(57)【要約】      （修正有）【課題】インビトロ無細胞系タンパク質合成方法において完全にキャップ非依存的に翻訳を行うことができる５’ＵＴＲリーダー配列を提供する。【解決手段】特定の塩基配列および前記塩基配列において塩基の一部が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列であって、コムギ胚芽インビトロ無細胞系タンパク質合成において５’キャップ構造なしでの効率的な翻訳反応を可能とするために使用される５’ＵＴＲリーダー配列、及びタンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に前記配列を接続した鋳型ＤＮＡを用いたインビトロ無細胞系タンパク質合成方法。【選択図】図３
2009165426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離された５’ＵＴＲ（非翻訳領域）リーダー配列であって、コムギ胚芽インビトロ無細胞系タンパク質合成において５’キャップ構造なしでの効率的な翻訳反応を可能とするために使用されることを特徴とする５’ＵＴＲリーダー配列：
（ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列；
（ｂ）配列表の配列番号２に示される塩基配列；および
（ｃ）上記（ａ）および（ｂ）のいずれかの塩基配列において塩基の一部が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列であって、コムギ胚芽インビトロ無細胞系タンパク質合成において５’キャップ構造なしでの効率的な翻訳反応を可能とする塩基配列。
【請求項２】
以下の工程を含むことを特徴とするインビトロ無細胞系タンパク質合成方法：
タンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に請求項１に記載の５’ＵＴＲリーダー配列を接続して鋳型ＤＮＡを作成する工程；
この鋳型ＤＮＡをインビトロで転写してｍＲＮＡを作成する工程；および
このｍＲＮＡをコムギ胚芽由来のインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液と反応させてこのｍＲＮＡからタンパク質を翻訳する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャップ構造を付加しなくても効率的に翻訳反応を行うことができる５’ＵＴＲリーダー配列に関する。本発明はさらに、かかる配列を利用した、低コストで効率が良くしかも簡便なインビトロ無細胞系タンパク質合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学の分野において遺伝子から目的タンパク質を生産する方法は、大別すると二種類ある。一つは遺伝子組換え生物を作成して目的タンパク質を組換え生物に生産させるインビボタンパク質合成方法であり、もう一つはインビトロで細胞抽出液に鋳型ｍＲＮＡを加えて翻訳反応を行うインビトロ無細胞系タンパク質合成方法である。
【０００３】
このうち、インビトロ無細胞系タンパク質合成方法は、生きた細胞を使用しないため、細胞毒性が高いタンパク質でも問題なく生産できるという点でインビボタンパク質合成方法より優れる。また、インビトロ無細胞系タンパク質合成方法は、遺伝子組換え生物を作成する必要がないため、ハイスループット化が可能であるという点でインビボタンパク質合成方法より優れる。これらの利点のため、近年生物学の基礎研究や創薬などの応用研究ではインビトロ無細胞系タンパク質合成方法が多用されている。
【０００４】
しかしながら、インビトロ無細胞系タンパク質合成は、インビボタンパク質合成と異なり、翻訳反応を効率的に行わせるためにキャップアナログという特別な試薬を使用しなければならない。キャップアナログは、ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの５’上流側に５’キャップ構造を付加するためのものであり、この５’キャップ構造が、リボソームの４０ＳサブユニットのｍＲＮＡへの結合を促進して翻訳反応を効率的に行わせるという重要な役割を有するが、キャップアナログはたいへん高価な試薬であり、インビトロ無細胞系タンパク質合成の高コスト化を招く。また、反応系にキャップアナログを加えると転写効率が著しく低下してｍＲＮＡが少量しか得られない。さらに、ｍＲＮＡに取り込まれなかった未反応のキャップアナログが翻訳反応液中に持ち込まれると翻訳反応を阻害するため、転写反応終了後に未反応のキャップアナログをエタノール沈殿やスピンカラムなどを用いて完全に除去しなければならない。
【０００５】
これらの問題の解決のために、ｍＲＮＡのキャップ構造の有無とは無関係に翻訳が開始される特定のウイルス由来の５’ＵＴＲリーダー配列の使用が提案されているが、かかる方法でも完全なキャップ非依存性は見られないのが現状である（非特許文献１）。
【非特許文献１】Ｓａｗａｓａｋｉ  Ｔ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｙ，Ｔｓｕｃｈｉｍｏｃｈｉ  Ｍ，Ｋａｓａｈａｒａ  Ｙ，Ｅｎｄｏ  Ｙ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ．４４，９−１０（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はかかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的はインビトロ無細胞系タンパク質合成方法において完全にキャップ非依存的に翻訳を行うことができる５’ＵＴＲリーダー配列を提供することにある。