(57)【要約】      （修正有）【課題】ニトリラーゼを持つ生体触媒を用いて、ニトリル化合物からカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造するに当たって、十分な初期活性すなわち初期生産速度を持たせることで工業的に有利なニトリル化合物からのカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法を提供すること。【解決手段】ニトリラーゼを用いてヒドラジンの存在下においてニトリル化合物の加水分解反応を行うことを含む、カルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリラーゼを用いてヒドラジンの存在下においてニトリル化合物の加水分解反応を行うことを含む、カルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
【請求項２】
ニトリル化合物がα−ヒドロキシニトリルである、請求項１に記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
【請求項３】
α−ヒドロキシニトリルがグリコロニトリルである、請求項２に記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
【請求項４】
ニトリラーゼが、微生物菌体又はその処理物、あるいは微生物菌体由来のニトリラーゼの固定化物又は懸濁液から選択される何れか１種以上の生体触媒である、請求項１から３の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
【請求項５】
ニトリラーゼが、Acinetobacter sp.AK226（受託番号FERM  BP-08590）由来のニトリラーゼ、又はAcinetobacter sp.AK226（受託番号FERM  BP-08590）のニトリラーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質酵素である、請求項１から４の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
【請求項６】
ニトリラーゼが、グラム陰性菌及び／またはその処理物の、固定化物及び／または懸濁液から選択される生体触媒である、請求項１から５の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
【請求項７】
ニトリラーゼがAcinetobacter属の菌体及び／またはその処理物の、固定化物及び／または懸濁液から選択される生体触媒である、請求項１から６の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
【請求項８】
ニトリラーゼがAcinetobacter sp.AK226（受託番号FERM  BP-08590）の菌体及び／またはその処理物の、固定化物及び／または懸濁液から選択される生体触媒である、請求項１から７の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
【請求項９】
ニトリラーゼを用いてニトリル化合物の加水分解反応を行う反応系内にヒドラジンを存在させることを特徴とする、ニトリラーゼの賦活方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリラーゼを持つ生体触媒を用いて、ニトリル化合物からカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造する方法を提供する。とりわけ原料としてグリコロニトリルを用いた時には、グリコール酸又はグリコール酸アンモニウムを製造する実用的な工業的方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
酵素活性を有する生体触媒を利用して目的の化合物を合成する方法は、反応条件が穏和であるため反応プロセスが簡略化できること、あるいは副生成物が少なく高純度の反応生成物を取得できる等の利点があるため、近年、様々な化合物の製造に用いられている。中でもニトリル化合物をカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムに変換する活性を持つニトリラーゼ及びニトリル化合物をカルボン酸アミドに変換する活性を持つニトリルヒドラターゼ等の加水分解酵素は、その特異的な反応挙動から、様々なカルボン酸、カルボン酸アンモニウム、又はカルボン酸アミドの製造に用いる検討がなされている。
【０００３】
