(57)【要約】【課題】  モズクなどの褐藻類を含む藻類をアルコール類等の有機溶媒によって加温加圧下で抽出することができるアポトーシス誘導物質を提供すること。【解決手段】アポトーシス誘導物質は、モズクなどの褐藻類を含む藻類をアルコール類等の有機溶媒によって加温加圧下で抽出することができる。このアポトーシス誘導物質は、例えば、がん細胞にアポトーシスを誘導することができることから、抗がん剤としての開発が可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻類を有機溶媒中において加温加圧下で処理することによってアポトーシス誘導物質を抽出することを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記藻類が褐藻類であることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記藻類がモズクであることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の藻類の加温加圧抽出方法。前記有機溶媒がアルコール類であることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記有機溶媒がメタノールまたはエタノールであることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記加温の温度が４０℃〜１００℃であることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記加温の温度が５０℃〜８０℃であることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記加圧の圧力が２〜７０００気圧であることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記加圧の圧力が１０〜６０００気圧であることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項１０】
下記式：Ｃ１４Ｈ１９ＮＯ８
式：Ｃ６Ｈ４（ＣＨ２ＣＯＯＣＨＯＨＯＣＨ２ＮＨ２）（ＣＨ２ＣＯＯＣＨＯＨＯＣＨ３）
【化１】
2009084259.tif 000006
で表される藻類の加温加圧抽出成分の二量体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の藻類の加温加圧抽出成分において、前記藻類の加温加圧抽出成分がガン細胞増殖抑制物質であることを特徴とする藻類の加温加圧抽出成分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明は、アポトーシス誘導物質およびその加温加圧抽出方法に関し、更に詳細には、特にモズクなどの海藻を溶媒中で加温加圧処理して抽出される新規なアポトーシス誘導物質およびその加温加圧抽出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  わが国の沿岸には多種多様の海藻が生えていて、古くから食用などに利用されている。また海藻には数多くの有用物質が含有されていることも知られている。【０００３】  海藻には、アオサ、アオノリ等の緑藻類、モズク、コンブ、ワカメ、メカブ等の褐藻類、アサクサノリ、テングサ等の紅藻類がある。このうち、特に褐藻類のモズクには、フコイダンという多糖が含有されていることはよく知られている。そのフコイダンは、フコースを主成分として、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース、マンノース、グルコース、アルギン酸など１０個以上の多くの糖等を含む硫酸化多糖である。また、フコイダンは、抗血液凝固作用、抗腫瘍作用、脂血清清澄作用、がん転移抑制作用、抗ウイルス作用等の重要な生物活性などの種々の作用効果があるとともに、アポトーシス誘導作用を有していることも知られている（例えば、特許文献１、２、３、４参照）。【０００４】  しかしながら、藻類から、フコイダンの他に、アポトーシス誘導作用を有する成分が抽出されることはこれまで知られていなかった。