(57)【要約】【課題】脂肪組織から分離した脂肪由来細胞のうち接着能および増殖能の高い細胞を分取して移植することによって、治療効果の高い移植を行う。【解決手段】脂肪組織から単離された脂肪由来細胞に対して、表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１の発現を測定し、測定された前記表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１が、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現しているか否かを判定し、前記ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している脂肪由来細胞を分取する脂肪由来細胞の濃縮方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織から単離された脂肪由来細胞に対して、表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１の発現を測定し、
測定された前記表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１が、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現しているか否かを判定し、
前記ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している脂肪由来細胞を分取する脂肪由来細胞の濃縮方法。
【請求項２】
前記細胞の分取がフローサイトメトリによって行われる請求項１に記載の脂肪由来細胞の濃縮方法。
【請求項３】
前記細胞の分取が抗体で標識した磁気ビーズを用いて行われる請求項１に記載の脂肪由来細胞の濃縮方法。
【請求項４】
請求項１から請求項３に記載の濃縮方法によって濃縮された脂肪由来細胞を含む移植材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪由来細胞の濃縮方法および移植材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、脂肪由来細胞は、細胞治療の細胞ソースとして注目されている。脂肪由来細胞には複数の細胞集団が存在することが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特表２００７−５０９６０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、脂肪由来細胞に含まれるどの細胞集団に治療効果が備わっているのかについては、はっきりしたメカニズムが解明されていない。このため、脂肪組織から分離した脂肪由来細胞によって所望の効果を得られない場合も発生する。
【０００５】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、脂肪組織から分離した脂肪由来細胞のうち接着能および増殖能の高い細胞を分取して移植することによって、治療効果の高い移植を行うことができる脂肪由来細胞の濃縮方法および移植材を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、脂肪組織から単離された脂肪由来細胞に対して、表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１の発現を測定し、測定された前記表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１が、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現しているか否かを判定し、前記ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している脂肪由来細胞を分取する脂肪由来細胞の濃縮方法を提供する。
【０００７】
発明者らは表面抗原マーカーＣＤ３１（抗原：Plate Endothelial Cell Adhesion Molecule-1）、ＣＤ３４（抗原：分子量約１１０ｋDａの単鎖膜貫通型リン酸化糖タンパク）、ＣＤ４５（抗原：白血球共通抗原）およびＣＤ２７１（抗原：Nerve growth factor receptor）を用いて、脂肪由来細胞について各表面抗原マーカーの発現を測定し、表面抗原マーカーＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−およびＣＤ２７１＋で分画される細胞群は接着能が高く、増殖能も高いことを見出した。
本発明によれば、接着能および増殖能が高い細胞群を分取して濃縮することにより、脂肪組織から分離した脂肪由来細胞のうち接着能および増殖能の高い細胞を分取して移植するという治療効果の高い移植を行うことができる。つまり、脂肪組織に含まれている様々な細胞の中から、目的とする治療効果の高い細胞を選択して移植するので、その治療効果を高めることができる。
【０００８】
