(57)【要約】【課題】簡易な構成で、誘電泳動特性の異なる複数種類の細胞を効率的に分離する。【解決手段】誘電泳動特性の異なる複数種の細胞Ａ，Ｂを含む細胞浮遊液を流動させる流路２と、該流路２の流動方向Ｌに交差する方向に対向して配置される電極３ａ，３ｂと、該電極３ａ，３ｂ間に形成される電界強度に勾配を生じさせる電界勾配形成手段４と、電極３ａ，３ｂ間に直流成分を有する交流電圧を加える電源５とを備える細胞分離装置１を提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電泳動特性の異なる複数種の細胞を含む細胞浮遊液を流動させる流路と、
該流路の流動方向に交差する方向に対向して配置される電極と、
該電極間に形成される電界強度に勾配を生じさせる電界勾配形成手段と、
前記電極間に直流成分を有する交流電圧を加える電源とを備える細胞分離装置。
【請求項２】
前記電界勾配形成手段が、前記電極間に配置された一以上の開口部を有する絶縁部材である請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項３】
前記電極が、ほぼ一様な電界強度を有する電界を形成する平行平板電極である請求項２に記載の細胞分離装置。
【請求項４】
前記電界勾配形成手段が、一方の電極を他方の電極に対して小さく形成することにより構成されている請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項５】
誘電泳動特性の異なる複数種の細胞を含む細胞浮遊液を流動させ、
該流路の流動方向に交差する方向に対向して配置された電極間に、電界強度に勾配を有する電界を形成するとともに、前記電極間に直流成分を有する交流電圧を加える細胞分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離装置および細胞分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、電気泳動特性の差を利用して粒子を分離する技術が知られている（例えば、特許文献１〜４参照。）。
特許文献１に開示された技術は、平板電極からなる複数のトラップを流路中に配置して、ある細菌を特異的に吸着する抗体を被覆したビーズを電極に捕集させておき、そこに分析したい汚水を流通させて、誘電泳動特性により電極に近接する細菌をビーズに捕集させるものである。
【０００３】
特許文献２に開示された技術は、波状の電極を複数並べた流路を形成し、その電極の配列方向に複数種の粒子を流動させることにより、誘電泳動特性の差を利用して、粒子を分離するものである。
特許文献３に開示された技術は、超音波により粒子を移動させた後に、電界を加えて誘電泳動により分離するものである。
特許文献４に開示された技術は、２種類以上の周波数の電界を加えることで、粒子に複数の誘電泳動力が作用するようにして粒子を分離するものである。
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９７／０３４６８９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／００５５１２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／００５５１３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／００５５１４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１の技術は、流路の下流に分析用のチャンバを用意しておき、予め、細菌を捕集していない誘電泳動特性を測定しておき、ある細菌が捕集されたビーズを電極から遊離させ、分析用チャンバまで流し込み、測定および捕集していないビーズとの特性の差を見ることで、細菌を定量するものであり、工程が複雑であるという不都合がある。
【０００６】
また、特許文献２の技術は、電極の配列方向に流動する粒子を分離するために、波形の電極形状を採用する必要があり、装置が複雑で高価になるとともに、効率的に分離することができないという不都合がある。
【０００７】
また、特許文献３の技術は、超音波のような余分のエネルギを必要とするという不都合がある。
さらに、特許文献４の技術は、２種類の周波数の電界を加える点において、複雑であるという問題がある。
