(57)【要約】【課題】粒子の表面電荷の差が微小であっても、明確な泳動差を発生させ、粒子を正確に分離する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る粒子の分離方法は、試料中に存在する少なくとも２種の粒子を電気泳動力と超音波の輻射圧を利用して分離する方法であって、前記電気泳動力により前記粒子間に泳動差を設け、前記超音波により、少なくとも２つの節を有し、かつ前記泳動差を広げるような定常波を発生させることを特徴とする。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する少なくとも２種の粒子を電気泳動力と超音波の輻射圧を利用して分離する方法であって、
前記電気泳動力により前記粒子間に泳動差を設け、
前記超音波により、少なくとも２つの節を有し、かつ前記泳動差を広げるような定常波を発生させることを特徴とする粒子の分離方法。
【請求項２】
前記電気泳動力により泳動差を設けた粒子の間に、前記定常波の腹が形成されるように前記定常波を発生させることを特徴とする請求項１に記載の粒子の分離方法。
【請求項３】
前記電気泳動力を発生させている際には前記定常波は発生させず、
前記定常波を発生させている際には前記電気泳動力は発生させないことを特徴とする請求項１又は２に記載の粒子の分離方法。
【請求項４】
前記電気泳動力を発生させる電界の向きと前記超音波が進行する向きとが平行であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の粒子の分離方法。
【請求項５】
前記超音波により前記泳動差を広げた後、前記超音波と異なる周波数の定常波を発生させ、泳動差をさらに広げることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の粒子の分離方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の粒子の分離方法を複数回繰り返し、前記泳動差を広げることを特徴とする粒子の分離方法。
【請求項７】
前記複数回繰り返して行う際に、超音波の周波数が異なることを特徴とする請求項６に記載の粒子の分離方法。
【請求項８】
前記試料をチャンバー内に流入口から投入する際に、超音波により定常波を発生させておき、前記粒子を前記流入口近傍の節に捕捉することを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の粒子の分離方法。
【請求項９】
前記粒子は、細胞又は微生物であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の粒子の分離方法。
【請求項１０】
前記電界は、前記チャンバーの両側面に配置された対向する電極により発生されること特徴とする請求項８又は９に記載の粒子の分離方法。
【請求項１１】
前記定常波は、前記チャンバーの両側面に配置された対向する超音波発生手段により発生されること特徴とする請求項８乃至１０のいずれかに記載の粒子の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動法を用いた粒子の分離方法に関する。より詳細には、混在する粒子を電気泳動により分離分画する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
粒子や細胞、生体試料等を分離、分画する方法として電気泳動法が行われている。電気泳動とは、荷電粒子に対して電位勾配を掛けることで、その荷電状態に応じて移動する現象を利用して分離を行う方法である。核酸やたんぱく質等の比較的分子量が少ない物質に対して良く用いられてきたが、一方で細胞のように大きな粒子に関しても電気泳動法で分離、分析する方法が利用されている。
【０００３】
一般に細胞はその表面構造から表面に負の電荷を持ち、細胞の種類や活性状態、生死状態、発現状態等に応じて電荷量が変化する。この変化を元に電気泳動法で細胞の種類もしくは状態ごとに分離分析することが可能である（例えば特許文献１）。このような方法は、従来の物理的パラメータによる遠心分離装置に比べて細胞の持つ機能的特性をより反映させた分離方法として良く使用されている。表面の電荷量に応じて分離できるため、細胞の種類だけでなく、活性状態や発現状態等の細胞内部状態に応じて分離分析できる。細胞の電気泳動方法としては、生理食塩水や各種バツフア溶液に細胞を懸濁し、前期液体に対して電圧を印加することによって行う。一般的にどのような細胞でも表面に電荷をもつので電気泳動が可能であるが、例えば赤血球、白血球、体細胞、細菌等についての電気泳動による分離が良く行われている。例えば、特許文献２では、分析・分離精度を向上させるために、粒子を色素や抗体等で修飾して電気泳動の差を大きくする方法が提案されている。また、溶液を一定の流速で流して、その流れの力との折衝を利用する方法が提案されている。さらに、特許文献３では、電気泳動槽に試料と支持液を連続的に注入しながら電気泳動による分離及び分取を行うフリーフロー電気泳動等も提案されている。
【０００４】
また、液中の粒子に対して超音波を照射することによって、その超音波により形成される定常波の節に粒子を捕捉できることは以前から知られていた。超音波定常波を用いた粒子の捕捉に関してはさまざまな研究がなされており、粒子が音波から受ける力（超音波輻射圧）は次式で示すことが一般的である。
