(57)【要約】【課題】免疫賦活作用及び／又はアレルギー抑制作用を有し、且つ胃液耐性を有する新規乳酸菌を提供する。【解決手段】免疫賦活作用及び／又はアレルギー抑制作用を有し、且つ胃液耐性を有するラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌並びに該乳酸菌又はその培養物を含有する飲食品又は医薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫賦活作用及び／又はアレルギー抑制作用を有し、且つ胃液耐性を有するラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌。
【請求項２】
１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列が配列番号１に記載のラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）である請求項１記載の乳酸菌。
【請求項３】
ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌がラクトバチルス  ブレビスNC-4株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２９６）である請求項２記載の乳酸菌。
【請求項４】
請求項１ないし３の何れか１項に記載の乳酸菌又はその培養物を含有する飲食品又は医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活作用及び／又はアレルギー抑制作用を有し、且つ胃液耐性を有する新規乳酸菌並びに該乳酸菌又はその培養物を含有する飲食品又は医薬に関するものであり、詳細には、免疫賦活作用及び／又は抗アレルギー作用を有し、且つ胃液耐性を有するラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌並びに該乳酸菌又はその培養物を含有する飲食品又は医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、古来より、チーズ、ヨーグルト、発酵バター等の乳製品や発酵ソーセージ、発酵サラミ等の畜肉製品を製造する際にスターターとして使用されている微生物であり、最近では、パンのスターターや飼料用サイレージのスターターとしても利用されている。また、味噌、醤油、漬物等の熟成工程においても、乳酸菌は重要な役割を果していることが知られている。さらに、近年において、乳酸菌、特にヨーグルト等の乳製品に含まれる乳酸菌が種々の生理効果を有することが明らかにされてきており、該乳酸菌の菌体自体や乳酸菌の培養物等を健康食品や医薬品等の素材として利用するようになってきている。しかし、乳製品以外に含まれる乳酸菌については、その生理効果が明らかにされていないものが未だ多数存在する。
また、乳酸菌の中には、生きたまま腸内に到達できる乳酸菌、いわゆる「腸内乳酸菌」が存在するが、これらは腸内において有益な生理活性物質を産生するため非常に有用なものと考えられる。生きたまま腸内に到達できる乳酸菌としては、ビフィズス菌（ビフィドバクテリウム属に属する乳酸菌）やラクトバチルス属に属する乳酸菌が知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、免疫賦活作用及び／又はアレルギー抑制作用を有し、且つ胃液耐性を有する新規乳酸菌並びに該乳酸菌又はその培養物を含有する飲食品又は医薬の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌において、免疫賦活作用及び／又はアレルギー抑制作用を有し、且つ胃液耐性を有する乳酸菌株を見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
即ち、本発明は、
１．免疫賦活作用及び／又はアレルギー抑制作用を有し、且つ胃液耐性を有するラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌、
２．１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列が配列番号１に記載のラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）である前記１．記載の乳酸菌、
３．ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌がラクトバチルス  ブレビスNC-4株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２９６）である前記２．記載の乳酸菌、
４．前記１．ないし３．の何れか１つに記載の乳酸菌の培養物を含有する飲食品又は医薬、に関するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の新規乳酸菌は、胃液耐性を有するため、生きたまま腸内に到達することが可能と考えられ、また、該乳酸菌は、高い免疫賦活活性及びアレルギー抑制効果を示すため、該乳酸菌を摂取することにより、高い免疫賦活活性及びアレルギー抑制効果を期待することができる。これにより、本発明の乳酸菌又はその培養物を含有することにより、高い免疫賦活活性及びアレルギー抑制効果が期待できる飲食品又は医薬を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の新規乳酸菌は、免疫賦活作用及び／又はアレルギー抑制作用を有し、且つ胃液耐性を有するラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌である。
【０００８】
前記ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌としては、好ましくは、１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列が配列番号１に記載されたラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）である乳酸菌が挙げられ、また、ラクトバチルス  ブレビスNC-4株である乳酸菌が挙げられる。
