(57)【要約】      （修正有）【課題】ＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドの提供。【解決手段】レポーター遺伝子の上流に位置するプロモーターのさらに上流に、特定の塩基配列を少なくとも包含する転写調節領域を有してなるＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミド。該ＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドを導入してなる形質転換体。該形質転換体にＴＧＦ−βと被験物質を作用させた後、レポーター遺伝子の発現程度を調べ、その結果を指標にして行う、被験物質のＴＧＦ−βシグナル応答に対する制御機能の判定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レポーター遺伝子の上流に位置するプロモーターのさらに上流に、配列番号１に記載の塩基配列を少なくとも包含する転写調節領域を有してなることを特徴とするＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミド。
【請求項２】
請求項１記載のＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドを導入してなることを特徴とする形質転換体。
【請求項３】
請求項２記載の形質転換体にＴＧＦ−βと被験物質を作用させた後、レポーター遺伝子の発現程度を調べ、その結果を指標にして行うことを特徴とする被験物質のＴＧＦ−βシグナル応答に対する制御機能の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦ−β（Transforming growth factor beta：トランスフォーミング増殖因子β）は、胎仔発生や組織の恒常性を維持するために重要な多機能サイトカインであることは当業者によく知られた事実であるが、そのシグナル伝達に関しては今だ不明な部分も多い。従って、ＴＧＦ−βシグナルについての研究ツールとしてやＴＧＦ−βシグナル応答を制御する物質の探索ツールなどとして、ＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドは有用である。しかしながら、これまでその報告は例えば非特許文献１などわずかしか存在しない。
【非特許文献１】Dennler S., Itoh S., Vivien D., ten Dijke P., Huet S., Gauthier J.-M. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGFβ-inducible elements in the promoter of human plasminogenactivator inhibitor-type 1 gene. EMBO J., 17, 3091-3100 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで本発明は、新規なＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、ＴＧＦ−βによって発現が誘導される遺伝子として知られているＴＭＥＰＡＩ遺伝子（Transmembrane, prostate androgen induced RNA：必要であればItoh S., Thorikay M., Kowanetz M., Moustakas A., Itoh F., Heldin C.-H., ten Dijke P. Elucidation of Smad requirement in transforming growth factor-β type I receptor-induced responses. J. Biol. Chem., 278, 3751-3761 (2003)を参照のこと）の第１イントロン内にＴＧＦ−βシグナルで誘導される領域を見出した。
【０００５】
上記の知見に基づいてなされた本発明のＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドは、請求項１記載の通り、レポーター遺伝子の上流に位置するプロモーターのさらに上流に、配列番号１に記載の塩基配列を少なくとも包含する転写調節領域を有してなることを特徴とする。
また、本発明の形質転換体は、請求項２記載の通り、請求項１記載のＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドを導入してなることを特徴とする。
また、本発明の被験物質のＴＧＦ−βシグナル応答に対する制御機能の判定方法は、請求項３記載の通り、請求項２記載の形質転換体にＴＧＦ−βと被験物質を作用させた後、レポーター遺伝子の発現程度を調べ、その結果を指標にして行うことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、新規なＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドは、レポーター遺伝子の上流に位置するプロモーターのさらに上流に、配列番号１に記載の塩基配列を少なくとも包含する転写調節領域を有してなることを特徴とするものである。
【０００８】
本発明のＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドにおいて、レポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの、発光量を検出できるタンパク質を発現するものが挙げられる。
【０００９】
本発明のＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドにおいて、プロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０、ＴＫ、ＡｄＭＬＰなどが挙げられる。
【００１０】
