(57)【要約】【課題】４倍体胚をホストとする非ヒトＥＳ動物の作成方法において、効率的に非ヒトＥＳ動物を得る方法を開発する。【解決手段】本発明は、非ヒトＥＳ動物を作成する方法であって、３個または４個の４倍体胚にＥＳ細胞を移入してキメラ胚を作成し、次いでキメラ胚を偽妊娠非ヒト動物に移植することを含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒトＥＳ動物を作成する方法であって、下記工程：
（ａ）３個または４個の４倍体胚にＥＳ細胞を移入してキメラ胚を作成すること；次いで
（ｂ）該キメラ胚を偽妊娠非ヒト動物に移植すること
を含む方法。
【請求項２】
該４倍体胚が３個である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該４倍体胚の発生時期が２細胞期または４細胞期である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該ＥＳ細胞が近交系のＥＳ細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により得られうる、非ヒトＥＳ動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４倍体胚をホストとして用いる非ヒトＥＳ動物の作成方法およびその方法により作成された動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子改変動物の作成による遺伝子機能の解析は、基礎生物学および医学分野の発展に大きな貢献を果たしてきた。遺伝子改変は主にＥＳ細胞において行われ、遺伝子改変動物を作成するためには、遺伝子改変後のＥＳ細胞を生殖細胞に分化させる必要がある。一般的に、ＥＳ細胞の生殖細胞への分化は、キメラ動物を作成することにより行われている。すなわち、ＥＳ細胞（ドナー）を初期胚（ホスト）へ注入させることによりキメラ動物を作出し、キメラ個体内でドナー由来の生殖細胞分化を誘導するという方法である（非特許文献１）。しかしながら、この方法ではホスト由来の生殖細胞も数多く存在するため、ＥＳ細胞由来の子孫を得るために多数の交配が必要な場合が多く、遺伝子改変動物の作出において大きな障壁となっていた。
【０００３】
この問題を回避するため、４倍体胚由来の胚をホストとして用いる方法が開発されてきた。４倍体胚由来の細胞は体を構成する細胞へ分化できないが、胎盤を形成できることが知られている。この特徴を利用してＥＳ細胞と４倍体胚のキメラ胚を作出すると、その産仔の胎盤は４倍体胚由来で、体は全てＥＳ細胞由来となる（以下「ＥＳ動物」という）。ＥＳ動物ではほぼ全ての細胞がＥＳ細胞由来であるため、その生殖細胞も全てＥＳ細胞由来となる（非特許文献２および３）。このようにＥＳ動物を作出することにより、ＥＳ細胞由来の産仔を効率的に得ることが可能であるが、この技術の問題点はＥＳ動物の作成効率自身が非常に低いことであった。なお、本明細書において「ＥＳ動物」とは、ＥＳ細胞および４倍体胚から作成されるキメラ胚に由来し、体が実質的に全てＥＳ細胞に由来する細胞からなる動物をいう。
【０００４】
これまでにＥＳ動物の作成効率を改善するために行われてきた方法は、主にＥＳ細胞の樹立という観点からであった。例えば、Ｆ１由来のＥＳ細胞を樹立することにより、ＥＳ動物の作成効率の改善が可能であると報告されている（非特許文献４）。この方法により確かにＥＳ動物の作成効率は改善したが、この方法ではこれまで樹立されているＥＳ細胞には適用できない。すなわち、大部分のＥＳ細胞に対しては依然として有効な方法は存在していなかった。
【非特許文献１】Capecchi MR. The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting. Trends Genet 1989;5:70-76
【非特許文献２】Nagy A, Gocza E, Diaz EM et al. Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse. Development 1990;110:815-821
【非特許文献３】Nagy A, Rossant J, Nagy R et al. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:8424-8428
