(57)【要約】【課題】  本発明は、ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を用いた相同対合反応を検出する方法において、基板上に固定した単鎖のプローブＤＮＡと二重鎖のターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションを確実に行わせるためにＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させた単鎖のプローブＤＮＡフィラメント複合体を固定化する方法、及び標識化による標識の強度の測定による塩基配列の相同性を測定する方法を提供する。【解決手段】  本発明は、基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブに少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させ、フィラメント複合体を形成させる段階（ａ）、及び、ターゲット二重鎖ＤＮＡを混合し、相同対合反応および鎖交換反応を起こさせる段階（ｂ）とを含んでなる基板に固定化されているフィラメント複合体とターゲット二重鎖ＤＮＡとを基板上でハイブリダイゼーションさせる方法、そのための固定化基板、及び当該方法を含んでなるターゲット二重鎖ＤＮＡ中の相同性を検出又は定量する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブに少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させ、フィラメント複合体を形成させる段階（ａ）、及び、ターゲット二重鎖ＤＮＡを混合し、相同対合反応および鎖交換反応を起こさせる段階（ｂ）とを含んでなる基板に固定化されているフィラメント複合体とターゲット二重鎖ＤＮＡとを基板上でハイブリダイゼーションさせる方法。
【請求項２】
段階（ａ）が、基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブにブロック処理を施した後、少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させて、フィラメント複合体を形成させることからなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ブロック処理が、カゼイン又はその混合物を用いるものである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、標識化されているものである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を標識する物質が、蛍光分子、放射性物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属粒子、又は量子ドットなどの粒子状物質である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ターゲット二重鎖ＤＮＡが、物理的又は化学的に標識されているターゲット二重鎖ＤＮＡである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブが、少なくとも１８塩基である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、原生生物あるいは古細菌由来である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、大腸菌由来の蛋白質又はその部分ペプチドである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
基板上への固定が、ＤＮＡマイクロアレイである請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかの方法により基板上に固定化されているフィラメント複合体とターゲット二重鎖ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせて、当該ハイブリダイゼーション中の相同部位において三重鎖構造を有する複合体を製造する方法。
【請求項１２】
少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブに少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させて形成されたフィラメント複合体が基板上に固定されている、フィラメント複合体固定化基板。
【請求項１３】
基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブにブロック処理を施した後、少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させて、フィラメント複合体を形成させたものである請求項１２に記載の基板。
【請求項１４】
ブロック処理が、カゼイン又はその混合物を用いるものである請求項１３に記載の基板。
【請求項１５】
ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、標識化されているものである請求項１２〜１４のいずれかに記載の基板。
【請求項１６】
ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を標識する化合物が、蛍光分子、放射性物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属粒子、又は量子ドットなどの粒子状物質である請求項１５に記載の基板。
【請求項１７】
基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブが、少なくとも１８塩基である請求項１２〜１６のいずれかに記載の基板。
【請求項１８】
少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、原生生物あるいは古細菌由来である、請求項１２〜１７のいずれかに記載の基板。
【請求項１９】
少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が大腸菌由来の蛋白質あるいはその部分ペプチドである、請求項１８に記載の基板。
【請求項２０】
請求項１２〜１９のいずれかに記載の基板を含有してなるＤＮＡハイブリダイゼーション用キット。
【請求項２１】
請求項１２〜１９のいずれかに記載の基板からなるＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２２】
基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブに少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させ、フィラメント複合体を形成させる段階（ａ）、ターゲット二重鎖ＤＮＡを混合し、相同対合反応および鎖交換反応を起こさせる段階（ｂ）、及び、結合二重鎖ＤＮＡを検出又は定量する段階（ｃ）とを含んでなる、基板上で基板に固定化されたフィラメント複合体とターゲット二重鎖ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせて、ターゲット二重鎖ＤＮＡ中の相同性を検出又は定量する方法。
【請求項２３】
