(57)【要約】    【課題】  美白化粧料に用いることができ、メラニン生成抑制効果に優れ、かつ安全性及び安定性の高いメラニン生成抑制剤を提供すること。    【解決手段】  コーンファイバー及び／又はコーンコブに由来し、分子中にウロン酸残基を有する酸性オリゴ糖を有効成分とするメラニン生成抑制剤。酸性オリゴ糖の平均重合度が３．０〜１０．０であり、かつウロン酸以外の構成単糖のうち、キシロースの占める割合が７０質量％〜９５質量％であることが好ましい。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーンファイバー及び／又はコーンコブに由来し、分子中にウロン酸残基を有する酸性オリゴ糖を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
【請求項２】
前記酸性オリゴ糖の平均重合度が３．０〜１０．０であり、かつウロン酸以外の構成単糖のうち、キシロースの占める割合が７０質量％〜９５質量％であることを特徴とする請求項１に記載のメラニン生成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品及び医薬部外品分野に於いて使用される新規なメラニン生成抑制剤に関する。より詳細には、優れた生理活性を有し、しかも安全性の高いメラニン生成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
しみ・そばかす及び日焼け後の肌への色素沈着は、加齢に伴い発生、増加、或いは消失しにくくなり、中高年齢層にとって悩みとなっている。これらの色素沈着症の発生機構は未だ解明されていないが、太陽光線、特に紫外線やメラノサイト刺激ホルモン等の作用により表皮メラノサイトのメラニン合成機構が亢進する為と考えられている。
【０００３】
また、表皮角化細胞（ケラチノサイト）の加齢に伴う角化遅延もメラニンの表皮外への排泄速度を遅延させ、メラニン合成能の亢進と合わせて、表皮内のメラニン顆粒密度の増加、即ち臨床的に色素沈着が増加する症状を発現させるものと考えられている。更に、それらの色素沈着部は局部的に存在し、周囲の正常皮膚部と明らかな差異を生ずることもある。
【０００４】
この為、上記の後天的な色素沈着部を正常な皮膚色にまで回復させる薬剤や、色素沈着を予防する薬剤（美白剤）が強く望まれており、これまでにもアスコルビン酸、グルタチオン、コロイドイオウ等が開発され、美白剤の有効成分として商品化されてきた。また、種々の薬用植物抽出物や海草抽出物、植物由来の没食子酸、ゲラニイン等を用いた例もある。近年は、コウジ酸及びその誘導体（特許文献１）やグルコピラノシド誘導体であるアルブチン等（特許文献２）も美白剤成分として使用されている。かかる美白剤成分としては、メラニン生成を触媒するチロシナーゼの活性を阻害するチロシナーゼ活性阻害剤、チロシンからドーパ、ドーパキノン、ドーパクロムを経てメラニンを生成する過程の一部又は全部を阻害するメラニン生合成阻害剤、メラニンの代謝を正常化するメラニン排泄促進剤等が知られている。
【０００５】
しかしながら、アスコルビン酸は酸化されやすく不安定であり、グルタチオンやコロイドイオウは特有の異臭や沈殿を生じるという欠点がある。また、従来の薬用植物抽出物や
海草抽出物は効果が不十分であったり、品質が一定しないという問題点があった。更に、コウジ酸等に於いても高濃度では安全性に問題があり、また、その安定性の維持等にも配慮しなければならなかった。その他にも、運用により副作用を生じるものもあった。
【０００６】
ウロン酸を含有した酸性キシロオリゴ糖にはメラニン生成抑制効果があることが確認されているが（特許文献３）原料となる木材に含まれているヘミセルロース含有量が多いものでも３０％程度と少なく（非特許文献１参照）、生産効率が悪いという欠点があった。またリグノセルロース材料より酸性キシロオリゴ糖を得る場合、オリゴ糖はリグニンとの複合体として得られるため酸加水分解処理によりリグニンを分離除去する必要があった。
【０００７】
【特許文献１】特公平６−５５７４７号公報