【０００５】
Fcs = (π/3)k(φ-β/β0)ρUs2・a3sin(2ky)
ｋは溶液中の波数、φは（微粒子の密度）／（溶媒の密度）、βは微粒子の弾性率、β０は溶液の弾性率、ρは溶液の密度、ａは微粒子の直径、Ｕｓはつぎに定義する量である。Ｕｓ2＝（２Ｉ／ρＣ）×１０7（ｃｍ2／Ｓ2）、ただしＩはパワー密度（Ｗ／ｃｍ2）、Ｃは溶媒中の音速、ｙは超音波進行方向の位置であり、槽中央における定在波の節の位置をｙ＝０とする。微粒子はＦｃｓによって節（ｙ＝０）の位置に集中する。式から明らかなように、超音波によって粒子が受ける力は、その表面電荷や誘電率等に左右されず、密度や弾性率にのみ依存する。このような特徴を利用して、粒子の捕捉や操作を超音波で行う技術が開発されている（例えば特許文献４）。超音波を利用することによって、通常のフィルターやピンセット等の物理的な捕捉手段を用いることなく、溶液中に分散されたプラスティック粒子や、微生物、組織細胞、血球細胞等の細胞粒子、粒状高分子を捕捉、濃縮することが可能である。また、非常に性質が異なる粒子であれば、その超音波による移動特性の違いから、分離・濃縮することも可能である。
【０００６】
また、特許文献５では、超音波輻射圧と電気泳動力との拮抗を利用することで電荷を持つ細胞を分離回収する細胞分画装置が提案されている。
【特許文献１】特公昭６１−０４８８６３号公報
【特許文献２】特登録２５６４５４０号明細書
【特許文献３】特登録３８３３１１０号明細書
【特許文献４】特開平７−４７２５９号公報
【特許文献５】特開平１１−３２６１５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、細胞等の大きい粒子を電気泳動するためには、ある程度大きな電圧を印加しなければならず、その電流による発熱が問題となる。この発熱に伴って泳動槽内に熱対流が起こることから、泳動精度の低下につながる。従って、泳動速度を速めるために印加電圧を大きくしたいところであるが、実際には上記問題があるためにあまり大きな電圧は印加できない。また、細胞等の生体分子に対してあまり大きな電圧を印加してしまうと、細胞の性質が変化しひいては細胞が死んでしまうおそれがある。そのために印加電圧はある程度以下に抑えざるを得ず、そのため、泳動速度は非常に遅くなり分析に多大な時間がかかってしまう。特に細胞種間の泳動度の差は一般的に小さいので、明確に分離・分析するための泳動差を発生させようとすると、長い距離を泳動させて、分離可能な泳動差を発生させる必要がある。長い距離を低い電圧で移動させるには、さらに長い処理時間が必要となる。このような問題のために、上述のように細胞を抗体等で修飾することによる泳動差向上方式（特許文献２）も提案されているが、新たな処理が必要となり処理時間およびコストを増大させる。さらに、修飾工程を経ることによって結果が修飾効率にも左右されることから、初期の細胞の状態を反映しない可能性も否定できない。また、微少な泳動差から分離するために、特許文献３に開示されるフリーフロー電気泳動等では、電気泳動槽への微細な加工が必要であり、しかも流速の管理にも非常な高精度が求められるため、装置が複雑化、巨大化してしまう。
【０００８】
また、特許文献４に開示されるような超音波を利用した細胞の濃縮や分離方法では、正確な操作を行うことが非常に困難である。性質が異なる粒子であれば、ある程度の挙動の違いによって区別可能であるが、細胞や細菌のように基本構造が非常に近似している粒子では同様の挙動を示してしまい、分離することが困難である。
【０００９】
また、溶液中の全細胞をまとめて捕捉したり、細胞を集めた上で凝集させて分離する方法が提案されているが、細胞種や細胞の状態に応じて分離することは非常に困難である。
【００１０】
また、電気泳動力と超音波輻射圧の力の比率によって分離する方法では（特許文献５）、電気泳動の泳動力の差が超音波輻射圧によって減じられる影響があるため分離精度が低く、処理時間もかかってしまう。
【００１１】
このように、細胞や微生物等の粒子を精度良く高速に分離するという目的は未だ達成されておらず、分離技術の高性能化が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで、本発明に係る粒子の分離方法は、
（１）試料中に存在する少なくとも２種の粒子を電気泳動力と超音波の輻射圧を利用して分離する方法であって、
前記電気泳動力により前記粒子間に泳動差を設け、
前記超音波により、少なくとも２つの節を有し、かつ前記泳動差を広げるような定常波を発生させることを特徴とする粒子の分離方法。
【００１３】
（２）前記電気泳動力により泳動差を設けた粒子の間に、前記定常波の腹が形成されるように前記定常波を発生させることを特徴とする（１）に記載の粒子の分離方法。
【００１４】
（３）前記電気泳動力を発生させている際には前記定常波は発生させず、
前記定常波を発生させている際には前記電気泳動力は発生させないことを特徴とする（１）又は（２）に記載の粒子の分離方法。
【００１５】
（４）前記電気泳動力を発生させる電界の向きと前記超音波が進行する向きとが平行であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の粒子の分離方法。
【００１６】
