(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、生体内に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞に取り込まれたｓｉＲＮＡを簡便、かつ精密に定量する方法を提供することにある。【解決手段】  （Ａ）標識物質を結合したｓｉＲＮＡを生物に投与する、もしくは細胞の培養液に添加する工程；（Ｂ）該生物、もしくは該細胞から該ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを同時に精製抽出する工程；及び（Ｃ）該抽出ＲＮＡ中の標識物質を測定することにより、生体に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞に取り込まれたｓｉＲＮＡを簡便、かつ精密に定量する方法を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）標識物質を結合したｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；短鎖干渉ＲＮＡ）を生物に投与する、もしくは細胞の培養液に添加する工程；（Ｂ）該生物、もしくは該細胞から該ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを同時に精製抽出する工程；及び（Ｃ）該抽出ＲＮＡ中の標識物質を測定することにより、生体に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞に取り込まれたｓｉＲＮＡを定量することを特徴とする、ｓｉＲＮＡの簡便な精密定量法。
【請求項２】
上記標識物質には、蛍光色素、Ｂｉｏｔｉｎ、Ｂｉｏｔｉｎ化合物、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ化合物、Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ、Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ化合物、放射性同位元素のいずれか、もしくはこれらの組み合わせを用いる請求項１に記載のｓｉＲＮＡの簡便な精密定量法。
【請求項３】
上記トータルＲＮＡの精製抽出には、シリカ粒子、シリカ粉末、シリカ繊維（グラスファイバー）、シリカメンプレン、シリカクロス、一体型多孔質シリカ、セラミック粒子、セラミック粉末、セラミック繊維、セラミックメンプレン、セラミッククロス、一体型多孔質セラミックのいずれか、もしくはこれらを混成したもの、もしくはこれらを混合したものを用いる請求項１に記載のｓｉＲＮＡの簡便な精密定量法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、生体内に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞に取り込まれたｓｉＲＮＡの簡便な精密定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】  医学分野において、薬物の病巣部への運搬を目指した薬物送達システムが開発されてきたが、未だ決定的なものは存在しない。特に、２００６年度ノーベル賞受賞テーマであるｓｉＲＮＡの機能の解明以降、ｓｉＲＮＡは疾患の原因遺伝子を破壊する新規核酸医薬としても大変期待されているが、患部へのｓｉＲＮＡの送達法の開発は非常に遅れている。【０００３】  その一因として、実験動物等の生体内に分布したｓｉＲＮＡを蛍光顕微鏡等により定性的に検出する方法は存在するものの、生体内に分布したｓｉＲＮＡを簡便、かつ精密に定量する有効な手段が存在しないことがあげられる。【０００４】  その状況の中で、最近、蛍光色素等によるｓｉＲＮＡの標識技術、カラム等によるＲＮＡの精製抽出技術、及び蛍光色素の高感度測定技術が開発されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明の課題は、生体内に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞に取り込まれたｓｉＲＮＡを簡便、かつ精密に定量する方法を提供することにある。特に、標識物質として放射性同位元素等の危険な物質を使用しない場合には、どこでも安全に使用できる方法となる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  出願人は先に、ｓｉＲＮＡ等の核酸医薬を磁気送達可能な磁性ナノ粒子、及びその製造方法を提案している（特願２００７−１９８１０４）。該発明過程において、１０〜１８塩基対以上のＲＮＡを精製抽出可能なカラムを用いて、標識物質を結合したｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを同時に、生物、もしくは細胞から精製抽出後、標識物質の定量を行うことにより上記課題を解決しうるという知見を得た。