(57)【要約】【課題】  ｅｒｂＢ１を介したシグナル伝達経路の活性化を調節できるシグナル伝達調節剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】  候補物質の存在下、ｅｒｂＢ１またはその部分ペプチドとＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとを接触させ、前記候補物質による前記両者の相互作用の促進または抑制を検出し、前記相互作用を促進した候補物質をシグナル伝達を促進する調節剤として選択し、前記相互作用を抑制した候補物質をシグナル伝達を抑制する調節剤として選択する。ｅｒｂＢ１の部分ペプチドはチロシンキナーゼドメインを含むペプチド、ＦＲＳ２βの部分ペプチドはＰＴＢドメインを含むペプチドである。この方法によりｅｒｂＢを介したシグナル伝達の活性化を調節する物質がスクリーニングできる。得られた物質は、ＦＲＳ２βとの併用により、前記シグナル伝達の阻害や癌の予防・治療に使用できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｅｒｂＢ１を介したシグナル伝達を調節するシグナル伝達調節剤のスクリーニング方法であって、
前記調節剤が、ｅｒｂＢ１とＦＲＳ２βとの相互作用を調節する物質であり、下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を有することを特徴とするスクリーニング方法。
（Ａ）  候補物質の存在下、ｅｒｂＢ１またはその部分ペプチドと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとを接触させる工程であり、
前記ｅｒｂＢ１の部分ペプチドが、チロシンキナーゼドメインを含むペプチドであり、前記ＦＲＳ２βの部分ペプチドがＰＴＢドメインを含むペプチドである、前記工程
（Ｂ）  前記候補物質による、ｅｒｂＢ１またはその部分ペプチドと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用の促進または抑制を検出する工程
（Ｃ）  前記ｅｒｂＢ１またはその部分ペプチドと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用を促進した候補物質を、シグナル伝達を促進する調節剤として選択し、前記ｅｒｂＢ１またはその部分ペプチドと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用を抑制した候補物質を、シグナル伝達を抑制する調節剤として選択する工程
【請求項２】
前記（Ａ）工程において、ＦＲＳ２βの部分ペプチドを、ｅｒｂＢ１の部分ペプチドに接触させる、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ｅｒｂＢ１を介したシグナル伝達を調節する調節剤のスクリーニング方法であって、
前記調節剤が、ＥＲＫとＦＲＳ２βとの相互作用を調節する物質であり、下記（ａ）〜（ｃ）工程を有することを特徴とするスクリーニング方法。
（ａ）  候補物質の存在下、ＥＲＫと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとを接触させる工程であり、
前記ＦＲＳ２βの部分ペプチドが、ＦＲＳ２βの２５０番目−２５１番目のジペプチドおよび３１５番目−３１６番目のジペプチドの少なくとも一方のジペプチドを含むペプチドである、前記工程
（ｂ）  前記候補物質による、ＥＲＫと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用の促進または抑制を検出する工程
（ｃ）  前記ＥＲＫと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用を促進した候補物質を、シグナル伝達を促進する調節剤として選択し、前記ＥＲＫと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用を抑制した候補物質を、シグナル伝達を抑制する調節剤として選択する工程
【請求項４】
