(57)【要約】【課題】本発明の目的は、測定の高速化、測定システムの小型化、操作の簡便化などのメリットがあるホモジニアス蛍光法を測定原理とし、発光法同等以上の検出感度を有する高感度バイオセンサーを提供することである。【解決手段】本発明のバイオセンサーチップは、粉状フォトニック結晶（PC）が溶媒（S）中に分散された試料液(SL)が、励起光（L）を透過する材料から構成される槽内に満たされ、粉状フォトニック結晶（PC）が試料液(SL)中の被測定分子(M)と特異的に結合するリガンド分子（A）を表面に有しかつ蛍光物質（F）を含有し、励起光（L）が照射される槽の内壁に固定化されたリガンド分子（B）と試料液(SL)中の被測定分子(M)を介して粉状フォトニック結晶（PC）のリガンド分子（A）が結合することにより、蛍光法で試料液(SL)中の被測定分子(M)を高感度に検出することを特徴とする。【選択図】図２
2009092616.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉状フォトニック結晶（PC）が溶媒（S）中に分散された試料液(SL)が、励起光（L）を透過する材料から構成される槽内に満たされ、粉状フォトニック結晶（PC）が試料液(SL)中の被測定分子(M)と特異的に結合するリガンド分子（A）を表面に有しかつ蛍光物質（F）を含有し、励起光（L）が照射される槽の内壁に固定化されたリガンド分子（B）と試料液(SL)中の被測定分子(M)を介して粉状フォトニック結晶（PC）のリガンド分子（A）が結合することにより、蛍光法で試料液(SL)中の被測定分子(M)を高感度に検出することを特徴とするバイオセンサーチップ。
【請求項２】
粉状フォトニック結晶（PC）の数平均粒子径が、0.3〜20μmである請求項１に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項３】
粉状フォトニック結晶（PC）が、微粒子集積体（PPC）又は多層構造球状粒子（LPC）である請求項1又は2に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項４】
リガンド分子（A）及びリガンド分子（B）が免疫蛋白質である請求項1〜3のいずれか1項に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項５】
被測定分子(M)が粉状フォトニック結晶（PC）表面のリガンド分子（A）に結合する工程1、被測定分子(M)を表面に有する粉状フォトニック結晶（PC）が被測定分子(M)を介してリガンド分子（B）に結合される工程2、及び励起光（L）の照射部位（R）に励起光（L)が照射され被測定分子(M)の量に応じた蛍光シグナルを観測する工程3を含む請求項1〜4のいずれか1項に記載のバイオセンサーチップを使用した被測定分子(M)の検出方法。
【請求項６】
励起光（L）として中心発振波長350〜550nmのレーザー光を使用する請求項5に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量化学物質測定、創薬分野等の研究開発や臨床診断分野（イムノアッセイなど）において使用されるバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、特にバイオメディカルの分野において、遺伝子解析や蛋白質の機能解明等の基礎研究、解析したデーターを利用する新薬開発、癌、ホルモン、感染症などの臨床診断などの用途で各種蛍光法や発光法が広く使用されている。
蛍光法は目的分子によらない測定チップなどの非特異的な蛍光の影響等から、発光法よりも検出感度が低いため、バイオメディカル分野のなかでも特に高感度測定が要求されるイムノアッセイ等の分野においては発光法が主流となっている。
一方、蛍光法によれば、B/F分離不要のホモジニアスな測定が可能であり、測定の高速化、測定システムの小型化、操作の簡便化などを実現することができるため、ホモジニアス蛍光法の検出感度が向上できれば、発光法に対するメリットは大きい。
【０００３】
ホモジニアス蛍光法の高感度化手法として、エバネッセンス波蛍光イムノアッセイや蛍光エネルギー転移イムノアッセイ、蛍光偏光イムノアッセイなどが開発されている（特許文献1、非特許文献1、非特許文献2）。
エバネッセンス波蛍光免疫法は、反応キュベットの表面から染み出る光であるエバネッセント波を利用するホモジニアス蛍光法である。プラスチック内を全反射させながら励起光を通すと、反応キュベットの表面近傍にエバネッセント波が染み出て、目的抗原を介して該表面に結合された蛍光標識を選択的に励起する。従って、遊離の蛍光標識はキュベットの表面から離れているため、B/F分離不要なホモジニアス測定が可能となる。
蛍光エネルギー転移イムノアッセイは、アクセプターとドナーの2種類の蛍光標識を使用して、免疫反応により両者が近接した場合にアクセプターからドナーに蛍光エネルギーが移動する現象を利用したホモジニアス測定法である。
蛍光偏光イムノアッセイは、蛍光標識抗原と抗原が結合していない場合と結合した場合で偏光度が異なる現象を利用したホモジニアス測定法である。
いずれの方法も、通常の蛍光法よりも検出感度が高く、特にエバネッセンス波蛍光イムノアッセイは極めて高感度な蛍光法である。しかし、ケミルミ法や発光酵素イムノアセイ法などの発光法の検出感度レベルには1桁〜2桁程度及ばないのが現状である。また、蛍光エネルギー転移イムノアッセイは試薬の調整が難しく、蛍光偏光イムノアッセイは分子量の大きな抗原は定量できないなど検出感度以外の課題も有している。
【０００４】
【特許文献１】特開平07-063756
【非特許文献１】臨床検査  vol47 no13 p1611
【非特許文献２】臨床検査  vol47 no13 p1599
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
即ち、本発明の目的は、測定の高速化、測定システムの小型化、操作の簡便化などのメリットがあるホモジニアス蛍光法を測定原理とし、発光法同等以上の検出感度を有する高感度バイオセンサーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のバイオセンサーチップは、粉状フォトニック結晶（PC）が溶媒（S）中に分散された試料液(SL)が、励起光（L）を透過する材料から構成される槽内に満たされ、粉状フォトニック結晶（PC）が試料液(SL)中の被測定分子(M)と特異的に結合するリガンド分子（A）を表面に有しかつ蛍光物質（F）を含有し、励起光（L）が照射される槽の内壁に固定化されたリガンド分子（B）と試料液(SL)中の被測定分子(M)を介して粉状フォトニック結晶（PC）のリガンド分子（A）が結合することにより、蛍光法で試料液(SL)中の被測定分子(M)を高感度に検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のバイオセンサーによれば、発光法同等以上の検出感度を有するホモジニアスな測定が可能である。即ち、測定の高速化、測定システムの小型化、操作の簡便化といったホモジニアス測定に由来する効果と高感度検出とを両立することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明においてフォトニック結晶とは、光の波長と同程度の周期的な屈折率変化を有する構造体を意味し、明確なフォトニックバンドギャップを有する必要はない。周期的な屈折率変化はフォトニック結晶を構成する２種類以上の材料により決定される。
【０００９】
フォトニックバンドギャップとは、電磁波に対するバンドギャップであり、電磁波の絶縁帯域を意味する。従って、フォトニック結晶の内部で発生した電磁波は、結晶内部において反射反復して閉じ込められる。
フォトニックバンドギャップによる電磁波の反射は、ブラック反射を原理とするため、通常の鏡のように表面のみで反射されるわけではなく、何層かの結晶面において反射される。真球状微粒子を集積して作製されるフォトニック結晶の場合には、反射される電磁波は次式に従う。
λmax＝2ｄ（n2-sin2θ）1/2
ここで、λmaxは反射光のピーク波長、ｄは真球状微粒子の粒径、nはフォトニック結晶の屈折率、θは入射角度である。
フォトニックバンドギャップの位置は、フォトニック結晶の反射スペクトルを測定する事により容易に特定する事ができる。反射スペクトルのピークが現れる波長領域がフォトニックバンドギャップの位置である。反射スペクトルは、顕微紫外可視分光光度計MSV-350（日本分光社製）などを使用して測定することができる。
【００１０】
特定波長の電磁波としては、γ線、X線、紫外線、可視光線、赤外線、ミリ波、マイクロ波等が挙げられる。本発明においては、バイオメディカル分野等に適用することを目的とするため、紫外線、可視光線、近赤外線に対応するフォトニックバンドギャップを有するフォトニック結晶を使用することが好ましく、更に好ましくは、波長100〜1000nmの紫外線、可視光線、近赤外線に対応するものであり、特に好ましくは、波長400〜800nmの可視光線に対応するものである。
【００１１】
一方、明確なフォトニックバンドギャップを有さない場合或いはフォトニックバンドギャップに対応しない電磁波（以下、光とする）を扱う場合においても、光の波長と同程度の周期的な屈折率変化を有する構造があれば、拡散反射等の反射が起こり、結晶内部で発生した光は反射反復して閉じ込められる。
ここで明確なフォトニックバンドギャップを有さない場合とは、明確な反射スペクトルのピークが観測できない場合を意味し、フォトニックバンドギャップに対応しない光を扱う場合とは、明確な反射スペクトルのピークは存在するが、そのピーク波長とは重ならない波長の光を取り扱う場合を意味する。
光の波長と同程度の周期的な屈折率変化を有する構造体であって、フォトニックバンドギャップを有さない場合とは、周期構造の乱れが大きい場合や屈折率の変化度即ち屈折率コントラストが小さい場合などが挙げられる。
光の閉じ込め効果は、フォトニック結晶の屈折率コントラストが高いほど向上し、更にはフォトニックバンドギャップを利用した方がより向上する。
