture（ロシュ製）、pH7.5）に懸濁した。斯くして調製した酵素液の一部（70μl）を所定濃度の各被験物質5μlと混合して10分間インキュベーションした。この中に、［γ-32P］ATP（10nM、2mCi/ml、Institute of Isotope 社製）1μl、240nM ATP ９μl、および20μlの混合ミセル（5mMカルジオリピン、7.5% β-オクチルグルコシド、1mM ジエチレントリアミン5酢酸、200μM セラミド(C16:0、d18:1、SIGMA)）を添加して反応を開始した。30℃で30分間インキュベーションした後、各反応液から、[３２Ｐ]セラミド１リン酸（[32P]C1P）を抽出して、C1Pの生成量を求めた。
【０１６７】
具体的には、反応後、反応液に３倍容のクロロホルムとメタノールの混合液（混合比＝1:1）、次いで1.235倍容の１％塩化カリウム溶液を加え、ボルテックスミキサー（サイエンティフィックインダストリー社製）を用いて強く混和した後、得られた反応液を遠心分離した（4,000xg）。得られた上清を、マイクロピペット（ニチリョー社製）を用いて除去し、下層をエバポレーターで乾固させた。乾固させた総脂質に20μlのクロロホルムとメタノールの混合液（混合比＝1:1）を加えて脂質を再溶解させ、マイクロピペット（ニチリョー社製）を用いてシリカゲル ６０ ＴＬＣプレート（メルク社製）にスポットした。このプレートをクロロホルム／アセトン／メタノール／酢酸／水（10:4:3:2:1、v/v）の展開溶媒を用いて展開し、バイオイメージングアナライザーBAS2500（フジフィルム社製）を用いて、放射線標識されたセラミド１−リン酸（[32P]C1P）のバンドから、C1Pの生成量を定量した。
【０１６８】
各被験化合物を用いた場合のC1Pの生成量を、被験化合物を用いないコントロール系のC1Pの生成量（100％）に対する相対比（％）として算出した。結果を図２に示す。  図２からわかるように、化合物１（Ｋ１）とその鏡像異性体（ＫＤ）はいずれも、化合物F12509A、ＫＢ、ＫＣ、およびＫ２に比して、強いＣＥＲＫ阻害活性を有していた。
【０１６９】
なお、被験化合物のうち、Ｋ１、ＫＤ、およびＫＣについて、図２の結果を、J.T.Edsalらの方法（J.T.Edsal et al., Biochemical Chemistry, 1, 605-638 (1958)）に従ってスキャッチャードプロットした結果を図３に示す。この結果から、各被験化合物のＫi値は、ＫＣが４５２μＭであるのに対して、Ｋ１は２.２μＭ、ＫＤは３.３μＭであった。
【０１７０】
比較化合物（F12509A、KB,KC,およびK2）と本発明の化合物（K1,KD）の主な相違は、本発明の化合物がエーテル環を有するのに対して、比較化合物はこれを有しない点である。このことから本発明の化合物のＣＥＲＫ阻害作用には、エーテル環が強く関与していると考えられる。また、鏡像異性体であるＫ１とＫＤはいずれも共通して強いＣＥＲＫ阻害作用を有していることから、セラミドキナーゼは、本発明の化合物の絶対配置を認識しないと考えられた。
【０１７１】
Ｋ１とＫＤによるＣＥＲＫ阻害のキネティックスを調べるために、Lineweaver-Burk plot analysisを行った。結果を図４ＡとＢに示す。Ｋ１とＫＤの増加に伴って、ＣＥＲＫのＶmax値は減少したが、Km値はほとんど変化しなかった。また、この３本のラインはいずれもＸ線を遮り、典型的な非競合的な阻害パターンを示した。セラミドキナーゼは、基質結合ドメインに加えて、Ｎ末端、ＰＨドメイン（pleckstrin-homology domein）、およびCa２＋／CaM結合部位を有する。ＰＨドメインは、ＣＥＲＫ活性に重要な領域であるが、基質への親和性やKm値には全く関与しない領域である。またCa２＋／CaM結合部位はCa２＋依存した活性に重要である。本発明の化合物は、基質認識部位ではなく、これらの活性調節領域の活性を阻害する作用を有しており、それがゆえに、非競合的にＣＥＲＫ活性を阻害するものと考えられる。
【０１７２】
試験例２  in vitroセラミドキナーゼ活性の測定（その２）
（１）酵素（セラミドキナーゼ）の調製
