(57)【要約】      （修正有）【課題】セルロースからグルコースなどの糖類を得て安価にＰＨＢを生産することを可能とするために、セルロースをより低分子量の分解生成物に分解することのできる組換えタンパク質を提供する。【解決手段】Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属細菌由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、または前記アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）の組換えタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号２で表される２７番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）このアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ｃ）または（ｄ）の組換えタンパク質。
（ｃ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）このアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ分子。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡ分子を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターによって宿主を形質転換した形質転換体。
【請求項６】
前記宿主が、バチルス菌または大腸菌であることを特徴とする請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
前記バチルス菌が、バチルス・メガテリウムであることを特徴とする請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５から請求項７のいずれか１項に記載の形質転換体を培地で培養し、この培地に発現誘導物質を添加して、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質を組換えタンパク質として発現させ、発現させた組換えタンパク質を精製して取得することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
【請求項９】
発現させた前記組換えタンパク質は、前記形質転換体外に分泌されるものであって、
前記形質転換体外に分泌された当該組換えタンパク質が、
配列表の配列番号２で表される２７番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質
であることを特徴とする請求項８に記載の組換えタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースをより低分子量の分解生成物に分解することのできる組換えタンパク質と、かかる組換えタンパク質を得ることのできるＤＮＡ分子、組換えベクター、形質転換体および組換えタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界にはポリ−３−ヒドロキシブチレート樹脂（以下、「ＰＨＢ」という。）を菌体内蓄積物質として生産し、貯蔵する、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）などの微生物が存在していることが知られている。このＰＨＢは、ポリエステル樹脂の一種であり、融点が高いため、汎用樹脂やエンジニアリングプラスチックとしての使用が期待されている。しかし、バチルス・メガテリウムがＰＨＢを産生する際、その主栄養源（炭素源）としてグルコース（ブドウ糖）を使用するため、グルコースのコストがＰＨＢの生産コストに直接的に反映されてしまい、低コスト化することが困難であった。
【０００３】
このような状況下、最近では、例えば、特許文献１に記載のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（ＰＨＢを含む樹脂の総称）の製造法のように、遺伝子組換え技術により、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子と、脂肪酸合成酵素遺伝子とを宿主微生物に導入して形質転換し、この形質転換微生物（大腸菌）を炭素源存在下で増殖させ、この増殖微生物からポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を単離・精製することで、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を簡便かつ大量に、しかも安価に産出させる方法が提案されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−１３５０８３号公報（請求項１〜３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載の方法は、宿主微生物（大腸菌）を遺伝子組換え技術によって形質転換させることにより、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を簡便かつ大量に、しかも安価に産出できるようにすることを目的としているが、主たる栄養源はグルコースに代表される糖類であるため、その生産コストを十分に低くすることができない。
【０００６】
また、一般的にそのような糖類を得る場合、食用植物由来の食品として用いられるデンプン質を酵素分解して得ることが多いが、バイオエタノールの需要急増や、食品原料から樹脂を生産する抵抗感から問題があった。
