(57)【要約】【課題】複数種類の遺伝子多型を識別する場合において、従来よりも作業工程が少なく、簡便かつ低コストに、遺伝子多型を識別し得る方法の提供。【解決手段】ゲノム試料中のゲノムの、複数種類の遺伝子多型を識別する方法であって、（ａ）各遺伝子多型部位を含む複数種類のゲノム断片を、一のＰＣＲにより増幅する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）により得られたゲノム断片を用いて、複数種類の遺伝子多型をそれぞれ識別する工程と、を有することを特徴とする遺伝子多型の識別方法、前記工程（ｂ）における遺伝子多型の識別が、遺伝子多型のいずれかのアレルを特異的に認識するプライマー又はプローブを用いて行われる遺伝子多型の識別方法、及び、前記遺伝子多型が一塩基多型である遺伝子多型の識別方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム試料中のゲノムの、複数種類の遺伝子多型を識別する方法であって、
（ａ）  各遺伝子多型部位を含む複数種類のゲノム断片を、一のＰＣＲにより増幅する工程と、
（ｂ）  前記工程（ａ）により得られたゲノム断片を用いて、複数種類の遺伝子多型をそれぞれ識別する工程と、
を有することを特徴とする遺伝子多型の識別方法。
【請求項２】
前記工程（ｂ）における遺伝子多型の識別が、遺伝子多型のいずれかのアレルを特異的に認識するプライマー又はプローブを用いて行われることを特徴とする請求項１記載の遺伝子多型の識別方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）が、遺伝子多型の種類ごとに、
（ｂ１）  前記工程（ａ）により得られたゲノム断片に、遺伝子多型のいずれかのアレルを特異的に認識するプライマーを添加し、前記ゲノム断片を鋳型として、前記プライマーの伸長反応を行う工程と、
（ｂ２）  前記工程（ｂ１）において得られた伸長産物を検出することにより、遺伝子多型を識別する工程と、
を有することを特徴とする請求項１記載の遺伝子多型の識別方法。
【請求項４】
前記プライマーが蛍光標識されたプライマーであり、前記工程（ｂ２）における伸長産物の検出を、蛍光相関分光法を用いて行うことを特徴とする請求項３記載の遺伝子多型の識別方法。
【請求項５】
前記遺伝子多型が一塩基多型である請求項１〜４のいずれか記載の遺伝子多型の識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来よりも作業工程が少なく、簡便かつ低コストに、複数種類の遺伝子多型を識別するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子操作技術や遺伝子組換え技術等の進歩に伴い、核酸分析による遺伝子検査は、医療、研究、産業への応用に広く用いられている。このような検査は試料中の標的塩基配列を有するＤＮＡの存在の検出を行うものであり、疾患の診断、治療だけでなく、食品検査等の様々な分野において応用されている。特に、一塩基多型（ＳＮＰ）をはじめとする遺伝子多型は、学術研究においてのみならず、実際の臨床検査においても、遺伝子多型解析が広く行われている。このため、高精度かつ迅速に遺伝子多型を識別し得る方法の開発が盛んである。
【０００３】
遺伝子多型を識別する方法として、プローブやプライマー等の人工合成した短鎖のオリゴヌクレオチドを用いて核酸の塩基配列を調べる方法が多数報告されている。例えば、あるＳＮＰにおいてあるアレルに特異的に結合し得るプライマーを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）等の伸長反応を行い、伸長産物の有無により遺伝子多型を識別する方法や、多型のうちの特定のアレルに特異的に結合し得るプローブとのハイブリダイゼーションの有無により遺伝子多型を識別する方法等が汎用されている。
【０００４】
遺伝子多型を検出する対象となるゲノム試料は、臨床検査における検体等のように、微量である場合が多い。このため、通常は、予めＰＣＲ等により、識別対象である遺伝子多型（標的多型）の多型部位を含むゲノム断片を増幅し、この増幅されたゲノム断片を用いて標的多型の識別が行われている。