前記（ａ）工程において、ＦＲＳ２βの部分ペプチドを、ＥＲＫに接触させる、請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記ＦＲＳ２βの部分ペプチドが、ＦＲＳ２βの２５０番目−２５１番目のジペプチドおよび３１５番目−３１６番目のジペプチドを含むペプチドである、請求項３または４記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シグナル伝達調節剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シグナル伝達経路の受容体チロシンキナーゼが、癌の発症に関与することが、広く知られている。中でも、ｅｒｂＢファミリーに属するｅｒｂＢ１は、細胞膜に発現する、チロシンキナーゼ活性を有する受容体型タンパク質であり、種々の癌での過剰発現が報告されている。ｅｒｂＢ１は、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）、ＨＥＲ１とも呼ばれており、例えば、口腔癌、食道癌等の扁平上皮性の癌や、非小細胞肺癌等で過剰発現が確認されている。このようにｅｒｂＢ１の過剰発現が癌の発症と関連していることから、これらの受容体のチロシンキナーゼ活性を抑制する薬剤を分子標的抗癌剤として使用することが試みられている。具体例としては、非小細胞肺癌に対するｅｒｂＢ１チロシンキナーゼ阻害剤（一般名Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、商品名イレッサ）があげられる。しかしながら、ｅｒｂＢ１を標的とする抗癌剤の投与は、前記受容体を過剰発現している癌症例に限られている。したがって、新たな抗癌剤の提供が望まれている。
【０００３】
【非特許文献１】Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．２０，ｐ１７６３−１７７１，２００６
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２５，ｐ５８７−５９５，２００７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、癌の発症に関与するシグナル伝達経路、特にｅｒｂＢ１を介したシグナル伝達経路の活性化を調節できるシグナル伝達調節剤のスクリーニング方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明のスクリーニング方法は、シグナル伝達を調節するシグナル伝達調節剤のスクリーニング方法であって、以下の第１のスクリーニング方法と第２のスクリーニング方法を含む。
【０００６】
本発明の第１のスクリーニング方法は、前記調節剤が、ｅｒｂＢ１とＦＲＳ２βとの相互作用を調節する物質であり、下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を有することを特徴とする。
（Ａ）  候補物質の存在下、ｅｒｂＢ１またはその部分ペプチドと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとを接触させる工程であり、前記ｅｒｂＢ１の部分ペプチドが、チロシンキナーゼドメインを含むペプチドであり、前記ＦＲＳ２βの部分ペプチドがＰＴＢドメインを含むペプチドである、前記工程
（Ｂ）  前記候補物質による、ｅｒｂＢ１またはその部分ペプチドと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用の促進または抑制を検出する工程
（Ｃ）  前記ｅｒｂＢ１またはその部分ペプチドと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用を促進した候補物質を、シグナル伝達を促進する調節剤として選択し、前記ｅｒｂＢ１またはその部分ペプチドと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用を抑制した候補物質を、シグナル伝達を抑制する調節剤として選択する工程
【０００７】
本発明の第２のスクリーニング方法は、前記調節剤が、ＥＲＫとＦＲＳ２βとの相互作用を調節する物質であり、下記（ａ）〜（ｃ）工程を有することを特徴とする。
（ａ）  候補物質の存在下、ＥＲＫと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとを接触させる工程であり、前記ＦＲＳ２βの部分ペプチドが、ＦＲＳ２βの２５０番目−２５１番目のジペプチドおよび３１５番目−３１６番目のジペプチドの少なくとも一方のジペプチドを含むペプチドである、前記工程
（ｂ）  前記候補物質による、ＥＲＫと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用の促進または抑制を検出する工程
（ｃ）  前記ＥＲＫと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用を促進した候補物質を、シグナル伝達を促進する調節剤として選択し、前記ＥＲＫと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用を抑制した候補物質を、シグナル伝達を抑制する調節剤として選択する工程
