(57)【要約】【課題】乾燥血液付着繊維に付着した血液中の微量抗原を検出・定量する方法を提供すること。【解決手段】乾燥血液が付着した繊維を緩衝液に浸した後、緩衝液を回収する。一方、標識としてのオリゴヌクレオチド鎖と抗原に特異的に結合する抗体とを有し、オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を含むオリゴヌクレオチド複合抗体と、回収した緩衝液中の抗原と、を接触させて抗原抗体複合体を形成させる。その後、抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を切断部位で切り離して回収し、増幅し、検出する。また、既知の濃度の抗原を用いて作製した検量線と比較することにより、血液中の抗原濃度を定量できる。【選択図】図１
2009124990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥血液付着繊維に付着した血液中の抗原を検出する方法であって、
前記繊維を緩衝液に浸す工程と、
前記緩衝液を回収する工程と、
標識としてのオリゴヌクレオチド鎖と前記抗原に特異的に結合する抗体とを有するオリゴヌクレオチド複合抗体と、前記抗原と、を接触させて抗原抗体複合体を形成させる工程と、
前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程と、
を含み、
前記オリゴヌクレオチド複合抗体は、前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を含み、
前記検出工程は、
前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、
回収された前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、
増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド鎖は、アダプター部分を含み、少なくとも前記アダプター部分を介して前記抗体に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド鎖の切り離しが、制限酵素、光照射、または活性酸素によって行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アダプター部分が二次抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記アダプター部分が、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、及びプロテインＡとプロテインＧとの融合タンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
乾燥血液付着繊維に付着した血液中の複数の抗原を識別して検出する方法であって、
前記繊維を緩衝液に浸す工程と、
前記緩衝液を回収する工程と、
各抗原に特異的に結合する抗体と、当該抗体に結合する結合部位を有し、抗原の種類に対応するオリゴヌクレオチド鎖を混合して、前記抗体と前記オリゴヌクレオチドとを含有するオリゴヌクレオチド複合抗体をそれぞれ形成させる工程と、
形成した前記オリゴヌクレオチド複合抗体をそれぞれ精製した後で混合する工程と、
前記緩衝液中の複数の前記抗原と、前記混合したオリゴヌクレオチド複合抗体とを接触させて当該抗原と当該抗原に特異的に結合する当該抗体を含む当該オリゴヌクレオチド複合抗体との抗原抗体複合体を形成させる工程と、
前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程、を含み、
前記オリゴヌクレオチド複合抗体が、当該オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を有し、
前記検出工程が、
前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、
前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、
増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。
【請求項７】
乾燥血液付着繊維に付着した血液検体中の抗原を定量する方法であって、
前記繊維を緩衝液に浸す工程と、
前記緩衝液を回収する工程と、
標識としてのオリゴヌクレオチド鎖と前記抗原に特異的に結合する抗体とを有するオリゴヌクレオチド複合抗体と、前記抗原と、を接触させて抗原抗体複合体を形成させる工程と、
前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程と、
当該抗原を事実上含有しない血液に、複数の既知濃度の当該抗原を添加し、前記血液検体と同様にして  前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出することにより検量線を作成する工程と、
