(57)【要約】      （修正有）【課題】角層バリア強化剤の提供。【解決手段】式(１)で表されるホスファチジン酸誘導体を有効成分とするトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤(式中、Ｒは炭素数が８〜２２のアルキル基またはアシル基を示す。またＸは１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体または１−O−アルキル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体から式（１）を除いた残基、および１−アシル−グリセロホスフェート誘導体または１−O−アルキル−グリセロホスフェート誘導体から式（１）を除いた残基を示す。)。2009234931.tif 000008【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(１)で表されるホスファチジン酸誘導体を有効成分とするトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤。
【化１】
2009234931.tif 000006
(式中Ｒは、炭素数８〜２２のアルキル基または炭素数８〜２２のアシル基を示す。Ｘは、式(２)または式(３)で表される基を示す。Ｍは水素原子、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子、置換アンモニウム基または無置換アンモニウム基を表す。)
【化２】
2009234931.tif 000007
【請求項２】
請求項１記載のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤を含むトランスグルタミナーゼ活性増強剤。
【請求項３】
請求項１記載のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤を含むコーニファイドエンベロップ形成促進剤。
【請求項４】
請求項１記載のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤を含む角層バリア強化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞のトランスグルタミナーゼの遺伝子発現を亢進することができるトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤、当該酵素活性を増強し、細胞のコーニファイドエンベロップ形成を促進することで角層バリア強化効果を発揮させ、医療および美容を目的としてイオントフォレシス(イオン導入法)や皮内あるいは皮下投与により表皮の角質バリアを強化することができるトランスグルタミナーゼ活性増強剤、コーニファイドエンベロップ形成促進剤及び角層バリア強化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮は、身体の最外層にあって常に外界と接している。このため、表皮の本質的役割は、異物侵入、紫外線、活性酸素種や化学物質から生命を守ることにある。表皮の最も外側の角層は厚さわずか数十ミクロンではあるが、化学的に極めて安定であり水分などの体内成分の喪失を防ぎ、外界からの異物の侵入を抑制するなど生命維持で重要な役割を担っている。
老化や、乾燥、紫外線その他の外界ストレスにより表皮細胞の分化が阻害されると表皮のターンオーバーが乱れ、角化異常症、乾皮症、ざ瘡などが引き起こされる。近年、発症年齢の高齢化や若齢化が問題視されているアトピー疾患についても角質バリアの低下がその要因であることは見過ごせない。
従来このような皮膚症状を軽減する手段としては、油分の塗布の他、保湿性の高い物質であるコラーゲン、ヒアルロン酸を配合した組成物を塗布することが主流であった。しかし、いずれも一時的、表面的であり必ずしも充分な効果を得ることができていない。より本質的な効果を得るため、正常角化の回復を促す外用剤として、天然の植物・海藻類の抽出物(特許文献１及び２)が用いられることがある。しかし、効果や安全性の面で更に優れた有効成分が望まれている。
【０００３】
角層は、表皮細胞が基底膜から上層へ終末分化しながら最終的に死んだ細胞層となることで形成される。この角化過程でインボルクリンやロリクリンなど疎水性のタンパク質が共有結合で架橋されて、不溶性のコーニファイドエンベロップ(cornified envelope(角質肥厚膜))と呼ばれる細胞膜の裏打ちタンパク質となり角層の安定化に寄与する。この形成において最も重要な役割を担うトランスグルタミナーゼの活性欠乏は、魚鱗癬など皮膚バリアを失う重篤な疾患となる。近年は、セラミドも単独では充分なバリア効果を発揮できず当該酵素による架橋が角質バリアの充実に重要であることも明らかになりつつある。
したがって、トランスグルタミナーゼの発現の促進や活性の増強は、上述の皮膚症状の本質的な改善につながると期待される。当該酵素の活性化の観点から、月見草抽出物(特許文献１)、パントテインスルホン酸カルシウムやグルコン酸カルシウム等の外用剤(特許文献３)が提案されている。また、細胞の遺伝子発現亢進の観点からは、ビタミンDやAの誘導体を含有する化粧料(特許文献４及び５)、サイシンやラフマ等の植物抽出物(特許文献６)、ニガリ、塩化カルシウム等のカルシウム類(特許文献７)が提案されている。しかし、さらなるトランスグルタミナーゼ発現促進剤が求められている。
【０００４】
ところで、環状ホスファチジン酸は、元来真性粘菌(Physarum polycephalum)培養液から真核生物のDNAポリメラーゼα阻害活性を有する物質として見出された(非特許文献１)。構造解析の結果、グリセリン骨格の２位、３位間で自己環状エステルを有するユニークな構造のグリセロリン脂質であることが明らかにされた。その後、分析技術の向上に伴って、このような環状ホスファチジン酸は、哺乳類の血清中にも約１０-7M程度存在することが明らかにされた(非特許文献2)。更に、ヒト血清やウサギ涙腺液中にも環状ホスファチジン酸が確認されるなど高等動物体液中に普遍的に存在することが明らかになり、その機能への関心が高まっている。
