(57)【要約】      （修正有）【課題】設計自由度の高い核酸検出プローブを提供する。【解決手段】標的核酸に対して，一方の末端が蛍光標識された第一プローブ１と，他方の末端がクエンチャー６で標識された第二プローブ２とを同時にハイブリダイズさせ蛍光体５とクエンチャーの相互作用による消光の様子を観察することにより，試料中に存在する特定の標的遺伝子量を調べることを特徴とする核酸検出プローブ。【選択図】図１
2009159945.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一の標的核酸にハイブリダイズする第1プローブ及び第2プローブを含む核酸分析キットであって、
前記第1プローブは、前記第1プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域が、前記第2プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域よりも3’末端側となるものであり、かつ3’末端に蛍光体又は消光体を有し、
前記第2プローブは、5’末端に、前記第1プローブが3’末端に蛍光体を具備するときには消光体を有し、前記第1プローブが3’末端に消光体を有するときには蛍光体を有することを特徴とするキット。
【請求項２】
前記第1プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域と、前記第2プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域とが、前記標的核酸において0〜10塩基離れていることを
特徴とする請求項1に記載のキット。
【請求項３】
前記第1プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域と、前記第2プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域とが、前記標的核酸において0〜3塩基離れていることを特徴とする請求項1又は2に記載のキット。
【請求項４】
前記第1プローブと前記第2プローブとは、融解温度の違いが3℃以下であることを特徴
とする請求項1〜3のいずれか1項に記載のキット。
【請求項５】
以下の工程を含む核酸分析方法：
1) 同一の標的核酸にハイブリダイズする第1プローブ及び第2プローブを含む反応液の蛍
光を検出する第1検出の工程、
2) 標的核酸に、前記第1プローブと前記第2プローブとをハイブリダイズさせる工程、
3) 前記ハイブリダイズ工程後に、前記反応液の蛍光を検出する第2検出の工程、及び
4) 前記第1検出と前記第2検出との結果を比較することにより、前記標的核酸の量を分析
する工程：
ただし、前記第1プローブは、前記第1プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域が、前記第2プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域よりも3’末端側となるものであり、かつ3’末端に蛍光体又は消光体を有し、前記第2プローブは、5’末端に、前記
第1プローブが3’末端に蛍光体を具備するときには消光体を有し、前記第1プローブが3’末端に消光体を有するときには蛍光体を有する。
【請求項６】
前記第1プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域と、前記第2プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域とが、前記標的核酸において0〜10塩基離れていることを
特徴とする請求項5に記載の核酸分析方法。
【請求項７】
前記第1プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域と、前記第2プローブの前記標的核酸へのハイブリダイズ領域とが、前記標的核酸において0〜3塩基離れていることを特徴とする請求項5に記載の核酸分析方法。
【請求項８】
前記第1プローブと前記第2プローブとは、融解温度の違いが3℃以下であることを特徴
とする請求項5〜7のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【請求項９】
同一の標的核酸にハイブリダイズする第1配列及び第2配列が標的核酸にハイブリダイズしない第3配列によって繋ぎ合わされた構造を有するプローブを含む核酸分析キットであ
って、
前記第1配列は、前記第1配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域が、前記第2配列
の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域よりも3’末端側となるものであり、かつ3’末端に蛍光体又は消光体を有し、
前記第2配列は、5’末端に、前記第1配列が3’末端に蛍光体を有するときには消光体を有し、前記第1配列が3’末端に消光体を有するときには蛍光体を有することを特徴とするキット。
【請求項１０】
前記第1配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域と、前記第2配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域とが、前記標的核酸において0〜10塩基離れていることを特徴とす
る請求項9に記載のキット。
【請求項１１】
前記第1配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域と、前記第2配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域とが、前記標的核酸において0〜3塩基離れていることを特徴とする請求項9又は10に記載のキット。
【請求項１２】
前記第1配列と前記第2配列とは、融解温度の違いが3℃以下であることを特徴とする請
求項9〜11のいずれか1項に記載のキット。
【請求項１３】
以下の工程を含む核酸分析方法：
1) 一方の末端を蛍光体で、他方の末端を消光体で標識されたプローブを含む反応液の蛍
光を検出する第1検出の工程、
2) 標的核酸に、前記プローブをハイブリダイズさせる工程、
3) 前記ハイブリダイズ工程の後に、前記反応液の蛍光を検出する第2検出の工程、
4) 前記第1検出と前記第2検出との結果を比較することにより、前記標的核酸の量を分析
する工程：
ただし、前記プローブは、同一の標的核酸にハイブリダイズする第1配列及び第2配列が標的核酸にハイブリダイズしない第3配列によって繋ぎ合わされた構造を有するプローブ
であって、前記第1配列は、前記第1配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域が、前記第2配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域よりも3’末端側となるものであり、かつ3’末端に蛍光体又は消光体を有し、前記第2配列は、5’末端に、前記第1配列が3’末端
に蛍光体を有するときには消光体を有し、前記第1配列が3’末端に消光体を有するときには蛍光体を有する。
【請求項１４】
