(57)【要約】【課題】観察対象の標本を動かすことなく、ラマン散乱光検出およびＣＡＲＳ光観察を選択的に行うことができ、煩雑な作業を要することなく、ＣＡＲＳ光観察のための振動周波数を効率的に選択できるレーザ顕微鏡を提供する。【解決手段】レーザ照射光学系（３，４，５，６）により、ＣＡＲＳ励起光とラマン散乱励起光とを同軸で標本に照射して、ＣＡＲＳ光をＣＡＲＳ光検出手段１２で検出し、ラマン散乱光をラマン散乱光検出手段１３で検出するようにする。【選択図】図１
2009047435.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光とラマン散乱励起光とを同軸で標本に照射可能なレーザ照射光学系と、
前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光の照射により前記標本から発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段と、
前記ラマン散乱励起光の照射により前記標本から発生するラマン散乱光を検出するラマン散乱光検出手段と、
を有することを特徴とするレーザ顕微鏡
【請求項２】
前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段と前記ラマン散乱光検出手段とを、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の透過側に配置したことを特徴とする請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記標本の透過側に、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と前記ラマン散乱光とを分離して、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段に導き、前記ラマン散乱光を前記ラマン散乱光検出手段に導くダイクロイックミラーを配置したことを特徴とする請求項２に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の反射側に配置し、
前記ラマン散乱光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の透過側に配置したことを特徴とする請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項５】
前記標本の反射側に、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光および前記ラマン散乱励起光と、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光とを分離して、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光および前記ラマン散乱励起光を前記標本に導き、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段に導く、ダイクロイックミラーを配置したことを特徴とする請求項４に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項６】
前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の透過側に配置し、
前記ラマン散乱光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の反射側に配置したことを特徴とする請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項７】
前記標本の反射側に、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光および前記ラマン散乱励起光と、前記ラマン散乱光とを分離して、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光および前記ラマン散乱励起光を前記標本に導き、前記ラマン散乱光を前記ラマン散乱光検出手段に導く、ダイクロイックミラーを配置したことを特徴とする請求項６に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項８】
前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段と前記ラマン散乱光検出手段とを、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の反射側に配置したことを特徴とする請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項９】
前記標本の反射側に、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と前記ラマン散乱光とを分離して、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段に導き、前記ラマン散乱光を前記ラマン散乱光検出手段に導くダイクロイックミラーを配置したことを特徴とする請求項８に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項１０】
前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段は、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光のみを抽出するバンドパスフィルタを有することを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項１１】
前記ラマン散乱光検出手段は、前記ラマン散乱光のみを抽出するバンドパスフィルタを有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項１２】
前記ラマン散乱光検出手段は、前記ラマン散乱光のスペクトルを検出する分光器を有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項１３】
