(57)【要約】【課題】ＭＣＡ  ４４−３Ａ６によって検出された抗原のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を決定すること【解決手段】ラビリンチン（Ｌａｂ）と命名されるタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子を単離し、そしてそのヌクレオチド配列を決定する。このタンパク質、またはこのタンパク質に由来するペプチドは、新規なクラスのガンを規定するために有用なマーカーである。これらのガンについての診断アッセイは、Ｌａｂに対する抗体、またはｌａｂ遺伝子もしくはそれからのフラグメントとハイブリダイズするヌクレオチドプローブを用いる。Ｌａｂ（またはｌａｂ）についての試験がポジティブな被験体におけるガンの再発を予防するか、またはガンの初期発生を予防するかのいずれかに有用なワクチンは、Ｌａｂに由来するタンパク質またはペプチドを使用する。【選択図】図１
2009165492.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載のｃＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以前に規定された組織学的クラスのガンに制限されないマーカーとして有用なエピトープ、ガン関連抗原を含む、タンパク質をコードする遺伝子およびそれからのペプチドに関する。抗原性ペプチドは、ガンの処置および予防のためのワクチンとして、ならびに新規な特異的モノクローナル抗体の調製のために有用である。アンチセンス分子は、薬学的組成物において有用であり、そして診断および処置のために有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ガン1は、世界中の男性および女性の死の主な原因である。米国だけで、毎年１００万を超える新たな症例が診断され、そして５０万を超える死亡が毎年報告されている（Ｌａｎｄｉｓら，１９９８）。歴史的に、腫瘍は、部分的には、腫瘍が生じた組織に基づいて分類および処置されている（例えば、乳ガン、結腸ガン、および肺ガンなど）。だが、例えば、肺ガンにおいて、これらの腫瘍が非常に不均質な群の新生物であることが十分に認識されている。これはまた、他の組織において生じた腫瘍についても事実である。部分的には、この不均質性のために、ヒトの腫瘍について用いられる、複雑かつ矛盾した分類スキームが存在する。ガンを処置するための以前の試みは、以下によって妨げられている：１）所定の組織において生じる腫瘍の任意の分類、および２）これらの腫瘍がどのように見えるか（組織学的分類）に基づく顕微鏡法を用いること。種々の腫瘍型についての既存の分類は、いくらかの予後的価値を有するが、ほぼ全ての分類は、処置に対する応答性および治癒の可能性または疾患の経過について予測することができない。これらの新生物の生物学的構成に基づく改善された分類スキームは、ガンを有するヒトの生存の統計学を有意に変更することが必要とされる。これらの問題を解決するための１つのアプローチは、腫瘍に特異的な分子、特にガン細胞のマーカーである分子における抗原を位置決めすることである。（「マーカー」は、本明細書中で、ガンを正常組織および他の疾患状態から区別するために用いられ得る、任意の特性と定義される）。次いで、マーカーの存在は、分類の基礎である。
【０００３】
（注）1  本明細書中で用いられる用語は以下の通りである：「ガン」は、悪性の腫瘍であり、ここで「腫瘍」は異常な塊の組織であり、悪性である必要はない。「新生物」は、新規の増殖形態である。
【０００４】
通常マウスにおいて、体細胞ハイブリダイゼーション技術によって調製されるモノクローナル抗体（ＭＣＡ）は、細胞抗原の検出および区別のための有用な分子プローブであり、それゆえ、ガン関連抗原を検出するための大きな可能性を有する。これらの抗体は、特異的抗原に結合し、そしてこの結合は、周知の方法によって検出可能である。結合が生じる場合、特異的抗原が存在すると推論される。細胞表面に曝露されるか、またはガン塊に見出される、ガン関連抗原は、宿主の免疫系（宿主の抗体を含む）についての分子標的である。近年の知見は、腫瘍に対する抗体を有するガン患者が、この型の免疫応答を備えないガン患者よりも良好であることを示唆する（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら，１９９４）。それゆえ、天然の、誘導された、または投与された抗体は、有望な治療アプローチである。
【０００５】
非ヒトＭＣＡのヒト化（非ヒトＭＣＡ反応性部位が、クローニングされたヒト抗体中にシャトルされ、そして発現されるプロセス）は、インビボおよびエキソビボでの適用においてそれらの特異的結合の損失を伴わずに、外来抗体の減少した免疫原性をもたらす。ＭＣＡは、インビボ画像化剤、診断試験として、および治療のために用いられ得る（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら  １９８８，１９９６；Ｒｅｓｅｎら  １９８８）。
【０００６】
ワクチン治療は、疾患または状態の原因因子に曝露することなく、免疫応答を誘導することが指向された十分に確立されたアプローチである。例えば、細菌因子およびウイルス因子に対する宿主における応答を刺激する多くのワクチンが利用可能である。ワクチンにおける腫瘍関連抗原（マーカー）の使用は、原発性ガンの発生を予防し得、そしてまたこの疾患の再発を予防する手段を提供し得る。
【０００７】
遺伝子治療は、細胞の遺伝的構成を目的の遺伝子を発現するように改変する手段である。以下を含む多くの形態の遺伝子治療が存在する：遺伝子の置換、アンチセンス抑制治療、および代理遺伝子発現。ガン関連抗原、好ましくはガン特異的抗原（マーカー）をコードする遺伝子の発見により、ガン細胞増殖に対する遺伝的介入に門戸を開く。正常組織からガン性組織を区別するためのガンマーカーの正確かつ一貫した使用は、診断的可能性を有するだけでなく、そしてまた処置および予後診断のために望ましい。それゆえ、このようなマーカーが求められている。
【０００８】
近年の研究は、ヒトアスパルチルβ−ヒドロキシラーゼ（ＨＡＡＨ）をコードする酵素が、いくつかのヒト腺ガン細胞株および原発性肝細胞ガンにおいて過剰発現され、それゆえ、マーカーであり得ることを示した。ＨＡＡＨをコードするといわれる遺伝子がクローニングされ、そして配列決定された（Ｇｒｏｎｋｅら，１９８９，１９９０；Ｗａｎｇら，１９９１；Ｊｉａら，１９９２，１９９４；Ｋｏｒｉｏｔｈら，１９９４；Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１９９６）。しかし、一般に、ヒト腫瘍におけるＨＡＡＨ発現についてはほとんど知られていない（Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１９９６）。
【０００９】
