(57)【要約】【課題】物質表面に存在する分子（対象分子）を選択的に識別し、かつ複数種類の対象分子を、位置情報を含めて高い分解能で識別することができる方法を提供すること。【解決手段】サンプル表面に存在する対象分子を識別する方法であって、Ａ）物理特性が異なる２種以上の微粒子群であって、前記２種以上の微粒子群のそれぞれの微粒子は、それぞれ異なる分子に特異的に結合する分子で修飾されている微粒子群を準備するステップ；Ｂ）前記サンプル表面に前記微粒子を接触させて、前記微粒子群の微粒子を前記対象分子に結合させ、サンプル表面に固定するステップ；およびＣ）前記微粒子が固定されたサンプル表面を、走査型プローブ顕微鏡を用いて走査し、前記それぞれの対象分子を識別しうる情報を得るステップ；を含む方法。【選択図】図１
2009058427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル表面に存在する対象分子を識別する方法であって、
Ａ）物理特性が異なる２種以上の微粒子群であって、前記２種以上の微粒子群のそれぞれの微粒子は、それぞれ異なる対象分子に特異的に結合する分子で修飾されている微粒子群を準備するステップ；
Ｂ）前記サンプル表面に前記微粒子を接触させて、対象分子に結合させ、サンプル表面に固定するステップ；および
Ｃ）前記微粒子が固定されたサンプル表面を、走査型プローブ顕微鏡を用いて走査し、前記それぞれの対象分子を識別しうる情報を得るステップ；を含む方法。
【請求項２】
前記微粒子群に含まれる微粒子の粒径は、１ｎｍ〜１０μｍの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象分子に特異的に結合する分子は、核酸、ペプチド、糖ペプチド、多糖または脂質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微粒子の物理特性は、粒径であって、前記走査型プローブ顕微鏡は原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記微粒子の物理特性は、粒径および微粒子の光学的特性であって、前記走査型プローブ顕微鏡は近接場光学／原子間力顕微鏡（ＳＮＯＡＭ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記微粒子が固定されたサンプル表面の同一部位について、前記Ｃ）のステップを２回以上繰り返して、前記対象分子の存在位置の変化を観察する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルは、対象分子が固定された基板である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルは、ＤＮＡまたはタンパク質が固定された基板を含むバイオチップである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルは、生体物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルは、細胞であって、前記対象分子は膜タンパク質、膜糖タンパク質または脂質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞は、基板に配置されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
サンプル表面に存在する対象分子を識別する識別装置であって、
微粒子を前記サンプル表面に提供する微粒子提供部材；
サンプル表面に固定された前記微粒子の物理特性を測定し、前記対象分子を識別しうる情報を得る測定部材；および
前期情報を出力する出力部材；を有する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質の表面に存在する分子を識別する方法および物質の表面に存在する分子を識別する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
物質表面に存在する分子（以下「対象分子」という）を識別する技術は、化学修飾された基板（例えばバイチップなど）を評価したり、細胞膜表面の状態を観察したりする上で重要な技術である。従来の識別技術は、以下の３つに大別されうる。
［１］対象分子に蛍光分子を結合させて、蛍光を測定して識別する方法。この方法では、細胞膜表面に存在する対象分子を識別することができる（非特許文献１参照）。また、波長の異なる蛍光分子を用いることで、複数種類の対象分子を識別することができる（非特許文献２参照）。
［２］対象分子に微粒子（粒径１００ｎｍ程度）を結合させて、光学顕微鏡で識別する方法。この方法では、対象分子に特異的に結合する分子で修飾された微粒子を、対象分子に結合させ、対象分子を識別して、対象分子の動きを解析することができる（非特許文献３参照）。
［３］原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）などの走査型プローブ顕微鏡を用いて、化学修飾された探針で物質表面を走査し、対象分子を識別する方法。この方法では、対象分子と特異的に相互作用をする分子で先鋭化探針を化学修飾し、走査型プローブ顕微鏡で対象分子を識別することができる。この方法は、空間分解能が高いという利点を有する（特許文献１および非特許文献４参照）。
【特許文献１】国際公開第２００４／０９２７１２号パンフレット
【非特許文献１】Yu Ohsugi, Kenta Saito, Mamoru Tamura and Masataka Kinjo “Lateral Mobility of Membrane-Binding Proteins in Living Cells Measured by Total Internal Reflection Fluorescence Correlation Spectroscopy", Biophysical Journal 91, 3456-3464 (2006).