マウスセラミドキナーゼ遺伝子をpcDNA3.1ベクター（インビトロジェン社製）に組み込んだプラスミドを構築し、このプラスミドを、リポフェクトアミンプラス トランスフェクションキット（インビトロジェン社製）を用いて、Human embryonic kidney（HEK）293細胞に一過性に発現させた。この細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（10mM HEPES、2mM EGTA、1mM dithiotheritol、40mM KCl、およびCompleteＴＭ protease inhibitor mixture（ロシュアプライドサイエンス社製））で溶菌させて、この細胞溶解物を酵素液として用いた。
【０１７３】
（２）セラミドキナーゼ活性の測定
上記で調製した酵素液を、蛋白含量が５μｇとなるように、各濃度の被験化合物（化合物１〜４）、［γ-32P］ATP（10μCi/μmol、パーキンエルマーライフサイエンス社製）、20mM HEPES、80mM KCl、3mM CaCl2、1mM カルジオリピン、1.5％ β−オクチルグルコシド、0.2mMジエチレントリアミン5酢酸、および40μM セラミド（C18：0，d18：1）（アバンティポーラーリピッヅ社製）を含む反応液（50μl）に加え、エッペンドルフチューブ内にて30℃で30分間インキュベートした。また対照試験として、被験化合物を配合しない系（コントロール）についても同様に反応させた。
【０１７４】
反応後、脂質をすべて抽出するために、反応液に３倍容のクロロホルムとメタノールの混合液（混合比＝1:1）、次いで1.235倍容の１％塩化カリウム溶液を加え、ボルテックスミキサー（サイエンティフィックインダストリー社製）を用いて強く混和した後、得られた反応液を遠心分離した（4,000xg）。得られた上清を、マイクロピペット（ニチリョー社製）を用いて除去し、下層をエバポレーターで乾固させた。乾固させた総脂質に20μlのクロロホルムとメタノールの混合液（混合比＝1:1）を加えて脂質を再溶解させ、マイクロピペット（ニチリョー社製）を用いてシリカゲル ６０ ＴＬＣプレート（メルク社製）にスポットした。このプレートをクロロホルム／アセトン／メタノール／酢酸／水（10:4:3:2:1、v/v）の展開溶媒を用いて展開し、バイオイメージングアナライザーBAS2500（フジフィルム社製）を用いて、放射線標識されたセラミド１−リン酸（C1P）のバンドから、C1Pの生成量を定量した。
【０１７５】
各被験化合物（化合物１〜４）を用いた場合のC1Pの生成量を、コントロール系のC1Pの生成量（100％）に対する相対比（％）として算出し、これを各被験化合物のＣＥＲＫ活性（％）とした。結果を図５に示す。図５からわかるように、化合物１（K1）〜４はいずれもＣＥＲＫ阻害活性を有していた。なかでも化合物３と４は、化合物１（K1）および２よりも、強いＣＥＲＫ阻害活性を示した。
【０１７６】
試験例３    細胞内Ｃ１Ｐ量の変化  
化合物１〜４を代表して化合物１（K1）を用いて、細胞内のセラミド１−リン酸（C1P）生成に対する影響を調べた。
【０１７７】
まずマスト細胞のモデル細胞であるラット好塩基球性白血病細胞由来のＲＢＬ−２Ｈ３細胞（2×10６個／ml）を、１０％のウシ胎仔血清を含み、リン酸ナトリウムおよびピルビン酸ナトリウムを含まないダルベッコ改変イーグル高グルコース液体培地（ギブコ社製）を用いて、ＣＯ２インキュベータにて３７℃で培養した。５０μＣｉのＨ３［３２Ｐ］Ｏ４（パーキンエルマーライフサイエンス社製）を培地に添加し、その３０分間後にＫ１（10〜80μＭ）を添加した。Ｋ１の存在下または非存在下にてさらに培養した細胞を、４℃に冷却したリン酸緩衝化生理食塩水で一度洗浄し、７００μｌのクロロホルム／メタノール（１：１）を加えて反応を停止させた。
【０１７８】
