(57)【要約】      （修正有）【課題】グルタチオンやシステイニルグリシン等のチオール基を有する生理活性物質を簡便、迅速、正確に計測できる色彩色差計測方法及び計測装置を提供する。【解決手段】金ナノ粒子と、化学式１で表されるポリマーとで構成された複合体溶液を用い、グルタチオン又はシステイニルグリシンの計測を行う。化学式１中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基を表し、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基を表す。2009229147.tif 000008【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金ナノ粒子と、化学式１で表されるポリマーとで構成された複合体溶液を用い、グルタチオン又はシステイニルグリシンの計測を行うことを特徴とする色彩色差計測方法。
【化１】
2009229147.tif 000007
（化学式１中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基を表し、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基を表す。ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、ｎは１〜４である。）
【請求項２】
金ナノ粒子と上記化学式１で表されるポリマーとで構成された複合体溶液と、所定量のグルタチオンと、γ−ＧＴＰの補酵素とを有する試験溶液に、未知量のγ−ＧＴＰを配合し、該γ−ＧＴＰが前記グルタチオンを分解して生じたシステイニルグリシンに因る色彩色差を計測することによって、前記γ−ＧＴＰの計測を行うことを特徴とする色彩色差計測方法。
【請求項３】
前記化学式１中、Ｒ１とＲ２はそれぞれメチル基であり、Ｒ３とＲ４はそれぞれ水素である、請求項１又は２に記載の色彩色差計測方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の色彩色差計測方法を用いる計測装置であって、該色彩色差計測方法で用いる複合体溶液と測定対象物とを収容する容器と、該複合体溶液と測定対象物とを混ぜた後の色彩色差の比較色彩表又は吸光度計とを少なくとも備えることを特徴とする計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタチオン又はシステイニルグリシン等のチオール基含有化合物の定量を行うことができる色彩色差計測方法及びそれを用いた計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
分散状態の金ナノ粒子は、表面プラズモン吸収により赤色を呈するとともに、周囲の環境の変化に敏感に反応して凝集し、青色を呈することが知られている。こうした金ナノ粒子は凝集状態が安定であるため、金ナノ粒子の赤色から青色への変化を利用した分析法が種々検討されている。
【０００３】
例えば下記非特許文献１では、ホモシステイン、システイン、グルタチオンといったチオール基を有するアミノ酸が存在する条件下での金ナノ粒子の特異的な色調変化に関する検討が行われ、ホモシステインによる色調変化の速度が、システインの２倍、グルタチオンの少なくとも５倍以上であると報告されている。同文献では、この反応性の違いが、ホモシステイン、システイン、グルタチオンの金ナノ粒子への表面被覆とそれに引き続いて生じる架橋構造の形成に関連していると考察している。
【非特許文献１】Analyst,  127,  p.462−465(2002).
【０００４】
また、下記非特許文献２では、グルタチオンにより誘起される金ナノ粒子の会合（凝集）についての検討が行われ、グルタチオンにより誘起される金ナノ粒子の会合（凝集）によって長波長側に生じる新たなピークは，グルタチオン濃度、ナノ粒子のサイズ、ｐＨに依存すると報告されている。
【非特許文献２】J.  Colloid  Inter.  Science,  313,  p.724−734(2007).
【０００５】
また、下記非特許文献３では、蛍光分子を複合化した金ナノ複合体とグルタチオンとの反応（ナノ粒子表面での置換反応）により、遊離した蛍光分子が発する蛍光の強度を測定することでグルタチオンの計測が試みられている。
【非特許文献３】Langmuir,  23,  p.8815−8819(2007).
【０００６】
また、下記非特許文献４では、アプタマー（遺伝物質の一種）を修飾した金ナノ複合体を用いて、質量分析法によりＡＴＰやグルタチオンを分析する方法が提案されている。この方法では、金ナノ粒子複合体がＡＴＰやグルタチオンをイオン化するマトリックスとして働いていると考察されている。
【非特許文献４】Analytical  Chemistry,  79,  p.4852−4859(2007).
【０００７】
また、下記非特許文献５では、蛍光色素ナイルレッドを修飾した金ナノ粒子複合体を用いて、質量分析法によりグルタチオン等のアミノチオールを分析する方法が提案されている。この方法では、金ナノ複合体がアミノチオールをイオン化するマトリックスとして働いていると考察されている。
【非特許文献５】Analytical  Chemistry,  78(5),  p.1485−1493(2006).
【０００８】
上記の金ナノ粒子や金ナノ粒子複合体は凝集状態が安定であるため、一度凝集した金ナノ粒子を再び分散状態に戻すことは非常に難しいと考えられていた。しかしながら、近年において比較的簡単な手順で金ナノ粒子の再分散を発現できることが報告されるようになり、そうした金ナノ粒子の再分散現象を利用した分析法も提案されている。
【０００９】
例えば下記非特許文献６では、グルタチオンやシステインが誘起する金ナノロッドの直線的配列について検討され、グルタチオンやシステインの添加により金ナノロッドの直線的な配列が延び、これにより新たに長波長側に吸収スペクトルが生じること、また、グルタチオンやシステインの濃度が増加するにつれて長波長側に吸収スペクトルは大きくなることが検討されている。そして、この原理に基づいてグルタチオンやシステインの濃度を計測することができることが提案されている。
【非特許文献６】J.  Am.  Chem.  Soc.,  127,  p.6516−6517(2005).
