(57)【要約】【課題】本発明の目的は、ヘテロジニアスな検出法において、夾雑物やリガンド分子等の固相への非特異的吸着を最小限抑制し、簡便で、且つＳ／Ｎ比の高い検出方法を提供するものである。【解決手段】本発明は、第１のリガンド分子、標的物質及び第２のリガンド分子を含む複合体を形成させた後、Ｂ／Ｆ分離を行う。そして、光照射により第２のリガンド分子中の光照射結合部位を活性化させ、複合体を基体上に形成した非特異吸着防止膜に固定化する。【選択図】図１
2009288069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を用いて標的物質の有無又は量を検出する方法であって、
（ａ）非特異吸着防止膜を有する基体と、前記標的物質を特異的に捕捉する第１のリガンド分子を有する粒子と、前記標的物質を特異的に捕捉する部位及び光照射により前記非特異吸着防止膜に結合する光照射結合部位を有する第２のリガンド分子と、を用意する工程と、
（ｂ）反応媒体中で前記第１のリガンド分子及び前記第２のリガンド分子を前記標的物質に結合させ、前記第１のリガンド分子を有する粒子と前記標的物質と前記第２のリガンド分子とを含んで構成される複合体を形成する工程と、
（ｃ）前記複合体をＢ／Ｆ分離によって分離する工程と、
（ｄ）光照射により、前記複合体に含まれる第２のリガンド分子中の光照射結合部位を前記非特異吸着防止膜に結合させる工程と、
（ｅ）前記非特異吸着防止膜に固定された粒子の有無又は量を検出する工程と、
を有することを特徴とする標的物質の有無又は量の検出方法。
【請求項２】
前記非特異吸着防止膜は、少なくとも前記粒子の非特異吸着を抑制する材料からなることを特徴とする請求項１に記載の標的物質の有無又は量の検出方法。
【請求項３】
前記非特異吸着防止膜は、親水性及び極性の高い化合物からなることを特徴とする請求項２に記載の標的物質の有無又は量の検出方法。
【請求項４】
前記非特異吸着防止膜は、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ヘパリン、リン脂質、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、又はデキストランを含んで構成されることを特徴とする請求項３に記載の標的物質の有無又は量の検出方法。
【請求項５】
前記光照射結合部位は、光親和性化合物を有して構成されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の標的物質の有無又は量の検出方法。
【請求項６】
前記光親和性化合物はジアジリン誘導体であることを特徴とする請求項５に記載の標的物質の有無又は量の検出方法。
【請求項７】
前記粒子は、磁性粒子であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の標的物質の有無又は量の検出方法。
【請求項８】
磁力を利用して前記工程（ｃ）を行うことを特徴とする請求項７に記載の標的物質の有無又は量の検出方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）から（ｅ）を同一の容器内でこの順序に従って行うことを特徴とする請求項８に記載の標的物質の有無又は量の検出方法。
【請求項１０】
粒子を用いて標的物質の有無又は量を検出するための検出用キットであって、
前記非特異吸着防止膜を有する基体と、
前記標的物質を特異的に捕捉する第１のリガンド分子を有する粒子と、
前記標的物質を特異的に捕捉する部位及び光照射により前記非特異吸着防止膜に結合する光照射結合部位を有する第２のリガンド分子と、
を有することを特徴とする検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質などの標的物質を検出する方法、及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野において、血液などの検体中から疾病に関連する標的物質を検出する方法は、癌、感染症、生活習慣病などの診断方法として広く用いられている。昨今の臨床検査では、これら疾病の早期発見のために、検体中の極微量の標的物質を正確に、かつ短時間で定量する方法が求められている。検体中の極微量の標的物質を検出するためには、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比の高い検出法が必要であり、これまで、免疫測定法に基づいたヘテロジニアスな検出法が用いられてきた。この検出法は、まず、固相上で標的物質に対して特異的に補足可能な第１のリガンド分子と、標的物質と、標的物質に対して特異的に補足可能で且つ標識物質を有する第２のリガンド分子とをサンドイッチ反応させる。次に、Ｂ／Ｆ分離後、固相上に固定化された標識物質の有無及び量を測定することで標的物質を検出するものである。
【０００３】
一方で、検体中の極微量の標的物質を検出するためには、測定時におけるノイズを低減することも重要となる。ノイズを低減するためには、固相に非特異的に吸着する夾雑物や第２のリガンド分子を除去することが必要であり、一般的に固相表面を非特異的吸着防止剤でブロックする方法が用いられる。特開平０１―２０９３７０号公報（特許文献１）では、標的物質に対して液相中でサンドイッチ反応させた後、予め親水性タンパク質でブロッキングした固相上でビオチン−アビジン結合を介して標的物質を固定化し、競合反応により標的物質を検出する方法が開示されている。この検出方法では、固相表面をブロッキングすることで、固相に対する夾雑物やリガンド分子の非特異的吸着を抑制できる。
【特許文献１】特開平０１―２０９３７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に示すような固相表面のブロッキング法では、固相表面に対する夾雑物、及び第２のリガンド分子の非特異的吸着を抑制することは可能である。しかし、固相上に存在する第１のリガンド分子への夾雑物、及び第２のリガンド分子の非特異的吸着は抑制できない。特に、第１のリガンド分子と第２のリガンド分子との交差反応による非特異的吸着は防止することが難しく、大きなノイズの原因となる。例えば、特許文献１では、固相上に固定されたアビジン（第１のリガンド分子）と抗体（第２のリガンド分子）との交差反応が生じ、ノイズの原因となってしまうことが知られている。
【０００５】
これに対して、リガンド分子同士の交差反応を防止する方法は、これまで報告されているが、防止能・簡便性・コストパフォーマンスの点で課題の残るものが多い。例えば、Ｌｕらのグループ（非特許文献１）は、リガンド分子同士の交差反応を抑制するため、予めパパイン、ペプシンで処理した抗体を調製し、この抗体を固定した固相上で標的物質を検出する方法が報告されている。この方法では、第１のリガンド分子である抗体のＦｃ部分を除去することで、第１の抗体と第２の抗体の交差反応は抑制される。しかし、上記に示す抗体調製法においては、煩雑な操作を必要とする。また、検体中に含まれる夾雑物の非特異吸着物を完全に除去することも不可能である。
【０００６】
そこで、本明細書は、ヘテロジニアスな検出法において、固相上での夾雑物および第２のリガンド分子の非特異的吸着を抑制し、簡便で且つＳ／Ｎ比の高い検出方法を提供することを目的とするものである。
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ６７巻，  ８３項，  １９９５年。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る標的物質の有無又は量の検出方法は、
粒子を用いて標的物質の有無又は量を検出する方法であって、
（ａ）非特異吸着防止膜を有する基体と、前記標的物質を特異的に捕捉する第１のリガンド分子を有する粒子と、前記標的物質を特異的に捕捉する部位及び光照射により前記非特異吸着防止膜に結合する光照射結合部位を有する第２のリガンド分子と、を用意する工程と、
（ｂ）反応媒体中で前記第１のリガンド分子及び前記第２のリガンド分子を前記標的物質に結合させ、前記第１のリガンド分子を有する粒子と前記標的物質と前記第２のリガンド分子とを含んで構成される複合体を形成する工程と、
（ｃ）前記複合体をＢ／Ｆ分離によって分離する工程と、
（ｄ）光照射により、前記複合体に含まれる第２のリガンド分子中の光照射結合部位を前記非特異吸着防止膜に結合させる工程と、
（ｅ）前記非特異吸着防止膜に固定された粒子の有無又は量を検出する工程と、
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、リガンド分子や夾雑物等の固相への非特異的吸着を抑制することができ、従来技術に比べ更なるノイズの低減が可能となる。また、本発明は、光反応を介して標的物質を含む複合体を固相上に効率的且つ選択的に固定可能であり、Ｓ／Ｎ比の高い検出を達成可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１０】