前記第1配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域と、前記第2配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域とが、前記標的核酸において0〜10塩基離れていることを特徴とす
る請求項13に記載の核酸分析方法。
【請求項１５】
前記第1配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域と、前記第2配列の前記標的核酸へのハイブリダイズ領域とが、前記標的核酸において0〜3塩基離れていることを特徴とする請求項13に記載の核酸分析方法。
【請求項１６】
前記第1配列と前記第2配列とは、融解温度の違いが3℃以下であることを特徴とする請
求項13〜15のいずれか１項に記載の核酸分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸（DNAもしくはRNA）検出方法に関する。より詳しくは、オリゴヌクレオチドプローブと試料（ゲノムDNAやRNA、PCR産物などの一本鎖あるいは二本鎖核酸）とを特
異的にハイブリダイズさせる工程を含む遺伝子検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現量を高感度かつ広範なダイナミックレンジで分析することは、遺伝子の機能解析や疾病の研究や診断において極めて重要な役割を果たす。例えば肝炎、HIV、結核
菌、性感染症などの感染症検査では、感染拡大の回避や効果的な治療のため、初期段階で感染病原体の遺伝子を定量する必要がある。また製薬分野では創薬ターゲットを同定したり、薬効を評価するため、疾病特異的に変動する遺伝子を定量する必要がある。
【０００３】
遺伝子を定量するには、対象となる遺伝子をPCR（Polymerase Chain Reaction）法、NASBA法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）、LAMP法（Loop mediated isothermal amplification）などで増幅してから検出するのが一般的である。検出に用いられるプローブとしては、TaqManプローブ、Molecular Beaconプローブ、Quenchingプローブなどがある。このうちTaqManプローブによる検出には、5'→3'exo活性をもつ酵素を使用する必要がある。そのため、5'→3'exo活性をもつDNAポリメラーゼ酵素を使用するPCR増幅法には適用できるが、鎖置換活性を持つが5'→3'exo活性を持たないDNAポリメラーゼやRNAポリメラーゼを使用する必要がある、恒温増幅法であるNASBA法やLAMP法では使用できない。そのため、LAMP法あるいはNASBA法で使用できる検出プローブは、Molecular BeaconプローブとQuenchingプローブとなる。
【０００４】
Molecular Beaconプローブでは、標的核酸にハイブリダイズする配列を設計することのほかに、標的核酸が存在しない場合にはステム配列が安定したヘアピン構造をとるように設計する必要がある。安定したヘアピン構造をとることができないとクエンチングが不完全になりバックグラウンドの上昇を生じるからである。これを防ぐために標的核酸にハイブリダイズする配列とステム配列とを慎重に設計する必要が生じ、その結果、プローブ配列の設計の自由度が限られるといった問題がある。
【０００５】
一方、Quenchingプローブは、プローブの5'末端か3'末端を蛍光体で標識し、プローブ
が標的核酸に結合した際に蛍光体が標的核酸配列中のグアニンと相互作用することによって蛍光が消光する現象を利用している。標的核酸が存在すると、蛍光が消光し、存在しない場合には蛍光が消光しないため、標的核酸の有無を判定できる。しかし、グアニンと相互作用して消光する蛍光体はPacific Blue、 TAMRA、CR6G、 BODIPY FLなどに限られており、多色検出には適さない。また、標的核酸配列中のグアニンと相互作用する位置にプローブを必ず設計しなければならず、設計の自由度に制約が生じるといった問題もある。
【０００６】
【非特許文献１】R. K. Saiki, et al., Science, 1988, 239, 487-491
【非特許文献２】J. Compton, et.al., Nature, 1991, 350, 91-92
【非特許文献３】T. Notomi, et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28, e63
【非特許文献４】Pamela M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, August 1991, 88, 7276-7280
【非特許文献５】S. Tyagi, F. R. Kramer, Nature Biotechnology, 1996, 14, 303-308
【非特許文献６】S.Kurata, et al., Nucleic Acids Research 2001, 29, e34
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の主な目的は、5'→3'exo活性を持たないDNAポリメラーゼを用いる核酸増幅法での検出に適用可能な、設計の自由度の高いプローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、発明者らは、第一プローブと第二プローブをそれぞれ蛍光体と消光体（クエンチャー）で標識し、標的核酸にタンデムにハイブリダイズさせることで、蛍光体からの蛍光シグナルを消光させ、標的核酸の存在の有無を判定する方法を見出した。
【０００９】
本発明では、標的核酸にハイブリダイズする第一プローブと、第一プローブと0〜10塩
基、好ましくは0〜3塩基、最も好ましくは1塩基のギャップを生じるように、第一プロー
ブの3'末端側にハイブリダイズする第二プローブを用いる。第一プローブの3'末端には消光体が標識され、第二プローブの5'末端側には蛍光体、3'末端側には第二プローブの伸長を防ぐためにリン酸あるいはアミノ基が標識されている。
【００１０】
反応液中に標的核酸が存在しない場合には、第一プローブと第二プローブは反応液中にそれぞれ独立して存在しており、反応液からは第一プローブ由来の蛍光が検出される。一方、標的核酸が存在する場合には、第一プローブと第二プローブは標的核酸にハイブリダイズする。このとき、第一プローブと第二プローブは上記したようなギャップを生じるようにタンデムにハイブリダイズするため、第一プローブの3'末端に標識された消光体と、第二プローブの5'末端に標識された蛍光体が接近し、蛍光共鳴エネルギートランスファーにより、蛍光体からの蛍光シグナルが消光される。
【００１１】
核酸増幅反応の過程では、反応進行に伴って標的核酸が生成されるため、第一プローブと第二プローブが徐々に増幅産物にハイブリダイズしていく。つまり、時間の経過に伴って反応液中からの蛍光シグナル量は減少することになる。従来のMolecular BeaconプローブやTaqManプローブでは標的核酸の増幅に伴って蛍光シグナル量が増加し、蛍光シグナル量がある閾値よりも大きくなるタイミングは反応開始前の標的核酸の存在量に依存する。一方、本発明の核酸検出用プローブでは、標的核酸の増幅に伴って蛍光シグナル量が減少する。蛍光シグナル量がある閾値よりも小さくなるタイミングは反応開始前の標的核酸の存在量に依存する。従って、蛍光シグナルの絶対値から蛍光シグナルの減少量を算出してプロットすることによって、従来のMolecular BeaconプローブやTaqManプローブと同様に検量線を作製して、標的核酸の定量をすることが可能となる。
