(57)【要約】【課題】グリセロール、特にバイオディーゼル廃液から有用物質を生成すること。【解決手段】本発明は、グリセロールからピルビン酸を生成する方法を提供し、この方法では、特定のピルビン酸産生細菌をグリセロール含有培地中で培養するか、あるいは該細菌の菌体、菌体処理物、若しくはそれらの固定化物を、グリセロールに接触させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルスロバクタ（Arthrobacter）属、バチラス（Bacillus）属、マイクロバクテリウム（Microbacterium）属、ラオウルテラ（Raoultella）属、アクロモバクタ（Archromobacter）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、カートバクテリウム（Curtobacterium）属、デボシア（Devosia）属、イクジグオバクテリウム（Exiguobacterium）属、フラテウリア（Frateuria）属、ハフニア（Hafnia）属、メソリゾビウム（Mesorhizobium）属、ノカルディオイデス（Nocardioides）属、パエニバチラス（Paenibacillus）属、プロテウス（Proteus）属、サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）属、スピリロスポラ（Spirillospora）属およびストレプトマイセス（Streptomyces）属からなる細菌属群から選ばれる細菌属に属し、グリセロールからピルビン酸を生産する能力を有する細菌を、グリセロール含有培地中で培養するか、またはグリセロールにその菌体、菌体処理物、もしくはそれらの固定化物を接触させることを特徴とする、グリセロールからピルビン酸を製造する方法。
【請求項２】
アルスロバクタ属、バチラス属、マイクロバクテリウム属、ラオウルテラ属、アクロモバクタ属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、カートバクテリウム属、デボシア属、イクジグオバクテリウム属、フラテウリア属、ハフニア属、メソリゾビウム属、ノカルディオイデス属、パエニバチラス属、プロテウス属、サッカロポリスポラ属、スピリロスポラ属およびストレプトマイセス属からなる細菌属群から選ばれる細菌属に属する細菌が、アルスロバクタ・オウレセンス（Arthrobacter aurescens）、アルスロバクタ・シツレウス（Arthrobacter citreus）、アルスロバクタ・ヒスティディノロボランス（Arthrobacter histidinolovorans）、アルスロバクタ・ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）、アルスロバクタ・プロトフォルミアエ（Arthrobacter protophormiae）、アルスロバクタ・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）、アルスロバクタ・パセンス（Arthrobacter pascens）、アルスロバクタ・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、バチラス・バディウス（Bacillus badius）、バチラス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）、バチラス・リチェニフォーミス（Bacillus licheniformis）、バチラス・セレウス・バー・ジュロイ（Bacillus cereus var. juroi）、マイクロバクテリウム・バルケリ（Microbacterium barkeri）、マイクロバクテリウム・テスタセウム（Microbacterium testaceum）、マイクロバクテリウム・リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）、マイクロバクテリウム・エステラロマティカム（Microbacterium esteraromaticum）、ラオウルテラ・プランティコラ（Raoultella planticola）、ラオウルテラ・テリゲナ（Raoultella terrigena）、アクロモバクタ・デニトリフィカンス（Archromobacter denitrificans）、アクロモバクタ・リティカス（Achromobacter lyticus）、ブレビバクテリウム・ブタニカム（Brevibacterium butanicum）、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム（Brevibacterium ketoglutamicum）、ブレビバクテリウム・フスカム（Brevibacterium fuscum）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、カートバクテリウム・アルビダム（Curtobacterium albidum）、カートバクテリウム・ルテウム（Curtobacterium luteum）、カートバクテリウム・シトレウム（Curtobacterium citreum）、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina）、イクジグオバクテリウム・アセティリカム（Exiguobacterium acetylicum）、フラテウリア・オウランティア（Frateuria aurantia）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、ノカルディオイデス・シンプレックス（Nocardioides simplex）、パエニバチラス・バリダス（Paenibacillus validus）、パエニバチラス・ポリミキシア（Paenibacillus polymyxa）、パエニバチラス・マセランス（Paenibacillus macerans）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Saccharopolyspora erythraea）、スピリロスポラ・アルビダ（Spirillospora albida）、ストレプトマイセス・パルバラス（Streptomyces parvulus）、ストレプトマイセス・バージニアエ（Streptomyces virginiae）、ストレプトマイセス・ギャリラエウス（Streptomyces galilaeus）、ストレプトマイセス・カヌス（Streptomyces canus）、ストレプトマイセス・フラディアエ（Streptomyces fradiae）、ストレプトマイセス・アルボフラバス（Streptomyces alboflavus）、ストレプトマイセス・アルボビナセウス（Streptomyces albovinaceus）、ストレ��トマイセス・セルロサエ（Streptomyces cellulosae）、ストレプトマイセス・フマナス（Streptomyces fumanus）またはストレプトマイセス・ロンギスポロラバ（Streptomyces longispororuber）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アルスロバクタ属、バチラス属、マイクロバクテリウム属、ラオウルテラ属、アクロモバクタ属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、カートバクテリウム属、デボシア属、イクジグオバクテリウム属、フラテウリア属、ハフニア属、メソリゾビウム属、ノカルディオイデス属、パエニバチラス属、プロテウス属、サッカロポリスポラ属、スピリロスポラ属およびストレプトマイセス属からなる細菌属群から選ばれる細菌属に属する細菌が、アルスロバクタ・オウレセンス NBRC 12136株、アルスロバクタ・シツレウス NBRC 12957株、アルスロバクタ・ヒスティディノロボランス JCM 2520株、アルスロバクタ・ニコチアナエ JCM 1333株、アルスロバクタ・プロトフォルミアエ JCM 1973株、アルスロバクタ・グロビフォルミス ATCC 4336株、アルスロバクタ・パセンス ATCC 13346株、アルスロバクタ・パラフィネウス ATCC 21003株、バチラス・バディウス ATCC 14574株、バチラス・スファエリカス NBRC 3341株、バチラス・リチェニフォーミス NBRC 12197株、バチラス・セレウス・バー・ジュロイ ATCC 21182株、マイクロバクテリウム・バルケリ JCM 1343株、マイクロバクテリウム・テスタセウム JCM 1353株、マイクロバクテリウム・リクエファシエンス JCM 3879株、マイクロバクテリウム・エステラロマティカム NBRC 3751株、ラオウルテラ・プランティコラ JCM 7251株、ラオウルテラ・テリゲナJCM 1687株、アクロモバクタ・デニトリフィカンス NBRC 12669株、アクロモバクタ・リティカスATCC 21456株、ブレビバクテリウム・ブタニカム ATCC 21196株、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム ATCC 21004株、ブレビバクテリウム・フスカム JCM 1488株、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC 14020株、カートバクテリウム・アルビダム JCM 1344株、カートバクテリウム・ルテウム JCM 1480株、カートバクテリウム・シトレウム JCM 1345株、デボシア・リボフラビナ NBRC 13584株、イクジグオバクテリウム・アセティリカム JCM 1968株、フラテウリア・オウランティア NBRC 3247株、ハフニア・アルベイ NBRC 3731株、メソリゾビウム・ロティ NBRC 13336株、ノカルディオイデス・シンプレックス NBRC 12069株、パエニバチラス・バリダス NBRC 13635株、パエニバチラス・ポリミキシア NBRC 3020株、パエニバチラス・マセランス JCM 2500株、プロテウス・ブルガリス NBRC 3851株、サッカロポリスポラ・エリスラエア NBRC 13426株、スピリロスポラ・アルビダ  NBRC 12248株、ストレプトマイセス・パルバラス NBRC 13193株、ストレプトマイセス・バージニアエ NBRC 12827株、ストレプトマイセス・ギャリラエウス ATCC 31133株、ストレプトマイセス・カヌス ATCC 12646株、ストレプトマイセス・フラディアエ ATCC 10745株、ストレプトマイセス・アルボフラバス NBRC 13196株、ストレプトマイセス・アルボビナセウス NBRC 12739株、ストレプトマイセス・セルロサエ NBRC 3713株、ストレプトマイセス・フマナス NBRC 13042株またはストレプトマイセス・ロンギスポロラバ NBRC 13488株である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