本発明は、粒子を用いて標的物質の有無又は量を検出する方法であって、
（ａ）非特異吸着防止膜を有する基体と、前記標的物質を特異的に捕捉する第１のリガンド分子を有する粒子と、前記標的物質を特異的に捕捉する部位及び光照射により前記非特異吸着防止膜に結合する光照射結合部位を有する第２のリガンド分子と、を用意する工程と、
（ｂ）反応媒体中で前記第１のリガンド分子及び前記第２のリガンド分子を前記標的物質に結合させ、前記第１のリガンド分子を有する粒子と前記標的物質と前記第２のリガンド分子とを含んで構成される複合体を形成する工程と、
（ｃ）前記複合体をＢ／Ｆ分離によって分離する工程と、
（ｄ）光照射により、前記複合体に含まれる第２のリガンド分子中の光照射結合部位を前記非特異吸着防止膜に結合させる工程と、
（ｅ）前記非特異吸着防止膜に固定された粒子の有無又は量を検出する工程と、
を有することを特徴とする。
【００１１】
本発明では、液相中で、第１のリガンド分子を有する粒子と、標的物質と、光照射結合部位を有する第２のリガンド分子とを含む複合体を形成した後、Ｂ／Ｆ分離を行い、複合体を形成しなかったリガンド分子や夾雑物を除去する。そして、Ｂ／Ｆ分離を行った後、複合体に光を照射し、第２のリガンド分子中にある光照射結合部位を活性化し、非特異吸着防止膜に結合を形成させることにより、複合体を固定化する。本発明によれば、複合体の形成後のＢ／Ｆ分離及び非特異吸着防止膜の利用により、リガンド分子や夾雑物等の固相への非特異吸着を大幅に低減することができる。また、複合体を液液反応で形成するため、反応時間を短縮することができるという利点もある。
【００１２】
さらに、本発明では、好ましい形態として、複合体の形成、Ｂ／Ｆ分離、複合体の固定化、及び粒子の検出までを同一固相上で行うこともできる。つまり、本発明において、基体は非特異吸着防止膜で覆われているため、複合体を固相上で形成しても、リガンド分子や夾雑物等の非特異吸着は抑制される。そして、適当な方法でＢ／Ｆ分離を行うことにより、リガンド分子や夾雑物等を除去した後、複合体を光照射により選択的に非特異吸着防止膜に固定することができる。
【００１３】
また、詳細は後述するが、本発明においては、磁性粒子を用いることにより、Ｂ／Ｆ分離、複合体の固定化、及び粒子の検出までを同一固相上で、容易かつ精度良く行うことができる。
【００１４】
図１を用いて、本発明に係る標的物質の検出方法の概要について説明する。本発明においは、まず、第１のリガンド分子１０２を有する粒子１０１と、光照射結合部位を有する第２のリガンド分子１０３と、標的物質１０９とを混合し、複合体１０７を形成する。その後、Ｂ／Ｆ分離を行い、複合体を形成しなかったリガンド分子や夾雑物等を除去する。そして、複合体に光を照射し、第２のリガンド分子中にある光照射結合部位を活性化し、非特異吸着防止膜１０５に結合を形成させることにより、複合体１０７を固定化する。そして、第１のリガンド分子１０２を有する粒子１０１などを除去するため、洗浄を行うことが好ましい。本発明では、複合体を形成する工程やＢ／Ｆ分離を行う工程、複合体を固相に固定化する工程は、特に同一固相上で行うものに限定されない。例えば、複合体の形成やＢ／Ｆ分離を別の容器内で行った後、複合体を非特異吸着防止膜１０５を有する基体１０６上に配置し、光照射により固定化することもできる。
【００１５】
以下、各構成について詳細に説明する。
【００１６】
＜標的物質＞
本発明における標的物質とは、存在あるいは量を測定する対象となる物質を言い、特に限定されるものではないが、例えば生体物質が挙げられる。生体物質としては、例えば核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体から選択される物質等が含まれる。生体物質として、具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプタ、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖又はスフィンゴ脂質等が挙げられる。また、これらの物質を産生する細菌や細胞そのものも生体物質に含まれる。
【００１７】
例えば、標的物質がある特定の核酸（標的核酸）である場合、標的核酸の由来元としては、例えば、人工合成産物、ヒトやマウスなどの動物、植物、細菌、真菌、古細菌、ウイルスなどの微生物等を挙げることができる。
【００１８】
また、標的物質は、上述のように生体物質に限られることなく、非生体物質も含まれる。抗原は、上記抗体を誘発させる物質であり、例えば非生体物質と生体物質に分けることができる。非生体物質の抗原として産業上利用価値の大きいものは、例えば、環境汚染物質としての塩素置換数／位置の異なるＰＣＢ類、同じく塩素置換数／位置の異なるダイオキシン類、いわゆる環境ホルモンと呼ばれる内分泌撹乱物質等が挙げられる。また、生体物質の抗原としては、上記の核酸、タンパク質、糖鎖、脂質およびそれらの複合体から選択される生体物質が少なくとも含まれる。さらに詳しくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプター、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖及びスフィンゴ糖脂質等のいずれかから選択された物質が含まれる。
【００１９】
標的物質は、例えば試料の中に含まれている。試料としては、例えば、医療診断、環境測定又は食品管理を含む分野等における、分析が所望される標的物質を含む試料溶液が挙げられる。医療診断用の試料溶液の例としては、血液、リンパ液、ＤＮＡ抽出液又は組織液を包含する体液が挙げられる。環境測定用の試料溶液の例としては、土壌、河川、大気などから採取した材料を含む溶液が挙げられる。食品管理用の試料溶液の例としては、ひき肉からの抽出液やまな板表面からの抽出液等が挙げられる。また、試料の調製に用いる溶媒は、標的物質の種類に応じて適宜決めることができ、例えば、水、リン酸バッファー、酢酸バッファー、トリスバッファーなどを使用することができる。
【００２０】
＜複合体＞
本発明に置ける複合体とは、第１のリガンド分子を有する粒子と、標的物質と、光照射結合部位を有する第２のリガンド分子と、を含んで構成される。各構成要素については後述するが、本発明では、まず、この複合体を形成した後、この複合体を残すようにＢ／Ｆ分離を行う。そして、基体の上に配置された非特異吸着防止膜にこの複合体を光照射により固定化し、固定化した複合体を粒子の観測により検出する。なお、この複合体中の第２のリガンド分子には光照射により基体の上に配置された非特異的吸着膜に結合可能な光照射結合部位があり、この部位が光照射により非特異吸着防止膜に結合する。
【００２１】
例えば、標的物質が抗原で、第１及び第２のリガンド分子が抗体の場合、第１のリガンド分子及び第２のリガンド分子が標的物質を挟むようにサンドイッチ構造を形成することが好ましい。
【００２２】
＜粒子＞
本発明で用いられる粒子は、検出機器を用いて粒子の有無および量を検出できる構成を有していれば良い。このような粒子としては、例えば、顕微鏡等を用いて粒子の有無および量を検出できる粒子であることが望ましい。また、粒子の表面及び／又は内部に標識物質を有する構成とすることも望ましい。また、粒子は、試料溶液や分散液等の液媒体（例えば緩衝液）に対して不溶性であることが好ましい。また、本発明で用いられる粒子は、その表面に第１のリガンド分子を担持できる構成を有することが好ましい。
【００２３】
ここで、顕微鏡等を用いて粒子の有無および量を検出できる粒子とは、光学顕微鏡、電子顕微鏡又は原子間力顕微鏡などを用いて観察できる粒子であり、少なくとも５ｎｍ以上の直径を有する粒子であることが好ましい。
【００２４】
例えば、粒子としては、ポリスチレン、ナイロン、ガラス、金属、多孔質体又はデキストランなどの糖誘導体等で構成される粒子などが挙げられる。他の例としては、シリカ、ポリスチレンラテックス、ラテックス、ポリ乳酸、アガロース、キトサン、アルブミン又はデンプン等も挙げることができる。これらの粒子の中でも、粒子表面への第１のリガンド分子の固定化が容易であるという観点から、ラテックス粒子や、粒子表面に官能基を有するポリスチレン粒子、カルボン酸変性スチレン系粒子等のポリスチレン系粒子等が好ましい。このようなポリスチレン粒子は、市販品として入手可能なものを使用することもできる。例えば、粒子表面にアミノ基を有するものとしてＤｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）ＸＰ−５００２（ダイノインダストリーズ社）が利用できる。カルボキシル基を有するものとしてＩＭＭＵＴＥＸ  Ｇシリーズ（ＪＳＲ社）が利用できる。カルバモイル基を有するものとしてｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）ＰＳＩ  １８１（プロラボ社）、アミジノ基を有するものとして、ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）ＰＳＩ  ６２９（プロラボ社）等の製品が知られている。