【０００５】
その他、高感度に遺伝子多型を識別する方法として、例えば、（１）ポリヌクレオチド中に含まれ得る多型配列に結合し得る１種類以上のプローブと前記ポリヌクレオチドとを混合する工程と、共焦点顕微鏡を用いて、微小空間内に存在する前記ポリヌクレオチドを検出する工程と、蛍光相関分光法を用いて検出結果を解析して、前記ポリヌクレオチドに結合したプローブの種類を決定することにより、前記多型部位の型を決定する工程とを具備する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。  
【特許文献１】特開２００１−２６９１９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
複数種類の遺伝子多型を識別する場合には、遺伝子多型の種類ごとに、それぞれの遺伝子多型部位を有するゲノム断片を別個に増幅した後、得られたゲノム断片を用いて遺伝子多型を識別することが行われている。つまり、遺伝子多型部位を有するゲノム断片の種類の数だけ、増幅反応を行う必要があるため、識別すべき遺伝子多型の種類が多くなるほど、作業工程数が多くなり時間がかかるという問題があった。
一方、上記（１）の方法では、一分子の大きさを識別しており、高感度に遺伝子多型を識別することができる。このため、遺伝子多型の種類によっては、遺伝子多型を有するゲノム断片を増幅することなく、ゲノム試料をそのまま用いて遺伝子多型を検出することも可能である。しかしながら、ヒトゲノムは非常に複雑な構造を有しているため、ゲノム試料をそのまま用いた場合には、遺伝子多型の識別の精度が損なわれる場合が多いという問題がある。
【０００７】
本発明は、複数種類の遺伝子多型を識別する場合において、従来よりも作業工程が少なく、簡便かつ低コストに、遺伝子多型を識別し得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、遺伝子多型の識別に用いるために遺伝子多型部位を有するゲノム断片を増幅する場合に、従来のように遺伝子多型ごとにゲノム断片を増幅するのではなく、各遺伝子多型部位を含む複数種類のゲノム断片を、マルチプレックスＰＣＲを行って同時に増幅することにより、作業工程を顕著に低減し得ることを見出し、本発明を完成させた。  
【０００９】
すなわち、本発明は、ゲノム試料中のゲノムの、複数種類の遺伝子多型を識別する方法であって、（ａ）各遺伝子多型部位を含む複数種類のゲノム断片を、一のＰＣＲにより増幅する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）により得られたゲノム断片を用いて、複数種類の遺伝子多型をそれぞれ識別する工程と、を有することを特徴とする遺伝子多型の識別方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ｂ）における遺伝子多型の識別が、遺伝子多型のいずれかのアレルを特異的に認識するプライマー又はプローブを用いて行われることを特徴とする遺伝子多型の識別方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ｂ）が、遺伝子多型の種類ごとに、（ｂ１）前記工程（ａ）により得られたゲノム断片に、遺伝子多型のいずれかのアレルを特異的に認識するプライマーを添加し、前記ゲノム断片を鋳型として、前記プライマーの伸長反応を行う工程と、（ｂ２）前記工程（ｂ１）において得られた伸長産物を検出することにより、遺伝子多型を識別する工程と、を有することを特徴とする遺伝子多型の識別方法を提供するものである。
また、本発明は、前記プライマーが蛍光標識されたプライマーであり、前記工程（ｂ２）における伸長産物の検出を、蛍光相関分光法を用いて行うことを特徴とする遺伝子多型の識別方法を提供するものである。
