(57)【要約】【課題】抗炎症作用を有するソバスプラウトの抽出物を提供する。【解決手段】ソバスプラウトを溶媒で抽出して得られるソバスプラウトの抽出物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソバスプラウトを溶媒で抽出して得られるソバスプラウトの抽出物。
【請求項２】
溶媒が、水性溶媒、有機溶媒またはその混合溶媒である、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
有機溶媒が、アルコールである、請求項２に記載の抽出物。
【請求項４】
抗炎症作用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抽出物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抽出物を含有する組成物。
【請求項６】
食料である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
化粧料である、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
医薬である、請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
近年炎症性腸疾患患者数の増大が報告され、様々なタイプの抗炎症剤や抗サイトカイン療法が行われているが、副作用の問題を含め解決すべき問題も多く残されている（非特許文献１)。したがって、副作用の少ない抗炎症剤の開発が求められている。
【０００２】
これまでに、培養細胞を使って食品抽出物の抗炎症効果が報告されている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。
【０００３】
しかし、ソバスプラウトおよびソバスプラウトの抽出物の抗炎症作用についての報告はない。
【０００４】
さらに、これまで食品抽出物の抗炎症効果の報告が培養細胞を用いたものがほとんどであったのに対し、本発明者は、培養細胞を用いた実験に加えさらにマウスを用いた実験においても、ソバスプラウトの抽出物が経口で抗炎症作用を示すことを見出した。
【非特許文献１】綜合臨牀2007.8/Vol.56/No.8, p.2423-2424
【非特許文献２】J.Altern.Compl.Med.2004.10:1009-1013
【非特許文献３】Biochem.Biophys.Res.Commun.2005.327:742-749
【非特許文献４】Planta Med.2006.72:697-702
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、抗炎症作用を有するソバスプラウトの抽出物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ソバスプラウトの抽出物が抗炎症作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
よって、
（１）本発明は、ソバスプラウトを溶媒で抽出して得られるソバスプラウトの抽出物に関する。
（２）本発明は、溶媒が、水性溶媒、有機溶媒またはその混合溶媒である、上記（１）に記載の抽出物に関する。
（３）本発明は、有機溶媒が、アルコールである、上記（２）記載の抽出物に関する。
（４）本発明は、抗炎症作用のための、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の抽出物に関する。
（５）本発明は、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の抽出物を含有する組成物に関する。
（６）本発明は、食料である、上記（５）に記載の組成物に関する。
（７）本発明は、化粧料である、上記（５）に記載の組成物に関する。
（８）本発明は、医薬である、上記（５）に記載の組成物に関する。
【発明の効果】
【０００８】
培養細胞及びマウスを用いた経口投与の実験からソバスプラウト抽出物に強い抗炎症作用を持つ物質が含まれることが明らかになった。したがって炎症性の疾患の予防もしくは治療への応用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で用いるソバとは、タデ科（Polygonaceae）ソバ属（Fagopyrum）に属する一年草で、Fagopyrum esculentumを意味する。
【００１０】
本発明で用いるスプラウトとは、植物の新芽の総称であるが、根、茎、新芽を含む植物体全体を意味する。好ましくは、子葉（双葉）が開いた状態で、茎と新芽を合わせた長さが５cm〜２０cm、より好ましくは５cm〜１０cmのものである。スプラウトには、バーティカルスプラウト、カールスプラウト、もやしスプラウト等が挙げられるが、好ましくは、暗室で育て、その後光をあてて育成させたバーティカルスプラウトまたは光をあてて育成させたバーティカルスプラウトである。
【００１１】
バーティカルスプラウトの栽培期間における暗期間と明期間の比は、例えば、栽培期間が合計８日間の場合、暗期間が０〜４日間、明期間が８〜４日間である。好ましくは、暗期間が０〜１日間、明期間が８〜７日間である。栽培期間における暗期間と明期間の比が様々であるバーティカルスプラウトの混合物であっても良い。
【００１２】
光は、自然光、人工光であってもよい。光の強さはソバの芽が育つ強度であれば限定されないが、好ましくは２０００〜２５０００ルクスである。
【００１３】
栽培の温度は、ソバの芽が育つ温度であれば限定されないが、好ましくは２０〜３５℃、より好ましくは、２５〜３５℃である。
