(57)【要約】【課題】腫瘍形成のＷｎｔ経路の開始における調節機能に利用される腫瘍特異的抗原又はタンパク質となり得る細胞表面分子を含む、上記の科の更なるメンバーを解明する必要性がある。これらは、形質転換した表現型及び癌の進展にとって重要であるＷｎｔシグナリング経路の下流成分をも含むであろう。【解決手段】遺伝子が少なくともＷｎｔ−１によって誘導されるＷｎｔ−１誘導分泌タンパク質（ＷＩＳＰｓ）が提供される。また、そのポリペプチドをコードしている核酸分子、同じくその核酸配列を含んでいるベクターと宿主細胞、異種ポリペプチド配列に融合した該ポリペプチドを含むキメラポリペプチド分子、該ポリペプチドに結合する抗体、及び該ポリペプチドを生産するための方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）図８のアミノ酸２４から２５０の配列（配列番号：１５）を含むヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸。
【請求項２】
少なくとも１のＷＩＳＰ生物学的活性を有する請求項１記載の核酸。
【請求項３】
（ａ）図８のアミノ酸２４から２５０の配列（配列番号：１５）を含むヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含む請求項１記載の核酸。
【請求項４】
図８のアミノ酸残基２４から２５０を有するヒトＷＩＳＰ-２（配列番号：１５）をコードしているＤＮＡ、又は図８のアミノ酸残基１から２５０を有するヒトＷＩＳＰ-２（配列番号：１６）をコードしているＤＮＡ、又は該コード化ＤＮＡの何れかの相補体を含む請求項１記載の核酸。
【請求項５】
（ａ）図８のアミノ酸１から２５０の配列（配列番号：１６）を含むヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸。
【請求項６】
少なくとも約５００ヌクレオチドを有するとともに、（ａ）図３のアミノ酸２４から２５１の配列（配列番号：１９）を含むマウスＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸。
【請求項７】
（ａ）図３のアミノ酸２４から２５１の配列（配列番号：１９）を含むマウスＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含む請求項６記載の核酸。
【請求項８】
図３のアミノ酸残基２４から２５１を有するマウスＷＩＳＰ-２（配列番号：１９）をコードしているＤＮＡ、又は図３のアミノ酸残基１から２５１を有するマウスＷＩＳＰ-２（配列番号：２０）をコードしているＤＮＡ、又は該コード化ＤＮＡの何れかの相補体を含む請求項７記載の核酸。
【請求項９】
少なくとも約５００ヌクレオチドを有するとともに、（ａ）図３のアミノ酸１から２５１の配列（配列番号：２０）を含むマウスＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸。
【請求項１０】
少なくとも約４００ヌクレオチドを有するとともに、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９３９１（ＤＮＡ３３４７３）においてヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドｃＤＮＡによってコードされた同じ完全長ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に少なくとも約７５％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸。
【請求項１１】
受託番号ＡＴＣＣ２０９３９１の下に寄託されたクローンＵＮＱ２２８（ＤＮＡ３３４７３）の配列の完全長コード化配列の核酸配列を含む請求項１０記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
ＷＩＳＰ-２ポリペプチドの発現のために好適な条件下で請求項１３記載の宿主細胞を培養すること及び該培養物からＷＩＳＰ-２ポリペプチドを回収することを含むＷＩＳＰ-２ポリペプチドの製造方法。
【請求項１５】
請求項１記載の核酸によってコードされた単離したＷＩＳＰ-２ポリペプチド。
【請求項１６】
図８のアミノ酸残基１から２５０（配列番号：１６）を含む又は図８のアミノ酸残基２４から２５０（配列番号：１５）を含む単離した天然配列ヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドである請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項１７】
異種アミノ酸配列に融合したＷＩＳＰ-２ポリペプチドを含むキメラ分子。
【請求項１８】
ＷＩＳＰ-２ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１９】
モノクローナル抗体である請求項１８記載の抗体。
【請求項２０】
少なくとも約４００ヌクレオチドを有するとともに、（ａ）図８のアミノ酸２４から２５０の配列（配列番号：１５）を含むヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と、ストリンジェントな条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズすること、及びもし該試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約７５％の配列同一性を有するならば、該試験ＤＮＡ分子を単離することによって製造される単離した核酸。
【請求項２１】
（ｉ）（ａ）図８のアミノ酸２４から２５０の配列（配列番号：１５）を含むヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と、ストリンジェントな条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズすること、及びもし該試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約７５％の配列同一性を有するならば、（ｉｉ）該ポリペプチドの発現のために適した条件下で該試験ＤＮＡを含む宿主細胞を培養すること、及び（ｉｉｉ）該細胞培養物から該ポリペプチドを回収することによって製造したポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１５記載のポリペプチドとそのための担体とを含む組成物。
【請求項２３】
ＷＩＳＰ-２ポリペプチドと製薬上許容される担体とを含む組成物。
【請求項２４】
化学療法剤又は増殖抑制剤をさらに含む請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
ＷＩＳＰ-２ポリペプチドがヒトのポリペプチドである請求項２３記載の組成物。
【請求項２６】
（ａ）請求項２３記載の組成物；
（ｂ）上記組成物を収容している容器；及び
（ｃ）ＷＩＳＰ関連疾患の治療におけるＷＩＳＰ-２ポリペプチドの使用に関しての上記容器に添付されたラベル又は薬学製品中に含まれた包装挿入物、とを含む薬学製品。
【請求項２７】
ＷＩＳＰ-２ポリペプチドに結合する単離した抗体。
【請求項２８】
ＷＩＳＰ-２ポリペプチドを過剰発現している細胞の死滅を誘導する請求項２７記載の抗体。
【請求項２９】
上記細胞が癌細胞である請求項２８記載の抗体。
【請求項３０】
ヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドに結合し、ヒト又はヒト化した抗体である請求項２７記載の抗体。
【請求項３１】
モノクローナル抗体である請求項２７記載の抗体。
【請求項３２】
抗体フラグメント、一本鎖抗体、または抗イディオタイプ抗体である請求項３１記載の抗体。
【請求項３３】
製薬上許容される担体との混合物中に請求項２７記載の抗体を含む組成物。
【請求項３４】
上記抗体の増殖抑制量を含む請求項３３記載の組成物。
【請求項３５】
抗ＷＩＳＰ-２抗体に、ＷＩＳＰ-２ポリペプチドの含有が疑われる細胞をさらすこと、及び該細胞への上記抗体の結合を測定することを含む、ＷＩＳＰ-２ポリペプチドの存在を測定する方法。
【請求項３６】
ＷＩＳＰ-２ポリペプチドに対するアゴニストを同定するための方法であり、
（ａ）該ポリペプチドによって細胞増殖の刺激のために適当な条件下で細胞とスクリーニングするべき化合物とを接触させること；及び
（ｂ）その化合物が有用なアゴニストかどうか測定するために、細胞の増殖を測定すること、を含む方法。
【請求項３７】
ＷＩＳＰ-２ポリペプチドの発現又は活性化を抑制する化合物を同定する方法であり、該化合物とポリペプチドとの反応を与えるための条件下で且つ十分な時間、候補化合物とＷＩＳＰ-２ポリペプチドとを接触させることを含む方法。
【請求項３８】
（ａ）ポリペプチドにより細胞増殖の刺激のために適当な条件下でＷＩＳＰ-２ポリペプチドの存在中で細胞とスクリーンするべき化合物とを接触させること；及び
（ｂ）その化合物が有効なアンタゴニストかどうかを測定するために該細胞の増殖を測定すること、の工程を含む請求項３７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、National Institutes of Health, National Cancer Instituteによって承認された許可番号第5PO1 CA41086の下に政府支援により成された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、全体として新規ＤＮＡの同定と単離及びＷｎｔ-１誘導分泌タンパク質（ＷＩＳＰｓ）としてここで定義した結合組織増殖因子に相同性を有する新規ポリペプチドの組換え体生産に関する。
【背景技術】
【０００３】
悪性腫瘍（癌）は、米国において心臓疾患に次ぐ死亡原因の第２位である。Boringら、Ca Cancer J. Clin.,43:7(1993)。
【０００４】
癌は、多くの異常な、又は新生性の、正常細胞から派生した腫瘍塊を形成するように増殖する細胞の増大、これら新生腫瘍細胞による隣接組織の変換、及び局部リンパ節に又は遠位に血液又はリンパ系を経て結局は拡散する（転移）悪性細胞の生成により特徴付けられる。癌の段階において細胞は、正常細胞が成長しないであろう条件下で増殖する。癌は、侵襲性及び攻撃的な異なる度合によって特徴付けられ、それ自身が広範な形態で現れる。
【０００５】
遺伝子発現の変更は、全ての癌の共通の特徴である非制御細胞増殖と脱分化に密接に関係付けられる。ある種の良く研究された腫瘍のゲノムは、悪性細胞増殖を防止するように通例は機能するであろう腫瘍抑制遺伝子と普通呼ばれる劣性遺伝子の発現を減じ、及び／又は悪性の増殖を促進するように作用する、オンコジーンのようなある種の優性遺伝子の過剰発現を示すことが見出されている。これら遺伝子変化のそれぞれは、全体として、完全な新生表現型を表すいくつかの特徴を移入するために応答可能とされると思われる。Hunter, Cell, 64: 1129(1991); Bishop, Cell, 64: 235-248(1991)。
【０００６】
癌細胞における遺伝子(例えばオンコジーン)過剰発現の良く知られたメカニズムは、遺伝子増幅である。これは、特有な遺伝子の祖先細胞多重コピーの染色体が生産される場合のプロセスである。該プロセスは、該遺伝子を含む染色体の領域の無計画な複製、その後の染色体に戻る複製したセグメントの組換えを含む。Alitaloら、Adv. Cancer Res., 47: 235-281(1986)。それは、該遺伝子の過剰発現が遺伝子増幅と並行して起こる、即ち作られたコピーの数に比例すると思われる。
【０００７】
増殖因子及び増殖因子レセプターをコードするプロトオンコジーンは、胸癌を含む各種のヒトの悪性疾患の病因において重要な役割を演じることが同定されている。例えば、上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)に関連した185-kdトランスメンブレン糖タンパク質レセプター(ｐ１８５HER2；ＨＥＲ２)をコードするヒトＥｒｂＢ２遺伝子(erbB2、her2又はc-erbB-2としても知られる)が、ヒトの胸癌の約２５％から３０％で過剰発現されることが見出されている。Slamonら、Science, 235:177-182(1987); Slamonら、Science,244:707-712(1989)。
【０００８】
プロトオンコジーンの遺伝子増幅が、癌のより悪性形に典型的に含まれる事象であり、且つ臨床的な結果の前兆として作用できることが報告されている。Schwabら、Genes Chromosomes Cancer, 1: 181-193(1990); Alitaloら、上記。かくしてｅｒｂＢ２過剰発現は、特に腋窩のリンパ節を含む初期疾患に罹った患者において、乏しい予後徴候予測として普通関わり(Slamonら、(1987)と(1989)、上記；RavdinとChamness, Gene, 159: 19-27(1995); 及びHynesとStern, Biochem Biophys Acta, 1198:165-184(1994))、及びホルモン治療と、ＣＭＦ(シクロホスファミド、メトトレキサート、及びフルオロウラシル)及びアントラサイクリンを含む化学療法的な養生の感受性及び／又は抵抗性に結び付けられている。Baselgaら、Oncology, 11(3 Suppl 1):43-48(1997)。しかしながら、乏しい予後徴候を持つｅｒＢ２過剰発現の関連にかかわらず、タキサン(taxanes)による治療に臨床的に応答するＨＥＲ２陽性患者の率は、ＨＥＲ２陰性患者のそれらの３倍以上である。Baselgaら、上記。組換えヒト化抗ＥｒｂＢ２(抗ＨＥＲ２)モノクローナル抗体(ネズミ抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５のヒト化したバーション、rhuMAb HER2又はHERCEPTINRと呼ばれる)は、広範囲の従来の抗癌治療で受け入れられているＥｒｂＢ２過剰発現転移性胸癌に罹った患者において臨床的に活用されている。Baselgaら、J. Clin. Oncol., 14:737-744(1996)。
【０００９】
サイトカインは、神経学的な機能障害がアミノ酸神経伝達代謝における変化に起因すると考えられている脳の病気の病因に関連付けられている。ＴＧＦペプチドは、培養における非癌細胞の増殖及び形質転換を誘導するその能力によって最初に同定された小さなポリペプチドである。増殖因子として始めに定義されたとしても、ＴＧＦ-βは、上皮の、内皮の、リンパ様の、及び造血細胞の増殖もまた阻害する。このサイトカインは、結果として治療プロセスを与える、炎症応答の持続を調節することにおいて重要な役割を演じると思われる。それはまた、多くの他のサイトカインの調節を含む、多くの多面発現性作用を有する潜在的な免疫調節物質でもある。
【００１０】
ＴＧＦ-βスーパーファミリーは、骨形態発生タンパク質(BMP-2,BMP-4,BMP-6,BMP-7)、アクチビンＡ＆Ｂ、デカペンタプレジック(dpp)、６０Ａ、ＯＰ-２、ドルサリン、増殖分化因子(GDFs)、結節性の、ＭＩＳ、インヒビン-α、ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β５、及びグリア-誘導神経親和性因子(GDNF)を含む。Atrisanoら、J. Biochemica et Biophysica Acta, 1222:71-80(1
994)。その名称の意味として特に重要な増殖分化因子、これらの因子は細胞の分化の意を含む。
【００１１】
結合組織増殖因子(CTGF)は、ＴＧＦ-βを含む多くの因子によって線維芽細胞中に誘導される増殖因子であり、足場依存性増殖(AIG)、形質転換細胞の属性を誘導するためのＴＧＦ-βの能力のために必須である。ＣＴＧＦは、培養した内皮細胞の増殖培地中に存在する血小板由来増殖因子(PDGF)ダイマーの型を同定するための試みにおいて発見され、且つＰＤＧＦに免疫学的に且つ生物学的に関連する。米国特許第５４０８０４０号参照。ＣＴＧＦはまた、細胞にマイトジェンで且つ走化性であり、それ故にこの科の増殖因子は、正常な発育、増殖、及びヒト組織の再生において役割を演じるものと思われる。
【００１２】
Ｃｙｒ６１のためのニワトリオルトログ、ＣＥＦ１０、ヒト、マウス、及びゼノプス・レビス(Xenopus laevis)ＣＴＧＦ、及びヒト、ニワトリ、及びゼノプス・レビスＮｏｖを含むＣＴGFに関連した７のタンパク質は、単離され、クローン化され、配列決定され、且つＣＴＧＦ遺伝子科に属するとして特徴付けられている。OemarとLuescher, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17: 1483-1489(1997)。Ｃｙｒ６１をコードしている遺伝子は、脈管形成、腫瘍増殖、及び血管新生を促進することが見出されている。Babicら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 6355-6360(1998)。該ｎｏｖ遺伝子は、胚の段階で必須に腎臓で発現され、正常な腎臓に関し、ｎｏｖ発現の変更は、鳥類腎芽細胞腫及びヒトウィルムス腫の療法で検出されている。Martinerieら、Oncogene, 9:2729-2737(1994)。Ｗｔ１は、ダウンレギュレーションが正常な及び腫瘍の腎形成における鍵となる要素を表すであろう、ヒトｎｏｖ発現をダウンレギュレーションする。Martinerieら、Oncogene, 12: 1479-1492(1996)。保存配列とそのＮ末端配列中の且つ低い親和性によってＩＧＦｓと結合するＩＧＦＢＰモチーフを含む分泌したタンパク質をコードするＣＴＧＦ、ｎｏｖ、及びｃｙｒ６１遺伝子が、低アフィニティーｍａｃ２５／ＩＧＦＢＰ-７(ヤマナカら、J. Biol. Chem., 272: 30729-30734(1997))及び高アフィニティーＩＧＦＢＰｓ１−６と一緒に、ＩＧＦＢＰスーパーファミリーの更なるメンバーを表すことが、最近提案されている。この提案の下でＣＴＧＦは、ＩＧＦＢＰ-８と定義されるであろう。Kimら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12981-12986(1997)。
【００１３】
最近、タンパク質が低い転移性で発現されるＥＬＭ１と定義したマウスにおいて見出された。ハシモトら、J. Exp. Med., 187:289-296(1998)。ｅｌｍ１遺伝子、後述したＷＩＳＰ-１のネズミ相同体は、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１／Ｃｅｆ１０、及び神経芽細胞腫過剰発現遺伝子科の別なメンバーであり、インビボで腫瘍増殖及びＫ-１７３５ネズミ黒色腫細胞の転移を抑制する。ｒＣｏｐ-１に関する別な最近の文献は、後述したＷＩＳＰ-２のラットオルトログが、細胞形質転換後にこの遺伝子の発現の損失を記載する。Zhangら、Mol. Cell. Biol., 18:6131-6141(1998)。
【００１４】
ＣＴＧＦ科メンバー(ｎｏｖの例外を伴う)は、細胞増殖、分化、胚形成、及び創傷治癒を調節すると思われる早期増殖応答遺伝子と直接関係する。ＣＴＧＦ遺伝子科のメンバー中の配列相同性は高い；しかしながら、これらのタンパク質のインビトロの機能は、増殖刺激（即ちヒトＣＴＧＦ）から増殖抑制（即ちニワトリＮｏｖとｈＣＴＧＦとも思われる）までの範囲である。さらに、ＣＴＧＦに相同ないくつかの分子は、線維形成、より高度な細胞の形成、いくつかの癌及び強皮症、ケロイド、好酸球性筋膜炎、結節性筋膜炎、及びデュプュイトラン拘縮のような各種の皮膚疾患に関連した線維症性病変と関連した結合組織基質の過剰の防止において有用であることが示される。さらにＣＴＧＦ発現は、癌基質形成を示唆している哺乳動物腫瘍の線維症瘻が創傷治癒に類似の線維増殖活性増殖因子の誘導を含むことが最近示されている。ヒトＣＴＧＦはまた、進行したアテローム性動脈硬化症病変において非常に高いレベルで発現されるが、しかし正常な動脈では無く、アテローム性動脈硬化症における役割をそれが演じ得ることを示唆する。OemarとLuescher,上記。従って、ＣＴＧＦに相同な分子は興味あるものである。
【００１５】
細胞外及び膜結合タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を演じる。多くの個別の細胞の運命は、例えば増殖、移動、分化、又は他の細胞との相互作用は、他の細胞から受けた情報及び／又は直接の環境によって典型的に支配される。この情報は、異なった細胞レセプター又は膜結合タンパク質によって交互に受け取られ且つ解釈される、分泌したポリペプチド(例えばマイトジェンの因子、生存因子、細胞毒性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)によってしばしば伝達される。これらの分泌したポリペプチド又はシグナリング分子は、細胞外環境で、普通は膜結合レセプタータンパク質での作用のその部位に達するため細胞分泌経路を経て通常は通過する。
【００１６】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー、及びバイオリアクターとしての使用を含む、各種の工業的な適用を有する。実際に、目下利用可能な多くのタンパク質医薬、例えば血栓崩壊剤、インターフェロン、インターロイキン、エリトロポイエチン、コロニー刺激因子、及び他の各種サイトカインは、分泌タンパク質である。膜結合タンパク質であるそのレセプターはまた、治療用又は新剤剤としての可能性をも有する。レセプター免疫付着因子は例えば、レセプター-リガンド相互作用を阻止するための治療薬剤として利用することができる。膜結合タンパク質はまた、相対的なレセプター／リガンド相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子のインヒビターのスクリーニングのためにも利用することができる。そのような膜結合タンパク質と細胞レセプターは、制限されることなしに、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞-細胞相互作用に含まれるレセプター、及び細胞付着因子分子様セレクチンとインテグリンを含む。細胞増殖と分化を調節するシグナルの形質導入は、各種の細胞タンパク質のリン酸化によって部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素、タンパク質チロシンキナーゼもまた、増殖因子レセプターとして作用する。実例は、線維芽細胞増殖因子レセプターと神経増殖因子レセプターを含む。
【００１７】
天然分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にＣＴＧＦに相同性を有するそれらを新たに同定するための努力が、工業的及び学術的の両方で始められた。主な努力は、新規分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード化配列を同定するための哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに集中される。スクリーニング法と技術の実例は、文献中に記載される。例えば、Kleinら、Proc. N
atl. Acad. Sci., 93:7108-7113(1996)；及び米国特許第５５３６６３７号を参照。
【００１８】
Ｗｎｔｓは、円形動物、昆虫、軟骨魚類、及び脊椎動物において見出されているメンバーである大きな遺伝子科によりコードされる。Hollandら、Dev. Suppl., 125-133(1994)。Ｗｎｔｓは、多種多様の種が多重保存Ｗｎｔ遺伝子を有することから、各種の発生的な及び生理学的なプロセスにおいて機能すると思われる。McMahon, Trends Genet., 8: 236-242(1992); NusseとVarmus, Cell, 69: 1073-1087(1992)。Ｗｎｔ遺伝子は、幾つかの原始細胞型においてパラクリン又はオートクリンシグナル活性として機能すると思われる。McMahon, 上記；NusseとVarmus, 上記。Ｗｎｔ増殖因子科は、マウスにおいて同定された１０より多い遺伝子を含み（Ｗｎｔ-１，-２，-３Ａ，-３Ｂ，-４，-５Ａ，-５Ｂ，-６，-７Ａ，-７Ｂ，-８Ａ，-８Ｂ，-１０Ｂ，-１１，-１２，及び-１３）（例えば、Gavinら、Genes Dev., 4: 2319-2332(1990); Leeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 2268-2272(1995); Christiansenら、Mech. Dev., 51:341-350(1995)を参照）、且つｃＤＮＡクローニングによってヒトにおいて少なくとも９つ（Ｗｎｔ-１，-２，-３，-５Ａ，-７Ａ，-７Ｂ，-８Ｂ，-１０Ｂ，及び-１１）を含む。例えば、Vant Veerら、Mol. Cell. Biol., 4: 2532-2534(1984)を参照。
【００１９】
Ｗｎｔ-１プロトオンコジーン（ｉｎｔ-１）は、ウイルスＤＮＡ配列のためマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）によって誘導した乳癌から最初に同定された。NusseとVarmus, Cell, 31: 99-109(1982)。成体マウスにおいて、Ｗｎｔ-１ｍＲＮＡの発現レベルは、精子発生の後期の間に精巣のみで検出される。Ｗｎｔ-１タンパク質は、約４２ＫＤａであり、分泌のためのシグナル配列として機能し得るアミノ-末端疎水性領域を含む(NusseとVarmus, 上記，1992)。Ｗｎｔ-２／ｉｒｐは、マウス胎児と成体組織において検出され、且つその分布はＷｎｔ-１の発現パターンと重複していない。Ｗｎｔ-３は、マウス乳癌原性と関連する。マウス胚におけるＷｎｔ-３の発現は、神経管において及び肢芽において検出される。Ｗｎｔ-５ａは、９．５から１４．５日で前及び後脚の発生分化において検出され且つ最高のレベルは四肢の遠心端で外胚葉中に濃縮される。NusseとVarmus, 上記(1992)。最近、Ｗｎｔ-ｘと称される、Ｗｎｔ増殖因子は、骨組織と骨起因細胞におけるＷｎｔ-ｘ発現の検出とともに記載されている（ＷＯ９５／１７４１６）。成熟骨芽細胞の維持におけるＷｎｔ-ｘの役割及び治療薬として又は骨関連疾患を治療するための他の治療薬の開発においてのＷｎｔ-ｘ増殖因子の使用もまた記載されている。
【００２０】
Ｗｎｔｓは、局部細胞シグナリングにおいて役割を演じ得る。生物学的な研究では、より多く分泌されたＷｎｔタンパク質が、媒体中で自由に拡散されると言うよりはむしろ、細胞表面又は細胞外マトリックスと結合して見出すことができることが知見されている。PapkoffとSchryver, Mol. Cell. Biol., 10: 2723-2730(1990); BradleyとBrown, EMBO J., 9: 1569-1575(1990)。
【００２１】
Ｗｎｔ遺伝子中の変異の研究では、成長制御と組織パターン化におけるＷｎｔの役割が示されている。ショウジョウバエにおいて、羽根なし（ｗｇ）は、Ｗｎｔ-関連遺伝子をコードし（Rijsewikら、Cell, 50: 649-657(1987))、且つｗｇ変異は、外胚葉、神経発生、及び想像上の円板発芽後成育のパターンを変える。MorataとLawerence, Dev. Biol., 56: 227-240(1977)；Baker, Dev. Biol., 125: 96-108(1988)；KlingensmithとNusse,Dev. Biol., 166: 396-414(1994)。線虫(Caenorhabditis elegans)において、lin-44は、非対称細胞分割のために要求されるＷｎｔ相同体をコードする。HermanとHorvitz, Development, 120: 1035-1047(1994)。マウスにおけるノックアウト変異は、脳発育（McMahonとBradley, Cell, 62: 1073-1085(1990)；ThomasとCappechi, Nature, 346: 847-850(1990))、及び腎臓の胚始原の発芽後成育(Starkら、Nature, 372: 679-683(1994))、尾芽(タカダら、Genes Dev., 8: 174-189(1994))、及び肢芽のために必須となるＷｎｔを示している。乳腺におけるＷｎｔｓの過剰発現は、乳房過形成(McMahon，上記(1992)；NusseとVarmus，上記(1992))、及び早期肺胞発育をもたらすことができる。Bradburyら、Dev. Biol., 170: 553-563(1995)。
【００２２】
Ｗｎｔ-５ａとＷｎｔ-５ｂは、７−８日ネズミ胚の後及び側板中胚葉と胚外中胚葉において発現される。Gavinら、上記(1990)。これらの胚ドメインは、得られる多分化能造血前駆体とＨＳＣｓからのＡＧＭ領域と卵黄嚢組織の一助となる。DzierzakとMedvinsky, Trends Genet., 11: 359-366(1995)；Zonら、GluckmanとCoulombel, ed., Colloque, INSERM, 235: 17-22(1995)中，Joint International Workshop on Foetal and Neonatal Hematopoiesis and Mechanism of Bone Marrow Failure, Paris France, April 3-6, 1995で提示された；カナツとニシカワ，Development, 122: 823-830(1996)。Ｗｎｔ-５ａ，Ｗｎｔ-１０ｂ，及び他のＷｎｔｓは、Ｗｎｔ-７ｂについて示されたような早期骨ミクロ環境の発育とパターン化において可能性のある役割が示されている肢芽において検出されている。Gavinら、上記；Christiansenら、Mech. Devel., 51: 341-350(1995)；ParrとMcMahon，上記(1995)。
【００２３】
Ｗｎｔ／Ｗｇシグナル導入経路は、その成体の生物学的発展において重要な役割を演じ、且つ幾つかのヒトの癌において関与している。この経路もまた、腫瘍抑制遺伝子、ＡＰＣを含む。該ＡＰＣ遺伝子における変異は、ヒト結腸直腸癌の散在性及び遺伝的な形態の進展と関連付けられる。該Ｗｎｔ／Ｗｇシグナルは、ベータ-カテニンと、リンパ球様エンハンサー結合因子／Ｔ細胞因子（ＬＥＦ／ＴＣＦ）ＨＭＧボックス転写因子科の一員からなる二分割転写複合体の形成に帰結する、該細胞中のベータ-カテニン／アルマジロ(beta-catenin/Armadillo)の蓄積に至る。この複合体は、それがショウジョウバエにおいて前後区画変換(engrauled)し且つウルトラバイソラックス遺伝子のような、Ｗｎｔ／Ｗｇシグナルの遺伝子下流の発現を活性化できる場合に、その核に転座する。腫瘍形成におけるその機能を推定する脊椎におけるＷｎｔ-１の下流標的遺伝子は、しかしながら、目下のところ未知である。
【００２４】
Ｗｎｔについてのもっとも新しい報告は、CadiganとNusse, Genes & Dev., 11: 3286-3305(1997)を参照。
【非特許文献１】CadiganとNusse, Genes & Dev., 11: 3286-3305(1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
腫瘍形成のＷｎｔ経路の開始における調節機能に利用される腫瘍特異的抗原又はタンパク質となり得る細胞表面分子を含む、上記の科の更なるメンバーを解明する必要性がある。これらは、形質転換した表現型及び癌の進展にとって重要であるＷｎｔシグナリング経路の下流成分をも含むであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
発明の開示
いくつかの推定Ｗｎｔ-１融合遺伝子が、高スループットｃＤＮＡサブストラクション実験においてｍＲＮＡレベルで同定されている。かくして、本出願人は、それぞれＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、及びＷＩＳＰ-３と定義した、ＷＩＳＰ科の新規ポリペプチドをコードする新規ｃＤＮＡクローン(ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、及びＷＩＳＰ-３)を同定している。この分類のポリペプチドは、以前はそれぞれＷＩＧ-１とＷＩＧ-２と呼ばれていたＷＩＳＰ-１とＷＩＳＰ-とともに、Ｗｎｔ-１誘導遺伝子(ＷＩＧ)として以前は呼ばれていた。ｃＤＮＡクローンの一つは、ＣＴＧＦに相同性を有する、新規ポリペプチド、ヒトＷＩＳＰ-２をコードし、該ポリペプチドは「ヒトＷＩＳＰ-２」又は「ＰＲＯ２６１」として本明細書中で定義される。ＷＩＳＰ-１とＷＩＳＰ-３分子もまたＣＴＧＦとの相同性を有する。
【００２７】
一つの実施態様において、本発明は、少なくとも約６００ヌクレオチドを有するとともに、（ａ）図５と６のアミノ酸２３から３６７の配列（配列番号：３）を含むヒトＷＩＳＰ-１をコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に少なくとも約７５％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸を提供する。好ましくは、この核酸は、少なくとも１のＷＩＳＰ生物学的活性を有する。より好適な実施態様において、この核酸は、（ａ）図５と６のアミノ酸２３から３６７の配列（配列番号：３）を含むヒトＷＩＳＰ-１をコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に少なくとも約９５％の配列同一性を有する。
【００２８】
より好ましくは、図５と６のアミノ酸残基２３から３６７の配列（配列番号：３）を有するヒトＷＩＳＰ-１をコードしているＤＮＡ、又は図５と６のアミノ酸残基１から３６７の配列（配列番号：４）を有するヒトＷＩＳＰ-１をコードしているＤＮＡ、又は該コード化ＤＮＡのいずれかの相補体を含む核酸である。さらに好ましくは、バリン残基よりむしろ位置１８４でイソロイシン残基であること、又はアラニン残基よりむしろ位置２０２でセリン残基であること以外は、図５と６のアミノ酸残基２３から３６７又は１から３６７（それぞれ配列番号：５−８）を有するヒトＷＩＳＰ-１をコードしているＤＮＡを含む核酸である。さらにこの核酸がバリン残基よりむしろ位置１８４でイソロイシン残基であること及びアラニン残基よりむしろ位置２０２でセリン残基であること以外は、図５と６のアミノ酸残基２３から３６７又は１から３６７（それぞれ配列番号：２１と２２）を有するヒトＷＩＳＰ-１をコードしているＤＮＡを含むことが好ましい。
【００２９】
また好ましくはこの核酸は、図１のアミノ酸残基２３から３６７を有するマウスＷＩＳＰ-１（配列番号：１１）をコードしているＤＮＡ、又は図１のアミノ酸残基１から３６７を有するマウスＷＩＳＰ-１（配列番号：１２）をコードしているＤＮＡ、又は該コード化ＤＮＡの何れかの相補体を含む。
【００３０】
また本発明によって、少なくとも約６００ヌクレオチドを有するとともに、（ａ）図１のアミノ酸２３から３６７の配列（配列番号：１１）を含むマウスＷＩＳＰ-１をコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に少なくとも約８５％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸も提供される。好ましくは、この核酸は、少なくとも１のＷＩＳＰ生物学的活性を有する。より好ましくは、この核酸は、（ａ）図１のアミノ酸２３から３６７の配列（配列番号：１１）を含むマウスＷＩＳＰ-１をコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含む。
【００３１】
別の好ましい実施態様において、本発明は、少なくとも約６００ヌクレオチドを有するとともに、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９５３３＿（ｐＲＫ５Ｅ．ｈ．ＷＩＳＰ-１．５６８．３８）においてヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドｃＤＮＡによってコードされた同じ完全長ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に少なくとも約７５％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸を提供する。この核酸は、好ましくは少なくとも約６００ヌクレオチドを有するとともに（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９５３３（ｐＲＫ５Ｅ．ｈ．ＷＩＳＰ-１．５６８．３８）においてヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドｃＤＮＡによってコードされた同じ完全長ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含む。
【００３２】
別の態様において、本発明は、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの発現のために好適な条件下で上記核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び該細胞培養物からＷＩＳＰ-１ポリペプチドを回収することを含む、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの製造方法を提供する。さらに、該ポリペプチドがヒトＷＩＳＰ-１又はマウスＷＩＳＰ-１である場合を含む、上記核酸によってコードされた単離したＷＩＳＰ-１ポリペプチドが提供される。
【００３３】
別な実施態様において、本発明は、配列番号：２３，２４，２５，２６，２７，２８，又は２９を含む核酸、及びそのような核酸によってコードされた単離したＷＩＳＰ-１ポリペプチドを提供する。
【００３４】
また本発明によって、少なくとも約６００ヌクレオチドを有するとともに、（ａ）図５と図６のアミノ酸２３から３６７の配列（配列番号：３）を含むヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と、ストリンジェントな条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズすること、及びもし該試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約７５％の配列同一性を有するならば、該試験ＤＮＡ分子を単離することによって製造される単離した核酸が提供される。
【００３５】
さらに、（ｉ）（ａ）図５と６のアミノ酸２３から３６７の配列（配列番号：３）を含むヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と、ストリンジェントな条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズすること、及びもし該試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約７５％の配列同一性を有するならば、（ｉｉ）該ポリペプチドの発現のために適した条件下で該試験ＤＮＡを含む宿主細胞を培養すること、及び（ｉｉｉ）該細胞培養物から該ポリペプチドを回収することによって製造したポリペプチドが提供される。
【００３６】
別な態様において、本発明は、（ａ）図８のアミノ酸２４から２５０の配列（配列番号：１５）を含むヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸を提供する。好ましくはこの核酸は、少なくとも１のＷＩＳＰ生物学的活性を有する。また、好ましくはこの核酸は、（ａ）図８のアミノ酸２４から２５０の配列（配列番号：１５）を含むヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含む。別の好適な実施態様において、この核酸は、図８のアミノ酸残基２４から２５０を有するヒトＷＩＳＰ-２（配列番号：１５）をコードしているＤＮＡ、又は図８のアミノ酸残基１から２５０を有するヒトＷＩＳＰ-２（配列番号：１６）をコードしているＤＮＡ、又は該コード化ＤＮＡの何れかの相補体を含む。
【００３７】
別な態様において、本発明は、（ａ）図８のアミノ酸１から２５０の配列（配列番号：１６）を含むヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸を提供する。
【００３８】
別な態様において、本発明は、少なくとも約５００ヌクレオチドを有するとともに、（ａ）図３のアミノ酸２４から２５１の配列（配列番号：１９）を含むマウスＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸を提供する。好ましい実施態様において、この核酸は、（ａ）図３
のアミノ酸２４から２５１の配列（配列番号：１９）を含むマウスＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含む。より好ましくは、該核酸は、図３のアミノ酸残基２４から２５１を有するマウスＷＩＳＰ-２（配列番号：１９）をコードしているＤＮＡ、又は図３のアミノ酸残基１から２５１を有するマウスＷＩＳＰ-２（配列番号：２０）をコードしているＤＮＡ、又は該コード化ＤＮＡの何れかの相補体を含む。
【００３９】
更なる態様において、本発明は、少なくとも約５００ヌクレオチドを有するとともに、（ａ）図３のアミノ酸１から２５１の配列（配列番号：２０）を含むマウスＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸を提供する。
【００４０】
さらに別な態様において、本発明は、少なくとも約４００ヌクレオチドを有するとともに、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９３９１（ＤＮＡ３３４７３）においてヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドｃＤＮＡによってコードされた同じ完全長ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に少なくとも約７５％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸を提供する。好ましくは、この核酸は、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９３９１（ＤＮＡ３３４７３）においてヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドｃＤＮＡによってコードされた同じ完全長ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含む。
【００４１】
別な実施態様において、本発明は、受託番号ＡＴＣＣ２０９３９１の下に寄託されたクローンＵＮＱ２２８（ＤＮＡ３３４７３）の配列の完全長コード化配列の核酸配列を含む単離した核酸を提供する。
【００４２】
別な態様において、本発明は、ＷＩＳＰ-２ポリペプチドの発現のために好適な条件下で上記核酸を含む宿主細胞を培養すること及び該培養物からＷＩＳＰ-２ポリペプチドを回収することを含むＷＩＳＰ-２ポリペプチドの製造方法を提供する。さらに、該ポリペプチドがヒトＷＩＳＰ-２またはマウスＷＩＳＰ-である場合を含む、単離した核酸によってコードされたＷＩＳＰ-２ポリペプチドが提供される。この特有な実施態様において、本発明は、図８のアミノ酸残基１から２５０（配列番号：１６）を含む又は図８のアミノ酸残基２４から２５０（配列番号：１５）を含む単離した天然配列ヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドを提供する。
【００４３】
更なる実施態様において、本発明は、少なくとも約４００ヌクレオチドを有するとともに、（ａ）図８のアミノ酸２４から２５０の配列（配列番号：１５）を含むヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と、ストリンジェントな条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズすること、及びもし該試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約７５％の配列同一性を有するならば、該試験ＤＮＡ分子を単離することによって製造される単離した核酸を提供する。
【００４４】
更なる実施態様において、本発明は、（ｉ）（ａ）図８のアミノ酸２４から２５０の配列（配列番号：１５）を含むヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と、ストリンジェントな条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズすること、及びもし該試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約７５％の配列同一性を有するならば、（ｉｉ）該ポリペプチドの発現のために適した条件下で該試験ＤＮＡを含む宿主細胞を培養すること、及び（ｉｉｉ）該細胞培養物から該ポリペプチドを回収することによって製造したポリペプチドを提供する。
【００４５】
さらに別の実施態様において、本発明は、（ａ）図１１と１２のアミノ酸３４から３７２の配列（配列番号：３２）を含むヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と約５００ヌクレオチド以上において１００％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸を提供する。好ましくは、この核酸は、少なくとも１のＷＩＳＰ生物学的活性を有する。好ましくは、この核酸は、図１１と１２のアミノ酸残基３４から３７２（配列番号：３２）又は図１１と１２のアミノ酸残基１から３７２（配列番号：３３）又はその相補体を有するヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドをコードしているＤＮＡを含む。
【００４６】
更なる実施態様において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９７０６(ＤＮＡ５６３５０-１１７６-２)においてヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドｃＤＮＡによってコードされた同じ完全長ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に、約５００ヌクレオチド以上において１００％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸を提供する。本発明の更なる態様は、ＷＩＳＰ-３ポリペプチドの発現のために好適な条件下でＷＩＳＰ-３コード化核酸を含む宿主細胞を培養すること及びその細胞培養物からＷＩＳＰ-３ポリペプチドを回収することを含むＷＩＳＰ-３ポリペプチドの製造方法を含む。
【００４７】
ＷＩＳＰ-３コード化核酸によってコードされた単離したＷＩＳＰ-ポリペプチドがさらに提供される。好ましくは、このポリペプチドはヒトＷＩＳＰ-３である。
【００４８】
別な実施態様において、本発明は、（ａ）図１１と１２のアミノ酸３４から３７２の配列（配列番号：３２）を含むヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と、ストリンジェントな条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズすること、及びもし該試験ＤＮＡ分子が約５００ヌクレオチド以上において（ａ）又は（ｂ）と１００％の配列同一性を有するならば、該試験ＤＮＡ分子を単離することによって製造される単離した核酸を提供する。
【００４９】
また、（ｉ）（ａ）図１１と１２のアミノ酸３４から３７２の配列（配列番号：３２）を含むヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と、ストリンジェントな条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズすること、及びもし該試験ＤＮＡ分子が約５００ヌクレオチド以上において（ａ）又は（ｂ）と１００％の配列同一性を有するならば、（ｉｉ）該ポリペプチドの発現のために適した条件下で該試験ＤＮＡを含む宿主細胞を培養すること、及び（ｉｉｉ）該細胞培養物から該ポリペプチドを回収することによって製造したポリペプチドも提供される。
【００５０】
