(57)【要約】【課題】  複数の照射光を試料に照射して複数の放射光を計測し分析する光分析装置に於いて、計測データの信号処理負担を増やすことなく、クロストークのない計測データを取得できる装置を提案すること。【解決手段】  本発明の光分析装置は、試料に複数の照射光を選択的に照射するための光照射手段と、複数の放射光の各々を選択的に検出する複数の光検出手段と、放射光の計測を制御する計測制御手段とを含み、計測制御手段が、複数の照射光のうちの一つを試料に対して出射されるよう選択したときに、光検出許可手段が、選択されている照射光に対応して試料から発せられるべき放射光を検出するための光検出手段のみの放射光の検出を許可することを特徴とする。【選択図】        図１
2009058405.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の波長帯域又は波長特性の照射光を試料に照射して前記複数の照射光に対応して発せられる前記試料からの複数の波長帯域又は波長特性の放射光を計測し分析する光分析装置であって、
前記試料に前記複数の照射光を選択的に照射するための光照射手段と、
前記複数の波長帯域又は波長特性の放射光の各々を選択的に検出するための複数の光検出手段と、
前記試料に照射する前記照射光を選択して前記放射光の計測を実行するための計測制御手段とを含み、
前記計測制御手段が、前記試料に対して出射される前記照射光を選択する照射光選択手段と、前記複数の光検出手段の各々による前記放射光の検出を選択的に許可する光検出許可手段とを含み、前記照射光選択手段が前記複数の照射光のうちの一つを前記試料に対して出射されるよう選択したときに、前記光検出許可手段が、前記複数の照射光のうち選択されている前記照射光に対応して前記試料から発せられるべき前記放射光を検出するための前記光検出手段の放射光の検出を許可することを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１の装置であって、前記照射光選択手段が前記複数の照射光を一つずつ順々に前記試料に対して照射されるよう選択し、前記光検出許可手段が前記照射光選択手段の前記照射光の選択に同期して前記選択された照射光に対応して前記試料から発せられるべき前記放射光を検出するための前記光検出手段の放射光の検出を許可することを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１の装置であって、前記光照射手段が、各々特定の波長の照射光を発生する複数の光源を含み、前記照射光選択手段が選択的に前記複数の光源のうちのいずれかの光源からの照射光を前記試料に与えられるよう前記光源のうちの一つを選択的に照射光が発生可能な状態とすることを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１の装置であって、前記照射光選択手段が前記複数の照射光のうちのいずれかの照射光の波長帯域の光を選択的に透過させる光学素子を含むことを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項１の装置であって、前記光検出許可手段が前記試料から前記光検出手段までの前記放射光の光路を選択的に開放することにより前記光検出手段への前記放射光の入射を許すシャッター手段を含むことを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項１の装置であって、前記光検出許可手段が前記選択されている前記照射光に対応して前記試料から発せられるべき前記放射光を検出するための前記光検出手段を選択的に前記放射光の検出が可能な状態とすることを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項１の装置であって、前記試料が複数の互いに発光波長特性の異なる蛍光分子を含み、前記複数の照射光の各々が前記複数の蛍光分子のいずれかを選択的に励起するための励起光であり、前記複数の放射光の各々が前記複数の蛍光分子から発せられる蛍光のいずかであることを特徴とする装置。
【請求項８】
請求項１の装置であって、前記光照射手段から前記試料の位置まで及び前記試料の位置から前記光検出手段までの光学系が共焦点顕微鏡の光学系を構成していることを特徴とする装置。
【請求項９】
請求項８の装置であって、前記複数の照射光を前記試料に照射し前記複数の照射光に対応して発せられる前記試料からの前記複数の放射光を計測して蛍光相互相関分光分析を実行することを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に対して光（照明光、励起光又はその他の照射光）を照射し、その試料から発せられる光（蛍光、りん光、散乱光、化学発光、生物発光又はその他の放射光）を計測し分析する光分析装置に係り、より詳細には、試料に対して複数の波長帯域又は波長特性の照射光を照射してそれらの照射光に対応して発せられる試料からの放射光を計測し分析する光分析装置に係る。