段階（ａ）が、基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブにブロック処理を施した後、少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させて、フィラメント複合体を形成させることからなる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ブロック処理が、カゼイン又はその混合物を用いるものである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、蛍光分子、放射性物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属粒子、又は量子ドットなどの粒子状物質で標識されたものであり、当該標識物質の量を測定することによってフィラメント複合体上の標識蛋白質を検出又は定量するものである請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
蛍光分子により標識された少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を用いる段階（ａ）と、その蛍光強度を測定することによってフィラメント複合体上の標識蛋白質量を検出又は定量する段階（ｃ）とを有する、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質標識化合物が放射性物質である段階（ａ）と、その放射線強度を測定することによってフィラメント複合体上の標識蛋白質量を検出又は定量する段階（ｃ）とを有する、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を標識する化合物がビオチン又はジゴキシゲニンである段階（ａ）と、その量を測定することによってフィラメント複合体上の標識蛋白質を検出又は定量する段階（ｃ）とを有する、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
相同対合反応および鎖交換反応を起こさせる段階（ｂ）に予め物理的あるいは化学的に標識されているターゲット二重鎖ＤＮＡを用いることを特徴とする、請求項２２〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
ターゲット二重鎖ＤＮＡを標識する化合物が、蛍光分子、放射性物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属粒子、又は量子ドットなどの粒子状物質である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブが少なくとも１８塩基である、請求項２２〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、原生生物あるいは古細菌由来である請求項２２〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、大腸菌由来の蛋白質又はその部分ペプチドである請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブに少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させ、フィラメント複合体を形成させる段階（ａ）、及び、ターゲット二重鎖ＤＮＡを混合し、相同対合反応および鎖交換反応を起こさせる段階（ｂ）とを含んでなる基板に固定化されているフィラメント複合体とターゲット二重鎖ＤＮＡとを基板上でハイブリダイゼーションさせる方法、そのための固定化基板、及び当該方法を含んでなるターゲット二重鎖ＤＮＡ中の相同性を検出又は定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムプロジェクトの進行に伴い、新たな遺伝子が次々と同定されてきているが、これらの機能を効率よく解析するためにより信頼性の高いＤＮＡマイクロアレイの開発が急務になってきている。
しかし、現状のＤＮＡマイクロアレイ法の主流は、（例えば非特許文献１）まず、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調整し、ｃＤＮＡを単鎖ＤＮＡに変性させてからプローブＤＮＡにハイブリダイズさせるため、調整溶液内に相補配列を持つＤＮＡ鎖が必ず存在し、それらがアニール反応してしまうとその分の減少をモニターできない。そのため、正確な情報解析を困難にしている。
また、プローブに用いるＤＮＡは現在数十塩基のものがよく使用されているが、非特異的な結合によるアーティファクトを排除するために精度の高い実験が要求され、得られる情報も膨大で重要な規則性・法則性を導き出すための情報解析が困難である。
このようにｃＤＮＡを単鎖ＤＮＡに変性させることなく、高い精度でＤＮＡ塩基配列相同性を評価する方法の開発が有益であることは明らかであるが、簡便にして有効な手段は未だ知られていない。
【０００３】
現状においては、バッチ内反応におけるＲｅｃＡの相同対合を利用した塩基配列検出技術は数多く知られている。例えば、少なくとも１種の組換え酵素、少なくとも１種のホモプローブ、および少なくとも１種のヘテロプローブを、サンプル中の二本鎖標的核酸配列とを混合し、サンプル中の二本鎖標的核酸配列をターゲティング、濃縮、検出、および／または単離する方法であって、 二本鎖標的核酸配列とホモ核酸プローブとの相同的対合又は鎖交換の特異性がヘテロ核酸プローブの添加により増強される方法（特許文献１参照）、三本鎖ＤＮＡ複合体を形成させる反応条件下において、被検多型部位を含む二本鎖ＤＮＡ、該二本鎖ＤＮＡの多型部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、および相同組換えタンパク質を接触させることからなる二本鎖ＤＮＡ中の多型を検出する方法（特許文献２参照）、ＲｅｃＡ様タンパク質を用いて標的核酸の一方の端部領域に対して相補的な一本鎖の第２ヌクレオチド部をタンパク質複合体とした自己相補的なステム・ループ構造をなす第１ヌクレオチド部を有する標識されてなるヘアピン型のプローブを用いる方法（特許文献３参照）、及び大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ及びこのエキソヌクレアーゼＩと類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかであるヌクレアーゼを用いて、相同的組換えタンパク質が存在しなくても安定な構造を維持することができる三本鎖ＤＮＡの形成方法（特許文献４参照）などが報告されている。これらの方法では、プローブＤＮＡプローブとＲｅｃＡとを予め結合させ、次いでターゲットＤＮＡと混合することによりターゲットＤＮＡの相同部位をプローブＤＮＡと対合することにより相同性を検出している。しかしながら、これらの技術は、プローブを基板に固定していないため、一度に数多くのサンプルの試験ができない、検出までの操作が複雑で時間がかかるなどの致命的な欠陥があった。
【０００４】
