(57)【要約】      （修正有）【課題】出芽酵母を用いるＧｅｎｅｔｉｃ−Ｔａｇ−ｏｆ−Ｗａｒ（ｇＴＯＷ）法を広く様々な標的遺伝子に適用できるようにするためのサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターの提供。【解決手段】マーカー遺伝子としてのｌｅｕ２ｄ遺伝子と、前記ｌｅｕ２ｄ遺伝子の発現を制御するプロモーター領域として特定の塩基配列のうち３´末端側の１塩基または２以上の塩基部分とを少なくとも有する、サッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。【選択図】図７
2009112271.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マーカー遺伝子としてのｌｅｕ２ｄ遺伝子と、
前記ｌｅｕ２ｄ遺伝子の発現を制御するプロモーター領域として配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち３´末端側の１塩基または２以上の塩基部分とを
少なくとも有することを特徴とする、サッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
【請求項２】
第２のマーカー遺伝子としてＵＲＡ３遺伝子を有することを特徴とする、請求項１に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
【請求項３】
ＥＧＦＰ遺伝子を更に含む、請求項１または２に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
【請求項４】
複製起点として２ミクロンＯＲＩを有する請求項１〜３のいずれか一項に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
【請求項５】
プラスミド安定化配列としてＲＥＰ３遺伝子を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
【請求項６】
標的遺伝子クローニング部位、前記ＵＲＡ３遺伝子、前記ＥＧＦＰ遺伝子、前記２ミクロンＯＲＩ、前記ＲＥＰ３遺伝子、前記プロモーター領域、前記ｌｅｕ２ｄ遺伝子をこの順序で含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
【請求項７】
配列番号２に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３５、配列番号３に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３６、配列番号４に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３７、配列番号５に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３８、配列番号６に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３９、配列番号７に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８４０、配列番号８に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８４１、配列番号９に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８４２、および配列番号４２に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２から選ばれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを含むサッカロミセス属微生物。
【請求項９】
標的遺伝子を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを、ロイシン要求性のサッカロミセス属微生物に導入しロイシン無添加の培地で培養する工程、および
導入細胞内でのプラスミドベクターの最大コピー数を測定する工程、
を少なくとも有することを特徴とする標的遺伝子の最大発現強度の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サッカロミセス属微生物用プラスミドベクターに関し、詳しくは、Ｇｅｎｅｔｉｃ−Ｔａｇ−ｏｆ−Ｗａｒ（ｇＴＯＷ：遺伝子綱引き）法において測定の精度を高めることのできるサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロバストネス（頑健性）は、外乱、内乱などさまざまな摂動に抗って機能を維持しようとするシステムの特性であり、生命現象に普遍的に見られる特徴である。従来、ロバストネスは淘汰圧を受けながら進化してきた複雑なシステムである生命システムの基本特性と考えられていた。生命のロバストネスは、生命をシステムレベルで扱ったときのみそれを実現するための原理の議論が可能になるため、近年急速に発展しているシステムレベルでの生命研究によりようやくその原理が理解されるようになってきた。生命のロバストネスを知ることにより、生命システムの基本原理の解明、コンピューター細胞モデルの開発、疾患に対する新たな治療手段の提供が可能になることが提唱されてきた。
【０００３】
これまでの生命のロバストネスについての研究は、そのほとんどが理論的な研究に留まっていた。これは、実際の細胞のロバストネスを検定する有効な実現技術がなかったことがその大きな原因の一つである。
【０００４】
非特許文献１では、出芽酵母を用いた細胞システムのロバストネスを検定する実験技術である、Ｇｅｎｅｔｉｃ−Ｔａｇ−ｏｆ−Ｗａｒ（ｇＴＯＷ：遺伝子綱引き）法を開発し、出芽酵母の細胞周期の遺伝子過剰発現に対するロバストネス・プロファイルの測定に成功した。
ｇＴＯＷ法の原理は、図１に示すとおりである。ｌｅｕ２ｄ遺伝子を持つ多コピーのプラスミドｐＳＢＩ４０上に標的の遺伝子をクローニングし、このプラスミドをロイシン要求性の出芽酵母に導入し、ロイシンのない培地で増殖させると、より高いプラスミドコピー数を持つ細胞がより高い増殖速度を持つために濃縮され、最終的には細胞あたり１００コピー以上のプラスミドコピー数を持つ細胞が濃縮される。プラスミドコピー数は、標的遺伝子とｌｅｕ２ｄ遺伝子のコピー数上昇のバイアスの引き合った地点に比例するが、ｌｅｕ２ｄ遺伝子のコピー数の上昇のバイアスは一定であるため、標的遺伝子のコピー数の上限がプラスミドコピー数に反映される。そのため、ｇＴＯＷ法によれば、導入された標的遺伝子が関わる細胞システムのロバストネスを知ることができる。言い換えれば、標的遺伝子の細胞システムに対する影響の大きさを知ることができる。