【０００７】  本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、（Ａ）標識物質を結合したｓｉＲＮＡを生物に投与する、もしくは細胞の培養液に添加する工程；（Ｂ）該生物、もしくは該細胞から該ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを同時に精製抽出する工程；及び（Ｃ）該抽出ＲＮＡ中の標識物質を測定することにより、生体に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞に取り込まれたｓｉＲＮＡを簡便、かつ精密に定量する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】  本発明の生体内に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞内に取り込まれたｓｉＲＮＡの精密な簡便定量法は、（Ａ）標識物質を結合したｓｉＲＮＡを生物に投与する、もしくは細胞の培養液に添加する工程；（Ｂ）該生物、もしくは該細胞から該ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを同時に精製抽出する工程；及び（Ｃ）該抽出ＲＮＡ中の標識物質を測定することにより、生体に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞に取り込まれたｓｉＲＮＡを簡便、かつ精密に定量することを特徴とする。【０００９】  本発明の生体内に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞内に取り込まれたｓｉＲＮＡの精密な簡便定量においては、（Ａ）標識物質を結合したｓｉＲＮＡを生物に投与する、もしくは細胞の培養液に添加する工程；（Ｂ）該生物、もしくは該細胞から該ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを同時に精製抽出する工程；及び（Ｃ）該抽出ＲＮＡ中の標識物質を測定することにより、生体に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞に取り込まれたｓｉＲＮＡを定量する工程からなる。【００１０】  先ず、本発明において用いられるｓｉＲＮＡについて述べる。ｓｉＲＮＡは、通常、１９〜２３塩基対からなる短い２本鎖ＲＮＡで、哺乳動物細胞内において遺伝子配列特異的に遺伝子発現を抑制する機能をもつことが知られている。即ち、ｓｉＲＮＡを用いて狙った遺伝子の発現を特異的に制御することが可能である。しかし、ｓｉＲＮＡは不安定、かつ高価であるため、目的部位にｓｉＲＮＡを効率良く送達する技術の開発が望まれている。【００１１】  しかし、ｓｉＲＮＡを生体内に投与した後の、ｓｉＲＮＡの生体内分布を簡便、かつ精密に定量する有効な手段が現在まで存在しなかったことが一因となり、ｓｉＲＮＡの患部への送達法の開発は非常に遅れている。【００１２】  次に、本発明の生体内に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞に取り込まれたｓｉＲＮＡの簡便な精密定量法について、工程毎に説明する。先ず、上記工程（Ａ）について説明する。上記工程（Ａ）は、標識物質を結合したｓｉＲＮＡを生物に投与する、もしくは細胞の培養液に添加する工程である。【００１３】  本発明において用いられるｓｉＲＮＡの標識物質については、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＦＡＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＴＡＭＲＡ、Ｒ６Ｇ、ＲＯＸ，ＪＯＥ、Ｙａｋｉｍａ  ｙｅｌｌｏｗ、Ｂｉｏｄｉｐｙ  ＦＬ、Ｂｉｏｄｉｐｙ  ５３０／５５０、Ｂｉｏｄｉｐｙ  ＴＲ、Ｂｉｏｄｉｐｙ  ＴＭＲ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ等の蛍光色素、Ｂｉｏｔｉｎ、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ、Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ等の非放射性物質、もしくは、放射性同��元素等、特に限定されず、ｓｉＲＮＡを標識することのできるものは全て用いることができるが、蛍光色素であることが好ましい。【００１４】  本発明において用いられるｓｉＲＮＡの標識物質の結合部位については、ｓｉＲＮＡの３’末端、５’末端等、特に限定されず、ｓｉＲＮＡを標識することのできる結合部位は全て用いることができる。【００１５】  標識物質を結合したｓｉＲＮＡは、生体内、生体外のいずれにおいても使用することができる。生体内で使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈内、実質臓器内（例えば、脳、目、甲状腺、乳腺、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、副腎、卵巣、精巣等）、管腔臓器の管腔内（例えば、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、大腸、胆嚢、尿管、膀胱内等）、脳脊髄腔内、胸腔内、腹腔内、筋肉内、関節内、皮下、皮内等、特に限定されない。【００１６】  標識物質を結合したｓｉＲＮＡの投与を行う生物種は、例えば、動物、植物、微生物等、特に限定されることはないが、動物由来であることが好ましく、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット等、哺乳動物であることがより好ましい。また、ｓｉＲＮＡを取り込む細胞の種類は、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等、特に限定されない。【００１７】  標識物質を結合したｓｉＲＮＡの投与、もしくは添加時に、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー等、特に限定されず併用することができる。