【非特許文献２】Schwille, P., F. J. Meyer-Almes, and R. Rigler. 1997. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophys. J. 72:1878-1886.
【非特許文献３】A. Kusumi, Y. Sako, and M. Yamamoto. “Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovideo microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.” Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
【非特許文献４】Peter Hinterdorfer and Yves F Dufrene,“Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy”, Nature Methods 3, 347 - 355 (2006).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、前述の［１］の蛍光分子を使う方法では、蛍光分子は、細胞表面の分子以外に、細胞内外に存在する分子とも結合することがあるため、細胞表面の対象分子だけを検出することは容易ではない。また、光学顕微鏡を用いるため分解能に制限がある。［２］の光学顕微鏡を用いて識別する方法では、[１]の方法と同様に、光の回折限界により分解能に制限がある。また、複数種類の対象分子を識別することも困難である。［３］の化学修飾された探針を用いる方法では、一つの探針に一種類程度の分子を修飾するので、多種類の対象分子を同時に識別することは容易ではない。
【０００４】
そこで本発明者は、物質表面に存在する分子（対象分子）だけを高い分解能で選択的に識別することができ、かつ複数種類の対象分子を、位置情報を含めて高い分解能で識別することができる方法を提供することを検討した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第一は、以下に示す識別方法に関する。
［１］サンプル表面に存在する対象分子を識別する方法であって、Ａ）物理特性が異なる２種以上の微粒子群であって、前記２種以上の微粒子群のそれぞれの微粒子は、それぞれ異なる対象分子に特異的に結合する分子で修飾されている微粒子群を準備するステップ；Ｂ）前記サンプル表面に前記微粒子を接触させて、対象分子に結合させ、サンプル表面に固定するステップ；およびＣ）前記微粒子が固定されたサンプル表面を、走査型プローブ顕微鏡を用いて走査し、前記それぞれの対象分子を識別しうる情報を得るステップ；を含む方法。
［２］前記微粒子群に含まれる粒子の粒径は、１ｎｍ〜１０μｍの範囲である、［１］に記載の方法。
［３］前記分子に特異的に結合する分子は、核酸、ペプチド、糖ペプチド、多糖または脂質である［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記微粒子の物理特性は粒径であって、前記走査型プローブ顕微鏡は原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記微粒子の物理特性は粒径および微粒子の光学的特性であって、前記走査型プローブ顕微鏡は近接場光学／原子間力顕微鏡（ＳＮＯＡＭ）である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記微粒子が結合されたサンプル表面の同一部位について、前記Ｃ）のステップを２回以上繰り返して、前記対象分子の存在位置の変化を観察する、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記サンプルは、対象分子が固定された基板である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記サンプルは、ＤＮＡ又はタンパク質が固定された基板を含むバイオチップである、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記サンプルは生体物質である、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記サンプルは細胞であって、前記対象分子は膜タンパク質、膜糖タンパク質または脂質である、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記細胞は、基板に配置されている、［１０］に記載の方法。
【０００６】
本発明の第二は、以下に示す識別装置に関する。