【００１０】
金ナノ粒子の再分散性を利用した研究として、本発明者は、熱応答性高分子を複合化した金ナノ粒子複合体を用い、熱刺激により金ナノ粒子複合体が凝集状態（青色）から分散状態（赤色）に変化することを利用し、グルタチオンのセンシングを行った例（非特許文献７）、及び、その熱応答性高分子を複合化した金ナノ粒子複合体に熱刺激を行い、その再分散性を利用したＬ−システインの簡易定量法（非特許文献８）について報告している。この再分散現象は熱刺激によって起こるが、その再分散はＬ−システイン等のようなチオール基含有化合物が共存すると阻害される。
【非特許文献７】日本分析化学会第５５年会講演要旨集、ｐ．３２（２００６年９月６日発行）
【非特許文献８】第６７回分析化学討論会講演要旨集、ｐ．２０８（２００６年４月２９日発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
金ナノ粒子をカラーセンサーとする研究はＤＮＡの検出等について研究されているが、金ナノ粒子は安定状態が凝集態様であるためにもともと凝集しやすく、その結果、金ナノ粒子を用いる計測方法は正確さに欠けるという指摘がされている。
【００１２】
本発明は、グルタチオン又はシステイニルグリシン等のチオール基含有化合物を簡便、迅速、正確に計測することができる色彩色差計測方法及びそれを用いた計測装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、チオール基含有化合物の分散現象に及ぼす影響について詳細に検討している過程で、特定のポリマーを金ナノ粒子に複合化させた複合体溶液を用いた場合、特に特定のチオール基含有化合物に対し、その定量測定を極めて簡便、迅速、再現性よく行うことができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち、上記課題を解決するための本発明の第１の観点に係る色彩色差計測方法は、金ナノ粒子と、化学式１で表されるポリマーとで構成された複合体溶液を用い、グルタチオン又はシステイニルグリシンの計測を行うことを特徴とする。化学式１中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基を表し、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基を表し、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、ｎは１〜４である。
【００１５】
【化２】
2009229147.tif 000002
【００１６】
この第１の観点に係る発明によれば、金ナノ粒子と上記化学式１で表されるポリマーを複合化した金ナノ粒子複合体は溶液中で略凝集状態となって青色を呈するが、金ナノ粒子複合体はポリマーが金ナノ粒子に化学吸着することにより溶液中で沈降しない。そして、この複合体溶液にグルタチオンやシステイニルグリシン等の特定のチオール基含有化合物を混合することにより、ポリマーが離脱する代わりにグルタチオンやシステイニルグリシン等が金ナノ粒子に吸着し、さらにそのグルタチオンやシステイニルグリシン等が有するカルボキシル基の作用により分散状態になって赤色に変化する。なお、グルタチオンよりもシステイニルグリシンの方が迅速に赤色に変化する。
【００１７】
本発明の第２の観点に係る色彩色差計測方法は、金ナノ粒子と上記化学式１で表されるポリマーとで構成された複合体溶液と、所定量のグルタチオンと、γ−ＧＴＰの補酵素とを有する試験溶液に、未知量のγ−ＧＴＰを配合し、該γ−ＧＴＰが前記グルタチオンを分解して生じたシステイニルグリシンに因る色彩色差を計測することによって、前記γ−ＧＴＰの計測を行うことを特徴とする。
【００１８】
この第２の観点に係る発明によれば、グルタチオンをシステイニルグリシンに分解する未知量のγ−ＧＴＰの計測を、複合体溶液中でのグルタチオンとシステイニルグリシンの色変化のし易さを利用して行うことができる。その結果、例えば血液中から抽出した未知量のγ−ＧＴＰを、複合体溶液とグルタチオンを含む溶液中に配合すれば、その色の変化によってγ−ＧＴＰの血中濃度の簡易計測が可能となる。
【００１９】
本発明の色彩色差計測方法の好ましい態様は、前記化学式１中、Ｒ１とＲ２はそれぞれメチル基であり、Ｒ３とＲ４はそれぞれ水素であるように構成する。
【００２０】
上記課題を解決するための本発明の計測装置は、上記本発明に係る色彩色差計測方法を用いる計測装置であって、該色彩色差計測方法で用いる複合体溶液と測定対象物とを収容する容器と、該複合体溶液と測定対象物とを混ぜた後の色彩色差の比較色彩表又は吸光度計とを少なくとも備えることを特徴とする。
【００２１】
この発明によれば、色彩色差計測方法で用いる複合体溶液と測定対象物とを収容する容器と、複合体溶液と測定対象物とを混ぜた後の色彩色差の比較色彩表又は吸光度計とを少なくとも備えるので、混ぜた後の溶液の色を比較色彩表と比較し又は吸光度を測定し、測定対象物の濃度を迅速且つ簡易に計測することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の色彩色差計測方法及びそれを用いた計測装置によれば、溶液中で沈降せず、グルタチオンやシステイニルグリシン等の特定のチオール基含有化合物を混合することにより青色（凝集状態から）赤色（分散状態）に変化する金ナノ粒子複合体を用いるので、測定対象物の検出や濃度計測を視覚的に又は簡易吸光度測定結果として捉えることができる。その結果、測定対象物の測定を迅速且つ簡易に行うことができる。なお、従来、Ｌ−システイン等のチオール基含有化合物は金ナノ粒子の分散を阻害して色調変化も生じなかったが、本発明によれば、意外にも同じチオール基含有化合物であるグルタチオンやシステイニルグリシンに対して特異的に分散状態とすることができる。すなわち、本発明の色彩色差計測方法は、上記複合体の特異現象を利用し、チオール基含有化合物の色彩色差計測を行うものである。
【００２３】
