(57)【要約】      （修正有）【課題】脱毛抑制剤及び毛髪の脱色素化抑制剤の提供。【解決手段】（i）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、(ii）配列番号：１のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、（iii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列がコードするＸＶＩＩ型コラーゲン、又は（iv）配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸がコードし、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、を含む、脱毛抑制剤及び毛髪の脱色素化抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、
（ii）配列番号：１のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、
（iii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列がコードするＸＶＩＩ型コラーゲン、又は
（iv）配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸がコードし、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、
を含む、脱毛抑制剤。
【請求項２】
前記脱毛が、毛包幹細胞の消失による脱毛である、請求項１に記載の脱毛抑制剤。
【請求項３】
（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、
（ii）配列番号：１のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、
（iii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列がコードするＸＶＩＩ型コラーゲン、又は
（iv）配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸がコードし、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、
を含む、毛髪の脱色素化抑制剤。
【請求項４】
前記毛髪の脱色素化が、色素幹細胞の消失による脱色素化である、請求項３に記載の毛髪の脱色素化抑制剤。
【請求項５】
ＸＶＩＩ型コラーゲン又はその変異体が毛包幹細胞を含む領域において発現するように制御するプロモーター配列、及び該プロモーター配列の下流に
（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、若しくは
（ii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列、若しくは配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、
を有するベクター
を含む、脱毛抑制のための組成物。
【請求項６】
前記プロモーターが、表皮基底層で発現するように制御するプロモーターである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記プロモーターが、配列番号：３に示すヌクレオチド配列を有するケラチン１４プロモーターである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ＸＶＩＩ型コラーゲン又はその変異体が毛包幹細胞を含む領域において発現するように制御するプロモーター配列、及び該プロモーター配列の下流に
（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、若しくは、
（ii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列、若しくは配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、
を有するベクター、
を含む、毛髪の脱色素化抑制のための組成物。
【請求項９】
前記プロモーターが、表皮基底層で発現するように制御するプロモーターである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記プロモーターが、配列番号：３に示すヌクレオチド配列を有するケラチン１４プロモーターである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか一項に記載の剤あるいは組成物を投与することを含む、脱毛又は毛髪の脱色素化の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＸＶＩＩ型コラーゲンに関する脱毛抑制剤、又は毛髪の脱色素化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、外界から個体を護るほかに、毛髪や皮膚の色調やパターンにより個体の識別や防御においても重要な役割を果たしている。外側から表皮、真皮、皮下脂肪組織の３層から成り、毛包が表皮から連続して皮下脂肪組織に向かって伸長する。毛包の恒常部は毛周期を通じて維持されるのに対し、一過性部は毛周期に同調してその成長と退縮を周期的に繰り返している。また、色素細胞は、皮膚において分化するとメラニン色素を産生し、周囲の角化細胞へと受け渡すことで、皮膚や毛に色素を供給しており、紫外線から皮膚を護ると同時に個体間の識別や防御等の役割を担っている。
【０００３】
また、白髪は、我々の誰もが経験する最も目立つ老化現象である。白毛を生やす毛包では色素を産生する色素細胞の数が減少していることは現象として知られていたが、そのメカニズムについてはほとんど知られていなかった。１９９０年、Cotsarelis等は、毛包の幹細胞がバルジ領域に局在して多く認められることから、毛包の幹細胞がバルジ領域に存在することを提唱した（非特許文献１）。本発明者は、これまでに色素幹細胞を見いだし（非特許文献２）、白髪のメカニズムとして色素幹細胞の維持が必須であることを明らかとしてきた（非特許文献３）。
【０００４】
一方、毛髪は皮膚から派生しており、皮膚の変化や欠陥に大きく影響される。さらに、皮膚疾患による脱毛を含めない場合であっても、男性だけでなく女性においても加齢に伴い脱毛現象が増加する傾向にあることが知られている。特に、男性型脱毛症では、前頭部や頭頂部の毛包が退行し脱毛に至るが、このような毛包の退行は、テストステロン（男性ホルモン）の影響によるものであることが知られており、男性ホルモンを標的とした育毛剤が開発されている（特許文献１）。また、剪毛された皮膚において毛の伸長を促進する、コラーゲン蛋白質の加水分解物を用いた育毛剤も開発されている（特許文献２）。その他、毛包退行の要因として、毛包を含む皮膚の結合組織における形態学的変化も、脱毛現象の一因となっている。
【０００５】
【非特許文献１】Cotsarelis G.等、Cell 61: 1329-1337.1990