さらに別な実施態様において、本発明は、（ａ）図１４と１５のアミノ酸１６から３５５の配列（配列番号：３６）を含むヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と約４００ヌクレオチド以上において１００％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸を提供する。好ましくは、この核酸は、少なくとも１のＷＩＳＰ生物学的活性を有する。好ましくは、この核酸は、図１４と１５のアミノ酸残基１６から３５５（配列番号：３６）又は図１４と１５のアミノ酸残基１から３５５（配列番号：３７）又はその相補体を有するヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドをコードしているＤＮＡを含む。
【００５１】
更なる実施態様において、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９７０７（ＤＮＡ５８８００-１１７６-２）におけるヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドｃＤＮＡによりコードされた同じ完全長ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と約４００ヌクレオチド以上において１００％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離した核酸を提供する。
【００５２】
本発明の更なる態様は、ＷＩＳＰ-３ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項６５記載の宿主細胞を培養すること及びその細胞培養物からＷＩＳＰ-３ポリペプチドを回収することを含むＷＩＳＰ-３ポリペプチドの製造方法を含む。
【００５３】
ＷＩＳＰ-３コード化核酸によってコードされた図１４と１５の単離したＷＩＳＰ-１ポリペプチドが提供される。好ましくは、このポリペプチドはヒトＷＩＳＰ-３である。
【００５４】
別な実施態様において、本発明は（ａ）図１４と１５のアミノ酸１６から３５５の配列（配列番号：３６）を含むヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と、ストリンジェントな条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズすること、及びもし該試験ＤＮＡ分子が約４００ヌクレオチド以上において（ａ）又は（ｂ）と１００％の配列同一性を有するならば、該試験ＤＮＡ分子を単離することによって製造される単離した核酸が提供される。
【００５５】
また、（ｉ）（ａ）図１４と１５のアミノ酸１６から３５５の配列（配列番号：３６）を含むヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体と、ストリンジェントな条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズすること、及びもし該試験ＤＮＡ分子が約４００ヌクレオチド以上において（ａ）又は（ｂ）と１００％の配列同一性を有するならば、（ｉｉ）該ポリペプチドの発現のために適した条件下で該試験ＤＮＡを含む宿主細胞を培養すること、及び（ｉｉｉ）該細胞培養物から該ポリペプチドを回収することによって製造したポリペプチドも提供される。
【００５６】
好ましくはここでのＤＮＡ分子の相補体は、少なくとも中等度の下で、任意に、より高度なストリンジェンシー条件下で主要な配列に安定な結合を維持する。
【００５７】
また、上記核酸を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞も提供され、好ましくはその細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、大腸菌細胞、バキュロウイルス感染細胞又は酵母細胞である。
【００５８】
異種アミノ酸配列に融合した上記ポリペプチド又はその不活性化した変異体の一つを含むキメラ分子がさらに提供され、該異種アミノ酸配列は、例えば、エピトープ標識配列、ポリヒスチジンのようなポリアミノ酸、又は免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)とし得る。上記ポリペプチドの一つに特異的に結合する抗体も提供され、該抗体はモノクローナル抗体とし得る。
【００５９】
上記ポリペプチドの一つとそのための担体(carrier)とを含む組成物、及び該ポリペプチドの一つに対するアンタゴニストとその担体とを含む組成物がさらに提供される。そのような実施態様の一つにおいて、本発明は、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドと製薬上許容される担体を含む組成物を提供する。好ましくは、該ポリペプチドは、ヒトポリペプチドである。また、好ましくはこれらの組成物はまた、化学療法剤または増殖抑制剤も含み得る。
【００６０】
別な態様において、本発明は、
（ａ）ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドと製薬上許容される担体とを含む組成物；
（ｂ）上記組成物を収容している容器；及び
（ｃ）ＷＩＳＰ関連疾患の治療におけるＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドの使用に関しての上記容器に添付されたラベル又は薬学製品中に含まれた包装挿入物、とを含む薬学製品を提供する。
【００６１】
さらに別な実施態様において、本発明は、製薬上許容される担体中にＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドの組成物を含む、及び製薬上許容される担体中にＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドに対するアンタゴニストの組成物を含む上記何れかの組成物有効量を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物においてＷＩＳＰ関連疾患を治療するための方法を提供する。好ましくは、該疾患は胸癌、卵巣癌、結腸癌、または黒色腫である。また、好ましくは該哺乳動物はヒトである。別の好適な実施態様において、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、化学療法剤、増殖抑制剤、または細胞毒性剤との組合せにおいて投与される。
【００６２】
別な実施態様において、本発明は、
（ａ）宿主から得られた試料からＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドをコードしている核酸配列を単離すること；及び
（ｂ）ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドをコードしている核酸配列中の変異を測定すること、
を含む、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドをコードしている核酸配列中の変異に関係した疾患又は疾患に対する感受性を診断する方法を提供する。
【００６３】
別な実施態様において、本発明は、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料中の、及び（ｂ）同じ細胞型の既知の正常組織細胞のコントロール試料中の、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドをコードしている遺伝子の発現のレベルを検出することを含む哺乳動物におけるＷＩＳＰ関連疾患を診断する方法であり、試験試料におけるより高い又はより低い発現レベルが、その試験組織細胞が得られた哺乳動物においてＷＩＳＰ関連機能障害の存在を示す診断方法を提供する。
【００６４】
更なる実施態様において、本発明は、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドを結合している単離した抗体を提供する。好ましくは、該抗体は、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドを過剰発現している細胞、より好ましくは癌細胞の死滅を誘導する。また、ヒトＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドに結合し、ヒト又はヒト化した抗体が好適である。より好ましくはモノクローナル抗体であり、さらにより好ましくは、相補性決定領域と定常免疫グロブリン領域を有するモノクローナル抗体であり、さらに他の実施態様においては、抗体フラグメント、一本鎖抗体、または抗イディオタイプ抗体である。加えて、該抗体は検出可能な標識で的とに標識されまたは固相上に固定化される。
【００６５】
また、製薬上許容される担体との混合物中に、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドに対する抗体を含む組成物が提供される。好ましくは、該抗体はヒトＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドに対するものであり、且つヒトまたはヒト化した抗体であり、最も好ましくはヒトＷＩＳＰ-１に対するモノクローナル抗体である。さらに、該組成物は、上記固体の増殖抑制量を含み得る。
【００６６】
別な実施態様において、本発明は、上記抗体組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌を治療するための方法を提供する。この方法の好ましい態様において、その癌は結腸癌であり、該抗体はヒトＷＩＳＰ-１に対するもの及びヒト化したまたはヒトのモノクローナル抗体であり、該哺乳動物はヒトである。
【００６７】
他の態様において、本発明は、製薬上許容される担体中にＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドに対するアンタゴニストを含む組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物におけるＷＩＳＰ関連疾患を治療する方法を提供する。
【００６８】
更なる態様において、本発明は、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドの発現又は活性化を抑制するアンタゴニストの有効量に、Ｗｎｔ-１誘導遺伝子が過剰発現する細胞をさらすことを含む腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供する。
【００６９】
更なる態様は、製薬上許容される担体と混合して抗ＷＩＳＰ-１、抗ＷＩＳＰ-２、又は抗ＷＩＳＰ-３抗体の増殖抑制量を持つ組成物の有効量に細胞をさらすことを含む腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法を伴う。この方法の好ましい態様において、該腫瘍細胞は結腸癌細胞であり、該抗体は、ヒトＷＩＳＰ-１に対するもので且つヒト化した又はヒトのモノクローナル抗体であり、且つ該哺乳動物はヒトである。
【００７０】
また、上記ＷＩＳＰポリペプチド又は抗ＷＩＳＰ抗体のようなＷＩＳＰアンタゴニストと、Ｗｎｔによって誘導される癌のようなＷＩＳＰ関連疾患を検出又は治療するため該ポリペプチド又はアンタゴニストを用いるための指示書を含むキットもここに提供される。そのような好適なキットの一つは、適当な包装の中に抗ＷＩＳＰ-１、抗ＷＩＳＰ-２、又は抗ＷＩＳＰ-３抗体と担体とを含む癌診断キットである。好ましくは、このキットはさらに、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドを検出するために上記抗体を用いるための指示書をさらに含む。
【００７１】
また、上記ＷＩＳＰポリペプチド又は抗ＷＩＳＰ抗体のようなＷＩＳＰアンタゴニストの一つの有効量に、Ｗｎｔによって誘導された細胞をさらすことを含む細胞死滅を誘導する方法も提供する。好ましくは、そのような細胞は癌細胞である。より好ましくは、該細胞は哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。加えて、別な化学療法抗体の有効量が、例えば抗ＥｒｂＢ２抗体が、細胞の曝露において用いられる。さらに、任意に該方法は、化学療法剤、増殖抑制剤、又は放射に該細胞がさらされることを含む。任意に、該細胞は抗体への曝露の前に増殖抑制剤にさらされる。
【００７２】
更なる態様において、本発明は、
容器；
該容器上のラベル；及び
該容器内に収容された活性剤を含む組成物；
とを含む製品であり、該組成物は腫瘍細胞の細胞死を誘導するための又は増殖を抑制するために有効であり、該容器上のラベルは、該組成物がＷｎｔ又はＷＩＳＰ関連疾患の過剰誘導によって又はＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、或いはＷＩＳＰ-３ポリペプチドの過剰発現によって特徴付けられる病状を治療するために使用できることが示され、且つ該組成物中の活性剤は、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドの発現又は活性化を抑制するアンタゴニストである製品を提供する。
【００７３】
別な実施態様において、本発明は、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドに対するアゴニストを同定するための方法であり、
（ａ）該ポリペプチドによって細胞増殖の刺激のために適当な条件下で細胞とスクリーニングするべき化合物とを接触させること；及び
（ｂ）その化合物が有用なアゴニストかどうか測定するために、細胞の増殖を測定すること、を含む方法を提供する。
加えて、本発明は、上記方法によって同定したＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，又はＷＩＳＰ-１３ポリペプチドに対するアゴニストを提供する。
【００７４】
さらに、本発明は、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドの発現又は活性化を抑制する化合物を同定する方法であり、該化合物とポリペプチドとの反応を与えるための条件下で且つ十分な時間、候補化合物とＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドとを接触させることを含む方法を提供する。好ましい実施態様において、この方法は、
（ａ）ポリペプチドにより細胞増殖の刺激のために適当な条件下でＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドの存在中で細胞とスクリーンするべき化合物とを接触させること；及び
（ｂ）その化合物が有効なアンタゴニストかどうかを測定するために該細胞の増殖を測定すること、の工程を含む。
【００７５】
さらに、この方法によって同定した化合物が提供される。
【００７６】
別な態様において、本発明は、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドの発現又は活性化を抑制する化合物を提供する。
【００７７】
別な実施態様において、本発明は、抗ＷＩＳＰ-１、抗ＷＩＳＰ-２、又は抗ＷＩＳＰ-３抗体に、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドを含むことが疑われる細胞をさらすこと、及び上記細胞への上記抗体の結合を測定することを含むＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドの存在を測定するための方法が提供される。
【００７８】
別の好ましい実施態様において、本発明は、（ａ）抗ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドと、哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料とを接触させること、及び（ｂ）該抗ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチド抗体と試験試料中のＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出すること、を含む哺乳動物におけるＷＩＳＰ関連疾患を診断する方法を提供する。好ましくは、上記試験試料は、新生物性細胞成長又は増殖を有することが疑われる個人から得られる。また、好ましくは該抗体は、検出可能な標識で標識され及び／又は固相上に固定化される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７９】
１．定義
用語「ＷＩＳＰポリペプチド」は、天然配列ヒト及びマウスＷＩＳＰタンパク質及び遺伝子が少なくともＷｎｔ-１によって誘導されるここに記載した変異体の科に関する。この用語は、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、及びＷＩＳＰ-３を含む。
【００８０】
ここで用いた用語「ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」、「ＷＩＳＰ-１相同体」及びその文法的な変異体は、天然配列ＷＩＳＰ-１タンパク質とその変異体（この中でさらに定義される）を包含する。該ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、ヒト組織タイプから又は別の供給源からのような各種の供給源から単離され、又は組換え又は合成法によって、又はこれらの何れかの組合せと類似の技術によって作製され得る。
【００８１】
ここで用いた用語「ＷＩＳＰ-２ポリペプチド」、「ＷＩＳＰ-２相同体」、「ＰＲＯ２６１」、及び「ＰＲＯ２６１ポリペプチド」及びその文法的な変異体は、天然配列ＷＩＳＰ-２タンパク質とその変異体（この中でさらに定義される）を包含する。該ＷＩＳＰ-２ポリペプチドは、ヒト組織タイプから又は別の供給源からのような各種の供給源から単離され、又は組換え又は合成法によって、又はこれらの何れかの組合せと類似の技術によって作製され得る。
【００８２】
ここで用いた用語「ＷＩＳＰ-３ポリペプチド」、「ＷＩＳＰ-３相同体」及びその文法的な変異体は、天然配列ＷＩＳＰ-３タンパク質とその変異体（この中でさらに定義される）を包含する。該ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、ヒト組織タイプから又は別の供給源からのような各種の供給源から単離され、又は組換え又は合成法によって、又はこれらの何れかの組合せと類似の技術によって作製され得る。
【００８３】
「天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」は、天然から得られたＷＩＳＰ-１ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、天然から単離することができ、又は組換え又は合成手段によって作製することができる。用語「天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」は、ここに開示したＷＩＳＰ-１の端切りした(truncated)天然生起又は他の形態、天然生起変異型（例えば代替スプライス型又はスプライス変異体）、及びＷＩＳＰ-１ポリペプチドの天然生起アレル変異体を特に包含する。本発明の一つの実施態様において、該天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、Ｎ-末端メチオニンを持つ又は無しの、それぞれ図５と６のアミノ酸２３から２６７(配列番号：３)又は図５と６のアミノ酸１から２６７(配列番号：４)を含む成熟又は完全長天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドである。
【００８４】
本発明の別な実施態様において、該天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、Ｎ-末端メチオニンを持つ又は無しの、それぞれ、位置１８４でバリン残基又は位置２０２でアラニン残基がイソロイシン又はセリン残基に変更されている、図５と６のアミノ酸２３から２６７又は１から２６７(配列番号：５−８)を含む完全長又は成熟天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドである。本発明の別な実施態様において、該天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、Ｎ-末端メチオニンを持つ又は無しの、それぞれ、位置１８４でバリン残基又は位置２０２でアラニン残基がイソロイシン又はセリン残基に変更されている、図５と６のアミノ酸２３から２６７又は１から２６７(それぞれ配列番号：２１と２２)を含む完全長又は成熟天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドである。本発明の別な実施態様において、該天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、Ｎ-末端メチオニンを持つ又は無しの、それぞれ、図１のアミノ酸２３から３６７(配列番号：１１)又は１から３６７(配列番号：１２)を含む成熟又は完全長天然配列マウスＷＩＳＰ-１ポリペプチドである。
【００８５】
本発明の別な実施態様において、該天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、Ｎ-末端メチオニンを持つ又は無しの、配列番号：２３，２４，２５，２６，２７，２８，又は２９を含む、ヒトＷＩＳＰ-１スプライス又は他の天然配列変異体の一つを含むヌクレオチド配列によってコードされるそれである。
【００８６】
「天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチド」又は「天然配列ＰＲＯ２６１ポリペプチド」は、天然から得られたＷＩＳＰ-２ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチドは、天然から単離することができ、又は組換え又は合成手段によって作製することができる。用語「天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチド」は、ここに開示したＷＩＳＰ-２の端切りした天然生起又は分泌形態、天然生起変異型（例えば代替スプライス型又はスプライス変異体）、及びＷＩＳＰ-２ポリペプチドの天然生起アレル変異体を特に包含する。本発明の一つの実施態様において、該天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチドは、Ｎ-末端メチオニンを持つ又は無しの、図８のアミノ酸２４から２５０とアミノ酸１から２５０(それぞれ配列番号：１５と１６)を含む、図８のアミノ酸１−２４までから２５０を含む成熟又は完全長天然配列ヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチド(配列番号：１５，１６，及び５６−７７)である。本発明の別な実施態様において、該天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチドは、Ｎ-末端メチオニンを持つ又は無しの、図３のアミノ酸２４から２５１とアミノ酸１から２５１(それぞれ配列番号：１９と２０)を含む、図３のアミノ酸１−２４までから２５０を含む成熟又は完全長天然配列マウスＷＩＳＰ-２ポリペプチド(配列番号：１９，２０，及び７８−９９)である。
【００８７】
「天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチド」は、天然から得られたＷＩＳＰ-３ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、天然から単離することができ、又は組換え又は合成手段によって作製することができる。用語「天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチド」は、ここに開示したＷＩＳＰ-３の端切りした天然生起又は他の形態、天然
生起変異型（例えば代替スプライス型又はスプライス変異体）、及びＷＩＳＰ-３ポリペプチドの天然生起アレル変異体を特に包含する。本発明の一つの実施態様において、該天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、Ｎ-末端メチオニンを持つ又は無しの、それぞれ、図１１と１２のアミノ酸３４から３７２(配列番号：３２)と図１１と１２のアミノ酸１から３７２(配列番号：３３)を含む成熟又は完全長天然配列マウスＷＩＳＰ-３ポリペプチドである。本発明の別な実施態様において、該天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、Ｎ-末端メチオニンを持つ又は無しの、図１４と１５のアミノ酸１６から３５５(配列番号：３６)とアミノ酸１から３５５(配列番号：３７)を含む成熟又は完全長天然配列ヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドである。
【００８８】
用語「ＷＩＳＰ-１変異体」は、図５と６中に示した推定アミノ酸配列を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-１(配列番号：３)と、及び／又は図５と６中に示した推定アミノ酸配列を有するヒト完全長ＷＩＳＰ-１(配列番号：４)と、及び／又は図１中に示した推定アミノ酸配列を有するマウス成熟ＷＩＳＰ-１(配列番号：１１)と、及び／又は図１中に示した推定アミノ酸配列を有するマウス完全長ＷＩＳＰ-２(配列番号：１２)と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義した通り活性なＷＩＳＰ-１を意味する。そのような変異体は、例えば、他の種からの、しかし天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドを除く変異体を含む、１以上のアミノ酸残基が、図５と６及び１の完全長又は成熟配列のＮ又はＣ末端に付加され又は欠失されたＷＩＳＰ-１ポリペプチド(それぞれ配列番号：４，３，１２，及び１１)を含む。
【００８９】
用語「ＷＩＳＰ-２変異体」又は「ＰＲＯ２６１変異体」は、図８中に示した推定アミノ酸配列を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-２(配列番号：１５)と、及び／又は図８中に示した推定アミノ酸配列を有するヒト完全長ＷＩＳＰ-２(配列番号：１６)と、及び／又は図３中に示した推定アミノ酸配列を有するマウス成熟ＷＩＳＰ-２(配列番号：１９)と、及び／又は図３中に示した推定アミノ酸配列を有するマウス完全長ＷＩＳＰ-２(配列番号：２０)と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義した通り活性なＷＩＳＰ-２を意味する。そのような変異体は、例えば、他の種からの、しかし天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチドを除く変異体を含む、１以上のアミノ酸残基が、図８と３の完全長及び推定上成熟配列(それぞれ配列番号：１６，１５，２０，及び１９)のＮ又はＣ末端に付加され又は欠失されたＷＩＳＰ-２ポリペプチドを含む。
【００９０】
用語「ＷＩＳＰ-２変異体」は、図１１と１２中に示した推定アミノ酸配列を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-３(配列番号：３２)と、及び／又は図１１と１２中に示した推定アミノ酸配列を有するヒト完全長ＷＩＳＰ-３(配列番号：３３)と、及び／又は図１４と１５中に示した推定アミノ酸配列を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-３(配列番号：３６)と、及び／又は図１４と１５中に示した推定アミノ酸配列を有するヒト完全長ＷＩＳＰ-３(配列番号：３７)と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義した通り活性なＷＩＳＰ-３を意味する。そのような変異体は、例えば、他の種からの、しかし天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチドを除く変異体を含む、１以上のアミノ酸残基が、図１１−１２と１４−１５の完全長及び推定上成熟配列(それぞれ配列番号：３２，３３，３６及び３７)のＮ又はＣ末端に付加され又は欠失されたＷＩＳＰ-３ポリペプチドを含む。
【００９１】
ここに同定したＷＩＳＰ配列に関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、要すれば、最大パーセント配列同一性を達成するために、その配列のアライニング及びギャップ導入後、ＷＩＳＰポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基とのそのパーセンテージとして定義され、且つ配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮しない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ，ＡＬＩＧＮ，又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公用で利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当業者の範囲内である各種の手法で達成することができる。当業者であれば、比較するべき配列の完全長にわたり最大のアライメントを達成するために必要とされるいずれのアルゴリズムをも含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【００９２】
ここに同定した、ＵＮＱ２２８(DNA34387-seq min)配列、及びそのコード化領域を含むＷＩＳＰ配列のコード化領域に関して「パーセント（％）核酸配列同一性」は、要すれば、最大パーセント配列同一性を達成するために、その配列のアライニング及びギャップ導入後、興味あるＷＩＳＰ配列、例えばＵＮＱ２２８(DNA34387-seqmin)配列(配列番号：３８)中のコード化配列又はそのコード化配列(配列番号：３８)中のヌクレオチドと同じである候補配列中のヌクレオチドとのそのパーセンテージとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ，ＡＬＩＧＮ，又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲTM）ソフトウェアのような公用で利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当業者の範囲内である各種の手法で達成することができる。当業者であれば、比較するべき配列の完全長にわたり最大のアライメントを達成するために必要とされるいずれのアルゴリズムをも含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【００９３】
「ストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のための低いイオン強度と高温を使う、例えば５０℃で0.015Mの塩化ナトリウム／0.0015Mのクエン酸ナトリウム／0.1%ドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドのような変性剤を使う、例えば４２℃で、0.1%ウシ血清アルブミンを伴う50%(vol/vol)ホルムアミド／0.1%のFicoll／0.1%ポリビニルピロリドン／750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウムを伴う50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5；（３）0.2xSSCと0.1%のSDS中、４２℃での洗浄とともに、４２℃で50%ホルムアミド、5xSSC（0.75MのＮａＣｌ、0.075Mクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード溶液、音波処理したサケ精子ＤＮＡ(50μg/ml)、0.1%ＳＤＳ、及び10%デキストラン硫酸を用いる；（４）10%デキストラン硫酸、2xSSC(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)の緩衝液、及び５５℃で50%ホルムアミド、続いて５５℃でＥＤＴＡを含む0.1xSSCからなる高ストリンジェント洗浄を用いるそれらである。
【００９４】
「中等度にストリンジェントな条件」は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中に記載され、且つ上述したよりも、より劣る洗浄液とハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、及びＳＤＳパーセント）の使用を含む。中等度にストリンジェントな条件の実例は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのＮａＣｌ、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、５ｘデンハード溶液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性し切断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃で一晩のインキュベーション、続いて約37-50℃で1xSSC中で該フィルターの洗浄、のような条件である。熟達した研究者であれば、プローブ長などのようなファクターを調整するために必要な、温度、イオン強度などをどのように調節するかを認識するであろう。
【００９５】
ここに開示した各種のポリペプチドを記述するために用いる場合、「単離した」とは、その天然環境の成分から同定し及び分離及び／又は回収されているポリペプチドを意味する。その天然環境の不純成分は、そのペプチドの診断的又は治療的な使用を典型的に妨害するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク様又は非タンパク様溶質を含む。好適な実施態様において、該ポリペプチドは、（１）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端の少なくとも１５残基又は中間アミノ酸配列を得るために十分な度合まで、又は（２）クマシーブルー又は、好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥによって均質となるまで、精製されるであろう。単離したポリペプチドは、ＷＩＳＰの天然環境の成分の少なくとも一つが存在しないであろうことから、組換え細胞内の原位置にポリペプチドを含む。通常、しかしながら、単離したポリペプチドは、少なくとも一の精製工程によって製造されるだろう。
【００９６】
ＷＩＳＰポリペプチドをコードしている「単離した」核酸又は「単離した」ＤＮＡ３３４７３又は「単離した」ＰＲＯ２６１ポリペプチド-コード化核酸分子は、それぞれの核酸の天然供給源にそれが普通に結合される少なくとも一の不純核酸分子から同定され且つ分離される核酸分子である。単離したＤＮＡ３３４７３又は単離したＷＩＳＰコード化核酸分子は、天然で見出される形態又はセッティング以外のものである。単離したＷＩＳＰコード化又はＤＮＡ３３４７３核酸分子は、従って、それが天然細胞に存在するようなＷＩＳＰコード化又はＤＮＡ３３４７３核酸分子とそれぞれ区別される。しかしながら、単離したＷＩＳＰコード化又はＤＮＡ３３４７３核酸分子は、例えばその核酸分子が天然細胞のそれと異なる染色体配置中にある場合、ＷＩＳＰコード化ＤＮＡ又はＤＮＡ３３４７３ＤＮＡのそれぞれを普通に発現する細胞中に含まれた核酸分子を含む。
【００９７】
用語「制御配列」は、特有な宿主成体中の操作可能に結合したコード化配列の発現のために必要なＤＮＡ配列に関する。原核生物のために好適である制御配列は、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを用いることが知られる。
【００９８】
核酸は、それが別の核酸配列との機能的関係に置かれる場合に「操作可能」に結合される。例えば、予備配列決定又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、もしそれが該ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチド用のＤＮＡに操作可能に結合される；プロモーターとエンハンサーは、もしそれが該配列の転写に影響を及ぼすならば、コード化配列に操作可能に結合される；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を促進するように配置されるならば、コード化配列に操作可能に結合される。一般に「操作可能に結合」は、結合されるそのＤＮＡ配列が隣接され、且つ分泌リーダーのケースにおいては隣接し且つリーディング相中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接されない。結合は、利便的な制限部位での結紮によって達成される。もしそのような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが通常の実施に従って使用される。
【００９９】
用語「抗体」は、最も広い認識で用いられ、且つ抗ＰＲＯ２６１のような単純抗ＷＩＳＰポリペプチド、モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、及び抗ＰＲＯ２６１のような抗ＷＩＳＰポリペプチド、及びポリエピトピック特異性を持つ抗体組成物を明確にカバーする。ここで用いた用語「モノクローナル抗体」は、実質上均一な抗体の集団から得られた抗体、即ちその集団に含まれる個別の抗体が少量で存在し得る天然生起変異の可能性を除いて同一であることに関する。
【０１００】
ここで意図する「活性の」又は「活性」又は「ＷＩＳＰ生物学的活性」は、ＰＲＯ２６１のような固有の又は天然生起（天然配列）ＷＩＳＰポリペプチド又はそのアンタゴニストの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持する、その変異体又はそのアンタゴニストを含む、ＰＲＯ２６１のようなＷＩＳＰポリペプチドの形を表現する。ＷＩＳＰポリペプチド又はそのアンタゴニストの好ましい「活性」は、腫瘍細胞の増殖を阻害する又は正常細胞の増殖を促進する、且つアテローム性動脈硬化症を含む動脈硬化症を治療する、同じく創傷治癒と造血を誘導する、線維形成を防止する、強皮症、ケロイド、好酸球性筋膜炎、結節性筋膜炎のような皮膚疾患と関連した線維症病変、及びデュプュイトラン拘縮を防止する、骨粗しょう症のような骨関連疾患を治療する、成長の促進を含む代謝を調節する、免疫疾患を治療する、ウィルムス腫と腎臓関連疾患を治療する、精巣関連疾患を治療する、肺関連疾患を治療する、及び心臓関連疾患を治療する能力を含む。
【０１０１】
ＷＩＳＰポリペプチドの「アンタゴニスト」は、ＷＩＳＰポリペプチドの活性を阻害する分子である。好ましいアンタゴニストは、ＷＩＳＰポリペプチドが癌細胞を刺激するように作用し得るとともに該アンタゴニストがそれら細胞の増殖を抑制することに利用されるであろう場合のように、ＷＩＳＰポリペプチドを妨害するか又はＷＩＳＰの望ましくない生物学的活性を阻止するそれらである。ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、及びＷＩＳＰ-３に関してのような、いくつかの場合に、該アンタゴニストは、ＩＧＦへのＷＩＳＰポリペプチドの結合を抑制するために有用とし得る。そのような分子は、そうした抑制的な能力を有する抗体及び小分子、同様にＷＩＳＰに結合するＷＩＳＰポリペプチド変異体、そのためのレセプター、ＷＩＳＰポリペプチド（もし利用できれば）又はその部分を含む。例えば、アンタゴニストは、ＷＩＳＰｓ-１，-２，及び-３用のレセプター(ＣＴＧＦレセプター)の予測される科を用いて、ＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，及びＷＩＳＰ-３のレセプターから得ることができる。かくして、該レセプターは、その科からクローンされると表すことができ；そして該レセプターの溶質形は、細胞外ドメインを同定すること及びそれからのトランスメンブレンドメインを引き出すことによって作製される。該レセプターの溶質形は、アンタゴニストとして使用することができ、該レセプターは、ＷＩＳＰポリペプチド活性と拮抗するであろう小分子をスクリーンするために用いることができる。
【０１０２】
代替的に、図１−４に示した配列（それぞれ、配列番号：１１，１２，１９，又は２０）、図５−６と８（それぞれ配列番号：３，４，１５，及び１６）、１１−１２，及び１４−１５に示したヒト配列、天然ＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，又はＷＩＳＰ-３の変異体の使用は、アンタゴニストとして作用するようになされる。ＣＴＧＦレセプター科からの知見を用いて、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、及びＷＩＳＰ-３ポリペプチドのレセプター結合部位は、該分子がアンタゴニストとして作用するように、結合実験によって及び標準的な技術(欠失又はラジカル置換)によってそれらの一つを除くことによって測定することができる。
【０１０３】
アンタゴニスト活性は、ここに記載したような細胞死滅の誘導のための標準的な方法を含む、幾つかの手段、例えば3Ｈ-チミジン増殖アッセイ、又は他のマイトジェンアッセイ、例えば標的細胞系のＥＧＦ-有効化固定非依存性増殖(Volckaertら、Gene, 15:215-223(1981))及び／又は新生細胞系の増殖抑制を誘導するアンタゴニスト候補の能力を測定するアッセイを含む。Robertsら、Proc. Natl. Acad. Sci. Sci. USA, 82:119-123(1985)。固定非依存性増殖は、軟寒天中でコロニーを形成し該細胞の形質転換に特徴的に表す、ＷＩＳＰポリペプチド処理した又はＴＧＦ-β-処理した及びＥＧＦ処理した非新生標的細胞の能力に関する。このアッセイにおいて、その候補は、ＷＩＳＰポリペプチドの等モル量と、さもなければＥＧＦ有効化固定非依存性標的細胞増殖アッセイにおいて検出可能なものとともにインキュベートされ、そして該培養は、固定非依存性増殖を誘導できないことを観測する。加えて、アンタゴニストは、ＩＧＦ-１のようなＩＧＦ又はＩＧＦ-１のペプチド模倣物又はＩＧＦに対するレセプター又はＩＧＦＢＰに対するレセプターとし得る。
【０１０４】
「治療」は、治療的処置と予防的な及び予防的意味の両方に関する。治療の必要なそれらは、既に疾患に罹った又は状態の、同じくその疾患又は状態が予期されるそれらを含む。
【０１０５】
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び農業用動物、及び動物園の、スポーツの又は愛玩用動物を含み、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなどの、哺乳動物として分類される何れかの動物に関する。好ましくは、ここでの哺乳動物はヒトである。
【０１０６】
「疾患」又は「ＷＩＳＰ関連疾患」は、ここでのＷＩＳＰポリペプチド又はＷＩＳＰアンタゴニストによって治療の利益を得るであろう何れかの状態である。これは、慢性及び急性疾患、同様に、当該の疾患に該哺乳動物を陥らせる傾向にあるそれらの病理学的状態を含む。ここで治療するべき疾患の非制限的な実例は、両性及び悪性腫瘍；白血病と悪性リンパ腫；ニューロンの、グリアの、星状細胞の、視床下部の及び他の腺の、マクロファージの、上皮の、間質の及び胞胚腔の疾患；造血関連疾患；組織増殖疾患；皮膚疾患；線維形成、線維症病変；腎臓疾患；骨関連疾患；熱傷、切開創、及び他の創傷のような外傷；異化作用状態；精巣関連疾患；及び動脈硬化症を含む、炎症性、血管由来の、及び免疫学的疾患を含む。「Ｗｎｔ-関連疾患」は、Ｗｎｔ-１とＷｎｔ-４、しかし好ましくはＷｎｔ-１を含む、Ｗｎｔ遺伝子経路のアップレギュレーションによって少なくとも生じる、癌を含み得るそれである。
【０１０７】
用語「癌」、「癌性の」、及び「悪性」は、無調節細胞増殖によって典型的に特徴付けされる哺乳動物における生理学的状態に関し又は表される。癌の実例は制限されることなしに、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、メラノーマ、肉腫、及び白血病を含む癌を含む。そのような癌のより特有な実例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸の癌、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、グリア芽細胞腫、頸部癌、卵巣癌、肝癌とヘパトームのような肝臓癌、膀胱癌、胸癌、結腸癌、結腸直腸の癌、子宮内膜の癌、唾液腺癌、腎細胞癌とウィルムス腫のような腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌及び頭部と首部の各種のタイプの癌を含む。ここでの治療のために好ましい癌は、胸癌、結腸癌、肺癌及び黒色腫である。
【０１０８】
ここで用いたような用語「細胞毒性剤」は、細胞の機能を抑制又は防止する及び／又は細胞の破壊を生じる物質に関する。その用語は、放射性同位体（例えば、131Ｉ，125Ｉ，90Ｙ，及び186Ｒｅ）、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそのフラグメントのような毒素を含むことを意図する。
【０１０９】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の実例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（"Ara-C"）、シクロフォスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タキソール、トクソテル、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクレイスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第４６７５１８７号参照）、メルファラン、及び他の関連するニトロジェンマスタードを含む。またこの定義には、タモキシフェンとオナプリストンのような腫瘍においてホルモン作用を調整する又は抑制するように作用するホルモン剤も含まれる。
【０１１０】
ここで用いる場合、「増殖抑制剤」は、インビトロ又はインビボでのいずれか一方で、Ｗｎｔ過剰発現癌細胞のような細胞の増殖を抑制する化合物又は組成物に関する。かくして、増殖抑制剤は、Ｓ相中の悪性細胞のパーセンテージを有意に減じるそれである。増殖抑制剤の実例は、Ｇ１阻止とＭ-相阻止を誘導する剤のような、細胞循環進行を（Ｓ相以外の所で）阻止する剤を含む。従来のＭ-相ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチンとビンブラスチン）、タキソール、及びドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンのようなtopoIIインヒビターを含む。ＧＩがＳ-相阻止にも流出するのを阻止するそれらの剤は、例えば、タモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣのようなＤＮＡアルキル化剤である。更なる情報が、ムラカミらによって"Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs"と題されたThe Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1,(WB Saunders: Philadelphia,1995)、特に13頁中に見出すことができる。その４Ｄ５抗体（及びその機能的な均等物）は、もしその癌がＥｒｂＢ２過剰発現癌細胞を含むならば、この目的のために利用することもできる。例えばＷＯ９２／２２６５３を参照。
【０１１１】
「ノーザン分析」又は「ノーザンブロット」は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡ又はそのフラグメント、又はＲＮＡフラグメントのような知られたプローブにハイブリダイズするＲＮＡ配列を同定するために用いる方法である。そのプローブは、32Ｐのような放射性同位体、又はビオチン化によって、又は酵素によって標識される。分析するべきＲＮＡは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル上で普通に電気泳動的に分離され、ニトロセルロース、ナイロン、又は他の適当な膜に転移し、さらにSambrookら、上記、のセクション7.39-7.52中に記載されたそれらのような当該分野で周知の標準技術を用いて、該プローブとハイブリダイズされる。
【０１１２】
