(57)【要約】【課題】Ｃ型肝炎ウイルスの産生を抑制する材料と、それを用いた医薬品及び食品を提供する。【解決手段】サトイモ科植物の塊茎の加工処理物は、Ｃ型肝炎ウイルスの産生を抑制する特異な作用をもつ。加工処理物としては、サトイモ科植物の塊茎自体でも良いが、用途に応じて乾燥粉砕物、搾汁、抽出物から適宜選択使用するのが望ましい。また、サトイモ科植物の塊茎の中でも皮加工処理物を用いることが、効率良く活性得るという観点から最適である。本発明のＨＣＶ産生抑制剤は、ＨＣＶ感染者を対象とし、ＨＣＶにより誘発される疾患、例えば、ＨＣＶ感染者の肝炎発症、急性期および慢性期の肝炎、並びに慢性肝炎から肝硬変および肝癌発症、あるいはウイルス感染症により悪化する疾患を予防および／または治療するために用いることができる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サトイモ科植物の塊茎の加工処理物を有効成分とするＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤。
【請求項２】
サトイモ科植物の加工処理物が、塊茎の粉砕物、塊茎の搾汁、および塊茎の抽出物からなる群から選ばれた少なくともひとつである、請求項１記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤。
【請求項３】
サトイモ科植物の加工処理物が、塊茎の皮であることを特徴とする、請求項１または２記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤。
【請求項４】
Ｃ型肝炎ウイルス感染者に対して、ウイルスの産生を抑制するために用いられる請求項１記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤を含む医薬品組成物。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルス感染者に対して、Ｃ型肝炎ウイルスにより誘発される疾患、あるいはこれらのウイルス感染症により悪化する疾患を予防および／または治療するために用いられる、請求項１記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤を含む医薬品組成物。
【請求項６】
Ｃ型肝炎ウイルス感染者に対して、Ｃ型肝炎ウイルスにより誘発される肝炎の発症を抑制するために用いられる、請求項１記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤を含む医薬品組成物。
【請求項７】
サトイモ科植物の塊茎の加工処理物を有効成分とするＣ型肝炎ウイルス産生抑制材料。
【請求項８】
サトイモ科植物の加工処理物が、塊茎の粉砕物、塊茎の搾汁、および塊茎の抽出物からなる群から選ばれた少なくともひとつである、請求項８記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制材料。
【請求項９】
サトイモ科植物の加工処理物が、塊茎の皮であることを特徴とする、請求項８または９記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制材料。
【請求項１０】
Ｃ型肝炎ウイルス感染者に対して、ウイルスの産生を抑制するために用いられる請求項７記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制材料を含む食品組成物。
【請求項１１】
Ｃ型肝炎ウイルス感染者に対して、Ｃ型肝炎ウイルスにより誘発される疾患、あるいはこれらのウイルス感染症により悪化する疾患を予防および／または治療するために用いられる、請求項７記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制材料を含む食品組成物。
【請求項１２】
Ｃ型肝炎ウイルス感染者に対して、Ｃ型肝炎ウイルスにより誘発される肝炎の発症を抑制するために用いられる、請求項７記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制材料を含む食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防及び治療するための医薬品組成物に関する。
【０００２】
また、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防及び治療するための食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染者は、国内200万人、アメリカ500万人、全世界で１億7000万人と推定されており、疫学的調査結果からHCVの感染経路が明らかにされつつあるが、未だHCV感染者数は増加傾向にある。ＨＣＶ感染者は、持続的に炎症を繰り返し、やがては慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進行する。手術により癌部を摘出しても、非癌部で引き続き起こる炎症のため、肝癌が再発する患者が多いことも知られている。
【０００４】
現在、ＨＣＶ排除の唯一の治療法としてインターフェロン治療が行われているが、治療が有効なＨＣＶ感染者は約３割程度である。抗ウイルス薬リバビリンを併用するＨＣＶ治療も行われているが、奏効率は３割よりも若干高くなる程度にとどまり、有効率は依然として低く、未だ全ＨＣＶ感染者に有効とされる薬剤は見出されていない。また、インターフェロン治療は、脱毛、食欲減退、鬱、血小板の減少など副作用も強く、長期にわたる継続的治療には問題もある（非特許文献１）。従って、当該技術分野においては、副作用が少なく、長期に渡って服用が可能なＨＣＶ治療方法及び治療薬の開発が切望されている。
【０００５】
