(57)【要約】【課題】血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)及びアラニンアミノ基転移酵素(ALT)生成抑制作用を有する成分を探索し、肝臓関連の疾患、症状を緩和、予防および治療に関わる物質を得ることを課題とした。【解決手段】ゲラニルゲラニオールにリポ多糖によるAST及びALT生成を抑制する作用を見出し、この知見に基づきアルコール性肝臓障害の予防剤として有効であることを発明した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲラニルゲラニオールにより、リポ多糖に基因するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)生成を抑制する方法。
【請求項２】
ゲラニルゲラニオールにより、リポ多糖に基因するアラニンアミノ基転移酵素(ALT)生成を抑制する方法。
【請求項３】
ゲラニルゲラニオールを有効成分として含有する、リポ多糖によるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)生成抑制剤。
【請求項４】
ゲラニルゲラニオールを有効成分として含有する、リポ多糖によるアラニンアミノ基転移酵素(ALT)生成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びアラニンアミノ基転移酵素生成抑制物質に関する。より詳細には、ゲラニルゲラニオールを有効成分とした血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びアラニンアミノ基転移酵素生成抑制剤に関し、ゲラニルゲラニオールは、細菌由来リポ多糖による肝機能異常時に出現する血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びアラニンアミノ基転移酵素生成を抑制する。
【背景技術】
【０００２】
ゲラニルゲラニオールは、今日、主に化学合成法により合成されている。化学合成法によると、炭素骨格が同じで1種あるいは2種以上の二重結合がシス体である混合物として得られるが、工業的に利用価値のあるのは、二重結合が全てトランス体であるゲラニルゲラニオールである。（特開平8-133999号公報(特許文献１)）また、近年、生物学的にトランス体のゲラニルゲラニオール及びその誘導体の生産法が開示されている（特開平9-238692号公報(特許文献２)、特開2005-137287号公報(特許文献３)）。一方、天然界において、ゲラニルゲラニオール及びゲラニルリナロールがマツ類の樹脂中に存在するほか、ゲラニルリナロールのニトリル置換体がサンゴの仲間から得られたことは知られている。
【０００３】
アナトー（ベニノキ科ベニノキ、Bixa orellana）は、中央〜南アメリカに自生する植物であるが、今日では、インド、アフリカ等全世界的に栽培されている。その種子は、赤色を帯び、色素抽出原料として数万トンが収穫されている。その内容成分は、カロチノイドであるビキシン、ノルビキシンが主であり、有機溶剤にてアナトー種子より抽出された抽出物は、油溶性、水溶性色素としてチーズ、バター等の乳製品、加工食品、菓子等の食品用着色に使用されている。
【０００４】
ところで、このアナトー色素を除去した抽出残渣からのゲラニルゲラニオールおよびトコトリエノールの分子蒸留による回収法が開示されている（米国特許第6,350,453号明細書(特許文献４)）。また、アナトー種子からの主要産物である赤色色素を製造した後の油状残渣を、アルカリ性水溶液を加え液液分配後、イオン交換樹脂で非吸着画分を得る方法については、本出願人が特許出願をしている(特願2006-063677)。
【０００５】
ゲラニルゲラニオールは、ビタミンE、ビタミンK2、胃炎薬ブラウノトール、制ガン剤であるゲラニルゲラニルアミン誘導体（特開平9-291030号公報(特許文献５)）の原料となる重要な物質である。
【０００６】