【０００５】
【非特許文献１】Ｈｉｓａｏ  Ｍｏｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．ＰｌｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌｕｍｅ２  Ｉｓｓｕｅ  ７  ＪＵＬＹ  ２００６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記非特許文献１の手法では、ｇＴＯＷ法において標的遺伝子のプラスミドコピー数を高めるバイアスが強すぎるとき、或いは弱すぎるときには、標的遺伝子のコピー数の上限を正確に定めることが困難であった。
本発明の目的は、出芽酵母を用いるｇＴＯＷ法を広く様々な標的遺伝子に適用できるようにするための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた。その結果、ｌｅｕ２ｄ遺伝子と共に、該遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部を挿入したプラスミドを用いることにより、ｌｅｕ２ｄ遺伝子のコピー数を適度に制御し、ｇＴＯＷ法において標的遺伝子を導入した場合にプラスミドのコピー数を正確に測定できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を提供するものである。
〔１〕  マーカー遺伝子としてのｌｅｕ２ｄ遺伝子と、前記ｌｅｕ２ｄ遺伝子の発現を制御するプロモーター領域として配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち３´末端側の１塩基または２以上の塩基部分とを少なくとも有することを特徴とする、サッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
〔２〕  第２のマーカー遺伝子としてＵＲＡ３遺伝子を有することを特徴とする、〔１〕に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
〔３〕  ＥＧＦＰ遺伝子を更に含む、〔１〕または〔２〕に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
〔４〕  複製起点として２ミクロンＯＲＩを有する〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
〔５〕  プラスミド安定化配列としてＲＥＰ３遺伝子を有する〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
〔６〕  標的遺伝子クローニング部位、前記ＵＲＡ３遺伝子、前記ＥＧＦＰ遺伝子、前記２ミクロンＯＲＩ、前記ＲＥＰ３遺伝子、前記プロモーター領域、前記ｌｅｕ２ｄ遺伝子をこの順序で含む〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
〔７〕  配列番号２に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３５、配列番号３に記載のｐＴＯＷｕｇ２−８３６、配列番号４に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３７、配列番号５に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３８、配列番号６に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３９、配列番号７に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８４０、配列番号８に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８４１、配列番号９に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８４２、および配列番号４２に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２から選ばれる、〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクター。
〔８〕  〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを含むサッカロミセス属微生物。
〔９〕  標的遺伝子を含む〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを、ロイシン要求性のサッカロミセス属微生物に導入しロイシン無添加の培地で培養する工程、および導入細胞内でのプラスミドベクターの最大コピー数を測定する工程、を少なくとも有することを特徴とする標的遺伝子の最大発現強度の評価方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、サッカロミセス属微生物を用いるｇＴＯＷ法において、プラスミドのコピー数の正確な測定を可能とするプラスミドが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターは、マーカー遺伝子としてのｌｅｕ２ｄ遺伝子と、ｌｅｕ２ｄ遺伝子の発現を制御するプロモーター部位とを少なくとも含むことを特徴とする。
【００１１】
ｌｅｕ２ｄはサッカロミセス属微生物に由来し、ロイシン生合成遺伝子ＬＥＵ２のアレルであり、プロモーターにおいて大きな欠失を持つため、ＬＥＵ２と比較して非常に活性が低い。本発明においてｌｅｕ２ｄ遺伝子は、プラスミド作成の際の選択の際有用であると共に、ｇＴＯＷ法実施の際にプラスミドコピー数を上げようとする遺伝的選択圧として働く。ｌｅｕ２ｄ遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号１０に記載するとおりである。配列表の配列番号Ａに記載の塩基配列のうち、塩基番号２９〜１１２３がＬＥＵ２遺伝子のＯＲＦである。
