(57)【要約】【課題】  遺伝子工学的手法によって生産された不活性なリパーゼ封入体から高い比活性を有する活性リパーゼを調製する方法を提供する。【解決手段】  可溶化された不活性なリパーゼに対し重量比等量以上の分子シャペロンを添加して混合する段階、及び得られた混合物にカルシウムイオンをその終濃度が０．５ｍＭ以上になるように添加して混合する段階を含むことを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶化された不活性なリパーゼから活性なリパーゼを調製する方法であって、可溶化された不活性なリパーゼに対し重量比等量以上の分子シャペロンを添加して混合する段階、及び得られた混合物にカルシウムイオンをその終濃度が０．５ｍＭ以上になるように添加して混合する段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
分子シャペロンの添加量が、可溶化された不活性なリパーゼに対し重量比２倍量以上であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
可溶化された不活性なリパーゼの終濃度が１０〜２５ｍｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
リパーゼがシュードモナス・エルギノーサ由来のリパーゼであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
調製された活性なリパーゼの比活性が野生型リパーゼの比活性の２．５倍以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学的手法によって生産された不活性なリパーゼ封入体から活性なリパーゼを調製する方法に関し、特に、野生型リパーゼの２．５倍以上の比活性を有する高比活性リパーゼを調製することができる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼはトリグリセライドを基質とし、これを脂肪酸とグリセロールに加水分解する酵素であり、臨床検査薬、油脂からの脂肪酸の製造などに工業的に利用されている。低水分条件下においては、リパーゼは、グリセリンと脂肪酸からトリグリセリドを合成する反応を触媒することも知られている。また、リパーゼのかかる機能の応用例として、エステル合成、エステル交換等が挙げられる。
【０００３】
リパーゼは、他の酵素と同様に、微生物を利用した大量生産が図られている。従来、リパーゼを生産する微生物としては、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ゲオトリカム属、ムコール属、リゾプス属、アスペルギルス属、ペニシリウム属等が知られている。更に近年、リパーゼを大量に生産させる目的で、遺伝子工学的手法が応用されるようになり、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ゲオトリカム属等に属する多数の微生物からリパーゼ構造遺伝子が単離されている。しかしながら、単離されたリパーゼ構造遺伝子を利用してリパーゼを生産させる場合、単にリパーゼ構造遺伝子を有するベクターを宿主に導入し、これを培養しても、必ずしも活性なリパーゼを得ることはできない。特にシュードモナス属由来のリパーゼのある種のものは、リパーゼ構造遺伝子の下流に本来存在する分子シャペロン（あるいはフォールダーゼ）構造遺伝子を同時に宿主に導入しないと活性なリパーゼが得られないことが知られている（非特許文献１，２、特許文献１参照）。すなわち、分子シャペロンが存在しないとリパーゼ蛋白質は不活性な封入体として生産される。
【０００４】
また、エステル合成、エステル交換等の反応は有機溶媒中で行うため、有機溶媒耐性の高いリパーゼの効率的生産や酵素の高純度化を図ることを目的として、有機溶媒耐性を有するリパーゼ及びその製法（特許文献２参照）、有機溶媒耐性の高いリパーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡ断片等を含有する形質転換体の培養物から有機溶媒耐性の高いリパーゼ活性を有する蛋白質を製造する方法（特許文献３参照）等の製造法が提案されている。更に、リパーゼ生産能を有し、かつ有機溶媒に耐性を有するシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）から、多種類の有機溶媒存在下において水中の酵素活性よりも高い酵素活性を有する有機溶媒耐性リパーゼが得られている（特許文献４，５参照）。
【０００５】
一方、リパーゼ構造遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させ、得られたリパーゼ蛋白質を不活性な封入体として回収し、尿素等の変性剤で可溶化した後、分子シャペロンを加えて活性化することによりリパーゼ活性を有する蛋白質を生産する方法が知られている（非特許文献３参照）。この方法では、シグナル配列を削除したリパーゼ構造遺伝子を大腸菌のＴ７プロモーター発現系にて封入体として過剰発現させ回収している。そして尿素で可溶化した後、別途シグナル配列を削除した分子シャペロン構造遺伝子を大腸菌にて生産し、これを添加して活性化している。本方法のメリットとして、リパーゼ封入体が水不溶の粒子であるため、高純度蛋白質の回収が活性型酵素の精製よりも極めて容易であり且つ回収された蛋白質が活性型酵素よりも安定であることが挙げられる。
