(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の治療に有用なペプチド等を提供する。【解決手段】Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体により認識されるペプチドであって，特定のアミノ酸配列を有するペプチド。また，このペプチドを有効成分として含有する，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物，ならびに上述のペプチドを含有する，ＨＣＶ関連疾患を診断するかまたはＨＣＶ関連疾患の進行を予測するための組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体により認識されるペプチドであって，以下の配列：
E1 335-344：  AYAMRVPEVI（配列番号１）
E2 576-584：  DFNASTDLL（配列番号２）
E2 627-635：  NYTIFKIRM（配列番号３）
E2 649-658：  NFTRGDRCNL（配列番号４）
NS2 889-897：  VFDITKWLL（配列番号５）
NS2 936-945：  KYVQMALLAL（配列番号６）
NS3 1085-1094：  VYHGAGNKTL（配列番号７）
NS3 1104-1112：  MYSSAEGDL（配列番号８）
NS3 1447-1456：  GYTGDFDSVI（配列番号９）
NS3 1560-1569：  EFWEAVFTGL（配列番号１０）
NS5 2445-2453：  SYSWTGALI（配列番号１１）
E2 576-584：  DFN(A/T)S(T/M)DLL（配列番号１２）
E2 627-635：  N(Y/F)(T/S)(I/T/V)FK(I/V)RM（配列番号１３）
NS3 1085-1094：  VYHGAG(N/T)(K/R)T(L/I)（配列番号１４）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
配列番号１２−１４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する，請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号２，３または７で表されるアミノ酸配列を有する，請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうる，請求項１−３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１−４のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有する，Ｃ型肝炎ウイルス関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項６】
請求項１−４のいずれかに記載のペプチドを含有する，Ｃ型肝炎ウイルス関連疾患を診断するかまたはＣ型肝炎ウイルス関連疾患の進行を予測するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の治療およびＨＣＶ関連疾患の診断または進行予測に有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口の約３％がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対してセロポジティブであると見積もられている（World Health Organization. Hepatitis C: global prevalence. Wkly. Epidemiol. Rec. 1997; 72(46):341-344）。ＨＣＶ感染の急性期はしばしば無症状であるが，セロポジティブの個人の約７０％は慢性感染を発症し，感染した患者は進行性の肝臓病，例えば，線維症，肝硬変，および肝細胞癌に罹患しやすい（Alter HJ, Seeff LB., Semin Liver Dis. 2000; 20(1):17-35; Shimotohno, K., Semin. Cancer Biol. 2000;10:233-240）。ＨＣＶ感染の現在の治療法はリバビリンと組み合わせたインターフェロン（ＩＦＮ）−αであり，最近では，ポリエチレングリコール修飾型のＩＦＮ−αが用いられている。しかし，持続性の応答は，治療した患者の約５０％にしか見られない（Manns MP, et al, Lancet. 2001; 358:958-965）。さらに重要なことには，抗ウイルス療法は，感染患者の大部分が居住するほとんどの発展途上国では利用できない。したがって，新たな治療法の開発が必要とされている。
【０００３】
ＨＣＶ感染後の肝細胞傷害の病因メカニズムはまだよくわかっていないが，多くの証拠から，ウイルス特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）がＨＣＶ感染後の肝臓障害に重要な役割を果たしているかもしれないことが示されている（Chang KM, et al., Springer Semin Immunopathol. 1997; 19:57-68）。一方，ＣＴＬは，感染の間にウイルスの広がりを制限しウイルスを排除するのに有効であると考えられている（Kurokohchi K, et al., J Virol. 1996; 70:232-240）。したがって，ワクチンによるＣＴＬ誘導は，ＨＣＶ感染に伴う疾患の管理の有望な戦略であろう。さらに，コストが低いことおよび保存が容易であることから，ＣＴＬ誘導を指向したペプチドワクチンの開発が求められている。
【０００４】
ＨＣＶのゲノタイプとしては，１ａおよび１ｂが主であるため，これまでこれらのタイプに関して多くの研究が行われてきた。ＨＣＶ１ａおよび１ｂに由来するいくつかのＨＬＡ拘束性エピトープが，ペプチドワクチンの候補として同定されている（Kurokohchi K, et al., J Hepatol. 2001; 34(6):930-935; Uno-Furuta S, et al., Vaccine. 2001; 19:2190-2196; Dikopoulos N, et al., Hepatology. 2004; 40(2):300-309; Curiel TJ, et al., J Immunol. 2004; 172(12):7425-7431）。しかし，ＨＣＶ２ａは中国，日本およびイタリアにおいて支配的なゲノタイプであるにもかかわらず，ＨＣＶ２ａについてはほとんど知られていない（Zein NN, Clin Microbiol Rev. 2000; 13(2):223-235; Huy TT, Abe K., Pediatr Int. 2004; 46(2):223-230）。