（５）前記超音波により前記泳動差を広げた後、前記超音波と異なる周波数の定常波を発生させ、泳動差をさらに広げることを特徴とする（１）乃至（４）のいずれかに記載の粒子の分離方法。
【００１７】
（６）（１）乃至（５）のいずれかに記載の粒子の分離方法を複数回繰り返し、前記泳動差を広げることを特徴とする粒子の分離方法。
【００１８】
（７）前記複数回繰り返して行う際に、超音波の周波数が異なることを特徴とする（６）に記載の粒子の分離方法。
【００１９】
（８）前記試料をチャンバー内に投入口から投入する際に、超音波により定常波を発生させておき、前記粒子を前記投入口近傍の節に捕捉することを特徴とする（１）乃至（７）のいずれかに記載の粒子の分離方法。
【００２０】
（９）前記粒子は、細胞又は微生物であることを特徴とする（１）乃至（８）のいずれかに記載の粒子の分離方法。
【００２１】
（１０）前記電界は、前記チャンバーの両側面に配置された対向する電極により発生されること特徴とする（８）又は（９）に記載の粒子の分離方法。
【００２２】
（１１）前記定常波は、前記チャンバーの両側面に配置された対向する超音波発生手段により発生されること特徴とする（８）乃至（１０）のいずれかに記載の粒子の分離方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る粒子の分離方法により、粒子の表面電荷に応じて高速に精度良く分離することが可能となる。つまり、微少な表面電荷の差であっても、明確な泳動差を発生させることが可能となり、粒子を正確に分離することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
従来の電気泳動法による細胞や微生物等の分離では、細胞の性質変化や死滅を防ぐため印加電圧をある程度に抑えなければならず、分析に多大な時間がかかってしまっていた。特に細胞種間の泳動度の差は一般的に小さいので、明確に分離するための泳動差を発生させようとすると、長い距離を泳動させる必要があり、さらに多くの時間がかかってしまっていた。そこで、本発明者らは、電気泳動力と超音波の輻射圧と拮抗させるのではなく、相互に利用することにより、より短い時間で細胞や微生物等の分離が可能となることを見い出し、本発明に至った。
【００２５】
そこで、本発明に係る粒子の分離方法は、
試料中に存在する少なくとも２種の粒子を電気泳動力と超音波の輻射圧を利用して分離する方法であって、
前記電気泳動力により前記粒子間に泳動差を設け、
前記超音波により、少なくとも２つの節を有し、かつ前記泳動差を広げるような定常波を発生させることを特徴とする。
【００２６】
本発明に係る分離方法の対象となる粒子としては、例えば、細胞や微生物等が挙げられる。また、これらに限定されるものではなく、核酸やたんぱく質等の生体内分子であっても利用可能である。また、プラスティック等の非生体内粒子の分離にも適用可能である。細胞としては、特に限定されるものではないが、赤血球や白血球等の血球細胞、動植物細胞、又は細胞内小器官等が挙げられる。また、微生物としては、特に限定されるものではないが、例えば真菌、放線菌、細菌又はウイルス等が挙げられる。また、生体内分子としては、特に限定されるものではないが、核酸やたんぱく質を含み、例えば、染色体、免疫グロブリン、血清蛋白質、抗体、抗原、脂質又は糖鎖等を挙げることができる。また、非生体内粒子としては、プラスチックを含み、例えば、例えば、シリカ、アルミナ等の酸化物、金、チタン、鉄若しくはニッケル等の金属、アガロース、セルロース若しくは不溶性デキストラン等の多糖類、セラミック等の無機酸化物、又は、ポリマーラテックス、ポリスチレン若しくはスチレン‐ブタジエン共重合体等の高分子化合物等が挙げられる。本発明では、細胞や微生物を分離対象とする場合に特に有効である。
【００２７】
前記試料としては、少なくとも二種類の粒子を含む液体のことであり、例えば、血清、血漿、髄液、滑液、リンパ液等の体液若しくは尿、糞便のような排泄物等の生体由来試料、又はその処理物等が挙げられる。処理物としては、例えばこれら生体由来試料を水や緩衝液等で適宜希釈等したもの、あるいはこれら生体由来試料に由来する粒子を水や緩衝液等に適宜溶解又は懸濁させ、再構成して得られたもの等が挙げられる。
【００２８】
前記定常波とは、周波数や速さ(速度の絶対値)が同じで進行方向が互いに逆向きの２つの波が重なり合うことによってできる、波形が進行せずその場に止まって振動しているようにみえる波動のことである。なお、本発明においては、逆向きの二つの波の周波数や速さが完全に同じである必要はなく、少しの差異があってもよく、本発明の効果を奏する範囲であれば、多少の波の進行があってもよい。
【００２９】
前記超音波を発生させる手段としては、従来公知の装置を用いることができ、例えばピエゾ素子を用いることができる。そして、定常波は１以上の超音波発生手段から発生させることができる。超音波発生手段が１つの場合は、波の進行方向に対して垂直な面で波が反射すると、もとの波(入射波)と進行方向が逆向きの反射波が発生する。この入射波と反射波が合成することにより定常波が発生する。また、２つの超音波発生手段を用いて定常波を形成する場合は、超音波の周波数を同じにし、進行方向が逆向きになるように設定することにより、定常波を形成することができる。この場合、例えば、超音波発生手段は、チャンバーの両側面に配置することができる。特に面状で平行に設置することが好ましい。
【００３０】