【非特許文献２】Nishimura EK et al. Nature. 416(6883):854-60, 2002
【非特許文献３】Nishimura EK et al. Science. 307(5710):720-724. 2005
【特許文献１】特開２００４−２４８６３２号公報
【特許文献２】特許第３２４７７６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
脱毛や毛髪の脱色素化の抑制を目的として、これまでにも血管拡張剤や植物抽出物等の様々な方法が講じられて来たが、何れも上記問題を解決するには至っておらず、脱毛抑制剤や毛髪の脱色素化抑制剤の開発は、医薬品およびバイオ関連製品開発の分野で望まれている。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、脱毛抑制剤又は毛髪の脱色素化抑制剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に至る過程では、本発明者は、ＸＶＩＩ型コラーゲン遺伝子欠損（ＣＯＬ１７ＫＯ）マウスにおいて加齢に伴って見られる白毛化と脱毛に先立ち、色素幹細胞及び毛包幹細胞が消失することを見いだした。そこで、ＣＯＬ１７ＫＯマウスにおいて毛包幹細胞を含む領域で特異的にヒトＸＶＩＩ型コラーゲンを発現させたところ、色素幹細胞および毛包幹細胞の異常分化が抑制され、形態・分布にも異常が見られず、脱毛及び白毛化は認められなかったことを確認した。以上から、ＸＶＩＩ型コラーゲンにより脱毛及び白毛化が抑制されることが明らかとなり、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、（ii）配列番号：１のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、（iii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列がコードするＸＶＩＩ型コラーゲン、又は（iv）配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸がコードし、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む脱毛抑制剤が提供される。本発明は、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンにより、脱毛を抑制する。
【００１０】
さらに、本発明によれば、（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、（ii）配列番号：１のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、（iii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列がコードするＸＶＩＩ型コラーゲン、又は（iv）配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸がコードし、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む毛髪の脱色素化抑制剤が提供される。本発明は、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンにより、毛髪の脱色素化を抑制する。
【００１１】
また、本発明によれば、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はその変異体が毛包幹細胞を含む領域において発現するように制御するプロモーター配列、及び該プロモーター配列の下流に（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、若しくは（ii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列、若しくは配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含む脱毛抑制のための組成物が提供される。本発明は、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンにより、脱毛を抑制する。
【００１２】
また、本発明によれば、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はその変異体が毛包幹細胞を含む領域において発現するように制御するプロモーター配列、及び該プロモーター配列の下流に（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、若しくは（ii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列、若しくは配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含む毛髪の脱色素化抑制のための組成物が提供される。本発明は、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンにより、毛髪の脱色素化を抑制する。
【００１３】
また、本発明によれば、上記脱毛抑制剤、毛髪の脱色素化抑制剤、脱毛抑制のための組成物又は毛髪の脱色素化抑制のための組成物を投与することを含む、脱毛又は毛髪の脱色素化の抑制方法が提供される。本発明は、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンにより、脱毛又は毛髪の脱色素化を抑制する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、後述の実施例に示すように、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンにより、脱毛又は毛髪の脱色素化を抑制する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の経緯）
本発明者は、ＸＶＩＩ型コラーゲンの皮膚での発現を詳細に解析したところ、毛包間表皮に加えて毛包バルジ領域（毛包幹細胞に相当する細胞群）にその発現を特異的に認めた。さらに、加齢に伴い脱毛及び白毛化が起こるＣＯＬ１７ＫＯマウスを、色素幹細胞に着目して調べた。すると、白毛化と脱毛に先立ち、色素幹細胞がバルジ領域において成熟色素細胞へと異所性分化し、それに引き続いて消失することから、さらに、色素幹細胞の維持に重要となる周囲の毛包幹細胞について調べたところ、毛包幹細胞が未分化角化細胞としてバルジ領域を構成していることに加えて、そのバルジ領域を構成する未分化角化細胞が、表皮や脂腺等などの通常は抑制されている分化方向に対して異常な成熟分化を示すことにより、毛包幹細胞が消失することを認めた。また、ＣＯＬ１７ＫＯマウスにおいて毛包幹細胞を含む領域で特異的に発現するプロモーター（ケラチン１４プロモーター）を用いてヒトＸＶＩＩ型コラーゲンを発現させたところ、色素幹細胞および毛包幹細胞の異常分化が抑制され、形態・分布にも異常が見られず、脱毛及び白毛化は認められなかったことを確認した。以上の知見は、脱毛治療や白髪治療を目的として、皮膚のＸＶＩＩ型コラーゲンを標的とした医薬品およびバイオ関連製品開発に応用できることを強く示唆する。
