(57)【要約】【課題】  脂肪の蓄積異常、特に脂肪の過剰蓄積に起因する肥満は、糖尿病、心臓病、動脈硬化等の他の生活習慣病を引き起こす万病の元凶であり、現代人にとって深刻な問題である。しかし、根本的な治療方法は確立されておらず、食事療法や運動療法を用いているのが現状である。そこで、脂肪蓄積異常を早期発見し、脂肪蓄積量を適切な量に調節し維持する方法が望まれている。【解決手段】  生物由来サンプルにおけるＤ−ドーパクロームトートメラーゼ（ＤＤＴ）遺伝子発現量の測定を包含する脂肪蓄積異常の検出方法、脂肪蓄積異常検出用試薬、抗肥満物質のスクリーニング方法、並びにＤＤＴまたはそれをコードする核酸を有効成分として含有する肥満の治療・予防剤。【選択図】図５
2009178073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来サンプルにおけるＤ−ドーパクロームトートメラーゼ遺伝子の発現量を測定し、そして
測定値を基準値となる健常者のＤ−ドーパクロームトートメラーゼ遺伝子の発現量と比較し、該測定値が基準値よりも低い場合に、過剰な脂肪蓄積が生じていると判断する
ことを包含する脂肪蓄積異常の検出方法。
【請求項２】
Ｄ−ドーパクロームトートメラーゼ検出用の試薬を包含する、脂肪蓄積異常検出用試薬。
【請求項３】
抗肥満物質のスクリーニング方法であって、
（１）成熟脂肪細胞を被検物質で処理し、
（２）処理した成熟脂肪細胞におけるＤ−ドーパクロームトートメラーゼ遺伝子の発現量を測定し、そして
（３）上記（２）の測定値が、被検物質によって処理していない成熟脂肪細胞におけるＤ−ドーパクロームトートメラーゼ遺伝子の発現量と比べて上昇している場合に、該被検物質を抗肥満物質と同定する
ことを包含する方法。
【請求項４】
Ｄ−ドーパクロームトートメラーゼまたはそれをコードする核酸を有効成分として含有する、肥満の治療・予防剤。
【請求項５】
成熟脂肪細胞においてＤ−ドーパクロームトートメラーゼ遺伝子の発現を亢進する物質を有効成分として含有する、肥満の治療・予防剤。
【請求項６】
請求項３の方法によって同定した抗肥満物質を有効成分として含有する、肥満の治療・予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪蓄積異常、特に肥満、に関連した、Ｄ−ドーパクロームトートメラーゼ（ＤＤＴ）及びそれをコードする核酸の用途に関する。更に詳細には、生物由来サンプルにおけるＤＤＴ遺伝子発現量の測定を包含する脂肪蓄積異常の検出方法、脂肪蓄積異常検出用試薬、抗肥満物質のスクリーニング方法、並びに肥満の治療・予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、脂肪組織が異常に増加した状態と定義されており、その原因は遺伝的なものではなく、環境因子によるところが大きい。肥満は、糖尿病、心臓病、動脈硬化等の他の生活習慣病を引き起こす万病の元凶であり、現代人にとって深刻な問題である。
【０００３】
脂肪組織は主に脂肪細胞で構成されている。脂肪細胞は、脂肪前駆細胞と呼ばれる内部に脂肪を含んでいない細胞から、細胞増殖因子や分化誘導物質の作用を受けて、内部に脂肪滴を含んでいる脂肪細胞に増殖・分化する。脂肪前駆細胞との関係において、脂肪細胞を成熟脂肪細胞と呼ぶこともある。
【０００４】
近年、脂肪組織は脂肪を蓄える機能を有するだけではなく、様々な生理活性物質を合成・分泌していることが明らかになってきた。これらの生理活性物質はアディポサイトカイン（adipocytokine）と呼ばれている。特に、肥満となった個体の脂肪組織においてはアディポサイトカインの産生異常が生じており、全身の糖・脂質代謝に重大な影響が及ぶことが知られている。例えば、ＬＩＰＥ（hormone sensitive lipase、ホルモン感受性リパーゼ）、ＦＡＳＮ（fatty acid synthase、脂肪酸合成酵素）やペリリピンをコードする遺伝子は、肥満者由来の成熟脂肪細胞において特異的に発現量が上昇しているが、その一方でレプチンをコードする遺伝子は、肥満者由来の成熟脂肪細胞においてその発現量が低下していることが知られている（特許文献１）。
【０００５】
上述したように、肥満との関連が知られている遺伝子やタンパク質は多数存在する。また、肥満の予防や治療を目的としてこのような肥満関連因子の発現を調節する医薬組成物に関する発明も多数存在する。例えば、肥満になると血中濃度が低下するアディポネクチンの発現を上昇させるための、ジンゲロール類を有効成分として含有する肥満の治療・予防剤（特許文献１）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）を抑制する活性を有する新規な単一のポリペプチド（特許文献２）、肥満に関連するシステインジオキシゲナーゼ（ＣＯＤ）の発現を調節する因子の検査方法及びスクリーニング方法（特許文献３）などが挙げられる。
【０００６】
また、非特許文献１によれば、痩せ（lean）マウスと比べて、肥満（obese）マウスにおいて発現量の低下が観察された遺伝子の１つはＤ−ドーパクロームトートメラーゼ（D-dopachrome tautomerase、ＤＤＴ）をコードする遺伝子である。ＤＤＴは種々の組織に偏在する１２ＫＤａの細胞内タンパク質であり、Ｄ−ドーパクロームを５，６−ジヒドロキシインドールに変換する酵素である。Ｄ−ドーパクロームを５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸に変換するトートメラーゼ活性を有するマクロファージ遊走阻止因子（macrophage migration inhibitory factor、ＭＩＦ）とＤＤＴは高い相同性を有し、構造の類似性も指摘されている（非特許文献１）。
【０００７】
ＤＤＴやＭＩＦなどのドーパクロームトートメラーゼの生理学的機能については未だ不明な点が多い。例えば、男性の不妊症の診断と治療にＭＩＦのＤＤＴ活性を用いる方法（特許文献４）が知られている。しかしながら、ＤＤＴ発現と脂肪細胞との関係については未だ不明な点が多く、肥満の検査、治療や予防を目的としたＤＤＴの使用に関する報告はない。
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−２４９０６４
【特許文献２】特開平６−２７７０６５
【特許文献３】特開２００６−６２３１
【特許文献４】ＷＯ ０３／０６５９７９
【非特許文献１】Sanchez et al.、Proteomics（独国）2003年、3巻、p.1500-1520
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