例えば、特許文献８や９には、環状ホスファチジン酸によるがん細胞浸潤の抑制効果に基づく抗がん剤が、特許文献１０及び１１には、ニューロンやグリア細胞の生存維持、並びに神経突起伸展作用を有する薬剤が、特許文献１２には、環状ホスファチジン酸による抗シワ効果を有する皮膚外用剤が、特許文献１３には、環状ホスファチジン酸を用いた細胞のヒアルロン酸産生増強剤が、特許文献１４には環状ホスファチジン酸による保湿効果を利用したしっとり感の高い浴用剤がそれぞれ開示されている。しかしながら、トランスグルタミナーゼの遺伝子発現促進効果、当該酵素活性増強や角質を強化するコーニファイドエンベロップ形成促進効果については全く知られていない。
【０００５】
一方、遊離のリン酸残基を有する環状ホスファチジン酸の構造異性体であるリゾホスファチジン酸(ＬＰＡ)は、最も単純な構造のリン脂質である。その含有率は細胞膜では全リン脂質の０．５％であり、１９８０年代以前は、単なるリン脂質の代謝中間体や分解物としての理解にすぎなかった。その後、van CorvenやMoolenarらによってＬＰＡが血清中の細胞増殖因子の本体の一つであることが明らかにされた(非特許文献３、４)。さらにＬＰＡには、アクチン細胞骨格の再構築に及ぼす作用やフォーカルアドヒージョン形成(非特許文献５)、コラーゲンゲル収縮促進作用があることが明らかにされ、細胞の情報伝達物質としての役割が組織損傷時において即効的に機能することが可能な治癒促進物質あるいは局所ホルモン(オータコイド)としての理解が進んでいる。ＬＰＡの利用としては、例えば、細胞増殖亢進作用によるアンチリンクル剤(特許文献１２)、ヒアルロン酸合成酵素の誘導促進によるヒアルロン酸産生増強剤(特許文献１５)や、毛穴引き締め剤(特許文献１６)が提案されている。しかしながら、トランスグルタミナーゼの遺伝子発現促進効果や当該酵素活性増強や角層を強化するコーニファイドエンベロップ形成促進効果については全く知られていない。
【０００６】
ところで、トランスグルタミナーゼの発現促進および当該酵素活性増強剤による角質バリア強化剤の開発が、細胞レベルでの診断や治療の分野、また美容医療領域において望まれている。
【特許文献１】特開２００４−９１３７６号公報
【特許文献２】特開２００１−３５４５１８号公報
【特許文献３】特開平１１−１００３２０号公報
【特許文献４】特開２００４−１１５４５１号公報
【特許文献５】特開２００４−１１５４５２号公報
【特許文献６】特開２００７−１９１４号公報
【特許文献７】特開２００４−５１５９６号公報
【特許文献８】特開平７−２５８２７８号公報
【特許文献９】特開平９−２５２３５号公報
【特許文献１０】特開２００２−３０８７７８号公報
【特許文献１１】特開２００２−３０８７７９号公報
【特許文献１２】ＷＯ９２／２１３２３号パンフレット
【特許文献１３】特開２００２−３６３０８１号公報
【特許文献１４】特開平１１−１５８０５７号公報
【特許文献１５】特開平８−６７６２１号公報
【特許文献１６】特開２００５−９７２５０号公報
【非特許文献１】The J. Biol. Chem., 267, 30, 21512−21517(1992)
【非特許文献２】Life Sciences, 65, 21, 2185−2191(1999)
【非特許文献３】Cell. 59, 1, 45-54(1989)
【非特許文献４】Cell Growth Differ., 4, 4, 245-55. (1993)
【非特許文献５】ENBO J.13.,11,2600-2610（1994）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、短時間に細胞のトランスグルタミナーゼ遺伝子の発現を引き起こすことが可能なトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤を提供することにある。
本発明の別の課題は、短時間に細胞のトランスグルタミナーゼ遺伝子の発現を引き起こすことが可能なトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤を利用した、トランスグルタミナーゼ活性増強剤、コーニファイドエンベロップの形成促進剤、これらの作用を利用した角層バリアを効率的に強化することができる角層バリア強化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、式(１)で表されるホスファチジン酸誘導体を有効成分とするトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤が提供される。
【化３】
2009234931.tif 000002
(式中Ｒは、炭素数８〜２２のアルキル基または炭素数８〜２２のアシル基を示す。Ｘは、式(２)または式(３)で表される基を示す。Ｍは水素原子、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子、置換アンモニウム基または無置換アンモニウム基を表す。)
【化４】
2009234931.tif 000003
【０００９】
また本発明によれば、上記トランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤を含むトランスグルタミナーゼ活性増強剤が提供される。
更に本発明によれば、上記トランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤を含むコーニファイドエンベロップ形成促進剤が提供される。
更にまた本発明によれば、上記トランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤を含む角層バリア強化剤が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤は、特定のホスファチジン酸誘導体を有効成分とするので、安全性に優れ、短時間にトランスグルタミナーゼ遺伝子の発現を引き起こすことができ、トランスグルタミナーゼ活性増強剤に利用することができる。