他方、デンプン質以外の原料としては、地球上に潤沢なセルロースを用いることが考えられ、セルロースからグルコースなどの糖類を得る方法としてセルラーゼを使用する方法や硫酸／超臨界水を使用する方法があるものの、いずれの方法も生産されるＰＨＢが高価になってしまうという問題があった。
【０００７】
本発明は前記問題点に鑑みてなされたものであり、セルロースからグルコースなどの糖類を得て安価にＰＨＢを生産することを可能とするために、セルロースをより低分子量の分解生成物に分解することのできる組換えタンパク質と、かかる組換えタンパク質を得ることのできるＤＮＡ分子、組換えベクター、形質転換体および組換えタンパク質の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究した結果、バチルス・メガテリウムを遺伝子組換え技術によって形質転換させることにより、グルコースの原料の一つであり、通常残渣として処分されるセルロースを、自ら分泌する酵素でより低分子量の分解生成物に分解することができるようにすることで前記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
〔１〕前記課題を解決した本発明に係る組換えタンパク質は、（ａ）配列表の配列番号２で表される２７番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｂ）このアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質である。
〔２〕また、本発明に係る組換えタンパク質は、（ｃ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｄ）このアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質である。
【００１０】
〔１〕で規定した組換えタンパク質や、〔２〕で規定した組換えタンパク質は、セルラーゼ活性を有しているので、セルロースをより低分子量の分解生成物に分解することができる。
【００１１】
〔３〕本発明に係るＤＮＡ分子は、〔１〕または〔２〕に記載の組換えタンパク質をコードし、〔４〕本発明に係る組換えベクターは、〔３〕に記載のＤＮＡ分子を含む。
かかるＤＮＡ分子や組換えベクターによれば、〔１〕または〔２〕に記載の組換えタンパク質を得ることができるので、得られた組換えタンパク質により、セルロースをより低分子量の分解生成物に分解することができる。
【００１２】
〔５〕本発明に係る形質転換体は、〔４〕に記載の組換えベクターによって宿主を形質転換したものであり、好ましくは、〔６〕前記宿主が、バチルス菌または大腸菌であり、より好ましくは、〔７〕前記バチルス菌が、バチルス・メガテリウムである。
かかる形質転換体によれば、確実に〔１〕または〔２〕で規定した組換えタンパク質を得ることができるので、セルロースをより低分子量の分解生成物に分解することができる。
【００１３】
〔８〕そして、本発明に係る組換えタンパク質の製造方法は、〔５〕から〔７〕のいずれか１つに記載の形質転換体を培地で培養し、この培地に発現誘導物質を添加して、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質を組換えタンパク質として発現させ、発現させた組換えタンパク質を精製して取得するものである。
【００１４】
〔９〕発現させた前記組換えタンパク質は、前記形質転換体外に分泌されるものであって、前記形質転換体外に分泌された当該組換えタンパク質が、配列表の配列番号２で表される２７番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質であるのが好ましい。
このように、本発明の組換えタンパク質の製造方法によれば、確実に〔１〕または〔２〕で規定した組換えタンパク質を製造することができ、さらには、培地中に分泌させることができるので、培地中のセルロースをより低分子量の分解生成物に分解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の特徴は、セルロースを分解する能力を持たない宿主（例えば、バチルス・メガテリウム）に、セルロース分解酵素であるセルラーゼをコードする構造遺伝子を導入して形質転換することにより、セルロースをより低分子量の分解生成物に分解することができるようにした点にある。
【００１６】
なお、本発明では、組換えタンパク質を得るために、バチルス・メガテリウムや大腸菌といった宿主を形質転換させた形質転換体を得るものであるが、このような宿主の取り扱いや宿主の形質転換体を得る際に行う必要な操作について、発明を実施するための最良の形態および実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いることができる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いることができる。また、当業者であれば本明細書の記載および前記した標準的なプロトコール集などの記載から容易に本発明を再現することができる。
【００１７】
以下、本発明に係る組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、組換えベクター、形質転換体、および組換えタンパク質の製造方法について詳細に説明する。
【００１８】
［１．組換えタンパク質（最終産物）］
本発明に係る組換えタンパク質は、（ａ）配列表の配列番号２で表される２７番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質であるが、（ｂ）このアミノ酸配列からなるタンパク質がセルラーゼとしての活性を有する限り、このアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加等の変異があってもよい。
