(57)【要約】【課題】リン脂質がカプセル内に封入した標識物質を効率よく検出するためのアナライト分析用カプセル及びそれを用いたアナライト分析方法を提供する。【解決手段】カプセルの内部に標識物質及び金属コロイド粒子を封入し、前記カプセル表面にリガンドを接続したアナライト分析用カプセルに検出すべきアナライトを反応させる反応ステップと、未反応のアナライト分析用カプセルを除去する洗浄ステップと、アナライト結合アナライト分析用カプセルを電極に添加する電極添加ステップと、前記アナライト分析用カプセルに対して電圧を印加してアナライト分析用カプセルに封入した標識物質からの電気化学発光量を測定する測定ステップと、からなるアナライト分析方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプセルの内部に標識物質及び金属コロイド粒子を封入し、前記カプセル表面にリガンドを接続したアナライト分析用カプセル。
【請求項２】
前記カプセルは親水基と疎水基とを備えた物質からなる、請求項１に記載のアナライト分析用カプセル。
【請求項３】
前記親水基は、リン酸、糖、アミノ酸、グリセリン、コリン、アルコール、エタノールアミン、イノシトール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、アルデヒド、アミンまたはこれらの組み合わせからなり、
前記疎水基は、脂肪酸、テルペノイド、ステロイド、カロテノイド、スフィンゴシン、アルキル鎖またはこれらの組み合わせからなる、請求項２に記載のアナライト分析用カプセル。
【請求項４】
前記親水基と疎水基とを備えた物質は、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、コレステロール、ジセチルリン酸、ステアリルアミン、α―トコフェロール、ガングリオシド、リゾホスファチジルコリン、セレブロシド、カルジオリピン、モノガラクトシルジグリセリド、オレイルジメチルアミンオキシドの何れかである、請求項２に記載のアナライト分析用カプセル。
【請求項５】
前記標識物質は酸化還元性を有する化合物である、請求項１に記載のアナライト分析用カプセル。
【請求項６】
前記酸化還元性を有する化合物は電気化学発光を示す化合物である、請求項５に記載のアナライト分析用カプセル。
【請求項７】
前記金属コロイド粒子は前記標識物質の酸化還元反応を行うことができる電位を与えることが可能な物質である、請求項１に記載のアナライト分析用カプセル。
【請求項８】
前記金属コロイド粒子は金、白金、銀、パラジウム、ロジウム、イリジウム、タングステン、カーボンから選ばれる、請求項７に記載のアナライト分析用カプセル。
【請求項９】
前記リガンドは抗原、抗体、核酸またはこれらの組み合わせからなりアナライトと反応する物質である、請求項１に記載のアナライト分析用カプセル。
【請求項１０】
前記アナライトは抗原、抗体、核酸またはこれらの組み合わせからなりリガンドと反応する物質である、請求項１に記載のアナライト分析用カプセル。
【請求項１１】
請求項１に記載のアナライト分析用カプセルに検出すべきアナライトを反応させる反応ステップと、
未反応のアナライト分析用カプセルを除去する洗浄ステップと、
アナライト結合アナライト分析用カプセルを電極に添加する電極添加ステップと、
前記アナライト分析用カプセルに対して電圧を印加してアナライト分析用カプセルに封入した標識物質からの電気化学発光量を測定する測定ステップと、
からなるアナライト分析方法。
【請求項１２】
前記洗浄ステップの後に、アナライト分析用カプセルを破壊する工程を設けた請求項１１に記載のアナライト分析方法。
【請求項１３】
前記反応ステップは電極上で反応を行うこととする請求項１１に記載のアナライト分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定のアナライトを、高感度に検出するためのアナライト分析用カプセル及びそれを用いたアナライト分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来のアナライト分析方法は、リン脂質の２分子膜をカプセルとして用いた抗体修飾カプセルの内部に、標識物質として電気化学発光物質であるルテニウム錯体を封入したカプセルを準備し、あらかじめ測定対象物質を固定した電極上に、このカプセルとサンプルとを共に添加して競合反応させる。
【０００３】
洗浄後、前記測定対象物質と結合したカプセルを破壊し、ルテニウム錯体を流出させ、電極に電圧を印加することにより、前記ルテニウム錯体から生じた電気化学発光を測定し、その発光量から対象のアナライト量を分析していた（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
