(57)【要約】      （修正有）【課題】トリ宿主にニューカッスル病に対する免疫応答を誘導する免疫原性又はワクチン組成物を提供する。【解決手段】ニューカッスル病ウイルスＨＮタンパク質をコードする配列を有する核酸分子を含み、トリ宿主細胞においてインビボで発現させる環状ＤＮＡプラスミドと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。該環状プラスミドは、さらにニューカッスル病ウイルスＦタンパク質をコードする配列を有する核酸分子を含んでもよく、上記組成物は、さらにニューカッスルウイルスＦタンパク質をコードする配列を有する核酸分子を含み、宿主細胞においてインビボで発現させる第２の環状プラスミドを含んでいてもよい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューカッスル病ウイルスＨＮタンパク質をコードする配列を有する核酸分子を含み、トリ宿主細胞においてインビボで発現させる環状ＤＮＡプラスミドと、薬学的に許容される担体とを含む、トリ宿主にニューカッスル病に対する免疫応答を誘導する免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項２】
環状プラスミドが、さらにニューカッスル病ウイルスＦタンパク質をコードする配列を有する核酸分子を含み、宿主細胞においてインビボで発現させることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。 
【請求項３】
組成物が、さらにニューカッスルウイルスＦタンパク質をコードする配列を有する核酸分子を含み、宿主細胞においてインビボで発現させる第２の環状プラスミドを含むことを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
配列の発現が、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、及び細胞骨格遺伝子のプロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
配列の発現が、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかの記載の組成物。
【請求項６】
全生ワクチン、不活性化全ワクチン、サブユニットワクチン、及び組換えワクチンからなる群より選択されるワクチンをトリに投与し、その後前記トリに請求項１〜５のいずれかに記載の免疫原性又はワクチン組成物を投与することを含む、トリに免疫応答又は保護応答を誘導する方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の免疫原性又はワクチン組成物をトリに投与することを含む、トリに免疫応答又は保護応答を誘導する方法。
【請求項８】
（i）請求項１〜５のいずれかに記載の免疫原性又はワクチン組成物と（ii）全生ワクチン、不活性化全ワクチン、サブユニットワクチン、及び組換えワクチンからなる群より選択されるトリ用ワクチンとを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥類、特にニワトリのニューカッスル病の予防接種用の免疫原性又はワクチン組成物と、それに対応する予防接種方法とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ニワトリに病理を引き起こす多くのウイルスに対するワクチンの組合せは既に提案されている。
【０００３】
これまでに開発されたワクチン組合せは不活性化ワクチンまたは生ワクチンから調製されていた。これらの使用は抗原結合価(valence)の適合性と安定性に問題がある。すなわち、配合物自体の観点または用いられる抗原の観点から、互いに異なる抗原結合価を適合させる必要がある。さらに、組合せのワクチンの保存の問題、特に免疫賦活剤存在下での安全性にも問題がある。
【０００４】
国際特許第WO-A-90 11092号、WO-A-92 19183号、WO-A-94 21797号およびWO-A-95 20660号では最近開発されたポリヌクレオチドワクチン技術を用いている。これらのワクチンはプラスミドに挿入された抗原を宿主細胞内で発現できるプラスミドを用いるということは知られている。全ての投与経路(腹腔内経路、静脈内経路、筋肉内経路、経皮的経路、皮内経路、粘膜経路など)が提案されている。
【０００５】
各種予防接種手段を用いることもでき、例えばDNAを金の粒子の表面に堆積させ、動物の皮膚に噴射侵入させたり(Tang et al.,Nature,356.152-154,1992)、液体ジェット注射装置を用いて皮膚、筋肉、脂肪組織および乳腺組織に同時に形質移入することができる(Furth et al.,AnalyticalBiochemistry,205,365-368,1992)。
【０００６】
ポリヌクレオチドワクチンは裸のDNAでも脂質またはカチオンリポソーム内に配合されたDNA等でも使用できる。
【特許文献１】国際公開第９０／１１０９２
【特許文献２】国際公開第９２／１９１８３
【特許文献３】国際公開第９４／２１７９７
【特許文献４】国際公開第９５／２０６６０
【非特許文献１】Tang et al.,Nature,356.152-154,1992
【非特許文献２】Furth et al.,AnalyticalBiochemistry,205,365-368,1992
【発明の開示】
【０００７】