本発明のさらなる目的は、かかる５’ＵＴＲリーダー配列を利用した、低コストで効率が良くしかも簡便なインビトロ無細胞系タンパク質合成方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下、本発明の完成に到るまでの経緯をまず説明する。真核生物のｍＲＮＡは、タンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に構造遺伝子の翻訳を制御する５’ＵＴＲ（非翻訳領域）リーダー配列が配置され、さらにその５’上流側にリボソームの４０ＳサブユニットのｍＲＮＡへの結合を促進する５’キャップ構造が付加された構造を一般的に有する。真核生物においてｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳開始はいわゆるリボソーム走査モデルで行われる。すなわち、翻訳反応に必要な４０Ｓと６０Ｓの二つのリボソーム・サブユニットのうち、まず４０ＳサブユニットがｍＲＮＡの５’キャップ部位に結合し、下流の５’ＵＴＲリーダー配列を走査する。そして４０Ｓサブユニットが一般には５’ＵＴＲリーダー配列から最初のＡＵＧコドン（翻訳開始ＡＵＧコドン）に遭遇した時点で６０Ｓサブユニットが４０Ｓサブユニットに会合して下流の構造遺伝子の翻訳（タンパク質合成）が開始される（参考文献１，２）。しかし、翻訳開始ＡＵＧコドンの存在のみならずその周辺の配列も翻訳開始の重要なシグナルとしてリボソーム・サブユニットによって認識されること、そして生物種ごとに翻訳開始に適したＡＵＧコドン周辺配列（以下ＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔと称する）が存在することが知られている。例えば、脊椎動物ではいわゆるＫｏｚａｋ配列とよばれるＧＣＣ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ配列（この内、下線を引いたＡＵＧが開始コドンである）が最適ＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔとして知られており、ショウジョウバエのような昆虫、双子葉植物および単子葉植物、酵母などでもそれぞれの最適ＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔがあることが知られている。これら全てのＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔに共通する特徴は、翻訳開始ＡＵＧコドンのＡを＋１ポジションとした時、−３ポジションに当たる塩基が必ずプリン塩基（ＡまたはＧ）であるということである（参考文献１）。また、発現量の多い遺伝子のＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔほど最適ＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔ配列がより保存されているという傾向もある（参考文献３）。
参考文献１：Ｋｏｚａｋ  Ｍ，Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｇｅｎｅ，２３４，１８７−２０８（１９９９）
参考文献２：Ｋｏｚａｋ  Ｍ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｍＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｇｅｎｅ，３６１，１３−３７（２００５）
参考文献３：Ｍｉｙａｓａｋａ  Ｈ，Ｋａｎａｉ  Ｓ，Ｔａｎａｋａ  Ｓ，Ａｋｉｙａｍａ  Ｈ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｍ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，６６，６６７−６６９（２００２）
【０００８】
本発明者は真核生物の翻訳開始因子１（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉｔａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １：ｅＩＦ１）遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列のＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔを多数の真核生物で調べた結果、この遺伝子がきわめて発現量が多い遺伝子であるにもかかわらず、その５’ＵＴＲリーダー配列のＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔが調査したあらゆる真核生物で最適配列から大きく外れていることを見出した。図１はヒト、ショウジョウバエ、シロイヌナズナ（双子葉植物）、およびコムギ（単子葉植物）において、ｅＩＦ１、真核生物翻訳開始因子１Ａ（ｅＩＦ１Ａ）、真核生物翻訳開始因子５（ｅＩＦ５）、および真核生物翻訳開始因子３（ｅＩＦ３）シータサブユニットの遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列のＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔをそれぞれの生物の最適配列と比較した表であり、その右端には最適配列との一致箇所数が示されている。この表から、ｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列のＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔはどの生物種においても、他の遺伝子のそれと比べると明らかに一致箇所数が少なく、最適配列から大きく外れていることがわかる。