大量の試料を迅速に処理するための具体的な固定化については未だ報告されていないが、特許文献５には、一本鎖が残る領域が生じるイー・コリＲｅｃＡ 蛋白質などのリコンビナーゼ蛋白質の存在下に、メチル化などにより変性させた第一及び第二起源からのＤＮＡ分子の相同性領域にＤＮＡデュプレックスが形成された該第一及び該第二起源からのＤＮＡを、イー・コリのメチル−指向性誤対合修復系並びにＭｕｔＳ及びＭｕｔＬ蛋白質からなる誤対合修復系の蛋白質、一本鎖結合蛋白質、並びにＡＴＰと混合し、次いで 該集団から該一本鎖領域を含む分子を除去する方法において、誤対合修復系のある種または全ての蛋白質が固形支持体に固定化されていてもよい旨が記載されており（特許文献５、請求項３７及び６１参照）、特許文献６には標識を導入すべき標的核酸を含む試料に、ＲｅｃＡタンパク質と、前記標的核酸の末端領域と相同な第一の核酸プローブとを添加することにより、前記第一の核酸プローブの一部が前記標的核酸から突出するように、前記ＲｅｃＡタンパク質を介して前記第一の核酸プローブを前記標的核酸に結合せしめ、前記標的核酸に結合した前記ＲｅｃＡタンパク質を前記標的核酸から解離させて、前記第一の核酸プローブの突出部分に、標識された第二の核酸プローブをハイブリダイズさせることにより、標識が導入された核酸を製造する方法が開示され、当該標識が導入された核酸は、サザンハイブリダイゼーション法のプローブや、ＤＮＡチップのプローブ等として使用することができることが記載されている（特許文献６、請求項１及び段落番号［００５０］参照）。特許文献７には、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブをＲｅｃＡタンパク質又はＲｅｃＡホモログと接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成させ、これを該標的ＤＮＡと接触させて三本鎖ＤＮＡ構造を形成させた後、当該三重鎖構造のオリゴヌクレオチドプローブを、ＤＮＡポリメラーゼと１種以上の標識ｄＮＴＰ又はＤＮＡ合成ターミネーターとを使用して伸長させることからなる標的二本鎖ＤＮＡ分子における変異、ＳＮＰなどを検出する方法において、「あるいは、その連結パートナーオリゴヌクレオチドの一方または複数のオリゴヌクレオチドは、固定を可能にするための付加物（例えば、ビオチン、または特定オリゴヌクレオチド配列（「固定オリゴヌクレオチド」））を含み得、他方のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識（「レポーターオリゴヌクレオチド」）を含み得る。」と記載されている（特許文献７、段落番号［００８５］参照）。さらに、特許文献８には、必要に応じて検出可能に標識されている一本鎖ＤＮＡプローブをＲｅｃＡタンパク質と接触させてＲｅｃＡフィラメントを形成させ、これを試験ＤＮＡと接触させて三本鎖ＤＮＡ構造を形成させた後、二重鎖部分に存在する１つ以上の塩基対ミスマッチまたは不対塩基に結合するＭｕｔＳタンパク質と接触させて、結合したＭｕｔＳの存在を検出することからなる試験ＤＮＡ中の変異又はＳＮＰの存在を検出する方法において、前記ＭｕｔＳが、固体支持体に固定化されていてもよい旨が記載され（特許文献８、請求項１２参照）、また、前記試験ＤＮＡが、固体支持体に固定化されていてもよい旨が���載されている（特許文献８、請求項２３参照）。
【０００５】
このように試験用の試料ＤＮＡやプローブを固定化する旨の開示はなされてきているが、その具体的な成功についての記載はなされておらず、実際にこれをマイクロアレイに応用したとしても、実施者は、その都度、分離する手間と、標識を付与する手間と、その間に生ずる誤差により検出精度を確定することが困難となるなどの問題があった。ＲｅｃＡタンパク質を用いる検出方法は優れた方法ではあるが、固定化による大量処理が困難であるという大きな問題があり、これらの問題を解決するためにはＤＮＡプローブを基板に確実に固定して相同対合反応を検出する方法の開発が有効であり、この手法の開発によって初めて、ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質をＤＮＡマイクロアレイに応用することが可能となる。
また、現在のＤＮＡマイクロアレイはＤＮＡに結合した蛍光色素の強度によって、結合ＤＮＡ量を定量する方法が主流であって、前処理段階としてＤＮＡを蛍光標識する作業が必要である。従って、ＤＮＡを標識する段階の必要が無いＤＮＡマイクロアレイの方法を開発することにより、操作の簡便化が図られる。
【０００６】
【特許文献１】特表２００１−５０６１２４号公報
【特許文献２】特開２００２−１８６４９９号公報
【特許文献３】特開２００５−２５３４２７号公報
【特許文献４】特開２００２−２７２４６４号公報
【特許文献５】特表平９−５０４４３７号公報
【特許文献６】特開２００２−２８１９８１号公報
【特許文献７】特表２００５−５０７６６８号公報
【特許文献８】特表２００４−５２１６３４号公報
【非特許文献１】Helen C. Causton 他、Microarray Gene Expression Data Analysis: A Beginner's Guide, Blackwell Pub (2003/05)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を用いた相同対合反応を検出する方法において、基板上に固定した単鎖のプローブＤＮＡと二重鎖のターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションを確実に行わせるためにＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させた単鎖のプローブＤＮＡフィラメント複合体を固定化する方法、及び蛍光標識による蛍光強度の測定による塩基配列の相同性を測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
タンパク質や核酸類を基板上に固定化する技術は多数報告されている。しかし、ＲｅｃＡなどの相同組換えタンパク質は、ガラス基板やシリコン基板に対して非特異的に結合し、これらのタンパク質又はこれらのタンパク質を含有するプローブなどを基板上に固定化した場合には、多数の非特異的に結合したこれらのタンパク質が基板上に残り、これが多量のバックグラウンドとなり計測を困難にしていた。
ＲｅｃＡ（大腸菌において最もよく特徴付けされている細菌リコンビナーゼ）は、複数のＲｅｃＡ分子が一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を被覆して、ＲｅｃＡ「フィラメント」と称される複合体を形成する。このフィラメントは、ＡＴＰの存在下で、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の相同配列を探し、相同な配列が存在すれば三鎖構造が形成されるという特異な性質を有している。この性質を利用して、ＲｅｃＡは、特異的配列を含むプラスミドについてのプラスミドライブラリーのスクリーニング、細菌ゲノムＤＮＡやヒトゲノムＤＮＡ由来の特定のＤＮＡ領域のマッピング、制限エンドヌクレアーゼ生成性「粘着末端」のＤＮＡポリメラーゼからの保護、及び二本鎖ＤＮＡから特定のＤＮＡ領域を同定又は検出などをするために応用されてきた。このようにＲｅｃＡは極めて特異な性質を有しており応用範囲の広いものではあるが、前記してきた非特異的な結合のために、固定化技術の開発が大きな問題となってきていた。
本発明者は鋭意研究の結果、ＲｅｃＡを含有するフィラメントを特異的に基板上に固定化できることを見出し、基板上に固定した単鎖のプローブＤＮＡに、ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させ、フィラメント複合体と成し、ターゲット二重鎖ＤＮＡとを基板上でハイブリダイゼーションさせることに成功した。更にまた、本発明者は意外にも、上記手法においてＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質をあらかじめ標識し、そのシグナル強度をモニターすることによりＤＮＡハイブリダイゼーションの過程および効率が容易に評価できることをも見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブに少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させ、フィラメント複合体を形成させる段階（ａ）、及び、ターゲット二重鎖ＤＮＡを混合し、相同対合反応および鎖交換反応を起こさせる段階（ｂ）とを含んでなる基板に固定化されているフィラメント複合体とターゲット二重鎖ＤＮＡとを基板上でハイブリダイゼーションさせる方法、及び当該ハイブリダイゼーション方法により当該ハイブリダイゼーション中の相同部位において三重鎖構造を有する複合体を製造する方法に関する。
