(57)【要約】【課題】多型マーカーの位置に因らず、ハプロタイプをより正確に検出することができるハプロタイプの検出方法を提供する。【解決手段】  第１の多型部位が野生型または変異型である標的核酸の夫々を増幅する２つの系について、特定の第１の多型部位を増幅可能な順方向プライマーと非特異的な逆方向プライマーを用いて、標的核酸における前記第１および第２の多型部位を含む領域の核酸をＰＣＲ増幅し、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の原理における受容体および供与体を有する、第２の多型部位を特定するためのプローブと標的核酸もしくはその相補鎖との間でハイブリッド体を形成させ、ハイブリッド体の形成、あるいはその分解により放出可能となる前記プローブの受容体または供与体のシグナルを検出することにより２箇所の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプを決定する。【選択図】  図３
2009159854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’末端側から順に第１、第２とする２箇所の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプの決定方法であって、
（１）前記第１の多型部位が野生型または変異型である標的核酸の夫々を増幅する２つの系について、以下の（Ａ）または（Ｂ）のプライマーセットを用いて、標的核酸における前記第１および第２の多型部位を含む領域の核酸をＰＣＲ増幅する工程と、
（Ａ）前記第１の多型が野生型である前記標的核酸を特異的に増幅する順方向プライマー、及び前記第２および第１の多型部位を含む領域の前記標的核酸の相補鎖を非特異的に増幅する逆方向プライマー、
（Ｂ）前記第１の多型が変異型である前記標的核酸を特異的に増幅する順方向プライマー、及び前記第２および第１の多型部位を含む領域の前記標的核酸の相補鎖を非特異的に増幅する逆方向プライマー、
（２）前記２つの系について、
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の原理における受容体および供与体を有する、以下の（i）または（ii）のプローブの少なくとも１種と、前記ＰＣＲにより増幅された増幅対象領域の標的核酸もしくはその相補鎖との間でハイブリッド体を形成させる工程と、
（i）前記第２の多型が野生型である前記標的核酸もしくはその相補鎖と特異的にハイブリッド体を形成する塩基配列を有するプローブ、
（ii）前記第２の多型が変異型である前記標的核酸もしくはその相補鎖と特異的にハイブリッド体を形成する塩基配列を有するプローブ、
（３）前記２つの系について、
前記ハイブリッド体の形成、あるいはその分解により放出可能となる前記プローブの受容体または供与体のシグナルを検出する工程と、を有することを特徴とするハプロタイプの決定方法。
【請求項２】
前記（２）の工程において、
前記（i）及び（ii）のプローブとして、それぞれ以下の（i−１）及び（ii−１）を用い、
前記ハイブリッド体の形成を前記ＰＣＲ増幅の反応中に行い、
前記（３）の工程において、
前記ハイブリッド体を形成したプローブが前記ＰＣＲ増幅のプライマー伸長時に分解されることで放出可能となる前記プローブの供与体のシグナルを検出する、
ことを特徴とする請求項１記載のハプロタイプの決定方法。
（i−１）前記第２の多型部位が野生型ヌクレオチドである前記標的核酸の前記第２の多型部位を含む領域の塩基配列と同一または相補的な配列を有し、
且つ蛍光共鳴エネルギー転移の供与体の機能を持つ第１の標識を有するプローブ。
（ii−１）前記第２の多型部位が変異型ヌクレオチドである前記標的核酸の前記第２の多型部位を含む領域の塩基配列と同一または相補的な配列を有し、且つ蛍光共鳴エネルギー転移の供与体の機能を持ち、前記第１の標識とは異なるシグナルを与える第２の標識を有するプローブ。
【請求項３】
前記（２）の工程において、
前記（i）及び（ii）のプローブとして、それぞれ以下の（i−２）及び（ii−２）を用い、
前記（３）の工程において、
前記プローブが前記標的核酸もしくはその相補鎖にアニールすることで前記蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が解消されることにより放出可能となる前記プローブの供与体のシグナルを検出する、
ことを特徴とする請求項１記載のハプロタイプの決定方法。
（i−２）前記第２の多型部位が野生型ヌクレオチドである前記標的核酸の前記第２の多型部位を含む領域の塩基配列と同一または相補的な配列を有し、
前記標的核酸およびその相補鎖とは結合せず、前記プローブ内で自己相補鎖を形成する配列を有し、
且つ蛍光共鳴エネルギー転移の供与体の機能を持つ第一の標識を有するプローブ。
（ii−２）前記第２の多型部位が変異型ヌクレオチドである前記標的核酸の前記第２の多型部位を含む領域の塩基配列と同一または相補的な配列を有し、
前記標的核酸およびその相補鎖とは結合せず、前記プローブ内で自己相補鎖を形成する配列を有し、
且つ蛍光共鳴エネルギー転移の供与体の機能を持ち、前記第１の標識とは異なるシグナルを与える第２の標識を有するプローブ。
【請求項４】
前記（２）の工程において、
前記（i）及び（ii）のプローブのいずれか１種のみを用い、且つ、（i）又は（ii）のプローブとしてそれぞれ以下の（i−３）又は（ii−３）を用い、
前記ハイブリッド体の形成を前記ＰＣＲ増幅の反応後に行い、
前記（３）の工程において、
前記プローブが前記標的核酸もしくはその相補鎖にアニールさせる温度を変化させて、前記ハイブリッド体が形成されていることにより、放出可能となる前記プローブの受容体のシグナルを検出する、
ことを特徴とする請求項１記載のハプロタイプの決定方法。
（i−３）前記第２の多型部位が野生型ヌクレオチドである前記標的核酸の前記第２の多型部位を含む領域の塩基配列と同一または相補的な配列を有し、
３’末端に前記供与体の機能を持つ標識を有する第１のプローブと、
前記標的核酸もしくはその相補鎖と結合し、前記第１のプローブと近傍に位置し、
５’末端に前記受容体の機能を持つ標識を有する第２のプローブとから構成されるプローブ。
（ii−３）前記第２の多型部位が変異型ヌクレオチドである前記標的核酸の前記第２の多型部位を含む領域の塩基配列と同一または相補的な配列を有し、
３’末端に前記供与体の機能を持つ標識を有する第１のプローブと、
前記標的核酸もしくはその相補鎖と結合し、前記第１のプローブと近傍に位置し、
５’末端に前記受容体の機能を持つ標識を有する第２のプローブとから構成されるプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は統計的な推定を用いず、実験的にハプロタイプを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハプロタイプとは、単一の染色体上に位置する２つまたはそれ以上の多型マーカーの組み合わせのことである。例えば、図１において、個体Aのゲノムの遺伝子座１と遺伝子座２とがある場合、一方のゲノム上ではA-Tというハプロタイプを持ち、もう一方のゲノム上ではA-Gというハプロタイプを持つと言う。ハプロタイプは、図１でA-T,A-Gと表すように、ゲノム上の特定の位置にある１塩基の多型であるＳＮＰｓ（１塩基遺伝子多型）に基づいている。
【０００３】
近年の研究で、上記ハプロタイプが疾患の発症や薬剤応答性（薬効・副作用）と関係があることが明らかになりつつある。例えば、薬物代謝酵素のN−アセチル化転移酵素２（NAT2）が挙げられる。このNAT２酵素をコードする遺伝子には３ヶ所のＳＮＰが存在するが、２本の染色体のうち少なくとも一本の染色体において、3ヶ所のＳＮＰが全て野生型でないと副作用のリスクが高まる。したがって、ハプロタイプを正確に検出することは大変重要である。
【０００４】
現在ハプロタイプの解析に用いられるものとして、統計学的にハプロタイプを推定する手法が注目されている。家系データが与えられたときのハプロタイプを決定する手法としては、Linkage Package（例えば、非特許文献１参照）やGENEHUNTER（例えば、非特許文献２参照）のようなソフトウェアがある。一方、家系データが存在しない場合は、Clarkのアルゴリズムやハーディ・ワインバーグ平衡（Hardy-Weinberg equilibrium: HWE）を仮定して遺伝子を数えることによるＥＭアルゴリズムを用いた最尤推定する手法（非特許文献３）がある。しかし、これらの方法はあくまでも推定であり、パラメーターの設定によっては結果が異なってくるので、精度が高いと言い切ることはできない。つまり、統計学を利用している限り正確度が100%にはなりえない。
【０００５】
そこで、統計的な推定を用いず、実験的な方法でハプロタイプを検出することが望まれている。
【０００６】
現状、多型を解析する装置として代表的なものにシーケンサーとリアルタイムＰＣＲが存在する。ただ、これらの装置では２本の染色体情報が１本の染色体情報としてまとめられて検出されるため、１本の染色体情報であるハプロタイプを正確に検出することは困難である。図２に示すように個体Aの遺伝子座1がA/A、遺伝子座２がT/Gという遺伝子型であることが解析された場合、一方のゲノム上のハプロタイプはA-Tであり、もう一方のゲノム上のハプロタイプはA-Gであることが分かる。しかし、個体Bの遺伝子座１にはA/C、遺伝子座2にはT/Gという遺伝子型が解析結果として得られた場合は、この解析結果から個体Bのハプロタイプを判定することは不可能である。つまり、個体Bのハプロタイプが、一方のゲノム上でA-T、他方のゲノム上でC-Gである場合と、一方のゲノムがA-G、他方のゲノムがC-Tである場合とを区別することはできない。
