(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞機能調節物質のスクリーニング方法及びアクチン細胞骨格の形成調節剤の提供。【解決手段】以下の(a)又は(b)のタンパク質。(a) 特定の配列に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、(b) 特定の配列に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質。また、ニューロトニンまたはそのＣ末端側部分断片とRock2タンパク質との結合を調節する物質のスクリーニング方法、およびアクチン細胞骨格の形成調節剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするDNA。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
【請求項３】
以下の(a)又は(b)のDNA。
(a) 配列番号３若しくは５に示される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号３若しくは５に示される塩基配列からなるDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項４】
請求項２又は３に記載のDNAを含有するベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からRock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質を採取する工程を含む、Rock2タンパク質と結合するタンパク質の製造方法。
【請求項７】
ニューロトニンのC末端側部分断片に候補物質を接触させ、候補物質の中から前記部分断片に結合する物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
候補物質の存在下で、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2タンパク質とを接触させ、候補物質の中から当該ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2タンパク質との結合を調節する物質をスクリーニングする方法。
【請求項９】
ニューロトニンが以下の(a)又は(b)のタンパク質である請求項８記載の方法。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
【請求項１０】
ニューロトニンのC末端側部分断片が、以下の(a)又は(b)のタンパク質である請求項７又は８記載の方法。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
【請求項１１】
ニューロトニン又はそのC末端側部分断片を含む、アクチン細胞骨格の形成調節剤。
【請求項１２】
ニューロトニンが以下の(a)又は(b)のタンパク質である請求項１１記載の調節剤。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
【請求項１３】
ニューロトニンのC末端側部分断片が、以下の(a)又は(b)のタンパク質である請求項１１記載の調節剤。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞機能調節物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
末梢神経障害は、運動神経筋接合部終末において神経の興奮伝達の欠陥に由来する疾患であり、筋疾患をも伴うことが多い。このため、末梢神経障害においては感覚異常、運動障害、自律神経障害など種々の病態が現われることが知られている。末梢神経障害の病因は多様であり、詳細は不明な場合が多いが、末梢神経のVGKC(Voltage gated potassium channel)異常、神経末端からの持続的なアセチルコリンの放出を伴う神経・筋疾患として、Isaacs症候群が知られている。この疾患は持続性筋線維活動症候群ともいわれており、その臨床的特徴として、四肢の筋硬直、有痛性筋痙攣、筋収縮後の弛緩困難（例えば手指の開排制限等）、歩行障害、発汗過多などの症状が観察されている。Isaacs症候群の発症機序は不明であるが、胸腺腫との合併の存在、血中に免疫複合体を有する症例が見られることから、一つには自己免疫疾患機序が関与していることが想定されている。
【０００３】
このようなIsaacs症候群を始めとする末梢神経障害の治療方法として、血漿交換による方法、ビタミンB12投与などが挙げられるが、これらの治療法は対処的な治療法に留まるものであり、現在では根本的に治療し得る選択的かつ有効な方法がないのが実情である。本格的な高齢化社会の到来を間近に控えて、上記末梢神経障害に加えて、糖尿病の合併症である末梢性多発性神経炎、筋の全般的な有痛性痺れなどにも有効な治療法の開発が待たれている。
【０００４】
本発明者は、Isaacs症候群患者から単離されたcDNAが、ある特定のタンパク質をコードして、そのタンパク質が患者の血中に増加している事実を捉えた。そしてさらに鋭意研究を進めた結果、上記cDNAおよびそれによりコードされるタンパク質は、Isaacs症候群の病態に関わる因子と示唆された。この同定された分子をニューロトニンと呼び、cDNAの塩基配列及びタンパク質のアミノ酸配列情報（ヒト由来）を決定した（特許文献１）。
【０００５】
ニューロトニンは、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であり（特許文献１）、上記患者の血液に見出される抗体と結合する活性を有し、さらに末梢神経細胞に存在する「14-3-3」と呼ばれるタンパク質と結合することができる。
【０００６】
しかし、14-3-3タンパク質以外のタンパク質については、どのような物質がニューロトニンに結合するのかは明らかでなく、機能も不明である。