【００１４】
栽培の湿度は、ソバの芽が育つ湿度であれば限定されないが、好ましくは６０〜９０％、より好ましくは、７０〜９０％である。
【００１５】
抽出に用いるソバスプラウトは、生であっても、乾燥されたものであってもよい。乾燥は、天日乾燥、加熱乾燥、真空乾燥、凍結乾燥であってよい。好ましくは凍結乾燥したソバスプラウトである。また、抽出に用いるソバスプラウトは、細断されていてもされていなくてもよい。
【００１６】
本発明で用いる溶媒は、液体であれば限定されないが、水性溶媒、有機溶媒またはそれらの混合溶媒、または超臨界ＣＯ２のような超臨界液体も含む。
【００１７】
水性溶媒は、水を含む液体であれば限定されないが、水、緩衝溶液（リン酸緩衝液など）などが挙げられる。これらには、無機塩（ＮａＣｌなど）、無機酸（ＨＣｌなど）、無機塩基（ＮａＯＨなど）、有機酸（ＣＨ３ＣＯＯＨなど）、アミノ酸などが含まれても良い。
【００１８】
有機溶媒には、アルコール、クロロホルム、酢酸エチル、エーテル、アセトンなどが挙げられる。
【００１９】
アルコールには、メタノール、エタノールなどが挙げられる。
【００２０】
水性溶媒と有機溶媒の混合溶媒中の水性溶媒と有機溶媒の混合比率は、いずれの比率であってもよいが、好ましくは、混合溶媒１００容量部中の有機溶媒の量が５０〜１００容量部、より好ましくは、５０〜８０容量部である。
【００２１】
抽出は、ソバスプラウトに溶媒を加えた後、攪拌または振とうして抽出を行う。
【００２２】
抽出における、ソバスプラウトと溶媒の混合比率は、凍結乾燥したソバスプラウト１００重量部に対して、溶媒が１０００〜１００００重量部、好ましくは１０００〜５０００重量部である。
【００２３】
抽出の温度は、１０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃である。
【００２４】
攪拌または振とうの回転数は、ソバスプラウトと溶媒が接触する回転数であれば特に限定されないが、５０〜１５０rpm、好ましくは８０〜１２０rpmである。
【００２５】
攪拌または振とうの時間は、特に限定されないが５〜４８時間、好ましくは１６〜２４時間である。
【００２６】
抽出の回数は、特に限定されないが、１回又は２回以上行うことができる。
【００２７】
抽出処理後、濾紙又は濾布による濾過又は遠心分離などの分離手段によりソバスプラウトの抽出液を得ることができる。
【００２８】
本発明で用いるソバスプラウトの抽出物は、ソバスプラウトの抽出液であってもよい。あるいは、ソバスプラウトの抽出液から溶媒を完全に又は部分的に除去したものであってよい。好ましくは、抽出液を乾燥させた固体、もしくは乾燥させた固体を７０容量％エタノール溶液に可溶化した液体である。抽出液の乾燥は、溶媒を蒸発させる方法であれば限定されないが、ロータリーエバポレーターを用いた方法及び／または凍結乾燥を用いた方法により乾燥させることが好ましい。
【００２９】
本発明で用いる、抗炎症作用とは、炎症の発生を抑制する作用、および／または、既に起こっている炎症を抑制する作用を意味する。ここで、炎症の発生を抑制する作用とは、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）により誘導される炎症性サイトカイン遺伝子の発現上昇および／または炎症性サイトカインの産生上昇を抑制する作用を意味し、また、既に起こっている炎症を抑制する作用とは、既に発現しているリポポリサッカライド（ＬＰＳ）により誘導される炎症性サイトカイン遺伝子の発現量および／または既に産生されている炎症性サイトカインの産生量を抑制する作用を意味する。
【００３０】
リポポリサッカライド（ＬＰＳ）による炎症の発生はグラム陰性細菌による敗血症において詳細に研究され（Chest 1991.100 :164-168）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）抗体を用いることで炎症が抑えられた実験的結果からリポポリサッカライド（ＬＰＳ）と炎症との関連性が証明されている（J.Immunol.1984.132:2590-2592）。また、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）により発生した炎症は、炎症性肝障害（Hepatology 2001.33 :1441-1450）、関節リウマチ（Scand.J.Immunol.2005.62:117-122）、炎症性腸疾患（J.Immunol.2005.174 :6416-6423）などの炎症性疾患モデルとなっている。
【００３１】
そして、本発明で用いる抗炎症作用は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦαからなる群から選択される少なくとも１つの炎症性サイトカンの遺伝子発現量および／または炎症性サイトカインの産生量を測定することで決定できる。
【００３２】
炎症性サイトカインの抑制と抗炎症作用との関連性については、炎症に対する炎症性サイトカインをブロックするモノクローナル抗体を用いた実験結果からその関連性が証明されている。
【００３３】
ＩＬ−８に対するモノクローナル抗体は、肺における急性炎症を顕著に抑制する（Nature 1993.365:654-657）。また、ＴＮＦαやＩＬ−６については臨床的にも抗体が応用され、炎症性腸疾患に対する抗ＴＮＦα抗体（Gastroenterology 2004.126:1593-1610）や、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６抗体（Arthritis Rheum.2004.50:1761-1769）が、炎症を治療しすばらしい臨床成績を上げている。
