(57)【要約】【課題】  高効率で対象微生物を分離し、作業の自動化・省力化を図ることを課題とする。【解決手段】  本発明では、検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉して微生物を計測する微生物計測方法において、前記検査対象水に界面活性剤と酸を添加するステップ３０１と、前記膜を用いて前記検査対象水をろ過して微生物を含む微粒子を捕捉するステップ３０３と、前記微粒子を回収するステップ３０９とを含む微生物計測方法が提供される。【選択図】  図３
2009201421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収して微生物を計測する微生物計測方法において、
前記検査対象水に界面活性剤と酸を添加するステップと、
前記膜を用いて前記検査対象水をろ過して微生物を含む微粒子を捕捉するステップと、
前記微粒子を回収するステップと
を含むことを特徴とする微生物計測方法。
【請求項２】
検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収して微生物を計測する微生物計測方法において、
前記微生物を含む微粒子を捕獲するステップの後、前記検査対象水を、界面活性剤を含むｐＨが中性付近の洗浄液に切り替えるステップと、
前記膜に対して検査対象水側から通水するステップと、
前記膜を用いて前記検査対象水をろ過して微生物を含む微粒子を捕捉するステップと、
前記微粒子を回収するステップと
を含むことを特徴とする請求項１に記載の微生物計測方法。
【請求項３】
前記微粒子を回収するステップが、
洗浄液を前記膜に対してろ液側から逆流させて膜上に捕捉された検出対象の微生物を膜から脱離させるステップと、
前記膜上に溜まった検出対象の微生物が含まれる試料液を採水するステップと
を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の微生物計測方法。
【請求項４】
前記膜上に溜まった検出対象の微生物が含まれる試料液を採水するステップが、
前記膜上に溜まった試料液を前記膜に対して検査対象水側から加圧するステップを含むことを特徴とする請求項３に記載の微生物計測方法。
【請求項５】
検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収して微生物を計測する微生物計測装置において、
前記検査対象水に界面活性剤と酸を添加する手段と、
前記膜を用いて前記検査対象水をろ過して微生物を含む微粒子を捕捉する手段と、
前記微粒子を回収する手段と
を備えることを特徴とする微生物計測装置。
【請求項６】
前記検査対象水を、界面活性剤を含むｐＨが中性付近の洗浄液に切り替える手段と、
前記膜に対して検査対象水側から通水する手段と、
前記膜を用いて前記検査対象水をろ過して微生物を含む微粒子を捕捉する手段と、
前記微粒子を回収する手段と
を備えることを特徴とする請求項５に記載の微生物計測装置。
【請求項７】
前記微粒子を回収する手段が、
洗浄液を前記膜に対してろ液側から逆流させて膜上に捕捉された検出対象の微生物を膜から脱離させる手段と、
前記膜上に溜まった検出対象の微生物が含まれる試料液を採水する手段と
を備えることを特徴とする請求項５または６に記載の微生物計測装置。
【請求項８】
前記膜上に溜まった検出対象の微生物が含まれる試料液を採水する手段が、
前記膜上に溜まった試料液を前記膜に対して検査対象水側から加圧する手段を備えることを特徴とする請求項７に記載の微生物計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を計測する方法及び装置に関し、特に、河川及び湖沼などの環境水や上下水道の各処理プロセスの処理水など存在する原虫、細菌、ウイルスといった水系感染性微生物を計測する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中には多種多様な化学物質が存在するため、水道原水となる河川や湖沼などの環境水も様々な化学物質で汚染されていると考えられる。しかし、このような水環境の水質問題のほかにクリプトスポリジウムなどの原虫類、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７やレジオネラ菌などの細菌、ウイルスなどによる水系感染症の発生が大きな社会問題となっている。
【０００３】
