(57)【要約】【課題】電界の不均一性を誘起するための電極構造を簡素化してコストを低減することが可能な微粒子測定装置およびそれに用いる電極を提供する。【解決手段】微生物測定装置は、基板３１，３２間に電極３３，３４を設け、一方の電極３４上に電界歪を作るための構造体３５を設けてチャンバ１を構成する。また、チャンバ１の一方の端に試料導入口３７を設け、他方の端に流出口３８を設ける。そして、チャンバ１内を懸濁液で満たし、電極３３，３４を泳動電源部４に接続して電界を印加する。これによれば、構造体３５が一対の電極３３，３４間に配置され電界の不均一性を誘起するので、懸濁液中の微粒子に誘電泳動力を作用させる電極３３，３４の構造を簡素化して微粒子測定装置のコストを低減することが可能になる。【選択図】図３
2009192479.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子含有の液体を導入するチャンバと、
前記チャンバ内に設けられた少なくとも一対の電極と、
前記一対の電極間に配置され、電界の不均一性を誘起する構造体と、
前記一対の電極間に交流電圧を印加し、前記微粒子に誘電泳動力を作用させる泳動電源部と、
前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記チャンバ内の微粒子数を算出するインピーダンス計測装置と、を備える微粒子測定装置。
【請求項２】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
前記構造体が、微細孔を持つフィルタである微粒子測定装置。
【請求項３】
請求項２記載の微粒子測定装置であって、
前記微細孔の有効径が異なる複数のフィルタを備え、
前記複数のフィルタに対応させて、前記一対の電極を複数組設ける微粒子測定装置。
【請求項４】
請求項２記載の微粒子測定装置であって、
前記構造体中あるいはその表面にインピーダンス計測電極を含む微粒子測定装置。
【請求項５】
請求項２記載の微粒子測定装置であって、
前記構造体が、イオン吸着体で構成されるものあるいはイオン吸着体を一部に含むものである微粒子測定装置。
【請求項６】
請求項２記載の微粒子測定装置であって、
前記フィルタが、前記一対の電極の表面にある微粒子測定装置。
【請求項７】
請求項２記載の微粒子測定装置であって、
前記フィルタが、前記一対の電極の両方の電極の表面にある微粒子測定装置。
【請求項８】
請求項２記載の微粒子測定装置であって、
前記フィルタが、前記一対の電極の中間に位置する微粒子測定装置。
【請求項９】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
前記インピーダンス計測装置は、インピーダンスの初期変化により前記微粒子数を測定する微粒子測定装置。
【請求項１０】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
検出物質に特異的に結合し、凝集塊を形成する試薬を含む微粒子測定装置。
【請求項１１】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
前記一対の電極が透明であり、
前記構造体を透明基板上に構成し、
前記チャンバ内の微粒子数を光学測定する微粒子測定装置。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか一項記載の微粒子測定装置に用いる電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘電泳動を用いて懸濁液中の微粒子数を測定するための微粒子測定装置およびそれに用いる電極に関する。更に詳しくは、電界の不均一性を誘起するための電極構造を簡素化して簡易な製造を可能とし、コストを低減することが可能な微粒子測定装置およびそれに用いる電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、食中毒や感染症などの原因となり、人体に何らかの害を及ぼす可能性がある微生物を、迅速、簡便、高感度に定量測定するニーズは特に高い。食品の製造工程や微生物検査施設を備えない診療所などにおいて、その場で微生物検査を実施することで、食中毒や感染症などの防止、予防が可能になるためである。
【０００３】
また、いわゆるバイオセンサにおいて、抗体など、測定対象に特異的に結合する物質を標識したポリスチレンなどの人工微粒子を用いて、検体中の生化学的物質を定量測定する際に、検体中の微粒子数あるいはその結合状態を定量測定する必要がある。このように、昨今、液体中に含まれる微粒子を迅速、簡便、定量的に測定する要求は高い。
【０００４】
ここで、本願における微粒子の定義について説明する。本願で言う微粒子とは、ポリスチレンやそれらに何らかのコーティングを施した粒子、カーボンナノチューブ、金コロイドなどの金属粒子、細菌、真菌、放線菌、リケッチア、マイコプラズマ、ウイルス、として分類されているいわゆる微生物、原生動物や原虫のうちの小型のもの、生物体の幼生、動植物細胞、精子、血球、核酸、蛋白質等も含む広い意味での生体または生体由来の微粒子である。この他にも、本願で言う微粒子とは、誘電泳動可能な大きさのあらゆる粒子を意味する。本願では特に、微生物の測定を想定しており、以下、測定対象を微生物として説明を行う。
