(57)【要約】      （修正有）【課題】出芽酵母を用いて開発されたＧｅｎｅｔｉｃ−Ｔａｇ−ｏｆ−Ｗａｒ（ｇＴＯＷ）法を分裂酵母でも実現するためのシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターの提供。【解決手段】マーカー遺伝子としてのｌｅｕ２ｄ遺伝子と、前記ｌｅｕ２ｄ遺伝子の発現を制御するプロモーター領域として特定の塩基配列のうち３´末端側の１塩基または２以上の塩基とを少なくとも有する、シゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。【選択図】図５
2009112272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マーカー遺伝子としてのｌｅｕ２ｄ遺伝子と、
前記ｌｅｕ２ｄ遺伝子の発現を制御するプロモーター領域として配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち３´末端側の１塩基または２以上の塩基と
を少なくとも有することを特徴とする、シゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
【請求項２】
第２のマーカー遺伝子としてｕｒａ４＋遺伝子を有することを特徴とする、請求項１に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
【請求項３】
ＥＧＦＰ遺伝子を更に含む、請求項１または２に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
【請求項４】
自己複製配列としてＡＲＳ３０２を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
【請求項５】
標的遺伝子クローニング部位、前記ＡＲＳ３０２、前記ＥＧＦＰ遺伝子、前記ｕｒａ４＋遺伝子、前記プロモーター領域、前記ｌｅｕ２ｄ遺伝子をこの順序で含む請求項１〜４のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
【請求項６】
配列番号２に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４、配列番号３に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３５、配列番号４に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３６、配列番号５に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３７、配列番号６に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３８、配列番号７に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３９、配列番号８に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８４０から選ばれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを含む分裂酵母。
【請求項８】
標的遺伝子を含む請求項１〜６のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを、ロイシン要求性のシゾサッカロミセス属微生物に導入しロイシン無添加の培地で培養する工程、および
導入細胞内でのプラスミドベクターの最大コピー数を測定する工程、
を少なくとも有することを特徴とする標的遺伝子の最大発現強度の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターに関し、詳しくは、Ｇｅｎｅｔｉｃ−Ｔａｇ−ｏｆ−Ｗａｒ（ｇＴＯＷ：遺伝子綱引き）法において測定の精度を高めることのできるシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロバストネス（頑健性）は、外乱、内乱などさまざまな摂動に抗って機能を維持しようとするシステムの特性であり、生命現象に普遍的に見られる特徴である。従来、ロバストネスは淘汰圧を受けながら進化してきた複雑なシステムである生命システムの基本特性と考えられていた。生命のロバストネスは、生命をシステムレベルで扱ったときのみそれを実現するための原理の議論が可能になるため、近年急速に発展しているシステムレベルでの生命研究によりようやくその原理が理解されるようになってきた。生命のロバストネスを知ることにより、生命システムの基本原理の解明、コンピューター細胞モデルの開発、疾患に対する新たな治療手段の提供が可能になることが提唱されてきた。
【０００３】
これまでの生命のロバストネスについての研究は、そのほとんどが理論的な研究に留まっていた。これは、実際の細胞のロバストネスを検定する有効な実現技術がなかったことがその大きな原因の一つである。
【０００４】
非特許文献１では、出芽酵母を用いた細胞システムのロバストネスを検定する実験技術である、Ｇｅｎｅｔｉｃ−Ｔａｇ−ｏｆ−Ｗａｒ（ｇＴＯＷ：遺伝子綱引き）法を開発し、出芽酵母の細胞周期の遺伝子過剰発現に対するロバストネス・プロファイルの測定に成功した。
ｇＴＯＷ法の原理は、図１に示すとおりである。ｌｅｕ２ｄ遺伝子を持つ多コピーのプラスミドｐＳＢＩ４０上に標的の遺伝子をクローニングし、このプラスミドをロイシン要求性の出芽酵母に導入し、ロイシンのない培地で増殖させると、より高いプラスミドコピー数を持つ細胞がより高い増殖速度を持つために濃縮され、最終的には細胞あたり１００コピー以上のプラスミドコピー数を持つ細胞が濃縮される。プラスミドコピー数は、標的遺伝子とｌｅｕ２ｄ遺伝子のコピー数上昇のバイアスの引き合った地点に比例するが、ｌｅｕ２ｄ遺伝子のコピー数の上昇のバイアスは一定であるため、標的遺伝子のコピー数の上限がプラスミドコピー数に反映される。そのため、ｇＴＯＷ法によれば、導入された標的遺伝子が関わる細胞システムのロバストネスを知ることができる。言い換えれば、標的遺伝子の細胞システムに対する影響の大きさを知ることができる。
【０００５】
