(57)【要約】      （修正有）【課題】パラゴムノキの品種を簡便かつ正確に判別可能な方法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列からなるプライマーと別の特定の塩基配列からなるプライマーとを用いて、パラゴムノキから抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行うことによって得られた増幅ＤＮＡ断片の有無、該増幅ＤＮＡ断片の長さ及び該増幅ＤＮＡ断片の制限酵素による切断パターンの少なくとも１の基準によってパラゴムノキの品種を判別することを特徴とするパラゴムノキの品種判別方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーとを用いて、パラゴムノキから抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行うことによって得られた増幅ＤＮＡ断片の有無、該増幅ＤＮＡ断片の長さ及び該増幅ＤＮＡ断片の制限酵素による切断パターンの少なくとも１の基準によってパラゴムノキの品種を判別することを特徴とするパラゴムノキの品種判別方法。
【請求項２】
配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号２に示すプライマーとからなるパラゴムノキの品種判別用のプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラゴムノキの簡便かつ正確な品種判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パラゴムノキ（Hevea brasiliensis）は、天然ゴムの原料として栽培される代表的なゴムノキである。従来、パラゴムノキの品種は、葉・樹皮・樹形などの形態で判別されていた。
【０００３】
しかしながら、パラゴムノキの形態による品種判別においては、実際に品種を判別し、決定するのに長期間要する。その上、このような判別法の習熟・熟練にも時間を要する。また、パラゴムノキの品種によっては外観で判別しにくい品種があったり、品種判別において誤判定が生じることがあった。
【０００４】
一方で、近年、植物においていくつかの遺伝子工学を応用した品種判別方法が開発されてきた。これらの方法では品種間での塩基配列の違い、すなわち多型を検出することで品種判別を行っている。すなわち、遺伝子上の客観的な特徴を指標とすることから、正確な品種判定が可能となる。既に多くの商業作物においてＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）法、ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphisms）法、ＡＦＬＰ（Amplified Fragment Length Polymorphisms）法、マイクロサテライト法などの遺伝子工学を用いた品種判別方法が開発されている。
【０００５】
パラゴムノキにおいては、遺伝子の多型を検出可能なＤＮＡマーカとして、矮性の変異体のクローンを識別可能なＲＡＰＤマーカー（非特許文献１）や、耐乾燥性の変異体のクローンの開発やスクリーニングに有用なＤＮＡマーカー（非特許文献２）が報告されている。
【０００６】
【非特許文献１】Venkatachalam, P. et al. "Identification, cloning and sequence analysis of a dwarf genome-specific RAPD marker in rubber tree [Hevea brasiliensis (Muell.) Arg.]"  Plant Cell Rep. 2004; 23(5): 327-32.
【非特許文献２】Venkatachalam, P. et al. "Molecular cloning and sequencing of a polymorphic band from rubber tree [Hevea brasiliensis (Muell.) Arg.] : the nucleotide sequence revealed partial homology with proline-specific permease gene sequence"  Current Schience 2006; 90(11): 1510-1515
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、実際にパラゴムノキの農園において栽培されている多くの品種を効果的に判別可能な遺伝子工学的な品種判別方法は知られていない。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、パラゴムノキの品種を簡便かつ正確に判別可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意検討を行った結果、パラゴムノキの品種を判別可能なＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって安定して増幅可能なプライマーセットを見出した。さらに、前記プライマーセットを用いて増幅したＤＮＡ断片に基づいて、簡便かつ正確にパラゴムノキの品種を判別することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明のパラゴムノキの品種判別方法は、配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーとを用いて、パラゴムノキから抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行うことによって得られた増幅ＤＮＡ断片の有無、該増幅ＤＮＡ断片の長さ及び該増幅ＤＮＡ断片の制限酵素による切断パターンの少なくとも１の基準によってパラゴムノキの品種を判別することを特徴とする。
【００１１】
また、本発明のパラゴムノキの品種判別用のプライマーセットは、配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号２に示すプライマーとからなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、パラゴムノキの品種を簡便かつ正確に判別することができるという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に、本発明について詳細に説明する。本発明のパラゴムノキの品種判別方法は、配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーとを用いて、パラゴムノキから抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行うことによって得られた増幅ＤＮＡ断片の有無、該増幅ＤＮＡ断片の長さ及び該増幅ＤＮＡ断片の制限酵素による切断パターンの少なくとも１の基準によってパラゴムノキの品種を判別することを特徴とする。上述したように、配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基配列からなるプライマーのセットを用いたＰＣＲを行うことによって、パラゴムノキのゲノムＤＮＡ中の品種を判別することが可能なＤＮＡ断片が安定して増幅され、当該増幅ＤＮＡ断片に基づいて、簡便かつ正確にパラゴムノキの品種を判別することができる。なお、上記プライマーのセットを用いて増幅可能であり、品種判別可能なＤＮＡ断片の部分配列を配列表の配列番号３及び４に示す。