【００１２】
さらに、本発明のプラスミドベクターは、上記のｌｅｕ２ｄ遺伝子の発現を制御するプロモーター領域を含む。このプロモーター領域は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち３´末端側の１塩基または２以上の塩基、好ましくは１０〜５００、より好ましくは２０〜４００塩基を有する。例えば、配列番号１に記載の塩基配列中の１５８〜５００塩基番号の部分、好ましくは２３２〜５００塩基番号の部分を有する。このプロモーター領域によりｌｅｕ２ｄ遺伝子の発現量が制御されるので、標的遺伝子のコピー数に応じたプラスミドとすることができる。配列番号１中の２９２〜３２２番目（ＬＥＵ２  ＯＲＦから−１９８〜−１８９番目）は、Ｌｅｕ３ｐ結合部位であるが、この結合部位は含まれていない方がこのましい。プロモーター領域の塩基長が長い場合（好ましくは、配列番号１の２９２〜５００塩基番号の部分を含む場合）には、ｌｅｕ２ｄ遺伝子のコピー数増大バイアスが減少する。一方、プロモーター領域の塩基長が短い場合（好ましくは、配列番号１の３２２〜５００塩基番号の部分を含む場合）には、ｌｅｕ２ｄ遺伝子のコピー数増大バイアスが増大する。よって、ｇＴＯＷ法においてコピー数の上限が低い標的遺伝子を導入する際にはプロモーター領域の塩基長が長くなるように調整することが有用である。一方、ｇＴＯＷ法においてコピー数の上限が高い標的遺伝子を導入する際にはプロモーター領域の塩基長が短くなるように調整することが有用である。
【００１３】
本発明のプラスミドベクターは、ｌｅｕ２ｄ遺伝子とは別に第２のマーカー遺伝子として、ＵＲＡ３遺伝子を有することが好ましい。ＵＲＡ３遺伝子はウラシル合成酵素（Ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５´−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＯＭＰ）ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）に関する遺伝子であるから、本発明のプラスミドベクターがＵＲＡ３遺伝子を有することにより、ウラシルを含まない選択培地での選択が可能となる。ＵＲＡ３遺伝子の配列は配列番号１１に示すとおりである。
更に、本発明のプラスミドベクターは、ＨＩＳ３遺伝子、ＭＥＴ１５遺伝子、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＥ２遺伝子など他のマーカー遺伝子を含むものであってもよい。
【００１４】
本発明において、プラスミドベクターに導入され得る遺伝子（標的遺伝子（目的遺伝子））には特に制限はないが、通常は宿主のサッカロミセス属微生物の遺伝子である。本発明のプラスミドの標的遺伝子クローニング部位は、プラスミドを構成する要素を破壊しない部位であればどこでもよく、１箇所であってもよいし２箇所以上であってもよい。また、標的遺伝子のサイズにも特に制限はない。
【００１５】
本発明のプラスミドベクターはレポータータンパク質遺伝子を含むものであってもよい。これにより、コピー数の評価をフローサイトメトリーなどにより容易に行うことができる。レポータータンパク質としては例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ホタル・ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＥＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）、ヒト分泌型アルカリ性ホスファターゼなどが挙げられる。このうち、ＥＧＦＰが最も好ましい。レポータータンパク質遺伝子のプラスミド内の位置は、ＵＲＡ３遺伝子の直後であることが好ましい。ＥＧＦＰの塩基配列は、配列表の配列番号１２に示すとおりである。
【００１６】
標的遺伝子とは、本発明のプラスミドベクターを用いて遺伝子コピー数の上限をしろうとする遺伝子である。標的遺伝子の由来、サイズなどは特に限定されないが、通常は、宿主の出芽細胞由来の遺伝子である。また、標的遺伝子のサイズは、８ｋｂ程度のものまで挿入することが可能である。
【００１７】
本発明のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターは、サッカロミセス属微生物の細胞内で自己複製する能力（染色体に組み込まれずとも複製を自立的に続ける能力）をプラスミドに与える働きをするための複製起点を持つ。このような複製起点としては、２ミクロンＯＲＩをはじめとする出芽酵母のＡＲＳ（自立複製起点）などが挙げられる。２ミクロンＯＲＩの塩基配列は、配列表の配列番号１３に示すとおりである。
【００１８】
また、本発明のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターは、その目的に反しない限りにおいて、薬剤耐性遺伝子などの他のマーカー遺伝子、プラスミド安定化配列、外来遺伝子など一般的なプラスミドに含まれる配列や遺伝子領域を含んでいてもよい。
【００１９】
薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）、ゲンタマイシン耐性遺伝子（ＧｍＲ）、カナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＭＸ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｃＲ）等が挙げられ、これらのうちから単独でまたは複数組み合わせて含有させることができる。このうち、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）遺伝子が好ましい。
【００２０】
プラスミド安定化配列としては、ＲＥＰ３を挙げることができる。ＲＥＰ３の塩基配列は、配列表の配列番号１４に示すとおりである。
【００２１】
その他の外来遺伝子としては、大腸菌など他の生物由来の自己複製配列（例えばｐＢＲ３２２  ｏｒｉｇｉｎ、その他ｐＡＣＹＣ系プラスミドの複製起点）などを挙げることができる。ｐＢＲ３２２  ｏｒｉｇｉｎを挿入することにより、プラスミドを増加し、その状態で大腸菌内で維持することができる。
【００２２】