【特許文献１】国際公開WO02/064787号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ニューロトニンのC末端側部分断片及びその製造方法、前記断片に結合する物質をスクリーニングする方法、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2タンパク質との結合を調節する物質をスクリーニングする方法、及びアクチン細胞骨格の形成調節剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ニューロトニンに結合する物質はRock2タンパク質であることを見出し、また、ニューロトニンのRock2への結合領域はそのアミノ酸配列のC末端側領域であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１０】
（１）以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
（２）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするDNA。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
（３）以下の(a)又は(b)のDNA。
(a) 配列番号３若しくは５に示される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号３若しくは５に示される塩基配列からなるDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質をコードするDNA
（４）（２）又は（３）に記載のDNAを含有するベクター。
【００１１】
（５）（４）に記載のベクターを含む形質転換体。
【００１２】
（６）（５）に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からRock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質を採取する工程を含む、Rock2タンパク質と結合するタンパク質の製造方法。
【００１３】
（７）ニューロトニンのC末端側部分断片に候補物質を接触させ、候補物質の中から前記部分断片に結合する物質をスクリーニングする方法。
【００１４】
（８）候補物質の存在下で、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2タンパク質とを接触させ、候補物質の中から当該ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2タンパク質との結合を調節する物質をスクリーニングする方法。
【００１５】
（９）ニューロトニンが以下の(a)又は(b)のタンパク質である（８）記載の方法。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
（１０）ニューロトニンのC末端側部分断片が、以下の(a)又は(b)のタンパク質である（７）又は（８）記載の方法。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
【００１６】
（１１）ニューロトニン又はそのC末端側部分断片を含む、アクチン細胞骨格の形成調節剤。
【００１７】
（１２）ニューロトニンが以下の(a)又は(b)のタンパク質である（１１）記載の調節剤。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
（１３）ニューロトニンのC末端側部分断片が、以下の(a)又は(b)のタンパク質である（１１）記載の調節剤。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、ニューロトニンに結合し、細胞機能調節活性を有する物質としてRock2タンパク質をスクリーニングすることができた。また、Rock2タンパク質が結合する領域は、ニューロトニンのアミノ酸配列領域のうちC末端側であることが判明した。Rock2タンパク質は、低分子量Gタンパク質RhoAにより活性化され多数の基質に作用するキナーゼであり、ニューロトニンに結合してアクチン細胞骨格の形成に作用する因子、すなわち、細胞のアクチン細胞骨格の制御を介して細胞形態や細胞の運動・極性・接着などを制御し得る因子である。従って、本発明のニューロトニンのC末端側部分断片、及び、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合を調節する物質は、神経疾患、ガンの転移、血管新生の治療法及び治療薬開発に有用である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、ニューロトニンと結合する物質をスクリーニングした結果、Rock2(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 2)と呼ばれるタンパク質（以下、単に「Rock2」という）が得られたことにより完成されたものである。Rock2は、低分子量Gタンパク質RhoAにより活性化され多数の基質に作用するキナーゼである。そして、Rock2は、ニューロトニンのC末端側に結合し、細胞のアクチン細胞骨格の形成に関与して細胞形態や細胞の運動・極性・接着などを制御する。言い換えれば、アクチン細胞骨格の形成には、ニューロトニンのC末端側部分断片が重要な役割を果たすといえる。
【００２０】
従って、本発明は、ニューロトニンのC末端側部分断片及びその製造方法を提供する。また、本発明は、ニューロトニンのC末端側部分断片に結合する物質をスクリーニングする方法を提供する。さらに、本発明は、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合を調節する物質をスクリーニングする方法を提供する。さらに、本発明は、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片を含む、アクチン細胞骨格の形成調節剤を提供する。
【００２１】
１．ニューロトニン
ニューロトニン(Neurotonin、「NT」と略す場合もある）とは、Isaacs症候群患者の血清を利用するイムノスクリーニングにより取得することができるタンパク質であり、SDS・PAGEにより求めた分子量は約66kDaである。ニューロトニンをコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、その配列情報は GenBank 等の公共データベースを通じて容易に入手することができる (GenBank Accession No. NM 176816等)。ニューロトニンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号1、ニューロトニンのアミノ酸配列を配列番号2に示す。