【０００８】
本発明において、「相互作用」とは、２以上の物質（例えば、分子、原子）が互いに力を及ぼしあうこといい、例えば、イオン間相互作用、水素結合、双極子相互作用、ファンデルワールス力等が例示できる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明者等は、鋭意研究の結果、ＦＲＳ２βが、ｅｒｂＢ１およびＥＲＫと相互作用（結合）することで、ｅｒｂＢ１を介したシグナル伝達をダウンレギュレーションすることを見出した。そして、さらに、このダウンレギュレーションは、ＦＲＳ２βのＰＴＢドメイン（リン酸化チロシン結合ドメイン）とｅｒｂＢ１のキナーゼドメインとの相互作用、ＦＲＳ２βの２５０番目−２５１番目のジペプチドとＥＲＫとの相互作用、または、ＦＲＳ２βの３１５番目−３１６番目のジペプチドとＥＲＫとの相互作用によって、生じることを見出した。このため、例えば、目的のヒト細胞に、ＦＲＳ２βやその部分ペプチドを導入したり、それらを発現する核酸を導入することによって、前記細胞におけるシグナル伝達を抑制することができる。そして、ｅｒｂＢ１のシグナル伝達は、前述のように、癌の発症に関与していることから、ＦＲＳ２βやその部分ペプチドによりシグナル伝達を阻害することによって、癌の発症を予防し、また、癌の治療を行うことができる。また、前記シグナル伝達の阻害によって、例えば、細胞の癌化ならびに細胞の増殖や生育を抑制できることからも、ＦＲＳ２βやその部分ペプチドは、癌の予防や治療に有用といえる。以上の点から、ＦＲＳ２βやその部分ペプチドのｅｒｂＢ１またはＥＲＫに対する相互作用（結合）を促進する物質をスクリーニングすれば、ＦＲＳ２βやその部分ペプチドとの併用によって、さらに効率よく、シグナル伝達の阻害ひいては癌の予防や治療を行えることが明らかとなった。そこで、本発明のように、候補物質の存在下、ＦＲＳ２βとｅｒｂＢ１またはＥＲＫとの相互作用を検出することによって、ＦＲＳ２βのｅｒｂＢ１またはＥＲＫに対する相互作用（結合）を調節する物質をスクリーニングできる。そして、スクリーニングにより得られる物質は、ＦＲＳ２βのｅｒｂＢ１またはＥＲＫに対する相互作用を調節できるため、結果的に、本発明のスクリーニング方法によれば、ｅｒｂＢ１を介したシグナル伝達を調節する物質を得ることができる。また、本発明のスクリーニング方法により得られる調節剤は、例えば、ＦＲＳ２βの相互作用によるダウンレギュレーションの機能を促進できることから、ＦＲＳ２βの補助剤、抗癌剤としても使用可能といえる。このため、本発明のスクリーニング方法は、医療分野等において極めて有用といえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
＜第１のスクリーニング方法＞
本発明の第１のスクリーニングは、前述のように、ｅｒｂＢ１を介したシグナル伝達を調節する調節剤のスクリーニング方法であって、前記調節剤が、ｅｒｂＢ１とＦＲＳ２βとの相互作用を調節する物質であり、下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を有することを特徴とする。
（Ａ）  候補物質の存在下、ｅｒｂＢ１またはその部分ペプチドと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとを接触させる工程であり、前記ｅｒｂＢ１の部分ペプチドが、チロシンキナーゼドメインを含むペプチドであり、前記ＦＲＳ２βの部分ペプチドがＰＴＢドメインを含むペプチドである、前記工程
（Ｂ）  前記候補物質による、ｅｒｂＢ１またはその部分ペプチドと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用の促進または抑制を検出する工程
（Ｃ）  前記ｅｒｂＢ１またはその部分ペプチドと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用を促進した候補物質を、シグナル伝達を促進する調節剤として選択し、前記ｅｒｂＢ１またはその部分ペプチドと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用を抑制した候補物質を、シグナル伝達を抑制する調節剤として選択する工程
【００１１】
