(57)【要約】【課題】ビール粕の有効利用を図るため、ビール粕の処理物を有効成分とする抗酸化活性組成物、セラミド量やγ−アミノ酪酸が増加された組成物やその製造方法、該組成物を含む機能性食品又は食品素材を提供すること。【解決手段】ビール粕と醗酵基質とを混合して加熱殺菌したビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に醗酵することにより得られるビール粕醗酵処理物、その製造方法、該醗酵処理物を有効成分とする抗酸化活性組成物、醗酵前に比してセラミド量やγ−アミノ酪酸が増加した組成物、及びビール粕醗酵処理物を含む機能性食品又は食品素材とすること。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビール粕と醗酵基質とを混合して加熱殺菌したビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵することにより得られるビール粕醗酵処理物。
【請求項２】
醗酵基質が、糖蜜を含有するものであることを特徴とする請求項１記載のビール粕醗酵処理物。
【請求項３】
請求項１又は２記載のビール粕醗酵処理物を有効成分とすることを特徴とする抗酸化剤組成物。
【請求項４】
請求項１又は２記載のビール粕醗酵処理物が、発酵前に比してセラミド含量が増加したことを特徴とするセラミド含有組成物。
【請求項５】
請求項１又は２記載のビール粕醗酵処理物が、発酵前に比してγ−アミノ酪酸含量が増加したことを特徴とするγ−アミノ酪酸含有組成物。
【請求項６】
ビール粕に必要に応じて加水し、醗酵基質とを混合し、加熱殺菌後、ビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵することを特徴とする、抗酸化活性を有し、セラミド含量及びγ−アミノ酪酸含量が増加したビール粕醗酵処理物の製造方法。
【請求項７】
醗酵基質が、糖蜜を含有することを特徴とする請求項６記載のビール粕醗酵処理物の製造方法。
【請求項８】
ビール粕と醗酵基質とを混合し、加熱殺菌後、ビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵することにより得られるビール粕醗酵処理物を食品又は食品素材に添加したことを特徴とする、抗酸化活性の改善作用、セラミド量増加改善作用、γ−アミノ酪酸量増加改善作用の表示を付した機能性食品又は食品素材。
【請求項９】
ビール粕と醗酵基質とを混合し、加熱殺菌後、ビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵することにより得られるビール粕醗酵処理物を添加した食品又は食品素材を、抗酸化活性改善用、セラミド量増加改善用又はγ−アミノ酪酸量増加改善用の食品又は食品素材として使用する方法。
【請求項１０】
ビール粕と醗酵基質とを混合し、加熱殺菌後、ビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵することにより得られるビール粕醗酵処理物を抗酸化活性改善用、セラミド量増加改善用又はγ−アミノ酪酸量増加改善用の食品又は食品素材の配合剤として使用する方法。
【請求項１１】
ビール粕と醗酵基質とを混合し、加熱殺菌後、ビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵することにより得られるビール粕醗酵処理物を食品又は食品素材に添加することを特徴とする抗酸化活性改善用、セラミド量増加改善用又はγ−アミノ酪酸量増加改善用の食品又は食品素材を製造する方法。
【請求項１２】
醗酵基質が、糖蜜を含有することを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品工業における副産物を有効に利用する発明に関し、より詳しくは、ビールの製造過程において副生するビール粕と醗酵基質とを混合し、酵素処理及び乳酸発酵することにより得られるビール粕醗酵処理物、その製造方法、該ビール粕醗酵処理物を有効成分とする抗酸化剤組成物、該ビール粕醗酵処理物がセラミド含量が増加したセラミド含有組成物又はγ−アミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡと略称する場合がある）含量が増加したγ−アミノ酪酸含有組成物、及びビール粕醗酵処理物を含む食品又は食品素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、食品工業における副産物には種々のものが知られ、かつその量も膨大であり、例えばビールの製造工程において副生する、麦芽が主原料であるモルトフィードと呼ばれるビール粕（ビール製造用麦汁絞り粕）は年間１００トンもの量が産出される。