(57)【要約】【課題】フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに特異的な、サブナノモルの解離定数を有する抗体を生成することにある。【解決手段】本発明は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインの特性エピトープ即ち、血管新生のマーカーに特異的なサブナノモルの親和性を有する抗体に関する。更に、それは、新形成血管をインビボで検出するための放射線標識化高親和性抗ＥＤ−Ｂ抗体の用途と、前記抗体を備える診断キットとに関する。更にまた、それは、上記抗体並びに好適な光活性分子（例えば、妥当に選択された光増感剤）を備える抱合体と、新血管の選択的に光仲介された閉塞に対する用途に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインの特性エピトープに対する特異的親和性を有する抗体であって、前記ＥＤ−Ｂドメインに対するサブナノモル範囲の親和性を有することを特徴とする抗体。
【請求項２】
前記抗体は、ＥＤ−Ｂ（＋）フィブロネクチンを認識するものである請求項１の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、ｓｃＦｖ型である請求項１の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、組換え抗体である請求項３の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインを５４ｐＭのＫｄで結合させるものである請求項１の抗体。
【請求項６】
以下のアミノ酸配列：
ＶＨ
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSSGTTYY
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
TAVYYCAKPF PYFDYWGQGT LVTVSS
(SEQ ID NO:19)
リンカー
GDGSSGGSGGASTG
(SEQ ID NO:20)
ＶＬ
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS
SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY YASSRATGIP
DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ
QTGRIPPTFG QGTKVEIK
(SEQ ID NO:21)
を有する請求項１の抗体。
【請求項７】
前記抗体は、Ｌ１９の機能的に等価な変異体形態であって、
該Ｌ１９は、配列番号１９、２０及び２１のアミノ酸配列を有する請求項１の抗体。
【請求項８】
前記抗体は、放射線標識化されたものである請求項７の抗体。
【請求項９】
前記抗体は、放射線ヨウ素化されたものである請求項８の抗体。
【請求項１０】
血管新生のマーカーを迅速に標的化する方法に使用するための請求項１乃至９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
血管新生の免疫シンチグラフィー検出のための請求項１０に記載された抗体。
【請求項１２】
血管増殖によって特徴付けられる疾病を検出するための請求項１１に記載された抗体。
【請求項１３】
前記疾病は、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症または腫瘍である請求項１２に記載された抗体。
【請求項１４】
前記抗体は、その注入後３〜４時間、それぞれの組織に局在化するものである請求項１０に記載された抗体。
【請求項１５】
前記抗体は、その注入後３時間、それぞれの組織に局在化するものである請求項１０に記載された抗体。
【請求項１６】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載の抗体と、ドメイン血管新生を検出するために必要な１以上の試薬とを備えることを特徴とする診断キット。
【請求項１７】
血管増殖によって特徴付けられる腫瘍および疾病の診断および治療をするための請求項１乃至９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
請求項１の抗体と、血液凝固および血管閉塞を導入可能な分子とを備えることを特徴とする抱合体。
【請求項１９】
前記血液凝固および血管閉塞を導入可能な分子は、光活性分子である請求項１８の抱合体。
【請求項２０】
前記光活性分子は、光増感剤である請求項１９の抱合体。
【請求項２１】
前記光増感剤は、６００ｎｍ以上の波長を吸収するものである請求項２０の抱合体。
【請求項２２】
前記光増感剤は、スズ（ＩＶ）クロリンｅ６の誘導体である請求項２１の抱合体。
【請求項２３】
血管新生に関連した病状の処置用に注入可能な組成物の調製に使用するための、請求項１８の抱合体。
【請求項２４】
前記血管新生に関係した病状は、眼球血管新生により、または眼球血管新生に関連して引き起こされるものである請求項２３の抱合体。
【請求項２５】
前記抗体は、配列番号１９に記載のＶＨドメインを有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインの特性エピトープ、即ち血管新生のマーカーに特異的なサブナノモルの親和性を有する抗体に関する。それはまた、新形成血管をインビボで検出するための、放射線標識化された高親和性の抗ＥＤ−Ｂ抗体の用途と、前記抗体を備える診断キットとに関する。
【０００２】
更に、本発明は、上記抗体および好適な光活性分子（例えば、光増感剤）を備える抱合体と、新血管の検出および／または凝固へのそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍は、新血管の形成（血管新生）なくして、一定の塊以上に成長することはできない。また、微細血管密度と腫瘍侵襲性との間の相関が、多数の腫瘍について報告されている(Folkman (1995), Nature Med., 1, 27-31)。更に、血管新生は、視力を失わせる眼球不調の大半の基礎となる[Lee et al., Surv. Ophthalmol. 43, 245-269 (1998); Friedlander, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 9764-9769 (1996)]。血管新生のマーカーを選択的に標的化できる分子は、腫瘍や、血管増殖によって特徴付けられる他の疾病、例えば糖尿病性網膜症や、加齢黄斑変性症の診断および治療用の診療的機会を創生する。血管新生のマーカーは、積極的な固形腫瘍の大半で発現され、そして静脈注射された特異的バインダーに対して容易にアクセス可能であるべきである(Pasqualini et al. (1997), Nature Biotechnol., 15, 542-546; Neri et al. (1997), Nature Biotechnol., 15 1271-1275)。新生欠陥構造の標的化された閉塞は、腫瘍の梗塞および崩壊を生ずる結果になる(O'Reilly et al. (1996), Nature Med., 2, 689-692; Huang et al. (1997), Science, 275, 547-550)。
【０００４】
フィブロネクチン分子中に交互に継ぎ合わせることによって挿入されるフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインは、マウス、ラットおよびヒトにおいて等しく９１個のアミノ酸の配列であって、新生血管構造の回りに特異的に累積し(Castellani et al. (1994), Int. J. Cancer 59, 612-618)、そして分子のインターベンションに対する標的を表すことができる。事実、我々は最近、抗ＥＤ−Ｂ単鎖Ｆｖ抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）が、腫瘍のあるマウスの腫瘍血管中に選択的に累積すること、並びに抗体親和性が現れて標的化性能を指示することを蛍光法によって示した(Neri et al. (1997), Nature Biotechnol., 15 1271-1275)（ＧＢ９６／１０９６７．３に基づく国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９７／０１４１２号)。腫瘍標的化は、注入後２４時間、またはそれより遅い時点において評価された。
【０００５】
従来から、ＥＤ−Ｂドメインに抗する抗体を腫瘍標的化用に使用するために、それらを出現させるための種々の試みが知られている。
【０００６】
ピーター等は(Peters et al. Cell Adhesion and Communication 1995, 3: 67-89)、生来のＥＤ−Ｂドメイン以外のＦＮ配列を含まない抗原に対して出現したポリクロナール抗体を開示し、そして、それらの抗体が特異的且つ直接的にこのドメインに結合することを示している。
【０００７】
しかしながら、ピーター等の試薬は、一連の欠点を有する。即ち、ピーター等の抗血清は、ＥＤ−Ｂ（＋）−ＦＮをＮ−グリカナーゼによる処置後にだけ認識する。このことは、脱グリコシル化をインビボで行うことができないという理由から、これらの試薬を腫瘍の標的化、撮像および治療のような応用にとって不適切なものにする。
【０００８】
著者等は彼ら自身、それらの抗体が哺乳類細胞によって生成された完全な長さのＥＤ−Ｂ（＋）−ＦＮを認識しないことを確認している。彼らはまた、フィブロネクチンの他のドメイン（例えば、ＥＤ−Ａ）に抗する抗体が生成されているにも関わらず、ＥＤ−Ｂドメインに対して特異的なモノクロナール抗体を生成することが不可能であったことを確認している。ポリクロナール抗血清が上述した応用に受け入れられないものであることは、従来から周知のことである。
