(57)【要約】【課題】ヒト血小板アロ抗原を検出する新たな手段を提供すること。【解決手段】ヒト血小板アロ抗原を選択的に認識するモノクローナル抗体、前記抗体を用いて少なくとも１種のヒト血小板アロ抗原の有無を検出する方法、前記抗体の産生方法、前記抗体を含む医薬組成物、および前記抗体を含有するキットを提供する。【選択図】図１
2009013175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血小板アロ抗原を選択的に認識するモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項２】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ヒト血小板アロ抗原がＨＰＡ−５ｂである、請求項１から３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
ヒト血小板アロ抗原を選択的に認識するモノクローナル抗体の断片である、請求項１から４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
少なくとも１種のヒト血小板アロ抗原の有無を検出する方法であって、
（ａ）少なくとも１種のヒト血小板アロ抗原を含有する第１の系と、請求項１から５のいずれかに記載の少なくとも１種の抗体を含有する第２の系とを、抗体／抗原複合体形成条件下でインキュベートするステップ、および
（ｂ）ステップ（ａ）で形成される抗体／抗原複合体を定性的および／または定量的に評価するステップ
を含む方法。
【請求項７】
ヒト血小板アロ抗原がＨＰＡ−５ｂである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ヒト血小板アロ抗原を選択的に認識するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗ＨＰＡ−５ｂ抗体を産生するＢリンパ球を単離するステップ、
（ｂ）抗ＨＰＡ−５ｂ抗体を産生する少なくとも１個のリンパ球を増殖(expand)させるステップ、
（ｃ）少なくとも１つの該Ｂリンパ球をエプスタイン・バーウィルスに感染させるステップ、
（ｄ）フィーダー細胞の存在下、限界希釈により少なくとも１個の該Ｂリンパ球をクローニングするステップ、
（ｅ）該クローン化細胞を少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体と共にインキュベートするステップ、
（ｆ）少なくとも１つのモノクローナル細胞系を同定し、クローニングするステップ、
（ｇ）少なくとも１つの該モノクローナル細胞系を培養し、その抗体を採取するステップ
を含む方法。
【請求項９】
前記抗体が請求項１から５のいずれかに記載の抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれかに記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
同種免疫(alloimmunisation)を予防および／または治療するための請求項１０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれかに記載の抗体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血小板アロ抗原を選択的に認識するモノクローナル抗体、前記抗体を用いて少なくとも１種のヒト血小板アロ抗原の有無を検出する方法、前記抗体の産生方法、前記抗体を含む医薬組成物、および前記抗体を含有するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板アロ抗原に対する抗体は、免疫媒介疾患において重要な役割を果たす。ＨＰＡ−１およびＨＰＡ−５は、病的状況に関係している最も重要な血小板アロ抗原である。白色人種におけるＨＰＡ−５に関する近似的な遺伝子型頻度は、ＨＰＡ−５ａａが７９．４％、ＨＰＡ−５ａｂが１９．４％、ＨＰＡ−５ｂｂが１．２％である。したがって、人口の相当程度の比率が、妊娠または輸血後にＨＰＡ−５抗原で免疫される危険性に瀕している。ＨＰＡ−５のこの２つの対立形質間の差異を含有するアロ抗原は、糖タンパクＩａ（ＧＰＩａ）上に配置され、このＧＰＩａはＧＰＩＩａと非共有結合で結合している。ＨＰＡ−５ｂ対立遺伝子は、１６４８番塩基にグアニンの代わりにアデニンを含有するため、２つの当該対立遺伝子の免疫学的差異の原因となるグルタミン酸からリジンへのアミノ酸置換が生じている。ＧＰＩａ／ＩＩａ（ＶＬＡ−２、ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９）は、細胞間および細胞・マトリックス間の相互作用に関与する接着受容体のインテグリンファミリーに属する。機能的に、ＧＰＩａはコラーゲン結合部位を含有している。血管が損傷した場合、内皮下のコラーゲンが露出する。血小板の重要な生理的活性化剤として、ＧＰＩａ／ＩＩａに結合するコラーゲンは凝集および接着を誘発する。
【０００３】
