(57)【要約】【課題】振盪培養器を必要とせず、嫌気条件下での培養により遺伝子組換え細菌を自然界にばら撒くおそれがない、少量の試料から精度よく短期間で簡便にヒ素等の環境中の有害汚染物質を検出することができる、コスト、操作性、迅速性の面で優れたバイオセンサーを提供すること。【解決手段】被検物質の存在下に、フィトエン不飽和化酵素（ＣｒｔＩ）遺伝子が破壊され、ＣｒｔＩを発現する機能を喪失した、スピリロキサンチン経路を有する淡水性紅色細菌に、誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーターとその下流に作動可能に連結されたＣｒｔＩ遺伝子とを組み込んだベクターが導入されている形質転換淡水性紅色細菌を嫌気的明条件下で培養し、前記形質転換淡水性紅色細菌菌体の緑色から赤色への色調変化の程度を評価し、色調変化が認められた場合、前記被検物質が前記誘導物質を含むと判断する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィトエン不飽和化酵素（ＣｒｔＩ）遺伝子の全部又は一部が欠損・置換等の遺伝子変異により破壊され、ＣｒｔＩを発現する機能を喪失した、スピリロキサンチン経路を有する淡水性紅色細菌に、誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーターと該誘導性プロモーターの下流に作動可能に連結されたＣｒｔＩ遺伝子とを組み込んだベクターが導入されていることを特徴とする形質転換淡水性紅色細菌。
【請求項２】
ベクターに組み込まれるＣｒｔＩ遺伝子が、ＣｒｔＩをコードする構造遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の形質転換淡水性紅色細菌。
【請求項３】
ベクターに組み込まれるＣｒｔＩ遺伝子が、ＣｒｔＩをコードする構造遺伝子及びプロモーター活性を有さないその制御領域からなることを特徴とする請求項１記載の形質転換淡水性紅色細菌。
【請求項４】
淡水性紅色細菌が、ロドシュードモナス・パルストリスであることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の形質転換淡水性紅色細菌。
【請求項５】
誘導性プロモーターが、ヒ素に応答して下流遺伝子への転写を促進するヒ素誘導性プロモーターＰａｒｓであることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の形質転換淡水性紅色細菌。
【請求項６】
被検物質の存在下に、フィトエン不飽和化酵素（ＣｒｔＩ）遺伝子の全部又は一部が欠損・置換等の遺伝子変異により破壊され、ＣｒｔＩを発現する機能を喪失した、スピリロキサンチン経路を有する淡水性紅色細菌に、誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーターと該誘導性プロモーターの下流に作動可能に連結されたＣｒｔＩ遺伝子とを組み込んだベクターが導入されている形質転換淡水性紅色細菌を嫌気的明条件下で培養し、前記形質転換淡水性紅色細菌菌体の緑色から赤色への色調変化の程度を評価し、色調変化が認められた場合、前記被検物質が前記誘導物質を含むと判断することを特徴とする前記形質転換淡水性紅色細菌をバイオセンサーとして使用する方法。
【請求項７】
淡水性紅色細菌が、ロドシュードモナス・パルストリスであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
誘導性プロモーターが、ヒ素に応答して下流遺伝子への転写を促進するヒ素誘導性プロモーターＰａｒｓであることを特徴とする請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーターと該誘導性プロモーターの下流に作動可能に連結されたＣｒｔＩ遺伝子とを組み込んだベクターからなるバイオセンサー用ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物バイオセンサーとして有用な形質転換淡水性紅色細菌や、かかる微生物バイオセンサーを用いたヒ素等の環境中の有害汚染物質の検出方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、世界各地で地下水のヒ素汚染が確認されており、深刻な問題となっている。バングラデッシュなどの発展途上国では飲料用としてヒ素に汚染されている地下水を利用していることが多く、高濃度に汚染された水を摂取し続けると皮膚病やガンなど多様な症状をきたすことが判明している（例えば、非特許文献１参照）。こうした水系環境中からヒ素を除去することによる水質改善は公衆衛生の観点からも早急の課題であり、水質改善を行うにあたって、まずはヒ素の検出が重要となるといわれている。ヒ素のような環境中の有害物質の検出には機器分析法によるものがある一方で、バイオセンサーによる簡便な検出法が近年着目され研究されている。
【０００３】
バイオセンサーはコスト、操作性、迅速性の面で注目されており、また酵素反応、抗原抗体反応、リガンドのレセプターへの結合といった生化学的反応を利用することにより特定物質との特異性が高いという特徴を有するため、試料が少量で済み、センシングシステムの微小化も可能となる。様々なバイオセンサーが研究されている中で、微生物細胞を利用した場合、培養が容易なだけではなく遺伝子操作が容易であるため、環境中の検出対象物質やレポーター遺伝子の選択が可能となり、用途の広がりに期待がもてるといわれている。
【０００４】
微生物バイオセンサーにも様々なシステムがある中で、組換え微生物バイオセンサーは宿主細胞、特定の物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーター、そしてプロモーターの下流のレポーター遺伝子の三要素からなり、場合によってレポーターの発するシグナルを検出する装置を組み合わせたシステムを利用するものである。このシステムの場合、レポーターとしてよく利用されているのが細菌やホタル由来のルシフェラーゼ（非特許文献２〜４参照）、オワンクラゲ由来のＧＦＰ(非特許文献３及び５参照)、大腸菌由来のＬａｃＺ(非特許文献３及び６参照)などである。
【０００５】
本発明者らは、カロテノイド合成系酵素ＣｒｔＡをレポーターとし、海洋性光合成細菌ロドブラム・サルフィドフィラム（Rhodovulum sulfidophilum）を宿主としたヒ素応答バイオセンサーを既に開発している(非特許文献７)。ロドブラム・サルフィドフィラムはカロテノイド合成系の一種、スフェロイデン経路を有しており、本来はその最終産物であるスフェロイデノンを蓄積し、赤色を呈する細菌である。そしてこのセンサーはスフェロイデン経路の最終段階を触媒するスフェロイデンモノオキシゲナーゼ（ＣｒｔＡ）をコードするｃｒｔＡを破壊して得られたｃｒｔＡ欠損株を用いているため、スフェロイデノンの前駆体のスフェロイデンを蓄積して黄色を呈している。そのためｃｒｔＡをレポーター遺伝子とし、その上流にヒ素誘導性のプロモーターを組み込んだプラスミドをロドブラム・サルフィドフィラムの菌体内に導入することで、ヒ素存在下においてＣｒｔＡ活性が復活し、黄色から赤色への色調変化が起こる。
【０００６】