【０００５】
従来、微生物の検査法として最も一般的に用いられるのは培養法である。培養法は、培地上に微生物検体を塗抹し、微生物が生育条件下で培養を行い、形成される培地上のコロニー数を計数することで微生物数を定量する方法である。
【０００６】
しかし、コロニー形成までに通常１〜２日、微生物種によっては数週間を要するため、迅速な検査を実施できない問題があった。また、濃縮や希釈、培地への塗抹などが必要なため、専門家による操作が必要であり、簡便な検査が実施できない、あるいは操作上のバラツキによる精度低下の問題があった。
【０００７】
これら従来の問題を解決するため、本発明者は他の発明者らと共に、迅速、簡便、高感度な微生物数測定法として、誘電泳動とインピーダンス計測を組み合わせたＤＥＰＩＭ（Dielectrophoretic Impedance Measurement Method）法を提案した（例えば、特許文献１を参照）。
【０００８】
ＤＥＰＩＭ法は、微生物を誘電泳動力によってマイクロ電極に捕集し、同時にマイクロ電極のインピーダンス変化を測定することによって試料液中の微生物数を定量測定する方法である。以下、その測定原理について概説する。
【０００９】
微生物は一般に、イオンリッチで誘電率および導電率の高い細胞質および細胞壁が、比較的誘電率および導電率の低い細胞膜に囲まれた構造を有し、誘電体粒子とみなすことができる。ＤＥＰＩＭ法では、電界中で分極した誘電体粒子に一定方向に働く力である誘電泳動力を利用し、誘電体粒子である微生物をマイクロ電極のギャップ間に捕集する。
【００１０】
誘電体粒子に働く誘電泳動力ＦＤＥＰは、以下の（数１）で与えられることが公知である（例えば、非特許文献１を参照）。以下、誘電体粒子が、微生物である場合を例として説明する。
【００１１】
【数１】
2009192479.tif 000003
【００１２】
ここで、a：球形近似したときの微生物の半径、ε０：真空の誘電率、εｍ：試料液の比誘電率、Ｅ：電界強度であり、▽は演算子で勾配（gradient）を表す。この場合、▽Ｅ２は、電界Ｅ２の勾配なので、その位置でどれだけＥ２が傾斜を持っているか、つまり電界Ｅが空間的にどれだけ急に変化をするかを意味する。また、Ｋはクラウジウス・モソッティ数と呼ばれ、（数２）で表され、Ｒｅ［Ｋ］＞０は正の誘電泳動を表し、微生物は電界勾配と同方向、つまり、電界集中部に向かって泳動される。Ｒｅ［Ｋ］＜０は負の誘電泳動を表し、電解集中部から遠ざかる方向、すなわち弱電界部に向かって泳動される。
【００１３】
【数２】
2009192479.tif 000004
【００１４】
ここで、εｂ＊およびεｍ＊はそれぞれ、微生物および溶液の複素誘電率を表し、一般に複素誘電率εｒ＊は（数３）で表される。
【００１５】
【数３】
2009192479.tif 000005
【００１６】
ここで、εｒ：微生物あるいは試料液の比誘電率、σ：微生物あるいは試料液の導電率、ω：印加電界の角周波数を表す。
【００１７】
（数１）（数２）（数３）から、誘電泳動力は、微生物の半径、クラウジウス・モソッティ数の実部（以下、Ｒｅ［Ｋ］と表す）および電界強度に依存することが分かる。また、Ｒｅ［Ｋ］は、試料液および微生物の複素誘電率、電界周波数に依存して変化することが分かる。
【００１８】
そのため、ＤＥＰＩＭ法では、これらのパラメータを適切に選択し、微生物に働く誘電泳動力を十分大きくし、微生物を電極ギャップに確実に捕集する必要がある。また、ＤＥＰＩＭ法では、上記誘電泳動による電極への微生物捕集と同時に、電気的計測を行い、試料液中の微生物数を定量測定することを特徴としている。
【００１９】
微生物は、前述した構造を有するため、電気的には固有のインピーダンスを持った微粒子と考えることができる。そのため、誘電泳動によりマイクロ電極のギャップ間に捕集される微生物数が増加すると、その捕集数に応じて電極間のインピーダンスが変化する。
【００２０】
従って、電極間インピーダンス時間変化の傾きは、単位時間当たりに電極ギャップ間に捕集される微生物数に応じた値となり、傾きの大きさは試料液中の微生物濃度に対応する。よって、電極間インピーダンス時間変化の傾きを測定することで、試料液中の微生物濃度、言い換えれば微生物数を測定することが可能となる。
【００２１】
更に、ＤＥＰＩＭ法では、誘電泳動を開始直後のインピーダンス時間変化の傾きから微生物数を定量することで、短時間での微生物測定を実現している。以上、ＤＥＰＩＭ法の測定原理について概説したが、詳しくは非特許文献２を参照されたい。
【００２２】
一方、媒体中の物体、特にはセル、リポソームもしくは同様な微小物体の電気的測定をするための装置及び方法が知られている。図１１は、チャンネル内に満たされた液体５１のインピーダンスを測定する装置を示す。この装置では、電極５２がチャンネル内の液体にそれぞれ電気接触するよう設けられ、さらに電極５２がその電流及び電圧を測定するために図示しない電気的測定装置に接続されている（例えば、特許文献２参照）。
【００２３】
【特許文献１】特開２０００−１２５８４６号公報
【特許文献２】特表２００３−５２７５８１号公報
【非特許文献１】Ｈｙｗｅｌ  Ｍｏｒｇａｎ、他：「ＡＣ  Ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃｓ：ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、ＲＥＳＥＲＣＨ  ＳＴＵＤＩＥＳ  ＰＲＥＳＳ  ＬＴＤ．２００３年出版、ｐｐ．１５〜６３