ＧＰＩａ／ＩＩａ上のＨＰＡ−５ｂに対するアロ抗体は、同種免疫性新生児血小板減少（ＮＡＩＴ）の症例および多回輸血患者の血清において初めて見出された。発明者等の経験では、ＨＰＡ−５ｂに対する同種免疫が原因のＮＡＩＴの発症は、ＨＰＡ−１ａに対する場合とほぼ同頻度であるが、臨床症状はそれ程重くないことが多い。ＮＡＩＴの発生率は生児出生１０００件当たり１．３件である。致死の危険性はかなりあり、罹患幼児の２０％が神経性の後遺症に罹り、死亡率は約１０％である。ＮＡＩＴの症例は、その大部分が血小板特異的アロ抗原ＨＰＡ−１ａに対する母親の免疫が原因であり（ＮＡＩＴ症例の８０％）、その他の症例は抗ＨＰＡ−５ｂ反応が主因である。血小板輸血不応例では、アロ抗ＨＰＡ−５ｂはアロ抗ＨＰＡ−１ａより頻度が高い。他の研究では、抗ＨＰＡ−５ｂアロ抗体の方がはるかに頻度が高い。リヨン（Ｌｙｏｎ）血液センターでは、抗ＨＰＡ−５ｂの頻度が９０％である。ＮＡＩＴの軽度例または無症状例で誘導されるような低濃度のアロ抗体ですら、出産後何年にも亘り輸血後紫斑病（ＰＴＰ）の危険性を高めることが知られている免疫記憶を起こす。ＰＴＰの臨床経過は、原因となる輸血から約１週後の顕著な血小板減少および重度の出血性素因を特徴とする。血小板アロ抗原に関連する重大な合併症は、妊娠時の同種不適合状況だけでなく、多回輸血患者でも、骨髄移植例でさえも見出される。まとめると、こうした臨床的合併症から、ＡＢＯ血液型系に対する日常的なタイピングと平行して、血小板型の日常的タイピングが必要であることが強調されている。この理由および血小板アロ抗体の検出のために、広範な使用に適し、少数の基準検査室による実施に留まらない簡潔で信頼すべき診断アッセイが必要とされている。
【０００４】
現在までのところ、ＨＰＡ−５ｂのフェノタイピングは、血小板特異的アロ抗体を含有する希少なヒトポリクローナル血清の入手性に依存してきた。しかし、こうした血清の大部分は、特にＨＬＡクラスＩ抗原に対するアロ抗体の存在で損なわれており、大掛かりな吸収および精製の手順に委ねなければならない。更に、こうした抗血清の品質は、ドナー血清の抗体力価の揺らぎのために、バッチ間で大きな変動がある。
【０００５】
最近になって、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ上のＨＰＡ−１ａに対する特異的なヒトアロ抗体が、ファージディスプレー技術により単離され、全長ＩｇＧ１抗体として産生された。抗ＨＰＡ−１ａ特異的ファージの選択のために、精製したＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが入手可能であった。ＨＰＡ−１を含有する該ＩＩｂ／ＩＩＩａは、血小板１個当たり５００００〜８００００コピーで発現されるが、ＨＰＡ−５を有するＧＰＩａ／ＩＩａの発現はそれの１００分の１である（血小板１個当たり８００〜２８００コピー）。この低い発現量のために、抗ＨＰＡ−５ｂ特異的Ｆａｂファージの選択にその後使用できる、ＧＰＩａ／ＩＩａの十分量を精製することは極めて困難であった。そういう理由で、この技術は、抗ＨＰＡ−５ｂモノクローナル抗体の産生には非効率的である。
【０００６】
更に、血小板型タイピング血液産物のパネルの確立は、効力あるポリクローナル抗ＨＰＡ−５ｂ血清が必要な現行のフェノタイピングアッセイにより複雑化している。また、血清および血漿中のアロ抗体を検出し、血小板のフェノタイピングに使用される標準法である、血小板抗原のモノクローナル抗体特異的固定化（ＭＡＩＰＡ）アッセイは、ポリクローナル抗血清に依存している。このポリクローナル抗血清は、希少であり、新生児に同種免疫された婦人からの血液提供に依存している。更に、このような血清の使用は、ＡＢＯ血液型またはＨＬＡなどの他の多型抗原に対する抗体の存在で損なわれる恐れがある。該ポリクローナル抗血清を診断アッセイでの使用に好適にするには、吸収および精製の複雑な手順が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の基礎となる問題は、ヒト血小板アロ抗原を検出する新たな手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記のこの技術的問題に対する解決は、特許請求の範囲に特徴を示した実施形態により実現される。
【０００９】
特に本発明は、ヒト血小板アロ抗原（ＨＰＡ）を選択的に認識するモノクローナル抗体に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書で使用する場合の用語「抗体」とは、任意の抗体でもよく、それには、抗体と実質的に同じ生物学的機能、例えば、特定のヒト血小板アロ抗原に対する結合能を有する該抗体の生物活性断片も含まれる。特に、本発明による抗体には、従来のハイブリドーマ技法で誘導される抗体、および組換え技法、例えばファージディスプレーまたはリボソームディスプレーで得られる抗体または抗体断片であり得る。本発明の好ましい実施形態では、該抗体は、Ｂリンパ球の不死化技術により産生されるモノクローナル抗体である。本発明の別の好ましい実施形態では、該抗体はアロ抗体である。本発明の別の好ましい実施形態では、該抗体はヒト抗体である。本発明の別の好ましい実施形態では、該モノクローナル抗体は、ヒト血小板アロ抗原を選択的に認識するモノクローナル抗体の断片である。
【００１１】
本発明の抗体は、任意の免疫グロブリンクラスに属してもよい。本発明の好ましい実施形態では、該モノクローナル抗体は、主としてＩｇＧであるが、ＩｇＭおよびＩｇＡも包含し得る。本発明のより好ましい実施形態では、該抗体はＩｇＧ１抗体である。
【００１２】
本明細書で使用する場合の用語「ヒト血小板アロ抗原（ＨＰＡ）」とは、個々のヒト血小板アロ抗原と実質的に同じ生物学的機能を有する、ヒト血小板アロ抗原の任意の生物活性誘導体、例えば、ヒト血小板アロ抗原の実質的に同じ生物学的性質を有する断片またはハプテンにも関する。本発明の好ましい実施形態では、ＨＰＡはＨＰＡ−５である。本発明のより好ましい実施形態では、ＨＰＡはＨＰＡ−５ｂである。
