(57)【要約】【課題】プローブ核酸を固相上に固定させた状態でのハイブリダイゼーションにおいて、プローブ核酸の標的領域を核酸試料の高次構造形成部位以外に設計しても、ハイブリダイゼーションの効率が低下するという新たな知見を得た。これは、ハイブリダイゼーション部位以外の位置で核酸試料が高次構造を形成することに起因する、隣接する核酸試料同士あるいは核酸試料と固相との立体障害が原因であることがわかった。本発明は、上記の課題を解決し、固相上に固定されたプローブと、核酸試料とのハイブリダイゼーションの反応効率を向上させる方法を提供する。【解決手段】本発明は、修飾ヌクレオシドを含む核酸試料を用いて高次構造を不安定化させることで、これらの立体障害を緩和し、ハイブリダイゼーション反応を効率化させた核酸検出方法、および核酸検出のためのキットを提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を基に調製された核酸試料と固相上に担持されたプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせて前記標的核酸を検出する方法であって、
前記核酸試料は、非天然型塩基を有する以下の（１）及び（２）：
（１）Ａ’及びＴ’、
（２）Ｇ’及びＣ’
の少なくとも一方の修飾ヌクレオシドを含み、
前記Ａ’とウリジンまたはチミジンとは安定な塩基対（ａ）を形成し、
前記Ｔ’とアデノシンまたはデオキシアデノシンとは安定な塩基対（ｂ）を形成し、
前記Ａ’と前記Ｔ’とは、前記塩基対（ａ）及び（ｂ）よりも安定な塩基対を形成せず、
前記Ｇ’とシチジンまたはデオキシシチジンとは安定な塩基対（ｃ）を形成し、
前記Ｃ’とグアノシンまたはデオキシグアノシンとは安定な塩基対（ｄ）を形成し、
前記Ｇ’と前記Ｃ’とは、前記塩基対（ｃ）及び（ｄ）よりも安定な塩基対を形成しないこと
を特徴とする核酸検出方法。
【請求項２】
前記標的核酸中の前記核酸試料に相当する部位の塩基配列からなる核酸断片は、前記プローブ核酸とハイブリダイゼーションする領域以外の領域で高次構造を形成し、前記プローブ核酸とハイブリダイゼーションする領域では高次構造を形成しないことを特徴とする請求項１に記載の核酸検出方法。
【請求項３】
前記核酸試料中のＡ’の位置は、前記標的核酸中のアデノシン又はデオキシアデノシンの位置に対応して配置されたものであり、
前記核酸試料中のＴ’の位置は、前記標的核酸中のウリジンまたはチミジンの位置に対応して配置されたものであり、
前記核酸試料中のＧ’の位置は、前記標的核酸中のグアノシンまたはデオキシグアノシンの位置に対応して配置されたものであり、
前記核酸試料中のＣ’の位置は、前記標的核酸中のシチジンまたはデオキシシチジンの位置に対応して配置されたものであること
を特徴とする請求項１又は２に記載の核酸検出方法。
【請求項４】
前記Ａ’の非天然型塩基は２，６−ジアミノプリンまたはその誘導体であり、
前記Ｔ’の非天然型塩基は２−チオチミン若しくは２−チオウラシル又はそれらの誘導体であり、
前記Ｇ’の非天然型塩基はヒポキサンチンまたはその誘導体であり、
前記Ｃ’の非天然型塩基はピリミジン−２（１Ｈ）−オンまたはその誘導体であること
を特徴とする請求項１乃至３のいずれかの請求項に記載の核酸検出方法。
【請求項５】
前記核酸試料は、前記標的核酸中の全てのアデノシンまたはデオキシアデノシンが前記Ａ’に置換され、かつ、前記標的核酸中の全てのウリジンまたはチミジンが前記Ｔ’に置換された核酸配列を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかの請求項に記載の核酸検出方法。
【請求項６】
前記核酸試料は、前記標的核酸中の全てのグアノシンまたはデオキシグアノシンが前記Ｇ’に置換され、かつ、前記核酸試料中の全てのシチジンまたはデオキシシチジンが前記Ｃ’に置換された核酸配列を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかの請求項に記載の核酸検出方法。
【請求項７】
前記核酸試料は、前記標的核酸を鋳型として核酸ポリメラーゼによる反応で調製されたことを特徴とする請求項１乃至６のいずれかの請求項に記載の核酸検出方法。
【請求項８】
標的核酸を検出するためのキットであって、
少なくとも、
前記標的核酸を基に核酸試料を調製するための非天然型塩基を有する以下の（１）及び（２）：
（１）Ａ’及びＴ’、
（２）Ｇ’及びＣ’
の少なくとも一方の修飾ヌクレオシドの三リン酸体と、
プローブ核酸を担持した支持体とを含み、
前記標的核酸中の前記核酸試料に相当する部位の塩基配列からなる核酸断片は、前記プローブ核酸とハイブリダイゼーションする領域以外の領域で高次構造を形成し、前記プローブ核酸とハイブリダイゼーションする領域では高次構造を形成せず、
さらに、
前記Ａ’とウリジンまたはチミジンとは安定な塩基対（ａ）を形成し、
前記Ｔ’とアデノシンまたはデオキシアデノシンとは安定な塩基対（ｂ）を形成し、
前記Ａ’と前記Ｔ’は前記塩基対（ａ）及び（ｂ）よりも安定な塩基対を形成せず、
