(57)【要約】【課題】細胞由来情報を担体と密度勾配遠心分離法を利用し、高効率に分離・回収することを目的とする。【解決手段】細胞由来情報を担体に結合させ、その担体の密度を対象とした密度勾配遠心分離を行い、特定の細胞分離・回収を高効率で安定して実施する。担体α１、担体β２、担体γ３は、表面に抗体を結合させており、その抗体の特異的な抗原α４、抗原β５、抗原γ６を反応させ、担体α１、担体β２、担体γ３の表面に結合させる。その担体を密度勾配遠心分離に掛けるものである。これにより、密度勾配遠心分離層７の上に載せた細胞由来情報を結合させた担体α１、担体β２、担体γ３は、遠心分離を実施することで、密度勾配遠心分離後８のように正確な層となり分離が可能となる。つまり、担体の均一性を対象とした分離であるため、安定し、高精度な分離が可能となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の細胞情報を担体に付着させた後、前記担体に適合した密度勾配遠心分離を行なう細胞情報分離方法。
【請求項２】
特定の細胞情報を細胞自体とした請求項１記載の細胞情報分離方法。
【請求項３】
特定の細胞情報を細胞由来の核酸とした請求項１記載の細胞情報分離方法。
【請求項４】
特定の細胞情報を細胞の糖鎖とした請求項１記載の細胞情報分離方法。
【請求項５】
担体を金コロイド、磁気コロイド、シリカコロイドを単独あるいは少なくとも二種類以上組み合わせたものとした請求項１記載の細胞情報分離方法。
【請求項６】
担体を着色した請求項１記載の細胞情報分離方法。
【請求項７】
担体の大きさを１０マイクロメートルから１０ミリメートルとした請求項１記載の細胞情報分離方法。
【請求項８】
担体の表面に抗体を結合させた請求項１記載の細胞情報分離方法。
【請求項９】
担体の数を少なくとも２種類以上とした請求項１記載の細胞情報分離方法。
【請求項１０】
それぞれの担体を異なる色で着色した請求項９記載の細胞情報分離方法。
【請求項１１】
担体一種類に対し、一種類の特定の細胞情報を結合対象とした請求項１記載の細胞情報分離方法。
【請求項１２】
密度勾配遠心処理後、担体のみを回収対象とする請求項１乃至１１のいずれかに記載の細胞情報分離方法。
【請求項１３】
密度勾配遠心処理後、磁気を備えた担体に別途磁気を当てて、回収する請求項１乃至１２のいずれかに記載の細胞情報分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、密度勾配遠心分離を利用した細胞情報分離方法ならびに回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来この種の密度勾配遠心分離を利用した細胞分離方法は、密度の層を容器内で形成させ、遠心分離し、層の境界に集まった細胞などを回収する技術であった。しかし、これは、回収する細胞が一定の密度ならば回収が容易であるが、細胞の複数種類がある場合、多層に分かれ、また、同じ層内でも分布が異なる場合がある。また、分離重要であり、困難であった（例えば特許文献１参照）。また、細胞分離後、細胞種を特定する工程において、目的の細胞であるかを判断するために、回収した層の細胞を培養や抗体反応など特定することが必要であるが、回収工程が不安定な場合、正確に確認することが困難である。さらに、密度勾配の境界層は、他の境界層と同様に半透明で密度の差による揺らぎを目視で判断し、分離した細胞を回収することが手法として挙げられる。しかし、密度の差による揺らぎは、目視だけでの判断では困難であり、境界層に回収した細胞の過剰回収あるいは、過小回収を行なってしまう場合があった。
【特許文献１】特開２００３−３１９７７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このような従来の密度勾配遠心分離を利用した細胞情報分離方法は、密度の境界層に集まった細胞などを回収する際、特定の細胞情報の完全な分離が困難であるといった課題がある。また、分離の困難さに伴い、回収も困難になるため、正確な分離、回収ができないといった課題がある。また、分布が悪い場合、特定の細胞情報が複数種存在する場合、一度での分離が困難であるという課題がある。そこで、正確な分離が可能であり、回収が容易な、密度勾配遠心分離を利用した特定の細胞情報の分離、回収方法が要求されている。