このような変異は、作為的に導入されたか無作為的に導入されたかを問わず、前記した（ｂ）のタンパク質からなる組換えタンパク質の機能や活性が、実質的に本発明の（ａ）のタンパク質からなる組換えタンパク質と同じであれば、化学的または生化学的な改変、または天然若しくは非天然のアミノ酸残基またはアミノ酸配列が含まれてもよいことを意味している。このような変異の作為的な導入は、例えば、ＰＣＲ法を用いた部位特異的人工変異導入など、当業者に周知の手法により行うことができ、無作為的な導入は、例えば、ＰＣＲ法を用いた場合の鋳型となる染色体に変異がある場合や、ＰＣＲ法で用いたＤＮＡポリメラーゼの転写ミスが生じた場合などに行われる。
【００１９】
かかる組換えタンパク質は、後記する形質転換体によって産生された後、当該形質転換体外、つまり、液体培地などの培地中に分泌される、いわゆる最終産物に相当するものであり、実質的に培地中のセルロースを分解する酵素として機能する。
【００２０】
かかる組換えタンパク質は、エンド型の作用形式でセルロースを加水分解するセルロース分解酵素、具体的には、EC.3.2.1.4のセルラーゼを遺伝子組換え技術によってアミノ酸配列の一部を組み換えたものである。なお、かかるセルラーゼは、例えば、Cellulomonas fimi由来のＣｅｎＢ、具体的には、Meinke, A., Braun, C., Gilkes, N. R., Kilburn, D. G., Miller, R. C. Jr. and Warren, R. A.,”Unusual sequence organization in CenB, an inverting endoglucanase from Cellulomonas fimi”, J. Bacteriol. 173 (1), 308-314 (1991)にて報告され、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号Ｍ６４６４４で登録されている。なお、かかるセルラーゼのアミノ酸残基の１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、前記したセルラーゼと実質的に同一の活性を有するタンパク質が本願発明に含まれることはいうまでもない。
【００２１】
かかるセルラーゼが、形質転換体から培地中に分泌させるのに適切でないオリゴペプチドまたはポリペプチドをその分子内に有する場合、組換えＤＮＡ技術を用いてそのようなオリゴペプチドやポリペプチドを欠損させたり、用いる形質転換体（つまり宿主）にあわせて形質転換体から培地中に分泌させるのに適切な他のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドやポリペプチドを付加させたり、その一部のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換させてもよい。
なお、本発明においては、オリゴペプチドとは、アミノ酸残基数が２〜１０個程度以下の短いペプチドをいい、ポリペプチドとは、オリゴペプチドよりも多くのアミノ酸残基数でなるペプチドをいうが、以下では説明の都合上これらを総称して「ポリペプチド」という。
【００２２】
ここで、組換えＤＮＡ技術によって構造遺伝子の一部を操作した場合、形質転換体によって発現される組換えタンパク質のコドンと、ＣｅｎＢにおいて相当する部分のコドンと、が一致しないことがある。そのような場合は、発現される組換えタンパク質のコドンと、ＣｅｎＢにおいて相当する部分のコドンと、を一致させるため、セルラーゼ活性を失活させない範囲で１若しくは数個の塩基を欠失、置換または付加させることができる。
【００２３】
［２．組換えタンパク質（中間体）］
配列表の配列番号２で表される１番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質は、前記した内容を考慮して作出されたセルラーゼ活性を有する組換えタンパク質である。
つまり、配列表の配列番号２のうち、１番から２８番のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、前記したシグナルペプチドに相当するものであり、これよりも下流（Ｃ末端側）のタンパク質を形質転換体外に分泌させることができる。この１番から２８番のアミノ酸配列は、シグナルペプチダーゼであるＬｉｐＡ（extracellular esterase LipA）によってポリペプチド中の特定の部分が認識され、特定の位置で切断される。本発明の場合、宿主の細胞膜に存在するＬｉｐＡが、配列表の配列番号２の１番から２８番のポリペプチドをシグナルペプチドであると認識し、さらにそのうちの２６番から２８番のアミノ酸配列（Ala-Gly-Ala（ＡＧＡ））をＡＫＡモチーフとして認識して２６番のAlaと２７番のGlyとの間で切断する（Malten, M. et al., “A Bacillus megaterium Plasmid System for the Production, Export, and One-Step Purification of Affinity-Tagged Heterologous Levansucrase from Growth Medium” APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Feb.(2006) Vol.72, No.2, p.1677-1679）。したがって、配列表の配列番号２で表される１番から２８番のアミノ酸配列からなるポリペプチドを備えることにより、配列表の配列番号２で表される２７番以降のアミノ酸配列からなるタンパク質（組換えタンパク質）を形質転換体外に分泌することができる。
【００２４】
また、配列表の配列番号２のうち、２９番から３８番のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、セルラーゼ活性を失活させない範囲で１若しくは数個のアミノ酸残基を欠失、置換または付加したものである。
【００２５】