また、本発明は、前記遺伝子多型が一塩基多型である遺伝子多型の識別方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の遺伝子多型の識別方法を用いることにより、従来遺伝子多型ごとに別個に行っていた遺伝子多型部位を含むゲノム断片の増幅を、一度の増幅反応により行うことができ、作業工程が低減されるため、複数種類の標的多型を、迅速かつ簡便に識別することができる。また、必要な増幅反応の回数を減少することにより、ゲノム断片の増幅反応に用いられるＤＮＡポリメラーゼ等の高価な試薬の使用量を抑えることができるため、経済的にも好ましい。特に、多検体を処理することが要求される臨床検査において、本発明の遺伝子多型の識別方法を用いることにより、検査全体の低コスト化と作業効率の向上を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明においてゲノム試料とは、遺伝子多型を識別すべきゲノムが含まれている試料であれば、特に限定されるものではない。該ゲノム試料は、動物等から採取した生体試料であってもよく、培養細胞溶液等から調製した試料であってもよく、生体試料等から抽出・精製したゲノム溶液でもよい。特に臨床検査等に用いられるヒト由来の生体試料や、ヒト由来の生体試料から抽出・精製したゲノム溶液であることが好ましい。ヒト由来の生体試料として、例えば、血液、骨髄液、リンパ液、尿、喀痰、腹水、滲出液、羊膜液、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、膀胱洗浄液、膵液、唾液、精液、胆汁、又は大便等がある。また、該生体試料は、生物から採取された状態の試料であってもよく、調製した試料であってもよい。該調製の方法は、該生体試料中に含有されているゲノムを損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、通常、生体試料に対してなされている調製方法を行うことができる。その他、生体試料から抽出・精製したゲノム溶液をＰＣＲ等により増幅処理したものでもよい。
【００１２】
本発明の遺伝子多型の識別方法の対象となる遺伝子多型は、ある生物種の集団内で、個体ごとに遺伝子の塩基配列が異なるものであれば、特に限定されるものではない。該遺伝子多型として、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト等がある。本発明の遺伝子多型の識別方法の対象となる遺伝子多型として、特にＳＮＰであることが好ましい。ＳＮＰは、疾患に対する罹り易さや、薬物代謝能等の個体差の主要因と考えられており、臨床検査等においても広く解析が行われているためである。
【００１３】
本発明において多型部位とは、各遺伝子多型において、ゲノムの塩基配列が異なる部位を意味する。例えば、ある遺伝子多型において、多型Ａ１における塩基配列がｇｇｇａａａであり、多型Ａ２における塩基配列がｇｇｃａａａである場合に、多型Ａ１においてｇであり、多型Ａ２においてｃである５’側から３番目の塩基が多型部位である。また、本発明において、遺伝子多型を識別するとは、あるゲノム試料に含有されているゲノムの多型部位が、いずれの多型と同じ塩基配列を有しているかを識別することを意味する。したがって、本発明の遺伝子多型の識別方法の対象となる遺伝子多型は、識別が可能である程度に塩基配列が明らかになっているものである。
【００１４】
本発明において遺伝子多型部位を含むゲノム断片とは、遺伝子多型部位及びその近傍の塩基配列と同じ塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡであり、これは、ゲノム試料中のゲノムを鋳型とし、遺伝子多型部位を挟むようにして設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、増幅することができる。
【００１５】
本発明の遺伝子多型の識別方法は、ゲノム試料中のゲノムの、複数種類の遺伝子多型を識別する方法であって、（ａ）各遺伝子多型部位を含む複数種類のゲノム断片を、一のＰＣＲにより増幅する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）により得られたゲノム断片を用いて、複数種類の遺伝子多型をそれぞれ識別する工程と、を有することを特徴とする。以下、工程ごとに説明する。
【００１６】
