(57)【要約】【課題】  微細植物プランクトンの数をより正確に計測することができ、しかもその計測を迅速、客観的に行うことができる植物プランクトンの計測法を提供する。【解決手段】  群体を形成している微細な植物プランクトンを含む水５に植物プランクトンそのものが破壊されない程度の超音波を照射して植物プランクトンを細胞単位にバラバラに分散し、この分散した細胞単位の植物プランクトンの数をフローサイトメーター４で計測する。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
群体を形成している微細な植物プランクトンを含む水に植物プランクトンそのものが破壊されない程度の超音波を照射して植物プランクトンを細胞単位にバラバラに分散し、この分散した細胞単位の植物プランクトンの数をフローサイトメーターで計測することを特徴とする植物プランクトンの計測法。
【請求項２】
寒天状物質に包まれている植物プランクトンに超音波を周波数２０〜４５ｋＨｚ、２ｗ〜１００ｗで、５〜２０秒照射し、寒天状物質のみを破壊して植物プランクトンを細胞単位にバラバラに分散する請求項１に記載の植物プランクトンの計測法。
【請求項３】
フローサイトメーターで計測する際、フローセルの目詰まりを防ぐため目開き約５０μｍのメッシュで水をろ過する請求項１又は２に記載の植物プランクトンの計測法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、湖沼やダム湖に存在する微細植物プランクトンの量を計測する植物プランクトンの計測法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、湖水中には数μｍの微細な植物プランクトンが存在することが明らかになり、この微細植物プランクトン、一例を挙げるとその大きさによりフェムトプランクトン（０．０２〜０．２μｍ）、ピコプランクトン（０．２〜２μｍ）、ナノプランクトン（２〜２０μｍ）、ミクロプランクトン（２０〜２００μｍ）、等々であるが、水質に悪影響を及ぼしていることが明らかになってきた。微細植物プランクトンは、そのサイズが小さいことから光学顕微鏡で検出することが困難であり、湖水中の植物プランクトンの量は明らかになっていない。最近は特殊な顕微鏡（蛍光顕微鏡）での計数も試みられるようになってきたが、これはフィルタへの捕捉といった前処理と目視による計数であり、迅速、客観的に、植物プランクトンを計測できないのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで発明者らは、微細な粒子を流体中に分散させ、その流体を細く流して個々の粒子を光学的に分析するフローサイトメトリーは、１秒あたり数千個程度の細胞を計数できることから、微細植物プランクトンの迅速な計数には、フローサイトメトリーに用いられる装置であるフローサイトメーターは有効であると考え、本技術の微細植物プランクトン計測への適用性を検討してきた。その結果、水中の微細植物プランクトンは、群体を形成しているものも多く、フローサイトメーターによる微細植物プランクトンの計測では、細胞をバラバラに分散させる必要があることが分かった。
【０００４】
しかも、水中の微細植物プランクトンの中には、複数の細胞が寒天状物質に包まれているものがあり、フローサイトメーターで細胞数を正確に計測するためには、寒天状物質を破壊し、藻類を細胞単位にバラバラにさせる必要がある。
【０００５】
前記のことから、発明者らは、細胞が破壊されない程度の超音波を照射することにより、寒天状物質を破壊し、細胞単位にバラバラにし、植物プランクトンが有するクロロフィルとフィコエリスリンの粒子数とその蛍光強度をフローサイトメーターで計測することを見出した。これにより、微細植物プランクトンの数をより正確に計数することが可能となること、さらに、フローサイトメーターで計測する際、フローセルの目詰まりを防ぐため５０μｍ程度のメッシュで試料をろ過する必要が好ましいこと、超音波処理は、藻類を分散させることから、メッシュに捕捉される藻類を減少させる効果も期待できること、また、超音波処理前と処理後のフローサイトメーターによる計測結果を比較することにより、群体形成種を同定することも可能であること、等も見出した。
【０００６】
すなわち、この発明は、前記従来の技術では解決できなかった課題を解決し、微細植物プランクトンの数をより正確に計測することができ、しかもその計測を迅速、客観的に行うことができる植物プランクトンの計測法を提供することを目的とする。
【０００７】