【非特許文献１】Y. Hagiwara, et al., (2004) Annuals of Disas. Prev. Res. Inst., Kyoto Univ., No. 47B
【非特許文献２】Wilson T, Hastings JW (1998) Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol 14:197-230
【非特許文献３】Stocker J, Balluch D, Gsell M, Harms H, Feliciano J, Daunert S,Malik KA, van der Meer JR (2003) Environ Sci Technol37:4743-4750
【非特許文献４】Trang PT, Berg M,VietPH, van Mui N, van der Meer JR (2005) Environ Sci Technol 39:7625-7630
【非特許文献５】Tsien RY (1998) Ann Rev Biochem 67:509-544
【非特許文献６】Silhavy TJ, Beckwith JR (1985) Microbiol Rev 49:398-418
【非特許文献７】Fujimotoet al., (2006) Appl. Microbiol.  Biotechnol., 73(2): 332-338
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述のルシフェラーゼやＧＦＰをレポーターとして用いた場合は暗所で検出を行う必要があり、ＬａｃＺをレポーターとして使用した場合はＸ−Ｇａｌが必要であり、ホタル・ルシフェラーゼをレポーターとして使用した場合はＤ−ルシフェリンが必要である。
【０００８】
また、上述のロドブラム・サルフィドフィラムを利用した生細胞ヒ素応答バイオセンサーは、ＣｒｔＡが酸素を必要とするケト化反応を触媒するので（Maeda et al., (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol., 70, 397-402）、検出のために振盪培養が必要となり、培養液中の溶存酸素濃度により色調変化が左右されるおそれがある。また、ロドブラム・サルフィドフィラムが海水サンプルから単離された細菌であるため、サンプルの塩濃度を３％に調整する必要があるなど作業が煩雑になり、遺伝子組換え細菌を自然界にばら撒くおそれがある。また、黄色と赤色は同じ暖色に属するため、バックグラウンドの状況によっては黄色から赤色への変化を認識することが困難となる場合があった。
【０００９】
本発明の課題は、振盪培養器を必要とせず、嫌気条件下での培養により遺伝子組換え細菌を自然界にばら撒くおそれがない、少量の試料から精度よく短期間で簡便にヒ素等の環境中の有害汚染物質を検出することができる、コスト、操作性、迅速性の面で優れたバイオセンサーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した。ロドシュードモナス・パルストリスは、カロテノイド合成系の一種、スピリロキサンチン経路を有しており（図１参照）、その途中の段階にはフィトエン不飽和化酵素（ＣｒｔＩ）によって無色のフィトエンから段階的に不飽和化が起こり、赤色のリコペンが合成される過程を含むため、赤色を呈する細菌である。しかし、ロドシュードモナス・パルストリスのＣｒｔＩ遺伝子を破壊したロドシュードモナス・パルストリスの変異株は、フィトエンからリコペンへの合成が進行せず、バクテリオクロロフィルの緑色を呈することが予想された。そこで、振盪培養器を必要とせず、嫌気条件下で培養できる淡水性紅色細菌であるロドシュードモナス・パルストリスと、ロドシュードモナス・パルストリスが有するスピリロキサンチン経路におけるフィトエンからリコペンへのフィトエン不飽和化酵素（ＣｒｔＩ）による不飽和化反応に注目し、野生型ロドシュードモナス・パルストリスのＣｒｔＩ遺伝子を欠損させたロドシュードモナス・パルストリスの色素変異株をまず構築した。
【００１１】
また、ヒ素化合物に耐性をもつ大腸菌には２つの調節遺伝子（ａｒｓＲ、ａｒｓＤ）、３つの構造遺伝子（ａｒｓＡ、ａｒｓＢ、ａｒｓＣ）からなるａｒｓオペロンが備わっていることが知られており（非特許文献３）、前記のように、本発明者らは、大腸菌に由来するａｒｓオペロンのオペレーター／プロモーター領域とａｒｓＲ遺伝子、及び光合成細菌ロドブラム・サルフィドフィラムにおいてカロテノイド合成をになうｃｒｔＡを広宿主域プラスミドｐＲＫ４１５に挿入することによりヒ素バイオセンサープラスミドを構築していた。
【００１２】
本発明者らは、以上の知見を基に、大腸菌−ロドシュードモナス・パルストリスシャトルベクターｐＭＧ１０３にヒ素応答性ＣｒｔＩ発現ユニットを挿入したベクターを構築し、該ベクターをＣｒｔＩ遺伝子欠損変異株に導入し、ヒ素応答バイオセンサーの構築を試みた。すなわち、大腸菌由来のヒ素誘導性オペレーター／プロモーター領域の下流にレポーター遺伝子ｃｒｔＩを組み込んだプラスミドを、ロドシュードモナス・パルストリスの菌体内に導入し、ヒ素存在下においてＣｒｔＩ活性を復活させることで、色調の変化を指標としてヒ素の存在を判定することができることを見い出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち本発明は、（１）フィトエン不飽和化酵素（ＣｒｔＩ）遺伝子の全部又は一部が欠損・置換等の遺伝子変異により破壊され、ＣｒｔＩを発現する機能を喪失した、スピリロキサンチン経路を有する淡水性紅色細菌に、誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーターと該誘導性プロモーターの下流に作動可能に連結されたＣｒｔＩ遺伝子とを組み込んだベクターが導入されていることを特徴とする形質転換淡水性紅色細菌や、（２）ベクターに組み込まれるＣｒｔＩ遺伝子が、ＣｒｔＩをコードする構造遺伝子であることを特徴とする上記（１）記載の形質転換淡水性紅色細菌や、（３）ベクターに組み込まれるＣｒｔＩ遺伝子が、ＣｒｔＩをコードする構造遺伝子及びプロモーター活性を有さないその制御領域からなることを特徴とする上記（１）記載の形質転換淡水性紅色細菌や、（４）淡水性紅色細菌が、ロドシュードモナス・パルストリスであることを特徴とする上記（１）〜（３）いずれか記載の形質転換淡水性紅色細菌や、（５）誘導性プロモーターが、ヒ素に応答して下流遺伝子への転写を促進するヒ素誘導性プロモーターＰａｒｓであることを特徴とする上記（１）〜（４）いずれか記載の形質転換淡水性紅色細菌に関する。
【００１４】