前記レーザ光照射光学系に入射する前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光とラマン散乱励起光とを切り替える切替手段と、
該切替手段による切り替えを制御する制御手段とを備えることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載のレーザ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学の分野をはじめとし、医学、薬学、半導体の検査技術等に好適に利用可能なレーザ顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質やＤＮＡ等の生体分子の機能解明をするための研究等に利用可能な顕微鏡として、これらの分子を非染色で３次元的に観察することが可能な、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡（以下、ＣＡＲＳ顕微鏡と呼ぶ）が知られている。
【０００３】
この顕微鏡は、３次の非線形光学過程の１つであるコヒーレントアンチストークスラマン散乱過程（以下、ＣＡＲＳ散乱過程と呼ぶ）により発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光（以下、適宜、ＣＡＲＳ光とも呼ぶ）を計測するものである。以下に、図１４に示したＣＡＲＳ散乱過程のエネルギーダイアグラムを用いて、ＣＡＲＳ光の発生原理を説明する。
【０００４】
観察対象である標本内の分子が振動数ωＶの振動モードを有するものとする。ここに、振動数ω１の第１パルスレーザ光と、振動数ω２の第２パルスレーザ光とが入射すると、これら２つの入射光が有する振動数の差ω１−ω２が、標本の振動数ωＶと一致したときに、基底状態にある分子の多数が振動数ωＶで共鳴振動を起こして励起状態となる。そして、振動数ω１の第１パルスレーザ光の一部が、この分子の固有振動数ωＶのドップラー変調を受けて、ωＡＳのＣＡＲＳ光が発生する。ここで、上記の各振動数の間には、次の関係が成立する。
ωＡＳ＝ω１＋ωＶ＝２ω１−ω２  ・・・（１）
【０００５】
このＣＡＲＳ散乱過程を利用するＣＡＲＳ顕微鏡は、蛍光性を有さない分子であっても標本に悪影響を与える染色をする必要が無く、また、自然ラマン散乱顕微鏡と比較するとより少ない励起パワーでより強力な信号を得ることができる。
【０００６】
上記のように、ＣＡＲＳ散乱過程は、特定の振動数ωＶを有する振動モードに対応する、波長の異なる２つのコヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光（以下、適宜、ＣＡＲＳ励起光とも呼ぶ）を用いるものであるから、ＣＡＲＳ顕微鏡で標本の観察を行う前には、標本に固有の振動数を知ることが必要となる。この振動数を取得するには、ラマン分析装置を用いて、標本の分子振動情報を取得することが行われている。
【０００７】
図１５に示したラマン散乱過程のエネルギーダイアグラムを用いて、この分子振動数を取得する方法を説明する。標本にω０のラマン散乱励起光を照射すると、標本を構成する分子とラマン散乱励起光との間にエネルギーの授受が生じる。このため、ω０−ωＶの成分を有するラマン散乱光が発生する。よって、入射光と散乱光との周波数の差から分子振動数を得ることができる。
【０００８】
通常は標本には多くの分子が含まれ、それぞれの分子が複数の振動モードを有する。したがって、ラマン散乱光を計測した結果は、単一波長のレーザを照射して発生するラマン散乱光を分光器もしくは干渉計を用いて検出する、ラマンスペクトルとして得られる。図１６にラマン散乱スペクトルの例を示す。このスペクトルでラマン散乱光強度のピークが得られる振動数は、標本分子の振動数情報を反映していると考えられる。ＣＡＲＳ光分析では、このようにして得られた、ピークを有する振動数の中から、計測の対象とする分子振動数ωＶを決定する。
【０００９】
以上のような原理に従ったＣＡＲＳ顕微鏡としては、既にいくつかの開発事例がある。たとえば、波長の異なる２つのＣＡＲＳ励起光を同軸にして顕微鏡対物レンズにより標本上に集光させて、標本を走査することで、標本上における焦点のスポット寸法を最小化して、空間解像度の向上を図るようにしたＣＡＲＳ顕微鏡が知られている（たとえば、特許文献１参照）。
【００１０】
また、１つのレーザ光源から発せられる光を２分割し、その分割された光の一方を光パラメトリック増幅器により波長変換をするとともに、波長変換されていない光と重ね合わせて単一ビームのＣＡＲＳ散乱励起光とする技術や（たとえば、特許文献２参照）、１波長のパルスレーザ光を、マイクロストラクチャー光学素子により広帯域化し、その帯域内から２波長を選択してＣＡＲＳ散乱励起光とするＣＡＲＳ顕微鏡が知られている（たとえば特許文献３参照）。
【００１１】
このように、ＣＡＲＳ顕微鏡においては、２波長のレーザ光を同軸上に重ね合わせて、顕微鏡対物レンズにより標本上に集光させている。
【００１２】
【特許文献１】特表２００２−５２０６１２号公報
【特許文献２】特開２００２−１０７３０１号公報
【特許文献３】米国特許第７０９２０８６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、前述のように、ＣＡＲＳ顕微鏡で標本の観察をするためには、標本の分子振動情報をあらかじめ知る必要がある。このため、公知のＣＡＲＳ顕微鏡法では、標本の分子振動情報を得るために、別途用意されたラマン分析装置を用いてラマン散乱光の観察を行っている。この方法では、分子情報を得るためのラマン散乱光の観測とＣＡＲＳ光の観察との間で異なる装置を用い、標本を載せ換えることが必要となる。その結果、１つの標本上の同一観察場所について分子振動情報の取得およびＣＡＲＳ光の観察の両方を行うことは極めて困難であり、標本上の観察場所に応じて高いＣＡＲＳ光が得られる振動数を効率的に選択することが難しかった。適切な振動数の選択ができないと、強いＣＡＲＳ光を計測することができず、十分なコントラストを有する顕微鏡画像が得られない。このため、再度ラマン散乱光の観測を行って振動情報を得る必要が生じ、作業が煩雑で非効率であった。
【００１４】
したがって、これらの点に着目してなされた本発明の目的は、観察対象の標本を動かすことなく、ラマン散乱光検出およびＣＡＲＳ光観察を選択的に行うことができ、煩雑な作業を要することなく、ＣＡＲＳ光観察のための振動周波数を効率的に選択できるレーザ顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成する請求項１に記載のレーザ顕微鏡の発明は、
コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光とラマン散乱励起光とを同軸で標本に照射可能なレーザ照射光学系と、
前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光の照射により前記標本から発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段と、
前記ラマン散乱励起光の照射により前記標本から発生するラマン散乱光を検出するラマン散乱光検出手段と、
を有することを特徴とするものである。
【００１６】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のレーザ顕微鏡において、
前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段と前記ラマン散乱光検出手段とを、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の透過側に配置したことを特徴とするものである。
【００１７】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載のレーザ顕微鏡において、
前記標本の透過側に、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と前記ラマン散乱光とを分離して、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段に導き、前記ラマン散乱光を前記ラマン散乱光検出手段に導くダイクロイックミラーを配置したことを特徴とするものである。
【００１８】
請求項４に記載の発明は、請求項１に記載のレーザ顕微鏡において、
前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の反射側に配置し、
前記ラマン散乱光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の透過側に配置したことを特徴とするものである。
【００１９】
請求項５に記載の発明は、請求項４に記載のレーザ顕微鏡において、
前記標本の反射側に、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光および前記ラマン散乱励起光と、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光とを分離して、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光および前記ラマン散乱励起光を前記標本に導き、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段に導く、ダイクロイックミラーを配置したことを特徴とするものである。
【００２０】
請求項６に記載の発明は、請求項１に記載のレーザ顕微鏡において、
前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の透過側に配置し、
前記ラマン散乱光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の反射側に配置したことを特徴とするものである。
【００２１】
請求項７に記載の発明は、請求項６に記載のレーザ顕微鏡において、
前記標本の反射側に、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光および前記ラマン散乱励起光と、前記ラマン散乱光とを分離して、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光および前記ラマン散乱励起光を前記標本に導き、前記ラマン散乱光を前記ラマン散乱光検出手段に導く、ダイクロイックミラーを配置したことを特徴とするものである。
【００２２】
請求項８に記載の発明は、請求項１に記載のレーザ顕微鏡において、
前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段と前記ラマン散乱光検出手段とを、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の反射側に配置したことを特徴とするものである。
【００２３】
請求項９に記載の発明は、請求項８に記載のレーザ顕微鏡において、
前記標本の反射側に、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と前記ラマン散乱光とを分離して、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段に導き、前記ラマン散乱光を前記ラマン散乱光検出手段に導くダイクロイックミラーを配置したことを特徴とするものである。
【００２４】
請求項１０に記載の発明は、請求項１〜９のいずれか一項に記載のレーザ顕微鏡において、
前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段は、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光のみを抽出するバンドパスフィルタを有することを特徴とするものである。
【００２５】
請求項１１に記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のレーザ顕微鏡において、
前記ラマン散乱光検出手段は、前記ラマン散乱光のみを抽出するバンドパスフィルタを有することを特徴とするものである。
【００２６】
請求項１２に記載の発明は、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のレーザ顕微鏡において、
前記ラマン散乱光検出手段は、前記ラマン散乱光のスペクトルを検出する分光器を有することを特徴とするものである。
【００２７】
請求項１３に記載の発明は、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のレーザ顕微鏡において、