まず、工程（ａ）として、各遺伝子多型部位を含む複数種類のゲノム断片を、一のＰＣＲにより増幅する。すなわち、各遺伝子多型部位を含むゲノム断片をそれぞれＰＣＲ増幅するために必要な全てのプライマーを、ゲノム試料とともに一のＰＣＲ反応溶液に添加し、マルチプレックスＰＣＲを行うことにより、複数種類のゲノム断片を同時に増幅する。ゲノム断片の増幅をマルチプレックスＰＣＲにより行うため、遺伝子多型の種類ごとにＰＣＲを行っていた従来法よりも迅速かつ低コストで、複数種類の遺伝子多型を検出する場合に必要な複数種類のゲノム断片を増幅することができる。
【００１７】
ゲノム断片は、遺伝子多型部位を含む二本鎖ＤＮＡであれば、特に限定されるものではなく、ゲノム断片の塩基対長や、ゲノム断片中の遺伝子多型部位の位置等は、工程（ｂ）において行われる遺伝子多型の識別方法の種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００１８】
ゲノム断片を増幅するためのプライマーは、遺伝子多型部位及びその近傍の塩基配列に応じて、常法により設計することができる。例えば、公知のゲノム配列データやＳＮＰデータと、汎用されているプライマー設計ツールを用いて、簡便に設計することができる。公知のゲノム配列データは、通常、国際的な塩基配列データベースであるＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）等において入手することができる。また、公知のＳＮＰデータは、例えば、東大医科学研究所の整備した日本人のＳＮＰのデータベースＪＳＮＰ（ｈｔｔｐ：//ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ/ｉｎｄｅｘ＿ｊａ.ｈｔｍｌ）等のデータベースから入手することができる。該プライマー設計ツールとして、例えば、Ｗｅｂ上で利用可能なＰｒｉｍｅｒ３（Ｒｏｚｅｎ, Ｓ., Ｈ.Ｊ. Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ、１９９６年、ｈｔｔｐ: //ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ.ｗｉ.ｍｉｔ.ｅｄｕ/ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ/ｏｔｈｅｒ/ｐｒｉｍｅｒ３. ｈｔｍｌ）や、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（ＤＮＡ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）等がある。
【００１９】
特に、特開２００６−３２０２１７号に開示されている方法により設計されたプライマーであることが好ましい。具体的には、プライマーの鋳型とハイブリダイズする領域を３０塩基長以上、Ｔｍ値を７０〜１００℃として設計されたプライマーである。このように設計されたプライマーは、アニーリング効率すなわちハイブリダイゼーション効率をほぼ均一にすることができるため、マルチプレックスＰＣＲのためのプライマーとして特に好適であるためである。
【００２０】
このようにして設計したプライマーは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても合成することができる。例えば、オリゴ合成メーカーに合成をされ依頼してもよく、市販の合成機を用いて独自に合成してもよい。
【００２１】
ゲノム断片を増幅するためのマルチプレックスＰＣＲの反応条件は、特に限定されるものではなく、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類やプライマーのＴｍ値等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、上記特開２００６−３２０２１７号に開示されている方法により設計されたプライマーを用いる場合には、アニーリング時間と伸長反応時間の和を３分間以上とすることが好ましく、アニーリング温度と伸長温度を一致させ、アニーリングと伸長反応を同時に進行させるシャトルＰＣＲを行うことがより好ましい。
【００２２】
ゲノム断片を増幅するためのＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、バッファー等の試薬は、特に限定されるものではなく、通常ＰＣＲを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。
