(57)【要約】【課題】カスパーゼ活性に関する網羅的な解析手法を提供する。【解決手段】複数のペプチドを固定化したアレイを用いて、表面プラズモン共鳴により解析する。特にビオチン化されてなり、好ましくは親水性のリンカーが挿入されたペプチドを用い、ストレプトアビジンの結合シグナルの低減により、カスパーゼ活性を検出する方法が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５よりなる群から選ばれるアミノ酸配列とビオチン残基を含有する２種以上のペプチドが金表面上に固定化されていることを特徴とする、基板上における該ペプチドのカスパーゼによる切断を表面プラズモン共鳴により検出するためのペプチドアレイ。
【請求項２】
サンプル中のカスパーゼ活性を、表面プラズモン共鳴イメージングによる前記ペプチドの切断の検出に基づき検出するための請求項１に記載のペプチドアレイ。
【請求項３】
配列番号１〜５よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチドの自由側末端をビオチン修飾してなることを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチドアレイ
【請求項４】
配列番号１〜５よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチドのアレイ側末端にシステイン残基を有していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドアレイ。
【請求項５】
配列番号１〜５よりなる群から選ばれるアミノ酸配列と末端のシステイン残基との間にスペーサーが挿入されてなることを特徴とする請求項４に記載のペプチドアレイ。
【請求項６】
スペーサーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする請求項５に記載のペプチドアレイ。
【請求項７】
スペーサーが式(Ｉ)もしくは（ＩＩ）に示される化学構造を含有することを特徴とする請求項５に記載のペプチドアレイ。
【化１】
2009052908.tif 000009
(式中、ｎは１〜１０、好ましくは２〜３である。ｍは１〜３を示す。)
【請求項８】
配列番号１〜５よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチドが、スクシンイミド（ＮＨＳ）基もしくは硫酸スクシンイミド基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いて、金表面に固定化されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドアレイ。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のペプチドアレイを用いて、基板上でカスパーゼ反応を行った後、アビジンもしくはストレプトアビジンを作用させることにより得られる表面プラズモン共鳴のシグナルによりカスパーゼ活性を検出する方法。
【請求項１０】
基板上でカスパーゼ反応を行う前に、ブロッキングを行うことを特徴とする請求項９に記載のカスパーゼ活性を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いることによる、チップ上におけるカスパーゼ活性の検出方法に関する。より詳細には、ペプチドが固定化されてなるチップ上で、カスパーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液(サンプル)を作用させることによりカスパーゼ活性を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カスパーゼはアポトーシスのシグナル伝達の基幹となる酵素であり、重要なプロテアーゼ系酵素の一つである。アポトーシスはＫｅｒｒらにより提唱された概念であり、個体の生命を維持するために遺伝子により制御された細胞死を意味するものである。これは、個体発生における形態形成や神経系ネットワークの確立だけでなく、成熟個体における細胞交替や内分泌系による恒常性の維持及び免疫系の成立などに重要な役割を果たしている。また、癌、自己免疫疾患、エイズなどのウイルス感染症、アルツハイマー病などの神経変性疾患などの発症に密接に関わっている。アポトーシスの実行過程においては、カスパーゼによる特定蛋白質（ＰＡＲＰ、ＩＣＡＤ、Ａｃｉｎｕｓ等）の限定分解が中心的な役割を果たしている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３２６巻、第１〜１６頁（１９９７年））。カスパーゼには、既に多種類のものが報告されており、それらの活性化に関するメカニズムも解明されつつある。これらカスパーゼの活性を網羅的に解析する技術を確立することは、薬剤の開発や診断等の分野において重要な意味を有する。
【０００３】
カスパーゼをはじめとする、プロテアーゼ活性の測定は、基質である蛋白質やペプチドの分解を紫外線吸収による定量や、蛍光物質、放射性物質等により標識された基質を用いて遊離される標識物質の量を定量するなどの方法により通常は行われている。しかしながら、こうした手法はプロテオミクス研究などの分野において、近年求められてきているハイスループット化には到底対応できるものではない。
【０００４】