【００２２】
本発明のニューロトニン部分断片は、ニューロトニンの全長アミノ酸配列のうちC末端側の断片である。ヒト由来ニューロトニンのアミノ酸残基は511個存在するため（配列番号２）、全長を等分割すると、N末端側領域として１〜255番、C末端側領域として256〜511番の領域に分けることができる。従って、本発明の部分断片は、全長アミノ酸配列のうちC末端側の２分の１の領域（256〜511番）中に含まれる断片である。
【００２３】
また、本発明のC末端側部分断片は、上記全長の1/2の長さに限定されるものではなく、C末端側の1/3の領域、C末端側の1/4の領域などを含むものである。例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、256〜511番、260〜511番、270〜511番、280〜511番、290〜511番、300〜511番、310〜511番、320〜511番、330〜511番、340〜511番、350〜511番、360〜511番、370〜511番、380〜511番、390〜511番、400〜511番、410〜511番、420〜511番の領域を挙げることができる。但し、本発明においては、上記の具体的にアミノ酸の位置を示した断片に限定されるものではなく、部分断片を発現させる際に遺伝子の塩基配列に付加する任意配列（例えば制限酵素部位）やコドンを考慮して、アミノ酸領域を適宜設計することが可能である。例えば、全長の1/2の長さのC末端側部分断片を設計する場合は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、256〜511番の領域（配列番号４、遺伝子の塩基配列では配列番号３）を選択することができ、全長の1/3の長さのC末端側部分断片を設計する場合は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、335〜511番の領域（配列番号６、遺伝子の塩基配列では配列番号５）を選択することができる。
【００２４】
また、本発明は、上記ニューロトニンのC末端側部分断片のアミノ酸配列のほか、当該アミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有する変異型タンパク質を提供する。具体的には、上記変異型タンパク質は、(i) C末端側部分断片のアミノ酸配列（例えば配列番号４又は配列番号６）中の1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii) C末端側部分断片のアミノ酸配列（例えば配列番号４又は配列番号６）に1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が付加（挿入を含む）したアミノ酸配列、(iii) C末端側部分断片のアミノ酸配列（例えば配列番号４又は配列番号６）中の1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。但し、C末端側部分断片のアミノ酸配列は、配列番号４及び配列番号６に示されるものに限定されるものではない。
【００２５】
このような1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードするDNAは、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons (1987-1997))、Kunkel, Method. Enzymol. 85: 2763-6 (1988)等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
【００２６】
また、DNAの塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
【００２７】
なお、上記変異型ニューロトニンは、天然の生物学的変異として発生することがあるが、そのような天然に変異が生じたニューロトニンのC末端側部分断片も、Rock2との結合活性を有する限り、本発明に含まれる。
【００２８】
ここで、「Rock2との結合活性」とは、Rock2に結合するリガンドタンパク質との結合特性に基づいて定義され、結合特性がRock2との親和性を有することを意味する。この結合活性は、ニューロトニンとの結合活性と同等もしくはそれ以上が好ましい。このような活性を有するタンパク質は、上記変異型タンパク質に含まれる。なお、Rock2との結合活性及び結合部位は、プルダウン法等の公知の結合解析方法を用いて確認することができる。なお、Rock2タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、その配列は GenBank 等の公共データベースを通じて容易に入手することができる (GenBank Accession No. NM 004850等)。
【００２９】
本発明はまた、上記C末端側部分断片又はその変異型断片をコードするDNAも提供する。具体的には、上記C末端側の1/3の領域、C末端側の1/4の領域をコードするDNA（例えば配列番号3又は5に示される塩基配列を含むDNA）、好ましくは、配列番号3又は5に示される塩基配列からなるDNA、及び、上記C末端側の1/3の領域、C末端側の1/4の領域をコードするDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質をコードするDNAも含まれる。
【００３０】
このようなDNAは、例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法により得ることができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法を用いて得ることも可能である。上記方法は、Moleculer cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。あるいは、配列番号3又は5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその部分断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press (1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
【００３１】
