(57)【要約】【課題】  臭気が無く、蒸気の刺激が無い安全性の高い消毒剤であって、細菌芽胞菌、及び抗酸菌等に殺菌性が高い消毒剤を提供することを課題とする。【解決手段】  ０．０００１〜５０質量％の濃度の過マレイン酸を有効成分とすることを特徴とする消毒剤を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．０００１〜５０質量％の濃度の過マレイン酸を有効成分とすることを特徴とする、消毒剤。
【請求項２】
ガス検知管で測定した際の酢酸換算による臭気感知濃度が１ｐｐｍ以下であることを特徴とする、請求項１記載の消毒剤。
【請求項３】
マレイン酸および／または過酸化水素を更に含む、請求項１または２記載の消毒剤。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の消毒剤を用いた消毒方法であって、細菌芽胞に対して、前記過マレイン酸を１０質量％の濃度以上で施用することを特徴とする、消毒方法。
【請求項５】
請求項１〜３いずれか１項に記載の消毒剤を用いた消毒方法であって、抗酸菌に対して、前記過マレイン酸を２．５質量％の濃度以上で施用することを特徴とする、消毒方法。
【請求項６】
請求項１〜３いずれか１項に記載の消毒剤を用いた消毒方法であって、バクテリアに対して、前記過マレイン酸を０．３質量％の濃度以上で施用することを特徴とする、消毒方法。
【請求項７】
請求項１〜３いずれか１項に記載の消毒剤を用いた消毒方法であって、真菌に対して、前記過マレイン酸を１．２５質量％の濃度以上で施用することを特徴とする、消毒方法。
【請求項８】
請求項１〜３いずれか１項に記載の消毒剤を用いた消毒方法であって、ウイルスに対して、前記過マレイン酸を０．１質量％の濃度以上で施用することを特徴とする、消毒方法。
【請求項９】
ヒト及び動物衛生、パッキング、ラッピング、医療器具、工業器具、ヘルスケア環境、工業設備、冷却塔、エアコン導管、食品産業用である、請求項４〜７いずれか１項に記載の消毒方法。
【請求項１０】
過酸化水素と無水マレイン酸を混合して過マレイン酸を発生させる工程を含む、消毒剤の製造方法。
【請求項１１】
過酸化水素と無水マレイン酸を構成成分とする消毒剤製造用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過マレイン酸を有効成分とした消毒剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
消毒薬はその効力の順に、高水準消毒薬、中水準消毒薬、低水準消毒薬に分類される（Spauldingによる分類）。この中でも高水準消毒薬は、芽胞（中水準消毒薬、低水準消毒薬では殺菌できない）を含む、バクテリア、真菌、ウイルスなど抗菌スペクトルが幅広く、重要である。
過酸系の殺菌剤・消毒剤の代表例は過酢酸であるが、強い刺激臭があり、蒸気は目、呼吸器等の粘膜を激しく刺激し、取扱い時には換気の良い作業場所が必要であり、粘膜を守るためのマスクとゴーグルが欠かせない。
過酢酸同様に強い殺菌性を持つ高水準消毒薬としてアルデヒド系のグルタラールやフタラール及び二酸化塩素がある。しかし、何れも過酢酸同様、強い刺激臭があり、粘膜を守るためのマスクとゴーグルが必要である。また、グルタラール等アルデヒド製剤は、抗酸菌に対して殺菌作用の弱さが指摘されている。
過酸と言えども全て消毒剤としての能力が高い訳ではなく、例えば過炭酸には芽胞を殺す能力がほとんど無い。これは、本願出願人により、１０％過炭酸水溶液に10分間芽胞を暴露後、普通寒天培地で生育させ、生菌数を測定した結果、生菌数が減少していないことから確認されている。また、過酸化水素は濃度７．５％、２０℃の場合、芽胞の殺滅に、６時間必要である（非特許文献１）。
このように、高水準消毒薬である過酢酸、グルタラールやフタラールには強い刺激臭があることから、蒸気は目、呼吸器等の粘膜を激しく刺激し、取扱い時には換気の良い作業場所が必要であり、粘膜を守るためのマスクとゴーグルが欠かせないという欠点があった。そこで、刺激の少ない消毒薬の出現が望まれていた。
【０００３】
特許文献１には、無水マレイン酸より過マレイン酸を生成することが記載されているが、その生成方法は過炭酸塩ナトリウムを用いるものであり、また、過マレイン酸が抗菌性を有するデータは示されていない。
特許文献２，３には、特許文献１を例に挙げているが、過マレイン酸の殺菌性が無水マレイン酸と比較して不十分であることを記載するのみであり、過マレイン酸の抗菌性が優れていることを示唆するものではない。