本発明のプラスミドにおいて、上記構成要素の配置に特に制限はないが、標的遺伝子クローニング部位、前記ＵＲＡ３遺伝子、前記ＧＦＰ遺伝子、前記２ミクロンＯＲＩ、前記ＲＥＰ３遺伝子、前記プロモーター領域、前記ｌｅｕ２ｄ遺伝子をこの順序で含むことが好ましい。
本発明のプラスミドベクターの具体例としては、配列番号２に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３５、配列番号３に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３６、配列番号４に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３７、配列番号５に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３８、配列番号６に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８３９、配列番号７に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８４０、配列番号８に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８４１、配列番号９に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２−８４２、配列番号４２に記載の塩基配列を有するｐＴＯＷｕｇ２を挙げることができる。それぞれのプラスミドの、標的遺伝子を導入しない状態でのロイシン無添加培地でのコピー数（細胞あたりのコピー数を意味する。以下同じ。）は、ｐＴＯＷｕｇ２は１５０程度、ｐＴＯＷｕｇ２−８３５は１３０程度、ｐＴＯＷｕｇ２−８３６は２３０程度、ｐＴＯＷｕｇ２−８３７は８０程度、ｐＴＯＷｕｇ２−８３８は１９０程度、ｐＴＯＷｕｇ２−８３９は１４０程度、ｐＴＯＷｕｇ２−８４０、ｐＴＯＷｕｇ２−８４１およびｐＴＯＷｕｇ２−８４２は２０以下である。また、ｐＴＯＷＩｇおよびｐＴＯＷｕｇも、ｇＴＯＷ法に用いることができるので本発明のプラスミドベクターの具体例ではあるが、測定において手間を要するおそれがある（実施例１参照）。
これらのうち、ｐＴＯＷｕｇ２−８３６、ｐＴＯＷｕｇ２−８３７は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１０日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、２００７年１０月２６日付でそれぞれ受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−４４７、ＮＩＴＥ  Ｐ−４４８で寄託されており、分譲可能である。
【００２３】
本発明のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターの作製は、各構成要素である遺伝子や配列を他のプラスミドなどから切り出して必要に応じてＰＣＲなどにより増幅するか、或いは人工的に合成した後、サッカロミセス属微生物内での相同組替えなどにより連結して作製することができる。また、各構成要素である遺伝子や配列を、サッカロミセス属微生物内での相同組替えなどにより骨格となるプラスミドに導入して作成してもよい。ｌｅｕ２ｄ遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＲＥＰ３遺伝子、２ミクロンＯＲＩはサッカロミセス属微生物プラスミドｐＳＢ１４０より得ることができる。ＥＧＦＰ遺伝子はｐＫＴ１２８からＥＧＦＰ−ｓｐｈｉｓ５ＭＸ（ヒスチジン合成酵素（ｉｍｉｄａｚｏｌｅｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子）断片として得ることができる。
【００２４】
サッカロミセス属微生物としては、特に制限なく様々な菌株を用いることができ、特に出芽酵母、すなわちサッカロミセス・セレビシエが好ましい。後述の評価方法においては、サッカロミセス属微生物のうちロイシン要求性を示す菌株を用いる。ロイシン要求株としては例えば、サッカロミセス・セレビシエ  ＢＹ４７４１株（ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０）、Ｗ３０３（ＭＡＴａ；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１Δ２；ｌｅｕ２−３＿１１２；ｈｉｓ３−１１；ａｄｅ２−１；ｃａｎ１−１００）などを挙げることができる。ＢＹ４７４１株は、Ｂｒａｃｈｍａｎｎ  ＣＢ，Ｄａｖｉｅｓ  Ａ，Ｃｏｓｔ  ＧＪ，Ｃａｐｕｔｏ  Ｅ，Ｌｉ  Ｊ，Ｈｉｅｔｅｒ  Ｐ，Ｂｏｅｋｅ  ＪＤ．  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ：ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｓｔｒａｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｙｅａｓｔ．１９９８  Ｊａｎ  ３０；１４（２）：１１５−３２に記載の方法に従って入手可能である。ＢＹ４７４１株、Ｗ３０３株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８  ＵＳＡ）にアクセッションナンバー２０１３８８、２０００６０としてそれぞれ登録されており、入手が可能である。
【００２５】
本発明のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターへの標的遺伝子の導入は、常法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法等に従って行うことができる。例えば、細胞接合法、電気的導入方法（エレクトロポレーション法）、化学的処理によるＤＮＡ導入法、感染等により行うことができる。
【００２６】
