(57)【要約】【課題】本発明は、チロシナーゼ阻害活性成分、チロシナーゼ阻害剤及びこれを配合した美白化粧料を提供する。【解決手段】チロシナーゼ阻害作用を有する５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンと、５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンを含むチロシナーゼ阻害剤と、５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンを含む美白化粧料とを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
2009280539.tif 000010
で表される、５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノン。
【請求項２】
請求項１に記載の５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンを含むチロシナーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１に記載の５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンを含む美白化粧料。
【請求項４】
トリコデルマ・ビリデ菌株に、請求項１に記載の５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンを産生させるための培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノン、チロシナーゼ阻害剤及びこれを配合した美白化粧料に関する。特に、化粧品、食品等に用いられる５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンに関する。
【背景技術】
【０００２】
チロシナーゼ（ＥＣ１．１４．１８．１）は、植物や動物や微生物中に幅広く存在する銅含有酵素である。この酵素は、メラニン細胞中でのメラニン合成の重要な酵素としてよく知られており、Ｌ−チロシンの３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−ＤＯＰＡへの水酸化、及びＬ−ＤＯＰＡのドーパキノンへの酸化の触媒として作用する。
【０００３】
メラニンの役割は、皮膚を紫外線誘発皮膚損傷から保護することにある。しかし、メラニンの産生が過剰になると、日焼け、そばかす、黒子及びメラニン沈着のような、高色素沈着作用が起こることになる。それに加えて、チロシナーゼは、エビやカニのような甲殻類のメラニン形成にも関与している。したがって、チロシナーゼ阻害活性を有する物質は、化粧品及び食品業界等において、注目されている。
【０００４】
本発明者らは、チロシナーゼ阻害活性成分を生成する微生物のトリコデルマ・ビリデ菌株を海洋堆積物から分離した。この菌株は糸状菌で、チロシナーゼ阻害活性成分を分泌することを突き止めていた。しかし、チロシナーゼ阻害作用を有する活性成分自体が何であるかは未だ不明であった。すなわち、本発明者らは、チロシナーゼ阻害活性成分が何であるかを、鋭意検討し、本発明に想到した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
すなわち、本発明は、チロシナーゼ阻害作用を有する、５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノン、チロシナーゼ阻害剤及びこれを配合した美白化粧料を、提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、上記課題を解決するため、チロシナーゼ阻害作用を有する、下記式（Ｉ）で表される５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンが提供される。
【化１】
2009280539.tif 000002
別の側面によれば、本発明は、チロシナーゼ阻害剤である。さらに別の側面によれば、本発明は、５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンを配合した美白化粧料である。
【０００７】
本発明に係る５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンは、市販の以下の化学式IIで表されるシクロペンタン−１，３−ジオンを出発物質として、後述する有機合成経路により製造することが可能である。
【化２】
2009280539.tif 000003
【０００８】
さらに、本発明に係る５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンは、トリコデルマ・ビリデ菌株を培養することによる以下のような工程（Ａ〜Ｄ）を経て得ることもできる。
Ａ．トリコデルマ・ビリデ菌株を至適培養条件で培養する。
Ｂ．トリコデルマ・ビリデ菌株の培養を行った後、培地から上澄液を遠心分離操作によって分離する。
Ｃ．上澄液から溶媒抽出操作によって、５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンを分離する。