また本発明は、（６）被検物質の存在下に、フィトエン不飽和化酵素（ＣｒｔＩ）遺伝子の全部又は一部が欠損・置換等の遺伝子変異により破壊され、ＣｒｔＩを発現する機能を喪失した、スピリロキサンチン経路を有する淡水性紅色細菌に、誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーターと該誘導性プロモーターの下流に作動可能に連結されたＣｒｔＩ遺伝子とを組み込んだベクターが導入されている形質転換淡水性紅色細菌を嫌気的明条件下で培養し、前記形質転換淡水性紅色細菌菌体の緑色から赤色への色調変化の程度を評価し、色調変化が認められた場合、前記被検物質が前記誘導物質を含むと判断することを特徴とする前記形質転換淡水性紅色細菌をバイオセンサーとして使用する方法や、（７）淡水性紅色細菌が、ロドシュードモナス・パルストリスであることを特徴とする上記（６）記載の方法や、（８）誘導性プロモーターが、ヒ素に応答して下流遺伝子への転写を促進するヒ素誘導性プロモーターＰａｒｓであることを特徴とする上記（６）又は（７）記載の方法や、（９）誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーターと該誘導性プロモーターの下流に作動可能に連結されたＣｒｔＩ遺伝子とを組み込んだベクターからなるバイオセンサー用ベクターに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の生細胞ヒ素応答バイオセンサーに用いられているロドシュードモナス・パルストリスは淡水性であるため、地下水などの塩分濃度の低い被検物質をそのまま使用できる。またフィトエンからリコペンへの反応は脱水素反応であるので、酸素が存在しなくても反応が進行し、振盪培養などの処理が不要のため遺伝子組換え細菌を自然界にばら撒くおそれがない。また、緑色と赤色は補色の関係にあるため、被検物質が前記誘導物質を含む場合における本発明の形質転換淡水性紅色細菌の色調変化を認識することが容易となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の形質転換淡水性紅色細菌としては、フィトエン不飽和化酵素（ＣｒｔＩ）遺伝子の全部又は一部が欠損・置換等の遺伝子変異により破壊され、ＣｒｔＩを発現する機能を喪失した、スピリロキサンチン経路を有する淡水性紅色細菌に、誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーターと該誘導性プロモーターの下流に作動可能に連結されたＣｒｔＩ遺伝子とを組み込んだベクターが導入されている形質転換体であれば特に制限されず、本発明において淡水性紅色細菌とは、塩分を全く又はほとんど含まない水中で生育する、グラム陰性菌のうち、嫌気的条件下で、細胞膜が嵌入してできた内膜の小胞体状のクロマトフォアに含まれるバクテリオクロロフィルにより酸素を発生しない光合成を行って生育している紅〜褐色を呈する細菌全般を意味する。なお、紅色細菌は近年の１６ＳｒＲＮＡ系統解析により、プロテオバクテリア門に散在する種々の属に属する細菌であることが明らかとなっている。
【００１７】
このように本発明において使用する淡水性紅色細菌としては、淡水で生育可能であって、かつスピリロキサンチン経路とバクテリオクロロフィル合成経路を有し、スピリロキサンチン経路で合成される種々のカロテノイドの蓄積により菌株が赤色を呈する紅色細菌に属する菌を例示することができ、一般的に通性嫌気性菌で、有機酸を炭素源として好気条件下で生育するほか、光栄養的に嫌気条件下で生育可能である細菌であり、例えば、ロドシュードモナス属、ロドスピリルウム属、ロドミクロビウム属、ロドプラネス属、ロドシスタ属、ロドスピラ属、ロドビウム属、ルブリヴィヴァクス属、及びブラストクロリス属等に属する細菌などを挙げることができ、具体的には、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドシュードモナス・レノバセンシス（Rhodopseudomonas rhenobacensis）、ロドシュードモナス・フェカリス（Rhodopseudomonas faecalis）、ロドスピリルウム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）、ルブリヴィヴァクス・ゲラチノサス（Rubrivivax gelatinosus）、ロドミクロビウム・バニエリ（Rhodomicrobium vannielii）、ロドプラネス・ロゼウス（Rhodoplanes roseus）、ロドシスタ・センテナリア（Rhodocista centenaria）、ロドスピラ・トゥルエペリ（Rhodospira trueperi）、ロドビウム・オリエンティス（Rhodobium orientis）、ブラストクロリス・ヴィリディス（Blastochloris viridis）等を挙げることができ、好ましくはロドシュードモナス・パルストリスを挙げることができる。
【００１８】
本発明の形質転換淡水性紅色細菌を作製するために用いられる宿主細菌、すなわちＣｒｔＩ遺伝子の全部又は一部が欠損・置換等の遺伝子変異により破壊され、ＣｒｔＩを発現する機能が喪失した、スピリロキサンチン経路を有する淡水性紅色細菌は、ＣｒｔＩ遺伝子の全部又は一部を欠損・置換等の遺伝子変異手段により破壊することにより得ることができる。ＣｒｔＩをコードする構造遺伝子、及びその転写制御領域からなる上記ＣｒｔＩ遺伝子の変異手段としては、ＣｒｔＩをコードする構造遺伝子（ＣｒｔＩ遺伝子コード領域）を、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により置換、欠失等をさせることにより、ＣｒｔＩを発現する機能を喪失させる方法を例示することができ、例えば、ＣｒｔＩ遺伝子コード領域の一部又は全部を含む領域に薬剤耐性マーカー遺伝子を導入することにより、ＣｒｔＩ遺伝子を発現する機能を喪失させ、かかる薬剤耐性マーカー遺伝子が導入された細菌が該薬剤に対して耐性になる性質を利用して変異が導入された細菌だけを選別することができる。上記薬剤耐性マーカー遺伝子としては、該遺伝子が導入された細胞を選別できるものであれば特に制限されず、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等を具体的に挙げることができる。
【００１９】
上記ＣｒｔＩ(フィトエン不飽和化酵素)は、スピリロキサンチン経路の出発物質である無色のフィトエンを脱水素反応により不飽和化することで赤色のリコペンに転換する酵素活性を有するタンパク質である。スピリロキサンチン経路とは、光合成色素のカロテノイド生合成経路の一つであって、前駆体であるゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）２分子が結合して生成したフィトエンからスピリロキサンチンに至る図１に示される経路であり、該経路において合成されたオレンジ色〜赤色を呈する様々なカロテノイドは、化学式Ｃ４０Ｈ５６の基本構造を有するイソプレノイドの誘導体であって、クロロフィルでは吸収しきれない光（おもに４００〜５００ｎｍ）を吸収することにより光エネルギーの変換効率の増大、酸素ラジカルに対する防御作用等に役立っていると考えられている。
【００２０】