【０００５】  ここで、アポトーシスとは、細胞が機械的に破壊されたり、飢餓状態に陥れられたりしたときの死（ネクローシス）とは異なり、予めプログラムされた細胞死のことである。アポトーシスの過程では、細胞では核の凝縮が起こり、核中の遺伝子ＤＮＡが分解酵素で分解・断片化され、細胞表面の原形質膜の破壊が起こり、細胞質も細分化されて、細胞は死滅する。この細胞死をアポトーシスという。このアポトーシスは、偶発的な細胞死とは異なり、細胞自身によって厳密にコントロールされている。したがって、がん細胞にアポトーシスを誘導できる物質は、有力な抗がん剤候補物質となると考えられることから、新規なアポトーシス誘導物質を見出して新規な抗がん剤を開発することが要望されている。
【特許文献１】  特開平０６−６２８５２号公報
【特許文献２】  特開２０００−２３９３０２号公報
【特許文献３】  特開２０００−２３９３０１号公報
【特許文献４】  特開２０００−２３６８８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  かかる要望に応えるべく、本発明者らは、モズクをアルコール類中で加温加圧下において抽出を試みた結果、アポトーシス誘導物質が抽出されることを見出すとともに、そのアポトーシス誘導物質の一つと考えられる物質の構造を決定することによって、この発明を完成した。【０００７】  したがって、この発明は、モズクなどの褐藻類を含む藻類から抽出されるアポトーシス誘導物質を提供することを目的としている。
また、この発明は、モズクなどの褐藻類を含む藻類からアポトーシス誘導物質を抽出することができる抽出方法を提供することを別の目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  上記目的を達成するために、この発明は、モズクなどの褐藻類を含む藻類をアルコール類等の有機溶媒の存在下において加温加圧下で処理して抽出することによって得られるアポトーシス誘導物質を提供する。【０００９】  更に詳細には、この発明は、式：Ｃ１４Ｈ１９ＮＯ８
式：Ｃ６Ｈ４（ＣＨ２ＣＯＯＣＨＯＨＯＣＨ２ＮＨ２）（ＣＨ２ＣＯＯＣＨＯＨＯＣＨ３）【００１０】
【化２】
2009084259.tif 000002
で表されるアポトーシス誘導物質の二量体を提供する。【００１１】  この発明は、モズクなどの褐藻類を含む藻類をアルコール類等の有機溶媒の存在下において加温加圧下で処理して抽出することによって得られるアポトーシス誘導物質およびその抽出方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】  この発明に係るアポトーシス誘導物質は、
式：Ｃ１４Ｈ１９ＮＯ８
式：Ｃ６Ｈ４（ＣＨ２ＣＯＯＣＨＯＨＯＣＨ２ＮＨ２）（ＣＨ２ＣＯＯＣＨＯＨＯＣＨ３）【００１３】
【化３】
2009084259.tif 000003
で表される単量体の二量体である。
なお、単量体名は次の通りである。パラキシレン−α，α’−ジカルボン酸（１’−アミノメトキシ−１’−ヒドロキシ）メチル−（１”−メトキシ−１”−ヒドロキシ）。【００１４】  この発明のアポトーシス誘導物質は、モズクなどの褐藻類を含む藻類を水またはアルコール類等の有機溶媒の存在下において加温加圧下で抽出することによって得ることができる。【００１５】  この発明の別の態様であるアポトーシス誘導物質の加温加圧抽出方法は、モズクなどの褐藻類を含む藻類を水またはアルコール類等の有機溶媒の存在下において加温加圧下で処理して抽出することによってアポトーシス誘導物質を効率よく抽出する方法からなっている。【００１６】  この発明の加温加圧抽出方法に使用することができる藻類は、藻類であれば、特に限定されるものではなく、いずれの藻類であってもよい。好ましいのはモズク、ワカメ、メカブなどの褐藻類である。モズク、ワカメなどにも多種類のものがあるが、それらもいずれも使用することができる。【００１７】  この発明において、原材料となる藻類は、アルコール類等の有機溶媒の存在下で加温加圧処理をするのがよい。使用するアルコール類としては、例えば、メタノール、エタノールなどが挙げられるが、アポトーシス誘導物質を抽出する場合には、メタノールが好ましい。