なお、この発明と関連する技術として、これまでに特許文献１や特許文献２などが提案されている。しかし、特許文献１は低濁検水中の微小植物プランクトンを即座にしかも連続的に計数することを技術的課題とし、その課題解決のために、測定セルと、微粒子計と、蛍光光度計とからなり、検水中の粒子径毎の粒子数及びクロロフィル含有粒子数を蛍光光度計の出力から計数するものであり、また、特許文献２は現地で簡便に植物プランクトンを測定できるようにすることを技術的課題とし、その課題解決のために、センサ部とデータ解析部とからなり、前記センサ部は、特定の波長光を透過する干渉フィルタと該干渉フィルタを透過した光量を検知する光センサとからなるセンサユニットを備えるとともに、該センサユニットの複数種類を耐水圧ケース内に納めており、前記データ解析部は、前記センサ部を水中に沈めた時に前記各センサユニットから出力される信号に基づいて各波長光ごとの分光放射照度を演算し植物プランクトン量を求める手段を備えているものであり、いずれもフローサイトメーターによって計測するものでなく、また計測に際して超音波照射によって植物プランクトンを細胞単位にバラバラに分散するものでもなく、この発明とは技術的に程遠いものである。
【特許文献１】特開２００３−２５４８９１号公報
【特許文献２】特開平６−２１３８０２号公報
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、群体を形成している微細な植物プランクトンを含む水に植物プランクトンそのものが破壊されない程度の超音波を照射して植物プランクトンを細胞単位にバラバラに分散し、この分散した細胞単位の植物プランクトンの数をフローサイトメーターで計測することを特徴とする。請求項２に記載の発明は、請求項１において、寒天状物質に包まれている植物プランクトンに超音波を周波数２０〜４５ｋＨｚ、２ｗ〜１００ｗで、５〜２０秒照射し、寒天状物質のみを破壊して植物プランクトンを細胞単位にバラバラに分散することを特徴とする。
【０００９】
請求項３に記載の発明は、請求項１又は２において、フローサイトメーターで計測する際、フローセルの目詰まりを防ぐため目開き約５０μｍのメッシュで水をろ過することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
請求項１ないし３に記載の発明は、前記のように水に植物プランクトンそのものが破壊されない程度の超音波を照射することにより、寒天状物質を破壊し、細胞単位にバラバラに分散し、フローサイトメーターで計数するものであるから、微細植物プランクトンの数をより正確に計測することができる。しかも、目視の必要がないから、その計測を迅速、かつ客観的に行うことができる。さらに、フローサイトメーターで計測する際、フローセルの目詰まりを防ぐため目開き約５０μｍのメッシュで水をろ過するが、その際には超音波処理は藻類を分散させることから、メッシュに捕捉される藻類を減少させる効果も期待できる。また、プランクトンが含まれる水を超音波処理する工程では、例えばホーン型又は水浴型の超音波発生槽を使用し、藻類を包む寒天状物質のみが破壊される程度（藻類細胞自体は破壊されない）の強度で超音波処理を行うので、水中のプランクトンを大きく損傷しない。
【００１１】
また、請求項１ないし３に記載の発明は、植物プランクトンの計測に関連して、計測結果である超音波未処理と、超音波処理サンプルのサイトグラムを比較するという簡単な手法により、計測した微細植物プランクトンの群体形成藻類集団における種類（群体形成種）を容易に同定することができ、同定後はそのサンプルを使って各種の活用を図ることができる効果も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この発明の一実施の形態を、図面を参照して説明する。
【００１３】
図１は、植物プランクトンの計測法を説明するための工程とその工程を実施するための装置概要を示す図面である。
【００１４】
同図に示すように、装置は大略、ホーン型の超音波発生器１又は水浴型の超音波洗浄機２と、ろ過手段としてのメッシュ３と、フローサイトメーター４とからなっている。これら機器は市販の製品を使用する。超音波を発生させる装置としての超音波発生器１又は超音波洗浄機２はあくまでも一例であって、これ以外の装置を使用してもよいことは勿論である。フローサイトメーター４は図示のようなフローセル、アルゴンレーザー、前方散乱光検出器、側方散乱検出器、蛍光検出器（赤色蛍光、橙色蛍光、黄色蛍光、緑色蛍光）、光学フィルタ、偏向板、ソーティング調整器、等の構成部材からなっている。フローサイトメーター４の細部構成と、その使用上の動作は従前より周知であるため、ここでは詳しい説明は省略する。
【００１５】
前記の装置を用いた植物プランクトンの計測法について、各工程別に説明する。
【００１６】
＜超音波処理工程＞
まず、植物プランクトンが含まれる水を超音波処理する工程では、微細藻類が含まれる試料としての水５を入れるホーン型のチップ６を有する超音波発生器１又は水浴型の超音波洗浄機２を使用し、微細藻類を包む寒天状物質のみが破壊される程度（藻類細胞自体が破壊されない程度）の強さで超音波を水５に照射して植物プランクトンを細胞単位にバラバラに分散する処理を行う。分散の効果が期待できる超音波周波数は２０〜４５ｋＨｚであり、２０ｋＨｚ，２ｗ程度のホーン型の超音波発生器１では１０〜２０秒程度の照射、２８〜４５ｋＨｚ，１００ｗ程度の超音波洗浄機２では５秒程度の照射で植物プランクトンの分散が可能となる。