ｅｒｂＢ１は、前述のように、シグナル伝達に関与するｅｒｂＢファミリーに属する受容体型チロシンキナーゼであり、ＥＧＦ（上皮増殖因子）等をリガンドとする受容体である。前記リガンドが前記ｅｒｂＢ１の細胞外ドメインに作用すると、前記受容体分子のホモ二量体化やヘテロ二量体化が誘導され、ｅｒｂＢ１の細胞内ドメインにおけるキナーゼドメインが活性化される。ｅｒｂＢ１は、例えば、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）またはＨＥＲ１とも呼ばれる。ｅｒｂＢ１のアミノ酸配列ならびにＤＮＡ配列等は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．Ｘ００５８８等に登録されている。ヒトｅｒｂＢ１のアミノ酸配列を、配列番号２に示す。
【００１２】
本発明においては、ｅｒｂＢ１とその部分ペプチドのいずれを用いてもよいが、後述する（Ｂ）工程において、相互作用が確認し易いことから、部分ペプチドを用いることが好ましい。ｅｒｂＢ１の部分ペプチドは、前述のように、チロシンキナーゼドメインを含むペプチドである。ヒトｅｒｂＢ１のチロシンキナーゼドメインは、配列番号２の７１８番目−９６４番目の領域である。前記部分ペプチドは、チロシンキナーゼドメインのみからなるペプチドでもよいし、チロシンキナーゼドメインを含むペプチドであってもよい。後者の場合、部分ペプチドのアミノ酸残基数は、例えば、７１８〜８００残基である。
【００１３】
また、本発明において、前記チロシンキナーゼドメインを含む部分ペプチドは、チロシンキナーゼドメインのアミノ酸配列（配列番号２の７１８番目−９６４番目）において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであり、ｅｒｂＢ１のチロシンキナーゼドメインと同等の機能を有するペプチドを含む。欠失、置換または付加が可能なアミノ酸残基数は、チロシンキナーゼドメインの機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。
【００１４】
ＦＲＳ２βは、ＳＮＴ−２またはＦＲＳ３とも呼ばれる。ＦＲＳ２βは、ＦＧＦＲ（繊維芽成長因子受容体）やニュートロフィン受容体のシグナル伝達に関与するドッキングタンパク質であり、以下のことが知られている。ＦＲＳ２βは、Ｎ末端にミリスチレーションシグナルを持つことにより、細胞膜の脂質に結合している。そして、ＦＧＦＲやニュートロフィン受容体が活性化すると、ＦＲＳ２βは、ＦＲＳ２βのＰＴＢドメイン（リン酸化チロシン結合ドメイン）を介して、前記受容体の細胞内ドメインに結合する。前記受容体に結合したＦＲＳ２βは、さらに、チロシン残基にリン酸化を受ける。ＦＲＳ２βがリン酸化を受けると、このチロシンリン酸化ドメインに、各種チロシンホスファターゼ（例えば、Ｓｈｐ２、Ｇｒｂ２等）が結合し、これらのチロシンホスファターゼが活性化する。そして、これらのチロシンホスファターゼの活性化により、例えば、Ｒａｓ−ＥＲＫ経路等の活性化が引き起こされる。しかしながら、ＦＲＳ２βは、ｅｒｂＢ１のシグナル伝達において、すでに報告されている前記ＦＧＦＲのシグナル伝達における機能とは、全く異なる機能を示す。そして、このことは何ら報告されていない。ｅｒｂＢ１のシグナル伝達において、ＦＲＳ２βが、シグナル伝達の活性化ではなく、ダウンレギュレーションを引き起こすことは、前述のように本発明者らがはじめて見出した。そして、本発明者らは、さらに、ＦＲＳ２βにおけるＰＴＢドメイン、および、ＥＲＫと結合するドメイン（２５０番目−２５１番目のジペプチド、３１５番目−３１６番目のジペプチド）の少なくとも一方によれば、前記ダウンレギュレーションを実現できることを見出した。具体的には、例えば、ｅｒｂＢ１の自己リン酸化や下流分子のリン酸化が阻害されるというような、シグナル伝達のダウンレギュレーションが生じる。
【００１５】
ヒトＦＲＳ２βのアミノ酸配列、ヒトＦＲＳ２β遺伝子の完全長配列、および、ヒトＦＲＳ２βをコードするＣＤＳ配列（終止コドンを含む）等は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００６６５３に登録されている。ヒトＦＲＳ２βのアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００１６】
本発明においては、ＦＲＳ２βとその部分ペプチドのいずれを用いてもいが、後述する（Ｂ）工程において、相互作用が確認し易いことから、部分ペプチドを用いることが好ましい。ＦＲＳ２βの部分ペプチドは、前述のように、ＰＴＢドメインを含むペプチドである。ヒトＦＲＳ２βのＰＴＢドメインは、配列番号１の１番目〜１８５番目の領域である。前記部分ペプチドは、ＰＴＢドメインのみからなるペプチドでもよいし、ＰＴＢドメインを含むペプチドであってもよい。後者の場合、部分ペプチドのアミノ酸残基数は、例えば、１８８〜２５０残基である。
【００１７】