【背景技術】
【０００２】
分光分析技術の分野に於いて、しばしば、上記の如く、計測又は分析されるべき試料に対し、波長帯域又は波長特性の互いに異なる少なくとも２種類の照射光を照射し、それらの照射光の各々に対応して試料から放射される波長帯域又は波長特性の互いに異なる放射光を別々に計測して分析するといったことが行われる。例えば、蛍光相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ、Fluorescence  Cross-Correlation  Spectroscopy−非特許文献１参照）や共焦点蛍光コインシデンス分析（ＣＦＣＡ、Confocal  fluorescence  coincidence  analysis−非特許文献２参照）では、励起・蛍光波長特性の互いに異なる複数種類の蛍光標識を有する生体分子等の試料に対しそれらの複数種類の蛍光分子を各々励起する励起光を照射し、これにより発せられる複数種類の蛍光分子の各々からの蛍光の強度をそれぞれ別々の受光器によって時系列的に計測して、その計測された複数種類の蛍光分子からの蛍光強度の相互相関関数（ＦＣＣＳ）或いは複数種類の蛍光分子の蛍光強度の揺らぎが一致する頻度（ＣＦＣＡ）が算出される。かくして得られる相互相関関数又は頻度の値は、試料中の複数種類の蛍光分子が一体的にブラウン運動しているか否かを表しているので、それらの値から試料中の複数の分子の結合・解離状態、構造変化又は分子間相互作用に関する種々の情報を得ることが可能となる。こういった情報は、一つの試料を単一の照射光にて照射し該試料からの単一の放射光を計測する手法により容易に得ることは困難である。
【０００３】
上記の如き複数の波長帯域又は波長特性の照射光を試料に照射してその試料からの複数の波長帯域又は波長特性の放射光を計測する光分析手法に於いては、或る一つの波長帯域の照射光に対応して試料から発せられる放射光の計測値を、他の波長帯域の照射光に対応して試料から発せられる放射光から完全に分離した状態で取得すること、即ち、一方の照射光に対応して試料から発せられる放射光を受光する受光器の計測値に於いて、他方の照射光に対応して試料から発せられる放射光による寄与がない状態とすることが要求される場合がある。例えば、上記のＦＣＣＳやＣＦＣＡの例の場合、或る蛍光分子からの蛍光強度の計測値に、別の蛍光分子からの蛍光強度の寄与が含まれていると、複数種類の蛍光分子からの蛍光強度の相互相関関数等を正確に算出することができなくなる（相関関数の値がみかけ上増大してしまう。）。従って、装置に於いて、各蛍光分子の蛍光強度を別々に計測するために、複数の蛍光分子の各々の発光波長帯域の光のみを受光する受光器がそれぞれ準備され、且つ、複数の蛍光分子の選択が各蛍光分子の発光波長が別の蛍光分子のための受光器の検出波長帯域と重複しないように為され、これにより、一つの受光器が一種類の蛍光分子からの蛍光のみを計測する状態を達成することが試みられる。
【０００４】
しかしながら、上記の如き一つの照射光に対応して試料から発せられる放射光の計測値から他の照射光に対応して試料から発せられる放射光からの寄与を除去するという要求を実現することは、しばしば、困難である。前記のＦＣＣＳやＣＦＣＡの場合でいえば、試料（特に、生体分子等）に対するアーティファクトを考慮すると、蛍光プローブとして選択可能な蛍光分子の種類の範囲は限られるので、全ての蛍光分子についての発光波長の帯域各々が、別の蛍光分子のための受光器の検出波長帯域に重複しないように、使用する蛍光分子を選択することは、通常、困難であり、従って、或る蛍光分子の蛍光が別の蛍光分子のための受光器で検出されてしまうといったことが起き得る。即ち、複数の照射光を同時に試料に照射した状態で、一方の照射光に対応して試料から発せられる一方の放射光の計測値から、他方の照射光に対応して試料から発せられる他方の放射光の寄与が除去されている状態を達成することは困難である（一つの放射光の計測値に含まれる別の放射光の寄与は、「クロストーク」と称される。）。
【０００５】
この点に関し、ＦＣＣＳ又はＣＦＣＡに於ける上記の如きクロストークを回避するべく、特許文献１及び２に於いては、複数の蛍光分子を励起するための複数の励起光を同時に試料に対して照射するのでなく、複数の励起光を一つずつ順々に試料に照射し、即ち、一時に試料に照射される励起光が一つとなる状態にして、一時に計測される試料からの蛍光が一種類の蛍光分子からのものとなるよう構成された装置及び方法が提案されている。かかる装置又は方法によれば、各励起光が照射されている期間を把握することにより、各々の励起光に対応する蛍光が計測される時間が分かるので、クロストークのない計測データを取得することが可能となる（この場合、各蛍光分子の蛍光強度の計測値が間欠的になるが、複数の励起光の切換のタイミングを、計測される試料の蛍光強度の時間変化、即ち、蛍光分子を担持する分子がブラウン運動により蛍光観察領域を通過する速さに比して十分に速くなるよう設定することにより、複数の蛍光分子からの蛍光強度の相互相関関数を有意に算定することが可能となる。）。