［１２］サンプル表面に存在する対象分子を識別する識別装置であって、微粒子を前記サンプル表面に提供する微粒子提供部材；サンプル表面に固定された前記微粒子の物理特性を測定し、前記対象分子を識別しうる情報を得る測定部材；および前期情報を出力する出力部材；を有する装置。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、物質表面に存在する複数種類の分子の位置と種類を高い分解能で識別することができる。また、本発明より物質表面に存在する複数種類の分子の経時的な挙動を観察するこができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
１．本発明による表面分子の識別方法について
本発明の識別方法により、サンプル表面に存在する対象分子を識別することができる。サンプルは特に限定されず、その表面に識別したい対象分子が存在すると思われる物質であればよい。
【０００９】
サンプルとは、例えば対象分子が表面に固定された固体基板である。このような固定基板の例には、ＤＮＡチップやプロテインチップなどのバイオチップが含まれる。ＤＮＡチップとは、オリゴヌクレオチドが表面に固定された基板であり、プロテインチップとは、タンパク質が表面に固定された基板である。サンプルとしてＤＮＡチップを用いた場合、基板上に固定されたオリゴヌクレオチドが対象分子となり、サンプルとしてプロテインチップを用いた場合、基板上に固定されたタンパク質が対象分子となる。固体基板の材質は、一般的に、プラスチックやガラス、金属などの材質からなる、板状、ビーズ状、フィルム状のものであり、通常は板状である。本発明のサンプルとしてＤＮＡチップやプロテインチップなどを用いることで、これらのチップの品質チェックを行うことができる。
【００１０】
サンプルの他の例には、細胞がある。細胞表面はリン脂質を主成分とする細胞膜によって形成されている。細胞膜には、リン脂質以外に膜タンパク質、膜糖タンパク質などが存在している。本発明の識別方法により、細胞膜表面に存在する膜タンパク質などを対象分子として識別することができる。
【００１１】
対象分子を識別するとは、対象分子の種類を特定すること；対象分子の存在位置や、その経時的な変化を観察すること、などを意味する。
【００１２】
本発明の識別方法は、Ａ）物理特性が異なる２種以上の微粒子群であって、前記２種以上の微粒子群のそれぞれの微粒子は、それぞれ異なる対象分子に特異的に結合する分子で修飾されている微粒子群を準備するステップ；Ｂ）前記サンプル表面に前記微粒子を接触させて、対象分子に結合させ、サンプル表面に固定するステップ；およびＣ）前記微粒子が固定されたサンプル表面を、走査型プローブ顕微鏡を用いて走査し、前記それぞれの対象分子を識別しうる情報を得るステップを含む。
【００１３】
ステップＡ）では、その物理特性が異なる２種類以上の微粒子群を準備する。物理特性の例には、微粒子のサイズ（粒径）や、粒径と光学的特性を組み合わせたものなどが含まれる。
【００１４】
物理特性が異なる２種類以上の微粒子群の微粒子は、その種類ごとに異なる修飾がなされる。つまり、いずれの種類の微粒子も対象分子に特異的に結合する分子（以下「結合性分子」という）で修飾されるが、その結合性分子の種類が異なり、それぞれ別の対象分子に特異的に結合することができる。これにより、２種以上の複数種類の対象分子を同時に識別することが可能となる。
【００１５】
微粒子群に含まれる微粒子の材質は、例えば、金属や、樹脂、セラミックなどであるが、走査型プローブ顕微鏡で測定できるものであれば特に限定されない。微粒子の粒径は、走査型プローブ顕微鏡の分解能から、プローブの最大可動範囲内の大きさであればよい。例えば、微粒子の粒径は、１ｎｍ〜１０μｍである。
結合性分子は、対象分子に特異的に結合するものであれば特に限定されない。結合性分子の例には、核酸やペプチド、糖ペプチド、多糖、脂質などが含まれる。ここで修飾とは、微粒子表面に結合性分子を固定させることなどをいう。例えば、微粒子の素材が金である場合は、結合性分子にチオール基を付与し、微粒子表面の金原子とメルカプチド結合を形成させることで、結合性分子を固定することができる。また、１）結合性分子を含む樹脂で微粒子をコーティングしたり、２）アビシンとビオチンの強力な結合を利用したりして、結合性分子を微粒子表面に固定することができる。
【００１６】
ステップＢ）では、サンプル表面に前記微粒子を接触させて、前記微粒子のいずれかを前記対象分子に結合させサンプル表面に固定させる。
【００１７】