【００１２】
フォトニック結晶の内部で発生した光の閉じ込め効果が高ければ、フォトニック結晶が光共振器として機能し、一定の条件を満たすことにより非線形的な蛍光シグナルの増幅（以下、レーザー発振とも称する）が起こる。即ち、本発明のバイオセンサーチップが被測定分子（M）を高感度に検出できる理由はこのレーザー発振現象による。ここでレーザーとは、通常定義されるレーザーと同義であり、レーザー発振の原理も同様である。また蛍光シグナルとは、粉状フォトニック結晶（PC）に含有される蛍光物質（F）から発生する光であり、励起光（L）が蛍光物質（F）に照射・吸収されることにより発生する。
【００１３】
蛍光法は、通常、被測定分子（M）に蛍光標識を付け、該蛍光標識から発生する蛍光シグナルを観測することにより被測定分子（M）を検出する。蛍光標識の数は、被測定分子（M）の量に比例して多くなり定量測定が可能となる。本発明においては粉状フォトニック結晶（PC）が蛍光標識である。
レーザー発振が起こると、通常の蛍光シグナル強度よりも数千倍〜数万倍強い蛍光シグナルを観測することが出来る。従って、被測定分子（M）が極微量で蛍光標識即ち粉状フォトニック結晶（PC）の数が少ない場合においても強い蛍光シグナルを観測することが可能となる。
【００１４】
蛍光シグナルは、公知の蛍光測定装置にて測定することができ、通常は光電子増倍管を検出器として使用し、フォトンカウンティング法により蛍光量が測定される。フォトンカウンティング法による蛍光測定の検出限界感度は、検出器に導入される光子の数、即ち、蛍光量とノイズである暗電流量によって決定される。本発明においては、蛍光量を大幅に増幅して高感度検出を実現する。勿論蛍光シグナルが強いために、非特異的な蛍光との差も大きく、蛍光法の欠点を十分に克服する。またレーザー発振が起こると、後述するようにブランクの蛍光シグナルも低減でき、ホモジニアスで高感度な検出が可能となる。
本発明のバイオセンサーチップにおいてレーザー発振を起こすには、粉状フォトニック結晶（PC）の存在が不可欠であり、粉状フォトニック結晶（PC）の蛍光閉じ込め効率、励起光強度、蛍光物質（F）の種類や濃度が重要な因子となり、蛍光閉じ込め効率及び励起高強度が高い方がレーザー発振が起こりやすい。また、量子効率が高い蛍光物質（F）を使用し、その濃度は10-3モル/cm3程度であることが好ましい。
【００１５】
粉状フォトニック結晶（PC）は、２種類以上の材料から構成される。２種類以上の材料は屈折率が異なる材料である事を要求し、一方が無形の液状物であっても良い。
粉状フォトニック結晶（PC）の構成材料としては、有機化合物、無機化合物のいずれも使用することができる。構成材料の屈折率は、蛍光シグナルの増幅倍率向上の観点等から、一方の屈折率が高く、一方が低いことが好ましい。即ち屈折率のコントラストが高いことが好ましく、具体的には屈折率コントラストが１．２以上であることが好ましく、更に好ましくは１．２５以上、より好ましくは１．３以上である。ここで屈折率コントラストとは、屈折率が高い方の構成材料の屈折率／屈折率が低い方の構成材料の屈折率で定義される。
加えて、構成材料は後述する励起光（Ｌ）の波長領域において、透明性が高いことが好ましい。透明性が高ければ、励起光（L）を吸収することがなく、励起効率を高めることができるからである。
また、両者の屈折率の組み合わせによって、上式のフォトニック結晶の屈折率nが変化するので、閉じ込められる光の波長が変化する。  
【００１６】
有機化合物としては、各種ポリマーを使用することが好ましく、開環重合系ポリマー、重付加系ポリマー、重縮合系ポリマー、ビニル重合系ポリマーなどの合成ポリマー、多糖類（セルロース、アミロース、アミロペクチン、キトサン、キチン、アラミド繊維など）、脂質（リン脂質、糖脂質、コレステロールなど）、各種ポリペプチド（コラーゲンなど）などの天然ポリマー等が挙げられる。
開環重合系ポリマー、重付加系ポリマー、重縮合系ポリマーなどの非ビニル重合系ポリマーとしては、ウレタン樹脂、ウレア樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエーテル樹脂等が挙げられる。
【００１７】
ビニル重合系ポリマーは、ビニル基を有するモノマーを構成単位とするポリマーであり、
シアノ基含有ビニルモノマー、（メタ）アクリレート（アクリル樹脂）、カルボキシル基含有ビニルモノマー、芳香族ビニル炭化水素、脂肪族ビニル炭化水素、脂環式ビニル炭化水素、（メタ）アクリルアミド、ビニルスルホン酸、ビニルケトン、多官能モノマー、フッ素系モノマー等を構成単位として使用することができる。
後述の真球状微粒子（P）をフォトニック結晶の構成材料として使用する場合には、専ら、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、これらの構成モノマーとカルボキシル基含有ビニルモノマー、多官能モノマーなどとの共重合体が使用される。市販されている単分散ポリスチレン系微粒子を使用することもできる。
【００１８】
無機化合物としては、天然物、天然物の変性物及び合成物（精製物を含む）のいずれも使用することができるが、生産ロットのブレ防止等の観点から、合成物であることが好ましい。例えば、金属化合物や有機物を前駆体とする炭化物等が挙げられる。  
金属化合物としては、元素の周期率表において、１族〜１６族の金属酸化物（酸化チタン、酸化ケイ素（シリカ）、酸化亜鉛、酸化アルミニウム、酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化バナジウム、及び酸化インジウム等）、金属硫化物（硫化銅、硫化亜鉛、硫化鉛、硫化ニッケル及び硫化白金等）、金属ハロゲン化物（フッ化カルシウム、フッ化スズ及びフッ化カリウム等）、金属炭化物（炭化カルシウム、炭化チタン、炭化鉄及び炭化ナトリウム等）、金属窒化物（窒化アルミニウム、窒化クロム、チッ化ケイ素、窒化ゲルマニウム及び窒化コバルト等）、金属塩（チタン酸塩（チタン酸バリウム、チタン酸マグネシウム、チタン酸カリウム等）、アルミン酸塩（アルミン酸イットリウム（YAG）等）、これらの固溶体（チタン酸ジルコン酸ランタン鉛等）などが挙げられる。
これらのうち、透明性や屈折率、製造容易性などの観点から、金属酸化物が好ましく、特に好ましくは、酸化チタン、ジルコニア、シリカである。市販されている単分散シリカ微粒子を使用することもできる。
【００１９】
本発明のフォトニック結晶は、粉状であることが要求される。粉状とは、微細である事を意味し、数平均粒子径が20μm以下である事が好ましい。肉眼で確認できるサイズのフォトニック結晶は本発明における粉状フォトニック結晶（PC）には該当せず、サイズの上限はリガンド分子（B）と被測定分子(M)を介して粉状フォトニック結晶（PC）のリガンド分子（A）とが結合可能なサイズから決定される。粉状フォトニック結晶（PC）のサイズが大きくなると、槽内の緩やかな攪拌等によっても粉状フォトニック結晶（PC）が受ける力が大きくなり、リガンド分子（B）とリガンド分子（A）との結合外れる、即ち蛍光標識である粉状フォトニック結晶（PC）が外れるためバイオセンサーとして機能しなくなる。
従って、粉状フォトニック結晶（PC）のサイズの上限はその比重や溶媒（S）の種類などによっても多少異なるため、明確な数値を用いて上限を規定することは困難であるが、数平均粒子径が0.3〜20μmであることが好ましく、更に好ましくは0.5〜10μmであり、特に好ましくは0.7〜7μmである。粉状フォトニック結晶（PC）のサイズの下限は、蛍光シグナルの増幅倍率向上の観点から決定され、小さくなりすぎると光共振器としての機能が失われ蛍光シグナルの増幅が観測されない。
粉状フォトニック結晶（PC）の形状は、球状、板状、針状など特に制限されるものではないが、球状又は板状であることが好ましい。
【００２０】
粉状フォトニック結晶（PC）の作製方法としては、マイクロマニュピュレーター等を使用して構成単位を1個ずつ集積する方法や構成単位として真球状微粒子（P）を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法が挙げられる。
いずれの方法においても、バルク状のフォトニック結晶を作製した後に破砕やエッチングなどにより微細化して粉状フォトニック結晶（PC）を作製する2ステップの作製方法或いは初めから粉状フォトニック結晶（PC）を作製する１ステップの作製方法をとることが出来る。
マイクロマニュピュレーター等を使用して構成単位を1個ずつ集積する方法としては、構成単位、具体的には、公知の微細加工技術（リソグラフィー及びエッチング、レーザー加工等）により作製した金属化合物や合成ポリマーからなる柱状体や板状体を電子顕微鏡等で確認しながら1個ずつ集積していく方法が挙げられる。この方法によれば、反射率の極めて高いフォトニック結晶を作製することが可能であるが、生産速度が極めて遅く、産業的に利用できる方法ではない。
【００２１】
一方、構成単位として真球状微粒子（P）を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法は、電子顕微鏡等で確認しながら集積する必要がなく、集積ドライビングフォースを適切に選択すれば、極めて容易に大量生産することができるため前者の方法よりも好ましい。この方法によれば、フォトニック結晶は六方最密充填構造及び／又は立方最密充填構造からなる微粒子集積体（PPC）である。
ある特定形状のテンプレート基板を使用する場合には、選択的に立方最密充填構造が得られる。例えば、図1に示す基板表面に対して正確に54.7°の角度をなす逆ピラミッド型からなるテンプレート基板に真球状微粒子（P）を集積した場合である。このテンプレート基板は電子線リソグラフィーと異方性エッチングにより作製することができる。具体的には、シリコン基板状に塗布したレジスト膜を電子線によりパターンニング（電子線リソグラフィー）した後、水酸化カリウム水溶液にて100面を選択的に溶解（異方性エッチング）することにより作製できる。
【００２２】