【００１２】
また、第一プローブの3'末端側に蛍光体を標識し、第二プローブの5'末端側に消光体を標識しても良い。この場合も標的核酸に対して第一プローブと第二プローブが0〜10塩基
、好ましくは0〜3塩基、最も好ましくは1塩基のギャップを生じるようにハイブリダイズ
し、蛍光体と消光体の相互作用によって蛍光体からの蛍光シグナルが消光される。この場合も第二プローブの3'末端は第二プローブの伸長を防ぐために標識をしておく。
【００１３】
また、第一プローブと第二プローブが一つのプローブとして繋がっていてもよい。具体的には、第一プローブに相当する配列部分と第二プローブに相当する配列部分が標的核酸に対してタンデムにハイブリダイズするように設計され、それぞれの配列部分が標的核酸にハイブリダイズしない配列部分で繋ぎ合わされており、5'末端側に蛍光体が標識され、3'末端側に消光体が標識されたプローブを用意する。このハイブリダイズしない配列部分の長さは、第一プローブに相当する配列部分と第二プローブに相当する配列部分を足し合わせた長さ以上であり、数百塩基程度の長さである必要がある。好ましくは50〜200塩基
長である。標的核酸が存在しない場合には、プローブは直鎖状となるためプローブの5'末
端と3'末端にそれぞれ標識された蛍光体と消光体は離れており反応液からは蛍光が検出される。標的核酸が存在すると、プローブは5'末端と3'末端が標的核酸に対してタンデムにハイブリダイズし、その結果蛍光体と消光体が接近するため蛍光共鳴エネルギートランスファーにより蛍光体からの蛍光シグナルが消光される。このように第一プローブと第二プローブが繋がった場合にも、上述の第一プローブと第二プローブを使用する場合と同様に反応進行に伴って標的核酸が生成される様子を計測できる。また、プローブの3'末端側に蛍光体を標識し、5'末端側に消光体を標識しても良い。
【００１４】
以上のように、本発明によれば、標的配列に対して配列の制約なしにプローブが設計できる。
【００１５】
また、本発明は、以下の核酸検出プローブキットを提供する。
１つの実施態様において、キットは標的核酸を認識する配列を持つ2種類のオリゴヌク
レオチドプローブからなり、それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは標的核酸に対して、0〜10塩基、好ましくは0〜3塩基、最も好ましくは1塩基のギャップを生じるようにタンデムにハイブリダイズする配列を持つ。このギャップを挟んで片方のオリゴヌクレオチドプローブには蛍光体が標識され、もう片方のオリゴヌクレオチドプローブには消光体が標識されている。
【００１６】
別な実施態様において、第一プローブと第二プローブは繋がった1種類のオリゴヌクレ
オチドプローブからなり、その5'末端と3'末端にはそれぞれ蛍光体と消光体が標識されており、この蛍光体と消光体が近接するように標的核酸にタンデムにハイブリダイズする。
【００１７】
別な実施形態において、前記した蛍光体や消光体をユーザーが標識できるように、オリゴヌクレオチドプローブは末端がアミノ基などの官能基やビオチン修飾がなされたものであってもよい。その場合、キットは官能基と反応するための導入部分を有する蛍光体や消光体を別個に含むことができる。
【００１８】
キットの必須構成要素は上述したオリゴヌクレオチドプローブであるが、本発明のキットは検出反応に必要な他の試薬、例えば反応緩衝液、基質ヌクレオチド、増幅用プライマー、酵素等を含んでいても良い。
【発明の効果】
【００１９】
本発明では、標的遺伝子に対して、蛍光体及び消光体で標識された2種類あるいは1種類のオリゴヌクレオチドプローブを作用させ、蛍光共鳴エネルギートランスファーによって生じる蛍光シグナルの変化を検出する。これにより、従来、自由度の高い設計が困難であったMolecular BeaconプローブやQuenchingプローブと同様の機能を有する核酸検出用プローブを、標的遺伝子配列に関わらずに設計できることになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、図面を参照しながら、本発明について具体的に説明する。
本発明の第1のフローを図1に示す。本発明は核酸配列を検出するプローブであって、標的核酸3の塩基配列に対して特異的な配列を有する塩基配列を有する第一プローブ1と、第一プローブ1の3'末端から1塩基離れた位置に5'末端が位置するように標的核酸3にハイブ
リダイズする配列を有する第二プローブ2から構成される。第一プローブ1の3'末端にはDABCYLやBHQなどの消光体6が標識されており、第二プローブ2の5'末端にはFAMやCy5などの蛍光体5が標識されている。また、第二プローブの3'末端は、プローブが伸長しないようにリン酸化やアミノ化、あるいはダイデオキシ化などの修飾がなされている（図1にはリン酸7の場合を記載）。第一プローブには1つの消光体が標識されており、第二プローブには1つの蛍光体が標識されている。つまり1つのプローブにつき蛍光体あるいは消光体の標識は１つであることから、プローブ合成が容易となり合成収率が向上する。従来では二重標識が困難で、Molecular BeaconプローブやTaqManプローブには利用できない蛍光体についても本発明によって利用可能となる。例えば、Alexa350、Alexa750やAlexa790のような紫外領域で励起したり、あるいは遠赤外領域で蛍光を発する蛍光体でも利用できるようになる。標的核酸3が存在する場合、例えばPCR反応の進行に伴って標的核酸3の量が反応時間の経過とともに増加してくる場合には、第一プローブ1と第二プローブ2は増幅産物である標的核酸3にハイブリダイズする。第一プローブ1と第二プローブ2は1塩基のギャップを生じるような位置関係で標的核酸にハイブリダイズするように設計されているため、第一プローブ1に標識された消光体6と第二プローブに標識された蛍光体5が接近して蛍光体5からの蛍光が消光される。図1では標的核酸に対して第一プローブ１と第二プローブ2が1塩基のギャップを生じるようにハイブリダイズしているが、ギャップは0塩基（ギャップなし）から10塩基、好ましくは0塩基から3塩基の範囲であれば良い。
【００２１】
なお、本発明において利用可能な蛍光体としては、FAM・TET・HEX・Fluorescein・FITC・CR6G・ROX・TAMRA・JOE・Texas Red・Oregon Green・Yakima Yellow・Pacific Blue・Cascade Blue・Cy Dyeシリーズ・CAL Fluorシリーズ・ALEXAシリーズ・Rhodamineシリーズ・BODIPYシリーズ等を挙げることができ、本発明において利用可能な消光体としては、TAMRA・Dabcyl・Eclipse(R) Dark Quencher・BHQシリーズ・DDQシリーズ等をあげることができる。本発明で用いる蛍光体と消光体の組み合わせとしては，ALEXA 350とBHQ-0・FAMとBHQ-1・ROXとBHQ-2・Cy5とBHQ-3・TETとDabcyl・FluoresceinとTAMRA・HEXとDDQＩ・Rhodamine 6GとDDQＩＩ・Yakima YellowとEclipse(R) Dark Quencher等が考えられるが、この組み合わせに限定するものではない。