ここで、ルテニウム錯体の電気化学発光について詳述する。電極近傍に存在する二価のルテニウム錯体及び、シュウ酸や第三級アミンなどの還元体は、陽極下で酸化され、三価のルテニウム錯体及び、還元体の酸化物を生成する。還元体の酸化物は、脱プロトン反応により、還元性の高い中間体となる。三価のルテニウム錯体は、この中間体によって還元され、励起状態のルテニウム錯体となり、基底状態に遷移する際に発光が生じる。
【０００５】
このときに、不要物質として、電極上に固定されたタンパク質等の測定対象物質や、カプセルの原料となるリン脂質が破壊され、溶出したルテニウム錯体と共に電極上に存在する。
【特許文献１】特開２００７−１０１３３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の構成では、ルテニウム錯体を電極に吸着させる際に、この不要物質も一緒に電極上に吸着されるため、大部分のルテニウム錯体が電極に接近できない。したがって、リポソーム内にルテニウム錯体を多量に入れても、発光に利用できるルテニウム錯体の数が少ないため、発光量が向上しないという課題を有していた。
【０００７】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、カプセル内に封入した標識物質を効率よく検出するためのアナライト分析用カプセル及びそれを用いたアナライト分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために、本発明のアナライト分析用カプセル及びそれを用いたアナライト分析方法は、カプセルの内部に標識物質及び金属コロイド粒子を封入し、前記カプセル表面にリガンドを接続したアナライト分析用カプセルを特徴としたものである。
【０００９】
また、本発明は、前記カプセルは親水基と疎水基とを備えた物質からなる、ことを特徴としたものである。
【００１０】
さらに、アナライト分析用カプセル及びそれを用いたアナライト分析方法において、前記親水基はリン酸、糖、アミノ酸、グリセリン、コリン、アルコール、エタノールアミン、イノシトール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、アルデヒド、アミンまたはこれらの組み合わせからなり、前記疎水基は脂肪酸、テルペノイド、ステロイド、カロテノイド、スフィンゴシン、アルキル鎖またはこれらの組み合わせからなることを特徴としたものである。
【００１１】
さらに、アナライト分析用カプセル及びそれを用いたアナライト分析方法において、
アナライト分析用カプセルに検出すべきアナライトを反応させる反応ステップと、未反応のアナライト分析用カプセルを除去する洗浄ステップと、アナライト結合アナライト分析用カプセルを電極に添加する電極添加ステップと、前記アナライト分析用カプセルに対して電圧を印加してアナライト分析用カプセルに封入した標識物質からの電気化学発光量を測定する測定ステップからなることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のアナライト分析用カプセル及びそれを用いたアナライト分析方法によれば、金属コロイド粒子と標識物質とをカプセルに封入させることにより、前記金属コロイド粒子が電子伝達の役割を果たし、電極近傍から離れた標識物質の電子授受を行うことが可能となる。その結果、効率良く標識剤からのシグナルを得ることができ、従来法よりも高感度なアナライト分析が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に、本発明のアナライト分析用カプセル及びそれを用いたアナライト分析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１４】
（実施の形態１）
本実施例では、本発明のアナライト分析用カプセルの詳細を説明する。以下に、アナライト分析用カプセルの具体的な作製の詳細を示す。
【００１５】
まず、カプセルの材料を準備する。カプセルの材質は、親水基と疎水基から形成されるものであれば特に限定されず、前記親水基は、リン酸、糖、アミノ酸、グリセリン、コリン、アルコール、エタノールアミン、イノシトール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、アルデヒド、アミンまたはこれらの組み合わせからなり、前記疎水基は、脂肪酸、テルペノイド、ステロイド、カロテノイド、スフィンゴシン、アルキル鎖またはこれらの組み合わせからなる。具体的には、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、コレステロール、ジセチルリン酸、ステアリルアミン、α―トコフェロール、ガングリオシド、リゾホスファチジルコリン、セレブロシド、カルジオリピン、モノガラクトシルジグリセリド、オレイルジメチルアミンオキシドのうちの何れか用いれば良い。
