(57)【要約】【課題】NFATシグナルを阻害することができる新規なNFATシグナル阻害剤を提供する。【解決手段】ドリカンドロネ・スパタケア、ネコノヒゲ、アオツヅラフジ及びツクシメナモミから選ばれる少なくとも１種の植物、当該植物の抽出物及び当該抽出物に含まれる成分からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分としている。本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、例えば、外用剤、医薬組成物、化粧品及び食品等の様々な分野に応用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドリカンドロネ・スパタケア、ネコノヒゲ、アオツヅラフジ及びツクシメナモミから選ばれる少なくとも１種の植物、当該植物の抽出物及び当該抽出物に含まれる成分からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とするNFATシグナル阻害剤。
【請求項２】
上記抽出物は、ドリカンドロネ・スパタケアの果実の水性アルコール抽出物、ネコノヒゲの花及び枝の水性アルコール抽出物、アオツヅラフジの新芽の水性アルコール抽出物及びツクシメナモミの全草の水性アルコール抽出物から選ばれる少なくとも１種類の抽出物であることを特徴とする請求項１記載のNFATシグナル阻害剤。
【請求項３】
上記アルコール抽出物は９５％エタノール抽出物であることを特徴とする請求項２記載のNFATシグナル阻害剤。
【請求項４】
対象の細胞又は組織に対して、請求項１乃至３いずれか一項記載のNFATシグナル阻害剤を接触させる、NFAT活性阻害方法。
【請求項５】
請求項１乃至３いずれか一項記載のNFATシグナル阻害剤を有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項６】
請求項１乃至３いずれか一項記載のNFATシグナル阻害剤を有効成分として含有する、化粧品組成物。
【請求項７】
請求項１乃至３いずれか一項記載のNFATシグナル阻害剤を有効成分として含有する、外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物、植物抽出物或いは植物抽出物に含まれる成分を有効成分とするNFAT（nuclear factor of activated T cells）シグナル阻害剤及びNFATシグナル阻害方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Nuclear factor of activated T cells （以下、NFATと略称する）は、T細胞活性化に重要なInterleukin-2（IL-2）の転写を活性化する因子として発見され、免疫抑制剤であるサイクロスポリンA（以下、CsAと略称する）やタクロリムス（以下、FK506と略称する）の標的であるセリン／スレオニン脱リン酸化酵素カルシニューリンによりその転写活性調節が行われていることが報告されている（図２参照）。すなわちCsAやFK506はNFATシグナルを阻害することによりT細胞活性化を抑制する。CsAやFK506は移植免疫抑制剤としてのみならず、免疫系の関与することが知られている関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎の治療薬としても認可されている。このようなNFATがNFAT結合配列（図２においては“NFAT site”）に結合することによって、当該NFAT結合配列より下流の遺伝子の転写が促進される系を『NFATシグナル』と称する。
【０００３】
発見の経緯などから、NFATは免疫系にのみ作用する因子として考えられてきたが、最近の研究からは免疫系に留まらず、心筋・骨格筋の分化調節による筋組織形成、脳における神経ネットワークの形成、骨芽細胞分化調節による骨代謝など、多くの臓器で発現し、重要な役割を果たす"多機能転写因子"として捉えられるようになってきた。
【０００４】
NFATシグナルが生体において及ぼす役割としては上述したとおりであるがNFATシグナルを阻害することで、免疫抑制作用（非特許文献１）、乾癬治療（非特許文献２）、アトピー性皮膚炎治療（非特許文献３）、（心）筋肥大抑制（非特許文献４）、抗リウマチ薬としての可能性（非特許文献５）、発毛作用（非特許文献６）及び破骨細胞分化抑制作用（非特許文献７）などが期待できると報告されている。また、前述のようにNFATは免疫性サイトカインIL-2を産生する経路を介していることから、NFATシグナル阻害剤は自己免疫疾患を含む免疫性サイトカインが関与していると考えられる疾患の治療または予防に有用である。かかる対象疾患としては、例えば各種のガン、各種白血病、各種肝炎、各種感染症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、消化性潰瘍、敗血症ショック、結核、不妊症、動脈硬化、ベーチェット病、喘息、腎炎、急性バクテリア髄膜炎、急性心筋梗塞、急性膵炎、急性ウイルス脳炎、成人呼吸促迫症候群、バクテリア肺炎、慢性膵炎、末梢血管疾患、敗血症、間質性肝疾患、時局性回腸炎、多発性硬化症などが挙げられる。したがって、新規にNFATシグナル阻害剤が同定されれば、免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、（心）筋肥大抑制剤、抗リウマチ薬、骨代謝疾患治療剤及び、上記に列記したような新規な医薬用途が期待される。また、新規にNFATシグナル阻害剤が同定されれば、発毛促進剤としての医薬部外品や化粧品用途が期待される。