【００２２】
本発明の第2のフローとして、第一プローブ11に蛍光体5を標識し、第二プローブ12に消光体6を標識した形態を図2に示す。図2では第二プローブ12の伸張を防ぐために、第二プ
ローブの3’末端にはアミノ基8を修飾している。この場合も図1の場合と同様に標的核酸3に第一プローブ11と第二プローブ12がハイブリダイズし、蛍光体5と消光体6が接近することによって消光作用が生じる。
【００２３】
本発明の第3のフローとして、第一プローブと第二プローブを繋いだ形態を図3に示す。この場合は、第一プローブに相当する配列部分と、第二プローブに相当する部分が標的核酸に対してタンデムにハイブリダイズするように設計され、それぞれの配列部分が標的核酸にハイブリダイズしない第三の配列部分で繋ぎ合わされた直鎖状のオリゴヌクレオチドプローブ15を用いる。オリゴヌクレオチドプローブ15の5'末端と3'末端には蛍光体5と消
光体6がそれぞれ標識されている。標的核酸3が存在しない場合には、オリゴヌクレオチドプローブ15は直鎖状のコンフォーメーションをとるためオリゴヌクレオチドプローブ15の5'末端と3'末端にそれぞれ標識された蛍光体5と消光体6は離れており反応液からは蛍光が検出される。一方、標的核酸3が存在すると、オリゴヌクレオチドプローブ15は5'末端と3'末端が標的核酸3に対してタンデムにハイブリダイズし、その結果蛍光体5と消光体6が接近するため蛍光共鳴エネルギートランスファーにより蛍光体からの蛍光シグナルが消光される。この場合もまた、プローブの3'末端側に蛍光体を標識し、5'末端側を消光体で標識しても良い。
【００２４】
本発明の第一プローブと第二プローブを用いれば、PCRで増幅反応を実施する前と実施
した後の溶液の蛍光強度を測定することで標的核酸の有無を判断することができる。このとき、第一プローブと第二プローブのTmは、プライマーのTmよりも5〜10℃程高く設定す
る。アニーリング時に蛍光測定するので、プローブはプライマーよりも先に確実にハイブリダイズするようにするためである。たとえば、後述する〔実施例2〕で使用したプライ
マーのTmは、F側59.0℃、R側57.2℃であり、これに対し、プローブのTmは、第一プローブ65.3℃、第二プローブ66.3℃である。
【００２５】
図4のグラフ20は標的核酸のPCR増幅反応前後での蛍光強度を、本発明の第一プローブと第二プローブを用いて測定した結果と、Quenchingプローブを用いて測定した結果を比較
したものである。グラフ20の縦軸は増幅反応前の蛍光強度で規格化した蛍光シグナル量(%)を示している。(a)〜(e)は増幅反応前後の、Quenchingプローブや本発明による第一プローブ由来の蛍光シグナル量をそれぞれ示している。(a)は増幅反応前のQuenchingプローブの蛍光シグナル量、(b)は増幅反応後のQuenchingプローブの蛍光シグナル量を示す。
(a)と(b)を比較すると増幅反応後の蛍光シグナル量が増幅反応前に比べて50%程度に減少している。一方、(c)は第一プローブと第二プローブを用いる系での増幅反応前の蛍光シグナル量、(d)は第一プローブと第二プローブを用いる系での増幅反応後の蛍光シグナル量を示す。(c)と(d)を比較すると増幅反応後の蛍光シグナル量が増幅反応前に比べて45%程度に減少している。この結果から、本発明の第一プローブと第二プローブを用いると、従来法であるQuenchingプローブと同様に標的核酸の有無を判定できることがわかる。また、(e)はコントロールとして第二プローブを含まない（第一プローブだけを用いた）場合の増幅反応後の蛍光シグナル量を示す。(c)と(e)の比較から、増幅反応の前後で蛍光シグナル量はほとんど変化していなかった。この結果から、本発明の核酸検出プローブを機能させるためには消光体を標識した第二プローブを用いることが必要であることがわかる。以上から、本発明の第一プローブと第二プローブを用いることで、標的核酸の有無を判定可能であることが理解できる。
【００２６】
一般的に、標的核酸が存在しない場合の蛍光強度と、標的核酸が存在する場合の蛍光強度の比が検出プローブの感度を示す指標となる。本発明では、標的核酸が存在しない場合の蛍光強度が大きく、標的核酸が存在する場合の蛍光エネルギートランスファーによる蛍光シグナルの減少を観察する。そこで、蛍光シグナルの減少分を示す指標として、反応開始直後の蛍光強度減少前と、蛍光強度減少後の蛍光強度比を消光率として定義すると、消光率の高いプローブを検出感度に優れたプローブと判定できる。
【００２７】
図5は消光率と、第一プローブと第二プローブのギャップ塩基数の関係を示すグラフで
ある。グラフ25は横軸を第一プローブと第二プローブのギャップ塩基数にとり、縦軸に消光率(%)をプロットしたしている。グラフ25から、ギャップ塩基数が2の時に消光率が最大値をとるが、ギャップ塩基数1や3の場合とほぼ同じであることがわかる。従って、本発明におけるギャップ塩基数は0〜10塩基程度、好ましくは0〜3塩基、より好ましくは1塩基であることがわかる。
【００２８】
本発明では、標的核酸に対して第一プローブと第二プローブが同時にハイブリダイズする必要がある。第一プローブだけ、あるいは第二プローブだけが標的核酸にハイブリダイズしても消光作用は観測されず、標的核酸の有無を判定できないからである。第一プローブと第二プローブが標的核酸に対して同時にハイブリダイズするためには、第一プローブと第二プローブのTm値をできるだけ揃えることが望ましい。
【００２９】
図6に第一プローブと第二プローブのTm値の差と消光率(%)の関係を示す。グラフ30は第二プローブのTm値と第一プローブのTm値の差（横軸）に対して消光率(%)を縦軸にプロッ
トしたものである。グラフ中の点線で示す消光率52.8%の線は、従来法であるQuenchingプローブで3点測定した場合の平均消光率である。二つのプローブのTm値の差が2℃前後までの場合は、消光率は従来法であるQuenchingプローブの消光率を上回っているが、Tm値の
差が4℃、6℃と大きくなるにつれて、消光率はQuenchingプローブよりも小さくなり、プ
ローブ感度が低下していることがわかる。また、Tm値の差が大きくなるにつれて消光率のばらつきも大きくなり、プローブ動作の再現性も低下していることがわかる。この結果から、2つのプローブのTm値の差は3℃以内とすることが望ましい。
【００３０】
また、増幅反応実施中に蛍光強度を測定することによって標的核酸の有無をリアルタイムで判定することもできる。リアルタイム計測の結果から、標的核酸の定量も可能である。
【実施例】
【００３１】
以下に、本発明の実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕
１．材料
1) 実施例1で使用したプライマー
LAMP反応用、フォワード側、内側プライマー
5'-tcc agg ggt ctt aac ttg atg gaa aaa t-3'（配列番号 1）
LAMP反応用、フォワード側、外側プライマー
5'-tcc aga aac gtt tcg-3'（配列番号 2）
LAMP反応用、リバース側、内側プライマー
5'-gga tcc agg ccc aga aaa aaa gac tgt-3'（配列番号 3）