【０００７】
ハプロタイプを実験的に直接解析する方法として、アレル特異的ＰＣＲと電気泳動の解析を組み合わせたものがある（特許文献１参照）。この方法では２つの多型マーカーのハプロタイプを決定するもので、各多型マーカーに対してアレル特異的なプライマーを２種類ずつ用意し、２つの多型マーカーが含まれるように順方向と逆方向プライマーの両方でアレル特異的なＰＣＲを行う。そして得られた増幅産物が、どの順方向および逆方向プライマー対の組み合わせで増幅されたかを、電気泳動にて解析することで、ハプロタイプを決定する。さらに具体的に示すと、第一の多型マーカーを含む順方向プライマーは5'末端に、アレルによって異なるシグナルを与える標識が修飾されている。また第二の多型マーカーを含む逆方向プライマーにおいては、5'末端にターゲット配列には含まれないフラップ配列をつけて、アレルによって異なる長さになるように設計されている。これらのプライマーを用いて両方向でアレル特異的にＰＣＲを行い、増幅産物中の蛍光標識と増幅産物長を検出することによって、どのプライマー対により増幅されたかが分かり、ハプロタイプを決定することが可能となる。
【特許文献１】特開2002-272482号公報
【非特許文献１】G. M. Lathrop et al., "Multilocus linkage analysis in humans: detection of linkage and estimation of recombination," Am. J. Hum. Genet., vol.37, pp.482-498, 1985
【非特許文献２】L. Kruglyak, M. J. Daly, M. P. Reeve-Daly and E. S. Lander, "Parametric and nonparametric linkage analysis: a unified multipoint approach," Am. J. Hum. Genet., vol.58, pp.1347-1363, 1996
【非特許文献３】M. N. Chiano and D. G. Clayton, "Fine genetic mapping using haplotype analysis and the missing problem," Ann. Hum. Genet., vol.62, pp.55-60, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上記方法においては、順方向および逆方向の両方のプライマーに多型配列部位が含まれることが必須の要件となる。そのため、プライマーの塩基配列の選択の自由度が制限を受ける。ここで、アレル特異的なＰＣＲを行なう為には、ＰＣＲに用いる順方向のプライマーと逆方向のプライマー間でTmを揃えることが必要となるが、上記した通り、プライマーの塩基配列の選定に制約があると、プライマー間でTmを揃えることが困難となる場合が想定される。言い換えると、上記特許文献１の方法によって精度よくハプロタイプを検出できるのはTmが揃ったプライマーを設定可能な位置に多型マーカーが存在している場合に限定されてしまう可能性がある。また、上記検出法では、両方向のプライマーの配列位置をずらすことが困難なため、順方向のプライマーと逆方向のプライマー間でプライマーダイマーを形成した場合には、ハプロタイプを検出できなくなる。
【０００９】
そこで、本発明の目的は、多型マーカーの位置に因らず、ハプロタイプをより正確に検出することができるハプロタイプの検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係るハプロタイプの決定方法は、
５’末端側から順に第１、第２とする２箇所の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプの決定方法であって、
（１）前記第１の多型部位が野生型または変異型である標的核酸の夫々を増幅する２つの系について、以下の（Ａ）または（Ｂ）のプライマーセットを用いて、標的核酸における前記第１および第２の多型部位を含む領域の核酸をＰＣＲ増幅する工程と、
（Ａ）前記第１の多型が野生型である前記標的核酸を特異的に増幅する順方向プライマー、及び前記第２および第１の多型部位を含む領域の前記標的核酸の相補鎖を非特異的に増幅する逆方向プライマー、
（Ｂ）前記第１の多型が変異型である前記標的核酸を特異的に増幅する順方向プライマー、及び前記第２および第１の多型部位を含む領域の前記標的核酸の相補鎖を非特異的に増幅する逆方向プライマー、
（２）前記２つの系について、
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の原理における受容体および供与体を有する、以下の（i）または（ii）のプローブの少なくとも１種と、前記ＰＣＲにより増幅された増幅対象領域の標的核酸もしくはその相補鎖との間でハイブリッド体を形成させる工程と、
（i）前記第２の多型が野生型である前記標的核酸もしくはその相補鎖と特異的にハイブリッド体を形成する塩基配列を有するプローブ、
（ii）前記第２の多型が変異型である前記標的核酸もしくはその相補鎖と特異的にハイブリッド体を形成する塩基配列を有するプローブ、
（３）前記２つの系について、
前記ハイブリッド体の形成、あるいはその分解により放出可能となる前記プローブの受容体または供与体のシグナルを検出する工程と、を有することを特徴とするハプロタイプの決定方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るハプロタイプの検出方法によれば、逆方向プライマーはＰＣＲ産物が第２のＳＮＰ部位を含むよう設計すればよく、アレル特異的配列にする必要がない。したがって、逆方向プライマーのTmを順方向プライマーに合わせやすく、アレル特異的ＰＣＲを容易に達成可能である。その結果、前記アレル特異的ＰＣＲと蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）プローブでの検出を組み合わせて、ハプロタイプの検出を正確に行うことができる。
【００１２】
本発明によれば、考えられうる全てのハプロタイプの組み合わせを蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）プローブから得られるシグナルのプロファイルから一意に決定することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明に係る２箇所の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプを決定する方法は、以下で示す工程（１）から（３）を有する。２箇所の多型部位は、標的核酸の５’末端側から順に第１の多型部位、第２の多型部位とする。
【００１４】
工程（１）は、第１の多型部位が野生型または変異型である標的核酸の夫々を増幅する２つの系について、以下の（Ａ）または（Ｂ）のプライマーセットを用いて、標的核酸における第１および第２の多型部位を含む領域の核酸をＰＣＲ増幅する工程である。
（Ａ）のプライマーセットは、第１の多型が野生型である標的核酸を特異的に増幅する順方向プライマー、及び第２および第１の多型部位を含む領域の標的核酸の相補鎖を非特異的に増幅する逆方向プライマーからなる。
（Ｂ）のプライマーセットは、第１の多型が変異型である標的核酸を特異的に増幅する順方向プライマー、及び第２および第１の多型部位を含む領域の標的核酸の相補鎖を非特異的に増幅する逆方向プライマーからなる。
【００１５】
工程（２）は、工程（１）の２つの系について、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）原理における受容体と供与体とを有する、以下の（i）または（ii）のプローブの少なくとも１種と、工程（１）でのＰＣＲ増幅の反応中もしくは反応後の増幅対象領域の標的核酸もしくはその相補鎖との間でハイブリッド体を形成させる工程である。
（i）のプローブは、第２の多型が野生型である標的核酸もしくはその相補鎖と特異的にハイブリッド体を形成する塩基配列を有するプローブである。
（ii）のプローブは、第２の多型が変異型である標的核酸もしくはその相補鎖と特異的にハイブリッド体を形成する塩基配列を有するプローブである。
【００１６】
（i）のプローブと（ii）のプローブの両方を共存させて用いる場合、アニーリング温度の差から、第１の多型部位が野生型である標的核酸もしくは相補鎖と（i）のプローブとの間でハイブリッド体が形成され、変異型である標的核酸もしくは相補鎖と（ii）のプローブとの間でハイブリッド体が形成される。プローブの受容体および供与体のうち検出対象となるものが、（i）及び（ii）のプローブの間で区別し検出できるように異なる標識を用いることが好ましい。
【００１７】
工程（３）は、上記２つの系について、工程（２）でのプローブと標的核酸もしくはその相補鎖とのハイブリッド体が形成、あるはその分解により放出可能となるプローブにおける受容体または供与体のシグナルを検出する工程である。
【００１８】
工程（２）についてはより詳しくは次のとおりである。
まず、工程（２）におけるハイブリッド体の形成は、工程（１）のＰＣＲ増幅により増幅された増幅対象領域の標的核酸もしくはその相補鎖とプローブとの間で行い、反応中に行う場合と反応後に行う場合の２通りがある。