【０００５】
【非特許文献１】Lee M and Park J、"Regulation of NFAT activation: a potential therapeutic target for immunosuppression" Mol Cells, 22: 1-7, 2006
【非特許文献２】Feldman S、"Advances in psoriasis treatment" Dermatol Online J, 6: 4, 2000
【非特許文献３】Hultsch T、"Immunomodulation and safety of topical calcineurin inhibitors for the treatment of atopic dermatitis" Dermatology, 211: 2, 2005
【非特許文献４】Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, Markham B, Richardson J, Robbins J, Grant SR, and Olson EN、"A calcineurin-dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy" Cell, 93: 215-228, 1998
【非特許文献５】Urushibara M, Takayanagi H, Koga T, Kim S, Isobe M, Morishita Y, Nakagawa T, Loeffler M, Kodama T, Kurosawa H, and Taniguchi T、" Antirheumatic drug, leflunomide, inhibits osteoclastgenesis by interfering with RANKL-stimulated induction of NFATc1" Arthritis and Rheumatism, 50: 794-804, 2004
【非特許文献６】Gafter-Gvili A, Sredni B, Gal R, Gafter U, and Kalechman Y、"Cyclosporin A-induced hair growth in mice is associated with inhibition of calcineurin-dependent activation of NFAT in follicular keratinocytes" Am J Physiol Cell Physiol, 284: C1593-C603, 2003
【非特許文献７】Takayanagi H, Kim S, Koga T, Nishina H, Isshiki M, Yoshida H, Saiura A, Isobe M, Yokochi T, Inoue J, Wagner EF, Mak TW, Kodama T, and Taniguchi T、" Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) integrate RANKL signaling in termial differentiation of osteoclasts" Developmental Cell, 3: 889-901, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、外用剤、医薬組成物、化粧品及び食品等に使用することのできる、新規なNFATシグナル阻害剤及び新規NFATシグナル阻害剤を使用したNFATシグナル阻害方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、NFATシグナル伝達に対する作用を評価する系を新規に構築し、当該系を用いて種々の植物についてNFATシグナル阻害作用を網羅的に解析した結果、NFATシグナル阻害作用を有する植物を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、ドリカンドロネ・スパタケア、ネコノヒゲ、アオツヅラフジ及びツクシメナモミから選ばれる少なくとも１種の植物、当該植物の抽出物及び当該抽出物に含まれる成分からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分としている。
【０００９】
特に、本発明に係るNFATシグナル阻害剤としては、ドリカンドロネ・スパタケアの果実の水性アルコール抽出物、ネコノヒゲの花及び枝の水性アルコール抽出物、アオツヅラフジの新芽の水性アルコール抽出物及びツクシメナモミの全草の水性アルコール抽出物を上記抽出物として含有することが好ましい。ここで、上記アルコール抽出物としては９５％エタノール抽出物を挙げることができる。
【００１０】