ここで用いたような「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」の技術は、特有な１片の核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡが、1987年7月28日発行の米国特許第４６８３１９５号中に記載されたように増幅される手法に全般的に関する。一般に、重要な領域の末端又はそれ以外からの配列情報は、オリゴヌクレオチドプライマーが定義することができるように利用可能とすることを要する；これらのプライマーは、増幅するべき鋳型の鎖の対の配列に同一又は類似となるであろう。その２のプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅した材料の末端と一致する。ＰＣＲは、特有なＲＮＡ配列、全体のゲノムＤＮＡからの特有のＤＮＡ配列、及び全体の細胞のＲＮＡ、バクテリオファージ、又はプラスミド配列から転写したｃＤＮＡを増幅するために使用することができる。全般的には、Mullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263(1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)を参照。ここで用いたような、ＰＣＲは、一つであることが考慮されるが、しかしそれに限定されず、核酸試験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ連鎖反応法の実例は、特有の一片の核酸を増幅又は生成するためのプライマーと核酸ポリメラーゼとして周知の核酸の使用を含む。
【０１１３】
ＩＩ．本発明の組成物と方法
Ａ．完全長ＷＩＳＰポリペプチド
本発明は、ＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドを含むＷＩＳＰポリペプチドとして本出願に関するポリペプチドをコードしている新規に同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、ｃＤＮＡｓは、後述の実施例においてさらに詳細に開示されるような新規のネズミ及びヒトＷＩＳＰ-１とＷＩＳＰ-２，及びヒトＷＩＳＰ-３スプライス変異体が同定され且つ単離されている。
【０１１４】
ＢＬＡＳＴとＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータープログラムの使用は、マウス及びヒトＷＩＳＰ-１と-２、同じくここに開示されたヒトＷＩＳＰ-３の２のコード化配列が、Adamsら、Nature, 377: 3-174(1995)により公開されるそれらを含む、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中に開示されたＤＮＡ配列に顕著な相同性を示すことが見出された。
【０１１５】
ＢＬＡＳＴとＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータープログラムの使用は、マウスとヒトＷＩＳＰ-１とＷＩＳＰ-２のコード化配列の各種部分がＣＴＧＦ、ｃｅｆ−１０、Ｃｙｒ６１、及び／又はＮｏｖタンパク質に顕著な相同性を示すことが見出された。これに関して、マウスＷＩＳＰ-１は、マウスＣＴＧＦに４７％相同で且つヒトＣＴＧＦに４６％相同であり、マウスＷＩＳＰ-２は、雛鳥cef-10タンパク質プレカーサーに４６％相同で且つヒトＣｙｒ６１タンパク質に４２％相同であり、ヒトＷＩＳＰ-１は、マウスＣＴＧＦに４７％相同で且つヒトＣＴＧＦに４８％相同であり、さらにヒトＷＩＳＰ-２は、マウスＣＴＧＦに４８％相同、ヒトＣＴＧＦプレカーサーに４９％相同、マウスＮｏｖタンパク質相同プレカーサーに４６％相同、ヒトＣＴＧＦに４９％相同、且つマウスＣＴＧＦプレカーサーに４８％相同である。さらに外見上、マウスＷＩＳＰ-１とマウスＥＬＭ１(ハシモトら、上記)のアミノ酸配列は同一であり、さらにヒトＷＩＳＰ-１とマウスＥＬＭ１のアミノ酸配列は８４％同一である。
【０１１６】
これらの因子がＩＧＦＢＰｓと相関関係をも有することから、本明細書中に開示したＷＩＳＰ-１とＷＩＳＰ-２ポリペプチドは、ＣＴＧＦ又はＩＧＦＢＰ科のメンバーと新たに同定され、且つ正常な、損傷した、及び癌の細胞及び組織の進行に関して活性を有していると目下のところ確信される。とりわけ、ＷＩＳＰ-１とＷＩＳＰ-２は、胸癌、肺癌、黒色腫、及び結腸癌に、同じく創傷治癒に含まれ得る。
【０１１７】
さらに、ＢＬＡＳＴとＦａｓｔＡ配列アライメントコンピュータープログラムの使用は、ヒトＷＩＳＰ-３の２つのスプライス変異体のコード化配列の各部が、マウスＥＬＭ１とＣＴＧＦタンパク質に顕著な相同性を示すことが見出された。これについて、ＷＩＳＰ-３の両方のスプライス変異体は、ゼノプス(Xenopus)ＣＴＧＦと４３％相同である図１２のより長い変異体及びゼノプスＣＴＧＦに４２％相同である図１４のより短い変異体とともに、マウスとヒトＣＴＧＦ及びそのプレカーサーに４２％相同である。
【０１１８】
Ｂ．ＷＩＳＰポリペプチド変異体
ここに記載した完全長天然配列ＷＩＳＰポリペプチドに加え、これらの配列の変異体が作製できることが意図される。ＷＩＳＰ変異体は、適当なヌクレオチドをＷＩＳＰコード化ＤＮＡへの変更を誘導することによって、又は望まれる変異体ＷＩＳＰポリペプチドの合成によって作製することができる。当業者であれば、アミノ酸変更が、もしそのＷＩＳＰポリペプチドが膜結合しているならば、グリコシル化部位の数又は位置を変えること、又は膜固定特性を変えることのような、ＷＩＳＰポリペプチドの後翻訳プロセスを変更し得ることを予測するであろう。
【０１１９】
ここに記載した天然の完全長ＷＩＳＰ配列における、又はＷＩＳＰポリペプチドの各種ドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号中に記載されるような保存的及び非保存的変異のための技術とガイドラインのいずれかを用いて作製することができる。変異は、天然配列ＷＩＳＰポリペプチドとの比較として、そのアミノ酸配列における変化に帰結するＷＩＳＰポリペプチドをコードする１以上のコドンの置換、欠失、又は挿入とし得る。任意に、その変異は、該ＷＩＳＰポリペプチドの何れかの位置で何れかの他のアミノ酸による少なくとも１のアミノ酸の置換による。アミノ酸残基が望まれる活性に不利な影響を及ぼすことなしに挿入され、置換され又は欠失されることを測定することにおけるガイダンスは、ＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２及びＷＩＳＰ-３のケースにおいて、相同性が知られたＣＴＧＦタンパク質分子のそれとの該ＷＩＳＰポリペプチドの配列を比べること、及び高い相同性の領域でなされるアミノ酸配列変更の数を最少化することによって見出し得る。アミノ酸置換は、セリンによるロイシンの置換のような、即ち保存性アミノ酸置換体のような、構造及び／又は化学的特徴の類似性を有する別なアミノ酸によって一つのアミノ酸を置換することの結果とすることができる。挿入又は欠失は、任意に１から約５アミノ酸の範囲内とし得る。その変異は、その配列中のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を系統的に作ること及び遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションのためにインビトロアッセイにおいて及びトランスジェニック又はノックアウト動物においての活性について得られる変異体を試験することによって測定し得る。
【０１２０】
該変異は、オリゴヌクレオチド介在（部位特異的）変異誘導(Carterら、Nucl. Acids Res,. 13:4331(1986)；Zollerら、Nucl. Acids Res., 10:6487(1987))、カセット変異誘導(Wellsら、Gene, 34:315(1985))、アラニンスキャニング、ＰＣＲ変異誘導、制限選択変異誘導(Wellsら、Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415(1986))、又は他の周知の技術のような分野において知られた技術を用いて変異体ＤＮＡを製造するためのクローン化ＤＮＡで作ることができる。
【０１２１】
スキャニングアミノ酸分析はまた、隣接配列に従って１以上のアミノ酸を同定するために利用することができる。好ましいスキャニングアミノ酸の中では、相対的に小さい、中性アミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、それがベータ炭素以外の側鎖を排除し且つその変異体の主鎖構造を変更する可能性が少ないため、このグループの中で典型的に好ましいスキャニングアミノ酸である。アラニンはまた、それが最も普通のアミノ酸であるため、典型的に好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方で頻繁に見出される。T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties (W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983)；Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)。もしアラニン置換が変異体の要求量を生じないならば、アイソテリックアミノ酸を使用することができる。
【０１２２】
完全長ＷＩＳＰポリペプチドの更なる欠失変異体は、Ｎ-末端シグナルペプチドからの、もしあれば(例えばＷＩＳＰ-１についてのアミノ酸１から２２，ＷＩＳＰ-２についての１から２３、図１１のＷＩＳＰ-３についての１−３３及び図１４のＷＩＳＰ-３についての１−１５のような)、及び／又は開始メチオニンが欠失されている変異体を含む。
【０１２３】
Ｃ．ＷＩＳＰポリペプチドの修飾
ＷＩＳＰポリペプチドの共有結合修飾物は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合修飾の一つのタイプは、選択した側鎖又はＮかＣ末端残基と反応することができる有機誘導化剤によって、ＷＩＳＰポリペプチドの標的としたアミノ酸残基を反応させることを含む。二官能剤による誘導体化は、例えば抗ＷＩＳＰ抗体を精製するための方法において使用するために水不溶性支持体マトリックスに又は表面にＷＩＳＰポリペプチドを、及びその反対を架橋するために有用である。普通に使用される架橋剤は、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタンのような二官能マレイミド、及びメチル-3-((p-アジドフェニル)ジチオ)プロピオイミダートを含む。
【０１２４】
他の修飾は、グルタミニルとアスパラギニル残基をそれぞれ相当するグルタミルとアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンとリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基の水酸基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(Creighton,上記,79-86頁)、Ｎ末端アミンのアセチル化、何れかのＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。本発明の範囲内に含まれるＷＩＳＰポリペプチドの共有結合修飾の別なタイプは、該ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変えることを含む。「天然グリコシル化パターンを変えること」とは、該天然配列中で見出される１以上の炭水化物部分を欠失すること（内在するグリコシル化部位を欠失することによって又は化学的及び／又は酵素的手段によりグリコシル化部分を取り去ることによって）及び／又は天然配列中に存在しない１以上のグリコシル化部位を加えることを意味すると、ここでの目的のために意図される。加えて、その表現は、存在する各種糖残基の本質と比率における変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における質的な変化を含む。
【０１２５】
ここでのＷＩＳＰポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変えることによって達成し得る。その付加は、例えば、天然配列への１以上のセリン又はトレオニン残基の付加、又はそれによる置換によって作製し得る（Ｏ-結合したグリコシル化部位）。該アミノ酸配列は、特にコドンが望まれるアミノ酸に翻訳されるであろうようにそれが生成されるよう、予備選択した塩基で該ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているＤＮＡを変異することによって、ＤＮＡレベルでの変更を通して任意に変更し得る。ＤＮＡ変異は、上述した方法を用いて作製し得る。
【０１２６】
ＷＩＳＰポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加するための別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによるものである。そのような方法は、当該分野において、例えば、1987年9月11日公開のＷＯ８７／０５３３０中に、及びAplinとWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306(1981)中に記載されている。
【０１２７】
ＷＩＳＰポリペプチド上にある炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、又はグリコシル化のための標識として利用されるアミノ酸残基をコードしているコドンの突然変異的置換によって達成し得る。化学的な脱グリコシル化は、当該分野で周知であり、且つ例えば、Hakimuddin,ら、Arch. Biochem. Biophys.,259:52(1987)によって、及びEdgeら、Anal. Biochem., 118:131(1981)によって記載される。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的な切断は、Thokakuraら、Meth. Enzymol., 138:350(1987)により記載されたようなエンド-及びエキソ-グリコシダーゼの使用によって達成することができる。
【０１２８】
共有結合修飾の別なタイプは、例えば、米国特許第４６４０８３５；４４９６６８９：４３０１１４４；４６７０４１７；４７９１１９２又は４１７９３３７号中に記載される手法において、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのような各種の非タンパク様ポリマーの一つに、ＷＩＳＰを結合することを含む。
【０１２９】
本発明のＷＩＳＰポリペプチドはまた、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ＷＩＳＰポリペプチド、又はそのフラグメントを含むキメラ分子を形成する手法においても修飾され得る。一つの実施態様において、そのようなキメラ分子は、ＷＩＳＰポリペプチドと、抗標識抗体が選択的に結合できるエピトープを提供する標識ポリペプチドとの融合体を含む。該エピトープ標識は、天然又は変異体ＷＩＳＰ分子のアミノ又はカルボキシ末端で一般に配される。そのようなエピトープ標識した形の存在は、該標識ポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープ標識の提供は、エピトープ標識に結合する抗標識抗体又は別なタイプのアフィニティーマトリックスを用いるアフィニティー精製によって容易に精製されるべきＷＩＳＰポリペプチドを可能にする。代替的な実施態様において、該キメラ分子は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特有な領域と、ＷＩＳＰポリペプチド、又はそのフラグメントの融合体を含む。キメラ分子の二価形態のため、そのような融合は、ＩｇＧ分子のようなＩｇのＦｃ領域にすることができる。
【０１３０】
各種の標識ポリペプチドとそのそれぞれの抗体は、当該分野で良く知られる。実例は、ポリヒスチジン（ポリ-his）又はポリヒスチジングリシン(ポリ-his-gly)標識；ｆｌｕ ＨＡ標識ポリペプチドとその抗体１２ＣＡ５(Fieldら、Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165(1988))；ｃ-ｍｙｃ標識とそれの８Ｆ９，３Ｃ７，６Ｅ１０，Ｇ４，Ｂ７，及び９Ｅ１０抗体(Evanら、Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616(1985))；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）標識及びその抗体を含む。Paborskyら、Protein Engineering, 3(6):547-553(1990)。他の標識ポリペプチドは、Ｆｌａｇ-ペプチド(Hoppら、BioTechnology, 6:1204-1210(1988))；ＫＴ３エピトープペプチド(Martinら、Science, 255:192-194(1992))；α-チューブリンエピトープペプチド(Skinnerら、J. Biol.Chem., 266:15163-15166(1991))；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチド標識を含む。Lutz-Freyermuthら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397(1990)。
【０１３１】
Ｄ．ＷＩＳＰポリペプチドの製造
以下の記載は、少なくともヒト又はマウスＷＩＳＰ-１（それぞれ配列番号：４３，４，１１，又は１２）の成熟又は完全長配列をコードしているＤＮＡを含む、又は少なくともヒト又はマウスＷＩＳＰ-２（それぞれ配列番号：１５，１６，１９，又は２０）の成熟又は完全長配列をコードしているＤＮＡを含む、又は少なくとも図１１のヒトＷＩＳＰ-３（それぞれ配列番号：３２又は３３）の成熟又は完全長配列をコードしているＤＮＡを含む、又は少なくとも図１４のヒトＷＩＳＰ-３（それぞれ配列番号：３２又は３３）の成熟又は完全長配列をコードしているＤＮＡを含むベクターによって形質転換した又はトランスフェクトした細胞を培養することによる、ポリペプチドの製造に本質的に関する。
【０１３２】
勿論、それはＷＩＳＰポリペプチドを製造するために利用し得る、当該分野で周知である方法で代替することが意図される。例えば、ＷＩＳＰポリペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いて直接ペプチド合成によって製造し得る。例えば、Stewartら、Solid-Phase Peptide Synthesis (W.H. Freeman Co.: San Francisco, CA, 1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154(1963)を参照。インビトロタンパク質合成は、手動技術を用いて又は自動によって実施し得る。自動化合成は、例えば、製造者の指示に従ってApplied Biosystemsペプチドシンセサイザー(Foster City, CA)を用いて達成し得る。ＷＩＳＰポリペプチドの各部は、別々に化学合成し、完全長ＷＩＳＰポリペプチドを製造するための化学的又は酵素的方法を用いて結合して良い。
【０１３３】
１．ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているＤＮＡの単離
ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているＤＮＡは、ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているｍＲＮＡを持つとともにそれを検出可能なレベルで発現すると確信した組織から作製したｃＤＮＡライブラリーから得られる。従って、ヒトＷＩＳＰポリペプチドをコードしているＤＮＡは、ヒト胎児肝臓ライブラリー又は実施例中に記載したその他のようなヒト組織から作製したｃＤＮＡライブラリーから利便的に得ることができる。ＷＩＳＰポリペプチドをコードしている遺伝子は、ゲノムライブラリーから、或いはオリゴヌクレオチド合成によって得ることもできる。
【０１３４】
ＷＩＳＰポリペプチドクローニングの更なる代替方法は、識別的調節した又は組織特異的ｃＤＮＡプローブ及びライブラリーを生成するための方法である、抑制的サブトラクティブハイブリダイゼーションである。これは、例えば、Diatchenkoら、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93:6025-6030(1996)中に記載される。その方法は、抑制ＰＣＲと称する技術に本質的に基づき、単一手法において標準化と削減を組み合わせる。標準化工程は、標的集団内の多量のｃＤＮＡを均一にし、削減工程は、標的とドライバー集団の間の共通の配列を排除する。
【０１３５】
ライブラリーは、興味ある遺伝子又はそれによってコードしたタンパク質を同定するために設計したプローブ（ＷＩＳＰポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド）によってスクリーンすることができる。その選択したプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrookら、上記、中に記載されるような標準手法を用いて処理し得る。ＷＩＳＰポリペプチドをコードしている遺伝子を単離するための代替手段は、ＰＣＲ方法論を使用することである。Sambrookら、上記；Dieffenbachら、PCR Primer: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)。
【０１３６】
後述の実施例は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術を記載する。プローブとして選択したオリゴヌクレオチド配列は、擬陽性が最少化されるように十分な長さにすると共に十分に明白なものにすべきである。そのオリゴヌクレオチドは、それがスクリーンするべきライブラリー中のＤＮＡへのハイブリダイゼーションを検出できるように好ましくは標識される。標識化の方法は、当該分野で周知であり、32Ｐ-標識したＡＴＰのような放射性標識、ビオチン化、又は酵素標識を含む。中等度ストリンジェンシー及び高度なストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら、上記、中に提供される。
【０１３７】
そのようなライブラリースクリーニング法で同定される配列は、寄託された及びＧｅｎＢａｎｋのような公共のデータベース又は他のプライベートな配列データベースで利用可能な他の周知の配列と比較し且つアライメントすることができる。その分子の定められた領域内の又は完全長配列にわたる配列同一性（アミノ酸又はヌクレオチドレベルでの何れか一方）は、相同性を測定するため各種アルゴリズムを利用する、ＡＬＩＧＮ，ＤＮＡｓｔａｒ，及びＩＮＨＥＲＩＴのようなコンピューターソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを経て決定することができる。
【０１３８】
ポリペプチドコード化配列を有する核酸は、最初にここに記載した推定アミノ酸配列を用いて、要すれば、プレカーサーを検出する及びｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの中間体を加工するために、Sambrookら、上記、中に記載したような通常のプライマー伸張手法を用いて、選択したｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。
【０１３９】
２．宿主細胞の選択と形質転換
宿主細胞は、ＷＩＳＰポリペプチド作製用にここに記載した発現又はクローニングベクターによって形質転換され、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は望まれる配列をコードしている遺伝子の増幅のために適切なように修正した通常の栄養培地中で培養される。培地、温度、ｐＨなどのような培養条件は、過度の実験なしに熟達した研究者であれば選択することができる。一般に、細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコル、及び実践技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed.(IRL Press, 1991)及びSambrookら、上記、中に見出すことができる。
【０１４０】
トランスフェクションの方法は、例えば、ＣａＰＯ4とエレクトロポレーションのように、当業者に周知である。使用した宿主細胞に基づいて、形質転換は、そのような細胞に対して適切な標準技術を用いて実行される。Sambrookら、上記、に記載される塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、又はエレクトロポレーションは、一般に原核生物又は本質的に細胞壁バリアを含む他の細胞用に使用される。アグロバクテリウム・チュメファシエンスによる感染は、Shawら、Gene, 23:315(1983)と1989年6月29日に公開されたＷＯ８９／０５８５９によって記載されるようなある種の植物細胞の形質転換のために使用される。そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞のためには、Grahamとvan der Eb, Virology, 52:456-457(1978)のリン酸カルシウム沈殿法が利用できる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般態様は、米国特許第４３９９２１６号中に記載されている。酵母における形質転換は典型的に、Van Solingenら、J. Bact., 130:946(1977)とHsiaoら、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829(1979)の方法に従って実施される。しかしながら、核ミクロ注入、エレクトロポレーション、完全な細胞との細菌のプロトプラスト融合、ポリカチオン、例えばポリブレン又はポリオルニチン、のような細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も使用し得る。哺乳動物細胞を形質転換するための各種の技術については、Keownら、Methods in Enzymology, 185:527-537(1990)とMansourら、Nature, 336:348-352(1988)を参照。
【０１４１】
ここでのベクター中のＤＮＡをクローニング又は発現するために適当な宿主細胞は、原核生物、酵母又はより高等な真核生物を含む。適当な原核生物は、真性細菌属に制限されることなく、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば大腸菌のようなエシェリキア属、エンテロバクター属、エルウイニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばネズミチフス菌、セラティア属、例えば霊菌、及びシゲラ属のような腸内細菌科、同じくＢ．スブチリス、Ｂ．リケニホルミス（例えば、Ｂ．リケニホルミス４１Ｐは1989年4月12日に公開されたＤＤ２６６７１０中に開示される）のようなバチルス属、緑膿菌のようなシュードモナス属、及びストレプトマイセス属を含む。大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ATCC 31446)；大腸菌Ｘ１７７６(ATCC 31537)；大腸菌Ｗ３１１０株(ATCC 27325)；及びＫ５ ７７２(ATCC 53635)のような各種の大腸菌株が公的に利用可能である。これらの例示は、制限のためではなく説明のためである。Ｗ３１１０株は、それが組み換えＤＮＡ製品発酵のために普通の宿主株であるために特に好ましい宿主又は親の一つである。好ましくは、該宿主細胞は、最少量の蛋白分解酵素を分泌する。例えば、Ｗ３１１０株は、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ATCC 55244)；完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT  rbs7 ilvG kanrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性degT欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第４９４６７８３号中に開示される変異ペリプラズミックプロテアーゼを有する大腸菌株を含むそのような宿主の実例とともに、該宿主に内因性のタンパク質をコードしている遺伝子中の遺伝的変異をもたらすように修正し得る。代替的に、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好適である。
【０１４２】
原核生物に加えて、糸状真菌又は酵母のような真核微生物が、ＷＩＳＰポリペプチドをコードしている核酸を含むベクターのための適当なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエは、普通に用いられる下等な真核宿主微生物である。しかしながら、多数の他の属、種、及び株が普通に利用でき且つここで有用である、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ(BeachとNurse, Nature, 290: 140(1981); 1985年5月2日公開のＥＰ１３９３８３)；クリベロマイセス宿主(米国特許第４９４３５２９号；Fleerら、Bio/Technology, 9:968-975(1991))例えばＫ．ラクチス(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら、J. Bacteriol., 737(1983))、Ｋ．フラジリス(ATCC 12424)、Ｋ．ブルガリクス(ATCC 16045)、Ｋ．ウイッケラミイ(ATCC 24178)、Ｋ．ワルチ(ATCC 56500)、Ｋ．ドロソフィラルム(ATCC 36906; Van den Bergら、Bio/Technology, 8:135(1990)、Ｋ．サーモトレランス及びＫ．マキシアヌス；ヤロウィア(EP402226)；ピシア・パストリス(EP183070；Sreekrishnaら、J. Basic Microbiol., 28:265-278(1988))；カンジダ属；トリコデルマ・リーシア(EP244,234)；ニューロスポラ・クラシア(Caseら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263(1979))；シュヴァニオミセス属、例えばシュヴァニオミセス・オクシデンタリス(1990年10月31日公開のEP394538)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポクラディウム属(1991年1月10日公開のWO91/00357)のような、及びアスペルギルス属宿主、Ａ．ニドランス(Ballanceら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289(1983); Tilburnら、Gene, 26:205-221(1983); Yeltonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474(1984))及びＡ．ニガー KellyとHynes, EMBO J., 4:475-479(1985)。メチロトロピック酵母がここでは好適であり、制限されることなしに、ハンセヌラ属、カンジダ属、クロエケラ属、ピシア属、サッカロミセス属、トルロプシス属及びロドトルラ属からなる属から選択されるメタノールで増殖可能な酵母を含む。酵母のこのクラスの例示である特有の種のリストは、C.Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269(1982)中に見出される。
【０１４３】
グリコシル化ＷＩＳＰポリペプチドの発現用に好適な宿主細胞は、多細胞生体から得られる。無脊椎動物細胞の実例は、ショウジョウバエＳ２とスポドプテラＳｆ９のような昆虫細胞、同じく植物細胞を含む。有用な哺乳動物宿主細胞系の実例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）とＣＯＳ細胞を含む。より特有な例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１系(ＣＯＳ-７,ATCC CRL 1651)；ヒト胚腎臓系(２９３又は懸濁培養での増殖用にサブクローンした２９３細胞)；チャイニーズハムスター卵巣細胞/-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、UrlaubとChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980))；マウスセルトーリ細胞(ＴＭ４，Mather, Biol. Reprod., 23:243-251(1980))；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ATCC CCL 75)；ヒト肝臓細胞(Hep G2, HB 8065)；及びマウス乳癌(MMT 060562, ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、当業者の範囲内と思われる。
【０１４４】
３．複製可能ベクターの選択と使用
望まれるＷＩＳＰポリペプチドをコードしている核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニングのため（そのＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能ベクターに挿入し得る。各種のベクターが、好適に利用可能である。該ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とし得る。その適切な核酸配列は、各種の手法によって該ベクター内に挿入し得る。一般に、ＤＮＡは、当該分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター構成要素は、一般に、制限されることなしに、１以上のシグナル配列、複製の起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終止配列を含む。これらの１以上の構成要素を含む適当なベクターの構築は、熟達した研究者に周知である標準的な結紮技術を利用する。
【０１４５】
望まれるクローンＷＩＳＰポリペプチドは、直接的にのみならず、もしＷＩＳＰポリペプチドが分泌されるように伝導性であるか、又は成熟またか完全長タンパク質又はポリペプチドのＮ末端で特異的切断部位を有する他のポリペプチドであるならば、シグナル配列とし得る、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組み換えによって製造し得る。一般に、該シグナル配列は、ベクターの構成要素として良く、又はそれはベクターに挿入されるＷＩＳＰポリペプチドをコードしているＤＮＡの一部とし得る。該シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、又は心臓-安定エンテロトキシンIIリーダーのような原核生物のシグナル配列とし得る。酵母分泌用のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(サッカロミセスとクリベロミセスα因子リーダーを含む、後者は米国特許第５０１０１８２号中に記載される)、又は酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日公開のEP362179)、又は1990年11月15日公開のＷＯ９０／１３６４６に記載されたシグナルとして良い。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列は、同じ又は関連する種の分泌されたポリペプチドからのシグナル配列のようなタンパク質の直接分泌、同じくＷＩＳＰ-１ポリペプチドからのシグナルを含むウイルス分泌リーダーに使用し得る。
【０１４６】
発現及びクローニングベクターの両方は、選択した宿主細胞の１以上の中でそのベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は、各種の細菌、酵母、及びウイルスについて良く知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製の起点は、大部分のグラム陰性細菌用に好適であり、２μプラスミド起点は、酵母用に好適であり、且つ各種のウイルス起点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、又はＢＰＶ)は、哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用である。
【０１４７】
発現及びクローニングベクターは、典型的に選択遺伝子、選択可能マーカーとも言われる、を含むであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンに対する耐性を与える、（ｂ）補充栄養要求性欠如、又は（ｃ）例えばバチルス属のＤ-アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子のような、複合培地から利用可能でない臨界栄養源の供給。
【０１４８】
哺乳動物細胞用の適当な選択マーカーの実例は、ＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼのような、ＷＩＳＰポリペプチドをコードしている核酸を取り込むための感応細胞の同定を可能にするそれらである。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合に適当な宿主細胞は、Urlaubら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)によって記載されるように製造され且つ増殖された、ＤＨＦＲ活性が不足したＣＨＯ細胞系である。酵母において使用するために適当な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Stinchcombら、Nature, 282:39(1979)；Kingsmanら、Gene, 7:141(1979)；Tschemperら、Gene, 10:157(1980)。該ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠いた酵母の変異株、例えば、ATCC No.44076又はPEP4-1用の選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12(1977)。
【０１４９】
発現及びクローニングベクターは、ｍＲＮＡ合成を導くためのＷＩＳＰポリペプチドをコードしている核酸配列に操作可能に結合したプロモーターを通例は含む。各種の可能性のある宿主細胞によって認識されるプロモーターは周知である。原核生物宿主で使用するために好適なプロモーターは、β-ラクタマーゼとラクトースプロモーター系(Changら、Nature, 275:615(1978)；Goeddelら、Nature, 281:544(1979))、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057(1980); EP36776)、及びｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターを含む。deBoerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25(1983)。細菌系において使用するためのプロモーターは、ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているＤＮＡに操作可能に結合したShine-Dalgarno(S.D.)配列をも含むであろう。
【０１５０】
酵母宿主で使用するために適当なプロモーター配列は、３-ホスホグリセラートキナーゼ(Hitzemanら、J. Biol. Chem., 255:2073(1980))又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのような他の解糖酵素のためのプロモーターを含む。
【０１５１】
増殖状態によって制御される転写の更なる効果を有する誘導可能なプロモーターである、他の酵素プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトースとガラクトース利用のための応答可能な酵素のプロモーター領域である。酵母発現における使用のための適当なベクターとプロモーターは、ＥＰ７３６５７中に更に記載される。
【０１５２】
哺乳動物宿主細胞中のベクターからのＷＩＳＰ転写は、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス(1989年7月5日公開のＵＫ２２１１５０４)、アデノウイルス(アデノウイルス２のような)、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０(SV40)のようなウイルスのゲノムから；異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター；及び宿主細胞系と和合されるそのようなプロモーターを提供する、熱ショックプロモーター、から得られたプロモーターによって制御される。
【０１５３】
より高等な真核生物によるＷＩＳＰをコードしているＤＮＡの転写は、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増加し得る。エンハンサーは、通常約１０から３００ｂｐまでのＤＮＡのシス-作用要素であり、その転写を増加するプロモーターに作用する。多くのエンハンサー配列が哺乳動物から現在知られている（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトタンパク質、及びインスリン）。典型的に、しかしながら、それは真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるだろう。実例は、複製起点の後の側上のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後方上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーを含む、該エンハンサーは、ＷＩＳＰポリペプチドをコードしている位置５’又は３’でベクター内にスプライスされるが、しかし好ましくは該プロモーターからの部位５’に配される。
【０１５４】
真核生物細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物からの有核細胞）において使用される発現は、転写の終止のため及びｍＲＮＡを安定化するために必要な配列をも含むであろう。そのような配列は普通、真核生物又はウイルスＤＮＡｓ又はｃＤＮＡｓの５’及び時折３’非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写したヌクレオチドセグメントを含む。
【０１５５】
組換え脊椎動物細胞培養におけるＷＩＳＰポリペプチドの合成への適合のために好適な更に他の方法、ベクター、及び宿主細胞は、Gethingら、Nature, 293:620-625(1981); Manteiら、Nature, 281:40-46(1979); EP117060; とEP117058中に記載される。
【０１５６】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子増幅／発現は、直接試料で、例えば、ここに提供した配列に基づいて、適切に標識したプローブを用いて、通常のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロット法(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205(1980))、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、又はin situハイブリダイゼーションで測定し得る。代替的に、抗体は、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク質二本鎖を含む特異的二本鎖を認識できるそれを利用し得る。その結果抗体は、標識されて良く、且つ該アッセイは、その二本鎖がその表面上に二本鎖の形成において、該二本鎖に結合した抗体の存在が検出できるように表面に結合される場合、実行し得る。
【０１５７】
代替的に遺伝子発現は、細胞の免疫組織学的染色又は組織切片のような免疫学的方法及び遺伝子生成物の発現を直接定量するため、細胞培養又は体液のアッセイによって測定し得る。流体試料の免疫組織学的染色のために有用な抗体は、モノクローナル又はポリクローナルのいずれかとして良く、また何れの哺乳動物においても作製し得る。利便的に、該抗体は、天然配列ＷＩＳＰポリペプチドに対して、又はここに提供したＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して又はＷＩＳＰポリペプチドをコードしているとともに特異的抗体エピトープをコードしているＤＮＡと融合した外因性配列に対して製造し得る。
【０１５８】
５．ポリペプチドの精製
ＷＩＳＰポリペプチドの形成物は、培地又は宿主細胞溶解物から回収し得る。もし膜に結合しているならば、それは適当な洗剤溶液(例えばTriton-X100)を用いて又は酵素的な切断によってその膜から離すことができる。ＷＩＳＰポリペプチドの発現において用いた細胞は、凍結-融解サイクル、音波処理、機械的粉砕、又は細胞溶解剤のような各種の物理的化学的手段によって破砕することができる。
【０１５９】
それは組換え細胞タンパク質又はポリペプチドからＷＩＳＰポリペプチドを精製するために望まれるであろう。以下の手法は、好適な精製手法の例示である：イオン交換カラムでの分画によって；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカでの又はＤＥＡＥのようなカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫安沈殿；例えばSEPHADEXTMG-75を用いたゲル濾過；ＩｇＧのような不純物を除去するためのプロテインＡSEPHAROSETMカラム；及びＷＩＳＰポリペプチドのエピトープ標識化形を結合する金属キレート化カラム。タンパク質精製の各種の方法を用いて良く、且つそのような方法は当該分野で周知であり、且つ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990); 及びScopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag: New York, 1982)中に記載される。
【０１６０】
精製の特有な実例に一つにおいて、ポリ-ＨＩＳ標識又はヒトＩｇＧのＦｃ部分の何れか一方が、発現前のＷＩＳＰのためのｃＤＮＡのＣ末端コード化領域に加えられる。トランスフェクトした細胞からの馴化培地は、該細胞を取り除くために遠心分離によって採取され且つ濾過される。ポリ-ＨＩＳ標識化構造物を得るため、該タンパク質はＮｉ-ＮＴＡカラムを用いて精製し得る。ローディング後、該カラムは、更なる平衡化緩衝液で洗浄して良く、該タンパク質は、0.25Mのイミダゾールを含む平衡化緩衝液で溶出される。より高度に精製したタンパク質は、要すれば、貯蔵緩衝液で脱塩し得る。
【０１６１】
ＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，及びＷＩＳＰ-３タンパク質の免疫付着因子(Fc-含有)は、リン酸塩緩衝液で平衡化されている5-mlプロテインＡカラムにそれをポンピングすることによって馴化培地から精製し得る。ローディング後、該カラムは、クエン酸で溶出する前に平衡化緩衝液で広範囲に洗浄し得る。溶出したタンパク質は、トリス緩衝液を含む管に1-ml分画を採取することによって直ちに中和化し得る。より高度に精製したタンパク質は、ポリ-ＨＩＳ標識化タンパク質のための上述した貯蔵緩衝液で続いて脱塩して良い。該タンパク質の均質性は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって及びエドマン分解によってＮ末端アミノ酸配列決定によって評価し得る。
【０１６２】
選択した精製工程は、例えば、使用した製造プロセスの本質と生成した個々のＷＩＳＰポリペプチドに基づくであろう。
【０１６３】
Ｅ．ＷＩＳＰポリペプチド及びその核酸の使用
ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列（又はその相補体）は、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡとＤＮＡの生成においてハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む、分子生物学の分野における各種の適用を有する。ＷＩＳＰポリペプチドをコードしている核酸は、ここに記載した組換え技術によってＷＩＳＰポリペプチドの製造用にも有用であろう。
【０１６４】
マウス又はヒトＷＩＳＰ-１又はＷＩＳＰ-２のための完全長ヌクレオチド配列（それぞれ配列番号：９，１，１７，及び１３）又はその一部、又は図１１のヒトＷＩＳＰ-３のための完全長ヌクレオチド配列(配列番号：３０)又は図１４のＷＩＳＰ-３(配列番号：３４)は、図１，３，５，８，１１と１２，及び１４と１５中に開示したＷＩＳＰポリペプチド配列（それぞれ配列番号：３，４，１１，１２，１５，１６，１９，２０，３２，３３，３６，又は３７）への望まれる配列同一性を有する、興味あるＷＩＳＰポリペプチドをコードしている完全長遺伝子を単離又は検出するための、又は更に他の遺伝子（例えば、ＷＩＳＰポリペプチドの自然生起変異体、他のＷＩＳＰポリペプチド科メンバー、又は他の種からのＷＩＳＰポリペプチドをコードしているそれら）を単離又は検出するためのｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。例えば、in situハイブリダイゼーション、ノーザン及びサザンブロット法、及びＰＣＲ分析のような手法が、異なるＷＩＳＰポリペプチドをコードしているＤＮＡ及び／又はＲＮＡが評価するべき細胞型中に存在するかどうかを測定するために使用し得る。任意に、該プローブの長さは、約２０から約５０塩基とされるであろう。例えば、該ハイブリダイゼーションプローブは、ＵＮＱ２２８(DNA33473-seq min)ヌクレオチド配列(配列番号：３８)又は図８中に示したヒトＷＩＳＰ-２ヌクレオチド配列(配列番号：１３)又は天然配列ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているＤＮＡのプロモーター、エンハンサー要素及びイントロンを含むゲノム配列から得ることができる。
【０１６５】
実例として、スクリーニング法は、約４０塩基の選択したプローブを合成するための周知のＤＮＡ配列を用いてＷＩＳＰ遺伝子のコード化領域を単離することを含むであろう。ハイブリダイゼーションプローブは、32Ｐ又は35Ｓのような放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチン結合系に結合したアルカリホスファターゼのような酵素標識を含む、各種の標識によって標識化し得る。本発明のＷＩＳＰポリペプチドをコードしている何れかの遺伝子のそれに相補な配列を有する標識化プローブは、プローブをハイブリダイズするそのようなライブラリーのメンバーを決定するためヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーンするために使用することができる。ハイブリダイゼーション技術は、後述の実施例中に更に詳細に記載される。
【０１６６】
該プローブは、密接に関係したＷＩＳＰ配列の同定のための配列のプールを生成するためのＰＣＲ技術においても利用し得る。
【０１６７】
ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列はまた、個別のＷＩＳＰポリペプチドをコードするその遺伝子のマッピングのため及び遺伝的疾患を持つ個人の遺伝的分析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築するためにも使用できる。ここに提供されたヌクレオチド配列は、in situハイブリダイゼーション、周知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーによるハイブリダイゼーションスクリーニングのような周知技術を用いた染色体及び染色体の特有の領域にマッピングし得る。得られた遺伝子の増幅が機能的に関係があるならば、その遺伝子は、腫瘍生存のために重要でない近傍ゲノム領域以上に増幅されるべきである。この試験のため、該遺伝子は例えば放射線ハイブリッド分析によって、特有の染色体にマップ化することができる。該増幅レベルは、同定した位置で、及び隣接したゲノム領域で測定される。遺伝子までマップ化されているゲノム領域での選択的又は優先的な増幅は、観測した遺伝子増幅が腫瘍増殖と生存性を刺激する可能性と一致する。染色体マッピングは、フレームワークと中心点マッピングの両方を含む。更なる詳細については、例えば、Stewartら、Genome Research 7,422-433(1997)を参照。
【０１６８】
ＷＩＳＰポリペプチドをコードしている核酸は、患者の細胞中のＷＩＳＰポリペプチドをコードしているＤＮＡの発現の程度と割合を測定するための診断として使用し得る。そのようなアッセイを達成するため、患者の細胞の試料が、in situハイブリダイゼーション、又は他の適当な手段を経て処理され、そしてその試料が該核酸分子とハイブリダイズが可能なｍＲＮＡ分子を含むかどうか測定するために分析される。
【０１６９】
ＷＩＳＰポリペプチド又は何れかのその修正された形態をコードしている核酸は、治療的に有効な試薬の開発又はスクリーニングにおいて、その結果有用であるトランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物の何れか一方を生産するためにも使用できる。トランスジェニック動物（例えばマウス又はラット）は、出生前の、例えば胎児段階で、トランスジーンがその動物に、又はその動物の親に導入された、トランスジーンを含む細胞を有する動物である。トランスジーンは、開発するトランスジェニック動物からの細胞のゲノム内に導入されるＤＮＡである。一つの実施態様において、ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは、ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を生成するために用いた確立した技術及びゲノムの配列に従いＷＩＳＰポリペプチドをコードしているゲノムＤＮＡをクローンするため使用することができる。
【０１７０】
トランスジェニック動物、特にマウス又はラットのような動物を作製するための方法は、当該分野において通常的になされており、例えば米国特許第４７３６８６６と４８７０００９号中に記載される。典型的に、個々の細胞は、組織特異的エンハンサーによるＷＩＳＰトランスジーン組み込みのための標的とされるであろう。胎児段階でその動物の生殖細胞系に導入したＷＩＳＰポリペプチドをコードしているトランスジーンのコピーを含むトランスジェニック動物は、ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているＤＮＡの増加した発現の作用を実験するために用いることができる。そのような動物は、例えば、それの過剰発現と関連した病的状態からの保護を与えることを通して試薬のためのテスター動物として使用することができる。本発明のこの態様に従い、動物はその試薬で治療され、その病的状態の可能性のある治療的な介入を示すであろう、該トランスジーンを持つ治療しない動物と比べて、病的状態の徴候が減じられる。
【０１７１】
代替的に、ＷＩＳＰポリペプチドの非ヒト相同体は、ＷＩＳＰポリペプチドをコードしている内因性遺伝子と、該動物の胚の細胞に導入したＷＩＳＰポリペプチドをコードしている変更したゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、ＷＩＳＰポリペプチドをコードしている欠陥のある且つ変更された遺伝子を有するＷＩＳＰポリペプチド「ノックアウト」動物を構築するために使用できる。例えば、ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているゲノムＤＮＡをクローンするために用いることができる。ＷＩＳＰポリペプチドをコードしているゲノムＤＮＡの一部は、欠失されるか、或いはモニター統合に用いることができる選択可能なマーカーをコードしている遺伝子のような、別な遺伝子と置換することができる。典型的に、変更していない隣接ＤＮＡの数キロ塩基（５’と３’での両方）は、ベクター中に含まれる。例えば、相同組換えベクターの記載についてのCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照。該ベクターは、胚の幹細胞系内に導入され（例えばエレクトロポレーションで）、内因性ＤＮＡで相同的に組み換えられている導入されたＤＮＡで細胞が選択される。例えば、Liら、Cell, 69:915(1992)を参照。選択した細胞は次いで凝集キメラを形成するために動物（例えばマウス又はラット）の芽細胞に注入される。Bradley,Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed.(IRL, Oxford, 1987), 113-152頁中を参照。キメラの胚は、適当な偽妊娠メス里親動物に移植することができ、その胚は「ノックアウト」動物が生成するまで成長される。それの生殖細胞における相同的に組換えたＤＮＡを持った子孫は、標準的な技術によって同定することができ、相同的に組み換えたＤＮＡを含むその動物の全ての全ての細胞が動物繁殖に使用できる。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病的状態に対して防御するその能力によって及びＷＩＳＰの不在のための病的状態のその進行によって特徴付けできる。
【０１７２】
特に、ＣＴＧＦ，ＩＧＦＢＰｓ，及び他のＣＴＧＦスーパーファミリーの他のメンバーが通例用いられるアッセイが、ＷＩＳＰ-１とＷＩＳＰ-２ポリペプチドで好適に実行される。例えばＴＧＦ-βが、癌における役割を示している、ＷＩＳＰポリペプチドを誘導するかどうかを測定するためのアッセイが、当該分野で周知なように、同じく細胞死滅の誘導を含むアッセイ及び3Ｈチミジン増殖アッセイのように実施し得る。マイトジェンの及び組織増殖アッセイもまた、上述したＷＩＳＰポリペプチドによって実行し得る。その結果は従って適用される。
【０１７３】
本発明のＷＩＳＰポリペプチドはまた、後述の通りルーチンのスクリーニングによって同定される、抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体の形成を誘導するためにも使用し得る。
【０１７４】
上記それの使用に加え、本発明のＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，及びＷＩＳＰ-３ＩＧＦ活性のアッセイのためのベースとして有用である。重要なことは、そのようなアッセイが生理学的に顕著な結合事象、即ち、そのＩＧＦＢＰへのＩＧＦのそれ、検出可能な変化の誘発(リン酸化、切断、化学修飾などのような)を測定することから、それが抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体へのＩＧＦの生理学的に有意でない結合を検出する免疫アッセイよりもより感受性で且つより正確である両方と思われる。たとえ抗体よりもより感受性で且つ正確であろうとも、本発明のＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，及びＷＩＳＰ-３分子は、抗体が使用されるのと同じ方法で試料中のＩＧＦ(IGF-I又はIGF-IIのような)レベルを測定するために使用することができる。
【０１７５】
診断的な目的のため、ＷＩＳＰポリペプチドは、免疫アッセイ技術に従って使用できる。免疫アッセイの実例は、Radioimmune Assay Method, KirkhamとHuner, ed., E & S. Livingstone, Edinburgh, 1970の199-206頁でWideによって提供される。
【０１７６】
かくして、一つの実施態様において、ＷＩＳＰポリペプチドは、検出可能に標識され、興味ある分子を含む試験試料（生物学的液体、例えば血清、痰、尿など）とインキュベーションし、その試料に結合したＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，及びＷＩＳＰ-３分子の量を確定することができる。
【０１７７】
試薬の固定化は、ある種の測定法に必要となる。固定化は、溶液中で遊離を保つ何れかの分析物からＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドを分離することを伴う。これは、利便的には、不溶性マトリックス又は表面への吸着によってＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，又はＷＩＳＰ-３ポリペプチドを不溶化することによって(Bennichら、米国特許第３７２０７６０号)、共有結合によって(例えばグルタルアルデヒド架橋を用い)、又は例えば免疫沈降によってそれ以後その分子を不溶化することによって達成される。
【０１７８】
上記はＩＧＦのための単に例示的な診断アッセイである。これら分析物の測定のためのこれまでの又は今後開発される他の方法は、この文章の範囲内に含まれる。
【０１７９】
ＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，及びＷＩＳＰ-３ポリペプチドはまた、ＩＧＦ-Ｉ又はＩＧＦ-IIのようなＩＧＦｓを測定するためのラジオイムノアッセイにおいても有用である。そのようなラジオイムノアッセイは、ＷＩＳＰ要素として天然の精製した又は組換えＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，又はＷＩＳＰ-３を用いて文献中に記載された通り実行されるであろう。
【０１８０】
加えて、ＷＩＳＰポリペプチドは、先の定義したようなそれらに結合する化合物をスクリーニングするために有用である。好ましくは、これら化合物は、１以上の望まれる活性を示す有機の又はペプチド分子のような小分子である。この種のスクリーニングアッセイは、当該分野では通常であり、且つ何れのそのようなスクリーニング手法を利用して良く、それによってここでのＷＩＳＰポリペプチドが接触され、且つその結合分子の結合の程度と生物学的活性が測定される。
【０１８１】
とりわけ、本発明は、ＷＩＳＰポリペプチドを模倣する(アゴニスト)又はＷＩＳＰポリペプチドの作用を防止する(アンタゴニスト)それらを同定するための化合物をスクリーニングする方法を包含する。アンタゴニスト薬剤候補のスクリーニングアッセイは、ここで同定した遺伝子によってコードされたＷＩＳＰポリペプチドに結合する又は複合化する、或いはコード化ポリペプチドと他の細胞のタンパク質との相互作用をその他に妨害する化合物を同定することと定義される。そのようなスクリーニングアッセイは、小分子薬剤候補を同定するために特に適したそれを行う化合物ライブラリーの高スループットスクリーニングに適し易いアッセイを含むであろう。
【０１８２】
該アッセイは、当該分野で充分特徴付けられた、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、及び細胞ベースのアッセイを含む、各種の形式で実行することができる。
【０１８３】
アンタゴニスト用の全てのアッセイは、それが、ここで同定した核酸によってコードされたＷＩＳＰポリペプチドと該薬剤候補とを、これら２の化合物に相互作用を与えるに十分な条件下及び時間接触させることを要することにおいて共通である。
【０１８４】
結合アッセイにおいて、その相互作用は結合であり、生じた複合体は該反応混合物中で単離又は検出できる。特有の実施態様において、ここで同定した遺伝子によってコードされたＷＩＳＰポリペプチド又は該薬剤候補は、共有結合又は非共有結合付着によって固相、例えばミクロタイタープレート上に固定化される。非共有結合付着は一般に、ＷＩＳＰポリペプチドの溶液によって固相表面をコーティングし乾燥することによって達せされる。代替的に、固定化した抗体、例えば固定化するべきＷＩＳＰポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、固相表面にそれを固定(anchor)するために用いることができる。該アッセイは、固定化成分、例えば固定した成分を含むコート化表面に、検出可能な標識によって標識し得る、非固定化成分を加えることによって実行される。該反応が完遂される場合、未反応成分は、例えば洗浄によって除去され、こそ有情に固定された複合体が検出される。初め非固定化成分が検出可能な標識を持つ場合、該表面上に固定された標識の検出は、複合体が生じたことを示す。初めの非固定化成分が標識を有さない場合、複合体は、例えば該固定化された複合体に特異的に結合する標識した抗体を用いることによって検出することができる。
【０１８５】
該候補化合物が、ここに同定した遺伝子によってコードされた特有のＷＩＳＰポリペプチドと相互作用するが、結合しないなら、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によって測定することができるポリペプチドと相互作用させる。そのようなアッセイは、例えば、架橋、共免疫沈降、及び濃度勾配又はクロマトグラフィーカラムを通しての共精製のような従来のアプローチを含む。加えて、タンパク質-タンパク質相互作用は、ChevrayとNathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793(1991)によって開示されるようなFieldsと共同研究者(Fields and Song, Nature (London), 340: 245-246(1989); Chienら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:9578-9582(1991))によって記載された酵母ベースの遺伝的システムを用いることによってモニターすることができる。酵母ＧＡＬ４のような多くの転写アクチベーターは、一方でＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方で転写活性化ドメインとして機能する２の生理的に別個のモジュラードメインからなる。上述の公表文献(全体として「２-ハイブリッドシステム」に関する)中に記載された交互発現系は、この特性の有効性を保持し、２のハイブリッドタンパク質、その１つは標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合され、もう１つは候補活性化タンパク質が活性化ドメインに融合される、を利用する。ＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下でのＧＡＬ１-ｌａｃＺレセプター遺伝子の発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を経てＧＡＬ４活性化の再構築に基づく。相互作用ポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼのために色素形成基質によって検出される。２-ハイブリッド技術を用いて２の特異性タンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完成キット(MATCHMAKERTM)がClontechから商業的に利用できる。
【０１８６】
ここで同定したＷＩＳＰポリペプチドをコードしている遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を妨害する化合物は、以下のように試験できる：通例、反応混合物は、２つの生成物の相互作用と結合を与える条件下及び時間、遺伝子の生成物と細胞内又は細胞外成分とを含み作製される。結合を抑制するための候補化合物の能力を試験するために、その反応は、該試験化合物の不在及び存在中で実行される。加えて、プラシーボが陽性コントロールとして利用する、第３の反応混合物に加える。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との間の結合(複合体形成)は、上述した通りモニターされる。コントロール反応における複合体の形成、しかし試験化合物を含む反応混合物において無いことは、該試験化合物が試験化合物とその反応パートナーの相互作用を妨げることを示す。
【０１８７】
ＷＩＳＰポリペプチドが共マイトジェンＣｏｎＡの存在において内皮細胞の増殖を刺激する能力を有するならば、スクリーニング法の一つの実例は、この能力の有効性を持つ。特に、増殖アッセイにおいて、ヒト臍静脈内皮細胞が得られ、且つ９６ウェル平底培養板中で培養され(Costar, Cambridge, MA)、該細胞の増殖を促進するために適した反応混合物によって補充され、該混合物はCon-A(Calbiochem, La Jolla, CA)を含む。Con-Aとスクリーンされるべき化合物とが加えられ、３７℃でインキュベーションの後、培養物は3-Ｈチミジンでパルスされ、そしてガラス繊維フィルター(phD; Cambridge Technology, Watertown, MA)上に収穫する。三重の培養物の平均3-(Ｈ)チミジン取込み(cpm)は、液体シンチレーションカウンター(Beckman Instruments, Irvine, CA)を用いて測定される。有意な3-(Ｈ)チミジン取込みは、内皮細胞増殖の刺激を示す。
【０１８８】
アンタゴニストのアッセイについて、上述したアッセイが実行される：しかしながら、このアッセイにおいてＷＩＳＰポリペプチドは、スクリーンするべき化合物と一緒に加えられ、且つＷＩＳＰポリペプチドの存在中での3-(Ｈ)チミジン取込みを抑制する該化合物の能力は、その化合物がＷＩＳＰポリペプチドに対するアンタゴニストであることを示す。代替的に、アンタゴニストは、競合阻害アッセイのために適当な条件下で、膜結合ＷＩＳＰポリペプチドレセプター又は組換えレセプターによりＷＩＳＰポリペプチドと潜在アンタゴニストを結合することによって検出し得る。該ＷＩＳＰポリペプチドは、該レセプターに結合したＷＩＳＰポリペプチド分子の数が、潜在アンタゴニストの有効性を測定するのに使用できるように、例えば放射能によって標識することができる。該レセプターをコードしている遺伝子は、多くの当業者に周知の方法、例えば、リガンドパンニング及びＦＡＣＳソーティングによって同定することができる。Coliganら、Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5(1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、これではポリアデニル化ＲＮＡがＷＩＳＰポリペプチドに応答する細胞から作製され、さらにこのＲＮＡから創製したｃＤＮＡライブラリーがプール中に分割され、且つＣＯＳ細胞又はＷＩＳＰポリペプチドに応答可能でない他の細胞をトランスフェクトするために用いられる。スライドガラス上で増殖させたトランスフェクト細胞は、標識したＷＩＳＰ-１ポリペプチドにさらされる。該ＷＩＳＰポリペプチドは、部位特異的タンパク質キナーゼのための認識部位のヨウ素化又は包含を含む各種の手段によって標識することができる。固定及びインキュベーションに続き、該スライドはオートラジオグラフィー分析にかけられる。陽性のプールが同定され、さらにサブプールが作製され、そして推定レセプターをコードする単一クローンを最終的にもたらす、相互作用サブプール化及び再スクリーニングプロセスを用いて再度トランスフェクトされる。
【０１８９】
レセプター同定のための代替アプローチとして、標識したＷＩＳＰポリペプチドは、細胞膜又は該レセプター分子を発現する抽出物と光アフィニティー結合することができる。架橋材料は、ＰＡＧＥによって消散され、Ｘ線フィルムに感光される。該レセプターを含む標識化複合体は切除でき、ペプチドフラグメントに消散され、そしてタンパク質ミクロシークエンシングにかけられる。ミクロシークエンシングから得られたアミノ酸配列は、推定レセプターをコードしている遺伝子を同定するためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするための一連の変質オリゴヌクレオチドプローブを設計するために用いられるであろう。
【０１９０】
アンタゴニスト用の別なアッセイにおいて、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は該膜調製物は、候補化合物の存在において標識したＷＩＳＰポリペプチドとインキュベーションされるだろう。そしてこの相互作用を増加又は阻止する該化合物の能力が測定できる。
【０１９１】
ＷＩＳＰ関連疾患の治療において有用な組成物は、制限されることなしに、標的遺伝子生成物の発現及び／又は活性化を抑制する、抗体、小さな有機及び無機分子、ペプチド、ホスポペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、トリプルヘリックス分子などを含む。
【０１９２】
潜在アンタゴニストのより特有の実例は、ＷＩＳＰポリペプチド、(ポリ)ペプチド-免疫グロブリン融合物、及び、特に、制限されることなしに、ポリ及びモノクローナル抗体と抗体フラグメント、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、及びそのような抗体又はフラグメントのキメラ又はヒト化した形態を含む抗体、同じくヒト抗体と抗体フラグメントを含む。代替的に、潜在アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、該レセプターを認識するが、作用を授けない、それによってＷＩＳＰポリペプチドの作用を競合的に阻害しないＷＩＳＰポリぺぴちどの変異型とし得る。
【０１９３】
別な潜在ＷＩＳＰポリペプチドアンタゴニストは、例えばアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子が標的としたｍＲＮＡにハイブリダイスすること及びタンパク質翻訳を防止することによってｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する場合、アンチセンス技術を用いて作製したアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ構築物である。アンチセンス技術は、ＤＮＡ又はＲＮＡにポリヌクレオチドを結合することに基づく方法の両方を、トリプルヘリックス構造又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通しての遺伝子発現を制御することに使用できる。例えば、ここでの成熟ＷＩＳＰポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５′コード化部分は、長さにおいて約１０から４０塩基対までのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれた遺伝子の領域に相補となるように設計され(トリプルヘリックス−Leeら、Nucl. Acids Res., 6: 3073(1979); Cooneyら、Science, 241: 456(1988); Dervanら、Science, 251: 1360(1991))、そしてＷＩＳＰポリペプチドの転写と生成を防止する。該アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＷＩＳＰポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止する(アンチセンス−オカノ, Neurochem., 56: 560(1991); Oligodeoxynucleotidesas Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)。上述したオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがＷＩＳＰポリペプチドの生成を抑制するためインビボで発現されるように細胞に届けることもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、転写開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０と＋１０位置の間から得られたオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１９４】
潜在アンタゴニストは、活性部位、レセプター結合部位、又はＷＩＳＰポリペプチドの増殖因子又は他の関結紮合部位に結合し、そしてＷＩＳＰポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小さな分子を含む。小さな分子の実例は、制限されることなしに、小さいペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド様有機又は無機化合物を含む。
【０１９５】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補標的ＲＮＡに配列特異的にハイブリダイゼーションし、その後エンドヌクレアーゼ分解的切断によって作用する。潜在ＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位は、周知の技術によって同定することができる。更なる詳細のために、例えば、Rossi, Current Biology, 4: 469-471(1994)，及びＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３３５５１(1997年9月18日公開)を参照。
【０１９６】
転写を抑制するために用いたトリプルヘリックス構造における核酸分子は、一本鎖とされ、且つデオキシヌクレオチドで構成されるべきである。これらオリゴヌクレオチドのベース組成は、一つの一本鎖又は二本鎖上のプリン又はピリミジンのかなり大きなシト列置が一般に要求される、フーグスティーン型塩基対則を経てそれがトリプルヘリックス構造を助長するように設計される。更なる詳細のため、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３３５５１，上記、を参照。
【０１９７】
これらの小さい分子は、上述したスクリーニングアッセイのいずれか１つ以上によって及び／又は当業者に周知の何れかの他のスクリーニング技術によって同定することができる。
【０１９８】
ＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、ＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，又はＷＩＳＰ-３に結合するＩＧＦ(例えばＩＧＦ-Ｉのような)のアフィニティー精製において、及びそれによって抗体の精製において更に有用である。ＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，又はＷＩＳＰ-３は典型的に、当該分野で周知の手段によって、Affi-Gel 10TM(Bio-Rad, Richmond, CA)又は他のそのような樹脂(支持マトリックス)のような固定化樹脂に結合される。該樹脂は、緩衝液(50%グリセリンと0.5%のNP-40を補充した150mMのＮａＣｌ、20mMのＨＥＰＥＳ,pH7.4)中で平衡化し、そして精製するべき調製物をその樹脂に接触させ、それにより該分子は、該樹脂上のＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，又はＷＩＳＰ-３に選択的に吸着される。
【０１９９】
該樹脂は、精製するべき混合物から、望ましくない不純物を含む、非吸着材料を除去するために、適当な緩衝液、例えば、0.5%のNP-40を含む150mMのＮａＣｌ、20mMのＨＥＰＥＳ,pH7.4；0.5MのＮａＣｌと0.1%のNP-40を含む150mMのＮａＣｌ、20mMのＨＥＰＥＳ,pH7.4；0.1%デオキシコール酸を含む150mMのＮａＣｌ、20mMのＨＥＰＥＳ,pH7.4；0.1%のNP-40を含む150mMのＮａＣｌ、20mMのＨＥＰＥＳ,pH7.4；及び0.1%のNP-40、20%グリセリンと50mMグリシン、pH3の溶液を用いて、続いて洗浄される。該樹脂は、ＩＧＦとＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，又はＷＩＳＰ-３との間の結合を破壊するであろう緩衝液を用いて(例えば、50mMのグリシン，ｐＨ３，0.1%のNP-40，20%のグリセリン，及び100mMのＮａＣｌを用いて)ＩＧＦを溶出するために処理される。
【０２００】
本発明のＷＩＳＰポリペプチドは、少なくともＷｎｔ経路の過剰発現及び／又は活性化によって特徴付けられるそれらを含む、各種の状態を治療するために使用し得ることが意図される。更に、ＷＩＳＰ-１，ＷＩＳＰ-２，及びＷＩＳＰ-３分子がマウスにおけるホルモン発現化胸癌に応答し且つヒトの癌において異常に発現され、且つ各種の結腸癌細胞系において過剰増幅されることから、それらは、癌に対する増加した感受性のための又は癌を有しているためのマーカーとして癌を診断することにおいて有用である。ＷＩＳＰポリペプチドによって治療するべき状態又は疾患の例示は、両性又は悪性腫瘍（例えば、腎臓、肝臓、腎臓、膀胱、睾丸、胸部、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺、食道、外陰部、甲状腺、肝性癌；肉腫；グリア芽細胞腫；及び頭部と頸部の腫瘍）；白血病及び悪性リンパ腫；ニューロンの、グリア細胞の、星状細胞の、視床下部の、及び他の腺の、マクロファージの、上皮の、間質の、及び胞胚腔の疾患；心臓疾患；腎臓疾患；代謝疾患；骨粗しょう症のような骨関連疾患；及び動脈硬化のような炎症性の、血管由来の、及び免疫学的疾患；同じく創傷治癒を含む結合組織疾患を含む。
【０２０１】
本発明のＷＩＳＰポリペプチドは、ボーラス又は一定期間にわたり継続する注入によるような静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑液包内、鞘内、経口、局所又は吸入ルートによるような周知の方法に従って、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。
【０２０２】
ＷＩＳＰポリペプチドの治療用製剤は、親液化製剤又は水溶液の形で、望ましい度合の純度を持つポリペプチドと、任意に製薬上許容される担体、賦形剤、又は安定化剤とを混合するために貯蔵用に製造される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980))。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いる用量及び濃度で受容者に無毒性であり、且つリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸とメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールのような）；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む、モノサッカリド、ジサッカリド、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールのような糖；ナトリウムのような塩形成カウンターイオン；金属複合体(例えばＺｎ-タンパク質複合体)；及び／又はTWEENTM、PLURONICSTM、又はポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン性界面活性剤を含む。
【０２０３】
他の治療用養生法は、本発明のＷＩＳＰポリペプチドの投与と組み合わせ得る。例えば、ここに記載したポリペプチドにより治療すべき患者は、その疾患が癌であるならば、放射線治療を受け得る。代替的に、又は加えて、化学療法剤を癌に罹った患者に投与し得る。そのような化学療法剤のための製剤と用量は、製造者の指示に従って又は熟達した開業医によって経験的に決められるように使用し得る。そのような化学療法剤のための製剤と投薬スケジュールは、Chemotherapy Service, Ed., M.C. Perry (Williams & Wilkins: Baltimore, MD, 1992)中にも記載される。化学療法剤は、該ポリペプチドの投与の前或いは後に投与して良く又はそれと同時に与えて良い。該ポリペプチドは、そのような分子の周知の用量で、タモキシフェンのような抗エストロゲン化合物又はオナプリストン(EP616812を参照)のような抗プロゲステロンと組み合わせてて良い。
【０２０４】
ＷＩＳＰポリペプチド（又は抗ＷＩＳＰポリペプチド）と、ＨＥＲ-２，ＥＧＦＲ，ＥｒｂＢ２，ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体のような、他の腫瘍結合抗原に対する抗体との共投与もまた好ましい。代替的に、又は加えて、抗ＥｒｂＢ２抗体のような２以上の異なる抗癌抗体が、ＷＩＳＰポリペプチド（又は抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体）と共に患者に共投与し得る。時折、それは患者に１以上のサイトカインを投与するためにも有益となり得る。
【０２０５】
好適な実施態様において、ＷＩＳＰポリペプチドは、癌患者に増殖抑制剤と共投与される。例えば、増殖抑制剤は、最初に、該ＷＩＳＰポリペプチドに続いて、投与し得る。しかしながら、同時投与又は最初にＷＩＳＰポリペプチドの投与もまた意図される。増殖抑制剤の適切な用量は、目下使用されるそれらであり、且つ増殖抑制剤とポリペプチドの組み合わせ作用（相乗作用）のため低くし得る。該抗体、細胞毒性剤、サイトカイン、又は増殖抑制剤は、意図した目的のために有効である量での組み合わせにおいて好ましくは存在させる。
【０２０６】
該活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンミクロカプセルとポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル、それぞれコロイド状ドラッグデリバリーシステムにおいて(例えば、リポソーム、アルブミンミクロ球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)によって製造したマイクロカプセル中に、又はマクロエマルジョン中に内包し得る。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed.(1980),上記、中に開示される。
【０２０７】
インビボでの投与のために使用するための製剤は、滅菌する必要がある。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成できる。
【０２０８】
徐放性製剤を調製し得る。徐放性製剤の好適な実例は、例えばマトリックスはフィルム又はマイクロカプセルに成型した製品の形態である、該ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性材料を含む。徐放性材料の実例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリラート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-L-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロ球体)のような非分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン-酢酸ビニルと乳酸-グリコール酸のようなポリマーが１００日を越えて分子の放出が可能である一方、ある種のヒドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。被包したポリペプチドが長期間体内に保持される場合、それは、生物学的活性の欠如をもたらし且つ免疫原性に変化する可能性のある、３７℃で水分にさらされる結果として、変性又は凝集し得る。論理的な計画は、包含されたメカニズムに基づいて安定化するために工夫することができる。例えば、もしその凝集メカニズムがチオ-ジスルフィド間交換を経て分子内Ｓ-Ｓ結合形であることが発見されるなら、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含量を制御すること、適当な添加物を用いること、及び特別なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成し得る。
【０２０９】
病気又は疾患の予防又は治療のために、ＷＩＳＰポリペプチドの好適な用量は、上述した通り、治療するべき疾患のタイプ、その重篤度と疾患の原因、該ポリペプチドが予防的又は治療的目的、治療に先立って投与されるかどうか、その患者の病歴とポリペプチドに対する応答、投与のルート、患者の状態、及び主治医の判断に基づくであろう。該ポリペプチドは、一度で又は一連の治療にわたって、患者に適当に投与される。
【０２１０】
疾患のタイプと重篤度に基づいて、ＷＩＳＰポリペプチドの約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ(例えば、0.1-20mg/kg)が、例えば１回以上に分離した投与によって、又は継続的な注入によってのいずれかで、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日当たり用量は、上述したファクターに基づいて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲とし得る。数日以上にわたり繰り返される投与のために、その状態に基づいて、該治療は、疾患の徴候の望ましい抑制がもたらされるまで持続される。しかしながら、他の用量養生法が有用とされ得る。この治療の進展は、通常の技術とアッセイによって容易にモニターされる。本発明の別な実施例において、上述した疾患の治療のために有用な材料を含む製品が提供される。該製品は、容器とラベルを含む。適当な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジ及び試験管を含む。該容器は、ガラス又はプラスチックのような各種の材料から形成して良い。該容器は、その病状を治療するために有効である組成物を保持し、且つ滅菌出入口を有し得る（例えば、該容器は静脈輸液バッグ又は皮下用注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルとし得る）。該組成物中の活性剤は、ＷＩＳＰポリペプチドである。該容器上の又は容器に結紮したラベルは、該組成物が選択された病状と病気を治療するために使用されることを明示する。該製品は、リン酸塩緩衝化食塩水、リンゲル溶液、及びブドウ糖溶液のような製薬上許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含み得る。それはさらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用のための指示を挿入するパッケージを含む、商業上及び使用者の立場から望まれる他の材料をさらに含み得る。
【０２１１】
Ｆ．抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体
本発明は、抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体をさらに提供する。抗体の例示は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及び異種接合抗体を含む。
【０２１２】
１．ポリクローナル抗体
本発明の抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体の製造方法は、熟練した研究者に周知である。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫化剤の、及び望まれるなら、アジュバントとの１回以上の注射によって哺乳動物中に生起することができる。典型的に、該免疫化剤及び／又はアジュバントは、多重皮下又は腹腔内注射によって該哺乳動物に注射されるであろう。該免疫化剤は、ＷＩＳＰポリペプチド又はその融合タンパク質を含み得る。それは、免疫化される哺乳動物において免疫原であることが知られたタンパク質に対する免疫化剤を接合するために有用となり得る。そのような免疫原性タンパク質の実例は、制限されることなしに、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及びダイズトリプシンインヒビターを含む。利用し得るアジュバントの実例は、フロイント完全アジュバントとＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノマイコラート）を含む。該免疫化プロトコルは、過度の実験なしに当業者によって選択され得る。
【０２１３】
２．モノクローナル抗体
抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体は、代替的にモノクローナル抗体とし得る。モノクローナル抗体は、KohlerとMilstein, Nature 256:495(1975)によって記載されたそれらのようなハイブリドーマ法を用いて作製して良い。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫化剤に特異的に結合するであろう抗体を生成する又は精製することができるリンパ球を引き出すための免疫化剤によって典型的に免疫化される。代替的に、該リンパ球はインビトロで免疫化し得る。
【０２１４】
該免疫化剤は、ＷＩＳＰポリペプチド又はその融合タンパク質を典型的に含むであろう。一般に、もしヒト起源の細胞が望まれるなら末梢血液リンパ球("ＰＢＬｓ")が使用され、或いは非ヒト哺乳動物源が望まれるなら脾臓細胞又はリンパ節細胞が用いられる。該リンパ球は、次いでハイブリドーマ細胞を形成するために、ＰＥＧのような適当な融合化剤を用いて、不朽化細胞系に融合される。Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (Academic Press: New York, 1986)59-103頁。不朽化細胞系は、哺乳動物細胞、特に齧歯動物の骨髄腫細胞、ウシ、及びヒト起源が通例形質転換される。通例、ラット又はマウス骨髄腫細胞系が利用される。該ハイブリドーマ細胞は、融合していない不朽化細胞の増殖又は生存を阻害する１以上の物質を好ましくは含む適当な培養培地中で培養し得る。例えば、もしその親細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠くならば、そのハイブリドーマ用の培養培地は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻害する物質、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを典型的に含むであろう("ＨＡＴ培地")。
【０２１５】
好ましい不朽化細胞系は、十分に融合する、選択した抗体生産細胞によって抗体の安定な抗レベル発現を支持する、且つそのようなＨＡＴ培地のような培地に感受性であるそれらである。より好ましい不朽化細胞系は、例えば、Salk Insitute Cell Distribution Center, San Diego, California,及びAmerican Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから得ることができるネズミ骨髄腫系である。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞系はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産のために記載されている。Kozbor, J. Immunol., 133:3001(1984); Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987)51-63頁。
【０２１６】
ハイブリドーマが培養される培養培地は、次いでＷＩＳＰポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について測定することができる。好ましくは、該ハイブリドーマ細胞によって製造されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)のようなインビトロ結合アッセイによって測定される。そのような技術と測定法は、当該分野で周知である。該モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、MunsonとPollard, Anal. Biochem.,107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
【０２１７】