前記血液検体によって得られた前記オリゴヌクレオチド鎖の量を、前記検量線より特定する工程と、
を含み、
前記オリゴヌクレオチド複合抗体は、前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を含み、
前記検出工程は、
前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、
回収された前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、
増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。
【請求項８】
繊維が濾紙であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
血液中の抗原の検出用キットであって、
繊維と、
オリゴヌクレオチド鎖と、各抗原に特異的に結合する抗体とを含有するオリゴヌクレオチド複合抗体を含み、
前記オリゴヌクレオチド複合抗体は、前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を有する、キット。
【請求項１０】
繊維が濾紙であることを特徴とする請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥血液付着繊維に付着した血液中の微量抗原を検出・定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患の診断などで、血液中の抗原濃度を測定する場合、濾紙血が用いられることがある。血液を滴下した濾紙を乾燥させることによって、採血や血液の取り扱いが容易になる上に、必要な血液は少量で足りる。従って、多量のサンプルを扱うマススクリーニングや、自己採血した検査サンプルの郵送等に濾紙血は効果を発揮する。
【０００３】
しかしながら、濾紙に付着した血液は少量であること、乾燥した血液は濾紙に吸着され、血液中の成分を回収するのは容易ではないこと、特に、血液中の抗原は非常に少量である場合があり、従来のELISA法などでは、検出できないことも多かった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、乾燥血液付着繊維に付着した血液中の微量抗原を検出・定量する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）乾燥血液付着繊維に付着した血液中の抗原を検出する方法であって、前記繊維を緩衝液に浸す工程と、前記緩衝液を回収する工程と、標識としてのオリゴヌクレオチド鎖と前記抗原に特異的に結合する抗体とを有するオリゴヌクレオチド複合抗体と、前記抗原と、を接触させて抗原抗体複合体を形成させる工程と、前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程と、
を含み、前記オリゴヌクレオチド複合抗体は、前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を含み、前記検出工程は、前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、回収された前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。
【０００６】
（２）前記オリゴヌクレオチド鎖は、アダプター部分を含み、少なくとも前記アダプター部分を介して前記抗体に固定される、（１）に記載の方法。
【０００７】
（３）前記オリゴヌクレオチド鎖の切り離しが、制限酵素、光照射、または活性酸素によって行われる、（１）または（２）に記載の方法。
【０００８】
（４）前記アダプター部分が二次抗体である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
【０００９】
（５）前記アダプター部分が、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、及びプロテインＡとプロテインＧとの融合タンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１種である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
【００１０】
（６）乾燥血液付着繊維に付着した血液中の複数の抗原を識別して検出する方法であって、前記繊維を緩衝液に浸す工程と、前記緩衝液を回収する工程と、各抗原に特異的に結合する抗体と、当該抗体に結合する結合部位を有し、抗原の種類に対応するオリゴヌクレオチド鎖を混合して、前記抗体と前記オリゴヌクレオチドとを含有するオリゴヌクレオチド複合抗体をそれぞれ形成させる工程と、形成した前記オリゴヌクレオチド複合抗体をそれぞれ精製した後で混合する工程と、前記緩衝液中の複数の前記抗原と、前記混合したオリゴヌクレオチド複合抗体とを接触させて当該抗原と当該抗原に特異的に結合する当該抗体を含む当該オリゴヌクレオチド複合抗体との抗原抗体複合体を形成させる工程と、前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程、を含み、前記オリゴヌクレオチド複合抗体が、当該オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を有し、前記検出工程が、前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。
