(57)【要約】【課題】細胞毒性のないコア／シェル型シリコン量子ドットを提供する。また、それを用いた生体物質標識剤を提供する。【解決手段】シリコンを含有するコア部と酸化ケイ素を含有するシェル層からなるコア／シェル型シリコン量子ドットであって、当該コア／シェル型シリコン量子ドットを一定条件下熱水処理したときに遊離する過酸化水素の濃度が、過マンガン酸カリウム滴定法により１００ｐｐｍ以下であることを特徴とするコア／シェル型シリコン量子ドット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリコンを含有するコア部と酸化ケイ素を含有するシェル層からなるコア／シェル型シリコン量子ドットであって、当該コア／シェル型シリコン量子ドットを一定条件下熱水処理したときに遊離する過酸化水素の濃度が、過マンガン酸カリウム滴定法により１００ｐｐｍ以下であることを特徴とするコア／シェル型シリコン量子ドット。
【請求項２】
前記シェル層が、コア／シェル型シリコン量子ドットの製造工程において、過酸化水素水による水酸化処理とその後に熱水洗浄処理を施されていることを特徴とする請求項１に記載のコア／シェル型シリコン量子ドット。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のコア／シェル型シリコン量子ドットであって、その表面が有機分子により修飾されていることを特徴とするコア／シェル型シリコン量子ドット。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコア／シェル型シリコン量子ドットと分子標識物質とを有機分子を介して結合させたことを特徴とする生体物質標識剤。
【請求項５】
前記分子標識物質が、ヌクレオチド鎖またはタンパク質であることを特徴とする請求項４に記載の生体物質標識剤。
【請求項６】
前記コア／シェル型シリコン量子ドットと分子標識物質とを結合させる有機分子が、ビオチン及びアビジンであることを特徴とする請求項４又は５に記載の生体物質標識剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毒性のないコア／シェル型シリコン量子ドット及びそれを用いた生体物質標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
半導体ナノ粒子のうち、電子の波長（１０ｎｍ程度）より小さい粒子径を有するナノサイズの粒子は、量子サイズ効果として電子の運動に対するサイズ有限性の影響が大きくなってくるために、バルク体とは異なる特異な物性を示すことが知られている。一般に、ナノ・メートルサイズの半導体物質で量子閉じ込め（ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）効果を示す半導体ナノ粒子は、「量子ドット」とも称されている。このような量子ドットは、半導体原子が数百個から数千個集まった１０数ｎｍ程度以内の小さな塊であるが、励起源から光を吸収してエネルギー励起状態に達すると、量子ドットのエネルギーバンドギャップに相当するエネルギーを放出する。
【０００３】
したがって、量子ドットは、量子サイズ効果によりユニークな光学特性を有することが知られている。具体的には、（１）粒子のサイズを制御することにより、様々な波長，色を発光させることができる。（２）吸収帯が広く、単一波長の励起光で様々なサイズの微粒子を発光させることができる。（３）蛍光スペクトルが良好な対称形である。（４）有機色素に比べて耐久性、耐退色性に優れる、といった特徴を有する。
【０００４】
一方、小動物を対象としたｉｎ  ｖｉｖｏ光イメージングが注目されており、小動物の生体内の細胞を外部より、生体を傷つけることなく（非侵襲で）観察するような光学系装置が各メーカから販売され始めている。これは、生体内の観察したい部位に選択的に集まるような標識をつけた蛍光材料を生体内に注入し、外部より励起光を照射し出てきた発光を外部でモニターする方法である。生体物質を標識する手段として、分子標識物質をマーカー物質に結合した生体物質標識剤を用いる方法が検討されている。