そして、そのままあるいは発酵して、肥料（又は堆肥）や家畜の飼料として利用され、一部は廃棄物として焼却、埋め立て等により処理されている。ビール粕をそのままあるいは発酵して利用するタイプには、反芻動物、特に牛の飼料に用いられているが、最近では、キノコの菌床人工栽培における培養基に用いる技術（例えば、特許文献１、特許文献２参照）が知られ、また、ビール粕由来の高蛋白を利用してニジマス用飼料(例えば、特許文献３参照）としたり、食品アレルギー抑制剤（例えば、特許文献４参照）とする技術が知られている。さらに、ビール粕をビフィズス菌と乳酸菌を用いて発酵させて飼料を製造する方法（例えば、特許文献５参照）や特定の乳酸菌（ラクトバチルス・デルブリュッキィ・サブスピーシーズ・デルブリュッキィＡＭ３、ＬＭ２１及びＯＭ２株）を生ビール粕に添加して発酵させる飼料用ビール粕醗酵物の製造方法（例えば、特許文献６参照）、培養液の一部にビール粕を用いて乳酸菌、光合成細菌などの細菌により発酵して堆肥を製造する方法（例えば、特許文献７参照）が知られている。
【０００３】
一方、ビール粕を極性有機溶媒に浸漬する等の所定の処理工程を経て植物性セラミド関連物質を含有する大麦麦芽油の製造方法（例えば、特許文献８参照）や、ビール粕を乾燥させる乾燥工程と極性溶媒に浸す浸漬工程とビール粕を除去する工程とこれらの工程を繰り返すサイクル工程、及び濃縮工程とからなるビール粕由来の植物性セラミド関連物質製造方法（例えば、特許文献９参照）が知られている。
【０００４】
しかしながら、ビール粕は水分が多く、腐敗しやすく、また、乾燥に手間がかかることから前述のとおり飼料や肥料にすることが殆どであり、ビール粕を所定の工程を経て得られる処理物を医薬、あるいは化粧品や、機能性食品に利用する技術はあまり知られておらず、抗酸化活性等の生理活性を有するビール粕の醗酵処理物、その製造方法ついては未だ知られていない。
【０００５】
【特許文献１】特開平８−３３６３３０号公報
【特許文献２】特開平９−３０８３７３号公報
【特許文献３】特開平６−２９２５１６号公報
【特許文献４】特開平９−１２４６４号公報
【特許文献５】特開平１−２０６９５８号公報
【特許文献６】特開平３−２０１９４９号公報
【特許文献７】特開平８−２６８７１号公報
【特許文献８】特開平１１−１９３２３８号公報
【特許文献９】特開２００７−８２４２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、従来、食品工場から大量に排出される副産物の１つであるビール粕の有効利用を図るため、ビール粕含有醗酵基質を酵素処理後発酵を行うことにより、抗酸化活性が増強し、また、セラミド量、ＧＡＢＡ量が増加した組成物、その製造方法、及び該組成物を含む機能性食品又は食品素材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ビール粕はビールを製造する際の副産物であり、繊維が６０質量％（乾物換算）程度、粗タンパク質含量が２５質量％（乾物換算）の組成を有するが、前述の技術が示すように種々の研究・開発がなされ、努力されてきたが、現状では依然として反芻動物、特に牛の飼料としての用途が大部分を占めている。本発明者らは、ビール粕を処理することにより新たな用途を見出すべく、鋭意研究した結果、ビール粕含有醗酵基質をセルラーゼ系酵素で処理後乳酸発酵するという特定の処理工程により得られる醗酵処理物に発酵直前のものに比して、特に抗酸化活性の程度が上昇し、また、皮膚成分の１つであるセラミド量及び血圧降下作用などを有するＧＡＢＡ量が増加していることを見い出し本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）ビール粕と醗酵基質とを混合して加熱殺菌したビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵することにより得られるビール粕醗酵処理物や、（２）醗酵基質が、糖蜜を含有するものであることを特徴とする前記（１）記載のビール粕醗酵処理物や、（３）前記（１）又は（２）記載のビール粕醗酵処理物を有効成分とすることを特徴とする抗酸化剤組成物や、（４）前記（１）又は（２）記載のビール粕醗酵処理物が、発酵前に比してセラミド含量が増加したことを特徴とするセラミド含有組成物や、（５）前記（１）又は（２）記載のビール粕醗酵処理物が、発酵前に比してγ−アミノ酪酸含量が増加したことを特徴とするγ−アミノ酪酸含有組成物に関する。
