(57)【要約】【課題】炎症は、機械的損傷、感染、または抗原性刺激によって引き起こされるような傷害に対する体の防御反応である。炎症が自己抗原のような不適切な刺激によって誘導される場合、炎症反応は、病理学的に発現され得る。このような炎症反応は、特定のサイトカインの産生を含み得る。TNFは、感染および傷害のような種々の刺激に対する炎症性応答に関連する多くの異なる標的細胞における重要な生理学的効果を有する。機能的に活性なTNFインヒビターを提供することを本発明の課題とする。【解決手段】上記課題は、腫瘍壊死因子の活性を調節する、腫瘍壊死因子結合タンパク質という、タンパク質が開示することによって解決された。組換え遺伝子工学技法によって腫瘍壊死結合タンパク質を得るためのプロセスもまた開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
sTNFRを含む腫瘍壊死因子結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症の分野に関する。より詳細には、本発明は、短縮型腫瘍壊死因子レセプター（sTNFR）に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、機械的損傷、感染、または抗原性刺激によって引き起こされるような傷害に対する体の防御反応である。炎症が自己抗原のような不適切な刺激によって誘導される場合、炎症反応は、病理学的に発現され得、誇張された方法で発現され、または有害な薬剤の除去後に十分に持続する。このような炎症反応は、特定のサイトカインの産生を含み得る。
【０００３】
炎症の病因はほとんど理解されないが、炎症の分子的局面に関するかなりの情報が最近得られている。この調査は、炎症の調停において顕著に現れると考えられる特定のサイトカインの同定を導いた。サイトカインは、細胞、特にサイトカイン合成および放出の直ぐの領域（immediate area）における細胞の挙動を改変する細胞外タンパク質である。腫瘍壊死因子（TNF）は、単球およびマクロファージを含む多くの細胞タイプによって産生されるサイトカインのクラスである。
【０００４】
少なくとも２つのTNF、詳細には、TNFアルファ（TNFα）およびTNFベータ（TNFβまたはリンホトキシン）がこれまでに記載されており、そしてそれぞれはトリマー分子として活性であり、そして架橋レセプターによって細胞シグナルを開始すると考えられる（Engelmannら(1990), J. Biol. Chem., 265:14497-14504）。
【０００５】
証拠のいくつかの情報は、主要な炎症性サイトカインとしてTNF-αおよびTNF-βに関連する。これらの公知のTNFは、感染および傷害のような種々の刺激に対する炎症性応答に関連する多くの異なる標的細胞における重要な生理学的効果を有する。タンパク質は、線維芽細胞と滑液細胞の両方に潜在型コラゲナーゼおよびプロスタグランジンE２を分泌させ、そして骨細胞に骨吸収を刺激させる。これらのタンパク質は、好中球について内皮細胞の表面接着特性を増加させる。これらはまた、内皮細胞に凝固活性を分泌させ、そして凝血を溶解するそれらの能力を減少させる。さらに、これらは、酵素リポタンパク質リパーゼの発現を阻害することによって脂質の貯蔵でない方向に脂肪細胞の活性を向け直す。TNFはまた、肝細胞に「急性期反応物」として公知のタンパク質のクラスを合成させ、これは発熱物質として視床下部に作用する（Selbyら(1988), Lancet, 1(8583):483；Starnes, Jr.ら (1988), J. Clin.Invest., 82:1321；Oliffら (1987), Cell, 50:555；およびWaageら(1987), Lancet, 1(8529):355）。さらに、慢性関節リウマチを含む炎症の種々の予測動物モデルでの前臨床結果は、TNFの阻害が疾患の進行および重篤度に主要な衝撃を有し得ることを示唆している（Dayerら(1994), European Cytokine Network, 5(6):563-571およびFeldmannら(1995), Annals Of The New York Academy Of Sciences, 66:272-278）。さらに、TNFのインヒビターでの慢性関節リウマチにおける最近の予備的なヒト臨床試験は、有望な結果を示している（Rankinら(1995), British Journal Of Rheumatology, 3(4):4334-4342；Elliottら(1995), Lancet, 344:1105-1110；Takら (1996), Arthritis andRheumatism, 39:1077-1081；およびPaleologら (1996), Arthritis andRheumatism, 39:1082-1091）。
【０００６】
TNFのタンパク質インヒビターが当該技術分野で開示される。EP308 378は、発熱患者の尿由来のタンパク質がTNF阻害活性を有することを報告する。このタンパク質の効果は、おそらくレセプターのレベルでの競合メカニズムによる。EP308 378は、そのＮ末端によって特徴づけられるために十分に純粋なタンパク質を開示する。しかし、この参考文献は、何らDNA配列または組換え産生されたTNFインヒビターを教示しない。
【０００７】
組換え産生したTNFインヒビターはまた、当該技術分野で教示されている。例えば、EP393 438およびEP 422 339は、成熟組換えヒト「30kDa TNFインヒビター」（p55レセプターとしておよびsTNFR-Iとしても公知である）および成熟組換えヒト「40kDaインヒビター」（p75レセプターとしておよびsTNFR-IIとしても公知である）ならびにその改変した形態、例えば、フラグメント、機能的誘導体、および改変体のアミノ酸および核酸配列を教示する。EP393 438およびEP 422 339はまた、インヒビターをコードする原因の遺伝子を単離し、適切なベクターおよび細胞タイプで遺伝子をクローニングし、そしてインヒビターを産生するための遺伝子を発現するための方法を開示する。成熟組換えヒト30kDaTNFインヒビターおよび成熟組換えヒト40kDa TNFインヒビターは、TNFを阻害し得ることが証明されている（EP 393 438、EP 422 339、PCT公開第WO92/16221号、およびPCT公開第WO 95/34326号）。
【０００８】
sTNFR-IおよびsTNFR-IIは、神経成長因子レセプター（NGF）、Ｂ細胞抗原CD40、4-1BB、ラットＴ細胞抗原MRCOX40、Fas抗原、ならびにCD27およびCD30抗原を含む、レセプターの神経成長因子／TNFレセプタースーパーファミリーのメンバーである（Smithら(1990), Science, 248:1019-1023）。細胞表面レセプターのこの群の中で最も保存された特徴は、システインリッチな細胞外リガンド結合ドメインであり、これは、約40アミノ酸の４つの繰り返しモチーフに分割され得、そして良好に保存される位置に４〜６システイン残基を含む（Smithら(1990), 前出）。
【０００９】
EP 393438は、40kDa TNFインヒビターΔ51および40kDa TNFインヒビターΔ53をさらに教示し、これらは全長組換え40kDa TNFインヒビタータンパク質の短縮型であり、ここで成熟タンパク質のカルボキシル末端で、51または53アミノ酸残基が、それぞれ除去される。したがって、当業者は、30kDaTNFインヒビターおよび40kDaインヒビターのそれぞれの第４ドメインが、TNF阻害に必要ではないことを理解する。実際、種々のグループがこの理解を確認している。30kDaおよび40kDaTNFインヒビターのドメイン欠失誘導体が生成され、そして第４ドメインを含まない誘導体は全TNF結合活性を保持するが、第１、第２、または第３ドメインを含まない誘導体はそれぞれTNF結合活性を保持しない（Corcoranら(1994), Eur. J. Biochem., 223:831-840；Chih-Hsuehら (1995), TheJournal of Biological Chemistry, 270(6):2874-2878；およびScallonら(1995), Cytokine, 7(8):759-770）。
【００１０】
30kDaTNFインヒビターおよび40kDa TNFインヒビターによって示される細胞傷害性の比較的低い阻害（Butlerら (1994), Cytokine,6(6):616-623）のため、種々のグループがTNFインヒビタータンパク質のダイマーを作製した（Butlerら (1994), 前出；およびMartinら(1995), Exp. Neurol., 131:221-228）。しかし、ダイマーは、抗体応答を生じ得る（Martinら(1995), 前出；およびFisherら (1996), The New England Journal of Medicine, 334(26):1697-1702）。
【００１１】
本発明の目的は、機能的に活性な短縮型sTNFRを提供することである。本発明のこのおよび他の目的は、以下の本明細書の記載から明らかになる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、それぞれsTNFR-IおよびsTNFR-IIの機能的に活性な短縮型に関し、そして本明細書では「短縮型sTNFR」という。短縮型sTNFRは、第４ドメイン（sTNFR-Iのアミノ酸残基Thr１２７-Asn１６１およびsTNFR-IIのアミノ酸残基Pro１４１-Thr１７９）；第３ドメイン（sTNFR-Iのアミノ酸残基Asn１１１-Cys１２６およびsTNFR-IIのアミノ酸残基Pro１２３-Lys１４０）の一部を含まない；そして、必要に応じて、第１ドメイン（sTNFR-Iのアミノ酸残基Asp１-Cys１９およびsTNFR-IIのアミノ酸残基Leu１-Cys３２）の一部を含まない、sTNFR-IおよびsTNFR-IIの改変型である。TNF（例えば、TNF-αおよび／またはTNF-β）のこれらの新しいインヒビターは、一般的な適用性を有する。
【００１３】
本発明の短縮型sTNFRは、式R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２およびR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５によって表されるタンパク質を含む。これらのタンパク質は、それぞれsTNFR-IおよびsTNFR-IIの短縮型である。
【００１４】
「R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２」とは、[Cys１９-Cys１０３]がsTNFR-Iの残基19〜103を表す１つ以上のタンパク質を意味し、このアミノ酸残基番号付け図は、比較を容易にするために図１（配列番号２）に提供される；ここで、R１は、Cys１９のまたは以下の群から選択されるアミノ末端アミノ酸残基の、メチオニル化または非メチオニル化アミン基を表し：
C
IC
SIC
NSIC（配列番号15）
NNSIC（配列番号16）
QNNSIC（配列番号17）
PQNNSIC（配列番号18）
HPQNNSIC（配列番号19）
IHPQNNSIC（配列番号20）
YIHPQNNSIC（配列番号21）
KYIHPQNNSIC（配列番号22）
GKYIHPQNNSIC（配列番号23）
QGKYIHPQNNSIC（配列番号24）
PQGKYIHPQNNSIC（配列番号25）
CPQGKYIHPQNNSIC（配列番号26）
VCPQGKYIHPQNNSIC（配列番号27）
SVCPQGKYIHPQNNSIC（配列番号28）
DSVCPQGKYIHPQNNSIC（配列番号29）；
そして、ここでR２は、Cys１０３のまたは以下の群から選択されるカルボキシ末端アミノ酸残基の、カルボキシ基を表し：
F
FC
FCC
FCCS（配列番号30）
FCCSL（配列番号31）
FCCSLC（配列番号32）
FCCSLCL（配列番号33）；
およびそれらの改変体、ただし、R１がアミノ酸配列VCPQGKYIHPQNNSICのメチオニル化または非メチオニル化アミン基あるいは１〜15残基のそのＮ末端短縮型を表す場合、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質は、式R１-[Cys１９-Cys１０３]-FCCSLCL-R３を有する付加改変体ではなく、ここでR３は図１のアミノ酸配列Asn１１１-Asn１６１のカルボキシル基またはそのカルボキシ末端短縮型を表す。
【００１５】
本発明の代表的短縮型sTNFR-Iは、以下の分子を含む：NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FC-COOH（sTNFR-I2.6D/C105ともいう）；NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.6D/C106ともいう）；NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FN-COOH（sTNFR-I2.6D/N105ともいう）；NH２-MYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.3D/d8ともいう）；NH２-M-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.3D/d18ともいう）；およびNH２-MSIS-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.3D/d15ともいう）、メチオニル化または非メチオニル化のいずれか、ならびにその改変体および誘導体。
【００１６】
「R４-[Cys３２-Cys１１５]-R５」とは、[Cys３２-Cys１１５]がsTNFR-Iの残基Cys３２〜Cys１１５を表す１つ以上のタンパク質を意味し、このアミノ酸残基番号付け図は、比較を容易にするために図８（配列番号35）に提供される；ここで、R４は、Cys３２のまたは以下の群から選択されるアミノ末端アミノ酸残基の、メチオニル化または非メチオニル化アミン基を表し：
C
MC
QMC
AQMC（配列番号36）
TAQMC（配列番号37）
QTAQMC（配列番号38）
DQTAQMC（配列番号39）
YDQTAQMC（配列番号40）
YYDQTAQMC（配列番号41）
EYYDQTAQMC（配列番号42）
REYYDQTAQMC（配列番号43）
LREYYDQTAQMC（配列番号44）
RLREYYDQTAQMC（配列番号45）
CRLREYYDQTAQMC（配列番号46）
TCRLREYYDQTAQMC（配列番号47）
STCRLREYYDQTAQMC（配列番号48）
GSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号49）
PGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号50）
EPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号51）
PEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号52）
APEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号53）
YAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号54）
PYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号55）
TPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号56）
FTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号57）
AFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号58）
VAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号59）
QVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号60）
AQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号61）
PAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号62）
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号63）；
そして、ここでR５は、Cys１１５のまたは以下の群から選択されるカルボキシ末端アミノ酸残基の、カルボキシ基を表し：
A
AP
APL
APLR（配列番号64）
APLRK（配列番号65）
APLRKC（配列番号66）
APLRKCR（配列番号67）
およびそれらの改変体、ただし、R４がアミノ酸配列TCRLREYYDQTAQMCのメチオニル化または非メチオニル化アミン基あるいは１〜15残基のそのＮ末端短縮型を表す場合、R４-[Cys３２-Cys１１５]-R５は、式R４-[Cys３２-Cys１１５]-APLRKCR-R６を有する付加改変体ではなく、ここでR６は図８のアミノ酸配列Pro１２３-Thr１７９のカルボキシル基またはそのカルボキシ末端短縮型を表す。
【００１７】
本発明の１つの局面では、短縮型sTNFRは、グリコシル化または非グリコシル化の形態で作成され得る。短縮型sTNFRは、組換え遺伝子工学技法によって産生される。代わりの実施態様では、短縮型sTNFRは、化学的技法または組換えおよび化学的技法の組み合わせによって合成される。
【００１８】
本発明の別の局面では、短縮型sTNFRは、短縮型sTNFRを水溶性ポリマーに接着することによって誘導体化され得る。例えば、短縮型sTNFRは、分子の見かけの分子量を増加させることによって、薬学速度論的性能を改良するために、１つ以上のポリエチレングリコール分子に結合され得る。
【００１９】
本発明のさらに他の局面は、短縮型sTNFRをコードする種々のポリヌクレオチドを含む。適切な核酸配列には、例えば、特に図に示される配列ならびにその縮重配列および天然に存在する対立遺伝子改変体が含まれる。このような核酸配列は、真核生物または原核生物の宿主細胞における短縮型sTNFRの発現に使用され得、ここで発現産物またはその誘導体はTNFの活性を調節するための能力によって特徴づけられる。
【００２０】
本発明のさらなる局面は、増幅および／または発現制御配列に作動可能に連結された短縮型sTNFRをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。原核生物および真核生物の両方の宿主細胞は、短縮型sTNFRを発現するためにこのようなベクターで安定に形質転換またはトランスフェクトされ得る。本発明は、短縮型sTNFRの組換え産生をさらに含み、ここでこのようなポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、適切な栄養培地中で増殖され、そして、必要に応じて、細胞によって発現される短縮型sTNFRは、宿主細胞および／または栄養培地から単離される。
【００２１】
本発明の他の局面は、短縮型sTNFRまたはその誘導体を含む薬学的組成物を含む。代表的には、短縮型sTNFRまたはその誘導体は、薬学的に受容可能なビヒクルとともに処方され得る。種々の他の処方物質は、短縮型sTNFRまたはその誘導体の製造、貯蔵、取り扱い、送達、および／または効力を容易にするために使用され得る。
【００２２】
本発明の他の局面は、TNFの活性を調節する方法に関する。詳細には、TNF媒介性疾患（例えば、TNF-αおよび／またはTNF-βによって媒介される疾患）は、短縮型sTNFRまたはその誘導体の治療的有効量を患者に投与することによって処置され得る。
【００２３】
短縮型sTNFRをコードするポリヌクレオチドはまた、細胞治療または遺伝子治療適用に使用され得る。
【００２４】
本発明の短縮型sTNFRは、タンパク質の大規模量の産生に特に適する。例えば、sTNFR-Iは、アミノ酸配列111〜126（アミノ酸Asn１１１-Gly１２６）内の脱アミノ部位を有する。この部位の不在は、精製されたタンパク質の生化学的安定性を増強することが予測され、可能な分解産物を減少させそしてより貯蔵安定なタンパク質を生じる。短縮型sTNFRは、他の既に開示されたTNFインヒビタータンパク質よりも少ないジスルフィド架橋を有する。例えば、sTNFR-Iは、アミノ酸配列111〜126内に２つのジスルフィド架橋およびアミノ酸配列127〜161内に３つのジスルフィド架橋を有する；そして、sTNFR-IIは、Cys１２１とCys１３９との間、Cys１４２とCys１５７との間、およびCys１６３とCys１７８との間に１つのジスルフィド架橋を有する。ジスルフィド架橋の数の減少は、より多数のこれらの結合がタンパク質の再折り畳みプロセスを複雑にし得るという点で重要である。驚くべきことに、短縮型sTNFRは、抗原エピトープに対して、他の既に開示されたTNFインヒビタータンパク質よりも少数の部位を有し（例えば、第１の３つのドメインを有するsTNFR-Iの短くなった形態が、特定の残基を曝露することによって生じる新しい（neo-）エピトープである、実施例IIIを参照のこと）、比較的減少した抗原性を生じ、そして繰り返した投与でのクリアランス速度に有意な減少を有さない。短縮型sTNFRの減少した免疫原性は、TNF媒介性疾患、特に慢性炎症性疾患を含む疾患の処置に適切であることが予測される。
【００２５】
本発明の追加の局面および利点は、以下の説明の考慮によって当業者に明らかであり、これは本発明の実施を詳述する。
本発明は、例えば以下を提供する。
【００２６】
（項目１）  以下の式を有する短縮型sTNFR：
R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２
ここで、[Cys１９-Cys１０３]とは、sTNFR-Iの残基19〜103を表し、該アミノ酸残基番号付け図は、比較を容易にするために図１（配列番号２）に提供される；
ここで、R１は、Cys１９のまたは以下の群から選択される１つまたは複数のアミノ末端アミノ酸残基の、メチオニル化または非メチオニル化アミン基を表す：
C
IC
SIC
NSIC（配列番号15）
NNSIC（配列番号16）
QNNSIC（配列番号17）
PQNNSIC（配列番号18）
HPQNNSIC（配列番号19）
IHPQNNSIC（配列番号20）
YIHPQNNSIC（配列番号21）
KYIHPQNNSIC（配列番号22）
GKYIHPQNNSIC（配列番号23）
QGKYIHPQNNSIC（配列番号24）
PQGKYIHPQNNSIC（配列番号25）
CPQGKYIHPQNNSIC（配列番号26）
VCPQGKYIHPQNNSIC（配列番号27）
SVCPQGKYIHPQNNSIC（配列番号28）
DSVCPQGKYIHPQNNSIC（配列番号29）；
そして、ここでR２は、Cys１０３のまたは以下の群から選択されるカルボキシ末端アミノ酸残基の、カルボキシ基を表し：
F
FC
FCC
FCCS（配列番号30）
FCCSL（配列番号31）
FCCSLC（配列番号32）
FCCSLCL（配列番号33）；
ならびにそれらの改変体および誘導体、ただし、R１がアミノ酸配列VCPQGKYIHPQNNSICのメチオニル化または非メチオニル化アミン基あるいは１〜15残基のそのＮ末端短縮型を表す場合、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２は、式R１-[Cys１９-Cys１０３]-FCCSLCL-R３を有する付加改変体ではなく、ここで、R３は図１のアミノ酸残基Asn１１１-Asn１６１のカルボキシル基または図１のAsn１１１-Asn１６１のカルボキシ末端短縮型を表す。
【００２７】
（項目２）  sTNFR-I 2.6D/C105、sTNFR-I 2.6D/C106、sTNFR-I 2.6D/N105、sTNFR-I2.3D/d8、sTNFR-I 2.3D/d18、およびsTNFR-I 2.3D/d15、またはその改変体もしくは誘導体からなる群より選択される、項目１に記載の腫瘍壊死結合タンパク質。
【００２８】
（項目３）  以下の式を有する短縮型sTNFR：
R４-[Cys３２-Cys１１５]-R５
ここで、[Cys３２-Cys１１５]は、成熟全長40kDaTNFインヒビターの残基Cys３２〜Cys１１５を表し、該アミノ酸残基番号付け図は、比較を容易にするために図８（配列番号35）に提供される；
ここで、R４は、Cys３２のまたは以下の群から選択される１つまたは複数のアミノ末端アミノ酸残基の、メチオニル化または非メチオニル化アミン基を表し：
C
MC
QMC
AQMC（配列番号36）
TAQMC（配列番号37）
QTAQMC（配列番号38）
DQTAQMC（配列番号39）
YDQTAQMC（配列番号40）
YYDQTAQMC（配列番号41）
EYYDQTAQMC（配列番号42）
REYYDQTAQMC（配列番号43）
LREYYDQTAQMC（配列番号44）
RLREYYDQTAQMC（配列番号45）
CRLREYYDQTAQMC（配列番号46）
TCRLREYYDQTAQMC（配列番号47）
STCRLREYYDQTAQMC（配列番号48）
GSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号49）
PGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号50）
EPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号51）
PEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号52）
APEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号53）
YAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号54）
PYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号55）
TPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号56）
FTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号57）
AFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号58）
VAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号59）
QVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号60）
AQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号61）
PAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号62）
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号63）；
そして、ここでR５は、Cys１１５のまたは以下の群から選択されるカルボキシ末端アミノ酸残基の、カルボキシ基を表し：
A
AP
APL
APLR（配列番号64）
APLRK（配列番号65）
APLRKC（配列番号66）
APLRKCR（配列番号67）
およびそれらの改変体、ただし、R４がアミノ酸配列TCRLREYYDQTAQMCのメチオニル化または非メチオニル化アミン基あるいは１〜15残基のそのＮ末端短縮型を表す場合、R４-[Cys３２-Cys１１５]-R５は、式R４-[Cys３２-Cys１１５]-APLRKCR-R６を有する付加改変体ではなく、ここでR６は図８のアミノ酸残基Pro１２３-Thr１７９のカルボキシル基または図８のPro１２３-Thr１７９のカルボキシ末端短縮型を表す。
【００２９】
（項目４）  前記アミノ酸配列がグリコシル化されていない、項目１〜３のいずれか一項に記載の腫瘍壊死結合タンパク質。
【００３０】
（項目５）前記アミノ酸配列がグリコシル化される、項目１〜３のいずれか一項に記載の腫瘍壊死結合タンパク質。
【００３１】
（項目６）  前記タンパク質が、水溶性ポリマーに結合される、項目１〜５のいずれか一項に記載の腫瘍壊死結合タンパク質。
【００３２】
（項目７）  項目１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの腫瘍壊死結合タンパク質を含む、多価腫瘍壊死結合タンパク質。
【００３３】
（項目８）  式R１-X-R２を有する多価腫瘍壊死結合タンパク質：
ここで、Xはリンカーを含み、ここで該リンカーは水溶性ポリマーであり；そして
R１およびR２は、該水溶性ポリマーに共有結合される生物学的に活性な分子であり、ここでR１およびR２の少なくとも１つは、項目１〜６のいずれか一項に記載の腫瘍壊死結合タンパク質である。
【００３４】
（項目９）  前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである、項目８に記載の多価腫瘍壊死結合タンパク質。
【００３５】
（項目１０）  前記タンパク質が、sTNFR-I 2.6D/C105dbおよびsTNFR-I 2.6D/C106dbからなる群より選択される、項目９に記載の多価腫瘍壊死結合タンパク質。
【００３６】
（項目１１）  TNF媒介性疾患を処置することにおける使用のための、項目１〜１０のいずれか一項に記載の腫瘍壊死結合タンパク質。
【００３７】
（項目１２）  関節炎を処置することにおける使用のための、項目１〜１０のいずれか一項に記載の腫瘍壊死結合タンパク質。
【００３８】
（項目１３）  項目１〜３のいずれか一項に記載の腫瘍壊死結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００３９】
（項目１４）  以下から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる腫瘍壊死因子結合タンパク質を含む、核酸配列：
(a) 図２に示されるcDNA配列；
(b) 図３に示されるcDNA配列；
(c) 図４に示されるcDNA配列；
(d) 図５に示されるcDNA配列；
(e) 図６に示されるcDNA配列；
(f) 図７に示されるcDNA配列；
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、および(f)のコード領域またはその一部において縮重である配列；
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、および(g)にハイブリダイズする配列；および
(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、 (g)、および(h)に相補的である配列、
ただし、該核酸は、式R１-[Cys１９-Cys１０３]-FCCSLCL-R３を有するタンパク質をコードしない、ここで[Cys１９-Cys１０３]はsTNFR-Iの残基19〜103を表し、該アミノ酸残基番号付け図は、比較を容易にするために図１（配列番号２）に提供され；ここで、R１は、NNSICを含むアミノ酸配列のメチオニル化または非メチオニル化アミン基を表し、そしてR３は図１のアミノ酸残基Asn１１１-Asn１６１のカルボキシル基または図１のAsn１１１-Asn１６１のカルボキシ末端短縮型を表す。
【００４０】
（項目１５）  図２、３、４、５、６、または７に記載の配列あるいはその一部を有するポリヌクレオチド。
【００４１】
（項目１６）  発現制御配列に作動可能に連結された項目１３〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【００４２】
（項目１７）  項目１３〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、原核生物または真核生物宿主細胞。
【００４３】
（項目１８）  適切な栄養培地中で項目１７に記載の宿主細胞を増殖する工程、および、必要に応じて、該細胞または該栄養培地から該短縮型sTNFRを単離する工程を包含する、方法。
【００４４】
（項目１９）  前記宿主細胞がE. coliである、項目１８に記載の腫瘍壊死結合タンパク質の産生方法。
【００４５】
（項目２０）  前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、項目１８に記載の腫瘍壊死因子結合タンパク質の産生方法。
【００４６】
（項目２１）  以下の工程を包含する方法：
(a) 項目１７に記載の原核生物または真核生物宿主細胞を培養する工程；
(b) 該宿主細胞による短縮型sTNFRの発現を可能にする条件下で該宿主細胞を維持する工程；および
(c) 必要に応じて、該宿主細胞によって発現される該短縮型sTNFRを単離する工程。
【００４７】
（項目２２）  項目１３〜１５のいずれか一項に記載の外因性ポリヌクレオチドを含む原核生物または真核生物宿主細胞の組換え発現産物である、腫瘍壊死結合タンパク質。
【００４８】
（項目２３）  項目１〜１０のいずれか一項に記載の腫瘍壊死因子結合タンパク質を、薬学的に受容可能なビヒクルとともに含む、薬学的組成物。
【００４９】
（項目２４）  項目１８に記載の方法に従って産生される腫瘍壊死因子結合タンパク質を、薬学的に受容可能なビヒクルとともに含む、薬学的組成物。
【００５０】
（項目２５）  項目２１に記載の方法に従って産生される腫瘍壊死因子結合タンパク質を、薬学的に受容可能なビヒクルとともに含む、薬学的組成物。
【００５１】
（項目２６）  項目２３〜２５に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する、TNF媒介性疾患を処置する方法。
【００５２】
（項目２７）  前記TNF媒介性疾患が関節炎である、項目２６に記載の方法。
【００５３】
（項目２８）  薬学的組成物を調製する方法であって、治療的有効量の項目１〜１０のいずれか一項に記載の腫瘍壊死因子結合タンパク質が、１つ以上の薬学的に受容可能なビヒクルと混合される、方法。
【００５４】
（項目２９）  TNF媒介性疾患を処置するための、項目１〜１０のいずれか一項に記載の腫瘍壊死因子結合タンパク質の使用。
【００５５】
（項目３０）  関節炎を処置するための、項目２９に記載の腫瘍壊死因子結合タンパク質の使用。
【００５６】
（項目３１）  項目１〜１０のいずれか一項に記載の腫瘍壊死因子結合タンパク質および生理学的に受容可能な溶媒を有する第２の容器を含む水性タンパク質処方物を調製するためのキット。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
本発明の多くの局面および利点は、図面の検討によって明らかになる。
【図１】図１は、全長組換えヒトsTNFR-Iである、Asp１-Asn１６１をコードする核酸配列（配列番号１）を示す。Asp１-Asn１６１のアミノ酸配列（配列番号２）も示される。
【図２】図２は、NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FC-COOH（sTNFR-I2.6D/C105ともいう）をコードする核酸配列（配列番号３）を示す。NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FC-COOHのアミノ酸配列（配列番号４）も示される。
【図３】図３は、NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.6D/C106ともいう）をコードする核酸配列（配列番号５）を示す。NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOHのアミノ酸配列（配列番号６）も示される。
【図４】図４は、NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FN-COOH（sTNFR-I2.6D/N105ともいう）をコードする核酸配列（配列番号７）を示す。NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FN-COOHのアミノ酸配列（配列番号８）も示される。
【図５】図５は、NH２-MYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.3D/d8ともいう）をコードする核酸配列（配列番号11）を示す。NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOHのアミノ酸配列（配列番号12）も示される。
【図６】図６は、NH２-M-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.3D/d18ともいう）をコードする核酸配列（配列番号９）を示す。NH２-M-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOHのアミノ酸配列（配列番号10）も示される。
【図７】図７は、NH２-MSIS-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.3D/d15ともいう）をコードする核酸配列（配列番号13）を示す。NH２-MSIS-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOHのアミノ酸配列（配列番号14）も示される。
【図８】図８は、成熟組換えヒトsTNFR-IIである、Leu１-Thr１７９をコードする核酸配列（配列番号34）を示す。Leu１-Thr１７９のアミノ酸配列（配列番号35）も示される。
【図９】図９は、実施例IIに記載されるような、Streptococcusの細胞壁誘導された再活性化モデルにおいて誘導された腫脹の量を示す。
【図１０】図10は、実施例IIIに記載のような、0.2mg/kgの静脈内注入の２分後の健常ヒヒにおけるsTNFR-I4D/C105dbの血漿プロフィルを示す。
【図１１】図11は、実施例IIIに記載のような、0.2mg/kgの静脈内注入の２分後の健常ヒヒにおけるsTNFR-I3D/C105dbの血漿プロフィルを示す。
【図１２】図12は、実施例IIIに記載のような、0.2mg/kgの静脈内注入の２分後の健常ヒヒにおけるsTNFR-I2.6D/C105dbの血漿プロフィルを示す。
【図１３】図13は、実施例IIIに記載のような、種々のダイマーsTNFR-I構築物の用量とクリアランスとの間の関連を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明は、sTNFR-IおよびsTNFR-IIが、それぞれ、第４ドメインだけでなく第３ドメインの一部、および必要に応じて第１ドメインの一部も排除するようにサイズを減少され得、そして生物学的活性をなお保持しそして減少した抗原性を有するという予期されない発見に基づく。少なくとも以下の理由のため、これらの生物学的に活性な短縮型sTNFRまたはその誘導体を産生することは有利であると考えられる。第１に、これらの分子は、不安定化する可能性のより少ない１つの脱アミド化部位を有し得る。第２に、これらの分子は、より少ないジスルフィド架橋を有し、このことは、おそらく再折り畳みおよび精製を容易にする。第３に、これらの分子は、減少した潜在的な抗原エピトープ部位を有する。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「短縮型sTNFR」は、以下に記載のように、式R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２またはR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５の１つ以上の生物学的に活性な合成または組換え分子、およびその改変体（挿入、置換、および欠失改変体を含む）を含む。
【００６０】
用語「生物学的に活性」とは、本明細書で使用される場合、短縮型sTNFRが、類似のTNF阻害特性を示すことを意味するが、sTNFR-Iおよび／またはsTNFR-IIと同じ特性のすべてを示し、そして同じ程度に示すことを必ずしも意味しない。一般に、短縮型sTNFRおよびその誘導体は、TNFを阻害する能力を有する。短縮型sTNFRのバイオアッセイは、以下の実施例IIにさらに記載される。目的の特定のTNF阻害特性の選択は、短縮型sTNFRの所望の使用に依存する。
【００６１】
本発明の１つの局面では、短縮型sTNFRは、細菌、哺乳動物、または昆虫細胞系で組換え技法によって有利に産生され得、そしてタンパク質のグリコシル化または非グリコシル化のいずれかの形態であり得る。あるいは、短縮型sTNFRは化学的に合成され得る。現在好ましい産生方法は、以下により詳細に記載される。
【００６２】
短縮型sTNFRはそれぞれ、代表的には、他のタンパク質性物質（すなわち、非短縮型sTNFR）が実質的に存在しないように単離および精製され得る。好ましくは、短縮型sTNFRは、短縮型sTNFRの製造に使用される産生技法に起因して存在し得る他のタンパク質の約80％を含まない。より好ましくは、短縮型sTNFRは、他のタンパク質の約90％を含まず、特に好ましくは、他のタンパク質の約95％を含まず、そして最も好ましくは他のタンパク質の約98％より多くを含まない。しかし、以下にさらに詳細に記載されるように、所望のタンパク質が、投与前に他の活性成分、化学組成物および／または適切な薬学的処方物物質と組み合わされ得ることが理解される。
【００６３】
短縮型sTNFR
１つの基本的実施態様では、本発明の短縮型sTNFRは、以下の式によって表される１つ以上のタンパク質およびそれらの改変体であり得る：
R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２
ここで、 [Cys１９-Cys１０３]は、sTNFR-Iの残基19〜103を表し、このアミノ酸残基番号付けスキームは、比較を容易にするために図１（配列番号２）に提供される；ここで、R１は、Cys１９のまたは以下の群から選択されるアミノ末端アミノ酸残基の、メチオニル化または非メチオニル化アミン基を表し：
C
IC
SIC
NSIC（配列番号15）
NNSIC（配列番号16）
QNNSIC（配列番号17）
PQNNSIC（配列番号18）
HPQNNSIC（配列番号19）
IHPQNNSIC（配列番号20）
YIHPQNNSIC（配列番号21）
KYIHPQNNSIC（配列番号22）
GKYIHPQNNSIC（配列番号23）
QGKYIHPQNNSIC（配列番号24）
PQGKYIHPQNNSIC（配列番号25）
CPQGKYIHPQNNSIC（配列番号26）
VCPQGKYIHPQNNSIC（配列番号27）
SVCPQGKYIHPQNNSIC（配列番号28）
DSVCPQGKYIHPQNNSIC（配列番号29）；
そして、ここでR２は、Cys１０３のまたは以下の群から選択されるカルボキシ末端アミノ酸残基の、カルボキシ基を表す：
F
FC
FCC
FCCS（配列番号30）
FCCSL（配列番号31）
FCCSLC（配列番号32）
FCCSLCL（配列番号33）；
ただし、R１がアミノ酸配列VCPQGKYIHPQNNSICのメチオニル化または非メチオニル化アミン基あるいはその１〜15残基のＮ末端短縮型を表す場合、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２は、式R１-[Cys１９-Cys１０３]-FCCSLCL-R３を有する付加改変体ではなく、ここでR３は図１のアミノ酸配列Asn１１１-Asn１６１のカルボキシル基またはそのカルボキシ末端短縮型を表す。
【００６４】
他の基本的実施態様では、本発明の短縮型sTNFRは、以下の式によって表される１つ以上のタンパク質およびそれらの改変体であり得る：
R４-[Cys３２-Cys１１５]-R５
ここで、 [Cys３２-Cys１１５]はsTNFR-IIの残基Cys３２〜Cys１１５を表し、このアミノ酸残基番号付けスキームは、比較を容易にするために図８（配列番号35）に提供される；ここで、R４は、Cys３２のまたは以下の群から選択されるアミノ末端アミノ酸残基の、メチオニル化または非メチオニル化アミン基を表し：
C
MC
QMC
AQMC（配列番号36）
TAQMC（配列番号37）
QTAQMC（配列番号38）
DQTAQMC（配列番号39）
YDQTAQMC（配列番号40）
YYDQTAQMC（配列番号41）
EYYDQTAQMC（配列番号42）
REYYDQTAQMC（配列番号43）
LREYYDQTAQMC（配列番号44）
RLREYYDQTAQMC（配列番号45）
CRLREYYDQTAQMC（配列番号46）
TCRLREYYDQTAQMC（配列番号47）
STCRLREYYDQTAQMC（配列番号48）
GSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号49）
PGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号50）
EPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号51）
PEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号52）
APEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号53）
YAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号54）
PYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号55）
TPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号56）
FTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号57）
AFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号58）
VAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号59）
QVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号60）
AQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号61）
PAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号62）
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC（配列番号63）；
そして、ここでR５は、Cys１１５のまたは以下の群から選択されるカルボキシ末端アミノ酸残基の、カルボキシ基を表し：
A
AP
APL
APLR（配列番号64）
APLRK（配列番号65）
APLRKC（配列番号66）
APLRKCR（配列番号67）
ただし、R４がアミノ酸配列TCRLREYYDQTAQMCのメチオニル化または非メチオニル化アミン基あるいはその１〜15残基のＮ末端短縮型を表す場合、R４-[Cys３２-Cys１１５]-R５は、式R４-[Cys３２-Cys１１５]-APLRKCR-R６を有する付加改変体ではなく、ここでR６は図８のアミノ酸残基Pro１２３-Thr１７９のカルボキシル基またはそのカルボキシ末端短縮型を表す。
【００６５】
本発明の他の局面は、メチオニル化されたかまたはメチオニル化されていないかいずれかの、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２およびR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５の１つ以上の改変体を含む。したがって、用語「短縮型sTNFR」は、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２およびR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５の１つ以上の天然に存在する対立遺伝子改変体、および、アミノ酸がR１-[Cys１９-Cys１０３]-R２またはR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５のアミノ酸配列内の残基から欠失（「欠失改変体」）、残基に挿入（「付加改変体」）、または残基に置換（「置換改変体」）されている１つ以上の他の改変体タンパク質を含む。
【００６６】
アミノ酸配列欠失は、タンパク質の折り畳みを破壊しないように、代表的には約20アミノ酸残基、より代表的には約１〜10残基、そして最も代表的には約１〜５残基の範囲である。Ｎ末端、Ｃ末端、および内部の配列内欠失が考えられる。総欠失および／または連続欠失の数は、影響を受けるドメインにおけるタンパク質の三次構造（例えば、システイン架橋）を保存するように選択される。