前記電界を発生させる手段としては、従来公知の装置を用いることができ、例えば対向する電極を用いることができる。また、前記超音波の進行方向と前記電界の向きが平行となるように、前記超音波発生手段と前記電界発生手段は配置されることが好ましい。また、前記電極が前記超音波発振素子を兼ねる構成とすることも可能である。
【００３１】
（実施形態１）
以下、本発明に係わる粒子分離方法の実施形態を説明しつつ、本発明について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００３２】
図１は本発明の粒子分離方法に好適な装置の一例を示す模式図である。図１において、１０１は泳動を行うための空間を形成するチャンバー、１０２はチャンバーを形成する外壁である。チャンバー１０１は溶液の流入口１０７と流出口１０８を具備し、この流入口１０７及び流出口１０８によりチャンバー１０１への粒子を含む溶液の充填や排出が可能となっている。１０４および１０５が電気泳動のための電極であり、チャンバー１０１内に電界をかけることが可能となっている。１０３および１０６が超音波発振素子であり、チャンバー１０１内の溶液に超音波を照射することが可能となっている。
【００３３】
図２は、図１で示した粒子分離装置に関してＡ−Ａ’方向に見た断面を示したものである。チャンバー２０１は、溶液を保持できる形状であればどのような形状、素材であっても良い。分離した粒子等を観察するために、外壁１０２の一部もしくは全部を観察波長に対して透明な物質で形成することも可能である。
【００３４】
溶液は特に限定されず、細胞等の比較的大きい粒子を扱う場合にはＴＡＥ等の一般的なバッファーや溶媒を使用可能である。また、比較的低分子の粒子を分離するために、アガロース等を添加してある程度の粘度を付加することも可能であるが、超音波およびその定常波の発生を阻害しない程度のものである必要がある。
【００３５】
本図のチャンバー２０１には、流入口２０７と流出口２０８が具備されている。流入口２０７および流出口２０８を設ける場所は、試料の投入方法や採取方法によって適宜変更可能である。図１では、形成する定常波の節に沿って流入口が設けられているが、特にこれに限定されるものではない。また、それぞれを複数の泳動部位を設けて、複数の試料を同時に分離対象とすることも可能である。なお、複数の泳動部位はチャンバー内に粒子の泳動方向（電界の方向）に沿って仕切りを設けることで作製できる。
【００３６】
電極２０４、２０５は電気泳動に用いる一般的な電極でよい。通常は数〜数百Ｖ／ｃｍとなるような電圧を印加する。電極に接続する電源に特に限定はない。一般的な電気泳動には直流電源を用いるが、交流電源を用いた不均一電界による誘電効果を利用しても良い。装置構成の簡便性の観点から、直流電源を用いることが好ましい。直流電源を用いる場合であって、分離対象となる粒子が細胞や微生物である場合は、好ましい電圧の範囲は１〜２００Ｖ／ｃｍ、より好ましい電圧の範囲は２０〜１００Ｖ／ｃｍとなるような電圧である。
【００３７】
超音波発振素子２０３、２０６は数十ｋＨｚ程度〜数ＭＨｚ程度の発振が出来るものが好ましい。超音波発振素子２０３及び２０６のそれぞれから発せられる超音波の周波数は同じに設定する。あまり高エネルギーの超音波を照射すると、キャビテーションが発生して粒子を破壊してしまう可能性があるので、細胞等を生存した状態で扱う場合には注意が必要である。また、周波数もあまり低周波にしてしまうとキャビテーションが発生しやすくなり、細胞の生存率に影響を与えてしまう場合がある。故に、細胞等を生存したまま取り扱うには、周波数は、５０ｋＨｚ以上１００ＭＨｚ以下が望ましく、１００ｋＨｚ以上５ＭＨｚ以下がより望ましい。本発明では、超音波の進行方向と電界の向きが平行となるように、前記超音波発振素子と前記電極が設けられることが好ましい。また、超音波素子への印加電圧は、１０〜１００Ｖ程度とすることが好ましく、２０〜４０Ｖ程度とすることがより好ましい。
【００３８】
ここで、図１のように長方形のチャンバーの両側面に設置した２つの超音波発生手段を用いて定常波を形成する場合において、定常波を発生させる条件及び定常波の形状について説明する。チャンバーの長さがｘ[ｍ]とすると、２つの節を有する定常波、つまり波長が２ｘ／２[ｍ]の定常波を形成するための条件は、２つの超音波発生手段の周波数を２ｖ／２ｘ[１／ｓ]に設定すればよい（ｖ：溶液中における音波が伝わる早さ（音速）[ｍ／ｓ]）。また、３つの節を有する定常波、つまり波長が２ｘ／３[ｍ]の定常波を形成するための条件は、２つの超音波発生手段の周波数を３ｖ／２ｘ[１／ｓ]に設定すればよい。また、４つの節を有する定常波、つまり波長が２ｘ／４[ｍ]の定常波を形成するための条件は、２つの超音波発生手段の周波数を４ｖ／２ｘ[１／ｓ]に設定すればよい。つまり、ｎ個の節を有する定常波、つまり波長が２ｘ／ｎ[ｍ]の定常波を形成するための条件は、２つの超音波発生手段の周波数をｎ×ｖ／２ｘ[１／ｓ]に設定すればよい。
【００３９】
また、図１又は２では超音波発振素子２０３、２０６が電極２０４、２０５に隣接して配置されているが、この構成に限定されるわけではない。超音波発振素子を電極と離れた位置に配置することも可能である。また、図１又は２のように対向する位置に一対の超音波発振素子を配する構成に限定されるわけではなく、定常波を発生させられる構成であれば単一の発振素子で構成しても良い。また、定常波を形成することができれば、より多数の素子から超音波を発生する構成も可能であるし、電界を形成する電極が超音波発振素子を兼ねる構成とすることも可能である。