本発明の目的はトリニューカッスル病ウイルスに対して予防接種可能な免疫原性又はワクチン組成物を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、抗原結合価（valence）の相互適合性（compatibilite）および安定性で要求される全ての基準を満たした状態で、互いに異なる抗原結合価を組合せたワクチン製剤を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は互いに異なる抗原結合価を同一の媒体中で組合せたワクチン製剤を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は使用が容易且つ安価なワクチンを提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、多価保護を含めた保護を高効率且つ長期間得ることができ、しかも、安全性が良好で残留物が存在しないガレンシネ(Gallinaceans)予防接種法を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の対象は、各々が、宿主細胞の生体内で発現するように、1価の鳥類の病原体を含む遺伝子を組込んだ環状プラスミドからなるポリヌクレオチドワクチン抗原結合価で構成される鳥類用ワクチン製剤であって、各抗原結合価がニューカッスル病ウイルス(NDV)から選択され、環状プラスミドが、各抗原結合価ごとに、ニューカッスル病ウイルスのHNおよびＦから選択される1つまたは複数の遺伝子を含む免疫原性又はワクチン組成物にある。
【００１３】
本発明で「抗原結合価(valence)」とは、問題の病原体ウイルスに対する保護を提供する少なくとも1つの抗原を意味し、この抗原結合価は問題の病原体の１つまたは複数の株の天然または修飾された遺伝子をサブ抗原結合価として含むことができる。
【００１４】
病原体の遺伝子とは、完全な遺伝子だけでなく、保護反応を誘発する能力を保持する断片も含めた変化した塩基配列を意味する。
【００１５】
遺伝子の概念には実施例に詳細に記載したものと同じ塩基配列と均等なもの、すなわち、異なる配列で同じ蛋白質をコードする配列が包まれる。さらに、交雑保護または株または株群に特異的な保護を提供する問題の病原体の他の株の塩基配列も含まれる。遺伝子の概念にはさらに、宿主動物による生体内の発現を容易にするために修飾された同じ蛋白質をコードする塩基配列も含まれる。
【００１６】
ワクチン製剤は、マレック、感染性滑液嚢炎、感染性貧血症、ニューカッスルから選択される3つの抗原結合価を含むのが好ましい。感染性気管支炎の抗原結合価もこれらに加えることができる。
【００１７】
この3，4または5つの抗原結合価を基準に、トリ疫病、喉頭気管炎、肺炎、脳脊髄炎の1つまたは複数の抗原結合価を加えることもできる。
【００１８】
マレックの抗原結合価では、異なるプラスミド内または同一のプラスミド内でgBおよびgDをコードする2つの遺伝子を用いることができるが、gB遺伝子を単独で用いるのが好ましい。
【００１９】
ニューカッスルの抗原結合価では、2つのHNおよびＦ鎖が2つの異なるプラスミド内または同一のプラスミド内に組み込まれたものを用いるのが好ましい。
感染性気管支炎の抗原結合価では、Ｓ遺伝子を用いるのが好ましい。あまり好ましくはないが必要に応じてＳおよびＭは単一のプラスミドまたは異なるプラスミド内で組み合わせることができる。
【００２０】
感染性貧血症の抗原結合価では、2つの遺伝子ＣおよびNS1を同じプラスミド内で組合せるのが好ましい。
【００２１】
感染性喉頭気管炎ウイルスの抗原結合価では、gB遺伝子を単独で使用するのが好ましい。あまり好ましくはないが必要に応じて2つの遺伝子gBおよびgDを異なるプラスミド内または同一のプラスミド内で組み合わせることができる。
肺炎ウイルスの抗原結合価では、2つの遺伝子ＰおよびＧ遺伝子を単一のプラスミドまたは異なるプラスミド内で用いるのが好ましい。
【００２２】
トリ疫病の抗原結合価ではHA遺伝子を用いるのが好ましい。あまり好ましくはないが必要に応じてHAとNPまたはHAとＮを異なるプラスミド内または同一のプラスミド内で組合せて用いることができる。1つ以上のインフルエンザウイルス株、特にこの分野で見られる異なる株のHA配列を同じワクチン内で適当に組合せるのが好ましい。また、NPは交雑保護を提供するので、単一のウイルス株の配列で十分である。
【００２３】
脳脊髄炎の抗原結合価ではenvを用いるのが好ましい。
【００２４】
本発明のワクチン製剤は0.1・1ml、特に0.3・0.5mlの投与量で存在することができる。
【００２５】
投与量は一般にプラスミド型1個当り10ng・1mg、好ましくは100ng・500μｇ、さらに好ましくは0.1μｇ・50μｇである。
【００２６】
裸のプラスミドを予防接種媒体、一般に生理食塩水などに単に入れたものを使用するのが好ましい。当然、従来法に記載の全ての型のポリヌクレオチドワクチン、特にリポソームに配合されたものを使用できる。
【００２７】
各プラスミドは宿主細胞に挿入された遺伝子を確実に発現することができるプラスミドである。これは一般に強い真核生物プロモータ、特にヒトまたはネズミに由来のサイトメガロウイルスの初期プロモータCMV-IEあるいは由来の異なるCMV-IEプロモータ、例えばラット、ブタまたはモルモット由来のプロモータである。
【００２８】
一般的には、プロモータはウイルス由来または細胞由来のプロモータにすることができる。CMV-IE以外のウイルスプロモータとしてはSV40ウイルスの初期または後期プロモータまたはラウス肉腫ウイルスLTRプロモータを挙げることができる。遺伝子は得られるウイルスのプロモータ、例えば遺伝子固有のプロモータにすることもできる。
【００２９】
細胞プロモータとしては、細胞骨格遺伝子のプロモータ、例えばデスミンプロモータ(Bolmont et al.,Journalof Submicroscopic Cytology and Pathology,1990,22,117-122;and Zhenlin et al.,Gene,1989,78,243-254)またはアクチンプロモータを挙げることができる。
【００３０】
複数の遺伝子が同じプラスミド内に存在する場合は、これらは同じ転写ユニットまたは異なる2つのユニット内に存在することができる。
【００３１】