【特許文献２】特公昭６０−１６９０６号公報
【特許文献３】特許第３７７２７４９号公報
【非特許文献１】船岡正光  木質系有機資源の新展開 （シーエムシー出版）２００５年、p１８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明に於いては、メラニン生成抑制効果に優れ、かつ安全性及び安定性の高いメラニン生成抑制剤を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決する為、培養メラニン産生細胞に於けるメラニン生成を指標として、メラニン生成抑制剤のスクリーニングを行った。その結果、下記の本発明に到達した。
【００１０】
本発明は以下の構成を採用する。即ち、本発明の第１は、コーンファイバー及び／又はコーンコブに由来し、分子中にウロン酸残基を有する酸性オリゴ糖を有効成分とするメラニン生成抑制剤である。
【００１１】
本発明の第２は、前記第１発明において、酸性オリゴ糖の平均重合度が３．０〜１０．０であり、かつウロン酸以外の構成単糖のうち、キシロースの占める割合が７０質量％〜９５質量％であることを特徴とするメラニン生成抑制剤である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、生産性、安全性及び安定性に優れ、美白化粧料に使用し得るメラニン生成抑制剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で使用するオリゴ糖は、コーンファイバー及び／又はコーンコブに由来し、その構成成分としてはキシロースを主体とし、アラビノース、ガラクトース、グルコース、マンノースなどの単糖類も含むものある。また本発明で使用する酸性オリゴ糖とは、オリゴ糖１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を有するものを言う。
本発明で使用する酸性オリゴ糖とは、オリゴ糖１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を有するものを言う。またオリゴ糖を構成する糖の重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であっても良い。一般的には、天然物から製造するために、このような組成物として得られることが多く、以下、主として酸性オリゴ糖組成物について説明する。
【００１４】
該酸性オリゴ糖組成物は、平均重合度（オリゴ糖の鎖長の平均値）で、３．０〜１０．０が好ましく、オリゴ糖鎖長の上限と下限との差は２０以下が好ましい。中でも特に美白効果が高いため平均重合度が３．０〜５．０で、オリゴ糖鎖長の上限と下限との差が３．０以下のものがより好ましい。本発明のコーンファイバー及び／又はコーンコブから酸性オリゴ糖を有効成分とするメラニン生成抑制剤を製造する方法によれば、酵素処理を利用しなくても、低い重合度のもので、差長の上限と下限の差が小さく、かつ、キシロース以外の微量単糖成分を有するオリゴ糖が得られ、これまでに知られているオリゴ糖系のメラニン生成抑制剤に比較してその効果が高いものが得られる。
【００１５】
ウロン酸は天然では、ペクチン、ペクチン酸、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸等の種々の生理活性を持つ多糖の構成成分として知られている。本発明におけるウロン酸としては特に限定されないが、グルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル-グルクロン酸が好ましい。また該組成物のウロン酸以外の構成単糖のうち、キシロースの占める割合は７０質量％〜９５質量％であり、残りの構成糖はアラビノース、ガラクトース、グルコース、マンノースからなる。
【００１６】
本発明はコーンファイバー及び／又はコーンコブを原料とする点に特徴があり、上記のような酸性オリゴ糖組成物を得ることが出来れば、その製法は特に限定されないが、コーンファイバー及び／又はコーンコブを物理化学的に分解処理する方法が好ましい。以下にその概要を示す。