また、本発明は、少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブに少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させて形成されたフィラメント複合体が基板上に固定されている、フィラメント複合体固定化基板、並びに当該基板を含有してなるＤＮＡハイブリダイゼーション用キット、及び、当該基板からなるＤＮＡマイクロアレイに関する。
さらに、本発明は、基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブに少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させ、フィラメント複合体を形成させる段階（ａ）、ターゲット二重鎖ＤＮＡを混合し、相同対合反応および鎖交換反応を起こさせる段階（ｂ）、及び、結合二重鎖ＤＮＡを検出又は定量する段階（ｃ）とを含んでなる、基板上で基板に固定化されたフィラメント複合体とターゲット二重鎖ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせて、ターゲット二重鎖ＤＮＡ中の相同性を検出又は定量する方法に関する。
【００１０】
本発明は、さらに次のとおりである。
（１）基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブに少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させ、フィラメント複合体を形成させる段階（ａ）、及び、ターゲット二重鎖ＤＮＡを混合し、相同対合反応および鎖交換反応を起こさせる段階（ｂ）とを含んでなる基板に固定化されているフィラメント複合体とターゲット二重鎖ＤＮＡとを基板上でハイブリダイゼーションさせる方法。
（２）段階（ａ）が、基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブにブロック処理を施した後、少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させて、フィラメント複合体を形成させることからなる前記（１）に記載の方法。
（３）ブロック処理が、カゼイン又はその混合物を用いるものである前記（２）に記載の方法。
（４）ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、標識化されているものである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を標識する物質が、蛍光分子、放射性物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属粒子、又は量子ドットなどの粒子状物質である前記（４）に記載の方法。
（６）ターゲット二重鎖ＤＮＡが、物理的又は化学的に標識されているターゲット二重鎖ＤＮＡである前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブが、少なくとも１８塩基である前記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、原生生物あるいは古細菌由来である前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、大腸菌由来の蛋白質又はその部分ペプチドである前記（８）に記載の方法。
（１０）基板上への固定が、ＤＮＡマイクロアレイである前記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記（１）〜（１０）のいずれかの方法により基板上に固定化されているフィラメント複合体とターゲット二重鎖ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせて、当該ハイブリダイゼーション中の相同部位において三重鎖構造を有する複合体を製造する方法。
（１２）少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブに少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させて形成されたフィラメント複合体が基板上に固定されている、フィラメント複合体固定化基板。
（１３）基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブにブロック処理を施した後、少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させて、フィラメント複合体を形成させたものである前記（１２）に記載の基板。
（１４）ブロック処理が、カゼイン又はその混合物を用いるものである前記（１３）に記載の基板。
（１５）ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、標識化されているものである前記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の基板。
（１６）ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を標識する化合物が、蛍光分子、放射性物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属粒子、又は量子ドットなどの粒子状物質である前記（１５）に記載の基板。
（１７）基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブが、少なくとも１８塩基である前記（１２）〜（１６）のいずれかに記載の基板。
（１８）少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、原生生物あるいは古細菌由来である、前記（１２）〜（１７）のいずれかに記載の基板。
（１９）少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が大腸菌由来の蛋白質あるいはその部分ペプチドである、前記（１８）に記載の基板。
（２０）前記（１２）〜（１９）のいずれかに記載の基板を含有してなるＤＮＡハイブリダイゼーション用キット。
（２１）前記（１２）〜（１９）のいずれかに記載の基板からなるＤＮＡマイクロアレイ。
【００１１】
（２２）基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブに少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させ、フィラメント複合体を形成させる段階（ａ）、ターゲット二重鎖ＤＮＡを混合し、相同対合反応および鎖交換反応を起こさせる段階（ｂ）、及び、結合二重鎖ＤＮＡを検出又は定量する段階（ｃ）とを含んでなる、基板上で基板に固定化されたフィラメント複合体とターゲット二重鎖ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせて、ターゲット二重鎖ＤＮＡ中の相同性を検出又は定量する方法。
