(57)【要約】【課題】これまで十分な生成量が得られていなかった重合度5〜15糖類の分岐糖類含有組成物を製造できる方法とこの方法で得られる分岐糖類含有組成物を応用した食品を提供すること。【解決手段】α-グルカン含有物に枝作り酵素を作用させて分岐構造を増加させたα-グルカンを含有する生成物を得、次いで前記生成物に加水分解酵素を作用させて分岐糖類を含む組成物を得る、分岐糖類含有組成物の製造方法。この製造方法で得られた、重合度5〜15の分岐糖類を30 %以上含有する組成物を含有する飲食品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α-グルカン含有物に枝作り酵素を作用させて分岐構造を増加させたα-グルカンを含有する生成物を得、次いで前記生成物に加水分解酵素を作用させて分岐糖類を含む組成物を得る、分岐糖類含有組成物の製造方法。
【請求項２】
α-グルカン含有物が、DE5以下のデンプン液化液である請求項1記載の製造方法。
【請求項３】
枝作り酵素が、植物または藻類由来の枝作り酵素である請求項1記載の製造方法。
【請求項４】
植物がイネ、トウモロコシ、ジャガイモ、またはマメであり、藻類が紅藻、緑藻、または藍藻である請求項３記載の分岐糖類の製造方法。
【請求項５】
加水分解酵素との作用は、α-アミラーゼを単独で作用させて行うか、またはβ-アミラーゼおよびα-アミラーゼを順次または同時に作用させることで行う、請求項1〜4のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
分岐糖類を含む組成物が、重合度5〜15の分岐糖類を30 %以上含有する請求項1〜5のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載の製造方法で得られた、重合度5〜15の分岐糖類を30 %以上含有する組成物を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐糖類の製造方法およびこの製造方法で得られた分岐糖類を利用した飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
分岐糖類は、α-1,6-グルコシド結合を少なくとも1個以上を有する糖質で、高分子なものにはデンプンの構成成分であるアミロペクチンや分岐デキストリンが、オリゴ糖類では2〜3糖類（イソマルトース、パノースなど）を主成分とするもの、例えばバイオトース#50（日本食品化工（株）製）やパノリッチ（日本食品化工（株）製）が知られている。分岐デキストリンは、デンプンをα-アミラーゼやβ-アミラーゼ処理をした後に樹脂分画により製造されており、イソマルトースやパノースは、マルトースを主体とするデンプン分解物を原料としてα-グルコシダーゼの糖転移作用を利用して生産されている。これらは、消化を受けがたく血糖値の上昇抑制や整腸作用、抗う蝕作用などの生体調節機能を持つことが明らかとなっている（非特許文献１）。
【０００３】
生体調節機能のほかに糖質は、飲食品の甘味、コク味、ボディ感、着色性、吸保湿性などの物理化学的特性の調整に用いられ、飲食品のおいしさに寄与している。例えば、低甘味化やボディ感を付与するには、より高分子な糖を添加したり、保湿性や焼き色を付与するにはより低分子な糖を添加したりし調節する。このため、様々な重合度の糖質が、飲食品のおいしさや食感、マスキング効果、日持ち効果などの向上に開発され利用されている。さらに、分岐糖類は直鎖糖類と異なり、非醗酵性（酵母）や高い保湿性を有するなど食品加工上、特徴的な性質を具備している。
【０００４】
直鎖糖類の場合、デンプンを原料としてアミロペクチンの直鎖を構成するα-1,4-グルコシド結合を加水分解する種々のアミラーゼ‐タイプの酵素を使用して、重合度が3糖類を中心とするもの（フジオリゴ#360，日本食品化工（株）製）、4糖類を中心とするもの（フジオリゴ#450，日本食品化工（株）製）、5糖類を中心とするもの（ペントラップ,（株）林原商事製）、6糖や7糖類を中心とするもの（フジオリゴG67，日本食品化工（株）製）、高分子のものを中心とするデキストリンが生産され、様々な用途に利用されている。これに対して、分岐糖類は2〜3糖類（イソマルトース、パノースなど）を主成分とするものと高分子の分岐デキストリンが知られているのみで、4糖類〜15糖類の重合度を中心とした糖類は未だ市販されておらず、分岐糖類の用途は限定されている。