このような促進剤や強化剤を利用することにより、コーニファイドエンベロップ形成を促進することができ、これにより、表皮の角層バリアを強化することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下本発明を更に詳細に説明する。
本発明のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤は、上記式(１)で示されるホスファチジン酸誘導体を有効成分として含む。
式(１)においてＲは、炭素数８〜２２のアルキル基または炭素数８〜２２のアシル基を示す。このようなアルキル基またはアシル基は特に限定されないが、好ましくは、炭素数８〜２２の直鎖状若しくは分岐鎖状の飽和アシル基、炭素数８〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アシル基、炭素数８〜２２の直鎖状若しくは分岐鎖状の飽和アルキル基、炭素数８〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アルキル基が挙げられる。
【００１２】
前記炭素数８〜２２の直鎖状の飽和アシル基としては、例えば、カプリル酸(C８：０)、カプリン酸(C１０：０)、ラウリン酸(C１２：０)、ミリスチン酸(C１４：０)、ペンタデカン酸(C１５：０)、パルミチン酸(C１６：０)、マルガリン酸(C１７：０)、ステアリン酸(C１８：０)、ノナデカン酸(C１９：０)、アラキジン酸(C２０：０)、ヘネイコサン酸(C２１：０)、ベヘニン酸(C２２：０)に由来する残基が挙げられる。
前記炭素数８〜２２の分岐鎖状の飽和アシル基としては、例えば、イソバレリアン酸、イソ酸、アンテイソ酸に由来する残基が挙げられる。
前記炭素数８〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アシル基としては、例えば、ミリストレイン酸(C１４：１)、パルミトレイン酸(C１６：１)、オレイン酸(C１８：１)、エライジン酸(C１８：１)、バクセン酸(C１８：１)、リノール酸(C１８：２)、リノレン酸(C１８：３)、アラキドン酸(C２０：４)、エイコサペンタエン酸(C２０：５)、エルカ酸(C２２：１)、ドコサヘキサエン酸(C２２：６)等の不飽和脂肪酸に由来する残基が挙げられる。
前記炭素数８〜２２の直鎖状の飽和アルキル基としては、例えば、オクタノール(C８：０)、デカノール(C１０：０)、ドデカノール(C１２：０)、テトラデカノール(C１４：０)、ペンタデカノール(C１５：０)、ヘキサデカノール(C１６：０)、ヘプタデカノール(C１７：０)、オクタデカノール(C１８：０)、ノナデカノール(C１９：０)、イコサノール(C２０：０)、ヘネイコサノール(C２１：０)、ドコサノール(C２２：０)等のアルコール類に由来する残基が挙げられる。
【００１３】
前記炭素数８〜２２の分岐鎖状の飽和アルキル基としては、例えば、イソバレリアノール、イソノール、アンテイソノール等のアルコール類に由来する残基が挙げられる。
前記炭素数８〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アルキル基としては、例えば、テトラデセノール(C１４：１)、ヘキサデセノール(C１６：１)、オクタデセノール(C１８：１)、エイコセノール(C２０：１)、ドコセノール(C２０：１)、リノール(C１８：２)、リノレノール(C１８：３)、エイコセノール(C２０：４)、エイコサペンタエノール(C２０：５)、エルカノール(C２２：１)、ドコサヘキサノール(C２２：６)に由来する残基が挙げられる。
これらのうち、ホスファチジン酸誘導体としての取扱いのしやすさ、および活性の強さなどの点から、カプリン酸(C１０：０)、ラウリン酸(C１２：０)、ミリスチン酸(C１４：０)、ペンタデカン酸(C１５：０)、パルミチン酸(C１６：０)、ミリストレイン酸(C１４：１)、パルミトレイン酸(C１６：１)、オレイン酸(C１８：１)、エライジン酸(C１８：１)、リノール酸(C１８：２)、リノレン酸(C１８：３)、アラキドン酸(C２０：４)、エイコサペンタエン酸(C２０：５)、ドコサヘキサエン酸(C２２：６)に由来する残基が最も好ましい。
【００１４】
式(１)中のＸは、上記式(２)または式(３)で表される基を示す。
式(２)または式(３)中Ｍは、水素原子、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子、置換アンモニウム基または無置換アンモニウム基を表す。
前記アルカリ金属原子としては、例えば、ナトリウム、カリウムが挙げられる。前記アルカリ土類金属原子としては、例えば、マグネシウム、カルシウムが挙げられる。前記置換アンモニウム基としては、例えば、ブチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、テトラメチルアンモニウム基が挙げられる。前記無置換アンモニウム基としては、例えば、アンモニウムが挙げられる。これらＭとしては、ホスファチジン酸誘導体としての入手のしやすさなどの点から、ナトリウムまたはカリウムが最も好ましい。
【００１５】
本発明に用いる式(１)のホスファチジン酸誘導体には、式(１)のＸが式(２)である環状ホスファチジン酸(ｃＰＡ)誘導体と、式(１)のＸが式(３)であるリゾホスファチジン酸(ＬＰＡ)誘導体がある。
式(１)のＸが式(２)であるｃＰＡ誘導体のうち、好ましいものは、１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体または１−O−アルキル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体であり、そのアシル基またはアルキル基は、水酸基、シクロアルカン環もしくは芳香環を含んでいても良い。
