(57)【要約】【課題】男性不妊症患者の精子におけるインプリント異常発生リスクの判定方法の提供。【解決手段】ヒト男性不妊症患者の精子由来DNAについて、母性インプリント遺伝子PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、及びSNRPNのうち少なくとも１つのアレル特異的メチル化領域、及び必要によりさらに父性インプリント遺伝子H19及びGTL2のうち少なくとも１つのアレル特異的メチル化領域、においてメチル化異常を検出することを含む、該患者の精子におけるインプリント異常発生リスクを判定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト男性不妊症患者の精子由来DNAについて、母性インプリント遺伝子PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、及びSNRPNのうち少なくとも１つのアレル特異的メチル化領域におけるメチル化異常を検出することを含む、該患者の精子におけるインプリント異常発生リスクを判定する方法。
【請求項２】
前記精子由来DNAについて、父性インプリント遺伝子H19及びGTL2のうち少なくとも１つのアレル特異的メチル化領域におけるメチル化異常を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
男性不妊症患者が乏精子症患者である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
メチル化異常の検出が、バイサルファイト処理した前記精子由来DNAを鋳型として前記アレル特異的メチル化領域を核酸増幅する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
メチル化異常の検出が、バイサルファイト-シークエンス法及び／又はCOBRA法によるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アレル特異的メチル化領域内の以下のa)〜e)の領域についてメチル化異常を検出する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法：
a) PEG1のアレル特異的メチル化領域については、配列番号３の48〜1501位の塩基配列上の少なくとも636〜808位を含む領域；
b) LIT1のアレル特異的メチル化領域については、配列番号４の66508〜68649位の塩基配列上の少なくとも67277〜67521位を含む領域；
c) ZACのアレル特異的メチル化領域については、配列番号５の52190〜53667位の塩基配列上の少なくとも52758〜52859位を含む領域；
d) PEG3のアレル特異的メチル化領域については、配列番号６の162613〜163679位の塩基配列上の少なくとも163200〜163468位を含む領域；
e) SNRPNのアレル特異的メチル化領域については、配列番号７の14095〜15586位の塩基配列上の少なくとも15286〜15472位を含む領域。
【請求項７】
前記アレル特異的メチル化領域内の以下のf)〜g)の領域についてメチル化異常を検出する、請求項２記載の方法：
f) H19のアレル特異的メチル化領域については、配列番号１の7796〜8294位の塩基配列上の少なくとも7906〜8069位を含む領域；
g) GTL2のアレル特異的メチル化領域については、配列番号２の51030〜51417位の塩基配列上の少なくとも51045〜51240位を含む領域。
【請求項８】
以下のa)〜e)のプライマー対を含む、ヒト男性不妊症患者の精子のインプリント異常発生リスク判定用のプライマー・セット。
a) PEG1に対するプライマー対：
TYGTTGTTGGTTAGTTTTGTAYGGTT（配列番号13）
CCCAAAAACAACCCCAACTC      （配列番号14）
b) LIT1に対するプライマー対：
TTTTGGTAGGATTTTGTTGAGGAGT （配列番号15）
CCTCACACCCAACCAATACCTC    （配列番号16）
c) ZACに対するプライマー対：
GGGGTAGTYGTGTTTATAGTTTAGTA（配列番号17）
CRAACACCCAAACACCTACCCTA   （配列番号18）
d) PEG3に対するプライマー対：
AAAAGGTATTAATTATTTATAGTTTGGT（配列番号19）
AAAAATATCCACCCTAAACTAATAA   （配列番号20）
e) SNRPNに対するプライマー対：
GTGTTGTGGGGTTTTAGGGGTTTAG   （配列番号21）
AGGGAGTTGGGATTTTTGTATTG     （配列番号22）
CTCCCCAAACTATCTCTTAAAAAAAACC（配列番号23）
【請求項９】
以下のf)〜g)のプライマー対をさらに含む、請求項８記載のプライマー・セット。
f) H19に対するプライマー対：
AGGTGTTTTAGTTTTATGGATGATGG（配列番号8）
TATATGGGTATTTTTGGAGGTTTTT （配列番号9）
ATAAATATCCTATTCCCAAATAACCCC（配列番号10）
g) GTL2に対するプライマー対：
GGGTTGGGTTTTGTTAGTTGTT    （配列番号11）
CCAATTACAATACCACAAAATTAC  （配列番号12）
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のプライマー・セットと制限酵素TaqIとを含む、ヒト男性不妊症患者の精子のインプリント異常発生リスク判定用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精子におけるインプリント異常発生リスクの判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
精子や卵子を実験室で操作（体外受精など）する生殖補助治療（ART）は、今や不妊症患者にとって重要な治療法の１つとなっている。しかし近年、ART治療により産まれた子に、先天奇形、低出生体重児、その他の新生児における周産期合併症の発生頻度が高いという報告が多数みられる。また従来は稀であったベックウィズ・ウィーデマン症候群やアンジェルマン症候群などのインプリント病の発生頻度の増加も指摘されている。
【０００３】
ゲノムインプリント（遺伝子刷り込み）とは、特定の遺伝子について、定められた一方の親（父又は母）から継承した遺伝子のみが選択的に機能し、他方の遺伝子は機能しないというアレル特異的発現が見られる現象である。インプリントは、哺乳類胎児の正常な発生、胎盤機能又は神経行動学的発達において重要な役割を果たす。ゲノムインプリントを受ける遺伝子（インプリント遺伝子）は、２本あるアレル（対立遺伝子）のうち特定の片親由来のものが識別されて、片親性発現を示す。そしてこのようなインプリント遺伝子の片親性発現には、アレル特異的メチル化領域（differentially methylation region；DMR）でのDNAメチル化が必須であることが、マウスを使ったこれまでの研究から明らかになっている。DMRは遺伝子のプロモーター領域やイントロン等に多く存在し、特に、CpG部位（CpGジヌクレオチド、CG配列）が密集したCpGアイランドでのDNAメチル化が重要と考えられている。インプリントに関してはDMR内のCpG部位のDNAメチル化が最もよく研究されている。
【０００４】
インプリント遺伝子のDMRにおけるアレル特異的メチル化状態は、始原生殖細胞において一旦リセット（インプリントの消去）され、その後、配偶子形成・成熟過程で各インプリント遺伝子について性特異的にインプリントの獲得が為されることで再確立される。母性インプリント遺伝子（母親由来アレルのみがメチル化され不活化される遺伝子）は卵子ではメチル化されるが、精子ではメチル化されない（卵子型インプリント）。同様に父性インプリント遺伝子（父親由来アレルのみがメチル化され不活化される遺伝子）は精子ではメチル化されるが、卵子ではメチル化されない（精子型インプリント）。卵子及び精子で確立したそれぞれのインプリント（性特異的なメチル化状態）は、受精後の着床初期に起こるリプログラミング（ゲノム全体の脱メチル化）の影響を受けず、そのメチル化は安定的に維持される。
【０００５】