【００１３】
更に本発明は、少なくとも１種のヒト血小板アロ抗原を含有する系を前記定義の少なくとも１種の抗体を含有する系と接触させるステップを含む、少なくとも１種のヒト血小板アロ抗原を検出する方法に関する。
【００１４】
その上、本発明は、少なくとも１種のヒト血小板アロ抗原の有無を検出する方法であって、
（ａ）少なくとも１種のＨＰＡを含有する第１の系と前記定義の少なくとも１種の抗体を含有する第２の系とを、抗体／抗原複合体形成条件下でインキュベートするステップ、および
（ｂ）ステップ（ａ）で形成される抗体／抗原複合体を定性的および／または定量的に評価するステップ
を含む方法に関する。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、ＨＰＡは前記定義のＨＰＡである。
【００１６】
少なくとも１種のヒト血小板アロ抗原を含有する該第１の系は、少なくとも１種のヒト血小板アロ抗原を含有する任意のインビトロ系でもよい。本発明の一実施形態では、その系は、全血、血清、血漿および組織からなる群から選択される溶液などの天然の系でもよい。更にその系は、天然系由来の少なくとも１つの血小板を含有する溶液、例えば、単離した血中化合物または処理した血液産物を含有する溶液を含んでもよい。本発明の別の実施形態では、その系は、ヒト血小板アロ抗原を発現する細胞、例えば細胞培養系を含んでもよい。上記の系を得るための方法は従来技術で公知である。
【００１７】
第１の系および第２の系のインキュベーションは、抗体／抗原複合体形成に適当な任意の条件下で全く制約なしに実行される。これには、例えば、適当な任意の緩衝系、温度、時間および緩衝液の撹拌が含まれる。本発明の好ましい実施形態では、インキュベーションは、約４℃〜約３７℃の範囲の温度で約５分〜約４５分間実行される。本発明のより好ましい実施形態では、インキュベーションは、ほぼ室温で約３０分間実行される。
【００１８】
前記方法の一実施形態では、前記定義の１種または複数の抗体が、固体基材上に固定化される。本発明の別の実施形態では、前記定義の１種または複数のＨＰＡが固体基材上に固定化される。用語「基材」には何ら特定の制約はなく、例えば不溶性ポリマー材料に関しているが、その材料は、ポリアミドやビニルポリマー（例えば、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレンおよびポリビニルアルコール、もしくはその誘導体）などの有機ポリマー、セルロース、デキストラン、アガロース、キチン、ポリアミノ酸などの天然ポリマー、またはガラスや金属水酸化物などの無機ポリマーであり得る。該基材は、微小担体、粒子、膜、細片、紙、フィルム、ビーズ（ｐｅａｒｌ）、またはマイクロタイタープレートやマイクロアレイなどのプレートの形態とすることができる。本明細書で使用する場合の用語「マイクロアレイ」とは、基材上のアドレス可能位置における抗体または抗原の任意の配列であって、いわゆる「バイオチップ」を生じる配列を意味する。抗体または抗原は、共有結合によるカップリングで直接、または基材上に固定化したリンカー分子や抗体などの担体を介して、基材上に固定化することができる。
【００１９】
形成された抗体／抗原複合体は、当技術分野で周知の方法により定性的および／または定量的に評価することができる。前記複合体の評価例は、それだけに限らず、例えば、血液凝集の評価、フローサイトメトリー、ＭＡＩＰＡ試験、ウェスタンブロット、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）および他の免疫アッセイ、またはＨＰＡを選択的に認識するモノクローナル抗体に対する標識抗体の使用である。
【００２０】
本発明によるＨＰＡを選択的に認識するモノクローナル抗体は、検出可能な標識に共有結合で連結してもよい。本明細書で使用する場合の用語「検出可能な標識」は、生化学的検出マーカーなどの特定の型の検出標識に限定されず、検出に適当な当技術分野で公知の任意の残基を包含する。
【００２１】
検出可能な標識を測定する検知法は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）のような酵素アッセイ、発色アッセイ、発光アッセイ、蛍光アッセイおよび放射免疫アッセイからなる群から、例えば選択することができる。検出可能な標識の検出を行うための反応条件は、選択する検出法に依存する。使用する個々の検出系に対する緩衝系、温度、ｐＨなどの最適なパラメーターを選択することは、当業者の知識の範囲内である。更に、該検出法は、免疫ブロッティング、免疫沈降、免疫捕捉、血小板抗原のモノクローナル抗体固定化、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、タンパク質アレイ技術、分光法、質量分析、クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴、蛍光消光、蛍光エネルギー移動、エバネッセンス技術および／または全内部反射蛍光光度法からなる群から選択される１種または複数の検出法を含み得る。
【００２２】
本発明は更に、輸血用ドナー血液を検査するための前記方法の使用に関する。その上、本発明は更に、輸血用の受容者血液を検査するための前記方法の使用に関する。本明細書で使用する場合の用語「血液」は、例えば、血清、血漿などの抗体スクリーニングの実施に適当な任意の血液成分および／または血液産物、あるいはＨＰＡを含有し得る他の体液または組織を包含する。
【００２３】