特許文献４には、切り花用延命剤の一例として、有機化酸化物のなかに過マレイン酸が挙げられているが、実施例では過酢酸のみであり、過マレイン酸に関しては具体的な記述が無い。
【０００４】
【特許文献１】ドイツ国特許第２８１５４００号公報
【特許文献２】特開平１−２２１３０２号公報
【特許文献３】特開平１０−７２３０４号公報
【特許文献４】特許第３０１１５３４号公報
【非特許文献１】「消毒薬テキスト  新版」、発行  株式会社協和企画
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、臭気が無く、蒸気の刺激が無い安全性の高い消毒剤であって、細菌芽胞菌、及び抗酸菌に殺菌性が高い消毒剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、０．０００１〜５０質量％の濃度の過マレイン酸を有効成分とすることを特徴とする消毒剤を提供する。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）０．０００１〜５０質量％の濃度の過マレイン酸を有効成分とすることを特徴とする、消毒剤。
（２）ガス検知管で測定した際の酢酸換算による臭気感知濃度が１ｐｐｍ以下であることを特徴とする、（１）記載の消毒剤。
（３）マレイン酸および／または過酸化水素を更に含む、（１）または（２）記載の消毒剤。
（４）（１）〜（３）いずれか１項に記載の消毒剤を用いた消毒方法であって、細菌芽胞に対して、前記過マレイン酸を１０質量％の濃度以上で施用することを特徴とする、消毒方法。
（５）（１）〜（３）いずれか１項に記載の消毒剤を用いた消毒方法であって、抗酸菌に対して、前記過マレイン酸を２．５質量％の濃度以上で施用することを特徴とする、消毒方法。
（６）（１）〜（３）いずれか１項に記載の消毒剤を用いた消毒方法であって、バクテリアに対して、前記過マレイン酸を０．３質量％の濃度以上で施用することを特徴とする、消毒方法。
（７）（１）〜（３）いずれか１項に記載の消毒剤を用いた消毒方法であって、真菌に対して、前記過マレイン酸を１．２５質量％の濃度以上で施用することを特徴とする、消毒方法。
（８）（１）〜（３）いずれか１項に記載の消毒剤を用いた消毒方法であって、ウイルスに対して、前記過マレイン酸を０．１質量％の濃度以上で施用することを特徴とする、消毒方法。
（９）ヒト及び動物衛生、パッキング、ラッピング、医療器具、工業器具、ヘルスケア環境、工業設備、冷却塔、エアコン導管、食品産業用である、（４）〜（７）いずれか１項に記載の消毒方法。
（１０）過酸化水素と無水マレイン酸を混合して過マレイン酸を発生させる工程を含む、消毒剤の製造方法。
（１１）過酸化水素と無水マレイン酸を構成成分とする消毒剤製造用キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の消毒剤は、臭気が少なく従来の過酸系殺菌剤（過酢酸）よりも安全性が高い。
本発明の消毒剤は、また、殺菌力が大きく、細菌芽胞及び抗酸菌等にも効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の消毒剤は、過マレイン酸を有効成分とする消毒剤である。本発明の消毒剤に含まれる過マレイン酸の濃度としては、０．０００１〜５０質量％であればよいが、細胞芽胞に対して使用される場合は、過マレイン酸濃度が１０〜５０質量％であることが好ましく、抗酸菌に対して使用される場合は、過マレイン酸濃度が２．５〜５０質量％であることが好ましく、バクテリアに対して使用される場合は、過マレイン酸濃度が０．３〜５０質量％であることが好ましく、真菌に対して使用される場合は、過マレイン酸濃度が１．２５〜５０質量％であることが好ましく、ウイルスに対して使用される場合は、過マレイン酸濃度が０．１〜５０質量％であることが好ましい。
【００１０】
本発明の過マレイン酸を有効成分とする消毒剤は、マレイン酸および／または過酸化水素をさらに含むものであってもよい。
本発明の消毒剤は、添加剤として、界面活性剤、金属キレート剤、バッファー塩類、防
食剤、色剤などのその他の成分を含んでもよい。
【００１１】
本明細書で用いられる用語「消毒」とは、細胞芽胞、抗酸菌、バクテリア、真菌、ウイルスなどを殺傷すること、または、その増殖機能を停止させることを意味する。