【０００６】
しかしながら、本方法によって得られる活性リパーゼの活性はそれほど高くなく、本方法をリパーゼの工業生産に応用するにはまだ不十分である。
【特許文献１】特開平４−１６９１８４号公報
【特許文献２】特開平６−１４７７３号公報
【特許文献３】特開平７−２３１７８８号公報
【特許文献４】特開平７−２２７２７６号公報
【特許文献５】特開平１０−２３４３６５号公報
【非特許文献１】Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２９６，５０３〜５１３（１９９２）
【非特許文献２】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５２，３４９〜１３３５（１９９１）
【非特許文献３】Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ．，１１，８０９〜８１７（２００７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、遺伝子工学的手法によって生産された不活性なリパーゼ封入体から高い比活性を有する活性リパーゼを調製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するため、非特許文献３に開示されるような、可溶化された不活性なリパーゼに対し分子シャペロンを加えて活性化することによりリパーゼ活性を有する蛋白質を調製する方法の改良を鋭意検討した結果、分子シャペロンの添加後に特定濃度以上のカルシウムイオンをさらに添加することにより、リパーゼ蛋白質の構造を安定化させることができ、得られる活性リパーゼの比活性を著しく高めることができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、可溶化された不活性なリパーゼから活性なリパーゼを調製する方法であって、可溶化された不活性なリパーゼに対し重量比等量以上の分子シャペロンを添加して混合する段階、及び得られた混合物にカルシウムイオンをその終濃度が０．５ｍＭ以上になるように添加して混合する段階を含むことを特徴とする方法が提供される。
本発明の好ましい態様によれば、分子シャペロンの添加量は可溶化された不活性なリパーゼに対し重量比２倍量以上であり、可溶化された不活性なリパーゼの終濃度は１０〜２５ｍｇ／Ｌであり、調製対象のリパーゼはシュードモナス・エルギノーサ由来のリパーゼであり、調製された活性なリパーゼの比活性は野生型リパーゼの比活性の２．５倍以上である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、可溶化された不活性なリパーゼに分子シャペロンを添加した後、さらに特定濃度以上のカルシウムイオンを添加してリパーゼ蛋白質の構造を安定化させているので、高い比活性を有するリパーゼを調製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法による調製対象となるリパーゼは、活性化に分子シャペロンを要求するものであれば特に限定されないが、例えばシュードモナス・エルギノーサに由来するリパーゼを挙げることができる。かかるリパーゼとしては、配列表の配列番号１のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２のＤＮＡ配列によって示される、シュードモナス・エルギノーサＬＳＴ−０３株が分泌する有機溶媒耐性リパーゼ（ＬＳＴ−０３リパーゼ）（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８９，４５１（２０００））を挙げることができる。また、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において一部のアミノ酸が置換、欠失、挿入されたアミノ酸配列を有する蛋白質であって有機溶媒耐性リパーゼ活性を有する蛋白質も、かかるリパーゼに包含される。
【００１２】
本発明の方法で出発材料として使用する可溶化された不活性なリパーゼは、遺伝子工学的手法により生産された不活性なリパーゼ封入体を可溶化することにより得ることができる。すなわち、リパーゼ構造遺伝子をベクタープラスミドにクローニングし、宿主に移入して形質転換体を得、この形質転換体を培養することによりリパーゼ封入体を生産させることができる。リパーゼ構造遺伝子は、生産菌株からりゲノム抽出及びクローニングにより得ることができ、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、リパーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００１３】
具体的には、リパーゼ生産菌株よりリパーゼ構造遺伝子を得る方法としては、例えば、遺伝子配列が未知のリパーゼであれば、リパーゼ生産菌株から染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断し、この切断されたＤＮＡとリニアーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。得られた組換えベクターを、複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、リパーゼ及び分子シャペロンの両方をコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得ることができる。