【００１６】
以上の結果より、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの欠損により色素幹細胞及び毛包幹細胞の消失が起こり、その結果、脱毛及び白毛化を来たすことが明らかとなった。さらに、ＸＶＩＩ型コラーゲンにより毛包幹細胞及び色素幹細胞の消失を抑制し、脱毛及び白毛化を抑制することが可能であることが明らかとなり、本発明を完成した。
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
（概要）
本実施形態は、（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、（ii）配列番号：１のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、（iii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列がコードするＸＶＩＩ型コラーゲン、又は（iv）配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸がコードし、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む脱毛抑制剤である。後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体は、脱毛を抑制するという機能を有するため、それを含む脱毛抑制剤自体も脱毛を抑制する。
【００１８】
さらに、本実施形態は、（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、（ii）配列番号：１のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、（iii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列がコードするＸＶＩＩ型コラーゲン、又は（iv）配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸がコードし、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む毛髪の脱色素化抑制剤である。後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体は、毛髪の脱色素化を抑制するという機能を有するため、それを含む毛髪の脱色素化抑制剤自体も毛髪の脱色素化を抑制する。
【００１９】
また、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はその変異体が毛包幹細胞を含む領域において発現するように制御するプロモーター配列、及び該プロモーター配列の下流に（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、若しくは（ii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列、若しくは配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含む脱毛抑制のための組成物である。後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体は、脱毛を抑制するという機能を有するため、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を毛包幹細胞を含む領域で発現させる組成物自体も脱毛を抑制する。
【００２０】
また、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はその変異体が毛包幹細胞を含む領域において発現するように制御するプロモーター配列、及び該プロモーター配列の下流に（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、若しくは（ii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列、若しくは配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含む毛髪の脱色素化抑制のための組成物である。後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体は、脱毛を抑制するという機能を有するため、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を毛包幹細胞を含む領域で発現させる組成物自体も毛髪の脱色素化を抑制する。
【００２１】
また、本実施形態は、上記脱毛抑制剤、毛髪の脱色素化抑制剤、脱毛抑制のための組成物又は毛髪の脱色素化抑制のための組成物を投与することを含む、脱毛又は毛髪の脱色素化の抑制方法である。後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体は、脱毛を抑制するという機能及び毛髪の脱色素化を抑制するという機能を有するため、それを投与することを含む方法も脱毛又は毛髪の脱色素化を抑制する。
【００２２】
（ＸＶＩＩ型コラーゲン）
ここで使用される「ＸＶＩＩ型コラーゲン」という用語は、天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む。ここに記載されるＸＶＩＩ型コラーゲンは、組換え又は合成方法により調製しても種々の供給源から単離してもよい。
【００２３】
「天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲン」は、天然由来のＸＶＩＩ型コラーゲンのアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このような天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲンは、組換え又は合成手段により生産することもでき、種々の供給源から単離することもできる。
【００２４】
（ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリペプチド）
「ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体」とは、ここに開示される全長天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲンと８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するＸＶＩＩ型コラーゲンを意味する。このようなＸＶＩＩ型コラーゲン変異体には、全長天然アミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数（例えば、２、３・・・）のアミノ酸残基が付加、置換若しくは欠失されたＸＶＩＩ型コラーゲンが含まれる。通常、ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体は、ここに開示される全長天然アミノ酸配列、ここに開示された全長天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲン配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％以上のアミノ酸配列同一性、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有している。なお、以下に示す配列番号：１には、全長天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲンのアミノ酸配列が示されている。
