(57)【要約】      （修正有）【課題】公知の極微小タンパク質であるシニョリンと同様の固有の３次元立体構造（ヘアピン構造）を形成し、かつシニョリンに比べて熱安定性が優れ、結晶化も可能な極微小タンパク質、及びそれを含む融合タンパク質の提供。【解決手段】下記の式１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、式１に対応する領域が、特定の原子座標によって定義された立体構造、又は主鎖の座標との二乗平均平方根残差（ＲＭＳＤ）が5オングストローム以内である立体構造をとっているタンパク質。    XaaTyrAspProGluThrGlyThrTrpXbb （式１）                               （式１中で、Xaa及びXbbはGly,Ala以外の任意のアミノ酸残基を表し、XbbがC末端であるときのカルボキシル基はアミド化されていてもよい。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、式１に対応する領域が、表３に記載した原子座標によって定義された立体構造、又は表３に記載された主鎖の座標との二乗平均平方根残差（ＲＭＳＤ）が5オングストローム以内である立体構造をとっているタンパク質。
XaaTyrAspProGluThrGlyThrTrpXbb     （式１）                               
（式中、Xaa及びXbbはGly,Ala以外の任意のアミノ酸残基を表し、XbbがC末端であるときのカルボキシル基はアミド化されていてもよい。）
【請求項２】
式１で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
式１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と任意のタンパク質との融合タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
式１において、Xaaが、Thr、Val、Ile、Glu、Phe、Tyr及びTrpの群から選択され、Xbbが、Thr、Val、Ile、Lys、Arg、Phe、Tyr及びTrpの群から選択されるアミノ酸残基であって、XbbがC末端であるときのカルボキシル基はアミド化されていてもよい、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項５】
式１において、Xaa及びXbbがいずれもTyrであり、XbbがC末端であるときのカルボキシル基はアミド化されていてもよい、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
式２（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
TyrTyrAspProGluThrGlyThrTrpTyr  （式２：配列番号２）
【請求項７】
式１で示されるアミノ酸配列をコードする核酸を含み、請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
式２（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸。
【請求項９】
請求項７又は請求項８に記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１１】
請求項２又は６に記載のタンパク質の結晶であって、結晶学的対象性がP21212であり、単位格子定数がa=1.9±0.5nm、b＝3.4±0.5nm、およびc=1.2±0.5nmである結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固有の３次元立体構造を形成する新規な極微小タンパク質および該タンパク質の結晶に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、生命を担う最も重要な物質のひとつであり、また、その機能の発現には固有の３次元立体構造の形成が必須であることが知られている。これまで、一般にタンパク質が安定な立体構造を形成するには、30〜50個のアミノ酸が最低必要であるとの見方が支配的であったが、最近になってわずか10 個のアミノ酸ながら安定な立体構造を形成するタンパク質・シニョリンが人工的に設計・合成された（非特許文献１）。