（２３）段階（ａ）が、基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブにブロック処理を施した後、少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を反応させて、フィラメント複合体を形成させることからなる前記（２２）に記載の方法。
（２４）ブロック処理が、カゼイン又はその混合物を用いるものである前記（２３）に記載の方法。
（２５）ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、蛍光分子、放射性物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属粒子、又は量子ドットなどの粒子状物質で標識されたものであり、当該標識物質の量を測定することによってフィラメント複合体上の標識蛋白質を検出又は定量するものである前記（２２）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）蛍光分子により標識された少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を用いる段階（ａ）と、その蛍光強度を測定することによってフィラメント複合体上の標識蛋白質量を検出又は定量する段階（ｃ）とを有する、前記（２２）〜（２５）のいずれかに記載の方法。
（２７）少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質標識化合物が放射性物質である段階（ａ）と、その放射線強度を測定することによってフィラメント複合体上の標識蛋白質量を検出又は定量する段階（ｃ）とを有する、前記（２２）〜（２５）のいずれかに記載の方法。
（２８）少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を標識する化合物がビオチン又はジゴキシゲニンである段階（ａ）と、その量を測定することによってフィラメント複合体上の標識蛋白質を検出又は定量する段階（ｃ）とを有する、前記（２２）〜（２５）のいずれかに記載のの方法
（２９）相同対合反応および鎖交換反応を起こさせる段階（ｂ）に予め物理的あるいは化学的に標識されているターゲット二重鎖ＤＮＡを用いることを特徴とする、前記（２２）〜（２８）のいずれかに記載の方法。
（３０）ターゲット二重鎖ＤＮＡを標識する化合物が、蛍光分子、放射性物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属粒子、又は量子ドットなどの粒子状物質である前記（２９）に記載の方法。
（３１）基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブが少なくとも１８塩基である、前記（２２）〜（３０）のいずれかに記載の方法。
（３２）少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、原生生物あるいは古細菌由来である前記（２２）〜（３１）のいずれかに記載の方法。
（３３）少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が、大腸菌由来の蛋白質又はその部分ペプチドである前記（３２）に記載の方法。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
すなわち本発明は、ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質又はこれを含有してなるフィラメント複合体を、非特異的結合を排除して実用的な計測が可能となる基板上への固定化を初めて可能にしたものであり、本発明は、予め少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブを基板上に固定し、少なくとも１種のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質をこれと反応させ、フィラメント複合体を基板上に形成させることを第一の特徴としている。また、本発明は、基板上に固定された少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブにブロック処理、好ましくはカゼイン又はその混合物を用いたブロック処理をすることを第二の特徴としている。さらに、本発明は、ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質をあらかじめ標識、好ましくは蛍光標識して、そのシグナル強度をモニターすることによりＤＮＡハイブリダイゼーションの過程及びその効率を検出、同定、及び定量することを第三の特徴としている。
【００１３】
本発明に用いる基板としては、その種類に特に制限はなく、硝子、石英ガラス、プラスチック、金属薄膜、等が選択可能である。入手が容易であり、単鎖ＤＮＡを固定し易く、バッファー溶液に対し安定であり、また、チップ化が容易である等の理由で、硝子基板が好ましい。シリコンなどで表面処理を施した硝子基板も利用可能である。
【００１４】
本発明で使用する単鎖ＤＮＡについては使用目的に応じて適宜選択すれば良く、長さ、塩基配列、形状には制限はない。ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質の結合能が十分発揮されるために１８塩基以上の長さを持つ直鎖状ＤＮＡが好ましい。ＤＮＡの長さの上限は特に制限は無いが、１００００塩基までが好ましい。
また、使用するターゲット二重鎖ＤＮＡの長さ、塩基配列、形状には制限がない。相同性を検出、同定、又は定量するに充分な長さ、例えば１０塩基対〜２００００塩基対、好ましくは１００塩基対〜５０００塩基対程度の長さを有するものが挙げられる。
基板への固定化は、公知の任意の方法に準じておこなうことができる。例えば、アビジン又はストレプトアビジンでコーティングした基板表面に、ビオチン付加物を用いて固定化することができる。
フィラメント複合体とターゲット二重鎖ＤＮＡとの反応温度は、相同組換え蛋白質の活性が十分発揮される温度であればよく、例えば、１５℃から６０℃、好ましくは３７℃付近で行うのが望ましい。また、その反応溶媒条件は、使用するＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質によって異なるが、好ましくはアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）またはその類縁体、例えば（アデノシン（γ−チオ）−三リン酸（ＡＴＰ）−γＳ)などのヌクレオシド三リン酸の存在下で、その相同対合および鎖交換反応が十分発揮される条件であればよい。これらの反応条件は公知の反応条件に準じて選択することができ、特許文献１〜８などの記載に準じて行うことができる。これらの文献の記載を本明細書に取り込み参照する。
【００１５】