前記Ｇ’とシチジンまたはデオキシシチジンとは安定な塩基対（ｃ）を形成し、
前記Ｃ’とグアノシンまたはデオキシグアノシンとは安定な塩基対（ｄ）を形成し、
前記Ｇ’と前記Ｃ’は前記塩基対（ｃ）及び（ｄ）よりも安定な塩基対を形成しないこと
を特徴とするキット。
【請求項９】
さらに
アデノシン三リン酸またはデオキシアデノシン三リン酸と、
ウリジン三リン酸またはチミジン三リン酸と、
グアノシン三リン酸またはデオキシグアノシン三リン酸と、
シチジン三リン酸またはデオキシシチジン三リン酸とを含む
ことを特徴とする請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記Ａ’の非天然型塩基は２，６−ジアミノプリン又はその誘導体であり、
前記Ｔ’の非天然型塩基は２−チオチミン若しくは２−チオウラシル又はそれらの誘導体であり、
前記Ｇ’の非天然型塩基はヒポキサンチン又はその誘導体であり、
前記Ｃ’の非天然型塩基はピリミジン−２（１Ｈ）−オン又はその誘導体であること
を特徴とする請求項８又は９のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相上に担持されたプローブ核酸と、試料溶液中に含まれる核酸試料とのハイブリダイゼーション反応により、試料溶液中に含まれる核酸試料の有無または量を検出する方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム計画に代表されるように、種々の生物について、そのゲノム遺伝子、ミトコンドリア遺伝子などの塩基配列に関して、全般的な解析がなされてきている。更には、解明された遺伝子と、生命活動のメカニズム、各種疾病、疾患、遺伝的な体質等との関連性に関する研究も進み、次々と研究成果が報告されている。これらの研究結果から、特定の遺伝子の有無、その塩基配列の変異、あるいは、その発現産物の存在量（発現量）を知ることで、例えば、各種疾病、疾患等の要因に関して有用な情報が得られることが判明してきている。また、各種疾病、疾患等の要因に関して、より詳細な特徴付けやタイピングがなされると、効果的な治療方法の選択がより容易となり、疾患の診断のみでなく、その治療にも効果的に利用可能であることも検証されてきている。
【０００３】
核酸試料を含む検体中における特定の遺伝子の有無、並びに、その発現量を検出する方法として、従来から多数の方法が提案され、実際に利用されている。検出対象の遺伝子あるいは核酸分子の塩基配列が判明している場合、最も広範に利用されている手法としてはプローブ・ハイブリダイゼーション法がある。この手法では、検出対象の遺伝子あるいは核酸分子の塩基配列中から特徴的な部分塩基配列を選択し、それに相補的な塩基配列を有するプローブ核酸が利用される。このプローブ核酸によって、かかる特徴的な部分塩基配列を含む核酸鎖の有無を検出し、その含有量を測定する。具体的には、相補的な塩基配列を有するプローブ核酸鎖を予め調製し、検体中に含まれる遺伝子あるいは核酸分子を一本鎖核酸とした上で、このプローブ核酸とハイブリダイゼーション反応を行なわせる。この反応に基づくハイブリッド体形成の有無を適当な方法で検出し、また、その形成量を測定する。
【０００４】
プローブ・ハイブリダイゼーション法において、固相上に固定化されたプローブ核酸を利用するハイブリダイゼーション反応が好まれる第一の理由は、Ｂ／Ｆ分離が容易であることである。加えて、固相上の所定位置に固定化されているプローブ核酸を利用するため、検出領域を物理的に微小化でき、また、検出領域が特定されている結果、高感度の測定が可能となる。その際、複数種のプローブ核酸の固定位置を物理的に隔離することにより、同時に多項目の分析が可能である。さらには、予め所定量のプローブＤＮＡが固相上に固定化されているＤＮＡマイクロアレイ（またはＤＮＡチップ）の形態を選択すると、その取扱いや応用が一層容易になるという利点もある。
【０００５】
例えば、特許文献１には、平面基板上において合成されたオリゴＤＮＡに対し蛍光色素で標識された核酸を作用させ、その結果形成されるハイブリッド体を蛍光標識に由来する蛍光により検出する手法が開示されている。この基板上において合成されたオリゴＤＮＡで構成されるＤＮＡアレイと、蛍光色素標識による蛍光検出法を利用することで、検体中に含まれる特定の核酸の有無や量の検出を可能としている。
【０００６】
ＤＮＡアレイのみならず、プローブ・ハイブリダイゼーション法では、一般には核酸試料として何らかの手法で一本鎖化した長鎖の核酸を用いるが、このような一本鎖化された長鎖の核酸は部分的にステム・ループ構造などの高次構造をとりやすい。高次構造を形成する核酸試料の高次構造形成領域（例えばステム領域）をプローブ核酸の標的部位に設計すると、プローブ核酸と高次構造形成領域との結合が高次構造の形成と競争するため、プローブと核酸試料のハイブリダイゼーションの効率が下がる。この問題を解決するために、一般にはプローブ核酸の標的部位を高次構造形成領域以外に設計するなどの手法がとられてきた。
【０００７】