加えて、本発明は、ＨＰＡが前記定義のＨＰＡである、該ＨＰＡの２つの同種変異型（即ち、ａおよびｂ）を識別するための前記方法の使用に関する。この方法は、血小板の表現型を判定するために使用することができる。
【００２４】
本発明は更に、ヒト血小板アロ抗原を選択的に認識するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗ＨＰＡ−５ｂ抗体を産生するＢリンパ球を単離するステップ、
（ｂ）抗ＨＰＡ−５ｂ抗体を産生する少なくとも１個のリンパ球を増殖させるステップ、
（ｃ）少なくとも１つの該Ｂリンパ球をエプスタイン・バーウィルスに感染させるステップ、
（ｄ）フィーダー細胞の存在下、限界希釈により少なくとも１個の該Ｂリンパ球をクローニングするステップ、
（ｅ）該クローン化細胞を少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体と共にインキュベートするステップ、
（ｆ）少なくとも１つのモノクローナル細胞系を同定し、クローニングするステップ、
（ｇ）少なくとも１つの該モノクローナル細胞系を培養し、その抗体を採取するステップ
を含む方法に関する。
【００２５】
上記方法の各ステップは、何ら制約なく、従来技術で公知の適当な任意の条件下で実施される。これには、例えば、適当な任意の緩衝系、温度、時間および緩衝液の撹拌が含まれる。
【００２６】
ステップ（ａ）では、Ｂリンパ球は、任意の天然源、例えば血液細胞から、例えば単離してもよい。ステップ（ｃ）では、ＥＢＶ感染は、例えば電気穿孔またはマイクロインジェクションを介して実施してもよい。ステップ（ｇ）での細胞の培養は、例えば連続または回分で実施してもよく、抗体の発現は、例えば構成的または誘導的に実施してもよく、抗体の単離は、例えば培地から、または形質転換細胞の採取により実施してもよい。本発明の好ましい実施形態では、該抗体は、培養細胞の上清から採取される。別の好ましい実施形態では、該抗体は、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーにより更に精製される。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、該抗体は前記定義の抗体である。
【００２８】
本発明は、ヒト血小板アロ抗原を選択的に認識するモノクローナル抗体を作製する方法であって、（ｉ）抗ＨＰＡ−５ｂ抗体を産生し、エプスタイン・バーウィルスに感染した少なくとも１つのＢリンパ球のＤＮＡを単離するステップ、および（ｉｉ）該モノクローナル抗体を適当な系中で発現させるステップを含む方法にも関する。モノクローナル抗体を発現させる適当なその系は、当技術分野で公知の適当な任意の系でもよい。
【００２９】
本発明は、前記定義の方法によって得られる前記定義の抗体にも関する。
【００３０】
加えて、本発明は、前記定義の抗体を含む医薬組成物にも関する。本発明は更に、同種免疫を予防および／または治療するための本発明による医薬組成物の使用にも関する。
【００３１】
本発明は更に、同種免疫の予防および／または治療における前記定義の抗体の使用にも関する。
【００３２】
本発明は更に、個体の同種免疫を予防する方法であって、（ａ）個体におけるＨＰＡの存在を判定するステップ、および（ｂ）前記ＨＰＡを選択的に認識する本発明による抗体を投与するステップを含む方法にも関する。本発明は、個体の同種免疫を治療する方法であって、（ａ）個体におけるＨＰＡの存在を判定するステップ、および（ｂ）前記ＨＰＡを選択的に認識する本発明による抗体を投与するステップを含む方法にも関する。ＨＰＡの存在は、例えば、その個体のゲノム中にＨＰＡをコードする核酸配列の存在を判定すること、またはその個体の血液構成要素中にＨＰＡの存在を検出することにより、判定することができる。本発明の好ましい実施形態では、ＨＰＡの存在は、本発明による少なくとも１種のＨＰＡの有無を検出する方法を用いて判定される。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、該同種免疫は抗ＨＰＡ−５ｂ同種免疫である。
【００３４】
本発明の別の好ましい実施形態では、該同種免疫は原発性止血障害を起こす。本発明のより好ましい実施形態では、原発性止血障害は、輸血後紫斑病（ＰＴＰ）および同種免疫性新生児血小板減少症（ＮＡＩＴ）からなる群から選択される同種免疫性血小板減少症である。
【００３５】
本発明による抗体は、コラーゲン上への血小板の接着を実質的に阻害し、コラーゲンにより誘発される血小板の凝集を実質的に阻害する。したがって、本発明による医薬組成物および／または本発明による抗体は、例えば、同種免疫に起因する血小板の接着および凝集に関連する止血障害を予防および／または治療するために使用し得る。
【００３６】
該医薬組成物は、例えば薬学的に許容される担体、希釈剤、塩、緩衝剤または賦形剤からなる群から選択される補助剤を更に含んでもよい。前記の医薬組成物は、前記定義の出血性障害の治療に使用することができる。更に、該医薬組成物は、従来技術で公知の任意の経路により投与してもよい。一例では、該医薬組成物は静脈内に投与し得る。
【００３７】
前記定義の抗体は、母親の血漿中にある前記定義のＨＰＡを中和するために使用でき、胎児中または羊水中に注入することができる。その上、前記定義の抗体は、血漿交換操作（選択的血漿交換）中に該血漿をビーズやポリマーなどの支持体と共にインキュベートする際、ＨＰＡを枯渇させるために、こうした支持体上にグラフト化することができる。
【００３８】