それらの中で、ニトリラーゼを用いて、ニトリル化合物をカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムに変換するカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法も数多く検討されている。例えばCorynebacterium属を用いてグリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献１)、あるいはRhodococcus属またはGordona属を用いてグリコール酸を製造する方法(特許文献２)、あるいはAcidovorax属を用いてグリコール酸、２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３)、Rhodococcus属を用いてR−マンデル酸を製造する方法(特許文献４)、あるいはAlcaligenes属の由来のニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子DNAをベクターに組み込んだ組み替え体DNAで形質転換された形質転換体を用いてＲ−マンデル酸を製造する方法(特許文献５)、あるいはAcidovorax属 由来のNitrilaseを遺伝子工学的手法で大腸菌等に発現させたものを用いてグリコール酸を製造する方法(特許文献７)等が開示されている。また本発明者らも既にAcinetobacter属を用いてグリコール酸を製造する方法(特許文献８)について報告している。
【０００４】
しかしながら、前述の従来の技術では、用いているニトリラーゼがニトリル化合物に対して必ずしも工業的に満足できる初期生産速度を有しておらず、したがって自ずと平均生産速度やカルボン酸アンモニウムの蓄積濃度が低くなり、リアクターサイズが非常に大きくなる等の問題を抱えており、更なるニトリラーゼ初期生産速度の向上が求められていた。
【０００５】
例えば、前記特許文献１では、Corynebacterium属を用いて、グリコール酸（アンモニウム）を合成する実施例が示されているが、初期活性は29.3[mmol-グリコール酸アンモニウム/g-乾燥菌体/Hr]であることが記載されており、とても十分な初期生産速度を達成していない。また、前記特許文献２では、Rhodococcus属を用いて、グリコール酸アンモニウム蓄積濃度48.2重量％を達成しているが、その時の平均生産速度は47.3[mmol-グリコール酸アンモニウム/g-乾燥菌体/Hr]（20℃×24Hr）と計算され、十分な平均生産速度を達成しているとは言えない。また、前記特許文献３では、Acidovorax属を用いて、グリコール酸アンモニウム平均生産速度が0.42[mmol-グリコール酸アンモニウム/g-乾燥菌体/Hr]（25℃×40Hr）と低い値であることが記載されており、これもまた十分な平均生産速度を達成しているとは言えない。一方、前記特許文献７では、Acidovorax属由来のNitrilaseの改変酵素を大腸菌等の宿主に発現させた生体触媒を用いることで初期活性が最高で266[mmol-グリコール酸アンモニウム/g-乾燥菌体/Hr]（25℃）と高い値を達成しており、また、該大腸菌をカラギーナン等で固定化し繰り返し反応を行うこと及び、反応温度を25℃と低く抑えることで1225[g-グリコール酸アンモニウム/g-乾燥菌体]と非常に高い触媒生産性を達成できているが、グリコール酸アンモニウム蓄積濃度は30重量%以下で十分な蓄積濃度を達成できているとは言えない。これらの例は、いずれも工業的に満足できるレベルの初期生産速度を有しているとは言えず、したがって自ずと平均生産速度やカルボン酸アンモニウムの蓄積濃度や触媒生産性も低く問題があった。
【０００６】
初期生産速度が低いという問題を解決する方法としては、基質がα−ヒドロキシニトリルの場合、該α−ヒドロキシニトリルからの平衡反応で反応系内に微量に存在し、ニトリラーゼ活性を阻害及び又は失活させるアルデヒド類を低減する方法として、反応系内に亜硫酸イオン、酸性亜硫酸イオンまたは亜ジチオン酸イオンを添加する方法（特許文献４）もしくは、亜燐酸イオンまたは次亜燐酸イオンを添加する方法（特許文献６）が開示されているが、これらの作用はあくまで不純物として存在するアルデヒド類に対するものであり、ニトリラーゼに直接作用するものではないので、アルデヒド類の存在しない、α−ヒドロキシニトリル以外の基質の場合には全く効果がなかった。
【０００７】
一方ニトリラーゼの構造と活性中心及び反応メカニズムについて言及している文献は数多く見受けられる。（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）例えば前記非特許文献１では、ニトリラーゼの反応メカニズムは、ニトリラーゼが有するアミノ酸残基の一種であるシステインの持つ官能基、スルフィドリル基による、基質ニトリル炭素への求核的な攻撃であるとの提案が記載されている。一般的にスルフィドリル基は酸化されやすく、ジスルフィド結合を生成しやすい。よって、酸化劣化した酵素の持つ、ジスルフィド結合を還元処理することでスルフィドリル基に再生し、活性を賦活する効果については一般的によく知られている技術である。また、前記非特許文献２では、Rhodococcus属のニトリラーゼが所謂チオール試薬（スルフィドリル基と反応する）によって失活作用を受けることから、該ニトリラーゼがスルフィドリル酵素であり、ニトリラーゼの反応メカニズムは、ニトリラーゼのスルフィドリル基による、基質ニトリル炭素への求核的な攻撃によって起こり、酵素とのイミノチオールエステル体（四面体中間体）を経由して進行するとの提案が記載されている。