また、この発明によれば、溶媒を換えることによって抽出される有効成分は異なるが、どの溶媒においても従来法（常温・常圧）による抽出効率よりも抽出効率は高く、かつ短時間で抽出することが可能となった。【００１８】  加温加圧処理の条件のうち、加温の温度としては、使用する溶媒によって異なるが、例えば、４０℃〜１００℃、好ましくは５０℃〜８０℃の間がよく、また加圧としては、例えば、２〜７，０００気圧、好ましくは１０〜６，０００気圧であるのがよい。また加温加圧時間は、例えば、５分〜２時間、好ましくは１０分〜１時間の間がよい。【００１９】  この発明に係る物質の細胞増殖抑制能は、通常、ＭＴＴアッセイ法で測定する。このＭＴＴアッセイ法は、その詳細については後述するが、生細胞のミトコンドリア内膜の脱水酵素などによって、（３−（４，５−ジメチルチアゾ−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）が開裂して生成するＭＴＴホルマザンを、酸性イソプロパノールによる呈色反応によって細胞増殖抑制効果を調べる方法である。
サンプル処理によって何らかの形態変化を起こした細胞を回収し酵素処理をすることによって断片化したＤＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動法を用いて、ＤＮＡ断片の大きさにより分離・検出することによってアポトーシス誘導能を測定することもできる。このＤＮＡ断片の検出はアポトーシス誘導の指標となる。【００２０】  この発明によって得られるアポトーシス誘導物質含有抽出物として利用する場合には、例えば、アポトーシス誘導物質含有抽出物の１日使用量は、約１μｇ〜１０ｇであるのがよいが、それらの組成量は、これらの範囲に限定されるものではなく、状況などに応じて適宜変えることができる。なお、アポトーシス誘導物質含有抽出物は、いずれの藻類由来のものを混合して使用することができ、例えば、モズク由来のものと、メカブ由来のものと、またはその他の藻類由来のものと、を混合して使用してもよい。この場合、その混合割合は特に限定されるものではない。さらに、この発明によって得られるアポトーシス誘導物質含有抽出物には、有機溶媒によって抽出されるその他の有用物質が含有されていてもよい。
【実施例１】
【００２１】（メタノール抽出）
約１ｋｇの塩蔵オキナワモズクを、洗浄１回当たり５リットルの水道水を使用して、５分間ミキサーで攪拌しながら解凍、洗浄、脱塩を行った。この操作を５回ないし６回繰り返した。得られた脱塩オキナワモズクは、１時間水に漬けて、塩分濃度の確認後、水を切って１時間放置した。このようにして十分に塩抜きしたモズク１，２２０．９ｇを２つに分けて、８０℃で１２時間通風乾燥して水分を除去した。乾燥したモズクを大まかに粉砕して、それぞれ約３００ｍｌ容高圧処理用ポリ容器に入れ、メタノールをモズクが漬かるように注入した後、空気を抜いた。
上記処理を施したモズクを、６０℃、６，０００気圧の高温高圧で１０分間処理した。高温処理後、６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた上層を回収し、５０℃で減圧濃縮した。濃縮したメタノール抽出物は濃い緑色をしていた。この濃縮物を２日間凍結乾燥した。上記の処理によって、脱塩モズク６１０．０３ｇから１５３．３ｍｇのアポトーシス誘導物質を回収した。
【実施例２】
【００２２】（エタノール抽出）
約１ｋｇの塩蔵オキナワモズクを、洗浄１回当たり５リットルの水道水を使用して、５分間ミキサーで攪拌しながら解凍、洗浄、脱塩を行った。この操作を５回ないし６回繰り返した。得られた脱塩オキナワモズクは、１時間水に漬けて、塩分濃度の確認後、水を切って１時間放置した。このようにして十分に塩抜きしたモズク１，２２０．９ｇを２つに分けて、８０℃で１２時間通風乾燥して水分を除去した。乾燥したモズクを大まかに粉砕して、それぞれ約３００ｍｌ容高圧処理用ポリ容器に入れ、エタノールをモズクが漬かるように注入した後、空気を抜いた。