【００２３】
次に、工程（ｂ）として、工程（ａ）により得られたゲノム断片を用いて、複数種類の遺伝子多型をそれぞれ識別する。遺伝子多型の識別方法は、特に限定されるものではなく、遺伝子多型解析において通常用いられている方法により行うことができる。例えば、遺伝子多型のいずれかのアレルを特異的に認識するプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られた場合には該アレルの多型部位と同じ塩基配列を有する多型であり、ＰＣＲ産物が得られなかった場合には該アレルの多型部位とは異なる塩基配列を有する多型であると識別することができる。また、遺伝子多型のいずれかのアレルを特異的に認識するプローブとハイブリダイズさせ、会合体が得られた場合には該アレルの多型部位と同じ塩基配列を有する多型であり、会合体が得られなかった場合には該アレルの多型部位とは異なる塩基配列を有する多型であると識別することができる。
【００２４】
工程（ｂ）においては、ＳＳＰＣＥ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）法（例えば、Current Pharmaceutical Biotechnology、２００３年、第４巻、４７７〜４８４ページ参照。）により遺伝子多型を識別することが好ましい。ＳＳＰＣＥ法では、遺伝子多型のいずれかのアレルを特異的に認識するプライマーのみを用いて伸長反応を行うため、アレル非特異的なリバースプライマーを要するＰＣＲよりも、ＳＮＰをより精度よく識別することができる。
【００２５】
具体的には、遺伝子多型の種類ごとに、（ｂ１）前記工程（ａ）により得られたゲノム断片に、遺伝子多型のいずれかのアレルを特異的に認識するプライマーを添加し、前記ゲノム断片を鋳型として、前記プライマーの伸長反応を行う工程と、（ｂ２）前記工程（ｂ１）において得られた伸長産物を検出することにより、遺伝子多型を識別する工程とを有することが好ましい。ゲノム試料中のゲノムの遺伝子多型が、該プライマーが特異的に認識するアレルの多型部位と相同的な塩基配列を有する多型である場合には、工程（ｂ１）において伸長反応が進行するため、工程（ｂ２）において伸長産物が検出されるが、該プライマーが特異的に認識するアレルの多型部位と異なる塩基配列を有する多型である場合には、工程（ｂ２）において伸長産物が検出されない。このように、伸長産物の検出の有無により、遺伝子多型を識別することができる。
【００２６】
工程（ｂ１）において用いられる遺伝子多型のいずれかのアレルを特異的に認識するプライマーは、上記工程（ａ）において用いられるプライマーと同様に、遺伝子多型部位及びその近傍の塩基配列に応じて、常法により設計することができる。また、多型部位を認識するための領域以外に、付加的な塩基配列を有していてもよい。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列や、核酸の標識に供される配列等がある。その他、該プライマーは、工程（ｂ２）における伸長産物の検出を容易にするために、標識されたものであってもよい。該標識をするための物質は、核酸の標識に用いることができるものであれば、特に限定されるものではなく、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン等がある。
【００２７】
工程（ｂ１）におけるプライマーの伸長反応は、ＰＣＲと同様にポリメラーゼ活性を有する酵素を用いることにより、行うことができる。該伸長反応に用いられるＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、バッファー等の試薬は、特に限定されるものではなく、通常ＰＣＲを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。
【００２８】
工程（ｂ２）における伸長産物の検出は、伸長反応が進行する前のプライマーと、伸長反応が進行した結果得られる伸長産物を、区別して検出し得る方法であれば、特に限定されるものではない。例えば、塩基長の差異を利用して、電気泳動法やカラムクロマトグラフィー法により分離して検出してもよく、ＴＯＦ−ＭＳ等の質量分析法により検出してもよい。