サンプル表面に微粒子を接触させる方法は、微粒子が分散した溶液をサンプルに滴下したり、または当該溶液中にサンプルを添加したり浸漬したりして行なえばよい。またサンプルが溶媒中に浸漬されているときは、微粒子が分散した溶液をサンプルが浸漬している溶媒に加えてもよい。微粒子が分散した溶液の溶媒は、結合性分子および対象分子が安定して存在できるものであれば特に限定されない。前記溶媒は例えば水である。微粒子が分散した溶液には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム等の塩が含まれていてもよく、または前記溶液は緩衝液であってもよい。
【００１８】
サンプルがＤＮＡチップやプロテインチップのような固体基板である場合には、基板上に微粒子が分散した溶液を滴下することが好ましい。サンプルに細胞を用いる場合は、ステップＢ）に先立って細胞を培養液中で基板上に配置することが好ましい。細胞を基板上に配置するとは、細胞を基板に接着させることや、基板上の孔に細胞を閉じ込めて動かなくすることなどを含む。例えば、基板上に血清入り培養液で懸濁した細胞を播き、細胞を数時間培養することで、細胞を基板上に接着させることができる。サンプルとしてＨｅＬａ細胞や線維芽細胞を用いる場合、例えば、１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭを培養液に用いることができる。さらに細胞が配置された基板は、溶媒中に浸されていることが好ましい。培養細胞は、直接大気に触れると表面張力により細胞膜がダメージを受けるからである。
【００１９】
サンプル表面に微粒子を接触させることによって、微粒子を修飾している結合性分子が、その種類に応じてサンプル表面に存在する対象分子と結合する。その結果、微粒子がサンプル表面に固定される。ここで結合とは、分子間の静電気結合、疎水結合、イオン結合、水素結合を含むあらゆる物理的な吸着または化学的結合により複合体を形成することをいう。結合の例には、抗原と抗体の結合などが含まれる。
【００２０】
前記ステップＡ）において準備された２種以上の微粒子は、ステップＢ）において、種類毎に段階的にサンプル表面に固定されてもよく、または全ての種類の微粒子が同時にサンプル表面に固定されてもよい。
【００２１】
ステップＣ）では、前記微粒子が固定されたサンプル表面を、走査型プローブ顕微鏡を用いて走査し、対象分子を識別しうる情報を得る。つまり、微粒子が固定されたサンプル表面に、走査型プローブ顕微鏡の探針の先端を走査させればよい。
【００２２】
走査型プローブ顕微鏡の例には、原子間力顕微鏡や、原子間力顕微鏡と近接場光学顕微鏡とを組み合わせた、近接場光学／原子間力顕微鏡などが含まれる。微粒子の物理特性が粒径である場合は、走査型プローブ顕微鏡として原子間力顕微鏡を用いることが好ましい。原子間力顕微鏡は、検出対象と探針との間に働く力を利用し検出対象の表面形状を観察する。つまりサンプルと探針との間に働く力によって引き起こされるカンチレバーのたわみ量を測定することで、検出対象の表面形状を観測する。本発明において、原子間力顕微鏡の測定モードは、静的イメージング法（例えば、コンタクトモード）または動的イメージング法（例えば、振幅変調法や周波数変調法）とすることが好ましい。サンプル表面で探針を走査したとき、探針とサンプルとの間の斥力または引力によりカンチレバーがたわむ。このたわみ量を電気信号として取得して走査情報を得ることができる。
【００２３】
原子間力顕微鏡で微粒子が固定されたサンプル表面を走査すれば、サンプル表面に固定された微粒子の存在を確認でき、かつその微粒子の粒径が確認できる。微粒子の存在によって対象分子の存在が確認され、存在する微粒子の位置によってサンプル表面における対象分子の位置が特定される。そして、存在する微粒子の粒径によって対象分子の種類が特定される。
【００２４】
また、走査型プローブ顕微鏡として、原子間力顕微鏡と近接場光学顕微鏡とを組み合わせた近接場光学／原子間力顕微鏡（ＳＮＯＡＭ）を用いることもできる。近接場光学／原子間力顕微鏡では、近接場光学顕微鏡に原子間力顕微鏡にも適用可能な探針を用いる。近接場光学／原子間力顕微鏡を用いることで、微粒子の粒径と、微粒子の光学的特性を同時に観察することが可能となる。近接場光学／原子間力顕微鏡の一例は、特開２００１−１９４２８６に示される。近接場光学／原子間力顕微鏡を用いると、微粒子の粒径と微粒子および光学的特性を同時に観察できるため、より多くの種類の対象分子を同時に識別することができる。
【００２５】
ここで、近接場光学顕微鏡とは、エバネッセント場（光）を利用して、高い空間分解能でサンプル表面の光学的特性を特定することができる走査型プローブ顕微鏡の一種である。近接場光学顕微鏡では、エバネッセント場の散乱光強度を電気信号に変換することで走査情報を得ることができる。エバネッセント場は光の回折限界による制限を受けないため、近接場光学顕微鏡を用いると、光の回折限界を超えた空間分解能で、サンプルの光学的特性を得られるという利点がある。近接場光学顕微鏡の一例は、特開平４−２９１３１０に示される。
【００２６】