【０００４】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、事前に特定の担体に結合させた特定の細胞情報を密度勾配遠心分離することで、正確な分離が可能になるものであり、それに伴って、回収を容易にすることが可能となる。また、密度勾配遠心分離と複数の担体を併用することで複数種の特定の細胞情報を一度で分離することが可能となる。その結果、検体中の特定の細胞情報を、正確に、容易に、また多種の特定の細胞情報を一度で分離することが可能となる方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の細胞情報分離方法は上記目的を達成するために、密度勾配遠心分離を利用し正確な分離、回収を達成するために、特定の細胞情報を担体に担持させた後、前記担体に適合した密度勾配遠心分離を行なうことを特徴とする。
【０００６】
また、本発明の細胞情報分離方法は、特定の細胞情報を細胞自身とすることを特徴とする。
【０００７】
また、本発明の細胞情報分離方法は、特定の細胞情報を核酸とすることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明の細胞情報分離方法は、特定の細胞情報を糖鎖とすることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の細胞情報分離方法は、担体を金コロイド、磁気コロイド、シリカコロイドを単独あるいは少なくとも二種類以上組み合わせたものとすることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の細胞情報分離方法は、担体自体を着色することを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の細胞情報分離方法は、担体の大きさを１ナノメートルから１０ミリメートルとすることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の細胞情報分離方法は、担体の表面に抗体を結合させることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の細胞情報分離方法は、担体一種類に対し、一種類の特定の微生物を結合対象としたことを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の細胞情報分離方法は、密度勾配遠心処理後、担体のみを回収対象とすることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の細胞情報分離方法は、密度勾配遠心処理後、磁気を備えた担体に別途磁気を当てて、回収することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、特定の細胞情報を担体に付着させ、前記担体に適合した密度勾配層を有する密度勾配遠心分離を行なう特定の細胞情報分離、回収方法を用いることで、正確な分離が可能になり、それに伴って回収が容易になる。また、密度勾配遠心分離と複数の担体を併用することで多種類の特定の細胞情報を一度で分離することが可能となる。その結果、検体中の特定の細胞情報を、正確に、容易に、また多種の特定の細胞情報を一度で分離することが可能となり、特定の細胞情報の分離操作を容易にすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の請求項１記載の発明は、細胞情報を分離する方法において、特定の細胞情報を担体に付着させ、前記担体に適合した密度勾配層を有する密度勾配遠心分離を行なうことで、すなわち、密度の勾配の層を担体の密度に合致させた密度勾配層を有する密度勾配遠心分離を行なうことで、不安定な特定の細胞情報の密度ではなく、担体の安定した密度を対象とした分離が可能となることから、特定の細胞情報を正確に、容易に分離することができるという作用を有する。
