(57)【要約】      （修正有）【課題】金属コロイドを呈色標識物質として用いた免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法において、安価に高感度の測定が行えるようにする。【解決手段】分析対象物質と、該分析対象物質に対して免疫学的に反応する試薬とを反応させて両者の複合体を検出することからなる免疫測定法であって、前記分析対象物質または前記試薬の何れか一方を、パラジウムコロイドに白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で標識しておき、前記複合体を、金属イオンを含有する増感剤溶液と接触させることにより、前記金属コロイド粒子上で前記金属イオンを還元させて金属を析出させて検出するようにしたことを特徴とする免疫測定法が提供される。サンドイッチ法、特にイムノクロマトグラフィー測定法が好ましい。【選択図】図１
2009192270.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物質と、該分析対象物質に対して免疫学的に反応する試薬とを反応させて両者の複合体を検出することからなる免疫測定法であって、前記分析対象物質または前記試薬の何れか一方を、パラジウムコロイドに白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で標識しておき、前記複合体を、金属イオンを含有する増感剤溶液と接触させることにより、前記金属コロイド粒子上で前記金属イオンを還元させて金属を析出させて検出するようにしたことを特徴とする免疫測定法。
【請求項２】
競合法又はサンドイッチ法である、請求項１に記載の免疫測定法。
【請求項３】
前記分析対象物質に対して免疫学的に反応する第一及び第二の試薬を用意し、前記第一の試薬を担体に固定しておき、前記第二の試薬をパラジウムコロイドに白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で標識しておき、前記分析対象物質を前記第一の試薬と第二の試薬との間にサンドイッチするサンドイッチ法により行われる、請求項２に記載の免疫測定法。
【請求項４】
イムノクロマトグラフィー測定法である、請求項２または３に記載の免疫測定法。
【請求項５】
前記金属コロイド粒子は、平均粒径30〜90ナノメートルのパラジウムコロイド粒子の表面に白金コロイドを担持させてなる金属コロイド粒子である請求項１に記載の免疫測定法。
【請求項６】
前記金属イオンは、ニッケル、コバルト及び銅からなる群より選ばれた少なくとも１種のイオンである請求項１に記載の免疫測定法。
【請求項７】
前記増感剤溶液は、硫酸銅と還元剤とを含有する溶液である請求項１に記載の免疫測定法。
【請求項８】
分析対象物質に対して免疫学的に反応する第一及び第二の試薬並びに膜担体を用意し、前記第一の試薬を予め前記膜担体の所定位置に固定せしめて捕捉部位を形成し、前記第二の試薬をパラジウムコロイドに白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で予め標識しておき、該第二の試薬と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる分析対象物質と前記第二の試薬との複合体を前記捕捉部位に捕捉させた後、該捕捉部位を、金属イオンを含有する増感剤溶液と接触させることにより、前記金属コロイド粒子上で前記金属イオンを還元させて金属を析出させて検出するようにしたことを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法。
【請求項９】
前記金属コロイド粒子は、平均粒径30〜90ナノメートルのパラジウムコロイド粒子の表面に白金コロイドを担持させてなる金属コロイド粒子である請求項８に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
【請求項１０】
前記金属イオンは、ニッケル、コバルト及び銅からなる群より選ばれた少なくとも１種のイオンである請求項８に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
【請求項１１】
前記増感剤溶液は、硫酸銅と還元剤とを含有する溶液である請求項８に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
【請求項１２】
分析対象物質に対して免疫学的に反応する第一及び第二の試薬並びに膜担体を少なくとも備え、前記第一の試薬は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の試薬はパラジウムコロイドに白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で予め標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるイムノクロマト法テストキットであって、さらに、金属イオンを含有する増感剤溶液を備え、前記クロマト展開後に該増感剤溶液を前記捕捉部位に接触させることにより、前記金属コロイド粒子上で前記金属イオンを還元させて金属を析出させて検出するようにしたことを特徴とするイムノクロマト法テストキット。
