(57)【要約】【課題】混合型抗原免疫プロトコールに従ってモノクローナル抗体を生成する方法を提供すること。【解決手段】さらに、この方法により得られる抗体が開示され、この抗体は、Ａｐｏ−２リガンド（Ａｐｏ−２Ｌ）が結合し得る２つ以上の異なるレセプターと特異的に交叉反応する。驚くことに、異なる抗原の混合物で免疫された動物由来の血清力価は、単一抗原で免疫された動物において達成されるものと同様であることが、本発明で発見された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、慨してモノクローナル抗体を生成する方法に関する。本発明は、この方法によって入手可能な抗体にさらに関し、この抗体は、Ａｐｏ−２リガンド（Ａｐｏ−２Ｌ）が結合し得る２つ以上の異なるレセプターと特異的に交叉反応する。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野の説明）
ネイティブの抗体は、主に、「血漿細胞」と呼ばれる特殊化したリンパ球により合成される。宿主動物における強力な抗体応答の生成は、Ｂ細胞がこれらの血漿細胞へと分化するのを誘導することおよび調節することによって制御される。この分化とは、未刺激のＢ細胞（これは、細胞表面抗原レセプターとして改変された抗体を有し、そして抗体を分泌しない）が活性化Ｂ細胞（これは、両方とも抗体を分泌し、そして細胞表面抗体を有する）、次いで血漿細胞（これは、表面抗原レセプターを有さない、非常に特異化した抗体工場である）になることを含む。この分化プロセスは、抗原の存在によって、そしてＢ細胞とヘルパーＴ細胞との間の細胞の情報伝達によって影響される。
【０００３】
抗体が目的の抗原に選択的に結合する能力が原因で、抗体は、研究適用、診断適用および治療適用のために広範に使用されている。抗体の潜在的用途は、モノクローナル抗体の開発によって拡大された。ポリクローナル抗血清（これは、異なるエピトープに対する抗体の混合物を含む）とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基またはエピトープに対し、そして均一である。さらに、モノクローナル抗体は、無制限の量で生成され得る。
【０００４】
ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｓｔｅｉｎによる根本的研究は、モノクローナル抗体を生成し得るハイブリドーマを得る最初の方法を記載した［ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）］。この方法において、抗体分泌免疫細胞（免疫されたマウスから単離された）は、骨髄腫細胞（Ｂ細胞腫瘍の１つの型）と融合される。生じたハイブリッド細胞（すなわち、ハイブリドーマ）は、インビトロで維持され得、そして規定された特異性を有する抗体を分泌し続け得る。
【０００５】
マウスモノクローナル抗体はマウスに由来するので、ヒトにおける治療薬剤としてのその抗体の使用は制限される。なぜなら、患者に対するこのマウス抗体の投与に際してヒト抗マウス応答が生じるからである。従って、研究者らは、非ヒト抗体を操作して、これらがよりヒト抗体らしくなるようにしている。このような操作された抗体は「キメラ」抗体と呼ばれる；この抗体では、非ヒト抗原結合ドメインはヒト定常ドメインに結合されている［Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号］。このヒト定常ドメインのアイソタイプは、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害への関与について、このキメラ抗体を調整するように選択され得る。抗体の抗原結合機能を解明することおよびヒト抗体における異種配列の使用を最小にすることのためのさらなる努力において、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者［Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）］は、ヒト抗体の対応するセグメントに代えて齧歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）残基で置換してヒト化抗体を生成した。
【０００６】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒト化」抗体とは、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体の態様である。実際は、ヒト化抗体は代表的には、ＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が齧歯類抗体中のアナログ部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０００７】
他のグループが、完全に「ヒト」モノクローナル抗体を生成する方法を開発している。このような抗体は、特異的抗体を分泌するヒト細胞をエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）を使用して不死化することによって［Ｓｔｅｉｎｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ  ２６９：４２０〜４２２（１９７７）］か；またはそのモノクローナル抗体を分泌するヒト−ヒトハイブリドーマを調製することによって［Ｏｌｓｏｎら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７７：５４２９〜５４３１（１９８０）］生成され得る。ヒト抗体はまた、ファージ提示ライブラリーから誘導され得る［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９２）；Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９（１９９６）］。
【０００８】
あるいは、ヒト抗体は、トランスジェニック実験動物中で生成されている。この動物においては、ヒト免疫グロブリン遺伝子座がこの動物に導入され、そして内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的にかまたは完全に、不活化されている［Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：８４５〜８５１（１９９６）；およびＭｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６〜１５６（１９９７）］。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、１つの局面において、モノクローナル抗体を生成する方法を提供し、この方法においては、動物が２つ以上の異なる抗原で免疫され、そして各抗原に結合するモノクローナル抗体が生成および同定される。驚くことに、異なる抗原の混合物で免疫された動物由来の血清力価は、単一抗原で免疫された動物において達成されるものと同様であることが、本明細書中で発見された。
【００１０】
この方法は、異なる抗原結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体を生成するために免疫されそして屠殺される必要がある動物の数を減少させるのに有用であると考えられる。
【００１１】
さらに、この方法が、２つ以上の異なる抗原と交叉反応性である抗体を生成するのに有用であることが発見された。例えば、２つ以上の異なるＡｐｏ−２Ｌレセプターと特異的に交叉反応性である抗体が生成された。
【００１２】
従って、本発明は、抗体を生成する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：
（ａ）２つ以上の異なる抗原で動物を免疫し、この動物において各抗原に対するポリクローナル抗体を生成する工程；
（ｂ）モノクローナル抗体を調製する工程であって、このポリクローナル抗体を生成するこの免疫された動物の免疫細胞を使用する、工程；および
（ｃ）このモノクローナル抗体をスクリーニングして、各抗原に結合する１つ以上のモノクローナル抗体を同定する工程。このスクリーニング工程において、少なくとも２つの異なる抗原に対する少なくとも１つのモノクローナル抗体が見出される。好ましくは、少なくとも１つのモノクローナル抗体が、この動物を免疫した各抗原について見出される。
【００１３】
好ましくは、この動物は、２つ以上の異なる抗原の混合物を含む組成物で免疫され、そして工程（ｂ）は、この免疫された動物由来の免疫細胞を骨髄腫細胞と融合させて、モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞株を生成することを包含する。１つの実施態様において、この方法は、２つ以上の異なる抗原と交叉反応性である１つ以上のモノクローナル抗体を同定する工程をさらに包含する。
【００１４】
本発明は、上記の方法に従って生成されたモノクローナル抗体（例えば、構造的にかまたは機能的に関連する２つ以上の抗原と交叉反応性である抗体）をさらに提供する。
【００１５】
本発明はまた、２つ以上の異なるＡｐｏ−２Ｌレセプターと特異的に交叉反応する抗体（例えば、Ａｐｏ−２ポリペプチドに特異的に結合し、そしてさらに別のＡｐｏ−２Ｌレセプターと特異的に交叉反応する）に関する。
【００１６】
本願はさらに、３Ｈ１．１８．１０、３Ｈ３．１４．５および３Ｄ５．１．１０からなる群より選択されるモノクローナル抗体の生物学的特徴を有するモノクローナル抗体を供給する。
【００１７】
さらに、本発明は、本明細書中に開示されるモノクローナル抗体のいずれかを生成するハイブリドーマ細胞株を提供する。
【００１８】
本発明はまた、以下に関する：本明細書中で開示されるような抗体をコードするＤＮＡを含む、単離された核酸；この核酸を含むベクター；このベクターを含む宿主細胞；このＤＮＡが発現される条件下で宿主細胞を培養する工程を含み、必要に応じてこの宿主細胞培養物からこの抗体を回収する工程をさらに含む、抗体を生成する方法。
【００１９】
本発明は、本明細書中に記載されるような抗体およびキャリアを含む組成物をさらに提供する。
【００２０】
さらに、哺乳動物ガン細胞においてアポトーシスを誘導する方法が提供される。この方法は、哺乳動物ガン細胞を、本明細書中に開示されるような、有効量の交叉反応性アゴニスト抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体に曝露する工程を包含する。
【００２１】
本発明はさらに、容器およびこの容器中に含まれる組成物を含む製品に関し、ここでこの組成物は、本明細書中に記載されるような抗体を含む。したがって、本発明はまた、以下をも提供する。
（１）抗体を生成する方法であって、以下の工程：
（ａ）２つ以上の異なる抗原で動物を免疫し、該動物において各抗原に対するポリクローナル抗体を生成する工程；
（ｂ）モノクローナル抗体を調製する工程であって、該ポリクローナル抗体を生成する該免疫された動物の免疫細胞を使用する、工程；および
（ｃ）該モノクローナル抗体をスクリーニングして、各抗原に結合する１つ以上のモノクローナル抗体を同定する工程
を包含する、方法。
（２）項目１に記載の方法であって、工程（ａ）の抗原がタンパク質である、方法。
（３）項目１に記載の方法であって、前記２つ以上の異なる抗原の混合物を含む組成物で前記動物を免疫する工程を包含する、方法。
（４）項目３に記載の方法であって、前記組成物中の前記２つ以上の異なる抗原が精製された抗原である、方法。
（５）項目１に記載の方法であって、工程（ｂ）が、前記免疫された動物由来の免疫細胞を骨髄腫細胞と融合して、前記モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞株を生成することを包含する、方法。
（６）項目１に記載の方法であって、工程（ｃ）が、免疫アッセイにおいて前記モノクローナル抗体をスクリーニングすることを包含する、方法。
（７）項目１に記載の方法であって、前記動物が約２〜約１０の異なる抗原で免疫される、方法。
（８）項目１に記載の方法であって、前記動物が約３〜約４の異なる抗原で免疫される、方法。
（９）項目１に記載の方法であって、前記動物が齧歯類である、方法。
（１０）項目９に記載の方法であって、前記動物がマウスである、方法。
（１１）項目９に記載の方法であって、前記動物がヒト抗体を発現するマウスである、方法。
（１２）項目１に記載の方法であって、前記異なる抗原のうちの２つ以上と交叉反応する１つ以上のモノクローナル抗体を同定する工程をさらに包含する、方法。
（１３）項目１に記載の方法であって、工程（ａ）における抗原が構造的に関連しているか、または機能的に関連している、方法。
（１４）項目１３に記載の方法であって、工程（ａ）における抗原がそのレセプターまたはフラグメントを含み、ここで、該レセプターがそれぞれ同じリガンドに結合されている、方法。
（１５）項目１に記載の方法であって、工程（ｃ）において選択されたモノクローナル抗体をコードする核酸を単離する工程、および該モノクローナル抗体またはその改変体をコードする核酸で形質転換された宿主細胞において、該モノクローナル抗体またはその改変体を生成する工程をさらに包含する、方法。
（１６）項目１に記載の方法であって、工程（ｃ）において選択されたモノクローナル抗体をヒト化する工程をさらに包含する、方法。
（１７）項目１に記載の方法であって、工程（ｃ）において選択されたモノクローナル抗体から抗体フラグメントを形成する工程をさらに包含する、方法。
（１８）項目１に記載の方法であって、工程（ｃ）において選択されたモノクローナル抗体を異種分子と結合体化する工程をさらに包含する、方法。
（１９）項目１８に記載の方法であって、前記異種分子がポリエチレングリコール、標識薬剤または細胞傷害性薬剤である、方法。
（２０）項目１に記載の方法に従って生成された、モノクローナル抗体。
（２１）項目２０に記載のモノクローナル抗体であって、構造的に関連する抗原または機能的に関連する抗原の２つ以上と交叉反応する、モノクローナル抗体。
（２２）２つ以上の異なるＡｐｏ−２Ｌレセプターと特異的に交叉反応する、抗体。
（２３）項目２２に記載の抗体であって、モノクローナル抗体を含む、抗体。
（２４）項目２２に記載の抗体であって、Ａｐｏ−２ポリペプチドに特異的に結合し、そしてさらに別のＡｐｏ−２Ｌレセプターと特異的に交叉反応する、抗体。
（２５）項目２２に記載の抗体であって、Ａｐｏ−２ポリペプチドと特異的に結合し、そしてさらにＤＲ４と特異的に交叉反応する、抗体。
（２６）項目２２に記載の抗体であって、アゴニスト性抗体である、抗体。
（２７）項目２２に記載の抗体であって、遮断抗体である、抗体。
（２８）項目２２に記載の抗体であって、抗体フラグメントである、抗体。
（２９）項目２２に記載の抗体であって、非ヒト超可変領域残基およびヒトフレームワーク領域残基を含む、抗体。
（３０）ヒト抗体である、項目２２に記載の抗体。
（３１）３Ｈ１．１８．１０、３Ｈ３．１４．５および３Ｄ５．１．１０からなる群より選択されるモノクローナル抗体の生物学的特徴を有する、抗体。
（３２）項目３１に記載の抗体であって、３Ｈ１．１８．１０、３Ｈ３．１４．５および３Ｄ５．１．１０からなる群より選択されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する、抗体。
（３３）項目３１に記載のモノクローナル抗体であって、３Ｈ１．１８．１０、３Ｈ３．１４．５および３Ｄ５．１．１０からなる群より選択されるモノクローナル抗体の超可変領域残基を有する、抗体。
（３４）３Ｈ１．１８．１０、３Ｈ３．１４．５および３Ｄ５．１．１０からなる群より選択されるモノクローナル抗体を生成する、ハイブリドーマ細胞株。
（３５）項目２２に記載の抗体をコードするＤＮＡを含む、単離された核酸。
（３６）項目３５に記載の核酸を含む、ベクター。
（３７）項目３６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（３８）抗体を生成する方法であって、前記ＤＮＡが発現される条件下で項目３７に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
（３９）項目３８に記載の方法であって、前記宿主細胞培養物から前記抗体を回収する工程をさらに包含する、方法。
（４０）項目２２に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（４１）哺乳動物ガン細胞中でアポトーシスを誘導する方法であって、有効量の項目２６に記載のアゴニスト性抗体に対して哺乳動物ガン細胞を曝露する工程を包含する、方法。
（４２）容器および該容器中に含まれた組成物を含む製品であって、ここで該組成物は項目２２に記載の抗体を含む、製品。
（４３）項目４２に記載の製品であって、インビボかまたはエキソビボで前記抗体を使用するための説明書をさらに含む、製品。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、以下の免疫原についての例示的混合抗原免疫スキームを示す：Ａｐｏ−２−ＩｇＧ、ＤＲ４−ＩｇＧ、ＤｃＲ１−ＩｇＧおよびＤｃＲ２−ＩｇＧ。
【図２】図２は、以下の抗原についての例示的単一抗原免疫スキームを示す：Ａｐｏ−２−ＩｇＧ、ＤＲ４−ＩｇＧ、およびＤｃＲ２−ＩｇＧ。
【図３】図３は、ＤＲ４−ＩｇＧ、Ａｐｏ−２−ＩｇＧまたはＤｃＲ２−ＩｇＧで個々に免疫されたマウスの抗原特異的血清力価を示す。ＭＰＬ−ＴＤＭ中１μｇの各免疫粘着素（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）分子で足の指頭球（Ｆｏｏｔ  Ｐａｄ）（Ｆ．Ｐ．）に１０回免疫したＢａｌｂ／ｃマウス（５マウス／群）から、血清を収集した。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ部分に対する活性を、１００ｍｌの血清（ＰＢＳ中１：５００希釈）を３ｍｇ／５０ｍｌのＣＤ４−ＩｇＧとともに１時間室温（ＲＴ）でインキュベートすることによって、事前吸着させた。次に、この事前吸着した血清の連続希釈物を、ＰＢＳで調製した。この事前吸着した血清の抗原特異的活性を、特異的抗原で被覆したマイクロタイターウェルを使用する捕獲ＥＬＩＳＡで決定した。
【図４】図４は、ＤＲ４−ＩｇＧ、Ａｐｏ−２−ＩｇＧ、ＤｃＲ１−ＩｇＧおよびＤｃＲ２−ＩｇＧで一緒に免疫したマウスの抗原特異的血清力価を示す。マウスを、ＤＲ４−ＩｇＧ、Ａｐｏ−２−ＩｇＧ、ＤｃＲ１−ＩｇＧおよびＤｃＲ２−ＩｇＧの混合物で足指頭球に免疫した（マウスを、１４回免疫した；ＤｃＲ２−ＩｇＧを、最後の６回の免疫用の混合物中に含めた）。各免疫原の注射１回あたり１μｇを使用した。この血清におけるヒトＩｇＧ  Ｆｃの活性を、上記のようにＣＤ４−ＩｇＧとともにインキュベートすることによって吸着させた。この事前吸着させた各抗原に特異的な血清の活性を、特異的抗原で被覆したマイクロタイターウェルを使用する捕獲ＥＬＩＳＡで決定した。
