(57)【要約】      （修正有）【課題】心血管イベントの発症リスクの判定方法を提供する。【解決手段】対象患者由来の被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする心血管イベントの発症リスクの判定方法。心血管イベントが、心室性頻拍、重症冠硬化症及び完全房室ブロックから選ばれるものである。対象患者が、慢性動脈硬化症患者である。ＰＴＸ３濃度を経時的に２回以上測定し、２倍以上になった場合に発症リスクが高いと判定する。被検試料が、血液、血清または血漿である。被検試料が、血液、血清または血漿である。ＰＴＸ３測定試薬を含有する心室性頻拍、重症冠硬化症及び完全房室ブロックから選ばれる心血管イベントの発症リスクの診断薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象患者由来の被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする心血管イベントの発症リスクの判定方法。
【請求項２】
心血管イベントが、心室性頻拍、重症冠硬化症及び完全房室ブロックから選ばれるものである請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
対象患者が、慢性動脈硬化症患者である請求項１又は２記載の判定方法。
【請求項４】
ＰＴＸ３濃度を経時的に２回以上測定し、２倍以上になった場合に発症リスクが高いと判定する、請求項１〜３のいずれか１項記載の判定方法。
【請求項５】
被検試料が、血液、血清または血漿である請求項１〜４のいずれか１項記載の判定方法。
【請求項６】
ＰＴＸ３測定試薬を含有する心室性頻拍、重症冠硬化症及び完全房室ブロックから選ばれる心血管イベントの発症リスクの診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心血管イベントの発症リスクの判定方法および診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＴＸ３は、Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ、Ｐｅｎｔａｘｉｎ、ＴＳＧ−１４、ＭＰＴＸ３とも呼ばれ、インターロイキン１(ＩＬ−１)刺激を受けたヒト臍帯内皮細胞に発現しているものとして発見されたペントラキシン（Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ）ファミリーに属する分泌タンパク質である（非特許文献３）。
ペントラキシンファミリーはＬｏｎｇ  ＰｅｎｔｒａｘｉｎとＳｈｏｒｔ  Ｐｅｎｔｒａｘｉｎに大別される。炎症性タンパクとして知られているＣ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）やｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（ＳＡＰ）はＳｈｏｒｔ  Ｐｅｎｔｒａｘｉｎに属し、炎症により生じるＩＬ−６に反応して肝臓で産生される。しかし、ＰＴＸ３はＣＲＰやＳＡＰと異なりＩＬ−６による誘導を受けないことが知られている。（非特許文献１及び２）。
【０００３】
そして、近年、ＰＴＸ３濃度と心筋梗塞、心不全の予後との関連については報告がある（特許文献１及び２）。
従来、ＰＴＸ３濃度は、心筋梗塞発作後数時間の間に上昇し、その後さらに数日で正常値付近に下降することが知られている（非特許文献３〜５）。
更に、特許文献１において、心筋梗塞を発症した患者を３ヶ月間追跡し、心筋梗塞発症後２４時間以内のＰＴＸ３濃度によるイベント発生率の比較が行われ、その結果、イベントが発生した患者のＰＴＸ３濃度の平均値は、イベントを発生しなかった患者のＰＴＸ３濃度平均値の約２倍であったことが報告されている。ここでいうイベントとは、死亡または心不全の発症と定義されている。また、特許文献１には、患者群の三分位値の最高値群では、それ以下の患者群と比較して死亡リスクが３．８５倍（９５％信頼区間１．４７−１０．０７倍）であり、心不全発症のリスクも同じ傾向を有すると示されているが、いずれも心筋梗塞を発症して数時間から２４時間程度のいわゆる急性期におけるＰＴＸ３濃度と予後との関連を調べたものである。
【０００４】
一方、特許文献２には、ＰＴＸ３濃度と心不全の関連性について報告がなされており、ＰＴＸ３濃度と心不全の程度（ニューヨーク心臓協会の心機能分類（ＮＹＨＡ分類））との間に明確な相関関係が認められ、心不全の程度を判定できることが示されている。当該特許文献２には、心不全患者群をＰＴＸ３濃度により２群に分けると、ＰＴＸ３高値群は、低値群と比較し、心不全の悪化による死亡または再入院のリスクが高いことが示され、既に心不全を発症した患者のＰＴＸ３濃度と心不全患者の予後が関連することを示唆している。
【０００５】
ところで、世界的にも心筋梗塞や心不全等の心血管疾患による死亡は死亡原因の第一位とされ、斯様な死亡率を減少させるには、上述の如くＰＴＸ３等のマーカーを測定することによる心不全や心筋梗塞を発症した患者の予後のモニターも効果的であるが、心不全や心筋梗塞等の心血管疾患を未だ発症してない対象者、心筋梗塞を発症した後に急性期を脱し心不全に至らなかった対象者、または自覚症状のない対象者の中で心血管イベントの発症リスクが高まっている患者を見つけ出して心血管イベント発症前に治療や予防することができれば更に効果的である。
しかしながら、ＰＴＸ３濃度と心不全や心筋梗塞等の心血管疾患を未だ発症していない対象者または自覚症状のない対象者における心血管イベントの発症リスクとの関連性については全く知られていない。
【０００６】
【非特許文献１】Breviario et al.: J. Biol. Chem., 267(31), 22190-7 (1992)
【非特許文献２】Domyaku Koka (Arteriosclerosis), 24 (7-8), 375-80 (1996)
【非特許文献３】Arthritis and Rheumatism,44/12(2841-50),2001
【非特許文献４】Circulation,102,636-41(2000)
【非特許文献５】Arterioscler Thromb Vasc Biol.2002;22:e10-e14
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０１３７５４４号明細書