ところで、本発明と同様にサトイモに由来する成分に着目して、その薬理機能を開示する文献として非特許文献２をあげることができる。非特許文献２では、サトイモ科のキバナミズバショウのメタノール抽出物が、ウシヘルペスウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １）に対して抗ウイルス作用を有すること記載されているが、ＨＣＶに対する効果に関しては述べられていない。しかし、非特許文献３で開示されているように、ヘルペスウイルスとＨＣＶは異なるウイルスであり、ヘルペスウイルス産生抑制作用を有する物質が、ＨＣＶ産生抑制作用を有するとは言えない。また、本発明と同様に天然物由来の成分に着目して、その薬理機能を開示する文献として、特許文献１を挙げることができる。特許文献１ではブルーベリー葉に由来する植物成分がＨＣＶ産生抑制作用を有することを開示している。しかしながら、ブルーベリー葉とサトイモは植物分類学上から見ても遠縁であり、特許文献１はサトイモがＨＣＶ産生抑制作用を有することを開示ないし示唆するものではない。
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１１９３９８
【非特許文献１】「Ｃ型慢性肝炎に対する最近の話題  ＩＦＮの副作用とその対策」Ｍｅｄ Ｄｉｇ  Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．６，１９−２２（１９９７．１１）
【非特許文献２】Ａ．Ｒ．ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ “Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａｎ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｌａｎｔｓ”  Ｊｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４９，１０１−１１０（１９９５）
【非特許文献３】永田恭介著、「ウイルスの生物学―セントラルドグマ―」、羊土社出版、１９９６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、古来より食品として常用されてきたサトイモ科植物の塊茎由来で副作用が少なく、長期の服用が可能で、かつ効果の優れたＨＣＶ産生抑制剤及びそのＨＣＶ産生抑制剤を含む医薬品組成物を提供することにある。
【０００８】
また本発明の課題は、古来より食品として常用されてきたサトイモ科植物の塊茎由来で副作用が少なく、長期の服用が可能で、かつ効果の優れたＨＣＶ産生抑制材料及びそのＨＣＶ産生抑制材料を含む食品組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、サトイモ科植物の塊茎にＨＣＶ産生抑制作用があることを見出し、本発明に至った。
【００１０】
前記目的を達成した本発明は、次の態様を特徴としている。
項１：サトイモ科植物の塊茎の加工処理物を有効成分とするＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤。
項２：サトイモ科植物の加工処理物が、塊茎の粉砕物、塊茎の搾汁、および塊茎の抽出物からなる群から選ばれた少なくともひとつである、請求項１記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤。
項３：サトイモ科植物の加工処理物が、塊茎の皮であることを特徴とする、請求項１または２記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤。
項４：Ｃ型肝炎ウイルス感染者に対して、ウイルスの産生を抑制するために用いられる請求項１記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤を含む医薬品組成物。
項５：Ｃ型肝炎ウイルス感染者に対して、Ｃ型肝炎ウイルスにより誘発される疾患、あるいはこれらのウイルス感染症により悪化する疾患を予防および／または治療するために用いられる、請求項１記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤を含む医薬品組成物。
項６：Ｃ型肝炎ウイルス感染者に対して、Ｃ型肝炎ウイルスにより誘発される肝炎の発症を抑制するために用いられる、請求項１記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤を含む医薬品組成物。
項７：サトイモ科植物の塊茎の加工処理物を有効成分とするＣ型肝炎ウイルス産生抑制材料。
項８：サトイモ科植物の加工処理物が、塊茎の粉砕物、塊茎の搾汁、および塊茎の抽出物からなる群から選ばれた少なくともひとつである、請求項８記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制材料。
項９：サトイモ科植物の加工処理物が、塊茎の皮であることを特徴とする、請求項８または９記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制材料。
項１０：Ｃ型肝炎ウイルス感染者に対して、ウイルスの産生を抑制するために用いられる請求項７記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制材料を含む食品組成物。
項１１：Ｃ型肝炎ウイルス感染者に対して、Ｃ型肝炎ウイルスにより誘発される疾患、あるいはこれらのウイルス感染症により悪化する疾患を予防および／または治療するために用いられる、請求項７記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制材料を含む食品組成物。