【０００８】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な構成で、誘電泳動特性の異なる複数種類の細胞を効率的に分離することができる細胞分離装置および細胞分離方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、誘電泳動特性の異なる複数種の細胞を含む細胞浮遊液を流動させる流路と、該流路の流動方向に交差する方向に対向して配置される電極と、該電極間に形成される電界強度に勾配を生じさせる電界勾配形成手段と、前記電極間に直流成分を有する交流電圧を加える電源とを備える細胞分離装置を提供する。
【００１０】
本発明によれば、電源の作動により電極間に直流成分を有する交流電圧をかけると、電界勾配形成手段の作動により電極間に電界強度に勾配のある電界が形成されるとともに、交流電圧に含まれる直流成分によって、一方の電極側に電荷が偏ることになる。すなわち、細胞浮遊液内に含まれる複数種の細胞は全て、電荷の偏りによる電気泳動力を受ける。一方、細胞浮遊液内に含まれる負の誘電泳動特性を有する細胞は電界強度が弱まる方向に誘電泳動力を受け、正の誘電泳動特性を有する細胞は電界強度が強まる方向に誘電泳動力を受ける。また、誘電泳動特性を有しない細胞、例えば、死細胞には誘電泳動力は作用せず、電気泳動力のみが作用する。
【００１１】
したがって、誘電泳動特性の異なる細胞に対して、異なる方向の誘電泳動力および電気泳動力を作用させることができ、そのバランスを図ることによって、誘電泳動特性の異なる細胞を効果的に分離することができる。
すなわち、例えば、負の誘電泳動力の作用する方向と、電気泳動力の作用する方向とを逆方向に設定しておくと、負の誘電泳動特性を有する細胞に対しては、誘電泳動力と電気泳動力とを相殺させた比較的弱い力を作用させることができる一方、誘電泳動特性を有しない細胞に対しては、電気泳動力のみからなる比較的大きな力を作用させることができる。したがって、誘電泳動特性を有しない細胞を電気泳動力により吸着し、負の誘電泳動特性を有する細胞を流動方向に流動させて分離することができる。
【００１２】
上記発明においては、前記電界勾配形成手段が、前記電極間に配置された一以上の開口部を有する絶縁部材であることとしてもよい。
このようにすることで、絶縁部材によって電極間に形成される電気力線を開口部のみに通過させるように絞ることができ、電界強度に勾配を有する電界を電極間に簡易に形成することができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記電極が、ほぼ一様な電界強度を有する電界を形成する平行平板電極であることとしてもよい。
このようにすることで、簡易な構成の電極と絶縁板との組み合わせにより、電界強度に勾配を有する電界を電極間に、さらに簡易に形成することができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記電界勾配形成手段が、一方の電極を他方の電極に対して小さく形成することにより構成されていることとしてもよい。
このようにすることで、小さい電極から大きい電極に向かう電気力線に粗密を設けることで、電界強度に勾配を有する電界を簡易に形成することができる。
【００１５】
また、本発明は、誘電泳動特性の異なる複数種の細胞を含む細胞浮遊液を流動させ、該流路の流動方向に交差する方向に対向して配置された電極間に、電界強度に勾配を有する電界を形成するとともに、前記電極間に直流成分を有する交流電圧を加える細胞分離方法を提供する。
本発明によれば、電極間に直流成分を有する交流電圧をかけると、電極間に電界強度に勾配のある電界が形成されるとともに、交流電圧に含まれる直流成分によって、一方の電極側に電荷が偏ることになる。すなわち、細胞浮遊液内に含まれる複数種の細胞は全て、電荷の偏りによる電気泳動力を受ける。一方、細胞浮遊液内に含まれる負の誘電泳動特性を有する細胞は電界強度が弱まる方向に誘電泳動力を受け、正の誘電泳動特性を有する細胞は電界強度が強まる方向に誘電泳動力を受ける。また、誘電泳動特性を有しない細胞、例えば、死細胞には誘電泳動力は作用せず、電気泳動力のみが作用する。
【００１６】