【特許文献１】特開２００６−９３３７０公報
【特許文献２】特開２００６−９３３７１公報
【非特許文献１】"Dual-Color Fluorescence Cross-CorrelationSpectroscopy for Multicomponent Diffusional Analysis in Solution", Petra. Schwilleet al, Biophysical Journal 1997, 72, 1878-1886
【非特許文献２】Confocalfluorescence coincidence analysis (CFCA), Winkler et al., Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 96: 1375-1378, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１、２にて提案されている蛍光分光分析装置に於ける光計測の手法の場合、或る波長帯域の励起光が試料に対して照射されている際に発光する蛍光分子の発光波長帯域が別の蛍光分子の蛍光を受光するための受光器の検出波長帯域にも重複するときには、その受光器の計測値には、そのときに励起されている蛍光分子の蛍光によるクロストークが生ずる（図２（Ａ）参照）。そこで、同文献の装置の場合、各受光器の計測データの取得後、相互相関関数等の算定をする際に、対応する励起光の照射時間に対応する期間以外のデータを０値に修正するといった信号処理又は演算処理によって各受光器の計測データ中のクロストークの影響が排除される。即ち、かかる構成の場合、計測データを解析する際に、クロストークを除去する信号処理又は演算処理過程を実行する必要がある。
【０００７】
この点に関し、上記の如き光分析に於いて時系列に計測される放射光の計測データの量は、時間分解能によっては、しばしば、膨大となり、しかも、観測される蛍光分子の種類の数が増えれば、その分、膨大な時系列の計測データ量が更に増えることとなるので、信号処理又は演算処理されるべきデータ量が相当に大きく、信号解析に多大な時間を要する場合がある。その上、特許文献１、２に於ける手法の如く、試料に照射される照射光（励起光）を選択的に切り換えて対応する放射光を計測する場合には、既に触れたように、計測されるべき放射光の変化（ＦＣＣＳ又はＣＦＣＡの場合には、分子のブラウン運動の速さ）よりも速く且つ頻繁に実行されるので、計測データからクロストークの寄与を除去するための信号処理又は演算処理量も大きい。従って、特許文献１、２に於ける手法による場合、計測データの分析又は解析のための信号処理又は演算処理負担が、更に大きくなり、信号解析に多大な時間が更に必要となってしまう場合がある。
【０００８】
かくして、本発明の一つの課題は、複数の波長帯域又は波長特性の照射光を試料に照射して複数の波長帯域又は波長特性の試料からの放射光を計測し分析する光分析装置であって、計測データの信号処理又は演算処理負担を増やすことなく、上記の如きクロストークのない計測値又は計測データを取得することが可能な装置を提案することである。
【０００９】
また、本発明のもう一つの課題は、上記の如き装置であって、クロストークの寄与が排除された放射光の強度の計測値が得られ、その計測値が殆どそのまま分析又は解析演算処理に用いることができる装置を提案することである。
【００１０】
更にまた、本発明のもう一つの課題は、上記の如き装置であって、蛍光相互相関分光分析又は共焦点コインシデンス解析に於いて有利に用いることができる装置を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、上記の如き課題を達成するべく、放射光を検出する受光器又は光検出手段の各々の出力又は計測値に於いてクロストーク（即ち、一つの放射光の計測値に含まれる別の放射光の寄与）がない状態を達成し、光検出手段の出力値又は計測値からクロストークを除去する必要のない光分析装置が提供される。
【００１２】
本発明による複数の波長帯域又は波長特性の照射光を試料に照射してそれらの照射光に対応して発せられる試料からの複数の波長帯域又は波長特性の放射光を計測し分析する光分析装置（以下、「多重光照射−多重光検出型光分析装置」と称する。）は、試料に複数の照射光を選択的に照射するための光照射手段と、複数の波長帯域又は波長特性の放射光の各々を選択的に検出するための複数の光検出手段と、試料に照射する照射光を選択して放射光の計測を実行するための計測制御手段とを含む。そして、本発明の装置に於ける計測制御手段は、試料に対して出射される照射光を選択する照射光選択手段と、複数の光検出手段の各々による放射光の検出を選択的に許可する光検出許可手段とを含んでおり、照射光選択手段が前記の複数の照射光のうちの一つを試料に対して出射されるよう選択したときに、光検出許可手段は、複数の照射光のうち選択されている照射光に対応して試料から発せられるべき放射光を検出するための光検出手段の放射光の検出を許可することを特徴とする。なお、光照射手段に於ける光源としては、典型的にはレーザーであるが、水銀ランプ、キセノンランプ等のその他光分析技術の分野で用いられている任意のものであってよい。また、光検出手段に於いて、光を実際に受光する受光素子は、フォトダイオード、ＣＣＤ等の光分析技術の分野で用いられている任意のものであってよい。