本発明のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターをサッカロミセス属微生物に導入する方法は特に限定されない。一般的には、Ａｍｂｅｒｇらによる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００５  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００５）などの実験書に記載されている、電気的導入法や化学的処理によるＤＮＡ導入法を用いることができる。例えば、遺伝子等をサッカロミセス属微生物に導入して相同組替えを行い酵母内で本発明のプラスミドベクターを構築すれば、そのまま導入した状態になる。一方、他の酵母内で作製した本発明のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを取り出して別のサッカロミセス属微生物に、上述した公知の遺伝子導入法にて導入することも可能である。
【００２７】
本発明のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターは、Ｇｅｎｅｔｉｃ−Ｔａｇ−ｏｆ−Ｗａｒ（ｇＴＯＷ：遺伝子綱引き）法（Ｈｉｓａｏ  Ｍｏｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．ＰｌｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌｕｍｅ２  Ｉｓｓｕｅ  ７  ＪＵＬＹ  ２００６）に基づき、標的遺伝子のサッカロミセス属微生物内における発現の上限の評価に利用することができる。
【００２８】
本発明の評価方法は、標的遺伝子を含む上記本発明のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを、ｌｅｕ２ｄ遺伝子が破壊されたサッカロミセス属微生物に導入しロイシン無添加の培地で培養する工程、および導入細胞内でのプラスミドベクターの最大コピー数を測定する工程、を有する。
【００２９】
まず、標的遺伝子を含む上記本発明のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを、ｌｅｕ２ｄ遺伝子が破壊されたサッカロミセス属微生物に導入しロイシン無添加の培地で培養する。
【００３０】
サッカロミセス属微生物用プラスミドベクターへの標的遺伝子の導入は、先に述べたとおりである。
サッカロミセス属微生物用プラスミドベクターのサッカロミセス属微生物へ導入する方法は特に限定されない。例えば、遺伝子等をサッカロミセス属微生物に導入して相同組替えを行い酵母内で本発明のプラスミドベクターを構築すれば、そのまま導入した状態になる。一方、他の酵母内で遺伝子導入した本発明のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターを取り出して別のサッカロミセス属微生物に、電気的導入方法（エレクトロポレーション法）、化学的処理によるＤＮＡ導入法などの公知の手段で導入することも可能である。
【００３１】
ロイシン無添加の培地における培養条件は、上述のＡｍｂｅｒｇらの実験書に記載されている方法を用いることが出来る。培地は、ロイシン無添加のＳＣ培地（合成完全培地）を用いることができる。培養条件は培地及び酵母細胞の種類、量などの条件にもよるが、ＳＣ培地を用いる場合、一般には２０〜３５℃、１〜３日程度の条件とすることができる。
【００３２】
続いて、導入細胞内でのプラスミドベクターの最大コピー数を測定する。測定は、ＧＦＰを含むプラスミドベクターの場合には、ＧＦＰの蛍光強度をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）などにより測定することにより行うことができる。また、リアルタイムＰＣＲにより測定することもできる。
【００３３】
測定されたコピー数は、その酵母における標的遺伝子の最大発現強度として評価することができる。最大コピー数の高さ及び低さの基準は、ベクターのみでの測定値を基準に定めることができる。この標的遺伝子のコピー数が高い場合（最大発現強度が高い場合）、酵母細胞はその標的遺伝子の過剰発現に対し頑健であることを示し、また、コピー数が低い場合（最大発現強度が低い場合）、酵母細胞はその標的遺伝子の過剰発現に対し脆弱であることを示す。従って、本発明の評価方法は、標的遺伝子の創薬ターゲットとしての有用性の評価に利用することができる。
【００３４】
尚、本発明のサッカロミセス属微生物用プラスミドベクターの用途は、ｇＴＯＷ法に基づく評価方法に限定されず、クローニング用プラスミドベクターとして利用することもできる。
【実施例】
【００３５】
以下本発明を実施例により詳細に説明する。
【００３６】
（サッカロミセス属微生物（出芽酵母））
以下の実施例において使用したサッカロミセス属微生物（出芽酵母）は、サッカロミセス・セレビシエ  ＢＹ４７４１株（ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０、Ｂｒａｃｈｍａｎｎ  ＣＰ  ｅｔ  ａｌ．  Ｙｅａｓｔ  １４：１１５−１３２（１９９８）、ＡＴＣＣ２０１３８８）である。これはＰｒｏｆ．Ｍａｒｋ  Ｊｏｈｓｔｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅより分与されたものである。
【００３７】
（酵母へのＤＮＡ断片導入条件（プロトコル））
以下の実施例において、酵母へのＤＮＡ断片の導入は下記のようにして行った。
酵母細胞をＹＰＤ培地で培養し、この培養液（ＯＤ６００＝１．０程度）１ｍＬを遠心して細胞を回収した。回収した細胞を０．１Ｍの酢酸リチウム溶液で洗浄した。この細胞に、５０％  ポリエチレングリコール４０００  ３００μＬ、１Ｍ  酢酸リチウム溶液  ４０μＬ、２ｍｇ／ｍＬ  サケ精子ＤＮＡ  ２５μＬ、および、ＰＣＲ反応後のＤＮＡ  それぞれ５０μＬを加え懸濁させた。続いて室温で３０分静置した後、４２℃で２０分間放置した。遠心して細胞を回収し、５０μＬの水に懸濁した。選択寒天培地（ＳＣ培地）に細胞懸濁液をひろげ、３０℃でコロニーが見えるまで培養した。
【００３８】
（ＰＣＲ反応）
以下の実施例においてＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−、カタログ番号ＫＯＤ−２０２、東洋紡株式会社製）を用いておこなった。サーマルサイクラーとしてＴＰ６００（タカラバイオ株式会社製）を用いた。ＰＣＲ反応液は下記の通り概ねＰＣＲキットを利用して、キットの説明書に準じて調製した。
【００３９】
〔ＰＣＲ反応液〕
・  ５μＬ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（キットに添付のもの）