したがって、誘電泳動特性の異なる細胞に対して、異なる方向の誘電泳動力および電気泳動力を作用させることができ、そのバランスを図ることによって、誘電泳動特性の異なる細胞を効果的に分離することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、簡易な構成で、誘電泳動特性の異なる複数種類の細胞を効率的に分離することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の一実施形態に係る細胞分離装置１について、図１〜図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１は、図１および図４に示されるように、複数種の細胞Ａ，Ｂ、例えば、生細胞Ａの中に死細胞Ｂが混在した細胞浮遊液を一方向に流動させる流路２と、流路２に配置された電極３ａ，３ｂと、電極３ａ，３ｂ間に配置された絶縁板４と、電極３ａ，３ｂに電圧を加える電源５とを備えている。
【００１９】
流路２は絶縁板４によって、流動方向に沿って延びる第１の流路２ａと第２の流路２ｂとに区画されている。
電極３ａ，３ｂは、例えば、平行平板電極であって、流路の対向する壁面に、流動方向Ｌに直交する方向に対向して配置されている。
【００２０】
また、絶縁板４は、前記電極３ａ，３ｂの間隔方向の中央位置に配置される平板状に形成され、１つ以上の貫通孔４ａを有している。
したがって、第１の流路２ａと第２の流路２ｂとは、絶縁板４の貫通孔４ａによって相互に連絡している。
【００２１】
これにより、電源５を作動させることによって電極３ａ，３ｂの一側から他側に向かって発生する電気力線Ｃは、絶縁板４により遮られるので、図３に示されるように、絶縁板４に形成された貫通孔４ａのみを通過するようになる。すなわち、電気力線Ｃは、貫通孔４ａにおいて束ねられてその密度が高くなるので、電極３ａ，３ｂ間に形成される電界は、貫通孔４ａにおいて電界強度が最も高くなり、両側の電極３ａ，３ｂに向かうに従って弱くなるような勾配を形成するようになっている。
前記電源５は、図２に示されるように、一方向（例えば、＋方向）にオフセットした直流成分を有する正弦波からなる交流電圧を電極３ａ，３ｂ間に加えるようになっている。
【００２２】
このように構成された本実施形態に係る細胞分離装置１を用いた細胞分離方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１を用いて誘電泳動特性の異なる複数種の細胞Ａ，Ｂを分離するには、電源５を作動させて電極３ａ，３ｂ間に交流電圧を加え、図３に示されるような電気力線Ｃを電極３ａ，３ｂ間に形成する。
【００２３】
この状態で、誘電泳動特性の異なる複数種の細胞Ａ，Ｂを含む細胞懸濁液を第１の流路２ａ内に流動させる。ここでは、例えば、−側電極３ａと絶縁板４との間の第１の流路２ａに細胞懸濁液を流動させ、＋側電極３ｂと絶縁板４との間の第２の流路２ｂには、細胞Ａ，Ｂを含まない媒体を流動させる。細胞懸濁液および媒体の流速は十分に低く設定しておく。
【００２４】
負の誘電泳動特性を有する細胞Ａが電極３ａ，３ｂ間にさしかかると、当該細胞Ａには、図３に示されるように、電極３ａ，３ｂ間に形成されている電界強度に勾配のある電界によって、電界強度が低くなる方向に向かう誘電泳動力ｆ１を受ける。また、電源５から供給される交流電圧には直流成分が含まれているので、細胞Ａ，Ｂは、その有する電荷に応じて、例えば、図３に示されるように、誘電泳動力ｆ１とは逆方向に電気泳動力ｆ２を受ける。したがって、細胞Ａに作用する誘電泳動力ｆ１と電気泳動力ｆ２とがバランスしていれば、負の誘電泳動特性を有する細胞Ａは、電極３ａ，３ｂによって吸引されることなく、第１の流路２ａ内の細胞懸濁液の流れに従ってそのまま流動させられることになる。
【００２５】
一方、誘電泳動特性を有しない細胞Ｂに対しては、誘電泳動力ｆ１が発生しないので、電気泳動力ｆ２のみが作用する。その結果、当該細胞Ｂは電気泳動力ｆ２によって、＋側の電極３ｂに吸引され、絶縁板４の貫通孔４ａを通過して第２の流路２ｂ内に流れ込むことになる。
【００２６】
すなわち、電源５を操作して、電極３ａ，３ｂに加える交流電圧の振幅または周波数を調節することにより、誘電泳動特性を有する細胞Ａに作用する誘電泳動力ｆ１を調節し、交流電圧に含める直流成分の絶対値を調節することにより、細胞Ａ，Ｂに作用する電気泳動力ｆ２を調節する。これにより、誘電泳動特性の異なる細胞Ａ，Ｂに作用する力ｆ１，ｆ２の総和を変化させ、図４に示されるように、第１の流路２ａ内をそのまま流動する細胞Ａと、電極３ａ，３ｂに吸引されて第２の流路２ｂに流入する細胞Ｂとを構成し、両者を効率的に分離することができる。