上述したNFATシグナル阻害剤を対象の細胞又は組織に接触させることによって、当該細胞又は組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るNFATシグナル阻害剤によれば、NFATによって正に制御される転写を抑制することができる。したがって、本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、例えば免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、（心）筋肥大抑制剤及び抗リウマチ薬等の候補物質として有用である。また、本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、有効成分として天然物質に由来するものを含有することから安全に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、ドリカンドロネ・スパタケア、ネコノヒゲ、アオツヅラフジ及びツクシメナモミから選ばれる少なくとも１種の植物、当該植物の抽出物及び当該抽出物に含まれる成分からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分としている。ここで、ドリカンドロネ・スパタケアとは、学名をDolichandrone spthacea (L.F.) K. Schunと称し、ノウゼンカズラ科に分類される植物である。ネコノヒゲとは、学名をOrthosiphon aristatus (Blume) Higと称し、シソ科に分類される植物である。アオツヅラフジとは、学名をCocculus orbiculatus (Thunb.) DC と称し、ツヅラフジ科に分類される植物である。ツクシメナモミとは、学名をSiegesbeckia orientalis L. と称し、キク科に分類される植物である。
【００１３】
本発明に係るNFATシグナル阻害剤におけるNFATシグナル阻害作用は、NFATシグナル阻害率を指標として評価することができる。一例として、ドリカンドロネ・スパタケア抽出物においては、NFATシグナル阻害率が40.7％である。ネコノヒゲ抽出物においては、NFATシグナル阻害率が67.3％である。アオツヅラフジ抽出物においては、NFATシグナル阻害率が44.1％である。ツクシメナモミ抽出物においては、NFATシグナル阻害率が66.7％である。NFATシグナル阻害率とは、要するに、抽出物を作用させないときのNFATによる転写活性に対して、抽出物を作用させたときの当該転写活性の低下率を意味している。
【００１４】
ここで、NFATシグナル阻害とは、NFATに対して直接的又は間接的に作用してNFATによる転写促進活性を低減させることを意味する。NFATシグナル阻害作用を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば公知のNFAT結合配列と当該NFAT結合配列の下流にレポーター遺伝子と有するプラスミドを導入した宿主を用いるレポーターアッセイを挙げることができる（図１参照）。なお、NFATの活性はカルシウムイオンに依存するため、レポーターアッセイはカルシウムイオンを宿主に流入させる条件下で行う。レポーター遺伝子としては、特に限定されず、従来、生化学実験の分野で使用されている如何なるレポーター遺伝子も使用することができる。例えばレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子（GUS遺伝子）及びグリーンフルオレセントプロテイン遺伝子（GFP遺伝子）等を挙げることができる。
【００１５】
NFAT結合配列とは、NFATが結合する配列からなるオリゴヌクレオチド、例えば、GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT（pNFAT-Luc、Stratagene、配列番号１）といった塩基配列を例示することができる。なお、上述したプラスミドにおいては、このようなNFAT結合配列を１セットとして複数セットを連結して導入してもよい。複数のNFAT結合配列を連結して使用することによって、NFATによる転写促進活性をより高感度に測定することができる。
【００１６】
なお、上述したNFATシグナル阻害率は、上述したレポーターアッセイから算出した値である。
【００１７】
特に、本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、ドリカンドロネ・スパタケア、ネコノヒゲ、アオツヅラフジ及びツクシメナモミから選ばれる少なくとも１種の植物における全草、葉、樹皮、枝、果実又は根等をそのまま含むものとすることができる。あるいは本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、当該植物の全草、葉、樹皮、枝、果実又は根等を粉砕して用いたものを含むことが好ましい。
【００１８】
また、本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、ドリカンドロネ・スパタケアの果実、ネコノヒゲの花及び枝、アオツヅラフジの新芽、ツクシメナモミの全草を使用することが好ましい。本発明に係るNFATシグナル阻害剤として植物抽出物を有効成分とする場合、植物抽出物は、植物を常温又は加温下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得られる。本発明において、植物の抽出物とは、上記抽出方法で得られた各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末を意味する。