脂肪の蓄積異常、特に脂肪の過剰蓄積に起因する肥満は、糖尿病、心臓病、動脈硬化等の他の生活習慣病を引き起こす万病の元凶であり、現代人にとって深刻な問題である。しかし、根本的な治療方法は確立されておらず、食事療法や運動療法を用いているのが現状である。そこで、脂肪蓄積異常を早期発見し、脂肪蓄積量を適切な量に調節し維持する方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、上記の課題を解決するために、Ｄ−ドーパクロームトートメラーゼ（ＤＤＴ）またはそれをコードする核酸を用いることを特徴とする、脂肪蓄積異常の検出方法、脂肪蓄積異常検出用試薬、抗肥満物質のスクリーニング方法及び肥満の治療・予防剤を提供することにある。
【発明の効果】
【００１１】
新規なアディポサイトカインであるＤＤＴを使用することによって、脂肪細胞の分化機構や成熟脂肪細胞による脂肪分解機構について新たな観点から研究することが可能となり、肥満症の治療方法の確立にも繋げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者らは、上述の課題と実情に鑑み、長年にわたる深い洞察と試行錯誤の結果、ＤＤＴは分化初期の小さな脂肪細胞で分泌が亢進するが、肥大した成熟脂肪細胞で分泌量が低下することを発見した。このような特性を利用して、善玉である成熟脂肪細胞と悪玉である肥大した成熟脂肪細胞の識別にＤＤＴを用いることができる。また、肥大した成熟脂肪細胞ではＤＤＴの分泌量が低下することから、ＤＤＴタンパク質やそれをコードする核酸、またはＤＤＴ遺伝子の発現を亢進する物質が肥満の治療や予防に有効であると考えられる。
【００１３】
本発明によれば、前述の課題を解決するための手段として、次の［１］〜［６］項がそれぞれ提供される。
［１］生物由来サンプルにおけるＤ−ドーパクロームトートメラーゼ遺伝子の発現量を測定し、そして
測定値を基準値となる健常者のＤ−ドーパクロームトートメラーゼ遺伝子の発現量と比較し、該測定値が基準値よりも低い場合に、過剰な脂肪蓄積が生じていると判断する
ことを包含する脂肪蓄積異常の検出方法。
［２］Ｄ−ドーパクロームトートメラーゼ検出用の試薬を包含する、脂肪蓄積異常検出用試薬。
［３］抗肥満物質のスクリーニング方法であって、
（１）成熟脂肪細胞を被検物質で処理し、
（２）処理した成熟脂肪細胞におけるＤ−ドーパクロームトートメラーゼ遺伝子の発現量を測定し、そして
（３）上記（２）の測定値が、被検物質によって処理していない成熟脂肪細胞におけるＤ−ドーパクロームトートメラーゼ遺伝子の発現量と比べて上昇している場合に、該被検物質を抗肥満物質と同定する
ことを包含する方法。
［４］Ｄ−ドーパクロームトートメラーゼまたはそれをコードする核酸を有効成分として含有する、肥満の治療・予防剤。
［５］成熟脂肪細胞においてＤ−ドーパクロームトートメラーゼ遺伝子の発現を亢進する物質を有効成分として含有する、肥満の治療・予防剤。
［６］前記３項の方法によって同定した抗肥満物質を有効成分として含有する、肥満の治療・予防剤。
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
脂肪蓄積異常の検出方法と検出用試薬 
本発明は、Ｄ−ドーパクロームトートメラーゼ（ＤＤＴ）の新規なアディポサイトカインとしての特徴を利用した、ＤＤＴ及びそれをコードする核酸の新たな用途に関するものである。１つの態様として、生物由来サンプルにおけるＤ−ドーパクロームトートメラーゼ遺伝子発現量の測定を包含する、脂肪蓄積異常の検出方法及び検出用試薬を提供する。
【００１５】
本発明者らがＤＤＴと臨床データとの相関性について検討したところ、内臓脂肪組織中の成熟脂肪細胞におけるＤＤＴ遺伝子発現量と、ウエスト径、体重、ＢＭＩ、内臓脂肪面積、空腹時血糖、血清中性脂肪（ＴＧ）値及び血清尿酸値との間に負の相関が認められた。また、皮下脂肪組織中の成熟脂肪細胞におけるＤＤＴ遺伝子発現量と、ウエスト径、ＢＭＩ及び血清ＴＧ濃度との間に負の相関が認められた（本願の実施例１を参照）。更に本発明者らは、ＤＤＴは脂肪前駆細胞では発現しておらず、成熟脂肪細胞で発現しているが、脂肪滴が肥大するにつれてＤＤＴ発現量は低下することを見出した（実施例６を参照）。これらの知見によれば、脂肪細胞が過剰に脂肪を蓄積している状態においては、ＤＤＴ遺伝子の発現量が低下するので、ＤＤＴ遺伝子の発現量は脂肪蓄積異常の指標となる。
【００１６】
本発明の検出方法で使用する生物由来サンプルは、哺乳動物由来のサンプルであり、ＤＤＴ遺伝子の発現量を測定することができるものであれば特に限定はない。例えば、脂肪組織、脂肪組織から単離した脂肪細胞、血清などが挙げられる。脂肪組織には内臓脂肪組織と皮下脂肪組織があるが、本発明者らの研究によれば、内臓脂肪組織と皮下脂肪組織におけるＤＤＴ発現量に大差はない（本願の実施例４と図３を参照）。従って、脂肪組織やそこに含まれる脂肪細胞を生物由来サンプルとして用いる場合には、内臓脂肪組織と皮下脂肪組織のどちらでもかまわない。
【００１７】
生物由来サンプルにおけるＤＤＴ遺伝子の発現量は、ＲＮＡへの転写レベルとタンパク質への翻訳レベルの２つの段階のいずれかで測定すればよい。ＲＮＡへの転写レベルでＤＤＴ遺伝子発現量を測定する場合には、生物由来サンプルに存在するＤＴＴ遺伝子のｍＲＮＡ量を測定すればよく、ｍＲＮＡ量を測定する方法に特に限定はない。ＤＤＴ遺伝子の塩基配列は公知であり（例えば、配列番号１に示したＤＤＴの翻訳領域の塩基配列が挙げられ）、この塩基配列に基づいてＤＤＴ検出用プローブを設計することができる。検出用プローブとしては、ＤＤＴをコードする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ）のアンチセンス鎖の全長または一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（例えば、１５塩基以上）を有するものを使用することができる。生物由来サンプルが脂肪組織の場合には、in situ ハイブリダイゼーション法、後述する抗ＤＤＴ抗体を併用するin situ ＰＣＲ法などによって、ＤＤＴ遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１８】
タンパク質への翻訳レベルでＤＤＴ遺伝子発現量を測定する場合には、生物由来サンプルにおけるＤＤＴの存在量を測定すればよい。測定するＤＤＴは全長タンパク質でもよいが、ＤＤＴに特異的な特徴を有する限り、その部分ペプチドでもかまわない。ＤＤＴの存在量を測定する方法に特に限定はなく、例えば、抗ＤＤＴ抗体を用いた免疫学的な検出方法が挙げられる。抗ＤＤＴ抗体はＤＤＴタンパク質の全長または断片を用いて公知の方法で作製することもできるが、本願の実施例で使用したＤＤＴ−ＧＳＴモノクローナル抗体（Abnova製）のような、市販の抗体を使用してもよい。具体的には、抗ＤＤＴ抗体を用いた脂肪組織の免疫染色や、脂肪組織からのＤＤＴの単離・精製によって、生物由来サンプルにおけるＤＤＴタンパク質の存在量を測定することができる。また、ＤＤＴの酵素活性に基づいて、ＤＤＴタンパク質を定量することも考えられる。
【００１９】