また、本発明によれば、グルタチオンをシステイニルグリシンに分解する未知量のγ−ＧＴＰの計測を、複合体溶液中でのグルタチオンとシステイニルグリシンの色変化のし易さを利用して行うことができる。その結果、例えば血液中から抽出した未知量のγ−ＧＴＰを、複合体溶液とグルタチオンを含む溶液中に配合すれば、その色の変化によってγ−ＧＴＰの血中濃度の簡易計測が可能となる。
【００２４】
こうした本発明の色彩色差計測方法及び計測装置によれば、上記特定のチオール基含有化合物であるグルタチオンやシステイニルグリシンの測定が可能となり、医療現場で簡易に測定できるキットの実用化を可能とする。こうしたキットは、家庭内での健康管理にも活用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の色彩色差計測方法及びそれを用いた計測装置について、以下に詳しく説明する。
【００２６】
［色彩色差計測方法］
本発明の色彩色差計測方法は、金ナノ粒子と、後述の化学式１で表されるポリマーとで構成された複合体溶液を用いる。そして、この複合体溶液で、グルタチオンやシステイニルグリシン等のチオール基含有化合物の計測を行う。
【００２７】
（金ナノ粒子）
金ナノ粒子の形状は、粒形状又は球形状であることが望ましい。本発明の色彩色差計測方法に金ナノ粒子が用いられる理由は、化学的に安定であるともに、入手の点で有利だからである。なお、金ナノ粒子の粒径は、その調製方法に依存し、各種の粒径のものを得ることができるが、例えば後述の実験例では約１３ｎｍのものを用いている。本発明に使用可能な金ナノ粒子の粒径の範囲は特に限定されないが、粒径が小さすぎるものは作製が難しく、一方、粒径が大きすぎるものは沈降してしまう場合があるので、それらを考慮して選択する。なお、金ナノ粒子の粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）での観察結果から求めることができる。
【００２８】
金ナノ粒子は、金ナノ粒子溶液として調製することができる。この金ナノ粒子溶液の調製は、クエン酸ナトリウム還元により行うことができ、具体的には、例えば、所定量のテトラクロロ金酸水溶液に、クエン酸三ナトリウム水溶液を添加して調製する例を挙げることができるが、市販の所定の大きさからなる金ナノ粒子溶液を用いてもよい。
【００２９】
（ポリマー）
ポリマーは、下記化学式１で表される。下記の化学式１において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基を表し、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、ｎは１〜４である。
【００３０】
【化３】
2009229147.tif 000003
【００３１】
Ｒ１とＲ２のアルキル基としては、メチル基であることが好ましいが、同様の作用を奏する範囲で炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基であってもよい。特に下記化学式２に示すように、Ｒ１とＲ２がそれぞれメチル基であり、Ｒ３とＲ４がそれぞれ水素であることが好ましい。
【００３２】
【化４】
2009229147.tif 000004
【００３３】
化学式２のポリマーの左側の側鎖は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下、ＮＩＰＡＡｍという。）であり、右側の側鎖は、エチレンイミン鎖の繰り返し単位を含むアクリロイルアミン（以下、ＡＣという。）である。より具体的には、右側の側鎖のエチレンイミン鎖の繰り返し単位であるｎ＝０の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルエチレンジアミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＥＤＡ））という。］となり、ｎ＝１の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルジエチレントリアミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ））という。］となり、ｎ＝２の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルトリエチレンテトラミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））という。］となり、ｎ＝３の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルテトラエチレンペンタミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＰＡ））という。］、ｎ＝４の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルペンタエチレンヘキサミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＰＥＨＡ））という。］となる。
【００３４】
ポリマーの左側の側鎖の繰り返し単位であるｘと、右側の側鎖の繰り返し単位であるｙとの比は、ｘ／ｙで、９５／５〜７０／３０の範囲であることが好ましく、特に９０／１０〜８５／１５の範囲であることが好ましい。
【００３５】
ポリマーの分子量は、重量平均分子量で８０００以上１０００００以下のものを用いることができ、１００００以上２００００以下のものが好ましい。
【００３６】
ポリマーは、化学式１，２における右側の側鎖にエチレンアミン鎖を有するが、そのエチレンアミン鎖にはＮＨ基やＮＨ２基が多く、そうした基が金ナノ粒子に吸着して複合体を形成する。その結果、複合体は溶液中で沈殿することなく凝集状態を保持し、複合体溶液は青色を呈している。
【００３７】
（分散メカニズム）
図１は、複合体溶液にグルタチオンを混ぜたときの金ナノ粒子の分散メカニズムを示す模式図である。複合体溶液中の複合体は、非特許文献７，８に記載の先行技術のような相転移を伴わず、従来の再分散メカニズムとは本質的に異なっている。すなわち、従来の再分散メカニズムは、複合体に熱刺激を加えることにより熱応答性高分子であるポリマーの相転移が起き、それに伴ってポリマーが吸着している金ナノ粒子が再配列することにより、金ナノ粒子が凝集状態から分散状態へ変化するものと考えられている。