ハイスループット化に対応しうる可能性のあるカスパーゼのアッセイ系として、蛍光アレイを用いた方法が報告されている（非特許文献１−３）。この方法は高感度な検出が可能ではあるが、再現性、データの安定性に関して課題があり、定量的なアッセイには問題がある。
【０００５】
また、最近では、例えば特許文献１のように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた手法として、インタクトな基質の質量対切断された基質の質量を検出する方法が開示されている。しかしながら、この方法は別な反応容器内で予め酵素反応させてから、基質をチップ上に固定化してＳＰＲ測定に供する方法であり、必ずしもハイスループット化に十分に対応しうるような方法とはいえない。また、特許文献２においては、ビオチン化された基質ペプチドにストレプトアビジン（ＳＡ）を結合させた後、カスパーゼを作用させて、加水分解によるＳＰＲシグナルの低下をモニターすることによる方法が開示されている。この方法は、ＳＡを結合させることによる立体的な影響によるカスパーゼの固定化ペプチドへのアクセスが妨げられやすいため、データの安定性や再現性に問題がある。
【特許文献１】特許第２９６８０４８号
【特許文献２】特開２００４−３５７６４２号
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４，１４８６８，２００２
【非特許文献２】Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９，１６６７，１９９９
【非特許文献３】Ｃｏｍｂｉｎａｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ９，２１，２００６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、簡便で安全な方法による、創薬スクリーニングのためのハイスループット対応も可能であるＯｎ−ｃｈｉｐでのカスパーゼ活性の網羅的な解析のための評価系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、金属をコーティングした基板上にカスパーゼを認識するペプチドが固定化されてなるアレイを用いること、さらに該アレイ上における物質間の相互作用をＳＰＲにより検出することが、様々なカスパーゼに関する動態の迅速な解析を行う上で極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）配列番号１〜５よりなる群から選ばれるアミノ酸配列とビオチン残基を含有する２種以上のペプチドが金表面上に固定化されていることを特徴とする、基板上における該ペプチドのカスパーゼによる切断を表面プラズモン共鳴により検出するためのペプチドアレイ。
（２）サンプル中のカスパーゼ活性を、表面プラズモン共鳴イメージングによる前記ペプチドの切断の検出に基づき検出するための（１）に記載のペプチドアレイ。
（３）配列番号１〜５よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチドの自由側末端をビオチン修飾してなることを特徴とする（１）又は（２）に記載のペプチドアレイ
（４）配列番号１〜５よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチドのアレイ側末端にシステイン残基を有していることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチドアレイ。
（５）配列番号１〜５よりなる群から選ばれるアミノ酸配列と末端のシステイン残基との間にスペーサーが挿入されてなることを特徴とする（４）に記載のペプチドアレイ。
（６）スペーサーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする（５）に記載のペプチドアレイ。
（７）スペーサーが式(Ｉ)もしくは（ＩＩ）に示される化学構造を含有することを特徴とする（５）に記載のペプチドアレイ。
【０００９】
【化１】
2009052908.tif 000002
【００１０】
(式中、ｎは１〜１０、好ましくは２〜３である。ｍは１〜３を示す。)
（８）配列番号１〜５よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有するペプチドが、スクシンイミド（ＮＨＳ）基もしくは硫酸スクシンイミド基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いて、金表面に固定化されていることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載のペプチドアレイ。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドアレイを用いて、基板上でカスパーゼ反応を行った後、アビジンもしくはストレプトアビジンを作用させることにより得られる表面プラズモン共鳴のシグナルによりカスパーゼ活性を検出する方法。