ＰＣＲ増幅反応は、一般的には、標的核酸を含む鋳型ＤＮＡの熱変性工程、一本鎖になった標的核酸もしくは相補鎖とプライマーとのアニーリング工程、およびポリメラーゼによる標的核酸もしくは相補鎖に結合したプライマーの伸長（ＤＮＡ合成）工程を繰り返す反応である。そして、ＰＣＲ増幅の反応中（工程（１）の処理中）にハイブリッド体を形成する場合は、ＰＣＲ増幅反応のアニーリング反応工程においてハイブリッド体を形成することが好ましい。そのような場合に用いるプローブは、ＰＣＲ増幅プライマーのアニーリング温度までにハイブリッドを形成し、熱変性温度までにハイブリッド体を解離するようにプローブ配列を設定することが好ましい。
ＰＣＲ増幅の反応後（工程（１）の後）にプローブと増幅対象領域の標的核酸もしくはその相補鎖とのハイブリッド体を形成する場合は、増幅産物である増幅対象領域の標的核酸および相補鎖からなる２本鎖を例えば熱変性などにより一本鎖とした後にハイブリッド体を形成させることができる。
【００１９】
工程（３）についてより詳しくは次のとおりである。
【００２０】
まず、ハイブリッド体が形成されることで放出可能となるプローブのシグナルの検出は、（i）及び（ii）のプローブの両方を共存させてハイブリッド体を形成させたものについて行ってもよいし、いずれか１種を用いてハイブリッド体を形成させたものについて行ってもよい。（i）及び（ii）の両方を用いる場合は、上述したとおり、標的核酸として野生型、変異型あるいはその両方を含む検体の第２の多型部位を決定することができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物を用いる場合は、（i）及び（ii）のいずれか１種を用いることができ、プローブと野生型あるいは変異型の標的核酸との間でのフルマッチ（完全相補）であるか１塩基ミスマッチであるかによるアニーリング温度の違いにより標的核酸の多型を決定することができる。
また、アニールさせる温度を変化させる処置は（２）の工程におけるハイブリッド体を形成させる際に行ってもよいし、あるいはハイブリッド体を形成させた後、再び温度を上昇させることで行ってもよい。いずれの場合も、温度の変化は多型部位が塩基対を形成するものと形成しないものでハイブリッド体の形成のタイミングを区別できる程度に穏やかであることが好ましい。
検出を行う際のプローブと標的核酸等とを含む反応場の温度は、少なくとも以下の温度範囲を含むことが好ましい。すなわち、多型部位が塩基対を形成しないミスマッチのハイブリッド体がアニールする温度より高く、多型部位が塩基対を形成しないフルマッチのハイブリッド体がアニールする温度より低い範囲である。
例えば、熱変性させた後、プローブとフルマッチおよびミスマッチいずれの標的核酸もアニールするまで温度を下げてプローブと標的核酸とがハイブリッド体を形成した後に、昇温することによりミスマッチのハイブリッド体が解離し、フルマッチのハイブリッド体が維持される状態でシグナルを検出することで第２の多型部位を決定することができる。
【００２１】
ハイブリッド体が形成されることで放出可能となるプローブのシグナルとしては、プローブの種類によって適宜選択することができる。例えば、分子ビーコンタイプのプローブを用いる場合は、プローブ内で形成している自己相補鎖が解離することにより蛍光共鳴エネルギー転移が生じなくなるので供与体から放出可能となるシグナルを対象とすることが好ましい。また、受容体を有する第１のプローブと供与体を有する第２のプローブからなるハイブリプローブタイプのプローブを用いる場合は、ハイブリッド体の形成により、蛍光共鳴エネルギー転移が生じるようになるので、受容体から放出されるシグナルを検出対象とすることが好ましい。
【００２２】
同様に、ハイブリッド体の分解により放出可能となるプローブのシグナルを検出する場合は、ＴaqManプローブなどの蛍光共鳴エネルギー転移が生じる距離で受容体と供与体を保持するタイプのプローブを用いることができる。このタイプのプローブでは、分解によりＦＲＥＴが生じなくなるため、供与体からのシグナルを検出の対象とすることが好ましい。
【００２３】
ＦＲＥＴプローブの受容体または供与体に蛍光色素の標識を用いる場合は励起により放出されるシグナル（蛍光）を検出することができる。
【００２４】
以上の各工程を行うことにより、（１）の工程でのＰＣＲ増幅の結果から第１の多型を特定し、（３）の工程での検出結果から第２の多型を特定することを可能とする。
【００２５】
FRETの原理に基づく（i）及び（ii）のプローブとして以下のものが好適に用いることができる。
【００２６】
まず、以下の（i−１）及び（ii−１）を用いることができる。
（i−１）第２の多型部位が野生型ヌクレオチドである標的核酸の前記第２の多型部位を含む領域の塩基配列と同一または相補的な配列を有し、
且つ蛍光共鳴エネルギー転移の供与体の機能を持つ第１の標識を有するプローブ。
（ii−１）第２の多型部位が変異型ヌクレオチドである標的核酸の前記第２の多型部位を含む領域の塩基配列と同一または相補的な配列を有し、且つ蛍光共鳴エネルギー転移の供与体の機能を持ち、第１の標識とは異なるシグナルを与える第２の標識を有するプローブ。
このプローブを用いる場合は、工程（２）におけるハイブリッド体の形成を工程（１）のＰＣＲ増幅の反応中に行うことが好ましい。そして、工程（３）では、ハイブリッド体を形成したプローブが工程（１）のＰＣＲ増幅のプライマー伸長時に分解されることで放出可能となるプローブの供与体のシグナルを検出することで第２の多型を検出することができる。
【００２７】
次に、（i）及び（ii）のプローブとして、それぞれ以下の（i−２）及び（ii−２）を用いることができる。
（i−２）第２の多型部位が野生型ヌクレオチドである標的核酸の前記第２の多型部位を含む領域の塩基配列と同一または相補的な配列を有し、
標的核酸およびその相補鎖とは結合せず、前記プローブ内で自己相補鎖を形成する配列を有し、
且つ蛍光共鳴エネルギー転移の供与体の機能を持つ第一の標識を有するプローブ。
（ii−２）第２の多型部位が変異型ヌクレオチドである標的核酸の第２の多型部位を含む領域の塩基配列と同一または相補的な配列を有し、
標的核酸およびその相補鎖とは結合せず、プローブ内で自己相補鎖を形成する配列を有し、
且つ蛍光共鳴エネルギー転移の供与体の機能を持ち、第１の標識とは異なるシグナルを与える第２の標識を有するプローブ。
このプローブを用いる場合は、工程（２）におけるハイブリッド体の形成は、工程（１）のＰＣＲ増幅の反応中であってもよいし、ＰＣＲ増幅の反応の後の増幅産物を用いてもよい。そして工程（３）では、プローブが標的核酸もしくはその相補鎖にアニールすることで蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が解消されることにより放出可能となるプローブの供与体のシグナルを検出することで第２の多型を検出することができる。
【００２８】
さらに、（i）又は（ii）のプローブとして、それぞれ以下の（i−３）又は（ii−３）を用いることができる。
（i−３）第２の多型部位が野生型ヌクレオチドである標的核酸の前記第２の多型部位を含む領域の塩基配列と同一または相補的な配列を有し、
３’末端に前記供与体の機能を持つ標識を有する第１のプローブと、
標的核酸もしくはその相補鎖と結合し、第１のプローブと近傍に位置し、
５’末端に受容体の機能を持つ標識を有する第２のプローブとから構成されるプローブ。
（ii−３）第２の多型部位が変異型ヌクレオチドである標的核酸の第２の多型部位を含む領域の塩基配列と同一または相補的な配列を有し、
３’末端に供与体の機能を持つ標識を有する第１のプローブと、
標的核酸もしくはその相補鎖と結合し、第１のプローブと近傍に位置し、
５’末端に受容体の機能を持つ標識を有する第２のプローブとから構成されるプローブ。
このプローブを用いる場合は、工程（２）におけるハイブリッド体の形成は工程（１）のＰＣＲ増幅の反応後に行うことが好ましい。そして、工程（３）では、プローブが標的核酸もしくはその相補鎖にアニールさせる温度を変化させてハイブリッド体が形成されていることにより放出可能となるプローブの受容体のシグナルを検出することで第２の多型を検出することができる。
【００２９】
本発明に係る基本的な原理を図３から図６を用いて説明する。
【００３０】
図３において、標的核酸３０１は、その相補鎖３０３と二本鎖核酸を構成している。そして、標的核酸３０１は、５’側に第１のＳＮＰ、３’側に第２のＳＮＰを有している。従って、相補鎖３０３は、３’側に核酸３０１の第１のＳＮＰに対応する第３のＳＮＰ、５’側に、核酸３０１の第２のＳＮＰに対応する第４のＳＮＰを有していることとなる。ここで、標的核酸３０１の第１のＳＮＰ部位における野生型ヌクレオチドは「Ｃ」、変異型ヌクレオチドは「Ｔ」とする。また標的核酸３０１の第２のＳＮＰ部位における野性型ヌクレオチドは「Ｇ」、変異型ヌクレオチドは「Ｔ」とする。従って相補鎖３０３の第３のＳＮＰ部位における野性型ヌクレオチドは「Ｇ」、変異型ヌクレオチドは「Ａ」、第４のＳＮＰ部位における野性型ヌクレオチドは「Ｃ」、変異型ヌクレオチドは「Ａ」となる。
【００３１】
次いで、図３、４に示す通り標的核酸３０１の５’側に位置している第１のＳＮＰに対してアレル特異的な２種類の順方向プライマー３０５、３０７を用意する。第１の順方向プライマー３０５は、３’末端にヌクレオチド「Ｃ」を有する。第２の順方向プライマー３０７は、３’末端にヌクレオチド「Ｔ」を有する。
【００３２】
一方、逆方向プライマー３０９も用意する。逆方向プライマー３０９は、相補鎖３０３の、第４のＳＮＰ部位よりも５’側の、前記第４のＳＮＰを含まない所定の長さの塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するものとする。