【０００９】
この分野における何年もの意欲的な研究の後でさえも、Ｎ−グリカナーゼによる処置なしにフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインを認識するモノクロナール抗体は、本発明で適用されるファージ表示法を使用した場合にのみ生成できる。
【００１０】
ザング等(Zang et al., Matrix Biology 1994, 14: 623-633)は、犬歯のＥＤ−Ｂドメインに抗して出現したポリクロナール抗血清を開示している。著者等は、ヒトのＥＤ−Ｂ（＋）−ＦＮに対する交差反応性を期待しているが、このことはテストされてはいない。しかしながら、著者等は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインを直接認識するモノクロナール抗体を生成することの困難性を確認している（６３１頁）。その抗血清は、ＥＤ−Ｂ（＋）−ＦＮを、Ｎ−グリカナーゼによる処置後にのみウエスタンブロット法で認識する。前述したように、グリカナーゼ処置は、これらの試薬が本発明による応用には不適切であることを示している。
【００１１】
ＥＬＩＳＡにおけるＥＤ−Ｂ（＋）−ＦＮの認識は、変性剤（４Ｍの尿素）によって抽出され、そしてゼラチンを使用してプラスチック上に捕捉された軟骨についてだけ、脱グリコシル化の必要性無しに進行する。著者等は、「ＥＬＩＳＡプレートのプラスチック表面に結合したゼラチンへのＦＮ分子の結合は、抗血清による認識に対して十分なエピトープをどうにか露出することができる」、と注釈している。インビボ応用にとって、ＦＮは変性およびゼラチン結合されないので、本発明のモノクロナールバインダーは、異なる利点を提供する。
【００１２】
日本国特許ＪＰ０２０７６５９８およびＪＰ０４１６９１９５は、抗ＥＤ−Ｂ抗体について言及している。これらの文献からは、モノクロナール抗ＥＤ−Ｂ抗体が記載されているかは不明である。更に、単一の抗体（例えば、ＪＰ０２０７６５９８に記載された抗体）が、「化学式（１）、（２）または（３）のアミノ酸配列の抗原決定基」を有することは、以下の証拠に基づいて、不可能であるように見える。
【００１３】
−（１）EGIPIFEDFVDSSVGY
−（２）YTVTGLEPGIDYDIS
−（３）NGGESAPTTLTQQT
【００１４】
ｉ）モノクロナール抗体は、良く規定されたエピトープを認識すべきである。
ii）フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインの３次元構造は、ＮＭＲ分光分析によって決定されている。セグメント（１）、（２）および（３）は、ＥＤ−Ｂ構造の逆の面にあり、そして１つのモノクロナール抗体によって同時に結合されることができない。
【００１５】
更に、抗体の有用性を実証するためには、腫瘍中の局在化が、構造崩壊性試薬による処置をしない生物学的試料中のＥＤ−Ｂ（＋）−ＦＮ構造の染色の証拠と同様に、実証されるべきである。
【００１６】
カーネモラ等(Carnemolla et al. 1992, J. Biol. Chem. 267, 24689-24692)によって説明されたＢＣ１抗体は、ＦＮのドメイン７上のエピトープを認識するが、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインの存在下で潜在的であるＥＤ−Ｂドメイン上のエピトープを認識することがない。それは厳密にヒト特異的である。それ故、ＢＣ１抗体と本発明の抗体とは、異なる反応性を示す。更には、ＢＣ１抗体は、ドメイン７を単体で、またＥＤ−Ｂドメインの不存在下ではフィブロネクチンのドメイン７〜８を認識する(Carnemolla et al. 1992, J. Biol. Chem. 267, 24689-24692)。このようなエピトープは、ＦＮ分子のタンパク分解性の劣化によってインビボで生成することができる。本発明による試薬の利点は、それらがＥＤ−Ｂドメインを含有している場合にだけ、それらがＦＮ分子またはフラグメント上に局在化できる点である。
【００１７】
癌の診断のために、そしてより特異的には一次および二次腫瘍疾患に対して、免疫シンチグラフィーは、１つの選択される技術である。この方法論では、患者は、放射線標識化された化合物（例えば、好適なビヒクルにリンクされた放射線核種）を注入された後に、好適な装置（例えば、ガンマ線カメラ）によって撮像される。シンチグラフ応用については、イオン化放射に対する患者の被爆を最小化するために、典型的には短寿命のガンマ線エミッタ、例えばテクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３またはインジウム−１１１が使用される。
【００１８】
核医薬部門で最も頻繁に使用される放射線核種は、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）、即ち半減期が６時間のガンマ線エミッタである。９９ｍＴｃベースの放射線医薬を注射された患者は、典型的には注入後１２〜２４時間まで撮像され得るが、関心のある病状への核種の累積は早い時点であることが望ましい。
【００１９】
更には、新規に形成された血管上へ迅速且つ選択的に局在化可能な抗体が利用できる場合、研究者は、診断および／または治療の利益を達成するために、抗体と接合するための他の好適な分子を探求することを刺激されるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
注入後数時間で腫瘍病状を局在化可能な放射線医薬用の核医薬の必要性と、抗体親和性が現われてその性能を血管新生の標的化に影響させる情報とを鑑みて、本発明の１つの目的は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに特異的な、サブナノモルの解離定数を有する抗体を生成することにある（抗体―抗原親和性の定義および測定についてのレビューに関しては、例えばNeri et al. (1996), Trends in Biotechnol. 14, 465-470を参照のこと)。本発明の異なる目的は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに抗するものであって、注入後数時間で既に腫瘍病状を検出する放射線標識化された好適な形態の抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の１つの形態では、これらの目的は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインの特性エピトープに対する特異的親和性と、前記ＥＤ−Ｂエピトープに対する改善された親和性とを有する抗体によって達成される。
【００２２】
本発明の異なる形態では、上述した抗体は、血管新生のマーカーの迅速な標的化に使用される。
【００２３】
本発明の他の形態は、前記抗体と、血管新生を検出するための１以上の試薬とを備える診断キットである。
【００２４】
本発明の更に異なる形態は、血管増殖によって特徴付けられる腫瘍および疾病の診断および治療をするための前記抗体の用途である。
【００２５】
最後に、本発明の重要な形態は、上記抗体並びに好適な光活性分子（例えば、妥当に選択された光増感剤）を備える抱合体と、新血管の選択的に光仲介された閉塞用のそれらの用途によって代表される。
【００２６】
［用語］
この出願を通して、いくつかの技術的表現が使用され、それらに対して以下の定義が適用される。
【００２７】
−抗体
これは、天然の、あるいは部分的にまたは全体が合成的に生成された免疫グロブリンを記述する。この用語はまた、抗体結合ドメインであるか、またはそれと同族である結合ドメインを有する如何なるポリペプチドまたはタンパク質もカバーする。これらは、天然のソースに由来するか、またはそれらは、部分的にまたは全体が合成的に生成され得る。抗体の例としては、免疫グロブリンのイソタイプおよびそれらのイソタイプ的サブクラスと、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄのような抗原結合ドメインから構成されるフラグメントと、ダイアボディ(diabody)とがある。モノクロナールおよび他の抗体をとり、そして組換えＤＮＡ法の技術を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体やキメラ分子を生成することが可能である。このような技術は、１つの抗体の免疫グロブリン可変部または相補性決定部位（ＣＤＲ）を、異なる免疫グロブリンの定常部または定常部＋枠組み構造領域にするＤＮＡ符号化の導入を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００を参照のこと。抗体を生成するハイブリドーマまたは他の細胞は、生成された抗体の結合特異性を変更するか、または変更しない、遺伝子学的突然変異または他の変化に投入される。１つの抗体は多数の方法で修飾されうるので、「抗体」という用語は、必要とされる特性を有する結合ドメインを備えた如何なる特異的結合メンバーまたは基質をもカバーするように構築されるべきである。かくして、この用語は、抗体のフラグメント、誘導体、機能的等価物および抗体の相同染色体をカバーし、天然あるいは全体または部分的に合成された免疫グロブリン結合ドメインを有する如何なるポリペプチドをも含むことになる。免疫グロブリン結合ドメイン又は等価物を有して、他のポリペプチドに融合したキメラ分子は、それ故含まれることになる。キメラ抗体のクローン化と発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。抗体全体のフラグメントが結合抗体の機能を果たし得ることが示されている。