Ｄ．さらに、溶媒から回転蒸発器によって水に抽出し、クロマトグラフィーによって精製する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、チロシナーゼ阻害作用を有する、５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノン、チロシナーゼ阻害剤及びこれを配合した美白化粧料が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明者らは、トリコデルマ・ビリデ菌株が産生するチロシナーゼ阻害活性成分が下記式（Ｉ）で表される
【化３】
2009280539.tif 000004
５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンであることを突き止めた。なお、この化合物の官能基は、特性に実質的に影響しない範囲で他の官能基と置換できる。例えば、−ＮＣ基は、チロシナーゼ阻害活性を低下させないような他の置換基で置換することもできる。
【００１１】
本発明に係る５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンの有機合成経路による製造方法を具体的に説明する。
【００１２】
本発明に係る５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンは、例えば図１に示すスキームＩに従って合成することができる。
出発物質であるシクロペンタン−１，３−ジオン（図１中化合物１−１）に、メタノール及びヨウ素を作用させ、メチルエーテル（図１中化合物１−２）とする。次に、メチルエーテルに塩基を作用させてアニオンを発生させた後、アセトアルデヒドと反応させ、アルドール（図１中化合物１−３）に導く。好ましくは、単離することなく、酸性条件下で加熱を行い、エノン（図１中化合物１−４）に導く。次に、エノンに対して、ｍＣＰＢＡ（メタクロロ過安息香酸）を作用させてエポキシド（図１中化合物１−５）とし、これにフェニルセレニル基を位置選択的に導入し、５−ヒドロキシ−５−（１´−フェニルセレニル）エチル−３−メトキシ−２−シクロペンテン−１−オン（図１中化合物１−６）とする。次に、５−ヒドロキシ−５−（１´−フェニルセレニル）エチル−３−メトキシ−２−シクロペンテン−１−オンにｍＣＰＢＡを作用させてセレノキシドとし、加熱してセレン官能基を脱離させ、二重結合を導入して５−ヒドロキシ−５−ビニル−３−メトキシ−２−シクロペンテン−１−オン（図１中化合物１−７）へと導く。次に、アンモニアを作用させ、比較的安定な中間体３−アミノ−５−ヒドロキシ−５−ビニル−２−シクロペンテン−１−オン（図１中化合物１−８）を合成する。この不活性な中間体に蟻酸アセトキシを作用させたのち、脱水することにより、イソニトリル基を持った５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノン（図１中化合物Ｉ）を合成する。
【００１３】
さらに、本発明に係る５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンは、トリコデルマ・ビリデ菌株を培養することにより製造することも可能である。
Ａ．トリコデルマ・ビリデ菌株の培養
（１）トリコデルマ・ビリデ菌株は、適切な本培養培地を調製して、培養を行うことが好適である。なお、必要な場合、種培養、前培養を経て、本培養を行う。本培養培地は、栄養分としては、スターチ、デキストリン、グルコース、スクロース、ラクトースなどの資化性炭素源、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、植物性蛋白質、カゼイン、麦芽エキス、乾燥酵母、大豆粉などの有機窒素源、及び／又は硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源を含む。例えば、炭酸カルシウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、モリブデン酸アンモニウムなどのミネラル又はこれらの混合物が存在していてもよい。さらに発酵培地は、フマル酸及び／又はその水溶性の塩を含む。典型的な塩としては、フマル酸ナトリウム、フマル酸カリウム、フマル酸ナトリウムカリウム、フマル酸モノナトリウム、フマル酸モノカリウムなど、及びそれらの混合物が含まれる。
（２）本培養培地のｐＨは８．０に調整することが好ましい。培地は、１２０〜１３０℃で１０〜６０分間高圧滅菌処理を行うことが好適である。滅菌処理された培地を、滅菌した容器、例えば、１００ｍｌ容バッフル付三角フラスコ等に、１０〜３０ｍｌずつ無菌的に分注して、供試菌を一白金耳植菌したのち、２７℃において３〜１０日間ロータリーシェーカー上で振とう培養を行うことが好適である。ロータリーシェーカーの回転数は、１５０〜２００ｒｐｍが好ましい。培養後、遠心分離を、３０００〜８０００×ｇ、５〜１０分間行い、その沈渣を分取して、例えば、生理食塩水／グリセリン混合液（１：１）中で均一になるまで十分に分散処理を行うことが好ましい。均一に分散させた供試菌の種菌液は、例えば、クライオチューブ等に無菌的に分注後、−８０℃で凍結保存しておくことが好ましい。
【００１４】
Ｂ．上澄液の分離