【０００９】
また本発明は、（６）ビール粕に必要に応じて加水し、醗酵基質とを混合し、加熱殺菌後、ビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵することを特徴とする、抗酸化活性を有し、セラミド含量及びγ−アミノ酪酸含量が増加したビール粕醗酵処理物の製造方法や、（７）醗酵基質が、糖蜜を含有することを特徴とする前記（６）記載のビール粕醗酵処理物の製造方法や、（８）ビール粕と醗酵基質とを混合し、加熱殺菌後、ビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵することにより得られるビール粕醗酵処理物を食品又は食品素材に添加したことを特徴とする、抗酸化活性の改善作用、セラミド量増加改善作用、γ−アミノ酪酸量増加改善作用の表示を付した機能性食品又は食品素材に関する。
【００１０】
さらに本発明は、（９）ビール粕と醗酵基質とを混合し、加熱殺菌後、ビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵することにより得られるビール粕醗酵処理物を添加した食品又は食品素材を、抗酸化活性改善用、セラミド量増加改善用又はγ−アミノ酪酸量増加改善用の食品又は食品素材として使用する方法や、（１０）ビール粕と醗酵基質とを混合し、加熱殺菌後、ビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵することにより得られるビール粕醗酵処理物を抗酸化活性改善用、セラミド量増加改善用又はγ−アミノ酪酸量増加改善用の食品又は食品素材の配合剤として使用する方法や、（１１）ビール粕と醗酵基質とを混合し、加熱殺菌後、ビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵することにより得られるビール粕醗酵処理物を食品又は食品素材に添加することを特徴とする抗酸化活性改善用、セラミド量増加改善用又はγ−アミノ酪酸量増加改善用の食品又は食品素材を製造する方法や、（１２）醗酵基質が、糖蜜を含有することを特徴とする前記（９）〜（１１）のいずれか記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、ビール粕含有醗酵基質を酵素処理した後、ラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）により発酵処理することにより、副作用のない、健康上安全性に優れ、かつ服用に適した味を有する発酵前に比して抗酸化活性が増強し、セラミド含有量及びＧＡＢＡ量が増加した組成物、その製造方法及び該組成物を含有した機能性食品及び機能性食品素材を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において使用されるビール粕は、ビール製造用麦汁の絞り粕であり、水分を４５〜７５質量％（以下、単に％で記載する）、好ましくは５０〜７０％に調節される。ビール生産直後のビール粕は、約８０％もの水分を含み、腐敗などを考慮してシリンダープレスやフィルタープレスなどの脱水機により、水分を６０〜６５％程度まで低下させたものを用いてもよく、さらに乾燥ビール粕（水分約０〜２０％）など、何れの形態のものも利用可能である。醗酵基質として糖資化源を混合するが、ビール粕と水とを合わせた全質量の、少なくとも０．１５質量％以上、好ましくは２〜４質量％の糖資化源を混合することが好ましい。また、本発明の加熱殺菌方法は、特に制限されるものではないが、例えば、オートクレーブを用いて、１２１℃、２０分で加熱する方法等が挙げられる。
【００１３】
本発明のビール粕醗酵処理物としては、ビール粕と醗酵基質とを混合して加熱殺菌したビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵することにより得られるものであれば特に制限されるものではなく、また、本発明の抗酸化剤組成物としては、前記ビール粕醗酵処理物を有効成分とするものであれば特に制限されるものではなく、さらに、本発明のセラミド含有組成物としては、前記ビール粕醗酵処理物を含有し、発酵前に比してセラミド量が増加したものであれば特に制限されるものではない。さらに、本発明のＧＡＢＡ含有組成物としては、前記ビール粕醗酵処理物を含有し、発酵前に比してＧＡＢＡ量が増加したものであれば特に制限されるものではない。