シニョリンと命名されたこの極微小タンパク質は、溶解性が高く緩衝液中で単量体として存在し、２次元１Ｈ−ＮＭＲ法による構造解析の結果から、溶液中で自発的にフォールディングし、主鎖が一定のヘアピン構造を示すことが確認された。さらに、１次元ＮＭＲスペクトルおよび円二色性（ＣＤ）スペクトルの解析から、シニョリンが天然タンパク質と同じように熱変性し、変性温度は３９℃〜４２℃であって、熱変性後も放冷のみでほぼ定量的に速やかに再生すること、及び分子全体が協同的に変化し、二状態性構造転移を示すことも確認された。このように、シニョリンは、分子量1000程度という天然のタンパク質からかけ離れたサイズであるにもかかわらず、タンパク質にとって本質的な「安定な固有の立体構造」を有しており、かつその構造が「可逆的な変性・再生能力」を有していることから、従来のタンパク質の概念を変えるものとして注目され、２００４年８月号の米専門科学誌「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」の表紙を飾っている。
シニョリン自身には「機能」というべき性質はないが、シニョリンの類似配列からなる部分配列を有する天然タンパク質は多数存在し（たとえば、レチノイン酸レセプター、ヒアルロン酸リアーゼ、ＴＦＩＢ転写開始因子など）、いずれも当該部分配列がシニョリンと酷似したヘアピン構造を呈する部分構造を有している（非特許文献２）。つまり、シニョリン配列に類似のセグメントは、その前後にどのような配列が付加していても影響されることなく、常に自立的に一定のヘアピン構造を形成すると考えられる。
したがって、当該シニョリンの本質的な属性はこの「ヘアピン構造」それ自体であるということができる。すなわち、最小タンパク質としての標準物質としての役割と共に、この特徴的なヘアピン構造を認識する抗体などの認識物質を得ることができるから、アフィニティクロマトグラフィーによる精製、リガンド・レセプターの情報伝達を利用した医薬開発におけるリード化合物としての効果を内在している物質であるということができる。このようなことから、シニョリンに対しては今後、その技術を発展させることで、分解耐性のすぐれたペプチド医薬、分析測定器の校正等に用いるタンパク質標準物質、優れた分子認識能を有するナノバイオ素子などへの応用といった、医・農・工分野への波及が期待されている。
しかしながら、シニョリンを標準物質として用いるためには結晶化が可能であることが、標準物質としての純度を保障するうえで重要であるが、シニョリンの変性温度は４０℃前後であって結晶化させるためには、熱安定性が高いとはいえず、構造安定性が十分ではないので、シニョリンの特徴的な「ヘアピン構造」という特性は変えずにさらに構造安定性を高めることが求められていた。
【非特許文献１】S. Honda, K. Yamasaki, Y. Sawada, and H.Morii "10-residue folded peptide designed by segment statistics" Structure 12(8) 1507-1518 (2004).
【非特許文献２】化学と工業  第58巻  第8号  第940-943頁  (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、公知の極微小タンパク質であるシニョリンと同様の固有の３次元立体構造（ヘアピン構造）を形成し、かつシニョリンに比べて安定性が優れた極微小タンパク質を提供することであり、また、高純度で精製することを可能にするための、該タンパク質の結晶を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、シニョリンが構成する各アミノ酸の有する官能基同士の強固な水素結合によって、固有の構造が保たれていることを勘案し、まずこれら官能基の修飾を検討したが、安定化に寄与する修飾は見いだせなかった。たとえばＣ末端の荷電を中性化するために、末端カルボン酸をアミド化したが、むしろ構造安定性は低下した（表２におけるCLN001とCLN002の比較）。
そこで、本発明者らは、１０アミノ酸からなるシニョリンの変異体を作成することとし、１０アミノ酸配列のうちでヘアピン構造の両端にあたる１位と１０位のＧｌｙに注目した。両位置のアミノ酸残基を、小型アミノ酸、分岐アミノ酸、荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸にそれぞれ置換し、またそれぞれの10位アミノ酸をさらにアミド化した場合について系統的に合成して、その熱安定性を解析した（表1及び２）。
その結果、驚くべきことに、プラス荷電、マイナス荷電、極性、分岐度、芳香族性などには関係なく、Gly,Ala以外のアミノ酸はすべてシニョリンに比べて熱安定性が向上することが確認された。具体的には、エンタルピー変化（ΔHm）が27.5 kJ mol-1であったものが、すべて29.1以上に最大で50.7まで高くなり、同時に変性温度(Tm)が314.9 Kが316.5以上、最大で343.2まで上昇した。そして、アミド化された場合は、若干効果が減ずるものの、遊離カルボン酸末端の場合とほぼ同等のシニョリンに対する熱安定性向上効果を示した。