【００１８】
また、請求項２記載の発明は、特定の細胞情報を細胞自体とし、密度勾配遠心分離を実施することで、不安定な細胞の密度ではなく、担体の安定した密度を対象とした分離が可能となり、また、細胞そのものを直接回収することができることから、高効率な分離に繋がるという作用を有する。
【００１９】
また、請求項３記載の発明は、特定の細胞情報を細胞由来の核酸とした密度勾配遠心分離を実施することで、不安定な核酸の密度ではなく、担体の安定した密度を対象とした分離が可能となり、特定の核酸から細胞の種類だけでなく、その毒素生産性などを把握することができるという作用を有する。
【００２０】
また、請求項４記載の発明は、特定の細胞情報を糖鎖とし、密度勾配遠心分離を実施することで、不安定な糖鎖の密度ではなく、担体の安定した密度を対象とした分離が可能となり、細胞由来の細胞壁構成成分やリポポリサッカライドなどの毒素を検出し、細胞の有毒性を把握することができるという作用を有する。
【００２１】
また、請求項５記載の発明は、担体を金コロイド、磁気コロイド、シリカコロイドを単独あるいは少なくとも二種類以上組み合わせたものとし、密度勾配遠心分離を実施することで、一度の密度勾配遠心分離で複数種の特定の細胞情報の分離、回収を容易なものとすることができ、また、密度の異なる担体を二種類以上用いることで異なる種類の細胞を分離、回収することができるという作用を有する。
【００２２】
また、請求項６記載の発明は、担体を着色し、密度勾配遠心分離を行なうことで、担体が密度勾配層に集まることで、担体の層を目視で色を判断することができ、層の存在、回収性を直接把握することができるという作用を有する。
【００２３】
また、請求項７記載の発明は、担体の大きさを１ナノメートルから１０ミリメートルとし、密度勾配遠心分離を実施することで、担体が回収する対象の特定の細胞情報よりも大きく、分離が容易となるという作用を有する。
【００２４】
また、請求項８記載の発明は、担体の表面に抗体を結合させ、密度勾配遠心分離を実施することで、特定の細胞情報を回収することが可能となり、抗体の種類によって得られる複数の特定の細胞情報を分離、回収することができるという作用を有する。
【００２５】
また、請求項９記載の発明は、担体の数を少なくとも２種類以上とした密度勾配遠心分離を実施することで、一度に複数の特定の細胞情報を分離することができるという作用を有する。
【００２６】
また、請求項１０記載の発明は、それぞれの担体を異なる色で着色し、密度勾配遠心分離を実施することで、各層に集まる担体の分離状況を把握することが容易となり、かつ各層に集まった担体の層を把握しやすくするという作用を有する。
【００２７】
また、請求項１１記載の発明は、担体一種類に対し、一種類の特定の細胞情報を結合対象とした密度勾配遠心分離を行なうことで、特定の細胞情報を一つの担体に集中的に回収することができ、効率よく、分離、回収ができるという作用を有する。
【００２８】
また、請求項１２記載の発明は、分離した担体を回収する方法において、密度勾配遠心処理後、担体のみを回収対象とすることで、余分な密度勾配遠心分離剤を取り込むことなく、安定した、高効率な分離が可能になるという作用を有する。
【００２９】
また、請求項１３記載の発明は、分離した担体を回収する方法において、密度勾配遠心処理後、磁気を備えた担体に別途磁気を当てることで磁力を利用した回収を行なうことができ、目的の磁気を備えた担体のみを回収することができ、効率よく分離することが可能になるという作用を有する。
【００３０】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００３１】
（実施の形態１）