【００２５】
ここに定義される「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性が得られるように間隙を導入してもよく、保存的置換を配列同一性の一部と考えないとした、ＸＶＩＩ型コラーゲン配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントの選択は、当業者によく知られた方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含むアラインメントを測定するために、適切なパラメータを決定することができる。
【００２６】
（ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリヌクレオチド）
「変異体ポリヌクレオチド」とは、ポリペプチドが本来持っている活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する全長天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲンポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列に対して８０％以上の配列同一性を有する。通常は、ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリペプチドヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲンポリペプチド配列をコードする核酸配列に対して８０％以上の核酸配列同一性、好ましくは９０％の核酸配列同一性、より好ましくは９５％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。なお、以下に示す配列番号：２には、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンをコードする完全長配列が含まれている。
【００２７】
ここで同定されるＸＶＩＩ型コラーゲンコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性が得られるように間隙を導入してもよく、ＸＶＩＩ型コラーゲンポリペプチドコード化核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントの選択は、当業者にはよく知られた方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含むアラインメントを測定するために、適切なパラメータを決定することができる。
【００２８】
他の実施態様では、ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリヌクレオチドは、ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリペプチドをコードし、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、配列番号：１に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリペプチドは、ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００２９】
（毛髪）
ここでいう毛髪とは、ケラチンを主成分とする毛幹及び毛根からなる皮膚の付属器官のことをいい、例えば、頭髪や体毛等がこれに含まれる。
【００３０】
（脱毛）
ここでいう脱毛とは、例えば加齢や病気により、毛髪の一部若しくは全部が抜け落ちることをいう。その原因として様々な要因が考えられるが、男性ホルモンの上昇や毛包を含む皮膚の結合組織における形態学的変化が原因となるほか、毛包幹細胞の消失もその一因となりうる。
【００３１】
（脱毛の抑制）
ここでいう脱毛の抑制とは、除毛した毛等短くなった毛の伸長を促進することとは異なり、例えば皮膚の結合組織における形態学的変化等の要因により起こる脱毛を抑制すること等をいう。
【００３２】
（毛髪の脱色素化）
ここでいう毛髪の脱色素化とは、本来メラニン色素を有する毛髪が、色素細胞からのメラニン色素の供給が減少することにより、毛髪の色が白色に近づいていくことをいう。例えば、頭髪の白髪への変化や体毛の白毛化がこれに含まれる。
【００３３】
（皮膚の構造）
皮膚は表面から順番に表皮、真皮、皮下組織の３つの層に分かれており、身体の全表面を覆って、外界との境をなし、内臓などの内部諸器官を外部の刺激や衝撃から保護している。また、表皮は、角質層、顆粒層、有棘層及び基底層で構成されている。基底層は、表皮の最下層にあり、真皮とは波形になって接している。基底層を構成する基底細胞は、立方体又は円柱状をした細胞が一列に並ぶ単層構造からなり、数個おきに色素細胞が点在する。紫外線があたる等の刺激により色素細胞からメラニン色素が生成される。基底層では、真皮の毛乳頭の毛細血管から栄養を補給され常に細胞分裂を行い細胞の新生、増殖を繰り返している。
【００３４】
（幹細胞）
幹細胞とは、高い自己維持能（自己複製能）を示し、分化した子孫細胞を供給できる未分化な細胞のことをいう。例えば、色素細胞を子孫細胞として供給する色素幹細胞や、未分化角化細胞としてバルジ領域を構成し、表皮、汗腺及び皮脂腺等の皮膚付属器官へと分化する能力を有する毛包幹細胞等が挙げられる。
【００３５】
（ニッチ）
ニッチとは、幹細胞にとっての生態的適所をいう。通常、組織幹細胞の局在部位をニッチと呼んでいる。ニッチ環境において、幹細胞は未分化な状態に維持される。例えば、色素幹細胞や毛包幹細胞のニッチはバルジ領域に存在する。通常、バルジ領域において色素幹細胞から増殖した子孫細胞の一部は、バルジ領域から毛母へ移動し、そこで色素細胞に分化・成熟してメラニン色素を毛に供給する。
【００３６】
（色素幹細胞の異常分化）
色素幹細胞の異常分化とは、本来野生型マウスでは未分化な状態で維持されるバルジ領域（ニッチ）において、異所性に（場違いに）色素幹細胞がメラニン顆粒を持ち樹状の形態を獲得するなど成熟分化してしまうことをいう。通常、この異所性分化した細胞は維持されないで消失する。例えば、バルジ領域において色素幹細胞が未分化性を喪失し、成熟した色素細胞に分化すること等をいう。
【００３７】
（毛包幹細胞の異常分化）
毛包幹細胞の異常分化とは、毛包幹細胞が自己維持することなく異常な分化方向へと分化していくことをいう。例えば、バルジ領域において毛包幹細胞が幹細胞性を維持できなくなり、毛包、表皮、脂腺などへと分化してしまうなど正常の制御を逸した分化をいう。