脂肪細胞や血清などを生物由来サンプルとして用いる場合には、後述するスクリーニング方法の工程（２）で採用することのできる方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲやノーザンブロット法、でＤＤＴ ｍＲＮＡ量やＤＤＴ存在量を測定し、ＤＤＴ遺伝子発現量とすることができる。
【００２０】
本発明の検出方法で脂肪蓄積異常を検出する際には、ＤＤＴ遺伝子発現量の測定値を、基準値となる健常者のＤＤＴ遺伝子の発現量と比較し、測定値が基準値よりも低い場合に、過剰な脂肪蓄積が生じていると判断する。基準値となる健常者のＤＤＴ遺伝子の発現量は、生物由来サンプルを採取した生物と同種であり、且つ健常な（即ち、脂肪蓄積能が正常な）生物から採取した同種のサンプルについて測定した値とする。尚、「同種のサンプル」とは、生物由来サンプルと同じ種類の組織または細胞を意味する。基準値の計測に使用する測定方法は、脂肪蓄積異常の検出に使用する方法と同一でなくても良いが、測定誤差などのバラツキを低減するために、同じ方法であることが望ましい。基準値よりも低い測定値は過剰な脂肪蓄積を表していると考えられるが、測定値が基準値の４０％以下、より好ましくは２０％以下の場合に、過剰な脂肪蓄積が生じているか、生じやすい状態であると判断することができる。
【００２１】
生物由来サンプルにおける過剰な脂肪蓄積は、生物由来サンプルを提供した生物が既に肥満であるか、肥満になりやすい状態であることを意味する。従って、本発明の検出方法は、肥満の診断方法として使用することができる。
【００２２】
更に本発明は、ＤＤＴ検出用の試薬を包含する脂肪蓄積異常検出用試薬を提供する。
本発明の脂肪蓄積異常検出用試薬に含まれるＤＤＴ検出用の試薬は、本発明の脂肪蓄積異常検出方法において、ＤＤＴ遺伝子の発現量の測定に用いることのできる試薬であれば特に限定はない。例えば、ＤＤＴ遺伝子発現量の測定方法に関連して上述した、ＤＤＴ ｍＲＮＡを検出するための核酸プローブ（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ＤＤＴタンパク質を検出するための抗体、ＤＤＴの酵素活性を測定するための基質などが挙げられる。
【００２３】
本発明の脂肪蓄積異常検出用試薬を用いて生物由来サンプル中のＤＤＴ遺伝子発現量を測定することによって、肥満であるか、肥満になりやすい状態にある生物を検出することができる。従って、本発明の検出用試薬は肥満の診断剤として使用することができる。
【００２４】
抗肥満物質のスクリーニング方法 
他の１つの態様として、本発明は、（１）成熟脂肪細胞を被検物質で処理し、（２）処理した成熟脂肪細胞におけるＤＤＴ遺伝子の発現量を測定し、そして（３）上記（２）の測定値が、被検物質によって処理していない成熟脂肪細胞におけるＤＤＴ遺伝子の発現量と比べて上昇している場合に、該被検物質を抗肥満物質と同定することを包含する、抗肥満物質のスクリーニング方法を提供する。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法の工程（１）では、成熟脂肪細胞を被検物質で処理する。スクリーニングに使用する成熟脂肪細胞に特に限定はなく、生体試料から採取した成熟脂肪細胞でも、脂肪前駆細胞を分化誘導することにより調製した成熟脂肪細胞でもかまわない。また、成熟脂肪細胞は、肥大し、ＤＤＴ発現量の低下した成熟脂肪細胞でもよい。生体試料から脂肪前駆細胞または成熟脂肪細胞を採取する場合は、内臓脂肪（腸間膜脂肪）や皮下脂肪等から採取することができる。また、脂肪前駆細胞は凍結保存が可能であり、例えば、3T3-L1細胞、3T3-F442A細胞やHIB1B細胞は研究用に市販されているので、入手が容易である。脂肪前駆細胞を分化誘導する方法としては、例えば、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン等の分化誘導物質を添加した培地で脂肪前駆細胞を培養する方法が挙げられる。分化誘導用にあらかじめ調製された市販の培地を使用してもよい。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法に使用する被検物質に特に限定はなく、低分子化合物のみならず、ポリヌクレオチド、タンパク質やペプチド等のいかなる物質も適用可能である。
【００２７】
成熟脂肪細胞を被検物質で処理する方法に特に限定はなく、例えば、成熟脂肪細胞を被検物質の存在下で培養すればよい。この際の培養方法にも特に限定はなく、一般的な動物細胞の培養方法をそのまま適用することができる。培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０等の基礎培地に仔ウシ血清等の成分を適宜添加したものを用いることができる。また、市販の脂肪細胞培養用にあらかじめ調製された培地を用いてもよい。
【００２８】
被験物質の存在量（培養脂肪細胞への添加量）及び培養脂肪細胞への添加スケジュールは被試験物質の溶解性、物理的性質、特性等を考慮して適宜選択することができるが、成熟脂肪細胞の増殖を阻害しない範囲から選択することが好ましい。例えば、被検物質の最終濃度が０．００１〜５００μＭの範囲内になるように添加すればよい。具体的には、被験物質を培養液に溶解し、それを細胞培養上清に終濃度が上記範囲内となるように添加し、更に１〜３日間細胞を培養することができる。被検物質が脂肪酸などの非水溶性物質の場合は、超音波処理により適当な溶液に懸濁した後、培養細胞に添加することができる。
【００２９】
工程（２）においては、処理した成熟脂肪細胞におけるＤＤＴ遺伝子の発現量を測定する。ＤＤＴ遺伝子の発現量は、ＲＮＡへの転写レベルとタンパク質への翻訳レベルの２つの段階で測定することができる。ＲＮＡへの転写レベルでＤＴＴの発現量を測定する場合は、ＤＴＴ遺伝子のｍＲＮＡ量を測定する。この際の測定試料は、成熟脂肪細胞から全ＲＮＡを抽出することによって調製することができる。全ＲＮＡを成熟脂肪細胞から抽出する際には公知の方法が使用でき、例えば、グアニジンチオシアネート／塩化セシウム法により抽出することができる。その他、市販のＲＮＡ抽出キットを使用することにより、全ＲＮＡを簡便に抽出することもできる。また、ＤＴＴ遺伝子のｍＲＮＡ量を測定する方法としては、ＤＴＴ遺伝子のｍＲＮＡを特異的に定量できる方法であれば特に制限はなく、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、ノーザンブロット等を用いることができる。特に、ＲＴ−ＰＣＲは簡単かつ迅速にＤＴＴ遺伝子のｍＲＮＡ量を測定できるので、きわめて好適である。ＲＴ−ＰＣＲを行うためのプライマーは、公知のＤＴＴ遺伝子の塩基配列（例えば、本願の配列番号１の塩基配列）に基づいて設計することができる。このようなプライマーの一例として、本願の実施例４で使用したプライマー（配列番号２と３）が挙げられる。
【００３０】