【非特許文献２】J.Suehiro, R.Yatsunami, R.Hamada, M,Hara，J.Phys. D: Appl. Phys. 32(1999)2814-2820
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
従来、ＤＥＰＩＭに用いる電極は、電極ギャップ間に生じる電界歪を利用した誘電泳動により細菌をトラップするために微細なギャップ（５μｍ程度）を用いる必要があるため製造上の困難がある。また、電極ギャップ間に生じる電界歪みは、電極エッジの限られた領域のみであるため、トラップの空間的な効率も悪く、測定感度が制限されている。
【００２５】
また、電極を櫛歯状に形成して電界歪を生成していたが、電極を櫛歯状に加工することは製造上の困難性がありコストの上昇を招いていた。特に、電極は測定の都度交換することが望ましく、構造を簡素化してコストを低減させることが望まれていた。
【００２６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、電界の不均一性を誘起するための電極構造を簡素化してコストを低減することが可能な微粒子測定装置およびそれに用いる電極を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明の微粒子測定装置は、微粒子含有の液体を導入するチャンバと、前記チャンバ内に設けられた少なくとも一対の電極と、前記一対の電極間に配置され、電界の不均一性を誘起する構造体と、前記一対の電極間に交流電圧を印加し、前記微粒子に誘電泳動力を作用させる泳動電源部と、前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記チャンバ内の微粒子数を算出するインピーダンス計測装置とを備える。
【００２８】
上記構成によれば、構造体が一対の電極間に配置され電界の不均一性を誘起するので、懸濁液中の微粒子に誘電泳動力を作用させる電極の構造を簡素化しつつ、微生物をトラップする空間を多く取れるため、微粒子測定装置のコストを低減しながらも測定感度を向上することが可能になる。
【００２９】
また、本発明の微粒子測定装置は、前記構造体が微細孔を持つフィルタである。
【００３０】
上記構成によれば、簡単な構造で微粒子を微細孔に泳動させ、懸濁液のインピーダンスを変化させることができる。
【００３１】
また、本発明の微粒子測定装置は、前記微細孔の有効径が異なる複数のフィルタを備え、前記複数のフィルタに対応させて、前記一対の電極を複数組設ける。
【００３２】
上記構成によれば、微細孔の有効径によってトラップする菌の種類を変えることができ、測定のダイナミックレンジを向上することができる。また、大きさの異なる測定対象を選択的に検出することができる。
【００３３】
また、本発明の微粒子測定装置は、前記構造体中あるいはその表面にインピーダンス計測電極を含む。
【００３４】
上記構成によれば、懸濁液のインピーダンスを測定するインピーダンス計測電極を容易に製造することができ、微粒子測定装置のコストを低減することが可能になる。
【００３５】
また、本発明の微粒子測定装置は、前記構造体がイオン吸着体で構成されるものあるいはイオン吸着体を一部に含むものである。
【００３６】
上記構成によれば、イオン吸着体が懸濁液中のイオンを吸着し、懸濁液の導電率を下げることができるため、導電率の上昇による誘電泳動力の低下を防ぎ、高い導電率の測定試料も高感度に測定することが可能になる。
【００３７】
また、本発明の微粒子測定装置は、前記フィルタが前記一対の電極の表面にある。
【００３８】
上記構成によれば、フィルタの微細孔に微粒子を泳動させ、簡素な構成で懸濁液のインピーダンスを変化させることができる。
【００３９】
また、本発明の微粒子測定装置は、前記フィルタが前記一対の電極の両方の電極の表面にある。
【００４０】
上記構成によれば、一対の電極の両方に設けられたフィルタの微細孔に微粒子を泳動させ、懸濁液のインピーダンスを効率よく変化させることができる。
【００４１】
また、本発明の微粒子測定装置は、前記フィルタが前記一対の電極の中間に位置する。
【００４２】
上記構成によれば、フィルタを一対の電極の中間に配置し、フィルタの両側に微粒子をトラップすることができ、微粒子のトラップ効率を向上させることができる。
【００４３】
また、本発明の微粒子測定装置において、前記インピーダンス計測装置は、インピーダンスの初期変化により前記微粒子数を測定する。
【００４４】
上記構成によれば、インピーダンスの初期変化により微粒子数を測定するので、測定時間を短縮することができる。
【００４５】
また、本発明の微粒子測定装置は、検出物質に特異的に結合し、凝集塊を形成する試薬を含む。
【００４６】
上記構成によれば、検出物質に特異的に結合し凝集塊を形成するので、凝集塊の大きさに応じて誘電泳動力が大きくなり、他の物質が混在した中でも、検出物質を特異的に測定することが可能になる。
【００４７】
また、本発明の微粒子測定装置は、前記一対の電極が透明であり、前記構造体を透明基板上に構成し、前記チャンバ内の微粒子数を光学測定する。