望まれるハイブリドーマが同定された後、そのクローンは、制限希釈法と標準法による増殖によってサブクローンし得る。Goding, 上記。この目的のための適当な培養培地は、例えば、Dulbecco's修正イーグル培地とＲＰＭＩ-１６４０培地を含む。代替的に、該ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水としてインビボで増殖し得る。
【０２１８】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-Sepharose、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製法によって培地又は腹水液から単離又は精製し得る。
【０２１９】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４８１６５６７号中に記載されるそれらのような組換えＤＮＡ法によっても作製し得る。本発明のモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、通常の手法（例えば、ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）を用いて容易に単離及び配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として利用される。一度単離した該ＤＮＡは、発現ベクターの中に組み込むことができ、次いで組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得るため、他の免疫グロブリンタンパク質を生産しない類人猿ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞内にトランスフェクトされる。そのＤＮＡはまた、例えば相同ネズミ配列(米国特許第４８１６５６７号；Morrisonら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列で置換することにより、又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全部又は一部を免疫グロブリンコード化配列に共有結合接続することによって修正され得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインを置換することができ、又はキメラ二価抗体を創造するように本発明の抗体の１の抗原結合部位の可変領域と置換することができる。
【０２２０】
該抗体は、一価抗体とし得る。一価抗体を製造するための方法は、当該分野で周知である。例えば、一つの方法は、免疫グロブリン軽鎖と修正した重鎖との組換え発現を含む。該重鎖は、重鎖架橋化を防ぐため、Ｆｃ領域中の何れかのポイントで一般に端切りされる。代替的に、関係のあるシステイン残基は、他のアミノ酸残基で置換され又は架橋を防ぐために欠失される。
【０２２１】
インビトロでの方法はまた、一価抗体を調製するためにも適当である。そのフラグメント、特にＦａｂフラグメントを生産するための抗体の消化は、当該分野において知られたルーチンの技術を用いて達成することができる。
【０２２２】
３．ヒト化抗体
本発明の抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体をさらに含む。非ヒト(例えばネズミ)抗体のヒト化形は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又は非-ヒト免疫グロブリンから得られる最少配列を含むそのフラグメント(Fv,Fab,Fab',F(ab')2、又は抗体の他の抗原結合配列)である。ヒト化抗体は、受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、望まれる特異性、親和性、及び用量を有する、マウス、ラット、又はウサギのような非-ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基によって置換されるヒト免疫グロブリン（受容体抗体）を含む。いずれかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、相当する非ヒト残基と置換される。ヒト化抗体はまた、該受容体抗体中にも、或いは移入したＣＤＲ又はフレームワーク配列中にも見出されない残基を含み得る。一般に、該ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのそれに相当するＣＤＲ領域の全て又は実質上全て、及びＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン共通配列のそれである可変領域の少なくとも１，及び典型的には２の実質上全てを含むであろう。ヒト化抗体は、好ましくは免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも部分をも含むであろう。Jonesら、Nature, 321:522-525(1986)；Riechmannら、Nature, 332:323-329(1988)；Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)。
【０２２３】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒトでない供給源からそれに導入した１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」可変領域から典型的に取られる「移入」残基として関係する。ヒト化は、ヒト抗体の相当する配列で齧歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列を置換することによって、Winterと共同研究者の方法（Jonesら、Nature 321, 522-525(1986); Riechmannら、Nature, 332, 323-327(1988); Verhoeyenら、Science 239, 1534-1536(1988))に従い本質的に実行される。従って、そのような「ヒト化した」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４８１６５６７号）、完全なヒト可変領域よりも実質上劣るものが非ヒト種からの相当する配列により置換されている。実際、ヒト化した抗体は幾つかのＣＤＲ残基と可能性のある幾つかのＦＲ残基が齧歯類動物中の類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０２２４】
ヒト化抗体はまた、ファージディスプレーライブラリーを含む、当該分野で周知の各種の技術を用いて製造することもできる。HoogenboomとWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marksら、J. Mol. Biol., 222:581(1991)。Coleら及びBoernerらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のためにも利用可能である。Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77(1985)；Boernerら、J. Immunol., 147(1):86-95(1991)。
【０２２５】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２の異なる抗原に特異的結合性を有する、好ましくはヒト又はヒト化したモノクローナル抗体である。本ケースにおいて、特異的結合性の一つは、ＷＩＳＰポリペプチドのためのものであり；他方は、何れかの他の抗原のためのものであり、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットのためのものである。
【０２２６】
二重特異性抗体の製造方法は、当該分野で周知である。従来、二重特異性抗体の組み換え体生産は、二つの重鎖が異なる特異性を有する場合、二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアの共発現に基づいている。MilsteinとCuello, Nature 305, 537-539(1983)。免疫グロブリン重鎖と軽鎖の取り合わせがランダムであるために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、一つのみが正しい二重特異性構造を有する１０の異なる抗体分子の可能性のある混合物が生産される。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通例は達成される。類似の手法は、1993年5月13日公開のＷＯ９３／０８８２９中に、及びTrauneckerら、EMBO J., 10:3655-3659(1991)中に開示される。
【０２２７】
望まれる結合特異性を持つ抗体可変ドメイン(抗体-抗原結合部位)は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。その融合は、好ましくはヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを伴う。その融合体の少なくとも一つにおいて存在する軽鎖結合のために必要な部位を含む第１の重鎖定常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及びもし望むなら、免疫グロブリン軽鎖、をコードしているＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、且つ適当な宿主生物に共トランスフェクトされる。。二重特異性抗体を生成するための更なる詳細のために、例えば、Sureshら、Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照。
【０２２８】
５．ヘテロ接合抗体
ヘテロ接合抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ接合抗体は、共有結合した二つの抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、希望しない細胞に免疫系細胞を標的化する（米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案されている。ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９。該抗体は、架橋剤が含まれるそれらを含む、合成タンパク質化学において周知の方法を用いてインビトロで製造し得る。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を用いて又はチオエーテル結合を形成することによって構築し得る。この目的のための好適な試薬の実例は、イミノチオラートとメチル-4-メルカプトブチルイミダート及び米国特許第４６７６９８０号中に記載されるそれらを含む。
【０２２９】
Ｇ．抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体の使用
本発明の抗体は、アフィニティー精製剤として使用し得る。このプロセスにおいて、該抗体は、当該分野で周知の方法を用いて、SEPHADEXTM樹脂又は濾紙のような固相上に固定化される。固定化抗体は、精製するべきＷＩＳＰ(又はそのフラグメント)を含む試料と接触させ、その後に該支持体は、固定化抗体に結合されるＷＩＳＰタンパク質を除く試料中の材料の実質上全てを除去するように適当な溶媒で洗浄される。最後に、該支持体は、その抗体からＷＩＳＰポリペプチドを脱離するであろう、グリシン緩衝液、pH5.0のような別の適当な溶媒で洗浄される。
【０２３０】
抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体はまた、ＷＩＳＰポリペプチド用の診断アッセイ、例えば、特有の細胞、組織、又は血清におけるその発現を検出することにおいて有用となり得る。かくして、該抗体は、ヒトの悪性疾患(例えば米国特許第５１８３８８４号参照)の診断において使用し得る。
【０２３１】
診断的な適用のために、該抗体は典型的に、検出可能な機能基によって標識されるだろう。好ましくは以下のカテゴリーに分類することができる、多くの標識が利用可能である：
【０２３２】
（ａ）35Ｓ，14Ｃ，125Ｉ，3Ｈ，及び131Ｉのような放射性同位元素。抗体は例えば、Current Protocols in Immunology, Volumes 1と2, Coligenら、Ed.,(Wiley-Interscience: New York, 1991)中に記載される技術を用いて放射性同位体で標識することができ、且つ放射能はシンチレーション計数を用いて測定することができる。
【０２３３】
（ｂ）希土類キレート(ユーロピウムキレート)又はフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、及びテキサスレッドのような蛍光標識が利用可能である。該蛍光標識は、例えば、Current Protocols in Immunology, 上記, Coligen, ed.,中に開示される技術を用いて該抗体に接合することができる。蛍光は、フルオリメーターを用いて定量分析することができる。
【０２３４】
（ｃ）各種の酵素-基質標識が利用可能であり、且つ米国特許第４２７５１４９号は、これらのいくつかの説明を提供する。該酵素は、各種の技術を用いて測定することができる色素形成基質の化学的変化を好ましくは触媒する。例えば、該酵素は、分光測光的に測定することができる基質における色の変化を触媒し得る。代替的に、該酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変え得る。蛍光における変化を定量化するための技術は、先に述べられる。その化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起されることとなり、且つ測定できる(例えばケミルミノメーターを用いて)光を放出し得る、又は蛍光アクセプターにエネルギーを供与し得る。酵素的な標識の実例は、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)のようなペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ(例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ)、複素環オキシダーゼ(ウリカーゼとキサンチンオキシダーゼのような)、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。抗体に酵素を接合するための技術は、O'Sullivanら、Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym., Vol. 73, Langone and Van Vunakis, eds.(New York: Academic Press, 1981),147-166頁中に記載される。
【０２３５】
酵素-基質組合せの実例は、以下を含む：
(i)ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)と基質として過酸化水素、過酸化水素は染料プレカーサー(例えば、オルトフェニレンジアミン(ＯＰＤ)又は3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸(ＴＭＢ))を酸化する；
(ii)アルカリホスファターゼ(ＡＰ)と色素形成基質としてパラニトロフェニルホスファート；及び
(iii)β-Ｄ-ガラクトシダーゼ(β-Ｄ-gal)と色素形成基質(例えば、ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ)又は蛍光形成基質(4-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ)。
【０２３６】
多数の他の酵素-基質組合せが、当業者に利用可能である。これらの一般的な説明のためには、例えば、米国特許第４２７５１４９号と４３１８９８０号を参照。
【０２３７】
時折、該標識は抗体に間接的に接合される。熟達した研究者であれば、この達成のための各種の技術を承知しているだろう。例えば、該抗体は、ビオチン及びアビジンと結合することができる上述した標識の３つの広いカテゴリーのいずれか、又はその逆と結合することができる。ビオチンは、アビジンに選択的に結合し、かくして標識はこの間接手法において抗体と結合することができる。代替的に、該抗体と標識の間接的な結合を達成するため、該抗体は小さいハプテン(例えばジゴキシン)と結合され、且つ上述した標識の異なるタイプの一つが抗ハプテン抗体(例えば抗ジゴキシン抗体)と結合される。かくして、該標識と該抗体との間接結合が達成できる。
【０２３８】
本発明の別な実施態様において、抗クローン６５又は３２０ポリペプチド抗体は標識する必要はなく、且つその存在は、抗クローン６５又は３２０ポリペプチド抗体に結合する標識した抗体を用いて検出することができる。
【０２３９】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイのようないずれか周知のアッセイで利用し得る。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (New York: CRC Press, Inc.,1987),147-158頁。
【０２４０】
競合結合アッセイは、制限された量の抗体と結合することについて試験試料分析物と競合する標識した標準の能力による。該試験試料中のＷＩＳＰポリペプチドの量は、該抗体に結合が起こる標準の量に反比例する。結合が起こる標準の量を容易に測定するため、その抗体は、該抗体に結合される標準と分析物が、結合せずに残る標準と分析物と利便的に分離し得るように、該競合化の前又は後に好ましくは不溶化される。
【０２４１】
サンドウィッチアッセイは、検出するべきタンパク質の、異なる免疫原性部分、又はエピトープにそれぞれが結合できる、二つの抗体の使用を含む。サンドウィッチアッセイにおいて、該試験試料分析物は、固体支持体上に固定化される第１の抗体に結合され、その後、第２の抗体を該分析物に結合させ、かくして不溶性の３成分複合体が形成される。例えば、米国特許第４３７６１１０号参照。該第２の抗体は検出可能な部分によりそれ自身標識して良く(直接サンドウィッチアッセイ)又は検出可能な部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を用いて測定して良い(間接サンドウィッチアッセイ)。例えば、サンドウィッチアッセイの一つのタイプは、その検出可能な部分が酵素であるケースにおけるＥＬＩＳＡである。
【０２４２】
免疫組織化学にために、腫瘍試料は、新鮮物又は凍結物として良く又はパラフィン包埋及び例えばホルマリンのような保存剤で固定して良い。
【０２４３】
該抗体は、インビボでの診断アッセイのためにも使用し得る。好ましくは、該抗体は、その腫瘍が免疫シンチグラフィーを用いて探知できるように放射性核種(111Ｉｎ，99Ｔｃ，14Ｃ，131Ｉ，125Ｉ，3Ｈ，32Ｐ又は35Ｓのような)によって標識される。
【０２４４】
加えて、抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体は、ＷＩＳＰポリペプチドが癌細胞中でアップレギュレーションされ又はその増殖を刺激する又はアテローム性動脈硬化症の組織中でアップレギュレーションされる場合、ＷＩＳＰポリペプチド機能に対するアンタゴニストとして有用となり得る。故に、例えば、抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体は、それ自身で又は化学療法剤と又は、抗ＨＥＲ-２抗体のような他の癌治療剤又は薬剤とともに、胸癌、結腸癌、肺癌、及び黒色腫のようなある種の型の癌を治療することにおいて有効となり得る。該抗体の更なる使用は、適用可能であれば、そのレセプターに対する、又は適用可能であれば、ＩＧＦに結合するタンパク質に対する、ＷＩＳＰポリペプチドの結合を抑制することを含む。治療的使用のために、該抗体は、ＷＩＳＰポリペプチドのための使用の下に先に示した製剤、スケジュール、ルート及び用量で使用することができる。加えて、抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体は、リンパに、同じく血流に投与し得る。
【０２４５】
利便的な物品として、本発明の抗ＷＩＳＰポリペプチド抗体は、キットのような製品として提供することができる。先に記載した疾患の診断又は治療に有用なＷＩＳＰポリペプチド又はそのアンタゴニストを含む製品は、少なくとも容器とラベルとを含む。適当な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。該容器は、ガラス又はプラスチックのような各種の材料から形成し得る。該容器は、病状を診断する又は治療するために有効である組成物を保持し、且つ滅菌入出口(例えば、該容器は静脈輸液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルとし得る)を有し得る。
【０２４６】
該組成物中の活性剤は、ＷＩＳＰポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストである。容器上の、又はそれに結紮されたラベルは、該組成物が特有の病状を診断する又は治療するために使用されることを示す。該製品は、リン酸塩緩衝化食塩水、リンゲル液、及びブドウ糖溶液のような製薬上許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含み得る。他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用のための指示書を伴う包装挿入物を含む、商業上及び使用者の立場から望まれる他の材料をさらに含み得る。該製品はまた、先に記載したような別な活性剤を入れた第２又は第３の容器をも含み得る。キット形式は一般に、予め決められた量の試薬と診断又は治療アッセイを実行するための指示書との組合せが包装される。
【０２４７】
もし該活性剤が酵素によって標識されるなら、該キットは、基質と該酵素により要求されるコファクターを(例えば、検出可能な発色団又は蛍光団を提供する基質プレカーサー)含むであろう。加えて、安定剤、緩衝剤(例えば、ブロック緩衝液又は溶解緩衝液)などのような、他の添加物を含み得る。各種の試薬の相対的な量は、該アッセイの感度を実質上最大化する該試薬の溶液における濃度を提供するために変更して良い。特に、該試薬は、溶解時点で適切な濃度を有する試薬溶液を提供するであろう賦形剤を含む、通例は凍結乾燥した乾燥粉末として提供し得る。
【０２４８】
以下の実施例は、説明の目的のためにのみ提供され、且ついずれの手法も本発明の範囲を制限することを意図していない。
【０２４９】
本明細書中に引用した全ての特許と参考文献は、それらの全体が参照によりここに組み込まれる。
【実施例】
【０２５０】
本実施例中で参照される商業的に入手可能な試薬は、特に言及しない限り、製造者の指示通り使用した。以下の実施例においてＡＴＣＣ番号で同定される細胞の供給源は、本明細書を通じて、Virginia州Manassas, University Blvd., １０８０１のアメリカンタイプカルチャーコレクションのものである。
【０２５１】
実施例１：マウスＷＩＳＰ-１をコードしているｃＤＮＡクローンの単離
マウスの乳房細胞株（Ｃ５７ＭＧ）を使用して行った高スループットＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブストラクション実験では、複数の仮のＷＩＳＰ遺伝子がｍＲＮＡレベルにおいて同定されたが、この細胞株は、Ｗｎｔ-１レトロウイルスベクターで形質転換したものであり、親の細胞株に匹敵するものである。本願で開示するＷＩＳＰファミリーにはマウスのＷＩＳＰ-１遺伝子が含まれるが、これは形質転換された細胞株であるＣ５７ＭＧＷｎｔ-１でのみ誘導された。
【０２５２】
１．抑制差し引きハイブリダイゼーション（Suppression Subtractive Hybridiz
ation）
マウスのＷＩＳＰ-１を、Diatchenkoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:6025-6030 (1996)）が記載した抑制差し引きハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を使用したＷｎｔ-１示差スクリーニング（differential screening）により、独立に単離した。ＳＳＨは、ＰＣＲ-ＳＥＬＥＣＴ（商標）ｃＤＮＡサブトラクションキット（Clontech Laboratories, Inc.）を、製造者の指示通りに使用して行った。マウス乳腺癌筋上皮細胞株より得られるマウス乳房細胞株（Ｃ５７ＭＧ）より単離された２μｇのポリＡ+ＲＮＡより、ドライバー二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡを合成した。この細胞株は、Brownら、Cell, 46:1001-1009 (1986)；OlsonとPapkoff、Cell Growth and Differentiation, 5:197-206 (1994)；Wongら、Mol. Cell. Biol., 14:6278-6286 (1994)；Jueら、Mol. Cell. Biol., 12:321-328 (1992)により記載されており、Ｗｎｔ-１には反応するが、Ｗｎｔ-４には反応しない。テスターｄｓ ｃＤＮＡは、 Ｃ５７ＭＧを形質転換したものであってＣ５７ＭＧ／ｗｎｔ-１と呼ばれるものより単離された２μｇのポリＡ+ＲＮＡより合成した。
【０２５３】
このＣ５７ＭＧ／ｗｎｔ-１マウス乳房誘導細胞株は、親株を、Ｗｎｔ-１レトロウイルスであるｐＢａｂｅ ｐｕｒｏ（5.1ｋｂ）でまず形質転換して調製する。このベクターは、５’ＬＴＲ、パッケージング配列、多重クローニング部位、ＳＶ４０プロモータ駆動性のプロマイシン抵抗性遺伝子、３’ＬＴＲ、並びに複製及びアンピシリン選択用の細菌性配列を有する。このベクターは、ＳＶ４０プロモーター下流のＨｉｎｄＩＩＩを除去させ、またマルチクローニング部位にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加することにより、Ｗｎｔ-１クローニングとは少し異なっている。Ｗｎｔ-１は、多重クローニング部位中のＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄＩＩＩよりクローニングされる。図２４は、このベクターのマップである。
【０２５４】
形質転換された誘導細胞を通常の方法で増殖させ、最終的な細胞集団を、発現ベクターを安定化するために2.5μｇ／ｍｌのプロマイシンを含むＤＭＥＭ+１０％ＦＣＳ中で選択した。
【０２５５】
Clontechのキットを使用してＰＣＲを行ったが、このキットは図２５に示される、ｃＤＮＡ合成プライマー（配列番号４０）、アダプター１及び２（それぞれ配列番号４１及び４２）、及びアダプターの相補配列（それぞれ配列番号４３及び４４）、ＰＣＲプライマー１（配列番号４５）、ＰＣＲプライマー２（配列番号４６）、ネスト化（nested）ＰＣＲプライマー１（配列番号４７）、ネスト化ＰＣＲプライマー２（配列番号４８）、制御プライマーであるＧ３ＰＤＨ５’プライマー（配列番号４９）、及び制御プライマーであるＧ３ＰＤＨ３’（配列番号５０）を含む。
【０２５６】
第二ＰＣＲ反応で生じた生成物をｐＧＥＭ-Ｔベクター（Promega）のクローニング部位領域に挿入したが、これは図２６に示される（５’及び３’のそれぞれに対して配列番号５１及び５２）。ＷＩＺＡＲＤ ＭＩＮＩＰＲＥＰ（商標）キット（Promega）を使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。サブクローニングしたＰＣＲ断片のＤＮＡ配列は、鎖終止反応（chain termination reaction）（SEQUENASE 2.0（商標）キット、Pharmacia）により手動で行った。核酸の相同性サーチは、上記のＢＬＡＳＴプログラムを使用して行った。
【０２５７】
５０００個を越えるものの中から合計で１３８４のクローンについて配列決定した。合計で１９９６個のＤＮＡ鋳型を調製した。プログラムを使用してベクターのトリミング（trim off）を行い、また、別のプログラムを使用して当該クローンを二以上の同一又は５０塩基の重なりが同じであるクローンにクラスター化した。次いで、クラスター由来のそれぞれのクローンについてＢＬＡＳＴを行った。プライマーはＲＴ-ＰＣＲ用に設計して、クローンが示差発現するか否かを確かめた。
【０２５８】
２．半定量的ＲＴ-ＰＣＲ
クローンのうちの一つは、７１ｂｐのクローン５６８であるが、これはマウスのＷＩＳＰ-１をコードするものとして同定された。このクラスターには６つのクローンがある。マウスの完全長のＷＩＳＰ-１のヌクレオチド配列及び推定のアミノ酸配列を、図１−２に示した（それぞれ配列番号９及び１２）。ＲＴ-ＰＣＲプライマーは、示差発現を確認し、完全長のマウスのクローンをスクリーニングし、またヒトのクローンをスクリーニングするようにして設計した。これらのプライマーは、568.PCR.top1（図１−２のマウスＷＩＳＰ-１（配列番号９）をコードする完全長ヌクレオチド配列のヌクレオチド909-932）、及び568.PCR.bot1（図１−２のマウスＷＩＳＰ-１（配列番号１０）をコードする完全長の相補的ヌクレオチド配列のヌクレオチド955-978）であるが、これらは以下の通りで
ある：
568.PCR.top1：5’-CCAGCCAGAGGAGGCCACGAAC（配列番号：１００）
568.PCR.bot1：3’-TGTGCGTGGATGGCTGGGTTCATG（配列番号：１０１）
【０２５９】
ＲＴ-ＰＣＲ法の場合、細胞株を半集密的（subconfluent）になるまで増殖させてからＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡは、Ｓｔａｔ-６０（商標）（ＴＥＬ-ＴＥＳＴ（商標）Ｂ）を製造者の指示通り使用して抽出した。第一鎖ｃＤＮＡは、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＲＴキット（Gibco, BRL）を使用して、０．１μｇ−３μｇの全ＲＮＡから調製した。５μｌの第一鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は、５０μｌのＰＣＲ反応中で行った。上記のプライマーを使用して第一鎖ｃＤＮＡを増大した。コントロールとして、ヒトのトリオースホスフェートイソメラーゼ（ｈｕＴＰＩ）（Maquatら、J. Biol. Chem. 260:3748-3753 (1985)；BrownらMol. Cell. Biol. 5:1694-1706(1985)）の、ヌクレオチドの707-729に対応するプライマー（センス：5’-GTGGCCCATGCTCTGGCAGAGGG）（配列番号：１０２）、又はヌクレオチドの836-859に対応するプライマー（センス：5’-GACTGGAGCAAGGTCGTCCTCGCC ）（配列番号：１０３）、及びヌクレオチドの1048-1071に対応するプライマー（アンチセンス：5’-GCACCACCCACAAGGAAGCCATCC）（配列番号：１０４）を使用して第一鎖ｃＤＮＡを増幅した。マウスのトリオースホスフェートイソメラーゼの場合、ヌクレオチドの433-456ｂｐに対応するプライマー（センス：5’-GACGAAAGGGAAGCCGGCATCACC）（配列番号：１０５）又はヌクレオチドの457-480ｂｐに対応する（センス：5’-GAGAAGGTCGTGTTCGAGCAACACC）（配列番号：１０６）、及びヌクレオチドの577-600ｂｐに対応するプライマー（アンチセンス：CTTCTCGTGTACTTCCTGTGCCTG）（配列番号：１０７）又はヌクレオチドの694-717ｂｐに対応するプライマー（アンチセンス：5’-ACGTCAGCTGGCGTTGCCAGCTC）（配列番号：１０８）を使用して増幅を行った。
【０２６０】
簡潔にいうと、４μＣｉの（32Ｐ-）ＣＴＰ（3000Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、２．５ＵのＴＡＫＡＲＡ  ＥＸ  ＴＡＱ（商標）（Panvera, Madison, WI）及び０．２μＭのそれぞれのｄＮＴＰを含むそれぞれの反応物へ添加した。反応物は４８０ＰＣＲ  ＴＨＥＲＭＯＣＹＣＬＥＲ（商標）（Perkin Elmer）で、以下の条件で増幅させた：９４℃、１分間；６２℃、３０秒間；７２℃、１分間；１８−２５サイクル。５μｌのＰＣＲ生成物を６％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。ゲルをフィルムに露出した。濃度測定は、ＡＬＰＨＡ  ＥＡＳＥ  ＶＥＲＳＩＯＮ３．３ａ（商標）ソフトウェア（Alpha Innotech Corporation）を使用してＷＩＳＰ又はＴＰＩに特異的な遺伝子生成物を定量して行った。
【０２６１】
３．ノーザンブロット分析
成人多重組織ノーザンブロット（Clontech）、並びにＣ５７ＭＧ親株及びＣ５７ＭＧ／Ｗｎｔ-１誘導体のポリＡ+ＲＮＡ（２μｇ／レーン）のノーザンブロットを、上記のプライマー568.PCR.top1及び568.pcr.bot1を使用して作製した７０ｂｐのマウスＷＩＳＰ-１プローブ（図１−２のアミノ酸２７８から３００まで；QPEEATNFTLAGCVSTRTYRPKY；配列番号：１０９）とハイブリダイズさせた。その膜を０．１×ＳＳＣで５５-６５℃で洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。ブロットは、ヒトアクチン遺伝子由来の７５ｂｐの合成プローブで再ハイブリダイズした。数塩基（oligos）が重なり合ったプローブを作製する方法であって、このアクチンプローブを調製したものについては、Godowskiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8083-8087(1989)を参照。
【０２６２】
４．ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
完全長のマウスＷＩＳＰ-１をコードするクローンは、λｇｔ１０オリゴｄＴでプライムしたマウスの胎児ライブラリー（Clontech）を、上記のプライマーである568.PCR.top1及び568.PCR.bot1でスクリーニングして単離した。これらのクローンのうちの１３個の挿入物をｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩＳＫ＋にサブクローニングし、そのＤＮＡ配列をジデオキシＤＮＡ配列決定法により両方の鎖について決定した。
【０２６３】
５．結果
最近になって知られるようになったＳＳＨ技術は、高い差し引き効率を、差分的に発現された配列について均等化して表現したものと組み合わせたものである。この方法は、量が異なるｃＤＮＡの対数的な増幅を許容する特定のＰＣＲ反応に基づいているが、一方、二つの集団において同等の量である配列の増幅は抑制される。本願ではＳＳＨ技術を使用し、その発現が親の筋上皮細胞においては低減されているか、又は欠損している、Ｗｎｔ-１で形質転換したマウス乳房筋上皮細胞中で発現する遺伝子を単離した。両方のタイプの細胞より抽出したポリＡ+ＲＮＡを使用して、テスターｃＤＮＡ及びドライバーｃＤＮＡを合成した。差し引き効率の度合いは、β-アクチンプローブを使用して、差し引きしないＰＣＲ生成物及び差し引きしたＰＣＲ生成物についてのサザンブロットを行ってモニターした。差し引きしたＰＣＲ生成物中にはβ-アクチンのｍＲＮＡは一切なく、差し引き効率が確認された。
【０２６４】
差し引きｃＤＮＡライブラリーを、更なる分析用にｐＧＥＭ-１ベクターにサブクローニングした。得られた形質転換コロニーからの１９９６個のクローンのランダムなサンプルについて、配列決定した。得られたクローンが示差発現しているかを確認するため、選択したクローンに対してＰＣＲプライマーを設計し、マウス乳房細胞株及びその誘導体由来のｍＲＮＡを使用して半定量的ＲＴ-ＰＣＲ及びノーザン分析を行った。Ｃ５７ＭＧ中のＷｎｔ-１の発現により、細胞の形態がより長くなって、接触阻止が喪失することが判明した。
【０２６５】
示差発現の基準を満たすこれらの中の一のクローン（ｍ568.19Ａ）が、完全長のマウスＷＩＳＰ-１をコードすることが判明した。ＲＴ-ＰＣＲ分析とノーザン分析の両方により、このクローンは親の細胞株と比較して、Ｗｎｔ-１細胞株においては約三倍の誘導を提供することが判明した。
【０２６６】
このクローンのｃＤＮＡ配列、及び完全長のマウスＷＩＳＰ-１の推定のアミノ酸配列を、図１−２に示してある（それぞれ配列番号：９及び１２）。ヒトとマウスのＷＩＳＰ-１の配列のアライメント（それぞれ配列番号４及び１２）を図１７に示してある。チミジン取り込みアッセイ及び血管静態（angiostatic）アッセイの結果とともに、クローンのin situ分析を以下に示す。
【０２６７】
このクローンを、ヒトサイトメガロウイルス極初期遺伝子プロモーターと、ＳＶ４０の複製起点及びポリＡ部位と、ｓｐ６転写開始部位と、ヒト免疫グロブリンスプライスアクセプターと、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位とを有する、大腸菌由来のクローニングベクターであるｐＲＫ５Ｅ中に配した。これはＳｃｅＩ部位を更に有しているｐＲＫ５Ｄに由来するものである（Holmesら、Science, 253:1278-1280 (1991)）。ＪＭ１０９細胞へ形質転換すると、このプラスミドにより細胞がアンピシリン抵抗性になる。ＸｂａＩとＢａｍＨＩとで消化すると、１１４０ｂｐの断片が得られ、 ＡＴＧから終始コドンまでのマウスの挿入物の大きさは１１２２塩基対であり、これには６つのヒスチジンからなる３’の標識が含まれている。
【０２６８】
実施例２：マウスＷＩＳＰ-２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載した方法を使用して、Ｗｎｔ-１示差スクリーニングによりマウスＷＩＳＰ-２のｃＤＮＡを独立に単離した。最初に単離されたクローンは長さが３１８ｂｐであったが、これをクローン１３６７と命名した。このクラスター中には４個のクローンがあった。上記したようにしてクローンの配列決定を行い、ＲＴ-ＰＣＲプライマーは以下のように設計した：
1367.pcr.top1:図３−４のヌクレオチド1604-1627：
3’-GGTGTGAAGACCGTCCGGTCCCGG（配列番号：１１０）、及び
1367.pcr.bot1:図３−４のヌクレオチド1438-1461：
5’-GTGTGCCTTTCCTGATCTGAGAAC （配列番号：１１１）。
ＲＴ-ＰＣＲとノーザンブロットを実施例１に記載されるようにして実施して示差発現を確認すると、Ｗｎｔ-１細胞株では５倍の誘導が観察された。
【０２６９】
完全長マウスＷＩＳＰ-２をコードするクローンを、ＲＮＡライブラリー２１１：Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ-１より単離した。このライブラリーの構築のためのｍＲＮＡを、実施例１に記載されるＣ５７ＭＧ／Ｗｎｔ-１より単離した。このＲＮＡと、MD, Gathersburg,のLife Technologiesの試薬及びプロトコールを使用して（SUPERSCRIPT PLASMID SYSTEM（商標））、クローニングベクターｐＲＫ５Ｅ中の、オリゴ-ｄＴでプライムしたｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【０２７０】
この方法においては、 ＮｏｔＩ部位が含まれる二本鎖ｃＤＮＡを、オリゴｄＴでプライムしたものに、平滑化したＳａｌＩの半リン酸化アダプターを結紮し、ＮｏｔＩで開裂し、ゲル電気泳動により１０００ｂｐよりも大きいものに篩別し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで開裂済のｐＲＫ５Ｅベクター中へ定めた向きで挿入した。このライブラリーは、図３−４の１４６３-１５１２ベースのプローブ1367.50mer.1：
3’-GGGACGGGCCGACCCTTCTTAAAAGACCCTTGTACTTCTCTACCTTAGTG （配列番号：１１２）
によるコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。
【０２７１】
マウスのＷＩＳＰ-２のｃＤＮＡは、ＷＩＳＰ-１分子と同様に、新規の分泌タンパク質であってＣＴＧＦファミリーに属するものをコードし、また実施例４のＳＳＴ  ＤＮＡ３３４７３のマウスの相同体である。（ヒトとマウスのＷＩＳＰ-２のアライメントを図１８に示す（それぞれ配列番号：１６及び２０））。マウスＷＩＳＰ-２遺伝子は、実施例１に記載されるマウスＷＩＳＰ-１に対して、配列において３８％の相同性があるが、二量化と受容体結合とに関ると考えられているＣ末端の９５アミノ酸を欠いている。マウスのＷＩＳＰ-２を、肺において強く発現した。クローンのin situ分析を以下に記載する。マウスのＷＩＳＰ-２のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を、図３−４に示す（それぞれ配列番号：１７及び２０）。推定シグナル配列は、配列番号２０のアミノ酸の１位から２３位である。
【０２７２】
クローンを、上記したｐＲＫ５Ｅへ挿入した。ＪＭ１０９細胞への形質転換後、プラスミドによって、当該細胞がアンピシリン抵抗性となった。ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとでの消化後、１７７０ｂｐの断片が得られたが、これはＡＴＧから終止コドンまでの７５６ｂｐのマウスの挿入物を有している。
【０２７３】
実施例３：ヒトＷＩＳＰ-１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ｍ568.19Ａ（マウスＷＩＳＰ-１）に対応する完全長のヒトのクローンを単離するため、ヒトの肺ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）であって、上記のｐＲＫ５Ｅベクターを使用してＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）キットで処理したものを、７０ｂｐのプローブにより低ストリンジェント（２０％ホルムアミド、１×ＳＳＣ、５５℃洗浄）でスクリーニングした。プローブは、図１−２のマウスＷＩＳＰ-１の完全長ヌクレオチド配列の９０９−９７８ヌクレオチドを有していた。この配列は以下の通りである：
5’-CCAGCCAGAGGAGGCCACGAACTTCACTCTCGCAGGCTGTGTCAGCACACGCACCTACCGACCCAAGTAC（配列番号：１１３）。
唯一のクローンであるhL.568.15Aが同定された。このクローン中の挿入物を、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩＳＫ+内にサブクローニングし、そのＤＮＡ配列をジデオキシＤＮＡ配列決定により両方の鎖について決定した。このクローンにおいては、約２８０アミノ酸が欠失していることが判明した。従って、新しいプローブ（hu.568.50mer.1）を、図５及び６に示す完全長のヒトＷＩＳＰ-１の750-799のヌクレオチドを有するクローン15Aから設計したが、これらの配列は以下の通りである：
5’-GCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGG（配列番号：１１４）。
このプローブを使用して、上記したｐＲＫ５Ｅベクターを使用したＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）キットで処理したヒト胎児腎臓ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）のコロニーハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。このヒト胎児腎臓ｃＤＮＡライブラリー（名前にＡ又はＢを有していないクローン）、又はヒト腎臓λｇｔ１０ライブラリー（名前にＡ又はＢを有するクローン）をスクリーニングして、数多くのクローンを同定したが、これには上記と同じプローブを使用した。これらのクローンの挿入物をｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩＳＫ+にサブクローニングし、そのＤＮＡ配列を両方の鎖についてジデオキシＤＮＡ配列決定により決定した。
【０２７４】
これらのクローンのうちの二つである568.1A及び568.4Aは、図６７及び６９に示されたそれぞれの配列（配列番号２４及び２６）を有している。これらのクローンは、フォン・ウィルブランドＣ１領域、可変領域、及びトロンボスポジン１領域を欠失していて、又フレームシフトを有している。一以上の領域及び／又は短いアミノ酸ストレッチ（例えば８アミノ酸の欠失）を欠失するか、又は付加的な短いアミノ酸ストレッチを含みイントロン又は代替的なスプライス変異を含む、他のクローンである568.13、568.39、568.5A、568.6B、及び568.7（配列番号：２３、２５、２７、２８、及び２９；それぞれ図６６、６８、及び７０−７２）が得られた。
【０２７５】
完全長クローン568.38と顕著な量で配列を共有する二つのクローンである568.23と568.35が同定された。ヒトクローン568.38は完全長のヒトＷＩＳＰ-１をコードしている。クローン568.35についてのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を図５及び６に示す（それぞれ配列番号：１及び４）。クローン568.38と568.35の配列のアライメントは、対応するクローン568.15Aと568.23の配列のアライメントと比較すると、後者の二つのクローンの場合には、図５及び６に示される１８４位のアミノ酸がイソロイシン残基であり、一方、クローン568.38と568.35の対応する配列は、その位置においてバリン残基を有するという点において異なっている。更に、クローン568.35と568.38の配列のアライメントは、クローン568.35の配列が図５及び６に示される２０２位のアミノ酸がセリン残基であり、一方、クローン568.38の対応する配列がその位置においてアラニン残基を有するという点においてそれぞれ異なっている。
【０２７６】
ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、相同性検索により、ＣＴＧＦファミリーのメンバーであることも判明した。このクローンを上記したようにしてｐＲＫ５Ｅプラスミドへ配置し、ＡＴＣＣに寄託した。ＪＭ１０９細胞を形質転換すると、プラスミドにより当該細胞がアンピシリン抵抗性となった。ＣｌａＩとＥｃｏＲＶにより消化すると、ＡＴＧから終始コドンまでの１１０４ｂｐの大きさの挿入物を有する１４３５ｂｐの断片が生じた。
【０２７７】
in situハイブリダイゼーションをヒトのＷＩＳＰ-１について行ったが、その結果を以下に示す。ヒトのＷＩＳＰ-１についてのノーザン分析により、成人の心臓組織及び卵巣組織、並びに胎児の腎臓組織において高発現していることが示された。更にまた、チミジン取り込みアッセイ、遺伝子増幅アッセイ、及び血管静態アッセイの結果を以下に示す。
【０２７８】
ヒトＷＩＳＰ-１遺伝子の染色体上の位置は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｇ３（商標）及びＭＩＴ  Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ  ４  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄ（商標）を使用した放射線ハイブリッドマッピングにより決定した。ＷＩＳＰ-１は、Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅマップ上の有糸分裂マーカーであるＡＦＭ259ｘｃ5からおおよそ3.48ｃＲの位置にある（ＬＯＤスコア  16.31）。これは、ＷＩＳＰ-１を8q24.1から8q24.3のバンドに置くものであり、染色体バンド8q24.12-8q24.13に位置するｃ−ｍｙｃから約４メガ塩基離れている。（タカハシら、Cytogenet. Cell Genet., 57:109-111 (1991)）。ｃ−ｍｙｃは、非小細胞肺癌において増大される回帰部位（recurrent site）である。
【０２７９】