【特許文献２】国際公開第２００８／０１２９４１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、心血管イベントの発症リスクの判定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体を用いて血中ＰＴＸ３濃度を測定し、その濃度と種々の疾患との関係について検討してきたところ、心血管疾患を発症していない慢性動脈硬化患者を対象として各々の血中のＰＴＸ３濃度を経時的に測定すると、前回のＰＴＸ３濃度と比しＰＴＸ３濃度が２倍以上増加した患者は、心室性頻拍、重症冠硬化症または完全房室ブロックの心血管イベントを約３０％の割合で発症したことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、対象患者由来の被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする、心血管イベントの発症リスクの判定方法を提供するものである。
また、本発明は、心血管イベントが、心室性頻拍、重症冠硬化症及び完全房室ブロックから選ばれるものである上記記載の判定方法を提供するものである。
また、本発明は、対象患者が、慢性動脈硬化症患者である上記記載の判定方法を提供するものである。
また、本発明は、ＰＴＸ３濃度を経時的に２回以上測定し、２倍以上になった場合に発症リスクが高いと判定する、上記記載の判定方法を提供するものである。
また、本発明は被検試料が、血液、血清または血漿である上記記載の判定方法を提供するものである。
【００１０】
また、本発明はＰＴＸ３測定試薬を含有する心室性頻拍、重症冠硬化症及び完全房室ブロックから選ばれる心血管イベントの発症リスクの診断薬を提供するものである。
また、本発明は、ＰＴＸ３測定試薬の心室性頻拍、重症冠硬化症及び完全房室ブロックから選ばれる心血管イベントの発症リスクの診断薬製造のための使用を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、心血管疾患を未だ発症していない対象者、心筋梗塞を発症した後に急性期を脱し心不全に至らなかった対象者、または自覚症状のない対象者から心血管イベントの発症リスクの高い患者を鑑別して診断することができる。また、本発明によれば、簡便に短時間で診断することにより、斯様な心血管イベントの発症リスクの高い患者毎の適切な治療方針を策定するために有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において測定とは、定量的または非定量的な測定を含み、例えば、非定量的な測定としては、単にＰＴＸ３タンパク質が存在するか否かの測定、ＰＴＸ３タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、ＰＴＸ３タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができる。定量的な測定としては、ＰＴＸ３タンパク質の濃度の測定、ＰＴＸ３タンパク質の量の測定などを挙げることができる。なおＰＴＸ３遺伝子の塩基およびアミノ酸配列の情報はＧｅｎｂａｎｋ等の公共データベースより得ることができ、例えばＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００２８５２に開示されている。さらに、国際公開２００７／０５５３４０号パンフレット等に開示されている。
【００１３】
被検試料とは、ＰＴＸ３のタンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、肝組織などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿である。又、採取された肝組織の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
【００１４】
対象患者より被検試料を採取し、被検試料のＰＴＸ３濃度を測定し、高値もしくは対象者の経時的変化を測定し上昇が見られた場合に、心血管イベントの発症（発生）が疑われるまたは発症リスクが高いと診断することができる。
【００１５】
対象患者としては、心不全や心筋梗塞等の心血管疾患を未だ発症していない者、心筋梗塞を発症した後に急性期を脱し心不全に至らなかった者、または自覚症状のない者であるが、慢性動脈硬化症患者が好ましい。
【００１６】
心血管イベントとしては、心室性頻拍、重症冠硬化症および完全房室ブロック等の発症が挙げられる。
ここで、心室性頻拍とは、心室期外収縮が３連発以上発生する事と定義される。心拍出量の著明な減少をもたらし、心室細動に発展して死の危険を伴うため、救急治療の対象となる重症不整脈をいう（「内科学第９版」、朝倉書店、2007年、p472-480）。
また、重症冠硬化症とは、冠状動脈硬化症のうち冠動脈の７５％以上が狭窄したものをいう。
また、完全房室ブロックとは、房から心室への伝導が途絶するものをいい、第３度房室ブロックともいわれる（「内科学第９版」、朝倉書店、2007年、p482-485）。房室ブロックは、心房から心室への伝導の途絶または伝導遅延を有するものと定義される。
【００１７】
このとき心血管イベントの発症リスクを判定するために基準値を設け、当該基準値より高い場合に心血管イベントの発症リスクが高まると判定することが好ましい。例えば、当該基準値として、健常人のＰＴＸ３濃度の分布より求められた基準値や、予めカットオフ値を設定してもよく、また、測定系毎に感度・特異性等を考慮した適切な値を設定してもよい。特に、同一患者の前回採取した被検試料のＰＴＸ３濃度又は経時的にＰＴＸ３濃度を測定して得られた定常状態でのＰＴＸ３濃度を基準値として設定することが好ましい。
【００１８】
具体的には、対象患者より被検試料を採取し、被検試料のＰＴＸ３濃度を測定し、健常人のＰＴＸ３濃度の分布より求められた基準値と比較して高値であれば心血管イベントの発症（発生）のリスクが高いと判定する。
ここで、健常人のＰＴＸ３濃度の分布より求められた基準値は１．９８〜２．２８ｎｇ／ｍＬ以下であることが知られている（Inoue K et al., Aterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 27;161-167, 2007）。
【００１９】
また、同一対象患者個人のＰＴＸ３濃度の経時変動を観察し、定常状態でのＰＴＸ３濃度の平均値を基準値と定め、基準値を５０％以上上回った場合に心血管イベント発症（発生）のリスクが高いと判定することもできる。当該基準値を上回る割合を、７５％以上とするのが好ましく、特に１００％以上とするのが好ましい。この定常状態において、心不全と診断されていない患者が好ましい。
ここで、定常状態とは、初回測定値からの変動率が＋５０％（正の値に限る）を越える前までをいう。当該変動率は好ましくは＋２５％、さらに好ましくは＋１０％である。この変動率内の測定結果から定常状態の平均値を求める。
【００２０】
また、同一対象患者個人のＰＴＸ３濃度の経時変動を観察し、前回値を基準値として今回の測定値が前回値の２倍以上となった場合には、心血管イベントのリスクがあると判定してよい。