【図５Ａ】図５Ａは、ネイティブ配列ヒトＡｐｏ−２  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）およびその誘導されるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ネイティブ配列ヒトＡｐｏ−２  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）およびその誘導されるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＥＬＩＳＡによって決定された、以下のＡｐｏ２−Ｌレセプターに対する抗体結合を示す：ＤＲ４、Ａｐｏ−２、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２。抗体は、３Ｈ３．１４．５である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＥＬＩＳＡによって決定された、以下のＡｐｏ２−Ｌレセプターに対する抗体結合を示す：ＤＲ４、Ａｐｏ−２、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２。抗体は、３Ｈ１．１８．１０である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＥＬＩＳＡによって決定された、以下のＡｐｏ２−Ｌレセプターに対する抗体結合を示す：ＤＲ４、Ａｐｏ−２、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２。抗体は、３Ｄ５．１．１０である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＩｇＧコントロール［点線］と比較した場合の抗体３Ｈ１．１８．１０［太線により示される］についてのＦＡＣＳ分析を示す。抗体は、ヒト９Ｄ細胞において発現されたＡｐｏ−２を認識した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＩｇＧコントロール［点線］と比較した場合の抗体３Ｈ３．１４．５［太線により示される］についてのＦＡＣＳ分析を示す。抗体は、ヒト９Ｄ細胞において発現されたＡｐｏ−２を認識した。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＩｇＧコントロール［点線］と比較した場合の抗体３Ｄ５．１．１０［太線により示される］についてのＦＡＣＳ分析を示す。抗体は、ヒト９Ｄ細胞において発現されたＡｐｏ−２を認識した。
【図８】図８は、抗体３Ｈ１．１８．１０（３Ｈ１）、３Ｈ３．１４．５（３Ｈ３）および３Ｄ５．１．１０（３Ｄ５）、アイソタイプを適合させたコントロール（ＩｇＧ）、およびＡｐｏ−２Ｌにより誘導されたアポトーシスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
用語「抗体」とは、最も広い意味で使用され、そして詳細には、モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および遮断抗体または中和抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を有する抗体組成物を包含する。
【００２４】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細中で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいう。すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る潜在的な天然に存在する変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原性部位に指向されている。さらに、従来の（ポリクローナル）抗体調製物（これは、代表的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む）とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向される。
【００２５】
本明細書中でモノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体および組換え抗体を含み、これらの抗体は、抗体の可変（超可変を含む）ドメインを定常ドメインと接合させるか、または軽鎖を重鎖と接合させるか、または１つの種由来の鎖を別の種由来の鎖と接合させることによるか、あるいは異種タンパク質（起源の種または免疫グロブリンクラスもしくはサブクラスの名称に関わらない）ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖ）との融合物によって、そのモノクローナル抗体が所望の生物学的活性を示す限り、生成される。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭａｇｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、７９〜９７頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）。
【００２６】
従って、修飾語「モノクローナル」とは、抗体の実質的に均一な集団から得られるような抗体の特徴を示し、そしてこれは、いかなる特定の方法による抗体の生成を必要とするとしても解釈されるべきではない。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）により記載されたハイブリドーマ法によって生成されてもよいし、あるいは米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような組換えＤＮＡ法によって生成されてもよい。「モノクローナル抗体」とはまた、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４（１９９０）に記載された技術を使用して生成されたファージライブラリーからも単離され得る。
【００２７】
「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントすなわち「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントとしては、抗体のＶHドメインおよびＶLドメインが挙げられ、ここでこれらのドメインは、単鎖ポリペプチド鎖で存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが、抗原結合のために望ましい構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをＶHドメインとＶLドメインとの間にさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３巻，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２６９−３１５頁（１９９４）を参照のこと。
【００２８】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2または抗体の他の抗原結合部分配列）である。大抵は、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）の超可変領域由来の残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、このヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに改善および最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして代表的には２つの、可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、そしてＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。
【００２９】
本明細書中で用いられる場合、用語「超可変領域」とは、抗原結合を担う、抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、残基５０〜５６（Ｌ２）、および残基８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５（Ｈ１）、残基５０〜６５（Ｈ２）、および残基９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））由来のアミノ酸残基、ならびに／または「超可変ループ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、残基５０〜５２（Ｌ２）、および残基９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｈ１）、残基５３〜５５（Ｈ２）、および残基９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））由来の残基を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」残基は、本明細書中に定義された通りの超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３０】
用語「Ａｐｏ−２リガンド」すなわち「Ａｐｏ−２Ｌ」とは、１９９７年７月１７日に公開され、そして本明細書中で参考として明示的に援用される、ＷＯ９７／２５４２８に開示されるＡｐｏ−２Ｌポリペプチドをいう。本願の目的のために、これらの用語はまた、１９９７年１月１６日に公開されたＷＯ９７／０１６３３に開示され、そして本明細書中に参考として明示的に援用されるポリペプチドをいう。
【００３１】
「Ａｐｏ−２Ｌレセプター」は、Ａｐｏ−２Ｌ（本明細書中で定義される通り）が特異的に結合し得るポリペプチドである。用語「Ａｐｏ−２Ｌレセプター」は、本明細書中で用いる場合、ネイティブ配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターおよびそれらの改変体（これはさらに本明細書中で定義される）を含む。これらの用語は、ヒトを含む種々の哺乳動物由来のＡｐｏ−２Ｌレセプターを含む。このＡｐｏ−２Ｌレセプターは、種々の供給源から、例えば、ヒト組織型からもしくは別の供給源から単離され得るか、または組換え方法もしくは合成方法によって調製され得る。「ネイティブ配列」Ａｐｏ−２Ｌレセプターの例としては、Ａｐｏ−２ポリペプチド（本明細書中で以下に記載される通り）、Ｐａｎら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１１−１１３（１９９７）に記載される通りのネイティブ配列「ＤＲ４」；Ｓｈｅｒｉｄａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：８１８−８２１（１９９７）においてのようなネイティブ配列「おとりレセプター１」すなわち「ＤｃＲ１」；ならびにＭａｒｓｔｅｒｓら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：１００３−１００６（１９９７）においてのようなネイティブ配列「おとりレセプター２」すなわち「ＤｃＲ２」、およびネイティブ配列オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）［Ｓｉｍｏｎｅｔら  Ｃｅｌｌ  ８９：３０９−３１９（１９９７）ならびにＥｍｅｒｙら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８（５）：Ａ４７  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２．１７（１９９８）を参照のこと］が挙げられる。
【００３２】
本明細書中で用いられる場合、用語「Ａｐｏ−２ポリペプチド」および「Ａｐｏ−２」は、ネイティブ配列Ａｐｏ−２およびＡｐｏ−２改変体（これは、本明細書中でさらに定義される）を含む。これらの用語は、ヒトを含む種々の哺乳動物由来のＡｐｏ−２を含む。このＡｐｏ−２は、種々の供給源から、例えば、ヒト組織型由来もしくは別の供給源から単離され得るか、または組換え方法もしくは合成方法によって調製され得る。
【００３３】
「ネイティブ配列」ポリペプチド（例えば、「ネイティブ配列Ａｐｏ−２」）は、天然に由来するポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。従って、ネイティブ配列ポリペプチドは、任意の哺乳動物由来の、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。このようなネイティブ配列ポリペプチドは、天然から単離され得るか、または組換え手段もしくは合成手段によって生成され得る。用語「ネイティブ配列」ポリペプチドは、天然に存在する短縮形態または分泌形態のポリペプチド（例えば、細胞外ドメイン配列）、このポリペプチドの天然に存在する改変体形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）および天然に存在する対立遺伝子改変体を特異的に含む。
【００３４】
天然に存在する改変体形態のＡｐｏ−２としては、図５（配列番号２）に示されるアミノ酸配列において残基４１０にアミノ酸置換を有するＡｐｏ−２が挙げられる。このような天然に存在する改変体形態の１つの実施態様では、４１０位のロイシン残基は、メチオニン残基によって置換される。図５（配列番号２）では、４１０位のアミノ酸残基は、このアミノ酸が、必要に応じてロイシンまたはメチオニンのいずれかであり得ることを示すために「Ｘａａ」と同定される。図１０（配列番号２）では、１３６７位のヌクレオチドは、このヌクレオチドが、アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）のいずれかであり得ることを示すために、「Ｗ」と同定される。本発明の１つの実施態様では、このネイティブ配列Ａｐｏ−２は、図５（配列番号２）のアミノ酸１〜４１１を含む、成熟または全長のネイティブ配列Ａｐｏ−２である。必要に応じて、このＡｐｏ−２は、ＡＴＣＣ  ２０９０２１として寄託されるベクターのｃＤＮＡ挿入物によってコードされるポリペプチドを発現することによって入手されるかまたは入手可能である。
【００３５】
「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」（例えば、「Ａｐｏ−２細胞外ドメイン」または「Ａｐｏ−２  ＥＣＤ」）とは、レセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを本質的に含まないレセプターポリぺプチドの形態をいう。通常、ＥＣＤは、このような膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインの１％未満を有し、好ましくは、このようなドメインの０．５％未満を有する。必要に応じて、Ａｐｏ−２  ＥＣＤは、図５（配列番号２）のアミノ酸残基５４〜１８２、または図５（配列番号２）のアミノ酸残基１〜１８２を含む。必要に応じて、Ａｐｏ−２  ＥＣＤは、１つ以上のシステインに富むドメインを含み、好ましくは、Ｓｈｅｒｉｄａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：８１８−８２１（１９９７）に示された配列について同定されたシステインに富むドメインの１つまたは両方を含む。Ａｐｏ−２ポリぺプチドについて本明細書において同定された膜貫通ドメインが、疎水性ドメインの型を同定するために当該分野において慣用的に使用される基準に従って同定されることは、当業者によって理解される。膜貫通ドメインの正確な境界は変化し得るが、本明細書において特に言及されたドメインのいずれかの末端のせいぜい約５アミノ酸までのようである。
【００３６】
ポリぺプチド「改変体」（例えば、「Ａｐｏ−２改変体」）は、ネイティブ配列のポリぺプチド（例えば、全長ネイティブ配列ヒトＡｐｏ−２の図５（配列番号２）に示される推定アミノ酸配列、または本明細書において同定されたＡｐｏ−２  ＥＣＤもしくはデスドメイン（ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）の配列を有するＡｐｏ−２）と、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリぺプチドを意味する。このような改変体としては、例えば、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端で１つ以上のアミノ酸残基が付加されているか、または欠失されているポリぺプチドが挙げられる（例えば、図５の配列（配列番号２）または本明細書において同定されたＡｐｏ−２もしくはデスドメインの配列におけるＡｐｏ−２の場合）。
【００３７】
「抗体改変体」の例としては、非ヒト抗体のヒト化改変体、「アフィニティー成熟した」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：８８９−８９６（１９９２）およびＬｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３０（４５）：１０８３２−１０８３７（１９９１）を参照のこと）、および変化したエフェクター機能（単数または複数）を有する抗体変異体（例えば、１９９７年７月１５日に発行された米国特許第５，６４８，２６０号（これは参考として本明細書においてはっきりと援用される）を参照のこと）が挙げられる。
【００３８】
通常、改変体は、ネイティブ配列（例えば、Ａｐｏ−２については、図５（配列番号２）のアミノ酸配列、または本明細書において同定されたＡｐｏ−２  ＥＣＤもしくはデスドメインの配列）と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、およびさらにより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００３９】
「アミノ酸配列同一性割合（％）」は、必要であるならば、最大の配列同一性割合を達成するために、配列を整列させそしてギャップを導入した後での、ネイティブ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の割合として定義され、任意の保存的置換を配列同一性の部分として考慮しない。アミノ酸配列同一性割合を決定する目的のための整列は、例えば、公に利用可能であるコンピューターソフトウエア（例えば、ＡＬＩＧＮTMまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエア）を使用して、当業者の技術範囲内である種々の方法において達成され得る。当業者は、整列を測定するための適切なパラメーターを決定し得、これらには、比較される配列の全長にわたって最大整列を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムが含まれる。