この微粒子集積体（PPC）からなるフォトニック結晶を鋳型として、後述の方法において、逆オパール構造のフォトニック結晶を作製することができる。逆オパール構造とは、微粒子集積体（PPC）の間隙に構成材料の前駆体などを充填した後、微粒子集積体（PPC）を取り除くことにより形成される構造であり、微粒子集積体（PPC）をちょうど逆にした構造である。
ここで立方最密充填構造及び六方最密充填構造とは、いずれも最密充填構造であって、充填率は74体積％である。
【００２３】
立方最密充填構造は、面心立方格子構造とも呼ばれ、正四角形の単位格子の各頂点および各面の中心に粒子が位置し、最稠密面をABCABCABCの順に重ねた構造となっている。
六方最密充填構造は、単位格子を正六角柱で表し、この正六角柱の上面および底面の各角および中心と、六角柱の内部で高さ 1/2 のところに 3 つの粒子が存在する。底面の中心に位置する原子は、底面の角の 6 粒子および上下の各3粒子（計 12 粒子）と接しており、最稠密面をABABABの順に重ねた構造となっている。
また、バルク状の構成材料をレーザーにより直接加工する方法もフォトニック結晶の作製方法として挙げることができる。具体的な方法としては、感光性レジストに短パルスレーザーを照射することによりレーザーを照射した部分のみを選択的に硬化させて周期構造を得る方法（特開2004-126312に記載の方法）などが挙げられる。
【００２４】
真球状微粒子（P）を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法としては、公知の方法を使用することができる。
真球状微粒子（P）を集積する方法としては、毛細管力、遠心力をドライビングフォースとして使用する方法が、生産性、均一性、厚膜化などの観点から優れている。
真球状微粒子（P）の数平均粒子径は、可視光域にフォトニックバンドギャップを設定する観点等から、0.1〜0.5μmであることが好ましく、更に好ましくは0.12〜0.4μm、特に好ましくは0.12〜0.3μmである。真球状微粒子（P）の数平均粒子径は、動的光散乱法などによって測定することができ、DLS-8000(大塚電子社製)、LB-550（堀場社製）などを使用することができる。
【００２５】
毛細管力を使用した集積方法としては、細い管の中の溶媒が管の中を上昇する現象（毛細管現象）を使用する集積方法である。溶媒が上昇する高さは、溶媒の表面張力、管の濡れ易さ、溶媒の密度等によって決まり、次式により計算することができる。
h= 2Tcosθ/pgr
ここでTは表面張力(N/m)、θは接触角、pは溶媒の密度(kg/m3)、gは重力加速度(m/s2)
、rは管の半径(m)である。
【００２６】
溶媒中に分散されている真球状微粒子（P）は溶媒の上昇により一緒に上昇し、管の上から順に集積されていく。真球状粒子（P）の集積は、溶媒が蒸発することにより発生する液架橋力によって最終的に行われるが、毛細管、所謂、キャピラリーの形状制御効果と垂直方向に働きやすい方向の揃った液架橋力ため、均一性の高いフォトニック結晶を作製することが可能な方法である。
この方法に使用できる容器としては、ガラスや石英製のキャピラリーを使用することが好ましく、キャピラリーの断面形状は、円状や四角形状を使用することができる。
具体的な方法としては、キャピラリーを真球状微粒子（P）のスラリーに片端を浸漬するだけである。また、管表面の親疎水性を調整する等集積の条件を最適化することにより、更に均一性の高いフォトニック結晶を作製することができる。
【００２７】
遠心力を使用した集積方法は、遠心力を使用することにより、フォトニック結晶の生産効率を高め、更に従来の方法では作製することが困難である均一性の高い周期構造単位の小さなフォトニック結晶を作製することが可能な方法である。例えば、遠心力を10Ｇ加えると、集積速度が10倍となる。また、5000Ｇ程度の強い遠心力を加えると、粒子径がサブミクロンサイズの小さな粒子も容易に集積することが可能でる。
遠心力とは、遠心力中心から外へと向かう方向の慣性力であり、次式で与えられる。  
F  =  ｍｒω２
ここで、ｍは真球状微粒子（P）の質量、ｒは遠心場の中心から真球状微粒子（P）までの距離、ωは角速度（回転数×2π）である。ｒは、正確には遠心場の中心（遠心機の中心）から真球状微粒子（P）までの距離であるが、粒子は常に移動するので、便宜上遠心機の中心から基板等までの距離として扱う。
使用する遠心力の強さとしては、粒子径や粒子の比重により好ましい強さは異なるが、生産速度向上の観点からは強い方がよい。但し、規則性の高い均一な真球状微粒子（P）の集積体を作製するためには、遠心力の強さだけでなく、処理時間、粒子スラリーの濃度、溶媒の蒸発速度等のパラメーターを最適化する必要がある。
【００２８】
前述方法により作製した微粒子集積体（PPC）のフォトニック結晶を鋳型として、逆オパール構造のフォトニック結晶を作製することができる。ポリスチレン微粒子の集積体を鋳型として、酸化チタンを構成材料する逆オパール構造のフォトニック結晶を作製する方法を以下に説明する。
ポリスチレン微粒子の集積体の間隙に酸化チタンの前駆体であるエタノール、チタニウムテトライソプロポキシド、少量の水から作成されたチタニアゾルを充填し、エタノール及び水を乾燥除去した後、ポリスチレン微粒子を除去することにより酸化チタンからなる逆オパール構造体を作製することができる。ポリスチレン微粒子の除去方法としては、400〜500℃程度に加熱してポリスチレン微粒子を熱分解してガス化する方法やトルエンやジメチルスルホキシド等の有機溶剤を使用して溶解除去する方法が挙げられる。酸化チタンを構成材料する逆オパール構造のフォトニック結晶は、焼成温度を高くすることにより屈折率を高めることができ、５００℃で焼成すれば、２．５程度の屈折率となり、９００℃で焼成すれば、２．８程度の屈折率が得られる。これは、酸化チタンの結晶構造が、アモルファス、アナターゼ、ルチルと変化するためである。
【００２９】
一方、シリカ微粒子の集積体のフォトニック結晶を鋳型として、ポリスチレンを構成材料とする逆オパール構造のフォトニック結晶を作製することもできる。シリカ微粒子の集積体の間隙に構成材料の原料であるスチレンモノマー及び重合開始剤を充填し、加熱することによりスチレンを重合しポリマー化した後、シリカ微粒子を除去することによりポリスチレンからなる逆オパール構造体を作製することができる。シリカ微粒子の除去方法としては、フッ酸に浸漬してシリカ微粒子を溶解除去する方法が挙げられる。
【００３０】
前述の方法等により作製したバルク状のフォトニック結晶を微細化して粉状フォトニック結晶（PC）とする方法としては、ボールミル等の各種粉砕機を使用して粉砕する方法やレーザー加工、ドライエッチング等の微細加工技術を使用して切断する方法などが挙げられる。特に、ドライエッチングを使用すると微細化の精度が高く、サイズの揃った粉状フォトニック結晶（PC）を作製できるため好ましい。
【００３１】
一方、微粒子集積体（PPC）型の粉状フォトニック結晶（PC）を１ステップで作製する方法としては、予め作製したい粉状フォトニック結晶のサイズと同一の微細な穴を多数開けたテンプレート基板（例えば、前述の逆ピラミッド型テンプレート基板）を使用してそこに真球状微粒子（P）を集積する方法、エレクトロスプレーを使用した方法、特殊加工処理した基板を使用してコロイド粒子の自己組織化を利用する方法、コロイド粒子の水分散体をオイル中に分散してエマルジョン化した後水を除去する方法などが挙げられる。これらの公知の方法を使用することもできるが、簡便性、量産性、環境負荷低減の観点等から、噴霧乾燥を利用する方法が好ましい。
いずれの方法においても粉状フォトニック結晶（PC）の構成単位である単分散微粒子（P）の分散液を準備し、該分散液をまずは液滴化し、その後該分散液中の液体を除去する点は共通する。従って、大きくは、液滴化する際に該分散液を分散或いは浸漬する媒体、液滴化に利用する物理的な力が異なるだけである。
【００３２】
粉状フォトニック結晶（PC）の数平均粒子径の制御因子としては、単分散微粒子（P）の分散液を液滴化する時の物理的な力の強さ（せん断力）、該分散液の粘度、単分散微粒子（P）の分散液の固形分濃度、界面活性剤の種類や添加量（エマルジョンを利用する製造方法）が挙げられる。数平均粒子径を小さくしたい場合には、単分散微粒子（P）の分散液を液滴化する時のせん断力を高めればよい。一般的には、単分散微粒子（P）の分散液の固形分濃度を低くした場合も数平均粒子径は小さくなる。
噴霧乾燥を利用する方法によれば、単分散微粒子（P）及びバインダー物質が含まれる混合液を作製し、該混合液を気相中に噴霧することにより粉状フォトニック結晶（PC）を製造する。
【００３３】
バインダー物質は、単分散微粒子（P）を固定化する働きをし、バイオセンサーとしての使用に耐えうる粉状フォトニック結晶（PC）の機械的強度を確保する。バインダー物質を使用する以外にも、単分散微粒子（P）同士の融着による接着などにより、粉状フォトニック結晶（PC）の機械的強度を高めることができるが、バインダー物質を使用する方法が最も好ましい。バインダー物質としては、水溶性ポリマー(R)及びシラン系化合物（S）からなる群より選ばれる少なくとも１種からなるものを使用することが好ましい。
また、バインダー物質は、偏在することなく個々の単分散微粒子（P）の表面において、均等な厚みをもってコーティングされることが好ましい。特に、噴霧乾燥を利用した方法によれば均等な厚みをもってコーティングすることが可能である。
【００３４】
水溶性ポリマー(R) としては、水又は水系溶媒に溶解するものであれば種々のポリマーを使用することができる。ここで、水系溶媒としては、水と水に溶解する各種溶剤（低級アルコール、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、メチルエチルケトン、酢酸エチルなど）の混合物を意味する。
水溶性ポリマー(R)の具体例としては、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルピロリドン（POP）などが挙げられる。機械的強度向上の観点等から、水溶性ポリマー（R）としてはポリビニルアルコール（PVA）を使用することが好ましい。