本発明の異なるワクチン抗原結合価の組合せは、好ましくは各抗原結合価の抗原を発現するポリヌクレオチドプラスミドを混合して得ることができるが、同じプラスミドによって発現される複数の抗原結合価の抗原を発現させることもできる。
【００３２】
本発明のさらに他の対象は、上記ウイルスの由来の1つまたは複数の上記の遺伝子をコードする1つまたは複数のプラスミドを含む一価のワクチン製剤にある。このワクチン製剤は一価特性以外の遺伝子の選択、組合せ、プラスミド組成、投与量、投与回数などに関しては上記特性を有することができる。
【００３３】
一価のワクチン製剤は(i)上記多価ワクチン製剤の調製に、(ii)実際の病理に対して個々に、(iii)他の病理に対する他の型のワクチン(生または不活性化全ワクチン、組換えワクチン、サブユニットワクチン)と組合せて、または(iv)以下のようなワクチンのためのブースターとして用いることもできる。
【００３４】
本発明のさらに他の対象は、特に全生ワクチン、弱毒化全ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチンより成る群の中から選択された従来型の一般的な初期ワクチン(一価または多価)であって、交雑保護を提供するプラスミドまたは抗原によってコードされた抗原を有する(すなわち含むまたは発現可能な)初期ワクチンを用いて最初の予防接種で動物に予防接種するための鳥類用ワクチンの製造での本発明のプラスミドの使用にある。
【００３５】
このポリヌクレオチドワクチンが強力なブースター(免疫追加)効果を有し、免疫応答を増幅させ、持続性のある免疫が得られる点は注目すべきである。
【００３６】
一般に、初期予防接種用ワクチンは種々の獣医学用ワクチンメーカーから入手可能な市販のワクチンの中から選択することができる。
【００３７】
本発明のさらに他の対象は、本発明のワクチン製剤と、上記の初期予防接種用ワクチンとを一まとめにする予防接種キットにある。本発明はさらに、上記の初期予防接種のためのブースターとしてのこの製剤の使用を示す指示書が添付された本発明のワクチン製剤にある。
【００３８】
本発明のさらに他の対象は、上記の有効なワクチン製剤の投与を含む鳥類の予防接種方法にある。この予防接種方法はワクチン製剤の1回または数回の投与を含み、これらの投与は短時間で連続的な投与および／または間隔の長い連続的な投与にすることができる。
【００３９】
本発明のワクチン製剤は、この予防接種方法では、ポリヌクレオチドを予防接種するために従来法で提案された投与経路とは異なる投与経路や周知な投与方法を用いて投与することができる。筋肉内経路、in ovo経路、眼内経路、噴霧および飲料水経由が特に考えられる。
【００４０】
免疫系に対する抗原の存在効率は組織によって変わる。特に呼吸樹の粘膜は病原体の侵入に対してバリヤの役目をし、局所免疫を支持するリンパ組織と組合わされる。さらに、粘膜、特に頬側粘膜、咽頭粘膜および気管支部分の粘膜との接触によるワクチンの投与は大量の予防接種において重要なことは確かである。
【００４１】
投与の粘膜経路は本発明の投与の好ましい形態の一部で、特にneubilizationまたは噴霧または飲料水を用いる。本発明のワクチン製剤および予防接種法はこの実施例に適用することができる。
【００４２】
本発明のさらに他の対象は、本発明のワクチン製剤を用いた初期予防接種法およびブースター予防接種法にある。
【００４３】
本発明方法の好ましい実施例では、有効量の一般的なワクチン、特に不活性化ワクチン、生ワクチン、弱毒または組換えワクチン型またはサブユニットワクチンを動物に投与して第1の予防接種を提供した後、好ましくは2・6週間後に本発明の多価または一価のワクチンを投与する。
【００４４】
本発明はさらに、上記説明で明らかなワクチン製剤の調製方法すなわち抗原結合価およびその混合物の調製方法に関するものである。
【００４５】
以下、添付図面を参照した下記実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４６】
［実施例１］
ウイルスの培養 
ウイルスは適当な細胞系で細胞変性効果が得られるまで培養する。各ウイルスに使用される細胞系は当業者に周知なものである。要約すると、用いるウイルスに対して敏感な細胞をイーグルの最小必須培地(MEM培地)または他の適当な媒体で培養されたものに感染効率1でウイルス株を接種する。
【００４７】
次いで、感染した細胞を細胞変性効果が完全に現れるのに要する時間だけ37℃でインキュベートする(平均36時間)。
【００４８】
［実施例２］
ウイルスゲノムDNAの単離 
培養後、上澄みと溶解した細胞とを回収し、ウイルス懸濁液全体を＋4℃で10分間、1000gで遠心分離して細胞片を除去する。次いで、ウイルス粒子を回収し、＋4℃で1時間、400,000gで超遠心分離する。このペレットを最小量のバッファー(10mM Tris、1mM EDTA)に取り、硫酸ドデシルナトリウム(SDS)(最終濃度0.5％）の存在下、プロテイナーゼＫ(最終濃度100μｇ/ml)で37℃で2時間処理する。
【００４９】
次いで、ウイルスＤＮＡをフェノール／クロロホルム混合液を用いて抽出し、これを2容量の無水エタノールを用いて沈殿させる。・20℃で一晩放置した後、DNAを＋4℃で15分間、10,000gで遠心分離する。DNAペレットを乾燥させ、次いで最小量の滅菌した超純水に取る。制限酵素で処理できる状態にある。
【００５０】
［実施例３］  
ウイルスゲノムRNAの単離 
RNAウイルスを当業者に周知な方法で精製した。次いで、各ウイルスのゲノムウイルスRNAをP.Chromczynski and N.Sacchi(Anal.Biochem.,1987.162,156-159)が開示の「チオシアン酸グアニジウム／フェノール・クロロホルム」抽出方法を用いて単離した。
【００５１】
［実施例４］
分子生物学的方法 