本明細書で用いられる用語「消毒剤」とは、細胞芽胞、抗酸菌、バクテリア、真菌、ウイルスなどに対して、「消毒」する能力を有し、抗菌性、殺菌性も含むものである。
本明細書で用いられる用語「細菌芽胞」とは、好気性桿菌バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｉｍ）属に属する嫌気性桿菌などが、増殖期の終わりに形成する耐久型細胞を意味する。
本明細書で用いられる用語「抗酸菌」とは、当業者に周知の抗酸性染色陽性の細菌をいい、マイコバクテリウム属に属する細菌を含む。
【００１２】
本発明の消毒剤は、細胞芽胞（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの芽胞）、抗酸菌（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｒａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）、バクテリア（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、真菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、ウイルス（例えば、Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｕｒｓａｌ
ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）などに使用することができる。
【００１３】
本発明の消毒剤に含まれる過マレイン酸は、例えば本願実施例１に記載されるように、市販の無水マレイン酸を、市販の過酸化水素水に溶解することにより得ることができる。この場合、過酸化水素濃度が１０〜６０％、例えば３０％である過酸化水素水を用いることが好ましい。
このように、本発明の過マレイン酸を含む消毒剤は、消毒が必要とされる現場において、無水マレイン酸と過酸化水素から過マレイン酸を発生させて使用することもできる。
さらに、本発明の消毒方法は、消毒剤の液体の中に消毒対象を浸すことによって行うことができる。また、消毒対象に、消毒剤の液体を噴霧する態様なども挙げられる。
このような消毒は、ヒト及び動物衛生、パッキング、ラッピング、医療器具、工業器具、ヘルスケア環境、工業設備、冷却塔、エアコン導管、食品産業用においてなされるものである。
【００１４】
本発明の消毒剤は、臭気が少なく、例えば、使用時に、ガス検知管（GASTEC製）で測定した際の酢酸換算による臭気感知濃度が１ｐｐｍ以下であることが好ましい。
本発明の消毒方法は、場所は特に限定されず、消毒が必要とされる、細胞芽胞、抗酸菌、バクテリア、真菌、ウイルスが存在する場所で実施することができる。
【００１５】
本発明はまた、過酸化水素と無水マレイン酸を混合して過マレイン酸を発生させる工程を含む消毒剤の製造方法を提供する。
本発明はさらに、過酸化水素と無水マレイン酸を構成成分とする消毒剤製造用キットを提供する。キットに含まれる過酸化水素は、過酸化水素濃度が１０〜６０％、例えば３０％である過酸化水素水であることが好ましく、キットに混合の仕方や、消毒対象に関する使用説明書を含むことが好ましい。
【実施例】
【００１６】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明が、これら実施例にのみ、限定を受けないことは言うまでもない。
【００１７】
製造例１．過マレイン酸及び対照薬剤過酢酸の製造
30％過酸化水素水（和光純薬製：特級）１０ｍｌに無水マレイン酸（和光純薬製：特級）８．８ｇを加熱溶解することで過マレイン酸を製造した。抗菌試験時に適切な濃度に水で希釈し使用した。
対照剤である過酢酸は株式会社サラヤ製の６％アセサイドを使用した。アセサイドは2剤に分かれており第1剤（過酢酸６％含有し、過酸化水素水、酢酸、その他１成分（安定化剤）及びイオン交換水を含む平衡混合物）１０ｍｌと第２剤（実用液のｐＨ調製及び安定化に用いる。９成分（緩衝用塩、安定剤及び金属イオン封鎖剤）を含有）１０ｍｌを混和し3％過酢酸とし、抗菌試験時適切な濃度にイオン交換水で希釈して使用した。
【００１８】
実施例１．菌種別の抗菌データ
ＦＤＡ石炭酸係数測定法に準じた方法を用いた。
１）被検菌、被検ウィルス、被検細胞
（１）細菌
１．  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ６５３８