LAMP反応用、リバース側、外側プライマー
5'-agg gct tgg tca ata t-3'（配列番号 4）
【００３２】
2) 実施例1で使用したオリゴヌクレオチドプローブ
検出用第一プローブ
5'-ggt ttc tca gga agc aaa aaa ctt ggc ctt cct gg-(BHQ-1)-3'（配列番号 5）
検出用第二プローブ
5'-(FAM)-tcc agg ggg tgc tta caa tcc tga tgt ttt cat tc-(P)-3'（配列番号 6）
【００３３】
3) 実施例１で使用した反応液の組成（括弧内は終濃度の値を示す）
Tris-HCl pH8.2 (10 mM), KCl (20 mM), (NH4)2SO4(5 mM), MgSO4 (2 mM), dATP (0.25
mM), dCTP (0.25 mM), dGTP (0.25 mM), dTTP (0.25 mM), TritonX-100 (0.05%), Betaine(250 mM)
【００３４】
4) 実施例１で使用した酵素の組成
Bst DNAポリメラーゼ 8U
【００３５】
２．方法
図1で説明した本発明の核酸検出プローブを用いて標的核酸の検出が可能かを確認する
ために、LAMP反応を行い、増幅産物を蛍光プレートリーダにより検出した。ヒトゲノムDNA100ngを鋳型とし、シトクロムP450遺伝子を増幅するために上記1.に記載のフォワード側内側プライマー、フォワード側外側プライマー、リバース側内側プライマー、リバース側外側プライマーとBst DNAポリメラーゼを用いてLAMP反応を行った。
【００３６】
検出用第一プローブは3'末端が消光体であるBHQ-1で標識されており、標的核酸である
シトクロムP450遺伝子にハイブリダイズする配列を有する。また、検出用第二プローブは5'末端が蛍光体であるFAMで標識されており、3'末端はプローブの伸長を防ぐためにリン
酸化されている。また検出用第二プローブはシトクロムP450遺伝子にハイブリダイズする配列を有しており、検出用第一プローブの下流側に1塩基のギャップを空けてハイブリダ
イズするよう設計されている。
【００３７】
上記1.に記載のプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、BstDNAポリメラーゼを含む反応液に、鋳型となるヒトゲノムDNAを投入し、60℃に設定したヒートブロックにて90分
間インキュベートした。その後、蛍光プレートリーダにて反応液の蛍光シグナルを測定し
た。
【００３８】
３．結果
測定結果を図7に示す。グラフ35は様々な条件の反応液に対して蛍光シグナル量（％）
をプロットしたものである。グラフ35中の(a)と(c)は反応前の蛍光シグナル量、(b)と(d)は反応終了後の蛍光シグナル量であり、(a)で得られた蛍光シグナル量を100％として、核酸増幅反応後の(b)の蛍光シグナル量を規格化した。(a)と(b)の反応液には鋳型DNAが含まれているが、(c)と(d)の反応液は鋳型DNAを含まないネガティブコントロールである。(a)と(c)の蛍光シグナルから、鋳型DNAを含む/含まないにかかわらず増幅反応前では蛍光シ
グナル量が同程度に高いことが確認できた。また、(b)の鋳型DNAを含む反応用液では、反応進行により、蛍光シグナル量が減少していた。(d)の鋳型DNAを含まないネガティブコントロールの反応液では、反応が進行しても蛍光シグナル量は減少しなかった。これらの結果から、本発明のプローブの作用によって消光が起こり、標的核酸を検出できることが確認できた。
【００３９】
〔実施例2〕
１．材料
1) 実施例2で使用したプライマー
PCR反応用，フォワードプライマー
5'-gtc cca tta ttt tcc aga aac gtt tcg-3'（配列番号 7）
PCR反応用，リバースプライマー
5'-aag tac ttc agg gct tgg tca ata t-3'（配列番号8）
【００４０】
2) 実施例2で使用したオリゴヌクレオチドプローブ
検出用第一プローブ
5'-ggt ttc tca gga agc aaa aaa ctt ggc ctt acc tgg-(FAM)-3'（配列番号 9）
検出用第二プローブ
5'-(BHQ-1)-tcc agg ggg tgc tta caa tcc tga tgt ttt cat tc-(NH2)-3'（配列番号 10）
【００４１】
3) 実施例2で使用した反応液の組成（括弧内は終濃度の値を示す）
Tricine-KOH pH8.0 (40 mM), KCl (16 mM), MgSO4 (3.5 mM), dATP (0.4 mM), dCTP (0.4 mM), dGTP (0.4 mM), dTTP (0.4 mM), BSA(3.75 mg/mL)
【００４２】
4) 実施例2で使用した酵素の組成
TITANIUM Taq ポリメラーゼ2U（Clontech社）
【００４３】
２．方法
図2で説明した本発明の核酸検出プローブを用いて標的核酸の検出が可能かを確認する
ために、PCR反応を行い、増幅産物をリアルタイム検出装置により検出した。ヒトゲノムDNA102〜108コピーを鋳型とし、シトクロムP450遺伝子を増幅するために上記1.に記載のPCR反応用フォワードプライマー、PCR反応用リバースプライマーとTITANIUM Taq ポリメラーゼ（Clontech社）を用いてPCR反応を行った。
【００４４】
なお、TITANIUM Taq ポリメラーゼ（Clontech社）はTaqポリメラーゼのN末端欠失変異
体であり、この欠失により5'→3'エキソヌクレアーゼ活性が取り除かれている。このため、反応液中に含まれる検出用第一プローブと検出用第二プローブは分解されることなく増幅産物にハイブリダイズする。その結果、プローブ間の蛍光共鳴エネルギー移動によって蛍光が消光される。検出用第一プローブは3'末端が蛍光体であるFAMで標識されており、標的核酸であるシトクロムP450遺伝子にハイブリダイズする配列を有する。また、検出用第二プローブは5'末端が消光体であるBHQ-1で標識されており、3'末端はプローブの伸長を防ぐためにアミノ化されている。これはシトクロムP450遺伝子にハイブリダイズする配列を有しており、検出用第一プローブの下流側に1塩基のギャップを空けてハイブリダイズするよう設計されている。
【００４５】
上記1.に記載のプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、TITANIUM Taq ポリメラー
ゼを含む反応液に、鋳型となるヒトゲノムDNAを投入し、95℃20秒間と55℃40秒間のステ
ップを60回繰り返す熱サイクルを設定したリアルタイムPCR検出装置を用いて反応液の蛍
光シグナル量の時間変化を測定した。
【００４６】
３．結果
測定結果を図8のグラフ40に示す。横軸はサイクル数、縦軸はFAMの蛍光シグナル量を示す。核酸増幅前の発光量を100％、核酸増幅後の発光量を0％として規格化している。グラフ中、初期鋳型濃度が108コピーの場合のFAMの蛍光シグナル量は反応開始後、20サイクル付近で減少を開始した。FAMの蛍光シグナル量はシトクロムP450遺伝子が増幅したことに