【００１７】
＜メッシュ処理工程＞
次に、メッシュ処理する工程では、水５を目開き約５０μｍのメッシュ３に通してろ過し、大きな夾雑物を除去する。なお、このメッシュ処理工程は必須のものではなく、必要に応じて付加すれば足りる。また、メッシュ３も一例であって、大きなゴミを取り除き、フローサイトメーター４のフローセルの目詰まりを防ぐことが可能であれば、他のろ過手段を使用してもよい。
【００１８】
＜フローサイトメトリーによる計測工程＞
次に、フローサイトメトリーによる計測工程では、メッシュ処理して別の容器に移された水５を、別途に容器に用意したシース液とともにフローサイトメーター４のフローセルに投入する。そして、フローセルを１個１個の藻類が１列となり、１個ずつ順番に流れていく間にフローセルにアルゴンレーザーからレーザー光を照射する。レーザー光が照射された藻類からは藻類の特性（藻類にはクロロフィルやフィコエリスリンと呼ばれる蛍光色素をもつ）に応じ蛍光が出るので、レーザー光を横切った藻類の１つひとつの蛍光を前方散乱光検出器及び側方散乱光検出器で検出する。また、藻類から生じた蛍光は様々な光学フィルタを用いて波長別に分解され、それぞれの波長別に分解された光を蛍光検出器（光電子増倍管）で検出する。そして、このそれぞれの検出器で検出した藻類１個１個の蛍光の強さ等が数値化される。つまり、植物プランクトンが有するクロロフィルを反映する６７５ｎｍ（赤色）と、フィコエリスリン等を反映する６１０ｎｍ、５７５ｎｍ（橙色、黄色）の蛍光を前記蛍光検出器で検出し、その検出結果を増幅器で増幅し、さらにパルス処理し、デジタル変換して表示と解析処理を行う。この解析処理で水５中において分散された植物プランクトンの数を計測することができることとなる。
【００１９】
前記のようにフローサイトメーター４による計測の前に水５に超音波発生器１又は超音波洗浄機２により超音波を照射するので、植物プランクトンの分散がきわめて容易に行われる。しかも、メッシュ３でろ過してさらに不要な夾雑物を除去するので、純度の高い植物プランクトンを計測に供することができる。したがって、フローサイトメーター４による計測では微細植物プランクトンの数をより正確に計測することができる。また、計測も従前のように目視に頼らずに行えるため、迅速であるとともに、客観的な計測結果を担保することができる。
【００２０】
実験例１
琵琶湖表層のサンプルを使用し、超音波処理時間とフローサイトメーター４による検出個数の関係を調査した。超音波発生装置として用いたものはブランソン社製の超音波発信機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ  ４５０Ｄ）にチップ（マイクロチューブ）用ホーン７を取り付けたものであり、２０ｋＨｚ，約２ｗの条件で使用した。チップ６に水５を１ｍｌとり、ホーン７を直接、水５に浸透し、超音波処理を行った。超音波処理時間は０秒、２秒、５秒、１０秒、２０秒である。計測は、４８８ｎｍのアルゴンレーザーにより励起し、前方散乱、側方散乱、及び藻類中の蛍光物質の蛍光を測定した。測定した蛍光はクロロフィルを反映する６７５ｎｍ（赤色）とフィコビリン等を反映する６１０ｎｍ、５７５ｎｍ（橙色、黄色）の蛍光である。その結果、１０秒程度超音波処理することにより、検出される細胞数が３５０００〜４００００個に達し、増大することが分かった（図２）。
【００２１】
図３は、微細藻類が含まれる琵琶湖湖水１ｍｌの超音波処理前のサイトグラム、図４は、超音波処理後のサイトグラムを示す。すなわち、図４は、ホーン型の超音波発生器１で約２ｗ、１０秒間超音波処理し、その処理した水をフローサイトメーター４で計測した結果の一部である。図４は、蛍光検出器（黄色蛍光）と蛍光検出器（赤色蛍光）で検出された藻類１個１個の蛍光の強さを数値化しプロットしたものである。図４中のドット１つひとつが藻類、つまり微細植物プランクトン１個１個に対応している（図３でも同様である）。図４中のドットは約３万６千個ある（フローサイトメーター４には自動カウント機能がついている）ので、植物プランクトンは約３万６千個あることになる。同じ種類の植物プランクトンは、概ね同じ蛍光の強さとなるので、仮に水中に１種類の植物プランクトンしか存在しないとした場合、図４のように整理すると、ある一箇所にプロットが集中することになる。しかし、図４は概ねＡ、Ｂ、Ｃの３領域にわけることができるので３種類以上の植物プランクトンが存在していることが分かる。また、図３と図４のそれぞれプロットの対比において、図４では領域Ｃの斜め上方の領域のプロットが減少している。これから図３でこの位置に検出されていたものが群体形成藻類であることが分かる。超音波処理前と処理後のサイトグラムの変化は、微細植物プランクトンの群体構造が壊れ、小さな粒子となるため、蛍光強度が低下するためと考えられる。サイトグラム上で変化が見られた領域の藻類をソーティング（フローサイトメーター４には、サイトグラム上の任意に指定した領域の藻類を分取することができる機能がついている）し、顕微鏡観察などを用いることにより、前記藻類の群体形成藻類集団における種類を同定することが可能となる。