一方、タンパク質の定量によってＤＴＴ遺伝子の発現量を測定する場合は、成熟脂肪細胞の細胞内にあるＤＴＴ量と、成熟脂肪細胞が分泌したＤＴＴ量のいずれかを測定することができる。細胞内のＤＴＴ量を測定する場合は、成熟脂肪細胞の抽出液を測定試料とすることができる。例えば、成熟脂肪細胞を遠心分離等の方法で回収した後、低張処理あるいは機械的処理等によって細胞を破砕し、細胞抽出液を得ることができる。得られた細胞抽出液は必要に応じて粗精製等の前処理を行ってもよい。成熟脂肪細胞が分泌したＤＴＴ量を測定する場合は、例えば、培養上清やその濃縮物を測定試料とすればよい。ＤＴＴ量を測定する方法としては、ＤＴＴを特異的に測定できる方法であればよく、例えば、市販のＤＴＴ特異的抗体を使用した免疫測定法やウェスタンブロッティングを用いることができる。免疫測定法の例としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等が挙げられる。
【００３１】
続いて工程（３）では、上記（２）の測定値を、被検物質によって処理していない成熟脂肪細胞におけるＤＤＴ遺伝子の発現量と比較する。被検物質によって処理していない成熟脂肪細胞におけるＤＤＴ遺伝子の発現量は、上記（２）の測定値（即ち、被検物質によって処理した成熟脂肪細胞におけるＤＤＴ遺伝子の発現量）と同じ方法で測定する。尚、測定誤差などの測定値への影響を低減し、より正確な比較を行うために、被検物質によって処理した場合も、処理なしの場合も、測定値を内部標準などで補正してから比較することが望ましい。
【００３２】
上述したように、ＤＤＴの発現は、脂肪前駆細胞にはなく、分化初期の小さな脂肪細胞では亢進し、肥大した成熟脂肪細胞では低下する。ＤＤＴの発現は成熟脂肪細胞の肥大と密接な関係があり、ＤＤＴ発現の上昇は、成熟脂肪細胞の肥大（即ち、脂肪蓄積）の予防または低減につながると考えられる。そのため、本発明においては、成熟脂肪細胞におけるＤＤＴ遺伝子の発現量を上昇させる被検物質を抗肥満物質と同定する。本発明のスクリーニング方法によって同定された抗肥満物質は、後述する肥満の治療・予防剤の有効成分として有用である。また、ＤＤＴ遺伝子の発現に影響を与える抗肥満物質は、脂肪細胞の分化機構や成熟脂肪細胞による脂肪分解機構について新たな観点から研究する上で有用であると考えられる。
【００３３】
肥満の治療・予防剤 
更に別の態様においては、本発明は、ＤＤＴまたはそれをコードする核酸、あるいは成熟脂肪細胞においてＤＤＴ遺伝子の発現を亢進する物質を有効成分として含有する、肥満の治療・予防剤を提供する。上述したように、ＤＤＴの発現は脂肪前駆細胞にはなく、分化初期の小さな脂肪細胞では亢進し、肥大した成熟脂肪細胞では少なくなる。ＤＤＴの存在量と成熟脂肪細胞の肥大との間には負の相関関係があるので、ＤＤＴやそれをコードする核酸、あるいはＤＤＴ遺伝子の発現量を上昇させる物質を患者に投与し、肥大した成熟脂肪細胞に存在するＤＤＴ量を上昇させることによって、脂肪細胞の肥大を減少または防止し、その結果、肥満を治療・予防することができる。
【００３４】
本発明の治療・予防剤の有効成分として使用するＤＤＴはそのアディポサイトカインとしての機能を有する限り特に限定はない。従って、全長ＤＤＴタンパク質のみならず、その部分ペプチドを使用することもできる。
【００３５】
ＤＤＴ遺伝子の発現を亢進する物質も本発明の治療・予防剤の有効成分として使用することができる。ＤＤＴ遺伝子の発現を亢進する物質としては、本発明のスクリーニング方法によって同定した抗肥満物質が好ましい。
【００３６】
本発明の治療・予防剤は経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。経口的に投与する場合には、本発明の治療・予防剤の剤形に特に限定はなく、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、本発明の治療・予防剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。前記形態の治療・予防剤を非経口的に投与する方法としては、例えば、注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
【００３７】
本発明の治療・予防剤は、有効成分の他に、薬学的に許容される担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等を含有してもよい、また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
【００３８】
本発明の治療・予防剤の有効成分として使用するＤＤＴをコードする核酸も、アディポサイトカインとしての機能を有するＤＤＴをコードする核酸であれば特に限定はなく、ＤＮＡでもＲＮＡでもかまわない。また、全長塩基配列のみならず、ｃＤＮＡや部分配列も使用することができる。公知の遺伝子治療の技術に基づいてこのような核酸を包含する薬剤を調製することができる。このような薬剤を細胞または生体に導入し、ＤＤＴ発現量を増加させることによって、成熟脂肪細胞の肥大を減少または防止し、肥満を予防または治療することが考えられる。
【００３９】
本発明の治療・予防剤の投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度や現在のＤＤＴレベル、有効成分の種類、投与形態等に基づいて、適宜選択することができる。また、１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００４０】
また、本発明の治療・予防剤は、他の適当な抗肥満薬、例えば、食欲抑制剤、腸管吸収抑制剤、消化酵素阻害剤、代謝昂進ホルモン剤、脂肪合成阻害剤、インスリン分泌抑制剤と併用して用いてもよい。更に食事療法、運動療法とも併用して用いられ得る。この場合、他の抗肥満薬単独での処置の活性または効果、並びに他の抗肥満療法単独での処置の効果を増進し得る。
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
Ｄ−ドーパクロームトートメラーゼと臨床データとの相関性 
Ｄ−ドーパクロームトートメラーゼ（ＤＤＴ）と肥満に関連する臨床データとの相関性について検討するために、同一患者から内臓脂肪組織と皮下脂肪組織を採取した（患者数は２０例）。採取した脂肪組織の一部分を成熟脂肪細胞と間質・血管画分（stromal-vascular fraction、ＳＶＦ）細胞に分画し、脂肪組織全体、成熟脂肪細胞、ＳＶＦ細胞のそれぞれから全ＲＮＡを抽出した。脂肪組織の分画と全ＲＮＡの抽出は、後述する実施例４と同様に行った。
【００４３】
抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にてＤＤＴのｍＲＮＡ量を測定した。得られたＤＤＴ ｍＲＮＡ量と、ウエスト径、体重、ＢＭＩ、内臓脂肪面積、空腹時血糖、血清中性脂肪（トリグリセリド、ＴＧ）値、血清尿酸値を含む臨床パラメータとの相関解析は、Personの相関係数をSPSS 14.0J for windows（ＳＰＳＳ社製）で算出することによって行った。尚、脂肪面積の測定は、Fat Scan V3.0（Ｎ２システム社製）を用いて行った。