シュードモナス・アゾトフォーマンス（Pseudomonas azotoformans）、シュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）、シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）、シュードモナス・フラジ（Pseudomonas fragi）、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）、シュードモナス・タエツロレンス（Pseudomonas taetrolens）およびノカルディア・ユニフォーミス（Nocardia uniformis）からなる細菌種群から選ばれる細菌種に属し、グリセロールからピルビン酸を生産する能力を有する細菌を、グリセロール含有培地中で培養するか、またはグリセロールにその菌体、菌体処理物、もしくはそれらの固定化物を接触させることを特徴とする、グリセロールからピルビン酸を製造する方法。
【請求項５】
シュードモナス・アゾトフォーマンス、シュードモナス・オリジハビタンス、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・フラジ、シュードモナス・クロロラフィス、シュードモナス・タエツロレンスおよびノカルディア・ユニフォーミスからなる細菌種群から選ばれる細菌種に属する細菌が、シュードモナス・アゾトフォーマンス JCM 2777株、シュードモナス・オリジハビタンス JCM 2952株、シュードモナス・シンキサンタ NBRC 3913株、シュードモナス・フラジ JCM 20552株、シュードモナス・クロロラフィス NBRC 3904株、シュードモナス・タエツロレンス NBRC 3460株またはノカルディア・ユニフォーミス NBRC 13702株である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
エッシェリチア・コライ（Escherichia coli） NBRC 12734株を、グリセロール含有培地中で培養するか、またはグリセロールにその菌体、菌体処理物、もしくはそれらの固定化物を接触させることを特徴とする、グリセロールからピルビン酸を製造する方法。
【請求項７】
シトロバクタ（Citrobacter）属に属し、グリセロールからピルビン酸を生産する能力を有する細菌を、グリセロール含有培地中、好気的条件下で培養するか、またはグリセロールにその菌体、菌体処理物、もしくはそれらの固定化物を接触させることを特徴とする、グリセロールからピルビン酸を製造する方法。
【請求項８】
シトロバクタ属に属する細菌がシトロバクタ・フレウンディ（Citrobacter freundii）である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
シトロバクタ・フレウンディがシトロバクタ・フレウンディ JCM 1657株である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
培養が好気的条件下で行われる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
培養物からピルビン酸を回収する工程を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
グリセロールがバイオディーゼル廃液由来である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いてグリセロールからピルビン酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオディーゼル燃料(Bio Diesel Fuel (BDF))は、カーボンニュートラルな軽油代替燃料であり、エネルギー資源枯渇、地球温暖化、大気汚染などの環境問題の解決に貢献する燃料として近年注目を集めている。
【０００３】
バイオディーゼル燃料は、植物性油、動物性油、廃油などから製造されるが、その際、グリセロールを含有する廃液が副生成物として生じる。この廃液には特に有効な活用法がなく、廃棄されているのが現状である。
【０００４】
バイオディーゼル廃液を有効利用する方法として、特許文献１には、エンテロバクタ（Enterobactor）属に属する細菌を用いて、廃液中のグリセロールから水素及びエタノールを生成する方法が記載されている。
【０００５】
有機酸の生成について、特許文献２には、好気性細菌（特にコリネ型細菌）を用いてグルコースを炭素源として使用した有機酸を生成する方法が記載されている。また、特許文献３には、ブドウ糖から各種有機酸を生成する細菌株(マンヘイミア・スピーシス（Mannheimia sp）. 55E)が記載されている。
【０００６】
しかし、アルスロバクタ（Arthrobacter）属、バチラス（Bacillus）属、マイクロバクテリウム（Microbacterium）属、ラオウルテラ（Raoultella）属、アクロモバクタ（Archromobacter）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、カートバクテリウム（Curtobacterium）属、デボシア（Devosia）属、イクジグオバクテリウム（Exiguobacterium）属、フラテウリア（Frateuria）属、ハフニア（Hafnia）属、メソリゾビウム（Mesorhizobium）属、ノカルディオイデス（Nocardioides）属、パエニバチラス（Paenibacillus）属、プロテウス（Proteus）属、サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）属、スピリロスポラ（Spirillospora）属およびストレプトマイセス（Streptomyces）属からなる細菌属群から選ばれる細菌属に属する細菌ならびにシトロバクタ（Citrobacter）属に属する細菌、またはシュードモナス・アゾトフォーマンス（Pseudomonas azotoformans）、シュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）、シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）、シュードモナス・フラジ（Pseudomonas fragi）、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）、シュードモナス・タエツロレンス（Pseudomonas taetrolens）およびノカルディア・ユニフォーミス（Nocardia uniformis）からなる細菌種群から選ばれる細菌種に属する細菌、さらにはエッシェリチア・コライ（Escherichia coli） NBRC 12734株がグリセロールからピルビン酸を生成し得ることは、これまで知られていない。
【０００７】
シトロバクタ・フレウンディ（Citrobacter freundii）は、グリセロールから１，３−プロパンジオールなどを生成することが知られているが、ピルビン酸の生成は示唆されていない（特許文献４、非特許文献１、２及び３を参照）。シトロバクタ・フレウンディは、動物の腸内などに存在するグラム陰性の通性嫌気性桿菌である。特に、非特許文献３には、シトロバクタ・フレウンディを嫌気的条件下でグリセロールと共に培養した場合、１，３−プロパンジオール、エタノール、酢酸などが生成されることが記載されているが、ピルビン酸の生成は示唆されていない。
【特許文献１】特開２００６−１８０７８２号公報
【特許文献２】特開２００３−２３５５９２号公報
【特許文献３】特表２００４−５０１６３４号公報
【特許文献４】欧州特許出願公開０  ３６１  ０８２  Ａ２
【非特許文献１】Ke-Ke Cheng et al., Biotechnology Letters (2004)26: 911-915
【非特許文献２】F. Barbirato et al., Appl Microbiol Biotechnol (1995) 43: 786-793
【非特許文献３】T. Homann et al., Appl Microbiol Biotechnol (1990) 33: 121-126
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
資源の有効活用のため、バイオディーゼル廃液から有用物質を生成することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、アルスロバクタ（Arthrobacter）属、バチラス（Bacillus）属、マイクロバクテリウム（Microbacterium）属、ラオウルテラ（Raoultella）属、アクロモバクタ（Archromobacter）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、カートバクテリウム（Curtobacterium）属、デボシア（Devosia）属、イクジグオバクテリウム（Exiguobacterium）属、フラテウリア（Frateuria）属、ハフニア（Hafnia）属、メソリゾビウム（Mesorhizobium）属、ノカルディオイデス（Nocardioides）属、パエニバチラス（Paenibacillus）属、プロテウス（Proteus）属、サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）属、スピリロスポラ（Spirillospora）属およびストレプトマイセス（Streptomyces）属からなる細菌属群から選ばれる細菌属に属する細菌ならびにシトロバクタ（Citrobacter）属に属する細菌、またはシュードモナス・アゾトフォーマンス（Pseudomonas azotoformans）、シュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）、シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）、シュードモナス・フラジ（Pseudomonas fragi）、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）、シュードモナス・タエツロレンス（Pseudomonas taetrolens）およびノカルディア・ユニフォーミス（Nocardia uniformis）からなる細菌種群から選ばれる細菌種に属する細菌、さらにはエッシェリチア・コライ（Escherichia coli） NBRC 12734株（以下、本発明で用いるピルビン酸産生細菌、または単にピルビン酸産生細菌と記す）を、グリセロール含有培地で培養（シトロバクタ属に属する細菌については好気的条件下で）、特に好気的条件下で培養するか、またはグリセロールにその菌体、菌体処理物、もしくはそれらの固定化物を接触させることにより、グリセロールからピルビン酸を簡便に製造し得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下を提供し得る：