【００２５】
また、前記粒子の表面及び／又は内部に標識物質を有する構成において、標識物質として例えば磁性物質を用いることができる。例えば、粒子として、前記材料の内部に磁性物質を含ませた粒子を用いることができる。磁性物質を内部に含ませた粒子は、磁性物質を、例えばポリスチレンやシリカ、ラテックス等の前記材料で覆った構成としてもよいし、磁性物質を混合した材料を粒子状に形成した構成としてもよい。磁性物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、酸化鉄、酸化クロム、コバルト、フェライト又はこれらの材料のうち少なくとも２種を混合した材料などが挙げられる。
【００２６】
なお、本明細書において、粒子の表面及び／又は内部に標識物質を有する構成には、該標識物質のみで粒子が構成される場合も含まれるものとする。また、「標識物質を含む粒子」は、「表面及び／又は内部に標識物質を有する構成の粒子」と同義として用いる。また、本明細書において、「表面及び／又は内部に標識物質として磁性物質を有する粒子」を磁性粒子と称する。なお、磁性粒子には、上記の磁性物質を内部に含ませた粒子や磁性物質のみで構成された粒子が含まれる。
【００２７】
また、前記標識物質としては、磁性物質の他に、発光物質、電気化学的活性物質、重金属物質又は金属半導体物質などを用いることもできる。また、標識物質として酵素を用い、粒子表面に酵素を結合させておくこともできる。
【００２８】
ここで、本明細書では、発光には、例えば化学的な発光、物理的な発光及び生物的な発光等があり、発光物質には蛍光物質、燐光物質及び遅延蛍光物質等が含まれる。また、発光は蛍光及び燐光も含む概念である。なお、蛍光とは、励起光により励起された蛍光物質から発せられる発光のことをいう。また、燐光とは、三重項励起状態に遷移した電子が基底状態にもどるときに発せられる発光のことをいう。また、遅延蛍光物質とは、蛍光物質に比べ蛍光を発する時間が長い物質を示す。発光物質のうち蛍光物質としては、例えば、フルオロセイン誘導体、シアニン系色素、ローダミン系色素、クマリン系色素、ダンシル型色素、アントラセン誘導体、ピレン誘導体又は希土類金属錯体などが挙げられる。発光物質のうち燐光物質としては、例えば、イリジウム錯体などが挙げられる。発光物質のうち遅延蛍光物質としては、例えば、ユウロピウム錯体などの希土類蛍光錯体が挙げられる。その他の発光物質としては、例えば、ルミノール、ロフィン、ルシゲニン又はシュウ酸エステルルミノールなどが挙げられ、これらの発光物質は、酵素などを用いて化学反応が促進され発光効率を上げることもできる。
【００２９】
また、電気化学的活性物質としては、例えば、鉄錯体、コバルト錯体、ルテニウム錯体又はニッケル錯体などの重金属錯体物質が挙げられる。重金属物質としては、例えば、金、銀又は白金などナノ金属粒子が挙げられる。金属半導体物質としては、例えば、ＣｄＳｅ系粒子、ＺｎＳｅ系粒子、及びＩｎ（Ｇａ）Ａｓ系粒子などの量子ドット材料が挙げられる。
【００３０】
粒子の大きさは、粒子直径が５ｎｍから１００μｍの大きさであることが好ましい。
【００３１】
粒子の表面には、上述のように、前記第１のリガンド分子が固定化される。この第１のリガンド分子を粒子表面に固定化させる方法としては、既に多くの方法が提案されており、特に制限されるものではなく、第１のリガンド分子や粒子の表面状態によって適宜選択することができる。例えば、粒子への第１のリガンド分子の固定化方法は、化学結合もしくはアフィニティー結合を利用して行うことができる。ここで、化学結合とは、原子間やイオン間で電子の授受を伴って形成された結合であり、例えば、共有結合、配位結合、金属結合などが挙げられる。化学結合を利用する方法としては、例えば、縮合剤を用いて固定する方法、シラン剤を用いて固定する方法、アルデヒドを介して固定する方法、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによりアミド結合を介して固定する方法、マレイミドによりチオール結合で固定する方法、ニッケル錯体とリガンド分子内のヒスチジン部位の錯体形成によって固定する方法などが挙げられる。また、アフィニティー結合を利用する方法としては、ビオチン−アビジン結合で固定する方法、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡやＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇを介して固定する方法、抗原−抗体反応で固定する方法、これらを組み合わせたサンドイッチ結合を利用して固定する方法、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリダイズにより固定する方法、アプタマーを介してリガンド分子を固定する方法などを用いることができる。また、スペーサー分子をはさんで結合させる方法も知られている。なお、第１のリガンド分子を固定する際は、第１のリガンド分子が標的物質の検出や分離の用途において求められる活性を損なわないように変性が起こらない程度の緩和な温度および化学的条件下で行われることが望ましい。
【００３２】
粒子は、その表面に第１のリガンド分子を固定するために、例えば、その表面に第１のリガンド分子を固定できる部位を設けた構成とすることができる。以下、粒子表面に存在する第１のリガンド分子を固定できる部位を粒子表面固定部位と略す。粒子表面固定部位としては、第１のリガンド分子を化学的に固定できる部位、または、第１のリガンド分子に対して親和性の高い部位であることが望ましい。化学的に固定できる部位とは、第１のリガンド分子に対して結合可能な官能基又は活性基を有する部位を示す。化学的に固定できる部位としては、例えば、カルボキシル基、第１級から第４級までのアミン基、ヒドロキシル基、スルホニル基、リン酸基、ホスホニル基、アルデヒド基、チオール基、カルボジイミド部位、マレイミド基、イソシアネート部位、イソチオシアネート部位、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部位、ニッケル錯体又はビオチンなどが挙げられる。また、親和性の高い部位とは、第１のリガンド分子に対して親和性が高く、第１のリガンド分子を粒子に固定できる部位を示す。親和性の高い部位としては、第１のリガンド分子の種類にもよるが、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、プロテインＧ、プロテインＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ、アプタマーなどが挙げられる。ここで、親和性の高い部位と第１のリガンド分子との好ましい組み合わせとしては、アビジンとビオチン化抗体、ストレプトアビジンとビオチン化抗体、プロテインGと抗体、プロテインＡと抗体が好ましい。
【００３３】
例えば、粒子表面固定部位としてアミノ基を含む部位を有するポリスチレン粒子として、上述のように、Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ（登録商標）ＸＰ−５００２（ダイノインダストリーズ社）が挙げられる。同様に、粒子表面固定部位としてカルボキシル基を含む部位を有するポリスチレン粒子として、ＩＭＭＵＴＥＸ  Ｇシリーズ（ＪＳＲ社）が利用できる。同様に、粒子表面固定部位としてカルバモイル基を含む部位を有するものとしてｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）ＰＳＩ  １８１（プロラボ社）、アミジノ基を有するものとして、ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）ＰＳＩ  ６２９（プロラボ社）等の製品が知られている。
【００３４】
＜リガンド分子＞
本発明で用いられる第１のリガンド分子又は第２のリガンド分子は、標的物質を特異的に認識して捕捉することが可能な物質である。標的物質と第１又は第２のリガンド分子の組み合わせとしては、例えば、抗原−抗体、ペプチド−抗体、ウィルス−抗体、低分子化合物−抗体、細胞−抗体、抗原−アプタマー、抗原−酵素、ペプチド−タンパク質、ペプチド−ペプチド、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＰＮＡ、ＤＮＡ−タンパク質、ＲＮＡ−タンパク質、糖−タンパク質、タンパク質−タンパク質、糖−糖などが挙げられる。なお、「標的物質と第１又は第２のリガンド分子の組み合わせがＡ−Ｂである」と表記する場合は、標的物質がＡであり第１又は第２のリガンド分子がＢである場合と、標的物質がＢであり第１又は第２のリガンド分子がＡである場合の両方を含むものとする。例えば、標的物質に抗原を用い、第１又は第２のリガンド分子に抗体を用いる場合、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られたモノクロ−ナル抗体や抗原で免疫させて得られた血清により精製させるポリクローナル抗体などを用いることができる。また、第１及び第２のリガンド分子は、特に限定されるものではないが、同種のリガンド分子であることが好ましい。