【０００５】
したがって，本発明の目的は，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）２ａ感染に対する特異的免疫療法の基礎となる分子を提供することである。
【０００６】
【特許文献１】WO2005/028503
【非特許文献１】Kurokohchi K, et al., J Hepatol. 2001; 34(6):930-935
【非特許文献２】Uno-Furuta S, et al., Vaccine. 2001; 19:2190-2196
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は，ＨＣＶ２ａに感染した患者に適用することができる，ＨＣＶ関連疾患の治療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）２ａ由来エピトープペプチドがヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４陽性のＨＣＶ２ａ感染患者において細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導しうることを見いだした。
【０００９】
本発明は，Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体により認識されるペプチドであって，以下のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドを提供する：
E1 335-344：  AYAMRVPEVI（配列番号１）
E2 576-584：  DFNASTDLL（配列番号２）
E2 627-635：  NYTIFKIRM（配列番号３）
E2 649-658：  NFTRGDRCNL（配列番号４）
NS2 889-897：  VFDITKWLL（配列番号５）
NS2 936-945：  KYVQMALLAL（配列番号６）
NS3 1085-1094：  VYHGAGNKTL（配列番号７）
NS3 1104-1112：  MYSSAEGDL（配列番号８）
NS3 1447-1456：  GYTGDFDSVI（配列番号９）
NS3 1560-1569：  EFWEAVFTGL（配列番号１０）
NS5 2445-2453：  SYSWTGALI（配列番号１１）
E2 576-584：  DFN(A/T)S(T/M)DLL（配列番号１２）
E2 627-635：  N(Y/F)(T/S)(I/T/V)FK(I/V)RM（配列番号１３）
NS3 1085-1094：  VYHGAG(N/T)(K/R)T(L/I)（配列番号１４）
【００１０】
特に好ましくは，本発明のペプチドは以下のいずれかの配列を有する：
E2 576-584：  DFNASTDLL（配列番号２）
E2 627-635：  NYTIFKIRM（配列番号３）
NS3 1085-1094：  VYHGAGNKTL（配列番号７）
【００１１】
好ましくは，本発明のペプチドは，ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。
【００１２】
別の観点においては，本発明は，上述の本発明のペプチドを有効成分として含有する，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物を提供する。本発明はまた，上述の本発明のペプチドを含有する，ＨＣＶ関連疾患を診断するかまたはＨＣＶ関連疾患の進行を予測するための組成物を提供する。
【００１３】
本明細書において用いる場合，「ＨＣＶ関連疾患」とは，Ｃ型肝炎ウイルスの感染によって引き起こされる疾患を意味し，例えば，急性および慢性の肝炎，肝硬変，および肝細胞癌が含まれる。ＨＣＶ関連疾患の進行は，典型的には，慢性肝炎から肝硬変への進行，さらに肝硬変から肝癌への進行である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は，ＨＣＶ２ａに感染した患者の治療に用いることができる免疫原性ＨＣＶ由来ペプチドを提供する。本発明のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド（ＨＣＶペプチド）は，Ｃ型肝炎ウイルスタイプ２ａ由来の蛋白質の部分アミノ酸配列を含み，かつ，患者のＨＬＡと適合するＨＬＡ結合モチーフを配列中に含む。このペプチドは，Ｃ型肝炎ウイルス感染患者の血中抗体により認識されることができる。好ましくは，本発明に係るＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，ＣＴＬを誘導することができ，このようにして誘導されたＣＴＬは，ＨＣＶ感染細胞を標的にしてこの細胞を攻撃する。
【００１５】
下記の実施例に示されるように，本発明においては，ＨＣＶ２ａ感染患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有するＨＣＶ２ａ由来ペプチドで刺激して，ペプチド特異的かつＨＬＡ−Ａ２４拘束性の細胞傷害活性を調べた。また，ＨＣＶ２ａペプチドに対するイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の血漿レベルを蛍光的に測定した。その結果，１１種類のペプチドが，ＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＣＶ２ａ感染患者のＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを有効に誘導することが見いだされた。このうち，３つのペプチド（Ｅ２蛋白質からのHCV2a 576-584およびHCV2a 627-635およびＮＳ３蛋白質からのHCV2a 1085-1094）が，特に高い頻度でＣＴＬを誘導した。