結合フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ii）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（iii）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（iv）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al. (1989) Nature, 9, 341, 544-546)；（ｖ）隔離されたＣＤＲ部位；（vi）リンクされた２つのＦａｂフラグメントを備える２価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（vii）２つのドメインを会合させて１つの抗原結合部位を形成させるポリペプチドリンカーによって、１つのＶＨドメインと１つのＶＬドメインとがリンクされた単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）(Bird et al. (1988) Science, 242, 423-426., 426.; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-83.)；（viii）バイスペシフィック(bispecific)単鎖ＦＶダイマー（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）；そして（ix）遺伝子 融合によって構築された多価または多特異的フラグメントである「ダイアボディ(diabody)」が含まれる(WO94/13804; Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 6444-6448)。ダイアボディは、ポリペプチドの多重結合体(multimer)であ���、各ポリペプチドは、免疫グロブリンＬ鎖の結合領域を有する第１のドメインと、免疫グロブリンＨ鎖の結合領域を有する第２のドメインとを備える。２つのドメインは（例えば、ペプチドリンカーによって）リンクされているが、互いに会合して抗原結合部位を形成することは不可能である。抗原結合部位は、多重結合体内の１つのポリペプチドの第１のドメインと、その多重結合体内のもう１つのポリペプチドの第２のドメインとの会合によって形成される（ＷＯ９４／１３８０４）。バイスペシフィック抗体が使用される場合は、これらは種々の手法で製造され得る通常のバイスペシフィック抗体であり(Holliger and Winter (1993), Curr. Opin. Biotech., 4, 446-449)、例えば化学的にまたは混合ハイブリドーマから調製されるか、あるいは上述したバイスペシフィック抗体フラグメントのいずれかである。抗体全体よりも、むしろｓｃＦｖダイマーまたはダイアボディを使用することの方が好ましい。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインだけを使用し、潜在的に抗イディオタイプ反応の効果を低減して、Ｆｃ領域無しで構築することができる。バイスペシフィック抗体の他の形態には、ネリ等によって記載されている単鎖ＣＲＡｂｓがある(Neri et al. (1995), J. Mol. Biol., 246, 367-373)。
【００２８】
−相補性決定部位
伝統的に、抗体可変ドメインの相補性決定部位（ＣＤＲ）は、特異的抗原認識に本質的な残基を含む、超可変抗体配列として同定されている。この文献では、コシアおよびレスクによるＣＤＲの定義と番号付けを参照する(Chothia and Lesk (1987), J. Mol. Biol., 196, 901-917)。
【００２９】
−機能的に等価な変異体形態
これは、もう１つの分子（親）とは異なる構造を有するが、いくつかの有意な相同性と、親分子の生物学的機能の少なくともいくつか、例えば特別な抗原又はエピトープに結合する能力とを保持する１つの分子（変異体）のことである。変異体は、フラグメント、誘導体または突然変異体の形態である。変異体、誘導体または突然変異体は、１以上のアミノ酸の付加、削除、置換または挿入によるかまたはもう１つの分子のリンクによる、親分子の修飾によって得ることができる。これらの変化は、ヌクレオチドまたはタンパク質のレベルでなされる。例えば、符号化されたポリペプチドは、Ｆａｂフラグメントであり、それはもう１つのソースからのＦｃテールにリンクされる。この代わりに、酵素、蛍光等のマーカーがリンクされ得る。例えば、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインの特性エピトープに抗する抗体「Ａ」の機能的に等価な変異体形態は、相補性決定部位の異なる配列を有するが、抗体「Ａ」の同じエピトープを認識する抗体「Ｂ」であり得る。
【００３０】
我々は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対して特異的であって、組織部分のＥＤ−Ｂ（＋）フィブロネクチンを認識する抗体ファージ表示ライブラリから、ｓｃＦｖ型の組換え抗体を隔離した。これらの抗体の１つＥ１は、改善された親和性を有する抗体Ｈ１０およびＬ１９を生成するために親和性成熟された。抗体Ｌ１９は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対して、サブナノモル濃度範囲の解離定数を有する。
【００３１】
高親和性抗体Ｌ１９とＤ１．３（無関係な抗原であるヘンの卵のリゾチームに対して特異的な抗体）が放射線標識化され、腫瘍のあるマウスに注入された。腫瘍、血液および器官の生体分布が異なる時点で得られ、そして組織１グラム当たりの注入ドーズのパーセント（％ＩＤ／ｇ）として表現された。
【００３２】
注入３時間後既に、Ｌ１９に対する％ＩＤ／ｇ（腫瘍）は、％ＩＤ／ｇ（血液）よりも良好であったが、陰性対照Ｄ１．３に対するものよりは良くなかった。腫瘍：血液比は、より長い時点で増加した。このことは、高親和性抗体Ｌ１９が、例えば血管新生の免疫シンチグラフィー検出に対する有用な腫瘍標的化剤であることを示唆している。
【００３３】
−光増感剤（フォトセンシタイザー）
光増感剤は、水および／または酸素の存在下での照射時に、毒性分子種（例えば、一重項酸素）を生成する分子として定義することができる。この毒性分子種は、生体分子と反応可能であり、それ故に細胞、組織および体液のような生物学的標的に損傷を与える可能性のあるものである。
【００３４】
光増感剤は、それらが６００ｎｍ以上の波長で吸収するときに、特に有用である。事実、組織および体液中への光浸透は、６００〜９００ｎｍ範囲で最大になる[Wan et al. (1981), Photochem. Photobiol. 34, 679-681]。
【００３５】
後に照射される光増感剤の標的化された配給は、血管新生関連の疾病に対し[Yarmush, M.L. et al. Antibody targeted photolysis. Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 10, 197-252 (1993); Rowe, P.M. Lancet 351, 1496 (1998); Levy, J. Trends Biotechnol. 13, 14-18 (1995)]、特に眼球新生血管構造の選択的な切除に対して魅力的な道である。レーザ光凝固法のように利用可能な治療様式は、直接的であれ、光増感剤の投与後であれ、選択性の欠如によって制限され、そして典型的には健康な組織および血管に損傷を生じさせる[Macular Photocoagulation Study Group, Arch. Ophtalm. 112, 480-488 (1994); Haimovici, R. et al., Curr. Eye Res. 16, 83-90 (1997); Schmidt-Erfurth, U. et al., Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 236, 365-374 (1998)]。
【００３６】
上述した論議に基づいて、光増感剤の選択性と特異性を、例えば、それらを好適なキャリア分子と接合させることによって、改善するための手法を見出すことが極めて重要であることが判る。良質のキャリア分子の開発は、とるに足らない仕事とはならないであろう。更に、全てではないが、光感光剤は、それら自身が関心のある部位にインビボで「運搬される」ことを助けるであろう。光増感剤の化学構造、溶解度、親油性、粘着性および力価のようなファクターは、光増感剤の抱合体の「標的化能力(targetability)」と効能に決定的に影響しそうである。
【発明の効果】
【００３７】
我々はここで、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対して特異的な高親和性Ｌ１９抗体が、全身投与時に、眼球血管新生のラビットモデル中に新規に形成された血管に対して選択的に局在化することを示す。光増感剤であるスズ（ＩＶ）クロリンｅ６に化学的に結合し、更に赤色光を照射されたＬ１９抗体は、眼球血管新生構造の選択的閉塞を仲介し、そして対応する内皮細胞のアポプトーシスを促進した。これら結果は、親眼球血管が既存のものから免疫化学的にインビボで区別されることを実証し、そして後に照射される光増感剤の標的化された配給が、盲目眼疾病と、おそらく血管新生に関連した他の病原とを処置することに効果的であることを強く示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】Ａ）、Ｂ）は、設計された抗体ファージライブラリを示す。
【図２】Ａ、Ｂは、ヒト黒色腫ＣＯＬＯ−３８細胞の溶解物の２Ｄゲルウエスタンブロットを示す
【図３】Ａ〜Ｃは、多形膠芽腫の免疫組織化学実験を示す。
【図４】ａ〜ｃは、抗体−（ＥＤ−Ｂ）錯体の安定性の分析を示す。
