(57)【要約】【課題】非常に強化された深度即ちＺ方向の分解能を提供する３次元光学顕微鏡法のための方法及び装置を提供する。【解決手段】標本（９４）についてデュアル対向対物レンズ（７０、７２）及び拡張インコヒーレント照明（８４）を用いて向上された深度分解能を提供する３次元光学顕微鏡法のための方法及び装置が開示される。両対物レンズからの観察光は画像検出器（１２８）に入射され、ここで光路長調節器（１３８）によって干渉させられる。【選択図】図２６
2009223348.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学顕微鏡法のための装置であって、
（ａ）標本（１６）を支持するための手段を含み、
（ｂ）空間的に構成された照明光を前記標本に与えるための手段を含み、前記空間的に構成された照明光は横方向の構造を含み、前記空間的に構成された照明光を与えるための手段は、光を生成するための光源手段（８４）と、前記光源手段から前記標本までの光路（１０８，１１４）と、を含んでおり、
（ｃ）前記空間的に構成された照明光によって照明された標本の拡大画像を生成する光学的拡大手段（７０，７２）を含み、
（ｄ）前記標本の前記拡大画像を検出・記録するための画像形成手段（１２８）を含み、前記画像形成手段は、前記標本の画像スタックを取得し、前記画像スタックには、標本情報の観察可能な移された領域が含まれ、
（ｅ）強化された横方向の分解能を含む強化された分解能を有する前記標本の再構成を得るために前記画像形成手段からの前記記録済み画像を処理するための処理手段を含み、前記処理手段は、標本情報の成分を分離し、これらをフーリエ空間の適切な位置に移動させるように構成されている、光学顕微鏡法のための装置。
【請求項２】
光学顕微鏡法のための装置であって、
（ａ）標本（１６）を支持するための手段を含み、
（ｂ）空間的に構成された照明光を前記標本に与えるための手段を含み、前記空間的に構成された照明光は横方向の構造を含み、前記空間的に構成された照明光を与えるための手段は、光を生成するための光源手段（８４）と、前記光源手段から前記標本までの光路（１０８，１１４）と、を含んでおり、
（ｃ）前記空間的に構成された照明光によって照明された標本の拡大画像を生成する光学的拡大手段（７０，７２）を含み、
（ｄ）前記標本の前記拡大画像を検出・記録するための画像形成手段（１２８）を含み、前記画像形成手段は、前記標本の画像スタックを取得し、前記画像スタックには、標本情報の観察可能な移された領域が含まれ、
（ｅ）強化された横方向の分解能を含む強化された分解能を有する前記標本の再構成を得るために前記画像形成手段からの前記記録済み画像を処理するためのデータ処理手段を含み、前記データ処理手段は、標本情報の成分を分離し、これらをフーリエ空間の適切な位置に移動させるように構成されている、光学顕微鏡法のための装置。
【請求項３】
光学顕微鏡法のための装置であって、
（ａ）標本（１６）を支持するための手段を含み、
（ｂ）空間的に構成された照明光を前記標本に与えるための手段を含み、前記空間的に構成された照明光は横方向の構造を含み、前記空間的に構成された照明光を与えるための手段は、光を生成するための光源手段（８４）と、前記光源手段から前記標本までの光路（１０８，１１４）と、を含んでおり、
（ｃ）前記空間的に構成された照明光によって照明された標本の拡大画像を生成する光学的拡大手段（７０，７２）を含み、
（ｄ）前記標本の前記拡大画像を検出・記録するための画像形成手段（１２８）を含み、
（ｅ）複数の記録済み画像を格納するために前記画像形成手段にインターフェースされたマイクロプロセッサを含む、光学顕微鏡法のための装置。
【請求項４】
光学顕微鏡法のための装置であって、
（ａ）標本（１６）を支持するための手段を含み、
（ｂ）空間的に構成された照明光を前記標本に与えるための手段を含み、前記空間的に構成された照明光は横方向の構造を含み、前記空間的に構成された照明光を与えるための手段は、前記標本に少なくとも２つの互いにコヒーレントな光ビームを与えるための手段を含み、前記少なくとも２つの互いにコヒーレントな光ビームは前記標本において互いに干渉するようになされており、
（ｃ）前記空間的に構成された照明光によって照明された標本の拡大画像を生成する光学的拡大手段（７０，７２）を含み、
（ｄ）前記標本の前記拡大画像を検出・記録するための画像形成手段（１２８）を含み、
（ｅ）強化された横方向の分解能を含む強化された分解能を有する前記標本の再構成を得るために前記画像形成手段からの前記記録済み画像を処理するための処理手段を含む、光学顕微鏡法のための装置。
【請求項５】
光学顕微鏡法のための装置であって、
（ａ）標本（１６）を支持するための手段を含み、
（ｂ）空間的に構成された照明光を前記標本に与えるための手段を含み、前記空間的に構成された照明光は横方向の構造を含み、前記空間的に構成された照明光を与えるための手段は、前記標本に少なくとも２つの互いにコヒーレントな光ビームを与えるための手段を含み、前記少なくとも２つの互いにコヒーレントな光ビームは前記標本において互いに干渉するようになされており、
（ｃ）前記空間的に構成された照明光によって照明された標本の拡大画像を生成する光学的拡大手段（７０，７２）を含み、
（ｄ）前記標本の前記拡大画像を検出・記録するための画像形成手段（１２８）を含み、
（ｅ）強化された横方向の分解能を含む強化された分解能を有する前記標本の再構成を得るために前記画像形成手段からの前記記録済み画像を処理するためのデータ処理手段を含む、光学顕微鏡法のための装置。
【請求項６】
光学顕微鏡法のための装置であって、
（ａ）標本（１６）を支持するための手段を含み、
（ｂ）空間的に構成された照明光を前記標本に与えるための手段を含み、前記空間的に構成された照明光は横方向の構造を含み、前記空間的に構成された照明光を与えるための手段は、前記標本に少なくとも２つの互いにコヒーレントな光ビームを与えるための手段を含み、前記少なくとも２つの互いにコヒーレントな光ビームは前記標本において互いに干渉するようになされており、
（ｃ）前記空間的に構成された照明光によって照明された標本の拡大画像を生成する光学的拡大手段（７０，７２）を含み、
（ｄ）前記標本の前記拡大画像を検出・記録するための画像形成手段（１２８）を含み、
（ｅ）強化された横方向の分解能を含む強化された分解能を有する前記標本の再構成を得るために前記画像形成手段からの前記記録済み画像を処理するための計算再構成手段を含む、光学顕微鏡法のための装置。
【請求項７】
光学顕微鏡法のための装置であって、
（ａ）標本（１６）を支持するための手段を含み、
（ｂ）空間的に構成された照明光を前記標本に与えるための手段を含み、前記空間的に構成された照明光は横方向の構造を含み、前記空間的に構成された照明光を与えるための手段は、前記標本に少なくとも２つの互いにコヒーレントな光ビームを与えるための手段を含み、前記少なくとも２つの互いにコヒーレントな光ビームは前記標本において互いに干渉するようになされており、
（ｃ）前記空間的に構成された照明光によって照明された標本の拡大画像を生成する光学的拡大手段（７０，７２）を含み、
（ｄ）前記標本の前記拡大画像を検出・記録するための画像形成手段（１２８）を含み、
（ｅ）複数の記録済み画像を格納するために前記画像形成手段（１２８）にインターフェースされたマイクロプロセッサを含む、光学顕微鏡法のための装置。
【請求項８】
前記光学的拡大手段に前記標本の焦点を合わせなおした画像を生成させるために前記標本に対する前記光学的拡大手段の焦点を合わせなおすための焦点合わせ手段（１２６）をさらに含み、
前記画像形成手段（１２８）は、多数の前記焦点を合わせなおした画像を検出・記録するように構成され、
前記処理手段は、前記標本の３次元再構成を得るために、前記画像形成手段からの前記多数の記録済み画像を処理するように構成されている請求項１又は４記載の装置。      
【請求項９】
前記光学的拡大手段に前記標本の焦点を合わせなおした画像を生成させるために前記標本に対する前記光学的拡大手段の焦点を合わせなおすための焦点合わせ手段（１２６）をさらに含み、
前記画像形成手段（１２８）は、多数の前記焦点を合わせなおした画像を検出・記録するように構成され、
前記データ処理手段は、前記標本の３次元再構成を得るために、前記画像形成手段からの前記多数の記録済み画像を処理するように構成されている請求項２又は５記載の装置。
【請求項１０】
前記空間的に構成された照明光の空間的構成を変更するための構成変更手段をさらに含む請求項１〜請求項７の何れか１項記載の装置。
【請求項１１】
前記空間的に構成された照明光の空間的構成の位相を変更するための手段をさらに含む請求項１〜請求項７の何れか１項記載の装置。
【請求項１２】
前記空間的に構成された照明光を与える手段は、前記光路に沿って配置された偏向手段をさらに含む請求項１〜請求項７の何れか１項記載の装置。
【請求項１３】
前記少なくとも２つの互いにコヒーレントな光ビームは、少なくとも２つの互いにコヒーレントな光源から放射され、前記少なくとも２つの互いにコヒーレントな光源は、前記光学的拡大手段の後側焦平面に配置される、請求項４〜請求項７の何れか１項記載の装置。
【請求項１４】
前記空間的に構成された照明光は軸方向の構造を含み、前記軸方向の構造が前記横方向の構造と直交関係にある、請求項１〜請求項７の何れか１項記載の装置。
【請求項１５】
前記再構成は前記横方向の構造と直交関係にある強化された軸方向の分解能をさらに有する請求項１、２、４、５、又は６記載の装置。
【請求項１６】
選択的に前記照明光を反射させながら観察光を透過させるように構成されたビームスプリッタ（１６８）を更に含む、請求項１〜請求項７の何れか１項記載の装置。
【請求項１７】
前記少なくとも２つの互いにコヒーレントな光ビームの位相を調整するための位相調整ステージ（１９０）を更に含む、請求項１〜請求項７の何れか１項記載の装置。
【請求項１８】
前記光源手段は、空間的にインコヒーレントな光源を含むことを特徴とする請求項１〜請求項３の何れか１項記載の装置。
【請求項１９】
前記マイクロプロセッサは、前記横方向の構造と直交関係にある強化された軸方向の分解能を提供するために、前記複数の記録済み画像に対してフーリエ変換アルゴリズムを用いる、請求項３又は７記載の装置。
【請求項２０】
前記マイクロプロセッサは、前記標本の３次元再構成を得るために、前記複数の記録済み画像に対してフーリエ変換アルゴリズムを用いる、請求項３又は７記載の装置。
【請求項２１】
光学顕微鏡法の方法であって、
（ａ）画像検出及び記録手段を含む顕微鏡に発光標本を配置するステップと、
（ｂ）横方向の構造を含む照明パターンで前記標本を照明するステップと、
（ｃ）前記検出及び記録手段を用いて前記標本の少なくとも１つの画像を記録
するステップと、
（ｄ）前記照明パターンを少なくとも１回変更し、その変更のたびに、前記変更された照明パターンで照明された前記標本の少なくとも１つの画像を記録するステップと、
（ｅ）前記画像を収集して標本情報の成分のデータセットにするステップと、
（ｆ）強化された横方向の分解能を含む強化された分解能を有する前記標本の再構成を得るための前記データセットを演算処理するステップであって、複数の標本情報の成分を分離するステップと、前記標本情報の成分にフーリエ空間内の新しい位置を採らせるステップと、前記標本情報の成分を再結合させるステップとを含む前記データセットを演算処理するステップとを含む光学顕微鏡法の方法。
【請求項２２】
光学顕微鏡法の方法であって、
（ａ）画像検出及び記録手段を含む顕微鏡に発光標本を配置するステップと、
（ｂ）横方向の構造を含む照明パターンで前記標本を照明するステップと、
（ｃ）前記検出及び記録手段を用いて前記標本の少なくとも１つの画像を記録
するステップと、
（ｄ）前記照明パターンの波位相を少なくとも１回変更するステップと、
（ｅ）前記画像を収集して標本情報の成分のデータセットにするステップと、 
（ｆ）強化された横方向の分解能を含む強化された分解能を有する前記標本の再構成を得るための前記データセットを演算処理するステップであって、複数の標本情報の成分を分離するステップと、前記標本情報の成分にフーリエ空間内の新しい位置を採らせるステップと、前記標本情報の成分を再結合させるステップとを含む前記データセットを演算処理するステップと、
（ｇ）前記データセットに計算再構成手段を適用するステップとを含む光学顕微鏡法の方法。
【請求項２３】
光学顕微鏡法の方法であって、
（ａ）画像検出及び記録手段を含む顕微鏡に発光標本を配置するステップと、
（ｂ）横方向の構造を含む照明パターンで前記標本を照明するステップと、
（ｃ）前記検出及び記録手段を用いて前記標本の少なくとも１つの画像を記録