２．  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  桧山株、
３．  Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ１１７７５
４．  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ  Ｌ−５８株、
５．  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ  ＡＴＣＣ６６３３
６．  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  Ｗ１    を用いた。
（２）糸状菌
７．  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＮＢＲＣ６３４１
８．  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ  ＮＢＲＣ６３５２  を用いた。
（３）細菌芽胞
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ ６６３３を液体ブイヨン培地で２４時間培養後、Ｓｔｅｒｌｉｎｉｎ，Ｊ．Ｍ．およびＭａｎｄｅｌｓｔｅｍ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９６９；１１３：２９に記載の方法に従って胞子を調製し、滅菌蒸留水に懸濁したものを８５℃で１０分間処理し栄養型を死滅させた後、５℃で保存し、１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌとなるように滅菌蒸留水に懸濁し芽胞供試菌液とした。なお芽胞数は１０倍ずつ段階希釈した試験液をブイヨン寒天培地に混釈培養して得たコロニー数から算出した。
（４）抗酸菌
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ＡＴＣＣ  １５７６９
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｒａｒｅ  ＡＴＣＣ  １３９５０
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ  ＡＴＣＣ  ２５４１４を用いて試験した。
上記の各供試菌株を、１％小川培地（栄研化学社製）（以下、小川培地という）で培養し、発育した菌苔１白金耳を、直径５ｍｍの滅菌ガラスビーズ５個および滅菌した１０％
Ｔｗｅｅｎ８０液２滴を入れたスクリューキャップ付き試験管に入れ、オートマチックミキサーで１５秒間振とうした。これに７Ｈ９ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）４ｍｌを加え、各供試菌株細胞の均質な浮遊液を得た。フォトメーター（Ｍｉｎｉ ｐｈｏｔｏ ５１８、ＴＡＩＴＥＣ）を用い、６６０ｎｍの波長でこの浮遊液の吸光度を測定した後、滅菌蒸留水で希釈して０．３０に調整し、接種菌液とした。接種菌液中の生菌数は、接種菌液を、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6倍に希釈し、それぞれの希釈液の１００μｌを小川培地に接種した後３７℃で培養し、発育してきたコロニーの数を計数することにより求めた。
接種菌液２０μｌを、上記の過酢酸実用液または過マレイン酸液５００μｌに添加して混合し、室温で一定時間（１０分間）保持することにより薬剤と菌を接触させ、その１０μｌを定量白金耳（Ｂｉｏｌｏｏｐ、ＥＬＫＡＹ社製）を用いて、７Ｈ９ ｂｒｏｔｈに
接種し３７℃で培養した。４週間後に菌の発育の有無を観察し、菌の発育が認められた試料を発育陽性（＋）、発育の認められなかった試料を発育陰性（-）とした。
（５）被検ウィルス
Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  山形Ｓ−８１株
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｕｒｓａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  Ｊ１株を用いた。
（６）供試細胞
ＣＰＫ細胞（豚腎細胞）
ＣＥＦ細胞（鶏胎児繊維芽細胞）を使用した。
【００１９】