・  ５μＬ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（キットに添付のもの）
・  ２μＬ  ＭｇＳＯ４溶液（キットに添付のもの）
・  １μＬ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（キットに添付のもの）
・  １μＬ  ｐＫＴ１２８などプラスミド（アルカリ法で調製したＤＮＡを１００倍希釈したもの）
・  １μＬ  各プライマー（水で１０μＭに調整したもの）
・３５μＬ  超純水
【００４０】
サーマルサイクルは、９４℃２分  →  （９４℃１５秒→５５℃３０秒→６８℃６分）×３０サイクル  →  ６８℃５分  →  ４℃で保存、とした。
【００４１】
実施例１（ｐＴＯＷＩｇ、ｐＴＯＷｕｇプラスミドベクターの構築）
ｐＫＴ１２８（配列番号１５に記載の塩基配列からなる。ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ受託番号５０９２）を鋳型にして、ＯＳＢＩ０００５−０６５０（ｌｅｕ２ｄ−ＧＦＰ作成用プライマー）、ＯＳＢＩ０００３−０６４９（ＵＲＡ３−ＧＦＰ作成用プライマー）を用いてＥＧＦＰ−ｓｐｈｉｓ５ＭＸカセット（配列番号１６）を増幅するとともに末端に相同組み換え用配列を付加した。
【００４２】
ＯＳＢＩ０００５（配列番号１７）：  ＧＣＣＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＧＣＴｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｃｔｇｇｔｔｔａ
ＯＳＢＩ０６５０（配列番号１８）：  ＧＣＡＴＧＡＧＧＴＣＧＣＴＣＴＴＡＴＴＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧＧＣＡＴＧＣＣＧＡＧＧＴＡＣＣｔｃｇａｔｇａａｔｔｃｇａｇｃｔｃｇ
ＯＳＢＩ０００３（配列番号１９）：  ＴＡＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＴＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＣｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｃｔｇｇｔｔｔａ
ＯＳＢＩ０６４９（配列番号２０）：  ＴＴＣＣＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＧＡＴＣＧＡＴＣＣＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣＴＧＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＡＡＴＴｔｃｇａｔｇａａｔｔｃｇａｇｃｔｃｇ
尚、上記プライマーの塩基配列中大文字、小文字はそれぞれ、実際のプライミングに必要な配列と、ベクターなどに相同組み替えで組み込むために必要な配列（タグ配列）を示す。以下のプライマーの塩基配列においても同様とする。
【００４３】
増幅したＤＮＡ断片を、ｐＳＢＩ４０（配列番号２１、図２参照）とともに酵母菌内に同時に形質転換した。ｐＳＢＩ４０は、Ｐｒｏｆ．Ｍａｒｋ  Ｊｏｈｓｔｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅより分与されたものである。酵母細胞内での相同組み替えによって、ｐＳＢＩ４０のｌｅｕ２ｄの後ろ、或いはＵＲＡ３の後ろに、ＥＧＦＰ−ｓｐｈｉｓ５ＭＸカセットを挿入し、それぞれｐＴＯＷＩｇプラスミドベクター（図３参照）、ｐＴＯＷｕｇプラスミドベクター（図４参照）を得た。これらのプラスミドベクターは、ｌｅｕ２ｄ遺伝子が導入されているものの、そのプロモーター領域は導入されていない。
【００４４】
ｐＴＯＷＩｇおよびｐＴＯＷｕｇのそれぞれを含む酵母細胞を、ロイシンを含む培地と、含まない培地（ＳＣ培地）において培養し、ＧＦＰの発現量をフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ  ＢＤ社）で測定した。プラスミドのコピー数の測定は、Ｒｏｃｈｅ  ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ２．０を用いてリアルタイムＰＣＲ法によって行った。
【００４５】
また、対照として、ｐＳＢＩ４０をそのまま酵母細胞に導入して同様の実験をおこなった。
【００４６】
その結果、ロイシンを含まない培地におけるプラスミド最大コピー数は、ｐＴＯＷＩｇでは６３．１、ｐＴＯＷｕｇでは１０１．１、ｐＳＢＩ４０では１６２．６であった。
【００４７】
また、図５にｐＴＯＷＩｇのＦＡＣＳパターンを、図６にｐＴＯＷｕｇのＦＡＣＳパターンを示す。図５と図６から明らかなように、ｐＴＯＷＩｇ，ｐＴＯＷｕｇともに、ＧＦＰの蛍光強度の上昇をモニターすることによりプラスミド最大コピー数の上昇を知ることができたものの、ｐＳＢＩ４０と比較してコピー数が低かった。ｐＴＯＷＩｇでは、蛍光強度が全体として低かったが、その一方で、ｐＴＯＷｕｇでは十分な蛍光強度が得られ、直線性も保たれていた。
【００４８】
実施例２（ｐＴＯＷｕｇ２プラスミドベクターの構築）
参考例１のｐＴＯＷｕｇは、ロイシンを含まない培地でのコピー数がｐＳＢＩ４０に比べて低かったため、コピー数が低い原因と思われるｓｐｈｉｓ５ＭＸを取り除いて、ｐＴＯＷｕｇ２を作成することにした。
【００４９】
参考例１で作成したｐＴＯＷｕｇのｐＢＲ３２２ＯＲＩ，ＡｍｐＲ，ＵＲＡ３−ＥＧＦＰを含む断片を、プライマーＯＳＢＩ００９−０８４４を用いてＰＣＲにより増幅してＤＮＡ断片１を得た。また、一方、ｐＴＯＷｕｇのＬＥＵ２，ＲＥＰ３，２ミクロンＯＲＩを含む断片を、プライマーＯＳＢＩ００２７−０８４５を用いてＰＣＲにより増幅してＤＮＡ断片２を得た。
【００５０】
ＯＳＢＩ００９（配列番号２２）：ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
ＯＳＢＩ００２７（配列番号２３）：ＣＴＣＴＴＴＣＴＣＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＧ
ＯＳＢＩ０８４４（配列番号２４）：ＴＧＣＴＧＧＴＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＣＡＡＡＴＡＡａｇａｇｔａｃｔｇａｃａａｔａａａａａｇａｔｔｃｔｔｇｔｔｔｔｃａａｇａａｃｔｔ