このようなｃＰＡ誘導体において、アシル基またはアルキル基が水酸基を含む場合の具体例としては、例えば、２−ハイドロキシデカン酸(C１０：０)、２−ハイドロキシドデカン酸(C１２：０)、２−ハイドロキシテトラデカン酸(C１４：０)、２−ハイドロキシヘキサデカン酸(C１６：０)、２−ハイドロキシオクタデカン酸(C１８：０)、２−ハイドロキシイコ酸(C２０：０)、メチル２−ハイドロキシデカン酸(C１１：０)、メチル２−ハイドロキシドデカン酸(C１３：０)、メチル２−ハイドロキシテトラデカン酸(C１５：０)、メチル２−ハイドロキシヘキサデカン酸(C１７：０)、メチル２−ハイドロキシオクタデカン酸(C１９：０)、メチル２−ハイドロキシイコ酸(C２１：０)が挙げられ、入手のしやすさなどの点から、２−ハイドロキシドデカン酸(C１２：０)、２−ハイドロキシテトラデカン酸(C１４：０)、２−ハイドロキシヘキサデカン酸(C１６：０)、２−ハイドロキシオクタデカン酸(C１８：０)が最も好ましく挙げられる。
また、前記アシル基またはアルキル基が含むことができるシクロアルカン環としては、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロオクタン環が例示できる。
【００１６】
式(１)のＸが式(２)であるｃＰＡ誘導体の入手方法は特に限定されない。例えば、１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体の場合、市販品を用いることができる他、市販のホスファチジルコリンやホスファチジン酸等のリン脂質を酵素処理する方法、種々の生物資源を原料とし、抽出等の処理をする方法、特開平６−２２８１６９号公報、特開平７−２５８２７号公報、特開平９−２５２３５号公報に示された、ジシクロヘキシルカルボジイミド存在下に脂肪酸と２，３−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールから化学合成する方法により得ることができる。
また、１−O−アルキル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体の場合、市販品を用いることができる他、合成もしくは生体より抽出した血小板活性化因子、プラスマローゲン、その他の１−O−アルキルリゾリン脂質を、ホスホリパーゼＤやホスホリパーゼＡ２で酵素処理する方法、あるいは米国特許第５２３８９６５号明細書に示された、市販の１−O−アルキル−グリセロールをピリジン溶媒中でオキシ塩化リンと化学反応させる方法により得ることができる。
【００１７】
式(１)のＸが式(３)であるＬＰＡ誘導体は、通常、１−アシル−グリセロホスフェート誘導体または１−O−アルキル−グリセロホスフェート誘導体とも呼ばれる物質であり、そのアシル基またはアルキル基は、水酸基、シクロアルカン環もしくは芳香環を含んでいても良い。
このようなＬＰＡ誘導体において、アシル基またはアルキル基が水酸基を含む場合の具体例としては、例えば、２−ハイドロキシデカン酸(C１０：０)、２−ハイドロキシドデカン酸(C１２：０)、２−ハイドロキシテトラデカン酸(C１４：０)、２−ハイドロキシヘキサデカン酸(C１６：０)、２−ハイドロキシオクタデカン酸(C１８：０)、２−ハイドロキシイコ酸(C２０：０)、メチル２−ハイドロキシデカン酸(C１１：０)、メチル２−ハイドロキシドデカン酸(C１３：０)、メチル２−ハイドロキシテトラデカン酸(C１５：０)、メチル２−ハイドロキシヘキサデカン酸(C１７：０)、メチル２−ハイドロキシオクタデカン酸(C１９：０)、メチル２−ハイドロキシイコ酸(C２１：０)等が挙げられ、入手のしやすさなどの点から、２−ハイドロキシドデカン酸(C１２：０)、２−ハイドロキシテトラデカン酸(C１４：０)、２−ハイドロキシヘキサデカン酸(C１６：０)、２−ハイドロキシオクタデカン酸(C１８：０)が最も好ましく挙げられる。含むことができるシクロアルカン環としては、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロオクタン環を例示することができる。
【００１８】
式(１)のＸが式(３)であるＬＰＡ誘導体の入手方法は特に限定されない。例えば、１−アシル−グリセロホスフェート誘導体の場合、市販品を用いることができる他、市販のホスファチジルコリンやホスファチジン酸等のリン脂質を酵素処理する方法や、種々の生物資源を原料とし、抽出等の処理により得ることができる。
また、１−O−アルキル−グリセロホスフェート誘導体の場合、市販品を用いることができる他、合成もしくは生体より抽出した血小板活性化因子、プラスマローゲンあるいはその他の１−O−アルキルリゾリン脂質をホスホリパーゼＤやホスホリパーゼＡ２で酵素処理して得ることもできる。
【００１９】
上記ＬＰＡ誘導体のうち、水酸基を有するＬＰＡ誘導体は、特開平８−９２０４８号公報に開示されるような水酸化処理を利用して容易に得ることができる。一方、シクロプロパン環を有するＬＡＰ誘導体は、Tetrahedron Letters., 34, 4047頁，1993年等に記載される合成方法に従って得ることができる。
【００２０】
本発明において、トランスグルタミナーゼ遺伝子発現とは、生きた細胞においてＤＮＡの当該酵素に関する遺伝情報が、ｍＲＮＡに転写されることをいう。トランスグルタミナーゼ遺伝子発現の評価、確認は、細胞からｍＲＮＡをIsogen等の抽出用溶液を用いてＲＮＡの分解を抑制しながら抽出し、得られたＲＮＡをノーザンブロットやリアルタイムＰＣＲ等の生化学的な方法により行うことができる。
本発明において、トランスグルタミナーゼ活性とは、遺伝情報を担うＤＮＡから転写されたｍＲＮＡが小胞体において酵素タンパク質に翻訳され、更に当該タンパク質が活性を示すことをいう。トランスグルタミナーゼ活性の増強評価は、トランスグルタミナーゼの基質となるビオチン標識カダベリンやダンシルカダベリン等の合成基質が反応生成物である架橋重合体へ取り込まれた量を定量することにより行うことができる。
本発明において、コーニファイドエンベロップの形成とは、トランスグルタミナーゼにより細胞内の基質が細胞膜直下に架橋集積されることをいう。コーニファイドエンベロップの形成促進の評価は、例えば、表皮角化細胞によるビオチン標識カダベリンの取り込みをＦＩＴＣ化アビジンにより標識し，蛍光顕微鏡で蛍光物質の集積を観察することにより行うことができる。