【請求項１３】
前記金属コロイド粒子は、平均粒径30〜90ナノメートルのパラジウムコロイド粒子の表面に白金コロイドを担持させてなる金属コロイド粒子である請求項１２に記載のイムノクロマト法テストキット。
【請求項１４】
前記金属イオンは、ニッケル、コバルト及び銅からなる群より選ばれた少なくとも１種のイオンである請求項１２に記載のイムノクロマト法テストキット。
【請求項１５】
前記増感剤溶液は、硫酸銅と還元剤とを含有する溶液である請求項１２に記載のイムノクロマト法テストキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識物質として金属コロイドを用いた免疫測定法であって、増感剤を用いることにより、従来と同等の感度を有し且つ安価に実施できる測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金コロイド粒子は、従来、免疫測定法における呈色標識物質として知られている。また、金コロイド粒子の表面上で銀イオンを還元させて銀を生成させ、高感度の呈色を生じさせる方法も知られている（特許文献１〜３参照）。
【０００３】
また、金コロイド粒子の表面に白金を担持させてなる複合金属コロイド粒子を免疫測定法における呈色標識物質として使用できることも知られている。また、かかる複合金属コロイド粒子と硫酸銅や３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）などの発色剤を併用することにより、検出感度を向上できることも知られている（特許第３８８６０００号公報）。しかし、金コロイドは高価であり、測定に要するコストが高くなるため、安価に高感度の検出を行える測定法が求められている。
【０００４】
【特許文献１】特開昭６３−２７７９７１号公報
【特許文献２】特開平４−２２０６４２号公報
【特許文献３】特開平７−１２０４７０号公報
【特許文献４】特許第３８８６０００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、金属コロイドを呈色標識物質として用いた免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法において、安価に高感度の測定が行えるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、免疫測定法で呈色標識物質として用いられる金属コロイドとして金属イオンの還元を触媒する特定の金属コロイド粒子を使用し、抗体抗原反応終了後、該金属コロイド粒子に金属イオンを接触させて金属を析出させることにより、従来と同等の感度で安価に検出が行えることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の一局面によれば、分析対象物質と、該分析対象物質に対して免疫学的に反応する試薬とを反応させて両者の複合体を検出することからなる免疫測定法であって、前記分析対象物質または前記試薬の何れか一方を、パラジウムコロイドに白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で標識しておき、前記複合体を、金属イオンを含有する増感剤溶液と接触させることにより、前記金属コロイド粒子上で前記金属イオンを還元させて金属を析出させて検出するようにしたことを特徴とする免疫測定法が提供される。
【０００８】
この検出法における免疫測定法としては、特に限定されるものではなく、競合法でもサンドイッチ法でもよいが、サンドイッチ式法、とりわけＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法、イムノクロマトグラフィー測定法などが好ましい。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の免疫測定法は、前記分析対象物質に対して免疫学的に反応する第一及び第二の試薬を用意し、前記第一の試薬を担体に固定しておき、前記第二の試薬をパラジウムコロイドに白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で標識しておき、前記分析対象物質を前記第一の試薬と第二の試薬との間にサンドイッチするサンドイッチ法に従って実施される。
【００１０】