【非特許文献１】Ｈｉｓａｏ  Ｍｏｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．ＰｌｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌｕｍｅ２  Ｉｓｓｕｅ  ７  ＪＵＬＹ  ２００６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記非特許文献１の手法は、出芽酵母のみを対象としており、それ以外の微生物に適用するものではなかった。出芽酵母用のプラスミドは一般的には分裂酵母にも利用が可能である（ＧｕｔｈｒｉｅとＦｉｎｋ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＰａｒｔＡ，  ＥＬＩＳＥＶＩＥＲ  ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ，  １９９１）が、ｇＴＯＷ実験の場合、（１）プラスミドが細胞内で多コピーで維持される（２）プラスミドが細胞内で安定に維持される（３）プラスミドのコピー数を適当に増加させることが出来る、などの要件を必要とするため、出芽酵母用に作られたプラスミド（ｐＳＢＩ４０）をそのまま利用しても分裂酵母でｇＴＯＷ実験を行うことは出来ない。
本発明は、出芽酵母を用いて開発されたｇＴＯＷ法を分裂酵母でも実現するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた。その結果、出芽酵母由来のｌｅｕ２ｄ遺伝子をマーカー遺伝子として導入したプラスミドが、シゾサッカロミセス属微生物におけるｇＴＯＷ法の実施においても予想外に有用であり、しかも、更にｌｅｕ２ｄ遺伝子のプロモーター配列のうちの少なくとも一部を導入したプラスミドが、ｇＴＯＷ法におけるプラスミドコピー数の適切な調整において重要であることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を提供する。
〔１〕  マーカー遺伝子としてのｌｅｕ２ｄ遺伝子と、前記ｌｅｕ２ｄ遺伝子の発現を制御するプロモーター領域として配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち３´末端側の１塩基または２以上の塩基とを少なくとも有することを特徴とする、シゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
〔２〕  第２のマーカー遺伝子としてｕｒａ４＋遺伝子を有することを特徴とする、〔１〕に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
〔３〕  ＥＧＦＰ遺伝子を更に含む、〔１〕または〔２〕に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
〔４〕  自己複製配列としてＡＲＳ３０２を有する〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
〔５〕  標的遺伝子クローニング部位、前記ＡＲＳ３０２、前記ＥＧＦＰ遺伝子、前記ｕｒａ４＋遺伝子、前記プロモーター領域、前記ｌｅｕ２ｄ遺伝子をこの順序で含む〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
〔６〕  配列番号２に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４、配列番号３に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３５、配列番号４に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３６、配列番号５に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３７、配列番号６に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３８、配列番号７に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３９、配列番号８に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８４０から選ばれる、〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
〔７〕  〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを含む分裂酵母。
〔８〕  標的遺伝子を含む〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを、ロイシン要求性のシゾサッカロミセス属微生物に導入しロイシン無添加の培地で培養する工程、および導入細胞内でのプラスミドベクターの最大コピー数を測定する工程、を少なくとも有することを特徴とする標的遺伝子の最大発現強度の評価方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、シゾサッカロミセス属微生物においてもｇＴＯＷ法の実施を可能とするプラスミドが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターは、マーカー遺伝子としてのｌｅｕ２ｄ遺伝子と、ｌｅｕ２ｄ遺伝子の発現を制御するプロモーター部位とを少なくとも含むことを特徴とする。
【００１１】
ｌｅｕ２ｄは出芽酵母に由来し、ロイシン生合成遺伝子ＬＥＵ２のアレルであり、プロモーターにおいて大きな欠失を持つため、ＬＥＵ２と比較して非常に活性が低い。本発明においてｌｅｕ２ｄ遺伝子は、ｇＴＯＷ法実施の際にプラスミドコピー数を上げようとする遺伝的選択圧として働く。ｌｅｕ２ｄ遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号９に記載するとおりである。配列表の配列番号９に記載の塩基配列のうち、塩基番号２９〜１１２３がＬＥＵ２遺伝子のＯＲＦである。
【００１２】