本発明は更に、前記定義の同種免疫から生じる原発性止血障害を予防および／または治療する医薬の製造における、前記定義の抗体の使用に関する。
【００３９】
本発明は、前記定義の抗体を含有するキットにも関する。
【００４０】
加えて、本発明は、診断使用のための本発明によるキットに関する。本発明の好ましい実施形態では、該診断使用は、妊婦が、胎児細胞と反応し、最終的に新生児溶血性疾患を起こす、ＨＰＡに対する抗体を有するか否かを検出するために、母体血液中の１種または複数のＨＰＡの有無を検出するステップを含む。本発明の別の好ましい実施形態では、該診断は、輸血を実施できるか否かを判定するために、輸血のドナーおよび／または受容者の血液中に１種または複数のＨＰＡの有無を検出するステップ、即ち輸血前検査を含む。本発明の別の好ましい実施形態では、該診断は、臓器移植が成功するか否かを判定するために、臓器移植のドナーおよび／または受容者の血液中に１種または複数のＨＰＡの有無を検出するステップ、即ち臓器移植前検査を含む。本発明の別の好ましい実施形態では、該診断は、前記定義の同種免疫から生じる原発性止血障害の有無を検出するステップを含む。
【００４１】
本発明による抗体は、現在の診断で使用されているヒトポリクローナル血清を代替することができ、抗体媒介血小板破壊においてある役割を果たしている機構を調査する手段となり得る。前記定義の抗体は、希少ドナーに依存し、大掛かりな吸収および精製をしなければならないポリクローナル血清と比較して、幾つかの利点を有する。特に、該抗体は、需要に応じて一定の品質で、抗血清に認められるバッチ間の変動なく作製することができる。加えて、本発明による抗体の診断への適用は、少数の基準検査室でしか得られない専門技術に依存しない。その上、本発明による抗体は、同種免疫性新生児血小板減少症の予防、または血小板の接着および凝集の阻害による血栓症の予防に対する治療適用を有することができる。
【００４２】
各図には以下のことが示されている。
【実施例】
【００４３】
本発明を、それに限定されることのない以下の実施例でこれから更に例示する。
【００４４】
［実施例１］
血液試料、血小板およびポリクローナル抗血清
同種免疫されたある婦人からの、抗ＨＰＡ−５ｂ抗体の高い力価を有する血液試料（ＵＰＮ２２０５７４ＭＮ）を出産から１カ月後に得た。全ての実験に用いた血小板は、ＨＰＡ−５ａ（ＨＰＡ−５ａａ）、ＨＰＡ−５ｂ（ＨＰＡ−５ｂｂ）のいずれかについてホモ接合性であった（配列特異的なプライミング（ＰＣＲ−ＳＳＰ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応の使用でタイピングを行い、ＭＡＩＰＡ法の使用で実証した）。
【００４５】
［実施例２］
ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系の生成
末梢血単核細胞（ＭＮＣ）を標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心によって分離した。選択したドナーからの血液ＭＮＣの１０〜９０×１０６個をＥＢＶ感染後にＣＤ４０系中で、本質的には以前に記載の通り（Ｐｅｙｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｂｕｌｌｏｕｓ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＢＰＡｇ１）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５３，１３３３−１３３９）であるが、幾つか変更を加えて培養した。即ち、丸底９６穴培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）中に、１０００〜５０００細胞／穴のＭＮＣを、照射した（７０００ラド）ＣＤ３２トランスフェクトＬ細胞５０００個／穴（Ｐｅｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｃｌｏｎｅｄ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＩｇＧ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｎｔｉ  ＣＤ３  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４１，１８９１−１８９６）および０．５ｐｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０  ｍＡｂ８９（Ｖａｌｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｎｄ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｌｏｎｅｓ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７２，２１９−２２７）と共に播種した。培養は、１５％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび５０ｐｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補充したＹｓｓｅｌ改変Ｉｓｃｏｖｅ培地中で行った。１０〜１５日間の培養後、上清を収集し、抗ＨＰＡ−５ｂ抗体の有無をＭＡＩＰＡアッセイで検査した。次いで、陽性と確認したオリゴクローナル細胞系を増殖させて更なる分析用の上清を産生し、フィーダー細胞として照射済み同種血液ＭＮＣを用いた限界希釈によりクローニングした。２〜４週後に細胞増殖を示した培養穴の上清を、上記の通り抗ＨＰＡ−５ｂ抗体についてスクリーニングした。１×Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ  ＨＵ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で補充したＲＰＭＩ  １６４０中で培養した×３細胞の上清を硫安で沈殿させた後、プロテインＧ−セファロース４Ｂアフィニティカラム上でＨｕＭＡｂ×３を精製した。抗ＨＰＡ−５ｂヒトモノクローナル抗体を産生するクローンをＨＦ２Ｈ１１と命名した。