また、本発明の別の好ましい実施形態によれば、分析対象物質に対して免疫学的に反応する第一及び第二の試薬並びに膜担体を用意し、前記第一の試薬を予め前記膜担体の所定位置に固定せしめて捕捉部位を形成し、前記第二の試薬をパラジウムコロイドに白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で予め標識しておき、該第二の試薬と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる分析対象物質と前記第二の試薬との複合体を前記捕捉部位に捕捉させた後、該捕捉部位を、金属イオンを含有する増感剤溶液と接触させることにより、前記金属コロイド粒子上で前記金属イオンを還元させて金属を析出させて検出するようにしたことを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法が提供される。
【００１１】
また、本発明の別の局面によれば、分析対象物質に対して免疫学的に反応する第一及び第二の試薬並びに膜担体を少なくとも備え、前記第一の試薬は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の試薬はパラジウムコロイドに白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で予め標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるイムノクロマト法テストキットであって、さらに、金属イオンを含有する増感剤溶液を備え、前記クロマト展開後に該増感剤溶液を前記捕捉部位に接触させることにより、前記金属コロイド粒子上で前記金属イオンを還元させて金属を析出させて検出するようにしたことを特徴とするイムノクロマト法テストキットが提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、免疫測定法において、呈色標識物質として金コロイド以外の特定の金属コロイド粒子を使用するとともに、該金属コロイド粒子の触媒作用を利用して増感剤の金属イオンを該金属コロイド粒子上に析出させることとしたので、従来と同等の感度で安価に測定を行うことができる。
また、本発明で使用する金属コロイド粒子は、従来使用されている金属コロイド粒子よりも、金属イオンの還元を触媒する能力に優れ、また、粒径のばらつきの少ない粒子を安定に且つ安価に製造できるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の分析対象物質は、免疫学的に検出できるものであれば特に限定されない。分析対象物質が抗原である場合は、上記試薬として、該分析対象物質に対して特異的に反応する抗体が使用され、分析対象物質が抗体である場合は、上記試薬として、該抗体が特異的に反応する抗原が使用される。上記試薬として用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクローナル抗体とすることが好ましい。
【００１４】
イムノクロマトグラフィー測定法などのサンドイッチ式免疫測定法の場合、そこで使用する第一の試薬及び第二の試薬としては、分析対象物質が抗原である場合は、抗体が使用される。この場合、第一の試薬及び第二の試薬は、それぞれ、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、一般に、少なくとも一方の抗体をモノクローナル抗体とすることが好ましく、両方の抗体をモノクローナル抗体とすることが特に好ましい。
【００１５】
本発明において、分析対象物質及び上記試薬の何れか一方を金属コロイド粒子で標識すればよいが、上記のような第一の試薬及び第二の試薬を用いるイムノクロマトグラフィー測定法などのサンドイッチ式免疫測定法の場合、第一の試薬及び第二の試薬の何れか一方が金属コロイド粒子で標識される。
【００１６】
本発明では、金属コロイド粒子としては、パラジウムコロイドに白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子が用いられる。この複合金属コロイド粒子は、ニッケルイオン、コバルトイオン、銅イオン等の金属イオンの還元を触媒してそれぞれの金属を析出させる能力を有する。この複合金属コロイド粒子としては、パラジウムコロイド粒子の表面に白金コロイドを担持させてなるものが好ましく、平均粒径30〜90ナノメートルのパラジウムコロイド粒子の表面に白金コロイドを担持させてなる複合金属コロイド粒子がより好ましく、平均粒径40〜80ナノメートルのパラジウムコロイド粒子の表面に白金コロイドを担持させてなる複合金属コロイド粒子が更により好ましい。該複合金属コロイド粒子の平均粒径は、40〜200ナノメートルであることが好まし。イムノクロマトグラフィー測定法の場合、該複合金属コロイド粒子の平均粒径は60〜100ナノメートルであることが好ましく、該複合金属コロイド粒子として、平均粒径40〜80ナノメートルのパラジウムコロイド粒子の表面に白金を担持させてなる60〜100ナノメートルの複合金属コロイド粒子が特に好ましい。