また、これらを併用せずに、標識物質を結合したｓｉＲＮＡ単独で、投与、もしくは添加することも可能である。【００１８】  上述した工程（Ａ）により、標識物質を結合したｓｉＲＮＡを生物に投与する、もしくは細胞の培養液に添加する。【００１９】  次に、上記工程（Ｂ）について説明する。上記工程（Ｂ）は、上記工程（Ａ）で標識物質を結合したｓｉＲＮＡを投与、もしくは添加した生物、もしくは細胞から該ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを同時に精製抽出する工程である。【００２０】  本発明において用いられる生物、もしくは細胞からのトータルＲＮＡの抽出には、例えば、チオシアン酸グアニジン等のカオトロピック塩、硫酸アンモニウム等のアンチカオトロピック塩、酸性フェノール／クロロホルム混合液等が用いられるが、トータルＲＮＡの抽出が可能であれば特に制限なく使用することができる。【００２１】  本発明において用いられる生物からのトータルＲＮＡの抽出には、生物の一部、もしくは全部を用いて抽出することが可能である。【００２２】  本発明において用いられるｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡの精製には、例えば、アルコール沈殿、グラスファイバー担体、シリカ担体、セラミック担体等が用いられるが、効率の高いグラスファイバー担体、シリカ担体、セラミック担体が好ましく、１０〜１８塩基以上の長さの全てのＲＮＡを精製可能なグラスファイバー担体、シリカ担体、セラミック担体の使用がより好ましい。但し、ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡの精製が可能であれば、特に制限なく使用することができる。【００２３】  上述した工程（Ｂ）により、該生物、もしくは該細胞から標識物質を結合したｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを同時に精製抽出する。【００２４】  次に、上記工程（Ｃ）について説明する。上記工程（Ｃ）は、上記工程（Ｂ）で精製抽出した標識物質を結合したｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡ中の標識物質を測定することにより、生体に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞に取り込まれたｓｉＲＮＡを定量する工程である。【００２５】  本発明において用いられるｓｉＲＮＡに結合した標識物質の定量は、標識物質が蛍光色素の場合、蛍光色素固有の励起波長光を蛍光色素に照射し、発生した蛍光強度を測定する。該目的のため、蛍光測定装置、蛍光プレートリーダー等が用いられるが、微量の蛍光物質を定量することが可能であれば特に制限なく使用できる。【００２６】  本発明において用いられるｓｉＲＮＡに結合した標識物質の定量は、標識物質がＢｉｏｔｉｎ、もしくはＢｉｏｔｉｎ化合物の場合、ＡｖｉｄｉｎがＢｉｏｔｉｎ、もしくはＢｉｏｔｉｎ化合物に特異的に結合することを利用する。即ち、ペルオキシダーゼ結合Ａｖｉｄｉｎ、アルカリフォスファターゼ結合Ａｖｉｄｉｎ等を用いることにより、Ａｖｉｄｉｎに結合した該酵素の基質の分解による呈色反応、発光反応等を、吸光度計、プレートリーダー、ルミノメーター等を用いて定量する。【００２７】  本発明において用いられるｓｉＲＮＡに結合した標識物質の定量は、標識物質がＢｉｏｔｉｎ、Ｂｉｏｔｉｎ化合物、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ化合物、Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ、Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ化合物等の場合、これらに対しそれぞれ特異的に結合する抗体を用いる、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）等公知の方法を制限なく使用できる。【００２８】  本発明において用いられるｓｉＲＮＡに結合した標識物質の定量は、標識物質が放射性同位元素の場合、液体シンチレーションカウンタ、プレートシンチレーションカウンタ、ガンマカウンタ等公知の方法を制限なく使用できる。【００２９】  本発明において用いられるトータルＲＮＡの定量は、分光光度計を用いて２６０ｎｍの波長における吸光度（Ａ２６０）を測定し、計算により行う。具体的には、トータルＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）＝（Ａ２６０）×４０×１０／光路長（ｍｍ）と計算される。但し、トータルＲＮＡの定量は、公知の方法を制限なく使用することができる。
【発明の効果】
【００３０】  本発明の生体内に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞に取り込まれたｓｉＲＮＡの簡便な精密定量法を用いて、実験動物等におけるｓｉＲＮＡの生体内分布を簡便、かつ精密に定量することが可能になるので、病変部へのｓｉＲＮＡの送達法の開発等に大きく貢献する。
【実施例】
【００３１】  以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。【００３２】（工程Ａ）