詳しく説明すると、配列表の配列番号２のうち、２９番から３７番のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、後記する組換えベクターの有するオープンリーディングフレームにコードされているポリペプチドであり、３８番のアミノ酸残基は、３９番以降のアミノ酸配列を、ＣｅｎＢにおいて相当するアミノ酸配列と一致させるために任意の塩基を追加した結果、ＣｅｎＢと異なるアミノ酸残基に置換されたものである。つまり、配列表の配列番号２のうち、３８番のアミノ酸残基（Ile）は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号Ｍ６４６４４で登録されたＣｅｎＢの３５番目のアミノ酸残基（Ala）が置換されたものということができる。なお、本発明においては、AlaをIleに置換しているが、これに限定されるものではない。例えば、Alaは疎水性脂肪族アミノ酸であるので、疎水性脂肪族アミノ酸に属する他のアミノ酸残基（例えば、Gly、Val、Leu、Metなど）に置換してもよい。
【００２６】
したがって、（ｃ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（つまり、配列表の配列番号２で表される１番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質）、または（ｄ）このアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質である組換えタンパク質は、形質転換体内で産生されてこれに内在する、いわゆる組換えタンパク質の中間体に相当する。当該組換えタンパク質は、形質転換体外に分泌可能にするシグナルペプチドと連結された融合タンパク質であるため、形質転換体内で産生された当該組換えタンパク質を培地に分泌させることができる。これにより、培地中のセルロースを効率よく分解してより低分子量の分解生成物に分解することが可能となる。
【００２７】
［３．ＤＮＡ分子および組換えベクター］
（ａ）配列表の配列番号２で表される２７番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｂ）このアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子、つまり、配列表の配列番号１で表されるＤＮＡ分子のうち７９番から３１５０番（なお、３１４８番から３１５０番の塩基はストップコドンである。）の塩基配列からなるＤＮＡ分子は、例えば、Cellulomonas fimiの染色体を用いて、１０〜５０ｂｐｓ、より好ましくは２０〜４０ｂｐｓ程度のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いたＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法を行うことによって好適に得ることができる。
なお、配列表の配列番号１で表されるＤＮＡ分子は、組換えタンパク質（中間体）として翻訳される部分（配列番号１中のＣＤＳ；１〜３１５０ｂｐ（ストップコドンを含む））と、ＣｅｎＢをコードするＤＮＡ分子（配列番号１中のgene；１１５〜３１５０ｂｐ）と、その５’末端側に組換えベクターの有するシグナルペプチド等をコードするＤＮＡ分子（配列番号１中のsig_peptide；１〜８４ｂｐ、およびmisc_difference；８５〜１１４ｂｐ）と、ストップコドン以下に続く本発明の組換えタンパク質には翻訳されない領域（３１５１〜３２９０ｂｐ）と、制限酵素で切断されたリバースプライマーの相補鎖（３２９１〜３３１５ｂｐ）とを有する状態で示している。
【００２８】
ここで、配列表の配列番号１で表されるＤＮＡ分子のうち７９番から３１５０番の塩基配列からなるＤＮＡ分子をＰＣＲ法によって得る場合、前記したフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、任意の制限酵素の認識・切断サイトを５’末端側にデザインしておくのが好ましい。例えば、フォワードプライマーの５’末端側にBamHIの認識・切断サイトをデザインし、リバースプライマーの５’末端側にSphIの認識・切断サイトをデザインすることを例示することができる。このようなフォワードプライマーとしては、例えば、配列表の配列番号３に示す5'-cgggatccccacctacaactacgccgag-3'を挙げることができ、また、リバースプライマーとしては、例えば、配列表の配列番号４に示す5'-cggcatgctcggctacttcgtcgggatg-3'を挙げることができる。なお、本発明において用いることのできるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列はこれらに限定されるものではなく、（ａ）配列表の配列番号２で表される２７番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）またはこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加され且つセルラーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ分子、すなわち、配列表の配列番号１の７９番から３１５０番の塩基配列、またはこの塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるＤＮＡ分子を得ることができれば、他の塩基配列からなるプライマーであってもよい。また、用いる任意の制限酵素は前記したものに限定されないことはいうまでもない。
【００２９】