ケイ素系化合物（S）としては、シラン（メチルトリメトキシシラン、ジメチルジメトキシシラン、フェニルトリメトキシシラン、ジフェニルジメトキシシラン、テトラエトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、ヘキシルトリエトキシシラン、トリフルオロプロピルトリメトシシランなど）、及びシランカップリング剤（ビニルメトキシシラン、3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、3-メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、3-アミノプロピルメトキシシラン、3-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリエトキシシリルプロピル）テトラスルフィドなど）が反応したもの及びこれらのゾルが反応したものが挙げられる。
【００３５】
前述のシランなどは、その多くが液状形態であるが、水の添加により加水分解反応及び縮合反応を起こし固形物となる。
ゾルとはシランなど一部加水分解及び縮合してオリゴマー化したものを意味し、アルコールなどに溶解する。例えば、テトラエトキシシランのアルコール溶液を作成し、塩酸などの酸系触媒と水を加えることによりシリカゾル製造することができる。シリカゾルの分子量は概ね添加する水の量によって決定される。
これらのうち、機械的強度向上の観点等から、シラン又はシランのゾルが反応したものを使用することが好ましく、更に好ましくはシリカゲル（シリカゾルが反応したもの）である。
【００３６】
バインダー物質を使用する方法として、さらに好ましくは、単分散微粒子の表面官能基とバインダー物質の官能基との結合を利用する方法である。具体例としては、単分散微粒子としてシリカ微粒子を使用し、バインダー物質としてシリカゲルを使用する場合が挙げられる。この場合、シリカ微粒子表面のシラノール基とシリカゲルのアルコキシ基又はシラノール基が結合すると推定される。
バインダー物質の合計含有量は、単分散微粒子（P）の重量に対して0.5〜200重量%であることが好ましく、更に好ましくは1〜100重量%、特に好ましくは2〜50重量%である。バインダー物質の合計含有量がこの範囲内であると、粉状フォトニック結晶（PC）の機能を低下させることなく、機械的強度を高めることができるからである。
混合液の溶媒としては、単分散微粒子（P）を分散することができ、かつ、バインダー物質又はその前駆体を溶解又は分散することができる液体であれば、前述の水系溶媒やその他の有機溶剤など種々のものを使用することができる。
【００３７】
噴霧乾燥は、スプレーガンや霧吹きを使用しても行うことができるが、粉状フォトニック結晶の捕集の観点等からスプレードライヤーを使用することが好ましい。スプレードライヤーとしては、B-290（日本ビュッヒ社製）、GS-310・GA-32（ヤマト科学社製）、SD-1500（パワーポイント・インターナショナル社製）などを使用することができる。
数平均粒子径の制御方法は、概ね前述のとおりであるが、スプレードライヤーを使用した制御方法について具体的に説明する。
【００３８】
スプレードライヤーの場合、前述のせん断力としては吐出圧が相当する。吐出圧は概ね供給するガス流量を調整することにより制御でき、装置のチャンバーサイズにもよるが10m3/h〜400m3/hが好ましく、18m3/h〜100m3/hがさらに好ましく、20m3/h〜50m3/hが特に好ましい。このガス流量を制御することにより粉状フォトニック結晶（PC）の数平均粒子径を制御することができる。粉状フォトニック結晶（PC）の数平均粒子径を小さくしたい場合には、空気流量を上げ（35m3/h〜50m3/h）、逆に、大きくしたい場合には、空気流量を下げればよい（20m3/h〜30m3/h）。ガスとしては、通常、空気又は窒素を使用する。
その他の制御因子として、単分散微粒子（P）の分散液の固形分濃度、粘度、送液量、噴霧ガス温度が挙げられる。数平均粒子径0.3〜20μｍの粉状フォトニック結晶（PC）を製造する場合のこれら制御因子の好ましい範囲について説明する。
【００３９】
該分散液の固形分濃度は、0.1重量%〜30重量%が好ましく、1.0重量%〜20重量%がさらに好ましい。
該分散液の粘度は、0.1mPa・S〜500mPa・Sが好ましく、さらに好ましくは0.3mPa・S〜200mPa・Sであり、特に好ましくは0.4mPa・S〜50mPa・Sである。
該分散液の送液量は、10ml/h〜1500ml/hが好ましく、さらに好ましくは50ml〜800mlであり、特に好ましくは、100ml〜300ml/hである。送液量が多すぎると、液滴が大きくなりすぎて、乾燥時にチャンバーの壁面に付着し、粉状のフォトニック結晶を得ることが困難になる。
噴霧ガス温度は、分散液中の溶媒や単分散微粒子（P）の組成にもよるが、インレット（噴出口付近）温度で、20℃〜250℃が好ましく、さらに好ましくは、40℃〜180℃である。この時のアウトレット（試料回収口付近）温度は、25℃〜80℃であることが特に好ましい。
【００４０】
球形度の高い粉状フォトニック結晶（PC）を製造するためには、粉状フォトニック結晶の構成単位である単分散微粒子（P）の分散液を、該分散液と親和性の低い液体又は気体中において液滴化することが好ましい。一方、該分散液と親和性が高い液体等に分散等した場合には球形度は低くなる。従って、この親和性を調整することにより、粉状フォトニック結晶（PC）の球形度を制御することができる。その他にも、単分散微粒子（P）の分散液の固形分濃度、単分散微粒子の粒度分布、界面活性剤の種類や添加量（エマルジョンを利用する製造方法）などの因子も球形度に影響する。なお、分散液として如何なる液体を使用する場合にも、気体中において液滴化することが球形度を高くする上で有利であり、従って、噴霧乾燥を利用する方法によれば球形度の高い粉状フォトニック結晶（PC）を容易に製造することができる。
【００４１】
前述のごとく蛍光シグナルを増幅させるためには、蛍光物質（F）は粉状フォトニック結晶（PC）に含有されている必要がある。含有とは粉状フォトニック結晶（PC）の内部に存在することを意味し、蛍光物質（F）が内部に固定化されていなくても良い。例えば、微粒子集積体（PPC）の間隙に溶媒（S）に分散又は溶解した蛍光物質（F）が存在する状態であってもよく、粉状フォトニック結晶（PC）の内部以外の槽中にも蛍光物質（F）が存在しても良い。
当然に粉状フォトニック結晶（PC）の内部のみに蛍光物質（F）が固定化されていてもよく、ブランクシグナル低減の観点からは内部のみに存在する方が好ましい。内部のみに蛍光物質（F）を固定化する方法としては、前述のバインダー物質に蛍光物質（F）を含有させる方法、フォトニック結晶の構成材料である単分散微粒子（P）等に蛍光物質（F）を含有させる方法やフォトニック結晶の空隙に蛍光物質（F）を分散したポリマー等を充填する方法などが挙げられる。
【００４２】
バインダー物質に蛍光物質（F）を含有させる具体的な方法としては、噴霧乾燥する混合原料に蛍光物質（F）を分散又は溶解させておき、これを噴霧乾燥することが挙げられる。バインダー物質が析出する過程において、蛍光物質（F）がバインダー中に含有されるものと推定される。
フォトニック結晶の構成材料である単分散微粒子（P）等に蛍光物質（F）を含有させる具体的な方法としては、真球状微粒子（P）を蛍光物質（F）のアルコール溶液に浸漬する方法や真球状微粒子（P）の原料溶液に蛍光物質（F）を溶解し、この原料溶液をエマルジョン化する方法などが挙げられる。前者の方法は、真球状微粒子（P）のアルコールによる膨潤を利用したものであり、作製が極めて容易である。蛍光物質（F）がアルコールとともに真球状微粒子（P）の内部に入り込むことにより蛍光物質（F）を含有させることが出来る。この方法には真球状微粒子（P）の材料として専ら有機化合物が使用される。
【００４３】
微粒子集積体（PPC）のような3次元的な粉状フォトニック結晶（PC）のみならず、1次元や2次元のフォトニック結晶も使用することが出来る。例えば、多層構造体を使用することができ、これは１次元的に光の波長と同程度の周期的な屈折率変化を有する構造体即ち１次元フォトニック結晶である。
多層構造体からなる粉状フォトニック結晶（PC）としては、多層膜を微細化したものや多層構造球状粒子（LPC）が挙げられる。
【００４４】
多層膜とは、屈折率の異なる２種類以上の構成材料からなる薄膜が交互に形成されたものであり、膜の厚み方向以外には周期的な屈折率変化を有さない構造体である。従って、膜の厚み方向にのみ蛍光の閉じ込め効果を有する。
薄膜層の構成材料等は、微粒子集積体（PPC）の場合等と同様の有機化合物や無機化合物を使用する事ができる。
多層膜の作成方法としては、公知の方法を使用することができ、スピンコーティング法、イオンスパッタリング法、蒸着法などが挙げられる。いずれの方法も２種類の構成材料を交互に積層していくことにより作製する。スピンコーティングの場合は、前述の有機化合物及び無機化合物のいずれも構成材料として使用することが出来るが、イオンスパッタリング及び蒸着の場合は無機化合物に限られる。
【００４５】
積層する各薄膜層の厚みは、検出感度の向上等の観点から、10〜500nmであることが好ましく、更に好ましくは30〜300nm、特に好ましくは50〜150nmである。この範囲内であると、検出器の感度が高い可視光領域にフォトニックバンドギャップが現れるからである。多層膜は、主に多層膜干渉により高効率に特定波長の光、本発明の場合は内部にて発生する蛍光を反射閉じ込めする。なお特定波長λは、概ね下式に従い各薄膜層の厚みにより決定される。
λ＝ｍ×（１／ｎ）×（ｄ／４）
ここで、ｍは整数、ｎは薄膜層の屈折率、ｄは各薄膜層の厚さである。
合計の積層数は、数平均粒子径、蛍光シグナル増幅の観点等から、4〜50層が好ましく、更に好ましくは6〜30層、特に好ましくは8〜20層である。
【００４６】
蛍光物質（F）の含有形態は、大別して薄膜層に含有する場合と中央部の層に含有する場合がある。
中央部の層に含有する場合とは、蛍光物質（Ｆ）を含有した薄膜層（フィルム）を２枚の多層膜でサンドイッチした構造である。