この反応液に２５０μｌの１Ｍ塩化カリウムを加え、５分間強く転倒混和を行った後、遠心分離（12,000xg、２分間）した。上清を除去した後の下層に、45μlの１Ｎの水酸化ナトリウムを含むメタノールおよび７５μｌのクロロホルム／メタノール（１：１）を加えて混和し、５０℃で５０分間静置した。続いて、この混和液に、５５μｌの１Ｎ ＨＣｌを含むメタノールおよび７５μｌの１Ｍの塩化カリウム溶液を加え、５分間強く転倒混和を行った後、遠心分離（12,000xg、２分間）した。上清を除去した後の下層をエバポレーターで乾固させた。乾固させた総脂質に、２０μｌのクロロホルム：メタノール＝１：１を加えて脂質を再溶解させ、シリカゲル ６０ ＴＬＣプレート（メルク社製）にマイクロピペット（ニチリョー社製）を用いてスポットした。このプレートをクロロホルム／アセトン／メタノール／酢酸／水（１０：４：３：２：１、ｖ／ｖ）の展開溶媒を用いて展開し、バイオイメージングアナライザーＢＡＳ２５００（フジフィルム社製）を用いてアイソトープ標識されたセラミド１−リン酸（[32P]C1P）のバンドを定量した。Ｋ１濃度（０〜80μＭ）と細胞内の[32P]C1P生成量との関係を図６に示す。なお、図６は、Ｋ１濃度が０のときの細胞内[32P]C1P生成量を100％とした場合の相対％として示す。
【０１７９】
図６に示すように、マスト細胞（RBL-2H3細胞）をＫ１で処理することによって細胞内Ｃ１Ｐ量が減少した。この結果から、本発明の化合物はマスト細胞に作用してセラミドキナーゼ活性を阻害し、細胞内のセラミド１−リン酸（C1P）生成を抑制することがわかる。
【０１８０】
試験例４    マスト細胞活性化に対する影響  
化合物１〜４を代表して化合物１（Ｋ１）について、マウスの骨髄誘導マスト細胞（BMMC）を用いて、マスト細胞活性化による脱顆粒に対する影響を調べた。
【０１８１】
具体的には、ＢＭＭＣからのβ-hexosaminidaseの放出を指標として、カルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）によって誘起される脱顆粒に対するＫ１の影響を測定した。
【０１８２】
まずEagle’s ＭＥＭ培地（シグマ社製）中で培養したＢＭＭＣを回収し、１mM Ca２＋を含むTyrode’s緩衝液（25mM PIPES（pH7.2）、119mM NaCl、5mM KCl、0.4mM MgSO４、5.6mM glucose、1mM CaCl２、および0.1％ bovine serum albumin（シグマ社製）を含む）中に懸濁した。懸濁液にＫ１を添加した１０分間後に、１μＭのＡ２３１８７を用いて脱顆粒を誘導した。Ｋ１による脱顆粒の誘導抑制は、β-hexosaminidase活性を測定し、その低下の程度から評価した。結果を図７に示す。図７に示すように、Ｋ１が濃度依存的に、マスト細胞の脱顆粒を抑制する作用を有することが認められた。
【０１８３】
このように、Ｋ１がカルシウムイオノフォアに誘起される脱顆粒に対して抑制作用を示したことは、ＣＥＲＫがカルシウムイオノフォアによって誘起されるマスト細胞の脱顆粒に関与しているという報告（非特許文献２）と一致する。これらの結果は、ＣＥＲＫ阻害作用を有するＫ１ならびに本発明の化合物は、アレルギー反応や炎症に関わるマスト細胞の脱顆粒を抑制すること、すなわち、マスト細胞の脱顆粒を抑制してアレルギーや炎症を予防または改善する作用を有することを意味している。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】化合物１の合成スキームを示す（実施例１）。
【図２】化合物１（K1）とその鏡像異性体（KD）、F12509A、KB、KC、およびKDの、セラミドキナーゼ（ＣＥＲＫ）阻害活性を示す図である。
【図３】図２をスキャッチャードプロットした結果を示す。
【図４】Ｋ１とＫＤについで、図３のスキャッチャードプロットによるＣＥＲＫ阻害のキネティックスを調べるために、Lineweaver-Burk plot analysisを行った結果を示す。
【図５】化合物１（K1）とその鏡像異性体（KD）、化合物２、３および４の、セラミドキナーゼ（ＣＥＲＫ）阻害活性を示す図である。
【図６】各種濃度の化合物１（K1）で細胞を処理することによる細胞内Ｃ１Ｐ量の変化を示すグラフである。
【図７】カルシウムイオノフォアによる刺激に応じて生じる脱顆粒に対する化合物１（K1）の抑制効果を示すグラフである。
【図１】
2009051743.tif 000039
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2009051743.tif 000044
【図７】
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