【０００５】
近年、上記マーカー物質として量子ドットを用いる方法が注目されている。例えば、極性官能基を有する高分子を半導体ナノ粒子の表面に物理的および／または化学的に吸接合した生体物質標識剤が検討されている（例えば特許文献１参照）。
【０００６】
量子ドットを生体物質標識剤として応用するにあたり、発光本体である量子ドットをコアに、極性官能基を有する高分子を結合させる足場として、コアを覆うシェルを形成させることが公知である。例えば、特許文献１で実質的にその効果も含めて開示されている量子ドットは、ＣｄＳｅをコアに、ＺｎＳをシェルとした「コア／シェル型量子ドット」である。
【０００７】
しかしながら、例えば、特許文献１で実質的にその効果も含めて開示されている量子ドットは、（ＣｄＳｅ／ＺｎＳ型）量子ドットであり、使用されているカドミウム類は、発光半値幅は狭いが、有害重金属であるため、製造プロセスにおいても環境面への悪影響が懸念され、代替材料が求められている。
【０００８】
このような状況を鑑み、無毒性・無害性の量子ドットとしてシリコン量子ドットが検討をされている。中でも、より簡便なプロセスとして気相法が注目されている（特許文献２および３参照）。特許文献２においては、シリコン量子ドットの製造方法として、高周波スパッタリング法を用いて、シリコン量子ドットが粒子単位で分散した溶液を得る製造方法が開示されている。しかしながら、特許文献２には、生体物質標識剤として必要な、分子標識物質を結合させる方法については記載がない。
【０００９】
また特許文献３には、熱処理ＳｉＯｘ（ｘ＝１．９９９）のフッ酸中溶解によりシリコン量子ドットを製造する方法、ｐ型シリコンウェハーの陽極化成によりシリコン量子ドットを製造する方法が開示されている。特許文献３によれば、いずれの製造法においてもコアとなるシリコン結晶を製造したのちに、自然酸化によりシリコン結晶からなるコアの周囲に酸化ケイ素からなるシェル層を形成する。ついで分子標識物質を結合させるにあたり、上述のコア／シェル構造のシリコン量子ドットを、過酸化水素水との反応により表面を水酸化させる。水酸化した上でシランカップリング剤など有機分子と反応させ、官能基を導入し、さらに分子標識物質を結合させ、生体標識剤とする方法が開示されている。
【００１０】
ところが、公知の方法により本発明者らが作製したシリコン量子ドットからなる生体標識剤を、細胞内にインジェクションしたところ、その細胞は正常に培養せず、細胞毒性があることが懸念された。
【特許文献１】特開２００３−３２９６８６号公報
【特許文献２】特開２００６−７００８９号公報
【特許文献３】特開２００５−１７２４２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、細胞毒性のないコア／シェル型シリコン量子ドットを提供することである。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、従来法で得られるコア／シェル型シリコン量子ドットからなる生体標識材料の細胞毒性は、酸化ケイ素からなるシェル層を水酸化するために用いられる過酸化水素水によることを見出した。酸化ケイ素からなるシェル層を水酸化するために過酸化水素水により処理する工程後に、熱水洗浄することにより残存する過酸化水素水濃度を一定以下とすることで、無毒性な生体物質標識剤を得ることができることを見出し、本発明に至った。
【００１３】
すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
【００１４】
１．シリコンを含有するコア部と酸化ケイ素を含有するシェル層からなるコア／シェル型シリコン量子ドットであって、当該コア／シェル型シリコン量子ドットを一定条件下熱水処理したときに遊離する過酸化水素の濃度が、過マンガン酸カリウム滴定法により１００ｐｐｍ以下であることを特徴とするコア／シェル型シリコン量子ドット。
【００１５】
２．前記シェル層が、コア／シェル型シリコン量子ドットの製造工程において、過酸化水素水による水酸化処理とその後に熱水洗浄処理を施されていることを特徴とする前記１に記載のコア／シェル型シリコン量子ドット。