するステップと、
（ｄ）前記照明パターンを少なくとも１回変更し、その変更のたびに、前記変更された照明パターンで照明された前記標本の少なくとも１つの画像を記録するステップと、
（ｅ）前記画像を収集してデータセットにするステップと、
（ｆ）フーリエ空間の標本情報の異なる領域に関する標本情報の成分を分離することによって、前記データセットを演算処理し、前記標本情報の成分をフーリエ空間内の適切な位置に計算上移動させるステップとを含む光学顕微鏡法の方法。
【請求項２４】
光学顕微鏡法の方法であって、
（ａ）画像検出及び記録手段を含む顕微鏡に発光標本を配置するステップと、
（ｂ）横方向の構造を含む照明パターンで前記標本を照明するステップと、
（ｃ）前記検出及び記録手段を用いて前記標本の少なくとも１つの画像を記録するステップと、
（ｄ）前記照明パターンを少なくとも１回変更し、その変更のたびに、前記変更された照明パターンで照明された前記標本の少なくとも１つの画像を記録するステップと、
（ｅ）前記画像がそれぞれ複数の画像スタックを含み、
（ｆ）前記画像を収集してデータセットにするステップと、
（ｇ）強化された横方向の分解能を含む強化された分解能を有する前記標本の再構成を得るための前記データセットを演算処理するステップであって、前記複数の画像スタックを分離するステップと、前記画像スタックをフーリエ空間内の適切な位置に計算上移動させるステップと、前記変更された照明パターンの各々に対する前記画像スタックを再結合させるステップとを含む前記演算処理するステップとを含む光学顕微鏡法の方法。
【請求項２５】
前記再結合された標本情報は、強化された横方向の分解能を有する請求項２１〜請求項２３の何れか１項記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップ（ｂ）は、前記標本において少なくとも２つの互いにコヒーレントな光ビームを干渉させることによって実行される請求項２１〜請求項２４の何れか１項記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップ（ｄ）は、前記照明パターンの波位相を少なくとも１回変更するステップを含む請求項２１、２２、又は２４記載の方法。
【請求項２８】
焦点ぶれを取り除くために前記データセットにデータ処理手段を適用するステップをさらに含む請求項２１〜請求光２４の何れか１項記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（ｄ）は、前記照明パターンの波角度を少なくとも１回変更するステップを含む請求項２１〜請求項２４の何れか１項記載の方法。
【請求項３０】
前記ステップ（ｂ）は、前記標本を横方向に均一な照明で照明するステップを更に含み、
前記ステップ（ｃ）は、前記均一な照明で照明された前記標本の少なくとも１つの画像を記録するステップをさらに含む請求項２１〜請求項２４の何れか１項記載の方法。
【請求項３１】
前記標本に対する前記顕微鏡の焦点合わせのやりなおしを少なくとも１回行うステップと、前記顕微鏡の焦点合わせがやりなおされるたびに、前記ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を繰り返すステップと、前記データステップを収集して３次元データセットにするステップと、前記標本の３次元再構成を得るために前記３次元データセットを処理するステップとをさらに含む請求項２１〜請求項２４の何れか１項記載の方法。
【請求項３２】
前記ステップ（ａ）は、対向した第１及び第２の対物レンズを有する顕微鏡に前記標本を配置することによって実行され、前記ステップ（ｂ）は、横方向の構造を含む照明光を提供し、前記照明光を分割して第１及び第２の構成された照明光ビームとなし、前記第１の対物レンズを通る第１の光路に沿って前記第１の構成された照明光ビームを前記標本に方向付け、前記第２の対物レンズを通る第２の光路に沿って前記第２の構成された照明光ビームを前記標本に方向付け、前記第１及び第２の構成された照明光ビームを前記標本において干渉させることによって実行される請求項２１〜請求項２４の何れか１項記載の方法。
【請求項３３】
前記ステップ（ｂ）は、前記標本において互いに干渉するように、少なくとも２つの互いにコヒーレントな光ビームを配置するステップを含む請求項２１〜請求項２４の何れか１項記載の方法。
【請求項３４】
前記照明パターンは、波長及び波方向を有する波ベクトルによって特徴付けられる定在波を含む請求項２１〜請求項２４の何れか１項記載の方法。
【請求項３５】
前記ステップ（ｄ）は、異なる波ベクトルを有する定在波に関して前記ステップ（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すステップを含む請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記定在波の波方向は、Ｚ方向と平行でない請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所により与えられた許可番号ＧＭ２５１０１−１６及びＧＭ３１６２７−１２の下に合衆国政府の支援により発明された。合衆国政府は本発明にある権利を有する。
【０００２】
１．本発明の分野
本発明は一般に３次元光学顕微鏡法に関し、より詳細には、高レベルの解像深度を得るために標本についてデュアル対向対物レンズを使用する３次元光学顕微鏡法のための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景技術の説明
学顕微鏡法はこの１０年の間に医学及び生物化学においてめざましいルネッサンスを体験した。光学顕微鏡法の重要性が増大したのは、蛍光プローブ技術が発達し、及び計算形逆畳み込み（conputational deconvolution）または走査型共焦点顕微鏡法を介して得られる定量的３次元画像データが使用できるようになったからである。
【０００４】
光学顕微鏡法は非光学顕微鏡法技術より優れた幾つかの利点を提供する。光学顕微鏡法を使用することによって生体組織標本を自然な状態で観察することができる。これに比べて電子顕微鏡法の場合は顕微鏡検査の標本を乾燥して真空にさらす必要がある。更に、標本の内側は光学顕微鏡法を用いて３次元で観察して写像することができるが、走査電子顕微鏡法及び他の走査プローブ顕微鏡法は標本の表面だけしか写像できないため、標本の内側についての情報を提供することができない。光学顕微鏡法の他の利点は、特定の細胞要素を蛍光プローブで染色することによって非常に明白に識別し且つ写像することができることである。今は蛍光プローブを合成して殆どあらゆる生物分子を特定することが可能である。
【０００５】
光学顕微鏡法の唯一の重大な欠点は、対物レンズが光を収集できる角度に関連して、及び最終的には光の有限波長によりその分解能が制限されることである。
【０００６】
従って、光学顕微鏡法の分解能を大幅に増大する本発明のようなあらゆる技術は、細胞生物学、医療用撮像（imaging）、及び他の生物工学の分野において重要な用途を有するであろう。
【０００７】
３次元光学顕微鏡には現在２つの主なアプローチがある。１つは計算形逆畳み込みとしても知られている光学セクショニング顕微鏡法であり、もう１つは走査型共焦点顕微鏡法である。
【０００８】
光学セクショニング顕微鏡法において、標本のセクションを通って焦点を連続的に移動させて連続画像を得ることによって、顕微鏡法標本の一連の画像が得られる。各画像は焦平面にある標本のパーツ若しくはセクションから焦点の合った（in-focus、焦点内）情報、及び標本の他の部分から得られた焦点の外れた（out-of focus、焦点外）ぶれた情報を含む。コンピュータからの全データセットを分析することにより、標本の３次元構造の再生が可能になる。再生プロセスは、数学的アルゴリズム、及び単一の点光源により生じたぶれを記述する先に格納された基準データセットを使用する。光学セクショニング顕微鏡法は、一般に電荷結合素子アレイ（ＣＣＤ）カメラによって広域画像が記録される”広視野”顕微鏡である。従って、高い光スループット及び高データ獲得速度がこの技術を使用して可能となる。
【０００９】
共焦点顕微鏡法において、焦点を合わせたレーザビームが光源として使用され、光は標本中のレーザと同じスポットに焦点を当てられたピンホールを通る光倍増管によって検出される。この結合された焦点ポイントは次に標本を通して３次元で走査され、スポット位置の関数として検出された強度が標本の３次元画像を得るために使用される。このピンホールは焦点外情報を部分的に抑えて分解能を向上させるが、その代わり光の大部分を切捨てる。この光のロスによって露光時間を長く必要とし、これによって操作が遅くなり、しばしば標本の著しい漂白問題を生じる。光学セクショニング顕微鏡法で使用される広域画像撮像のために最大１００万ものピクセルが平行して得られるのに対し、データピクセルが１回に１つしか得られないことによって、共焦点顕微鏡法の操作は更に減速する。
【００１０】
光学セクショニング顕微鏡法及び共焦点顕微鏡法のどちらにも、分解能深度即ちＺ−方向の分解能が横方向即ちＸＹ平面における分解能よりも何倍も悪いという重大な欠点がある。Ｚ方向の分解能は、以下に詳細に記載するような基本的な幾何学的限界によって制限される。本発明は、Ｚ方向の分解能がＸＹ平面における分解能に等しいだけでなく、光学セクショニング顕微鏡を用いてこれまで得られたＸＹ平面における分解能の２倍以上増大された、光学顕微鏡法のための方法及び装置を提供する。光学セクショニング顕微鏡法を介して可能である高い光スループット及びデータ獲得速度を維持したまま、本発明はＺ方向の分解能をこのように増大させる。
【００１１】
デュアル対向対物レンズを使用した光学顕微鏡法の方法には２つのものがこれまで公知である。４Ｐi 共焦点顕微鏡法として公知である１つの方法は、広視野ではなくて共焦点の顕微鏡法である。４Ｐi 共焦点顕微鏡法には一般に３通りの使用方法がある。第一モードでは、焦点を合わせたレーザ光が両方向の対物レンズから標本を照明してこの標本で干渉するために使用される。第二モードでは、放射（emitted）された光が両方向から収集され、単一のピンホール検出器上で結合される。第三モードは、先の２つのモードを同時に組み合わせたものを含む。しかし、共焦点技術であるので、ピンホール光検出器による光のロス及びピクセル毎のデータ獲得による遅さのせいで、４Ｐｉ共焦点顕微鏡法の全てのモードは光スループットが乏しく、データ獲得時間が長い。
【００１２】
２つの対向レンズを使用した第二の公知の光学顕微鏡法は、一般に定在波蛍光顕微鏡法（ＳＷＦＭ）と呼ばれる。この技術は一般にレーザである、時間的及び空間的コヒーレンスが非常に高い光源を要する。この空間的及び時間的コヒーレント光源は、標本空間において標本の観察域全体に広がる正弦定在波（これをもって名称とする）である干渉縞になる。
【００１３】
ＳＷＦＭは一般的に本発明の１つの実施の形態（本明細書中のＩ3Ｍ形態）と同じ様なＺ分解能を達成するが、これは同様の動的装置上の走査鏡を使用して連続的に幾つかの異なる定在波パターンを組み合わせることによって、又は複数のレーザ等の複数の個々にコヒーレントなしかし相互にインコヒーレントな光源を使用することによってのみ、達成される。本発明はこのような移動部品を必要とせず、アークランプや白熱電球等の単一の空間的コヒーレント光源のみを要し、帯域制限光源が呈示する以上の時間的コヒーレントを必要とせずに、Ｚ方向の分解能を増大させる。単一のインコヒーレント光源によって照明光の波長を自由に選択することが可能となるが、波長の制限された選択においてのみレーザが使用できる。更に、本発明の１つの実施の形態（本明細書中ではＩ5Ｍ形態と記載される）は、ＳＷＦＭのみで可能な分解能よりも大きなＺ分解能を達成する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明は全ての既知の３Ｄ顕微鏡法技術と異なり且つこれらに比べて利点を有する。単一対物レンズを用いるあらゆるモードの顕微鏡法と比較すると、本発明は高いＺ分解能を提供する。ＳＷＦＭに比べて、本発明はより単純な照明手段を使用し、より優れた照明波長の選択を提供し、その実施の形態の１つにおいてはより高いＺ分解能を提供する。４Ｐｉ共焦点顕微鏡法に比べて本発明はより単純な照明手段、より優れた照明波長の選択、高速なデータ獲得速度、及び観察光（observed light）若しくは放射光線（emitted light）のより有効な利用を提供し、これにより著しい標本の漂白を減少することができる。
【００１５】