【００３４】
よって、ＩＬ−６、ＩＬ−８、またはＴＮＦα遺伝子の発現量および／またはＩＬ−６、ＩＬ−８、またはＴＮＦαの産生量の測定は、炎症の発生を抑制する作用、および／または、既に起こっている炎症を抑制する作用を測定する上でよい指標となりうる。したがって、（処理された対象でのＩＬ−６、ＩＬ−８、またはＴＮＦα遺伝子の発現量）÷（未処理の対象でのＩＬ−６、ＩＬ−８、またはＴＮＦα遺伝子の発現量）×１００が、８０％〜０％、好ましくは５０％〜０％となる場合、および／または、（処理された対象でのＩＬ−６、ＩＬ−８、またはＴＮＦαの産生量）÷（未処理の対象でのＩＬ−６、ＩＬ−８、またはＴＮＦαの産生量）×１００が８０％〜０％、好ましくは５０％〜０％となる場合を、抗炎症作用があると判断する。
【００３５】
また、本願発明には、本発明のソバスプラウトの抽出物を含む組成物が含まれる。組成物は、限定されないが、食品、化粧料、医薬の形態などが挙げられる。
【００３６】
本発明のソバスプラウトの抽出物は、それ自体で食品または食品添加物として使用することもできるし、食品の製造のために使用することもできる。特に、本発明のソバスプラウトの抽出物は、抗炎症作用を有するので、抗炎症作用を有する機能性食品の製造に使用することができる。ここで、食品には飲料品も含まれる。また、食品の形態は限定されないが、固体、粉体、溶液、懸濁液、クリーム、ゲル、グミ、シロップなどが挙げられる。
【００３７】
また、本発明のソバスプラウトの抽出物は、化粧料の製造のために使用することもできる。特に、本発明のソバスプラウトの抽出物は、抗炎症作用を有するので、炎症を抑制する成分として化粧料に配合することができる。化粧料の形態は限定されないが、パウダー、クリーム、溶液、懸濁液、乳液、ローションなど挙げることができる。
【００３８】
また、本発明のソバスプラウトの抽出物は、医薬の製造において使用することもできる。特に、本発明のソバスプラウトの抽出物は、抗炎症作用を有するので、抗炎症剤の製造に使用することができ、炎症性の疾患もしくは障害の予防もしくは治療に使用することができる。
【００３９】
炎症性の疾患もしくは障害とは、炎症性肝障害、関節リウマチ、炎症性腸疾患を意味する。好ましくは、炎症性肝障害である。
【００４０】
予防とは、疾患もしくは障害の発症を防ぐことまたは遅らせることを意味する。また、治療とは、既に発症している疾患もしくは障害の進行を抑制したり、または症状を改善もしくは軽減することを意味する。
【００４１】
予防もしくは治療は、疾患もしくは障害の予防や治療を必要とする被験者に、治療または予防のために有効な量の本発明のソバスプラウトの抽出物を投与することによって実施することができる。
【００４２】
被験者とは、哺乳動物、例えば、ヒト、犬、猫等の愛玩動物、ウシ、ブタ、ニワトリ等の家畜動物であるが、特にヒトであることが好ましい。
【００４３】
投与とは、全身投与、局所投与であってよく、全身投与、局所投与は、経皮投与、舌下投与、経口投与、経腸投与、筋肉内投与、皮下投与、静脈投与、経鼻投与、吸入投与、点眼などいずれの投与形態であってもよい。そのため、医薬の形態は限定されないが、クリーム、舌下剤、マッサジ油、溶液、懸濁液、ローション、軟膏、ゲル、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、坐剤などを挙げることができる。
【００４４】
治療または予防のために有効な量とは、疾患もしくは障害の程度、投与方法によって異なり、炎症を抑制するために有効な量であれば限定されないが、乾燥形態の本発明のソバスプラウトの抽出物の量が、１〜１００mg／体重kg・日、好ましくは５〜５０mg／体重kg・日である。
【００４５】
本発明の組成物には、慣用の担体、賦形剤、または添加剤等をさらに含んでもよい。慣用の担体、賦形剤、または添加剤等には、溶媒、植物油、鉱油、脂肪油、流動パラフィン、緩衝剤、保存剤、湿潤剤、キレート剤、抗酸化剤、安定化剤、乳化剤、懸濁化剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、坐剤基剤、浸透促進剤、芳香剤、甘味料、着色料、香料および皮膚保護剤などが挙げられる。
【００４６】
本発明について、以下の例によって更に説明する。ただし本発明は以下に示す例に限られたものではないことを理解されたい。
【実施例１】
【００４７】
ソバスプラウトのエタノール抽出物（ＥｘｔＢＳ）の調製
新得物産株式会社より入手したボタンそば（Fagopyrum esculentum）種子を、連続して４日間暗所で、その後連続して４日間明所（自然光、２０００〜２５０００ルクス）で栽培（合計８日間栽培）してソバスプラウト（５〜１５cm）を得た。栽培は、ＰＳ（ポリスチレン）のスプラウト用容器（赤松化成工業（株）、ＳＧ−１５０）にウレタンマット（田源（株）、ＡＨ）を敷き、洗浄したボタンそば種子を播種し、水道水を２時間毎に散布し、約３０℃、湿度約８０％で栽培した。
【００４８】
得られたスプラウト（根も含むスプラウト全体）は、凍結乾燥後、粉末化する。この乾燥粉末３０ｇ（生鮮で約４００ｇ相当）と２リットルの７０容量％エタノール（残りの３０容量％は水である）を、角型透明瓶（ＮＡＬＧＥＮＥ）に入れて混合する。次に、室温（約２２．５℃）で１７時間振とう（１００rpm／min、振とう培養装置ＩＭ４１、ヤマト科学（株））を行った後、ADVANTECろ紙（No.２、９０mm）を用いた吸引ろ過により７０容量％エタノール部分を回収して、ソバスプラウトの７０％エタノール抽出液（２リットル）を調製した。
【００４９】