【００１７】
本発明において用いるコーンファイバー及び／又はコーンコブはコーンスターチ製造時の副産物であり、安価に入手できる上に酸性オリゴ糖含有量が高いため好適に用いられる。
コーンファイバーはとうもろこしの外皮を剥く際に出た外皮そのもので使用できるし、更に粉砕してから水に分散してスラリーにしても良い。コーンコブは通常、乾式でペレット状に粉砕したものをそのまま水に分散してスラリーとして使用するが、必要に応じて、更に微粉砕してから水に分散してスラリーにしても良い。
【００１８】
酸性オリゴ糖の抽出効率を高める為に、加熱抽出前に糖質分解酵素やセルラーゼを用いてあらかじめコーンファイバーやコーンコブのセルロースやデンプン等を加水分解して前処理しておくと良い。糖質分解酵素としては、食品添加物として一般的に用いられているものなら特に限定はされない。例えば、液化酵素 T、リクィファーゼ L45、フクタミラーゼ 50、フクタミラーゼ10L、液化酵素 6T、オリエンターゼ AO10、オリエンターゼ AOG、プライマーゼ LC、プライマーゼ HT、ハイマルトシン G、ハイマルトシン GL、グルターゼ 6000、グルターゼ AN（以上、HBI社製）、スタラーゼ F（キッコーマン社製）、スペザイム  AA、ピュラスター  OｘAm、オプチサイズ  FLEX、オプチマルト  BBA、オプチデックス  L、オプチマックス  4060VHP、トランスグルコシダーゼL-500（以上、ジェネンコア共和社製）、ソフターゲン 3H、ソフターゲン3、ソフターゲン7（以上、タイショーテクノス社製）、グリンドアミルAG、グリンドアミルS、グリンドアミルXV、グリンドアミルEB77、グリンドアミルFD、グリンドアミルMAX-LIFE、グリンドアミルA（以上、ダニスコ  カルタージャパン社製）、ビオテックス L#3000、ビオテックス TS、スピターゼ HS.、スピターゼ CP-40FG、スピターゼ XP-404、β-アミラーゼ #1500、β-アミラーゼ L、β-アミラーゼ #1500S、XL-4、グルコチーム #20000、長瀬酵素剤 T-50、ビオプラーゼ 3LAP、ビオプラーゼ APS、ビオプラーゼ AP（以上、ナガセケムテックス社製）、BAN、ファンガミル、ターマミル、バイオフィードアルファ、ノバミル、マルトゲナーゼ、ステインザイム、アクアザイム、サーモザイム、デュラミル、AMG、サンスーパー、プロモザイム、デキストロザイム、トルザイム、ファンガミルスーパー、セレミックス、デキストラナーゼ（以上、ノボザイムズ社製）、ユニアーゼ BM-8、ユニアーゼ L、ユニアーゼ K, 2K、ユニアーゼ 30、ユニアーゼ 60F、ユニアーゼ S（以上、ヤクルト薬品工業社製）、GODO-GBA、GODO-ANG（以上、合同酒精社製）コクラーゼ、コクラーゼ・G2、コクラーゼ・M、デキストラナーゼ2F（以上、三共ライフテック社製）、スミチーム L、スミチーム A-10、スミチーム AS、スミチーム、スミチーム SG、スミチームＳ、スミチームAS（以上、新日本化学工業社製）、クライスターゼ、クライスターゼT、コクゲン、コクゲンT、ネオマルツ、ネオマルツH、ビオクライスターゼ、ビオクライスターゼT、クライスターゼY、クライスターゼＰＬＦ（以上、大和化成社製）、ビオザイム F10SD、アミラーゼ Ｓ「アマノ」35Ｇ、ビオザイムＡ 、ビオザイム L 、グルクSG、グルクザイムAF6、グルクザイムNL4.2、酒造用グルコアミラーゼ「アマノ」SD、プルラナーゼ「アマノ」3、グルクSBG、AMT 1.2L、トランスグルコシダーゼ L「アマノ」、コンチザイム、アミラーゼAY「アマノ」2、デキストラナーゼ L「アマノ」（以上、天野エンザイム社製）、ベイクザイム P500、ベイクザイム AN301、ベイクザイム AG800、ベイクザイム H1000（以上、日本シイベルヘグナー社製）、VERON AX、VERON GX、VERON M4、VERON ESL（以上、樋口商会社製）、ラタターゼ  SR、ラクトーゼRCS、SVA、マグナックスJW-121、マグナックスJW-201、マグナックスJW-101（以上、洛東化成工業社製）等が挙げられる。