【００４４】
その結果、内臓脂肪組織中の成熟脂肪細胞におけるＤＤＴ遺伝子発現量と、ウエスト径、体重、ＢＭＩ、内臓脂肪面積、空腹時血糖、血清ＴＧ値及び血清尿酸値との間に負の相関が認められ、皮下脂肪組織中の成熟脂肪細胞におけるＤＤＴ遺伝子発現量と、ウエスト径、ＢＭＩ及び血清ＴＧ値との間に負の相関が認められた。
【実施例２】
【００４５】
Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付加したＤＤＴの発現 
ＤＤＴが分泌蛋白であるか否かについて確認するために、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付加したＤＤＴ（DDT-CFLAG）を２９３ＦＴ細胞に発現させ、その培養上清にＦＬＡＧ抗体陽性シグナルが認められるか否かを検証した。
【００４６】
ヒト脂肪前駆細胞であるＳＧＢＳ細胞を後述する実施例５と同様に脂肪細胞に分化させ、そこからｃＤＮＡを調製し、ヒトＤＤＴの翻訳領域ｃＤＮＡ（配列番号１）をＰＣＲで増幅した。次に、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１＋（Invitrogen社製）のBamHI−EcoRI間にＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡを挿入したものを準備し、該プラスミドのHindIII−BamHI間に、ヒトＤＤＴの翻訳領域ｃＤＮＡを挿入することで、ヒトＤＤＴをサブクローニングした（DDT-CFLAG 発現ベクター）。尚、対照実験として、空のベクター、分泌蛋白質であるYKL-40の遺伝子を組み込んだベクター（ポジティブコントロール）及び分泌性ではないパラフィブロミン（ＰＦＣ）の遺伝子を組み込んだベクター（ネガティブコントロール）も用意した。
【００４７】
６穴ディッシュにおいて、培地として１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用い、２９３ＦＴ細胞を８０％コンフルエントまで培養した。各ベクターについて２ウェルの細胞を用意した。１ウェルに付き０．５μｇの発現ベクターを使用し、Effectene Transfection Reagent（QIAGEN社製）のプロトコールに従って、発現ベクターを細胞に導入した。
【００４８】
発現ベクターの導入から２４時間後には、１ウェルの細胞を細胞融解バッファー（５０ｍＭ Tris-Cl（pH 8.0）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Nonidet P-40）に溶解して細胞融解物を回収し、これを発現確認用サンプルとした。残りの１ウェルについては、発現ベクターの導入から２４時間後にウェルをＰＢＳで３回洗浄した。次に、２ｍｌのＦＢＳを含まないＤＭＥＭを加えて更に２４時間培養し、上記と同様に培養上清を回収した。回収した培養上清のうちの２０μｌは、ウェスタンブロッティングのための培養上清サンプルとして保存した。
【００４９】
回収した培養上清の残りを２，０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた上清を０．４５μｍのフィルターで濾過した。次に４倍量の冷アセトン（８ｍｌ）を加え、−８０℃で１時間放置後、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、残った沈殿を５０μｌの０．１％ Triton-Xを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）５０μｌに懸濁し、濃縮培養上清とした。
【００５０】
DDT-CFLAG発現ベクター導入細胞及び対照実験（空のベクターを導入した細胞、YKL-40発現ベクターを導入した細胞とＰＦＣ発現ベクターを導入した細胞）のそれぞれから調製した細胞融解物、培養上清及び濃縮培養上清について、ウェスタンブロッティングを行った。具体的には、各サンプルに１／４量の５×ＳＤＳバッファーを加えて煮沸した後、１５％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した。展開したタンパク質のバンドをImmobilon-P（Millipore社製）ＰＶＤＦ膜に転写し、２，０００倍に希釈したマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（SIGMA製）及び８０，０００倍に希釈したのＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（GE Healthcare社製）と共にＰＶＤＦ膜をインキュベートし、Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（Millipore社製）を用いて抗体と結合したバンドを検出した。結果を図１に示す。
【００５１】
図１から明らかなように、対照となる分泌蛋白ＹＫＬ４０の陽性シグナルは２９３ＦＴ細胞の培養上清原液及び濃縮培養上清（レーン７と１１）に認められたものの、ＤＤＴのシグナルは培養上清原液（レーン６）には認められなかった。しかし、濃縮培養上清（レーン１０）からはＤＤＴのシグナルが認められた。このことからＤＤＴは少量ながら培養上清中に分泌されていることが判明した。
【実施例３】
【００５２】
抗ヒトＤＤＴ抗体を使用したＤＤＴの検出 
同一患者から採取した内臓脂肪組織と皮下脂肪組織をそれぞれコラゲナーゼで処理し、成熟脂肪細胞を単離した。単離した成熟脂肪細胞をCellmatrix コラーゲンゲル培養キット（新田ゼラチン社製）のプロトコールに従い、１０％ NCS-Ham's F12培地を用いてコラーゲンゲル包埋培養を行った。
【００５３】
培養した内臓脂肪由来の成熟脂肪細胞と皮下脂肪由来の成熟脂肪細胞について、実施例２と同様に発現確認用のサンプル、培養上清と濃縮培養上清を調製した。次に、マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体の代わりに１０００倍に希釈した抗ヒトＤＤＴ抗体（ＤＤＴ−ＧＳＴモノクローナル抗体、Abnova製）を用いる以外は実施例２と同様にウェスタンブロティングを行った。また、抗ヒトＤＤＴ抗体がＤＤＴを認識することを確認するために、実施例２で調製したDDT-CFLAG発現ベクター導入細胞の細胞融解物と培養上清もサンプルとして使用し、更に１０００倍に希釈したマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロティングも行った。結果を図２に示す。
【００５４】