例えば、１０−３Ｍのローダミン６Ｇを含むポリスチレン薄膜層を、2枚の酸化チタン及びシリカを交互に4層ずつ積層した多層膜でサンドイッチした構造体の作成方法について説明する。2枚の多層膜は、イオンスパッタリング装置（トッキ社製）を使用して、スパッタリングのターゲットを交互に切り替えることにより、酸化チタン及びシリカの交互積層膜を作製した。薄膜層の厚みはスパッタリング時間を制御する事により数nmの精度で調整する事が可能である。次に作製した2枚の多層膜の間をスペーサーを用いて５μｍに調整し、そこに１０−３Ｍのローダミン６Ｇを含むポリスチレンのテトラヒドロキシフラン溶液を充填、乾燥し、５μｍの厚みを有する１０−３Ｍのローダミン６Ｇを含有するポリスチレン層を形成した。
各薄膜層に蛍光物質（F）を含有する場合は、専らスピンコーティング法が使用される。蛍光物質（Ｆ）を薄膜層の原料液に溶解又は分散させておき、スピンコーティングすることにより容易に作成することができる。薄膜層の厚みはスピンコーティングの時間や原料液の固形分濃度などを変更することによって調整する事ができる。
【００４７】
多層構造球状粒子（LPC）とは、中心層（Ｌ０）をコアとし、コアの中心に対して同心状に２種類以上の構成材料からなる薄膜が交互に形成された構造を有し、中心層（Ｌ０）及び交互に積層された薄膜層のうち少なくとも１層に蛍光物質（Ｆ）が含有されている構造体である。
前述の多層膜を3次元化した構造であり、発生した蛍光は、微粒子集積体（PPC）と同様に3次元的に閉じ込めることができる。
中心層（Ｌ０）や薄膜層の構成材料は、多層膜等と同様の組成物を使用する事ができる。好ましい各薄膜層の厚み、積層数等は、多層膜の場合と同様である。
【００４８】
多層構造球状粒子（LPC）の製造方法としては例えば次の方法が挙げられる。
１．電荷を有する粒子表面にそれと逆電荷を有する反応性界面活性剤を吸着させた粒子の分散液を製造する。該分散液に、層を形成させる樹脂の前駆体と上記反応性界面活性剤と逆のイオン性を有する反応性界面活性剤の混合物を加え、粒子表面の２重ミセル中に層を形成させる前駆体を閉じ込め、反応させ、層を形成させる。上記方法を繰り返すことにより、多層構造球状粒子を得る方法。
２．溶解度パラメーターの異なるブロックポリマーを有機溶剤に溶解し、その溶液を界面活性剤を用いて水中に分散し、脱溶剤することにより、多層構造球状粒子を得る方法。
３．粒子表面の反応性基にカップリング剤等を利用して、ビニル基を導入し、ビニル系モノマーをグラフトさせ、繰り返すことにより、多層構造球状粒子を得る方法。
４．活性水素基を有する粒子の表面で金属アルコキシドをゾル−ゲル法により層形成させ、繰り返すことにより、多層構造球状粒子を得る方法（表面ゾルゲル法）。
５．電荷を有する大粒子に逆電荷を有する十分小さい粒子を吸着させ、層を形成させ、繰り返すことにより、多層構造球状粒子を得る方法。
６．一般的な蒸着装置を用い、粒子を振動させながら表面をコーティングし、ターゲットを変更し、繰り返し実施することにより、多層構造球状粒子を得る方法。
７．粒子を懸濁させた溶液中にターゲットを設置し、ターゲットにレーザーを照射することにより、微小粒子を発生させ、粒子表面をコーティングし、ターゲットを変更し、繰り返し実施することにより、多層構造球状粒子を得る方法。
８．乾式で、大粒子と小粒子を高速で衝突させることにより、大粒子表面に小粒子の層を形成させ、繰り返すことにより、多層構造球状粒子を得る方法。
９．溶媒中に大粒子と小粒子を分散させておき、その溶液を高速で攪拌することにより、大粒子表面に小粒子の層を形成させ、繰り返すことにより、多層構造球状粒子を得る方法。
これらの方法の中で、均一な層形成及び生産性等の観点から、１、４、６、７及び８の方法が好ましく、更に好ましくは１及び４の方法であり、特に好ましくは４の方法である。
【００４９】
上記の４の方法の具体例として、中心層（Ｌ０）が数平均粒子径３００nmのシリカ粒子（「シーホスター」日本触媒社製）、薄膜層が酸化チタンとシリカの交互積層である場合について説明する。
１．シリカ粒子を低級アルコールなどに超音波分散器を使用して分散する。ここで低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノールなどが使用できるが、メタノール及びエタノールが特に好ましい。また低級アルコールに加えてアセトニトリル等他の低級アルコールと混ざり合う溶媒を使用する事ができる。以下、シリカ層の形成においても同様である。
２．該エタノール溶液に少量の水及び触媒を加えて均一に攪拌混合する。触媒としては、主にアミン系化合物を使用する事ができ、メチルアミン及びアンモニア（水）が特に好ましい。以下、シリカ層の形成においても同様である。
３．酸化チタンの前躯体であるチタニウムイソプロポキシドのエタノール溶液を加えて、２〜４時間室温にて反応させる。酸化チタンの前躯体としてはその他のアルコキシドや塩化チタン等も使用できるが、取り扱いやすさ等の観点から、チタニウムイソプロポキシドが特に好ましい。反応は、加温・加圧条件にて行っても良いが、反応速度が極めて速いため、室温・常圧にて十分である。添加方法は、攪拌下にて一括で添加しても良いし、定量ポンプ等を使用して少量単位で滴下しても良い。以下、シリカ層の形成においても同様である。
４．固液分離し、水又は低級アルコールにて粒子を洗浄後、乾燥させる。乾燥方法としては、特に限定されないが、低温又は室温にて乾燥させることが好ましい。
５．乾燥した粒子（シリカ粒子に酸化チタン層がついたコアシェル粒子）をエタノールに超音波分散器を使用して分散する。
６．該エタノール溶液に少量の水及びアンモニア水を加えて均一に攪拌混合する。
７．シリカの前躯体であるテトラエトキシシランのエタノール溶液を加えて４〜８時間室温にて反応させる。
８．固液分離し、水又は低級アルコールにて粒子を洗浄後、乾燥させる。
以上の操作を繰り返すことにより、シリカ粒子をコアとし、コアの中心に対して同心状に酸化チタン層とシリカ層が交互積層した多層構造球状粒子を作製することができる。
【００５０】
蛍光物質（Ｆ）を層に含有させる方法としては、特に限定されず公知の方法を使用する事ができる。例えば、中心層（Ｌ０）に含有させる場合は、樹脂粒子を蛍光物質（F）のアルコール溶液に浸漬する方法や樹脂粒子等の原料溶液に蛍光物質（F）を溶解し、この原料溶液をエマルジョン化する方法などが挙げられる。前者の方法は、樹脂粒子のアルコールによる膨潤を利用したものであり、作製が極めて容易である。蛍光物質（F）がアルコールとともに樹脂粒子の内部に入り込むことにより蛍光物質（F）を含有させることができる。    
薄膜層に含有させる場合は、反応系中に蛍光物質（Ｆ）を存在させる、即ち、薄膜の原料溶液又は溶媒中に蛍光物質（Ｆ）を溶解又は分散させる方法が最も簡便で層厚みの制御性に優れた方法である。薄膜層が中心層（Ｌ０）等の表面に形成される際に、蛍光物質（Ｆ）も取り込まれるものと推定され、蛍光物質（Ｆ）の含有濃度は、原料溶液又は溶媒中に溶解又は分散した蛍光物質（Ｆ）の濃度に依存する。
【００５１】
これらの粉状フォトニック結晶（PC）のうち、蛍光シグナルの増幅効果及び生産性の観点等から、微粒子集積体（PPC）及び多層構造球状粒子（LPC）を使用することが好ましく、更に好ましくはスプレードライヤーを使用して製造される真球状の微粒子集積体（PPC）及び多層構造球状粒子（LPC）である。
【００５２】
本発明において溶媒（Ｓ）としては、後述の被測定分子（Ｍ）が変性等しない溶媒であれば特に限定することなく使用することが出来る。主に緩衝液が使用されるが、被測定分子（Ｍ）やリガンド分子の安定性、蛍光物質（F）の量子効率などの観点から、エチレングリコールやポリエチレングリコール或いは類似の水溶性オリゴマーやポリマーを使用することが出来る。
【００５３】
試料液（ＳＬ）としては、血液（血清、血漿）、尿、大便、喀痰、髄液等が挙げられる。イムノアッセイに使用する場合には、血漿又は血清を使用することが一般的であるが、発明の構成上血液をそのまま使用しても問題ない。
【００５４】
リガンド分子（A）及びリガンド分子（B）は、試料液（ＳＬ）中の被測定分子（Ｍ）と特異的に結合する分子であり、それぞれの分子は被測定分子（Ｍ）に結合する部位が異なる。従って、リガンド分子（A）が被測定分子（Ｍ）と結合することにより、被測定分子（Ｍ）に蛍光標識である粉状フォトニック結晶（PC）が付くとともに、被測定分子（Ｍ）を介してリガンド分子（B）と結合し、励起光（L）が照射される槽の内壁に粉状フォトニック結晶（PC）を持ってくることが出来る。
被測定分子（Ｍ）が後述する免疫蛋白質（抗体）の場合、リガンド分子（A）及びリガンド分子（B）は、その抗体が認識する抗原である。
【００５５】
本発明において対象とする被測定分子（Ｍ）は、主に免疫蛋白質である。その他、例えば、酵素、核酸及び各種低分子化合物なども挙げられる。
免疫蛋白質としては、抗原、抗体やハプテンを例示することができる。抗体としては、次の抗原に対する抗体が使用でき、該抗原としては、薬剤、低分子ホルモン、腫瘍マーカー、ウイルス、高分子ホルモン、サイトカイン、各種グロスファクター等が挙げられる。薬剤としては、例えば、テオフィリン、フェニトイン、バルプロ酸などが挙げられる。低分子ホルモンとしては、例えば、サイロキシン、エストロゲン、エストラジオールなどが挙げられる。腫瘍マーカーとしては、例えば、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９などが挙げられる。ウイルスとしては、例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶなどが挙げられる。高分子ホルモンとしては、例えば、甲状腺刺激ホルモン、インシュリンなどが挙げられる。サイトカインとしては、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６などが挙げられる。各種グロスファクターとしては、例えば、ＥＧＦ、ＰＤＧＦなどが挙げられる。これらの抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよく、さらに抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂであってもよい。