【００４８】
上記構成によれば、チャンバ内の微粒子数を光学測定するので、懸濁液の導電率に依存することなく微粒子数を測定することができる。
【００４９】
また、本発明は、上記の微粒子測定装置に用いる電極である。
【００５０】
上記構成によれば、電極の構造を簡素化して微粒子測定装置のコストを低減することが可能になる。
【発明の効果】
【００５１】
本発明によれば、構造体が一対の電極間に配置され電界の不均一性を誘起するので、懸濁液中の微粒子に誘電泳動力を作用させる電極の構造を簡素化して微粒子測定装置のコストを低減することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
以下、本発明の実施の形態の微生物測定装置について、図面を用いて説明する。図１は、本実施形態の微生物測定装置の構成図である。
【００５３】
図１において、１は測定対象の微生物が含まれる懸濁液２を保持するチャンバ、３は誘電泳動で微生物を捕集する電極対を含む電極、４は泳動電源部、５は誘電泳動によってトラップされた微生物によって生じた光学的あるいは電気的な変化を測定する測定部、６は微生物測定装置全体の制御や測定結果の解析演算や入出力処理などを行う制御演算部、７は試料液２の導電率を入力するための導電率入力手段である。
【００５４】
図２（ａ）は、本実施形態の微生物測定装置におけるチャンバ１の構成を説明するための図である。本実施形態のチャンバ１は、基板３１，３２間に平面電極３３，３４を設け、一方の平面電極３４上に電界歪を作るための構造体３５（絶縁体など）を設ける。そして、平面電極３３と構造体３５の間を懸濁液２で満たし、平面電極３３，３４に泳動電源部４を接続して電界を印加する。
【００５５】
誘電泳動は、空間的に不均一な電界が形成された箇所で働く力なので、通常のＤＥＰ（誘電泳動）では、薄膜電極が対向した構成として、断面で見た鋭利なエッジ同士の対向部分で不均一な電界を作る。本実施形態では、電界中にメンブレンフィルタなどの構造体３５を配置することで不均一な電界（電界歪）を作り、そこで誘電泳動を働かせる現象（iDEP；insulator-based DiElectroPhoresis）を利用する。構造体３５は、不均一な電界を形成させられればいずれの材料も使用できるが、試料液（懸濁液２）との誘電率の差が大きいほど、大きな電界歪を形成することができるため、そのような材料が望ましい。本実施の形態では、懸濁液を比誘電率８０程度の水と想定しているため、比誘電率の小さな樹脂材料などの絶縁体、もしくは比誘電率が無限大とみなせる金属で形成するのが望ましい。
【００５６】
本実施の形態では、構造体３５として、一般的な材料で簡易に入手可能なフィルタを用いている。フィルタとは、その面に垂直な方向に微細な孔を有する構造体であって、一般的にはメンブレンフィルタなどが容易に入手可能である。メンブレンフィルタの材料は様々であり、ポリカーボネイトなどの樹脂材料などがある。樹脂材料の比誘電率は２〜３程度であるので、電界歪を形成するために好適である。入手性と物理的な特性により、本実施の形態では、ポリカーボネイト性のメンブレンフィルタを用いている。
【００５７】
図２（ｂ）は、構造体３５の穴のエッジにp-DEP（positive DiElectroPhoresis；正の誘電泳動）が作用し菌がトラップされている顕微鏡写真を示す。誘電泳動は、電界の周波数、粒子・溶液の物性値（誘電率、導電率）の条件によって、正の誘電泳動（p-DEP）と負の誘電泳動（n-DEP ; negative DiElectroPhoresis）の２つの現象が見られる。正の誘電泳動は、電界が集中する箇所に向かって粒子が動き、負の誘電泳動は、電界が集中する箇所から遠ざかる方向（つまり、正の誘電泳動と逆方向）に向かって粒子が動く。この場合、穴のエッジが電界集中部になり、ここに向かって誘電泳動力が働き、菌がトラップされる。
【００５８】
図２（ｃ）は、チャンバ１のインピーダンス等価回路を示す。懸濁液２のインピーダンスをＺｍ、構造体３５のインピーダンスをＺｓ、菌のインピーダンスをＺｂとすると、チャンバ１のインピーダンスＺｃは、
【数４】
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で表わされる。懸濁液２のインピーダンスＺｍおよび構造体３５のインピーダンスＺｓは略一定なので、チャンバ１のインピーダンスの時間変化は、菌のインピーダンスＺｂの増分に依存する。
【００５９】
また、本実施形態の微生物測定装置において、構造体３５をイオン吸着体で構成することもできる。前述した通り、誘電泳動力は懸濁液２の導電率に依存して変化する力であり、一般的には導電率が高くなると、誘電泳動力は低下する傾向にある。そこで、この構成によれば、イオン吸着体が懸濁液２中のイオンを吸着し、懸濁液２の導電率を下げることができるため、導電率の上昇による誘電泳動力の低下を防ぎ、測定を行うために必要十分な微生物を、十分な強度の誘電泳動力によってトラップすることができるため、高い導電率の測定試料も高感度に測定することが可能になる。
【００６０】
図３は、本実施形態の微生物測定装置におけるチャンバ１の具体的構成を説明するための図である。本実施形態の微生物測定装置は、基板３１，３２間に電極３３，３４を設け、一方の電極３４上に電界歪を作るための構造体３５を設けてチャンバ１を構成する。また、チャンバ１の一方の端に試料導入口３７を設け、他方の端に流出口３８を設ける。そして、チャンバ１内を懸濁液で満たし、電極３３，３４を泳動電源部４に接続して電界を印加する。