サンプルに細胞を用いる場合、細胞を溶液に浸漬した状態で走査を行うことが好ましい。培養細胞は、直接大気に触れると表面張力により細胞膜がダメージを受けるからである。細胞を浸漬する溶液の例には、培地やＴＥ緩衝液などが含まれる。細胞を培地や緩衝液に浸漬することで、細胞が生きた状態で、細胞表面を走査することが可能となる。
【００２７】
サンプル表面の同一部位を、経時的に、前記走査型プローブ顕微鏡により繰り返し走査してもよい。経時的に繰り返し走査することにより、サンプル表面に存在する対象分子に固定された微粒子の移動を観察することができる。サンプル表面に存在する対象分子（例えば細胞膜の膜タンパク質）は、自由拡散や相互作用により経時的に存在位置を変える（移動）ことがある。対象分子が移動することにより、それに結合した微粒子も移動するので、微粒子の移動を観察することにより、サンプル表面での対象分子の挙動がわかる。
【００２８】
走査により得られた情報を視覚化してもよい。例えば、走査により得られた情報を３次元情報としてディスプレイなどに表示してもよい。走査情報の視覚化は任意の方法で行なえばよい。
【００２９】
２．本発明の表面分子の識別装置について
前述の対象分子の識別方法は、例えば、以下に示される装置を用いて実施されうる。本発明の対象分子の識別装置は、微粒子をサンプル表面に提供する微粒子提供部材と、サンプル表面に固定された前記微粒子を測定し、前記対象分子を識別しうる情報を得る測定部材と、前記情報を出力する出力部材とを有する。
【００３０】
本発明の製造装置における微粒子提供部材は、前記微粒子をサンプル表面に滴下する部材でも、前記サンプルを微粒子を含む水溶液に添加する部材でもよい。微粒子をサンプル表面に滴下する微粒子提供部の例には、固定ノズルまたはディスポチップノズルが含まれる。
【００３１】
測定部材は、サンプル表面の対象分子に結合し固定された微粒子の粒径や微粒子の光学的特性などの物理特性を測定し、対象分子を識別しうる情報を得る。測定部材の例には走査型プローブ顕微鏡が含まれる。走査型プローブ顕微鏡の例には、原子間力顕微鏡や、原子間力顕微鏡と近接場光学顕微鏡とを組み合わせせた、近接場光学／原子間力顕微鏡を用いることもできる。近接場光学／原子間力顕微鏡を用いることにより、微粒子の粒径および微粒子の光学的特性に関する情報を同時に得ることができる。
【００３２】
出力部材は、走査により得られた情報を出力する。情報を出力する方法は例えば、サンプル表面の対象分子に結合した微粒子を視覚化することである。
【００３３】
以下、実施例を用いて本発明を説明する。しかし本発明の範囲は、以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
【実施例】
【００３４】
［基板の準備］
糖結合性タンパクであるレクチンの一種であるコンカナバリンＡ（以下「ＣｏｎＡ」という）をリン酸バッファー（１０ｍＭ  ｐＨ７．４）に溶解させ１０ｍＭのＣｏｎＡ溶液を得た。ＣｏｎＡとは異なるレクチンであるコムギ胚芽凝集素（以下「ＷＧＡ」という）を同様のリン酸バッファーに溶解させ１０ｍＭのＷＧＡ溶液を得た。
ガラス基板（１．５ｍｍ×１．５ｍｍ）の表面を左右に二分して、両者にそれぞれ異なるレクチンをコートした。すなわち左右の一方を、ＣｏｎＡ溶液に浸して乾燥させ、もう一方をＷＧＡ溶液に浸して乾燥させ、それぞれをコートしてレクチンが固定された基板１を作製した。作製された基板１には、ＣｏｎＡ（符号２）およびＷＧＡ（符号３）が固定されている（図１（Ａ）参照）。
【００３５】
［微粒子の準備］
金微粒子（粒径５ｎｍ）を含むコロイド溶液（Ａｕ  ｗｔ％  ０．００４４ｗｔ％  田中貴金属工業（株））５００μｌとα結合マンノース脂質（２−（２−（２−（２−（２−（２−（８−ｔｈｉｏ−ｏｃｔｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ−α−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）および水の混合溶液（１０μｇ／μｌ）とを混合し、室温で１時間攪拌した。その後混合液をゲルろ過カラムで精製し、α結合マンノースで修飾された金微粒子を得た。α結合マンノースは、ＣｏｎＡ２と特異的に結合する。得られたα結合マンノースで修飾された金微粒子を水に分散させ、金微粒子の濃度が０．００４４ｗｔ％の水溶液（以下「水溶液Ａ（符号８）」という）を得た。粒径５ｎｍの金微粒子（符号４）は、α結合マンノース（符号５）で修飾されている（図１（Ｂ）参照）。α結合マンノース脂質は、K. Niikuraら  “Accumulation of O-GlcNAc-displaying CdTe quantum dots in cells in the presence of ATP”, ChemBioChem,8, 379-384を参考に調製した。