【非特許文献４】Eggan K, Akutsu H, Loring J et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:6209-6214
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の解決課題は、４倍体胚をホストとする非ヒトＥＳ動物の作成方法において、効率的に非ヒトＥＳ動物を得る方法の開発であり、かつこれまでに樹立されているあらゆるＥＳ細胞に対して適用可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして驚くべきことに、３個または４個の４倍体胚にＥＳ細胞を移入する方法を試みたところ、ホストとして使用する４倍体胚の機能が大幅に改善されることを見出した。さらに、本発明者らは、この方法がこれまで樹立されているＥＳ細胞に適用されうることを示した。
【０００７】
すなわち、本発明は：
（１）非ヒトＥＳ動物を作成する方法であって、下記工程：
（ａ）３個または４個の４倍体胚にＥＳ細胞を移入してキメラ胚を作成すること；次いで
（ｂ）該キメラ胚を偽妊娠非ヒト動物に移植すること
を含む方法、
（２）該４倍体胚が３個である、（１）に記載の方法、
（３）該４倍体胚の発生時期が２細胞期または４細胞期である、（１）または（２）に記載の方法、
（４）該ＥＳ細胞が近交系のＥＳ細胞である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法、
（５）（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法により得られうる、非ヒトＥＳ動物を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、きわめて効率的に非ヒトＥＳ動物を得ることができ（従来法と比べて数倍の効率）、しかも従来は困難とされていた近交系ＥＳ細胞などからでもＥＳ動物を作成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、非ヒトＥＳ動物の作成方法に関するものである。本発明の方法に使用される動物はヒトを除く動物であってよいが、好ましいのは哺乳類である。適する動物の例として、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ならびにアカゲザル、チンパンジーなどの霊長類が挙げられるが、これらだけに限定されない。現在、トランスジェニック動物やノックアウト動物に関して研究が進んでいる実験動物としてマウスが挙げられ、本発明の方法を適用するのに最も好ましい動物の一例である。
【００１０】
本発明の方法を、手順を追って説明する。
本発明では、まず、ホスト胚として４倍体胚を作成する。ここで、「ホスト」とはＥＳ細胞を導入する動物と同種類の動物に由来することをいう。４倍体胚は、当業者間で周知の方法によって作成することができ、例えば、胚の融合によって得られてよい。胚の融合を、電気融合法、注入法などのごとき一般的な手法を用いて行ってもよい。本発明で用いられうる胚の融合の方法は、好ましくは電気融合法である。また、電気融合を、当該技術分野で一般的に用いられる電気融合装置を用いて行ってもよい。一般的な電気融合では、例えば、複数の２細胞期胚を直線状に並べ、両側を平行二重電極で挟み、電気融合を行ってよい。その後、電気融合に成功した胚を選別し、培養して４倍体胚を得ることができる。４倍体胚の培養は、例えば、ＣＺＢ培地にて一晩行ってもよい。これらの条件は当業者が適宜定めうる。
【００１１】
本発明では、例えば、４倍体胚を２種類の胚を融合して作成してもよい。一方の胚を、当該技術分野において一般的な手法である顕微授精（ＩＶＦ）を用いて作成してもよい。例えば、ＢＤＦ１マウスの精子および卵子から、ＩＶＦにより胚を得てもよい。ここで、「ＢＤＦ１マウス」はＣ５７ＢＬ／６の雌とＤＢＡ／２Ｎの雄の交配によって作出される当該技術分野で一般的な系統をいう。ＩＶＦは、例えば、卵子を過排卵処理を施した雌から採取し、ＴＹＨ培地にて培養し、精子を約１×１０５細胞／ｍｌのごとき一定濃度となるように添加して行うことができる。その後、授精した胚を培養して２細胞期の胚を得てもよい。この時の培養は、例えば、ＣＺＢ培地にて２４時間行ってもよい（Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD et al. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 1989;86:679-688）。もう一方の胚を、例えば、動物を交配させることにより得てもよい。例えば、ＩＣＲマウスの雄および雌を一晩交配させ、翌朝交配を確認し、その２４時間後に卵管を採取して２細胞期の胚を回収することにより胚を得てもよい。「ＩＣＲマウス」とは、一般的に使用される系統のマウスで、仔を多く産み、子育てを得意とする性質を有する。好ましくは、ＩＣＲマウスの雄がＧＦＰ遺伝子を有する。例えば、ｐＣＡＧ−ＥＧＦＰベクターを有するＩＣＲバックグランドのＧＦＰトランスジェニックマウス（ＩＣＲＧＦＰ）を含むが、これだけに限らない。これにより、ＥＳ動物を作成した際に、ホスト４倍体胚に由来する細胞をＧＦＰタンパク質の発現で確認できることが好ましい。
【００１２】
また、本発明に用いられる４倍体胚は、１種類のみの胚から作成されてもよい。１種類の胚は、例えば、前記のようにＩＶＦまたは交配により作成される２細胞期の胚を含んでよいが、それらだけに限らない。所望により胚の融合は前記の方法と同様に行ってもよい。
【００１３】
次いで、４倍体胚をディッシュなどの適当な容器に入れ、ＥＳ細胞を移入し、培養してキメラ胚を作成する。４倍体胚をホストとしてＥＳ動物を作成する際に、一般的には、１個または２個の４倍体胚が使用されている（非特許文献２および３）。本発明における４倍体胚の個数は、好ましくは３個または４個であり、最も好ましくは３個である。本発明において、３個の４倍体胚をホストとしてＥＳ動物を作成する場合には、１個または２個の４倍体胚を用いる場合に比較して、目的とするＥＳ動物の作成効率が２．５〜８．５倍程度上昇する。一方、５個またはそれ以上の４倍体胚を用いる場合には、ＥＳ動物の作成効率は３個または４個の場合より低下する。また、本発明で用いられる４倍体胚の発生時期は、電気融合直後の１細胞期以上であってよく、好ましくは、２細胞期から柔実胚期までである。最も好ましくは、４倍体胚の発生時期が２細胞期または４細胞期である。本発明では、４倍体胚を適当な容器に入れる前に、アシッドタイロード溶液などの当業者間で一般的な溶液を用いて透明帯を除去してもよい。本発明において、ＥＳ細胞の移入工程でディッシュを用いる場合には、当該分野で一般的に用いられるものであってよく、例えば、プラスチックディッシュを用いてもよい。その場合において、好ましくは１ウェルごとに小さな窪みを作成し、ＥＳ細胞の移入の際に４倍体胚を支持できるようにすることにより作成効率を向上させることができる。従って、本発明は、このような４倍体胚を支持できる窪みを有する容器、ならびに該容器を必須構成成分として含むＥＳ動物作成用キットなども提供する。
【００１４】
本明細書で用いられる「ＥＳ細胞」は、胚盤胞期の受精卵の内部細胞魂（ＩＣＭ）に由来する、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞を意味する。これまで、ホストとして４倍体胚を用いる効率的なＥＳ動物の作成においては、樹立されたＦ１由来のＥＳ細胞が使用されている（非特許文献４）。しかし、本発明では、ＥＳ細胞はあらゆる種類のものであってよく、当業者間で一般的に用いられるものを適用することができる。例えば、Ｅ１４、Ｒ１またＡＢ−１などの１２９系統に由来する細胞株、あるいはＴＴ２などの市販されている細胞株を含むが、これだけに限らない。また、本発明で用いるＥＳ細胞は、近交系または交雑系に由来する上記のごとき一般的なＥＳ細胞株であってよく、好ましくは近交系に由来するものである。本明細書で用いられる「近交系」とは、２０世代またはそれ以上にわたり兄妹交配が行われてきた系統のことをいう。また、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１、ＢＤｍｔ２またはＤＦＣ３Ｈのごとき核移植胚由来のＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）を本発明の方法に用いることができる。これらのｎｔＥＳ細胞は発明者らの研究室にて樹立された。ここで、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１はＧＦＰを発現する１２９Ｂ６Ｆ１系統のセルトリ細胞であり、ＢＤｍｔ２はＢＤＦ１系統の繊維芽細胞を用いた核移植胚由来のｎｔＥＳ細胞であり、ならびにＤＦＣ３ＨはＣ３Ｈの脳細胞から樹立した近交系に由来するｎｔＥＳ細胞である。
【００１５】