【０００５】
イソマルトースやパノースは、デンプンを液化後、β-アミラーゼや枝きり酵素を作用させマルトースを生成し、マルトースを基質としてα-グルコシダーゼの糖転移反応を利用して製造されている（非特許文献１）。このため、生成される分岐糖類は、主に2糖や3糖の低分子オリゴ糖であり、分子中の分岐位置はイソマルトースを除き非還元末端側に限定される。また、分岐デキストリンは、うるち種デンプン（コーンスターチや馬鈴薯デンプン）を原料に、α-アミラーゼやβ-アミラーゼを作用させ加水分解した後、高分子デキストリン区分を分離したもの（特許文献1，2）ともち種デンプン（ワキシーコーンスターチ）を原料に、α-アミラーゼを軽微に作用させ加水分解したものとして松谷化学工業（株）製のパインデックス#100が知られている。
【０００６】
重合度5〜15糖類の分岐糖類の生成法として、もち種デンプンを原料としてα-アミラーゼにより加水分解を行った後分画にて得る方法（非特許文献2）やもち種デンプンからβ-リミットデキストリンを調製後、さらにα-アミラーゼで加水分解を行い得る方法（非特許文献3, 4）が知られている。いずれの場合も、原料デンプンに由来する分岐構造を抽出する方法であり、重合度5〜15糖類の分岐糖類の生成量は原料デンプンに依存しており、その量は十分なものではなかった。
【特許文献１】特許第1815698号
【特許文献２】特許第3961157号
【非特許文献１】加藤工成:各種澱粉糖(澱粉起源糖質)．澱粉科学の辞典(不和英次  他)，pp.446-451  朝倉書店 (2003).
【非特許文献２】貝沼圭二，French, D. アミラーゼシンポジウム, 5, 35 (1970).
【非特許文献３】K. Umeki，T. Yamamoto, J. Biochem., 78, 889-896 (1975).
【非特許文献４】K. Umeki，T. Yamamoto, J. Biochem., 78, 897-903 (1975).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明は、原料デンプンに対する重合度5〜15糖類の分岐糖類の生成量の依存性が低減され、かつ重合度5〜15糖類の分岐糖類の含有量が高い、具体的には、重合度5〜15糖類の分岐糖類の含有量が30質量％以上である、重合度5〜15糖類の分岐糖類含有組成物を製造できる方法を提供することを目的とする。さらに、この方法で得られた分岐糖類含有組成物を応用した食品を提供することも本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、予め、天然デンプン以上に分岐構造を増加させたα-グルカンを生成させ、次いで、分岐構造を増加させたα-グルカンから生成することにより、これまで十分な生成量が得られていなかった重合度5〜15糖類の分岐糖類を効率よく得られることを見いだした。
【０００９】
より具体的には、本発明者らは、EC 2.4.1.18に分類されるデンプン枝作り酵素の作用に着目し、原料デンプンの分岐構造を増加させ、次いで、各種加水分解酵素を作用させることにより、原料デンプンの違いに重合度5〜15糖類の分岐糖類の生成量が依存する度合いを低減し、かつ5〜15糖類の分岐糖類の含有量が高い、5〜15糖類の分岐糖類を含有する組成物の製造方法を見出し、本発明の完成に至った。
【００１０】
本発明は以下の通りである。
[１]α-グルカン含有物に枝作り酵素を作用させて分岐構造を増加させたα-グルカンを含有する生成物を得、次いで前記生成物に加水分解酵素を作用させて分岐糖類を含む組成物を得る、分岐糖類含有組成物の製造方法。
[２]α-グルカン含有物が、DE5以下のデンプン液化液である[1]記載の製造方法。
[３]枝作り酵素が、植物または藻類由来の枝作り酵素である[1]記載の製造方法。
[４]植物がイネ、トウモロコシ、ジャガイモ、またはマメであり、藻類が紅藻、緑藻、または藍藻である[３]記載の分岐糖類の製造方法。
[５]加水分解酵素との作用は、α-アミラーゼを単独で作用させて行うか、またはβ-アミラーゼおよびα-アミラーゼを順次または同時に作用させることで行う、[1]〜[4]のいずれかに記載の製造方法。