［１］  アルスロバクタ（Arthrobacter）属、バチラス（Bacillus）属、マイクロバクテリウム（Microbacterium）属、ラオウルテラ（Raoultella）属、アクロモバクタ（Archromobacter）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、カートバクテリウム（Curtobacterium）属、デボシア（Devosia）属、イクジグオバクテリウム（Exiguobacterium）属、フラテウリア（Frateuria）属、ハフニア（Hafnia）属、メソリゾビウム（Mesorhizobium）属、ノカルディオイデス（Nocardioides）属、パエニバチラス（Paenibacillus）属、プロテウス（Proteus）属、サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）属、スピリロスポラ（Spirillospora）属およびストレプトマイセス（Streptomyces）属からなる細菌属群から選ばれる細菌属に属し、グリセロールからピルビン酸を生産する能力を有する細菌を、グリセロール含有培地中で培養するか、またはグリセロールにその菌体、菌体処理物、もしくはそれらの固定化物を接触させることを特徴とする、グリセロールからピルビン酸を製造する方法；
［２］  アルスロバクタ属、バチラス属、マイクロバクテリウム属、ラオウルテラ属、アクロモバクタ属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、カートバクテリウム属、デボシア属、イクジグオバクテリウム属、フラテウリア属、ハフニア属、メソリゾビウム属、ノカルディオイデス属、パエニバチラス属、プロテウス属、サッカロポリスポラ属、スピリロスポラ属およびストレプトマイセス属からなる細菌属群から選ばれる細菌属に属する細菌が、アルスロバクタ・オウレセンス（Arthrobacter aurescens）、アルスロバクタ・シツレウス（Arthrobacter citreus）、アルスロバクタ・ヒスティディノロボランス（Arthrobacter histidinolovorans）、アルスロバクタ・ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）、アルスロバクタ・プロトフォルミアエ（Arthrobacter protophormiae）、アルスロバクタ・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）、アルスロバクタ・パセンス（Arthrobacter pascens）、アルスロバクタ・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、バチラス・バディウス（Bacillus badius）、バチラス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）、バチラス・リチェニフォーミス（Bacillus licheniformis）、バチラス・セレウス・バー・ジュロイ（Bacillus cereus var. juroi）、マイクロバクテリウム・バルケリ（Microbacterium barkeri）、マイクロバクテリウム・テスタセウム（Microbacterium testaceum）、マイクロバクテリウム・リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）、マイクロバクテリウム・エステラロマティカム（Microbacterium esteraromaticum）、ラオウルテラ・プランティコラ（Raoultella planticola）、ラオウルテラ・テリゲナ（Raoultella terrigena）、アクロモバクタ・デニトリフィカンス（Archromobacter denitrificans）、アクロモバクタ・リティカス（Achromobacter lyticus）、ブレビバクテリウム・ブタニカム（Brevibacterium butanicum）、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム（Brevibacterium ketoglutamicum）、ブレビバクテリウム・フスカム（Brevibacterium fuscum）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、カートバクテリウム・アルビダム（Curtobacterium albidum）、カートバクテリウム・ルテウム（Curtobacterium luteum）、カートバクテリウム・シトレウム（Curtobacterium citreum）、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina）、イクジグオバクテリウム・アセティリカム（Exiguobacterium acetylicum）、フラテウリア・オウランティア（Frateuria aurantia）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、ノカルディオイデス・シンプレックス（Nocardioides simplex）、パエニバチラス・バリダス（Paenibacillus validus）、パエニバチラス・ポリミキシア（Paenibacillus polymyxa）、パエニバチラス・マセランス（Paenibacillus macerans）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Saccharopolyspora erythraea）、スピリロスポラ・アルビダ（Spirillospora albida）、ストレプトマイセス・パルバラス（Streptomyces parvulus）、ストレプトマイセス・バージニアエ（Streptomyces virginiae）、ストレプトマイセス・ギャリラエウス（Streptomyces galilaeus）、ストレプトマイセス・カヌス（Streptomyces canus）、ストレプトマイセス・フラディアエ（Streptomyces fradiae）、ストレプトマイセス・アルボフラバス（Streptomyces alboflavus）、ストレプトマイセス・アルボビナセウス（Streptomyces albovinaceus）、ストレプトマイセス・セルロサエ（Streptomyces cellulosae）、ストレプトマイセス・フマナス（Streptomyces fumanus）またはストレプトマイセス・ロンギスポロラバ（Streptomyces longispororuber）である、上記［１］記載の方法；
［３］  アルスロバクタ属、バチラス属、マイクロバクテリウム属、ラオウルテラ属、アクロモバクタ属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、カートバクテリウム属、デボシア属、イクジグオバクテリウム属、フラテウリア属、ハフニア属、メソリゾビウム属、ノカルディオイデス属、パエニバチラス属、プロテウス属、サッカロポリスポラ属、スピリロスポラ属およびストレプトマイセス属からなる細菌属群から選ばれる細菌属に属する細菌が、アルスロバクタ・オウレセンス NBRC 12136株、アルスロバクタ・シツレウス NBRC 12957株、アルスロバクタ・ヒスティディノロボランス JCM 2520株、アルスロバクタ・ニコチアナエ JCM 1333株、アルスロバクタ・プロトフォルミアエ JCM 1973株、アルスロバクタ・グロビフォルミス ATCC 4336株、アルスロバクタ・パセンス ATCC 13346株、アルスロバクタ・パラフィネウス ATCC 21003株、バチラス・バディウス ATCC 14574株、バチラス・スファエリカス NBRC 3341株、バチラス・リチェニフォーミス NBRC 12197株、バチラス・セレウス・バー・ジュロイ ATCC 21182株、マイクロバクテリウム・バルケリ JCM 1343株、マイクロバクテリウム・テスタセウム JCM 1353株、マイクロバクテリウム・リクエファシエンス JCM 3879株、マイクロバクテリウム・エステラロマティカム NBRC 3751株、ラオウルテラ・プランティコラ JCM 7251株、ラオウルテラ・テリゲナJCM 1687株、アクロモバクタ・デニトリフィカンス NBRC 12669株、アクロモバクタ・リティカスATCC 21456株、ブレビバクテリウム・ブタニカム ATCC 21196株、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム ATCC 21004株、ブレビバクテリウム・フスカム JCM 1488株、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC 14020株、カートバクテリウム・アルビダム JCM 1344株、カートバクテリウム・ルテウム JCM 1480株、カートバクテリウム・シトレウム JCM 1345株、デボシア・リボフラビナ NBRC 13584株、イクジグオバクテリウム・アセティリカム JCM 1968株、フラテウリア・オウランティア NBRC 3247株、ハフニア・アルベイ NBRC 3731株、メソリゾビウム・ロティ NBRC 13336株、ノカルディオイデス・シンプレックス NBRC 12069株、パエニバチラス・バリダス NBRC 13635株、パエニバチラス・ポリミキシア NBRC 3020株、パエニバチラス・マセランス JCM 2500株、プロテウス・ブルガリス NBRC 3851株、サッカロポリスポラ・エリスラエア NBRC 13426株、スピリロスポラ・アルビダ  NBRC 12248株、ストレプトマイセス・パルバラス NBRC 13193株、ストレプトマイセス・バージニアエ NBRC 12827株、ストレプトマイセス・ギャリラエウス ATCC 31133株、ストレプトマイセス・カヌス ATCC 12646株、ストレプトマイセス・フラディアエ ATCC 10745株、ストレプトマイセス・アルボフラバス NBRC 13196株、ストレプトマイセス・アルボビナセウス NBRC 12739株、ストレプトマイセス・セルロサエ NBRC 3713株、ストレプトマイセス・フマナス NBRC 13042株またはストレプトマイセス・ロンギスポロラバ NBRC 13488株である、上記［２］記載の方法；