より、検出用第一プローブと検出用第二プローブがハイブリダイズして蛍光が消光されたことを示している。蛍光シグナル量の減少が開始されるサイクル数は初期鋳型濃度依存的に増加したことから、本発明のプローブを用いて標的核酸をリアルタイムに検出できることが確認できた。
【００４７】
〔実施例3〕
１．材料
1) 実施例3で使用したプライマー
PCR反応用，フォワードプライマー
5'-gca gaa agc gtc tag cca tgg cg-3'（配列番号 11）
PCR反応用，リバースプライマー
5'-cat ggt gca cgg tct acg aga cc-3'（配列番号 12）
逆転写プライマー
5'-tgc tca tgg tgc acg gtc ta-3'（配列番号 13）
【００４８】
2) 実施例3で使用したオリゴヌクレオチドプローブ
5’-(FAM)-tgtt ggg tcgcg aaag gcc ccttc tca ctg ttc tct cat aga agt gat gag gga aca gag cac tca tct ctt ctc cct gtt aga ctg cta gcc gag tag-(BHQ-1)-3’（配列
番号 14）
下線部が鋳型にハイブリダイズする。
【００４９】
3) 実施例3で使用した反応液の組成
実施例3では反応液としてGene TaqUniversal Buffer（ニッポンジーン社）を使用した
。反応液は、dATP (0.2 mM), dCTP (0.2 mM), dGTP (0.2 mM), dTTP (0.2 mM)を含むよう調製した。
【００５０】
4) 実施例3で使用した酵素の組成。
Recombinant Taq DNA Polymerase：Gene Taq 0.625U（ニッポンジーン社）
【００５１】
２．方法
図3で説明した本発明の核酸検出プローブを用いて標的核酸の検出が可能かを確認する
ために、PCR反応を行い、増幅産物を蛍光プレートリーダを用いて検出した。HCVのゲノムRNAを逆転写用プライマーで逆転写して得たcDNA 1ngを鋳型とし、目的配列を増幅するた
めに上記1.に記載のPCR反応用フォワードプライマー、PCR反応用リバースプライマーとGene Taq（ニッポンジーン社）を用いてPCR反応を行った。
【００５２】
なお、Gene Taq（ニッポンジーン社）は天然型Taq DNAポリメラーゼのN末端を一部欠失させてあるため、内因性の5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有しない。このため、反応液中に含まれる検出用プローブは分解されることなく増幅産物にハイブリダイズする。その結果、プローブ間の蛍光共鳴エネルギー移動によって蛍光が消光される。検出用プローブは3'末端が消光体であるBHQ-1で、5'末端が蛍光体であるFAMで標識されている。3'末端から18塩基の配列（gat gag ccg atc gtc aga：配列番号15）と5'末端から18塩基の配列（tgt tgg gtc gcg aaa ggc c：配列番号16）が、1塩基のギャップを空けてタンデムにHCV遺伝子にハイブリダイズするよう設計されている。
【００５３】
上記1.に記載のプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、Gene Taqを含む反応液に鋳型となるcDNAを投入し、95℃20秒間と55℃40秒間のステップを40回繰り返す熱サイクルを行った。その後、蛍光プレートリーダにて反応液の蛍光シグナルを測定した。
【００５４】
３．結果
測定結果を図9のグラフ45に示す。グラフ45は上記の反応液に対して蛍光シグナル量（
％）をプロットしたものである。グラフ45中の(a)は反応前の蛍光シグナル量を、(b)は反応終了後の蛍光シグナル量であり、（a）で得られた蛍光シグナル量を100％として、核酸増幅反応後の（b）の蛍光シグナル量を規格化した。この結果から、本発明のプローブの
作用によって消光が起こり、標的核酸を検出できることが確認できた。
【００５５】
〔実施例4〕
１．材料
1) 実施例4で使用したプライマー
PCR反応用，フォワードプライマー
5'-tcttt ccaag caaca gcag-3’（配列番号 17）
PCR反応用，リバースプライマー
5'-cgttt gctga tgaac taagt c-3'（配列番号 18）
【００５６】
2) 実施例4で使用したオリゴヌクレオチドプローブ
検出用第一プローブ
5’-caatg accaa atcaa agaaa t-(BHQ-0)-3’（配列番号19）
5’-caatg accaa atcaa agaaa t-(DABCYL)-3’（配列番号 20）
検出用第二プローブ
5’-(ALEXA350)-actcg caagg ttagt gctga g-(NH2)-3’（配列番号 21）
5’-(ALEXA790)-actcg caagg ttagt gctga g-(NH2)-3’（配列番号 22）
【００５７】
3) 実施例4で使用した反応液の組成
実施例4では反応液としてGene TaqUniversal Buffer（ニッポンジーン社）を使用した
。反応液は、dATP (0.2 mM), dCTP (0.2 mM), dGTP (0.2 mM), dTTP (0.2 mM)を含むよう調製した。
【００５８】
4) 実施例4で使用した酵素の組成。
Recombinant Taq DNA Polymerase：Gene Taq 0.625U（ニッポンジーン社）
【００５９】
２．方法
図1で説明した本発明の核酸検出プローブを用いて標的核酸の検出が可能かを確認する
ために、PCR反応を行い、増幅産物を蛍光プレートリーダを用いて検出した。バクテリオ
ファージphiX174ゲノムDNAを鋳型とし、目的配列を増幅するために上記1.に記載のPCR反
応用フォワードプライマー、PCR反応用リバースプライマーとGene Taq（ニッポンジーン
社）を用いてPCR反応を行った。
【００６０】
なお、Gene Taq（ニッポンジーン社）は天然型Taq DNAポリメラーゼのN末端を一部欠失させてあるため、内因性の5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有しない。このため、反応液中に含まれる検出用プローブは分解されることなく増幅産物にハイブリダイズする。その結果、プローブ間の蛍光共鳴エネルギー移動によって蛍光が消光される。
【００６１】
配列番号19で示す検出用第一プローブは3'末端が消光体であるBHQ-0で標識されており
、標的核酸であるバクテリオファージphiX174ゲノムにハイブリダイズする配列を有する
。また配列番号21で示す検出用第二プローブは5'末端が蛍光体であるALEXA350で標識されており、3’末端はプローブの伸長を防ぐためにアミノ化されている。配列番号21で示す
検出用第二プローブはバクテリオファージphiX174ゲノムにハイブリダイズする配列を有
しており、配列番号19で示す検出用第一プローブの下流側に1塩基のギャップを空けてハ
イブリダイズするよう設計されている。
【００６２】
また、配列番号20で示す検出用第一プローブは、配列番号19で示す検出用第一プローブと同じ塩基配列であり、3’末端が消光体であるDABCYLで標識されている。配列番号22で
