(57)【要約】【課題】本発明は秩序構造をもつ細胞シートであり、細胞シート形成速度が速く、そして、形成された細胞シートの剥離が容易である細胞シート製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】２次元方向に秩序構造をもつ細胞シートを製造する方法であって、  Ａ）凹部と凸部とが秩序的に配置された表面構造を有する細胞培養支持体を作成するステップ；  Ｂ）作成された細胞培養支持体の表面を高分子で被覆するステップ；Ｃ）高分子で被覆した細胞培養支持体に細胞を載せて培養を行うステップ；  および  D）細胞と細胞培養支持体とを流体力学的な力または機械的な力で剥離するステップ；を含む。【選択図】図１
2009178050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
秩序構造をもつ層状の細胞構造体の製造方法であって、
Ａ）凹部と凸部とが秩序的に配置された表面構造を有する細胞培養支持体を作成するステップ；
Ｂ）作成された細胞培養支持体の表面を高分子で被覆するステップ；
Ｃ）高分子で被覆した細胞培養支持体に細胞を載せて培養を行うステップ；
および
D）細胞と細胞培養支持体とを流体力学的な力または機械的な力により剥離するステップ；を含む方法。
【請求項２】
細胞培養支持体の表面は、凹部と凸部を有する構造を有するものであって、
Ａ）１つの凹部に単一の細胞を閉じ込めるために、凹部の幅は、細胞培養支持体に播種する細胞サイズよりも大きいこと；
B）１つの凹部に複数の細胞が閉じ込められないほどに、凹部の幅は狭いこと；
C）凹凸の高さは、凹部に閉じ込めた細胞が水平方向に運動できないほどに高いこと；
D）凹凸の高さは、凹部に閉じ込めた隣接する細胞が接触し、細胞間結合が形成できるほど低いこと；
および
E）凹部の周期は、隣接する細胞が短時間で細胞間結合を形成できるほどに短いこと；を満たす請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接着分子は、ポリLリジン、フィブロネクチン、ラミニン、またはコラーゲンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、基板に接着可能な接着細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記流体力学的な力は、液体の流れにより発生する力である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記機械的な力は、器具を用いて、機械的に細胞を剥離する力である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞が秩序的な構造をもつ層状の細胞構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞シートとは、隣接する細胞が、細胞間相互作用により結合し、少なくとも単層で連結されたシート状の細胞集合体である。細胞シートは再生医療のための材料として用いられている。細胞シートの作成において、シャーレなどの支持体上で細胞培養し、細胞間結合を破壊することなく、細胞を支持体から剥離する操作を行う。これまで細胞を支持体から剥離するために、刺激応答性高分子を支持体に固定した細胞培養支持体を用いる方法（特許文献１）や、微細加工技術により細胞培養支持体の天面に微細な凹凸を作成し、細胞の接触面積を変化させて、剥離を容易にする方法が提案されてきた（特許文献２、非特許文献１、２）。
【０００３】
従来の方法では、細胞支持体上で細胞を増殖させ、コンフルエントになった状態で細胞を細胞支持体から剥離する。従って、コンフルエントになるまで培養を行わなければならない。
【０００４】
従来の方法では、細胞の空間分布は制御されていない。細胞の位置は、その増殖や運動により決まる。従って、形成された細胞シートの面方向の構造は、ランダムである。
【０００５】
従来の方法では、外部環境を変化させて細胞と細胞培養支持体との相互作用を変化させることにより、細胞を細胞培養支持体から剥離する。従って、細胞培養支持体から剥離する条件は、必ずしも細胞培養に最適な条件とは言えない。
【０００６】
【特許文献１】特公平６−１０４０６１号公報
【特許文献２】特開２００８?１１７６６
【非特許文献１】M. J. Dalby et al., Biomaterials 25 (2004) 5415-5422
【非特許文献２】C. C. Berry et al., Biomaterials 25 (2004) 5781-5788
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明では、細胞培養支持体表面上において、細胞の配置を空間的に制御して、かつ高密度で培養を行うことにより、面方向に秩序構造をもつ細胞シートを短時間で作成することを目的とする。
【０００８】
本作成方法により、流体力学的な力または機械的な力を用いて、細胞を細胞支持体から剥離することができる。流体力学的な力は、液体の流れにより発生する力である。機械的な力は、ピンセットのような器具を用いて、機械的に細胞を剥離する力である。従って、温度、pHやイオン濃度のような環境を変化させる必要はない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下に示す細胞シートの製造方法に関する。
［１］面方向に秩序構造をもつ細胞シートを製造する方法であって、Ａ）凹部と凸部とが秩序的に配置された表面構造を有する細胞培養支持体を作成するステップ；Ｂ）作成された細胞培養支持体の表面を高分子で被覆するステップ；Ｃ）高分子で被覆した細胞培養支持体に細胞を載せて培養を行うステップ；およびD）細胞と細胞培養支持体とを流体力学的な力または機械的な力で剥離するステップ；を含む方法。
［２］前記細胞培養支持体は、微細加工技術により表面に凹凸を形成した、［１］に記載の方法。
［３］前記高分子は、ポリLリジン、フィブロネクチン、ラミニン、またはコラーゲンである、［１］〜［２］のいずれかに記載の方法。