【００４０】
次に、図３を用いて本発明の粒子分離方法の一例を説明する。図３は２種の粒子が混在した溶液において、本発明に係る粒子分離方法を用いてそれぞれの粒子を分離する場合の流れを示す図である。図３に示す装置は本発明の粒子分離方法を具現化するのに好適な装置の一例であり、構成は図１に示した粒子分離装置と同じである。
【００４１】
まず、３０９および３１０の２種の粒子が懸濁された試料を準備する。３０９が粒子１であり、３１０が粒子２である。試料は、例えば粒子として細胞を選択することができ、例えば溶媒としてＴＡＥ等のバッファーや適当な電解質溶液を用いることができる。
【００４２】
図３の（Ａ）は試料の投入工程を示している。チャンバー３０１に配置される溶液としては例えば試料と同じ溶媒を選択でき、チャンバー内を満たすことができる。試料は流入口３０７から投入される。チャンバー３０１が予め溶液で満たされている場合は、試料が流入した容積分の溶液が流出口３０８から排出される。本例では試料投入前にチャンバーを溶液で満たしているが、必ずしもその必要はなく、空のチャンバーに投入する方法でも良い。
【００４３】
試料をチャンバー３０１に投入した後に、粒子を電気泳動の開始位置に揃える処理を行う。また、粒子の拡散を防ぐため、粒子を投入する時からチャンバー中の溶媒に超音波を発生させておくことが好ましい。図３の（Ｂ）のように、超音波発振素子３０３、３０６によって定常波を発生させ、流入口３０７付近の節３１１になるべく多くの粒子を捕集する。全ての粒子が同一の節に捕集されることが特に好ましい。また、試料をチャンバー内に投入する際には、予め定常波を発生させておくことが好ましい。そうすることにより、粒子が溶液中に拡散する前に粒子を流入口近傍の節、好ましくは同一の節上に捕捉し易いためである。また、本実施形態は２つの節を有する定常波を発生させる場合についてであるが、この場合、流入口３０７は泳動開始側（陰極の電極側）の節付近に設けること、又は、その節よりも陰極の電極側に流入口を設けることが好ましい。そうすることにより、試料を節の近くに投入することができるためである。また、その他にも、細胞の溶液中への拡散を防ぐために、壁や膜等の仕切りを設けておくこともできる。
【００４４】
ここで、溶液中での音速はほぼ１５００ｍ／ｓと推定できる。したがって、例えば図３の（Ｂ）にように、長さ（電極３０４−３０５間）約３．０ｃｍのチャンバー内に２つの節を有する定常波を発生させるためには、周波数が５０ｋＨｚ程度の超音波を超音波発振素子から発振すればよい。なお、式λ＝ｖ／ｆより計算し、音波の速さは１５００ｍ／ｓとした。なお、チャンバー内の溶液の種類によって多少音速は変わってくるが、その場合は周波数を調整することにより任意の定常波を発生させることができる。
【００４５】
次に、粒子を開始点に揃えた段階で超音波発振を停止し、電極３０４、３０５間に電圧を印加する。この工程を示しているのが図３の（Ｃ）である。図３（ｃ）では３０４が負極で３０５が陽極である。また、印加する電圧は１〜２００Ｖ／ｃｍとなるような電圧であることが好ましい。例えば表面が負に帯電している粒子であれば、各粒子の移動度で陽極３０５の方向に泳動する。それぞれの粒子は種類毎に泳動速度が異なり、ある程度の泳動差が発生する。
【００４６】
図３の（Ｄ）のように、粒子１（３０９）が１／４波長より進んだ時点で電極３０３、３０４への電圧印加を停止し、超音波定常波を発生させる。例えば、５０ｋＨｚの超音波を発生させているとすると、１／４波長は７．５ｍｍとなる（音波の速さを１５００ｍ／ｓとして計算）。ここで、定常波の最左の節３１１から１／４波長より進んだ粒子１は、超音波振動によって次の節３１２に移動し、節３１１から１／４波長未満しか進んでいない粒子２（３１０）は最左の節３１１に移動する。このように、電気泳動による粒子の移動が定常波の波長の１／４に達しているか否かを境にして、粒子を明確に分離することが出来る。なお、実際の波長は音波の周波数や音速によって異なるので、周波数や音速に応じた距離を電気泳動で移動させればよい。泳動させる距離は１／４波長分に限定されるわけではなく、より長い距離を泳動させても良い。また、粒子の泳動距離に応じて照射する超音波の波長を変えても良い。
【００４７】
このように電圧印加とそれに続く超音波照射を適切なタイミングで行うことによって、電気泳動によるわずかな泳動差を定常波の腹を境に各節にまで分離することができ、泳動差を大きくすることが可能となる。分離された粒子３０９は、例えば図３のＥのように流出口３０８から排出可能である。
【００４８】
（実施形態２）
次に、図４を用いて本発明の粒子分離方法の他の一例を説明する。図４は２種の粒子が混在した溶液において、本発明により分離する過程を示す図である。図４は本発明の粒子分離方法を具現化した装置の一例であり、構成は図１と同様である。
【００４９】
まず、４０９および４１０の２種の粒子が懸濁された試料を準備する。４０９が粒子１であり、４１０が粒子２である。試料は、例えば、粒子として細胞や微生物等を選択でき、溶媒としてＴＡＥ等のバッファーや適当な電解質溶液等を選択できる。
【００５０】