【００１３】
従前の多重光照射−多重光検出型光分析装置に於いては、既に述べた如く、試料の放射光の波長特性に依って、一つの放射光を検出するべき光検出手段に別の放射光の寄与が混在するクロストークが生じ、これにより、目的とする光分析の結果の精度が悪化する場合には、計測データを用いた信号解析又は分析に際して、その計測データからクロストーク成分を除去する必要があり、このことが、信号処理又は演算処理負担の増大となっていた。そこで、本発明の装置に於いては、上記の構成から理解される如く、更に、複数の光検出手段の各々による放射光の検出を選択的に許可する光検出許可手段が設けられ、複数の照射光のうち選択されている照射光に対応して試料から発せられるべき放射光を検出するための光検出手段だけが放射光の検出を許可されるよう構成されている。かかる構成によれば、或る照射光が試料に照射されている間は、その照射光に対応して試料から発せられる放射光の波長帯域を検出する光検出手段のみが放射光の検出が許可され、それ以外の光検出手段の放射光の検出が禁止されることとなる。従って、各々の光検出手段の出力値には、それぞれ対応する照射光とは別の照射光に対応して発せられるべき放射光のクロストークが含まれなくなり、それぞれの光検出手段の出力値が、クロストーク除去のための信号処理過程を実行することなく、計測データとしてその後の信号解析又は分析に使用できることとなる。なお、多重光照射−多重光検出型の光検出、即ち、複数の照射光による複数の放射光の検出を実行するために、本発明の分析装置に於いては、照射光選択手段が複数の照射光を一つずつ順々に試料に対して照射されるよう選択し、光検出許可手段が照射光選択手段の照射光の選択に同期して選択された照射光に対応して試料から発せられるべき放射光を検出するための光検出手段の放射光の検出を許可するようになっていてよい。
【００１４】
上記の本発明の実施の形態に於いて、試料に複数の照射光のうちのいずれかを選択的に照射する構成としては、光照射手段が複数の光源を含み、その光源の各々が特定の波長の照射光を発生する場合には、照射光選択手段が選択的に複数の光源のうちのいずれかの光源からの照射光を試料に与えられるよう光源のうちの一つを選択的に照射光が発生可能な状態とするようになっていてよい。また、別の構成として、照射光選択手段が複数の照射光のうちのいずれかの照射光の波長帯域の光を選択的に透過させる光学素子、例えば、音響光学素子（ＡＯＴＦ）、を含み、光学素子の透過波長帯域を選択的に変更するようになっていてよい。
【００１５】
また、上記の本発明の実施の形態に於いて、各光検出許可手段に於ける試料からの放射光の検出を選択的に許可又は禁止を行う構成としては、光検出許可手段は、試料から光検出手段までの放射光の光路を選択的に開放することにより光検出手段への放射光の入射を許すシャッター手段を含み、かかるシャッター手段の作動を制御して、光検出手段への放射光を透過又は遮断するようになっていてよい。なお、そのようなシャッター手段としては、音響光学素子（ＡＯＴＦ）、液晶を用いて光の透過率が制御される光学フィルタなどが用いられてよい。また、放射光の検出を選択的に許可又は禁止を行う構成の別の態様として、光検出許可手段が、選択されている照射光に対応して試料から発せられるべき放射光を検出するための光検出手段を選択的に放射光の検出が可能な状態とし、各光検出手段に対応しない照射光が照射されている期間は、放射光の検出が不可能な状態となるよう光検出手段の作動を制御するになっていてもよい。ここで、光検出手段を放射光の検出が可能な状態又は不可能な状態にもたらす具体的な構成は、光検出手段に於いて採用される受光器に応じて、適宜構成されてよいことは理解されるべきである。重要なことは、各光検出手段が、各々対応する照射光が試料に照射されていない期間は、放射光が受光器に到達しても放射光に対応した出力が発生しないようになっていることである。
【００１６】
ところで、上記の本発明の装置の構成は、特に、蛍光分光分析に於いて、複数の互いに発光波長特性の異なる蛍光分子を含む試料を用いた蛍光分析に有利に用いることができる。そこで、上記の構成に於いて、試料が複数の互いに発光波長特性の異なる蛍光分子を含む場合には、複数の照射光の各々が複数の蛍光分子のいずれかを選択的に励起するための励起光であり、検出されるべき複数の放射光の各々は、複数の蛍光分子から発せられる蛍光のいずかであってよい。