例えば、５００ｍｌ容バッフル付フラスコに上記培地を１００ｍｌずつ無菌的に分注し、供試菌種菌液を１〜５ｍｌずつ接種したのち、２７℃で振とう培養（１５０〜２００ｒｐｍ）を行うことが好適である。培養後、経日的に培養液を分取して遠心分離（５０００〜１５０００ｒｐｍ、５〜１５分間）を行い、その上澄を実験に供することが好ましい。
【００１５】
Ｃ．上澄液からの溶媒抽出
抽出溶媒の種類としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ヘキサノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、アセトン、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等の有機溶媒等や水等を用いることが可能である。これらの抽出溶媒は、単独で又は組み合わせて用いることが可能である。
【００１６】
Ｄ．クロマトグラフィーによる精製
ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを用いた方法を、単独で又は組み合わせることで、精製を行うことが好ましい。
例えば、本発明に係る供試菌の培養上澄中に含まれるチロシナーゼ活性阻害成分の分画に高速液体クロマトグラフィーを用いる場合、その溶出液は、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液／アセトニトリルを移動相として用いることが好適である。最初の６０分間は２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液で溶出させたのち、６０〜１２０分間でアセトニトリルが１００％になるように、直線的に変化させる濃度勾配溶出法により溶出させて３〜１０ｍＬずつ分取することが好ましい。検出波長は２１５ｎｍが好適である。得られた分画は、すべて遠心エバポレーター（４０℃）により移動相を留去したのち、蒸留水で置換処理することが好ましい。
【００１７】
本発明に係る美白化粧料は、５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンを配合して得られる、該チロシナーゼ阻害活性成分に加え、化粧料のタイプに応じて各種成分を適宜配合することができる。配合成分としては、ヤシ油、オリーブ油、ヒマシ油、カルナウバロウ、キャンデリラロウ、ラノリン、ミツロウ、スクワラン、トリグリセリド類、高級脂肪酸類、流動パラフィン、固形パラフィン、ミクロクリスタリンワックス、ワセリン、セレシン、油脂エステル類、ポリアルキレングリコール、シリコーンオイルなどの油性原料；高級脂肪酸石けん、高級アルコール硫酸エステル塩、スルホン酸塩、高級アルコールリン酸エステルなどのアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩などのカチオン界面活性剤；ベタイン構造型、イミダゾリン誘導体などの両性界面活性剤；ポリオキシエチレン型、多価アルコールエステル型などのノニオン界面活性剤；各種ガム類、アルギン酸塩、セルロース誘導体、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸塩、カルボキシメチルビニルポリマー、ポリエチレンオキサイド、ベントナイトなどの増粘剤；グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、ブチレングリコール、乳酸塩、２−ピロリドン−５−カルボン酸塩、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コラーゲンなどの保湿剤；タルク、カオリン、二酸化チタン、マイカ、微粉末シリカ、軽質炭酸カルシウム、重質炭酸カルシウム、微結晶セルロース、ナイロン微粒子などの粉末；ビタミン類、ホルモン、抗ヒスタミン剤、アミノ酸類、酵素剤などの薬剤；紫外線吸収剤；キレート剤；酸化防止剤；色素；香料；抗菌剤；防腐剤などが例示される。本発明の化粧料の剤型は任意であり、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系等、どのような剤型でもかまわない。また、本発明の化粧料の用途も任意であり、化粧水、乳液、クリームパック等のフェーシャル化粧料；ファンデーションなどのメーキャップ化粧料；皮フ保護用クリーム；芳香化粧料；サンスクリーン剤などに用いることができる。
【実施例１】
【００１８】
本発明に係る５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンを、トリコデルマ・ビリデ菌株を培養することにより製造した実施例を説明する。
【００１９】
トリコデルマ・ビリデ菌株は、ロータリーシェーカー（１６０ｒｐｍ）上で、２％グルコース（日本、京都、ナカライ・テスク）及び０．５％バクト‐ペプトン（米国、ニュージャージー州、フランクリン・レークス、Ｂｅｃｔｏｎ, Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を含有する媒質中において、２７℃で６日間振とう培養を行った。培養の後に、上澄を５分間の４０００×ｇでの遠心分離によって採集し、薄膜フィルター（膜孔サイズ：０．２μｍ、日本、東京、東洋濾紙）によって濾過した。
【００２０】
トリコデルマ・ビリデ菌株の培養上澄中のチロシナーゼ阻害活性は培養時間と共に増大し、６日間で最大５．４×１０５ Ｕ／ｍｌの産生量に達した。その後、チロシナーゼ阻害活性は徐々に減少した。