また、これらのプライマーを用いたＰＣＲ法の条件としては、例えば、９５℃で４分間保持した後、９５℃で１分間の熱変性と、５０℃で２分間のアニーリングと、７２℃で５分間の伸長反応と、を１サイクルとしてこれを３０サイクル繰り返して行うことを例示することができる。なお、かかるＰＣＲの条件は、（ａ）配列表の配列番号２で表される２７番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）またはこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加され且つセルラーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ分子を得られればよいので、前記した条件に限定されないことはいうまでもない。
【００３０】
かかるＤＮＡ分子は、前記したシグナルペプチド、すなわち、配列表の配列番号２で表される１番から２８番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたポリペプチドがコードされているのが好ましい。
【００３１】
このようなシグナルペプチドを有するＤＮＡ分子は、例えば、所望するシグナルペプチドを有する染色体ＤＮＡと、シグナルペプチドを得るためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーとを用いてＰＣＲ法を行い、得られたＰＣＲ産物（シグナルペプチドをコードするＤＮＡ分子）と、（ａ）配列表の配列番号２で表される２７番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）またはこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加され且つセルラーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ分子と、をライゲーションさせることで得ることが可能であるが、所望するシグナルペプチドをコードしているベクターが市販されている場合は、そのようなベクターを用いると、前記したシグナルペプチドを有するＤＮＡ分子を得るための労力を省くことができるので好ましい。
【００３２】
このようなベクターとしては、例えば、BamHIやSphIといった制限酵素で切断して、構造遺伝子などのＤＮＡ分子を導入することのできるマルチクローニングサイトを有し、また、例えば、キシロースなどの特定の物質によって、マルチクローニングサイトに導入したＤＮＡ分子の発現を誘導することのできるプロモーターを有し、さらにテトラサイクリン耐性遺伝子やアンピシリン耐性遺伝子などの抗生物質耐性マーカー遺伝子を有するものを好適に用いることができる。
このようなベクターとしては、例えば、バチルス菌と大腸菌のいずれの宿主でも自律増殖することのできるシャトルベクターpMM1525を好適に用いることができる。ここで、シャトルベクターpMM1525を用いた場合、テトラサイクリン耐性遺伝子はバチルス菌で発現され、当該バチルス菌をテトラサイクリン耐性とすることができる。また、アンピシリン耐性遺伝子は大腸菌で発現され、当該大腸菌にアンピシリン耐性とすることができる。なお、本発明において用いることのできるベクターは、導入したＤＮＡ分子に基づいて本発明に係る組換えタンパク質を発現させ、好ましくは菌体外に分泌可能な状態で得ることができればよく、前記したベクターに限定されないことはいうまでもない。
【００３３】
このようなベクターを用いた組換えタンパク質の発現系を構築するには、例えば、前記した配列表の配列番号３で表されるフォワードプライマー、および配列表の配列番号４で表されるリバースプライマーを用いたＰＣＲ法によって、目的とするＰＣＲ産物（少なくとも、配列表の配列番号１の７９番から３１５０番の塩基配列を含むＤＮＡ分子）を得た後、これを例えば、制限酵素であるBamHIおよびSphIによって切断する。また、ベクターのマルチクローニングサイトもBamHIおよびSphIによって切断する。そして、これらをライゲーションさせることによって、例えば、配列表の配列番号１の７９番から３１５０番の塩基配列を有する組換えベクターを作出することができる。なお、制限酵素による切断およびライゲーションの条件は、用いる制限酵素やライゲースによって適宜設定すればよいが、制限酵素処理は、３７℃で４〜５時間処理することを例示することができ、ライゲーション処理は、１６℃で１〜２時間反応させることを例示することができる。
【００３４】
［４．形質転換体］
前記したようにして作出した配列表の配列番号１の７９番から３１５０番の塩基配列を含む組換えベクターを宿主に導入することによって、形質転換体を得ることができる。
【００３５】
形質転換に用いる宿主としては、バチルス菌や大腸菌を用いることができる。バチルス菌を用いる場合は、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）を用いるのが好ましく、バチルス・メガテリウムWH320株を用いるのがより好ましい。かかる宿主を用いると、中間体に相当する、シグナルペプチドを有した組換えタンパク質、すなわち、（ｃ）配列表の配列番号２で表される１番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｄ）このアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質）を好適に発現させることができ、さらに、最終産物に相当する、シグナルペプチドを切断した組換えタンパク質、すなわち、（ａ）配列表の配列番号２で表される２７番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｂ）このアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質を形質転換体外に好適に分泌させることができる。
一方、大腸菌（Escherichia coli）を用いる場合は、大腸菌JM109株を用いるのが好ましい。かかる宿主を用いると、培養が容易であり、作出した組換えベクターを大量に得ることが可能である。
【００３６】