ＨＡＡＨ酵素の研究は、そのウシの対応物についての研究に起因した（Ｇｒｏｎｋｅら，１９８９，１９９０；Ｗａｎｇら，１９９１；Ｊｉａら，１９９２）。ウシアスパルチルβヒドロキシラーゼは、細胞内のグリコシル化されたタンパク質であり、粗面小胞体中に位置する。このタンパク質は、以下の３つの主要な分子種を有することが報告されている：８５キロダルトン形態、およびそれぞれ５６キロダルトンおよび５２キロダルトンの分子量を有する２つの活性な形態（Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１９９６）。
【００１０】
標準的な生化学的方法を用いて、ウシアスパルチルβ−ヒドロキシラーゼ（ｂＡＡＨ）が精製および特徴付けされた（Ｇｒｏｎｋｅら，１９９０；Ｗａｎｇら，１９９１）。この酵素の活性は、精製された５２キロダルトンおよび５６キロダルトンの種に相関することが示されている。免疫学的に、関連する、より高分子量の形態（８５〜９０キロダルトン）もまた観察された。精製の一部として、ｂＡＡＨは、ＣｏｎＡセファロースに結合され、これは、この酵素がグリコシル化されるという結論と一致している（そのＤＮＡ配列に関するその後の報告は、３つの可能なグリコシル化部位を示し、１つの部位は、公知の活性な酵素ドメインに非常に近い）。このタンパク質は性質が非常に酸性であり、そして活性な画分を可溶性にするために界面活性剤は必要とされない。この活性な酵素部位は、生化学的に単離されたウシタンパク質（ｂＡＡＨ）由来の６７５位のヒスチジンの存在に依存する（Ｊｉａら，１９９４）。
【００１１】
ＨＡＡＨについての部分的アミノ酸配列が得られた。このアミノ酸配列から推定されたＤＮＡプローブ（ＤＮＡプローブは、特定の条件下で特定のヌクレオチド配列に結合し得るヌクレオチド配列を有する分子である）を用いて、ウシｃＤＡＮライブラリーをスクリーニングした（Ｊｉａら，１９９２）。（ｃＤＮＡライブラリーは、ゲノムＤＮＡとは対照的に、遺伝子産物（例えば、ペプチド）をコードするＤＮＡの切片を含む）。ライブラリーにおけるいくつかの重複するｃＤＮＡ配列は、８５キロダルトンのタンパク質をコードすると期待される、７６４アミノ酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列を含んでいた。このＯＲＦ配列にはまた、２つの他の可能な開始コドン、すなわち、コードが始まる位置が存在していた。最も３’側の開始コドンは、リボソーム結合部位の後に存在していた。この配列を有するクローンの翻訳は、約８５キロダルトンであるタンパク質を生じた。抗血清を、ヒトＭＧ−６３細胞（ｃａｌｌ）の膜画分に対して惹起し、そしてこの抗血清を用いて、ＭＧ−６３細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーを免疫スクリーニングした。７５７アミノ酸のタンパク質をコードし得る１つのクローンについてデータが報告され、そして配列分析によって、ｂＡＡＨとの強力なＮ末端相同性を有することが見出された（Ｋｏｒｉｏｔｈら，１９９４）。このクローンを、インビトロ翻訳系（ｍＲＮＡをタンパク質へと変換するために用いられる正常細胞の細胞質の人工的カクテル）において用いた場合、５６キロダルトンのタンパク質が生成された。これは、翻訳後切断に起因することが示唆された。
【００１２】
ＨＡＡＨ酵素は、タンパク質の上皮増殖因子様ドメイン内の特異的アスパラギン酸残基の改変を担う。これらの改変されたアスパラギン酸残基が、上皮増殖因子様ドメインがカルシウム結合ドメインになることを可能にすると仮定された（Ｇｒｏｎｋｅら，１９８９，１９９０；Ｗａｎｇら，１９９１；Ｊｉａら，１９９２，１９９４；Ｋｏｒｉｏｔｈら，１９９４；Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１９９６）。
【００１３】
ＨＡＡＨに関連する酵素であるアスパルチルβヒドロキシラーゼ（ＡＡＨ）は、最初に研究された。なぜなら、これは、ビタミンＫ依存性凝固因子である第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子を含む、生物学的に重要なタンパク質の群において、選り抜きのアスパラギン酸残基またはアスパラギン残基を特異的に改変したからである。Ｃ、Ｓ、およびＺのような他のタンパク質もまたこの改変を有する（Ｇｒｏｎｋｅら，１９８９，１９９０；Ｗａｎｇら，１９９１；Ｊｉａら，１９９２，１９９４；Ｋｏｒｉｏｔｈら，１９９４；Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１９９６）。アスパラギン酸残基およびアスパラギン残基は、上皮増殖因子様ドメインを含むタンパク質において、ＨＡＡＨによって改変されることが示されている。βヒドロキシアスパラギン酸残基およびβヒドロキシアスパラギン残基の機能は未知であるが、しかし、この改変が、選択されたタンパク質の上皮増殖因子ＥＧＦ様ドメインにおけるカルシウム結合のために必要とされることが推定されている。
【００１４】
抗体は、ヒト肝細胞ガンＦＯＣＵＳ細胞に対して惹起された（Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１９９０）。１つのＭＣＡは、肝細胞ガンにおいて高度に発現された抗原と反応した（Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１９９６）。この抗体およびλｇｔ１１  ＨｅｐＧ２ライブラリーを用いる免疫スクリーニングは、部分的ｃＤＮＡの単離をもたらし、このｃＤＮＡは続いて、より大きなクローンを単離するために用いられた。
【００１５】
Ａ５４９と命名されたヒト腺ガン細胞株は、非常に高レベルのＨＡＡＨ活性を有すると報告された（Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１９９６）。ＭＣＡ４４−３Ａ６と命名されたマウスモノクローナル抗体（米国特許第４，８１６，４０２号）が、ヒト腺ガン細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ  １８５）に対して産生された（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９８５）。この抗体は、見積もられた見かけの分子量４０ｋＤａを有する細胞表面の非グリコシル化抗原性タンパク質を認識した。
【００１６】
この抗原は、Ａ５４９細胞によって発現され、そして良好な腺ガンマーカーであることが見出された；すなわち、この抗原は、組織学的に調べた場合に腺ガンであるように見えたガンによってしばしば発現される（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９９０ａ；Ｌｅｅら，１９８５）。ＭＣＡ  ４４−３Ａ６は、この結合特異性を有する最初のモノクローナル抗体であるという点で独特である。肺ガンに関する国際ワークショップからの結果により、ＭＣＡ  ４４−３Ａ６についての他の関連する公開された知見が確認された（Ｓｔａｈｅｌ，１９９４）。
【００１７】