次に、このソバスプラウトの７０％エタノール抽出液をロータリーエバポレーター（ＥＬ１３１型、柴田科学（株））を用いて、約２時間濃縮（０．２リットル）した後、真空凍結乾燥機（ＴＦＤ−５５０−８、（株）宝製作所）で約４８時間の凍結乾燥を行った。凍結乾燥物の重量（１．５ｇ）を秤量し、再度７０％容量エタノール溶液で溶解し、これをソバスプラウトのエタノール抽出物（ＥｘｔＢＳ）として用いた。
【実施例２】
【００５０】
ヒト大腸ガン細胞によるソバスプラウトのエタノール抽出物（ＥｘｔＢＳ）の抗炎症効果
ヒト大腸ガン細胞（ＣｏＬｏＴＣ細胞（ＲＣＢ１９８４）；理研細胞バンクより購入）を用いてソバスプラウトのエタノール抽出物（ＥｘｔＢＳ）の抗炎症効果を、ＬＰＳ刺激による炎症性サイトカインであるＩＬ−８の産生および遺伝子発現を測定することにより決定した。
【００５１】
ＣｏＬｏＴＣ細胞は１０％牛胎仔血清（Biological Industries）を含む培養液{Dulbecco's modified Eagle's medium (Sigma)}を用いて５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
【００５２】
抗炎症効果の実験ではＣｏＬｏＴＣ細胞（106 cells/well）を６−ｗｅｌｌ培養プレート（BD Falcon）で培養し、４時間後培養液中にＬＰＳ（L2880, Sigma）を濃度１００ng／mlになるように添加して細胞を刺激した。また同時にＥｘｔＢＳ（１００mg／ml、実施例１で得られた凍結乾燥物を７０％容量エタノールに溶解して調製した）を培養液の１００分の１量添加し、対象群にも同量の７０％容量エタノールを加え、培養した。１６時間培養後、上清を回収し、培養液中のインターロイキン−８（ＩＬ−８）産生量をヒトＩＬ−８  ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いキットの指示書に従って測定した。結果は、独立した３つの実験結果の平均±ＳＤで図１Ｂに示す。
【００５３】
また、細胞はPhosphate-buffered saline（PBS, Sigma）により洗浄した後、セルスクレーパー（住友ベークライト）を用いて回収した。回収した細胞からRNAiso（TaKaRa BIO）を用いてtotal RNAを調製した。なお、このRNAisoは、グアニジンイソチオシアン酸塩とフェノールなどを含むtotal RNA抽出溶液（Anal.Biochem.1990.188:338-343）であるが、公知の他のtotal RNA抽出方法を用いてもよい。
【００５４】
細胞にRNAiso ５００μlを加え、ピペッティングにより懸濁し、室温で５分間放置する。次に１００μlのクロロホルムを加え強く振って混合する。室温で５分間放置した後、インバータマイクロ冷却遠心機（1720、（株）久保田製作所）を用いて１２，０００ｘｇ、４℃、１５分間遠心し、上清１５０μlを別のチューブに移し、同量のイソプロパノールを加えて混合し、室温で１０分間放置する。これをインバータマイクロ冷却遠心機により１２，０００ｘｇ、４℃、１０分間遠心し、沈殿を得る。これを５００μlの７０％容量エタノール溶液を加えて洗浄し、１２，０００ｘｇ、４℃、５分間遠心して沈殿を得、乾燥後３０μlのRNA water（TaKaRa BIO）に溶解し、ＲＮＡサンプルとした。
【００５５】
２６０nmでの吸光度によりＲＮＡ濃度を０．２５mg／mlに調製し、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0（TaKaRa BIO）を用いて以下の記載するようにＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcriptase-polymerase chain reaction）を行った。なお、ＲＴ−ＰＣＲは、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0（TaKaRa BIO）以外の他の市販のキットを用いても実施できる。
【００５６】
サンプルRNA  ２５μg／mlを含む逆転写反応溶液（5 mM MgCl2, 1x RT buffer, 1 mM dNTP mix, 1 U/μl RNase inhibitor, 0.25 U/μl AMV reverse transcriptase XL, 2.5 μM random 9 mers）を調製し、サーマルサイクラー（2720、アプライドバイオシステムズ）にセットし、３０℃で１０分、４２℃で１５分、９９℃で５分、５℃で５分の反応を行った。反応の終わった逆転写反応溶液をＩＬ−８とコントール遺伝子増幅用とに分注し、逆転写反応溶液１容量に対し、４倍量のＰＣＲ反応液（1x PCR buffer, 25 mU/μl TaKaRa Ex Taq（登録商標） HS, ０．２μMフォーワードプライマーおよびリバースプライマー）を加えてサーマルサイクラーにセットし、９４℃で２分反応後、ＰＣＲ反応（９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒）を３０サイクル行い、最後に７２℃で１分反応後、４℃で保存した。
【００５７】