それぞれのペプチドに反応性のペプチド特異的ＣＤ８+Ｔ細胞により，ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の細胞傷害活性が示された。また，HCV2a 1085-1094反応性Ｔ細胞はＨＣＶ２ａＮＳ３−５遺伝子をトランスフェクションした標的細胞に対して細胞傷害活性を有していた。さらに，ＨＣＶ２ａ感染患者の血漿中で有意なレベルのHCV2a 627-635ペプチド特異的ＩｇＧが検出された。これらの結果は，これらの３つのペプチドを用いて，ＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＣＶ２ａ感染患者のペプチドに基づく免疫療法が可能であることを示す。中でも，HCV2a 576-584ペプチドは非常に免疫原性が高いことがわかった。
【００１６】
本発明においては，配列番号１−１１に示されるアミノ酸配列において，１個，２個または３個のアミノ酸残基が保存的に置換されていてもよい。保存的置換とは，あるアミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸で置換され，そのためペプチド化学分野の当業者によってポリペプチドの２次構造およびハイドロパシー特性が実質的に変化しないことが予期されるような置換をいう。互いに保存的置換であるアミノ酸の群としては一般に以下のものが知られている：（１）グリシン，アスパラギン，グルタミン，システイン，セリン，トレオニンおよびチロシン；（２）アラニン，バリン，ロイシン，イソロイシン，プロリン，フェニルアラニン，メチオニンおよびトリプトファン；（３）グリシン, アラニン, セリン, トレオニンおよびメチオニン；（４）ロイシン, イソロイシンおよびバリン；（５）グルタミンおよびアスパラギン；（６）グルタミン酸およびアスパラギン酸；（７）アルギニン, リジンおよびヒスチジン；（８）フェニルアラニン, トリプトファンおよびチロシン。
【００１７】
さらに，本発明のペプチドは，所望の作用効果を奏する程度に上記のアミノ酸配列を有していればよく，付加的な配列がさらに含まれていてもよい。当業者であれば，抗原ペプチドとして所望の作用効果を奏するためには，そのＮ末端側およびＣ末端側にそれぞれどの程度の配列の付加が許容されるかを当然に理解することができる。したがって，例えば，本発明にかかるペプチドのＮ末端側および／またはＣ末端側に，免疫感作を促進するのに有用なアミノ酸配列や，製剤化を容易にするアミノ酸配列や，融合蛋白質としてペプチドを発現させるのに便利なアミノ酸配列や，ペプチドの製造および精製に便利なアミノ酸配列などが付加されていてもよい。また，本発明にかかるペプチドは，抗体との結合の特異性が失われない限り，化学的に修飾されていてもよく，ポリマーや糖鎖が付加されていてもよい。
【００１８】
本発明に係るＨＣＶペプチドは，通常の化学的合成法，タンパク分子の酵素的分解法，目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現するように形質転換した宿主を用いる遺伝子組換え技術などにより製造することができる。
【００１９】
目的とするペプチドを化学的合成法で製造する場合には，通常のペプチド化学において公知の慣用されている手法によって製造することができ，例えば，ペプチド合成機を使用して，固相合成法により合成することができる。このようにして得られた粗ペプチドは，タンパク質化学において通常使用されている精製方法，例えば，塩析法，限外ろ過法，逆相クロマトグラフィー法，イオン交換クロマトグラフィー法，アフィニティークロマトグラフィー法などによって精製することができる。
【００２０】
一方，所望のペプチドを遺伝子組換え技術で生産する場合には，例えば，合成またはクローニングした目的のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組込み，この発現ベクターを用いて微生物や動物細胞を形質転換して，得られた形質転換体を培養することによって，所望のペプチドを得ることができる。使用できる発現ベクターとしては，当該技術分野において公知であるプラスミド，ウイルスベクターなどを用いることができる。
【００２１】
このペプチド生産技術における発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換方法としては，それ自体公知の方法，例えば，塩化カルシウム法，リン酸カルシウム共沈殿法，ＤＥＡＥデキストラン法，リポフェクチン法，エレクトロポレーション法などが使用でき，使用する宿主細胞に基づいて適宜選択するのがよい。得られたペプチドの精製は，培養した培地から回収した細胞抽出液もしくは培養上清から上記精製法により行うことができる。
【００２２】
本発明のペプチドは，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物，すなわちペプチドワクチンとして有用である。Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドからなるワクチンは，上記のようにして製造したペプチドを，医薬的に許容される補助剤および／または担体と適宜混合することにより調製する。補助剤としては，免疫応答を強化し得るアジュバント，例えばフロイントの不完全アジュバント，水酸化アルミニウムゲルなどを使用することができる。また，担体としては，例えば，リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ），蒸留水などの希釈剤，生理食塩水などを使用することができる。
【００２３】
ペプチドワクチンは，その使用形態に応じて，例えば，経口または静脈投与や皮下投与など経皮経路で投与することができる。その剤形としては，例えば，錠剤，顆粒剤，ソフトカプセル剤，ハードカプセル剤，液剤，油剤，乳化剤などが挙げられる。かかる医薬組成物の投与量は，投与する患者の症状などにより，適宜変動し得るが，一般的には，成人に対して１日当たり，ペプチド量として０．１−１０ｍｇが好ましく，投与間隔としては数日ないし数ヶ月に１回投与することが好ましい。また，ペプチドワクチンとインターフェロンとを併用してもよい。