従って、深度即ちＺ方向の分解能を大幅に強化し、高い光スループットを有し、データ獲得速度が速く、及び空間的コヒーレント光源の使用を必要としない、３次元光学顕微鏡法のための方法及び装置が必要となる。本発明はこれらの需要及び他の需要を満たし、公知の光学顕微鏡法装置及び方法に見られる欠陥を概ね克服する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、一般に標本について対向する対物レンズを用いる３次元光学顕微鏡法のための方法及び装置に関する。本発明には３つの好適な実施の形態があり、これらは主に同じ装置を使用し、標本を一方若しくは両方の対物レンズから照明し、一方又は両方の対物レンズを通して観察及び記録する。
【００１７】
本発明は一般に第一及び第二の対物レンズを含み、これらは薄い標本を挟んで互いに対向して取り付けられており、これらの対物レンズの少なくとも一方は並進調節手段を含む（これは例であって、これに限定するものでない）。照明手段、好ましくは１つ以上のアークランプ又は他の拡張空間的インコヒーレント光源によって標本を照明する。本発明は一般にビームスプリッタ及びビーム再結合器手段、好ましくはビームスプリッタ／再結合器キューブを含み、照明光を２つのパスに分割して両対物レンズを通して標本に当て、両対物レンズからの観察光若しくは放射光線を再結合して記録する。複数の調節可能ミラーによって照明光及び／又は観察光の方向を対物レンズと画像記録手段との間を行き来させることができる。画像記録手段は、好ましくはＣＣＤカメラを含む。異なる波長を選択的に透過及び反射させる手段、好ましくは１つ以上のダイクロイックミラーが、本発明に一般に含まれる。光路長調節手段、好ましくは１つ以上のミラーが好適に配置された並進ステージによって、光路長のチューニングが可能になる。照明光と観察光若しくは放射光線との間、及び／又は照明光及び／又は観察光若しくは放射光線内の異なる波長成分の間の位相差を補償するために、色相補償手段、好ましくは色相補償板が含まれてもよい。対物レンズに対して標本を位置合わせするための位置合わせ手段が提供され、これは好ましくは移動可能ミラー及び接眼レンズを含む。また、本発明はばらつき防振プラットフォーム若しくはハウジング等のばらつき防振支持手段を使用してもよい。
【００１８】
本発明の第一の実施の形態において、標本の２つの画像を同時に得るために２つの対向する対物レンズが標本に使用されるが、照明光は一般に一方の対物レンズから標本に方向付けられる。２つの対物レンズからの２つの画像は結合されて、ＣＣＤカメラ又は他の画像形成手段の上に入射される。２つの対物レンズからの２つの光路長は、標本からの放射光線のコヒーレント長よりも短い（好ましくは観察光若しくは放射光線の波長よりも非常に小さい）分だけ異なるように調節される。２つの画像は次にＣＣＤカメラ上で干渉して標本情報を提供する。本発明によって提供された強化された深度即ちＺ分解能情報は、これらの２つの画像が同じＣＣＤカメラ上に２つの光路長を慎重にバランスを取ってコヒーレントして結合されたときに、これらの２つの画像の干渉により生じる。本発明の第一の実施の形態は、蛍光顕微鏡法に関して概して記載されるが、当業者には、この実施の形態が、明視野、暗視野、及び位相差顕微鏡法を含む他の多くのモードの光学顕微鏡法にも同様に適用可能であることが分かるであろう。本発明の第一の実施の形態は、一般に”画像干渉顕微鏡法”又はＩ2顕微鏡法と呼ばれ、便宜上及び明確化のために、以下Ｉ2Ｍ形態と称す。本発明のＩ2Ｍ形態及び以下に関連する他の実施の形態の操作は、標準の光学セクショニング顕微鏡法で使用される操作に似た方法で進められる。即ち標本の一連の画像を異なる焦平面で獲得し、点光源によってぶれが生じた先に測定された標本を用いて焦点外のぶれを取り除くために全データの計算形逆畳み込みを行う。
【００１９】
本発明の第二の実施の形態（主に蛍光若しくはリン光顕微鏡法に適用される）において、拡張空間コヒーレント光源からの照明若しくは励起（excitation）光はビーム分割手段によって分割され、対向する対物レンズを介して標本を両面から照明するために使用される。光路長のバランスがとれたとき、２つの照明ビームは２つの対物レンズの焦平面で干渉する。この狭い干渉フリンジによって、焦平面を囲む標本の薄い切片又は領域において照明の強度が深度Ｚでばらつきが生じる。照明光の空間的構造によって標本からの蛍光放射光線が対応して変調し、この変調はＺ方向の分解能を拡大するもとである。第二の実施の形態において、標本は一般に単一対物レンズを介して観察される。本発明の第二の実施の形態は、”インコヒーレント干渉照明”即ちＩ3顕微鏡法と呼ばれ、便宜上及び明確化のために、以下本発明のＩ3Ｍ形態と称される。
【００２０】
本発明の第三の実施の形態では、Ｉ2Ｍ形態及びＩ3Ｍ形態を組合せ、本質的に同じ装置を使用して、Ｉ2Ｍ形態又はＩ3Ｍ形態のどちらかのみを単体で使用して可能な分解能よりもより大きいＺ方向の分解能を達成する。第三の実施の形態は、Ｉ2Ｍ形態及びＩ3Ｍ形態の組合せを含むため、以下Ｉ5顕微鏡法又はＩ5Ｍ形態と称する。Ｉ5Ｍ形態において、標本はＩ2Ｍ形態と同じように両方のレンズを介して観察されるが、標本はＩ3Ｍ形態と同じように両方の対物レンズを介して照明される。照明光及び観察光の必要な位置合わせは本質的に同じであるため、同じビームスプリッタが照明光及び観察光の両方に使用されてもよい。
【００２１】
本発明の目的は、非常に強化された深度即ちＺ方向の分解能を提供する３次元光学顕微鏡法のための方法及び装置を提供することである。
【００２２】
本発明の他の目的は、高い光スループットを有する３次元光学顕微鏡法のための方法及び装置を提供することである。
【００２３】
本発明の他の目的は、高データ獲得速度を可能にする３次元光学顕微鏡法のための方法及び装置を提供することである。
【００２４】
本発明の他の目的は、コヒーレント光源の使用を必要としない３次元光学顕微鏡法のための方法及び装置を提供することである。
【００２５】
本発明の他の目的は、不必要に標本を漂白しない３次元光学顕微鏡法のための方法及び装置を提供することである。
【００２６】
本発明の更なる目的及び利点は本明細書中の後続部分で明らかにするが、その詳細な説明は、本発明の好適な実施の形態を充分に開示するためのものであって、これらに限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明は以下の図面を参照してより充分に理解されるが、これらの図面は例示目的のみのためのものである。
【図１】図１は、本発明に従った光学顕微鏡の第一（Ｉ2Ｍ）の実施の形態の略図である。
【図２】図２は、本発明の第二（Ｉ3Ｍ）の実施の形態及び第三（Ｉ5Ｍ）の実施の形態に一般に使用される光学顕微鏡の略図である。
【図３】図３は、光学顕微鏡のＩ3Ｍ形態の略図である。
【図４】図４は、照明及び検出光のために共用ビーム分割光学系が使用される光学顕微鏡のＩ5Ｍ形態の略図である。
【図５】図５は、照明及び検出光のために別々のビーム分割光学系が使用される光学顕微鏡のＩ5Ｍ形態の略図である。
【図６】図６は、照明源及び画像検出器に隣接して含まれる追加のビームスプリッタを有する光学顕微鏡のＩ5Ｍ形態の略図である。
【図７】図７は、従来の広視野光学セクショニング顕微鏡法を通して得られるインコヒーレント光伝達関数のサポート領域をグラフで表した図であり、このグラフはｋYｋZ平面、即ちｋY及びｋZ軸が張られたフーリエ空間の平面で表されており、各軸は実際の空間のＹ及びＺ軸にそれぞれ対応する。
【図８】図８は、本発明のＩ2Ｍ形態を通して得られたインコヒーレント光伝達関数のサポート領域をｋYｋZ平面にグラフで表した図である。
【図９】図９は、本発明のＩ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態に使用される照明光強度の空間周波数成分の支持領域をｋYｋZ平面にグラフで表した図である。
【図１０】図１０は、本発明のＩ3Ｍ形態を通して得られたインコヒーレント光伝達関数のサポート領域をｋYｋZ平面にグラフで表した図である。
【図１１】図１１は、本発明のＩ5Ｍ形態を通して得られたインコヒーレント光伝達関数のサポート領域をｋYｋZ平面にグラフで表した図である。
【図１２】図１２は、標本からの放射光線のフーリエ空間における空間周波数成分若しくはコヒーレント伝達関数をｋYｋZ平面にグラフで表した図である。
【図１３】図１３は、図１２に表されたコヒーレント伝達関数の自己相関関数又はインコヒーレント伝達関数をｋYｋZ平面にグラフで表した図である。
【図１４】図１４は、受光角αを有する通常の対物レンズの簡略図である。
【図１５】図１５は、図１４の通常の対物レンズによって得られた、図１２に表されたコヒーレント伝達関数の部分をグラフで表した図である。
【図１６】図１６は、図１３に表されたインコヒーレント伝達関数の、図１４の通常の対物レンズによって得られた部分をグラフで表した図である。
【図１７】図１７は、本発明に従った、受光角αをそれぞれ有する対向する２つの対物レンズの簡略図である。
【図１８】図１８は、図１２に表されたコヒーレント伝達関数の図１７のデュアル対物レンズ配列によって得られた部分をグラフで表した図である。
【図１９】図１９は、図１３に表されたインコヒーレント伝達関数の、図１７のデュアル対物レンズ配列によって得られた部分をグラフで表した図である。
【図２０】図２０は、単一の対物レンズを用いた従来の顕微鏡法システムで一般に使用される照明配列の簡略図であり、光源の単一ポイントからの光を表している。
【図２１】図２１は、本発明のＩ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態に使用される照明配列の簡略図であり、光源の単一ポイントからの光がビーム分割手段によって２つのビームに分割された後、両方向から標本を照らしているところが表されている。
【図２２】図２２は、図２１の点光源照明配置からの照明若しくは励起光振幅に対応するｋYｋZ平面からおよそ見たフーリエ空間表示をグラフで表した図である。
【図２３】図２３は、図２１の点光源照明状態における照明光の強度に対応する、図２２のフーリエ空間表示の自己相関関数をグラフで表した図である。
【図２４】図２４は、図２２で表された領域（ポイントペア）の和集合、即ち照明源の全てのポイントをグラフで表した図である。
【図２５】図２５は、図２３で表された領域（ポイントトリプレット）の和集合、即ち照明源の全てのポイントをグラフで表した図である。
【図２６】図２６は、本発明のＩ2Ｍ形態の平面図である。
【図２７】図２７は、図２６に表されたＩ2Ｍ形態のよりコンパクトなバージョンの平面図である。
【図２８】図２８は、本発明のＩ3Ｍ形態の平面図である。
【図２９】図２９は、本発明のＩ5Ｍ形態の平面図である。
【図３０】図３０は、２つの画像記録装置が使用される、本発明のＩ5Ｍ形態の平面図である。
【図３１】図３１は、同じ画像検出器の異なる部分が使用される、本発明のＩ5Ｍ形態の平面図である。
【図３２】図３２は、エピ照明のために設けられた標準の倒立顕微鏡に組み込まれた本発明の簡略図である。
【図３３】図３３は、エピ−及び透過−照明の両方のために備えつけられる標準の倒立顕微鏡の簡略図である。
【図３４】図３４は、本発明のＩ2Ｍ形態を使用するための方法の一般的ステップを表す流図である。
【図３５】図３５は、本発明のＩ3Ｍ形態を使用するための方法の一般的ステップを表す流図である。
【図３６】図３６は、本発明のＩ5Ｍ形態を使用するための方法の一般的ステップを表す流図である。
【図３７】図３７は、フーリエ空間における光の２つのコヒーレントビームの振幅をグラフで表した図であり、一般にｋYｋZ平面に表されている。
【図３８】図３８は、図３７に表されたフーリエ空間振幅の自己相関関数を、一般にｋYｋZ平面にあらわしたグラフを表す図である。
【図３９】図３９は、従来の単一レンズ顕微鏡を通して観察して得られたフーリエ空間における直接観察可能領域及び置き換えられた領域をグラフで表した図であり、一般にｋYｋZ平面に表されている。
【図４０】図４０は、本発明のデュアル対向対物レンズ配置を通して観察して得られたフーリエ空間における直接観察可能領域及び置き換えられた領域をグラフで表した図であり、一般にｋYｋZ平面に表されている。
【図４１】図４１は、４ビーム定在波顕微鏡法技術のためのフーリエ空間における光振幅分布をグラフで表した図であり、一般にｋYｋZ平面に表されている。
【図４２】図４２は、図４１に表された関数の自己相関関数から得られた結果的な強度フィールドをグラフで表した図であり、一般にｋYｋZ平面に表されている。
【図４３】図４３は、２つの照明点光源が開口部内で互いに対称に対向して配置されたときに生じる、４ビーム定在波顕微鏡法技術のためのフーリエ空間における光振幅分布をグラフで表した図であり、一般にｋYｋZ平面に表されている。