【００１６】
次に、標識物質及び金属コロイド粒子を準備する。標識物質は、酸化還元反応を示す物質であれば特に限定されず、フェロシアン化カリウム、フェロセン、カテコールアミンなどの電子伝達物質や、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエン、トリスビピリジンルテニウム錯体、トリスビピリジンオスニウム錯体などの電気化学発光物質を挙げることができる。
【００１７】
金属コロイド粒子は、上記標識物質の酸化還元反応を行うことができる電位を与えることが可能な物質であれば特に限定されないが、金、白金、銀、パラジウム、ロジウム、イリジウム、タングステン、カーボンが好ましい。
【００１８】
上述したカプセルに標識物質及び、金属コロイド粒子を下記のステップで封入させる。
【００１９】
（ステップ１）
図１に、カプセル作製の手順を示す。まず、容器内に、有機溶媒に溶解させたカプセル材料を注入後（ａ）、エバポレーションや窒素気流下で有機溶媒を除去させることにより、容器の内壁に薄膜を形成させる（ｂ）。その後、前記標識物質及び、前記金属コロイド粒子を溶解させた溶液を添加し（ｃ）、振とう機や超音波装置などで激しく振とうさせることで、カプセルを形成させる（ｄ）ことができる。
【００２０】
なお、ステップ２で後述するリガンドと結合させるために、前記カプセル材料の一部に前記リガンドと共有結合させる物質を前記カプセル材料と同時に添加する。共有結合の例としては、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、ジスルフィド結合が挙げられ、もっとも広く使用されているのは、ジスルフィド結合、チオエーテル結合といった、チオールを利用した手法である。この手法は公知であるが、一例を挙げると、ジスルフィドやマレイミド等を親水基に修飾した脂肪酸（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）等を挙げることができる。
【００２１】
（ステップ２）
（ステップ１）で作製したカプセルにリガンドを結合させる。リガンドは、抗原、抗体、核酸のいずれかから選択される。また、（ステップ１）で作製したカプセルと結合させるために、リガンドに反応基を修飾させる。（ステップ１）の例で挙げたジスルフィドやマレイミドの場合、リガンドにはチオール基を修飾させる。リガンドが核酸の場合、５´末端若しくは３´末端にチオール基を修飾させた核酸を合成する。また、リガンドが抗原、及び抗体の場合、アミノ酸のシステイン残基を利用したり、チオール基を有するアミノ基もしくはカルボン酸を用いて縮合反応を行い、前記リガンドにチオール基を修飾させたりする。これらの手法は公知のため、詳細は省略する。
【００２２】
このようにして作製したアナライト分析用カプセルの一例を図２に示す。この図では、カプセルの材料としてリン脂質の２分子膜を使用した。そのカプセル内に標識物質であるルテニウム錯体と金属コロイド粒子の金コロイドを内封させた。また、カプセル表面には、リガンドとして抗体を修飾させた。
【００２３】
（実施の形態２）
本実施例では、本発明のアナライト分析用カプセルを用いた分析方法について図３を用いて説明する。なお、ここでは、アナライトとして遺伝子サンプルについて詳述するが、抗原若しくは抗体をアナライトとして用いても良い。
【００２４】
遺伝子サンプルとは、例えば、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他遺伝子を含有する任意の試料から、該試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させたものである。また、ＲＮＡから逆転写にて得られるｃＤＮＡを遺伝子サンプルとして用いても良い。さらに、制限酵素で切断して電気泳動による分離等で精製した核酸断片を用いるのでもよい。
【００２５】
（ステップ１）
まず、捕捉プローブを作製する（図３ａ）。この捕捉プローブは、化学合成で得られた一本鎖の核酸あるいは、生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸を用いることができる。生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。
【００２６】
（ステップ２）