上記処理を施したモズクを、６０℃、６，０００気圧の高温高圧で１０分間処理した。高温処理後、６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた上層を回収し、５０℃で減圧濃縮した。濃縮したエタノール抽出物は濃い緑色をしていた。この濃縮物を２日間凍結乾燥した。上記の処理によって、脱塩モズク６１０．８７ｇから１３．８ｍｇのアポトーシス誘導物質を回収した。
【実施例３】
【００２３】細胞増殖抑制試験
この発明による抽出物のサンプルについての細胞増殖抑制作用は、ヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）を用いてＭＴＴアッセイ法で調べた。この実験では、サンプル濃度を５，２５，５０，１００μｇ／ｍｌに設定した。
ＭＴＴアッセイは次のようにして行った。９６ウエルプレートにヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）をウエル当たり２．０×１０４個／１００μｌの割合で注入して、５％ＣＯ２の存在下３７℃で２４時間継代培養を行った。次に、各ウエルにサンプルを２μｌずつ添加し、５％ＣＯ２の存在下３７℃で規定時間処理を行った。規定時間経過後、ＭＴＴ液（５ｍｇ／ｍｌ）を各ウエルに１０μｌの割合で添加し、５％ＣＯ２の存在下３７℃で４時間処理を行った。処理後、遮光しながら、各ウエルに０．０４Ｎ塩酸イソプロパノール１００μｌずつ添加し、よく攪拌して、暗紫色の結晶を溶解して、ミクロプレートリーダーを用いて吸光度（５９５ｎｍ）を測定し、細胞生存率（％）を下記の式により算出した。
細胞生存率（％）＝
（細胞吸光度−サンプル吸光度）／コントロール細胞吸光度  ×  １００【００２４】（メタノール抽出物の細胞増殖抑制）
実施例１で得られたメタノール抽出物についての細胞増殖抑制試験の結果を表１および図１に示す。【００２５】
【表１】
2009084259.tif 000004
【００２６】  表１および図１の結果から、実施例１で得られたメタノール抽出物は、サンプル濃度５μｇ／ｍｌから顕著な細胞増殖抑制効果を示すことが分かった。また細胞増殖を半分に抑制する濃度ＩＣ５０は２６．２μｇ／ｍｌであった。【００２７】  実施例１で得られたメタノール抽出物によるＨＬ−６０細胞の形態変化を図２に示す。図２中、Ａは５μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｂは２５μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｃは５０μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｄは７５μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｅは１００μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｆはコントロール、Ｇはコントロールに０．２％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）のみを添加したものをそれぞれ示す。【００２８】（エタノール抽出物の細胞増殖抑制）
実施例２で得たエタノール抽出物をサンプルとして細胞増殖抑制試験の結果は表２および図１に示す通りである。【００２９】
【表２】
2009084259.tif 000005
【００３０】  表２および図１の結果から、実施例２で得られたエタノール抽出物は、サンプル濃度５μｇ／ｍｌから顕著な細胞増殖抑制効果を示すことが分かった。また細胞増殖を半分に抑制する濃度ＩＣ５０は５０μｇ／ｍｌであった。【００３１】  実施例２で得られたエタノール抽出物によるＨＬ−６０細胞の形態変化を図４に示す。図４中、Ａは５μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｂは２５μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｃは５０μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｄは７５μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｅは１００μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｆはコントロール、Ｇはコントロールに０．２％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）のみを添加したものをそれぞれ示す。