【図４４】図４４は、図４３に表された関数の自己相関関数から生じた結果的な強度フィールドをグラフで表した図であり、一般にｋYｋZ平面に表されている。
【図４５】図４５は、開口部のエッジ上の正反対の対向ポイントに配置された２つの相互コヒーレント光源のための照明振幅のためのサポート領域をグラフで表した図であり、一般にｋYｋZ平面に表されている。
【図４６】図４６は、図４５に表された関数に対応する照明強度のためのサポート領域を表した図であり、一般にｋYｋZ平面に表されている。
【図４７】図４７は、図４５及び図４６によって記載された照明配列のための、４ビーム定在波顕微鏡法技術を用いて得られたフーリエ空間の直接換算可能領域及び置き換えられた領域をグラフで表した図であり、一般にｋYｋZ平面に表されている。
【図４８】図４８は、１方の光源が開口部の中央に配置され、もう一方の光源が開口部のエッジに配置される、２つの相互コヒーレント光源の照明振幅のためのサポート領域をグラフで表した図であり、一般にｋYｋZ平面に表されている。
【図４９】図４９は、図４８に表された関数に対応する照明強度のためのサポート領域を表した図であり、一般にｋYｋZ平面に表されている。
【図５０】図５０は、図４８及び図４９によって記載された照明配列のための、４ビーム定在波顕微鏡法技術を用いて得られたフーリエ空間の直接換算可能領域及び置き換えられた領域をグラフで表した図であり、一般にｋYｋZ平面に表されている。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
図を更に詳細に参照すると、本発明を含む方法並びに装置、及び本発明の背後にある論理が例示のために図１〜図５０に一般的に表されている。本明細書中に開示された基本的な概念から逸脱しなければ、本発明の装置はその構成及び部品の詳細について異なってもよく、本発明の方法はそのステップ及びそのシーケンスについて変化してもよい。
【００２９】
図１を参照すると、本発明の第一の実施の形態、即ちＩ2Ｍ形態に従った顕微鏡装置の簡略図が概ね表されている。第一対物レンズ１２及び第二対物レンズ１４が標本１６の周りに取り付けられ、対物レンズ１２及び１４の焦点は対向方向から標本１６の１つの同じセクション又は平面に合わせられている。標本１６は好ましくは薄く、２つのカバーガラスの間に挟まれている。第一及び第二対物レンズ１２、１４から観察された光若しくは画像は、複数のミラー１８によってそれぞれパス２４及び２６に沿って反射され、ビーム分割及び再結合手段、好ましくはビームスプリッタ／再結合器２０に向けられる。対物レンズ１２、１４から観察された光又は画像はミラー１８及びビームスプリッタ／再結合器２０によって画像検出手段２２上に入射され、画像が記録される。好ましくは画像検出手段２２はＣＣＤカメラ又はそのようなものである。２つの光路２４、２６の光学長は、放射光線のコヒーレンス長より短い分だけ異なるように調節される。光路長の調節は以下により詳細に述べられる適切な手段（図示されていない）によって実行される。光路長２４及び２６が調節されると、第一及び第二対物レンズ１２及び１４から観察された光若しくは画像は、画像検出手段２２上で干渉する。一般に、照明手段（図示されていない）からの照明光はビームスプリッタ（ダイクロイックであってもなくてもよく、またミラー１８ａ又は１８ｄのうちの１つとして機能してもしなくてもよい）を用いて対物レンズ１２又は１４のどちらかを通って標本に向けられる。干渉する観察光からの画像は画像検出手段２２によって記録され、この画像検出手段２２にインターフェースするデータ処理手段（図示されていない）によって格納される。
【００３０】
顕微鏡装置１０の操作は、標準の光学セクショニング顕微鏡法とほぼ同じように進められる。標本１６のセクションの観察光又は画像が画像検出手段によって記録されたあと、対物レンズ１２及び１４は標本位置合わせ手段（図示されていない）を用いて新しいセクションに対応する他の画像を得るために、標本１６内の他のセクション又は平面上に焦点合わせされる。標本の一連の画像は異なる焦平面で得られ、この一連の画像から標本１６の所望の部分のための画像のデータセットが形成される。光学セクショニング顕微鏡法においてと同様、各画像は、第一及び第二対物レンズ１２及び１４の焦点が合わせられるセクション又は焦平面からの標本１６から焦点の合った情報、及び焦平面の外側の標本１６のセクションから焦点外の、即ちぶれた情報を含む。全データセットは演算処理され（我々が制限なく逆畳み込みと一般に称するプロセス）、点光源により生じたぶれの先に測定されたある標本を用いて、焦点外のぶれを取り除く。画像検出手段２２は好ましくはマイクロプロセッサ又は他のデータ処理手段（図示されていない）にインターフェースされており、標本１６からのデータセットの計算形逆畳み込みを簡易化する。
【００３１】
単一の対物レンズを用いた標準顕微鏡で行われるのと本質的に同じ物理的プロセスを行うことにより、強化されたＺ方向の分解能が得られる。標準の単一対物顕微鏡における分解能は、異なる方向に放射された光線同士の間の干渉により生じたものとみなされることができる。これは開口部がより大きい、即ちより広範囲の角度で光を受け取る対物レンズはより大きな分解能を有するというよく知られている事実に繋がる。本発明は、２つの対向する対物レンズを用いて”後方”及び”前方”方向に放射される光を含むようにこのプロセスを拡張する。
【００３２】
顕微鏡装置１０のためにミラー１８の幾つかの配列が使用されてもよく、図１に図示されたミラー配列は好適な配列のうち最もシンプルなものである。ミラー１８の幾つかの配列は図１に表された本発明には役に立たないことに注意されたい。なぜなら対物レンズ１２、１４のうち一方からの画像は他方のレンズからの画像に対して反転されるからである。
【００３３】
図１に図示された本発明のＩ2Ｍ形態は、一般に蛍光顕微鏡法に適用可能である。しかし、当業者には、この実施の形態は明視野、暗視野、位相差、及び他のモードの光学顕微鏡法にも適用可能であることが明らかであろう。従って、本発明は、蛍光顕微鏡法若しくはリン光顕微鏡法に使用されるとき、本明細書中における対物レンズからの"観察光"という用語は標本から放出される光を一般に指し、用語"照明光"は励起光を一般に指す。非照明タイプの顕微鏡法が使用される場合、"観察光"は標本によって反射された光又は標本を透過した光を一般に指す。
【００３４】
図２を参照すると、顕微鏡装置２８の簡略図が表されており、これは本発明の第二の実施の形態、即ちＩ3Ｍ形態及び第三の実施の形態、即ちＩ5Ｍ形態に使用するのに適している。ここで同じ参照番号は同じパーツを示す。また図１を参照すると分かるように、Ｉ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態は概ねＩ2Ｍ形態に使用されるのと同じ装置を使用し、主な違いは、一般に１つ以上のレンズ若しくはミラーを含み、レンズ３２で図示された照明焦点合わせ手段によって（好ましくは空間インコヒーレント光源３０からの）照明光が、Ｉ2Ｍ形態のように標本１６に主に方向付けられるのではなく、主にビームスプリッタ／再結合器２０に方向付けられることである。図２に表されたような本発明のＩ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態は主に蛍光顕微鏡法に使用するために考慮されるが、他のモードの顕微鏡法にも使用できる。従って、Ｉ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態において用語"照明光"は一般に励起光を指し、用語"観察光"は標本から放射された光線を一般に指す。
【００３５】
図２の装置２８における照明光は、ビームスプリッタ／再結合器２０によって２つのビームに分割され、ミラー１８によってパス２４及び２６にそれぞれ沿って第一及び第二対物レンズ１２及び１４に方向付けられる。照明光は対物レンズ１２及び１４によって標本１６のセクション又は平面上に焦点を合わされて入射される。Ｉ2Ｍ形態において、２つの光路２４及び２６の光学長は、適切な手段（図示されていない）によってほぼ等しく調節される。光路長２２及び２４を調節することによって照明光は標本１６の焦平面内に干渉する。従って、本発明のＩ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態において、照明光は、Ｉ2Ｍ形態のように検出手段上で観察光が干渉するのではなく、照明光が標本１６のセクションの焦平面に干渉する。しかし、３つの全ての実施の形態は、図１及び図２と比べて分かるように本質的に同じ装置を使用する。
【００３６】
ここで図３及び図４を参照すると（それぞれ本発明のＩ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態を表す）、Ｉ3Ｍ形態を含む装置とＩ5Ｍ形態を含む装置との間の主な違いは画像検出手段２２の位置であることが分かる。画像検出手段２２上に画像を焦点を合わせるために焦点合わせ手段（図示されていない）、一般的にレンズである、が使用されてもよい。図３を特に参照すると、本発明のＩ3Ｍ形態に従った装置３４が概ね表されており、この中では画像検出手段２２は第一対物レンズ１２のみからの観察光を記録する。第一対物レンズ１２からの観察光は、ここではビームスプリッタ３６で表されている選択反射及び透過手段（ダイクロイックであってもよい）を介して画像検出手段２２に達し、この選択反射及び透過手段は第一対物レンズ１２から観察された若しくは放射された光線を選択的に画像検出手段２２に透過する一方、画像検出手段２２から離れた照明又は励起光を選択的に反射する。ビームスプリッタ３６はＩ2Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態におけるミラー１８ａと同じ位置を一般に占めるか、又は別々の構成要素であってもよい。
【００３７】
特に図４を参照すると、本発明のＩ5Ｍ形態に従った装置３８が一般に表されており、ここでは画像検出手段２２が第一及び第二対物レンズ１２及び１４の両方からの観察光を記録するためにビームスプリッタ／再結合器２０に隣接して配置される。必要であれば、レンズ等の焦点合わせ手段（図示されていない）もまた、ビームスプリッタ／再結合器２０と画像検出手段２２との間に含まれてもよい。本発明のＩ5Ｍ形態はＩ2Ｍ形態と同様に画像検出手段２２上で干渉する画像を記録し、Ｉ3Ｍ形態と同様に第一及び第二対物レンズからの照明光を標本１６内で干渉させるので、これらの２つの実施の形態の単なる組合せである。照明光を標本１６のセクションの焦平面内に入射させて干渉させる同じ光路長調整により、観測光を画像検出手段２２上に入射させて干渉させ、これによって、多くの場合、同じ装置は光源３０を単に移動させることによってＩ2Ｍ形態及びＩ3Ｍ形態の両方に使用されることができる。
【００３８】
幾つかのミラー及びビームスプリッタ／再結合器配列が本発明の各実施の形態に考えられるが、Ｉ5Ｍ形態の可能な構成がおそらく一番多いであろう。図４に表されたように、装置３８は単一のビームスプリッタ／再結合器２０を有し、このビームスプリッタ／再結合器２０は照明光を分割し、及び画像検出手段２２に検出させるために観察光を再結合する。図５に図示された装置４０は、別々のビームスプリッタ／再結合器４２、４４を使用し、これらはそれぞれ照明光を分割し、観察光を再結合して、図４の装置３８によって得られるビーム分割及び再結合効果と同じ効果を達成する。図５の別々のビームスプリッタ４２、４４を使用するためには追加のミラー１８ｅ、１８ｆ及びダイクロイックミラー４６、４８が必要である。図６に表された装置５０はＩ5Ｍ形態に従った別々のビームスプリッタ／再結合器４２、４４の他の可能な配列であり、追加のミラーやダイクロイックミラーを必要としない。図４〜図６に表された配列のそれぞれの可能な利点を以下に記載する。
【００３９】
図２〜図６に図示された本発明のＩ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態に従った顕微鏡装置の操作は、上記のＩ2Ｍ形態と同じ方法で進行する。標本１６のセクションの観察光若しくは画像が画像検出手段２２によって記録された後、対物レンズ１２、１４の焦点は、新しいセクションに対応する他の画像を得るために、標本位置合わせ手段（図示されていない）を用いて標本を移動することによって標本１６内の他のセクション若しくは表面に合わせられる。異なる焦平面で標本の一連の画像が得られ、標本１６の所望の部分の画像のデータセットが形成される。全データセットは数学的に逆畳み込みされて、Ｚ方向の分解能が強化された３次元標本情報が得られる。