【００１９】
植物の抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤又は非極性溶剤のいずれをも使用することができる。抽出溶剤としては、例えば水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び二酸化炭素等が挙げられる。あるいは、上記溶剤の2種以上を組み合わせた混合物を、抽出溶剤として用いることができる。
【００２０】
本発明に係るNFATシグナル阻害剤として植物抽出物を有効成分とする場合、抽出溶剤としては、水性アルコールが好ましく、９５％エタノールを使用することが特に好ましい。本発明に係るNFATシグナル阻害剤としては、上記植物の抽出物を、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、上記植物等の抽出物をクロマトグラフィー液々分配等の分離技術に供し、当該抽出物から不活性な夾雑物を除去したものを用いることもできる。なお、本発明に係るNFATシグナル阻害剤においては、表２に示した複数の植物のうち、１種の植物やその植物抽出物を有効成分としてもよいが、複数種の植物やそれら植物の抽出物を混合して有効成分としてもよい。
【００２１】
本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、NFATによる転写促進活性を低減させることから、細胞や組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。具体的には、上述した本発明に係るNFATシグナル阻害剤を対象とする細胞や組織に接触させることによって、当該細胞や組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。これにより、当該細胞や組織においては、NFATシグナルによって生ずる種々の遺伝子発現を転写レベルで抑制することができる。
【００２２】
本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、NFATによる転写促進活性を低減させることから、NFATによる転写促進活性の亢進に起因する症状や疾患に対する治療剤、又は予防剤として使用することができる。NFATによる転写促進活性の亢進に起因する症状や疾患としては、免疫系疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、心筋を含む筋肥大症、リウマチ、骨代謝疾患、各種のガン、各種白血病、各種肝炎、各種感染症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、消化性潰瘍、敗血症ショック、結核、不妊症、動脈硬化、ベーチェット病、喘息、腎炎、急性バクテリア髄膜炎、急性心筋梗塞、急性膵炎、急性ウイルス脳炎、成人呼吸促迫症候群、バクテリア肺炎、慢性膵炎、末梢血管疾患、敗血症、間質性肝疾患、時局性回腸炎、多発性硬化症等を挙げることができる。したがって、本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、免疫抑制剤、乾癬治療剤、（心）筋肥大抑制剤、抗リウマチ薬及び骨代謝疾患治療剤等として使用することができる。
【００２３】
本発明に係るNFATシグナル阻害剤を医薬用途として使用する場合、剤形として、特に限定されないが、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等が挙げられる。本発明に係るNFATシグナル阻害剤を経口投与の医薬用組成物として使用する場合、上記NFATシグナル阻害剤の他、経口投与剤の形態に応じて一般に用いられる、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料等を添加し、常法に従って製造することができる。経口投与用医薬組成物としては、免疫抑制剤、乾癬治療剤、（心）筋肥大抑制剤及び抗リウマチ薬等が挙げられる。
【００２４】
また、本発明に係るNFATシグナル阻害剤を皮膚用の医薬又は医薬部外品として使用する場合には、剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、軟膏、水剤、エキス剤、ローション剤及び乳剤等が挙げられる。当該医薬又は医薬部外品には、植物の抽出物の他に、助剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、吸収促進剤及び界面活性剤等の薬学的に許容される担体を任意に組合せて配合することができる。皮膚用医薬組成物としては、アトピー性皮膚炎治療剤等が挙げられる。
【００２５】