【００１１】
（７）乾燥血液付着繊維に付着した血液検体中の抗原を定量する方法であって、前記繊維を緩衝液に浸す工程と、前記緩衝液を回収する工程と、標識としてのオリゴヌクレオチド鎖と前記抗原に特異的に結合する抗体とを有するオリゴヌクレオチド複合抗体と、前記抗原と、を接触させて抗原抗体複合体を形成させる工程と、前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程と、当該抗原を事実上含有しない血液に、複数の既知濃度の当該抗原を添加し、前記血液検体と同様にして前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出することにより検量線を作成する工程と、前記血液検体によって得られた前記オリゴヌクレオチド鎖の量を、前記検量線より特定する工程と、
を含み、前記オリゴヌクレオチド複合抗体は、前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を含み、前記検出工程は、前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、回収された前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。
【００１２】
（８）繊維が濾紙であることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
【００１３】
（９）血液中の抗原の検出用キットであって、繊維と、オリゴヌクレオチド鎖と、各抗原に特異的に結合する抗体とを含有するオリゴヌクレオチド複合抗体を含み、前記オリゴヌクレオチド複合抗体は、前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を有する、キット。
【００１４】
（１０）繊維が濾紙であることを特徴とする（９）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によって、乾燥血液付着繊維に付着した血液中の微量抗原を検出・定量する方法を提供することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコルを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１７】
＝＝乾燥血液付着繊維に付着した血液中の微量抗原を検出する方法＝＝
本発明の検出方法は、
（１）乾燥血液付着繊維から血液を回収する工程
（２）回収した血液中の抗原を検出する工程
を含む。
【００１８】
ここで、検査対象とする血液は、特に限定されないが、本発明が超微量抗原を検出できることを利用し、新生児の血液を対象とするのが好ましい。新生児からは採血が困難であり、微量の血液しか採取できず、本発明の方法を用いることにより、これまで不可能であった新生児血液に含まれる微量抗原の検出が可能になるからである。
【００１９】
本発明の検出方法によれば、糸、濾紙、ニトロセルロース、ナイロンメンブレン、布などの繊維に付着して乾燥した血液から回収した抗原を検出、定量できる。ここで繊維とは、毛細管現象で液体を吸収できるものであれば、特に限定されないが、コストや簡便さの点で繊維膜を使用するのが好ましく、濾紙を用いるのがより好ましい。以下、各工程を詳細に説明する。
【００２０】
（１）乾燥血液付着繊維から血液を回収する工程
乾燥血液付着繊維を緩衝液に浸し、３０〜６０分、４〜２０℃で処理することにより、繊維に付着した血中の成分を緩衝液に溶出させた後、緩衝液を回収する。溶出処理の間、静置していても振とうしても構わない。
【００２１】
（２）回収した血液中の抗原を検出する工程
（２−１）オリゴヌクレオチド複合抗体の形成
次に、回収した緩衝液中の抗原と、標識としてのオリゴヌクレオチド鎖を有する、抗原に特異的に結合する抗体と、を接触させて当該抗原と当該抗体を含有するオリゴヌクレオチド複合抗体を形成させる。
【００２２】
オリゴヌクレオチド鎖は、抗体に直接結合していてもよいが、アダプター部分を介して抗体に固定されるのが好ましい。アダプター部分を介した固定によりオリゴヌクレオチド複合抗体の構造安定性を一層高めることができ、得られる複合体の収率をより向上させるとともに、ひいては検出感度や検出効果を高める等の効果が得られる。アダプター部分としては、抗体に結合できるものなら特に限定されず、例えば、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、及びプロテインＡとプロテインＧとの融合タンパク質等や、抗イミュノグロブリン抗体（抗IgG抗体）のような二次抗体等が例示される。