【００４０】
本発明を更に充分に理解するために、図７〜図２５を参照する。これらの図面は本発明の根底にある倫理及び本発明により達成される強化されたＺ方向分解能のための物理的ベースに一般に関する。図７〜図２５には様々な３次元関数をフーリエ空間のｋY及びｋZ平面に一般にグラフで表しである。
【００４１】
上記に関連して、現在使用されている光学セクショニング顕微鏡法における再生プロセスは、点光源からのぶれを記述する基準データセットを使用する。この基準ぶれは顕微鏡の”点像分布関数”として一般に知られており、その光学特性を特徴付ける。点像分布関数のフーリエ変換は、光伝達関数（optical transfer funtion）即ちＯＴＦとして一般に知られており、標本情報の異なる空間周波数成分がどの程度データに現れるかを記述する。以下に概略で説明する理由のために、光学画像形成システムの光伝達関数は"サポート領域"と一般に呼ばれるある有限領域以外においてはどこでもゼロである。従って、サポート領域内にある標本のこれらの空間周波数のみが標本データに影響し、他の空間周波数についてのデータセットには情報は含まれない。標本についての更なる情報が入手可能であれば数学的再生はより正確になされることができるので、顕微鏡の光伝達関数のサポート領域をできるだけ大きくさせることが有利である。３次元光学顕微鏡の光伝達関数のサポート領域の大きさ及び形は、対物レンズが光を受け取ることができる角度によって決定される。本発明のＩ2Ｍ形態は光が収束される立体角を広げることによって分解能を増大させる。
【００４２】
図７は、従来の光学セクショニング顕微鏡法を介して得られたインコヒーレント光伝達関数のサポート領域をＹＺ平面にグラフで表したものである。従来の顕微鏡法で得られたＺ方向の分解能は一般に等式、 Ｚres ＝ ［１−Ｃos（α）］／λで表される。ここでαは対物レンズが光を収束できる角度であり、λは観察光又は放射光線の標本媒体における波長である。これとは対照的に、図８は本発明のＩ2Ｍ形態で得られたインコヒーレント光伝達関数の対応するサポート領域であり、Ｚ方向の分解能は等式、 Ｚres ＝ ２／λで表される。ここでλは観察光又は放射光線の標本媒体における波長である。どちらのグラフもｋZ軸の周りに回転対照的な３次元オブジェクトを表す。すぐに分かるように、本発明は従来の光学セクショニング顕微鏡法の状態よりもはるかに増大されたＺ方向の分解能を提供する。
【００４３】
本発明のＩ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態の照明方法特性を導入すると、図９に表された関数を用いて図７及び図８に表された光伝達関数を畳み込みすることによって変える。図９は、本発明のＩ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態に一般に使用される照明光若しくは励起光の空間周波数要素のためのサポート領域をだいたい表す。従って、Ｉ3Ｍ形態の光伝達関数は、図７及び図９に表された関数の畳み込みによって得られ、これは図１０に一般に表されたサポート領域となる。従ってＩ3Ｍ形態は以下の等式で記載されるＺ方向の分解能を提供する。
Ｚres ＝ ２／λexcitation＋［１−Ｃos（α）］／λemission
同様に、Ｉ5Ｍ形態の光伝達関数のサポート領域（図１１に図示）は図８及び図９に表された関数の畳み込みによって得られる。Ｉ5Ｍ形態の光伝達関数のサポート領域は以下の等式で表される。
Ｚres ＝ ２／λexcitation＋２／λemission
Ｉ5Ｍ形態の光伝達関数はＩ2Ｍ形態で得られるＺ分解能を２倍以上にするだけでなく、図８及び図１０に表されたＩ2Ｍ形態の光伝達関数のサポート領域における"ギャップ"を埋める。
【００４４】
以下のセクションでは、図１２〜図２５に対応して、図７〜図１２におけるオブジェクトの形状の背後にある物理的理由をより詳細に記載する。蛍光顕微鏡法標本によって放射されたような準単色光視野は単一波長λemissionを有効に有し、従ってその空間周波数要素の全てはフーリエ空間の薄いシェル（半径Ｒ＝１／λ）に制限される（図１２にグラフで表されている）。このフィールド振幅は、図１２における同じ薄いシェル内に入る標本放射振幅（及び位相）のこれらの空間周波数要素についてのみの情報を含む。このシェルは標本放射光線と電界との間のコヒーレント伝達関数とみなされることができる。しかし、インコヒーレント放射光線（例えば蛍光）標本の場合、明視野の平均強度は発光強度についての情報を含み、コヒーレント伝達関数の自己相関関数によって、関連する”インコヒーレント”伝達関数を得ることができる。図１２に表されたシェルの自己相関関数は、図１３に表されたように半径Ｒ＝２／λの球形内において非ゼロである。
【００４５】
しかし、図１４に表されたように、通常の対物レンズ５２は標本からの光５４にはその光軸のある角度α内でしかアクセスできない。その効果は、図１２に表されたコヒーレント伝達関数を切捨てて図１５に表された角度αの半分の錐内に含まれる球体キャップ型関数にする。対応するインコヒーレント伝達関数（図１５の球体キャップ型関数の自己相関関数）は図１６に表されている。従ってインコヒーレント伝達関数は図１６のフーリエ空間のドーナツ型領域内においてのみ非ゼロであり、この領域の外側からは標本についての情報は得られない。このドーナツ型領域は使用されるレンズの光学品質にかかわらず、顕微鏡の基本的な分解能の限界を表す。これが３次元光学顕微鏡法の主な限界であるということは、実験結果に対する論理的予測の類似点により明らかである。本発明のＩ2Ｍ形態を用いた顕微鏡法において、図１７に表されたように、２つの対物レンズ５２及び５６は角度αの半分の２つの錐内の光がアクセスされることができるように存在する。これによって２つの球体キャップからなるコヒーレント伝達関数が提供される（図１８に図示）。対応するインコヒーレント伝達関数（図１８に表された関数の自己相関関数）は図１９に表されている。図１６に比べて図１９の非常に大きな（ｋZ方向の）幅は、本発明で得られる増大されたＺ分解能に直接関連する。図７〜図１９に表されたグラフは、６７°の角度αで表されており、これは現在入手可能な最も高分解能対物レンズに相当する。このようなレンズでは、Ｉ2Ｍ形態は従来技術よりもほぼ３．２ファクタだけＺ方向の分解能を向上させるであろう。
【００４６】
図１６及び図１９に表された領域の外の情報にアクセスするためのＩ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態の能力は、一方で光放射の空間的構造と、他方で標本自体の空間的構造との間の区別という点で理解することができる。本発明のＩ2Ｍ形態の上記の記述は、標本から観察された又は放射された光の周りにアクセスできる情報に関連し、これを以下Ｅ（ｒ）と称することとする。しかし、より興味深いことは、標本それ自体、更に詳細には蛍光顕微鏡法においては、蛍光分子群（蛍光物質）の分布Ｆ（ｒ）である。Ｅ（ｒ）はＦ（ｒ）と以下のような関係がある。
Ｅ（ｒ）＝Ｆ（ｒ）Ｉ（ｒ）
ここでＩ（ｒ）は局所照明強度、即ちパターンである。広視野顕微鏡法において一般的にそうであるように、照明が均一であればＩ（ｒ）は一定であり、Ｅ（ｒ）及びＦ（ｒ）はあまり関係のない一定スケールファクタを除いて同じである。従って、Ｉ2Ｍ形態の上記に関連するＥの制限は、Ｅと全く同じようにＦにも適用される。
【００４７】
本発明のＩ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態の場合と同じように、照明が均一でなければ、状況は異なる。等式Ｅ（ｒ）＝Ｆ（ｒ）Ｉ（ｒ）の実空間の積は、フーリエ空間の畳み込みに対応する。Ｉ（ｒ）が原点の外側のフーリエ成分を有する場合（これはＩ（ｒ）が均一でないときに起こる）、この畳み込み操作は標本情報をフーリエ空間の新しい位置に"移動"させる。特に、これはいくつかの情報を通常の観察不可能領域からＥの観察可能領域に移動させる。これは本発明のＩ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態の分解能強化のための物理的ベースの本質である。しかし、上記に関連して、全ての３つの実施の形態は本質的に同じ装置を使用し、Ｚ方向の分解能強化のための物理的ベースが異なるだけである。
【００４８】
セクションからセクションにデータ獲得が進行するときに非均一照明パターンが標本に対して固定されたままである場合、標本の蛍光情報Ｆ（ｒ）を照明パターンＩ（ｒ）から見分けることはできない。言い換えれば、照明パターンは標本の一部のように見えるであろう。これにより、獲得されたデータは図７に表されたようなフーリエ空間の通常の（小さい）観察可能領域に制限されたままとなるが、標本の他の領域に属していた情報は前記獲得データに混合される。この混合データは分離することが一般に困難である。一方、照明パターンが焦平面に関して固定されたままであれば、これは”点像分布関数の一部に見える”であろう。
【００４９】
この場合、獲得データはフーリエ空間のその正しい位置に留まり、代わりに光伝達関数自体が拡張される。後者（明らかに好適な状態である）は本明細書中に記載された本発明の場合である。
【００５０】
アポダイゼーションによって、例えば対物レンズの後側焦平面に共役する平面において、画像形成ビーム、照明ビーム、又はその両方にマスクを導入することによって、光伝達関数の異なる部分の相対強度を変えることが可能である。照明光、画像形成光、又はその両方を単一の偏向状態に制限するために、要素の偏向が使用されてもよい。両ケースにおいて、これらの状態は同じであっっても異なっていてもよい。
【００５１】
干渉顕微鏡法は、高い時間的及び空間的コヒーレンスを有する光源を一般に使用し、及びレーザの使用を一般に要する。”インコヒーレント”光との干渉をどうやって達成するかと質問されるかもしれない。これを分析する標準的な方法は、インコヒーレント光源の個々の点光源について考察すること含む。熱成長光バルブフィラメント等の空間的”インコヒーレント”光源において、異なるポイントからの放射光線はランダムに変化する相対位相を有する、即ちこれらの光線は相互にインコーヒレントである。しかし点光源はそれ自体に対して異なる位相を有することができないので、各点光源自体はコヒーレント光源と考えられることができる。従って全光源の全効果は、第一に各個々の点光源自体を考慮し、次にそのポイントのみによって生じた光の強度を計算し（各ポイントはコヒーレントであるのでボナファイデ（bona fide）干渉パターンを提供する）、これに続いてすべてのこれらの強度を加える。多くの場合、例えば標準の卓上ランプを用いる場合、様々な干渉パターンは互いに消去し合い、付加しあって円滑な強度分布になる。しかし、本発明に使用される特定の幾何学は、全ての点光源の干渉パターンが焦平面でピークを有し、従ってこれらの合計、即ち全体の強度分布もまたこのようなピークを有するように設計される。
【００５２】
図２０を参照すると、標準の顕微鏡法に一般に使用される照明配列はケーラー照明と呼ばれ、照明源６０の各点光源５８からの光はレンズ６６によって標本空間及び標本平面６４内で平行ビーム６２に焦点合わせされ、その角度βは点光源毎に異なる。しかし、本発明のＩ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態において、各点光源からの光はビームスプリッタによって分割され、図２１に表されたように代わりに標本内の２つのビームに対応する。フーリエ空間でこれは図２２にグラフで表されたように半径１／λexcitationの球体状の２つのポイントに対応する。（特に考察される特定の点光源からの）結果的な強度は、図２３の３つのポイントによって表されているようなこれらの２つのポイントの自己相関関数であり、これは実空間においてＺ軸に位置合わせされた正弦干渉パターンに対応する。標本における全光強度は、光源の全てのポイントからの強度寄与の合計である。対物レンズによって透過されることができる可能な光ビームのセットは、図２４に表された２重空間キャップによってフーリエ空間に記載される。これは図１８に表されたものと概ね同じであるが、図１８の半径１／λemissionの代わりに図２４は半径１／λexcitationを表している。光源上の各ポイントは、ある特定の角度βに上昇し（図２１及び図２２に表される）、従って特定の値ΔｋZになり、これは＝２Ｃｏｓ（β）／λexcitationで表される。開口照明を全開にして、全てのこのような光線、及び全てのこのような値βは、光源上のあるポイントによって生成される。従って、βは−α〜αまでの全ての値を帯び、よって、ΔｋZはΔｋZmin＝２Ｃｏｓ（α）／λexcitationからΔkZmax＝２／λexcitationまでの全ての値を帯びる。従って全照明強度、即ち光源上の全てのポイントからの全ての寄与の合計は、ΔｋZminからΔｋZmaxの間のΔｋ全ての値のための図２３の領域の和集合によってフーリエ空間に表される。この結果の領域は図２５に表されている。この領域は、図９と比較すれば分かるが、標本における全照明光のフーリエ変換のサポート領域である。この領域は図１９のｋZ軸の外を全て切り捨てたバージョンであると考えられる。