（１０）基板上でカスパーゼ反応を行う前に、ブロッキングを行うことを特徴とする（９）に記載のカスパーゼ活性を検出する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明におけるアレイを用いた特にＳＰＲによる相互作用解析により、Ｏｎ−ｃｈｉｐでのカスパーゼの活性検出のための測定系を得ることができる。アレイでの解析を行うことにより、ハイスループット化への対応も可能である点も有用である。また、細胞ライゼートを用いたＳＰＲ測定においても、非常に有用なものである。特に、癌などの疾患の診断やカスパーゼ阻害剤などの新規な創薬スクリーニングのための評価系として非常に有用なものとして期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、ＳＰＲによる相互作用解析により、Ｏｎ−ｃｈｉｐでのカスパーゼによるペプチドの加水分解パターンの網羅的な検出を行うことを特徴とする。ＳＰＲを用いることにより、ラベルフリーに解析できる長所があり、一般的なチップ、アレイにおいては、放射線同位体等によるラベル手段による検出が必要なことに比べて、簡便性のみならず安全性の点でも優位である。この場合、最終的に物質が結合したかどうかだけを検出することができ、相互作用に関係のない物質が非特異的に吸着しても、誤って検出されることはない。従って、相互作用する対象物質がネガティブコントロールに対して非特異的に吸着してなければ、正確に測定できているものと判断することができる。
【００１３】
本発明において用いられる基板の素材は、特に限定されるものではないが、金、銀などの金属が好適に用いられる。なかでも、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであるとより好ましい。透明なガラスは容易に入手できるだけでなく、ＳＰＲ測定に極めて適しているからである。
【００１４】
金属基板を形成する方法としては、金属薄層をコーティングする方法が好ましい。金属をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金属薄層の剥離を抑制するため、０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。
【００１５】
このＳＰＲをアレイ解析技術に応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を、画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。図１においてその一例を示した。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。
【００１６】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００１７】
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。
【００１８】
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面面積は１０〜１０００ｍｍ２に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。
【００１９】
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラにより撮影される。
【００２０】
光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００２１】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。中でもガラスが特に好ましい。
【００２２】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎＤは１．５以上であることが好ましく、１．６以上が更に好ましい。
【００２３】
本明細書において、「ペプチドが金表面上に固定化されている」とは、カスパーゼの基質となるペプチドが金表面上に直接固定化されていてもよく、適当なスペーサー、ポリエチレングリコールなどの水溶性の連結基、或いは金表面に結合するためのＳＨ基を含有する物質（システイン、末端チオール基を有する化合物など）、ＮＨＳ基とマレイミド基を含むヘテロ二官能性架橋剤などの１種または２種以上を介して或いはそれらを用いて、金表面上に固定化されていてもよい。また、該ペプチドはさらにビオチン残基を結合していてもよく、ビオチン残基とカスパーゼの基質となるペプチドの間にはペプチド等の二価連結基を介在させることができる。
【００２４】
本発明においては、ペプチド基質が上述したような基板上に固定化されたアレイを用いる。ペプチドは、種々のカスパーゼの基質として機能しうるようなアミノ酸配列を含有するものとして、配列番号１〜５のアミノ酸配列を含有するペプチドを少なくとも２種以上、好ましくは３種以上を用いる。これらのペプチドは、種々のカスパーゼによる応答性が確認されているものであり、これら５種の中からいくつかを適宜選択して、組み合わせてアレイ解析に用いることにより、網羅的なカスパーゼ活性の解析を行うことができるものである。アレイ解析における検出手段として、定量的な再現性の観点から、例えば蛍光アレイ解析などの方法と比べて、ＳＰＲによる検出法は特に有利である。
５種のカスパーゼ各々の応答性を以下の表１に示す。
【００２５】
【表１】
2009052908.tif 000003
【００２６】