[６]分岐糖類を含む組成物が、重合度5〜15の分岐糖類を30 %以上含有する[1]〜[5]のいずれかに記載の製造方法。
[７][６]に記載の製造方法で得られた、重合度5〜15の分岐糖類を30 %以上含有する組成物を含有する飲食品。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、原料デンプンの違いに重合度5〜15糖類の分岐糖類の生成量が依存する度合いを低減し、かつ5〜15糖類の分岐糖類の含有量が高い、5〜15糖類の分岐糖類を含有する組成物の製造方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の重合度5〜15の分岐糖類を含有する組成物を製造するには、原料としてα-グルカン含有物を用いる。α-グルカン含有物ならば特に限定されないが、好ましくは入手しやすいコーンスターチ、ワキシーコーンスターチ、馬鈴薯デンプン、タピオカデンプン、コメデンプン、小麦デンプンなどを用いて、通常の酵素水あめなどと同様にα-アミラーゼを用いてデンプンを分解して得た液化液であることができる。この際、デンプンの分解度はできるだけ低いほうが良いが、分解度の低いデンプン液化液は老化しやすいため、老化しにくく且つ低分解度に調製された液化液を調製するのが好ましい。すなわち、液化されたデンプンの単位鎖長の大部分が重合度10以上であればよく、ブドウ糖当量（DE）5以下の液化液に相当する。なお、DE測定の困難な低分解液化液（概ねDE1以下）の場合には、例えば10〜15 w/w%の馬鈴薯デンプン懸濁液を液化した時、B型粘度計で液化液が70℃で約100cpの粘度を示すような分解度のものであるが、デンプン起源の違いにより同条件で液化した場合でも粘度の値は異なるため、使用するデンプンにより適切な粘度は異なる。このように調製されたα-グルカン含有物である液化液に、枝作り酵素を添加し枝作り反応を行うことが適当である。
【００１３】
使用する枝作り酵素は、EC 2.4.1.18に分類されるものであれば特に限定されないが、植物もしくは藻類起源のものが好ましい。植物起源としてはイネ、トウモロコシ、ジャガイモ、マメのものが、藻類起源としては紅藻、緑藻、藍藻ものがより好ましい。また、植物起源の枝作り酵素はアイソザイム（BE I, BE IIa, BE IIb）が存在することが知られているがいずれも使用することができる。
【００１４】
枝作り反応は、使用する枝作り酵素の特性に合わせて基質濃度、温度やpHを選択することが可能で、例えば基質濃度は固形分1〜50 %、pH 3〜8、温度10〜50 ℃とすることが適当である。枝作り酵素の作用によって、α-グルカンの分岐構造を増加させる。この状態を以下のスキームに示す。
【００１５】
【化１】
2009124994.tif 000002
【００１６】
枝作り酵素との反応は、原料であるα-グルカンに比べて、α-グルカンの分岐構造が所望の程度まで増加するまで行う。α-グルカンの分岐構造の程度は、例えば、ヨード呈色反応により確認することができる。具体的には、反応液がヨード呈色反応により青色または赤紫（原料）から黄褐色になるまで、より具体的には、反応液のヨード呈色反応後の660 nmの吸光度が反応前と比較して40%以上減少するまで、枝作り酵素との反応を行うことが適当である。
【００１７】
次いで、分岐構造を増加させたα-グルカン含有生成物に各種加水分解酵素を作用させ重合度5〜15の分岐糖類を得る。加水分解反応は、使用する加水分解酵素の特性に合わせて基質濃度、温度やpHを選択することが可能で、例えば基質濃度は固形分1〜50 %、pH 3〜8、温度20〜85℃で行うことができる。
【００１８】
使用する加水分解酵素は、アミラーゼ類を用いるのが好ましく、エキソ型でもエンド型のアミラーゼでも用いることが可能で、α-アミラーゼ、β-アミラーゼを用いることがより好ましい。α-アミラーゼやβ-アミラーゼは、その起源に特に限定はなく、同時に反応させたり、それぞれ酵素を別々に反応させたり適宜反応形態により選択することが可能である。
【００１９】
α-アミラーゼ、β-アミラーゼとの反応は、使用するα-アミラーゼ、β-アミラーゼの特性に合わせて基質濃度、温度やpHを選択することが可能で、例えば基質濃度は固形分1〜50 %、pH 3〜8、温度10〜80 ℃とすることが適当である。