【００２１】
次に、６日間の培養の後に、培養上澄からのチロシナーゼ阻害活性成分の分離を試みた。
上澄中のチロシナーゼ阻害活性成分を１／１０容量の酢酸ブチル（ナカライ・テスク）によって抽出した。５ｍｌの水を抽出物に添加し、回転蒸発器によって液量が５ｍｌの水溶液になるまで濃縮した。この水溶液をセンシューＰａＫ ＯＤＳ−５２５１−ＳＨカラム（Φ２０×２５０ｍｍ、日本、東京、センシュー科学）に適用した。ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸塩緩衝液中の０〜１００％のアセトニトリル（ＡｃＣＮ）を使用する直線勾配溶出法によって、６０分間５ｍｌ／分の流量で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行い、溶出液を２１５ｎｍで測定した（クロマトグラフィー１）。活性画分（３０〜４０％ ＡｃＣＮ）を集め、ケムコＰａＫ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ−５ カラム（Φ４．６×２５０ｍｍ、日本、大阪、ケムコ）に適用した。カラムを５％ＡｃＣＮ によって１ｍｌ／分の流量で溶出させ、溶出液を２１５ｎｍで測定した（クロマトグラフィー２）。次に、活性画分をセンシューＰａＫ ＤＯＣＯＳＩＬカラム（Φ６×２５０ｍｍ、センシュー科学）に適用した。カラムを５％ＡｃＣＮによって１ｍｌ／分の流量で溶出させ、溶出液を２１５ｎｍで測定した（クロマトグラフィー３）。精製したチロシナーゼ阻害活性成分を蒸発器によって真空中で濃縮した。
【００２２】
酢酸ブチル抽出物の回収率は７２．３％であり、チロシナーゼ阻害活性成分の活性は上澄に比べて約１００倍に増大した（表１）。センシューＰａＫ ＯＤＳ−５２５１−ＳＨカラムクロマトグラフィーによって、抽出物を画分Ｉ、画分II、画分III及び画分IVに分離した（図２）。これらの分画の中で、最も活性の高い画分IIを、ケムコＰａＫ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ−５とセンシューＰａＫ ＤＯＣＯＳＩＬの連続的クロマトグラフィーによって、単一ピークとしてさらに精製した（図３）。第１、第２及び第３ステップの回収率はそれぞれ３４．４％、１２．２％及び１２．５％であった（表１）。
【００２３】
【表１】
2009280539.tif 000005
【００２４】
次に、チロシナーゼ阻害活性の分析を行った。ｐＨ７．０の５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ中の２５μｌの１０００Ｕ／ｍｌマッシュルーム・チロシナーゼ（米国、ミズーリ州、セントルイス、シグマ）を９６穴プレート中の同じ容量の試料に添加し、３７℃で１０分間予備培養を行った。予備培養後に、同じ緩衝液に溶解した５０μｌの０．０３％Ｌ−チロシン（シグマ）を予備培養混合物に添加した。混合物を３７℃で６０分間静置し、１００μｌの１Ｍ ＮａＯＨの添加によって酵素反応を終了させた。光学濃度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ Ｒａｄ、モデル６８０）によって４１５ｎｍ で測定した。同時に、ブランク及び対照群の光学密度も測定した。阻害のパーセンテージ＝（１−Ｂ／Ａ）×１００（％）であり、ここに、Ａは阻害活性成分を含む場合の光学濃度、Ｂは阻害活性成分を含まない場合の光学濃度であった。阻害活性の１単位は、上記の条件の下で酵素の活性が最大５０％低下させられる量として定義した。
【００２５】
チロシナーゼ阻害活性成分のＮＭＲスペクトルを、内部標準として３−（トリメチリシリル）プロピオン−２, ３, ３, ３−４ｄ酸（ＴＳＰ）を含むＤ２Ｏ中で１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲについてそれぞれ５００及び１２５ＭＨｚで作動するＶａｒｉａｎのＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡ−５００スペクトロメータによって、２５℃で測定した。ＥＩ−ＭＳは、ＪＥＯＬ ＪＭＳ−７００（２）マススペクトロメータを使用して測定した。
【００２６】
チロシナーゼ阻害活性成分は、ポジティブＨＲ−ＥＩ−ＭＳ中でのｍ/ｚ １４９．０４７２における［Ｍ］＋ピークによって確立された分子式Ｃ８Ｈ７ＮＯ２を有する。このチロシナーゼ阻害活性成分をＤ２Ｏによって処理した場合、ＥＩ−ＭＳはｍ/ｚ １５０において［Ｍ］＋ピークを示し、これは、このチロシナーゼ阻害活性成分がＯＨ又はＮＨ基を有していたことを意味するものである。偏極移行（ＤＥＰＴ）及び異核多量子コーヒレンス（ＨＭＱＣ）実験による無ひずみエンハンスメント処理でのチロシナーゼ阻害活性成分の１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの細密検査の結果、１, ２, ３−三置換体二重結合（Ｃ−２及び℃−３）、ビニル基(Ｃ−６及びＣ−７)、ｓｐ３−ハイブリッドメチレン（Ｃ−５）、５−員共役ケトン（Ｃ−１）及び第３アルコール（Ｃ−４）の存在が明らかになった。窒素原子に結合した残りの炭素（Ｃ−９）は、１５６．５２ｐｐｍにおいて、１３Ｃシグナルによってイソニトリルに割り当てられた。チロシナーゼ阻害活性成分中における官能基の結合は、１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ及び異核多重電子対結合性（ＨＭＢＣ）相関関係に基づいて決定された（表２）。ＨＭＢＣの典型的な相関関係は以下のとおりであった。Ｈ２対Ｃ４及びＣ５、Ｈ４Ａ対Ｃ２、Ｃ５及びＣ６、Ｈ４Ｂ対Ｃ１、Ｃ２、Ｃ５及びＣ６、Ｈ６対Ｃ１及びＣ５、並びにＨ７Ａ及びＨ７Ｂ対Ｃ５。この証拠に基づいて、チロシナーゼ阻害活性成分のプレーナー構造を解明した（図４）。その結果、以下の化合物