ＭＣＡ  ４４−３Ａ６と命名された抗体は、臨床的有用性を有する。なぜなら、これは、腺ガンに関連する抗原を区別するからである。正常組織および胎児組織におけるこの抗原の分布は、いくつかの腺組織に制限されている（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９９１）。ホルマリン固定したパラフィン包埋組織上で検出が生じ得る（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９８５，１９８８，１９９０ａ，１９９０ｂ；Ｌｅｅら，１９８５，１９８６；Ｐｉｅｈｌら，１９８８；Ｃｏｍｂｓら，１９８８ｂ，１９８８ｃ；Ｂａｎｎｅｒら，１９８５）。この抗体は、ヒトの肺腫瘍において制限された結合パターンを有する（Ｌｅｅら，１９８５；Ｂａｎｎｅｒら，１９８５；Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９９０ａ，１９９０ｂ）。
【００１８】
２００を超える肺ガンについての研究では、ＭＣＡ  ４４−３Ａ６は、試験した腺ガンの全て、多くの大細胞ガン、ならびに中間神経内分泌小細胞肺ガンのサブセット、十分に分化した神経内分泌小細胞ガン、カルチノイドと反応するが、中皮腫とは反応しないことが見出された。ＭＣＡ４４−３Ａ６は、扁平上皮細胞ガンとも、細気管支ガンとも、小細胞ガンとも反応しない（Ｌｅｅら，１９８５）。ＭＣＡ  ４４−３Ａ６は、中皮腫から胸膜に転移する腺ガンを区別する際に有用である（Ｌｅｅら，１９８６）。この抗体は、腺ガンの間で、および大細胞ガンにおいて選択された反応性を有する（Ｐｉｅｈｌら，１９８８；Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９９０ｂ）。
【００１９】
細胞学的知見と組織学的知見とを比較する、４０症例を超える肺ガンの研究では、ＭＣＡ  ４４−３Ａ６は、細胞学的診断において有用であることが見出され、そして組織学的知見と一致した（Ｂａｎｎｅｒら，１９８５）。組織学は、組織（これは、細胞から構成される）の研究である。細胞学は、組織化された状況（これは通常、組織と呼ばれる）から取り出された細胞の研究である。組織から取り出された細胞は、その細胞が由来する組織において存在する細胞と必ずしも同じに行動するとは限らない。幸いにも、組織中の腺ガン細胞において発現されるＭＣＡ  ４４−３Ａ６によって検出される抗原は、組織から取り出した腺ガン細胞と同じように行動する。これは、診断的に非常に重要な特徴である。細胞学的に調製された肺ガンの細胞ブロック、ならびに身体全体の他の部位からの体液中におけるＡＣ提示を用いる類似の相関が実証された（Ｌｅｅら，１９８５；Ｓｐａｇｎｏｌｏら，１９９１；Ｃｏｍｂｓら，１９８８ｃ）。また、ＭＣＡ  ４４−３Ａ６は、肺ガン以外の部位からの腺ガンに結合する。原発性病巣および転移病巣におけるこの抗原の発現もまた報告された（Ｃｏｍｂｓら，１９８８ａ）。ガンをヒト胸部組織における良性の病巣から区別する際のＭＣＡ抗体の利用もまた示された（Ｄｕｄａら，１９９１）。
【００２０】
ＭＣＡ  ４４−３Ａ６によって検出される抗原の細胞の局在化が決定された。生存細胞放射免疫アッセイ（生存細胞に対する抗体の結合を決定することに指向された放射性抗体試験）、免疫蛍光、および生存細胞蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析を用いることにより、ＭＣＡ  ４４−３Ａ６によって検出された抗原が、この細胞の外側の表面上に存在することが示された（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９８５）。免疫金電子顕微鏡法およびＦＡＣＳ分析を用いるさらなる研究は、この抗原が調節されず（抗体によって結合された場合にガン細胞によって内部移行されない）、原形質膜の細胞外表面上で発現され、そして細胞周期特異的でない（すなわち、この細胞は、細胞複製のプロセスを通じて常に、そしてまた分裂していないときにタンパク質を作製する）ことを実証した（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９９１）。この抗原は、正常な患者の血清にも腫瘍を有する患者の血清にも見出されず、そしてポジティブ細胞株によって培養培地中に流されない（すなわち、ガン細胞は、それらの細胞膜の一部を小疱形成（ｂｌｅｄ  ｏｆｆ）し、そして周囲の液体中にそれを放出することが公知である）（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９８５）。近年、２７人のうち３人のランダムに試験した腺ガン患者は、この抗原に対する、天然に存在する抗体を有することが見出された。さらに、放射標識されたＭＣＡ  ４４−３Ａ６を用いて、ヌードマウス中で増殖するＡ５４９腫瘍が位置決定された。ドキソルビシン（ｄｏｕｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）免疫結合体ＭＣＡ  ４４−３Ａ６は、インビトロで選択的に毒性である（Ｓｉｎｋｕｌｅら，１９９１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
ＭＣＡ  ４４−３Ａ６によって検出された抗原のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の決定は、ガンの診断、処置、および予防におけるこの抗原の有用性を増強する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の簡潔な要旨）
背景において記載された通りの抗体ＭＣＡ  ４４−３Ａ６によって検出される抗原は、現在「ラビリンチン（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｉｎ）」と命名されている。ＭＣＡ  ４４−３Ａ６によって検出される抗原をコードする独特なヌクレオチド配列によって特徴付けられる遺伝子（ラビリンチンと命名される；ｌａｂと省略される）を単離および特徴付けした（ｌａｂとの表示は核のＤＮＡ／ＲＮＡ形態を示す；「Ｌａｂ」との表示は、ｌａｂ  ＤＮＡ／ＲＮＡによってコードされるタンパク質をいう）。
【００２３】
本明細書中に記載される発明は、抗体ＭＣＡ  ４４−３Ａ６を、Ｌａｂをコードする遺伝子をクローニングするための道具として用いた。さらに、ＭＣＡ  ４４−３Ａ６についてのエピトープ（この抗原において見出される抗体について必要な結合部位）を、ＰＴＧＥＰＱ2であるクローンによって発現されるＬａｂタンパク質において同定した。このエピトープは、重要な免疫優勢配列を表す；すなわち、動物に注射した場合、この動物は、この配列に対する抗体を容易に産生する。
【００２４】
本発明の１局面は、以下のためのセンス3発現態様におけるｌａｂ  ＤＮＡの使用である：１）ヌクレオチドプローブによるヒト腫瘍を標識するため；２）細胞および組織におけるｌａｂのＤＮＡおよびｍＲＮＡ発現の検出のため；３）腺様細胞型への細胞の形質転換のため；４）免疫のためのインビボでのＬａｂ抗原の産生のため；５）抗体を生成するための免疫のためのＬａｂのエキソビボ発現のため；ならびにインビトロでのＬａｂの産生のため。ラビリンチン発現（ガン性）細胞の増殖を抑制するための、例えば、センス分子への逆方向でのｍＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖の産生によるアンチセンス分子の使用は、本発明の別の局面である。
【００２５】
（注）2  アミノ酸についての標準的な略号。