【００４０】
用語「エピトープタグ化」とは、本明細書で使用される場合、「タグポリペプチド」に融合されたポリペプチドもしくはそのドメイン配列をいう。タグポリペプチドは、抗体を作製し得るエピトープを提供するに十分な残基を有し、さらにこれは十分に短く、そのポリペプチドの活性を妨げない。好ましくは、タグポリペプチドはまた、抗体が他のエピトープと実質的に交叉反応しないように、かなり独特である。一般的に、適切なタグポリペプチドは、少なくとも６アミノ酸残基、および通常約８〜約５０アミノ酸残基（好ましくは、約１０〜約２０残基）を有する。
【００４１】
Ａｐｏ−２Ｌレセプターに関して「生物学的に活性」および「所望の生物学的活性」とは、本明細書の目的のために、（１）少なくとも１つの型の哺乳動物細胞において、アポトーシスをインビボまたはエキソビボで調節する能力を有すること（アゴニスト様式もしくは刺激様式、またはアンタゴニスト様式もしくはブッロク様式のいずれか）；（２）Ａｐｏ−２Ｌリガンドを結合する能力を有すること；または（３）Ａｐｏ−２ＬリガンドシグナリングおよびＡｐｏ−２Ｌリガンド活性を調節する能力を有することを意味する。
【００４２】
用語「アポトーシス」および「アポトーシス活性」は、広範な意味に使用され、そして哺乳動物における細胞死の秩序立ったもしくは制御された形態をいい、代表的には、１つ以上の特徴的な細胞の変化（細胞質の凝縮、形質膜微絨毛の消失、核の断片化、染色体ＤＮＡの分解、またはミトコンドリア機能の消失を含む）を付随する。この活性は、例えば、細胞生存アッセイ、ＦＡＣＳ分析、またはＤＮＡ電気泳動により決定および測定され得、これらは全て当該分野において公知である。
【００４３】
用語「処置する」、「処置」、および「治療」は、本明細書で使用される場合、治効ある治療、予防的な（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）治療、および予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）治療をいう。
【００４４】
用語「癌」および「癌性」とは、代表的に、無秩序な細胞増殖により特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態をいうかまたは記載する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるがこれらに限定されない。そのような癌のさらに特定の例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、芽細胞腫、胃腸癌、腎臓（ｒｅｎａｌ）癌、脾臓癌、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝性癌腫、ならびに種々の型の頭部および頸部癌が挙げられる。
【００４５】
用語「哺乳動物」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物として分類される任意の動物をいい、これらには、ヒト、ウシ、ウマ、イヌおよびネコが挙げられる。
【００４６】
用語「抗原」および「免疫原」は、本明細書において交換可能に使用され、分子または物質で免疫された動物において、免疫応答（好ましくは抗体応答）を誘導する分子または物質をいう（すなわち、抗原は動物において「免疫原性」である）。抗原は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然に存在する化合物もしくは合成化合物であり得る。好ましくは、抗原は、約４ｋＤより大きい分子量を有する「タンパク質」である。このタンパク質は、例えば、細胞性タンパク質、細菌タンパク質またはウイルスタンパク質であり得る。
【００４７】
「異なる抗原」とは、構造的に異なる抗原；例えば、ペプチドまたはタンパク質の場合、異なるアミノ酸配列を有する抗原、を意味する。
【００４８】
「構造的または機能的に関連する抗原」という表現は、類似の構造および／または類似の機能を有する抗原をいう。例えば、抗原は、必要に応じて異種アミノ酸配列に融合されており、同じリガンドにより結合されそして／または活性化されるレセプター（またはそのフラグメント）（例えば、本明細書に記載されるＡｐｏ−２Ｌレセプター）を含み得る。構造的および機能的に関連するレセプターの他の例としては、ＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２レセプター、ＨＥＲ３レセプターおよびＨＥＲ４レセプターのような、ＥｒｂＢ２レセプターファミリーのメンバー；ならびにＲｓｅ、ＡｘｌおよびＭｅｒレセプターファミリーのメンバーが挙げられる。構造的または機能的に関連するリガンドの例としては、ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）などが挙げられる。
【００４９】
目的のタンパク質抗原は、「レセプター」［すなわち、細胞表面上または細胞の細胞質内に天然で存在し、そして１つ以上のリガンド（単数または複数）に結合し得るタンパク質分子］であり得る。別の例示的な抗原は、タンパク質「リガンド」［すなわち、１つ以上のレセプター（単数または複数）に結合し得、そして必要に応じてそれを活性化し得る分子；例えば、増殖因子］である。抗原は、本明細書において、例えば、レセプターまたはリガンドのフラグメントを包含し、これは、必要に応じて、１つ以上の異種アミノ酸配列に融合される（例えば、抗原は免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）であり得る）。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」は、異種「付着因子（ａｄｈｅｓｉｎ）」タンパク質（例えば、レセプター、リガンドまたは酵素）の「結合ドメイン」を、免疫グロブリン定常ドメインと結合させた抗体様分子を意味する。構造的に、免疫付着因子は、所望の結合特異性を有する付着アミノ酸配列（抗体の抗原認識および結合部位（抗原結合部位）以外（すなわち、異種性））と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。例えば、米国特許第５，５６５，３３５号および米国特許第５，１１６，９６４号を参照のこと（これらは明確に参考として本明細書中に援用される）。
【００５１】
用語「リガンド結合ドメイン」は、本明細書で使用される場合、任意の天然の細胞表面レセプターまたはそれらの任意の領域もしくは誘導体（対応する天然のレセプターの少なくとも質的なリガンド結合能力を保持する）をいう。特定の実施態様において、レセプターは、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーに相同の細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチドに由来する。免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではないが、それにもかかわらず、この定義により具体的に包括される他のレセプターは、サイトカインのレセプター、そして特に、チロシンキナーゼ活性を有するレセプター（レセプターチロシンキナーゼ）、ヘマトポイエチンおよび神経成長因子レセプタースパーファミリーのメンバー、ならびに細胞接着分子（例えば、（Ｅ−、Ｌ−およびＰ−）セレクチン）である。
【００５２】
用語「レセプター結合ドメイン」は、レセプターの任意の天然のリガンドを称するために使用され得、これらには、細胞接着分子、またはそのような天然のリガンドの任意の領域もしくは誘導体（対応する天然のリガンドの少なくとも質的なレセプター結合能力を保持する）が挙げられる。この定義には、とりわけ、上記に言及したレセプターのリガンドに由来する結合配列が特に含まれる。
【００５３】
「抗体−免疫付着因子キメラ」は、抗体の少なくとも１つの結合ドメイン（本明細書において定義されるような）を、少なくとも１つの免疫付着因子（本出願において定義されるような）と結合させた分子を含む。例示的な抗体−免疫付着因子キメラは、Ｂｅｒｇら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：４７２３−４７２７（１９９１）およびＣｈａｍｏｗら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４２６８（１９９４）に記載される、二重特異性のＣＤ４−ＩｇＧキメラである。
【００５４】
「単離された（した）」ポリペプチドは、その天然の環境の成分から同定されそして分離されそして／または回収されたポリペプチドである。その天然の環境の混入成分は、ポリペプチドの診断的使用または治療的使用を妨げる物質であり、これらには、酵素、ホルモン、および他の蛋白様溶質または非蛋白様溶質が挙げられる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、（１）Ｌｏｗｒｙ法で決定した場合には、ポリペプチドの９５重量％より多くまで、そして最も好ましくは９９重量％より多くまで、（２）Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を、スピニングカップシークエネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎｔｏｒ）を使用して得るために十分な程度にまで、または（３）還元条件下もしくは非還元条件下で、クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで、に精製される。
【００５５】
「精製された（した）」抗原は、１つ以上の精製手順に供された抗原である。精製された抗原は均質であり得、これは、本明細書において、組成物の全重量に基づいて、少なくとも約７０重量％〜約１００重量％の目的の抗原、好ましくは少なくとも約８０重量％〜約１００重量％の目的の抗原を含む組成物をいうために使用される。
【００５６】
用語「免疫する（免疫化する）」とは、動物において抗体が生じ得るように、１つ以上の抗原を動物に投与する工程（単数または複数）をいう。一般的に、免疫は、抗原（単数または複数）を動物に注射する工程を包含する。免疫は、抗原（単数または複数）を１回以上投与することを含む。
【００５７】
免疫される「動物」は、本明細書において、好ましくは齧歯類である。本明細書において免疫され得る他の動物としては、非ヒト霊長類（例えば、旧世界（Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ）サル（例えば、ヒヒまたはマカーク（アカゲザルおよびカニクイザルを含む）；米国特許第５，６５８，５７０号を参照のこと）；鳥類（例えば、ニワトリ）；ウサギ；ヤギ；ヒツジ；ウシ；ウマ；ブタ；ロバ；イヌなどが挙げられる。「齧歯類」は、胎盤哺乳動物の齧歯類目に属する動物である。例示的な齧歯類としては、マウス、ラット、モルモット、リス、ハムスター、フェレットなどが挙げられ、本明細書における方法に従う免疫にはマウスが好ましい齧歯類である。
【００５８】
「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗血清」とは、１つ（一価もしくは特異的抗血清）またはそれより多い（多価抗血清）抗原に特異的な抗体の混合物を含む免疫血清をいい、これは、抗原（単数または複数）で免疫された動物の血液から調製され得る。
【００５９】
用語「免疫細胞」とは、抗体を産生し得る細胞をいう。本明細書において特に興味深い免疫細胞は、例えば、脾臓、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、リンパ節、鼡径節、パイアー斑、扁桃、骨髄、臍帯血、胸水および腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）に由来するリンパ系細胞である。
【００６０】
「固相」とは、目的の分子が特異的にまたは非特異的に付着し得る非水溶性マトリクス（例えば、アッセイプレート）を意味する。
【００６１】
「アジュバント」は、免疫応答の非特異的な刺激因子である。アジュバントは、以下の成分のいずれかまたは両方を含む組成物の形態であり得る：（ａ）抗原を迅速な異化から保護する沈着物を形成するように設計された物質（例えば、鉱油、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リポソームまたは界面活性剤［例えば、多価ポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌ）］）、および（ｂ）免疫される宿主動物の免疫応答を非特異的に刺激する物質（例えば、それらにおけるリンホカインレベルを増大することによって）。リンホカインレベルを増大するための例示的な分子としては、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）またはそのリピドＡ部分；Ｂｏｒｄｅｔａｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ；百日咳毒素；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；およびムラミルジペプチド（ＭＤＰ）が挙げられる。アジュバントの例としては、フロイントアジュバント（必要に応じて、殺傷したＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む；完全フロイントアジュバント）；水酸化アルミニウムアジュバント；およびモノホスフォリルリピドＡ−合成トレハホースジコリノミルコレート（ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｌｃｏｌａｔｅ）（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が挙げられる。
【００６２】
「スクリーニング」とは、１つ以上のモノクローナル抗体（例えば、精製抗体および／または抗体を含むハイブリドーマ培養上清）を、目的の抗原に結合する抗体の能力を質的および／または量的に決定する１つ以上のアッセイに供することを意味する。
【００６３】
「イムノアッセイ」とは、抗体の抗原への結合を決定するアッセイを意味し、ここで、抗体もしくは抗原のいずれか、または両方が、アッセイのいくつかの段階において、必要に応じて固相上に付着される（すなわち、「免疫吸着因子」アッセイ）。例示的なそのようなアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、およびＦＡＣＳアッセイが挙げられる。
【００６４】
２つ以上の異なる抗原と「交叉反応する」抗体は、異なる抗原の各々に結合し得、例えば、以下の実施例に記載されるように、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳにより決定される。
【００６５】
２つ以上の異なる抗原と「特異的に交叉反応する」抗体は、第一の抗原と結合しそして第二の異なる抗原にさらに結合する抗体であり、ここで、約１０μｇ／ｍＬの抗体濃度での第二抗原に対する抗体の結合能力（例えば、ＯＤ  ４５０／６２０；図６Ａ〜Ｃ）は、以下の実施例にように捕獲ＥＬＩＳＡにおいて決定された場合、第一抗原の結合活性の約５０％〜約１００％（好ましくは、約７５％〜約１００％）である。例えば、抗体は、Ａｐｏ−２（「第一抗原」）に特異的に結合し得、そして別のＡｐｏ−２Ｌレセプター（例えば、ＤＲ４（「第二抗原」））と特異的に交叉反応し得る。ここにおいて、約１０μｇ／ｍＬの抗体のＤＲ４への結合の程度は、本明細書中の捕獲ＥＬＩＳＡにおいて、Ａｐｏ−２に対する抗体の結合能力の約５０％〜約１００である。
【００６６】
用語「標識」とは、本明細書で使用される場合、検出可能な化合物または組成物をいい、これらは、目的の分子に直接的にかまたは間接的に結合され得、そしてそれ自体が検出され得る（例えば、ラジオアイソトープ標識または蛍光標識）か、あるいは酵素標識の場合、それらは、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。
【００６７】
「単離された」核酸分子は、通常、ポリペプチド核酸の天然の供給源に関連する少なくとも１つの混入核酸分子から同定および単離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然において見出される形態またはセッティング以外のものである。従って、単離された核酸分子は、天然の細胞に存在する場合のその核酸分子と区別される。しかし、単離された核酸分子は、通常ポリペプチドを発現する細胞（ここでは、例えば、核酸分子は、天然の細胞の染色体位置とは異なる位置に存在する）中に含まれる核酸分子を含む。
【００６８】
発現「制御配列」とは、特に宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な制御配列は、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
【００６９】
核酸が別の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、この核酸は、「作動可能に連結」される。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現される場合、そのプレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡはそのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結される；プロモーターもしくはエンハンサーがコード配列の転写に作用する場合、プロモーターもしくはエンハンサーはそのコード配列に作動可能に連結される；またはリボソーム結合部位が翻訳を容易にするように配置される場合、リボソーム結合部位はコード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列は隣接し、そして分泌リーダーの場合、それは隣接しかつリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接する必要はない。連結は、都合の良い制限部位で連結することによって達成される。このような部位が存在しない場合、従来的な慣行に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【００７０】