そして、このような熱安定性が向上した変異体のうち、典型的なものとして配列番号２（式２）のGly1Tyr/Gly10Tyr変異体を結晶化させたところ、その結晶化にも成功した。このことは、本発明の各変異体は、構造的な安定性と同時に、標準物質としての高い純度が保証されることになる。
しかも、得られた結晶は良質のもので、これを用いてＸ線回折法により原子座標を決定し（表３）たところ、ほぼシニョリンと同様のヘアピン構造が保たれていることが確認できた。すなわち、本発明の変異体は、「ヘアピン構造」を数値化した、「表３に記載した原子座標によって定義された立体構造、又は表３に記載された主鎖の座標との二乗平均平方根残差（ＲＭＳＤ）が5オングストローム以内である立体構造」という特性により特定することができる。
また、本発明のシニョリン変異体はシニョリン以上に構造的に高い安定性を有するのであるから、当該変異体のアミノ酸配列（式１：配列番号１）からなる部分配列を有する融合タンパク質においても、そのヘアピン構造特性が安定に保たれることは、ほぼ確実である。
【０００５】
本発明は、以上の知見を得て完成することができたものであり、具体的には以下の通りのものである。
〔１〕  下記の式１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、式１に対応する領域が、表３に記載した原子座標によって定義された立体構造、又は表３に記載された主鎖の座標との二乗平均平方根残差（ＲＭＳＤ）が5オングストローム以内である立体構造をとっているタンパク質。
XaaTyrAspProGluThrGlyThrTrpXbb     （式１）                               
（式中、Xaa及びXbbはGly,Ala以外の任意のアミノ酸残基を表し、XbbがC末端であるときのカルボキシル基はアミド化されていてもよい。）
〔２〕  式１で示されるアミノ酸配列からなる、前記〔１〕に記載のタンパク質。
〔３〕  式１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と任意のタンパク質との融合タンパク質である、前記〔１〕に記載のタンパク質。
〔４〕  式１において、Xaaが、Thr、Val、Ile、Glu、Phe、Tyr及びTrpの群から選択され、Xbbが、Thr、Val、Ile、Lys、Arg、Phe、Tyr及びTrpの群から選択されるアミノ酸残基であって、XbbがC末端であるときのカルボキシル基はアミド化されていてもよい、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔５〕  式１において、Xaa及びXbbがいずれもTyrであり、XbbがC末端であるときのカルボキシル基はアミド化されていてもよい、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔６〕  式２（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
TyrTyrAspProGluThrGlyThrTrpTyr  （式２：配列番号２）
〔７〕  式１で示されるアミノ酸配列をコードする核酸を含み、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
〔８〕  式２（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸。
〔９〕  前記〔７〕又は〔８〕に記載の核酸を含有する組換えベクター。
〔１０〕  前記〔９〕に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
〔１１〕  前記〔２〕又は〔６〕に記載のタンパク質の結晶であって、結晶学的対象性がP21212であり、単位格子定数がa=1.9±0.5nm、b＝3.4±0.5nm、およびc=1.2±0.5nmである結晶。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、公知の極微小タンパク質シニョリンと同様の特徴的な「ヘアピン構造」を保持し、かつシニョリンに比べて、熱安定性が大きく向上し容易に結晶化できる極微小タンパク質、及びその結晶を提供できた。このことにより、より精度の高い標準物質が提供できると共に、その特徴的かつ安定なヘアピン構造に基づき、免疫反応物質、情報伝達物質などの検索にも有用であり、また優れたリード化合物としての期待も大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、式１（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなる特定の「ヘアピン構造」をとる極微小タンパク質、及び式１を部分配列として含み、当該部分配列が「ヘアピン構造」を呈する融合タンパク質に関する発明である。