【００５３】
例示のみのためであって限定的なものではないが、図２６〜図２９は本発明の可能な実施の形態を表している。図２６を参照すると、本発明のＩ2Ｍ形態で使用するための装置６８の略図が表されている。装置６８の全ての構成要素はプラットフォーム又はハウジング（図示されていない）のような支持手段に取り付けられており、該手段は好ましくは防振されている。第一及び第二対物レンズ７０、７２は、並進調節手段を含んでもよいが、一般に第二対物レンズ７２のみが並進調節手段（ここでは並進ステージ７４として表されている）に取り付けられており、この手段はＸ、Ｙ、Ｚ方向に傾斜した作動スクリュー７６によってＸＹＺ方向に調整されることができる。第二対物レンズ７２は傾斜可能取り付け台７８等の角度調節手段によって並進ステージ７４に取り付けられており、該ステージ７４は調節スクリュー８０等の作動手段を含む。対物レンズ７０は好ましくは支持手段８２に直接取り付けられている。対物レンズ７０及び７２は一般に、干渉が起こるような位置及び角度に注意深く位置合わせされなければならない。このような精密な調節は、並進ステージ７４の位置を支持手段上で調節することによって行われる。照明手段からの照明光、例えばフィルターされた水銀アークランプ（図示されていない）等からの光は、光学ファイバ８４を通して方向付けられ、照明焦点合わせ手段（レンズ８６、８８、９０で表されている）を通して焦点合わせされ且つビームスプリッタ９２上に方向付けられる。光学ファイバ８４は好ましくは広いコア（１ｍｍ）を有し、空間的インコヒーレント光源として機能する。ビームスプリッタ９２は第一対物レンズ７０を通して照明光を標本９４上に反射する。標本９４は支持体９６によって並進調節手段に取り付けられており（ここでは並進ステージ９８として表されている）、この調節手段はスクリュー１００によって並進移動させられる。観察された光、又は蛍光顕微鏡法の場合は標本からの放射光線は、第一及び第二対物レンズ７０、７２から現れて、ビームスプリッタ９２及び光学第二ビームスプリッタ１０２によって選択的に透過される。前記ビームスプリッタ９２、１０２はダイクロイックであってもよく、ここでは簡略化のためにダイクロイックミラー９２、１０２と称すことにする。ダイクロイックミラー９２によって透過された光は光路１０８に沿ってミラー１０４、１０６を横切り、ダイクロイックミラー１０２により透過された光は光路１１４に沿ってミラー１１０、１１２を横切る。光路１０８及び１１４に沿って方向付けられた光は、ビーム分割及び再結合手段、好ましくはビームスプリッタキューブ１１６によって単一ビーム１１８に方向付けられて結合される。ビームスプリッタキューブ１１６は好ましくは並進傾斜ステージ１２０に取り付けられており、このステージ１２０はスクリュー１２２によって移動される。ビーム１１８内の光はフィルタ１２４を通過して照明光を取り除き、最終的には焦点合わせ手段（ここでは色消しレンズ１２６で表されている）によって画像検出手段１２８（好ましくはＣＣＤカメラか何か）上に焦点を合わせられる。レンズ１２６は好ましくはスクリュー１３２によって位置が調節される焦点合わせステージ１��０を含む。画像検出手段１２８は一般に処理手段（図示されていない）にインターフェースされ、ここで標本からのデータセットは計算形逆畳み込みのために格納される。位置合わせをするために、ビームは取り出し可能ミラー１３４によって接眼レンズ１３６及び／又は他の位置合わせ補助装置（図示されていない）に偏向されることができ、これらは正確に取り変え及び再配置ができるように運動台板（図示されていない）上に取り付けられている。光路１０８及び１１４の光路長の差は、並進ステージ１３８を”位相調整”して観察光及び照明光のコヒーレンス長内に微妙に調節されることができる。このステージ１３８にはミラー１０４、１０６が傾斜可能ミラーマウント１４０、１４２のような角度調節手段によって、スクリュー１４４等の作動手段と共に取り付けられている。並進ステージ１３８の位置はスクリュー１４６によって調節され、光路１１４に対して光路１０８を長くしたり短くしたりする。位相の微妙な調節は、ステージ１３８の正確な動作及びデータ獲得後のソフトウェアのオフラインによって行うことができる。
【００５４】
画像検出手段１２８上の干渉パターンは、ピンホール開口フォトダイオード（図示されていない）を用いてモニターされることができる（この接眼レンズが表されている）。
【００５５】
本発明に使用される全ての光学表面（ビームスプリッタ／再結合器キューブ１１６を含む）は、好ましくは高光学平面度、好ましくはλ／２０又はそれ以上であり、異なる光線の相対位相を保持する。本発明によりＺ方向の分解能が増大されるので、標本は従来の顕微鏡の現在の状態に比べてより正確に移動されなければならない。これは圧電アクチュエータ１４８を標本並進ステージ上に使用して行われ、このアクチュエータ１４８は実際の標本の位置を測定する容量センサ１５０からのフィードバック制御に応答する。第二対物レンズ７２の位置及び／又は位相調節ステージ１３８を感知して修正するために、同様の位置センサ及びアクチュエータを使用することもできる。
【００５６】
蛍光放射は相当広範囲の波長（〜５０ｎｍ）に渡って一般に生じ、及び狭いフィルタで帯域を制限することは光が不要に切り捨てられるために望ましくないため、２つの光路長の等しさがこの帯域の全ての波長に当てはまる（トレランス内である）ように注意しなければならない。潜在的な問題は、光学物質の分散（波長への屈折率の依存性）である。従って、Ｉ2Ｍ形態が蛍光顕微鏡法に使用される場合、光が透過する全ての構成要素（即ちレンズ、ダイクロイックミラー、及び半分にわかれたビームスプリッタキューブの両方）が充分厳格なトレランス以内におさまるように２つのビーム即ち光路１０８、１１４において同じ光学的厚さを有するようにしなければならない。分散問題に対する他のアプローチは、必要であれば、効果的な厚さを変更するために傾けることができる、又はトータルの厚みが調節されることのできるように１つの補償板が屈折率整合流体によって隔てられた薄い２枚のプレートからなる、又は１つの補償板が単一の可変厚プレートを形成するように互いに擦れ違うことができる２つのエッジからなる補償板１５２、１５４、を含むことである。
【００５７】
ここで図２７を参照すると、本発明のＩ2Ｍ形態に一致した他の装置１５６が一般に表されており、ここで同じ参照番号は同じ部分を指す。装置１５６はややコンパクトであり、これは単に図２６に表されたようなミラー１０４及び１１０をダイクロイックミラー１５８、１６０に置き換えてダイクロイックミラー１５８を通して照明光を直接標本９４に当て、ダイクロイックミラー１５８がこの照明光又は励起光を透過して放射光線を反射することによって、コンパクトになる。装置１５６はよりコンパクトであるが、その対称性はやや劣る。それは、２つのダイクロイックミラー１５８、１６０は異なる角度で使用されるので、これら２つのミラーが同じであることはできず、同時に同じ位相及びそれぞれのビームに対する分光効果を有することもできない。
【００５８】
図２６及び図２７で上記に記載されたＩ2Ｍ形態は、ファイバ光学系８４からの照明光の位置と画像検出手段１２８及び焦点合わせレンズ１２６の位置とを単に置き換えることによってＩ3Ｍ形態に変えることができる。これは図２８を参照すると非常に明らかである（同じ参照番号は同じパーツを示す）。従って、図２８は、光学ファイバ８４からの照明光若しくは励起光がビームスプリッタ／再結合器１１６によって分割されて、光路１０８、１１４に沿って第一及び第二対物レンズ７０、７２にそれぞれ方向付けられる装置１６２を表している。この対物レンズ７０、７２は、照明光を標本９６の平面上に焦点を合わせる。上記に関連して、Ｉ3Ｍ形態は１つの対物レンズのみから観察された光を記録する。これは、ビームスプリッタ１５８（ダイクロイックでもよい）を画像検出手段１２８と第一対物レンズ７０との間に配置して放射光線若しくは観察光がダイクロイックミラー１５８を通して画像検出手段１２８に透過されるようにすることによって実行される。或いは、装置１６２は本発明のＩ2Ｍ形態のための図２６及び図２７に表された装置とほぼ同じ装置であり、且つだいたい同じ様に操作され、これについて以下により明らかに記載する。
【００５９】
図２９を参照すると、本発明のＩ5Ｍ形態に一致する装置１６４が概して表されている。上記に関連して、Ｉ5Ｍ形態はＩ2Ｍ形態及びＩ3Ｍ形態を組み合わせたものであり、従って、Ｉ2Ｍ形態と同じように両対物レンズ７０、７２からの観察光若しくは放射光線を記録し、且つＩ3Ｍ形態と同じように両対物レンズ７０、７２から標本を照明する。これは図２６〜図２９を比較すれば簡単に明らかになる。図９の装置１６４において、光学ファイバ８４からの照明光又は励起光はビームスプリッタ／再結合器１１６によって分割され、光路１０８、１１４に沿ってそれぞれ第一及び第二対物レンズ７０、７２に方向付けられ、ここで照明光は標本のセクション上に焦点を合わせられる。第一及び第二対物レンズ７０、７２によって収束された観察光若しくは放射光線は、それぞれ光路１０８、１１４を逆戻りしてビームスプリッタ／再結合器１１６によって結合され、画像検出手段１２８上に焦点合わせされる。従って、本発明のための一般的装置がＩ2Ｍ形態の操作のために位置合わせされると、次にＩ5Ｍ形態のために自動的に位置合わせされる。このときのたった１つの例外は、照明強度が焦平面で最大ではなく最少になるように２つの照明ビームの相対位相が理想的なものと反対であることである。この状態で装置１６４を使用することは可能であるが、信号対ノイズ比（ＳＮ比）を減少させる。この問題は、ビームスプリッタでの反射と同時に位相シフトが起こることによって生じる。これはエネルギー保存の法則により避けられない。しかし、この問題を回避する幾つかの方法がある。例えば、図５に一般に表されているように照明光のために別々のビーム分割ループを使用することができる。又は、図６に一般に表されたように放射光線が検出される同じ側からビームスプリッタキューブ上に照明光を入射させることができる。このアプローチもまた追加のビームスプリッタ／再分割器（ダイクロイックでもよい）を要する。更に他のアプローチは、照明光若しくは励起光と観察光若しくは放射光線との間の波長の差を利用して、色相補償板１５２、１５４を僅かにオフセットすることによってこれらの光の間の補償位相差を生成することである。しかし、このようなオフセットを行うと、代わりに励起光及び放射光帯域自体の中に幾らかの位相のばらつきが生じる。本発明のＩ5Ｍ形態に使用される装置は、両方の位相状態でのデータを獲得できるように照明光をビームスプリッタキューブ１１６の片側を介して誘導させる。
【００６０】
上記に関連して、図２６〜図２９に表された各実施の形態のための２つのビームパス１０８、１１４の位相は、概ね等しくなるように調節されなければならず、これは位相調節ステージ１３８を用いて実行される。必要な調節量を決定するための位相測定は、蛍光マイクロビーズ等のテスト標本を用いて簡単に行われる。しかし、本発明の商業的なアプリケーションのためのより実際的な方法は、ビームスプリッタから現れた放射光線の２つのビームの両方が検出されて記録されるデュアル検出を含み、これは図３０及び図３１に表されている。図３０において、画像検出手段１６６はビームスプリッタ／再結合器１６８の片側からの光を記録する。この光は光路１７０に沿って画像検出手段１６６に方向付けられる。ビームスプリッタ／再結合器１６８の反対側からの光路１７２に沿った光はダイクロイックミラー１７４によって画像検出手段１７６に反射される。図３１において、ビームスプリッタ／再結合器１６８から光路１７０に沿った光をミラー１８０によって画像検出手段１７８の一部分に方向付け、ビームスプリッタ／再結合器からの光路１７２に沿った光をダイクロイックミラー１７４及び切頭ミラー（truncated mirror）１８２によって画像検出手段１７８の他の部分に方向付けることによってだいたい同じ効果が得られる。レンズ１８４、１８６、１８８は光を光路１７０、１７２に焦点を合わせ、画像検出手段１７８上の検出器の部分を分離する。デュアル検出により、放射光線を更に効果的に用いた良い面の効果になる。ビームスプリッタ／再結合器１６８から放射される２つのビームは２つの入射ビームの異なる組み合わせを表し、これは１８０°の位相シフトにより異なる。図３０に表されたような別々のカメラ１６６、１７６のどちらかの上、又は図３１に表されたような同じカメラ１７８の異なる部分の上で両方のビームを検出することによって、及びフーリエ空間におけるこの２つのデータセットを比較することによって、放射光路及び照明光路の両方の位相角度を推論し、もし使用されるのであれば、位相調節ステージ１９０及び色相補償板（図示されていない）を調節することができる。これは自動的に容易に行うことができる。