２）細菌、糸状菌予備試験
被検菌１，３−５については、標準寒天培地（日水製薬）、被検菌２については血液寒天培地、被検菌６についてはＧＡＭ寒天培地を用いて純培養した供試菌株の単一コロニーから釣菌し、被検菌１−５は感受性ブイヨン（日水製薬）を用い３７℃、１６時間で前培養した。
被検菌６はＧＡＭブイヨン（日水製薬）で３７℃、１６時間嫌気状態で前培養した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。
その後、遠心分離により得られた沈殿を滅菌生理食塩水で１回洗浄し、培養時と同量の滅菌生理食塩液に再浮遊させたものを接種菌液とした。
被検菌７，８については、ＰＤＡ寒天培地（栄研化学）を用いて２５℃１０日間前培養した後、胞子をかきとり0.1％Ｔｗｅｅｎ８０添加精製水に懸濁させ、胞子数を約106/ｍｌとしたものを接種菌液とした。
被検薬剤および対照薬剤ともに滅菌蒸留水を用いて下記の濃度調製を行った。
【００２０】
【表１−１】
2009084159.tif 000002
【００２１】
薬剤の各希釈系列を試験管に１０ｍｌずつ分注し、接種菌液ともに２０℃の恒温水槽に静置し、温度が一定した１０分後に試験を開始した。すなわち、接種菌液を十分攪拌した後、１ｍｌを各希釈薬剤の試験管に加えて十分に混和し、１０分間作用させた後その１白菌耳（内径４ｍｍ）を後培養用培地（前培養と同じ：被検菌１−５  感受性ブイヨン被検菌；被検菌６  ＧＡＭブイヨン；被検菌７，８  ＰＤＡ寒天培地）に接種した。接種後の後、培養用培地は感受性ブイヨンおよびＧＡＭブイヨンは３７℃、２４時間培養、ＰＤＡ寒天培地は２５℃、５日間培養した。判定は、後培養培地における菌の増殖の有無を指標とした。予備試験の結果を表１−２に示す。
【００２２】
【表１−２】
2009084159.tif 000003
【００２３】
希釈倍数は、過酢酸については３％「アセサイド」（６％原液+緩衝液）の希釈倍数、過マレイン酸については用事調製１００％の希釈倍数とした。
【００２４】
３）細菌、糸状菌本試験
（1）接種菌液の調製
被検菌１，３−５については標準寒天培地（日水製薬）、被検菌２については血液寒天培地、被検菌６についてはＧＡＭ寒天培地を用いて純培養した供試菌株の単一コロニーから釣菌し、被検菌１−５は感受性ブイヨン（日水製薬）で３７℃１６時間前培養、被検菌６はＧＡＭブイヨン（日水製薬）で３７℃、１６時間嫌気状態で前培養した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。
遠心分離により得られた沈殿を滅菌生理食塩水で１回洗浄し、培養時と同量の滅菌生理食塩液に再浮遊させたものを接種菌液とした。
接種菌液中の菌数は滅菌生理食塩液で段階希釈したものを平板培地に塗抹し、培養後に形成されたコロニー数を計数して求めた。
被検菌７，８については、ＰＤＡ寒天培地（栄研化学）を用いて２５℃１０日間前培養した後、胞子をかきとり0.1％Ｔｗｅｅｎ８０添加精製水に懸濁させ、胞子数を約106/ｍｌとしたものを接種菌液とした。
【００２５】
（２）被検薬剤の調製
予備試験の結果から、下記の調製濃度を選択した。
対照薬剤および被検薬剤ともに調製（希釈）は滅菌蒸留水を用いた。
【表２】
2009084159.tif 000004
【００２６】
（３）薬剤の有効作用時間の測定
薬剤の各希釈系列をそれぞれ２本の試験管に１０ｍｌずつ分注し、接種菌液ともに２０℃の恒温水槽に静置し、温度が一定した１０分後に試験を開始した。
接種菌液を十分攪拌した後、１ｍｌを各希釈薬剤の試験管に加えて十分に混和し、所定の時間作用させた。
作用時間ごとにその１白菌耳（内径４ｍｍ）を後培養用培地（前培養と同じ：被検菌１−５  感受性ブイヨン；被検菌６  ＧＡＭブイヨン；被検菌７，８  ＰＤＡ寒天培地）に接種した。
作用時間は、2.5、5、10、15分とした。
接種後の後培養用培地は感受性ブイヨンおよびＧＡＭブイヨンは３７℃、２４時間、ＰＤＡ寒天培地は２５℃、５日間で培養した。
なお、試験は２反復行い、各薬剤ごとに２反復同時に操作を実施した。
【００２７】
（４）判定
後培養培地における菌の増殖の有無を指標とし、作用時間１０分で菌の発育が認められない薬剤の最高希釈倍率を、被検薬剤と対照薬剤で比較した。