また、プローブ核酸の標的部位をステム領域に設計せざるを得ない場合には、非特許文献１に記載される方法でハイブリダイゼーションの効率を上げることができる。この文献に記載の方法では、天然ヌクレオシドと安定な塩基対を形成するが互いには安定な塩基対を形成しない修飾ヌクレオシド群を用いている。このような性質をもつ修飾ヌクレオシド群を核酸試料に導入することで、核酸試料の高次構造が不安定化され、高次構造形成領域におけるプローブ核酸と核酸試料のハイブリダイゼーションが効率化される。
【０００８】
このように、高次構造形成領域へのプローブ核酸のハイブリダイゼーション効率の低下は広く認識されており、既に解決策も提示されている。また、高次構造形成領域における核酸試料とプローブ核酸のハイブリダイゼーション効率の低下は、固相上でのハイブリダイゼーションのみならず液相中でのハイブリダイゼーションにおいてもみられる現象であり、非特許文献１では液相中で検討されている。
【特許文献１】米国特許第６，４１０，２２９号明細書
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，６９７８−６９８６（２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
その一方で、我々は、核酸試料と固相上に担持されたプローブ核酸とのハイブリダイゼーション現象を鋭意検討した結果、固相上でのハイブリダイゼーションにおいては液相中でのハイブリダイゼーションでは見られない固有の阻害要因があることを見出した。具体的には、固相上では、プローブ核酸が核酸試料の高次構造を形成していない領域にハイブリダイゼーションする場合であっても、ハイブリダイゼーション領域外における核酸試料の高次構造形成がプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを阻害するという知見を得た。これは、固相上に担持されたプローブ核酸やプローブ核酸に結合した核酸試料の分子運動の自由度が液相中に比べ低く、それが原因でハイブリダイゼーション領域以外の高次構造形成が核酸試料同士の立体障害や核酸試料と固相間の立体障害をもたらすためである（図１）。これは固相上でのハイブリダイゼーション固有の問題である。さらに、一般に固相上でのプローブ・ハイブリダイゼーション反応では数十以上のプローブ核酸が存在し、かつ核酸試料も検体ごとに配列にバリエーションがある。このような状況において、核酸試料の高次構造形成をあらかじめ予測し、プローブ配列の設計によってハイブリダイゼーション効率の低下を回避することは困難である。
【００１０】
以上の理由より、プローブ核酸を固相上に固定させた状態でのハイブリダイゼーションにおいては、プローブ核酸の標的領域を核酸試料の高次構造形成部位以外に設計しても、高次構造の影響を受けてハイブリダイゼーションの効率が低下してしまう。したがって、本発明は、上記課題を解決し、固相上に固定されたプローブと核酸試料とのハイブリダイゼーションの反応効率を向上させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、我々は本発明を完成させるに至った。
【００１２】
本発明にかかる核酸検出方法は、
標的核酸を基に調製された核酸試料と固相上に担持されたプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせて前記標的核酸を検出する方法であって、
前記核酸試料は、非天然型塩基を有する以下の（１）及び（２）：
（１）Ａ’及びＴ’、
（２）Ｇ’及びＣ’
の少なくとも一方の修飾ヌクレオシドを含み、
前記Ａ’とウリジンまたはチミジンとは安定な塩基対（ａ）を形成し、
前記Ｔ’とアデノシンまたはデオキシアデノシンとは安定な塩基対（ｂ）を形成し、
前記Ａ’と前記Ｔ’とは、前記塩基対（ａ）及び（ｂ）よりも安定な塩基対を形成せず、
前記Ｇ’とシチジンまたはデオキシシチジンとは安定な塩基対（ｃ）を形成し、
前記Ｃ’とグアノシンまたはデオキシグアノシンとは安定な塩基対（ｄ）を形成し、
前記Ｇ’と前記Ｃ’とは、前記塩基対（ｃ）及び（ｄ）よりも安定な塩基対を形成しないこと
を特徴とする。
【００１３】
また、本発明にかかるキットは、
標的核酸を検出するためのキットであって、
少なくとも、
前記標的核酸を基に核酸試料を調製するための非天然型塩基を有する以下の（１）及び（２）：
（１）Ａ’及びＴ’、
（２）Ｇ’及びＣ’
の少なくとも一方の修飾ヌクレオシドの三リン酸体と、
プローブ核酸を担持した支持体とを含み、
前記標的核酸中の前記核酸試料に相当する部位の塩基配列からなる核酸断片は、前記プローブ核酸とハイブリダイゼーションする領域以外の領域で高次構造を形成し、前記プローブ核酸とハイブリダイゼーションする領域では高次構造を形成せず、
さらに
前記Ａ’とウリジンまたはチミジンとは安定な塩基対（ａ）を形成し、
前記Ｔ’とアデノシンまたはデオキシアデノシンとは安定な塩基対（ｂ）を形成し、
前記Ａ’と前記Ｔ’は前記塩基対（ａ）及び（ｂ）よりも安定な塩基対を形成せず、
前記Ｇ’とシチジンまたはデオキシシチジンとは安定な塩基対（ｃ）を形成し、
前記Ｃ’とグアノシンまたはデオキシグアノシンとは安定な塩基対（ｄ）を形成し、