・第１のリガンド分子
本発明で用いられる第１のリガンド分子は、標的物質を特異的に捕捉し、前記粒子の表面に固定される。例えば、標的物質が抗原である場合は、第１のリガンド分子はその抗原に対する抗体とすることができる。また、標的物質が核酸である場合には、第１のリガンド分子はその核酸に相補的な配列を有するプローブとすることができる。また、標的物質が抗体である場合はその抗体に対する抗原とすることができる。
【００３５】
前記第１のリガンド分子を粒子の表面に固定させる方法としては、特に制限されるものではない。たとえば、リンカー化学、ハイブリダイゼーション、ビオチン／アビジン親和性による親和性捕捉、コンビナトリアル化学、他の従来技術において周知のものを利用して、上述のように、第１のリガンド分子や粒子の表面状態に応じて適宜調製することができる。例えば、上述のように、粒子の表面には粒子表面固定部位を設けることが可能であり、この場合、粒子表面固定部位に結合可能な部位を第１のリガンド分子に設けることができる。粒子表面固定部位に結合可能な部位としては、粒子表面固定部位の種類にもよるが、例えば、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、ジスルフィド基又はヒドロキシル基などの官能基やビオチン誘導体などを有する部位が挙げられる。
【００３６】
ここで、粒子表面固定部位と粒子表面固定部位に結合可能な部位が有する官能基の好ましい組み合わせとしては、カルボキシル基とアミノ基、アルデヒド基とアミノ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部位とアミノ基、マレイミド基とチオール基、アビジンとビオチン、ストレプトアビジンとビオチン、プロテインＡと抗体、プロテインＧと抗体が好ましい。
・第２のリガンド分子
本発明で用いられる第２のリガンド分子は、前記標的物質を特異的に捕捉し、かつ、光照射により非特異吸着防止膜に結合する部位を有する。なお、本明細書において、光照射により非特異吸着防止膜に結合する部位を、光照射結合部位と称す。
【００３７】
第２のリガンド分子は、光照射結合部位として、光親和性化合物を有することが望ましい。ここで、本明細書において、光親和性化合物とは、光照射により活性化され、化合物（例えば、非特異吸着防止膜を構成する化合物）との間に結合を形成できるものである。光親和性化合物は、とくに、光照射により活性化され、非特異吸着防止膜に共有結合を形成できるものが好ましい。光親和性化合物としては、例えば、ナイトレン、カルベン又はラジカルを発生する化合物が挙げられる。これらの化合物は、特開２００１−１７８４７２号公報（特許文献２）などに記載されている。光親和性化合物としては、具体的には、例えば、芳香族アジド、アルキルアジド、ヘテロ環アジドなどのアジド基を有する化合物、ジアゾ基またはジアジリン環を有する化合物（ジアジリン誘導体）、ベンゾフェノン類やエノン類のような共役ケトン類、芳香族ハロゲン化物類、オレフィン類、芳香族ジアゾニウム塩、ニトロベンゼン類、スルホニウム塩、ホスホニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。また、ジアゾニウム基、アジド基、ジアジリン環、又はジアゾ基を部分構造とする化合物も挙げられる。なかでも、ジアジリン誘導体は、生体分子にダメージを与えない波長３６０ｎｍ付近の光を照射することで、非常に活性なカルベン誘導体を生成するため、有用性の高い化合物として用いられる（非特許文献２）。
【００３８】
また、光照射により活性化された光親和性化合物は、非特異吸着防止膜に対して無作為に共有結合可能である。そのため、あらゆる非特異吸着防止膜と結合可能である。特に好ましい光親和性化合物と非特異吸着防止膜との組み合わせとしては、ジアジリン誘導体とアルブミン、ジアジリン誘導体とカゼイン、ジアジリン誘導体とスキムミルク、ジアジリン誘導体とヘパリン、ジアジリン誘導体とリン脂質、ジアジリン誘導体とオリゴエチレングリコール、ジアジリン誘導体とポリエチレングリコール、ジアジリン誘導体とポリメタクリレート、ジアジリン誘導体とポリアクリレート、ジアジリン誘導体とデキストランが挙げられる。
【００３９】
また、光親和性化合物は、官能基や活性基を有する光親和性化合物を用いることで、第２のリガンド分子へ結合させることが可能である。例えば、官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、スルホニル基などが挙げられ、また活性基としては、Ｎ−スクシンイミドエステル部位、マレイミド基、カルボジイミド部位、イソシアネート部位、イソチオシアネート部位などが挙げられる。ここで、官能基や活性基と第２のリガンド分子との好ましい組み合わせとしては、カルボキシル基と抗体、アルデヒド基と抗体、Ｎ−スクシンイミドエステル部位と抗体、マレイミド基と抗体、カルボジイミド部位と抗体、イソシアネート部位と抗体、イソチオシアネート部位と抗体が好ましい。
【特許文献２】特開２００１−１７８４７２号公報
【非特許文献２】Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ，１２７巻，１６９３項，２００７年．
【００４０】
＜非特異吸着防止膜＞
本発明で用いられる非特異吸着防止膜は基体の上に設けられる。非特異吸着防止膜は、少なくとも第１のリガンド分子を有する粒子の吸着を抑制する。また、さらに夾雑物又は複合体を形成していない第２のリガンド分子の吸着も抑制することが好ましい。更に、非特異吸着防止膜は、未反応の標的物質が存在する可能がある場合は、標的物質の吸着も抑制できる膜であることが好ましい。また、非特異吸着防止膜は、複合体中の第２のリガンド分子への光照射により、光照射結合部位と結合を形成できる材料であれば良い。なお、夾雑物とは、試料中に存在する標的物質以外の物質のことを示す。たとえば、夾雑物としては、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＡ、リポタンパク質、コレステロール、アルブミン、ヘモグロビン、代謝物等が挙げられる。
【００４１】
非特異吸着防止膜としては、親水性、及び極性の高い化合物が用いられる。非特異的吸着の主たる原因は、疎水性相互作用や静電相互作用による吸着にある。特に、疎水性相互作用による非特異的吸着は、最も生じやすい吸着である。従って、疎水性相互作用を防止するために、親水性、及び極性の高い化合物が防止膜として用いられる。特に、親水性、及び極性の高い化合物としては、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ヘパリン、リン脂質、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、デキストランなどが挙げられる。また、非特異吸着防止膜は、基体上に固定化されることが好ましい。固定化方法としては、物理吸着、又は化学結合が用いられる。例えば、物理吸着を用いた場合、好ましい非特異的吸着防止膜と基体との組み合わせとしては、アルブミンとポリスチレン樹脂、又は金属基体、カゼインとポリスチレン樹脂、又は金属基体、スキムミルクとポリスチレン樹脂、または金属基体、リン脂質とポリスチレン樹脂、又は金属基体などが挙げられる。また、化学結合を用いた場合、非特異吸着防止膜は、官能基、又は活性基を有する基体を用いて固定化される。特に、好ましい非特異的吸着防止膜と官能基、又は活性基との組み合わせとしては、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、リン脂質、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、デキストランとカルボキシル基、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、リン脂質、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、デキストランとアミノ基、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、リン脂質、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、デキストランとアルデヒド基、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、リン脂質、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、デキストランとＮ−スクシンイミドエステル部位、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、リン脂質、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、デキストランとマレイミド部位、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、リン脂質、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、デキストランとカルボジイミド部位、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、リン脂質、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、デキストランとイソシアネート部位、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、リン脂質、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、デキストランとイソチオシアネート部位が挙げられる。