後記実施例から明らかなように、慢性動脈硬化患者で心血管疾患を発症していない者または自覚症状のない者において、ＰＴＸ３濃度の測定値が前回値の２倍以下の場合では、心血管イベントの発生率が３％程度であるが、２倍以上となった場合には心室性頻拍、重症冠硬化症又は完全房室ブロックの心血管イベントの発生率が約３０％も高まるとともに、心血管イベントを発症した患者はＰＴＸ３濃度急上昇後３ヶ月以内に発症したので、心血管疾患を発症していない者または自覚症状のない者であっても、心血管イベントの発症のリスクを予知することができる。
【００２１】
本発明方法においては、ＰＴＸ３濃度の測定は、抗ＰＴＸ３抗体を用いる免疫学的測定法が好ましい。以下、抗ＰＴＸ３抗体を用いた測定法について詳細に説明する。
【００２２】
本発明で用いられる抗ＰＴＸ３抗体はＰＴＸ３タンパク質に特異的に結合すればよい。好ましくは、ＰＴＸ３の立体構造に高い結合親和性を示し、より好ましくはＰＴＸ３の立体構造に高い結合親和性を示し、且つ、ＣＲＰやＳＡＰに交差反応しない抗体である。さらに好ましくは、ＰＰＭＸ０１０２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０３２６）、ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１９）およびＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２０）であり、最も好ましくは、ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１９）およびＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２０）である。
本明細書に記載したＰＰＭＸ０１０２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０３２６）、ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１９）およびＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２０）は平成１７（２００５）年９月２２日付で産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託したものである。
【００２３】
抗体の由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２４】
また、免疫学的測定法において支持体に固定される抗ＰＴＸ３抗体と標識物質で標識される抗ＰＴＸ３抗体はＰＴＸ３分子の同じエピトープを認識してもよいし、異なるエピトープを認識してもよい。
【００２５】
本発明で使用される抗ＰＴＸ３抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＰＴＸ３抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
【００２６】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＰＴＸ３を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００２７】
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＰＴＸ３を、入手可能な細胞の培養上清から精製して得る。あるいは、特表２００２−５０３６４２号公報に開示された方法に従い得ることもできる。
【００２８】
次に、この精製ＰＴＸ３タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ＰＴＸ３の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、当該部分ペプチドはヒトＰＴＸ３のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、ＰＴＸ３遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のＰＴＸ３をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるＰＴＸ３の部分および大きさは特に限定されない。
【００２９】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、その他、サル等が使用される。
【００３０】
感作抗原の動物への免疫は公知の方法に従って行うことができる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
【００３１】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００３２】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0（Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等が好適に使用される。
【００３３】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができる。
【００３４】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００３５】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００３６】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）溶液を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００３７】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
【００３８】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
【００３９】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＴＸ３に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＰＴＸ３への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＰＴＸ３を投与して抗ＰＴＸ３抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＰＴＸ３に対するヒト抗体を取得してもよい（ＷＯ９４／２５５８５号パンフレット、ＷＯ９３／１２２２７号パンフレット、ＷＯ９２／０３９１８号パンフレット、ＷＯ９４／０２６０２号パンフレット参照）。