これらの水系感染症の集団発生を防ぐためには水処理プロセスにおける原因微生物を高頻度にモニタリングすることが必要不可欠である。特に新興の水系感染症の原因となっているクリプトスポリジウムやジアルジアなどの原虫の検査方法（例えば、厚生労働省から示された「クリプトスポリジウム暫定対策指針」１９９８年に指針の改正）では、クリプトスポリジウムの検査手順は大きく分けて、試料採取、ろ過濃縮、剥離懸濁、分離精製、免疫蛍光染色、顕微鏡観察からなる。
【０００４】
試料採取ステップでは、容量１０〜２０Ｌのポリエチレン容器に河川水など水道原水は１０Ｌ、浄水や水道水は４０Ｌを採取する。次に、ろ過濃縮ステップでは、直径４７ｍｍ又は９０ｍｍ、ポアサイズ５μｍの親水性ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）ディスク膜を加圧又は吸引式の膜ホルダーに取付け、採取した試料を全量ろ過する。クリプトスポリジウムのオーシストは直径４〜５μｍ程度であるので、このステップにより試料中の微粒子とともに混入しているクリプトスポリジウムを分離することができる。剥離懸濁ステップでは、試料をろ過したディスク膜を５０ｍLの遠心管に入れ０．０２％ピロリン酸ナトリウム、０．０３％ＥＤＴＡ−３Ｎａ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０からなる誘出液（１％ＰＥＴ）を添加し、激しく攪拌する。これにより試料中の微粒子とともに膜に捕捉されたクリプトスポリジウムをディスク膜から剥離させる。次に遠心分離を行い、クリプトスポリジウムを含む微粒子と誘出液を分離し、誘出液を取り除き減容化する。続いて、分離精製ステップでは、上述の試料中の微粒子を含む懸濁液からクリプトスポリジウムを分離する。クリプトスポリジウムを特異的に認識する抗体が結合した免疫磁気ビーズを懸濁液に添加し、一定時間撹拌後、免疫磁気ビーズを磁石により容器に固定し、懸濁液を取り除く。免疫磁気ビーズにはクリプトスポリジウムが結合しており、ｐＨ変化により免疫磁気ビーズからクリプトスポリジウムを脱離させ、クリプトスポリジウムを回収する。免疫蛍光染色、顕微鏡観察ステップでは、回収したクリプトスポリジウムに蛍光標識した抗クリプトスポリジウム抗体を添加し、クリプトスポリジウムを標識し、蛍光顕微鏡で観察する。
【０００５】
また、特開２００６−０９４８２１には、微生物と微生物以外の粒子を含んだ多量の液体中から効率良く微生物のみを分離し、微生物を計測する微生物計測装置が記載されている。特に、この微生物計測装置が、ろ過状態を良好に保つため、界面活性剤又はイオン系界面活性剤を用いることが記載されている。
【特許文献１】特開２００６−０９４８２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
浄水処理プロセスにおいて、環境中に存在する水系感染性微生物を適切に除去あるいは消毒殺菌し安全な水道水を供給するためには、検出対象微生物を高頻度に測定し、その測定結果を処理プロセスにフィードバックする必要がある。
しかしながら、クリプトスポリジウムなどの病原性原虫類、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７やレジオネラ菌などの細菌、ウイルスの検査方法、特にクリプトスポリジウムの検査方法は前述のとおり、クリプトスポリジウムを捕捉し回収するとき、試料の微粒子によりディスク膜が目詰まりをおこし、短時間でろ過速度が低下するため全試験工程にかかる時間が長くなり迅速な測定ができず、大量の試料を効率よく処理できないという問題もある。また、蛍光顕微鏡観察では他の微生物との識別に高度な熟練を要するため、１時間に１回あるいは１日に１回程度の高頻度な測定が望まれている。さらに、上述のろ過濃縮及び剥離懸濁にけるクリプトスポリジウムの回収率は多くの場合、数十％〜８０％前後と変動が大きく、計測値のバラツキも大きい。さらに計測値の再現性や検出精度の面から改善すべき問題点が多い。
【０００７】
このように微生物の検査において検査精度が低いことや操作が複雑であるため熟練した技術が必要であり、長時間の作業のため作業者の負担が大きいため、作業ステップの自動化や省力化が望まれている。
【０００８】