図２から明らかなように、内臓脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞と皮下脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞のコラーゲンゲル包埋培養の培養上清からは、ＤＤＴ陽性シグナルを検出することはできなかった。この結果は、ＤＤＴの分泌濃度は非常に少ないことを示している。
【実施例４】
【００５５】
脂肪組織におけるＤＤＴ発現細胞の同定（１） 
同一患者から内臓脂肪組織と皮下脂肪組織を採取した（患者数は２０例）。１〜２ｇの脂肪組織をハサミで細切し、０．２％ コラゲナーゼ（Collagenase S-1；新田ゼラチン社製）と０．２％ ＢＳＡを含むＭＥＭ培地に加え、３７℃で２０分間ゆっくりと攪拌し、細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液をメッシュフィルター（１０4×１２１μｍ；共進理工社製）で濾過し、９００ｒｐｍで２分間遠心した。遠心サンプルの最上層を成熟脂肪細胞画分、沈殿をＳＶＦ細胞画分として回収した。それぞれの画分を１０％ NCS-Ham's F12培地で２回洗浄後、全ＲＮＡを抽出した。成熟脂肪細胞からの全ＲＮＡ抽出はRNeasy Lipid Tissue Kit（QIAGEN社製）で行い、ＳＶＦ細胞からの全ＲＮＡ抽出はトリゾール（Invitrogen社製）を用いて行った。
【００５６】
０．５μｇの全ＲＮＡから、Primescript RT reagent Kit（TaKaRa社製）を用いて２０μｌの系でｃＤＮＡ合成を行った。合成したｃＤＮＡを２０μｌのＴＥバッファーで希釈し、希釈したｃＤＮＡ １μｌをPower SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems社製）によるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに付し、ＤＤＴ ｍＲＮＡ量を測定した。ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９５℃で１０分間変性させた後、９５℃で１５秒、６０℃で１分を４５サイクル実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨ、ＴＢＰ、ＨＰＲＴ１の３種を用い、ＤＤＴ ｍＲＮＡ量を補正した。ＤＤＴ、ＧＡＰＤＨ、ＴＢＰ及びＨＰＲＴ１のｍＲＮＡ量の測定に使用したプライマーは以下の配列である。
ＤＤＴ：
フォワード： TCCATCCTGGGCAAACCTG（配列番号２）
リバース：   GGGCTAGCTCCTTGGTGAGAAAC（配列番号３）
ＧＡＰＤＨ：
フォワード： GAAGGTGAAGGTCGGAGTC（配列番号４）
リバース：   GAAGATGGTGATGGGATTTC（配列番号５）
ＴＢＰ：
フォワード： TGCTGCGGTAATCATGAGGATA（配列番号６）
リバース：   TGAAGTCCAAGAACTTAGCTGGAA（配列番号７）
ＨＰＲＴ１：
フォワード： GGCAGTATAATCCAAAGATGGTCAA（配列番号８）
リバース：   GTCAAGGGCATATCCTACAACAAAC（配列番号９）
【００５７】
結果を図３に示す。（尚、使用したサンプル数は２０例だったが、その内の３例については内部標準物質の測定値が小さかったため、図３の結果には含めなかった。）
図３から明らかなように、ＳＶＦ画分に比べて、成熟脂肪細胞画分にＤＤＴ ｍＲＮＡの発現が高いことが認められた。成熟脂肪細胞画分のＤＤＴ ｍＲＮＡ発現量については、内臓脂肪と皮下脂肪の間では大きな差は認められなかった。
【実施例５】
【００５８】
脂肪組織におけるＤＤＴ発現細胞の同定（２） 
ヒト脂肪前駆細胞株であるＳＧＢＳ細胞を培養し、成熟脂肪細胞に誘導した。具体的には、６穴ディッシュで１００％コンフルエントに培養したＳＧＢＳ細胞に分化培地（ＤＭＥＭ／ＨＡＭ＝１：１、０．０１ｍｇ／ｍｌ トランスフェリン、２０ｎＭ インスリン、１０μＭ コルチゾル、２００ｐＭ 甲状腺ホルモン（Ｔ３）、２５ｎＭ デキサメタゾン、５００μＭ ＩＢＭＸ、２μＭ トログリタゾン）を加えて４日間培養し、続いて培地を維持培地（ＤＭＥＭ／ＨＡＭ＝１：１、０．０１ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、２０ｎＭ インスリン、１０μＭ コルチゾル、２００ｐＭ Ｔ３）に交換して更に培養した。維持培地は３日ごとに交換した。
【００５９】
分化誘導開始から９日目の細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１０％ホルマリンで１０分間の固定を行った。固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．２％ Triton-Xと共に１０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、そこに２５０倍に希釈したマウスＤＤＴモノクローナル抗体（Abnova社製）あるいは２５０倍に希釈したマウスPref-1抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を加え、２時間反応させた。マウスPref-1抗体は脂肪前駆細胞を検出するために使用した。ＰＢＳで３回洗浄した後に、Alexa488標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular Probe社製）を加え、３７℃で３０分間反応させた。細胞をＰＢＳで６回洗浄した後、倒立顕微鏡（ＴＥ２０００Ｕ、ニコン社製）の下で観察した。尚、細胞核を染色するＤＡＰＩ染色も行った。蛍光画像はDIGITAL SIGHT DS-L1（ニコン社製）を用い、露光時間１秒の条件で撮影した。結果を図４に示す。
【００６０】
図４から明らかなように、脂肪滴をもった細胞がＤＤＴ−Alexa488陽性に発色したが、脂肪前駆細胞から陽性シグナルは観察されなかった。これらの結果から、ＤＤＴは成熟脂肪細胞で発現していることが確認された。
【実施例６】
【００６１】
脂肪前駆細胞の分化誘導におけるＤＤＴ発現の変動 
実施例５と同様にヒト脂肪前駆細胞株であるＳＧＢＳ細胞を培養し、成熟脂肪細胞に誘導した。誘導開始から０日、３日、６日、９日と１２日目に細胞をサンプリングし、その全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡの抽出は、ＲＮＡ抽出試薬としてＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて行った。
【００６２】
抽出した全ＲＮＡについて、実施例４と同様にＤＤＴのｍＲＮＡ量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。その際、内部標準としてＧＡＰＤＨを用いた。結果を図５の（Ａ）に示す。また、誘導開始から６日目、９日目と１２日目のＳＧＢＳ細胞の可視光での観察写真を図５の（Ｂ）に示す。
【００６３】