［４］  シュードモナス・アゾトフォーマンス（Pseudomonas azotoformans）、シュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）、シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）、シュードモナス・フラジ（Pseudomonas fragi）、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）、シュードモナス・タエツロレンス（Pseudomonas taetrolens）およびノカルディア・ユニフォーミス（Nocardia uniformis）からなる細菌種群から選ばれる細菌種に属し、グリセロールからピルビン酸を生産する能力を有する細菌を、グリセロール含有培地中で培養するか、またはグリセロールにその菌体、菌体処理物、もしくはそれらの固定化物を接触させることを特徴とする、グリセロールからピルビン酸を製造する方法；
［５］  シュードモナス・アゾトフォーマンス、シュードモナス・オリジハビタンス、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・フラジ、シュードモナス・クロロラフィス、シュードモナス・タエツロレンスおよびノカルディア・ユニフォーミスからなる細菌種群から選ばれる細菌種に属する細菌が、シュードモナス・アゾトフォーマンス JCM 2777株、シュードモナス・オリジハビタンス JCM 2952株、シュードモナス・シンキサンタ NBRC 3913株、シュードモナス・フラジ JCM 20552株、シュードモナス・クロロラフィス NBRC 3904株、シュードモナス・タエツロレンス NBRC 3460株またはノカルディア・ユニフォーミス NBRC 13702株である、上記［４］記載の方法；
［６］  エッシェリチア・コライ（Escherichia coli） NBRC 12734株を、グリセロール含有培地中で培養するか、またはグリセロールにその菌体、菌体処理物、もしくはそれらの固定化物を接触させることを特徴とする、グリセロールからピルビン酸を製造する方法；
［７］  シトロバクタ（Citrobacter）属に属し、グリセロールからピルビン酸を生産する能力を有する細菌を、グリセロール含有培地中、好気的条件下で培養するか、またはグリセロールにその菌体、菌体処理物、もしくはそれらの固定化物を接触させることを特徴とする、グリセロールからピルビン酸を製造する方法；
［８］  シトロバクタ属に属する細菌がシトロバクタ・フレウンディ（Citrobacter freundii）である、請求項７記載の方法；
［９］  シトロバクタ・フレウンディがシトロバクタ・フレウンディ JCM 1657株である、請求項８記載の方法；
［１０］  培養が好気的条件下で行われる、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法；
［１１］  培養物からピルビン酸を回収する工程を含む、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法；
［１２］  グリセロールがバイオディーゼル廃液由来である、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、微生物を用いてグリセロール（バイオディーゼル廃液）からピルビン酸を簡便に製造することができる。ピルビン酸は反応性が高いため、医薬、農薬等の合成などにおいて重要な中間体として使用されている。このように、本発明は、これまで廃棄されていたバイオディーゼル廃液中のグリセロールから、有用物質を生成する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明で用いるピルビン酸産生細菌としては、具体的には、前記[１]〜[９]において記載した細菌属、細菌種および細菌株が例示される。それらのうち、シトロバクタ属に属する細菌は、グリセロールを資化してピルビン酸を生成し得る限り特に制限されず、例えば、シトロバクタ・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）、シトロバクタ・ブラアキィ（Citrobacter braakii）、シトロバクタ・ファーメリ（Citrobacter farmeri）、シトロバクタ・フレウンディ、シトロバクタ・コセリ（Citrobacter koseri）、シトロバクタ・ロデンティウム（Citrobacter rodentium）、シトロバクタ・セドラキィ（Citrobacter sedlakii）、シトロバクタ・ワークマニィ（Citrobacter werkmanii）、シトロバクタ・ヤンガエ（Citrobacter youngae）等が挙げられる。好ましくはシトロバクタ・フレウンディである。シトロバクタ・フレウンディの好ましい例としては、シトロバクタ・フレウンディJCM 1657株が挙げられるがこれに限定されない。
これらのピルビン酸産生細菌のうちでもグリセロールからピルビン酸を良好な収量で生成し得る細菌が好ましく、このような細菌としては、例えば、アルスロバクタ・オウレセンス NBRC 12136株、アルスロバクタ・ヒスティディノロボランス JCM 2520株、アルスロバクタ・プロトフォルミアエ JCM 1973株、バチラス・スファエリカス NBRC 3341株、アルスロバクタ・グロビフォルミス ATCC 4336株、アルスロバクタ・パセンス ATCC 13346株、アルスロバクタ・パラフィネウス ATCC 21003株、バチラス・バディウス ATCC 14574株、バチラス・リチェニフォーミス NBRC 12197株、バチラス・セレウス・バー・ジュロイ ATCC 21182株、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC 14020株、カートバクテリウム・アルビダム JCM 1344株、カートバクテリウム・ルテウム JCM 1480株、カートバクテリウム・シトレウム JCM 1345株、デボシア・リボフラビナ NBRC 13584株、メソリゾビウム・ロティ NBRC 13336株、マイクロバクテリウム・バルケリ JCM 1343株、マイクロバクテリウム・リクエファシエンス JCM 3879株、マイクロバクテリウム・エステラロマティカム NBRC 3751株、パエニバチラス・バリダス NBRC 13635株、パエニバチラス・ポリミキシア NBRC 3020株、パエニバチラス・マセランス JCM 2500株、プロテウス・ブルガリス NBRC 3851株、ラオウルテラ・プランティコラ JCM 7251株、ラオウルテラ・テリゲナJCM 1687株、シュードモナス・アゾトフォーマンス JCM 2777株、シュードモナス・シンキサンタ NBRC 3913株、シュードモナス・フラジ JCM 20552株、シュードモナス・クロロラフィス NBRC 3904株、シュードモナス・タエツロレンス NBRC 3460株、アクロモバクタ・デニトリフィカンス NBRC 12669株、アクロモバクタ・リティカスATCC 21456株、ブレビバクテリウム・ブタニカム ATCC 21196株、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム ATCC 21004株、ブレビバクテリウム・フスカム JCM 1488株、エッシェリチア・コライ NBRC 12734株、シトロバクタ・フレウンディ JCM 1657株、イクジグオバクテリウム・アセティリカム JCM 1968株、フラテウリア・オウランティア NBRC 3247株、ハフニア・アルベイ NBRC 3731株、マイクロバクテリウム・テスタセウム JCM 1353株、ノカルディア・ユニフォーミス NBRC 13702株、ノカルディオイデス・シンプレックス NBRC 12069株、シュードモナス・オリジハビタンス JCM 2952株、アルスロバクタ・ニコチアナエ JCM 1333株、サッカロポリスポラ・エリスラエア NBRC 13426株、スピリロスポラ・アルビダ  NBRC 12248株、ストレプトマイセス・パルバラス NBRC 13193株、ストレプトマイセス・バージニアエ NBRC 12827株、ストレプトマイセス・ギャリラエウス ATCC 31133株、ストレプトマイセス・カヌス ATCC 12646株、ストレプトマイセス・フラディアエ ATCC 10745株、ストレプトマイセス・アルボフラバス NBRC 13196株、ストレプトマイセス・アルボビナセウス NBRC 12739株、ストレプトマイセス・セルロサエ NBRC 3713株、ストレプトマイセス・フマナス NBRC 13042株、ストレプトマイセス・ロンギスポロラバ NBRC 13488株が挙げられるが、これらに限定されない。なかでも、アクロモバクタ・デニトリフィカンス NBRC 12669株、アクロモバクタ・リティカスATCC 21456株、イクジグオバクテリウム・アセティリカム JCM 1968株、フラテウリア・オウランティア NBRC 3247株、マイクロバクテリウム・テスタセウム JCM 1353株、ノカルディア・ユニフォーミス NBRC 13702株、ノ��ルディオイデス・シンプレックス NBRC 12069株、シュードモナス・オリジハビタンス JCM 2952株、アルスロバクタ・ニコチアナエ JCM 1333株、アルスロバクタ・グロビフォルミス ATCC 4336株、ストレプトマイセス・パルバラス NBRC 13193株、ストレプトマイセス・バージニアエ NBRC 12827株、ストレプトマイセス・ギャリラエウス ATCC 31133株、ストレプトマイセス・カヌス ATCC 12646株、ハフニア・アルベイ NBRC 3731株、ストレプトマイセス・フラディアエ ATCC 10745株、ストレプトマイセス・アルボフラバス NBRC 13196株、ストレプトマイセス・アルボビナセウス NBRC 12739株、ストレプトマイセス・セルロサエ NBRC 3713株、ストレプトマイセス・フマナス NBRC 13042株、ストレプトマイセス・ロンギスポロラバ NBRC 13488株、エッシェリチア・コライ NBRC 12734株、シトロバクタ・フレウンディ JCM 1657株がより好ましく、アルスロバクタ・ニコチアナエ JCM 1333株、アルスロバクタ・グロビフォルミス ATCC 4336株、ストレプトマイセス・パルバラス NBRC 13193株、ハフニア・アルベイ NBRC 3731株、ストレプトマイセス・フラディアエ ATCC 10745株、ストレプトマイセス・アルボフラバス NBRC 13196株、ストレプトマイセス・アルボビナセウス NBRC 12739株、ストレプトマイセス・セルロサエ NBRC 3713株、ストレプトマイセス・フマナス NBRC 13042株、ストレプトマイセス・ロンギスポロラバ NBRC 13488株、エッシェリチア・コライ NBRC 12734株、シトロバクタ・フレウンディ JCM 1657株がより一層好ましい。
【００１３】