枝作り酵素の作用によって、分岐構造を増加させたα-グルカンに対して、α-アミラーゼを単独で作用させるか、またはβ-アミラーゼを作用させ、さらにα-アミラーゼを作用させたり、逆にα-アミラーゼを作用させ、さらにβ-アミラーゼを作用させたり、α-アミラーゼとβ-アミラーゼを同時に作用させたりすることで、重合度5〜15の分岐糖類含有物を得ることができる。重合度5〜15の分岐糖類含有物は、分岐構造を増加させたα-グルカン含有生成物に含まれるα-グルカンの分岐構造を高めることで、重合度5〜15の分岐糖類を30 %以上含有することもできる。
【００２０】
重合度5〜15の分岐糖類含有物には重合度5〜15の分岐糖類以外の糖類が含まれている。この分岐糖類以外の夾雑糖類を、イオン交換樹脂、シリカゲルや活性炭を用いたカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコールやアセトンなどの有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、そして重合度5〜15の分岐糖類を利用せず夾雑糖類を資化または分解する微生物、例えば乳酸菌、酢酸菌、酵母などによる発酵処理の1種または2種以上の方法により除去することにより重合度5〜15の分岐糖類をさらに高純度化することができる。
【００２１】
また、重合度5〜15の分岐糖類は、シラップ状でも粉末状でも使用状態により適宜選択することが可能である。粉末する方法は、凍結乾燥、噴霧乾燥など既存の方法を用いることができる。
【００２２】
このように製造される重合度5〜15の分岐糖類は、無毒、無害の甘味料で、芳醇で深み・コク味を有する独特の甘味を呈する。耐熱性、耐酸性にも優れた安定な糖質であり、加熱により適度に着色し、他の素材と混合し加工しても異臭などを発生することはなく、混合した他の素材を損なうこともほとんどない。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、離水防止性、固結防止性、保香性、変色防止効果、安定性、他の糖の晶出防止性、難醗酵性、デンプン老化防止効果、蛋白質変性防止効果、脂質劣化防止効果など種々の性質をも具備している。
【００２３】
したがって、本発明の重合度5〜15の分岐糖類またはこれを含む糖質は、甘味料、難醗酵性食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、保香剤、変色防止剤、脂質劣化防止剤、安定剤、賦形剤、粉末化基材などとして、プルラン、ヒドロキシエチルスターチおよびポリビニルピロリドンなどの1種または2種以上の結合剤と併用して錠剤や糖衣錠として利用することもできる。このため、そのまま、または必要に応じて本発明の糖質と公知材料と適宜併用して、各種飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品等の各種組成物に有利に利用できる。公知の材料としては、例えば、呈味料、着色料、着香料、強化剤、乳化剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、または薬効成分など適宜利用できる。
【００２４】
本発明により得られる重合度5〜15の分岐糖類は、他の甘味成分と併用することもできる。例えば、ショ糖、水飴、粉飴、ブドウ糖、果糖、マルトース、異性化糖、乳糖、蜂蜜、カップリングシュガー、フラクトシルオリゴ糖等の各種糖類、エリスリトール、ソルビトール、マルチトール、キシリトール、マンニトール、ラクチトール、還元キシロオリゴ糖、還元グルコースシラップ等の糖アルコール、アスパルテーム、アリテーム、サッカリン、グリチルリチン、ステビオシド、レバウディオシド、スクラロース、アセスルファムK等の高甘味度甘味、グリシン、アラニンなどの甘味料から選ばれた1種又は2種以上と組み合わせて用いることができる。また、必要ならば、デキストリン、澱粉などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００２５】
