(57)【要約】【課題】エフリン-Eph受容体シグナル伝達機構の制御により、神経再生時の軸索の伸長を制御する薬剤の提供、及びエフリン-Eph受容体シグナル伝達機構に異常を有するマウスの提供。【解決手段】α-キメリンの機能を促進し、又は抑制する薬剤を含む、軸索伸長制御剤及び左右の前後肢をそろえて歩行する歩行異常を呈するという形質に関して常染色体劣性遺伝を示し、α-キメリン遺伝子に変異を有する、B6マウス由来のミッフィーマウス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α-キメリンの機能を促進し、又は抑制する薬剤を含む、軸索伸長制御剤。
【請求項２】
α-キメリンの機能を促進する薬剤が、α-キメリンをコードするDNAである請求項１記載の軸索伸長制御剤。
【請求項３】
α-キメリンの機能を抑制ずる薬剤が、α-キメリンに対する抗体又はRNA干渉によりα-キメリンの発現を抑える２本鎖RNAである、請求項１記載の軸索伸長制御剤。
【請求項４】
エフリン/Eph関連疾患の治療薬をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を細胞又は動物に投与して、該薬剤がRho-GAPに作用して、エフリン/EphからRho-GAPを介して低分子量G蛋白質Rhoファミリーのメンバーの不活化に至る一連のシグナル伝達を制御するか否かを指標に治療薬を選択することを含むスクリーニング方法。
【請求項５】
左右の前後肢をそろえて歩行する歩行異常を呈するという形質に関して常染色体劣性遺伝を示し、α-キメリン遺伝子に変異を有する、B6マウス由来のミッフィーマウス。
【請求項６】
さらに、
（１）脊髄において、dorsal funiculusの白質が小さくなり、（２）脊髄正中線でCST軸索が再交叉しているという特徴を有する請求項５記載のミッフィーマウス。
【請求項７】
α-キメリン遺伝子の変異がα-キメリン遺伝子のエクソン９へのレトロポゾンの挿入である、請求項５又は６に記載のミッフィーマウス。
【請求項８】
左右の前後肢をそろえて歩行する歩行異常を呈するという特徴を有する、α-キメリン遺伝子ノックアウトマウス。
【請求項９】
軸索伸長制御剤をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を細胞又は動物に投与し、該薬剤を投与しない場合と比較して、該薬剤がEphA4とα-キメリンとの相互作用を制御するか否かを指標に軸索伸長制御剤を選択することを含むスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エフリン-Eph受容体シグナル伝達機構の制御に関する。特に、エフリンB3-EphA4シグナル伝達機構において、α-キメリンをターゲットとして、シグナル伝達機構を制御することに関する。
【背景技術】
【０００２】
エフリンは細胞表面に存在する蛋白でありEph受容体のリガンドである。エフリン/Ephの結合は双方向性のシグナルを誘導する（非特許文献１及び２を参照）。エフリン/Ephシグナルは近距離の細胞間コミュニケーションに通常反発性効果をもたらすことによって、神経回路形成で中心的な役割を担っている（非特許文献２〜４を参照）。下流シグナル機構は主に培養細胞を用いた実験によって研究されてきた。特にRhoA, Rac, and Cdc42などRhoファミリーGTPases (Rho-GTPases)が重要であるが、これらはアクチン動態を制御する鍵となる因子である（非特許文献１及び５〜７を参照）。Rho-GTPasesは直接Rho-guanine nucleotide-exchange 因子(Rho-GEF)によって活性化され、Rho-GTPase-activating protein (Rho-GAP)によって不活化される。近年エフリン/EphがRho-GEFを介してRho-GTPaseを制御する、という報告がされている（非特許文献８〜１４を参照）。エフリン/Ephに関与することが指摘されている数多くのRho-GEFの中でエフェキシン1（ephexin1）はもっとも研究の進んでいるものである。EphA受容体は軸索誘導においてエフェキシン1を介して成長円錐の動態を制御する（非特許文献１３及び１５を参照）。in vitro 実験において、RhoAの活性化は成長円錐の退縮、RacとCdc42の活性化は伸長を誘導する（非特許文献５及び６を参照）。Ephとエフリンの結合がエフェキシン1のGEF活性をRhoAへと導き成長円錐の崩壊を引き起こす（非特許文献１３を参照）。しかし、エフェキシン1-ノックアウト(KO)マウスは正常なため（非特許文献１５を参照）、生体でのエフェキシン1の機能はわかっていない。エフリン/Ephによるアクチン動態制御に関して、Rho-GEFに対する多大な関心と比較して、Rho-GAPが関与することはまったく想定されていなかったことは注目に値する。
【０００３】
生体でのエフリン/Ephの役割はマウス逆遺伝学によって研究されてきた。特にエフリンB3からEphA4へのフォワードシグナルは非常によく理解されている。エフリンB3-KO マウスとEphA4-KO マウスは共通の表現型を多く持つ。ウサギのような歩き方、皮質-脊髄路と中枢パターン発生器(CPG)という二つの主要運動系回路の異常などがこれに含まれる。同様の表現型は、EphA4のキナーゼ活性をもつEphA4KD/KDとEphA4FF/FFマウスにもみられるが、細胞内ドメインを欠くエフリンB3をもつマウスでは見られない（非特許文献１６〜２０を参照）。したがって、運動系回路形成に必要なのは、エフリンB3からEphAへのフォワードシグナルであり、EphA4からエフリンB3へのリバースシグナルではないことが明らかである。運動野から伸びるCST軸索は意識的運動を制御するものであるが、延髄で正中線を交叉し反対側の脊髄を下行する（非特許文献２１及び２２を参照）。野生型マウスでは、エフリンB3が正中線にあり、CST軸索表面にあるEphA4を介して反発性シグナルを伝えるため、CST軸索が脊髄内で正中線を再交叉することは滅多にない。エフリンB3又はEphA4ノックアウトマウスでは、エフリンB3/EphA4フォワードシグナルによる反発がないため、多くのCST軸索が正中線で停止できず再交叉する（非特許文献１８及び２０を参照）。脊髄CPGは歩行において左右交互の足の動きを生み出す回路と考えられている（非特許文献２３を参照）。単離した野生型の脊髄では、左右交互の歩行様のリズムを誘導することができるが（非特許文献２４を参照）、エフリンB3又はEphA4のノックアウトマウスでは左右のリズムは同調する（非特許文献１７を参照）。EphA4を発現するCPGインターニューロンが正中線を異常に高い頻度で越えることが、ノックアウトマウスでの異常の原因と考えられている（非特許文献１７及び２５を参照）。
【０００４】
【非特許文献１】Noren, N.K. et al., (2004) Cell Signal. 16, 655-666
【非特許文献２】Palmer, A. et al, (2003) Genes Dev. 17, 1429-1450
【非特許文献３】Flanagan, J.G. et al., (1998) Annu. Rev. Neurosci. 21, 309-345
【非特許文献４】Pasquale, E.B. (2005), Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 462-475
【非特許文献５】Etienne-Manneville, S. et al., (2002) Nature 420, 629-635
【非特許文献６】Luo, L. (2000), Nat. Rev. Neurosci. 1, 173-180
【非特許文献７】Wahl, S. et al, (2000) J. Cell Biol. 149, 263-270
【非特許文献８】Cowan, C.W. et al., (2005) Neuron 46, 205-217
【非特許文献９】Irie, F. et al., (2002) Nat. Neurosci. 5, 1117-1118
【非特許文献１０】Murai, K.K. et al., (2005) Neuron 46, 161-163
【非特許文献１１】Ogita, H. et al., (2003) Circ. Res. 93, 23-31
【非特許文献１２】Penzes, P. et al., (2003) Neuron 37, 263-274
【非特許文献１３】Shamah, S.M. et al., (2001) Cell 105, 233-244
【非特許文献１４】Tanaka, M. et al., (2004) EMBO J. 23, 1075-1088
【非特許文献１５】Sahin, M. et al., (2005) Neuron 46, 191-204
【非特許文献１６】Dottori, M. et al., (1998) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 95, 13248-13253
【非特許文献１７】Kullander, K. et al., (2003). Science 299, 1889-1892
【非特許文献１８】Kullander, K. et al., (2001). Genes Dev. 15, 877-888
【非特許文献１９】Kullander, K. et al., (2001) Neuron 29, 73-84
【非特許文献２０】Yokoyama, N. et al., (2001) Neuron 29, 85-97
【非特許文献２１】Gianino, S. et al., (1999) Brain Res. Dev. Brain Res. 112, 189-204
【非特許文献２２】Liang, F.Y. et al., (1991) J. Comp. Neurol. 311, 356-366
【非特許文献２３】Grillner, S. et al., (1985) Annu. Rev. Neurosci. 8, 233-261
【非特許文献２４】Nishimaru, H.et al., (2006) J. Neurosci. 26, 5320-5328
【非特許文献２５】Kiehn, O., et al., (2004) Neuron 41, 317-321
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、エフリン-Eph受容体シグナル伝達機構の制御により、神経再生時の軸索の伸長を制御する薬剤の提供、及びエフリン-Eph受容体シグナル伝達機構に異常を有するマウスの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
エフリン/Ephシステムは神経回路形成で中心的な役割を担うが、その下流の機構に関してはほとんどわかっていない。本発明者は、α-キメリン（α型キメリン）というRac特異的GTPase活性化蛋白(GAP)が、エフリンB3/EphA4フォワードシグナルを伝達することを見出した。
【０００７】
本発明者はマウスの兄妹交配を行う過程で、左右の前後肢をそろえてウサギのような歩き方をする突然変異マウスを見出し「ミッフィー(mfy)」と命名した。ミッフィーでは皮質-脊髄路と脊髄中枢パターン発生器の神経軸索に異常が見られた。ポジショナルクローニング、トランスジェニックマウスによるレスキュー、遺伝子標的法を用いて、ミッフィーが新規の劣性突然変異であること、すなわちα-キメリンの欠損がミッフィーの表現型の原因であることを見出した。本発明者はミッフィーを系統として確立した。
【０００８】
本発明者は、ミッフィーを用いて皮質-脊髄路の解析を行った。野生型マウスでは、左半身の動きは右脳、右半身の動きは左脳が制御している。左右の大脳皮質運動野から伸びた神経軸索は延髄で交叉し、反対側の脊髄内の白質を下行、それぞれ必要な箇所で髄質に入り、筋肉の動きを制御する末梢運動神経と直接又は間接的にシナプスをつくり接続する。このとき、脊髄内で左右が再び交叉して混線することはない。本発明者はトレーサーを用いてミッフィーの皮質-脊髄路を解析した結果、多くの軸索が脊髄正中線を越えて左右混線していることを見出した。
【０００９】
さらに、本発明者は、脊髄局所回路の解析を行った。トレーサーを用いて中枢パターン発生器（CPG）回路を解析した結果、ミッフィーでは多くの軸索が脊髄正中線を越えて左右混線していることを見出した。
【００１０】
本発明者はポジショナルクローニングの手法を用いて、ミッフィーではRho-GAP (Rhoファミリーの不活化因子）ファミリーに属するα-キメリン遺伝子が機能していないことを見出した。そこで、α-キメリン遺伝子のノックアウトマウスを作製し、行動を分析したところ、ミッフィーと同様の歩行異常、回路異常を呈していることを見出し、α-キメリンがミッフィー変異の原因遺伝子であることを確認した。
【００１１】
さらに、本発明者は、生化学的解析、培養細胞を用いて解析、免疫染色等の手法を用いてシグナル伝達機構について検討を行った。その結果、運動系神経の成長円錐表面にあるEphA4が、脊髄正中線においてエフリンB3を認識すると、成長円錐内でEphA4に結合しているα-キメリンが活性化され、α-キメリンがRacの働きを抑制し、Racは成長円錐を前進させる働きをする蛋白なので、その働きを抑制することにより成長円錐の前進はとまる。ミッフィーではエフリンB3もEphA4も正常であるが、α-キメリンがないため、成長円錐は止まることができず、正中線を越えて左右の神経が混線することになる。このため、両足がそろった歩行という行動異常を引き起こす。
【００１２】
ミッフィー表現型はEphA4ノックアウト及びエフリンB3ノックアウトマウスの表現型と似ている。α-キメリンはEphA4と結合し、エフリンB3/EphA4シグナルによって、プロセス伸長を促進するRacを不活化する。さらに、α-キメリンの発現を抑えるとエフリンB3によって誘導される成長円錐崩壊が抑制される。
【００１３】
本発明者は、シグナルが運動系神経回路形成において、α-キメリンによるRac不活化を介して、成長円錐の前進を防いでいること、エフリン/EphシグナルにおいてRhoファミリーGAPが鍵となる働きをすること、Rac特異的GAPであるα-キメリンが、CSTとCPG形成において、エフリンB3/EphA4フォワードシグナル下流因子として、必須の働きをすることを初めて見出した。
本発明者は、上記の知見に基づき本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  α-キメリンの機能を促進し、又は抑制する薬剤を含む、軸索伸長制御剤。
[２]  α-キメリンの機能を促進する薬剤が、α-キメリンをコードするDNAである[１]の軸索伸長制御剤。
[３]  α-キメリンの機能を抑制ずる薬剤が、α-キメリンに対する抗体又はRNA干渉によりα-キメリンの発現を抑える２本鎖RNAである、[１]の軸索伸長制御剤。
【００１５】
[４]  エフリン/Eph関連疾患の治療薬をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を細胞又は動物に投与して、該薬剤がRho-GAPに作用して、エフリン/EphからRho-GAPを介して低分子量G蛋白質Rhoファミリーのメンバーの不活化に至る一連のシグナル伝達を制御するか否かを指標に治療薬を選択することを含むスクリーニング方法。
[５]  左右の前後肢をそろえて歩行する歩行異常を呈するという形質に関して常染色体劣性遺伝を示し、α-キメリン遺伝子に変異を有する、B6マウス由来のミッフィーマウス。
【００１６】
[６]  さらに、
（１）脊髄において、dorsal funiculusの白質が小さくなり、（２）脊髄正中線でCST軸索が再交叉しているという特徴を有する[５]のミッフィーマウス。
[７]  α-キメリン遺伝子の変異がα-キメリン遺伝子のエクソン９へのレトロポゾンの挿入である、[５]又は[６]のミッフィーマウス。