密度勾配遠心分離は、細胞の密度を対象とした分離方法であり、動物細胞、植物細胞や、細胞内物質などを分離する方法として利用されている。密度勾配遠心分離は、蔗糖やシリカゲル、塩化セシウムなどを利用し、その濃度を変え、密度に勾配をつけるものである。密度の違いが層となって現れ、その密度に合わせてそれぞれの動物細胞、植物細胞、細菌などの微生物や、細胞内物質などを分離、回収することが可能である。しかし、密度の層を移動する時間が、大きさが均一でない場合は、密度の層の抵抗などが発生し、沈降速度に影響が出る。そのため、層に集まるべき細胞を正確に回収できない場合がある。また、複数の対象物を一度に分離する場合、密度の層が複数になり、更に分離が困難である。特定の細胞情報は、細胞自体、細胞由来の核酸、あるいは細胞の糖鎖など、細胞自体、細胞の構成物、部位、あるいは代謝物など、細胞由来情報等の一切の情報等である。細胞は、動物、植物、細菌、真菌、酵母菌など、一切の生物の細胞であり、細胞の生死を問わない。ウイルスも含み、ウイルスの糖鎖、あるいは核酸等も含む。
【００３２】
細胞情報を分離する方法において、密度勾配遠心分離を利用し正確な分離、回収を達成するために、特定の細胞情報を担体に担持させ、その特定の細胞に合致した細胞を付着させた後、前記担体に適合した密度勾配層を有する密度勾配遠心分離を行なう。すなわち、密度の勾配の層を担体の密度に合致させた密度勾配層を有する密度勾配遠心分離を行なう。これにより、均一な密度の担体を対象とした密度勾配遠心分離条件を行なうことで、安定した分離が可能となり、高効率分離に繋がる。特定の細胞情報は、アビジンとビオチンなどの媒体を経て、結合させることが可能である。また、ビオチンを担体に塗布後、一次抗体や、目的の核酸に相補的な核酸を結合させて、アビジンで処理した二次抗体や、目的の核酸を直接結合させることが可能である。二次抗体結合後、目的の特定の細胞情報を反応させて、回収する。回収後、タンパク質分解酵素などで分離し、目的の特定の細胞情報のみを回収し、分析等を行なうものである。
【００３３】
この時、細胞情報を特定の細胞自身とすることで、細菌や黴のように形状を観察する必要がある細胞をそのまま回収することが可能となる。更に、細胞を直接回収することでその生死を判別し、あるいは生きているものを回収し、別途培養することで次の操作段階として正確な生きている細菌から直接情報を得ることができる。また、細胞情報を細胞固体ではなく、特定の核酸とすることも有効である。特定の核酸を担体表面に回収し、核酸のみを回収することでポリメラーゼチェインリアクションなど遺伝子解析ツールへの分析にも活用できる。核酸の場合、そのもの単体では、密度勾配遠心分離で分離することが困難であるが、担体の密度を利用することで容易に分離が可能となる。特定の細胞情報である目的の核酸に対する相補的な核酸は、アビジンとビオチンなどを経てけつごうさせる。回収した特定の細胞情報である目的の核酸は、８０℃以上加熱することで、核酸を回収することができる。
【００３４】
それにより、目的の配列の核酸を容易に分離することが可能となる。本発明の密度勾配遠心分離により、検体中に含まれる反応妨害物質との分離も可能となることから、正確なポリメラーゼチェインリアクションなど遺伝子解析ツールへの応用展開が可能となる。また、細胞由来の糖鎖も回収方法対象となる。糖鎖の一例としてグラム陰性菌由来のリポポリサッカライドがある。リポポリサッカライドは、エンドトキシンとして細胞毒活性を示す。そのため、これらを効率よく分離することが検出にとって重要である。糖鎖の場合、そのもの単体では、密度勾配遠心分離で分離することが困難であるが、担体の密度を利用することで容易に分離が可能となる。担体については、金コロイド粒子、磁気コロイド粒子、シリカコロイド粒子などにウシ血清アルブミンなどでブロッキング処理後、一次抗体を担体表面へ付着させる場合は、表面をビオチン化処理し、二次抗体をアビジンで処理した特定の細胞情報を回収する。また、直接目的の特定の細胞情報の抗体を担体表面に付着させ、細胞または細胞由来の情報を回収することができる材料が有効である。
【００３５】
その他、細胞由来の情報を間接的、あるいは直接的に付着させることができる粒子でも有効である。これらを単独もしくは、二種類以上組み合わせることで、一度に数種類の細胞由来の情報を同時に分離することができる。これらの担体を着色し、用いることで、従来の密度勾配遠心分離では判別しにくかった密度勾配層を容易に判別することができ、目的の担体を効率よく回収することができる。
【００３６】