そしてこの後、前述のようにして得られた捕捉プローブを固相に固定する（図３ｂ）。本発明で用いる固相は、特に限定されず、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属や、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭化物や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物や、Ｓｉ、Ｇｅ、 ＺｎＯ、 ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体等が挙げられる。なお、以上の物質は電極として利用することができる。その場合、これらの電極は、導電性高分子によって被覆しても良く、このように被覆することによって、より安定な捕捉プローブ固定化電極を調製することができる。
【００２７】
なお、前記捕捉プローブを前記固相に固定化する方法としては、公知の方法が用いられる。一例をあげると、例えば前記固相が金電極である場合、固定する捕捉プローブの５’−もしくは３’−末端（好ましくは、５’−末端）にチオール基を導入し、金とイオウとの共有結合を介して、前記捕捉プローブが該金電極に固定される。この捕捉プローブにチオール基を導入する方法は、文献（Ｍ．Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１８０５〜１８０８（１９９４）及びＢ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，４４８４（１９８５））に記載されている手法が挙げられる。即ち、前記方法によって得られたチオール基を有する捕捉プローブを、金電極に滴下し、室温下で数時間放置することにより、該捕捉プローブが電極に固定され、捕捉プローブが作製される。
【００２８】
（ステップ３）
次に、検査対象となる遺伝子サンプルを作製する。この遺伝子サンプルは、前述したように、任意の試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖に変性させる（図３ｃ）。このとき、前記試料中の細胞の破壊は、公知の技術、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。
【００２９】
（ステップ４）
アナライト分析用カプセルを作製する（図３ｄ）。この手法は（実施の形態１）で詳述したので、ここでは省くが、リガンドは、遺伝子サンプルと相補的で且つ、捕捉プローブとは異なる部位で認識する配列を使用する。
【００３０】
（ステップ５）
上述した固相に固定化した捕捉プローブに、前記遺伝子サンプル及び前記アナライト分析用カプセルを含む溶液を添加する。これにより、前記遺伝子サンプルと、前記捕捉プローブ及び前記アナライト分析用カプセルとがハイブリダイズし、前記遺伝子サンプル及び、前記アナライト分析用カプセルが固相に固定される（図３ｅ）。このハイブリダイズさせる手法は周知であるため、ここでは説明を省略する。
【００３１】
（ステップ６）
前記遺伝子サンプルと、前記捕捉プローブ及び前記アナライト分析用カプセルとで二本鎖ＤＮＡを形成させた後、リン酸バッファーなどで洗浄処理をして、未反応の遺伝子サンプル及びアナライト分析用カプセルなどを除去する。
【００３２】
（ステップ７）
次に、固相に固定した、前記アナライト分析用カプセルを破壊して標識物質を溶出させる（図３ｆ）。破壊手法は、熱をかけてカプセルの成分を融解させる手法や、アルコールを添加させることにより膜を破壊する手法等が挙げられる。なお、十分な感度が得られるのであれば、この工程は行わなくても良い。
【００３３】
（ステップ８）
前記固相に電解液を添加し、電圧を印加させることにより生じた信号は、電流の場合は、アンペロメトリー等で計測し、電気化学発光の場合は、フォトマルチプライヤー等で計測する。ここで、電極上には金属コロイド粒子が存在し、電極近傍から離れた標識物質も電極近傍と同様の現象が生じるため、立体障害に左右されることなく、有効にシグナルを読み取ることができ、その結果、高感度測定が可能となる。
【００３４】
なお、カプセル内に電子を授受することが可能なカプセルを用いる場合、（ステップ６）のように、カプセルを破壊しなくても、金属コロイド粒子の効果により、標識物質を有効に発光させることができ、シグナルを読み取ることが可能である。
【００３５】
以下に実施例として、本発明のアナライト分析用カプセルを用いたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の測定手順を詳細に説明する。
【００３６】
（１）ＢＳＡ用アナライト分析カプセルの作製