【００１７】
また、上記の本発明の装置の構成は、特に、背景技術の欄に於いて記載されている如きＦＣＣＳ又はＣＦＣＡが実行可能する光分析装置に有利に適用することができる。これらのＦＣＣＳ又はＣＦＣＡの測定系に於いては、共焦点顕微鏡の光学系が用いられているので、本発明の構成に於いて、光照射手段から前記試料の位置まで及び試料の位置から光検出手段までの光学系が、共焦点顕微鏡の光学系を構成するようになっていてよい。
【発明の効果】
【００１８】
総じて、本発明の装置に於ける特徴的な構成よれば、複数の光検出手段の出力に於いて、上記の如きクロストークが存在せず、従って、光検出手段の出力の段階で、或る一つの波長帯域の照射光に対応して試料から発せられる放射光の計測値を、他の波長帯域の照射光に対応して試料から発せられる放射光から完全に分離した状態で取得するという要求を満たすことが可能となる。従って、特許文献１又は２に記載されている手法に比して、信号処理又は演算処理負担が低減され、信号解析に要する時間が低減される（計測データ上のクロストーク除去処理のためだけに信号解析装置のコンピュータ又は演算処理装置の仕様（演算速度、記憶容量）を上げる必要も無くなる。）。また、計測データ上のクロストークが混在しないこととなるので、計測データは、（通常のノイズ除去・バックグラウンド減算等の通常実行される処理の後）、そのまま、ＦＣＣＳ又はＣＦＣＡ等に基づく解析に用いることができるので、信号処理又は演算処理のためのプログラムの構成も簡単にすることができる。
【００１９】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に添付の図を参照しつつ、本発明を幾つかの好ましい実施形態について詳細に説明する。なお、以下の本発明の実施形態に於いては、共焦点蛍光顕微鏡の光学系を有する蛍光分析装置について説明されるが、本発明の概念は、その他の形式の多重光照射−多重光検出型の光分析装置に適用されてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属すると理解されるべきである。また、以下の説明に於いては、試料として、蛍光標識された試料が用いられる場合について説明され、従って、照射光は、励起光として、放射光は、蛍光として記載されるが、試料からの放射光は、りん光、散乱光、化学発光、生物発光等であってよく、照射光は、それらの放射光を発生又は誘発する光であってよい。
【００２１】
装置の構成
図１は、本発明の一つの好ましい実施形態による共焦点蛍光顕微鏡の光学系を有する多重光照射−多重光検出型光分析装置１０の構成を模式的に示したものである。光分析装置１０に於いては、蛍光標識された分子を含む試料Ｓ（典型的には、図示していないセル内に注入された溶液であってよい。）に対して複数の互いに異なる波長帯域又は波長特性の励起光を照射するための励起光学系（光照射手段）と、試料Ｓからの複数の互いに異なる波長帯域又は波長特性の蛍光を検出するための光検出系（光検出手段）と、光検出系にて検出された蛍光の解析又は分析を行う解析制御系と、励起光学系の励起光及び光検出系の検出光の選択の制御を行う計測制御系（計測制御手段）とが構成される。
【００２２】
励起光学系は、複数のレーザーＬａ〜Ｌｎから出射された励起光が、各々、図示していないビームエキスパンダーを介して拡大されレンズ１２ａ〜ｎにて平行光にされた後、ダイクロイックミラー１４ａ〜ｎ及び１６を経て、対物レンズ１８により、試料Ｓ中の或る一つの点領域にて焦点を結ぶ（集光される）よう構成される（図では、三つのレーザーが示されているが、その数は、任意であってよい。下記の受光器ＡＰＤの場合も同様。）。かかる励起光が焦点を結ぶ点領域（通常、光の波長程度の幅の領域）は、本実施形態の光分析装置の観察又は観測領域となり、その領域内に蛍光標識された分子が進入すると、蛍光標識が励起光により励起され、蛍光が発せられる。なお、レーザーは、蛍光分光分析の分野に於いて又は共焦点蛍光顕微鏡に於いて、通常使用されている形式のＹＡＧレーザー、アルゴンレーザー、Ｈｅ−Ｎｅレーザー等であってよく、励起光の波長は、４００ｎｍ〜６００ｎｍの範囲の任意の値であってよい。また、ダイクロイックミラー１４ａ〜ｎは、図に於いて、上方から到来する光を透過し、右方から到来する光を反射するよう適宜調製されたものであってよい（１４ｎは、通常のミラーであってもよい。）。
【００２３】