【００６７】
R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２アミノ酸配列内およびR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５アミノ酸配列内の欠失は、細胞表面膜タンパク質の群におけるNGF/TNFレセプターファミリーの他のメンバーの配列との低い相同性の領域に作成され得る。R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２アミノ酸配列内およびR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５アミノ酸配列内の欠失は、NGF/TNFレセプターファミリーの他のメンバーの配列と実質的な相同性の領域で作成され得、そしておそらく生物学的活性を著しく改変する。詳細には、NGF/TNFレセプターファミリーメンバー中の配列類似性は、ドメイン１の最初の二つのジスルフィドループ、ドメイン２の全体、およびドメイン３の最初のジスルフィドループに対応する領域で特異に高い（Bannerら(1993), Cell, 73:431-445）。例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２の２つの代表的欠失改変体は、R１-[Cys１９(ΔThr２０)-Cys１０３]-R２およびR１-[Cys１９(ΔCys１９-Lys２１)-Cys１０３]-R２であり、ここで、R１およびR２は上で定義される。例えば、R４-[Cys３２-Cys１１５]-R５の３つの代表的欠失改変体は、R４-[Cys３２-(ΔCys１１５)Cys１１５]-R５；R１-[Cys１９(ΔCys１１５-Lys１１５)-Cys１０３]-R２、およびR４-[Cys３２-(ΔCys１１５-Arg１１３)Cys１１５]-R５であり、ここでR１およびR２は上で定義される。
【００６８】
アミノ酸配列付加は、長さが１残基から100残基以上の範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の内部配列内挿入を含み得る。内部付加は、代表的には約１〜10アミノ酸残基、より代表的には約１〜５アミノ酸残基、そして最も代表的には約１〜３アミノ酸残基の範囲であり得る。
【００６９】
アミノ末端付加改変体は、メチオニン（例えば、細菌組換え細胞培養物におけるタンパク質の直接発現の人工物として）または追加のアミノ酸残基もしくは配列の付加を含む。アミノ末端挿入のさらなる例は、組換え宿主細胞からのタンパク質の分泌を容易にするために、シグナル配列との融合体ならびに他のプレ-プロ配列との融合体あるいはシグナル配列および他のプレ-プロ配列との融合体を含む。天然のsTNFR-IまたはsTNFR-IIシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群より選択される原核生物シグナル配列によって置換され得る。酵母細胞については、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼ、α因子、または酸性ホスファターゼリーダー配列の群から選択され得る。哺乳動物細胞発現では、sTNFR-IまたはsTNFR-IIの天然のシグナル配列（EP393 438およびEP 422 339）は満足であるが、他の哺乳動物シグナル配列も適切であり得る（例えば、他のNGF/TNFレセプターファミリーメンバーに由来する配列）。
【００７０】
カルボキシ末端付加改変体は、それぞれsTNFR-IまたはsTNFR-IIの再構成を生じる１つ以上のアミノ酸残基の付加を含まない。カルボキシ末端付加改変体が、sTNFR-IまたはsTNFR-IIの第３ドメインまたは第４ドメインの再構築を生じる１つ以上のカルボン酸残基の付加を含まない。カルボキシ末端付加改変体の例は、ヒト免疫グロブリンの重または軽鎖の定常ドメインのすべてまたは一部とR１-[Cys１９-Cys１０３]-R２またはR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５との融合体を含むキメラタンパク質を含む。それぞれの免疫グロブリン部分が、IgG、IgA、IgM、またはIgE、特にIgG、例えばIgG1またはIgG3のような、ヒト免疫グロブリンの重鎖定常領域の第１ドメイン以外のすべてのドメインを含む、このようなキメラタンパク質が好ましい。TNF結合部分がなおTNFと結合しそして免疫グロブリン部分がその特徴的特性の１つ以上を示す限り、それぞれの免疫グロブリン部分の任意のアミノ酸が、１つ以上のアミノ酸が欠失させられ得ること、または１つ以上のアミノ酸と置換され得ること、あるいは１つ以上のアミノ酸が付加され得ることを、当業者は理解する。
【００７１】
他の群の改変体は、アミノ酸置換改変体である。これらの改変体はそれぞれ、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２またはR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そしてその位置に異なる残基を挿入されている。置換改変体は対立遺伝子改変体を含み、これはアミノ酸変化を生じても生じなくてもよい種集団における天然に存在するヌクレオチド配列変化によって特徴づけられる。当業者は、可能な変異部位の選択においてポリペプチドの結合または活性部位について公知の任意の情報を使用し得る。
【００７２】
タンパク質の変異誘発のためのアミノ酸残基または領域を同定するための１つの方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる（CunninghamおよびWells (1989), Science, 244,:1081-1085、その開示は参考として本明細書に援用される）。この方法では、タンパク質のアミノ酸残基または標的残基群が、同定され（例えば、Arg、Asp、His、Lys、またはGluのような荷電残基）、そして細胞の内または外の周囲水性環境とのそのアミノ酸の相互作用をもたらすために、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）によって置換される。次いで、置換に対する機能的感受性を示す残基は、置換の部位で追加または代わりの残基を導入することによって純化される(refine)。したがって、アミノ酸配列改変を導入するための部位は予め決定され、そして、所定の部位で変異の性能を最適にするために、アラニンスキャニングまたはランダム変異誘発が行われ得、そして得られる改変体ポリペプチドが、所望の活性および活性の程度の最適な組み合わせについてスクリーニングされ得る。
【００７３】
置換変異誘発のための目的の部位は、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２またはR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５に見出されるアミノ酸が、他の種々の種のまたはNGF/TNFレセプターファミリーの他のメンバーのsTNFRのようなsTNFR様タンパク質とは、側鎖バルク、電荷、および／または疎水性の点で実質的に異なる部位を含む。
【００７４】
目的の他の部位は、特定の残基が、このようなsTNFR-I様タンパク質およびsTNFR-II様タンパク質の残基と類似するかまたは同一である部位を含む。このような位置は、一般的に、タンパク質の生物学的活性に重要である。例えば、当業者は、本発明の前に、sTNFR-IおよびsTNFR-IIを短縮することのそれぞれの三次元構造に対する効果が予測可能ではなかったことを理解している。しかし、本明細書で開示された結果があれば、当業者は、改変体を作成するためのストラテジーを開発することの第１原理が、sTNFR-IおよびsTNFR-IIの全長について既に明らかにされた情報に部分的に頼り得ることを認める。したがって、以下の情報は、sTNFR-Iに関して明らかにされている（Bannerら(1993), 前出、およびFuら (1995), Protein Engineering, 8(12):1233-1241）。ドメイン１における残基Tyr９、Thr３９、His５５、ドメイン２における残基Phe４９、Ser６３、Asp８２、ならびにドメイン３における残基Tyr９２、およびSer１０７は、それぞれ、ドメイン１、２、および３の構造の安定化に潜在的に重要であると同定されている。残基Pro１２およびHis５５は、TNFαのサブユニットＣ上のSer８６-Tyr８７と潜在的に相互作用すると同定されている。残基Glu４５-Phe４９は、TNFαサブユニットＡの残基Leu２９-Arg３２と潜在的に相互作用するループに存在すると同定されている。残基Gly４８は、TNFαのサブユニットＡ上のAsn１９-Pro２０と潜在的に相互作用すると同定されている。残基His５８-Leu６０は、伸長された鎖コンフォメーションに存在すると同定されており、そしてTNFαのサブユニットＡ上の残基Arg３１-Ala３３との側鎖相互作用を有すると同定されている。sTNFR-Iの残基His５８は、残基Arg３１と特異的に相互作用する。残基Lys６４-Arg６６は、伸長された鎖コンフォメーションに存在すると同定されており、そしてTNFαのサブユニットＡ上の残基Ala１４５-Glu１４６および残基Glu４６との側鎖および主鎖相互作用を有すると同定されている。残基Met６９は、TNFαのサブユニットＡ上の残基Tyr１１５と潜在的に相互作用すると同定されている。残基His９４-Phe１０１は、TNFαのサブユニットＣの残基Thr７２-Leu７５およびAsn１３７と相互作用するループを形成すると同定されている。sTNFR-Iの残基Trp９６は、TNFαのサブユニットＣ上の残基Ser７１-Thr７２と特異的に相互作用し、sTNFR-IのLeu１００は、TNFαのサブユニットＣ上の残基Asn１３７と密接して存在し、そしてsTNFR-Iの残基Gln１０２は、TNFαのサブユニットＡ上の残基Pro１１３と特異的に相互作用する。したがって、当業者は、まず第一に、これらの部位が、比較的保存された様式の置換によって改変されるべきであることを認識する。
【００７５】
このような保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表１に示される。このような置換が生物学的活性の変化を生じるならば、より実質的な変化（「代表的置換」）が導入され得、そして／または他の付加／欠失が行われ得、そして得られる産物がスクリーニングされる。
表１：アミノ酸置換
【００７６】
【表１】
2009280612.tif 000002
等しい性質のこのような変化を作成することにおいて、アミノ酸のハイドロパシーインデックスが考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づくハイドロパシーインデックスが帰属されており、これらは、イソロイシン(+4.5)；バリン(+4.2)；ロイシン(+3.8)；フェニルアラニン(+2.8)；システイン／シスチン(+2.5)；メチオニン(+1.9)；アラニン(+1.8)；グリシン(-0.4)；トレオニン(-0.7)；セリン(-0.8)；トリプトファン(-0.9)；チロシン(-1.3)；プロリン(-1.6)；ヒスチジン(-3.2)；グルタミン酸(-3.5)；グルタミン(-3.5)；アスパラギン酸(-3.5)；アスパラギン(-3.5)；リジン(-3.9)；およびアルギニン(-4.5)である。
【００７７】
タンパク質における相互作用的な生物学的機能に関するハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は、一般的に当該技術分野で理解される（KyteおよびDoolittle (1982), J. Mol. Biol., 157:105-131、その開示は参考として本明細書に援用される）。あるアミノ酸が、類似のハイドロパシーインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸に置換され得、そしてなお類似の生物学的活性を保持することが公知である。ハイドロパシーインデックスに基づく変化を作成することにおいて、ハイドロパシーインデックスが±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内である置換が特に好ましく、そして±0.5以内である置換がさらにより特に好ましい。
【００７８】
本発明の場合のように、特に、置換によって生成される生物学的機能等価なタンパク質またはペプチドが免疫学的実施態様における使用を意図する場合、類似のアミノ酸の置換が、ハイドロパシーを基準として効果的に作成され得ることも理解される。
【００７９】
米国特許4,554,101（その開示は参考として本明細書に援用される）は、隣接アミノ酸のハイドロパシーによって調節される場合、タンパク質の最大局所平均親水性が、免疫原性および抗原性と、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関することを述べる。
【００８０】
米国特許4,554,101に詳述されるように、以下の親水性値は、アミノ酸残基に帰属されている：アルギニン(+3.0)；リジン(+3.0)；アスパラギン酸(+3.0±1)；グルタミン酸(+3.0±1)；セリン(+0.3)；アスパラギン(+0.2)；グルタミン(+0.2)；グリシン(0)；トレオニン(-0.4)；プロリン(-0.5±1)；アラニン(-0.5)；ヒスチジン(-0.5)；システイン(-1.0)；メチオニン(-1.3)；バリン(-1.5)；ロイシン(-1.8)；イソロイシン(-1.8)；チロシン(-2.3)；フェニルアラニン(-2.5)；トリプトファン(-3.4)。
【００８１】
類似の親水性値に基づく変化を作成することにおいて、親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内である置換が特に好ましく、そして±0.5以内である置換がさらにより特に好ましい。
【００８２】
米国特許4,554,101はまた、親水性を基準として一次アミノ酸配列からのエピトープの同定および調製を教示する。米国特許4,545,101に開示される方法によって、当業者は、本明細書に開示されたsTNFR配列のようなアミノ酸配列内からエピトープを同定することができる。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」ともいう。
【００８３】
多くの科学刊行物は、アミノ酸配列の分析からの、二次構造の予測、およびエピトープの同定に向いている（ChouおよびFasman (1974), Biochemistry, 13(2):222-245；ChouおよびFasman,Biochemistry, 113(2):211-222；ChouおよびFasman (1978), Adv.Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148；ChouおよびFasman, Ann.Rev. Biochem., 47:251-276、およびChouおよびFasman (1979), Biophys. J.,26:367-384、これらの開示は参考として本明細書に援用される）。さらに、コンピュータプログラムが、現在、タンパク質の抗原性部分およびエピトープコア領域を予測することの補助に利用可能である。例としては、Jameson-Wolf分析に基づくプログラム（JamesonおよびWolf(1998), Comput. Appl. Biosci., 4(1):181-186、およびWolfら (1988), Comput.Appl. Biosci., 4(1):187-191、これらの開示は参考として本明細書に援用される）、プログラムPepPlot(R)（Brutlagら(1990) CABS, 6:237-245、およびWeinbergerら (1985), Science, 228:740-742、これらの開示は参考として本明細書に援用される）、およびタンパク質三次構造予測のための他の新しいプログラム（FetrowおよびBryant(1993), BIOTECHNOLOGY, 11:479-483、この開示は参考として本明細書に援用される）が挙げられる。
【００８４】
R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２およびR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５のアミノ酸配列に対する保存的改変（およびコードする核酸配列に対する対応する改変）は、改変されたタンパク質に類似の機能的および化学的特徴を有するタンパク質を産生することが予測される。
【００８５】
逆に、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２およびR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５の機能的および／または化学的特徴における実質的な改変は、(a)例えば、シートまたはヘリカルコンフォメーションのような、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、(b)標的部位でのタンパク質の電荷または疎水性、あるいは(c)側鎖のバルク、を維持することの効果が著しく異なる置換を選択することによって達成され得る。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づく群に分けられる：
1)疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
2)中性親水性：Cys、Ser、Thr；
3)酸性：Asp、Glu；
4)塩基性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
5)鎖配向に影響を及ぼす残基：Gly、Pro；および
6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
【００８６】
非保存的置換は、これらの群の１つのメンバーの別のものへの交換を含み得る。このような置換された残基は、他のNGF/TNFレセプターファミリーメンバーと相同または非相同であるR１-[Cys１９-Cys１０３]-R２およびR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５の領域に導入され得る。
【００８７】
R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２およびR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５の配列の特異的変異は、Ｎ末端で、Ｃ末端で、あるいはＮ連結したまたはＯ連結した炭水化物の付加によって改変されるタンパク質の任意の部位で、非天然アミノ酸の置換を含み得る。このような改変は、例えば、アミノ酸（例えば、システイン）の付加において、特に有用であり得、これは、以下に記載のように、誘導体を形成するために水溶性ポリマーの連結に有利である。例えば、sTNFR-Iの天然に存在するAsn１０５がポリエチレングリコール分子の付加を容易にするためにCysに変化される図５を参照のこと（実施例Ｉ）。
【００８８】
さらに、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２およびR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５の配列は、グリコシル化部位を付加するため、あるいは、Ｎ連結またはＯ連結したグリコシル化部位を欠失させるために改変され得る。アスパラギン連結したグリコシル化認識部位は、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、Asn-Xaa-ThrまたはAsn-Xaa-Serのいずれかであり、ここで、Xaaは、Pro以外の任意のアミノ酸であり得る。sTNFR-Iの証明されたまたは予測されたアスパラギン残基は、位置14、105、および111に存在する。sTNFR-IIの証明されたまたは予測されたアスパラギン残基は、位置149および171に存在する。種々のアミノ酸置換または欠失は、Ｎ連結またはＯ連結グリコシル化部位を改変または付加するために作成され得、改変されたグリコシル化を有するタンパク質を生じる。
【００８９】
特定の実施態様では、改変体は、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２またはR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５のアミノ酸に実質的に相同である。用語「実質的に相同」とは、本明細書で使用される場合、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらにより好ましくは90％以上、または最も好ましくはちょうど95％である相同性の程度を意味する。本明細書で記載される場合の相同性の割合は、100アミノ酸の長さにおける４つのギャップがその整列で補助するために導入され得る場合に、比較される配列中の同一のアミノ酸残基とともに整列する、２つの配列のより小さい方に見られるアミノ酸残基の割合として算出される。これは、Dayhoff(1972), Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:124, NationalBiochemical Research Foundation, Washington, D.C.に記載され、その開示は参考として本明細書に援用される。それぞれ配列番号２および配列番号35のアミノ酸配列に対する抗体との交差反応性によって単離され得る、あるいはその遺伝子が配列番号１もしくは配列番号34のDNAとのまたはそのセグメントとのハイブリダイゼーションによって単離され得る短縮型sTNFRも、実質的に相同として含まれる。
【００９０】
本発明の代表的sTNFRは、以下の分子を含む：NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FC-COOH（sTNFR-I2.6D/C105ともいう）；NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.6D/C106ともいう）；NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FN-COOH（sTNFR-I2.6D/N105ともいう）；NH２-MYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.3D/d8ともいう）；NH２-M-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.3D/d18ともいう）；およびNH２-MSIS-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.3D/d15ともいう）、メチオニル化または非メチオニル化のいずれか、ならびにその改変体および誘導体。
【００９１】
改変体短縮型sTNFRの産生は、以下にさらに詳細に記載される。このような改変体は、短縮型sTNFRをコードするDNAに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、あるいは所望の短縮型sTNFRのインビトロ化学合成によって調製され得る。最終短縮型sTNFRが生物学的に活性であるならば、欠失、挿入、および置換の多くの組み合わせが作成され得ることが、当業者に理解される。
【００９２】
１つ以上の選択されたアミノ酸残基の置換、挿入、または欠失についての変異誘発技法は、当業者に周知である（例えば、米国特許第4,518,584号、その開示は参考として本明細書に援用される）。各アミノ酸配列改変体の構築、変異部位の位置、および変異の性質において２つの主要な変数がある。各改変体を設計することにおいて、各変異部位の位置および変異の性質は、改変される生化学的特徴に依存する。各変異部位は、例えば、(1)達成された結果に依存して、最初に保存的アミノ酸選択で次いでよりラジカルな選択で置換すること、(2)標的アミノ酸残基を欠失すること、または(3)所定の部位に隣接するアミノ酸残基を挿入することによって、個々にまたは連続して改変され得る。
【００９３】
短縮型sTNFRの化学的に改変された誘導体は、本明細書の開示によれば、当業者によって調製され得る。結合体は、グリコシル化、非グリコシル化、または脱グリコシル化した短縮型sTNFRを使用して調製され得る。代表的には、非グリコシル化短縮型sTNFRが使用される。短縮型sTNFRの誘導体化に適切な化学部分は水溶性ポリマーを含む。
【００９４】
それぞれが付着されるタンパク質が水性環境（例えば、生理学的環境）で沈殿されないので、水溶性ポリマーが望ましい。好ましくは、ポリマーは、治療産物または組成物の調製に薬学的に受容可能である。ポリマー／タンパク質結合体が、治療に使用されるかどうかについてのような考慮、そしてそうであれば、所望の用量、循環時間、およびタンパク質分解に対する抵抗性に基づいて、当業者は、所望のポリマーを選択し得る。
【００９５】
適切な、臨床的に受容可能な、水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール(PEG）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ(β-アミノ酸)（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（PPG）、および他のポリアキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（POG）（例えば、グリセロール）、および他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコース、コロン酸、または他の炭水化物ポリマー、Ficollまたはデキストラン、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
本明細書で使用される場合、ポリエチレングリコールとは、モノ-(C1-C10)アルコキシ-またはアリールオキシ-ポリエチレングリコールのような、他のタンパク質を誘導体化するために使用されている形態のいずれかを含むことを意味する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のため製造における有利点を有し得る。
【００９７】
水溶性ポリマーはそれぞれ、任意の分子量であり得、そして分枝または非分枝であり得る。水溶性ポリマーはそれぞれ、代表的には、約２kDA〜約100kDaの間の平均分子量を有する（用語「約」は、水溶性ポリマーの調製において、いくつかの分子が記載された分子量よりも多いまたは幾分少ない量である）。各水溶性ポリマーの平均分子量は、好ましくは約５kDaと約50kDaとの間、より好ましくは約12kDaと約40kDaとの間、および最も好ましくは約20kDaと約35kDaとの間である。
【００９８】
一般に、分子量が高いほどまたは分枝が多いほど、ポリマー：タンパク質比が高い。所望の治療プロフィル（例えば、持続放出の期間；あるならば、生物学的活性における効果；取り扱いの容易さ；抗原性、および治療タンパク質における水溶性ポリマーの他の公知の効果の程度または欠如）に依存して、他のサイズが使用され得る。
【００９９】
水溶性ポリマーはそれぞれ、タンパク質の機能的または抗原性ドメインにおける効果を考慮して、タンパク質に付加されるべきである。一般的に、化学的誘導体化は、タンパク質を活性化されたポリマー分子と反応させるために使用される任意の適切な条件下で行われ得る。水溶性ポリマーを１つ以上のタンパク質に連結するために使用され得る活性化基は、以下を含む：スルホン、マレイミド、スルフィドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジジリン、オキシラン、および5-ピリジル。
【０１００】
水溶性ポリマーはそれぞれ、一般的に、アミノ酸のαまたはε-アミノ基あるいは反応性チオール基でタンパク質に付加されるが、水溶性基が、適切な反応条件下で水溶性基に付加されるために十分に反応性である、タンパク質の任意の反応性基に付加され得ることも意図される。したがって、水溶性ポリマーは、遊離アミノまたはカルボキシル基のような反応性基によってタンパク質に共有結合され得る。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含み得る。遊離カルボキシル基を有する残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基を含み得る。反応性チオール基を有する残基は、システイン残基を含む。
【０１０１】
水溶性ポリマーと結合したタンパク質を調製する方法は、それぞれ一般的に、(a)タンパク質が１つ以上の水溶性ポリマーに付加される条件下で水溶性ポリマーとタンパク質を反応させる工程、および(b)反応産物を得る工程を包含する。各結合についての反応条件は、当該技術分野で公知の条件またはその後に開発された条件のいずれかから選択され得るが、改変されるタンパク質を不活性化する温度、溶媒、およびpHレベルのような反応条件への曝露を避けるまたは制限するように選択されるべきである。一般に、反応のための最適反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて場合次第で決定される。例えば、水溶性ポリマー：タンパク質結合体の比が大きいほど、結合した産物の割合が大きい。最適比（過剰の未反応タンパク質またはポリマーがない点での反応の効率に関して）は、誘導体化の所望の程度（例えば、モノ、ジ、トリなど）、ポリマーが分枝であろうが非分枝であろうが選択されたポリマーの分子量、および使用される反応条件のような因子によって決定され得る。水溶性ポリマー（例えば、PEG）のタンパク質に対する比は、一般的に1:1〜100:1の範囲である。１つ以上の精製された結合体は、特に、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および電気泳動を含む標準的精製技法によって、各混合物から調製され得る。
【０１０２】
Ｎ末端が化学的に改変されたタンパク質が、特に所望され得る。分子量、分枝化など、反応混合物中のタンパク質（またはペプチド）分子に対する水溶性ポリマーの比率、行われる反応のタイプ、および選択されたＮ末端が化学的に改変されたタンパク質を得る方法によって、水溶性ポリマーが選択され得る。Ｎ末端が化学的に改変されたタンパク質調製物を得る方法（すなわち、必要であれば他の１つの誘導体化した部分からこの部分を分離すること）は、化学的に改変されたタンパク質分子の集団からＮ末端が化学的に改変されたタンパク質物質の精製によってであり得る。選択的Ｎ末端化学的改変は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な一次アミノ基（リジン対Ｎ末端）の種々のタイプの差のある反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切な反応条件下で、カルボニル基含有ポリマーとのＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。例えば、リジン残基のε-アミノ基とタンパク質のＮ末端残基のα-アミノ基との間のpKa差を利用させるpHで反応を行うことによって、タンパク質のＮ末端に水溶性ポリマーを選択的に付加させ得る。このような選択的誘導体化によって、タンパク質への水溶性ポリマーの付加が制御される：ポリマーとの結合は、タンパク質のＮ末端で主として起こり、そしてリジン側鎖アミノ基のような他の反応性基の顕著な改変は生じない。還元的アルキル化を使用して、水溶性ポリマーは、上記のタイプであり得、そしてタンパク質にカップリングするために単一の反応性アルデヒドを有するべきである。単一の反応性アルデヒドを含む、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが使用され得る。
【０１０３】
本発明は、モノまたはポリ（例えば、２〜４）PEG部分を含むように化学的に誘導体化されたタンパク質を特に意図する。PEG化（pegylation）は、当該技術分野で公知のPEG化反応のいずれかによって行われ得る。PEG化タンパク質産物を調製する方法は、一般的に、(a)それによってタンパク質が１つ以上のPEG基に付加されるようになる条件下で、ポリエチレングリコール（例えば、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）とタンパク質産物とを反応させる工程、および(b)反応産物（単数または複数）を得る工程、を包含する。一般に、この反応に最適な反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて場合次第で決定される。
【０１０４】
当業者に利用可能な多くの付加方法がある。例えば、EP 0 401 384を参照のこと（その開示は参考として本明細書に援用される）；Malikら (1992), Exp.Hematol., 20:1028-1035；Francis (1992), Focus on Growth Factors,3(2):4-10, (Mediscript, Mountain Court, Friern Barnet Lane, London N20OLD, UKによって刊行)；EP 0 154 316；EP 0 401 384；WO 92/16221；WO 95/34326；およびPEG化に関する本明細書で引用される他の刊行物も参照のこと（これらの開示は、参考として本明細書に援用される）。
【０１０５】
PEG化は、特に、反応性ポリエチレングリコール分子とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行われ得る。従って、本発明によるタンパク質産物は、PEG基（単数または複数）がアシルまたはアルキル基を介して付加されるPEG化タンパク質を含む。このような産物は、モノPEG化またはポリPEG化（例えば、２〜６、および好ましくは２〜５のPEG基を含む）され得る。PEG基は、一般的に、アミノ酸のα-またはε-アミノ基でタンパク質に付加されるが、PEG基が、適切な反応条件下でPEG基に付加されるようになるために十分に反応性である、タンパク質に付加される任意のアミノ基に付加され得ることも意図される。
【０１０６】
アシル化によるPEG化は、一般的に、タンパク質とポリエチレングリコール（PEG）の活性エステル誘導体とを反応させる工程を包含する。アシル化反応について、選択されたポリマー（単数または複数）は、単一の反応性エステル基を有するべきである。任意の公知のまたは後で発見される反応性PEG分子は、PEG化反応を行うために使用され得る。好ましい活性化PEGエステルは、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）にエステル化されたPEGである。本明細書で使用される場合、「アシル化」は、治療タンパク質とPEGのような水溶性ポリマーとの間の以下のタイプの結合を含むことを意図するが、これらに限定されない：アミド、カーバメート、ウレタンなど（Chamow(1994), Bioconjugate Chem., 5(2):133-140を参照のこと（その開示は参考として本明細書に援用される））。反応条件は、PEG化技術で公知の条件、または後で開発される条件のいずれかから選択され得るが、改変されるタンパク質を不活性化する温度、溶媒、およびpHのような条件を避けるべきである。
【０１０７】
アシル化によるPEG化は、一般的に、ポリPEG化されたタンパク質を生じる。好ましくは、接続結合はアミドである。また好ましくは、得られる産物は、実質的に単独に（例えば、＞95％）モノ、ジ、またはトリPEG化される。しかし、より高い程度のPEG化を有するいくつかの種は、使用される特定の反応条件に依存する量で形成され得る。所望であれば、さらに精製されたPEG化種は、とりわけ、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および電気泳動を含む、標準的精製技法によって、混合物（特に未反応種）から分離され得る。
【０１０８】
アルキル化によるPEG化は、一般的に、還元剤の存在下でタンパク質とPEGの末端アルデヒド誘導体を反応させる工程を包含する。還元的アルキル化反応については、選択されるポリマー（単数または複数）は、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。例示的な反応性PEGアルデヒドは、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは、水安定性である）、またはそのモノC1-C10アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である（米国特許第5,252,714号を参照のこと（その開示は参考として本明細書に援用される））。
【０１０９】
アルキル化によるPEG化はまた、ポリPEG化タンパク質を生じ得る。さらに、タンパク質のＮ末端のα-アミノ基でのみのPEG化（すなわち、モノPEG化タンパク質）を実質的に優先するための反応条件を操作し得る。モノPEG化またはポリPEG化のいずれの場合においても、PEG基は、好ましくは、-CH２-NH-基を介してタンパク質に付加される。特に-CH２-基に関して、このタイプの結合は、本明細書では「アルキル」結合という。
【０１１０】
モノポリマー／タンパク質産物の実質的に均一な集団を産生するための還元的アルキル化は、一般的に、(a)タンパク質のアミノ末端のα-アミノ基の選択的修飾を可能にするために適切なpHで、還元的アルキル化条件下で反応性PEG分子とタンパク質とを反応させる工程、および(b)反応産物（単数または複数）を得る工程、を包含する。モノPEG化された産物を産生するための還元的アルキル化による誘導体化は、リジンアミノ基とＮ末端のα-アミノ基との間のpKa差を利用する（pKaは、50％のアミノ基がプロトン化されそして50％がプロトン化されないpHである）。
【０１１１】
反応は、リジン残基のε-アミノ基とタンパク質のＮ末端残基のα-アミノ基との間のpKa差の利用を可能にするpHで行われる。一般に、pHがより低いならば、タンパク質に対してより多くの過剰のポリマーが所望される（すなわち、Ｎ末端α-アミノ基の反応性が低いほど、最適条件を達成するために必要とされるポリマーが多い）。pHがより高いならば、ポリマー：タンパク質比はさほど大きい必要がない（すなわち、利用可能な反応性基が多いほど、必要とされるポリマー分子は少ない）。本発明の目的のために、pHは、一般的に、３〜９、好ましくは３〜６の範囲内に入る。還元的アルキル化については、還元剤は、水溶液中で安定であるべきであり、そして好ましくは、還元的アルキル化の最初のプロセスで形成されるシッフ塩基のみを還元し得る。適切な還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、およびピリジンボランから選択され得る。特に適切な還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。溶媒、反応時間、温度、および産物の精製の手段のような他の反応パラメータは、タンパク質の水溶性ポリマーでの誘導体化に関する刊行された情報に基づいて、場合次第で決定され得る。
【０１１２】
このような選択的誘導体化によって、タンパク質への水溶性ポリマー（アルデヒドのような反応性基を含む）の付加が制御される：ポリマーとの結合は、主としてタンパク質のＮ末端で起こり、そしてリジン側鎖アミノ基のような他の反応性基の有意な修飾は生じない。調製物は、代表的には90％以上のモノポリマー／タンパク質結合体、およびさらに代表的には95％以上のモノポリマー／タンパク質結合体であり、観察される分子の残りは未反応である（すなわち、ポリマー部分を含まないタンパク質）。
【０１１３】
本発明の特定の実施態様は、還元的アルキル化によってsTNFR-I 2.6D/N105に結合した、約20kDaまたは約33kDaのいずれかの平均分子量（例えば、30kDaと35kDaとの間）を有する非分枝モノメトキシ-ポリエチレングリコールアルデヒド、あるいは約33kDaの平均分子量（例えば、30kDaと35kDaとの間）を有する３級ブチルポリエチレングリコールアルデヒドである。
【０１１４】
PEG化はまた、詳細には、少なくとも１つの反応性ヒドロキシ基を有する水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）を介して行われ得、これは反応性カルボニル、ニトリル、またはスルホン基を有する試薬と反応され得、ヒドロキシル基を反応性マイケルアクセプターに変換し、それによって種々のタンパク質を修飾することに有用な「活性化リンカー」を形成し、改良された生物学的に活性な結合体を提供する。「反応性カルボニル、ニトリル、またはスルホン」とは、カルボニル、ニトリル、またはスルホン基由来の第２の炭素におけるチオール特異的カップリングに対する反応性部位を有する、２つの炭素基が結合された、カルボニル、ニトリル、またはスルホン基を意味する（WO92/16221）。
【０１１５】
活性化リンカーは、一官能性、二官能性、または多官能性であり得る。この方法で使用され得る反応性スルホン基を有する有用な試薬には、クロロスルホン、ビニルスルホン、およびジビニルスルホンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
特定の実施態様では、水溶性ポリマーは、マイケルアクセプターで活性化される。WO 95/13312は、とりわけ、分子上および表面上のアミノ部分の代わりにチオール部分とカップリングすることに高度に選択的である水溶性のスルホン活性化PEGを記載する。これらのPEG誘導体は、約11以下のpHでの水性環境中で長い期間にわたり加水分解に対して安定であり、そして加水分解的に安定でもある結合体を形成するために分子との連結を形成し得る。それによってPEGおよび生物学的に活性な分子がカップリングされる連結には、チオール部分にカップリングされるスルホン部分が挙げられ、そしてこれは構造PEG-SO２-CH２-CH２-S-Wを有し、ここでWは生物学的に活性な分子を表し、そしてスルホン部分はビニルスルホンまたは活性エチルスルホンである。２つの特に有用なホモ二官能性誘導体は、PEG-bis-クロロスルホンおよびPEG-bis-ビニルスルホンである。
【０１１７】
PCT国際特許出願第US96/19459号（その開示は参考として本明細書に援用される）は、反応性ヒドロキシル基を有する化合物を得、そして変換のための溶媒としてテトラヒドロフラン（THF）を使用して、活性化リンカーを形成するためにヒドロキシル基を反応性マイケルアクセプターに変換することによる、スルホン活性化リンカーの製造方法を教示する。PCT国際特許出願第US96/19459号（その開示は参考として本明細書に援用される）は、サイズおよび末端基の官能性に基づいてリンカーを分離するために、疎水性相互作用クロマトグラフィーを利用する、活性化リンカーを精製するプロセスを教示する。
【０１１８】
詳細には、本発明は、モノまたはポリ（例えば、２〜４）PEG部分を含むように化学的に誘導体化された以下の原核生物で発現された分子を意図する：sTNFR-I 2.6D/C105、sTNFR-I2.6D/C106、sTNFR-I 2.6D/N105、sTNFR-I 2.3D/d8、sTNFR-I 2.3D/d18、およびsTNFR-I2.3D/d15（メチオニル化または非メチオニル化のいずれか）、ならびにその改変体および誘導体。
【０１１９】
多価形態
多価形態（単数または複数）、すなわち、１より多くの活性部分を含む分子が、構築され得る。１つの実施態様では、分子は、TNFリガンドに対する複数の腫瘍壊死因子結合部位を有し得る（例えば、短縮型sTNFR産物の組み合わせ）。さらに、分子は、少なくとも１つの腫瘍壊死因子結合部位、および、多価形態の所望の特徴に依存して、別の分子の少なくとも１つの結合部位を有し得る（例えば、以下に記載のような、少なくとも１つの短縮型sTNFR産物および少なくとも１つのインターロイキン-1レセプターアンタゴニスト（「IL-1ra」）の組み合わせ）。
【０１２０】
１つの実施態様では、多価形態は、例えば、少なくとも１つの短縮型sTNFR産物および別の部分、好ましくは別の短縮型sTNFR産物を、任意の臨床的に受容可能なリンカー（例えば、上記のような、水溶性ポリマー）と、化学的にカップリングすることによって構築され得る。原則として、リンカーは、新しい免疫原性を与えるべきでなく、そして新しいアミノ酸残基によって、その生体分布およびクリアランスに有害な影響を与えるように構造の疎水性および電荷バランスを変化させるべきではない。
【０１２１】
リンカーとして使用される場合、このようなポリマーは、直鎖もしくは分枝、置換、もしくは非置換の、上記に列挙するモノマーに基づく、モノポリマー、ランダムまたはブロックコポリマー、およびテルポリマー(terpolymer）であり得る。ポリマーは、任意の長さまたは分子量であり得るが、これらの特徴は生物学的特性に影響を与え得る。薬学的適用においてクリアランス速度を減少させるために特に有用なポリマー平均分子量は、2,000〜35,000ダルトンの範囲にある。さらに、ポリマーの長さは、所望の生物学的活性を最適にするかまたは与えるために変化され得る。
【０１２２】
２つ以上のタンパク質に水溶性ポリマーを連結するために使用され得る活性化基は、以下を含む：スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジジリン、オキシラン、および5-ピリジル。
【０１２３】
特定の実施態様では、少なくとも１つの反応性マイケルアクセプターを有する二官能性または多官能性活性化リンカーは、米国特許出願第08/473,809号に従って調製され得、そして米国特許出願第08/611,918号に従って精製され得る。
【０１２４】
活性部分は、従来のカップリング技法を使用して連結され得る（PCT公開公報第WO 92/16221号およびPCT公開公報第WO 95/34326号を参照のこと（これらの開示は参考として本明細書に援用される））。さらに、PCT公開公報第WO92/16221号は、種々のダイマー化されたsTNFR-Iインヒビター分子（例えば、ダイマー化されたc105 sTNFR-I）の調製を記載する。式(sTNFR-I2.6D/C106)２-(20kDa PEG)を有する例示的な多価腫瘍壊死因子結合タンパク質が、実施例Ｉに開示される。
【０１２５】
あるいは、二価分子は、ポリペプチドリンカー領域によって分離される短縮型sTNFR産物の２つのタンデムリピートからなり得る。ポリペプチドリンカーの設計は、タンパク質のデノボ設計におけるドメイン間の短いループ配列の挿入に設計が類似する（Mutter(1988), TIBS, 13:260-265、ならびにReganおよびDeGrado (1988), Science,241:976-978（これらの開示は参考として本明細書に援用される））。一本鎖抗体に適切なリンカーが、組換えヒトsTNFR-IIのダイマー形態を産生するために効果的であることが示されている（Neveら(1996), Cytokine, 8(5):365-370（その開示は参考として本明細書に援用される））。いくつかの異なるリンカー構築物が組み立てられており、そして抗体に有用であることが示されている；最も機能的リンカーは、12アミノ酸から25アミノ酸まで（非反応性側鎖基を有するアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、およびグリシン）サイズが変化し、これらはともに親水性配列を構成し、溶解性を増強するために少しの反対に荷電した残基を有し、そして可撓性である（WhitlowおよびFilpula(1991), Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:97-105、およびBrigidoら(1993), J. Immunol., 150:469-479（これらの開示は参考として本明細書に援用される））。
【０１２６】
別の実施態様では、短縮型sTNFRは、ビオチンに化学的にカップリングされ得、そして結合されたビオチン／短縮型sTNFRは次いでアビジンに結合させられ、四価アビジン／ビオチン／短縮型sTNFR分子を生じる。短縮型sTNFRはまた、ジニトロフェノール（DNP）またはトリニトロフェノール（TNP）に共有結合され得、そして得られる結合体は、TNF結合部位に対する10の原子価を有する十価結合体を形成するために抗DNPまたは抗TNP-IgMとともに沈殿され得る。
【０１２７】