本明細書で使用される場合、発現「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」は交換可能に使用され、そしてこのような指定の全ては子孫を含む。従って、単語「形質転換体」および「形質転換細胞」は、初代細胞およびそれに由来する転移回数に関わらない培養物を含む。全ての子孫が、意図的な変異または偶然の変異に起因して、ＤＮＡ含有量において正確に同一であり得ないことも理解され得る。本来の形質転換細胞についてスクリーニングされた場合、同様の機能または生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。異なる指定が意図されることが、本文脈から明らかである。
【００７１】
用語「細胞傷害性因子」とは、本明細書で使用される場合、細胞の機能を阻害もしくは妨げる物質、および／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射活性同位元素（例えば、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90およびＲｅ186）、化学療法剤、および毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素学的に活性な酵素、またはそれらの改変体および／もしくはフラグメント）を含むことが意図される。
【００７２】
「化学療法剤」は、癌の処置に有用な化合物である。化学療法剤の例としては以下が挙げられる：アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド（ｔａｘｏｉｄｓ）（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬTM，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ））、およびドクサタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（Ｔａｘｏｔｅｒａ，Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ
Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｒｎａｃｅ）、トキソテレ（ｔｏｘｏｔｅｒｅ）、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルバイン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、カルボプラチン、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、ダウノマイシン、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｓ）（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、メルファランおよび他の関連するナイトロジェンマスタード。この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を制御または阻害するように作用するホルモン因子（タモキシフェンおよびオナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ））もまた含まれる。
【００７３】
用語「プロドラッグ」とは、本出願において使用される場合、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態をいう。これは、親薬物と比較して腫瘍細胞に対してより細胞傷害性が少なく、そして酵素学的に活性化され得るか、またはより活性な親形態に変換され得る。例えば、Ｗｉｌｍａｎ、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、１４、３７５〜３８２頁、６１５ｔｈ
Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）およびＳｔｅｌｌａら、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら編、２４７〜２６７頁、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）。本発明のプロドラッグとしては、より活性な細胞傷害性遊離薬物に変換され得るリン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは必要に応じて置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンプロドラッグおよび他の５−フルオロリジンプロドラッグが挙げられる。本発明の使用のためのプロドラッグ形態に誘導体化され得る細胞傷害性薬物の例としては、上記される化学療法剤が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７４】
（本発明を実行するための様式）
（Ａ．混合抗原免疫プロトコル）
１つの局面において、本発明は、モノクローナル抗体を作製するための方法を提供する。ここにおいて、動物は、動物が免疫された２つ以上の抗原に対するポリクローナル抗体、および好ましくはモノクローナル抗体を産生するように、２つ以上の異なる抗原で免疫される。この方法は、以下の節においてより詳細に記載される。
【００７５】
（ｉ）抗原の選別および調製
本明細書における方法は、１つ以上の異なる抗原に対して指向される抗体の調製を包含する。好ましくは、少なくとも抗原の１つ（および好ましくは、全ての抗原）は、生物学的に重要な分子であり、そして疾患もしくは障害に罹患している哺乳動物へのそれらに対する抗体の投与により、その哺乳動物において治療的利益が生じ得る。本発明の好ましい実施態様において、抗原はタンパク質である。しかし、他の非ポリぺプチド抗原（例えば、腫瘍関連糖脂質；米国特許第５，０９１，１７８号を参照のこと）が使用され得る。
【００７６】
例示的なタンパク質抗原としては、以下が挙げられる：レニンのような分子；成長ホルモン（ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む）；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォン・ビルブラント因子）；ならびに抗凝固因子（例えば、プロテインＣ）；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；プラスミノーゲンアクチベーター（例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ））；ボンベシン;トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（正常なＴ細胞の活性化に際して制御されて発現されそして分泌される）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）；Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ阻害物質；リラキシンＡ−鎖；リラキシンＢ−鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質（例えば、β−ラクタマーゼ）；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）（例えば、ＣＴＬＡ−４）；インヒビン；アクチビン；血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子のレセプター；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；ニューロトロフィン因子（例えば、骨由来ニューロトロフィン因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、もしくはニューロトロフィン−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）、または神経成長因子（例えば、ＮＧＦ−β）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含む））；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９およびＣＤ２０）；エリトロポエチン；骨誘導性因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、および−γ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原（例えば、ＡＩＤＳエンベロープ部分のような））；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）；調節タンパク質；インテグリン（例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ）；腫瘍関連抗原（例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４レセプター）；ならびに上記に列挙したポリぺプチドのいずれかの改変体および／またはフラグメント。
【００７７】
本発明に含まれる抗体の好ましい分子標的には、以下が挙げられる：ＣＤタンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３４）；ＥｒｂＢレセプターファミリーのメンバー（例えば、ＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２レセプター、ＨＥＲ３レセプターまたはＨＥＲ４レセプター）；細胞接着分子（例えば、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭおよびαｖ／β３インテグリン（そのαサブユニットまたはβサブユニット（例えば、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１８抗体または抗ＣＤ１１ｂ抗体のいずれかを含む））；増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ）；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満（ＯＢ）レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣ；アポ２Ｌレセプター（例えば、Ａｐｏ−２、ＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２）；ならびに以上に同定された分子の改変体および／またはフラグメントなど。
【００７８】
この方法において使用されるべき各抗原は、好ましくは当該分野において利用可能な精製技術を使用して、抗原の本質的に均質な調製物を形成するように精製される。使用され得る精製手順の例には、以下が挙げられる：疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニルセファロース）での分画、エタノール沈降法、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ＨＥＰＡＲＩＮ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥTMでのクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、捕獲試薬として、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体、特異的基質、リガンドまたは抗原を使用する）、またはこれらの方法のうちの２つ以上の組合せ。
【００７９】
タンパク質抗原の場合において、免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ）は、そのタンパク質（または、そのフラグメント）を免疫グロブリンＦｃ領域に融合し、そしてプロテインＡクロマトグラフィーまたはプロテインＧクロマトグラフィーによって得られた免疫付着因子を精製することによって調製され得る。
【００８０】
可溶性抗原またはそのフラグメント（必要に応じて、１つ以上の他の分子に結合されている）は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。レセプターのような膜貫通分子について、これらのフラグメント（例えば、レセプターの細胞外ドメイン）は、免疫原として使用され得る。必要に応じて、目的のタンパク質またはそのフラグメントを、異種分子と融合して、例えば以下の実施例中のような免疫付着因子を形成する。
【００８１】
低分子量の抗原（例えば、ハプテンおよび合成ペプチド）および他の抗原について、その抗原を、以下のような「キャリア分子」と結合することが望ましくあり得る：血清アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）、ウシサイログロブリン、ダイズトリプシンインヒビターまたはツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）。そのようなキャリア分子は、免疫されるべき動物において免疫原性であり得る（すなわち、それらの分子は、クラスＩＩ−Ｔ細胞レセプター結合部位を提供し得る）。カップリングは、以下のような二官能性カップリング剤を使用して達成され得る：マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2またはＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ、ここでＲおよびＲ1は、異なるアルキル基である。あるいは、またはさらに、この抗原およびキャリア分子は、融合タンパク質として生成され得る。一般に、５０アミノ酸のキャリア分子あたり約１モルのハプテンが、合理的なカップリング比である。
【００８２】
抗原は、以下によって、より抗原性にされ得る：大きなマトリクス（例えば、アガロースビーズ）にカップリングすること；細胞（例えば、赤血球）に化学カップリングすること；自己重合（例えば、ジニトロフェノールまたはアルシニル（ａｒｓｙｎｙｌ）のような化学架橋剤を用いて、または部分的変性によって）によって、抗原をより大きな化合物に変換すること；免疫複合体を調製すること；抗原をニトロセルロースに結合させること；および／または抗原を「キャリア」タンパク質（上記を参照のこと）に結合させること。
【００８３】
別の実施態様において、抗原は、細胞、細菌またはウイルス中またはそれら上に存在し、そして宿主動物は、その細胞、細菌またはウイルスで免疫される。そのような抗原は、その細胞、細菌もしくはウイルスに対してネイティブであり得るか、または合成によって（例えば、組換え技術、化学カップリングなどによって）導入されてい得る。しかし、好ましくは、動物が免疫された抗原の各々は、少なくとも１つの精製工程によって精製されている。
【００８４】
（ｉｉ）免疫
抗原で免疫されるべき動物または宿主を選択する。好ましい実施態様において、動物は、げっ歯類（例えば、マウス）である。
【００８５】
免疫されるべきマウスは、例えば米国特許第５，７２１，１２２号（本明細書中に参考として明確に援用される）に記載されるような「抗原を含まない」マウスであり得る。
【００８６】
１つの実施態様において、宿主は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座が導入されているトランスジェニック動物である。例えば、このトランスジェニック動物は、導入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を含むマウス、および内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているマウスであり得る。チャレンジの際に、そのようなトランスジェニック宿主においてヒト抗体産生が観察される。これは、すべての点（遺伝子再配置、アセンブリおよび抗体レパートリーを含む）において、ヒトにおいて見られるものと非常に類似する。このアプローチは、例えば、以下に記載されている：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；ならびに以下の科学刊行物：Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３（１９９５）。
【００８７】
宿主動物に投与される各抗原の量は、例えば約０．０１μｇ〜約２５０μｇ、好ましくは約０．１μｇ〜約１００μｇの範囲に及び得る。本発明は、宿主動物を２つ以上の異なる抗原（例えば、約２〜約１０の異なる抗原、好ましくは約３〜約４の異なる抗原）で免疫することを含む。本発明の好ましい実施態様において、宿主動物は、２つ以上の異なる抗原の混合物、および必要に応じて生理学的に受容可能な希釈剤（例えば、ＰＢＳまたは他の緩衝液）を含む組成物で免疫される。あるいは、動物は、別々に抗原で免疫され得る。組成物を調製するために使用される抗原は、好ましくは少なくとも１つの精製工程によって精製されている。
【００８８】
宿主動物は、種々の異なる方法で、抗原で免疫され得る。例えば、皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、静脈内注射および／または腹腔内注射による。さらに、リンパ系器官、膝窩リンパ節および／またはフットパッドへの注射が可能である。別々および／または同時に、２つ以上の異なる投与経路の組合せを用いて、動物を免疫することが望ましくあり得る。
【００８９】
一次応答が弱い場合、抗体力価が増加または一定状態になるまで、一定間隔で動物を追加免疫することが望ましくあり得る。免疫の後に、血清サンプル（試験採血）を取り、特定の抗体の産生をチェックし得る。好ましくは、宿主動物は、宿主動物からの免疫細胞の単離の約３〜５日前に最後の追加免疫をされる。
【００９０】
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体産生
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製され得る。ハイブリドーマ法において、ポリクローナル抗体を産生するかまたは産生し得る「免疫細胞」を、上記のように免疫した動物から得る。種々の免疫細胞は、上記の通りであり、リンパ節または脾臓は、モノクローナル抗体を作製するための好ましい免疫細胞供給源である。次いで、そのような細胞は、適切な「融合剤」（例えば、ポリエチレングリコールまたはＳｅｎｄａｉウイルス）を用いて骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成し得る（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【００９１】