【図５】放射線標識化された抗体フラグメントを注入された、腫瘍のあるマウスの生体分布を示す。
【図６】Ｌ１９のアミノ酸配列を示す。
【図７】Ａ、Ｂは、ペレットを移植されたラビットの眼を示す。
【図８】ラビットの角膜部分の免疫組織化学を示す。
【図９】ａ〜ｃは、赤色アルカリ性フォスファターゼ基質およびヘマトキシリンを使用して、ラビットの眼球構造の部分（角膜、紅彩および結膜）の免疫組織化学を示す。
【図１０】ａ〜ｄは、蛍光標識化された抗体の眼球新生血管構造中での局在化を示す。
【図１１】ａ〜ｌは、光増感剤に結合したタンパク質を注入されたラビットの眼の、照射前後の、巨視的外観を示す。
【図１２】ａ〜ｌは、光増感剤に結合したタンパク質を注入され、さらに赤色光を照射されたラビットの眼球構造の部分の顕微鏡分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の実施形態が、以下の図面によって示される。
【００４０】
図１は、 設計された抗体ファージライブラリを示す。（ａ）抗体フラグメントは、模式的に図示されているように、ｐIII融解としてファージ上に表示されている。抗体結合部位（抗原の視野）では、ＶｋのＣＤＲの背骨が黄色であり、ＶＨのＣＤＲの背骨が青色である。ランダムな突然変異に向けられる残基は、ＶｋのＣＤＲ３の９１，９３，９４および９６位（黄色）と、ＶＨのＣＤＲ３の９５，９６，９７および９８位（青色）である。これら側鎖のＣｂ原子は、より濃い色で示されている。抗体親和性を改善するために突然変異させられるＣＤＲ１とＣＤＲ２の残基もまた示されている（灰色で）。プログラムＲａｓＭｏｌ (http://www. chemistry. ucsc. edu/ wipke/ teaching/ rasmol. html)を使用して、ｓｃＦｖの構造がｐｄｂファイル１ｉｇｍ(Brookhaven Protein Data Bank; http://www2. ebi. ac. uk/ pcserv/ pdbdb. hem)からモデル化された。（ｂ）は、ＰＣＲ増幅とライブラリクローン化戦略である。ＤＰ４７とＤＰＫ２２の生殖細胞テンプレートが修飾され（テキスト参照）、ＣＤＲ３領域に突然変異を生じさせた。遺伝子(gene)は矩形として示され、またＣＤＲはその矩形内の番号付きボックスとして示されている。ＶＨとＶＬのセグメントは、それから組み立てられ、そしてｐＤＮ３３２ファージミド(phagemid)ベクターにクローン化された。増幅および組立に使用されたプライマー（SEQ ID NO:11からSEQ ID NO:18まで）は、最下部に掲載されている。
【００４１】
図２は、２Ｄゲルおよびウエスタンブロット法を示す。（ａ）は、ヒト黒色腫ＣＯＬＯ−３８細胞の溶解物の２Ｄ−ＰＡＧＥの銀染色であり、これに対しては組換えＥＤ−Ｂ含有７Ｂ８９が添加されている。２つの７Ｂ８９スポット（円形）は、タンパク質増殖に使用されたＨｉｓ−タグ(tag)の部分的なタンパク分解による。（ｂ）は、抗ＥＤ−ＢのＥ１（表１）と、検出試薬としてのＭ２の抗ＦＬＡＧ抗体とを使用した、図２ａのものと同一のゲルの免疫ブロットである。７Ｂ８９スポットだけが検出され、ゲルのスポットから隔離された組換え抗体の特異性が確認された。
【００４２】
図３Ａ〜３Ｃは、多形膠芽腫のシリアルな部分についての免疫組織化学実験であり、ｓｃＦｖのＥ１（Ａ）、Ａ２（Ｂ）およびＧ４（Ｃ）を使用して染色された典型的な糸状血管構造を示している。スケールバーは、２０μｍである。
【００４３】
図４は、抗体・（ＥＤ−Ｂ）錯体の安定性と、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対するｓｃＦｖのＥ１、Ｈ１０およびＬ１９の結合の分析とを示す。（ａ）は、抗体の親和性−成熟について得られた改善された解離プロフィールを示すＢＩＡｃｏｒｅのセンサグラム(sensogram)である。（ｂ）は、ｓｃＦｖ・（ＥＤ−Ｂ）錯体の生来のゲル電気泳動分析である。高親和性抗体Ｌ１９だけが蛍光標識化された抗原との間で安定した錯体を形成できる。蛍光検出は、説明されているように行われた(Neri et al. (199l) Bio Techniques, 20, 708-712)。
【００４４】
（ｃ）ｓｃＦｖ・（ＥＤ−Ｂ―ビオチン）錯体と、１００倍過剰なモルの非ビオチニル化(unbiotinylated)ＥＤ−Ｂとの競合は、Ｏｒｉｇｅｎ装置を使用して、エレクトロケミルミネッセンスによってモニタされた。Ｌ１９・（ＥＤ−Ｂ）錯体に対する長い半減期は、観察することができる。黒四角は、Ｌ１９であり、白三角は、Ｈ１０である。
【００４５】
図５は、放射線標識化抗体フラグメントを注入された、腫瘍のあるマウスの生体分布を示す。
【００４６】
腫瘍および血液の生体分布は、グラム当たりの注入ドーズ量のパーセントして表現され、時間に対してプロットされている。関連する器官の生体分布もまた報告されている。
【００４７】
図６は、Ｈ鎖（ＶＨ）、リンカーおよびＬ鎖（ＶＬ）を有する抗体Ｌ１９のアミノ酸配列を示す。
【００４８】
図７Ａおよび７Ｂは、血管新生基質に浸漬されたポリマーペレットを移植されたラビットの眼を示す。
【００４９】
図８は、新形成血管を有し、Ｌ１９抗体で染色されたラビットの角膜部分の免疫組織化学を示す。
【００５０】
図９は、Ｌ１９抗体を使用した、ラビットの眼球構造の免疫組織化学研究を示す。特異的赤色染色は、角膜の新生血管構造の回りで観察される（ａ）が、紅彩（ｂ）と結膜（ｃ）の血管の回りでは観察されない。小さい矢印は、角膜上皮である。関連する血管は、大きな矢印で示される。スケールバーは、５０μｍである。
【００５１】
図１０は、眼球血管新生を標的化する、蛍光標識化抗体の免疫光検出を示す。強い蛍光性角膜血管新生（矢印で示される）は、ＦＮのＥＤ−Ｂドメインに特異的な抗体抱合体Ｌ１９−Ｃｙ５を注入されたラビット（ａ）で観察されるが、抗体ＨｙＨＥＬ−１０−Ｃｙ５を注入されたラビット（ｂ）では観察されない。角膜部分についての免疫蛍光顕微鏡は、角膜の新生欠陥構造の回りに、Ｌ１９−Ｃｙ５は局在化するが（ｃ）、ＨｙＨＥＬ−１０−Ｃｙ５は局在化しない（ｄ）ことを確認した。画像（ａ，ｂ）は、抗体注入から８時間後に得られたものであり、（ｃ，ｄ）は、抗体注入から２４時間後にラビットから隔離された角膜部分を使用して得られたものである。Ｐは、ペレットである。
【００５２】
図１１は、光増感剤の抱合体で処置されたラビットの眼の巨視的画像を示す。（ａ）は赤色光の照射前の、また（ｂ）は照射から１６時間後の、Ｌ１９−ＰＳを注入されたラビットの眼である。矢印は、凝固した新生血管を示す。これは、照射から１６時間後のパネル（ｃ）のＣｙ５フルオロアンジオグラム(fluoroangiogram)内のハイポ蛍光領域として確認されたものである。他の欠陥構造、例えば膨張した結膜血管中では何も凝固は観察されないという点を明記すべきである。比較のために、漏出血管のハイパー蛍光を伴うＣｙ５フルオロアンジオグラムと、ラビットの未処置の眼の対応するカラー写真が、（ｄ）と（ｈ）に示されている。写真（ｅ，ｆ，ｇ）は、（ａ，ｂ，ｃ）と類似しているが、これらはオバルミン−ＰＳを注入され、さらに赤色光を照射されたラビットに対応したものである。凝固は、何も観察することができず、そしてアンジオグラムは、漏出血管のハイパー蛍光を明らかにした。早期血管新生を有し、Ｌ１９−ＰＳを注入されたラビットの眼は、（ｉ−ｌ）に示されている。赤色光の照射前（ｉ）および照射から１６時間後（ｊ）の画像は、広範囲の選択的な光誘導血管内凝固（矢印）を明らかにしている。血管閉塞（矢印）は、安楽死直後のラビットの照射された眼（ｌ）では特に明らかであるが、同じラビットの未照射の眼（ｋ）では検出することができない。Ｐは、ペレットである。矢印の先端は、角膜−強膜接合部（角膜輪部）を示している。全ての図において、膨張した既存の結膜血管が角膜輪部の上に見えるが、それでも角膜新生血管の成長は、角膜輪部からペレット（Ｐ）に向かって観察できる。
【００５３】
図１２は、選択的な血管閉塞の顕微鏡分析を示す。ラビットの角膜のＨ／Ｅ部分（ａ，ｅ，ｂ，ｆは非固定、ｉ，ｊはパラホルムアルデヒド固定）は、オバルミン−ＰＳ（ａ，ｅ，ｉ）またはＬ１９−ＰＳ（ｂ，ｆ，ｊ）を注入され、さらに照射されたものである。大きな矢印は、代表的な非損傷の血管（ｅ，ｉ）または完全に閉塞された血管（ｆ，ｊ）を示す。照射後にＬ１９−ＰＳによって仲介された角膜新生血管構造の選択的閉塞と制限された血管周囲損傷（エオジン好性）（ｂ，ｆ，ｊ）とは対照的に、結膜の血管（ｋ）と虹彩の血管（ｌ）は、同じラビットについて損傷のサインを示していない。蛍光ＴＵＮＥＬアッセイは、Ｌ１９−ＰＳを注入され（ｃ，ｇ）、あるいはオバルミン−ＰＳを注入され（ｄ，ｈ）、照射されたラビットの部分で異なる数のアポプトーシス細胞を示している。大きな矢印は、いくつかの関連する血管構造を示す。小さな矢印は、角膜上皮を示す。スケールバーは、１００μｍ（ａ〜ｄ）と２５μｍ（ｅ〜ｌ）である。
【００５４】
本発明は、以下の実施例によって更に厳密に説明される。
【００５５】
［実施例１］
フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対して特異的なヒトｓｃＦｖ抗体フラグメントの、抗体ファージ表示ライブラリからの隔離