上記の如く励起光が照射されることにより試料Ｓから発せられた蛍光（の一部）は、対物レンズ１８により集光され、ダイクロイックミラー１６を透過した後、レンズ２０によりピンホール２２にて焦点を結ぶように集光される。なお、ピンホール２２に於いては、そこで結像した光のみ通過し、対物レンズ１８の焦点領域（観察領域）以外からの光は遮断されることとなるので、ピンホール２２を通過した後の光は、実質的に、焦点領域から発せられた光のみとなる（共焦点顕微鏡の原理）。かくして、ピンホール２２を透過した光は、更に集光レンズ２４を通過した後、ダイクロイックミラー２６ａ〜ｎとバンドパスフィルタ２８ａ〜ｎにより、その蛍光の波長に依存して選択的に分割され、受光器ＡＰＤａ〜ｎへ向けて配向され、受光器ＡＰＤａ〜ｎの各々の受光面（図示せず）に入射される。そして、各受光器ＡＰＤは、その入射した光の強度に応じた（強度の関数とした）大きさの電気信号Ｄａ〜Ｄｎを生成し、下記に説明される電子制御装置５０に送出する。即ち、上記の対物レンズから受光器ＡＰＤまで光学要素が光検出系を構成する。なお、ここで、各受光器ＡＰＤａ〜ｎは、各々対応するダイクロイックミラー２６で反射され、バンドパスフィルタ２８を透過する波長を受光することになるので、各受光器は、互いに異なる波長帯域の光を受光することは理解されるべきである。受光器ＡＰＤは、典型的には、蛍光分光分析又は共焦点蛍光顕微鏡に於いて、通常使用されているアバランシェフォトダイオードであってよい。
【００２４】
各受光器からの電気信号（検出信号）を受信する電子制御装置５０は、通常の形式の、双方向コモン・バスにより相互に連結されたＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ハードディスク等の記憶装置、入出力ポート装置及びそれらの駆動回路を有し、ＲＯＭ又はその他の記憶装置に記憶された制御プログラム（使用者の設定入力が適宜できるようになっていてよい。）に従って動作するコンピュータであってよい。電子制御装置５０は、解析制御系として機能し、受信した複数の電気信号の各々にノイズ除去及び／又はＡ／Ｄ変換処理を施した後、それらの複数の信号を用いて、特許文献１、２又は非特許文献１、２に記載されている如く、種々の信号解析・演算処理、例えば、蛍光相互相関分光分析に従った相互相関関数、共焦点コインシデンス解析に従った揺らぎ同時発生頻度（coincidence  value）の算出を実行する（図３（Ａ）参照）。
【００２５】
更に、本発明の装置では、上記の構成に於いて、後に説明される如き、光の検出値又は計測値のクロストークを除去する目的で、電子制御装置５０により作動制御される各レーザーからの出射光路に配置されるシャッタ３０ａ〜ｎ及び各受光器への入射光路に配置されシャッタ３２ａ〜ｎが設けられ、電子制御装置５０と前記のシャッタ３０ａ〜ｎ、３２ａ〜ｎとにより励起光学系及び光検出系の励起光及び蛍光の伝搬を制御する制御系が構成される。シャッタ３０ａ〜ｎ及びシャッタ３２ａ〜ｎは、電子制御装置５０からの制御指令（ｏｎ／ｏｆｆ）に従って、各々対応するレーザー光及び試料Ｓから対応する受光器ＡＰＤａ〜ｎへ向かう光を選択的に遮断することができるよう配置される。従って、各シャッタが、制御指令ｏｎが与えられるときのみ光を透過し、制御指令ｏｆｆが与えられているときには光を遮断する形式のものであるときには（この逆であってもよい。）、各レーザー光は、対応するシャッタ３０に制御指令ｏｎが与えられているときにのみ、試料Ｓに照射され、同様に、各受光器ＡＰＤは、対応するシャッタ３２に制御指令ｏｎが与えられているときにのみ試料Ｓからの放射光（蛍光）を受光し、その受光した光の強度に対応した信号を出力する。換言すれば、各受光器は、対応するシャッタ３２により蛍光の入射が阻止されているときは、光の検出が禁止され、その間は、受光強度が０の状態の電気信号を送出する。シャッタ３０ａ〜ｎ及びシャッタ３２ａ〜ｎは、電子制御装置からの制御指令に応答して選択的に光の透過又は遮断することが可能な任意の光学素子であってよく、例えば、音響光学素子（ＡＯＴＦ）、液晶フィルタ等が採用されてよい。
【００２６】
なお、試料Ｓへ照射される励起光の選択及び各受光器に於ける光の検出の許可及び禁止の選択は、それぞれ、レーザーの発光作動及び受光器の検出作動を制御することにより行われてもよい。その場合、電子制御装置５０は、図１中、点線矢印にて記載されている如く、レーザーに対しては、発光作動の許可及び禁止（ｏｎ／ｏｆｆ）を行うための制御指令を送出し、受光器に対しては、電気信号の送出の許可及び禁止（例えば、電気信号の出力線の接続／絶縁の切換）又は受光器の電気信号の生成の許可及び禁止を行うための制御指令を送出するようになっていてもよい。また、励起光の波長選択は、図中点線にて示されている如く、透過波長の選択可能なＡＯＴＦを全ての励起光が合流した後の励起光路に配置し、電子制御装置５０の制御指令に基づいて透過波長、即ち、試料Ｓに到達される光の波長が選択されるようになっていてよい。
【００２７】
かくして、上記の励起光波長の選択及び各受光器の光の検出の許可／禁止制御は、いずれの場合も、電子制御装置がその内部に記憶された制御プログラムに従って制御指令ｏｎ／ｏｆｆに送出することにより実行することが可能となる。即ち、電子制御装置５０の作動とシャッタ３０ａ〜ｎ及びシャッタ３２ａ〜ｎにより、励起光学系及び光検出系の励起光及び蛍光の選択の制御を行う計測制御系が構成される。