前記した組換えベクターをバチルス菌や大腸菌といった宿主に導入して形質転換体を得るには、例えば、エレクトロポーレーション法、塩化カルシウム法、プロトプラスト法などにより行うことができるが、本発明においてはこれらに限定されるものではなく、他の形質転換法によって形質転換体を得てもよいことはいうまでもない。
【００３７】
このようにして形質転換した形質転換体は、テトラサイクリンやアンピシリンといった抗生物質存在下で生育させることができるため、このような抗生物質を培地中に添加することによって容易にスクリーニングすることができる。
また、かかる形質転換体は、例えば、０．５％といった所定濃度のキシロースを培地中に添加することによって、組換えベクターに組み込んだＤＮＡ分子に基づいて本発明の組換えタンパク質、つまり、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質の発現を誘導することができる。また、このようにして発現させた組換えタンパク質を、例えば、宿主が有しているシグナルペプチダーゼ等によって形質転換体外、すなわち培地中に分泌させることができる。
【００３８】
したがって、本発明に係る形質転換体、特にバチルス・メガテリウムを宿主として用いた形質転換体は、培地中のセルロースを、より低分子量の分解生成物に分解することが可能となる。このようにして生成した分解生成物を用いれば、より容易にグルコースを生成することが可能となるため、ＰＨＢを安価に生産させることが可能となる。
【００３９】
また、形質転換体外に分泌させた組換えタンパク質は、常法により透析や塩析することができる。例えば、５０ｍＭのＫＰＢ（リン酸カリウムバッファー；ｐＨ６．８）や、トリス−ＨＣｌバッファーによって透析したり、７５％硫安飽和によって塩析したりすることができるが、本発明においてはこれに限定されることはなく、例えば、１０〜１００ｍＭのＫＰＢ（ｐＨ６．５〜７．５）やトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．５〜７．５）によって透析したり、６５〜８０％硫安飽和によって塩析したりすることができる。
【００４０】
発現させた組換えタンパク質のセルラーゼ活性は、例えば、当該組換えタンパク質を含む溶液を０．５ｍＬと、５０ｍＭのＫＰＢ（ｐＨ６．８）で溶解した１％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）基質液１．０ｍＬと、を加えて３７℃の条件下で任意の時間（例えば、０〜１８時間など）インキュベートした後、煮沸等して酵素反応を停止させ、組換えタンパク質によって生成された還元糖をＤＮＳ法（ジニトロサリチル酸法）などで測定することで、その活性を測定することがきる。ここで、ＤＮＳ法とは、ＤＮＳ試薬（例えば、蒸留水１００ｍＬ中、３，５−ジニトロサリチル酸０．５ｇ、２ＮのＮａＯＨ２０ｍＬ、ロッシェル塩３０ｇ）を用いて還元糖の生成量を５３５ｎｍの波長で吸光度を測定する方法である。なお、本発明におけるセルラーゼ活性の測定方法は前記したものに限定されないことはいうまでもない。例えば、ソモジー・ネルソン法、クロマトグラフ法によってもセルラーゼ活性を測定することができる。
【００４１】
以上に説明した本発明に係る形質転換体は、（ａ）配列表の配列番号２で表される２７番から１０４９番のアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｂ）このアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む組換えベクターを導入して形質転換されているので、発現した組換えタンパク質によって、培地中のセルロースを、より低分子量の分解生成物に分解することができる。そのため、ＰＨＢを安価に生産させることが可能となる。
【実施例】
【００４２】
次に、本発明の効果を確認した実施例について説明する。
（１）ＰＣＲ法によるセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子の増幅
まず、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法にて、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする構造遺伝子（ＤＮＡ分子）を増幅した。セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子としては、Cellulomonas fimi由来のＣｅｎＢを用いることとした。なお、Cellulomonas fimi由来のＣｅｎＢの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ６４６４４に登録されている。なお、Cellulomonas fimiは、独立行政法人製品評価技術基盤機構より分譲して頂いた（ＮＢＲＣ  １５５１３）。
【００４３】
かかる構造遺伝子を得るため、制限酵素であるBamHIの認識・切断サイトを５’末端側にデザインしたフォワードプライマー（配列表の配列番号３：5'-cgggatccccacctacaactacgccgag-3'）と、制限酵素であるSphIの認識・切断サイトを５’末端側にデザインしたリバースプライマー（配列表の配列番号４：5'-cggcatgctcggctacttcgtcgggatg-3'）と、Cellulomonas fimiの染色体ＤＮＡと、を用いて、GeneThermoUnit GTU-1605（タイテック社製）により、以下のＰＣＲ条件でＰＣＲ反応を行った。すなわち、９５℃で４分間保持した後、９５℃で１分間の熱変性と、５０℃で２分間のアニーリングと、７２℃で５分間の伸長反応と、を１サイクルとしてこれを３０サイクル繰り返して行った。