図４の（Ａ）は試料の投入工程を示している。チャンバー４０１は例えば試料の調製に用いた溶媒と同じものを溶液として配置されている。流入口４０７から前記試料を投入する。なお、試料投入前にチャンバーを溶液で満たしていてもよい。
【００５１】
試料をチャンバー４０１に投入した後に、電気泳動の開始位置を揃える処理を行う。図４の（Ｂ）のように、超音波発振素子４０３、４０６によって定常波を発生させる。このとき、流入口４０７付近の節４１３になるべく多くの粒子を捕集するようにする。溶媒中での音速はほぼ１５００ｍ／ｓと規定できるので、例えば図４の（Ｂ）にように、長さ（電極４０４−４０５間）約４．５ｃｍのチャンバー内に６つの節の定常波を発生させるためには、１００ｋＨｚ程度の音波を発振素子４０３および４０６から発振すればよい。なお、チャンバー内の溶液によって音速は変わってくるが、その場合は周波数を調整することにより任意の定常波を発生させることができる。
【００５２】
次に、粒子を開始点に揃えた段階で超音波発振を停止し、電極４０４、４０５間に電圧を印加し、粒子を電気泳動させる。この工程を示しているのが図４の（Ｃ）である。４０４が負極で４０５が陽極であり、１〜数十Ｖ／ｃｍ程度の電圧を印加するのが好適である。例えば表面が負に帯電している粒子は、各粒子の種類に応じた泳動速度で陽極４０５の方向に電気泳動する。それぞれの粒子は種類に応じて泳動速度が異なり、ある程度の泳動差が発生する。
【００５３】
図４の（Ｄ）のように、粒子１（４０９）が１／４波長より進んだ時点で電極４０３、４０４への電圧印加を停止し、超音波により定常波を発生させる。例えば、１００ｋＨｚの超音波を発振する場合には定常波の波長は、１５ｍｍとなり、１／４波長は３．７５ｍｍとなる。ここで、定常波の最左の節４１３から１／４波長より進んだ粒子１（４０９）は、超音波の輻射圧によって次の節４１４に移動する。また、節４１３から１／４波長未満しか進んでいない粒子２（４１０）は最左の節（元の節）４１３に移動する。このように、電気泳動による移動が定常波の１／４波長に達しているか否かを境にして粒子を分けることが出来る。なお、実際の波長は音波の周波数と速度によって異なるので、定常波の周波数と速度に応じた距離を電気泳動で移動させればよい。泳動させる距離は１／４波長に限定されるわけではなく、他の粒子と分離できる範囲で、より長い距離を泳動させても良い。また、粒子の泳動距離に応じて照射する超音波の波長を変えても良い。
【００５４】
次に、超音波の照射を停止し、超音波の照射によって節４１３と節４１４に分離された粒子１（４０９）と粒子２（４１０）に対して、さらに図４の（Ｃ）のように電圧を印加することによってさらに分離を進める。粒子は各節から陽極方向にさらに泳動される。
【００５５】
粒子１（４０９）が節４１４から１／４波長以上進んだ時点で、電極４０３、４０４への電圧印加を停止し、再度定常波を形成させる。節４１４から１／４波長以上進んだ粒子１（４０９）は、超音波振動によって次の節４１５に移動し、最左の節４１３から１／４波長未満しか進んでいない粒子２（４１０）は最左の節４１３に再度移動する。
【００５６】
電圧印加と超音波照射を適切なタイミングで繰り返すことによって、一部の粒子は陽極に向けて移動し、残りの粒子は最左の節に残留することになる。例えば図４の例であれば、電圧印加と超音波照射を５回繰り返すことによって、図４の（Ｅ）の状態になる。粒子１（４０９）は最右の節４１６まで移動し、粒子２（４１０）は最左の節４１３に位置した状態である。チャンバー４０１内で分離した粒子１（４０９）は、流出口４０８から排出可能である。このように、電気泳動によるわずかな泳動差を定常波の腹を境に各節にまで分離することができ、工程を繰り返すことによって泳動差を大きくすることが可能となる。
【００５７】
（実施形態３）
次に本発明の他の実施形態に関して図５を用いて説明する。図５は２種の粒子が混在した溶液において、本発明により分離する過程を示す図である。装置構成は図１と同様である。本実施形態は、超音波照射工程において照射周波数を変更することによってより効率的に分離する方法の例である。
【００５８】
試料をチャンバー５０１に投入し、定常波を形成して粒子を開始位置に揃える。その後、図５の（Ａ）のように電極５０４、５０５間に電圧を印加する。５０４が負極で５０５が陽極であり、１〜数十Ｖ／ｃｍ程度の電圧を印加するのが好適である。例えば負に帯電している粒子であれば、各粒子の種類に応じた移動速度で陽極５０５の方向に泳動される。それぞれの粒子は泳動速度が異なり、ある程度の泳動差が発生する。
【００５９】
次に、図５の（Ｂ）のように、粒子１（５０９）が１／４波長より進んだ時点で電極５０３、５０４への電圧印加を停止し、超音波により定常波を発生させる。ここで、溶媒中での音速はほぼ１５００ｍ／ｓと推定できる。したがって、例えば長さ（電極５０４−５０５間）約６ｃｍのチャンバー内に８つの節の定常波を発生させるためには、１００ｋＨｚ程度の音波を発振素子５０３および５０６から発振すればよい。１００ｋＨｚの超音波を発生させているとすると、１／４波長は３．７５ｍｍとなる。ここで、開始位置から１／４波長より進んだ粒子１（５０９）は、超音波振動によって次の節５１８に移動する。１／４波長未満しか進んでいない粒子２（５１０）は最左の節５１７に移動する。波長は音波の周波数によって異なるので、照射周波数に応じた距離を電気泳動で泳動させればよい。
【００６０】