前記Ｇ’と前記Ｃ’は前記塩基対（ｃ）及び（ｄ）よりも安定な塩基対を形成しないこと
を特徴とするキット。
【発明の効果】
【００１４】
核酸試料がプローブ核酸とハイブリダイゼーションする部位以外の領域で高次構造を形成する場合でも、非天然型の塩基を用いてその高次構造を不安定化した核酸試料を調製し使用することで、プローブ核酸と核酸試料との立体障害を緩和することができる。これによりハイブリダイゼーション効率を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明していく前に、本発明に関する用語を以下のように定義する。
【００１６】
プローブ核酸とは、特定のターゲット（標的）核酸と特異的に結合可能なもので、しばしばリガンドと呼ばれる。このプローブ核酸には、オリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド、あるいはその他の類縁体などが含まれる。プローブ核酸は、個々のポリヌクレオチド分子などのプローブ機能を有するプローブ分子そのものを意味する場合と、分散した状態等で固相表面に固定された同じ配列のポリヌクレオチドなどの同じプローブ機能を有するプローブ分子の集団を意味する場合がある。なお、本発明に採用されるプローブ核酸は、その使用目的に応じて、適宜選択されるものである。本発明の方法を好適に実施する上では、プローブ核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、その他の核酸あるいはその類縁体のいずれかであることが好ましい。具体的には人工的に合成されたオリゴ核酸や、バクテリア等のベクターで合成したＢＡＣ  ＤＮＡ、ｃＤＮＡなどが用いられる。また、必要に応じてこれらの２種以上を組み合わせて用いることができる。プローブ核酸の塩基長は、短鎖のオリゴＤＮＡで十から百塩基程度、長鎖のＢＡＣ  ＤＮＡで数千塩基程度が好適に用いられる。プローブ核酸の例として、１６ｓ  ｒＲＮＡを検査するプローブが特開２００７−０１４３５１号公報で開示されている。また、大腸がんの検査のためのプローブとしては特開２００７−１５９４９１号公報で開示されているプローブが例示できる。
【００１７】
プローブ核酸を担持させる固相は、目的に応じて適宜選択できる。例えばＤＮＡマイクロアレイを例に挙げるならば、核酸の固定領域を有する平面を構成する基板が固相として好適に用いられる。基板は石英や硼珪酸等のガラスや、樹脂で形成されていることが多く、多孔質にした場合もある。板状のものに限定されず、流路を形成するものや、複数のプローブを固定した糸を巻き取ったものであっても良い。また、プローブ核酸を固相に担持させる手法は共有結合によるものが好ましい形態であるが、化学的・物理的相互作用を利用した吸着によるものであってもよい。また、ＤＮＡマイクロアレイに限らず、二種類の蛍光色素で標識したＤＮＡを磁気ビーズに固定した、いわゆる蛍光バーコード化磁気ビーズを用いた多重化解析にも好適に使用できる。
【００１８】
標的核酸とは、定量若しくは定量的検出、または単なる検出の対象となる核酸のことを云う。標的核酸の精製が必要な場合は従来公知の方法で行なうことができる。上記の核酸の具体例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、２−Ｏ−メチル（Ｍｅ）ＲＮＡ、デオキシリボオリゴヌクレオチド、リボオリゴヌクレオチド等を挙げることができる。
【００１９】
ヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオシドであってもリボヌクレオシドであっても良く、使用目的に応じて適宜選択できる。
【００２０】
修飾ヌクレオシドとは、天然ヌクレオシドに対し何らかの化学構造の改変を加えたものであり、その改変は塩基部または／およびリボース環に対するものを含む。天然ヌクレオシドとは、塩基と糖が結合した化合物であって、塩基として、例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシルなどであり、糖としてはデオキシリボースやリボースである。
【００２１】
本明細書中においては、高次構造とは、ハイブリダイゼーション条件下で形成される自己相補的な二本鎖構造を指す。高次構造を形成している領域の決定は、ｍｆｏｌｄなどの高次構造予測ソフトを利用する、あるいは一本鎖核酸分解酵素に対する感受性を調べるなどすれば可能であるが、これらの手法に限定されるものではない。
【００２２】
以下、本発明にかかる核酸検出方法について簡単に説明する。
【００２３】
まず、本発明にかかる核酸検出方法は、
標的核酸を基に調製された核酸試料と固相上に担持されたプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせて前記標的核酸を検出する方法であって、
前記核酸試料は、非天然型塩基を有する以下の（１）及び（２）：
（１）Ａ’及びＴ’、
（２）Ｇ’及びＣ’
の少なくとも一方の修飾ヌクレオシドを含み、