【００２９】
特に、工程（ｂ１）において用いるプライマーが蛍光標識されたプライマーであり、前記工程（ｂ２）における伸長産物の検出を、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、以下、ＦＣＳという。）を用いて行うことが好ましい。ＦＣＳは、蛍光物質一分子当たりの蛍光強度のゆらぎを解析し、一分子の相対的な大きさを解析することが可能である（例えば、特開２００１−２７２４０４号公報参照。）。すなわち、ＦＣＳにより、溶液中の、伸長されていない蛍光標識済みプライマーと、伸長反応が進行した蛍光標識済みプライマー（伸長産物）の割合を測定することができる。このため、ＰＣＲよりも伸長産物量が少なくなる傾向があるＳＳＰＣＥ法においても、ＦＣＳを用いることにより、伸長産物量を感度よく簡便に検出することが可能となる。
【００３０】
その他、本発明の遺伝子多型の識別方法に用いられるプライマーや酵素等をキット化することもできる。例えば、各遺伝子多型部位を含む複数種類のゲノム断片をＰＣＲ増幅するために用いられるプライマー群を一のキットとすることができる。また、該キットには、ＰＣＲ増幅のためのＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、バッファー等の試薬を含めることが好ましい。さらに、各遺伝子多型の識別に用いられるプライマーやプローブを含むキットとしてもよい。このようなキットを用いることにより、迅速かつ簡便に複数種類の遺伝子多型を識別することが可能となる。
【実施例】
【００３１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、用いたＳＮＰの塩基配列は、東大医科学研究所の整備した日本人のＳＮＰのデータベースＪＳＮＰ（ｈｔｔｐ：//ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ/ｉｎｄｅｘ＿ｊａ.ｈｔｍｌ）から得た。
【００３２】
財団法人ヒューマンサイエンス振興財団より購入したゲノム１６サンプルに対して、１０種類の遺伝子多型ＳＮＰ０１（Ｃ／Ｔ）、ＳＮＰ０２（Ｃ／Ａ）、ＳＮＰ０３（Ｔ／Ｃ）、ＳＮＰ０４（Ｇ／Ｔ）、ＳＮＰ０５（Ｃ／Ｔ）、ＳＮＰ０６（Ｃ／Ｔ）、ＳＮＰ０７（Ｃ／Ａ）、ＳＮＰ０８（Ｔ／Ｃ）、ＳＮＰ０９（Ｇ／Ａ）、ＳＮＰ１０（Ｇ／Ａ）の識別を試みた。それぞれのアクセション番号を、表１に示す。
【００３３】
【表１】
2009089687.tif 000002
【００３４】
まず、特開２００６−３２０２１７号に開示されている方法に基づき、ＳＮＰ０１〜１０の各遺伝子多型の多型部位を含むゲノム断片をＰＣＲ増幅するためのプライマーをそれぞれ作製した。具体的には、塩基長が３０〜４５塩基、Ｔｍ値が７０〜１００℃（至適７５℃）となるように、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰを用いて設計した。得られたプライマーを表２に示す。なお、表２中、「Ｆ」と「Ｒ」は、各多型部位を含むゲノム断片をＰＣＲ増幅するために用いられるフォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）を、それぞれ意味する。
【００３５】
【表２】
2009089687.tif 000003
【００３６】
一の反応溶液に表２記載のプライマーの全てを添加して、マルチプレックスＰＣＲを行うことにより、１６のゲノムサンプルそれぞれから、ＳＮＰ０１〜１０の多型部位を含む１０種類のゲノム断片を増幅した。