さらに、本発明に用いられうるＥＳ細胞は、ＥＳ細胞に類似した性質（本発明でドナーのＥＳ細胞として用いることができる性質）を有する細胞であってもよく、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などを含むが、それだけに限らない。
【００１６】
また、本発明に用いられるＥＳ細胞において、特定の遺伝子が導入されているか、または特定の遺伝子がノックアウトされていてもよい。
【００１７】
ＥＳ細胞を適当な条件で培養してから、４倍体胚に移入することができる。ＥＳ細胞の培養は、当該技術分野において一般的な方法を用いて行われてよい。例えば、基本培地として、KNOCKOUT（登録商標）DMEM（Invitrogen, CA, USA）を用いてよい。また、添加物として２０％胎児ウシ血清（Sigma-Aldrich, MO, USA）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）（１０００ユニット／ｍｌ，Invitrogen）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（invitrogen）、１％Ｌ−グルタミン（Specialty Media, NJ, USA）、１％  非必須アミノ酸（Specialty Media）、１％  ヌクレオシド（Specialty Media）、または１％  β−メルカプトエタノール（Specialty Media）を添加して培養したものであってよい。
【００１８】
また、本発明では、ＥＳ細胞の培養は、ゼラチンでコートしたディッシュ（フィーダー細胞非存在）上で行われてもよい。
【００１９】
本発明では、４倍体胚に移入されるＥＳ細胞の数は、１個以上であってよい。また、４倍体胚に移入されるＥＳ細胞の数は、好ましくは８〜１５個である。移入されるＥＳ細胞は細胞塊として移入されてよい。本発明における移入は、例えば、ＥＳ細胞を４倍体胚に接触させる、あるいは注入することによって行ってもよい。これらの操作は、顕微鏡またはマイクロマニピュレータを使って行われるのが一般的である。
【００２０】
本明細書で用いられる「キメラ胚」は、由来の異なる２個以上の胚由来の細胞の結合により得られた胚を意味する。本発明に用いられうるキメラ胚は、好ましくは３個または４個の４倍体胚にＥＳ細胞を移入して培養した胚である。キメラ胚の培養は、例えば、ＣＺＢ培地にて約２４時間行われてよい。これらの条件は当業者が適宜定めうる。
【００２１】
次に、３個または４個の４倍体胚にＥＳ細胞を移入し、適当な条件で培養することにより得られたキメラ胚を偽妊娠非ヒト動物に移植して、子供を産ませ、ＥＳ動物を得る。キメラ胚を、偽妊娠非ヒト動物の卵管内または子宮内に移植してもよい。偽妊娠非ヒト動物は、ＥＳ細胞が由来する動物と同種の動物であればよく、系統が異なっていてもまたは同一であってもよい。例えば、偽妊娠非ヒト動物は、偽妊娠２．５日目のＩＣＲマウスであってもよいが、これだけに限定しない。本発明で用いられるキメラ胚の移植は、当業者間で一般的に用いられる方法によって行われうる。次いで、当業者間で一般的な方法に従って仮親（キメラ胚を移植された偽妊娠非ヒト動物）を飼育し、出産させてＥＳ動物を得ることができる。
【００２２】
前記のごとく、３個または４個、とりわけ３個の４倍体胚をホストとしてＥＳ動物を作成すると、従来の方法と比較して作成効率を高めることができる。また、この本発明の方法では、あらゆるＥＳ細胞が使用でき、例えば近交系由来のＥＳ細胞でも使用可能という利点を有する。さらに本発明の方法により得られたＥＳ動物は、奇形頻度が従来のＥＳマウスと同程度であり、十分に実用に供することができる。
【００２３】
次に、下記の実施例に用いた主な材料および方法を示すが、本発明を限定するものではない。
【００２４】
使用したマウスおよびＥＳ細胞