上記発明においては、前記細胞の分取がフローサイトメトリによって行われることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記細胞の分取が抗体で標識した磁気ビーズを用いて行われることとしてもよい。
本発明は、前記濃縮方法によって濃縮された脂肪由来細胞を含む移植材を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、脂肪組織から分離した脂肪由来細胞のうち接着能および増殖能の高い細胞を分取して移植することによって、治療効果の高い移植を行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の実施形態に係る脂肪由来細胞の濃縮方法および移植材について説明する。
本発明の第１の実施形態に係る脂肪由来細胞の濃縮方法は、例えば、脂肪組織から単離された前記脂肪由来細胞について、接着能および増殖能の高い細胞をフローサイトメトリにより分取する脂肪由来細胞の濃縮方法である。この濃縮方法は、脂肪組織から単離された脂肪由来細胞に対して、表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１の発現を測定し、測定された前記表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１が、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現しているか否かを判定し、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している脂肪由来細胞を分取することによって行われる。
【００１１】
つまり、細胞の膜表面で発現している前記表面抗原ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１に対する抗体（細胞表面マーカー）であって、予め蛍光色素等で標識されているＣＤ３１抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ４５抗体およびＣＤ２７１抗体が、前記表面抗原を発現している細胞の膜表面にそれぞれ結合される。これらの抗体が結合されている細胞に、フローサイトメータ等から発せられた励起光が照射されると、前記抗体が結合している細胞から蛍光が発せられる。この蛍光を測定することにより前記表面抗原マーカーの発現を確認することができる。
【００１２】
前記蛍光色素は、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＰＥ−Ｃｙ７（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−Ｃｙａｎｉｎ７）またはＡＰＣ−Ｃｙ７（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ−Ｃｙａｎｉｎ７）等を使用する。前記ＣＤ３１抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ４５抗体およびＣＤ２７１抗体がそれぞれ異なる前記蛍光色素で標識されている場合は、前記蛍光色素の種類によって放出される波長が異なるため、同時に複数の前記表面抗原マーカーの発現を測定することができる。
【００１３】
測定された前記表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１が、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現しているか否かの判定を行う際、前記表面抗原マーカーが発現していない状態を測定しておく。つまり、ＩｇＧ等のアイソタイプコントロール（ネガティブコントロール）を用いて自家蛍光等の非特異的な反応による影響を測定し、ネガティブ（−）の状態を確認する。次に、前記表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１を用いた測定を行い、ネガティブ（−）の状態をもとにポジティブ（＋）であるか否かを判断する。ネガティブ（−）の状態から変動が生じて蛍光強度が高くなった場合はポジティブ（＋）であるといえる。例えば、ＣＤ３１についてポジティブである細胞はＣＤ３１＋、ネガティブである細胞はＣＤ３１−と表記する。このようにして各前記表面抗原マーカーの発現について判断を行い、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している細胞群を特定する。
【００１４】
特定されたＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している細胞群の分取については、例えば、まず上から下に前記脂肪由来細胞を含む分取用サンプルを流し、一定の振動を加えることによってサンプル液が細胞１個を含む程度の小さな液滴となるようにする。次に上記判断によって特定されたＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している細胞を含む液滴のみをプラスまたはマイナスに荷電し、プラスに荷電した場合は液滴がマイナス極板側に、マイナスに荷電した場合は液滴がプラス極板側に引かれることによって分取が行われる。荷電されていない液滴は極板に引かれることなく垂直に落下するため、荷電された液滴に含まれた目的とする細胞のみを収集することができる。このようにして治療効果の高い細胞を濃縮することができる。