【００１４】
遺伝子配列が公知となっているリパーゼであれば、リパーゼをコードする遺伝子が増幅されるようなプライマーを作成した上で、ＰＣＲ法を用いて遺伝子を取得し、適当なベクターに連結することで、比較的容易にリパーゼをコードする遺伝子を含有する組み換えベクターを得ることができる。
【００１５】
形質転換を行う宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるものであれば特に制限されず、一般的には、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＨＢ１０１、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α、エシェリヒア・コリーＢＬ２１、エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）などを用いることができる。得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のリパーゼ封入体を安定に生産する。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーを発現する微生物を検索することによって行うことができる。
【００１６】
上記の方法により得られたリパーゼ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読される。また、リパーゼ蛋白質のアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定される。
【００１７】
リパーゼ遺伝子を保有する組換えベクターから、宿主微生物中で複製できる組換えベクターへのリパーゼ遺伝子の移入は、リパーゼ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりリパーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施することができる。また、これらのベクターによる宿主微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いて容易に実施することができる。
【００１８】
形質転換体である宿主微生物の培養は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を適宜選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００１９】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものを使用することができる。炭素源としては、宿主微生物が資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては、宿主微生物が利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００２０】
培養温度は、微生物が成育し、リパーゼ封入体を生産する範囲で適宜変更し得るが、例えば、エシェリヒア・コリーを宿主として利用する場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は、他の条件によって多少異なるが、リパーゼ封入体が最高収量に達する適当な時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは、微生物が発育し、リパーゼ封入体を生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００２１】
培養により得られた不活性なリパーゼ封入体は、常法により回収し、尿素等の変性剤で可溶化して、本発明の方法の出発材料である可溶化された不活性なリパーゼを得る。
【００２２】
本発明の方法で使用される分子シャペロンは、本発明の方法の調製対象となるリパーゼに対応するものであり、その構造遺伝子はリパーゼ構造遺伝子と由来を同じくする。このような分子シャペロンとして、シュードモナス・エルギノーサＬＳＴ−０３株のゲノム中でＬＳＴ−０３リパーゼ遺伝子の下流に存在するリパーゼ特異的分子シャペロン遺伝子により生産される分子シャペロンが挙げられる。ＬＳＴ−０３リパーゼの活性発現には、この分子シャペロンが必要である（非特許文献３参照）。
【００２３】
分子シャペロンの生産も、リパーゼ構造遺伝子と同様に遺伝子工学的手法により行われることができる。
【００２４】
以上のようにして準備された可溶化された不活性なリパーゼ及び分子シャペロンを使用して、本発明の活性リパーゼ調製方法は実施される。本発明の方法においてはまず、可溶化された不活性なリパーゼに対し重量比等量以上、好ましくは２倍量以上、更に好ましくは重量比３倍量以上の分子シャペロンを添加して混合する。分子シャペロンの添加量が上記下限未満である場合、不活性なリパーゼを効率的に活性化することができないおそれがある。分子シャペロンの添加量の上限については、特に限定されないが、過剰な分子シャペロンの添加は蛋白質成分同士の好ましくない相互作用、或いは凝集を生じる恐れがあり、リパーゼのダメージが懸念される。従って、１００倍量以下の添加が好ましい。