【００１６】
３．前記１又は２に記載のコア／シェル型シリコン量子ドットであって、その表面が有機分子により修飾されていることを特徴とするシリコン量子ドット。
【００１７】
４．前記１〜３のいずれか一項に記載のコア／シェル型シリコン量子ドットと分子標識物質とを有機分子を介して結合させたことを特徴とする生体物質標識剤。
【００１８】
５．前記分子標識物質が、ヌクレオチド鎖またはタンパク質であることを特徴とする前記４に記載の生体物質標識剤。
【００１９】
６．前記コア／シェル型シリコン量子ドットと分子標識物質とを結合させる有機分子が、ビオチン及びアビジンであることを特徴とする前記４又は５に記載の生体物質標識剤。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の上記手段により、細胞毒性のないコア／シェル型シリコン量子ドットを提供することができる。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明のコア／シェル型シリコン量子ドットは、シリコンを含有するコア部と酸化ケイ素を含有するシェル層からなるコア／シェル型シリコン量子ドットであって、当該コア／シェル型シリコン量子ドットを一定条件下熱水処理したときに遊離する過酸化水素の濃度が、過マンガン酸カリウム滴定法により１００ｐｐｍ以下であることを特徴とする。この特徴は、請求項１〜６に係る発明に共通する技術的特徴である。
【００２２】
なお、本発明の実施態様としては、前記シェル層が、コア／シェル型シリコン量子ドットの製造工程において、過酸化水素水による水酸化処理とその後に熱水洗浄処理を施されている態様が好ましい。また、当該コア／シェル型シリコン量子ドットの表面が有機分子により修飾されていることも好ましい。
【００２３】
本発明のコア／シェル型シリコン量子ドットは、有機分子を介して分子標識物質と結合させ生体物質標識剤とすることができる。この場合、分子標識物質は、ヌクレオチド鎖またはタンパク質であることが好ましい。また、当該コア／シェル型シリコン量子ドットと分子標識物質とを結合させる有機分子は、ビオチン及びアビジンであることが好ましい。
【００２４】
以下、本発明とその構成要素、および発明を実施するための最良の形態について詳細な説明をする。
【００２５】
〔コア／シェル型シリコン量子ドットの製造方法〕
本発明のコア／シェル型シリコン量子ドット（以下において、適宜、当該シリコン量子ドットのコア部を単に「シリコン量子ドット」という。）の製造方法においては、従来公知の種々の方法を利用することができるが、形成するシリコン量子ドットの粒子サイズを容易に制御することのできる高周波スパッタリング法と、シリコン量子ドットの形態を膜形態から粒子形態へ変えるための酸処理と攪拌処理をする工程を含む製造方法を採用することが好ましい。この製造方法の場合、シリコン量子ドットの形態を、膜形態から粒子形態に変え、溶液中に分散させて蛍光発光させる点に特徴がある。
【００２６】
具体的には、本発明のコア／シェル型シリコン量子ドットは、高周波スパッタリング法により製造されたコア／シェル型シリコン量子ドットであって、下記製造工程を経て製造されたことを特徴とする。
【００２７】
工程（１）：ターゲット材料としてシリコンとシリカを用い、高周波スパッタリング法により基板上にアモルファス酸化ケイ素薄膜を作製する。
【００２８】
工程（２）：上記アモルファス酸化ケイ素薄膜に熱処理を施し、アモルファス酸化ケイ素薄膜内にシリコン量子ドット（コア部）を形成する。
【００２９】
工程（３）：上記熱処理後アモルファス酸化ケイ素薄膜に、フッ酸による処理を施して、シリコン量子ドットを露出させる。
【００３０】
工程（６）：上記シリコン量子ドットが露出した基板を溶媒中に浸漬させることで、シリコン量子ドットを基板より離散させて、シリコン量子ドットが分散した溶液を得る。
【００３１】
工程（７）：シリコン量子ドットの表面を酸素雰囲気中で自然酸化、または加熱して熱酸化し、シリコン量子ドットからなるコアの周囲に酸化ケイ素からなるシェル層を形成する。