この状態で、照射している超音波の周波数を７５ｋＨｚにする。すると、図５の（Ｃ）のような状態になり、６つの節を有する定常波が形成される。すると、粒子１（５０９）は新たな節５２０に移動し、粒子２（５１０）は節５１９に移動する。
【００６１】
次に、図５の（Ｄ）のように、超音波の照射を停止して電極に電圧を印加する。粒子１（５０９）が数ｍｍ程度だけ泳動すればよく、その後に図５の（Ｅ）のように１００ｋＨｚの超音波を発振して節が８つの定常波を形成させる。節５２０、５１９からわずかだけ泳動された粒子は、粒子１（５０９）が節５２１に進み、粒子２（５１０）が節５１７にもどる。
【００６２】
なお、粒子１の移動量は、前の周波数での節の位置から、次の周波数の腹を超える位置である。図５で具体的に説明すると、移動前の節の位置が左端より、波長20mm(75kHz、1500m/sec)× 3/4 = 15mm になり、次の腹の位置が波長15mm(100kHz、1500m/sec)× 1 = 15mm となる。したがって、移動させたい方向に若干電気泳動すればよい。例えば1mm移動させればよい。
【００６３】
さらに図５のＦのように超音波を停止して電気泳動を行い、粒子を数ｍｍ程度移動させる。その後に図５のＧのように７５ｋＨｚの超音波を発振して節が６つの定常波を形成させる。節５２１、５１７からわずかだけ泳動された粒子は、５０９粒子１が５２２に進み、５１０粒子２が５１９に移動する。さらに、照射している超音波の周波数を１００ｋＨｚにすると、図５のＨのような状態になり、節が８つの定常波が形成される。すると、５０９粒子１は新たな節５２３に移動し、５１０粒子２は節５１７に移動する。同様にして、電気泳動と適切な周波数の超音波の照射を繰り返して粒子を移動させていく。周波数が異なる超音波の照射によって、より高速に粒子を分離することが可能となる。
【００６４】
このように、電気泳動と超音波による粒子捕捉を繰り返すことによって、電気泳動のわずかな泳動差を大きくすることができて、高速で高精度な分離が可能となる。前記例では泳動時間や超音波照射を一定の条件で行っているが、例えば粒子の挙動を観察しながら、印加電圧や印加時間、超音波照射時間、超音波周波数を調整することによってより一層の高速化、高精度化も可能である。
【００６５】
なお、選択する定常波の形状は、つまり、第１の定常波と次に選択する第２の定常波は、両粒子の泳動差を広げれるように適宜選択することができる。
【００６６】
なお、図３から図５では、試料の投入時に全ての粒子が同一の節上に捕捉されているが、本発明はこれに限定されるものではない。特に試料の投入時（最初の電気泳動開始時）に全ての粒子が同一節上になくても、電気泳動と超音波の輻射圧によって分離することができ、本発明の効果を奏することができる。
【実施例】
【００６７】
以下に本発明の粒子分離方法の実施例を示すが、以下の実施例で本発明の内容が限定されるものではない。
【００６８】
（実施例１）
本実施例では、白血球細胞と大腸菌を分離する例を示す。
【００６９】
図１のような装置を準備する。チャンバーの長さは４．５ｃｍとし、両端の超音波発振素子としてピエゾ素子を用いる。また、内部を観察できるように少なくとも壁面の一部透明にしておく。
【００７０】
ＴＡＥバッファに、培養した白血球細胞（Ｋ５６２）と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を懸濁し、試料とする。該試料中の細胞の濃度は、例えばそれぞれ１０＾４／ｍｌ程度とする。あらかじめＴＡＥバッファを充填した装置に上記細胞溶液を流入口から投入して、チャンバー内部のＴＡＥバッファを流出口から排出させる。細胞が投入時にチャンバーの広範囲に拡散しないように流速を制御する。
【００７１】
その後、投入した細胞をそろえるために１００ｋＨｚの超音波を両端の超音波発振素子から位相を揃えて発振する。超音波照射によってチャンバー内には定常波が形成され、その節は７．５ｍｍ間隔で６つ出来る。投入された細胞は流入口付近の端に形成される節に捕捉される。十分に捕捉された段階で超音波照射を停止する。
【００７２】
次に電極間に４５Ｖの電圧を印加する。各細胞は陽極側に泳動される。白血球細胞よりも大腸菌の方が早く泳動され、約１４０秒で大腸菌は約４ｍｍ泳動し、血球細胞は約１．５ｍｍ泳動する。この時点で電圧の印加を停止し、再度１００ｋＨｚの超音波を４０秒程度照射する。定常波の腹の中心は節から３．７５ｍｍの位置であるので、節からそれ以上進んでいる粒子は次の節に移動する。一方で３．７５ｍｍ以上進まなかった粒子は元の節に戻る。よって、白血球細胞は元の節に戻り、大腸菌は第二の節に移動する。
【００７３】
同様に、電圧の印加と超音波照射を４回繰り返す。このようにして、最終的に白血球細胞は負電極側の節の位置に捕集され、大腸菌は一番陽極側の節に捕集される。流出口から溶液を順次回収することによって、大腸菌と白血球を１５分程度で分離することが可能となる。
【００７４】
（実施例２）
次に実施例１と同様の装置を用いて、細菌と真菌の分離を実施する例を示す。細菌として大腸菌と、真菌はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを用いる。それ以外の点は実施例１と同じである。真菌は血球細胞よりも小さく、細菌よりも大きい。電気泳動速度も細菌よりは遅く、血球細胞よりも早い。
【００７５】