【００２５】
次に、得られた混合物にカルシウムイオンをその終濃度が０．５ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上になるように添加して混合する。カルシウムイオンの添加量が上記下限未満である場合、リパーゼの比活性を十分高めることができないおそれがある。カルシウムイオンの終濃度の上限については、特に限定されないが、過剰な濃度のカルシウムイオンが存在すると溶液中の他の成分と反応して不溶性の塩を形成する可能性があり、リパーゼのダメージが懸念される。従って、１Ｍ以下の濃度が好ましい。また、本発明の方法ではカルシウムイオンの添加時期も重要であり、カルシウムイオンを分子シャペロンより前に添加すること、或いは分子シャペロンと同時に添加することによっては、高い比活性のリパーゼを得ることができない。これは、カルシウムイオンの存在下では分子シャペロンによるリパーゼの構造変化が起こりにくく、活性化が十分行われなくなるためであると考えられる。本発明のように分子シャペロンより後に、つまり活性化が十分行われた後にカルシウムイオンを添加することで、高比活性リパーゼを得ることが可能となる。
【００２６】
本発明の方法では、使用するカルシウムイオンは、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウムなどの水溶液として添加することができ、好ましくは塩化カルシウムを含む緩衝液として添加する。
【００２７】
本発明の方法では、可溶化された不活性なリパーゼの終濃度は、１０〜２５ｍｇ／Ｌになるように調整されることが好ましい。可溶化された不活性なリパーゼの終濃度が上記上限を越えると、分子シャペロンが効果的に相互作用できないおそれがある。可溶化された不活性なリパーゼの終濃度が上記下限未満では、単位液量当りの製造コストが膨らみ、製造法として現実的ではなくなるおそれがある。
【００２８】
以上、本発明の方法によれば、可溶化された不活性なリパーゼから活性なリパーゼを調製することができる。この活性なリパーゼは、由来微生物中で本来発現される野生型リパーゼの２．５倍以上、さらには３．３倍以上の高い比活性を有し、エステル合成などの触媒としての工業用途に極めて有用である。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、特許請求の範囲で定義される発明の思想および範囲内に入る他の態様も本発明に含まれる。
【００３０】
本実施例において、調製対象のリパーゼとしてはＬＳＴ−０３リパーゼ（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８９，４５１（２０００））を使用した。すなわち、リパーゼ構造遺伝子として、配列表の配列番号２に示されるＤＮＡ配列を利用した。分子シャペロンとしてはＬＳＴ−０３リパーゼの分子シャペロン（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８９，４５１  （２０００））を使用した。すなわち、ＬＳＴ−０３リパーゼ構造遺伝子の下流に存在する分子シャペロン構造遺伝子として、配列表の配列番号３に示されるＤＮＡ配列を利用した。
【００３１】
本実施例において、リパーゼの活性は、ＢＡＬＢ−ＤＴＮＢ法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８４，１４５９（１９７８））により３０℃で測定した。試薬は和光純薬社から購入したものを使用した。
【００３２】
（１）不活性なリパーゼ封入体の生産
不活性なリパーゼ封入体の生産は、非特許文献３に従って行われた。宿主としては、エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いた。プラスミドとしては、Ｔ７プロモーターの下流にリパーゼのシグナル配列を切除した遺伝子を配したものを用いた。このプラスミドを宿主に移入することにより作成された形質転換体を３７℃で４時間培養した後、終濃度０．２ｍＭのイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に５時間培養した。培養細胞を超音波破砕後、遠心分離し、上清を可溶性画分とし、沈殿を不溶性画分とした。ＬＳＴ−０３リパーゼの不活性な封入体は、不溶性画分に含まれるため、不溶性画分を緩衝溶液で洗浄することにより得ることができた（精製度＞８５％）。
【００３３】
（２）分子シャペロンの調製
分子シャペロンの調製において、宿主としては実施例１と同様にエシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いた。プラスミドとしては、Ｔ７プロモーターの下流に分子シャペロンのアミノ末端の５８アミノ酸を除き、カルボキシル末端にヒスタグを付与した遺伝子を配したものを用いた。このプラスミドを宿主に移入することにより作成された形質転換体を３７℃で４時間培養した後、終濃度０．２ｍＭのＩＰＴＧを添加し、更に５時間培養した。培養細胞を超音波破砕後、遠心分離し、上清をＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製し、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を外液として４℃で透析することにより、分子シャペロンを得た（約１０８０μｇ／ｍｌ）。