本発明のＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドにおいて、プロモーターの上流に設けられる転写調節領域を構成する塩基配列としては、例えば、マウスやヒトのＴＭＥＰＡＩ遺伝子の第１イントロンの開始から８５０ｂｐの領域に相当する、配列番号１に記載の塩基配列を少なくとも包含する塩基配列、具体的にはマウスの（１−８４７）に相当する配列番号２に記載の塩基配列や（５９１−８４７）に相当する配列番号３に記載の塩基配列が挙げられる。
【００１１】
本発明のＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドは、例えば、市販のレポータープラスミド（例えばプロメガ社のホタルルシフェラーゼレポーターベクターであるｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒなど）のプロモーターの上流に設けられたマルチクローニングサイトに所望の転写調節領域を構成する塩基配列を組み込むことによって作製することができる。なお、レポーター遺伝子の発現程度の調節といった必要に応じ、市販のレポータープラスミドのレポーター遺伝子やプロモーターを、他のレポーター遺伝子やプロモーターに置換してもよい。
【００１２】
本発明のＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドは、例えば、ＴＧＦ−βシグナルに対して感受性が高いＨｅｐＧ２細胞などの動物細胞に自体公知の方法で導入することができる。本発明のＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドが組み込まれた形質転換体は、ＴＧＦ−βシグナルについての研究ツールとしてやＴＧＦ−βシグナル応答を制御する物質の探索ツールなどとして利用することができる。例えば、形質転換体にＴＧＦ−βと被験物質を培地中に添加するなどして作用させた後、レポーター遺伝子の発現程度を調べることで、コントロールに比較して発現が促進された場合には被験物質についてＴＧＦ−βシグナルを亢進する機能があると判定することができ、コントロールに比較して発現が抑制された場合には被験物質についてＴＧＦ−βシグナルを遮断する機能があると判定することができる。この方法を利用すれば、例えば、ＴＧＦ−βによって発現が誘導される遺伝子として知られているＴＭＥＰＡＩ遺伝子の発現を制御する物質を探索することができる。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１４】
（ＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドの作製その１）
マウスＴＭＥＰＡＩ遺伝子を含むＢＡＣベクター（Roswell Park Cancer Institute社が作製したマウスゲノムＢＡＣライブラリーを同社がスクリーニングして得られたクローンを同社より購入）を用い、第１イントロンの（１−８４７）に相当する配列番号２に記載の塩基配列の領域をＰＣＲにより増幅し、塩基配列確認後、ｐＧＬ３ｔｉ（プロメガ社のホタルルシフェラーゼレポーターベクターであるｐＧＬ３−ｂａｓｉｃにＡｄＭＬＰを組み込んだもの：必要であればJonk L. J. C., Itoh S., Heldin C.-H., ten Dijke P., Kruijer W. Identification and functional characterization of a Smad binding element (SBE) in the Jun B promoter that acts as a transforming growth factorβ, activin and bone morphogeneticprotein-inducible enhancer. J. Biol. Chem., 273, 21145-21152 (1998)を参照のこと）のプロモーターの上流に設けられたマルチクローニングサイトに制限酵素としてＮｈｅＩとＸｈｏＩを用いて組み込み、レポータープラスミド（ｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔ８５０ｂｐ）を作製した。
【００１５】
（レポーターアッセイ）
ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで培養したＨｅｐＧ２細胞にＦｕｇｅｎｅ６（Roche社）を用いてｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔ８５０ｂｐを導入した。２４時間後に培地をＤＭＥＭ／０．１％ＦＣＳに交換してからＴＧＦ−β３を５ｎｇ／ｍＬの割合で添加し、１６〜２０時間、ｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔ８５０ｂｐを導入したＨｅｐＧ２細胞（形質転換体）を刺激した。その後、細胞溶解剤（プロメガ社のCell Culture Lysis Reagent 5X）を添加し、１０分間静置した後、発光基質（プロメガ社のルシフェラーゼ測定用キット）を加え、マニュアルに従って化学発光測定装置（BMG LabTecnologies社のLUMI star）を用いて化学発光量を測定し、ｐＧＬ３ｔｉを導入したＨｅｐＧ２細胞についての測定結果との相対値でもってｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔ８５０ｂｐの転写活性（ＴＧＦ−βシグナル応答性）を評価した。結果を図１に示す（ｎ＝３）。また、図１には、細胞をＴＧＦ−β３で刺激しなかった場合の結果と、ＴＧＦ−β３のかわりにＢＭＰ６を２５ｎｇ／ｍＬの割合で培地に添加して刺激した場合の結果をあわせて示す。図１から明らかなように、マウスＴＭＥＰＡＩ遺伝子の第１イントロンの（１−８４７）にはＴＧＦ−βシグナルで誘導される領域（転写調節領域）が内在することがわかった。また、別途の実験により、ｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔ８５０ｂｐを導入した２９３細胞では、ｗｎｔシグナルを活性化するＬｉＣｌとＴＧＦ−βの刺激がなくてもそのシグナル伝達ができるＡＬＫ５ｃａの存在下で転写活性の相乗効果が見られることがわかった。