前記レーザ光照射光学系に入射する前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱励起光とラマン散乱励起光とを切り替える切替手段と、
該切替手段による切り替えを制御する制御手段とを備えることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、レーザ照射光学系により、ＣＡＲＳ励起光とラマン散乱励起光とを同軸で標本に照射して、ＣＡＲＳ光をＣＡＲＳ光検出手段で検出し、ラマン散乱光をラマン散乱光検出手段で検出するようにしたので、観察対象の標本を動かすことなく、ラマン散乱光観察およびＣＡＲＳ光観察を選択的に行うことができ、煩雑な作業を要することなく、ＣＡＲＳ光観察のための振動周波数を効率的に選択することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００３０】
[第１実施の形態]
図１は、本発明の第１実施の形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。このレーザ顕微鏡は、ＣＡＲＳ励起光光源部１とラマン散乱励起光光源部２とを備えている。ＣＡＲＳ励起光光源部１は、図２に示すように、波長の異なる第１パルスレーザ光源１ａと第２パルスレーザ光源１ｂとを有し、第１パルスレーザ光源からのレーザ光をハーフミラー１ｃを透過させて出射させ、第２パルスレーザ光源からのレーザ光は、反射ミラー１ｄで反射させた後、ハーフミラー１ｃで反射させて、第１パルスレーザ光源からのレーザ光と同軸に合成して出射させる。これにより、ＣＡＲＳ励起光光源部１から、２波長からなるＣＡＲＳ励起光を出射させる。本実施の形態では、第１パルスレーザ光源１ａとして波長固定のレーザを使用し、第２パルスレーザ光源１ｂとして観察対象の標本の分子振動数ωＶに応じて波長を調整可能なチタンサファイアレーザ等のレーザ等を使用するものとする。
【００３１】
また、ラマン散乱励起光光源部２は、図３に示すように単一波長のＣＷ（連続発振）レーザ光を射出するラマン散乱励起レーザ光源２ａを有して構成して、ラマン散乱励起光を出射させるようにする。
【００３２】
図１において、ＣＡＲＳ励起光光源部１から出射されるＣＡＲＳ励起光は、ハーフミラー３を透過させた後、反射ミラー４で反射させ、さらに、２次元走査用のミラー５ａ，５ｂを有するガルバノスキャナ５を経てレンズ６により標本面７上の集光位置に集光させるように構成する。とくに、ミラー５ａ，５ｂの振り角が０度のときは、この集光位置はレンズ６の焦点位置８と一致する。
【００３３】
また、ラマン散乱励起光光源部２から出射されるラマン散乱励起光は、反射ミラー９で反射させた後、ハーフミラー３で反射させて、ＣＡＲＳ励起光と同軸に合成して、すなわち、ＣＡＲＳ励起光の中心光線とラマン散乱励起光の中心光線とを光軸に一致させて、反射ミラー４およびガルバノスキャナ５を経てレンズ６により標本面７上の集光位置に集光させるように構成する。したがって、本実施の形態では、ハーフミラー３、反射ミラー４、ガルバノスキャナ５およびレンズ６を含んで、レーザ照射光学系を構成している。
【００３４】
本実施の形態では、ＣＡＲＳ光およびラマン散乱光をそれぞれ透過型で検出する。このため、標本に対し入射光の透過側に、レンズ１０、ＣＡＲＳ光とラマン散乱光とを分離するダイクロイックミラー１１、ＣＡＲＳ光検出手段１２およびラマン散乱光検出手段１３を配置し、標本面７の集光位置から発生するＣＡＲＳ光を、レンズ１０を経てダイクロイックミラー１１で分離してＣＡＲＳ光検出手段１２に導き、標本面７の集光位置から発生するラマン散乱光を、レンズ１０を経てダイクロイックミラー１１で分離してラマン散乱光検出手段１３に導くようにする。
【００３５】
ここで、ＣＡＲＳ光検出手段１２は、バンドパスフィルタ１４および検出器１５を有し、ダイクロイックミラー１１で分離されたＣＡＲＳ光をバンドパスフィルタ１４を経て検出器１５で検出するように構成する。また、ラマン散乱光検出手段１３は、バンドパスフィルタ１６および分光器１７を有し、ダイクロイックミラー１１で分離されたラマン散乱光をバンドパスフィルタ１６を経て分光器１７で検出するように構成する。
【００３６】
以下、ダイクロイックミラー１１、バンドパスフィルタ１４およびバンドパスフィルタ１６の波長特性について図４を参照して説明する。
【００３７】
ラマン散乱励起光は、散乱励起用レーザ光源１ａ，１ｂ，２ａから射出するレーザ光の中では最も短波長の単色レーザ光である。このラマン散乱励起光を標本に照射して得られるラマン散乱光のうち本実施の形態で観察対象とするのは、ラマン散乱励起光の波長よりも長波長側に現れるストークス光であって、標本の振動数に基づくスペクトル分布の広がりを有している。
【００３８】
一方、本実施の形態では前述のようにＣＡＲＳ励起光光源部１の第１パルスレーザ光源１ａは波長固定のレーザ光源であり、第２パルスレーザ光源１ｂは観察対象の振動数ωＶに応じて波長を調整することが可能な波長可変のレーザである。また、第１パルスレーザ光源１ａの波長、第２パルスレーザ光源１ｂの波長およびＣＡＲＳ光の波長は前述の（１）式を満たし、ＣＡＲＳ光は第１パルスレーザ光源１ａの波長よりも短波長側に現れる。
【００３９】
したがって、ダイクロイックミラー１１は、図４（ａ）に示すように、ＣＡＲＳ光およびＣＡＲＳ励起光を透過し、ラマン散乱光およびラマン散乱励起光を反射する波長特性を有して構成する。また、バンドパスフィルタ１４は、図４（ｂ）に示すように、ＣＡＲＳ光のみを透過し、バンドパスフィルタ１６は図４（ｃ）に示すようにラマン散乱光のみを透過する波長特性を有して構成する。
【００４０】
次に、本実施の形態に係る、レーザ顕微鏡を用いるＣＡＲＳ顕微鏡法について説明する。まず、標本のＣＡＲＳ光観察に先立って、標本の分子振動情報を得るためのラマンスペクトルの検出を行う。このラマンスペクトルの検出においては、標本をレーザ顕微鏡の標本ステージにセットした後、ラマン散乱励起光光源部２を動作させてラマン散乱励起光を出射させて、このラマン散乱励起光を、反射ミラー９、ハーフミラー３、反射ミラー４およびガルバノスキャナ５を経てレンズ６により標本面７上の集光位置に集光させる。なお、このラマンスペクトルの検出においては、ガルバノスキャナ５による走査は行わない。
【００４１】
ラマン散乱励起光の照射により標本から散乱するラマン散乱光は、レンズ１０およびダイクロイックミラー１１を経て、バンドパスフィルタ１６に入射させ、ここで、標本を透過したラマン散乱励起光を含むノイズ成分を除去してラマン散乱光成分のみを分光器１７に入射させて、図１６に示したようなラマンスペクトルを検出する。