ここで、「良好な収量」でピルビン酸が生成されるとは、グリセロールからピルビン酸が培養液中約０．１ｇ／Ｌ以上の収量で蓄積されることを意味するが、通常収量は高いほど好ましい。例えば、ピルビン酸は、約０．５ｇ／Ｌ以上、好ましくは約１ｇ／Ｌ以上の収量で、培養液中に蓄積される。
【００１４】
アルスロバクタ・ヒスティディノロボランス JCM 2520株、アルスロバクタ・ニコチアナエ JCM 1333株、アルスロバクタ・プロトフォルミアエ JCM 1973株、マイクロバクテリウム・バルケリ JCM 1343株、マイクロバクテリウム・テスタセウム JCM 1353株、マイクロバクテリウム・リクエファシエンス JCM 3879株、シュードモナス・アゾトフォーマンス JCM 2777株、シュードモナス・オリジハビタンス JCM 2952株、ブレビバクテリウム・フスカム JCM 1488株、シトロバクタ・フレウンディ JCM 1657株、パエニバチラス・マセランス JCM 2500株、ラオウルテラ・プランティコラ JCM 7251株、ラオウルテラ・テリゲナJCM 1687株、カートバクテリウム・アルビダム JCM 1344株、カートバクテリウム・ルテウム JCM 1480株、カートバクテリウム・シトレウム JCM 1345株、イクジグオバクテリウム・アセティリカム JCM 1968株、シュードモナス・フラジ JCM 20552株は独立行政法人理化学研究所  バイオリソースセンター  微生物材料開発室から、アルスロバクタ・オウレセンス NBRC 12136株、アルスロバクタ・シツレウス NBRC 12957株、バチラス・スファエリカス NBRC 3341株、バチラス・リチェニフォーミス NBRC 12197株、シュードモナス・シンキサンタ NBRC 3913株、シュードモナス・クロロラフィス NBRC 3904株、シュードモナス・タエツロレンス NBRC 3460株、アクロモバクタ・デニトリフィカンス NBRC 12669株、デボシア・リボフラビナ NBRC 13584株、フラテウリア・オウランティア NBRC 3247株、ハフニア・アルベイ NBRC 3731株、エッシェリチア・コライ NBRC 12734株、マイクロバクテリウム・エステラロマティカム NBRC 3751株、メソリゾビウム・ロティ NBRC 13336株、ノカルディア・ユニフォーミス NBRC 13702株、ノカルディオイデス・シンプレックス NBRC 12069株、パエニバチラス・バリダス NBRC 13635株、パエニバチラス・ポリミキシア NBRC 3020株、プロテウス・ブルガリス NBRC 3851株、サッカロポリスポラ・エリスラエア NBRC 13426株、スピリロスポラ・アルビダ  NBRC 12248株、ストレプトマイセス・パルバラス NBRC 13193株、ストレプトマイセス・バージニアエ NBRC 12827株、ストレプトマイセス・アルボフラバス NBRC 13196株、ストレプトマイセス・アルボビナセウス NBRC 12739株、ストレプトマイセス・セルロサエ NBRC 3713株、ストレプトマイセス・フマナス NBRC 13042株、ストレプトマイセス・ロンギスポロラバ NBRC 13488株は独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門から、アルスロバクタ・グロビフォルミス ATCC 4336株、アルスロバクタ・パセンス ATCC 13346株、アルスロバクタ・パラフィネウス ATCC 21003株、バチラス・バディウス ATCC 14574株、バチラス・セレウス・バー・ジュロイ ATCC 21182株、ブレビバクテリウム・ブタニカム ATCC 21196株、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム ATCC 21004株、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC 14020株、ストレプトマイセス・ギャリラエウス ATCC 31133株、ストレプトマイセス・カヌス ATCC 12646株、ストレプトマイセス・フラディアエ ATCC 10745株、アクロモバクタ・リティカスATCC 21456株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから、入手可能である。
【００１５】
また、本発明で用いるピルビン酸産生細菌は、それらの野生株だけでなく、任意の自然または人工の突然変異体、例えば、X線照射、紫外線照射、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンなどの化学的変異誘発剤等の処理により得られる変異体、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え体であってよい。尚、上記遺伝子組換え体の宿主としては、形質転換可能な微生物であれば、いずれの細菌属に属するものであっても良いが、対象となる遺伝子が由来する親株と同じ細菌属とするのが好ましい。その場合、ピルビン酸産生細菌として、グリセロールからピルビン酸への変換能が向上されているものを選択することが望ましい。
【００１６】
グリセロール含有培地は、培養培地中に純粋なグリセロールを添加したものであってもよく、グリセロール含有混合物を添加したものであってもよい。グリセロール含有混合物中の他の成分及びそれらの量は、本発明で用いるピルビン酸産生細菌に対して悪影響を及ぼさないものであることが好ましい。グリセロール含有混合物の由来は特に限定されないが、資源の有効利用の観点から、バイオディーゼル廃液等を使用することが好ましい。
【００１７】
バイオディーゼル燃料の製造法の１つは、アルカリ触媒を用いたトリグリセリドのアルコリシスにより、脂肪酸メチルエステル（Fatty Acid Methyl Ester : FAME）を生成させることである。この方法では、副生成物としてグリセロールを含有する廃液（バイオディーゼル廃液と呼ぶ）が発生する。この廃液には、触媒や未変換の脂肪酸（使用する油によって異なる）などが通常混入している。例えば、後述の実施例で用いたバイオディーゼル廃液の組成は、グリセロール：５１％、メタノール：１１％、水酸化カリウム：８％、水：４％、グリセリド等その他：２６％である。これ以外で、S. Papanikolaou et al., Bioresource Technology (2002) 82: 43-49に記載されるグリセロール：６５％、カリウム・ナトリウム塩：４−５％、メタノール：１％、水：２８％や、M. Gonzalez-Pajuelo et al., J IndMicrobiol Biotechnol (2004) 31: 442-446に記載されるグリセロール：６５％、ナトリウム塩：５％以下等の、任意の組成を有するバイオディーゼル廃液も使用することができる。
【００１８】
本発明の方法でバイオディーゼル廃液を培地に添加した場合、純粋なグリセロールを添加した場合と同等またはそれ以上の収量及び変換効率で、ピルビン酸を生成することが可能である。
【００１９】
本発明の方法で使用する培地は、細菌類の培養に通常用いられる成分を含有する培地であればよく、特定の培地に限定されない。本発明の方法では、炭素源、窒素源及び無機塩を含有する、ごく単純な組成の培地を用いても、ピルビン酸を得ることができる。
【００２０】
本発明の方法で用いる培地は、炭素源としてグリセロールを含む。培地中に含まれるグリセロールの濃度は、細菌の生育やピルビン酸産生に悪影響を与えない範囲で適宜選択され得るが、通常、約０．１〜約５００ｇ／Ｌ、好ましくは約１〜約３００ｇ／Ｌである。上記バイオディーゼル廃液をグリセロール源として用いる場合、当該廃液が含有するグリセロールの濃度に応じて、培地中のグリセロールの量が上記範囲になるように、希釈またはグリセロール添加してもよい。
【００２１】
培地は、グリセロール以外の物質を炭素源としてさらに含んでもよいが、他の炭素源は、グリセロールからのピルビン酸の生成を妨げない量で添加されるべきである。本発明で用いられる他の炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、デンプン、ラクトース、アラビノース、キシロース、デキストリン、糖蜜などが挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、他の炭素源は、グリセロールに対して約１０重量％以下、より好ましくは約１重量％以下である。培地は、グリセロールを単一の炭素源として含むことが最も好ましい。
【００２２】
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物ならびに尿素等を用いることができる。必要に応じて、グルテン粉、綿実粉、大豆粉、コーンスティープリカー、乾燥酵母、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、カザミノ酸などの有機窒素源あるいは各種ビタミン類などのさらなる成分を培地に添加して用いてもよいが、本発明の方法では、このような比較的高価な栄養素を含有させなくとも、ピルビン酸を生成することが可能である。
【００２３】
炭素源および窒素源は組み合わせて使用すると有利であるが、痕跡量の生育因子や相当量の無機栄養素を含む低純度の物質もまた、使用に適しているので、それらを純粋な形で使用する必要はない。
【００２４】
所望により、第一リン酸カリウム、第二リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化コバルトなどの無機塩を使用することができる。また、必要な場合、特に培地が著しく発泡する場合には、液状パラフィン、高級アルコール、植物油、鉱物油、シリコーンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００２５】
上記窒素源、無機塩及びさらなる成分は、当業者に公知である。
【００２６】
本発明の方法における各種ピルビン酸産生細菌（シトロバクタ属に属する細菌を除く）の培養は、嫌気的条件下に行ってもよいが、好ましくは好気的条件下で行われる。シトロバクタ属に属する細菌は好気的条件下で培養する。好気的条件とは、分子状酸素の存在下での培養をいう。酸素供給などのために、通気、攪拌、振盪などを行なってもよい。培養に使用する装置としては、微生物の培養に通常使用される各種装置を使用できる。本発明の方法で好気的条件下で培養を実施する場合、嫌気的条件をもたらすのに必要な装置等を使用することなく、簡便に細菌の培養およびピルビン酸生成を行うことができる。
【００２７】
一方、嫌気的条件下で培養する場合は、例えば、炭酸ガス、不活性ガス（窒素、アルゴンなど）を通気するか、あるいは無通気により行うことができる。
【００２８】
ピルビン酸の大量生産の条件としては液体培養が好ましい。大型タンク内で増殖させる場合は、ピルビン酸生成工程における増殖遅延を回避する目的で、増殖期にある菌を使用して生産タンク中に接種することが好ましい。即ち、まず比較的少量の培地に菌を接種して培養することにより増殖期の種菌を製造し、次いで該種菌を無菌的に大型タンクに移すのが望ましい。