さらに、本発明のプラスミドベクターは、上記のｌｅｕ２ｄ遺伝子の発現を制御するプロモーター領域を含む。このプロモーター領域は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち３´末端側の１塩基または２以上の塩基、好ましくは１０〜５００、より好ましくは２０〜４００塩基を有する。例えば、配列番号１に記載の塩基配列中の１５８〜５００塩基番号の部分、好ましくは２３２〜５００塩基番号の部分、より好ましくは２９２〜５００塩基番号の部分、特に好ましくは４１１〜５００塩基番号の部分を有する。このプロモーター領域によりｌｅｕ２ｄ遺伝子の発現量が制御されるので、標的遺伝子のコピー数に応じたプラスミドとすることができる。配列番号１中の２９２〜３２２番目（ＬＥＵ２  ＯＲＦから−１９８〜−１８９番目）は、Ｌｅｕ３ｐ結合部位であるが、この結合部位は含まれていてもよいし、含まれていなくともよい。プロモーター領域の塩基長が長い場合（好ましくは、配列番号１の４４１〜５００塩基番号の部分を含む場合）には、ｌｅｕ２ｄ遺伝子のコピー数増大バイアスが減少する。一方、プロモーター領域の塩基長が短い場合（好ましくは、配列番号１の４７１〜５００塩基番号の部分を含む場合）には、ｌｅｕ２ｄ遺伝子のコピー数増大バイアスが増大する。よって、ｇＴＯＷ法においてコピー数の上限が低い標的遺伝子を導入する際にはプロモーター領域の塩基長が長くなるように調整することが有用である。一方、ｇＴＯＷ法においてコピー数の上限が高い標的遺伝子を導入する際にはプロモーター領域の塩基長が短くなるように調整することが有用である。
【００１３】
本発明のプラスミドベクターは、ｌｅｕ２ｄ遺伝子とは別に第２のマーカー遺伝子として、ｕｒａ４＋遺伝子を有することが好ましい。ｕｒａ４＋遺伝子はウラシル合成酵素に関する遺伝子であるから、本発明のプラスミドベクターがｕｒａ４＋遺伝子を有することにより、ウラシルを含まない選択培地での選択が可能となる。
更に、本発明のプラスミドベクターは、ａｄｅ６＋遺伝子など他のマーカー遺伝子を含むものであってもよい。
【００１４】
本発明において、プラスミドベクターに導入され得る遺伝子（標的遺伝子（目的遺伝子））には特に制限はないが、通常は宿主のシゾサッカロミセス属微生物由来のタンパク質をコードする遺伝子である。本発明のプラスミドにおいて、標的遺伝子クローニング部位は、プラスミドを構成する要素を破壊しない部位であればどこでもよく、１箇所であってもよいし２箇所以上であってもよい。また、標的遺伝子のサイズにも特に制限はない。
【００１５】
本発明のプラスミドベクターはレポータータンパク質遺伝子を含むものであってもよい。これにより、コピー数の評価をフローサイトメトリーなどにより容易に行うことができる。レポータータンパク質としては例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ホタル・ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＥＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）、ヒト分泌型アルカリ性ホスファターゼなどが挙げられる。このうち、ＥＧＦＰが最も好ましい。ＥＧＦＰの塩基配列は、配列表の配列番号１０に示すとおりである。
【００１６】
本発明のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターは、シゾサッカロミセス属微生物の細胞内で自己複製する能力（染色体に組み込まれずとも複製を自立的に続ける能力）をプラスミドに与える働きをするための複製起点を持つ。特に、複製起点を含む配列（自己複製配列（ＡＲＳ、ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ））として、ＡＲＳ３０２が２つ連続して並列して位置することにより、本発明のプラスミドは微生物内で安定化し、特にｇＴＯＷ試験において安定するので好ましい。ＡＲＳ３０２の塩基配列は、配列表の配列番号１１に示す塩基配列の通りである。
【００１７】
また、本発明のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターは、その目的に反しない限りにおいて、ｌｅｕ２ｄ遺伝子やｕｒａ４＋遺伝子以外のマーカー遺伝子、薬剤耐性遺伝子などの他のマーカー遺伝子、プラスミド安定化配列、外来遺伝子など一般的なプラスミドに含まれる配列や遺伝子領域を含んでいてもよい。
マーカー遺伝子としては、ａｄｅ１＋、ａｄｅ６＋、ａｒｇ３＋、ｈｉｓ３＋、ｈｉｓ７＋遺伝子を挙げることができる。
【００１８】
プラスミド安定化配列としては、ｓｔｂ因子を挙げることができる。
【００１９】
薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）、ゲンタマイシン耐性遺伝子（ＧｍＲ）、カナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＭＸ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｃＲ）等が挙げられ、これらのうちから単独でまたは複数組み合わせて含有させることができる。このうち、アンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）が好ましい。
【００２０】
プラスミド安定化配列としては、ｓｔｂ因子を挙げることができる。尚、上述のように本発明のプラスミドにおいてＡＲＳ３０２が２つ連続して並ぶことにより、本発明のプラスミドは安定化する。
【００２１】
その他の外来遺伝子としては、大腸菌など他の生物由来の自己複製配列（例えばｐＢＲ３２２  ｏｒｉｇｉｎ、その他ｐＡＣＹＣ系プラスミドの複製起点）などを挙げることができる。ｐＢＲ３２２  ｏｒｉｇｉｎを挿入することにより、プラスミドを増加し、大腸菌内でその状態を維持することができる。
【００２２】
本発明のプラスミドにおいて、上記構成要素の配置に特に制限はないが、標的遺伝子クローニング部位、前記ＡＲＳ３０２、前記ＥＧＦＰ遺伝子、前記ｕｒａ４＋遺伝子、前記プロモーター領域、前記ｌｅｕ２ｄ遺伝子をこの順序で含むことが好ましい。