上記誘導性プロモーターとしては、誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進するプロモーターであれば特に制限されず、例えば、Ｐａｒｓ（オペレーター／プロモーター）（非特許文献３等）、ｃａｄＡオペレーター／プロモーター（G. Endo, et al. J. Bacteriol.,(1995), Vol.177, No.15, 4437-4441等）、ｍｅｒＲオペレーター／プロモーター（J.J.Caguiat, et al., J. Bacteriol.,(1999), Vol.181, No.11, 3462-3471等）などのオペレーター−リプレッサー等と協働して転写を促進するプロモーターやトルエン−ベンゼン代謝経路プロモーター（N.C.Casavant, et al., Environ. Microbiol.,(2003), Vol.5, No.4, 238-249等）、ｎａｒＧプロモーター（K.M.DeAngelis, et al., Appl. Environ. Microbiol.,(2005), Vol.71, No.12, 8537-8547等）、ｓａｌプロモーター（C.Werlen, et al., Appl. Environ. Microbiol.,(2004), Vol.70, No.1, 43-51等）、ＰａｌｋＢプロモーター／ＰａｌｋＳ２プロモーター（I.Cases and V. de Korenzo, Nat. Rev. Microbiol.,(2005), Vol.3, No.2, 105-118等）などのオペレーター−リプレッサーと協働することなく転写を促進するプロモーターを挙げることができ、なかでもＰａｒｓ（オペレーター／プロモーター）を好適に示すことができる。
【００２１】
上記誘導物質としては、具体的には、Ｐａｒｓを賦活化するＡｓ(III)、ビスマス(III)又はアンチモン(III)、ＣａｄＣタンパク質に結合してｃａｄＡオペレーター／プロモーターを賦活化するＣｄ(II)（G. Endo et al., J. Bacteriol.,(1995), Vol.177, No.15, 4437-4441等）、ＭｅｒＲに結合してｍｅｒオペレーター／プロモーターを賦活化するＨｇ(II)（J.J.Caguiat, et al., J. Bacteriol.,(1999), Vol.181, No.11, 3462-3471等）、ＴｂｕＴ及びトルエン−ベンゼン代謝経路プロモーターを賦活化するトルエン（N.C.Casavant, et al., Environ. Microbiol.,(2003), Vol.5, No.4, 238-249）、ｎａｒＧプロモーターを賦活化する硝酸（K.M.DeAngelis, et al., Appl. Environ. Microbiol.,(2005), Vol.71, No.12, 8537-8547等）、ｓａｌプロモーターを賦活化するナフタレン（C.Werlen, et al., Appl. Environ. Microbiol.,(2004), Vol.70, No.1, 43-51等）、ＡｌｋＳ及びａｌｋＢプロモーターを賦活化するオクタン（I.Cases and V. de Korenzo, Nat. Rev. Microbiol.,(2005), Vol.3, No.2, 105-118等）などを挙げることができる。
【００２２】
上記誘導物質が上記誘導性プロモーターを賦活化して、下流遺伝子への転写が誘導される。例えば、調節遺伝子ａｒｓＲによりコードされるＡｒｓＲはオペロンのオペレーター領域に結合するリプレッサータンパク質が、オペレーターに結合することにより通常はヒ素誘導性プロモーターＰａｒｓからの下流遺伝子への転写を抑制しているが、細胞内にヒ素が取り込まれたヒ素化合物がＡｒｓＲと結合すると構造的な変化が起こり、リプレッサーがオペレーターから解離して、Ｐａｒｓからの下流遺伝子への転写が促進される。この他、誘導物質がプロモーター部分に作用することで下流遺伝子への転写が促進されることもある。また、I.Cases and V. de Korenzo, Nat. Rev. Microbiol.,(2005), Vol.3, No.2, 105-118等に記載されているような、オクタンとＰａｌｋＢプロモーター／ＰａｌｋＳ２プロモーターにおける複雑な制御方法等も利用することができる。
【００２３】
また、上記のベクターに組み込まれるＣｒｔＩ遺伝子としては、ＣｒｔＩをコードする構造遺伝子及びその転写制御領域からなる遺伝子ＤＮＡ（例えば、配列番号１６に示される塩基配列）を挙げることができるが、誘導性プロモーター非依存的なＣｒｔＩ遺伝子の転写を確実に抑制するため、転写制御領域（例えば、配列番号１６に示される塩基配列のうち、１〜１９３からなる塩基配列）内のプロモーター活性がない遺伝子ＤＮＡ、具体的には、ＣｒｔＩをコードする構造遺伝子からなる遺伝子ＤＮＡ（例えば、配列番号１６に示される塩基配列のうち、１９４〜１７２９からなる塩基配列）や、ＣｒｔＩをコードする構造遺伝子とＳＤ配列からなる遺伝子ＤＮＡ（例えば、配列番号１６に示される塩基配列のうち、１８２〜１７２９からなる塩基配列）や、ＣｒｔＩをコードする構造遺伝子及び変異等によりプロモーター活性を有さないその制御領域からなる遺伝子ＤＮＡ（実施例２参照）などを好適に例示することができる。
【００２４】
本発明のバイオセンサー用ベクターとしては、誘導物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーターと該誘導性プロモーターの下流に作動可能に連結されたＣｒｔＩ遺伝子とを発現ベクターに組み込んだ組換えベクターであれば特に制限されず、ＣｒｔＩ遺伝子と誘導性プロモーターとを、自立複製可能である発現ベクター、例えば発現コスミドベクター又は発現プラスミドベクター、好ましくは発現プラスミドベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。また、ＣｒｔＩ遺伝子が発現できる位置に該誘導性プロモーターの他、リプレッサー遺伝子、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
【００２５】
本発明の形質転換淡水性紅色細菌の作製における組換えベクターの宿主への導入方法としては、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びMolecular Cloning: A laboratory Manual,3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 2001.（モレキュラークローニング第３版）等に記載されている方法などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、プロトプラスト−ＰＥＧ法、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、接合伝達（コンジュゲーション）法等により行うことができるが、エレクトロポレーション法、接合伝達（コンジュゲーション）法が好ましい。
【００２６】
本発明の形質転換淡水性紅色細菌をバイオセンサーとして使用する方法としては、上記本発明の形質転換淡水性紅色細菌を嫌気的明条件下で培養し、前記形質転換淡水性紅色細菌菌体の緑色から赤色への色調変化の程度を評価し、色調変化が認められた場合、前記被検物質が前記誘導物質を含むと判断する方法であれば特に制限されず、上記嫌気的明条件としては、バクテリオクロロフィルによる光合成を行うために必要な光量が存在し、かつ酸素が遮断されている状態を挙げることができる。かかる嫌気的明条件で、かつ誘導物質の存在下に培養すると、誘導された不飽和化酵素ＣｒｔＩの脱水素作用により、紅色細菌菌体内の無色のフィトエン分子の４ヶ所が不飽和化された赤色のリコペンに変換され、最終的にはスピリロキサンチンにまで、スピリロキサンチン経路により変換されることになる。そして、このような嫌気的明条件下での培養には、振盪培養器が不要であり、装置を小型化することができる上に、密封により嫌気的状態を維持するため、遺伝子組換え菌である本発明の形質転換淡水性紅色細菌の周囲環境への漏洩・拡散の危険性を限りなく小さなものとすることができる。