【００２３】
アダプター部分を含むオリゴヌクレオチド複合抗体の調製方法としては、限定はされないが、（i）まず、アダプター部分に標識部分となるオリゴヌクレオチド鎖等を結合させ、（ii）次いで、アダプター部分を抗体に固定する方法が好ましい。
【００２４】
例えば、（i）として、アダプター部分をアビジン修飾し、標識部分となるオリゴヌクレオチド鎖等をビオチン化して、両者を混合することにより、オリゴペプチド鎖等をアダプター部分に結合させることができる。あるいは、予めアダプター部分及びオリゴペプチド鎖等をいずれもビオチン化しておき、当該アダプター部分とオリゴペプチド鎖等とを混合すると共にアビジンを添加することで、アビジンを介してオリゴペプチド鎖等をアダプター部分に結合させることもできる。なお、前者の手法の場合、アダプター部分のアビジン修飾は、まずリンカー化合物をアダプター部分と結合反応させた後、当該化合物にアビジンを結合させてもよい。ここで使用されるアダプター部分がプロテインＡ、ＧまたはＬ等の場合は、リンカー化合物として、例えば「Sulhsuccinimidy1 4-（N・maleimidomethyl）cyclohexane−1−carboxylate （Sulfo・SMCC）」等を好ましく用いることができる
【００２５】
次に、（ii）においては、アダプター部分と抗体とが結合反応性を有する場合は、（i）で得られたアダプター部分／標識部分結合体と抗体とを混合することで、オリゴヌクレオチド複合抗体等の各種複合体を得ることができる。また、アダプター部分と結合物質とが、もともと結合反応性を有しない場合は、例えば、両者をビオチン化しておきアビジン存在下で混合するなど、（i）において採用し得る手法と同様の手法を用いて複合体を得ることができる。
【００２６】
こうして得られたオリゴヌクレオチド複合抗体は、抗原と反応させる前に精製しておくのが好ましい。その方が、フリーの抗体等による非特異的反応が生じないので、検出感度が向上するからである。オリゴヌクレオチド複合抗体の精製方法は、特に限定されないが、通常のゲル濾過などで行うことができる。
【００２７】
（２−２）抗原抗体複合体の形成
次に、（１）で得られた血液中の成分を含有する緩衝液中の抗原と、（２−１）で得られたオリゴヌクレオチド複合抗体とを接触させて抗原抗体複合体を形成させる。
【００２８】
その方法は特に限定されないが、例えば、抗原を支持体に固定化し、抗体を抗原に結合させることにより、抗体を支持体に結合させる。その後、緩衝液で洗浄することにより、未反応の抗体を除去することができ、高純度の抗原抗体複合体を得ることができる。この支持体には、プラスティックの底面やビーズなどを用いることができる。また、抗原を支持体に固定化するのに、抗原を支持体に直接結合させても、間接的に結合させても構わない。直接結合させる場合は、血液成分を含む緩衝液を支持体と接触させればよく、間接的に結合させる場合は、支持体に、抗原が結合する物質（例えば、抗体等）を予め結合させ、そこに血液成分を含む緩衝液を支持体と接触させればよい。特異性を高めるためには、後者の間接結合が好ましい。
【００２９】
（２−３）オリゴヌクレオチド鎖の検出
上述のオリゴヌクレオチド複合抗体は、オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を含む。この切断部位は、オリゴヌクレオチド、抗体、アダプターのいずれに設けられてもよいが、その特性によって、切断方法が異なる。例えば、オリゴヌクレオチドに設ける時は、制限酵素による切断部位、抗体やタンパク質のアダプターに設ける時は、プロテアーゼによる切断部位、アダプターとしてクロスリンカー（２価の架橋剤等）を設ける時は光照射や活性酸素によるによる切断部位などが挙げられる。しかし、簡便さと特異性の面で、オリゴヌクレオチドに制限酵素による切断部位を設けるのが好ましい。
【００３０】
そして、オリゴヌクレオチド鎖の検出をするために、この切断部位で抗原抗体複合体からオリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する。この回収工程によって、オリゴヌクレオチド鎖の検出前に濃縮することができ、より少量のオリゴヌクレオチド鎖も検出可能になる。
【００３１】
このようにして回収されたオリゴヌクレオチド鎖を増幅し、検出する。増幅方法は、常法に従えばよく、PCR法、LAMP法、ICAN法などを用いることが出来る。また、検出も、常法に従えばよく、電気泳動法などを用いればよいが、オリゴヌクレオチド鎖に放射性同位元素や酵素などでラベルしておき、それらをマーカーにして検出することも可能である。
【００３２】
＝＝血液中の複数の抗原を同時に検出する方法＝＝
血液中の複数の抗原を同時に検出するために、各抗原に特異的に結合する抗体と、抗原の種類に一対一で対応するオリゴヌクレオチド鎖とを含有するオリゴヌクレオチド複合抗体を用いることにより、各抗原を各オリゴヌクレオチド鎖と対応できるようにする。それによって、各オリゴヌクレオチド鎖を検出することで各抗原を個別に検出することができる。