全てのプラスミドの作製はサムブルック(Sambrook)達のMolecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版、Cold Spring Harbor Laboratory．Cold Spring Harbor NewYork.1989)に記載の分子生物学の標準的手法で行った。本発明で使用した全ての制限酵素断片はジェネクリーン(Geneclean)キット(BIO 101 Inc．La Jolla，CA)を用いて単離した。
【００５２】
［実施例５］
RT・PCR方法 
特異的なオリゴヌクレオチド(増幅断片のクローニングを容易にするために5'末端に制限部位を有する)を合成し、増幅すべき遺伝子のコード領域(特定の実施例参照)を完全にカバーした。逆転写(RT)反応およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を標準的手法(Sambrook J.etal.,1989)に従って行った。各RT・PCR反応は一対の特定の増幅器を用いて行い、鋳型として抽出したゲノムRNAを用いた。増幅した相補DNAをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(25:24:1)で抽出し、次いで制限酵素で処理した。
【００５３】
［実施例６］
プラスミドpVR1012 
環状プラスミドpVR1012(図1)はサンディエゴ、カナダ、米国のバイカル社(Vical Inc.,)で得られた。この作製法はJ.Hartikka達.(Human Gene Therapy,1996,7,1205-1217)が開示している。
【００５４】
［実施例７］
プラスミドpAB045(MDV gB遺伝子)の作製 
PCR反応を実施例2の方法に従って調製したマレック病ウイルス(MDV)(RB1B株)(L.Rosset al.,J.Gen.Virol.,1989,70,1789-1804)のゲノムDNAと、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、MDVウイルスのgB糖蛋白質をコードする遺伝子をPstI-BglII断片の形で単離した。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
精製後、2613bpのPCR生成物をPstIとBglIで処理して2602bpのPstI-BglII断片を単離した。この断片を予めPstIとBglIIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB045(7455bp)(図2)を得た。
【００５７】
［実施例８］
プラスミドpAB080(MDV gD遺伝子)の作製 
PCR反応を実施例2の方法に従って調製したマレック病ウイルス(MDV)(RBIB株)(L.Rosset al.,J.Gen.Virol.,1989,72,949-954)のゲノムDNAと、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、MDVウイルスのgD糖蛋白質をコードする遺伝子をPstI-BglII断片の形で単離した。
【００５８】
【表２】
2009149608.tif 000004
【００５９】
精製後、1215bpのPCR生成物をPstIとBglIIで処理して1199bpのPstI-BglII断片を単離した。この断片を予めPstIとBglIIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB080(6051bp)(図3)を得た。
【００６０】
［実施例９］
プラスミドpABO46(NDV HN遺伝子)の作製 
実施例5の方法によるRT・PCR反応を、実施例3の方法に従って調製したニューカッスル病ウイルス(NDV)(テキサスGB株)のゲノムRNAと、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、NDVウイルス、テキサスGB株のHN糖蛋白質をコードする遺伝子(図4、配列番号.7)をNotI-BamHI断片の形で単離した。
【００６１】
【表３】
2009149608.tif 000005
【００６２】
精製後、1741bpのRT・PCR生成物をNotIとBamHIで処理して1723bpのNotI-BamHI断片を単離した。この断片を予めNotIとBamHIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB046(6616bp)(図5)を得た。
【００６３】
［実施例１０］
プラスミドpAB047(NDV Ｆ遺伝子)の作製
実施例5の方法によるRT・PCR反応を、実施例3の方法に従って調製したニューカッスル病ウイルス(NDV)(テキサスGB株)のゲノムRNAと、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、NDVウイルス、テキサスGB株のＦ糖蛋白質をコードする遺伝子(図6、配列番号.10)をNotI-XbaI断片の形で単離した。
【００６４】
【表４】
2009149608.tif 000006
【００６５】
精製後、1684bpのRT・PCR生成物をNotIとXbaIで処理して1669bpのNotI-XbaI断片を単離した。この断片を予めNotIとXbaIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB047(6578bp)(図7)を得た。
【００６６】
［実施例１１］
プラスミドpAB048(IBDV VP2遺伝子)の作製 
実施例5の方法によるRT・PCR反応を、実施例3の方法に従って調製した感染性滑液嚢炎ウイルス(IBDV)(ファラガー株)のゲノムRNAと、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、IBDVウイルス、ファラガー株のVP2蛋白質をコードする遺伝子(図8、配列番号.13)をEcoRV−NotI断片の形で単離した。
【００６７】
【表５】
2009149608.tif 000007
【００６８】