また、目的の担体が密度勾配層に集まる状況を目視で観察することができ、回収の様子を直接把握することができる。これら担体の大きさを１ナノメートルから１０ミリメートルの大きさとすることで、目的の細胞由来の情報および細胞を回収することが容易に可能となる。これらは、目的の大きさの細胞由来情報に適合した担体を用いることで、効率よく回収することができ、適した分離条件下で分離することが可能となる。
【００３７】
例えば細菌の場合、大きさが０．５マイクロメートルから３マイクロメートルであり、これよりも大きな担体を使用することで分離しやすい。特定の細胞情報の回収には、抗体が有効である。抗体は、対象となる細胞由来の情報に適合させたものを用いることで、目的の細胞由来の情報を担体に回収することができる。担体に結合させる抗体は、一種類とは限らず、複数種結合させることで、目的の複数種の細胞由来情報を同じ担体に集めて、大分類することができる。また、一度に細かく分離、回収する場合には、細胞由来の情報に適合させた抗体は、担体種ごとに異なる種類の抗体を用いることで、密度勾配遠心分離を実施した際、多種の細胞由来情報を一度に分離することが可能となる。担体の密度は、分離したい細胞由来の情報の種類に合わせることが有効である。
【００３８】
また、回収方法について、従来は密度勾配遠心分離後、密度勾配遠心分離剤を合わせて分離を実施してきた。これは、密度勾配の層が明確ではなく、目的の細胞由来の情報と密度勾配遠心分離剤を合わせて分離、回収することで、目的の細胞由来の情報を合わせて回収しようとするものであるが、その結果、余分な密度勾配遠心分離剤が含まれるため、検体量が多くなり、計測が困難になる場合があった。そこで担体のみを選択的に回収する方法により、高効率に分離するものである。担体のみ選択的に回収する方法としては、マイクロピペットやピペット、キャピラリーチューブなど中空管を回収した担体の直接密度勾配層に接触させ、吸引するもの、あるいは、担体の大きさよりも小さい目の網状の篩で担体を濾し、回収することも有効である。また、この網状の篩を多段階式の層とすることで、各種担体を分離することが可能となる。担体の回収は、磁気を有した担体を使用した場合、磁石を使用することも有効である。磁石により、高効率に目的の層のみを回収することが可能となる。
【実施例１】
【００３９】
以下、本発明の実施例について説明する。図１に本発明の実施例１の細胞情報分離方法の概念図を示す。図１（ａ）は同反応容器内での担体および抗原の概念図であり、図１（ｂ）は同密度勾配遠心分離前後の概念図である。
【００４０】
特定の細胞情報を分離する方法であり、検体中に含まれる特定の細胞情報を特異的に回収するものである。特定の細胞情報を担体に付着させ、担体を対象とした密度勾配遠心分離（図１参照）を行なう。担体α１、担体β２、担体γ３にはそれぞれ細胞情報に特異的な抗体を結合させており、特定の細胞情報を抗原として、混合させ反応させる。具体的な担体として、セファロースビーズ、金コロイド粒子、ガラス粒子を用いる。
【００４１】
これらは、密度が異なるため併用できる。抗原α４、抗原β５、抗原γ６はそれぞれ、担体α１、担体β２、担体γ３に対応している。反応後、密度勾配遠心分離層７の上層に載せ、遠心分離を行なう。密度勾配遠心分離後８は各層の上に目的の担体が回収されており、容易に取り出すことが可能である。密度勾配遠心分離は、担体の密度に適合させて、利用することが可能であるが、蔗糖、シリカゲルが用いられる。これらを５０から８０％程度になるように蒸留水で調整し、密度勾配遠心分離容器に積層することで、密度勾配層を作製する。密度勾配層を調整後、表層に検体を滴下し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、目的の層に回収された担体を回収する。
【００４２】