【００１７】
[８]  左右の前後肢をそろえて歩行する歩行異常を呈するという特徴を有する、α-キメリン遺伝子ノックアウトマウス。
[９]  軸索伸長制御剤をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を細胞又は動物に投与し、該薬剤を投与しない場合と比較して、該薬剤がEphA4とα-キメリンとの相互作用を制御するか否かを指標に軸索伸長制御剤を選択することを含むスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のα-キメリンの機能を促進し、又は抑制する薬剤は、神経回路形成時に軸索の伸長を正常に制御することができる。また、本発明の左右の前後肢をそろえて歩行する歩行異常を呈するという特徴を有するマウスは、エフリン-Eph受容体シグナル伝達機構の解明等に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
低分子量G蛋白質Rhoファミリーは、アクチン細胞骨格を制御する鍵となる分子群であり、Rho-GEFにより活性化され、Rho-GAPにより不活化される。ファミリーメンバーとしてRhoA、Rac1、Cdc42等がある。キメリンは、Rho-GAPに属する蛋白質であり、低分子量G蛋白質Rhoファミリーのメンバーに相互作用し、低分子量G蛋白質Rhoファミリーのメンバーを不活化する。例えば、α-キメリンはRho-GAPの一種であり、Racに特異的に相互作用し、Racを不活化する。
【００２０】
生体で神経回路が形成される際に、エフリンとエフリンの受容体であるEph受容体が結合し、シグナルを伝達する。例えば、エフリンB3とEphA4が結合し、エフリンB3からEphA4へシグナルが伝達され、さらにシグナルがα-キメリンに伝達され、α-キメリンが活性化される。活性化α-キメリンは、Racを不活化する。すなわち、エフリンB3からEphA4へのシグナルがα-キメリンを介してRacに伝達されRacを不活化という形でRacに伝達されるというように、α-キメリンはエフリン-Ephシグナルを制御し得る。
【００２１】
動物左右の体の動きを制御する神経回路が形成される際、神経軸索先端の成長円錐の表面にEphA4受容体が発現し、一方、脊髄正中線にはEphA4のリガンドであるエフリンB3が壁を形成するように存在する。成長円錐が正中線に突き当たると、エフリンB3とEphA4が結合し、エフリンからEphA4へのシグナルが誘導される。該シグナルは、α-キメリンを介して、Racを不活化し、軸索先端の成長円錐の前進が抑制されるので、軸索は正中線を越えて伸長しない。
【００２２】
従って、エフリンB3からEphA4へのシグナルがα-キメリンを介してRacに伝達されRacの不活化という形でRacに伝達されるシグナルを制御することにより、神経系の伸長、増殖を制御することができる。シグナル伝達の制御のためには、例えば、α-キメリンの作用を調節すればよい。
【００２３】
例えば、脊髄損傷等の神経損傷疾患において、再生医療を応用して疾患の治療を行うことができる可能性がある。具体的には、神経幹細胞を利用し、又は軸索の伸長を促進することにより、神経を再生させ得る。左右の大脳皮質運動野から伸びた神経軸索は延髄で交叉し、反対側の脊髄内の白質を下行し、必要な箇所で髄質に入り、筋肉の動きを制御する末梢運動神経と直接あるいは間接的にシナプスを作り接続する。一旦交叉した軸索が再び脊髄正中線を越えて伸長してしまうと、軸索が再び交叉し、左右混線を起こしてしまう。従って、神経軸索の再生には、最初軸索が延髄で正中線を越えて交叉するように伸長させ、一旦交叉した後は、正中線を越えて交叉しないように伸長を調節する必要がある。このためには、神経細胞の成長円錐の前進を制御することが有効である。
【００２４】
そこで、神経再生の際に、α-キメリンを活性化し、Racの不活化を促進することにより、神経の軸索先端部である成長円錐の前進を抑制し、左右混線を防ぐことができる。一方、α-キメリンを不活化し、Racの不活化を抑制することにより、成長円錐の前進が促進され、軸索を脊髄正中線を越えて伸長させることができる。
【００２５】
α-キメリンを活性化するためには、例えば、α-キメリンをコードする遺伝子を導入し、強制発現すればよい。また、α-キメリンを活性化する薬剤を投与してもよい。一方、α-キメリンを不活化するためには、α-キメリンをターゲットとしてα-キメリンの作用を抑制し、又は発現を抑制する薬剤を投与すればよい。
【００２６】
α-キメリンを活性化する、あるいはα-キメリンの機能を促進する薬剤は、神経の軸索の伸長抑制剤として用いることができ、α-キメリンを不活化する、あるいはα-キメリンの機能を抑制する薬剤は、神経の軸索の伸長促進剤として用いることができる。
【００２７】
このような抑制効果を有する薬剤として、α-キメリンの作用を中和し得る抗α-キメリン抗体が挙げられる。α-キメリンの作用を中和し得る抗α-キメリン抗体、すなわち、α-キメリンに対するアンタゴニスティック抗体は、公知の抗体作製方法により作製することができる。このような抗体は、例えばα-キメリンとEphA4の結合をブロックし得る。これらの抗体は好ましくはヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化（Humanized）抗体である。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の薬剤の有効成分として有用である。ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体ともいい、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植することにより得ることができる。ヒト抗体遺伝子座を導入し、ヒト由来抗体を産生する能力を有するトランスジェニック動物に抗原を投与することにより得ることができるヒト抗体も含む。このようなトランスジェニック動物としてマウスが挙げられ、ヒト抗体を産生し得るマウスの作出方法は、例えば、国際公開第WO02/43478号パンフレットに記載されている。抗α-キメリン抗体は、抗α-キメリン抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を有する抗体の断片も含み、具体的にはF（ab'）2、Fab'、Fab、Fv、ジスルフィド結合Fv、一本鎖Fv（scFv）、及びこれらの重合体等が挙げられる。
【００２８】
さらに、α-キメリンをターゲットとし、α-キメリンの活性を抑制し、またはα-キメリンの発現を抑制し得る医薬として使用し得る化合物は、体内においてα-キメリンの発現を抑制し得る化合物を含む。このような化合物として、例えばRNAi(RNA干渉)により特定の配列を有する標的mRNAを切断し、そのmRNAに対応する遺伝子の発現を抑制し得る化合物が挙げられる。RNAiにおいては、特定の標的mRNAと実質的に同一な配列を有するセンス鎖と該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖からなるsiRNA(short interfering RNA)がガイドRNAとしてターゲット配列を認識し、ターゲットmRNAを切断することにより、遺伝子の発現が抑制される。siRNAは細胞内または生体内でダイサー(Dicer)によりプロセッシングを受けて２重鎖RNA(dsRNA)より形成される。該化合物として、例えばRNAi作用を有する２本鎖RNAが挙げられる。２本鎖RNAは、標的遺伝子のmRNA配列と相同な配列からなるセンスRNAおよびこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる。また、センス鎖またはアンチセンス鎖の3’末端にオーバーハングを有していてもよく、該オーバーハングの塩基の種類、数は限定されず、例えば、１〜５、好ましくは１〜３、さらに好ましくは１もしくは２塩基からなる配列が挙げられ、例えば、UUやTTが挙げられる。本発明において、オーバーハングとは、siRNAの一方の鎖の末端に付加された塩基であって、もう一方の鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。オーバーハングはDNAを構成する塩基であってもよい。２本鎖部分は、RNA干渉により発現を抑制しようとする標的遺伝子の配列中の標的配列にハイブリダイズし得る配列を有するRNA鎖（センス鎖）および該配列に相補的なRNA鎖（アンチセンス鎖）が相補的に結合した構造を有する。また、２本鎖RNAは、センス鎖とアンチセンス鎖がループ配列を介して連結しているステムループ構造を有しているショートヘアピンRNA（shRNA)であってもよい。本発明の２本鎖RNAの標的遺伝子であるα-キメリンをコードする遺伝子の特定の標的配列は、α-キメリンをコードするDNAの塩基配列に対応するRNA中の配列である。配列番号９９に示すヒトα-キメリンのDNA配列に基づいて適宜設定できる。その塩基数は、限定されず、15〜500塩基の範囲で選択される。好ましくは15〜50、15〜45、15〜40、15〜35もしくは15〜30塩基、さらに好ましくは20〜35塩基、さらに好ましくは19〜30塩基、特に好ましくは19〜29塩基もしくは28塩基である。
【００２９】
さらに、体内においてα-キメリンの発現を抑制し得る化合物として、アンチセンス核酸が挙げられる。アンチセンス核酸は、目的の標的遺伝子に相補的でありハイブリダイズする配列を持つDNAまたはRNAであり、その標的遺伝子の発現を抑制し得る。本発明のα-キメリンの発現を抑制するアンチセンス核酸は、α-キメリンをコードするDNAの塩基配列または該DNA配列に対応するRNA配列の一部に相補的な核酸である。該核酸は、長さが10から400ヌクレオチドであり、好ましくは長さが250以下のヌクレオチド、さらに好ましくは長さが100以下のヌクレオチド、さらに好ましくは長さが50以下のヌクレオチド、特に好ましくは長さが12〜28の間のヌクレオチドである。
【００３０】
本発明の２本鎖RNAまたはアンチセンス核酸の導入方法としては、Hydrodynamic法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。
【００３１】
本発明は、また、エフリン/EphからRho-GAPを介して低分子量G蛋白質Rhoファミリーのメンバーの不活化に至る一連のシグナル伝達を制御することによる、エフリン/Eph関連疾患の治療を包含する。この場合、α-キメリン等のRho-GAPをターゲットとすればよい。
【００３２】
上記のように、α-キメリンの作用を制御する薬剤等のRho-GAPの作用を制御する薬剤を用いることにより、エフリン/Eph関連疾患の治療を行うことができる。エフリン/Eph関連疾患としては、神経疾患、癌、免疫関連疾患等がある。
【００３３】
さらに、本発明はα-キメリン等のRho-GAPをターゲットとした、エフリン/Eph関連疾患の治療剤のスクリーニング方法を包含する。該スクリーニングにおいては、単離した細胞、組織や動物に候補薬剤を投与し、該薬剤がRho-GAPに作用して、エフリン/EphからRho-GAPを介して低分子量G蛋白質Rhoファミリーのメンバーの不活化に至る一連のシグナル伝達を制御するか否かを指標に効果を奏する薬剤を選択することができる。
【００３４】
本発明は、また軸索伸長制御剤をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を細胞又は動物に投与し、該薬剤を投与しない場合と比較して、該薬剤がEphA4とα-キメリンとの相互作用を制御するか否かを指標に軸索伸長制御剤を選択することを含むスクリーニング方法を包含する。すなわち、上記説明のようにα-キメリンはEphA4と結合することによりエフリンＢ３/EphA4シグナルにより活性化されてRacを不活性化する。その結果として、軸索の伸長は抑制される。従って、このシグナル伝達の一端を担うEphA4とα-キメリンとの相互作用を調整する（抑制/促進）ことにより軸索の伸長を制御することができると期待され、またこのような薬剤は軸索伸長制御剤として用いることが出来る可能性がある。より具体的には、EphA4とα-キメリンとの相互作用を促進する物質は軸索伸長抑制剤として、またEphA4とα-キメリンとの相互作用を抑制或いは阻害する物質は軸索伸長促進剤として用いることが出来る可能性がある。
【００３５】
本発明は、またα-キメリンに異常を有するヒトの遺伝病又は先天的な病気の治療を包含する。該遺伝病として、例えばクリッペル・フイル症候群（Krippel-File）等の両手共同運動（mirror movement）を発現する遺伝病が挙げられる。該遺伝病の治療のためには、例えば、α-キメリン遺伝子を投与し、強制発現させればよい。本発明は、α-キメリンに異常を有する遺伝病の遺伝子治療のためのα-キメリンをコードするDNA、又は該DNAを含む発現ベクター等を有効成分として含む医薬組成物を包含する。さらに、ヒトの遺伝病及び先天的な病気の原因遺伝子の探索のために、α-キメリン遺伝子及びRacファミリー遺伝子を利用することができる。すなわち、ヒトの運動制御の異常等に関連する遺伝病及び先天的な病気の原因遺伝子を探索する場合、運動制御の回路形成に関与するα-キメリン遺伝子やRacファミリー遺伝子をターゲットとすることができる。
【００３６】
本発明は、さらにα-キメリン遺伝子の機能を失うか、減じられ、左右の前後肢をそろえてウサギのような歩き方をすることを特徴とする歩行異常を呈するマウスを包含する。該マウスは、エフリン-Eph受容体シグナル伝達機構に異常を有するマウスである。
本発明のマウスは、例えば以下の方法で確立することができる。
【００３７】
B6マウス等の近交系マウスにおいて、兄妹交配を繰り返し、左右の前後肢をそろえてウサギのような歩き方をすることを特徴とするマウスを選択する。選択したマウスを同じ系統のマウスと戻し交配し、F1マウスを得る。該F1マウスは歩行異常に関連した遺伝子をヘテロで有するので、歩行異常を呈することはない。次いで、そのF1マウス同士を交配し、F2マウスを得る。該F2マウスは25％が歩行異常を呈する。さらに、F2マウス同士を交配することにより、歩行異常を100％呈するマウスが得られる。この段階で、本発明の歩行異常を呈するマウスが確立できる。さらに、F2マウス同士の交配を繰り返してもよい。
【００３８】
このようにして、確立されたマウスは、第２染色体のSNPであるrs13476571とrs13459064の間の3.27Mb部位に位置するα-キメリンをコードする遺伝子に変異を有する。具体的には、α-キメリンのエクソン９にレトロポゾン（Tn)（レトロポゾンの配列を配列番号９８に示す）が挿入されている。このため、転写産物においてエクソン９が欠失している。本発明において、該変異遺伝子をmfy変異（ミッフィー変異）と呼び、常染色体劣性突然変異である。本発明の異常歩行を呈するマウスは、ミッフィー変異をホモで有する。本発明において、該マウスをミッフィーマウスと呼ぶ。
【００３９】
本発明のミッフィーマウスは、以下の特徴を有する。
（１）左右の前後肢をそろえてウサギのような歩き方をする。
（２）脊髄において、dorsal funiculus（後索）の白質が小さくなる。特に腰部で顕著に小さくなる。
（３）脊髄正中線でCST軸索が再交叉している。
【００４０】
さらに、本発明は、α-キメリン遺伝子の全部又は一部を欠損させ、α-キメリン遺伝子の機能が失われたα-キメリン遺伝子ノックアウトマウスを包含する。該α-キメリン遺伝子ノックアウトマウスは、例えばα-キメリン遺伝子のエクソン９あるいはエクソン９及びエクソン１０が欠損している。
【００４１】