ＢＤＦ１およびＩＣＲマウスはＳＬＣ（浜松、日本）から購入し使用した。ＩＣＲバックグラウンドのＧＦＰトランスジェニックマウスはｐＣＡＧ−ＥＧＦＰをベクターとして以前発明者らの研究室で樹立したものを使用した。使用したＥＳ細胞は４種類で、一般的なＥＳ細胞としてＥ１４（Hooper M, Hardy K, Handyside A et al. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature 1987;326:292-295）、核移植胚由来のＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）として、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１、ＢＤｍｔ２およびＤＦＣ３Ｈを使用した。Ｅ１４は、１９８５年にＭａｒｔｉｎ  Ｈｏｏｐｅｒ博士（Edinburgh, Scotland）らにより樹立され、Ｐｅｔｅｒ  Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ博士（Rockefeller University）が培養・保存していたものを分与して頂いた。１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１は、ＧＦＰを発現する１２９Ｂ６Ｆ１系統のセルトリ細胞、ＢＤｍｔ２はＢＤＦ１系統の繊維芽細胞を用いた核移植胚由来のｎｔＥＳ細胞で、以前発明者らの研究室で樹立されたものを使用した。また近交系由来のｎｔＥＳ細胞として、Ｃ３Ｈの脳細胞から樹立したｎｔＥＳ細胞（ＤＦＣ３Ｈ）を１０株ランダムにＥＳマウスの作成に使用した。
【００２５】
ＥＳ細胞の培養条件
ＥＳ細胞の培養は一般的な条件に従って行った。基本培地としてKNOCKOUT（登録商標）DMEM（Invitrogen, CA, USA）を用い、下記の添加物を加えたものを培養液として使用した：２０％胎児ウシ血清（Sigma-Aldrich,MO,USA）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）（１０００ユニット／ｍｌ，Invitrogen）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（invitrogen）、１％  Ｌ−グルタミン（Specialty Media, NJ, USA）、１％  非必須アミノ酸（Specialty Media）、１％  ヌクレオシド（Specialty Media）、１％  β−メルカプトエタノール（Specialty Media）。ＥＳ細胞はゼラチンコートを施したディッシュ上においてフィーダー細胞非存在下で培養した。
【００２６】
４倍体胚の作成とＥＳマウスの作成
本実験で使用した４倍体胚は２種類の胚から作成した。１つはＢＤＦ１の精子と卵子を顕微授精（ＩＶＦ）させた胚（ＢＤＦ２）であり、もう１つはＩＣＲＧＦＰ雄とＩＣＲ雌を交配させた胚を使用した。後者の胚（ＩＣＲＧＦＰ）ではＧＦＰを発現するため、４倍体胚に由来する細胞の存在を緑色蛍光により確認できる。ＩＶＦは一般的に用いられている方法を用いて行った。具体的には、ＢＤＦ１マウスの精巣上体尾部から精子を回収し、ＴＹＨ培地（Toyoda Y, Yokoyama M, Hoshi T. Studies on fertilization of mouse eggs in vitro: I. In vitro fertilization of eggs by fresh epididymal sperm. Jpn J Anim Reprod 1971;16:147151）にて培養した。卵子は過排卵処理を施した雌ＢＤＦ１から採取し、ＴＹＨ培地を用いて培養した。ここに精子を１ｘ１０５細胞／ｍｌになるように添加することによりＩＶＦを行った。ＩＶＦ後、授精した胚を回収し、２細胞期胚を得るため、ＣＺＢ培地（Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD et al. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 1989;86:679-688）において２４時間培養した。一方、ＩＣＲＧＦＰ胚を得るためには、過排卵処理を施したメスＩＣＲと、オスＩＣＲＧＦＰマウスを一晩交配させた。翌朝、交配を確認し、その２４時間後に卵管を採取し、２細胞期の胚を回収した。ＢＤＦ２およびＩＣＲＧＦＰの２細胞期の胚を、電気融合装置（Model LF101、ネッパジーン（株）、千葉）を用いて電気融合させ、４倍体胚を作成した。電気融合に成功した胚を選別し、ＣＺＢ培地にて一晩培養した。
【００２７】
２〜４細胞期に発生した４倍体胚を選別し、アシッドタイロード溶液を用いて透明帯を除去した。次いで、プラスチックディッシュ上に作成した小さな窪みに、１個（１ｘ）から３個（３ｘ）の４倍体胚を入れた。さらにその上から８〜１５個のＥＳ細胞の細胞塊を入れることにより、ＥＳ細胞と４倍体胚のキメラ胚を作成した。ＣＺＢ培地にて２４時間培養後、得られたキメラ胚を偽妊娠マウス（偽妊娠２．５日目）の子宮内に戻した。これらのマウスを妊娠１８日目で帝王切開し、産仔の有無を解析した。