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合されていない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培養培地中に播きそして増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホチボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。
【００９２】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞によって抗体の安定な高レベル産生を支持し、そして培地（例えば、ＨＡＴ培地）に感受性である細胞である。これらのうち、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導される株、ならびにアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ、ＵＳＡから入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１、ＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。２１０−ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３ラット骨髄腫細胞株もまた利用可能である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７））。
【００９３】
あるいは、ハイブリドーマ細胞株は、他の方法で、例えば、目的のモノクローナル抗体を産生する不死化された細胞株を産生するために、免疫細胞をウイルス（例えば、エプスタインバーウイルス）またはオンコジーンで不死化することによって、免疫された動物の免疫細胞から調製され得る。Ｂａｂｃｏｏｋら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９３：７８４３〜７８４８（１９９６）もまた参照のこと。これは、免疫された動物の免疫細胞を使用してモノクローナル抗体を調製するためのなお別のストラテジーのために、特定の抗体を産生する単一の細胞から免疫グロブリンｃＤＮＡをクローニングすることによる、モノクローナル抗体の産生に関する。
【００９４】
（ｉｖ）スクリーニング
各抗原に結合し得る１つ以上のモノクローナル抗体を同定するために、スクリーニングを行う。一般に、動物が免疫された各抗原に結合する抗体についてのスクリーニングが行われる。そのようなスクリーニングは、融合から生じる各ハイブリドーマの培養上清からの培養上清および／または精製された抗体に対して行われ得る。あるいは、またはさらに、スクリーニングは、クローニングされたハイブリドーマ細胞からの培養上清および／または精製された抗体を用いて行われ得る（下記を参照のこと）。さらに、交叉反応性抗体が目的である場合、モノクローナル抗体の、２つ以上の異なる抗原と交叉反応する能力が決定され得る。さらに、特定の機能的特徴（例えば、アゴニスト活性、ブロッキング活性など）を有する抗体についてスクリーニングすることが望ましくあり得る。
【００９５】
ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、例えば、イムノアッセイにおいて（例えば、免疫沈降法によって）、または他のインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ））において決定され得る。
【００９６】
使用され得るスクリーニング方法には、以下の３つの一般的なクラスが存在する：（ａ）抗体捕獲アッセイ；（ｂ）抗原捕獲アッセイ；および（ｃ）機能性スクリーニング。
【００９７】
抗体捕獲アッセイにおいて、抗原を固相に結合し得、試験されるべきモノクローナル抗体を抗原に結合させ、結合していない抗体を洗浄によって除去し、次いで結合した抗体を、例えば二次試薬（例えば、抗体を特異的に認識する標識した抗体）によって検出する。
【００９８】
抗原捕獲アッセイのために、抗原は、直接的に標識され得る（種々の標識は、本明細書中に記載される）。１つの実施態様において、試験されるべきモノクローナル抗体を固相に結合し、次いで必要に応じて標識された抗原と反応させ得る。あるいは、抗体−抗原複合体を、試験されるべきモノクローナル抗体を固相に結合する前に、免疫沈降法によって形成させ得る。一旦、抗体−抗原複合体が固相に結合されると、結合していない抗原を洗浄によって除去し得、そしてポジティブのものを、抗原を検出することによって同定し得る。
【００９９】
所望の活性を有するモノクローナル抗体を同定するための種々の機能性スクリーニングが存在する。例には、以下の例のアゴニスト活性アッセイおよびブロッキングアッセイが挙げられる：ケラチノサイト単層接着アッセイおよび混合リンパ球応答（ＭＬＲ）アッセイ（Ｗｅｒｔｈｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９８６〜４９９５（１９９６））；腫瘍増殖因子阻害アッセイ（例えば、ＷＯ８９／０６６９２に記載されるアッセイ）；抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイおよび補体媒介細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５，５００，３６２号）；ならびに造血アッセイ（ＷＯ９５／２７０６２を参照のこと）。抗体のクラス／サブクラスは、例えば二重拡散アッセイ；抗原コートプレート上での抗体捕獲；および／または抗ＩｇＧ抗体での抗体捕獲によって決定され得る。
【０１００】
目的の抗原上の特定のエピトープに結合する抗体（例えば、本明細書中に開示される抗体のいずれかの、Ａｐｏ−２Ｌレセプターへの結合をブロックする抗体）についてスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８）に記載されるアッセイのような、慣用的な交叉ブロッキングアッセイが、行われ得る。あるいは、エピトープマッピング（例えば、Ｃｈａｍｐｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８〜１３９４（１９９５）において記載されるような）は、抗体が目的のエピトープを結合するか否かを決定するために行われ得る。
【０１０１】
所望の特性、親和性および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、単一細胞クローンが、限界希釈手順（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））；拾い上げ（ｐｉｃｋ）による単一細胞クローニング；または軟らかいアガー中での増殖によるクローニング（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；２２４〜２２７頁）によってサブクローニングされ得る。
【０１０２】
ハイブリドーマクローンは、標準的な方法によって増殖され得る。この目的のための適切な培養培地は、例えばＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；第７章）。
【０１０３】
サブクローン体によって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば以下のような従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水液または血清から適切に分離される：プロテインＧまたはＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィー。
【０１０４】
（ｖ）クローニングおよびＭＡｂのさらなる改変
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離および配列決定し得る。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として作用する。一旦単離すると、このＤＮＡを、発現ベクター中に置き得、次いで宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の様式で免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞）にトランスフェクトし、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。抗体の組換え産生を、以下により詳細に記載する。
【０１０５】
また、このＤＮＡを、例えば同種マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコード配列で置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは部分を共有結合させることによって改変し得る。
【０１０６】
代表的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドを、抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、またはそれらを、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位、および異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
【０１０７】
１つの実施態様において、モノクローナル抗体はヒト化される。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、または抗体の他の抗原結合部分配列）である。ヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来の抗体に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、頻繁に「インポート（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と呼ばれ、これは、代表的には「インポート」可変ドメインから取り出される。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））に従って、ヒト抗体の対応する配列の代わりにげっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することによって行われ得る。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここで、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的により少ないドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、代表的には、いくつかの超可変領域の残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類似の部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１０８】
ヒト化抗体を作製する際に使用されるヒト可変ドメイン（重鎖および軽鎖の両方）の選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」方法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、そのげっ歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体についてのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークは、いくつかの種々のヒト化抗体のために使用され得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３））。
【０１０９】
抗体は、抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化されることがさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体を、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および種々の概念的なヒト化産物の分析のプロセスによって調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、そして当業者に精通されている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元立体構造を例示し、そして表示するコンピュータープログラムは入手可能である。これらのディスプレイの検査によって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンの、その抗原を結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。この方法で、所望の抗体の特徴（例えば、標的抗原に対する増加した親和性）が達成されるように、ＦＲ残基は、レシピエント配列およびインポート配列から選択され、そして組合せられ得る。一般に、超可変領域の残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに、直接的そしてほぼ実質的に関与する。
【０１１０】
本発明の抗体はまた、一価抗体として調製され得る。一価抗体を調製するための方法は、当該分野において周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリンの軽鎖および改変された重鎖の組換え発現を含む。一般に、重鎖の架橋を妨げるように、重鎖を、Ｆｃ領域中のいずれかの点で短縮する。あるいは、架橋を妨げるように、関連するシステイン残基を、別のアミノ酸残基で置換するか、または欠失させる。
【０１１１】
インビトロ方法もまた、一価抗体を調製するために適切である。抗体の、そのフラグメント（特に、Ｆａｂフラグメント）を生成するための消化は、当該分野において公知の慣用的な技術を用いて達成され得る。例えば、消化は、パパインを用いて行われ得る。パパイン消化の例は、ＷＯ９４／２９３４８（１９９４年１２月２２日公開）および米国特許第４，３４２，５５６号において記載されている。抗体のパパイン消化は、代表的には、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント（各々、単一の抗原結合部位を有する）、および残りのＦｃフラグメントを生じる。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、そしてなお抗原を架橋し得るＦ（ａｂ’）2フラグメントを生じる。
【０１１２】
抗体消化において生成されるＦａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ1）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ1ドメインのカルボキシ末端でのいくつかの残基の付加によって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有しているＦａｂ’についての、本明細書中での命名である。Ｆ（ａｂ’）2抗体フラグメントは、元々、ヒンジシステインを互いの間に有するＦａｂ’フラグメントの対として産生された。抗体フラグメントの他の化学カップリングもまた公知である。
【０１１３】
モノクローナル抗体を含む多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を生成することが望ましくあり得る。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。そのような分子は、通常、２つの抗原のみを結合する（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）が、三重特異性抗体のようなさらなる特異性を有する抗体が、本明細書中で使用される場合にこの表現に含まれる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2二重特異性抗体）として調製され得る。
【０１１４】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該分野において公知である。全長の二重特異性抗体の伝統的な生成は、２つの免疫グロブリンの重鎖−軽鎖対の同時発現（ここで、２つの鎖は、異なる特異性を有する）に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７〜５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな分類に起因して、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の可能性のある混合物を生成し、そのうちのわずか１つのみが、正確な二重特異性構造を有する。正確な分子の精製（これは、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によってなされる）は、むしろ煩雑であり、そして産物の収率は低い。類似の手順が、ＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：３６５５〜３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１１５】
異なるアプローチに従って、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合されている。この融合は、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメインとであり、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の部分を含む。融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望される場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別々の発現ベクターに挿入し、そして適切な宿主生物に同時トランスフェクトする。このことは、この構築において使用される等しくない比の３つのポリペプチド鎖が至適な収率を提供する実施態様において、３つのポリペプチドフラグメントの相互の比を調整することにおいて大きな柔軟性を提供する。しかし、等しい比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率を生じる場合、または比が特に有意ではない場合に、１つの発現ベクターに、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【０１１６】