抗原としては、細胞そのものを対象とすることができる。抗原α４、抗原β５、抗原γ６はそれぞれ、担体α１、担体β２、担体γ３の反応は反応容器９内で行われる。細菌を対象とする場合、大腸菌や黄色ブドウ球菌など特定の細菌に結合する抗体が有効である。特定の細菌に対する抗体は、ウサギ由来、マウス由来などが取り扱い、作製手順などで有効である。また、その他の抗原として、レジオネラ、Ｃ型肝炎ウイルス、カンジダなど異なる種でも担体の密度を分離対象とするため、分離が可能である。抗体はレジオネラに特異的なリポポリサッカライドを検出対象としているものを利用できる。ウイルスの表面多糖類なども対象となる。また、担体の表面に核酸を結合させることも有効である。
【００４３】
核酸の配列は目的の細胞情報由来の核酸配列に相補的なものとすることで、結合させ、同様に回収させることができる。結合手段については、担体表面に塗布したビオチンと、目的の特定の細胞情報に対し相補的な核酸の結合を使用し、目的の特定の細胞情報を結合させることが有効である。回収条件として、密度勾配遠心分離は、担体の密度に適合させて、利用することが可能であるが、蔗糖、シリカゲルが用いられる。これらを５０から８０％程度になるように蒸留水で調整し、密度勾配遠心分離容器に積層することで、密度勾配層を作製する。密度勾配層を調整後、表層に検体を滴下し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、目的の層に回収された担体を回収する。
【００４４】
回収後、８０℃以上に加熱することで目的の特定の細胞情報を回収し、別途解析することができる。この際、検体中に異物や計測妨害物質が含まれたとしても、密度勾配遠心分離により分離することが可能となる。分離後、ポリメラーゼチェインリアクションなど分析ツールを用いて解析することが可能となる。また、担体の表面にカブトガニ由来血液成分を塗布し、グラム陰性菌由来の細胞壁構成成分であるリポポリサッカライドを回収することができる。担体には金コロイド、磁気コロイド、シリカコロイドを単独あるいは少なくとも二種類以上組み合わせたものを利用する。単独で使用する場合は、一種類の分離対象となるが、複数組み合わせることで、二種類以上の分離対象を一度に分離することができる。この際、分離層は担体の数に合わせたものであることが必要である。
【００４５】
担体はそれ自体を着色しておくことで、密度勾配遠心分離により、分離した際、容易に分離層から回収することができる。着色剤は、水で脱色しないもの、各種コロイドを着色できるものが適している。また、結合させたビオチンやブロッキング剤として塗布するウシ血清アルブミンなどのタンパク質を直接メチレンブルーなどで着色することも有効である。分離層は透明であり、目視では分かりにくいが、担体を目当てに回収することで容易に判別できる。また、担体ごとに色を分けることで、各層に集まる担体の状況を把握し、容易に分離することが可能となる。担体の大きさは、１ナノメートルから１０ミリメートルとすることで核酸やリポポリサッカライド、細胞自体に適した担体、また、それぞれの量に適した担体を使用し、高効率な分離を行なうことができる。
【００４６】
具体的には細菌などの微生物を取り扱う場合、大きさが０．５マイクロメートルから３マイクロメートルであるため、０．５マイクロメートル以上、または、３マイクロメートル以上が付着性から見ても有効である。この際、担体の方が回収対象の細胞由来情報よりも大きくすることで結合後の脱離を低減することができ、安定した分離が可能となる。担体には複数の情報を一度に取り込むために、一種類の担体に、複数種類の結合方法を組み込むことができる。分離対象が多い場合、一次分離方法として有効である。また、各担体に各種細胞由来情報を結合させる場合は、一度に個々の情報を分離することが可能となる。
【００４７】
回収された担体は、担体のみを分離することで余分な密度勾配遠心分離剤などを含まない目的物のみを回収することができる。回収はマイクロピペットやキャピラリー、ピペットのような中空管９を利用し、直接、密度勾配層１０に接触させ、吸引して分離する手法が有効（図２参照）である。また、分離には、篩を利用することも有効である。
【００４８】