項１２：Ｃ型肝炎ウイルス感染者に対して、Ｃ型肝炎ウイルスにより誘発される肝炎の発症を抑制するために用いられる、請求項７記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制材料を含む食品組成物。
【００１１】
なお、本発明において塊茎とは、サトイモ科植物の茎の地下部分全体を示す。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のサトイモ科植物の塊茎の加工処理物、例えばサトイモ科植物塊茎の粉砕物、塊茎の搾汁、および塊茎の抽出物を有効成分とするＨＣＶ産生抑制剤および／またはＨＣＶ産生抑制材料」は、ＨＣＶ感染者を対象とし、ＨＣＶにより誘発される疾患、例えば、ＨＣＶ感染者の肝炎発症、急性期および慢性期の肝炎、並びに慢性肝炎から肝硬変および肝癌発症、あるいはウイルス感染症により悪化する疾患を予防および／または治療するのに好適である。
【００１３】
また、元来食用に供することのできる天然由来のサトイモ科植物の塊茎を有効成分としているので、副作用が少なく、安全に長期にわたっての服用または摂取が可能である。特にインターフェロン投与が困難な患者にとっては、今のところ適切な代替治療剤がないことから大きな福音になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明に用いるサトイモ科植物は、サトイモ科（Ａｒａｃｅａｅ）サトイモ属（Ｃｏｌｏｃａｓｉａ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）に属する東南アジア原産の栽培植物である。茎の地下部分である塊茎を食用とする。また葉柄も食用にされる。コンニャク属（Ａｍｏｒｐｈｏｐｈａｌｌｕｓ  ｒｉｖｉｅｒｉ  ｖａｒ．ｋｏｎｊａｃ）も加工して食品となる。観賞用としてもいくつかの属が存在する。本発明では、使用するサトイモについて、種類、由来、原産地を特に制限するものではない。サトイモ科植物の塊茎に含まれる成分としてムチン、ガラクタン、カリウムが知られる。ムチンは粘膜の損傷を防ぎ胃腸壁の潰瘍予防となることが知られている。ガラクタンは脳細胞の活性化、免疫力を高めるなどの効果が知られている。カリウムはナトリウムを排泄して高血圧を予防すると言われている。しかし、これまでサトイモ科植物の塊茎によるＨＣＶ産生抑制機能の報告はない。
【００１５】
サトイモ科植物の塊茎は加工処理して用いる。加工処理方法としては、塊茎をそのまま粉砕する方法も使用できるが、塊茎の乾燥粉砕、塊茎の搾汁、塊茎の溶媒抽出が実用的である。ＨＣＶ産生抑制作用を効果的に発揮するために、塊茎皮の処理物を用いることが好適である。
【００１６】
乾燥粉砕物の調製方法としては、塊茎をそのまま乾燥した後粉砕するか、または細く切断した後乾燥する方法を挙げることができる。乾燥方法は、本発明の薬理効果を損なわなければ、特に制限はなく、真空凍結乾燥、熱風乾燥、遠赤外線乾燥、減圧乾燥、マイクロ波減圧乾燥及び過熱蒸気乾燥等を広く用いることができる。なかでも、成分変化の少ない真空凍結乾燥によるのが実用的である。真空凍結乾燥条件は、原料の状態によって異なるので特定できないが、例えば塊茎をそのまま乾燥する際、凍結温度は−３０℃〜−２０℃、乾燥温度は−３０〜３０℃、乾燥時間は１５時間〜２４時間の範囲が望ましい。また加温乾燥の場合、温度は３０℃〜５０℃、乾燥時間は１５時間〜２４時間の範囲が望ましい。
【００１７】
溶媒抽出物の調製では、塊茎をそのままもしくは破砕物とした後抽出するか、または乾燥後必要に応じて粉砕して抽出する。塊茎を搾って得られる搾汁を抽出原料として使用することもできる。この場合、必要に応じて原液を濃縮または乾燥してもよい。
【００１８】
使用する抽出溶媒も特に制限されないが、水または水と相溶性のある極性溶媒の使用が好適である。水と相溶性のある極性溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の炭素数１〜４の低級アルキルアルコール；エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどのグリコール類；エチルエーテル、アセトン等も使用できる。安全性の観点から、単独溶媒としては、低級アルコール、特にエタノールの使用が実際的である。
【００１９】
混合溶媒としては、水と前記極性溶媒を組み合わせて使用してもよいし、また前記極性溶媒を二種以上組み合わせて使用することもできる。後者の例として、例えば、アセトンとエチルエーテルの混合溶媒、好ましくはアセトンとエチルエーテルの１：１（ｖ／ｖ）混合液の使用も可能である。一般的には上記極性溶媒と水との混合溶媒（含水溶媒）の使用が望ましい。この含水溶媒としては、含水アルキルアルコール、より好ましくは含水エタノールである。含水アルコール中のアルコール濃度は、一般的に５〜９０容量％、好ましくは３０〜９０容量％、より好ましくは５０〜９０容量％である。
【００２０】
抽出方法としては、溶媒中に塊茎をそのままの粗末、細切物、またはそれらの乾燥粉砕物を冷浸、温浸等によって浸漬するのが実用的である。加温下で撹拌しながら抽出し、ろ過して抽出液を得ることもできる。また、パーコレーション法によってもよい。例えば、８０容量％エタノール水溶液による撹拌抽出では、溶液温度は望ましくは室温、浸漬時間は温度により異なるが３０秒〜１時間の範囲内が好適である。
【００２１】
得られた抽出物は、必要に応じてろ過または遠心分離などにより固形物を除去する。得られた濾液は、次工程に応じて、そのまま用いるか、または溶媒を留去して一部濃縮もしくは乾燥して用いてもよい。濃縮あるいは乾燥後、適正な洗浄溶媒、例えば非溶解性溶媒で洗浄精製して用いても、またこれをさらに適当な溶剤に溶解もしくは懸濁して用いることもできる。本発明においては、上記のようにして得られた溶媒抽出液を、減圧乾燥、凍結乾燥等により、塊茎乾燥抽出物にして使用することもできる。
