(57)【要約】【課題】皮膚感作性の検定方法を提供すること。【解決手段】ペプチド又はたんぱく質と被験物質を混合し一定時間反応させた後、混合物を核磁気共鳴スペクトル（NMR）法を用いて、それらの相互作用の有無を測定することを特徴とする被験物質の皮膚感作性の検定方法。例えば、ペプチド又はたんぱく質が、システイン残基を含むペプチドである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド又はたんぱく質と被験物質を混合し一定時間反応させた後、混合物を核磁気共鳴スペクトル（NMR）法を用いて、それらの相互作用の有無を測定することを特徴とする被験物質の皮膚感作性の検定方法。
【請求項２】
ペプチド又はたんぱく質が、システイン残基を含むペプチドである請求項１に記載の検定方法。
【請求項３】
核磁気共鳴スペクトル（NMR）法が、拡散NMR法（Diffusion Ordered Spectroscopy :DOSY）である請求項１又は２に記載の検定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質とペプチドとの相互作用を検出することを特徴とする被験物質の皮膚感作性の検定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、被験物質の皮膚感作性を検出する目的においてはMaximization試験、Buehler試験、Local Lymph Node Assay（LLNA）等が実施されている。Maximization試験においてはモルモットに被験物質をFreund's Complete Adjuvantと混合して皮内投与し、1週間後に被験物質を経皮適用し、さらに2週間後に被験物質を経皮適用して紅斑、浮腫等の皮膚反応を観察する。Buehler試験においては被験物質をモルモットに週１〜3回、合計３〜１０回経皮適用した後、被験物質を経皮適用して紅斑、浮腫等の皮膚反応を観察する。LLNAでは、被験物質を経皮適用した後、約1週間後にトリチウム標識したチミジンを投与してリンパ球の増殖を調べる。
これら生物学的な試験法に代わる皮膚感作性物質の検出手法として、システイン或いはリジン残基を含有するペプチド又はたんぱく質との反応を質量分析（MS）又はクロマトグラフ法とMSを結合したハイフン化技術を使用した検出方法が、Katoら、山下ら、岡本ら、穂谷らにより報告されている（特許文献１〜５及び非特許文献１）また、皮膚感作性の検定方法ではないが、アレルギー性喘息を誘発する気道感作物質の検出方法としてリジン残基を含有するペプチドと反応させて反応生成物を高速液体クロマトグラフ（HPLC）で分析する方法がUrban Wassらにより報告されている（非特許文献２）。
さらに、ペプチドの代わりにヒト血清アルブミンを用いて反応生成物をHPLCで分析して、被験物質の気道感作性を検出する方法をDorothy L. Gauggelらが報告している（非特許文献３）。
【特許文献１】特開２００３−１４７６１
【特許文献２】特開２００３−１０１５４
【特許文献３】特開２００３−１４７６２
【特許文献４】特願２００７−０２７７０１
【特許文献５】特開２００７−１８３２０８
【非特許文献１】The Journal of Toxicological Sciences, 2003; 28:19-24、
【非特許文献２】Scand. J. Work Environ. Health 1990; 16:208-214）。
【非特許文献３】J. Applied Toxicol. 1993; 13: 307-313
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記のMaximization試験、Buehler試験及びLLNAはいずれも被験物質を動物に投与し、その免疫応答を検出するものである。そのため、動物を飼育する施設が必要であり、また、最短でも約1週間の期間が必要なため多数のサンプルを検討することに不適であった。また、動物愛護上も代替法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
このような状況下、本発明者らは、低分子の被験物質とペプチドやたんぱく質などの相互作用のうち、従来の技術では検出が困難な水素結合、π-π相互作用やイオン結合などの弱い相互作用を検出することが出来れば、広く被験物質の皮膚感作性を評価できる可能性があることに着目し、例えば、弱い相互作用を拡散係数の違いで検出できる核磁気共鳴スペクトル（NMR）法である拡散NMR法（Diffusion Ordered Spectroscopy:DOSY）を用いて、被験物質とペプチド等が相互作用した複合体に相当する拡散係数を与えるかどうかについて検討した。その結果、皮膚感作性を示す被検物質は、ある種のペプチドと相互作用し、複合体としての拡散係数を与えること、さらには、皮膚感作性を示さない被験物質では、複合体を形成しないことから、皮膚感作性の有無と複合体形成能の間には相関関係があることを見出し、本発明に至った。
すなわち、本発明はペプチド又はたんぱく質と被験物質を混合し一定時間反応させた後、混合物を核磁気共鳴スペクトル（NMR）法を用いて、中でも特に、拡散NMR法（Diffusion Ordered Spectroscopy：DOSY）を用いて、それらの相互作用の有無を測定することを特徴とする被験物質の皮膚感作性の検定方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の皮膚感作性物質の検出方法では、被験物質とペプチドやたんぱく質と共有結合を形成しない場合にも、その皮膚感作性の有無が判断できる。ので非常に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明におけるペプチド又はたんぱく質としてはシステイン又はリジン残基を1個以上含むものが挙げられる。