本発明は、上述の問題点を鑑み、クリプトスポリジウムなど水系感染微生物を試料水中から短時間で大量の試料水から高効率で検出対象微生物を分離し、検出感度を高め、作業の自動化・省力化を図ることができる、微生物計測方法及び装置を提供することを課題とするものである。また、膜閉塞物質を分散や溶解して膜の目詰まりを防ぐことも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明は、検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収して微生物を計測する微生物計測方法を提供する。この微生物計測方法は、検査対象水に界面活性剤と酸を添加するステップと、膜を用いて検査対象水をろ過して微生物を含む微粒子を捕捉するステップと、微粒子を回収するステップとを含む。検査対象水は、河川や湖沼等から採水されたものであることが好適である。検査対象水に界面活性剤と酸を添加するステップでは、土壌由来の高分子の有機物等、膜の閉塞を促進する物質を分散又は溶解して膜の目詰まりを防止する。膜は、親水性かつ表面が平滑な膜であることが好適である。なお、本発明の微生物計測方法は、上記手順で行うことが好ましいが、上記手順に限定されるものではない。
【００１０】
また、上記の微生物計測方法で、微生物を含む微粒子を捕獲するステップの後に、検査対象水を、界面活性剤を含むｐＨが中性付近の洗浄液に切り替えるステップと、膜に対して検査対象水側から通水するステップと、膜を用いて検査対象水をろ過して微生物を含む微粒子を捕捉するステップと、微粒子を回収するステップとを含む。検査対象水は、河川や湖沼等から採水されたものであることが好適である。検査対象水をｐＨが中性付近の洗浄液に切り換えることによって、膜上に捕捉された検出対象の微生物を分散させて回収しやすくする。膜は、親水性かつ表面が平滑な膜であることが好適である。なお、本発明の微生物計測方法は、上記手順で行うことが好ましいが、上記手順に限定されるものではない。
【００１１】
また、本発明に係る微生物計測方法では、微粒子を回収するステップが、洗浄液を膜に対してろ液側から逆流させて膜上に捕捉された検出対象の微生物を膜から脱離させるステップと、膜上に溜まった検出対象の微生物が含まれる試料液を回収するステップとを含むことが好適である。
【００１２】
また、本発明に係る微生物計測方法では、膜上に溜まった検出対象の微生物が含まれる試料液を採水するステップが、膜上に溜まった試料液を膜に対して検査対象水側から加圧するステップを含むことが好適である。
【００１３】
さらに、上記課題を解決するために、本発明は、検出対象とする微生物の粒径よりも小さい孔径の膜を用いて検査対象水をろ過して、検出対象の微生物を捕捉、回収して微生物を計測する第１の微生物計測装置を提供する。この微生物計測装置は、検査対象水に界面活性剤と酸を添加する手段と、膜を用いて検査対象水をろ過して微生物を含む微粒子を捕捉する手段と、微粒子を回収する手段とを備える。検査対象水は、河川や湖沼等から採水されたものであることが好適である。検査対象水に界面活性剤と酸を添加するステップでは、土壌由来の高分子の有機物等、膜の閉塞を促進する物質を分散又は溶解して膜の目詰まりを防止する。膜は、親水性かつ表面が平滑な膜であることが好適である。
【００１４】
また、本発明の微生物計測装置は、更に検査対象水を、界面活性剤を含むｐＨが中性付近の洗浄液に切り替える手段と、膜に対して検査対象水側から通水する手段と、膜を用いて検査対象水をろ過して微生物を含む微粒子を捕捉する手段と、微粒子を回収する手段とを備える。検査対象水は、河川や湖沼等から採水されたものであることが好適である。検査対象水をｐＨが中性付近の洗浄液に切り換えることによって、膜上に捕捉された検出対象の微生物を分散させて回収しやすくする。膜は、親水性かつ表面が平滑な膜であることが好適である。
【００１５】
また、本発明に係る微生物計測方法では、微生物を回収する手段が、洗浄液を膜に対してろ液側から逆流させて膜上に捕捉された検出対象の微生物を膜から脱離させる手段と、膜上に溜まった検出対象の微生物が含まれる試料液を回収する手段とを備えることを好適とする。
【００１６】
また、本発明に係る微生物計測方法では、膜上に溜まった検出対象の微生物が含まれる試料液を採水する手段が、膜上に溜まった試料液を膜に対して検査対象水側から加圧する手段を備えることを好適とする。
【００１７】