【００１４】
本発明のセルラーゼ系酵素としては、特に限定するものではなく、当該分野で知られたもののうちから適宜選択して使用できるが、セルラーゼ系酵素としてはセルラーゼＴアマノ４〔天野製薬（株）製〕、セルロシンＴ２〔阪急バイオインダストリー（株）製〕、セルロシンＡＣ４０〔阪急バイオインダストリー（株）製〕を使用することができる。これらは、適宜、酵素濃度や条件を選択して使用するのが好適である。
【００１５】
本発明の発酵の際使用する菌は、ラクトバシルス・プランタリム（L. plantrum）であり、かかるラクトバシルス・プランタリムとしてＩＦＯ１４７１２菌株やＩＦＯ１４７１３菌株を具体的に例示することができる。またこれら乳酸菌は、ビール粕の乾物１ｇあたり、通常１０３〜１０７個、特に１０６〜１０７個用いることが好ましい。
【００１６】
本発明の抗酸化剤組成物とは、抗酸化作用又は抗酸化活性を有する組成物を指し、抗酸化活性（抗酸化作用）とは、生体内酸化により発生するフリーラジカル、活性酸素及び過酸化脂質を消去または低減する抗酸化効果を有するものである。生体内では、生体内酸化により生成するフリーラジカルや活性酸素には様々なものが存在していることが知られている。フリーラジカルは不対電子を持つ分子種の総称であるため、様々な生体内フリーラジカルが存在するが、活性酸素でもあるフリーラジカルとしてスーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカルが知られている。また、フリーラジカルではない活性酸素には、過酸化水素及び一重項酸素が知られている。
【００１７】
現在、生体内酸化により引き起こされると考えられている疾患として、以下のものが知られている。脳・神経系疾患としては、脳浮腫、外傷性てんかん、脳虚血、パーキンソン病、脊髄損傷等が、目の疾患としては、白内障、網膜変性、未熟児網膜症等が、呼吸器系疾患としては、気管支喘息、肺気腫、肺繊維症、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、未熟児呼吸窮迫症候群（IRDS）等が、循環器系疾患としては、動脈硬化、心筋梗塞等が、消化器系疾患としては、潰瘍性大腸炎、ストレス性胃潰瘍、すい炎、消化管粘膜障害等が、皮膚疾患としては、紫外線障害、アトピー性皮膚炎、火傷、凍傷、床ずれ等が、腎臓疾患としては、腎炎、腎不全等が、その他の疾患としては、ガン、糖尿病、膠原病、リウマチ、アルツハイマー病、自己免疫疾患、ベーチェット病等が挙げられる。また、老化、老化による皮膚のしわや痴呆症も、生体内酸化によると考えられている。本発明の抗酸化剤組成物も、このような疾患の予防・治療につながると考えられる。
【００１８】
本発明のビール粕醗酵処理物は、発酵前に比してセラミド含有量が増加されたものである。セラミドはヒトの皮膚に含まれる複合脂質であり、肌のみずみずしさと張りを保つ効果やメラニン色素の生成を抑制する効果があるとされている。皮膚の最外層である角質層、顆粒層は細胞間脂質で構成されているが、その４０〜６０％はセラミドからなっている。セラミドは皮膚最外層で水分透過バリヤー機能、すなわち保湿機能及びアレルゲンなどの外部刺激物の侵入を防ぐ機能を担っていると考えられている。セラミドは加齢にともなって減少するが、経口投与によって小腸消化管から吸収され、毛細血管を介して角質層に補充されることが確認されている。セラミド含有物を食品として吸収すると、身体の中から全身の皮膚に保湿のバリヤーを張る効果があり、肌のみずみずしさを保って乾燥肌やアトピー性皮膚炎の改善に効果があることが認められていることから、本発明のセラミド含有組成物を経口摂取することにより、前述の効果を奏するといえる。
【００１９】
本発明のビール粕醗酵処理物は、発酵前に比してＧＡＢＡ含有量が増加されたものである。ＧＡＢＡは、ギャバとも呼ばれ、自然界に広く分布している非タンパク質アミノ酸の１種であり、食品の成分としても、茶、野菜類、穀類などに普通に含まれている。生体内においては、グルタミン酸が脱炭酸されて生成され、人体では特に、脳内の黒質、大脳基底核、視床下部等に高濃度に存在していることが分かっている。
【００２０】
ＧＡＢＡの生理作用としては、血管を拡張して血圧を下げることが良く知られている。また、ＧＡＢＡは、脳内の血液の流れを活発にし、脳細胞への酸素供給量を増加させて、代謝機能を促進させる働きがあり、主要な抑制性の神経伝達物質として中枢神経系において重要な役割を果たしている。そして、医薬品としては、脳血管の狭窄や閉塞による頭痛、耳鳴りなどの治療に応用されている。また、ＧＡＢＡの人体への投与が、学習能力の増強や長期記憶の促進に貢献することも報告されている。