ＩＬ−８の増幅には、ＩＬ−８用フォーワードプライマー（配列番号１）：5'-acatgacttccaagctgg-3'とＩＬ−８用リバースプライマー（配列番号２）：5'-gaagtttcactggcatcttc-3'）を用いた。コントロール遺伝子としてのグリセロ３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の増幅には、ＧＡＰＤＨ用フォーワードプライマー（配列番号３）：5'-accacagtccatgccatca-3'とＧＡＰＤＨ用リバースプライマー（配列番号４）：5'-caccctgttgctgtagcc-3'）を用いた。増幅産物はミューピッド２プラス（（株）アドバンス）を用いた２％アガロースゲル上で電気泳動された後、エチジウムブロマイドで染色された。その後、トランスイルミネーター（デンシトグラフＡＢ−１５００、アトー株式会社）上で染色されたＤＮＡのバンドをポラロイド撮影し、目視で増幅の比較を行った。結果を図１Ａに示す。
【００５８】
ソバスプラウトのエタノール抽出物（ＥｘｔＢＳ）の細胞に対する毒性はトリパンブルーを用いた染色により、生細胞と死細胞を計数する方法で行った。細胞は抗炎症効果実験と同一の方法で処理し、処理後１６時間後に細胞を回収し、ＰＢＳで細胞を懸濁し、同量のトリパンブルー溶液（Sigma）を添加して５分後に顕微鏡下で計数した。その結果を図１Ｃに示す。
【００５９】
ヒト大腸ガン細胞を用いた実験結果からＥｘｔＢＳには、ＬＰＳ刺激による炎症性サイトカインＩＬ−８の遺伝子発現を抑制する作用が確認された（図１Ａ）。また、ＩＬ−８の産生量についても抑制する作用が確認された（図１Ｂ）。すなわち、コントロール細胞の培養液中ＩＬ−８は６２．１±６．４pg／mlであったが、ＬＰＳ刺激によりＩＬ−８は１６８．８±１６．５pg／mlに上昇し、ＥｘｔＢＳの添加によりＩＬ−８は１１０．８±２２．０pg／mlと顕著に抑制された。
【００６０】
また、このとき細胞毒性はいずれの処理によっても認められなかった（図１Ｃ）。これより、ＬＰＳ刺激による炎症の発生を、ソバスプラウトのエタノール抽出物（ＥｘｔＢＳ）が抑制する可能性がin vitroで示された。
【実施例３】
【００６１】
ＬＰＳ刺激によるＩＬ−８遺伝子発現に対するポリフェノールおよびソバスプラウトのエタノール抽出物（ＥｘｔＢＳ）の効果比較
ソバにはルチン等ポリフェノールが含まれていることが知られており、ＨＰＬＣ分析によりＥｘｔＢＳにも６種類のポリフェノール（ビテキシン、イソビテキシン、オリエンチン、イソオリエンチン、クロロゲン酸、ルチン）が存在し、総量で約５０mg／g含有することを確認した。
【００６２】
そこで、含有する６種類を含む７種類のポリフェノール｛ビテキシン（Ｖ）、イソビテキシン（ＩＶ）、オリエンチン（Ｏ）、イソオリエンチン（ＩＯ）、ケラシアニン（Ｋ）、クロロゲン酸（ＣＡ）それにルチン（Ｒ）；これらのポリフェノールはすべてフナコシより購入｝についてＬＰＳ刺激により誘導されるＩＬ−８遺伝子発現に対する影響をＥｘｔＢＳと比較した。
【００６３】
個々のポリフェノールとＥｘｔＢＳとの比較
ＥｘｔＢＳは培養液中に１mg／mlの濃度で添加していることから、１mg／mlのＥｘｔＢＳ中には約５０μg／mlポリフェノールが含まれると考えられる。そこで、それぞれの標準品をその2倍に相当する１００μg／mlの濃度で添加し、その効果を観察した。ＩＬ−８遺伝子発現の測定は、実施例２と同様に行った。
【００６４】
結果を図２Ａに示す。ルチンで弱い抗炎症効果が認められたが、ＥｘｔＢＳのそれより著しく弱かった。
【００６５】
６種類のポリフェノールの混合物とＥｘｔＢＳとの比較
ＥｘｔＢＳは培養液中に１mg／mlの濃度で添加していることから、１mg／mlのＥｘｔＢＳ中には約５０μg／mlの濃度でポリフェノールが含まれると考えられる。そこで、ＥｘｔＢＳに含まれるポリフェノールと同じ組成と濃度のポリフェノール標準品からなる約５０μg／mlのポリフェノール混合溶液（２．０μg／mlクロロゲン酸、６．４μg／mlオリエンチン、１２．６μg／mlイソオリエンチン、１０．８μg／mlビテキシン、８．３μg／mlイソビテキシン、９．４μg／mlルチン）を調製し、培養液に添加し、その効果を観察した。ＩＬ−８遺伝子発現の測定は、実施例１と同様に行った。
【００６６】
結果を図２Ｂに示す。ＥｘｔＢＳに含まれるポリフェノールと同じ組成のポリフェノール標準品の混合溶液ではＩＬ−８遺伝子発現の抑制は認められなかった。
【００６７】
以上の結果より、ＥｘｔＢＳの抗炎症作用は、ＥｘｔＢＳ中のポリフェノールの作用だけでは説明できないことが明らかとなった。
【実施例４】
【００６８】
マウスを用いた抗炎症効果（経口投与）
マウスはＣ５７Ｂｌｃメスマウス８週齢（日本チャールズリバー）を購入し、４日間の飼育後、一晩絶食させ、１群３匹で実験を行った。２０mg／ml  ＬＰＳと１００mg／ml  ＥｘｔＢＳの７０容量％エタノールもしくは７０容量％エタノールを等量混和し、マウスあたり０．２mlを強制経口投与した。対照群には３５容量％エタノールを０．２ml投与した。投与後４時間で採血し、脾臓と肝臓を摘出した。抗炎症効果は、ＬＰＳ刺激により誘導される炎症性サイトカインであるＩＬ−６とＴＮＦ−αの産生および遺伝子発現を測定することにより決定した。
【００６９】
脾臓と肝臓については、それぞれの臓器約０．２gに５００μlのRNAiso（TaKaRa BIO）を加え、マイクロホモジナイザーヒスコトロン（（株）マイクロテック・ニチオン）を用いてホモジナイズし、その後は実施例２と同様の方法でtotal RNAを調製した。２６０nmでの吸光度によりRNA濃度を０．２５mg／mlに調製し、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 （TaKaRa BIO）を用いて実施例２と同様の方法でＲＴ−ＰＣＲを行った。ただし、プライマーは次のＩＬ−６とＴＮＦ−α用プライマーを用いた。
【００７０】