【００２９】
培養液の攪拌及び通気は種々の方法で行うことができる。攪拌は、プロペラまたはこれに類似する機械的攪拌装置の使用、ファーメンタの回転または振盪、種々のポンプ装置の使用等により行うことができる。また、通気は、例えば、滅菌エアーを培養液中を通過させることによって行うことができ、この場合、通気操作により攪拌の効果も得ることが可能である。
【００３０】
液体培地で培養する場合、回分培養（batch culture）、流加培養（fed batch culture）、連続培養（continuous culture）などの培養方法を適宜選択して用いることができる。
【００３１】
培養条件は本発明で用いるピルビン酸産生細菌の培養に適したものであればよい。例えば、培養温度は、約４℃〜約４０℃、好ましくは約２０℃〜約３７℃である。培地のｐＨは、約５〜約９、好ましくは約６〜約８である。ピルビン酸の生成に伴い、培地のｐＨが低下する場合があるので、必要に応じて、培養中にアンモニア水、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリを添加して、培地のｐＨをこれらの範囲内に調整する。
【００３２】
上記培地の組成、上記および他の培養条件等は、当業者によって適宜調節可能である。ピルビン酸の収量および／または収率などをさらに向上させるために、これらを調節することも考えられよう。
【００３３】
本発明の方法で用いる細菌は、それぞれ菌体、菌体処理物、またはそれらの固定化物という形で使用しても良い。ここで、菌体処理物とは、菌体破砕物、または培養物（菌体、培養上清を含む）から抽出した酵素などをいう。菌体処理物としては、例えば、培養して得られた菌体を有機溶媒（アセトン、エタノール等）処理したもの、凍結乾燥処理したものもしくはアルカリ処理したもの、または、菌体を物理的もしくは酵素的に破砕したもの、または、これらのものから分離・抽出された粗酵素等を挙げることができる。具体的には、培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、酵素などを精製することができる。
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもできる。菌体の破砕および酵素の抽出は、前記の方法の他に、当業者に公知の方法で行うこともできる。
【００３４】
菌体、菌体処理物、またはそれらの固定化物をグリセロールに接触させる方法の例としては以下が挙げられる。
【００３５】
菌体や菌体処理物を用いてグリセロールからピルビン酸を製造する方法としては、細菌の菌体をグリセロールを含む基質液に懸濁し、反応させる方法を例示することができる。細菌の菌体は、ピルビン酸産生細菌を培養した後、遠心分離等を行なうことにより得ることができる。基質液中のグリセロール濃度は０．０１〜５０重量％程度が好ましい。反応温度は、通常、約４℃〜約４０℃、好ましくは約２０℃〜約３７℃である。反応液のｐＨは、通常、約５〜約９、好ましくは約６〜約８である。ピルビン酸の生成に伴い、培地のｐＨが低下する場合があるので、必要に応じて、培養中にアンモニア水、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリを添加して、培地のｐＨをこれらの範囲内に調整する。
【００３６】
菌体等の固定化物を用いてグリセロールからピルビン酸を製造する方法としては、細菌の菌体等の固定化物をカラムに充填し、グリセロールを含む基質液を流通させる方法を例示することができる。細菌の菌体や菌体処理物は、ピルビン酸産生細菌を培養した後、遠心分離等を行なうことにより得ることができる。菌体等を固定化する方法としては、ゲルにより包括固定化する手段、イオン交換体を担持させて固定化する手段などを例示することができる。使用するゲルとしては、カラギーナンゲル、寒天ゲル、マンナンゲル、PVAゲル、ポリアクリルアミドゲル等を挙げることができる。ゲル球の大きさは、ゲルの種類により異なるが、直径１〜１０ｍｍ程度が適当である。また、イオン交換体としては、例えば、セルロース系、スチレンジビニルベンゼン系、フェノールホルマリン系などのイオン交換体を挙げることができる。基質液中のグリセロール濃度は０．０１〜５０重量％程度が好ましい。また、当該溶液中には、メルカプトエタノール、システイン、グルタチオンなどのSH化合物、亜硫酸塩などの還元剤、マグネシウムイオン、マンガンイオンなどの酵素活性化剤を添加することもできる。流通させる溶液の速度は、カラムの大きさ、固定化物の量により異なるが、溶液を処理する速度の指標である空間速度（ｍｌ／ｍｌ樹脂・ｈｒ）は、０．０５〜１０が適当である。
【００３７】
ピルビン酸の分離および精製は、従来公知の方法に準じて実施され得る。例えば、培養終了後の培養液をろ過または遠心分離により培養上清を得、当該培養上清から、例えば、濃縮晶析などによりピルビン酸を分離することができるが、ピルビン酸の分離および精製方法はそれらに限定されない。具体的には、ピルビン酸は、培養上清から溶媒抽出法により分離するか、イオン交換樹脂に吸着させた後、溶出させ分離するイオン交換クロマトグラフィー法、カルシウムイオン等との金属塩をつくり単離する方法、不溶化処理による分別沈殿法、結晶化による分別結晶法、逆浸透膜による膜分離法及び濃縮晶析法等などの方法により分離、精製される。具体的には、例えば、特開平６−９１に記載の方法に準じてピルビン酸の分離および精製を行なってもよい。
【００３８】
本発明を以下の実施例によって例示するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能であることを理解すべきである。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）
アクロモバクタ・デニトリフィカンス NBRC 12669株を、プレート培養用培地であるＡ寒天培地（組成：第一リン酸カリウム３ｇ、第二リン酸ナトリウム６ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、塩化アンモニウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物４９２ｍｇ、塩化カルシウム・２水和物１４７ｍｇ、酵母エキス１００ｍｇ、グリセロール１０ｇ、寒天２０ｇ及び蒸留水１Ｌ（最終ｐＨ７．４））に塗布し、３０℃、４日間静置した。上記のプレート上で生育した同菌株を、試験管培養用培地であるＢ培地（組成：塩化カルシウム、酵母エキス及び寒天を含まないことを除けば、上記Ａ寒天培地と同一成分組成）３ｍｌに白金耳でもって植菌し、３０℃、２４時間、２００ｒｐｍで振盪培養（前培養）した。このように生育した同菌株培養液３０μｌを、試験管培養用培地であるＣ培地（組成：グリセロール１０ｇの代わりにバイオディーゼル燃料製造時に副生するグリセロール画分（グリセロール：５１％、メタノール：１１％、水酸化カリウム：８％、水：４％、グリセリド等その他：２６％）１９．６ｇを含むことを除けば、上記Ｂ試験管培養用培地と同一成分組成である）３ｍｌへ移し、３０℃、２００ｒｐｍで振盪培養（本培養）した。反応開始後、４日後に１リットル当りグリセロールが３．９ｇ消費され、ピルビン酸が０．３ｇ蓄積した。
【００４０】
（実施例２）
アクロモバクタ・デニトリフィカンス NBRC 12669株を、プレート培養用培地であるＡ寒天培地（組成：第一リン酸カリウム３ｇ、第二リン酸ナトリウム６ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、塩化アンモニウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物４９２ｍｇ、塩化カルシウム・２水和物１４７ｍｇ、酵母エキス１００ｍｇ、グリセロール１０ｇ、寒天２０ｇ及び蒸留水１Ｌ（最終ｐＨ７．４））に塗布し、３０℃、４日間静置した。上記のプレート上で生育した同菌株を、試験管培養用培地であるＤ培地（組成：寒天を含まないことを除けば、上記Ａ寒天培地と同一成分組成）３ｍｌに白金耳でもって植菌し、３０℃、２４時間、２００ｒｐｍで振盪培養（前培養）した。このように生育した同菌株培養液３０μｌを、試験管培養用培地であるＥ培地（組成：グリセロール１０ｇの代わりにバイオディーゼル燃料製造時に副生するグリセロール画分（グリセロール：５１％、メタノール：１１％、水酸化カリウム：８％、水：４％、グリセリド等その他：２６％）１９．６ｇを含むことを除けば、上記Ｅ試験管培養用培地と同一成分組成である）３ｍｌへ移し、３０℃、２００ｒｐｍで振盪培養（本培養）した。反応開始後、４日後に１リットル当りグリセロールが９．４ｇ消費され、ピルビン酸が０．７ｇ蓄積した。
【００４１】
（実施例３）
シュードモナス・アゾトフォーマンスJCM 2777株を、実施例１と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが３．３ｇ消費され、ピルビン酸が０．４ｇ蓄積した。
【００４２】
（実施例４）
シュードモナス・シンキサンタ NBRC 3913株を、実施例１と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが４．５ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００４３】
（実施例５）
ラオウルテラ・テリゲナJCM 1687株を、実施例１と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１．９ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００４４】
（実施例６）
イクジグオバクテリウム・アセティリカム JCM 1968株を、プレート培養用培地であるＡ寒天培地（組成：第一リン酸カリウム３ｇ、第二リン酸ナトリウム６ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、塩化アンモニウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物４９２ｍｇ、塩化カルシウム・２水和物１４７ｍｇ、酵母エキス１００ｍｇ、グリセロール１０ｇ、寒天２０ｇ及び蒸留水１Ｌ（最終ｐＨ７．４））に塗布し、３０℃、４日間静置した。上記のプレート上で生育した同菌株を、試験管培養用培地であるＤ培地（組成：寒天を含まないことを除けば、上記Ａ寒天培地と同一成分組成）３ｍｌに白金耳でもって植菌し、３０℃、６日間、２００ｒｐｍで振盪培養（前培養）した。このように生育した同菌株培養液３０μｌを、試験管培養用培地であるＤ培地３ｍｌへ移し、３０℃、２００ｒｐｍで振盪培養（本培養）した。反応開始後、６日後に１リットル当りグリセロールが１．４ｇ消費され、ピルビン酸が０．５ｇ蓄積した。
【００４５】
（実施例７）