ヒト抗体ライブラリが、ＶＨ(DP47; Tomlinson et al. (1992), J. Mol. Biol., 227 , 776-798)およびＶｋ (DPK22; Cox et al. (1994), Eur. J. Immunol., 24, 827-836)生殖細胞遺伝子を使用してクローン化された（クローン化および増幅戦略については、図１を参照のこと）。このライブラリのＶＨ成分は、部分的に劣化したプライマー（図１）（SEQ ID NO:11からSEQ ID NO:18まで）を使用して、ＣＤＲ３の９５〜９８位にランダムな突然変異を導入するためのＰＣＲをベースとした方法によって生成された。このライブラリのＶＬ成分は、ＣＤＲ３の９１，９３，９４および９６位にランダムな突然変異を導入することによって、同様の手法で生成された。ＰＣＲ反応は、記載されているように行われた(Marks et al. (1991), J. Mol. Biol., 222, 581-597)。ＶＨ−ＶＬのｓｃＦｖフラグメントは、ＰＣＲアッセンブリによって(Figure 1; Clackson et al. (1991), Nature , 352, 624-628)、ゲル精製されたＶＨおよびＶＬセグメントから構築された。３０μｇの精製されたＶＨ−ＶＬのｓｃＦｖフラグメントは、それぞれ３００ユニットのＮｃｏｌおよびＮｏｔｌにより二重に消化され、それから１５μｇのＮｏｔｌ／Ｎｃｏｌ消化ｐＤＮ３３２ファージミドベクターに結紮された。ｐＤＮ３３２は、ファージミドｐＨＥＮ１の誘導体であり(Hoogenboom et al. (1991), Nucl. Acids Res., 19, 4133-4137)、Ｎｏｔｌ部位と、遺伝子IIIに先行するアンバーコドンとの間の配列は、Ｄ３ＳＤ３−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ６タグに対し符号化する下記の配列によって置換されている(Neri et al. (1996), Nature Biotechnology, 14, 385-39O)。
【００５６】
Not1     D  D  D  S  D  D  D
Y  K  D  D
5' - GCG GCC GCA GAT GAC GAT TCC GAC GAT GAC TAC AAG GAC GAC
D    D   K    H   H    H   H    H    H  amber
GAC GAC AAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT TAG - 3'
【００５７】
ＴＧ１大腸菌株への形質転換は、マークス等(Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222, 581-597)に従って行われ、またファージは、標準プロトコルに従って調製された(Nissim et al., (1991), J. Mol. Biol., 222, 581-597)。拡大する汚染の不存在を調べるために、５つのクローンがランダムに選択され、そして配列化された。
【００５８】
組換えフィブロネクチンのフラグメントであって、タイプIIIの相同性の繰り返しをそれぞれ１および４含んだＥＤ−Ｂおよび７Ｂ８９は、ｐＱＥ１２ベースの発現ベクター(Qiagen, Chatsworth, CA, USA)から、記載されているように発現された(Carnemolla et al. (1996), Int. J. Cancer, 68, 397-405)。
【００５９】
フィブロネクチンの組換えＥＤ−Ｂドメインに対する選択(Carnemolla et al. (1996), Int. J. Cancer, 68, 397-405; Zardi et al. (1987), EMBO J., 6, 2337-2342)は、ビオチンジスルフィドＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチニル化(biotinylated)され、さらに２Ｄゲルか ら溶離された抗原(reagent B-4531; Sigma, Buchs, Switzerland; 10)と、ストレプトアビジンで被覆されたダイナビーズキャプチャー(Dynabeads capture, Dynal, Oslo, Norway)とを使用して１０ｎＭ濃度で行われた。１０１３のファージが、毎回のパニング(panning) について、１ｍｌの反応に使用された。ファージは、２％ミルク／ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）中の抗原で１０分間培養された。この溶液に対して、ＭＰＢＳ中でプリブロックされた１００μｌのダイナビーズ(Dynabeads, 10 mg/ml; Dynal, Oslo, Norway)が添加された。５分間混合した後に、ビーズは溶液から磁気的に分離され、そしてＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で７回、さらにＰＢＳで３回洗浄された。溶離は、５０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）５００μｌによる２分間の培養によって行われ、抗原とビオチンとの間のジスルフィド架橋を低減した。ビーズは再度捕捉され、そして結果として生じた溶液は、指数的に成長するＴＧ１大腸菌細胞に影響を与えるために使用された。３回のパニングの後に、溶離されたファージは、指数的に成長するＨＢ２１５１大腸菌細胞に影響を与えるために使用され、そして（２ｘＴＹ＋１％グルコース＋アンピリシリン１００μｇ／ｍｌ）−１．５％寒天プレート上に配置された。単一コロニーは、２ｘＴＹ＋０．１％グルコース＋アンピリシリン１００μｇ／ｍｌ中で成長させられ、そして抗体発現を達成するために３０度で一昼夜、１ｍＭのＩＰＴＧにより誘導された。結果として得られた上澄みは、１０ｎＭのビオチニル化ＥＤ−Ｂによって処置されたストレプトアビジン被覆微細滴定プレートと、抗ＦＬＡＧのＭ２抗体(IBI Kodak, New Haven, CT)を検出試薬として使用して、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングされた。スクリーニングされたクローンの３２％は、このアッセイでは陽性であった。その中で最強のＥＬＩＳＡ信号を与えた３つ（Ｅ１、Ａ２およびＧ４）が配列化され、更に特徴付けされた。
【００６０】
ＥＬＩＳＡアッセイは、ゲルスポットから回復されたビオチニル化ＥＤ−Ｂと、変性されていないビオチニル化ＥＤ−Ｂと、隣接するフィブロネクチンのドメインにリンクしたＥＤ−Ｂ（７Ｂ８９ドメインを含む組換えタンパク質）と、多数の無関係な抗原とを使用して行われた。抗体Ｅ１、Ａ２およびＧ４は、３つのＥＤ−Ｂ含有タンパク質全てと強く、且つ特異的に反応した。このことは、ＥＤ−Ｂ親和性カラムを使用して、３つの組換え抗体をバクテリアの上澄みから精製可能であるという事実と共に、ＥＤ−Ｂの生来の配座中に存在しているエピトープを、それらが認識していることを強く示唆している。ＥＤ−Ｂドメインを含有しないフィブロネクチンのフラグメントとの間では、何も反応は検出されなかった（データは示されていない）。
【００６１】
ゲルスポットに対して隔離された抗体が、生来の抗原に向けて良好な親和性を有していたか否かをテストするために、ＢＩＡｃｏｒｅ設備上での表面プラスモン共鳴を使用して、記載されているように(Neri et al. (1997) Nature Biotechnol.,15, 1271-1275)、実時間相互作用分析が行われた。Ｅ１、Ａ２およびＧ４のｓｃＦｖフラグメントのモノマーフラクションは、１０７〜１０８のＭ−１範囲内の親和力でＥＤ−Ｂに結合した（表１）。
【００６２】
抗体の特異性および有用性の異なるテストとして、２Ｄ−ＰＡＧＥ免疫ブロットが行われた。即ち、ヒト黒色腫ＣＯＬＯ−３８細胞の溶解物をゲル上で運用し、それに対して微少量のＥＤ−Ｂ含有組換え７Ｂ８９タンパク質が添加された（図２）。ｓｃＦｖ（Ｅ１）は、７Ｂ８９スポットだけを強く、且つ特異的に染色した。
【００６３】
抗体Ｅ１、Ａ２およびＧ４は、顕著な血管新生過程を伴う積極的なヒト脳腫瘍である多形膠芽腫のクリオスタット部分に、ＥＤ−Ｂ含有フィブロネクチン（Ｂ−ＦＮ）を免疫局在化するために使用された。図３は、３つの抗体によって赤色に染色された典型的な糸状血管構造を有する多形膠芽腫のシリアルな部分を示している。外科的手法で除去された直後に液体窒素で凍結された多形膠芽腫試料の部分に対する免疫染色が、記載されているように行われた(Carnemolla et al. (1996), Int. J. Cancer, 68, 397-405; Castellani et al. (1994), Int. J. Cancer, 59, 612-618)。要するに、Ｍ２−抗ＦＬＡＧ抗体(IBI Kodak)と、ビオチニル化抗マウスポリクロナール抗体(Sigma)と、ストレプトアビジン−ビオチンのアルカリ性フォスファターゼ錯体染色キット (BioSpa, Milan, Italy)と、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−リン酸塩およびファーストレッドＴＲ(Sigma)とを使用して免疫染色が行われた。ギル(Gill)のヘマトキシリンは、対向染色(counter-stain)として使用され、それから既に報告したように(Castellani et al. (1994), Int. J. Cancer, 59, 612-618)、グリセルゲル(glycergel, Dako, Carpenteria, CA)中に搭載された。
【００６４】
同様の技術と抗体Ｌ１９とを使用して（次の実施例を参照）、我々はまた、新形成血管を特異的に染色することができた。この新形成血管は、血管内皮成長因子又はホルボールエステルのような血管新生基質が浸漬されたポリマーペレットをラビットの角膜中に移植することによって誘導されたものである。
【００６５】
［実施例２］
サブナノモルの親和性でＥＤ−Ｂに結合するヒトｓｃＦｖ抗体フラグメントの隔離