【００５６】
酵素としては、酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、ターゲット物質がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、ターゲット物質がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等をターゲット物質とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００５７】
核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡの化学合成は、市販の合成装置を用いて行うことができるし、市販されているＤＮＡプローブをそのまま使用することもできる。
【００５８】
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００５９】
リガンド分子（A）が免疫蛋白質である場合、化学的に結合する方法としては、粉状フォトニック結晶（PC）表面にアミノ基、スルフヒドリル基などの官能基を導入し、リガンド分子（A）のアミノ基、スルフヒドリル基などの官能基をグルタルアルデヒド、サクシンアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロサクシンイミドエステル、ｏ−フェニレンビスマレイミドなどで架橋する方法が使用できる（例えば、米国特許第４２８０９９２号、米国特許第３６５２７６１号に記載されている。）。
他にも、粉状フォトニック結晶（PC）表面にカルボキシル基を導入し、カルボジイミドを介してリガンド分子（A）のアミノ基と結合する方法が挙げられる。粉状フォトニック結晶（PC）の材料として、カルボキシル基を表面に有する材料を使用する場合について具体的に説明する。まず、カルボキシル基とカルボジイミドとを室温で約１時間反応させた後、未反応のカルボジイミドを十分に洗浄除去する。次に、AFP抗体等の蛋白質を加え、約２時間反応させた後、未反応の蛋白質を洗浄除去することにより、蛋白質を化学的に固定化することができる。
【００６０】
物理吸着による方法としては、例えば、粉状フォトニック結晶（PC）がポリスチレンからなる場合、リガンド分子（A）を０．００１〜０．０４％（Ｗ／Ｖ）含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に固定部（A）を適当時間浸漬する方法が使用できる（例えば、バイオシム・バイオフィズ・アクタ、２５１巻、４２７頁、１９７１年に記載されている。）。
リガンド分子（A）を固定化する方法としては、検出感度向上等の観点から、化学的に結合する方法が好ましい。
【００６１】
リガンド分子（B）についてもリガンド分子（A）と同様の方法に槽の内壁に固定化することが出来る。
【００６２】
本発明の蛍光物質（Ｆ）としては、特に制限されることなく、公知の蛍光物質を使用することができる。
例えば、有機蛍光体としては、ローダミン系色素（ローダミンB、ローダミン６G、ローダミン１２３）、クマリン系色素（クマリン３４３、クマリン４８０）、フルオレセイン、リサミン-ローダミンBスルホニルクロライド、アニリノナフタレンスルホン酸、2-メトキシ2，4-ジフェニル3（2H）フラノン、メチルウンベリフェロン、ダンシルクロライド、ルシファーイエロー、エリスロシン、ピレン、テキサスレッド、エオシン、フルオレサミン、クロロフィルなどが挙げられる。
無機蛍光体としては、亜鉛、カドミニウム、マグネシウム、シリコン、イットリウム等の希土類元素等の酸化物、硫化物、珪酸塩、バナジン酸等が挙げられ、タングステン酸カルシウム、鉛含有珪酸バリウム、ユーロピウム含有燐酸ストロンチウム、ユーロピウム含有イットリア、セリウム含有イットリア、銅あるいは銀、錫、マンガン、砒素、アルミニウム、カドミウムの一種あるいは複数含有硫化亜鉛、マンガン含有ガリウム酸マグネシウム、フッ化マグネシウム、フッ化カルシウム、酸素欠損酸化亜鉛、ユーロピウム含有酸化亜鉛、セリウム含有酸化亜鉛、セシウム含有酸化亜鉛、マンガンあるいは砒素含有珪酸亜鉛、ビスマス含有硫化亜鉛カドミウム、ビスマス含有硫化カルシウムストロンチウム等を使用する事ができる。
【００６３】
蛍光シグナルを単純に増幅するという観点からは、蛍光物質（Ｆ）の使用形態は特に限定されることはなく、溶媒に分散した状態で使用することもできるし、固体状態にて使用することもできる。
しかし、実際の蛍光測定に適用するには、溶媒を使用した形態が好ましい場合が多く、使用できる溶媒は適用する蛍光測定の種類によって最適なものを選択する必要がある。少なくとも、溶媒としては、蛍光物質を溶解又は分散可能なものを使用することが好ましく、また後述のように、蛍光シグナルの増幅倍率向上の観点からは、溶媒の屈折率が概ね低い方が好ましい。
バイオメディカルの分野において使用する場合には、免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチド若しくはオリゴペプチドなどに結合した蛍光物質（Ｆ）を使用することができる。          
【００６４】
励起光（Ｌ）を透過する材料から構成される槽とは、試料液（ＳＬ）を注入するバイオセンサーチップの容器である。本発明の性質上、槽の形状やサイズの限定はされないが、励起光（Ｌ）を透過する材料から構成される必要がある。当然に励起光（Ｌ）を照射して発生する蛍光も透過する必要がある。励起光（Ｌ）及び蛍光の透過率が高い方が、検出感度が向上するからである。
好ましい励起光（Ｌ）の波長は後述するように概ね可視光領域であるので、適した材料としては、ガラス（シリカ、石英）、非晶性の樹脂（ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネートなど）が挙げられる。なお、励起光（Ｌ）の照射部位（Ｒ）（蛍光シグナルの観測部位も同じ）のみがこれらの材料にて構成されていてもよく、その他の部分については別の材料を使用する事もできる。
槽のサイズは、測定の高速化、測定システムの小型化、操作の簡便化等の観点から、０．１〜５ｃｍ角程度である事が好ましく、より好ましくは０．５〜２ｃｍ角程度である。
【００６５】
励起光（L）としては、公知の励起光を使用することができ、水銀ランプ、キセノンランプや各種レーザー光（アルゴンイオンレーザー、窒素レーザー等のガスレーザー、半導体レーザー、YAGレーザー等の固体レーザー）が挙げられる。
最適な励起光（L）の波長は、使用する蛍光物質（F）の最大吸収波長によって変化するが、検出感度向上の観点等から、中心波長300〜800nmの紫外線、可視光線、近赤外線を使用することが好ましく、更に好ましくは中心発振波長350〜550nmのレーザー光である。
また、測定の高速化、測定システムの小型化、操作の簡便化等の観点から、励起光源はコンパクトである事が好ましく、半導体レーザーやＹＡＧレーザーが好ましい。
【００６６】
本発明のバイオセンサーチップを使用した被測定分子（Ｍ）の検出は、被測定分子（Ｍ）が粉状フォトニック結晶（PC）表面のリガンド分子（A）に結合する工程１、被測定分子（Ｍ）を表面に有する粉状フォトニック結晶（PC）が被測定分子（Ｍ）を介してリガンド分子（B）に結合される工程2、及び励起光（L）の照射部位（R）に励起光（L）が照射され被測定分子（Ｍ）の量に応じた蛍光シグナルを観測する工程3からなる。
【００６７】
試料液(SL)中の被測定分子(M)を検出する操作としては、工程１の前段階として、バイオセンサーチップの槽に充填された溶媒（Ｓ）に試料液（ＳＬ）を注入する。この注入量は定量精度に大きく影響するので正確に秤量する事が好ましい。通常の測定システムとしては、マイクロピペッターにて自動で秤量・注入される。注入量は一般的に１〜１００μＬである。
【００６８】
試料液（ＳＬ）を槽に注入した後、工程１及び2において、被測定分子（Ｍ）とリガンド分子とを結合しやすくするために、何らかの攪拌操作を行う事ができる。攪拌操作としては、マグネティックスターラーや超音波、シェイキング、バブリングなどが挙げられる。工程１及び2に要する時間としては、合計で0.5〜10分程度が好ましく、更に好ましくは１〜5分程度である。
【００６９】
工程2の後に、Ｂ／Ｆ分離（洗浄工程）を組み込めば、ブランクシグナル即ち、被測定分子（Ｍ）と結合しない粉状フォトニック結晶（ＰＣ）を除去できるため、検出感度は更に向上する。本発明の構成上、Ｂ／Ｆ分離工程の導入は可能であり、マイクロポンプ等を使用して迅速・簡便にＢ／Ｆ分離を行うこともできる。
測定の高速化、測定システムの小型化、操作の簡便化等の観点からは、Ｂ／Ｆ分離不要なホモジニアス測定を行うことが好ましく、粉状フォトニック結晶（ＰＣ）によりレーザー発振を起こす事及び後述の励起光（Ｌ）の照射方法を工夫する等によりホモジニアス測定を実現する。
【００７０】
工程3では、励起光（L）の照射部位（R）に励起光（L）が照射され被測定分子（Ｍ）の量に応じた蛍光シグナルを観測する。即ち、本発明のバイオセンサーチップによる検出方法は蛍光法であることを意味する。
なお、蛍光シグナルは、公知の蛍光測定装置にて測定することができが、検出感度向上の観点等から、光電子増倍管やＣＣＤを使用した装置が好ましい。これら高感度な光センサーは、バイオメディカル分野において広く使用されている。
【００７１】
以下、レーザー発振及び励起光の照射方法とホモジニアス測定の関係について説明する。前述のように、レーザー発振が起こると非線形的に蛍光シグナルが増幅する。即ち、照射する励起光（Ｌ）の強度が少し大きくなると、蛍光シグナルが非線形的に増幅する事を意味する。例えば、レーザー発振が起こると、励起光（Ｌ）の強度が2倍になった場合に、蛍光シグナルが3桁以上増幅することは容易である。レーザー発振が起こる臨界励起光強度（しきい値）付近では、この傾向はさらに顕著となる。