また、本発明において、前記ＰＴＢドメインを含む部分ペプチドは、ＰＴＢドメインのアミノ酸配列（配列番号１の１番目〜１８５番目）において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであり、ヒトＦＲＳ２βのＰＴＢドメインと同等の機能を有するペプチドを含む。欠失、置換または付加が可能なアミノ酸残基数は、ＰＴＢドメインの機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。
【００１８】
本発明の第１のスクリーニング方法の一例として、以下に、ｅｒｂＢ１の部分ペプチド（以下、「ｅｒｂＢ１ペプチド」という）と、ＦＲＳ２βの部分ペプチド（以下、「ＦＲＳ２βペプチド」という）とを用いる方法を示す。なお、本発明は、これには制限されない。
【００１９】
まず、ＦＲＳ２βペプチドを９６穴プレートのウェルに固相化する。固相化は、従来公知の方法によって行うことができる。一方、ｅｒｂＢ１ペプチドは、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）との融合タンパク質（以下、「ＡＬＰ−ｅｒｂＢ１融合タンパク質」という）を調製する。そして、ＦＲＳ２βペプチドを固相化した前記ウェルに、ＡＬＰ−ｅｒｂＢ１融合タンパク質と候補物質とをアプライする。これによって、固相化したＦＲＳ２βペプチドとｅｒｂＢ１ペプチドとの結合反応を行う。この際、ＥＲＫ、活性化ＭＥＫおよびＡＴＰを反応系に加え、ＥＲＫの活性化反応と、これにより生じた活性化ＥＲＫによるＦＲＳ２βのリン酸化反応も同時に行わせることが好ましい。そして、反応終了後に、前記ウェルを洗浄し、未結合のＡＬＰ−ｅｒｂＢ１融合タンパク質を除去する。
【００２０】
続いて、前記ウェルに、ＡＬＰの発色基質として、例えば、ｐＮＰＰ(p-nitrophenyl  phospate)等のＡＬＰの発色基質を添加して、ＡＬＰ活性を測定する。そして、候補物質が無添加であるコントロールのＡＬＰ活性との比較を行う。その結果、コントロールよりも高いＡＬＰ活性を示した候補物質は、ＦＲＳ２βとｅｒｂＢ１との結合を促進する物質、すなわち、ｅｒｂＢ１を介するシグナル伝達を促進する調節剤として選択することができる。他方、コントロールよりも低いＡＬＰ活性を示した候補物質は、ＦＲＳ２βとｅｒｂＢ１との結合を抑制する物質、すなわち、ｅｒｂＢ１を介するシグナル伝達を抑制する調節剤として選択することができる。
【００２１】
本発明において使用する、ＦＲＳ２βやそのペプチド、ｅｒｂＢ１やそのペプチド、その他のタンパク質は、天然由来でもよいし、組換え技術により大腸菌などで発現させたものでもよい。
【００２２】
なお、ＦＲＳ２βが結合するｅｒｂＢ１の部位が、キナーゼドメインであることが明らかとなったことから、例えば、以下のようなことも可能になると考えられる。ＦＲＳ２βが結合するｅｒｂＢ１のキナーゼドメインを含むペプチドを、細胞内に投与または細胞内で発現させれば、この外来ｅｒｂＢ１ペプチドとＦＲＳ２βとの結合が生じる。外来ｅｒｂＢ１ペプチドとＦＲＳ２βとが結合することにより、ＦＲＳ２βの構造が変化すると、ＦＲＳ２βとＥＲＫとの結合が促進され、それによってＥＲＫの活性が低下し、ＥＲＫを介するシグナル伝達が阻害される。
【００２３】
＜第２のスクリーニング方法＞
本発明の第２のスクリーニング方法は、ｅｒｂＢ１を介したシグナル伝達を調節する調節剤のスクリーニング方法であって、前記調節剤が、ＥＲＫとＦＲＳ２βとの相互作用を調節する物質であり、下記（ａ）〜（ｃ）工程を有することを特徴とする。
（ａ）  候補物質の存在下、ＥＲＫと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとを接触させる工程であり、前記ＦＲＳ２βの部分ペプチドが、ＦＲＳ２βの２５０番目−２５１番目のジペプチドおよび３１５番目−３１６番目のジペプチドの少なくとも一方のジペプチドを含むペプチドである、前記工程
（ｂ）  前記候補物質による、ＥＲＫと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用の促進または抑制を検出する工程
（ｃ）  前記ＥＲＫと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用を促進した候補物質を、シグナル伝達を促進する調節剤として選択し、前記ＥＲＫと、ＦＲＳ２βまたはその部分ペプチドとの相互作用を抑制した候補物質を、シグナル伝達を抑制する調節剤として選択する工程
【００２４】
ＥＲＫは、ＥＲＫ１／２であり、そのアミノ酸配列ならびに塩基配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０１１９５２、ＮＭ＿００２７４５に登録されている。