【００１７】
本発明で使用する増感剤溶液は、上記金属イオンの供給源となる各種金属塩を必須成分として含有し、必要に応じて、還元剤、錯化剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、安定剤などを更に含有することができる。このような増感剤溶液としては、従来公知の無電解めっき溶液を使用することもできる。
【００１８】
上記金属イオンの供給源となる金属塩としては、周期律表第４、５、６周期に属する金属の塩が挙げられるが、析出速度などの観点からみて、ニッケル、コバルト、銅などの塩を使用することが好ましく、硫酸銅などの銅の塩を使用することがより好ましい。
【００１９】
還元剤としては、次亜リン酸ナトリウム、抱水ヒドラジン、硫酸ヒドラジン、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、ホルムアルデヒド、ロッシェル塩、ブドウ糖が挙げられるが、次亜リン酸ナトリウム又はホルムアルデヒドが好ましく使用され、このうち、ホルムアルデヒドが最も好ましい。
【００２０】
また、錯化剤としては、アンモニア、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩などが挙げられる。ｐＨ調製剤としては、酢酸塩、プロピオン酸塩、アンモニウム塩などが挙げられる。安定剤としては、各種の界面活性剤などが挙げられる。
【００２１】
イムノクロマト法テストストリップの具体例としては、例えば、図１に示されるテストストリップが挙げられる。図１において、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示している。
【００２２】
図示の例では、膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターで作成されている。
該膜担体３には、そのクロマト展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、第一の試薬が固定され、検体の捕捉部位３１が形成される。
図示の例では、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる分析対象物質をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉部位３１を形成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
【００２３】
含浸部材２は、前記第二の試薬を含浸等の方法で配置せしめた部材からなる。当該第二の試薬は、上記金属コロイド粒子で予め標識される。
図示の例では、含浸部材２として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
【００２４】
第二の試薬の標識物質として使用される金属コロイド粒子は、捕捉部位３１に集積することにより、肉眼で観察できる程度の色を呈し、さらに、増感剤溶液と接触することによって金属を析出させて呈色の度合いが向上するものであることが好ましい。
【００２５】
当該含浸部材２は、標識された第二の試薬の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。
【００２６】
図１に示されるように、膜担体３を粘着シート１の中程に貼着し、該膜担体３のクロマト展開の開始点側（すなわち図１の左側、以下「上流側」と記す、また、その逆の側、すなわち図１の右側を、以下「下流側」と記す）の末端の上に、含浸部材２の下流側末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着して本発明のイムノクロマト法テストストリップを作成できる。
【００２７】
さらに、必要に応じて、含浸部材２の上面に試料添加用部材５の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材５の上流側部分を粘着シート１に貼着してもよく、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材４の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材４の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめることもできる。
【００２８】
試料添加用部材５としては、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、ならびに、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または織布もしくは不織布を用いることができる。