一方、ゲラニルゲラニオール自身が、生体内での何らかの役割を示唆する報告も存在する。HMG‐CoA還元酵素は、ゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド化合物生合成の律速酵素であるが、高脂血症に用いるスタチン系製剤は、このHMG‐CoA還元酵素を阻害する（薬学雑誌、2004 Jly; 124(7) : 371-396（非特許文献１））。PDGFレセプターのチロシンリン酸化には、ゲラニルゲラニオールによるレセプターの修飾が必要である（J Biol. Chem.、1996 Nov 1; 271(44) : 27402-27407(非特許文献２)）。ゲラニルゲラニオールは、HL-60など、種々のがん細胞に対してアポトーシスを誘導する（Biochem. Biophys. Res. Commun.、1996 Sep24; 226(3): 741-745(非特許文献３)、日本ビタミン学会第58回大会プログラム・講演要旨、2006 Apl; 80(4) : 202(非特許文献４)）。更には、ゲラニルゲラニオール自身に関して、破骨細胞形成抑制作用を有し、抗骨粗鬆症剤としての有用性（特開平7-215849号公報(特許文献６)）が開示され、ゲラニルゲラニオールを有効成分とする抗動脈硬化治療剤（特開平10-87480号公報(特許文献７)）、熱ショック蛋白質誘導剤（特開2001-172171号公報(特許文献８)）についての開示がされている。
【０００７】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)及びアラニンアミノ基転移酵素(ALT)は、 肝臓の細胞中に含まれる酵素であり、血漿AST及びALTが異常高値であるということは、なんらかの原因で肝臓の細胞が壊れ、血中にAST及びALTがもれ出てきている可能性を意味する。肝硬変、肝ガン、慢性的な肝炎、心筋梗塞、胆石症、閉塞性黄疸、アルコール性肝炎、慢性肝炎、劇症肝炎、うっ血肝、急性肝炎など肝臓障害の関係する疾患において重要な指標となる。
【０００８】
内毒素は、細菌から遊離し、各種細胞を刺激することにより腫瘍壊死因子、インターロイキン‐1β、インターロイキン‐6 (IL6)、インターロイキン‐8、γ‐インターフェロン、白血病阻害因子、組織因子、ヒスタミン及び一酸化窒素を含む内因性炎症メディエーターなどを放出しショックを誘導するリポ多糖である。敗血症に至らなくとも、肝障害、腹膜炎、すい炎、中耳炎、歯周病などに関わる。
【０００９】
また、アルコール飲用は、腸内細菌からのリポ多糖の放出及び腸管のリポ多糖透過性を増大させ、血中のリポ多糖濃度を高め、増大したリポ多糖が肝臓Kupfferマクロファージ細胞からのエイコサノイド、腫瘍壊死因子α、フリーラジカルの放出を活性化させることがラットを用いた実験であきらかとなっており（J Nutr.、1997 May;127(5 Suppl):903S-906S. (非特許文献６)）、アルコール飲用による肝臓障害において、腸内細菌由来リポ多糖関与の可能性が示されている。
【００１０】
つまり、アルコールなどにより生じるリポ多糖による肝臓障害の予防に資し、かつ、安全性にも優れた食品の開発は望まれるところであるが、細菌由来リポ多糖による血漿AST及びALTの生成を抑制する物質がこの目的を達する良い候補となる。
【００１１】
ところで、ゲラニルゲラニオールに関しては、生体において有効成分として機能する可能性を示唆する報告があり、熱ショック蛋白質誘導剤(特許文献８)として臓器組織における熱ショック蛋白質を誘導し、組織のストレスに対する抵抗性を高め、その結果、肝臓障害予防に関わる可能性は示されていたが、これまで細菌由来リポ多糖によるAST及びALT生成を抑制する成分としての検討はなされていなかった。
【００１２】
【特許文献１】特開平8-133999号公報
【特許文献２】特開平9-238692号公報
【特許文献３】特開2005-137287号公報
【特許文献４】米国特許第6,350,453号明細書
【特許文献５】特開平9-291030号公報
【特許文献６】特開平7-215849号公報
【特許文献７】特開平10-87480号公報
【特許文献８】特開2001-172171号公報
【非特許文献１】薬学雑誌、2004 Jly; 124(7) : 371-396
【非特許文献２】J Biol. Chem.、1996 Nov 1; 271(44) : 27402-27407
【非特許文献３】Biochem. Biophys. Res. Commun.、1996 Sep24; 226(3): 741-745
【非特許文献４】日本ビタミン学会第58回大会プログラム・講演要旨、2006 Apl; 80(4) : 202
【非特許文献５】Biol. Pharm. Bull.、 2004 Jul;27(7):961-3.