ヒトインプリント遺伝子に関する報告は多数為されている。例えば、英国MRC（Mammalian Genetics Unit）のWWWサイト（http://www.mgu.har.mrc.ac.uk/research/imprinting/imprin-viewdatagenes.html）やオタゴ大学（ニュージーランド）のWWWサイト（http://igc.otago.ac.nz/Search.html）などを含む様々な学術用ウェブサイトにヒトを含む多様な生物由来のインプリント遺伝子のリストが掲載されている。配偶子形成・胚形成過程でのヒトインプリント遺伝子のメチル化状態に関する情報はまだ限られているが、正常な精子形成過程では減数分裂過程に入る以前に、SNRPN（母性インプリント遺伝子）ではメチル化が消去され（非特許文献１）、H19（父性インプリント遺伝子）はメチル化を獲得する（非特許文献２及び３）という報告などもある。また、インプリント遺伝子のDMRにおけるメチル化異常は、インプリント病を初めとする様々な疾患、発達異常、悪性腫瘍などと関連することも報告されている（非特許文献４）。例えば、ヒト及びマウスのPEG1のDMRは、PEG1遺伝子のプロモーターからエクソン１及びイントロン１にかけて存在し、その機能する方の父性アレルはメチル化されないが、その父性アレルがメチル化によって不活化される場合には胎児は発育遅延を生じ、胎児死亡例が増加する。
【０００６】
多くのインプリント遺伝子が新生児の成長や発生の調節において重要な役割を果たすことが分かってきており、その機能情報は例えば英国MRC（Mammalian Genetics Unit）のWWWサイトhttp://www.mgu.har.mrc.ac.uk/research/imprinting/function.htmlから入手できる。Marquesらは、乏精子症患者や正常精子を有する少数の不妊症患者の精子においてH19のインプリント異常が見出されたことを報告した（非特許文献３）。一方で、不妊症患者の精子ではインプリント遺伝子のメチル化は正常であったとの報告もあり（非特許文献５）、不妊症患者の精子におけるメチル化状態についてはまだ十分な解析はなされていないのが現状である。本発明者らはARTの際の過剰な排卵誘発が特定のインプリント遺伝子のメチル化に影響を及ぼすことも報告しており（非特許文献６）、生殖細胞においてインプリント異常が生じる原因は様々と考えられる。
【０００７】
【非特許文献１】Manning M., et al, Urol. Int. (2001) 67:151-155
【非特許文献２】Kerjean A., et al., Hum. Mol. Genet. (2000) 9:2183-2187
【非特許文献３】Marques C.J., et al., Lancet (2004) 363:1700-1702
【非特許文献４】Paulsen M. and Ferguson-Smith A.C., J. Pathol. (2001) 195:97-110
【非特許文献５】Hartmann S., et al., Mol. Hum. Reprod. (2006) 12:407-411
【非特許文献６】Sato A., et al., Hum. Reprod. (2007) 22:26-35
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、男性不妊症患者の精子におけるインプリント異常発生リスクの判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、男性不妊症患者の精子では、父性インプリント遺伝子（H19及びGTL2）のDMR及び母性インプリント遺伝子（PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、及びSNRPN）のDMRの双方においてメチル化異常が高頻度に発生すること、また、それらの母性インプリント遺伝子のDMRで特に高頻度にメチル化異常が発生することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] ヒト男性不妊症患者の精子由来DNAについて、母性インプリント遺伝子PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、及びSNRPNのうち少なくとも１つのアレル特異的メチル化領域におけるメチル化異常を検出することを含む、該患者の精子におけるインプリント異常発生リスクを判定する方法。
【００１１】
本発明のさらなる態様として、前記精子由来DNAについて、父性インプリント遺伝子H19及びGTL2のうち少なくとも１つのアレル特異的メチル化領域におけるメチル化異常を検出することをさらに含む上記方法も、好ましい。
【００１２】
本方法では、男性不妊症患者は乏精子症患者であることがより好適である。
【００１３】
本方法では、メチル化異常の検出が、バイサルファイト処理した前記精子由来DNAを鋳型として前記アレル特異的メチル化領域を核酸増幅する工程を含むことが好ましく、そのような工程を含むメチル化異常の検出は、バイサルファイト-シークエンス法及び／又はCOBRA法による方法で行うことが特に好適である。
【００１４】
本方法においては、前記母性インプリント遺伝子のアレル特異的メチル化領域内の以下のa)〜e)の領域についてメチル化異常を検出することが好ましい：
a) PEG1のアレル特異的メチル化領域については、配列番号３の48〜1501位の塩基配列上の少なくとも636〜808位を含む領域；
b) LIT1のアレル特異的メチル化領域については、配列番号４の66508〜68649位の塩基配列上の少なくとも67277〜67521位を含む領域；
c) ZACのアレル特異的メチル化領域については、配列番号５の52190〜53667位の塩基配列上の少なくとも52758〜52859位を含む領域；
d) PEG3のアレル特異的メチル化領域については、配列番号６の162613〜163679位の塩基配列上の少なくとも163200〜163468位を含む領域；
e) SNRPNのアレル特異的メチル化領域については、配列番号７の14095〜15586位の塩基配列上の少なくとも15286〜15472位を含む領域。
【００１５】
また本方法においては、前記父性インプリント遺伝子のアレル特異的メチル化領域内の以下のf)〜g)の領域についてメチル化異常を検出することが好ましい：
f) H19のアレル特異的メチル化領域については、配列番号１の7796〜8294位の塩基配列上の少なくとも7906〜8069位を含む領域；
g) GTL2のアレル特異的メチル化領域については、配列番号２の51030〜51417位の塩基配列上の少なくとも51045〜51240位を含む領域。
【００１６】
[2] 以下のa)〜e)のプライマー対を含む、ヒト男性不妊症患者の精子のインプリント異常発生リスク判定用のプライマー・セット。
【００１７】
a) PEG1に対するプライマー対：
TYGTTGTTGGTTAGTTTTGTAYGGTT（配列番号13）
CCCAAAAACAACCCCAACTC      （配列番号14）
b) LIT1に対するプライマー対：
TTTTGGTAGGATTTTGTTGAGGAGT （配列番号15）
CCTCACACCCAACCAATACCTC    （配列番号16）
c) ZACに対するプライマー対：
GGGGTAGTYGTGTTTATAGTTTAGTA（配列番号17）
CRAACACCCAAACACCTACCCTA   （配列番号18）
d) PEG3に対するプライマー対：
AAAAGGTATTAATTATTTATAGTTTGGT（配列番号19）
AAAAATATCCACCCTAAACTAATAA   （配列番号20）
e) SNRPNに対するプライマー対：
GTGTTGTGGGGTTTTAGGGGTTTAG   （配列番号21）
AGGGAGTTGGGATTTTTGTATTG     （配列番号22）
CTCCCCAAACTATCTCTTAAAAAAAACC（配列番号23）
本発明のこのようなプライマー・セットは、さらに、以下のf)〜g)のプライマー対：
f) H19に対するプライマー対：
AGGTGTTTTAGTTTTATGGATGATGG（配列番号8）
TATATGGGTATTTTTGGAGGTTTTT （配列番号9）
ATAAATATCCTATTCCCAAATAACCCC（配列番号10）
g) GTL2に対するプライマー対：
GGGTTGGGTTTTGTTAGTTGTT    （配列番号11）