【００１９】
セルラーゼとしては、食品添加物として一般的に用いられているものなら特に限定はされない。セルラーゼでは、例えばセルロシン AC40、セルロシン AL、セルロシン T2（以上、HBI社製）、キタラーゼ（ケイアイ化成社製）、スペザイム  CP、GC220、マルチフェクト  CL、マルチフェクト  BGL、β−グルカナーゼ  750L（以上、ジェネンコア協和社製）、ソフィターゲンC-1（タイショーテクノス社製）、セルラーゼ XL-531、セルチーム C（以上、ナガセケムテックス社製）、ウルトラフロ、ビスコザイム、フィニザイム、グルカネックス、バイオフォードプラス、エネルジェックス、セルクラスト（以上、ノボザイムズ社製）、セルラーゼ”オノズカ”3S、セルラーゼY-NC、パンセラーゼ BR（以上、ヤクルト薬品工業社製）、スミチームAC、スミチームC（以上、新日本化学工業社製）、ツニカーゼ（大和化成社製）、セルラーゼ A「アマノ」3、セルラーゼ T「アマノ」4、YL-NL「アマノ」（以上、天野エンザイム社製）、ベイクザイム XE（日本シイベルヘグナー社製）、エンチロンMCH、フェドラーゼ（以上、洛東化成工業社製）等が挙げられる。
【００２０】
また、上記の前処理とは別に、熱水抽出の前または後にヘミセルラーゼによる酵素処理を行い、酸性オリゴ糖の収率を上げることが可能である。
ヘミセルラーゼとしては、例えばセルロシン HC100、セルロシン HC、セルロシン TP25、セルロシン B、ヘミセルラーゼM（以上、HBI社製）、マルチフェクト720（ジェネンコア協和社製）、グリンドアミルH（ダニスコ  カルタージャパン社製）、ペントパン、ペントパンモノ、パルプザイム、シーアザイム（以上、ノボザイムズ社製）、スミチーム X（新日本化学工業社製）、ヘミセルラーゼ「アマノ」90（天野エンザイム社製）、ベイクザイム HS2000、ベイクザイム l Conc（以上、日本シイベルヘグナー社製）、VERON 191、VERON 393、Xylanase Conc（以上、樋口商会社製）、エンチロンLQ（洛東化成工業社製）等が挙げられる。
【００２１】
コーンファイバー及び／又はコーンコブの酵素処理方法、としては、酵素の至適pH付近に調整したコーンファイバー及び／又はコーンコブの水性スラリーに、酵素を添加することによって行う。pHの調整は、先に述べた酸もしくはアルカリを用いて行えばよい。酵素反応時のスラリー濃度としては、1〜30%が好ましく、5〜10%がより好ましい。
熱水抽出液をヘミセルラーゼ処理する場合も同様で、酵素の至適pH付近に調整した抽出液に、酵素を添加することによって行う。pHの調整は、先に述べた酸もしくはアルカリを用いて行えばよい。
【００２２】
上記のように必要に応じて前処理を施したコーンファイバー及び／又はコーンコブから酸性オリゴ糖を熱水抽出する際の温度は、50℃以上であればよいが、好ましくは100℃の沸騰水中での抽出、より好ましくは加圧条件下で100℃以上に過熱することが好ましい。圧力としては0.1〜0.5MPaの範囲が好ましい。
抽出方法としては、過熱水又は過熱水蒸気を用いる方法が好ましく、回分式と連続式の何れの装置で行うこともできる。過熱水を用いる方法の具体的な例としては、コーンファイバー及び／又はコーンコブの水性スラリーを耐圧容器に入れて間接加熱によって過熱水とする方法、又はジェットクッカーのように連続的に過熱水処理できる装置を利用する方法などが挙げられる。一方、過熱水蒸気を用いる方法の具体的な例としては、コーンファイバー及び／又はコーンコブのスラリーを耐圧容器に入れて過熱水蒸気を導入する方法、又は連続式の蒸煮装置や蒸解装置を利用する方法などが挙げられる。尚、抽出に供するコーンファイバー及び／又はコーンコブのスラリー濃度は、1〜30%程度であればよいが、5〜20％の濃度が生産効率や、作業効率の点から好ましい。またスラリー濃度が30％以上であると、得られるオリゴ糖の平均重合度が高くなり、好ましくない。加熱時間は加熱温度によって最適な条件を適宜選択すればよい。100℃で抽出する場合は30分以上が好ましい。加圧条件下で抽出する場合は15分以上が好ましい。また、加熱処理中に攪拌機などを用いて攪拌しながら抽出を行うことで、抽出効率を高め、加熱時間を短縮することが出来る。