さらに別の実施態様では、短縮型sTNFRを有する組換え融合タンパク質もまた、産生され得、ここで各組換えキメラ分子は、免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖のいずれかまたは両方の可変ドメインが置換され、そしてヒト免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメインのすべてまたは一部、しかし少なくとも１つの定常ドメインを有する、上記のような、sTNFR配列を有する。例えば、各々のこのようなキメラ短縮型sTNFR/IgG1融合タンパク質は、以下の２つのキメラ遺伝子から産生され得る：短縮型sTNFR/ヒトκ軽鎖キメラ（短縮型sTNFR/Ck）および短縮型sTNFR/ヒトγ-1重鎖キメラ（短縮型sTNFR/Cg-1）。２つのキメラ遺伝子の転写および翻訳の後、以下に記載のように、遺伝子産物は、二価に提示される短縮型sTNFRを有する単一のキメラ分子に組み立てられ得る。このようなキメラ分子の構築に関するさらなる詳細は、米国特許第5,116,964号、PCT公開公報第WO89/09622号、PCT公開公報第WO 91/16437号、およびEP 315062（これらの開示は参考として本明細書に援用される）に開示される。
【０１２８】
なおさらなる実施態様では、短縮型sTNFRを有する組換え融合タンパク質もまた産生され得、ここで各組換えキメラ分子は、上記のようなsTNFR配列、および欧州特許出願第96309363.8号に記載のようなオステオプロテゲリン（osteoprotegerin）（OPG）の領域186〜401の少なくとも一部を有する。
【０１２９】
ポリヌクレオチド
本発明は、さらに、短縮型sTNFRをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書の記載に基づいて、そして普遍的なコドン表を使用して、当業者は、短縮型sTNFRのアミノ酸配列をコードするすべての核酸配列を容易に決定し得る。ここで好ましい核酸配列は、sTNFR-I2.6D/C105、sTNFR-I 2.6D/C106、sTNFR-I 2.6D/N105、sTNFR-I 2.3D/d8、sTNFR-I 2.3D/d18、およびsTNFR-I2.3D/d15をコードするポリヌクレオチドを含む。種々のポリヌクレオチドの例は、図２、３、４、５、６、および７に示される。
【０１３０】
以下に記載の説明に従って行われる組換え発現技法は、これらのポリヌクレオチドを産生するためおよびコードされるタンパク質を発現するために続けられ得る。例えば、適切なベクターに短縮型sTNFRをコードする核酸配列を挿入することによって、当業者は、大量の所望のヌクレオチド配列を容易に産生し得る。次いで、配列は、検出プローブまたは増幅プライマーを生成するために使用され得る。あるいは、短縮型sTNFRをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターに挿入され得る。適切な宿主に発現ベクターを導入することによって、所望の短縮型sTNFRは大量に産生され得る。
【０１３１】
本明細書でさらに記載されるように、所望の核酸配列の増殖および／または短縮型sTNFRの産生に利用可能な多くの宿主／ベクター系がある。これらには、プラスミド、ウイルス、および挿入ベクター、ならびに原核生物および真核生物宿主が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本発明の配列を産生または発現させるために異種DNAを増殖または発現し得る宿主／ベクター系を適用し得る。
【０１３２】
さらに、本発明の開示の点で、新規核酸配列は、図面に記載の配列を有する短縮型sTNFRをコードする縮重核酸配列、およびこれらの核酸配列の相補物に（好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）ハイブリダイズする核酸配列を含む（Maniatisら(1982), Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring HarborLaboratory, 387〜389頁）ことは当業者によって認識される。代表的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、62〜67℃にて４×SSCでのハイブリダイゼーション、次いで約１時間62〜67℃にて0.1×SSCでの洗浄である。あるいは、代表的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、40〜45℃にて45〜55％ホルムアミド４×SSCでのハイブリダイゼーションである。緩やかなハイブリダイゼーション条件下で図１および９に記載の核酸配列にハイブリダイズし、そして短縮型sTNFRをコードするDNA配列も含まれる。このような緩やかなストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の例は、45〜55℃にて４×SSC、または40〜45℃にて30〜40％ホルムアミドでのハイブリダイゼーションである。
【０１３３】
短縮型sTNFRをコードするDNA配列とともにベクターDNAを含む組換えDNA構築物も、本発明によって提供される。各このようなDNA構築物では、短縮型sTNFRをコードする核酸配列（シグナルペプチドを含むまたは含まない）は、選択された宿主において短縮型sTNFRの複製および／または発現を指向し得る適切な発現制御配列または調節配列と、作動可能に関連する。
【０１３４】
組換え発現
ポリヌクレオチドの調製
短縮型sTNFRをコードする核酸配列は、化学合成、cDNAまたはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはcDNAのPCR増幅を含むが、これらに限定されない種々の方法で容易に得られ得る。これらの方法およびこのような核酸配列を単離するために有用である他の方法は、以下に記載される：Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY, (1989)；Ausubelら編, Current Protocols inMolecular Biology, Current Protocols Press, (1994)；ならびにBergerおよびKimmel, Methodsin Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, 152巻, Academic Press,Inc., San Diego, CA, (1987)、これらの開示は参考として本明細書に援用される。
【０１３５】
短縮型sTNFRをコードする核酸配列の化学合成は、Engelsら(1989), Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734およびWellsら (1985), Gene,34:315（これらの開示は参考として本明細書に援用される）に記載のような、当該技術分野で周知の方法を使用して達成され得る。これらの方法には、特に、核酸配列合成のホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、およびH-ホスホネート法が挙げられる。大きな核酸配列、例えば、約100ヌクレオチド長より大きな配列は、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、フラグメントは、短縮型sTNFRをコードする核酸配列を形成するように一緒に連結され得る。好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用するポリマー支持合成である。
【０１３６】
あるいは、適切な核酸配列は、適切なcDNAライブラリー（すなわち、タンパク質を発現すると考えられる１つ以上の組織ソースから調製されたライブラリー）またはゲノムライブラリー（全ゲノムDNAから調製されたライブラリー）をスクリーニングすることによって得られ得る。cDNAライブラリーのソースは、代表的には、妥当な量で所望のタンパク質を発現すると考えられる任意の種由来の組織である。ゲノムライブラリーのソースは、短縮型sTNFRをコードする遺伝子を有すると考えられる任意の哺乳動物または他の種由来の任意の１つまたは複数の組織であり得る。
【０１３７】
ハイブリダイゼーション培地は、ライブラリーに存在する１つまたは複数のcDNAまたは遺伝子と選択的にハイブリダイズする１つ以上の核酸プローブ（クローニングされるcDNAまたは遺伝子に対する受容可能なレベルの相同性を有するオリゴヌクレオチド、cDNA、またはゲノムDNAフラグメント）を使用して、短縮型sTNFRをコードするDNAの存在についてスクリーニングされ得る。代表的には、このようなスクリーニングに使用されるプローブは、ライブラリーが調製される種と同じまたは類似の種からDNA配列の小さい領域をコードする。あるいは、プローブは、本明細書に記載のように、縮重され得る。
【０１３８】
ハイブリダイゼーションは、代表的には、非特異的結合を抑制するがプローブまたはプライマーとの有意なレベルの相同性を有するクローンの結合を可能にするストリンジェンシーの条件下で、オリゴヌクレオチドプローブまたはcDNAをクローンにアニールすることによって達成される。代表的なハイブリダイゼーションおよび洗浄ストリンジェンシー条件は、cDNAまたはオリゴヌクレオチドプローブのサイズ（すなわち、長さでのヌクレオチドの数）、およびプローブが縮重するかどうかに一部依存する。クローンを同定する見込みはまた、ハイブリダイゼーション培地を設計するときに考慮される（例えば、cDNAまたはゲノムライブラリーがスクリーニングされるかどうか）。
【０１３９】
DNAフラグメント（例えば、cDNA）がプローブとして使用される場合、代表的なハイブリダイゼーション条件には、Ausubelら(1994)編, 前出に記載のような条件が含まれる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション培地は、プローブサイズ、クローンに対するプローブの予測される相同性、スクリーニングされるハイブリダイゼーション培地、スクリーニングされるクローンの数などのようないくつかの因子に依存して、適切なストリンジェンシーで洗浄される。イオン強度が通常低くそして比較的高い温度で使用される、ストリンジェントな洗浄溶液の例は、以下の通りである：このようなストリンジェント洗浄の１つは、55〜65℃にて0.015MNaCl、0.005M クエン酸ナトリウム、および0.1％SDSであり；このようなストリンジェントな洗浄のもう１つは、約40〜50℃にて1mM Na２EDTA、40mMNaHPO４、pH 7.2、および１％SDSであり；そして他のストリンジェント洗浄の１つは、約50〜65℃にて0.2×SSCおよび0.1％SDSである。
【０１４０】
オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーション培地をスクリーニングするために使用されるストリンジェントな洗浄条件についての代表的プロトコルもある。例えば、第１のプロトコルは、プローブの長さに依存して、約35℃と63℃との間の温度で0.05％ピロリン酸ナトリウムとともに６×SSCを使用する。例えば、14塩基プローブは35〜40℃で、17塩基プローブは45〜50℃で、20塩基プローブは52〜57℃で、そして23塩基プローブは57〜63℃で洗浄される。温度は、バックグラウンドの非特異的結合が高く現れる場合、２〜３℃上昇され得る。第２のプロトコルは、洗浄に塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）を使用する。このようなストリンジェント洗浄溶液の１つは、3MTMAC、50mM Tris-HCl、pH 8.0、および0.2％SDSである。
【０１４１】
適切な核酸配列を得るための別の適切な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。この方法では、cDNAは、酵素の逆転写酵素を使用してポリ(A)+RNAまたは全RNAから調製される。次いで、代表的には短縮型sTNFRをコードするcDNAの２つの別々の領域に相補的な、２つのプライマー（オリゴヌクレオチド）は、TaqポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにcDNAに添加され、そしてポリメラーゼは、２つのプライマー間のcDNA領域を増幅する。
【０１４２】
プローブまたはプライマーとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、スクリーニングまたはPCR増幅の間に生じ得る非特異的結合の量を最少にするように、適切な長さおよび十分に明瞭であるべきである。プローブまたはプライマーの実際の配列は、通常、保存されたまたは高度に相同な配列または領域に基づく。必要に応じて、プローブまたはプライマーは、完全にまたは部分的に縮重し得る、すなわち同じアミノ酸配列をコードするすべてであるが、そのようにするために種々のコドンを使用して、プローブ／プライマーの混合物を含み得る。縮重プローブを調製することの代わりは、種によって変化するコドン位置のいくつかまたはすべてにイノシンを配置することである。オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、上記のように、DNAについての化学合成法によって調製され得る。
【０１４３】
上記のように、改変体配列は、図２、３、４、５、６、および７の配列と比較して、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を含み、そして野生型アミノ酸配列と比較してアミノ酸配列改変体の発現を生じる天然（例えば、対立遺伝子改変体）または合成配列である。合成改変体配列の調製はまた、当該技術分野で周知であり、そして、例えば、Sambrookら (1989), 前出およびWellsら (1985), Gene, 34:315（これらの開示は参考として本明細書に援用される）に記載される。
【０１４４】
ベクター
短縮型sTNFRをコードするDNAは、さらなるクローニング（DNAの増幅）または発現のためのベクターに挿入され得る。適切なベクターは、商業的に入手可能であるか、またはベクターは特別に構築され得る。適切なベクターの選択または構築は、(1)DNA増幅またはDNA発現に使用されるかどうか、(2)ベクターに挿入されるDNAのサイズ、および(3)ベクターで形質転換される所定の宿主細胞に依存する。
【０１４５】
ベクターはそれぞれ、選択された宿主細胞による所望のタンパク質の発現を指向、制御、あるいは達成し得る、その後の発現制御配列または調節配列の１つ以上に作動可能に連結される、所望のタンパク質をコードする核酸配列を含む。各ベクターは、その機能（DNAの増幅またはDNAの発現）および所定の宿主細胞との適合性に依存して、種々の成分を含む。ベクター成分は、一般的に、以下の１つ以上を含むが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上の選択遺伝子またはマーカー遺伝子、プロモーター、エンハンサーエレメント、転写終結配列など。これらの成分は、天然ソースから得られ得るか、または公知の手順によって合成され得る。
【０１４６】
適切な原核生物クローニングベクターの例には、λ誘導体のようなバクテリオファージ、またはE. coliからのプラスミド（例えば、pBR322、colE1、pUC、F因子、およびBluescript(R)プラスミド誘導体（Stratagene,LaJolla, CA））が挙げられる。他の適切な発現ベクター（それらの多くのタイプが以下に記載の宿主細胞について当該技術分野で公知である）はまた、この目的に使用され得る。
【０１４７】
シグナル配列
シグナル配列をコードする核酸は、短縮型ｓＴＮＦＲをコードする配列の5'に挿入され得、例えば、これはベクターの成分であり得、あるいは短縮型ｓＴＮＦＲをコードする核酸の一部であり得る。sTNFR-IおよびsTNFR-IIの天然のシグナル配列をコードする核酸が、公知である（EP393 438およびEP 422 339）。
【０１４８】
複製起点
発現およびクローニングベクターはそれぞれ、一般的に、１つ以上の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。クローニングベクターでは、この配列は、代表的には、宿主染色体DNAから独立したベクターの複製を可能にする配列であり、そして複製起点または自律複製配列を含む。このような配列は周知である。プラスミドpBR322からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV、またはBPV）は、哺乳動物細胞においてクローニングベクターに有用である。一般的には、複製起点は、哺乳動物発現ベクターに必要ではない（例えば、SV40起点は、初期プロモーターを含むので、しばしば、単独で使用される）。
【０１４９】
選択遺伝子
発現およびクローニングベクターはそれぞれ、代表的には、選択遺伝子を含む。この遺伝子は、形質転換された宿主細胞が選択培養培地で増殖される場合、形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要な「マーカー」タンパク質をコードする。ベクターで形質転換されない宿主細胞は選択遺伝子を含まず、そしてしたがってこれらは培養培地中で生存しない。代表的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を与えるか、(b)栄養要求性欠失を補うか、または(c)培養培地から利用可能でない重要な栄養を供給するタンパク質をコードする。
【０１５０】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生により多くの需要がある遺伝子が組換え細胞の継続世代の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）およびチミジンキナーゼを含む。細胞形質転換体は、形質転換体のみがベクターに存在するマーカーによって生存するために独特に適応する選択圧下に置かれる。選択圧は、培地中の選択薬剤の濃度が連続して変化し、それによって選択遺伝子および短縮型sTNFRをコードするDNAの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって負荷される。結果として、増加した量の短縮型sTNFRは、増幅したDNAから合成される。
【０１５１】
例えば、DHFR選択遺伝子で形質転換された細胞は、最初に、DHFRの競合アンタゴニストであるメトトレキセートを含む培養培地中で形質転換体のすべてを培養することによって同定される。野生型DHFRが使用される場合、適切な宿主細胞は、DHFR活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣細胞株である（UrlaubおよびChasin(1980), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77(7):4216-4220、その開示は参考として本明細書に援用される）。次いで、形質転換された細胞は、増加したレベルのメトトレキセートに曝される。これは、DHFR遺伝子の複数コピー、および付随して、短縮型sTNFRをコードするDNAのような発現ベクターに存在する他のDNAの複数コピーの合成を導く。
【０１５２】
プロモーター
発現およびクローニングベクターはそれぞれ、代表的には宿主生物によって認識されるプロモーターを含み、そして短縮型sTNFRをコードする核酸配列に作動可能に連結される。プロモーターは、短縮型sTNFRをコードする遺伝子のような、特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する構造遺伝子（一般的に、約100〜1000bp以内）の開始コドンの上流（5'）に位置する非翻訳配列である。プロモーターは、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの２つのクラスの１つに便宜上分類され得る。誘導性プロモーターは、栄養の存在または非存在あるいは温度の変化のような、培養条件のいくつかの変化に応じて、その制御下でDNAからの増加したレベルの転写を開始する。種々の可能性のある宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。プロモーターは、制限酵素消化によってソースDNAからプロモーターを除去し、そして所望のプロモーター配列を挿入することによって、短縮型sTNFRをコードするDNAに作動可能に連結され得る。天然のsTNFR-Iプロモーター配列またはsTNFR-IIプロモーター配列は、短縮型sTNFRをコードするDNAの増幅および／または発現を指向するために使用され得る。しかし、天然のプロモーターと比較して発現されるタンパク質のより多くの転写およびより高い収量を可能にするならば、そして使用のために選択されている宿主細胞系に適合可能であるならば、異種プロモーターが好ましい。例えば、他のNGF/TNFファミリーメンバーの天然のプロモーター配列のいずれか１つが、短縮型sTNFRをコードするDNAの増幅および／または発現を指向するために使用され得る。
【０１５３】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターには、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系；細菌発光（luxR）遺伝子系、およびtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。他の公知の細菌プロモーターも適切である。それらのヌクレオチド配列は、公表されており、それによって、当業者が、任意の必要とされる制限部位を供給するのに必要なリンカーまたはアダプターを使用して、所望のDNA配列にそれらを連結することが可能である。
【０１５４】
酵母宿主との使用に適切なプロモーター配列も、当該技術分野で周知である。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、そして、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくは、シミアンウイルス40（SV40）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが挙げられる。
【０１５５】
エンハンサーエレメント
発現およびクローニングベクターはそれぞれ、代表的には、短縮型sTNFRをコードするDNA配列の高等真核生物による転写を増加させるためのエンハンサー配列を含む。エンハンサーは、通常約10〜300bpの長さの、その転写を増加させるためにプロモーターに作用するDNAのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、相対的に配向および位置に非依存性である。これらは、転写ユニットの5'および3'に見出されている。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに有利に利用される。哺乳動物遺伝子由来の利用可能ないくつかのエンハンサー配列は公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン、およびインスリン）。さらに、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーのようなウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための代表的なエンハンサーエレメントである。エンハンサーは、短縮型sTNFRをコードするDNAの5'または3'の位置でベクターにスプライスされ得るが、代表的には、プロモーターから5'の部位に位置する。
【０１５６】
転写終結
真核生物宿主細胞で使用される発現ベクターのそれぞれは、代表的には、転写の終結のためおよびmRNAを安定化するために必要な配列を含む。真核生物のDNAまたはcDNAの5'および時には3'非翻訳領域由来のこのような配列は、一般に利用可能である。これらの領域は、短縮型sTNFRをコードするmRNAの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【０１５７】
ベクター構築物
上記の成分の１つ以上を（短縮型sTNFRをコードするコード配列とともに）含む適切なベクターの構築は、標準的連結技術によって達成される。単離されたプラスミドまたはDNAフラグメントは、必要とされるベクターを生成するために所望の順で、切断され、調整され、そして再連結トされる。正確な配列が構築されたことを確認するために、連結混合物は、E.coliを形質転換するために使用され得、そして成功した形質転換体は、上記のような公知の技法によって選択され得る。次いで、多量の形質転換体由来のベクターが調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され、および／または所望の構築物の存在を確認するために配列決定される。
【０１５８】
哺乳動物細胞で短縮型sTNFRをコードするDNAの一過性発現を提供するベクターもまた使用され得る。一般に、一過性発現は、宿主細胞が、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、そして次に、発現ベクターによってコードされる高レベルの所望のタンパク質を合成するような、宿主細胞中で効率的に複製し得る発現ベクターの使用を含む。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む、各一過性発現系は、クローニングされたDNAによってコードされるタンパク質の好都合の陽性同定、ならびに所望の生物学的または生理学的特性についてのこのようなタンパク質の迅速なスクリーニング、すなわち、生物学的に活性な短縮型sTNFRを同定することを可能にする。
【０１５９】
宿主細胞
それぞれが所望のタンパク質を発現することにおける使用のための核酸配列を含む、種々の組換え宿主細胞のいずれかがまた、本発明によって提供される。代表的な原核生物および真核生物の宿主細胞としては、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または植物細胞が挙げられる。
【０１６０】
原核生物宿主細胞としては、グラム陰性生物体またはグラム陽性生物体のような真正細菌（例えば、E. coli（HB101、DH5a、DH10、およびMC1061））；B.subtilisのようなBacilli；P. aeruginosaのようなPseudomonas種；Streptomycesspp.；Salmonella typhimurium；またはSerratia marcescansが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様として、所望のタンパク質がE.coli中で発現され得る。
【０１６１】
原核生物宿主細胞に加え、糸状菌または酵母のような真核微生物は、短縮型sTNFRの発現に適切な宿主であり得る。Saccharomyces cerevisiae、すなわち普通のパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も普通に使用されるが、多くの他の属、種、および系統が周知であり、そして普通に利用可能である。
【０１６２】
短縮型sTNFRは、多細胞生物に由来する多くの適切な宿主細胞のいずれか１つによってグリコシル化した形態で発現され得る。このような宿主細胞は、複雑なプロセシングおよびグリコシル化活性が可能である。原則として、このような培養物が、脊椎動物細胞を含むか、植物細胞および昆虫細胞を含む無脊椎動物細胞を含むかのいずれにせよ、任意の高等真核生物細胞培養物が使用され得る。特定の実施態様として、所望のタンパク質がバキュロウイルス細胞で発現され得る。
【０１６３】
培養物（組織培養物）中での脊椎動物細胞の増殖が周知の手順であるので、脊椎動物細胞が使用され得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）、ヒト胚腎臓株（293細胞または懸濁培養物中での増殖のためにサブクローニングされた293細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な哺乳動物細胞株としては、HeLa、マウスL-929細胞、Swissに由来する3T3株、Balb-cマウスまたはNIHマウス、およびBHKハムスターまたはHaKハムスターの細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様として、所望のタンパク質がCOS細胞で発現され得る。
【０１６４】
宿主細胞は、トランスフェクトされ、そして好ましくは核酸の発現を可能にする適切な条件下で所望の核酸で形質転換され得る。適切な宿主細胞、および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、ならびに産物の産生および精製のための方法の選択は、当該分野で周知である（GethingおよびSambrook (1981), Nature, 293:620-625、あるいは、Kaufmanら(1985), Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759、または米国特許第4,419,446号、これらの開示は参考として本明細書に援用される）。例えば、細胞壁を有さない哺乳動物細胞について、リン酸カルシウム沈降法が使用され得る。エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、および他の公知の技法もまた使用され得る。
【０１６５】
短縮型sTNFRが、相同組換えによるか、または短縮型sTNFRをコードするDNAを既に含む細胞に導入された制御エレメントを利用する組換え産生方法で産生され得ることもまた可能である。相同組換えは、転写活性遺伝子において変異を誘導または訂正するために標的遺伝子について最初に開発された技法である（Kucherlapati(1989), Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol., 36:301、この開示は参考として本明細書に援用される）。基本的技法は、哺乳動物ゲノムの特定の領域に特定の変異を導入するための方法として（Thomasら(1986), Cell, 44:419-428；ThomasおよびCapecchi (1987), Cell, 51:503-512、およびDoetschmanら(1988), Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8583-8587、これらの開示は参考として本明細書に援用される）、または欠損遺伝子内の特定の変異を訂正するために（Doetschmanら(1987), Nature, 330:576-578、その開示は参考として本明細書に援用される）開発された。代表的技法は、米国特許第5,272,071号；WO92/01069；WO 93/03183；WO 94/12650、およびWO 94/31560に記載され、これらの開示は参考として本明細書に援用される。
【０１６６】
相同組換えによって、ゲノム中に挿入されるDNA配列は、標的DNAに付着することによって目的の遺伝子の特定の領域へ向けられ得る。標的DNAは、ゲノムDNAの領域に相補的（相同）なDNAである。ゲノムの特定の領域に相補的である標的DNAの小片は、DNA複製プロセスの間に親鎖と接触して置く。細胞内に挿入されているDNAの一般的特性は、共有した相同領域によって内因性DNAの他の片とハイブリダイズしそれによって組換えすることである。この相補鎖は、変異またはDNAの異なる配列を含むオリゴヌクレオチドに付着される場合、これはまた組換えの結果として新しく合成された鎖中に組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、DNAの新しい配列をテンプレートとして供することが可能である。したがって、転移されたDNAはゲノム中に組み込まれる。
【０１６７】
短縮型sTNFRの核酸配列のように、特定の遺伝子の配列が公知である場合、発現制御配列（遺伝子の選択された領域に相補的な一片のDNA）は、合成され得るか、そうでなければ、例えば、目的の領域の境界をつける特定の認識部位で天然のままのDNAの適切な制限によって得られる。この小片は、細胞内への挿入の際の標的配列として役立ち、そしてゲノム内のその相同領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションはDNA複製中に生じる場合、DNAのこの小片、およびそれに付着される任意の付加的配列は、岡崎フラグメントとして作用し、そしてDNAの新しく合成された娘鎖に返し縫い(backstitch)される。
【０１６８】
短縮型sTNFRの発現と相互作用し得るDNAの領域は、標的DNAのこれらの小片へ付着される。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサー、または外因性転写調節エレメントは、所望の短縮型sTNFRをコードするDNAの転写に影響を及ぼすために十分な近接および配向において、所定の宿主細胞のゲノム中に挿入される。制御エレメントは、短縮型sTNFRをコードしないが、代わりに宿主細胞ゲノムに存在するDNAの一部を制御する。したがって、短縮型sTNFRの発現は、短縮型sTNFRをコードするDNAのトランスフェクションによってではなく、むしろ短縮型sTNFRの転写のための認識可能なシグナルを有する内因性遺伝子配列を提供するDNA調節セグメントとカップリングした（目的の内因性遺伝子と相同の領域を含む）標的DNAの使用によって達成され得る。
【０１６９】
宿主細胞を培養する工程
所望のタンパク質の産生のための１つ以上の組換え宿主細胞のそれぞれを培養するための方法は、多くの因子および理由に依存して変化する；所定の状況に最適な産生手順は、最小の実験によることが当業者に明らかである。このような組換え宿主細胞は、適切な培地で培養され、次いで、発現された短縮型sTNFRは、必要に応じて、培養培地から（または、細胞内で発現される場合、細胞から）当業者に公知の適切な手段によって回収され、単離され、そして精製される。
【０１７０】
詳細には、所望の短縮型sTNFRを産生するために使用される組換え細胞のそれぞれは、プロモーターを誘導するか、適切な組換え体宿主細胞を選択するか、または所望の短縮型sTNFRをコードする遺伝子を増幅するために適切な培地中で培養され得る。この培地は、ホルモンおよび／もしくは他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、HEPES）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）、微量元素（マイクロモル範囲での最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは他のエネルギー源とともに必要に応じて補充され得る。他の追加物はまた、当業者に理解されるように、適切な濃度で含まれ得る。温度、pHなどのような、適切な培養条件もまた、選択された宿主細胞との使用について当業者に周知である。
【０１７１】
次いで、得られる発現産物は、当該技術分野で公知の手順を使用してほぼ同質まで精製され得る。代表的な精製技法は、EP 393 438およびEP 422 339に教示され、これらの開示は参考として本明細書中に援用される。
【０１７２】
薬学的組成物
薬学的組成物はそれぞれ、一般的に、治療的有効量の短縮型sTNFRおよび化学的に改変された短縮型sTNFRの誘導体（集団で、「短縮型sTNFR産物」）をビヒクルと混合して含む。ビヒクルは、好ましくは、１つ以上の薬学的および生理学的に受容可能な処方物物質を、短縮型sTNFR産物および制御放出物質と混合して含む。
【０１７３】
ビヒクル中の一次溶媒は、事実上、水性または非水性のいずれかであり得る。さらに、ビヒクルは、好ましくは5〜6.5の間、およびより好ましくは5.5〜6.0の間のpHを改変または維持するための他の薬学的受容可能な賦形剤（例えば、クエン酸塩、リン酸塩、およびグリシンのようなアミノ酸のような緩衝剤）；凍結乾燥した処方物のためのバルク剤（例えば、マンニトールおよびグリシン）；浸透圧（例えば、マンニトールおよび塩化ナトリウム）；界面活性剤（例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート80、トリトン、およびプルローニク(pluronic）；粘性；澄明性；色；無菌性；安定性（例えば、スクロースおよびソルビトール）；抗酸化剤（例えば、亜硫酸ナトリウムおよび亜硫酸水素ナトリウム）；保存剤（例えば、安息香酸およびサリチル酸）；処方物の香り；香味剤および希釈化剤；解離速度（例えば、溶解剤またはアルコール、ポリエチレングリコール、および塩化ナトリウムのような可溶化剤）；放出速度；乳化剤；懸濁化剤；溶媒；充填剤；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または薬学的アジュバントを含み得る。非経口的徐放出処方物、吸入霧、経口活性処方物、または坐剤のような他の有効な投与形態もまた考えられる。組成物はまた、バルク浸食ポリマー（例えば、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)（PLGA）コポリマー、PLGAポリマー混合物、PEGのブロックコポリマー、ならびに乳酸およびグリコール酸、ポリ(シアノアクリレート)）；表面浸食ポリマー（例えば、ポリ(無水物)およびポリ(オルトエステル)）；ヒドロゲルエステル（例えば、プルローニクポリオール、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸-アルキルビニルエーテルコポリマー、セルロース、ヒアルロン酸誘導体、アルギン酸塩、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ならびに澱粉およびデキストラン）、ならびにその組成物系；あるいはリポソームまたはマイクロスフェアの調製物のような、微粒子調製物を含み得る。このような組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼし得る。所望のタンパク質に最適な薬学的処方物は、投与経路および所望の用量に依存して当業者により決定される。代表的な薬学的組成物は、Remington'sPharmaceutical Sciences, 18版 (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042,1435-1712頁；GombotzおよびPettit (1995), Bioconjugate Chem., 6:332-351；Leone-Bayら(1995), Journal of Medicinal Chemistry, 38:4263-4269；Haasら(1995), Clinical Immunology and Immunopathology, 76(1):93；WO94/06457；WO 94/21275；FR 2706772、およびWO 94/21235に開示され、これらの開示は参考として本明細書中に援用される。
【０１７４】
特定の持続放出組成物は、以下の供給者から入手可能である：Depotech（DepofoamＴＭ、多小胞リポソーム）；Alkermes（ProLeaseＴＭ、PLGAマイクロスフェア）。本明細書中で使用される場合、ヒアルロナン（hyaluronan）とは、ヒアルロナン、ヒアルロン酸、その塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム）、エステル、エーテル、酵素的誘導体、および架橋したゲル、ならびにヒアルロン酸の化学改変した誘導体（例えば、ヒラン（hylan））を含むことを意図する。ヒアルロナンの代表的形態は、PeyronおよびBalazs(1974), Path. Biol., 22(8):731-736；Isdaleら (1991), J. DrugDev., 4(2):93-99；Larsenら (1993), Journal of Biomedical MaterialsResearch, 27:1129-1134；Namikiら (1982), International Journal ofClinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 20(11):501-507；Meyerら(1995), Journal of Controlled Release, 35:67-72；Kikuchiら (1996), Osteoarthritisand Cartilage, 4:99-110；Sakakibaraら (1994), Clinical Orthopaedicsand Related Research, 299:282-292；MeyersおよびBrandt (1995), 22(9):1732-1739；Laurentら(1995), Acta Orthop Scand, 66(266):116-120；Casconeら (1995), Biomaterials,16(7):569-574；Yerashalmiら (1994), Archives of Biochemistry andBiophysics, 313(2):267-273；Bernatchezら (1993), Journal ofBiomedical Materials Research, 27(5):677-681；Tanら (1990), AustralianJournal of Biotechnology, 4(1):38-43；GombotzおよびPettit (1995), BioconjugateChem., 6:332-351；米国特許第4,582,865号、第4,605,691号、第4,636,524号、第4,713,448号、第4,716,154号、第4,716,224号、第4,772,419号、第4,851,521号、第4,957,774号、第4,863,907号、第5,128,326号、第5,202,431号、第5,336,767号、第5,356,883号；欧州特許出願第0507 604 A2号および第0 718 312 A2号；ならびにWO 96/05845に開示され、これらの開示は参考として本明細書に援用される。特定のヒアルロナン組成物は、以下の供給者から入手可能である：BioMatrix,Inc. Ridgefield, NJ (SynviscＴＭ, ヒラン流体およびヒランゲルの90:10混合物)；FidiaS.p.A., Abano Terme, Italy (HyalganＴＭ, 雄鶏とさか由来のヒアルロン酸のナトリウム塩（約500,000〜約700,000MW))；Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan (ArtzＴＭ, 雄鶏とさか由来のヒアルロン酸の１％溶液、約700,000MW)；Pharmacia AB, Stockholm, Sweden (HealonＴＭ, 雄鶏とさか由来のヒアルロン酸, 約４×10６MW)；Genzyme Corporation, Cambridge, MA (SurgicoatＴＭ, 組換えヒアルロン酸)；PronovaBiopolymer, Inc. Portsmouth, NH (ヒアルロン酸FCH, Streptococcus zooepidemicusの培養物から調製された高分子量（例えば、約1.5〜2.2×10６MW）ヒアルロン酸；ヒアルロン酸ナトリウム MV, 約1.0〜1.6×10６ MW、およびヒアルロン酸ナトリウム LV, 約1.5〜2.2×10６MW)；Calbiochem-Novabiochem AB, Lautelfingen, Switzerland (Hyaluronic Acid, Streptococcussp.から調製されたナトリウム塩 (1997 会社カタログ番号385908))；Intergen Company, Purchase, NY (雄鶏とさか由来のヒアルロン酸,＞１×10６ MW)；Diosynth Inc., Chicago, IL；Amerchol Corp., Edison, NJ、およびKyowaHakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan。
【０１７５】
一旦薬学的組成物が処方されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳化液、固体、または脱水されたかもしくは凍結乾燥された粉末として、滅菌バイアル中に貯蔵され得る。このような処方物は、用事調製形態でまたは投与前に再構成を必要とする（例えば、凍結乾燥した）形態でのいずれかで貯蔵され得る。
【０１７６】
特定の実施態様では、本発明は、単回用量投与単位を生成するためのキットに関する。このキットは、それぞれ、乾燥したタンパク質を有する第１の容器および水性処方物を有する第２の容器の両方を含み得る。本発明の範囲内に含まれるキットは、単一および複数の部屋に分かれた予め充填されたシリンジ；代表的な予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジ、およびLyo-Ject(R)のようなlyosyringe、二室の予め充填されたlyosyringe）は、Vetter GmbH,Ravensburg, Germanyから入手可能である。
【０１７７】
用途
短縮型sTNFR産物は、研究試薬としてならびに治療および診断薬剤として有用であり得る。したがって、短縮型sTNFRは、組織または器官試料中の天然のsTNFR-IまたはsTNFR-IIの量を定量するため、あるいはTNFを発現する細胞を決定および／または単離するためにインビトロおよび／またはインビボ診断アッセイに使用され得る（Scallonら(1995), 前出）。組織または器官のアッセイでは、１２５I-短縮型sTNFRの標準化した結合曲線と比較して、TNFに対する非標識の天然のsTNFR-IまたはsTNFR-I結合のため、TNFに対する１２５I-短縮型sTNFR結合からの放射活性がほとんどない。同様に、１２５I-短縮型sTNFRの使用は、種々の細胞タイプにおけるTNFの存在を検出するために使用され得る。
【０１７８】
本発明はまた、抗体の生成における短縮型sTNFR産物および得られる抗体（詳細には、天然のsTNFR-IまたはsTNFR-IIにも結合する抗体を含む）の使用を意図する。R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２アミノ酸配列内またはR４-[Cys３２-Cys１１５]-R５アミノ酸配列内のエピトープのような、短縮型sTNFRに結合する抗体が、開発され得る。当業者は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、または組換え抗体を得るために周知の公表された手順を使用し得、これらは、本発明のアミノ酸配列によってコードされる種々のタンパク質を特異的に認識し、そして結合する。次いで、このような抗体は、全長の成熟30kDaTNFインヒビターおよび全長の成熟40kDa TNFインヒビターを精製および特徴づけるために使用され得る。
【０１７９】
本発明はまた、TNFによって媒介される特定の疾患および医学的症状（その多くは炎症性疾患として特徴づけられ得る）の処置の方法に関する。疾患または医学的症状は、自発的または実験的疾患が、体液であるいは体内の疾患または徴候の病巣に隣接する組織でのTNFのレベルの上昇に関連する場合に、「TNF媒介性疾患」であると考えられる。TNF媒介性疾患はまた、以下の２つの条件によって認識され得る：(1)疾患に関連する病理学的所見は、TNFの投与によって動物で実験的に模倣され得る、および(2)疾患の実験的動物モデルで誘導される病理は、TNFの作用を阻害する薬剤での処置によって阻害または廃止され得る。多くのTNF媒介性疾患は、これらの３つの状態のうちの２つを満たし、そして他は３つの状態のすべてを満たす。それぞれが本発明の方法に従って処置され得る、TNF媒介性疾患、ならびに関連の続発症、およびそれに付随する症状の非排除リストは、成人呼吸窮迫症候群；悪質液／食欲不良；ガン（例えば、白血病）；慢性疲労症候群；移植片対宿主拒絶；痛覚過敏；炎症性腸疾患；神経炎症性疾患；脳虚血（外傷、てんかん、出血、または発作の結果としての脳損傷、これらのそれぞれは神経変性を導き得る）を含む、虚血／再潅流損傷；糖尿病（例えば、若年性１型糖尿病）；多発性硬化症；眼疾患；疼痛；膵炎；肺線維症；リウマチ病（例えば、慢性関節リウマチ、骨関節炎、若年性（リウマチ様）関節炎、血清陰性多発関節炎、強直性脊椎炎、ライテル症候群および反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎、脳血管炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多軟骨炎およびリウマチ性多筋痛および巨大細胞動脈炎）；敗血症性ショック；放射線治療からの副作用；全身性エリテマトーデス；一過性下顎骨関節疾患；甲状腺炎および組織移植である。
【０１８０】