また、特に重要な−３ポジションは、ｅＩＦ１Ａ，ｅＩＦ５、およびｅＩＦ３シータサブユニットでは常に最適なプリン塩基（Ｐｕ：ＡまたはＧ）であるのに対して、ｅＩＦ１では常に不適切なピリミジン塩基（Ｐｙ：ＣまたはＵ）になっている。ｅＩＦ１は３０種類以上ある翻訳開始因子タンパク質の一つであり、リボソームがｍＲＮＡの５’ＵＴＲリーダー配列を走査して翻訳開始ＡＵＧコドンを認識する際、適正なＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔを認識するのに重要な役割を果たしていると考えられている。ｅＩＦ１は適切なＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔの認識に関与するにもかかわらず、その遺伝子自体のＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔは皮肉なことに非常に不適切であり、特に最も重要な−３ポジションが全ての生物で適切なプリン塩基（ＡまたはＧ）ではなく不適切なピリミジン塩基（ＣまたはＴ）となっている。このことは、ｅＩＦ１遺伝子の翻訳開始に他の遺伝子とは異なる特殊なメカニズムが存在することを示唆していると本発明者は考えた。
【０００９】
そこで、本発明者はインビトロ無細胞タンパク質翻訳系としてよく利用されるコムギ胚芽系において、コムギのｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列（配列番号１）を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としてその翻訳効率を調査した。その結果、ｅＩＦ１遺伝子のＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔは非常に不適切な配列であるにもかかわらず、同遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列を利用した場合、効率良くインビトロでの翻訳が起こることが判った。また、不適切なＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔを適切な配列（配列番号５）に変えた変異体では、むしろ翻訳効率が下がり、このことからｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列が特殊な機能を持っていることが示された。
【００１０】
本発明者はさらに、５’ＵＴＲリーダー配列の上流に５’キャップ構造を付加（キャップ化）したｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列とキャップ化していないｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列によるインビトロ翻訳反応の効率をルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として比較した。その結果を図２に示す。対照としてｅＩＦ１と翻訳開始プロセスで共同的に働くｅＩＦ１Ａタンパク質をコードする遺伝子（ｅＩＦ１Ａ遺伝子）の５’ＵＴＲリーダー配列を用いた。図２から明らかなように、ｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列を用いた場合はキャップ化してもしなくても高い翻訳効率が得られたのに対して、対照のｅＩＦ１Ａ遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列ではキャップ化しない場合、キャップ化したときと比べて著しく翻訳効率が低下した。このことから、ｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列はキャップ化した場合でもしない場合でも同様に効率良く翻訳され、ｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列は効率的な翻訳にキャップ化を必要としないことが判明した。また、図２に示すように、ｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列のＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔであるＧＡＴＴＴＣＡＵＧをコムギの最適配列であるＧＣＣＧＣＣＡＵＧに変えた変異体（ｅＩＦ１  ＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔ最適化変異体）ではキャップ化したときと比べてキャップ化しないときには翻訳効率が著しく低下した。このことから、ｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列のＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔが不適切な配列であることが、同遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列がキャップ化されなくても効率的な翻訳を可能とすることと関係があることが示された。
【００１１】
さらに、本発明者はｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列のキャップ非依存性について調べることを目的として、ｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列において多くの植物種で保存されている１１箇所の塩基に変異を導入した変異体（配列番号２）を作成し、これを使用して翻訳効率におよぼす影響を検討した。その結果を図３に示す。保存されている塩基に変異を導入することによりキャップ非依存性が低下するとの予想のもとに検討を行ったが、結果は本発明者の予想に反し、図３に示されたように変異体のキャップ非依存性は低下せず、しかも翻訳効率は変異を入れていないｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列に比べて１．５倍以上向上した。本発明者の予想とは逆の結果ではあったが、このことから、ｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列に変異を導入することにより翻訳効率をさらに高めることが可能なことが示された。