【００２４】
好ましい態様においては，投与されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性もしくはＣＴＬの存在に基づいて選択される。更に好ましくは抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性とＣＴＬの両方の存在に基づいて選択される。ここで，「抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性」とは，投与すべきペプチドのいずれかが，患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体により認識されることをいう。それぞれの患者における抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性を検査して，各人に適するペプチドのみを投与する，いわゆるテーラーメイド型の投与により，より高い治療効果を期待することができる。癌ペプチドワクチン臨床試験における経験により，テーラーメイド型投与により二次免疫の賦活が速やかに誘導されるため，より安全により良い臨床効果が発現することが立証されている（Mine et al., Clin. Can. Res. 929-937,2004）。
【００２５】
ＨＣＶ関連疾患の治療効果の確認は，ＨＣＶ関連疾患に罹患している被験者の血中抗体価，すなわちペプチドに対する反応性を有する抗体の血中濃度を，ＥＬＩＳＡ等の慣用の方法によりモニターすることによって行うことができる。また，ＨＣＶ  ＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲ等の慣用の方法により測定することにより，ウイルス量をモニターすることができる。
【００２６】
本発明のペプチドはまた，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を診断し，あるいは疾患の進行を予測するための組成物としても有用である。本発明のペプチドを用いて，当該技術分野においてよく知られる抗原抗体反応を用いて，被験者の血液中の抗体価を測定することができる。例えば，典型的なＥＬＩＳＡ法を用いる場合には，以下のようにして測定を行うことができる。抗原であるペプチドを９６ウエルなどの慣用のＥＬＩＳＡプレートに結合させ，非特異的吸着を防止するためにプレートを適宜ブロッキングする。次に被験者の血液から調製した血清を適宜希釈してプレートの各ウエルに加えて，所定時間反応する。プレートを洗浄して未結合成分を除去した後，ヒト抗体と結合しうる抗体（例えばウサギ抗ヒト抗体）を加える。ＩｇＧを検出することが望まれる場合には，γ鎖特異的抗ヒトＩｇＧを用いることができる。所定時間反応した後，プレートを洗浄し，検出可能なように標識した抗体（例えば抗ウサギＩｇＧ）を加える。標識は，酵素，蛍光色素，化学発光物質，ビオチン，放射線化合物等を用いて，当業者によく知られる方法により行うことができる。プレートを所定時間反応した後，適当な基質を加えて基質の減少もしくは生成物の増加を測定するか，または蛍光，発光，放射活性を測定することにより，標識を検出する。このようにして，被験者の血清における特定のペプチドに対する抗体の量を測定することができる。さらに，抗体の量をモニターすることにより，ＨＣＶ関連疾患の進行の予測を行うことができる。
【００２７】
このような抗原抗体反応により抗体を検出する方法のうち，感度の高い方法の１つとしてｘＭＡＰ技術がある。これは，Luminex社が開発した蛍光マイクロビーズアレイシステムによるフローメトリー測定法であり，ペプチドを結合させたマイクロビーズと血清とを接触させ，次に，蛍光標識二次抗体を結合させて，フローメトリーにより蛍光強度を測定する。
【００２８】
また，病院の検査室などで抗体価を測定する場合には，免疫クロマト法を用いることができる。この方法は，試験紙上に抗原（または抗体）を線状に分布させた部分を作っておき，検体中の抗体と着色粒子で標識された抗原との複合体が試験紙上を移動する際に，抗原（または抗体）に集中的に捕捉されることで現れる色付きのラインの有無によって定性分析を行う方法である。この方法を用いれば，簡便な設備で短時間（２０〜３０分以内）に結果を得ることができる。
【実施例】
【００２９】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし，これらの実施例は本発明をより具体的に説明するために例示的に示したものであり，本発明は実施例により限定されるものではない。
【００３０】
方法
被験者
ＨＬＡ−Ａ２４陽性の，ＨＣＶ２ａ感染による慢性肝炎患者２０名および健康なドナー１５名を被験者とした。ＣＴＬ誘導実験には，１０名のＨＬＡ−Ａ２４陽性患者および５名のＨＬＡ−Ａ２４陽性の健康なドナーのＰＢＭＣを用いた。ＨＣＶ２ａ患者は，抗ＨＣＶ抗体（Ａｂｓ）についてセロポジティブであった。健康なドナーは肝臓の機能障害の症状を有していなかった。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得るためには，２０ｍｌの末梢血を採取し，フィコール−コンレー密度勾配遠心分離によりＰＢＭＣを調製した。
【００３１】
ペプチド
以下の実施例で用いたＨＣＶ２ａ由来ペプチドを表１に示す。これらのペプチドは，ＨＣＶ−ゲノタイプ２ａの蛋白質に由来する，ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有する１１種類の９量体または１０量体の合成ペプチドである。陰性対照としては，ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有するインフルエンザウイルス（Ｆｌｕ）由来ペプチド（ＲＦＹＩＱＭＣＹＥＬ（配列番号１５）），ＥＢＶ由来ペプチド（ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ（配列番号１６）），およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ペプチド（ＲＹＬＲＱＱＬＬＧＩ（配列番号１７））を用いた。すべてのペプチドは，ＢＩＯＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Lewisville, TX）またはＳｙｎＰｅｐ（Dublin, CA）から購入し，９０％以上の純度であった。ペプチドは，１０ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して−２０℃で保存した。