担体α１、担体β２、担体γ３は、それぞれ細胞由来情報を結合させ、密度勾配遠心処理し、回収した後、担体α１、担体β２、担体γ３の層をそれぞれ篩に掛ける。篩α１１の目は担体α１に、篩β１２の目は担体β２に、篩γ１３の目は担体γ３の大きさよりもそれぞれわずかに細かく、それぞれ密度勾配遠心分離後、分離することで、密度勾配遠心分離剤や付着している異物を分離、洗浄することができ、より効率よく分離が可能（図３参照）となる。この時、中空管１７は、担体を回収するため、それぞれの担体よりも大きな内径であることが必要である。また、磁気を有した担体１４を使用した場合、密度勾配遠心分離後、密度勾配遠心分離容器１５に直接、磁石１６を接触させ磁気を有した担体１４を回収することで、効率よく、目的の担体を回収することができる。
【００４９】
また、密度勾配遠心分離後、分離することで、密度勾配遠心分離剤や付着している異物を分離、洗浄することができ、より効率よく分離が可能（図４参照）となる。磁気を有した担体に利用する磁気粒子は磁性細菌が形成した磁気粒子なども有効である。
【００５０】
なお、回収後の検出の際は、担体をそのまま検出することも有効である。そのまま検出する場合は、担体を直接顕微鏡などで拡大観察する方法や、細菌のように培養することができる場合は、培地へ接触させ培養する方法などが有効である。
【００５１】
なお、回収後の検出の際は、担体から細胞由来情報成分を分離することも有効である。分離させる方法としては、超音波処理や、薬剤洗浄、バッファー洗浄、プロテアーゼ処理など、物理的、あるいは化学的処理が有効である。
【００５２】
なお、用いる担体に結合させるものは細胞由来成分が付着するものであれば、抗体や核酸、カブトガニ血液由来成分に限らない。ＳＬＰなど蚕血液由来成分も有効である。
【００５３】
なお、用いる担体に直接結合させることも可能である。
【００５４】
なお、密度勾配遠心分離の条件として、回転数１０００ｒｐｍ以上１０００００ｒｐｍ以下のものが望ましい。１０００００ｒｐｍ以上になる場合、細胞由来成分に影響を与える場合がある。また、回転数が１０００ｒｐｍ以下の場合、分離効率が低くなる場合がある。
【００５５】
なお、磁気担体を回収する方法として用いる磁石は直接密度勾配遠心分離層内に入れても構わない。
【００５６】
なお、複数の担体を用いる時、その内の一種を磁気担体とすることで効率よく分離が可能となる。数種に磁気担体を使用する場合は、密度勾配分離層の距離をあけて用いることが有効である。
【００５７】
なお、磁気担体を回収する方法として磁石を用いる場合、密度勾配遠心分離に使用する容器は、鉄製以外でなければならない。
【００５８】
なお、中空管は一度に密度勾配層の数だけ挿入することも有効である。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の密度勾配遠心分離を利用した特定細胞分離、回収方法を用いることで、これまで明確な分離が困難であった密度勾配遠心分離を安定分離処理化することが可能となり、また、それに伴う密度勾配遠心分離後の回収も簡便になった。密度が予め判明している担体を利用し、密度勾配遠心分離を実施することで効率よく分離するものであり、担体を回収対象とすることで安定した分離が可能となるものである。これにより、様々な検体中の微生物や核酸、リポポリサッカライドのような特定細胞由来の情報を特異的に、かつ高効率で分離することができ、正確に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の実施例１の細胞情報分離方法の概念図（（ａ）同反応容器内での担体および抗原の概念図、（ｂ）同密度勾配遠心分離前後の概念図）
【図２】同、実施例１の中空管を利用した特定の細胞情報分離後の回収方法の図
【図３】同、実施例１の篩を利用した特定の細胞情報分離後の回収方法の図
【図４】同、実施例１の磁石を利用した特定の細胞情報分離後の回収方法の図
【符号の説明】
【００６１】
１  担体α
２  担体β
３  担体γ
４  抗原α
５  抗原β
６  抗原γ
７  密度勾配遠心分離層
８  密度勾配遠心分離後
９  反応容器
【図１】
2009089612.tif 000003
【図２】
2009089612.tif 000004
【図３】
2009089612.tif 000005
【図４】
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