【００２７】
このように、本実施形態に係る細胞分離装置１および細胞分離方法によれば、細胞懸濁液を流動させる流路２に、平行平板からなる電極３ａ，３ｂと、絶縁板４を配置するだけの簡易な構成によって、誘電泳動特性の異なる複数種の細胞Ａ，Ｂを効率的に分離することができるという利点がある。
【００２８】
なお、本実施形態においては、電極３ａ，３ｂ間に配置した絶縁板４に１以上の貫通孔４ａを設けることとしたが、その数は制限されるものではない。また、貫通孔４ａの形状、配列や間隔についても、十分な電界強度の勾配を形成し得るものであれば任意でよい。
【００２９】
また、平行平板からなる電極３ａ，３ｂの間隔方向の中央位置に絶縁板４を配置することとしたが、これに代えて、図５に示されるように、平行平板からなる電極３ａ，３ｂの一方の電極３ａ表面に絶縁板４を密着させて配置してもよい。この場合には、絶縁板４により被覆された電極３ａにおいては、貫通孔４ａから露出する部分のみから電気力線Ｃが形成され、他方の電極３ｂに向かって、電界強度が漸次低下していくような電界が形成される。これにより、上記と同様にして、流路２における流動方向Ｌに交差する方向に、誘電泳動特性の異なる細胞Ａ，Ｂを分離することが可能となる。
【００３０】
ここで、図５の細胞分離装置１を用いた実験例について、図６を参照して説明する。
電極３ａ，３ｂとして、厚さ１ｍｍのチタン製の一対の平板状の電極３ａ，３ｂを用いた。電極３ａ，３ｂ間の間隔は約１ｍｍとした。また、絶縁板４として、厚さ５０μｍのカプトン膜を用いた。また、絶縁板４に形成された貫通孔４ａとしては約１００μｍの孔を採用した。
【００３１】
また、誘電泳動特性を有する細胞Ａ，Ｂの代わりに、径寸法約１０μｍのポリスチレンビーズからなる粒子Ｄを使用した。
交流電圧としては、振幅１Ｖ，１．２Ｖ，１．５Ｖ、直流成分０〜３Ｖ、周波数１０ｋＨｚ，１００ｋＨｚ，５００ｋＨｚ、１ＭＨｚ．５ＭＨｚ．１０ＭＨｚの正弦波状に変化する電圧を用いた。
【００３２】
その結果を図６に示す。
図６は、絶縁板４の貫通孔４ａに対応する位置において、絶縁板４から一定の距離に配される位置に粒子Ｄを静止させるための、交流電圧の振幅、直流成分および周波数の関係を示している。すなわち、交流電圧の振幅を１Ｖ，１．２Ｖ，１．５Ｖに設定し、それぞれ周波数を順次変化させたときに、粒子Ｄがいずれの電極３ａ，３ｂにも吸着されないための直流成分の値をプロットしている。
【００３３】
いずれの振幅の場合においても、周波数１ＭＨｚ付近において、必要な直流成分の値が極大値となり、大きな電気泳動力ｆ２が粒子Ｄに作用していることがわかる。したがって、周波数１ＭＨｚ付近において、大きな電気泳動力ｆ２に対抗する大きな誘電泳動力ｆ１が作用していることがわかる。
【００３４】
その結果、交流電圧の振幅と、直流成分とを調節することにより、電気泳動力ｆ２によって粒子Ｄを電極３ａの方向に泳動させ、誘電泳動力Ｆ１が作用する粒子Ｄはそのまま流動させ、あるいは反対方向に泳動させることにより、分離することができる。
【００３５】
また、上記実施形態においては、電極３ａの表面に絶縁板４を被覆することにより、貫通孔４ａから露出する部分のみを電極３ａとして構成することとしたが、もともと貫通孔４ａの面積と同様に狭い面積を有する電極（図示略）を採用することにしてもよい。
【００３６】
ここで、図１の細胞分離装置１を用いた別の実験例について、図７および図８を参照して説明する。
装置条件としては、電極３ａ，３ｂ間の間隔は約１.２ｍｍとし、厚さ０．２ｍｍの絶縁板４を用いた。流路２の幅は０．５ｍｍ（流路２ａおよび流路２ｂの幅をそれぞれ０．５ｍｍ）とし、絶縁板４に形成された貫通孔４ａとしては約０．２ｍｍの孔を採用した。
【００３７】
生細胞および死細胞は培養２日目の３−２Ｈ３細胞を用い、周囲溶媒は８．５ｗｔ％スクロースと０．３ｗｔ％グルコース水溶液の混合溶液とした。
図７は、交流電圧の振幅８０Ｖとし、周波数を１ｋＨｚ，５ｋＨｚ，１０ｋＨｚに変化させた場合の生細胞保持境界の周波数特性を示す。図７に示されるように、周波数が５ｋＨｚでオフセット電圧が最も高く出力されるとともに、保持領域が広範囲になることがわかる。
【００３８】