前記Ａ’とウリジンまたはチミジンとは安定な塩基対（ａ）を形成し、
前記Ｔ’とアデノシンまたはデオキシアデノシンとは安定な塩基対（ｂ）を形成し、
前記Ａ’と前記Ｔ’とは、前記塩基対（ａ）及び（ｂ）よりも安定な塩基対を形成せず、
前記Ｇ’とシチジンまたはデオキシシチジンとは安定な塩基対（ｃ）を形成し、
前記Ｃ’とグアノシンまたはデオキシグアノシンとは安定な塩基対（ｄ）を形成し、
前記Ｇ’と前記Ｃ’とは、前記塩基対（ｃ）及び（ｄ）よりも安定な塩基対を形成しないこと
を特徴とする。
【００２４】
従来の固相上でのハイブリダイゼーションを利用した核酸検出方法では、標的核酸から天然ヌクレオシドを用いて核酸試料を調製し、該核酸試料と固相上に担持されたプローブ核酸とをハイブリダイズさせるのが一般的であった。この場合、ハイブリダイゼーション領域以外に高次構造を形成する部位があると、その立体反発により固相上でのハイブリダイゼーションを阻害する要因となる（図１）。
【００２５】
本発明では、標的核酸を基に調製される核酸試料が、非天然型塩基を有する修飾ヌクレオシド（１）Ａ’及びＴ’又は（２）Ｇ’及びＣ’のうち、（１）又は（２）の何れか一方又は両方の修飾ヌクレオシドを含むことに特徴がある。ここで、Ａ’、Ｔ’、Ｇ’、Ｃ’は修飾ヌクレオチドであり、Ａ’とＴ’は安定な塩基対を形成せず、Ａ’とウリジンまたはチミジンは安定な塩基対を形成し、Ｔ’とアデノシンまたはデオキシアデノシンは安定な塩基対を形成する。Ｇ’とＣ’についても、Ｇ’とＣ’は安定な塩基対を形成せず、Ｇ’とシチジンまたはデオキシシチジンは安定な塩基対を形成し、Ｃ’とグアノシンまたはデオキシグアノシンは安定な塩基対を形成する。なお、ここでいう塩基対の安定性は絶対値で定義されるものではなく、相対的なものである。例えば、Ａ’とＴ’との塩基対の安定性が、Ａ’とチミジンとの塩基対及びＴ’とデオキシアデノシンとの塩基対の安定性より低ければよい。Ｇ’やＣ’が関わる塩基対の安定性についても同様に相対的なものである。これら修飾ヌクレオシド−修飾ヌクレオシド間あるいは修飾ヌクレオシド−天然ヌクレオシド間の塩基対の安定性は、天然ヌクレオシドからなる相補的な二本鎖の中央部のヌクレオシド対を対応するヌクレオシド対に置換することで調べることができる。
【００２６】
天然ヌクレオシドのみからなる核酸試料では様々な部位で高次構造をとることが予想されるが、このような少なくとも二種の修飾ヌクレオシドを核酸試料に導入することで、核酸試料が形成する高次構造の安定性が下がる。その一方で、天然ヌクレオシドを修飾ヌクレオシドに置換しても、プローブ核酸と核酸試料との二本鎖形成の特異性や結合能を維持することが可能である。すなわち、修飾ヌクレオシドを用いて核酸試料を調製することにより、核酸試料のプローブ核酸とのハイブリダイゼーション機能を維持しつつ、核酸試料中の高次構造の形成を緩和することができる。その結果、図２に示すように、核酸試料中のハイブリダイゼーション領域以外の領域における高次構造形成による立体障害が緩和され、ハイブリダイゼーション反応の効率を向上させることができる。この原理から明らかなように、修飾ヌクレオシドとしてＡ’、Ｔ’、Ｇ’、Ｃ’の全てを用いると効果的であるが、Ａ’とＴ’のみ、あるいはＧ’とＣ’のみを用いることも可能である。また、修飾ヌクレオシドＡ’を使用して核酸試料を調製する場合に、必ずしも核酸試料中のすべてのアデノシンまたはデオキシアデノシンを修飾ヌクレオシドＡ’にする必要はない。これはＴ’、Ｇ’、Ｃ’を使用する場合についても同様である。
【００２７】
修飾ヌクレオシドＡ’、Ｔ’、Ｇ’、Ｃ’はそれぞれ、アデニンまたはデオキシアデニン、ウリジンまたはチミジン、グアノシンまたはデオキシグアノシン、シチジンまたはデオキシシチジンの修飾体が好適に用いられる。Ａ’、Ｔ’、Ｇ’、Ｃ’について、好ましい塩基部を以下に示す。また、図３と図４に、それらの塩基対の結合状態を示す（図中に示したのは塩基部のみである）。
【００２８】
【化１】
2009142229.tif 000003
（２，６−ジアミノプリン）
【００２９】
【化２】
2009142229.tif 000004
（２−チオチミン）
【００３０】
【化３】
2009142229.tif 000005
（２−チオウラシル）
【００３１】
【化４】
2009142229.tif 000006
（ヒポキサンチン）
【００３２】
【化５】
2009142229.tif 000007
（ピリミジン−２（１Ｈ）−オン）
【００３３】
Ａ’の塩基部の例は２，６−ジアミノプリンで、Ｔ’の塩基部の例は２−チオチミンである。Ａ’とＴ’は２，６−ジアミノプリンの２位のアミノ基と２−チオチミンの２位の硫黄原子との間の立体反発のために安定な塩基対を形成しない。その一方で、Ａ’とデオキシチミジン、またはＴ’とデオキシアデノシンは安定な塩基対を形成できる。図３にて比較すると、Ａ’とＴ’では水素結合が１つだけ形成されるのに対し、Ａ’とＴでは水素結合が３つ、ＡとＴ’では水素結合が２つ形成されることになる。したがって、Ａ’とＴ’との塩基対結合の安定性は、Ａ’とＴとの塩基対結合やＡとＴ’との塩基対結合の安定性より低くなる。