本発明のプラスミドベクターの具体例としては、配列番号２に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４、配列番号３に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３５、配列番号４に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３６、配列番号５に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３７、配列番号６に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３８、配列番号７に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８３９、配列番号８に記載の塩基配列を有するｐＨＭ００４−８４０を挙げることができる。それぞれのプラスミドの、標的遺伝子を導入しない状態でのロイシン無添加培地でのコピー数（細胞あたりのコピー数を意味する。以下同じ。）は、ｐＨＭ００４は２００程度、ｐＨＭ００４−８３５は８０程度、ｐＨＭ００４−８３６は２５程度、ｐＨＭ００４−８３７は８０程度、ｐＨＭ００４−８３８は９０程度、ｐＨＭ００４−８３９は８０程度、ｐＨＭ００４−８４０は６０程度である。また、ｐＨＭ００２、ｐＨＭ００４−８４１、ｐＨＭ００４−８４２も、ｇＴＯＷ法には用いることができるので本発明のプラスミドベクターの具体例ではあるが、測定に手間を要するおそれがある（実施例１参照）。
これらのうち、ｐＨＭ００４、ｐＨＭ００４−８３５、およびｐＨＭ００４−８３６は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１０日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、ｐＨＭ００４−８３５は２００７年１０月３０日付で、ｐＨＭ００４およびｐＨＭ００４−８３６は２００７年１０月２６日付で寄託されており、入手可能である。ｐＨＭ００４、ｐＨＭ００４−８３５、およびｐＨＭ００４−８３６のそれぞれの受託番号はＮＩＴＥ  Ｐ−４４５、ＮＩＴＥ  Ｐ−４４９、およびＮＩＴＥ  Ｐ−４４６である。
【００２３】
本発明のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターの作製は、各構成要素である遺伝子や配列を他のプラスミドなどから切り出して必要に応じてＰＣＲなどにより増幅するか、或いは人工的に合成した後、出芽酵母内での相同組替えなどにより連結して作製することができる。また、各構成要素である遺伝子や配列を、出芽酵母内での相同組替えなどにより骨格となるプラスミドに導入して作成してもよい。ｌｅｕ２ｄ遺伝子はｐＲＳ３１５より得ることができる。ｕｒａ４＋遺伝子断片はシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドｐＤＢｌｅｔより得ることができる。ＥＧＦＰ遺伝子はｐＫＴ１２８からＥＧＦＰ−ｓｐｈｉｓ５ＭＸ断片として得ることができる。
【００２４】
本発明におけるシゾサッカロミセス属微生物は特に制限なく、例えば、一般に分裂酵母と称されるもの、すなわちシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｃｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｐｏｍｂｅ）、シゾサッカロミセス・ジャポニクス（Ｓｃｈｉｃｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、シゾサッカロミセス・オクトスポラス（Ｓｃｈｉｃｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ）の様々な菌株を用いることができる。中でも、シゾサッカロミセス・ポンベが好ましい。また、後述の評価方法においては、シゾサッカロミセス属微生物のうちロイシン要求性を示す菌株を用いる。このようなロイシン要求株としては例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ  ＦＹ７６５２株、ＡＴＣＣ２０１４０２株などを挙げることができる。ＦＹ７６５２株は、Ｔａｍａｉ  ＫＫ，Ｓｈｉｍｏｄａ  Ｃ．  Ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ＨＥＣＴ−ｔｙｐｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｓｅ  Ｐｕｂ２ｐ  ｓｈａｒｅｓ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｐｕｂ１ｐ  ｉｎ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ．Ｊ  ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２００２  Ｍａｙ  １；１１５（Ｐｔ  ９）：１８４７−５７．  ＰＭＩＤ：１１９５６３１６  ［ＰＵＢＭｅｄ  −  ｉｎｄｅｘｅｄ  ｆｏｒ  ＭＥＤＬＩＮＥ］に記載の方法に従って入手可能である。ＦＹ７６５２株は、ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ）のもと酵母遺伝資源センター（ＹＧＲＣ）にＦＹ７６５２として登録されており、分譲を受けることができる。ＡＴＣＣ２０１４０２株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８  ＵＳＡ）に登録されており、分譲を受けることができる。
【００２５】
本発明のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターへの標的遺伝子の導入は、常法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法等に従って行うことができる。例えば、細胞接合法、電気的導入方法（エレクトロポレーション法）、化学的処理によるＤＮＡ導入法、感染等により行うことができる。
【００２６】
本発明のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターをシゾサッカロミセス属微生物に導入する方法は特に限定されない。例えば、遺伝子等をサッカロミセス属微生物に導入して相同組替えを行い酵母内で本発明のプラスミドベクターを構築すれば、そのまま導入した状態になる。一方、出芽酵母など他の微生物内で作製した本発明の分裂酵母用プラスミドベクターを取り出してシゾサッカロミセス属微生物に、上述した公知の遺伝子導入法にて導入することも可能である。
【００２７】