予め基板上に固定される少なくとも１種の単鎖ＤＮＡプローブは、固定された基板に対しブロック処理を施すことが好ましい。特に、ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質の非特異的結合を最小限にするために、ブロック処理を行うことが重要である。ブロック処理の方法としては、例えば、緩衝液に溶かしたカゼイン溶液の使用が好ましい。このようなカゼイン溶液としては、例えば、緩衝液、例えばＨＥ緩衝液(10mM HEPES and 0.1 mM EDTA)に溶かした脱リン酸化α−カゼイン、ヘパリン、グルタミン酸カリウムの混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。ブロック処理は、基板を室温又は室温付近の温度で、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬ程度、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ〜１．５ｍｇ／ｍＬ程度の濃度のカゼインの緩衝液溶液に浸し、次いで緩衝液で基板を洗浄することにより行うことができる。浸す時間としては特に制限はなく、基板の大きさや状態にもよるが、好ましくは１０〜６０分、１０〜３０分程度である。
【００１６】
ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質は、多くの原核生物、古細菌および真核生物から単離、精製されている。本発明で用いられるＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質の種類には特に制限はないが、原核生物あるいは古細菌由来のものが好ましい。例えば、大腸菌ＲｅｃＡ蛋白質、枯草菌ＲｅｃＡ蛋白質、高度高熱菌ＲｅｃＡ蛋白質、古細菌ＲａｄＡ蛋白質、分裂酵母ＲＡＤ５１蛋白質などが挙げられる。また、大腸菌ＲｅｃＡ由来Ｌ２ペプチド（Voloshin O.N.ら, Science 272:868(1996)）などの部分ペプチドが挙げられる。相同対合、鎖交換反応活性を持つものであれば、それらのシステイン誘導体など、類似のアミノ酸配列を持った蛋白質でもよい。好ましい態様においては、大腸菌培養物から単離、精製されたＲｅｃＡ蛋白質を用いることができる。また、市販のＲｅｃＡ蛋白質を用いてもよい（New England Biolab社製、GE-Healthcare）。
また、ＲｅｃＡ遺伝子から部位特異的変異を誘発させて作出された１個以上のアミノ酸が欠損、置換、又は付加された変異されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。例えば、ＲｅｃＡの３５３番目のアミノ酸がシステインに変異したＲｅｃＡ３５３Ｃ変異体（T.Nishinaka, A.Takano, et al., J.Am.Chem.Soc., 127, 8120-8125 (2005)）を用いることもできる。
【００１７】
本発明のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質は、予め物理的または化学的な標識を付加しておくことが好ましい。このような標識としては、反応に格別の影響を与えず計測可能なものであれば、特に制限は無い。例えば、Ｎ−末端を標識する方法、リジンなどのアミノ基を標識する方法、トリプトファンなどの蛍光を利用する方法、蛍光団を有する蛋白質と融合させる方法などの各種の標識化方法を利用することができる。また、前記したＲｅｃＡ３５３Ｃ変異体を用いてシステインを標識化することもできる。標識としては、蛍光分子、放射性物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属粒子、量子ドットなどの粒子状物質などの各種の物質を利用することができるが、取り扱いが容易で定量的に付与できる、定量に大きな装置が要らない、検出のダイナミックレンジが広い等の理由で蛍光化合物の導入が好ましい。蛍光分子としては、例えば、フルオレセイン（および誘導体）、６−Ｆａｍ、Ｈｅｘ、テトラメチルローダミン、シアニン−５、ＣＹ−３、アロフィコシアニン、ルシファーイエローＣＦ、テキサスレッド、ローダミン、Ｔａｍｒａ、Ｒｏｘ、Ｄａｂｃｙｌなどの公知の物質を広く利用することができる。また、前記したＲｅｃＡ３５３Ｃ変異体はシステインのＳＨ基を有していることから、ＳＨ基に特異的な蛍光分子として、ＩＣ３−ＰＥ−マレイミド（Dojindo社製）（Ｎ−エチル−Ｎ’−｛５−［Ｎ”−（２−マレイミドエチル）ピペラジノカルボニル］ペンチル｝−インドジカルボシアナミン  クロライド）を用いることもできる。
【００１８】
基板上に固定化された単鎖ＤＮＡとＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質とのフィラメント複合体を形成させる反応も公知の方法に準じて行うことができる。これらの方法も特許文献１〜８に記載されており、これらの記載を本明細書に取り込み参照する。例えば、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体の存在下において、緩衝液中で行うのが好ましく、ｐＨは約４．０〜９．０、好ましくは約７．０〜８．０で行うことにより、ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質が単鎖ＤＮＡに安定に結合したフィラメント複合体を得ることができる。
【００１９】
本発明のハイブリダイゼーション方法は、基板に単鎖ＤＮＡを固定化し、好ましくは前記したブロック処理を行い、次いでＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質、好ましくは標識化されたＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を加えて反応させ、フィラメント複合体を形成させることからなる段階（ａ）、及び、得られた基板上に固定化されたフィラメント複合体にターゲット二重鎖ＤＮＡを混合し、相同対合反応および鎖交換反応を起こさせる段階（ｂ）を含んでなるものである。さらに、必要に応じて洗浄工程、精製工程などの各種の工程を付加することができる。
このようにして為されたハイブリダイゼーションにより、単鎖ＤＮＡと相同な配列を有するターゲット二重鎖ＤＮＡと、当該単鎖ＤＮＡとの三重鎖構造の複合体を基板上に形成することができる。また、このような三重鎖構造を形成することができないターゲット二重鎖ＤＮＡ、即ち、単鎖ＤＮＡと相同な配列を有していないターゲット二重鎖ＤＮＡは、基板上から洗い流されることになる。
したがって、本発明は、このようなハイブリダイゼーション方法及び当該ハイブリダイゼーション方法による当該ハイブリダイゼーション中の相同部位において三重鎖構造を有する複合体を基板上に固定して製造する方法を提供するものである。また、本発明は、このための固定化基板を提供するものである。
【００２０】
また、本発明は、フィラメント複合体が単鎖ＤＮＡの状態で存在している場合のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質の安定性と、フィラメント複合体がターゲット二重鎖ＤＮＡと共に三重鎖構造になっている場合のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質の安定性との相違に着目したものでもある。
この安定性を説明するための模式図を図１に示す。図１の左側は、フィラメント複合体がターゲット二重鎖ＤＮＡの相同部位とハイブリダイゼーションしているところを示している。図１において黒丸印（原図では赤色）は標識化されているＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を示し、灰色印（原図では緑色）は標識化されていないＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を示す。