【００２５】
また、本発明において、ＥＲＫは、例えば、前述の登録されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであり、ＥＲＫと同等の機能を有するペプチドを含む。欠失、置換または付加が可能なアミノ酸残基数は、ＥＲＫの機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。
【００２６】
本発明においては、ＦＲＳ２βとその部分ペプチドのいずれを用いてもよいが、後述する（Ｂ）工程において、相互作用が確認し易いことから、部分ペプチドを用いることが好ましい。ＦＲＳ２βの部分ペプチドは、前述のように、ＦＲＳ２βの２５０番目−２５１番目のジペプチドおよび３１５番目−３１６番目のジペプチドの少なくとも一方のジペプチドを含むペプチドである。前記部分ペプチドは、前記２種類のジペプチドのうち２５０番目−２５１番目のジペプチドのみを含むペプチドでもよし、３１５番目−３１６番目のジペプチドのみを含むペプチドでもよいし、両方のジペプチドを含む領域からなるペプチドでもよい。２５０番目−２５１番目のジペプチドのみを含むペプチドとしては、例えば、配列番号１の２３７番目〜２５２番目の領域があげられる。３１５番目−３１６番目のジペプチドのみを含むペプチドとしては、例えば、配列番号１の３０９番目〜３３３番目の領域があげられる。前記部分ペプチドのアミノ酸残基数は、例えば、１０〜１００残基である。
【００２７】
本発明において、ＦＲＳ２βの２５０番目−２５１番目のジペプチドおよび３１５番目−３１６番目のジペプチドの少なくとも一方のジペプチドを含む部分ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであり、ヒトＥＲＫと結合する機能を有するペプチドを含む。欠失、置換または付加が可能なアミノ酸残基数は、ヒトＥＲＫと結合する機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。
【００２８】
本発明の第２のスクリーニング方法の一例として、以下に、ＥＲＫと、ＦＲＳ２βの部分ペプチド（以下、「ＦＲＳ２βペプチド」という）とを用いる方法を示す。なお、本発明は、これには制限されない。
【００２９】
まず、ＦＲＳ２βペプチドを９６穴プレートのウェルに固相化する。固相化は、従来公知の方法によって行うことができる。一方、ＥＲＫは、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）との融合タンパク質（以下、「ＡＬＰ−ＥＲＫ融合タンパク質」という）を調製する。そして、ＦＲＳ２βペプチドを固相化した前記ウェルに、ＡＬＰ−ＥＲＫ融合タンパク質と候補物質とをアプライする。これによって、固相化したＦＲＳ２βペプチドとＥＲＫとの結合反応を行う。この際、活性化ＭＥＫおよびＡＴＰを反応系に加え、ＥＲＫの活性化反応と、これにより生じた活性化ＥＲＫによるＦＲＳ２βのリン酸化反応も同時に行わせることが好ましい。そして、反応終了後に、前記ウェルを洗浄し、未結合のＡＬＰ−ＥＲＫ融合タンパク質を除去する。
【００３０】
続いて、前記ウェルに、ＡＬＰの発色基質として、例えば、ｐＮＰＰ(p-nitrophenyl  phospate)等のＡＬＰの発色基質を添加して、ＡＬＰ活性を測定する。そして、候補物質が無添加であるコントロールのＡＬＰ活性との比較を行う。その結果、コントロールよりも高いＡＬＰ活性を示した候補物質は、ＦＲＳ２βとＥＲＫとの結合を促進する物質、すなわち、ｅｒｂＢ１を介するシグナル伝達を促進する調節剤として選択することができる。他方、コントロールよりも低いＡＬＰ活性を示した候補物質は、ＦＲＳ２βとＥＲＫとの結合を抑制する物質、すなわち、ｅｒｂＢ１を介するシグナル伝達を抑制する調節剤として選択することができる。
【００３１】
なお、本発明において、相互作用の検出方法は、前述の方法には限られず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、ＦＬＥＴ、ＢＩＡＣＯＲＥ等も採用できる。
【００３２】
本発明において使用する、ＦＲＳ２βやそのペプチド、ｅｒｂＢ１やそのペプチド、その他のタンパク質は、天然由来でもよいし、組換え技術により大腸菌などで発現させたものでもよい。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法により得られるシグナル伝達調節剤は、ＦＲＳ２βの機能を促進または抑制することから、本発明は、ＦＲＳ２βの補助剤のスクリーニング方法ということもできる。また、本発明のスクリーニング方法により得られるシグナル伝達調節剤は、ＦＲＳ２βとの併用により抗癌剤として使用できることから、本発明は、抗癌剤のスクリーニング方法ということもできる。