CCAATTACAATACCACAAAATTAC  （配列番号12）
を含むことも好ましい。
【００１８】
[3] 上記[2]のプライマー・セットと制限酵素TaqIとを含む、ヒト男性不妊症患者の精子のインプリント異常発生リスク判定用のキット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法によれば、男性不妊症患者（特に、乏精子症患者）の精子において特異的に発生頻度が上昇している父性及び母性インプリント遺伝子のDMRのメチル化異常を検出することにより、当該患者の精子がインプリント異常を有するリスクを効率よく判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、男性不妊症患者の精子由来DNAについて、所定の母性及び父性インプリント遺伝子のアレル特異的メチル化領域（DMR）、特に、母性インプリント遺伝子（PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、及びSNRPNのうち少なくとも１つ）のDMR、又はその母性インプリント遺伝子のDMRと父性インプリント遺伝子（H19及びGTL2のうち少なくとも１つ）の両方のDMRにおけるメチル化異常を検出することにより、その男性不妊症患者の精子におけるインプリント異常発生リスクを判定する方法に関する。
【００２２】
本発明の方法で被験対象となる男性不妊症患者とは、不妊症カップルを構成する男性患者である。本発明において不妊症カップルとは、１年間夫婦生活を営んでいても妊娠しないヒトの男女と定義される。本発明における男性不妊症患者には、不妊原因が男性にあることが示されている患者の他、不妊原因が不明の不妊症カップルの男性患者や、不妊原因が女性患者にあることが示されているが不妊治療が成功していない不妊症カップルの男性患者なども含まれる。本発明の方法は、男性不妊症患者の中でも乏精子症患者に適用する場合に、特に好適に使用することができる。乏精子症患者では母性インプリント遺伝子PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、及びSNRPNのDMR、及び父性インプリント遺伝子H19及びGTL2のDMRにおいて、特に高頻度にDNAメチル化異常が生じるためである。本発明において乏精子症患者とは、顕微鏡下での精液検査で精子数（精子濃度）が20×106/ml未満であった患者を指し、ここではさらに重症乏精子症患者（5×106/ml未満）と中等度乏精子症患者（5〜20×106/ml）とに分けられる。本発明により、重症乏精子症患者では特に上記のようなDNAメチル化異常が生じやすいことが示された。
【００２３】
本発明の方法では、男性不妊症患者の精子細胞（通常は、精子集団）から常法によりDNA（特にゲノムDNA）を抽出し、そのDNAサンプルを、母性インプリント遺伝子及び／又は父性インプリント遺伝子のアレル特異的メチル化領域（DMR）におけるメチル化解析に用いることができる。精子からのDNAの抽出は、限定するものではないが、例えばBahnak B.R., et al., Nucleic Acids Res. (1988) 16:1208に記載の方法に従って行うことができる。DNAを抽出するための精子は、精液中の運動性良好な精子のみをスイムアップ法等により選別したものを用いてもよい。抽出したDNAについては、常法によりさらに精製してもよい。
【００２４】
次に、得られた各男性不妊症患者の精子由来DNAサンプルを用いて、母性インプリント遺伝子PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、及びSNRPNのうちの少なくとも１つ（好ましくは２以上）のアレル特異的メチル化領域（DMR）におけるメチル化を解析する。母性インプリント遺伝子では、通常、母親由来遺伝子のDMRがメチル化されて遺伝子が不活化され、メチル化されていない父親由来遺伝子のみが発現している。正常な精子では母性インプリント遺伝子のDMRはメチル化されないので、もしそれが精子でメチル化されている場合にはメチル化異常が存在することになる。
【００２５】
母性インプリント遺伝子として知られるPEG1（Kobayashi S., et al., Human PEG1/MEST, an imprinted gene on chromosome 7. Hum Mol Genet. 1997 May;6(5):781-6. PMID: 9158153；Lefebvre L., et al., Genomic structure and parent-of-origin-specific methylation of Peg1. Hum Mol Genet. 1997 Oct;6(11):1907-15. PMID: 9302270；Kerjean A, et al., Establishment of the paternal methylation imprint of the human H19 and MEST/PEG1 genes during spermatogenesis. Hum Mol Genet. 2000 Sep 1;9(14):2183-7. PMID: 10958657を参照されたい）、LIT1（Mitsuya K., et al., an imprinted antisense RNA in the human KvLQT1 locus identified by screening for differentially expressed transcripts using monochromosomal hybrids. Hum Mol Genet. 1999 Jul;8(7):1209-17. PMID: 10369866を参照されたい）、ZAC（Gardner RJ, et al., An imprinted locus associated with transient neonatal diabetes mellitus. Hum Mol Genet. 2000 Mar 1;9(4):589-96. PMID: 10699182；Kamiya M., et al., The cell cycle control gene ZAC/PLAGL1 is imprinted--a strong candidate gene for transient neonatal diabetes. Hum Mol Genet. 2000 Feb 12;9(3):453-60. PMID: 10655556を参照されたい）、PEG3（Murphy S.K., et al., Imprinting of PEG3, the human homologue of a mouse gene involved in nurturing behavior. Genomics. 2001 Jan 1;71(1):110-7. PMID: 11161803を参照されたい）、及びSNRPN（El-Maarri O, et al., Maternal methylation imprints on human chromosome 15 are established during or after fertilization. Nat Genet. 2001 Mar;27(3):341-4. PMID: 11242121を参照されたい）の、コード配列及びDMRの塩基配列は、それぞれ、GenBankアクセッション番号Y10620、U90095、AL109755、AC006115、U41384で参照したゲノム配列（順に、配列番号３〜７に示した；表２参照）中に含まれている。
【００２６】
本発明においてPEG1のDMRとは、典型的には、そのY10620に示すゲノム配列（配列番号３の塩基配列）上の48〜1501位の領域をいう。本発明の方法では、そのPEG1のDMR内の、CpGアイランドに相当する配列番号３の636〜808位を少なくとも含む領域（173〜1454bp長、好ましくは173〜300bp長の領域）について、メチル化異常を検出することが好ましい。
【００２７】
またLIT1のDMRとは、典型的には、そのAL109755に示すゲノム配列（配列番号４の塩基配列）上の66508〜68649位の領域をいう。本発明の方法では、そのLIT1のDMR内の、CpGアイランドに相当する配列番号４の67277〜67521位を少なくとも含む領域（245〜2142bp長、好ましくは245〜400bp長の領域）について、メチル化異常を検出することが好ましい。