【００３８】
ところが、本発明においては、後述の図２に示すＭＳ（マス）スペクトルからもわかるように、金ナノ粒子へのグルタチオンの吸着によって金ナノ粒子からポリマーが脱離することがその原因であると考えられる。すなわち、凝集状態の金ナノ粒子複合体にチオール基を有するグルタチオンを加えると、金ナノ粒子の表面で、ポリマーのアミノ基と交換してグルタチオンが吸着する。グルタチオンは分子サイズが大きく、後述の実施例で検討したｐＨ６〜９においてカルボキシル基が負の電荷を有するために、金ナノ粒子の有効な分散剤として作用するものと考えられる。同様な作用を与えたチオール基含有化合物としては、システイニルグリシンがある。これに対して、Ｌ−システインは再現性のない結果を与えたことから、金ナノ粒子の分散剤としては不十分であると考えられる。
【００３９】
以上のことから、本発明に係る複合体溶液へのチオール基含有化合物の配合による再分散には、（１）チオール基の存在、（２）分子サイズ及び構造、（３）カルボキシル基やアミノ基間の水素結合、が必要であると考えられる。
【００４０】
（１）のチオール基は、金ナノ粒子の表面に吸着し、アミノ基との交換反応を起こすと考えられる。
【００４１】
（２）の分子サイズ及び構造については、複合化した金ナノ粒子を安定に再分散させるグルタチオンとシステイニルグリシンとの比較において、グルタチオンよりも低分子量のシステニイルグリシンンのほうがより迅速に金ナノ粒子を凝集状態から分散状態へ変化させることができる。グルタチオンのように分子サイズが大きいと金ナノ粒子の保護効果が大きいものの、ポリマーとの置換が遅い。Ｌ−システイン等低分子量のカルボキシル基を有するチオール基含有化合物では金ナノ粒子の保護効果はほとんどなく、反応ははやい。グルタチオンとＬ−システインの中間のサイズにあるシステイニルグリシンは、金ナノ粒子の保護効果を有し、ポリマーとの置換の反応速度もはやいと考えられる。
【００４２】
（３）カルボキシル基の静電反発については、チオール基含有化合物の酸解離したカルボキシル基の静電反発が大きく関与すると考えられる。グルタチオンの二つのカルボキシル基のｐＫａはｐＫａ１＝２．１６及びｐＫａ２＝３．５５であり、主に検討しているポリマー濃度０．２重量％における複合体溶液のｐＨが約８であるため、カルボキシル基はＣＯＯ−となっている。その一方、ＮＨ基、ＮＨ２基は一部水素イオンが付加して正に帯電している。はじめに金ナノ粒子はクエン酸によりアニオン性の状態であり、静電反発により分散している。この状態にＮＨ基、ＮＨ２基を有するポリマーを添加することにより、金ナノ粒子表面の電荷が部分的に打ち消されるとともに、ＮＨ基、ＮＨ２基が金に吸着して、金ナノ粒子が凝集する。このとき、金ナノ粒子は、ポリマーで被覆され、凝集した粒子間にポリマーが入りこんだ状態になっている。この状態の金ナノ粒子にチオール基含有化合物であるグルタチオン等を添加すると、チオール基とＮＨ基、ＮＨ２基とが交換し、チオール基含有化合物が金ナノ粒子の表面に結合する。このとき、金ナノ粒子の表面では官能基が非常に込み合っている状態となっているが、チオール基含有化合物や熱応答性高分子の極性基（官能基）がランダムな状態で存在することはエネルギー的に不利になる。極性基（官能基）が水素結合により配列することで、エネルギー的に不利な状態が解消される。結果として、金ナノ粒子間の距離を広がることになるものと考えられる。
【００４３】
以上のチオール基の存在、分子サイズや構造、チオール基含有化合物のカルボキシル基の存在、ＮＨ基、ＮＨ２基を有するポリマーによる非共有結合的な保護効果が金ナノ粒子の再分散に影響するほかに、チオール基含有化合物の他の官能基の電荷や溶液中に存在する化合物の構造や各官能基の電荷等が、全体として金ナノ粒子の再分散に影響している。
【００４４】
金ナノ粒子の再分散に影響する他の条件として、金ナノ粒子の濃度、ポリマー濃度、ｐＨ、加熱・冷却温度等を挙げることができる。これらの条件は、測定対象物の種類によっても異なるが、例えば、金ナノ粒子の濃度は０．００１８〜０．００９０重量％の範囲であることが好ましく、ポリマーの濃度は０．１〜０．５重量％の範囲であることが好ましく、両者の比［金ナノ粒子の濃度／ポリマーの濃度］は０．００１８／０．５〜０．００９０／０．１の範囲であることが好ましい。また、複合体溶液のｐＨは、後述の実験例では約８前後であるが、６．５〜８．５であることが好ましい。
【００４５】
グルタチオンは図１中に示しているが、システイニルグリシンは下記化学式３に示すとおりである。
【００４６】
【化５】
2009229147.tif 000005
【００４７】
（γ−ＧＴＰの測定）
次に、γ−ＧＴＰの色彩色差計測方法について詳しく説明する。γ−ＧＴＰ（ガンマ−グルタミントランスペプチターゼ）は肝臓の解毒作用に関係している酵素である。過度の飲酒によりその値が上昇することから、肝臓の働きを知る検査項目として一般にも良く知られている。γ−ＧＴＰの測定を行うには、医療機関で受診をし、血液検査を受けなければならない。そして検査結果を知るために再度受診しなければならない。簡単な操作で検査項目値が正常範囲にあるかどうかを迅速に判断できれば、初回診療時における診察の判断の助けになるだけでなく、検査結果を知るためだけの再受診という患者の負担を減らすことができる。本発明では、金ナノ粒子が分散状態にあるときには赤色を呈し、凝集状態では青色を呈するという特性を利用し、簡易に目視でグルタチオンやシステイニルグリシンの活性を測定する方法を用いてγ−ＧＴＰの測定を実現している。
【００４８】