本発明において、角層バリア強化とは、角質細胞のコーニファイドエンベロップの架橋が十分になされることをいう。角層バリア強化の評価は、コーニファイドエンベロップの形成を顕微鏡観察で調べることや皮膚の経表皮水分喪失量の低下を水分蒸散量の計測により調べることにより行うことができる。
【００２１】
本発明において、トランスグルタミナーゼ活性増強剤、コーニファイドエンベロップ形成促進剤及び角層バリア強化剤は、上述のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤を含む。
前記トランスグルタミナーゼ遺伝子発現の促進、活性の増強およびコーニファイドエンベロップ形成促進による角層バリア強化の対象となる細胞やその生体組織としては、例えば、皮膚や粘膜等の外皮、胃、食道、腸等の消化器、血管や心臓等の循環器、気管や肺等の呼吸器が挙げられる。また、口腔、食道、鼻粘膜の上皮細胞に対してもトランスグルタミナーゼ活性発現を増強させることができる。
【００２２】
本発明のトランスグルタミナーゼ活性増強剤、コーニファイドエンベロップ形成促進剤及び角層バリア強化剤は、経口的もしくは非経口的に投与することができる。その剤形としては、例えば、液剤、ドリンク剤、散剤、顆粒剤、注射剤、点滴剤、点眼剤、点鼻薬、吸入剤、座剤、イオン導入剤のいずれであっても良いが、局所適用が可能であるとの理由から、注射剤、点眼剤、点鼻剤あるいはイオン導入剤が好ましい。
【００２３】
本発明のトランスグルタミナーゼ活性増強剤、コーニファイドエンベロップ形成促進剤及び角層バリア強化剤の製剤化は、例えば、有効成分である式(１)で表されるホスファチジン酸誘導体と、公知の薬理的に許容される担体、賦形剤、崩壊剤、増量剤、希釈剤、可溶化剤等とを用いて、公知の方法によって行うことができる。この際、式(１)で表されるホスファチジン酸誘導体の含有率は、通常０．０１〜３０質量％の範囲、好ましくは０．１〜１０質量％の範囲、より好ましくは１〜５質量％の範囲である。
【００２４】
本発明のトランスグルタミナーゼ活性増強剤、コーニファイドエンベロップ形成促進剤及び角層バリア強化剤の投与量は、いずれの場合も、投与対象投与経路、症状等によっても著しく異なるが、経口的に投与する場合、式(１)で表されるホスファチジン酸誘導体として、通常１〜１０００ｍｇ／Ｋｇ体重を１日１〜３回程度である。また、非経口的に投与する場合は、例えば、皮内注では式(１)で表されるホスファチジン酸誘導体として約０．０１〜１００ｍｇ／Ｋｇ体重を１日１回程度、１週間に１〜７回繰り返して投与することが好ましい。
【００２５】
本発明のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現の促進、活性の増強およびコーニファイドエンベロップ形成促進による角層バリア強化剤は、上皮系細胞のバリアに寄与するコーニファイドエンベロップ形成促進剤等の目的を達成するための医薬品として用いることができる他、その働きを利用した特殊な使用方法として、細胞試験のための試験試薬や美容目的の薬剤として用いることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
尚、例中の31P-NMRの測定は、日本電子社製JNM AL-400、溶媒：重クロロホルム−重メタノール−重水(２：５：２ Ｖ／Ｖ／Ｖ)を用い、温度２５℃の条件で行った。
合成例１
Ｃ１８：１−リゾホスファチジルコリン(ＬＰＣ、AVANTI POLAR LIPIDS社製)１０ｇに水２５０ｇを加え十分に溶解させた。ｐＨ５．５の酢酸ナトリウム緩衝液１Ｍを１００ｇ、２Ｍ塩化ナトリウム１０ｍｌ、ホスホリパーゼＤ(ＰＬ−Ｄ、名糖産業社製)１００ｍｇを添加し、５５℃で加温した。１８時間後にクロロホルム６５０ｇとメタノール７００ｇを添加し、激しく混合した。クロロホルム６５０ｇを加えて混合後、静置して下層を回収し溶媒を５５℃で留去し、１−オレオイル−環状ホスファチジン酸誘導体(以下、Ｃ１８：１−ｃＰＡと略す)(式(１)中のRがC18H33O-であり、Xが式(２)で示される基である化合物)を得た。
得られた化合物は、31Ｐ−ＮＭＲによりリン酸環状構造を有し、開環したＬＰＡや原料のＬＰＣを含有しないことを確認した。結果を図１に示す。
【００２７】
合成例２
Ｃ１８：１−リゾホスファチジルコリンの代わりに、大豆リゾリン脂質(ＳＬＰ−ペーストリゾ、辻製油社製：アシル鎖の組成は、Ｃ１６：０が２１．８％、Ｃ１８：０が３．９％、Ｃ１８：１が１０．４％、Ｃ１８：２が５８．３％、Ｃ１８：３が５．６％である)１０ｇを用いた以外合成例１と同様にして１−アシル−環状ホスファチジン酸誘導体(以下、大豆ｃＰＡと略す)(式(１)中のRが構成脂肪酸残基に由来し、Xが式(２)で示される基である化合物)を調製した。
得られた化合物は、31Ｐ−ＮＭＲによりリン酸環状構造を有し、開環したＬＰＡや原料のＬＰＣをほとんど含有しないことを確認した。結果を図２に示す。
【００２８】
合成例３
Ｃ１８：１−リゾホスファチジルコリンの代わりに、Ｃ１０：０−リゾホスファチジルコリン(ＬＰＣ、AVANTI POLAR LIPIDS社製)を用いた以外合成例１と同様にしてＣ１０：１−ｃＰＡ(式(１)中のRがC10H19O-であり、Xが式(２)で示される基である化合物)を得た。得られた化合物は、31Ｐ−ＮＭＲによりリン酸環状構造を有し、開環したＬＰＡや原料のＬＰＣを含有しないことを確認した。
【００２９】
合成例４
Ｃ１８：１−リゾホスファチジルコリンの代わりに、Ｃ１６：０−リゾホスファチジルコリン(ＬＰＣ、AVANTI POLAR LIPIDS社製)を用いた以外合成例１と同様にしてＣ１６：０−ｃＰＡ(式(１)中のRがC16H28O-であり、Xが式(２)で示される基である化合物)を得た。得られた化合物は、31Ｐ−ＮＭＲによりリン酸環状構造を有し、開環したＬＰＡや原料のＬＰＣを含有しないことを確認した。
【００３０】
合成例５
Ｃ１８：１−リゾホスファチジルコリンの代わりに、Ｃ６：０−リゾホスファチジルコリン(ＬＰＣ、AVANTI POLAR LIPIDS社製)を用いた以外合成例１と同様にしてＣ６：０−ｃＰＡ(式(１)中のRがC6H11O-であり、Xが式(２)で示される基である化合物)を得た。得られた化合物は、31Ｐ−ＮＭＲによりリン酸環状構造を有し、開環したＬＰＡや原料のＬＰＣをほとんど含有しないことを確認した。