さらに、通常の飲食物の甘味付けや呈味改良、風味改良、品質改良等の効果の他、塩味や他の旨味をまろやかにしつつ引き立てる効果も有しているので、例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、各種ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼肉等のタレ、カレールウ、シチューの素、だしの素、各種複合調味料、新みりん、テーブルトップシュガー、コーヒーシュガー、中華の素、天つゆ等の各種調味料、合成清酒、みりん、甘味果実酒、リキュール、粉末酒、雑酒などの混成酒類、ビール、発泡酒などの発泡性酒類、清酒、果実酒などの醸造酒類、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料などに有効に使用することができる。
【００２６】
また、低甘味で非常に上品な甘味を有し、甘味付けとしてだけでなく、甘味質、味質の改善効果も有し、更に、艶出し効果や蛋白質変性防止効果、賦コク等の効果も有しているので、煎餅、あられ、かりん糖、おこし、餅類、饅頭、求肥、餡類、羊羮、ゼリー、カステラ、飴玉、パン、パイ、クラッカー、ビスケット、プリン、ワッフル、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、スポンジケーキ、ドーナツ、アイスクリーム、シャーベット等の各種飲食物や、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト等のペースト類、ジャム、マーマレード等の各種ジャム類、福神漬、千枚漬、らっきょう漬等の漬物類、ハム、ソーセージ、蒲鉾、ちくわ等の畜産練製品、水産練製品及びその原材料のすり身、各種珍味類、佃煮等に用いることができる。上記のような飲食物等に含有させるには、その飲食物等の任意の製造工程において、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、被覆、噴霧、注入、晶出、固化、造粒等の公知の方法を適宜選択して行うことができる。上記したような効果の他に、飲食品成分の結晶化防止、アミラーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼなどの酵素安定化、難消化性による血糖値のコントロール等の効果も有している。
【００２７】
本発明の重合度5〜15の分岐糖類は、家畜、家禽、その他、ミツバチ、蚕、魚などの飼育動物ための飼料、餌料などの嗜好性向上のほか、難消化性の性質を有することから、整腸作用、健康維持、ストレス低減などの目的にも使用できる。上記のような飼料、餌料などに使用する場合、トウモロコシ、マイロ、大麦などの穀類、グルコースやデンプンなどの他の糖質、植物や動物由来の蛋白質、リジン、スレオニンやトリプトファンのアミノ酸類、ビタミンA、ビタミンB2、ビタミンB12、ビタミンEなどのビタミン類、ホルモン類、抗生物質などと混合して使用することができる。
【００２８】
本発明の重合度5〜15の分岐糖類は、他の天然糖質と同様に皮膚へ適用した場合、低刺激性かつ皮膚の水分保持にも奏功するので、皮膚外用組成物に配合して使用することができる。例えば、化粧品として、油脂、アルコール類、界面活性剤、色素、香料、ホルモン類、ビタミン類、動物エキス、植物エキス、微生物エキス、塩類、紫外線吸収剤、抗酸化剤、殺菌剤、制汗剤、消臭剤、清涼剤、糖類、キレート剤、増粘剤などから適宜選ばれる１種または2種以上とともに配合される。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。
【００３０】
[試験方法]分岐糖類の測定法
測定試料50 mgに0.5 M 酢酸緩衝液(0.5 M CaCl2を含む) pH 6を10μl、Pseudomonas stutzeri由来のエキソマルトテトラオヒドロラーゼ（EC 3.2.1.60） 4.5 Uを添加し、精製水にて1 mlとする。これを55℃の温浴中で24時間反応させる。反応後、10分間煮沸失活をさせ冷却をする。これをイオン交換、ろ過処理を行い液体クロマトグラフィーの試料とする。以下に示す条件の液体クロマトグラフィーに試料を供し、重合度5〜15糖類の分岐糖類を測定した。
【００３１】
カラム：MCI GEL CK02AS (20 mm ID × 250 mm)
溶媒：精製水
流速：1.0 ml/min
カラム温度：85 ℃
検出器：示唆屈折計
【００３２】
[参考例1]
各種起源の枝作り酵素による枝作り反応