［４］前記細胞は、細胞培養支持体に接着可能な細胞である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記流体力学的な力は、培養液の流れにより発生する力である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記機械的な力は、器具を用いて、機械的に細胞を剥離する力である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞培養支持体に細胞を高密度で配置することができる。従って、細胞を播種してから細胞培養支持体から剥離するまでは短時間になる。
【００１１】
本発明により、細胞シートの面方向の秩序構造を制御することができる。従って、細胞の機能と関係する細胞間結合の位置や結合数を制御することができる。
【００１２】
本発明で用いる秩序構造をもつ細胞培養支持体の表面は、ポリLリジン、フィブロネクチン、ラミニン、またはコラーゲンで被覆される。これは、プラスチックシャーレを用いるような通常の培養の条件と同じであるので、細胞支持体への被覆が容易である。
【００１３】
本発明では、細胞を細胞培養支持体から剥離するために、流体力学的な力または機械的な力を用いる。従って、温度、pH、イオン濃度のような外部環境を変化させる必要がない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
細胞培養支持体の表面は、以下の条件を凹部と凸部を有する必要がある。
（１）１つの凹部に単一の細胞を閉じ込めるために、凹部の幅は、細胞培養支持体に播種する細胞サイズよりも大きいこと。
（２）１つの凹部に複数の細胞が閉じ込められないほどに、凹部の幅は狭いこと。
（３）凹凸の高さは、凹部に閉じ込めた細胞が水平方向に運動できないほどに高いこと。
（４）凹凸の高さは、凹部に閉じ込めた隣接する細胞が接触し、細胞間結合が形成できるほど低いこと。
（５）凹部の周期は、隣接する細胞が短時間で細胞間結合を形成できるほどに短いこと。
【００１５】
以下、本発明の典型的な実施形態について、マウス由来の繊維芽様細胞（NIH3T3）を用いた形態を具体的に説明する。  
【００１６】
繊維芽細胞（NIH3T3）において、上記細胞培養支持体の条件を満たすサイズは、例えば、凹部が周期１５?２０μｍ、凹凸の高さが３?８μｍであるハニカム構造である。
【００１７】
細胞培養支持体は、カバーガラス基板を微細加工した。クロムを10nm、金を60nm、およびレジスト膜を2■3μmの順で被覆する。次に、UV露光によりレジスト膜のパターンをとり、金のウェットエッチング、そしてクロムのウェットエッチングにより支持体表面に秩序構造を形成する。
【００１８】
秩序的な凹凸表面構造をもつガラス基板を、ポリLリジン、フィブロネクチン、ラミニン、またはコラーゲンで被覆する。基板にコートする濃度は、細胞が基板に接着可能で、かつ、細胞基板間接着が細胞間接着よりも弱くなる条件であればよい。繊維芽細胞において、細胞接着分子としてラミニンを用いる場合、濃度は1.0 μg/cm2でよい。通常のガラス基板やプラスチックシャーレを表面被覆する条件であればよい。
【００１９】
細胞が単一層として高密度に載せることができる細胞濃度（例えば、1.2×106 cells/mL）の細胞懸濁液を細胞支持体上に添加して、１つの凹部に単一の細胞を配置する。図１は、１２時間培養した後の細胞位置を、核染色により観察した結果である。細胞は、９８％以上の充填率で凹部に閉じ込められており、細胞培養支持体と同じハニカム構造で配置されていることがわかる。
【００２０】
細胞を細胞培養支持体に配置する方法は、上記のように培養液を添加させる方法の他に、光ピンセットやマイクロピペットを用いて、単一の細胞を１つの凹部に配置することもできる。
【００２１】
繊維芽細胞（NIH3T3）の場合、培養時間が３時間以内で細胞培養支持体に接着することができる。また、細胞培養時間が３時間以上で、隣接する細胞の間で細胞間結合が形成され、細胞シートとして、細胞を細胞培養支持体から剥離することができる。
【００２２】
細胞を細胞培養支持体から剥離するためには、細胞培養支持体に接着した細胞に流体力学的な力または機械的な力を与える。最も簡便な方法の１つは、200μLのマイクロピペットを用いて細胞間結合が破壊しない程度の微小な流れ（例えば、流量200μL/sec）を細胞に与える。図２に示すように、細胞間結合を破壊することなく、細胞を細胞培養支持体から剥離できる。また、ピンセットを用いて機械的に剥離することができる。
【００２３】
細胞の剥離速度の条件は、培養時間や細胞のバイアビリティに依存し、細胞間結合が破壊されない速度であればよい。
【００２４】
細胞培養支持体から剥離した細胞シートは、平らな基板に再び接着させることも可能である（図３）。平らな基板に再接着した細胞シートは、秩序構造をもつ細胞で構成された表面材料として利用できる。
【００２５】
平板基板に秩序構造をもった細胞を接着させる方法として、マイクロコンタクトプリンティング法がある。これは、細胞接着タンパク質などの細胞と接着する分子を平板基板上にパターン化し、パターン化した領域内で細胞を接着させて、パターン構造と同じ細胞接着構造を作成するものである。しかし、この方法では、細胞間結合を有する高密度で細胞を基板上に構造化することが困難である。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
上記において、繊維芽細胞を例として具体的に実施形態を説明した、しかし、本発明は、繊維芽細胞を用いた細胞シートの作成に限定されるものではない。また、細胞培養支持体の凹凸構造は上記の構造やサイズに限定されない。細胞培養支持体の構造とサイズを変化させることにより、細胞シートの面方向の構造を制御し、細胞間結合の位置や結合数を自在に変化させることができる。従って、再生医療のための材料、細胞を用いたセンサー、また多数の細胞の検査試料として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】細胞培養支持体の凹部（１００）に閉じ込めた細胞の核染色（１０１）像。
【図２】細胞培養支持体に接着した細胞を剥離する過程の時間変化を矢印の向きで示している。細胞が細胞培養支持体から剥離する領域（２００）が増加し、接着している領域（２０１）が減少しながら、細胞シートとして、細胞培養支持体から完全に剥離する。
【図３】平板ガラス基板（３００）に再接着させた細胞シート（３０１）
【図１】
2009178050.tif 000003
【図２】
2009178050.tif 000004
【図３】
2009178050.tif 000005