更には、測定に関する信頼性を確認するために、ネガティブコントロールとなるペプチドも同じ基板上に固定化されているのが好ましい。ネガティブコントロールとなるペプチドを用いる場合は、上記配列番号１〜５において１もしくは数個のアミノ酸配列が異なるアミノ酸に置換されているものを用いることが好ましい。好ましくは、アミノ酸配列全体の電荷量が大きく変動しないようなアミノ酸に置換することが好ましい。またアミノ酸置換を加える部位としては、カスパーゼによる切断部位に加えることが好ましい。合成のしやすさ、取り扱いやすさ、保存安定性などの点では、比較的低分子量のペプチドを用いる方が好ましい。ここでペプチドとは一般的に用いられる意味のものを指し、アミノ酸が２個以上ペプチド結合により連結されたものである。そのアミノ酸残基の数は特に限定されないが、４〜２０残基程度のものが好ましく、４〜１０残基程度がより好ましい。
【００２７】
本発明において用いられるペプチドは、その一方の末端にビオチンが修飾されていることが好ましい。ビオチン化されたペプチドを固定化した場合、カスパーゼによる切断反応が進むと、アビジン、ストレプトアビジン（ＳＡ）などによる結合量が減少することから、ＳＰＲ測定を行った場合に、シグナルが低下する様子を確認することにより、カスパーゼ活性を検出することが可能である。更に、抗ＳＡ抗体を作用させることが、カスパーゼ活性の有無によるＳＡの結合性の相違が、よりクリアになる点で好ましい。この方法によると、固定化される分子へのカスパーゼのアクセスが容易である点でも好ましい。
【００２８】
本発明のペプチドアレイにおけるペプチドの固定化方法は特に限定されるものではなく、ペプチド配列におけるアミノ基やチオール基のような官能基を介した方法、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグなどのアフィニティ結合を利用する方法などが挙げられる。この中では、特にチオール基を介してペプチドを固定化する方法が、特異性、感度の両面から特に好ましい。
【００２９】
固定化されるペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１箇所以上のシステイン残基が存在することが好ましい。システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は、一方の末端のみに付加されてなることが好ましい。一方の末端にシステイン残基を付加させる場合、システイン残基のみを付加してもよいが、固定化されたペプチドの自由度を上げることにより作用させる物質との相互作用の効率を高めるためにスペーサーとして１乃至数残基のアミノ酸配列をさらに付加させてもよい。スペーサー部分のアミノ酸配列は特に限定されないが、なかでもグリシン残基及び／又はアラニン残基もしくはセリン残基が１乃至数個の配列を付加させることが特に好ましい。
【００３０】
本発明においては、上記基板に固定化される部位と基質配列部位との間にスペーサーとして親水性化合物が挿入されていることがより好ましい。親水性化合物の分子量は特に限定されないが、１００〜２０００が好ましく、４００〜１０００がより好ましい。また、上記親水性化合物とともに、アミノ酸残基数が２〜１０個、より好ましくは２〜６個からなるスペーサー配列を更に付加させてもよい。スペーサー配列を構成するアミノ酸残基の種類は特に限定されるものではないが、高次構造の形成を起こしにくいアミノ酸を含むことが好ましい。具体的には、少なくとも１つはグリシン残基を含むことが好ましい。より好ましくは、１残基のグリシン（Ｇ）、２残基のグリシン（ＧＧ）、グリシンとアラニン（ＧＡもしくはＡＧ）、あるいはグリシンとセリン（ＧＳもしくはＳＧ）残基の繰り返しを１回以上、更に好ましくは２回以上含んでなる。
【００３１】
ここで、親水性化合物とは水に可溶もしくは水に膨潤する性質をもつ、繰り返し単位をもつ化合物のことをいうものであり、合成物であっても天然物であってもよい。具体的に例示すると、親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、さらにはキトサン、カラギーナン、グルコマンナンなどの多糖類が挙げられる。なかでも、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が特に好ましい。
【００３２】
あるいは、下記の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）に示されるような化学構造を含有する化合物が挿入されていてもよい。この場合、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）に限定されるものではなく、これらの化学式を基本骨格として、より鎖長の長いものを用いてもよい。例えば、１２−ａｍｉｎｏ−３，６，９−ｔｒｉｏｘａｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄや８−ａｍｉｎｏ−３，６−ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄの誘導体を用いることが可能である。
【００３３】
【化２】
2009052908.tif 000004
【００３４】
(式中、ｎは１〜１０、好ましくは２〜３である。ｍは１〜３を示す。)
こうしたスペーサーを付加させることにより、固定化された基質ペプチドの自由度を向上させることができ、その結果としてカスパーゼの固定化ペプチドへのアクセスが容易になることより、受けるカスパーゼによる作用の効率をより高めることが可能となる。スペーサーの挿入される位置に関しては特に制限されるものではないが、固定化部位に近接している方がより好ましい。親水性化合物の挿入されたペプチドの合成方法も特に限定されるものではなく、例えば市販されているペプチド合成用の保護基で修飾されている化合物を用いることにより容易に得ることが可能である。保護基の種類も特に限定されるものではなく、Ｆｍｏｃ基、ｔＢｏｃ基などの一般的なものが用いられる。