ノックアウトマウスは相同組換え等の公知の方法で作製することができる。例えば、リコンビナーゼと該リコンビナーゼの認識部位を利用した方法が挙げられる。該方法においては、動物にノックアウトしようとするα-キメリン遺伝子を前記リコンビナーゼの認識部位ヌクレオチド配列で挟んだDNAおよび前記リコンビナーゼの上流にプロモーターを連結したDNAを導入する。前記リコンビナーゼが発現されると、リコンビナーゼ認識部位で挟まれたα-キメリン遺伝子が切り出されて機能を失う。このような方法としてCre-loxPシステムを利用した方法が挙げられる。Cre-loxPシステムは、Sauer, B. et al., Proc. Natl. Acad, Sci.USA, 85: 5166-5170, 1988; Gu, H., et al., Cell, 73, 1155-1164, 1993等に記載されており、これらの記載に従いCre-loxPシステムを用いてα-キメリン遺伝子ノックアウトマウスを作製することができる。以下にCre-loxPシステムを用いたα-キメリン遺伝子のノックアウトについて詳細に説明する。Creとは、バクテリオファージP1由来の38KDタンパク質であり、リコンビナーゼのintegrazeファミリーに属する。Creは34bpのloxPサイトを認識して特異的にこの部位でDNAのリコンビネーションを起こす。本発明においては、プロモーターの下流にCre遺伝子を連結し、欠損させようとするα-キメリン遺伝子をloxP配列で挟んでおく。Cre遺伝子産物が産生され、loxP遺伝子で挟まれたα-キメリン遺伝子を切り出し、α-キメリン遺伝子を欠損させたマウスができる。本発明のマウスを作製するには、２系統のマウスを必要とする。１系統はCre遺伝子の上流にプロモーターを連結したDNAを有するトランスジェニックマウスである。もう１系統は、２つのloxP遺伝子で挟まれたα-キメリン遺伝子（flox化α-キメリン遺伝子）を有するトランスジェニックマウスである。これらのトランスジェニックマウスは、公知の方法で、例えば、Pro.Natl.Acad.Sci.USA 77:7380-7384, 1980の方法等に従って、作製することができる。例えば、Creの上流にプロモーターを連結したDNAを含む適当なベクターおよびα-キメリン遺伝子の3’側および5’側にloxP遺伝子を連結し、α-キメリン遺伝子の両側をloxP遺伝子で挟んだDNAを含む適当なベクターを用いて、上記DNAをマウスの胚性幹細胞（ES細胞）等の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞および生殖細胞染色体中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって作出することができる。Cre遺伝子の上流にプロモーターを連結したDNAを有するトランスジェニックマウスとしては、例えばCAGプロモーターを含み全身においてCre酵素を発現し得るCAG-Creマウスを用いればよい。上記２系統のマウスを掛け合わせることにより、α-キメリン遺伝子ノックアウトマウスを作製することができる。本発明のα-キメリン遺伝子ノックアウトマウス（α-chn KOマウス）は、上記のミッフィーマウスと同様の特徴を有する。
【００４２】
ミッフィーマウス及びα-キメリンノックアウトマウスは、例えばα-キメリンの異常を原因とするヒト遺伝病のモデルマウスとして、病態の解明、治療薬のスクリーニング等に用いることができる。また、エフリンB3/EphA4フォワードシグナル、α-キメリンが関与するシグナル伝達の研究用マウスとして用いることができる。
【実施例】
【００４３】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
本実施例においては、以下の材料、方法を用いた。
【００４４】
抗体の作製
α2-キメリンのN末に対応する合成ペプチド(MALTLFDTDEYRPPVWKC（配列番号１）)(図１１A)をKLH-カップルし、ウサギを用いてポリクロ抗体を作製した（BSI Research Resources Center）。
血清は同じペプチドを用いてアフィニティー精製した。
【００４５】
抗EphA4抗体(07-309, Upstate Cell Signaling Solutions)、抗エフリンB3抗体(sc-7281, Santa Cruz Biotechnology)及び抗アクチン抗体(MAB1501, Chemicon)を含む市販の抗体を用いた。さらに、抗-myc及びGFPマウスモノクローナル抗体、抗HAラビットポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology)、抗HAラットモノクローナル抗体(Roche)、抗Rac1マウスモノクローナル抗体(Transduction Laboratories)、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合２次抗体(DAKO)を用いた。
【００４６】
DNA塩基配列のアクセッション番号
DNA塩基配列情報はDNA Data Bank of Japan(DDBJ)にデポジットした。
アクセッション番号は以下のとおりである。AB264771(α1-Chnmfy cDNA)（配列番号９４、図１６）、AB264772(α2-Chnmfy cDNA)（配列番号９５、図１７）、AB264773(α3-Chnmfy cDNA)（配列番号９６、図１８）、AB264774(α3-ChnWT cDNA)（配列番号９７、図１９）及びAB264775 (retroposon)（配列番号９８、図２０）。
【００４７】
組織学的研究
マウスの脳と脊髄とを切開し、0.1 M リン酸バッファ(PB) (pH 7.4)中の4％パラホルムアルデヒド(PFA)にて固定した。
切片作成のためマイクロスライサ(Dosaka, Japan)又は凍結ミクロトーム(Yamato Kohki, Japan) を用いた。
【００４８】
いずれもアダルトである３匹の野生型マウス、16匹のヘテロ型マウス、及び17匹のホモ型マウスについて、非染色の400μm厚の連続切片(水平又は横断方向)又はNissl染色した60μ又は100μm厚の連続切片(水平, coronal, sagittal又は横断方向)を作成し、脳と脊髄との全体形態を調べた。
【００４９】
ひと腹(同腹)から産まれたP2-P11の仔マウスの脳幹と脊髄との横断切片(50〜60μm厚)に対し、抗-α2-キメリン抗体(1:4,000)又は抗-EphA4(Upstate; 1: 2,000)を用いた免疫組織化学的実験を行った。
これらの実験手法はIwasato et al., 2004, Genesis, 38, 130-138記載の方法に従っている。
【００５０】
皮質脊髄路と脊髄との局部回線のトレース実験
順行性トレース実験をKullander et al., 2001, Neuron 29, 73-84の記載に基づき、幾らか改変をしながら行った。大人のマウスをケタミン/キシラジン 混合物にて麻酔をし、左運動皮質に対して圧力注射により順行性トレーサであるビオチンデキストランアミン(15% BDA in 0.01 M PB; Invitrogen, Eugene; 0.2μl/site into 8-10injection sites)を注入した。
【００５１】
9〜34日後、これらのマウスを生理的食塩水で、次いで0.1 M PB (pH 7.4)中の4％ PFAでかん流した。脳と脊髄とを取り出し、固定化、抗凍結処理をし、凍結ミクロトーム(YamatoKohki, Japan)により60μm厚で切片にした。作成された切片はphosphate-buffered saline(PBS)中の3％ H2O2にて10分間反応に供され、次いでABC kit(Vector)で処理し、3,3'-diaminobenzidine(DAB)中にて現像した。
【００５２】
実験には、７匹のmfy/mfy、８匹のmfy/+、３匹のα-Chn KO、三匹の野生型マウスを用いた。
【００５３】
逆行性のトレース実験はYokoyama et al., 2001, Neuron 29, 85-97の記載に基づき、幾つかの改変を加えた上で行った。
【００５４】
麻酔したアダルトのマウスに対し、腰椎レベルにおける脊髄の左半分に、cholera toxin subunit B, Alexa Fluor 488 conjugate(1％ CTB in 0.01 M PB; Invitrogen;0.1μl/site into 3-5 injection sites)を注入した。6〜11日後、マウスをかん流し、脳と脊髄とを回収し、固定、抗凍結処理をし、凍結ミクロトームを用いて60μm厚に切片化した。
【００５５】
皮質ニューロンの定量的な比較は、連続する切片４つごとに顕微鏡(Leica DMR)を用いて行った。
片側性注入の検証は、注入が行われた部位における脊髄の連続する切片６つごとに行った。
【００５６】
同側に伸長した神経の解析は、Kullander et al., 2003, Science 299, 1889-1892に記載の方法に従い、幾つかの改変を加えて行った。
P1-P5から単離された脊髄は0.1 M PB 中の4％ PFAにて固定した。
【００５７】
DiI(Molecular Probes, Oregon, USA)の小結晶をL4のレベルで作成したtunilateral切片に添加し、Lee et al.,2005, Neurol. 485, 280-292に記載の方法に従い、脊髄は同じ固定液中で染色剤を拡散するために37℃ダーク中で11〜15日間インキュベートした。
【００５８】
DiIで標識された脊髄はマイクロスライサを用いてL2のレベルで横断方向にカットされ、それぞれのマウスから、下行性の交連インターニューロンの細胞体が最も良く見える切片(100μm厚)を選び出した。
【００５９】
画像イメージはDC300Fデジタルカメラ(Leica)を用いて取得した。シグナル強度はImage-J software(NIH)を用いて測定した。実験はジェノタイプ情報をブラインドにして行った。
【００６０】
連鎖解析
連鎖解析のために、B6バックグラウンドを有するmfy/mfyマウスをWT DBA/2 (DBA)と交配し、得られたF1(mfy/+)マウスをmfy/mfy親に戻し交配した。得られた子孫マウスの遺伝子型をマイクロサテライトマーカー(Mouse Genome Informatics)及び表現型（歩行）と関連したSNP(National Center for Biotechnology Information)を用いて決定した。ミッフィー変異を含む部位のための「境界」マーカー(D2Mit379及びD2Mit436)を特定した後に、すべての戻し交配で得られた子孫についてD2Mit379及びD2Mit436を用いて遺伝子型を決定した。これらのマーカーとの間で組換えが生じたマウスについてさらに解析を行いミッフィー遺伝子座のマッピングを行った。最終的にミッフィー遺伝子座は第２染色体のSNPであるrs13476571とrs13459064の間の3.27Mb部位にマップされた（図１０)。マイクロサテライトマーカー及びSNPのためのPCRプライマーを、それぞれMouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/)及びNational Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)データベースを用いて設計し、近交系B6マウス及びDBA/2マウス、並びにB6/DBA F1ハイブリッドマウスのゲノムDNAを用いてPCRにより確認した。選んだSNPのためのPCRプライマーとして以下のものを用いた。
rs13476571：
5'-GGC TCA GTG TGG TGC TTT GG-3'（配列番号２）
5'-TAG TTG GTA CCA CGC AGCAG-3'（配列番号３）
rs13476573：
5'-AGC TTT GAG CCT GGT GAT CT-3'（配列番号４）
5'-AGA ACG ATGTGC TAC ACA TG-3'（配列番号５）
rs13459064：
5'-CTG GCA TTT CAC TGA ACA CA-3'（配列番号６）
5'-TTA GGG CCG TTC TGT TTG AC-3'（配列番号７）
rs13476589：
5'-CCT CAA CAC TGA CTGAAC TA-3'（配列番号８）
5'-TCT TAA TGC ACT GCA GTG TC-3'（配列番号９）
【００６１】
候補遺伝子の発現プロファイリング
NCBIデータベースによると、SNPであるrs13476571とrs13459064の間の3.27Mb内に30遺伝子が報告されている。20の候補遺伝子（グループ２〜４、表１)の転写産物のサイズと量をmfy/mfy(n=3)、mfy/+(n=3)及び野生型(n=1)のP5マウスの脳を用い、５’及び３’非翻訳領域の間を増幅するプライマー対を用いたRT-PCRにより比較した。PCRのフォワードプライマーは以下のものを用いた。
B230120H23Rik：TATGAGATGTCGTCTCTCGG（配列番号１０）
Cdca7：TGTGTTCCGACGAACTATCC（配列番号１１）
Sp3：GGTGATTTGGCTTCTGCACA（配列番号１２）及びTGAGCTGTCCTAAACACAC（配列番号１３）
1700011J10Rik：AAGGTATGCCTGCTGCTCAT（配列番号１４）
2810409H07Rik：CACGATGCCCCCGAAAAAGG（配列番号１５）
Sp9：CAGCCCAAAACCTGCTATGG（配列番号１６）及びTGCTATGGCCACGTCTATAC（配列番号１７）
1700023B02Rik：GACGCCAAGATGGGGAAGTC（配列番号１８）
Scrn3：GAGAAATGGAACCCTATTCC（配列番号１９）
Gpr155：AAGAACTCAACGCTTGCTGG（配列番号２０）、TCTGATTGTTGACCAGCAAC（配列番号２１）及びAGGCCAGTTTGGAAGTGGAG（配列番号２２）
Chrna1：TTCTGGGCTCCGAACATGAG（配列番号２３）及びTGGAGCTCTCGACTGTTCTC（配列番号２４）
α1-Chn：GAGAGATGCTGCATGCTTTG（配列番号２５）
α2-Chn：CCATGGCTCTGACCCTGTTC（配列番号２６）
α3-Chn：AGGGCTTTCCTTGCTGTGTC（配列番号２７）
Atp5g3：CGCCAGGAAGAAAGATGTTC（配列番号２８）
Lnp：CCGCTTTTCTCAGCTGTGAC（配列番号２９）
Hoxd8：ATGAGCTCGTACTTCGTGAA（配列番号３０）及びTGAACCCGCTGTACTCCAAC（配列番号３１）
6720416L17Rik：AAGAAGGTGTGCCCAAGGCT（配列番号３２）
Hoxd1：GAAGCCACTATTTACCTCGG（配列番号３３）及びAGCGAGCCATGAGCTCTTAC（配列番号３４）
Mtx2：CTCTGCTCGTCTTAGCGTTG（配列番号３５）
A330043C09Rik：CCAGGAGCCATTTATCTCAG（配列番号３６）及びGCAAGACAGATGGGACTTTC（配列番号３７）
PCRのリバースプライマーは以下のものを用いた。
B230120H23Rik：GCATCTGACCCAATCCCTCA（配列番号３８）
Cdca7：ATCTTCAGGCTCTACGCTTG（配列番号３９）
Sp3：ACTGTGACAAGCTGTAAAGG（配列番号４０）及びGGTTAGACTACCATTCGCA（配列番号４１）
1700011J10Rik：GTGCTCATGTGAGTATCTTC（配列番号４２）
2810409H07Rik：AAAACACCCATCCCCCCAAG（配列番号４３）
Sp9：CTCTAGGAGTCGTTGGGACC（配列番号４４）及びTTATGTCGGAGGATGGCTCG（配列番号４５）
1700023B02Rik：TGCTCCGAAGCTCTGTTGAG（配列番号４６）
Scrn3：TTACCAGGGCAGTGAGGAAG（配列番号４７）
Gpr155：CTAGCACTTGAGTTCGTTAC（配列番号４８）、TCTGGCACTTAAGTCTTAGG（配列番号４９）及びAGATGACCTGCCCAAGGTCA（配列番号５０）