界面活性剤には、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤等を使用する。具体的には、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソスビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）、ｎ−テトラデシル−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−４０）、３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ））プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から選択される少なくとも一を使用することが好ましいが、これに限定されない。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の微生物計測方法及び装置は、試料水中の病原性微生物を試料水から分離するとき、膜の微細孔内又は表面上に試料中の夾雑物が蓄積することによってろ過性能が低下することを防止するものである。さらに、本発明の微生物計測方法及び装置は、短時間で、自動的に検出対象の微生物を膜から回収することができる。よって、作業の自動化及び省力化を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明に係る微生物計測方法及び装置の実施の形態について説明する。
図１に、本発明に係る微生物計測方法を実施するための装置に用いるろ過器１００についてその一実施の形態を示す。なお、本発明に係る微生物計測方法及び装置では、様々な微生物を計測することができる。本実施の形態では、その一例として、クリプトスポリジウムを計測する。
【００２０】
図１に示すように、本実施の形態に係るろ過器１００は、その本来の機能を果たすトラックエッチ膜１０１（以下、膜１０１）を備えている。膜１０１は、メッシュクロス１０２を支持体とし、膜固定パッキン１０３で固定されている。この全体をフローセル上部１０４とフォローセル下部１０５とで挟み込んでいる。これによって、膜１０１を介して試料水とろ液が分離できる構造となる。
【００２１】
ろ過器１００内の圧力変化により、膜１０１が変形して伸びることがある。これによって、膜１０１の孔径が広がることがある。したがって、本実施の形態では、試料水の供給圧による膜１０１の変形を防ぐため、ろ液が流下でき、膜１０１の形状を保持できる支持体の上に膜１０１を固定した。支持体としてはメッシュクロス１０２を用いることができる。具体的には、例えば、ポリプロピレン製の目開き３０メッシュクロス（ＮＢＣ社）を用いることができる。また、樹脂製の焼結板も用いることができる。具体的には、例えば、ポリプロピレン製の通過径２００μｍのプラスチックフィルター板（フロン工業）を用いることができる。
【００２２】
フローセル上部１０４には、試料水供給口１１１と、試料水から分離された微生物を含む懸濁液を回収する試料回収口１１２と、試料水から分離された微生物を含む懸濁液を空気圧により回収するための加圧／吸気口１１３とが設けられている。
フローセル下部１０５には、ろ液排出口１１４と、洗浄水供給口１１５とが設けられている。
試料水から分離された微生物を回収するため、微生物回収口１１２は、下側に傾けた構造であることが望ましい。これにより、膜上部１０４に溜まったクリプトスポリジウムを含む液を微生物回収口１１２に流下させ、効率よく回収することができる。
【００２３】
さらに、本実施の形態では、磁石入りの撹拌子１０６を用いて、膜１０１上を撹拌する構造としている。撹拌子１０６はフローセルの下部１０５に設置するマグネティックスターラーを用いて磁力により回転させることができる。フローセル上部１０４に設置する（図示せず）こともできる。
試料となる環境水中には藻類や砂などの夾雑物が多く含まれ、これが膜の微細孔に入り込み目詰まりしたり、膜表面上に蓄積し、ろ過性能が低下したりする。また、クリプトスポリジウムは夾雑物とともに膜表面に付着するため、クリプトスポリジウムを回収するときに、膜から剥がす必要がある。
これに対して、攪拌子１０６は、試料水中の夾雑物が膜１０１の微細孔に目詰まりすることを防ぐことができる。さらに、攪拌子１０６は、クリプトスポリジウムが膜１０１表面に付着することによって回収率が低下してしまうことを防ぐことができる。
【００２４】
次に、図２及び図３を用いて、本発明に係る微生物計測方法の実施形態について説明する。図２は、本発明に係る微生物計測方法を実施するための装置についてその一実施の形態を示す。図３には、本発明に係る微生物計測方法の一実施形態についてその流れを示す。
【００２５】
本実施の形態の装置は、上記図１について説明した、ろ過器１００と、試料タンク２１１と、洗浄液タンク２１２と、廃液タンク２１３、試料回収タンク２１４と、バルブ２０８、負圧圧力計２０９と、正圧圧力計２１０と、バルブ（２１６〜２２７）とを備える。ろ過器１００は、ラインＬ２１によって試料タンク２１１と、ラインＬ２２によって洗浄液タンクと、ラインＬ２３によって廃液タンクと、ラインＬ２４によって試料回収タンクとそれぞれ接続されている。
【００２６】