【００４２】
このようにして、ラマンスペクトルを検出したら、このラマンスペクトルから標本の分子振動モードに相当する分子振動数ωＶを選択して、標本のＣＡＲＳ光観察を行う。ＣＡＲＳ光観察においては、標本をラマンスペクトル検出状態から移動させることなく、ラマン散乱励起光光源部２の動作を停止させ、ＣＡＲＳ励起光光源部１を動作させて、ＣＡＲＳ励起光を出射させる。
【００４３】
このＣＡＲＳ励起光は、ハーフミラー３、反射ミラー４およびガルバノスキャナ５を経てレンズ６により標本面７上に集光するとともに、この集光位置をガルバノスキャナ５により標本面７上で２次元走査する。
【００４４】
ＣＡＲＳ励起光の照射により標本から散乱するＣＡＲＳ光は、レンズ１０およびダイクロイックミラー１１を経て、バンドパスフィルタ１４に入射させ、ここで、標本を透過したＣＡＲＳ励起光を含むノイズ成分を除去してＣＡＲＳ光成分のみを検出器１５に入射させて検出する。
【００４５】
ここで、本実施の形態に係るＣＡＲＳ顕微鏡は、検出器１５で得られるＣＡＲＳ光の信号を演算処理して画像を形成する図示しないコンピュータを備える。ＣＡＲＳ励起光光源部１のパルス発振とともに、ガルバノスキャナ５により標本面７上を走査して、このコンピュータ上で各パルス発振に対応する集光位置を画素として演算処理して、標本の２次元画像を形成する。さらに、標本に対するＣＡＲＳ励起光の集光位置を光軸方向に変位させ、異なる深さの面画像を得ることにより、３次元の顕微鏡画像を構成することができる。
【００４６】
以上のように、本実施の形態では、標本へのＣＡＲＳ散乱励起光の入射光路と、ラマン散乱励起光の入射光路とを同軸にしたので、ＣＡＲＳ顕微鏡観察とラマン散乱光観察とを同一の装置上で、試料を移動することなく選択的に行うことができる。したがって、ＣＡＲＳ顕微鏡観察を行おうとする標本位置から得られたラマン散乱により観測した分子振動から効率良く振動数ωＶを選択して、ＣＡＲＳ光観察をすることが可能となる。さらに、本実施の形態では、透過型でＣＡＲＳ光を検出するようにしたので、特に、標本中の分子（分子団）が、ＣＡＲＳ励起光の波長オーダよりも大きい場合には、ＣＡＲＳ光自身の干渉効果により励起光の照射方向に対して前方のみにＣＡＲＳ光が強く放射されるので、ＣＡＲＳ光を有効に観察することができる。
【００４７】
[第２実施の形態]
図５は、本発明の第２実施の形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。本実施の形態は、第１実施の形態において、ＣＡＲＳ光検出手段１２を反射側に配置してＣＡＲＳ光を落射型で検出するようにしたものである。
【００４８】
このため、本実施の形態では、第１実施の形態のダイクロイックミラー１１を取り除くとともに、反射ミラー４に代えてダイクロイックミラー１８を配置し、標本面７の集光位置から反射方向に散乱する光を、レンズ６、ガルバノスキャナ５およびダイクロイックミラー１８を経てＣＡＲＳ光検出手段１２に入射させるように構成する。また、標本面７の集光位置から透過方向に散乱する光を、レンズ１０を経てラマン散乱光検出手段１３に入射させるように構成する。
【００４９】
ここで、バンドパスフィルタ１４，１６は、第１実施の形態におけるバンドパスフィルタと同じ波長特性を有する。また、ダイクロイックミラー１８は、図６に示すように少なくともＣＡＲＳ光を透過し、ＣＡＲＳ励起光およびラマン散乱励起光を反射する波長特性を有して構成する。その他の構成は、第１実施の形態と同様であるので、同一構成要素には同一参照符号を付して説明を省略する。
【００５０】
本実施の形態に係る、レーザ顕微鏡を用いるＣＡＲＳ顕微鏡法においては、ラマン散乱励起光の標本への照射は、反射ミラー４をダイクロイックミラー１８に変更したことを除き、第１実施の形態と同様に行い、また、ラマン散乱光の検出は、散乱光の光路上にダイクロイックミラー１１が無いことを除けば、第１実施の形態と同様の動作によってラマンスペクトルを得ることができる。  
【００５１】
また、ＣＡＲＳ励起光は、反射ミラー４がダイクロイックミラー１８と入れ替わったことを除き、第１実施の形態と同様の光路を経て、レンズ６により標本面７上に集光するとともに、第１実施の形態と同様にこの集光位置をガルバノスキャナ５により標本面７上で２次元走査する。
【００５２】
ＣＡＲＳ励起光の照射により標本から反射方向に散乱するＣＡＲＳ光は、レンズ６、ガルバノスキャナ５を経て、ダイクロイックミラー１８に入射し、ここで、標本面７で反射されたＣＡＲＳ励起光を分離する。さらに、このダイクロイックミラー１８を透過した光は、ＣＡＲＳ光検出手段１２のバンドパスフィルタ１４に入射し、ここでノイズ成分を除去してＣＡＲＳ光成分のみを検出器１５に入射させて検出する。
【００５３】
本実施の形態においても、第１実施の形態と同様の方法により、図示しないコンピュータにより標本の２次元および３次元のＣＡＲＳ顕微鏡画像を得ることができる。
【００５４】
以上のように、本実施の形態では、第１実施の形態と同様に、標本へのＣＡＲＳ散乱励起光の入射光路と、ラマン散乱励起光の入射光路とを同軸にしたので、ＣＡＲＳ顕微鏡観察とラマン散乱光観察とを同一の装置上で、試料を移動することなく選択的に行うことができる。したがって、第１実施の形態と同様に、ＣＡＲＳ顕微鏡観察を行おうとする標本位置から得られたラマン散乱により観測した分子振動から効率良く振動数ωＶを選択して、ＣＡＲＳ光観察をすることが可能となる。さらに、本実施の形態では、落射型でＣＡＲＳ光を検出するようにしたので、特に、標本中の分子（分子団）がＣＡＲＳ励起光の波長オーダよりも小さい場合には、標本の前方にＣＡＲＳ光とともにより大きなノイズ成分（非共鳴バックグランド）が発生する透過型のＣＡＲＳ光検出手段よりも、ＣＡＲＳ光を有効に観察することができる。また、本実施の形態は、標本中の分子（分子団）の大きさがＣＡＲＳ光励起波長オーダよりも大きい試料であって、波長透過率の悪い試料（生体の組織など）のＣＡＲＳ観察をする際にも有効である。
【００５５】
[第３実施の形態]
図７は、本発明の第３実施の形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。本実施の形態は、第１実施の形態において、ラマン散乱光検出手段１３を反射側に配置してラマン散乱光を落射型で検出するようにしたものである。