【００６１】
図４（ａ）は、本実施形態の微生物測定装置におけるチャンバ１のバリエーション（１）を示す。バリエーション（１）は、懸濁液３６内に中空状態でフィルタ４１（構造体）を配置してトラップ効率を更に向上させるものである。フィルタ４１を中空状態にすることで、フィルタ４１の図４中の上側および下側の両方に微生物をトラップすることが可能となる。
【００６２】
図４（ｂ）は、本実施形態の微生物測定装置におけるチャンバ１のバリエーション（２）を示す。バリエーション（２）は、基板３１，３２上に電極３３，３４を配置し、電極３３，３４の両方にフィルタ４２，４３を配置し、フィルタ４２，４３間に懸濁液３６を満たすものである。この構成によれば、一対の電極３３，３４の両方に設けられたフィルタ４２，４３の微細孔に微粒子を泳動させ、懸濁液のインピーダンスを効率よく変化させることができる。
【００６３】
図４（ｃ）は、本実施形態の微生物測定装置におけるチャンバ１のバリエーション（３）を示す。バリエーション（３）は、複数の電極対３３ａ，３４ａ，３３ｂ，３４ｂの間に、それぞれ目の粗さが異なるフィルタ４１ａ，４１ｂを設け、電極対３３ａ，３４ａおよびフィルタ４１ａと、電極対３３ｂ，３４ｂおよびフィルタ４１ｂを仕切り板４５，４６，４７で区分するものである。
【００６４】
バリエーション（３）によれば、フィルタ４１ａ，４１ｂの径によってトラップする菌の種類を変えることができ、測定のダイナミックレンジを向上することができる。また、大きさの異なる測定対象を選択的に検出することができ、免疫凝集した粒子を検出することができる。
【００６５】
電極３３，３４はそれぞれ泳動電源部４に接続されており、泳動電源部４は電極３３，３４間に特定周波数の交流電圧を印加する。なお、ここで交流電圧というのは、正弦波のほか、ほぼ一定の周期で流れの向きを変える電圧のことであり、かつ両方向の電流の平均値が等しいものである。後述するが、泳動電源部４が印加する周波数は、制御演算部６（図１参照）によって適切に決定される。
【００６６】
電極３３，３４が懸濁液３６に接した状態で、電極３３，３４間に交流電圧が印加されると、懸濁液３６中に含まれる微生物が、電極３３，３４に挟まれた構造体４１等の微細孔に誘電泳動力によって捕捉される。
【００６７】
微生物に十分な大きさの正の誘電泳動力が働く場合は、図２（ａ）のように電界集中部である孔のエッジ部に微生物がトラップされる。
【００６８】
測定部５は、このようにして構造体３５にトラップされた微生物によるインピーダンス変化を測定する。具体的には、図６に示すように、泳動電源部４と電極３の間に、測定部５を電極３間のインピーダンスを測定する回路を構成する。
【００６９】
この場合、測定部５は電極３間に流れる電流値と、泳動電源部４が印加した電圧と電流の位相差を測定するための回路等から構成される。測定部５は、誘電泳動によって微生物が移動し電界集中部近傍に濃縮されることに起因する電極３間の電流および位相差の変化を測定する。
【００７０】
測定部５で測定した電流値と位相差は、制御演算部６に渡される。制御演算部６は、これら電流、位相差、および、泳動電源部４が印加している電圧および周波数の情報から、電極３間のインピーダンス値を計算する。
【００７１】
電圧印加前、電極３間の懸濁液３６のみで満たされた領域が、誘電泳動によるトラップによって誘電率の異なる微生物で置き換えられることで、電極３間のインピーダンスはトラップされた微生物数に応じて変化する。
【００７２】
従って、ある時間におけるインピーダンス値と、電圧印加直後の初期インピーダンス値との差分、言い換えれば変化分から、微細孔にトラップされた微生物数を推定することが可能である。そして、トラップされた微生物数は懸濁液中に含まれる微生物濃度に依存するものであるから、懸濁液中の微生物数を測定することが可能になる。
【００７３】
測定部５はまた、図７に示すように、光学的測定手段によっても実現可能である。この場合、光源２１と受光部２２の光路内にギャップが含まれるような位置関係にチャンバ１を配置する。ギャップにトラップされた微生物数によって、受光部２１に入射する光量が変化することを利用して、ギャップにトラップされた微生物数を推定することができる。
【００７４】
あるいは、受光部２２の情報を制御演算部６に渡して画像化し、制御演算部６が粒子判定アルゴリズムなどを用いて直接粒子数を計数してもよいし、視野面積に対する微粒子面積を求めることで微粒子数に換算してもよい。このようにして得られたギャップにトラップされた微生物数は懸濁液中に含まれる微生物濃度に依存するものであるから、懸濁液中の微生物数を測定することが可能になる。
【００７５】
以上のように微生物をギャップにトラップするためには、微生物に働く粘性力や重力、ブラウン運動など、誘電泳動以外の全ての外力に対して十分大きな誘電泳動力を誘起する必要がある。これが不十分であれば、測定部５が測定できる微生物数が減少するため、測定感度および精度が著しく低下し、測定部５が測定可能な信号の大きさを下回ると微生物の測定が出来なくなる。
【００７６】