【００６１】
画像形成ビーム、照明ビーム、又はその両方の、異なる相対位相を有する複数のデータセットを得たい場合もある。特に、本発明のＩ3Ｍ形態又はＩ5Ｍ形態を用いる場合、１つのデータセットは焦平面において構造的干渉を有するように照明位相を調節して得られ、又第二データセットはその反対の照明位相で得られることができ、従ってここで照明強度は焦平面で最少値を有する。これらの２つのデータセットの間の差を用いて、干渉計情報成分は強調され、背景は抑えられる。
【００６２】
本発明のＩ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態はケーラー照明を用いて概略的に記載されたが、幾つかの他の照明配列がこれらの実施の形態に使用するのに適している。例えば、臨界照明はあらゆる中間配列と同様にケーラー照明と同様の結果を提供するであろう。
【００６３】
本発明は、第一及び第二対物レンズがＸ、Ｙ、Ｚ方向において同じ位置に焦点が合わせられることを一般に要する。これは２つの３次元テストデータセット（高速なので実際のデータセットよりも小さいかもしれない）を取ることによって行うことができる。このとき１つのデータセットは第一対物レンズのみを用い（即ち第二レンズからのビームパスのシャッターを閉めることによって）、及びもう１つのデータセットは第二対物レンズのみを用いて（データの記録中にもう一方のレンズからのパスを同様にブロックして）行われる。次に簡単な相互相関処理によって焦点及び側方オフセット誤差を決定し、これらは対物レンズの一方をもう一方のレンズに相対的に移動することによって修正されることができる。この処理は自動的に行うことができ、デュアル検出があってもなくてもＩ2Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態に適用することができる。
【００６４】
図３２及び図３３を参照すると、図３２の顕微鏡１９２等の本発明の商業的実施は、その前の図が示すものより、図３３に略図で表された典型的な顕微鏡のように見えるかもしれない。例えば図３２に表されたように、ビームスプリッタ／再結合器１９６、位相調整ステージ１９８、レンズ２００、フィルタ２０２、及びミラー２０４と同様、他の構成要素（図示されていない）が、既存の商業用顕微鏡に類似した構造２０６に組み込まれることができる。このとき光源２０８及び画像検出手段２１０は使用される本発明の（１つ以上の）実施の形態のために適切に配置される。
【００６５】
ここで図３４、図３５、及び図３６を参照すると、本発明の各実施の形態を用いた方法に関するフローチャートが概ね示されている。図３４を参照すると、本発明のＩ2Ｍ形態のためのフローチャートが全体的に表されている。ステップ２１２で、顕微鏡標本は第一及び第二の対向する対物レンズの間に配置される。上記に関連して、顕微鏡標本は、好ましくはガラスカバースライドの間に挟まれる。蛍光顕微鏡法では、標本は選択された蛍光プローブで適切にレベル付けされる。
【００６６】
ステップ２１４で、２つの対向する対物レンズが標本内のセクション又は表面に焦点合わせされる。焦点合わせは、好ましくは並進ステージ等の精度並進手段上で一方又は両方の対物レンズ、又は標本を移動することによって行われる。
【００６７】
ステップ２１６で、第一及び第二対物レンズによって観察された光又は画像は、画像を記録するために第一及び第二パスに沿ってＣＣＤカメラ等の画像検出手段に向けられ、ここでこの２つのパスからの観察光は入射させられる。このステップは、一般に複数のミラーによって実行されるが、このミラーは光を第一及び第二パスに沿ってビームスプリッタ／再分割器に向け、このビームスプリッタ／再分割器はこの２つのパスからの光を再結合して画像検出手段に方向付ける。
【００６８】
ステップ２１８で、第一及び第二パスの光路長は、この２つの光路長がコヒーレント長よりも短い分だけ異なる、好ましくは波長よりも非常に短い分だけ異なるように調節され、これによってステップ２１６で画像検出手段上に入射する観察光を画像検出手段上で干渉させる。光路長調節はミラーが取り付けられた並進ステージによって一般に実行される。ステップ２１８で干渉する観察光又は画像は、ステップ２２０で画像検出手段によって記録される。画像検出手段は、好ましくはマイクロプロセッサ等のデータ処理手段にインターフェースされ、記録画像を格納させる。
【００６９】
ステップ２２２で、第一及び第二の対物レンズは標本の他のセクションに焦点合わせされる。このステップは、好ましくは標本を対物レンズに対して並進運動させたり、対物レンズを並進運動させたり、又は標本とレンズを並進運動させたりすることによって行われる。
【００７０】
標本の各セクションが上記のように観察されて記録されるまで、ステップ２２４、ステップ２２０〜ステップ２２２まで、又は選択的にステップ２１８〜ステップ２２２までが繰り返される。標本の各セクションから記録された画像は標本全体のデータセットを形成し、このデータセットは画像検出手段にインターフェースしているマイクロプロセッサに格納される。
【００７１】
ステップ２２６で、計算形逆畳み込みのための手段はステップ２２４のデータセットに適用されて、Ｚ方向の分解能が強化された標本の３次元画像を生成する。本明細書中に使用される用語”逆畳み込み”は、再構成方法又はアルゴリズムのあらゆる形態を意味することを理解されたい。計算形逆畳み込みは、複数のフーリエ変換アルゴリズムを用いるソフトウェアを一般に含む。及び／又は画像データもまたより簡単な処理の後であって完全な計算形逆畳み込みの全てが終わる前、又は何も始められない前にディスプレイされてもよい。これを行う理由は、データをリアルタイムでディスプレイすることである。処理されていなくても、従来の広視野顕微鏡法よりも多くの情報を送る。
【００７２】
ステップ２１２及びステップ２１４の間に、対物レンズの一方を介して標本に照明光が提供される追加のステップ（図示されていない）が含まれてもよい。上記のようなケーラー照明が好適な照明技術であるが、当技術に使用される他の照明方法が考慮されてもよい。
【００７３】
観察された光の色相マッチングが実施される追加ステップ（図示されていない）もまたステップ２２０の前に含まれてもよい。色相マッチングは好ましくは色相補償板を用いて実行される。この補償板のうち一方は、組合せの光学的厚さを変えるように一方のウェッジが他方のウェッジを過ぎて並進移動することができる２つのウェッジを含む。
【００７４】
更に、第一及び第二対物レンズから観察された光を画像検出手段上に焦点合わせする追加のステップ（図示されていない）がステップ２２０の前に更に追加されてもよい。この焦点合わせは、好ましくは１つ以上の並進運動可能レンズによって実施される。
【００７５】
また、標本が第一及び第二の対物レンズの間に位置合わせされる追加のステップが、ステップ２１２及びステップ２１４の間に更に含まれてもよい。この位置合わせは、好ましくは（１つ以上の）着脱可能ミラーによって標本を観察する接眼レンズを用いて行われる。
【００７６】
図３５を参照すると、本発明のＩ3Ｍ形態の方法を含む一般的なステップに関するフローチャートが表されている。ステップ２２８で、顕微鏡標本は第一及び第二の対向する対物レンズの間に配置される。Ｉ2Ｍ形態について先に記載したように、顕微鏡標本は好ましくはガラスカバースライド間に挟まれる。Ｉ3Ｍ形態は主に蛍光顕微鏡法に使用するために考慮されているので、標本は好ましくは選択された蛍光プローブで適切にラベル付けされる。
【００７７】
ステップ２３０で、励起光又は他の照明光は、第一及び第二の対物レンズを介して顕微鏡標本のセクション上に向けられ、その上で焦点合わせされる。このステップは、照明光をビームスプリッタ／再結合器に方向付け、このビームスプリッタ／再結合器はこの光を第一及び第二パスに分割し、複数のミラーでこれらの光を第一及び第二パスに沿ってそれぞれ第一及び第二の対物レンズに方向付けることによって、一般に行われる。一般に、拡張された、空間的インコヒーレント光源が照明光を提供するのに使用される。
【００７８】
ステップ２３２で、第一対物レンズから放出された光はＣＣＤカメラ等の画像検出手段に向けられる。一般に、ダイクロイックミラーがこのステップで使用されるが、このダイクロイックミラーは観察された光を透過して照明光を反射する、又はその逆である。
【００７９】
ステップ２３４で、標本に方向付けられた照明光は標本のセクション内で干渉させられる。この干渉は、第一及び／又は第二パスの光路長を調節することによって行われる。一般に光路長の調節は、ミラーが取り付けられた並進ステージを移動することによって行われる。
【００８０】
ステップ２３６で、画像検出手段に方向付けられた、観察光又は放射光線が記録される。本発明のＩ2Ｍ形態と同様に、画像検出手段は複数の画像を格納するために好ましくはマイクロプロセッサにインターフェースされる。
【００８１】
ステップ２３８で、照明光又は励起光は標本の他のセクションに向けられ、そこで第一及び第二の対物レンズによって焦点合わせされる。
【００８２】
ステップ２４０で、ステップ２３６〜ステップ２３８、又は選択的にステップ２３４〜ステップ２３６が、標本の各セクションの記録データを含むデータセットが得られて格納されるまで繰り返される。
【００８３】
ステップ２４２で、計算形逆畳み込み手段がステップ２４０からのデータセットに加えられて、Ｚ方向の分解能が強化された標本の３次元画像を提供する。Ｉ2Ｍ形態と同様、位相マッチングステップ及び位置合わせステップ、及び観察光が画像検出手段に焦点合わせされるステップが含まれてもよい。
【００８４】
図３６を参照すると、本発明のＩ5Ｍ形態の方法を構成する一般的なステップに関するフローチャートが表されている。ステップ２４４で、顕微鏡標本は第一及び第二の対物レンズの間に配置される。Ｉ2Ｍ形態及びＩ3Ｍ形態に関連して先に述べたように、顕微鏡標本は好ましくはガラスカバースライド間に挟まれる。
【００８５】
Ｉ5Ｍ形態は主に蛍光顕微鏡用に考慮されているので、標本は好ましくは選択された蛍光プローブで適切にラベル付けされる。
【００８６】
ステップ２４６で、励起光又は他の照明光は第一及び第二の対物レンズを介して顕微鏡標本のセクション上に方向付けられ、そこに焦点が合わせられる。このステップは、一般に照明光をビームスプリッタ／再結合器に方向付け、該ビームスプリッタ／再結合器によって光を第一及び第二パスに分割して複数のミラーでこの光を第一及び第二パスに沿ってそれぞれ第一及び第二対物レンズに方向付けることによって行われる。
【００８７】
ステップ２４８で、標本により観察された又は放射光線は第一及び第二対物レンズから第一及び第二パスに沿ってＣＣＤカメラ等の画像検出手段に方向付けられ、ここに第一及び／又は第二パスから観察された光は入射される。標本から観察された光を画像検出手段に方向付けるために、ステップ２４６で使用されたのと同じミラー及びビームスプリッタ／再結合器を用いてもよいし、図４〜図６で記載したように別々のビームスプリッタ及び追加のミラーを使用してもよい。
【００８８】
ステップ２５０で、標本に向けられた照明光を標本のセクション内で干渉させる。この干渉は、第一及び第二パスの光路長を調節することによって一般になされる。一般に、光路長調節は（１つ以上の）ミラーが取り付けられた並進ステージを移動することによって行われる。
【００８９】
ステップ２５２で、画像検出手段に向けられて入射された観察光若しくは放射光線は、この画像検出手段によって記録される。画像検出手段は好ましくは本発明の他の実施の形態と同様に、複数の画像が格納されるようにマイクロプロセッサにインターフェースされてもよい。
【００９０】
ステップ２５４で、照明若しくは励起光は第一及び第二対物レンズによって標本の他のセクション上に向けられてそこで焦点合わせられる。
【００９１】
ステップ２５６で、ステップ２５２〜ステップ２５４、又は選択的にステップ２５０〜ステップ２５４は、標本の各セクションの記録画像を構成するデータセットが得られて格納されるまで、繰り返される。画像ビーム、照明ビーム、又はその両方の、異なる相対位相を有する複数のデータセットを得たい場合もある。