本発明では、例えばポリイソプロピルアクリルアミドにポリアミノ基を導入したポリマーを金ナノ粒子と複合化した本発明に係る金ナノ粒子複合体が、グルタチオンやシステイニルグリシンの存在により自発的に再分散することを見いだしたが、こうした再分散を促進させる効果はシステイニルグリシンの方がグルタチオンに比べて大きい。すなわち、グルタチオンを添加した場合には、金ナノ複合体の溶液の色調はゆっくりと青色（凝集状態）から赤色（分散状態）へと変化するが、システイニルグリシンを添加した場合には、青色から赤色への変化が速やかに起こる。γ−ＧＴＰはグルタチオンをシステイニルグリシンとグルタミン酸に分解する酵素であるので、金ナノ複合体の溶液に、グルタチオンと、γ−ＧＴＰ及びその補酵素を含む酵素溶液とを混合すれば、γ−ＧＴＰの作用によりグルタチオンが分解してその量が減り、システイニルグリシンの量が増える。その結果、青色（凝集状態）から赤色（分散状態）への変化が促進される。
【００４９】
すなわち、こうした原理に基づいた本発明に係るγ−ＧＴＰの色彩色差計測方法は、金ナノ粒子と上記化学式１で表されるポリマーとで構成された複合体溶液と、所定量のグルタチオンと、γ−ＧＴＰの補酵素とを有する試験溶液に、未知量のγ−ＧＴＰを配合することにより行う。試験溶液にγ−ＧＴＰを配合することにより、未知量のγ−ＧＴＰが所定量のグルタチオンを分解し、その結果生じたシステイニルグリシンに因る色彩色差を計測することによって、γ−ＧＴＰの計測を行う。この方法、グルタチオンをシステイニルグリシンに分解する未知量のγ−ＧＴＰの計測を、複合体溶液中でのグルタチオンとシステイニルグリシンの色変化のし易さを利用して行ったものであり、その結果、例えば血液中から抽出した未知量のγ−ＧＴＰを、複合体溶液とグルタチオンを含む溶液中に配合すれば、その色の変化によってγ−ＧＴＰの血中濃度の簡易計測が可能となる。
【００５０】
なお、測定時間は各溶液の配合量、溶液の加熱温度等の溶液条件を調整することにより規定できるが、溶液の加熱温度が３７℃であれば３０分〜６０分程度の範囲であれば容易に結果を評価でき、簡易測定手段として好ましい。また、定量にあたっては、予め既知量のγ−ＧＴＰを用いて測定し、検量線を作成しておくことにより、得られた結果をその検量線に当てはめ、未知量のγ−ＧＴＰの定量を行うことができる。
【００５１】
以上説明したように、本発明の色彩色差計測方法によれば、溶液中で沈降せず、グルタチオンやシステイニルグリシン等の特定のチオール基含有化合物を混合することにより速やかに赤色（分散状態）に変化する複合体溶液を用いるので、測定対象物の検出や濃度計測を視覚的に又は簡易吸光度測定結果として捉えることができる。その結果、測定対象物の測定を迅速且つ簡易に行うことができる。こうした本発明の色彩色差計測方法によれば、上記特定のチオール基含有化合物であるグルタチオンやシステイニルグリシンの色変化速度の違い基づき、グルタチオンの分解酵素であるγ−ＧＴＰの簡易定量も可能となり、医療現場で簡易に測定できるキットの実用化を可能とする。こうしたキットは、家庭内での健康管理にも活用できる。
【００５２】
［計測装置］
本発明の計測装置は、上記本発明の色彩色差計測方法を用いる装置であって、その色彩色差計測方法で用いる複合体溶液と測定対象物とを収容する容器と、その複合体溶液と測定対象物とを混ぜた後の色彩色差の比較色彩表又は吸光度計とを少なくとも備える。
【００５３】
容器としては、目視により又は吸光度測定によって、収容した溶液の色彩色差の変化を観察又は測定できる透過性容器であればよく、種々の形態とすることができる。一例としては、吸光度測定に用いる石英セルのような形態を挙げることができる。
【００５４】
容器は、予め調製された複合体溶液が入っている態様のものでもよいし、測定時に別容器から注いで用いる空容器であってもよい。いずれにしても、測定に用いる複合体溶液は、予め調製された状態で、容器内に又は別容器内に準備されていることが好ましい。
【００５５】
複合体溶液の入った容器に測定対象物を入れ、測定対象物を入れない容器をブランクとして比較測定して色彩色差を観察又は測定する。観察は目視により行うが、その際に、比較色彩表を準備し、色変化した容器をその比較色彩表に表された色サンプルと照らし合わせ、測定する容器の色と最も近い色サンプルの情報を適用する。一方、吸光度測定の場合には、吸光度測定用のセル容器を吸光度測定装置にセットして吸光度を測定する。
【００５６】
本発明の計測装置は、測定対象物の検出や濃度計測を視覚的に又は簡易吸光度測定結果として捉えることができるので、測定対象物の測定を迅速且つ簡易に行うことができる。
【００５７】
さらに、γ−ＧＴＰの測定も可能であり、その場合には、容器内に、金ナノ粒子と上記化学式１で表されるポリマーとで構成された複合体溶液と、所定量のグルタチオンと、γ−ＧＴＰの補酵素とを有する試験溶液を入れておき、試験溶液の入った容器に、未知量のγ−ＧＴＰを配合して測定に供する。こうした計測装置は、医療現場で簡易に測定できるキットの実用化を可能とするとともに、家庭内での健康管理にも活用できる。
【実施例】
【００５８】
以下の実験によって、本発明をさらに詳しく説明する。
【００５９】
（実験１：グルタチオンの測定）
１０ｍＬメスフラスコに、０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液３ｍＬ、２ｗｔ％ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ）共重合体の水溶液１．０ｇ、水４ｍＬをそれぞれ加えて複合体溶液を調製し、その複合体溶液に、１．０×１０−６〜１．０×１０−３ｍｏｌ／Ｌグルタチオン１．０ｍＬを添加し、水で定容（１０ｍＬ）とした。そして、３７℃・１５分間反応させた後、２５℃で４０分間冷却した後、この溶液の色調変化を目視するとともに可視吸収スペクトルを測定した。
【００６０】
ここで、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ）共重合体は、化学式２のポリマーを用い、ｘ／ｙ＝９０／１０、ｎ＝１のもの（ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ）−ｃｏ−ＤＥＴＡ）を合成して用いた。
【００６１】