【００３２】
工程（８）：上記シリコン量子ドットを過酸化水素水中で反応させ、結晶表面を水酸化させる。水酸化させることにより、シランカップリング剤などとの反応が容易に進行するようにできる。
【００３３】
工程（９）：上記水酸化したシリコン量子ドットを熱水により洗浄する。
【００３４】
なお、本発明のコア／シェル型シリコン量子ドットは、以下の工程を経て、分子標識物質と有機分子を介して結合させることにより生体物質標識剤とすることができる。
【００３５】
工程（１０）：上記熱水洗浄したシリコン量子ドットの水酸基と有機分子と結合させる。
【００３６】
工程（１１）：有機分子と反応させたシリコン量子ドットを分子標識物質と結合させ、生体物質標識剤を得る。なお、前記有機分子が、ビオチン及びアビジンであることが好ましい。また、生体物質標識剤において、前記分子標識物質がヌクレオチド鎖またはタンパク質であることが好ましい。
【００３７】
なお、本発明のコア／シェル型シリコン量子ドットは、シリコンを含有するコア部と酸化ケイ素を含有するシェル層からなるコア／シェル型シリコン量子ドットでことを特徴とするが、発光強度を高めるために、コア部及びシェル層のうち少なくともいずれか一方にドーパントとして、Ｂｅ、Ｇａ、Ｍｇ、Ｇｅ等の原子を微量含有させることも好ましい。
【００３８】
本発明のコア／シェル型シリコン量子ドットは、平均粒径が２〜１０ｎｍであり、かつ２００〜４００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜可視光により励起されたときに、４００〜８００ｎｍの範囲内の波長の可視光の発光を示す態様のシリコン量子ドットであることが好ましい。
【００３９】
本発明において、コア／シェル型シリコン量子ドットの平均粒径は本来３次元で求める必要があるが、微粒子過ぎるため難しく、現実には二次元画像で評価せざるを得ないため、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真の撮影シーンを変えて数多く撮影し平均化することで求めることが好ましい。従って、本発明において、当該平均粒径は、ＴＥＭを用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めて、その算術平均を平均粒径とした。ＴＥＭで撮影するクラスター粒子数としては１００個以上が好ましく、１０００個の粒子を撮影するのが更に好ましい。本願においては、１０００個の粒子の算術平均を平均粒径とした。
【００４０】
〈高周波スパッタリング法〉
本発明に係る高周波スパッタリング法は、シリコン量子ドットの製造初期の段階で、発光色に直接寄与する粒子サイズを自在に制御することができるので、本発明では、様々な発光色を容易に実現することが可能である。
【００４１】
高周波スパッタリング装置は、側面下部にアルゴンガス導入口と排気口を備える真空チャンバー、真空チャンバーの上面に絶縁材料を介して取り付けられ、冷却管から導入、排出される冷却水で冷却される基板ホルダー、及び、真空チャンバーの下面に絶縁材料を介して取り付けられ、冷却管から導入、排出される冷却水で冷却される陰極シールドを備える高周波電極から構成されている。
【００４２】
そして、上記装置において、アルゴンガスを真空チャンバー内にアルゴンガス導入口から導入し、高周波コントローラによりアルゴンガスをイオン化し、イオン化されたアルゴンイオンを、高周波電極上のターゲット材料であるシリコンチップと石英ガラスへ衝突させ、ターゲット材料から放出された原子や分子を基板ホルダーに保持した基板上に堆積させ、アモルファス酸化ケイ素薄膜を形成する。
【００４３】
シリコン量子ドットの粒子サイズは、ターゲット材料を構成するシリコンチップと石英ガラスの面積比を変化させることで制御することができる。この面積比は、通常、１〜５０％とするが、好ましくは５〜３０％。さらに好ましくは１０〜１５％である。
次に、上記アモルファス酸化ケイ素薄膜を不活性ガス（アルゴン等）の雰囲気中で熱処理して、該薄膜内に、所定粒子サイズのシリコン量子ドットを形成する。