【００４６】
［実施例３］
抗ＨＰＡ−５ｂ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
精製ＩｇＧ  ０．５μｇと、タンパク質精製の前（装填液）および後（通過液）の細胞非含有上清とを、４×還元性試料用緩衝液１５μｌに添加し、９５℃、５分間加熱し、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上およびウェスタンブロットで分析したが、そのためにＨＲＰ標識ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｔｄ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈｍａｎ、英国）および発色剤としての４−クロロ−１−ナフトール（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）と共にインキュベートした。Ｒａｉｎｂｏｗ（商標）着色分子マーカーＣＦＡ７５６ＲＰＮ７５６（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の３μｌを分子量（ＭＷ）標準として用いた。総タンパク質染色は、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ（商標）クーマシー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、製造業者の使用説明書に従って行った。
【００４７】
［実施例４］
ＥＬＩＳＡ試験を目的としたＨＲＰＯによる抗ＨＰＡ−５ｂモノクローナル抗体の標識
シッフ塩基反応に基づく自前技術を用いて、精製抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）で標識した。
【００４８】
［実施例５］
免疫ドットアッセイおよび血小板抗原のモノクローナル抗体特異的固定化（ＭＡＩＰＡ）アッセイによるヒト抗ＨＰＡ−５ｂの特異性試験
抗ＨＰＡ−５ｂ抗体の特異性を判定するために、免疫ドットアッセイを行った。
【００４９】
ＭＡＩＰＡアッセイは、Ｋｉｅｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．  １９８７；７０：  １７２２−１７２６  に記載の通り行った。手短に言えば、マウス抗ＧＰＩａ／ＩＩａモノクローナル抗体（Ｇｉ９、抗ＣＤ４９ｂ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、フランス）をＰＢＳ／ＥＤＴＡ／０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中、タイピングした血小板（２５×１０７／ｍｌ）および抗ＨＰＡ−５ｂ（２２５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。次いで、血小板を溶解し、ヤギ抗マウスＩｇＧで予備被覆したマイクロタイタープレート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、米国）上に固定化した。ＴＢＳ洗浄用緩衝液（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を２％、Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含有するｐＨ７．４のＴｒｉｓ緩衝塩水）で大掛かりに洗浄した後、結合した抗ＨＰＡ−５ｂを、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、米国）とのインキュベーション、ならびに蒸留水１２ｍｌおよび３０％Ｈ２Ｏ２５ｍｌ（使用直前に添加）に溶解した基質溶液１００μｌ（１，２−ｏ−フェニレンジアミンジクロリドレートの３．５ｍｇタブレット（Ｄａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＡＧ、スイス））の添加によって検出した。
【００５０】
発色反応は、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により１５〜２０分後に停止させ、吸光度をλ＝４９０ｎｍで測定した。
【００５１】
［実施例６］
フローサイトメトリーで評価した血小板上のＨＰＡ−５ｂ発現