【００３４】
（３）不活性なリパーゼ封入体の可溶化（希釈法）
上記（１）で得られた不活性なリパーゼ封入体は、４Ｍの尿素と０．０５ｍＭのジチオスレイトールを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて可溶化した（約５１０μｇ／ｍｌ、４℃、１２００ｒｐｍ、２４時間）後、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２０分の１に希釈した。
（４）不活性なリパーゼ封入体の可溶化（透析法）
上記（１）で得られた不活性なリパーゼ封入体は、４Ｍの尿素と０．０５ｍＭのジチオスレイトールを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて可溶化した（約８１０μｇ／ｍｌ、４℃、１２００ｒｐｍ、２４時間）後、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を外液として４℃で透析した。
【００３５】
（５）（ｉ）分子シャペロンの重量比の影響の検討
上記（３）で得られた２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中の可溶化された不活性なリパーゼ２．５５μｇに、上記（２）で調製された分子シャペロンを、可溶化された不活性なリパーゼに対する重量比を０〜５．１倍量の間で様々に変化させて添加して混合し、全量を４００μｌとし、３０℃で６０分間保温した。
【００３６】
その結果を図１に示す。図１から明らかな通り、可溶化された不活性なリパーゼに対して重量比等量以上の分子シャペロンを混合することにより十分な比活性向上効果が見られ、重量比２倍量以上の分子シャペロンを混合することにより、比活性が最大となった。
【００３７】
（ｉｉ）可溶化された不活性なリパーゼの濃度の影響の検討
上記（４）で得られた２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中の可溶化された不活性なリパーゼ（終濃度１２ｍｇ／Ｌ〜１７０ｍｇ／Ｌ）に、上記（２）で調製された分子シャペロンを、可溶化された不活性なリパーゼに対する重量比が２倍になるよう添加して混合し、３０℃で６０分間保温した。その後、ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（カルシウムイオンとしての終濃度５ｍＭ）を添加して混合し、３０℃で６０分間保温した後、リパーゼ活性を測定した。
【００３８】
その結果を図２に示す。図２から明らかな通り、いずれの可溶化された不活性なリパーゼ濃度でも野生型リパーゼの比活性（約８０Ｕ／ｍｇ）より高いリパーゼ比活性が得られたが、特に、可溶化された不活性なリパーゼの終濃度が１２〜２４ｍｇ／Ｌで、野生型リパーゼの比活性の２．５倍（約２００Ｕ／ｍｇ）以上の比活性を有する高比活性リパーゼを調製することができた。
【００３９】
（ｉｉｉ）カルシウムイオン濃度の影響の検討
上記（３）で得られた２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中の可溶化された不活性なリパーゼ（終濃度１２．３ｍｇ／Ｌ）に、上記（２）で調製された分子シャペロンを、可溶化された不活性なリパーゼに対する重量比が２倍になるよう添加して混合し、３０℃で６０分間保温した。その後、ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（カルシウムイオンとしての終濃度０〜１０ｍＭ）を添加して混合し、３０℃で６０分間保温した後、リパーゼ活性を測定した。
【００４０】
その結果を図３に示す。図３から明らかな通り、終濃度０．５ｍＭ以上のカルシウムイオンを添加することにより、野生型リパーゼの比活性（約８０Ｕ／ｍｇ）の３．３倍（約２６４Ｕ／ｍｇ）以上の比活性を有する高比活性リパーゼを調製することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明のリパーゼ調製方法によれば、野生型リパーゼの２．５倍以上、さらには３．３倍以上の高い比活性を有するリパーゼを調製することができる。従って、本発明のリパーゼ調製方法は、臨床検査薬、油脂からの脂肪酸の製造、各種エステル合成、エステル交換等において工業的に有用なリパーゼ酵素を調製するのに広く応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】分子シャペロンの重量比の影響を示す。
【図２】可溶化された不活性なリパーゼの濃度の影響を示す。
【図３】カルシウムイオン濃度の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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