具体的には、１０μＬの２×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ II  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に対して、５ｎｇのゲノムサンプルと、表２記載の全種類のプライマーを最終濃度が０．０８μＭとなるようにそれぞれ添加し、２０μＬの反応溶液を調製した。該反応溶液を、９４℃で２分間処理した後、９４℃で３０秒間、６８℃で６分間の熱サイクルを４０サイクル行うことにより、マルチプレックスＰＣＲを行い、ゲノム断片溶液（ＰＣＲ増幅後の反応溶液）を得た。その後、得られたゲノム断片溶液からそれぞれ１μＬを回収して、電気泳動法により、１０種類のゲノム断片が増幅されたか否かを確認した。この結果、得られた１６のゲノム断片溶液のいずれにおいても、１０種類のゲノム断片が増幅されていた。図１に、１６のうちの１つのゲノム断片溶液を電気泳動で確認したバンドパターンを示す。図１（ａ）はアガロースゲル電気泳動像であり、図中「１」は塩基対長マーカーを、「２」はゲノム断片溶液を、それぞれ泳動したものである。図１（ｂ）はゲノム断片溶液を２１００ＢＩＯＡＮＡＬＹＺＥＲ（Ａｇｉｌｎｅｔ社製）で確認したバンドパターンを、縦軸をバンドの蛍光強度（ＦＵ）、横軸を泳動時間（秒）として示した図である。矢印アがＳＮＰ０１、矢印イがＳＮＰ０２、矢印ウがＳＮＰ０３、矢印エがＳＮＰ０４、矢印オがＳＮＰ０５、矢印カがＳＮＰ０６、矢印キがＳＮＰ０７、矢印クがＳＮＰ０８、矢印ケがＳＮＰ０９、矢印コがＳＮＰ１０のバンドである。
【００３７】
次に、ＳＳＰＣＥ法に基づき、マルチプレックスＰＣＲにより得られたゲノム断片に、遺伝子多型のいずれかのアレルを特異的に認識するプライマーを添加し、該ゲノム断片を鋳型として、該プライマーの伸長反応を行った。
まず、ＳＮＰ０１〜１０のいずれかのアレルを特異的に認識するプライマーをＶｉｓｕａｌ ＯＭＰを用いて設計して作製した後、５’末端を蛍光物質（ＴＡＭＲＡ又はＣｙ５）でそれぞれ修飾して標識した。得られたプライマーを表３に示す。表中、ＳＮＰ番号の後ろのＣ、Ａ、Ｔ、Ｇは、各プライマーが特異的に認識するアレルの多型部位の塩基を示している。例えば、「ＳＮＰ０１Ｃ」とは、ＳＮＰ０１の多型のうち、多型部位が「Ｇ」である塩基配列を有するゲノム断片を特異的に認識し得るプライマーである。
【００３８】
【表３】
2009089687.tif 000004
【００３９】
次に、得られた１６のゲノム断片溶液のそれぞれに対して、増幅されたゲノム断片を鋳型として、各ＳＮＰを検出する２種類のプライマーにより伸長反応を行った。なお、「ＳＮＰを検出する２種類のプライマー」とは、例えば、ＳＮＰ０１の場合には、表３記載のＳＮＰ０１ＣプライマーとＳＮＰ０１Ｔプライマーをいう。
具体的には、２μＬの１０×Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に、２μＬの２５ｍＭ塩化マグネシウム溶液と、１ＵのＳｔｏｆｆｅｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と、１μＬのゲノム断片溶液を添加し、さらに、各ＳＮＰを検出する２種類のプライマーを最終濃度が０．０２μＭとなるようにそれぞれ添加して混合し、２０μＬの伸長反応溶液を調製した。該伸長反応溶液を、９５℃で２分間処理した後、９５℃で３０秒間、５５〜６６℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の熱サイクルを４０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間処理することにより、各プライマーの伸長反応を行った。
その後、伸長反応溶後の伸長反応溶液の７倍希釈溶液に対して、ＭＦ−１０ｓ（オリンパス社製）を用いてＦＣＳ測定を行った。該７倍希釈溶液に代えて純水を用いたものを、ネガティブコントロールとした。具体的には、５秒間の測定を３回行い、蛍光ゆらぎの自己相関関数を、２成分を仮定した近似式でフィッティングした。並進拡散時間の大きい分子種を伸長産物、並進拡散時間の小さい分子種を伸長されなかったプライマーとして、伸長産物の割合を測定し、３回測定の平均をプライマーの反応効率とした。
【００４０】