脂肪細胞は分化誘導後の日数が経過するにつれて脂肪滴が肥大してくることが図５の（Ｂ）から明らかである。更に図５の（Ａ）の結果からは、誘導開始３日目からＤＤＴの遺伝子発現が上昇し、６日目で発現はピークに達し、それ以降、脂肪細胞の脂肪滴が大きくなるにつれてＤＴＴ遺伝子の発現が減少する傾向が見られる。
【実施例７】
【００６４】
組み換えヒトＤＤＴの作製 
脂肪細胞に分化させたＳＧＢＳ細胞のｃＤＮＡを調製し、そこからヒトＤＤＴの翻訳領域ｃＤＮＡ（配列番号１）をＰＣＲで増幅した。次にヒトＤＤＴの翻訳領域ｃＤＮＡを発現ベクターｐＧＥＸ６ｐ−３（GE Healthcare社製）のBamHI−NotI間に挿入してＤＤＴ−ＧＳＴ融合蛋白発現ベクターを構築した。
【００６５】
ＤＤＴ−ＧＳＴ融合蛋白発現ベクターで大腸菌株ＢＬ２１（TaKaRa社製）を形質転換した。形質転換した細胞を、最終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５００ｍｌのＬＢ培地を用いて、ＯＤ ６００ｎｍが０．５になるまで培養した。続いて、最終濃度が０．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えて１６℃で一晩振とう培養した。培養液を６，０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿（菌体）を回収し、１０ｍｌのソニケーションバッファー（５０ｍＭ Tris-Cl（pH 8.0）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁した。菌体の懸濁液を超音波処理に付して大腸菌を破砕した。そこに終濃度が１％になるようにTriton-Xを加え、遠心分離した。得られた上清を可溶化画分として回収し、沈殿を１０ｍｌのＰＢＳ−Ｔに懸濁して不溶性画分とした。可溶化画分と不溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、可溶性画分からはＤＤＴ−ＧＳＴ融合蛋白質と推定されるサイズ（３７ｋＤａ）にバンドが確認された。
【００６６】
４℃の条件下でGlutathione Sepharose 4B（GE Healthcare社製）をカラムに充填し、カラム体積の５倍量のＰＢＳ−Ｔで平衡化した。そこに可溶性画分を添加し、カラム体積の５倍量のＰＢＳ−Ｔで洗浄した。１６０ ＵのPreScission プロテアーゼ（GE Healthcare社製）をカラムに添加し、４℃で１６時間インキュベートすることによりカラム中でＧＳＴとＤＤＴを切り離した。４ｍｌのソニケーションバッファーでＤＤＴを溶出し、この溶出画分を新しいGlutathione Sepharose 4B充填カラムに添加し、素通り画分をＤＤＴ画分として回収した。ＤＤＴの精製確認はＳＤＳ−ＰＡＧＥとＣＢＢ染色、抗ＤＤＴ抗体によるウェスタンブロッティング、及び質量分析により行った。
【００６７】
最後に５ｍｌ容のZeba Desalt Spin Column（Pierce社製）でＤＴＴを脱塩し、ＰＢＳにバッファー置換を行った。蛋白質の定量をBradford法で行ったところ、２．５ｍｇ／ｍｌ（２００μＭ）のＤＤＴ溶液が４ｍｌ得られた。この溶液を精製ＤＤＴ画分とした。
【００６８】
精製ＤＤＴ画分、分化誘導開始から３日目、６日目、９日目と１２日目のＳＧＢＳ細胞の濃縮培養上清、分化誘導開始から９日目の細胞融解物、及び実施例２と同様に調製したDDT-CFLAG発現ベクター導入細胞の細胞融解物について、ＤＤＴ抗体によるウェスタンブロッティングを行った。結果を図６に示す。
【００６９】
図６から明らかなように、精製ＤＤＴ画分（レーン６）からは、ＤＤＴ抗体で強いシグナルが得られた。この結果は、ＤＤＴが正常に精製されたことを示している。
【実施例８】
【００７０】
成熟脂肪細胞における遺伝子発現に対するＤＤＴの影響 
６穴ディッシュを用いて、ヒト脂肪前駆細胞株であるＳＧＢＳ細胞を実施例５と同様に成熟脂肪細胞に分化誘導した。分化誘導開始から９日目の細胞をＰＢＳで３回洗浄した後に、以下の成分のいずれかを培養細胞に添加した：２ｍｌ ＤＭＥＭ（DMEM）、１００ｎｇ／ｍｌ ＧＨ（GH）、２．５μｇ／ｍｌ 組み換えＤＤＴ（DDT）、１／１０００倍希釈した精製ＹＫＬ−４０（微量と思われる）（YKL）、５０％ マクロファージ培養上清（Mphage CM）、５０％ ＤＤＴ−ＣＦＬＡＧ発現２９３ＦＴ培養上清（DDT-FT CM）及び５０％ ベクター発現２９３ＦＴ培養上清（V FT CM）。尚、上記濃度は最終濃度であり、添加物の容量が２ｍｌとなるようにＤＭＥＭも添加した。
【００７１】
成分の添加後に更に２４時間培養し、各細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。次に、以下の遺伝子発現量をｍＲＮＡの定量によって測定した：ａＰ２、ＰＰＡＲγ、アディポネクチン、レプチン、ＡＥＢＰ−１、ＬＩＰＥ（ホルモン感受性リパーゼ）、ＩＮＳＲ（インシュリン受容体）、ＰＬＩＮ（ペリリピン）、ＧＬＵＴ４、ＤＧＡＴ２（ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼホモログ２）、ＦＡＳＮ（脂肪酸シンターゼ）、ＧＰＡＭ（グリセロール ３−リン酸アシルトランスフェラーゼ）、ＭＣＰ−１及びＩＬ−６。具体的には、０．５μｇの全ＲＮＡからPrimescript RT reagent Kit（TaKaRa社製）を用いて、２０μｌの系でｃＤＮＡ合成を行った。合成したｃＤＮＡを２０μｌのＴＥバッファーで希釈し、希釈したｃＤＮＡ １μｌについて、Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems社製）によるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、各遺伝子のｍＲＮＡ量を測定した。ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９５℃で１０分間変性させた後、９５℃で１５秒、６０℃で１分を４５サイクル実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを用い、ｍＲＮＡ量を補正した。結果を図７Ａ〜図７Ｃに示す。
【００７２】
図７Ａ〜図７Ｃから明らかなように、ＤＤＴで成熟脂肪細胞を処理しても、脂肪細胞の分化マーカーであるａＰ２遺伝子、ＰＰＡＲγ遺伝子、アディポネクチン遺伝子やレプチン遺伝子、脂肪前駆細胞マーカーであるＡＥＢＰ−１遺伝子には変動が見られなかった（図７Ａ）。脂質代謝に関わる遺伝子群については、組み換えＤＤＴによる処理によってＬＩＰＥ遺伝子の発現量が約２倍に上昇した（図７Ｂ）。また、ＩＮＳＲ遺伝子、ＰＬＩＮ遺伝子、ＧＬＵＴ４遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子、ＦＡＳＮ遺伝子、ＧＰＡＭ遺伝子の発現にも変動は見られなかった（図７Ｂ）。更に、炎症性サイトカインであるＭＣＰ−１やＩＬ−６の遺伝子発現にも影響は見られなかった（図７Ｃ）。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