【００４０】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００４１】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００４２】
これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる方法が用いられる。
【００４３】
また、これらの抗体は、ＰＴＸ３遺伝子によってコードされる蛋白質の全長または一部を認識する特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、ペプシンやパパインによりＩｇＧのＦｃ部分を消化する方法や、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
【００４４】
前記のように産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（ＧＥヘルスケア 社製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
【００４５】
抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗ＰＴＸ３抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００４６】
本発明において測定するＰＴＸ３は、特に限定されず、全長ＰＴＸ３でも、その断片でもよい。
【００４７】
被検試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗ＰＴＸ３抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法(enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ)（例えば、sandwich ELISA）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００４８】
抗ＰＴＸ３抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質を検出することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
【００４９】
本発明において用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコーン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＰＴＸ３抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
【００５０】
抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
【００５１】
本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法においては、ＰＴＸ３タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、ＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質を定量的に検出することも可能である。
【００５２】
抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質の測定の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＰＴＸ３抗体を用いる方法を挙げることができる。
【００５３】
例えば、支持体に固定された抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
【００５４】
抗ＰＴＸ３抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ(32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、131Ｉなど)、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＰＴＸ３抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
【００５５】
抗体の酵素標識法としては、ヒンジ法とノンヒンジ法の２つが挙げられるがこれに限定しない。ヒンジ法は、抗体ＩｇＧの抗原結合能を有するＦ（ａｂ’）２部分との間のヒンジ部と呼ばれる部分にあるジルスフィド結合を還元して生成するチオール基を利用してＦａｂ’と酵素分子を結合する方法である。一方、ノンヒンジ法は、抗体のいずれの反応基を利用するかは特定しないが、多くの場合、抗体のアミノ基を利用して抗体分子と酵素分子を結合する方法である。
【００５６】
具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ＰＴＸ３抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
【００５７】
本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法の特に好ましい態様として、抗体ＩｇＧの抗原結合能とは関係のないＦｃ部分を除去し、一般的な酵素標識法記載の方法で標識をした抗体を用いる方法を挙げることができる。
【００５８】
具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ペルオキシダーゼ直接標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＰＴＸ３タンパク質を検出する。
【００５９】
本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法の他の態様として、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
【００６０】
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＰＴＸ３タンパク質を、一次抗ＰＴＸ３抗体および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
【００６１】
本発明のＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＰＴＸ３抗体を感作した担体を用いてＰＴＸ３を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中に抗ＰＴＸ３抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＰＴＸ３を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。