吸収用部材４は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
【００２９】
さらに、市販品の場合、図１のイムノクロマト法テストストリップは、試料添加用部材５と捕捉部位３１の上方にそれぞれ被験試料注入部と判定部が開口された適当なプラスチック製ケース内に収容されて提供してもよい。
【００３０】
かくして、生体試料などを含む被験試料を必要に応じて適当な展開溶媒と混合してクロマト展開可能な混合液を得た後、当該混合液を図１に示されるイムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材５上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材５を通過して含浸部材２において、標識された第二の試薬と混合する。
その際、該混合液中に分析対象物質が存在すれば、抗原抗体反応により分析対象物質と第二の試薬との複合体が形成される。
【００３１】
この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位３１に到達し、そこに固定された第一の試薬と抗原抗体反応して捕捉される。
このとき、標識物質である金属コロイド粒子の集積により捕捉部位３１が発色する。そして、さらに、該捕捉部位３１と増感剤溶液とを接触させることにより、増感剤溶液に含まれている金属イオンが金属コロイド粒子の触媒作用によって還元されて金属として析出するので、金属コロイド粒子による発色がさらに増強されて、高い感度で測定を行うことができる。捕捉部位３１の発色を測定機器で読み取り、定量的に測定することもできる。
【００３２】
なお、本発明では、第二の試薬又は第二の試薬を含有する前記含浸部材を膜担体上に配置せず、適当な容器に収納しておき、当該容器内で被験試料と第二の試薬を混合して膜担体に注入することにより、膜担体にてクロマト展開可能なように用意しておくこともできる。
【００３３】
被験試料の調製に用いる生体試料としては、特に制限はなく、公知の免疫測定法で使用されている生体試料であれば何れも使用することができる。また、本発明の分析対象物質も生体試料由来のものに限られず、公知の免疫測定法で使用されているものであれば何れも使用できる。
【００３４】
なお、全血を被験試料として用いる場合、前記試料添加用部材に血球捕捉膜部材を配置しておくことが好ましい。血球捕捉膜部材は、前記含浸部材と前記試料添加用部材との間に積層することが好ましい。これにより、赤血球が膜担体に展開されるのが阻止されるので、膜担体の捕捉部位における呈色標識の集積の確認が容易になる。血球捕捉膜部材としては、カルボキシメチルセルロース膜が用いられ、具体的には、アドバンテック東洋株式会社から販売されているイオン交換濾紙ＣＭ（商品名）や、ワットマンジャパン株式会社から販売されているイオン交換セルロースペーパーなどを用いることができる。
【実施例】
【００３５】
下記の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１（白金微粒子被覆パラジウムコロイド粒子の調製）
（１）使用するガラス器具の全てを王水で洗浄した。
（２）390mlの超純水をフラスコに入れて沸騰させ、この沸騰水に塩化パラジウム水溶液（水溶液１Lあたりパラジウムとして1g）30mlを加え、その後、1重量％クエン酸ナトリウム水溶液60mlを加え、20時間還流しパラジウムコロイド懸濁液を得た。得られた懸濁液中のパラジウムコロイド粒子の平均粒径を動的光散乱式粒径分布測定装置LB-500（（株）堀場製作所製）によって測定したところ60nm（標準偏差2.4）であった。た。その後、上記懸濁液に塩化白金酸水溶液（水溶液１Lあたり白金として1g）30mlを加えた。塩化白金酸水溶液添加から5分後に１重量％クエン酸ナトリウム水溶液60mlを加え、4時間還流を行い白金微粒子被覆パラジウムコロイド懸濁液を得た。
（３）得られた白金微粒子被覆パラジウムコロイド懸濁液1mlを13800×ｇで25分間遠心分離を行い、遠心分離後、上清を除き、残った沈殿に超純水を0.5ml加え、攪拌後、超音波で沈殿を再懸濁せしめ、この懸濁液を200mM炭酸カリウム水溶液でpH9.0に調整し、これに超純水を加えて全量を100mlとして白金微粒子被覆パラジウムコロイド再懸濁液を得た。この再懸濁液中の白金微粒子被覆パラジウムコロイドの平均粒径を動的光散乱式粒径分布測定装置LB-500（（株）堀場製作所製）によって測定したところ80nmであった。
【００３７】
実施例２（白金−パラジウムコロイド標識抗体の調製）
抗ヒトCRP（C反応性蛋白、C-reactive protein）マウスモノクローナル抗体の蛋白換算重量１μｇ（以下抗体の重量を示すとき、その蛋白換算重量を示す）と実施例１で得られた白金微粒子被覆パラジウムコロイド再懸濁液１ｍｌとを混合し、室温で2分間静置して、この抗体の全量を該再懸濁液中の白金微粒子被覆パラジウムコロイド粒子（以下「白金−パラジウムコロイド粒子」と記す）と結合させた。