新規なアディポサイトカインであるＤ−ドーパクロームトートメラーゼ（ＤＤＴ）を使用することによって、脂肪細胞の分化機構や成熟脂肪細胞による脂肪蓄積や脂肪分解機構について新たな観点から研究することが可能となり、肥満の治療方法の確立にも繋げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付加したＤＤＴを発現するベクターを導入した２９３ＦＴ細胞（DDT-CFLAG）及び対照実験となる細胞［空のベクターを導入した細胞（Vector）、YKL-40発現ベクターを導入した細胞（YKL40CHA）とＰＦＣ発現ベクターを導入した細胞（PFCFLAG）］のそれぞれから調製した細胞融解物、培養上清及び濃縮培養上清について、ＦＬＡＧ抗体を用いて行ったウェスタンブロッティング。レーン１〜４：細胞融解物（lysate）、レーン５〜８：培養上清（CM）、レーン９〜１２：濃縮培養上清（CM conc.）であり、４つのレーンからなるグループにおけるサンプルの順番は、Vector、DDT-CFLAG、YKL40CHA、そしてPFCFLAGである。
【図２】内臓脂肪組織由来の成熟脂肪細胞と皮下脂肪組織由来の成熟脂肪細胞のそれぞれから調製した培養上清と濃縮培養上清について、（Ａ）抗ヒトＤＤＴ抗体を用いて行ったウェスタンブロッティング、および（Ｂ）抗ＦＬＡＧ抗体を用いて行ったウェスタンブロッティング。レーン１：空のベクターを導入した２９３ＦＴ細胞の細胞融解物、レーン２：ＤＤＴ−ＣＦＬＡＧ発現ベクターを導入した２９３ＦＴ細胞の細胞融解物、レーン３：内臓脂肪組織由来の成熟脂肪細胞の培養上清、レーン４：皮下脂肪組織由来の成熟脂肪細胞の培養上清、レーン５：内臓脂肪組織由来の成熟脂肪細胞の濃縮培養上清、レーン６：皮下脂肪組織由来の成熟脂肪細胞の濃縮培養上清。
【図３】内臓脂肪組織と皮下脂肪組織のそれぞれから調製した成熟脂肪細胞画分とＳＶＦ細胞画分におけるＤＤＴ遺伝子発現量の比較。ＤＤＴ遺伝子の発現量はｍＲＮＡ量として測定し、内部標準のｍＲＮＡ量を用いて補正した。（Ａ）〜（Ｃ）はそれぞれ異なる内部標準を用いた結果であり、（Ａ）はＧＡＰＤＨ、（Ｂ）はＴＢＰ、（Ｃ）はＨＰＲＴ１である。
【図４】ＳＧＢＳ細胞を分化誘導した成熟脂肪細胞のAlexa488蛍光免疫染色。（Ａ）マウスＤＤＴモノクローナル抗体を用いた結果、および（Ｂ）マウスPref-1抗体を用いた結果。
【図５】ＳＧＢＳ細胞の成熟脂肪細胞への分化誘導におけるＤＤＴ発現の変動。（Ａ）分化誘導開始から０日、３日、６日、９日と１２日目の細胞における、ＤＤＴ遺伝子発現量の変化。（Ｂ）分化誘導開始から６日目、９日目と１２日目のＳＧＢＳ細胞の可視光での観察写真。
【図６】精製した組み換えＤＤＴの、抗ヒトＤＤＴ抗体を用いて行ったウェスタンブロッティング。レーン１〜４：分化誘導開始から３日目、６日目、９日目と１２日目のＳＧＢＳ細胞の濃縮培養上清、レーン５：分化誘導開始から９日目のＳＧＢＳ細胞の細胞融解物、レーン６：精製組み換えＤＤＴ、レーン７：ＤＤＴ−ＣＦＬＡＧ発現ベクターを導入した２９３ＦＴ細胞の細胞融解物。
【図７Ａ】成熟脂肪細胞の遺伝子発現に対するＤＤＴの影響。ＤＭＥＭのみ（DMEM）、ＧＨ（GH）、組み換えＤＤＴ（DDT）、精製ＹＫＬ−４０（YKL）、マクロファージ培養上清（Mphage CM）、ＤＤＴ−ＣＦＬＡＧ発現２９３ＦＴ細胞の培養上清（DDT-FT CM）またはベクター発現２９３ＦＴ細胞の培養上清（V FT CM）の存在下で成熟脂肪細胞を培養し、ａＰ２遺伝子、ＡＥＢＰ−１遺伝子、レプチン遺伝子、アディポネクチン遺伝子及びＰＰＡＲγ遺伝子の発現量をｍＲＮＡ量として測定し、内部標準として測定したＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量を用いて補正した値を示した。
【図７Ｂ】成熟脂肪細胞の遺伝子発現に対するＤＤＴの影響。ＤＭＥＭのみ（DMEM）、ＧＨ（GH）、組み換えＤＤＴ（DDT）、精製ＹＫＬ−４０（YKL）、マクロファージ培養上清（Mphage CM）、ＤＤＴ−ＣＦＬＡＧ発現２９３ＦＴ細胞の培養上清（DDT-FT CM）またはベクター発現２９３ＦＴ細胞の培養上清（V FT CM）の存在下で成熟脂肪細胞を培養し、ＩＮＳＲ遺伝子、ＰＬＩＮ遺伝子、ＧＬＵＴ４遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子、ＦＡＳＮ遺伝子、ＧＰＡＭ遺伝子及びＬＩＰＥ遺伝子の発現量をｍＲＮＡ量として測定し、内部標準として測定したＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量を用いて補正した値を示した。
【図７Ｃ】成熟脂肪細胞の遺伝子発現に対するＤＤＴの影響。ＤＭＥＭのみ（DMEM）、ＧＨ（GH）、組み換えＤＤＴ（DDT）、精製ＹＫＬ−４０（YKL）、マクロファージ培養上清（Mphage CM）、ＤＤＴ−ＣＦＬＡＧ発現２９３ＦＴ細胞の培養上清（DDT-FT CM）またはベクター発現２９３ＦＴ細胞の培養上清（V FT CM）の存在下で成熟脂肪細胞を培養し、ＭＣＰ−１遺伝子及びＩＬ−６遺伝子の発現量をｍＲＮＡ量として測定し、内部標準として測定したＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量を用いて補正した値を示した。
【配列表フリーテキスト】
【００７５】
配列番号２：  ＤＤＴ ｍＲＮＡ検出用のフォワードプライマー
配列番号３：  ＤＤＴ ｍＲＮＡ検出用のリバースプライマー
配列番号４：  ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ検出用のフォワードプライマー
配列番号５：  ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ検出用のリバースプライマー
配列番号６：  ＴＢＰ ｍＲＮＡ検出用のフォワードプライマー
配列番号７：  ＴＢＰ ｍＲＮＡ検出用のリバースプライマー
配列番号８：  ＨＰＲＴ１ ｍＲＮＡ検出用のフォワードプライマー
配列番号９：  ＨＰＲＴ１ ｍＲＮＡ検出用のリバースプライマー
【図３】
2009178073.tif 000003
【図７Ａ】
2009178073.tif 000004
【図７Ｂ】
2009178073.tif 000005
【図７Ｃ】
2009178073.tif 000006
【図１】
2009178073.tif 000007
【図２】
2009178073.tif 000008
【図４】
2009178073.tif 000009
【図５】
2009178073.tif 000010
【図６】
2009178073.tif 000011
【配列表】
2009178073000001.app