短縮型sTNFR産物はそれぞれ、上で定義されたように、リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）を含むTNF媒介性疾患の処置のための治療的有効量で患者に投与され得る。用語「患者」は、動物（例えば、ネコ、イヌ、およびウマ）ならびにヒトを含むことが意図される。
【０１８１】
短縮型sTNFR産物は、局所、腸内、または非経口投与によって投与され得、これには、静脈内、筋肉内、動脈内、莢膜内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、室内、および胸骨内注射および注入が挙げられるが、これらに限定されない。短縮型sTNFR産物はまた、経口投与によって投与され得るか、または粘膜を通って、すなわち、全身送達のために鼻内、舌下、頬側、または直腸内に投与され得る。
【０１８２】
短縮型sTNFR産物が、関節内、皮下、筋肉内、または静脈内注射によって投与されることが好ましい。さらに、短縮型sTNFR産物は、投与の期間にわたって血液中で所望のレベルの短縮型sTNFR産物を連続的に提供するように、連続注入（例えば、一定または間欠性の移植されたまたは外部注入フロー調節デバイス）によって投与され得る。これは、好ましくは、例えば、浸透ミニポンプのようなミニポンプによる、連続注入によって達成される。これらの方法では、薬物の量が所望のレベルで維持されることを確実にし得、そして血液試料を取りそして血流中の薬物の量をモニターし得る。種々のポンプは、MiniMedInc, Sylmar, CA (例えば、MT507)およびAlza Corp., Palo Alto, CA (例えば、Alzet浸透ポンプ、モデル2MLI)のような供給者から市販で入手可能である。
【０１８３】
連続的またはほぼ連続的な投与の他の態様が実施され得ることも意図される。例えば、化学的誘導体化は、所定の投与法に基づく予測可能な量で、血流中の連続的存在の効果を有するタンパク質の持続放出形態を生じ得る。
【０１８４】
関節の炎症性症状（例えば、骨関節炎、乾癬性関節炎、およびリウマチ様関節炎）を含む、TNF媒介性疾患の処置のために短縮型sTNFR産物を使用する態様は、ヨーロッパ特許出願567566に記載され、その教示は参考として本明細書に援用される。限定されないが例示として、１つの特定の実施態様では、短縮型sTNFR産物は、リウマチ様関節炎および骨関節炎の処置のために関節内に投与され得る。限定されないが例示として、別の特定の実施態様では、短縮型sTNFR産物は、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患、悪質液／食欲不良、または多発性硬化症の処置のために皮下または筋肉内に投与され得る。限定されないが例示として、なおさらなる特定の実施態様では、短縮型sTNFR産物は、外傷、てんかん、出血、または発作の結果としての脳損傷の処置のために静脈内に投与され得；あるいは外傷の結果としての脳損傷の処置のために脳室内に投与され得る。関節炎の処置のために好ましい態様には、(1)関節炎の発赤を抑制または治療するために必要とされる場合、定期的に与えられる短縮型sTNFR産物の単回関節内注射、および(2)短縮型sTNFR産物の定期的皮下注射が含まれる。敗血症性ショックの処置の開始は、敗血症または敗血症の可能性が診断された後できるだけ早く開始しなければならない。例えば、処置は、外科手術または事故あるいは敗血症性ショックが始まる危険を有し得る何らかの他の事象の直後に開始され得る。成人呼吸窮迫症候群の処置に好ましい態様には、(1)短縮型sTNFR産物の単回または複数回気管内投与、および(2)短縮型sTNFR産物のボーラスまたは連続的静脈内注入が含まれる。
【０１８５】
別の実施態様では、細胞治療、例えば、短縮型sTNFRを産生する細胞の移植もまた意図される。本発明のこの実施態様は、短縮型sTNFRの生物学的に活性な形態を合成および分泌し得る細胞を患者に移植する工程を包含し得る。短縮型sTNFRを産生するこのような細胞は、短縮型sTNFRを正常に産生しないが短縮型sTNFRを産生するように改変されている細胞であり得るか、あるいは短縮型sTNFRを産生する能力が、短縮型sTNFRの発現および分泌に適切なポリヌクレオチドでの形質転換によって増大されている細胞であり得る。外来種の短縮型sTNFRを投与することによって患者における潜在的免疫学的反応を最小にするために、細胞が、患者（例えば、ヒト）と同じ種であるか、または細胞が、免疫認識に対するバリアを提供する物質でカプセル化されるか、あるいは細胞が、例えば、精巣、眼、または中枢神経系において、免疫学的に特典のある解剖学的位置に配置されることが好ましい。
【０１８６】
ヒトまたは非ヒト動物細胞は、短縮型sTNFRの放出を可能にするためであるが、患者の免疫系によってもしくは周辺組織からの他の有害な因子によって細胞の破壊を防止するために、生体適合性の半透過性ポリマー封入体または膜中で、患者に移植され得る。あるいは、短縮型sTNFRを産生するためにエクスビボで形質転換された患者自身の細胞は、このような封入体なしで患者に直接移植され得る。生きている細胞の膜封入体化のための方法論は、当業者に熟知しており、そして封入体化された細胞の調製および患者でのそれらの移植が達成され得る。
【０１８７】
さらに別の実施態様では、インビボ遺伝子治療もまた包含され、ここでは、短縮型sTNFRをコードする核酸配列は患者に直接導入される。例えば、短縮型sTNFRをコードする核酸配列は、アデノ随伴ウイルスベクターのような適切な送達ベクターとともにまたはなしで、核酸構築物の局所注射によって標的細胞に導入される。代わりのウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびパピローマウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。物理的導入は、所望の核酸構築物または所望の核酸配列を含む他の適切な送達ベクターの局所注射、リポソーム媒介輸送、直接注射（裸のDNA）、レセプター媒介導入（リガンド−DNA複合体）、あるいはマイクロパーティクルボンバードメント（遺伝子銃）によって、インビボで達成され得る。
【０１８８】
代表的な細胞および遺伝子治療技法は、米国特許第4,892,538号；米国特許第5,011,472号；米国特許第5,106,627号；DE 4219626、WO 94/20517、および96/22793に開示され、これらの開示は参考として本明細書に援用される。
【０１８９】
投与の方法に関わりなく、TNF媒介性疾患の処置は、疾患の徴候を減少または緩和するために有効な短縮型sTNFRの用量または全投与方法を必要とする。適切な投与量を決定することにおける他の因子には、処置または予防される疾患または状態、疾患の重篤度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別、および医学的症状が含まれ得る。処置に適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる工夫は、特に、本明細書に開示された投与量情報およびアッセイの点で、当業者によって日常的に行われる。投与量はまた、適切な用量−応答データと組合わせて使用される投与量を決定するための公知のアッセイの使用によって決定され得る。特定の用量は、患者の大体の体重または体表面積に従って計算される。
【０１９０】
投与の頻度は、使用される処方物中の短縮型sTNFRの薬物動態学的パラメータに依存する。短縮型sTNFRは、１回または重篤なおよび長期障害の場合に投与され得、少ない頻度の投与で毎日投与され得、あるいは最初のボーラス投与に続いて連続投与または持続送達で投与され得る。非経口投与の場合、非経口単位用量は、例えば、それぞれ10mgまで、一般的には15mgまで、およびより一般的には20mgまでであり得る。関節腔に投与される場合、薬学的組成物は、好ましくは、例えば、等張リン酸緩衝化生理食塩水に溶解した約5mg/ml〜10mg/mlの短縮型sTNFRの用量を含む、例えば、３〜10mlシリンジからの単回注射として投与される。調製物は、例えば、７〜10日毎に１回の頻度で関節腔に投与され得る。このような方法では、投与は、例えば、必要ならば容量を変化しながら４〜５回連続的に行われる。
【０１９１】
いくつかの場合では、短縮型sTNFR産物は、他の治療への補助薬として、およびまた、処置される徴候に適切な他の薬学的処方物とともに投与され得る。短縮型sTNFR産物および１つ以上の伝統的または新しい抗炎症薬物のいずれかは、別々にまたは組み合わせて投与され得る。
【０１９２】
短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）および１つ以上のさらなる抗炎症薬物のいずれかは、別々にまたは組み合わせて投与され得る。以下の化合物についての情報は、TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy,第16版, Merck, Sharp & Dohme ResearchLaboratories, Merck & Co., Rahway, NJ (1992)、およびPharmaprojects, PJBPublications Ltd.で見出され得る。
【０１９３】
リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびブドウ球菌誘導（「敗血症性」）関節炎）のような急性および慢性炎症を含む、上で定義されたような、TNF媒介性疾患の現在の処置には、非ステロイド抗炎症薬物（NSAID）として分類される疼痛および炎症の制御のための第１の系統の薬物が挙げられる。第２の処置には、副腎皮質ステロイド遅延作用抗リウマチ薬物（SAARD）または疾患改変（DM）薬物が挙げられる。
【０１９４】
特定の実施態様では、本発明は、リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）のような急性および慢性炎症を含む、上で定義されたような、TNF媒介性疾患；および移植片対宿主病の処置のための、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）および任意の１つ以上のNSAIDの使用に関する。NSAIDは、その抗炎症作用が、少なくとも一部は、プロスタグランジン合成の阻害によるものである（GoodmanおよびGilman「ThePharmacological Basis of Therapeutics」, MacMillan,第7版 (1985)）。NSAIDは、９つの群に特徴づけられ得る：(1)サリチル酸誘導体；(2)プロピオン酸誘導体；(3)酢酸誘導体；(4)フェナム酸誘導体；(5)カルボン酸誘導体；(6)酪酸誘導体；(7)オキシカム；(8)ピラゾール；および(9)ピラゾロン。
【０１９５】
特定の実施態様では、本発明は、１つ以上のサリチル酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。このようなサリチル酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩は、アセタミノサロール、アロキシピリン、アスピリン、ベノリレート、ブロモサリゲニン、アセチルサリチル酸カルシウム、トリサリチル酸マグネシウムコリン、ジフルシナル、エテルサレート、フェンドサル、ゲンチジン酸、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、アセチルサリチル酸リジン、メサラミン、サリチル酸モルホリン、1-ナフチルサリチル酸、オルサラジン、パルサルミド、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、サラセタミド、サリチルアミドO-酢酸、サルサレート、およびスルファサラジンを含む。類似の鎮痛および抗炎症特性を有する構造的に関連するサリチル酸誘導体はまた、この群に包含されることが意図される。
【０１９６】
特定の実施態様では、本発明は、任意の１つ以上のプロピオン酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩と組み合わせた（処置前、処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。プロピオン酸誘導体、そのプロドラッグエステル、および薬学的に受容可能な塩は、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、バクロキシ酸（bucloxicacid）、カルプロフェン、デキンドプロフェン、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン（flurbiprofen）、フルクロプロフェン、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロキサム、インドプロフェン、イソプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピケトプロフェン、ピメプロフェン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸、プリドキシプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸、およびチオキサプロフェンを含む。類似の鎮痛および抗炎症特性を有する構造的に関連するプロピオン酸誘導体はまた、この群に包含されることが意図される。
【０１９７】
特定の実施態様において、本発明は、１つ以上の酢酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。酢酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げられる：アセメタシン、アルクロフェナク、アムフェナク、ブフェキサマク、シンメタシン、クロピラク、デルメタシン、ジクロフェナクナトリウム、エトドラク、フェルビナク、フェンクロフェナク、フェンクロラク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、フロフェナク、グルカメタシン、イブフェナク、インドメタシン、イソフェゾラク、イソキセパク、ロナゾラク、メチアジン酸、オキサメタシン、オキシピナク、ピメタシン、プログルメタシン、スリンダク、タルメタシン、チアラミド、チオピナク、トルメチン、ジドメタシン、およびゾメピラク。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連する酢酸誘導体もまた、この群に包含されることが意図される。
【０１９８】
特定の実施態様において、本発明は、１つ以上のフェナム酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。フェナム酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げられる：エンフェナム酸、エトフェナメート、フルフェナム酸、イソニキシン、メクロフェナム酸、メクロフェナム酸ナトリウム、メドフェナム酸、メファナム酸、ニフルム酸、タルニフルメート、テロフェナメート、トルフェナム酸、およびウフェナメート。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するフェナム酸誘導体もまた、この群に包含されることが意図される。
【０１９９】
特定の実施態様において、本発明は、１つ以上のカルボン酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。カルボン酸誘導体、使用され得るそのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げられる：クリダナク、ジフルニサル、フルフェニサル、イノリジン、ケトロラク、およびチノリジン。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するカルボン酸誘導体もまた、この群に包含されることが意図される。
【０２００】
特定の実施態様において、本発明は、１つ以上の酪酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。酪酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げらる：ブマジゾン、ブチブフェン、フェンブフェン、およびキセブシン。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連する酪酸誘導体もまた、この群に包含されることが意図される。
【０２０１】
特定の実施態様において、本発明は、１つ以上のオキシカム、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。オキシカム、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げられる：ドロキシカム、エノリカム、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカム、および4-ヒドロキシル-1,2-ベンゾチアジン1,1-ジオキシド4-(N-フェニル)-カルボキサミド。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するオキシカムもまた、この群に包含されることが意図される。
【０２０２】
特定の実施態様において、本発明は、１つ以上のピラゾール、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。ピラゾール、使用され得るそのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げられる：ジフェナミゾール、およびエピリゾール。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するピラゾールもまた、この群に包含されることが意図される。
【０２０３】
特定の実施態様において、本発明は、１つ以上のピラゾロン、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。ピラゾロン、使用され得るそのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げられる：アパゾン、アザプロパゾン、ベンズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン、プロピルフェナゾン、ラミフェナゾン、スキシブゾン、およびチアゾリノブタゾン。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するピラゾロンもまた、この群に包含されることが意図される。
【０２０４】
特定の実施態様において、本発明は、１つ以上の以下のNSAIDのいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する：ε-アセタミドカプロン酸、S-アデノシルメチオニン、3-アミノ-4-ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、アニトラザフェン、アントラフェニン、ベンダザク、ベンザダクリジネート、ベンジダミン、ベプロジン、ブロペラモル、ブクロメ、ブフェゾラク、シプロクアゾン、クロキシメート、ダジダミン、デボキサメト、デトミジン、ジフェンピラミド（difenpiramide）、ジフェンパイラミド（difenpyramide）、ジフィサラミン、ジタゾール、エモルファゾン、ファネチゾールミシレート、フェンフルミゾール、フロクラフェニン、フルミゾール、フルニキシン、フルプロクアゾン、フォピルトリン、フォスフォサル、グアイメサル、グアイアゾレン、イソニシキルン（isonizirn）、レフェタミンHCl、レフルノミド、ロフェミゾール、ロチファゾール、リジンクロニキシネート、メセクラゾン、ナブメトン、ニクチンドール、ニメスリド、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサセプロルム、オキサパドール、パラニリン、ペリソキサル、クエン酸ペリソキサル、ピフォキシム、ピプロキセン、ピラゾラク、ピルフェニドン、プロクアゾン、プロキサゾール、チエラビンＢ、チフラミゾール、チメガジン、トレクチン、トルパドール、トリプタミド、ならびに、480156S、AA861、AD1590、AFP802、AFP860、AI77B、AP504、AU8001、BPPC、BW540C、CHINOIN127、CN100、EB382、EL508、F1004、FK-506、GV3658、ITF182、KCNTEI6090、KME4、LA2851、MR714、MR897、MY309、ONO3144、PR823、PV102、PV108、R830、RS2131、SCR152、SH440、SIR133、SPAS510、SQ27239、ST281、SY6001、TA60、TAI-901（4-ベンゾイル-1-インダンカルボキシル酸)、TVX2706、U60257、UR2301、およびWY41770のような会社コード番号によって命名されたもの。上記のNSAIDと類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するNSAIDもまた、この群に包含されることが意図される。
【０２０５】
特定の実施態様において、本発明は、リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）のような急性および慢性の炎症を含む、上で定義されたようなTNF媒介性疾患；および多発性硬化症の処置のための、１つ以上の副腎皮質ステロイド、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。副腎皮質ステロイド、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げられる：ヒドロコルチゾン、およびヒドロコルチゾン由来である化合物（例えば、21-アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ベタメタゾンベレラート、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾル、クロベタゾールプロピオネート、クロベタゾン、酪酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノル、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾル、デフラザコン、デソニド、デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドネート、エノキソロン、フルアザコルト、フルクロロニド、フルメタゾン、フルメタゾンピバレート、フルニゾリド、フルシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロコルトロンヘキサノエート、ジフルコルトロンベレラート、フルオロメトロン、フルペロロンアセテート、フルプレドニデンアセテート、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコルタール、ハルシノニド、ハロメタゾン、ハロプレドンアセテート、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン21-コハク酸ナトリウム、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニコロン、モメタゾンフロエート、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾロン21-ジエドリアミノ酢酸、プレドニゾロンリン酸ナトリウム、プレドニゾロンコハク酸ナトリウム、プレドニゾロン21-m-スルホ安息香酸ナトリウム、プレドニゾロン21-ステアログリコール酸ナトリウム、プレドニゾロンテブテート、プレドニゾロン21-トリメチル酢酸、プレドニデン、プレドニバル、プレドニリジン、プレドニリデン21-ジエチルアミノ酢酸、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニド、およびトリアムシノロンヘキサセトニド）。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連する副腎皮質ステロイドもまた、この群に包含されることが意図される。
【０２０６】
特定の実施態様において、本発明は、リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）のような急性および慢性の炎症を含む、上で定義されたようなTNF媒介性疾患；および多発性硬化症の処置のための、１つ以上の遅延作用性抗リウマチ薬物（SAARD）または疾患改変抗リウマチ薬物（DMARD）、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。SAARDまたはDMARD、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げられる：アロカプレイドナトリウム、アウラノフィン、アウロチオグルコース、アウロチオグリカニド、アザチオプリン、ブレキナルナトリウム、ブシラミン、3-アウロチオ-2-プロパノール-1-スルホネートカルシウム、クロラムブシル、クロロキン、クロブザリト、クプロキソリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、ダプゾン、15-デオキシスペルグアリン、ジアセレイン、グルコサミン、金塩（例えば、シクロキン金塩、チオマリン酸金ナトリウム、チオ硫酸金ナトリウム）、ヒドロキシクロロキン、ヒドロキシ尿素、ケブゾン、レバミゾル、ロベンザリト、メリチン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、ミゾリビン、ミコフェノレートモフェチル、ミオラル、ニトロゲンマスタード、D-ペニシルアミン、ピリジノルイミダゾル（例えば、SKNF86002およびSB203580）、ラパマイシン、チオール、チモポイエチン、およびビンクリスチン。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するSAARDまたはDMARDもまた、この群に包含されることが意図される。
【０２０７】
特定の実施態様において、本発明は、急性および慢性の炎症を含む、上で定義されたようなTNF媒介性疾患の処置のための、１つ以上のCOX2インヒビター、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。COX2インヒビター、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩の例は、例えば、セレコキシブ（celecoxib）を含む。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するCOX2インヒビターもまた、この群に包含されることが意図される。
【０２０８】
特定の実施態様において、本発明は、急性および慢性の炎症を含む、上で定義されたようなTNF媒介性疾患の処置のための、１つ以上の抗菌剤、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。抗菌剤として、例えば、アンピシリン、アモキシシリン、アウレオマイシン、バシトラシン、セフタジジム、セフトリアキソン、セフォタキシム、セファクロル、セファレキシン、セフラジン、シプロフロキサシン、クラブラン酸（clavulanicacid）、クロキサシリン、ジクロキサシラン、エリスロマイシン、フルクロキサシラン、ゲンタマイシン、グラミシジン、メチシラン、ネオマイシン、オキサシラン、ペニシリン、およびバンコマイシンが挙げられる。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連する抗菌剤もまた、この群に包含されることが意図される。
【０２０９】
特定の実施態様において、本発明は、急性および慢性の炎症を含む、上で定義されたようなTNF媒介性疾患の処置のための、１つ以上の以下の化合物のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する：顆粒球コロニー刺激因子；サリドマイド；BN50730；テニダップ；E 5531；チアパファントPCA 4248；ニメスリド；パナビル；ロリプラム；RP 73401；ペプチドT；MDL 201,449A；(1R,3S)-シス-1-[9-(2,6-ジアミノプリニル)]-3-ヒドロキシ-4-シクロペンテン塩酸；(1R,3R)-トランス-1-[9-(2,6-ジアミノ)プリン]-3-アセトキシシクロペンタン；(1R,3R)-トランス-1-[9-アデニル)-3-アジドシクロペンタン塩酸；および(1R,3R)-トランス-1-[6-ヒドロキシ-プリン-9-イル)-3-アジドシクロペンタン。
【０２１０】
特定の実施態様において、本発明は、急性および慢性の炎症を含む、上で定義されたようなTNF媒介性疾患の処置のための、１つ以上のさらなるTNFインヒビターのいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。TNFインヒビターは、以下の化合物を含む、TNFのインビボ合成または細胞外放出をブロックする化合物およびタンパク質を含む。
【０２１１】
さらなるTNFインヒビターは、抗TNF抗体（例えば、MAK195F Fab抗体（Hollerら (1993), 第１回International Symposium on Cytokines in Bone MarrowTransplantation, 147；CDP 571 抗TNFモノクローナル抗体（Rankinら (1995), British Journalof Rheumatology, 34:334-342、その開示は参考として本明細書に援用される）；BAY X 1351マウス抗腫瘍壊死因子モノクローナル抗体（Kieftら(1995), 第７回European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases,9、その開示は参考として本明細書に援用される）；CenTNF cA2抗TNFモノクローナル抗体（Elliottら (1994), Lancet,344:1125-1127およびElliottら (1994), Lancet, 344:1105-1110、その開示は参考として本明細書に援用される）を含む。
【０２１２】
特定の実施態様において、本発明は、可溶性組換えヒトFas抗原またはその組換え型（WO 96/20206およびMountzら, J. Immunology, 155:4829-4837；およびEP510 691、これらの開示は参考として本明細書に援用される）と組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。WO96/20206は、分泌されたヒトFas抗原（天然および組換え、Ig融合タンパク質を含む）、可溶性組換えヒトFas抗原をコードするための遺伝子を単離する方法、適切なベクターおよび細胞タイプで遺伝子をクローニングする方法、およびインヒビターを産生するために遺伝子を発現させる方法を開示する。EP510 691は、可溶性Fas抗原を含むヒトFas抗原をコードするDNA、このDNAを発現するベクター、およびこのベクターでトランスフェクトされた形質転換体を教示する。非経口投与される場合、Fas抗原融合タンパク質の用量は、それぞれ、一般的に、１μg/kg〜100μg/kgである。
【０２１３】
特定の実施態様において、本発明は、リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）のような急性および慢性の炎症を含む、上で定義されたようなTNF媒介性疾患；外傷、てんかん、出血、または発作の結果としての脳損傷；および多発性硬化症の処置のための、１つ以上のインターロイキン-１インヒビターのいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）の使用に関する。インターロイキン-１インヒビターのクラスは、以下に記載のような、IL-1raのようなインターロイキン-１レセプターアンタゴニスト（IL-1に対する細胞レセプターの活性化を特異的に抑制し得る任意の化合物）を含む；抗IL-1レセプターモノクローナル抗体（例えば、EP623674、その開示は参考として本明細書に援用される）；可溶性IL-1レセプターのようなIL-1結合タンパク質（例えば、米国特許第5,492,888号、米国特許第5,488,032号、米国特許第5,464,937号、米国特許第5,319,071号、および米国特許第5,180,812号、これらの開示は参考として本明細書に援用される）；抗IL-1モノクローナル抗体（例えば、WO9501997、WO 9402627、WO 9006371、米国特許第4935343号、EP 364778、EP 267611、およびEP 220063、これらの開示は参考として本明細書中に援用される）；IL-1レセプター補助タンパク質、例えば、WO96/23067（その開示は参考として本明細書に援用される）；およびIL-1のインビボ合成または細胞外放出をブロックする他の化合物およびタンパク質。
【０２１４】
インターロイキン-１レセプターアンタゴニスト（IL-1ra）は、インターロイキン-1の天然のインヒビターとして作用するヒトタンパク質である。好ましいレセプターアンタゴニスト、ならびにその製造方法および使用方法は、米国特許第5,075,222号（本明細書では'222特許という）；WO91/08285；WO 91/17184；AU 9173636；WO 92/16221；WO 93/21946；PCT国際特許出願第US97/02131（これは、(a)有効量の制御放出ポリマー（例えば、ヒアルロン酸）および(b)有効量のIL-1raを含む薬学的組成物を教示する）；WO94/06457；WO 94/21275；FR 2706772；WO 94/21235；DE 4219626、WO 94/20517；およびWO96/22793に記載され、これらの開示は参考として本明細書に援用される。タンパク質は、グリコシル化ならびに非グリコシル化したIL-1レセプターアンタゴニストを含む。
【０２１５】
詳細には、それぞれ同じDNAコード配列に由来する、３つの好ましい形態のIL-1ra（IL-1raα、IL-1raβ、およびIL-1rax）は、Hannumらによって「Interleukin-1Inhibitors」と題される米国特許第5,075,222号に開示および記載される。本明細書で'222特許という、この米国特許は、特に、参考として本明細書に援用される。３つすべてのこれらのインターロイキン-1インヒビターは、類似の機能的および免疫学的活性を有する。IL-1インヒビター、特にIL-1raを産生する方法も、'222特許に開示される。１つの開示された方法は、ヒト単球からインヒビターを単離する工程（天然に産生される場合）を包含する。第２の開示された方法は、IL-1raをコードする遺伝子を単離する工程、適切なベクターおよび細胞タイプで遺伝子をクローニングする工程、IL-1raを産生するために遺伝子を発現させる工程、およびIL-1raを採取する工程を包含する。後者の方法は、一般的に組換えDNA方法の代表例であり、本発明の好ましい方法である。特定の実施態様では、IL-1raは、E.coliでの発現の結果としてN-末端メチオニル基を含む。本発明はまた、改変されたIL-1raを含む。改変されたIL-1raは、例えば、システイン残基が、天然に存在するインヒビターのアミノ酸配列中の１つ以上の部位のアミノ酸に関して置換されている、このようなインヒビターのムテインを含む。次いで、このようなムテインは、IL-1raPEG種を作出するために、機能化されたポリエチレングリコール（PEG）単位または他のスルフヒドリル含有ポリエーテルと、部位選択的に反応し得る。PCT公開公報第WO92/16221号は、多くの改変されたIL-1ra種およびこのようなPEG改変されたインヒビターの製造方法を開示する。
【０２１６】
インターロイキン-1インヒビターの追加のクラスは、IL-1に対する細胞レセプターの活性化を特異的に抑制し得る化合物を含む。このような化合物は、可溶性レセプターおよびモノクローナル抗体のような、IL-1結合タンパク質を含む。このような化合物はまた、レセプターに対するモノクローナル抗体を含む。
【０２１７】
インターロイキン-1インヒビターのさらなるクラスは、IL-1のインビボ合成および／または細胞外放出をブロックする化合物およびタンパク質を含む。このような化合物は、IL-1遺伝子の転写またはIL-1プレタンパク質のプロセシングに影響を与える薬剤を含む。
【０２１８】
上記は、例示のためであり、そして当業者に公知であるか、または本明細書に記載のガイドラインを使用して当業者が到達し得る、これらの抗炎症化合物と同時に使用される他の処置を排除しない。
【０２１９】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために単位投与形態で追加の抗炎症化合物の組成物を処方することは、特に有利である。本明細書で使用される場合、「単位投与形態」とは、処置される哺乳動物被験体についての単一の投与量として適した物理的に別個の単位をいい、各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共に、所望の治療効果を生じるように算出された所定の量の追加の抗炎症化合物を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意およびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含み、これらは、活性成分とならびに投与の態様および処方物の他の成分と適合性であり、そしてレシピエントに有害でない。このような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18版(1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, 1435-1712頁を参照のこと、その開示は参考として本明細書に援用される）。補足の活性成分も組成物に組み込まれ得る。
【０２２０】
経口治療投与については、追加の抗炎症化合物が賦形剤とともに組み込まれ得、そして摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブラートなどの形態で使用され得るか、あるいは食餌中の食物とともに直接組み込まれ得る。錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどはまた、以下のものを含み得る：トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、アルギン酸などのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；スクロース、ラクトース、またはサッカリンのような甘味剤；あるいはペパーミント、冬緑油、またはサクラもしくはオレンジ香味のような香味剤。単位投与形態がカプセルである場合、上記のタイプの物質の他に、液体キャリアを含み得る。種々の他の物質が、コーティングとして、あるいは投与単位の物理的形態を他に改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、セラック、糖または両方でコーティングされ得る。もちろん、任意の単位投与形態を調製することに使用される任意の物質は、薬学的に純粋であり、そして用いられる量で実質的に非毒性でなければならない。さらに、追加の抗炎症化合物は、持続放出調製物および処方物に組み込まれ得る。このような治療に有用な組成物中の追加の抗炎症化合物の量は、適切な投与量が得られるような量である。
【０２２１】
非経口治療投与については、それぞれの追加の抗炎症化合物は、滅菌注射用溶液とともに組み込まれ得る。滅菌注射用溶液は、以下に列挙される（必要とされる）種々の他の成分とともに、適切な薬学的に受容可能なキャリア中に必要とされる量で追加の抗炎症化合物を組み込み、次いで滅菌濾過することによって、調製され得る。分散剤の場合では、それぞれは、基本分散媒体および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に、追加の抗炎症化合物を組み込むことによって、調製され得る。滅菌注射用溶液の場合には、それぞれは、追加の抗炎症化合物の粉末、および必要に応じて、その既に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分を組み込むことによって調製され得、ここで、粉末は任意の適切な技法（例えば、真空乾燥および凍結乾燥）によって調製される。
【０２２２】
追加の抗炎症化合物の特定の用量は、患者の大体の体重または表面積に従って算出される。適切な投与量を決定することにおける他の要因は、処置または予防される急性または慢性の炎症性疾患または症状、疾患の重篤度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別、および医学的症状を含む。上記の処方物のそれぞれを含む処置のための適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる工夫は、当業者によって日常的に行われる。投与量はまた、適切な用量-応答データと関連して使用される投与量を決定するための公知のアッセイの使用によって決定され得る。
【０２２３】
したがって、例えば、リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）のような特定の急性または慢性の炎症性疾患を処置するために選択された追加の抗炎症化合物の用量が、所望の治療効果を達成するために変化され得ることは、本発明の範囲内である。追加の抗炎症化合物の１つが副作用(sideeffect)を有する場合、それは、組み合わせ治療の交替の処置期間中患者に与えられ得る。例えば、慢性的なメトトレキセート処置は、胃腸、肝臓、骨髄、および肺の毒性に関連する（Sandovalら(1995), British Journal of Rheumatology, 34:49-56、その開示は参考として本明細書に援用される）。
【０２２４】
疾患の改善をモニターするための試験は、例えば、炎症に対する全身応答の決定に関する特定の試験を含み得、これは、赤血球沈降速度（ESR）および急性期反応体（APR）を含む。観察は、罹患身体部の腫脹などから行われる。患者の強直および把握(grip)（適用可能な場合）および疼痛の減少における改善もまた観察される。患者の症状が安定であるならば、毎週同じ投与量で再処置されそして毎週評価される。患者の症状が安定であるならば、処置は続けられ得る。処置の６カ月後、骨格の解剖学的変化は、例えば、Ｘ線撮影法による放射線イメージングによって決定される。
【０２２５】
各期間の最後で、患者は再度評価される。処置前および処置後の放射線医学的評価、ESRおよびAPR、の比較は、処置の効能を示す。処置の効能および患者の症状に従って、投与量は、処置の期間にわたり増加または一定に維持され得る。
【０２２６】
好ましくは、本発明は、リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）のような、上で定義された急性または慢性の炎症性疾患および症状を処置または予防するために、必要に応じて以下の組み合わせの１つを用いる方法に関する：短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）およびメトトレキセート；短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）、メトトレキセート、およびIL-1インヒビター、好ましくはIL-1ra；短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）および任意の１つ以上のメトトレキセート、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン）、シプロフロキサシン、Fas抗原、およびIL-1インヒビター、好ましくはIL-1ra；短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）およびメトトレキセートおよび免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン）；短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）およびメトトレキセートおよびシプロフロキサシン；ならびに短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）およびメトトレキセートおよびIL-1インヒビター、好ましくはIL-1ra；短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）および任意の１つ以上のメトトレキセート、スルファサジン、およびヒドロキシクロロキン；短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）、メトトレキセート、およびヒドロキシクロロキン；ならびに短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質）、メトトレキセート、およびスルファサジン。
【０２２７】
特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、上で定義された（例えば、ライム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎ならびにそれに付随する徴候）リウマチ性疾患を処置するために、必要に応じて、メトトレキセートおよび／またはIL-1インヒビター（例えば、IL-1ra）および／または可溶性組換えヒトFas抗原と組み合わせた（処置前、処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質、必要に応じて持続放出処方物（例えば、ヒアルロナン）中に処方される）の投与（例えば、関節内、皮下、または筋肉内）を包含する。
【０２２８】
特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、それぞれが神経変性を導き得る、外傷、てんかん、出血、または発作の結果としての脳損傷を処置するために、必要に応じて、組織プラスミノーゲンアクチベーターおよび／またはIL-1インヒビター（例えば、IL-1ra）と組み合わせた（処置前、処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質、必要に応じて持続放出処方物（例えば、ヒアルロナン）中に処方される）の投与（例えば、静脈内または脳室内）を包含する。
【０２２９】
特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、多発性硬化症を処置するために、必要に応じて、１つ以上の副腎皮質ステロイド、シクロスポリン、FK-506、またはインターフェロン（例えば、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、またはコンセンサスインターフェロン）および／またはIL-1raと組み合わせた（処置前、処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質、必要に応じて持続放出処方物（例えば、ヒアルロナン）中に処方される）の投与（例えば、皮下または筋肉内）を包含する。
【０２３０】
特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、炎症性腸疾患を処置するために、必要に応じて、G-CSFおよび／またはIL-1raと組み合わせた（処置前、処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質、必要に応じて持続放出処方物（例えば、ヒアルロナン）中に処方される）の投与（例えば、皮下または筋肉内）を包含する。
【０２３１】
特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、悪液質／食欲不良を処置するために、必要に応じて、レプチン、MarinolＴＭ、またはMegaceＴＭと組み合わせた（処置前、処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質、必要に応じて持続放出処方物（例えば、ヒアルロナン）中に処方される）の投与（例えば、皮下または筋肉内）を包含する。
【０２３２】
特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、アルツハイマー病を処置するために、必要に応じて、NSAID（例えば、インドメタシン）および／またはIL-1インヒビター（例えば、IL-1ra）と組み合わせた（処置前、処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質、必要に応じて持続放出処方物（例えば、ヒアルロナン）中に処方される）の投与（例えば、皮下、脳室内、または莢膜内）を包含する。