更に前記非特許文献３では、Acinetobactger属のニトリラーゼがスルフィドリル基を活性中心にしていることを記載しているが、一般的なスルフィドリル酵素の阻害剤として知られる硝酸銀、p-クロロメルクリ安息香酸、フェニルメルクリ酢酸では阻害を受けるにも拘わらず、硫酸銅、硝酸鉛、塩化水銀、N-エチルマレイミド、ヨードアセタミド、p-ヒドロキシメルクリ安息香酸は阻害しないことが記載されている。また、還元剤の効果についても記載されているが、ジチオスレイトール（DTT）は活性に対し全く影響のないことが記載されおり、必ずしも全てのニトリラーゼに対し、還元剤による活性の賦活効果が現れるわけではないことを示唆している。また、前記非特許文献４においても、実験例の中に還元剤の効果を見ているものがあるが、L-システインと亜硫酸ナトリウムで若干の効果が見られるが、DTTや還元型グルタチオン、フェニルヒドラジンにおいてはむしろ活性低下傾向を示しており、やはり還元剤の効果が単純な機構ではないことを示している。また、前記非特許文献５においても、Pyrococcus 属由来ニトリラーゼに対する還元剤の効果について言及しているが、L-システイン、DTTにおいて若干の賦活効果が見られるが、決して十分な効果とは言えない。また、前記非特許文献６ではPseudomonas属由来ニトリラーゼに対する還元剤の効果について言及しているが、2-メルカプトエタノール、DTTにおいて若干の賦活効果が見られるが、D-システイン、L-システイン、アスコルビン酸、還元型グルタチオンでは還元剤の効果が出ていない。これらの文献から言えることは、ニトリラーゼは活性中心にスルフィドリル基を有しており、基本的に酸化劣化を起こしやすいため、還元剤による賦活効果が期待できるにも拘わらず、還元剤種によっては効果があるものとないものが存在するということである。また、これらの文献に示されているのは、ニトリラーゼ酵素に対する還元剤の効果についてのみであり、ニトリラーゼ活性を有する生体触媒、例えばニトリラーゼ活性を有する休止菌体を用いた反応等の例は全く見られない。
【０００８】
【特許文献１】特公平３−３８８３６号公報
【特許文献２】特開平９−０２８３９０号公報
【特許文献３】特開２００５−５０４５０６号公報
【特許文献４】特開平５−１９２１９８号公報
【特許文献５】特開平６−１５３９６８号公報
【特許文献６】特開平７−２１３２９６号公報
【特許文献７】ＷＯ２００６０６９１１０
【特許文献８】特開２００７−２８９０６２号公報
【非特許文献１】Journal of Applied Microbiology,95,1161-1174 (2003)
【非特許文献２】Actynomycetologica,19(1),18-26 (2005)
【非特許文献３】Agric. Biol. Chem.,55(6),1459-1466 (1991)
【非特許文献４】Extemophiles,3,283-291 (1999)
【非特許文献５】Protein Expression and Purification,47,672-681 (2006)
【非特許文献６】Arch Microbiol,184,407-418 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ニトリラーゼを持つ生体触媒を用いて、ニトリル化合物からカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造するに当たって、十分な初期活性すなわち初期生産速度を達成することができる、工業的に有利なニトリル化合物からのカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ニトリラーゼを用いて、ニトリル化合物を原料にカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造するに当たって、十分な初期活性すなわち初期生産速度を達成することができる、工業的に有利なニトリル化合物からのカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法について鋭意検討を行ったところ、驚くべきことに、ニトリラーゼを持つ生体触媒を用いたニトリル化合物の加水分解反応液中に特定の化学物質ヒドラジンを存在させることで該ニトリラーゼ初期活性を大幅に賦活させることができることを発見し、これによってカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの初期生産速度を増加させることが可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本発明は以下に記載する通りの構成を有する。