【００３８】
（剤形）
ここで、本実施形態の脱毛抑制剤又は毛髪の脱色素化抑制剤は、経口投与や経皮投与によりその効果を奏する可能性が考えられ、その剤形として、例えば散剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、クリーム剤、内用液剤、注射剤であってもよく、また、ヘアトニック、ヘアローション、ヘアクリーム、エアゾール、軟膏、シャンプーやリンス等へ添加することも考えられる。
【００３９】
（ベクター）
ベクターは、組換えＤＮＡ手順に都合よく付すことのできるいずれのベクターであってもよく、またベクターの選択は該ベクターを導入しようとする宿主細胞に依存することが多い。従って、ベクターは、自己複製ベクター、すなわちその複製が染色体複製から独立している染色体外物質として存在するベクターであってもよい。そのようなベクターとしては例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ミニ、クロモゾーム、またはウイルスが挙げられる。あるいはまた、ベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞ゲノムに一体化されそしてその中に一体化された一つまたは複数のクロモゾームと共に複製されるものであってよい。適切なベクターの例は細菌発現ベクターおよび酵母発現ベクターである。前記ウイルスベクターの例として、アデノウイルス、レトロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス等のウイルス由来のベクター等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。本発明において構築した発現ベクターにより、ＸＶＩＩ型コラーゲンを任意の場所で発現させることができる。
【００４０】
（プロモーター）
ここでいうプロモーターとは、プロモーター配列の下流に存在するポリペプチドの発現を制御する配列のことをいい、ここでは特に毛包幹細胞を含む領域において発現させることが可能なプロモーターが望ましい。例えば、Ｋ１４プロモーターやＫ５プロモーター等が挙げられるが、後述する実施例では、毛包幹細胞を含む表皮基底層における特異的な発現を制御するプロモーターとして、ケラチン１４プロモーターを用いている。
【００４１】
（投与方法）
ここでいう投与方法は、上記剤又は組成物を投与する方法であり、ここで、本実施形態の脱毛抑制剤又は毛髪の脱色素化抑制剤は、経口投与や経皮投与によりその効果を奏する可能性が考えられ、例えば散剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、クリーム剤、内用液剤やヘアトニック、ヘアローション、ヘアクリーム、エアゾール、軟膏、シャンプーやリンス等へ添加し投与する方法が考えられる。また、注射剤として、医師や看護士による皮下等への注射により投与する方法も考えられる。
【００４２】
本実施形態の（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、（ii）配列番号：１のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、（iii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列がコードするＸＶＩＩ型コラーゲン、又は（iv）配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸がコードし、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む脱毛抑制剤は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体が脱毛を抑制するという作用を有するため、後述の実施例に示すように、それを含む脱毛抑制剤自体も脱毛を抑制するという効果を奏する。
【００４３】
さらに、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む、毛包幹細胞の消失による脱毛の抑制剤であってもよい。この場合には、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体が毛包幹細胞の消失を抑制するという機能を有するため、それを含む脱毛抑制剤自体も毛包幹細胞の消失を抑制するという効果を奏し、その結果、脱毛を抑制するという効果を奏する。
【００４４】
また、本実施形態の（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、（ii）配列番号：１のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、（iii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列がコードするＸＶＩＩ型コラーゲン、又は（iv）配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸がコードし、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む毛髪の脱色素化抑制剤は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体が毛髪の脱色素化を抑制するという作用を有するため、後述の実施例に示すように、それを含む毛髪の脱色素化抑制剤自体も毛髪の脱色素化を促進するという効果を奏する。
【００４５】
さらに、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む、色素幹細胞の消失による毛髪の脱色素化抑制剤であってもよい。この場合には、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体が色素幹細胞の消失を抑制するという機能を有するため、それを含む毛髪の脱色素化抑制剤自体も色素幹細胞の消失を抑制するという効果を奏し、その結果、毛髪の脱色素化を抑制するという効果を奏する。
【００４６】
また、本実施形態のＸＶＩＩ型コラーゲン又はその変異体が毛包幹細胞を含む領域において発現するように制御するプロモーター配列、及び該プロモーター配列の下流に（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、若しくは（ii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列、若しくは配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含む脱毛抑制のための組成物は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体が脱毛を抑制するという作用を有するため、後述の実施例に示すように、その様な機能を有するＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を毛包幹細胞を含む領域特異的に発現させる組成物自体も脱毛を抑制するという効果を奏する。