【００３３】
この工程において、各抗原に対する特異的なオリゴヌクレオチド複合抗体を得るには、それぞれのオリゴヌクレオチド複合抗体をそれぞれ形成した後、精製しておく必要があり、使用する際には、各オリゴヌクレオチド複合抗体をそれぞれ混合すればよい。
【００３４】
あるいは、もし、抗体が異なる動物種で作製された時には、アダプターとして、各抗体に特異的に反応する抗IgG抗体を用いることにより、各オリゴヌクレオチド複合抗体を精製しなくても、各オリゴヌクレオチド複合抗体は一対一の対応で特異的に抗原に結合し得る。この場合、予め各オリゴヌクレオチド複合抗体を作製するのではなく、抗原に抗体を結合させ、そこにオリゴヌクレオチドを結合させたアダプターである二次抗体を、順に結合させることも可能になる。
【００３５】
なお、異なる抗原に対応するオリゴヌクレオチド鎖は、配列を変えることで特異性を持たせてもよく、長さを変えることで特異性を持たせてもよい。後者の場合、ＤＮＡ増幅のためのプライマーを共通にすることも可能になる。また、各オリゴヌクレオチド鎖に、異なる種類の標識（例えば、酵素の場合、アルカリホスファターゼとＨＲＰというように）でラベルすることにより、特異性を持たせることもできる。
【００３６】
＝＝乾燥血液付着繊維に付着した血液中の抗原を定量する方法＝＝
上述した抗原検出方法を用いて、検出対象の抗原を定量することもできる。そのためには、その抗原を事実上含有しない血液に、複数の既知濃度の抗原を添加し、上述した血液検体の場合と同様にしてオリゴヌクレオチド鎖を検出する。この時、抗原の量に従って、それに結合するオリゴヌクレオチド鎖も増えるため、オリゴヌクレオチド鎖を定量すれば、存在する抗原の量と相関性を持たせることが可能になる。この相関性を利用して作製した検量線に対し、血液検体によって得られたオリゴヌクレオチド鎖の量をあてはめることにより、検体に存在する抗原を定量することが可能になる。
【実施例】
【００３７】
本実施例では、遺伝病であるFabry 病、Gaucher病、Pompe病の各疾患に関する欠損若しくは不活化酵素 であるα-Galactosidase （以下α-Gal）、β-Glucocerebrosidase （以下GCR）、acid-α-Glucosidase （以下GAA)) を濾紙血から抽出し、MUSTagにより検出・定量することができることを示す。
【００３８】
（１）オリゴヌクレオチド複合抗体の調整
本実施例では、オリゴヌクレオチド複合抗体としてMUSTagを用いた。以下、その作製方法を説明する。
【００３９】
（１−１）オリゴヌクレオチドの合成
まず、１つ目の 131merのオリゴヌクレオチドは、５’プライマーとして、３’末端にビオチンが結合したプライマー１（配列番号１）、３’プライマーとして、プライマー２（配列番号２）を使用し、鋳型１（配列番号3）を使用して、ＰＣＲにより合成した。２つ目の136merのオリゴヌクレオチドは、５’プライマーとして、３’末端にビオチンが結合したプライマー１（配列番号１）３’プライマーとして、プライマー２（配列番号２）を使用し、鋳型２（配列番号4）を使用して、同様に合成した。３つ目の161merのオリゴヌクレオチドは、５’プライマーとして、３’末端にビオチンが結合したプライマー１（配列番号１）３’プライマーとして、プライマー２（配列番号２）を使用し、鋳型３（配列番号５）を使用して、同様に合成した。各ＰＣＲ後の増幅産物は、MinElute PCR Purification spin column（キアゲン社製）又はMiniprepカラム（Invitrogen社製）を用いて精製した。以下に、プライマーの配列及び反応条件を示す。
プライマー１：CTTACTGGCTTATCGAAA（配列番号１）
プライマー２：GGCAAGCCACGTTTGGTG（配列番号２）
鋳型１：CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATGGAATTCTGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGCATAGTGTCACCTAAATGCTAGGCACCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGCACACCAAACGTGGCTTGCC（配列番号３）
鋳型２：CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATGGAATTCTGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGCATAGTGTCACCTAAATGCTAGGCAATCAGCCTCGACTGTGCCTTCgcaGCAtgGCACACCAAACGTGGCTTGCC (配列番号４）