【００１５】
本発明の第２の実施形態に係る脂肪由来細胞の濃縮方法は、例えば、脂肪組織から単離された前記脂肪由来細胞について、接着能および増殖能の高い細胞を抗体で標識した磁気ビーズを用いて分取する脂肪由来細胞の濃縮方法である。
この濃縮方法は、例えば、ＣＤ３１抗体で標識された磁気ビーズと前記脂肪由来細胞とを混合し、前記ＣＤ３１抗体で標識された磁気ビーズと結合したＣＤ３１抗原を発現している細胞のみを磁力で引き寄せておき、残りの細胞を回収することによりＣＤ３１−の細胞を分取する。次に回収されたＣＤ３１−の細胞群について、ＣＤ４５抗体で標識された磁気ビーズと結合したＣＤ４５抗原を発現している細胞のみを磁力で引き寄せておき、残りの細胞を回収することによりＣＤ３１−かつＣＤ４５−の細胞が分取されたこととなる。
【００１６】
次に回収されたＣＤ３１−かつＣＤ４５−の細胞群についてＣＤ３４抗体で標識された磁気ビーズと結合したＣＤ３４抗原を発現している細胞のみを磁力で引き寄せておき、引き寄せられなかった細胞を取り除くことによってＣＤ３１−、ＣＤ４５−かつＣＤ３４＋の細胞が分取されたこととなる。続いて回収されたＣＤ３１−、ＣＤ４５−かつＣＤ３４＋の細胞群についてＣＤ２７１抗体で標識された磁気ビーズと結合したＣＤ２７１抗原を発現している細胞のみを磁力で引き寄せておき、引き寄せられなかった細胞を取り除くことによってＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の細胞が分取されたこととなる。
このようにして、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している細胞群を特定して分取し、治療効果の高い細胞を濃縮することができる。
【００１７】
本発明の第３の実施形態に係る脂肪由来細胞の移植材は、例えば、脂肪組織から単離された前記脂肪由来細胞のうち、前記表面抗原マーカーの発現によって特定された接着能および増殖能の高い細胞を分取して濃縮した脂肪由来細胞を含む移植材である。前記移植材は、濃縮した細胞以外にサイトカイン等の治療効果を高める成分を含んでいてもよい。
目的とする細胞の分取方法については、第１の実施形態と同様に前記フローサイトメトリによる分取方法であってもよく、また、第２の実施形態と同様に前記抗体で標識した磁気ビーズを用いた分取方法であってもよい。
【００１８】
発明者らは表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１を用いて、脂肪由来細胞についてこれらの表面抗原マーカーの発現を測定し、表面抗原マーカーＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋で分画される細胞群は、他の分画と比較して生着能が高い細胞群であることを見出した。したがって、接着能および増殖能が高い細胞を分取して濃縮することができ、採取された前記脂肪由来細胞中の目的とする細胞の構成比に影響されることなく、治療効果の高い移植を行うことができる。
【００１９】
次に、第１の実施形態の脂肪由来細胞の濃縮方法に係る、細胞を判定する方法の一実施例について、図１から図４を参照して説明する。
脂肪由来細胞は、コラゲナーゼ等のタンパク質分解酵素を用いて脂肪組織から単離される。このようにして単離された脂肪由来細胞とＣＤ３１抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ４５抗体およびＣＤ２７１抗体を混合し、反応させた測定用試料ＳＡを用意する。この測定用試料ＳＡとは別に、単離された脂肪由来細胞とＩｇＧ等のアイソタイプコントロールを混合したコントロール試料ＳＢを、抗体に標識されている蛍光色素の種類に応じて用意する。
【００２０】
図１は、表面抗原マーカーＣＤ３１およびＣＤ４５の発現および細胞群の分画を示すドットプロット（２パラメータヒストグラム）である。縦軸は表面抗原マーカーＣＤ３１の蛍光強度、横軸は表面抗原マーカーＣＤ４５の蛍光強度をそれぞれ表している。
【００２１】
まず、表面抗原マーカーＣＤ３１用のコントロール試料ＳＢ３１および表面抗原マーカーＣＤ４５用のコントロール試料ＳＢ４５を測定し、自家蛍光等の非特異的反応による影響を確認する。このコントロール試料ＳＢ３１の測定結果をＣＤ３１−（ネガティブ）の状態とし、図１のヒストグラムについてＣＤ３１−（ネガティブ）とＣＤ３１＋（ポジティブ）との境界線Ｋ１を決定する。同様にしてコントロール試料ＳＢ４５を測定し、ＣＤ４５−とＣＤ４５＋との境界線Ｋ２を決定する。これらの前記境界線Ｋ１およびＫ２をもとにＣＤ３１−かつＣＤ４５−である細胞分画をＰ１、ＣＤ３１＋かつＣＤ４５−である細胞分画をＰ２、ＣＤ３１−かつＣＤ４５＋である細胞分画をＰ３、ＣＤ３１＋かつＣＤ４５＋である細胞分画をＰ４とした。
【００２２】