細菌試験における結果は表３−１、表３−２に示した。表３−３には、石炭酸係数測定法による有効希釈倍数を示した。過酢酸ではBacillus以外のグラム陽性、陰性菌については希釈倍率３８４０〜１０２４０倍（2.9〜9.0ppm）の範囲となった。Bacillusでは６０倍(563ppm)となった。真菌では１０〜２０倍(1500〜3000ppm）となった。過マレイン酸ではBacilllus以外のグラム陽性・陰性菌では１９２０〜３８４０倍(293〜586ppm)の範囲となり、Bacillusでは６０倍(18750ppm)となった。真菌では４０〜８０倍(12500〜25000ppm)となった。
【００２８】
【表３−１】
2009084159.tif 000005
【００２９】
【表３−２】
2009084159.tif 000006
【００３０】
希釈倍数は、過酢酸については３％「アセサイド」（６％原液+緩衝液）の希釈倍数、
過マレイン酸については用事調製１００％の希釈倍数とした。
【００３１】
【表３−３】
2009084159.tif 000007
尚、試験に使用した接種菌液濃度を表３−４に示す。
【００３２】
【表３−４】
2009084159.tif 000008
【００３３】
４）細菌芽胞Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６６３３に対する被検薬剤と対照薬剤の濃度調製は下記のように行った。[ 注：2 ), 3 ) の試験はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６６３３の生菌対象の殺菌試験になっている]
【表３−５】
2009084159.tif 000009
試験の結果を表３−６に示した。
【００３４】
【表３−６】
2009084159.tif 000010
【００３５】
希釈倍数は、過酢酸については３％「アセサイド」（６％原液+緩衝液）の希釈倍数、
過マレイン酸については用事調製１００％の希釈倍数とした。
細菌芽胞（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６６３３）に対する殺菌に必要な有効濃度は過酢酸で10〜20倍（1500〜3000ppm）、過マレイン酸は５〜１０倍（100000〜200000ppm）ということがわかった。
【００３６】
５）抗酸菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ ＡＴＣＣ １５７６９、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｒａｒｅ ＡＴＣＣ １３９５０、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ ＡＴＣＣ ２５４１４）に対する過酢酸および本発明の過マレイン酸の殺菌効果を調べた結果を下記表３−７に示した。
【００３７】
【表３−７】
2009084159.tif 000011
【００３８】
表３−７に示されるように、抗酸菌の種類や菌株により多少感受性に差が認められた。
１０分間の消毒時間では、過酢酸は２０〜４０倍（750〜1500ppm）で完全殺菌され、過マレイン酸では、20〜40倍（50,000〜100,000ppm）で完全殺菌された。
【００３９】
６）ウイルス試験方法
（１）予備試験
供試薬剤の培養細胞に与える影響の確認試験
供試薬剤について、殺ウイルス試験を実施する際に使用する培養細胞に対しての毒性を確認しておく必要があるため、供試薬剤のみを段階希釈し、９６ｗｅｌｌマイクロプレートにおいて培養細胞に同時接種および細胞シート形成後の２通りの方法で接種し、３７℃、５％炭酸ガス条件で５日間培養した。
その結果、ＣＥＦ細胞においてはシート形成後に、ＣＰＫ細胞については同時接種においてより高い濃度まで細胞への影響がみられなかった。また、IBDウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｕｒｓａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  Ｊ１株）についてはCEF細胞シート形成後、ADウイルス（Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  山形Ｓ−８１株）についてはCPK細胞同時培養において増殖能力に問題ないと考えられたため、本試験はこの方法で行うこととした。
供試薬剤の培養細胞に与える影響の確認試験の結果を表４−１に示す。
【００４０】
【表４−１】
2009084159.tif 000012
【００４１】