【００４２】
また、非特異吸着防止膜は、基体の全面に配置されることが好ましいが、特に限定されるものではない。本発明の効果を有する限り、基体の上に部分的に配置された場合も含む。
【００４３】
基体としては、非特異的吸着防止膜を物理吸着、又は化学結合によって固定化可能な材料である限り、構成等は特に限定されない。例えば、基体としては、ポリスチレン樹脂、金、銀、金属酸化物、ガラスなどが挙げられる。また、各種の測定方法に応じて、光透過性を有するものや光反射性を有するもの、電極基板、表面に金薄膜や金ドットが形成された基体等が用いられる。
【００４４】
＜検出方式＞
本発明で使用される検出方式は、非特異吸着防止膜（固相）上に固定された粒子の有無または量を検出できる方法であれば特に限定されない。
【００４５】
例えば粒子がポリスチレン粒子、ナイロン粒子、ガラス粒子、金属粒子、金属で被覆された各種粒子又は多孔質体の粒子等の場合では、これらの粒子の固定化に伴う基体の屈折率又は誘電率の変化を光学的な手法により検出することができる。加えて、光学顕微鏡、電子顕微鏡、原子間力顕微鏡などで直接的に粒子を観察することにより検出することもできる。
【００４６】
また、粒子が金属粒子、金属で被覆された粒子の場合では、これらの粒子による吸収スペクトル変化を光学的な手法により検出することもできる。
【００４７】
また、粒子が磁性物質を含む場合では、磁界効果を利用する方式として、基体に磁気抵抗効果素子、ホール効果素子、磁気インピーダンス素子又は超電導量子干渉計素子を用いて検出することができる。
【００４８】
また、粒子が蛍光物質や燐光物質、遅延蛍光物質などの発光物質を含む場合（標識物質として発光物質を用いた場合）では、プレートリーダ、分光光度計又は蛍光測定器などの光検出器を用いて検出できる。
【００４９】
また、粒子が電気化学的活性物質を含む場合では、基体に電極を用いたサイクリックボルタンメトリー、パルスボルタンメトリー、アンペロメトリー、クーロメトリーなどの電気化学的測定方法を用いることで検出できる。また、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ測定やＴＯＦ  ＳＩＭＳ測定などの分子量測定機器を用いれば、ここに示す粒子１０１に対して検出することができる。
【００５０】
また、粒子が酵素を有する場合（標識物質として酵素を用いた場合）は、その酵素活性を測定することで粒子を検出することができる。例えば、酵素にアルカリホスファターゼを用い、４−メチルウンベリフェリルリン酸の脱リン酸化により生じる蛍光を測定する方法や、酵素にペルオキシターゼを用い、ルミノールの酸化により生じる化学発光を測定する方法などが挙げられる。
【００５１】
＜Ｂ／Ｆ分離＞
本発明では、複合体を形成した後、Ｂ／Ｆ分離によって、複合体を形成していない第２のリガンド分子および夾雑物を除去する。ここでＢ／Ｆ分離とは、結合（Ｂｏｕｎｄ）したもの（複合体）と遊離（Ｆｒｅｅ）なものを分離することを意味し、本明細書においては、粒子に結合または固定された物質と、粒子に結合または固定されていない遊離の物質とを分離することを示す。
【００５２】
具体的なＢ／Ｆ分離の手法としては、遠心分離による粒子沈降を利用した分離法、粒子の自然沈降を利用した分離法、サイズ排除が可能なフィルターを用いた粒子の分離法などが挙げられる。これらの分離法を用いる場合は、効果的な分離を行う上で好適な密度やサイズなどの分離に影響する物性の十分な差を、第２のリガンドと粒子との間に設けておくとよい。また、粒子が磁性物質を含む場合では、磁石や電磁石などの磁場発生装置を用いた磁気分離法を用いることができる。
【００５３】
（実施形態１）
以下、本発明における実施形態について図２又は図３を用いて説明する。しかし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００５４】
本発明では、複合体の固相への固定法は、光照射により複合体を非特異吸着防止膜に選択的かつ効率的に固定できる方法であることが好ましい。本実施形態においては、複合体を同一固相上で選択的かつ効率的に固定可能な方法について図２を用いて説明する。図２は、粒子２０１が磁性粒子である場合における、複合体２０７が非特異吸着防止膜２０５上に固定されるまでの工程の一例を示す。
【００５５】
図２（Ａ）に示すように、非特異吸着防止膜２０５上で、溶液中において、標的物質２０９と、第１のリガンド分子２０２を有する粒子２０１と、第２のリガンド分子２０３と、を結合させ、複合体２０７を形成させる。
【００５６】
次に、図２（Ｂ）に示すように、磁石や電磁石などの磁場発生装置２１０を基体２０６近傍に設置し、磁場を発生させ、磁性粒子を非特異吸着防止膜２０５に引き寄せる。そして、溶液を除去し、Ｂ／Ｆ分離を行う。この工程により、複合体２０７を形成していない第２のリガンド分子２０３及び夾雑物２０８が除去される。
【００５７】
次に、図２（Ｃ）に示すように、光源を有する光照射装置２１１を用いて、磁場発生装置２１０により非特異吸着防止膜２０５上に濃縮された複合体２０７に対して光照射を行い、複合体２０７を非特異吸着防止膜２０５に固定する。ここで用いられる光照射とは、光照射結合部位（たとえば光親和性化合物）の種類に応じて適宜決定された波長を含む光を照射することである。光としては、太陽光、電灯光、半導体レーザやガスレーザなどのレーザ光、発光ダイオードの発光又はエレクトロルミネッセント素子の発光などが利用できる。光照射の方法は、光源からの光を必要に応じて適当なフィルターを介して、複合体２０７に照射することができる。また、マスクなどを用いて所望の形状のパターン露光を行うこともできる。また、光をレンズや鏡を用いて集光し微細な形状に照射することや、集光した光線を走査露光することも可能である。照射時間は、特に限定されない。また、磁場発生装置２１０により固相上に複合体２０７を濃縮しながら光照射を行うこともできる。これにより、固相に対する複合体２０７の固定効率の向上が期待できる。また、非特異吸着防止膜２０５上に複合体２０７を濃縮させた状態で乾固させた後、光照射により複合体２０７を非特異吸着防止膜２０５上に固定することも可能である。これにより、非特異吸着防止膜２０５と複合体２０７が密接に接近し、複合体２０７が、非特異吸着防止膜２０５上の様々な部位で結合可能となり、固定効率の向上が期待できる。乾固させる方法は特に限定されない。
【００５８】
次に、図２（Ｄ）に示すように、非特異吸着防止膜２０５を適当な溶媒又は緩衝液で洗い、固定されなかった粒子２０１を除去する。また、磁場発生装置２１０により固定されなかった粒子を除去することも可能である。洗浄後、光照射により固定された複合体２０７の有無または量を例えば上記に示した検出方式により検知することで、試料中の標的物質２０９を検出することが可能となる。
【００５９】
本実施形態の図２に示した例では、同一の固相上で複合体の形成から粒子の検出までを行うことが可能である。これにより、別途Ｂ／Ｆ分離を行う容器などを必要としないため、検出工程の簡便化及び迅速化が可能となる。
【００６０】
（実施形態２）
図３は、本発明に係る標的物質の検出方法の一例を示す図である。粒子３０１は、磁性粒子でもよいし、標識物質として磁性物質以外の物質を含む粒子でもよい。例えば、上記に例示したポリスチレン、ナイロン、ガラス、金属、又は多孔質体等の粒子が挙がられる。また、例えば、デキストランなどの糖誘導体やフルオロセイン誘導体で構成される粒子も挙げられる。また、例えば、シアニン系色素、ローダミン系色素、クマリン系色素、ダンシル型色素、アントラセン誘導体、ピレン誘導体、又は希土類金属錯体などを含む蛍光を発する粒子も挙げられる。また、例えば、鉄錯体、コバルト錯体、ルテニウム錯体、又はニッケル錯体などの重金属錯体物質を含む電気化学的に活性な粒子も挙げられる。また、例えば、金、銀、又は白金などのナノ金属粒子も挙げられる。また、例えば、ＣｄＳｅ系粒子、ＺｎＳｅ系粒子、又はＩｎ（Ｇａ）Ａｓ系粒子などの量子ドット粒子なども挙げられる。