【００２２】
このようにして得られるサトイモ科植物塊茎の加工処理物は、後述の実験例２で示すように、サトイモ科植物の塊茎である可食部及び皮において、顕著なＨＣＶ産生抑制作用を有している。具体的には、サトイモ科植物塊茎可食部メタノール抽出試料では、表１からわかるように、いずれの品種においても５０％生細胞数濃度は１００μｇ／ｍｌ以上であり、５０％ ルシフェラーゼ活性濃度は３．２５〜６３．３７μｇ／ｍｌであった。また、サトイモ科植物塊茎皮メタノール抽出試料でも、表２からわかるように、５０％生細胞数濃度は２５．２６〜１３３．０１μｇ／ｍｌであり、５０％ ルシフェラーゼ活性濃度は１．７２〜３．６２μｇ／ｍｌであった。本結果からわかるように、サトイモ科植物塊茎は細胞に影響を及ぼすことなく、ＨＣＶレプリコンＲＮＡの産生を抑制する作用を有し、図３に示すインターフェロンの作用と同様の作用を有することから、本発明のＨＣＶ産生抑制剤は、ＨＣＶＲＮＡ産生を抑制することによって、ＨＣＶにより誘発される疾患、例えば、ＨＣＶ感染者の肝炎発症、急性期および慢性期の肝炎、並びに慢性肝炎から肝硬変および肝癌発症、あるいはウイルス感染症により悪化する疾患を予防および／または治療する作用を発揮するものである。
【００２３】
本発明のＨＣＶ産生抑制材剤剤は、塊茎の粉砕物、搾汁もしくは抽出物そのものを単独の固体または液体状で利用することもできるが、必要に応じて薬学的もしくは食品上許容される担体または添加剤を配合して、固体または液体状の医薬品または機能性飲食物として提供することもできる。また他の抗ウイルス剤を有効成分として配合することもできる。
【００２４】
本発明のＨＣＶ産生抑制剤を医薬品として用いる場合、その形態は特に問わないが、経口に適した形態であることが好ましい。経口投与用固形医薬製剤としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等の形態を、また経口投与用液状医薬製剤としては、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などの形態を挙げることができる。これらの製剤にあたっては、各種製剤に応じた賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤等を適宜配合することができる。なお、本発明の医薬品の主な用途としては、ＨＣＶ産生抑制剤、または慢性肝炎予防、肝硬変発症予防、若しくは肝がん発症阻止に有効に使用できる肝炎治療剤を挙げることができる。
【００２５】
医薬品に含まれる前記有効成分の量は、その製剤形態や適用疾患の種類などによって種々異なり、一概に規定することはできないが、１投与あたりの投与量に応じて適宜設定すればよい。また投与時期は限定されないが、望ましくは肝炎の急性期、慢性期、肝硬変の時期である。
【００２６】
本発明のＨＣＶ産生抑制材料を機能性飲食物として用いる場合も、その形態は特に制限されない。例えば、上記ＨＣＶ産生抑制材料を、必要に応じて食品上配合が許容される担体や添加剤とともに、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、トローチ剤、または溶液（ドリンク）等の形態に調製することができる。
【００２７】
機能性飲食物の適用例としては、本発明のＨＣＶ産生抑制材料を加えた次の形態のものを挙げることができる。
（１）乳飲料、乳酸菌飲料、果汁入り清涼飲料、清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、野菜飲料、野菜・果実飲料、アルコール飲料、粉末飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、麦茶飲料などの飲料類。
（２）カスタードプリン、ミルクプリン、スフレプリン、果汁入りプリン等のプリン、ゼリー、ババロア、ヨーグルト等のデザート類。
（３）アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、ミルクアイスクリーム、果汁入りアイスクリーム及びソフトクリーム、アイスキャンディー、シャーベット、氷菓等の冷菓類。
（４）チューインガムや風船ガム等の板状または糖衣錠ガム類。
（５）マーブルチョコレート等のコーティングチョコレートの他、イチゴチョコレート、ブルーベリーチョコレート及びメロンチョコレート等の風味を付加したチョコレート等のチョコレート類。
（６）ハードキャンディー（ボンボン、バターボール、マーブル等を含む）、ソフトキャンディー（キャラメル、ヌガー、グミキャンディー、マシュマロ等を含む）、ドロップ、タフィ等のキャラメル類
（７）ハードビスケット、クッキー、おかき、煎餅等の焼き菓子類
（８）コンソメスープ、ポタージュスープ等のスープ類
（９）味噌、醤油、ドレッシング、ケチャップ、たれ、ソース、ふりかけなどの各種調味料
（１０）ストロベリージャム、ブルーベリージャム、マーマレード、リンゴジャム、杏ジャム、プレザーブ等のジャム類。
（１１）赤ワイン等の果実酒。
（１２）シロップ漬のチェリー、アンズ、リンゴ、イチゴ、桃等の加工果実。
（１３）ハム、ソーセージ、焼き豚等の畜肉加工品。
（１４）魚肉ハム、魚肉ソーセージ、魚肉すり身、蒲鉾、竹輪、はんぺん、薩摩揚げ、伊達巻き、鯨ベーコン等の水産練り製品。
（１５）うどん、冷麦、そうめん、ソバ、中華そば、スパゲッティ、マカロニ、ビーフン、はるさめ及びワンタン等の麺類。
（１６）その他、各種総菜及び麩、田麩等の種々の加工食品。
【００２８】