希釈倍数は、過酢酸については３％「アセサイド」（６％原液+緩衝液）の希釈倍数、
過マレイン酸については用事調製１００％の希釈倍数とした。
**：実験はＣＥＦ細胞では４反復実施、ＣＰＫ細胞では３反復実施
***：ＣＥＦ細胞についてはジート形成後接種、****：ＣＰＫ細胞については同時接種
【００４２】
表４−１の結果より、ＣＥＦ細胞接種時には過酢酸は100000倍に、過マレインは300000倍に希釈、ＣＰＫ細胞接種時には過酢酸は30000倍に、過マレインは300000倍に希釈されていなければならないことがわかった。
【００４３】
（２）本試験
予備試験の結果を踏まえて、供試薬剤の各濃度を調整後、病原ウイルスを２０℃、１０分間感作させ、各培養細胞への供試薬剤の影響のない濃度まで希釈した後、培養細胞へ接種した。
ウイルスはIBDV（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｕｒｓａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ
Ｊ１株）についてはCEF細胞、ADV（Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  山形Ｓ−８１株）についてはCPK細胞によりともにGMを用いて３７℃、３〜５日間培養した。８０％のＣＰＥが出現した時点で培養液を抜き取り３０００rpm５min遠心分離し、上清を凍結保存した。保存ウイルス液を解凍後、ウイルス力価（TCID５０）を測定した。
本試験には同時に保存したウイルス液を使用した。
供試薬剤の希釈段階は下記のとおりとした。
【００４４】
【表４−２】
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【００４５】
ウイルス濃度は細胞接種時に102 . 3（２００）ＴＣＩＤ50になるよう次の通り感作させた。
上記倍数の２倍濃度の消毒液（滅菌PBSで希釈）を作成した。106 . 1ＴＣＩＤ50濃度のウイルス液（MM）を作成した。消毒液１ｍｌとウイルス液１ｍｌを感作（２０℃  １０分間）させた。感作後、MMにて3000倍に希釈して細胞に接種した。
感作後は、同時接種の場合は上記感作後希釈液を５０μｌと細胞浮遊液５０μｌを９６wellマイクロプレートの４wellずつに分注し、３７℃で５％炭酸ガス条件化で５日間培養した。
シート形成後の場合は、予めシート形成の認められたマイクロプレートのGMを抜き取り、MMを５０μｌずつ加えた後、上記感作後希釈液を５０μｌを４wellずつ加え、３７℃で５％炭酸ガス条件化で５日間培養した。
判定は、細胞培養においては細胞変性の有無について観察し、変性（CPE）のみられたものをウイルス陽性、変性（CPE)の見られなかったものをウイルス陰性とした。
【００４６】
（３）結果
ウイルス試験では、表４−３に示すとおり、過酢酸ではIBDV（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｕｒｓａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  Ｊ１株）では殺ウイルス価が3.357（×2280）、ADV（Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  山形Ｓ−８１株）では殺ウイルス価が4.238（×17320）、過マレイン酸ではIBDVに対する殺ウイルス価が3.238（×1732）、ADVについては3.607（×4054）であった。
【００４７】
【表４−３】
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【００４８】
希釈倍数は、過酢酸については３％「アセサイド」（６％原液+緩衝液）の希釈倍数、
過マレイン酸については用事調製１００％の希釈倍数とした。
＊実験は４反復実施
＊ＩＢＤＶ（ＣＥＦ細胞）についてはジート形成後接種
＊ＡＤＶ（ＣＰＫ細胞）については同時接種
【００４９】
7）過マレイン酸と過酢酸の殺菌・殺ウィルス効果の比較
過マレイン酸と過酢酸製剤であるアセサイドの２薬剤を用い、８種類の細菌および２種類のウイルスに対する消毒効果の比較試験を石炭酸係数測定法に準じて実施した。