【００４７】
また、本実施形態のＸＶＩＩ型コラーゲン又はその変異体が表皮基底層において発現するように制御するプロモーター配列、及び該プロモーター配列の下流に（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、若しくは（ii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列、若しくは配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含む脱毛抑制のための組成物は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体が脱毛を抑制するという作用を有するため、後述の実施例に示すように、そのような機能を有するＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を表皮基底層に発現させる組成物自体も脱毛を抑制するという効果を奏する。
【００４８】
また、本実施形態のＸＶＩＩ型コラーゲン又はその変異体が表皮基底細胞特異的に発現するように制御するケラチン１４プロモーター配列、及び該プロモーター配列の下流に（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、若しくは（ii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列、若しくは配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脱毛を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含む脱毛抑制のための組成物であってもよい。この場合には、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体は、脱毛を抑制するという機能を有するため、そのような機能を有するＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を表皮基底細胞特異的に発現させることができる組成物自体も脱毛を抑制するという効果を奏する。
【００４９】
また、本実施形態のＸＶＩＩ型コラーゲン又はその変異体が毛包幹細胞を含む領域において発現するように制御するプロモーター配列、及び該プロモーター配列の下流に（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、若しくは（ii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列、若しくは配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含む毛髪の脱色素化抑制のための組成物は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体が毛髪の脱色素化を抑制するという作用を有するため、後述の実施例に示すように、そのような機能を有するＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を毛包幹細胞を含む領域特異的に発現させる組成物自体も毛髪の脱色素化を抑制するという効果を奏する。
【００５０】
また、本実施形態のＸＶＩＩ型コラーゲン又はその変異体が表皮基底層において発現するように制御するプロモーター配列、及び該プロモーター配列の下流に（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、若しくは（ii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列、若しくは配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含む毛髪の脱色素化抑制のための組成物は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体が毛髪の脱色素化を抑制するという作用を有するため、後述の実施例に示すように、そのような機能を有するＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を表皮基底層に発現させる組成物自体も毛髪の脱色素化を抑制するという効果を奏する。
【００５１】
また、本実施形態のＸＶＩＩ型コラーゲン又はその変異体が表皮基底細胞特異的に発現するように制御するケラチン１４プロモーター配列、及び該プロモーター配列の下流に（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列、若しくは（ii）配列番号：２に示すヌクレオチド配列、若しくは配列番号：２のヌクレオチド配列又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ毛髪の脱色素化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含む毛髪の脱色素化抑制のための組成物であってもよい。この場合には、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体は、毛髪の脱色素化を抑制するという機能を有するため、そのような機能を有するＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を表皮基底細胞特異的に発現させることができる組成物自体も毛髪の脱色素化を抑制するという効果を奏する。
【００５２】
また、本実施形態の脱毛抑制剤、毛髪の脱色素化抑制剤、脱毛抑制のための組成物又は毛髪の脱色素化抑制のための組成物を投与することを含む、脱毛又は毛髪の脱色素化の抑制方法である。後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体は、脱毛を抑制するという機能及び毛髪の脱色素化を抑制するという機能を有するため、それを投与することを含む方法も脱毛又は毛髪の脱色素化を抑制するという効果を奏する。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５４】
実施例１  ＣＯＬ１７ＫＯマウスの解析
１．試験方法
（１）実験動物
本研究で用いたＤｃｔ−ｌａｃＺトランスジェニックマウスは、英国MRC、Ian Jackson博士のご提供、ＣＡＧ−ＣＡＴ−ＥＧＦＰマウスは大阪大学、宮崎純一教授のご提供、Ｄｃｔｔｍｌ（Ｃｒｅ）ＢｅｅマウスはFreedrich Beerman博士のご提供、K14-hCOL17トランスジェニックマウスはウィスコンシン医科大学のKim Yancey教授の提供、ＣＯＬ１７ＫＯマウスは北海道大学医学研究科皮膚科学分野清水宏教授の提供による。
【００５５】
（２）免疫組織化学
マウスの背部皮膚を４％パラホルムアルデヒド固定、またはそのままで、ＯＣＴｃｏｍｐｏｕｎｄ (Sakura Finetechnical)で凍結包埋した後、８μｍの切片にし、３％スキムミルクを用いて常温で３０分間ブロッキングした。その後、一次抗体を適当に希釈し４℃で一晩反応させ、ＰＢＳで洗浄した後に二次抗体を反応させた。
【００５６】