本発明のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターは、Ｇｅｎｅｔｉｃ−Ｔａｇ−ｏｆ−Ｗａｒ（ｇＴＯＷ：遺伝子綱引き）法（Ｈｉｓａｏ  Ｍｏｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．ＰｌｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌｕｍｅ２  Ｉｓｓｕｅ  ７  ＪＵＬＹ  ２００６）に基づき、標的遺伝子のシゾサッカロミセス属微生物内における発現強度の限界の評価に利用することができる。
【００２８】
本発明の評価方法は、標的遺伝子を含む上記本発明のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを、ロイシン要求性のシゾサッカロミセス属微生物に導入しロイシン無添加の培地で培養する工程、および導入細胞内でのプラスミドベクターの最大コピー数を測定する工程、を有する。
【００２９】
まず、標的遺伝子を含む上記本発明のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを、ロイシン要求性のシゾサッカロミセス属微生物に導入しロイシン無添加の培地で培養する。
【００３０】
シゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターへの標的遺伝子の導入は、先に述べたとおりである。
シゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターをシゾサッカロミセス属微生物へ導入する方法は特に限定されない。例えば、  ＧｕｔｈｒｉｅとＦｉｎｋ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＰａｒｔＡ，  ＥＬＩＳＥＶＩＥＲ  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ（１９９１）に記載されている、プロトプラスト法、塩化リチウム法、酢酸リチウム法などといった、一般的な方法を用いることが出来る。
【００３１】
ロイシン無添加の培地における培養において、培地は、ロイシン無添加のＥＭＭ培地（エジンバラ最小培地）等の培地を用いることができる。培養条件は培地及び酵母細胞の種類、量などの条件にもよるが、ＥＭＭ培地を用いる場合、一般には２５〜３５℃、１〜７日程度の条件とすることができる。
【００３２】
続いて、導入細胞内でのプラスミドベクターの最大コピー数を測定する。測定は、ＧＦＰを含むプラスミドベクターの場合には、ＧＦＰの蛍光強度をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）などにより測定することにより行うことができる。また、リアルタイムＰＣＲにより測定することもできる。
【００３３】
測定された最大コピー数は、その酵母における標的遺伝子の最大発現強度として評価することができる。最大コピー数の高さ及び低さの基準は、ベクターのみでの測定値を基準に定めることができる。この標的遺伝子のコピー数が高い場合（最大発現強度が高い場合）、酵母細胞はその標的遺伝子の過剰発現に対し頑健であることを示し、また、コピー数が低い場合（最大発現強度が低い場合）、酵母細胞はその標的遺伝子の過剰発現に対し脆弱であることを示す。従って、本発明の評価方法は、標的遺伝子の創薬ターゲットとしての有用性の評価に利用することができる。
【００３４】
尚、本発明のシゾサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターの用途は、ｇＴＯＷ法に基づく評価方法に限定されず、クローニング用プラスミドベクターとして利用することもできる。
【実施例】
【００３５】
以下本発明を実施例により詳細に説明する。
【００３６】
（シゾサッカロミセス属微生物（分裂酵母））
以下の実施例において使用した分裂酵母は、サッカロミセス・ポンベ  ＦＹ７６５２株（ＭＭ７２−１Ｄ株、ゲノタイプ：ｈ−ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｄ１８）である。これは、ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ）にＩＤ：ＦＹ７６５２として登録されており、寄託を受けたものである。
【００３７】
（酵母へのＤＮＡ断片導入条件（プロトコル））
以下の実施例において、酵母へのＤＮＡ断片の導入は下記のようにして行った。
酵母細胞をＹＰＤ培地で培養し、この培養液（ＯＤ６００＝１．０程度）１ｍＬを遠心して細胞を回収した。回収した細胞を０．１Ｍの酢酸リチウム溶液で洗浄した。この細胞に、５０％  ポリエチレングリコール４０００  ３００μＬ、１Ｍ  酢酸リチウム溶液  ４０μＬ、２ｍｇ／ｍＬ  サケ精子ＤＮＡ  ２５μＬ、および、ＰＣＲ反応後のＤＮＡ  それぞれ５０μＬを加え懸濁させた。続いて室温で３０分静置した後、４２℃で２０分間放置した。遠心して細胞を回収し、５０μＬの水に懸濁した。選択寒天培地（ＥＭＭ培地）に細胞懸濁液をひろげ、３０℃でコロニーが見えるまで培養した。
【００３８】
（ＰＣＲ反応）
以下の実施例においてＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−、カタログ番号ＫＯＤ−２０２、東洋紡株式会社製）を用いておこなった。サーマルサイクラーとしてＴＰ６００（タカラバイオ株式会社製）を用いた。ＰＣＲ反応液は下記の通り概ねＰＣＲキットを利用して、キットの説明書に準じて調製した。
【００３９】
〔ＰＣＲ反応液〕
・  ５μＬ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（キットに添付のもの）
・  ５μＬ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（キットに添付のもの）
・  ２μＬ  ＭｇＳＯ４溶液（キットに添付のもの）
・  １μＬ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（キットに添付のもの）
・  １μＬ  ｐＫＴ１２８などプラスミド（アルカリ法で調製したＤＮＡを１００倍希釈したもの）
・  １μＬ  各プライマー（水で１０μＭに調整したもの）
・３５μＬ  超純水
【００４０】