【００１２】
これらの知見に基づき、本発明者は遂に本発明の完成に至った。即ち、本発明によれば、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む単離された５’ＵＴＲリーダー配列であって、コムギ胚芽インビトロ無細胞系タンパク質合成において５’キャップ構造なしでの効率的な翻訳反応を可能とするために使用されることを特徴とする５’ＵＴＲリーダー配列が提供される：
（ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列；
（ｂ）配列表の配列番号２に示される塩基配列；および
（ｃ）上記（ａ）および（ｂ）のいずれかの塩基配列において、塩基の一部、好ましくは１個から数個が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列であって、コムギ胚芽インビトロ無細胞系タンパク質合成において５’キャップ構造なしでの効率的な翻訳反応を可能とする塩基配列。
また、本発明によれば、以下の工程を含むことを特徴とするインビトロ無細胞系タンパク質合成方法が提供される：
タンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に請求項１に記載の５’ＵＴＲリーダー配列を接続して鋳型ＤＮＡを作成する工程；
この鋳型ＤＮＡをインビトロで転写してｍＲＮＡを作成する工程；および
このｍＲＮＡをコムギ胚芽由来のインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液と反応させてこのｍＲＮＡからタンパク質を翻訳する工程。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の５’ＵＴＲリーダー配列は、キャップ化しなくてもキャップ化した場合と同等またはそれ以上の高い翻訳効率を示す。従って、目的とする有用タンパク質をコードする遺伝子の上流に本発明の５’ＵＴＲリーダー配列を組込んだものを鋳型として使用すれば、高価なキャップアナログを用いて５’キャップ構造を付加しなくてもインビトロ無細胞系タンパク質合成を効率的に行うことができる。また、結果として、キャップアナログの使用によるコストアップや反応効率の低下や工程の煩雑化の問題を回避することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の５’ＵＴＲリーダー配列は、キャップ構造に依存することなく、インビトロ無細胞系タンパク質合成において効率的に翻訳反応を行う機能を有するものである。ここで「効率的に」とは、本発明の５’ＵＴＲリーダー配列を使用してインビトロ無細胞系タンパク質合成反応を行ったとき、キャップ化した場合とキャップ化しなかった場合での比較で、キャップ化しなかった場合においてキャップ化した場合と同等またはそれ以上の翻訳効率を示すことを指す。
【００１５】
具体的には、本発明の５’ＵＴＲリーダー配列は以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を含む：
（ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列；
（ｂ）配列表の配列番号２に示される塩基配列；および
（ｃ）上記（ａ）および（ｂ）のいずれかの塩基配列において、塩基の一部、好ましくは１個から数個が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列であって、コムギ胚芽無細胞系タンパク質合成において５’キャップ構造なしでの効率的な翻訳反応を可能とする塩基配列。
【００１６】
（ａ）の配列番号１に示される塩基配列は、コムギの真核生物翻訳開始因子１（ｅＩＦ１）遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列に相当する。（ｂ）の配列番号２に示される塩基配列は、（ａ）の配列番号１に示される塩基配列の変異体に相当し、具体的には（ａ）の配列番号１に示される塩基配列において多くの植物種で保存されている１１箇所の塩基に変異を導入したものである。配列番号１の塩基配列と比較した配列番号２の塩基配列の変異箇所を図４に示す。以下の実施例に示されるように、配列番号２の塩基配列は、配列番号１の塩基配列より１．５倍以上優れた翻訳効率を示す優れた変異体５’ＵＴＲリーダー配列である。
【００１７】
（ｃ）の塩基配列は、（ａ）または（ｂ）の塩基配列と同等の機能を有し均等の範囲に含まれる変異体塩基配列であるか、または（ａ）または（ｂ）の塩基配列より機能的に優れた変異体塩基配列である。（ａ）または（ｂ）の塩基配列への一部の塩基の欠失、置換、挿入または付加は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（タカラバイオ製）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）等の市販キットを使用して容易に行うことができる。得られた変異体塩基配列が（ａ）または（ｂ）の塩基配列と同等またはそれ以上の機能を有するかどうかは、この変異体塩基配列を５’ＵＴＲリーダー配列として使用してコムギ胚芽インビトロ無細胞系タンパク質合成において５’キャップ構造なしで翻訳反応を行わせ、翻訳反応が起こるかどうかおよびその翻訳効率はどの程度かを測定することによって容易に確認することができる。特に、本発明の５’ＵＴＲリーダー配列の場合、実施例に示されたように保存塩基を失わせる方向の変異導入によって（ａ）または（ｂ）の塩基配列より機能的に一層優れた変異体を得られる可能性もある。