まず、河川原水などの環境試料にクリプトスポリジウムの誘出液として用いられている１００％ＰＥＴ（２％（ｗ／ｖ）ピロリン酸ナトリウム、３％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ−３Ｎa、１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０）を終濃度０．１％ＰＥＴになるように検査対象水に添加する。なお、２％（ｗ／ｖ）ピロリン酸ナトリウム及び３％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ−３Ｎaは分散剤として用い、１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０は界面活性剤として用いている。続いて、塩酸を終濃度０．１モル／Ｌになるように添加して撹拌する（ステップ３０１）。このとき、Ｔｗｅｅｎ８０の終濃度は０．０１％（ｖ／ｖ）とする。この試料水を試料タンク２１１に移す（ステップ３０２）。
ここで、酸の種類としては、硝酸、クエン酸なども挙げることができ、濃度は例えば０．０１モル／Ｌ〜０．２モル／Ｌとする。
【００２７】
バルブ２１５、バルブ２１６を開き試料供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動する（ステップ３０３）。廃液タンク２１３内は減圧され、ろ過器１００内も減圧されるため試料水はろ過器１００内に吸引される。ろ液は膜１０１（図１）を透過し、ろ液排出口１１４から廃液タンク２１３内に排出される。ここで、廃液タンク２１３は耐圧性のものを使用することが望ましい。このとき、エアポンプ２０８による吸引圧力は負圧圧力計２０９で測定される。膜の破断圧力は、６９ｋＰａである。したがって、安全をみて、吸引圧力が４５〜５０ｋＰａになるようにエアポンプの運転を制御する。これにより試料水は一定圧力でろ過される。また、例えば、試料中の鋭利な粒子が膜を傷つけて膜が破断した場合、４５〜５０ｋＰａに制御されていた吸引圧力が正圧側に急激に変化するため、この圧力変動をモニタすることで試料調整の運転中止を判断することができる。
【００２８】
試料水のろ過が終了したら、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２１５、バルブ２１６を閉じ、バルブ２２４、バルブ２２５を開き、配管内を大気開放として残圧を除く（ステップ３０４）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００２９】
クリプトスポリジウムを検出するため、蛍光物質で標識された抗クリプトスポリジウム抗体を使用する。試料が酸性であると、抗クリプトスポリジウムがクリプトスポリジウムに結合できない。さらに、蛍光物質の蛍光活性を消失させてしまう。
ここで、試料水は、界面活性剤及び塩酸が添加されているため、ｐＨは２程度である。したがって、洗浄液を用いて、膜１０１上に捕捉されたクリプトスポリジウムを含む粒子及びろ過器１００内に付着している酸性の水滴を、中性付近にする必要がある。
【００３０】
したがって、次に、ｐＨが中性付近の洗浄液をろ過器１００内に通水し、膜１０１上に捕捉されたクリプトスポリジウムを含む粒子及びろ過器１００内を洗浄する。バルブ２１７、バルブ２１９、バルブ２１６を開き洗浄水供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ３０５）。廃液タンク２１３内は減圧され、ろ過器内も減圧されるため洗浄水タンク２１２の洗浄水はろ過器１００内に吸引される。洗浄水は膜１０１を透過し、ろ液排出口から廃液タンク２１３内に排出される。このとき、エアポンプ２０８による吸引圧力は負圧圧力計２０９で測定される。膜の破断圧力は６９ｋＰａであるので安全をみて、吸引圧力が４５〜５０ｋＰａになるようにエアポンプの運転を制御する。なお、ｐＨが中性付近になるまでの時間を予め測定しておく。洗浄時間は、この時間に基づいて決定される。洗浄時間の経過後、エアポンプを停止し、バルブ２１７、バルブ２１９、バルブ２１６を閉じ、バルブ２２４、バルブ２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ３０６）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００３１】