従って、本実施の形態では、微生物をギャップにトラップするために十分な誘電泳動力が働くような周波数を、制御演算部６が適切に決定し、泳動電源部４が決定した周波数の電圧を印加する。これにより、測定部５が十分に検出可能な信号を取り出すことが出来るため、微生物濃度の測定が高精度かつ高感度に行える。
【００７７】
制御演算部６は、図示しないＣＰＵや、一連の動作を規定するプログラムや各種データが格納されたメモリ６ａなどの回路から構成され、一連の測定動作を制御する。導電率入力手段７は、懸濁液の導電率を、測定前に入力できるようになっている。例えば、テンキーで数値入力する方法や、「０〜５０μＳ／ｃｍ」、「５０〜１００μＳ／ｃｍ」など複数の導電率範囲に対応したスイッチを押下するなどの方法で実現できる。
【００７８】
メモリ６ａは、導電率入力手段７から与えられた懸濁液の導電率の値から、泳動電源部４が印加する電圧の適切な周波数を選択するための周波数選択テーブルを有する。周波数選択テーブルには、懸濁液の導電率毎に、微生物に十分な誘電泳動力が働く最適な周波数と印加電圧値がテーブル化されている。
【００７９】
ここで、メモリ６ａに格納されている周波数選択テーブルについて詳説する。表１に示すように、周波数選択テーブルは少なくとも、懸濁液の導電率、印加する交流電圧の振幅、最適周波数が互いに関連付けられて格納されている。懸濁液の導電率は特定の数値であってもよいし、ある範囲を設定してテーブルを作成してもよい。制御演算部６は、与えられた導電率に該当する交流電圧の振幅と最適周波数を選択する。尚、導電率３００μS／ｃｍ〜に対応する周波数の“Ｅ”は、エラーであることを示しており、あまりにも導電率が高い場合には測定が出来ないことを表している。
【００８０】
【表１】
2009192479.tif 000007
【００８１】
次に、最適周波数について説明する。（数１）において、誘電泳動力ＦＤＥＰは、クラウジウス・モソッティ数Ｋの実部、すなわちＲｅ［Ｋ］に比例する。そして、Ｒｅ［Ｋ］は、（数２）および（数３）から明らかなように、懸濁液の導電率に依存する。懸濁液の導電率が変化した場合、Ｒｅ［Ｋ］すなわち誘電泳動力がどのように変化するかを示したものが図８である。
【００８２】
図８においては、誘電泳動に用いる電界、言い換えれば印加電圧の周波数をパラメータに、懸濁液の導電率の関数として示している。Ｒｅ［Ｋ］は、誘電泳動力ＦＤＥＰに対応しており、その正負は誘電泳動力が引力として作用するか、あるいは斥力として作用するかにそれぞれ対応する。
【００８３】
図８（ａ）に示すように、たとえば、誘電泳動用交流電圧の周波数が（１）１０ＫＨｚの場合は、溶液導電率３μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微粒子に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
【００８４】
一方、誘電泳動用交流電圧の周波数が（２）１００ＫＨｚの場合は、溶液導電率３０μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微粒子に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
【００８５】
なお、図８（ｂ）は、誘電泳動用交流電圧の周波数が（２）１００ＫＨｚおよび（３）８００ＫＨｚの場合に、溶液導電率を１μＳ／ｃｍ〜１０００μＳ／ｃｍまで変化させた場合の誘電泳動力ＦＤＥＰの変化を示す。周波数が（２）１００ＫＨｚの場合、約２０μＳ／ｃｍ以上でＲｅ［Ｋ］＜０となるが、８００ＫＨｚでは導電率上昇に対する誘電泳動力の低下が抑えられ、約２５０μＳ／ｃｍまでＲｅ［Ｋ］＞０となり引力によりギャップ１３のエッジ部にトラップすることができる。
【００８６】
このことは、懸濁液の導電率上昇に対して最も誘電泳動力の低下が小さくなる最適な周波数が存在することを示している。この最適周波数を決定するには、次のような実験を行って決定するのがよい。すなわち、同じ微粒子濃度で、導電率を変えた複数の懸濁液を用意し、それぞれの懸濁液に対して印加電圧の周波数を変えながら測定を行う。その結果、測定応答が最も大きくなった周波数が、それぞれの懸濁液導電率に対する最適周波数となる。表１に示した最適周波数は、このようにして決定する。
【００８７】
しかしながら、あまりにも周波数が高いと測定回路の実現が困難となり、あまりにも周波数が低いとジュール熱による対流や、極端な場合、電気分解による気泡発生が測定に悪影響をもたらす。このため、最適周波数は、誘電泳動にとって最適とはいえないが、微粒子測定を行うのに十分な誘電泳動を働かせることの出来る、許容範囲の周波数が存在する。
【００８８】
図９は、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）をパラメータとした場合における、誘電泳動用交流電圧の周波数（Ｈｚ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフである。懸濁液の導電率１００μＳ／ｃｍにおいて、正の誘電泳動を利用して微粒子の測定を行う場合、測定応答を得られる十分な誘電泳動力がＲｅ［Ｋ］＞０．４であったとすると、最適周波数は約７００ＫＨｚ〜４ＭＨｚとなる。この場合、高周波による測定回路の複雑化を避けるために、下限の周波数である７００ＫＨｚを最適周波数として採用することも可能である。
【００８９】
