(57)【要約】【課題】対物レンズを切り替えても精度良くセクショニングが可能で標本の画像取得後に所望のセクショニング分解能の正確な共焦点画像を得る。【解決手段】光源５の光を走査する走査手段１６と、走査手段１６を経た光を標本３に集光する対物レンズ１３と、観察光の光路を分割する分割手段１９と、対物レンズ１３の焦点と略共役な位置で分割手段１９で分割された一方の光路上に配置された開口径を変更可能な第１ピンホール手段２０と、該手段２０と開口径が異なり対物レンズ１３の焦点と略共役な位置で分割手段１９で分割された他方の光路上に配置された第２ピンホール手段２２と、これらのピンホール手段２０，２２を通過したセクショニング分解能の異なる２つの光束から得た２つの共焦点画像のデータに基づき前記共焦点画像とセクショニング分解能の異なる共焦点画像を作成する演算手段３７を有する共焦点顕微鏡。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの光を走査する走査手段と、
前記走査手段を経た光を標本上に集光する対物レンズと、
前記標本からの観察光の光路を分割する光路分割手段と、
前記対物レンズの焦点と略共役な位置であって前記光路分割手段で分割された一方の光路上に配置された開口径を変更可能な第１ピンホール手段と、該第１ピンホール手段と開口径が異なり、前記対物レンズの焦点と略共役な位置であって前記光路分割手段で分割された他方の光路上に配置された第２ピンホール手段と、
前記第１ピンホール手段及び前記第２ピンホール手段を通過したセクショニング分解能の異なる２つの光束から得た２つの共焦点画像のデータに基づいて、前記共焦点画像とセクショニング分解能の異なる共焦点画像を作成する演算手段と、
を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記第１ピンホール手段の前記開口径は、前記対物レンズの倍率及び開口数に基づいて変更されることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記第２ピンホール手段は、開口径を変更可能であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項４】
前記第１ピンホール手段は、開口径の異なる複数のピンホールを切替可能に備えたターレット部材からなることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項５】
前記第２ピンホール手段は、開口径の異なる複数のピンホールを切替可能に備えたターレット部材からなることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、対物レンズの焦点位置と共役な位置にピンホールを配置することで、観察対象を標本のピント面近傍の薄い層に限定（セクショニング）して観察を行う共焦点顕微鏡が知られており、近年では観察対象となるこの層の厚み、所謂セクショニング分解能を変更可能なものが提案されている。
斯かる背景において本出願人は、標本からの観察光を開口径の異なる２つのピンホールを備えた光分離手段によってセクショニング分解能の異なる２つの光束に分離して検出することで２つの共焦点画像を取得し、これらの画像データを用いて所望のセクショニング分解能の共焦点画像を作成する構成の共焦点顕微鏡、即ち標本の画像取得後においてセクショニング分解能を変更した共焦点画像を観察可能な共焦点顕微鏡を提案している（例えば、特許文献１を参照。）。
【特許文献１】特開２００５−２７４５９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ここで、前述のような従来の共焦点顕微鏡においては、光分離手段に備えられたピンホールの対物レンズに対する最適な開口径は、使用する対物レンズの倍率や開口数によって異なる。しかしながら従来の共焦点顕微鏡においては、光分離部材のピンホールの開口径は固定であるため、対物レンズを切り替えて使用する場合には、セクショニングの精度が低下してしまい、セクショニング分解能を変更した際に標本の正確な共焦点画像を得ることが困難になってしまうという問題があった。
【０００４】
そこで本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、対物レンズを切り替えても精度良くセクショニングを行うことが可能で、標本の画像取得後において所望のセクショニング分解能の正確な共焦点画像を得ることができる共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために本発明は、
光源からの光を走査する走査手段と、
前記走査手段を経た光を標本上に集光する対物レンズと、
前記標本からの観察光の光路を分割する光路分割手段と、