【００２８】
ZACのDMRとは、典型的には、そのAL109755に示すゲノム配列（配列番号５の塩基配列）上の52190〜53667位の領域をいう。本発明の方法では、そのZACのDMR内の、CpGアイランドに相当する配列番号５の52758〜52859位を少なくとも含む領域（102〜1478bp長、好ましくは102〜300bp長の領域）について、メチル化異常を検出することが好ましい。
【００２９】
PEG3のDMRとは、典型的には、そのAC006115に示すゲノム配列（配列番号６の塩基配列）上の162613〜163679位の領域をいう。本発明の方法では、そのPEG3のDMR内の、CpGアイランドに相当する配列番号６の163200〜163468位を少なくとも含む領域（269〜1067bp長、好ましくは102〜400bp長の領域）について、メチル化異常を検出することが好ましい。
【００３０】
SNRPNのDMRとは、典型的には、そのU41384に示すゲノム配列（配列番号７の塩基配列）上の14095〜15586位の領域をいう。本発明の方法では、そのSNRPNのDMR内の、CpGアイランドに相当する配列番号７の15286〜15472位を少なくとも含む領域（187〜1492bp長、好ましくは102〜300bp長の領域）について、メチル化異常を検出することが好ましい。
【００３１】
さらに、上記の母性インプリント遺伝子のDMRのメチル化解析に加え、父性インプリント遺伝子H19及びGTL2の少なくとも一方（好ましくは両方）のDMRにおけるメチル化を解析することも好ましい。父性インプリント遺伝子では、通常、父親由来遺伝子のDMRがメチル化されて遺伝子が不活化され、メチル化されていない母親由来遺伝子のみが発現している。正常な精子では父性インプリント遺伝子のDMRはメチル化されることから、精子でそれがメチル化されない場合にはメチル化異常が存在することになる。
【００３２】
父性インプリント遺伝子として知られるH19（Jinno Y., et al., Mouse/human sequence divergence in a region with a paternal-specific methylation imprint at the human H19 locus. Hum Mol Genet. 1996 Aug;5(8):1155-61. PMID: 8842735； Kerjean A, et al., Establishment of the paternal methylation imprint of the human H19 and MEST/PEG1 genes during spermatogenesis. Hum Mol Genet. 2000 Sep 1;9(14):2183-7. PMID: 10958657を参照されたい）、及びGTL2（Wylie A.A., et al., Novel imprinted DLK1/GTL2 domain on human chromosome 14 contains motifs that mimic those implicated in IGF2/H19 regulation. Genome Res. 2000 Nov;10(11):1711-8. PMID: 11076856; Geuns E., et al., Methylation analysis of the intergenic differentially methylated region of DLK1-GTL2 in human. Eur J Hum Genet. 2007 Mar;15(3):352-61. Epub 2007 Jan 10. PMID: 17213841を参照されたい）の、コード配列及びDMRの塩基配列は、それぞれ、GenBankアクセッション番号AF125183、AL117190で参照したゲノム配列（順に、配列番号１〜２に示した）中に含まれている。
【００３３】
本発明においてH19のDMRとは、典型的には、そのAF125183に示すゲノム配列（配列番号１の塩基配列）上の7796〜8294位の領域をいう。本発明の方法では、そのH19のDMR内の、CpGアイランドに相当する配列番号１の7906〜8069位を少なくとも含む領域（164〜499bp長、好ましくは164〜300bp長の領域）について、メチル化異常を検出することが好ましい。
【００３４】
またGTL2のDMRとは、典型的には、そのAL117190に示すゲノム配列（配列番号２の塩基配列）上の51030〜51417bp位の領域をいう。本発明の方法では、そのGTL2のDMR内の、CpGアイランドに相当する配列番号２の51045〜51240位を少なくとも含む領域（196〜388bp長、好ましくは196〜300bp長の領域）について、メチル化異常を検出することが好ましい。
【００３５】
なお、本発明において「配列番号ＸのＹ〜Ｚ位」とは、配列番号Ｘで示す塩基配列上で１番目の塩基（又はアミノ酸）を１位としたときにＹ番目（Ｙ位）からＺ番目（Ｚ位）までの塩基配列（又はアミノ酸配列）をいう。
【００３６】
本方法では、上記の各インプリント遺伝子のDMRにおけるメチル化異常を、公知のDNAメチル化解析法を用いて検出することができる。典型的には、本発明の方法においてメチル化異常の検出を行う際には、バイサルファイト処理した前記精子由来DNAを鋳型として用いて、当該アレル特異的メチル化領域（DMR）を核酸増幅（一般的にはPCR増幅）する工程を含むことが好ましい。DNAのバイサルファイト（亜硫酸水素塩）処理は、典型的には、重亜硫酸水素ナトリウムを含むDNA溶液を55℃で１晩インキュベートし、脱硫酸化後にエタノールによる洗浄・精製を行えばよい。例としてはEZ DNA Methylation Kit（Zymo Research）を用い、添付の処理手順に従って使用すればよい。
【００３７】
このバイサルファイト処理により、DNAサンプル中の各インプリント遺伝子のDMRにおいて非メチル化シトシン塩基がウラシル塩基に置換されるが、メチル化シトシン残基は塩基置換することなく維持される。そしてバイサルファイト処理したDNAを鋳型とした核酸増幅により、DNAサンプル中に含まれていた非メチル化シトシン残基がチミン残基に変換された増幅産物が得られる。このような増幅産物を解析すれば、個々のDMRにおけるメチル化状態を容易に調べることができる。本発明では、DNAサンプルをバイサルファイト処理した後、それを鋳型として用いて、メチル化されている可能性のある領域をPCR増幅して増幅産物を得る上記の方法を、バイサルファイト-PCR法と称する。
【００３８】
バイサルファイト-PCR法に用いるプライマーは、当業者であれば容易に設計することができる。簡単に説明すれば、増幅領域の両端にプライマーを設計する際、バイサルファイト処理後のPCRではメチル化されるシトシン残基（典型的にはCpG部位のシトシン残基）以外ではシトシン残基がチミン残基に置換されることを考慮して、バイサルファイト処理後のPCRで得られる塩基配列を推定し、その推定配列に基づいてプライマー配列を設計すればよい。プライマーは、増幅領域のセンス鎖に対して設計してもよいし、アンチセンス鎖に対して設計してもよい。バイサルファイト処理によればセンス鎖でもアンチセンス鎖でもウラシルへの塩基置換が起こるからである。プライマー長は、限定するものではないが、通常は18〜40bpが好ましい。本発明においてインプリント遺伝子H19、GTL2、PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、及びSNRPNのDMRに対するバイサルファイト-PCR法において好適に使用可能なプライマー対の例を後述の表１に示す。
【００３９】