【００３３】
次に、図３、４に示す通り核酸３０１の、第２のＳＮＰについて野生型及び変異型の各々のヌクレオチド「Ｇ」、「Ｔ」を含む所定の長さ塩基配列に対して同一な塩基配列を有する２つの蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）プローブ３１１、３１３の各々を用意する。ＦＲＥＴプローブとしては、両末端を異なる蛍光色素で標識した数十塩基のオリゴヌクレオチドを好適に用いることができる。ＦＲＥＴプローブが有する異なる蛍光色素の一方はエネルギーを与える供与体となり、他方はエネルギーを受け取る受容体として働き、供与体と受容体は蛍光共鳴エネルギー転移が起きる程度に互いに接近していることが条件となる。ＦＲＥＴプローブが単体で存在しているとき、供与体となるレポーターの励起光を照射してもレポーター色素の蛍光波長が受容体となるクエンチャー色素の励起波長に近似しているため、クエンチャー色素の励起エネルギーとして利用されるため、レポーター色素の蛍光は抑制される。しかし、ＦＲＥＴプローブが分解されるとレポーター色素はクエンチャー色素と距離が離れるため、蛍光を発生するという特徴を持つ。本発明では、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によりＦＲＥＴプローブ３１３は分解される。具体的には、相補鎖３０３を鋳型として順方向プライマーのＤＮＡ鎖を伸長させるＤＮＡポリメラーゼが、ＦＲＥＴプローブ３１３がハイブリッド体を形成する相補鎖３０３上の位置に達することでＦＲＥＴプローブ３１３を分解することができる。
【００３４】
ここで、第１のＦＲＥＴプローブ３１１は、５’末端に第１のレポーター色素３１５を有し、３’末端に第１のクエンチャー色素３１７を有する。第２のＦＲＥＴプローブ３１３は、５’末端に第２のレポーター色素３１９を有し、３’末端に第２のクエンチャー色素３２１を有する。そして、第１のレポーター色素３１５と第２のレポーター色素３１９は、互いに区別し得るシグナルを生じるものである。例えば、異なる波長の蛍光を発する２種の標識の組み合わせが挙げられる。具体的には、下表１中１）と２）等の組み合わせが挙げられる。
【００３５】
【表１】
2009159854.tif 000003
【００３６】
次いで、２つの生化学反応容器を用意する。第１の生化学反応容器内では、図３に示す通り、第１の順方向プライマー３０５と第１のＦＲＥＴプローブ３１１と第２のＦＲＥＴプローブ３１３を用いて、前記標的核酸３０１のＰＣＲ増幅をする。
【００３７】
一方、第２の生化学反応容器内では、図４に示す通り、第２の順方向プライマー３０７と第１のＦＲＥＴプローブ３１１と第２のＦＲＥＴプローブ３１３を用いて、前記標的核酸３０１のＰＣＲ増幅を行う。
【００３８】
すると相補鎖３０３は、第３のＳＮＰ部位にヌクレオチド「Ｇ」を有するため、第１の生化学反応容器内に含まれる第１の順方向プライマー３０５が伸長される。一方、第２の生化学反応容器内に含まれる第２の順方向プライマー３０７は、標的核酸３０１の第１のＳＮＰ部位、及び相補鎖３０３の第３のＳＮＰ部位において相補的なヌクレオチドを有しないため、伸長しない。
【００３９】
さらに、ＳＮＰ部位が「Ｇ」である第１のＦＲＥＴプローブ３１１は、ＰＣＲ工程内のアニーリング中に相補鎖３０３と図５に示すようにハイブリッド体を形成する。そのため、図６に示す通り伸長反応時に５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により、第１のＦＲＥＴプローブ３１１が分解されて、第１のレポーター色素３１５由来のシグナルが検出される。一方、ＳＮＰ部位が「Ｔ」である第２のＦＲＥＴプローブ３１３は、ミスマッチのため、ハイブリッド体を形成しない。そのため、第２のＦＲＥＴプローブ３１３は分解されず、第２のレポーター色素３１９由来のシグナルは検出されない。
【００４０】
つまり、ＦＲＥＴプローブの分解によって得られるシグナルから、標的核酸３０１の第２のＳＮＰ部位のヌクレオチドが「Ｇ」であることが決定される。また、ＦＲＥＴプローブの分解によって得られるシグナルが、どの生化学反応容器から検出されるかによって、標的核酸３０１の第１のＳＮＰ部位のヌクレオチドが「Ｃ」であることが決定される。
【００４１】
標的核酸３０１の第１のＳＮＰが「Ｔ」、第２のＳＮＰが「Ｔ」であった場合について、説明する（図７参照）。上述の原理に基づくと、相補鎖３０３は第３のＳＮＰ部位にヌクレオチド「Ａ」を有するため、第２の生化学反応容器内に含まれる第２の順方向プライマー３０７が伸長される。さらに、ＳＮＰ部位が「Ｔ」である第２のＦＲＥＴプローブ３１３は、ＰＣＲ工程中のアニーリング中に相補鎖３０３と図７に示すようにハイブリッド体を形成する。そのため、伸長反応時に第２のＦＲＥＴプローブ３１３が分解されて、第２のレポーター色素３１９由来のシグナルが検出される。これにより、標的核酸３０１の第１のＳＮＰが「Ｔ」、第２のＳＮＰが「Ｔ」であることが決定される。
【００４２】
標的核酸３０１の第１のＳＮＰが「Ｃ」、第２のＳＮＰが「Ｔ」であった場合は以下の通りとなる（図８参照）。相補鎖３０３は第３のＳＮＰ部位にヌクレオチド「Ｇ」を有するため、第１の生化学反応容器内に含まれる第１の順方向プライマー３０５のみから伸長される。さらに、ＳＮＰ部位が「Ｔ」である第２のＦＲＥＴプローブ３１３は、ＰＣＲ工程内のアニーリング中に相補鎖３０３と図８に示すようにハイブリッド体を形成する。そのため、伸長反応時に第２のＦＲＥＴプローブ３１３が分解されて、第２のレポーター色素３１９由来のシグナルが検出される。これにより、標的核酸３０１の第１のＳＮＰが「Ｃ」、第２のＳＮＰが「Ｔ」であることが決定される。
【００４３】
また標的核酸３０１の第１のＳＮＰが「Ｔ」、第２のＳＮＰが「Ｇ」であった場合には以下の通りである（図９参照）。相補鎖３０３は第３のＳＮＰ部位にヌクレオチド「A」を有するため、第２の生化学反応容器内に含まれる第２の順方向プライマー３０７からのみ伸長される。さらに、ＳＮＰ部位が「Ｇ」である第１のＦＲＥＴプローブ３１１は、ＰＣＲ工程内のアニーリング中に相補鎖３０３と図９に示すようにハイブリッド体を形成する。そのため、伸長反応時に第１のＦＲＥＴプローブ３１１が分解されて、第１のレポーター色素３１５由来のシグナルが検出される。これにより、標的核酸３０１の第１のＳＮＰが「Ｔ」、第２のＳＮＰが「Ｇ」であることが決定される。
【００４４】
（染色体２本の場合）
ヒトは染色体を２本ずつ持っているため、ハプロタイプが２種存在し得る。即ち、図１０において、５０１は第１の染色体を構成する核酸であり、５０３は第２の染色体を構成する核酸である。図１０では、標的核酸５０１の相補鎖、及び標的核酸５０３の相補鎖は簡略のために不図示とした。そして標的核酸５０１及び標的核酸５０３の各々には、第１のＳＮＰと第２のＳＮＰが存在している。ここで、第１のＳＮＰにおける野生型のヌクレオチドが「Ｃ」、変異型のヌクレオチドが「Ｔ」、第２のＳＮＰにおける野生型のヌクレオチドが「Ｇ」、変異型のヌクレオチドが「Ｔ」であったとする。この場合、ハプロタイプには、下記表２に示した様に１０通りの組み合わせがあり得る。
【００４５】
下記表２中、標的核酸５０１と標的核酸５０３とで、ハプロタイプが一致している場合をホモ検体、不一致の場合をヘテロ検体とよぶ。
【００４６】
【表２】
2009159854.tif 000004
【００４７】
そして前記した本発明に係るハプロタイプの検出方法は、上記表に掲げた１０通りの組み合わせの全てについて、検出されるレポーター色素の種類とその検出シグナルがどの生化学反応容器から検出されるかの識別により一意に決定することが可能である。
【００４８】
以下具体的に説明する。
【００４９】
先ず、ホモ検体の場合、即ち、ハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｇ、Ｃ−Ｇ）、（Ｔ−Ｔ、Ｔ−Ｔ）、（Ｃ−Ｔ、Ｃ−Ｔ）及び（Ｔ−Ｇ、Ｔ−Ｇ）である場合について説明する。この場合、プライマー３０５あるいは３０７、３０９とＦＲＥＴプローブ３１１、３１３を用いて得られるハイブリッド体は、図５、７、８、９と同様となる。
【００５０】
一方、ヘテロ検体の場合、例えばハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｔ、Ｃ−Ｇ）の場合、第１の順方向プライマーからのみ伸長する。また、図５、８に示すように第１のＳＮＰ部位が「Ｇ」である第１のＦＲＥＴプローブと、またＳＮＰ部位が「Ｔ」である第２のＦＲＥＴプローブとハイブリッド体を形成する。次いで、伸長反応とともにＦＲＥＴプローブは分解され、第１のレポーター色素由来のシグナルと、第２のレポーター色素由来のシグナルが、第１の順方向プライマーを有する第１の生化学反応容器からのみ検出される。
【００５１】
ハプロタイプの組み合わせが（Ｔ−Ｇ、Ｃ−Ｔ）の場合、第１の順方向プライマーおよび第２の順方向プライマーから伸長する。そして、図８、９に示すようにＳＮＰ部位が「Ｇ」である第１のＦＲＥＴプローブと、またＳＮＰ部位が「Ｔ」である第２のＦＲＥＴプローブとハイブリッド体を形成する。次いで、伸長反応とともにＦＲＥＴプローブは分解され、第１のレポーター色素由来のシグナルは第２の順方向プライマーを有する第２の生化学反応容器から、第２のレポーター色素由来のシグナルが、第１の順方向プライマーを有する第１の生化学反応容器から検出される。
【００５２】
ハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｇ、Ｔ−Ｔ）の場合、第１の順方向プライマーおよび第２の順方向プライマーから伸長する。そして、図５と７に示すようにＳＮＰ部位が「Ｇ」である第１のＦＲＥＴプローブと、またＳＮＰ部位が「Ｔ」である第２のＦＲＥＴプローブとハイブリッド体を形成する。次いで、伸長反応とともにＦＲＥＴプローブは分解され、第１のレポーター色素由来のシグナルは第１の順方向プライマーを有する第１の生化学反応容器から、第２のレポーター色素由来のシグナルが、第２の順方向プライマーを有する第２の生化学反応容器から検出される。
【００５３】
ハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｇ、Ｔ−Ｇ）の場合、第１の順方向プライマーおよび第２の順方向プライマーから伸長する。そして、図５と９に示すようにＳＮＰ部位が「Ｇ」である第１のＦＲＥＴプローブのみとハイブリッド体を形成する。次いで、伸長反応とともにＦＲＥＴプローブは分解される。その結果、第１のレポーター色素由来のシグナルが、第１の順方向プライマーを有する第１の生化学反応容器と第２の順方向プライマーを有する第２の生化学反応容器から検出される。
【００５４】
ハプロタイプの組み合わせが（Ｔ−Ｔ、Ｃ−Ｔ）の場合、第１の順方向プライマーおよび第２の順方向プライマーから伸長する。そして、図７、８に示すようにＳＮＰ部位が「Ｔ」である第２のＦＲＥＴプローブのみとハイブリッド体を形成する。次いで、伸長反応とともにＦＲＥＴプローブは分解され、第２のレポーター色素由来のシグナルが、第１の順方向プライマーを有する第１の生化学反応容器からも第２の順方向プライマーを有する第２の生化学反応容器からも検出される。
【００５５】
ハプロタイプの組み合わせが（Ｔ−Ｔ、Ｔ−Ｇ）の場合、第２の順方向プライマーおよびからのみ伸長する。そして、図７、９に示すようにＳＮＰ部位が「Ｇ」である第１のＦＲＥＴプローブとＳＮＰ部位が「Ｔ」である第２のＦＲＥＴプローブとハイブリッド体を形成する。次いで、伸長反応とともにＦＲＥＴプローブは分解され、第２の順方向プライマーを有する第２の生化学反応容器から、第１と第２両方のレポーター色素由来のシグナルが検出される。
【００５６】
以上のとおり、本発明によれば、ＦＲＥＴプローブの分解によって得られるシグナルの種類と、どの生化学反応容器からシグナルが検出されるかによって、ヘテロ検体のハプロタイプの種類が決定される。
【００５７】
標的核酸の検出には、蛍光共鳴エネルギー転移現象を利用するが、その際TaqManプローブ（アプライドバイオシステムズ社製）、分子ビーコンプローブ、ハイブリプローブ（Roche社製）、Invaderプローブ（サードウェーブテクノロジー社製）などを用いることも可能である。
【００５８】
（ターゲットの準備）
検体由来の核酸の増幅反応（ＰＣＲ）の例を以下に説明する。
先ず、増幅反応液を用意する。増幅反応液の組成の例を以下の表３に示す。
【００５９】
【表３】
2009159854.tif 000005
【００６０】
上記組成の反応液を、図３１に例を示す温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行う。
【００６１】
反応終了後、精製用カラム（QUIAGEN QIAquick PCR Purification Kit: QUIGEN社製）を用いてPrimerを除去した後、電気泳動（BioAnalyzer: Agilent社製）により、増幅産物の定量を行う。
（アレル特異的ＰＣＲ）
前述の増幅したＰＣＲ産物を用い、アレル特異的ＰＣＲを行う。溶液組成は以下の表４の通りである。
【００６２】
【表４】
2009159854.tif 000006
【００６３】
なお上記組成の反応液は、２つの変異型の組み合わせとなるハプロタイプを検出する際に、２つの反応チューブに作成される。プライマーは第１のチューブには、第１の順方向プライマーと逆方向プライマーを有し、第２のチューブには、第２の順方向プライマーと逆方向プライマーを有する。ＦＲＥＴプローブは、第１のＦＲＥＴプローブも第２のＦＲＥＴプローブも、各チューブに入れられる。
【００６４】
上記組成の反応液を図３２に示す温度サイクルのプロトコルに従って、リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems社製、7500 リアルタイムＰＣＲシステム）を用いて増幅反応を行う。
【００６５】
（蛍光測定）
前述の反応チューブを、リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems社製、7500 リアルタイムＰＣＲシステム）を用いて、ＦＲＥＴプローブに標識されたレポーター色素由来のシグナルの検出を行なう。前記したように、標識として「VIC」及び「FAM」を用いる場合には、具体的には、これらの標識が発する蛍光の測定を行う。
【００６６】
（ハプロタイプ判定）
検出されたＦＲＥＴプローブのレポーター色素が検出される反応チューブの中に含まれる順方向プライマーの種類によって、ハプロタイプが決定される。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
【００６８】
（実施例１）TaqManプローブを用いた検出例
ヒトのCYP2D6（Cytochrome P450 2D6）遺伝子における第１の多型C100Tおよび第２の多型G310Tについて、表５に示したアレルを有する検体に関してハプロタイプ決定を行った。
【００６９】
【表５】
2009159854.tif 000007
【００７０】
まずターゲットの準備として、CYP2D6領域を特異的に増幅した。ターゲットの準備は実施様態例に従った。プライマーは下記２つの配列を用いた。
【００７１】
配列a）5’  GTTATCCCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA  3’  （配列番号１）
配列b）5’  GCCGACTGAGCCCTGGGAGGTAGGTA  3’  （配列番号２）
次に、順方向プライマーには配列ｃ)および配列ｄ)を、逆方向プライマーには配列e)を用いた。以下に各配列を示す。
【００７２】
配列ｃ)  5'  GGGCTGCACGCTACC  3'  （配列番号３）
配列ｄ)  5'  GGGCTGCACGCTACT  3'  （配列番号４）
配列e）  5'  GCATCCCATTCCCAGATGA  3'   （配列番号５）
ここで順方向プライマーｃ)は3'末端に多型C100T野生型ヌクレオチドと同一なヌクレオチドを有する。また、プライマーｄ)は3'末端に多型C100T変異型ヌクレオチドと同一なヌクレオチドを有する。さらに、逆方向プライマーはＰＣＲ産物が多型G310Tを含むように設計した。
【００７３】
第２の多型G310Tを検出するためのＦＲＥＴプローブには、配列ｆ）、ｇ）を用いた。ここで第１のＦＲＥＴプローブｆ）には5’末端にレポーター色素「VIC」を、3’末端にはクエンチャー色素とMGB（Minor Groove Binder）を有する。さらに配列ｆ）は、第２の多型G310T部位が野生型ヌクレオチドである標的核酸の多型部位を含む所定の長さの塩基配列と同一な配列である。一方、第２のＦＲＥＴプローブｇ）には５’末端にレポーター色素「FAM」を、３’末端にはクエンチャー色素とMGB（Minor Groove Binder）を有する。さらに配列ｇ）は、第２の多型部位が変異型ヌクレオチドである標的核酸の多型部位を含む所定の長さの塩基配列と同一な配列である。
【００７４】
配列ｆ)  5'   GGGGACGTCCTGG  3'   （配列番号６）
配列ｇ)  5'   GGGGACTTCCTGG  3'   （配列番号７）
上記工程で用意したプライマーとＦＲＥＴプローブを用いて、ＰＣＲ反応を行った。その際、第１の反応チューブには、順方向プライマー配列ｃ）と逆方向プライマー配列e）とＦＲＥＴプローブ配列ｆ）、ｇ）を入れた。また、第２の反応チューブには、順方向プライマー配列d）と逆方向プライマー配列e）とＦＲＥＴプローブ配列f）、g）を入れた。なおＰＣＲ反応液組成、ＰＣＲ反応工程およびハプロタイプ判定の各工程は、実施様態例に従った。
【００７５】
以下、各検体に関して得られた解析結果を図示し、ハプロタイプの決定を行う。
【００７６】
（アレル1/1）
図１１は、鋳型DNAとしてC100TおよびG310Tの両多型に関して両方の染色体のいずれも野生型を有する検体を用いた場合の解析結果を示すグラフである。第一の多型Ｃ１００Ｔに関わる反応チューブＮｏを項目軸にとり、第一の多型Ｃ１００ＴがＣである検体を増幅する系をＣ１００Ｔ−Ｃと示し、Ｔである検体を増幅する系をＣ１００Ｔ−Ｔと示す。また、各反応チューブについて、第二の多型Ｇ３１０Ｔに関してＧを有する検体のシグナルを示す縦棒をＧ３１０Ｔ−Ｇと示し、Ｔを有する検体のシグナルを示す縦棒をＧ３１０Ｔ−Ｔと示す。解析結果を示すその他のグラフ（図１２−１５、１８−２２、）についても同様の形式で記す。
図１１に示したとおり、野生型の順方向プライマーを有する第１の反応チューブからのみ、G310T野生型に対応するレポーター色素VICに由来する蛍光が観測された。以上から、本検体の第１の多型C100Tは共にCであることが分かる。また、蛍光がG310Tの野生型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310Tは共にGであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、C-G、C-Gと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００７７】
（アレル10/10）