前記対物レンズの焦点と略共役な位置であって前記光路分割手段で分割された一方の光路上に配置された開口径を変更可能な第１ピンホール手段と、該第１ピンホール手段と開口径が異なり、前記対物レンズの焦点と略共役な位置であって前記光路分割手段で分割された他方の光路上に配置された第２ピンホール手段と、
前記第１ピンホール手段及び前記第２ピンホール手段を通過したセクショニング分解能の異なる２つの光束から得た２つの共焦点画像のデータに基づいて、前記共焦点画像とセクショニング分解能の異なる共焦点画像を作成する演算手段と、
を有することを特徴とする共焦点顕微鏡を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、対物レンズを切り替えても精度良くセクショニングを行うことが可能で、標本の画像取得後において所望のセクショニング分解能の正確な共焦点画像を得ることができる共焦点顕微鏡を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡を添付図面に基づいて詳細に説明する。
図１（ａ）は、本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す概略構成図である。
図１（ａ）に示すように本実施形態に係る顕微鏡装置１は、倒立顕微鏡２、標本３の共焦点観察を行うための共焦点観察システム４、該共焦点観察システム４へ照明光を供給するレーザユニット５、共焦点観察システム４で得られた標本３の観察光（蛍光）を検出する２つの光検出ユニット６,７、及びコントローラ８からなる。
【０００８】
倒立顕微鏡２は、上方から順に、透過照明装置９、標本３を載置するステージ１０、対物レンズターレット１１、及び結像レンズ１２を有している。対物レンズターレット１１は、複数の対物レンズ１３を備えており、これを回転操作することで所望の対物レンズ１３を光路内に切り替えて配置することができる。なお、斯かる倒立顕微鏡２は、標本３からの観察光を接眼観察部１４へ導くための不図示の光学系も備えている。
【０００９】
共焦点観察システム４は、倒立顕微鏡２の本体２ａに直接取り付けられており、該倒立顕微鏡２の結像レンズ１２側から順に、スキャナレンズ１５、光を二次元的に走査するガルバノスキャナ１６、ダイクロイックミラー１７、集光レンズ１８、ハーフミラー１９、第１ピンホールターレット２０を有している。そして、ハーフミラー１９の反射光路上には、全反射ミラー２１を介して第２ピンホールターレット２２を有している。また、ダイクロイックミラー１７の反射光路上には、コリメートレンズ２３を有している。
【００１０】
第１ピンホールターレット２０は、対物レンズ１３の焦点位置と共役な位置に配置されており、図１（ｂ）に示すように開口径の異なる複数のピンホール２０ａが円周に沿って設けられたターレット部材であって、これを回転操作することで所望のピンホール２０ａを光路内へ切り替えて配置することができる。本実施形態において具体的には、直径が３０，１００，１２０，１５０，１８０，２００，２５０，３００μｍのピンホール２０ａが第１ピンホールターレット２０に備えられている。このような第１ピンホールターレット２０の構成により、使用する対物レンズ１３に合わせて最適な開口径のピンホール２０ａを選択して光路内に配置することができる。
【００１１】
また第２ピンホールターレット２２は、第１ピンホールターレット２０と同様の構成であり、本実施形態においては第１ピンホールターレット２０に備えられたピンホール２０ａよりも大径のピンホール２２ａを備えている。具体的には、直径が２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０μｍのピンホール２２ａが第２ピンホールターレット２２に備えられている。このような第２ピンホールターレット２２の構成により、前述の第１ピンホールターレット２０で選択したピンホール２０ａに応じて所望の開口径のピンホール２２ａを選択して光路内に配置することができる。
【００１２】
レーザユニット５は、光ファイバ５ａを介して共焦点観察システム４と接続されており、共焦点観察システム４のコリメートレンズ２３側から順に、集光レンズ２４、ダイクロイックミラー２５、全反射ミラー２６を有し、これらのミラー２５，２６の反射光路上には、シャッタ装置２７ａ,２８ａ、波長の異なるレーザ光を発するレーザ光源２７ｂ,２８ｂをそれぞれ有している。なお、シャッタ装置２７ａ,２８ａには、レーザ光のパワーを調整するための音響光学素子等も含まれている。
【００１３】
光検出ユニット６は、光ファイバ６ａを介して共焦点観察システム４の第１ピンホールターレット２０と接続されており、この光ファイバ６ａの入力ポート側から順に、レンズ３０、ダイクロイックミラー３１、該ダイクロイックミラー３１と波長特性の異なるダイクロイックミラー３２を有している。そして、各ダイクロイックミラー３１，３２の透過光路上及び反射光路上に、バリアフィルタ３３ａ，３４ａ，３５ａ、集光レンズ３３ｂ，３４ｂ，３５ｂ、ＰＭＴ３３ｃ，３４ｃ，３５ｃをそれぞれ有している。