上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜2×SSC、0.1％〜0.5％SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0.1％SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))等を参照することができる。
【００３２】
得られたDNAは公知の方法により、あるいはキットを用いて精製してもよい。例えば、GENECLEAN(フナコシ)、QIAGEN(QIAGEN 社)等によるアガロースゲルを用いる方法、DEAE-セルロース濾紙を用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動し、DNA断片をアガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、適当なDNAシークエンサー（例えば、ABI PRISM(アプライドバイオシステムズ社)）を利用して配列を解析することが可能である。
【００３３】
２．ベクター及び形質転換体
ニューロトニンの発現ベクター及び上記ベクターを含む形質転換体は、以下のように作製することができる。
上記ニューロトニン又はそのC末端側部分断片をコードするDNAの塩基配列領域の開始コドンの5’側と終止コドンの3’側にそれぞれ異なる制限酵素配列を有するプライマーを設定し、本領域を遺伝子増幅する。増幅した領域を制限酵素で切り出して発現ベクターに組み込み、宿主（大腸菌等）に導入して形質転換体を得ることができる。
具体的には、クローニングを行ったプラスミドを、制限酵素を用いて消化する。上記の塩基配列中に適当な制限酵素切断部位があれば、それに対応した制限酵素を用いればよい。また、別法としてPCRにより目的のDNAを得た場合は、PCRプライマー中に挿入された制限酵素認識配列に対応した制限酵素を用いることができる。
【００３４】
次に、制限酵素消化後のDNA断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。このDNA断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込み、ニューロトニンのC末端側部分断片をコードするDNAを含有する発現用ベクターを得ることができる。この発現ベクターを宿主に導入し形質転換体を作製し、目的遺伝子の発現に供する。
【００３５】
発現ベクター及び宿主は、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、宿主としてHEK293細胞、COS細胞、CHO細胞、NIH細胞、HeLa細胞等の哺乳類細胞、大腸菌（Escherichia coli) 、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) 等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の酵母などが挙げられる。
【００３６】
本発明のベクターには、遺伝子工学分野での公知の、または文献に記載された技術に用いられるプラスミド、バクテリオファージおよびウイルス（真核ウイルスも含む）などが挙げられ、これらのベクターは、公知のさまざまな発現システムにおいて使用することができる。好ましいウイルス性ベクターとしてバキュロウイルス、アデノウイルスおよびワクシニアウイルスなどを例示することができる。
【００３７】
哺乳類細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpCAGGSやpcDNA3(INVITROGEN CORPORATION)等が挙げられる。例えば、HEK293細胞に組換えpCAGGS 発現ベクタープラスミドを導入するには、PolyFect Transfection Reagent(QUAGEN)や、Lipofectamine(GIBCO BRL社) を用いたリポソーム法を用いることができる。
【００３８】
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の遺伝子が宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、例えばファルマシア社のpGEX等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、trpプロモーター、lac プロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組み換え体DNAの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
【００３９】
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばYEp13、YCp50等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばgal1 プロモーター、gal10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００４０】
３．C末端側部分断片又はその変異型断片の製造
本発明においてC末端側部分断片又はその変異型断片を製造するには、前記形質転換体を培養し、得られる培養物から目的のタンパク質を採取すればよい。
【００４１】
「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００４２】
培養後、目的タンパク質（C末端側部分断片又はその変異型断片）が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のタンパク質を単離精製することができる。なお、変異型断片を製造する際には、Rock2との結合活性を測定しておくことが好ましい。結合活性の測定法は前記の通りである。
【００４３】
例えば、ANTI-FLAG M2 Affinity Gel等と反応させ、非特異的なタンパク質を洗浄除去してから、目的タンパク質をFLAG peptide等で溶出する。回収されたタンパク質をカルバモイルメチル化後、Lysyl Endopeptidase等のタンパク質分解酵素により消化して得られたペプチド混合物を分析試料とし、HPLCと質量分析装置を用いて測定することにより、C末端側部分断片又はその変異型断片と結合するタンパク質（例えばRock2）を分析することができる。Rock2におけるタンパク質結合領域は、上記のように、pulldown 法等の公知の結合解析方法を用いて決定することができる。