【００９２】
特に、本発明のＩ3Ｍ形態又はＩ5Ｍ形態を用いて、焦平面で構造的な干渉を有するように照明位相を調節して１つのデータセットを得ることができ、また照明強度が焦平面で最少値を有する逆の照明位相を有する第二データセットを得ることもできる。これらの異なる２つのデータの差を用いて、干渉計情報成分を強調して背景を抑えることができる。
【００９３】
ステップ２５８で、計算形逆畳み込み手段をステップ２５８からのデータセットに適用してＺ方向の分解能が強化された標本の３次元画像を提供する。他の実施の形態と同様に、位相マッチングステップ及び位置合わせステップと同時に、観察光を画像検出手段に焦点合わせするステップが含まれてもよい。
【００９４】
図３４〜図３６を比較すると、Ｉ5Ｍ形態を構成する方法は、Ｉ2Ｍ形態及びＩ3Ｍ形態の両方からのステップを組み合わせたものであることが分かる。これは本発明の３つの実施の形態に使用される装置の類似性を反映する。
【００９５】
ステップ２２６、２４２、及び２５８で適用された演算アルゴリズムは、外部制約の適用を含んでもよい。このような制約は一般に逆畳み込みアルゴリズムにおける空間的拘束制約、及び本発明を蛍光顕微鏡法に使用するときには放射強度及び蛍光濃度のポジティビティー（positivity）を含む。
【００９６】
本発明の開示に関連するコンセプトは、現在達成されることのできるものよりも大きなレベルにまで横方向、即ちＸＹ分解能を拡張するために既存の顕微鏡法技術と組み合わせて使用してもよい。例えば、本発明はＳＷＦＭへの”開口合成”アプローチを用いて既存技術の定在波蛍光顕微鏡法（以下ＳＷＦＭと称す）の態様と組合せて用いてもよい。
【００９７】
ＳＷＦＭ”において、先に述べたように標本を照明するために光の２つのコヒーレントビームが使用される。フーリエ空間において、これら２つのビームの振幅は図３７に表されたように２つのポイントにおいてのみ非ゼロである。図３７に表された２つのポイントの自己相関又は強度は図３８と関連しており、図３７では図３８のアウトラインの引かれた領域内のどこにでも当てはまる３つのポイントがある。
【００９８】
ＳＷＦＭは一般にＺ方向に位置合わせされた定在波を含む。先に記載されたような本発明は、原則としてＳＷＦＭで達成されることのできるＺ方向の分解能の全てを既に組み込んでいる。しかし、定在波の方向がＺ方向と平行でないＳＷＦＭを用いて横方向即ちＸＹ分解能を増大させることは可能である。特定の定在波方向及びベクトルｋst.waveを有する波長では、定在波の異なる位相で３つの画像スタックが得られる。又は、異なる位相で２つの画像スタックと定在波のない基準スタックを使用してもよい。同じ基準スタックを異なる定在波角度で使用して、得なくてはならない全スタック数を減少することができる。これらの画像スタック自体はそれぞれ光伝達関数のサポート領域即ち”直接観察可能領域”の外側にはフーリエ成分を含まないが、その中の情報は標本情報の３つの異なる領域（直接観察可能領域自体、及び＋ｋst.wave及び−ｋst.waveによってそれぞれそこから移されたこの直接観察可能領域の２つのコピー）に関する。これらは図３９及び図４０に表されている。図３９は通常の単一レンズ顕微鏡で観察したときの直接観察可能領域及び移動領域を一般に表しており、図４０は本発明のＩ2Ｍ形態のデュアル対向対物レンズ配列を介して観察したときの直接観察可能領域及び移動領域を一般に表している。図３９及び図４０のブラック領域は直接観察可能領域の光伝達関数を表し、＋ｋst.wave及び−ｋst.waveによってオフセットされた領域は影を付けて表されている。組合せたデータセットから、標本情報のこれらの３つの成分を分離してこれらをフーリエ空間のこれらの適切な位置に計算上移動させることが可能である。異なる波ベクトルｋst.waveでこの操作を繰り返すことによって、フーリエ空間の異なるパートを連続的に埋めて大きな領域をカバーすることができる。このようにアクセスすることができるフーリエ空間の領域の範囲は、生成されることができる可能な波ベクトルｋst.waveのセットを用いた直接観察可能領域の畳み込みによって決定される。
【００９９】
対物レンズを通して送られることのできる光の波動ベクトルのセットは、図１２〜図１９で先に示したような出射する放射光線と全く同じように、光の波長及び対物レンズの許容角度（開口数）によって制限される。このように、単一対物レンズシステムの可能な定在波ベクトルのセットが図７に表されており、デュアル対物レンズシステムの可能な定在波ベクトルのセットが図８に表されている。
【０１００】
この中でλは文脈上λexcitationを示すと理解される。同じレンズで両方のレーザビームを送ることができないデュアル対物レンズシステムの可能な定在波ベクトルのセットが図８の副ローブによって表されており、ここではλはλexcitationである。
【０１０１】
上記に関連した処理は、従来の単一レンズ検出を用いるか、又は本発明のＩ2Ｍ形態のデュアルレンズ検出を用いて行われることができるが、従来の単一レンズ検出を用いる場合は先のパラグラフにおける位相の"直接観察可能領域"は図７に概ね表された領域を指し、デュアルレンズ検出を用いる場合は同じ位相は図８に概ね表された領域を指す。上記の定在波開口合成処理を用いてアクセスすることができるフーリエ空間の対応領域は、単一レンズ及びデュアルレンズ構成の場合で図３９及び図４０にそれぞれ中の白いアウトラインによってグラフで表されている。図３９にはｋYｋZ平面の近くにディスク型領域があることに注意されたい。これはｋY軸に沿った斜線領域によってグラフで表されており、顕微鏡が同じ対物レンズを介して両方のレーザビームを送ることができない限り従来の形態で上記の定在波開口合成処理によりアクセスすることはできない。図４０に表されたように、本発明はそのようなことができなくてもこの領域にアクセスする。
【０１０２】
本発明のＩ2Ｍ形態を組み合わせて用いることには更に２つの利点がある。第一に、フーリエ空間のアクセス可能領域を適度にカバーするために必要な画像スタックは少なくて済む（異なる定在波ベクトルｋst.waveが少なくて済む）。第二に、図４０のブラック領域が図３９の対応する領域よりもｋZ方向に長いことから分かるように、Ｚ分解能が増大する。事実、図４０のアクセス可能領域は半径１／λexcitation＋１／λemissionの球面のほぼ全体であり、この球面はあらゆる遠視野光学手段によってアクセスすることができる全ての空間情報を表す。
【０１０３】
本発明のＩ5Ｍ形態の１つと同じように、全体をカバーするために必要な画像スタックが更に少なくて済むように、上記の定在波／開口合成処理において更に大きい伝達関数を有することができる。この技術（以下４−ビーム定在波顕微鏡法と称する）は、対物レンズの後側焦平面への平面共役において、セットアップにおいて拡張された光源のために、２つの相互コヒーレント点光源の入替えを含む、或いは図４〜図６及び図２９に表されたＩ5Ｍ形態に使用されるものと同じである。これらの相互コヒーレント点光源は、例えば焦点合わせされたレーザビーム又は単一モードの光学ファイバ出力であって、これらの両方の場合単一レーザによって供給される。ビームスプリッタが在るので、標本における結果的な照明は４つのコヒーレント平面波からなる。これらの波は干渉してＺ方向及び横（Ｘ Ｙ）方向の両方の構造を有する強度フィールドを形成する。Ｉ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態に関して先に述べたように、Ｚ構造は標本の基準枠内に固定されているのでＺ方向の光伝達関数を単純に延長させる。横方向の構造は、以下に説明するように、上記の開口合成処理が概して直接適用されることができるように光の強度の正弦波変調から全て成る。
【０１０４】
図４１は４ビーム定在波顕微鏡法技術のためのフーリエ空間における光振幅分布をグラフで表している。この２つの点光源は、図４１の右側の２つのドットで表されたようにそれぞれ”左側の”対物レンズを通して１つの各平面波を入射させる。ビームスプリッタがあるので、２つの点光源もまた図４１の左側のドットで表わしたように右側の対物レンズを通してミラー画像ビームを入射させる。図４２は図４１の自己相関からの結果的な強度フィールドを表す。この強度フィールドは、図４１に表された４つのポイントの間の可能な異なる１２個のベクトル全て、及び原点のポイントの計１３ポイントに相当する。この原点はあらゆるポイント自体の異なるベクトルと考えられる。図４２に表された強度フィールドは複雑なように見えるかもしれないが、１３ポイント全てはｋZ軸上に存在する、又はｋZ軸に平行な２つのライン上に対称に存在することに注意されたい。これは光の強度が、ＸＹ平面において均一である１つの成分と、横方向に正弦波変調された（且つ異なるＺ構造を有する）１つの成分との合計であることを意味する。このため、先に述べたような情報分離及び開口合成処理を用いて処理することが尚可能である。しかし変調された成分及び中央情報成分のための光伝達関数がもはや同じではないので、変調は僅かである。
【０１０５】
非同一光伝達関数によるミラー修正さえ必要でない特別なケースがある。これは２つの点光源が完全に対称に配置された（横平面において互いに正反対に配置された）場合に生じる。この場合、図４２のポイントの幾つかは一致し、図４３及び図４４によって表されたように３つの同じ列になる。これは同じ”中央”及び”変調”伝達関数を生成する。
【０１０６】
４ビーム定在波顕微鏡法技術のための有効な光伝達関数は、後側焦平面における２つの光源の特定の配置に依存する。図４５〜図４７及び図４８〜図５０は２つの例を表している。図４５にグラフで表わされているのは、開口のエッジ上の正反対のポイントに配置された２つの相互コヒーレント光源のための照明振幅のためのサポート領域である。図４６は図４５に対応する照度のサポート領域であり、図４７は結果的な光伝達関数を表す。中央伝達関数は黒で表されており、変調によって得られる標本情報の追加領域は影を付けた領域で表されている。図４８は２つの相互コヒーレント光源の照明振幅のサポート領域を表しており、ここで１つの光源は開口部の中央に配置され、もう一方の光源は開口部のエッジに配置されている。図４９は図４５に対応する照度のサポート領域を表し、図５０は結果的な光伝達関数を表す。中央伝達関数は黒で表され、変調によって入手できる標本情報の領域は影の部分で表されている。明らかに、図４７及び／又は図５０に対応するタイプの非常に少ないデータスタックのみが、フーリエ空間のアクセス可能領域の大半をカバーするのに必要とされる。
【０１０７】
先に述べた開口合成技術の全てにおいて、未知であろう様々な定在波の絶対位相を決定する必要があるかもしれない。これらの位相は図４０に全体的に表されたような情報成分がオーバーラップする領域にある異なる情報成分を、ゼロ−位相”中央”成分から連続的に比較することによって推定される。
【０１０８】
４ビーム定在波顕微鏡法技術への代替法として、励起光パス、画像平面への平面共役においてマスクを使用して標本照明に横方向の構造を生成することができる。これにより、上記の方法のうち１つの方法に似たコヒーレント光源を必要としない開口合成方法を使用することが可能となるであろう。これは高額であり且つ使用可能な波長の選択が制限されているために限定される。
【０１０９】
本発明のＩ2Ｍ形態、Ｉ3Ｍ形態及びＩ5Ｍ形態のあらゆる組合せ、及び本明細書中に記載された横方向の分解能強化のための方法が、同じ標本に連続的に使用されることができる。従って、最終的な情報がコンピュータによって結合されて単一構造にされてもよい。例えば、Ｉ5Ｍ形態を用いた顕微鏡法から得たデータを本発明の上記の定在波応用から得たデータと組み合わせたい場合もあるだろう。
【０１１０】
従って、本発明は広視野顕微鏡法でこれまで得られたものより深度の大きい、即ちＺ方向の分解能が大きい３次元光学顕微鏡法のための方法及び装置を提供することが分かるであろう。上の記述は多くの特定を含むが、これらは限定的なものではなく、本発明の好適な実施の形態の幾つかを単に例示したものである。従って、本発明の範囲は請求の範囲及びその法的同等物によって決定されるべきものとする。
【符号の説明】
【０１１１】
７０   第一対物レンズ
７２   第二対物レンズ
８４  光学ファイバ
１０８ ビームパス
１１４ 光路
１２６  レンズ
１２８ 画像検出手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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