また光検出ユニット７は、光検出ユニット６と同様の構成であり、光ファイバ７ａを介して共焦点観察システム４の第２ピンホールターレット２２と接続されている。
【００１４】
コントローラ８は、コンピュータ３７と接続されており、該コンピュータ３７からの指示に基づいて本共焦点顕微鏡１の各部を制御するものである。具体的には、コントローラ８は、倒立顕微鏡２、共焦点観察システム４のガルバノスキャナ１６、レーザユニット５、光検出ユニット６，７を制御するために、それぞれに対応した制御部８ａ，８ｂ，８ｃ，８ｄを備えている。なお、コンピュータ３７には、標本３の観察画像等を表示するためのモニタ３８も接続されている。
【００１５】
次に、以上に述べた構成の共焦点顕微鏡１を用いて行われる所望のセクショニング分解能での標本３の共焦点観察について説明する。
はじめに本共焦点顕微鏡１の観察者は、使用する対物レンズ１３の倍率及び開口数に応じて第１ピンホールターレット２０から最適な開口径のピンホール２０aを選択して光路内に配置し、さらに選択したピンホール２０ａに応じて第２ピンホールターレット２２から所望の開口径のピンホール２２ａを選択して光路内に配置する。具体的には、ピンホール２０ａの開口径をａとすると、ピンホール２２ａの開口径ｂはｂ＝２ａ，３ａ・・・の関係を満たすものが選択される。
【００１６】
この前提の下、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１では、レーザユニット５においてレーザ光源２７ｂから発せられた光は、シャッタ装置２７ａを経てダイクロイックミラー２５で反射され、集光レンズ２４に入射する。また、もう１つのレーザ光源２８ｂから発せられた光は、シャッタ装置２８ａを経て全反射ミラー２６で反射され、さらにダイクロイックミラー２５を透過して集光レンズ２４に入射する。これにより、各レーザ光源２７ｂ，２８ｂのレーザ光は、集光レンズ２４によってまとめて光ファイバー５ａの端面に集光され、この光ファイバー５ａを介して照明光として共焦点観察システム４へ入力される。
【００１７】
共焦点観察システム４に入力された照明光は、コリメートレンズ２３を経てダイクロイックミラー１７で反射され、ガルバノスキャナ１６とスキャナレンズ１５を介して倒立顕微鏡２へ入力される。この照明光は、倒立顕微鏡２の本体２ａ内において結像レンズ１２と対物レンズ１３を順に介してステージ１０上の標本３に照射される。
【００１８】
これによって標本３から発せられた観察光は、再び対物レンズ１３と結像レンズ１２を順に経て、共焦点観察システム４へ入力される。この観察光は、共焦点観察システム４において再びスキャナレンズ１５とガルバノスキャナ１６を経てダイクロイックミラー１７を透過し、さらに集光レンズ１８を経てハーフミラー１９へ導かれ、該ハーフミラー１９によって透過光と反射光に等分される。そしてハーフミラー１９からの透過光は、第１ピンホールターレット２０のピンホール２０ａに対して集光し、該ピンホール２０ａを通過した光は光ファイバー７ａを経由して光検出ユニット７に入力される。これに対してハーフミラー１９からの反射光は、全反射ミラー２１で反射されて第２ピンホールターレット２２のピンホール２２ａに対して集光し、該ピンホール２２ａを通過した光は光ファイバー６ａを経由して光検出ユニット６に入力される。
【００１９】
次に、光検出ユニット７に入力された観察光（第１ピンホールターレット２０からの観察光）は、レンズ３１を経た後、２枚のダイクロイックミラー３１，３２によって３つの波長成分に分離され、それぞれ対応するバリアフィルタ３３ａ，３４ａ，３５ａと集光レンズ３３ｂ，３４ｂ，３５ｂを順に経た後、ＰＭＴ３３ｃ，３４ｃ，３５ｃで検出される。なお、標本３に照射される照明光は、上述のようにガルバノスキャナ１６によって二次元的に走査されるため、各ＰＭＴ３３ｃ，３４ｃ，３５ｃでは標本３の観察領域全体にわたって観察光が検出されることとなる。
【００２０】
これによりコンピュータ３７は、光検出ユニット６の各ＰＭＴ３３ｃ，３４ｃ，３５ｃから観察光の波長成分毎の検出信号をコントローラ８を介して取得し、これに基づいて標本３の二次元画像データを作成して当該コンピュータ３７内に備えられている不図示のメモリに格納する。
なお、ここで得られた標本３の二次元画像データは、第１ピンホールターレット２０に備えられた小径のピンホール２０ａのうち、対物レンズ１３に対して最適な開口径のピンホール２０ａを通過した観察光に基づくものであるため、標本３におけるピント面近傍の薄い層の情報、即ちセクショニング分解能が高い情報であって、セクショニング精度の高い正確な情報を有している。