Chrna1：TGTGAGACATACACGTAGGC（配列番号５１）、TCAGCCTCTGCTCATCCTTG（配列番号５２）及びAGGACATGTAGAACACTGCA（配列番号５３）
α-Chn：TCTGGGTATTTGGCCAAACC（配列番号５４）
Atp5g3：TACAGTCTTCGGAGTCACAG（配列番号５５）
Lnp：ATCCAGTTGAAGGCACATGG（配列番号５６）
Hoxd8：TGGTGTCCACCAGTATATAC（配列番号５７）及びCAAGAGCAGTGACATTAAGG（配列番号５８）
6720416L17Rik：CCGGGTCTTCGAGAAGCAAA（配列番号５９）
Hoxd1：AAGGCTCTTGAGCCTGAGAA（配列番号６０）及びCGTTTAGGCAGGTAGCTAAG（配列番号６１）
Mtx2：CCTCACAGCATCATCACGTG（配列番号６２）
A330043C09Rik：TCACGCTGATGATACCATCA（配列番号６３）、AGCAAGGGGGTTTCTGTTGG（配列番号６４）及びCCAGACATCTGGATGTCAGT（配列番号６５）
【００６２】
【表１】
2009051742.tif 000002
2009051742.tif 000003
グループ１  ノックアウトマウスが大人になるまで生存し、歩行異常を呈さないことが明らかなので、除いた遺伝子群
グループ２  P5のmfy/mfy、mfy/+又は野生型の脳に発現が認められない遺伝子
グループ３  野生型とmfy/mfyマウスとで転写物のサイズと量が異ならない遺伝子
グループ４  野生型とmfy/mfyマウスとで転写物のサイズと量が異なるα-Chm遺伝子
【００６３】
定量的リアルタイムRT-PCR
トータルRNAをP4マウス(n = 3)の運動皮質及び脊髄からRNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて単離した。すべてのサンプルはRNaseを含まないDNaseを用いてカラム上で消化した。cDNAをSuperscriptIII two-step qRT-PCR kit(Invitrogen)を用いてトータルRNA（1.2μg/サンプル）から合成した。Platinum SYBR green qRT-PCR Super mix UDG with ROX (Invitrogen)を用いてABI Prism7700 (ABI)によりリアルタイム定量RT-PCRを行った。PCRのパラメーターは、50℃２分間、95℃２分間、95℃15秒を45サイクル、65℃30秒及び72℃30秒であった。それぞれの工程の最後に融解曲線解析を行った。すべての定量RT-PCR反応は３回行った。用いたプライマーセットは以下のとおりであった。
【００６４】
α1-Chnに対しては、5'-GAGAGATGCTGCATGCTTTG-3'（配列番号６６）及び5'-TGAAGCACTTCTTCACAAGG-3'（配列番号６７）、α2-Chnに対しては5'-GCTACCTCATCCGTGAGAGC-3'（配列番号６８）及び5'-CCCAACAAAGTGCTTTCCAT-3'（配列番号６９）、α3-Chnに対しては5'-AGGGCTTTCCTTGCTGTGTC-3'（配列番号７０）及び5'-TAGGTCCCTTCTCATGAACC-3'（配列番号７１）を用いた。直線プラスミドpS80(α1-Chn cDNA)、pM2(α2-Chn cDNA)及びpM3(α3-Chn cDNA)を希釈して、cDNA定量の絶対的スタンダードとして用いた。
【００６５】
ノックアウト動物の作製
TgコンストラクトはB6系統ゲノムDNA由来のRP23-413N9 BACクローン(Roswell Park Cancer Institute, NY, USA)を修飾することによって作製された。Tgファウンダーマウスはリニア化されたコンストラクトを受精卵にインジェクションすることによって作製された。α-キメリンKOマウスはB６由来のMS12ES細胞を用いて作製された。詳細は以下に示す。全てのマウスは理研脳センターの動物規定のガイドラインに沿って行われた。
【００６６】
BACトランスジェニック及びα-Chn KOマウス
BAC α-Chn TgコンストラクトをRed/ET recombination system (Gene Bridges,Germany)を用いて作製した。SV40 poly(A)及びFRT-Amp-FRTに続いてα2-Chn cDNAをDNA polymerase Pyrobest (Takara, Japan)及びプライマー347（5'-GTTGACATCACTTGTTAGAAG-3'（配列番号７２））及びプライマー348（5'-TCAAAGGCATCCAAAGATGAGCCTGTAACACTGCACACTCCAAGCACTGAGCATTCCCTTGACCAAGTTGCTGAAG-3'（配列番号７３））を用いて増幅した。α2-Chnのエキソン１−７をカバーするC57BL/6 (B6)マウスゲノムDNA (RoswellPark Cancer Institute, NY, USA)由来のRP23-413N9 BACクローンを含むE.coli. 株をpSC101-BAD-gbaA (Gene Bridges, Germany)、ついで精製PCR産物を用いて形質転換した。706-FLPプラスミド(Gene Bridges, Germany)を大腸菌にトランスフォームすることにより、コンストラクトからAmp遺伝子を除去した。得られたBAC α-Chn Tg コンストラクトは制限酵素による消化により確認し、Iwasato et al., 2004, Genesis 38, 130-138に記載の方法でDNA配列を決定した。Hammes and Schedl, 2000, Generation of transgenic mice from plasmids, BACs and YACs . In Mouse genetics and transgenics, I. J. Jackson, and C. M. Abbott, eds. (Leeds , Oxford University Press ), pp. 217-245に記載の方法で、NotIフラグメントをセファローズカラムを用いて精製し、BACベクターの除去をパルスフィールドゲル電気泳動(FIGE Mapper: Bio-Rad, CA, USA)により確認した。精製したDNA断片（２ng/μl）をB6/DBA F2マウスの受精卵の前核に注入し、TGマウス(BSI Research Resources Center)を作製した。
【００６７】
α-Chnノックアウト(KO)アレルは、α-Chn floxマウス(T.I. M.I and S.I., unpublished results)とCAG-Cre deleterマウスと交配することにより作成した。KOアレルにおいて、エクソン９及び１０を含むKpnI-HindIIIフラグメントをloxP部位で置換した。これらのマウスは、B6系統由来のMS12胚性幹細胞（ES細胞）を用いて作成し、B6バックグラウンドで維持した。
【００６８】
遺伝子型決定
遺伝子型決定に用いたプライマー対は以下のとおりであった。
5'-AGGGCTTTCCTTGCTGTGTC-3'（配列番号７４）/5'-ACGTCTCCTGACACCATTCC-3'（配列番号７５）(WTで0.9 kb, 2.8 kb、mfy KOアレルでバンドなし）、5'-GGAGTTCCAGCTCCATTGTG-3'（配列番号７６）/5'-ACCATGACAGTGAGCTTTCC-3'（配列番号７７）(KOアレルで234 bp)及び5'-CTTCACGAAGCACTGAGATC-3'（配列番号７８）/5'-AGGTTCTCTGCACTCATCAG-3'（配列番号７９）(Tgで119 bp)。
【００６９】
ウエスタンブロット解析
Helmbacher et al., 2000, Development 127, 3313-3324の方法を改変してウエスタンブロット解析を行った。マウスの脳及び脊髄を溶解バッファー(10 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10％ glycerol, 1％ Triton X-100, プロテアーゼインヒビター含有)又はPro-PREPタンパク質抽出溶液(iNtROM Biotechnology, Inc.)中でホモジナイズし、遠心分離により清澄化した。タンパク質をSDS−PAGEにより分離しpolyvinylidene difluoride膜にブロットした。膜を抗EphA4ポリクローナル抗体(1:2,000;Upstate Cell Signaling Solutions, Lake Placid, NY,#07-309)、抗エフリンB3ポリクローナル抗体(1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, sc-7281)、抗EphB1ポリクローナル抗体(1:200; Santa Cruz Biotechnology, sc-926)、抗α2-キメリンポリクローナル抗体(1:2,000)、抗エフリンA2モノクローナル抗体(1:500; Techne Corporation, Mineapolis, MN, 43458)及び抗アクチンモノクローナル抗体(1:5,000; Chemicon International Inc, Temecula, CA, MAB1501R)で染色し、enhanced chemiluminescence (Amersham Pharmacia Biotechnology, EPN2132; Santa Cruz Biotechnology, sc-2048)を用いてオートラジオグラフを行った。
【００７０】
DNAコンストラクト
EphA4 cDNAをB6マウスの脳のcDNAからhigh-fidelity DNA polymerase Pyrobest (Takara, Japan)で、プライマーセットとして5'-TGAGCTCTAGAAGCTGGGATTTTCTATTTCATC-3'（配列番号８０）及び5'-TGCGGCCGCTCAGACAGGAACCATCCTGCCATG-3'（配列番号８１）を用いて増幅した。次いで、N末端にIgk-Myc-tagを有するpcDNA3 (Invitrogen)ベクター中に挿入した。EphA4-FF(Y596F/Y602F)変異体は以下のプライマーセットを用いたPCRベースの方法で作製した。
CCATGGCTGGGATTTTCTATTTC（配列番号８２）/AAGTTCTAACACCTTGATTCAAA（配列番号８３）、TGAGCTCTAGAAGCTGGGATTTTCTATTTCATC（配列番号８４）/AAGGGATCCACAAAAGTTCTAACACCTTGATTC（配列番号８５）、CGAAGACCCCAACCAGGCAGT（配列番号８６）/GCTCAGACAGGAACCATCCTG（配列番号８７）、GTGGATCCCTTTACATTCGAAGACCCCAACCAGGCAG（配列番号８８）/TGCGGCCGCTCAGACAGGAACCATCCTGCCATG（配列番号８９）。
【００７１】
野生型及びミッフィーα2（又はα1）-Chnを野生型及びmfy/mfy マウスの脳のcDNAから、それぞれ増幅し、N末端にHA-tagを有するpEF-BOSベクターに挿入した。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST)融合タンパク質発現プラスミドを作るために、ｐGEXベクター(Amersham)を用いた。CAGプロモーターを有するEnhanced yellow fluorescent protein (EYFP)発現プラスミドは、大阪大学の宮崎博士及び千葉大学の斉藤博士より提供された。pSilencer short hairpin RNA (shRNA)発現ベクター由来のU6RNAポリメラーゼIIIプロモーターをｐCAG-EYFPのEYFP遺伝子の下流に挿入しshRNA及びEYFPタンパク質を同じ細胞内で発現させた。ラットα-キメリン用siRNAは、Van de Ven et al., 2005, J. Neurosci. 25, 9488-9496の記載に基づいて設計した。siRNAオリゴ（5'-TCGAGGCTTCCTCTCATCACCTACGATTCAAGAGATCGTAGGTGATGAGAGGAATTTTTTGGAA-3'（配列番号９０）及び5'-CTAGAAGGTTTTTTAAGGAGAGTAGTGGATGCTAGAGAACTTAGCATCCACTACTCTCCTTCGG-3'（配列番号９１））又は陰性コントロールのオリゴ(5'-TCGAGGCTTCAGTACATCCTCCTCCATTCAAGAGATGGAGGAGGATGTACTGAATTTTTTGGAA-3'（配列番号９２）及び5'-CTAGAAGGTTTTTTAAGTCATGTAGGAGGAGGTAGAGAACTTACCTCCTCCTACATGACTTCGG-3'（配列番号９３）)をアニールし、pCAG-EYFP-hu6ベクターのXhoI/BamHI部位にクローニングした。それぞれのコンストラクトのすべてのコードされている配列又はsiRNA配列はヌクレオチドの配列決定により確認した。
【００７２】
細胞培養及びトランスフェクト
HEK293T及びCOS-7細胞を10％ウシ胎児血清、4mMグルタミン、100ユニット/mlペニシリン及び0.2mg/mlペニシリンを含むDulbecco’s Modified Eagle’s Medium中で、5％CO2、 37℃の条件で培養した。これらの細胞を、それぞれLipofectamine Plus及びLipofectamine 2000を用いてトランスフェクトした。
【００７３】
免疫沈降
トランスフェクトの24時間後に、HEK293T細胞(1×106細胞/60 mm 培養ディッシュ)を氷冷した細胞溶解バッファー(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 2mM MgCl2, 1％ Triton X-100, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10μg/ml aprotinin, 及び10μg/ml leupeptin)を用いて溶解した。遠心分離後、上清をproteinGセファローズビーズ(Amersham Biosciences)を用いて４℃で１時間事前に清澄化した。ライセートを1μg/mlのエフリンA1-Fc融合タンパク質(R&D Systems)と共に２時間インキュベートし、その後１時間protein Gセファローズビーズを用いてインキュベートした。内在性のα-キメリンとEphA4の相互作用を検出するためにE18.5ラットの皮質ニューロンをポリDリジンでコーティングした60mmのディッシュに1×106細胞の密度で播き、２％のB27を補足したNeurobasal培地中で２日間培養した。ニューロンを５μg/mlの事前にクラスター化したエフリンB3-Fc又はコントロールFcで５分又は１５分間刺激した後、P3野生型マウスのanterior dorsomedial（前背内側）からdorsal（背側副）にかけての新皮質から細胞ライセートを調製した。遠心分離後、上清を抗α2-キメリン抗体と共に２時間インキュベートし、次いでprotein Gセファローズビーズと共に１時間インキュベートした。ビーズを溶解バッファーで洗浄し、結合したタンパク質をSDS-PAGEと免疫ブロッティングで分析した。Image-J softwareを用いてデンシトメトリー分析を行い、相対的Rac活性を細胞ライセート中のRac1量に対して標準化したGST-CRIBに結合したRac1の量により決定した。
【００７４】
プルダウンアッセイ