免疫染色に使用した一次抗体は、抗ヒトＸＶＩＩ型コラーゲン抗体（N18、Santa Cruz）、抗マウスＸＶＩＩ型コラーゲン抗体（滋賀医科大学田中俊広教授より提供して頂いた）、抗βガラクトシダーゼ抗体 (Cappel)、抗ケラチン１５抗体(Covance)、抗ＣＤ３４抗体(eBioscience)、抗α６インテグリン抗体(BD Pharmingen)、抗Ｓ１００ａ６抗体(LAB VISION)である。二次抗体はＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８、５６８、５９４(Molecular Probes)を用いた。
【００５７】
（３）Ｈ．Ｅ．染色
マウスの背部皮膚をブアン固定後にパラフィン包埋した後、４μｍの切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオジンを用いて定法により染色した。
【００５８】
（４）色素細胞の分離
生後６日の色素幹細胞を含む色素細胞がＧＦＰ陽性となっているＣＡＧ−ＣＡＴ−ＥＧＦＰ；  Ｄｃｔｔｍｌ（Ｃｒｅ）Ｂｅｅマウスの背部皮膚を採取し、１０００Ｕ／ｍｌのディスパーゼ（SANKO JUNYAKU）／ＰＢＳの中にて４℃で一晩反応させた後、実体顕微鏡下で真皮を取り除いた。その後、０．２５％トリプシンを加え、３７℃で１０分反応させ、ウシ胎仔血清で中和した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）法を用いてＧＦＰ陽性の色素細胞を分離した。
【００５９】
（５）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析
色素細胞の分離には、上記の方法でGFP陽性細胞分画を採取した。また角化細胞については同様に酵素処理にて用意した皮膚懸濁液を上記のＣＤ３４、α６インテグリンの抗体と反応させた。ＦＡＣＳ分析にはＢａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＪＳＡＮまたはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ caliberを使用した。
【００６０】
（６）ＲＴ−ＰＣＲによるマウスＸＶＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡ発現の解析
マウス背部皮膚およびＧＦＰ陽性の色素細胞からＴＲＩｚｏｌ（GIBCO）を用いてＲＮＡを抽出した。３μｇのＲＮＡをＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（GIBCO）を用いて逆転写を行いｃＤＮＡを合成した。以下のプライマーを用いてマウスＸＶＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡ発現の解析を行った。また、内部標準としてＧＡＰＤＨｍＲＮＡの発現を測定した。
・マウスＸＶＩＩ型コラーゲン
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ａｃｔｃｇｃｃｔｃｔｔｃｔｔｃａａｃｃａ（配列番号：４）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ｇａｇｃａｇｇａｃｇｃｃａｔｇｔｔａｔｔ（配列番号：５）
・ＧＡＰＤＨ
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ａｃｃａｃａｇｔｃｃａｔｇｃｃａｔｃａｃ（配列番号：６）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ｔｃｃａｃｃａｃｃｃｔｇｔｔｇｃｔｇｔａ（配列番号：７）
【００６１】
（結果及び考察）
ＣＯＬ１７ＫＯマウスは多くが生後２週間以内に死亡するが、生存する個体は、生後４週頃までは外見上は正常で、黒色の体毛に覆われていた（図１ａ）。しかしその後、徐々に白毛化がみられ、生後３ヵ月頃には、白毛化・脱毛がかなり目立つようになるとともに、体毛が通常よりも長くなってくる現象がみられた。生後６ヵ月頃には全身がほぼ完全に白毛化し、最終的に１０ヵ月頃には全身で脱毛が起こった。
【００６２】
我々は以前に色素幹細胞の維持不全が白毛化の原因となりうることを明らかにした。そこで、ＣＯＬ１７ＫＯマウスの白毛化の原因が、色素幹細胞の維持不全にあるのかどうかを調べるため、色素幹細胞をマーキングできるＤｃｔ−ＬａｃＺトランスジーンをＣＯＬ１７ＫＯマウスに導入し、ＣＯＬ１７ＫＯマウスの色素幹細胞の分布及び形態を観察した。その結果、ＸＶＩＩ型コラーゲンは、バルジ領域及び表皮の基底細胞で強く発現していること及び色素幹細胞が毛包幹細胞に囲まれた状態で存在していることが明らかとなった（図１ｃ）。また、ＣＯＬ１７ＫＯマウスにおける色素幹細胞の分布・形態は、出生直後において異常は認めなかったが、生後３ヵ月頃より、色素幹細胞の数が徐々に少なくなってくると同時に、メラニン顆粒をもち胞体がやや大きく複数の突起をもつ分化した形態の成熟した色素細胞がみられるようになった（図１ｄ、ｅ）。全身が白毛化を来す５ヵ月頃では、色素幹細胞は完全に消失した。以上の結果から、ＣＯＬ１７ＫＯマウスにおける白毛化の原因は色素幹細胞の維持不全によるものと結論づけられた。
【００６３】
一般的にＸＶＩＩ型コラーゲンは、ヘミデスモソームを形成する上皮系の細胞で発現する事が知られている。色素幹細胞を含む皮膚の色素細胞においてＸＶＩＩ型コラーゲン発現の有無を調べるため、色素細胞でＧＦＰを発現するマウス（ＣＡＧ−ＣＡＴ−ＥＧＦＰ；  Ｄｃｔｔｍｌ（Ｃｒｅ）Ｂｅｅマウス）で、ＧＦＰ陽性の色素細胞のＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、マウスＸＶＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡの発現を解析したところ、色素幹細胞を含む色素細胞においてＸＶＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡの発現がないことを確認した（図１ｆ）。以上の結果より、色素幹細胞ではＸＶＩＩ型コラーゲンの発現はなく、ＣＯＬ１７ＫＯマウスでみられる色素幹細胞の消失の原因として、色素幹細胞の周囲の細胞におけるＸＶＩＩ型コラーゲン発現の異常が原因である可能性が示唆された。
【００６４】
毛包幹細胞の異常の有無を調べるため、最初にＣＯＬ１７ＫＯマウス及びコントロールの背部皮膚を各週齢で調べた。 Ｈ．Ｅ．染色組織像の所見上、生後３ヵ月頃より、表皮の肥厚と脂腺の増大がみられた（図２ａ）。さらに６ヵ月頃では、毛包の嚢胞化や、萎縮した毛包が多くみられた（図２ｂ）。最終的に１０ヵ月頃では、毛包など皮膚付属器はほぼ消失した（図２ｃ）。これらの所見より、毛包の維持にはＸＶＩＩ型コラーゲンが必要であることが示唆された。また、これらのＨ．Ｅ．染色組織像の所見は表皮における幹細胞が枯渇するマウスとして報告されたｃ−Ｍｙｃが基底細胞で活性化されたマウスや、Ｒａｃ１が皮膚でノックアウトされたマウスのＨ．Ｅ．染色組織像の所見と非常に似ていることがわかった。そこで、ＣＯＬ１７ＫＯマウスでも、同様に毛包幹細胞が枯渇している可能性を考え、毛包幹細胞マーカーである抗ケラチン１５抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗α６インテグリン抗体、抗Ｓ１００ａ６抗体での染色、及びＦＡＣＳ分析を行い、毛包幹細胞の枯渇が確認できた（図２ｄ−ｆ）。