【００４４】
上記熱処理の際、熱処理温度は９００〜１２００℃とするが、好ましくは、１０００〜１１００℃である。また、熱処理時間は１５〜１００分であるが、好ましくは、３０〜８０分、さらに好ましくは、５０〜７０分である。
【００４５】
また、スパッタリング条件である高周波電力やガス圧（作製中の圧力であり、本製造プロセスではアルゴンガスの圧力）を変化させても、粒子サイズを制御することが可能である。このとき、高周波電力は１０〜５００Ｗの範囲内で変化させ、ガス圧は、１．３×１０-2〜１．３×１０Ｐａ（１×１０-4〜１×１０-1ｔｏｒｒ）の範囲内で変化させる。
【００４６】
次に、シリコン量子ドットが形成された酸化ケイ素薄膜を載置する基板をアクリル板に貼り付け、フッ酸水溶液を収容する容器に対し、上記酸化ケイ素薄膜を下にして装着する。
【００４７】
このとき，フッ酸水溶液の濃度は１〜５０％とする。好ましくは１０〜４０％であり、さらに好ましくは、２０〜３０％である。
【００４８】
そして、上記フッ酸水溶液を収容する容器を、ヒーターを備え、純水を収容する恒温水槽内に設置し、フッ酸水溶液処理を行う。
【００４９】
上記処理の際、処理温度は１０〜７０℃である。好ましくは、３０〜５０℃であり、さらに好ましくは、４０℃である。また、処理時間は０．５〜２５分である。好ましくは、１〜２０分である、さらに好ましくは、８〜１５分である。
【００５０】
上記フッ酸水溶液処理においては、容器内の酸水溶液から蒸発したフッ酸が薄膜の表面に付着し、酸化ケイ素薄膜中の酸化ケイ素部分を表面から徐々にエッチングしていく。その結果、基板上には、多数のシリコン量子ドットが凝集状態で露出する。
【００５１】
次に、シリコン量子ドットが凝集露出した基板を、エタノールを収容した容器に浸漬する。容器内に磁気撹拌子をいれ、スターラーにて撹拌する又は容器ごと超音波洗浄器に載置して超音波照射を行う。この撹拌処理により、基板上に凝集状態で露出していたシリコン量子ドットは、基板から離散し、エタノール中に分散する。
【００５２】
攪拌処理の処理時間は、通常、１０〜１２０００秒とするが、好ましくは、３０〜９００秒であり、さらに好ましくは、６０〜６００秒である。
【００５３】
次に、エタノール中分散したシリコン量子ドットを酸素雰囲気において自然酸化、または加熱して熱酸化させる。酸化処理においては、シリコン量子ドットからなるコアの周囲に酸化ケイ素からなるシェル層を形成する。
【００５４】
上記処理の際、処理温度は２０〜５０℃である。好ましくは、２５〜４０℃であり、さらに好ましくは、２５〜３５℃である。また、処理時間は２〜２４時間である。好ましくは、５〜１８時間である、さらに好ましくは、８〜１４時間である。
【００５５】
次に、上述のシリコン量子ドットを過酸化水素水と反応させる、結晶表面を水酸化させる。
【００５６】
上記反応の際、処理温度は１５〜５０℃である。好ましくは、２０〜４０℃であり、さらに好ましくは、２５〜３５℃である。また処理時間は１〜６０分である。好ましくは、５〜４０分である、さらに好ましくは、１０〜３０分である。このとき過酸化水素水の濃度は、１〜５０％とする。好ましくは１０〜４５％であり、さらに好ましくは、２０〜３５％である。
【００５７】
次に、上記水酸化したシリコン量子ドットを熱水により洗浄する。通常、１０〜６００秒とするが、好ましくは、２０〜３００秒であり、さらに好ましくは、３０〜２４０秒である。処理温度は６０〜９０℃である。好ましくは、７０〜８５℃であり、さらに好ましくは、７５〜８０℃である。
【００５８】
（シリコン量子ドットに残存する過酸化水素の定量方法）
シリコン量子ドットに残存する過酸化水素を評価するために、過酸化水素濃度を、以下の手順で過マンガン酸カリウム滴定により測定した。
【００５９】
〈０．０５Ｍ−シュウ酸ナトリウム一次標準溶液の調製〉
（１）乾燥した空の秤量瓶の質量を分析天秤で測定する。
（２）秤量瓶に上皿天秤（電子天秤）を使って、乾燥したシュウ酸ナトリウムを約１．７ｇ採取する。
（３）分析天秤で、シュウ酸案ナトリウムを入れた秤量瓶の質量を精秤する。