【００２６】
3  センス鎖のＤＮＡからのｍＲＮＡ鎖を生成するための３’から５’末端へ進行するＤＮＡ配列の正常な転写。このｍＲＮＡは、そのＤＮＡに相補的である。
【００２７】
本発明の１つの局面は、Ｌａｂ抗原の少なくともエピトープをコードするヌクレオチド配列、および宿主細胞における発現を可能にするための適切な調節配列を有するＤＮＡ分子を含むベクターである。
【００２８】
本発明の別の局面は、ｌａｂ遺伝子のタンパク質コード領域から推定されるアミノ酸配列である。この配列の選択された領域は、天然に存在する産物（ガン細胞由来）、化学的に生成される産物（合成的に生成されるペプチド）、およびクローン化されたｌａｂ遺伝子の発現産物の両方からの効果に対応する効果を生じることが免疫学的方法を介して見出された。
【００２９】
本発明の別の局面は、Ｌａｂの推定アミノ酸配列全体、Ｌａｂ由来のペプチド、もしくは化学的に生成された（合成）Ｌａｂペプチド、またはこれらの分子の任意の組合せの、ヒトのガンを予防するためおよび／またはガンを有するヒトの処置のためのワクチンの調製における使用のための使用である。本発明の目的のために、「ガンを有するヒト」は、それらの細胞において検出されたＬａｂ抗原を有するヒトである。これらの調製物はまた、最初の発生の前に患者がこれらの腫瘍を絶えず有することを予防するために用いられ得る。
【００３０】
Ｌａｂタンパク質に指向されるモノクローナル抗体、またはＬａｂタンパク質の抗原性成分もしくは誘導体は、Ｌａｂの検出のため、および他の目的のために有用である。Ｌａｂ抗原と反応する種以外の種において作製されるモノクローナル抗体は、これらのモノクローナル抗体が、ラビリンチンペプチドとのそれらの結合を保持するが、依然としてヒトにおいて免疫原性でないように、多数の分子クローニング方法によって改変され得る（Ｓａｓｔｒｙら，１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９０）。手短には、これは、クローニングしたヒト抗体遺伝子の結合部位の配列を、目的の非ヒトモノクローナル抗体の結合部位の配列で置換することによって行われる。これらの「ヒト化」ＭＣＡは、治療試薬および診断試薬として、インビボ、エキソビボ、およびインビトロで使用される。
【００３１】
ガンについての診断アッセイにおけるＬａｂタンパク質またはそれに由来する抗原性ペプチドの使用は、患者の血液または他の体液もしくは組織において有する抗体の存在および量について患者をモニタリングする方法である。この検出は、以前に規定されたクラスのガンに限定されないが、Ｌａｂマーカー抗原を有するガン細胞について有用である。当業者に公知の技術［例えば、ＥＬＩＳＡ（ＥｎｇｒａｌｌおよびＰｅｒｌｍａｎｎ，１９７１）］によって測定される場合のセロコンバージョンの程度は、処置の効果をモニタリングするために用いられ得る。
【００３２】
薬学的組成物におけるｌａｂに対するアンチセンス分子またはＬａｂに対する抗体での処置は、患者のガン細胞中またはガン細胞上にＬａｂを有する患者を処置するアプローチである。
【００３３】
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）  図１に示す通りのヌクレオチド配列を有する、単離されたｃＤＮＡ分子。
（項目２）  図１のヌクレオチド配列に約７０％の相同性を示すヌクレオチド配列を有する、単離されたｃＤＮＡ分子。
（項目３）  項目１に記載の単離されたｃＤＮＡ分子のセグメントであって、ここで、該セグメントが、前記ヌクレオチド配列における開始コドン（ＡＴＧ）から終止コドンＴＡＡにまたがり、そして７６５塩基対を含む、セグメント。
（項目４）  項目２に記載の単離されたｃＤＮＡ分子のセグメントであって、ここで、該セグメントが、前記ヌクレオチド配列における開始コドン（ＡＴＧ）から終止コドンＴＡＡにまたがり、そして約７６５塩基対を含む、セグメント。
（項目５）  単離されたｃＤＮＡのセグメントであって、抗体ＭＣＡ４４−３Ａ６によって検出可能なＬａｂタンパク質におけるエピトープをコードするに十分である、セグメント。
（項目６）  項目１に記載のｃＤＮＡセグメントによってコードされる、アミノ酸配列。
（項目７）  項目２に記載のＤＮＡセグメントによってコードされる、アミノ酸配列。
（項目８）  細胞サンプルにおけるガン細胞を診断するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該細胞サンプルを、ｌａｂ遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズし得る標識プローブと、ストリンジェントな条件下で接触させる工程；および
（ｂ）該プローブが、該サンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズしたか否かを決定する工程であって、それによって該ｌａｂ遺伝子の存在が推論され、該存在がガンの診断である、工程、
を包含する、方法。
（項目９）  ＡＰＰＥＤＮＰＶＥＤ、ＥＥＱＱＥＶＰＰＤＴ、ＤＧＰＴＧＥＰＱＱＥ、およびＥＱＥＮＰＤＳＳＥＰＶからなる群より選択されるアミノ酸配列を有する分子。
（項目１０）  アミノ酸配列ＰＴＧＥＰＱを有する分子。
（項目１１）  図２におけるアミノ酸であるようにアラインメントされる、３と２０との間のアミノ配列長である全ての配列からなる群より選択される、ペプチドであって、ここで、ｎアミノ酸の配列の最初のアミノ酸の位置が、１位〜ｎ−３位からｎ−２０位からなる群より選択される、ペプチド。
（項目１２）  抗体であって、項目６、８、９、１０、または１１に記載の配列から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドに対する、抗体。
（項目１３）  モノクローナル抗体であるとさらに規定される、項目１２に記載の抗体。
（項目１４）  抗体であって、項目２、３、４、もしくは５に記載のＤＮＡ分子によってコードされるアミノ酸配列、またはエピトープを含むそのフラグメントに対する、哺乳動物において産生された、抗体。
（項目１５）  細胞サンプルにおける、項目２、３、４、または５に記載ののｃＤＮＡ分子を検出するための方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）該細胞サンプルを、該ｃＤＮＡまたはそのフラグメントにハイブリダイズし得る標識プローブと、ストリンジェントな条件下で接触させる工程；
（ｂ）該プローブが、該サンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズしたか否かを決定する工程；および
（ｃ）該プローブがハイブリダイズした場合に該ｃＤＮＡの存在を推論する工程、
を包含する、方法。
（項目１６）  項目２、３、４、または５に記載のｃＤＮＡ分子の発現の効果を弱める方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）該ｃＤＮＡ分子またはその発現産物に対するアンチセンス分子を得る工程、および
（ｂ）該アンチセンス分子を該ｃＤＡＮ分子またはその発現産物にハイブリダイズする工程、
を包含する、方法。