サーマルサイクルは、９４℃２分  →  （９４℃１５秒→５５℃３０秒→６８℃６分）×３０サイクル  →  ６８℃５分  →  ４℃で保存、とした。
【００４１】
参考例１（ｐＨＭ００１プラスミドベクターの構築）
ｐＲＳ３１５（配列番号１２記載の塩基配列からなる。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、ＡＴＣＣ７７１４４として寄託されており、分譲可能である。）を鋳型にして、プライマーＯＳＢＩ０５８２−０５８４を用いて出芽酵母ＬＥＵ２遺伝子を増幅した。ｐＤＢｌｅｔを鋳型にして、プライマーＯＳＢＩ０５８３−０５８５を用いて分裂酵母ｕｒａ４＋遺伝子を増幅した。
ＯＳＢＩ０５８２（配列番号１３）：ｇｃａｔｃｔｇｔｇｃｇｇｔａｔｔｔｃａｃａｃｃｇＣＡＴＡＴＧａａｔｇｇｔｃａｇｇｔｃａｔｔｇａｇｔｇ
ＯＳＢＩ０５８３（配列番号１４）：ａｇａｔｔｇｔａｃｔｇａｇａｇｔｇｃａｃ
ＯＳＢＩ０５８４（配列番号１５）：ＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｃｃｔｃａａｃａｔａａｃｇａｇａａｃａｃａｃａｇｇ
ＯＳＢＩ０５８５（配列番号１６）：ｃｃｔｇｔｇｔｇｔｔｃｔｃｇｔｔａｔｇｔｔｇａｇｇＣＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＴＡＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＣ
【００４２】
一方、ｐＤＢｌｅｔ（図２参照。配列表の配列番号１７記載の塩基配列参照。ｐＤＢｌｅｔの塩基配列はＮＣＢＩに登録されており、そのアクセッションナンバーはＡＦ５３１１７３である。）を下記の条件で制限酵素ＮｄｅＩで切断した。２ｍＬのＬＢａｍｐ培地でプラスミドｐＤＢｌｅｔを持つ大腸菌（ＸＬ１−ｂｌｕｅ株、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）（ｐＤＢｌｅｔのＸＬ１−ｂｌｕｅ株への挿入はエレクトロポレーション法によった。）を培養した。この大腸菌より、プラスミドをアルカリ法により精製し、５０μＬの水に溶かした。このプラスミド溶液  １０μＬを、ＮＥＢ４バッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）１０μＬ、Ｎｄｅ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社、カタログ番号Ｒ０１１１Ｓ）  １０μＬ、および超純水  ７０μＬに溶解し、３７℃で１時間静置後、室温で一晩放置した。
【００４３】
これらの増幅産物および制限酵素切断断片を出芽酵母細胞内での相同組替え法により結合し、ｐＨＭ００１を得た（図３参照）。ｐＨＭ００１は、ｌｅｕ２ｄ遺伝子が導入されているものの、そのプロモーター領域は導入されていない。
【００４４】
ｐＨＭ００１を含む酵母細胞を、ロイシンを含まない培地（ＥＭＭ培地）において培養し、ＧＦＰの発現量をフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ  ＢＤ社）で測定した。プラスミドのコピー数の測定は、Ｒｏｃｈｅ  ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ２．０を用いてリアルタイムＰＣＲ法によって行った。
【００４５】
プラスミドコピー数を調べた結果、プラスミドベクターｐＨＭ００１は、プラスミドコピー数を上げるバイアスが６コピー程度（５．９）と低すぎて、ｇＴＯＷ法への適用にはふさわしくないことが明らかになった。
【００４６】
実施例１（ｐＨＭ００２プラスミドベクターの構築）
実施例１のｐＨＭ００１は、ロイシンを含まない培地でのコピー数が低かったため、コピー数が低い原因と思われるＬＥＵ２をｌｅｕ２ｄに置き換えて、ｐＨＭ００２を作成することにした。
【００４７】
ｐＲＳ３１５を鋳型にして、ＯＳＢＩ０５８２−０６０６を用いてｌｅｕ２ｄ遺伝子断片を増幅した。一方、ｐＤＢｌｅｔを鋳型にして、ＯＳＢＩ０５８３−０６０７を用いて分裂酵母ｕｒａ４＋遺伝子を増幅した。
【００４８】
ＯＳＢＩ０５８２（配列番号１３）:ｇｃａｔｃｔｇｔｇｃｇｇｔａｔｔｔｃａｃａｃｃｇＣＡＴＡＴＧａａｔｇｇｔｃａｇｇｔｃａｔｔｇａｇｔｇ
ＯＳＢＩ０５８３（配列番号１４）：ａｇａｔｔｇｔａｃｔｇａｇａｇｔｇｃａｃ
ＯＳＢＩ０６０６（配列番号１８）：ＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｔａｔａｔａｔａｔｔｔｃａａｇｇａｔａｔａｃｃａｔ
ＯＳＢＩ０６０７（配列番号１９）：ａｔｇｇｔａｔａｔｃｃｔｔｇａａａｔａｔａｔａｔａＣＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＴＡＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＣ
【００４９】
一方、ｐＤＢｌｅｔを参考例１と同様の条件で制限酵素ＮｄｅＩで切断した。
これらの増幅産物および制限酵素切断断片を分裂酵母細胞内での相同組替え法により結合し、ｐＨＭ００２を得た（図４参照）。
【００５０】
ｐＨＭ００２を含む酵母細胞について、参考例１と同様にしてＧＦＰの発現量の測定およびプラスミドのコピー数の測定を行なった。また、図６−１及び図６−２にｐＨＭ００２のＦＡＣＳパターンを示す。
【００５１】
その結果、ｐＨＭ００２のロイシンのない培地での最大コピー数は１００を超えておりｇＴＯＷ法に用いるプラスミドとして十分であることが分かった。しかし、図６−１及び図６−２に示すように、ＦＡＣＳでプラスミドコピー数をモニターすることは困難であることが分かった。
【００５２】
実施例２（ｐＨＭ００４の構築）
プラスミドコピー数の分散をモニターできるように、ＧＦＰを組み込んだプラスミド（ｐＨＭ００４）を作成した。
【００５３】
実施例１で作成したプラスミドベクターｐＨＭ００２を鋳型として、ＯＳＢＩ００９−０７１９を用いてｌｅｕ２ｄ−ｕｒａ４＋遺伝子断片を増幅した。一方、ｐＫＴ１２８（配列番号２０に記載の塩基配列参照。Ｅｕｒｏｓｃａｒｆに登録されておりそのアクセッションナンバーはＰ３０１７４である。）を鋳型にして、ＯＳＢＩ０７２０−０７２１を用いてＥＧＦＰ−ｓｐｈｉｓ５ＭＸ遺伝子カセット（配列番号２１）を増幅した。
【００５４】