【００３１】
トランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進試験
実施例１
(１−１)細胞培養
正常ヒト表皮角化細胞として、新生児包皮角化細胞(商品名「凍結ＮＨＥＫ(Ｆ)」(ＮＨＥＫ細胞と略す)、クラボウ(株)製)を準備した。ＮＨＥＫ細胞を、ウシ脳下垂体抽出液０．４質量％、インスリン１０μｇ／ｍＬ、ヒト組換え型上皮成長因子０．１ｎｇ／ｍＬ、ハイドロコーチゾン０．５μｇ／ｍＬを含有するＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地(クラボウ社製)を用いて継代培養した。
【００３２】
(１−２)遺伝子発現促進評価
培養用ディシュ６ｃｍ(ファルコン社製)に、ＮＨＥＫ細胞を懸濁したＨｕＭｅｄｉａ−KG２を４ｍＬ加え、３７℃で３日間培養を行った。その後培地を無血清のＤＭＥＭ−Ｆ１２(１：１)４ｍＬで置換し、更に１日間培養を継続した。
次いで、合成例１で合成したＣ１８：１−ｃＰＡ ２０μＭを添加し、３７℃で培養を行い０、４及び８時間目に培地を吸引除去し、Isogen(ニッポンジーン社製)を用いて、細胞を溶解して全ＲＮＡを回収した。得られたＲＮＡを１×ＴＡＥ緩衝液で０．２〜２０μｇ／μＬとなるように希釈後、One Step SYBR RT−PCR Kit(TAKARA社製)を用いてリアルタイムRT-PCRを実施した。
β−アクチンのプライマー配列として、５’-ＧＧＣＣＡＣＧＧＣＴＧＣＴＴＣ-３’および５’-ＴＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧ-３’を用い、トランスグルタミナーゼのプライマーとして、５’-ＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＣＴＴＣＣＣ-３’および５’-ＴＣＴＧＴＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＴＣＧＡ-３’を用いた。DNA Engine Opticon System(MJ Research社製)を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。反応条件は、逆転写：４２℃、１５分、変性：９５℃、５秒、アニーリング：６０℃、２０秒、鎖長延長：７２℃、１５秒とし、これを４５回反復した。ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンの発現強度に対するトランスグルタミナーゼの相対発現強度を求めた。結果を図３に示す。また、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間が８時間の場合のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現増強効果の評価結果を表１に示す。
図３より、角化細胞にホスファチジン酸誘導体環状エステルを付与すると、短時間にトランスグルタミナーゼ遺伝子の発現が引き起こされ、８時間後に３０倍近くに達することがわかった。
【００３３】
実施例２
ホスファチジン酸誘導体として、合成例３で合成したＣ１０：０−ｃＰＡを用いた以外実施例１と同様に、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間が８時間の場合のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現増強効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００３４】
実施例３
ホスファチジン酸誘導体として、合成例４で合成したＣ１６：０−ｃＰＡを用いた以外実施例１と同様に、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間が８時間の場合のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現増強効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００３５】
実施例４
ホスファチジン酸誘導体として、合成例２で合成した大豆ｃＰＡを用いた以外実施例１と同様に、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間が８時間の場合のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現増強効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００３６】
実施例５
ホスファチジン酸誘導体として、市販のＣ１８：１のＬＰＡ(Sigma社製)(式(１)中のRがC18H33O-であり、Xが式(３)で示される基である化合物)を用いた以外実施例１と同様に、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間が８時間の場合のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現増強効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００３７】
実施例６
ホスファチジン酸誘導体として、市販のＣ１０：０のＬＰＡ(AVANTI POLAR LIPIDS社製)(式(１)中のRがC10H19O-であり、Xが式(３)で示される基である化合物)を用いた以外実施例１と同様に、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間が８時間の場合のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現増強効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００３８】
実施例７