本発明では、好ましくは、このバイサルファイト-PCR法で得られたインプリント遺伝子のDMRの増幅産物を解析してDMRのメチル化状態を決定し、それを正常精子における当該遺伝子のDMRのメチル化状態と比較することにより、該DMRにおけるメチル化に異常があるかどうかを検出する。DMRのメチル化状態を決定するため、DMRの増幅産物を、限定するものではないが、Sanger法やマクサム・ギルバート法等の公知の塩基配列決定法により、例えば市販の自動シークエンサー（ABI Prism 3130x/Genetic Analyser（Applied Biosystems）等）を用いて、塩基配列決定することができる。該増幅産物は、塩基配列決定の前に公知の組換えベクター等にクローニングしてもよい。あるいは該増幅産物は、クローニングすることなく、ダイレクトシークエンス法によって塩基配列を決定してもよい。DMRの増幅産物について決定した塩基配列を、増幅したDMRの元の塩基配列と比較したときに、シトシン残基、特にDMRのCpG部位に含まれているシトシン残基が増幅断片でチミン残基に塩基置換されているか否かを判定することが好ましい。所定のCpG部位のシトシン残基が増幅断片の配列においてチミン残基に塩基置換されている場合には、そのシトシン残基はDMRでメチル化されていなかったこと、逆に、シトシン残基が増幅断片の配列においてチミン残基に塩基置換されずに保持された場合には、そのシトシン残基はDMRでメチル化されていたことが示される。本発明では、このように、バイサルファイト-PCRによって得た核酸増幅断片について塩基配列決定（シークエンス）を行うことによるメチル化解析法を、バイサルファイト-シークエンス法と称する。バイサルファイト-シークエンス法によれば、DMR中の個々のシトシン残基（特に、CpG部位のシトシン残基）についてのメチル化異常を検出することができる。
【００４０】
バイサルファイト-シークエンス法で配列決定を行う各クローンは、単独の精子に由来するDNAから得られることになる。従ってバイサルファイト-シークエンス法で検出したメチル化異常は、核酸増幅断片のクローニングの際にクローン選別にバイアスがかかる場合には、精子集団全体のメチル化状態を反映しない可能性もある。そのため、上記のDMRの増幅断片について、バイサルファイト-シークエンス法の代わりに、又はその解析方法と組み合わせて、精子集団全体のメチル化状態を定量的に解析することも好ましい。このような定量的なメチル化解析法としては、限定するものではないが、メチル化部位特異的制限酵素切断を利用したCOBRA法（combined bisulphite-PCR restriction analysis；Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4. PMID: 9171110）を用いることが好ましい。COBRA法では、上記と同様に、バイサルファイト処理したDNAのDMRの増幅断片を調製し、メチル化されたDMR由来の増幅断片とメチル化されていないDMRの増幅断片との間で異なる制限酵素切断パターンを生じる制限酵素を使用してその増幅断片を切断処理する。得られた切断断片を、例えば電気泳動法にかけて現れたバンドパターンの違いを判定することにより、メチル化されているDMRとメチル化されていないDMRとを判別することができる。この方法では、精子サンプルから抽出したDNAから得た増幅断片を直接分析するため、１人の患者から得た精子集団全体でのメチル化状態を定量化することができる。COBRA法で得られた所定のDMRについての定量的なメチル化状態を、正常精子の当該DMRの定量的なメチル化状態と比較することにより、該DMR全体のメチル化に異常があるかどうかを検出することができる。例えば、母性インプリント遺伝子のDMRについては、COBRA法で、精子由来DNAにメチル化DMRが有意な割合（例えば、PCR産物総量の5％以上、より好ましくはPCR産物総量の10％以上）で含まれることが示された場合には、一部の精子においてその母性インプリント遺伝子のDMRにメチル化異常が検出されたものと判断できる。また父性インプリント遺伝子のDMRについては、COBRA法で、精子由来DNAに非メチル化DMRが有意な割合（例えば、PCR産物総量の5％以上、より好ましくはPCR産物総量の10％以上）で含まれることが示された場合には、一部の精子においてその父性インプリント遺伝子のDMRにメチル化異常が検出されたものと判断できる。
【００４１】
以上のようにして、男性不妊症患者の精子由来DNAについて上記インプリント遺伝子（特に、少なくとも１つの上記母性インプリント遺伝子、又は上記母性インプリント遺伝子の少なくとも１つと上記父性インプリント遺伝子の少なくとも１つ）のDMRにおけるメチル化異常の検出を行った結果、調べた母性又は父性インプリント遺伝子の少なくとも１つについて、少なくとも一部の精子においてその母性又は父性インプリント遺伝子のDMRにメチル化異常が検出された場合には、その男性不妊症患者の精子ではインプリント異常が発生するリスクが高いと判定される。母性インプリント遺伝子のDMRのメチル化異常が検出された場合には、その患者はインプリントの消去機構に関わる異常を有する可能性があると思われる。また父性インプリント遺伝子のDMRのメチル化異常が検出された場合には、その患者はインプリントの獲得機構に関わる異常を有する可能性があると思われる。すなわち、それら父性インプリント遺伝子（H19及び／又はGTL2）又は母性インプリント遺伝子（PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、及びSNRPNのうち少なくとも１つ）のDMRにおいてメチル化異常が検出された男性不妊症患者では、インプリントに関わる機構に異常を有する可能性がより高く、その患者の精子では何らかのインプリント異常が発生するリスクが高いと判定される。その精子においてインプリント異常が発生するリスクが高いと判定された患者では、その児においてインプリント病を発症しやすいことも予測される。
【００４２】
本発明は、さらに、ヒト男性不妊症患者の精子のインプリント異常発生リスク判定用のプライマー・セットにも関する。このプライマー・セットは、上記のバイサルファイト-シークエンス法やCOBRA法を始めとするメチル化解析法で用いるバイサルファイト-PCR法での使用に特に好適なものであり、母性インプリント遺伝子のDMRの増幅用としては、以下のa)〜e)のプライマー対を含む：
a) PEG1に対するプライマー対：
TYGTTGTTGGTTAGTTTTGTAYGGTT（配列番号13）
CCCAAAAACAACCCCAACTC      （配列番号14）
b) LIT1に対するプライマー対：
TTTTGGTAGGATTTTGTTGAGGAGT （配列番号15）
CCTCACACCCAACCAATACCTC    （配列番号16）
c) ZACに対するプライマー対：
GGGGTAGTYGTGTTTATAGTTTAGTA（配列番号17）
CRAACACCCAAACACCTACCCTA   （配列番号18）
d) PEG3に対するプライマー対：
AAAAGGTATTAATTATTTATAGTTTGGT（配列番号19）
AAAAATATCCACCCTAAACTAATAA   （配列番号20）
e) SNRPNに対するプライマー対：
GTGTTGTGGGGTTTTAGGGGTTTAG   （配列番号21）
AGGGAGTTGGGATTTTTGTATTG     （配列番号22）
CTCCCCAAACTATCTCTTAAAAAAAACC（配列番号23）。
【００４３】
このプライマーセットは、さらに、父性インプリント遺伝子のDMRの増幅用として、以下のf)〜g)のプライマー対をさらに含んでもよい：
f) H19に対するプライマー対：
AGGTGTTTTAGTTTTATGGATGATGG（配列番号8）
TATATGGGTATTTTTGGAGGTTTTT （配列番号9）
ATAAATATCCTATTCCCAAATAACCCC（配列番号10）
g) GTL2に対するプライマー対：
GGGTTGGGTTTTGTTAGTTGTT    （配列番号11）
CCAATTACAATACCACAAAATTAC  （配列番号12）。
【００４４】
本発明はさらに、これらのプライマー・セットと制限酵素TaqIとを含む、ヒト男性不妊症患者の精子のインプリント異常発生リスク判定用のキットにも関する。このキットは、TaqIの他に、COBRA法に使用しうる他の制限酵素、例えばHhaI、MboI、HinfI、MluI、及びNruIのうち１つ以上をさらに含んでもよい。
【００４５】
これらのヒト男性不妊症患者の精子のインプリント異常発生リスク判定用のプライマー・セットやキットは、上記のインプリント異常発生リスク判定方法において、便利に使用することができる。しかしながら、本発明の方法において上記以外のプライマー・セットやキットも使用できることは言うまでもない。
【００４６】