【００２８】
光検出に於けるクロストークについて
「背景技術」及び「発明の開示」の欄にも記載されているように、図１に例示されている如き、多重光照射−多重光検出型の光分析装置にて任意の蛍光分析を実行するべく、各々の励起光に対して対応する一つの蛍光の強度の検出値又は計測値を取得する場合に、或る一つの励起光に対応して試料Ｓから発せられる蛍光の計測値を、他の励起光に対応して試料Ｓから発せられる蛍光から完全に分離した状態で取得する、即ち、一つの励起光に応答して発せられる蛍光の計測値に於いて、他の励起光による蛍光の寄与（クロストーク）がない状態が要求されることがある。しかしながら、一般に、一つの試料に於いて用いられる蛍光色素又は蛍光分子の発光波長は、互いに重複してしまうので、或る蛍光の計測値に於いて、上記の如くクロストークが混在することとなる。
【００２９】
図２（Ａ）は、試料Ｓ中に二種類の蛍光分子が存在する場合の、励起光波長、蛍光分子の発光波長、及び、受光器の検出波長帯域の関係を表したものである。同図を参照して、例えば、図示の如く、試料中の一方の蛍光分子Ａ（励起・発光スペクトルλｅｘ１、λｅｍ１を有する。）をレーザーＬａの光にて励起し、その蛍光を、図示の如き検出域を有する受光器ＡＰＤａにより検出又は計測し、他方の蛍光分子Ｂ（励起・発光スペクトルλｅｘ２、λｅｍ２を有する。）をレーザーＬｂの光にて蛍光分子Ｂを励起し、その蛍光を、図示の如き検出域を有する受光器ＡＰＤｂにより検出又は計測するものとする。その場合、励起光Ｌａ及びＬｂにて試料Ｓを励起した場合、受光器ＡＰＤａは、蛍光分子Ａの発光波長λｅｍ１のみを受光し検出するが、受光器ＡＰＤｂの検出域には、蛍光分子Ｂの発光波長λｅｍ２だけでなく、蛍光分子Ａの発光波長λｅｍ１の長波長側の一部が進入することとなるので、受光器ＡＰＤｂの検出値又は計測値には、蛍光分子Ａの蛍光の寄与、即ち、クロストークが混在することとなる。そして、かかる受光器ＡＰＤａ及び受光器ＡＰＤｂの検出値を用いて、信号解析、例えば、ＦＣＣＳの相互相関関数、ＣＦＣＡの揺らぎ同時発生頻度の算出、を行うと、それらの解析結果の値は、受光器ＡＰＤｂの検出値に蛍光分子Ａの蛍光の寄与（クロストーク）が混在するため、精度が低下する（みかけ上、値が増大することとなる。）。
【００３０】
上記の如きクロストークによる影響を光分析の結果から排除するために、特許文献１、２の手法に於いては、既に述べた如く、複数の励起光を逐次的に一つずつ試料Ｓに対して照射し、一時に試料Ｓを励起する励起光を一つにした状態で蛍光を検出するといったことが行われる。この場合、各励起光が試料Ｓを照射する期間が把握されるので、時系列的に得られた検出値から、信号解析又は演算処理の段階で、各受光器に対応する励起光が選択されている期間の検出値を抽出し、これにより、検出値からクロストークを排除される（例えば、レーザーＬａが選択されている期間に受光器ＡＰＤｂは、蛍光分子Ａの蛍光を受光するが、その間の検出値は、信号解析の段階で排除される。）。
【００３１】
かかる手法によれば、確かに、解析結果からクロストークの影響は排除される。しかしながら、既に述べた如く、膨大な時系列の或る受光器の検出値に於いて、対応する励起光が選択されている期間に於ける検出値を特定して抽出するという演算処理は、信号処理の負担が大きくなる。そこで、本発明の装置では、一つの励起光が試料Ｓに照射されている間は、一つの受光器のみ光の検出が許可される状態とし、励起光の逐次的な切換に同期して、光の検出が許可される受光器も逐次的に切換られるよう計測制御系が構成される。例えば、図２（Ａ）の例の場合、本発明に於いては、同（Ｂ）、（Ｃ）に例示されている如く、励起光Ｌａが選択されている場合には、受光器ＡＰＤａのみが、光の検出が可能な状態（ＯＮ）とされ、励起光Ｌｂが選択されている場合には、受光器ＡＰＤｂのみが、光の検出が可能な状態（ＯＮ）となるよう受光器の光の検出の許可／禁止が制御される。かかる本発明の制御手法によれば、一時に試料Ｓに与えられる励起光は、一種類であり、これに対応して、同時に光の検出が許可される受光器は、一つに制限され、その他の受光器の光の検出は禁止されるので、各々の受光器の出力に於いて上記の如きクロストークの混在が回避されることとなる。
【００３２】
励起光及び受光器の選択及び切換制御
上記に述べた如く、本発明の装置では、電子制御装置による制御下、励起光の逐次的な切換に同期して、光の検出が許可される受光器も逐次的に切換られるよう、レーザーＬａ〜Ｌｎに対応するシャッタ３０ａ〜ｎ及び受光器ＡＰＤａ〜ｎに対応するシャッタ３２ａ〜ｎの光の透過／遮断が制御される。図３（Ａ）は、かかるシャッタの切換制御と、受光器にて検出された信号の処理及び解析を実行する電子制御装置５０の構成を機能ブロックの形式にて表したものである。かかる構成は、電子制御装置５０に於いて制御プログラムを実行することにより達成されてよい。また、図示の構成は、使用者の指示に従って光分析のための光の計測が実行される際、作動される。なお、簡単のため図示していないが、電子制御装置５０に於いては、公知の態様にて、光分析装置の各種の設定、例えば、励起光又は検出光の波長帯域又は使用するレーザー及び受光器の選択、一回の蛍光の計測時間、計測回数等の設定を使用者の入力に基づいて実行する部分、種々の分光分析のためのパラメータの入力する部分等が設けられる。