ホスファチジン酸誘導体として、市販のＣ１６：０のＬＰＡ(Sigma社製)(式(１)中のRがC16H28O-であり、Xが式(３)で示される基である化合物)を用いた以外実施例１と同様に、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間が８時間の場合のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現増強効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００３９】
実施例８
ホスファチジン酸誘導体として、市販の大豆リン脂質由来のリゾホスファチジン酸(大豆ＬＰＡ、Sigma社製)(式(１)中のRが構成脂肪酸残基に由来し、Xが式(３)で示される基である化合物)を用いた以外実施例１と同様に、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間が８時間の場合のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現増強効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００４０】
比較例１
ホスファチジン酸誘導体として、市販の大豆リン脂質由来のホスファチジン酸(大豆ＰＡ、Sigma社製)を用いた以外実施例１と同様に、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間が８時間の場合のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現増強効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００４１】
比較例２
ホスファチジン酸誘導体として、合成例５で合成したＣ６：０−ｃＰＡを用いた以外実施例１と同様に、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間が８時間の場合のトランスグルタミナーゼ遺伝子発現増強効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2009234931.tif 000004
【００４３】
トランスグルタミナーゼ活性増強試験
実施例９
ホスファチジン酸誘導体として、合成例１で合成した１８：１−ｃＰＡを用いた。
トランスグルタミナーゼ活性の評価
(２−１)細胞培養
正常ヒト表皮角化細胞５．０×１０5cells／バイアルを解凍後、ＨｕＭｅｄｉａ ＫＧに(ＫＫ−６１５０、１０μｇ／ｍＬインスリン、０．５μｇ／ｍＬハイドロコーチゾン、０．１ｎｇ／ｍＬ ｈｒＥＧＦ、０．４％ＢＰＥ(Bovine Pituitary Extract)含有)を培地として用いて１０ｃｍディシュ１枚に播種後、１０日間継代培養を行った。継代操作は、培養５、７日目に添付手順書に準じて実施した。すなわち、ＰＢＳ(−)で細胞を洗浄後、０．２５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ液２ｍＬを添加し、１分後に吸引除去して更に６分間３７℃でインキュベートした。トリプシンインヒビター(Ｋｕｒａｂｏ社製)液２ｍＬを添加し、４℃、８００ｒｐｍで５分間遠心し細胞を回収した。回収した細胞を１０ｍＬのＨｕＭｅｄｉａ ＫＧに再懸濁後１０ｃｍディシュに播種した。
１０日目に全細胞を２００ｍＬのＨｕＭｅｄｉａＫＧに懸濁後、３５ｍｍディシュに２ｍＬずつ播種した。その後、２日目に同様の培地で培地交換を行い、培養４日目に無血清のＤＭＥＭ−Ｆ１２(１：１)に置換し、翌日に最終濃度が２５μＭとなるようＣ１８:１−ｃＰＡを添加した。添加後２４、４８時間目に培養液を吸引除去し細胞層を測定まで−８０℃で保管した。
【００４４】
(２−２)酵素活性の測定
各ディシュを室温に戻した後、氷上で抽出用緩衝液(１０ｍＭトリス塩酸緩衝液：ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０μｇ／ｍＬ ＰＭＳＦ)を２０μＬずつ添加し、セルスクレーパーで掻き取りながら細胞を回収した。抽出用緩衝液に穏やかに懸濁した後、５０００ｒｐｍで１０分間冷却遠心し、上清を回収して粗酵素液とした。
抽出用緩衝液で必要に応じて希釈した粗酵素液３０μＬに同量の反応液(１００ｍｌＭトリス塩酸緩衝液(pＨ９．０)、２０ｍＭＣａＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍｇ／ｍＬジメチルカゼイン、２００μＭダンシル−カダベリン(Sigma社製))を添加し、３７℃で１０分から６０分間静置した。６０μＬの２ｍＭヨードアセトアミドを添加し氷冷して反応を停止させた後、２００μＬのBioMag Dextran−coated Charcoal(Polysciences社製)を添加し、室温で６０分間十分に振盪させた。マグネットプレート上に１０分間静置した後、蛍光プレートリーダー(BioTEK FLx800：励起光３４０ｎｍ、蛍光５３５ｎｍ)で測定した。
【００４５】
(２−３)タンパク質量の測定
Lowry法の改良法として、ＲＣＤＣプロテインアッセイキット(Bio−radプロテインアッセイ)を用いてＢＳＡを標準物質として粗酵素液のタンパク質を定量した。本改良法では、被験液に界面活性剤や還元物質が共存してもタンパク質の定量が可能である。
即ち、標準液や粗酵素液(適宜希釈)２５μＬにＲＣ−Ｉ試薬を１２５μＬ添加し、十分攪拌の後１分間静置した。ここにＲＣ−II試薬を１２５μＬ添加し攪拌した。１５０００ｒｐｍで５分間遠心して沈殿を回収し、予め調製したＡ'試薬(Ａ試薬１ｍｌにＳ試薬２０μＬ添加して調製した)１２７μＬを添加し、沈殿を十分溶解させた。更に、Ｂ試薬を１ｍｌ添加し室温で１５分間以上静置した後、２００μＬずつ分取し、マイクロプレートリーダを用いて７５０ｎｍの吸光度を測定した。粗酵素液中のタンパク質濃度をＢＳＡ濃度として求めた。
【００４６】
(２−４)相対活性値の算出