【００５６】
このため、本実施の形態では、第１実施の形態のダイクロイックミラー１１を取り除くとともに、反射ミラー４に代えてダイクロイックミラー１８を配置し、標本面７の集光位置から透過方向に散乱する光を、レンズ１０を経てＣＡＲＳ光検出手段１２に入射させるように構成する。また、標本面７の集光位置から反射方向に散乱する光を、レンズ６、ガルバノスキャナ５、ダイクロイックミラー１８を経てラマン散乱光検出手段１３に入射させるように構成する。
【００５７】
ここで、バンドパスフィルタ１４，１６は、第１実施の形態におけるバンドパスフィルタと同じ波長特性を有する。また、ダイクロイックミラー１８は、図６に示すように少なくともラマン散乱光を透過し、ＣＡＲＳ励起光およびラマン散乱励起光を反射する波長特性を有して構成する。その他の構成は、第１実施の形態と同様であるので、同一構成要素には同一参照符号を付して説明を省略する。
【００５８】
本実施の形態に係る、レーザ顕微鏡を用いるＣＡＲＳ顕微鏡法においては、ラマン散乱励起光の標本への照射は、反射ミラー４をダイクロイックミラー１８に変更したことを除き、第１実施の形態と同様に行い、また、ラマン散乱励起光の照射により標本から散乱するラマン散乱光は、レンズ６およびガルバノスキャナ５を経てダイクロイックミラー１８に入射し、ここで標本面７で反射されたラマン散乱励起光を分離する。さらにこのダイクロイックミラー１８を透過した光は、ラマン散乱光検出手段１３のバンドパスフィルタ１６に入射し、ここでノイズ成分を除去してラマン散乱光成分のみを分光器１７に入射させて検出する。
【００５９】
また、ＣＡＲＳ励起光は、反射ミラー４がダイクロイックミラー１８と入れ替わったのを除き、第１実施の形態と同様の光路を経て、レンズ６により標本面７上に集光するとともに、第１実施の形態と同様にこの集光位置をガルバノスキャナ５により標本面７上で２次元走査する。また、ＣＡＲＳ光の検出は、散乱光の光路上にダイクロイックミラー１１が無いことを除けば、第１実施の形態と同様の動作によってＣＡＲＳ光を検出することができる。
【００６０】
本実施の形態においても、第１実施の形態と同様の方法により、図示しないコンピュータにより標本の２次元および３次元のＣＡＲＳ顕微鏡画像を得ることができる。
【００６１】
さらに、本実施の形態においては、後述するように、ガルバノスキャナ５を走査した場合でも、ラマン散乱観察用の分光器１７に入射するラマン散乱光の光軸がぶれないため、ラマン散乱光観察とＣＡＲＳ顕微鏡観察とを同時に行うことも可能である。この場合は、ＣＡＲＳ励起光光源部１とラマン散乱励起光光源部２とを同時に動作させて、ＣＡＲＳ励起光とラマン散乱励起光とを同時に射出する。これらの励起光は、それぞれ上述した単独照射の光路と同じ光路を経て、同時に同軸で標本面７上の集光位置に集光照射する。
【００６２】
この場合は、標本面７の反射側に散乱する散乱光は、レンズ６、ガルバノスキャナ５を経てダイクロイックミラー１８に入射する。ここで、標本面７で反射されたＣＡＲＳ励起光およびラマン散乱励起光を分離し、ＣＡＲＳ光およびラマン散乱光のみが透過する。さらに、このダイクロイックミラー１８を透過した光は、バンドパスフィルタ１６に入射し、ＣＡＲＳ光を含むノイズ成分を除去してラマン散乱光成分のみを分光器１７に入射させて検出し、これによってラマンスペクトルが得られる。
【００６３】
このとき、分光器１７を標本面７から見てガルバノスキャナ５の背面側に配置した、本実施の形態における落射型のラマン散乱検出の装置構成では、ガルバノスキャナ５によりラマン散乱励起光を標本面７上で走査した場合でも、分光器１７に入射するラマン散乱光の光軸を一定に保つ位置（デスキャン位置）に置くことが可能である。したがって、光軸のずれによる分光器１７の分光特性の劣化が生じることはない。
【００６４】
一方、標本面７の透過側に散乱する散乱光は、レンズ１０を経てバンドパスフィルタ１４に入射する。ここで、ＣＡＲＳ励起光、ラマン散乱励起光およびラマン散乱光を含むノイズ成分を除去して、ＣＡＲＳ光のみを検出器１５に入射させて検出する。これにより得られたＣＡＲＳ光を処理することにより、上述のラマンスペクトルと同時に観察したＣＡＲＳ顕微鏡画像が得られる。
【００６５】
以上のように、本実施の形態では、第１および第２実施の形態と同様に、標本へのＣＡＲＳ散乱励起光の入射光路と、ラマン散乱励起光の入射光路とを同軸にしたので、ＣＡＲＳ顕微鏡観察とラマン散乱光観察とを同一の装置上で、試料を移動することなく選択的に行うことができる。したがって、第１および第２実施の形態と同様に、ＣＡＲＳ顕微鏡観察を行おうとする標本位置から得られたラマン散乱により観測した分子振動から効率良く振動数ωＶを選択して、ＣＡＲＳ光観察をすることが可能となる。さらに、本実施の形態では、透過型でＣＡＲＳ光を検出するようにしたので、特に、標本中の分子（分子団）が、ＣＡＲＳ励起光の波長オーダよりも大きい場合には、第１実施の形態でも述べたようにＣＡＲＳ光を有効に観察することができる。また、試料をＣＡＲＳ励起光で走査しながらラマン散乱光のスペクトルを検出することができるので、ＣＡＲＳ光観察中に標本の分子振動周波数の変更に迅速に対応できる。
【００６６】
[第４実施の形態]
図８は、本発明の第４実施の形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。本実施の形態は、第１実施の形態において、ＣＡＲＳ光検出手段１２およびラマン散乱光検出手段１３を反射側に配置してＣＡＲＳ光およびラマン散乱光を落射型で検出するようにしたものである。
【００６７】
このため、本実施の形態では、第１実施の形態のダイクロイックミラー１１およびレンズ１０を取り除くとともに、反射ミラー４に代えてダイクロイックミラー１８を配置し、標本面７の集光位置から反射方向に散乱する光を、レンズ６、ガルバノスキャナ５およびダイクロイックミラー１８を経由してダイクロイックミラー１９に入射させ、このダイクロイックミラー１９でＣＡＲＳ光成分とラマン散乱光成分とを分離し、ＣＡＲＳ光成分をＣＡＲＳ光検出手段１２に入射させ、また、ラマン散乱光成分をラマン散乱光検出手段１３に入射させるように構成する。
【００６８】
さらに、ＣＡＲＳ光検出手段１２は、入射したＣＡＲＳ光成分を、バンドパスフィルタ１４を経由して検出器１５に入射させ、ラマン散乱光検出手段１３は、ラマン散乱光成分を、バンドパスフィルタ１６を経由して分光器１７に入射させるように構成する。