（１−１）活性型ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）の調製
ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）６．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）３．８ｍｇ（２０μｍｏｌ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）２．８μL（１２μｍｏｌ）をクロロホルム：無水メタノール＝９：１の混合液に溶解させ、室温で２時間撹拌した。撹拌後、リン酸二水素カリウムで調製した０．１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を２ｍL加えて激しく撹拌し、上相を除去した。その後、再度蒸留水を加えて激しく撹拌させた後、上相を除去してから下相を採取した。採取した下相の溶媒を留去し、１２時間、室温で減圧乾燥させることにより活性型ＤＰＰＥを得た（収率６５．２％）。
【００３７】
（１−２）リポソームの調製
ナス型フラスコにクロロホルム：無水メタノール＝９：１溶液にそれぞれ溶解したジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）１０μｍｏｌ、活性型ＤＰＰＥ０．０３μｍｏｌ、コレステロール１０μｍｏｌを入れ、エバポレーターで溶媒を留去することにより、フラスコの内壁に脂質フィルムを形成させた。この脂質フィルムを減圧乾燥させることにより、完全に溶媒を取り除いた後、標識物質である１０ｍＭのトリスビピリジンルテニウム錯体（Ｒｕ錯体）を０．５ｍＬ、１０ｎｍの金コロイド溶液を０．５ｍＬ注入した。次に、このナス型フラスコを激しく攪拌させて、フラスコ内壁の脂質フィルムを剥がすことにより、Ｒｕ錯体を封入した多重層リポソーム（ＭＬＶ；ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を作製した。その後、エクストルーダーを用いて１００ｎｍのフィルターを通すことにより粒計が均一な一枚膜リポソームのルテニウム錯体‐金コロイド封入リポソームを調製した。
【００３８】
なお、従来例として、ルテニウム錯体のみ封入したリポソームも、上記と同様な手法で調製した。
【００３９】
（１−３）ＳＰＤＰ修飾ＢＳＡ抗体の調製
１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解させたＢＳＡ抗体１ｍｇ／ｍＬに、無水メタノールで調製した６４μＭＳＰＤＰ５μＬを加え、３０分、室温で静置した。その後、透析膜（分画分子量：３５００ダルトン）に移し、１００ｍＭ酢酸緩衝液中（ｐＨ４．５）で２４時間、透析を行った。
【００４０】
（１−４）ＢＳＡ抗体修飾リポソームの調製
上述したＳＰＤＰ修飾ＢＳＡ抗体に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）３．９μｇ（２５．３ｎｍｏｌ）を５００μＬの酢酸緩衝液に溶解させて調製したＤＴＴ溶液を添加して、３０分間室温で静置した。その後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５で分画し、ＤＴＴ、副生成物のピリジン−２−チオンを除去した。このときの溶出液はｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液で行った。分画したＳＰＤＰ修飾ＢＳＡ抗体に、ルテニウム錯体‐金コロイド封入リポソームを加えて２４時間室温にて静置した。静置したルテニウム錯体-金コロイド封入リポソームは、4℃下でＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂで分画し、未結合のＳＰＤＰ修飾抗体を除去することにより、ＢＳＡ抗体修飾ルテニウム‐金コロイド内封リポソームを得た。
【００４１】
また、従来例としてルテニウム錯体のみ内封したリポソームも同様な手法でＢＳＡ抗体を修飾した。
【００４２】
得られたＢＳＡ抗体修飾ルテニウム錯体‐金コロイド封入リポソーム及び、従来例のＢＳＡ抗体修飾ルテニウム錯体内封リポソームをマルバーン社製のゼータ電位計で粒径測定したところ、共に粒径平均値が１２０ｎｍであった。
【００４３】
（２）ＢＳＡの測定
（２−１）ＢＳＡの電極への固定
電極には、金電極を使用した。この金電極は、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで準備した。この金電極をピラニア溶液（硫酸：過酸化水素＝３：１）に１分間浸漬させた後、超純水を注いで電極表面を洗浄した。