【００２１】
本発明のビール粕醗酵処理物の製造方法としては、ビール粕に必要に応じて加水し、醗酵基質とを混合し、加熱殺菌後、ビール粕含有醗酵基質にセルラーゼ系酵素を添加して酵素処理し、酵素処理後のビール粕含有醗酵基質にラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加して嫌気的に発酵する、抗酸化活性を有し、セラミド含量及びγ−アミノ酪酸含量が増加した製造方法であれば特に制限されるものではないが、例えば、脱水ビール粕に水を加えて４５〜７５％、好ましくは、５０〜７０％になるように水分調製し、糖蜜などの醗酵基質を０．１質量％以上加え、加熱殺菌する。この醗酵基質にセルラーゼ系酵素を３〜８％、好ましくは４〜６％添加し、酵素処理としては、４０〜５０℃、好ましくは４３〜４８℃で、２０〜４０時間、好ましくは、２２〜３０時間反応させる。その後ラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）を添加する。ラクトバシルス・プランタリム（L. plantarum）は純粋培養後、醗酵基質へ１〜１０質量％添加することが好ましい。発酵は、嫌気条件下で行うが、温度２０〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃で行い、発酵期間は、ｐＨや、菌数等の条件による発酵の進行状況により適宜選択することができ、例えば、ｐＨ４〜５、菌数１０５以上であれば、約５日間発酵することが好ましい。
【００２２】
上記醗酵基質としては、発酵菌であるラクトバシルス・プランタリムにより資化される炭水化物や蛋白質等を挙げることができる。かかる炭水化物として糖蜜、市販のブドウ糖、蔗糖を用いることができ、好ましくは、糖蜜を挙げることができる。また、蛋白質としては、米糠、ふすま等が好適に例示することができる。これら炭水化物や蛋白質等の添加量としては培地（ビール粕含有醗酵基質）当たり１〜５質量％が好ましく、特に３質量％前後が適当である。これら例示した醗酵基質は１種又は２種以上を用いてもよい。
【００２３】
発酵終了後、乾燥機により水分値が１０％以下となるように乾燥させることが好ましく、乾燥方法としては、加熱乾燥や凍結乾燥によることができ、加熱乾燥の場合は、品温が１００℃以下で行われることが、生理活性成分の失活を防止することができるため好ましい。乾燥後、必要に応じて加熱等公知の方法により滅菌処理を行ない、食品素材や、エキスの原料として使用される組成物が得られる。本発明のビール粕醗酵処理物は、抗酸化活性の改善作用、セラミド量増加改善作用、ＧＡＢＡ量増加改善作用を有するものであり、抗酸化活性改善、セラミド量増加改善及びＧＡＢＡ量増加改善のために用いられる旨の表示を付した機能性食品又は食品素材として利用することができる。或いは、ビール粕醗酵処理物を抗酸化活性改善用、セラミド量増加改善用又はＧＡＢＡ量増加改善用の食品又は食品素材の配合剤として使用する方法とすることができる。
【００２４】
本発明は、上記本発明の抗酸化剤組成物、セラミド含有組成物及びＧＡＢＡ含有組成物を有効成分とするものであれば、特に限定されるものではなく、これらの組成物を、毎日、適度の量を摂取することが望ましく、その方法として飲食品に含有させて摂取するのが望ましい。本発明の抗酸化剤組成物、セラミド含有組成物及びＧＡＢＡ含有組成物を含む食品又は飲料はその点で極めて有用である。本発明の食品又は飲料は特に限定されるものではなく何れのものであってもよく、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム、チョコレート等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、食用油、マーガリン、ラード、バター、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜へ配合して食品として使用することができる。配合量は、特に限定されるものではなく、食品によって適宜選択することができる。
【００２５】
本発明の抗酸化剤組成物における、抗酸化活性測定はＤＰＰＨ法、ロダン鉄法等により測定することができるが、本発明では、ＤＰＰＨ法を採用した。
【００２６】