紅藻(Porphridium purpureum)、緑藻(Chlorella Kessleri)、藍藻(Synechococcus elongates)、イネ由来の枝作り酵素を用いて、アミロペクチンの分岐数を以下のようにして増加させた。反応系は、640μg/ml アミロペクチン、50 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）、1 mM DTT、1 mg/ml 牛血清アルブミン、8.0 U/mlの各酵素とし、20 ℃にて一時間反応した。
【００３３】
分岐の増加確認は、反応液を100℃、2分間処理して反応停止後、反応停止液 180μlに100% 酢酸 10μl、600 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.4） 20μl、イソアミラーゼ（林原製）およびプルラナーゼ 各2μl、蒸留水で全量 304μlに調整して、37 ℃、一晩反応した。100 ℃、10分間処理して反応停止後、15,000 rpm、20分、室温での遠心分離で得られた上清を脱イオンカラム（AG500-X8(D)）へ供した。脱イオン化したオリゴ糖サンプルの還元糖量を改良Park-Johnson法により測定して、還元糖量10 nmol分のオリゴ糖サンプルを減圧乾燥した。この乾燥サンプルに2μl APTS（1-aminopyrene-3,6,8-trisulfonic acid, trisodium salt）溶液（200 mg APTSを15% 酢酸水溶液で溶解）と2μl シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム(CBNa)溶液 （5 mg CBNaに79μl テトラヒドロフランで溶解）を加えて、撹拌後、55 ℃、90分間反応した。そして、46μl蒸留水を加えてキャピラリー電気泳動用サンプルとした。
【００３４】
APTS標識したオリゴ糖の鎖長解析はキャピラリー電気泳動装置 P/ACE DQ carbohydrate system（BECKMAN COULTER）を用いて行った。各種起源の枝作り酵素を作用させたアミロペクチンの鎖長分布の結果を図1に示す。その結果、いずれの酵素を用いても重合度6〜12の鎖長が顕著に増加していた。これは、枝作り酵素の作用で重合度6〜12のオリゴ糖がα-1,6-グルコシド結合で結合した分岐鎖が顕著に増加していることを意味している。
【００３５】
[参考例2]
枝作り酵素のアイソザイムによる枝作り反応
イネ由来の枝作り酵素のアイソザイム（BE I、BE IIa、BE IIb）を用いて、アミロペクチンの分岐数を参考例1と同様に増加させた。反応は、640μg/ml アミロペクチン、50 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）、1 mM DTT、1 mg/ml 牛血清アルブミン、8.0 U/mlイネBE酵素を加えて、20℃、一時間反応した。反応液を100℃、2分間処理して反応停止後、BE反応停止液 480μlに100% 酢酸 25μl、600 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.4） 50μl、イソアミラーゼ 3μl、蒸留水で全量 758μlに調整して、37℃、一晩反応した。100℃、10分間処理して反応停止後、15,000 rpm、20分、室温での遠心分離で得られた上清を脱イオンカラム（AG500-X8(D)）へ供した。脱イオン化したオリゴ糖サンプルの還元糖量を改良Park-Johnson法により測定して、還元糖量10 nmol分のオリゴ糖サンプルを減圧乾燥した。次いで実施例2と同様の操作を行うことにより枝作り反応の確認をした。イネ起源の枝作り酵素（アイソザイム）を作用させたアミロペクチンの鎖長分布の結果を図2に示す。その結果、いずれの酵素を用いても重合度6〜12の鎖長が顕著に増加していた。これは、枝作り酵素の作用で重合度6〜12のオリゴ糖がα-1,6-グルコシド結合で結合した分岐鎖が顕著に増加していることを意味している。
【００３６】
[実施例1]
重合度5〜15糖類の分岐糖類シラップの調製