デボシア・リボフラビナNBRC 13584株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが０．９ｇ消費され、ピルビン酸が０．３ｇ蓄積した。
【００４６】
（実施例８）
メソリゾビウム・ロティNBRC 13336株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが０．４ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００４７】
（実施例９）
アルスロバクタ・ニコチアナエ JCM 1333株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが７．１ｇ消費され、ピルビン酸が１．７ｇ蓄積した。
【００４８】
（実施例１０）
アルスロバクタ・シツレウス NBRC 12957株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが２．４ｇ消費され、ピルビン酸が０．３ｇ蓄積した。
【００４９】
（実施例１１）
アルスロバクタ・オウレセンス NBRC 12136株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが２．５ｇ消費され、ピルビン酸が０．２ｇ蓄積した。
【００５０】
（実施例１２）
アルスロバクタ・ヒスティディノロボランス JCM 2520株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが３．８ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００５１】
（実施例１３）
アルスロバクタ・プロトフォルミアエ JCM 1973株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２日間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが３．７ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００５２】
（実施例１４）
ストレプトマイセス・パルバラス NBRC 13193株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが９．４ｇ消費され、ピルビン酸が２．２ｇ蓄積した。
【００５３】
（実施例１５）
フラテウリア・オウランティア NBRC 3247株を、プレート培養用培地であるＡ寒天培地（組成：第一リン酸カリウム３ｇ、第二リン酸ナトリウム６ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、塩化アンモニウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物４９２ｍｇ、塩化カルシウム・２水和物１４７ｍｇ、酵母エキス１００ｍｇ、グリセロール１０ｇ、寒天２０ｇ及び蒸留水１Ｌ（最終ｐＨ７．４））に塗布し、３０℃、４日間静置した。上記のプレート上で生育した同菌株を、試験管培養用培地であるＢ培地（組成：塩化カルシウム、酵母エキス及び寒天を含まないことを除けば、上記Ａ寒天培地と同一成分組成）３ｍｌに白金耳でもって植菌し、３０℃、２４時間、２００ｒｐｍで振盪培養（前培養）した。このように生育した同菌株培養液３０μｌを、試験管培養用培地であるＢ培地３ｍｌへ移し、３０℃、２００ｒｐｍで振盪培養（本培養）した。反応開始後、４日後に１リットル当りグリセロールが０．７ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００５４】
（実施例１６）
フラテウリア・オウランティア NBRC 3247株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが２．４ｇ消費され、ピルビン酸が０．５ｇ蓄積した。
【００５５】
（実施例１７）
マイクロバクテリウム・テスタセウム JCM 1353株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２日間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが３．１ｇ消費され、ピルビン酸が０．６ｇ蓄積した。
【００５６】
（実施例１８）
マイクロバクテリウム・バルケリ JCM 1343株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２日間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが４．２ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００５７】
（実施例１９）
ノカルディオイデス・シンプレックス NBRC 12069株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが２．２ｇ消費され、ピルビン酸が０．５ｇ蓄積した。
【００５８】
（実施例２０）
パエニバチラス・バリダス NBRC 13635株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１．１ｇ消費され、ピルビン酸が０．２ｇ蓄積した。
【００５９】
（実施例２１）
バチラス・スファエリカス NBRC 3341株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１．９ｇ消費され、ピルビン酸が０．３ｇ蓄積した。
【００６０】
（実施例２２）
バチラス・バディウスATCC 14574株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが２．７ｇ消費され、ピルビン酸が０．３ｇ蓄積した。
【００６１】
（実施例２３）
ノカルディア・ユニフォーミス NBRC 13702株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが３．７ｇ消費され、ピルビン酸が０．６ｇ蓄積した。
【００６２】
（実施例２４）
プロテウス・ブルガリスNBRC 3851株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが５．３ｇ消費され、ピルビン酸が０．４ｇ蓄積した。
【００６３】
（実施例２５）
カートバクテリウム・アルビダム JCM 1344株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１．４ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００６４】
（実施例２６）
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC 14020株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１．９ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００６５】
（実施例２７）
シュードモナス・オリジハビタンス JCM 2952株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが９．５ｇ消費され、ピルビン酸が０．７ｇ蓄積した。
【００６６】
（実施例２８）
シュードモナス・アゾトフォーマンス JCM 2777株を、実施例１５と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが５．６ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００６７】
（実施例２９）
ラオウルテラ・プランティコラ JCM 7251株を、実施例１５と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１．３ｇ消費され、ピルビン酸が０．２ｇ蓄積した。
【００６８】
（実施例３０）
パエニバチラス・ポリミキシア NBRC 3020株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが０．４ｇ消費され、ピルビン酸が０．３ｇ蓄積した。
【００６９】
（実施例３１）
ストレプトマイセス・バージニアエ NBRC 12827株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが４．０ｇ消費され、ピルビン酸が０．８ｇ蓄積した。
【００７０】
（実施例３２）
ストレプトマイセス・ギャリラエウス ATCC 31133株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが４．３ｇ消費され、ピルビン酸が０．７ｇ蓄積した。
【００７１】
（実施例３３）
ストレプトマイセス・カヌス ATCC 12646株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが５．７ｇ消費され、ピルビン酸が０．８ｇ蓄積した。
【００７２】
（実施例３４）
ストレプトマイセス・フラディアエ ATCC 10745株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが４．０ｇ消費され、ピルビン酸が２．４ｇ蓄積した。
【００７３】
（実施例３５）
スピリロスポラ・アルビダ  NBRC 12248株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが０．３ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００７４】
（実施例３６）
エッシェリチア・コライNBRC 12734株を、実施例１５と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが８．３ｇ消費され、ピルビン酸が２．０ｇ蓄積した。
【００７５】
（実施例３７）
エッシェリチア・コライNBRC 12734株を、実施例１と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが８．９ｇ消費され、ピルビン酸が２．９ｇ蓄積した。
【００７６】
（実施例３８）
エッシェリチア・コライNBRC 12734株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが８．１ｇ消費され、ピルビン酸が１．９ｇ蓄積した。
【００７７】
（実施例３９）
エッシェリチア・コライNBRC 12734株を、実施例２と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１０．２ｇ消費され、ピルビン酸が３．３ｇ蓄積した。
【００７８】
（実施例４０）
ハフニア・アルベイNBRC 3731株を、実施例１と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが８．５ｇ消費され、ピルビン酸が２．４ｇ蓄積した。