リコンビナントGST融合α2-キメリン及びその除去変異体（deletion mutant）をKatoh et al., 1998, J. Biol. Chem. 273, 2489-2492の方法により大腸菌から精製した。タンパク質濃度をSDS-PAGE後クーマシーブリリアントブルー染色したウシ血清アルブミンスタンダードと比較し決定した。プルダウンアッセイのために、Mycタグを付けたEphA4でトランスフェクトしたHEK293T細胞（1×106細胞）氷冷した細胞溶解バッファー(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 2mM MgCl2, 1％ Triton X-100, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10μg/ml aprotinin, 及び10μg/ml leupeptin)を用いて溶解した。遠心分離後、上清を10μgのGST融合タンパク質と共に１時間４℃でインキュベートし、次いでグルタチオン-セファローズビーズと共に１時間４℃でインキュベートした。ビーズを氷冷細胞溶解バッファーで洗浄し、結合したタンパク質をLaemmliのサンプルバッファーに溶解させSDS-PAGE及び抗Myc抗体を用いた免疫ブロットで解析した。
【００７５】
Rac１活性の測定
αPak（アミノ酸70〜150）のCRIBドメインを大腸菌中でGSTとの融合タンパク質として発現させ、グルタチオン-セファローズビーズで精製し16mMの還元グルタチオンを用いてビーズから単離した。精製タンパク質を10mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM MgCl2, 及び0.1 mM dithiothreitol (DTT)に対して透析し、-80℃で保存した。タンパク質濃度をSDS-PAGE後クーマシーブリリアントブルー染色したウシ血清アルブミンスタンダードと比較し決定した。24時間後、トランスフェクチン、COS-7細胞(5×105細胞/60mm培養ディッシュ)を無血清培地で10分間、２μg/mlの濃度で事前にクラスター化したエフリンB3-Fc又はFcを用いて刺激した。次いで、細胞を４μgのGST-CRIBを含む氷冷細胞溶解バッファー(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1％ Nonidet P-40, 10％ glycerol, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), 1μg/ml aprotinin及び1μg/ml leupeptin)で５分間溶解させた。細胞ライセートを５分間４℃、10,000gで遠心分離し、上清をグルタチオン-セファローズビーズと４℃で30分間インキュベートした。ビーズを溶解バッファーで洗浄し、結合したタンパク質をSDS-PAGEと免疫ブロッティングで分析した。
【００７６】
免疫蛍光顕微鏡観察
カバースリップ上で一次培養した皮質ニューロンをPBS中４％PFAを用いてで20分間固定しPBSで５回洗浄した。細胞をPBS中0.2% TritonX-100に10分間浸透させPBS中10％FBSを用いて30分間インキュベートし、非特異的抗体結合をブロックした。次いで、細胞をPBS中で抗α2-キメリン抗体（1:4000希釈）と共に１時間インキュベートし、その後PBS中でAlexa594結合ヤギ抗ラビットIgG抗体(1:2000希釈、Molecular Probes)と共に１時間インキュベートした。カバースリップ上の細胞をPBS中0.1％p-phenylenediamine dihydrochloride含有90％グリセロール中にマウントした。Nikon Eclipse E800顕微鏡を含むLeica DC350Fデジタルカメラシステムを用いて細胞の写真撮影を行った。
【００７７】
成長円錐（Growth cone)崩壊アッセイ
Ishikawa et al., 2003, J. Neurosci. 23, 11065-11072; Kullander et al.,2001, Neuron 29, 73-84に記載の方法で、一次ニューロンをE16.5 マウス又はE18.5ラットのanterior dorsomedialからdorsalにかけての新皮質から分離した。ニューロンをポリ-D-リジン及びラミニン（Sigma)でコーティングしたカバースリップ（円形、直径13mm）に1.0×104細胞(マウスニューロン)又は4.0×104細胞(ラットニューロン)の密度で置き、２％のB27を補足したneurobasal培地(Invitrogen)中で培養した。次いで、それらを5μg/mlのエフリンB3-Fc融合タンパク質(R&D Systems)又はコントロールとしてFc(Jackson ImmunoResearch)のみを用いて30分間刺激した。Fc及びエフリン-Fcを抗Fc抗体(1/10 w/w 抗Fc/Fc; Jackson ImmunoResearch)を用いて１時間室温で使用前にプレクラスター化させた。細胞をPBS中４％PFAを用いて固定しローダミン結合phallidin(Invitrogen)を用いて染色した。Oinuma et al., 2004, Science 305, 862-865に記載されているように最も長い神経突起の先端を解析し、成長円錐陽性細胞をF-アクチン染色による可視化で葉状仮足及び糸状仮足を有しているものとして特定した。short-hairpin RNAs (shRNAs)の発現のために、Lipofectamine 2000又はAmaxa rat neuron nucleofector kit (Amaxa Biosystems)によりニューロンをpCAG-EYFP-U6-shRNAでトランスフェクトした。
【００７８】
本実施例において、以下の結果が得られた。
１．  ウサギのような歩き方をもたらす新規の常染色体劣性突然変異
ChAT-Cre#23コンストラクトのトランスジェニックマウス(Inoue et al., 2003, MBO J. 22, 6665-6674)のホモを作製する過程で偶然、ウサギのような歩行をする変異マウスを発見した。この新規変異は常染色体劣性でありミッフィー（mfy）と名付けられた。当初はミッフィー変異はトランスジーン(Tg)挿入による遺伝子破壊が原因と推測された。しかし、交配の過程でミッフィーとTgは分離したので、その推測は間違いであり、ミッフィー変異は自然発生変異であることが示唆された。ホモのミッフィーマウスは健康で繁殖可能であった。発達期には体が少し小さかったが、成体ではこうした違いは見られなかった。野生型マウスやヘテロマウスは前後肢の左右を交互に動かせて歩くが、ミッフィーのホモ(n > 100)は両足をそろえてウサギのように歩くことが見いだされた(図１A)。ランダムに40歩を抽出して解析したところ、左右の足の動きが同期している割合の平均±SEMはmfy/+(n=13)では0、mfy/mfy(n=19)マウスでは98.42±0.61％(p<0.0001, unpaired t-test)であった。mfy/mfyマウスの脳のおおまかな構造には異常は認められなかった(WTとmfy/+マウス;図８A及びB)。一方、脊髄の形態は、dorsal funiculusの白質が小さくなっていたが、このことは腰部で最も顕著であった(図８C)。
【００７９】
図８は、ミッフィー脊髄での形態異常を示す。図８Aは、成体マウスのsagittal切片をニッスル染色した結果を示す。ミッフィーと対照マウスで脳の組織学に明らかな違いは検出されなかった。図８A中のスケールは、５mmである。図８Bは、無染色の前脳水平切片の暗視野観察の結果を示す。どちらのマウスでもanterior and posterior branches of the anterior commissures (aAC and pAC)に異常は検出されなかった。図８Aのスケールは、1 mmである。図８Cは、腰部脊髄の暗視野観察の結果を示す。ミッフィーでは、the dorsal funiculusのventral extensions (矢頭)が対照マウスのものよりも短い。図８Cのスケールは、250μmである。
【００８０】
２．  ミッフィーホモマウス脊髄正中線でのCST軸索の再交叉
CST軸索は直接又は間接の接触を介して、脊髄末梢運動神経を制御する(Liang et al., 1991, J. Comp. Neurol. 311,356-366)。これらの軸索を可視化するために、順行性トレーサーを運動野に注入し、円錐及び脊髄でCST投射を解析した。左皮質からのCST軸索は、ミッフィーと対照マウスの両者で、延髄で正中線を交叉し、右側へと投射した(図８D)。しかし、脊髄内で、対照マウスではCST軸索は反対側（右）の灰白質にのみ投射し、正中線を再交叉して同側（左）に投射することは滅多になかった。一方、すべてのミッフィーの脊髄で異常な正中線再交叉が見られた(n = 7;図１B及びC)。順行性トレーサー実験の結果を再確認するために、腰部脊髄の片側に逆行性トレーサーを注入した(図１D)。野生型では逆行性にラベルされるCST神経細胞のほとんどが反対側の皮質第５層に位置した(図１E)。しかし、mfy/mfyマウスでは同側の皮質もまた多くの神経細胞がラベルされるのが見つかった(図１F)。運動野での細胞数をカウントしたところ、同側と反対側の皮質のラベルされた細胞数の比は、野生型(n=4)とmfy/mfy(n=7)でそれぞれ2.02±0.92％と34.26±5.22％であり、統計学的に有意であった(p<0.002; 図１G)。
【００８１】
図８は、ミッフィー脊髄での形態異常を示す。図８Dは、片側運動野に順行性トレーサーを注入しCST軸索を延髄レベルで解析した結果を示す。どちらのマウスでも、CST軸索は正中線（矢頭）を交叉しているだけではなく、腹側（図８D中右斜め下を向いた青矢印）から背側（図８D中左斜め上を向いた赤矢印）へシフトしていた。図８Dのスケールは、400μmである。
【００８２】
図１は、新規突然変異マウス「ミッフィー」における歩行とCST軸索誘導の異常を示す。
【００８３】
図１Aは、後肢の足跡の一例を示す。後肢に黒インクをつけ、マウスを白い紙の上に置いて足跡をとった。図１Bは、biotinylated dextran amine(BDA)を用いたCST軸索の順行性トレースを行い、頚部脊髄の切片を作製した結果を示す。トレーサー注入と反対側のdorsal funiculus (asterisk)の中を下行するCST軸索は、ミッフィー及び対照マウスの両方で灰白質に投射した。しかし、ミッフィーでのみ、多くのCST軸索（右斜め下を向いた青矢印）が正中線（白矢印）で再交叉した。図１Cは、脊髄におけるCST軸索（脊髄の中央上から出ている赤の曲線）の模式図を示す。図１Dは、蛍光標識逆行性トレーサーであるコレラ毒素B(CTB)を腰部脊髄の片側に注入した結果を示す。図１E及びFは、運動野第５層では、野生型ではほとんどの標識された細胞は反対側に位置したことを示す。図１Eは、mfy/mfy マウスでは同側でもまた多くの標識細胞が検出されたことを示す。図１Gは、標識細胞数の同側/反対側の比は、ミッフィーマウス(n=7)で対照マウス(n=4)と比較して、有意に大きかったことを示す。データは平均±標準誤差。Student’s t-test, p<0.002. 図中のスケールは、100μmである。
【００８４】
３．  ミッフィーマウスでの脊髄CPG軸索誘導の異常
生後４日目のミッフィーと対照マウスの脊髄の片側腹側にトレーサーを注入し、ミッフィーでは、同側投射インターニューロン由来と考えられる軸索の多くが正中線を交叉しているのを発見した(図２、定量的解析の結果は図９B及びCに示す)。
【００８５】
図２において、脊髄L4腹側片側にDiIをアプライし、L2レベルでTransverse切片（厚さ100μm）を作製した。同側投射インターニューロン由来と思われる神経線維（斜めの黄矢印）が、ミッフィー脊髄では対照マウスの脊髄と比較して、より多く正中線（白矢印）を交叉して反対側（左）に投射しているのが観察された。下行性commissuralインターニューロンの細胞体（点線の丸）には違いは見られなかった。図２中のスケールは、500μmである。
【００８６】
図９は、脊髄局所回路での脊髄交叉の定量的解析の結果を示す。図９Aは、DiIで片側を標識した脊髄の100μm厚切片（図2D参照）の背側正中線（M）及びその隣接する反対側（C)、同側(I) 灰白質で、蛍光シグナル強度を計測した結果を示す。下行性交連線維（点線）由来の蛍光の影響を最小限にするため、central canal（星印）の腹側は計測せず。計測領域の縦幅はdorsal funiculusとcentral canalの間、横幅はcentral canalの幅を適用した。central canalの横幅は対照マウスとミッフィーの間で大きな違いはなかった。P4での平均±標準誤差は、対照で(n=6): 63.54±5.10μmであり、ミッフィー(n=9)で78.24±5.12μm (p>0.05)であった。スケールは、100μmである。図９Bは、計測値の比(M/I及びC/I)を対照とミッフィー間で比較した結果を示す。mfy/mfy (n=9)では、M/I比は野生型(n=6)と比較して有意に大きかった(***p<0.001)。C/I比は統計学的な有意差はつかなかったが、同様の傾向を示した(p>0.05)。有意差はunpaired Student’s t-testで検定した。
【００８７】
４．  ミッフィー遺伝子座はRac特異的GAPであるα-キメリンをコードしている
ミッフィー変異の位置を特定するために、DBA/2(DBA)とC57BL/6(B6)の二つの近交系を区別できるマイクロサテライトとSNPを用いた。ミッフィーはB6バックグランドで発見され維持されてきた。したがって、ミッフィーマウスをDBA野生型と交配し、B6/DBA F1のバックグランドを持つmfy/+マウスを手に入れた。これらのF1マウスをミッフィーホモマウスと戻し交配し、その仔を299匹をタイピングすることによって、ミッフィー変異が染色体２番のSNPであるrs13476571とrs13459064の間にあることを見つけた(図１０)。この3.27-Mbの領域には30の遺伝子の存在が知られていた(表１)。その中で10の遺伝子は、そのノックアウトが作製され正常な歩行をすることが報告されているので除外した(表１)。残りの20遺伝子に関しては、転写産物のサイズと量を野生型とミッフィーの間で比較した。この実験は５’非翻訳領域（UTR）と３’UTRの間を増幅するプライマーを用いたRT-PCR法を用いて、P5のcDNAを増幅することによって行われた。その結果、α-キメリン(α-Chn)遺伝子のみにサイズの違いがあることを見つけた(図３A及びB、表１)。α-キメリンは、アクチン重合の正の制御因子であるRacに特異的なRho-GAPである(Diekmann et al., 1991, Nature 351, 400-402; Hall et al., 1990, J. Mol. Biol. 211, 11-16; Hall et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13, 4986-4998)。最近の培養神経細胞や組織スライスでの過剰発現やsiRNAによるノックダウンを用いた研究により、α-キメリンは樹状突起の形態やスパイン密度の制御に関与することが報告されている(Buttery et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 1924-1929; Van de Ven et al., 2005, J. Neurosci. 25, 9488-9496)。また、セマフォリン3Aによって誘導される成長円錐崩壊に関与するという報告もある(Brown et al., 2004, J. Neurosci. 24, 8994-9004)。しかしながら、α-キメリンの生体での機能は未知である。
【００８８】
