(57)【要約】      （修正有）【課題】ペプチドからより多くの情報量を取得し、データベース上のペプチドを特定することのできるペプチドの同定手法。【解決手段】ペプチドのＣ末端からアミノ酸を逐次的に分解し、Ｃ末端からアミノ酸残基が欠損したＣ末端欠損ペプチドを得る。Ｃ末端欠損ペプチドの分子量と、ピログルタミル化ペプチドの分子量とをそれぞれ測定する。Ｃ末端欠損ペプチドの分子量と、ペプチドの分子量との差を算出することにより、Ｃ末端欠損ペプチドの逐次的分解による分子量の減少量を求める。減少量に対応する分子量を有するアミノ酸を選択することにより、ペプチドのＣ末端から所定の数のアミノ酸を同定する。データベースに記録された一連の既知アミノ酸配列の中から、同定された所定の数のアミノ酸から構成されるペプチドのＣ末端アミノ酸配列と一致するＣ末端アミノ酸配列を有する既知アミノ酸配列を抽出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析対象とするペプチドのアミノ酸配列を同定するペプチドの同定方法であって、
前記ペプチドのＣ末端からアミノ酸を逐次的に分解し、前記Ｃ末端からアミノ酸残基が欠損したＣ末端欠損ペプチドを得るステップと、
前記Ｃ末端欠損ペプチドを得る前記ステップと並行して、前記ペプチドを脱水処理により所定の位置で切断し、Ｎ末端のアミノ酸残基が分子内脱水された脱水型ペプチドを得るステップと、
前記Ｃ末端欠損ペプチドの分子量と、前記脱水型ペプチドの分子量とをそれぞれ測定するステップと、
前記Ｃ末端欠損ペプチドの分子量と、前記ペプチドの分子量との差を算出することにより、前記Ｃ末端欠損ペプチドの逐次的分解による分子量の減少量を求めるステップと、
前記減少量に対応する分子量を有するアミノ酸を選択することにより、前記ペプチドの前記Ｃ末端から所定の数のアミノ酸を同定するステップと、
データベースに記録された一連の既知アミノ酸配列の中から、同定された所定の数のアミノ酸から構成される前記ペプチドのＣ末端アミノ酸配列と一致するＣ末端アミノ酸配列を有する前記既知アミノ酸配列を抽出するステップと、
抽出された前記既知アミノ酸配列の中から前記脱水型ペプチドの測定結果に基づいて一の既知アミノ酸配列を選択するステップと、
を含むことを特徴とするペプチドの同定方法。
【請求項２】
前記脱水型ペプチドを所定の位置で切断して脱水型ペプチド断片を得るステップをさらに含み、
前記脱水型ペプチドの分子量を測定する前記ステップは、前記脱水型ペプチド断片の分子量を測定することを特徴とする請求項１に記載のペプチドの同定方法。
【請求項３】
前記Ｃ末端欠損ペプチドを所定の位置で切断してＣ末端欠損ペプチド断片を得るステップをさらに含み、
前記Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する前記ステップは、前記Ｃ末端欠損ペプチド断片の分子量を測定することを特徴とする請求項１または２に記載のペプチドの同定方法。
【請求項４】
前記Ｃ末端欠損ペプチドの分子量を測定する前記ステップは、陰イオン種による質量分析測定を行うステップを含み、
前記脱水型ペプチドの分子量を測定する前記ステップは、陽イオン種による質量分析測定を行うステップを含むことを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載のペプチドの同定方法。
【請求項５】
前記脱水型ペプチドを得る前記ステップは、グルタミン酸のＮ末端の位置で切断し、Ｎ末端のアミノ酸残基がピログルタミル化した脱水型ペプチドを得ることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載のペプチドの同定方法。
【請求項６】
前記脱水型ペプチドを得る前記ステップは、前記ペプチド中の特定のアミノ酸残基を保護し、前記脱水型ペプチド断片を得る前記ステップにおける前記切断に対する前記特定のアミノ酸残基の感受性を失わせるステップを含むことを特徴とする請求項２に記載のペプチドの同定方法。