【００２３】
熱水抽出時にpHを酸性側もしくはアルカリ側に調整することで抽出効率を高めることが出来る。酸性側では、pH0.5〜4.0が好ましく、pH1.0〜3.5がより好ましい。アルカリ側ではpH9.0〜13.0が好ましく、pH10.0〜11.0がより好ましい。pH調整に用いる酸としては、酢酸、塩酸、硫酸、リン酸、シュウ酸等、食品添加物として食品製造に一般的に用いられている酸であれば良い。pH調整に用いるアルカリとしては、重曹や苛性ソーダなど、食品添加物として食品製造に一般的に用いられているアルカリであれば良い。
前記した温度およびｐＨの組み合わせとして、温度110〜130℃、ｐＨ1.0〜3.5の範囲にすれば、得られるオリゴ糖の構成糖としてキシロースの割合が多くなる。酸性キシロオリゴ糖の整理活性作用が最近研究されており、この点で、上記範囲が好ましい。全糖中の構成糖を分析した時のキシロース含有量で言うと50質量％が好ましく、特に70〜95質量％が好ましい。
【００２４】
熱水抽出処理後は、まず抽出液と固形分を分離する固液分離処理が必要である。
固液分離には、濾過、遠心分離、湿式分級などの一般的な方法を採用することができる。その後、必要に応じて加水、pH調製を行い、酸性キシロオリゴ糖を含む糖液を得る。
前記した、熱水抽出後のヘミセルラーゼ処理を行う場合は、熱水抽出後の抽出液にヘミセルラーゼを添加して酵素処理しても良いし、固液分離後の糖液中に対してヘミセルラーゼ処理を行っても良い。
【００２５】
本発明の酸性オリゴ糖の製造方法は、酸性オリゴ糖を含む糖液をイオン交換処理することを特徴の一つとする。酸性オリゴ糖を含む糖液をイオン交換処理することにより、酸性オリゴ糖のみを得ることができる。
本発明において、オリゴ糖は、次のようにして得ることができる。すなわち、酸性オリゴ糖を含む糖液を陰イオン交換樹脂が装填されたカラムに通液して、陰イオン交換樹脂に糖液中の酸性オリゴ糖を吸着させる。次いで、酸性オリゴ糖が吸着した陰イオン交換樹脂に塩溶液又はアルコールを通液して、陰イオン交換樹脂に吸着した酸性オリゴ糖を塩溶液又はアルコールに溶出させる。このようにして得られた溶出液には、酸性オリゴ糖のみが含まれる。
【００２６】
陰イオン交換樹脂としては、強塩基性陰イオン交換樹脂又は弱塩基性陰イオン交換樹脂のいずれも用いることができる。強塩基性陰イオン交換樹脂としては、例えば、アンバーライトＩＲＡ４１０Ｊ  ＣＬ、アンバーライトＩＲＡ４１１  ＣＬ若しくはアンバーライト９１０ＣＴ  ＣＬ（以上、オルガノ（株）社製）又はダイヤイオンＳＡ１０Ａ、ダイヤイオンＮＳＡ１００、ダイヤイオンＰＡ３０８、ダイヤイオンＰＡ４０８若しくはダイヤイオンＨＰＡ２５（以上、三菱化学（株）社製）を挙げることができる。弱塩基性陰イオン交換樹脂としては、例えば、アンバーライトＩＲＡ６７、アンバーライトＩＲＡ９６ＳＢ、アンバーライトＸＴ６０５０ＲＦ若しくはアンバーライトＸＥ５８３（以上、オルガノ（株）社製）又はダイヤイオンＷＡ１０、ダイヤイオンＷＡ２０、ダイヤイオンＷＡ２１Ｊ若しくはダイヤイオンＷＡ３０（以上、三菱化学（株）社製）等を挙げることができる。
【００２７】
陰イオン交換樹脂に吸着した酸性オリゴ糖を回収する際に用いられる塩溶液及びアルコールとしては、塩化ナトリウム水溶液又はエタノールを挙げることができる。塩化ナトリウム水溶液の濃度としては、特に制限はないが、50〜100mMであるのが好ましい。
【００２８】
陰イオン交換樹脂に酸性オリゴ糖を含む糖液を通液する際の通液速度としては、2.0〜5.0ml/min.であるのが好ましい。
【００２９】
粉末状の酸性オリゴ糖を得たい場合には、陰イオン交換樹脂に塩溶液又はアルコールを通液して得られた溶出液をスプレードライ処理又は凍結乾燥処理等をすることができる。
【００３０】