図１２は、鋳型DNAとしてC100TおよびG310Tの両多型に関して両方の染色体のいずれも変異型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図１２に示したとおり、変異型の順方向プライマーを有する第２の反応チューブからのみ、G310T変異型に対応するレポーター色素FAMに由来する蛍光が観測された。以上から、本検体の第１の多型C100Tは共にTであることが分かる。また、蛍光がG310Tの変異型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310Tは共にTであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、T-T、T-Tであると決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００７８】
（アレル10/1）
図１３は、鋳型DNAとしてC100Tに関してCおよびT、G310Tに関してGおよびTを有する検体を用いた場合の解析結果である。図１３に示したとおり、野生型の順方向プライマーを有する第１の反応チューブから、G310T野生型に対応するレポーター色素VICに由来する蛍光が観測された。また、変異型の順方向プライマーを有する第２の反応チューブから、G310T変異型に対応するレポーター色素FAMに由来する蛍光が観測された。以上から、第１の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのC、第２の多型は蛍光がG310Tの野生型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310TはGであることが分かる。一方、第２の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのT、第２の多型は蛍光がG310Tの変異型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310TはTであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、C-G、T-Tと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００７９】
（アレル10/2）
図１４は、鋳型DNAとしてC100Tに関してCおよびT、G310Tに関してTを有する検体を用いた場合の解析結果である。図１４に示したとおり、野生型の順方向プライマーを有する第１の反応チューブから、G310T変異型に対応するレポーター色素FAMに由来する蛍光が観測された。また、変異型の順方向プライマーを有する第２の反応チューブから、G310T変異型に対応するレポーター色素FAMに由来する蛍光が観測された。以上から、第１の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのC、第２の多型は蛍光がG310Tの変異型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310TはTであることが分かる。一方、第２の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのT、第２の多型は蛍光がG310Tの変異型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310TはTであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、C-T、T-Tと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００８０】
（アレル2/1）
図１５は、鋳型DNAとしてC100Tに関してC、G310Tに関してGおよびTを有する検体を用いた場合の解析結果である。図１５に示したとおり、野生型の順方向プライマーを有する第１の反応チューブから、G310T野生型に対応するレポーター色素VICおよび変異型に対応するレポーター色素FAMに由来する蛍光が観測された。以上から、第１の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのC、第２の多型は蛍光がG310Tの野生型プローブに対応するレポーター色素および変異型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310TはGおよびTであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、C-G、C-Tと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００８１】
上記実施例で示したとおり、本発明の手法で得られる輝度パターンはアレルから予想されるパターンと一致する。従って、本発明を用いることで同一染色体上に存在するＳＮＰの組み合わせを一意に決定することができる。
【００８２】
（実施例２）分子ビーコンを用いた検出例
本実施例で用いる分子ビーコンとしては、ヘアピンループ構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドの両末端に、一方は供与体となるレポーター色素を、他方は受容体となるクエンチャー色素を標識したものを用いる。核酸と分子ビーコンを混合した際、核酸中に分子ビーコンのループ領域３２３と相補的な配列を有しない場合、分子ビーコンの末端３２５がステムを形成可能な配列となっているため、前記レポーター色素３２７と前記クエンチャー色素３２９が蛍光共鳴エネルギー移動する近接位に存在する。そこで前記レポーター色素由来の蛍光は、前記クエンチャー色素により消光される（図１６）。
【００８３】
一方、核酸中に分子ビーコンのループ領域と相補的な配列を有する場合は、前記分子ビーコンが棒状の構造に変化することから、前記レポーター色素３３１と前記クエンチャー色素３３３がＦＲＥＴの不可能な距離に位置する。そのため、前記レポーター色素由来の蛍光が復活する仕組みである。図１７にその仕組みを示す。
【００８４】
前記分子ビーコンをＦＲＥＴプローブとして用いて、第１の多型C100Tおよび第２の多型G310Tのハプロタイプを決定するため、表５に示した検体に関してハプロタイプ決定を行った。ターゲットの準備は前記実施様態例に従った。また、順方向プライマー配列ｃ）、ｄ）、および逆方向プライマー配列e）については、前記実施例１に従った。
【００８５】
第２の多型G310Tを検出するための分子ビーコンには、配列h）、i）を用いた。ここで第１の分子ビーコンh）には5’末端にレポーター色素「VIC」を、３’末端にはクエンチャー色素を有する。さらに配列h）は、第２の多型G310T部位が野生型ヌクレオチドである標的核酸の多型部位を含む所定の長さの塩基配列と同一な配列と分子ビーコン内で二本鎖を形成する配列を有する。一方、第２のＦＲＥＴプローブi）には５’末端にレポーター色素「FAM」を、３’末端にはクエンチャー色素を有する。さらに配列i）は、第２の多型部位が変異型ヌクレオチドである標的核酸の多型部位を含む所定の長さの塩基配列と同一な配列と分子ビーコン内で二本鎖を形成する配列を有する。よって、配列h)と配列i)は、一塩基のみが異なるため、融解温度に大きな違いがないため、この２つの配列間で、ハイブリダイズの有無を見るには、一方がハイブリダイズしている時点で検出することにすることができる。
【００８６】
分子ビーコンは、標的核酸とのアニーリングする温度が、ＰＣＲのプライマーのアニーリング温度より高くなるように配列を設計する。より好ましくは、順方向プライマーのアニーリング温度として設定する温度において、一方がハイブリダイズし、他方が遊離している状態であるように分子ビーコンのうち、標的核酸にハイブリダイズする領域の配列についてアニーリング温度を設定することが好ましい。
【００８７】
配列h)  5'  CTGAC  TTGGGGGACGTCCTGGAGA  GTCAG  3'   （配列番号８）
配列i )  5'  CTGAC  TTGGGGGACTTCCTGGAGA  GTCAG  3'   （配列番号９）
上記工程で用意したプライマーと分子ビーコンを用いて、ＰＣＲ反応を行った。その際、第１の反応チューブには、順方向プライマー配列c）と逆方向プライマー配列e）と分子ビーコン配列配列h）、i）を入れた。また、第２の反応チューブには、順方向プライマー配列d）と逆方向プライマー配列e）と分子ビーコン配列h）、i）を入れた。なおＰＣＲ反応液組成、ＰＣＲ反応工程およびハプロタイプ判定の各工程は、実施様態例に従った。
【００８８】
以下、各検体に関して得られた解析結果を図示し、ハプロタイプの決定を行う。
【００８９】
（アレル1/1）
図１８は、鋳型DNAとしてC100TおよびG310Tの両多型に関して両方の染色体のいずれも野生型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図１８に示したとおり、野生型の順方向プライマーを有する第１の反応チューブからのみ、G310T野生型に対応するレポーター色素VICに由来する蛍光が観測された。以上から、本検体の第１の多型C100Tは共にCであることが分かる。また、蛍光がG310Tの野生型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310Tは共にGであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、C-G、C-Gと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００９０】