【実施例４】
【００３２】アポトーシス誘導
この発明に係る抽出物のアポトーシス誘導能は次のようにして調べた。６ｃｍディシュにヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）を１．０×１０６個／３ｍｌの割合で注入して５％ＣＯ２の存在下３７℃で２４時間継代培養を行った。これに規定濃度のサンプルを添加し、５％ＣＯ２の存在下３７℃で規定時間処理をした後、ＤＮＡの抽出をした。次に、アガロースゲルを用いた電気泳動を行って、エチジウムブロマイドによってゲル染色をした後、ＵＶ照射によりＤＮＡバンドを検出した。【００３３】（メタノール抽出サンプルのアポトーシス誘導能）
上記メタノール抽出サンプルをＨＬ−６０細胞に５，２５，５０，７５，１００μｇ／ｍｌのサンプル濃度で添加して、２４時間サンプル処理をした。その後、光学顕微鏡下で観察したところ、顕著な細胞小体の形成や細胞形態の変化などのアポトーシス誘導の特長たる形態変化が認められた（図２Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ。なお、Ｆはコントロール、Ｇはコントロールに０．２％ＤＭＳＯ添加）。
この細胞を回収後、酵素処理して細胞ＤＮＡを抽出し、これを０．２％アガロースゲル電気泳動にかけて断片化ＤＮＡの検出をした。この結果、５μｇ／ｍｌのサンプル濃度で２４時間処理した細胞から、明確な断片化ＤＮＡが検出され、アポトーシス誘導が起こっていることが確認された（図３。図中、左側から、指標、コントロール、０．２％ＤＭＳＯ、５μｇ／ｍｌサンプル濃度、２５μｇ／ｍｌサンプル濃度、５０μｇ／ｍｌサンプル濃度、７５μｇ／ｍｌサンプル濃度、１００μｇ／ｍｌサンプル濃度）。【００３４】  また、同様のサンプル処理条件でヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）を処理してタンパク質を回収した。これをウエスタンブロッテイング法によりタンパク質を検出したところ、アポトーシス誘導の指標となるタンパク質であるカスパーゼ３の活性化とＰＡＲＰの不活性化とがサンプル濃度依存的に検出された。【００３５】（エタノール抽出サンプルのアポトーシス誘導能）
上記メタノール抽出サンプルのアポトーシス誘導能の場合と同様に、上記エタノール抽出サンプルをＨＬ−６０細胞に５，２５，５０，７５，１００μｇ／ｍｌのサンプル濃度で添加して、２４時間サンプル処理をした。その後、光学顕微鏡下で観察したところ、顕著な細胞小体の形成や細胞形態の変化などのアポトーシス誘導の特長たる形態変化が認められた（図４Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ。なお、Ｆはコントロール、Ｇはコントロールに０．２％ＤＭＳＯ添加）。
この細胞を回収後、酵素処理して細胞ＤＮＡを抽出し、これを２％アガロースゲル電気泳動にかけて断片化ＤＮＡの検出をした。この結果、５μｇ／ｍｌのサンプル濃度で２４時間処理した細胞から、明確な断片化ＤＮＡが検出され、アポトーシス誘導が起こっていることが確認された（図５。図中、左側から、指標、コントロール、０．２％ＤＭＳＯ、５μｇ／ｍｌサンプル濃度、２５μｇ／ｍｌサンプル濃度、５０μｇ／ｍｌサンプル濃度、７５μｇ／ｍｌサンプル濃度、１００μｇ／ｍｌサンプル濃度）。【００３６】  また、同様のサンプル処理条件でヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）を処理してタンパク質を回収した。これをウエスタンブロッテイング法によりタンパク質を検出したところ、アポトーシス誘導の指標となるタンパク質であるカスパーゼ３の活性化とＰＡＲＰの不活性化とがサンプル濃度依存的に検出された。