【００４４】
さらに、本発明においては、in vitro翻訳によるタンパク質合成を採用することができる。この場合は、RNAを鋳型にする方法とDNAを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。鋳型RNAとしては、本発明のDNAを転写させたポリヌクレオチドが挙げられ、鋳型DNAとしては、翻訳開始点の上流にプロモーターが組み込まれたポリヌクレオチドが挙げられる。in vitro翻訳システムは、市販のシステム、例えばExpresswayTMシステム（Invitrogen社）、PURESYSTEM（登録商標；ポストゲノム研究所）、TNTシステム(登録商標；Promega社)などを用いることができる。in vitro翻訳システムによるタンパク質合成後は、上記の一般的な生化学的方法を単独又は組み合わせることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
【００４５】
４．ニューロトニンC末端側部分断片に対する抗体
ニューロトニンに対する抗体は、Isaacs症候群およびそれ以外の末梢神経患者において産生されている。したがって、患者の血清にはニューロトニンに対する種々の抗体も存在するが、本発明者らの研究により特にそのC末端側部分に対する抗体が多くの患者に見出されている。これらの抗体もニューロトニンの生理機能と密接に関連し、症状に関与している。このため、これらのニューロトニンのC末端側部分断片に結合できる抗体もまた、Isaacs症候群または末梢神経障害において何らかの薬理学的作用を発揮することができる。
【００４６】
上記抗体は、抗原となるタンパク質を動物に接種して免疫することにより調製することができる。そのための動物として、広く利用されている、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラットなどが挙げられる。
【００４７】
抗体の中で、モノクローナル抗体は、単一のエピトープに特異的に結合する均一な抗体であるため、特に有用かつ好ましい抗体である。モノクローナル抗体の製造は、抗原となるニューロトニン又はそのC末端側部分断片などで免疫した動物脾臓からのリンパ球細胞とHAT感受性の骨髄腫細胞とのハイブリドーマ細胞を調製しクローン化する従来の確立された細胞融合技術を利用してもよく、また公知の遺伝子組み換え技術を利用してもよい。ヒト化モノクローナル抗体を得るには、マウス、ラットなどからの動物細胞の抗体cDNAとヒト抗体cDNAとの融合を含む遺伝子組み換え技術によるキメラ又はヒト化抗体の産生がある。ヒト由来細胞・腫瘍細胞クローンの利用、マウス腫瘍細胞とヒト細胞との融合、トランスジェニックマウス利用によるヒト抗体の産生方法も挙げられる。
【００４８】
上記抗体用途として、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片を検出するための検査薬、Isaacs症候群などの診断薬又は治療薬、研究用試薬、分析用試薬、免疫スクリーニング用試薬などが挙げられる。
【００４９】
５．スクリーニング方法
（１）ニューロトニンのC末端側部分断片に結合する物質のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、ニューロトニンのC末端側部分断片に候補物質を接触させ、候補物質の中からC末端側部分断片に結合した物質を選択する工程を含むものである。上記スクリーニング方法によって得られ得るリガンド又は化合物は、ニューロトニンの阻害剤となり得るものである。従って、上記のスクリーニングで得られる化合物は、ニューロトニンとの結合を利用することにより、Isaacs症候群などの末梢神経障害の治療用薬剤として使用することができる。
【００５０】
具体的なスクリーニング方法は、ニューロトニンのC末端側部分断片に候補物質を接触させ、ニューロトニンのC末端側部分断片と候補物質との結合活性を、免疫沈降反応等の公知の方法を用いて測定すればよい。
上記スクリーニングによって得られた化合物として、例えばRock2を挙げることができる。
【００５１】
（２）ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合を調節する物質のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、候補物質の存在下で、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2とを接触させ、候補物質の中から、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合を調節する物質を選択する工程を含むものである。
【００５２】
「結合を調節する」とは、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合を促進又は抑制することを意味し、結合を調節する物質として、アゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する物質を含む。
【００５３】
スクリーニングされた物質は、Isaacs症候群を始めとする末梢神経障害の治療用薬剤及びアクチン細胞骨格の形成調節剤として神経疾患、ガンの転移、血管新生の治療法及び治療開発に有用となる。
【００５４】
具体的なスクリーニング方法は、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片を含む実験系に候補物質を添加した場合と無添加の場合において、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合活性を測定し、両者を比較すればよい。結合活性が変化した場合には、その候補物質はニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合を調節するのに有効な物質であるとして選択することができる。
【００５５】
（３）候補物質
本発明のスクリーニング方法において、候補物質としては特に限定されるものではなく、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物（高分子又は低分子化合物）、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩として、生理学的に許容される酸（例えば、無機酸や有機酸など）や塩基（例えば、金属酸など）などとの塩が用いられる。