尚、ラクトバチルス  ブレビスNC-4株は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２９６である。
また、ラクトバチルス  ブレビスNC-4株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列は、配列番号１に記載した。
【０００９】
以下にラクトバチルス  ブレビスNC-4株の菌学的性質を示す。
細胞形態                        桿菌
芽胞                            形成せず
グラム染色性                    陽性
運動性                          非運動性
カタラーゼ反応                  陰性
15℃での生育                    生育良好
45℃での生育                    生育せず
グルコースからのガス生成        陽性
初発ｐＨ                        ｐＨ６で増殖可能
糖の資化性（陽性：＋、陰性：−、弱陽性：w）（30℃、３日間培養）
mannitol              （−）            mannose               （−）
lactose               （ｗ）            fructose              （＋）
cellobiose            （−）            melibiose             （＋）
melezitose            （−）            raffinose             （ｗ）
maltose               （＋）            glucose               （＋）
sorbitol              （−）            D-ribose              （＋）
trehalose             （−）            D-xylose              （ｗ）
galactose             （ｗ）            rhamnose              （−）
salicin               （−）            L-arabinose           （＋）
sucrose               （ｗ）            gluconate             （−）
esculin               （ｗ）            amygdalin             （−）
ラクトバチルス  ブレビスNC-4株の形態を示す写真を図１に示した。
【００１０】
本発明のラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌は、胃液耐性を有するものであり、従って、生きたまま腸に到達することができると考えられる。
【００１１】
また、本発明のラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉ
ｓ）に属する乳酸菌の培養物は、マウス脾臓細胞を用いたin vitro実験系においてＣＤ６９分子の発現促進（ＣＤ６９陽性細胞の割合の増加）効果、ＩＮＦ−γの産生促進効果、ＩＬ−１２の産生促進効果、また、ＩＬ−４の産生抑制効果を示した。
【００１２】
ＣＤ６９分子は、免疫細胞表面における活性化マーカーであり、従って、ＣＤ６９分子の発現が促進（ＣＤ６９陽性細胞の割合の増加）されると、免疫が賦活されることになる。
ＩＮＦ−γは、免疫系を活性化して抗ウイルス活性を奏する生理活性物質であり、従って、ＩＮＦ−γの産生が促進されると免疫系が活性化されることになる。
また細胞性免疫を活性化するＴｈ１細胞への分化にも関与する。
ＩＬ−１２は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化と細胞性免疫の活性化を介して、非特異的な免疫と抗原特異的な細胞免疫の両方を賦活化するサイトカインであり、従って、ＩＬ−１２の産生が促進されると細胞性免疫が活性化され、またそれを介して非特異的な免疫と抗原特異的な細胞免疫の両方が賦活化されることになる。
ＩＬ−４はアレルギー反応に係るサイトカインであり、アレルギー反応を活性化する作用を有し、また、アレルギー反応に係るＴ細胞であるＴｈ２細胞の分化の際にも関与する。従って、ＩＬ−４の産生を抑制することにより、アレルギー反応が抑制されることになる。
以上のことより、本発明の前記乳酸菌の培養物は優れた免疫賦活作用及び／又はアレルギー抑制作用を奏することができる。
上記の効果は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１優位にすることを可能にすると考えられる。
【００１３】
本発明の前記乳酸菌は、胃液耐性を有するものであり、従って、生きたまま腸に到達することができると考えられるため、前記乳酸菌を摂取することにより、高い免疫賦活活性及びアレルギー抑制効果を期待することができる。これにより、本発明の乳酸菌又はその培養物を含有することにより、高い免疫賦活活性及びアレルギー抑制効果が期待できる飲食品又は医薬を提供することができる。
【００１４】
本発明は前記乳酸菌又はその培養物を含有する飲食品又は医薬にも関する。例えば、飲食品に用いる場合には、免疫賦活作用及び／又はアレルギー抑制作用を有する健康食品として実施することが好適である。また、公知の甘味料、酸味料、ビタミン等の各種成分と混合してユーザーの嗜好に合う製品とすればよい。例えば、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、ヨーグルト等の乳製品、調味料、加工食品、発酵食品、デザート類、菓子等の形態で提供することが可能である。
【００１５】
また、医薬に用いる場合には、主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用する公知の補助剤を用いて製剤化することができる。剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、座剤、注射剤等を挙げることができ、特に限定されるものではない。本医薬品の投与経路としては、例えば、経口投与、直腸投与、経腸投与等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明の前記乳酸菌の培養条件は、乳酸菌の培養を行うための通常の条件を用いて行うことができる。