ＯＳＢＩ００９（配列番号２２）：ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
ＯＳＢＩ０７１９（配列番号２３）：ｔｇｔｔａａｔｔａａａｃｃａｇｃａｃｃｇｔｃａｃｃＡＴＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧ
ＯＳＢＩ０７２０（配列番号２４）：ＣＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＡＴｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｃｔｇｇｔｔｔａａｔｔａａｃａ
ＯＳＢＩ０７２１（配列番号２５）:ＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣｔｃｇａｔｇａａｔｔｃｇａｇｃｔｃｇ
【００５５】
一方、ｐＤＢｌｅｔを参考例１と同様の条件で制限酵素ＮｄｅＩで切断した。
これらの増幅産物および制限酵素切断断片を分裂酵母細胞内での相同組替え法により結合し、ｐＨＭ００４（ＮＩＴＥ  Ｐ−４４５）を得た（図５参照）。
ｐＨＭ００４を含む酵母細胞について、参考例１と同様にしてＧＦＰの発現量の測定およびプラスミドのコピー数の測定を行なった。また、図６−１及び図６−２にｐＨＭ００４のＦＡＣＳパターンを示す。
【００５６】
その結果、図６−１及び図６−２から明らかなように、ｐＨＭ００４は、ロイシンのない条件（１０日間培養）での最大コピー数が約２７０コピー（２７６．３コピー）であり、他に比べて分散も少ない上に、２日目で十分にコピー数が上がるなど増殖も速かった。また、ＦＡＣＳで簡便にコピー数の変化をモニターすることができ、正確な上限を知ることができた。
その半面で、ｌｅｕ２ｄの発現が弱いため、上限の測定に１０日程度かかることがあり、また、プラスミドコピー数を上げるバイアスが強いため、標的遺伝子の種類によってはコピー数の測定が困難となることが予想された。
【００５７】
実施例４（ｐＴＯＷｕｇ２−８３５〜８４２の構築）
様々なコピー数上昇バイアスを持つセット（ｐＨＭ００４−８３５〜８４２）を作成した。
【００５８】
まず、実施例３で作成したｐＨＭ００４を鋳型にして、ＯＳＢＩ０５８５−０６４０を用いて、ｕｒａ４＋−ＥＧＦＰ−ｓｐｈｉｓ５ＭＸ遺伝子カセットを増幅した。すなわち、参考例１で作成したプラスミドベクターｐＨＭ００１を鋳型として、プライマーＯＳＢＩ００９−０８４２を用いて、プロモーターにそれぞれ欠失のある（図８参照）ＬＥＵ２遺伝子を増幅した。一方、実施例３で作成したｐＨＭ００４を鋳型にして、ＯＳＢＩ０５８５−０６４０を用いて、ＵＲＡ４＋−ＥＧＦＰ−ｓｐｈｉｓ５ＭＸ遺伝子カセットをＰＣＲで増幅した。
【００５９】
ＯＳＢＩ００９（配列番号２２）：ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
ＯＳＢＩ０５８５（配列番号１６）:ｃｃｔｇｔｇｔｇｔｔｃｔｃｇｔｔａｔｇｔｔｇａｇｇｃａｔａｔｇｇａｇｃｔＴＡＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＣ
ＯＳＢＩ０６４０（配列番号２６）：ｇｃｇｃｇｔｔｔｃｇｇｔｇａｔｇａｃｇｇ
ＯＳＢＩ０８３５（配列番号２７）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｔｔｃｔｔａｃｃｔｔｔｔａｃａｔｔｔｃａ
ＯＳＢＩ０８３６（配列番号２８）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｇｔｇｇｔｔａｇｃａａｔｃｇｔｃｔｔａｃ
ＯＳＢＩ０８３７（配列番号２９）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｔａｔｔｔａａｇｇａｃｃｔａｔｔｇｔｔｔ
ＯＳＢＩ０８３８（配列番号３０）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｔｔｇｃａｔｃａｃａａｔａｃｔｔｇａａｇ
ＯＳＢＩ０８３９（配列番号３１）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｔａｇａａｔａｇａｇａａｇｃｇｔｔｃａｔ
ＯＳＢＩ０８４０（配列番号３２）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧａｇｇｔｇａｇａｇｃｇｃｃｇｇａａｃｃｇ
ＯＳＢＩ０８４１（配列番号３３）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｔｔｔｃａａｃｔｇａａａａａｔｔｇｇｇａ
ＯＳＢＩ０８４２（配列番号３４）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧａｔｔｔｃａｇａｇｇｔｃｇｃｃｔｇａｃｇ
【００６０】
一方、ｐＤＢｌｅｔ（ＡＦ５３１１７３の配列を有する。）を参考例１と同様の条件で制限酵素ＮｄｅＩで切断した。
これらの増幅産物および制限酵素切断断片を分裂酵母細胞内での相同組替え法により結合し、ｐＨＭ００４−８３５〜８４２を得た（図７及び図８参照）。
【００６１】
ｐＨＭ００４−８３５〜８４２を含む酵母細胞について、参考例１と同様にしてＧＦＰの発現量の測定およびプラスミドのコピー数の測定を行なった。また、図９−１〜図９−８にｐＨＭ００４のＦＡＣＳパターン（ロイシンを含まない培地で２日間培養）を示す。
【００６２】
ロイシンを含まない培地におけるプラスミドの最大コピー数は、ｐＨＭ００４−８３５（ＮＩＴＥ  Ｐ−４４９）では８０．４、ｐＨＭ００４−８３６（ＮＩＴＥ  Ｐ−４４６）では２６．４、ｐＨＭ００４−８３７では７８．８、ｐＨＭ００４−８３８では８９．２、ｐＨＭ００４−８３９では８０．９、ｐＨＭ００４−８４０では６３．１、ｐＨＭ００４−８４２では６１．５であった。
【００６３】
この結果から、ｐＨＭ００４−８３５〜８４２のうち、８３５と８３６が適度なコピー数を持ち、他に比べて分散も少ないことが明らかとなった。また、２日の培養で十分にコピー数が上昇することから増殖も速いことが明らかとなった。８３５はｐＨＭ００４よりも低めのコピー数を持っており、８３６はｐＨＭ００４よりも高いコピー数を持っていた。また、８３５と８３６以外のプラスミドも、標的遺伝子のコピー数の高低に応じて利用できるものと推測された。
【００６４】
実施例５（遺伝子を導入した状態でのコピー数の測定）