【００３５】
本発明において、チオール基を介してペプチドを固定化する場合、予めアミノ基を表面に導入した後、スクシンイミド（ＮＨＳ）基もしくは硫酸スクシンイミド基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いることが特に好ましい。このようなヘテロ二官能型架橋剤としては、低分子なものを用いてもよいし、ＰＥＧのような親水性高分子の両端がＮＨＳ基とＭＡＬ基で修飾されたものを用いることも可能である。いずれを用いても問題ないが、ＰＥＧ誘導体は好適に用いられる。この場合の分子量としては、５００〜５，０００の間のものが好ましく、８００〜２，０００の間のものがより好ましい。
【００３６】
低分子量なヘテロ二官能型架橋剤としては、式（Ｉ）に示す化合物Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくは式（ＩＩ）に示す化合物Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）が挙げられる。なお、式（ＩＩＩ）もしくは式（ＩＶ）に示す化合物と完全に同一構造のものだけを指すのではなく、その機能を損なわない範囲でアナログ化された化合物をも包含する。また、本発明においてはＳＭＣＣ及びＳＳＭＣＣのいずれも適用することが可能であるが、水に対する溶解性の点からは、緩衝液のような水系で反応させる場合においてはＳＳＭＣＣを用いる方がより好ましい。ペプチドの溶解性に応じて、両方を使い分けることが可能である。
【００３７】
【化３】
2009052908.tif 000005
【００３８】
【化４】
2009052908.tif 000006
【００３９】
上記架橋剤を用いてチップ上にマレイミド表面を形成させるためには、スクシンイミド基あるいは硫酸スクシンイミド基と反応性を有する官能基、具体的にはアミノ基を予めチップ上に導入させておく必要がある。チップ上にアミノ基を導入する手段は特に限定されるものではない。基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質をチップ上にコーティングする手段などが挙げられる。また、表面に導入しておいた官能基を起点として、架橋剤を用いてアミノ基を導入する手段なども含まれる。
【００４０】
本発明において用いられるペプチドアレイは、ペプチドの固定化されていない部分（バックグラウンド部）が、式（Ｖ）に示すような化合物によりコーティングされていることが好ましい。式（Ｖ）においてｍは１〜２０の整数、ｎは１〜１０の整数を示す。ｍの値は、２〜１０の範囲がより好ましく、４〜８の範囲が更に好ましい。ｎの値は、２〜８の範囲がより好ましく、３〜６の範囲が更に好ましい。この化合物によりバックグラウンド部をコーティングすることにより、バックグラウンド部における非特異的吸着を非常に効果的に抑制することが実現される。また、本発明のペプチドアレイは、基板の製造ロットや処理条件などの様々な変動要因に依存されるデータの再現性も向上し、非常に安定な測定データを得ることが可能である。
【００４１】
【化５】
2009052908.tif 000007
【００４２】
しかし、ラベルフリーな光学的検出方法においては、どのような物質がチップ上に吸着してもシグナルとして検出される。すなわち、測定対象ではない物質が非特異的に吸着するのと、特異的な吸着を区別することが難しい。よって、よりシビアに非特異的な吸着を抑制する手段が求められるため、上記の固定化方法は非常に効果的である。
【００４３】
測定に際しては、ブロッキングを行うことにより非特異的な吸着などによる影響を抑制させる手段を用いることが、正確な測定データを得るうえでは好ましい。マレイミド表面を用いる場合、チオール基を有する化合物を用いるのが好ましく、例えばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の誘導体を用いることが可能である。あるいは牛血清アルブミン（ＢＳＡ）やカゼインなどを用いてもよい。また、リン脂質からなるブロッキング剤も適用することができる。
【００４４】
本発明は、アレイ上でのカスパーゼ活性の検出を目的とする。したがって、上述のようにして得られたアレイ上で、カスパーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させるに際しては、該カスパーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることになる。プロファイリングの対象となるカスパーゼは市販されているような試薬であってもよいが、細胞由来の破砕液中に既に含まれる、もしくは含まれると推定されるものを用いることも可能である。例えば、バッファーもしくは細胞破砕液（細胞ライゼート）または両者混合液中にカスパーゼ試薬もしくは細胞破砕液中にすでに含まれるカスパーゼを直接アレイに作用させることにより固定化基質への作用を行うことができる。
【００４５】
特に、種々の薬剤による刺激を与えた細胞ライゼートを、本発明に適用することにより、薬剤による各種カスパーゼ活性についての応答パターンの変化を捉えることが可能である。また、阻害剤を共存させる系でのカスパーゼ活性の阻害評価を行うことも可能である。さらに、本発明のペプチドアレイは、カスパーゼ促進剤のスクリーニングにも有用である。したがって、例えば、各種カスパーゼの阻害剤のような新規なドラッグのスクリーニング、カスパーゼをマーカーとして癌などの疾患診断などに展開することも可能である。