機能性飲食物における本発明のＨＣＶ産生抑制材料の含有量及び摂取量は、特に限定されない。飲食物の種類、目的とする機能、効能、その他の諸条件に応じて適宜選択することができるが、望ましい摂取量はＨＣＶ産生抑制に有効な量である。また、摂取時期は限定されないが、望ましくは肝炎発症前、肝炎の急性期、慢性期、肝硬変の時期である。
【００２９】
本発明の機能性飲食物は、ＨＣＶ産生抑制材料を含むことに基づいて、ＨＣＶ産生抑制効果、肝炎発症抑制効果、肝炎進行抑制効果、肝硬変発症予防効果、または肝癌発症予防効果を有している。このため、本発明の機能性飲食物は、ＨＣＶ感染者を対象とした飲食物であり、例えば当該患者の肝炎発症前、肝炎の急性期若しくは慢性期、または肝硬変の時期に好適に摂取することのできる飲食物である。
【実施例】
【００３０】
以下の各試験で用いるレプリコン細胞の調製及び試験方法は下記によった。また実施例中、「％」は特に言及しないかぎり、「Ｗ／Ｗ％」を意味する。
【００３１】
レプリコン細胞の調製：ＨＣＶのゲノムＲＮＡは、ウイルス粒子を構成するコアとエンベロープの構造タンパク質翻訳領域、ウイルスゲノム複製などに機能する非構造タンパク質翻訳領域とに大別される。この構造タンパク質翻訳領域をルシフェラーゼ翻訳領域・ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（脳心筋ウイルス内部リボゾーム結合配列）・ネオマイシン耐性遺伝子に置換したサブゲノムレプリコンＲＮＡを作成し、得られたＲＮＡをヒト肝がん細胞Ｈｕｈ−７の細胞質に導入すると、サブゲノムレプリコンＲＮＡが導入されたＨｕｈ−７は、同時にネオマイシン耐性能を有するので、ネオマイシンによる選択が可能となる。このようにして得られた細胞を、ＨＣＶレプリコンＲＮＡの産生量の評価に供試した。なお、ＨＣＶレプリコンＲＮＡの産生量は下記に説明するルシフェラーゼアッセイ法により測定した。この細胞の培養には、ＤＭＥＭ［ＧＩＢＣＯ社のＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｍｅｄｉａ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ(Ｄ−ＭＥＭ)(1×)，ｌｉｑｕｉｄ(Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ)］にＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）１０％、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ社）１％、およびＧｅｎｔｉｃｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１％を添加した培地を用いる。アッセイを行なう際のアッセイ培地には、ＤＭＥＭにＦＢＳを５％、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを１％添加したもの（但し、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎは加えない。）を用いた。
【００３２】
ルシフェラーゼアッセイ法：マグネシウム存在下で、ルシフェリンとＡＴＰから酸化ルシフェリンとＡＭＰを作る反応をルシフェラーゼが触媒する。ルシフェラーゼアッセイ法は、この時発生する光を発光検出器で検出して、得られた光量に基づいてルシフェラーゼ活性を評価する方法である。本発明では便宜上、この光量をＨＣＶレプリコンＲＮＡ量とした。
【００３３】
ＷＳＴ−８アッセイ法：新規テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８は、細胞内脱水素酵素により還元され、水溶性のホルマザンを生成する。生成したホルマザン量が生細胞の数と比例することから、本発明ではホルマザンの吸光度から生細胞数を評価し、被検試料の細胞毒性作用を判定した。
【００３４】
＜実験例１＞
（１）サトイモ泉南中野早生メタノール抽出試料の調製
サトイモ泉南中野早生の皮・可食部をそれぞれ凍結温度３０℃、乾燥温度３０℃、乾燥時間２４時間の条件で真空凍結乾燥（真空凍結乾燥機、ＦＴＳ  ＳＹＳＴＥＭ、Ｄｕｒａ−Ｔｏｐ  ＭＰ＆Ｄｕｒａ−Ｄｒｙ  ＭＰ）した。次いで、超遠心粉砕機（ＭＲＫ＆ＲＥＴＳＣＨ、ＥＭ−１型）の０．５ｍｍスクリーンを通して粉砕し、サトイモ泉南中野早生の皮・可食部、それぞれの乾燥粉末物を得た。得られたサトイモの凍結乾燥粉末物の約３ｇに、メタノール約１００ｍｌを加えて、室温で３０分間振とう後、自然ろ過（サイズ１２５ｍｍ ろ紙：Ｎｏ．２）を行なって固形物を除いた。この操作を３回繰り返しメタノール抽出ろ液約２９０ｍｌを回収した。このろ液を減圧濃縮して、溶媒を留去した。最後に溶媒を完全に留去するため、真空凍結乾燥処理を行ない、サトイモの乾燥抽出物約３６０ｍｇ（皮部）と２５０ｍｇ（可食部）を得た。皮抽出物はＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）で可食部抽出物はメタノールで１０ｍｇ／ｍｌ濃度に調製し抽出試料とした。
【００３５】
（２）ＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験
(２−１)ＨＣＶレプリコン細胞毒性試験