【００５６】
６．アクチン細胞骨格の形成調節剤
本発明のアクチン細胞骨格の形成調節剤は、ニューロトニンのC末端側部分断片を有効成分として含むものである。
【００５７】
アクチン細胞骨格とは、細胞骨格を構成する要素のひとつである。動物細胞では、細胞骨格の組織構造と細胞接着によってその形態が決定されており、細胞の状態、例えば、細胞周期、細胞癌化及び細胞分化などによって著しくその形態が変わる。細胞骨格は細胞運動の主装置としても機能しており、細胞骨格の形成には細胞骨格調節タンパク質が関与している。
【００５８】
上記のように、Rock2は低分子量Gタンパク質RhoAにより活性化され多数の基質に作用するキナーゼであり、細胞のアクチン細胞骨格の制御を介して細胞形態や細胞の運動・極性・接着などを制御し得る因子である。従って、Rock2との相互作用が見出されたニューロトニン又はそのC末端側部分断片は細胞のアクチン細胞骨格制御に関与するため、アクチン細胞骨格の形成調節剤として好ましい。
【００５９】
ニューロトニン又はそのC末端側部分断片が細胞のアクチン細胞骨格制御に関与することは、ニューロトニン又はそのC末端側部分を細胞内で強発現させたときのアクチン細胞骨格の変化を公知の方法で観察すればよい。具体的には、上記ニュートロニン等を強発現させた細胞にリゾフォスファチジン酸（LPA）等のRhoA-Rock2のシグナル伝達系を活性化し得る刺激物質を添加して、細胞膜を破壊した後に、細胞骨格の主要アクチンであるF-アクチンを特異的染色し、続いて細胞核を染色した細胞サンプルのアクチン細胞骨格の変化を蛍光顕微鏡により観察すればよい。それにより、ニュートロニンを強発現させた細胞では、通常の細胞と異なり、細胞膜辺縁部に強いアクチン細胞骨格の集積が見られたことから、ニューロトニンがアクチン細胞骨格の形成に作用することが示される。
【００６０】
また、本発明においては、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片は、アクチン細胞骨格の形成調節のための医薬組成物、あるいはアクチン細胞骨格の形成を解析するための研究用試薬として使用することができる。
【００６１】
医薬組成物として使用する場合は、アクチン細胞骨格の形成異常にともなう疾患を対象とすることができる。このような疾患としては、例えばIsaacs症候群、ジストロフィン異常症、拡張型心筋症、筋萎縮性側索硬化症、癌転移、癌浸潤、血管浸潤、ミオパチー、ニューロパチー、運動ニューロン疾患、アルツハイマー、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、ポリグルタミン病、Cushing病、Addison病、Nelson症候群、糖質コルチコイド不応症、ACTH不応症、神経性食欲不振症、下垂体前葉機能障害、視床下部障害、ADH（抗利尿ホルモン）分泌異常症、末端肥大症、巨人症、腎不全、インスリン依存型糖尿病、Laron小人症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、両側無睾丸（卵巣）症、Turner症候群、Klinefelter症候群、卵巣蓑腫、睾丸腫瘍、副腎腫瘍、Sheehan症候群、Pit1症候群、アルドステロン産生性腺腫、アルドステロン症、Batter症候群、褐色細胞腫、神経芽細胞腫、特発性起立性低血圧症、クレチン症，橋本病，肥満症、炎症性大腸炎、脱髄性多発根神経炎、結節性多発動脈炎・  HYPERLINK "http://mmh.banyu.co.jp/mmhe2j/sec05/ch069/ch069c.html" 側頭動脈炎、 HYPERLINK "http://mmh.banyu.co.jp/mmhe2j/sec05/ch069/ch069d.html" リウマチ性多発筋痛、 HYPERLINK "http://mmh.banyu.co.jp/mmhe2j/sec05/ch069/ch069e.html" ヴェーゲナー肉芽腫症、ベーチェット症候群、骨粗鬆症などが挙げられる。
【００６２】
医薬組成物を投与する対象は、哺乳動物が挙げられ、例えばヒトのほか、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜、イヌ、ネコ等の愛玩動物、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験動物が挙げられるが、これらの動物に限定されるものではない。
【００６３】
本発明の医薬組成物の投与形態は、経口、非経口投与のいずれでも可能である。経口投与の場合は、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤又はシロップ剤等による投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤、座剤、点眼剤、経肺剤型(例えばネフライザーなどを用いたもの)、経鼻投与剤型、経皮投与剤型(例えば軟膏、クリーム剤)等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの医薬上許容される添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【００６４】
賦形剤としては、例えば、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。
【００６５】
滑沢剤（コーティング剤）としては、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。
【００６６】
結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。
【００６７】
崩壊剤としては、例えば前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。
【００６８】
安定剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾール等のフェエノール類が挙げられる。
【００６９】
矯味矯臭剤としては、例えば通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。