（アレル10/10）
図１９は、鋳型DNAとしてC100TおよびG310Tの両多型に関して両方の染色体のいずれも変異型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図１９に示したとおり、変異型の順方向プライマーを有する第２の反応チューブからのみ、G310T変異型に対応するレポーター色素FAMに由来する蛍光が観測された。以上から、本検体の第１の多型C100Tは共にTであることが分かる。
【００９１】
また、蛍光がG310Tの変異型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310Tは共にTであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、T-T、T-Tであると決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００９２】
（アレル10/1）
図２０は、鋳型DNAとしてC100Tに関してCおよびT、G310Tに関してGおよびTを有する検体を用いた場合の解析結果である。図２０に示したとおり、野生型の順方向プライマーを有する第１の反応チューブから、G310T野生型に対応するレポーター色素VICに由来する蛍光が観測された。また、変異型の順方向プライマーを有する第２の反応チューブから、G310T変異型に対応するレポーター色素FAMに由来する蛍光が観測された。以上から、第１の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのC、第２の多型は蛍光がG310Tの野生型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310TはGであることが分かる。一方、第２の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのT、第２の多型は蛍光がG310Tの変異型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310TはTであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、C-G、T-Tと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００９３】
（アレル10/2）
図２１は、鋳型DNAとしてC100Tに関してCおよびT、G310Tに関してTを有する検体を用いた場合の解析結果である。図２１に示したとおり、野生型の順方向プライマーを有する第１の反応チューブから、G310T変異型に対応するレポーター色素FAMに由来する蛍光が観測された。また、変異型の順方向プライマーを有する第２の反応チューブから、G310T変異型に対応するレポーター色素FAMに由来する蛍光が観測された。以上から、第１の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのC、第２の多型は蛍光がG310Tの変異型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310TはTであることが分かる。一方、第２の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのT、第２の多型は蛍光がG310Tの変異型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310TはTであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、C-T、T-Tと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００９４】
（アレル2/1）
図２２は、鋳型DNAとしてC100Tに関してC、G310Tに関してGおよびTを有する検体を用いた場合の解析結果である。図２２に示したとおり、野生型の順方向プライマーを有する第１の反応チューブから、G310T野生型に対応するレポーター色素VICおよび変異型に対応するレポーター色素FAMに由来する蛍光が観測された。以上から、第１の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのC、第２の多型は蛍光がG310Tの野生型プローブに対応するレポーター色素および変異型プローブに対応するレポーター色素であったことから、第２の多型G310TはGおよびTであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、C-G、C-Tと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００９５】
上記実施例で示したとおり、本発明の手法で得られる輝度パターンはアレルから予想されるパターンと一致する。従って、本発明を用いることで同一染色体上に存在するＳＮＰの組み合わせを一意に決定することができる。
【００９６】
（実施例３）ハイブリプローブを用いた検出例
ハイブリプローブとは、多型部位を含む配列を有する変異プローブ335と多型部位を含まず変異プローブと標的核酸に対して近傍に並ぶようにハイブリをするアンカープローブ337とからなる。変異プローブ335の３’末端にはフルオロセイン標識を有し、アンカープローブ337の５’末端にはLC Red 640標識を有する。変異プローブ335とアンカープローブ337の標識は、ＦＲＥＴを生じる距離に位置し、フルオロセインを励起するとLC Red 640が蛍光を発する。
【００９７】
このようなハイブリプローブをPCR反応溶液に加えて増幅した後、融解曲線を取得する。すると図２３の下図に示すように、温度上昇とともにミスマッチでもハイブリしていた変異プローブが、図２４の下図に示すように解離する。すると、変異プローブ３３５に標識された色素を励起しても、ＦＲＥＴ現象は生じなくなるため、アンカープローブ３３７に標識された色素のシグナルは得られなくなる。一方、ハイブリプローブと増幅産物がフルマッチの場合（図２３、２４の上図）は、より高い温度になるまで変異プローブが解離しないため、ミスマッチの場合と比べ、高い温度でもアンカープローブに標識された色素のシグナルが得られる。
【００９８】
このようにして得られたアンカープローブに標識された色素のシグナルを温度に対して微分して得られたピークがTm値となるわけだが、変異プローブと増幅産物がフルマッチの場合は、図２５の実線に示すようにTm値は高くなる。一方、ミスマッチの場合は、図２５の破線に示すようにTm値は低くなる。ヘテロの場合は、図２５の太線で示すようにTm値は２つ得られる。
【００９９】
上記したハイブリプローブを用いたハプロタイプの検出法を下に示す。
【０１００】
前記ハイブリプローブをＦＲＥＴプローブとして用いて、第１の多型C100Tおよび第２の多型G310Tのハプロタイプを決定するため、表５に示した検体に関してハプロタイプ決定を行った。ターゲットの準備は前記実施様態例に従った。また、順方向プライマー配列c）、d）、および逆方向プライマー配列e）については、前記実施例１に従った。
【０１０１】
第２の多型G310Tを検出するためのハイブリプローブには、変異プローブ配列ｊ）、アンカープローブ配列ｋ）を用いた。ここでハイブリプローブの変異プローブｊ）には３’末端にフルオロセインを、アンカープローブ配列ｋ）には５’末端にはLC Red640を有する。さらに変異プローブ配列ｊ）は、第２の多型G310T部位が野生型ヌクレオチドである標的核酸の多型部位を含む塩基配列と同一な配列を有する。多型部位を下線で示した。
【０１０２】
配列ｊ)  5'  TTTGGGGGACGTCCT  3'  （配列番号１０）
配列ｋ)  5'  GAGAAGGGCATTTATACATGGCATGAAGGACTGG  3'  （配列番号１１）
上記工程で用意したプライマー用いてＰＣＲ反応を行い、続いてハイブリプローブの融解曲線を取得した。その際、第１の反応チューブには、順方向プライマー配列a）と逆方向プライマー配列ｃ）とハイブリプローブ配列j）、k）を入れた。また、第２の反応チューブには、順方向プライマー配列b）と逆方向プライマー配列ｃ）とハイブリプローブ配列j）、k）を入れた。なおＰＣＲ反応液組成、ＰＣＲ反応工程の各工程は、実施様態例に従った。但し、実施例１と２のＰＣＲ反応液組成においては各多型のＦＲＥＴプローブを入れていたが、本実施例においては変異プローブとアンカープローブの２種類を入れた。また、融解曲線の取得も実施例１と同じ装置の融解曲線取得モードを使用し、ハプロタイプの決定を行った。
【０１０３】
以下、各検体に関して得られた融解曲線の温度に対する微分値を図示し、ハプロタイプの決定を行う。
【０１０４】
（アレル1/1）
図２６は、鋳型DNAとしてC100TおよびG310Tの両多型に関して両方の染色体のいずれも野生型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図２６に示したとおり、野生型の順方向プライマーを有する第１の反応チューブからのみ、変異プローブが増幅産物とフルマッチであることを示す融解曲線の変曲点（Tm値）が観測された。以上から、本検体の第１の多型C100Tは共にCであることが分かる。また、Tm値がG310Tの野生型のTmに対応していることから、第２の多型G310Tは共にGであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、C-G、C-Gと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【０１０５】