【００１８】
次に、本発明の５’ＵＴＲリーダー配列を利用したインビトロ無細胞系タンパク質合成方法について説明する。本発明の５’ＵＴＲリーダー配列を利用してインビトロ無細胞系タンパク質合成を行うにはまず、合成したい目的タンパク質をコードする構造遺伝子の５’上流側に本発明の５’ＵＴＲリーダー配列を接続して本発明の鋳型ＤＮＡを作成する。これは、実際には適当なベクターを準備しておき、そこに構造遺伝子および本発明の５’ＵＴＲリーダー配列を適切な配向で組込んで組換えベクターを作成することにより容易に行うことができる。本発明の鋳型ＤＮＡは、５’ＵＴＲリーダー配列の５’上流側に転写を促進させるためのプロモーター配列を有することが好ましい。使用するプロモーター配列としては、例えば、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列などを挙げることができる。また、構造遺伝子の３’下流側には転写を終結させるためのターミネーター配列を有することが好ましい。使用するターミネーター配列としては、例えば、Ｔ７ターミネーター配列、ＳＰ６ターミネーター配列、Ｔ３ターミネーター配列などを挙げることができる。
【００１９】
次に、このようにして作成された本発明の鋳型ＤＮＡをインビトロで転写してｍＲＮＡを作成する。この転写反応は、例えば、ＲｉｂｏＭａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）などの市販の試薬キットを利用して容易に行うことができる。通常のインビトロ細胞系タンパク質合成方法では、この転写反応の際に反応系に高価なキャップアナログを添加してｍＲＮＡに５’キャップ構造を付加する必要があるが、本発明の方法の場合、反応系にキャップアナログを添加する必要はない。作成されたｍＲＮＡは常法により精製すればよい。
【００２０】
最後に、このｍＲＮＡをコムギ胚芽由来のインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液と反応させてこのｍＲＮＡからタンパク質を翻訳する。この反応に使用するコムギ胚芽由来のインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液としては、Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｐｌｕｓ（プロメガ社製）やＰＲＯＴＥＩＯＳ（東洋紡績社製）などの市販の試薬キットを利用することができる。なお、本反応において反応液としてコムギ胚芽由来のものを使用するのは、本発明の５’ＵＴＲリーダー配列がコムギ由来の配列であるためにコムギ胚芽由来の反応液との相性が良いからである。通常のインビトロ無細胞系タンパク質合成方法とは異なり、このｍＲＮＡには５’キャップ構造が付加されていないが、本発明の５’ＵＴＲリーダー配列のおかげでリボソームの４０ＳサブユニットのこのｍＲＮＡへの結合及び続く目的タンパク質の翻訳は５’キャップ構造が付加されていない場合と同等またはそれ以上の効率で行われる。翻訳反応終了後は反応液中に生成された目的タンパク質を常法により回収して精製すればよい。
【００２１】
本発明の５’ＵＴＲリーダー配列を利用したインビトロ無細胞系タンパク質合成方法によれば、高価なキャップアナログを使用してｍＲＮＡをキャップ化しなくてもｍＲＮＡからタンパク質への翻訳が効率的に行われるので、目的とするタンパク質を低コストで合成することができる。また、キャップアナログを使用しないので、高反応効率でかつ簡便な工程で目的とするタンパク質を合成することができる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明の５’ＵＴＲリーダー配列の効果をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００２３】
以下の実施例では、本発明の５’ＵＴＲリーダー配列として配列表の配列番号１に示される塩基配列および配列番号２に示される塩基配列を使用した。配列番号１の塩基配列は、コムギｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列であり、配列番号２の塩基配列は、配列番号１の塩基配列において図４に示すように多くの植物種で保存されている１１箇所の塩基に変異を導入した変異体（変異導入ｅＩＦ１変異体）である。ただし、実際の使用にあたっては遺伝子操作を可能とするため各塩基配列の５’側および３’側に制限酵素ＫｐｎＩ認識部位およびＢｓｔＥＩＩ認識部位がそれぞれ付与されたものを使用した。それらの塩基配列を配列表の配列番号３および配列番号４にそれぞれ示す。
【００２４】
また、比較例の５’ＵＴＲリーダー配列として配列表の配列番号５に示される塩基配列および配列番号６に示される塩基配列を使用した。配列番号５の塩基配列は、配列番号３の塩基配列においてＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔであるＧＡＴＴＴＣＡＵＧを最適配列であるＧＣＣＧＣＣＡＵＧに変えた変異体（ｅＩＦ１  ＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔ最適化変異体）である。配列番号６の塩基配列は、ｅＩＦ１遺伝子とは別の遺伝子であるコムギｅＩＦ１Ａ遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列である。
【００２５】
（１）鋳型ＤＮＡ（組換えベクター）の作成