固形分15 %の馬鈴薯デンプンおよびワキシーコーンスターチ懸濁液を常法によりα-アミラーゼによりDE3以下になるように液化液を調製した。各デンプンの液化液をpH 7.0、温度30 ℃に調整し、これに基質1g当り1330 Uのイネ由来の枝作り酵素(BEIIb)を添加し枝作り反応を開始した。反応48時間後に反応液がヨードにより青色または赤紫に呈色しなくなったのを確認し、反応液をpH 5.5、温度55 ℃に調整した。これに、β-アミラーゼ(β-アミラーゼ#1500, ナガセケムテックス（株）製) を基質1g当り5 mg添加して14時間反応し、β-リミットデキストリンを生成させた。同様に、枝作り反応未処理の液化液もβ-リミットデキストリン生成反応を行った。次いでこれらの反応液にα-アミラーゼ(クライスターゼ T-5, 大和化成（株）製)を基質1g当り3 mg添加して48時間反応し、分岐オリゴ糖の調製をした（試験区A〜D）。また、同様にワキシーコーンスターチを原料に調製した枝作り反応未処理液化液と枝作り反応処理液化液をpH 5.5、温度55 ℃に調整し、β-アミラーゼ(β-アミラーゼ#1500, ナガセケムテックス（株）製)を基質1g当り5 mgとα-アミラーゼ(クライスターゼ T-5, 大和化成（株）製)を基質1g当り3 mgを同時に添加して48時間反応し分岐オリゴ糖を調製した（試験区E, F）。さらに、ワキシーコーンスターチを原料に調製した枝作り反応未処理液化液と枝作り反応処理液化液をpH 5.5、温度55 ℃に調整し、α-アミラーゼ (クライスターゼ T-5, 大和化成（株）製)を基質1g当り3 mg添加して48時間反応し、α-リミットデキストリンを生成させた（試験区G, H）。次いでβ-アミラーゼ(β-アミラーゼ#1500, ナガセケムテックス（株）製)を基質1g当り5 mg添加して14時間反応し、分岐オリゴ糖の調製をした（試験区I, J）。分岐オリゴ糖の生成量は、実施例1に示す方法で確認したところ、表1のような結果を得た。
【００３７】
【表１】
2009124994.tif 000003
【００３８】
[比較例1]
既存製品の重合度5〜15糖類の分岐糖類含量
試験方法に記載の方法に従い、市販されている酵素水あめ、分岐オリゴ糖シラップ（バイオトース#50、パノリッチ（日本食品化工（株）製）、デキストリン（パインデックス#1（松谷化学工業（株）製）、分岐デキストリン（パインデックス#100（松谷化学工業（株）製、BLD（参松工業（株）製）の重合度5〜15糖類の分岐糖類の含量を調べた。その結果、重合度5〜15糖類の分岐糖類は、いずれの場合にも20 %を満たしていなかった。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
[実施例2]
重合度5〜15糖類、重合度5の分岐糖類の分画（１）
実施例1の表1に記載の試験区A, BおよびDの分岐糖類を原料に、ゲルろ過により以下に示す分画条件にて重合度5〜15糖類の分岐糖類を分画した。各分岐糖類はBrix 30に調製し、カラムへ3 g注入した。2.5mlずつ分画をし、各フラクションを分岐糖類の測定法に従い分析を行い、重合度5〜15糖類の分岐糖類画分を回収し、イオン交換樹脂処理、0.45μmのフィルターろ過により精製後、凍結乾燥によりそれぞれ約0.3 gずつ得た。また、固形分5 %のワキシーコーンスターチ懸濁液を基質として、基質1 gあたりイソアミラーゼ（日本食品化工（株）製）3,000 U およびプルラナーゼ（商品名:プルラナーゼ3, アマノエンザイム製）3mgを添加して反応液をpH6.0、温度53℃で48時間反応を行い、重合度5〜15糖類の直鎖糖の調製をした。これを分岐糖類と同様に分画を行った。上記で得られたサンプルの糖組成を、分岐糖類の分析条件で確認した結果を表3に示した。
【００４１】
また、実施例1の表1に記載の試験区Dの分岐糖類を原料に、同様に重合度5画分のみを回収し、純度約70％の重合度5の分岐糖類を得た。これをさらに、分岐糖類の分析条件にて分画を行い、重合度5画分のみを回収し、純度99.5 ％の重合度5の分岐糖類を10 mg得た。
【００４２】
カラム：TSK gel TOYOPEARL-40C [φ2.6×80 cm] (東ソー)
溶媒：精製水
流速：0.5ml/min
カラム温度：60℃
【００４３】
【表３】
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[実施例3]