（項目１７）  前記アンチセンス分子が、少なくとも１００ヌクレオチド長である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）  項目２または３に記載のｃＤＮＡが誘導される、単離されたゲノムＤＮＡ分子。
（項目１９）  項目２、３、４、または５に記載の単離されたｃＤＮＡ分子を含む、ベクター。
（項目２０）  項目６、８、９、１０、または１１に記載のアミノ酸配列を有する分子をコードするｃＤＮＡ分子を含む、ベクター。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ｌａｂ遺伝子の核酸配列（配列番号１）である。
【図２】図２は、ｌａｂ遺伝子から推定された、Ｌａｂについてのアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図３】図３は、ｌａｂ遺伝子およびこれがＨＡＡＨ酵素にどのように関連するかの例示である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（発明の詳細な説明）
ラビリンチンの分子生物学：エピトープＭＣＡ  ４４−３Ａ６が、タンパク質配列によってコードされることを実証するために、細胞株Ａ５４９からの高分子量ＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、（カルシウムによって）プラスミド（ｐＳＶｎｅｏ）とともに共沈し、そしてこれを用いてＢ７８Ｈ１細胞と命名されるマウス細胞株をトランスフェクトした（Ａｌｂｉｎｏら，１９８５）。このマウス細胞株は、このエピトープの発現に関してネガティブであり、そして高い効率の任意のヒトＤＮＡ配列の取り込みおよび発現を有することが報告された。所定のＢ７８Ｈ１細胞がＤＮＡを取り込む状態にある場合、ヒトＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡの両方を取り込むことが期待される。プラスミドＤＮＡは、細胞をＧ４１８（通常は毒性の薬物）に対して耐性にする。それゆえ、通常、Ｇ４１８増殖インヒビターに感受性である細胞がＧ４１８において増殖する場合、この細胞は、このプラスミドを取り込んでいる必要があり、そしてまた、１以上のＡ５４９  ＤＮＡ配列を取り込んでいるかもしれない。Ｇ４１８選択後（ｐＳＶｎｅｏプラスミド上のＮｅｏ遺伝子の取り込み／発現によってＧ４１８における増殖に対する耐性を有する細胞のみを選択し、それゆえ、同時に他のＤＮＡを取り込んだ状態にある細胞を表す方法）、約１５の１×１０5クローンを、ＭＣＡ  ４４−３Ａ６での免疫選択を用いて検出した。この知見は、ヒトＡ５４９細胞が、ＬａｂをコードするＤＮＡを有し、そしてＬａｂの発現のために必要な調節配列を有するという結論と一致する。
【００３６】
ＨＡＡＨとラビリンチンとの比較：ｌａｂのＤＮＡ配列が本発明の１局面として決定されたので、ＨＡＡＨおよびｌａｂを比較し得る。ＨＡＡＨおよびｌａｂのヌクレオチド配列は、いくつかの内部フラグメント類似性を有するが、このフラグメントのいずれの側でも異なり、そして異なる産物に関連する。この結論は、部分的に、これらの２つの遺伝子について報告されたＤＮＡ配列の分析および相同性に基づく。詳細には、ｌａｂ  ５’領域は、ＨＡＡＨとは相同性を全く有さない。ｌａｂのタンパク質コード領域は、ＨＡＡＨについて提案されたタンパク質コード領域の内部セグメントとの約９９．６％の相同性を有する。３’領域は、ＨＡＡＨの報告された配列とは相同性を全く有さない。ＨＡＡＨとラビリンチンとを比較する実質的に全ての他のデータは、例えば以下のように異なる：１）これらのタンパク質の分子量、２）細胞局在、３）染色体局在、４）正常組織および腫瘍における組織学的提示、５）ノーザンブロット発現、６）免疫学的知見。
【００３７】
ｌａｂのタンパク質コード領域は、ＨＡＡＨについて報告された配列の内部領域と同一であるが、ＨＡＡＨの５’非翻訳領域は、異なり、そしてＨＡＡＨの５'翻訳タンパク質コード領域部分は、ｌａｂクローンにおいて見出される５'翻訳タンパク質コード領域から失われている。ＨＡＡＨクローンおよびｌａｂクローンの両方から、推定タンパク質が、その性質が非常に酸性であると予期され、それゆえ、ＳＤＳゲルにおいて変則的に（ａｎｏｍｏｌｏｕｓｌｙ）泳動する。予想されたように、Ｌａｂタンパク質は、ＳＤＳゲルにおいて変則的に移動する。本発明においてクローニングされ、そして開示されたものは、いくつかの細胞株において見出されたネイティブなタンパク質と同一に泳動した。ＭＣＡ  ４４−３Ａ６によって検出される抗原をコードする正確な遺伝子フラグメントがクローニングされた（ｍＲＮＡ）という確信的証拠は、この組換えタンパク質を作製した場合に、その組換えタンパク質が、そのタンパク質の独立した生物学的に誘導された供給源と同じに作用する（この場合、見かけの分子量を有する）べきことである。クローンから提供されたＬａｂは、細胞からのＬａｂの特徴を有する。
【００３８】
ＨＡＡＨによってコードされる推定アミノ酸配列は、８５〜９０キロダルトンであるタンパク質を生成するオープンリーディングフレームの使用を必要とし、そしていくつかの開始コドンおよび他のより短いオープンリーディングフレームが存在することを考慮しない。推定ＨＡＡＨタンパク質（生化学的）は、グリコシル化され、そして報告された配列は、グリコシル化部位を有する（Ｋｏｒｉｏｔｈら，１９９４；Ｌａｖａｉｓｓｌｅｒｅら，１９９６）。対照的に、Ｌａｂはグリコシル化されず、推定グリコシル化部位を有しもしない。
【００３９】
推定ＨＡＡＨアミノ酸配列は、非常に疎水性であることが推定されるＬａｂアミノ酸配列によって共有される領域を含む。Ｌａｂは、可溶性であるためには、強力な界面活性剤を必要とする；ＨＡＡＨはそうではない。ｌａｂをクローニングおよび十分に研究するために用いた同じ細胞株（Ａ５４９）における（酵素活性の測定による）ＨＡＡＨの増加した発現は、これらの両方の遺伝子産物が、ＡＣ表現型に重要であり得ること、および少なくともＡ５４９細胞が機能的なＨＡＡＨおよびＬａｂの両方を作製することを示唆する。Ａ５４９へのｌａｂに対するアンチセンスの成功裏のトランスフェクションは、ｌａｂの発現および細胞の増殖速度の著しい減少をもたらした。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（正常なマウス線維芽細胞）におけるセンスｌａｂ構築物の発現は、ＡＣの表現型と一致した表現型である、表現型の著しい変化をもたらした。それゆえ、ｌａｂ発現は、ガン細胞への正常細胞の変換と関連する。ＬａｂおよびＨＡＡＨは、共通の潜在的カルシウム結合ドメインを有する。
【００４０】
ｃＤＮＡライブラリーの構築およびクローニング：ｃＤＮＡ  λｇｔ１１ファージライブラリーを、活性に増殖するＡ５４９細胞から単離したｍＲＮＡを用いて構築した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９０）。このオリゴ（ｄＴ）プライムド（ｐｒｉｍｅｄ）ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩリンカーを用いてＥｃｏＲＩ部位へとクローニングした。このライブラリーは、ポリメラーゼ連鎖反応によって、０．６キロベース〜５キロベースの範囲のインサートサイズを有する、最少１．４６×１０6の独立したプラークを示す、１．２×１０10／ｍｌの力価を有する、約８３％の明瞭な（インサートを含む）プラークを有する。Ｌａｂが４０キロダルトンの内在性タンパク質（原形質膜中に埋め込まれるタンパク質）であるので、潜在的リーダー配列を含む、このタンパク質をコードする理論的全長ｍＲＮＡは、約１．１キロベースであると見積もられる。このライブラリーを、抗体ＭＣＡ