ここで、特定の「ヘアピン構造」については、「表３に記載した原子座標によって定義された立体構造、又は表３に記載された主鎖の座標との二乗平均平方根残差（ＲＭＳＤ）が5オングストローム以内である立体構造」として数値化することができる。
そして、本発明の極微小タンパク質は、１０アミノ酸からなる公知の極微小タンパク質であるシニョリンにおいて、その１位と１０位のアミノ酸であるグリシン（Gly）を、小型アミノ酸であるAla以外の他のバルキーなアミノ酸に変換したシニョリン変異体、又はその末端アミド化物であるといえるので、シニョリンに対して適用できる製造法、精製法、融合タンパクの製造法などの関連技術はすべて適用できる。
したがって、本発明の実施態様を以下に示すがこれには限定されない。
【０００８】
１．  本発明タンパク質の製造方法
シニョリン変異体は、有機化学的手法、例えば固相ペプチド合成法などによって製造することができる。また、遺伝子工学手法を用いて組換えタンパク質として製造することもできる。このような手法を利用したタンパク質の生産方法は当技術分野で周知であり、以下に簡潔に説明する。
（１）  有機化学的手法によるシニョリン変異体の製造方法
固相ペプチド合成法により化学的にタンパク質を製造する場合、好ましくは自動合成機を利用して、活性化されたアミノ酸誘導体の重縮合反応を繰り返すことにより、本発明のシニョリン変異体のアミノ酸配列を有する保護ポリペプチドを樹脂上で合成する。この際、使用する樹脂を適切に選択することによって、最終産物のＣ末端をカルボキシル基とすることも、アミド化することもできる。ついで、この保護ポリペプチドを樹脂上から切断すると共に側鎖の保護基も同時に切断する。この切断反応には、樹脂や保護基の種類、アミノ酸の組成に応じて適切なカクテルがあることが知られている（大野茂男、西村善文監修 (1997) タンパク質実験プロトコール２−構造解析編、秀潤社）。この後、有機溶媒層から粗精製タンパク質を水層に移し、目的の変異型タンパク質を精製する。精製法としては、逆相クロマトグラフィーなどを利用することができる（大野茂男、西村善文監修
(1997) タンパク質実験プロトコール２−構造解析編、秀潤社）。
【０００９】
（２）  遺伝子工学手法によるシニョリン変異体の製造方法
組換えタンパク質として製造する場合、本発明のシニョリン変異体は、そのアミノ酸配列をコードする核酸が挿入された組換えベクターが導入された形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。なお、形質転換のための宿主／ベクター系としては、原核細胞、酵母、昆虫細胞、動植物細胞、植物など通常の遺伝子工学的手法で用いられる系であれば全て用いることができる。
形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。培養後、本発明のシニョリン変異体が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより該タンパク質を採取する。また、該タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のシニョリン変異体を単離精製することができる。
組換えタンパク質として製造した場合のＣ末端のアミド化反応は、たとえば、上記で単離精製した産物をペプチジルグリシンモノオキシゲナーゼで処理することで遂行することができる（水野健作、松尾寿之(1988) 生理活性ペプチドのＣ末端アミド化酵素、生化学、60、551-557）。
また、タンパク質の生合成反応にかかわる因子（酵素、核酸、ＡＴＰ、アミノ酸など）のみを混合させた、いわゆる無細胞合成系を利用すると、生細胞を用いることなく、ベクターから本発明のシニョリン変異体を試験管内で合成することができる（岡田雅人、宮崎香 (2004) タンパク質実験ノート(上)、羊土社）。その後、前記と同様の精製法を用いて、反応後の混合溶液から本発明のシニョリン変異体を単離精製することができる。
【００１０】
（３）  融合型タンパク質
本発明における、式１（配列番号１）で示されるアミノ酸配列に対応する領域を含む融合型タンパク質の場合は、当該領域がシニョリン変異体と同様の「ヘアピン構造」を有しているので、その構造的特徴を利用して、精製、検出などが容易に行える。
シニョリン変異体と融合するタンパク質としては、生理活性タンパク質などそれ自体が有用なタンパク質であることが好ましい。膜タンパク質との融合タンパク質であれば、形質転換細胞の膜表面にシニョリン変異体による「ヘアピン構造」を複数表示するように発現させた形質転換体を得ることができる。
本発明の融合型タンパク質は、シニョリン変異体を合成した後に、任意の天然タンパク質又は合成もしくは組換えタンパク質と化学的に結合させることができる。またそれぞれのタンパク質をコードする核酸をつなぎ、遺伝子工学的手法を用いて、組換え融合タンパク質として得ることができる。