【００６９】
ここで、バンドパスフィルタ１４，１６は、第１実施の形態におけるバンドパスフィルタと同じ波長特性を有し、また、ダイクロイックミラー１８は、図６に示すように、ＣＡＲＳ光およびラマン散乱光を透過し、ＣＡＲＳ励起光およびラマン散乱励起光を反射する波長特性を有して構成する。また、ダイクロイックミラー１９は、図９に示すようにＣＡＲＳ光およびＣＡＲＳ励起光を反射し、ラマン散乱光およびラマン散乱励起光を透過する波長特性を有して構成する。その他の構成は、第１実施の形態と同様であるので、同一構成要素には同一参照符号を付して説明を省略する。
【００７０】
本実施の形態に係る、レーザ顕微鏡を用いるＣＡＲＳ顕微鏡法においては、ラマン散乱励起光の標本への照射は、反射ミラー４をダイクロイックミラー１８に変更したことを除き、第１実施の形態と同様に行い、また、ラマン散乱励起光の照射により標本から散乱するラマン散乱光は、レンズ６およびガルバノスキャナ５を経てダイクロイックミラー１８に入射し、ここで標本面７で反射されたラマン散乱励起光を分離する。さらにこのダイクロイックミラー１８を透過した光は、ダイクロイックミラー１９を経て、ラマン散乱光検出手段１３のバンドパスフィルタ１６に入射し、ここでノイズ成分を除去してラマン散乱光成分のみを分光器１７に入射させて検出する。
【００７１】
また、ＣＡＲＳ励起光は、反射ミラー４がダイクロイックミラー１８と入れ替わったことを除き、第１実施の形態と同様の光路を経て、レンズ６により標本面７上に集光するとともに、第１実施の形態と同様にこの集光位置をガルバノスキャナ５により標本面７上で２次元走査する。
【００７２】
ＣＡＲＳ励起光の照射により標本から反射方向に散乱するＣＡＲＳ光は、レンズ６、ガルバノスキャナ５を経て、ダイクロイックミラー１８に入射し、ここで、標本面７で反射されたＣＡＲＳ励起光を分離する。さらに、このダイクロイックミラー１８を透過した光は、ダイクロイックミラー１９を経て、ＣＡＲＳ光検出手段１２のバンドパスフィルタ１４に入射し、ここでノイズ成分を除去してＣＡＲＳ光成分のみを検出器１５に入射させて検出する。
【００７３】
本実施の形態においても、第１実施の形態と同様の方法により、図示しないコンピュータにより標本の２次元および３次元のＣＡＲＳ顕微鏡画像を得ることができる。
【００７４】
さらに、本実施の形態では、第３実施の形態と同様に、ラマン散乱光観察とＣＡＲＳ光観察とを同時に行うことが可能である。この場合も、第３実施の形態と同様に、ＣＡＲＳ励起光光源部１とラマン散乱励起光光源部２とを同時に動作させて、同時に同軸で標本面７上の集光位置に集光照射する。
【００７５】
標本面７の反射側に散乱する散乱光は、レンズ６、ガルバノスキャナ５を経てダイクロイックミラー１８に入射する。ここで、標本面７で反射されたＣＡＲＳ励起光およびラマン散乱励起光を分離し、ＣＡＲＳ光およびラマン散乱光のみが透過する。このダイクロイックミラー１８を透過した光は、ダイクロイックミラー１９に入射し、ＣＡＲＳ光成分とラマン散乱光成分とに分離する。さらに、このＣＡＲＳ光成分はバンドパスフィルタ１４に入射し、ノイズ成分を除去して検出器１５に入射させて検出する。また、ラマン散乱光成分は、バンドパスフィルタ１６に入射し、ＣＡＲＳ光を含むノイズ成分を除去してラマン散乱光成分のみを分光器１７に入射させて検出し、ラマンスペクトルが得られる。
【００７６】
これによって、第３実施の形態と同様に、本実施の形態においても、分光器１７を標本面７から見てガルバノスキャナ５の背面側に配置した構成により、光軸のずれによる分光器１７の分光特性の劣化を生じることなく、ＣＡＲＳ光の検出によるＣＡＲＳ顕微鏡観察とラマンスペクトルの観察とを同時に行うことができる。
【００７７】
以上のように、本実施の形態では、第１、第２および第３実施の形態と同様に、標本へのＣＡＲＳ散乱励起光の入射光路と、ラマン散乱励起光の入射光路とを同軸にしたので、ＣＡＲＳ顕微鏡観察とラマン散乱光観察とを同一の装置上で、試料を移動することなく選択的に行うことができる。したがって、第１および第２実施の形態と同様に、ＣＡＲＳ顕微鏡観察を行おうとする標本位置から得られたラマン散乱により観測した分子振動から効率良く振動数ωＶを選択して、ＣＡＲＳ光観察をすることが可能となる。さらに、本実施の形態では、落射型でＣＡＲＳ光を検出するようにしたので、特に、標本中の分子（分子団）がＣＡＲＳ励起光の波長オーダよりも小さい場合には、第２実施の形態と同様に、透過型のＣＡＲＳ光検出手段よりも、ＣＡＲＳ光を有効に観察することができる。また、本実施の形態は、標本中の分子（分子団）の大きさがＣＡＲＳ光励起波長オーダよりも大きい試料であって、波長透過率の悪い試料（生体の組織など）のＣＡＲＳ観察をする際にも有効である。さらに、試料をＣＡＲＳ励起光で走査しながらラマン散乱光のスペクトルを検出することができるので、ＣＡＲＳ光観察中に標本の分子振動周波数の変更に迅速に対応できる。
【００７８】
[第５実施の形態]
次に本発明の第５実施の形態について説明する。本実施の形態では、図１０に示すように観察するラマン散乱光とＣＡＲＳ光との波長に重なりがある場合を想定する。すなわち、本レーザ顕微鏡では、標本の分子振動に応じて図２に示した第２パルスレーザー光源１ｂから出射するレーザ光の波長を変化させるようにしているので、観察対象とする分子振動数によっては、ラマン散乱によるラマンスペクトルと重なりを生じる場合がある。このような場合、たとえば、バンドパスフィルタ１４，１６の波長特性を図１１（ａ），（ｂ）に示すように設定すると、ＣＡＲＳ光とラマン散乱光とを完全に分離することができないことになる。本実施の形態では、このような場合でもＣＡＲＳ光とラマン散乱光とを完全に分離できるレーザ顕微鏡を提供する。
【００７９】
図１２は、本発明の第５実施の形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。本実施の形態は、上述の第３実施の形態において、ＣＡＲＳ励起光とラマン散乱励起光とを切り替えて標本に入射させるように構成するとともに、これらＣＡＲＳ励起光とラマン散乱励起光との切り替えに同期して、検出器１５によるＣＡＲＳ光の検出および分光器１７によるラマン散乱光の検出を制御する。
【００８０】