その結果、過酢酸と同等の消毒効果を示すには過マレイン酸においてグラム陽性・陰性菌では約３０〜１００倍、真菌では約４〜２０倍、ウイルスではエンベローブを持たないIBDウイルスでは約４０倍、エンベローブを保有するADVウイルスでは約１５０倍の濃度が必要とわかった。また、細菌芽胞には約７倍の濃度が必要であった。（表５）
【００５０】
【表５】
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【００５１】
グラム陽性菌、グラム陰性菌、芽胞菌に対する消毒効果の効き具合については両薬剤ともに同様の傾向を示し、グラム陰性菌に対して最も強く、過マレイン酸は、過酢酸と比較して、Bacillusおよび抗酸菌については約30倍程度の濃度を必要とした。Clostridiumについては両薬剤ともに他のグラム陽性菌と同様の殺菌効果を示した。真菌についても両薬剤ともに高い濃度を必要とした。
このことから、過マレイン酸の殺菌効果は濃度の調整により過酢酸と同様の殺菌効果が得られるものと判断された。
ウイルスについても過マレイン酸において濃度は高いものの、過酢酸と同様の殺ウイルス効果が期待できるものと判断された。また、エンベローブを保有する場合とそうでない場合の殺ウイルス効果について過マレイン酸においては差が少なくみられたことからエンベローブを保有の有無に左右されにくい可能性も考えられた。
【００５２】
実施例２．滴定による分析
過酸（過酢酸、過マレイン酸）及びこれらの化合物との平衡混合物である過酸化水素の濃度定量は、硫酸セリウムーチオ硫酸ナトリウム法を使用した。以下に概要を記す。
(i)過酸化水素の濃度定量法
100ml容コニカルビーカーに過酸製剤水溶液（過酸濃度50〜5,000ppm）をマイクロピペットで１ml採取し、１０％硫酸溶液10mlを加える。0.1N硫酸セリウム標準溶液で滴定し、硫酸セリウムの黄色が消失したところを終点（Aml）とする。下式で、過酸化水素濃度を定量した。
過酸化水素濃度（％（w/w））＝A×０．１７×ｆ１
ｆ１：０．１Ｎ硫酸セリウム標準溶液のファクター
(ii)過酸濃度定量法
過酸化水素濃度測定後の溶液に１０％ヨウ化カリウム溶液1mlを添加する。0.01Nチオ硫酸ナトリウム標準液で淡黄色になるまで滴定し、１％可溶性デンプン溶液を約1ml加え、
暗青色が消えたところを終点（Bml）とする。
ブランクの測定：精製水１ｍｌを採取後、上記の過酸化水素濃度分析法および過酢酸濃度分析法の操作を繰り返し、ブランク値（B0ｍｌ）を求める。
下式で、過酸濃度を求めた。
（過酸濃度）
過酢酸濃度（％（w/w））＝（B− B0）×０．０３８×ｆ２
過マレイン酸濃度（％（w/w））＝（B− B0）×０．０６６×ｆ２
ｆ２：０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム標準溶液のファクター
【００５３】
実施例３．臭気測定
下記したように過酢酸および過マレイン酸の希釈溶液を作成し、同じ濃度における臭気の比較を行った。測定にはガス検知管（GASTEC製、N0.81）・ガス検知器（GASTEC製）を使用した。
アセサイド（過酢酸濃度６質量％、0.8mol%）の希釈溶液を作成し、各１ｍｌを採取し１０００ｍｌの三角フラスコに入れた。１時間後、三角フラスコ内の有機酸濃度をガス検知管により測定した。
30%過酸化水素水に無水マレイン酸を質量比で１：１となるように加えて溶解し過マレイン酸を生成させる。滴定により濃度測定すると、過マレイン酸濃度が4mol%となることから、この溶液を蒸留水により１／５希釈し、過マレイン酸濃度が0.8mol%の溶液としてから、アセサイドと同様に希釈溶液を作成し、各１ｍｌを１０００ｍｌの三角フラスコに入れた。同様に１時間後、三角フラスコ内の有機酸濃度をガス検知管により測定した。結果を下記した。
表から分かるように、過マレイン酸は臭気が無く、取扱者に優しい消毒剤である事が分かる。
【００５４】
【表６】
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【００５５】
【表７】
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以上のように、本発明の過マレイン酸を有効成分とする消毒剤は、過酢酸を有効成分とする消毒剤と比較して、臭気がなく、同様に高い殺菌性を有することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、臭気がなく、殺菌性も高い消毒剤を提供することができる。本発明の消毒剤は、医療、工業、農業、食品産業の分野において使用できる。