【００６１】
まず、図３（ａ）に示すように、溶液中で、容器３０５内で標的物質３０８と、第１のリガンド分子３０２を有する粒子３０１と、第２のリガンド分子３０３とを結合させ、複合体３０６を形成させる。
【００６２】
次に、図３（ｂ）に示すように、遠心分離法や自然沈降法により、Ｂ／Ｆ分離を行う。この工程により、複合体３０６を形成していない第２のリガンド分子３０３及び夾雑物３０７が除去される。
【００６３】
次に、図３（ｃ）に示すように、図３（ｂ）に示した工程で精製された複合体３０６を非特異吸着防止膜３１０上に滴下し、光源を有する光照射装置３０９を用いて、複合体３０６に対して光照射を行い、複合体３０６を非特異吸着防止膜３１０上に固定する。ここで用いられる光照射とは、光親和性化合物の種類に応じて決定された波長を含む光を照射することである。光としては、例えば、太陽光、電灯光、半導体レーザやガスレーザなどのレーザ光、発光ダイオードの発光又はエレクトロルミネッセント素子の発光などを利用できる。光照射の方法は、光源からの光を必要に応じて適当なフィルターを介して複合体３０６に照射することができる。また、マスクなどを用いて所望の形状のパターン露光を行うこともできる。また、光をレンズや鏡を用いて集光し微細な形状に照射することや、集光した光線を走査露光することも可能である。照射時間は、特に限定されない。また、非特異吸着防止膜３１０上に複合体３０６を滴下させた状態で乾固させた後、光照射により複合体３０６を非特異吸着防止膜３１０上に固定することも可能である。これにより、非特異吸着防止膜３１０と複合体３０６が密接に接近し、複合体３０６が非特異吸着防止膜３１０上の様々な部位で結合可能となり、固定効率が向上することが期待できる。乾固させる方法は特に限定されない。
【００６４】
次に、図３（ｄ）に示すように、非特異吸着防止膜３１０を適当な溶媒又は緩衝液で洗い、固定されなかった粒子３０１を除去する。洗浄後、光照射により固定された複合体３０６の有無、量を上記に示した検出方式により検知することで、試料中の標的物質３０８を検出することが可能となる。
【００６５】
＜キット＞
本発明は、上記材料、基体などを用いて標的物質の検出用キットとすることもできる。例えば、
１−１）非特異的吸着防止膜を有する基体
１−２）第１のリガンド分子を有する粒子
１−３）光照射結合部位を有する第２のリガンド分子
または、粒子が磁性粒子である場合では
２−１）非特異的吸着防止膜を有する基体
２−２）第１のリガンド分子を有する粒子
２−３）光照射結合部位を有する第２のリガンド分子
２−４）磁場発生装置
を備えていることを特徴とするキットである。
【００６６】
前記検出キットでは、非特異的吸着防止膜を有する基体上で、標的物質を含む試料と、第１のリガンド分子を有する粒子、及び光照射結合部位を有する第２のリガンド分子を混合させ、複合体を形成させた後、Ｂ／Ｆ分離を行う。Ｂ／Ｆ分離後、光照射によって形成した複合体を非特異吸着防止膜に固定し、粒子の有無または量を検知することにより、試料中の標的物質を検出することが可能である。また、前記検出キットにおいて、粒子が磁性粒子である場合では、上記の方法で複合体を形成させた後、基体近傍に磁場発生装置を設置し、磁力を利用して複合体を非特異吸着防止膜上に濃縮させることができる。これにより、複合体を効率良く非特異吸着防止膜に固定させることができ、Ｓ／Ｎ比の高い検出が可能となる。
【００６７】
また、本発明における検出キットにおいては、複合体を形成させるための反応容器、Ｂ／Ｆ分離を行うための容器、及び標的物質を検出するための検出容器のうち少なくとも一つをさらに含んでいても良い。また、前記反応容器および検出容器とが、各々別々であってもよいし、あるいは、同一であってもよい。また、容器の形状は複合体を形成させる反応、Ｂ／Ｆ分離、及び標的物質の検出が行える限り、特に限定されるものではない。また、複合体を形成させるための反応容器に、第１のリガンド分子固定粒子と、光照射結合部位を有する第２のリガンド分子が予め含まれる構成としてもよい。本発明で用いられる容器とは、複合体の形成の役割を果たすものであれば特に制限されず、また、その大きさについても特に制限されない。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例を用いてさらに詳細に本発明を説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６９】
（実施例１）
本実施例では、図２に示すような工程により行った。粒子２０１として磁気粒子を用いる。また、第１のリガンド分子２０２として、αサブユニット認識抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を用いる。また、第２のリガンド分子２０３として、ジアジリン部位（光照射結合部位２０４）を有する抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を用いる。そして、これらを含む溶液を混合させ、抗体２０２を固定した磁気粒子２０１−標的物質である人絨毛性ゴナトトロピン２０９（ロート製薬社製）−ジアジリン部位２０４を有する抗体２０３から成るサンドイッチ複合体２０７を形成させる。そして、基体２０６としての機能を有するセンサ素子上（詳細にはセンサ素子上に形成した非特異吸着防止膜）に選択的且つ効率的に固定し、固定した複合体を磁気センサで検出する。
【００７０】
１−１．抗体固定化磁性粒子の作製
まず、第１のリガンド分子２０２としてのビオチン化αサブユニット認識抗体の作製を行う。αサブユニット認識抗体５００μｇをｐＨ９．０のホウ酸緩衝液１００μＬに溶かし、この溶液にＮＨＳ−ｄＰＥＧ１２Ｂｉｏｔｉｎ  １．０ｍｇ（ＱｕａｎｔａＢｉｏＤｅｓｉｇｎ社製）を加え、室温で３時間攪拌する。攪拌後、反応溶液からマイクロコンＹＭ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて未反応のＮＨＳ−ｄＰＥＧ１２Ｂｉｏｔｉｎを除去する。上清を回収し、ビオチン化αサブユニット認識抗体が得られる。得られた抗体は、分光光度計にて濃度決定する。
【００７１】
次に、作製したビオチン化αサブユニット認識抗体を磁性粒子に固定し、第１のリガンド分子２０２を有する粒子２０１を作製する。表面がアビジンで被覆された粒子直径約１μｍの磁性粒子：「商品名」Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１（インビトロジェン社製）１ｍｇ／ｍＬ溶液に、作製したビオチン化αサブユニット認識抗体１ｎｍｏｌを加え、室温で１時間以上攪拌する。攪拌終了後、磁石を用いてＢ／Ｆ分離を行い、未反応のビオチン化αサブユニット認識抗体を除去する。最後に、溶液を１×ＰＢＳＴ溶液に置換し、αサブユニット認識抗体を固定化した磁性粒子を得る。
【００７２】
得られた粒子は、ＵＶ測定、動的光散乱測定により、磁性粒子表面に固定化されているビオチン化αサブユニット認識抗体量と平均粒子径が求められる。
【００７３】
１−２．光親和性化合物を有する抗体の作製
光親和性化合物として、ｐ−（３−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｄｉａｚｉｒｉｎ−３−ｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＡＣＨＥＭ社製）を用いる。ｐ−（３−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｄｉａｚｉｒｉｎ−３−ｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ５ｍｇをＤＭＦ溶液に溶かした後、この溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（アルドリッチ社製）２５ｍｇと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（アルドリッチ社製）２５ｍｇを溶かした水溶液を徐々に加えていき、６時間以上攪拌させる。攪拌後、有機溶媒で目的物を抽出し、溶媒を減圧留去し、ｐ−（３−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｄｉａｚｉｒｉｎ−３−ｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄのスクシンイミドエステル体が得られる。
【００７４】