得られた酸性オリゴ糖を含む糖液は、必要に応じて脱色、脱塩、分画、精製、濃縮、乾燥などの操作を施す。
【００３１】
コーンファイバー及び／又はコーンコブを原料とした酸性オリゴ糖組成物の上記製造法のメリットは、経済性とオリゴ糖の平均重合度の高い酸性オリゴ糖組成物が容易に得られる点にある。平均重合度は、例えば、希酸処理条件を調節するか、再度ヘミセルラーゼで処理することによって変えることが可能である。また、弱陰イオン交換樹脂溶出時に用いる溶出液の塩濃度を変化させることによって、１分子あたりに結合するウロン酸残基の数が異なる酸性オリゴ糖組成物を得ることもできる。さらに、適当なキシラナーゼ、ヘミセルラーゼを作用させることによってウロン酸結合部位が末端に限定された酸性オリゴ糖組成物を得ることも可能である。
【００３２】
このようにして得られた酸性オリゴ糖組成物は、エタノール、プロパノール及びイソプロパノール等の低級アルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール及びグリセリン等の多価アルコール、希酸、希アルカリの水溶液等に溶解して美白剤基材に含有させる。或いは、アルコール、エステル等を含有する基材成分に直接添加、溶解して含有させることもできる。また、マイクロカプセル化やリポソームに内含させて添加してもよい。
【００３３】
本発明のメラニン生成抑制剤を配合した美白化粧料を作成する場合、メラニン生成抑制剤の配合量は、美白効果を得るため、０．００１〜２０％（以下全て質量％）の濃度範囲とすることが望ましい。配合量が０．００１％未満であると十分な効果が得られない。また、２０％を越えると美白化粧料の安定性等に影響を及ぼすことがある。
【００３４】
本発明の酸性オリゴ糖組成物を配合した美白化粧料は、ローション、乳剤、クリーム、軟膏等の形態をとることが出来る。また更に、柔軟性化粧水、収れん性化粧品、洗浄用化粧水等の化粧水類、エモリエントクリーム、モイスチュアクリーム、クレンジングクリーム、メイクアップクリーム等のクリーム類、エモリエント乳液、モイチュア乳液、ナリシング乳液、クレンジング乳液等の乳液類、ゼリー状パック、ピールオフパック、洗い流しパック、粉末パック等のパック類、美容液及び洗顔料といった種々の製剤形態の美白化粧料とすることが出来る。
【００３５】
本発明に於いては、更に、他の美白剤成分や、保湿剤、抗炎症剤、紫外線吸収剤等、他の有効成分を配合することも出来、日焼け止め化粧料、皮膚保護用化粧料、肌荒れ改善用化粧料等の薬用化粧料或いは医薬部外品等として提供することも出来る。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明について実施例により詳説する。本発明はこれにより限定されるものではない。まず、各測定法の概要、本発明で有効成分として含有させた酸性オリゴ糖組成物ＣＸ３の調製例１を示す。
【００３７】
＜測定法の概要＞
(1) 全糖量の定量：
全糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製し、フェノール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(2) 還元糖量の定量：
還元糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製、ソモジ−ネルソン法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(3) ウロン酸量の定量：
ウロン酸は検量線をＤ−グルクロン酸（和光純薬工業（株）製）を用いて作製、カルバゾール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(4) 平均重合度の決定法：
サンプル糖液を５０℃に保ち１５０００ｒｐｍにて１５分遠心分離し不溶物を除去し上清液の全糖量を還元糖量（共にキシロース換算）で割って平均重合度を求めた。
(5) 酸性オリゴ糖の分析方法：