このアプローチの好ましい実施態様において、二重特異性抗体は、１つのアームにおける第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）から構成される。二重特異性分子の一方の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が、分離の容易な方法を提供するので、この対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せから所望の二重特異性化合物を分離することを容易にすることが見出された。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を生成することのさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１１７】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にするように操作され得る。好ましい界面は、少なくとも、抗体定常ドメインのＣH３ドメインの一部分を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖と同じまたは類似のサイズの補償的な「空洞」が、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することによって第２の抗体分子の界面上に作製される。このことは、ホモ二量体のような他の所望されない最終生成物を超えて、ヘテロ二量体の収率を増加させるための機構を提供する。
【０１１８】
二重特異性抗体としては、架橋または「ヘテロ結合体化」された抗体が挙げられる。例えば、ヘテロ結合体中の抗体のうちの一方はアビジンに結合し、そして他方はビオチンに結合し得る。そのような抗体は、例えば、所望されない細胞へと免疫系の細胞を標的化させるため（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために提案されてきた（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）。ヘテロ結合体抗体は、任意の従来の架橋方法を使用して、作製され得る。適切な架橋剤は、当該分野において周知であり、そして多数の架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号において開示される。
【０１１９】
２つより多い原子価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１２０】
本発明はまた、細胞傷害性薬剤（例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素学的に活性な毒素、またはそのフラグメント）、または放射性同位元素（すなわち、放射性結合体）と結合体化された、本明細書中に記載の抗体を含む免疫結合体に関する。
【０１２１】
そのような免疫結合体の生成に有用な化学療法剤は上記されている。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、体外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ
ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＲＩ、ＰＡＰＩＩ，およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカカランカチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア（ｓａｐａｏｎａｒｉａ）薬用インヒビター、ジェロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトジェリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が挙げられる。種々の放射性核種が、放射性結合体抗体の産生のために利用可能である。例としては、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、および186Ｒｅが挙げられる。
【０１２２】
抗体および細胞傷害性薬剤の結合体は、以下のような種々の二官能性タンパク質結合剤を使用して作製され得る：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート（ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）  ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載のように調製され得る。炭素−１４標識された１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドの結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０１２３】
別の実施態様において、抗体は、腫瘍前標的化（ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）における利用のための「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合体化され得る。ここで、抗体−レセプター結合体は患者に投与され、次いで、キレート剤を使用して循環から未結合の結合体を除去し、次いで、細胞傷害性薬剤（例えば、放射性ヌクレオチド）に結合体化された「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
【０１２４】
抗体を含む免疫リポソームもまた調製され得る。抗体を含むリポソームは、以下に記載されるような当該分野において公知の方法によって調製される；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７７：４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号。循環時間を増加したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。
【０１２５】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含有する脂質組成物を用いて逆相エバポレーション法によって生成され得る。リポソームは、規定された孔の大きさのフィルターを通して押し出されて、所望の直径を有するリポソームを産生する。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載のようにリポソームに結合体化され得る。化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）は、必要に応じてリポソーム内に含められる。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０１２６】
本発明の抗体はまた、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤（ＷＯ８１／０１１４５を参照のこと））を活性な抗癌薬物へと変換するプロドラッグ活性化酵素に抗体を結合体化することによって、ＡＤＥＰＴ中で使用され得る。例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。
【０１２７】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫結合体の酵素成分としては、プロドラッグをより活性（細胞傷害性）な形態へと変換するような様式で、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が挙げられる。
【０１２８】
本発明の方法において有用な酵素としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルカリホスファターゼ（リン酸塩含有プロドラッグを遊離型薬物に変換するために有用）；アリールスルファターゼ（硫酸塩含有プロドラッグを遊離型薬物に変換するために有用）；シトシンデアミナーゼ（非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬物である５−フルオロウラシルに変換するために有用）；プロテアーゼ（例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびカテプシンＬ））（ペプチド含有プロドラッグを遊離型薬物に変換するために有用）；Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ（Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するために有用）；炭水化物切断酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ）（グリコシル化プロドラッグを遊離型薬物に変換するために有用）；β−ラクタマーゼ（β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離型薬物に変換するために有用）；およびペニシリンアミダーゼ（例えば、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼ）（それぞれ、それらのアミン窒素にてフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基で誘導体化された薬物を、誘導体化されていない薬物に変換するために有用）。あるいは、酵素活性を有する抗体（当該分野において、「アブザイム」としてもまた公知）を使用して、本発明のプロドラッグを活性な遊離型薬物に変換し得る［例えば、Ｍａｓｓｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照のこと］。抗体−アブザイム結合体は、腫瘍細胞増殖へのアブザイムの送達のために、本明細書中に記載されるように調製され得る。
【０１２９】
本発明の酵素は、当該分野において周知の技術（例えば、上記で議論されたヘテロ二官能性架橋試薬の使用）によって、抗体に共有結合され得る。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に結合された、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築され得る［例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照のこと］。
【０１３０】
本発明の特定の実施態様において、例えば、腫瘍穿通を増加させるために、インタクトな抗体ではなく抗体フラグメントを使用することが所望され得る。この場合、その血清半減期を増加させるために、抗体フラグメントを改変することが所望され得る。これは、例えば、この抗体フラグメント内にサルベージレセプター結合エピトープを組込むことによって（例えば、抗体フラグメント中の適切な領域を変異させることによって、またはエピトープタグ中にエピトープを組込み、次いでこれを、いずれかの末端もしくはその中間で抗体フラグメントに融合させることによって（例えば、ＤＮＡまたはペプチド合成によって））達成され得る。
【０１３１】
サルベージレセプター結合エピトープは、好ましくは領域を構成する。ここで、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループ由来の１つ以上の任意のアミノ酸残基は、抗体フラグメントの類似の位置に転移される。なおより好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループ由来の３つ以上の残基が転移される。さらにより好ましくは、エピトープは（例えば、ＩｇＧの）Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから採取され、そして抗体のＣＨ１、ＣＨ３、もしくはＶH領域、または１つより多いそのような領域に転移される。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから採取され、そして抗体フラグメントのＣL領域もしくはＶL領域、またはその両方に転移される。例えば、米国特許第５，７４７，０３５号（特に本明細書中で参考として援用される）を参考のこと。
【０１３２】
抗体の共有結合修飾は、本発明の範囲内である。これらは、化学合成によって、または、適用可能であれば抗体の酵素的もしくは化学的切断によって作製され得る。抗体の共有結合修飾の他の型は、抗体の標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基で反応し得る有機誘導体化剤と反応させることによって、分子中に導入される。
【０１３３】
抗体は、必要に応じて、１つ以上の化学基に共有結合的に連結され得るか、または結合体化され得る。例えば、ポリオルは、ＷＯ９３／００１０９に開示されるように、リジン残基を含む１つ以上のアミノ酸残基で抗体分子に結合体化され得る。必要に応じて、ポリオルは、ポリ（アルケレングルコール）（例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ））である。しかし、当業者は、他のポリオル（例えば、ポリ（プロピレングリコール）およびポリエチレン−ポリプロピレングルコールコポリマーのような）が、ポリペプチドにＰＥＧを結合体化させるための技術を用いて使用され得ることを認識する。ポリペプチドをペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）するための種々の方法が記載されている。例えば、米国特許第４，１７９，３３７号（これは、低減された免疫原性を有する生理学的に活性な組成物を産生するための、ＰＥＧおよびポリプロピレングリコールへの多数のホルモンおよび酵素の結合体化を開示する）を参照のこと。
【０１３４】
抗体はまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列（例えば、エピトープタグ）に融合または結合され得る。
【０１３５】
（Ｂ．抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体）
本発明はまた、２つ以上の異なるＡｐｏ−２Ｌレセプターと交叉反応し得る抗体を提供する。これらの交叉反応性抗体は、上記の混合抗原免疫化方法に従って（または、単一抗原（例えば、Ａｐｏ−２または別のＡｐｏ−２Ｌレセプター）で動物を免疫化することによって）調製され得るか、または以下に詳述されるような他の技術によって作製され得る。
【０１３６】
以下の実施例に記載のように、抗Ａｐｏ−２モノクローナル抗体が調製された。これらの抗体のうちの３つ（３Ｈ１．１８．１０、３Ｈ３．１４．５、および３Ｄ５．１．１０）が、ＡＴＣＣに寄託されている。１つの実施態様において、本発明のモノクローナル抗体は、抗体３Ｈ１．１８．１０、３Ｈ３．１４．５、または３Ｄ５．１．１０を産生するＡＴＣＣに寄託された３つのハイブリドーマ細胞株によって分泌される１つ以上のモノクローナル抗体と同じような生物学的特性を有する。用語「生物学的特性」は、モノクローナル抗体のインビトロおよび／またはインビボでの活性または特性（例えば、Ａｐｏ−２および／または別のＡｐｏ−２Ｌレセプターに特異的に結合する能力、あるいはＡｐｏ−２Ｌレセプター活性化を実質的にブロック、誘導、または増強する能力）をいう。必要に応じて、モノクローナル抗体は、本明細書中に開示される１つ以上の３Ｈ１．１８．１０、３Ｈ３．１４．５、または３Ｄ５．１．１０抗体と同じエピトープに結合する。モノクローナル抗体は、好ましくは、前述の抗体のうちの１つ以上の超可変領域を有する（例えば、これは、ヒト化改変体を含み得る）。
【０１３７】
抗体を得るための上記の方法（１つ以上の抗原で宿主を免疫化することによる）のほかに、他の技術が、抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体を産生するために利用可能である。例えば、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにおいて生成され得る［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９２）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）］。Ｃｏｌｅら、およびＢｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である［Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、第７７頁（１９８５）、およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）８６−９５（１９９１）］。ファージライブラリーを調製するために適切な方法は、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５（１９９４）；Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１３０：１０９−１２３（１９９２）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｔｉｂｔｅｃｈ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９７、第１５巻；Ｎｅｒｉら、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２７：４７−６１（１９９５）に概説および記載されている。単鎖抗体のライブラリーはまた、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、およびＷＯ９５／１５３８８に記載の方法によって調製され得る。抗体ライブラリーはまた、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃ．Ａ．Ｔ．）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫから市販される。
【０１３８】
（Ｃ．組換え抗体）