ＤＰＰＨ法とは、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を利用したラジカル消去能の測定による方法であり、ＤＰＰＨラジカルが捕捉されると黒紫色が退色するＤＰＰＨを使用し、被検体を加えた液にＤＰＰＨを添加するとＤＰＰＨラジカルが捕捉され、吸光度の減少はＤＰＰＨラジカルを捕捉した抗酸化活性に相当することから、吸光度の変化を測定しＤＰＰＨラジカル残存率を求める方法である。このラジカル残存率は、その値が小さいものほど、即ち、ＤＰＰＨラジカルの消費量が大きいものほど被検体によるラジカル捕捉反応が高速に進行したことを示し、被検体の抗酸化活性が高いことを表す。
【００２７】
本発明の組成物の抗酸化活性の測定は、ＤＰＰＨ法を適用する場合以下のようにして行うことができる。１）８０％エタノール抽出の場合は、各サンプルに対し１０倍量の８０％エタノールを加え静置抽出して抽出液を得、ろ過後残渣にも１０倍量の８０％エタノール抽出を加え静置抽出後ろ過して抽出液を得、あわせて両抽出液を濃度調整し測定に使用する。２）熱抽出の場合は、各サンプルに８０℃熱水を加え所定時間室温で抽出後ろ過し、残渣に８０℃熱水を加え同様に抽出後、定容した液を使用する。前記１）と２）の方法により得られた抽出液を測定するには、０．７５ｍＭ  ＤＰＰＨエタノール溶液と、エタノール溶液と、サンプル溶液とを所定量９６穴マイクロプレートに入れ混合し、所定時間後にマイクロプレートリーダーにて５３２ｎｍの吸光度を測定する。コントロールは、熱水抽出液の場合は水を、８０％エタノール抽出液の場合は８０％エタノールを使用し、吸光度を１００％とし、評価する。
【００２８】
セラミド量の測定方法は、ビール粕醗酵処理物を粉砕したもの所定量に、クロロホルム／メタノール混液を加え、試験ミキサーで２５〜３５秒間撹拌し、抽出する。この抽出溶液を、乾燥したＴＬＣプレートにシリンジでスポットし、展開液で展開し、風乾する。アンスロン硫酸を噴霧後、１３０℃で加熱して発色させ、Ｓｃｉｃｏｎ  Ｉｍａｇｅ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（フリーソフト）によって、標準物質（例えば、植物性グルコシルセラミド：Ｍａｔｒｅｙａ社製）とのスポットの濃さからセラミド濃度を算出する。
【００２９】
ＧＡＢＡの測定方法は、ビール粕醗酵処理物を粉砕したものの所定量に７５％エタノールを所定量加え、ホモゲナイザーで所定時間磨砕し、さらに７５％エタノールの所定量１０ｍＬでホモゲナイザーを洗浄し、さらに７５％エタノール所定量で、丸底フラスコへ全量を移し替える。次に、ソックスレー抽出機にて所定温度、所定時間抽出し上澄みをろ過し、７５％エタノール所定量を加え再度同様に抽出する。これを合計３回繰り返して抽出し、得られた抽出液をロータリーエバポレーターにて減圧濃縮乾固する。その後、ｐＨ５．０のクエン酸緩衝液所定量を加え所定時間超音波抽出し、その後ろ過し所定量に定容し測定用サンプルとする。この測定用サンプルを０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過し、ＯＰＡ試薬を用いたポストカラム法による島津製作所製アミノ酸分析システムで定量した。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
［ビール粕醗酵処理物の製造］
ビール粕（水分１０％）１００ｇを入れた容器に水を加えて水分７０％になるように水分調整し、糖蜜を３ｇ（約３％）加え混合し、該混合物をオートクレーブにて１２１℃、２０分で加熱殺菌処理を行って、加熱殺菌された混合物を得た（この混合物を「発酵前ビール粕」という）。加熱殺菌された混合物を収容した容器に、セルラーゼ（セルラーゼＴ「アマノ」４）を５％添加し４５℃、２４時間反応させた（この反応物を「セルラーゼのみ」という）。その後ラクトバシルス・プランタリム（L. plantrum：独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）より入手）を添加［ビール粕の質量に対し、１質量％（醗酵原料１ｇ当たりの生菌数：１×１０６）］し、混合した。容器を密閉して、発酵を開始した。発酵条件は、嫌気下で４０℃、５日間、静置培養である。発酵後ビール粕醗酵処理物（この醗酵処理物を「酵素処理＋発酵」と表わす）を得た。保存のため、水分８％になるまで１００℃以下で熱風乾燥し、粉粒体を得た。
【００３２】
比較例１（発酵のみ）