ＩＬ−６とＴＮＦ−αの増幅にはそれぞれＩＬ−６用プライマーセット（ＩＬ−６用フォーワードプライマー（配列番号５）：5'-gagacttcacagaggatac-3'およびＩＬ−６用リバースプライマー（配列番号６）：5'-tgtactccaggtagctatg-3'）とＴＮＦ−α用プライマーセット（ＴＮＦ−α用フォーワードプライマー（配列番号７）：5'-gctcttctgtctactgaac-3'と用リバースプライマー（配列番号８）：5'-cttgtcccttgaagagaac-3'）を用いて行った。ＧＡＰＤＨ用プライマーセットは実施例２と同一のもの（配列番号３と４）を使用した。
【００７１】
結果を図３に示す。脾臓、肝臓ともＩＬ−６やＴＮＦ−αといった炎症性サイトカイン遺伝子の発現はＬＰＳ投与により顕著に上昇するが、その上昇はＥｘｔＢＳの同時投与により抑制され、ほぼコントロールと同レベルであった。
【００７２】
また、血液は室温で凝固させ、遠心により血清を分離した。血清中のＩＬ−６とＴＮＦ−αの量をマウスＩＬ−６  ELISAキット及びマウスＴＮＦ−αELISAキット（R&D Systems）を用いて測定した。
【００７３】
結果は１群４ないし５匹のマウス血清サンプルの測定結果の平均±ＳＤで図４に示す。ＬＰＳ投与により血清中のＩＬ−６量は３．６±１．３pg／mlから２３５．２±８６．０pg／mlに、またＴＮＦ−α量は６．３±３．８pg／mlから１０６．７±３７．４pg／mlに上昇するが、ＥｘｔＢＳの同時投与で、ＩＬ−６は２８．８±１６．３pg／ml、ＴＮＦ−ａは２３．７±１１．７pg／mlとその上昇を有意に低下させた。
【００７４】
これより、ＬＰＳ刺激による炎症の発生を、ソバスプラウトのエタノール抽出物（ＥｘｔＢＳ）が、in vivoにおいても抑制する可能性が示された。
【実施例５】
【００７５】
マウスを用いた抗炎症効果（腹腔内投与）
次に投与方法を腹腔内投与に変えてＥｘｔＢＳの効果を検討した（図６）。腹腔内投与ではＬＰＳに対する感受性が高まることから投与量は強制経口投与の２０００分の１量、すなわちマウスあたり１μg  ＬＰＳで刺激した。ＥｘｔＢＳは強制経口投与の場合と同一割合で希釈したものとその１００倍量との２種類の濃度を以下のように調製した。１０μg／ml  ＬＰＳ−ＰＢＳ溶液と｛ＰＢＳと０．５または５０mg／ml  ＥｘｔＢＳの７０％エタノールとの混合液（９：１）｝とを等量混和し、これらをマウスあたり０．２mlを腹腔内投与した。対照群には３．５％エタノール−ＰＢＳ溶液を０．２ml投与した。
【００７６】
マウスはＣ５７Ｂｌｃメスマウス８週齢（日本チャールズリバー）を４日間の飼育後、一晩絶食させ、１群３匹で実験を行った。投与後４時間で脾臓と肝臓を摘出し、実施例４の方法で脾臓と肝臓からtotal RNAを調製し、ＲＴ−ＰＣＲによりＩＬ−６とＴＮＦ−αの発現量を比較した。アガロースゲル電気泳動画像をスキャナーGT-X750（エプソン）で取り込み、画像読み取りソフトScion Image（Scion Corporation）によりＤＮＡバンドを数値化し、ＧＡＰＤＨのバンドで補正して比較した（図５）。
【００７７】
図５からも明らかなようにＥｘｔＢＳは腹腔内投与ではＬＰＳによる刺激を抑えることができないばかりか、脾臓においてはむしろＩＬ−６の発現量を顕著に上昇させることが明らかとなった。これよりＥｘｔＢＳがＬＰＳとの非特異的結合によりＬＰＳのＬＰＳ受容体（ＴＬＲ４）への結合を阻害して、炎症の発生を抑制しているのではないことがわかった。
【００７８】
ＥｘｔＢＳの抗炎症作用が、ＬＰＳのような炎症を引き起こす物質と非特異的に結合することで炎症の発生を抑制する作用でないことから、ＥｘｔＢＳの炎症発生予防効果は、ＬＰＳによる刺激に限らず、広く炎症の発生を予防できると考えられた。
【実施例６】
【００７９】
マウスを用いた急性肝障害に対する効果
ＬＰＳとガラクトサミン投与による急性肝障害の発生に対する影響を検討した。なお、高濃度のガラクトサミンを投与することにより、肝障害が引き起こされることは古くから良く知られたことであり（Gastroenterology 1978.74:664-671）、また、ＬＰＳをガラクトサミンと同時投与することでこの肝障害の発生が顕著になることも、そしてこれがＬＰＳにより産生されたＴＮＦαによるものであることもまた証明されている（Hepatology 1990.12:1187-1191）。
【００８０】
マウスは１群１０匹を用い、ＬＰＳのみ、またはＬＰＳ及びＥｘｔＢＳは実施例４と同様に強制経口投与し、同時にそれぞれのマウスの腹腔内に５０mg／mlガラクトサミン（和光）ＰＢＳ溶液を０．２ml投与し、その後の生存率を５日間観察した（図６Ａ）。
【００８１】
２４時間後の生存率はＬＰＳのみでは６０％であったが、同時にＥｘｔＢＳを投与すると生存率は８０％に上昇した。これより、ＥｘｔＢＳがＬＰＳとガラクトサミンによる急性肝障害の発生を予防できることが示された（図６Ａ）。
【００８２】
また、同様にＬＰＳのみ、またはＬＰＳ及びＥｘｔＢＳを強制経口投与し、対照には３５％エタノールを投与し、同時にそれぞれのマウスの腹腔内にガラクトサミン（和光）ＰＢＳ溶液を投与し、２４時間後に肝臓を摘出し、へマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色した（図６Ｂ）。
【００８３】
２４時間後に摘出した肝臓は１辺約５mmのブロックに裁断し、１０％ホルマリン液（和光純薬）で固定した。順じエタノール濃度を上げていくことで脱水し、溶解させたパラフィン（和光純薬）を用いて包埋した。ミクロトームＲＭ２１２５ＲＴ（ライカ）で４μmの切片を調製した後、ヘマトキシリン溶液（和光純薬）とエオシン溶液（和光純薬）を用いて染色した。これを顕微鏡（ＢＸ５１、オリンパス）下で観察した。図内のバーは１００μmを示す（図６Ｂ）。