精製後、1384bpのRT-PCR生成物をEcoRVとNotIで処理して1367bpのEcoRV-NotI断片を単離した。この断片を予めEcoRVとNotIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB048(6278bp)(図9)を得た。
【００６９】
［実施例１２］
プラスミドpAB049(IBV S1遺伝子)の作製
実施例5の方法によるRT・PCR反応を、実施例3の方法に従って調製したニワトリの感染性気管支炎ウイルス(IBV)(マサチューセッツ41株)のゲノムRNAと、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、IBVウイルス、マサチューセッツ41株のＳ糖蛋白質のS1サブユニットをコードする遺伝子（図10、配列番号.16)をSalI−BglII断片の形で単離した。
【００７０】
【表６】
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【００７１】
精製後、1635bpのRT・PCR生成物をSalIとBglIIで処理して1622bpのSalI-BglII断片を単離した。この断片を予めSalIとBglIIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB049(6485bp)(図11)を得た。
【００７２】
［実施例１３］
プラスミドpAB050(IBV Ｍ遺伝子)の作製 
実施例5の方法によるRT・PCR反応を、実施例3の方法に従って調製したニワトリの感染性気管支炎ウイルス(IBV)(マサチューセッツ41株)のゲノムRNAと、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、IBVウイルス、マサチューセッツ41株のＭ糖蛋白質をコードする遺伝子(図12、配列番号.19)をNotI-NotI断片の形で単離した。
【００７３】
【表７】
2009149608.tif 000009
【００７４】
精製後、710bpのRT・PCR生成物をNotIで処理して686bpのNotI-NotI断片を単離した。この断片を予めNotIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入してプロモータに対して正配向にIBV Ｍ遺伝子を含む環状プラスミドpAB050(5602bp)(図13)を得た。
【００７５】
［実施例１４］
プラスミドpAB051(IBV Ｎ遺伝子)の作製 
実施例5の方法によるRT・PCR反応を、実施例3の方法に従って調製したニワトリの感染性気管支炎ウイルス(IBV)(マサチューセッツ41株)のゲノムRNAと、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、IBVウイルス、マサチューセッツ41株のＮ蛋白質をコードする遺伝子（図14、配列番号.22)をPstI-BamHI断片の形で単離した。
【００７６】
【表８】
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【００７７】
精製後、1250bpのRT・PCR生成物をPstIとBamHIで処理して1233bpcのPstI-BamHI断片を単離した。この断片を予めPstIとBamHIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB051(6092bp)(図15)を得た。
【００７８】
［実施例１５］
プラスミドpAB054(VAC VP1遺伝子)の作製 
PCR反応を実施例2の方法に従って調製したニワトリの貧血症ウイルス(CAV)(Cuxhaven-1株)のゲノムDNA(B.Meehan et al.,Arch.Virol.,1992,124,301-319)と、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、CAV VP1カプシド蛋白質をコードする遺伝子をNotI-NotI断片の形で単離した。
【００７９】
【表９】
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【００８０】
精製後、1377bpのPCR生成物をNotIで処理して1359bpのNotI-NotI断片を単離した。この断片を予めNotIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入してプロモータに対して正配向にCAV VP1遺伝子を含む環状プラスミドpAB054(6274bp)(図16)を得た。
【００８１】
［実施例１７］
プラスミドpAB055(CAV VP2遺伝子)の作製 
PCR反応を実施例2の方法に従って調製したニワトリの貧血症ウイルス(CAV)(Cuxhaven-1株)のゲノムDNA(B.Meehan et al.,Arch.Virol.,1992,124,301-319)と、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、CAVウイルスVP2蛋白質をコードする遺伝子をNotI-BamHI断片の形で単離した。
【００８２】
【表１０】
2009149608.tif 000012
【００８３】
精製後、674bpのPCR生成物をNotIとBamHIで処理して659bpのNotI-BamHI断片を単離した。この断片を予めNotIとBamHIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB055(5551bp)(図17)を得た。
【００８４】
［実施例１８］
プラスミドpAB076(ILTV gB遺伝子）の作製