これに最終濃度が0.2％となるように1％ウシ血清アルブミン（以下「BSA」と記す）水溶液を加えて、上記抗体に結合せしめられた白金−パラジウムコロイド粒子の表面をブロックした。この懸濁液を4000×gで25分間遠心分離して、白金−パラジウムコロイド粒子の表面がBSAでブロックされた白金−パラジウムコロイド標識抗体を沈殿せしめて集めた。この白金−パラジウムコロイド標識抗体を0.05％ツイーン（Tween）20および1％BSAを含有する50mMトリス塩酸塩緩衝液（pH7.4）に再懸濁して、精製白金−パラジウムコロイド標識抗体懸濁液を得た。
【００３８】
実施例３（イムノクロマト法テストストリップの作成）
図１に示されるイムノクロマト法テストストリップを下記の手順で作成した。
（１）抗CRP抗体と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体３として用意した。
抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、このクロマト展開用膜担体３におけるクロマト展開開始点側の末端から7.5mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、抗原であるヒトCRPと白金−パラジウムコロイド標識抗体との複合体の捕捉部位３１とした。
（２）白金−パラジウムコロイド標識抗体含浸部材
5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布に、実施例２で得られた白金−パラジウムコロイド標識抗体懸濁液37.5μlを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて白金−パラジウムコロイド標識抗体含浸部材２とした。
（３）イムノクロマト法テストストリップの作成
上記クロマト展開用膜担体３、上記標識抗体含浸部材２の他に、試料添加用部材５として綿布と、吸収用部材４として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図１と同様のクロマト法テストストリップを作成した。
【００３９】
比較例１（金コロイドの調製）
使用するガラス器具の全てを王水で洗浄するかまたはシリコンコーティングした。
99mlの超純水をフラスコにいれ沸騰させ、この沸騰水に塩化金酸（片山工業株式会社製）水溶液（水溶液1リットル当たり金として5.8g）1mlを加えさらにその1分後に、1重量％クエン酸ナトリウム水溶液1.5mlを加え、5分間還流を行い、その後、室温に放置して冷却し懸濁液を得た。次いでこの懸濁液を200mM炭酸カリウム水溶液でpH9.0に調整し、これに超純水を加えて全量を100mlとして金コロイド懸濁液を得た。
【００４０】
比較例２（金コロイド標識抗体の調製）
白金微粒子被覆パラジウムコロイド再懸濁液の代わりに比較例１の金コロイド懸濁液を用いた以外は実施例２と同様にして金コロイド標識抗体を得た。
【００４１】
比較例３（イムノクロマト法テストストリップの作成）
白金−パラジウムコロイド標識抗体の代わりに比較例２の金コロイド標識抗体を使用した以外、実施例３と同様にしてイムノクロマト法テストストリップを得た。
【００４２】
比較例４（白金微粒子被覆金コロイド粒子の調製）
（１） 使用するガラス器具の全てを王水で洗浄した。
（２） ３９０ｍｌの超純水をフラスコに入れて沸騰させ、この沸騰水に塩化金酸水溶液（水溶液１リットル当たり金として１ｇ 、片山科学工業株式会社製）３０ｍｌを加え、その後、１重量％ クエン酸ナトリウム水溶液６０ｍｌを加え、６分４５秒後に、塩化白金酸水溶液（水溶液１リットル当たり白金として１ｇ 、和光純薬工業株式会社製）３０ｍｌを加えた。塩化白金酸水溶液添加から５分後に１重量％ クエン酸ナトリウム水溶液６０ｍｌを加え、４時間還流を行い、白金微粒子被覆金コロイド懸濁液を得た。
（３）次いでこの懸濁液を200mM炭酸カリウム水溶液でpH9.0に調整し、これに超純水を加えて全量を100mlとして白金微粒子被覆金コロイド再懸濁液を得た。この再懸濁液中の白金微粒子被覆金コロイドの平均粒径を動的光散乱式粒径分布測定装置LB-500（（株）堀場製作所製）によって測定したところ80nmであった。
【００４３】
比較例５（白金微粒子被覆金コロイド標識抗体の調製）
白金微粒子被覆パラジウムコロイド再懸濁液の代わりに比較例４の白金微粒子被覆金コロイド懸濁液を用いた以外は実施例２と同様にして白金微粒子被覆金コロイド標識抗体を得た。
【００４４】
比較例６（イムノクロマト法テストストリップの作成）
白金−パラジウムコロイド標識抗体の代わりに比較例５の白金微粒子被覆金コロイド標識抗体を使用した以外、実施例３と同様にしてイムノクロマト法テストストリップを得た。