【００３４】
Ｇ’の塩基部の例はヒポキサンチンで、Ｃ’の塩基部の例はピリミジン−２（１Ｈ）−オンである。これにより、Ｇ’とＣ’は１つの水素結合しか形成しないため安定な塩基対を形成しないが、Ｇ’とデオキシシチジンやＣ’とデオキシグアノシンは二つの水素結合からなる安定な塩基対を形成できる（図４）。
【００３５】
また、これらの塩基の原子種を改変したり置換基を導入したりすることで得られる誘導体も、前記修飾ヌクレオシドの塩基部として用いることができる。例えば、プリン環の場合（２，６−ジアミノプリンやヒポキサンチン）は７−デアザ体、３−デアザ体、８−アルキル体や８−ハロゲン化体、ピリミジン環の場合（２−チオウラシル、２−チオチミンやピリミジン−２（１Ｈ）−オン）は５−アルキル体、６−アルキル体、５−ハロゲン化体や６−ハロゲン化体といった様々な誘導体が知られており、当業者は適宜選択可能である。なお、ここに記載したものは本発明を実施するための形態例であって、本発明に利用できる修飾ヌクレオシドはこれらに限定されるものではない。
【００３６】
修飾ヌクレオシドを有する核酸試料は、好適には核酸ポリメラーゼによる修飾ヌクレオシドの取り込みを利用して調製することができる。例えば、修飾ヌクレオシドの三リン酸体を用い、標的核酸を鋳型としてＰＣＲ反応を行うことにより、前記修飾ヌクレオシドを有する核酸試料を調製することができる。この際、天然ヌクレオシドの三リン酸体を対応する修飾ヌクレオシドの三リン酸体に（例えば、アデノシン三リン酸をＡ’の三リン酸体に）完全に置き換えて、核酸試料を調製してもよい。また、天然ヌクレオシドの三リン酸体と、対応する修飾ヌクレオシドの三リン酸体を混合して用いて、核酸試料を調製してもよい。核酸ポリメラーゼの種類によっては、修飾ヌクレオシドを用いた場合に増幅効率が悪くなる場合がある。このような場合には後者のように天然ヌクレオシドの三リン酸体と、対応する修飾ヌクレオシドの三リン酸体を混合して用いる事が好ましい。通常全ての天然ヌクレオシドが修飾ヌクレオシドに置換されずとも高次構造は不安定化されるため、好適な方法である。天然ヌクレオシドの三リン酸体としては、例えば、アデノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、グアノシン三リン酸若しくはシチジン三リン酸、又はデオキシアデノシン三リン酸、チミジン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸若しくはデオキシシチジン三リン酸等を挙げることができる。
【００３７】
ＰＣＲ法により核酸試料を調製する場合に用いるヌクレオシドの三リン酸体における修飾ヌクレオシドの三リン酸体の比率は、４０％以上が好ましく、さらに好ましくは６０％〜８０％がよい。これらの比率は核酸ポリメラーゼの種類や、増幅プロトコルなどによって異なり、本発明はこの比率に限定されるものではない。
【００３８】
さらに、本発明は核酸試料検出のためのキットも提供する。
【００３９】
本発明にかかるキットは、
標的核酸を検出するためのキットであって、
少なくとも、
前記標的核酸を基に核酸試料を調製するための非天然型塩基を有する以下の（１）及び（２）：
（１）Ａ’及びＴ’、
（２）Ｇ’及びＣ’
の少なくとも一方の修飾ヌクレオシドの三リン酸体と、
プローブ核酸を担持した支持体とを含み、
前記標的核酸中の前記核酸試料に相当する部位の塩基配列からなる核酸断片は、前記プローブ核酸とハイブリダイゼーションする領域以外の領域で高次構造を形成し、前記プローブ核酸とハイブリダイゼーションする領域では高次構造を形成せず、
さらに
前記Ａ’とウリジンまたはチミジンとは安定な塩基対（ａ）を形成し、
前記Ｔ’とアデノシンまたはデオキシアデノシンとは安定な塩基対（ｂ）を形成し、
前記Ａ’と前記Ｔ’は前記塩基対（ａ）及び（ｂ）よりも安定な塩基対を形成せず、
前記Ｇ’とシチジンまたはデオキシシチジンとは安定な塩基対（ｃ）を形成し、
前記Ｃ’とグアノシンまたはデオキシグアノシンとは安定な塩基対（ｄ）を形成し、
前記Ｇ’と前記Ｃ’は前記塩基対（ｃ）及び（ｄ）よりも安定な塩基対を形成しないこと
を特徴とするキット。
【００４０】
このようなキットを用いることで、上述したように核酸試料の高次構造を不安定化させ、立体反発を低減させて、ハイブリダイゼーション反応を効率化することができる。
【００４１】
本発明のキットは，好適にはこれと併せて核酸ポリメラーゼを使用して、核酸試料に修飾ヌクレオシドを取り込ませる。これにより、核酸試料の高次構造が不安定化する。したがって、この核酸試料を用いることにより固相上でのハイブリダイゼーション反応が効率化する。使用する核酸ポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、核酸ポリメラーゼは耐熱性を有するものであってもよく、この場合にはポリメラーゼ反応を熱サイクル下で行なうこともできる。
【００４２】