次に、式１に示すスキームに従い、作製したｐ−（３−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｄｉａｚｉｒｉｎ−３−ｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄスクシンイミドエステルを用いて、抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体へ光親和性化合物を導入する。抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体５００μｇをｐＨ９．０のホウ酸緩衝液１００μＬに溶かし、この溶液にｐ−（３−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｄｉａｚｉｒｉｎ−３−ｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄスクシンイミドエステル  １．０ｍｇを溶かしたＤＭＳＯ溶液、またはＤＭＦ溶液を加え、室温で３時間攪拌する。攪拌後、反応溶液からマイクロコンＹＭ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて未反応のｐ−（３−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｄｉａｚｉｒｉｎ−３−ｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄスクシンイミドエステルを除去する。上清を回収し、光照射結合部位として光親和性化合物を有する抗体２０３が得られる。得られた抗体は、分光光度計にて濃度決定する。
【００７５】
【化１】
2009288069.tif 000003
【００７６】
１−３．夾雑物吸着を防止する部位を有するセンサ素子２１３の作製
基体２０６として用いられるセンサ素子上に、金蒸着で金をコートする。センサ素子上の金表面に、非特異吸着防止膜２０５を、ＢＳＡやスキムミルク、またはＮ１０１（「商品名」、日本油脂社製）やＴｈｉｏｌ−ｄＰＥＧ−ａｃｉｄ（ＱｕａｎｔａＢｉｏＤｅｓｉｇｎ社製）を用いて形成する。形成方法は、例えばタンパク質、または合成化合物を含む溶液をセンサ素子上に滴下し、高湿下で３時間以上固定化する。形成後、溶媒、または緩衝液で非特異吸着防止膜上を十分洗浄し、素子上の固定化されていないタンパク質、または合成化合物を除去し、非特異吸着防止膜を有するセンサ素子を得る。
【００７７】
１−４．人絨毛性ゴナトトロピン２１０の検出
図２に示す工程を経て、標的物質２０９である人絨毛性ゴナトトロピンを検出する。まず、１−３で作製したセンサ素子上で、所定濃度の人絨毛性ゴナトトロピンを含む溶液と、１−１で作製した所定濃度の抗体固定化磁性粒子と、１−２で作製した所定濃度の光親和性化合物を有する抗体とを混合し、複合体を形成させる（図２（Ａ））。次に、所定時間反応させた後、磁場発生装置２１０をセンサ素子の下部に近づけ、複合体と未反応の抗体固定化磁性粒子をセンサ素子上に濃縮させる。この状態のまま、センサ素子表面を溶媒または緩衝液で洗浄し、複合体を形成していない光親和性化合物を有する抗体や夾雑物２０８をセンサ素子上から除去する（２（Ｂ））。次に、磁場発生装置２１０をセンサ素子の下部に近づけたまま、センサ素子上部へ波長３６０ｎｍのレーザ光を１分以上照射する（図２（Ｃ））。光照射後、センサ素子下部から磁場発生装置２１０を離し、センサ素子上を溶媒または緩衝液で洗浄し、非特異吸着防止膜に固定化されていない抗体固定化磁性粒子を除去する（図２（Ｄ））。最後に非特異吸着防止膜に固定化された複合体を、センサ素子を用いて磁気抵抗測定により検出し、人絨毛性ゴナトトロピンを定量する。
【００７８】
上記に示す検出工程は、以下の測定操作を用いて行われる。図４は、本発明の測定システムのブロック図である。サンプリングプローブ４０７により、標的物質を含む試料液４０１を非特異吸着防止膜を有するセンサ素子４１１を有する容器４１０へ分注する。希釈液４０４も同様にして容器４１０へ分注する。さらに、抗体固定化磁性粒子を含む試薬４０２および光親和性化合物を有する抗体を含む試薬４０３も同様にして容器４１０へ分注する。抗体固定化磁性粒子−標的物質−光親和性化合物を有する抗体から成るサンドイッチ複合体を形成させた後、容器４１０の外部に設置した磁場発生装置４１２により磁場を印加し、複合体及び抗体固定化磁性粒子をセンサ素子４１１上に集磁する。複合体及び未反応の抗体固定化磁性粒子以外の検体及び試薬は、サンプリングプローブ４０７により容器４１０から廃液容器４０６へ移送される。さらに、サンプリングプローブ４０７により、洗浄液４０５を容器４１０内へ満たし、洗浄を行う。サンプリングプローブ４０７により、容器４１０内から廃液容器４０６へ、使用された洗浄溶液は移送される。サンプリングプローブ４０７により、希釈液４０３を容器４１０へ分注する。磁場発生装置４１２により磁場を印加した状態で、光照射プローブ４１４を用いてセンサ素子４１１上を光照射し、光親和性化合物を活性化させ、センサ素子上に形成された非特異吸着防止膜と結合を形成させる。次に、センサ素子４１１上に固定化された複合体以外の検体及び試薬は、洗浄され、サンプリングプローブ４０７により容器４１０から廃液容器４０６へ移送される。さらに、サンプリングプローブ４０７により、洗浄液４０５を容器４１０内へ満たし、洗浄を行う。サンプリングプローブ４０７により、容器４１０内から廃液容器４０６へ、使用された洗浄溶液は移送される。サンプリングプローブ４０７により、希釈液４０３を容器４１０へ分注する。磁場発生装置４１２により、センサ素子４１１に対して垂直に磁場を発生させる。予め、磁気信号検出器４１３により、サンプルなしの状態で初期値の測定を行った後、センサ素子４１１上（非特異吸着防止膜）に固定化された複合体の磁性粒子より発生した磁気信号を、磁気信号検出器４１３により測定する。既知濃度の標的物質を用いて予め作成した検量線を基に、初期値と比較した磁気信号の変化量から、検体中の標的物質濃度を算出する。
【００７９】
（実施例２）
本実施例では、図３に示すような工程により行った。粒子３０１として標識物質として蛍光物質を含む粒子を用いる。第１のリガンド分子３０２としてαサブユニット認識抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を用いる。第２のリガンド分子３０３としてジアジリン部位（光照射結合部位３０４）を有する抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を用いる。抗体を固定した蛍光粒子３０１−標的物質である人絨毛性ゴナトトロピン３０８（ロート製薬社製）−ジアジリン部位を有する抗体３０３から成るサンドイッチ複合体３０６を基体としてのプレート上に形成した非特異吸着防止膜３１０に選択的且つ効率的に固定し、固定した複合体３０６を蛍光顕微鏡、または蛍光プレートリーダで検出する。
【００８０】
２−１．抗体固定化蛍光粒子の作製
まず、第１のリガンド分子３０３としてのビオチン化αサブユニット認識抗体の作製を行う。αサブユニット認識抗体５００μｇをｐＨ９．０のホウ酸緩衝液１００μＬに溶かし、この溶液にＮＨＳ−ｄＰＥＧ１２Ｂｉｏｔｉｎ  １．０ｍｇ（ＱｕａｎｔａＢｉｏＤｅｓｉｇｎ社製）を加え、室温で３時間攪拌する。攪拌後、反応溶液からマイクロコンＹＭ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて未反応のＮＨＳ−ｄＰＥＧ１２Ｂｉｏｔｉｎを除去する。上清を回収し、ビオチン化αサブユニット認識抗体が得られる。得られた抗体は、分光光度計にて濃度決定する。
【００８１】
次に、作製したビオチン化αサブユニット認識抗体を蛍光粒子に固定し、第１のリガンド分子３０２を有する粒子３０１を作製する。表面がアビジンで被覆された粒子直径約１μｍのフルオロセイン含有蛍光粒子：「商品名」ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎＴＭ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（インビトロジェン社製）１ｍｇ／ｍＬ溶液に、作製したビオチン化αサブユニット認識抗体１ｎｍｏｌを加え、室温で１時間以上攪拌する。攪拌終了後、遠心分離機を用いてＢ／Ｆ分離を行い、未反応のビオチン化αサブユニット認識抗体を除去する。最後に、溶液を１×ＰＢＳＴ溶液に置換し、αサブユニット認識抗体固定化蛍光粒子が得られる。
【００８２】
得られた粒子は、ＵＶ測定、動的光散乱測定により、蛍光粒子表面に固定化されているビオチン化αサブユニット認識抗体量と平均粒子径が求められる。
【００８３】
２−２．光親和性化合物を有する抗体３０６の作製