（４）あらかじめ、１００ｍｌビーカーに純水を約６０ｍｌ入れておき、その中に採取したシュウ酸ナトリウムを洗い落とし、攪拌して溶解する。純水で秤量瓶をよくすすぎ、秤量瓶中にシュウ酸ナトリウムが残らないようにする。
（５）ロートとロート台を用い、２５０ｍｌメスフラスコに溶解したシュウ酸ナトリウム溶液を入れる。純水でビーカーやガラス棒、ロートをよくすすぎ、シュウ酸ナトリウムを全てメスフラスコへ洗い入れる。
（６）メスフラスコの８分目程度まで純水を加え、良くかくはんする。さらに純水を加え、標線の少し下まで入れたら、後は駒込ピペットを用い、液面の最下部（メニスカス）が標線に重なるよう純水を加える。
（７）メスフラスコに共栓をし、栓を手で押さえ、メスフラスコを逆さにして、よく混合し、溶液の濃度を均一にする。
（８）この０．０５Ｍ−シュウ酸ナトリウム一次標準溶液の力価を計算する。
【００６０】
〈０．０２Ｍ−過マンガン酸カリウム標準溶液の標定〉
（１）褐色ビュレットに、０．０２Ｍ−ＫＭｎＯ4標準溶液を入れ、ビュレット台にセットする。
（２）０．０５Ｍ−シュウ酸ナトリウム一次標準溶液１０ｍｌを、ホールピペットを用いコニカルビーカーに正確にとる。
（３）メスシリンダーで純水を約１００ｍｌ加える。
（４）Ｈ2ＳＯ4（１：４）溶液を約１０ｍｌ加える。
（５）コニカルビーカーを湯せんなべに入れ、液温を温度計で確認しながら７０〜８０℃に加温する。
（６）０．０２Ｍ−ＫＭｎＯ4溶液で滴定をする。滴定中液温が６０℃を下らないよう注意する。終点は、淡赤色が少なくとも１５秒間つづくときとする。
（７）２〜６の操作を３回繰り返す。
（８）０．０２Ｍ−ＫＭｎＯ4標準溶液の力価を求める。
【００６１】
〈試料溶液の滴定〉
（１）被検試料としてのコア／シェル型シリコン量子ドットを純水１０ｍｌあたりに１×１０-8〜１×１０-1ｇ、好ましくは１×１０-7〜１×１０-2ｇ、さらに好ましくは１×１０-6〜１×１０-4ｇの条件で分散させる。分散させた試料５ｍｌをホールピペットで１００ｍｌメスフラスコに正確に採取する。試料溶液５ｍｌを、ホールピペットを用いて正確にコニカルビーカーにとる。
（２）メスシリンダーで純水を約１００ｍｌ加える。
（３）Ｈ2ＳＯ4（１：４）溶液を約２０ｍｌ加える。
（４）ビュレットの０．０２Ｍ−ＫＭｎＯ4標準溶液で滴定を行う。
（５）１〜３の操作を３回繰り返す。
（６）滴定平均値から、試料中の過酸化水素量を計算する。
【００６２】
なお、本発明においては、被検試料としてのコア／シェル型シリコン量子ドット１×１０-5ｇを純水１０ｍｌに分散させ、８０℃にて１２時間加熱し、得られた溶液について、上記過マンガン酸カリウム滴定法により過酸化水素濃度を測定したときに、過酸化水素濃度が１００ｐｐｍ以下であることを要する。なお、当該濃度値が小さいほど、毒性が少なく、好ましい。
【００６３】
（有機分子修飾）
本発明に係る生体物質標識剤は、有機分子修飾されたコア／シェル型シリコン量子ドットと、分子標識物質とが有機分子により結合されている。当該有機分子としてはコア／シェル型シリコン量子ドットと分子標識物質とを結合できる有機分子であれば特に制限はないが、例えば、タンパク質中でも、アルブミン、ミオグロビンおよびカゼイン等、またタンパク質の一種であるアビジンをビオチンと共に用いることも好適に用いられる。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
【００６４】
当該有機分子としては、メルカプト基（チオール基）、カルボキシル基、アミノ基等を持つものが好ましく用いられ、具体的にはメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、アミノプロパンチオール、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどがあげられる。
【００６５】
（生体物質標識剤）
本発明に係る生体物質標識剤は、上述したコア／シェル型シリコン量子ドットと、分子標識物質と有機分子を介して結合させて得られる。
【００６６】