【００８４】
組織染色による観察でもＬＰＳ刺激により肝臓に炎症が認められたが、ＥｘｔＢＳによりその炎症が抑制されていることも観察された（図６Ｂ）。これより、ＥｘｔＢＳがＬＰＳとガラクトサミンによる肝臓における炎症の発生を予防できることが示された。
【実施例７】
【００８５】
ＩＬ−６とＩＬ−８を高発現する細胞におけるソバスプラウトのエタノール抽出物（ＥｘｔＢＳ）の抗炎症効果
ＨｅＬａ細胞は、炎症性サイトカインであるＩＬ−６もしくはＩＬ−８遺伝子を高発現している細胞である（Cell Biochem.Funct.2004.22:41-44）。そこで、ＨｅＬａ細胞中のＩＬ−６もしくはＩＬ−８遺伝子発現に対するＥｘｔＢＳの効果を測定した。ＨｅＬａ細胞には、ＬＰＳを添加しないでＥｘｔＢＳのみを添加した。ＥｘｔＢＳ添加１６時間後に、ＩＬ−６もしくはＩＬ−８遺伝子およびコントロール遺伝子であるグリセロ３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の発現をそれぞれＲＴ−ＰＣＲにより測定し、比較した。ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現測定は、実施例２と４と同様に実施した。
【００８６】
ヒト頚部癌細胞であるＨｅＬａ細胞はＩＬ−６とＩＬ−８を高発現する細胞であるが、ＥｘｔＢＳは、すでに高レベルであるこれらサイトカインの発現を顕著に抑制した、すなわちＩＬ−６では無処理の１８．９％に、またＩＬ−８では無処理の３７．９％に発現が低下した（図７ＡおよびＢ）。
【実施例８】
【００８７】
８日間明所のみで栽培したソバスプラウトを用いて、実施例１と同様にExtBSを調製し、実施例２〜７の実験を行ったところ、明所のみで栽培したExtBSにも、実施例１のExtBS（４日間暗所＋４日間明所）と同様に強い抗炎症作用が認められた。これより、ソバスプラウトの栽培には、暗期間が無くてもよいことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明のソバスプラウトの抽出物は、食品、食品添加物、化粧料、医薬の製造に使用することができる。特に、本発明のソバスプラウトの抽出物は、抗炎症作用を有するので炎症性の疾患の予防、治療に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ヒト大腸ガン細胞（ＣｏＬｏＴＣ）を用いた抗炎症効果。（Ａ）ＣｏＬｏＴＣ細胞中の炎症性サイトカインであるＩＬ−８とコントロール遺伝子であるグリセロ３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ用いて測定した。増幅産物は、２％アガロースゲル上で電気泳動され、エチジウムブロマイドで染色された。ＬＰＳ：１００ng／ml  ＬＰＳ、ＥｘｔＢＳ：１mg／ml  ＥｘｔＢＳ、＋：培地中に含まれていること、−：培地中に含まれていないことを表す。（Ｂ）培養液中のインターロイキン−８（ＩＬ−８）産生量をヒトＩＬ−８  ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いて測定した。結果は、独立した３つの実験結果の平均±ＳＤで示す。＊は、統計学的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５）。ＬＰＳ：１００ng／ml  ＬＰＳ、ＥｘｔＢＳ：１mg／ml  ＥｘｔＢＳ、＋：培地中に含まれていること、−：培地中に含まれていないことを表す。（Ｃ）ＣｏＬｏＴＣ細胞の生存率を示す。生存率は、トリパンブルーを用いた染色により、生細胞と死細胞を計数後、（生細胞数）÷（生細胞数＋死細胞数）×１００により求めた。結果は、独立した３つの計数結果の平均±ＳＤで示す。ＬＰＳ：１００ng／ml  ＬＰＳ、ＥｘｔＢＳ：１mg／ml  ＥｘｔＢＳ、＋：培地中に含まれていること、−：培地中に含まれていないことを表す。
【図２】ＬＰＳ刺激によるＩＬ−８遺伝子発現に対するポリフェノールおよびソバスプラウトのエタノール抽出物（ＥｘｔＢＳ）の効果比較。（Ａ）各ポリフェノール（クロロゲン酸、オリエンチン、イソオリエンチン、ビテキシン、イソビテキシン、ルチン、ケラシアニン）とＥｘｔＢＳとの比較。ＣｏＬｏＴＣ細胞中の炎症性サイトカインであるＩＬ−８とコントロール遺伝子であるグリセロ３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ用いて測定した。増幅産物は、２％アガロースゲル上で電気泳動され、エチジウムブロマイドで染色された。＋ＥｘｔＢＳ：１mg／ml  ＥｘｔＢＳが培地中に含まれていること、＋Ｖ：１００μg／mlビテキシンが培地中に含まれていること、＋ＩＶ：１００μg／mlイソビテキシンが培地中に含まれていること、＋Ｏ：１００μg／mlオリエンチンが培地中に含まれていること、＋ＩＯ：１００μg／mlイソオリエンチンが培地中に含まれていること、＋Ｋ：１００μg／mlケラシアニンが培地中に含まれていること、＋ＣＡ：１００μg／mlクロロゲン酸が培地中に含まれていること、＋Ｒ：１００  μg／mlルチンが培地中に含まれていることを表す。＋；１００ng／ml  ＬＰＳが培地中に含まれていること、−：ＬＰＳが培地中に含まれていないことを表す。（Ｂ）６種類のポリフェノールの混合物（＋Ｐｍｉｘ）とＥｘｔＢＳとの比較。ＣｏＬｏＴＣ細胞中の炎症性サイトカインであるＩＬ−８とコントロール遺伝子であるグリセロ３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ用いて測定した。増幅産物は、２％アガロースゲル上で電気泳動され、エチジウムブロマイドで染色された。＋Ｐｍｉｘ：ポリフェノール混合液（２．０μg／mlクロロゲン酸、６．４μg／mlオリエンチン、１２．６μg／mlイソオリエンチン、１０．８μg／mlビテキシン、８．３μg／mlイソビテキシン、９．４μg／mlルチン）が培地中に含まれていること、＋ＥｘｔＢＳ：１  mg／ml  ＥｘｔＢＳが培地中に含まれていることを表す。＋；１００ｇ／ml  ＬＰＳが培地中に含まれていること、−：ＬＰＳが培地中に含まれていないことを表す。