ＯＳＢＩ０８４５（配列番号２５）：ａａｇｔｔｃｔｔｇａａａａｃａａｇａａｔｃｔｔｔｔｔａｔｔｇｔｃａｇｔａｃｔｃｔＴＴＡＴＴＴＧＴＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＡＡＴＡＣＣＡＧＣＡ
【００５１】
ＤＮＡ断片１−２を酵母菌内（実施例１と同様の酵母）で相同組替えにより結合し、プラスミドベクターｐＴＯＷｕｇ２を得た（図７参照）。
【００５２】
ｐＴＯＷｕｇ２を含む酵母細胞について、実施例１と同様にしてＧＦＰの発現量の測定およびプラスミドのコピー数の測定を行なった。
【００５３】
その結果、ｐＴＯＷｕｇ２のロイシンのない培地でのコピー数は１４２．８と、ｐＳＢＩ４０（１６２．６  標準偏差３９．５）と同程度であった。
【００５４】
実施例３（ｐＴＯＷｕｇ２−８３５〜８４２の構築）
様々なコピー数上昇バイアスを持つセット（ｐＴＯＷｕｇ−８３５〜８４２）を作成した。
【００５５】
まず、プラスミドベクターＰＨＭ００１を作製した。すなわち、ｐＲＳ３１５（配列番号２６記載の塩基配列からなる。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、ＡＴＣＣ７７１４４として寄託されており、分譲可能である。）を鋳型にして、プライマーＯＳＢＩ０５８２−０５８４を用いて出芽酵母ＬＥＵ２遺伝子を増幅した。ｐＤＢｌｅｔを鋳型にして、プライマーＯＳＢＩ０５８３−０５８５を用いて分裂酵母ｕｒａ４＋遺伝子を増幅した。
ＯＳＢＩ０５８２（配列番号２７）：ｇｃａｔｃｔｇｔｇｃｇｇｔａｔｔｔｃａｃａｃｃｇＣＡＴＡＴＧａａｔｇｇｔｃａｇｇｔｃａｔｔｇａｇｔｇ
ＯＳＢＩ０５８３（配列番号２８）：ａｇａｔｔｇｔａｃｔｇａｇａｇｔｇｃａｃ
ＯＳＢＩ０５８４（配列番号２９）：ＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｃｃｔｃａａｃａｔａａｃｇａｇａａｃａｃａｃａｇｇ
ＯＳＢＩ０５８５（配列番号３０）：ｃｃｔｇｔｇｔｇｔｔｃｔｃｇｔｔａｔｇｔｔｇａｇｇＣＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＴＡＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＣ
【００５６】
一方、ｐＤＢｌｅｔ（配列表の配列番号３１記載の塩基配列参照。ｐＤＢｌｅｔの塩基配列はＮＣＢＩに登録されており、そのアクセッションナンバーはＡＦ５３１１７３である。）を下記の条件で制限酵素ＮｄｅＩで切断した。２ｍＬのＬＢａｍｐ培地でプラスミドｐＤＢｌｅｔを持つ大腸菌（ＸＬ１−ｂｌｕｅ株、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）（ｐＤＢｌｅｔのＸＬ１−ｂｌｕｅ株への挿入はエレクトロポレーション法によった。）を培養した。この大腸菌より、プラスミドをアルカリ法により精製し、５０μＬの水に溶かした。このプラスミド溶液  １０μＬを、ＮＥＢ４バッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）１０μＬ、Ｎｄｅ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社、カタログ番号Ｒ０１１１Ｓ）  １０μＬ、および超純水  ７０μＬに溶解し、３７℃で１時間静置後、室温で一晩放置した。
【００５７】
これらの増幅産物および制限酵素切断断片を出芽酵母細胞内での相同組替え法により結合し、ｐＨＭ００１を得た。
【００５８】
このプラスミドベクターｐＨＭ００１を鋳型として、プライマーＯＳＢＩ００９−０８３５からＯＳＢＩ００９−０８４２までの８つのプライマーセットを用いて、プロモーターに欠失のあるＬＥＵ２遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。一方、ｐＴＯＷｕｇ２を鋳型にして、ＯＳＢＩ０８４９−０８５０を用いて、ＵＲＡ３−ＧＦＰ、２ｍｉｃｒｏｎＯＲＩ−ＲＥＰ３配列を持つＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。
【００５９】
ＯＳＢＩ００９（配列番号２２）：ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
ＯＳＢＩ０８４９（配列番号３２）：ＣＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＴＡＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＧＣＴＡＴＡＴＧＴＡｔｃａａｔｇａｔａｔｔｃｇａａｔａｃｇｃ
ＯＳＢＩ０８５０（配列番号３３）：ＣＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＴＡＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＧＣＴＡＴＡＴＧＴＡｔｃａａｔｇａｔａｔｔｃｇａａｔａｃｇｃ
ＯＳＢＩ０８３５（配列番号３４）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｔｔｃｔｔａｃｃｔｔｔｔａｃａｔｔｔｃａ
ＯＳＢＩ０８３６（配列番号３５）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｇｔｇｇｔｔａｇｃａａｔｃｇｔｃｔｔａｃ
ＯＳＢＩ０８３７（配列番号３６）:ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｔａｔｔｔａａｇｇａｃｃｔａｔｔｇｔｔｔ
ＯＳＢＩ０８３８（配列番号３７）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｔｔｇｃａｔｃａｃａａｔａｃｔｔｇａａｇ
ＯＳＢＩ０８３９（配列番号３８）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｔａｇａａｔａｇａｇａａｇｃｇｔｔｃａｔ
ＯＳＢＩ０８４０（配列番号３９）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧａｇｇｔｇａｇａｇｃｇｃｃｇｇａａｃｃｇ