α-Chnにはα1とα2の二つのスプライス・アイソフォームがあることが知られている（Hall et al., 1990, J. Mol. Biol. 211, 11-16; Hall et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13, 4986-4998）。野生型とミッフィーでの、α1-Chnとα2-ChnのcDNAの塩基配列を比較した結果、ミッフィーのα1-Chnとα2-Chnではエクソン９（174塩基対(bp)）が欠如していることが見つかった。エクソン9がコードする58アミノ酸はEIEを含んでいたが、そのアミノ酸はα-キメリンのRac-GAP活性に必須であることが知られている(Ahmed et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 17642-17648)。変異型α2-キメリンは実際にRac-GAP活性を失っていることを確認した(図１１A〜C)。α1とα2アイソフォームに加えて新規アイソフォームを同定し、α3と名付けた。変異型α3-Chnの転写産物は、エクソン９で、開始コドンと予想される配列を含む４塩基対(GATG)がレトロポゾンと置換されていた。さらに、イントロン９がスプライシングされなかった(図３A)。ミッフィーのゲノムDNAをクローニングし、塩基配列を決定することにより、エクソン９へのレトロポゾンの挿入を発見した。この挿入がエクソン９のスプライシングドナーとアクセプターの両方の機能を障害したと考えられた(図３A)。P4野生型マウスの運動野と脊髄を用いた定量的RT-PCRによって、α2-Chnが強い発現をすること、α1-Chnが弱い発現、そしてα3-Chnはほとんど発現が見られないこと、を見つけた(図３C)。したがって、以下の解析はα2イソフォームを中心に行った。α2-キメリン特異的ポリクロ抗体を作製し、ウエスタンによってミッフィーの脳では野生型α2-キメリンは見られないことを確認した(図３D）。さらに、ミッフィーの脳や脊髄では変異型のα2-キメリンもほとんど検出されなかった(図３D及びE)。培養細胞での過剰発現系では変異型の発現も検出されるが(図４B)、内在性の変異型α2-キメリンは不安定なのだろうだと考えられる。
【００８９】
図１０は、ミッフィー変異の遺伝子マッピングを示す。連鎖解析のために、ミッフィー(B6バックグランド)はDBA/2(DBA)マウスと交配され、手に入ったF1マウスはさらにミッフィーマウスと戻し交配された。手に入った産仔はマイクロサテライトマーカー(Mouse Genome Informatics)とSNPs (National Center for Biotechnology Information)でジェノタイプを決定され、表現型（歩行パターン）と比較された。使用したマイクロサテライトマーカーとSNPは図１０の左列に記載してある。マウス表現型は図１０の上に記載した(m=ウサギ様; + =正常; ND=解析せず)。D2Mit379とD2Mit436の間にミッフィー遺伝子座が存在することがわかった後は、すべてのマウスはこの二つの境界マーカーで先ず解析された。そして、この２つのマーカーの間で組換えが検出されたときに限って、さらに詳細な解析が行われた。最終的に、ミッフィー遺伝子座は２番染色体のSNPであるrs13476571とrs13459064に挟まれた3.27Mbにマップされた。
【００９０】
図３は、ミッフィーにおけるα-キメリンRac-GAPの変異を示す。図３Aは、野生型とミッフィーにおける、α1-Chn、α2-Chn及びα3-Chnスプライシングイソフォームのエクソン-イントロン構造の模式図を示す。ミッフィー変異では、エクソン９にレトロポゾン（Tn）が挿入され、結果としてα1とα2の転写産物ではエクソン９（174 bp）の欠失（図中太い赤線で示される）、α3では開始コドンとみられる配列を含む４塩基対が欠失し、イントロン９のスプライシングが障害された。CDSはコーディング配列を示す。図３Bは、P5のWT(+/+)、mfy/+ (m/+)、及びmfy/mfy (m/m)脳由来のcDNAから、α1-Chn、α2-Chn、及びα3-Chnスプライスイソフォームの5'-UTRと3'-UTR間を増幅したRT-PCR産物の電気泳動の結果を示す。PCR産物は精製してクローニング、塩基配列決定された。図３Cは、発達期運動野と脊髄ではα2の発現が強かったことを示す。P4野生型マウスの運動野と脊髄を用いた定量的RT-PCRを行った。データはすべて平均±標準誤差(n=3 mice)で示す。図３Dは、α2-キメリン特異的抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す。野生型α2-キメリン蛋白は、ミッフィーマウスでは検出されなかった。予想に反して、ミッフィーマウスでは、ミッフィー型α2-キメリンの発現もほとんど検出されなかった。P10マウスの終脳からトータルライセートを調製し用いた。図３Eは、α2-キメリン特異的抗体を用いた免疫組織化学の結果を示す、野生型脊髄dorsal funiculus(点線)のCSTでα2-キメリン蛋白の強い発現が見られた(矢印)。この結果は発達期CSTでα2-キメリンが機能を持つことを示唆する。ミッフィーマウス脊髄ではα2-キメリンは検出されなかった。図中のスケールは、50μmである。
【００９１】
図４は、ミッフィー型α2-キメリンはRac1-GAP活性を欠損していることを示す。図４Aは、WT及びmfy-型のα1及びα2イソフォームの模式図を示す。C1とGAPドメインをもつC端はα1とα2イソフォームに共通である。一方、N端はイソフォーム特異的であり、α2ではSH2ドメインを含む。野生型とミッフィー型の転写産物の塩基配列を比較したところ、ミッフィー型のα1及びα2ではエクソン９（174塩基対）が欠失していた。(図３A)。エクソン９は、GAP活性に必須のアミノ酸配列（EIE）を含む58アミノ酸をコードしている。ポリクロ抗体はα2のN端の17アミノ酸（矢頭）を用いて作製された。図４Bは、COS細胞に記載のプラスミドが導入された。細胞ライセートはpPakのRac1結合ドメインとGSTの融合蛋白とインキュベートされた。結合蛋白及びトータル蛋白はSDS-PAGEと免疫ブロットで解析された。GTP-結合Rac1量が計測され、全Rac1量で標準化された。図４Cは、野生型α2-キメリンはRac1を不活化したが、ミッフィー型はできなかった。Rac1活性はベクター導入されていないCOS細胞での基部レベルとの比で表現された。全データは平均と標準誤差で表された。n = 8(WT)又は4(mfy）であった。(**p < 0.01,Student’s t-test)。
【００９２】
５．  Tg-α-キメリン発現によるミッフィーマウスの歩行の改善
α-キメリンがミッフィー変異の原因であることを確認するために、α-キメリンTgを発現させて、それがミッフィー表現型をレスキューできるかどうかを解析した。α-キメリンの上流の49kbとエクソン１から７までを含むBACクローンをRed/ETシステムを用いて修飾し、BAC-α-キメリンコンストラクトを作製した。そのコンストラクトではエクソン７の直後にエクソン８から１３のcDNA及びポリAシグナルが挿入された(図４A)。２系統(#539と#883)のBACトランスジェニックマウスを、受精卵の前核へのコンストラクトのマイクロインジェクションにより作製した。さらに、そのトランスジェニックマウスをミッフィーマウスと交配し、ミッフィーのバックグランドをもったトランスジェニックマウスを作製した(図４B)。Tg#539:mfy/mfyでは歩行の改善は見られなかったが、このことはα-キメリンの発現がこれらのマウスでは見られなかったことと合致する(図１２A及びB)。一方、Tg#883:mfy/mfyマウスでは歩行の大幅な改善が見られた(図４C)。無作為に抽出した40歩を解析したところ、左右が同期している割合の平均±SEMは、Tg#883:mfy/mfyマウス(n=13)では53.65±6.56％であり、mfy/mfyマウスと比較して大幅に改善がみられた(n=6, 99.58±0.42％; p<0.0001, unpaired t-test)。Tg#883:mfy/mfyマウスでは、α-キメリン蛋白質の弱い発現がみられたが(図１２A〜C)、このマウスでの中間的なレスキューと合致する。これらの結果はα-キメリン遺伝子がミッフィー変異の原因遺伝子であることを強く示唆する。
【００９３】
図４は、α-Chn欠損がミッフィー表現型の原因であることを示す。図４Aは、Bac Tgコンストラクトの模式図を示す。エクソン8-13、ポリAシグナル、FRTで挟まれた薬剤耐性マーカー、を含むcDNAがBACクローンのエクソン７の直後に、大腸菌内でRed/ET組換えを用いて挿入された。大腸菌内でflp組換え酵素を発現させることによって薬剤耐性マーカーが除去された。図４Bに示す実験において、トランスジェニックマウス系統は、直鎖上にしたコンストラクトを、マウス受精卵にインジェクションすることによって作製された。２系統が作製されミッフィーと交配され、ミッフィーバックグランドのトランスジェニックマウスが作製された。図４Cは、Tg#883:mfy/mfマウスにおける歩行の改善を示す図である。
【００９４】
図１２は、Tg:mfy/mfyとα-Chn KOマウスにおけるα2-キメリンタンパク量のウエスタンブロット解析の結果を示す。図１２A及びBは、成体終脳由来のトータルライセートをα2-キメリンとアクチンに対する抗体でそれぞれブロットした結果を示す。Tg539:mfy/mfyマウスではmfy/mfy (m/m)と同様、野生型α2-キメリンは検出されなかったが、このマウスでは歩行改善が見られなかったという結果と合致した。Tg539:mfy/mfyマウス（n=11）では、無作為に選ばれた40歩の中で、左右の後肢の動きが同期している割合の平均±標準誤差は99.09±0.51%であり、同腹仔のミッフィー対照群（n=5, 100%)と差は無かった（p>0.2)。一方、Tg883:mfy/mfyマウスでは、Tg由来の野生型α2-キメリン蛋白が、低レベルではあるが検出された。この結果はTg883:mfy/mfyマウスで歩行の中程度の改善が見られたという結果と合致する。図１２Cに示すように、野生型α2-キメリン蛋白は、P7のTg883:mfy/mfyマウス全脳ライセートでも検出された。図１２CのMにおいては、野生型マウス由来のトータルライセート少量が、野生型α2-キメリン蛋白のサイズマーカーとして用いられた。
【００９５】
６．  α-Chn KOマウスの作製と解析
α-キメリン遺伝子がミッフィー変異の原因遺伝子であることをさらに確認するために、ES細胞での相同組換えとマウス生殖系列でのCre/loxP組換えを用いて、α-キメリン遺伝子のエクソン９と１０を欠損させ、そのホモマウス（α-Chn KOマウス）を作製した(図４D及び図１２D)。ノックアウトマウスはウサギのような歩き方をした(図４E)。さらにCST(図４F)とCPG(図９C)軸索の脊髄正中線での交叉、脊髄のdorsal funiculusの長さが短いことを見いだした。これらの表現型はすべてミッフィーと共通である。以上の結果を統合し、α-キメリン遺伝子がミッフィー表現型の原因遺伝子であると結論づけられた。
【００９６】
図４は、α-Chn欠損がミッフィー表現型の原因であることを示す。図４Dは、KO遺伝視座の模式図を示す。エクソン９と１０が、ES細胞での相同組換えとマウス生殖系列でのCre/loxP組換えによって欠失された。図４Eは、α-Chn KO マウスの後肢の足跡を示す。ミッフィーと同様の歩行様式を示した。図４Fは、CST軸索の順行性トレースの脊髄頚部での切片を示す。α-Chn KOマウスのCST軸索は、ミッフィーと同様に脊髄正中線で再交叉した。図中のスケールは、100μmである。
【００９７】
図１２は、Tg:mfy/mfyとα-Chn KOマウスにおけるα2-キメリンタンパク量のウエスタンブロット解析の結果を示す。図１２Dは、α2-キメリン特異的抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す。α-Chn KO (-/-)マウスは野生型α2-キメリンを持たないことが確認された。また、変異型蛋白もほとんど検出されなかった。
【００９８】
図９は、脊髄局所回路での脊髄交叉の定量的解析の結果を示す。図９Cは、α-Chn KO(n=10)と対照マウス(WT又は+/-)(n=5)でのM/C及びI/C比を示す。M/I(***p<0.001)とC/I(*p<0.05)比の両者ともノックアウトで対照マウスと比較して有意に大きかった。有意差はunpaired Student’s t-testで検定した。
【００９９】
７．  α-キメリン蛋白質はCSTに存在する
上述のミッフィーマウスとα-キメリンKOマウスの表現型はすべて、報告されているエフリンB又はEphA4のKOマウス(Dottori et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13248-13253; Kullander et al., 2003, Science 299, 1889-1892; Kullander et al., 2001, Genes Dev. 15, 877-888; Yokoyama et al., 2001, Neuron 29, 85-97)、さらにキナーゼ活性欠損型EphA4を発現するマウス（EphA4FF/FFとEphA4KD/KD）(Kullander et al., 2001, Neuron 29, 73-84)の表現型と共通であることは特筆すべきである。一方、EphA4リバースシグナル依存的であることが知られているanterior commissureの形成は(Kullander et al., 2001, Neuron 29, 73-84)、ミッフィーマウスでは正常であった(図８B)。これらのことから、ミッフィー表現型はエフリンB3/EphA4フォワードシグナルの異常に起因する可能性が示唆された。免疫組織化学によりα2-キメリンが発達期のCSTにおいてEphA4と共局在することを見つけた(図１３A及びC)。α-キメリンノックアウトマウスでは、α2-キメリン蛋白質は検出されなかったが、EphA4蛋白の量は変化しなかった(図１３B及びD)。さらに発達期運動野から調製した培養神経細胞の成長円錐にα2-キメリン蛋白が存在することを見出された(図１４C)。これらの結果は、発達期CST軸索でα-キメリンが、エフリンB3/EphA4フォワードシグナルの下流因子として機能していることを示唆した。
【０１００】
図１３は、発達期CSTにおけるα2-キメリンとEphA4の共局在を示す。α2-キメリン(図１３A及びB)又はEphA(図１３C及びD)4特異的抗体を用いた、P11の野生型(図１３A及びC)及びα-Chn KO(図１３B及びD)マウスの頚部脊髄切片の免疫組織化学の結果を示す。野生型の脊髄では、α2-キメリンもEphA4もdorsal funiculus(点線)のCST（青矢印）に共局在が見られた。α-Chn KOマウスの脊髄では、α2-キメリンは検出されなかったが、EphA4発現には減少はみられなかった。白矢印：正中線。図中、スケールは50μmである。
【０１０１】
図１４は、α2-キメリン蛋白の培養皮質細胞の細胞体と成長円錐における局在、及び、siRNAによるダウンレギュレーションを示す。図１４A〜Cは、α2-キメリン特異的抗体による免疫染色の結果を示し、その結果は、α-キメリン蛋白が、E18.5ラット由来の細胞体(図１４A〜C)及び成長円錐(図１４C)に存在することを示した。星印で示された細胞には、EYFPとコントロールsiRNAを同時に発現するプラスミドが導入されている。図１４D〜Fは、α-キメリン蛋白は、EYFPとα-キメリン特異的siRNAを同時に発現するプラスミドを導入された神経細胞の、細胞体(星印：図１４D、E)にも成長円錐（矢印：図１４F)には検出されなかったことを示す。図中スケールは、50μmである。
【０１０２】
８．  α-キメリンとEphAの結合