なお本発明の方法を実施する上で、mRNAの調製、cDNAの作製、PCR、RT-PCR、ライブラリーの作製、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、DNAの塩基配列の決定、核酸化学合成、タンパク質のN末端側のアミノ酸配列決定、突然変異誘発、タンパク質の抽出等の実験は、必要に応じて、通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。そのような実験書としては、例えば、SambrookらのMolecular Cloning, A laboratory manual, (2001) 3rd Ed., Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Pressを挙げることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４８】
１．男性不妊症患者由来の精子からのDNAサンプルの調製
不妊クリニックに通院している不妊症夫婦の男性患者97名から、精子サンプルを採取した。各精子サンプルについて通常の精液検査（精液量、精子数、精子運動率、精細胞占有率）を行った。97名の患者のうち、79名は正常精子数（＞20×106／ml）を示した。残りの18名の患者は乏精子症であり、うち10名は重度乏精子症、8名は中等度乏精子症であった。本研究は、患者の同意のもと、倫理委員会の承認を受けて行った。
【００４９】
各精子サンプル中の運動性良好な精子を、スイムアップ（swim-up）法（Ushijima C. et al., Hum. Reprod. (2000) 15:1107-1111）により、リンパ球、未成熟生殖細胞、上皮細胞等を除去し、精製した。得られた精子はPBS（phosphate-buffered saline）液で繰り返し洗浄した。
【００５０】
得られた精子からは、0.1mM 2-メルカプトエタノールを添加する精子由来DNAの標準的抽出法（Bahnak B.R. et al., Nucleic Acids Res. (1988) 16:1208）によりゲノムDNAを抽出した。具体的には、スイムアップ法にて体細胞の混入をなくし、精子細胞のみを選別したサンプルに１％SDS、100mg/mlプロテイナーゼＫ、１％βメルカプトエタノールを加え６５℃で一晩インキュベートし、次いでフェノール、フェノール：CIAA(1:1；CIAAはクロロホルム：イソアミルアルコール、24:1)抽出によるタンパク質除去の後、DNAをエタノール精製した。コントロールとしては、ヒト正常血液白血球由来のDNAを用いた。この白血球DNAは非特定正常成人男性及び女性由来白血球から抽出した。
【００５１】
２．バイサルファイト-PCR法及びそのPCR産物を用いたDNAメチル化の解析
上記で得られた各男性不妊症患者精子由来DNAについて、以下の通り、バイサルファイト-シークエンス法とCOBRA（combined bisulphite-PCR restriction analysis）法とを組み合わせて使用し、インプリント遺伝子のアレル特異的メチル化領域（DMR；differentially methylated region；父性アレルと母性アレルとの間でメチル化に差が生じる領域）内のCpGアイランドについて、DNAメチル化解析を行った。その結果、７つのインプリント遺伝子（H19、GTL2、PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、SNRPN）のDMR中のCpG部位（表２）のDNAメチル化に異常が認められた。
【００５２】
具体的には、まず、得られた精子由来DNAを、EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research）を用いてバイサルファイト（亜硫酸水素塩）処理し、非メチル化シトシン塩基をウラシル塩基に置換した。次いで、バイサルファイト処理した精子由来DNAを鋳型として、次の条件でDMRをPCR増幅した（バイサルファイト-PCR法）。PCR反応液は、1nｇ鋳型DNA（バイサルファイト処理済み）、0.5μM 各プライマー（表１を参照）、200μM dNTPs、1×PCRバッファー、1.25U EX Taq Hot Start DNA Polymerase（TaKaRa Bio）を含む総量20μLとして調製した。PEG1とLIT1について用いたPCRプログラムは、以下の通りである：94℃で1分の熱変性後、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒を35サイクル、さらに72℃で5分の最終伸長。H19とSNRPNについては、セミネスティッド（semi-nested）PCRを行うため、１回目のPCRを行った後、そのPCR産物のうち1μLをDNA鋳型とし、2nd PCRプライマーを1種類（表１中、F2）用いて、1回目のPCRと同様のPCR条件（反応液組成及びPCRプログラム）で2回目のPCRを行った。H19とSNRPNについて用いたPCRプログラムは以下の通りである：94℃で1分の熱変性後、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒を35サイクル、さらに72℃で5分の最終伸長（１回目、２回目のPCRは同じプログラムで行う）。GTL2、PEG3について用いたPCRプログラムは以下の通りである：94℃で1分の熱変性後、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒を35サイクル、さらに72℃で5分の最終伸長。ZACについて用いたPCRプログラムは以下の通りである：94℃で1分の熱変性後、94℃で30秒、59℃で30秒、72℃で30秒を35サイクル、さらに72℃で5分の最終伸長。
【００５３】
コントロールには、インプリントを受けずにメチル化される反復配列LIKE-1及びAluを用いて同様にPCR増幅を行った。LINE-1について用いたPCRプログラムは以下の通りである：94℃で1分の熱変性後、94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で30秒を35サイクル。Aluについて用いたPCRプログラムは以下の通りである：94℃で1分の熱変性後、96℃で30秒、60℃で120秒、72℃で120秒を27サイクル。
【００５４】
上記のPCRに用いたDMR増幅用プライマー・セットを表１にまとめた。
【００５５】
【表１】
2009165409.tif 000002
【００５６】
得られたPCR産物は、次に、常法によりpGEM-Tベクター（Promega）中にクローニングした。得られた各クローンは、自動シークエンサーABI Prism 3130x/Genetic Analyser（Applied Biosystems）を用いて、M13リバースプライマーを使用してシークエンス反応及び配列決定を行った。各PCRにつき約20クローンの配列決定を行った。決定した各クローンのインサートDNAの配列を、対応する既知配列と比較した。その既知配列中に含まれるCpG部位（CG配列）のシトシン残基がインサートDNAの配列においてチミン残基に変換されていなかった場合、そのシトシン残基は、既知配列においてメチル化されている（メチル化シトシン残基）ものとした。なお、インサートDNAの両端のプライマー配列部分に含まれるシトシン残基は、解析対象から外した。
【００５７】
下記表２には、上記バイサルファイト-PCR法で増幅したアレル特異的メチル化領域（DMR）及びその領域内に含まれる解析を行ったCpG部位を、既知ゲノム配列を基準とした塩基位置で示した。また図１には、既知ゲノム配列上のPCR増幅配列とプライマーの位置関係、及びそのPCR増幅配列内のCpG部位の位置を模式的に示した。
【００５８】
【表２】
2009165409.tif 000003
2009165409.tif 000004
【００５９】
解析の結果、試験したうちのかなりの割合の男性不妊症患者の精子由来DNAにおいて、通常は精子ではメチル化されるが卵子ではメチル化されない父性インプリント遺伝子H19又はGTL2のDMR内に、メチル化されていないシトシン残基（CpG部位）が存在することが示された（詳細は後述）。同様に、かなりの割合の男性不妊症患者の精子由来DNAにおいて、通常は卵子ではメチル化されるが精子ではメチル化されない母性インプリント遺伝子PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、又はSNRPNのDMR内に、メチル化されたシトシン残基（CpG部位）が存在することも認められた（詳細は後述）。