【非特許文献６】J Nutr.、1997 May;127(5 Suppl):903S-906S.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明においては、血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)及びアラニンアミノ基転移酵素(ALT)生成抑制作用を有する成分を探索し、肝臓関連の疾患、症状を緩和、予防および治療に関わる物質を得ることを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ゲラニルゲラニオール（GGOH）に細菌由来リポ多糖による血漿AST及びALT生成抑制作用を認め、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち本発明は、
・  ゲラニルゲラニオールにより、リポ多糖に基因するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)生成を抑制する方法、
・  ゲラニルゲラニオールにより、リポ多糖に基因するアラニンアミノ基転移酵素(ALT)生成を抑制する方法、
・  ゲラニルゲラニオールを有効成分として含有する、リポ多糖に基因するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)生成抑制剤、
・  ゲラニルゲラニオールを有効成分として含有する、リポ多糖に基因するアラニンアミノ基転移酵素(ALT)生成抑制剤
に関するものである。
【００１６】
GGOHは非環状ジテルペンとして知られ、下記に示される構造式を有している。
【００１７】
【化１】
2009013076.tif 000002
【００１８】
GGOHは、アナトー種子若しくはその色素抽出油状残渣より抽出することによって得られる。
【００１９】
アナトー種子からの抽出方法は、ベニノキ科ベニノキの種子の被覆物より、油脂又は有機溶剤で抽出若しくは加水分解を経る。有機溶剤での抽出は、油脂分が抽出される有機溶媒であれば限定されず、好ましくはアルコールの使用が良い。
【００２０】
アナトー種子からの抽出にて、GGOHの製造は可能であるが、経済的な観点から、アナトー色素抽出油状残渣(図１の「油状物」)を使用することが出来る。
【００２１】
種子抽出物、色素抽出油状残渣にはビキシン、ノルビキシンに代表される酸性成分が多く含有されている。この状態で、蒸留等の加熱操作が加わるとGGOHのアルコール基とカルボン酸との縮合反応、GGOHの熱分解、異性化等が発生する。
【００２２】
また、ヘミエステル化反応、イオン交換樹脂による精製を行う上で、これらの成分は、反応不足、吸着力低下、分割不良、精製不足の原因となる。よって、酸性成分の除去を行うことが好ましい。方法として脱酸、低級アルコールとのエステル化、陰イオン交換樹脂等が挙げられる。
【００２３】
酸性成分が除去されたアナトー抽出物は、トコフェロール類の精製方法として既知のイオン交換樹脂による精製法、すなわち、抽出油を有機溶剤に溶解し、強塩基性陰イオン交換樹脂に通液し、その後、酸、アルカリ等を用いる方法により、更に微量に存在する酸性成分及びトコトリエノールとの分割を行う。この際、アルコールであるGGOHは、イオン交換樹脂に吸着されない粗GGOHとして得る。
【００２４】
得られた粗GGOHを非極性溶媒中で二塩基酸無水物と反応させてGGOHのヘミエステル化物とし、これを非極性溶媒とアルコール系溶媒との混合溶媒の存在下で陰イオン交換樹脂で吸着精製を行う。ヘミエステル化物は陰イオン交換樹脂に吸着されて不純物から分離され、吸着されたヘミエステル化物は混合溶媒アルカリ溶液で脱着、加水分解することにより容易にGGOHを回収することが出来る。
【００２５】
以上のGGOH取得フローを図示すると図１のようになる。
【００２６】
生体における血漿AST及びALT生成は、肝硬変、肝ガン、慢性的な肝炎、心筋梗塞、胆石症、閉塞性黄疸、アルコール性肝炎、慢性肝炎、劇症肝炎、うっ血肝、急性肝炎など肝臓障害の関係する疾患において重要な指標となる。すなわち、AST及びALT生成を抑制する物質は、肝臓に関わる疾患の治療および予防に有用と考えられる。特にアルコールは細菌由来リポ多糖の腸管透過性を高めるとされ、リポ多糖によるAST及びALT生成を抑制する物質は日常生活における肝障害予防に有用な素材といえる。
【００２７】
本発明は、GGOHが、リポ多糖によるAST及びALT生成を抑制する作用を見出し、この知見に基づきアルコール性肝臓障害の予防剤として有効であることを発明したものである。
【００２８】
本発明における抑制剤は、液状あるいは粒状、固形状でもよく、経口投与あるいは静脈注射であってもよい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によって、GGOHがリポ多糖によるAST及びALT生成抑制剤として利用できることが示され、アルコール性肝臓障害の予防剤として有効であることが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
図１に示された工程により調製したGGOHについて、リポ多糖によるAST及びALT生成抑制作用に対する効果について検証した。マクロファージ様に分化させたTHP‐1細胞をGGOHで24時間インキュベーションした後、リポ多糖を添加し、インキュベーション3時間後のIL6 mRNA量を調べた。
【００３１】
GGOH無添加では顕著にmRNAの上昇を認めるが、GGOH、10μM添加でmRNA の低下を認めた。Wister雄ラットをリポ多糖で感作する前に予めGGOHを10日間経口摂取させた。その結果、GGOHはAST及びALTの生成を抑制した（図２、３）。
【００３２】