【００３２】
【表１】
2009051733.tif 000003
【００３３】
細胞株
C1R-A2402はHLA-A*2402を発現するＣ１Ｒリンパ腫のサブラインである（Dr. M. Takiguchi, Kumamoto University, Japan）。この細胞は，１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）および５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Gibco BRL, New York, NY, USA）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で維持した。
【００３４】
ＲＮＡ合成
ＨＣＶ２ａサブゲノムＪＦＨ−１のＮＳ３−ＮＳ５の保存配列を含むプラスミドｐＳＧＲ−ＪＦＨ１はKato ら（Gastroenterology. 2003; 125(6):1808-1817）に記載されている。プラスミドをＸｂａＩ消化により直線化し，さらにマングビーン・ヌクレアーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）で処理して４ヌクレオチドを除去して，ＨＣＶ  ｃＤＮＡの３’平滑末端を得た。消化したプラスミドＤＮＡを精製し，これをテンプレートとして，ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キット（Ambion, Austin, TX）を用いるインビトロＲＮＡ合成を行った。合成したＨＣＶサブゲノムＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（RQ1 TM RNase-free DNase, Promega, Madison, WI）で処理し，次に酸フェノール抽出を行って，残留するテンプレートＤＮＡを除去した。
【００３５】
ＲＮＡトランスフェクション
トリプシン処理したC1R-A2402細胞をＰＢＳで洗浄し，氷冷Ｃｙｔｏｍｉｘバッファ（van den Hoff MJ, et al., Nucleic Acids Res. 1992; 20(11):2902）に０．５−１ｘ１０7／ｍｌの濃度で再懸濁した。合成したレプリコンＲＮＡ（５μｇ）を４００μｌの細胞懸濁液と混合し，エレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad, Hercules, CA）に移し，Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ装置（Bio-Rad）を用いて３００Ｖ，９５０μＦでパルスを印加した。次に，トランスフェクションした細胞を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に移し，培養フラスコで培養した。トランスフェクションの１８−２４時間後に，Ｇ４１８（０．５ｍｇ／ｍｌ）（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）を培地に加えた。Ｇ４１８を補充した培地を週に２回交換した。トランスフェクションの３週間後，細胞を選択培地で１細胞／２００μｌの濃度に希釈した。９６ウエルプレートにウエルあたり１００μｌの細胞を播種し，さらに２−３週間培養した。Ｇ４１８耐性コロニーを回収し，１０ｃｍ培養皿で８０−９０％コンフルエントとなるまで増殖させて，核酸および蛋白質分析に用いた。
【００３６】
ＨＣＶ２ａ感染患者のＰＢＭＣにおけるＨＣＶ２ａ由来ペプチドを用いるＣＴＬのインビトロ誘導
ペプチド特異的ＣＴＬの検出は先の報告にしたがって行った（Maeda Y, et al., Br. J. Cancer. 2002; 87: 796-804）。簡単には，ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＣＶ２ａ感染患者のＰＢＭＣ（１Ｘ１０5細胞／ウエル）を１０μｇ／ｍｌの各ペプチドとともにＵ底９６ウエルマイクロ培養プレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で２００μｌの容量の培養液でインキュベートした。培地は，４５％ＲＰＭＩ−１６４０，４５％ＡＩＭ−Ｖ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＮＹ，ＵＳＡ），１０％ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２），および４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンからなる。３−４日ごとに培養液の半分を除去し，２０μｇ／ｍｌの対応するペプチドを含む新たな培地で置き換えた。第１５日に，ウエル中の培養細胞の半分を４つのウエルに等分した。２つのウエルは対応するペプチドでパルスしたC1R-A2402細胞でさらに刺激し，他方の２つのウエルは対照ＨＩＶペプチドでパルスしたC1R-A2402細胞で刺激した。１６−１８時間インキュベートした後，上清中のＩＦＮ−γのレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。対照ＨＩＶペプチドに応答したＩＦＮ−γ産生をバックグラウンドとして差し引いた。ＨＣＶ２ａペプチドで刺激したＰＢＭＣは，放射線照射したＨＬＡ−Ａ２４陽性バフィーコート細胞をフィーダー細胞としてさらに約２−３週間培養して，細胞傷害活性分析に十分な数の細胞を得た。
【００３７】
細胞傷害活性のアッセイ