洗浄液には、誘出液１００％ＰＥＴを希釈した０．１％ＰＥＴ溶液を用いた。この誘出液は「クリプトスポリジウム、解説と試験方法」（日本水道協会）に記載されている誘出液であり、クリプトスポリジウムの試験方法で用いられている。この誘出液のｐＨは、例えば７〜８である。これは粒子の分散剤として用いられているため、捕捉された粒子を膜１０１から脱離させやすくする。洗浄液は０．１％ＰＥＴに限らず、ｐＨは中性付近の緩衝液も使用することができ、好ましくは界面活性剤を含んでいることが望ましい。
【００３２】
続いて、ろ過器１００の試料側を陰圧にし、洗浄液をろ液側から逆流させることによって膜１０１を逆洗する。粒子を膜１０１から剥離させるためには、膜上を磁石入りの撹拌子１０６を用いることだけでは不十分である。これによって、膜１０１上に捕捉されたクリプトスポリジウムを含む粒子を効率よく回収することができる。
【００３３】
バルブ２１７、バルブ２２０を開き洗浄水逆流流路を形成し、バルブ２２１、バルブ２２４を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ３０７）。これにより、ろ過器の加圧／吸気口からエアが吸引され、ろ過器内は減圧されるため洗浄水タンク２１２の洗浄水は洗浄水供給口からろ過器１００内に流入し、膜１０１を透過し膜１０１上に溜まる。このとき予め設定した量の洗浄液が膜１０１上に溜まるように時間を設定しておき、設定時間経過後、バルブ２１７、バルブ２２０を閉じ、エアポンプを停止する（ステップ３０８）。このとき、膜上からより効率よく粒子を脱離させるため、膜上に溜まった洗浄液を磁石入りの撹拌子１０６で撹拌し続けることが望ましい。その後、バルブ２２１、バルブ２２４、バルブ２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００３４】
バルブ２１８を開き試料回収流路を形成し、バルブ２２２、バルブ２２３を開きエアポンプを作動させる（ステップ３０９）。これにより、ろ過器の加圧／吸気口からエアが供給され、ろ過器１００内は加圧され、膜上に溜まったクリプトスポリジウムを含む洗浄液は試料回収タンク２１４に圧送される。このとき試料回収口のチューブは膜１０１上の直上まで接近し、ろ過器１００も試料回収口側に傾いており、洗浄水が試料回収口に溜まっていることが望ましい。
【００３５】
試料を回収したら、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２１８を閉じ、バルブ２２５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ３１０）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００３６】
回収したクリプトスポリジウムを含む試料に、クリプトスポリジウムと選択的に結合し、蛍光物質により標識された標識抗体を添加し、クリプトスポリジウムを蛍光標識する。このクリプトスポリジウムは蛍光顕微鏡やフローサイトメーターで検出する。
【実施例１】
【００３７】
本発明者らは、本発明に係る微生物計測方法及び装置の上記効果を検証するため、環境水に界面活性剤と、酸又はアルカリとを添加し、ろ過性能の比較を行った。
【００３８】
界面活性剤はクリプトスポリジウムの試験方法で用いられている２％ピロリン酸ナトリウム、３％ＥＤＴＡ−３Ｎａ、１％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ８０）からなる誘出液（１００％ＰＥＴ、「クリプトスポリジウム、解説と試験方法」日本水道協会）を用いた。
【００３９】
試料水は多摩川河川原水を用い、所定の濃度になるように１００％ＰＥＴを添加した。また、酸として塩酸、アルカリとして水酸化ナトリウムを用い、これらも所定の濃度になるように試料水に添加した。条件を表１に示す。
【００４０】
【表１】
2009201421.tif 000003
【００４１】
上述の試料水を、図２及び図３に記載した方法でろ過を行い、各試料のろ過性能の比較を行った。膜は試料中のクリプトスポリジウムを捕捉するための親水性でかつ表面が平滑な孔径２μｍのトラックエッチ膜（ワットマン社、商品名ニュークレポア膜）を用いた。クリプトスポリジウムオーシストの粒径は３〜５μｍであり、またトラックエッチ膜の孔径はプラス０％、マイナス１０％の精度を有するため、ほぼ１００％でクリプトスポリジウムを膜上に捕捉することができる。
【００４２】
上述のトラックエッチ膜（膜の直径１４２ｍｍ、有効ろ過面の直径１２４ｍｍ）を介して試料水を吸引ポンプにより一定流量（１００ｍＬ／分）をろ過し、このときの使用限界の吸引圧力に到達するまでの時間と通水量を比較した。なお、膜の破断圧力は６９ｋＰａであるので安全をみて５０ｋＰａを使用限界の指標とした。その結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