【００３３】
図３（Ａ）を参照して、電子制御装置５０に於いては、シャッタの切換制御のために、励起光波長選択制御部５０ａと、励起光透過／遮断制御指令決定部５０ｂと、検出光透過／遮断制御指令決定部５０ｃとが設けられる。励起光波長選択制御部５０ａは、予め定められたスキームに従って、試料Ｓに照射されるべきレーザーＬａ〜Ｌｎの励起光を逐次的に選択し、指示指令を励起光透過／遮断制御指令決定部５０ｂと、検出光透過／遮断制御指令決定部５０ｃとに同時に送出する。例えば、二つのレーザーＬａ及びＬｂの励起光が計測に於いて用いられる場合には、これらの励起光が所定時間毎に交互に試料を照射するよう、ＬａとＬｂとのうちのいずれかを選択し、いずれの励起光が使用されるかが二つの制御指令決定部５０ｂ、５０ｃへ同時に指示される。制御指令決定部５０ｂ、５０ｃは、それぞれ、レーザーＬａ、Ｌｂの励起光路のシャッタ３０ａ、ｂのうち、指示された励起光に対応する方及び受光器ＡＰＤａ〜ｎの受光光路のシャッタ３２ａ、ｂのうち指示された励起光に対応する方を開放し、それ以外のシャッタを閉鎖して光の透過を遮断する。かくして、励起光波長選択制御部５０ａは、前記の如く、ＬａとＬｂとを交互に選択するので、シャッタ３０ａ、ｂ、３２ａ、ｂは、図３（Ｂ）に例示されている如く、交互に切換られることとなる（ＯＮが開放、ＯＦＦが閉鎖）。
【００３４】
一方、上記の如く励起光と検出光の切換を実行する間に、受光器ＡＰＤａ〜ｎにて検出された蛍光強度に対応する出力は、電子制御装置５０へ入力され、この分野で通常実行されているノイズ除去又はバックグラウンド減算及びＡ／Ｄ変換が実行された後、使用者の指定した信号解析を行う信号解析部へ送られる（なお、計測中、リアルタイムに解析が行われる必要はない。）。その際、受光器ＡＰＤａ〜ｎの各出力には、クロストークが原理的に混在しないこととなるので、信号解析部は、励起光波長選択制御部から、何時、励起光が切り換えられたかという情報をもらう必要はなく、従って、そのためのプログラミングを予め準備する必要がなくなる。又、クロストークを除去する処理が実行されないので、信号処理量が低減され、解析処理に要する時間も低減されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本発明の光分析装置の一つの好ましい実施形態である多重光照射−多重光検出型の蛍光分光分析装置の光学系を模式的に表したものである。図において、レーザーＬａ〜Ｌｎ及び受光器ＡＰＤａ〜ｎは、それぞれ、三体ずつ示されているが、それらの数は、任意であってよい。
【図２】図２（Ａ）は、二種類の蛍光分子を同時励起する場合の励起波長（一点鎖線）、蛍光波長（実太線）、励起光Ｌａ〜ｂ、受光器ＡＰＤａ〜ｂの検出域との関係を示した図である。λｅｘ１及びλｅｍ１は、それぞれ、一方の蛍光分子の励起・蛍光波長スペクトルであり、λｅｘ２及びλｅｍ２は、それぞれ、他方の蛍光分子の励起・蛍光波長スペクトルを示す。ＡＰＤｂの検出域に於いて、λｅｍ１の長波長が侵入している帯域に於いて、クロストークが生ずる（斜線の領域）。図２（Ｂ）、（Ｃ）は、本発明による励起光及び検出光の選択制御を実行した場合の（Ａ）と同様の図である。なお、蛍光分子の励起スペクトルは省略されている。（Ｂ）は、励起光Ｌａが選択されている場合であり、このとき、ＡＰＤａのみが光検出が許可（ＯＮ）されるので、λｅｍ１のうち、ＡＰＤａの検出域の実太線の付された帯域の蛍光が受光され、ＡＰＤｂの検出域に進入する成分は、ＡＰＤｂの出力に反映されない。（Ｃ）は、励起光Ｌｂが選択されている場合であり、λｅｍ２のうち、ＡＰＤｂのみが光検出が許可（ＯＮ）され、ＡＰＤｂの検出域の実太線の付された帯域の蛍光が受光される。
【図３】図３（Ａ）は、本発明の光分析装置の電子制御装置の内部構成の一部を制御機能ブロックの形式にて表したものである。図３（Ｂ）は、計測にレーザーＬａ〜ｂ及び受光器ＡＰＤａ〜ｂが用いられる場合の、図３（Ａ）に例示の構成により制御されるシャッタ３０ａ、ｂ及びシャッタ３２ａ、ｂの作動スキーム（時間変化）を表したものである。ＯＮは、開放（光透過）、ＯＦＦは、閉鎖（光遮断）を表す。
【符号の説明】
【００３６】
Ｌａ〜ｎ…レーザー
ＡＰＤａ〜ｎ…受光器
１４ａ〜ｎ，１６，２６ａ…ダイクロイックミラー
１８…対物レンズ
２２…ピンホール
２８ａ〜ｎ…バンドパスフィルター
３０ａ〜ｎ，３２ａ〜ｎ…シャッタ
５０…電子制御装置
【図１】
2009058405.tif 000003
【図２】
2009058405.tif 000004
【図３】
2009058405.tif 000005