オリゴ糖鎖の分布はイオンクロマトグラフ（ダイオネクス社製、分析用カラム：Ｃａｒｂｏ  Ｐａｃ  ＰＡ−１０）を用いて分析した。分離溶媒には１００ｍＭ  ＮａＯＨ溶液を用い、溶出溶媒には前述の分離溶媒に酢酸ナトリウムを５００ｍＭとなるように添加し、溶液比で、分離溶媒：溶出溶媒＝１０：０〜４：６となるような直線勾配を組み分離した。得られたクロマトグラムより、キシロース鎖長の上限と下限との差を求めた。また酸性オリゴ糖鎖中のウロン酸を除いた部分の構成単糖の比率は酸性オリゴ糖を硫酸で単糖にまで加水分解した後、イオンクロマトグラフ（ダイオネクス社製、分析用カラム：Ｃａｒｂｏ  Ｐａｃ  ＰＡ−１）を用いて分析した。分離溶媒には水を用い、内部標準法により構成糖の質量比を決定した。
(6) オリゴ糖１分子あたりのウロン酸残基数の決定法
サンプル糖液を５０℃に保ち１５０００ｒｐｍにて１５分遠心分離し不溶物を除去し上清液のウロン酸量（Ｄ−グルクロン酸換算）を還元糖量（キシロース換算）で割ってオリゴ糖１分子あたりのウロン酸残基数を求めた。
(7) 酵素力価の定義：
酵素として用いたキシラナーゼの活性測定にはカバキシラン（シグマ社製）を用いた。酵素力価の定義はキシラナーゼがキシランを分解することで得られる還元糖の還元力をＤＮＳ法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）を用いて測定し、１分間に１マイクロモルのキシロースに相当する還元力を生成させる酵素量を１ユニットとした。
【００３８】
＜酸性オリゴ糖組成物の調製例＞
＜調製例１＞
コーンファイバー２００gに水１８００mlを加え、溶液を希塩酸でpH０．５に調整した。オートクレーブ装置を用いて１２０℃、１００分間加熱した。室温にまで冷却後、遠心分離によって上清を得た。
次に、得られた処理液を濃縮工程、精製工程の順に供した。
濃縮工程では、逆浸透膜（日東電工（株）製、RO NTR-7410）を用いて濃縮液を調製した。
【００３９】
精製工程では、限外濾過・脱色工程、吸着工程の順に供した。限外濾過・脱色工程では、希酸処理溶液を限外濾過膜（オスモニクス社製、分画分子量８０００）を通過させた後、活性炭（和光純薬（株）製）６００ｍｇの添加及びセラミックフィルター濾過により脱色処理液を得た。吸着工程では、脱色処理液を強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＫ２１８）、強陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＡ４０８）、強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＫ２１８）各１００ｇを充填したカラムに順次通過させた後、弱陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＷＡ３０）１００ｇを充填したカラムに供した。この弱陰イオン交換樹脂充填カラムから５０ｍＭ NaCl溶液によって溶出した溶液を凍結乾燥することによって、酸性オリゴ糖組成物の粉末を得た。以下、この酸性オリゴ糖組成物をＣＸ３とする。前述の測定方法により、ＣＸ３は平均重合度３．２、オリゴ糖鎖長の上限と下限との差は２、酸性オリゴ糖１分子あたりウロン酸残基を１つ含む糖組成化合物であった。ウロン酸を除いた構成糖の比率はキシロースが９３％、アラビノースが３％、ガラクトースが４％であった。
【００４０】
次に、得られた酸性オリゴ糖組成物を用いて行ったメラニン生成抑制試験の概要と結果を実施例１に、安全性試験及び安定性試験の概要と結果を実施例２に示す。また、酸性オリゴ糖組成物を含有する美白化粧品（化粧水及び軟膏）の処方と製造法を実施例３及び実施例４に示す。
【００４１】
＜実施例１＞