【００４５】
実施例４（硫酸銅−ホルムアルデヒド混合液の調製）
純水500mlに対し、酒石酸カリウムナトリウム（キシダ化学製）114g、硫酸銅（和光純薬株式会社製）23.5g、炭酸ナトリウム（関東化学株式会社製）40g、水酸化ナトリウム15g、EDTA 10gを溶解し、硫酸銅溶液を調製した。得られた硫酸銅溶液15mlにホルムアルデヒド3mlを添加し、硫酸銅−ホルムアルデヒド混合液を調製した。混合液はテストストリップに反応させる前に調製した。
【００４６】
試験例１
実施例３（Pt-Pdコロイド標識）、比較例３（Auコロイド標識）および比較例６（Pt-Auコロイド標識）で得られたイムノクロマト法テストストリップを使用して、抗原であるリコンビナントCRPを測定した。リコンビナントCRP（オリエンタル酵母工業株式会社製）は、0.25% Tweenを含むリン酸緩衝液（ｐH7.4）と混合し、リコンビナントCRPの濃度を1.0ng/mlおよび500、250、125、62.5、31.25、15.63pg/mlに調製し被験試料とした。
これらの被験試料100μlを上記のイムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材に5上に滴下して膜担体3に展開せしめ、15分後に捕捉部位31の呈色の度合いを肉眼で観察した。ブランクは、0.25% Tweenを含むリン酸緩衝液（ｐH7.4）とした。その後、イムノクロマト法テストストリップを超純水にて洗浄し、水気を切った後、捕捉部位31を上記で作成した硫酸銅−ホルムアルデヒド混合液に浸漬し、呈色の度合いを肉眼で観察した。
捕捉量は、その量に比例して増減する黒色の呈色度合いを肉眼で−（着色なし）、±ｗｗ（微弱な着色）、±ｗ（弱い着色）、＋（明確な着色）の４段階に区分して判定した。
結果を表1に示す。
【００４７】
【表１】
2009192270.tif 000003
【００４８】
金コロイド標識した場合（比較例６）は、硫酸銅−ホルムアルデヒド混合液に浸漬前後で変化はなく同様の検出感度を示した。また、白金-金コロイド標識した場合（比較例３）は、硫酸銅−ホルムアルデヒド混合液に浸漬前の目視判定では125pg/mlが検出限界であったのに対し、浸漬後では31.25pg/mlと検出感度が向上した。一方、白金−パラジウムコロイド標識した場合（実施例３）は、硫酸銅−ホルムアルデヒド混合液に浸漬前の目視判定では250pg/mlが検出限界であったのに対し、浸漬後では31.25pg/mlと検出感度が向上し、白金-金コロイドよりも2倍高い触媒能を有することが確認された。白金の触媒作用により添加した増感剤溶液中の銅イオンが還元されて、触媒作用を有する金属コロイド粒子表面に析出させることで増感効果が得られた。更に、白金−パラジウムコロイドでは白金およびパラジウムの触媒作用にて酸化還元反応がより効果的に働くことが示された。
【００４９】
試験例２
実施例３で得られたイムノクロマト法テストストリップを使用して、展開後のイムノクロマト法テストストリップの捕捉部位３１に３,３’，５,５’テトラメチルベンジジン（TMBZ）（ペルオキシダーゼ用発色キットST（株式会社タウンズ製））を１０μl加え、呈色の有無を肉眼で観察した。
一方、実施例３で得られたイムノクロマト法テストストリップを使用して、展開後のイムノクロマト法テストストリップを超純水にて洗浄し、水気を切った後、捕捉部位31を上記で作製した硫酸銅−ホルムアルデヒド混合液に浸漬し、呈色の度合いを肉眼で観察した。
【００５０】
【表２】
2009192270.tif 000004
【００５１】
上記の結果から、TMBZを併用した際（試験例２）には、抗原濃度500pg/ml、また、硫酸銅−ホルムアルデヒド混合液を併用した際（実施例３）には、抗原濃度31.25pg/mlまで検出できることが示された。したがって、従来から増感剤として使用されているTMBZよりも硫酸銅−ホルムアルデヒド混合液のほうが高い増感効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、従来よりも高感度で測定が行える免疫測定法、とりわけ、サンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマト法テストストリップを提供するものであり、標識物質として金属コロイド粒子を用いて肉眼で簡便に判定できるようにした免疫測定法の分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ａはイムノクロマト法テストストリップの平面図、ｂはａで示されたイムノクロマト法テストストリップの縦断面図。
【符号の説明】
【００５４】
１  粘着シート
２  含浸部材
３  膜担体
３１  捕捉部位
４  吸収用部材
５  試料添加用部材
【図１】
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