単鎖ＤＮＡ又は単鎖状部分のＤＮＡに結合しているＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質は安定に結合しており、外部の非標識化ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質と交換することは無い。しかし、相同対合部分（三重鎖の部分）のＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質はＡＴＰの加水分解と共にＤＮＡから解離して、外部の非標識化ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質と交換される。この結果、相同対合部分（三重鎖の部分）における標識化ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質の量が減少することになり、標識強度の減少として計測することが可能となる。
したがって、フィラメント複合体に結合している標識化ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質の標識強度を計測することにより、相同性の検出、同定、又は定量化を行うことができることになる。
【００２１】
本発明のＤＮＡ相同塩基配列の検出、並びに定量方法は、２つの選択肢を有している。その１つは、ターゲット二重鎖ＤＮＡに予め物理的または化学的な標識を付加し、相同対合反応および鎖交換反応を起こした後に、これを検出、定量する方法と、前記したフィラメント複合体を形成するＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質に予め物理的または化学的な標識を付加し、相同対合反応および鎖交換反応を起こした後に残ったＲｅｃＡ様蛋白質を検出、定量する方法がある。いずれの方法を選択するかは、これを利用する者が任意に行うことができる。
化学的な標識方法としては、蛍光化合物、ビオチン、ジゴキシゲニン等が選択できるが、取り扱いが容易で定量的に付与できる、定量に大きな装置が要らない、検出のダイナミックレンジが広い等の理由で蛍光化合物の導入が好ましい。
物理的な標識方法としては、放射性物質、金属粒子、量子ドット等が使用可能であるが、その中で、特に量子ドットが、取り扱いが容易で定量的に付与できる、定量に大きな装置が要らない、検出のダイナミックレンジが広い等の理由で好ましい。ここで言う量子ドットとは、ＣｄＳｅ等の半導体発光材料を意味する。
【００２２】
このような標識化を行うことにより、前記してきた本発明のハイブリダイザーション方法の工程に次いで、結合二重鎖ＤＮＡを検出又は定量する段階（ｃ）をさらに設けることにより、基板上で基板に固定化されたフィラメント複合体とターゲット二重鎖ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせて、ターゲット二重鎖ＤＮＡ中の相同性を検出又は定量する方法を提供することができる。
このような検出、同定、又は定量化の方法としては、標識として蛍光標識を用いた場合には、蛍光強度を測定すればよいし、標識として放射性物質を用いた場合には、その放射線強度を測定すればよいし、また、標識としてビオチン又はジゴキシゲニンを用いた場合には、その量を測定すればよいことになる。
また、ターゲット二重鎖ＤＮＡに予め標識化する場合には、検体試料となるターゲット二重鎖ＤＮＡを標識化することになるが、フィラメント複合体を形成するＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を標識化する場合には、検体試料となるターゲット二重鎖ＤＮＡの標識化は不要となる。
【００２３】
本発明の方法における塩基配列相同性の計測は、主に単鎖ＤＮＡと二重鎖ＤＮＡとの間であるが、両者には部分的に二重鎖ＤＮＡ、単鎖ＤＮＡ部分があっても構わない。
また、本発明は、上記の方法を実施するために、本発明はまた、ＤＮＡの相同性を検出するためのキットも提供する。当該キットにはあらかじめ単鎖ＤＮＡを固定させておいた基盤と、ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を含む容器から構成されうる。
また、少なくとも１つ以上の単鎖ＤＮＡプローブをアレイ状に配列させ、それらのプローブＤＮＡとターゲット二重鎖ＤＮＡとの間の相同性をＤＮＡハイブリダイゼーションの原理により評価するＤＮＡマイクロアレイへの応用も、本発明に含まれる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、正確な二重鎖ＤＮＡの塩基配列相同性の検出、同定、又は定量化が、既存の装置を使い、容易にできることになった。また、検体試料となるターゲット二重鎖ＤＮＡを標識化することなく検出、同定、又は定量化することができることになる。さらに、本発明により、ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質又は標識化されたＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を含有するフィラメント複合体を特異的に固定化することが可能となり、ＲｅｃＡ様相同組換え蛋白質を用いた相同性の検出、同定、又は定量化を、迅速に、大量に、かつ簡便に行うことができることになる。
その結果、遺伝子研究分野における方法論は大きく前進できる。また、本発明の成果をＤＮＡチップに応用すれば、遺伝子治療と呼ばれる医療分野においても飛躍的な進歩が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何等限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
遺伝子操作実験により部位特異的にシステイン残基を導入した変異型大腸菌ｒｅｃＡ遺伝子（ＲｅｃＡのＣ末端にシステインを付加したもの：３５３Ｃ）を大量発現系ベクターに組み込んだものを調製して、大腸菌内に発現させ、ポリエチレンイミン分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィーにより、システイン変異ＲｅｃＡ蛋白質を単離、精製した。
Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡのマルチクローニングサイトの部分配列に相補的なオリゴヌクレオチドd(GGATCCCCGGGTACCG)（ＳｍａＩ切断部位を中央に含む）を合成した。これをＭ１３ｍｐ１８環状一本鎖 ＤＮＡとアニールさせた後、制限酵素ＳｍａＩによって切断した。ＤＮＡ産物を含む反応溶液をイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、Ｍ１３ｍｐ１８線状一本鎖ＤＮＡを調製した。ＳｍａＩ配列に相補的な配列と、６０個からなるエチレングリコールリンカー部分と、ビオチン部分を持つオリゴヌクレオチドbiotin-(spacer１８)１０-d(GGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGT)を合成し、前記Ｍ１３ｍｐ１８線状一本鎖ＤＮＡとアニールさせ、ビオチンタグ付Ｍ１３ｍｐ１８線状一本鎖ＤＮＡを調製した。
線状相同鎖二重鎖ＤＮＡはＭ１３ｍｐ１８ＦｏｒｍＩ  ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断し、フェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿により精製した。