【０２３３】
特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、ガン（例えば、白血病）；糖尿病（例えば、若年性１型糖尿病）；移植片対宿主拒絶；肝炎；脳虚血（それぞれが神経変性を導き得る、外傷、てんかん、出血、または発作の結果としての脳損傷）を含む虚血／再潅流損傷；神経炎症性疾患；上で定義された（例えば、ライム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）のようなリウマチ性疾患；および組織移植を処置するために、必要に応じて、可溶性組換えヒトFas抗原と組み合わせた（処置前、処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R１-[Cys１９-Cys１０３]-R２タンパク質、必要に応じて持続放出処方物（例えば、ヒアルロナン）中に処方される）の投与（例えば、皮下、脳室内、または莢膜内）を包含する。
【０２３４】
本発明の他の局面および利点は、以下の例示の実施例の考慮で理解される。
【実施例】
【０２３５】
以下の実施例に記載の多くの手順または適切な代わりの手順についての標準的方法は、例えば、Sambrookら (1989), 前出およびAusubelら (1990), 前出のような分子生物学の広く認識されたマニュアルで提供される。読者の便宜のために、「mL」は、ミリリットルをいい、「L」はリットルをいう。
【０２３６】
実施例Ｉ
以下の実施例は、短縮型の組換え可溶性TNFR-Iの種々の形態の産生を教示する：NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FC-COOH（sTNFR-I2.6D/C105）；NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.6D/C106）；NH２-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FN-COOH（sTNFR-I2.6D/N105）；NH２-MYIHPQNNSIC-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.3D/d8）；NH２-M-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.3D/d18）；およびNH２-MSIS-[Cys１９-Cys１０３]-FNCSL-COOH（sTNFR-I2.3D/d15）。
【０２３７】
Ａ．DNAの調製：
１．sTNFR-I2.6D/C106
sTNFR-I2.6D/C106のPCR増幅を、テンプレートとしてクローンλ-gt107ctnfbp（EP 422339）に由来のクローン化cDNAおよび以下のPCRプライマーを使用して行う：
5' OLIGO#1：（配列番号68）
5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3' OLIGO#2：（配列番号69）
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
OLIGO#1およびOLIGO#2は、NdeIおよびHindIIIをコードし、そしてそれぞれ、短縮型遺伝子の5'および3'末端にアニールする。PCR増幅は、25サイクルで行われ；各サイクルは、94℃にて30秒の変性、55℃にて15秒のアニーリング、および72℃にて１分の伸長からなる［Model2400熱サイクラー（Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT）］。PCR産物を、製造者の指示に従ってQIAquickＴＭPCR Purification Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA)を使用して精製する。精製されたPCR産物を、NdeIおよびHindIIIで切断し、次いで製造者の指示に従ってQIAquickＴＭGel Extraction Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA)を使用してゲル精製する。ゲル単離されたPCR産物を、pAMG11に連結し（WO95/26746）、そしてFM15 E. coli細胞（ATCC 55765）中に形質転換する。
【０２３８】
２．sTNFR-I2.6D/C105
sTNFR-I2.6D/C105のPCR増幅を、テンプレートとしてのsTNFR-I 2.6D/C106プラスミドDNAおよび以下のPCRプライマーを使用して行う：
OLIGO#3：（配列番号70）
5'-ACTCGAGGATCCGCGGATAAATAAGTAACGATCCGGTCCA-3'
OLIGO#4：（配列番号71）
5'-CAGGTCGGATCCTATCAGCAGAAGCACTGGAAAAGGTTTTC-3'
OLIGO#3およびOLIGO#4は、BamHIおよび変異N(105)C次いで停止コドンをコードする。OLIGOを、連結のための新しいBamHI部位の組込みのためのテンプレートの周囲に完全に伸長するように設計する。PCR増幅は、35サイクル；10サイクル（各サイクルは、92℃にて10秒の変性、55℃にて30秒のアニーリング、および68℃にて４分の伸長からなる）；次いで25サイクル（各サイクルは、92℃にて10秒の変性、55℃にて30秒のアニーリング、および68℃にて４分＋20秒の伸長からなる）で行われる［Model2400熱サイクラー（Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT）］。PCR産物を、製造者の指示に従ってQIAquickＴＭGel Extraction Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA)を使用してゲル精製し、BamHIで切断し、フェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿する。次いで、これを再懸濁し、pAMG11に連結し、そしてFM15E. coli細胞中に形質転換する。
【０２３９】
３．sTNFR-I2.6D/C105
sTNFR-I2.6D/N105のPCR増幅を、テンプレートとしてのsTNFR-I 2.6D/C106プラスミドDNAおよび以下のPCRプライマーを使用して行う：
5' OLIGO#5：（配列番号72）
5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3' OLIGO#6：（配列番号73）
5'-CGCGGATCCCTATTAATTGAAGCACTGGAAAAGG-3'
OLIGO#5およびOLIGO#6は、NdeIおよびBamHIをコードし、そしてそれぞれ短縮型遺伝子の5'および3'末端にアニールする。PCR増幅は、30サイクルで行われ；各サイクルは、95℃にて45秒の変性、65℃にて１分のアニーリング、および72℃にて２分の伸長からなる［Model2400熱サイクラー（Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT）］。
【０２４０】
PCR産物を、製造者の指示に従ってWizardＴＭDNA Clean-Up System (Promega, Madison, WI)を使用して精製する。精製されたPCR産物を、NdeIおよびBamHIで切断し、フェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿する。次いで、これを再懸濁し、pAMG11に連結し、そしてFM15E. coli細胞中に形質転換する。
【０２４１】
本発明の記載に基づいて、当業者は、種々の物質および方法が、宿主細胞（例えば、E. coliおよび他の細菌）中での適切な発現について容易に使用または適用され得ることを理解する。
【０２４２】
４．sTNFR2.3D/d18；sTNFR-I 2.3D/d8；およびsTNFR-I 2.3D/d15
sTNFR-I2.3D/d18；sTNFR-I 2.3D/d8；およびsTNFR-I 2.3D/d15のPCR増幅を、テンプレートとしてのsTNFR-I 2.6D/C106プラスミドDNAおよび以下のPCRプライマーを使用して各々行う：
sTNFR-I 2.3D/d8PCRプライマー：
5' OLIGO#7：（配列番号74）
5'-CCCCATATGTATATCCACCCTCAAAATAAT-3'
3' OLIGO#8：（配列番号75）
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
sTNFR-I2.3D/d15 PCRプライマー
5' OLIGO#9：（配列番号76）
5'-CCCCATATGTCGATTAGCTGTACCAAGTGCCACAAAGG-3'
3' OLIGO#10：（配列番号77）
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
sTNFR-I2.3D/d18 PCRプライマー
5' OLIGO#11：（配列番号78）
5'-CCCCATATGTGTACCAAGTGCCACAAAGGA-3'
3' OLIGO#12：（配列番号79）
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
OLIGO#7、OLIGO#9、およびOLIGO#11はそれぞれ、NdeIをコードし、そしてOLIGO#8、OLIGO#10、およびOLIGO#12はそれぞれ、HindIIIをコードする。PCR増幅は、25サイクルで行われ；各サイクルは、95℃にて45秒の変性、65℃にて１分のアニーリング、および72℃にて２分の伸長からなる［Model2400熱サイクラー（Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT）］。PCR産物を、製造者の指示に従ってWizaedＴＭDNA Clean-Up System (Promega, Madison, WI)を使用して精製する。精製されたPCR産物を、NdeIおよびHindIIIで切断し、フェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿する。これらを再懸濁し、pAMG11に連結し、そしてFM15E. coli細胞中に形質転換する。
【０２４３】
Ｂ．E.coliでの産生：
最初に、sTNFR-I2.6D/N105、sTNFR-I 2.6D/C105 sTNFR-I 2.6D/C106、sTNFR-I 2.3D/d18、sTNFR-I 2.3D/d8、およびsTNFR-I2.3D/d15についての所望の構築物を有する所望の組換えE. coliクローンの１つの少量の新たに培養した接種物を、凍結したグリセロールストックシードアンプルの全体の含量（約1.5mL）を500mLのLuriaブロスを含む２Ｌフラスコ中に移すことによって開始する。培養物を、37℃にて350rpmで操作する旋回振盪機でインキュベートする。培養物の密度を、660nmでの吸光度（OD６６０）を測定することによって決定する。シード培養物を、＞2.0OD６６０の密度まで増殖させ、そのときに125mLを、10Ｌの滅菌増殖培地を含む15Ｌ産生発酵槽に無菌的に移す。
【０２４４】
産生発酵のためのバッチ培地および発酵条件は、Sniff (1993),「A Chemically-Defined Medium for the Overproduction ofa Recombinant Protein in E. coli」学位論文, Colorado State Universityに記載されるような複合培地発酵条件である。一般的に、参考文献は、カゼイン加水分解物、塩、グリセリン、および消泡剤を含む複合培地の使用を教示し、これらは発酵槽中で滅菌される。タンクを40℃より低くまで冷却した後、濾過滅菌した微量ミネラルおよび塩酸チアミンを添加する。
【０２４５】
培地の温度が37℃で安定である場合、培地に、シード培養物を接種する。培養増殖を、OD６６０を測定することによってモニターする。培養物を、5M水酸化ナトリウムおよび5M塩酸の自動的添加によって、6.0のpHで維持する。OD６６０が9.5と10.5との間である場合、培養物を、滅菌イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）の0.50mMの最終濃度までの無菌添加によって誘導する。培養物を、増殖の停止時に採取する。
【０２４６】
培養培地および増殖条件は、以下を除いて、Sniff (1993)、前出に記載される通りである：硫酸アンモニウム（2.0g/L）およびL-システイン塩酸塩１水和物（1.0g/L）を培地に添加する；塩酸テトラサイクリンを培地から省く；pHを、水酸化ナトリウムのみで7.0に維持するのではなく、水酸化ナトリウムおよび塩酸で6.0に維持する；増殖温度を37℃に上昇させる；インデューサー濃度は、0.15mMから0.50mMIPTGへと増加させた；そして採取基準は、誘導後の時間ではなく増殖の停止に基づく。
【０２４７】
発酵の完了時に、細胞を、500mLボトル中に遠心分離で採取する。細胞を、10,000rpmにて30分間、遠心分離によってペレットにする。回収した細胞ペーストを、50mMTrisおよび５mM EDTAから構成されるpH 8.0の破壊緩衝液中に15％固体まで希釈する。次いで、懸濁した細胞を、8000psi圧で３回操作するホモジナイザー（APVGaulin, Inc., Everett, MA）に溶液を通過させることによって溶解する。次いで、ホモジネートを、10,000rpmで30分間遠心分離して、封入体（IB）を回収する。IBを、破壊緩衝液に再懸濁し、そして10,000rpmにて30分間溶液を３回目の遠心分離によって、洗浄する。IBを、脱イオン水に再懸濁し（1:1比）、そして２回目の洗浄について10,000rpmにて30分間最後の遠心分離をする。各タンパク質について回収し洗浄した封入体を、可溶化、再折り畳み、および精製のために準備する。各操作は、約200〜250gのIBを得る。
【０２４８】
代わりの実施態様では、短縮型sTNFR-1は、以下のように発酵され得る：
最初に、sTNFR-I2.6D/N105またはsTNFR-I 2.6D/C106についての所望の構築物を有する所望の組換えE. coliクローンの１つの少量の新たに培養した接種物を、凍結したグリセロールストックシードアンプルの全体の含量（約1.5mL）を500mLの10g/LBBL酵母抽出物、pH 7.0を含む２Ｌフラスコ中に移すことによって開始する。培養物を、33℃にて300rpmで操作する旋回振盪機でインキュベートする。培養物の密度を、600nmでの吸光度（OD６００）を測定することによって決定する。シード培養物を、＞2.0OD６００の密度まで増殖し、そのときにこの培養物（80mL）を、７Ｌの滅菌増殖培地を含む15Ｌ産生発酵槽に無菌的に移す。
【０２４９】
産生発酵は、フィード-バッチプロセスを用いる。バッチ培地は、酵母抽出物、塩、および消泡剤を含む複合培地であり、これらは発酵槽中で滅菌される。タンクを40℃以下まで冷却した後、濾過滅菌した微量ミネラル、グルコース、硫酸マグネシウム、およびヘキサメタホスフェートを添加する。２つのフィードを用い、第１は、炭素含有フィード（グルコース／硫酸マグネシウム）であり、そして第２は酵母抽出物を含む窒素フィードである。
【０２５０】
バッチ培地の温度が33℃で安定である場合、培地に、シード培養物を接種する。培養増殖を、OD６００を測定することによってモニターする。培養物を、水酸化アンモニウムおよび48.7％クエン酸の自動的添加によって、7.0のpHで維持する。OD６００が8.0と12.0との間である場合、フィードＩを、指数フィード速度を使用して開始する。OD６００が30と40との間である場合、フィード2を、一定のフィード速度を使用して開始する。OD６００が67〜83に達すると、培養物を、滅菌自己インデューサー（ホモセリンラクトン）の0.6mg/Lの最終濃度までの無菌添加によって誘導する。フィードＩおよびIIの両方の速度を、誘導では一定速度に変化させる。培養物を、誘導の16±2時間後に採取する。
【０２５１】
発酵の完了時に、細胞を、500mLボトル中に遠心分離で採取する。細胞を、10,000rpmにて30分間、遠心分離によってペレットにする。回収した細胞ペーストを、50mMTrisおよび５mM EDTAから構成されるpH 8.0の破壊緩衝液中に15％固体まで希釈する。次いで、懸濁した細胞を、8000psi圧で３回操作するホモジナイザー（APVGaulin, Inc., Everett, MA）に溶液を通過させることによって溶解する。次いで、ホモジネートを、10,000rpmで30分間遠心分離して、封入体（IB）を回収する。IBを、破壊緩衝液に再懸濁し、そして10,000rpmにて30分間溶液を３回目の遠心分離によって、洗浄する。IBを、脱イオン水に再懸濁し（1:1比）、そして２回目の洗浄について10,000rpmにて30分間最後の遠心分離をする。回収し洗浄した封入体を、可溶化、再折り畳み、および精製のために準備する。
【０２５２】
Ｃ．可溶化／再折り畳み：
各10Ｌ発酵全体からの洗浄したIBを、800mLの可溶化緩衝液（50mMTris、8M尿素、160mMシステイン pH9.5）で可溶化する。可溶化混合物のpHを、10N NaOHで9.5に調整し、そして２〜３時間室温で撹拌する。各操作は、約200〜250gのIBを得た。
【０２５３】
各可溶化混合物を、冷Renaturation Buffer（50mM Tris、1.1M尿素）中1:20に希釈する。各最終容量は、約16Ｌである。その後、各混合物を、6NHClでpH 9.7に調整し、そして２〜３日間４℃でゆっくり撹拌する。
【０２５４】
次いで、各混合物のpHは、氷酢酸および6N HClで5.0に調整する。各混合物では、Beckman Model J2-HS遠心機で10,000×gでの遠心分離によって取り出される沈殿物を形成する。次いで、各物質を、5μmおよび0.22μmフィルターを通して濾過する。
【０２５５】
Ｄ．精製：
再折り畳み物質を、IX-1 SP-Sepharose Big BeadＴＭカラム（Pharmacia Biotech, Inc.,Piscataway, NJ）でのカラム精製のために準備する。
【０２５６】
IX-1SP-Sepharose Big BeadＴＭカラム（4.4cm×20cm）
緩衝液Ａ 緩衝液Ｂ
25mM アセテート        25mM アセテート
50mMNaCl               375mM NaCl
pH5.0                  pH5.0
カラムを、各再折り畳み物質の別々のローディングの前に、４〜５カラム容量の緩衝液Ａで平衡化する。再折り畳み物質を、精製のためにカラム上に別々にロードする。各ローディングについて、カラムを、樹脂１リットル当たり12グラムを越えないタンパク質をロードする。次いで、各ローディングについて、カラムを３〜４カラム容量の緩衝液Ａで洗浄する(U.V.がベースラインに戻るまで）。各ローディングについて、タンパク質を、50〜375mMNaClで行う塩グラジエントを増加させる直線的８カラム容量を使用して、カラムから溶出する。各ローディングについて全体のタンパク質ピークを、１つのプールに集める。U.V.吸光度がピーク最大の約20％まで上昇したときに、各タンパク質ピークの収集を始める。U.V.吸光度がピーク最大の約50％に達するかまたは吸光度の減少が止まるかのいずれか早い場合に、プールすることを停止する。
【０２５７】
流速−  平衡化、洗浄について7.5cv/時間
ローディングについて15cv/時間
溶出について６cv/時間
各カラム精製を４℃にて行う。
【０２５８】
各IX-1プールを、ToyoPearlＴＭ Butyl 650M HICカラム（Toso Haas, Philadelphia, PA）での精製のために準備する。
【０２５９】
300mL− ToyoPearl ButylＴＭ 650M カラム（4.4cm×20cm）
緩衝液Ａ 希釈緩衝液 緩衝液Ｂ
20mM NaPO４              40mMNa NaPO４            Milli Q H２O
1.8M NaCl,pH6.0                                 4M NaCl pH6.0
カラムを、各IX-1プール物質の別々のローディングの前に４〜５カラム容量の緩衝液Ａで平衡化する。各IX-1プールを希釈緩衝液で1:1に希釈し、そしてpHを6.0に調整する。各ローディングについて、希釈したIX-1プールをカラム上にロードする。各ローディングについて、カラムを、樹脂１リットル当たり10グラムを越えないタンパク質でロードする。各ローディングについて、カラムを３カラム容量の緩衝液で洗浄する。各ローディングについて、タンパク質を、1.8MNaClからH２Oで行う塩グラジエントを減少させる直線的８カラム容量でカラムから溶出する。各タンパク質ピークの収集を、U.V.吸光度がピーク最大の約15〜20％まで上昇したときに開始する。U.V.吸光度がピーク最大の約50％に達するかまたは吸光度の減少が止まるいずれかより早い場合に、プールすることを停止する。
【０２６０】
流速−  平衡化、ローディング、および洗浄について６cv/時間
溶出について３cv/時間
各カラム精製を、室温で行う。
【０２６１】
各HICプールを、濃縮／ダイアフィルトレーションのために準備する。
【０２６２】
濃縮／ダイアフィルトレーション（C/D）
１sq ftPLCCＴＭ再生セルロース、5,000M.W.カットオフメンブレン（Milli-Pore, Bedford, MA）を、各HICプールについてのC/D工程に使用する。各HICプールを、約200mLまで濃縮し、次いで電導率が＜4mm時間になるまで、６〜７容量の20mMNaPO４ pH6.0に対してダイアフィルトレートする。
【０２６３】
各濃縮／ダイアフィルトレーション工程を室温で行う。
【０２６４】
次いで、各C/Dプールを、IX-2- 365mL SP-Sepharose HPＴＭカラム（Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ）での精製のために準備する。
【０２６５】
IX-2 - 365mLSP-Sepharose HPＴＭカラム（5cm×18.5cm）
平衡化緩衝液 緩衝液Ａ 緩衝液Ｂ
20mM Na NaPO４              20mMNaPO４              20mM NaPO４
pH6.0                      pH6.350mM NaCl          pH6.8
カラムを、各C/Dプールの別々のローディングの前に４カラム容量の平衡化緩衝液で平衡化する。各C/Dプールを、樹脂１リットル当たり８グラムを越えないタンパク質を使用してカラムにロードする。各ローディングについて、カラムを３カラム容量の平衡化緩衝液で、次いで３カラム容量の緩衝液Ａで洗浄する。各ローディングについて、タンパク質を、6.3〜6.8のpHグラジエントおよび０〜50mMNaCl（緩衝液Ｂ）で行う塩グラジエントからなる直線的８カラム容量グラジエントで、カラムから溶出する。プールすることを、ピークの前側が1.0 O.D.を越えたときに開始し、そして後ろ側のピーク最大の50％で停止する。
【０２６６】
代わりの実施態様では、短縮型sTNFR-1は、以下のように、可溶化され、再折り畳みされ、そして精製され得る：
C.1  可溶化／再折り畳み：
洗浄したIBを、8M尿素、60mMTris、100mMシステインで可溶化し、6.5M尿素、50mM Tris、および80mMシステイン、pH9.4、および５〜10mg/mL短縮型sTNFR-1の最終濃度を得る。（後者は、g/Lベースでの洗浄したIB中の短縮型sTNFR-1の量の定量に基づく。）物質を、室温で90分間撹拌し、次いで冷（４〜８℃）0.85M尿素、50mMTris、pH9.8（pH測定を４〜８℃で行った）中に1:10に希釈することによって再折り畳みする。
【０２６７】
再折り畳み溶液を、４〜８℃にて24〜72時間撹拌する。この時間の最後に、氷酢酸（約20mM）を添加し、そしてpHを5.0に調整する。形成する沈殿物を遠心分離によって除去し、そして上清を、第１のカラムをローディングするために蓄える。
【０２６８】
D.1  精製
澄明にした酸沈殿プールを、20mM酢酸ナトリウム、75mM NaCl、pH5.0で平衡化されているSP-Sepharose Big BeadＴＭカラム（PharmaciaBiotech, Inc., Piscataway, NJ）にロードする。カラムに、ベッド容量１Ｌ当たり15gを越えない短縮型sTNFR-1をロードする。ローディング後、カラムを、３カラム容量の20mM酢酸ナトリウム、75mMNaCl、pH5.0で洗浄し、そして20mM酢酸ナトリウム、pH5.0中75mM〜450mM NaClの直線的９カラム容量グラジエントで溶出する。全体のSP-SepharoseBig BeadＴＭカラム（SP-BB）工程を、４〜８℃で行う。
【０２６９】
必要であれば、SP-BBプールを、2MNaCl、60mM酢酸塩、pH4.5で1:1に希釈し、そしてpHを4.5に調節する。希釈したSP-BBプールを、1M NaCl、30mM酢酸塩、pH4.5で平衡化されているToyopearlＴＭButyl 650Mカラム（Toso Haas, Philadelphia, PA）にロードする。カラムに、ベッド容量１リットル当たり約10〜13グラムの短縮型sTNFR-1をロードする。ローディング後、カラムを、３カラム容量の1MNaCl、30mM酢酸塩、pH4.5で洗浄し、そして30mM酢酸塩、pH4.5中の1M〜0M NaClの直線的８カラム容量グラジエントで溶出する。
【０２７０】
Butyl650Mカラムからの精製した短縮型sTNFR-1画分をプールし、水で1:5に希釈し、そして30mM酢酸塩、pH4.5で平衡化されているSP-SepharoseHigh PerformanceＴＭカラム（SP-HP）（Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ）上にロードする（約15g/Lベッド容量を越えないローディング）。次いで、カラムを、３カラム容量の30mM酢酸塩、pH4.5で洗浄し、そして30mM酢酸塩、pH4.5中の100mM〜400mMNaClで行う直線的12カラム容量グラジエントで溶出する。精製した短縮型sTNFR-1画分をプールし、そしてNaOHでpH5.0に調節する。
【０２７１】
Ｃ．PEG化：
１．sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)の調製
50mM酢酸ナトリウム、pH4中のsTNFR-2.6D/N105（3.5mg/ml）の冷却した（４℃）撹拌した溶液に、３倍モル過剰のt-BuPEG（モノ-t-ブトキシ-ポリエチレングリコール、平均MW＝33kDa、ShearwaterPolymers, Inc.）を添加する。NaCNBH３を添加して、20mMの最終濃度にし、そして反応混合物を７℃にて18〜24時間撹拌する。
【０２７２】
反応の経過中のタンパク質改変の程度を、0.7ml/分にて0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液 pH6.9、0.5M NaCl、および10％エタノールで溶出するTSKG3000swＸＬカラム（TosoHaas, Montgomeryville, PA）を使用するSEC HPLC（Toso Haas, Montgomeryville, PA）によってモニターする。
【０２７３】
反応混合物のpHを、1MHClで約3.5に調節し、そして反応混合物を水で希釈して、1.5mg/mlの最終タンパク質濃度にする。
【０２７４】
sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)を、SP Sepharose HP 16/10ＴＭイオン交換クロマトグラフィー（PharmaciaBiotech, Inc., Piscataway, NJ）を使用することによって、過剰のt-BuPEGおよび他の反応副産物から分離する。
【０２７５】
反応混合物を、カラム上にロードし、そして未反応t-BuPEGを、３カラム容量の開始の緩衝液Ａ（20mM酢酸ナトリウム、pH4.0）で溶出する。sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)を、０〜30％緩衝液Ｂ（20mM酢酸塩、pH4.0中の1M NaCl）の直線的20カラム容量グラジエントを使用して溶出する。溶出物を280nmでモニターする。sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)を含む各画分を、４〜20％プレキャストしたグラジエントゲル（Novex, San Diego, CA）を使用してSDS-PAGEによって分析する。SDS-PAGE分析結果に基づいて、画分をプールし、濃縮し、そして滅菌濾過する。精製したsTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)の各最終プールを、SDS-PAGEおよびSEC HPLCによって再度分析する。このタンパク質を、10mMリン酸ナトリウム、pH6.5および20mMNaCl中に処方する。
【０２７６】
２．sTNFR-I2.6D/N105-33kDa(MePEG)の調製
sTNFR-2.6D/N105（4mg/ml）の冷却した（７℃）撹拌した溶液に、pHが5.0になるまで10％酢酸を添加する。この溶液に、15mMNaCNBH３および２倍モル過剰のt-ブトキシPEG（t-ブトキシポリエチレングリコール、平均MW＝33kDa、ShearwaterPolymers, Inc.）を添加する。反応混合物を、同じ温度で簡単に撹拌し、次いで約18時間インキュベートする。
【０２７７】
18時間後、反応混合物中のタンパク質濃度を、クエン酸でpH3.0に調節する。
【０２７８】
sTNFR-I2.6D/N105-MePEG(33kDa)を、SP Sepharose HPＴＭカラム（Pharmacia Biotech,Inc., Piscataway, NJ）を使用するイオン交換クロマトグラフィーによって、過剰のMePEGおよび他の反応副産物から分離する。
【０２７９】
反応混合物を、カラム上にロードし（8mg/ml樹脂を越えない）、そして未反応MePEGを、３カラム容量の開始の緩衝液Ａ（20mMクエン酸ナトリウム、pH3.0）で溶出する。sTNFR-I2.6D/N105-MePEG(33kDa)を、20mMクエン酸塩、pH3.0中の0.1〜0.5M NaClの直線的な16カラム容量グラジエントを使用して溶出する。溶出物を280nmでモニターする。sTNFR-I2.6D/N105-MePEG(33kDa)を含む各画分を、４〜20％プレキャストしたグラジエントゲル（Novex, San Diego, CA）を使用してSDS-PAGEによって分析する。SDS-PAGE分析結果に基づいて、画分をプールし、濃縮し、そして滅菌濾過する。精製したsTNFR-I2.6D/N105-MePEG(33kDa)の各最終プールを、SDS-PAGEによって再度分析する。精製したsTNFR-I2.6D/N105-MePEG(33kDa)を５〜20mg/mLに濃縮し、そしてPBS、pH6.5（10mMリン酸ナトリウム、35〜100mM NaCl）または20mM酢酸塩、100mMNaCl、pH5.0のいずれか中に処方する。
【０２８０】
３．sTNFR-I2.6D/N105-MePEG(20kDa)の調製
sTNFR-I2.6D/N105-MePEG(33kDa)の調製のための工程Ａの手順を、MePEG（モノ-メトキシ-ポリエチレングリコール、平均MW＝20kDa、ShearwaterPolymers, Inc.）を、MePEG（モノ-メトキシ-ポリエチレングリコール、平均MW＝33kDa、Shearwater Polymers, Inc.）に置換することを除いて、実質的に繰り返す。このタンパク質を、10mMリン酸ナトリウム、pH6.5および20mMNaCl中に処方する。
【０２８１】
４．追加の結合体の調製
sTNFR-2.6D/N105の追加の結合体を、以下のタイプのPEGアルデヒド（ShearwaterPolymers, Inc.）を使用することを除いて、実質的にsTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa)のように調製する：
直線状単官能性−  MW 5kDa、6kDa、および57kDa；
分枝状単官能性−  MW 10kDa、20kDa、および40kDa；
直線状二官能性−  MW 8kDaおよび20kDa；
分枝状三官能性−  MW 10kDa。
これらのタンパク質を、10mMリン酸ナトリウム、pH6.5および20mM NaCl中に処方する。
【０２８２】
５．代わりのPEG化方法
代わりの実施態様では、短縮型sTNFR-1分子は、以下の技法によってPEG化および精製され得る：
SP-HP溶出物（pH5.0に調節した３〜５mg/mL）を、１モルのsTNFR-I2.6D/N105当たり２モルのポリエチレングリコール（例えば、MePEGまたはt-BuPEG）（１グラムのsTNFR-I 2.6D/N105当たり約５グラムのt-BuPEG）と反応させる。ポリエチレングリコールの溶解後、10〜20mMシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、そして溶液を７〜15℃にて一晩インキュベートする。PEG化反応の最後に（約18時間）、反応を、10mMグリシンを添加することによって停止する。
【０２８３】
PEG化混合物を、必要であればpH4.0に調節した、４容量の50mM酢酸塩、pH4.0で希釈し、そして50mM酢酸塩、pH4.0で平衡化されているSP-HPカラム上にロードする。カラムに、ベッド容量１リットル当たり約８グラムを越えないsTNFR-2.6D/N105をロードする。ローディング後、カラムを３カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄し、そして50mM酢酸塩、pH4.0中の直線的０〜0.3MNaClグラジエントで溶出する。sTNFR-2.6D/N105-30kDaモノPEG化画分を集め、pH5.0に調節し、濃縮し、そして等張処方緩衝液にダイアフィルター(diafilter)する。すべての精製工程を室温にて行う。タンパク質を、PBS、pH6.5（10mMリン酸ナトリウム、35〜100mMNaCl）または20mM酢酸塩、100mM NaCl、pH5.0のいずれかに処方する。
【０２８４】
６．sTNFR-I2.6D/C105ダンベルおよびsTNFR-I 2.6D/C106ダンベルの調製
スルホン活性化ポリエチレングリコール（1995年6月7日に出願された米国特許出願第08/473,809号および1996年3月6日に出願された米国特許出願第08/611,918号に実質的に従って調製および精製される）［PEG-20,000-bis-ビニルスルホン］を使用して、還元および反応条件を除いて、PCT公開公報第WO95/34326号に記載の方法に実質的に従って、タンパク質をダイマー化する。タンパク質を、ポリエチレングリコールの付加の前に、５〜６℃、pH7.6でタンパク質１モル当たり４モルのDTTで還元する。すべての反応を、30％グリセロールの存在下で行う。ダイマー化したタンパク質を、sTNFR-I2.6D/C105dbおよびsTNFR-I 2.6D/C106dbと呼ぶ。各タンパク質を、PBS、pH6.5（10mMリン酸ナトリウム、35〜100mMNaCl）または20mM酢酸塩、100mM NaCl、pH5.0のいずれかに処方する。
【０２８５】
７．比較用sTNFR-I分子の調製
(i)．sTNFR-I4D/N105を、EP 422339に記載のように調製する。sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kda)を、sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)のPEG化についての上記の手順に実質的に従ってsTNFR-I 4D/N105をPEG化することによって調製する。sTNFR-I4D/N105-t-MePEG(33kda)を、sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa)のPEG化についての上記の手順に実質的に従ってsTNFR-I4D/N105をPEG化することによって調製する。sTNFR-I 4D/C105およびsTNFR-I 4D/C105dbを、PCT公開公報第WO95/34326号に記載のように調製する。このタンパク質を、10mMリン酸ナトリウム、pH6.5および20mM NaCl中に処方する。
【０２８６】
(ii)．sTNFR-I4D/C105-33kDa(MePEG)を、反応がsTNFR-Iの１モル当たり1.3モルのDTTとpH7.5にて約５〜６時間起こり、次いでSP-SepharoseＴＭFFカラムでのDTTの除去およびタンパク質１モル当たり1.5〜3モルのPEGとの少なくとも15時間室温でのPEG化を行うことを除いて、sTNFR-I2.6D/C105-33kDa(MePEG)のPEG化についての上記の手順に実質的に従って、4D/C105をPEG化することによって調製する。このタンパク質を、PBS、pH6.5（10mMリン酸ナトリウム、35〜100mMNaCl）または20mM酢酸塩、100mM NaCl、pH5.0のいずれかに処方する。
【０２８７】
(iii)．sTNFR-I3D/N105（sTNFR-I 4D/N105のＣ末端34アミノ酸の短縮）を、以下のように調製する。PCR増幅を、テンプレートとしてsTNFR-I4D/N105、ならびにそれぞれNdeIおよびHindIIIをコードするOLIGO#13およびOLIGO#14を使用して行い、そしてそれぞれ短縮型遺伝子の5'および3'末端にアニールする。PCR増幅を、25サイクルについて行う：各サイクルは、94℃にて30秒の変性、60℃にて15秒のアニーリング、および72℃にて１分の伸長からなる［Model2400熱サイクラー（Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT）］。PCR産物を、QIAquickＴＭ PCRPurification Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA)を使用して精製する。精製したPCR産物を、NdeIおよびHindIIIで切断し、次いでQIAquickＴＭGel Extraction Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA)を使用してゲル精製する。ゲル単離したPCR産物を、pAMG11に連結し、そしてFM15E. coli細胞に形質転換する。
【０２８８】
5' OLIGO#13：（配列番号80）
5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3' OLIGO#14：（配列番号81）
5'-CCCAAGCTTTTAGGTGCACACGGTGTTCTGTTT-3'
このタンパク質を、10mMリン酸ナトリウム、pH6.5および20mM NaCl中に処方する。
【０２８９】
(iv)．sTNFR-I3D/C105（sTNFR-I 4D/C105のＣ末端34アミノ酸の短縮）を、テンプレートがsTNFR-I 4D/C105であることを除いて、sTNFR-I3D/N105と実質的に同様に調製する。sTNFR-I 3D/C105を、PBS、pH6.5（10mMリン酸ナトリウム、35〜100mM NaCl）または20mM酢酸塩、100mMNaCl、pH5.0のいずれかに処方する。
【０２９０】
(v)．sTNFR-I3D/C105dbを、sTNFR-I 4D/C105の代わりにsTNFR-I 3D/C105を開始物質として使用することを除いて、sTNFR-I4D/C105dbと実質的に同様に調製する。sTNFR-I 3D/C105dbを、PBS、pH6.5（10mMリン酸ナトリウム、35〜100mM NaCl）または20mM酢酸塩、100mMNaCl、pH5.0のいずれかに処方する。
【０２９１】
実施例II
種々の形態の短縮型組換え可溶性TNFR-Iを、それらがTNF活性を阻害する能力について評価する。
【０２９２】
Ａ．WEHI細胞傷害性アッセイ：
WEHIアッセイは、インビトロ細胞増殖アッセイである（Edwardsら(1991), Endocrinology, 128:989-996）。細胞株は、TNF-αに感受性である（すなわち、TNF-αは細胞傷害性である）。TNF-αインヒビターの存在下では、細胞は、細胞傷害効果から防御され、したがって増殖し得る。
【０２９３】
プロトコル：
TNF感受性WEHI164クローン13細胞（ATCC, Rockville, MD）を、５％ウシ胎児血清（Hyclone, Ogden, UT）およびペニシリン 50U/mL：ストレプトマイシン50mg/mLを補充したRPMI（Gibco, Grand Island, NY）培地中、20×10４細胞/mLの濃度で懸濁する。この細胞懸濁液の100μLを、平底96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにいれ、そして細胞を５％CO２中37℃にて４〜６時間接着させる。各ウェルに、10μLの0.0060mg/mLアクチノマイシン-D（SigmaChemical Co., St. Louis, MO）を添加する。50ng/mlで10μLの組換えヒトTNFα（5ng/mlの最終濃度）を、各ウェルに添加する。連続希釈した２倍濃度の種々のsTNFR形態（sTNFR-I2.6D/C106、sTNFR-I 4D/C105、およびsTNFR-I 4D/C105db）をPBSで希釈し、次いで組換えヒトTNF-αの添加後に、接着WEHI164細胞を含む２組のウェル（10μL/ウェル）に添加する。WEHI-164クローン13細胞を、５％CO２中で37℃にて18時間インキュベートする。インキュベーション後、有機染料MTTテトラゾリウム（3-[4,5-ジメチルチオゾール-2-イル]2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド；SigmaChemical Co., St. Louis, MO）の2mg/mLの10mLを添加し、そして細胞をさらに４〜６時間インキュベートする。細胞を、50μLDMF/SDS溶液（20％SDSおよび50％N,Nジメチルホルムアミド、pH4.7）の添加によって溶解する。すべてのMTT結晶が溶解するまで、DMF/SDS溶液を数回ピペットで上下させ、そして細胞をさらに２〜22時間インキュベートする。吸光度（abs）を570でのVmaxリーダーで読む。特異的細胞傷害性のパーセントを、以下の式を使用して光学密度から算出する：％特異的細胞傷害性＝100％×［abs（細胞＋培地）−abs（細胞＋試料）］／abs（細胞＋培地）−abs（細胞＋TX−100）］。各試料中のTNFのユニットの数を、既に記載のように、マウス標準の特異的細胞傷害性のパーセントを使用して決定する。
WEHIアッセイ結果を、以下の表２にまとめる：
表２：WEHIアッセイにおけるインビトロ活性
化合物 IC50（ng/mL)
sTNFR-12.6D/C106                  208
sTNFR-14D/C105                    238
sTNFR-14D/C105db                  N/A
WEHIアッセイの結果に基づいて、インビトロバイオ効率の点で、sTNFR-I2.6D/C106とsTNFR-I 4D/C105との間の顕著な差はない。
【０２９４】
Ｂ．L929細胞傷害性アッセイ：
L929細胞傷害性アッセイは、TNF-α-感受性殺傷の細胞傷害性も評価するインビトロ細胞増殖アッセイである（Parmelyら(1993), J. Immunol., 151:389-396）。細胞株はTNF-αに感受性である（すなわち、TNF-αは細胞傷害性である）。可溶性TNF-αインヒビターの存在下、細胞は細胞傷害性効果から防御され、したがって増殖し得る。
【０２９５】
プロトコル：
L929細胞株を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（カタログ番号CCL1, NCTC クローン929, L株のクローン, 結合組織, マウス)から得る。増殖に使用される培地は、10％FBS＋１％L-グルタミン溶液＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液を補充したRPMIMedium 1640である。
【０２９６】
96-ウェルマイクロタイタープレート（Corning）をアッセイで使用し、そして内側の60ウェルのみを利用する。標準および試験試料を、同じプレート上で３つ組で試験する。
【０２９７】
アッセイで使用されるTNFαは、R&D Systems (Minneapolis, MN)からである。アッセイで使用されるTNFαの最終濃度は、すべてのアッセイウェルで1ng/mLである。
【０２９８】
アッセイ希釈剤は、L929増殖培地、10ng/mLのTNFα、および10μg/mLのアクチンマイシンD（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）。
【０２９９】
プレートを、XTT/MEN溶液（1.5mg/mLXTT＋75mM MEN）を使用して採取する。
【０３００】
１日目に、細胞をアッセイプレートにプレートする。細胞懸濁液をトリプシン処理し、そして3.33×10４細胞/mLで細胞を再懸濁することによって調製する。この細胞懸濁液の180mLを、アッセイプレートの内側の60ウェルのそれぞれに入れる。200mLの増殖培地を、アッセイにおけるエバポレーションアーチファクトを避けることを助けるために、外側の36ウェルに分散する。プレートを、ホイルでカバーして通気をなくし、約１時間室温に放置する。アッセイプレートを、37±2℃高湿度5±1％CO２インキュベーター中に置く。プレートを、sTNFR-I連続希釈の添加前に約20〜22時間インキュベートする。
【０３０１】
２日目、sTNFR-I4D/N105標準および試験試料を調製する：希釈sTNFR-I 4D/N105標準、および約2.0mg/mLの濃度までの試験試料（または別の適切な濃度）。０ng/mL（アッセイ希釈のみ）点を含む、約1.0×10６ng/mL〜1.0×10−３ng/mLの範囲の10点の希釈曲線を得るために、この濃度の連続希釈を作成する。他の濃度が適切であるならば、それらが使用され得る。各アッセイプレートに三連で1000μLの各希釈を添加する。連続希釈アリコートをアッセイプレートに移した後、37±2℃高湿度5±1％CO２インキュベーター中で20±1時間プレートをインキュベートする。
【０３０２】
３日目、50μL/ウェルのXTT/MEN溶液を、アッセイプレートの内側の60ウェルに添加する。プレートを、37±2℃高湿度5±1％CO２インキュベーター（Falcon,New York, New York）中で24±0.5時間インキュベートする。
【０３０３】
４日目、アッセイプレートの光学密度（O.D.）を、ELISAプレートリーダー（SpectraMAX, Beckman Instruments, Inc.,Fullerton, CA）で450nm−（マイナス）650nmで読む。4.000 ODの値が、これらの波長でプレート中のウェルについて得られるならば、プレートは、490nm−650nmですぐに再読されるべきであり、そして490nm−650nmデータが、計算に使用されるべきである。
【０３０４】
標準用量−応答曲線対対数を、４パラメータロジスティック曲線適合を使用して作成する。標準曲線から算出される未知試料の元の濃度を算出し、そして標準についてのED５０および標準曲線適合についての相関係数を算出する。
【０３０５】
結果：
L929細胞傷害性アッセイ結果を以下の表３にまとめる：
表３：L929細胞傷害性アッセイにおけるインビトロ活性
化合物 濃度(mg/mL) ED５０(ng/mL)
sTNFR-I4D/C105db                        7.8              1.0±0.1
sTNFR-I2.6D/C105db                      2.6              1.1±0.0
sTNFR-I2.6D/C106db                      2.2              1.0±0.1
sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG833kDa)           2.0            229.2±8
sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG833kDa)           1.1            325.5±147
sTNFR-I2.6D/C105-t-BuPEG833kDa)         1.7            210.2±9