メラニン生成抑制試験は、マウス由来のメラニン産生細胞であるＢ１６メラノーマ細胞（大日本製薬（株）製）を用いて実施した。以下にその概要を示す。まず、Ｂ１６メラノーマ細胞を培地（ＦＢＳ（大日本製薬（株）製）１０％を含むＭＥＭダルベッコ培地（大日本製薬（株）製）、以下培地と略す）５ｍｌを入れたフラスコに播種し、前培養（ＣＯ２濃度：５％、３７℃、以下培養と略す）した。５日後、常法に従い、トリプシン処理及び遠心分離により細胞を集めた。次に、得られた細胞を、９６ウエルマイクロプレートに１×１０３個／培地１００μｌ／１ウエルになるように播種した。２４時間培養後、サンプルを培地に添加し、培養を継続した。更に４日後、培養上清の４２０ｎｍに於ける吸光度を測定し、下記の計算式によりメラニン生成抑制率を算出した。なお、各サンプルについて同試験を６ウエルずつ実施し、対照としてはコウジ酸（陽性、和光純薬工業（株）製）及び培地（陰性）を用いた。
【００４２】
メラニン生成抑制率（％）＝〔（ａ−ｂ)／ａ〕×１００
ａ：サンプル無添加培養に於ける吸光度、ｂ：サンプル添加培養に於ける吸光度
【００４３】
また、上記の各ウエルを洗浄、培地交換（１００μｌ）後、アラマーブルー（旭テクノグラス（株）製）を用いた常法に従って、蛍光強度を測定（励起波長：５４４ｎｍ、検出波長：５９０ｎｍ）し、下記の計算式により細胞増殖阻害率を算出した。なお、細胞増殖阻害率は細胞毒性に相当する。
【００４４】
細胞増殖阻害率（％）＝〔（ｃ−ｄ)／ｃ〕×１００
ｃ：試料無添加培養における蛍光強度、ｄ：試料添加培養における蛍光強度
【００４５】
酸性オリゴ糖組成物ＣＸ３のメラニン生成抑制試験の結果を表１に示す（各値は６ウェルの平均値）。
【００４６】
【表１】
2009013084.tif 000002
【００４７】
表１より明らかなように、酸性オリゴ糖組成物ＣＸ３には顕著なメラニン生成抑制効果が認められた。また、何れの濃度でもＣＸ３には細胞毒性はなかったが、コウジ酸の場合は０．１％以上の濃度で強い細胞毒性が認められた。細胞毒性のない濃度範囲に於けるメラニン生成抑制効果を比較すると、ＣＸ３（１％）はコウジ酸（０．０５％）と同等以上の効果があると言える。
【００４８】
＜実施例２＞
安全性試験及び安定性試験は以下のように実施した。酸性オリゴ糖組成物ＣＸ３の２％溶液（５０％エタノール）１００μｌをＣ３Ｈマウス（雄、６週齢、日本チャールズリバー（株）製）の背皮に約１ヶ月間連日塗布した結果、背皮の炎症等の副作用は観察されなかった。また、１ヶ月後の上記ＣＸ３溶液のイオンクロマトグラムに於ける変化は認められなかった。これらのことは、酸性オリゴ糖組成物の高い安全性と安定性を示す。
【００４９】
＜実施例３＞
酸性オリゴ糖組成物ＣＸ３を用いて、メラニン生成抑制作用を付与した下記組成の化粧水を常法にて製造した。
処方：（１）１，３−ブチレングリコール、３．０％  （２）ソルビトール、２．０％  （３）エタノール、１０．０％  （４）カルボキシビニルポリマー１％水溶液、１０．０％  （５）ＣＸ３、１．０％  （６）パラオキシ安息香酸メチル、０．１％  （７）香料、０．１％  （８）精製水、７３．８％
製造法：（６）（７）を（３）に溶解して（８）に加え、（１）（２）（５）を順次添加して混合した後、（４）を加え、混合し、均一化した。
【００５０】
＜実施例４＞
酸性オリゴ糖組成物ＣＸ３を用いて、メラニン生成抑制作用を付与した下記組成の化粧用軟膏を常法にて製造した。
処方：（１）白色ワセリン、２５．０％  （２）ステアリルアルコール、１５．０％  （３）ラウリル硫酸ナトリウム、１．０％  （４）パラオキシ安息香酸ブチル、０．１％  （５）ＣＸ３、１．０％  （６）精製水、５７．９％  
製造法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して、溶解、均一化する。７５℃に加熱した（６）に油相成分を添加して乳化し、冷却後４０℃にて（５）を順次添加、混合、均一化する。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明で得られる酸性オリゴ糖組成物を含有したメラニン生成抑制剤は、強い薬理活性を有しており、化粧品及び医薬部外品の成分として、肌を白くする効果が期待でき、美白化粧料の原料として有用である。またコーンファイバー及び／又はコーンコブを原料として酸性オリゴ糖を製造することにより高い効果と安全性を持ち、なおかつ安価なメラニン生成抑制剤を提供される。