ＯＳＢＩ０８４１（配列番号４０）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧｔｔｔｃａａｃｔｇａａａａａｔｔｇｇｇａ
ＯＳＢＩ０８４２（配列番号４１）：ＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧａｔｔｔｃａｇａｇｇｔｃｇｃｃｔｇａｃｇ
【００６０】
各増幅断片を、出芽酵母細胞内（実施例１と同様の酵母）での相同組み替え法により結合し、プラスミドベクターｐＴＯＷｕｇ２−８３５〜８４２を得た（図８及び図９参照）。
【００６１】
ｐＴＯＷｕｇ２−８３５〜８４２を含む酵母細胞について、実施例１と同様にしてＧＦＰの発現量の測定およびプラスミドのコピー数の測定を行なった。
ロイシンを含まない培地におけるプラスミドの最大コピー数は、ｐＴＯＷｕｇ２−８３５では１２８．９、ｐＴＯＷｕｇ２−８３６（ＮＩＴＥ  Ｐ−４４７）では２３２．３、ｐＴＯＷｕｇ２−８３７（ＮＩＴＥ  Ｐ−４４８）では７１．５、ｐＴＯＷｕｇ２−８３８では１８７．４、ｐＴＯＷｕｇ２−８３９では１３７．２、ｐＴＯＷｕｇ２−８４０では１８．０、ｐＴＯＷｕｇ２−８４１では１５．７、ｐＴＯＷｕｇ２−８４２では１９．２であった。また、図１０に、ｐＴＯＷｕｇ２−８３６、ｐＴＯＷｕｇ２−８３７およびｐＴＯＷｕｇ２−８４２のＦＡＣＳパターンを示す。
この結果から、ｐＴＯＷｕｇ−８３５〜８４２のうち、８３７がｐＴＯＷｕｇ２よりも低めのコピー数を持っており、８３６はｐＴＯＷｕｇ２よりも高いコピー数を持つことが明らかとなった。
【００６２】
実施例４
ｐＴＯＷｕｇ２に出芽酵母由来の表１中に示す各遺伝子（それぞれＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）より遺伝子名で検索することで遺伝子情報を取得可能）をクローニングし、出芽酵母ＢＹ４７４１株に導入した。各形質転換酵母細胞をＳＣ−Ｌｅｕの培地（ロイシンを除いた培地）で５０時間培養した後に、リアルタイムＰＣＲでプラスミドコピー数を測定した。各遺伝子につき２つ以上のサンプルのプラスミドコピー数を測定し、その平均値（ＡＶＥ）と標準偏差（ＳＤ）を計算した。
【００６３】
【表１】
2009112271.tif 000003
【００６４】
表１から明らかなとおり、各プラスミドは、導入した遺伝子に応じて異なるコピー数を示した。このことから、本発明のプラスミドは、ｇＴＯＷ法において、導入遺伝子に応じたプラスミドコピー数を得ることができ有用であることが明らかとなった。
【００６５】
なお、実施例で得られたプラスミドのうち、ｐＴＯＷｕｇ２、ｐＴＯＷｕｇ２−８３５、ｐＴＯＷｕｇ２−８３６、ｐＴＯＷｕｇ２−８３７、ｐＴＯＷｕｇ２−８３８、ｐＴＯＷｕｇ２−８３９、ｐＴＯＷｕｇ２−８４０、ｐＴＯＷｕｇ２−８４１、ｐＴＯＷｕｇ２−８４２の塩基配列は、それぞれ配列番号４２、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９に記載されている。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号１：ＬＥＵ２プロモーター
配列番号２：ｐＴＯＷｕｇ２−８３５
配列番号３：ｐＴＯＷｕｇ２−８３６
配列番号４：ｐＴＯＷｕｇ２−８３７
配列番号５：ｐＴＯＷｕｇ２−８３８
配列番号６：ｐＴＯＷｕｇ２−８３９
配列番号７：ｐＴＯＷｕｇ２−８４０
配列番号８：ｐＴＯＷｕｇ２−８４１
配列番号９：ｐＴＯＷｕｇ２−８４２
配列番号１０：ｌｅｕ２ｄ遺伝子
配列番号１１：ＵＲＡ３遺伝子
配列番号１２：ＥＧＦＰ遺伝子
配列番号１３：２ミクロンＯＲＩ
配列番号１４：ＲＥＰ３遺伝子
配列番号１５：ｐＫＴ１２８
配列番号１６：ＥＧＦＰ−ｓｐｈｉｓ５ＭＸカセット
配列番号１７：プライマーＯＳＢＩ０００５
配列番号１８：プライマーＯＳＢＩ０６５０
配列番号１９：プライマーＯＳＢＩ０００３
配列番号２０：プライマーＯＳＢＩ０６４９
配列番号２１：ｐＳＢＩ４０
配列番号２２：プライマーＯＳＢＩ０００９
配列番号２３：プライマーＯＳＢＩ００２７
配列番号２４：プライマーＯＳＢＩ０８４４
配列番号２５：プライマーＯＳＢＩ０８４５
配列番号２６：ｐＲＳ３１５
配列番号２７：ＯＳＢＩ０５８２
配列番号２８：ＯＳＢＩ０５８３
配列番号２９：ＯＳＢＩ０５８４
配列番号３０：ＯＳＢＩ０５８５
配列番号３１：ｐＤＢｌｅｔ
配列番号３２：プライマーＯＳＢＩ０８４９
配列番号３３：プライマーＯＳＢＩ０８５０
配列番号３４：プライマーＯＳＢＩ０８３５
配列番号３５：プライマーＯＳＢＩ０８３６
配列番号３６：プライマーＯＳＢＩ０８３７
配列番号３７：プライマーＯＳＢＩ０８３８
配列番号３８：プライマーＯＳＢＩ０８３９
配列番号３９：プライマーＯＳＢＩ０８４０
配列番号４０：プライマーＯＳＢＩ０８４１
配列番号４１：プライマーＯＳＢＩ０８４２
配列番号４２：ｐＴＯＷｕｇ２
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、ｇＴＯＷ法の原理を示す図である。
【図２】図２は、ｐＳＢＩ４０のプラスミドマップである。
【図３】図３は、ｐＴＯＷＩｇのプラスミドマップである。
【図４】図４は、ｐＴＯＷｕｇのプラスミドマップである。
【図５】図５は、ｐＴＯＷＩｇのＦＡＣＳパターンを示すグラフである。
【図６】図６は、ｐＴＯＷｕｇのＦＡＣＳパターンを示すグラフである。
【図７】図７は、ｐＴＯＷｕｇ２のプラスミドマップである。
【図８】図８は、ｐＴＯＷｕｇ２−８３５〜８４２のプラスミドマップである。
【図９】図９は、ｐＴＯＷｕｇ２−８３５〜８４２のプロモーター部分の長さの相違を示す模式図である。
【図１０】図１０は、ｐＴＯＷｕｇ２−８３６、ｐＴＯＷｕｇ２−８３７、ｐＴＯＷｕｇ２−８４２のＦＡＣＳパターンを示すグラフである。
【図１】
2009112271.tif 000004
【図２】
2009112271.tif 000005
【図３】
2009112271.tif 000006
【図４】
2009112271.tif 000007
【図５】
2009112271.tif 000008
【図６】
2009112271.tif 000009
【図７】
2009112271.tif 000010
【図８】
2009112271.tif 000011
【図９】
2009112271.tif 000012
【図１０】
2009112271.tif 000013
【配列表】
2009112271000001.app