【００２８】
胚盤胞期胚の細胞数の解析
胚盤胞期の細胞数を数えるため、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色およびＣｄｘ２の免疫染色を行った。ＰＩでは全ての細胞が染まるため、全細胞数の指標として使用し、抗Ｃｄｘ２抗体では栄養外胚葉（ＴＥ）細胞のみが染まるため、ＴＥ細胞の細胞数の指標として使用した。細胞内部魂（ＩＣＭ）の細胞数を、全細胞数（ＰＩ陽性細胞）からＴＥ細胞数（Ｃｄｘ２陽性細胞）を差し引いた細胞数として計算した。具体的には、１ｘから３ｘの４倍体胚を胚盤胞期まで発生させ、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し（室温で４５分間）、ＰＢＳで３回洗浄後、抗Ｃｄｘ２抗体（１：２００； BioGenex, CA, USA）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、２次抗体（goat anti-mouse IgG conjugated with Alexa Fluor 488; Molecular Probes, Eugene, OR, USA）と室温で３０分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、１μｇ／ｍｌのＰＩ溶液に移し、共焦点顕微鏡を用いてそれぞれの胚盤胞期胚を撮影した。細胞数のカウントには、焦点写真をMetaMorph software（Universal Imaging Co., Downingtown, PA, USA）を用いて立体構築し、ＰＩ陽性細胞数およびＴＥ陽性細胞数をカウントした。この解析には、正常胚（１ｘ２ｎ）および１ｘないし３ｘの４倍体胚に由来する胚盤胞期の胚をそれぞれ１０個ずつ使用してカウントした。
【００２９】
新生仔ＥＳマウスの解析
ＥＳマウスを妊娠１８日目で帝王切開し、体重、胎盤重量の測定、および奇形（腹部ヘルニア、開眼、巨大産仔）の有無を観察した。また、ホストとしてＩＣＲＧＦＰの４倍体胚を用いた実験では、ＥＳマウスにおいて４倍体胚由来の細胞の有無を調べるため、ＥＳマウスの肝臓および脳組織を用いてフローサイトメトリーを行った。具体的には、新生仔ＥＳマウスから肝臓および脳を摘出し、ハサミで細切後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で培養した（３７℃で１５分間）。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを等量添加後、遠心分離し（３００ｇで７分間）、上清を捨てた後、ＰＢＳで同様に２回洗浄した。細胞を１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭに懸濁し、フローサイトメトリーに使用した。フローサイトメトリーにはＦＡＣＳａｒｉａ（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）を用い、それぞれの組織における主要細胞群を側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）を指標として同定した。主要細胞群中のＧＦＰ陽性細胞数を測定することにより、４倍体胚由来の細胞を同定した。
【００３０】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例】
【００３１】
Ａ．倍化ＥＳマウスの出産率の比較
本実験の目的は、複数の４倍体胚を用いることによりＥＳマウスの作成効率の向上を図ることである。そのためにまず、正常胚を用いて、倍化胚（３ｘおよび５ｘ）を作成し、その発生能を解析した。その結果、３ｘ正常胚では正常な範囲内で産仔を得ることに成功したが（５０％；８／１６）、５ｘ正常胚からは産仔を得るにいたらなかった（０％；０／８）。以上の結果から、過剰な胚の数は発生能を障害することが示唆された。この結果を元に本実験では１ｘから３ｘの４倍体胚とＥＳ細胞のキメラ胚を作成し、ＥＳマウスの出産率を比較検討した。
【００３２】
Ｂ．倍化４倍体胚の細胞数の解析