本発明はまた、本明細書中に開示される抗体（例えば、混合抗原免疫化によって得られるような抗体および／または抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体）をコードする単離された核酸、この核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにこのような抗体を産生するための組換え技術を提供する。
【０１３９】
抗体の組換え産生について、抗体をコードする核酸が単離され、そしてさらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、この抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に対して、特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）を使用して、容易に単離および配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分は、一般的に、以下のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。このような発現系成分の例は、米国特許第５，７３９，２７７号（１９９８年４月１４日発行）（特に本明細書中で参考して援用される）に開示される。
【０１４０】
本明細書中において、ベクター中のＤＮＡをクローニングまたは発現させるために適切な宿主細胞は、原核生物細胞、酵母細胞、または高等真核細胞である（例えば、米国特許第５，７３９，２７７号（特に本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０１４１】
宿主細胞は、抗体の産生のために、上記の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換される。そしてこれは、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切なように改変された従来の栄養培地中で培養される。
【０１４２】
本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養され得る。任意の必須サプリメントもまた、当業者に公知の適切な濃度で含有され得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用された条件であり、そしてこれは当業者に明らかである。
【０１４３】
組換え技術を使用する場合、抗体は、ペリプラズム空間において細胞内で産生され得るか、または培地中に直接的に分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１の工程として、粒子状細片（宿主細胞または溶解されたフラグメント）が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清は、一般的にまず、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過ユニット）を用いて濃縮される。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼインヒビターを、前述の工程のいずれかに含ませることによってタンパク質分解を阻害し得、そして抗生物質を含ませることによって外因性の夾雑物の増殖を阻害し得る。
【０１４４】
この細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得る。ここで、アフィニティークロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する、任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、抗体を精製するために用いられ得、これはヒトγ1、γ2、またはγ4重鎖に基づく（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスのアイソタイプおよびヒトγ3について推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合されるマトリクスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリクスは利用可能である。機械的に安定なマトリクス（例えば、制御された細孔性のガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン）は、アガロースを用いて達成され得るよりも、早い流速およびより短い処理時間を可能にする。抗体がＣH３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸTM樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が、精製のために有用である。タンパク質精製のための他の技術（例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥTM上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿）はまた、回収されるべき抗体に依存して利用可能である。
【０１４５】
（Ｄ．抗体についての治療的使用）
本明細書中に記載の抗体は、治療的有用性を有する。例えば、アゴニストのＡｐｏ−２Ｌレセプター抗体は、癌細胞におけるアポトーシスを活性化または刺激するために使用され得る。従って、本発明は、抗体（例えば、交叉反応性Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体）を用いて癌を処置するための方法を提供する。本発明の方法が、外科手術のようなさらに他の治療的技術と組み合わせて使用され得ることは、当然意図される。
【０１４６】
抗体は、好ましくは、キャリア中で哺乳動物に投与される。適切なキャリアおよびそれらの処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、１９８０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．、Ｏｓｌｏら編、に記載される。代表的には、適切な量の薬学的に受容可能な塩が処方物で使用されて、処方物を等張性にする。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、そしてより好ましくは約７〜約７．５である。さらなるキャリアは、例えば、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリクス（このマトリクスは、成形物の形態（例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子）にある）のような徐放調製物を含む。特定のキャリアが、例えば、投与の経路および投与される抗体の濃度に依存して、より好ましいものであり得ることは、当業者に明らかである。
【０１４７】
抗体は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）によって、または有効な形態での血流への送達を保証する注入のような他の方法によって、哺乳動物に投与され得る。抗体はまた、局所的ならびに全身的治療効果を及ぼすように、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内、または病変周囲経路によって投与され得る。局所的注射または静脈内注射が好ましい。
【０１４８】
抗体の投与について有効な投薬量およびスケジュールは、経験的に決定され得、そしてそのような決定をなすことは、当該技術の範囲内である。当業者は、投与されねばならない抗体の投薬量が、例えば、抗体を受容する哺乳動物、投与の経路、使用される抗体の特定の型、およびその哺乳動物に投与される他の薬物に依存して変動することを理解する。抗体の適切な用量を選択する際の指針は、抗体の治療的使用に関する文献（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｆｅｒｒｏｎｅら編、Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．（１９８５）、第２２章、および第３０３〜３５７頁；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｈａｂｅｒら編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７）第３６５〜３８９頁）において見出される。単独で使用される抗体の代表的な１日用量は、上記に言及した因子に依存して、１日あたり約１μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重以上までの範囲であり得る。
【０１４９】
抗体はまた、有効量の１つ以上の他の治療剤との組み合わせにおいて、または放射線治療と組み合わせて、哺乳動物に投与され得る。意図される治療剤としては、化学療法剤ならびに免疫アジュバントおよびサイトカインが挙げられる。抗体は、１つ以上の他の治療剤と連続的に、または同時に投与され得る。抗体および治療剤の量は、例えば、どのような型の薬物が使用されるか、処置される癌、および投与のスケジュールおよび経路に依存する。しかし、これは一般的に、各々が個々に用いられる場合よりも少ない。
【０１５０】
哺乳動物への抗体の投与後に、この哺乳動物の癌および生理学的状態が、熟練した開業医に周知の種々の様式でモニターされ得る。例えば、腫瘍塊は、物理的にか、または標準的なＸ線画像技術によって観察され得る。
【０１５１】
本発明のＡｐｏ−２Ｌレセプター抗体はまた、例えば、ＡＤＣＣの補体結合を通して、Ａｐｏ−２Ｌレセプターを発現する細胞において免疫媒介性細胞死を増強する際に有用であり得る。あるいは、拮抗性の抗Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体が、過剰なアポトーシス（例えば、神経変性疾患における）をブロックするために、またはＮＦ−κＢ活性化から生じるＡｐｏ−２の潜在的な自己免疫／炎症性効果をブロックするために使用され得る。そのような拮抗性の抗体は、上記の治療方法および治療技術に従って、利用され得る。
【０１５２】
（Ｅ．抗体についての非治療的使用）
抗体はさらに、それらの抗原についての診断的アッセイ（例えば、特定の細胞、組織、または血清におけるその発現を検出すること）において、使用され得る。当該分野において公知の種々の診断アッセイ技術（例えば、競合的結合アッセイ、直接的または間接的サンドウィッチアッセイ、および異種相または同種相のいずれかにおいて実施される免疫沈降アッセイ）が、使用され得る［Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）第１４７−１５８頁］。診断的アッセイにおいて使用される抗体は、検出可能な部分で標識され得る。検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生成し得るはずである。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、または125Ｉ）、蛍光化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリン）、または酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋わさびペルオキシダーゼ）であり得る。検出可能な部分に抗体を結合体化させるための当該分野で公知の任意の方法が使用され得、これには、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）；ならびにＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２）に記載の方法が挙げられる。
【０１５３】
抗体はまた、組換え細胞培養物または天然の供給源由来の抗原のアフィニティー精製のために有用である。このプロセスにおいて、抗体は、当該分野において周知の方法を使用して、適切な支持体（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙）に固定化される。次いで、固定化された抗体は、精製されるべき抗原を含有するサンプルと接触され、その後、支持体が、固定化された抗体に結合されるこの抗原を除いたサンプル中の実質的にすべての物質を取り除く適切な溶媒を用いて洗浄される。最終的に、この支持体は、抗体から抗原を放出する別の適切な溶媒を用いて洗浄される。
【０１５４】
（Ｆ．抗体を含むキット）
本発明のさらなる実施態様では、例えば、上記の治療的または非治療的適用に使用され得る抗体を含む、製品およびキットが提供される。製品は、ラベルを有する容器を備える。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、および試験管が挙げられる。この容器は、ガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成され得る。この容器は、上記のような、治療的または非治療的適用のために有用である活性薬剤を含む組成物を収容する。この組成物中のこの活性薬剤は、抗体（例えば、Ａｐｏ−２Ｌレセプター抗体）である。容器のラベルは、この組成物が、特定の治療的または非治療的適用のために使用されることを示し、そしてまた、上記のような、インビボまたはインビトロのいずれかでの使用についての指示を示し得る。
【０１５５】
本発明のキットは、代表的に、上記の容器、および商業的観点および使用者の観点から望ましい材料（緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用のための指示を有するパッケージインサートを含む）を含む１以上の他の容器を備える。
【実施例】
【０１５６】
以下の実施例は、例示の目的のためにのみ提供され、そしていかなる様式においても本発明の範囲を限定することは決して意図しない。
【０１５７】
本明細書中に引用される全ての特許および文献の参考文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１５８】
（実施例１：免疫原の調製）
以下の実施例２および実施例３のレセプター抗原は全て、Ａｐｏ−２リガンドについてのレセプターである［Ｐｉｔｔｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１２６８７−１２６９０（１９９６）；およびＷ０９７／２５４２８］。Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、以下であった：ＤＲ４［Ｐａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１１−１１３（１９９７）］；Ａｐｏ−２［Ｓｈｅｒｉｄａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：８１８−８２１（１９９７）において「ＤＲ５」と呼ばれる］；ＤｃＲ１［Ｓｈｅｒｉｄａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：８１８−８２１（１９９７）］；およびＤｃＲ２［Ｍａｒｓｔｅｒｓら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，７：１００３−１００６（１９９７）］。
【０１５９】
レセプター免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎｓ）（「ＤＲ４−ＩｇＧ」、「Ａｐｏ−２−ＩｇＧ」、「ＤｃＲ１−ＩｇＧ」、および「ＤｃＲ２−ＩｇＧ」と称される）を、各レセプターの細胞外ドメイン配列を、以前［Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）］に記載されたようにｐＲＫ５中の、ヒト免疫グロブリンＧ1重鎖のヒンジ領域およびＦｃ領域に融合することにより調製した。免疫付着因子タンパク質は、ヒト２９３細胞への一過性トランスフェクションによって発現され、そしてＡｓｈｋｅｎａｚｉら（前出）によって記載されるように、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって細胞上清から精製された。精製された免疫付着因子を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁した。
【０１６０】
（実施例２：混合抗原免疫）
本実施例における動物を、上記の実施例の４つのレセプター免疫付着因子で免疫した。用いた混合抗原免疫スキームを、図１に示す。
【０１６１】
Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した）を、１：１の免疫付着因子：アジュバント比でモノホスホリルリピドＡ＋トレハロースジコリノミコレートアジュバント（ＭＰＬ−ＴＤＭ；Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）中に懸濁したＤＲ４−Ｉ、Ａｐｏ−２−ＩｇＧ、ＤｃＲ１−ＩｇＧおよびＤｃＲ２−ＩｇＧの混合物（各１μｇ）を用いて各後肢パッドに３〜４日間の間隔で１４回免疫した（ＤｃＲ２−ＩｇＧは、６回目の最後の免疫のための混合物にのみ含まれていた）。
【０１６２】
最後のブーストの３日後、膝窩リンパ節細胞節をこれらのマウスから取り出し、そして単一細胞懸濁物を、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔａｋｋｅｒ  Ｃｏｒｐ．から入手した）中に調製した。リンパ節細胞を、３５％ポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ．１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５９７）に融合し、そして９６ウェル培養プレート中で培養した。
【０１６３】
ハイブリドーマを、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、および１６μＭチミジン（１×ＨＡＴ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するスーパーＤＭＥＭ［ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１０％  ＮＣＴＣ−１０９（ＢｉｏＷｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１００ｍＭピルベート、１００Ｕ／ｍｌインスリン、１００ｍＭオキサロ酢酸、２ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン］中で選択した。
【０１６４】