【００２７】
上記のように、本発明の形質転換淡水性紅色細菌の菌体の緑色から赤色への色調変化の程度を評価し、色調変化が認められた場合、前記被検物質が前記誘導物質を含むと判断することができる。具体的には、淡水性光合成細菌であるロドシュードモナス・パルストリスのゲノム上からＣｒｔＩをコードするＣｒｔＩ遺伝子を、例えばカナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）と置換することにより破壊したＣｒｔＩ遺伝子欠損ロドシュードモナス・パルストリス株は、紫〜青及び橙〜赤の波長域の光を吸収して光合成を触媒するバクテリオクロロフィルを保有し、ＣｒｔＩ遺伝子が欠損してスピリロキサンチン経路におけるカロテノイド合成が行われていないため緑色を呈しているのに対し、誘導物質が存在するとプロモーター部分からＣｒｔＩ遺伝子への転写が促進され、スピリロキサンチン経路における種々のカロテノイドの合成が行われ、かかるカロテノイドの蓄積により赤色を呈するようになることで、被検物質が誘導物質を含むと判断することができる。緑色から赤色への色調変化は、目視により判断することもでき、また、分光測色計により測定することもできる。また、形質転換淡水性紅色細菌菌体の色調の変化を、ＨＳＢ表色系、ＲＧＢ表色系、ＣＩＥ１９７６Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系等で表すことができる。例えば、ＣＩＥ１９７６Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系は、波長に基礎をおかず、心理的（色を見たとき）に、同じ色違いに見える色同士の距離（心理的な距離感）を均等に設定した色立体（＝色空間）のことであって、例えば赤２色の色違いの度合いと、緑２色の色違いの度合いが、心理的に同じに見えるときには、その２色間の距離を同じにするという考え方のもとに開発されたシステムであり「色の並びが均等にできている」ということで、均等色空間と呼ばれる。Ｌ＊値（Light:明度）、ａ＊値（赤緑方向の色彩）、ｂ＊値（黄青方向の色彩）という３軸の座標で色が表現され、座標を見れば色が推定できるモデルになっており、例えば、Ｌ＊＝１００は白、Ｌ＊＝０は黒、ａ＊＞０ならば赤系統の色、ａ＊＜０なら緑系統、ｂ＊＞０は黄系統、ｂ＊＜０は青系統というように推定できる。このシステムの利点は、色違い（色差）が均等に測れる点であり、三次元の色座標軸上でのベクトルの長さが長いほど視覚上の色変化が大きいと判断される。
【００２８】
一般的にバイオセンサーとは、狭義では酵素や抗体、脂質膜、一本鎖ＤＮＡ等の基質認識能を利用した、生体反応を電気信号に変換することで読み取る装置を意味する場合もあるが、広義では測定対象物質と選択的に反応する物質の物理的・化学的変化、例えば酵素反応、抗原抗体反応、リガンドのレセプターへの結合といった生化学的反応における生体内分子の高度な分子認識機能を利用したセンサーの総称である。本発明の形質転換淡水性紅色細菌からなるバイオセンサーは、測定に特別な装置及び補酵素等を必要とせずにセンシングデバイスとして微生物細胞そのものを利用することが特徴となっている。本発明の組換え微生物バイオセンサーとして、宿主細胞、特定の物質に応答し、下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーター、そしてその下流のレポーター遺伝子の三要素からなり、形質転換淡水性紅色細菌菌体の色調変化の程度を評価し、色調変化が認められた場合、前記被検物質が前記誘導物質を含むと判断するものであり、場合によってレポーターの発するシグナルを検出する装置を組み合わせたシステムを利用することができるものである。
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
１−１  センサープラスミドの構築
（１）実験材料
使用した培地を表１に、プラスミドを表２に、リンカーＤＮＡ（配列番号１、２）及びプライマー（配列番号３〜１５）を表３にそれぞれ示す。また、ｐＧＥＭＴ(登録商標)ベクターシステムＩ（Promega社製)のプロトコールに従って形質転換した大腸菌ＪＭ１０９形質転換株の培養はＬＢ培地（表１参照）を用い、培地には必要に応じてアンピシリン（Ａｍｐ）、カナマイシン（Ｋｍ）、クロラムフェニコール（Ｃｐ）を各終濃度が５０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬとなるよう添加した。また形質転換過程の一時的な培養にはＳＯＣ培地（表１参照）を用いた。
【００３１】
【表１】
2009159862.tif 000002
【００３２】
表２：実施例１で用いたプラスミド
【表２】
2009159862.tif 000003
【００３３】
【表３】
2009159862.tif 000004
【００３４】
（２）５’−ＮｄｅＩ−ＣｒｔＩ−ＳａｌＩ−３’断片の作製
レポーター遺伝子として使用するｃｒｔＩ（上流１９３ｂｐ及びＯＲＦを含む領域）(配列番号１６)を、ロドシュードモナス・パルストリスＮｏ．７（Fujii et al.(1983) Agric. Biol. Chem. 47, 2747-2753）のトータルＤＮＡを鋳型として、プライマーＫｐｎＩ−ｃｒｔＩＡ（配列番号４）及びＮｄｅＩ−ＳＤ−ｃｒｔＩＳ（配列番号３）を用いて、Ｐｆｘ５０（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ(Invitrogen社製)、ＬＡ  Ｔａｑ  ｗｉｔｈ  ＧＣバッファー(TaKaRa社製)、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Roche社製)を用い、各プロトコールに従ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。得られたＰＣＲ断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）ＰＣＲ精製キット(QIAGEN社製)を用いて精製し、ＴＡクローニングによりｐＧＥＭ−Ｔ（登録商標）（Promega社製)にプロトコールに従い挿入してｐＧＥＭｃｒｔＩとし、大腸菌ＪＭ１０９に導入して形質転換した。形質転換株をＬＢ／アンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレート上で、青／白カラーセレクションによりスクリーニングを行った。選抜された形質転換株からプラスミドｐＧＥＭｃｒｔＩを抽出し、制限酵素ＳｐｈＩ処理によりｃｒｔＩの挿入方向を確認した。ｃｒｔＩがプラスミド上のｌａｃＺの転写方向と逆に挿入されたｐＧＥＭｃｒｔＩを選抜した。
【００３５】