図２は、１．０×１０−４ｍｏｌ／Ｌのグルタチオン１．０ｍＬを添加したときに得られた可視吸収スペクトルである。ポリマーを金ナノ粒子に複合化すると、金ナノ粒子複合体は凝集状態となって青色を呈したが、この溶液にグルタチオンを添加すると、図２の結果からも分かるように、３０秒から１２分に時間が経過するとともに金ナノ粒子は再分散し、溶液の可視吸収スペクトルは長波長側の吸収が減少し、短波長側の吸収が増加してブルーシフトした。また、図示しないが、可視吸収スペクトルの変化する速さは、グルタチオン濃度に依存した。溶液調製から測定までの温度が一定となっている場合、グルタチオンの添加による金ナノ粒子の再分散に伴う色調変化は高い再現性があった。このことから、グルタチオンの添加による金ナノ粒子の再分散に伴う色調変化を利用したグルタチオンのカラーセンシングが可能になる。
【００６２】
また、グルタチオンを添加して分散させた金ナノ粒子のＭＳスペクトルを図３に示した。図３（Ａ）はグルタチオンを添加していないときのＭＳスペクトルであり、図３（Ｂ）はグルタチオンを添加したときのＭＳスペクトルである。その結果から、金ナノ粒子の表面への、ポリマー中のエチレンアミン残基の付着は観察されなかった。このことは、金ナノ粒子表面において、ポリマー中のエチレンアミン基がグルタチオンにより置換されたことを示している。また、グルタチオンによる金ナノ粒子の再分散は、時間の経過に伴い進行し、この色調が変化する速さは溶液中のグルタチオン濃度が高いほど大きくなった。
【００６３】
（実験２：システイニルグリシンの測定）
１０ｍＬメスフラスコに、０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液３ｍＬ、２ｗｔ％ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ）共重合体の水溶液１．０ｇ、水４ｍＬをそれぞれ加えて複合体溶液を調製し、その複合体溶液に、１．０×１０−６〜１．０×１０−３ｍｏｌ／Ｌシステイニルグリシン１．０ｍＬを添加し、水で定容（１０ｍＬ）とした、３７℃・１５分間反応させた後、２５℃で４０分間冷却した後、この溶液の色調変化を目視するとともに可視吸収スペクトルを測定した。
【００６４】
ここで、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ）共重合体は、化学式２のポリマーを用い、ｘ／ｙ＝９０／１０、ｎ＝１のもの（ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ）−ｃｏ−ＰＥＨＡ）を合成して用いた。
【００６５】
図４は、得られた可視吸収スペクトルである。図４の結果からも分かるように、ポリマーを金ナノ粒子に複合化すると、金ナノ粒子複合体は凝集状態となって青色を呈したが、この溶液にシステイニルグリシンを添加すると、溶液を加熱しなくても溶液の色調は青色から赤色に変化した。詳しくは、図４において、符号１は金ナノ粒子溶液であり、符号２は金ナノ粒子複合体溶液であり、符号３は金ナノ粒子複合体溶液に１×１０−６ｍｏｌ／Ｌのシステイニルグリシンを添加したものであり、符号４は金ナノ粒子複合体溶液に１×１０−５ｍｏｌ／Ｌのシステイニルグリシンを添加したものであり、符号５は金ナノ粒子複合体溶液に１×１０−４ｍｏｌ／Ｌのシステイニルグリシンを添加したものであり、符号６は金ナノ粒子複合体溶液に１×１０−３ｍｏｌ／Ｌのシステイニルグリシンを添加したものである。図４の結果において、吸収ピークが５１０ｎｍ付近にあるものは赤色（分散状態）であり、吸収ピークが６３０ｎｍ付近にあるものは青色（凝集状態）であった。図４の結果から分かるように、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＰＥＨＡ））（９０：１０）金ナノ粒子複合体は、システイニルグリシン濃度を１×１０−５〜１×１０−３ｍｏｌ／Ｌとしたとき（符号４〜６）、溶液の色調が青色から赤色まで変化した。このとき、システイニルグリシン濃度が高いほど青色から赤色への色調の変化は迅速であった。また、システイニルグリシン濃度１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ（符号３）においては溶液は青色のままであった。
【００６６】
（実験３：グルタチオンとシステイニルグリシンの測定）
エチレンアミン鎖長の長いｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＰＥＨＡ））を複合化した金ナノ粒子の再分散ではグルタチオンとシステイニルグリシンによる色調変化の速度に違いが現れた。そこで、濃度依存性について検討した。既に、システイニルグリシンの濃度依存性については図４で検討した。図５はグルタチオン濃度を変え得られた金ナノ粒子複合体の可視吸収スペクトルである。図５において、符号１は金ナノ粒子溶液であり、符号２は金ナノ粒子複合体溶液であり、符号３は金ナノ粒子複合体溶液に１×１０−６ｍｏｌ／Ｌのグルタチオンを添加したものであり、符号４は金ナノ粒子複合体溶液に１×１０−５ｍｏｌ／Ｌのグルタチオンを添加したものであり、符号５は金ナノ粒子複合体溶液に１×１０−４ｍｏｌ／Ｌのグルタチオンを添加したものであり、符号６は金ナノ粒子複合体溶液に１×１０−３ｍｏｌ／Ｌのグルタチオンを添加したものである。図５の結果より、グルタチオンを添加した場合は、１×１０−５、１×１０−４ｍｏｌ／Ｌ（符号４，５）の場合は青紫色に、１×１０−３ｍｏｌ／Ｌ（符号６）の場合も紫色までしか変化しなかった。実験２で得られた図４の結果と図５の結果を比較すると、グルタチオンよりもシステイニルグリシンの方が色調変化が早いことがわかった。
【００６７】
また、図６は、金ナノ粒子複合体に及ぼすグルタチオンとシステイニルグリシンの濃度をそれぞれ１×１０−４ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した場合のａ＊値の経時変化であり、図７は、金ナノ粒子複合体に及ぼすシステイニルグリシンの濃度を１．０×１０−４ｍｏｌ／Ｌとした場合と５．０×１０−４ｍｏｌ／Ｌとした場合のａ＊値の経時変化である。
【００６８】