鋳型３：CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATGGAATTCTGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGCATAGTGTCACCTAAATGCTAGGCAACCGACAATTGCATGAAGAAcTCGCACATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCAcCACCAAACGTGGCTTGCC（配列番号５）
反応条件：
〈反応液組成〉
鋳型DNA（100μg/μL）：  １μL
Taq polymerase： 2.5u
プライマー（各20μM）： 2μL x2
dNTP（各2．5mM）： 8μL
10×Buffer： 10μL
滅菌水： 77μL（合計 100μL）
〈条件〉
「95℃・１分間→55℃・１分間→72℃・３０秒間」
を1サイクルとして30サイクル。
【００４０】
（１−２）プロテインＧ／アビジン結合体の調製
（i）Maleimide活性化プロテインGの調製
5mgのプロテインＧを、500pLの50mM sodiumphosphate（pH7.4）に溶解した。次いで、50μL ＤＭＳＯに化学修飾剤（chemical linker）としてのSulfosuccinimidy1 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate（以下「Sulfo-SMCC」（PIERCE 50mg，＃22322，Molecular Weight：436.37，Spacer Arm Lengt: 11．6Å）を1mg溶解し、これを上記プロテインＧの溶液に添加した。添加後の溶液を、室温で60分間ゆっくりと撹拝して、プロテインＧとSulfo-SMCCとを反応させ結合させた。なお、当該結合は、Sulfo-SMCCのSulfo-NHSエステル基とプロテインＧとの結合である。
反応後に残った余分なSulfo-SMCCを取り除くために、結合バッファーで平衡化した脱塩カラムを用いて、反応液を500μLずつの分画に分けた。各々の分画における溶出タンパク質（Maleimide活性化プロテインＧ）の濃度を測定し、ピークの画分を採取した。
５kDa pore size filter tubeを用いて、遠心によりMaleimide活性化プロテインＧを濃縮し、溶液の最終容量を500μLに調整した。
【００４１】
（ii）アビジンとの結合
バッファー（100mM Na-Phosphate（pH7.6)、5mM ＥＤＴＡ）に、EZ−Link  Maleimide Activated NeutroAvidin（PIERCE 5mg，＃31007，60kDa）を溶解させた。この溶液に、Maleimide活性化プロテインＧ溶液を添加した。この添加は、プロテインＧとアビジンとのモル比が１：３程度となるように調整して行った。
混合後の溶液を、40℃で4時間以上（〜一晩）ゆっくりと攪拌しながら反応させた。反応後の溶液を、ゲル濾過カラム（FPLC gel filtration（PC12 column））にかけ、プロテインＧ／アビジン結合体のうち、プロテインＧの１分子に対してアビジンが２又は３分子結合している結合体に相当する分子量の画分を採取した。
【００４２】
（１−３）複合抗体の調製
（i）プロテインＧ／アビジン結合体とオリゴヌクレオチド鎖との結合
バッファー（50mM Tris(pH8．0)，1mM EDTA，0.1M NaCl，0.5％ gelatin，0．1％ Tween20）中に、（１−１）で精製して得られた各オリゴヌクレオチド鎖（ビオチン化オリゴ）と、（１−２）で得られたプロテインＧ／アビジン結合体とを、それぞれモル比（ビオチン化オリ：プロテインＧ／アビジン結合体）が１：２程度となるように混合した。混合溶液を、室温で30分間以上撹拝しながら反応（ビオチンーアビジン結合反応）させ、オリゴヌクレオチド／プロテインＧ結合体を得た。
【００４３】
（ii）抗体とアダプター部分との結合
バッファー（50mM Tris(pH8.0)，1mM EDTA，0.1M NaCl，0.5％ gelatin，0.1％ Tween20）中に、オリゴヌクレオチド／プロテインＧ結合体と、各種モノクローナル抗体（全てGenzyme社）とを、それぞれ１：１のモル比となるように混合し、攪拌しながら室温で1時間あるいは4℃で12時間反応させた。具体的には、抗α-Galモノクローナル抗体は131merのオリゴヌクレオチドが結合した上記結合体と混合し、抗GCRモノクローナル抗体は136merのオリゴヌクレオチドが結合した上記結合体と混合し、抗GAAモノクローナル抗体は161merのオリゴヌクレオチドが結合した上記結合体と混合して、反応させた。各反応液を、それぞれ、5mLの脱塩カラムに通し、目的の画分を回収して、３種のオリゴヌクレオチド複合抗体（以下、それぞれα-Gal#1、Immi#2 、α-Glu#7と称する）を得た。
【００４４】
（２）Capture抗体の固相化