新鮮な非活性化血小板を人血９ｍｌから分離し、ｐＨ５．５のクエン酸ナトリウム３．８％を１ｍｌ用いて抗凝固処理をした。ＣＬ−２Ｂセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、スイス）を用いて、血小板を血漿から分離した。陽性対照として組換えヒト抗ＨＰＡ−５ｂまたはトロンビン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、スイス）を、ＨＥＰＥＳ／ＢＳＡ０．１％中の血小板（５×１０７細胞／ｍｌ）に添加した。次いで、血小板をＣａＣｌ２（２ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１ｍＭ）を含有するＨＥＰＥＳ中のＨＦ２Ｈ１１モノクローナル抗体で染色した。３７℃、１５分間インキュベーション後、血小板をＰＢＳ  ０．１％  ＢＳＡ中で洗浄した。洗浄後、血小板を抗ヒトＩｇＧ  ＦＩＴＣと３０分間インキュベートし、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国）を用いたＦＡＣＳｃａｎ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国）上のフローサイトメトリーで分析した。血小板を前方および側方散乱に基づいてゲート制御した。
【００５２】
［実施例７］
凝集の阻害
血小板凝集試験では、血小板凝集計（Ｓｅｒｖｉｂｉｏ）を用いて血漿の曇り（濁度）を測定する。血漿試料にコラーゲン（６．５μｇ／ｍｌ）を添加すると、血小板が凝集し、液の透明度が増加する。次いで、血小板凝集計で試料を通して増加した光透過率を測定する。
【００５３】
この試験は、ＨＦ２Ｈ１１抗体の無添加、および様々な濃度の抗体存在下で行った。血小板凝集計はコラーゲン添加後の濁度および時間を記録する。幾つかのパラメーターとして、対照（抗体なし）と比較した場合の阻害率（％）、遅延時間および凝集速度を計算する。
【００５４】
［実施例８］
接着の阻害
ＰＦＡ−１００試験（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）では、毛細管を通して引き上げる血液が、コラーゲンおよびエピネフリン（ＣＥＰＩ）またはコラーゲンおよびＡＤＰ（ＣＡＤＰ）で被覆した膜を詰まらせるのに要する時間を測定する。これは閉鎖時間（ＣＴ）と称し、秒単位で測定される。したがって、この試験は血小板の接着および凝集の組合せ尺度である。この試験は、ＨＦ２Ｈ１１抗体の無添加、および様々な濃度の抗体存在下で行った。
【００５５】
［実施例９］
ＭＡＩＰＡアッセイにおける天然ＨＰＡ−５ｂに対するモノクローナル抗体の特異性
全血小板上の天然ＨＰＡ−５ｂに対する抗ＨＰＡ−５ｂの結合をＥＬＩＳＡで検査したところ、ＨＰＡ−５ｂｂまたは５ａｂの血小板には強い結合を示し、ＨＰＡ−５ａａの血小板には全く結合しなかった（図１）。
【００５６】
［実施例１０］
ＨＰＡ−５ｂに特異的なＩｇＧ１抗体の産生および精製
ＨＦ２Ｈ１１ｂ細胞系をＤＥＭＦ１２＋１０％ＦＣＳ中、２つの系を用いて培養した。第１の系は「静置培養」と称し、５０ｍｌフラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中で行った。第２の系は、高密度用装置（ＩＢＳ  Ｉｎｔｅｇｒａ製のＩｎｔｅｇｒａ  ｃｅｌｌｌｉｎｅ  １０００）中で行った。播種から１０日後に細胞非含有上清を収集し、プロテインＧセファロースを用いてＩｇＧを精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析の結果、図２に示すように、組換えＩｇＧは他のタンパク質からの優れた分離および精製を示した。抗体産生の収量は、静置法では上清１リットル当たり１０ｍｇまで、高密度技術では１リットル当たり１０００ｍｇまでであった。
【００５７】
［実施例１１］
タイピングした血小板に対する抗ＨＰＡ−５ｂの特異性の検査
ヒト抗ＨＰＡ−５ｂ抗体をＨＲＰＯで標識し、ＨＰＡ−５ｂへの結合性について血小板上での免疫ドットアッセイで検査した。様々なドナー由来の血小板上に発現したＧＰＩａ／ＩＩａの量的変動をモニターするために、対立遺伝子「ａ」および「ｂ」に同等に結合する抗ＧＰＩａ／ＩＩａ抗体を使用した。参照として、大掛かりに吸収し、精製したポリクローナルヒト抗ＨＰＡ−５ｂ血清を同じアッセイで分析した。血小板上のＦｃγ受容体に対する免疫グロブリンの抗原非関連結合を調べるために、ヒトポリクローナルＩｇＧを対照として用いた。ヒト抗ＨＰＡ−５ｂ抗体は、ポリクローナルヒト抗ＨＰＡ−５ｂ血清と同様に、ＨＰＡ−５ａａとＨＰＡ−５ｂｂの血小板とを識別することができた。ＨＰＡ−５の低抗原発現量を考慮して、抗体濃度を一定にし、血小板の量を増加させる滴定を行った。図２で明らかな抗原濃度に対する強い依存性は、結合抗体の検出にとって抗原が限定的となり得ることを示しており、血小板１０７個をアッセイに使用した場合でも、プラトーに到達しない（図３）。
【００５８】
［実施例１２］
ＭＡＩＰＡ法を用いたヒトモノクローナル抗ＨＰＡ−５ｂ抗体の性能
ＭＡＩＰＡアッセイは、血小板のアロ抗原／アロ抗体診断法に現在使用されている標準法であり、少数の専門的検査室に限られている。この方法は、血小板上のＨＰＡ−５ｂを選択的に認識できるように、大掛かりに吸収し、精製したポリクローナルヒト抗血清の供給源に依存している。ＭＡＩＰＡアッセイを行うために、ヒト抗ＨＰＡ−５ｂ抗体ＨＦ２Ｈ１１を血小板およびマウスモノクローナル抗ＧＰＩａ／ＩＩａ抗体と共にインキュベートした。次いで、血小板を溶解し、抗マウスＩｇＧ被覆マイクロタイタープレート上に固定化した。このアッセイでは、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抗体を用いて発現させた。様々なドナーからの血小板を用いて、この実験を６回繰り返した。この組換え抗ＨＰＡ−５ｂ抗体は、ＨＰＡ−５ａとＨＰＡ−５ｂとを明瞭に識別し、ＨＰＡ−５ａａの血小板には全く結合しない（図４）。