また、天然ヌクレオシドと対応する修飾ヌクレオシドとを混合して用いても、天然ヌクレオシドを完全に対応する修飾ヌクレオシドに置き換えて用いても良い。使用する核酸ポリメラーゼの種類や増幅プロトコルによっては、修飾ヌクレオシドを用いた場合の増幅効率が低下する場合もあり、その際には天然ヌクレオシドと対応する修飾ヌクレオシドを混合して用いるのが好適である。すべての天然ヌクレオシドを修飾ヌクレオシドに置換しなくても高次構造を不安定化することは可能なため、ハイブリダイゼーションを効率化できる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例をもって詳細に説明する。
【００４４】
（１）ＤＮＡチップの作製
（基板洗浄）
１インチ角のガラス板をラックに入れ、超音波洗浄用洗剤に一晩漫した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、水洗により洗剤を除去した。蒸留水ですすいだ後、蒸留水のはいった容器中でさらに超音波処理を２０分間行なった。次に、あらかじめ加温してあった１Ｍ水酸化ナトリウム溶液に１０分間漫した。引き続き水洗、蒸留水洗浄を行なった。
【００４５】
（表面処理）
１％シランカップリング剤水溶液（信越化学工業社製、商品名ＫＢＭ６０３）に室温で２０分浸し、その後、窒素ガスを両面に吹き付けて、水分を飛ばし、乾燥させた。１２０℃に加熱したオーブンで１時間ベークしシランカップリング処理を完結させた。続いて、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：Ｄｏｊｉｎ社製）を２．７ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ／エタノールの１：１溶液に溶解した（最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）。シランカップリング剤処理を行なったガラス基板をこのＥＭＣＳ溶液に２時間浸し、シランカップリング剤のアミノ基とＥＭＣＳ溶液のカルボキシル基を反応させた。この状態でガラス表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が表面に存在することになる。ＥＭＣＳ溶液と反応させたガラス板は蒸留水で洗浄後、窒素ガスで乾燥させ、ＤＮＡとの結合反応に用いられる。
【００４６】
（ＤＮＡの基板への結合反応）
５’−（ＳＨ）ＴＡＡＣＣＴＴＴＴＡＧＧＡＧＣＴＡＧＣＣＧＴＣＧＡ−３’・・・配列番号１
配列番号１の配列を持つ、５’−チオール修飾されたＤＮＡを定法により合成した。合成したプローブＤＮＡを水に溶解し、グリセリン７．５％・尿素７．５％・チオジグリコール７．５％・アセチレノール（登録商標）Ｅ１００（川研ファインケミカル社製）１％を含む水溶液を用いて最終濃度８μＭになるよう希釈した。
【００４７】
少量のサンプルが吐出できるように改造したバブルジェットプリンター（登録商標）用のノズルにプローブＤＮＡの溶液を１００μｌ充填した。ＤＮＡ溶液を基板に吐出した後、基板を３０分加湿チャンバー中に放置し、プローブＤＮＡを基板に結合させて固定する反応を行なった。１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流した後でスピンドライにより乾燥し、ガラス基板表面に一本鎖ＤＮＡが固定したＤＮＡチップを得た。
【００４８】
（２）核酸試料の調製
（ゲノムＤＮＡからの１ｓｔ  ＰＣＲ）
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＪＣＭ２１５１）のゲノムを、特開２００７−０１４３５１に記載の方法に従って精製した。さらに以下のプロトコルに従って増幅し、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ社製  ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いてプライマーを除去（精製）して１ｓｔ  ＰＣＲ産物を得た。
【００４９】
プライマー
５’−ＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡＡＧ−３’・・・配列番号２
５’−ＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＧＡＴＡＣ−３’・・・・配列番号３
１ｓｔ  ＰＣＲ反応溶液の組成
PCR premix (Ex Taq (タカラバイオ社製)  25 (l
Primer1 (配列番号２、10 (M)           0.5 (l
Primer2 (配列番号３、10 (M)           0.5 (l
Genome DNA (10^5 copy/(l)               2 (l
純水                                   22 (l
計                                     50 (l
１ｓｔ  ＰＣＲ条件
95oC, 10 min.
↓
92oC, 45 sec.
↓
65oC, 45 sec.
↓
72oC, 45 sec.
↓
72oC, 10 min.