【実施例５】
【００３７】  モズクに対し、メタノールを用いて、６０℃、６，０００気圧という高温・高圧を１０分間かけることにより従来法（常温・常圧）による抽出効率よりも高い効率で有効成分を抽出できた。
まず、上記の抽出溶媒画分を濃縮・乾固して、溶出溶媒としてメタノールを用いてＭＣＩゲルによる分画を行った。その結果、全体を１３画分（Ｆｃｏ９−ＭｅＯＨ  Ｎｏ．１〜１３）に分画した。
ＭＣＩゲル分画は、室温にて、直径４．５ｃｍ，ゲル高さ１６ｃｍのＭＣＩゲルを使用して行った。少量のメタノールを用いてサンプルを溶解させた後、そのサンプル溶液をゲルに注入した。溶出溶媒は１００％Ｈ２Ｏからスタートし、５％ずつメタノール濃度を上げ、１００％メタノールになるまで、各溶媒を約２５０ｍｌずつ流した。すべての画分をフラクションコレクターにて分取し、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により、内容物を確認しつつ大まかに１３画分に分離した。【００３８】  次に、画分Ｆｃｏ９−ＭｅＯＨ  Ｎｏ．１２をセファデックス▲Ｒ▼ＬＨ−２０ゲルによって３画分（Ｆｃｏ９−ＭｅＯＨ  Ｎｏ．１２Ａ〜Ｃ）に分画した。
ＬＨ−２０ゲル分画は、室温にて、直径４．５ｃｍ，ゲル高さ１６ｃｍのＬＨ−２０ゲルを使用して行った。溶出溶媒はアセトンとメタノールを使用し、アセトンにて、Ｆｃｏ９−ＭｅＯＨ  Ｎｏ．１２画分を溶解し、そのサンプル溶液をゲルに注入した。ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により、内容物を確認しつつ１００％アセトンを流し、分離できる２画分を分取した。その後、１００％メタノールを流し、１画分を分取した。それぞれの画分を、溶出した順に、Ｆｃｏ９−ＭｅＯＨ  Ｎｏ．１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃとした。【００３９】  上記画分のうち、分画Ｆｃｏ９−ＭｅＯＨ  Ｎｏ．１２Ａを、シルカゲル担体にオクタデシルシリル基を化学結合した充填剤を詰めた逆相クロマトグラフィーで用いられるＯＤＳカラムを用いたＯＤＳゲルによって１７画分（Ｆｃｏ９−ＭｅＯＨ  Ｎｏ．１２Ａ１〜１７）に分画した。
ＯＤＳゲル分画は、室温にて、直径４．５ｃｍ，ゲル高さ１６ｃｍのＯＤＳゲルを使用して行った。溶出溶媒は、１００％Ｈ２Ｏからスタートし、５％ずつメタノール濃度を上げ、各溶媒を約２５０ｍｌずつ流した。ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により、内容物を確認しつつ、物質を分取した。８０％メタノール：２０％Ｈ２Ｏという組成溶媒時に、上層のレイヤーが動き出すため、２Ｌほど溶出溶媒を流し続け、上層部の物質を分取する。その結果、１７の画分が分取でき、それぞれ、Ｆｃｏ９−ＭｅＯＨ  Ｎｏ．１２Ａ１〜１７とした。【００４０】  得られた画分についてそれぞれ細胞実験、つまり細胞増殖抑制能の有無の検索をＭＴＴアッセイをして、画分Ｆｃｏ９−ＭｅＯＨ  Ｎｏ．１２Ａ１０に細胞増殖抑制能があることを見出した。【００４１】  細胞増殖抑制能がある画分ＭｅＯＨ  Ｎｏ．１２Ａ１０について、その物理化学的性質を調べた結果を下記に示す。【００４２】（１Ｈ−ＮＭＲ測定）
化合物中の水素原子の数と、電子状態に依存するケミカルシフト（ｐｐｍ）を調べるために、１Ｈ−ＮＭＲを測定した。その結果、７．７３〜７．６５ｐｐｍの領域にベンゼン環由来の水素のピークを、また４．２２，４．２１，３．６６，３．６５ｐｐｍにエーテル（−ＣＨ２−Ｏ−）由来の水素のピークを、更に１．３２ｐｐｍ付近にアルキル基由来の水素のピークを確認した。【００４３】（１３Ｃ−ＮＭＲ測定）
化合物中における炭素原子の数と、電子状態に依存するケミカルシフト（ｐｐｍ）とを調べるために、１３Ｃ−ＮＭＲ測定した。その結果、１６８．２６ｐｐｍにカルボニル基由来の炭素のピークを、また１３２．３０，１３１．５１，１２８．７９ｐｐｍにベンゼン環由来の炭素のピークを、更に７０．２１，６８．０５ｐｐｍに、エーテル基（−ＣＨ２，−Ｏ−）由来の炭素のピークを確認した。【００４４】（ＦＴ−ＩＲ測定）