内部標準：
sTNFR-I 4D/C105                          3.5            314.8±188.1
データは、sTNFR-I4D/C105dbならびにsTNFR-I 2.6D/C105dbおよびsTNFR-I 2.6D/C106dbが、活性であり、そして標準と比較した場合かなり用量応答を有することを示す。データはまた、sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)およびsTNFR-I 2.6D/C105-t-BuPEG(33kDa)が、活性でほぼ２対数低いが、それにも関わらず、sTNFR-I4D/C105dbと比較した場合、このアッセイで活性であることを示す。
【０３０６】
実行#2：
sTNFR-I3D/C105db                0.2                  2.27±0.3
sTNFR-I3D/C105db                0.2                  2.0＊
sTNFR-I3D/C105db                1.9                  1.8＊
sTNFR-I 3D/N105                  2.4                413.3＊
内部標準：
sTNFR-I 4D/C105                  3.5                  115.9±42.1
＊単一データ点
これらのデータは、sTNFR-I 3D/C105dbが活性であり、そしてED５０値が、sTNFR-I 4D/C105db（実行#1）、sTNFR-I2.6D/C105db（実行#1）、およびsTNFR-I 2.6D/C106db（実行#1）の範囲にあることを示す。データはまた、sTNFR-I3D/N105が、sTNFR-I 4D/C105内部標準よりも活性でないことを示す。
【０３０７】
Ｃ．Streptococcus細胞壁誘導した再活性化モデル：
ラットアッセイにおける関節炎のStreptococcus細胞壁誘導した再活性化モデルを、公知のプロトコルを使用して完成する（Esserら (1985), ArthritisAnd Rheumatism, 28:1402-1411およびMakarovら (1996), Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 93:402-406）。
【０３０８】
プロトコル：
それぞれ175〜185グラムの体重の雌Lewisラット（CharlesRiver Laboratories, Inc., Wilmington, MA）に、ペプチドグリカン−ポリサッカライド（SCW）（LeeLaboratory, Grayson, GA）を含むstreptococcusの細胞壁産物の滅菌懸濁液を、関節当たり1.5mg/10mgの用量で、右足首関節に関節内注射する。生理食塩水を、コントロールを提供するために反対側の関節に注射する。SCWの関節内注射は、注射の１〜２日後にピークとなる関節の腫脹を伴う比較的短期の急性関節炎を生じる。急性炎症反応が消散した20日の期間の後、SCWを、ラット当たり200mg/200mLの用量で静脈内注射によって再度投与する。SCWの２回目の投与は、SCWを既に注射された足首関節において炎症を再活性化するために十分であり、そして生理食塩水注射した足首にほとんど効果がない。SCWの静脈内注射後の72時間の期間中に炎症の程度を評価するために、足首関節の大きさを、関節炎の再活性化の後の０、24、36、48、および72時間に、後側足首の足首カリパス測定次いで組織学（例えば、炎症、パンヌス形成、軟骨傷害、および骨傷害）について反対の後側足採取によって測定する。
【０３０９】
結果：
投与した場合のsTNFR-I2.6D/C106dbの効果を、関節炎の再活性化中の関節腫脹の発達について試験する。インヒビターおよびビヒクルを、SCWでの再活性化24時間前に単回静脈内注射でそれぞれ投与する。
【０３１０】
sTNFR-I2.6D/C106dbは、再活性化後２および３日目にすべて４用量でならびに１日目に１用量（1.5mg/kg）を除くすべての用量において、分散（ANOVA）フィッシャーポスト-ホック試験（Statview(R)）の分析によって、関節腫脹を減少する統計学的に有意な効能を証明する。腫脹のこの減少は、再活性化の１日前に始まり再活性化の３日後までの毎日0.5mg/kgの用量（すなわち、8.8nM）で与えられるsTNFR-I4D/C105dbの陽性コントロールに匹敵する。sTNFRはまた、腫脹の量が全体として３日を越えると考えられる場合、有意な効能を示す。曲線下面積（AUC）は、すべての用量で用量−応答相関関係を示す（例えば、図９を参照のこと、ここでsTNFR-I2.6D/C106dbは「sTNFR-I 2.6D」といい、そしてsTNFR-I 4D/C105dbは「sTNFR-I 4D」という）。
【０３１１】
sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)は、モデルの中で疾患コントロール群と比較した場合、足首幅および組織学的指標の顕著な減少を示す。
【０３１２】
Ｄ．D-ガラクトサミン／リポポリサッカライドモデル：
D-ガラクトサミン（D-GalNH２）/リポポリサッカライド（LPS）モデル（Parmelyら(1993), 前出）は、致死率のインビボの非常にTNF-α-依存的動物モデルである。さらに、MRL-lpr/lpr自己免疫マウスは、LPS-またはSEB-誘導されたTNF-αに非常に感受性であることが示されている（Mountzら(1995), J. Immunol., 155:4829-4837）。
【０３１３】
プロトコル：
一晩の絶食後、６〜８週齢の雌MRL-lpr/lprマウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）に、以下の薬理学的試薬でI.P.投与する：Hank's平衡化塩溶液(Gibco Laboratories, Inc., Grand Island, NY)に懸濁した25mgのD-GalNH２(SigmaChemical Co., St. Louis,MO)(50mg/mL)；および滅菌のエンドトキシンを含まないリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）(25mg/マウス)中のE.coli血清型0127:B8（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)または正常生理食塩水中のSEB（ToxinTechnologies, Sarasota, FL) (50mg/マウス)からのリポポリサッカライド（LPS）。種々の形態のsTNFRを、MacIntosh（Statview(R),Mountain View, CA）用の統計学的ソフトウエアで生成したED５０曲線を得るために、連続２倍希釈（mg/kg投与量）で投与する。致死率は、投与後＋48時間まで続く。
【０３１４】
結果：
以下の表４に示すように、sTNFR-I 2.6D/C106dbが上記のようにLPS/DGalNH２投与の１時間前に投与される場合、48時間でのED５０（すなわち、50％防御に必要なsTNFR-I2.6D/C106dbの用量）は、約50μg/kgである（N=8 個々のマウス）。sTNFR-I 4D/C105dbとの比較では、この形態が致死率を抑制する能力に有意な（P＞0.05）差はない（ED５０＝約50μg/kg；N=8 個々のマウス）。
【０３１５】
表４：LPS/D-GalNH２モデルでのsTNFRと最適にした短縮型sTNFR形態との比較
薬剤 ED１００ ED５０
sTNFR-I4D/C105db                      約100μg/kg          約50μg/kg
sTNFR-I2.6D/C106db                    約100μg/kg          約50μg/kg
sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)         約2mg/kg         約400μg/kg
sTNFR-I2.6D/N105-MePEG(20kDa)       約800〜1000μg/kg       約１mg/kg
sTNFR-I2.6D/N105-MePEG(20kDa 分枝)         ２mg/kg       約１〜1.5mg/kg
sTNFR-I2.6D/N105-MePEG(40kDa 分枝)         1.5mg/kg            約１mg/kg
データは、sTNFR-I2.6D/C106dbが、sTNFR-I 4D/C105dbと比較して等しい活性を有するが、sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)は、約400μg/kgのED５０（n=5個々のマウス）を有するこのモデルではあまり活性でないことを示す。さらに、sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20kDa分枝)およびsTNFR-I2.6D/N105-MePEG(40kDa分枝)の活性は、このモデルであまり活性ではない。
【０３１６】
Ｅ．アジュバント誘導関節炎モデル：
アジュバントによって、ラットにおいて誘導されるリウマチ様関節炎は、ヒトリウマチ様関節炎と多くの類似点を有する。この実験の目的は、短縮型sTNFRの全身投与が、マウスにおけるアジュバント誘導関節炎の病理において緩和作用を有することを証明することである。
【０３１７】
プロトコル：
少なくとも200gの体重の雄Lewisラット（５〜７/群）（CharlesRiver Laboratories, Inc., Wilmington, MA）にSQカテーテルをカニュレーションし、そして数日間回復させる。次いで、これらを注入ケージに入れ、そして生理食塩水注入を開始する前１週間順応させる。
【０３１８】
０日目に、すべてのラットに、合成アジュバント、N,N-ジオクチルデシルデシル-N',N-ビス(2-ヒドロキシエチル)プロパンジアミン、50mg/mlが添加される100μlのフロイント完全アジュバント（SigmaChemical Co., St. Louis, MO）を注射する。８日目に、種々の群のラットに、sTNFR-I 4D/C105およびsTNFR-I2.6D/N105の連続SQ注入によって投与する。
【０３１９】
結果を表５に記載する。
【０３２０】
【表５】
2009280612.tif 000003
驚くべきことに、sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)およびsTNFR-I 4D/C105dbは、Lewisラットにおけるアジュバント関節炎にかなり抗関節炎活性であるが、sTNFR-I4D/C105dbは、WEHI-164およびL929インビトロ細胞傷害性アッセイならびにLPS/GalNモデルにおいてより強力である。
【０３２１】
Ｆ．コラーゲン誘導関節炎モデル：
ラットにおけるII型コラーゲン誘導関節炎は、ヒト慢性関節リウマチに多くの類似点を有する。この実験の目的は、短縮型sTNFRの全身投与が、ラットおよびマウスにおけるII型コラーゲン誘導関節炎の病理を緩和する効果を有することを証明することである。
【０３２２】
ラットプロトコル：
雌Lewisラット（CharlesRiver Laboratories, Inc., Wilmington, MA）にSQカニューレを移植し、そして連続注入のためのテザリング（tethering）に順応させる。続いて、フロイント不完全アジュバント中のウシII型コラーゲンで免疫する。免疫後13、14、または15日目に、樹立した関節炎を有する動物を、各８動物の群にランダムに分ける。実験群に、７日間、表６に記載のように、ビヒクルまたは種々の用量のsTNFR-Iを注入する。足炎症を、足首関節の毎日のカリパス測定によって評価する。７日目に、動物を安楽死させ、そして足を、炎症のインデックスとしての重量決定のために集める。足首および膝関節を、関節炎パラメータの組織病理学的評価のために集める。
【０３２３】
結果を表６Ａに記載する。
【０３２４】
【表６Ａ】
2009280612.tif 000004
興味深いことに、ラット樹立コラーゲンモデルでは、すべての処置群は、効能がほぼ同じである（例えば、曲線形状、30〜59％の範囲の曲線下面積（AUC）の阻害パーセント(%)、および40〜64％の範囲の足重量阻害）。処置をしない群は、関節炎のこのモデルにおいて他とは統計学的に異なる。
【０３２５】
マウスプロトコル：
雄DBA/1（JacksonLaboratories, Inc., Bar Harbor, ME）を、フロイント不完全アジュバント中のウシII型コラーゲン（Sigma ChemicalCo., St. Louis, MO）で免疫する。免疫後24、25、および26日目に、樹立した関節炎を有する動物を、各８動物の群にランダムに分ける。実験群に、連続する３日間（＋27、＋28、＋29日）、生理食塩水またはsTNFR-I2.6D/N105-MePEG(33kDa)のいずれかを、IP経路によって１日２回投与する。足炎症を、足首関節の毎日のカリパス測定によって評価する。＋34日目に、動物を安楽死させ、そして炎症のインデックスとしての重量の決定のために足を集める。足首および膝関節を、関節炎パラメータの組織病理学的評価のために集める。
【０３２６】
結果を表６Ｂに記載する。
【０３２７】
【表６Ｂ】
2009280612.tif 000005
Ｇ．LPS-誘導TNF-α産生の連続注入ラットモデル：
sTNFR-I2.6D/C105dbおよびsTNFR-I 2.6D/C106db、sTNFR-I 2.6D/N105およびsTNFR-I 4D/N105を、48時間連続注入（１mg/kg）のために、製造者の指示に従って、AlzetＴＭミニポンプ（AlzaCorp., Palo Alto, CA）で、IV頚部移植する。ELISA（Genzyme, Cambridge, MA）によって測定された血清TNF-αレベルは、高用量LPSチャレンジの＋２時間後にコントロールと比較して著しく減少する。
【０３２８】
実施例III：免疫原性研究
種々の形態の短縮型組換え可溶性TNFR-Iを、いくつかの動物モデルにおける免疫原性について評価する。
【０３２９】
Ａ．齧歯類：
sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)およびsTNFR-I 4D/C105db（コントロール）を、雌Sprague Dawleyラット（CharlesRivers Labs, Wilmington, MA）(n＝6〜8/群）に対する実験の１および５日目に皮下投与する（4mg/kg）。後眼窩血液試料を、最初の投与の21日後まで毎週集める。試料を、IgMおよびIgG抗体産生について評価する。
【０３３０】
【表７】
2009280612.tif 000006
表７に見られるように、＋１日目および＋５日目に皮下（SC）投与されたsTNFR-I 4D/C105dbは、あるとしても非常に弱い抗体力価を有するsTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)よりも、＋21日までの間、より高いラット抗sTNFR-IIgG抗体力価を記録する。＋21日を通してラット抗sTNFR-I IgM抗体を発現するラットで、免疫原性において類似の傾向も観察される。sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)は、＋21日までの間はラット抗sTNFR-I IgM抗体を生じない。
【０３３１】
Ｂ．Papioanubis：
研究の第１部、Ａ相の目的は、健常ヒヒに21日あけて２回IV投与した場合に、sTNFR-I 4D/C105db（0.2mg/kg体重［BW］）、sTNFR-I3D/C105db（0.2mg/kg BW）、またはsTNFR-I 2.6D/C105db（0.2mg/kg BW）それぞれのいずれかのファーマコキネティクスおよび免疫原性を決定することである。
【０３３２】
第１部の研究は、２つの相に分かれる。第１部、Ａ相は、２つの注射に応じて健常ヒヒにおいて異なるsTNFR-I構築物のファーマコキネティクスおよび免疫原性を決定することに関する。12匹のヒヒを３群に分ける。麻酔と同時に、各群に、sTNFR-I4D/C105db、sTNFR-I 3D/C105db、またはsTNFR-I 2.6D/C105dbのいずれかの0.2mg/kg BWを投与する。３匹のヒヒを各期間研究する。動物を21日間追跡し、次いでタンパク質の第２の同一のIV注射を投与し、そしてさらに21日間研究する。ファーマコキネティクスおよび免疫原性を、その後に間隔をおいて決定する。
【０３３３】
研究の第１部、Ｂ相は、TNFα媒介致死率の十分に樹立されたモデル（Espatら, J. Surg. Res., 59:153-158,1995）におけるこれらの調製物の効能を評価することに関する。致死的E. coli菌血症を、５〜10×10１０cfu/kgの生E.coliの投与によって、４つの群の16動物で誘導する。プラセボ群を、sTNFR-I 4D/C105db（0.2mg/kg体重［BW］）、sTNFR-I3D/C105db（0.2mg/kg BW）、または１mg/kg BWで投与されたsTNFR-I 2.6D/C105dbのいずれかでIV前処置されたヒヒと比較する。
【０３３４】
第１部の研究の両方の相において、若い成熟雄および雌ヒヒPapio anubis（6〜11kg）（Biomedical ResearchFoundation, San Antonio, TX）を一晩絶食させる。動物をケタミン（10mg/kg、i.m.）で麻酔をかけ、そして頭部静脈を経皮的にカニューレ挿入する。麻酔を、35mg/kgまでのペントバルビタールナトリウムの最初の投与、次いで３〜５mg/kg/時間のペントバルビタールナトリウムの反復注射によって維持する。上方の気道を、折り返しした気管内チューブの配置によって確保し、そして動物は自発呼吸を維持する。カテーテルを、大腿動脈中に経皮的に配置し、これは繰り返しの全身的動脈血サンプリング、ならびにDatascope2000麻酔モニター（Datascope, San Antonio, TX）心臓モニターによって心拍数および平均動脈血圧の連続的モニタリングを可能にする。動脈血試料を、時々採取し、EDTAまたはヘパリンで抗凝固し、そして採血後すぐに氷で冷却する。血漿画分を、４℃での遠心分離によって分離し、そしてアッセイするまで−70℃で保存する。中心温度を、直腸プローブによってモニターする。内在Foleyタイプ泌尿器カテーテルを、尿採取を可能にするためにおよび尿産出およびクレアチニンクリアランスをモニターするために配置する。血液動力学的パラメータを、15分毎にモニターする。すべての動物に、維持静脈内液として0.9％塩化ナトリウム（4ml/kg）を投与する。Ｂ相研究では、以下の生理学的基準の２つが適合するならば、動物にさらなる液体（15分毎に10ml/kg）を投与する：1)平均動脈圧が30％を超えて下がる；2)心拍数が30％を超えて増加する；および3)尿産出が＜1ml/kg/時間に下がる。ベースライン血液サンプリングおよび平衡化させるための少なくとも１時間の待機期間の後、タンパク質の注入を開始する。
【０３３５】
研究の第１部Ａ相では、組換えタンパク質を、頭部静脈を介して注入し、そしてすべてのカテーテルを取り出した後８時間動物を観察し、そして動物を21日間ケージに戻す。24および48時間ならびに３、５、８、11、16、および21日に、動物を、IMケタミン（10mg/kg）で短時間麻酔し、そして静脈血試料を得る。21日目に、動物を再麻酔し、タンパク質の２回目の注射をし、そして０日目に行った完全な手順をさらに21日間繰り返し、そのとき動物を安楽死させる。
【０３３６】
第１部Ｂ相研究では、E. coliの注入の１時間前、４匹の動物を、プラセボまたは上記の構築物の１つのいずれかを投与するために、ランダムに割り当てる。すべてのカテーテルを取り出した８時間の期間動物を観察し、動物をケージに戻し、そして致死に対するその後の生存；菌血症を観察する。過度の不快にある動物を安楽死させる。過度の不快を、IACUCによって定義する：1)過去12時間にわたり座位または立位を維持できない、2)過去12時間内に食餌または水を摂取できない、3)カテーテル部位からの制御できない出血、または4)外部刺激に対する非応答性。静脈血試料を、-1、0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、24時間、48時間、ならびに3、5、8、11、16、および21日目に得る。21日目に、生存している動物を安楽死させる。
【０３３７】
投与された組換えタンパク質に対するPapio抗体の存在を、サンドイッチELISAによって決定する。非常に簡単には、sTNFR-1構築物を、ELISAプレート上にコーティングし（1μg/ml）、そして希釈したヒヒ血漿（1:50〜1:100,000）（100μL）を添加する。試料を洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合したプロテインＡを添加し（0.5μg/ml）、そしてアッセイをTMBで可視化する。
【０３３８】
結果（第I部）：
血漿半減期は、３つの構築物間で著しく異なった。消失曲線を、モデル非依存的方法を使用して決定し、そして見かけの半減期を、一般的に８〜172時間の間で評価する。未処置の動物では、血漿半減期は、4.0ドメイン構築物で処置したヒヒで最長であり（29時間）、そしてsTNFR-I3D/C105db（24.7時間）およびsTNFR-I 2.6D/C105db（21.5時間）で処置したヒヒで続いて減少する。差は、統計学的には有意であるが、ほんの26％である。
【０３３９】
予期できないことに、それぞれのヒヒに対するタンパク質の第２の投与後、血漿半減期は非常に短くなる傾向があり、これはより迅速なクリアランスを示す。半減期のこの減少は、48％短くなる（ｐ＜0.01）sTNFR-I 4D/C105dbを投与されているヒヒにおいて最も明らかである［図10］。半減期の減少は、sTNFR-I3D/C105dbで処置したヒヒにおいて中間であり（31％）［図11］、そしてsTNFR-I 2.6D/C105dbを投与した動物において最小である（14％）［図12］。半減期の減少は、sTNFR-I2.6D/C105dbで処置したヒヒにおいて統計学的に差はない。
【０３４０】
調製物はすべてヒヒにおいて免疫原性である。しかし、免疫原性の頻度は、sTNFR-I 4D/C105dbで処置したヒヒで最大であり、sTNFR-I 3D/C105dbで処置した動物で中間であり、そしてsTNFR-I2.6D/C105dbを投与した動物で最低である（表８）。
【０３４１】
【表８】
2009280612.tif 000007
１対数スケール（サンドイッチELISAにおける最大吸収の半分を生成するために必要な血漿の逆希釈；実験方法を参照のこと）
＊ｐ＝0.056、Kruskal-Wallis 二方向 ANOVAによる（対数変換値は正常性の試験には不足である）
抗体応答は、一般的には、構築物の投与後約８日目に発現し、そして21日の研究期間を押して存在する。さらに、抗体応答は、タンパク質構築物の第２の注射に対する応答の間により強くなる傾向がある。
【０３４２】
sTNFR-I4D/C105dbが投与されているヒヒの４匹すべてが抗体を発現し、sTNFR-I 3D/C105dbが投与されている４匹の動物のうちの２匹が抗体を発現し、そしてsTNFR-I2.6D/C105dbが投与されている４匹のヒヒのうち１匹が抗体を発現する。Kruskall-Wallis ANOVAによって、抗体応答の程度（対数変換した）は、時間の関数として３つの群間で有意に異なる（ｐ＜0.05）。ポストホック分析は、抗体応答の有意な差が、主として、sTNFR-I4D/C105dbおよびsTNFR-I 2.6D/C105dbが投与されている動物の間であり、sTNFR-I 3D/C105dbで処置した動物からは中間（および有意でない）応答であることを示唆する。
【０３４３】
抗体の発現と２回の21日研究中のクリアランスの変化との間の相関関係が観察される（ｐ＜0.01）。予期できないことではないが、構築物の第１の投与後に強力な抗体応答を発現する動物では、タンパク質は、第２の投与後により迅速にクリアランスされる。第１と第２の注射間のクリアランスの変化を、抗体応答を発現した動物（n＝7）と発現しなかった動物（n＝5）との間で比較する［図13］。
【０３４４】
ヒヒの血漿中で検出される抗体を、ME-180細胞株での直接細胞傷害性およびL-929アッセイでの中和能力について、選択した数の動物で評価する。細胞傷害性も中和も、これらの構築物のいずれかを生成する抗体で見られない。
【０３４５】
第１部Ａ相ヒヒ研究では、最も強い抗体応答を発現する動物はまた、第２の投与後に構築物のクリアランスの最も迅速な増加を有する。したがって、このような所見は、抗体応答が生物学的半減期、およびこのように構築物の治療効率を減少させ得、そして用量調節が必要とされ得ることを示唆する。しかし、構築物が２回目に投与される場合、抗体の存在に対してなんら有害な臨床的応答はないようである。したがって、半減期または効率に著しい影響を及ぼすことのない、このような構築物を免疫原性を減少させるように改変するための治療成果は、有害な反応の危険性よりもむしろ、主として、増加する用量調節の必要性を減少させることに関する。
【０３４６】
第１部Ｂ相結果：
最後に、未処置のヒヒにおいて、３つの構築物はすべて、1.0mg/kg BWの用量で投与した場合、E. coli菌血症後のサイトカイン媒介損傷を予防することにほぼ等しく有効である。それぞれ、４匹のプラセボ処置したヒヒのうちの１匹が生存する；４匹のsTNFR-I4D/C105dbおよびsTNFR-I 3D/C105db処置したヒヒのうちの４匹が生存する；そして４匹のsTNFR-I 2.6D/C105db処置したヒヒのうちの３匹が生存する。３つの構築物はすべて、TNFα生物活性を抑制し、そして過剰の中和能力を提供する。
【０３４７】
第II部：
ヒヒにおける第II部研究の特定の目的は、種々のsTNFR-I構築物への動物の反復曝露（すなわち、３回の別々の注射）が、さらなる免疫原性および半減期の減少を生じるかどうかを決定することである。さらに、この研究を、sTNFR-I2.6D/C105dbおよびsTNFR-I 4D/C105db、ならびにsTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)およびsTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)を含む、いくつかのsTNFR-I構築物の免疫原性およびファーマコキネティクスを比較するように設計する。最後に、この研究を、抗体応答の臨床的有意性を評価しそしてTNFα-媒介損傷攻撃（E.coli菌血症）に対するその後の応答におけるクリアランスを変更するように設計する。
【０３４８】
０、21、および42日目に、ヒヒに種々の構築物（それぞれ、sTNFR-I4D/C105db、sTNFR-I 2.6D/C105db、sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)、またはsTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)）の0.2mg/kgをI.V.投与する。＋63日目に、ヒヒに2.0mg/kg BWのそれぞれの構築物を投与する。＋65日目に（すなわち、48時間後）、ヒヒに、上の第Ｉ部に概説されるように、E.coliの致死用量で攻撃する。第II部の主な所見は以下の通りである：
結果（第II部）：
一般的に、ドメインの数に関わりなく、未処置のヒヒでは、sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)およびsTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)は、sTNFR-I4D/C105dbおよびsTNFR-I 2.6D/C105dbよりも長い半減期を有する。半減期は、ダイマーのPEG化形態についての10〜20時間と比較して、モノPEG化sTNFR-I形態については30〜35時間の範囲である。さらに、sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)およびsTNFR-I 4D/C105dbは、未処置の動物においてsTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)およびsTNFR-I 2.6D/C105dbよりも長い半減期を有する。
【０３４９】
sTNFR-I4D/C105dbおよびsTNFR-I 2.6D/C105dbはまた、sTNFR-I 2.6D/C105dbでの免疫原性の減少に対する適度な傾向を伴い、免疫原性である。しかし、TNFR-I4D/C105dbのみが反復投与でのクリアランスの減少を示す。sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)および2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)は、抗原性でもなく、クリアランス速度が反復投与で著しく変化もしない。
【０３５０】
＋21日、＋42日、および＋61日目に、異なる化合物で処置した各ヒヒ（N＝3）から得た血清を、捕獲抗原として異なる構築物を使用することによって、他の構築物に対する免疫反応性（サンドイッチ捕獲ELISAによる）についてインビトロで評価する。例えば、＋21日目（表９）に2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)を投与したヒヒから得た血清は、sTNFR-I 4D/C105db、sTNFR-I 4D/N105を捕獲抗原としてELISAプレート上で使用する場合に、これらの化合物のいずれとも「反応」しない。
【０３５１】
【表９】
2009280612.tif 000008
陽性反応は、＞1:400力価の抗体応答である。＋42および＋61日目からのデータを表10および11に示す。重要なことには、sTNFR-I4D/C105db捕獲抗原に対して試験した場合、2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)で既に処置した１匹のヒヒから得た血清との、インビトロでの陽性反応がある（表11）。
【０３５２】
【表１０】
2009280612.tif 000009
【０３５３】
【表１１】
2009280612.tif 000010
構築物に既に３回曝露したヒヒでは、TNFα媒介損傷応答への効率は、(1)sTNFR-I 4D/C105db、(2)sTNFR-I 2.6D/C105db、(3)sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)、および(4)2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)で最大である（生存する、多系器官不全（MSOF）、血清IL-6、およびWBC応答によって決定される場合）。「警告」は、この研究が、種々の構築物のTNF中和能力の差を考慮しないことである。
【０３５４】
Ｃ．チンパンジー：
この研究の目的は、チンパンジーに１カ月の期間にわたってI.V.経路によって繰り返し注射される種々のsTNFR-I形態の免疫原性を評価することである。この研究で試験されるsTNFR-I形態は、sTNFR-I2.6D/C105db、sTNFR-I4D/C105db、sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)、sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)、およびsTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)である。処置群当たり合計３匹のチンパンジーである。
【０３５５】
この研究の投与法／パラメータは以下の通りである：各チンパンジーに、４週間、月曜日および金曜日の週に２回、0.1mg/kgで静脈内ボーラス注射として試験物質を投与する（総計８用量）。投与容量は、供給される試験物質の濃度に依存して変動する。５mLの血清試料を、処置前の０日目に各動物から得る。追加の血清試料を、7、14、21、および28日目の薬物投与直前に得る。
【０３５６】
チンパンジー免疫原性生データを、表12に示す。
【０３５７】
【表１２】
2009280612.tif 000011
＋28日目までに、sTNFR-I 4D/C105dbまたはsTNFR-I 2.6D/C105dbのいずれかで処置したすべての動物（N＝3）は、それぞれ1:12,800または1;3200として観察される最も高い力価で、陽性反応（ELISAによって測定される）を記録する（表12）（注：実験のこの部分では、すべての「免疫する」抗原を、ELISAプレートに固定した対応する捕獲抗原として使用する）。sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)で処置した１匹の動物は、＋21および＋28日目に陽性抗体反応を有する（表12）。重要なことには、sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa)またはsTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)のいずれかで処置した動物は、実験全体を通して抗sTNFR-I抗体を発現することが観察されない（表12）。
【０３５８】
上のヒヒ実験の項に記載のように、＋28日目に種々のsTNF-RI形態で処置した各チンパンジー（N＝3）を、捕獲抗原としてsTNF-RI形成を使用することによって他の構築物に対して（ELISAによって）免疫反応性についてインビトロで評価する。陽性反応は、＞1:400力価の抗体応答である。重要なことには、sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)を投与したチンパンジーから得た血清は、sTNFR-I 4D/C105db、sTNFR-I 4D/N105が捕獲抗原としてELISAプレート上で使用される場合、これらの化合物のいずれとも「反応」しない（表13）。
【０３５９】
【表１３】
2009280612.tif 000012
これはまた、sTNFR-I4D/C105db、sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)、またはsTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)のいずれかで処置した動物で観察される（表13）。
【０３６０】
実施例IV
EAEは、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）のような神経抗原での遺伝的に感受性の動物の感作から生じるCNSの急性または慢性再発炎症性脱ミエリン病である。EAEは、当該技術分野で受け入れられており、そして急性ヒトMSについての動物モデルでしばしば使用される。
【０３６１】
雌Lewisラット（JacksonLaboratories, Bar Harbor, ME）に麻酔をかけ、そして5mg/mlのMycobacterium tuberculosisH37Ra (Difco Lab MI)を含む等容量の完全フロイントアジュバント（CFA）とともに、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）に溶解した完全フロイントアジュバント中のミエリン塩基性タンパク質（MBP）を含む0.1mLの乳化液で、左後足の足蹠に、０日目に免疫する。コントロールラットに、左後足の足蹠に、MBPを含まない0.1mlのPBS/CFA乳化液を投与する。
【０３６２】
臨床疾患の評価は、従来の０〜５評価システムに基づく。評点のスペクトルは：０、正常；0,5、尻尾緊張力の部分的消失；１、尻尾緊張力の感染消失；２、一方の後足の引きずり；３、両方の後足の麻痺；４、罹患；および５、死亡である。sTNFR-I構築物またはビヒクルのすべての注射を、免疫後９日目に開始して１日おきに１mg/kgS.C.で投与する。すべての動物を21日目に終了させる。結果を、２つの形態、時間の関数としての臨床的重篤度スコアで表し、そして疾患の全体の経過にわたる各ラットについての積分した臨床的スコアを、毎日の臨床的スコア対時間の曲線下面積として産出する。積分した臨床的スコアについての処置した群の値を、Mann-Whitney試験を使用してコントロール群の値に対して統計学的に比較する。
【０３６３】
ビヒクル処置した動物は、約10日目に疾患が発症し、16日目に疾患がピークになり、次いで減退する。sTNFR-I 4D/C106dbは、ビヒクル処置した動物と比較した場合、臨床的徴候が約73％減弱する。sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa)もまた、臨床的徴候を約85％減弱する。sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)およびsTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)は、臨床的徴候を減弱することにおいて等しく強力である（それぞれ、64％および57％）。
【０３６４】
結論として、短縮型sTNFRは、MSのこの動物モデルにおいて臨床的結果のいくつかを媒介することに有効であるようである。
【０３６５】
本発明は、一般的におよび好ましい実施態様に関しての両方で上で記載されているが、他の変更および改変を、上の記載を考慮して当業者が行うことが理解される。
【０３６６】
配列表
(1)一般的情報：
出願人：
(A)名称：アムジェン  インコーポレイテッド
(ii)発明の名称：短縮型可溶性腫瘍壊死因子Ｉ型およびII型レセプター
(iii)配列数：81
(iv)連絡住所：
(A)住所：アムジェン  インコーポレイテッド
(B)番地：デ  ハヴィルランド  ドライヴ  1840
(C)市：サウザンド  オークス
(D)州：カリフォルニア
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：91320-1789
(v)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピー（登録商標）ディスク
(B)コンピューター：IBMPC 互換用
(C)OS：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントインリリース #1.0, バージョン #1.30
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)分類：
(vii)先願データ：
(A)出願番号：US60/021,443
(B)出願日：1996年７月９日
(vii)先願データ：
(A)出願番号：US60/032,534
(B)出願日：1996年12月６日
(vii)先願データ：
(A)出願番号：US60/037,737
(B)出願日：1997年１月23日
(vii)先願データ：
(A)出願番号：US60/039,314
(B)出願日：1997年２月７日
(vii)先願データ：
(A)出願番号：US60/039,792
(B)出願日：1997年３月４日
(viii)代理人/事務所情報：
(A)名称：ジンドリック，トーマス  デー．
(B)登録番号：32,185
(C)照会/記録番号：A-415E
(2)配列番号１の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：483塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..483
(xi)配列：配列番号１:
GAT AGT GTG TGTCCC CAA GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT TCG               48
Asp Ser Val CysPro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser   
1                            5                                   10                                   15           
ATT TGC TGT ACCAAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT               96
Ile Cys Cys ThrLys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys   
20                                   25                                   30                   
CCA GGC CCG GGGCAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC GGC TCC             144
Pro Gly Pro GlyGln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser   
35                                   40                                   45                           
TTC ACC GCT TCAGAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC TCC AAA             192
Phe Thr Ala SerGlu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys   
50                                  55                                   60                                   
TGC CGA AAG GAAATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC             240
Cys Arg Lys GluMet Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp   
65                                  70                                   75                                   80   
CGG GAC ACC GTGTGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT TAT TGG             288
Arg Asp Thr ValCys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp   
85                                   90                                   95           
AGT GAA AAC CTTTTC CAG TGC TTC AAT TGC AGC CTC TGC CTC AAT GGG             336
Ser Glu Asn LeuPhe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly   
100                                 105                                 110                   
ACC GTG CAC CTCTCC TGC CAG GAG AAA CAG AAC ACC GTG TGC ACC TGC             384
Thr Val His LeuSer Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys   
115                                 120                                 125                           
CAT GCA GGT TTCTTT CTA AGA GAA AAC GAG TGT GTC TCC TGT AGT AAC             432
His Ala Gly PhePhe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn   
130                                135                                 140                                   
TGT AAG AAA AGCCTG GAG TGC ACG AAG TTG TGC CTA CCC CAG ATT GAG             480
Cys Lys Lys SerLeu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu   
145                                 150                                155                                 160   
AAT                                                                                                                                    483
Asn 
(2)配列番号２の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：161アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２:
Asp Ser Val CysPro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser 
1                            5                                   10                                   15         
Ile Cys Cys ThrLys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys 
20                                   25                                   30                 
Pro Gly Pro GlyGln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser 
35                                   40                                   45                         
Phe Thr Ala SerGlu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys 
50                                  55                                   60                                 
Cys Arg Lys GluMet Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp 
65                                  70                                   75                                   80 
Arg Asp Thr ValCys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp 
85                                   90                                   95         
Ser Glu Asn LeuPhe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly 