融合１０日後、１８０μｌの各ハイブリドーマ培養上清を、３つの異なる抗原に対する抗体（すなわち、ＤＲ４−ＩｇＧ、Ａｐｏ−２−ＩｇＧおよびＣＤ４−ＩｇＧコントロール）の存在について捕獲ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングした。ハイブリドーマ細胞に、１０％  ＦＣＳおよび抗生物質を含む２００μｌのスーパーＤＭＥＭを再度供給した。２日後、１８０μｌの培養上清を収集し、そして別の２つの異なる抗原に対する抗体（すなわち、ＤｃＲ１−ＩｇＧおよびＤｃＲ２−ＩｇＧ）の存在について捕獲ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡの結果を慎重に調べた後に、各抗原に対するモノクローナル抗体を分泌する潜在的にポジティブなハイブリドーマを、限界希釈法を用いて２回クローン化した。これらのクローンから得た培養上清を、特定の抗原に結合するが他の抗原（ＣＤ４−ＩｇＧを含む）には結合しない能力について、捕獲ＥＬＩＳＡにおいて再度試験した。抗体のアイソタイプもまた決定した。
【０１６５】
選択されたクローンもまた、（ａ）細胞膜上に発現されるＡｐｏ−２Ｌレセプターを認識する能力についてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって；（ｂ）リガンド−レセプター相互作用をブロックする能力について、および（ｃ）アゴニスト活性について試験した。
【０１６６】
（実施例３：単一抗原免疫）
単一抗原免疫スキームを、図２に示す。一般的な方法は、単一抗原のみを免疫原として用い、そしてハイブリドーマのスクリーニングの間に、特定の抗原およびコントロールのＣＤ４−ＩｇＧに対するポジティブなモノクローナル抗体の存在についてスクリーニングするために上清（１８０μｌ）を１回しか収集しなかったこと以外は、上記の実施例２における混合抗原免疫プロトコルとほぼ同じであった。
【０１６７】
Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した）を、０．５μｇ／５０μｌの免疫接着因子タンパク質（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴから購入したＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント中に希釈した）を各後肢のパッドに３〜４日間の間隔で１０回注射することによって免疫した。最後のブーストの３日後、膝窩リンパ節をマウスから取り出し、そして単一細胞懸濁物を、１％ペニシリンーストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔａｋｋｅｒ  Ｃｏｒｐ．から入手した）中に調製した。次いで、リンパ節細胞を、３５％ポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ．１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５９７）に融合し、そして９６ウェル培養プレート中で培養した。融合物から得られるハイブリドーマを、実施例２においてと同様にＨＡＴ培地中で選択した。融合の１０日後、ハイブリドーマ培養上清（１８０μｌ）を、ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングして、免疫接着因子タンパク質に結合しているモノクローナル抗体の存在について試験した。
【０１６８】
（実施例４：捕獲ＥＬＩＳＡ）
捕獲ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ；Ｎｕｎｃ，Ｋａｍｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ＰＢＳ中の５０μｌの２μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した）を各ウェルに添加し、そして４℃にて一晩インキュベートすることによりコーティングした。次いで、このプレートを、洗浄緩衝液（０．０５％  ＴＷＥＥＮ  ２０TMを含むＰＢＳ）を用いて３回洗浄した。次いで、マイクロタイタープレート中のウェルを、ＰＢＳ中の５０μｌの２．０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロックし、そして室温にて１時間インキュベートした。次いで、このプレートを、洗浄緩衝液を用いてさらに３回洗浄した。
【０１６９】
洗浄工程の後、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％  ＢＳＡ）中の５０μｌの１μｇ／ｍｌの免疫付着因子タンパク質（上記の通り）を各ウェルに添加した。このプレートを、シェーカー装置上で室温にて１時間インキュベートし、その後、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄した。
【０１７０】
洗浄工程後、１００μｌのハイブリドーマ上清または精製された抗体（プロテインＧ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いる）（１μｇ／ｍｌ）を、指定されたウェルに添加した。１００μｌのＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１骨髄腫細胞馴化培地を、他の指定されたウェルにコントロールとして添加した。このプレートを、シェーカー装置上で室温にて１時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液を用いて３回洗浄した。
【０１７１】
次いで、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ中の０．５％ウシ血清アルブミン、０．０５％  ＴＷＥＥＮ  ２０TM、０．０１％  Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）中に１：１０００に希釈した５０μｌのＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ（Ｃａｐｐｅｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入される）を、各ウェルに添加し、そしてこのプレートを、シェーカー装置上で室温にて１時間インキュベートした。このプレートを、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄し、続いて５０μｌの基質（ＴＭＢミクロウェルペルオキシダーゼ基質、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を各ウェルに添加し、そして室温にて１０分間インキュベートした。この反応を、５０μｌのＴＭＢ  １成分停止溶液（ジエチルグリコール、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ）を各ウェルに添加することによって停止させ、そして４５０ｎｍでの吸光度を自動マイクロタイタープレートリーダーにおいて読み取った。
【０１７２】
（実施例５：抗体のアイソタイプ分類）
抗体のアイソタイプを、アイソタイプ特異的ヤギ抗マウスＩｇ（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いてマイクロタイタープレートを４℃にて一晩コーティングすることにより決定した。次いで、このプレートを、洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、マイクロタイタープレート中のウェルを、２００μｌの２％ウシ血清アルブミンを用いてブロックし、そして室温にて１時間インキュベートした。このプレートを、洗浄緩衝液を用いてさらに３回洗浄した。次に、１００μｌのハイブリドーマ培養上清または５μｇ／ｍｌの精製抗体を、指定のウェルに添加した。このプレートを、室温にて３０分間インキュベートし、次いで５０μｌのＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（上記の通り）を各ウェルに添加した。このプレートを、室温にて３０分間インキュベートした。このプレートに結合したＨＲＰのレベルを、上記の通りにＨＲＰ基質を用いて検出した。
【０１７３】
（実施例６：フローサイトメトリー）
ＦＡＣＳ分析を、９Ｄ細胞（Ａｐｏ−２およびＤＲ４を発現するヒトＢリンパ球細胞株；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）またはＤｃＲ１およびＤｃＲ２を発現するヒト微小血管内皮（ＨＵＭＥＣ）細胞（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。セルソーター緩衝液（１％  ＦＣＳおよび０．０２％  ＮａＮ3を含むＰＢＳ）中の２５μｌの細胞懸濁物（４×１０6細胞／ｍｌ）を、Ｕ底型マイクロタイターウェルに添加し、セルソーター緩衝液（ＣＳＢ）中の１００μｌの培養上清または精製モノクローナル抗体（プロテイン−Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上に精製される）（１０μｇ／ｍｌ）と混合し、そして氷上で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、１００μｌのＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧとともに４℃にて３０分間インキュベートした。細胞をＣＳＢ中で２回洗浄し、そして１５０μｌのＣＳＢ中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって分析した。
【０１７４】
（実施例７：Ａｐｏ−２Ｌ誘導性アポトーシスをブロックする抗体の能力についてのアッセイ）
ハイブリドーマ上清および精製抗体を、Ａｐｏ−２リガンド誘導性９Ｄ細胞アポトーシスをブロックする能力について試験した。ヒト９Ｄ細胞（５×１０5細胞）を、Ｆａｌｃｏｎ  ２０５２チューブ中の５０μｌの完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ＋１０％  ＦＣＳ、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびにピルビン酸ナトリウム）中に懸濁した。２００μｌの培地中の１０μｇの抗体＋１０μｇのＤＲ４抗体を細胞に添加し、そして細胞を氷上で１５分間インキュベートした。２５０μｌの完全ＲＰＭＩ中の０．５μｇのＡｐｏ−２Ｌ（ＷＯ  ９７／２５４２８に記載される通りに調製される可溶性Ｈｉｓタグ化Ａｐｏ−２Ｌ；Ｐｉｔｔｉら、前出もまた参照のこと）を、細胞に添加した。９Ｄ細胞を、７％ＣＯ2の存在下にて３７℃にて一晩インキュベートした。細胞を回収し、そしてＰＢＳ中で１回洗浄した。次いで、細胞の生存率を、製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の推奨に従い、ホスファチジルセリンに結合しているＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖの染色によって決定した。手短には、ＰＢＳ中で洗浄した細胞を、２００μｌの結合緩衝液中に再懸濁した。１０μｌのＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ（１μｇ／ｍｌ）および１０μｌのヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）を、細胞に添加した。暗所での１５分間のインキュベーションの後、細胞をＦＡＣＳｃａｎによって分析した。
【０１７５】
（実施例８：抗マウスＩｇとの架橋後のモノクローナル抗体によるアポトーシス）
５０μｌの完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ＋１０％  ＦＣＳ、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびにピルビン酸ナトリウム）中のヒト９Ｄ細胞（２．５×１０5細胞）を、Ｆａｌｃｏｎ  ２０５２チューブに添加した。次いで、細胞を、１００μｌの完全ＲＰＭＩ培地中の１μｇのモノクローナル抗体とともに氷上で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を、３５０μｌの完全ＲＰＭＩ培地中の１０μｇのヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃとともに３７℃にて一晩インキュベートした。ＰＢＳでの１回の洗浄後、細胞を、０．５％  ＢＳＡを含む２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、そして１０μｌのＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎおよび１０μｌのヨウ化プロピジウムとともに暗所で１５分間インキュベートした。次いで、死んだ細胞を、上記の通りにＦＡＣＳｃａｎによって検出した。
【０１７６】
（結果および考察）
図３および図４は、混合抗原で免疫したマウス（図４）に対する、単一抗体で免疫したマウス（図３）からの抗原特異的血清力価の比較を提供する。
【０１７７】
各々の抗原で免疫したマウスからの血清力価（ＥＣ５０）は、各々の特異的抗原について約１０，０００であった。混合抗原で免疫したマウスの抗原特異的血清力価（ＥＣ５０）は、ＤＲ４−ＩｇＧ、Ａｐｏ−２−ＩｇＧ、ＤｃＲ１−ＩｇＧについて約１０，０００であり、そしてＤｃＲ２−ＩｇＧについて約５，０００であった。従って、この抗原特異的抗体力価は、マウスを個々の抗原で免疫したか、または４つの異なる抗原の混合物で免疫したかによらず、極めて同等であった。４つの異なる抗原で免疫したマウスのＤｃＲ２−ＩｇＧ特異的力価（約１：４，０００）は、ＤｃＲ２−ＩｇＧ単独で免疫したマウスのＤｃＲ２−ＩｇＧ特異的力価（約１：１０，０００）よりもわずかに低かった。しかし、これは、混合抗原で免疫したマウスは、ＤｃＲ２−ＩｇＧを６回しか受けなかったが、ＤｃＲ２−ＩｇＧ単独で免疫されたマウスは、１０回の注射を受けたという事実に起因し得る。
【０１７８】
【表１】
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表１は、混合抗原で免疫したマウスに対して、単一抗原で免疫したマウスを用いてのＤＲ４、Ａｐｏ−２、およびＤｃＲ２に対するモノクローナル抗体の作製の有効性を比較する。両方の方法を用いてモノクローナル抗体を作製し得る。しかし、混合抗原免疫スキームは、異なるレセプターと交叉反応する（すなわち、２つのタンパク質間で共有されるエピトープを認識する；表１を参照のこと）、より多くの抗体の生成および単離をもたらした。詳細には、混合抗原免疫プロトコルを用いて、異なるＡｐｏ−２Ｌレセプターと交叉反応する抗体を同定した。捕獲ＥＬＩＳＡによって決定した場合の交叉反応性を、表２に示す。
【０１７９】
【表２】
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図６Ｃおよび表２に示すように、３Ｄ５．１．１０抗体は、Ａｐｏ−２に特異的に結合し、そしてＤＲ４と特異的に交叉反応した。抗体３Ｈ１．１８．１０および３Ｈ３．１４．５は、Ａｐｏ−２を特異的に結合し、そして試験した他のＡｐｏ−２Ｌレセプターとのいくらかの交叉反応性を提示した（表２ならびに図６Ａおよび図６Ｂ）。表２からの抗体の他の生物学的活性を、実施例６（細胞表面レセプターに対する抗体結合）；実施例７（ブロッキング能力または中和能力）；および実施例８（アポトーシス活性）に記載される方法に従って評価した。結果を以下の表３に示す。
【０１８０】
【表３】
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３つの抗体全ては、９Ｄ細胞の表面上に発現されたＡｐｏ−２を結合し得た。３Ｈ３．１４．５抗体はまた、Ａｐｏ−２ＬとＡｐｏ−２との間の相互作用を介して誘導されるアポトーシスを阻害し得た。この抗体はさらに、抗体を架橋する抗Ｆｃ抗体の存在下で９Ｄ細胞のアポトーシスを誘導し得た。
【０１８１】
（材料の寄託）
以下の材料を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した：
【０１８２】
【表４】
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この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項およびそれに基づく規則（ブダペスト条約）に拠って行われた。このことは、寄託日から３０年間の寄託物の生存可能な培養物の維持を保証する。この寄託は、ブダペスト条約の条項に基づいてＡＴＣＣによって利用可能にされ、そしてＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間の合意を受けなければならず、この合意は、関連する米国特許の発行によって、またはいずれかの米国もしくは外国特許出願の公共への公開のいずれか速い方によって、寄託培養物の子孫の公共への永続的かつ制限されない利用可能性を保証し、そして米国特許法１２２条およびそれに従う長官の規則（８８６  ＯＧ  ６３８を特に参照して、米国特許法施行規則１．１４を含む）に基づいて権利を与えられる米国特許商標庁長官によって決定されたものへのこの子孫の利用可能性を保証する。
【０１８３】
本特許出願の譲受人は、適切な条件下で培養した場合に寄託材料の培養物が、死滅するか、失われるか、または破壊された場合、この材料が、通知により、同一材料の別のもので迅速に置き換えられることに合意した。この寄託材料の利用可能性は、いずれかの政府機関の下でその特許法に従って与えられる権利に違反して本発明を実施することのライセンスであるとは解釈されない。
【０１８４】
上記の詳細な説明は、当業者が本発明を実施するのを可能にするに充分であると考えられる。本発明は、寄託された構築物による範囲に限定されない。なぜなら、寄託された実施態様は、本発明の特定の局面の１つの例示として意図され、そして機能的に等価である任意の構築物が本発明の範囲内にあるからである。本明細書中の寄託材料は、本明細書中に含まれる詳細な説明が本発明のいずれかの局面（本発明の最良の形態を含む）の実施を可能にするのに不適切であることについての承認を構成せず、かつ寄託材料が示す特定の例示へと特許請求の範囲の範囲を限定するとも解釈されない。実際、本明細書中に示され、かつ記載されたものに加えて、本発明の種々の改変は、上記の説明から当業者に明らかになり、そして添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【配列表】
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