本発明に係る生体物質標識剤は分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応することにより、生体物質の標識が可能となる。
【００６７】
当該分子標識物質としては例えば、ヌクレオチド鎖、抗体、抗原およびシクロデキストリン等が挙げられる。
【００６８】
具体的には、コア／シェル型シリコン量子ドットをメルカプトウンデカン酸で処理した場合は、有機分子としてアビジンおよびビオチンを用いることができる。この場合当該ナノ粒子のカルボキシル基はアビジンと好適に共有結合し、アビジンがさらにビオチンと選択的に結合し、ビオチンがさらに分子標識物質と結合することにより生体物質標識剤となる。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００７０】
〈実施例１〉
（スパッタリングによる成膜）
真空チャンバー内にアルゴンガスを導入し、高周波コントローラによりイオン化されたアルゴンイオンをシリコンチップと石英ガラスからなるターゲット材料に衝突させ、これから放出された原子および分子を半導体基板上に体積し、シリコン原子と酸素原子が混ざった薄膜を形成した。スパッタリング条件は、プラズマ出力１００Ｗ，アルゴン圧力１Ｐａとし、このときの膜厚は３ミクロンであった。シリコンチップと石英チップの比率をかえた試料を作製し、このときの、シリコンチップの面積％を表１にを示す。
【００７１】
（熱処理）
得られた薄膜を、アルゴン雰囲気中において、１１００℃まで急速に昇温し６０分間熱処理を行った。
【００７２】
（フッ酸処理）
得られたシリコン量子ドット含有薄膜を４０℃のフッ酸蒸気に１０分間晒すことで、シリカ溶解処理を行い、シリコン量子ドット露出させた。
【００７３】
（発光スペクトル）
得られたシリコン量子ドット含有薄膜について、磁気撹拌子を備えたビーカーにエタノールを入れたところに浸漬し、６００秒撹拌処理を行うことで、シリコン量子ドットをエタノール分散溶液として得た。波長２８０ｎｍの励起光を照射して発生する蛍光スペクトルを日立分光光度計Ｆ７０００を用いて測定した。発光スペクトルの、極大発光波長を表１に示す。
【００７４】
（シリコン量子ドットの溶液への分散）
上記シリコン量子ドットが露出した基板をエタノール中に浸漬させ、超音波照射を１２０秒することで、シリコン量子ドットを基板より離散させて、シリコン量子ドットが分散した溶液を得た。
【００７５】
（酸化処理）
上記シリコン量子ドットが分散した溶液に、２５℃にて空気を８時間通じることで、表面に酸化ケイ素からなるシェルを形成させた。
【００７６】
（過酸化水素水による水酸化処理）
上記酸化ケイ素からなるシェルをもつコア／シェル型シリコン量子ドットを、３０％過酸化水素水に１０分間分散させ、表面を水酸化させた。
【００７７】
（熱水洗浄処理）
上記表面を水酸化処理したコア／シェル型シリコン量子ドットを、８０℃の熱水で６０秒洗浄処理を行った。
【００７８】
〈過酸化水素濃度の測定〉
合成したコア／シェル型シリコン量子ドット１×１０-5ｇを純水１０ｍｌに分散させ、８０℃にて１２時間加熱した。得られた溶液について前記の過マンガン酸カリウム滴定法により過酸化水素濃度を測定した。結果を表１に示す。
【００７９】
〈毒性評価法および細胞形態観察〉
上記熱水洗浄処理までの各種処理を施したコア／シェル型シリコン量子ドットのＥ．ｃｏｌｉ細胞に対する毒性について振盪フラスコ実験で試験した。使用したＥ．ｃｏｌｉ菌株は、ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＵＣ１８］である。
【００８０】