【００２１】
一方、光検出ユニット６に入力された観察光（第２ピンホールターレット２２からの観察光）は、上述の光検出ユニット７に入力された観察光と同様に当該光検出ユニット６で検出され、コンピュータ３７によって波長成分毎の標本３の二次元画像データが作成されてメモリに格納される。
なお、ここで得られた標本３の二次元画像データは、第２ピンホールターレット２２の大径のピンホール２２ａを通過した観察光に基づくものであるため、標本３におけるピント面周辺の厚い層の情報、即ちセクショニング分解能が低い情報を有している。
【００２２】
以上のようにしてセクショニング分解能の高い二次元画像データとセクショニング分解能の低い二次元画像データを波長成分毎に得たコンピュータ３７は、これらに演算を施すことで、観察者より指定されているセクショニング分解能の二次元画像データを波長成分毎に作成し観察画像としてモニタ３８に表示させる。なお、演算は、セクショニング分解能の高い二次元画像データをＤａ、セクショニング分解能の低い二次元画像データをＤｂとすると、Ｄ＝Ｄｂα＋（１−α）Ｄａである（αは重み係数であり、−１≦α≦＋１）。
このようにして観察者は、標本３を波長成分毎に所望のセクショニング分解能にて共焦点観察することが可能となる。
なお、観察者によるセクショニング分解能の変更は、標本３の二次元画像データの取得前後に関わらず、当該コンピュータ３８に設けられている不図示の入力部を介して行うことができる。
【００２３】
以上の構成によって本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、セクショニング分解能を変更することが可能であり、標本３の画像取得後において所望のセクショニング分解能の共焦点画像を得ることができる。そしてまた、上述のように使用する対物レンズ１３に最適な開口径のピンホール２０ａを第１ピンホールターレット２０から選択して用いることで高精度なセクショニングを行うことが可能となり、これによって得られた正確な二次元画像データを上述の演算に用いることで、所望のセクショニング分解能の正確な共焦点画像を得ることができる。
【００２４】
さらに本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、第２ピンホールターレット２２のピンホール２２ａを切り替えることで上記セクショニング分解能の低い二次元画像データの分解能を変更することができ、これを上述の演算に用いることで所望のセクショニング分解能の共焦点画像の明るさを変更することが可能となる。例えば、本実施形態においては第２ピンホールターレット２２のピンホール２２ａを大径のものに切り替えることで、所望のセクショニング分解能であってより明るい共焦点画像を得ることが可能となる。
【００２５】
以上、本実施形態によれば、対物レンズ１３を切り替えても精度良くセクショニングを行うことが可能で、標本３の画像取得後において所望のセクショニング分解能の正確な共焦点画像を得ることが可能な共焦点顕微鏡１を実現することができる。また本実施形態では、上述した従来の共焦点顕微鏡における光分離手段に比して、簡便な構成の第１ピンホールターレット２０及び第２ピンホールターレット２２を備えた構成であるため、製造の容易化も実現することができる。
【００２６】
なお、本実施形態における第１ピンホールターレット２０の構成は上述のものに限られない。例えば、対物レンズ１３の倍率と開口数に基づいて定められた最適な開口径のピンホールを、本共焦点顕微鏡１で切り替えて用いられる複数の対物レンズ１３の分だけ備えた構成とすることもでき、これによって本発明の効果を最大限に発揮することが可能となる。また例えば、第１ピンホールターレット２０に代えて開口径が可変のピンホール部材を対物レンズ１３の焦点位置と共役な位置に備えた構成とすることもでき、これによって本発明と同様の効果を奏することができる。なお、このことは第２ピンホールターレット２２についても同様である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】（ａ）は本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す概略構成図であり、（ｂ）は第１ピンホールターレット及び第２ピンホールターレットの構成を示す図である。
【符号の説明】
【００２８】
１      共焦点顕微鏡
２      倒立顕微鏡
３      標本
４      共焦点観察システム
５      レーザユニット
６，７  光検出ユニット
８      コントローラ
１３    対物レンズ
１６    ガルバノスキャナ
１９    ハーフミラー
２０    第１ピンホールターレット
２２    第２ピンホールターレット
３７    コンピュータ
【図１】
2009192721.tif 000003