透明の９６ｗｅｌｌプレートに被検細胞（レプリコン細胞）の懸濁液（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を９０μｌずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２存在下、相対湿度１００％の条件で２４時間培養した。（１）で調製した抽出試料の最も濃い終濃度を可食部では１００μｇ／ｍｌ、皮では５０μｇ／ｍｌになるよう３倍希釈系列で７段階希釈調製、上記９６ｗｅｌｌプレートに１０μｌ／ｗｅｌｌの割合で添加した。この後、さらに７２時間培養した。一旦培養液を廃棄し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で１０倍希釈したＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８試薬（株式会社  同仁化学研究所）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて、さらに４時間培養した。培養後、６５０ｎｍを対照波長として、抽出試料の各濃度における溶解培養液の吸光度（４５０ｎｍ）を吸光マイクロプレートリーダー（日本モレキュラーデバイス株式会社製  商品名：ＥＭａｘＴＭ）で測定した。コントロールとして、上記の抽出試料の代わりに、乾燥抽出物から抽出試料の調製に使用した溶媒であるＤＭＳＯまたはメタノールを用いて調製した溶解培養液の吸光度を測定した。
吸光度測定値から、コントロールに対する百分率を求め、抽出試料の各濃度における被検細胞の生細胞数（％）を算出した。生細胞数が５０％になる値をＣ５０（５０％生細胞数濃度：μｇ／ｍｌ）とした。可食部メタノール抽出試料の結果を図１に、皮メタノール抽出試料の結果を図２に示す。
【００３６】
(２−２)ＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験
白色の９６ｗｅｌｌプレートに被検細胞（レプリコン細胞）の懸濁液（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を９０μｌずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２存在下、相対湿度１００％の条件で２４時間培養した。抽出試料の最も濃い終濃度が５０μｇ／ｍｌになるよう４倍希釈系列で６段階希釈調製、上記９６ｗｅｌｌプレートに１０μｌ／ｗｅｌｌの割合で添加した。この後、さらに７２時間培養した。プレートをインキュベーターから取り出し、室温で３０分以上静置後、ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社、商品名：
ｓｔｅａｄｙ−ＧｌｏＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて、よくピペッティングした。５分以上放置してから発光検出器（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ株式会社製  商品名：ＤＴＸ８００）で発光測定を行った。コントロールとして、上記抽出試料の代わりに滅菌水を用いて上記と同様にして調製した反応液について、同様に発光量を測定した。
【００３７】
発光測定値から、コントロールに対する百分率を求め、抽出試料の各濃度における被検細胞のルシフェラーゼ活性（％）を算出した。前述したように、当該ルシフェラーゼ活性（％）はHCVレプリコンRNA量を反映している。ルシフェラーゼ活性が５０％になる値をＬ５０（５０％ルシフェラーゼ活性濃度：μｇ／ｍｌ）とした。
【００３８】
ルシフェラーゼ活性のＬ５０に対する生細胞数のＣ５０の比をＳｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ（ＳＩ＝生細胞数Ｃ５０／ルシフェラーゼ活性Ｌ５０）とした。この値が大きければ大きいほど細胞に障害を与えずＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生を抑制することを意味する。可食部メタノール抽出試料の結果を図１に、皮メタノール抽出試料の結果を図２に示す。
【００３９】
＜比較例１＞
ＩＦＮ試料の調製およびＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験
インターフェロン（フナコシ株式会社、商品名：ＩＦＮ-α２(α２ｂ),Ｈｕｍａｎ, Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）をＰＢＳ（０．１％ＢＳＡを添加）に溶解した。最も濃い終濃度を１０Ｕ／ｍｌとし２倍希釈系列で１０段階希釈調製を行ない、実験例１に従いＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験を行なった。ＩＦＮ試薬添加して４８時間後にルシフェラーゼおよびＷＳＴ−８アッセイを行った。結果を図３に示す。
【００４０】
サトイモ泉南中野早生可食部のメタノール抽出試料は図１に示すように生細胞数のＣ５０は１００μｇ／ｍｌ以上、ルシフェラーゼ活性のＬ５０は３．２５μｇ／ｍｌ、ＳＩは３０以上であった。皮のメタノール抽出試料は図２に示すように生細胞数のＣ５０は４１．５９μｇ／ｍｌ、ルシフェラーゼ活性のＬ５０は０．４９μｇ／ｍｌ、ＳＩは８５であり、可食部・皮のいずれにおいてもＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制効果を認めた。また可食部メタノール抽出試料１００μｇ／ｍｌの濃度において相対生細胞数はコントロールとほぼ同程度で、相対ルシフェラーゼ活性は０．０８％まで抑制されていた。皮メタノール抽出試料においては濃度５．５６μｇ／ｍｌで相対生細胞数はコントロールとほぼ同程度で、相対ルシフェラーゼ活性は０．９２％まで抑制されていた。これらの効果はＩＦＮの効果に匹敵する（図３）。
【００４１】
＜実験例２＞
泉南中野早生、富士早生、白芽ダイキチ、赤芽ダイキチ、大野芋、女早生、京芋、えぐいもの８品種を用いて品種間差を検討した。
【００４２】
（１）サトイモメタノール抽出試料の調製
被検試料として前述の８品種を用いた。実験例１に従ってメタノール抽出試料を調製した。抽出物はメタノールに溶解し抽出試料とした。
【００４３】