ＦＴ−ＩＲ測定は、分子中のある原子団（基）のうち、分子のほかの部分の構造に無関係に、同一の振動数、またはそれに近い振動数で吸収帯を生じるところの特性的な吸収帯の位置は不変であるため、これらのスペクトルを見て、特性基吸収帯の一般化した表を参照して、構造に関する有用な情報を得ることができる。その結果、３４２２．０３ｃｍ−１にヒドロキシル基（−ＯＨ）の特性吸収帯を確認した。また、２８５６．８３ｃｍ−１に芳香族のＣ−Ｈ伸縮が認められ、１７３６．０９ｃｍ−１にカルボニル基（−Ｃ＝Ｏ−Ｏ−）の特性吸収帯と、１２７３．１３ｃｍ−１に、エーテル結合（−Ｃ−Ｏ−Ｃ−）の特性吸収帯を確認した。【００４５】（ＭＳ測定）
質量分析（Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）は、原子、分子、クラスター等の粒子を何等かの方法で気体状のイオンとし、真空中で運動させ電磁気力を用いてそれらイオンを質量電荷比（ｍ／ｚ）に応じて分離・検出する分析法である。ＭＳの測定結果から、上記の結果の構造式の二量体と一致した分子量（ＭＨ＋（ｍ／ｚ）＝６５９）が求められた。
【実施例６】
【００４６】（メタノール抽出）
約１ｋｇの塩蔵オキナワモズクを、洗浄１回当たり５リットルの水道水を使用して、５分間ミキサーで攪拌しながら解凍、洗浄、脱塩を行った。この操作を５回ないし６回繰り返して得られた脱塩オキナワモズクを、１時間水に漬けて、塩分濃度の確認後、水を切って１時間放置した。このようにして十分に塩抜きしたモズク１，２２０．９ｇを２つに分けて、８０℃で１２時間通風乾燥して水分を除去した。乾燥したモズクを大まかに粉砕して、それぞれ約３００ｍｌ容高圧処理用ポリ容器に入れ、メタノールをモズクが漬かるように注入した後、空気を抜いた。
上記処理を施したモズクを、１１０℃，２気圧で１５分間処理した。その後、上層をろ過し、得られた抽出物を回収、５０℃で減圧濃縮した。濃縮したメタノール抽出物は濃い緑色をしていた。この濃縮物を２日間凍結乾燥した。上記の処理によって脱塩モズク１ｇから３９．７ｍｇのモズク抽出物を回収した。
【産業上の利用可能性】
【００４７】  この発明は、モズク、メカブなどの褐藻類を含む藻類をアルコール類等の有機溶媒によって加温加圧下でアポトーシス誘導物質を効率よく抽出することができる。この発明によって得られるアポトーシス誘導物質は、例えば、がん細胞にアポトーシスを誘導することができるので、抗がん剤としての開発が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例１および２で得られたメタノール抽出物およびエタノール抽出物についての細胞増殖抑制試験の結果を示すグラフ。
【図２】実施例１で得られたメタノール抽出物によるＨＬ−６０細胞の形態変化を示す図。
【図３】実施例１で得られたメタノール抽出物のサンプル濃度５，２５，５０，７５，１００μｇ／ｍｌによるＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化を示す図。
【図４】実施例２で得られたエタノール抽出物によるＨＬ−６０細胞の形態変化を示す図。
【図５】実施例２で得られたエタノール抽出物のサンプル濃度５，２５，５０，７５，１００μｇ／ｍｌによるＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化を示す図。
【図１】
2009084259.tif 000007
【図２Ａ】
2009084259.tif 000008
【図２Ｂ】
2009084259.tif 000009
【図２Ｃ】
2009084259.tif 000010
【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
2009084259.tif 000012
【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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