【００１６】
（ＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドの作製その２）
上記の結果をもとにＴＧＦ−βシグナルで誘導される領域を特定すべく、マウスＴＭＥＰＡＩ遺伝子の第１イントロンの（１−８４７）に相当する塩基配列について、（１−４４７）に相当する配列番号４に記載の塩基配列、（３６５−６０４）に相当する配列番号５に記載の塩基配列、（５９１−８４７）に相当する配列番号３に記載の塩基配列に分割し、上記と同様にしてそれぞれの塩基配列をｐＧＬ３ｔｉに組み込んでレポータープラスミドを作製した後、ＨｅｐＧ２細胞に導入し、レポータープラスミドの転写活性を評価した。結果を図２に示す（ｎ＝３）。図２において、ｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔＦは（１−４４７）に相当する塩基配列を組み込んだレポータープラスミド、ｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔＭは（３６５−６０４）に相当する塩基配列を組み込んだレポータープラスミド、ｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔＢは（５９１−８４７）に相当する塩基配列を組み込んだレポータープラスミドを表す。図２から明らかなように、ｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔＢのみがｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔ８５０ｂｐと同様の転写活性を有していたことから、ＴＧＦ−βシグナルで誘導される領域は（５９１−８４７）に内在することがわかった。
【００１７】
（ＴＧＦ−βシグナルで誘導される領域の特定）
上記の結果をもとにマウスとヒトで保存されている（８１４−８２２）の塩基配列（配列番号１）にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ点変異導入キット（STRATAGENE社）を用いて点変異を加え（GTCgggtTT：小文字は変異導入塩基）、上記と同様にして（５９１−８４７）に相当する塩基配列を組み込んだｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔＢに対応するｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔＢ（ＴＣＦ４ｍｕｔ）を作製した後、ＨｅｐＧ２細胞に導入し、レポータープラスミドの転写活性を評価した。結果を図３に示す（ｎ＝３）。図３から明らかなように、（８１４−８２２）に相当する塩基配列に点変異を加えて作製したｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔＢ（ＴＣＦ４ｍｕｔ）は転写活性を有していなかったことから、（８１４−８２２）がＴＧＦ−βシグナルで誘導される領域であることがわかった。
【００１８】
（ＴＧＦ−βシグナルで誘導される領域に対するＴＣＦ４の作用）
ｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔＢを導入したＨｅｐＧ２細胞とｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔＢ（ＴＣＦ４ｍｕｔ）を導入したＨｅｐＧ２細胞のそれぞれに０．３μｇのＴＣＦ４発現ベクターをさらに導入して４０時間培養した後、細胞を溶解し、上記と同様にして化学発光量を測定することで転写活性を評価した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、ｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔＢが有していた転写活性をｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔＢ（ＴＣＦ４ｍｕｔ）は有していなかったことから、（８１４−８２２）はＴＣＦ４の結合サイトであることがわかった。また、上記の結果の通り、（８１４−８２２）はＴＧＦ−βシグナルで誘導される領域であり、別途の実験により、ｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔ８５０ｂｐを導入したＨｅｐＧ２細胞をＴＧＦ−βで刺激するとともに細胞内でＴＣＦ４を発現させると転写活性に相乗効果が見られ、ＴＣＦ４を発現させるかわりにそのドミナントネガティブ変異体（ＴＣＦ４（Δ１−３０））を発現させると転写活性が喪失することから、ＴＧＦ−βシグナルは（８１４−８２２）に結合したＴＣＦ４を介して伝達されることがわかった。よって、本発明のレポータープラスミドが有するＴＧＦ−βシグナル応答性はＴＣＦ４を介したものであり、本発明のレポータープラスミドはＴＣＦ４を介したＴＧＦ−βシグナル応答を制御する物質の探索に有用であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明は、新規なＴＧＦ−βシグナル応答性を有するレポータープラスミドを提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例におけるｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔ８５０ｂｐの転写活性を示すグラフである。
【図２】同、ＴＧＦ−βシグナルで誘導される領域がＴＭＥＰＡＩ遺伝子の第１イントロンの（５９１−８４７）に内在することを示すグラフである（ｐＧＬ３ｔｉ−ｉｎｔＢ）。
【図３】同、（８１４−８２２）がＴＧＦ−βシグナルで誘導される領域であることを示すグラフである。
【図４】同、（８１４−８２２）がＴＣＦ４の結合サイトであることを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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