（２）ＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験
実験例１に従いＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験を行なった。可食部メタノール抽出試料の結果を表１および図４に、皮メタノール抽出試料の結果を表２および図５に示す。
【００４４】
【表１】
2009149552.tif 000003
いずれの品種も可食部によるＣ５０は１００μｇ／ｍｌ以上であり、Ｌ５０は３．２５〜６３．３７μｇ／ｍｌであった。
【００４５】
【表２】
2009149552.tif 000004
Ｃ５０は２５．２６〜１３３．０１μｇ／ｍｌであり、Ｌ５０は１．７２〜３．６２μｇ／ｍｌであった。ＳＩ値では白芽ダイキチがもっとも高い値となった。
【００４６】
表１、表２、図４及び図５からわかるように、サトイモ科植物の塊茎抽出物は、いずれの品種においてもＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制作用を有し、また、皮抽出物の方により強いＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制作用が認められることが明らかとなった。
【００４７】
＜実験例３＞
（１）サトイモ泉南中野早生８０％エタノール抽出試料の調製
実験例１に従いサトイモ泉南中野早生皮の乾燥粉末物を得た。得られたサトイモ皮の乾燥粉末物の約１ｇに、８０容量％エタノール水溶液約３０ｍｌを加えて、室温で３０秒間激しく撹拌した後、吸引ろ過（有限会社  桐山製作所  商品名：桐山ロート  サイズ６０ｍｍ  ろ紙：５Ａ）を行なって固形物を除いた。ろ液を減圧濃縮して、溶媒を留去した。最後に溶媒を完全に留去するため、真空凍結乾燥処理を行ない、サトイモ皮の乾燥抽出物約１００ｍｇを得た。これをＤＭＳＯで２００ｍｇ／ｍｌ濃度に調製し抽出試料とした。  
【００４８】
（２）ＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験
最も濃い終濃度を５００μｇ／ｍｌとし３倍希釈系列で９段階希釈調製を行ない、実験例１に従いＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験を行なった。（１）で調製した皮８０％エタノール抽出試料の結果を図６に示す。
【００４９】
Ｃ５０は９９μｇ／ｍｌであり、Ｌ５０は５μｇ／ｍｌであった。ＳＩ値は２０で、皮の８０％エタノール抽出物でもＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制活性が認められた。
【００５０】
＜実験例４＞
（１）ノーザンブロット解析
１２ｗｅｌｌプレートに被検細胞（レプリコン細胞）を４×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるようまきこみ、３７℃、５％ＣＯ２存在下、相対湿度１００％の条件で２４時間培養した。泉南中野早生の皮抽出物を最も濃い終濃度が５０μｇ／ｍｌになるよう３倍希釈系列を４段階希釈し、この希釈系列を試験用プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。この後、さらに７２時間培養した。培養液を廃棄した後−８０℃で保存した。
【００５１】
−８０℃保存の１２ｗｅｌｌプレートを取り出し、Ｒｎｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）によりＲＮＡを回収した。得られたＲＮＡをＵｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３３００により定量した。２μｇ／ｌａｎｅになるようサンプルを調製し、３×Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて６５℃、１５分間処理後、急冷した。１％Ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌにて電気泳動（１００Ｖ、６０分）を行い、得られたゲルをエチジウムブロマイド溶液で染色し、バンドを確認後、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｍａｘ（Ａｍｂｉｏｎ社  商品名：Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｌｏａｄ  Ｄｙｅ  ＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘ）にてメンブレンに４時間転写した（Ａｍｂｉｏｎ社  商品名：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｍａｘ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒ）。メンブレンをＴＢＥで洗浄後、４２℃にてプレハイブリダイゼーションし、レプリコンに含まれるネオマイシン耐性遺伝子ビオチン化プローブで４２℃、オーバーナイトでハイブリダイゼーションを行った（Ａｍｂｉｏｎ社  商品名：ＵＬＴＲＡｈｙｂ）。メンブレンをＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、ブロッキング（Ａｌｏｋａ社  商品名：Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）を行い、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社）でＯｄｙｓｓｅｙ（Ａｌｏｋａ社）により検出を行った。
【００５２】
検出されたバンドの濃淡によりＩＣ５０値を算出した。検出結果を表３および図７に示す。