示す検出用第二プローブは、配列番号21で示す検出用第二プローブと同じ塩基配列であり、5'末端が蛍光体であるALEXA790で標識されており、3’末端はプローブの伸長を防ぐためにアミノ化されている。配列番号20の検出用第一プローブと配列番号22の検出用第二プローブを組み合わせて用いる場合も、配列番号19の検出用第一プローブと配列番号21の検出用第二プローブを組み合わせて用いる場合と同様に、バクテリオファージphiX174ゲノムに検出用第一プローブの下流側に検出用第二プローブが1塩基のギャップを空けてハイブリダイズする。
【００６３】
上記1.に記載のプライマー、検出用第一プローブと検出用第二プローブ（配列番号19と配列番号21の組み合わせ、あるいは配列番号20と配列番号22の組み合わせ）、Gene Taqを含む反応液に鋳型となるcDNAを投入し、95℃15秒間と60℃60秒間のステップを45回繰り返す熱サイクルを行った。その後、蛍光光度計にて反応液の蛍光シグナルを測定した。
【００６４】
３．結果
測定結果を図10のグラフ50に示す。グラフ50は上記の反応液に対して蛍光シグナル量（％）をプロットしたものである。グラフ50中の(a)は反応前の蛍光シグナル量を、(b)は反応終了後の蛍光シグナル量であり、（a）で得られた蛍光シグナル量を100％として、核酸増幅反応後の（b）の蛍光シグナル量を規格化した。グラフ中、グレーで示すバーは配列番号19と配列番号21の組み合わせを使用した反応溶液の反応前と終了後の蛍光強度を、蛍光光度計を用いて励起波長345 nmで励起し、400〜500 nmの波長範囲の蛍光強度を測定したものである。一方、白で示すバーは配列番号20と配列番号22の組み合わせを使用した反応溶液の反応前と終了後の蛍光強度を、蛍光光度計を用いて励起波長790 nmで励起し、800〜850 nmの波長範囲の蛍光強度を測定したものである。グレー、白いずれのバーも反応前の蛍光強度に比べて、反応終了後の蛍光強度が半分以下に消光されていた。これらの結果から、本発明では、紫外光で励起可能なALEXA350のような蛍光体や遠赤外領域の蛍光色素であるALEXA790のような蛍光体も利用可能であることが確認できた。
【００６５】
〔実施例5〕
１．材料
1) 実施例5で使用したプライマー
PCR反応用センスプライマー
5'-tgcta tgtca cttcc ccttg gttct ctca-3’（配列番号 23）
PCR反応用アンチセンスプライマー
5'-agtgg gggga catca agcag ccatg caaa-3'（配列番号 24）
【００６６】
2) 実施例5で使用したオリゴヌクレオチドプローブ
検出用第一プローブ
5’-ctgcagaatgggacaggit-(DABCYL)-3’（配列番号 25）
5’-gaggaagctgcagaatgg-(DABCYL)-3’（配列番号 26）
5’-aagataccatcaatgagg-(DABCYL)-3’（配列番号 27）
5’-cagaatgggatagggt-(DABCYL)-3’（配列番号 28）
検出用第二プローブ
5’-(ALEXA350)-acagccagtacatgcag-(NH2)-3’（配列番号 29）
5’-(ALEXA430)-gatagattgcatcccagt-(NH2)-3’（配列番号 30）
5’-(ALEXA594)-aggctgcagaatggga-(NH2)-3’（配列番号 31）
5’-(ALEXA790)- acacccagtacatgcagggc-(NH2)-3’（配列番号 32）
【００６７】
3) 実施例5で使用した反応液の組成（括弧内は終濃度の値を示す）
Tricine-KOH pH8.0 (40 mM), KCl (16 mM), MgSO4 (3.5 mM), dATP (0.4 mM), dCTP (0.4 mM), dGTP (0.4 mM), dTTP (0.4 mM), BSA(3.75 mg/mL)
【００６８】
4) 実施例5で使用した酵素の組成。
TITANIUM Taq ポリメラーゼ2U（Clontech社）
【００６９】
２．方法
図1で説明した本発明の核酸検出プローブを用いて標的核酸のジェノタイピングが可能
かを確認するために、PCR反応を行い、増幅産物をリアルタイム検出装置により検出した
。HIV-1ウイルスゲノムRNAを鋳型とし、gag領域を増幅するために上記1.に記載のPCR反応用センスプライマー、PCR反応用アンチセンスプライマーとTITANIUM Taq ポリメラーゼ（Clontech社）を用いてPCR反応を行った。
【００７０】
なお、TITANIUM Taq ポリメラーゼ（Clontech社）はTaqポリメラーゼのN末端欠失変異
体であり、この欠失により5'→3'エキソヌクレアーゼ活性が取り除かれている。このため、反応液中に含まれる検出用第一プローブと検出用第二プローブは分解されることなく増幅産物にハイブリダイズする。その結果、プローブ間の蛍光共鳴エネルギー移動によって蛍光が消光される。
【００７１】
配列番号25、26、27、28で示す検出用第一プローブは3'末端が消光体であるDABCYLで標識されており、それぞれHIV-1ウイルスゲノムのサブタイプA、B、C、CRFs (Circulating Recombinant forms) AE標的核酸であるgag領域にハイブリダイズする配列を有する。また、配列番号29、30、31、32で示す検出用第二プローブはそれぞれの5'末端が蛍光体であるALEXA350、ALEXA430、ALEXA594、ALEXA790で標識されており、3'末端はプローブの伸長を防ぐためにアミノ化されている。またこれらはそれぞれHIV-1ウイルスゲノムのサブタイプA、B、C、CRFs (Circulating Recombinant forms) AE標的核酸であるgag領域にハイブリダイズする配列を有しており、同じサブタイプにハイブリダイズする検出用第一プローブの下流側にハイブリダイズするよう設計されている。つまり、サブタイプAに対して配列番号25の検出用第一プローブの下流側に配列番号29の検出用第二プローブがハイブリダイズし、サブタイプBに対して配列番号26の検出用第一プローブの下流側に配列番号30の検出用第二プローブがハイブリダイズし、サブタイプCに対して配列番号27の検出用第一プローブの下流側に配列番号31の検出用第二プローブがハイブリダイズし、CRFs AEに対して配列番号28の下流側に配列番号32の検出用第二プローブがハイブリダイズする。
【００７２】
上記1.に記載のプライマー、検出用第一プローブと検出用第二プローブ（配列番号25と配列番号29の組み合わせ、配列番号26と配列番号30の組み合わせ、配列番号27と配列番号
31の組み合わせ、あるいは配列番号28と配列番号32の組み合わせ）、TITANIUM Taq ポリ
メラーゼを含む反応液に、鋳型となるHIV-1ウイルスゲノムを投入し、95℃20秒間と55℃40秒間のステップを40回繰り返す熱サイクル条件にてPCRを実施し、それぞれ白色光源で励起して得られる55℃での蛍光強度を中心波長440 nm全値幅30 nm（ALEXA350用）、中心波長540 nm全値幅30 nm（ALEXA430用）、中心波長620 nm全値幅30 nm（ALEXA594用）、もしくは中心波長810 nm全値幅30 nm（ALEXA790用）のバンドパスフィルターを通じて1サイクルごとに測定した。
【００７３】
３．結果
測定結果を図11に示す。図11のグラフはいずれも横軸はPCRサイクル数、縦軸は相対蛍