照射部位（Ｒ）においてのみ励起光強度を強くすればホモジニアス測定が可能になり、本発明のバイオセンサーチップを使用した被測定分子(M)の検出方法においても、励起光の照射方法を工夫することによりこの条件を実現する事が好ましい。
背景技術に挙げたエバネッセンス波蛍光免疫法は、この条件を達成する事によりホモジニアス測定を可能としている。本発明では粉状フォトニック結晶（ＰＣ）を使用してレーザー発振を起こすため、励起光強度に対して線形的な蛍光シグナルを示すエバネッセンス波蛍光免疫法よりも大幅にブランクシグナルを低減でき、かつ蛍光シグナル量を大幅に増幅できるため高感度なホモジニアス測定が可能となる。
【００７２】
レンズ等によって励起光の照射スポットを絞ぼれば、バイオセンサーチップの照射部位（R）においてのみ励起光強度を強くすることができる。照射スポットのサイズ（直径）は、検出感度及び測定レンジ等の観点から、５〜５００μｍであることが好ましく、更に好ましくは１０〜２００μｍ、特に好ましくは２０〜１００μｍである。
レンズの焦点距離としては、検出感度及び測定レンジ等の観点から、１０〜１０００μｍであることが好ましく、更に好ましくは２０〜５００μｍである。ここで焦点距離とはレンズの中心から焦点までの距離を意味する。
検出感度を向上させるためには、照射スポットを小さくし、焦点距離を短くすることが好ましく、レンズの開口数（NA）は大きい事が好ましい。ここで開口数とはレンズの解像度を決定する数値であり、この数値が大きければより小さな領域に集光できることを意味する。従って、開口数は０．８０以上である事が好ましく、更に好ましくは０．９０以上、特に好ましくは０．９５以上である。
照射部位（R）においてのみ励起光強度が強い状況を造る方法としては、他にもピンホールを通して励起光（Ｌ）を照射する方法や励起光（Ｌ）を吸収し、測定したい蛍光シグナルと同一波長領域に蛍光を有しないもの（金属ナノ粒子等）を溶媒（Ｓ）中に分散させておく方法、エバネッセント波を利用する方法などが挙げられる。
【００７３】
バイオセンサーとしては、レンジオーバーによる再測定を回避するために、測定レンジは広い方が好ましく、本発明においては、励起光を走査して照射することにより測定レンジを広くする事ができる。測定レンジとしては、2桁以上である事が好ましく、更に好ましくは3桁以上である。
【実施例】
【００７４】
次に本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明の主旨を逸脱しない限り本発明は実施例に限定されるものではない。なお、特記しない限り部は重量部、％は重量％を意味する。
【００７５】
＜粉状フォトニック結晶（ＰＣ１）の作製＞
噴霧乾燥法により、微粒子集積体からなる粉状フォトニック結晶（ＰＣ１）を作製した。
平均粒子径300nmの単分散シリカ微粒子（真球状微粒子（Ｐ））の水分散体（シリカ微粒子濃度；20%、商品名；シーホスターKE-W30、製造元；日本触媒）にメタノールを加えて固形分濃度を10%とした。この単分散シリカ微粒子分散液に、シリカゾルをシリカ微粒子に対して50%となるように混合・溶解して原料液とした。
シリカゾルは、メタノール２０重量部、35%塩酸１．５重量部、テトラエトキシシラン１０重量部を混合・溶解し、スターラー攪拌下、室温にて約1時間反応させることにより作製した。
噴霧乾燥機（商品名；ミニスプレードライヤーB-290、製造元；日本ビュッヒ）を使用して、前述の原料液を噴霧することにより、粉状フォトニック結晶（ＰＣ１）を得た。
噴霧乾燥条件は、送液量200ml/h、インレット温度120℃、空気流量35m3/hとした。この時のアウトレット温度は65℃であった。シリカゾルは、噴霧により乾燥してシリカゲルとなる過程において、シリカ微粒子表面に固着するとともに、シリカ微粒子の表面官能基（シラノール基）とシリカゾルの官能基（アルコキシド基）とが反応して、シリカ微粒子同士を結合すると推定される。
得られた粉状フォトニック結晶（ＰＣ１）は、後述の方法に従って、（１）フォトニックバンドギャップの位置（反射スペクトルの測定（λmax））及び（２）数平均粒子径について評価を行った。
・  反射スペクトルの単一ピークが観測され、反射率が最大となるピーク波長（λmax）が６００nmであった。
反射スペクトルは、顕微紫外可視分光光度計MSV-350（日本分光社製）を使用して測定した。測定スポットには、球状フォトニック結晶が1個しかない状態にして測定した。
・  数平均粒子径は６．０μmであった。数平均粒子径は、FPIA-3000（シスメックス社製）を使用して測定した。
【００７６】
＜粉状フォトニック結晶（ＰＣ２）の作製＞
原料液の固形分濃度が５％である以外は、粉状フォトニック結晶（ＰＣ１）の場合と同様にして、微粒子集積体からなる粉状フォトニック結晶（ＰＣ２）を作製した。数平均粒子径は２．５μｍであった。
【００７７】
＜粉状フォトニック結晶（ＰＣ３）の作製＞
１０−３Ｍのローダミン６Ｇを含有する単分散ポリスチレン微粒子（平均粒子径２５０nm、商品名； K０２５、製造元；モリテックス）を使用する以外は、粉状フォトニック結晶（ＰＣ１）の場合と同様にして、微粒子集積体からなる粉状フォトニック結晶（ＰＣ３）を作製した。数平均粒子径は６μｍであった。
１０−３Ｍのローダミン６Gを含有するポリスチレン粒子の作製は、ポリスチレン粒子を１０−３Ｍのローダミン６Gを含むエタノール溶液に２４時間浸漬することにより作製した。
【００７８】
＜粉状フォトニック結晶（ＰＣ４）の作製＞
下記の中心層（Ｌ０）、薄膜層等からなる多層構造球状粒子からなる粉状フォトニック結晶（PC4）を作製した。
・  中心層（Ｌ０）；  シリカ微粒子（「シーホスター」日本触媒社製）
・  数平均粒子径；  ０．３μｍ（Ｃｖ約３％、円形度０．９９）
・  薄膜層  シリカ層及び酸化チタン層の交互積層
・  シリカ層の厚み；  １００nm
・  酸化チタン層の厚み；  ８０nm
・  蛍光物資（Ｆ）；  ローダミン６G
・  濃度；  １０−３Ｍ
・  含有形態；  薄膜層の全ての層に含有
【００７９】
「酸化チタン層１層目の作製」
シリカ粒子5重量部を１０−３Ｍのローダミン６Gを含む５８重量％：４２重量％のエタノール／アセトニトリル混合溶液３０００重量部に超音波分散器を使用して分散し、水１０重量部及び40％メチルアミン水溶液５重量部を加えて攪拌翼を用いて均一に混合した。
チタニウムイソプロポキシド４０重量部と１０−３ＭのローダミンＢを含む５８重量％：４２重量％のエタノール／アセトニトリル混合溶液９００重量部を均一混合した溶液を、攪拌下にて先のシリカ微粒子分散液に加え、室温にて２時間反応させて、シリカ粒子に酸化チタン層がついたコアシェル粒子（Ｌ１−Be１）を得た。
固液分離し、水にて粒子を洗浄後、室温・窒素気流下にて乾燥させた。乾燥した粒子をＳＥＭにて観測し、数平均粒子径を算出したところ、５６０nmであった。
【００８０】
「シリカ層２層目の作製」
乾燥したコアシェル粒子（Ｌ１−Be１）10重量部を１０−３ＭのローダミンＢを含むエタノール２５０重量部に超音波分散器を使用して分散分散し、水７０重量部及び28％アンモニア水２１重量部を加えて攪拌翼を用いて均一に混合した。
テトラエトキシシラン４０重量部と１０−３ＭのローダミンＢを含むエタノール２５０重量部とを均一混合した溶液を、攪拌下にて先のコアシェル粒子分散液に加え、室温にて４時間反応させて、多層構造球状粒子（Ｌ１−Be２）を得た。
固液分離し、水にて粒子を洗浄後、室温・窒素気流下にて乾燥させた。乾燥した粒子をＳＥＭにて観測し、数平均粒子径を算出したところ、７５０nmであった。
【００８１】
「酸化チタン層３層目の作製」
多層構造球状粒子（Ｌ１−Be２）を使用する以外は１層目と同様にして薄膜層を３層有する多層構造球状粒子（Ｌ１−Be３）を得た。なお、それぞれの数量は、１層目の記載順に、多層構造球状粒子（Ｌ１−Be２）5重量部、１０−３ＭのローダミンＢを含む５８重量％：４２重量％のエタノール／アセトニトリル混合溶液（以下、実施例１においては単にエタノール／アセトニトリル混合溶液と称する）１８００重量部、水６重量部、40％メチルアミン水溶液２重量部、チタニウムイソプロポキシド２１重量部、エタノール／アセトニトリル混合溶液４８０重量部とした。
【００８２】
「シリカ層４層目の作製」
多層構造球状粒子（Ｌ１−Be３）を使用する以外は２層目と同様にして薄膜層を４層有する多層構造球状粒子（Ｌ１−Be４）を得た。なお、それぞれの数量は、２層目の記載順に、多層構造球状粒子（Ｌ１−Be３）10重量部、１０−３ＭのローダミンＢを含むエタノール（以下、実施例１においては単にエタノール溶液と称する）１３０重量部、水３６重量部、28％アンモニア水１１重量部、テトラエトキシシラン２１重量部、エタノール溶液１３０重量部とした。
【００８３】
「酸化チタン層５層目の作製」
多層構造球状粒子（Ｌ１−Be４）を使用する以外は１層目と同様にして薄膜層を５層有する多層構造球状粒子（Ｌ１−Be５）を得た。なお、それぞれの数量は、１層目の記載順に、多層構造球状粒子（Ｌ１−Be４）5重量部、エタノール／アセトニトリル混合溶液１０００重量部、水３重量部、40％メチルアミン水溶液１重量部、チタニウムイソプロポキシド１１重量部、エタノール／アセトニトリル混合溶液２５０重量部とした。
【００８４】
「シリカ層６層目の作製」
多層構造球状粒子（Ｌ１−Be５）を使用する以外は２層目と同様にして薄膜層を６層有する多層構造球状粒子（Ｌ１−Be６）を得た。なお、それぞれの数量は、２層目の記載順に、多層構造球状粒子（Ｌ１−Be５）１０重量部、エタノール溶液７８重量部、水２１重量部、28％アンモニア水６．５重量部、テトラエトキシシラン１２重量部、エタノール溶液７８重量部とした。
【００８５】
「酸化チタン層７層目の作製」
多層構造球状粒子（Ｌ１−Be６）を使用する以外は１層目と同様にして薄膜層を７層有する多層構造球状粒子（Ｌ１−Be７）を得た。なお、それぞれの数量は、１層目の記載順に、多層構造球状粒子（Ｌ１−Be６）5重量部、エタノール／アセトニトリル混合溶液６５０重量部、水２重量部、40％メチルアミン水溶液１重量部、チタニウムイソプロポキシド７，５重量部、エタノール／アセトニトリル混合溶液１７０重量部とした。