図２〜１１は、ＦＣＳ測定の結果得られた各プライマーの反応効率を、１のプライマーの反応効率をＸ軸とし、他方のプライマーの反応効率をＹ軸として、ＳＮＰごとに示した散布図である。図中、「×」はネガティブコントロールの結果であり、「◆」、「▲」、「◇」は、１６のゲノム断片溶液のいずれかの結果を示している。より詳細には、「◆」はＹ軸に記載したプローブで伸長産物が得られ、かつＸ軸に記載したプローブで伸長産物が得られなかったと判断されたサンプルを示し、「▲」はＸ軸に記載したプローブで伸長産物が得られ、かつＹ軸に記載したプローブで伸長産物が得られなかったと判断されたサンプルを示し、「◇」はＸ軸に記載したプローブとＹ軸に記載したプローブのいずれにおいても伸長産物が得られたサンプルを示す。なお、Ｘ及びＹ軸の「Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」は、伸長産物が得られた、すなわち、該プローブが特異的に認識するアレルがゲノム試料中に存在した、と判断した閾値をそれぞれ示している。
【００４１】
この結果、ＳＮＰ０３以外の９種類のＳＮＰにおいて、分離が確認できた。つまり、ゲノムサンプルの遺伝子多型は、「◆」のサンプルはＹ軸に記載したプローブが特異的に認識するアレルのホモ体であり、「▲」のサンプルはＸ軸に記載したプローブが特異的に認識するアレルのホモ体であり、「◇」のサンプルはＸ軸に記載したプローブが特異的に認識するアレルとＹ軸に記載したプローブが特異的に認識するアレルのヘテロ体であると識別することができた。したがって、これらの結果から、ゲノム試料中のゲノムをマルチプレックスＰＣＲにより増幅して得たゲノム断片を用いた場合であっても、遺伝子多型を識別し得ることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の遺伝子多型の識別方法を用いることにより、従来よりも作業工程が少なく、簡便かつ低コストに、遺伝子多型を識別し得るため、限られた時間と予算内で多検体を処理することが期待される医療機関等におけるＳＮＰタイピング等の分野において利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施例において、ゲノム断片溶液（マルチプレックスＰＣＲ増幅後の反応溶液）を電気泳動で確認したバンドパターンを示したものである。図１（ａ）はアガロースゲル電気泳動像であり、図中「１」は塩基対長マーカーを、「２」はゲノム断片溶液を、それぞれ泳動したものである。図１（ｂ）はゲノム断片溶液を２１００ＢＩＯＡＮＡＬＹＺＥＲで確認したバンドパターンを、縦軸をバンドの蛍光強度（ＦＵ）、横軸を泳動時間（秒）として示した図である。矢印アがＳＮＰ０１、矢印イがＳＮＰ０２、矢印ウがＳＮＰ０３、矢印エがＳＮＰ０４、矢印オがＳＮＰ０５、矢印カがＳＮＰ０６、矢印キがＳＮＰ０７、矢印クがＳＮＰ０８、矢印ケがＳＮＰ０９、矢印コがＳＮＰ１０のバンドである。
【図２】実施例において、ＳＮＰ０１Ｃプライマーの反応効率をＸ軸とし、ＳＮＰ０１Ｔプライマーの反応効率をＹ軸とした散布図である。
【図３】実施例において、ＳＮＰ０２Ｃプライマーの反応効率をＸ軸とし、ＳＮＰ０２Ａプライマーの反応効率をＹ軸とした散布図である。
【図４】実施例において、ＳＮＰ０３Ｔプライマーの反応効率をＸ軸とし、ＳＮＰ０３Ｃプライマーの反応効率をＹ軸とした散布図である。
【図５】実施例において、ＳＮＰ０４Ｇプライマーの反応効率をＸ軸とし、ＳＮＰ０４Ｔプライマーの反応効率をＹ軸とした散布図である。
【図６】実施例において、ＳＮＰ０５Ｃプライマーの反応効率をＸ軸とし、ＳＮＰ０５Ｔプライマーの反応効率をＹ軸とした散布図である。
【図７】実施例において、ＳＮＰ０６Ｃプライマーの反応効率をＸ軸とし、ＳＮＰ０６Ｔプライマーの反応効率をＹ軸とした散布図である。
【図８】実施例において、ＳＮＰ０７Ｇプライマーの反応効率をＸ軸とし、ＳＮＰ０７Ａプライマーの反応効率をＹ軸とした散布図である。
【図９】実施例において、ＳＮＰ０８Ｔプライマーの反応効率をＸ軸とし、ＳＮＰ０８Ｃプライマーの反応効率をＹ軸とした散布図である。
【図１０】実施例において、ＳＮＰ０９Ｇプライマーの反応効率をＸ軸とし、ＳＮＰ０９Ａプライマーの反応効率をＹ軸とした散布図である。
【図１１】実施例において、ＳＮＰ１０Ｇプライマーの反応効率をＸ軸とし、ＳＮＰ１０Ａプライマーの反応効率をＹ軸とした散布図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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