α-キメリンがEphA4と結合するかどうかを調べるために、293T細胞にEphA4とα-キメリンを発現させ、Fc領域を融合したエフリンA1を用いて、細胞ライセートからEphA4を免疫沈降した。野生型のα1-キメリン、α2-キメリンのどちらも、野生型及びキナーゼ活性欠損のEphA4と共沈降した(図５A)。また、ミッフィー型α2-キメリンは野生型EphA4と共沈降した(図１５)。これらの結果から、α-キメリンはEphA4とin vitroで結合すること、及び、その結合にはEphA4のキナーゼ活性もα-キメリンのRac-GAP活性も要求されないことが示唆された。EphA4と結合するα-キメリンの領域を決めるために、GST融合蛋白プルダウンを行った。EphA4は完全長のα2-キメリン及びα2とα2に共通のC末と結合したが、α2特異的なN末とは結合しなかった(図５B)。これらの結果はEphA4がα1及びα2とその共通のC末で結合することを示す。次いで神経細胞で結合するかどうか、また、もし、結合するとすればそれはリガンドに刺激によって強くなるかどうか、を調べた。EphA4は、エフリンB3刺激のない状態でα2-キメリンと共免疫沈降したが、その結合はクラスター化したeprhinB3刺激によって増強されることはなかった。(図５C)。これらの結果は、神経細胞内でα-キメリンがEphA4と結合すること、及び、その結合がエフリンB3刺激非依存的であることを示す。最後に発達期の野生型運動野からライセートを調製し、α-キメリン特異的抗体を用いて免疫沈降を行った。この実験においても、EphA4とα2-キメリンは結合した(図５D)。
【０１０３】
図５は、α-キメリンはEphA4と結合し、エフリンB3からEphA4へのフォワードシグナルによりRac1活性を制御することを示す。図５Aは、EphA4とα1-キメリン及びα2-キメリンイソフォームはin vitroで結合することを示す。キナーゼ活性をもたないEphA4FFもまた両イソフォームと結合する。293T細胞は記載の発現ベクターを導入された。トータルライセートをFc領域融合エフリンA1で沈降し、HAとMycに対する抗体でそれぞれα-キメリンとEphA4を検出した。トータルライセートもまたHAとMycに対する抗体でブロットした。図５Bは、α1及びα2イソフォームに共通なα-キメリンのC末がEphA4と結合したことを示す。プルダウンアッセイのために、Myc-tagged EphA4を導入されたHEK293T細胞のライセートを調製し、上清をα2-キメリンの全長及び部分のGST融合蛋白質と共にインキュベートし、さらにglutathione-sepharose beadsと共にインキュベートした。結合蛋白はSDS-PAGEとMycに対する抗体を用いた免疫ブロットで検出した。下パネルはこの実験に用いたGST融合蛋白のCoomassie Brilliant Blue(CBB)染色の結果を示す。図５Cは、神経細胞で内在性α-キメリンとEphA4は結合したが、エフリンB3刺激による結合の増強は見られなかったことを示す。E18.5ラットから調製した皮質神経細胞を、クラスター化したエフリンB3-Fc又は対照Fcで５分から１５分刺激した。結合蛋白及びトータル蛋白をEphA4及びα2-キメリンに対する抗体で検出した。図５Dは、マウス脳で内在性α-キメリンとEphA4が結合したことを示す。P3マウス皮質ライセートをα2-キメリン又はMyc（ネガティブ対照）に対する抗体で免疫沈降した。ミッフィー皮質も第２のネガティブ対照として用いられた。結合蛋白及びトータル蛋白をEphA4及びα2-キメリンに対する抗体で検出した。
【０１０４】
図１５は、EphA4とα2-キメリンの結合にはα-キメリンのRac-GAP活性は必要ないことを示す。EphA4はミッフィー型α2-キメリンとin vitroで結合した。293T細胞に図示されたプラスミドが導入された。トータルライセートはFc領域を融合されたエフリンA1で沈降され、α-キメリンとEphA4を検出するために、それぞれHA及びMycに対する抗体で免疫沈降された。トータルライセートもHA及びMyc特異的抗体でブロットされた。
【０１０５】
９．  α-キメリンはエフリンB3/EphA4シグナルによりRacを不活化する
α-キメリンがエフリン/Ephシグナルに関与するという報告はこれまで皆無である。α-キメリンがエフリンB3/EphA4フォワードシグナルを受けてRac活性を制御するかどうかを解析するために、COS7細胞にEphA4（野生型又はキナーゼ欠損型）とα2-キメリン（野生型とミッフィー型）を発現させ、エフリン刺激の前後でRac活性を計測した(図５E)。エフリンB3刺激によってRac不活化は、EphA4とキメリンの両者とも野生型の細胞では誘導されたが、どちらかが変異型のときには誘導されなかった(図５F)。これらの結果は、エフリンB3がRac不活化を誘導するには、EphA4のキナーゼ活性と機能的なα2-キメリンの両者が必須であることを示す。特筆すべきこととして、COS細胞で過剰発現したEphA4蛋白はリン酸化されている（すなわちキナーゼが活性化されている）にも関わらず、エフリンB3刺激のない状態ではα-キメリンを十分に活性化することができなかった(図５E)。これらの結果は、EphA4のキナーゼ活性単独では、α-キメリンのRac-GAP活性を誘導するには十分ではないことを示唆する。
【０１０６】
図５は、α-キメリンはEphA4と結合し、エフリンB3からEphA4へのフォワードシグナルによりRac1活性を制御することを示す。図５Eに結果を示す実験においては、COS7細胞は記載のプラスミドを導入され、pre-clusteredエフリンB3-Fc(+)又はFc(-)で10分間刺激された。GST融合Rac1をSDS-PAGEと免疫ブロットで検出し、量が計測され、対応する全Rac1量で標準化された。Rac1活性(fold increase/basal)は平均と標準誤差であらわされた。図５Fは、図５Eに示したデータの統計的処理の結果を示す。エフリンB3刺激は、EphA4とα-キメリンの両者が野生型の細胞ではRacを不活化するが、どちらか一方が機能を失っている場合にはRacを不活化しなかった。n=4(EphA4WT+α2-キメリンWT)、5(EphA4FF+α2-キメリンWT)、又は3(EphA4WT+α2-キメリンmfy)。全データは、平均±標準誤差で示す。(*p<0.05, ANOVA/Tukey HSD)。
【０１０７】
１０．  エフリンにより培養皮質神経細胞に誘導される成長円錐崩壊は、α-キメリンのダウンレギュレーションにより抑制される
エフリンB3/EphA4フォワードシグナルは、運動野由来の培養神経細胞の成長円錐崩壊を誘導することが知られている(Egea et al., 2005, Neuron 47, 515-528; Kullander et al., 2001, Neuron 29, 73-84)。α-キメリンが、エフリンB3/EphA4フォワードシグナルの経路で、成長円錐崩壊を制御するかどうかを知るために、２種類の実験を行った。第一の実験として、胎生期16.5日（E16.5)の野生型及びミッフィーマウスの運動野に由来する神経細胞を培養し、クラスター化したFc又はエフリンB3で刺激した。エフリンB3は従来の知見どおり野生型の皮質神経細胞で成長円錐崩壊を誘導した（Kullander et al., 2001, Genes Dev. 15, 877-888、図６A及びB)。しかし、ミッフィーの皮質神経細胞では、その頻度が有意に減少した(図６B)。第二の実験として、α-キメリン特異的siRNAを、E18ラット運動野から調製した培養神経細胞に発現ベクターを用いて導入させた(図１４)。エフリンB3によって誘導される成長円錐崩壊は、ベクター導入細胞で顕著に減少した(図６C)。実際、抗α-キメリン抗体を用いたウエスタンブロットによって、α-キメリン蛋白はベクター導入細胞で大幅に（90％以上）減少していることを確認した(図６D)。これらの結果から、α-キメリンRac-GAPはエフリンB3/Ephシグナルの下流で皮質神経細胞の成長円錐崩壊を引き起こすと結論づけられる。
【０１０８】
以上のin vitroと生体での実験結果を総合して、α-キメリンはエフリンB3によるEphA4の活性化を、プロセス伸長の正制御因子であるRacの不活化とをリンクさせ、成長円錐崩壊、さらには脊髄正中線における反発作用を引き起こす鍵となる分子である、と結論づけられた。
【０１０９】
図６は、α-キメリンのダウンレギュレーションは、エフリンB3によって誘導される成長円錐崩壊を抑制することを示す。図６Aは、クラスター化処理したFc対照(uncollapsed)又はエフリンB3-Fc(collapsed)で処理された培養皮質神経をphalloidin染色した成長円錐の代表例を示す。図６A中、スケールは10μmである。図６Bは、野生型由来培養皮質神経をエフリンB3で刺激すると成長円錐崩壊が誘導されたが、ミッフィー皮質由来のものでは、ほとんど成長円錐は誘導されなかったことを示す。全てのデータは、それぞれ100細胞ずつをカウントした４回の独立した実験の平均と標準誤差で示す(***p<0.001, Student’s t-test)。図６Cは、siRNAによりα-キメリンをダウンレギュレーションされると、エフリンB3に誘導される成長円錐崩壊が抑制されたことを示す。E18.5ラット皮質由来の培養神経細胞にsiRNAとEYFP'発現ベクターが導入された。各実験で、EYFPを発現する34-67神経細胞がカウントされた。(*p<0.05, Student’s t-test)。
【０１１０】
本実施例より以下のことが言える。
α-キメリンは、エフリンB3/EphA4フォワードシグナルを中継する鍵であり、脊髄正中線でCST軸索の反発を引き起こす。
本実施例では以下のことが判明した。（１）α-キメリンとEphA4は発達期CSTで共局在する(図１３)。（２）α-キメリンとEphA4はin vitroでもin vivoでも結合する(図５A〜D)。（３）EphA4がエフリンB3によって刺激されると、α-キメリンがプロセス伸長の正制御因子であるRacを不活化する(図５F)。（４）エフリンB3刺激は培養皮質細胞での成長円錐崩壊を誘導するが、RNAiやミッフィー変異によってα-キメリン蛋白発現を抑制すると、その効果が減少する(図６)。（５）脊髄正中線でのCST軸索とCPG軸索の反発は、エフリンB3/EphA4フォワードシグナル依存的であることが知られているが(Kullander et al., 2003, Science 299, 1889-1892; Kullander et al., 2001, Genes Dev. 15, 877-888; Kullander et al., 2001, Neuron 29, 73-84; Yokoyama et al., 2001, Neuron 29, 85-97)、両者ともミッフィーマウス及びα-キメリンKOマウスで障害される(図１B、２D及び４F)。この結果は、Rac-GAP α-キメリンは、エフリンB3/EphA4フォワードシグナルを媒介して、CSTとCPGの軸索誘導を制御していることを示す(図７)。図７は、正中線でのCST軸索誘導におけるエフリンB3/EphA4フォワードシグナルのモデルを示す。図７Aに示すように、野生型では、エフリンB3刺激を受けない成長円錐は、プロセス伸長の正制御因子であるRacの基部活性にため伸長する（左の緑枠）。一方、脊髄正中線ではエフリンB3が存在するため、CST軸索にはEphA4を介してフォワードシグナルが誘導される。このフォワードシグナルがα-キメリンを介してRac不活化をするため、成長円錐の退縮が起きる（右の赤枠）。エフリン/EphAシグナルはエフェキシンを介してプロセス伸長の負制御因子であるRhoAを活性化する可能性が報告されている。エフェキシンによるRhoA活性化とα-キメリンによるRac不活化は協調して効率よく軸索の退縮を誘導するのかも知れない。また、図７Bに示すように、ミッフィーマウスでは、たとえエフェキシンが存在しても、α-キメリンによるRac不活化が起きないため、成長円錐は正中線で止まることができない。
【０１１１】
EphAがRho-GEFであるエフェキシン１を介して、成長円錐動態を制御することが最近注目されている(Shamah et al., 2001, Cell 105, 233-244)。成長円錐に関して、RhoA活性化は崩壊を誘導し、RacやCdc42活性化は前進を促進する(Etienne-Manneville and Hall, 2002, Nature 420, 629-635; Luo, 2000, Nat. Rev. Neurosci. 1, 173-180)。Ephがエフリンによって刺激されると、エフェキシンのRhoAに対するGEF活性が誘導され、結果として成長円錐崩壊が起きるというin vitro実験の結果が報告されている(図７A、 Shamah et al., 2001, Cell 105, 233-244)。一方、本実施例においてエフリンとEphの結合が、α-キメリンのGAP活性によるRac不活化を介して成長円錐崩壊を誘導することが示された。エフェキシン１もα-キメリンも中枢神経系に幅広く発現しているので(Hall et al., 2001, J. Neurosci. 21, 5191-5202; Hall et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13, 4986-4998; Shamah et al., 2001, Cell 105, 233-244)、エフェキシンによって誘導されるRhoA活性化とα-キメリンによって誘導されるRac不活化は、様々な回路形成での軸索誘導において、協調して効率よい成長円錐崩壊を誘導するのかもしれない。エフェキシン１KOマウスでは特段の異常は検出されていないが(Sahin et al., 2005, Neuron 46, 191-204)、その理由として他のファミリーメンバーによる補償ということは可能性がある。あるいはエフェキシンによるRhoA活性化がなくても、α-キメリンが存在すれば、エフリン/EphシグナルはRac不活化を介して成長円錐の前進を止められるのかも知れない。エフェキシンノックアウトが正常なのに対し、α-キメリン変異マウスではCSTとCPGの軸索誘導が障害されていることが見出された。
【０１１２】
エフリン/EphシグナルにおけるRho-GTPase不活化の重要性
エフリン-Ephシグナルは、受精卵成熟、初期発生、分節化、細胞異動、シナプス可塑性、樹状突起形成、軸索誘導など幅広い生命現象で重要な働きを担う(Flanagan and Vanderhaeghen, 1998, Neurosci. 21, 309-345; Palmer and Klein, 2003, Genes Dev. 17, 1429-1450; Pasquale, 2005, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 462-475)。最近のin vitroでの研究で、様々な生命現象で、エフリン/EphシグナルはRhoA、Rac、Cdc42のようなRhoファミリー低分子G蛋白質（Rho-GTPase）の活性化を介してアクチン動態を制御していると考えられている(Cowan et al., 2005, Neuron 46, 205-217; Fu et al., 2007, Nat.Neurosci. 10, 67-76; Irie and Yamaguchi, 2002, Nat. Neurosci. 5, 1117-1118; Murai and Pasquale, 2005, Neuron 46, 161-163; Ogita et al., 2003, Circ. Res. 93, 23-31; Penzes et al., 2003, Neuron 37, 263-274; Shamah et al., 2001, Cell 105, 233-244;Tanaka et al., 2004, EMBO J. 23, 1075-1088)。本実施例の結果は、EphがRho-GAPによるRhoファミリー不活化を介してアクチン動態を制御するという、さらなる仕組みが存在することを示唆する。