４４−３Ａ６を用いて免疫スクリーニングした。８個の独立して由来されたファージストック（同じプラークに由来する同一のファージ）が単離された。これらは、全て、免疫スクリーニング／単離の反復サイクルによってプラーク精製された。これらの８つの単離物のＥｃｏＲＩ消化によって、約２ｋｂの挿入物が見られた。最大の挿入片を単離し（２ＡｌＡｌ）、そしてこのＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＥＭ−３Ｚプラスミド中にクローニングした。
【００４１】
配列決定および配列分析：２ＡｌＡｌと命名されるＤＮＡフラグメントは、２５５アミノ酸のタンパク質（図２）をコードすると予期される、５’非翻訳領域、リボソーム結合部位、および開始コドンを含有する、２４４２塩基対長の挿入片を有する（図１）ことが見出された。３’非翻訳領域は、４つの不安定性配列ＡＴＴＴＡ（Ｘｕら，１９９７）のみを含むという点で注目すべきである。さらに、ｍＲＮＡのアデニル化をもたらす、ｍＲＮＡのまさに３’末端において見出される配列が存在する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９０）。ｌａｂ配列は、準最適なポリアデニル化部位（ＡＴＴＡＡＡ）および最適のポリアデニル化部位（ＡＡＴＡＡＡ）の両方を含む。これらは、ｍＲＮＡのアデニル化をもたらす、ｍＲＮＡのまさに３’末端において見出される配列である。この知見は、本明細書中に概説された、細胞データおよび生化学的データを支持する分子データを提供する（ＨＡＡＨクローンは、ポリＡシグナルを有するが、３’領域全体は配列決定されていない）。
【００４２】
カルシウム結合部位のモチーフが、Ｌａｂアミノ酸配列において示される（図２）が、しかし、結合部位であるための公知の必要とされる構造の状況の外である。この場合、カルシウム制限配列がそこに存在するが、この配列は、これを結合部位として作用させることが公知であるタンパク質配列の状況下にはない。ｌａｂクローンと、３’非翻訳領域の一部のみを示し、そしてこの配列のこの部分が独立して確認されたＥＳＴクローン（番号０５５０１と命名される）との間の相同性が示された。いくつかの内部フラグメントの相同性はまた、ＨＡＡＨについて示されるが、５’非翻訳領域および５’翻訳領域の一部が異なり（５８アミノ酸）、ならびに３’コード配列の主な部分がｌａｂにおいて失われている（図３）。
【００４３】
ゲノムＤＮＡクローニングおよび分析：ｌａｂのタンパク質コード領域を示すＰＣＲフラグメントをプローブとして用いて、ヒト肺線維芽細胞株ＷＩ−３８から作製されたゲノムλＦＩＸ  ＩＩライブラリーをスクリーニングした。１０個の一次プラークを、約１×１０6のスクリーニングされたプラークから単離した。これらの７個を標的ＤＮＡとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応条件が、タンパク質コード領域についてプライマーを用いて確立され、ｌａｂについての予期されたタンパク質コード領域である７６５塩基対のフラグメントを生成した。ノーザンブロット（ｍＲＮＡを定性的に評価するために用いられる方法）について、ｌａｂは、２．７キロベースで示される１つのバンドのみを検出する。ｌａｂクローンから作製される組換えタンパク質は、ＭＣＡ  ４４−３Ａ６を用いるウェスタンブロット（タンパク質を定性的に規定するために用いられる方法）で試験した場合、Ａ５４９細胞によって作製される場合のＬａｂタンパク質と同じ相対移動度を有する。
【００４４】
Ｌａｂ遺伝子およびＨＡＡＨ遺伝子は、これらがコードするタンパク質において異なる結果を与える。ＨＡＡＨは、一貫してノーザンブロット分析（２．６キロベースおよび４．３キロベース）で２つのバンドを与え、２．６キロベースのバンドが、選択的スプライシングに起因すること、すなわち、この細胞は、ｍＲＮＡを切断し、そしてスプライスすることを示唆する。また、ｌａｂおよびＨＡＡＨは同じ遺伝子である場合、ＨＡＡＨは、Ｌａｂが見出される全ての組織およびガン細胞株において検出されるべきである。しかし、Ｌａｂは、細胞株ＥＭＴ６またはＱＵ−ＤＢのノーザンブロットにおいて見られず、これらの細胞において免疫反応性も存在しない；これらは、Ｌａｂ  ｍＲＮＡが作製されないこと、およびＬａｂタンパク質がこれらの細胞において生成されないことを示す。Ｌａｂタンパク質は、正常細胞において稀にしか発現されないが、ここでＨＡＡＨ  ｍＲＮＡおよびＨＡＡＨタンパク質の両方が、研究されたほぼ全ての組織において発現されると報告されている。
【００４５】
ｍＲＮＡ分析：プローブとしてｌａｂ  ｃＤＮＡを用いるＡ５４９細胞株からのＤＮＡフラグメントのノーザンブロット分析は、約２．７キロベースの単一のバンドを同定した。これは、ｃＤＮＡ（２４４２塩基対）および約３００塩基対のポリＡテールに基づくと予期される。マウス細胞株ＥＭＴ６、およびヒト大細胞ガン細胞株ＱＵ−ＤＢのノーザンブロット分析は、ｌａｂについての転写物がこれらの細胞によって生成されないことを確認する。このことは、これらの細胞についてのｌａｂ発現についてネガティブである免疫アッセイと一致する。
【００４６】
アンチセンスｃＤＮＡ発現およびセンスｃＤＮＡ発現：プラスミド（ｐＢＫ−ＣＭＶ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９０）は、Ａ５４９細胞およびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞へのセンスまたはアンチセンスの全長ｃＤＮＡのｌａｂのいずれかを保有し得る。アンチセンス分子は、例えば、センス分子にハイブリダイズするセンス分子に対して相補配列であり得、その発現を防止する。ｌａｂに対してアンチセンスを発現するＡ５４９細胞の増殖速度を評価するためのＭＴＴアッセイ（Ｓｉｄｄｉｑｕｅら，１９９２）を用いて、増殖速度における著しい減少が示された。アンチセンスでトランスフェクトされたＡ５４９細胞は、より大きな程度の接触阻害を有するようである。検出可能な量のＬａｂは、これらのアンチセンスでトランスフェクトされた細胞において低減される。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、センスの発現が生じた場合に、線維芽細胞様細胞型形態（大きい、薄い紡錘体状）から、大きな腺ガン出現細胞（非常に円形で丸い）へと転換する。
【００４７】