実施例１と同様に、ＴＡＥバッファに培養した真菌（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を懸濁する。細胞の濃度は、例えばそれぞれ１０＾４／ｍｌ程度とする。あらかじめＴＡＥバッファを充填した装置に上記細胞溶液を流入口から投入して、チャンバー内部のＴＡＥバッファを流出口から排出させる。細胞がチャンバー中広範囲に拡散しないように流速を制御する。
【００７６】
その後も実施例１と同様に、投入した細胞をそろえるために１００ｋＨｚの超音波を両端の素子から位相を揃えて発振する。超音波照射によってチャンバー内には定常波が形成され、その節は７．５ｍｍ間隔で６つ出来る。投入された細胞は流入口付近の端に形成される節に捕捉される。十分に捕捉された段階で超音波照射を停止する。
【００７７】
次に電極間に４５Ｖの電圧を印加する。各細胞は陽極側に泳動される。真菌よりも大腸菌の方が早く泳動され、約１４０秒で大腸菌は約４ｍｍ泳動し、真菌は約２．５ｍｍ泳動する。この時点で電圧の印加を停止し、再度１００ｋＨｚの超音波を４０秒程度照射する。定常波の腹の中心は節から３．７５ｍｍの位置であるので、節からそれ以上進んでいる粒子は次の節に移動する。一方で３．７５ｍｍ以上進まなかった粒子は元の節に戻る。よって、真菌は元の節に戻り、大腸菌は第二の節に移動する。
【００７８】
同様に、電圧の印加と超音波照射を４回繰り返す。このようにして、最終的に真菌は負電極側の節の位置に捕集され、大腸菌は一番陽極側の節に捕集される。流出口から溶液を順次回収することによって、大腸菌と真菌を１５分程度で分離することが可能となる。
【００７９】
（実施例３）
次に実施例１と同様の装置を用いて、２種類の血球細胞を分離する例を示す。白血球細胞として、Ｋ５６２とＨＬ６０を用いた以外は実施例１と同じである。
【００８０】
実施例１と同様に、ＴＡＥバッファに培養したＫ５６２とＨＬ６０を懸濁する。細胞の濃度は、例えばそれぞれ１０＾４／ｍｌ程度とする。あらかじめＴＡＥバッファを充填した装置に上記細胞溶液を流入口から投入して、チャンバー内部のＴＡＥバッファを流出口から排出させる。細胞がチャンバー中広範囲に拡散しないように流速を制御する。
【００８１】
その後も実施例１と同様に、投入した細胞をそろえるために１００ｋＨｚの超音波を両端の素子から位相を揃えて発振する。超音波照射によってチャンバー内には定常波が形成され、その節は７．５ｍｍ間隔で６つ出来る。投入された細胞は流入口付近の端に形成される節に捕捉される。十分に捕捉された段階で超音波照射を停止する。
【００８２】
次に電極間に４５Ｖの電圧を印加する。各細胞は陽極側に泳動される。約２５０秒泳動することによって、Ｋ５６２は２．５ｍｍ泳動され、ＨＬ６０は３．９ｍｍ泳動される。この時点で電圧の印加を停止し、再度１００ｋＨｚの超音波を４０秒程度照射する。定常波の腹の中心は節から３．７５ｍｍの位置であるので、節からそれ以上進んでいる粒子は次の節に移動する。一方で３．７５ｍｍ以上進まなかった粒子は元の節に戻る。よって、Ｋ５６２は元の節に戻り、ＨＬ６０は第二の節に移動する。
【００８３】
同様に、電圧の印加と超音波照射を４回繰り返す。このようにして、最終的にＫ５６２は負電極側の節の位置に捕集され、ＨＬ６０は一番陽極側の節に捕集される。流出口から溶液を順次回収することによって、Ｋ５６２とＨＬ６０を２５分程度で分離することが可能となる。
【００８４】
このように、本発明の粒子分離方法を用いると、表面電荷に応じて高速に精度良く分離することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の実施に好適な装置例を示す模式図である。
【図２】本発明の実施に好適な装置例の断面図である。
【図３】本発明に係る粒子の分離方法の一例を示す模式図である。
【図４】本発明に係る粒子の分離方法の一例を示す模式図である。
【図５】本発明に係る粒子の分離方法の一例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００８６】
１０１、２０１、３０１、４０１、５０１      チャンバー
１０２                                      外壁
１０３、２０３、３０３、４０３、５０３      超音波発振素子
１０４、２０４、３０４、４０４、５０４      電極１
１０５、２０５、３０５、４０５、５０５      電極２
１０６、２０６、３０６、４０６、５０６      超音波発振素子
１０７、２０７、３０７、４０７              流入口
１０８、２０８、３０８、４０８              流出口
３０９、４０９、５０９                      粒子１
３１０、４１０、５１０                      粒子２
３１１、３１２                              定常波の節
４１３、４１４、４１５、４１６              定常波の節
５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３  定常波の節
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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