培地中には、乳酸菌の生育を促すための栄養源を添加することができ、例えば、脱脂粉乳を添加するのが好ましい。
脱脂粉乳等を添加する場合、その添加量は、質量割合で、５ないし１５％、好ましくは７．５ないし１２．５％、また、例えば、１０％である。
【実施例】
【００１７】
以下に示す実施例において、本発明を具体的且つ更に詳細に説明する。下記実施例は本発明の説明のためのみのものであり、これらの実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
尚、本実施例中で使用する“ＮＣ−１”はワイセラ  シバリアNC-1株（１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号２に記載した。）を意味し、“ＮＣ−２”はラクトバチルス  エスピーNC-2株（１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号３に記載した。）を意味し、“ＮＣ−３”はワイセラ  シバリアNC-3株（１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号４に記載した。）を意味し、“ＮＣ−４”はラクトバチルス  ブレビスNC-4株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２９６：１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号１に記載した。）を意味し、“ＮＳＢＣ４０１７”はペディオコッカス  ペントサセウスNSBC4017株を意味し、“ＫＷ  ３１１０Ｍ”はラクトバチルス  パラカゼイKW3110M株を
意味し、“ＥＣ−１２”はエンテロコッカス  フェカリスEC-12株を意味し、“ＫＢ−２
９０”はラクトバチルス  ブレビスKB-290株を意味し、Ｃｏｎｔ．はコントロール（対照）を意味する。
尚、ＮＣ−１、ＮＣ−２及びＮＣ−３は、いずれもキムチから分離された乳酸菌である。
【００１８】
実施例１
本発明の新規乳酸菌及び上記に挙げた他の乳酸菌の免疫賦活効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調べた。免疫賦活効果は、試験に使用した各乳酸菌の死菌体を用い、マウス脾臓細胞中におけるＣＤ６９陽性細胞の割合、培養上清におけるＩＮＦ−γの濃度の測定及び培養上清におけるＩＬ−１２の濃度の測定により判断した。
細胞培養用９６穴プレートに５×１０5個／穴のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞を入れ
、各乳酸菌の培養物を濃度１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬになるように添加した。細胞培養液の総量は２５０μＬ／穴とした。
細胞培養を開始してから３日後に細胞を回収し、フローサイトメーターを使用して免疫細胞の活性化マーカーであるＣＤ６９の発現上昇の程度を確認した。
各乳酸菌における結果を図２に示した。
また、各乳酸菌の培養上清におけるＩＮＦ−γの濃度を図３に示し、また、各乳酸菌の培養上清におけるＩＬ−１２の濃度を図４に示した。
【００１９】
実施例２
各乳酸菌におけるアレルギー抑制効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験で検討した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にＯｖａｌｂｕｍｉｎ  １ｍｇ／匹を含むＡｌｕｍ  ａｊｕｖａｎｔ
２ｍｇ／匹を１５０μＬ／匹に調整し、ｄａｙ０とｄａｙ６の計２回接種した。その後ｄａｙ１３にマウスを解剖し、脾臓を採取した。調製した脾臓細胞を細胞培養用９６穴プレートに５×１０5個／穴入れ、各乳酸菌の培養物を濃度１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ
及び１００μｇ／ｍＬになるように添加した。細胞培養液の総量は２５０μＬ／穴とした。培養開始から１週間後に培養上清を回収し、上清中のＩＮＦ−γ濃度及びＩＬ−４濃度を測定した。
各乳酸菌の培養上清におけるＩＮＦ−γの濃度を図５に示し、また、各乳酸菌の培養上清におけるＩＬ−４の濃度を図６に示した。
【００２０】
実施例３
ＮＣ−１（ワイセラ  シバリアNC-1株）、ＮＣ−２（ラクトバチルス  エスピーNC-2株）、ＮＣ−３（ワイセラ  シバリアNC-3株）及びＮＣ−４（ラクトバチルス  ブレビスNC-4株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２９６））の胃液耐性をｐＨ２．５の人工胃液を用いて評価した。
試験は、各人工胃液中の各処理時間（１時間、２時間、３時間）における各乳酸菌の生
存率（％）の変化として測定した。
人工胃液処理後の各乳酸菌の生存率（％）を図７に示した。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ラクトバチルス  ブレビスNC-4株の形態を示す写真である。
【図２】実施例１で行った、各乳酸菌におけるＣＤ６９陽性細胞の割合を比較したグラフである。
【図３】実施例１で行った、各乳酸菌の培養上清におけるＩＮＦ−γの濃度を比較したグラフである。
【図４】実施例１で行った、各乳酸菌の培養上清におけるＩＬ−１２の濃度を比較したグラフである。
【図５】実施例２で行った、各乳酸菌の培養上清におけるＩＮＦ−γの濃度を比較したグラフである。
【図６】実施例２で行った、各乳酸菌の培養上清におけるＩＬ−４の濃度を比較したグラフである。
【図７】実施例３で行った、人工胃液処理後の各乳酸菌の生存率（％）の経時変化を示すグラフである。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【配列表】
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