PCR反応を実施例2の方法に従って調製したニワトリの感染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)(SA-2株)のゲノムDNA(K.Kongsuwan et al.,Virology 1991.184.404-410)と、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、ILTVウイルスgB糖蛋白質をコードする遺伝子をNotI-NotI断片の形で単離した。
【００８５】
【表１１】
2009149608.tif 000013
【００８６】
精製後、2649bpのPCR生成物をNotIで処理して2631bpのNotI-NotI断片を単離した。この断片を予めNotIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入してプロモータに対して正配向にILTV gB遺伝子を含む環状プラスミドpAB076(7546bp)(図18)を得た。
【００８７】
［実施例２０］
プラスミドpAB089(ILTV gD遺伝子)の作製 
PCR反応を実施例2の方法に従って調製したニワトリの感染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)(SA-2株)のゲノムDNA(M.Johnson et al.,1994,Genbank Sequence accession No.=L31965)と、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、ILTVウイルスgD糖蛋白質をコードする遺伝子をSalI-BglII断片の形で単離した。
【００８８】
【表１２】
2009149608.tif 000014
【００８９】
精製後、1134bpのPCR生成物をSalIとBglIIで処理して1122bpのSalI-BglII断片を単離した。この断片を予めSalI-BglIIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB089(5984bp)(図19)を得た。
【００９０】
［実施例２１］
プラスミドpAB086(AEV env遺伝子)の作製 
実施例5の方法によるRT・PCR反応を、実施例3の方法に従って調製した鳥類の脳脊髄炎ウイルス(AEV)(Ｃ型)のゲノムRNA(E.Bieth et al.,Nucleic Acids Res.,1992,20,367)と、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、AEVウイルス、Env糖蛋白質をコードする配列をEcoRV−BamHI断片の形で単離した。
【００９１】
【表１３】
2009149608.tif 000015
【００９２】
精製後、1836bpのRT・PCR生成物をEcoRVとBamHIで処理して1825bpのEcoRV−BamHI断片を単離した。この断片を予めEcoRVとBamHIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB086(6712bp)(図20)を得た。
【００９３】
［実施例２２］
プラスミドpAB081(AEV gag/pro遺伝子)の作製
実施例5の方法によるRT・PCR反応を、実施例3の方法に従って調製した鳥類の脳脊髄炎ウイルス(AEV)(Ｃ型)のゲノムRNA(E.Bieth et al.,Nucleic Acids Res.,1992,20,367)と、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、AEVウイルス、GagおよびPro蛋白質をコードする配列をSalI-XbaI断片の形で単離した。
【００９４】
【表１４】
2009149608.tif 000016
【００９５】
精製後、2125bpのRT・PCR生成物をSalI-XbaIで処理して2111bpのSalI-XbaI断片を単離した。この断片を予めSalIとXbaIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB081(6996bp)(図21)を得た。
【００９６】
［実施例２３］
プラスミドpAB082(ニューモウイルスＧ遺伝子)の作製 
実施例5の方法によるRT・PCR反応を、実施例3の方法に従って調製した七面鳥の鼻気管炎ウイルス(TRV)(2119株)のゲノムRNA(K.Juhasz et al.,J.Gen.Virol.1994.75.2873-2880)と、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、TRVウイルス、Ｇ糖蛋白質をコードする遺伝子をPstI-BglII断片の形で単離した。
【００９７】
【表１５】
2009149608.tif 000017
【００９８】
精製後、2165bpのRT・PCR生成物をPstIとBglIIで処理して1249bpcのPstI-BglII断片を単離した。この断片を予めPstIとBglIIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB082(6101bp)(図22)を得た。
【００９９】
［実施例２４］
プラスミドpAB077(トリ疫病のHA遺伝子、H2N2株)の作製
実施例5の方法によるRT・PCR反応を、実施例3の方法に従って調製したトリ疫病ウイルス(AIV)(H2N2Postdum株)のゲノムRNA(J.Schafer et al.,Virology.1993.194.781-788)と、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、トリ疫病ウイルス(H2N2株)のHA糖蛋白質をコードする遺伝子をPstI-BglII断片の形で単離した。
【０１００】
【表１６】
2009149608.tif 000018
【０１０１】
精製後、1709bpのRT・PCR生成物をPstIとBglIIで処理して1693bp1のPstI-BglII断片を単離した。この断片を予めPstIとBglIIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB077(6545bp)(図23)を得た。