実施例４：ヒトＰＲＯ２６１（本願ではヒトＷＩＳＰ-２と命名）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（商標）パブリックプロテインデータベースにおける約９５０の既知の分泌タンパク質についての細胞外領域（ＥＣＤ）配列（分泌配列がある場合にはそれ含む）を使用して、発現配列標識（expression sequence tag）（ＥＳＴ）データベースを検索した。このＥＳＴデータベースには公的なＥＳＴデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ）、そして専有的ＤＮＡデータベース（LIFESEQ（商標）, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）が含まれる。検索は、コンピュータプログラムであるＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２を使用し、ＥＣＤタンパク質配列をＥＳＴ配列の６フレーム分の翻訳物と比較して行った（Altshulら、Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）。このような比較により、位置のタンパク質をコードしないことを意味する７０（ある場合には９０）
以上のＢＬＡＳＴスコアが示されたが、これをクラスター化し、プログラム“ｐｈｒａｐ”（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington：http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html）を使用して共通ＤＮＡ配列を求めた。
【０２８０】
共通ＤＮＡ配列は、ｐｈｒａｐを使用して他のＥＳＴ配列に対して組み立てた。使用したＥＳＴ配列（Incyteより入手）は、2633736、2118874、360014、2316216、1985573、2599326、1544634、2659601、1319684、783649、627240、1962606、2369125、939761、1666205、692911、984510、1985843、2104709、及び2120142である。この共通配列は本願ではＤＮＡ30843（図１０）と命名する。ＤＮＡ30843共通配列に基づき、１）興味ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲで同定するため、２）ＰＲＯ261（ヒトＷＩＳＰ-２）をコードする完全長配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するため、オリゴヌクレオチドを合成した。それぞれ以下の配列を有する一対のＰＣＲプライマー（順方向及び逆方向）を合成した：
5’-AAAGGTGCGTACCCAGCTGTGCC（配列番号：１１５）、及び
3’-TCCAGTCGGCAGAAGCGGTTCTGG（配列番号：１１６）。
更に、共通ＤＮＡ30843から、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを構築したが、このプローブは以下の配列を有する：
5’-CCTGGTGCTGGATGGCTGTGGCTGCTGCCGGGTATGTGCACGGCGGCTGGG（配列番号：１１７）。
【０２８１】
完全長クローンを供給するための複数のライブラリーのスクリーニングをするため、上記のＰＣＲプライマー対を使用して、Ausbelら（Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Association and Wiley Intersience, N.Y., (1989)）のようにしてＰＣＲ増幅によりライブラリーからＤＮＡをスクリーニングした。陽性ライブラリーを次いで、プローブオリゴヌクレオチドとＰＣＲプライマーの一方とを使用したコロニーハイブリダイゼーションでスクリーニングし、ＰＲＯ261（ヒトＷＩＳＰ-２）をコードするクローンを単離した。
【０２８２】
ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのＲＮＡは、ヒトの胎児肺組織より単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために使用したｃＤＮＡライブラリーは、商業的に入手可能な試薬、例えばInvitrogen（San Diego, CA）から入手されるものを使用して標準的な方法により構築した。ＮｏｔＩ部位が含まれるこのｃＤＮＡを、オリゴｄＴでプライムし、平滑化したＳａｌＩの半リン酸化アダプターと結紮し、ＮｏｔＩで開裂し、ゲル電気泳動により適切な大きさに分け、定めた向きで適切なクローニングベクター（ｐＲＫ５ＢやｐＲＫ５Ｄ等；ｐＲＫ５Ｂは、ｐＲＫ５Ｄの前駆体でありＳｆｉＩ部位を含まない；Holmesら、Sicence, 253:1278-1280 (1991)）の独自なＸｈｏＩとＮｏｔＩ部位中にクローニングした。
【０２８３】
上記したように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、配列番号１３（図８−９）のヌクレオチド１３で始まるＰＲＯ261のＤＮＡ配列（本願ではＵＮＱ228（ＤＮＡ33473-seqmin）と命名する；配列番号：３８）と、ＰＲＯ261の推定のアミノ酸配列（配列番号：１６）が得られた。
【０２８４】
ヒトＷＩＳＰ-２をコードする完全なヌクレオチド配列を図８−９（配列番号：１３）に示した。この配列には、配列番号：１３のヌクレオチドの２２−２４位における明白な翻訳開始部位を有し、配列番号：１３のヌクレオチド７７０位の後の終始コドンで終わる単一のオープンリーディングフレームが含まれる（図８−９）。予想されるポリペプチド前駆体は２５０アミノ酸である（図８−９）。推定シグナル配列は、配列番号：１６のアミノ酸の１位から２３位の間にある。クローンＵＮＱ228（ＤＮＡ33473-seq min）は、ＡＴＣＣに寄託されたが、ＡＴＣＣ寄託番号は209391である。
【０２８５】
完全長のＰＲＯ226ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、その一部がＣＴＧＦファミリーに対してかなり相同的であることが示唆されたが、従ってＰＲＯ261が新規の増殖因子であることを示している。
【０２８６】
ヒトＷＩＳＰ-２のin situハイブリダイゼーションを以下に示す。ヒトＷＩＳＰ-２遺伝子の染色体上の位置は、ヒトＷＩＳＰ-１について上記したようにして決定した。具体的には、ＷＩＳＰ-２はマーカーＳＨＧＣ-33922に結紮していて、ＬＯＤスコアは1000である。これは、ＷＩＳＰ-２を20q12-20q13.1のバンドに配置する。ヒト染色体20q12は、ヒトの乳癌の場合のＤＮＡ増幅における頻度の高い部位である。アフリカツメガエルアッセイ（Xenopus assay）においては、ヒトＷＩＳＰ-２ＲＮＡを注入すると、軸重複（axis duplication）が一部誘導された（実施例１１参照）。ヒトＷＩＳＰ-２についての、チミジン取り込みアッセイ、遺伝子増幅アッセイ、及び血管静態アッセイの結果も以下に示す。
【０２８７】
実施例５：ヒトＷＩＳＰ-３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
本実施例においては、ＷＩＳＰ-３をコードする遺伝子を、本質上並行して二回クローニングした。まず、上記したデータベース中にＷＩＳＰファミリーの何れかの新規のメンバーが含まれているかどうかを調べた。ＷＩＳＰ類に対して相同的な二つのＥＳＴが発見され、その両方をクローニングした。これらのＥＳＴ相同体のそれぞれに対応する完全長のクローンを単離した。その結果、同じ遺伝子の二つの完全長クローンが得られた（元々のＥＳＴ相同性は、同じ遺伝子の離れた領域に由来するものであった）。得られた第一クローンをＤＮＡ56350、第二クローンをＤＮＡ58800と命名した。
【０２８８】
ＤＮＡ56350
INCYTE 3208053の配列に基づき、仮想ＤＮＡ48917を得、ＰＲＯ956（ヒトＷＩＳＰ-３）の完全長のコード配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドを合成した。一対のＰＣＲプライマー（順方向及び逆方向）を合成したが、これは以下の配列を有する：
5’-GTCTTGTGCAAGCAACAAAATGGACTCC（配列番号：１１８）
3’-GACACAATGTAAGTCGGAACGCTGTCG（配列番号：１１９）。
更に、INCYTE配列から合成オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションプローブを構築したが、これは以下の配列を有する：
5’-GCTCCAGAACATGTGGGATGGGAATATCTAACAGGGTGACCAATGAAAAC（配列番号：１２０）。
【０２８９】
オリゴｄＴでプライムした、３７００ｋｂよりも大きいサイズの、ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ切断をしたヒト胎児腎臓ライブラリーについて、上記したＰＣＲプライマー対を使用したＰＣＲ増幅を行って、完全長クローンのスクリーニングを行った。次に陽性ライブラリー、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を使用して、ＰＲＯ956（ヒトＷＩＳＰ-３）をコードするクローンを単離した。
【０２９０】
上記した単離クローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ956のＤＮＡ配列（本願では、ＵＮＱ462（配列番号：３０）と命名する）、及びＰＲＯ956についての誘導アミノ酸配列（配列番号：３３）が得られた。
【０２９１】
このクローンに由来する、ヒトＷＩＳＰ-３をコードした全ヌクレオチド配列を図１１−１３（配列番号：３０）に示す。この配列には、配列番号：３０のヌクレオチド４６−４８位の明白な翻訳開始部位を有し、配列番号：３０の１１６１位のヌクレオチドの後の終始コドンで終了する単一のオープンリーディングフレームが含まれている（図１１−１３）。推定されるポリペプチド前駆体の長さは、３７２アミノ酸である（図１１−１３）。推定のシグナル配列は、配列番号：３３のアミノ酸の１位〜３３位である。クローンＵＮＱ462（ＤＮＡ56350-1176-2）を、ＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号209706が与えられた。
【０２９２】
完全長のＰＲＯ956ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、その一部がＣＴＦＧと顕著に相同的であることが示唆されたが、従ってＰＲＯ956が新規の増殖因子であることを示している。このクローンには、その一番目のメチオニンのすぐ５’側に更なるメチオニンがある。このクローンのアミノ酸配列は、ヒトＷＩＳＰ-１のものに対して４２％の相同性があり、ヒトＷＩＳＰ-２のものに対しては３２％の相同性がある。
【０２９３】
ヒトＷＩＳＰ-３のin situハイブリダイゼーションを以下に示す。上記のマッピング技術を使用して、ヒトＷＩＳＰ-３が、染色体6q22-6q23に位置づけられ、ＬＯＤスコアが１０００でマーカーＡＦＭ211ze5に関連づけられた。ＷＩＳＰ-３は、ＣＴＦＧに対しておおよそ１８メガ塩基近位（proximal）であり、ヒトの細胞性癌遺伝子ＭＹＢに対して２３メガ塩基近位（promimal）であるが、これらは6q22-6q23にも位置する。（Martinerieら、Oncogene, 7:2529-2534 (1992)；Meeseら、Genes Chromosomes Cancer, 1:88-94 (1984)）。
【０２９４】
このクローンを上記のｐＲＫ５Ｅへ挿入した。ＪＭ１０９細胞を形質転換すると、プラスミドにより当該細胞がアンピシリン抵抗性を付与した。ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化すると、図１１−１３に示されるようにＡＴＧから終始コドンまでのヒトの挿入物を有する断片が得られた。
【０２９５】
ＤＮＡ58800
ＨＳ142Ｌ7の配列に基づき、仮想ＤＮＡ56506を得、またＰＲＯ790（ヒトＷＩＳＰ-３）の完全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとしてのオリゴヌクレオチドを合成した。そして一対のＰＣＲプライマー（順方向及び逆方向）を合成したが、これは以下の配列を有している：
5’-CCTGGAGTGAGCCTGGTGAGAGA（配列番号：１２１）
3’-ACACTGGGTGTGTTTCCCGACATAACA（配列番号：１２２）。
更に、ＨＳ１４２Ｌ７配列から、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを構築したが、これは以下の配列を有する：
5’-TGGTTGCTTGGCACAGATTTTACAGCATCCACAGCCATCTCTCA（配列番号：１２３）。
【０２９６】
オリゴｄＴでプライムしたヒトの骨髄ライブラリーであって、１−３ｋｂの大きさの断片であるＸｈｏＩ−ＮｏｔＩを含むものを、完全長クローンの供給源を得るべく、上記したＰＣＲプライマーの対でＰＣＲ増幅によるスクリーニングにかけた。次に陽性ライブラリー、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーのうちの一つを使用して、ＰＲＯ790（ヒトＷＩＳＰ-３）をコードするクローンを単離した。
【０２９７】
上記したように単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ790（配列番号：３４）のＤＮＡ配列、及びＰＲＯ790の誘導アミノ酸配列（配列番号：３７）を得た。
【０２９８】
ヒトＷＩＳＰ-３をコードするこのクローンの完全なヌクレオチド配列を図１４−１６（配列番号：３４）に示した。この配列には、配列番号：３４のヌクレオチド１６−１８位の明白な翻訳開始部位を有し、配列番号：３４のヌクレオチド１０７７の後の終始コドンで終わる単一のオープンリーディングフレームが含まれている（図１４−１６）。推定ポリペプチド前駆体の長さは、３５５アミノ酸である（図１４−１６）。推定シグナル配列は、配列番号：３７のアミノ酸の１位乃至１５位にある。このクローンＤＮＡ58800-1176-2は、ＡＴＣＣ寄託されたが、ＡＴＣＣ寄託番号209707が与えられている。
【０２９９】
完全長ＰＲＯ790ポリペプチドのアミノ酸配列分析により、その一部がＣＴＦＧに対して顕著な相同性を有することが示唆されたが、従って、このスプライシング変異体であるＰＲＯ956のように、ＰＲＯ790は新規の増殖因子であることを示している。
【０３００】
ヒトＷＩＳＰ-３のin situハイブリダイゼーションを以下に示す。
【０３０１】
クローンを上記のｐＲＫ５Ｅへ挿入した。ＪＭ１０９細胞への形質転換後、プラスミドによって、当該細胞はアンピシリン抵抗性となった。ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで消化すると、図１４−１６に示されるようにＡＴＧから終始コドンまでのヒトの挿入物を有する断片が得られた。
【０３０２】
実施例６：ＷＩＳＰをコードするＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとしての使用
以下の方法は、ＷＩＳＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をハイブリダイゼーションプローブとしての使用を記載している。
【０３０３】
ヒトの完全長又は成熟ＷＩＳＰ-１（図５及び６に記載；それぞれ配列番号：４又は３）、又はマウスの完全長又は成熟ＷＩＳＰ-１（図１−２に記載；それぞれ配列番号：１２又は１１）、又はヒトの完全長又は推定成熟ＷＩＳＰ-２（図８−９に記載；それぞれ配列番号：１６又は１５）、又はマウスの完全長又は推定成熟ＷＩＳＰ-２（図３−４に記載；それぞれ配列番号：２０又は１９）のコード配列を具備するＤＮＡをプローブとして使用し、相同的ＤＮＡ（例えばヒトの組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒトの組織ゲノムライブラリーにおけるこれら特定のＷＩＳＰタンパク質の天然の変異体をコードするもの）をスクリーニングした。
【０３０４】
何れかのライブラリーＤＮＡを含んだフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高ストリンジェント条件下で行われる。放射性標識したＷＩＳＰポリペプチド誘導プローブ（例えばＵＮＱ228（ＤＮＡ33473-seqmin）誘導プローブ）の、このフィルターに対してのハイブリダイズは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、及び１０％の硫酸デキストランの溶液中で、４２℃、２０時間行った。このフィルターの洗浄は、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液中で４２℃で行った。
【０３０５】
次いで、完全長の天然配列ＷＩＳＰポリペプチドをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡを、当該技術分野で標準的な技術を使用して同定した。
【０３０６】
実施例７：大腸菌内でのＷＩＳＰポリペプチドの発現
本実施例は、非グリコシル化ＷＩＳＰポリペプチドを、大腸菌内で組換え発現することによる調製を例示する。
【０３０７】
ＷＩＳＰポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をまず、選択したＰＣＲプライマーで増幅した。このプライマーは、選択した発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を有している必要がある。種々の発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン抵抗性の遺伝子を有するｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Bolivarら、Gene, 2:95 (1977)を参照）がある。ベクターを制限酵素で消化し、脱リン酸化する。ＰＣＲで増幅した配列を次いでこのベクターへ結紮する。ベクターは好ましくは、抗生物質抵抗性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ開裂部位を含む）、ＷＩＳＰコード領域、ラムダ転写ターミネーター、及びａｒｇＵ遺伝子をコードする。
【０３０８】
次に、結紮混合物を使用し、上記のSambrookらに記載される方法により、選択した大腸菌を形質転換する。形質転換体は、ＬＢ平板培地上での増殖能により同定し、抗生物質抵抗性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡは、単離し、制限分析及びＤＮＡ配列決定により確認することができる。
【０３０９】
選択したクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロス等の液体培地で一晩増殖させことができる。一晩培養したものは、次により大規模な培養に接種するのに使用し得る。次いで細胞を所望の光学密度まで増殖させるが、その間に発現プロモーターのスイッチを入れる。
【０３１０】
細胞を更に数時間培養した後、細胞を遠心分離で回収する。遠心分離して得られた細胞の沈殿を当該技術分野で既知の種々の薬剤を使用して可溶化し、次いで金属キレートカラムをタンパク質との強固な結合を許容する条件下で使用してＷＩＳＰポリペプチドを精製する。
【０３１１】
実施例８：哺乳動物細胞中でのＷＩＳＰポリペプチドの発現
本実施例は、哺乳動物細胞中における組換発現による、ＷＩＳＰポリペプチドの潜在的にグリコシル化されたものの調製を例示する。
【０３１２】
ベクターｐＲＫ５Ｅを発現ベクターとして使用した。ＷＩＳＰポリペプチドをコードする適切なＤＮＡをｐＲＫ５Ｅに結紮したが、これは上記のSambrookらに記載される結紮方法を使用し、選択した制限酵素によるＷＩＳＰポリペプチドの挿入を許容するものである。得られるベクターは、pRK5E.h.WIG-1.568.38、 pRK5E.m.WIG-1.568.6his、pRK5E.m.WIG-2.1367.3であって、ヒトのＷＩＳＰ-２、ＤＮＡ56350-1176-2、及びＤＮＡ58800-1176-2をコードするプラスミドであり、これらは全てＡＴＣＣに寄託した。これらのベクターは、以下の一般的な記載中においては、便宜上、集合的にｐＲＫ５Ｅ.ＷＩＳＰと呼ぶ。
【０３１３】
一の態様においては、２９３細胞を宿主細胞として選択してもよい。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  1573）は、ウシ胎児血清と適宜栄養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭ等の培地中で、組織培養プレートで集密的になるまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ５Ｅ.ＷＩＳＰのＤＮＡを、ＶＡ  ＲＮＡ遺伝子（Thimmapparaら、Cell, 31:543 (1982)）がコードされた約１μｇのＤＮＡとともに混合し、５００μｌの、１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ  ＣａＣｌ2に溶解する。この混合物に対して、５００μｌの、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ7.35）、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＮａＰＯ4を滴下し、沈殿物を２５℃で１０分間かけて生成させた。この沈殿物を懸濁して２９３細胞へ添加し、３７℃で４時間静置した。培地を吸引除去して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２０％グリセリン２ｍｌを３０秒間添加した。次いで２９３細胞を無血清培地で洗浄して、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間培養した。
【０３１４】
トランスフェクション後約２４時間で、培地を除去して培地（のみ）、又は２００μＣｉ／ｍｌの35Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの35Ｓ−メチオニンを含む培地と交換した。インキュベーションの１２時間後、馴化培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルにのせた。工程にかけたゲルを乾燥して、ＷＩＳＰポリペプチドの存在がわかるのに必要な時間だけ露出した。トランスフェクションした細胞を含んだ培養物は、更に（無血清培地中での）インキュベーションにかけてもよく、培地は選択したバイオアッセイで試験する。
【０３１５】
代替技術においては、Somparyracら（Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)）が記載した硫酸デキストラン法を利用して、当該ＷＩＳＰポリペプチドを２９３細胞へ一過的に導入することができる。２９３細胞を、スピナーフラスコ中で最大密度まで増殖させ、７００μｇのｐＲＫ５Ｅ.ＷＩＳＰ  ＤＮＡを添加する。細胞をまず、遠心分離してスピナーフラスコから濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞の沈殿物上で４時間インキュベーションする。細胞を２０％グリセリンで９０秒間処理し、組織培養液で洗浄し、組織培養液、５μｇ／ｍｌのウシインスリン及び０．１μｇ／ｍｌのウシトランスフェリンを含有するスピナーフラスコへ再導入する。約４日後、馴化培地を遠心し、フィルターにかけて細胞とその破片を除去する。発現したＷＩＳＰポリペプチドを含有する試料は次いで、濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した何れかの方法によって精製してもよい。
【０３１６】
別の態様においては、ＷＩＳＰポリペプチドはＣＨＯ細胞内で発現することも可能である。ＣａＰＯ4やＤＥＡＥデキストラン等の既知の試薬を使用して、ｐＲＫ５Ｅ.ＷＩＳＰをＣＨＯ細胞へ形質移入することができる。上記したように、培養細胞をインキュベーションし、培地を培養液（のみ）又は35Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培養液と交換する。ＷＩＳＰポリペプチドの存在を確認した後、培地を無血清培地と交換してもよい。好ましくは、培養物は、約６日間インキュベーションし、そして馴化培地を回収する。発現したＷＩＳＰポリペプチドを含む培地を次に、濃縮して何れかの選択した方法で精製することができる。
【０３１７】
エピトープの標識ＷＩＳＰポリペプチドは、宿主ＣＨＯ細胞内でも発現させてもよい。ＷＩＳＰポリペプチドは、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングすることもできる。Suvaら（Science, 237:893-896 (1987)）；３／１５／８９に発行されたＥＰ  307，247。このサブクローニングされた挿入物は、ＰＣＲにかけてポリ−ｈｉｓ標識などの選択したエピトープ標識とフレームを合わせてバキュロウイルス発現ベクター中に融合させることができる。このポリ−ｈｉｓ標識の付いたＷＩＳＰポリペプチド挿入物は次いで、安定クローンの選択に使うＤＨＦＲ等の選択マーカーを含んだＳＶ４０駆動性ベクター中にサブクローニングすることができる。最後に、ＣＨＯ細胞は、（上記したように）ＳＶ４０駆動性のベクターでトランスフェクションすることができる。上記したように標識して、発現を確認してもよい。発現したポリ−ｈｉｓ標識したＷＩＳＰを含む培地を次いで、濃縮して、Ｎｉ2+-キレートアフィニティークロマトグラフィー等の選択した何れかの方法で精製することができる。
【０３１８】
具体的には、哺乳動物発現ベクターに挿入するマウスＷＩＳＰ-１ｃＤＮＡは、クローン568.19Ａ（上記参照）純粋ファージＤＮＡを鋳型として使用し、６−ｈｉｓ型の場合にはプライマーとして、m.568.pcr.top4（5’-TGACTTCCAGGCATGAGGTGGCTCCTG；配列番号：１２４）、及びm.568.pcr.bot3（5’-ATTGGCAATCTCTTCGAAGTCAGGGTAAGATTCC；配列番号：１２５）を使用し、又は非−ｈｉｓ型の場合にはm.568.pcr.top4（配列番号：１２４）及び568.pcr.bot5（3’末端にはＸｂａＩ部位を有する（5’-GGTACGTCTAGACTAATTGGCAATCTCTTCGAAGTCAGGG；配列番号：１２６））を使用してＰＣＲにより作製した。挿入物の組み込み具合については、配列決定により確認して分析した。Ｐｆｕポリメラーゼを利用してＰＣＲを行ったが、この条件は以下の通りであった：
温度        時間
変性            ９４℃    １分間
アニーリング    ６２℃    ３０秒間
伸長            ７２℃    １．５分間
サイクル数：２５。
【０３１９】
２９３細胞内での一過性発現は、ウェスタンブロットにより分析し、ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＭＡＮＮＨＥＩＭ（商標）のラピッドライゲーションキットを使用して上記の挿入物を上記のｐＲＫ５ベクターのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ部位へ結紮した。得られるプラスミドは、Ｈｉｓ標識した及びＨｉｓ標識無し挿入物のそれぞれについて、ｐＲＫ5.mu.ＷＩＳＰ-１.6-his、及びｐＲＫ5.mu.ＷＩＳＰ-１.nohisと命名した。次いで、２９３細胞をプレートに播種し、一晩で約８５％の集密度まで増殖させる（３７℃／５％ＣＯ2）。リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を脂質：ＤＮＡ比率が４．５：１となるように使用して、プレートにまかれた細胞を、プラスミドＤＮＡであるｐＲＫ5.mu.ＷＩＳＰ-１.6his又はｐＲＫ5.mu.ＷＩＳＰ-１.nohisでトランスフェクションした。
【０３２０】
トランスフェクション効率（通常は＞７０％）は、ＧＦＰ発現プラスミド（ｐＧＲＥＥＮ  ＬＡＮＴＥＲＮ（商標）、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬより）を使用してモニターした。トランスフェクション後約５時間で、培地をタンパク質産生用の新鮮なＳＦ培地（１×Ｌ−Ｇｌｕと１×Ｐ／Ｓとが５０：５０）と交換した。馴化培地を（実験に応じて）特定の時間だけ蓄積させてから回収した。
【０３２１】
培地を回収して１ｍＭのＰＭＳＦ存在化でＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−１０（商標）を使用して濃縮した。濃縮済の馴化培地（通常は１．５ｍｌ）を次いでＮｉ++ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）に２時間結合させた（Ｈｉｓ標識した場合のみ）。還元済、又は非還元タンパク質のそれぞれについて、ベータ−メルカプトエタノール含有、又は非含有の２×ＳＤＳローディング緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）中で１０分間煮沸して、タンパク質を当該ビーズより溶出した。
【０３２２】
タンパク質は、１０ウェル、１ｍｍ厚の４−２０％濃度勾配ＴＲＩＳ−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化した。ゲルは１２５Ｖ（定常）で９５分間、泳動した。ＮＯＶＥＸ（商標）転移装置を使用して、２００ｍＡ（定常）、４５分間でＰＶＤＦ膜へのウェスタン転移を行った。このブロットを、少なくとも１時間、室温でブロッキング緩衝液（ＰＢＳ+ＴＷＥＥＮ−２０（商標）（０．５％）、５％粉乳、及び３％ヤギ血清）でブロッキングした。ブロットは、一次抗体（Ｈｉｓ標識化タンパク質の場合にはＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）の抗−ｈｉｓ（Ｃ-末端）-ＨＲＰ-接合抗体、非Ｈｉｓ型の場合、上記のように調製したポリクローナルマウスＷＩＳＰ-１抗体）を新鮮なブロッキング緩衝液中で１：２０００としたものと、１時間室温にてインキュベーションした。非Ｈｉｓ標識型のタンパク質のプロットは、二次抗体（ＰＩＥＲＣＥ（商標）のヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｈ+Ｌ）ＨＲＰ接合物）を新鮮なブロッキング緩衝液で１：２０００に希釈したものとインキュベーションした。ブロットは、フィルムに露出する前に１分間、化学ルミネセンス物質（ＡｍｅｒｓｈａｍのＥＣＬ（商標）、又はＰｉｅｒｃｅのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（商標））とインキュベーションした。
【０３２３】
抗体染色により分析する一過性発現の場合、２９３細胞を上記のようにして培養し、プレートにまき、形質移入した。１：１のメタノール：アセトン溶液で細胞を培養皿に２分間固定した。固定された細胞を次に、１０％ウシ胎児血清を含むＰＢＳで１：１０００に希釈された一次抗体（Ｈｉｓ-標識化タンパク質の場合、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）の抗−ｈｉｓ（Ｃ-末端）-ＨＲＰ接合抗体、非Ｈｉｓ型の場合、上記のように調製したポリクローナル抗−マウスＷＩＳＰ-１抗体）と、２時間インキュベーションした。非Ｈｉｓ標識型のタンパク質のブロットは次いで、１０％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳで１：１５０に希釈した二次抗体（ＰＩＥＲＣＥ（商標）のヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｈ+Ｌ）ＨＲＰ接合物）で１時間インキュベーションした。インキュベーションは、ＨＲＰ用の色試薬基質（１．０％  Ｏ−ジアニシジン飽和ＥＴＯＨ、０．０１％過酸化水素（ＰＢＳ中））中で最大１時間行った。
【０３２４】
哺乳動物細胞中でのマウスＷＩＳＰ-１の安定発現の場合、使用した開始ベクターは、ｐＲＫ５.ＣＭＶ.puro-dhfRであったが、その配列は図２７−３０に示す。このベクターには、ＳＶＩＤ５スプライスドナーベクター中のＫｐｎＩ、ＳａｐＩ部位にクローニングされた二つのＳＡＲ配列があり、ｐＲＫ５クローニングリンカー（ｐＳＶＩ５）、及びｐＳＶ１.ＷＴＳＤ.Ｄより調製したイントロンを有するｐＳＶ１骨格を有している。配列を編集して、ｐＲＫ５の配列に由来するｐｕｃ118ベクター骨格内に変化を含むようにしたが、これはＳＶ１ベクターのＭＣＳ特徴部以降に４塩基の挿入物を含んでいる。
【０３２５】
上記の挿入物をｐＲＫ５.ＣＭＶ.puro-dhfRのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ部位に、ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＭＡＮＮＨＥＩＭ（商標）のラピッドライゲーションキットを使用して結紮し、ｐＲＫ５.ＣＭＶ.puro-dhfR.mu.ＷＩＳＰ-１.6his又はｐＲＫ５.ＣＭＶ.puro-dhfR.mu.ＷＩＳＰ-１.nohisを作製した。この構築物により、プロマイシン（２９３細胞では２μｇ／ｍｌ、又はＣＨＯ−ＤＰ１２細胞では１０μｇ／ｍｌ）又はＣＨＯ−ＤＰ１２細胞株を使用して、発現細胞の安定な選択が可能になったが、後者はメトトレキセート中での増幅を可能にするものである。安定にトランスフェクションされた細胞を表す、分離したコロニーを単離し、淘汰圧下で培養し、上記したように抗体染色又はウェスタンブロットで分析した。
【０３２６】
実施例９：酵母中でのＷＩＳＰポリペプチドの発現
以下の方法は、酵母内でＷＩＳＰポリペプチドの組換え発現について記載している。
【０３２７】
まず、ＷＩＳＰポリペプチドのＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターによる細胞内産生又は分泌のための、酵母発現ベクターを構築する。ＷＩＳＰポリペプチド及びプロモーターをコードするＤＮＡを、選択したプラスミドの適切な制限酵素部位に、細胞内発現が行われるようにして挿入する。分泌の場合には、ＷＩＳＰポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、天然のＷＩＳＰシグナルペプチド又は他の哺乳動物のシグナルペプチド又は酵母アルファ因子又はインバーターゼ分泌シグナル／リーダー配列、そして（必要ならば）発現用リンカー配列をコードするＤＮＡとともに選択したプラスミドにクローニングする。
【０３２８】
酵母細胞、例えばＡＢ１１０株などを次に、上記した発現プラスミドで形質転換し、選択した培養液中で培養する。形質転換した酵母の上清を、１０％トリクロロ酢酸での沈殿及びＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離、そしてその後のクマシーブルー染料でのゲルの染色により分析することができる。
【０３２９】
次に組換体ＷＩＳＰポリペプチドを単離し、酵母細胞を遠心分離により培養液から除去して精製し、次いで選択したカートリッジフィルターを使用して培地を濃縮する。ＷＩＳＰポリペプチドを含む濃縮物は更に、選択したカラムクロマトグラフィー樹脂を使用して精製してもよい。
【０３３０】
実施例１０：バキュロウイルス感染昆虫細胞内でのＷＩＳＰポリペプチドの発現及びその精製
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞内でのＷＩＳＰポリペプチドの組換え発現及びその精製について記載している。
【０３３１】
概論
ＷＩＳＰポリペプチドをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクター内に含まれるエピトープ標識の上流に融合する。このようなエピトープ標識には、ポリ-Ｈｉｓ標識、及び免疫グロブリン標識（ＩｇＧのＦｃ領域）が含まれる。種々のプラスミドを使用することができるが、これにはｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）等の商業的に入手可能なプラスミドが含まれる。簡潔にいうと、ＷＩＳＰポリペプチドをコードする配列、又はコード領域の所望の部分（例えば細胞外タンパク質の場合には成熟タンパク質をコードする配列）を、その５’と３’の領域に相補的なプライマーで増幅する。５’プライマーは、両端に（選択した）制限酵素部位を有していてもよい。次に生成物を前記の選択した制限酵素で消化して、発現ベクター中へサブクローニングする。
【０３３２】
組換バキュロウイルスは、上記のプラスミドと、ＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤ（商標）ウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とを、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（“Ｓｆ９”）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）に、リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬより商業的に入手可能）を使用して共形質転換して作り出す。２８℃でのインキュベーションを４，５日間行った後、放出されたウイルスを回収して更なる増殖に使用する。ウイルス感染及びタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら（Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford: Oxford University Press; 1994)）に記載されるようにして行う。
【０３３３】
発現したポリ-Ｈｉｓ標識化ＷＩＳＰポリペプチドは次いで、Ｎｉ2+-キレートアフィニティークロマトグラフィーを使用して以下のように精製した。抽出物は、組換ウイルス感染Ｓｆ９細胞より、Ｒｕｐｅｒｔら（Nature, 362:175-179 (1993)）に記載されるようにして調製した。簡潔にいうと、Ｓｆ９細胞を洗浄し、音波処理用緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；０．１ｍＭＥＤＴＡ；１０％グリセリン；０．１％  ＮＰ−４０；０．４Ｍ  ＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２０秒間、二回音波処理した。音波処理物を遠心分離して透明化し、上清をロード用緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセリン、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈し、０．４５μｍのフィルターに通した。Ｎｉ2+-ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎより商業的に入手可能）を、床容量５ｍＬで調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬのロード用緩衝液で平衡化する。フィルターを通した細胞抽出物を、０．５ｍＬ／分でカラムにのせる。Ａ280のベースラインになるまでカラムをロード用緩衝液で洗浄し、そこで分画を開始する。次にカラムを二次洗浄用緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセリン、ｐＨ６．０）で洗浄するが、これにより非特異的に結合したタンパク質が溶出される。Ａ280のベースラインに到達した後、カラムを二次洗浄用緩衝液中の０−５００ｍＭのイミダゾール濃度勾配で展開する。１ｍｌの画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び銀染色又はアルカリホスファターゼに接合したＮｉ2+-ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）でのウェスタンブロットにより分析する。溶出されたＨｉｓ10-標識化ＷＩＳＰポリペプチドを含む画分をプールし、ロード用緩衝液に対して透析する。
【０３３４】
或いは、ＩｇＧ標識付き（又はＦｃ-標識付き）ＷＩＳＰポリペプチドの精製を、既知のクロマトグラフィー技術を使用して行うこともできるが、これには例えばプロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーが含まれる。
【０３３５】
各論
１.発現
具体的には、バキュロウイルス転移ベクターとしてpb.PH.mu.568.9.IgG.baculo又はpb.PH.mu.568.8.his.baculoを使用して、マウスＷＩＳＰ-１ポリペプチドを、上記したのと同様のバキュロウイルス発現系において発現した。図３１−３４は、プラスミドpb.PH.IgGの配列（配列番号：５４）を示すものであるが、これはpb.PH.mu.568.9.IgG.baculoを調製するのに使用したものである。図３５−３８は、プラスミドpb.PH.His.cの配列（配列番号：５５）を示すものであるが、これはpb.PH.mu.568.8.his.baculoを調製するのに使用したものである。
【０３３６】
これらのバキュロウイルス転移ベクターの両方は、ｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に基づくものであり、これはＨｉｓ標識もＦｃ標識も有さない。pb.PH.IgGベクター（図３１−３４）は、（ウイルス感染の極後期に活性である）ＡｃＮＰＶ多核体プロモーター下の外来性タンパク質の発現を許容する。外来性タンパク質は、Ｃ末端のヒトＩｇＧ融合タンパク質として発現することができる。このＨｉｓ（８）標識は、このＨｉｓ−（８）標識のすぐ５’にあるＩｇＧ終始コドンにより翻訳されない。融合タンパク質をコードする配列は、３’を平滑化した断片としてｈｉｓ標識の前にある独自のＳｔｕＩ部位へと挿入するべきである。この場合、付加的なプロリン残基を添加する。５部位は、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＮｃｏＩ、及びＮｈｅＩの何れかにすることができる。
【０３３７】
ＩｇＧベクターは、ｐＶＬ１３９３.IgGプラスミドをＮｄｅＩで消化し、次にクレノー断片で粘着末端部位を埋めることにより構築した。その次に、ＮｃｏＩで消化し、pbPH.His.c xＮｃｏＩ／ＳｍａＩ消化したベクターへ挿入する。
【０３３８】
図３５−３８に示されるpbPH.His.cの配列には、ベクターｐＶＬ１３９３の骨格となる配列が含まれているが、これには、０．０から５．７muの位置にある、ＡｃＭＮＰＶのＥｃｏＲＩ/ＸｍａＩＩＩ断片がほぼ含まれている。Posseeら（Virology, 185:229-241 (1991)）。これにより、オートグラファ  カリフォルニカ核多核体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）の多核体遺伝子プロモーター（これはウイルス感染の極後期に活性である）の制御下で外来タンパク質の発現が許容される。
【０３３９】
外来タンパク質は、Ｈｉｓ-又はＩｇＧ（Ｆｃ領域のみ）の標識化タンパク質のＣ末端的に発現することができる。外来タンパク質をコードする配列は、３’を平滑化した断片で、独自のＨｉｓ標識の前にあるＳｍａＩ部位又はＩｇＧのＳｔｕＩに挿入する必要がある。この場合、付加的なグリシン残基を、Ｈｉｓ標識に対して添加し、プロリンをＩｇＧ標識に対して添加する。５’部位は、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩの何れかとすることができる。ＢａｍＨＩを、両者に使用した。
【０３４０】
ベクターは、ＰＣＲ挿入物をＨｉｓベクターのＢａｍＨＩ/ＳｍａＩ部位へ、ＩｇＧベクターのＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩへ挿入して構築した。ＰＣＲ挿入物は、以下のような５’リン酸化プライマーを使用して調製した：
m.568.pcr.top6（5’-TTTCCCTTTGGATCCTAAACCAACATGAGGTGGCTCCTGCCC；配列番号１２７）、
m.568.pcr.bot．3（配列番号１２５）５’リン酸化済。Ｐｆｕポリメラーゼ酵素を使用した２０サイクルのＰＣＲ反応を、以下の条件で行った：９５℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で３．５分間。ＰＣＲ生成物を、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（商標）で精製し、ＢａｍＨＩを使用して３７℃で１時間消化した。消化したＰＣＲ生成物を、消化したベクターに結紮したが、挿入物：ベクターの比率を１：３にし、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢｉｏＬａｂｓ）を使用した。ＵＬＴＲＡ  ＭＡＸ（商標）ＤＨ５ａＦＴコンピテント細胞を１００μｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  カタログ番号10643-013）を結紮生成物に添加し、この混合物を氷上で３０分間インキュベーションし、次に４２℃で４５秒間熱ショックにかけた。個々のコロニーを選別し、小スケールのＤＮＡをＱＩＡ  ＰＲＥＰ（商標）（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して調製した。構築物の配列決定は、ＡＢＩ  ＰｒｉｓｍのｄＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＤＹＥ（商標）ターミネーターサイクル配列決定を使用して行った。
【０３４１】
プラスミドpbPH.IgG.は、ポリリンカーであるＢａｍＨＩ-ＮｏｔＩ-ＥｃｏＲＩ-ＮｃｏＩ-ＳｒｆＩ-ＳｔｕＩ-（ＩｇＧのＦｃ領域のみ）-終止-ＸｂａＩ-ＳｐｅＩ-ＰｓｔＩ-ＢｇｌＩＩを有している。このプラスミドの特定の領域の位置は以下の通りである：
ポリリンカー／外来遺伝子：４１２９−４９１２（ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ）；
ｐｏｌｈコード領域：４９１３−５４７９；
ＯＲＦ  １６２９：７１３４−４８２０；
ＯＲＦ  ５８８（ＰＫ１）：７１３３−７７２３；
ＣｏｌＥ１複製起点：７９７３−８８５８；及び
アンピシリンコード領域：９７７９−８２３０。
プラスミドpb.PH.His.cは、ポリリンカーであるＢａｍＨＩ-ＮｏｔＩ-ＥｃｏＲＩ-ＮｃｏＩ-ＳｒｆＩ-ＳｔｕＩ-（Ｈｉｓ8）-終止-ＸｂａＩ-ＳｐｅＩ-ＰｓｔＩ-ＢｇｌＩＩを有している。pbPH.His.cのＮｃｏＩ部位は、コザック配列内にある。このプラスミドの特定領域の位置は次の通りである：
ＯＲＦ５０４（ＰＴＰ）：７６−５８２；
ＯＲＦ９８４（ＯＲＦ２）：１６００−６１４；
ＯＲＦ４５３（ＯＲＦ３）：２３２３−１８６８；
コノトキシン（conotoxin）：１８１８−１６５７；
ＯＲＦ３２７（ＯＲＦ４）：２３５２−２６８１；
ＯＲＦ６３０（ｌｅｆ−２）：２６６２−３２９４；
ＯＲＦ６０３：３９３７−３３３２；
ＯＲＦ  ｐｏｌｈ：４０９３（変異コドンＡＴＧ／ＡＴＴ）；
ポリリンカー／外来遺伝子の挿入：４１２９−４２１８（ＢａｍＨＩ-ＢｇｌＩ
Ｉ）；
ｐｏｌｈコード領域：４２２４−４７９０；
ＯＲＦ１６２９：６４４５−４８２０；
ＯＲＦ５８８（ＰＫ１）：６４４４−７０３４；
ＣｏｌＥ１複製起点：７２８４−８１６９；及び
アンピシリンコード領域：９０９０−８２３０。
【０３４２】
本願で開示するマウスのＷＩＳＰ-１ｃＤＮＡは、Ｈｉｓ標識又はＩｇＧ標識の前の独自のＳｍａＩ部位へのクローニング用に３’を平滑化した断片を創出することにより、ベクターpbPH.His.c及びpb.PH.IgGに挿入してそれぞれの発現ベクターを作製した。付加的なグリシン残基を、産生されるＨｉｓタンパク質へ加えた。付加的プロリンをＩｇＧタンパク質に加えた。ｃＤＮＡ挿入物の５’部位はＢａｍＨＩであった。
【０３４３】
２.精製
精製目的のため、ポリ−Ｈｉｓ標識又はヒトＩｇＧのＦｃ部分を、ｃＤＮＡのＣ末端のコード領域に発現前に加えた。形質移入した細胞の馴化培地（０．５乃至２Ｌ）を遠心により回収し、細胞を除去して０．２２ミクロンのフィルターで濾過した。ポリ−Ｈｉｓ標識化構築物の場合、タンパク質はＮｉ2+-ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。精製前に、イミダゾールを馴化培地に５ｍＭとなるようにして添加した。馴化培地を０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのイミダゾールを含んだ２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４緩衝液で平衡化した6ｍｌのＮｉ2+-ＮＴＡカラムに、ポンプで４℃で４−５ｍｌ／分でかけた。ロード後、カラムを更なる平衡化緩衝液で洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍのイミダゾールが含まれる平衡化緩衝液で溶出した。高度に精製されたタンパク質を次に、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１４ＭのＮａＣｌ、及び４％マンニトール、ｐＨ６．８を含む保存緩衝液に対して、２５ｍｌのＧ２５ＳＵＰＥＲＦＩＮＥ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを使用して脱塩し、−８０℃で保存した。