その際、組換え融合型タンパク質を精製後、シニョリン変異体と融合されたタンパク質の間のアミノ酸配列を、たとえばプロテアーゼを用いた限定加水分解によって分割することで、シニョリン変異体及び融合されたタンパク質のそれぞれを単離精製することもできる。
【００１１】
２．  本発明タンパク質の熱安定性測定方法
本発明のシニョリン変異体の熱安定性は、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル、蛍光スペクトル、赤外分光法、示差走査熱量測定法などを利用して評価することができる。中でもＣＤスペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることから、シニョリン変異体が固有の立体構造を形成しているかの示唆を与えるとともに、シニョリン変異体の温度に対する立体構造の変化を観測し、構造安定性を熱力学的に定量的に評価することができる。
【００１２】
３．  本発明タンパク質の結晶化方法
結晶化は、目的のタンパク質溶液に沈殿剤を添加する又は溶媒量を蒸発等により減少させる等の操作により、ある特定の条件下でタンパク質が結晶として析出する性質を利用している。結晶化には高純度に精製されたタンパク質が必要である。また、結晶化する条件として、タンパク質濃度・塩濃度・水素イオン濃度（pH）・沈殿剤の種類と濃度・その他の添加剤の種類と濃度・温度などの物理的および化学的な因子が関与している。更に、沈殿剤添加や溶媒量の調整方法として、バッチ法・透析法・蒸気拡散法などの結晶化の手法が数多く存在している（Blundell, T. L. & Johnson, L. N. (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York, 59-82）。このように、Ｘ線結晶解析に適したタンパク質結晶を得るには、高純度のタンパク質を得ることと、結晶化における様々な条件や手法を最適化することが必要になる。
本発明の結晶に用いたシニョリン変異体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質で、ここではCLN025と呼ぶ。結晶化法としてはバッチ法・透析法・蒸気拡散法などの手法を用いることができる。タンパク質濃度・塩濃度・ｐＨ・沈殿剤の種類と濃度・その他の添加剤の種類と濃度・温度などの物理的および化学的な因子に関しては、タンパク質濃度1〜20mg/ml、好ましくは5mg/mL、緩衝液として35〜100mM、好ましくは72mMのクエン酸緩衝液（pH3〜6、好ましくはpH5.0）、沈殿剤として15〜40％、好ましくは29％の飽和硫酸アンモニウム、温度0〜30℃、好ましくは10℃の条件下で2〜10週間静置するとCLN025の空間群P21212に属する結晶を得ることができる。ただし、当業者において、同一のタンパク質が異なる条件下でも結晶化し得ることは周知の事実であるので、本発明はここに記述された条件に限定されるものではなく、実質的に本発明と同一の結晶学的定数を与えるシニョリン変異体の結晶は本発明の範囲内である。
【００１３】
４．  Ｘ線回折による原子座標決定法
タンパク質の３次元構造を明らかにする手法として、最も一般的に行われているのは、Ｘ線結晶構造解析の手法である。即ち、目的タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化したＸ線をあて、得られたＸ線の回折像を基にそのタンパク質の３次元構造を明らかにしていくものである。前項で得たシニョリン変異体の結晶を用い、このＸ線結晶構造解析の手法（平山令明訳（2004）ブロウ生命系のためのＸ線解析入門、化学同人）により３次元構造を明らかにすることができる。
シニョリン変異体CLN025の結晶は、斜方晶系の空間群P21212に属するもので、単位格子としてa軸の方向に1.9±0.5nm、b軸の方向に3.4±0.5nm、c軸の方向に1.2±0.5nmの大きさを有する。この結晶を用いたＸ線結晶構造解析の手法により、本発明であるシニョリン変異体CLN025の３次元構造座標（各原子間の空間的な位置関係を示す値）が初めて得られる。得られた構造座標を当業者において一般的に用いられているプロテインデータバンク（ＰＤＢ）の表記方法に従って示す（表３）。
【実施例】
【００１４】
本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例1）
本実施例においては、公知の極微小タンパク質・シニョリンのアミノ酸配列をもとにして、シニョリンのGly1とGly10を異なるアミノ酸に置換した変異体を系統的に解析することとした。