【００７９】
（実施例４１）
ハフニア・アルベイNBRC 3731株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが８．１ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００８０】
（実施例４２）
カートバクテリウム・ルテウム JCM 1480株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが２．１ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００８１】
（実施例４３）
シュードモナス・フラジJCM 20552株を、実施例１と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが４．４ｇ消費され、ピルビン酸が０．２ｇ蓄積した。
【００８２】
（実施例４４）
シュードモナス・フラジJCM 20552株を、実施例２と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが４．５ｇ消費され、ピルビン酸が０．２ｇ蓄積した。
【００８３】
（実施例４５）
サッカロポリスポラ・エリスラエア NBRC 13426株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが３．２ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００８４】
（実施例４６）
アクロモバクタ・リティカスATCC 21456株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが２．２ｇ消費され、ピルビン酸が０．７ｇ蓄積した。
【００８５】
（実施例４７）
バチラス・リチェニフォーミス NBRC 12197株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１．８ｇ消費され、ピルビン酸が０．３ｇ蓄積した。
【００８６】
（実施例４８）
マイクロバクテリウム・リクエファシエンス JCM 3879株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが２．３ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００８７】
（実施例４９）
ブレビバクテリウム・ブタニカム ATCC 21196株を、実施例２と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが２．８ｇ消費され、ピルビン酸が０．２ｇ蓄積した。
【００８８】
（実施例５０）
ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム ATCC 21004株を、実施例６と同様に反応した
ところ、１リットル当りグリセロールが１．４ｇ消費され、ピルビン酸が０．３ｇ蓄積した。
【００８９】
（実施例５１）
アルスロバクタ・グロビフォルミス ATCC 4336株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが５．３ｇ消費され、ピルビン酸が１．３ｇ蓄積した。
【００９０】
（実施例５２）
アルスロバクタ・パラフィネウス ATCC 21003株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１０ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００９１】
（実施例５３）
アルスロバクタ・パセンス ATCC 13346株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが２．９ｇ消費され、ピルビン酸が０．１ｇ蓄積した。
【００９２】
（実施例５４）
バチラス・セレウス・バー・ジュロイ ATCC 21182株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが０．７ｇ消費され、ピルビン酸が０．２ｇ蓄積した。
【００９３】
（実施例５５）
シュードモナス・タエツロレンス NBRC 3460株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例１５と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが３．２ｇ消費され、ピルビン酸が０．３ｇ蓄積した。
【００９４】
（実施例５６）
シュードモナス・クロロラフィス NBRC 3904株を、実施例１と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが５．４ｇ消費され、ピルビン酸が０．２ｇ蓄積した。
【００９５】
（実施例５７）
ストレプトマイセス・アルボフラバス NBRC 13196株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１０．４ｇ消費され、ピルビン酸が２．０ｇ蓄積した。
【００９６】
（実施例５８）
ストレプトマイセス・アルボビナセウス NBRC 12739株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１０．３ｇ消費され、ピルビン酸が３．０ｇ蓄積した。
【００９７】
（実施例５９）
ストレプトマイセス・フマナス NBRC 13042株を、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが８．７ｇ消費され、ピルビン酸が３．２ｇ蓄積した。
【００９８】
（実施例６０）
ストレプトマイセス・セルロサエ NBRC 3713株を、前培養の培養時間６日間の代わりに２４時間及び本培養の培養時間６日間の代わりに４日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが７．５ｇ消費され、ピルビン酸が３．３ｇ蓄積した。
【００９９】
（実施例６１）
ストレプトマイセス・ロンギスポロラバ NBRC 13488株を、前培養の培養時間２４時間の代わりに６日間及び本培養の培養時間４日間の代わりに６日間であることを除き、実施例２と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１１ｇ消費され、ピルビン酸が２．９ｇ蓄積した。
【０１００】
（実施例６２）
パエニバチラス・マセランス JCM 2500株を、本培養の培養時間６日間の代わりに１３日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１．７ｇ消費され、ピルビン酸が０．２ｇ蓄積した。
【０１０１】
（実施例６３）
マイクロバクテリウム・エステラロマティカム NBRC 3751株を、本培養の培養時間６日間の代わりに８日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１．３ｇ消費され、ピルビン酸が０．６ｇ蓄積した。
【０１０２】
（実施例６４）
カートバクテリウム・シトレウム JCM 1345株を、本培養の培養時間６日間の代わりに１３日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが１．２ｇ消費され、ピルビン酸が０．２ｇ蓄積した。
【０１０３】
（実施例６５）
ブレビバクテリウム・フスカム JCM 1488株を、本培養の培養時間６日間の代わりに７日間であることを除き、実施例６と同様に反応したところ、１リットル当りグリセロールが０．９ｇ消費され、ピルビン酸が０．３ｇ蓄積した。
【０１０４】
（実施例６６）
シトロバクタ・フレウンディ JCM 1657株を、プレート培養用培地であるＡ寒天培地（組成：第一リン酸カリウム３ｇ、第二リン酸ナトリウム６ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、塩化アンモニウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物２５０ｍｇ、グリセロール２０ｇ、寒天２０ｇ及び蒸留水１Ｌ（最終ｐＨ７．４））に塗布し、３０℃、４日間静置した。上記のプレート上で生育した同菌株を、試験管培養用培地であるＢ培地（組成：寒天を含まないこと及びグリセロール２０ｇの代わりに１０ｇを含むことを除けば、上記Ａ寒天培地と同一成分組成）３ｍｌに白金耳でもって植菌し、３０℃、２４時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。このように生育した同菌株培養液３０μｌを、試験管培養用培地であるＢ培地３ｍｌへ移し、３０℃、２４時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。反応開始の４日後にピルビン酸が３．１ｇ／Ｌ蓄積していた。
【０１０５】
（実施例６７）
シトロバクタ・フレウンディ JCM 1657株を、プレート培養用培地であるＡ寒天培地（組成：第一リン酸カリウム３ｇ、第二リン酸ナトリウム６ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、塩化アンモニウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物２５０ｍｇ、グリセロール２０ｇ、寒天２０ｇ及び蒸留水１Ｌ（最終ｐＨ７．４））に塗布し、３０℃、４日間静置した。上記のプレート上で生育した同菌株を、試験管培養用培地であるＢ培地（組成：寒天を含まないこと及びグリセロール２０ｇの代わりに１０ｇを含むことを除けば、上記Ａ寒天培地と同一成分組成）３ｍｌに白金耳でもって植菌し、３０℃、２４時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。このように生育した同菌株培養液３０μｌを、試験管培養用培地であるＣ培地（組成：グリセロール１０ｇの代わりにバイオディーゼル燃料製造時に副生するグリセロール画分（グリセロール：５１％、メタノール：１１％、水酸化カリウム：８％、水：４％、グリセリド等その他：２６％）１９．６ｇを含むことを除けば、上記Ｂ寒天培地と同一成分組成である）３ｍｌへ移し、３０℃、２４時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。反応開始の４日後にピルビン酸が４．２ｇ／Ｌ蓄積していた。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明の方法によれば、微生物を用いてグリセロール（バイオディーゼル廃液）からピルビン酸を簡便に生成することができる。ピルビン酸は反応性が高いため、医薬、農薬等の合成などにおいて重要な中間体として使用される。このように、本発明は、廃棄物から有用物質を生成するのに役立つ。