また、測定する必要がある懸濁液導電率の範囲内で、ある特定の一つの周波数で十分に誘電泳動力が得られることがある。その場合は、表２に示すような周波数選択テーブルになる。
【００９０】
【表２】
2009192479.tif 000008
【００９１】
例えば、測定する必要のある懸濁液導電率の範囲が０〜１００μＳ／ｃｍであった場合、周波数８００ＫＨｚであれば、全ての導電率領域に対してＲｅ［Ｋ］＞０．４となり、単一の周波数で所望の懸濁液導電率の範囲で測定を行うことができるため、回路構成が簡易となり好都合である。この場合、懸濁液導電率が１００μＳ／ｃｍを超えた場合には、周波数選択テーブルに示されるよう、エラーに該当するデータが書き込まれている。
【００９２】
図１０は、本実施形態にかかる微生物測定方法を説明するためのフローチャートである。以下、フローチャートを参照して、試料の導入からチャンバ１内の微生物の濃縮、測定、結果提示にいたるまでの一連の流れを説明する。まず、初期状態では、チャンバ１に測定対象の微生物が含有された懸濁液を投入する（ステップＳ１１）。
【００９３】
次に、導電率入力手段７によって、投入した懸濁液の導電率を入力する。入力された導電率は、制御演算部６に渡される（ステップＳ１２）。
【００９４】
懸濁液の導電率を渡された制御演算部６は、メモリ６ａに備わる最適周波数テーブルを参照し、電極に印加すべき電圧振幅値および周波数を選択する（ステップＳ１３）。この時の電圧振幅値（以下、「誘電泳動のための電圧」と呼ぶ）は、微生物を微細孔にトラップするために十分な値を選択すればよく、本実施の形態では５Vｐ−ｐとしている。
【００９５】
また、表１および表２では、誘電泳動のための電圧は導電率に対して一定の値としているが、それぞれの導電率で最適な値を選択することができる。例えば、導電率が高い場合は、あまりに電圧が高すぎるとジュール熱が発生し、誘電泳動による微生物トラップに影響が出るため、導電率が高くなるに従い、誘電泳動のための電圧を低くする、などとする。
【００９６】
次いで、制御演算部６は、メモリ上に保存された、入力された導電率に対応する周波数がエラーコード（Ｅ）であるか判断する（ステップＳ１４）。エラーコード（Ｅ）であった場合には、ステップＳ１６に進み、制御演算部６は、入力された導電率が測定範囲外であることを表示手段９に表示するよう指示し、測定を終了する（ステップＳ２２）。
【００９７】
ステップＳ１４において、選択した周波数がエラーコード（Ｅ）でなかった場合、制御演算部６は泳動電源部４に対し、最適周波数テーブルで選択した電圧振幅および周波数にて、電極３間に電圧を印加させる（ステップＳ１５）。
【００９８】
電極３間に所定の電圧が印加されると、測定部５は直ちに電圧印加直後の初期状態のデータとして、電極３間のインピーダンスを測定し、測定結果は制御演算部６に渡され、メモリ６ａに初期のインピーダンス値として保存する（ステップＳ１７）。
【００９９】
ここでは、インピーダンス測定を例として記載するが、測定部５が光学的な手段を用いてギャップの状態を測定するのであれば、電圧を印加しなくても初期状態が測定できるので、ステップＳ１７はステップＳ１５の前に行うことも可能である。なお、測定部５が光学測定を行う場合、透明電極及び透明基板を用いる。
【０１００】
次に、制御演算部６は、図示しない時計手段によって所定の時間が経過するまで待つ。この時、泳動電源部４は電圧印加を保持したままである（ステップＳ１８）。
【０１０１】
所定の時間が経過すると、制御演算部６は所定の測定回数が満了したかを判断し（ステップＳ１９）、満了していなければステップＳ１７に戻る。ステップＳ１７に戻り、制御演算部６は測定部５に命じ、電極３間のインピーダンスを測定し、その結果をメモリ６ａに所定時間経過後の結果として保存する。
【０１０２】
所定の測定回数が満了した場合、制御演算部６は泳動電源部４に電圧印加を止めるよう指示する（ステップＳ２０）。
【０１０３】
電圧印加を停止後、制御演算部６は、メモリ６ａに保存された、電極３間インピーダンスの経時変化データから、懸濁液２中の微粒子濃度を算出し、表示手段９に結果を表示させ（ステップＳ２１）、一連の測定動作を終了する（ステップＳ２２）。
【０１０４】
微生物濃度の算出は、メモリ６ａに予め保存された、検量線から求めることができる。この検量線は、微生物濃度が明らかな校正用試料を、本実施の形態で説明した微生物測定装置の測定系を用いて予め測定し、その時の微生物数とインピーダンス変化の相関関係からばらつきを回帰分析して得られる曲線をあらわす関数を使用する。
【０１０５】
この変換式を制御演算部６のメモリ６ａに記憶させ、微生物濃度が未知の試料を測定する場合には、所定時間内におけるインピーダンス変化の値を代入することにより、セル１内の微生物濃度を算出できる。なお、換算テーブルを用いる場合は、変換式による演算結果を予めメモリさせている。
【０１０６】
以上説明したように、本実施形態の微粒子測定装置によれば、微粒子含有の液体を導入するチャンバ１と、チャンバ１内に設けられた一対の電極３と、一対の電極３間に配置され、電界の不均一性を誘起する構造体３５等と、一対の電極３間に交流電圧を印加し、微粒子に誘電泳動力を作用させる泳動電源部４と、一対の電極３間のインピーダンスの時間変化を演算し、チャンバ１内の微粒子数を算出する測定部５とを備えるので、懸濁液中の微粒子に誘電泳動力を作用させる電極３の構造を簡素化して微粒子測定装置のコストを低減することが可能になる。