具体的には、表１で示される新規のアミノ酸を設計し、それぞれのペプチドを合成した。ペプチドの合成は、公知のFmoc固相合成法により有機化学的に行った。具体的には、固相法自動ペプチド合成装置PSSM-8システム（（株）島津製作所）を使用し、この合成マニュアルに従い合成を行った。固相担体は、2-クロルトリチルレジンを用いた。合成スケールは、リアクションベッセル１個に対しレジン74mg(50.0μmol)、Fmoc-アミノ酸は、レジンの2.5倍量加えた。合成終了後、リアクションベッセル内のペプチドレジンにジメチルホルムアミド及びジクロロメタンを加えて順次洗浄した後、ペプチドレジンを１時間減圧乾燥した。乾燥後遠心管に移し、これにクリーベッジカクテル（レジン74mgのスケールに対してトリフルオロ酢酸／エタンジチオール／トリイソピルシラン／水＝4.2ml/0.4ml/0.2ml/0.2)を加えて、1.5時間振盪攪拌した。その後、冷却したジエチルエーテルを加え、遠心操作を行い、析出した沈殿物を回収し、風乾の後、減圧乾燥した。これに5%酢酸水溶液を加え溶解し、不溶物をフィルターで除去し、粗ペプチド溶液を得た。
【００１５】
表１  合成したシニョリン変異体
2009112282.tif 000002
【００１６】
（実施例２）
本実施例においては、実施例1で合成したシニョリン変異体の粗ペプチド溶液を液体クロマトグラフィーで精製した値、質量分析によりその同定および純度確認を行った。
粗ペプチド溶液は、Ｃ１８カラム(YMC-R&D-ODS)を装着した逆相系液体クロマトグラフィー（HPLC；溶出液 0.1%トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と100％アセトニトリル水溶液（Ｂ液）の混合系、グラジエントＡ液100〜0%／Ｂ液0〜100%、流速7.0ml/min、分析波長220nm）で単離した。グラジエントはHPLC分析に応じて30minで5％変化するように設定した。HPLCによって、分画、精製したペプチド溶液は遠心下で減圧濃縮し、水に溶解させた後、凍結乾燥することによって精製したシニョリン変異体を得た。
質量分析は、精製した試料をＡ液で希釈し50ug/100uLの濃度に調整し、エレクトロスプレーイオン化型質量分析計QP8000α（（株）島津製作所）にて行った。検出されたピークの分子量と合成した試料のアミノ酸配列より算出された理論分子量(表１)を比較した結果、いずれの試料も両者は測定誤差内で一致し、目的のシニョリン変異体が合成されていることが確認された。また、質量スペクトルに目的のタンパク質以外の有意なピークは見出されなかった。
【００１７】
（実施例3）
本実施例においては、シニョリン変異体の立体構造および熱安定性を評価した。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることが知られている。タンパク質が固有の立体構造を形成しているかの示唆を与えるとともに、ＣＤスペクトルの強度に相当するモル楕円率を試料の温度を変化させながら観測することで、どの程度の温度で各々のシニョリン変異体が変性するのかを明らかにすることができる。
単離精製したシニョリン変異体をそれぞれ約1.0mMの濃度で含む水溶液（20mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.0）に調製した。シニョリン変異体の濃度は表1-2のモル吸光係数を用いて決定した。この試料溶液を円筒型セル（セル長0.1cm）に注入し、J805型円偏光二色性分光光度計（日本分光）を用いて、20℃の温度で測定波長を260nmから195nmに移動させＣＤスペクトルを得た。合成したすべての変異体において、シニョリンに特徴的な229nmの正のピークが検出された(図１)。これより、すべての変異体が、シニョリンと同等の立体構造を形成することが強く推察される。次いで、同じ試料を100℃に加熱、さらに100℃から20℃に冷却し260nmから195nmの円二色性スペクトルを得た。加熱後再冷却したスペクトルのモル楕円率は98％以上回復し、シニョリン変異体の立体構造の可逆性が確認された。また、測定波長を229nmに固定し0℃から100℃に1℃/minの速度で昇温させてモル楕円率の経時変化を測定した。得られた熱融解曲線について二状態相転移モデルの理論式（有坂文雄(2004)バイオサイエンスのための蛋白質科学入門、裳華房）を用いて解析し、変性温度Tm、およびTmにおける変性のエンタルピー変化ΔHmを決定した。
その結果、測定したシニョリン変異体においては、Gly、Alaという小型アミノ酸以外のアミノ酸に置換した場合は、末端カルボン酸がアミド化されたか否かを問わず、熱安定性がオリジナルのシニョリンに比べて、向上していることが明らかになった（表２）。たとえば、CLN025はシニョリンに比べて28℃以上の変性温度を示している。
【００１８】
表２  シニョリン変異体の熱安定性
2009112282.tif 000003
【００１９】
（実施例4）
本実施例においては、合成したシニョリン変異体のうちのCLN025の単結晶を作成した。なお、CLN025は、エンタルピー変化、変性温度のいずれにおいても特に最高値を示すものではなく、典型例として選択した。