ＥＳマウスの作成の前に、まず、倍化した４倍体胚の細胞数が実際に増加しているのかを検討した。授精後９６時間の１ｘから３ｘの４倍体胚をそれぞれ１０個ずつＰＩとＣｄｘ２の２重染色を行った。以前の報告（Koizumi N, Fukuta K. Preimplantation development of tetraploid mouse embryo produced by cytochalasin B. Exp Anim. 1995;44(2):105-109）と一致して、１ｘ４倍体胚では正常胚（１ｘ２ｎ）と比較して総細胞数の減少が認められた（表１および図１Ａ−Ａ”、Ｄ−Ｄ”）。一方で、２ｘ４倍体胚および３ｘ４倍体胚では、総細胞数の増加が確認された（表１および図１Ｂ−Ｂ”、Ｃ−Ｃ”）。これらの２ｘ４倍体胚および３ｘ４倍体胚では、ＴＥ細胞数およびＩＣＭ細胞数もそれぞれ増加していることが示された（表１）。また、３ｘ４倍体胚を抗Ｏｃｔ３／４抗体で免疫染色したところ、正常にＩＣＭ細胞が染色された（図１Ｅ−Ｅ”）。以上の結果から、胚盤胞期の倍化４倍体胚では、予想通り細胞数が増加しており（表１）、ＩＣＭなどへの分化も正常に行われることが証明された（図１Ｅ−Ｅ”）。
（表１．倍化４倍体胚の細胞数の解析）
【表１】
2009159878.tif 000002
【００３３】
Ｃ．倍化４倍体胚を用いたＥＳマウスの作成効率の検討
先の実験で倍化４倍体胚の細胞数の増加が確認されたので、次にＥＳマウスの作成効率の検討を行った。使用したＥＳ細胞は、一般的なＥＳ細胞株であるＥ１４、ｎｔＥＳ細胞として１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１（ＧＦＰ陽性）およびＢＤｍｔ２、ならびに近交系由来のＥＳ細胞株としてＤＦＣ３Ｈ（合計１０株をランダムに使用）を用いた。図２に示したように、ＧＦＰを発現する１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１を用いてキメラ胚を作成したところ、３ｘ４倍体胚にＥＳ細胞が正常に取り込まれることが示された（図２Ｄ−Ｆ）。
【００３４】
次に、各ＥＳ細胞と１ｘないし３ｘの４倍体胚とのキメラ胚を作成し、胚移植後の発生能の検討を行った。１ｘおよび２ｘ４倍体胚をホスト胚として用いた場合では、３系統のＥＳ細胞（Ｅ１４、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１およびＢＤｍｔ２）は、ＥＳマウスの作成効率が約１−３％と非常に低頻度であった（表２）。一方、３ｘ４倍体胚を用いた場合では、その作成効率が約２．５−８．５倍に向上した（８．６％：表２）。また、従来作成が困難と考えられていた近交系由来のＥＳマウスでも、３ｘ４倍体胚を用いることにより約７％の成功率で作成可能であることが示された（表２）。
【００３５】
以上の結果から、２ｘ４倍体胚では正常胚と同程度の細胞数を有するが（表１）、ＥＳマウスの作成効率は、３ｘ４倍体胚を使用したものが最も効率がよく（表２）、従来法の１ｘもしくは２ｘ４倍体胚では不十分であることが示された。
（表２．倍化４倍体胚を用いたＥＳマウスの作成効率の検討）
【表２】
2009159878.tif 000003
*:E14;一般的に用いられているES細胞。129B6F1G1およびBDmt2;ntES細胞。DFC3H;近交系由来ntES細胞。
【００３６】
Ｄ．倍化４倍体胚より作成された新生仔ＥＳマウスの解析
ＥＳマウスは奇形仔の頻度が高いことが知られているので、次に３ｘ４倍体胚より作成されたＥＳマウスの表現型を観察した。３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスは、体重・胎盤重量とも１ｘまたは２ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスと同程度であった（表３）。また開眼・腹部ヘルニア・巨大産仔の出現率なども差は認められなかった（表３）。以上の結果から、３ｘ４倍体胚を用いた場合であってもＥＳマウスの奇形頻度は、少なくとも従来のＥＳマウスと同程度であることが示された。
【００３７】
ＥＳマウスの最大の特徴は、体を構成しているほぼ全ての細胞がＥＳ細胞由来であるという点である。表１に示したように、３ｘ４倍体胚では、総細胞数のみならず、体を構成しうるＩＣＭ細胞も増加している。最後に、３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスが実際にＥＳ細胞由来の細胞で構成されているかを検討した。
【００３８】