上記ｐＧＥＭｃｒｔＩ中のｃｒｔＩのＤＮＡ塩基配列をシークエンス反応により確認後にｐＧＥＭｃｒｔＩを制限酵素ＳａｌＩで処理し、フェノール／クロロホルム処理による精製後、制限酵素ＮｄｅＩ処理した。続いて電気泳動を行い、１．７ｋｂ付近のバンドを回収し、ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キット(QIAGEN社製)を用いて、プロトコールに従い５’−ＮｄｅＩ−ｃｒｔＩ−ＳａｌＩ−３’ＤＮＡ断片を精製した（図２参照）。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅターミネーターＶ３．１サイクルシークエンシングキット(Applied Biosystem社製)を用い、サンプルの調製は宇都宮大学のシークエンシング管理者が推奨する節約法のプロトコールに従って行った。
【００３６】
（３）５’−ＳｐｈＩ−ΩａｒｓＲ−ＮｄｅＩ−３’断片の作製
１）５’−ＰｓｔＩ−ａｒｓＲ−ＮｄｅＩ−３’断片の作製
オペレーター及びプロモーターと推測される配列を上流に含むａｒｓＲのクローニングのためにｐＳＥＮＳＥ−Ａｓ（H. Fujimoto, et al., (2006) Appl. Microbiol.  Biotechnol.,73, 332-338）を鋳型として表３記載のプライマーｔｔｔ−ＰｓｔＩ−Ｐａｒｓ−ａｒｓＲＦ（配列番号５）及び５’−ＣｒｔＡ  ＳＤＲ（配列番号６）を用いて上記同様にＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キットを用いて精製し、次いで制限酵素ＰｓｔＩとＮｄｅＩの処理を行い、５’−ＰｓｔＩ−ａｒｓＲ−ＮｄｅＩ−３’断片を作製した。
【００３７】
２）ターミネーター（Ω）のｐＧＥＭ−Ｔベクターへの挿入
上記５’−ＮｄｅＩ−ｃｒｔＩ−ＳａｌＩ−３’断片の作製時に用いたｐＧＥＭｃｒｔＩを制限酵素ＳｐｈＩで処理し、バッファーのＮａＣｌ濃度を調整後、制限酵素ＰｓｔＩで処理した。続いてｃｒｔＩ断片を除くため電気泳動を行い、３．０ｋｂ付近のバンドを回収し、上記ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、ＤＮＡ断片を精製した。次に上流にＳｐｈＩサイト、下流にＰｓｔＩサイトの粘着末端を付加したターミネーター配列（Ω）（表３参照）を有するリンカーＤＮＡをｐＧＥＭＴ付属のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入してｐＧＥＭΩとし、大腸菌ＪＭ１０９に導入して形質転換した。コロニーＰＣＲにより選抜した形質転換株からプラスミド（ｐＧＥＭΩ）を抽出し、ＢｓｓＨII及びＳｐｈＩ処理を行い簡易的に挿入の確認後、上記と同様の方法のシークエンス反応により配列を確認した。
【００３８】
ｐＧＥＭΩをＮｄｅＩ及びＰｓｔＩ処理した後、プラスミドのセルフライゲーションを防ぐ目的で両制限酵素サイト間の６塩基対を除くための電気泳動を行い３．０ｋｂ付近のバンドを分別・回収し、上記同様ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、ＤＮＡ断片を精製した。
【００３９】
３）５’−ＳｐｈＩ−Ω−ａｒｓＲ−ＮｄｅＩ−３’断片の作製
上記１）で得た５’−ＰｓｔＩ−ａｒｓＲ−ＮｄｅＩ−３’断片を、上記２）で得たｐＧＥＭΩへ挿入してｐＧＥＭΩＰａｒｓＲとし、大腸菌ＪＭ１０９に導入して形質転換した。コロニーＰＣＲにより選抜した形質転換株よりｐＧＥＭΩＰａｒｓＲを抽出した。ｐＧＥＭΩＰａｒｓＲを鋳型にプライマーＭ１３−Ｆｗｄ（配列番号７） 及びＭ１３−Ｒｅｖ（配列番号８）を用いて上記同様にＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ産物を精製後、ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩ処理を行い、５’−ＳｐｈＩ−Ω−ａｒｓＲ−ＮｄｅＩ−３’断片を得た（図３参照）。
【００４０】
４）ｐＭＧ１０５ΩＰａｒｓＲｃｒｔＩの作製
ｐＭＧ１０５ベクターをＳｐｈＩ処理した後、バッファーのＮａＣｌ濃度を調整し、ＳａｌＩ処理を行った。続いてプラスミドのセルフライゲーションを防ぐ目的で両制限酵素サイト間の塩基対を除くための電気泳動を行い５．６ｋｂ付近のバンドを分別・回収し、上記同様ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いてＤＮＡ断片を精製した。次に５’−ＮｄｅＩ−ｃｒｔＩ−ＳａｌＩ−３’断片及び５’−ＳｐｈＩ−Ω−ａｒｓＲ−ＮｄｅＩ−３’ 断片をｐＭＧ１０５ベクターとライゲーションさせたｐＭＧ１０５ΩＰａｒｓＲｃｒｔＩを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。上記青／白カラーセレクション及びコロニーＰＣＲにより選抜した形質転換株よりプラスミド（ｐＭＧ１０５ΩＰａｒｓＲｃｒｔＩ）（図４参照）を抽出した。
【００４１】
５）ｐＭＧ１０５ΩＰａｒｓＲｃｒｔＩＣｍＲの作製
ＣｒｔＩ遺伝子を発現する機能を喪失させた、ロドシュードモナス・パルストリスＮｏ．７１１はゲノム上のｃｒｔＩをＫｍＲと置換した変異株であるため、カナマイシン以外に感受性のある抗生物質を選択する必要があった。本研究室においてカナマイシン、アンピシリン、パロモマイシン、スペクチノマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリンを用いた薬剤耐性試験の結果、クロラムフェニコールに対し感受性が見られたため、クロラムフェニコールを利用することにより、センサープラスミド導入後のスクリーニングを行うことにした。そこでｐＭＧ１０５ΩＰａｒｓＲｃｒｔＩ中にクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）を挿入することにした。
【００４２】
ｐＬｙｓＳ由来のＣｍＲをプライマーＣｍｒ−ＳｐｅＩＦ（配列番号９）及びＣｍｒ−ＳｐｅＩＲ（配列番号１０）を用いて上記同様にＰＣＲにより増幅し、得られたＣｍＲ断片を精製し、制限酵素ＳｐｅＩ処理をしたｐＭＧ１０５ΩＰａｒｓＲｃｒｔＩに挿入して、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。コロニーＰＣＲにより選抜した形質転換株からプラスミド（ｐＭＧ１０５ΩＰａｒｓＲｃｒｔＩＣｍＲ）（図４参照）を抽出し、ＮｄｅＩ、ＳａｌＩ及びＳｐｅＩ処理を行い簡易的に挿入の確認後、シークエンスにより配列を確認した（図４参照）。
【００４３】
１−２  ヒ素応答バイオセンサー株の構築
（１）形質転換
上記ｐＭＧ１０５ΩＰａｒｓＲｃｒｔＩＣｍＲをセンサープラスミドとしてロドシュードモナス・パルストリスＮｏ．７１１を形質転換した。対数増殖期（ＯＤ６００：０．５）の状態にある−８０℃にて保存していたロドシュードモナス・パルストリスＮｏ．７１１を氷上で融解し、菌体は７０μＬ、ＤＮＡは１〜２μＬ（〜１μｇ）用いた。パラメーター設定はジーンパルサーを２５μＦ、１．２５ｋＶ／ｍｍに、パルスコントローラーは２５０Ωとし、タイムコンスタント値は４．６〜４．８ｍｓｅｃになった。直ちに氷上へ移し３０分間置き、ビタミン溶液（Vitamin solution：表１参照）を０．５％（ｖ／ｖ）添加した４ＣｙＭＯＭ（表１参照）（抗生物質非添加）５ｍＬに植菌し、３０℃にて明条件で試験管内で２４時間培養した。２４時間後、遠心分離により（６，０００ｒｐｍ、５分間）集菌した。エレクトロポレーション時の残存プラスミドを除く目的で、集菌した菌体を２回洗浄（４ＣｙＭＯＭ１ｍＬに懸濁し、遠心分離後上清を除去）した。洗浄後、４ＣｙＭＯＭ１００μＬに懸濁したものを基準とし、１００倍希釈、１，０００倍希釈、１０，０００倍希釈した希釈液１００μＬを４ＣｙＭＯＭ寒天培地（Ｃｐ１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ）に撒き、３０℃にて明条件で培養しスクリーニングした。なお、コロニーが確認できるまで１週間程度要した。