条件２の１００％ＰＥＴを終濃度０．１％すなわち界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０の終濃度が０．０１％を添加し、塩酸を終濃度で０．１モル／Ｌとなるように添加するとろ過できる河川原水の量が最も多くなった。
【００４５】
一方、水酸化ナトリウムを添加した場合は他の条件に比べ短時間で吸引圧力が上昇することが確認され、膜の目詰まりを促進する物質が生成していると考えられた。このことから、吸引圧力が３０ｋＰａに到達した時点でろ過を停止した。水酸化ナトリウムを添加した河川原水にはゲル状の沈殿物が生成していたため、これが膜の目詰まりの原因になっていると考えられたため、河川原水に界面活性剤とともにアルカリを添加することは不適切であると判断した。
【００４６】
次に、本発明での回収率を測定した。多摩川河川原水１０Ｌにクリプトスポリジウムの代替粒子であるクリプトレーサー（水道技術研究センター）を平均１００．３個添加し、終濃度０．１モル／Ｌの塩酸と０．１％のＰＥＴをそれぞれ添加しよくかき混ぜた後、上述のろ過器でろ過を行った。クリプトレーサーは紫外線を照射することにより、青色の蛍光を発するのでクリプトレーサーの個数を蛍光顕微鏡で計数することができる。
【００４７】
膜上に捕捉された粒子を含む懸濁液を回収した後、孔径１．０μｍの親水性ＰＴＦＥ膜（ミリポア）を用いてろ過し、その膜を紫外線照射のもと蛍光顕微鏡でクリプトレーサーを計数した。約９０％の回収率でクリプトレーサーを検査対象水中から分離して測定することができた。以上より、河川原水に界面活性剤とともに酸を添加しｐＨを下げることで、河川原水をろ過する速度が増し、ろ過時間の短縮とろ過量の増大とともに高回収率でクリプトスポリジウムを回収することができた。
【００４８】
なお、クリプトスポリジウムオーシストの細胞壁は酸に耐性があるため、酸の添加によりダメージはほとんどないと考えられる。
【００４９】
環境水中には砂や泥などの無機粒子のほかにフミン質などの土壌有機物も多く含まれている。フミン質は動植物の遺体が土壌中の微生物によって分解又は重合を受け生成した有機化合物である。このときの分解・重合反応は非常に複雑であるため、フミン質は特定の構造を有する単一物質ではなく、複雑な構造をもった複数の化合物の混合物であると考えられている。
【００５０】
フミン質の主要な成分はアルカリ及び酸に対する挙動からフミン酸、フルボ酸、フスム質に分類される。すなわちアルカリ性溶液に可溶で酸性溶液に不要な区分をフミン酸、アルカリ性溶液に可溶で酸性溶液に可溶な区分をフルボ酸、アルカリ性溶液及び酸性溶液にも不要な区分をフスム質と分類している。
【００５１】
例えば、フミン酸は不定形の高分子であり分子量は１０２〜１０６の範囲といわれている。膜での環境水のろ過において、フミン酸のような高分子がろ過の途中で微粒子に絡まりつき、膜の微細孔を詰まらせる原因となっていることに、本発明者らは想到した。
【００５２】
界面活性剤は一般的に微粒子の分散性を向上させることが知られているが、フミン質などの高分子の分散性などへの効果は低いと仮定した。
【００５３】
本発明者らは、このような経緯で、本発明に想到した。本実施例１の結果は、「クリプトスポリジウムなど水系感染微生物を試料水中から短時間で大量の試料水から高効率で検出対象微生物を分離し、検出感度を高め、作業の自動化・省力化を図ることができる」という効果が本発明に期待できることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明に係る微生物計測方法及び装置のろ過器の概略図である。
【図２】本発明に係る微生物計測装置の構成図である。
【図３】本発明に係る試料調整方法のフローチャートである。
【符号の説明】
【００５５】
１００  ろ過器
１０１  膜
１０２  メッシュクロス
１０３  膜固定パッキン
１０４  フローセル上部
１０５  フローセル下部
１０６  磁石入り撹拌子
２０８  エアポンプ
２０９  負圧圧力計
２１０  正圧圧力計
２１１  試料タンク
２１２  洗浄水タンク
２１３  廃液タンク
２１４  試料回収タンク
２１５〜２２７  バルブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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