一方、本発明に係るNFATシグナル阻害剤を化粧料として使用する場合には、剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、油中水型又は水中油型の乳化化粧料、クリーム、ローション、ジェル、フォーム、エッセンス、ファンデーション、パック、スティック及びパウダー等が挙げられる。当該化粧料には、植物の抽出物の他に、化粧料成分として一般に使用されている油分、界面活性剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、pH調整剤、防腐剤、増粘剤、色素類、香料及び各種皮膚栄養剤等を任意に組合せて配合することができる。具体的には、本発明に係る皮膚外用剤には、皮膚化粧料に配合される薬効成分、例えば微粒子酸化亜鉛、酸化チタン、パーソールＭＣＸ、パーソール１７８９等の紫外線吸収剤、アスコルビン酸等のビタミン類、ヒアルロン酸ナトリウム、ワセリン、グリセリン、尿素等の保湿剤、ホルモン剤、及びコウジ酸、アルブチン、プラセンタエキス、ルシノール等の他の美白成分、ステロイド剤、アラキドン酸代謝物やヒスタミン等に代表される化学伝達物質産生・放出抑制剤（インドメタシン、イブプロフェン）、レセプター拮抗剤等の抗炎症剤、抗男性ホルモン剤、ビタミンＡ酸、ローヤルゼリーエキス、ローヤルゼリー酸等の皮脂分泌抑制剤、ニコチン酸トコフェロール、アルプロスタジル、塩酸イソクスプリン、塩酸トラゾリン等の抹消血管拡張剤及び末梢血管拡張作用のある炭酸ガス等、ミノキシジル、塩化カルプロニウム、トウガラシチンキ、ビタミンE誘導体、イチョウエキス、センブリエキス等の血行促進剤、ペンタデカン酸グリセリド、ニコチン酸アミド等の細胞賦活化剤、ヒノキチオール、L-メントール、イソプロピルメチルフェノール等の殺菌剤、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、セラミド及びセラミド類似化合物等を添加配合することができる。
【００２６】
本発明に係るNFATシグナル阻害剤を医薬、医薬部外品又は化粧料として使用する場合、植物の抽出物の配合量は、乾燥物として計算して、通常、医薬、医薬部外品又は化粧料の全組成の0.00001〜5重量％、特に0.0001〜0.1重量％とすることが好ましい。また、本発明に係るNFATシグナル阻害剤を医薬として用いる場合、植物の抽出物の塗布量は、通常の成人で固形分残量にして0.01mg〜1g/1日とすることが望ましい。なお、本発明に係る皮膚外用剤は、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合には皮膚面1cm2当たり1〜20mg、液状製剤の場合には同じく1〜20mg使用するのが好ましい。
【００２７】
また、本発明に係るNFATシグナル阻害剤を化粧品、医薬又は医薬部外品として使用する場合、例えばチョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、ゴム、コロイドシリカナトリウムポリアクリレート等の粉体；例えば鉱油、植物油、シリコーン油等の油又は油状物質；例えばソルビタントリオレエート、ソルビタントリステアレート、グリセロールモノオレエート、高分子シリコーン界面活性剤等の乳化剤；パラ−ヒドロキシベンゾエートエステル等の防腐剤；ブチルヒドロキシトルエン等の酸化防止剤；グリセロール、ソルビトール、２−ピロリドン−５−カルボキシレート、ジブチルフタレート、ゼラチン、ポリエチレングリコール等の湿潤剤；トリエタノールアミン又は水酸化ナトリウムのような塩基を伴う乳酸等の緩衝剤；グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の界面活性剤；密ろう、オゾケライトワックス、パラフィンワックス等のワックス類；増粘剤；活性増強剤；着色料；香料等、を必要に応じ適宜組合せて用いることができる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕  植物抽出物の製造
本実施例では、以下に示すように、４種類の植物から４種類の抽出液を製造した。
（１）ドリカンドロネ・スパタケア抽出物の製造
ドリカンドロネ・スパタケアの果実(ベトナム産)を１０ｇとり、１００ｍＬの９５％エタノールを加え、室温で７日間静置抽出後、ろ過し、ろ液を濃縮して抽出物１.３ｇを得た。蒸発残分１．０ｗ/ｖ％であった。
（２）ネコノヒゲ抽出物の製造
ネコノヒゲの花と枝(ベトナム産)を１０ｇとり、１００ｍＬの９５％エタノールを加え、室温で７日間静置抽出後、ろ過し、ろ液を濃縮して抽出物２.１ｇを得た。蒸発残分１．０ｗ/ｖ％であった。
（３）アオツヅラフジ抽出物の製造
アオツヅラフジの新芽(ベトナム産)を１０ｇとり、１００ｍＬの９５％エタノールを加え、室温で７日間静置抽出後、ろ過し、ろ液を濃縮して抽出物を得た。蒸発残分１．０ｗ/ｖ％であった。
（４）ツクシメナモミ抽出物の製造
ツクシメナモミの全草(ベトナム産)を１０ｇとり、１００ｍＬの９５％エタノールを加え、室温で７日間静置抽出後、ろ過し、ろ液を濃縮して抽出物を得た。蒸発残分１．０ｗ/ｖ％であった。
【００２９】
以上、本実施例１においては、（１）及び（４）に示したように４種類の植物抽出物を調整した。
【００３０】
〔実施例２〕  NFATシグナル阻害効果
本例では、NFATシグナル阻害効果を検証するための評価システムを構築し、当該評価システムを用いて実施例１で製造した４種類の植物抽出物についてのNFATシグナル阻害効果を検証した。
（１）評価システムのための材料及び方法
細胞培養