（１）  ニトリラーゼを用いてヒドラジンの存在下においてニトリル化合物の加水分解反応を行うことを含む、カルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（２）  ニトリル化合物がα−ヒドロキシニトリルである、（１）に記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（３）  α−ヒドロキシニトリルがグリコロニトリルである、（２）に記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（４）  ニトリラーゼが、微生物菌体又はその処理物、あるいは微生物菌体由来のニトリラーゼの固定化物又は懸濁液から選択される何れか１種以上の生体触媒である、（１）から（３）の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（５）  ニトリラーゼが、Acinetobacter sp.AK226（受託番号FERM  BP-08590）由来のニトリラーゼ、又はAcinetobacter sp.AK226（受託番号FERM  BP-08590）のニトリラーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質酵素である、（１）から（４）の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（６）  ニトリラーゼが、グラム陰性菌及び／またはその処理物の、固定化物及び／または懸濁液から選択される生体触媒である、（１）から（５）の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（７）  ニトリラーゼがAcinetobacter属の菌体及び／またはその処理物の、固定化物及び／または懸濁液から選択される生体触媒である、（１）から（６）の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（８）  ニトリラーゼがAcinetobacter sp.AK226（受託番号FERM  BP-08590）の菌体及び／またはその処理物の、固定化物及び／または懸濁液から選択される生体触媒である、（１）から（７）の何れかに記載のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法。
（９）  ニトリラーゼを用いてニトリル化合物の加水分解反応を行う反応系内にヒドラジンを存在させることを特徴とする、ニトリラーゼの賦活方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、ニトリラーゼを用いて、ニトリル化合物からカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造するに当たり、十分な初期活性すなわち初期生産速度を持たせることで、工業的に有利なニトリル化合物からのカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下本発明について具体的に説明する。
本発明における「カルボン酸又はカルボン酸アンモニウム」という表記についてまず説明する。ニトリラーゼを用いてニトリル化合物を加水分解した場合、ニトリル化合物中のＮはアンモニアに変換され、通常、ニトリラーゼを用いる加水分解反応条件においては、該アンモニアが同時に生成されるカルボン酸と瞬時にアンモニウム塩を形成するので最終的にはカルボン酸アンモニウムが生成されることとなる。しかしながら、反応機構的にはカルボン酸を合成する課程を経ているため、本発明においては、カルボン酸あるいはカルボン酸アンモニウムの両方を意味する方法として、カルボン酸又はカルボン酸アンモニウムという表記を採っている。
【００１４】
本発明で用いるニトリル化合物は、ニトリル基（−ＣＮ）を有する化合物であれば特に限定されないが、好ましくはα−ヒドロキシニトリルである。本発明で言うα−ヒドロキシニトリルとは、一般式[Ｉ]：RCH(OH)CN（式中Rは水素原子、置換基を有してもよいC1〜C6のアルキル基、置換基を有してもよいC2〜C6のアルケニル基、置換基を有してよいC1〜C6アルコキシル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す）で表されるα−ヒドロキシニトリルを言い、例えば、マンデロニトリル、アセトンシアンヒドリン、グリコロニトリル、ラクトニトリル、２−ヒドロキシ４−メチルチオイソブチロニトリル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記の中でも特に好ましくは、グリコロニトリルを用いることができる。
【００１５】
本発明で用いるニトリラーゼの形態は特に限定されないが、好ましくはニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いることができる。本発明で言うニトリラーゼ活性を有する生体触媒とは、ニトリル基を、カルボン酸又はカルボン酸アンモニウム基へ直接変換する能力を有する酵素、ニトリラーゼを保有する触媒であれば如何なる形態のものでもよい。
【００１６】