【００７０】
また、液剤を製造するための溶媒としては、エタノール、フェノール、クロロクレゾール、精製水、蒸留水等を使用することができる。
【００７１】
界面活性剤又は乳化剤としては、例えば、ポリソルベート80、ステアリン酸ポリオキシル40、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
【００７２】
上記添加物等は、本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製されたニューロトニンのC末端側部分断片、その薬学的に許容可能な塩、又はこれらの水和物を溶剤(例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等)に溶解し、これにTween 80、Tween 20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００７３】
本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。有効投与量は、例えば一日につき体重1kgあたり約0.1 mg〜100 mg、好ましくは0.1 mg〜1.0 mgである。但し、上記アクチン細胞骨格の形成調節剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００７４】
本発明のC末端側部分断片を、アクチン細胞骨格の形成調節を解析するための研究用試薬として使用する場合は、in vitro及びin vivoのいずれにおいても適用が可能である。in vivoで使用する場合の解析対象は、昆虫（例えばショウジョウバエ）、前記した実験動物などの動物体のほか、ゼブラフィッシュなどが挙げられる。in vitroの場合は、筋細胞の抽出液、筋肉由来培養細胞などを使用することができる。
【００７５】
アクチン細胞骨格の形成調節の解析は、in vitroの場合は培養細胞の蛍光ファロイジン染色、in vivoの場合は血管新生、癌転移、癌浸潤の変化などを指標に行うことができる。
【００７６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７７】
新規NT相互作用因子の探索
本実施例では、機能未知因子Neurotonin(NT)の生体内における役割を明らかにするため、NT相互作用因子の探索を以下の手順で行った。Issacs症候群患者からの血清を利用するイムノスクリーニング手法により、神経細胞由来のcDNAライブラリーから特定のcDNAを分離し、それを解明することにより入手したNT遺伝子（配列番号１）をHEK293細胞にPolyFect Transfection Reagent(QUAGEN)を用いてトランスフェクションし、発現させた。操作は取り扱い説明書の内容に準じ、培養時間は48時間とした。培養終了後の細胞を溶解後、遠心分離し、上清を遠心濾過した。その後ANTI-FLAG M2 Affinity Gelと反応させ、非特異的なタンパク質を洗浄除去し、目的タンパク質をFLAG peptideで溶出した。回収されたタンパク質をDTT、ヨードアセトアミドを用いてカルバモイルメチル化した後、Lysyl Endopeptidaseを添加して37℃で一晩インキュベートした。得られたペプチド混合物を分析試料とし、HPLCシステムと質量分析装置を用いて測定を行った。
【００７８】
その結果、NTに結合する物質としてRho-associated, coiled-coil containing protein kinase 2 （Rock2）を得た。
【実施例２】
【００７９】
NTとRock2の細胞内相互作用
質量分析装置によりNT相互作用因子として同定されたRock2がNTと細胞内で結合活性を示すことを確認するため、HEK293細胞に哺乳類培養細胞発現ベクターpCAGGSまたはHAタグを付加しているNT発現ベクター(HA-NT)を一過性に導入したHEK293細胞を作製し、この細胞抽出液をLysis buffer（20 mM Hepes （pH7.9），420 mM NaCl，10% glycerol，0.5% NP-40，0.5 mM DTT，1 mM PMSF，10 mM NaF，2 mM Na3VO4，1 μg/ml Aprotinin，1 μg/ml Leupeptin，1 μg/ml Pepstatin A）により回収した。回収産物に、αRho kinase Alpha (BL964)抗体（αRock2抗体）4 μgを加え、4℃でローテーターにて撹拌しながら2時間反応させた。そこにprotein G sepharose 30 μl（50% slurry）を加えて4℃でローテーターにて撹拌しながらさらに2時間反応させた。
【００８０】
その後、Wash buffer（50 mM Tris-HCl pH7.5 、10% glycerol、150 mM NaCl，0.1 % NP-40，0.5 mM DTT，1 mM PMSF，10 mM NaF，2 mM Na3VO4，1 μg/ml Aprotinin，1 μg/ml Leupeptin，1 μg/ml Pepstatin A）でprotein G sepharose を洗浄し、15 μlの6xUrea SDS sample bufferに懸濁した。各懸濁液10μlをSDS-PAGEにかけ、5 % スキムミルクでブロッキング後、αRock2抗体（1/10000 希釈）またはαHA-C抗体（1/1000 希釈）を加え1 時間振盪した。その後サンプルを TBS-T で洗浄した後に、1/5000 希釈したα-rabbit-IgG HRPを加え1時間振盪後、TBS-T で洗浄しHome made ECL により検出した。
【００８１】
その結果、HA-NTを一過性発現させた細胞においてαRock2抗体による免疫沈降により、共沈されたHA-NTのバンドが確認された（図１）。よって、細胞内においてNTとRock2の相互作用が示された。
【実施例３】
【００８２】
NTにおけるRock2結合領域の決定