ｓｃＦｖ（Ｅ１）が選択され、その親和性の改善可能性が、抗原結合部位の周辺部に位置するＣＤＲ残基の制限された数の突然変異に対してテストされた（図１Ａ）。我々は、抗体ＶＨの残基３１〜３３、５０、５２および５４を結合的に突然変異させ、そして対応するレパートリーを繊維状ファージについて表示した。これらの残基は、抗体・抗原錯体の既知の３次元構造中の抗原と頻繁に接触することが見出されている。結果として得られた４×１０８個のクローンのレパートリーは、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに結合するために選択された。２回のパニングと９６個の個別クローンのスクリーニングの後に、親和性が２７倍改善された抗体が隔離された（Ｈ１０；表１および２）。他の人達が親和性成熟抗体について観察していることと同様に、改善された親和性は、改善されたｋｏｎ値によってというよりはむしろ、抗原からのより緩やかな解離に起因していた(Schier et al. (1996), Gene, 169. 147-155; Ito (1995), J. Mol. Biol., 248, 729-732)。Ｌ鎖を欠いた天然および人工的双方の抗体が依然として抗原に結合できるという事実によって支持されるように、抗体のＬ鎖は、抗原結合親和性にあまり貢献していない、としばしば考えられている(Ward et al. (1989) Nature, 341, 544-546; Hamers-Casterman et al. (1993), Nature, 363, 446-448)。この理由のために、我々は、抗原結合部位の中心に位置し（図１ａ）、しばしば抗原に接触することが３Ｄ構造中で見出されるＶＬドメインの２つの残基（３２および５０）だけを無作為化することを選択した。結果として得られる４００のクローンを含んだライブラリーは、ファージ上に表示され、そして抗原結合用に選択された。ＢＩＡｃｏｒｅ設備による実時間相互作用分析を用いる解離プロフィールの解析(Jonsson et al. (1991), BioTechniques, 11, 620-627)と、エレクトロケミルミネッセンス検出を用いる競合実験によるｋｏｆｆ測定とから、Ｋｄ＝５４ｐＭのフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに結合する１つのクローン（Ｌ１９）が同定された（表１および２）。
【００６６】
親和性成熟実験は、次のように行われた。ｓｃＦｖ（Ｅ１）の遺伝子は、ＶＨのＣＤＲ１の３１〜３３位にランダムな突然変異を導入するために（番号付けについては：２８）、プライマーＬＭＢ１ｂｉｓ(5'-GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG-3') (SEQ ID NO:1)とプライマーＤＰ４７ＣＤＲ１ｆｏｒ(5'-GA GCC TGG CGG ACC CAG CTC ATM NNM NNM NNGCTA AAG GTG AAT CCA GAG GCT G-3') (SEQ ID NO:2)で増幅され、またＶＨのＣＤＲ２の５０，５２，５４位をランダムに突然変異させるために、プライマーＤＰ４７ＣＤＲ１ｂａｃｋ(5'-ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CC-3') (SEQ ID NO:3)とプライマーＤＰ４７ＣＤＲ２ｆｏｒ(5'-GTC TGC GTA GTA TGT GGT ACC MNN ACT ACC MNN AAT MNN TGA GAC CCA CTC CAG CCC CTT-3') (SEQ ID NO:4)で増幅された。ＶＨ遺伝子の３’位、ペプチドリンカーおよびＶＬ遺伝子をカバーするｓｃＦｖ遺伝子の残りのフラグメントは、プライマー ＤＰ４７ＣＤＲ２ｂａｃｋ(5'-ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG-3') (SEQ ID NO:5)とプライマーＪｆｏｒＮｏｔ(5'-TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC TTG GCC GAA CG-3') (SEQ ID NO:6)で増幅された（９４Ｃで１分、６０Ｃで１分、７２Ｃで１分）。結果として得られた３つのＰＣＲ生成物は、ゲル精製され、プライマーＬＭＢ１ｂｉｓおよびＪｆｏｒＮｏｔを有するＰＣＲ（２１）によって組み立てられた（９４℃で１分、６０Ｃで１分、７２Ｃで１分）。結果として得られた単一のＰＣＲ生成物は、ＰＣＲ混合物から精製され、Ｎｏｔｌ／Ｎｃｏｌで二重に消化され、Ｎｏｔｌ／Ｎｃｏｌ消化ｐＤＮ３３２ベクターに結紮された。約９μｇのベクターと３μｇのインサートが結紮混合物中で使用された。この混合物は、フェノール化およびエタノール沈殿によって精製され、５０μｌの無菌水中に再懸濁され、さらに電気適格性ＴＧＩ大腸菌細胞内で電気穿孔された。結果として得られた親和性成熟ライブラリは、４×１０８個のクローンを含んでいた。記載されているように生成された抗体−ファージ粒子(Nissim et al. (1994), EMBO J., 13, 692-698)は、７Ｂ８９被覆免疫チューブ(Carnemolla et al. (1996), Int. J. Cancer, 68, 397-405)上での１回目の選択に使用された。選択されたファージは、ビオチニル化ＥＤ−Ｂによって行われる２回目のパニングに使用され、それからストレプトアビジン被覆磁気ビーズ(Dynal, Oslo, Norway; see previous paragraph)によって捕捉された。選択後の、約２５％のクローンが可溶性ＥＬＩＳＡで陽性であった（実験プロトコルについては前章を参照のこと）。ＥＬＩＳＡで陽性の候補から、我々は更に、最低のｋｏｆｆを有する１つ（Ｈ１０；表１）をＢＩＡｃｏｒｅ分析(Jonsson et al. (1991), BioTechniques, 11, 620-627)によって同定した。
【００６７】
ｓｃＦｖ（Ｈ１０）の遺伝子は、ＶＬのＣＤＲ１の３２位にランダムな突然変異を導入するために（番号付けについては：Chothia and Lesk (1987) J.Mol.Biol., 196, 901-917）、プライマーＬＭＢ１ｂｉｓおよびＤＰＫＣＤＲ１ｆｏｒ(5'-G TTT CTG CTG GTA CCA GGC TAA MNN GCT GCT GCT AAC ACT CTG ACT G) (SEQ ID NO:7)でＰＣＲ増幅され、またＶＬのＣＤＲ２の５０位にランダムな突然変異を導入するために、プライマーＤＰＫＣＤＲ１ｂａｃｋ(5'-TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CC-5') (SEQ ID NO:8)およびプライマーＤＰＫＣＤＲ２ｆｏｒ(5'-GCC AGT GGC CCT GCT GGA TGC MNN ATA GAT GAG GAG CCT GGG AGC C-3') (SEQ ID NO:9)によって増幅された。ｓｃＦｖ遺伝子の残りの部分は、オリゴ類ＤＰＫＣＤＲ２ｂａｃｋ(5'-GCA TCC AGC AGG GCC ACT GGC-3') (SEQ ID NO:10)およびＪｆｏｒＮｏｔで増幅された（９４Ｃで１分、６０Ｃで１分、７２Ｃで１分）。結果として得られた３つのＰＣＲ生成物は、Ｈ鎖の突然変異誘発に対して説明したようにして、組み立てられ、消化され、そしてｐＤＮ３３２にクローン化された。結果として得られたライブラリは、３％ＢＳＡ中のビオチニル化ＥＤ−Ｂによって３０分間培養され、それからストレプトアビジン被覆微細滴定プレート(Boehringer Mannheim GmbH, Germany)上で１０分間捕捉された。ファージは、２０ｍＭのＤＴＴ溶液（１，４−ジチオ−ＤＬ−トレイトール、Fluka）で溶離され、そして指数的に成長するＴＧ１細胞に影響を与えるために使用された。
【００６８】
９６コロニーの上澄みにおけるＥＤ−Ｂ結合のＥＬＩＳＡによる分析とＢＩＡｃｏｒｅによる分析は、クローンＬ１９の同定を可能にした。抗ＥＤ−ＢのＥ１、Ｇ４、Ａ２、Ｈ１０およびＬ１９のｓｃＦｖ抗体フラグメントは、積極的な腫瘍の部分の新形成血管を選択的に染色する（図３）。
【００６９】
それからペニー等(Pini et al. (1997), J. Immunol. Meth., 206, 171-182)に既に記載されているように、単一の新鮮なコロニーを１リッターの２ｘＴＹ媒体中に接種して上述した抗ＥＤ−Ｂ抗体フラグメントが生成され、さらに１０ｍｇのＥＤ−Ｂ含有７Ｂ８９組換えタンパク質(Carnemolla et al. (1996), Int. J. Cancer, 68, 397-405)と結合しているＣＮＢｒ活性化セファローズカラム(Pharmacia, Uppsala, Sweden)上に親和性精製された。装填後に、カラムは５０ｍｌの平衡化緩衝液(ＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣｌ)で洗浄された。抗体フラグメントは、それから１００ｍＭのトリメチルアミンによって溶離され、直ちにｐＨ７のＨｅｐｅｓを１Ｍ使用して中性化され、更にＰＢＳに対して透析された。ＢＩＡｃｏｒｅによる親和性実験は、記載されているように(Neri et al. (1997), Nature Biotechnol., 15 1271-1275)、精製された抗体に対して行われた（図４）。バンドシフト分析は、記載されているように(Neri et al. (1996), Nature Biotechnology, 14, 385-390)、Ｎ−終末先端部に赤外フルオロフォアＣｙ５ (Amersham) で蛍光標識化組換えＥＤ−Ｂを使用して行われた(Carnemolla et al. (1996), Int. J. Cancer, 68, 397-405; Neri et al. (1997), Nature Biotechnol., 15 1271-1275)（図４）。ＢＩＡｃｏｒｅ分析は、可能性のある再結合効果と、基底不安定性と、解離相が単一指数的プロフィールに追従することを確実にするに必要な長い実験時間とに起因して、遅い解離反応に対する動力学的パラメータの正確な決定を必ずしも可能にはしない。従って我々は、競合実験(Neri et al. (1996), Trends in Biotechnol., 14, 465-470)によって動力学的解離定数ｋｏｆｆの実験を行った（図４）。簡単に説明すれば、抗ＥＤ−Ｂ抗体（３０ｎＭ）は、記載されているように(Deaver, D. R. (1995), Nature, 377, 758-760)、ルテニウム錯体で予め標識化されているＭ２の抗ＦＬＡＧ抗体（０．５μｇ／ｍｌ）およびポリクロナール抗マウスＩｇＧ(Sigma)の存在下で、ビオチニル化ＥＤ−Ｂ（１０ｎＭ）により１０分間培養された。この溶液に対して、並行反応で、非ビオチニル化ＥＤ−Ｂ（１μＭ）が異なる時間で添加された。その後、Ｏｒｉｇｅｎアッセイ緩衝液(Deaver, D.R. (1995), Nature, 377, 758-760)中に希釈されたストレプトアビジン被覆ダイナビーズが添加され（２０μｌ、１ｍｇ／ｍｌ）、その結果として得られた混合物がＯＲＩＧＥＮアナライザー(IGEN Inc. Gaithersburg, MD, USA)で分析された。この装置は、競合反応の終期にも依然としてビオチニル化ＥＤ−Ｂに結合しているｓｃＦｖフラグメントの量と相関のあるエレクトロケミルミネッセンス信号（ＥＣＬ）を検出するものである。ＥＣＬ信号対競合時間のプロットは、特性定数ｋｏｆｆを有する単一指数に適合可能なプロフィールを生ずる（図４、表２）。