また、リポ多糖による感作では、マクロファージなどからIL6といった炎症因子が放出されるが、リポ多糖感作によるIL6放出もGGOHにより抑制され（図４）、AST及びALTの低下が炎症作用の抑制により生じていることが示唆された。
【００３３】
以下に本発明の実施例を挙げて、より詳細に説明するが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
[in vitro試験]
マクロファージ様に分化させたTHP‐1細胞を用いてリポ多糖感作によるIL6生成に対するGGOHの影響について調べた。THP-1細胞は、10% 牛胎児血清(ICN)、2 mM L-glutamine、100 U/mL penicillin、100 μg/mL streptomycinを含有するRPMI 1640 培地(Sigma)を用いて、37℃、5％CO2/95％空気下CO2インキュベーター(Model IT43、ヤマト科学)で培養した。
【００３５】
5mlの10%FBS/RPMI 1640培地にTHP‐1細胞を懸濁し、60mm細胞培養用ディッシュ(NUNKTM)に播種した。細胞を播種後、phorbol 12-myristate 13-acetate ( Sigma)を終濃度10ng /mLとなるように加え、48時間分化誘導させた。分化したTHP‐1細胞に、GGOH、10μMを加え、37℃、24時間インキュベーションした後、大腸菌由来リポ多糖を1μg/mLとなるように加え、3時間培養した。
【００３６】
細胞からRNAを回収し、RT‐PCR法により、IL6のmRNA量を測定した(n=4)。無添加のmRNA量を1±0.09 (平均値±標準誤差)とした場合、10μMGGOHでは0.56±0.02であり、One-way Analysis of Varianceの後，Tukey test により、p<0.01で有意な低下を示した。
【実施例２】
【００３７】
[動物飼育]
Wistar雄ラット（日本SLC社製）を7週齢で購入し、明期8:00〜20:00、室温23±1℃、相対湿度60±5％の空調飼育室内で飼育した。Wistar雄ラットは調製飼料（Hartland Teklad 社製HT90753）を与え、水道水と共に自由摂取させた。
【００３８】
Wistar雄ラットは5群に分け、8週齢となったWistar雄ラットをAST及びALT値、体重共に有意差が生じないよう5群に分け、対照群(n=8)にはビタミンK1を0.75mg/kg含有するHT90753を、実験群(n=8)には、ビタミンK1を75mg/kg含有するHT90753（K1群）、ゲラニルゲラニオールを48.3mg/kg含有するHT90753（GGI群）、ゲラニルゲラニオールを483mg/kg含有するHT90753（GGX群）、ゲラニルゲラニオールを4830mg/kg含有するHT90753（GGC群）飼料を与え10日間飼育した。
【００３９】
10日間摂取後、腹腔内にラット体重0.5mg/kgの大腸菌由来リポ多糖を注入し水以外は18時間絶食し、解剖した。
【実施例３】
【００４０】
[ALT測定]
ALTは日本臨床化学会準拠、POP・TOOS法によった。ラットよりヘパリンを含んだ注射筒で採取した血液を、遠心分離し血漿を得た。血漿中のALTをトランスアミナーゼCII‐テストワコー（和光純薬工業社製）を用い測定した。
【００４１】
対照群では、932±233 Karmen unitであったのに対し、K1群、478±117 Karmen unit、GGX群、122±55 Karmen unit、GGC群、34±1.7mg/kgであり、One-way Analysis of Varianceの後，Tukey test により、有意なALT低下を示した。(図2)
【実施例４】
【００４２】
[AST測定]
ASTは日本臨床化学会準拠、POP・TOOS法によった。ラットよりヘパリンを含んだ注射筒で採取した血液を、遠心分離し血漿を得た。血漿中のASTをトランスアミナーゼCII‐テストワコー（和光純薬工業社製）を用い測定した。
【００４３】
対照群では、3310±817 Karmen unitであったのに対し、K1群、1210±320 Karmen unit、GGX群、326±141 Karmen unit、GGC群、89±3.5 Karmen unitであり、One-way Analysis of Varianceの後，Tukey test により、有意なAST低下を示した。(図3)
【実施例５】
【００４４】
[IL6測定]
IL6は酵素免疫測定法によった。ラットよりエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含んだ注射筒で採取した血液を、遠心分離し血漿を得た。血漿中のIL6をQuantikine  Rat IL-6 （R & D Systems社製）を用い測定した。
【００４５】
対照群では、657±279 pg/kgであったのに対し、K1群、151±19 pg/kg、GGX群、136±13 pg/kg、GGC群、145±14 pg/kgであり、One-way Analysis of Varianceの後，Tukey test により、有意なIL6低下を示した。(図4)
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ゲラニルゲラニオールの製造フローを示す図。
【図２】ゲラニルゲラニオール及びLPS処理後WisterラットにおけるALT測定図。
【図３】ゲラニルゲラニオール及びLPS処理後WisterラットにおけるAST測定図。
【図４】ゲラニルゲラニオール及びLPS処理後WisterラットにおけるIL6測定図。
【図１】
2009013076.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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