生体触媒の形態としては微生物細胞を休眠状態でそのまま使用しても構わないし、あるいは破砕処理したもの、または該微生物細胞から必要なニトリラーゼ酵素を取り出したものをそのまま使用しても構わないし、一般的な包括法、架橋法、担体結合法等で固定化したものを使用してもよい。尚、固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸、光架橋樹脂等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
ニトリラーゼの起源となる微生物種としては多くのものが知られているが、例えばニトリラーゼ高活性を有するものとして、Rhodococcus属、Acinetobacter属、Alcaligenes属、Pseudomonas属、Corynebacterium属等が挙げられる。本発明においてはこれらの中でも、特にグラム陰性菌であるAcinetobacter属、Alcaligenes属が好ましく、更に好ましくはAcinetobacte属がよい。具体的にはAcinetobacter sp.AK226(受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５９０)、Acinetobacter sp.AK227(受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５９１)である。これらの菌株は、特開2007-28962、特開2005-176639、特開2004-305066、特開2004-305058、特開2004-305062、特開2001-299378、特開平11-180971、特開平06-303991、特開昭63-209592、特公昭63-2596号公報等に記載されている。
【００１８】
また例えば、天然のあるいは人為的に改良したニトリラーゼ遺伝子を遺伝子工学的手法によって組み込んだ微生物、あるいはそこから取り出したニトリラーゼ酵素であっても構わないが、ニトリラーゼの発現量が少ない微生物あるいはニトリル化合物からカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムへの変換活性の低いニトリラーゼを発現した微生物を少量用いてカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造するには、より多くの反応時間を要するため、可能な限りニトリラーゼを高発現した微生物、及びまたは変換活性の高いニトリラーゼを発現した微生物、あるいはそこから取り出したニトリラーゼ酵素を用いることが望ましい。
【００１９】
本発明におけるカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの初期生産速度を高くする最大のポイントは、ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いてニトリル化合物の加水分解反応を行う反応液中にヒドラジンを存在させ、該ニトリラーゼの初期活性を高めることにある。ヒドラジンという物質は、示性式でH2NNH2と表され、無色の液体で強い還元性を持つ。
【００２０】
ニトリラーゼの活性中心については、前出の通りスルフィドリル基であるとの考え方が有力で、該スルフィドリル基は容易に酸化されやすく、その結果ジスルフィド結合を生成しやすい。一度酸化されてジスルフィド結合を生成すると、本来のニトリラーゼとしての活性は消失するため、還元剤で処理してスルフィドリル結合を再生することはニトリラーゼの賦活法として有力である。そのため、従来の技術においても、ニトリラーゼ酵素を菌体等から取り出して使用する場合、DTT（ジチオスレイトール）等の還元剤を反応系中に添加することは公知であるが、そのような還元作用を示す物質としてヒドラジンの使用について言及しているものは見あたらない。但し、一般的にヒドラジンはアルデヒド類と反応してヒドラジドを生成することが知られており、基質がα-ヒドロキシニトリルの場合、一部α-ヒドロキシニトリルからの平衡反応で生成するアルデヒド類の阻害効果を低減することで賦活効果を現すことも十分に考えられるが、反応後のアルデヒド類の消失がほとんど見られないことから、本メカニズムによる賦活ではないことが推定される。
【００２１】
また、本発明のようにニトリラーゼ活性を有する生体触媒は、休眠状態の菌体をそのまま使用する例もあり、菌体内に還元剤が届くためには、低分子量の還元剤が有利であると考えられる。この点からもヒドラジンは非常に低分子量の還元剤のため、このような生体触媒の賦活効果を効果的に現したのではないかと類推される。
【００２２】
使用するヒドラジンの濃度は必ずしも限定されないが、少量でも存在すれば効果が現れるので、濃度に依存して活性の上昇率が見られるまでは高濃度にすることが望ましい。一方、ヒドラジン自体が不純物N化合となるので品質に影響しない程度に抑える必要がある。また、ある一定以上の濃度となると活性の上昇は見られなくなり、最適な濃度が存在すると考えられる。具体的には2〜200重量ppmがよく、より好ましくは10〜 100重量ppm、更に好ましくは20〜80重量ppm、最も好ましくは50〜80重量ppmがよい。
【００２３】