具体的には、図７の第３実施の形態に示す構成に加えて、ＣＡＲＳ励起光光源部１とハーフミラー３との間と、ラマン散乱励起光光源部２と反射ミラー９との間とに、それぞれレーザ切替手段２０、２１を設け、制御手段２２によりレーザ光の透過、遮光を切り替えられるように構成する。また、検出器１５および分光器１７は制御手段２２により検出機能の開始、停止を制御する。その他の構成は、第１実施の形態と同様であるので、同一構成要素には同一参照符号を付して説明を省略する。
【００８１】
次に、本実施の形態の動作を、図１３に示すタイムチャートを参照して説明する。本実施の形態では、制御手段２２でレーザ切替手段２０、２１を交互に切り替え、ＣＡＲＳ励起光とラマン散乱励起光とを時間的に重複することなく交互に射出する。これらの励起光はそれぞれ第３実施の形態で説明した光路を経て、レンズ６により標本面７上に集光するとともに、集光位置をガルバノスキャナ５により標本面７上で２次元走査する。
【００８２】
ＣＡＲＳ励起光が射出しているときは、標本面７の透過側に散乱するＣＡＲＳ光は、第３実施の形態と同様にして検出器１５に入射させて検出する。一方、反射側に散乱する散乱光は、レンズ６、ガルバノスキャナ５、ダイクロイックミラー１８およびバンドパスフィルタ１６を経て分光器１７に入射するが、この状態では、分光器１７は制御手段２２により検出停止状態となっているため、ＣＡＲＳ光は検出されない。
【００８３】
他方、ラマン散乱励起光が射出しているときは、標本面７の透過側に散乱するラマン散乱光は、レンズ１０およびバンドパスフィルタ１４を経て検出器１５に入射するが、検出器１５は制御手段２２によって検出停止状態となっているため、ラマン散乱光は検出されない。これに対し、反射側に散乱するラマン散乱光は、レンズ６、ガルバノスキャナ５、ダイクロイックミラー１８およびバンドパスフィルタ１６を経て分光器１７に入射して検出される。
【００８４】
本実施の形態では、このような動作方法によって、観察するラマン散乱光とＣＡＲＳ光との波長に重なりがある場合であっても、ＣＡＲＳ光検出とラマン散乱光検出とを時間的に分離したので、相互に影響を与えることなくＣＡＲＳ顕微鏡観察とラマン散乱観察とができるという点で優位である。
【００８５】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。たとえば、ＣＡＲＳ励起光光源部では第２パルスレーザのみでなく第１パルスレーザーも波長可変のレーザとしても良い。また、ＣＡＲＳ励起光光源部は２台のレーザを用いる場合に限らず、１台のレーザを光源として、ビームスプリッタ等で分離したビームの一つに波長変換を行うことで波長の異なる２本のレーザ光を得ることも可能である。さらには、各散乱励起用の光源は、レーザ顕微鏡本体内に設ける必要は無く、本体とは別体に設けてレーザ光を導入するようにしても良い。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】本発明の第１実施の形態に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。
【図２】図１に示すＣＡＲＳ散乱励起光光源部の概略構成図である。
【図３】図１に示すラマン散乱励起光光源部の概略構成図である。
【図４】図１に示すダイクロイックミラーおよびバンドパスフィルタの波長特性を説明する模式図である。
【図５】本発明の第２実施の形態に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。
【図６】図５に示すダイクロイックミラーの波長特性を説明する模式図である。
【図７】本発明の第３実施の形態に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。
【図８】本発明の第４実施の形態に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。
【図９】図８に示すダイクロイックミラーの波長特性を説明する模式図である。
【図１０】本発明の第５実施の形態におけるラマン散乱光とＣＡＲＳ光との波長の重なりを説明する模式図である。
【図１１】本発明の第５実施の形態に用いられるバンドパスフィルタの波長特性を説明する模式図である。
【図１２】本発明の第５実施の形態に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。
【図１３】図５に示すレーザ切替手段、検出器および分光器の切り替え動作を示すタイムチャートである。
【図１４】コヒーレントアンチストークスラマン散乱過程のエネルギーダイアグラムである。
【図１５】ラマン散乱過程のエネルギーダイアグラムである。
【図１６】ラマン散乱スペクトルの例を示すグラフである。
【符号の説明】
【００８７】
１  ＣＡＲＳ励起光光源部
１ａ  第１パルスレーザ光源
１ｂ  第２パルスレーザ光源
１ｃ  ハーフミラー
１ｄ  ミラー
２  ラマン散乱励起光光源部
２ａ  ラマン散乱励起レーザ光源
３  ハーフミラー
４  ミラー
５  ガルバノスキャナ
５ａ  ミラー
５ｂ  ミラー
６  レンズ
７  標本面
８  焦点位置
９  ミラー
１０  レンズ
１１  ダイクロイックミラー
１２  ＣＡＲＳ光検出手段
１３  ラマン散乱光検出手段
１４  バンドパスフィルタ
１５  検出器（ディテクタ）
１６  バンドパスフィルタ
１７  分光器
１８  ダイクロイックミラー
１９  ダイクロイックミラー
２０  レーザ切替手段
２１  レーザ切替手段
２２  制御手段
【図１】
2009047435.tif 000003
【図２】
2009047435.tif 000004
【図３】
2009047435.tif 000005
【図４】
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【図５】
2009047435.tif 000007
【図６】
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【図７】
2009047435.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2009047435.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2009047435.tif 000017
【図１６】
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