図６におけるａ＊値を観察してもグルタチオンとシステイニルグリシンの差は明らかである。また、図７に示すように、システイニルグリシンの濃度が高いほどａ＊の初期の増加分が大きく、より短い時間で赤色まで変化することを示している。このｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＰＥＨＡ））を複合化した金ナノ粒子のシステイニルグリシンとグルタチオンとの再分散の速度差に伴う色調の差は、γ−ＧＴＰの計測法の開発を期待させる。
【００６９】
ここで、システイニルグリシンとグルタチオンによる再分散の速度の違いについて考察する。両者の違いは主に、分子サイズと構造の違いに起因すると考えられる。システイニルグリシンはグルタチオンのグルタミン酸基が解離したシステインとグリシンからなるジペプチドであり、グルタチオンよりも分子サイズが小さい。それに対してグルタチオンはシステイン、グリシン及びグルタミン酸からなるトリペプチドであるために分子サイズが大きい。そのかさ高さのために、金ナノ粒子に吸着したｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＰＥＨＡ））（９０：１０）のエチレンアミンとチオール基との交換速度がシステイニルグリシンと比べてグルタチオンは遅いと考えられる。また、グルタチオンのチオール基は構造の中心付近に存在するのに対し、システイニルグリシンはチオール基とアミノ基が隣接している。このことから、システイニルグリシンが金ナノ粒子との親和性をより強めていると考えられる。金ナノ粒子に対する親和性が強い官能基（−ＳＨ，−ＮＨ２）が隣接した構造にあるシステイニルグリシンはよりはやくポリマーのエチレンアミンとの置換がおき、グルタチオンはその構造とかさ高さのために、ポリマーのエチレンアミンとの置換が遅く再分散による色調の変化が緩やかに進行すると考えられる。
【００７０】
（実験４：γ−ＧＴＰの測定）
γ−ＧＴＰの活性を計測した。５ｍＬメスフラスコに１０ｗｔ％ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ）共重合体（ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ）−ｃｏ−ＰＥＨＡ）の水溶液０．１ｍＬ、水１．５ｍＬ、０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液１．５ｍＬをそれぞれ加えて複合体溶液を調製し、その複合体溶液に、１．０×１０−３ｍｏｌ／Ｌグリシルグリシン（γ−ＧＴＰの補酵素）０．５ｍＬ、γ−ＧＴＰ（所定量）を含む試料溶液０．１５ｍＬ、１．０×１０−３ｍｏｌ／Ｌグルタチオン０．２５ｍＬを添加し、水で定容（５ｍＬ）とした、３７℃・１５分間反応させた後、２５℃で４０分間冷却した後、この溶液の色調変化を目視するとともに可視吸収スペクトルを測定した。
【００７１】
図８は、得られた可視吸収スペクトルである。図８の結果からも分かるように、金ナノ粒子複合体溶液にグルタチオンとシステイニルグリシンを配合した試験溶液は、赤色（分散状態）を呈していた。この赤色の試験溶液に、γ−ＧＴＰを濃度を変えて添加すると、濃度にしたがって吸収が規則的になり、色彩も規則的に変化している波長領域があった。図９は、得られた可視吸収スペクトルを基にして作成したγ−ＧＴＰとａ＊との関係を示す検量線である。この検量線を利用することにより、測色色差計によってａ＊を測定してγ−ＧＴＰを容易に定量できる。
【００７２】
下記式は、γ−ＧＴＰによるグルタチオンの分解反応である。γ−ＧＴＰにより、グルタチオンが消費され、システイニルグリシンが生成すると金ナノ複合体の再分散が促進されて赤色が強まった。この色調の変化に基づいて、γ−ＧＴＰの酵素活性を目視計測できた。
【００７３】
【化６】
2009229147.tif 000006
【００７４】
（測定）
可視吸収スペクトルの測定には、光路長１ｃｍプラスチックセルを装備した紫外可視分光光度計（日本分光製、Ｖ−５６０型）を使用した。主にＬ＊ａ＊ｂ＊値は、測定した可視吸収スペクトルを基に、色彩計算プログラム（日本分光製、Ｖ−５００ＤＳ）を用いて算出を行った。また、一部のＬ＊ａ＊ｂ＊値は、測色色差計（日本電色製、ＺＥ  ２０００）を用いて測定した。透過率の測定には、光路長１ｃｍプラスチックセルを装備したダブルビーム分光光度計（日立製作所製、Ｕ−２０００Ａ型）を使用した。赤外吸収スペクトルの測定には、フーリエ変換赤外分光装置（ＦＴ−ＩＲ、日本分光製、４３０型）を用いた。ｐＨの測定には、ｐＨメーター（ＨＯＲＩＢＡ製、Ｆ−１３）を使用した。
【００７５】
（金ナノ粒子の調製）
上記核実験で用いた金ナノ粒子溶液の調製は、クエン酸ナトリウム還元により行った。５００ｍＬ丸底フラスコに１ｍＭテトラクロロ金酸水溶液を２５０ｍＬ入れ、攪拌しながら沸騰させた後、３８．８ｍＭクエン酸三ナトリウム水溶液を２５ｍＬ添加し、溶液の色が淡黄色から深紅色へと変化することを確認した。沸騰させ、室温でさらに攪拌した後、溶液を孔径１μｍメンブランフィルターを用いてろ過を行って、０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液を調製した。この金ナノ粒子の金粒子は、粒径約１３ｎｍであった。
【００７６】
（ポリマーの調製）