【００６０】
このようなバイサルファイト-シークエンス法により、患者の個々の精子細胞由来の上記インプリント遺伝子のDMR内において、CpG部位毎にメチル化の異常の有無を検出することができた。
【００６１】
次に、上記のバイサルファイト-PCR法で得られたPCR産物をCOBRA法で解析することにより、各患者から得た精子集団全体についてインプリント遺伝子のメチル化パターンに異常が認められるかどうかも検討した。
【００６２】
具体的には、上記のようにして各患者の精子由来DNAからバイサルファイト-PCR法により各インプリント遺伝子のDMRを増幅したPCR産物を、制限酵素で処理した。制限酵素TaqI（ニッポンジーン）により、H19、GTL2、PEG1、LIT1、ZAC、PEG3のDMRのPCR産物を処理した。また、制限酵素HhaI（ニッポンジーン）によりSNRPNのDMRのPCR産物を、制限酵素NruI（ニッポンジーン）でGTL2のDMRのPCR産物を、MboI（TaKaRa）でPEG1のDMRのPCR産物を、それぞれ処理した。インプリントを受けずにメチル化される反復配列LIKE-1及びAluのPCR産物は、それぞれ制限酵素HinfI（ニッポンジーン）、MboI（TaKaRa）で処理した。これらの制限酵素は、メチル化されていたDMRのバイサルファイト-PCRによるPCR産物は切断するが、メチル化されていなかったDMRの同PCR産物は切断しないものである。
【００６３】
コントロールとしては、上記でヒト正常血液白血球（体細胞）由来のDNAからバイサルファイト-PCR法により同様に増幅した各DMRまたは反復配列のPCR産物を、それぞれ各制限酵素で処理した。
【００６４】
制限酵素反応後のPCR産物は、それぞれ2.5％アガロースゲルで電気泳動した。その結果、制限酵素処理によりPCR産物の少なくとも一部が切断された場合（メチル化パターン）には当該患者の精子の少なくとも一部のDNAにおいて当該インプリント遺伝子のDMRがメチル化されていたことを、PCR産物の切断が示されなかった場合（非メチル化パターン）には当該患者の精子のDNAにおいて当該インプリント遺伝子のDMRがメチル化されていなかったことを示すことができた。なお各制限酵素による切断部位は図１中に模式的に示されている。また各制限酵素によるPCR産物の切断パターンを下記表３に示した。
【００６５】
次いで、父性インプリント遺伝子H19又はGTL2のDMRについて非メチル化パターンが示された場合、また母性インプリント遺伝子PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、SNRPNのDMRについてメチル化パターンが示された場合には、その電気泳動像に基づき、Lumiimager analyzer及びLumianalystソフトウェアパッケージ（いずれもRoche Diagnostics）を用いて、各遺伝子のDMRにおけるメチル化割合を定量化した。各精子由来DNAサンプルについて、調べた制限酵素認識部位でのメチル化パーセンテージを、制限酵素処理したPCR産物総量に対する制限酵素で切断されたPCR産物量の比率から算出し、それを各遺伝子のDMRにおけるメチル化割合とした。得られたメチル化パーセンテージのデータについては、二群の比率の差の検定（two proportions test; STATISTICA, StatSoft, Tokyo, Japan）に従って統計解析を行った。有意差検定（P値）は0.05とした。このメチル化割合（％）は、当該患者から得た精子集団中の、メチル化された当該インプリント遺伝子DMRを有する精子の割合を示す。
【００６６】
【表３】
2009165409.tif 000005
【００６７】
上記のように、バイサルファイト-シークエンス法に加えてCOBRA法での解析も行うことにより、個々のDNAの個々のCpG部位でのメチル化の有無と精子集団全体のメチル化状態との両面からメチル化異常を検出した。さらにバイサルファイト-シークエンス法の解析結果がCOBRA法の結果に適合するか否かを調べることにより、配列決定用に用いたPCR産物のクローニングの際にクローン選択にバイアスがかかった可能性を排除した。これにより、少量の精子由来DNAを試験に用いた場合でも、バイサルファイト-シークエンス法による個々のCpG部位でのメチル化検出の結果を正確に評価することができる。
【００６８】
３．DNAメチル化解析の結果とそれに基づく男性不妊症患者の精子のインプリント異常発生リスクの判定
上記のバイサルファイト-PCR法に基づくバイサルファイト-シークエンス法及びCOBRA法によるメチル化解析の結果を以下にまとめた。
【００６９】
男性不妊症患者の父性インプリント遺伝子H19のDMRに関するCOBRA法解析では、症例の多くは、正常精子に見られるメチル化パターンを示した。しかし乏精子症の症例４例（中等度：１例、重症：３例）は、非メチル化パターンを示した（精子型インプリントの異常）。H19のDMRに関するバイサルファイト-シークエンス法による解析結果も、COBRA法による結果と一致するものであった。これらの結果の一例を図２（上段）及び後述する表４に示している。
【００７０】
同様に、父性インプリント遺伝子GTL2のDMRに関するCOBRA法解析でも、その症例の多くは、正常精子に見られるメチル化パターンを示した。しかし乏精子症の症例６例（中等度：２例、重症：４例）は、非メチル化パターンを示した。GTL2のDMRに関するバイサルファイト-シークエンス法による解析結果も、COBRA法による結果と一致するものであった。これらの結果の一例を図２（上段）及び後述する表４に示している。
【００７１】
また１症例では、父性インプリント遺伝子H19とGTL2の両方でメチル化パターンを示した。この症例は、重症乏精子症の患者であった。
【００７２】
驚いたことに、試験した男性不妊症患者のうち精液検査で正常精子数（＞20×106/ml）を示した症例５例でも、COBRA法解析で非メチル化パターンが示された。
【００７３】
一方、母性インプリント遺伝子PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、SNRPNの各DMRに関するCOBRA法解析では、その症例の多くが、正常精子に見られる非メチル化パターンを示した。しかしPEG1では12症例［乏精子症の症例５例（中等度：２例、重症：３例）、顕微鏡下での精液検査で正常精子数（＞20×106/ml）を示した症例：７例］、LIT1では４症例［乏精子症の症例１例（重症：１例）、正常精子数の症例：４例］、ZACでは３症例［重症乏精子症の症例３例］、PEG3では５症例［乏精子症の症例１例（中等度：１例）、正常精子数の症例：４例］、SNRPNでは４症例［乏精子症の症例３例（中等度：２例、重症：１例）、正常精子数の症例：１例］が、メチル化パターンを示した。PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、SNRPNの各DMRに関するバイサルファイト-シークエンス法による解析（各々10〜20個のクローンを解析）の結果も、COBRA法による結果と一致した。これらの結果の一例を図２（下段；PEG1のDMRについてのCOBRA法の解析結果）、図３（複数症例のPEG1のDMRにおけるバイサルファイト-シークエンス法での解析結果）、図４（一症例の各インプリント遺伝子のDMRにおけるバイサルファイト-シークエンス法での解析結果）並びに後述する表４に示している。
【００７４】
母性インプリント遺伝子の解析では、重症乏精子症の１０症例中５例が、調べたいずれかの母性インプリント遺伝子のDMRにおいてメチル化パターンを示し、すなわち卵子型インプリントの異常が示された。また中等度乏精子症の８症例中３例が、いずれかの母性インプリント遺伝子のDMRにおいてメチル化パターンを示した。さらに、試験した男性不妊症患者のうち精液検査で正常精子数（＞20×106/ml）を示した症例１２例も、いずれかの母性インプリント遺伝子のDMRにおいてメチル化パターンを示し、卵子型インプリントに異常があることが示された。男性不妊症患者の精子では、母性インプリント遺伝子のDMRにおけるメチル化異常（卵子型インプリント異常）が、父性インプリント遺伝子のDMRにおけるメチル化異常（精子型インプリント異常）よりも高頻度に発生することも示された。
【００７５】