５週齢の雄ヌードマウス（系統ＢＡＬＢ／Ｃ  ｎｕ／ｎｕ）３０匹の尾静脈に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ４８８で標識したコントロールｓｉＲＮＡ（キアゲン社より購入）（３００ｎＭ）と２６．８μｇの陽性荷電脂質ナノ粒子（Ｏ，Ｏ‘−ｄｉｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−（α−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏａｃｅｔｙｌ）ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、（ＤＣ−６−１４）及びｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＯＰＥ）（モル比；１：１）から構成される）の混合物（０．５ｍＬ）を投与した。【００３３】（工程Ｂ）
上記の投与を行い、０．５時間後、１．５時間後、４．５時間後、１３．５時間後、４０．５時間後に、それぞれ６匹のマウスを屠殺し、肺、脾臓、肝臓、腎臓、筋肉、心臓、胃、小腸、脳の各臓器を摘出し、ＴＲＩＺＯＬ（フェノール／チオシアン酸グアニジン混合液；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を臓器２５ｍｇあたり０．７ｍＬ加え、激しく攪拌することにより、均一なホモジネートを得た。さらに、該ホモジネートに０．１４ｍＬのクロロホルムを添加し、激しく攪拌したのち４℃、１２０００Ｇ（重力加速度）にて１５分間遠心分離を行い、上層のトータルＲＮＡを含む水層を採取した。【００３４】  該水層０．３５ｍＬと１００％エタノール０．５２５ｍＬを混合後、混合液０．７ｍＬをシリカメンブレンの充填されたカラム（ｍｉＲＮｅａｓｙスピンカラム（キアゲン社製））に添加し、室温、８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することにより、シリカメンブレンにトータルＲＮＡを吸着させた。【００３５】  シリカメンブレンに付着した不純物を除去するため、ＲＷＴ緩衝液（キアゲン社製）０．７ｍＬをスピンカラムに添加し、室温、８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することによりシリカメンブレンを洗浄した。さらに、この洗浄をもう一度、繰り返した後、ＰＲＥ緩衝液（キアゲン社製）０．５ｍＬをスピンカラムに添加し、室温、８０００Ｇにて２分間遠心分離することによりシリカメンブレンを強力に洗浄するとともに、乾燥させた。【００３６】  該スピンカラムにＲＮＡ分解酵素除去水（ワコー純薬製）を６０μＬ添加し、シリカメンブレンに付着した、蛍光標識ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを溶出した。【００３７】（工程Ｃ）
各トータルＲＮＡ溶出液５０μＬを９６ｗｅｌｌ蛍光測定用黒色プレート（ファルコン社製）のｗｅｌｌ内に入れ、蛍光プレートリーダー（パーキンエルマー社製：ｍｏｄｅｌ  １４２０）を用いて、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１８ｎｍの蛍光強度を測定した。【００３８】  同時に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ４８８で標識したコントロールｓｉＲＮＡ１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇを５０μＬ中に含む希釈系列をＲＮＡ分解酵素除去水で作製し、これらの希釈系列における蛍光強度を同様にして測定し、図２に示すような標準曲線を作成した。【００３９】  各溶出液の蛍光強度、及び該標準曲線から各溶出液に含まれる蛍光標識ｓｉＲＮＡの量を計算した。さらに、残りの溶出液５μＬを、それぞれ０．２４５ｍＬのＲＮＡ分解酵素除去水で希釈後、Ａ２６０を計算することにより、各溶出液のトータルＲＮＡの濃度を計算した。【００４０】  最終的に、各溶出液に含まれる蛍光標識ｓｉＲＮＡの量を各溶出液のトータルＲＮＡの濃度で除することにより、図３に示すように、各組織に分布したｓｉＲＮＡ量を比較した。
【産業上の利用可能性】
【００４１】  以上説明したように、本発明の、生体内に分布したｓｉＲＮＡ、もしくは細胞に取り込まれたｓｉＲＮＡの簡便な精密定量法は、ｓｉＲＮＡが医薬品として利用される上での最重要課題である患部への運搬法を開発するうえで非常に有用な手段となる。そのため、ｓｉＲＮＡの各種送達法の開発、及び様々な疾患治療に対応する新規ｓｉＲＮＡの開発に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ４８８で標識したコントロールｓｉＲＮＡ１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇを５０μＬ中に含む希釈系列を用いて作成した標準曲線を示したものである。この範囲において、蛍光標識ｓｉＲＮＡ量と蛍光強度の間の直線性を確認した。
【図２】Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ４８８で標識したコントロールｓｉＲＮＡ（３００ｎＭ）と２６．８μｇの陽性荷電脂質ナノ粒子（ＤＣ−６−１４、及びＤＯＰＥ（モル比；１：１）から構成される）の混合物（０．５ｍＬ）をマウスに静脈内投与した際の、ｓｉＲＮＡの各臓器における分布の経時的変化を示したものである。それぞれ、投与後０．５時間（ａ）、１．５時間（ｂ）、４．５時間（ｃ）、１３．５時間（ｄ）、４０．５時間（ｅ）を示す。
【図１】
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【図２】
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