本発明の測定においては、被験物質又はペプチドやたんぱく質を通常、溶媒に溶かして用いる。
被験物質の溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、などの有機溶媒、又はこれらの混合溶媒が用いられる。
ペプチド又はたんぱく質の溶媒としては水又は酢酸系もしくはリン酸系などの緩衝液又はこれらと有機溶媒との混合溶媒などがあげられる。
なお、これらの溶媒は、ＮＭＲ測定を容易ならしめるため、適宜水素原子が重水素置換された重水素化物が用いられる。
【０００７】
ペプチド又はたんぱく質及び被験物質の試料濃度としては、例えば、０．０１μMから１M程度の濃度をあげることができる。より好ましくは、例えば、１mMから5mMの範囲をあげることができる。
【０００８】
また、混合（反応）温度としては、４℃から６０℃程度の範囲をあげることができる。より好ましくは、例えば２５から３０℃付近をあげることができる。なお、溶解に用いる溶媒及び試料濃度はペプチド又はたんぱく質及び被験物質の性質に応じて適宜選ぶことができる。
【０００９】
本発明方法において、まず上記のようなペプチド又はたんぱく質を溶解した溶液と被験物質を溶解した溶液を混合して例えば、約３７℃の温度で一定時間反応させ試料溶液を調製する。
このように調製された溶液を分析し、被験物質及びペプチド又はたんぱく質の拡散係数が変化するかどうかを観測する。
【００１０】
試料溶液を分析する方法としては、核磁気共鳴スペクトル（NMR）法、特に拡散ＮＭＲ法（DOSY  Diffusion Ordered Spectroscopy）を用いることができる。本発明方法では、複数成分からなる試料であってもそれらが各成分のＮＭＲスペクトルが異なる場合は、試料溶液をそのまま拡散ＮＭＲ法による分析に供してもよい。
【００１１】
このような測定に使用可能な市販の装置としては、パルス磁場勾配（ＰＦＧ）プローブを装備した日本電子社製、Bruker Daltonics Inc社製、Varian社製のものなどが挙げられる。
【００１２】
試料溶液を上記のようにして分析し、それぞれ被験物質、ペプチド又はたんぱく質単独の溶液のＤＯＳＹスペクトルを比較し、両者に認められない拡散係数をもつ分子を確認することにより、被験物質とペプチド又はたんぱく質から生成した複合体を検出することができる。
該分析により、共有結合などの化学反応を介した相互作用だけでなく、水素結合やイオン結合などの弱い相互作用による複合体についても拡散係数の違いにより測定が可能となり、ＤＯＳＹスペクトルから得られる情報に基づいて、複合体構造等を解析し、相互作用の有無を特定することができる。
【００１３】
本発明方法によって得られるＤＯＳＹスペクトルにおいては、複合体に相当する拡散係数の違いが明瞭に認められるので、その解析が容易であり、従来法では検出が難しかった弱い相互作用によっても複合体が生成したということを確認する上できわめて有利である。
【実施例】
【００１４】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。測定条件は以下の通りである。
装置：バリアン（Varian）社製  INOVA 500型（500MHz）  核磁気共鳴測定装置
パルス系列：bppste
グラジエント長：２ms
拡散時間（Diffusion Delay）：50 ms
測定時間：２時間、拡散パラメータ：δ=1.2ms, Δ=300ms
磁場勾配強度：〜0.32T/m、DOSY 処理アルゴリズム：V NMR  6.3
測定温度：  ２７℃
反応液組成：D2O/CD3OD（1:1）  
グラジエント強度は、40ガウスを20回に分けて変化させた。
実施例にペプチドと被験物質を反応させ、DOSY法にて両者の複合体を検出した例を記載した。
【００１５】
［実施例１］（ペプチドと被験物質との反応液をDOSY法で検出）
被験物質として、2,4-ジニトロ-1-クロロベンゼン(DNCB)を用いた。
被験物質の8ｍMの重水素化メタノール溶液と、重水（D2O）に溶解した8ｍMのグルタチオン溶液を容量比１：１の割合にて混合し、３７℃で１時間インキュベート後、反応液をDOSY法にて分析した。NMRはバリアン社製 IONVA 500型核磁気共鳴分光装置をもちいた。
【００１６】
［比較例１］
被験物質として、サリチル酸メチル（MS）を用いた以外は、実施例１と同様に実施した。
DOSY法で分析したところ、サリチル酸メチルについてグルタチオンとの化学反応を介しない複合体の形成による新たな拡散係数を有する分子は観測されなかった。
なお、サリチル酸メチルには、皮膚感作性は認められていない。
【００１７】
被験物質とグルタチオンとの反応液をDOSY法で分析した結果を図１に示す。
比較例を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】DNCBとグルタチオン（GSH）との反応液（重水/重メタノール溶液）のDOSYスペクトルである。図の7.8から8.8ppm付近に観測されるDNCB由来のシグナルの一部の拡散係数が元のDNCBのそれに比べて大きくなっていることがわかる。このことから、DNCBについてグルタチオンとで複合体の形成（拡散係数が減少している分子の存在から確認できる）による新たなシグナルが検出され、このシグナルからグルタチオンと被験物質が相互作用して複合体を形成していることがわかる。
【図２】サリチル酸メチル（MS）とグルタチオン（GSH）との反応液のDOSYスペクトルである。サリチル酸メチルとグルタチオンのいずれに由来するシグナルについても拡散係数の変化が認められなかったので、複合体を形成されていないことがわかる。
【図１】
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【図２】
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