本実施例では、NTにおけるRock2の結合領域を決定するため、GST-pulldown法により結合解析を行った。TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems(promega)を用いたin vitro translationにより35S ラベルされたRock2タンパク質溶液10 μlにglutathione sepharose beads に結合させた各GST 融合タンパク質（GST, GST-NT, -NT(N), -NT(M), -NT(C)）3 μgとpulldown buffer(50 mM Tris-HCl(pH7.5)，150 mM NaCl、0.5% NP-40，1 mM EDTA，1 mM DTT，1 mM PMSF，1 μg/ml Aprotinin，1 μg/ml Leupeptin，1 μg/ml Pepstatin A）を500 μl加え、4℃で撹拌しながら一晩結合反応を行った。GST-NTはNT遺伝子全長、-NT(N)はN末端側から1-200、-NT(M)は199-347、-NT(C)は335-511アミノ酸残基を表す（アミノ酸番号は、配列番号２を基準）。その後、Pulldown bufferによりglutathione sepharose beadsを５回洗浄し、4 x SDS sample bufferを加えて100℃でボイルしたサンプルをSDS-PAGEにより展開し、autoradiographyにより35S-Rock2と各NT欠失変異体間の結合活性を検出した。
【００８３】
その結果、GST-NT(C)によるpulldownにおいて35S-Rock2のバンドが検出された（図２）。よって、Rock2はNTのC末端領域を介して相互作用することが示された。
【実施例４】
【００８４】
Rock2におけるNT結合領域の決定
実施例３ではNTにおけるRock2への結合領域の解析を行ったが、本実施例では、Rock2におけるNTの結合領域を決定するため、GST-pulldown法により結合解析を行った。
【００８５】
TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systemsを用いたin vitro translationにより35S ラベルされたNTタンパク質溶液10 μlに、glutathione sepharose beads に結合させた各GST 融合タンパク質（GST, GST-Rock2, -Rock2(N), -Rock2(C)）3 μgとpulldown buffer(50 mM Tris-HCl(pH7.5)，150 mM NaCl、0.5% NP-40，1 mM EDTA，1 mM DTT，1 mM PMSF，1μg/ml Aprotinin，1μg/ml Leupeptin，1μg/ml Pepstatin A）を500μl加え、4℃で撹拌しながら終夜結合反応を行った。「-Rock2(N)」はRock2のアミノ酸配列の1-708、「-Rock2(C)」はRock2のアミノ酸配列698-1388番のアミノ酸残基を表す（いずれも、Accession 番号NM 004850のアミノ酸配列を基準)。
【００８６】
その後、pulldown bufferによりglutathione sepharose beadsを５回洗浄し、4xSDS sample bufferを加えて100℃でボイルしたサンプルをSDS-PAGEにより展開し、autoradiographyにより35S-NTと各Rock2欠失変異体間の結合活性を検出した。
【００８７】
その結果、GST-Rock2(C)のpulldownにおいてGST-Rock2と同程度の35S-NTのバンドが検出された（図３）。よって、Rock2はNTのC末端領域により強く結合活性を有することが示された。
【実施例５】
【００８８】
NT stable cell line におけるアクチン細胞骨格の観察
Rock2は、低分子量Gタンパク質RhoAにより活性化され多数の基質に作用するキナーゼであり、細胞のアクチン細胞骨格の制御を介して細胞形態や細胞の運動・極性・接着などを制御し得る因子である。そこで本発明者は、Rock2との相互作用が見出されたNTが細胞のアクチン細胞骨格制御に関与し得るのではないかと予想し、NT強発現におけるアクチン細胞骨格の変化を観察した。HEK293細胞にpcDNA3-FLAGまたはFLAG-humanNT (hNT)を恒常的に発現させた細胞株に対して、RhoA-Rock2のシグナル伝達系を活性化し得る刺激であるリゾフォスファチジン酸（LPA）（WAKO）を無血清培地に終濃度10μMで添加した。37℃にて30分間培養後、細胞を3.7% ホルムアルデヒドにより固定した。細胞膜破壊のため、固定した細胞に0.1% TritonX-100/PBS(-)を30分間処理し、1% BSA/0.1%  Tween20/PBS(-)により30分間ブロッキングを行った。その後、細胞骨格の主要アクチンであるF-アクチンを特異的染色するRhodamin-FITC (SIGMA)を50 μg/mlにて用いて40分間細胞を染色し、続いてDAPIにより細胞核を染色した細胞サンプルのアクチン細胞骨格の変化を蛍光顕微鏡により観察した。また、代表的なRho ファミリー Cdc42、Rac1及びRhoAの各恒常的活性化変異体をBHK 細胞に強制発現させた後、各Rho ファミリーとアクチンフィラメントを染色して観察した。
【００８９】
その結果、pcDNA3-FLAG発現株とFLAG-hNT発現株において、LPA処理を行った際のPhalloidin-FITC染色の像を比較すると、pcDNA3-FLAG発現株ではアクチン細胞骨格が細胞全体に広がっているのに対し、FLAG-hNT発現株では細胞膜辺縁部に強いアクチン細胞骨格の集積が観察された（図４）。また、Cdc42を発現させると、糸状仮足である突起構造が見られ、Rac1 を発現させると、葉状仮足である形質膜辺縁部に強いアクチンフィラメントを集積し、RhoAを発現させると、太いファイバー状のアクチンフィラメントが集積した（図５）。
【００９０】
以上の結果から、NTの強発現がアクチン細胞骨格の形成に作用し得ることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】インビボにおけるニューロトニンとRock2の結合解析を示す図。
【図２】ニューロトニンにおけるRock2結合領域の決定を示す図。
【図３】Rock2におけるニューロトニン結合領域の決定を示す図。
【図４】ニューロトニン恒常化細胞系におけるアクチン骨格の観察を示す図。
【図５】Rhoファミリーによるアクチンフィラメントの制御を示す図。
【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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