抗α-Galモノクローナル抗体、抗-GCRモノクローナル抗体、抗-GAA モノクローナル抗体を0.05M Sodium Carbonate（pH 9.6）でそれぞれ4 μg/mL、4 μg/mL、1 μg/mLになるように混合し、50 μL/wellで96 wellプレートに添加した。プレートシールを貼って密閉し、4℃内で一晩静置することにより、プレートに抗体を固相化した。その後、0.05% Tween20含有PBSで、３回ウエルを洗浄した。1% BSA含有PBSを200 μL/wellでウエルに添加し、湿潤箱に入れ37℃インキュベーター内で１時間静置することにより、ウエルをブロッキングした。その後、再度、0.05% Tween20含有PBSで、３回ウエルを洗浄した。
【００４５】
（３）検量線用検体の作製
α-Gal（FABRAZYME）、GCR（CEREZYME）、GAA（全てGenzyme社）の各タンパク質 を1% BSA含有PBSでそれぞれ1.2 μg/mL、3 μg/mL、60 μg/mLになるように混合し、そこから5倍希釈ずつ7段階希釈した。φ3 mmに切り取り、マウス血液をしみ込ませた濾紙に、各混合タンパク質溶液を、1 μL/paperで滴下した。1.5 mL マイクロチューブに入れ、蓋を開けた状態で60分間そのまま乾燥させた。チューブに0.05% Tween20含有5 mM Tris-HCl （pH 7.4）を 60 μL/tubeで添加し、60分間室温で静置してタンパク質を濾紙から溶出した。この溶出液を検量線用抗原として用いた。
【００４６】
（４）サンプルの調製
健常者から採取した血液を濾紙に滴下し、完全に乾燥させた。血液が浸透した部分の濾紙をパンチングしてφ3 mmに切り取り、1.5 mL tubeに入れて、0.05% Tween20含有5 mM Tris-HCl (pH 7.4) 60μL/tubeを添加した。60分間、室温で静置して、抗原を濾紙から抽出した後、溶液をサンプルとして回収した。
次に、検量線用抗原と、sampleを（２）で準備したプレートに50 μL/wellで添加し、一晩４℃で静置した後、ウエルを３回洗浄した。
【００４７】
（５）抗原抗体複合体の作製
（１）で調整したα-Gal#1、Immi#2 、α-Glu#7の各MUSTagを緩衝液（5% Goat Serum、0.05% Tween20、0.45 M NaCl、50 mM PB (pH7.4)）を用いて各8 ng/mLになるように混合した。（４）で洗浄後のプレートから洗浄用緩衝液を除去し、混合したMUSTagを25μL/wellで添加し、湿潤箱に入れ37℃インキュベーター内で１時間静置した。その後、同じ緩衝液で１回洗浄し、次に血清を含まない同じ組成の緩衝液で３回洗浄し、最後に0.05% Tween20含有PBS（0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 7.53 mM Na2H・PO4・12H2O, 1.47 mM KH2・PO4）で１回洗浄した。
【００４８】
（６）オリゴヌクレオチドの検出
ウエルから洗浄用緩衝液を除去し、0.3 units/30μL /wellでEcoR Iを添加した。プレートシールを貼って、37℃で15分静置することにより、オリゴヌクレオチドを抗原抗体複合体より切り離し、オリゴヌクレオチドを含んだ溶液をReal-Time PCR用サンプルとして回収した。この溶液３μLに対し、以下のプライマー（Forward : TGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATA：配列番号６）（Reverse : GGCAAGCCACGTTTGGTG：配列番号７）を用いてReal-Time PCR（条件は、95℃15分の後、95℃-60℃を３５サイクル）を行い、DNA Intercarator法またはTaqMan法により蛍光強度（Ct）を測定した。検量線用検体に対する測定値を用いて検量線を作製し、被検者のサンプルについて抗原量を算出した。
【００４９】
（７）結果
MUSTagを用いて濾紙血からの抽出液を用い、α-Gal、GCR、GAAの各抗原濃度を測定した結果（図１）、α-Galにおいては、サンプルAは25.0pg/spot、C.V.（変動係数）値が4.6% 、サンプルBは36.9pg/spot、C.V.が6.8% であった。
GCRにおいては、サンプルAは408pg/spot、C.V.が39%、サンプルBは187pg/spot、C.V.が10%であった。GAAにおいては、サンプルAは1472pg/spot、C.V.が20%、サンプルBは778 pg/spot、C.V.が42%であった。これらの値は、酵素活性によって測定した抗原濃度とほぼ一致した。
このように、MUSTagを用いることによって、乾燥血液付着濾紙に付着した微量の血液中の抗原でも検出でき、その濃度を定量できる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の実施例において、MUSTagを用いて、健常者２人から採血した血中のα-Gal、βGCR、GAAを同時検出したことを示すグラフである。
【図１】
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【配列表】
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