目的タンパク質として代表的なレポータータンパク質であるルシフェラーゼを使用し、ルシフェラーゼ遺伝子の５’上流側に配列番号３〜６のいずれかの５’ＵＴＲリーダー配列を接続して鋳型ＤＮＡを作成した。
具体的には、配列番号３〜６に示される塩基配列を、参考文献４，５の方法によって合成し、合成した塩基配列を制限酵素ＫｐｎＩとＢｓｔＥＩＩで消化し、これをルシフェラーゼ遺伝子を有するｐＳＰ−Ｌｕｃ＋ＮＦ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）のＴ７プロモーター配列とルシフェラーゼ遺伝子の開始コドン部分との間にあるＫｐｎＩとＢｓｔＥＩＩサイトにライゲーション反応で挿入して組換えベクターを作成した。作成した組換えベクターは大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社製）中で増幅させた。増幅させたベクターの一部について、挿入した５’ＵＴＲリーダー配列領域とルシフェラーゼコード領域の塩基配列解析を行い、目的の５’ＵＴＲリーダー配列が正しくルシフェラーゼの開始コドンの上流に挿入されたことを確認した。
参考文献４：Ａｕ  ＬＣ，Ｙａｎｇ  ＦＹ，Ｙａｎｇ  ＷＪ，Ｌｏ  ＳＨ，Ｋａｏ  ＣＦ．Ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ａ  ＬＣＲ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ：ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｐｔｉｎ−Ｌ５４  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２４８，２００−２０３，（１９９８）
参考文献５：Ｒｏｕｉｌｌａｒｄ  ＪＭ，Ｌｅｅ  Ｗ，Ｔｒｕａｎ  Ｇ，Ｇａｏ  Ｘ，Ｚｈｏｕ  Ｘ，Ｇｕｌａｒｉ  Ｅ．Ｇｅｎｅ２Ｏｌｉｇｏ：ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２，Ｗ１７６−１８０，（２００４）
【００２６】
（２）インビトロ転写反応による鋳型ＤＮＡ（組換えベクター）からのｍＲＮＡの作成
（１）で作成した鋳型ＤＮＡからインビトロ転写反応によりｍＲＮＡを作成した。その際、反応液組成としてキャップアナログを添加しないものと添加したものの２種類を使用し、非キャップ化ｍＲＮＡおよびキャップ化ｍＲＮＡをそれぞれ合成した。
具体的には、（１）で作成した各組換えベクターを、制限酵素ＸｈｏＩで消化して直鎖化し、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。直鎖化したベクター６μｇを鋳型ＤＮＡとして、ＲｉｂｏＭａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（プロメガ社製）を使用して以下の反応液組成ＡまたはＢで、３７℃、４時間のインビトロ転写反応を行い、非キャップ化ｍＲＮＡおよびキャップ化ｍＲＮＡを合成した。
転写反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去し、続いてエタノール沈殿を行った。沈殿したｍＲＮＡをＤＥＰＣ処理滅菌水に溶解し、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度を測定して定量して、約１μｇ／μｌの濃度となるように調整した。ｍＲＮＡがＲＮＡｓｅの分解を受けて断片化していないことは、アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００２７】
反応液組成Ａ（非キャップ化ｍＲＮＡ合成用）
ＳＰ６  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ５ｘｂｕｆｆｅｒ                ２０μＬ
ｒＮＴＰｓ（２５ｍＭ  ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，ＵＴＰ）              ２０μＬ
直鎖化したベクター                                          ６μｇを含む液量
ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ酵素液                                    １０μＬ
ＤＥＰＣ処理蒸留水により全量を１００μＬとした
【００２８】
反応液組成Ｂ（キャップ化ｍＲＮＡ合成用）
ＳＰ６  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ５ｘｂｕｆｆｅｒ                ２０μＬ
ｒＮＴＰｓ（２５ｍＭ  ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰおよび３ｍＭ  ＧＴＰ）  ２０μＬ
直鎖化したベクター                                          ６μｇを含む液量
Ｒｉｂｏｍ  ７Ｇ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ（４０ｍＭ）                    ４μＬ
ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ酵素液                                    １０μＬ
ＤＥＰＣ処理蒸留水により全量を１００μＬとした
【００２９】
（３）インビトロ無細胞系タンパク質合成によるｍＲＮＡからの目的タンパク質の翻訳および翻訳効率の測定