実施例１において、加熱殺菌された混合物を酵素処理することなく、直ちにラクトバシルス・プランタリム（L. plantrum）を添加［ビール粕の質量に対し、１質量％（醗酵原料１ｇ当たりの生菌数：１×１０６）］し、混合した。容器を密閉して、発酵を開始した。発酵条件は、嫌気下で４０℃、７日間、静置培養により発酵を行ってビール粕醗酵処理物を得た。保存のため、水分８％になるまで１００℃以下で熱風乾燥し、粉粒体を得た。
【００３３】
比較例２［発酵→酵素処理（酵素添加量１％）］
実施例１と同様の殺菌されたビール粕含有醗酵基質を用いるが、先ずラクトバシルス・プランタリム（L. plantrum）を添加［ビール粕の質量に対し、１質量％（醗酵原料１ｇ当たりの生菌数：１×１０６）］し、混合した。そして、容器を密閉して、発酵を開始した。発酵条件は、嫌気下で４０℃、５日間、静置培養し、その後、セルラーゼ（セルラーゼＴ「アマノ」４）を１％添加し４５℃、２４時間反応させて醗酵処理物を得た。保存のため、水分８％になるまで１００℃以下で熱風乾燥し、粉粒体を得た。
【００３４】
比較例３［発酵→酵素処理（酵素添加量５％）］
比較例２において、酵素の添加量を５％とした以外は比較例２と同様の方法により粉粒体を得た。
【実施例２】
【００３５】
［ＤＰＰＨ法（８０％エタノール抽出）による抗酸化活性の測定］
実施例１により得られたビール粕醗酵処理物に対し１０倍量の８０％エタノールを加え１２時間静置抽出し、ろ過し、ろ過後残渣にも１０倍量の８０％エタノール抽出を加え１２時間静置抽出後ろ過し、抽出液をあわせて濃度調整した。３．３３ｍｇ／ｍＬと１．６７ｍｇ／ｍＬにそれぞれ濃度調整したものを本件サンプル溶液（酵素処理＋発酵）として測定に使用した。同様の方法によりビール粕、糖蜜などの原料混合物からなる発酵前ビール粕を抽出して得られた５０μＬ、同様の方法によりビール粕、糖蜜などの原料混合物をセルラーゼのみ処理した処理物を抽出して得られた５０μＬ、同様の方法により比較例１の発酵のみ処理した処理物を抽出して得られた５０μＬを、それぞれ９６穴マイクロプレートに入れ混合し、２０分後にマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）にて５３２ｎｍの吸光度を測定した。コントロール（８０％エタノールを使用）の吸光度を１００％とし評価した。
【００３６】
［結果］
ＤＰＰＨ法（８０％エタノール抽出）による抗酸化活性の測定結果を図１に示す。図１の縦軸に示す「コントロール」、「発酵前ビール粕」、「セルラーゼのみ」、「発酵のみ］は、前述のとおりの意味を表し、「酵素処理＋発酵」は、本発明の実施例１によるサンプルを示す。図１の横軸に示す、数値は、ＤＰＰＨラジカルの残量割合（％）を示す。図１に示すように、８０％エタノール抽出物において、原液及び２倍希釈液ともに本発明のセルラーゼ系酵素処理及び乳酸発酵処理を行うことで両処理前のものと比べて抗酸化活性が増加したことが分った。
【実施例３】
【００３７】
［ＤＰＰＨ法（熱水抽出）による抗酸化活性の測定］
熱水抽出による使用サンプルは、１ｇの各サンプルに８０℃熱水を２５ｍＬ加え２０分間室温で抽出後ろ過し、ろ過後の残渣にも８０℃熱水２５ｍＬを加え同様に抽出し、抽出液をあわせて５０ｍＬに定容した液を使用した。サンプルは、本発明の実施例１による「酵素処理＋発酵」、及び「コントロール」、「発酵前ビール粕」、「セルラーゼのみ」、「発酵のみ］とし、これらサンプル５０ｍＬと、０．７５ｍＭ  ＤＰＰＨエタノール溶液と、水（コントロール）とを９６穴マイクロプレートに入れ混合し、２０分後にマイクロプレートリーダーにて５３２ｎｍの吸光度を測定した。コントロール（水）の吸光度を１００％とし、評価した。
【００３８】
［結果］
ＤＰＰＨ法（熱水抽出）による抗酸化活性の測定結果を図２に示す。図２に示すように、熱水抽出物において、原液及び２倍希釈液ともに本発明のセルラーゼ系酵素処理及び乳酸発酵処理を行うことで、両処理前（発酵前）のもの、セルラーゼ系酵素処理のみのもの、及び乳酸発酵処理のみのものに比べて抗酸化活性が増加したことが分った。
【実施例４】
【００３９】
［ＴＬＣデンシトメトリー法によるセラミド濃度測定］