【表３】
2009149552.tif 000005
【００５３】
ノーザンブロット法ではＩＣ５０値は４．４μｇ／ｍｌで、１６．６μｇ／ｍｌ以上でＨＣＶ  ＲＮＡがほぼ消失した。
【００５４】
＜実験例５＞
（１）ウエスタンブロット解析
実験例４に従い、１２ｗｅｌｌプレートを用いて細胞を調製した。−８０℃保存の１２ｗｅｌｌプレートを取り出し、１ｍＬのＰＢＳでピペッティングにて細胞をはがし、チューブに回収した。１０，０００ｒｐｍ、３分遠心後、上清を吸引し、１％  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＩＧＭＡ社  商品名：ＰＲＯＴＥＡＳＥ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ  ＣＯＣＫＴＡＩＬ）のＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＩＧＭＡ社  商品名：ＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭ−Ｍ）を添加して細胞を溶解した。１５分間振とうし、１５，０００ｒｐｍ、１５分で遠心後、上清を回収し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク質定量を行った。
【００５５】
タンパク質定量後、５μｇ／Ｌａｎｅになるようにサンプルを調製し、４×Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＷＡＫＯ社  商品名：Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２ＭＥ＋）（×４））を４分の１容量加えて９５℃、５分間熱処理を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを３０ｍＡ、６０分間行い、得られたゲルを５０Ｖ、オーバーナイトでＢｌｏｔｔｉｎｇした。メンブレンをＴＢＳで洗浄後、３０分間Ｂｌｏｃｋｉｎｇを行い、一次抗体（Ｒｏｃｈｅ社  α−ＮＳ３）を加えて３０分間反応させた。ＴＢＳＴで２回洗浄後、二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社  商品名：Ａｌｅｘａ  ６８０  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｇｏａｔ））で３０分間反応させた。洗浄後、Ｏｄｙｓｓｅｙにより検出した。検出結果を表４および図８に示す。
【００５６】
【表４】
2009149552.tif 000006
【００５７】
ウエスタンブロット法ではＩＣ５０値は１．９μｇ／ｍｌで、５０μｇ／ｍｌ以上でＨＣＶタンパク質（ＮＳ３）がほぼ消失した。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明のサトイモ科植物の塊茎の加工処理物、例えばサトイモ科植物塊茎の粉砕物、塊茎の搾汁、および塊茎の抽出物を有効成分とするＨＣＶ産生抑制剤は、ＨＣＶ感染者を対象とし、ＨＣＶにより誘発される疾患、例えば、ＨＣＶ感染者の肝炎発症、急性期および慢性期の肝炎、並びに慢性肝炎から肝硬変および肝癌発症、あるいはウイルス感染症により悪化する疾患を予防および／または治療するのに好適である。また、元来食用に供することのできる天然由来のサトイモ科植物の塊茎を有効成分としているので、副作用が少なく、安全に長期にわたっての服用可能な日常薬としての利用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】サトイモ泉南中野早生可食部メタノール抽出試料によるＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験および細胞毒性試験の結果を示すグラフである。
【図２】サトイモ泉南中野早生皮メタノール抽出試料によるＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験および細胞毒性試験の結果を示すグラフである。
【図３】インターフェロンによるＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験および細胞毒性試験の結果を示すグラフである。
【図４】８品種のサトイモ可食部メタノール抽出試料によるＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験の結果を示すグラフである。
【図５】８品種のサトイモ皮メタノール抽出試料によるＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験の結果を示すグラフである。
【図６】サトイモ泉南中野早生皮８０％エタノール抽出試料によるＨＣＶレプリコンＲＮＡ産生抑制試験および細胞毒性試験の結果を示すグラフである。
【図７】サトイモ泉南中野早生皮メタノール抽出試料を用いて、ＨＣＶレプリコンＲＮＡをノーザンブロット解析にて測定した図である。
【図８】サトイモ泉南中野早生皮メタノール抽出試料を用いて、ＨＣＶレプリコンＲＮＡをウエスタンブロット解析にて測定した図である。
【図２】
2009149552.tif 000007
【図３】
2009149552.tif 000008
【図４】
2009149552.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図７】
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【図８】
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