本発明で言う初期活性とは、反応温度30℃、pH=6.5〜7.0、反応基質濃度：1重量%の反応条件で、生体触媒リン酸バッファー懸濁液にニトリル化合物水溶液を添加することで反応を開始し、反応開始から10分におけるカルボン酸アンモニウム生産モル量を使用乾燥生体触媒重量で除し、更に反応時間(10分=1/6時間)で除することにより得られる、乾燥生体触媒重量当たり、1時間当たりのカルボン酸アンモニウム生産量と定義する。但し、菌体使用量はニトリル化合物転化率が15〜30%になるように調整するものとする。
【００２４】
本発明で定義する初期生産速度は、任意の反応条件で、生体触媒懸濁液にニトリル化合物水溶液を連続的あるいは間欠的に添加する事で反応を開始し、反応開始から0.5時間におけるカルボン酸アンモニウム生産モル量を使用乾燥生体触媒重量と反応時間(0.5時間)で除することにより得られる、乾燥生体触媒重量当たり、1時間当たりのカルボン酸アンモニウム生産量と定義する。
【００２５】
本発明で定義する平均生産速度は、任意の反応条件で、生体触媒懸濁液にニトリル化合物水溶液を連続的あるいは間欠的に添加する事で反応を開始してから反応終了時点までの時間平均の生産速度のことであり、その時点までのカルボン酸アンモニウムの生産モル量を反応時間で除することにより得られる。ここでいう反応終了時点とは、実質触媒活性が限りなく０に近づき、それ以上反応時間を延長しても該触媒生産性がほとんど伸びないと判断される時点、あるいは目的とする触媒生産性に達した時点を指す。
【００２６】
本発明における乾燥生体触媒重量とは、微生物菌体を用いる場合は該微生物菌体の乾燥重量を表し、ニトリラーゼを用いる場合はニトリラーゼの乾燥重量を表し、微生物菌体あるいはニトリラーゼの固定化物を用いる場合は該固定化物中の微生物菌体あるいはニトリラーゼの乾燥重量を表す。ここで定義する平均生産速度が高いほど、短時間で目的とする濃度のカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造できることとなり、実用性を示す指標として非常に重要となる。
【００２７】
本発明で定義するカルボン酸アンモニウム蓄積濃度とは、反応終了時点での反応液のカルボン酸アンモニウム重量濃度を表し、単位は重量％である。該カルボン酸アンモニウム蓄積濃度が高いということは、使用したニトリラーゼを持つ生体触媒が生成物（カルボン酸アンモニウム）阻害を受けにくく、高塩濃度においてもニトリラーゼ酵素の活性が維持されることを示す。前出の平均生産速度が高いと同時に該カルボン酸アンモニウム蓄積濃度が高いということはカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造法としての実用性を示す指標として非常に重要となる。
【００２８】
本発明で定義する触媒生産性とは使用する乾燥生体触媒重量当たりの反応終了時点までのカルボン酸アンモニウムの生成重量を表し、単位は[g-カルボン酸アンモニウム/g-乾燥生体触媒重量]である。該触媒生産性が高いということは、前出のカルボン酸アンモニウム蓄積濃度と同様に、使用したニトリラーゼを持つ生体触媒が生成物（カルボン酸アンモニウム）阻害を受けにくく、高塩濃度においてもニトリラーゼ酵素の活性が維持されることを示す。該触媒生産性が高いということはカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造法としての実用性を示す指標として非常に重要となる。なお、本発明の方法により十分な初期活性すなわち初期生産速度を達成することによって、１）十分な平均生産速度、２）十分なα−ヒドロキシ酸アンモニウム蓄積濃度、３）十分な触媒生産性を達成することも可能になる場合もある。
【００２９】
原料であるニトリル化合物がα-ヒドロキシニトリルの場合、該α-ヒドロキシニトリルは非常に不安定な物質であるため、通常、安定剤として硫酸やリン酸あるいは酢酸といった酸成分を含む。よって、反応開始後は、反応系中のpHを調整するため反応系へのアルカリの添加が必須となる。その場合使用するアルカリは反応に影響を及ぼさなければ特に限定されないが、生成物の一つであるアンモニアを使用するのが望ましい。アンモニアの形態はガスであろうが、アンモニア水であろうが構わないが、通常、扱いの容易さからアンモニア水が望ましい。
【００３０】
原料であるニトリル化合物がα-ヒドロキシニトリルの場合、反応液のpHは、１）使用する生体触媒のニトリラーゼ比活性の至適pHと２）基質α−ヒドロキシニトリルのHCNとアルデヒドあるいはケトンへの分解抑制の観点から決定される。１）については、α−ヒドロキシニトリル以外のニトリルの加水分解活性挙動よりpH=7〜11のアルカリ性領域がよいと推定されるが、２）の観点からは、pH=2程度の酸性領域がよいことが判っている。本発明においては反応液のpHは6〜8がよく、好ましくは6.5〜7がよい。
【００３１】