【００４４】
（２）ヒ素検出試験
寒天培地上に緑、赤、白及び中心が緑で縁が赤色をした４種類のコロニーが出現したので、各クローンからプラスミド及びトータルＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによりヒ素応答性ＣｒｔＩ発現ユニット構造を調べた（図５参照）。またＰＣＲにより形質転換が成功したと考えられる株を選抜後、それらのクローンを用いてヒ素検出試験を行った。結果を表４に示す。いずれのクローンにおいてもヒ素添加による色変化は認められなかった。この原因としてヒ素非添加時においてもＮｏ．７１１形質転換株が背景色として赤色を呈したことが考えられる。
【００４５】
【表４】
2009159862.tif 000005
Ｃｏｌｏｒ    Ｒ：赤色、Ｇ：緑色、Ｗ：白色、Ｒ／Ｇ：中心が緑で縁が赤色
ＰＣＲ        ○:電気泳動において目的の長さのバンド検出
×:電気泳動において目的の長さとは異なるバンド検出
△:電気泳動において目的の長さのバンドが微かに検出
―:実施せず
Ａｓ          ×:ヒ素検出試験において色調変化なし
―:実施せず
【００４６】
（３）まとめ
ロドシュードモナス・パルストリスＮｏ．７１１形質転換株がヒ素非添加時に寒天培地上で赤くなった原因として、
１）センサープラスミド導入後にセンサープラスミドがＮｏ．７１１のゲノムＤＮＡにインテグレートしたため、ＣｒｔＩがＰａｒｓではなく内在性ｃｒｔＩプロモーターの制御下で発現した、
２）センサープラスミド上にＰａｒｓと共に内在性のｃｒｔＩプロモーターが含まれていたため、内在性ｃｒｔＩプロモーターの制御下でｃｒｔＩが発現した、
３）ＣｒｔＩ発現ユニット上流に挿入したターミネーターが機能せず、センサープラスミド上においてリードスルーが起きた事によりＣｒｔＩが発現した、といった可能性があると結論づけた。
【実施例２】
【００４７】
２−１  ＣｒｔＩをレポーターとしたヒ素応答センサープラスミドの再構築
実施例１において構築したプラスミドでは、ロドシュードモナス・パルストリスＮｏ．７株由来のｃｒｔＩのＯＲＦ及びその上流１９３ｂｐが用いられている。ｃｒｔＩのＯＲＦのみを使用することで内在性ｃｒｔＩプロモーターがセンサープラスミド内に配置される可能性を排除することとした。
（１）実験材料
使用したプライマー（配列番号１７〜２５）を表５に、プラスミドを表６に示す。
【００４８】
【表５】
2009159862.tif 000006
【００４９】
【表６】
2009159862.tif 000007
【００５０】
（２）ｃｒｔＩの再クローニング
ｃｒｔＩのＯＲＦの上流１９３ｂｐを除くことで、内在性のＳＤ配列も除かれると推測できるので、人工的にＳＤ配列を付加し、さらに転写制御のより強いコンストラクトを目的とし、ａｒｓＲの終止コドンとｃｒｔＩの開始コドンの間にオペレーターを人工的に付加するなどして、図６に示すようにプライマーＣｒｔＩ−ＮｄｅＩ−ＳＤｌｅｓｓＦ（配列番号１８）とｎｏｎ−ｃｒｔＩＡ（配列番号２０）を用いて「ＳＤ−ｌｅｓｓ」を、プライマーＣｒｔＩ−ＮｄｅＩ−ＳＤＦ１（配列番号１７）とｎｏｎ−ｃｒｔＩＡ（配列番号２０）を用いて「ＳＤ」を、プライマーＮｄｅＩ−ａｒｓｏｐｅＳＤＦ１（配列番号１９）とｎｏｎ−ｃｒｔＩＡ（配列番号２０）を用いて「ｏｐｅｒａｔｏｒ」の３種類のセンサープラスミドの構築を試みた。先に構築したセンサープラスミド（ｐＭＧ１０５ΩＰａｒｓＲｃｒｔＩＣｍＲ）を鋳型に、目的のコンストラクトに合わせた上記プライマーの組合せを用いて（図６参照）、ＰＣＲによりｃｒｔＩのＯＲＦを増幅させ、得られた増幅断片を精製し、ＴＡクローニングによりｐＧＥＭ−Ｔベクターへ挿入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。上記青／白カラーセレクションにより形質転換株のスクリーニングを行い、選抜した形質転換株よりプラスミドを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＮｄｅＩ処理によりｃｒｔＩの挿入方向を確認した。ｃｒｔＩがベクター上のｌａｃＺの転写方向と逆に挿入されたプラスミドを選抜し、ＮｄｅＩ及びＳａｌＩ処理を行った。続いて電気泳動を行い、１．５ｋｂ付近のバンドを回収し、精製して、５’−ＮｄｅＩ−ＳＤ−ｌｅｓｓ−ｃｒｔＩ−ＳａｌＩ−３’、５’−ＮｄｅＩ−ＳＤ−ｃｒｔＩ−ＳａｌＩ−３’、５’−ＮｄｅＩ−ｏｐｅｒａｔｏｒ−ｃｒｔＩ−ＳａｌＩ−３’を得た。
【００５１】
（３）センサープラスミドの構築
ＮｄｅＩ−ＳＤ−ｌｅｓｓ−ｃｒｔＩ−ＳａｌＩ、ＮｄｅＩ−ＳＤ−ｃｒｔＩ−ＳａｌＩ、あるいはＮｄｅＩ−ｏｐｅｒａｔｏｒ−ｃｒｔＩ−ＳａｌＩと実施例１で用いたＳｐｈＩ−ΩＰａｒｓＲ−ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩ及びＳａｌＩの両制限酵素の粘着末端を有するｐＭＧ１０３ベクターをライゲーションした。この過程を経て得られた３種類のプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。カラーセレクション及びコロニーＰＣＲにより選抜した形質転換株からプラスミドを抽出した。ＮｄｅＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｅＩ処理を行い簡易的にΩＰａｒｓＲｃｒｔＩ断片の挿入を確認後、シークエンスにより配列の確認をした。次に、各プラスミドをまずＳｐｅＩ処理を行い精製後、５’−ＳｐｅＩ−ＣｍＲ−ＳｐｅＩ−３’をプラスミド上のＳｐｅＩ粘着末端と連結させた。このプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換株よりプラスミドを抽出しＳｐｅＩ処理よりＣｍＲ断片の挿入の確認後、シークエンスにより配列の確認をした。これらの過程を経て得られたプラスミドをそれぞれＳＤ、ＳＤ−ｌｅｓｓ、ｏｐｅｒａｔｏｒとする。
【００５２】
（４）ヒ素応答バイオセンサー株の構築
各センサープラスミドを用いて上記実施例１−１同様ロドシュードモナス・パルストリスＮｏ．７１１を形質転換後、寒天培地上のコロニーからプラスミドを抽出し、ＰＣＲによりヒ素応答性ＣｒｔＩ発現ユニット構造を調べた。ＳＤとＳＤ−ｌｅｓｓを用いた形質転換で得られたコロニーでは、３種類のプライマーの組合せを用いたＰＣＲでＳＤあるいはＳＤ−ｌｅｓｓ陽性のコロニーが得られたが、３日間の培養後にコロニーの色が赤色に変化した。このため、ＳＤ及びＳＤ−ｌｅｓｓはセンサープラスミドとして利用しないことにした。一方、ｏｐｅｒａｔｏｒを用いた形質転換で得られたコロニーを観察すると、緑、赤、及び中心が緑で縁が赤色の３種類が認められた。各コロニーからプラスミドを熱抽出し、ＰＣＲによりｏｐｅｒａｔｏｒの構造を維持したプラスミドがコロニー中に保持されているか否かを確認した（図７参照）。そのＰＣＲの結果は表７に示す。構築したｏｐｅｒａｔｏｒを維持していると考えられるコロニー（クローンＮｏ．２０、２５、及び３６）について更に観察を続けた。