【０１０７】
なお、チャンバ１内には、検出物質に特異的に結合し、凝集塊を形成する試薬を含む液体を導入してもよい。前述したように、誘電泳動力は泳動する対象の大きさによって変化する力であり、実効的な粒子径が大きくなるほど働く誘電泳動力は大きくなる。このため、懸濁液２内に測定対象である検出物質と、測定対象で無い挟雑物が混在した場合に、凝集塊を形成した検出物質は実効的な粒子径が大きくなっていることになり、挟雑物質に比べ大きな誘電泳動力が働くことになる。印加する電圧値を調整すれば、挟雑物質にはトラップするのに不十分な誘電泳動力しか働かず、測定対象の凝集塊には十分な誘電泳動力を働かせることができる。この条件下では、測定される結果は、測定対象物質のみによる反応であると考えられる。よって、この構成によれば、他の物質（挟雑物）が混在した中でも、検出物質を特異的に測定することが可能になる。
【０１０８】
以下に、本発明の実施例を示す。
[実施例１]
（１）試料液の調整
標準寒天培地（ＭＢ００１０、栄研器材（株））上で３７℃、１６時間の好気培養を行った大腸菌Ｋ−１２株（ＮＢＲＣ３３０１、製品評価技術基盤機構）をコンラージ棒で採取し、０．１Ｍ  Ｄ−マニトール溶液（導電率、約１μＳ／ｃｍ）に懸濁したものを標準試料とし、適宜希釈して測定に用いる試料液を作成した。
（２）測定装置
図３の測定装置を使用した。構造体としてのメンブレンフィルタには、有効径０．２μmのポリカーボネイト製メンブレンフィルタ（K020N025A、ADVANTEC）を用いた。印加電圧振幅は５Ｖｐ−ｐ、周波数は１００ＫＨｚとした。まず、試料液中に大腸菌を含まないブランク溶液を用いて測定を行った後に、大腸菌を含む試料液の測定を行ない、それぞれの測定のインピーダンス値、具体的にはインピーダンスから算出したキャパシタンス値を記録した。
（３）結果
図９に、測定結果を示す。図９において、横軸は測定時間（秒）、縦軸は、大腸菌を含む試料液のキャパシタンス増加分から、ブランクのキャパシタンス変化分を差し引いた容量変化CT（ｐF）である。電圧を印加し、大腸菌がフィルタのエッジ部にトラップされるに従って、電極間のキャパシタンス値が増加しており、本測定装置によって試料液中の大腸菌を測定することが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明は、電界の不均一性を誘起するための電極構造を簡素化してコストを低減することが可能な微粒子測定装置およびそれに用いる電極として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】本発明の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図（１）
【図２】本発明の実施形態にかかる微粒子測定装置のチャンバ１の構成を説明するための図
【図３】本発明の実施形態にかかる微粒子測定装置のチャンバ１の具体的構成を説明するための図
【図４】本発明の実施形態にかかる微粒子測定装置のチャンバ１のバリエーションを示す図
【図５】本発明の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図（２）
【図６】本発明の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図（３）
【図７】誘電泳動用交流電圧の周波数をパラメータとした場合に、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）とＲｅ［Ｋ］の関係を示すグラフ
【図８】誘電泳動用交流電圧の周波数（Ｈｚ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフ
【図９】本発明の実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャート
【図１０】本発明の実施例１にかかる微粒子測定結果を示すグラフ
【図１１】チャンネル内に満たされた液体５１のインピーダンスを測定する従来の装置を示す図
【符号の説明】
【０１１１】
１  チャンバ
２，３６  懸濁液
３，１１ａ，１１ｂ  電極
４  泳動電源部
５  測定部
６  制御演算部
６ａ  メモリ
７  導電率入力手段
９  表示手段
１３  ギャップ
１４  微粒子
１７  攪拌手段
２１  光源
２２  受光部
３１，３２  基板
３３，３４  平面電極
３５，４１，４２，４３  構造体
３７  試料導入口
３８  流出口
４５，４６，４７  仕切り板
【図１】
2009192479.tif 000009
【図２】
2009192479.tif 000010
【図３】
2009192479.tif 000011
【図４】
2009192479.tif 000012
【図５】
2009192479.tif 000013
【図６】
2009192479.tif 000014
【図７】
2009192479.tif 000015
【図８】
2009192479.tif 000016
【図９】
2009192479.tif 000017
【図１０】
2009192479.tif 000018
【図１１】
2009192479.tif 000019