図８は、周波数を５ｋＨｚとし、交流電圧の振幅を６０Ｖ，８０Ｖ，１００Ｖ，１２０Ｖと変化させた場合の生細胞および死細胞の保持境界および保持領域を示す。図８に示される分離可能領域の範囲となるように細胞分離装置１の条件設定を行うことにより、死細胞が透過し生細胞を保持することができるため、生細胞と死細胞とを分離することができる。
【００３９】
ここで、図９の細胞分離装置１１１を用いたさらに別の実験例について、図９から図１１を参照して説明する。
装置条件としては、幅１２ｍｍ、長さ９０ｍｍ、高さ３０ｍｍの細胞分離装置１１１について、電極３ａ，３ｂ間の間隔は約１.２ｍｍとし、厚さ０．２ｍｍの絶縁板４を用いた。孔数は約１０００個とし、絶縁板４に形成された貫通孔４ａとしては約０．２ｍｍの孔を採用した。孔間距離は図１０に示されるような配列で０．３ｍｍおよび０．６ｍｍとした。
【００４０】
図９に示されるように、細胞懸濁液はポンプＰを介して細胞分離装置１１１に導入され、周囲溶媒とともに流動方向Ｌに沿って移動する。任意波形ジェネレータＧの作動により交流電圧をかけると、絶縁板４の作動により電極３ａ，３ｂ間に電界強度に勾配のある電界が形成されるとともに、交流電圧に含まれる直流成分によって、一方の電極側に電荷が偏ることになる。例えば、生細胞はこの電荷の偏りによって電界強度が弱まる方向に誘電泳動力を受け、誘電泳動特性を有しない死細胞には誘電泳動力は作用せずに電気泳動力のみが作用することにより、生細胞を保持側、死細胞を透過側に分離することができる。あるいは、生細胞はこの電荷の偏りによって電界強度が強まる方向に誘電泳動力を受けるよう電界を形成させると、誘電泳動特性を有しない死細胞には誘電泳動力は作用せずに電気泳動力のみが作用することにより、生細胞を透過側、死細胞を保持側に分離することもできる。
【００４１】
図１１は、周波数を５ｋＨｚ、交流電圧の振幅を１００Ｖとし、オフセット電圧を０から１．０Ｖ出力させて生細胞・死細胞の混合分離を行った場合の生細胞および死細胞の保持率を示す。
流量はそれぞれ細胞懸濁液流量０．３ｍｌ／ｍｉｎ、周囲溶媒流量０．３ｍｌ／ｍｉｎ、保持液流量０．２ｍｌ／ｍｉｎ、透過液流量０．４ｍｌ／ｍｉｎに設定した。
【００４２】
生細胞および死細胞は培養２日目の３−２Ｈ３細胞をそれぞれ５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌずつ用い、周囲溶媒は８．５ｗｔ％スクロースと０．３ｗｔ％グルコース水溶液の混合溶液とした。
図１１に示されるように、細胞分離装置１１１によれば、オフセット電圧が出力されることにより、死細胞は保持率が低下して透過され、高い保持率を維持たままの生細胞と保持率が低下した死細胞とを分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞分離装置を示す模式的な全体構成図である。
【図２】図１の細胞分離装置の電源により発生する交流電圧波形を示す図である。
【図３】図１の細胞分離装置の電極間に形成される電気力線と細胞に作用する力を示す図であり，（ａ）分離前の状態、（ｂ）分離後の状態をそれぞれ示している。
【図４】図１の細胞分離装置により異なる誘電特性を有する細胞の分離動作を説明する図である。
【図５】図１の細胞分離装置の変形例を示す部分的な拡大縦断面図である。
【図６】図５の細胞分離装置を用いて発生した交流電圧の周波数変化を示すグラフである。
【図７】細胞保持境界の周波数特性を示すグラフである。
【図８】生細胞および死細胞の保持境界および保持領域を示すグラフである。
【図９】本発明の一実施形態に係る細胞分離装置を示す模式的な全体構成図である。
【図１０】本発明の一実施形態に係る細胞分離装置の多細孔絶縁板の概略を示す図である。
【図１１】生細胞および死細胞の保持率を示す図である。
【符号の説明】
【００４４】
Ａ，Ｂ  細胞
Ｃ  電気力線
Ｄ  粒子
Ｇ  任意波形ジェネレータ
Ｌ  流動方向
Ｐ  ポンプ
１  細胞分離装置
２  流路
２ａ  第１の流路（流路）
２ｂ  第２の流路（流路）
３ａ，３ｂ  電極
４  絶縁板（絶縁部材：電界勾配形成手段）
４ａ  貫通孔（開口部）
５  電源
１１１  細胞分離装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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