実施例１で得られた乾燥したビール粕醗酵処理物［酵素処理（５％）→発酵］、酵素添加量１％とした以外は実施例１と同様のもの［酵素処理（１％）→発酵］、比較例２で得た発酵後酵素処理したもの［発酵→酵素処理（５％）］、比較例３で得た発酵後酵素処理したもの［発酵→酵素処理（１％）］、発酵のみ行った以外は実施例１と同じ方法により得たもの［発酵のみ］、酵素（添加量１％）処理のみ行った以外は実施例１と同じ方法により得たもの［酵素のみ（１％）］、及び酵素（添加量５％）処理のみ行った以外は実施例１と同じ方法により得たもの［酵素のみ（５％）］のそれぞれを粉砕したもの５０ｍｇに、クロロホルム／メタノール＝２／１混液を２００μＬ加え、試験管ミキサーで３０秒撹拌した。この抽出溶液２０μＬを、乾燥したＴＬＣプレート（シリカゲル６０：メルク社製）にシリンジでスポットし、展開液（クロロホルム／メタノール／水＝６５／２５／４）で展開し、風乾した。アンスロン硫酸を噴霧後、１３０℃で加熱して発色させ、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（フリーソフト）によって、標準物質（植物性グルコシルセラミド：Ｍａｔｒｅｙａ社製）とのスポットの濃さからセラミド濃度を算出した。
【００４０】
［結果］
ＴＬＣデンシトメトリー法によるセラミド濃度の測定結果を図３に示す。図３に示すように、酵素処理後に発酵処理を行うことで、発酵前、発酵のみ、酵素処理のみ、及び発酵後酵素処理に比べてセラミド含量が増加したことが分った。セラミド量の増加は本発明の酵素添加量５％の場合にもっとも顕著であった。
【実施例５】
【００４１】
ＧＡＢＡ測定：
１．実施例１の方法により得られたもの、及び発酵前のものの各サンプル１ｇに７５％エタノールを２０ｍＬ加え、ホモゲナイザーで１分間摩砕した。このホモゲナイザーを７５％エタノール１０ｍＬで洗浄し、さらに７５％エタノール１０ｍＬで、丸底フラスコへ全量を移し替えた。
２．次に、ソックスレー抽出機にて８０℃、３５分間抽出し上澄みをろ過し、７５％エタノール２０ｍＬ加え再度同様に抽出した。これを合計３回繰り返して抽出し、得られた抽出液をロータリーエバポレーターにて減圧濃縮乾固した。
３．濃縮後、ｐＨ５．０のクエン酸緩衝液４０ｍＬを加え１０分間超音波抽出し、その後ろ過し５０ｍＬに定容し測定用サンプルとした。
４．ＨＰＬＣ分析条件
上記測定用試料を０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過し、ＯＰＡ試薬を用いたポストカラム法による島津製作所製アミノ酸分析システムで定量した。
システム：Shimadzu LC-10A Amino acid analysis system
分離カラム：Shim-pack Amino-Na (6.0mm I.D.×150mm）
アンモニアトラップ：Shim-pack ISC-30 (4.0mm I.D.×50mm）
移動相：Shimadzu amino acid mobile phase Kit, Na type Gradient elution
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：６０℃
反応試薬：Shimadzu amino acid reaction reagent Kit
Solution A (Hypochlorite reagent)
Solution B (o-Phthalaldehyde reagent)
検出：蛍光検出器（Shimadzu RF-10A)、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ
【００４２】
［結果］
前記ＧＡＢＡの測定法により測定した結果を図４に示す。図４に示すように本発明のビール粕含有醗酵基質に酵素処理、及びその後乳酸発酵したものは、これらの処理を施さない発酵前の原料混合物に比べて約１．７倍の増加したＧＡＢＡ量を含有していることが分った。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明により得られたビール粕醗酵処理物（酵素処理＋発酵）の８０％エタノール抽出物及び発酵前ビール粕等の抗酸化活性をＤＰＰＨ法により測定した結果を示す図である。
【図２】本発明により得られたビール粕醗酵処理物（酵素処理＋発酵）の熱水抽出物及び発酵前ビール粕等の抗酸化活性をＤＰＰＨ法により測定した結果を示す図である。
【図３】本発明により得られたビール粕醗酵処理物（酵素処理＋発酵）及び発酵前ビール粕等のセラミド濃度をＴＬＣデンシトメトリー法により測定した結果を示す図である。
【図４】本発明により得られたビール粕醗酵処理物（酵素処理＋発酵）及び発酵前ビール粕等のＧＡＢＡ含量をアミノ酸分析システムにより測定した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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