【０３４４】
ＷＩＳＰ-１タンパク質の免疫付着素（Ｆｃ含有）構築物を、馴化培地より以下のようにして精製した。２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にポンプで馴化培地を入れた。ロード後、カラムを平衡化緩衝液で十分に洗浄してから、１００ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．５で溶出させた。溶出したタンパク質を、２７５μｌの１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ９を含んだ試験管に１ｍｌ画分で回収することによりすぐに中和した。高度に精製されたタンパク質を次に上記したポリ−Ｈｉｓ標識化タンパク質用保存緩衝液に対して脱塩した。タンパク質の均一性は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル及びエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定により調べた。
【０３４５】
実施例１１：軸線重複（axis duplication）アッセイ
ツメガエルの胚に、８から１６細胞段階の予定腹側または予定背側植物割球中に、仮定ヒトＷＩＳＰ-２ｍＲＮＡを注射し、局所的にコードされたタンパク質を過剰発現させ、その発達の効果をアッセイした。用いた方法は、Sokolら,Cell,67:741-752(1991)に記載されている。
【０３４６】
より具体的には、キャップ化ＲＮＡの合成のために、ヒトＷＩＳＰ-２とマウスＷｎｔ-１ ｃＤＮＡを、ｐＧＥＭＨＥベクター（AECOM、Todd Evans博士より委譲）内にクローン化して、ｐＧＥＭＨＥ.ｈｕ.ＷＩＳＰ-２.８ＨとｐＧＥＭＨＥ.ｍｕ.Ｗｎｔ-１を各々調製した。構築物は、３’末端でSphI制限酵素を用いて線状化した。キャップ化ＲＮＡを、AMBION's T7 MESSAGEMACHINE（商標）RNA合成キットを用いて合成した。
【０３４７】
成熟卵母細胞を得るために、成体のメスツメガエルに、使用３日前の２００Ｉ.Ｕ.の妊娠したメスの血清を注射した。実験の前夜、メスのカエルにヒト絨毛ゴナドトロピンの８００Ｉ.Ｕ.を注射した。翌朝新鮮な卵母をメスのカエルから圧搾した。卵母細胞のインビトロ受精を、卵母細胞を屠殺したメスのカエルからの切片（minced tests）と混合することにより行った。受精した卵は、２％システイン（ｐＨ７.８）で１０分間脱ゼリー化（dejellied）した。脱ゼリー化卵は、一度蒸留水で洗浄し、５％のフィコールを含む０．１×修正Barth's溶液（ＭＢＳ）（Methods in Cell Biology, 36巻、ツメガエル：細胞分子生物学における実際の使用;Kay および Peng, Eds(New York:Academic Press, 1991)）に移した。卵は、５％フィコールを含有する０．１×ＭＢＳを含む注射皿に、注射のために並べた。注射の後、胚は、１８℃インキュベーター内の０．１×ＭＢＳ内に保たれた。胚はNieuwkoopおよびFaber、ツメガエルの通常の表 (Daudin)(アムステルダム：北オランダ、1967)に従って、段階付けられた（staged）。
【０３４８】
動物のcapアッセイのために、胚は、２細胞段階で１ｎｇのキャップかＲＮＡで注射され、動物のcapを、段階８で単離し、１×ＮＭＲ内でさらに２４時間ＲＴ-ＰＣＲアッセイのために培養した。全ＲＮＡを、得られた動物のcapからRNEASY（商標）キット（Qiagen）を用いて単離した。ＲＮＡサンプル（約１μｇ）を、ランダムヘキサマーとGIBCO BRL CUPERCSRIPT II（商標）逆転写酵素を用いて逆転写した。ＰＣＲ反応のためのアニーリング温度は、別に記載しない限り５５℃とした。
【０３４９】
軸線重複アッセイのために、８細胞段階の胚に、背側または腹側植物割球に、１ｎｇのキャップ化ＲＮＡを注射し、０．１×ＭＢＳ中に７２時間インキュベートした。この実験で用いたＰＣＲプライマーの配列は：
EF-la.U：5'-CAGATTGGTGCTGGATATGC（配列番号１２８）
EF-la.D：5'-ACTGCCTTGATTACTCCTAC（配列番号１２９）
ノギン（noggin）.U：5'-AGTTGCAGATGTGGCTCT（配列番号１３０）
ノギン（noggin）.D：5'-AGTCCAAGAGTCTCAGCA（配列番号１３１）
グースコイド(goosecoid).U：5'-ACAACTGGAAGCACTGGA（配列番号１３２）
グースコイド(goosecoid).D：5'-TCTTATTCCAGAGGAACC（配列番号１３３）
心臓−アクチン.U：5'-TCCCTGTACGCTTCTGGTCGTA（配列番号１３４）
心臓−アクチン.D：5'-TCTCAAAGTCCAAAGCCACATA（配列番号１３５）
NCAM.U：5'-CACAGTTCCAGCAAATAC（配列番号１３６）
NCAM.D：5'-GGAATCAGGCGGTACAGT（配列番号１３７）
【０３５０】
このアッセイで、ヒトＷＩＳＰ-２は、軸線重複を部分的に誘導できることが見出された。
【０３５１】
実施例１２:チミジン取り込みアッセイ
（3Ｈ）-チミジン取り込みアッセイにおいて、以下の表１に示す、ＲＡＧ（腎臓腺癌、マウス）およびＮＲＫ−４９Ｆ（正常腎臓繊維芽細胞、ラット）細胞を含む１９の異なる細胞系を、１０％血清を含むＨＧＤＭＥＭ中３×１０4で９６ウェルプレートに平板培養した（plated）。プレーティングから２４時間後、被験タンパク質を添加する前に、培地を０．２％の血清を含むＨＧＤＭＥＭに交換した。ＷＩＳＰタンパク質を、最終濃度約３．６ng/μｌで添加した。新鮮培地全容量７０μｌ／ウェルで連続希釈を行った。３７℃でインキュベーション１８時間後、５μCi／ｍｌ（3Ｈ）チミジンを５時間添加した。培地を吸引し、細胞を、Packard's（商標）９６ウェルFILTERMATE 196（商標）用いて、ＧＦ／Ｃフィルター上の1×トリプシンで除去した。フィルターを乾燥させ、トップカウント、マイクロプレートシンチレーションカウンターで計数するために、４０μｌのシンチレーション液を添加した（Packard）。
【０３５２】
結果を表１に示す：
【表１】
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【０３５３】
ＷＩＳＰ-１とＷＩＳＰ-２が、用いる細胞系によって、正常および癌細胞の増殖に対して促進と阻害効果の両方を示すことがわかる。
【０３５４】
実施例１３：ＷＩＳＰポリペプチドに結合する抗体の調製
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗血清を、メスのニュージーランドホワイト（New Zealand White）ウサギにおいて、ネズミＷＩＳＰ-１およびヒトＷＩＳＰ-２に対して作製した。用いた抗原は、ネズミＷＩＳＰ-１のためのヒスチジンと融合されたタンパク質、およびヒトＷＩＳＰ-２のためのＩｇＧのＦｃ部分と融合されたタンパク質であった。両タンパク質で同じプロトコールを用いた。各タンパク質を、最初の接種のためにフロイント完全アジュバントで均質化し、以降のすべてのブーストのためにフロイント不完全アジュバントで均質化した。最初の免疫と最初のブーストのために、Bennettら、J.Biol.Chem.,266:23023060-23067(1991)およびMorton Sigelら、Methods in Enzymology, Vol.93(New York:Academic Press,1983)による「リンパ節内への接種による抗体の生産」に記載されたように、体重ｋｇ当たり３．３μｇを、直接膝窩のリンパ節に注射した。それ以降のブーストはすべて、体重ｋｇ当たり、３．３μｇを、皮下および筋肉部位に注射した。注射は３週間ごとに行ない、その２週間後に採血した。
【０３５５】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を産生する技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Goding（上掲）に記載されている。用いられる免疫原は、精製されたＰＲＯポリペプチド、ＰＲＯポリペプチドを含む融合タンパク、並びに細胞表面に組み換えＰＲＯポリペプチドを提示する細胞を含む。免疫原の選択は、過度の実験を要することなく当業者によって実施される。
【０３５６】
Balb/cのようなマウスが、フロイント完全アジュバント中に乳化されたＰＲＯポリペプチド免疫原で免疫され、１−１００マイクログラムの量で皮下または腹膜内に注射される。あるいは、この免疫原はＭＰＩ-ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT）に乳化され、動物の後足に注入される。免疫されたマウスは、選択されたアジュバントに乳化されたさらなる免疫原を用いて１０ないし１２日後にブーストされる。その後、数週間、マウスは、さらなる免疫注射でブーストされてもよい。血清サンプルは、抗ＰＲＯポリペプチド抗体を検出するためにＥＬＩＳＡアッセイで試験するための後眼窩採血(retro-orbital bleeding)によりマウスから定期的に得ることができる。
【０３５７】
適切な抗体力価が検出された後、抗体に“陽性”の動物は、ＰＲＯポリペプチドの最終的な静脈注射により注射されてもよい。３−４日後、このマウスを屠殺し、脾臓細胞が回収される。脾臓細胞は、ATCC、No.CRL1597から入手できるP3X63AgU.1のような選別されたマウスミエローマ細胞系に融合（３５％ポリエチレングリコールを用いて）される。融合体はハイブリドーマ細胞を生じ、非融合細胞、ミエローマハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するためにＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに平板培養され得る。
【０３５８】
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯポリペプチドに対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＰＲＯポリペプチドに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する“陽性”ハイブリドーマ細胞の決定は、当業者の技術範囲である。
【０３５９】
陽性ハイブリドーマ細胞は、抗ＰＲＯポリペプチドモノクローナル抗体を含む腹水を産生するために同系のBalb/cマウスに腹膜内注入されてもよい。あるいは、このハイブリドーマ細胞は、組織培養フラスコまたはローラーボトルで生育することもできる。腹水中に産生されたモノクローナル抗体の精製は、硫安沈殿、ゲル排除クロマトグラフィーを用いて実施することができる。あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。
【０３６０】
具体的には、ヒトＷＩＳＰ-１抗体の各々について、５匹のメスBalb-cマウスをプレブリードし（pre-bled）、ついでそれらの後足に（hind foot pads）、ＩｇＧのＦｃ部分で標識化され、注射の前に、アジュバントに対するＷＩＳＰ抗原の割合が１：１であるＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunological Reserch, Hamilton,MT）で乳化された、精製したヒトＷＩＳＰ-１を注射した。ＷＩＳＰ-１免疫原の投与スケジュールは以下の通りであった：
注射日                投与/部位          投与/動物      濃度
第１月の第１６日    ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    ６μｇ/動物
第２月の第１２日    ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    ６μｇ/動物
第２月の第２１日    ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    ６μｇ/動物
第２月の第２８日    ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    ２μｇ/動物
第３月の第４日      ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    ２μｇ/動物
第３月の第１１日    ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    ２μｇ/動物
第３月の第１８日    ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    ２μｇ/動物
第３月の第２５日    ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    ２μｇ/動物
【０３６１】
ＷＩＳＰ-１については、マウスは第４月第１０日に採血した。マウスから採血後、それらの脾臓を回収し、ネズミのミエローマ細胞系Ｘ６３.Ａｇ８.６５３を用いて上述のごとく融合させることにより、モノクローナル抗体を作製した。
【０３６２】
ヒトＷＩＳＰ-１に対して作製された５つのモノクローナル抗体は以下の通りである：
10F2.2A7  ガンマ２ｂ/カッパ
10F9.2B1  ガンマ２ａ/カッパ
8F7.1B1   ガンマ１/カッパ
１H1.1D5  ガンマ１/カッパ
２G7.2H4  ガンマ１/カッパ
【０３６３】
ヒトＷＩＳＰ-２モノクローナル抗体については、上記プロトコールにおいて免疫原として、精製ヒトＷＩＳＰ-１の代わりに精製ヒトＷＩＳＰ-２を用いる以外は、同じ療法（regimen）を用いる。ＷＩＳＰ-１免疫原の投与スケジュールは以下の通りである：
注射日                投与/部位          投与/動物      濃度
第１月の第１６日    ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    ６μｇ/動物
第２月の第２１日    ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    １μｇ/動物
第２月の第２８日    ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    １μｇ/動物
第３月の第４日      ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    １μｇ/動物
第３月の第１１日    ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    １μｇ/動物
第３月の第１８日    ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    １μｇ/動物
第３月の第２５日    ５０μｌ/部位    １００μｌ/動物    １μｇ/動物
【０３６４】
実施例１４：ＷＩＳＰポリペプチドに結合する抗体の使用
１．細胞系
構築されたヒト胸腫瘍細胞ＢＴ４７４とＭＤＡ-ＭＢ-２３１(ＡＴＣＣから利用可能である）を、１０％熱不活性化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（HyClone,Ligan,UT）、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン（２ｍＭ）、非必須アミノ酸、および２×ビタミン溶液を補った最少必須培地（Gibco,Grand Island,NY）で増殖させ、３７℃５％ＣＯ2中で保持する。Zhangら,Invas.&Metas.,11:204-215(1991);Priceら,Cancer Res.,50:717-721(1990)。
【０３６５】
２．抗体
上述のように調製され得る抗ＷＩＳＰ-１または抗ＷＩＳＰ-２モノクローナル抗体を、２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで回収し、BALB/cマウスの免疫に用いる。マウスは、第０，２，５，７週に、０．５ｍｌのＰＢＳ中１０7の注射i.p.を与えられる。32Ｐ標識化Ｗｎｔ−１が免疫沈降された抗血清を有するマウスは、コムギ凝集素−SEPHAROSE（商標）（ＷＧＡ）−精製Ｗｎｔ膜抽出のi.p.注射を、第９と１３週に与えられる。この後、０．１ｍｌのＷｎｔ−１調製物のi.v.注射を行ない、脾臓細胞（splenocytes）をマウスミエローマ細胞系Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合させる。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡと放射免疫沈降によってＷｎｔ−１結合についてスクリーニングする。ＭＯＰＣ−２１（ＩｇＧ１）（Cappell,Durham,NC）を、アイソトープ適合対照として用いる。
【０３６６】
さらに、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインに特異的な、抗ＥｒｂＢ２ ＩｇＧ1κネズミモノクローナル抗体４Ｄ５（1990年3月24日寄託、ATCC CRL 10463）と７Ｃ２を、上記抗体とともに用いてもよい。それらは、Fendly,Cancer Research,50:1550-1558(1990)およびWO89/06692に記載されたように作製される。
【０３６７】
３．細胞サイクル状態と生存度の分析
細胞は、同時に、FACSTAR PLUS（商標）（Becton Dickinson Immunocytometry Systems USA, San Jose,CA）でのフローサイトメトリーにより生存度と細胞サイクル状態を調べる。単層をＰＢＳで洗浄し、０．０５％トリプシンおよび０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ(Gibco)中で細胞をインキュベートし、それらを培地中に再懸濁することにより、胸部腫瘍細胞を回収する。細胞を２回、１％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄し、ペレットを３０分間氷上で、４００μＭのすべての透過可能な細胞を染色する生きた組織用の染料（vital dye）である７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）（Molecular Probes,Eugene,OR）５０μｌとともにインキュベートする。細胞はついで、１．０ｍｌのＰＢＳ中の０．５％パラホルムアルデヒドで固定し、同時に透過可能とし（permeabilized）、１６時間４℃において、５％TWEEN 20（商標）を含む１０μｇ/ｍｌのHOECHST 33342（商標）染料（同様にＤＮＡ結合染料）２２０μｌで染色する。
【０３６８】
１×１０4細胞からのデータを、ＬＹＳＹＳII（商標）ソフトウェアを用いて集めて保存し、PAINT-A-GATE（商標）ソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて分析する。Darzynkiewicaら、Cytometryら,13:795-808(1992);Picker,J.Immunol.,150:1105-1121(1993)。生存度と細胞サイクルの各段階の細胞の割合は、各々７ＡＡＤとHoechst染色を用いて、ゲート化（gated）単一細胞で決定する（細胞２倍体は、Hoechstシグナルの幅対面積のパルス分析により排除される）。細胞数は血液細胞測定器（hemocytometer）を用いて測定される。
【０３６９】
４．ＤＮＡ合成（（3Ｈ）−チミジン取り込みアッセイ）
アッセイは、テストタンパク質として用いたＷＩＳＰポリペプチドを、実施例１３に記載されたネズミＷＩＳＰ-１とヒトＷＩＳＰ-２に対するニュージーランド白ウサギポリクローナル抗体に代え、実施例１２の細胞系すべてはテストしなかった以外は実施例１２に記載された通りに行なった。結果を表２に示す：
【表２】
2009165470.tif 000003
【０３７０】
マウスＷＩＳＰ-１に対する、およびヒトＷＩＳＰ-２に対するポリクローナル抗体は、用いる細胞系によって、正常および腫瘍細胞の増殖に対して、促進的効果と阻害効果の両方を示した。
【０３７１】
５．推定レセプターに対する結合アフィニティ
放射性ヨウ素化抗ＷＩＳＰ-１および抗ＷＩＳＰ-２抗体を、IODOGEN（商標）方法により調製する。Frackerら、Biochem.Biophys.Res.Comm.,80:849-857(1978)。結合アッセイを、９６ウェルの組織培養プレート（Falcon,Becton Dickinson Labware,Lincoln Park,N.J.）で培養した適当なレセプター発現細胞（例えばマウス抗ＷＩＳＰ抗体、ＭＬＧ、ＡＴＣＣから利用可能なマウス肺細胞系）を用いて行なう。細胞はトリプシン処理し（trypsinized）、９６ウェルプレートのウェルに１０4細胞/ウェルの濃度で接種して一晩吸着させる。単層を、０．１％アジ化ナトリウムを補った冷培地で洗浄し、０．１％アジ化ナトリウムを含む冷培地中の125Ｉ-抗-ＷＩＳＰ-１またはＷＩＳＰ-２抗体の１００μｌの連続希釈の３連で、４時間氷上でインキュベートする。全量１００μｌ中の１００倍モル過剰の非放射性抗体を有する各試料のプレインキュベーションによって、非特異的結合を評価する。結合していない放射活性を０．１％アジ化ナトリウムを含む冷培地での２回の洗浄で除去する。細胞結合性放射活性を、１５０μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨ／ウェルでの細胞の可溶化の後、ガンマカウンターで検出する。ＷＩＳＰ-１及びＷＩＳＰ-２結合定数（Ｋd）と抗ＷＩＳＰ抗体結合アフィニティーをスキャッチャード分析により測定する。
【０３７２】
ＷＩＳＰ-１およびＷＩＳＰ-２に対する抗体が、これらの細胞の増殖に影響を与えるであろうことが予想される。
【０３７３】
実施例１５；ＷＩＳＰポリペプチドに結合する抗体のさらなる使用
１．ＷＩＳＰ-１およびＷＩＳＰ-２
この実施例は、ＷＩＳＰ-１とＷＩＳＰ-２の遺伝子が、ある種のヒト肺、腸、及び／又は胸部悪性腫瘍及び／又は細胞系のゲノム中で増幅することを示す。増幅は、生産された遺伝子の過剰発現と相関しており、ＷＩＳＰ-１とＷＩＳＰ-２タンパク質が、腸、肺、胸、および他の癌などのある種の癌での治療的介入のための有用な標的であることを示している。治療薬は、ＷＩＳＰ分子のアンタゴニストの形態をとり得、例えば、ネズミ−ヒト、キメラ、ヒト化、またはＷＩＳＰ-１およびＷＩＳＰ-２に対するヒト抗体、例えば上述のように調製された抗体である。
【０３７４】
スクリーニングのための出発材料は、種々の癌から分離されたゲノムＤＮＡとした。ＤＮＡは厳密に、例えば蛍光比色法で定量する。陰性対照として、ＤＮＡを１０の正常健常人から細胞から単離し、プールし、健常人の遺伝子コピーのアッセイ対照として用いる。
【０３７５】
５’ヌクレア−ゼアッセイ（例えば、TAQMAN（商標））及びリアルタイムの定量的ＰＣＲ（例えば、ABI PRIZM 7700（商標）Sequence Detection System（商標）（Perkin Elmer,Applied Biosystems Division,Foster City,CA））を、ある種の癌で増幅される可能性のある遺伝子に見出すために用いた。その結果を、ＷＩＳＰ-１とＷＩＳＰ-２をコードするＤＮＡが、スクリーニングされた初期肺または腸癌または癌細胞系または胸癌細胞系のいずれかで過剰発現するかどうかを調べるために用いた。初期肺癌は、表３に示される型と病期の腫瘍を有する個人から得た。表３に挙げられた初期腫瘍を示すために用いられた略語と、この実施例を通じて参照される初期腫瘍及び細胞系の説明は以下の通りである：
【０３７６】
ヒト肺癌細胞系は、Ａ５４９（ＳＲＣＣ７６８），Ｃａｌｕ−１（ＳＲＣＣ７６９），Ｃａｌｕ−６（ＳＲＣＣ７７０），Ｈ１５７（ＳＲＣＣ７７１），Ｈ４４１（ＳＲＣＣ７７２），Ｈ４６０（ＳＲＣＣ７７３），ＳＫＭＥＳ−１（ＳＲＣＣ７７４），およびＳＷ９００（ＳＲＣＣ７７５）を含み、すべてＡＴＣＣから利用可能である。初期肺腫瘍細胞は、通常、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、非小細胞癌、小細胞癌、および気管支肺胞癌に由来し、例えば、ＳＲＣＣ７２４（扁平上皮癌、”ＳｑＣＣａ”と略記）、ＳＲＣＣ７２５（非小細胞癌、”ＮＳＣＣａ”と略記）、ＳＲＣＣ７２６（腺癌、”ＡｄｅｎｏＳｑＣＣａ”と略記）、ＳＲＣＣ７２７（腺癌）、ＳＲＣＣ７２８（扁平上皮癌）、ＳＲＣＣ７２９（腺癌）、ＳＲＣＣ７３０（腺／扁平上皮癌）、ＳＲＣＣ７３１（腺癌）、ＳＲＣＣ７３２（扁平上皮癌）、ＳＲＣＣ７３３（腺癌）、ＳＲＣＣ７３４（腺癌）、ＳＲＣＣ７３５（気管支肺胞癌、”ＢＡＣ”と略記）、ＳＲＣＣ７３６（扁平上皮癌）、ＳＲＣＣ７３８（扁平上皮癌）、ＳＲＣＣ７３９（扁平上皮癌）、ＳＲＣＣ７４０（扁平上皮癌）、およびＳＲＣＣ７４０（肺細胞癌、”ＬＣＣａ”と略記）、を含む。
【０３７７】
腸癌細胞系は、例えば、ＡＴＣＣ細胞系ＳＷ４８０（腺癌、ＳＲＣＣ７７６）、ＳＷ６２０（腸腺癌のリンパ節転移、ＳＲＣＣ７７７）、ＣＯＬＯ３２０（腺癌、ＳＲＣＣ７７８）、ＨＴ２９（腺癌、ＳＲＣＣ７７９）、ＨＭ７（癌、ＳＲＣＣ７８０）、ＣａＷｉＤｒ（腺癌、ｓｒｃｃ７８１）、ＨＣＴ１１６（癌、ＳＲＣＣ７８２）、ＳＫＣＯ１（腺癌、ＳＲＣＣ７８３）、ＳＷ４０３（腺癌、ＳＲＣＣ７８４）、ＬＳ１７４Ｔ（癌、ＳＲＣＣ７８５）、およびＨＭ７（ＡＴＣＣ腸腺癌細胞系ＬＳ１７４Ｔの高ムチン生産変異体、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｗａｒｒｅｎ博士、ＵＣＳＦから得る）を含む。初期腸腫瘍は、ＣＴ（ＳＲＣＣ７４２），ＣＴ３（ＳＲＣＣ７４３），ＣＴ８（ＳＲＣＣ７４４），ＣＴ１０（ＳＲＣＣ７４５），ＣＴ１２（ＳＲＣＣ７４６），ＣＴ１４（ＳＲＣＣ７４７），ＣＴ１５（ＳＲＣＣ７４８），ＣＴ１７（ＳＲＣＣ７５０），ＣＴ１（ＳＲＣＣ７５１），ＣＴ４（ＳＲＣＣ７５２），ＣＴ５（ＳＲＣＣ７５３），ＣＴ６（ＳＲＣＣ７５４），ＣＴ７（ＳＲＣＣ７５５），ＣＴ９（ＳＲＣＣ７５６），ＣＴ１１（ＳＲＣＣ７５７），ＣＴ１８（ＳＲＣＣ７５８），およびＤｃＲ３，ＢＡＣｒｅｖ，ＢＡＣｆｗｄ，Ｔ１６０，およびＴ１５９と表示される腸腺癌を含む。
【０３７８】
ヒト胸癌細胞系は、例えば、ＨＢＬ１００（ＳＲＣＣ７５９），ＭＢ４３５ｓ（ＳＲＣＣ７６０），Ｔ４７Ｄ（ＳＲＣＣ７６１），ＭＢ４６８（ＳＲＣＣ７６２），ＭＢ１７５（ＳＲＣＣ７６３），ＭＢ３６１（ＳＲＣＣ７６４），ＢＴ２０（ＳＲＣＣ７６５），ＭＣＦ７（ＳＲＣＣ７６６）、およびＳＫＢＲ３（ＳＲＣＣ７６７）を含む。
【０３７９】
結果は、デルタ（△）ＣＴ単位で示す。１単位は１ＰＣＲサイクルまたは正常に対して約２倍の増幅に対応し、２単位は４倍に、３単位は８倍増幅等々に対応する。定量は、ＷＩＳＰ-１およびＷＩＳＰ-２  ｃＤＮＡの３’不飽和領域由来のプライマーと、各介入（intervening）配列に対応するTAQMAN（商標）蛍光プローブを用いて得た。３’領域を用いることは、ゲノムＤＮＡにおいてイントロン−エクソンの境界をクロスすることを避ける傾向があり、この方法を用いる遺伝子増幅の正確な評価のための必須の要件である。ＷＩＳＰ-１をコードするおよびＷＩＳＰ-２をコードする遺伝子の増幅のために用いられるプライマーとプローブ（順方向(forward)、逆方向(reverse)、及びプローブ）配列は以下の通り
であった：
ＷＩＳＰ-１プローブおよびプライマー：
hu.ＷＩＳＰ-１.TMP（プローブ）
5'-AGCCTTTCCAAGTCACTAGAAGTCCTGCTGG（配列番号１３８）
hu.ＷＩＳＰ-１.TMF（順方向プライマー）
5'-CTGGACTACACCCAAGCCTGA（配列番号１３９）
hu.ＷＩＳＰ-１.TMR（逆方向プライマー）
5'-CATTTCTTGGGATTTAGGCAAGA（配列番号１４０）
ＷＩＳＰ-２プローブおよびプライマー：
DNA33473.3utr-5（順方向プライマー）
5'-TCTAGCCCACTCCCTGCCT（配列番号１４１）
DNA33473.3utr-3（逆方向プライマー）
5'-GAAGTCGGAGAGAAAGCTCGC（配列番号１４２）
DNA33473.3utr-プローブ  
5'-CACACACAGCCTATATCAAACATGCACACG（配列番号１４３）
【０３８０】
５’ヌクレアーゼアッセイ反応は、リアルタイムで増幅をモニターするために、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を用いる蛍光ＰＣＲに基づく技術である。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲ反応で典型的なアンプリコン(amplicon)を生成させるために用いる。第３のオリゴヌクレオチドまたはプローブを、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するためにデザインする。プローブはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によっては非伸張性であり、レポーターの蛍光染料と消光(quencher)蛍光染料に標識される。２つの染料がプローブ上にあって非常に近くに位置するときに、レポーター染料からのレーザー誘導エミッションは消光染料により消光される。増幅反応の間、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型に依存してプローブを開裂する。結果として得られるプローブ断片は、溶液中で解離し、放出されたレポーター染料からのシグナルは、第２の蛍光物質の消光効果からフリーとなる。レポーター染料の１つの分子が、各新しく合成された各分子のために解離し、非消光レポーター染料の検出は、データの定量的解釈の基礎を提供する。
【０３８１】
５’ヌクレオチド手法は、ABI PRIZM 7700（商標）Sequence Detection System（商標）などのリアルタイム定量的ＰＣＲ装置で行なわれる。装置は、サーモサイクラー（thermocycler）、レーザー、荷電結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピューターからなる。装置は試料を９６ウェル形式でサーモサイクラー内で増幅する。増幅の間、レーザーに誘導された蛍光シグナルが、９６ウェルすべてについてリアルタイムで光ファイバを通じて集められ、ＣＣＤで検出される。装置は計器を作動させデータを分析するためのソフトウェアを含む。
【０３８２】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初に、Ｃｔとして、またはしきい値サイクルとして表される。これは、レポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドレベルより上に累積されるサイクルとして定義される。△Ｃｔ値は、癌ＤＮＡの結果を正常ヒトＤＮＡの結果と比較するときに、核酸試料中の特定の標的配列の出発コピーの相対数の定量的測定として用いられる。
【０３８３】
実施した第１の実行（run）の結果を、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２の各々、および対照について、図３９−４２と図４３−４６に示す。図４０（huＷＩＳＰ-１と記されている）に示したパターンを参照。正常ヒトＤＮＡの２つの試料の標準偏差を、Ｎｏｒ Ｈｕと記された欄に示す。これは質の対照材料として用いた。もし標準偏差が、許容できないほど大きいなら、全体の実行を繰り返した。９のさらなる欄は、上記のヒト腸癌細胞系に対応した。ＨＴ２９とＷＩＤｒについてのデルタＣＴは、３を超えており、正常試料と比較して、これらの試料におけるＷＩＳＰ-１遺伝子の約８倍の過剰発現に対応している。同様に、図４０は、ＨＣＴ１１６、ＳＫＣｏ−１、およびＳＷ４０３細胞系中でのＷＩＳＰ-１の約４倍の増幅を示唆している。
【０３８４】
比較として、図４４参照（ｈｕＦＡＳｒと記されている）。一般的に小さなデルタＣＴ値は、この遺伝子が、どの細胞系においても多くは増幅していなかったことを示す（２倍の増幅に対応するＳＷ６２０についての１の値は、アッセイのノイズレベルの範囲内である）。
【０３８５】
ＷＩＳＰ-１の結果は、３つの複製反応で確認された。図４７−５０、５１−５４、および５５−５７参照。得られたパターンとデルタＣＴ値は、図４７−４９（各々ｈｕＷＩＳＰ-１ｃ，ｈｕＷＩＳＰ-１ｂ，およびｈｕＷＩＳＰ-１ａと記されている）で非常に類似していた。結果は、第１の実行で得られたものと実質的に同一であった。ＨＴ２９とＷＩＤｒは最高のレベルのＷＩＳＰ-１増幅を示したが、ＨＣＴ１１６、ＳＫＣｏ-１、およびＳＷ４０３細胞系はいくらか低レベルのＷＩＳＰ−遺伝子増幅を示した。第２の実行から２つのさらなる反応が確認された。図６２および６３参照。
【０３８６】
ＷＩＳＰ-１遺伝子は第８染色体上、ある種の腸癌細胞系で増幅されることが知られているmyc遺伝子の概略的近傍（general vicnity）に位置している。myc遺伝子についてのプライマーとプローブを用いて得られるパターン、すなわち
hu.c-myc.tm.p 
5'-CTTGAGACTGAAAGATTTAGCCATAATGTAAACTGCCT（配列番号１４４）
hu.c-myc.tm.f 
5'-CAAATGCAACCTCACAACCTTG（配列番号１４５）、および
hu.c-myc.tm.r 
5'-TTCTTTTATGCCCAAAGTCCAATT（配列番号１４６）
は、公表された報告（Cancer Resarch,57:1769-1775(1997)）と一致しており、５’ヌクレアーゼアッセイ方法を立証する傾向があるが、明らかにＷＩＳＰ-１で得られたものと異なる。これらのデータは、myc遺伝子が、ＷＩＳＰ-１に対するプライマーとプローブを用いて検出される増幅のターゲットでないことを証明する。
【０３８７】
ＷＩＳＰ-２ＤＮＡ配列に基づくプライマーとプローブを用いたデータは、この遺伝子が調べた多くの細胞系で低レベルの遺伝子増幅の標的となり得ることを示唆する。図４５、５１−５４、および６４および６５参照。したがって、ＷＩＳＰ-１とＷＩＳＰ-２の両方に対する抗体、特にヒト化抗体は、臨床の用途において、ヒト化抗ＨＥＲ−２抗体と同様に、ある種の癌、例えば腸癌などに抗することにおいて役立つと予想される。
【０３８８】
２．ＷＩＳＰ-２
癌と細胞系の説明
いくつかの異なる腫瘍型を用いた増幅を、下記の通り、ヒトＷＩＳＰ-２（ＰＲＯ２６１）について行なった。表３には、本発明のＷＩＳＰ-２化合物のスクリーニングに用いた種々の初期腫瘍のステージ、Ｔステージ、およびＮステージが記載されている。
【表３】
2009165470.tif 000004
【０３８９】
ＤＮＡ調製：
ＤＮＡは、培養された細胞系、初期腫瘍、正常ヒト血液（対照およびフレームワークおよび中心点(epicenter)マッピング）から調製した。精製キット＃１３３６２（各々４００μｇのゲノムＤＮＡ容量を有する１０の精製チップを含む）、緩衝液セット＃１９６０とプロテアーゼ＃１９１５５および＃１９１０１、すべてQuiagenから、を用いて、生産者の指示に基づいて下記の通り単離した。
【０３９０】
細胞培養溶解：
細胞は、洗浄し、チップ当たり７．５×１０8の濃度でトリプシン処理し、１０００ｒｐｍ５分間４℃の遠心分離によりペレットにし、１／２容量のＰＢＳ再遠心分離し再度洗浄した。ペレットを３回洗浄し、懸濁した細胞を集めて２×ＰＢＳで洗浄した。細胞はついで１０ｍＬのＰＢＳで懸濁した。緩衝液Ｃ１を４℃で平衡化した。プロテアーゼ＃１９１５５（Quiagen）を６．２５ｍｌの冷ｄｄＨ2Ｏに最終濃度２０ｍｇ/ｍｌになるように希釈し、４℃で平衡化した。１０ｍＬのＧ２緩衝液を、ＲＮＡｓｅ  Ａストック（Quiagen）（１００ｍｇ/ｍｌ）を最終濃度２００μｇ/ｍｌに希釈することにより調製した。
【０３９１】
緩衝液Ｃ１（１０ｍＬ、４℃）およびｄｄＨ2Ｏ（４０ｍＬ、４℃）をついで１０ｍＬの細胞懸濁液に添加し、反転により混合し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞核を、BECKMAN（商標）スイングバケットローターで２５００ｒｐｍ、４℃１５分間の遠心分離でペレットにした。上清を捨て、核を２ｍＬ緩衝液Ｃ１（４℃で）と６ｍＬ  ｄｄＨ2Ｏ中に渦動撹拌で懸濁し、２５００ｒｐｍ１５分間の第２の４℃遠心分離を行なった。核をついで、チップ当たり２００μｌを用いて残りの緩衝液に再懸濁した。Ｇ２緩衝液（１０ｍｌ）を、穏やかな渦動撹拌をかけながら、懸濁した核に添加した。緩衝液の添加を完了したとき、激しい渦動撹拌を３０秒間行なった。Quiagenプロテアーゼ（２００μｌ、上述のごとく調製）を添加し、５０℃６０分間インキュベートした。インキュベーションと遠心分離を、溶解液が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに３０−６０分間インキュベート、３０００×ｇ１０分間、４℃でペレット化）。
【０３９２】
固体ヒト腫瘍試料調製と溶解：
腫瘍試料は計量し、５０ｍｌ三角フラスコ内に入れ、氷上に置いた。処理は、調製物当たり２５０ｍｇ組織以下に制限した（１チップ/調製物）。プロテアーゼ溶解物は、希釈によって新しく６．２５ｍｌの冷ｄｄＨ2Ｏ中に最終濃度２０ｍｇ/ｍｌとなるように調製し、４℃で保存した。Ｇ２緩衝液（２０ｍｌ）を、ＤＮアーゼＡを最終濃度２００ｍｇ／ｍｌ（１００ｍｇ／ｍｌストックから）に希釈することにより調製した。腫瘍組織を１９ｍｌのＧ２緩衝液中で６０秒間、エアゾールの吸入を防ぐために層流TCフード内で、ポリトロンの大チップを用いて均質化し、室温に置いた。試料の間、ポリトロンを各々２ＬのｄｄＨ2Ｏ中で、２×３０秒回転させ、その後Ｇ２緩衝液（５０ｍｌ）で回転させることにより洗浄した。組織が発生器チップにまだ存在する場合は、装置を分解して洗浄した
。
【０３９３】
上述の通り調製したプロテアーゼ（Quiagen）１．０ｍｌを添加し、渦動撹拌し、５０℃３時間インキュベーションした。インキュベーションと遠心分離を、溶解液が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに３０−６０分間インキュベート、３０００×ｇ１０分間、４℃でペレット化）。
【０３９４】
ヒト血液調製および溶解：
健康なボランティアから、標準感染剤プロトコールを用いて、血液を採取し、チップ当たり１０ｍｌ試料でクエン酸処理した（citrated）。プロテアーゼ（Quiagen）は、希釈によって新しく６．２５ｍｌの冷ｄｄＨ2Ｏ中に最終濃度２０ｍｇ/ｍｌとなるように調製し、４℃で保存した。ＲＮアーゼＡを、１００ｍｇ/ｍｌストックから最終濃度２００μｇ/ｍｌに希釈することにより、Ｇ２緩衝液を調製した。血液（１０ｍｌ）を５０ｍｌ三角フラスコに入れ、１０ｍｌのC1緩衝液と３０ｍｌのｄｄＨ2Ｏ（両者ともに予め４℃で平衡化されたもの）を添加し、成分を反転により混合し、氷上に１０分間置いた。核を、BECKMAN（商標）スイングバケットローターで２５００ｒｐｍ、４℃１５分間の遠心分離でペレットにし、上清を捨てた。核を２ｍＬ緩衝液Ｃ１（４℃）と６ｍＬ  ｄｄＨ2Ｏ（４℃）中に渦動撹拌によって懸濁した。ペレットが白くなるまで渦動撹拌を繰り返した。次いでその核を、２００μｌチップを用いて残りの緩衝液に懸濁した。Ｇ２緩衝液（１０ｍｌ）を、穏やかな渦動撹拌をかけながら、懸濁した核に添加し、その後、激しい渦動撹拌を３０秒間行なった。プロテアーゼ（Quiagen）（２００μｌ）を添加し、５０℃６０分間インキュベートした。インキュベーションと遠心分離を、溶解液が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに３０−６０分間インキュベート、３０００×ｇ１０分間、４℃でペレット化）。
【０３９５】
透明化溶解液の精製；ゲノムＤＮＡの単離：
ゲノムＤＮＡを、１０ｍｌのＱＢＴ緩衝液で平衡化した（最大チップ調製物当たり１試料）。ＱＦ溶出緩衝液を５０℃で平衡化した。試料を３０秒間渦動撹拌し、平衡化チップの上におき、重力で排水した。チップを２×１５ｍｌ  ＱＣ緩衝液で洗浄した。シラン処理（silanized）かつオートクレーブした３０ｍｌのCOREX（商標）チューブ内で、１５ｍｌのＱＦ緩衝液により、ＤＮＡを溶出した。イソプロパノール（１０．５ｍｌ）を各試料に添加し、チューブをパラフィンで覆い、反転の繰り返しによりＤＮＡが沈殿するまで混合した。試料を、ＳＳ−３４ローターで１５，０００ｒｐｍ、１０分間４℃の遠心分離によりペレットにした。ペレットの位置に印をつけ、上清を捨て、１０ｍｌの７０％エタノール（４℃）を添加した。試料を、ＳＳ−３４ローターで１０，０００ｒｐｍ、１０分間４℃の遠心分離により再びペレットにした。ペレットの位置に印をつけ、上清を捨てた。チューブをついで乾燥棚に横向きに置き、１０分間３７℃で乾燥させたが、試料を過剰に乾燥させないように注意した。
【０３９６】
乾燥の後、ペレットを１．０ｍｌの（ｐＨ８．５）中に溶解し、１−２時間５０℃に置いた。溶解を続行させるように試料を一晩４℃に置いた。ＤＮＡ溶液をついで、ツベルクリンシリンジの２６ゲージの針で１．５ｍｌのチューブに移した。ＤＮＡを切断するためにこの移す操作を５回繰り返した。ついで試料を５０℃に１−２時間置いた。
【０３９７】
ゲノムＤＮＡの定量と遺伝子増幅アッセイのための調製：
各チューブにおけるＤＮＡレベルを標準Ａ２６０，Ａ２８０分光光度法により、１：２０希釈（５μｌのＤＮＡ＋９５μｌのｄｄＨ2Ｏ）で、BECKMAN DU640（商標）分光光度計において０．１ｍｌ石英キュベットを用いて、定量した。Ａ２６０／Ａ２８０比は１．８−１．９の範囲であった。各ＤＮＡ試料をついでさらにＴＥ（ｐＨ８．５）中約２００ｎｇ／ｍｌに希釈した。元の材料が高く濃縮されていた場合（約７００ｎｇ／μｌ）は、材料は数時間再懸濁されるまで５０℃に置いた。
【０３９８】
ついで蛍光光度によるＤＮＡ定量を、希釈された材料（２０−６００ｎｇ／ｍｌ）で、下記の修正を加えた製造者のガイドラインを用いて行なった。このことは、HOEFFER DYNA QUANT 200（商標）蛍光計を約１５分間ウォームアップさせることによりなされた。HOECHST（商標）染料作用溶液（＃H33258、１０μｌ、使用１２時間以内に調製）を１００ｍｌの１×ＴＮＥ緩衝液に希釈した。２ｍｌのキュベットに、蛍光光度計溶液を充填し、機械の中に置き、機械を零点調節した。ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）（２０μｌ、ロット番号＃３６０８５１０２６）を、２ｍｌの蛍光光度溶液に添加し、２００単位で較正した。第２の２μｌのｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）ＤＮＡを、ついで試験し、読みを４００＋／−１０単位で確認した。各資料をついで少なくとも３連で読みとった。３試料が、各々１０％以内であることを見出したとき、それらの平均をとり、この値を定量値として用いた。
【０３９９】
蛍光光度で測定された濃度はついで、各試料をｄｄＨ2Ｏ中で１０ｎｇ／μｌに希釈するために用いた。このことは、単一のTAQMAN（商標）プレートアッセイについてすべての鋳型試料で同時に行ない、５００−１０００アッセイを実行するのに十分な材料であった。試料は、正常ヒトＤＮＡを有する単一プレート上でＢアクチンとＧＡＰＤＨの両方とともに３連で、および鋳型のない対照で試験した。テストＤＮＡから減じた正常ヒトＤＮＡのＣＴ値が＋／−１  ＣＴという条件で、希釈された試料を用いた。希釈されロットで認定された（lot-qualified）ゲノムＤＮＡを、−８０℃、１．０ｍｌアリコートで保存した。その後遺伝子増幅アッセイに用いられたアリコートを４℃で保存した。各１ｍｌのアリコートは８−９プレートまたは６４回のテストに十分である。
【０４００】
フレームワークマッピングおよび中央点標識化（epicenter marking）
ヒトＷＩＳＰ-１を、フレームワークマッピングおよび中央点マッピングの両方で再度調べた。上記最初のスクリーニングで選択された腫瘍を、フレームワークマッピングおよび中央点マッピングの両方で再度調べた。表４は、本実施例で用いられたフレームワーク標識の染色体マッピングを示す。フレームワーク標識は第８染色体に沿って約２０メガ塩基毎に位置しており、異数体の制御のために用いた。
【表４】
2009165470.tif 000005
【０４０１】
表５は、ＷＩＳＰ-１とともに用いられた中心点標識を記載している。これらの標識は、ＷＩＳＰ-１の遺伝子の非常に近位に位置しており、ＷＩＳＰ-１遺伝子が位置している第８染色体の領域の増幅状態の評価に用いられる。個々の標識の間の距離は、センチレイ（ｃＲ）で測定され、これは２つの標識の間の約１％の可能性の破壊に等しい放射線破壊単位である。１ｃＲは、概算で２０キロ塩基に対応する。標識ＳＨＧＣ−３２９５８は、ＷＩＳＰ-１をコードする遺伝子が最も近くにマップされる第８染色体の位置の最も近くに見出される標識である。
【表５】
2009165470.tif 000006
【０４０２】
ヒトＷＩＳＰ-２のためのフレームワーク標識は、第２０染色体に沿って約２０メガ塩基ごとに位置しており、異数体を制御するために用いられる。標識を表６に示す。
【表６】
2009165470.tif 000007
【０４０３】
標識ＳＨＧＣ-３３９２２は、ヒトＷＩＳＰ-２  ＤＮＡが最も近くにマップされる標識である。この標識は、フレームワーク標識の間にある。フレームワーク分析は、腫瘍で全ての標識がu7pであることを示し、したがって第２０染色体が多くの腫瘍で異数体である。標識は異数体であったために、中心点分析は、ヒトＷＩＳＰ-２遺伝子についてなされなかった。
【０４０４】
ＷＩＳＰ-１に対する第８染色体に沿った上記フレームワーク標識の△Ｃｔ値は、表７から表９の選択された腫瘍に対して示す。
【表７】
2009165470.tif 000008
【表８】
2009165470.tif 000009
【表９】
2009165470.tif 000010
【０４０５】
遺伝子増幅アッセイの結果
本発明のヒトＷＩＳＰ-２（ＰＲＯ２６１）化合物を以下の初期腫瘍においてスクリーニングし、その結果の△Ｃｔ値を表１０から表１２に示す。
【表１０】
2009165470.tif 000011
【表１１】
2009165470.tif 000012
【表１２】
2009165470.tif 000013
【０４０６】
種々の初期の肺と腸の腫瘍におけるＤＮＡ３３４７３（ＰＲＯ２６１；ヒトＷＩＳＰ-２）の△Ｃｔ値は、肺腫瘍細胞細胞系と共に表１０から表１２で報告する。１を超えた△Ｃｔ値は、典型的に、増幅スコアの閾値として用い、これは遺伝子のコピーの二倍を示す。表１０から表１２は、（１）初期肺腫瘍ＬＴ１ａ、ＬＴ１０、ＬＴ１２、ＬＴ１５、ＬＴ１７、およびＬＴ１９；（２）初期腸腫瘍ＣＴ２、ＣＴ３、ＣＴ１４、およびＣＴ５；（３）腸腫瘍細胞系ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＨＴ２９、ＷｉＤｒ、ＨＣＴ１１６、ＳＫＣＯ１、ＳＷ４０３、およびＬＳ１７４Ｔおよび（４）胸腫瘍細胞系ＨＢＬ１００、ＭＢ４３５ｓ、ＢＴ２０およびＳＫＢＲ３におけるＤＮＡ３３４７４の高い増幅を示す。
【０４０７】
初期肺腫瘍に対する△Ｃｔと平均△Ｃｔ値は、各々以下の通りである：１．０８、１．１６、１．１７、１．６４、１．５０、および１．４７。初期腸腫瘍に対しては、各々、１．１６、２．１４、１．０３、および１．０７。腸腫瘍細胞系に対しては、各々、１．６７、１．５４、１．７３、１．２４、１．３２、１．３５、１．６５、および１．４８。胸腫瘍細胞系に対しては、各々１．４０、１．４３、１．６６、および１．７３。
【０４０８】
肺腫瘍について、これは、正常組織に対して、遺伝子コピーで、各々約２．１、２．２、２．２、３．１、２．８、および２．８倍の増加であることを示す。腸腫瘍について、これは、正常組織に対して、遺伝子コピーで、各々約２．２、４．４、２．０、および２．１倍の増加であることを示す。腸腫瘍細胞系について、これは、正常組織に対して、遺伝子コピーで、各々約３．２、２．９、３．３、２．４、２．５、２．５、３．１、および２．８倍の増加であることを示す。胸腫瘍細胞系について、これは、正常組織に対して、遺伝子コピーで、各々約２．６、２．７、３．２、および３．３倍の増加であることを示す。ＤＮＡ３３４７３（ＰＲＯ２６１）の増幅が、種々の腫瘍で起こることから、それが腫瘍の形成あるいは増殖に関与しているらしい。この結果、ＤＮＡ３３４７３（ＰＲＯ