得られたタンパク質試料を、以下に示すハンギングドロップ法を用いて結晶化した。空間群Ｐ２１２１２に属する結晶を得るには、このタンパク質試料を５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０に１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解しこのタンパク試料溶液1μｌと、等量の結晶化剤溶液（0.1Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０と飽和硫酸アンモニウム溶液を5：2の割合で混合)をピペットマンを用いてカバーガラス（Ｈａｍｐｔｏｎ社製）上で滴下・混合して結晶化溶液とした。上述の結晶化剤溶液をＨａｍｐｔｏｎ社製２４穴プレートに注入し、結晶化溶液を滴下したカバーガラスで蓋をして高真空グリースを用いて密封した。このプレートを１０℃に保たれたインキュベーター中で保管した。およそ３週間後に４０μｍ×４０μｍ×５０μｍ程度の大きさの結晶が結晶化溶液中に得られた。
【００２０】
（実施例5）
本実施例においては、CLN025の立体構造をＸ線回折解析により決定した。
実施例４で得られた単結晶を、微量の母液とともに結晶解析用ガラスキャピラリー（内径0.5 mm, 肉厚10μm）に封入しＸ線回折実験に供した。Ｘ線としては回転対陰極型Ｘ線発生装置M06-XHF（マックサイエンス社）から得られる銅のKα線を用い，回折データ測定装置としてSMART6000（ブルカーエイエックスエス社）を使って，分解能1.11Åまでの回折データの収集を行った。得られた回折像についてプログラムSMART（ブルカーエイエックスエス社）を用いて回折点の指数付けおよび積分強度の測定・数値化をおこない20393個の強度データを得た。この段階で、使用した単結晶の結晶パラメータが決定された。すなわち、結晶の空間群は斜方晶系Ｐ21212、格子定数はa＝19.246(4) Å、b＝33.597(7) Åおよびc＝11.551(2) Åであった。さらにプログラムSAINT+（ブルカーエイエックスエス社）を用いてそれらのマージとスケーリングを行い、3094個のユニークな強度データを得た。これらのRmerge値は5.7%であった。
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【００２１】
表３  シニョリン変異体CLN025の結晶から得られた３次元構造座標
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表３において、１行目は結晶学的定数の記述で、左から単位格子の大きさ（ａ軸・ｂ軸・ｃ軸の順でÅ単位）、各軸のなす角度（α・β・γ）、空間群、Ｚ値（単位胞あたりの分子数）を表している。２行目以降ＴＥＲおよびＥＮＤで始まる行以外の行により各原子の３次元座標が記述されている。１列目のＡＴＯＭはポリペプチド部分の原子座標、ＨＥＴＡＴＭはポリペプチド以外の部分の原子座標を表す。ＡＴＯＭまたはＨＥＴＡＴＭ行の２列目はその原子の識別番号を、３列目はその原子の名称を、４列目はその原子が属する残基名を、５列目はその原子が属する残基番号を、６・７・８列目はその原子の座標（ｘ・ｙ・ｚの順でÅ単位）を、９列目はその原子の占有率を、１０列目はその原子の温度因子を、１１列目は原子記号を示している。ＴＥＲ行はポリペプチド鎖の区切りを示し、ＥＮＤ行はこの３次元構造座標の最終行であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
原子座標によって定義された固有の３次元立体構造を形成する極微小タンパク質は、その特筆すべき構造的特性及び熱安定性から多くの産業利用の可能性を有する。たとえば、上述のようなタンパク質の標準物質として、あるいは分子標的医薬のリード化合物としての利用が期待できることの他、分子のサイズを測定する分析機器の校正物質として、ナノサイズの孔を有する膜、繊維、構造物等の孔の検定物質として、他の分子を高精度に配置しうる分子スペーサーとしての利用が期待できる。特に、この極微小タンパク質の結晶は、該タンパク質を高い純度で提供すること、および安定な状態で長期に保存することを可能にし、加えて、それにより見出された原子座標は、分子シミュレーションなどを行う大規模高精度コンピュータの性能評価や構造を基盤とする医薬設計の対象としての利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】シニョリン変異体のＣＤスペクトル
【図１】
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【配列表】
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