【００８６】
「シリカ層８層目の作製」
多層構造球状粒子（Ｌ１−Be７）を使用する以外は２層目と同様にして薄膜層を８層有する多層構造球状粒子（LPC１）を得た。なお、それぞれの数量は、２層目の記載順に、多層構造球状粒子（Ｌ１−Be７）１０重量部、エタノール溶液５５重量部、水１５重量部、28％アンモニア水５重量部、テトラエトキシシラン９重量部、エタノール溶液５５重量部とした。
この薄膜層を８層有する多層構造球状粒子（LPC１）が粉状フォトニック結晶（PC4）であり、数平均粒子径は１．１μｍであった。蛍光物質（Ｆ）は、薄膜層の全ての層に１０−３Ｍの濃度にて含有されているものと推定される。なお、明確な反射スペクトルのピークは観測されなかった。
【００８７】
＜粉状フォトニック結晶（ＰＣ５）の作製＞
薄膜層を２４層有する以外は、粉状フォトニック結晶（ＰＣ５）の場合と同様にして、多層構造球状粒子からなる粉状フォトニック結晶（ＰＣ５）を作製した。数平均粒子径は３．４μｍであった。
【００８８】
＜粉状フォトニック結晶（ＰＣ６）の作製＞
１０−３Ｍのローダミン６Ｇを含むポリスチレン層を、２つの８層からなる多層膜でサンドイッチした構造体（多層膜１）からなる粉状フォトニック結晶（PC６）を作製した。
イオンスパッタリング装置（トッキ社製）を使用して、シリカと酸化チタンを交互に積層した合計８層の多層膜を２つ作製した。酸化チタン層の厚みは８０nm、シリカ層の厚みは１００nmであった。
２つの多層膜の間を、スペーサーを用いて２μｍに調整し、そこに１０−３Ｍのローダミン６Ｇを含むポリスチレンのテトラヒドロフラン溶液を充填、乾燥し、２μｍの厚みを有する１０−３Ｍのローダミン６Ｇを含有するポリスチレン層を形成した。
サンドイッチ多層膜をドライエッチングにより、４μm×４μmのサイズに切断してキュウビック状の多層膜１からなる粉状フォトニック結晶（PC６）を得た。数平均粒子径は３．８μm、反射スペクトルのピーク波長は６００nmであった。
【００８９】
＜粉状フォトニック結晶（ＰＣ７）の作製＞
１０−３Ｍのローダミン６Ｇを含有する単分散ポリスチレン微粒子（平均粒子径３５０nm、商品名； K０３５、製造元；モリテックス）を使用する以外は、粉状フォトニック結晶（ＰＣ３）の場合と同様にして、微粒子集積体からなる粉状フォトニック結晶（ＰＣ７）を作製した。数平均粒子径は６μｍ、反射スペクトルのピーク波長は７８０nmであった。
【００９０】
＜試料液（ＳＬ１）の作製＞
試料液（SL）は通常、血液等であるが発明の効果（検出感度）を明確に図るために、本実施例においては被測定分子（M）の濃度が既知であるサンプルを試料液（SL）として使用する。
AFP抗原（被測定分子（M））をPH７．０に調整した燐酸緩衝液（以下、燐酸緩衝液とする）に添加して、AFP抗原濃度を１０００、５００、１００、５０、１０、５、１pg/mLに調整したリン酸緩衝液を作製した。それぞれ試料液（SL1−１０００）、（SL1−５００）、（SL1−１００）、（SL1−５０）、（SL1−１０）、（SL1−５）、（SL1−１）とした。
【００９１】
＜試料液（ＳＬ２）の作製＞
AFP抗原をＣＭ-ＭＢ抗原とする以外は試料液（SL１）の場合と同様にして、試料液（SL２）を作製した。
【００９２】
＜実施例１＞
厚み１００μｍ、縦横１０ｍｍのカバーガラス（照射部位（R））及び、その上に内径５×５×５ｍｍにくり抜いた上部及び下部が貫通した厚み５ｍｍ、縦横１０ｍｍのポリプロピレン製シートを設置した槽を作製した。
この槽に、燐酸緩衝液及び１０−３Mローダミン６Gを含有するエチレングリコール（EG）を６０重量％：４０重量％で混合した溶媒（溶媒（Ｓ））１００μＬ及びＡＦＰ抗体a（リガンド分子Ａ）を表面に固定化した粉状フォトニック結晶（ＰＣ１）０．１ｍｇを充填し、バイオセンサーチップ（BS1）とした。
なお、ＡＦＰ抗体a（リガンド分子Ａ）を表面に固定化した粉状フォトニック結晶（ＰＣ１）は、カルボジイミドを介して（PC1）の水酸基と結合した。ＡＦＰ抗体b（リガンド分子Ｂ）も同様の方法により照射部位（R）であるカバーガラスに結合した。ＡＦＰ抗体aとＡＦＰ抗体bは、AFP抗原の別の部位をそれぞれ認識して結合するモノクロナール抗体である。
試料液（ＳＬ１−１０００）１０μＬを注入し、５分間エアーバブリングを行った（工程１及び２）。
半導体励起小型パルスYAGレーザー（FDSS 532-1000、CryLaS社製）を励起光源として使用した。励起光（L）は波長532nm、出力エネルギー100μJ／パルスであり、照射スポットサイズ（直径）３０μmとした。照射スポットサイズを絞るために、開口数１．４の対物レンズを使用した。
蛍光シグナルの測定（工程３）には、ポリクロメーター及び高感度CCD（プリンストンインスツルメンツ社製）を使用した。工程３のイメージを図２に示した。励起光（L）を照射部位（R）の5×5mmの領域において走査しながら照射し、蛍光シグナルを積算した。積算時間は１分間である。
他の試料液（SL1）についても同様の操作を行い、検出限界濃度（pg/ml）を決定した。検出限界濃度は、蛍光シグナルが測定不可能になる濃度であり、ブランクシグナル（燐酸緩衝液のみを注入した場合）と分離不可能となる濃度とした。本測定条件におけるバイオセンサーチップ（BS1）の検出限界濃度は、５pg/mLであった。各工程の測定時間の合計は６分であった。
【００９３】
実施例１〜９のバイオセンサーチップの評価等を表１〜２に示す。
【００９４】
【表１】
2009092616.tif 000003
【００９５】
【表２】
2009092616.tif 000004
【００９６】
＜実施例２＞
粉状フォトニック結晶（ＰＣ１）の代わりに、粉状フォトニック結晶（ＰＣ２）を使用する以外は実施例１と同様にしてバイオセンサーチップ（BS２）を作製し、同一測定条件にて検出限界濃度を決定した。
【００９７】
＜実施例３＞
粉状フォトニック結晶（ＰＣ１）の代わりに、粉状フォトニック結晶（ＰＣ３）を使用を使用し、溶媒（S）として燐酸緩衝液を使用する以外は実施例１と同様にしてバイオセンサーチップ（BS３）を作製し、同一測定条件にて検出限界濃度を決定した。
【００９８】
＜実施例４＞
粉状フォトニック結晶（ＰＣ１）の代わりに、粉状フォトニック結晶（ＰＣ４）を使用する以外は実施例３と同様にしてバイオセンサーチップ（BS４）を作製し、同一測定条件にて検出限界濃度を決定した。
【００９９】
＜実施例５＞
粉状フォトニック結晶（ＰＣ４）の代わりに、粉状フォトニック結晶（ＰＣ５）を使用する以外は実施例３と同様にしてバイオセンサーチップ（BS５）を作製し、同一測定条件にて検出限界濃度を決定した。
【０１００】
＜実施例６＞
粉状フォトニック結晶（ＰＣ１）の代わりに、粉状フォトニック結晶（ＰＣ６）を使用する以外は実施例３と同様にしてバイオセンサーチップ（BS６）を作製し、同一測定条件にて検出限界濃度を決定した。
【０１０１】
＜実施例７＞
粉状フォトニック結晶（ＰＣ１）の代わりに、粉状フォトニック結晶（ＰＣ７）を使用する以外は実施例１と同様にしてバイオセンサーチップ（BS７）を作製し、同一測定条件にて検出限界濃度を決定した。
【０１０２】
＜実施例８＞
ＡＦＰ抗体a（リガンド分子A）及びＡＦＰ抗体b（リガンド分子B）の代わりに、ＣＫ−ＭＢ抗体a （リガンド分子A）及びＣＫ−ＭＢ抗体b（リガンド分子B）を使用する以外は実施例１と同様にしてバイオセンサーチップ（BS8）を作製した。試料液（SL2）である以外は、実施例１と同様にして検出限界濃度を決定した。
【０１０３】
＜実施例９＞
工程２の終了後にB/F分離工程を追加する以外は、実施例３と同様にして検出限界濃度を決定した。なお、バイオセンサーチップは（BS3）を使用し、B/F分離は試料液（SL1）等を除去後、燐酸緩衝液１００μLを槽に加え排出する操作を２回行った。
測定時間はB/F分離工程時間（２分）が加わり、８分となった。
【０１０４】
＜比較例１＞
粉状フォトニック結晶（ＰＣ４）の代わりに同一サイズ（１．１μｍ）の蛍光物質（F）含有ポリスチレン粒子を使用する以外は実施例１と同様にしてバイオセンサーチップ（BSR1）を作製し、同一測定条件にて検出限界濃度を決定した。
検出限界濃度は、１０００ｐｇ/ｍＬ以上であった。測定時間は6分であった。
蛍光物質（F）はローダミン６G（濃度も同一、１０−３M）であり、作製方法は、１．１μmのポリスチレン粒子を１０−３Ｍのローダミン６Gを含むエタノール溶液に２４時間浸漬することにより作製した。
【０１０５】
＜比較例２＞
エバネットＥＶ２０（ダイキン工業社製）によるＣＫ-ＭＢの基礎的検討（医学検査Vol46,No3,P411,1997）を比較例2とする。
エバネッセンス波蛍光免疫測定法の市販機種であるエバネットＥＶ２０を使用して、ＣＫ-ＭＢ抗原の定量検討を行った。測定時間は10分であり、検出限界濃度は８００pg/mLであった。
【０１０６】
いずれの実施例のバイオセンサーチップを使用した場合においても、発光法同等以上の検出感度レベル（100pg/mL（ＡＦＰ））を達成した。ホモジニアス測定が可能であり、発光法よりも測定時間を大幅に短縮することが出来る。
粉状フォトニック結晶を使用することにより、検出感度が通常の蛍光法よりも3桁以上向上することがわかった（比較例1より）。また、背景技術に挙げたエバネッセンス波蛍光免疫測定法よりも、検出感度が高く、測定時間も迅速であった（比較例2より）。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明のバイオセンサーチップは、微量化学物質測定、創薬分野等の研究開発や臨床診断分野（イムノアッセイなど）において使用することができる。高感度ホモジニアスな測定が可能であるため、ベッドサイドや診察室など身近な場所においてもイムノアッセイ等に使用する事ができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】噴霧乾燥法による微粒子集積体（PPC）からなる粉状フォトニック結晶（PC）の電子顕微鏡写真
【図２】工程３のイメージ
【図１】
2009092616.tif 000005
【図２】
2009092616.tif 000006