【００４６】
反応条件はカスパーゼの種類により変動するが、通常は１０〜４０℃程度、好ましくは２０〜４０℃程度の温度で５分〜８時間程度、好ましくは１０分〜５時間程度反応させることで、固定化されたペプチドを加水分解することができる。反応バッファーは、特に限定されないが、中性バッファーが好ましく、例えばリン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、トリス−ＨＣＬバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＭＥＳバッファーなどが用いられる。ｐＨは６〜８の範囲が好ましく、６．５〜７．５の範囲がより好ましい。また、必要に応じて反応液中には、酵素活性を補助、促進する物質を共存させてもよい。
【００４７】
また、本発明は、アレイ上でのカスパーゼに関する阻害活性の検出を目的とすることも可能である。この場合は、カスパーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させるに際しては、該カスパーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることになる。共存される阻害剤は特に限定されるものではないが、ペプチドもしくは蛋白質であってもよいし、その他の低分子化合物であってもよい。低分子化合物としては、分子量２，０００以下のものが挙げられるが特に制約されない。
【００４８】
上述したような本発明の方法により、Ｏｎ−ｃｈｉｐでの反応を行うことにより、カスパーゼ活性のプロファイリングによる網羅的な解析を実現することができる。特に、創薬のスクリーニングや癌などの診断の分野において、有用な技術となることが期待される。
【実施例】
【００４９】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
［実施例１］
（ＳＰＲアレイの作製）
式（ＶＩ）に示すような、末端官能基がチオール基である直鎖型チオールＰＥＧ試薬（ＳｅｎｓｏＰａｔｈ製ＳＰＳＰＴ−００１１）を１ｍＭの濃度でエタノール７ｍｌに溶解させた。直鎖型チオールＰＥＧの分子量は３３６．５４である。特に、金に対する金属結合性を示す。
【００５０】
【化６】
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【００５１】
１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記直鎖型ＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＰＥＧチオールを結合させた。
【００５２】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部のＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分はＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００５３】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。ＮＨＳ−ｄＰＥＧ１２−ＭＡＬ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ製）を２０ｍＭ  リン酸緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１ｍＭで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＳＳＭＣＣのＮＨＳ基とが反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。
【００５４】
上記のようにして得られた表面に、１００μＭ濃度のペプチド溶液（いずれもリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に０．５ｍＭ濃度で溶解）を、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）自動スポッター（東洋紡績製）を用いて１０ｎｌずつスポッティングを行った。固定化するペプチドは、図２に示したように、システイン残基を末端に、リンカー分子を３つ挿入して、ペプチドは、配列番号１〜９に示す配列を用い、更にグリシン（Ｇｌｙ）−グリシン（Ｇｌｙ）−セリン（Ｓｅｒ）−リジン（Ｌｙｓ）の配列を加えて、末端をビオチンしたものを用いた。リンカーとしては、８−ａｍｉｎｏ−３，６−ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄを挿入した。このリンカー挿入に際しては、ペプチドを合成する際に、Ｆｍｏｃ−ｍｉｎｉ−ＰＥＧ（登録商標；Ｐｅｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製Ｆｍｏｃ−８−ａｍｉｎｏ−３，６−ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）を用いることにより、容易にリンカー挿入されたペプチドを得ることができる。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。チップの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができる。