【００６２】
本発明のＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia 社製）等のバイオセンサーを用いることによりＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を検出することが可能である。具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗ＰＴＸ３抗体に結合するＰＴＸ３タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
【００６３】
本発明の測定方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
【００６４】
本発明は、免疫組織化学染色に用いることもできる。バイオプシーや手術によって得られた組織を当業者に公知の方法で抗ＰＴＸ３抗体を用いて染色することができる。
【００６５】
本発明は、心血管イベントの発症リスクの判定を行う診断薬の提供をも目的とするが、該診断薬は抗ＰＴＸ３抗体を含むことが好ましい。ここで診断薬には、キットも含まれる。該診断薬がＥＬＩＳＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
【００６７】
＜実施例１  ＥＬＩＳＡ法によるＰＴＸ３濃度の測定＞
血中のＰＴＸ３タンパク質を検出するため、ＰＴＸ３のサンドイッチＥＬＩＳＡ系を以下のように構築した。すなわち、９６ウェルプレートにコートする抗体には、ＷＯ２００７／０５５３４０に従って調製したＦ（ａｂ’）２化ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１９）を５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ｗｅｌｌ、４℃、一晩インキュベーションし固相化を行った。
翌日３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄緩衝液（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）で３回洗浄後、ＡＢＩ社のイムノアッセイスタビライザー（ＡＢＩ  ＃１０−６０１−００１）を１５０μＬ加え、ブロッキングを行い、４℃で一晩保管した。
血漿を、動物血清などを含む希釈緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で適当に希釈したものを加え２時間室温でインキュベートした。次いで、動物血清などを含むＰＢＳ（−）で２０μｇ／ｍＬとなるように希釈したＨＲＰＯ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識Ｆａｂ’化ＰＰＭＸ０１０５抗体を加え２時間室温でインキュベートした。反応液を捨てた後、３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄緩衝液で５回洗浄した後、添付のプロトコールに従いＳｃｙｔｅｋ社のＴＭＢ（Ｃａｔ＃ＴＭ４９９９）を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。サンプル中のＰＴＸ３タンパク質濃度の換算には、表計算ソフトＧｌａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（ＧｌａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．ｖｅｒ．３．０）を用いて解析した。
【００６８】
＜実施例２  対象＞
日本国内の循環器クリニック２施設を受診した動脈硬化を有する患者を対象とした。少なくとも６ヶ月に１回、血圧、空腹時血糖、血清総コレステロール（ＴＣＨＯ）、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、ヘモグロビンＡ1c、ＣＲＰの測定を行った。
また、初回受診時には、上腕動脈波伝搬速度（ｂａＰＷＶ）を仰臥位で５分間の安静後に測定した（Ｆｏｒｍ  ＰＷＶ／ＡＢＩ、日本コーリン社製）。また、頚動脈内膜―中膜肥厚度（ＩＭＴ）を平均周波数１０ＭＨｚのリニアプローブを用いて頚動脈内膜―中膜複合体の最大厚を計測した。
上腕動脈波伝搬速度（ｂａＰＷＶ）１４００ｍｍ／ｓｅｃ以上、もしくは頚動脈内膜―中膜複合体１ｍｍ以上の患者を動脈硬化を有する患者であると判定し、解析の対象とした。
心血管イベントのリスクファクターとして知られる因子とＰＴＸ３、ＣＲＰ濃度それぞれとの関連を表１に示す。各リスクファクターの高リスク群と低リスク群との間でＰＴＸ３濃度に有意な差は認められなかった。ＰＴＸ３はこれらとは独立した危険因子であると予測された。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
＜実施例３  ＰＴＸ３濃度の経時変化と心血管イベントのリスク＞
ＰＴＸ３濃度を経時的に測定し、ある時点でのＰＴＸ３濃度が初回測定値の２倍以上になった対象者群をＰＴＸ３上昇率≧２．０群、２倍未満であった患者群をＰＴＸ３上昇率＜２．０群として心血管イベント発生の有無を６ヶ月間追跡し比較した。
ＰＴＸ３上昇率≧２．０群では心室性頻拍、重症冠硬化症、完全房室ブロックが観察された。
心室性頻拍の症例では、ＰＴＸ３濃度が２．０１ｎｇ／ｍＬから４．１０ｎｇ／ｍＬと２．０４倍に上昇し、上昇が認められてから６ヵ月後に心室性頻拍と診断された。診断前には心室性頻拍の症状は発現していないことが確認されている。
重症冠硬化症の症例では、ＰＴＸ３濃度が１．６３ｎｇ／ｍＬから３．７９ｎｇ／ｍＬと２．３３倍に上昇した。ＰＴＸ３上昇前のトレッドミル負荷心電図は陰性であったが、上昇を確認されたときと同時期に施行されたトレッドミル負荷心電図では陽性所見を認めたため、冠動脈ＣＴ検査を行った結果、左前下行枝に有意所見を認めたため冠動脈造影検査を施行され重症冠硬化症と診断された（その際経皮的冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）を施行されている）。
完全房室ブロックの症例では、ＰＴＸ３濃度が１．１９ｎｇ／ｍＬから３．３６ｎｇ／ｍＬと２．８２倍に上昇し、上昇が認められてから５ヶ月後に完全房室ブロックを発症した。発症以前には房室ブロックの兆候は全く認められなかった。
ＰＴＸ３上昇率≧２．０群とＰＴＸ３上昇率＜２．０群の心血管イベントの発症リスクを比較すると、ＰＴＸ３上昇率≧２．０群では２３４例中７例（３．０％）であり、ステューデントのｔ検定を行ったところ、ｐ＜０．０００１と有意差が認められた。