【００６５】
以上の結果より、ＸＶＩＩ型コラーゲンの欠損は白毛化を来たし、色素幹細胞の消失に起因することが示された。つまり、毛包幹細胞におけるＸＶＩＩ型コラーゲンは毛包幹細胞の維持においてのみならず、色素幹細胞の維持において必須であることが明らかになった。
【００６６】
実施例２  ＣＯＬ１７ＫＯ, Ｋ１４−ｈＣＯＬ１７トランスジェニックマウスの解析
（１）実験動物
ＣＯＬ１７ＫＯは、北海道大学北海道大学医学研究科皮膚科学分野清水宏教授より提供して頂いた。
【００６７】
（ＣＯＬ１７ＫＯ, Ｋ１４−ｈＣＯＬ１７トランスジェニックマウスの作製）
マウス１２９Ｓｖ／Ｅｖゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｎｅ社）から、１４．７ｋｂのマウスＸＶＩＩ型コラーゲン遺伝子をクローニングし、さらにそこから１１．５ｋｂの制限酵素ＮｈｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントをサブクローニングした。このフラグメント中にあるエクソン２からイントロン３の部位へＰＧＫ／Ｎｅｏカセットを組み込んでターゲッティングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｎｅ社）を作製し、１２９Ｓｖ／Ｅｖマウスの胚性肝細胞に組み換えベクターを導入し、正確にターゲット化された胚細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのｂｌａｓｔｃｙｔｅに注入してキメラマウスを作製した。このキメラマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとをさらに交配させ、Ｆ１ヘテロ動物を４世代以上にわたってクロスさせてヘテロマウス（ＣＯＬ１７ｍ−／−）を作製した。
【００６８】
Ｋ１４プロモーターの下流へＸＶＩＩ型コラーゲンｃＤＮＡを組み込むことによって、表皮下層のみに特異的にヒトＸＶＩＩ型コラーゲンを発現するＣ５７ＢＬ／６Ｊをバックグラウンドとするトランスジェニックマウス（ＣＯＬ１７ｍ＋／＋、ｈ＋マウス）とヘテロマウス（ＣＯＬ１７ｍ＋／−マウス）を交配した。その結果得られたヘテロかつヒトＸＶＩＩ型コラーゲントランスジーンを有するマウス（ＣＯＬ１７ｍ＋／−、ｈ＋マウス）同士を交配し、ＣＯＬ１７ＫＯ, Ｋ１４−ｈＣＯＬ１７トランスジェニックマウス（ＣＯＬ１７ｍ−／−、ｈ＋マウス）を作製した。
【００６９】
（２）免疫組織化学
マウスの背部皮膚を実施例１と同様の方法で免疫染色した。免疫染色に使用した一次抗体は、抗マウスＸＶＩＩ型コラーゲン抗体（滋賀医科大学田中俊広教授より提供して頂いた）及び抗βガラクトシダーゼ抗体 (Cappel) である。Ｄｃｔの染色は、Ｄｃｔ−ｌａｃＺ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅを持つマウスを抗βガラクトシダーゼ抗体で染色した。
【００７０】
（結果及び考察）
ＣＯＬ１７ＫＯマウスにおいて毛包幹細胞の異常が色素幹細胞の異常を引き起こすことを確認するため、ケラチン１４プロモーターでヒトＸＶＩＩ型コラーゲンが発現するトランスジーンを導入したＣＯＬ１７ＫＯマウス（ＣＯＬ１７ｍ−／−、ｈ＋マウス）を調べた。このマウスではバルジを含む角化細胞ではヒトＸＶＩＩ型コラーゲンが発現しているが、色素細胞を含むその他の細胞ではヒト・マウスどちらのＸＶＩＩ型コラーゲンも発現していないことを確認した（図３ａ及びｂ（一部データ未掲載））。このマウスでは生後５ヵ月を経過しても脱毛及び白毛化はみられず（図３ａ及びｂ）、またＤｃｔ陽性の色素幹細胞の形態・分布にも異常はみられなかった（図３ｃ及びｄ）。以上の結果より、ＸＶＩＩ型コラーゲンの欠損は脱毛及び白毛化を来たし、その脱毛及び白毛化は毛包幹細胞及び／又は色素幹細胞の消失に起因すること、毛包幹細胞でＸＶＩＩ型コラーゲンを発現させることで毛包幹細胞及び色素幹細胞の消失を防げることが示された。つまり、毛包幹細胞におけるＸＶＩＩ型コラーゲンは、毛包幹細胞の維持においてのみならず、色素幹細胞を維持し、脱毛及び毛髪の脱色素化の抑制において必須であることが明らかになった。
【００７１】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ＣＯＬ１７ＫＯマウスでみられる白毛化および脱毛、コントロールマウスにおけるＸＶＩＩ型コラーゲン発現を示す図である。(a)ＣＯＬ１７ＫＯマウスの写真。上から生後２週・６週・２ヵ月・３ヵ月・６ヵ月・１０ヵ月のマウスを示す。進行性の脱毛及び白毛化がみられた。(b)１０ヵ月のコントロールの写真。 (c) 左：ＸＶＩＩ型コラーゲンはバルジ領域及び表皮の基底細胞で強く発現している。右：色素幹細胞は毛包幹細胞に囲まれている。(d)出生後６日、３ヵ月、５ヵ月のコントロールのＬａｃＺ染色像。(e)ノックアウトマウス(ＫＯマウス)のＬａｃＺ染色像。ＫＯマウスではコントロールマウスに比べてＬａｃＺ陽性色素幹細胞は徐々に減少し、分化した像が目立つようになる。５ヵ月以降では陽性細胞はほぼ全て消失する。(f) ＲＴ−ＰＣＲ。ＧＦＰ陽性色素細胞ではＸＶＩＩ型コラーゲンの発現は認めない。
【図２】色素幹細胞のニッチである毛包幹細胞の消失を示す図である。（ａ）生後３ヵ月頃より、表皮の肥厚、脂腺の増大がみられた。（ｂ）生後６ヵ月頃より、毛包が嚢胞化する像もみられた。（ｃ）生後１０ヵ月では、毛包など皮膚付属器は消失する。（ｄ）α6インテグリンとＣＤ３４二重陽性の毛包幹細胞は、ＣＯＬ１７ＫＯマウスでは著しく減少した。 （ｅ）コントロール組織の毛包幹細胞マーカーでの染色。（ｆ）ＣＯＬ１７ＫＯマウス組織の毛包幹細胞マーカーでの染色。ＣＯＬ１７ＫＯマウスではケラチン１５・ＣＤ３４・α６インテグリン・Ｓ１００ａ６陽性細胞を認めなかった。
【図３】ＣＯＬ１７ｍ−／−、ｈ＋マウス及びＣＯＬ１７ＫＯマウスにおける毛髪の状態、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの発現及び幹細胞の形態・分布を示す図である。（ａ）ＣＯＬ１７ＫＯマウスでは、ＸＶＩＩ型コラーゲンの発現を認めず、進行性の白毛化および脱毛が観察された。（ｂ）ＣＯＬ１７ｍ−／−、ｈ＋マウスでは、表皮基底層および毛包のバルジ領域においてヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの発現が観察され、脱毛及び白毛化は観察されず、野生型マウスと同様の外観を示した。（ｃ）ＣＯＬ１７ＫＯマウスでは、生後６日では色素幹細胞が観察されたが、生後５ヵ月では色素幹細胞の消失がみられた。（ｄ）ＣＯＬ１７ｍ−／−、ｈ＋マウスでは、生後６日においても生後５ヵ月においても幹細胞の消失はみられなかった。
【図１】
2009051753.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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