重合度5〜15糖類、重合度5の分岐糖類の分画 （2）
実施例1の表1に記載の試験区E,Fの分岐糖類を原料に、Na型の分画樹脂を用いて以下に示す分画条件にて重合度4以上の糖類を分画した。各分岐糖類はBrix 50に調製し、カラムへ12 ml注入した。1.5mlずつ分画をし、各フラクションを分岐糖類の測定法に従い分析を行い、重合度5〜15糖類の分岐糖類画分を回収した。回収した画分の重合度5〜15糖類の分岐糖類純度を約50%とした場合と、約70％とした場合について、その純度と分画に供した固形分に対する回収率を表4に示した。その結果、枝作り酵素を作用させることによって、分画による重合度5〜15の分岐糖類の高純度化が、枝作り酵素を作用させない場合と比較して高回収率でできることが明らかとなり、経済性に優れることが判明した。
【００４４】
カラム：DIAION UBK530 [φ1.6×60 cm] (三菱化学製)
溶媒：精製水
流速：0.5ml/min (SV=0.25)
カラム温度：60℃
【００４５】
【表４】
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【００４６】
[試験例2]
消化性試験
消化性試験として、各種糖類の加水分解速度をラット小腸刷子縁膜から抽出した酵素を用いて、加水分解に伴い遊離するブドウ糖を測定することにより求めた。ラット小腸刷子縁膜は、シグマ-アルドリッチ社製のラット小腸アセトンパウダーを用い、50mM リン酸緩衝液(ｐＨ7.0) 加え、ホモジナイズ後、遠心分離した上清を小腸抽出酵素として用いた。得られた上清は、0.2 %マルトースを基質として常法によりマルターゼ活性を求めた。マルターゼ活性は、上記の反応条件において、1分間当り1μmolのマルトースが加水分解される酵素量を1 Uとした。
【００４７】
基質として、マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、パノース、マルトペンタオース、実施例2で得た分岐糖類（重合度5）を用いた。各基質7.5mMに対して、36U/mlの小腸抽出酵素を、50 mMリン酸緩衝液(pH 7.0)、0.2 mg/mlアジ化ナトリウム存在下で37にて、経時的に加水分解により遊離したブドウ糖をグルコスタット法にて測定した。遊離したブドウ糖生成の初速度は、図3に示した通りで、易消化性糖質であるマルトースは、速やかに加水分解されるのに対して、同じ重合度のイソマルトースの加水分解速度は1/6で、緩やかに加水分解した。分岐糖類（重合度5）は、同じ重合度のマルトペンタオースに対して1/14の加水分解速度であり、マルトースに対して1/37の、イソマルトースに対しても1/6の、マルトトリオースやパノースに対しても1/7程度の加水分解速度で緩やかに加水分解した。
【００４８】
また、実施例2の重合度5〜15の分岐糖類a, b, dと重合度5〜15の直鎖糖類を基質として、1 w/w%の各基質に、基質1g 当り14,000 Uの小腸抽出酵素を、50 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)、0.2 mg/ml アジ化ナトリウム存在下で37 ℃にて、経時的に加水分解により遊離したブドウ糖をグルコスタット法にて測定した。遊離したブドウ糖生成の初速度は、図4に示した通りで、易消化性の直鎖糖類に対していずれの分岐糖類も60〜70%程度の加水分解速度であった。
【００４９】
以上のように、分岐糖類は消化酵素による加水分解速度が緩やかで、難消化性糖質であった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は糖関連分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】各種起源の枝作り酵素を作用させたアミロペクチンの鎖長分布
【図２】イネ起源の枝作り酵素（アイソザイム）を作用させたアミロペクチンの鎖長分布
【図３】重合度5の分岐糖類の消化酵素による分解速度
【図４】重合度5〜15の分岐糖類の消化酵素による分解速度
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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