合計１０3個の51Ｃｒ−標識標的細胞を異なるエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で，Ｕ底９６ウエルプレートのウエルで６時間培養し，上清への51Ｃｒ放出を調べた。非特異的溶解を排除するために，４０倍過剰の未標識Ｋ５６２細胞の存在下で細胞傷害性活性を調べた。抗体ブロッキング実験においては，アッセイの最初に，抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２：マウスＩｇＧ２ａ）または抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３：マウスＩｇＧ２ａ）単クローン抗体のいずれかを２０μｇ／ｍｌの濃度でウエルに加えた。いくつかの実験では，ＣＤ８単離キット（DYNAL, Oslo, Norway）を用いてＣＤ８+細胞を精製した。
【００３８】
血液単球からの樹状細胞（ＤＣ）の作成
ＰＢＭＣを培養プレートに，１０％ＦＣＳ，ＰＲＭＩ１６４０培地中４ｘ１０6細胞／ｍｌで播種し，３７℃で６０−９０分間インキュベートして，細胞を培養プレートに付着させた。付着した単球に富んだ集団を以下の培地で７日間培養した。培地は，４５％ＲＰＭＩ−１６４０，４５％ＡＩＭ−Ｖ培地，１０％ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２），１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Cosmo Bio, Tokyo, Japan），１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Cosmo Bio），および４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンからなる。この培養期間中には培地の追加または除去を行わなかった。第５日に，１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（Ｓｉｇｍａ，ＭＩ，ＵＳＡ）を培養液に加えて，ＤＣを成熟させた。第７日に細胞を回収してＤＣとして用いた。
【００３９】
健康なドナー由来ＰＢＭＣからＨＣＶ２ａペプチドでパルスしたＤＣを用いたＣＴＬの誘導
第０日に，ＤＣをＰＢＳで洗浄し，１．０ｍｌの培養液に再懸濁し，３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリン（Ｓｉｇｍａ）および１０μｇ／ｍｌのペプチドとともに３７℃で２時間インキュベートした。放射線照射（４０Ｇｙ）の後，ＤＣを１：２０の比率の非付着性ＰＢＭＣとともにさらにインキュベートした。第７，１４および２１日に，ＰＢＭＣ培養物をペプチドでパルスし放射線照射したＤＣで１：４０の比率で再刺激した。第２８日に細胞傷害活性アッセイを行った。
【００４０】
ペプチド反応性抗体の測定
ペプチド特異的ＩｇＧの血漿レベルは，先に報告されているように（Komatsu N, et al., Scand J Clin Lab Invest. 2004; 64(6):535-545），蛍光計で測定した。簡単には，製造元の方法を若干改変して，各ペプチド（０．１Ｍ  ＭＥＳバッファ中１００μｇ，ｐＨ４．５）をカラーコード化ビーズ（Luminex Corp., Austin, TX）に結合させた。希釈した血漿サンプル（１：１００，１：２００，および１：４００）を９６ウエルのフィルタープレート（NUNC, NY, USA）中で，ペプチドを結合したカラーコード化ビーズとともに，プレート振盪器（３００ｒｐｍ）で室温で２時間インキュベートした。インキュベート後，プレートを真空マニホルド装置で洗浄し，ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧとともに室温で１時間インキュベートした。次にプレートを洗浄し，ストレプトアビジン−ＰＥをウエルに加え，３０分間インキュベートした。結合したビーズを３回洗浄し，１００μｌの５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを各ウエルに加えた。５０μｌのサンプルをＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムに供した。
【００４１】
統計学
統計学的解析はスチューデントｔ検定により行った。Ｐ値が０．０５より低いものを統計学的に有意とした。
【００４２】
結果
Ｔ細胞エピトープペプチドの決定
ＨＣＶ２ａに由来するＨＬＡ−Ａ２４−結合推定ペプチドをＢＩＭＡＳソフトウエア（Bioinformatics and Molecular Analysis Section, NIH）により分析した。ペプチド結合スコアは，ＨＬＡクラスＩ分子からの解離の予測半減期に基づいて計算した (Bioinformatics and Molecular Analysis Section, Computational Bioscience and Engineering Laboratory, Division of Computer Research & Technology, NIH)。
【００４３】
これらのペプチドが，１０名のＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＣＶ２ａ感染患者のＰＢＭＣからＣＴＬを誘導する能力を調べた。患者および健康なドナーからのＰＢＭＣを各ペプチドで２週間インビトロ刺激した後に，対応するペプチドに対する反応性について試験した。ＣＴＬの誘導が認められた１１種類のペプチドおよびそのペプチド−ＭＨＣ解離の半減期のＢＩＭＡＳ結合スコアを表１に，ＣＴＬ誘導の結果を表２にそれぞれ示す。表２の値は，対応するペプチドで予めパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に応答してエフェクターＰＢＭＣから産生されたＩＦＮ−γを示す。対照ＨＩＶペプチドで予めパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対するＩＦＮ−γ応答をバックグラウンドとして差し引いた。有意な値（両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５）を下線で示す。Ｎ．Ｄ．，測定せず。
【００４４】
【表２】
2009051733.tif 000004
【００４５】