【表７】
2009159862.tif 000008
Ｃｏｌｏｒ  Ｒ:赤色、Ｇ:緑色、Ｒ／Ｇ:中心が緑で縁が赤色
ＰＣＲ      ○:電気泳動において目的の長さのバンド検出
×:電気泳動において目的の長さとは異なるバンド検出
―:実施せず
【００５３】
クローンＮｏ．２０、２５は時間が経つとコロニーが赤色に変化し、液体培養においても赤色を呈した。今回、オペレーター領域をａｒｓＲの下流に人工的に付加することでより強い転写制御が期待できるコンストラクトを作製したが、完全なＣｒｔＩ発現ユニットが挿入されたプラスミドをもった形質転換株においてもベースとなるｃｒｔＩの発現を完全に防ぐことはできなかった。ｍＲＮＡからの逆転写産物を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ａｒｓＲからｃｒｔＩまでのポリシストロン性のｍＲＮＡが転写されていることが確認できたので、導入したオペレーター領域によりＣｒｔＩ遺伝子の転写が完全に防げないことが原因であると推定される。しかし、実施例１で構築した形質転換株のヒ素非添加の培養液と比較し、クローンＮｏ．３６は明らかにベースの赤色が抑えられており、ｏｐｅｒａｔｏｒプラスミドでは比較的強いＣｒｔＩ遺伝子の転写制御が行われていると推測される。またＣｒｔＩの翻訳にＳＤ配列付加の有無は関係しないことも明らかになった。
【００５４】
２−２  ヒ素検出試験
（１）実験方法
Ｎｏ．３６の形質転換株（表７参照）を用いて、培養液中にヒ素を添加することによる色の変化を視覚的に観察することにより、バイオセンサーとしての有用性の有無を確認した。−８０℃にて保存のＮｏ．３６の形質転換株を、ビタミン溶液を０．５％（ｖ／ｖ）添加した４ＣｙＭＯＭ（抗生物質非添加）５ｍＬに植菌し、３０℃、明条件下試験管内で４８時間前培養した。次に、前培養液の３００μＬをビタミン溶液を０．５％（ｖ／ｖ）添加した４ＣｙＭＯＭ（Ｋｍ３０μｇ／ｍＬ、Ｃｐ１００μｇ／ｍＬ）５０ｍＬに植菌し、３０℃にて明条件で３６時間本培養を行った。遠心分離により集菌後、菌体を２回洗浄（４ＣｙＭＯＭに懸濁し、遠心分離後、上清を除去）した。洗浄後菌体を、ビタミン溶液を０．５％（ｖ／ｖ）添加した４ＣｙＭＯＭ（抗生物質非添加）により希釈し、ＯＤ６００を０．５に調整したものを試験管に５ｍＬ分注し、亜ヒ酸ナトリウムを添加し、３０℃にてタングステンランプ照射条件下で培養した。亜ヒ酸ナトリウム添加２４時間後の培養液の色調を確認した。
【００５５】
（２）結果
ヒ素（亜ヒ酸ナトリウム）を添加することにより、ヒ素無添加のコントロールと比較して培養液の赤色が濃くなっていたことが目視により確認できた（図８参照）。この結果から、育種されたバイオセンサー株を用いることで２４時間以内に色調変化による亜ヒ酸ナトリウムの検出が可能であることが明らかとなった。このことから、転写スイッチを構成するＰａｒｓとａｒｓＲによる転写調節システムがロドシュードモナス・パルストリスＮｏ．７１１を宿主とした場合においても機能していることが確認できた。
【００５６】
（３）比較試験
本発明のＣｒｔＩをレポーターとしたバイオセンサー（図９（左）参照）と、ＣｒｔＡをレポーターとし、海洋性光合成細菌ロドブラム・サルフィドフィラムを宿主としたバイオセンサー（図９（右）参照）との嫌気的条件における比較を示す。亜ヒ酸を１０ｐｐｂ及び５０ｐｐｂ添加した場合の、本発明によるバイオセンサーのΔＥ*ａｂは、それぞれ１．８５及び１．９４であるのに対し、海洋性光合成細菌ロドブラム・サルフィドフィルムを宿主としたバイオセンサーによる値は、０．３５及び０．７１であり、本発明によるＣｒｔＩをレポーターとしたバイオセンサーは、特に嫌気条件での亜ヒ酸検出が可能である点が特に優れているといえる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】スピリロキサンチン経路を示す図である。
【図２】ｐＧＥＭ−ＴベクターにｃｒｔＩを挿入してｐＧＥＭｃｒｔＩを作製する方法を示す図である。
【図３】ｐＧＥＭΩベクターにａｒｓＲを挿入してｐＧＥＭΩＰａｒｓＲを作製する方法を示す図である。
【図４】ｐＭＧ１０５ベクターにｃｒｔＩ、ΩａｒｓＲを挿入してｐＭＧ１０５ΩＰａｒｓＲｃｒｔＩベクターを作製し、さらに該ベクターにＣｍＲを挿入して、ｐＭＧ１０５ΩＰａｒｓＲｃｒｔＩＣｍＲを作製する方法を示す図である。
【図５】形質転換ロドシュードモナス・パルストリスが保持するｐＭＧ１０５ΩＰａｒｓＲｃｒｔＩＣｍＲを確認するためのＰＣＲで用いられたプライマーの結合部位を示す図である。ＰＣＲａは、ｔｔｔＰｓｔＩ―ＰａｒｓａｒｓＲ（配列番号５）×ＲｐａｌＩＵ  Ｄ−４−２（配列番号１１）を用いるコロニーＰＣＲ；ＰＣＲｂは、ｔｔｔＰｓｔＩ―ＰａｒｓａｒｓＲ×ＰａｒｓａｒｓＲＦ（配列番号１５）を用いるネストＰＣＲ；ＰＣＲｃは、ｔｔｔＰｓｔＩ―ＰａｒｓａｒｓＲ×ＣｒｔＩＤ−６（配列番号１２）を用いるネストＰＣＲ；ＰＣＲｄは、ｔｔｔＰｓｔＩ―ＰａｒｓａｒｓＲ×ＲｐａｌＩＵ  Ｄ−４−２（配列番号１１）を用いる総ＤＮＡによるＰＣＲ；ＰＤＲｅは、ＣｒｔＩＤ−７（配列番号１３）×ｐＭＧ１０５ｌａｃＺＦ（配列番号１４）を用いる総ＤＮＡによるＰＣＲを示す。
【図６】プラスミド再構築に用いたＣｒｔＩ遺伝子３種類と、該ＣｒｔＩ遺伝子を構築するために用いたプライマーとを示す図である。１は「５’−ＮｄｅＩ−ＳＤ−ｌｅｓｓ−ｃｒｔＩ−ＳａｌＩ−３’」、２は「５’−ＮｄｅＩ−ＳＤ−ｃｒｔＩ−ＳａｌＩ−３’」、３は「５’−ＮｄｅＩ−ｏｐｅｒａｔｏｒ−ｃｒｔＩ−ＳａｌＩ−３’」を示す。
【図７】形質転換ロドシュードモナス・パルストリスが保持するプラスミド、ｏｐｅｒａｔｏｒを確認するためのＰＣＲで用いられたプライマーの結合部位を示す図である。ＰＣＲａは、ｐＭＧ１０５ｌａｃＺＦ２（配列番号２１）×ＲｐａｌＩＵ  Ｄ−４−２（配列番号２２）を用いるコロニーＰＣＲ；ＰＣＲｂは、ｐＭＧ１０５ｌａｃＺＦ２×ＣｒｔＩＤ−６（配列番号２３）を用いるコロニーＰＣＲ；ＰＣＲｃは、ｐＭＧ１０５ｌａｃＺＦ２×Ｍ１３−Ｒｅｖ（配列番号２４）を用いるコロニーＰＣＲ；ＰＣＲｄは、ｐＭＧ１０５ｌａｃＺＦ２×ＲＰａｒｓａｒｓＲＦ（配列番号２５）を用いるコロニーＰＣＲを示す。
【図８】ロドシュードモナス・パルストリス Ｎｏ．７１１を宿主、ｃｒｔＩをレポーター遺伝子としたバイオセンサー株の微好気明条件下における亜ヒ酸に対する２４時間後のレスポンスを示す。
【図９】ｃｒｔＩをベースとしたバイオセンサーとｃｒｔＡをベースとした旧バイオセンサーとの、比較を表す表である。両バイオセンサーとも亜ヒ酸を添加して２４時間嫌気明条件に置かれた後の、Ｌ*、ａ*、ｂ*及びΔＥ*ａｂ値を示したものである。色差ΔＥ*ａｂは、Ｌ*ａ*ｂ*表色系で規定されるそれぞれの測色値を（Ｌ１*，ａ１*，ｂ１*）及び（Ｌ２*，ａ２*，ｂ２*）としたとき、次式：ΔＥ*ａｂ＝（（Ｌ２−Ｌ１）2＋（ａ２−ａ１）2＋（ｂ２−ｂ１）2）１／２により求めた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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