【００２２】
また、前記の計測に基づく、超音波未処理（０秒）と超音波処理（１０秒）の水の計測結果（サイトグラム）の比較から、群体を形成する藻類は赤色及び黄色の蛍光を同時にもつ藻類であることが分かる（図３，４）。
【００２３】
実験例２
琵琶湖水深別のサンプルを使用し、超音波処理を１０秒行った水と、未処理の水を用いた分析を行った。フローサイトメトリーの計測法は実験例１と同様である。その結果、表層付近では未処理サンプルより、超音波処理したサンプルで藻類検出個数が４万個と未処理のものより倍近く増大していた（図５）。水面から水深が１０ｍ位までの表層付近では群集で存在している藻類が多いことが分かる。すなわち、この実験例２は、実験例１（最適な超音波条件を調べたもの）で決めた超音波処理条件を用いて、琵琶湖の水深別の水を超音波処理なしと、超音波処理ありの条件でフローサイトメーター４により計測したものであるが、表層では超音波処理した植物プランクトンの数は超音波処理しない植物プランクトンの数より断然多いが、水深が深くなるにしたがって超音波処理してもしなくとも植物プランクトンの数に大差なく少ないこと、換言すると水深が深くなるにしたがって超音波処理しても、しなくても植物プランクトンの数に大差なく少ないことが分かるデータともなっている。これは、水深が深くなるにしたがい群体を形成する微細植物プランクトン数が少なくなるためであると考えられる。
【００２４】
図６は、超音波周波数と琵琶湖水中の藻類の分散効果を調べた結果である。横軸の未処理は超音波処理せずにフローサイトメーター４で計測したときの藻類の個数（植物プランクトン検出個数／ｍｌ）である。横軸の２０ｋＨｚ、ホーン型は実験例１と実験例２で使用した超音波発生器１で２ｗ、１０秒で処理したものである。この処理では植物プランクトン検出個数がｍｌ当り１万５千個近くに達し、分散効果が認められた。さらに、横軸の２８ｋＨｚ，３８ｋＨｚ，４５ｋＨｚ，１００ｋＨｚのものは超音波洗浄機２で１００ｗ〜１２０ｗ、５秒で処理したものである。この２８ｋＨｚ，３８ｋＨｚ，４５ｋＨｚの超音波洗浄機２でも植物プランクトン検出個数がｍｌ当り１万５千個近くから２万個近くに及び、２０ｋＨｚのホーン型と同等以上の分散効果があることが分かった。ただし、１００ｋＨｚの超音波洗浄機２では分散効果が期待できないことも明らかとなった。
【００２５】
図７は超音波照射前の植物プランクトンの画像写真、図８は超音波照射後の植物プランクトンの画像写真である。これら両図の画像から超音波の照射によって植物プランクトンがバラバラに分散されている状態が分かる。画像には５μｍの長さのバーが示されているので、これとの比較からバラバラにされた１つひとつの植物プランクトンの大きさが窺い知れる。また、この顕微鏡観察からも、超音波照射後では群体を形成している植物プランクトンは減少していることが分かる。
【００２６】
以上のように、この発明の一実施の形態を説明してきたが、あくまでも一例を示すものであり、その実施に際しては使用する超音波発生の装置や数値等を特許請求の範囲に記載した範囲内で、任意に設計変更・修正ができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】この発明の一実施の形態である、植物プランクトンの計測法を説明するための工程とその工程を実施するための装置概要を示す図面である。
【図２】超音波処理時間と微細植物プランクトン検出個数を表わすグラフである。
【図３】超音波処理前のサイトグラムを表わす図面である。
【図４】超音波処理後のサイトグラムを表わす図面である。
【図５】琵琶湖水深方向と植物プランクトン数を表わすグラフである。
【図６】超音波周波数と植物プランクトン数を表わすグラフである。
【図７】超音波照射前の植物プランクトン画像を表わす写真である。
【図８】超音波照射後の植物プランクトン画像を表わす写真である。
【符号の説明】
【００２８】
１  ホーン型の超音波発生器
２  超音波洗浄機
３  メッシュ
４  フローサイトメーター
５  水（試料）
６  チップ（マイクロチューブ）
７  チップ（マイクロチューブ）用ホーン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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