１１種類すべてのペプチドは，少なくとも１名の患者からペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができた。７種類のＨＣＶ２ａ由来ペプチド（HCV2a 576-584，HCV2a 627-635，HCV2a 649-658，HCV2a 889-897，HCV2a 1085-1094，HCV2a 1447-1456，およびHCV2a 2445-2453）は，患者の１／３以上からペプチド特異的ＣＴＬを誘導した。HCV2a 627-635ペプチドが最も効率よくペプチド特異的ＣＴＬを誘導し，このペプチドは１０名のＨＬＡ−Ａ２４陽性患者のうち７名からペプチド特異的ＣＴＬを生成した。さらに，これらの１１種類のペプチドは，健康なドナーのＰＢＭＣからもペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができた。
【００４６】
患者のＰＢＭＣから誘導されたＨＣＶ２ａペプチド特異的ＣＴＬの細胞傷害活性
ＨＶＣ２ａ感染患者のＰＢＭＣからのペプチド誘導性ＣＴＬの細胞傷害活性を調べた。対応するＨＣＶ２ａペプチド，または陰性対照としてＨＩＶペプチドでパルスしたC1R-A2402細胞に対する細胞傷害活性を，標準的な６時間51Ｃｒ−放出アッセイにより調べた。３つのペプチド（HCV2a 576-584，HCV2a 627-635，およびHCV2a 1085-1094）により誘導されたＣＴＬは，ペプチド特異的細胞傷害活性を示した。患者１，２，４および８についての代表的な結果を図１に示す。値は，３回の測定の平均であり，統計学的分析はスチューデントｔ検定により行った（＊Ｐ＜０．０５）。これらのペプチド特異的ＣＴＬは，対応するペプチドを負荷したC1R-A2402細胞に対して，対照ＨＩＶペプチドを負荷したC1R-A2402細胞に対するものと比較して有意に高いレベルの細胞傷害活性を示した。
【００４７】
上述の結果は，３つのＨＣＶ２ａ由来ペプチド（HCV2a 576-584，HCV2a 627-635，およびHCV2a 1085-1094）が，対応するペプチドおよびＨＶＣ２ａを発現する標的細胞に対して細胞傷害性を有するＣＴＬを誘導しうることを示す。これらの３つのペプチドのうち，特にHCV2a 627-635ペプチドは試験した患者の半分以上からペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができた。
【００４８】
なお，上述のペプチドは，いくつかのＨＣＶ２ａ株から選択したものである。３つのペプチド（HCV2a 576-584，HCV2a 627-635，およびHCV2a 1085-1094）について，８種類のＨＣＶ２ａ株の配列の比較を表３に示す。これらの３つのペプチドのアミノ酸配列は，それぞれ，６，５，および７種類のＨＣＶ２ａ株で保存されていた。
【００４９】
【表３】
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【００５０】
健康なドナーのＰＢＭＣから誘導されたペプチド特異的ＣＴＬの細胞傷害活性
ＨＣＶ２ａペプチドをパルスしたＤＣを用いてＨＬＡ−Ａ２４陽性の健康なドナーのＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導した。代表的な結果を図２−５に示す。
【００５１】
健康なドナーのＰＢＭＣをインビトロでＨＣＶ２ａペプチドを負荷したＤＣで刺激し，その細胞傷害活性を６時間51Ｃｒ−放出アッセイにより調べた。標的としては，対応するＨＣＶ２ａペプチドまたは対照ＨＩＶペプチドでパルスしたC1R-A2402細胞を用いた。HCV2a 576-584，HCV2a 627-635，またはHCV2a 1085-1094ペプチドでパルスしたＤＣのインビトロ刺激により，健康なドナーのＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができた（図２）。示される値は３回の測定の平均であり，統計学的解析はスチューデントｔ検定により行った（＊Ｐ＜０．０５）。
【００５２】
ＨＣＶ２ａペプチドで刺激したＰＢＭＣのＣＤ８+細胞を精製し，種々のｍＡｂの存在下で，対応するＨＣＶ２ａペプチドでパルスしたC1R-A2402細胞に対する細胞傷害活性について調べた。精製したＣＤ８+Ｔ細胞は，ペプチド特異的細胞傷害活性を示し，細胞傷害活性は抗ＨＬＡクラスＩ抗体を加えることによりブロックされたが，抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体ではブロックされなかった（図３）。これらの結果は，ペプチド特異的ＣＤ８+Ｔ細胞がＨＬＡクラスＩ拘束性の様式で細胞傷害活性を示すことを表す。
【００５３】
さらに，ＨＣＶ２ａＲＮＡで安定にトランスフェクトされたC1R-A2402細胞を樹立して，ＨＣＶ２ａペプチド特異的ＣＴＬがＨＣＶ２ａを発現するC1R-A2402細胞を殺すことができるか否かを調べた。健康なドナーからのHCV2a 1085-1094ペプチド特異的ＣＴＬが，ＨＣＶ２ａでトランスフェクションしたC1R-A2402細胞に及ぼす細胞傷害活性を６時間51Ｃｒ−放出アッセイにより測定した。51Ｃｒ−放出アッセイの結果から，３名の健康なドナーから得たHCV2a 1085-1094ペプチド特異的ＣＴＬがＨＣＶ２ａでトランスフェクトしたC1R-A2402細胞を有意に傷害したことが明らかとなった（図４）。
【００５４】
HCV2a 1085-1094ペプチドで誘導したＣＴＬの精製ＣＤ８+細胞を，種々のｍＡｂの存在下で，ＨＣＶ２ａでトランスフェクトしたC1R-A2402細胞に対する細胞傷害活性について測定した。抗ＨＬＡクラスＩ抗体を加えると細胞傷害活性はブロックされたが，抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体ではブロックされなかった（図５）。したがって，HCV2a 1085-1094ペプチドについても，ペプチド特異的ＣＤ８+Ｔ細胞がＨＬＡクラスＩ拘束性の様式で細胞傷害活性を示すことが確認された。
【００５５】