【００３４】
また、本発明のスクリーニング方法により得られたシグナル伝達調節剤は、例えば、ｅｒｂＢ１を介したシグナル伝達経路が関与する癌細胞を処理するのに有用である。前記癌細胞としては、例えば、乳癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、口腔癌、食道癌、脳腫瘍、肺非小胞癌等の癌細胞があげられる。また、前述の癌が発生する可能性がある細胞、例えば、乳房、卵巣、胃、膀胱、口腔、食道、脳、肺非小胞等の正常細胞への適用も有用である。
【００３５】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例によってなんら制限されない。
【実施例１】
【００３６】
ｅｒｂＢ１におけるＦＲＳ２βの結合部位を決定した。以下、ｅｒｂＢ１は、「ＥＧＦＲ」という。
【００３７】
実施例１−１
野生型ヒトＥＧＦＲの全長およびＥＧＦＲ欠失変異体をコードするｃＤＮＡをベクターに連結し、ＥＧＦＲ発現ベクターならびにＥＧＦＲ変異体発現ベクターを作製した。ＥＧＦＲ欠失変異体の欠失部位を、図１に示す。同図において、ＷＴは野生型、ｄｅｌ６７３−７３７は、アミノ酸６７３番目−７３７番目の領域を欠失する変異体、ｄｅｌ９６２−９９８は、アミノ酸９６２番目−９９８番目の領域を欠失する変異体、１−９９２は、アミノ酸１番目−９９２番目の領域からなる変異体（９９３以降を欠失）である。同図において、ＴＭは、細胞膜貫通ドメインを示す（６４３番目−６６８番目）。
【００３８】
ヒトＦＲＳ２βの全長をコードするｃＤＮＡをベクターに連結し、ＦＲＳ２β発現ベクターを作製した。ＦＲＳ２β発現ベクターは、ＦＲＳ２βのＣ末端にＦｌａｇ−ｔａｇを付加するプラスミドベクターとした。
【００３９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、前記ＥＧＦＲ発現ベクターまたはＥＧＦＲ変異体発現ベクターとＦＲＳ２β発現ベクターとを、リポフェクション方法により一過性に発現させた。そして、免疫共沈法により、発現した野生型ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲ欠失変異体とＦＲＳ２βとの相互作用を確認した。なお、免疫共沈法は、抗ＥＧＦＲ抗体（５２８）を用いて、従来公知の方法により行った。この結果を、図２に示す。図２は、ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【００４０】
同図に示すように、アミノ酸９９３番目以降を欠失した１−９９２変異体、アミノ酸６７３番目−７３７番目を欠失したｄｅｌ６７３−７３７変異体、および、アミノ酸９６２番目−９９８番目を欠失したｄｅｌ９６２−９９８は、いずれも、野生型（ＷＴ）と同様に、ＦＲＳ２βとの相互作用が確認された。この結果から、ＥＧＦＲは、キナーゼドメインにおいてＦＲＳ２βと相互作用することが示唆された。
【００４１】
実施例１−２
さらに、ＥＧＦＲのキナーゼドメインとＦＲＳ２βとの相互作用を確認した。
【００４２】
野生型ヒトＥＧＦＲのキナーゼドメイン（配列番号２の７１８番目−９６４番目）コードするｃＤＮＡをベクターに連結し、ＥＧＦＲキナーゼドメイン発現ベクターを作製した。前記ベクターは、ＥＧＦＲキナーゼドメインのＣ末端に６Ｍｙｃ−ｔａｇを付加するプラスミドベクターとした。
【００４３】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、前記ＥＧＦＲキナーゼドメイン発現ベクターとＦＲＳ２β発現ベクターとを、リポフェクション方法により一過性に発現させた。そして、免疫共沈法により、発現したＥＧＦＲキナーゼドメインとＦＲＳ２βとの相互作用を確認した。なお、免疫共沈法は、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて、従来公知の方法により行った。この結果を、図３に示す。図３は、ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【００４４】
同図に示すように、ＥＧＦＲキナーゼドメインとＦＲＳ２βとの相互作用が確認された。この結果から、ＥＧＦＲは、キナーゼドメインにおいてＦＲＳ２βと相互作用することが明らかとなった。
【実施例２】
【００４５】
ＦＲＳ２βにおけるＥＲＫの結合部位を決定した。
【００４６】
図４に、ＦＲＳ２βのアミノ酸配列の概略を示す。同図におけるアミノ酸２５０番目−２５１番目のジペプチド、および、３１５番目−３１６番目のジペプチドが、ＦＲＳ２βとＥＲＫとの相互作用に関与か否かを確認した。