（２）で作成した非キャップ化ｍＲＮＡおよびキャップ化ｍＲＮＡを、コムギ胚芽由来のインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液であるＷｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｐｌｕｓ（プロメガ社製）と反応させてこのｍＲＮＡから目的タンパク質であるルシフェラーゼのインビトロ翻訳反応を行った。具体的な反応液組成は以下に示す通りであり、反応は２５℃で１５分間行った。
反応液組成
Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｐｌｕｓ      ２０μＬ
非キャップ化ｍＲＮＡまたはキャップ化ｍＲＮＡ          ４μｇを含む液量
ＤＥＰＣ処理蒸留水により全量を３３μＬとした。
【００３０】
反応終了後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を使用して、反応液中に生成されたルシフェラーゼタンパク質の活性（化学発光の強度）を測定し、タンパク質翻訳効率の指標とした。その結果を図２および図３に示す。
【００３１】
図２はコムギｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列（配列番号１（３））、コムギｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列のＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔを最適化した変異体（配列番号５）、コムギｅＩＦ１Ａ遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列（配列番号６）のそれぞれを５’ＵＴＲリーダー配列として使用してインビトロ無細胞系タンパク質合成方法により合成したルシフェラーゼの活性測定結果を示す。図２からわかるように、コムギｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列を使用した本発明例では非キャップ化、キャップ化で翻訳効率にほとんど差がみられなかったのに対して、コムギｅＩＦ１Ａ遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列を使用した比較例では非キャップ化ｍＲＮＡでは著しく翻訳効率が低下した。また、ｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列のＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔを最適化した変異体を使用した比較例では元のｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列を使用した本発明例に比べて非キャップ化の場合にむしろ翻訳効率が低下した。この結果からコムギｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列（配列番号１（３））を利用することにより、ｍＲＮＡをキャップ化しなくても効率よく翻訳反応を行わせることができることが示された。
【００３２】
図３はコムギｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列、およびこの配列において多くの植物種で保存されている１１箇所の塩基に変異を導入した変異体（配列番号２（４））を５’ＵＴＲリーダー配列として使用してインビトロ無細胞系タンパク質合成方法により合成したルシフェラーゼの活性測定結果を示す。本発明者の予想は、かかる変異を導入することによって変異体ではルシフェラーゼ活性が低下するというものであったが、結果は予想に反してルシフェラーゼ活性は変異体の方が元の野生型配列より有意に高くなった。このことからコムギｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列（配列番号１（３））に変異を導入することによりさらに翻訳効率を向上させることが可能なこと、そしてかかる変異としては保存塩基を失わせる方向の変異が有効でありうることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の５’ＵＴＲリーダー配列を利用したインビトロ無細胞系タンパク質合成方法は、高価でしかも反応効率の低下や工程の複雑化をもたらすキャップアナログを用いて５’キャップ構造を付加しなくても目的タンパク質の合成を効率的に行うことができるので、安価で効率が良く工程も簡便なタンパク質合成方法として生物学等の基礎研究や創薬などの応用研究に広く利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ヒト、ショウジョウバエ、シロイヌナズナ、およびコムギの４種類の真核生物翻訳開始因子遺伝子のＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔの最適配列との比較を示す。
【図２】実施例で使用した３種類の５’ＵＴＲリーダー配列の翻訳効率を示す。
【図３】実施例で使用した２種類の５’ＵＴＲリーダー配列の翻訳効率を示す。
【図４】配列番号１の塩基配列と配列番号２の塩基配列との相違点を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３５】
配列番号１および３はコムギｅＩＦ１遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列である。
配列番号２および４は変異導入ｅＩＦ１変異体の配列である。
配列番号５はｅＩＦ１  ＡＵＧ  ｃｏｎｔｅｘｔ最適化変異体の配列である。
配列番号６はコムギｅＩＦ１Ａ遺伝子の５’ＵＴＲリーダー配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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