また、線状非相同鎖二重鎖ＤＮＡはφX１７４ ＦｏｒｍＩ  ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断し、フェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿により精製した。
ガラス基盤（チャンバー）は以下のように調製した。シランカップリング剤によってシリコナイズした２４×３２ｍｍ２のカバーガラスと１８×１８ｍｍ２のカバーガラスとを２つの両面テープを介して貼り合わせて、３×１８ｍｍ２の流路を形成した。流路の入り口に斜めに切った６ｃｍ長のテフロン（登録商標）チューブ（φ１．０×１．５ｍｍ）を置き、ブチルゴムで封じた。
【００２７】
ガラス基板上のストレプトアビジン固定、及びブロック方法は以下のように行った。ＨＥ緩衝液(10mM HEPES and 0.1 mM EDTA)＋５ｍＭ 酢酸マグネシウムに溶かした１ｍｇ  ｍｌ−１ビオチン標識ＢＳＡをチャンバー内に導入、ＨＥ緩衝液で洗浄、ＨＥ緩衝液に溶かした０．２ｍｇ  ｍｌ−１ストレプトアビジンをチャンバー内に導入、ＨＥ緩衝液で洗浄、ＨＥ 緩衝液に溶かした１ｍｇ  ｍｌ−１  脱リン酸化α−カゼイン、８０μｇ  ｍｌ−１ヘパリン、５０ｍＭグルタミン酸カリウムをチャンバー内に導入、 ＨＥ緩衝液で洗浄、緩衝液Ａに溶かした１ｍＭ  ｄＡＴＰで洗浄した。
【００２８】
以上の方法で調製したＲｅｃＡ蛋白質、単鎖ＤＮＡ、二重鎖ＤＮＡ、ガラス基板を使用して以下のとおり行った。
（ａ）２０ｍＭトリス−酢酸バッファー（ｐＨ７．５）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭデオキシアデノシン三燐酸を含んだ溶液中に、ビオチンタグ付きＭ１３ｍｐ１８線状一本鎖ＤＮＡ及び３５３Ｃ  ＲｅｃＡ蛋白質をそれぞれ最終濃度が１μＭ及び２μＭになるように加え、この反応液を  ３７℃にて２０分間インキュベートした。この反応液にモノマレイミド修飾された蛍光分子ＩＣ３−ＰＥマレイミド０．０６ｍＭを加え、室温にて１分間反応させた。サンプルはその後、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精製し、蛍光標識したＲｅｃＡフィラメントを調製した。この反応溶液をチャンバーに導入し、蛍光標識したＲｅｃＡフィラメントをアビジン・ビオチン結合によりガラス基板上に固定させた。
（ｂ）２０ｍＭトリス−酢酸バッファー（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭデオキシアデノシン三燐酸、１μＭ  ＲｅｃＡ、２．４μＭ  ＳＳＢタンパク質を含む１００ｎＭ  Ｍ１３ｍｐ１８線状二重鎖ＤＮＡあるいは１００ｎＭ  φＸ１７４線状二重鎖ＤＮＡを３７℃に保温したチャンバー内に導入し、相同対合、鎖交換反応を開始させた。
（ｃ）蛍光標識したＲｅｃＡ蛋白質の蛍光強度の経時変化を測定した。
【００２９】
蛍光強度の測定結果を図２に示す。図２は、線状相同鎖二重鎖ＤＮＡはＭ１３ｍｐ１８を用いた場合（図２の左側）、及び線状非相同鎖二重鎖ＤＮＡはφX１７４（図２の右側）を用いた場合のそれぞれの上記、相同対合・鎖交換反応時の蛍光強度の変化を示している。図２の各グラフの縦軸は蛍光強度を示し、横軸は時間（分）を示している。これから明らかのように相同二重鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８）を基質に用いた場合の方が、非相同二重鎖ＤＮＡ（φＸ１７４）を基質に用いた場合よりも、蛍光強度の減少が急速に起きる。これは相同対合・鎖交換反応が進行することによって、蛍光標識ＲｅｃＡタンパク質がＤＮＡから解離してゆくからである。蛍光標識ＲｅｃＡフィラメントの蛍光減少をモニターすることによって、ターゲット二重鎖ＤＮＡとプローブ単鎖ＤＮＡとの間の相同性を簡便に評価することができた。
【実施例２】
【００３０】
実施例１記載の通りに調製したＲｅｃＡ蛋白質、単鎖ＤＮＡ、二重鎖ＤＮＡ、ガラス基盤を使用して以下の実験を行った。
（ａ）２０ｍＭトリス−酢酸バッファー（ｐＨ７．５）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭデオキシアデノシン三燐酸を含んだ溶液中に、上記のビオチンタグ付きＭ１３ｍｐ１８線状一本鎖ＤＮＡ及び３５３Ｃ  ＲｅｃＡ蛋白質をそれぞれ最終濃度が１μＭ（ＤＮＡの濃度はヌクレオチド換算濃度、以下同様）及び２μＭになるように加え、この反応液を  ３７℃にて２０分間インキュベートした。この反応溶液を上記作成のチャンバーに導入し、ＲｅｃＡフィラメントをアビジン・ビオチン結合によりガラス基板上に固定させた。
（ｂ）２０ｍＭトリス−酢酸バッファー（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭデオキシアデノシン三燐酸、１μＭ  ＲｅｃＡ、２．４μＭ  ＳＳＢタンパク質を含む１００ｎＭ  Ｍ１３ｍｐ１８線状二重鎖ＤＮＡあるいは１００ｎＭ  φＸ１７４線状二重鎖ＤＮＡを３７℃に保温したチャンバー内に導入し、相同対合、鎖交換反応を開始させた。
（ｃ）４０分間反応せしめた後、ＲｅｃＡタンパク質を除去し、抗ＤＮＡ抗体（MAB030、Chemicon）を用いた免疫染色法によりＤＮＡを蛍光染色した。
【００３１】
この結果を図３に蛍光顕微鏡像の写真として示す。図３の左側は線状相同鎖二重鎖ＤＮＡはＭ１３ｍｐ１８の場合を示し、右側は線状非相同鎖二重鎖ＤＮＡはφX１７４の場合を示す。図３から明らかなように、相同二重鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８）を基質に用いた場合の方が、非相同二重鎖ＤＮＡ（φX１７４）を基質に用いた場合よりも、二重鎖ＤＮＡ由来のシグナルが顕著に多い。こうして、ＲｅｃＡタンパク質を利用することによって、ターゲット分子として二重鎖ＤＮＡを用いることが初めてでき、ＤＮＡハイブリダイゼーションによる塩基配列相同性の評価が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の方法は、ＲｅｃＡ相同組換えタンパク質を用いた迅速、大量処理可能な、かつ簡便な相同性の検出、同定、又は定量化方法を提供するものであり、遺伝子工学、遺伝子産業、医療、特に遺伝子に原因する各種疾患の検査、治療に極めて有効で実用的な方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、本発明の測定の方法における測定原理を模式的に示した模式図である。
【図２】図２は、相同対合・鎖交換反応によるＲｅｃＡフィラメントの蛍光強度の減少を示したグラフである。図２の左側は、線状相同二重鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８二重鎖ＤＮＡ）を用いた場合。右側は、線状非相同二重鎖ＤＮＡ（φＸ１７４二重鎖ＤＮＡ）を用いた場合をそれぞれ示している。
【図３】図３は、二重鎖ＤＮＡをターゲットに用いた、ＲｅｃＡ相同組換えタンパク質によるＤＮＡハイブリダイゼーション（スケール：１０μｍ）の蛍光顕微鏡像を示した図面に代わる写真である。図３の左側は、線状相同二重鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８二重鎖ＤＮＡ）を用いた場合。右側は、線状非相同二重鎖ＤＮＡ（φＸ１７４二重鎖ＤＮＡ）を用いた場合をそれぞれ示している。
【図１】
2009124960.tif 000002
【図２】
2009124960.tif 000003
【図３】
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