【００７０】
［実施例３］
フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対して特異的な高親和性放射線標識化ｓｃＦｖによる腫瘍の標的化
放射線ヨウ素化ｓｃＦｖ（Ｌ１９）またはｓｃＦｖ（Ｄ１．３）（ヘンの卵のリゾチームに対して特異的な無関係の抗体）が、ミューラインＦ９奇形癌、即ち急速に成長する積極的な腫瘍を皮下移植されたマウスの静脈に注射された。抗体の生体分布は、異なる時点で得られた（図４）。ｓｃＦｖ（Ｌ１９）およびｓｃＦｖ（Ｄ１．３）は、抗体カラム上で親和性精製され(Neri et al. (1997), Nature Biotechnol. 15, 1271-1273)、そしてＩｏｄｏｇｅｎ法(Pierce, Rockford, IL, USA)を使用して、ヨウ素−１２５で放射線標識化された。放射線標識化抗体を抗体カラム上に装填し、それから流通および遊離液フラクションを放射能計数することによって評価されたように、放射線標識化抗体フラグメントは、８０％以上の免疫活性度を保持した。Ｆ９ミューライン奇形癌(Neri et al. (1997), Nature Biotechnol. 15, 1271-1273)を皮下移植されたヌードマウス（生後１２週目のスイスヌードのオス）は、３μｇ（３〜４μＣｉ）のｓｃＦｖを含む塩水溶液１００μｌを注射された。腫瘍サイズは、大きな腫瘍が壊死性中心を有する傾向にあるので、５０〜２５０ｍｇであった。しかしながら、より大きな腫瘍（３００〜６００ｍｇ）に対して行われた標的化実験は、本質的に同じ結果を与えた。３匹の動物は、各時点で使用された。マウスは、苦痛を与えない方法で殺処理され、そして器官は、計量および放射能計数された。代表的な器官の標的化の結果は、組織１グラム当たりの抗体注入ドーズのパーセント（％ＩＤ／ｇ）として表現されている。ＳｃＦｖ（Ｌ１９）は、腎臓を通して血液から速やかに排除された。通常の抗体とは異なり、それは肝臓や他の器官に累積することがない。組織１グラム当たりの注入ドーズの８％は、注入から３時間後に既に腫瘍上に局在化している。この値の後続する減少は、腫瘍が２４〜４８時間で２倍のサイズになったという事実に起因している。注入から３、５および２４時間後の腫瘍：血液比は、Ｌ１９に対してはそれぞれ１．９、３．９および１１．８であったが、陰性対照抗体に対しては常に１．０以下であった。
【００７１】
放射線標識化ｓｃＦｖ（Ｌ１９）は、注入から数時間後には既に腫瘍上に優先的に局在化し、患者の血管新生の免疫シンチグラフィー検出に対するその有用性を示唆している。
【００７２】
［実施例４］
新形成眼球血管を選択的に染色する抗ＥＤ−Ｂ抗体
既存の血管から新規な血管を形成する血管新生は、癌や、視界を失わせる眼球不調の大半を含む多くの疾病の基礎となる特性プロセスである。選択的な標的化と新生血管構造を閉塞させる能力は、診断および治療機会を開放することになろう。
【００７３】
我々は、Ｂ−ＦＮが、眼球血管新生の特異的マーカーであるか否か、そしてＢ−ＦＮを認識する抗体が、全身投与時に選択的に眼球新生血管構造をインビボで標的化することができるか否かについて調査した。この目的のために、我々は、新血管の直接観察を可能にするラビットの角膜内の血管新生を、血管内皮成長因子またはホルボールエステルを含有する外科的移植ペレットによって刺激した（図７）。スクラルフェイト(Sucralfate, kind gift of Merck, Darmstadt, Germany)／ヒドロン(hydron)のペレットが、記載されているように[D'Amato, R.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4082-4085 (1994)]、ニュージーランドホワイトのメスラビットの角膜に移植された。前記ペレットは、８００ｎｇの血管内皮成長因子(Sigma)または４００ｎｇのホルボール１２−ミリスチリン酸塩１３−アセテート（ＰＭＡ）(phorbol 12-myristate 13-acetate, Sigma）のいずれかを含有している。血管新生は、両因子によって誘導された。ラビットは毎日モニタされた。両誘導物質によって新規に形成された血管は、免疫組織化学において強ＥＤ−Ｂ陽性であった。全ての更なる実験に対して、ＰＭＡペレットが使用された。
【００７４】
免疫組織化学的研究は、Ｌ１９が、ラビットの角膜中に誘導された新生血管構造を強く染色するものの（図８，９ａ）、眼の既存の血管（図９ｂ，ｃ）や、他の組織の既存の血管（データは示されていない）は染色しないことを示した。免疫組織化学は、記載されているように行われた[Carnemolla, B. et al., Int. J. Cancer 68, 397-405 (1996)]。
【００７５】
［実施例５］
サブナノモルの親和性でＥＤ−Ｂに結合し、眼球血管新生をインビボで標的化するヒト抗体フラグメントＬ１９
前の実施例で説明した血管新生のラビット角膜モデルと、免疫光検出方法論[Neri, D. et al., Natune Biotechnol. 15, 1271-1275 (1997)]とを使用して、我々は、無関係な抗体に対する抗体フラグメント（ＨｙＨＥＬ−１０）−Ｃｙ５ではなく（図１０ａ，ｂ）、赤色フルオロホアＣｙ５に化学的に結合したＬ１９が、静脈注射時に眼球血管新生を選択的に標的化することを実証した。成長する眼球血管の蛍光染色は、注入直後にＬ１９で明瞭に検出可能であり、そして少なくとも２日間は、腫瘍血管新生について先に観察されたものとの類似性を維持した。続く角膜部分についてのイクスビボでの免疫蛍光顕微鏡分析は、血管構造の回りで、ＨｙＨＥＬ−１０ではなく、Ｌ１９の局在化を確認した（図１０ｃ，ｄ）。
【００７６】
眼球新生血管形成の抗体ベースの選択的標的化の決定は、異なる種の抗Ｂ−ＦＮ抗体の反応性と共に、将来の診療的調査を保証する。免疫蛍光撮像は、病状がフルオロアンジオグラフィーで顕著になる前に、危険性のある患者の眼球血管新生の早期検出に有用である。
【００７７】
いくつかの方法論的詳細：
イクスビボ免疫蛍光のために、そしていくつかのＨ／Ｅ染色のために、角膜が、包埋に先行して、パラホルムアルデヒドを４％含むＰＢＳ中に固定された。蛍光光検出実験は、５ｍｇ／ｋｇのアセプロマジン(Acepromazin)を使用して沈静化されたラビットについて行われた。標的化実験のために、３．５ｍｇのｓｃＦｖ（Ｌ１９）１−Ｃｙ５０．６６および２．８ｍｇのｓｃＦｖ（ＨｙＨＥＬ−１０）１−Ｃｙ５０．８３が、各ラビットに静脈注射された（注入時間＝１５分）。角膜新生血管構造中の強い蛍光は、Ｌ１９の注入直後に既に観察され、数時間保持されたが、ＨｙＨＥＬ−１０の注入に対しては観察されなかった。特異性の追加的なテストとして、前日にｓｃＦｖ（ＨｙＨＥＬ−１０）−Ｃｙ５が注射されたが、蛍光光検出では陰性であったラビットに対して、翌日にｓｃＦｖ（Ｌ１９）−Ｃｙ５が注射された。このラビットは、角膜血管新生の強い蛍光染色を示した。
【００７８】
蛍光検出のために、眼は、タングステンハロゲンランプ(model Schott KL1500; Zeiss, Jena, Germany)によって照射された。このランプは、Ｃｙ５−励起フィルタ(Chroma, Brattleboro, VT, U.S.A.)と、２つの光ガイドとを装備し、その光ガイドのエミッタは、眼から約２ｃｍ離れて配置された。蛍光は、冷却Ｃ−５９８５モノクロームＣＣＤカメラ(Hamamatsu, Hamamatsu-City, Japan)によって検出された。このカメラは、Ｃ−マウントキャノンズームレンズ（Ｖ６×１６；１６〜１００ｍｍ；１：１．９）と、口径５０ｍｍのＣｙ５放射フィルタ(Chroma)とを装備し、照射された眼から３〜４ｃｍ離れて配置された。取得時間は、０．４ｓであった。
【００７９】
Ｃｙ５フルオロアンジオグラフィー実験は、同じ実験的設定で行われたが、０．２５ｍｇのＣｙ５−Ｔｒｉｓを静脈注射した（Ｃｙ５−ＮＨＳとトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタンの反応生成物；注入時間＝５ｓ）。取得時間は、０．２ｓであった。
【００８０】
抗体フラグメントは、ｓｃＦｖ型であった。ｓｃＦｖ（Ｌ１９）およびｓｃＦｖ（ＨｙＨＥＬ−１０）の精製と、インドシアニン染料のＮ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルによるそれらの標識化は、どこにでも記載されている[Neri, D. et al., Nature Biotechnol. 15, 1271-1275 (1997); Fattorusso, R., et al. (1999) Structure, 7, 381-390]。２つの抗体についての抗体：Ｃｙ５標識比は、それぞれ１．５：１および１．２：１であった。Ｃｙ５−ＮＨＳは、アマーシャム社 (Amersham Pharmacia Biotech, Zurich, Switzerland)から、またオバルミンは、シグマ社(Sigma, Buchs, Switzerland)から購入された。