測定用試料ＳＡを測定し、前記細胞分画Ｐ１からＰ４をもとに細胞群Ｆの発現を特定した。現れた細胞群Ｆは、ＣＤ３１−かつＣＤ４５−である細胞群Ｆ１、ＣＤ３１＋かつＣＤ４５−である細胞群Ｆ２、ＣＤ３１＋＋かつＣＤ４５−である細胞群Ｆ３、ＣＤ３１＋またはＣＤ３１−かつＣＤ４５＋である細胞群Ｆ４の４群であった。
【００２３】
これら４つの細胞群Ｆ１からＦ４を個別に培養すると、図３に示すように、細胞群Ｆ３およびＦ４は接着細胞がみられず、細胞群Ｆ１およびＦ２は接着細胞がみられた。細胞群Ｆ１の細胞のうち１％の細胞が接着、増殖し、細胞群Ｆ２の細胞のうち０．１％以下の細胞が接着し、増殖した。よって、細胞群Ｆ１は他の細胞群Ｆ２からＦ４と比較して最も接着能が高い細胞群であるといえる。
【００２４】
図２は、ＣＤ３１−かつＣＤ４５−である細胞群Ｆ１について測定された、表面抗原マーカーＣＤ２７１およびＣＤ３４の発現および細胞群の分画を示すドットプロットである。縦軸は表面抗原マーカーＣＤ２７１の蛍光強度、横軸は表面抗原マーカーＣＤ３４の蛍光強度をそれぞれ表している。
【００２５】
上記の方法と同様にして、表面抗原マーカーＣＤ２７１用のコントロール試料ＳＢ２７１および表面抗原マーカーＣＤ３４用のコントロール試料ＳＢ３４を測定し、自家蛍光等の非特異的反応による影響を確認する。コントロール試料ＳＢ２７１の測定結果をＣＤ２７１−の状態とし、図２のヒストグラムについてＣＤ２７１−とＣＤ２７１＋との境界線Ｋ３を決定する。同様にして表面抗原マーカーＣＤ３４用のコントロール試料ＳＢ３４を測定し、ＣＤ３４−とＣＤ３４＋との境界線Ｋ４を決定する。これらの前記境界線Ｋ３およびＫ４をもとに、ＣＤ２７１−かつＣＤ３４−である細胞分画をＰ５、ＣＤ２７１＋かつＣＤ３４−である細胞分画をＰ６、ＣＤ２７１−かつＣＤ３４＋である細胞分画をＰ７、ＣＤ２７１＋かつＣＤ３４＋である細胞分画をＰ８とした。
【００２６】
前記測定用試料ＳＡに含まれる細胞群Ｆ１をさらに解析し、前記細胞分画Ｐ５からＰ８をもとに表面抗原マーカーＣＤ２７１およびＣＤ３４の発現について特定した。前記細胞群Ｆ１は、ＣＤ２７１−かつＣＤ３４−である細胞群Ｆ１−１、ＣＤ２７１＋かつＣＤ３４−である細胞群Ｆ１−２、ＣＤ２７１−かつＣＤ３４＋である細胞群Ｆ１−３、ＣＤ２７１＋かつＣＤ３４＋である細胞群Ｆ１−４の４群であった。
【００２７】
前記細胞群Ｆ１から分画されたこれら４つの細胞群Ｆ１−１からＦ１−４を個別に培養すると、図４に示すように、細胞群Ｆ１−１およびＦ１−２は接着細胞がみられず、細胞群Ｆ１−３およびＦ１−４は接着細胞がみられた。細胞群Ｆ１−３の細胞のうち０．５％の細胞が接着、増殖し、細胞群Ｆ１−４の細胞のうち２．５％の細胞が接着し、増殖した。よって細胞群Ｆ１−４は他の細胞群Ｆ１−１からＦ１−３と比較して最も接着能および増殖能が高い細胞群であるといえる。
【００２８】
接着能および増殖能が高い細胞群Ｆ１−４は、ＣＤ３１−かつＣＤ４５−である細胞群Ｆ１をさらにＣＤ２７１およびＣＤ３４によって分画された、ＣＤ２７１＋かつＣＤ３４＋の発現を示す細胞群である。したがって、このＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋を発現している細胞群を分取することにより、脂肪組織に含まれている様々な細胞の中から目的とする治療効果の高い細胞を濃縮することができるという効果を奏する。
なお、これらの表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１の測定順序は上記実施例に限られず、また、前記表面抗原マーカーを１つずつ４回測定してもよいし、４つを同時に測定することとしてもよい。また、上記表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１に加えて、他の表面抗原マーカーを組み合わせて測定してもよいこととする。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施形態に係る脂肪由来細胞の濃縮方法において、表面抗原マーカーＣＤ３１およびＣＤ４５の発現および細胞群の分画を示すヒストグラムである。
【図２】本発明の一実施形態に係る脂肪由来細胞の濃縮方法において、細胞群Ｆ１についての表面抗原マーカーＣＤ２７１およびＣＤ３４の発現および細胞群の分画を示すヒストグラムである。
【図３】本発明の一実施形態に係る脂肪由来細胞の濃縮方法において、フローサイトメトリを用いた測定によって分画された各細胞群についての接着率を示す顕微鏡写真である。
【図４】本発明の一実施形態に係る脂肪由来細胞の濃縮方法において、フローサイトメトリを用いた測定によって分画された各細胞群についての接着率を示す顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【００３０】
ＳＡ  測定用試料
ＳＢ  コントロール試料
Ｋ  境界線
Ｐ  細胞分画
Ｆ  細胞群
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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