最終的にトランスグルタミナーゼ酵素の比活性(ＡＩＵ)を単位時間・タンパク質当たりの蛍光値の増大分として、下記式に従って算出し、活性の単位タンパク質の比活性に換算後、さらに以下の参考例に示す無添加対照群の比活性に対する相対活性値を求めた。結果を表２に示す。
ＡＩＵ＝(Ｆi−Ｆb)／Ｆr−Ｆs
式中、Ｆi；６０分間のインキューベッション後の蛍光値、Ｆb；インキュベーション前の蛍光値、Ｆr；１μＭダンシル−カダベリンの蛍光値、Ｆs；溶媒の蛍光値を示す。
【００４７】
実施例１０
ホスファチジン酸誘導体として、合成例２で合成した大豆ｃＰＡを用いた以外、実施例９と同様にしてトランスグルタミナーゼ活性増強効果について評価を行った。結果を表２に示す。
【００４８】
実施例１１
ホスファチジン酸誘導体として、合成例３で合成したＣ１０：０−ｃＰＡを用いた以外、実施例９と同様にしてトランスグルタミナーゼ活性増強効果について評価を行った。結果を表２に示す。
【００４９】
実施例１２
ホスファチジン酸誘導体として、市販のＣ１８：１のＬＰＡ(Sigma社製)(式(１)中のRがC18H33O-であり、Xが式(３)で示される基である化合物)を用いた以外、実施例９と同様にしてトランスグルタミナーゼ活性増強効果について評価を行った。結果を表２に示す。
【００５０】
実施例１３
ホスファチジン酸誘導体として、市販の大豆リン脂質由来のリゾホスファチジン酸(大豆ＬＰＡ、Sigma社製)(式(１)中のRが構成脂肪酸残基に由来し、Xが式(３)で示される基である化合物)を用いた以外、実施例９と同様にしてトランスグルタミナーゼ活性増強効果について評価を行った。結果を表２に示す。
【００５１】
実施例１４
ホスファチジン酸誘導体として、市販のＣ１０：０のＬＰＡ(AVANTI POLAR LIPIDS社製)(式(１)中のRがC10H19O-であり、Xが式(３)で示される基である化合物)を用いた以外、実施例９と同様にしてトランスグルタミナーゼ活性増強効果について評価を行った。結果を表２に示す。
【００５２】
比較例４
ホスファチジン酸誘導体として、合成例５で合成したＣ６：０−ｃＰＡを用いた以外、実施例９と同様にしてトランスグルタミナーゼ活性増強効果について評価を行った。結果を表２に示す。
【００５３】
参考例１
ホスファチジン酸誘導体を用いなかった以外、実施例９と同様にしてトランスグルタミナーゼ活性増強効果について評価を行った。結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
2009234931.tif 000005
【００５５】
コーニファイドエンベロップ形成促進試験
実施例１５
ホスファチジン酸誘導体として、合成例１で合成したＣ１８：１−ｃＰＡを用いた。
コーニファイドエンベロップ形成評価
(３−１)細胞培養
正常ヒト表皮角化細胞５．０×１０5 cells／バイアル)を解凍後、ＨｕＭｅｄｉａ ＫＧに(ＫＫ−６１５０、１０μｇ／ｍＬインスリン、０．５μｇ／ｍＬハイドロコーチゾン、０．１ｎｇ／ｍＬ ｈｒＥＧＦ、０．４％ＢＰＥ含有)を培地として用いて１０ｃｍディシュに播種後、１０日間継代培養を行った。継代操作は、培養５、７日目に添付手順書に準じて実施した。すなわち、ＰＢＳ(−)で細胞を洗浄後、０．２５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ液２ｍＬを添加し、１分後に吸引除去して更に６分間３７℃でインキュベートした。１×トリプシンインヒビター(Ｋｕｒａｂｏ社製)液２ｍＬを添加し、４℃、８００ｒｐｍで５分間遠心し細胞を回収した。回収した細胞を１０ｍＬのＨｕＭｅｄｉａ ＫＧに再懸濁後１０ｃｍディシュに播種した。
【００５６】
(３−２)コーニファイドエンベロップの染色
１０日目に全細胞を２００ｍＬのＨｕＭｅｄｉａＫＧに懸濁後、カバーガラスを挿入した２４ウェルディシュに０．５ｍＬずつ播種した。その後、２日目に同様の培地で培地交換を行い、培養４日目に無血清のＤＭＥＭ−Ｆ１２(１：１)に置換し、翌日に最終濃度が２０μＭとなるようＣ１８:１−ｃＰＡを添加した。添加後４８時間目に培養液に最終濃度４ｍＭのビオチン化カダベリンを添加し、６時間培養を行った。培地を吸引除去後４％パラフォルムアルデヒドで１０分間細胞を固定した。固定中に１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、細胞膜を処理した。ブロックエース(雪印牛乳社製)でブロッキング後、０．１ｍｇ／ｍｌ ＦＩＴＣ−ストレプトアビジン(Sigma社製)で染色した。蛍光顕微鏡で蛍光染色像を観察した。蛍光染色像の写しを図４に示す。
【００５７】
実施例１６
ホスファチジン酸誘導体として、市販のＣ１８：１のＬＰＡ(Sigma社製)(式(１)中のRがC18H33O-であり、Xが式(３)で示される基である化合物)を用いた以外、実施例１５と同様にしてコーニファイドエンベロップの染色を行った。蛍光染色像の写しを図４に示す。
【００５８】
参考例２
無添加対照としてホスファチジン酸誘導体を全く添加せずに培養を行った以外実施例１５と同様にコーニファイドエンベロップの染色を行った。蛍光染色像の写しを図４に示す。
【００５９】
以上の結果から、本発明に用いるホスファチジン酸誘導体は、細胞によるトランスグルタミナーゼの遺伝子発現を促進し、当該酵素活性が増強することがわかった。また、本発明に用いるホスファチジン酸誘導体は、コーニファイドエンベロップ形成を促進し、皮膚においては角層バリアを増強することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】合成例１で合成したＣ１８：１−ｃＰＡの31Ｐ−ＮＭＲを示すチャートである。
【図２】合成例２で合成した大豆ｃＰＡの31Ｐ−ＮＭＲを示すチャートである。
【図３】実施例１におけるトランスグルタミナーゼの相対的発現量を示すチャートである。
【図４】実施例１５、１６及び参考例２で行った角化細胞のコーニファイドエンベロップ形成を蛍光顕微鏡で観察した蛍光染色像の写しである。
【図１】
2009234931.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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