100                                 105                                 110                 
Thr Val His LeuSer Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys 
115                                 120                                 125                         
His Ala Gly PhePhe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn 
130                                135                                 140                                 
Cys Lys Lys SerLeu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu 
145                                150                                 155                                 160 
Asn 
(2)配列番号３の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：332塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：4..324
(xi)配列：配列番号３:
CAT ATG GAC AGCGTT TGC CCC CAA GGA AAA TAC ATC CAC CCT CAA AAT               48
MetAsp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn   
1                            5                                   10                                   15   
AAT TCG ATT TGCTGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT               96
Asn Ser Ile CysCys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn   
20                                   25                                   30           
GAC TGT CCA GGCCCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC             144
Asp Cys Pro GlyPro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser   
35                                   40                                   45                   
GGC TCC TTC ACCGCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC             192
Gly Ser Phe ThrAla Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys   
50                                   55                                   60                           
TCC AAA TGC CGAAAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA             240
Ser Lys Cys ArgLys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr   
65                                  70                                   75                                   
GTG GAC CGG GACACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT             288
Val Asp Arg AspThr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His   
80                                  85                                   90                                   95   
TAT TGG AGT GAAAAC CTT TTC CAG TGC TTC TGC TGA TAGGATCC                           332
Tyr Trp Ser GluAsn Leu Phe Gln Cys Phe Cys   *                     
100                                 105                                   
(2)配列番号４の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：107アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号４:
Met Asp Ser ValCys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn 
1                            5                                   10                                   15         
Ser Ile Cys CysThr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp 
20                                   25                                   30                 
Cys Pro Gly ProGly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly 
35                                   40                                   45                         
Ser Phe Thr AlaSer Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser 
50                                  55                                   60                                 
Lys Cys Arg LysGlu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val 
65                                  70                                   75                                   80 
Asp Arg Asp ThrVal Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr 
85                                   90                                   95         
Trp Ser Glu AsnLeu Phe Gln Cys Phe Cys   *   
100                                 105                 
(2)配列番号５の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：339塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：4..333
(xi)配列：配列番号５:
CAT ATG GAC AGCGTT TGC CCC CAA GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT               48
MetAsp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn   
1                            5                                   10                                   15   
AAT TCG ATT TGCTGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT               96
Asn Ser Ile CysCys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn   
20                                   25                                   30           
GAC TGT CCA GGCCCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC             144
Asp Cys Pro GlyPro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser   
35                                   40                                   45                   
GGC TCC TTC ACCGCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC             192
Gly Ser Phe ThrAla Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys   
50                                   55                                   60                           
TCC AAA TGC CGAAAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA             240
Ser Lys Cys ArgLys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr   
65                                  70                                   75                                   
GTG GAC CGG GACACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT             288
Val Asp Arg AspThr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His   
80                                  85                                   90                                   95   
TAT TGG AGT GAAAAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC TCT CTG TAA                     333
Tyr Trp Ser GluAsn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu   *   
100                                 105                                 110 
AAGCTT                                                                                                                              339
(2)配列番号６の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：110アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号６:
Met Asp Ser ValCys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn 
1                            5                                   10                                   15         
Ser Ile Cys CysThr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp 
20                                   25                                   30                 
Cys Pro Gly ProGly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly 
35                                   40                                   45                         
Ser Phe Thr AlaSer Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser 
50                                  55                                   60                                 
Lys Cys Arg LysGlu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val 
65                                  70                                   75                                   80 
Asp Arg Asp ThrVal Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr 
85                                   90                                   95         
Trp Ser Glu AsnLeu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu   *   
100                                 105                                 110 
(2)配列番号７の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：333塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：4..324
(xi)配列：配列番号７:
CAT ATG GAC AGCGTT TGC CCC CAA GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT               48
MetAsp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn   
1                            5                                   10                                   15   
AAT TCG ATT TGCTGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT               96
Asn Ser Ile CysCys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn   
20                                   25                                   30           
GAC TGT CCA GGCCCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC             144
Asp Cys Pro GlyPro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser   
35                                   40                                   45                   
GGC TCC TTC ACCGCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC             192
Gly Ser Phe ThrAla Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys   
50                                   55                                   60                           
TCC AAA TGC CGAAAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA             240
Ser Lys Cys ArgLys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr   
65                                  70                                   75                                   
GTG GAC CGG GACACC GTG TGT GGT TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT             288
Val Asp Arg AspThr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His   
80                                  85                                   90                                   95   
TAT TGG AGT GAAAAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TAA TAGGGATCC                         333
Tyr Trp Ser GluAsn Leu Phe Gln Cys Phe Asn   *                       
100                                 105                                     
(2)配列番号８の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：107アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号８:
Met Asp Ser ValCys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn 
1                            5                                   10                                   15         
Ser Ile Cys CysThr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp 
20                                   25                                   30                 
Cys Pro Gly ProGly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly 
35                                   40                                   45                         
Ser Phe Thr AlaSer Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser 
50                                  55                                   60                                 
Lys Cys Arg LysGlu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val 
65                                  70                                   75                                   80 
Asp Arg Asp ThrVal Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr 
85                                   90                                   95         
Trp Ser Glu AsnLeu Phe Gln Cys Phe Asn   *   
100                                 105                 
(2)配列番号９の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：285塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：4..279
(xi)配列：配列番号９:
CAT ATG TGT ACCAAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT               48
MetCys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys   
1                            5                                   10                                   15   
CCA GGC CCG GGGCAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC GGC TCC               96
Pro Gly Pro GlyGln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser   
20                                   25                                   30           
TTC ACC GCT TCAGAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC TCC AAA             144
Phe Thr Ala SerGlu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys   
35                                   40                                   45                   
TGC CGA AAG GAAATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC             192
Cys Arg Lys GluMet Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp   
50                                   55                                   60                           
CGG GAC ACC GTGTGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT TAT TGG             240
Arg Asp Thr ValCys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp   
65                                  70                                   75                                   
AGT GAA AAC CTTTTC CAG TGC TTC AAT TGC TCT CTG TAA AAGCTT                       285
Ser Glu Asn LeuPhe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu   *                 
80                                  85                                   90                               
(2)配列番号10の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：92アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号10:
Met Cys Thr LysCys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro 
1                            5                                   10                                   15         
Gly Pro Gly GlnAsp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe 
20                                   25                                   30                 
Thr Ala Ser GluAsn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys 
35                                   40                                   45                         
Arg Lys Glu MetGly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg 
50                                  55                                   60                                 
Asp Thr Val CysGly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser 
65                                  70                                   75                                   80 
Glu Asn Leu PheGln Cys Phe Asn Cys Ser Leu   *   
85                                   90                 
(2)配列番号11の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：315塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：4..309
(xi)配列：配列番号11:
CAT ATG TAT ATCCAC CCT CAA AAT AAT TCG ATT TGC TGT ACC AAG TGC               48
MetTyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys   
1                            5                                   10                                   15   
CAC AAA GGA ACCTAC TTG TAC AAT GAC TGT CCA GGC CCG GGG CAG GAT               96
His Lys Gly ThrTyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp   
20                                   25                                   30           
ACG GAC TGC AGGGAG TGT GAG AGC GGC TCC TTC ACC GCT TCA GAA AAC             144
Thr Asp Cys ArgGlu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn   
35                                   40                                   45                   
CAC CTC AGA CACTGC CTC AGC TGC TCC AAA TGC CGA AAG GAA ATG GGT             192
His Leu Arg HisCys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly   
50                                   55                                   60                           
CAG GTG GAG ATCTCT TCT TGC ACA GTG GAC CGG GAC ACC GTG TGT GGC             240
Gln Val Glu IleSer Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly   
65                                  70                                   75                                   
TGC AGG AAG AACCAG TAC CGG CAT TAT TGG AGT GAA AAC CTT TTC CAG             288
Cys Arg Lys AsnGln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln   
80                                  85                                   90                                   95   
TGC TTC AAT TGCTCT CTG TAA AAGCTT                                                                       315
Cys Phe Asn CysSer Leu   *                 
100                               
(2)配列番号12の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：102アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号12:
Met Tyr Ile HisPro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His 
1                            5                                   10                                   15         
Lys Gly Thr TyrLeu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr 
20                                   25                                   30                 
Asp Cys Arg GluCys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His 
35                                   40                                   45                         
Leu Arg His CysLeu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln 
50                                  55                                   60                                 
Val Glu Ile SerSer Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys 
65                                  70                                   75                                   80 
Arg Lys Asn GlnTyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys 
85                                   90                                   95         
Phe Asn Cys SerLeu   *   
100                 
(2)配列番号13の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：294塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：4..288
(xi)配列：配列番号13:
CAT ATG TCG ATTAGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC               48
MetSer Ile Ser Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr   
1                            5                                   10                                   15   
AAT GAC TGT CCAGGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG               96
Asn Asp Cys ProGly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu   
20                                   25                                   30           
AGC GGC TCC TTCACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC             144
Ser Gly Ser PheThr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser   
35                                   40                                   45                   
TGC TCC AAA TGCCGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC             192
Cys Ser Lys CysArg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys   
50                                   55                                   60                           
ACA GTG GAC CGGGAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG             240
Thr Val Asp ArgAsp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg   
65                                  70                                   75                                   
CAT TAT TGG AGTGAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC TCT CTG TAA             288
His Tyr Trp SerGlu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu   *   
80                                  85                                   90                                   95 
AAGCTT                                                                                                                              294
(2)配列番号14の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：95アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号14:
Met Ser Ile SerCys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn 
1                            5                                   10                                   15         
Asp Cys Pro GlyPro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser 
20                                   25                                   30                 
Gly Ser Phe ThrAla Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys 
35                                   40                                   45                         
Ser Lys Cys ArgLys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr 
50                                  55                                   60                                 
Val Asp Arg AspThr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His 
65                                  70                                   75                                   80 
Tyr Trp Ser GluAsn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu   *   
85                                   90                                   95 
(2)配列番号15の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：４アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号15:
AsnSer Ile Cys 
1                            
(2)配列番号16の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号16:
AsnAsn Ser Ile Cys 
1                            5     
(2)配列番号17の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：６アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号17:
GlnAsn Asn Ser Ile Cys 
1                            5             
(2)配列番号18の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：７アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号18:
ProGln Asn Asn Ser Ile Cys 
1                            5                     
(2)配列番号19の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：８アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号19:
HisPro Gln Asn Asn Ser Ile Cys 
1                            5                             
(2)配列番号20の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：９アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号20:
IleHis Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys 
1                            5                                     
(2)配列番号21の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：10アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号21:
TyrIle His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys 
1                            5                                     10   
(2)配列番号22の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：11アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号22:
LysTyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys 
1                            5                                     10           
(2)配列番号23の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：12アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号23:
GlyLys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys 
1                            5                                     10                   
(2)配列番号24の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：13アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号24:
GlnGly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys 