いずれかの父性インプリント遺伝子又は母性インプリント遺伝子のDMRで異常なメチル化パターンを示した２４症例のうち１２症例は、１つのDMRのみでメチル化異常を示した。一方、１０症例は、父性インプリント遺伝子のDMRと母性インプリント遺伝子のDMRの両方でメチル化異常を示した。特に、メチル化異常を示した６例の重症乏精子症症例のうち５例が、父性インプリント遺伝子のDMRと母性インプリント遺伝子のDMRの両方でメチル化異常を示した。さらに、正常精子数（＞20×106/ml）を示す症例のうちごく少数にも、父性インプリント遺伝子のDMRと母性インプリント遺伝子のDMRの両方でメチル化異常を示すものがあった。調べた父性インプリント遺伝子及び母性インプリント遺伝子のうちPEG1のDMRにおけるメチル化異常の頻度が最も高かった。
【００７６】
なお母性インプリント遺伝子PEG1、LIT1、ZACのDMRについては、体細胞ではゲノムDNAの50％がメチルされているが、完全に成熟した卵子ではゲノムDNAの100％がメチル化されていることは、本発明者らが以前に報告している（Sato A., et al., Hum. Reprod. (2007) 22:26-35）。そこで本発明者らは、母性インプリント遺伝子SNRPN及びPEG3のDMRについても、体細胞ではゲノムDNAの50％がメチルされているが、完全に成熟した卵子ではゲノムDNAの100％がメチル化されていることを同様にして確認した。
【００７７】
またCOBRA法での解析では、精子におけるDNAメチル化異常が、アレル特異的メチル化領域(DMR）だけでなくゲノムDNA全体のメチル化の異常であるかどうかを調べるため、インプリントを受けない反復配列LINE-1及びAluのメチル化パターンも解析した。その結果、いずれの症例でもLINE-1及びAluのメチル化パターンは正常であり、また、いずれかのインプリント遺伝子のDMRについてメチル化異常が検出された症例とメチル化異常が検出されなかった症例との間に有意差は見られなかった（表４）ことから、男性不妊症患者の精子におけるメチル化異常は、ゲノムDNA全体のメチル化の異常ではなく、上記インプリント遺伝子H19、GTL2、PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、SNRPNのDMRに特異的に生じている異常であることが示された。
【００７８】
なお表４には、メチル化異常が検出された各患者の精子由来DNAサンプルについて上記の通り算出されたメチル化割合（メチル化DNA率）を示す。
【００７９】
【表４】
2009165409.tif 000006
【００８０】
以上の結果に示されるように、男性不妊症患者の精子では、父性インプリント遺伝子H19及びGTL2、並びに母性インプリント遺伝子PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、及びSNRPNにおけるインプリントに異常が生じやすいことが示された。とりわけ母性インプリント遺伝子のDMRではメチル化異常がより高頻度に発生した。また乏精子症患者の精子では、これらインプリント遺伝子のDMRにおいて特に高頻度にメチル化異常が検出された。
【００８１】
インプリント遺伝子のDMRにおけるDNAメチル化は次世代の配偶子形成の際にリセットされる。そのため、父性インプリント遺伝子H19及びGTL2におけるインプリント異常は、精子形成・成熟過程でのDNAメチル化機構に異常があることを示すと考えられる。一方、母性インプリント遺伝子PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、及びSNRPNのインプリント異常は、配偶子形成・成熟過程での親ゲノムDNAにおけるインプリントの消去機構に異常があることを示すと考えられる。すなわち、父性インプリント遺伝子H19及びGTL2、並びに母性インプリント遺伝子PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、及びSNRPNは、そのようなDNAメチル化機構の異常又はインプリント消去機構の異常に対してより影響を受けやすいインプリント遺伝子でありうる。従って、父性インプリント遺伝子（H19及び／又はGTL2）、又は母性インプリント遺伝子（PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、及びSNRPNのうち少なくとも１つ）のDMRにおいてメチル化異常が検出された男性不妊症患者では、インプリントに関わる機構に異常がある可能性がより高いことから、その患者の精子では何らかのインプリント異常が発生するリスクが高いと判定された。
【００８２】
これら父性インプリント遺伝子及び母性インプリント遺伝子のDMRにおけるメチル化異常をそれぞれ検出することにより、メチル化機構とその消去機構というインプリンティングの両方の側面から、不妊症患者精子におけるインプリント異常の存在を調べることができる。このようにして、男性不妊症患者の精子由来DNAについて、上述の母性インプリント遺伝子、又は母性インプリント遺伝子と父性インプリント遺伝子の両方のDMRにおけるメチル化異常を検出することにより、男性不妊症患者の精子がインプリント異常を有するリスクを効率良くかつ多面的に検査することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の方法を用いれば、男性不妊症患者（特に、乏精子症患者）の精子がインプリント異常を発生するリスクが高いかどうかを効率よく判定することができる。この方法による精子のインプリント異常発生リスクの判定は、体外受精等の生殖補助医療（ART）を実施する際にインプリント病の発生を予測する上で有用な指標の１つとなりうる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、ヒトインプリント遺伝子H19、GTL2、PEG1、LIT1、ZAC、PEG3、SNRPNとそのアレル特異的メチル化領域（DMR）、及び反復配列LINE-1及びAluのゲノム構造、及びPCR増幅したDMR内のCpG部位を示す図である。GenBankアクセッション番号で示したゲノム配列に基づいて図示している。黒い四角は各インプリント遺伝子の位置を表し、遺伝子の転写方向をその四角からの矢印で示す。白い三角は反復配列を示す。横矢印はDMRを増幅したプライマーを示し、増幅範囲の3'及び5'末端の位置をGenBankアクセッション番号で示した配列上の塩基番号で示している。白枠は各インプリント遺伝子のDMRである。DMR内の垂直線はCpG部位を表す。DMR内に示した黒三角は、COBRA法での解析において制限酵素で認識されうる部位を示す。TはTaqI、MlはMluI、NはNruI、MbはMboI、HはHhaI、HiはHinfIを示す。
【図２】図２は、COBRA法での解析結果の一例（H19、PEG1のDMR増幅断片のTaqI処理の結果）を示す電気泳動写真である。細胞集団全体としての精子DNAと白血球DNA（コントロール）のDMRのメチル化状態を検出した。図１に示したプライマーを用いてバイサルファイト処理後のDMRを増幅して得たPCR産物は、DMRがメチル化されている場合のみ、制限酵素で切断される。H19の症例26（重症乏精子症）では、非メチル化バンドパターンが示された。PEG1の症例62、63、66ではメチル化バンドパターンが示された。
【図３】図３は、バイサルファイト-シークエンス法での解析結果の一例（PEG1の症例62、63、64、66）を示す。それぞれ、縦列は各CpG部位の位置、横列は配列決定したクローンを示す。また黒丸はメチル化CpG部位、白丸は非メチル化CpG部位を表す。
【図４】図４は、１人の患者の精子由来DNAの各インプリント遺伝子のDMRについてのバイサルファイト-シークエンス法での解析結果を示す。縦列は各CpG部位の位置、横列は配列決定したクローンを示す。コントロールとしては正常白血球由来DNAの各インプリント遺伝子のDMRについてのバイサルファイト-シークエンス法での解析結果を示す。また黒丸はメチル化CpG部位、白丸は非メチル化CpG部位を表す。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号８〜２７の配列は、プライマーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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