２６１）によりコードされたタンパク質に対するアンタゴニスト（例えば抗体）は、癌の治療に役立つことが期待されよう。
【０４０９】
実施例１６
in situハイブリダイゼーション
in situハイブリダイゼーションは、細胞または組織調製物内における核酸配列の検出および位置決定のための強力かつ用途の広い技術である。例えば、遺伝子発現部位を同定するため、転写の組織分布を分析するため、ウイルス感染を同定および位置決定するため、特異的なｍＲＮＡ合成の変化を追求するため、並びに染色体地図作製を支援するために使用できる。
【０４１０】
in situハイブリダイゼーションは、ＰＣＲ産生33Ｐ-ラベル化リボプローブを用いて、LuとGillett, Cell Vision 1:169-176 (1994)によるプロトコールの最適化されたバージョンに従って行われた。簡単に説明すると、ホルマリン固定、パラフィン包埋されたヒト組織が切断され、パラフィンが除かれ、プロテイナーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）で１５分間３７℃でタンパク除去され、上記LuとGillettに記載されているようにin situハイブリダイゼーションのために処理される。［33−Ｐ］ＵＴＰ-ラベルされたアンチセンスリボプローブがＰＣＲ生成物から産生され、５５℃で一晩ハイブリダイズされた。このスライドを、Kodak NTB2核トラックエマルジョンに浸して、４週間感光させた。
【０４１１】
33Ｐ-リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の33Ｐ-ＵＴＰ（Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol）を乾燥させた。乾燥した33Ｐ-ＵＴＰを含む各チューブに、以下の成分を添加した：
２．０μｌ ５ｘ 転写緩衝液
１．０μｌ ＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌ ＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ：１０μ；それぞれ１０ｍＭのＧＴＰ
、ＣＴＰ＆ＡＴＰ＋１０μｌ Ｈ2Ｏ）
１．０μｌ ＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌ Rnasin
１．０μｌ ＤＮＡ鋳型（１μｇ）
１．０μｌ Ｈ2Ｏ
１．０μｌ ＲＮＡポリメラーゼ（通常、ＰＣＲ生成物Ｔ３＝ＡＳ、Ｔ７＝Ｓ）
【０４１２】
このチューブを、３７℃で１時間インキュベートした。１．０μｌのＲＱ１ ＤＮアーゼを添加し、その後に３７℃で１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Tris pH7.6/1mM EDTA pH8.0）を添加し、この混合物をＤＥ８１ペーパーにピペットで移した。残りの溶液を、Microcon-50限外濾過ユニットに充填し、プログラム１０を用いて遠心した（６分）。濾過ユニットを第二チューブにあけ、プログラム２を用いて遠心した（３分）。最終的な回収遠心分離の後に、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終生成物をＤＥ８１ペーパーにピペットで移し、６ｍｌのBiofluor IIにおいてカウントした。
【０４１３】
このプローブをＴＢＥ／尿素ゲルにかけた。１−３μｌのプローブまたは５μｌのＲＮＡ Ｍｒｋ IIIを３μｌの充填緩衝液に添加した。９５℃のヒートブロックで３分間熱した後、このゲルを直ちに氷に移した。ゲルのウェルを洗い、サンプルを充填し、４５分間１８０−２５０ボルトで流した。このゲルをサランラップで覆い、−７０℃のフリーザーの中で１時間から一晩の間、増感紙を用いてＸＡＲフィルムに感光させた。
【０４１４】
33Ｐ-ハイブリダイゼーション
Ａ．冷凍切片の前処理
このスライドをフリーザーから取り出し、アルミニウムのトレイに移し、室温で５分間解凍した。このトレイを、凝縮を下げるために、５分間５５℃のインキュベーターに置いた。このスライドをフュームフードにおいて氷上で４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、０．５ｘＳＳＣで５分間、室温で洗浄した（２５ｍｌ  ２０ｘＳＳＣ＋９７５ｍｌ ＳＱＨ2Ｏ）。１０分間３７℃で０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中で脱タンパクした後（２５０ｍｌの予め温められたＲＮアーゼを含まないＲＮＡ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌストックの１２．５μｌ）、この切片を０．５ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。この切片を７０％、９５％、１００％のエタノール、２分間でそれぞれ脱水した。
【０４１５】
Ｂ．パラフィン-包埋された切片の前処理
このスライドを脱パラフィン化し、ＳＱ Ｈ2Ｏに移し、２ｘＳＳＣ、室温、５分間でそれぞれ二回洗浄した。この切片を、２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮアーゼを含まないＲＮアーゼ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌの５００μｌ；３７℃、１５分）−ヒト胎芽、あるいは、８ｘのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮアーゼ緩衝液中の１００μｌ；３７℃、３０分）−ホルマリン組織において脱タンパク化した。次いで、上述したように０．５ｘＳＳＣですすぎ、脱水を行った。  
【０４１６】
Ｃ．プレハイブリダイゼーション
このスライドを、Ｂｏｘ緩衝液（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）−飽和フィルターペーパーを備えたプラスチックボックスに配置した。この組織を５０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（３．７５ｇ デキストランスルファート＋６ｍｌＳＱ Ｈ2Ｏ）で被覆し、渦動撹拌し、キャップを緩めて２分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、１８．７５ｍｌのホルムアミド、３．７５ｍｌの２０ｘＳＳＣおよび９ｍｌのＳＱ Ｈ2Ｏを添加し、組織をよく渦動撹拌し、４２℃で１−４時間インキュベートした。
【０４１７】
Ｄ．ハイブリダイゼーション
スライド当たり、１．０ｘ１０6ｃｐｍプローブと１．０μｌｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を３分間９５℃で加熱した。このスライドを氷冷し、スライド当たり４８μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を添加した。渦動撹拌した後、５０μｌの33Ｐ混合物を、スライドの５０μｌのプレハイブリダイゼーションに添加した。このスライドを５５℃で一晩インキュベートした。
【０４１８】
Ｅ．洗浄
洗浄を２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて室温で行い（４００ｍｌ ２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌ ０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｖf＝４Ｌ）、その後に３７℃で３０分間ＲＮアーゼＡ処理した（２５０ｍｌのＲＮアーゼ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌの５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。このスライドを２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて室温で洗浄した。ストリンジェントな洗浄条件は、５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌ ２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌ ＥＤＴＡ、Ｖf＝４Ｌ）であった。
【０４１９】
Ｆ．オリゴヌクレオチド
ここで開示されたDNA配列についてin situ 分析を行った。これらの分析に用いられたオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
【０４２０】
（１）マウスＷＩＳＰ-１（クローン568）
Notrim-p1:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGTCCCTGGCCAGTGCTGTGAG-3'（配列番号１４７）
Notrim-p2:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGGGCCAGGCTTTGCTTCCATT-3'（配列番号１４８）
（２）ヒトＷＩＳＰ-１
hm ＷＩＳＰ-１ p1：
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGAGGCATGGCACAGGAAC-3'（配列番号１４９）
hm ＷＩＳＰ-１ p2：
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGATCCGGATCAGGCTTGGGTGTA-3'（配列番号１５０）
（３）マウスＷＩＳＰ-２（クローン1367.3）
1367.p1:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGCTTGGGATGGAGGTCTTTC-3'（配列番号１５１）
1367.p2:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGGGCACTGGGGTGGTGT-3'（配列番号１５２）
（４）ヒトＷＩＳＰ-２（DNA33473）
DNA33473-p1:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGCGAGGACGGCGGCTTCA-3'（配列番号１５３）
DNA33473-p2:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAAGAGTCGCGGCCGCCCTTTTT-3'（配列番号１５４）
（５）ヒトＷＩＳＰ-３
ＷＩＳＰ-３-p1:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGGGGCTCCTCTTCTCCACTCT-3'（配列番号１５５）
ＷＩＳＰ-３-p1:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGCTGTCGCAAGGCTGAATGTA-3'（配列番号１５６）
【０４２１】
Ｇ．結果
ここで開示された上記ＤＮＡ配列について、in situ分析を行った。これらの分析からの結果は以下の通りである。
（１）マウスＷＩＳＰ-１
マウス組織での発現
マウス胎児組織：マウスＷＩＳＰ-１のin situハイブリダイゼーションは、胚間葉組織（embryonic mesenchymal tissues）で強い発現を見せた。Ｅ１０．５において、成体で骨格成分に発達するであろう組織で発現が観察された。このパターンは胚発達の後期ステージでも保持された。後期ステージ（Ｅ１２．５およびＥ１５．５）で、発現は、骨形成の部位の骨芽細胞で最高であった。発現は、胚の心臓でも観察され、シグナルはＥ１２．５の房（atria）で特に強かった（Ｅ１５．５での区画に房は含まれていなかった）。
【０４２２】
マウス成体組織：心臓、肺、腎臓、副腎、肝臓、膵臓、大脳、および小脳を含む、試験したいずれの成体組織でも発現は観察されなかった。これらの結果はノザンデータと相関していない。
【０４２３】
胎児でのさらなる部位の発現は、発達中の血管の壁で、肝門脈間葉（hepatic portal tract mesenchyme）内部の繊維芽細胞様細胞中であった。
【０４２４】
正常およびＷｎｔ−１トランスジェニック腫瘍での発現
アンチセンスプローブでの発現が、Ｐ１０（出産１０日後の子（ｐｕｐｓ））および妊娠中のメスで、皮下の骨格筋に隣接する繊維芽細胞様細胞全体で観察された。研究で調べたいずれの時間でも、胸上皮細胞全体では、発現は観察されなかった。
【０４２５】
マウスＷＩＳＰ-１の発現は、試験した３つのＷｎｔ−１トランスジェニック腫瘍全部で高く、弱い結合組織支質内の支持している繊維芽細胞様細胞に制限されているようであった。腫瘍細胞自身全体でいくらかの発現が見られた。しかしながら、これは、腫瘍細胞による真の発現というより、腫瘍繊維芽細胞からの余剰を表していると思われる。
【０４２６】
要約すると、マウスＷＩＳＰ-１は、胚の骨格間葉と骨形成部位で発現された。さらに、それは成長している子と妊娠中のメスのサブカタス（sub-cutus）の繊維芽細胞で発現された。骨形成に役割を果たしているらしく、損傷の後の修復に関与しているかもしれない。発現は胚の心臓でも観察された。
【０４２７】
（２）ヒトＷＩＳＰ-１
ヒト組織での発現
ヒト胎児組織
試験した胎児組織（Ｅ１２−Ｅ１６週）は以下のものを含む：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、太い血管（great vessels）、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、目、脊髄、体壁、骨盤および下肢。
【０４２８】
ヒトＷＩＳＰ-１は、胚、例えば発達中の門脈（portal tracts）、筋肉中の筋膜の面、および発達中の骨格成分と腱を囲む結合組織などの、胎児の結合組織界面の部位で発現を示した。発現は、発達中の腎皮質上皮と胎児の副腎の紡錘形状の繊維芽細胞様細胞でも見られた。ヒトＷＩＳＰ-１は、胎児リンパの骨形成部位の骨芽細胞により強く発現した。
【０４２９】
ヒト成人組織
調べた成人組織は以下の通りである：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、肺、皮膚、軟骨肉腫、目、胃、胃癌、腸、腸癌、腎細胞癌、前立腺、膀胱粘膜、および胆嚢、アセトアミノフェンで誘導された肝臓障害と肝硬変を有する組織。
【０４３０】
この研究において正常または病気の成人組織では発現は見られなかった。
【０４３１】
要するに、ヒトＷＩＳＰ-１の発現の全体のパターンは、上記マウス遺伝子で観察されたものと広く類似していた。ヒトＷＩＳＰ-１プローブは、マウス胚切片とクロス反応しなかった。
【０４３２】
ヒト胸癌と正常胸細胞での発現
ヒトＷＩＳＰ-１は、良性および悪性の上皮細胞で陰性であったが、間葉細胞、特に組織修復領域で、ジストロフィー骨形成を含めて、特異的ハイブリダイゼーションを示した。最も陽性の細胞は、繊維芽細胞の形態を有していた。平滑筋細胞は陰性とみられた。
【０４３３】
要するに、この研究は、ヒトＷＩＳＰ-１ ＲＮＡの、組織修復及び／又はコラーゲン沈着に関与する間葉細胞での発現を示す。シグナルは特に、良性、炎症性条件（管破裂）のための、湿潤性胸癌細胞または組織破壊に隣接する良性の繊維芽細胞様細胞で強かった。なお、良性類骨（osteoid）の沈着は、ＲＮＡの強い発現に相関しているようであった。
【０４３４】
（３）マウスＷＩＳＰ-２
正常マウス組織での発現
マウス胎児組織：マウスＷＩＳＰ-２の発現は、Ｅ１５．５マウス胚の骨芽細胞において、発達している下顎骨内で観察された。
マウス成体組織：マウスＷＩＳＰ-２の発現は、起点の周囲の胃細胞、成体心臓の僧帽弁と三尖弁の臓弁膜尖（cusps）内で観察された。発現は、腎動脈の外膜細胞でも観察された。発現は、すべての動脈のこの部位に存在すると推測された。
すべての他の組織は陰性であった。
【０４３５】
Ｗｎｔ−１腫瘍での発現
結果は、試験したすべてのＷｎｔ−１腫瘍の支質で、マウスＷＩＳＰ-２の特異的発現を示した。オープンな小胞核を有する単核細胞、おそらくマクロファージの全体にシグナルが存在した。良性または悪性の上皮においていずれも発現はみられなかった。
【０４３６】
（４）ヒトＷＩＳＰ-２
ヒト組織での発現
ＷＩＳＰ-２をコードする遺伝子の強い発現が、正常成人皮膚の皮膚繊維芽細胞で観察された。さらに、２つの肝硬変の肝臓において、活性肝繊維症の部位で強い発現が観察された。適度な発現が、副腎皮質の束状帯細胞全体に見られた。この位置は、ヒトＷＩＳＰ-２の細胞外マトリックス形成またはターンオーバーにおける役割を支持している。
【０４３７】
ヒト胸癌および正常胸組織、および肺癌における発現
ヒトＷＩＳＰ-２は、試験した２つの胸腫瘍でヒトＷＩＳＰ-１（上述）と同様のハイブリダイゼーションパターンを示した。良性および悪性の上皮細胞では陰性であったが、間葉細胞、特に組織修復領域で、ジストロフィー骨形成を含めて、特異的ハイブリダイゼーションを示した。シグナルは、両プローブＷＩＳＰ-１とＷＩＳＰ-２で同じ細胞母集団に位置しているようだった。しかしながら、いくつかの領域で（胸癌０２）、ＷＩＳＰ-２のシグナルが、ヒトＷＩＳＰ-１よりも著しく強かった。最も陽性の細胞は、繊維芽細胞の形態を有していた。平滑筋細胞は陰性とみられた。ヒトＷＩＳＰ-２のシグナルは、肺腫瘍組織よりも強度が弱かった。しかしながら、この切片は、胸腫瘍スライドに比べて、より低い組織修復も示した。正常肺と腎組織は、ヒトＷＩＳＰ-１と同様に、ヒトＷＩＳ
Ｐ-２でも実質的には陰性であった。
【０４３８】
要するに、この研究は、ヒトＷＩＳＰ-１ ＲＮＡの、組織修復及び／又はコラーゲン沈着に関与する間葉細胞での発現を示す。シグナルは特に、良性、湿潤性条件（管破裂）のための、湿潤性胸癌細胞または組織破壊に隣接する良性の繊維芽細胞様細胞で強かった。なお、良性類骨（osteoid）の沈着は、ＲＮＡの強い発現に相関しているようであった。
【０４３９】
（５）ヒトＷＩＳＰ-３
正常成人と胎児組織およびヒト胸癌と正常胸組織および腸癌における発現
分析は、正常成人皮膚の皮膚繊維芽細胞で、および活性肝繊維症の部位の肝硬変肝臓で、ヒトＷＩＳＰ-３の強い発現を示す。この位置パターンは、この成長因子の細胞外マトリックス形成またはターンオーバーにおける役割を支持している。
【０４４０】
ヒトＷＩＳＰ-３のプローブは、多くの試験した組織で陰性であった。それは、骨肉腫の切片で、弱い、散在性の陽性を示した。いくつかの陽性細胞は、悪性細胞を示した。ＷＩＳＰ-３は、試験したすべての正常および胎児細胞で陰性であった。
【０４４１】
実施例１７：ＷＩＳＰポリペプチドの、内皮細胞成長のＶＥＧＦ−促進化増殖を阻害する能力
マウスとヒトのＷＩＳＰ-１とヒトのＷＩＳＰ-２ポリペプチドの、内皮細胞のＶＥＧＦ−促進増殖を阻害する能力をテストした。具体的には、ウシ副腎皮質毛細内皮細胞（ＡＣＥ）細胞（１次培養から、最大１２−１４継代）を９６ウェルマイクロタイタープレート（Amersham Life Science）に、３ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦが添加された、低グルコースＤＭＥＭ、１０％子ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１×pen/strept、およびファンギゾン（fungizone）の１００μＬ当たり５００細胞／ウェルの密度で平板培養した。対照は、そのうちいくつかがＶＥＧＦを含まなかった以外は、同様に平板培養した。マウスＷＩＳＰ-１、ＩｇＧに接合したヒトＷＩＳＰ-１、またはポリーＨｉｓに接合したヒトＷＩＳＰ-２（ＰＲＯ２６１）の試験サンプルを、１００μｌの容量で、最終容量２００μＬとなるように添加した。細胞は、５−７日間３７℃でインキュベートした。培地を吸引し、細胞を１×ＰＢＳで洗浄した。酸性ホスファターゼ反応混合物（１００μＬ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５、５、０．１％ ＴＲＩＴＯＮ−１００（商標）、１０ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート）を添加した。３７℃２時間のインキュベーションの後、反応を１０μＬ １Ｎ ＮａＯＨの添加により停止した。ＯＤを４０５ｎｍにおいてマイクロタイタープレートリーダーで測定した。対照は：細胞なし、細胞単独、細胞＋ＦＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）、細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）＋ＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）、細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）＋ＬＩＦ（５ｎｇ／ｍｌ）。（１ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＧＦ−βは、ＶＥＧＦ促進化細胞増殖の７０−９０％を阻害することが知られている）。
【０４４２】
その結果を、（１）促進されない細胞に対する、および（２）ＶＥＧＦ促進化活性の参照ＴＧＦ−β阻害に対する、酸性ホスファアーゼ活性のＯＤ４０５ｎｍでの測定により決めた、ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）促進化細胞増殖の阻害率を計算することにより評価した。結果は、以下の表１３に示すように、ＷＩＳＰポリペプチドの癌治療での、具体的には癌新脈管形成阻害における有用性を示している。表１３で示される数値（相対阻害）は、促進されない細胞に対する、マウスＷＩＳＰ-１、ヒトＷＩＳＰ-１−ＩｇＧ、およびヒトＷＩＳＰ-２−ポリーＨｉｓポリペプチドによるＶＥＧＦ−促進増殖の阻害率を計算し、ついでそのパーセントで、ＶＥＧＦ促進細胞増殖の７０−９０％を阻害することが知られている１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βで得られる阻害パーセントを割ることにより決められる。ヒトＷＩＳＰ-１およびヒトＷＩＳＰ-２は特に血管新生抑制剤（angiostatic agents）として有用である。
【０４４３】
表１３
ポリペプチド         濃度（ｎＭ ）     相対阻害
マウスＷＩＳＰ-１            ０．１         １１３
"                 １．０         １０８
"                 １０．０       １０９
ヒトＷＩＳＰ-１-IgG   １．１         １
"                 １１．０       ０．９５
"                 １１０．０     ０．９
ヒトＷＩＳＰ-２-ポリ-His      ０．０１％     ０．９５
"                 ０．０１％     １．１
"                 ０．１         ０．６２
"                 １．０         １．０３
"                 １．０         ０．５
"                 １．０         ０．６
【０４４４】
材料の寄託
以下の材料は、American Type Culture Collection, 2301 Parklawn Drive, Rockville, MD,USA (ATCC)に寄託されている。
材料                                ATCC寄託番号     寄託日
pRK5E.h.WIG-1.568.38                  209533      1997年12月10日
pRK5E.m.WIG-1.568.6his                       209537      1997年12月10日
プラスミド（ヒトＷＩＳＰ-２をコード） 209391      1997年10月17日
pRKE.m.WIG-2.1367.3                  209538      1997年12月10日
DNA56350-1176-2                             209706      1998年3月26日
DNA58800-1176-2                             209707      1998年3月26日
【０４４５】
これらの寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定およびそれに基づく規則の下で行われた（ブダペスト条約）。これは、寄託日から３０年間、寄託物の生存可能な培養物の維持を保証する。寄託物はブダペスト条約の下でＡＴＣＣにより入手可能であり、Genentech, Inc.とＡＴＣＣとの間の合意を得ることを条件として、直接関係する米国特許の発行、もしくは米国またはその他の国の早い方の特許出願の公開に基づいて、公衆に寄託物の培養物の子孫の永久的かつ無制限の利用可能性を保証し、そして、その子孫の入手を、３５ ＵＳＣ 第１２２条およびそれに準ずる長官規則（特に８８６ＯＧ６３８に関して３７ ＣＦＲ 第１．１４条を含む）に従って付与される米国特許商標庁長官によって定められた者に保証する。
【０４４６】
本願の譲受人は、寄託物の培養物が適切な条件下で培養された場合に死滅または損なわれた場合には、この材料を速やかに同一物で置き換えることに同意した。寄託材料の利用可能性は、その国の特許法に従って政府の権力の下に付与された権利に違反して本発明を実施するライセンスとして解釈されない。
【０４４７】
上記明細書は、当業者が本発明を十分に実施できるものと解する。寄託された実施態様は、本発明の一部の態様の単なる例示に過ぎないこと、並びに、機能的に等価なあらゆる構成物が本発明の範囲に含まれることから、本発明は、寄託された構成物により、範囲が制限されるものではない。ここに言う材料の寄託は、上記記述が、その最良の形態を含めた本発明のあらゆる態様の実施を可能にするのに不適切であることの承認、あるいは、それが示す特定の例示に請求の範囲を限定すると解釈されるとの承認を構成するものではない。実際に、ここに記載または示されたものに加えて、本発明の種々の変更が、上記記載から当業者にとって明白になり、添付された請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０４４８】
【図１】図１は、アミノ酸１から３６７（配列番号：１２）からの天然配列マウスＷＩＳＰ-１タンパク質の誘導アミノ酸配列と該タンパク質をコードしているヌクレオチド配列(及び相補体配列)(それぞれ配列番号：９と１０)を示す。１１０４-ｂｐコード化領域と３’非翻訳領域の５８４ｂｐがある。図中、アミノ酸１から２２は推定シグナル配列を形成し、アミノ酸２３から３６７は、潜在グリコシル化部位であるアミノ酸８６から８８、１４３から１４５、２８４から２８６、及び３４３から３４６を伴う推定成熟タンパク質（配列番号：１１）である。潜在タンパク質キナーゼＣリン酸化部位は、アミノ酸４３−４５，１５９−１６１，２３５−２３７，２９２−２９４，２９５−２９７，及び３４５−３４７である。潜在カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位は、アミノ酸４４−４７，１３１−１３４，１４５−１４８，及び３５８−３６１である。潜在ミリストイル化部位は、アミノ酸１８−２３，７２−７７，１２７−１３２，１４９−１５４，２３１−２３６及び２８９−２９４である。潜在アミド化部位は、アミノ酸２６９−２７２である。潜在原核生物膜リポタンパク質脂質接合部位は、アミノ酸１１３−１２３である。潜在von Willebrand C1ドメインは、アミノ酸１３０−１４６である。潜在トロンボスポンジン１ドメインは、アミノ酸２２３−２３７である。潜在ＣＴモジュールは、アミノ酸３０１−３１２である。潜在ＩＧＦ結合タンパク質共通部位は、アミノ酸７２−８０である。
【図２】図２は図１の配列の続きである。
【図３】図３は、アミノ酸配列１から２５１まで（配列番号：２０）の天然配列マウスＷＩＳＰ-２タンパク質の誘導アミノ酸配列とクローン１３６．７からの該タンパク質をコードしている核酸配列(及び相補配列)(それぞれ配列番号：１７と１８)を示す。コード化ヌクレオチドの７５６ｂｐと３’非翻訳領域の７２２ｂｐがある。図中、アミノ酸１から２３は推定シグナル配列を形成し；アミノ酸２４から２５１は、推定成熟タンパク質（配列番号：１９）である。潜在Ｎ-グリコシル化部位は、アミノ酸１９７−２００である。潜在グリコサミノグリカン接合部位は、アミノ酸８５−８８である。潜在タンパク質キナーゼＣリン酸化部位は、アミノ酸８５−８７及び１１２−１１４である。潜在Ｎ-ミリストイル化部位は、アミノ酸４９−５４，８１−８６，１２６−１３１，２１０−２１５，及び２４５−２５０である。潜在アミド化部位は、アミノ酸１０３−１０６である。潜在ホスホリパーゼＡ２アスパラギン酸活性部位は、アミノ酸１２０−１３０である。潜在ＩＧＦ結合タンパク質共通記号は、アミノ酸４９−６４である。潜在von Willebrand C1ドメインは、アミノ酸１０７−１２３である。潜在トロンボスポンジン１ドメインは、アミノ酸２０２−２１６である。潜在ＩＧＦ結合タンパク質共通部位は、アミノ酸４９−５７である。
【図４】図４は図３の配列の続きである。
【図５】図５は、アミノ酸配列１から３６７まで（配列番号：４）の天然配列ヒトＷＩＳＰ-１タンパク質の誘導アミノ酸配列と該タンパク質をコードしている核酸配列(及び相補配列)(それぞれ配列番号：１と２)を示す。このヒトクローン５６８．３８中のコード化領域の１１０４ｂｐと３’非翻訳領域の１６３８ｂｐがある。図中、アミノ酸１から２２は推定シグナル配列を形成し、アミノ酸２３から３６７は、潜在グリコシル化部位であるアミノ酸８５から８７、１４３から１４５、２８４から２８６、及び３４３から３４５を伴う、推定成熟タンパク質（配列番号：３）である。潜在ｃＡＭＰ-とｃＧＭＰ依存タンパク質キナーゼリン酸化部位は、アミノ酸１７１から１７４までである；潜在タンパク質キナーゼＣリン酸化部位は、アミノ酸４３−４５、２３５−２３７、２９２−２９４、及び３４５−３４７である。潜在カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位は、アミノ酸３０−３３、１４５−１４８、及び３５８−３６１である。潜在Ｎ-ミリストイル化部位は、アミノ酸７２−７７，１２７−１３２，１４９−１５４，２１０−２０６，２３１−２３６，２８９−２９４，及び３２７−３３２である。潜在アミド化部位は、アミノ酸２６９−２７２である。潜在原核生物膜リポタンパク質脂質接合部位は、アミノ酸１１３−１２３である。潜在von Willebrand C1ドメインは、アミノ酸１３０−１４６である。潜在トロンボスポンジン１ドメインは、アミノ酸２２３−２３７である。潜在ＣＴ(Ｃ末端)モジュールは、アミノ酸３０１−３１２である。潜在ＩＧＦ結合タンパク質共通部位は、アミノ酸７２−８０である。
【図６】図６は図５の配列の続きである。
【図７】図７は図６の配列の続きである。
【図８】図８は、アミノ酸配列１から２５０まで（配列番号：１６）の天然配列ヒトＷＩＳＰ-２タンパク質の誘導アミノ酸配列と該タンパク質をコードしている核酸配列(及び相補配列)(それぞれ配列番号：１３と１４)を示す。そのコード化領域は７５３ｂｐであり３’非翻訳領域は５１９ｂｐである。推定シグナル配列はアミノ酸残基１から２３までであり、推定成熟領域は、２４から２５０(配列番号：１５)までである。「UNQ228」及び／又は「DNA33473-seqmin」としてここで定義したクローン（配列番号：３８）は、配列番号：１３のヌクレオチド３４で始まる。潜在タンパク質キナーゼＣリン酸化部位は、アミノ酸４−６、１１８−１２０、及び２２７−２２９である。潜在カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位は、アミノ酸９８−１０１である。潜在Ｎ-ミリストイル化部位は、アミノ酸３−８，４９−５４，８１−８６，８５−９０，１２６−１３１，１６４−１６９，１６６−１７１，１６７−１７２，１８３−１８８，及び２０９−２１４である。潜在ＩＧＦ結合タンパク質共通記号は、アミノ酸４９−６４である。潜在von Willebrand C1ドメインは、アミノ酸１０７−１２３である。潜在トロンボスポンジン１ドメインは、アミノ酸２０１−２１５である。潜在ＩＧＦ結合タンパク質共通部位は、アミノ酸４９−５７である。
【図９】図９は図８の配列の続きである。
【図１０】図１０は、Incyteからの２０の別個に発現した配列標識のヌクレオチド配列から得られた「DNA30843」(配列番号：３９)と定義した841-bp共通ヌクレオチド配列を示す。他の配列とともにアライメントした場合、ＤＮＡ３０８４３は３ギャップを有する。それは４１１ｂｐ ｏｒｆ(+1)を有する。ＤＮＡ３０８４３は、ヒトＷＩＳＰ-２の単離のためのプローブを設計するために使用した。
【図１１】図１１は、アミノ酸配列１から３７２まで（配列番号：３３）の天然配列ヒトＷＩＳＰ-３タンパク質の誘導アミノ酸配列と該タンパク質をコードしている核酸配列(及び相補配列)(それぞれ配列番号：３０と３１)を示す。図中、アミノ酸１から３３は推定シグナル配列を形成し、アミノ酸３４から３７２は、潜在グリコシル化部位であるアミノ酸１９６から１９８と３２６から３２８を伴う推定成熟タンパク質(配列番号：３２)である。潜在タンパク質キナーゼＣリン酸化部位は、アミノ酸２０９−２１１，２４６−２４８，２７７−２７９，３０８−３１０，及び３４２−３４４である。潜在カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位は、アミノ酸４７−５０，２５４−２５７，及び２９３−２９６である。潜在Ｎ-ミリストイル化部位は、アミノ酸２１−２６，８９−９４，１３９−１４４，１６６−１７１，１８０−１８５，１８５−１９０，１８８−１９３，２４２−２４７，及び３０２−３０７である。潜在アミド化部位はアミノ酸１８８−１９１である。潜在原核生物膜リポタンパク質脂質接合部位は、アミノ酸１３０−１４０，１６０−１７０である。潜在ＩＧＦ結合タンパク質記号は、アミノ酸８９−１０４である。潜在ＩＧＦ結合タンパク質部位(前位置よりストリンジェントの劣る)は、アミノ酸８９−１０４である。
【図１２】図１２は図１１の配列の続きである。
【図１３】図１３は図１２の配列の続きである。
【図１４】図１４は、アミノ酸配列１から３５５まで（配列番号：３７）の天然配列ヒトＷＩＳＰ-３タンパク質の誘導アミノ酸配列と該タンパク質をコードしている核酸配列(及び相補配列)(それぞれ配列番号：３４と３５)を示す。このタンパク質は、より短い５’末端を持つ図１１−１３中に示したヌクレオチド配列のスプライス変異体であると確信される。図中、アミノ酸１から１５は推定シグナル配列を形成し、アミノ酸１６から３５５は、潜在グリコシル化部位であるアミノ酸１７８から１８０と３０８から３１０を伴う推定成熟タンパク質(配列番号：３６)である。潜在タンパク質キナーゼＣリン酸化部位は、アミノ酸１９１−１９３，２２８−２３０，２５９−２６１，２９０−２９２，及び３２４−３２６である。潜在カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位は、アミノ酸２９−３２，２３６−２３９，及び２７５−２７８である。潜在Ｎ-ミリストイル化部位は、アミノ酸３−８，７１−７６，１２１−１２６，１４８−１５３，１６２−１６７，１６７−１７２，１７０−１７５，２２４−２２９，及び２８４−２８９である。潜在アミド化部位はアミノ酸１７０−１７３である。潜在原核生物膜リポタンパク質脂質接合部位は、アミノ酸１１２−１２２，及び１４２−１５２である。潜在ＩＧＦ結合タンパク質記号は、アミノ酸７１−８７である。潜在ＩＧＦ結合タンパク質部位(前位置よりストリンジェントの劣る)は、アミノ酸７１−７９である。
【図１５】図１５は図１４の配列の続きである。
【図１６】図１６は図１５の配列の続きである。
【図１７】図１７は、ヒトとマウスＷＩＳＰ-１の完全長アミノ酸配列(それぞれ配列番号：４と１２)のアライメントを示す。
【図１８】図１８は、ヒトとマウスＷＩＳＰ-２の完全長アミノ酸配列(それぞれ配列番号：１６と２０)のアライメントを示す。
【図１９】図１９は、ヒトＷＩＳＰ-３の２のクローンのアミノ酸配列のアライメントを示す（それぞれ配列番号：３３と３７）。
【図２０】図２０は、ヒトＷＩＳＰ-１（配列番号：１のヌクレオチド８９−１１８８）とヒトＷＩＳＰ-３（配列番号：３０）のヌクレオチド配列のアライメントを示す。
【図２１】図２１は、図２０の配列の続きである。
【図２２】図２２は、図２１の配列の続きである。
【図２３】図２３は、ヒトＷＩＳＰ-１（配列番号：４）とヒトＷＩＳＰ-３(配列番号：３３)のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２４】図２４は、識別的発現の目的のために細胞を形質転換するために用いたベクターｐＢａｂｅ ｐｕｒｏ(5.1kb)の地図を示す。該ベクターは、独自の制限部位と多重制限部位の両方を含む。Ｗｎｔ-１クローニング用の変更型がここに示され、元のｐＢａｂｅ ｐｕｒｏベクター中のＳＶ４０プロモーター後のHindIII部位は取り外され且つ元のｐＢａｂｅ ｐｕｒｏベクターの多重クローニング部位に加えられている。Ｗｎｔ-１は、多重クローニング部位中のEcoRI-HindIIIからクローン化される。このベクターから得られた構築物は、アンピシリン(100μg/ml)中で選択され、培養中に感染した細胞は、1.0-2.5μg/mlのプロマイシン中で選択される。
【図２５】図２５は、ＷＩＳＰクローンを同定するための抑制サブトラクティブハイブリダイゼーションに用いた、PCR-SelectRｃＤＮＡ合成プライマー(配列番号：４０)、アダプター１と２(それぞれ配列番号：４１と４２)と該アダプターの相補配列(それぞれ配列番号：４３と４４)、ＰＣＲプライマー１(配列番号：４５)、ＰＣＲプライマー２(配列番号：４６)、ネスト化ＰＣＲプライマー１(配列番号：４７)、ネスト化ＰＣＲプライマー２(配列番号：４８)、制御プライマーＧ３ＰＤＨ５’プライマー(配列番号：４９)、及び制御プライマーＧ３ＰＤＨ３’プライマー(配列番号：５０)の配列を示す。該アダプターがRsaI-消化ｃＤＮＡに結紮される場合、RsaI部位が復元される。
【図２６】図２６は、ここでのＷＩＳＰ配列の全てをクローンするために用いたプラスミドｐＧＥＭ-Ｔのクローニング部位領域を示す(それぞれ５’と３’配列用の配列番号：５１と５２)。
【図２７】図２７は、哺乳動物細胞中でマウスＷＩＳＰ-１の発現用の発現プラスミドを作製するために用いられるプラスミドの配列(配列番号：５３)を示し、後者はpRK5.CMV.puro-dhfR.mＷＩＳＰ-１.6Hisと定義されている。
【図２８】図２８は図２７の配列の続きである。
【図２９】図２９は図２８の配列の続きである。
【図３０】図３０は図２９の配列の続きである。
【図３１】図３１は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中のマウスＷＩＳＰ-１ＤＮＡの発現用の発現プラスミドを作製するために用いられるプラスミドpb.PH.IgGの配列(配列番号：５４)を示す。
【図３２】図３２は図３１の配列の続きである。
【図３３】図３３は図３２の配列の続きである。
【図３４】図３４は図３３の配列の続きである。
【図３５】図３５はバキュロウイルス感染昆虫細胞中でマウスＷＩＳＰ-１の発現用の発現プラスミドを作製するために用いられるプラスミドpbPH.His.cの配列(配列番号：５５)を示し、後者はpbPH.mu.568.8his.baculoと定義されている。
【図３６】図３６は図３５の配列の続きである。
【図３７】図３７は図３６の配列の続きである。
【図３８】図３８は図３７の配列の続きである。
【図３９】図３９は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いた、ヒトＴＮＦについて、コントロールとして９の結腸癌細胞系及び１０の正常なヒトドナー(Nor Hu)の血液からのＤＮＡ中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図４０】図４０は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いた、ヒトＷＩＳＰ-１について、コントロールとして９の結腸癌細胞系及び１０の正常なヒトドナー(Nor Hu)の血液からのＤＮＡ中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図４１】図４１は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたＬｙｒａについて、コントロールとして９の結腸癌細胞系及び１０の正常なヒトドナー(Nor Hu)の血液からのＤＮＡ中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図４２】図４２は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたヒトＡｐｏ２について、コントロールとして９の結腸癌細胞系及び１０の正常なヒトドナー(Nor Hu)の血液からのＤＮＡ中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図４３】図４３は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたヒトＣＤＲ１について、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図４４】図４４は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたｈｕＦＡＳについて、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図４５】図４５は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたヒトＷＩＳＰ-２について、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図４６】図４６は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたＡｐｏ３について、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図４７】図４７は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いた、ヒトＷＩＳＰ-１ｃについて、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図４８】図４８は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いた、ヒトＷＩＳＰ-１ｂについて、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図４９】図４９は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いた、ヒトＷＩＳＰ-１ａについて、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図５０】図５０は、図４７−４９の平均を示す。
【図５１】図５１は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いた、ヒトＷＩＳＰ-２ｃについて、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図５２】図５２は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いた、ヒトＷＩＳＰ-２ｂについて、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図５３】図５３は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いた、ヒトＷＩＳＰ-２ａについて、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図５４】図５４は、図５１−５３の平均を示す。
【図５５】図５５は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたヒトＤＲ５ａについて、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図５６】図５６は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたヒトＤＲ５ｂについて、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図５７】図５７は、図５５と５６の平均を示す。
【図５８】図５８は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたｃ-ｍｙｃ（ａ１）について、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図５９】図５９は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたｃ-ｍｙｃ（ｂ１）について、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図６０】図６０は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたｃ-ｍｙｃ（ｂ）について、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図６１】図６１は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたｃ-ｍｙｃ（ａ）について、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図６２】図６２は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたヒトＷＩＳＰ-１（ａ）について、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図６３】図６３は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたヒトＷＩＳＰ-１（ｂ）について、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図６４】図６４は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたヒトＷＩＳＰ-２（ａ）について、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図６５】図６５は、ゲノム増幅を試験するためのABI Prism 7700TMSequence Detection System法を用いたヒトＷＩＳＰ-２（ｂ）について、コントロールとして９の結腸癌細胞系及びNor Hu中のデルタＣＴのグラフを示す。
【図６６】図６６は、完全長ヒトＷＩＳＰ-１ＤＮＡを得るためのプロセスにおいてヒト肺ライブラリーから単離した最初のクローンであるクローン５６８．１５Ａから得たプローブでのスクリーニングによって得たヒトＷＩＳＰ-１の潜在スプライス変異体、クローン５６８．１３の配列(配列番号：２３)を示す。
【図６７】図６７は、クローン５６８．１５Ａから得たプローブでのスクリーニングによって得られた、５’末端のみ、潜在ヒトＷＩＳＰ-１スプライス変異体、クローン５６８．１Ａの配列(配列番号：２４)を示す。
【図６８】図６８は、クローン５６８．１５Ａから得たプローブでのスクリーニングによって得られた、５’末端のみ、潜在ヒトＷＩＳＰ-１スプライス変異体、クローン５６８．３９の配列(配列番号：２５)を示す。
【図６９】図６９は、クローン５６８．１５Ａから得たプローブでのスクリーニングによって得られた潜在ヒトＷＩＳＰ-１スプライス変異体、クローン５６８．４Ａの配列(配列番号：２６)を示す。
【図７０】図７０は、クローン５６８．１５Ａから得たプローブでのスクリーニングによって得られた、５’末端のみ、潜在ヒトＷＩＳＰ-１スプライス変異体、クローン５６８．４Ａの配列(配列番号：２７)を示す。
【図７１】図７１は、クローン５６８．１５Ａから得たプローブでのスクリーニングによって得られた、５’末端のみ、潜在ヒトＷＩＳＰ-１スプライス変異体、クローン５６８．６Ｂの配列(配列番号：２８)を示す。
【図７２】図７２は、クローン５６８．１５Ａから得たプローブでのスクリーニングによって得られた、５’末端のみ、潜在ヒトＷＩＳＰ-１スプライス変異体、クローン５６８．７の配列(配列番号：２９)を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【配列表】
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