反応温度については、反応温度が低すぎると反応活性が低くなり、高濃度のカルボン酸アンモニウムを製造する場合、より多くの反応時間を要する。一方、反応温度が高すぎると生体触媒の熱劣化で、目的とするカルボン酸アンモニウムの濃度が高い場合、該濃度まで到達させることが困難となり、結果として新たな生体触媒の追添等の処置が必要となり触媒コストが高くなる。また、原料であるニトリル化合物がα−ヒドロキシニトリルの場合、温度が高すぎると、基質α−ヒドロキシニトリルの青酸とアルデヒドあるいはケトンへの分解促進にも繋がり、それらによる反応阻害や失活等、ますますの反応活性低下を引き起こす。よって、通常、反応温度は30〜60℃がよく、好ましくは40〜50℃がよい。
【００３２】
カルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造する反応方法は、固定床、移動層、流動層、撹拌槽等、いずれでもよく、また連続反応でも半回分反応でもよいが、特に固定化されていない微生物菌体を用いる場合、反応の容易性から攪拌槽を用いた半回分反応がよい。その場合、反応効率の観点から、適切な攪拌を行うのがよい。また、半回分反応を行う場合、ニトリラーゼを持つ生体触媒は１バッチ使い捨てでもよいし、繰り返し反応を行ってもよい。但し、繰り返し反応を行う場合、該生体触媒をカルボン酸アンモニウム高濃度から低濃度へ急激に変化させるため、浸透圧の影響等で生産速度が低下する場合があるので注意を要する。
【００３３】
反応基質であるニトリル化合物の定常濃度については、２重量％以下が好ましく、より好ましくは０．１〜１．５重量％、更に好ましくは０．１〜１．０重量％、最も好ましくは０．２〜０．５重量％にコントロールするのがよい。ニトリル化合物の濃度が高すぎると、生成物阻害及びまたは失活、あるいは高生成物蓄積濃度で初めて顕著となる基質阻害及びまたは失活の影響が急激に大きくなり、それまで進行していた反応が停止してしまう場合がある。また、ニトリル化合物の濃度が低すぎると反応速度を低下させることとなり、効率的にカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造できないので不利である。以上の理由から、反応中のニトリル化合物定常濃度を管理することは非常に重要である。
【００３４】
製造されるカルボン酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量比は１／１００以下がよく、好ましくは１／１００〜１／２００、より好ましくは１／２００〜１／３００、更に好ましくは１／３００〜１／５００である。製造されるカルボン酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量が多すぎると該生体触媒懸濁液由来の不純物が反応液中に多く同伴されるため精製コストが上がり、製品品質が低下するので好ましくない。逆に、製造されるカルボン酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量が少なすぎるとリアクターボリューム当たりの生産性が低下し、大きなリアクターサイズが必要となり経済的に不利となる。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。尚、本発明はこれらの実施例により必ずしも限定されるものではなく、その要旨を超えない限り、様々な変更、修飾が可能である。特に実施例においては、グリコロニトリル（HO-CH2-CN）を用いた実験のみを示すが、本発明の主旨を考慮すると、反応液中に存在するヒドラジンの効果により、ニトリラーゼの活性中心を賦活化する作用が重要なので、グリコロニトリル以外のニトリル化合物についても同様の現象と結果が得られることは容易に類推できるものである。
【００３６】
本発明に使用する生体触媒であるAcinetobacter sp.AK226は、本発明者らが独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに国際寄託したものであり、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５９０の国際寄託番号を有するものである。
【００３７】
生体触媒懸濁液中の乾燥生体触媒重量の測定法は、以下のごとく実施した。まず、適当な濃度の生体触媒懸濁液を適量取り、−80℃まで冷却した後、凍結乾燥機を用いて完全に乾燥し、その重量値から前記生体触媒懸濁液の濃度を算出した。固定化物については固定化時における既知となった生体触懸濁液の使用量と架橋剤や固定化担体の使用量から乾燥生体触媒重量を算出した。
【００３８】
反応液及び処理液の分析は、以下のごとく実施した。基質であるグリコロニトリル及び生成物であるグリコール酸（アンモニウム）及び副生成物であるグリコロアミドは、高速液体クロマトグラフィーで測定した。カラムはイオン排除カラム（島津Shim-pack SCR-101H）、カラム温度は４０℃、移動相はリン酸水溶液（ｐＨ=2.3）、流速は0.7mL/min、検出器はＵＶ（島津SPD-10AV vp、210nm）及びＲＩ（島津RID-6A）、注入量は10μLで実施した。
【００３９】
[生体触媒の調製]