【化４】
2009280539.tif 000006
５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンとして同定された。
【００２７】
【表２】
2009280539.tif 000007
【００２８】
チロシナーゼ阻害活性成分の動態解析を行った。チロシナーゼ阻害活性成分のミカエリス定数（Ｋｍ）及び最大速度（Ｖｍａｘ）を、様々な濃度のＬ−チロシン（０．２〜３．３ｍＭ）を使用して、ラインウィーバー・バークプロットを使用して測定した。酵素活性を上記と同じ手順で測定した。
【００２９】
チロシナーゼ阻害活性成分の阻害動態をラインウィーバー・バーク法によって解析した。阻害活性成分ありの場合となしの場合について、初期反応速度を測定した。ラインウィーバー・バークプロットは図５に示してある。ミカエリス定数（Ｋｍ）は１．４ｍＭ Ｌ−チロシンであり、Ｖｍａｘ は０．０１５であった。元の濃度の１／４及び１／８に希釈された阻害活性成分が存在する場合は、チロシン活性は同じＶｍａｘ値０．０１５と、Ｋｍ値２．５及び４．１ｍＭを示した。従って、この阻害活性成分はマッシュルーム・チロシナーゼに対する競合的阻害剤であり、マッシュルーム・チロシナーゼの銅活性部位との結合によって酵素阻害活性を示していることに想到した。
【実施例２】
【００３０】
次に、本発明に係る５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンの有機合成経路により製造した実施例を説明する。
【００３１】
シクロペンタン−１，３−ジオン（アルドリッチ社製）を出発物質とし、室温、常圧、攪拌条件下で、メタノールとヨウ素を作用させることにより、メチルエーテル（化合物１−２）を合成した。
【００３２】
メチルエーテル（化合物１−２）を、無水テトラヒドロフラン中、摂氏−７８度、窒素気流中、常圧条件下で、塩基とアセトアルデヒドを作用させることにより、アルドール（化合物１−３）を合成した。
【００３３】
アルドール（化合物１−３）を、酸性条件下、加熱することにより、エノン（化合物１−４）を合成した。
【００３４】
エノン（化合物１−４）を、ジクロロメタン中、室温、常圧条件下で、ｍＣＰＢＡ（メタクロロ過安息香酸）を作用させることにより、エポキシド（化合物１−５）を合成した。
【００３５】
エポキシド（化合物１−５）を、窒素気流下無水テトラヒドロフラン中、摂氏−７８度、常圧条件下で、ＰｈＳｅＮａを作用させることにより、５−ヒドロキシ−５−（１´−フェニルセレニル）エチル−３−メトキシ−２−シクロペンテン−１−オン（化合物１−６）を合成した。
【００３６】
５−ヒドロキシ−５−（１´−フェニルセレニル）エチル−３−メトキシ−２−シクロペンテン−１−オン（化合物１−６）を、室温、ジクロロメタン、常圧条件下で、ｍＣＰＢＡ（メタクロロ過安息香酸）を作用させた後、加熱することにより、５−ヒドロキシ−５−ビニル−３−メトキシ−２−シクロペンテン−１−オン（化合物１−７）を合成した。
【００３７】
５−ヒドロキシ−５−ビニル−３−メトキシ−２−シクロペンテン−１−オン（化合物１−７）を、密閉容器中、加熱、加圧条件下で、アンモニアを作用させることにより、３−アミノ−５−ヒドロキシ−５−ビニル−２−シクロペンテン−１−オン（化合物１−８）を合成した。
【００３８】
３−アミノ−５−ヒドロキシ−５−ビニル−２−シクロペンテン−１−オン（化合物１−８）を、ジクロロメタン、窒素気流下、室温、常圧条件下で、蟻酸アセトキシを作用させたのち、脱水することにより、５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノン（化合物Ｉ）を合成した。
【００３９】
有機合成経路により製造した化合物を分析したところ、以下のようなスペクトルが得られた。ポジティブＨＲ−ＥＩ−ＭＳでは［Ｍ］＋ピークによって確立された分子式Ｃ８Ｈ７ＮＯ２を有していた。偏極移行（ＤＥＰＴ）及び異核多量子コーヒレンス（ＨＭＱＣ）実験による無ひずみエンハンスメント処理でのチロシナーゼ阻害活性成分の１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの細密検査では、１, ２, ３−三置換体二重結合（Ｃ−２及び℃−３）、ビニル基(Ｃ−６及びＣ−７)、ｓｐ３−ハイブリッドメチレン（Ｃ−５）、５−員共役ケトン（Ｃ−１）及び第３アルコール（Ｃ−４）の存在が明らかになった。窒素原子に結合した残りの炭素（Ｃ−９）は、１３Ｃシグナルによってイソニトリルに割り当てられた。チロシナーゼ阻害活性成分中における官能基の結合は、１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ及び異核多重電子対結合性（ＨＭＢＣ）相関関係に基づいて、表２と同様に決定された。ＨＭＢＣの典型的な相関関係は、Ｈ２対Ｃ４及びＣ５、Ｈ４Ａ対Ｃ２、Ｃ５及びＣ６、Ｈ４Ｂ対Ｃ１、Ｃ２、Ｃ５及びＣ６、Ｈ６対Ｃ１及びＣ５、並びにＨ７Ａ及びＨ７Ｂ対Ｃ５であった。したがって、有機合成経路により製造した化合物は、トリコデルマ・ビリデ菌株を培養することにより製造した化合物と同一であると同定できた。