【００８１】
標識反応後に、抗体抱合体は、５０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ（ＰＢＳ）中で平衡化されたＰＤ−１０カラム(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、未統合のフルオロホアまたは光増感剤から分離された。抗体抱合体の免疫活性度は、抗体カラム上での親和性クロマトグラフィ [Neri, D. et al., Nature Biotechnol. 15, 1271-1275 (1997)]によって測定され、そして全てのケースで＞７８％であった。免疫抱合体は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析され、ＭＷ＝３０’０００ダルトンのバンドとして移動させられた（純度３９０％）。
【００８２】
［実施例６］
光増感剤スズ（ＩＶ）クロリンｅ６に化学的に接合し、眼球血管新生を選択的に標的化し、赤色光照射時にその閉塞を仲介するヒト抗体フラグメントＬ１９
選択的な血管切除が抗体仲介標的の力で達成されるか否かをテストするために、我々は、ラビットに対し、Ｌ１９抗体フラグメントを注射し、あるいは光増感剤スズ（ＩＶ）クロリンｅ６（以下、「ＰＳ」と呼ばれる）に結合した新形成血管（オバルミン）に局在化しない無関係なタンパク質を注射した。注射された動物の眼は、赤色光で照射された（光ドーズ＝７８Ｊ／ｃｍ２）。代表的な結果が図１１に示されている。顕著な巨視的相違点が、照射から１６時間後に、Ｌ１９−ＰＳで処置されたラビットで観察された（図１１ａ，ｂ）。これは、角膜新生血管構造の凝固を伴うものであるが、結膜あるいは他の眼球構造中の血管の凝固はなかった。インドシアニンフルオロホアＣｙ５（図１１ｃ）によるフルオロアンジオグラフィーは、血管閉塞を特性ハイポ蛍光領域として確認した。これに対し、ハイパー蛍光領域は、非照射の眼の漏出新生血管構造中で観察された（図１１ｄ，ｈ）。オバルミン−ＰＳで処置されたラビットの照射された血管中では、検眼鏡的にも、またＣｙ５フルオロアンジオグラフィーによっても、巨視的変更は何も検出できなかった（図１１ｅ〜ｇ）。角膜血管新生の早期における標的化Ｌ１９−ＰＳ抱合体の照射の効果は、図１１ｉ〜ｌに示されている。選択的に凝固した血管は、生存中の動物（図１１ｉ，ｊ）で、また一層明らかには、安楽死直後の動物（図１１ｋ，ｌ）で巨視的に視認可能である。
【００８３】
光力学的な損傷は、顕微鏡技術を使用して更に調査された。照射後の血管閉塞は、Ｌ１９−ＰＳで処置された動物の非固定およびパラホルムアルデヒド固定された角膜部分の双方において、標準ヘマトキシリン／エオジン（Ｈ／Ｅ）染色法を使用して検出することができるが（図１１ｂ，ｆ，ｊ）、オバルミン−ＰＳで処置されたものでは検出できない（図１１ａ，ｅ，ｉ）。光増感剤抱合体によって標的化された角膜の部分のアポプトーシスは、蛍光ＴＵＮＥＬアッセイで明瞭に視認できるが（図１１ｃ，ｇ）、陰性対照では殆ど検出できない（図１１ｄ，ｈ）。より高倍率の視野は、血管構造中の内皮細胞のアポプトーシスを示した（図１１ｇ）。処置された動物の虹彩、強膜および結膜の血管への損傷は、ＴＵＮＥＬアッセイ（図示せず）によっても、Ｈ／Ｅ染色（図１１ｋ，ｌ）によっても観察することができた。
【００８４】
新生血管構造の選択的な光力学的切除は、眼球不調の処置と、光拡散体または光ファイバ技術を使用する照射を受け入れ可能な他の血管新生関連の病状の処置にとって利益があることを約束する。この研究の結果は、眼球新生血管構造を、既存の血管および正常な組織を損傷することなく、選択的に閉塞できることを明らかに実証している。
【００８５】
いくつかの方法論的詳細：スズ（ＩＶ）クロリンｅ６は、光増感剤のパネルから、それらの効能、可溶性および特異性に基づいて、ラビットの抗マウスポリクロナール抗体(Sigma)に結合した後に、選択された。これらの免疫抱合体は、ヒトＣＤ４７(#313441A; Pharmingen, San Diego CA, U.S.A.)に対して特異的なモノクロナール抗体で被覆された赤血球の標的化光分解によってスクリーニングされた。スズ（ＩＶ）クロリンｅ６は、記載されているように調製された[Lu, X.M. et al., J. Immunol. Methods 156, 85-99 (1992)]。タンパク質への結合に対して、スズ（ＩＶ）クロリンｅ6（２ｍｇ／ｍｌ）は、ジメチルホルムアルデヒド中で、１０倍過剰なモルのＥＤＣ（Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピル−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸、シグマ社）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロスクシンイミド、シグマ社）と室温で３０分間混合された。結果として得られた活性化混合物は、それから８倍多い体積のタンパク質溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に添加され、そして室温で１時間培養された。
【００８６】
標識化反応後に、５０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ（ＰＢＳ）中で平衡化されたＰＤ−１０カラム(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、未統合のフルオロホアまたは光増感剤から、抗体抱合体は分離された。抗体抱合体の免疫活性度は、前の実施例で説明したように測定された。
【００８７】
フォトキリング(photokilling)実験については、１２ｍｇのｓｃＦｖ（Ｌ１９）１−スズ（ＩＶ）クロリンｅ６０．８または３８ｍｇのオバルミン１−スズ（ＩＶ）クロリンｅ６０．３６がラビットに静脈注射され、そして実験の期間中は暗部に維持された。注入から８時間後に、ラビットは、ケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）／アセプロマジン（１ｍｇ／ｋｇ）により麻酔され、そして２つの眼の一方が、スコット(Schott)ＫＬ１５００タングステンハロゲンランプによって１３分間照射された。このランプは、Ｃｙ５フィルタ(Chroma)と、２つの光ガイドとを装備し、その光ガイドの先端部は、眼から１ｃｍ離れて配置された。照射電力密度１００ｍＷ／ｃｍ２で照明された面積は、ＳＬ８１８光検出器(Newport Corp., Irvine, CA, U.S.A.)を使用して測定したところ、約１ｃｍ２であった。照射後の動物の不快さのサインは、何も観察されなかった。予防処置として、ラビットは照射後に鎮静剤を受けた（ブプレノルフィン０．０３ｍｇ／Ｋｇ）。フォトキリングをモニタするために、眼は検眼鏡で調査され、そしてＫＯＷＡの眼底カメラＳＬ−１４ (GMP SA, Rennens, Lausanne, Switzerland)を使用して撮影された。５匹のラビットは、スズ（ＩＶ）クロリンｅ６抱合体のそれぞれで処置され、そして一方の眼だけが照射され、他方の眼は内部陰性対照とされた。追加的対照として、２匹のラビットが照射のみされたが、光増感剤抱合体は受けなかった。
【００８８】
オーバードーズの麻酔剤によるラビットの安楽死直後に、眼が除核され、角膜が除去され、それからＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ(Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan)中に包埋され、そして凍結された。イクスビボ免疫蛍光のために、そしていくつかのＨ／Ｅ染色のために、角膜が、包埋に先行して、パラホルムアルデヒドを４％含むＰＢＳ中に固定された。５μｍのクリオスタット部分は、更なる顕微鏡分析用に使用された。蛍光ＴＵＮＥＬアッセイは、製造者の指示に従って行われた(Roche Diagnostic, Rotkreuz, Switzerland)。
【００８９】
【表１】
2009280607.tif 000002
【００９０】
抗体クローンの関連アミノ酸位置（＊：番号付けはトムリンソン等(Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14, 4628-4638)による）は、設計された合成ライブラリから隔離された。単一アミノ酸コードは、標準ＩＵＰＡＣ命名法に従って使用されている。
【００９１】
【表２】
2009280607.tif 000003
【００９２】
＊）Ｋd＝ｋoff／ｋonである。高親和性バインダーＨ１０およびＬ１９についてのＢＩＡｃｏｒｅ実験からのｋoff値は、負に荷電されたカルボキシル化固体デキストランマトリクスの効果に起因して、十分に信頼できるものではない。従って、ｋｄ値は、競合実験によって得られたｋoff測定値から計算された(Experimental Procedures)。
【００９３】
ｋoffは、動力学的解離定数であり、ｋonは、動力学的会合定数であり、ｋd、解離定数である。Ｂ＝ＢＩＡｃｏｒｅで測定され、Ｃ＝はエレクトロケミルミネッセンス検出との競合によって測定された。値は、密度決定の精度に基づいて、＋／−５０％の正確さである。
【図１１】
2009280607.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【配列表】
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