（アレル10/10）
図２７は、鋳型DNAとしてC100TおよびG310Tの両多型に関して両方の染色体のいずれも変異型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図２７に示したとおり、変異型の順方向プライマーを有する第２の反応チューブからのみ、変異プローブが増幅産物にミスマッチであることを示す融解曲線の変曲点（Tm値）が観測された。以上から、本検体の第１の多型C100Tは共にTであることが分かる。また、Tm値がG310Tの変異型のTmに対応していることから、第２の多型G310Tは共にTであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、T-T、T-Tであると決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【０１０６】
（アレル10/1）
図２８は、鋳型DNAとしてC100Tに関してCおよびT、G310Tに関してGおよびTを有する検体を用いた場合の解析結果である。図２８に示したとおり、野生型の順方向プライマーを有する第１の反応チューブから、変異プローブが増幅産物にフルマッチであることを示すTm値が観測された。また、変異型の順方向プライマーを有する第２の反応チューブから、変異プローブが増幅産物にミスマッチであることを示すTm値が観測された。以上から、第１の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのC、第２の多型はTm値がG310Tの野生型のTmに対応していたことから、第２の多型G310TはGであることが分かる。一方、第２の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのT、第２の多型はTm値がG310Tの変異型のTmに対応していたことから、第２の多型G310TはTであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、C-G、T-Tと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【０１０７】
（アレル10/2）
図２９は、鋳型DNAとしてC100Tに関してCおよびT、G310Tに関してTを有する検体を用いた場合の解析結果である。図２９に示したとおり、野生型の順方向プライマーを有する第１の反応チューブから、変異プローブが増幅産物にミスマッチであることを示すTm値が観測された。また、変異型の順方向プライマーを有する第２の反応チューブから、変異プローブが増幅産物にミスマッチであることを示すTm値が観測された。以上から、第１の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのC、第２の多型はTm値がG310Tの変異型のTmに対応していたことから、第２の多型G310TはTであることが分かる。一方、第２の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのT、第２の多型はTm値がG310Tの変異型のTmに対応していたことから、第２の多型G310TはTであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、C-T、T-Tと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【０１０８】
（アレル2/1）
図３０は、鋳型DNAとしてC100Tに関してC、G310Tに関してGおよびTを有する検体を用いた場合の解析結果である。図３０に示したとおり、野生型の順方向プライマーを有する第１の反応チューブから、変異プローブとフルマッチである増幅産物を含むことを示すTm値およびミスマッチである増幅産物を含むことを示すTm値が観測された。以上から、第１の反応チューブで検出された検体の第１の多型はC100TのC、第２の多型はTm値がG310Tの野生型のTmおよび変異型のTmに対応していることから、第２の多型G310TはGおよびTであることが分かる。以上のことから、本検体のハプロタイプは、C-G、C-Tと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【０１０９】
上記実施例で示したとおり、本発明の手法で得られる輝度パターンはアレルから予想されるパターンと一致する。従って、本発明を用いることで同一染色体上に存在するＳＮＰの組み合わせを一意に決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ハプロタイプの説明図である。
【図２】ハプロタイプの説明図である。
【図３】本発明に係るハプロタイプの検出原理の説明図である。
【図４】本発明に係るハプロタイプの検出原理の説明図である。
【図５】本発明に係るハプロタイプの検出原理の説明図である。
【図６】本発明に係るハプロタイプの検出原理の説明図である。
【図７】本発明に係るハプロタイプの検出原理の説明図である。
【図８】本発明に係るハプロタイプの検出原理の説明図である。
【図９】本発明に係るハプロタイプの検出原理の説明図である。
【図１０】染色体２本の場合のハプロタイプの説明図である。
【図１１】アレル1/1検体の解析結果を示すグラフである。
【図１２】アレル10/10検体の解析結果を示すグラフである。
【図１３】アレル10/1検体の解析結果を示すグラフである。
【図１４】アレル10/2検体の解析結果を示すグラフである。
【図１５】アレル2/1検体の解析結果を示すグラフである。
【図１６】分子ビーコンを用いたハプロタイプ検出の説明図である。
【図１７】分子ビーコンを用いたハプロタイプ検出の説明図である。
【図１８】アレル1/1検体の解析結果を示すグラフである。
【図１９】アレル10/10検体の解析結果を示すグラフである。
【図２０】アレル10/1検体の解析結果を示すグラフである。
【図２１】アレル10/2検体の解析結果を示すグラフである。
【図２２】アレル2/1検体の解析結果を示すグラフである。
【図２３】ハイブリプローブを用いたハプロタイプ検出の説明図である。
【図２４】ハイブリプローブを用いたハプロタイプ検出の説明図（温度上昇時）である。
【図２５】ハイブリプローブを用いたハプロタイプ検出の説明図（融解曲線の微分値）である。
【図２６】アレル1/1検体の解析結果を示すグラフである。
【図２７】アレル10/10検体の解析結果を示すグラフである。
【図２８】アレル10/1検体の解析結果を示すグラフである。
【図２９】アレル10/2検体の解析結果を示すグラフである。
【図３０】アレル2/1検体の解析結果を示すグラフである。
【図３１】検体由来の核酸の増幅反応（ＰＣＲ）のプロトコルを示す図である。
【図３２】アレル特異的ＰＣＲのプロトコルを示す図である。
【符号の説明】
【０１１１】
３０１：標的核酸
３０３：標的核酸の相補鎖
３０５：第１の順方向プライマー
３０７：第２の順方向プライマー
３０９：逆方向プライマー
３１１：第１のＦＲＥＴプローブ
３１３：第２のＦＲＥＴプローブ
３１５：第１のレポーター色素
３１７：第１のクエンチャー色素
３１９：第２のレポーター色素
３２１：第２のクエンチャー色素
３２３：ループ構造
３２５：ステム構造
３２７：第１のレポーター色素
３２９：第１のクエンチャー色素
３３１：第２のレポーター色素
３３３：第２のクエンチャー色素
３３５：変異プローブ
３３７：アンカープローブ
５０１：第１の染色体を構成する核酸
５０３：第２の染色体を構成する核酸
【図１】
2009159854.tif 000008
【図２】
2009159854.tif 000009
【図３】
2009159854.tif 000010
【図４】
2009159854.tif 000011
【図５】
2009159854.tif 000012
【図６】
2009159854.tif 000013
【図７】
2009159854.tif 000014
【図８】
2009159854.tif 000015
【図９】
2009159854.tif 000016
【図１０】
2009159854.tif 000017
【図１１】
2009159854.tif 000018
【図１２】
2009159854.tif 000019
【図１３】
2009159854.tif 000020
【図１４】
2009159854.tif 000021
【図１５】
2009159854.tif 000022
【図１６】
2009159854.tif 000023
【図１７】
2009159854.tif 000024
【図１８】
2009159854.tif 000025
【図１９】
2009159854.tif 000026
【図２０】
2009159854.tif 000027
【図２１】
2009159854.tif 000028
【図２２】
2009159854.tif 000029
【図２３】
2009159854.tif 000030
【図２４】
2009159854.tif 000031
【図２５】
2009159854.tif 000032
【図２６】
2009159854.tif 000033
【図２７】
2009159854.tif 000034
【図２８】
2009159854.tif 000035
【図２９】
2009159854.tif 000036
【図３０】
2009159854.tif 000037
【図３１】
2009159854.tif 000038
【図３２】
2009159854.tif 000039
【配列表】
2009159854000001.app