染色体の局在：インサイチュハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９０）による、全長ｃＤＮＡをプローブとして用いてのｌａｂについての染色体局在は、第４染色体および第８染色体とおそらくいくらか反応性を有する、試験的に染色体２ｑ１２−１４上である。同じプローブ（ｌａｂの全長ｃＤＮＡ配列）およびＦＡＣＳ選別された染色体（Ｌｅｂｏら，１９８５）を用いてまた、第２染色体上に染色が示され、第４染色体において弱い染色を有し、そして第８染色体において染色がなかった。ゲノムクローンの使用は、これらのデータを決定する際に特に価値がある。なぜなら、ｃＤＮＡについて許容され得るよりも高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が用いられ得、それによって、バックグラウンドシグナルを減少させるからである。これは、正確な遺伝子がクローニングされること、および結果が方法のアーチファクトに起因しないことのなお別の証明である。腫瘍のゲノムＤＮＡには変異が存在し得、そして本発明については、ＤＮＡが腫瘍細胞（Ａ５４９）からクローニングされた。それゆえ、変異遺伝子が、クローニングされ得る。しかし、これは、この場合ではない。なぜなら、正常細胞（ＤＮＡ）からのゲノムＤＮＡは、本明細書中に記載されるようにクローニングされた配列と同じ配列を生成したからである。それゆえ、正常遺伝子を、Ａ５４９細胞からクローニングした。第４染色体および第８染色体についての弱いシグナルは、偽遺伝子または関連遺伝子と一致する。例えば、ＨＡＡＨは、インサイチュハイブリダイゼーションによって第８ｑ１２染色体上であると報告され、それゆえ、第８染色体についてのこの結果は、ＨＡＡＨ配列およびｌａｂ配列の相同性を反映し得る。
【００４８】
ラビリンチンのタンパク質分子の特徴付け：ウェスタンブロット分析（抗原を評価するための定性的アッセイ）を用いる以前の研究は、Ｌａｂ抗原は、Ａ５４９細胞（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９８５）において検出可能な４０キロダルトン（相対移動度による）タンパク質であることを示した。エピトープは、レクチンによって調節されるまたはブロックされるようではなく、そして主に原形質膜上に局在する細胞表面上で選択的に発現される（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９８５，１９９１）。Ｌａｂは、プロテアーゼに対して感受性であるが、脂質または炭水化物改変反応には感受性でない（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９８５）。Ｌａｂの生化学的特性は、内在性膜タンパク質であるＬａｂと一致する。
【００４９】
本発明のｌａｂ遺伝子由来の推定アミノ酸配列を有することは、Ｌａｂタンパク質のさらなる特徴付けを可能にする。Ｌａｂの大量のコンピューター分析は、真核生物リーダー様配列および理論的切断部位、３’ミリスチル化配列部位、弱い膜係留ドメイン（ＭＡＤＩ）、および強い膜係留ドメイン（ＭＡＤＩＩ）（図２）を同定した［（ＨＡＡＨ配列では、５８個の（理論的）アミノ酸、続いてＬａｂタンパク質コード配列における配列相同性、およびｌａｂ配列に対して３’側のさらなる４４５アミノ酸が存在する）］。
【００５０】
Ｌａｂが、細菌のＧＳＴ融合発現系（ｐＧＥＭＥＸ−２Ｔ）（Ａｍｅｒｅｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，０８８５４，ＵＳＡ）において融合タンパク質として発現され、そして抗体ＭＣＡ  ４４−３Ａ６を用いるウェスタンブロット分析に供する場合、得られるブロットは、発現され切断される融合タンパク質が、Ａ５４９細胞において検出されるタンパク質と同じ相対移動度を有することを実証する。Ｌａｂについての推定分子量は、２８．８キロダルトンであり、そしてウェスタンブロットでは、これは、Ａ５４９細胞により発現される形態と同一の相対移動度（見かけの相対移動度＝４０キロダルトン）を有する。５５個のグルタミン酸残基および２７個のアスパラギン酸残基（合わせて８２残基）は、リーダー配列および最強の膜係留ドメイン（ＭＡＤＩＩ）を除いて、タンパク質（計２５５アミノ酸；リーダー配列なしで２２８）全体にほぼ均一に分布する。これらのデータは、Ｌａｂが、ＳＤＳゲルにおいて変則的に移動することを示唆する。Ａ５４９以外の細胞株（例えば、腺ガンＤＵ−１４５、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−８１；ＺＲ−７５−１、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５０４など）は、Ｌａｂと同じ分子量の抗原を用いて検出された抗原を有する。８５〜９０キロダルトンの分子量種も、５２および５６キロダルトンの分子量種も、Ｌａｂについてウェスタンブロットをプローブした場合に示されない。
【００５１】
抗体ＭＣＡ  ４４−３Ａ６を用いるエピトープマッピングおよびＬａｂのワクチン実行可能性：ポリメラーゼ連鎖反応およびＧＳＴ融合タンパク質系を用いて、タンパク質コード領域のサブクローンを作製し、そしてエピトープを、Ｌａｂのアミノ酸番号１１７〜１２２を示す６アミノ酸（ＰＴＧＥＰＱ）（「Ｐ」ペプチド）に対するＭＣＡ  ４４−３Ａ６の結合にマッピングした。このエピトープを決定するために、コード領域全体を領域に分け、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーを設計して各領域を増幅し、そしてその後の発現のポリメラーゼ連鎖反応産物を、クローニングし、そして抗体ＭＣＡ  ４４−３Ａ６を用いてウェスタンブロット分析によって試験した。
【００５２】
次いで、ポジティブなウェスタンブロットの結果を示すＤＮＡフラグメントを、さらに細かく分けた。ポリメラーゼ連鎖反応の産物を、生成し、そしてクローニングし、発現させ、そしてウェスタンブロットによって試験した。構築物を、５’末端および３’末端の両方からこのようにして作製し、そしてアミノ酸数の間隔を各回において減少させた。このことは、最後の回がその前の回とは（両方の方向において）１アミノ酸の相違を示すことを生じ、その結果、ＭＣＡ  ４４−３Ａ６の正確な結合部位を推定し得た。このことは、少なくともこれらの６アミノ酸が、外部細胞表面に露出していることを実証する。この点をさらに実証するために、これらの６アミノ酸のみをコードするＤＮＡをクローニングし、そして融合タンパク質がウェスタンブロット分析によってポジティブである。合成によって調製された「Ｐ」ペプチドは、ＭＣＡ４４−３Ａ６によって特異的に検出され得、そして合成ペプチドは、試験した５匹のマウスのうちの５匹において免疫原性であった。コンピューター分析／モデリングはまた、このエピトープが、コンピューター補助分析（ＧＣＧプログラム）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉ  ５３７０３）を用いて非常に免疫原性であることを予測した。
【００５３】