ホストである４倍体胚由来の細胞とＥＳ細胞を区別するため、ＥＳ細胞にはＥ１４、ホストにはＩＣＲＧＦＰ由来の４倍体胚を使用した。このことにより、４倍体胚由来の細胞がＧＦＰを発現するため、ＥＳマウスにて４倍体由来の細胞を容易に確認することが可能となる。この方法を用いて、３ｘ４倍体胚から合計１５匹のＥＳマウスを作成し、蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。図３に示すように、得られた１５匹すべてにおいて、胎盤でＧＦＰが発現し、産仔では発現していなかった（図３Ａ−Ｃ）。これらの結果から、３ｘ４倍体胚を使用してもＥＳマウスに４倍体胚由来の細胞が大きく混入する可能性は低いと考えられる。次に、より詳細な解析を行うため、フローサイトメトリーによるＧＦＰ細胞の検出を行った。１ｘおよび３ｘ４倍体胚より作成したＥＳマウスをそれぞれ２匹ずつ使用し、脳および肝臓におけるＧＦＰ陽性細胞を検出した。解析の結果、１ｘおよび３ｘ４  
【００３９】
倍体胚由来のＥＳマウスとも、４倍体胚由来のＧＦＰ細胞の混入率は１％未満であった。
以上の結果から、３ｘ４倍体胚を用いたＥＳマウスは、従来法に由来するＥＳマウスと同様に、ほぼ全ての構成細胞がＥＳ細胞由来であることが証明された。
（表３、ＥＳマウスの表現型の解析）
【表３】
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a平均±SD(g)。
bOE:開眼、AH:腹部ヘルニア、LO:巨大産仔、OELO:開眼および巨大産仔を併発した仔、OEAH:開眼および腹部ヘルニアを併発した仔。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、トランスジェニック動物やノックアウト動物のごとき遺伝子改変非ヒト動物を効率的に作成する方法およびこの方法により作成された遺伝子改変非ヒト動物を提供する。そのため、病理学的な研究や新治療法の開発に用いる実験動物の製造、新薬の開発をはじめとする多くの産業分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、倍化４倍体胚の細胞数の解析結果を示す。Ａ−Ｅは１ｘから３ｘ４倍体胚および正常胚（１ｘ２ｎ）をＰＩ染色した写真、Ａ’−Ｄ’は１ｘから３ｘ４倍体胚および正常胚（１ｘ２ｎ）をＣｄｘ２で免疫染色した写真、Ａ”−Ｄ”はそれぞれの写真を合成した写真である。Ａ−Ａ”は１ｘ４倍体胚、Ｂ−Ｂ”は２ｘ４倍体胚、Ｃ−Ｃ”は３ｘ４倍体胚、Ｄ−Ｄ”は正常胚（１ｘ２ｎ）、Ｅ−Ｅ”は３ｘ４倍体胚をＰＩ（Ｅ）、Ｏｃｔ３／４  （Ｅ’）で染色した写真、およびその合成写真をＥ”として示した。スケールバー：Ａ”−Ｄ”１００μｍ。Ｅ”２００μｍ。
【図２】図２は、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１を用いた４倍体胚とのキメラ胚の作成を示す。Ａ−Ｃは１ｘ４倍体胚とＥＳ細胞（１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ）のキメラ胚、Ｄ−Ｆは３ｘｘ４倍体胚とＥＳ細胞（１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ）のキメラ胚を示す。Ａ、Ｄは可視光写真、Ｂ、Ｅは蛍光写真、Ｃ、Ｆはそれぞれの合成写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図３】図３は、３ｘ４倍体胚から作出されたＥＳマウスの解析である。（Ａ−Ｃ）ＧＦＰを発現する３ｘ４倍体胚とＥ１４  ＥＳ細胞を用いたＥＳマウスである。（Ａ）可視光写真を示す。（Ｂ）蛍光写真を示す。（Ｃ）ＡとＢの合成写真を示す。胎盤においてのみ４倍体胚由来（ＧＦＰ陽性）の細胞が確認される。（Ｄ、Ｅ）フローサイトメトリーによる解析結果である。１ｘ４倍体胚由来のＥＳマウス（Ｄ）および３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウス（Ｅ）の脳（左パネル）および肝臓（右パネル）におけるＧＦＰ陽性細胞の存在頻度を解析した。１ｘおよび３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスともＧＦＰ陽性細胞の存在頻度は１％未満であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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