【実施例３】
【００４０】
次に、本発明に係る５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンの美白効果を確認する実験を行った。
シミ、ソバカス等色素沈着が認められた被験者１０名を１群とし、色素沈着部に配合例１〜５及び比較例１〜５の化粧料については、朝晩２回塗布してもらい、配合例５及び比較例５の浴剤については、２００Ｌの湯に対して浴剤５０ｇを溶解し、１日１回入浴使用してもらい、表３の判定基準に基づいて色素沈着改善作用を評価した。なお、判定は化粧料及び浴剤の使用開始２週間後、１ヵ月後及び３ヵ月後の合計３回行った。
なお、本試験期間を通して皮膚に異常を訴えた者はなかった。
【００４１】
【表３】
2009280539.tif 000008
【００４２】
以下、本発明に係る５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンを含む美白化粧料の配合例と比較例を示す。
【００４３】
配合例１
化粧水
成分                                                重量％
５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニル
シクロペント−２−エノン                          ０．１０
クエン酸三ナトリウム                                ３．００
濃グリセリン                                        ４．００
１，３−ブチレングリコール                          ５．００
キサンタンガム                                 ０．０５
ヒアルロン酸ナトリウム                              ０．０１
防腐剤                                                適量
精製水                            全量が１００．００となる量
【００４４】
配合例２
乳液
成分                                              重量％
トリオクタン酸グリセリル                            ３．００
ホホバ油                                            １．００
オリーブ油                                          １．００
メチルポリシロキサン                                ０．１０
天然ビタミンＥ                                      ０．１０
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノオレエート              １．５０
ソルビタンモノオレエート                            ０．５０
５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニル
シクロペント−２−エノン                          ０．１０
Ｌ−セリン                                          ０．５０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム                      ０．１０
ポリビニルピロリドン                                ０．０５
防腐剤                                              適量
精製水                            全量が１００．００となる量
【００４５】
配合例３
クリーム
成分                                              重量％
ベヘニルアルコール                                  ２．００
トリオクタン酸グリセリル                            ３．００
ホホバ油                                            １．００
オリーブ油                                          １．００
メチルポリシロキサン                                ０．１０
天然ビタミンE                                       ０．１０
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノステアレート            ２．５０