【００４４】
次に、ジチオブチリック酸１４．０ｍｇ（５８．８μｍｏｌ）をエタノール７ｍLに溶解した溶液に、上述した金電極を浸して１２時間室温で穏やかに振とうさせ、ＳＡＭ（ｓｅｌｆ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）により金電極上にチオブチル酸を修飾した。
【００４５】
反応後の電極は、エタノールで洗浄した後、１‐Ｅｔｈｙｌ‐３‐（３‐ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ５０ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド３０ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのリン酸緩衝液に溶解させた溶液に１時間浸漬させて、カルボキシル基を活性化させた。
【００４６】
１０ｍＭのリン酸緩衝液で軽く注いだ後、ＢＳＡ１０ｍｇ（０．１５μｍｏｌ）を１０ｍＭリン酸緩衝液１ｍＬで溶解させた溶液を１ｎｇ／ｍＬまで希釈（１００μｇ／ｍＬ）し、その溶液に電極を浸漬させて４℃で１５時間穏やかに撹拌させ、ＢＳＡを電極に固定した。
【００４７】
活性化した未反応のカルボキシル基は、１０ｍＭのリン酸緩衝液１０ｍＬに溶解した２‐アミノエタノール６１．０ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）を４℃で１時間撹拌させることにより、不活性化（ブロッキング）させた。
【００４８】
その後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭのリン酸緩衝液で軽く洗浄した。
【００４９】
（２−２）ＢＳＡの検出
上述のようにＢＳＡを固定した電極にＢＳＡ抗体修飾ルテニウム錯体‐金コロイド封入リポソーム溶液１０μＬを添加し、室温で１時間抗原‐抗体反応を行った後、１０ｍＭのリン酸緩衝液で洗浄した。
【００５０】
その後、６０℃に加熱したホットプレート上に電極を置き、エタノール５μＬを電極上に滴下することによりリポソームを破壊し、溶出したルテニウム錯体及び金コロイドを吸着させた。
【００５１】
以上の工程の後、０．１Ｍのリン酸緩衝液及び、０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解液を８０μＬ滴下し、電極に電圧を印加することにより発生した電気化学発光の発光量を測定した。電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、４秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。
【００５２】
なお、従来例であるＢＳＡ抗体修飾ルテニウム錯体内封リポソームも同様な手法で測定を行なった。
【００５３】
図４に、本発明の本実施例であるＢＳＡ抗体修飾ルテニウム錯体‐金コロイド封入リポソームと従来例であるＢＳＡ抗体修飾ルテニウム錯体内封リポソームを用いたＢＳＡの測定結果である。図４に示す通り、本発明の金コロイドを封入したリポソームを用いることにより、従来に比べて３倍強に最大発光量が増加した。従って、本発明の手法により、高感度に目的のアナライトを検出できる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明にかかるアナライト分析用カプセル及びそれを用いたアナライト分析方法は、金属コロイド粒子と標識物質とをカプセルに封入させることにより、試料中に存在する特定のアナライトを高感度に検出することができ、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途等に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の実施の形態１におけるアナライト分析用カプセルの調製法を示す図
【図２】本発明の実施の形態１で作製したアナライト分析用カプセルを示す図
【図３】本発明の実施の形態２におけるアナライト分析カプセルを用いた分析方法を示す図
【図４】本発明の実施の形態２における実施例及び従来例のＢＳＡ測定結果を示す図
【符号の説明】
【００５６】
１  リガンド（抗体）
２  リン脂質（ホスファチジルコリン）の２分子膜
３  導電性物質（金コロイド）
４  標識物質（ルテニウム錯体）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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