ワクチン調製：ワクチンは、宿主に与えられた場合に、この抗原に対する抗体を産生する宿主を生じる、抗原の調製物である。宿主応答は、ワクチンが指向される疾患に対して免疫性である宿主を生じる。それゆえ、ワクチン処置は、宿主が疾患の原因因子に曝露されることなく、疾患の臨床的提示を予防する。Ｌａｂは、好ましいガンワクチンの全ての特徴を有する。ｌａｂ遺伝子は、腺ガンのように見える腫瘍によって頻繁に発現され、細胞の外側に発現され、所定のガンにおける全ての細胞によって発現され、これらのガン細胞の全ての時点で発現され、そして正常細胞によってめったに発現されない。Ｌａｂタンパク質（ペプチド）は、分子クローニング技術を用いて任意の数の方法によって生成され得、そして大量に生成され得、従って、これをワクチンとして用いるために実用的な抗原にする。ヒトへの注射のために適切であるようにＬａｂタンパク質が精製された後、Ｌａｂタンパク質は、皮内に、皮下に、または他の経路によって個体に投与され、その結果、免疫系をチャレンジしてこのタンパク質（ペプチド）に対する抗体が生成される。
【００５４】
分子モデリングおよびコンピューター補助分析ＧＣＧプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７０３）の使用は、エピトープよりもわずかに大きな（タンパク質については６〜７アミノ酸）、分子の小さな部分の同定を可能にし、これは、タンパク質分子の表面に存在すると予期される。さらに、所定の配列の疎水性または親水性の程度、ならびに動物においてこの配列がどの程度免疫原性であるかが決定され得る（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７０３）。どの配列がこれらの基準を満たすかについて規定した後、ペプチドを合成によって作製するかまたは多数の標準的な方法によって生成する。次いで、１以上のこれらのペプチドは、ワクチンとして使用されるように処方され得、そして上記で概説した宿主にワクチンとして投与され得る。
【００５５】
図１のｃＤＮＡによってコードされる配列、このｃＤＮＡによってコードされる図２の配列、ペプチドＡＰＰＥＤＮＰＶＥＤ（配列番号６）、ＥＥＱＱＥＶＰＰＤＴ（配列番号７）、ＤＧＰＴＧＥＰＱＱＥ（配列番号８）、およびＥＱＥＮＰＤＳＳＥＰＶ（配列番号９）、ならびにそれらの任意のフラグメントまたは組合せの群より選択されるアミノ酸配列を有する分子を含むワクチン。
【００５６】
所定のワクチンは、宿主に１回投与され得るか、または何回も投与され得る。いくつかの患者が所定のワクチンを認識するように、アジュバントもまたこのペプチドとともに投与される必要があるかもしれない。アジュバントは、免疫の容易さを高め、かつ検出可能な血清抗体を有さない状態から非常に高い力価の血清抗体を有する状態への宿主の変換を補助する、非特異的な免疫刺激因子である。宿主を、抗体が指向される疾患または状態から効率的保護するのは、この高レベル（力価）の抗体である。
【００５７】
機能研究：Ｌａｂの細胞機能を理解することに関する研究は、細胞局在／特徴付け研究（Ｓｉｄｄｉｑｕｅら，１９９２）の延長である。種々の陽イオン（Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｃｕ＋＋、およびＦｅ＋＋）への細胞外曝露に応じたＬａｂのレベルの変化が起きた。Ａ５４９細胞におけるＬａｂ発現は、Ｃａ＋＋によってのみ調節された。細胞質ゾルのＣａ＋＋を測定する非常に特異的な蛍光Ｆｕｒａ−２／ＡＭ  Ｃａ＋＋方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ  ９７４０２）を用いて、以下のことが実証された；１）内部Ｃａ＋＋濃度がＱＵ−ＤＢ細胞よりもＡ５４９細胞において高い、そして２）Ａ５４９細胞株は、種々の外部Ｃａ＋＋レベルに対して応答する（Ｓｉｄｄｉｑｕｅら，１９９２）。ｐＨは細胞内の遊離のＣａ＋＋レベルを調節し得るので、外部ｐＨの操作は、Ｌａｂの発現レベルにおける変化をもたらすはずである。（正常なＣａ＋＋濃度の存在下での）細胞外ｐＨ変化は、以下をもたらす：１）ＳＮＡＲＦ−１  ＡＭ／ＦＡＣＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ  ９７４０２）により測定した場合の細胞内ｐＨの並行変化、２）Ｌａｂについての転写レベルの増加（ノーザンブロットによるＧＡＰＤＨ発現と比較した場合）；および３）Ｌａｂタンパク質はまた、増加する（ウェスタンブロット／スロットブロット分析を用いて）。Ａ５４９細胞についてのｐＨにおける細胞内変化（外部変化に起因する）は、正常細胞について報告された細胞内変化と同一である。ｌａｂの増加した発現はまた、細胞死に起因しない（ＭＴＴアッセイによって測定した場合）（Ｓｉｄｄｉｑｕｅら，１９９２）。さらに、種々のｐＨ溶液での組換えＬａｂのインキュベーションは、免疫反応性を変更しない。予備的なデータは、これらの実験が、減少したＣａ＋＋において増殖したＡ５４９細胞に対して行われた場合、誘導されたｌａｂ発現は弱まることを示唆する。
【００５８】
細胞サンプルにおけるガン細胞の診断方法：被験体からの生物学的サンプルは、ガン細胞がこの被験体において存在するか否かを決定するために用いられる。適切なサンプルの例としては、血液および生検材料が挙げられる。診断の１方法は、このサンプル中の細胞由来のＤＮＡを、ｌａｂ遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズし得る標識プローブにストリンジェントな条件（例えば、６×ｓｓｃ；０．０５×ブロット（ｂｌｏｔｔｏ）；５０％  ホルムアミド；４２℃（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９０））下で曝露することである。もちろん、ハイブリダイズする条件は、最適な感度および特異性を達成するために、生物学的サンプルの性質、ガンの型、プローブの調製方法、および組織調製方法に依存して変更される。
【００５９】
サンプルをプローブと接触させた後、次の工程は、このプローブが、このサンプルからのＤＮＡのヌクレオチド配列とハイブリダイズしたか否かを決定することであり、このことから、ｌａｂ遺伝子の存在が推論され、この存在がガンの診断である。
【００６０】
別の診断方法は、既に存在する抗体、または本発明の局面である、この抗原性ペプチドに指向される新規な抗体のいずれかである、好ましくは標識された、モノクローナル抗体を得て、そしてサンプルをこれらの抗体と接触させてＬａｂ抗原を検出させることである。これらのモノクローナル抗体は、Ｌａｂ抗原の検出に関する非常に特異的なアッセイの開発において有用であり、そして多くの異なる形式において実行される試験を可能にし；科学および医学において、より広範な適用をもたらす。
【００６１】
本発明は、腫瘍の表面上に発現される、以前に報告されていなかった新規な遺伝子を記載するという点で有用である。この遺伝子は組織特異的でなく、それゆえ、腫瘍が生じた器官にかかわらず、腫瘍の検出を可能にする。同様に、これらの腫瘍のためのワクチンを生成するためのこの遺伝子の使用は、非常に広範な適用を有する。診断試験はまた、この広範な組織的用途を有し、Ｌａｂ／ｌａｂの検出を、ガンについての、特に以前に腺ガンと指摘されてきたガンについての「汎マーカー（ｐａｎ−ｍａｒｋｅｒ）」とする。
【００６２】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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