なお、ＰＣＲ反応は、Cellulomonas fimiの染色体ＤＮＡと、dGTP、dATP、dCTP、dTTPのそれぞれを２．５ｍＭで含むdNTP mixture（タカラバイオ社製）を８μＬ、１０×ＰＣＲバッファー（タカラバイオ社製）を１０μＬ、前記したフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ２０μＭで２μＬ、Takata Ex Taq（タカラバイオ社製）を０．５μＬ、滅菌水を７５．５μＬ加え、総量１００μＬとした。
【００４４】
このような条件でＰＣＲ反応を行ったＰＣＲ反応溶液をピペッターで２μＬ分取し、０．５％アガロースゲルを用いて電気泳動したところ、目的とするCellulomonas fimi由来のＣｅｎＢ（3211ｂｐｓ）とほぼ同じ大きさである約３．２ｋｂｐｓの長さのＰＣＲ産物を確認することができた。
【００４５】
（２）組換えタンパク質発現用ベクターの作製
前記したＰＣＲ法によって得られたＰＣＲ産物をNucleoSpin Extract II（日本ジェネティック社製）で精製した。
そして、BamHI（NewEngland BioLabs社製）およびSphI（NewEngland BioLabs社製）を用いて３７℃、５時間の制限酵素処理を行った。
また、ベクターはpMM1525（MoBiTec社製）を用いた。これも同様に、BamHIおよびSphIを用いて３７℃、５時間の制限酵素処理を行った。
BamHIおよびSphIを用いて処理したＰＣＲ産物（約３．２ｋｂｐｓ）およびpMM1525（約７．４ｋｂｐｓ）を、０．５％アガロースゲルを用いて電気泳動した後、これらを含むそれぞれの位置でゲルを切り出し、NucleoSpin Extract IIで精製した。
【００４６】
次いで、アガロースゲルから精製したＰＣＲ産物およびpMM1525を用いてライゲーションを行った。ライゲーションは、DynaExpress DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory Inc.社製）を用いて、１６℃、２時間反応させることにより行った（以下、このようにして作製した産物をpMM1525CenBと呼ぶ。）。
次いで、pMM1525CenBを用いて、塩化カルシウム法によりEscherichia coli JM109株に導入し、形質転換体（E. coli JM109/pMM1525CenB）を作製した。そして、作製したE. coli JM109/pMM1525CenBを、２ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／ＬのBacto Trypton、５ｇ／ＬのYeast extract、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）にて培養し、遠心分離した後、得られたペレットを、NucleoSpin Plasmid Kit(日本ジェネティック（株）)を用いて処理し、pMM1525CenBを調製した。
【００４７】
（３）pMM1525CenBのBacillus megateriumへの導入
まず、Bacillus megaterium（バチルス・メガテリウム、以下、「B. megaterium」）WH320株を用意し、これを細胞懸濁液１ｍＬあたり２ｍｇのリゾチーム（和光純薬社製）で処理し、これのプロトプラストを作製した。
そして、E. coli JM109/pMM1525CenBから調製したpMM1525CenBを１μｇ用いて形質転換することにより、B. megateriumに導入して形質転換体を作製した。以下、この形質転換体をB. megaterium/pMM1525CenBと呼ぶ。なお、このようにして作製した形質転換体は、２００７年１２月１４日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、B. megaterium/pMM1525CenB；受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−４６６として寄託され、受領されている。
【００４８】
B. megaterium/pMM1525CenBをＬＢ平板培地（１０ｇ／ＬのBacto Trypton、５ｇ／ＬのYeast extract、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、１．５％の寒天）上に播き、３７℃で約１６時間培養してB. megaterium/pMM1525CenBのコロニーを生育させた。そして、生育した単一コロニーを２個選択して滅菌済みの楊枝でピックアップし、それぞれテトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）入りの５ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／ＬのBacto Trypton、５ｇ／ＬのYeast extract、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）に接種して、３７℃で２４時間、１５０ｒｐｍ（回転／分）の振とう回数で前培養を行った。
【００４９】
そして、前培養と同じ組成のテトラサイクリン含有ＬＢ液体培地１００ｍＬを２本ずつ２セット用意して、前培養した前培養液をそれぞれ１ｍＬずつ加え、本培養を行った。本培養は、３７℃で最大１１時間、１５０ｒｐｍの振とう回数で行った（それぞれ表１中に「WH320(CenB)-1」、および「WH320(CenB)-2」と表わす。）。なお、表１において培養時間が０とは培養開始時を表す。
比較対象のため、pMM1525CenBで形質転換していないB. megaterium WH320株（表１中に「WH320 形質転換せず」と表わす。）も２本のＬＢ液体培地１００ｍＬで本培養した。