【０１０２】
［実施例２５］
プラスミドpAB078(トリ疫病のHA遺伝子、H7N7株）の作製 
実施例5の方法によるRT・PCR反応を、実施例3の方法に従って調製したトリ疫病ウイルス(AIV)(H7N7Leipzig株)のゲノムRNA(C.Rohm et al.,Virology.1995.209.664-670)と、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、トリ疫病ウイルス(H7N7株)のHA糖蛋白質をコードする遺伝子をPstI-BamHI断片の形で単離した。
【０１０３】
【表１７】
2009149608.tif 000019
【０１０４】
精製後、1707bpのRT・PCR生成物をPstIとBamHIで処理して1691bPのPStI-BamHI断片を単離した。この断片を予めPstIとBamHIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB078(6549bp)(図24)を得た。
【０１０５】
［実施例２６］
プラスミドpAB088(トリ疫病のNP遺伝子、H1N1株)の作製 
実施例5の方法によるRT・PCR反応を、実施例3の方法に従って調製した鳥類のインフルエンザウイルス(AIV)(H1N1 Bavaria株)のゲノムRNA(M.Gammelin et al.,Virology.1989.170.71-80)と、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、鳥類のインフルエンザウイルスのNP核蛋白質をコードする遺伝子をSalI-BamHI断片の形で単離した。
【０１０６】
【表１８】
2009149608.tif 000020
【０１０７】
精製後、1515bpのRT・PCR生成物をSalIと-BamHIで処理して1503bpのSalI-BamHI断片を単離した。この断片を予めSalIとBamHIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB088(6371bp)(図25)を得た。
【０１０８】
［実施例２７］
プラスミドpAB079(トリ疫病のＮ遺伝子、H7N1株)の作製 
実施例5の方法によるRT・PCR反応を、実施例3の方法に従って調製したトリ疫病(AIV)(H7N1Rostock株)のゲノムRNA(J.McCauley1990.Genbank Sequence accession No.=X52226)と、下記オリゴヌクレオチドとを用いて行い、トリ疫病ウイルス(H7N1株)のＮ糖蛋白質をコードする遺伝子をSalI-BglII断片の形で単離した。
【０１０９】
【表１９】
2009149608.tif 000021
【０１１０】
精製後、1361bpのRT・PCR生成物をSalIとBglIIで処理して1350bpのSalI-BglII断片を単離した。この断片を予めSalIとBglIIで処理したベクターpVR1012(実施例6)に導入して環状プラスミドpAB079(6212bp)(図26)を得た。
【０１１１】
［実施例２８］
プラスミドの調製と精製 
動物の予防接種用のプラスミドを調製するためにスーパーコイル状の精製したプラスミドの懸濁液が得られる任意の方法を用いることができる。これらの方法は当業者に周知である。特に、アルカリ法の後に臭化エチジウムの存在下、塩化セシウム勾配で連続2回の超遠心分離を行うサムブルック(Sambrook)達の(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版、Cold Spring Harbor Laboratory.ColdSpring Harbor New York.1989)に記載の方法を挙げることができる。参考文献としては、予防接種に使用可能なプラスミドの工業規模の製造方法を記載した特許出願PCT WO 95/21250号およびPCT WO 96/02658号も挙げることができる。ワクチンを製造するためには(実施例17参照)、精製したプラスミドを再懸濁して貯蔵可能な高濃度(＞2mg/ml)の溶液を得る。このために、プラスミドを超純水またはTEバッファー(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)に再懸濁する。
【０１１２】
［実施例２９］
組み合せワクチンの製造 
組み合せワクチンの製造に必要な各プラスミドをそれぞれの濃厚溶液(実施例16)から混合する。この混合液を各プラスミドの最終濃度が各プラスミドの有効量に対応するように調製する。ワクチンの最終濃度を調節するのに使用できる溶液は、0.9％NaCl溶液、またはPBSバッファーにすることができる。
【０１１３】
このワクチンの製造には特殊配合物、例えばリポソーム、カチオン脂質も使用できる。
【０１１４】
［実施例３０］
ニワトリの予防接種 
プラスミド1個当り10、50または100μｇの投与量でニワトリに予防接種する。
【０１１５】
注射は注射針を用いる筋肉内経路によって行うことができる。注射する部位は気管分岐部(生後2週間以上のニワトリ)および大腿(生後1日以上のニワトリ)である。この場合、ワクチンは0.1・0.3mlの量で投与される。
【０１１６】
成鳥(生後20週以上)の場合も、注射は筋肉内経路で行われるが、(注射針ではなく)ニワトリの予防接種のために特殊設計された液体ジェット注射装置(例えばAVIJET装置)を用いる。この場合の注射量は0.3mlにする。注射は気管分岐部または大腿の位置で行うことができる。また、成鳥の場合は、注射針を用いる筋肉内経路によって気管分岐部または大腿に0.3mlの量で注射することもできる。プラスミドワクチンの注射はin ovoでも可能である。この場合は、実施例29に記載の特殊な配合物を用いることができる。18日目の孵化孵卵に対する注射量は50・200μｌにする。
【０１１７】
配列リスト(配列番号.)