【００１４】
本発明のパラゴムノキの品種判別方法において、まず、パラゴムノキからＰＣＲの鋳型として用いるゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡを抽出するためのパラゴムノキとしては、パラゴムノキの植物体のいずれの組織も用いてもよく、生育段階も限定されない。植物体の組織からのゲノムＤＮＡの抽出は、常法により行うことができ、例えば、フェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法等によって行うことができる。また、ゲノムＤＮＡとして粗精製のものを使用することもできる。必要に応じて、抽出したゲノムＤＮＡを、クロロホルム／イソアミルアルコール処理、イソプロパノール沈澱、フェノール／クロロホルムによる除蛋白、エタノール沈澱等の公知のＤＮＡ精製方法によって精製してもよい。
【００１５】
次に、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲは、それ自体公知の通常用いられる方法に従って行われる。反応条件は、目的の塩基配列、すなわち上述した品種判別可能なＤＮＡ断片の部分配列（配列番号３及び４）が増幅されるものであればいかなるものでもよい。
【００１６】
次いで、本発明においては、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片の有無、該増幅ＤＮＡ断片の長さ及び該増幅ＤＮＡ断片の制限酵素による切断パターンの少なくとも１の基準によって、パラゴムノキの品種を判別する。本発明においては、増幅断片の有無、長さ又は切断パターンのいずれか一つを基準にして品種判別を行うことができるが、より広範囲の品種に渡って品種判別が可能となるという観点から、これらの２つ以上の基準を用いて品種判別を行うことが好ましい。なお、上記プライマーのセットを用いて増幅されたＤＮＡ断片の有無、長さが同じである品種間においても、ある制限酵素による切断パターンが異なれば、該切断パターンに基づいて品種判別が可能となる。
【００１７】
上記基準による品種判別は、具体的には以下のようにして行うことができる。増幅ＤＮＡ断片の有無や長さによって品種判別を行う場合、例えば、上記ＰＣＲによって得られた産物を、常法により電気泳動によって分離し、上記プライマーのセットを用いて増幅されたＤＮＡ断片を検出し、品種判別の対象である各パラゴムノキの間で当該増幅ＤＮＡ断片の有無や長さを比較することによって品種判別を行うことができる。なお、上記プライマーのセットを用いてＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ断片の長さは通常約1500bp〜約2500bpの範囲内である。
【００１８】
増幅ＤＮＡ断片の制限酵素による切断パターンによって品種判別を行う場合には、例えば、上記ＰＣＲによって得られた産物を、常法により、ある制限酵素によって処理し、電気泳動によって分離し、上記プライマーのセットを用いて増幅されたＤＮＡ断片の切断パターン（切断断片の長さ及び／又は数）を検出し、品種判別の対象である各パラゴムノキの間で当該切断パターンを比較することによって品種判別を行うことができる。なお、制限酵素を単独で又は複数種組み合わせて使用することができる。
【００１９】
本発明の品種判別方法によって判別可能なパラゴムノキの品種としては、特に限定されず、例えばGT1、PB260、RRIM600、PB330、PB340等が挙げられる。
【００２０】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
（植物材料及びゲノムＤＮＡの抽出）
パラゴムノキの農園より、GT1、PB260、RRIM600の各クローンの茎を採取した。これらの茎から抽出したＤＮＡを材料として、品種判別可能なＤＮＡ断片の確認を行った。茎からのＤＮＡ抽出は、DNeasy Plant Kit（Quiagen社）を用いて行った。
【００２２】
得られたパラゴムノキのゲノムＤＮＡを鋳型とし、RAPD PCR反応を行った。このときのPCR法の反応液組成および反応条件は以下の通りである。反応液は1 x reaction buffer、0.25mM dNTP mixture、0.5 units Ex Taq DNA polymerase (Takara社)、1.25μM  プライマー、25ng鋳型DNAを含み20μlとなるように水で調節した。反応サイクルは、94℃で4分間保持した後、94℃にて1分間、37℃で1.5分間、72℃で2分間の繰り返し35回行った後、72℃で7分間反応させ、その後4℃で維持した。なお、反応にはTaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（登録商標） Gradient（タカラバイオ社）を用いた。次にPCR反応液をバイオアナライザー2100（Agilent社）を用いた電気泳動により分離して増幅断片の長さの確認を行った。品種間で増幅断片に違いが見られたPCR反応液をTOPO-TA cloning kit (Invitrogen社)によるサブクローニングを行い大腸菌に形質転換した。目的とした品種判別可能なＤＮＡ断片のサブクローニングができたプラスミドの塩基配列を、CEQ 8000 (ベックマン社)を用いて決定した。以上の結果、品種判別可能なＤＮＡ断片の塩基配列は配列番号３及び４に示すとおりであった。
【００２３】
（品種判別可能なＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅及び検出）
上記のようにして得られた品種判別可能なＤＮＡ断片の配列情報から、当該ＤＮＡ断片を特異的に増幅するためのプライマーペア（4-1F（配列番号１）及び4-1R（配列番号２））を設計した。このプライマーペアを用いて以下の反応液組成および反応条件で上述した各クローン（GT1、PB260、RRIM600）のゲノムDNAを鋳型にPCRを行った。反応液は1 x reaction buffer、0.2mM dNTP mixture、0.5 units Ex Taq DNA polymerase (Takara社)、各1.25μM  プライマー（4-1F及び4-1R）、25ng鋳型DNAを含み20μlとなるように水で調節した。反応サイクルは、94℃で4分間保持した後、94℃にて30秒間、55℃で30秒間、72℃で2分間の繰り返し30回行った後、72℃で7分間反応させ、その後4℃で維持した。得られたPCR産物をバイオアナライザー2100（Agilent社）を用いて電気泳動し、泳動パターンを検出した。検出された泳動パターンを図１に示す。図１より、品種間で違う長さのDNA断片（約1500〜約2500bpの範囲）の増幅や増幅DNA断片の有無が見られた。これによって、配列番号１及び２のプライマーのセットを用いてPCRにより増幅して得られた上記品種判別可能なＤＮＡ断片の増幅断片の有無及び／又は長さによって品種判別が可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明は、天然ゴムの生産分野において、天然ゴムの原料となるパラゴムノキの品種判別方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、各品種のＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片の泳動パターンを示す写真である。
【図１】
2009165386.tif 000002
【配列表】
2009165386000001.app