金微粒子（粒径５０ｎｍ）を含むコロイド溶液（クエン酸タイプ  Ａｕ  ｗｔ％  ０．００６６ｗｔ％  田中貴金属工業（株））５００μｌとＮ-アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）脂質（２−（２−（２−（２−（２−（２−（８−ｔｈｉｏ−ｏｃｔｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ−２−ａｃｅｔａｍｉｄｅ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）と水との混合溶液（１０μｇ／μｌ）とを混合し、室温で一時間攪拌した。その後混合液をゲルろ過カラムで精製し、Ｎ-アセチルグルコサミンで修飾された金微粒子を得た。Ｎ-アセチルグルコサミンは、ＷＧＡと特異的に結合する。得られたＮ-アセチルグルコサミンで修飾された金微粒子を水に分散させ、金微粒子の濃度が０．００６６ｗｔ％の水溶液（以下「水溶液Ｂ（符号９）」という）を得た。粒径５０ｎｍの金微粒子（符号６）は、Ｎ−アセチルグルコサミン（符号７）で修飾されている（図１（Ｂ）参照）。Ｎ−アセチルグルコサミン脂質は、K. Niikuraら  “Accumulation of O-GlcNAc-displaying CdTe quantum dots in cells in the presence of ATP”, ChemBioChem,8, 379-384を参考に調製した。
【００３６】
[基板に微粒子を提供]
準備した基板１に、水溶液Ａおよび水溶液Ｂをそれぞれ１００μｌ滴下して、室温で１５分間インキュベートした。その後、緩衝液（金微粒子を含まない）で基板１を洗浄して、乾燥した。この処理により、基板１には、粒径５ｎｍの金微粒子（符号４）および粒径５０ｎｍの金微粒子（符号６）が付着する（図１（Ｃ）参照）。
【００３７】
［走査型顕微鏡による走査］
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）のプローブで、金微粒子（符号４、符号６）が付着した基板１の表面を走査した（図１（Ｄ）参照）。原子間力顕微鏡装置は、ＭＦＰ−３Ｄ（Ａｓｙｌｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いた。カンチレバー１０としてＯＭＣＬ−ＡＣ１６０（オリンパス社）を用いた。走査の方法はカンチレバー１０をその共振周波数で振動し、振動振幅変化でフィードバックをかけイメージングをするタッピングモードを採用した。イメージング周波数は１〜２Ｈｚとした。
【００３８】
走査により得られた情報により、表面形状をイメージングした。イメージングの結果を図２に示す。
【００３９】
図２（Ａ）には、ＣｏｎＡでコートされた領域（１μｍ×１μｍ）をイメージングした様子が示される。図２（Ｃ）には、ＷＧＡでコートされた領域（１μｍ×１μｍ）をイメージングした様子が示される。一方、図２（Ｂ）には、ＣｏｎＡでコートされた領域とＷＧＡでコートされた領域との境界領域（１μｍ×１μｍ）をイメージングした様子が示される。
【００４０】
図２（Ａ）〜（Ｃ）に示されたように、ＣｏｎＡでコートされた領域では５ｎｍ程度の金微粒子が観察され；ＷＧＡでコートされた領域では５０ｎｍ程度の金微粒子が観察され；ＣｏｎＡでコートされた領域とＷＧＡでコートされた領域との境界領域では、明確な境界が観察された。
このように、微粒子の粒径（本実施例では５０ｎｍ）以下の分解能で、対象分子を識別し、空間分布を測定できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明により、物質表面に存在する複数種類の分子の「位置」と「種類」を識別することができる。バイオチップなどに結合された核酸やタンパク質などの分布を調べることによりバイオチップの品質を検査したり、生体膜（細胞膜）に存在する膜タンパク質などを識別したりすることにより生物学的な知見を得たりすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の識別方法のフローを示す模式図である。
【図２】実施例で得られた情報の写真である。
【符号の説明】
【００４３】
１  基板
２  コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）
３  コムギ麦芽凝縮素（ＷＧＡ）
４  粒径５ｎｍの金微粒子
５  α結合マンノース
６  粒径５０ｎｍの金微粒子
７  Ｎ−アセチルグルコサミン
８  水溶液Ａ
９  水溶液Ｂ
１０  カンチレバー
【図１】
2009058427.tif 000003
【図２】
2009058427.tif 000004