配列番号.1 オリゴヌクレオチドAB062
配列番号.2 オリゴヌクレオチドAB063
配列番号.3 オリゴヌクレオチドAB148
配列番号.4 オリゴヌクレオチドAB149
配列番号.5 オリゴヌクレオチドAB072
配列番号.6 オリゴヌクレオチドAB073
配列番号.7 テキサスGB株のNDV HN遺伝子の配列
配列番号.8 オリゴヌクレオチドAB091
配列番号.9 オリゴヌクレオチドAB092
配列番号.10 テキサスGB株のNDV Ｆ遺伝子の配列
配列番号.11 オリゴヌクレオチドAB093
配列番号.12 オリゴヌクレオチドAB094
配列番号.13 ファラガー株のIBDV VP2「遺伝子」の配列
配列番号.14 オリゴヌクレオチドAB095
配列番号.15 オリゴヌクレオチドPB096
配列番号.16 マサチューセッツ41株のIBV Ｓ遺伝子の配列
配列番号.17 オリゴヌクレオチドAB097
配列番号.18 オリゴヌクレオチドAB098
配列番号.19 マサチューセッツ41株のIBV Ｍ遺伝子の配列
配列番号.20 オリゴヌクレオチドAB099
配列番号.21 オリゴヌクレオチドAB100
配列番号.22 マサチューセッツ41株のIBV Ｎ遺伝子の配列
配列番号.23 オリゴヌクレオチドCD064
配列番号.24 オリゴヌクレオチドCD065
配列番号.25 オリゴヌクレオチドCD066
配列番号.26 オリゴヌクレオチドAB105
配列番号.27 オリゴヌクレオチドAB140
配列番号.28 オリゴヌクレオチドAB141
配列番号.29 オリゴヌクレオチドAB164
配列番号.30 オリゴヌクレオチドAB165
配列番号.31 オリゴヌクレオチドAB160
配列番号.32 オリゴヌクレオチドAB161
配列番号.33 オリゴヌクレオチドAB150
配列番号.34 オリゴヌクレオチドAB151
配列番号.35 オリゴヌクレオチドAB152
配列番号.36 オリゴヌクレオチドAB153
配列番号.37 オリゴヌクレオチドAB142
配列番号.38 オリゴヌクレオチドAB143
配列番号.39 オリゴヌクレオチドAB144
配列番号.40 オリゴヌクレオチドAB145
配列番号.41 オリゴヌクレオチドAB156
配列番号.42 オリゴヌクレオチドAB158
配列番号.43 オリゴヌクレオチドAB146
配列番号.44 オリゴヌクレオチドAB147
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】プラスミドpVR1012
【図２】プラスミドpAB045
【図３】プラスミドpAB080
【図４−１】テキサスGB株のNDV HN遺伝子の配列
【図４−２】テキサスGB株のNDV HN遺伝子の配列
【図５】プラスミドpAB046
【図６】テキサスGB株のNDV Ｆ遺伝子の配列
【図７】プラスミドpAB047
【図８】ファラガー株のIBDV VP2遺伝子の配列
【図９】プラスミドpAB048
【図１０−１】マサチューセッツ41株のIBV Ｓ遺伝子の配列
【図１０−２】マサチューセッツ41株のIBV Ｓ遺伝子の配列
【図１１】プラスミドpAB049
【図１２】マサチューセッツ41株のIBV Ｍ遺伝子の配列
【図１３】プラスミドpAB050
【図１４】マサチューセッツ41株のIBV Ｎ遺伝子の配列
【図１５】プラスミドpAB051
【図１６】プラスミドpAB054
【図１７】プラスミドpAB055
【図１８】プラスミドpAB076
【図１９】プラスミドpAB089
【図２０】プラスミドpAB086
【図２１】プラスミドpAB081
【図２２】プラスミドpAB082
【図２３】プラスミドpAB077
【図２４】プラスミドpAB078
【図２５】プラスミドpAB088
【図２６】プラスミドpAB079
【図１】
2009149608.tif 000022
【図２】
2009149608.tif 000023
【図３】
2009149608.tif 000024
【図４−１】
2009149608.tif 000025
【図４−２】
2009149608.tif 000026
【図５】
2009149608.tif 000027
【図６】
2009149608.tif 000028
【図７】
2009149608.tif 000029
【図８】
2009149608.tif 000030
【図９】
2009149608.tif 000031
【図１０−１】
2009149608.tif 000032
【図１０−２】
2009149608.tif 000033
【図１１】
2009149608.tif 000034
【図１２】
2009149608.tif 000035
【図１３】
2009149608.tif 000036
【図１４】
2009149608.tif 000037
【図１５】
2009149608.tif 000038
【図１６】
2009149608.tif 000039
【図１７】
2009149608.tif 000040
【図１８】
2009149608.tif 000041
【図１９】
2009149608.tif 000042
【図２０】
2009149608.tif 000043
【図２１】
2009149608.tif 000044
【図２２】
2009149608.tif 000045
【図２３】
2009149608.tif 000046
【図２４】
2009149608.tif 000047
【図２５】
2009149608.tif 000048
【図２６】
2009149608.tif 000049
【配列表】
2009149608000001.app