初めにＬＢ培地で種培養を行った。ＬＢ培地の組成は下記のとおり。１０ｇＮａＣｌ、１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物。Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞を、５００ｍｌの振盪フラスコに入れた１００ｍｌのＬＢ培地中で、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養した。その後、発酵培養用のＭＲ培地が入れられた５００ｍｌ振盪フラスコに種培養をピペットで加えた。各フラスコには１５ｇ／ｌのグルコースと１０％（ｖ／ｖ）の播種された種培養を含む１００ｍｌのＭＲ培地が入れられている。ＭＲ培地の組成は次のとおり。１３．５ｇＫＨ2ＰＯ4、４．０ｇ（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、０．７ｇＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．８５ｇクエン酸、１０．０ｍｌの１０ｇ／ｌ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０．０ｍｌの微量金属溶液（ＴＥ）、及び１．０ｍｌの２０ｇ／ｌ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ。各フラスコには更に以下の濃度で異なる量のコア／シェル型シリコン量子ドットが加えられている。すなわち全部で４本のフラスコに対して０％（対照）、０．５％、１％、２％である。４本のフラスコを用いて３７℃、２２０ｒｐｍで発酵培養を行った。
【００８１】
分光光度計（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５２Ａ）で６００ｎｍの光学密度を測定し、細胞増殖の指標とした。８時間後の光学密度を測定し、対照試料のそれと同等にある場合、細胞増殖を阻害しない、つまり毒性なし。減少している場合を毒性ありと判定する。結果を表１に示す。
【００８２】
また８時間後にフラスコより採取した培養細胞について光学顕微鏡によりその形態を観察し、対照試料の細胞と、コア／シェル型シリコン量子ドット２％添加の試料の細胞とで比較し、形態変化の有無を目視にて判定した。対照試料との細胞とくらべ、形態が大きく変化しているものを異常。変化のわずかのものを良好、変化がないものを正常と判定した。結果を表１に示す。
【００８３】
【表１】
2009124067.tif 000002
【００８４】
表１から本発明の生体物質標識剤に用いられるシリコン量子ドットは、所望の蛍光発光を示すのはもちろん、過酸化水素濃度が十分低く、細胞毒性を示さないことが分かる。
【００８５】
比較例では、過酸化水素濃度が高く、細胞毒性を示したとわかる。このことから、本発明のコア／シェル型シリコンナノ粒子は、生体物質標識剤に好適に使用できると言える。
【００８６】
〈実施例２〉
（有機分子の修飾）
得られたシリコン量子ドット１０-5ｇをメルカプトウンデカン酸０．２ｇが溶解した純水１０ｍｌ中に分散させて、４０℃、１０分間攪拌し、シェルの表面を処理することでシリコン量子ドットの表面をカルボキシル基で修飾した。
【００８７】
〈分子標識物質の結合〉
上記メルカプトウンデカン酸修飾シリコン量子ドット１．０×１０-5ｍｏｌ／ｌの水分散液にアビジン２５ｍｇを添加し４０℃で１０分間攪拌を行い、アビジンコンジュゲートナノ粒子を作製した。
【００８８】
得られたアビジンコンジュゲートナノ粒子溶液にビオチン化された塩基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを混合攪拌し、ナノ粒子で標識（ラベリング）されたオリゴヌクレオチドを作製した。
【００８９】
さまざまな塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを固定化したＤＮＡチップ上に上記の標識（ラベリング）したオリゴヌクレオチドを滴下・洗浄したところ、標識（ラベリング）されたオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列をもつオリゴヌクレオチドのスポットのみが粒子の粒径に依存して異なる色の発光を示すことを確認した。
【００９０】
このことより、ナノ粒子でのオリゴヌクレオチドの標識（ラベリング）を確認することができた。すなわち、この結果により、本発明のシリコン量子ドットを用いた生体物質標識剤を提供することができることが分かる。