ＨＣＶ２ａでトランスフェクションしたC1R-A2402細胞およびその親細胞において，ＨＣＶ２ａ  ｍＲＮＡが発現していることを確認するために，ＲＴ−ＰＣＲを行った。５μｇの総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し，ＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いた。ＨＣＶ２ａに特異的な１組のオリゴヌクレオチドプライマー（フォワードプライマー，ヌクレオチド位置5050-5069：5'-ACACATAGACGCCCACTTCC-3'（配列番号１８）およびリバースプライマー，ヌクレオチド位置5214-5233：5'-ACGGTACAGGAGAGGTGTGG-3'（配列番号１９））をＰＣＲ増幅において用いた。ＰＣＲは，ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Promega, WI, USA）を用いて３０サイクル（１分，９５℃，１分６０℃，および１分，７２℃）実施した。対照としてβアクチンを用いた。ＰＣＲ生成物は２％アガロースゲルで分析した。その結果，ＲＴ−ＰＣＲ分析により，安定にトランスフェクトされたC1R-A2402細胞におけるＨＣＶ２ａサブゲノムＲＮＡの存在が確認された（図６）。
【００５６】
ＨＣＶ２ａ感染患者中のＨＣＶ２ａペプチドに反応性のＩｇＧ
次に，２０名のＨＣＶ２ａ感染患者および１５名の健康なドナーの血漿において，１１種類のペプチドに反応性のＩｇＧのレベルを測定した。これらの被験者には，ＨＬＡ−Ａ２４陽性および−Ａ２４陰性の両方が含まれていた。
【００５７】
図７Ａは，ＨＣＶ２ａ感染患者および健康なドナーの１：１００希釈血漿中の抗HCV2a 627-635 ＩｇＧレベルを示す。患者の抗HCV2a 627-635 ＩｇＧ（２４２．５±９５．０ＦＩＵ）は，健康なドナー（６４．０±５２．０ＦＩＵ）より有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。他の１０種類のペプチドに対するＩｇＧのレベルについては，患者と健康なドナーとの間で有意な相違はなかった。（ＦＩＵ：Fluorescence Intensity Unit，螢光強度単位）
【００５８】
HCV2a 627-635ペプチドに対するＩｇＧの特異性を確認するために，９６ウエルプレートで患者の１：１００希釈血漿サンプルを免疫ペプチド（２０μｇ／ウエル）で３７℃で２時間吸収させた。吸収工程を３回繰り返し，上清中のHCV2a 627-635ペプチドに反応性のＩｇＧのレベルをLuminex（登録商標）システムにより測定した。陰性対照としては，ＨＩＶ由来ペプチドおよび無関係なHCV2a 2850-2858ペプチドを用いた。結果を図７Ｂに示す。値は３回のアッセイの平均である。＊は統計学的に有意（ｐ＜０．０５）を示す。サンプルをＨＶＣ２ａペプチドで被覆したプレートで培養すると抗HCV2a 627-635 ＩｇＧは吸収されたが，無関係なＨＩＶペプチドまたはHCV2a 2850-2858ペプチドで被覆したプレートでは吸収されなかった。このことは，ＨＣＶ２ａ感染患者の血清中にHCV2a 627-635ペプチド特異的ＩｇＧが存在することを立証する。
【００５９】
ＨＬＡ−Ａ２４陽性の健康なドナーのＰＢＭＣからペプチドパルスＤＣを用いて誘導されたＨＣＶ２ａペプチド特異的ＣＴＬは，ＨＬＡクラスＩ拘束性にペプチド特異的細胞傷害活性を示した。さらに重要なことには，健康なドナーのＰＢＭＣから誘導されたHCV2a 1085-1094ペプチド特異的ＣＴＬは，ＨＣＶ２ａでトランスフェクトしたC1R-A2402細胞に対して細胞傷害活性を示した。この結果は，HCV2a 1085-1094ペプチドが自然にプロセシングされ，ＨＣＶ２ａ感染細胞上に提示されたことを示唆する。これらの結果を合わせると，本発明のＨＣＶ２ａペプチドは免疫原性を有しており，したがって，ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＣＶ２ａ感染患者の特異的免疫療法に有用であることが示唆される。
【００６０】
これまでに，腫瘍反応性ＣＴＬを誘導する能力があるとして同定されたいくつかのＨＬＡクラスＩ−結合性腫瘍抗原由来ペプチドがＩｇＧによっても認識されること（Ohkouchi S, et al. Tissue Antigens.2002; 59: 259-272; Kawamoto N, et al., Tissue Antigens. 2003; 61:352-361），臨床試験においてペプチドワクチンはしばしばそのペプチドに反応性のＩｇＧを誘導することが知られている（Noguchi M, et al., Prostate.2003; 57:80-92; Tanaka S, et al., J Immunother. 2003; 26:357-366）。さらに重要なことには，ワクチンペプチドに反応性のＩｇＧの誘導は，進行した癌患者の生存期間延長と正に相関していた（Mine T, et al., Cancer Science 2003; 94:548-556; Sato Y, et al., Cancer Science. 2002; 94: 802-808）。したがって，本発明のペプチドは，ＨＣＶ２ａ感染に対するペプチドワクチンとして有用であると期待される。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明のペプチドはＨＣＶ関連疾患の治療，およびＨＣＶ関連疾患の診断または進行予測に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は，ＨＣＶ２ａ感染患者のＰＢＭＣからのＨＣＶ２ａペプチド特異的ＣＴＬの細胞傷害活性を示す。
【図２】図２は，健康なドナーのＰＢＭＣからのＨＣＶ２ａペプチド特異的ＣＴＬの細胞傷害活性を示す。
【図３】図３は，健康なドナーのＰＢＭＣからのＨＣＶ２ａペプチド特異的ＣＴＬの細胞傷害活性を示す。
【図４】図４は，健康なドナーのＰＢＭＣからのＨＣＶ２ａペプチド特異的ＣＴＬの細胞傷害活性を示す。
【図５】図５は，健康なドナーのＰＢＭＣからのＨＣＶ２ａペプチド特異的ＣＴＬの細胞傷害活性を示す。
【図６】図６は，安定にトランスフェクトされたＣ１ＲＡ２４０２細胞におけるＨＣＶ２ａｍＲＮＡの発現を示す。
【図７】図７は，ＨＣＶ２ａ感染患者および健康なドナーにおけるHCV2a 627-635ペプチドに反応性のＩｇＧを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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