↓
4oC, ∞
（核酸試料への非天然型塩基の取り込みと蛍光標識のための２ｎｄ  ＰＣＲ）
修飾ヌクレオシドの三リン酸体を用いて調製した核酸試料と、それを取り込ませていない核酸試料（天然ヌクレオシドの三リン酸体を用いて調製した核酸試料）を得るために、１ｓｔ  ＰＣＲ産物をテンプレートとして以下のプロトコルに従って２ｎｄ  ＰＣＲ反応を行なった。また、５’末端をＣｙ３でラベルしたプライマーを用いることで核酸試料の蛍光標識も同時に行なった。反応終了後、精製用カラムによる精製・増幅産物の定量を行い、ハイブリダイゼーションのための核酸試料を得た。なお、修飾ヌクレオシドを取り込ませた核酸試料の調製には、修飾ヌクレオシドＡ’の三リン酸体（塩基：２，６−ジアミノプリン）、Ｔ’（塩基：２−チオチミン）の三リン酸体、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを用いた。修飾ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドである。
【００５０】
プライマー
５’−（Ｃｙ３）ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＡ−３’・・・配列番号４
２ｎｄ  ＰＣＲ反応溶液の組成
PCR enzyme (TAKARA Ex Taq)  0.25 (l
10 x buffer                    5 (l
dNTP mixture (2 mM each)       5 (l
(A, T, G, C or 2,6-diaminopurine, 2-thiothymine, G, C)
Primer (配列番号４、10 (M)     5 (l
1st PCR産物 (20 ng/(l)       1.5 (l
純水                       33.25 (l
計                            50 (l
２ｎｄ  ＰＣＲ反応条件
95oC, 10 min.
↓
92oC, 45 sec.
↓
65oC, 45 sec.
↓
72oC, 2 min.
↓
72oC, 10 min.
↓
4oC, ∞
（３）ハイブリダイゼーション
（ＤＮＡチップの洗浄）
「（１）ＤＮＡチップの作製」で作製したＤＮＡチップを、まず１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）、次いで純水により表面を洗浄し、スピンドライにより乾燥した。
【００５１】
（ハイブリダイゼーション）
乾燥させたＤＮＡチップをハイブリダイゼーション装置（ＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ.  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行なった。
【００５２】
（ハイブリダイゼーション溶液）
１０ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／０.０５％  ＳＤＳ／２ｎｄ  ＰＣＲ産物  ４ｎＭ／ｐＨ７.０
（ハイブリダイゼーション条件）
６５℃  ３ｍｉｎ→９２℃  ２ｍｉｎ→５０℃  ４ｈｒ→Ｗａｓｈ  ２ｘＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ  ａｔ  ２５℃→Ｗａｓｈ  ２ｘＳＳＣ  ａｔ  ２０℃→（Ｒｉｎｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｈ2Ｏ：Ｍａｎｕａｌ）→Ｓｐｉｎ  ｄｒｙ
（６５℃で３分、９２℃で２分、４５℃で４時間ハイブリダイゼーション反応させた後、２ｘＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ，２５℃で洗浄、２ｘＳＳＣ，２０℃で洗浄後、純水でリンスしスピンドライした）
（ＤＮＡチップのプローブスポット上の蛍光輝度測定）
上記ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡチップをＤＮＡチップ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）を用いて蛍光測定を行なった。その結果を図５に示す（蛍光輝度の数値は、ホトマル電圧４００Ｖ。解像度５μｍでのピクセル平均輝度を示す）。このように、修飾塩基を取り込ませた核酸試料の方が約３倍高い蛍光輝度を示した。
【００５３】
以上のように、ハイブリダイゼーション部位以外において高次構造をとる場合でも、本発明の方法によりその高次構造を不安定化させ、核酸試料同士あるいは核酸試料と固相との立体反発を軽減させる事により、固相上でのハイブリダイゼーション効率を向上させる事が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】従来の固相上でのプローブ・ハイブリダイゼーション法における高次構造による立体障害を表す模式図。
【図２】本発明の核酸検出方法の一例を示す模式図。
【図３】本発明で好適に用いられる、２，６−ジアミノプリンを有する修飾ヌクレオシドＡ’と２−チオチミンを有する修飾ヌクレオシドＴ’の水素結合様式。
【図４】本発明で好適に用いられる、ヒポキサンチンを有する修飾ヌクレオシドＧ’とピリミジン−２（１Ｈ）−オンを有する修飾ヌクレオシドＣ’の水素結合様式。
【図５】実施例における天然ヌクレオシドを用いた従来法と修飾ヌクレオシドを用いた本発明とのハイブリダイゼーション効率の比較を示したグラフ。
【符号の説明】
【００５５】
１  プローブ核酸との結合部位以外の領域で高次構造を形成する核酸試料
２  高次構造形成領域
３  固相
４  固相上に担持されたプローブ核酸
５  修飾ヌクレオシドへの置換により高次構造が不安定化した核酸試料
６  修飾ヌクレオシドＡ’またはＧ’
７  修飾ヌクレオシドＴ’またはＣ’
８  固相
９  固相上に担持されたプローブ核酸
【図１】
2009142229.tif 000008
【図２】
2009142229.tif 000009
【図３】
2009142229.tif 000010
【図４】
2009142229.tif 000011
【図５】
2009142229.tif 000012