塩化ナトリウム0.1重量%、リン酸二水素カリウム0.1重量%、硫酸マグネシウム七水和物0.05重量%、硫酸第一鉄七水和物0.005重量%、硫酸アンモニウム0.1重量%、硝酸カリウム0.1重量%硫酸マンガン五水和物0.005重量%を含む培養液250mlを三角フラスコに仕込み、pHが7になるように水酸化ナトリウムで調整し、121℃で20分間滅菌した後、アセトニトリル0.5重量%を添加した。これにAcinetobacter sp.AK226を接種して30℃で振とう培養した(前培養)。ミーストパウダー0.3重量%、グルタミン酸ナトリウム0.5重量%、硫酸アンモニウム0.5重量%、リン酸水素二カリウム0.2重量%、リン酸ニ水素カリウム0.15重量％、塩化ナトリウム0.1重量%、硫酸マグネシウム七水和物0.18重量%、塩化マンガン4水和物0.02重量%、塩化カルシウム二水和物0.01重量%、硫酸鉄7水和物0.003重量%、硫酸亜鉛7水和物0.002重量%、硫酸銅5水和物0.002重量%、大豆油2重量%を含む培養液3Lを5Lジャーファーメンターに仕込み、121℃で20分間滅菌した後、前記の前培養液を接種して30℃で通気攪拌を行った。培養開始10時間後から大豆油のフィードを開始した。PHは7になるようにリン酸及びアンモニア水でコントロールし、最終的に約5重量%のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を得た。更に0.06Mリン酸バッファーを用いて2回洗浄を行い、最終的にリン酸バッファーに懸濁されたAcinetobacter sp.AK226懸濁液(乾燥菌体濃度１０重量%)を得た。
【００４０】
[原料グリコロニトリル]
原料グリコロニトリル水溶液は東京化成製の55重量％グリコロニトリル水溶液をそのまま用いた。
【００４１】
[添加剤]
ヒドラジン１水和物、DTT（ジチオスレイトール）、２−メルカプトエタノール、チオ硫酸ナトリウム等の還元剤は広島和光製のものを用い、次亜硫酸ナトリウムはアルドリッチ製のものをそのまま用いた。
【００４２】
[実施例１]
上記の55重量％グリコロニトリル水溶液を原料に、前記の生体触媒懸濁液を用いて加水分解反応を行った。まず0.06Mリン酸バッファーに懸濁した状態で保存された既知菌体濃度のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を濃度が約640重量ppmとなるように、また予め適当に水で希釈したヒドラジン１水和物水溶液を濃度が2.4〜177重量ppm（表１に示す各濃度）となるように15ml試験管に1重量%のリン酸バッファーとともに仕込み全液量を1mLに調製(pH=6.8)した。該試験管を恒温水槽に入れてスターラー攪拌を実施し、内温が30℃になるまでしばらく保持した。次に原料の55重量％グリコロニトリル水溶液を、マイクロピペッターを用いて20μL添加して反応を開始した。（初期HCHO仕込量は2.26μmol）10分後にサンプリングを実施し、2M塩酸水溶液で希釈することで反応を停止し、0.2μmフィルター処理で菌体を除いた後、高速液体クロマトグラフィー分析を実施した。結果を表１及び図１に示す。
【００４３】
[比較例１]
ヒドラジンを添加しない以外は実施例１と同様の操作を行った。結果を表１及び図１に示す。
【００４４】
[比較例２]
ヒドラジンを添加する代わりに、２−メルカプトエタノールを27〜417重量ppm添加する以外は実施例１と同様の操作を行った。結果を表２及び図１に示す。なお、本物質の添加量は品質の問題上、出来る限り低減することが望ましい。以下、比較例３〜５についても同様である。
[比較例３]
ヒドラジンを添加する代わりに、チオ硫酸ナトリウム（Na2S2O3）を52〜769重量ppm添加する以外は実施例１と同様の操作を行った。結果を表２及び図１に示す。
[比較例４]
ヒドラジンを添加する代わりに、次亜硫酸ナトリウム(Na2S2O4)を58〜888重量ppm添加する以外は実施例１と同様の操作を行った。結果を表２及び図１に示す。
[比較例５]
ヒドラジンを添加する代わりに、DTT（ジチオスレイトール）を52〜793重量ppm添加する以外は実施例１と同様の操作を行った。結果を表２及び図１に示す。
【００４５】
【表１】
2009165381.tif 000002
【００４６】
【表２】
2009165381.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によれば、ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いて、ニトリル化合物からカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムを製造するに当たって、十分な初期活性すなわち初期生産速度を達成することができる、工業的に有利なニトリル化合物からのカルボン酸又はカルボン酸アンモニウムの製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、グリコロニトリル水溶液を原料に、生体触媒を用いて、各種添加物の存在下において加水分解反応を行った時の初期活性を示す。
【図１】
2009165381.tif 000004