1                            5                                     10                           
(2)配列番号25の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：14アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号25:
ProGln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys 
1                            5                                     10                                   
(2)配列番号26の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：15アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号26:
CysPro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys 
1                            5                                     10                                   15   
(2)配列番号27の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：16アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号27:
ValCys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys 
1                            5                                     10                                   15           
(2)配列番号28の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：17アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号28:
SerVal Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile 
1                            5                                     10                                   15           
Cys 
(2)配列番号29の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：18アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号29:
AspSer Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser 
1                            5                                     10                                   15           
IleCys 
(2)配列番号30の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：４アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号30:
PheCys Cys Ser 
1                            
(2)配列番号31の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号31:
PheCys Cys Ser Leu 
1                            5     
(2)配列番号32の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：６アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号32:
PheCys Cys Ser Leu Cys 
1                            5             
(2)配列番号33の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：７アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号33:
PheCys Cys Ser Leu Cys Leu 
1                            5                     
(2)配列番号34の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：705塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..705
(xi)配列：配列番号34:
TTG CCC GCC CAGGTG GCA TTT ACA CCC TAC GCC CCG GAG CCC GGG AGC               48
Leu Pro Ala GlnVal Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser   
1                            5                                   10                                   15           
ACA TGC CGG CTCAGA GAA TAC TAT GAC CAG ACA GCT CAG ATG TGC TGC               96
Thr Cys Arg LeuArg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys   
20                                   25                                   30                   
AGC AAG TGC TCGCCG GGC CAA CAT GCA AAA GTC TTC TGT ACC AAG ACC             144
Ser Lys Cys SerPro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr   
35                                   40                                   45                           
TCG GAC ACC GTGTGT GAC TCC TGT GAG GAC AGC ACA TAC ACC CAG CTC             192
Ser Asp Thr ValCys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu   
50                                  55                                   60                                   
TGG AAC TGG GTTCCC GAG TGC TTG AGC TGT GGC TCC CGC TGT AGC TCT             240
Trp Asn Trp ValPro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser   
65                                  70                                   75                                   80   
GAC CAG GTG GAAACT CAA GCC TGC ACT CGG GAA CAG AAC CGC ATC TGC             288
Asp Gln Val GluThr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys   
85                                   90                                   95           
ACC TGC AGG CCCGGC TGG TAC TGC GCG CTG AGC AAG CAG GAG GGG TGC             336
Thr Cys Arg ProGly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys   
100                                 105                                 110                   
CGG CTG TGC GCGCCG CTG CGC AAG TGC CGC CCG GGC TTC GGC GTG GCC             384
Arg Leu Cys AlaPro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala   
115                                 120                                 125                           
AGA CCA GGA ACTGAA ACA TCA GAC GTG GTG TGC AAG CCC TGT GCC CCG             432
Arg Pro Gly ThrGlu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro   
130                                135                                 140                                   
GGG ACG TTC TCCAAC ACG ACT TCA TCC ACG GAT ATT TGC AGG CCC CAC             480
Gly Thr Phe SerAsn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His   
145                                150                                 155                                 160   
CAG ATC TGT AACGTG GTG GCC ATC CCT GGG AAT GCA AGC AGG GAT GCA             528
Gln Ile Cys AsnVal Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Arg Asp Ala   
165                                 170                                 175           
GTC TGC ACG TCCACG TCC CCC ACC CGG AGT ATG GCC CCA GGG GCA GTA             576
Val Cys Thr SerThr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val   
180                                 185                                 190                   
CAC TTA CCC CAGCCA GTG TCC ACA CGA TCC CAA CAC ACG CAG CCA ACT             624
His Leu Pro GlnPro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr   
195                                 200                                 205                           
CCA GAA CCC AGCACT GCT CCA AGC ACC TCC TTC CTG CTC CCA ATG GGC             672
Pro Glu Pro SerThr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly   
210                                215                                 220                                   
CCC AGC CCC CCAGCT GAA GGG AGC ACT GGC GAC                                                     705
Pro Ser Pro ProAla Glu Gly Ser Thr Gly Asp 
225                                230                                 235 
(2)配列番号35の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：235アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号35:
Leu Pro Ala GlnVal Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 
1                            5                                   10                                   15         
Thr Cys Arg LeuArg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 
20                                   25                                   30                 
Ser Lys Cys SerPro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 
35                                   40                                   45                         
Ser Asp Thr ValCys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 
50                                  55                                   60                                 
Trp Asn Trp ValPro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 
65                                  70                                   75                                   80 
Asp Gln Val GluThr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys 
85                                   90                                   95         
Thr Cys Arg ProGly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys 
100                                 105                                 110                 
Arg Leu Cys AlaPro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 
115                                 120                                 125                         
Arg Pro Gly ThrGlu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro 
130                                135                                 140                                 
Gly Thr Phe SerAsn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His 
145                                150                                 155                                 160 
Gln Ile Cys AsnVal Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Arg Asp Ala 
165                                 170                                 175         
Val Cys Thr SerThr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 
180                                 185                                 190                 
His Leu Pro GlnPro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 
195                                 200                                 205                         
Pro Glu Pro SerThr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 
210                                215                                 220                                 
Pro Ser Pro ProAla Glu Gly Ser Thr Gly Asp 
225                                230                                 235 
(2)配列番号36の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：４アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号36:
AlaGln Met Cys 
1                            
(2)配列番号37の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号37:
ThrAla Gln Met Cys 
1                            5     
(2)配列番号38の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：６アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号38:
GlnThr Ala Gln Met Cys 
1                            5             
(2)配列番号39の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：７アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号39:
AspGln Thr Ala Gln Met Cys 
1                            5                     
(2)配列番号40の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：８アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号40:
TyrAsp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
1                            5                             
(2)配列番号41の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：９アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号41:
TyrTyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
1                            5                                     
(2)配列番号42の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：10アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号42:
GluTyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
1                            5                                     10   
(2)配列番号43の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：11アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号43:
ArgGlu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
1                            5                                     10           
(2)配列番号44の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：12アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号44:
LeuArg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
1                            5                                     10                   
(2)配列番号45の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：13アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号45:
ArgLeu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
1                            5                                     10                           
(2)配列番号46の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：14アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号46:
CysArg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
1                            5                                     10                                   
(2)配列番号47の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：15アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号47:
ThrCys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
1                            5                                     10                                   15   
(2)配列番号48の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：16アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号48:
SerThr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
1                            5                                     10                                   15           
(2)配列番号49の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：17アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号49:
GlySer Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met 
1                            5                                     10                                   15           
Cys 
(2)配列番号50の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：18アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号50:
ProGly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln 
1                            5                                     10                                   15           
MetCys 
(2)配列番号51の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：19アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号51:
GluPro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala 
1                            5                                     10                                   15           
GlnMet Cys 
(2)配列番号52の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：20アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号52:
ProGlu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr 
1                            5                                     10                                   15           
AlaGln Met Cys 
20   
(2)配列番号53の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：21アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号53:
AlaPro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 
1                            5                                     10                                   15           
ThrAla Gln Met Cys 
20           
(2)配列番号54の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：22アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号54:
TyrAla Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp 
1                            5                                     10                                   15           
GlnThr Ala Gln Met Cys 
20                   
(2)配列番号55の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：23アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号55:
ProTyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr 
1                            5                                     10                                   15           
AspGln Thr Ala Gln Met Cys 
20                           
(2)配列番号56の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：24アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号56:
ThrPro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr 
1                            5                                     10                                   15           
TyrAsp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
20                                   
(2)配列番号57の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：25アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号57:
PheThr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu 
1                            5                                     10                                   15           
TyrTyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
20                                   25   
(2)配列番号58の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：26アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号58:
AlaPhe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg 
1                            5                                     10                                   15           
GluTyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
20                                   25           
(2)配列番号59の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：27アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号59:
ValAla Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu 
1                            5                                     10                                   15           
ArgGlu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
20                                   25                   
(2)配列番号60の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：28アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号60:
GlnVal Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg 
1                            5                                     10                                   15           
LeuArg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
20                                   25                           
(2)配列番号61の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：29アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号61:
AlaGln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys 
1                            5                                     10                                   15           
ArgLeu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
20                                   25                                   
(2)配列番号62の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：30アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号62:
ProAla Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr 
1                            5                                     10                                   15           
CysArg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
20                                   25                                   30   
(2)配列番号63の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：31アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号63:
LeuPro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 
1                            5                                     10                                   15           
ThrCys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys 
20                                   25                                   30           
(2)配列番号64の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：４アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号64:
AlaPro Leu Arg 
1                            
(2)配列番号65の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号65:
AlaPro Leu Arg Lys 
1                            5     
(2)配列番号66の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：６アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号66:
AlaPro Leu Arg Lys Cys 
1                            5             
(2)配列番号67の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：７アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号67:
AlaPro Leu Arg Lys Cys Arg 
1                            5                     
(2)配列番号68の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：31塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号68:
GGTTAGCCATATGGACAGCG TTTGCCCCCA A                                                                         31
(2)配列番号69の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号69:
CCCAAGCTTTTACAGAGAGC AATTGAAGCA CTG                                                                     33
(2)配列番号70の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：40塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号70:
ACTCGAGGATCCGCGGATAA ATAAGTAACG ATCCGGTCCA                                                       40
(2)配列番号71の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：41塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号71:
CAGGTCGGATCCTATCAGCA GAAGCACTGG AAAAGGTTTT C                                                   41
(2)配列番号72の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：31塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号72:
GGTTAGCCATATGGACAGCG TTTGCCCCCA A                                                                         31
(2)配列番号73の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：34塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号73:
CGCGGATCCCTATTAATTGA AGCACTGGAA AAGG                                                                   34
(2)配列番号74の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：30塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号74:
CCCCATATGTATATCCACCC TCAAAATAAT                                                                             30
(2)配列番号75の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号75:
CCCAAGCTTTTACAGAGAGC AATTGAAGCA CTG                                                                     33
(2)配列番号76の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：38塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号76:
CCCCATATGTCGATTAGCTG TACCAAGTGC CACAAAGG                                                           38
(2)配列番号77の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号77:
CCCAAGCTTTTACAGAGAGC AATTGAAGCA CTG                                                                     33
(2)配列番号78の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：30塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号78:
CCCCATATGTGTACCAAGTG CCACAAAGGA                                                                             30
(2)配列番号79の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号79:
CCCAAGCTTTTACAGAGAGC AATTGAAGCA CTG                                                                     33
(2)配列番号80の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：31塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号80:
GGTTAGCCATATGGACAGCG TTTGCCCCCA A                                                                         31
(2)配列番号81の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：33塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号81:
CCCAAGCTTTTAGGTGCACA CGGTGTTCTG TTT                                                                     33
【図１】
2009280612.tif 000013
【図２】
2009280612.tif 000014
【図３】
2009280612.tif 000015
【図４】
2009280612.tif 000016
【図５】
2009280612.tif 000017
【図６】
2009280612.tif 000018
【図７】
2009280612.tif 000019
【図８】
2009280612.tif 000020
【図９】
2009280612.tif 000021
【図１０】
2009280612.tif 000022
【図１１】
2009280612.tif 000023
【図１２】
2009280612.tif 000024
【図１３】
2009280612.tif 000025