【図３】経口投与マウスにおける抗炎症効果（ＩＬ−６とＴＮＦ−αの遺伝子発現）。脾臓と肝臓における、炎症性サイトカインであるＩＬ−６とＴＮＦ−αとコントロール遺伝子であるグリセロ３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ用いて測定した。増幅産物は、２％アガロースゲル上で電気泳動され、エチジウムブロマイドで染色された。対照群：３５容量％エタノール０．２ml、ＬＰＳ投与群：１０mg／ml  ＬＰＳの３５％容量エタノール溶液０．２ml、ＬＰＳ＋ＥｘｔＢＳ投与群：１０mg／ml  ＬＰＳ＋５０mg／ml  ＥｘｔＢＳの３５容量％エタノール溶液０．２mlをそれぞれマウスに経口投与し、投与４時間後に各臓器を摘出した。
【図４】経口投与マウスにおける抗炎症効果（ＩＬ−６とＴＮＦ−αの産生）。血清中のＩＬ−６とＴＮＦ−αの量をマウスＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキット及びマウスＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いて測定した。結果は、１群４ないし５匹のマウス血清サンプルの測定結果の平均±ＳＤで示す。＊は、統計学的に有意であることを示す（ｐ＜０．００５）。対照群：３５容量％エタノール０．２ml、ＬＰＳ投与群：１０mg／ml  ＬＰＳの３５容量％エタノール溶液０．２ml、ＬＰＳ＋ＥｘｔＢＳ投与群：１０mg／ml  ＬＰＳ＋５０mg／ml  ＥｘｔＢＳの３５容量％エタノール溶液０．２mlをそれぞれマウスに経口投与し、投与４時間後に心臓より採血した。
【図５】腹腔内投与マウスにおける抗炎症効果（ＩＬ−６とＴＮＦ−αの遺伝子発現）。ＬＰＳまたはＬＰＳ＋ＥｘｔＢＳをマウス（１群３匹）に腹腔内投与し、投与後４時間の脾臓と肝臓におけるＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＧＡＰＤＨの発現量をＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＩＬ−６とＴＮＦ−αの発現量は、増幅産物のアガロースゲル電気泳動画像をスキャナーで取り込み、Scion ImageによりＤＮＡバンドを数値化し、ＧＡＰＤＨに対する比で表した。結果は、独立した３匹の実験結果の平均±ＳＤで示す。対照群：３．５容量％エタノール−ＰＢＳ溶液０．２ml、ＬＰＳ投与群：５μg／ml  ＬＰＳの３．５容量％エタノール−ＰＢＳ溶液０．２ml、ＬＰＳ＋ＥｘｔＢＳ投与群：５μg／ml  ＬＰＳ＋２５μg／ml  ＥｘｔＢＳの３．５容量％エタノール−ＰＢＳ溶液０．２ml、ＬＰＳ＋ＥｘｔＢＳ（×１００）投与群：５μg／ml  ＬＰＳ＋２．５mg／ml  ＥｘｔＢＳの３．５容量％エタノール−ＰＢＳ溶液０．２mlをそれぞれマウスに腹腔内投与し、投与４時間後に各臓器を摘出した。
【図６】マウスを用いた急性肝障害に対する効果（経口投与）。（Ａ）生存率：マウスは１群１０匹（ｎ＝１０）を用い、１０mg／ml  ＬＰＳの３５容量％エタノール溶液０．２mlまたは１０mg／ml  ＬＰＳ＋５０mg／ml  ＥｘｔＢＳの３５容量％エタノール溶液０．２mlをマウスに強制経口投与し、同時に腹腔内に５０mg／mlガラクトサミン（和光純薬）ＰＢＳ溶液を投与し、その後の生存率を観察した。（Ｂ）組織染色：ＬＰＳのみ、またはＬＰＳ及びＥｘｔＢＳを強制経口投与し、対照には３５容量％エタノールを投与し、同時にそれぞれのマウスの腹腔内にガラクトサミン（和光）ＰＢＳ溶液を投与した。２４時間後に肝臓を摘出し、肝臓をへマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色した画像を示す。図内のバーは１００μmを示す。
【図７】ＨｅＬａ細胞のＩＬ−６、ＩＬ−８遺伝子発現に対するソバスプラウトのエタノール抽出物（ＥｘｔＢＳ）の効果比較。ＨｅＬａ細胞中の炎症性サイトカインであるＩＬ−６もしくはＩＬ−８遺伝子発現に対するＥｘｔＢＳの効果を測定した。測定は、ＥｘｔＢＳ処理１６時間後のＩＬ−６もしくはＩＬ−８遺伝子発現とコントロール遺伝子であるグリセロ３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の発現をそれぞれＲＴ−ＰＣＲにより測定し、比較した。増幅産物は、２％アガロースゲル上で電気泳動され、エチジウムブロマイドで染色された。ＩＬ−６とＩＬ−８の発現量は、増幅産物のアガロースゲル電気泳動画像（Ｂ）をスキャナーで取り込み、Scion ImageによりＤＮＡバンドを数値化し、ＧＡＰＤＨに対する比で表した（Ａ）。＋ＥｘｔＢＳ：１mg／ml  ＥｘｔＢＳが培地中に含まれていることを表す。−：ＥｘｔＢＳが培地中に含まれていないことを表す。結果は、独立した３回の実験結果の平均±ＳＤで示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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