光シグナル強度を示す。図11のA（グラフ60）は配列番号25と配列番号29の組み合わせでHIV-1サブタイプAを、B（グラフ61）は配列番号26と配列番号30の組み合わせでHIV-1サブ
タイプBを、C（グラフ62）は配列番号27と配列番号31の組み合わせでHIV-1サブタイプCを、D（グラフ63）は配列番号28と配列番号32の組み合わせでHIV-1 CRFs AEを検出した結果を示す。AからDいずれのグラフでも10サイクル目以降で蛍光シグナル強度は減少を開始した。蛍光シグナル強度はHIV-1ウイルスゲノムRNAが増幅したことにより、検出用第一プローブと検出用第二プローブがハイブリダイズして蛍光が消光されたことを示している。4種類の蛍光体の蛍光波長は、ALEXA350が440 nm、ALEXA430が540 nm、ALEXA594が620 nm、ALEXA790が810 nmと最小でも80 nm以上離れているため、お互いの蛍光体由来の蛍光の漏れこみの影響が少ない状態での蛍光検出が可能であることが確認できた。従来のDNAシーケンサでは4種類の蛍光体の蛍光波長はおよそ20 nm程度しか離れていないが、この20 nm程度の差でもお互いの蛍光体の漏れこみの影響を考慮すればジェノタイピング可能である。このことから、本発明の検出プローブを使用することで440〜800 nmの範囲の蛍光波長をもつ蛍光体を組み合わせて10種類以上のマルチプレックス検出が可能であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明によれば、標的核酸の有無を2種類のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダ
イゼーションによる反応液の蛍光強度の変化で判定できる。また、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは設計の自由度が高く、さまざまな蛍光体に対して適用可能であることから、微量核酸の増幅反応実施時のリアルタイム検出においても、複数種類の標的核酸を同時に複数の蛍光体で検出するマルチプレックス検出を容易とする。従って、本発明は、微量核酸の増幅を必要とする遺伝子診断などの医療分野、ライフサイエンス分野などにおいて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明による標的遺伝子を検出するフローを示す図
【図２】本発明による標的遺伝子を検出するフローを示す図
【図３】本発明による標的遺伝子を検出するフローを示す図
【図４】標的核酸の増幅反応前後の蛍光強度を示すグラフ
【図５】第一プローブと第二プローブのギャップ塩基数と消光率の関係を示すグラフ
【図６】第一プローブと第二プローブのTm値の差と消光率の関係を示すグラフ
【図７】増幅反応前後の蛍光シグナル量を示すグラフ
【図８】増幅反応のリアルタイム検出結果を示すグラフ
【図９】増幅反応前後の蛍光シグナル量を示すグラフ
【図１０】増幅反応前後の蛍光シグナル量を示すグラフ
【図１１−１】増幅反応のリアルタイム検出結果を示すグラフ
【図１１−２】増幅反応のリアルタイム検出結果を示すグラフ
【符号の説明】
【００７６】
1，11…第一プローブ
2，12…第二プローブ
3…標的核酸
5…蛍光体
6…消光体（クエンチャー）
7…リン酸基
8…アミノ基
15…直鎖状オリゴヌクレオチドプローブ
20，25，30，35，40，45，50，60，61，62，63…グラフ
【配列表フリーテキスト】
【００７７】
配列番号 1 -人工配列の説明：本発明に使用する，フォワード側，内側の増幅用プライマー
配列番号 2 -人工配列の説明：本発明に使用する，フォワード側，外側の増幅用プライマー
配列番号 3 -人工配列の説明：本発明に使用する，リバース側，内側の増幅用プライマー配列番号 4 -人工配列の説明：本発明に使用する，リバース側，外側の増幅用プライマー配列番号 5 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号 6 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号 7 -人工配列の説明：本発明に使用する，フォワードプライマー
配列番号 8 -人工配列の説明：本発明に使用する，リバースプライマー
配列番号 9 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号10 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号11 -人工配列の説明：本発明に使用する，フォワードプライマー
配列番号12 -人工配列の説明：本発明に使用する，リバースプライマー
配列番号13 -人工配列の説明：本発明に使用する，逆転写用プライマー
配列番号14 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号15 -HCV遺伝子にハイブリダイズする3'末端側配列
配列番号16 -HCV遺伝子にハイブリダイズする5'末端側配列
配列番号 17 -人工配列の説明：本発明に使用する，フォワードプライマー
配列番号 18 -人工配列の説明：本発明に使用する，リバースプライマー
配列番号 19 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 20 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 21 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 22 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 23 -人工配列の説明：本発明に使用する，センスプライマー
配列番号 24 -人工配列の説明：本発明に使用する，アンチセンスプライマー
配列番号 25 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 26 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 27 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 28 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第一オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 29 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 30 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 31 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
配列番号 32 -人工配列の説明：本発明に使用する，検出用第二オリゴヌクレオチドプロ
ーブ
【図１】
2009159945.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【配列表】
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