光親和性化合物として、ｐ−（３−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｄｉａｚｉｒｉｎ−３−ｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＡＣＨＥＭ社製）を用いる。ｐ−（３−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｄｉａｚｉｒｉｎ−３−ｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ５  ｍｇをＤＭＦ溶液に溶かした後、この溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（アルドリッチ社製）２５  ｍｇと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（アルドリッチ社製）２５ｍｇを溶かした水溶液を徐々に加えていき、６時間以上攪拌させる。攪拌後、有機溶媒で目的物を抽出し、溶媒を減圧留去し、ｐ−（３−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｄｉａｚｉｒｉｎ−３−ｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄのスクシンイミドエステル体が得られる。
【００８４】
次に、式１に示すスキームに従い、作製したｐ−（３−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｄｉａｚｉｒｉｎ−３−ｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄスクシンイミドエステルを用いて、抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体へ光親和性化合物を導入する。抗人絨毛性ゴナトトロピン抗体５００μｇをｐＨ９．０のホウ酸緩衝液１００μＬに溶かし、この溶液にｐ−（３−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｄｉａｚｉｒｉｎ−３−ｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄスクシンイミドエステル  １．０ｍｇを溶かしたＤＭＳＯ溶液、またはＤＭＦ溶液を加え、室温で３時間攪拌する。攪拌後、反応溶液からマイクロコンＹＭ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて未反応のｐ−（３−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｄｉａｚｉｒｉｎ−３−ｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄスクシンイミドエステルを除去する。上清を回収し、光親和性化合物を有する抗体３０３が得られる。得られた抗体は、分光光度計にて濃度決定する。
【００８５】
２−３．夾雑物吸着を防止する部位を有するプレート３１１の作製
基体として用いられるポリスチレンマイクロウェルプレート（パーキンエルマー社製）上に、非特異吸着防止膜３１０を、ＢＳＡやスキムミルク、または合成化合物としてＮ１０１（日本油脂社製）を用いて形成する。形成方法は、タンパク質、または合成化合物を含む溶液をプレート上に滴下し、高湿下で３時間以上固定化する。形成後、溶媒または緩衝液でプレート上を十分洗浄し、プレート上の固定化されていないタンパク質または合成化合物を除去することで、非特異吸着防止膜を有するプレートが得られる。
【００８６】
２−４．人絨毛性ゴナトトロピン３１０の検出
図３に示す工程を経て、標的物質３０８である人絨毛性ゴナトトロピンを検出する。まず、Ｂ／Ｆ分離可能な容器３０５に所定濃度の人絨毛性ゴナトトロピンを含む溶液と、２−１で作製した所定濃度の抗体固定化蛍光粒子、２−２で作製した所定濃度の光親和性化合物を有する抗体を加え混合し、複合体を形成させる（図３（ａ））。所定時間反応させた後、容器３０５を遠心分離装置に設置し、複合体３０６を形成していない光親和性化合物を有する抗体と夾雑物３０７を容器３０５内から除去する（図３（ｂ））。次に、２−３で作製したプレート上に、Ｂ／Ｆ分離により精製された溶液を滴下し、プレート上部へ波長３６０ｎｍのレーザ光３１２を１分以上照射し、複合体を非特異吸着防止膜に固定化する（図３（ｃ））。光照射後、プレート上を溶媒、または緩衝液で洗浄し、非特異吸着防止膜に固定化されていない抗体固定化蛍光粒子を除去する（図３（ｄ））。最後にプレート上にに固定化された複合体３０６を、蛍光顕微鏡または蛍光プレートリーダにより検出し、人絨毛性ゴナトトロピンを定量する。
【００８７】
上記に示す検出工程は、以下の測定操作を用いて行われる。図５は、本発明の測定システムのブロック図である。サンプリングプローブ５０７により、標的物質を含む試料液５０１を反応容器５１０へ分注する。希釈液５０４も同様にして容器５１０へ分注する。さらに、抗体固定化蛍光粒子を含む試薬５０２および光親和性化合物を有する抗体を含む試薬５０３も同様にして容器５１０へ分注する。抗体固定化蛍光粒子−標的物質−光親和性化合物を有する抗体から成るサンドイッチ複合体を形成させた後、容器５１０を外部に設置した遠心分離機５１１により遠心させ、容器底部に沈降した複合体、及び未反応の抗体固定化蛍光粒子以外の検体及び試薬は、サンプリングプローブ５０７により容器５１０から廃液容器５０６へ移送される。さらに、サンプリングプローブ５０７により、洗浄液５０５を容器５１０内へ満たし、洗浄を行う。サンプリングプローブ５０７により、容器５１０内から廃液容器５０６へ、使用された洗浄溶液は移送される。サンプリングプローブ５０７により、希釈液５０３を容器５１０へ分注する。容器５１０内の複合体および抗体固定化蛍光粒子を溶液中に再分散させる。サンプリングプローブ５０７により、容器５１０内の複合体および抗体固定化蛍光粒子を含む溶液を反応容器５１０から検出容器５１４へ移送する。容器５１４には非特異吸着防止膜が形成されたプレートが設置されており（不図示）、光照射プローブ５１３を用いてこのプレート上を光照射し、非特異吸着防止膜に複合体を固定化する。非特異吸着防止膜に固定化された複合体以外の検体及び試薬は、サンプリングプローブ５０７により容器５１４から廃液容器５０６へ移送される。さらに、サンプリングプローブ５０７により、洗浄液５０５を容器５１４内へ満たし、洗浄を行う。サンプリングプローブ５０７により、容器５１４内から廃液容器５０６へ、使用された洗浄溶液は移送される。サンプリングプローブ５０７により、希釈液５０３を容器５１４へ分注する。複合体が固定化された非特異吸着防止膜に対して光源５１６で例えば波長４８５ｎｍの光を照射し、固定化された蛍光粒子から発せられる蛍光（例えば波長５１５ｎｍ）を検出プローブ５１５を用いて測定する。既知濃度の標的物質を用いて予め作成した検量線を基に、初期値と比較した蛍光量の変化量から、検体中の標的物質濃度を算出する。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明に係る標的物質の検出方法の概要を表す模式図である。
【図２】本発明に係る標的物質の検出方法の実施形態の一例を説明する模式図である。
【図３】本発明に係る標的物質の検出方法の実施形態の一例を説明する模式図である。
【図４】実施例１における測定システムの一例を表すブロック図である。
【図５】実施例２における測定システムの一例を表すブロック図である。
【符号の説明】
【００８９】
１０１．粒子
１０２．第１のリガンド分子
１０３．第２のリガンド分子
１０４．光照射結合部位
１０５．非特異吸着防止膜
１０６．基体
１０７．複合体
１０８．夾雑物
１０９．標的物質
２０１．粒子（磁性粒子）
２０２．第１のリガンド分子
２０３．第２のリガンド分子
２０４．光照射結合部位（例えば光親和性化合物）
２０５．非特異吸着防止膜
２０６．基体
２０７．複合体
２０８．夾雑物
２０９．標的物質
２１０．磁場発生装置（例えば磁石）
２１１．光照射装置
３０１．粒子
３０２．第１のリガンド分子
３０３．第２のリガンド分子
３０４．光照射結合部位（例えば光親和性化合物）
３０５．容器
３０６．複合体
３０７．夾雑物
３０８．標的物質
３０９．光照射装置
３１０．非特異吸着防止膜
４０１．検体液
４０２．第１のリガンド分子固定磁性粒子を含む試薬
４０３．光親和性化合物を有する第２のリガンド分子を含む試薬
４０４．希釈液
４０５．洗浄液
４０６．廃液容器
４０７．サンプリングプローブ
４０８．チューブ
４０９．ポンプ
４１０．検出容器
４１１．センサ素子
４１２．磁場発生装置
４１３．磁気信号検出器
４１４．光照射プローブ
４１５．光源
５０１．検体液
５０２．第１のリガンド分子固定蛍光粒子を含む試薬
５０３．光親和性化合物を有する第２のリガンド分子を含む試薬
５０４．希釈液
５０５．洗浄液
５０６．廃液容器
５０７．サンプリングプローブ
５０８．チューブ
５０９．ポンプ
５１０．反応容器
５１１．遠心分離機
５１２．光源
５１３．光照射プローブ
５１４．検出用容器（ウェルプレート）
５１５．検出プローブ
５１６．光源
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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