【０１１３】
エフリン/Ephはアクチン動態を、アクチン重合のネガティブレギュレーター（RhoAなど）とポジティブレギュレータ（Racなど）のバランスを制御することによってコントロールしていると考えられている(Sahin et al., 2005, Neuron 46, 191-204.; Shamah et al., 2001, Cell 105, 233-244)。この考え方では、Rhoファミリーの活性化機構しか考慮されていない。一方、本実施例で、Rho不活化もまたエフリン/Ephがアクチン動態を制御する上で重要であることが示された。それぞれのRhoファミリーの活性は、Rho-GEFによる活性化とRho-GAPによる不活化のバランスで制御されていると考えられる。哺乳動物では異なった基質特異性を有し、異なった機構で制御されるRho-GEFとRho-GAPが多数存在する(Etienne-Manneville and Hall, 2002, Nature 420, 629-635)。したがって、異なった生命現象でエフリン/Ephシグナルは、特異的なRho-GEFとRho-GAPの組み合わせを使うことにより、それぞれのRhoファミリーの活性を適切にコントロールすることが可能である。まとめると、エフリン/Ephはアクチン動態を二段階で制御していること：すなわち、第一はRhoAやRacなど異なったRho-GTPaseの間のバランスを制御すること、第二はそれぞれのRho-GTPaseの活性化と不活化の間のバランスを制御することが示唆される。
【０１１４】
神経系の発生と機能におけるα-キメリンの制御と役割
本実施例はα-キメリンがエフリンB3/EphA4フォワードシグナルに関与していることを示した。また、エフリンB3/EphA4がどのようにしてα-キメリンを活性化するかについても回答を与えた。キナーゼ活性欠損EphA4蛋白質はα-キメリンを活性化できないので(図５F)、α-キメリンの活性化にEphA4のキナーゼ活性が必要であることは明らかである。しかし、EphA4蛋白を過剰発現したCOS細胞ではEphA4はリン酸化されている、つまり、キナーゼアクティブであるが、エフリンB3刺激なしではα-キメリンを十分に活性化することはできない(図５E及びF)ことからも、キナーゼ活性単独では十分でないことがわかる。実際、最近の報告で、常時活性型のEphA4を持つマウスが、正常な歩行パターン、CSTとCPGの正中線軸索誘導、正常な脊髄形態をもつことが示されている(Egea et al., 2005, Neuron 47, 515-528)。そのマウスの皮質由来の培養神経細胞はエフリンB3刺激に応答して正常な成長円錐崩壊を誘導できる。これらの結果から、生体でのエフリンB/EphA4シグナルに、EphA4のキナーゼ活性単独では十分でなく、EphA4のクラスター化が必須であることが提唱されている(Egea et al., 2005, Neuron 47, 515-528)。本実施例で示された培養細胞でのα-キメリンの制御様式は、生体でのエフリンB3/EphA4シグナルの様式と合致する。
【０１１５】
α1もα2もどちらのイソフォームも、C1ドメインを１個持ち、そこにphorbol ester 又はDAGが結合することによって活性化されることができる(Hall et al., 1990, J. Mol. Biol. 211, 11-16; Hall et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13, 4986-4998)。最近、Cdk5がEphA4による樹状突起スパイン形成の退縮を制御しているという報告がある(Fu et al., 2007, Nat. Neurosci. 10, 67-76)。Cdk5はα2-キメリンと結合するという報告がある(Qi et al., 2004, FEBS Lett. 561, 177-180)。EphA4クラスター化による蛋白質複合体に何らかの蛋白質がリクルートされ、それらがEphA4活性化とα-キメリン活性化を結びつける可能性がある。そうした蛋白質には、Cdk5/p35やDAG産生酵素（phospholipase Cγなど）が含まれるかも知れない。ただ、COS細胞にEphA4とα2-キメリンを発現させただけで、エフリンB3によるRac不活化には十分なことを考慮すると、こうした分子又は同等の働きをする分子は神経細胞特異的ではなく、普遍的なものと思われる(図５E及びF)。
【０１１６】
α-キメリン遺伝子は発達期及び生体の中枢神経系に広範囲に発現している(Hall et al., 2001, J. Neurosci. 21, 5191-5202; Hall et al., 1990, J. Mol. Biol. 211, 11-16; Hall et al., 1993, Mol. Cell Biol. 13, 4986-4998)。また、α-キメリン蛋白は軸索だけでなく樹状突起にも発現している(Hall et al., 2001, J. Neurosci. 21, 5191-5202)。α-キメリンが脳の樹状突起発達に役割をもつかどうかを解析することは興味深い。最近の培養海馬神経細胞や小脳スライスで、過剰発現やsiRNAによるノックダウンを用いた実験で、α-キメリンが樹状突起形態やスパイン密度を制御しているという報告もある(Buttery et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 1924-1929; Van de Ven et al., 2005, J. Neurosci. 25, 9488-9496)。また、α-キメリンはin vitroでNMDA型グルタミン酸受容体と結合することから（Van de Ven et al., 2005, J. Neurosci. 25, 9488-9496)、α-キメリンはまたNMDA受容体を介したバレル皮質の成熟のような発達期可塑性や記憶学習機構にも関与している可能性もある(Iwasato et al., 2000, Nature 406, 726-731; Iwasato et al., 1997, Neuron 19, 1201-1210)。ミッフィーマウスはこのように、中枢神経系の発達及び機能におけるα-キメリンRac-GAPの役割を知るために、発展性のある実験材料である。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１Ａ】ミッフィーの後肢の足跡を示す図である。
【図１Ｂ】ミッフィーのCST軸索誘導の異常を示す図であり、biotinylated dextran amine(BDA)を用いたCST軸索の順行性トレースの結果を示す図である。
【図１Ｃ】ミッフィーのCST軸索誘導の異常を示す図であり、脊髄におけるCST軸索の模式図ある。
【図１Ｄ】ミッフィーのCST軸索誘導の異常を示す図であり、蛍光標識逆行性トレーサーであるコレラ毒素B(CTB)を腰部脊髄の片側に注入した結果を示す図である。
【図１Ｅ】ミッフィーのCST軸索誘導の異常を示す図であり、運動野第５層における標識された細胞の位置を示す図である。
【図１Ｆ】ミッフィーのCST軸索誘導の異常を示す図であり、運動野第５層における標識された細胞の位置を示す図である。
【図１Ｇ】ミッフィーのCST軸索誘導の異常を示す図であり、標識細胞数の同側/反対側の比を示す図である。
【図２】ミッフィーにおけるCST軸索誘導を示す図である。
【図３Ａ】野生型とミッフィーにおける、α1-Chn、α2-Chn及びα3-Chnスプライシングイソフォームのエクソン-イントロン構造の模式図である。
【図３Ｂ】RT-PCR産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図３Ｃ】P4野生型マウスの運動野と脊髄を用いた定量的RT-PCRの結果を示す図である。
【図３Ｄ】α2-キメリン特異的抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図３Ｅ】α2-キメリン特異的抗体を用いた免疫組織化学の結果を示す図である。
【図４Ａ】Bac Tgコンストラクトの模式図である。
【図４Ｂ】Tgマウスの作製法を示す図である。
【図４Ｃ】Tg#883:mfy/mfy マウスにおける歩行の改善を示す図である。
【図４Ｄ】ノックアウトマウスにおけるKO遺伝視座の模式図である。
【図４Ｅ】α-Chn KOマウスの後肢の足跡を示す図である。
【図４Ｆ】CST軸索の順行性トレースの脊髄頚部での切片を示す図である。
【図５Ａ】α1-キメリンとEphA4との結合を示す図である。
【図５Ｂ】α-キメリンのC末とEphA4との結合を示す図である。
【図５Ｃ】神経細胞での内在性α-キメリンとEphA4との結合が、エフリンB3刺激により増強されるかを示す図である。
【図５Ｄ】マウス脳における内在性α-キメリンとEphA4との結合を示す図である。
【図５Ｅ】Rac１活性を示す図である。
【図５Ｆ】Rac１活性を示す図である。
【図６Ａ】クラスター化処理したFc対照(uncollapsed)又はエフリンB3-Fc (collapsed)で処理された培養皮質神経をphalloidin染色した成長円錐を示す図である。
【図６Ｂ】野生型マウス及びミッフィーマウスにおけるエフリンB3刺激による成長円錐の変化を示す図である。
【図６Ｃ】siRNAによるα-キメリンのダウンレギュレーションが、エフリンB3に誘導される成長円錐崩壊を抑制することを示す図である。
【図６Ｄ】α-キメリン-特異的siRNAによるα-キメリン蛋白量の変化を示す図である。
【図７Ａ】野生型マウスにおける正中線でのCST軸索誘導におけるエフリンB3/EphA4フォワードシグナルのモデルを示す図である。
【図７Ｂ】ミッフィーマウスにおける正中線でのCST軸索誘導におけるエフリンB3/EphA4フォワードシグナルのモデルを示す図である。
【図８】ミッフィーマウスの脊髄での形態異常を示す図である。
【図９Ａ】脊髄局所回路での脊髄交叉の定量的解析の結果を示す図である。
【図９Ｂ】脊髄局所回路での脊髄交叉の定量的解析の結果を示す図である。
【図９Ｃ】脊髄局所回路での脊髄交叉の定量的解析の結果を示す図である。
【図１０】ミッフィー変異の遺伝子マッピングを示す図である。
【図１１Ａ】野生型及びミッフィー型のα1及びα2イソフォームの模式図である。
【図１１Ｂ】ミッフィー型α2-キメリンのはRac1-GAP活性を示す図である。
【図１１Ｃ】ミッフィー型α2-キメリンのはRac1-GAP活性を示す図である。
【図１２Ａ】Tg:mfy/mfyとα-Chn KOマウスにおけるα2-キメリンタンパク量のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図１２Ｂ】Tg:mfy/mfyとα-Chn KOマウスにおけるα2-キメリンタンパク量のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図１２Ｃ】Tg:mfy/mfyとα-Chn KOマウスにおけるα2-キメリンタンパク量のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図１２Ｄ】Tg:mfy/mfyとα-Chn KOマウスにおけるα2-キメリンタンパク量のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図１３】発達期CSTにおけるα2-キメリンとEphA4の共局在を示す図である。
【図１４】α2-キメリン蛋白の培養皮質細胞の細胞体と成長円錐における局在及びsiRNAによるダウンレギュレーションを示す図である。
【図１５】EphA4とα2-キメリンの結合に対するα-キメリンのRac-GAP活性の必要性を示す図である。
【図１６】α1-Chnmfy cDNAの配列情報を示す図である。
【図１７】α2-Chnmfy cDNAの配列情報を示す図である。
【図１８Ａ】α3-Chnmfy cDNAの配列情報を示す図である。
【図１８Ｂ】α3-Chnmfy cDNAの配列情報を示す図である（図１８Aの続き）。
【図１９】α3-ChnWT cDNAの配列情報を示す図である。
【図２０Ａ】retroposonの配列情報を示す図である。
【図２０Ｂ】retroposonの配列情報を示す図である（図２０Aの続き）。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号１〜９３：合成
【図１Ａ】
2009051742.tif 000004
【図１Ｂ】
2009051742.tif 000005
【図１Ｃ】
2009051742.tif 000006
【図１Ｄ】
2009051742.tif 000007
【図１Ｅ】
2009051742.tif 000008
【図１Ｆ】
2009051742.tif 000009
【図１Ｇ】
2009051742.tif 000010
【図２】
2009051742.tif 000011
【図３Ａ】
2009051742.tif 000012
【図３Ｂ】
2009051742.tif 000013
【図３Ｃ】
2009051742.tif 000014
【図３Ｄ】
2009051742.tif 000015
【図３Ｅ】
2009051742.tif 000016
【図４Ａ】
2009051742.tif 000017
【図４Ｂ】
2009051742.tif 000018
【図４Ｃ】
2009051742.tif 000019
【図４Ｄ】
2009051742.tif 000020
【図４Ｅ】
2009051742.tif 000021
【図４Ｆ】
2009051742.tif 000022
【図５Ａ】
2009051742.tif 000023
【図５Ｂ】
2009051742.tif 000024
【図５Ｃ】
2009051742.tif 000025
【図５Ｄ】
2009051742.tif 000026
【図５Ｅ】
2009051742.tif 000027
【図５Ｆ】
2009051742.tif 000028
【図６Ａ】
2009051742.tif 000029
【図６Ｂ】
2009051742.tif 000030
【図６Ｃ】
2009051742.tif 000031
【図６Ｄ】
2009051742.tif 000032
【図７Ａ】
2009051742.tif 000033
【図７Ｂ】
2009051742.tif 000034
【図８】
2009051742.tif 000035
【図９Ａ】
2009051742.tif 000036
【図９Ｂ】
2009051742.tif 000037
【図９Ｃ】
2009051742.tif 000038
【図１０】
2009051742.tif 000039
【図１１Ａ】
2009051742.tif 000040
【図１１Ｂ】
2009051742.tif 000041
【図１１Ｃ】
2009051742.tif 000042
【図１２Ａ】
2009051742.tif 000043
【図１２Ｂ】
2009051742.tif 000044
【図１２Ｃ】
2009051742.tif 000045
【図１２Ｄ】
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【図１３】
2009051742.tif 000047
【図１４】
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【図１５】
2009051742.tif 000049
【図１６】
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【図１７】
2009051742.tif 000051
【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
2009051742.tif 000056
【配列表】
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