【００５９】
［実施例１３］
ヒトモノクローナル抗ＨＰＡ−５ｂの新鮮な非活性化血小板に対する生理的効果
ＧＰＩａ上にあるコラーゲン受容体などのインテグリンは、血小板活性化および血小板凝集体の形成に関与している。コラーゲン受容体の近傍にあるアロ抗原（ＨＰＡ−５ａ／ｂ）に結合する抗体は、血小板を活性化する能力を示すのではないかと思われる。この可能性を試験するために、新鮮な非活性化血小板を抗ＨＰＡ−５ｂ抗体ＨＦ２Ｈ１１と３７℃、１５分間混合し、血小板の活性化は、血小板活性化の初期マーカーであるＣＤ６２（Ｐ−セクレチン）のアップレギュレーションをフローサイトメトリーで測定することにより判定した。
【００６０】
しかし、血小板に結合したヒト抗ＨＰＡ−５ｂ抗体（データは示していない）は、陽性対照として用いたトロンビンとは対照的に血小板を活性化しなかった（図６）。
【００６１】
［実施例１４］
ヒト抗ＨＰＡ−５ｂ抗体の血小板凝集に対する効果
新鮮な非活性化血小板（５×１０７／ｍｌ）を抗ＨＰＡ−５ｂ抗体０．２５、６．２５または２５ｍｇ／ｍｌ（四角）と共にインキュベートし、同濃度の非関連抗体（三角）と比較した。この試験は、当該抗体がコラーゲンに誘発される凝集を抑制することを示している。図５は、２５μｇ／ｍｌを用いたとき、該抗体が凝集を８０％抑制することを示している。
【００６２】
［実施例１５］
ヒト抗ＨＰＡ−５ｂ抗体の血小板接着に対する効果
この効果はＰＦＡ−１００試験を用いて評価した。ＨＰＡ５ａｂドナーからの新鮮血を抗ＨＰＡ−５ｂ抗体５０ｍｇ／ｍｌと共にインキュベートし、ＨＰＡ５ａａドナーからの同濃度の新鮮血と比較した。この試験は、当該抗体がコラーゲン＋ＡＤＰに誘発される接着を抑制することを示している（表１）。
【００６３】
結論として、抗ＣＤ４０抗体の使用によるＢリンパ球刺激、およびＥＢＶの使用による不死化を用いて完全ヒト抗ＨＰＡ−５ｂ抗体を単離することができた。ＨＦ２Ｈ１１抗体は、全長ＩｇＧ１抗体として産生されたものであり、ＨＰＡ−５の対立遺伝子「ａ」と「ｂ」との識別に使用することができる。
【００６４】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＨＦ２Ｈ１１ヒト抗体は、ＥＬＩＳＡ試験でヒト血小板上に存在するＨＰＡ５ｂ対立遺伝子に特異的である。遺伝子型がＨＰＡ５ａまたは５ｂと知られている６０サンプルを評価した図である。この試験ではフェノタイピングとジェノタイピングとの乖離はない。
【図２】全長ヒト抗ＨＰＡ−５ｂ抗体の精製に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を示す図である。全長ヒト抗ＨＰＡ−５ｂ抗体は、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。装填液（細胞非含有上清）、通過液、および精製抗ＨＰＡ−５ｂ  ＩｇＧを、還元性条件下で１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上、およびウェスタンブロットで分析した。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、ＨＲＰとコンジュゲートしたポリクローナル抗ＨｕＩｇＧ抗体で検出した。総タンパク質はクーマシーブルーによるゲルの染色によって分析した。
【図３】モノクローナル抗体ＨＦ２Ｈ１１と抗血清（ポリクローナルヒト抗ＨＰＡ−５ｂ抗体）との比較による、ヒト抗ＨＰＡ−５ｂ抗体の特異性を示す図である。２種の技法でドナー５０点およびパネル血小板１０点を試験した。内訳は、ドナー遺伝子型がＨＰＡ−５ｂ陰性は３８点、ＨＰＡ−５ｂ陽性は１２点、パネル血小板はＨＰＡ−５ｂ陰性と知られているもの３点、ＨＰＡ−５ｂ陽性は７点である。
【図４】ＭＡＩＰＡアッセイにおける抗ＨＰＡ−５ｂの性能を示す図である。ＭＡＩＰＡアッセイは、ＨＰＡ−５ａおよびＨＰＡ−５ｂについてタイピングがなされた様々なドナーの血小板に対する組換え抗ＨＰＡ−５ｂ抗体の特異性を検査するために行った。マウスモノクローナル抗ヒトＧＰＩａ／ＩＩａを、タイピングした血小板および抗ＨＰＡ−５ｂと共にインキュベートした。血小板を溶解し、プレート上に結合したヤギ抗マウスＩｇＧにより固定化した。洗浄後、結合抗ＨＰＡ−５ｂを抗ＨｕＩｇＧ−ＨＲＰで検出した。吸光度はλ＝４９０ｎｍで読み取った。ＨＰＡ−５ａａの血小板についてはシグナルが検出されなかった。２種の技法でドナー５０点およびパネル血小板１０点を試験した。内訳は、ドナー遺伝子型がＨＰＡ−５ｂ陰性は３８点、ＨＰＡ−５ｂ陽性は１２点、パネル血小板はＨＰＡ−５ｂ陰性と知られているもの３点、ＨＰＡ−５ｂ陽性は７点である。
【図５】ヒト抗ＨＰＡ−５ｂ抗体の血小板凝集に対する効果を示す図である。新鮮な非活性化血小板を抗ＨＰＡ−５ｂ抗体０．２５、６．２５または２５μｇ／ｍｌ（四角）と共にインキュベートし、同濃度の非関連抗体（三角）と比較した。この試験は、当該抗体がコラーゲンに誘発される凝集を抑制することを示している。
【図６】ＨＦ２Ｈ１１抗体で標識した血小板のフローサイトメーター分析を示す図である。ＨＰＡ−５ｂエピトープに特異的な抗ヒトモノクローナル抗体ＨＦ２Ｈ１１による、ＨＰＡ−５ｂ−（黒色）およびＨＰＡ−５ｂ＋（灰色）血小板の標識を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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