【００４７】
野生型ヒトＦＲＳ２βの全長およびアミノ酸変異体をコードするｃＤＮＡをベクターに連結し、ＦＲＳ２β発現ベクターならびにＦＲＳ２β変異体発現ベクターを作製した。ＦＲＳ２β変異体は、配列番号１の２５０番目−２５１番目のアルギニン（Ｒ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体（Ｒ２５０  ２５１Ａ）、配列番号１の３１５番目−３１６番目のアルギニン（Ｒ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体（Ｒ３１５  ３１６Ａ）、配列番号１の２５０番目−２５１番目および３１５番目−３１６番目のアルギニン（Ｒ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体（４ＲＡ）の３種類を作製した。前記ベクターは、ＦＲＳ２βのＣ末端にＦｌａｇ−ｔａｇを付加するプラスミドベクターとした。
【００４８】
ＭＥＫ１の恒常活性変異体であるＣＡＭＥＫ１のｃＤＮＡ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）を、ｐＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）に連結して、ＣＡＭＥＫ１発現ベクターを作製した。ＣＡＭＥＫ１は、ＭＥＫ１の２１８番目および２２２番目のセリン（Ｓ）が、グルタミン酸（Ｅ）に置換されている。
【００４９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、前記ＦＲＳ２β発現ベクターまたはＦＲＳ２β変異体発現ベクターとＣＡＭＥＫ１発現ベクターとを、リポフェクション方法により一過性に発現させた。そして、免疫共沈法により、発現したＦＲＳ２βまたはＦＲＳ２β変異体とＥＲＫとの相互作用を確認した。なお、免疫共沈法は、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて、従来公知の方法により行った。この結果を、図５に示す。図５は、ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【００５０】
同図に示すように、２種類のジペプチドのうち一方のＲＲをＡＡに置換した変異体（Ｒ２５０  ２５１Ａ、Ｒ３１５  ３１６Ａ）では、野生型ＦＲＳ２β（ＷＴ）と比較して、若干、ＥＲＫとの相互作用が低下した。そして、２種類のジペプチドを全て置換した変異体（４ＲＡ）では、野生株と比較して、著しくＥＲＫとの相互作用に低下が見られた（約１０％以下に低下）。この結果から、ＦＲＳ２βにおいて、アミノ酸２５０番目−２５１番目の領域およびアミノ酸３１５番目−３１６番目の領域付近が、ＥＲＫとの結合部位であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によれば、候補物質の存在下、ＦＲＳ２βとｅｒｂＢ１またはＥＲＫとの相互作用を検出することによって、ＦＲＳ２βのｅｒｂＢ１またはＥＲＫに対する相互作用（結合）を調節する物質をスクリーニングできる。そして、スクリーニングにより得られる物質は、ＦＲＳ２βのｅｒｂＢ１またはＥＲＫに対する相互作用を調節できるため、結果的に、本発明のスクリーニング方法によれば、ｅｒｂＢ１を介したシグナル伝達を調節する物質を得ることができる。また、本発明のスクリーニング方法により得られる調節剤は、例えば、ＦＲＳ２βの相互作用によるダウンレギュレーションの機能を促進できることから、ＦＲＳ２βの補助剤、抗癌剤としても使用可能といえる。このため、本発明のスクリーニング方法は、医療分野等において極めて有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の実施例１におけるＥＧＦＲ欠失変異株の欠失部位を示す概略図である。
【図２】本発明の実施例１において、ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図３】本発明の前記実施例１において、ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図４】本発明の実施例２において、ＦＲＳ２βのアミノ酸ならびにＥＲＫとの結合領域を示す概略図である。
【図５】本発明の前記実施例２において、ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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