本培養の途中で、下記表１中の下線で示したタイミング、すなわち、表１中(1)は６時間培養時、(3)は５時間培養時、(5)は３．５時間培養時に、培養液中での濃度が０．５％となるようにキシロースを加えて、pMM1525CenBにコードされた組換えタンパク質の発現の誘導を行った。これは、対数増殖初期から中期（濁度計（Akiyama Fuji DS光電光度計）で波長６６０ｎｍでの濁度（光電光度計の表示値）が４０〜１００程度）になったところでキシロースを添加することにより、組換えタンパク質の発現を誘導させるためである。したがって、それぞれの菌株で増殖度に差が出るため、培養開始後のキシロース添加時間が異なっている。なお、キシロースで組換えタンパク質の誘導を行ったものを表中に「xylose誘導」と表わす。
【００５０】
【表１】
2009165399.tif 000002
【００５１】
（４）発現させた組換えタンパク質のセルラーゼ活性の確認
前記した前培養および本培養の条件に準じて、「WH320(CenB)-1」および「WH320(CenB)-2」についてそれぞれ２本ずつ各１００ｍＬ培養し、また、比較対象として「WH320 形質転換せず」について１００ｍＬ培養した（２本）。これらを増殖度に応じて１１時間または１８時間本培養した後、それぞれ遠心分離を行って培養上清液を得、この培養上清液から２ｍＬを分取し、４℃条件下、５０ｍＭのＫＰＢ（ｐＨ６．８）で２４時間の透析を行って、(a)透析酵素液を得た。
他方、遠心分離して得た培養上清液８５ｍＬを７５％硫安飽和によって沈殿を回収した後、この沈殿を５０ｍＭのＫＰＢ（ｐＨ６．８）２ｍＬに溶解し、４℃条件下、同バッファーで２４時間の透析を行って、(b)濃縮酵素液を得た。
【００５２】
このようにして得られた合計６本の(a)透析酵素液および合計６本の(b)濃縮酵素液からそれぞれ０．５ｍＬ分取し、５０ｍＭのＫＰＢ（ｐＨ６．８）で溶解した１％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）基質液１．０ｍＬに加えて３７℃の条件下で、(a)透析酵素液については、表２に示すように、酵素反応開始時（０時間）と酵素反応開始から１８時間後のセルラーゼ活性を測定し、(b)濃縮酵素液については、表３に示すように、酵素反応開始時（０時間）と酵素反応開始から４時間後のセルラーゼ活性を測定した。すなわち、所定時間酵素反応させたものと、酵素反応開始時と、の還元糖量の差をみることにした。なお、(b)濃縮酵素液で酵素反応時間を短くしているのは、反応が進みすぎるためである。
【００５３】
表２および表３におけるセルラーゼ活性は、以下のようにして測定した。
所定時間酵素反応させた後、これらの反応液を１０分間煮沸することにより酵素反応を停止させ、生成された還元糖をＤＮＳ法（ジニトロサリチル酸法）により測定した。すなわち、０．５ｍＬの反応液を煮沸した後、１．０ｍＬのＤＮＳ試薬（蒸留水１００ｍＬ中、０．５ｇの３，５−ジニトロサリチル酸、２０ｍＬの２ＮのＮａＯＨ、３０ｇのロッシェル塩（いずれも関東化学社製））を加えてよく混合した後５分間煮沸し、水道水にて冷却する。その後、蒸留水４．５ｍＬを加えて希釈し、５３５ｎｍにおける吸光度（Ａ５３５）を測定した。(a)透析酵素液についての結果を表２に示す。また、(b)濃縮酵素液についての結果を表３に示す。
【００５４】
【表２】
2009165399.tif 000003
【００５５】
【表３】
2009165399.tif 000004
【００５６】
表２および表３に示すように、(a)透析酵素液では、セルロースが分解されて生成した還元糖の量はわずかであったものの、キシロースで誘導したサンプルには、セルラーゼ活性を有する組換えタンパク質が発現していることが確認された。また、(b)濃縮酵素液では、セルロースが分解されて生成した還元糖の量が多かった。この結果からもキシロースで誘導したサンプルにはセルラーゼ活性を有する組換えタンパク質が発現していることが確認された。
【配列表】
2009165399000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月1日(2008.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
したがって、本発明に係る形質転換体、特にバチルス・メガテリウムを宿主として用いた形質転換体は、培地中のセルロースを、より低分子量の分解生成物に分解することが可能となる。このようにして生成した分解生成物を用いれば、より容易にグルコースを生成することが可能となるため、ＰＨＢを安価に生産させることが可能となる。このような形質転換体としては、２００７年１２月１４日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、識別の表示ＢｍＷＨ３２０／ｐＭＭｃｅｎＢ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４６６として寄託され、受託されたものを好適に用いることができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
（３）pMM1525CenBのBacillus megateriumへの導入
まず、Bacillus megaterium（バチルス・メガテリウム、以下、「B. megaterium」）WH320株を用意し、これを細胞懸濁液１ｍＬあたり２ｍｇのリゾチーム（和光純薬社製）で処理し、これのプロトプラストを作製した。
そして、E. coli JM109/pMM1525CenBから調製したpMM1525CenBを１μｇ用いて形質転換することにより、B. megateriumに導入して形質転換体を作製した。以下、この形質転換体をB. megaterium/pMM1525CenBと呼ぶ。なお、このようにして作製した形質転換体は、２００７年１２月１４日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、識別の表示ＢｍＷＨ３２０／ｐＭＭｃｅｎＢ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４６６として寄託され、受託されている。