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルエチレンアミン）の合成を行った。ｐｏｌｙ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルジエチレントリアミン）［ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ））］  は、まず、ＤＥＴＡと塩化アクリロイル（ＡＣ）よりアクリロイルジエチレントリアミン［以下、ＡＣ−ＤＥＴＡ］の合成を以下の手順で行った。ＤＥＴＡを含む１，４−ジオキサンの混合溶液（２０．６３ｇ／２００ｍＬ）に、ＡＣと１，４−ジオキサンの混合溶液（１．６２５ｍＬ／５０ｍＬ）を一滴ずつ滴下して反応させた（ＤＥＴＡの物質量：ＡＣの物質量＝１０：１）。滴下終了後、白色の沈殿を濾別し、少量（約４０ｍＬ）のメタノールに溶解した。これにＫＯＨ−メタノール溶液を加えて攪拌、濾別し、得られた濾液をＮＩＰＡＡｍとの共重合に用いた。５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにモノマーの供給比（ＮＩＰＡＡｍの物質量：ＤＥＴＡの物質量）がモル比で９０：１０（ｍｏｌ％）となるようにＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）とＡＣ−ＤＥＴＡを含むメタノール溶液を加えた。これに重合促進剤と重合開始剤を添加し、油浴中でフラスコ内の溶液を攪拌しながら窒素雰囲気下で脱酸素を行った。その後、窒素を通気しながら、油浴で６０℃とし、窒素雰囲気下で４時間重合を行った。
【００７７】
また、エチレンイミン鎖長の異なるエチレンジアミン（ＥＤＡ）１２．０２ｇ（０．２ｍｏｌ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）２０．６３ｇ（０．２ｍｏｌ）、テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）３７．８６ｇ（０．２ｍｏｌ）、ペンタエチレンヘプタミン（ＰＥＨＡ）４６．４９ｇ（０．２ｍｏｌ）をそれぞれ用いて、ＮＩＰＡＡｍの物質量とＤＥＴＡの物質量がモル比で９０：１０ｍｏｌ％としたｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ））の合成と同様の操作を行い、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルエチレンジアミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＥＤＡ））］、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルトリエチレンテトラミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））］、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルテトラエチレンペンタミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＰＡ））］、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルペンタエチレンヘプタミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＰＥＨＡ））］を合成した。
【００７８】
重合終了後、生成物を含むメタノール溶液を室温まで冷却する。メタノール１００ｍＬに対して２Ｌの冷ジエチルエーテルを用い、生成物を含むメタノール溶液を冷ジエチルエーテルに１滴ずつゆっくり滴下し、攪拌する。これにより析出したガム状の生成物を回収し、再びメタノール約５０ｍＬに溶解する。この精製を２回行った後、得られたポリマーを水に溶解し、溶液を凍結させた。溶液が完全に凍結した後、凍結乾燥を行い、冷暗所に保存した。こうしてポリマーを合成した。
【００７９】
（測定対象物）
グルタチオンは関東化学社製特級品を使用し、システイニルグリシン（Ｆｗ：１７８．２）はシグマ社製の８５％ＴＬＣ級のものを使用した。牛の肝臓から得たγ−グルタミルトランスペプチターゼ（γ−ＧＴＰ）（ＥＣ  ２．３．２．２）（Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ６．６Ｕ／ｍｇ  ｐｏｗｄｅｒ、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  １６５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、オリエンタル酵母社製のものを用いた。日本臨床検査標準協議会（ＪＣＣＬＳ）の認証を得た日本・常用酵素標準物質（ＪＣ・ＥＲＭ  ０５０４１３）は、中間法人ＨＥＣＴＥＦスタンダードレファレンスセンターより購入した。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、グルタチオンやシステイニルグリシン等の計測が可能となり、また、その原理を利用してγ−ＧＴＰの計測も可能になり、医療現場で簡易に測定できる測定方法と測定キットの実用化を可能とする。こうした測定キットは、家庭内での健康管理にも活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】金ナノ粒子複合体溶液にグルタチオンを混ぜたときの金ナノ粒子の分散メカニズムを示す模式図である。
【図２】実験１で得られた可視吸収スペクトルである。
【図３】グルタチオンを添加して分散させた金ナノ粒子のＭＳスペクトルである。
【図４】実験２で得られた可視吸収スペクトルである。
【図５】実験３で得られた可視吸収スペクトルである。
【図６】金ナノ粒子複合体に及ぼすグルタチオンとシステイニルグリシンの濃度をそれぞれ１×１０−５Ｍとなるように添加した場合のａ＊値の経時変化である。
【図７】金ナノ粒子複合体に及ぼすシステイニルグリシンの濃度を１．０×１０−５Ｍとした場合と５．０×１０−５Ｍとした場合のａ＊値の経時変化である。
【図８】実験４で得られた可視吸収スペクトルである。
【図９】実験４で得られた可視吸収スペクトルから作成したγ−ＧＴＰとａ＊との関係を示す検量線である。
【図１】
2009229147.tif 000009
【図２】
2009229147.tif 000010
【図３】
2009229147.tif 000011
【図４】
2009229147.tif 000012
【図５】
2009229147.tif 000013
【図６】
2009229147.tif 000014
【図７】
2009229147.tif 000015
【図８】
2009229147.tif 000016
【図９】
2009229147.tif 000017