上記評価システムには、ヒト腎（HEK293）細胞をATCC（American Type Culture Collection）より購入し、使用した。HEK293細胞は、DMEM（High glucose、10% heat-inactivated FBS）中37℃、5% CO2条件下で培養した。
【００３１】
プラスミド、トランスフェクション
上記評価システムには、NFAT結合配列の下流にホタルルシフェラーゼが導入されたプラスミドpNFAT-Luc（Stratagene）をHEK293細胞にトランスフェクションしたものを使用した。詳細には、NFAT転写活性の評価用に4連のNFAT結合配列の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子が導入されたpNFAT-luc（STRATAGENE）をHEK293細胞にトランスフェクションした。また、トランスフェクション効率によるばらつきをなくすことを目的として、ホタルルシフェラーゼに由来するシグナルを補正するためにCMV promoterの下流にウミシイタケルシフェラーゼが導入されたpRL-CMV（Promega）を同時にトランスフェクションした。
【００３２】
トランスフェクションは、LipofectAMINE 2000 reagent（Invitrogen）を用いて使用説明書に従って行った。トランスフェクションの8時間後に培地を交換し、一晩インキュベートした。その後、実施例１で製造した植物抽出物を添加（0.5 vol%）し、その1時間後に1μM Ionomycinを添加した。8時間後、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。Ionomycinは、カルシウムイオンに特異的なイオノフォアであり、細胞内にカルシウムイオンを流入させる薬剤として知られている。Ionomycin添加により、カルシウムイオン依存性脱リン酸化酵素であるカルシニューリンが活性化し、それに伴ってNFATの転写活性が上昇することから、本システムはNFATシグナル活性化阻害剤を探索するのに適していると考えられる。
【００３３】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ルシフェラーゼレポーターアッセイは、Dual-Glo Luciferase Assay System（Promega）を用い、使用説明書に従って行った。すなわち、培地を除去後、PBSにより2倍希釈したDual-Glo luciferase reagentを加え、攪拌した後、20分後にホタルルシフェラーゼ活性を測定した。その後、等量のDual-Glo Stop&Glo reagentを加え、攪拌した後にウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性測定はMiniLumat LB 9506（EG&G BERTHOLD）を用いて行い、ルシフェラーゼによる発光量を定量的に検出した。双方ともルシフェラーゼ活性の測定時間は2秒とした。
【００３４】
NFATシグナル阻害率の算出
全てのNFAT転写活性（ホタルルシフェラーゼ活性）はトランスフェクション効率補正のために導入されたウミシイタケルシフェラーゼ活性にて除することで補正した。その後、NFATシグナル阻害率を以下の式にて算出した。
NFATシグナル阻害率（%）＝100−（試験サンプル及びIonomycin添加群−無刺激群）／（Ionomycinのみ添加群−無刺激群）×100
上記計算により、Ionomycin刺激によるNFATシグナル活性化をテストサンプルが何%阻害したかについて算出することができる。
【００３５】
結果
実施例１で製造した４種類の植物抽出物によるNFATシグナル阻害率を算出したところ、実施例１（１）で製造したドリカンドロネ・スパタケア抽出物によるNFATシグナル阻害率は４０．７％であり、実施例１（２）で製造したネコノヒゲ抽出物によるNFATシグナル阻害率は６７．３％であり、実施例１（３）で製造したアオツヅラフジ抽出物によるNFATシグナル阻害率は４４．１％であり、実施例１（４）で製造したツクシメナモミ抽出物によるNFATシグナル阻害率は６６．７％であった。
【００３６】
実施例１で製造した４種類の植物抽出物の全てにおいて、NFATシグナルを阻害することが明らかとなった。すなわち、実施例１で製造した４種類の植物抽出物は、全てNFATにより正に制御される転写を抑制することができる。したがって、実施例１で製造した４種類の植物抽出物は、全て優れたNFATシグナル阻害剤であり、例えば免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、（心）筋肥大抑制剤及び抗リウマチ薬等の候補物質として同定されたこととなる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】NFATシグナル阻害作用を測定する方法の一例として挙げたレポーターアッセイの概略構成図である。
【図２】NFATとNFAT結合部位との結合及びその下流の遺伝子転写促進を示す、NFATシグナルの概略構成図である。
【図１】
2009051741.tif 000002
【図２】
2009051741.tif 000003
【配列表】
2009051741000001.app