【００５５】
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、１％  ＢＳＡ（ＰＢＳ溶液）を、チップ上にドロップして、３７℃で３時間インキュベートしてブロッキングを行った。
【００５６】
［実施例２］
（ＳＰＲ解析によるカスパーゼ活性の検出）
実施例１で得た、ブロッキング処理までを行ったアレイを用いて、チップ上でのカスパーゼ５による反応を行った。カスパーゼ５溶液３００μｌをアレイ上にドロップして、３７℃で１６時間の反応を行った。カスパーゼ５溶液の組成は、カスパーゼ５（ＭＢＬ製）を０．１ｕｎｉｔ／μｌになるように、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２；５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｃｈａｐｓ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）で希釈して用いた。
【００５７】
上記カスパーゼ反応を施されたアレイを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ、１％ＳＤＳ含有ＴＢＳ、ミリＱ水の順に、超音波処理をしながら各１０分ずつ洗浄を行った。その後、アレイをＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）：東洋紡績製）にセットし、ランニングバッファーとしてＰＢＳを１００μｌ／ｍｉｎの速度でフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、０．５μｇ／ｍｌ濃度のストレプトアビジン（ＳＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製）溶液を２０分間作用させ、ランニングバッファーを３分間送液して洗浄を行い、更に１μｇ／ｍｌ濃度の抗ＳＡ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ製）溶液を２０分間作用させた。その後、再度ランニングバッファーを３分間送液して洗浄を行った。送液は、全て０．１ｍｌ／分で行った。シグナル変化の観察は、各基質のスポット部位に加え、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄにおいても実施した。
【００５８】
（観察の結果と考察）
各プローブにおいて得られたＳＰＲセンサグラムにおけるシグナル値をグラフ化した結果を図３に示した。グラフの横軸に示した、Ｐは各カスパーゼの基質として作用することが知られているペプチドを示し、Ｎは各カスパーゼの基質のネガティブコントロールのペプチドを示すものである。カスパーゼ５，６，８の基質に関しては、酵素反応によりＳＡの結合シグナルが低減する様子が確認できていることから、カスパーゼ５の作用により切断されたものと推察される。
【００５９】
［実施例３］
実施例１で得た、ブロッキング処理までを行ったアレイを用いて、同様にして、チップ上でのカスパーゼ６、カスパーゼ８及びカスパーゼ９の、Ｏｎ−ｃｈｉｐ反応を行った。カスパーゼ６、カスパーゼ８、カスパーゼ９は全てＭＢＬ製のものを用い、実施例２と同じく、いずれも０．１ｕｎｉｔ／μｌになるように、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２；５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｃｈａｐｓ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）で希釈して、３００μｌをアレイ上にドロップして、３７℃で１６時間の反応をいった。その後のＳＰＲによる解析も、実施例２と同様にして行った。
結果を図４，５，６にそれぞれ示した。カスパーゼ作用により、ＳＡの結合シグナルが低減する様子が見られ、カスパーゼの種類によってその傾向が相違している。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明を利用することにより、多種類のカスパーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のカスパーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＳＰＲイメージングの原理を示す図である。
【図２】実施例１において用いた、固定化ペプチドプローブの構成を示す図である。
【図３】実施例２において実施した、カスパーゼ５によるＯｎ−ｃｈｉｐ反応に関するＳＰＲ解析を行った結果を示す図である。
【図４】実施例３において実施した、カスパーゼ６によるＯｎ−ｃｈｉｐ反応に関するＳＰＲ解析を行った結果を示す図である。
【図５】実施例３において実施した、カスパーゼ８によるＯｎ−ｃｈｉｐ反応に関するＳＰＲ解析を行った結果を示す図である。
【図６】実施例３において実施した、カスパーゼ９によるＯｎ−ｃｈｉｐ反応に関するＳＰＲ解析を行った結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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