ｐＨＭ００４、８３５および８３６のそれぞれに、分裂酵母のｃｄｃ２＋、ｃｄｃ１３＋、ｃｄｃ２５＋、ｒｕｍ１＋、ｗｅｅ１＋のそれぞれの遺伝子（それぞれＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ＧｅｎｅＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｄｂ／ｐｏｍｂｅ／）よりＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｎａｍｅ  ＳＰＢＣ１１Ｂ１０．０９，ＳＰＢＣ５８２．０３，ＳＰＡＣ２４Ｈ６．０５，ＳＰＢＣ３２Ｆ１２．０９，ＳＰＣＣ１８Ｂ５．０３にて遺伝子情報を取得可能）をクローンした。
【００６５】
各プラスミドをシゾサッカロミセス・ポンベ  ＡＴＣＣ２０１４０２株に導入し、５０時間ＥＭＭ培地で培養した後に、リアルタイムＰＣＲでプラスミドのコピー数を測定した。結果を図１０に示す。図１０中、縦軸の数値はプラスミドコピー数を示し、「ｖｅｃｔｏｒ」は何も導入していない状態のプラスミドのコピー数を示す。
【００６６】
図１０から明らかなとおり、各プラスミドは、導入した遺伝子に応じて異なるコピー数を示した。このことから、本発明のプラスミドは、ｇＴＯＷ法において、導入遺伝子に応じたプラスミドコピー数を得ることができ有用であることが明らかとなった。
なお、実施例で得られたプラスミドのうち、ｐＨＭ００４、ｐＨＭ００４−８３５、ｐＨＭ００４−８３６、ｐＨＭ００４−８３７、ｐＨＭ００４−８３８、ｐＨＭ００４−８３９、ｐＨＭ００４−８４０の塩基配列は、それぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８に記載されている。
【配列表フリーテキスト】
【００６７】
配列番号１：ＬＥＵ２プロモーター
配列番号２：ｐＨＭ００４
配列番号３：ｐＨＭ００４−８３５
配列番号４：ｐＨＭ００４−８３６
配列番号５：ｐＨＭ００４−８３７
配列番号６：ｐＨＭ００４−８３８
配列番号７：ｐＨＭ００４−８３９
配列番号８：ｐＨＭ００４−８４０
配列番号９：ｌｅｕ２ｄ遺伝子
配列番号１０：ＥＧＦＰ遺伝子
配列番号１１：ＡＲＳ３０２
配列番号１２：ｐＲＳ３１５
配列番号１３：プライマーＯＳＢＩ０５８２
配列番号１４：プライマーＯＳＢＩ０５８３
配列番号１５：プライマーＯＳＢＩ０５８４
配列番号１６：プライマーＯＳＢＩ０５８５
配列番号１７：ｐＤＢｌｅｔ
配列番号１８：プライマーＯＳＢＩ０６０６
配列番号１９：プライマーＯＳＢＩ０６０７
配列番号２０：ｐＫＴ１２８
配列番号２１：ＥＧＦＰ−ｓｐｈｉｓ５ＭＸカセット
配列番号２２：プライマーＯＳＢＩ００９
配列番号２３：プライマーＯＳＢＩ０７１９
配列番号２４：プライマーＯＳＢＩ０７２０
配列番号２５：プライマーＯＳＢＩ０７２１
配列番号２６：プライマーＯＳＢＩ０６４０
配列番号２７：プライマーＯＳＢＩ０８３５
配列番号２８：プライマーＯＳＢＩ０８３６
配列番号２９：プライマーＯＳＢＩ０８３７
配列番号３０：プライマーＯＳＢＩ０８３８
配列番号３１：プライマーＯＳＢＩ０８３９
配列番号３２：プライマーＯＳＢＩ０８４０
配列番号３３：プライマーＯＳＢＩ０８４１
配列番号３４：プライマーＯＳＢＩ０８４２
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、ｇＴＯＷ法の原理を示す図である。
【図２】図２は、ｐＤＢｌｅｔのプラスミドマップである。
【図３】図３は、ｐＨＭ００１のプラスミドマップである。
【図４】図４は、ｐＨＭ００２のプラスミドマップである。
【図５】図５は、ｐＨＭ００４のプラスミドマップである。
【図６−１】図６−１は、ｐＨＭ００２およびｐＨＭ００４をロイシンのない条件で３日培養した際のＦＡＣＳパターンを３次元で示すグラフである。
【図６−２】図６−２は、ｐＨＭ００２およびｐＨＭ００４をロイシンのない条件で１０日培養した際のＦＡＣＳパターンを３次元で示すグラフである。
【図７】図７は、ｐＨＭ００４−８３５〜８４２のプラスミドマップである。
【図８】図８は、ｐＨＭ００４−８３５〜８４２のプロモータ部分の長さの相違を示す模式図である。
【図９−１】図９−１は、ｐＨＭ００４−８３５のＦＡＣＳパターンを示すグラフである。
【図９−２】図９−２は、ｐＨＭ００４−８３６のＦＡＣＳパターンを示すグラフである。
【図９−３】図９−３は、ｐＨＭ００４−８３７のＦＡＣＳパターンを示すグラフである。
【図９−４】図９−４は、ｐＨＭ００４−８３８のＦＡＣＳパターンを示すグラフである。
【図９−５】図９−５は、ｐＨＭ００４−８３９のＦＡＣＳパターンを示すグラフである。
【図９−６】図９−６は、ｐＨＭ００４−８４０のＦＡＣＳパターンを示すグラフである。
【図９−７】図９−７は、ｐＨＭ００４−８４２のＦＡＣＳパターンを示すグラフである。
【図９−８】図９−８は、ｐＨＭ００４−８３５、ｐＨＭ００４−８３６、ｐＨＭ００４およびｐＨＭ００２のＦＡＣＳパターンを示すグラフである。
【図１０】図１０は、ｐＨＭ００４、ｐＨＭ００４−８３５、およびｐＨＭ００４−８３６に遺伝子を導入した場合のプラスミドコピー数を示すグラフである。
【図１】
2009112272.tif 000003
【図２】
2009112272.tif 000004
【図３】
2009112272.tif 000005
【図４】
2009112272.tif 000006
【図５】
2009112272.tif 000007
【図６−１】
2009112272.tif 000008
【図６−２】
2009112272.tif 000009
【図７】
2009112272.tif 000010
【図８】
2009112272.tif 000011
【図９−１】
2009112272.tif 000012
【図９−２】
2009112272.tif 000013
【図９−３】
2009112272.tif 000014
【図９−４】
2009112272.tif 000015
【図９−５】
2009112272.tif 000016
【図９−６】
2009112272.tif 000017
【図９−７】
2009112272.tif 000018
【図９−８】
2009112272.tif 000019
【図１０】
2009112272.tif 000020
【配列表】
2009112272000001.app