ＰＯＥ（８０）硬化ヒマシ油                          ０．５０
５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニル
シクロペント−２−エノン                          ０．１０
Ｌ−セリン                                          ０．５０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム                      ０．１０
カルボキシビニルポリマー                            ０．０５
水酸化カリウム                                      ０．０１
防腐剤                                              適量
精製水                            全量が１００．００となる量
【００４６】
配合例４
パック
成分                                              重量％
ヒドロキシエトキシセルロース                        ３．００
カルボキシビニルポリマー                            １．００
ポリオキシエチレンオレイルエーテル
（１５ＥＯ）                                        １．００
５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニル
シクロペント−２−エノン              ０．１０
エタノール                                          ５．００
防腐剤                                              適量
精製水                            全量が１００．００となる量
【００４７】
配合例５
浴剤
成分                                              重量％
無水硫酸ナトリウム                                ４５．００
炭酸水素ナトリウム                                ５０．００
ホウ酸ナトリウム                                    ３．００
５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニル
シクロペント−２−エノン                            ０．０１
【００４８】
[比較例１]
比較化粧水
配合例１の５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンの代わりに精製水を使用して調製した。
【００４９】
[比較例２]
比較乳液
配合例２の５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンの代わりに精製水を使用して調製した。
【００５０】
[比較例３]
比較クリーム
配合例３の５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンの代わりに精製水を使用して調製した。
【００５１】
[比較例４]
比較パック
配合例４の５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンの代わりに精製水を使用して調製した。
【００５２】
[比較例５]
比較浴剤
配合例５の５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンの代わりに炭酸水素ナトリウムを使用して調製した。
【００５３】
色素沈着改善作用を評価したところ、配合例では、軽快であるという判定が集中し、比較例では、ほとんど変化は認められなかった（表４）。したがって、５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンの美白効果を確認することができた。
【００５４】
【表４】
2009280539.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】５−ヒドロキシ−３−イソシアノ−５−ビニルシクロペント−２−エノンの有機合成経路を示す説明図である。
【図２】カラムクロマトグラフィーによる、抽出物の分離（画分Ｉ、画分II、画分III及び画分IV）を示すグラフである。
【図３】クロマトグラフィーによる、画分IIの精製を示すグラフである。
【図４】チロシナーゼ阻害活性成分のプレーナー構造を示す構造式である。
【図５】ラインウィーバー・バークプロットによる、チロシナーゼ阻害活性成分の阻害動態を示すグラフである。
【図１】
2009280539.tif 000011
【図２】
2009280539.tif 000012
【図３】
2009280539.tif 000013
【図４】
2009280539.tif 000014
【図５】
2009280539.tif 000015