【請求項７】
前記脱水型ペプチド断片を得る前記ステップは、プロテアーゼ処理することにより前記脱水型ペプチドを切断することを特徴とする請求項６に記載のペプチドの同定方法。
【請求項８】
前記プロテアーゼがトリプシンであって、
特定のアミノ酸残基の感受性を失わせる前記ステップは、前記ペプチドをＮ−アシル化するステップを含むことを特徴とする請求項７に記載のペプチドの同定方法。
【請求項９】
特定のアミノ酸残基の感受性を失わせる前記ステップは、前記ペプチドをＯ−アシル化するステップをさらに含み、
前記脱水型ペプチドを得るステップの後、前記脱水型ペプチド断片を得る前記ステップの前に、前記Ｏ−アシル化の脱保護を行うことを特徴とする請求項６乃至８いずれかに記載のペプチドの同定方法。
【請求項１０】
前記ペプチドをアルカン酸無水物と接触させることにより、前記Ｃ末端欠損ペプチドと前記脱水型ペプチドとを得ることを特徴とする請求項１乃至９いずれかに記載のペプチドの同定方法。
【請求項１１】
前記ペプチドを無水酢酸と接触させることにより、前記Ｃ末端欠損ペプチドと前記脱水型ペプチドとを得ることを特徴とする請求項１乃至１０いずれかに記載のペプチドの同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解析対象とするペプチドのアミノ酸配列を同定するペプチドの同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドのアミノ酸配列について質量分析を利用してデータベースサーチする方法に関しては従来（１）ＰＭＦ法、（２）ペプチドタグ法、（３）ＭＳ／ＭＳ法が知られている。
【０００３】
このうち（１）ＰＭＦ法では、ペプチドを特異性の高い分解方法で断片化し、得られた断片を質量分析にかけ断片化法の特異性を考慮して、データベース中のペプチドに対して特異的断片化法に対応するペプチド断片群の質量を算出し、実験結果と一致するペプチドをサーチする方法である。この方法は非常に簡便であること、近年の質量分析装置の精度が非常に向上したことがあいまって多用されている方法である。しかしながら、もとのペプチドがある程度以上大きくないと十分な数のペプチド断片が得られず、その結果データベースのペプチド候補がたくさん上げられひとつに絞り込めないことが多々あるのが問題であった。
【０００４】
（２）のペプチドタグ法はシークエンスタグ法ともよばれ、ペプチド断片の断片化前の質量とそのペプチド断片に対して不活性ガスを当てるなどしてフラグメンテーションを生じさせた結果得られるイオン種を観測し、そのスペクトルから数残基のアミノ酸配列情報や組成、さらには、順序は問わないものの２残基分の特定のアミノ酸の組み合わせ、などの情報を取得し、ペプチド断片を得る際に使用した酵素の特異性なども加味して、データベースサーチを行い、ペプチドを帰属する手法である。近年、質量分析装置の高機能化、ハイブリッド化が促進されＭＳ／ＭＳ法の性能・感度が向上しつつあり、（３）に述べるＭＳ／ＭＳ法が多用される傾向があり、ペプチドタグ法はあまり用いられない。ペプチドのカバー率をなるべく上げることにより検索結果の確からしさを向上させようとする風潮がその傾向を加速している。
【０００５】
（３）のＭＳ／ＭＳ法はペプチドを断片化して得られたなるべく多数のペプチド断片のイオン種に対して不活性ガスをあてるなどしてペプチド結合部位でフラグメンテーションしアミノ酸配列を反映したフラグメントイオン種を生成させてこれを質量分析器で検出し、データベース中のペプチド断片群に対してもっともマッチするペプチド断片を含むペプチドをサーチするものである。マッチするペプチド断片の個数がより多いペプチドがより確からしい同定候補と判定される。しかしながら、ペプチド結合の開裂の程度は配列に大きく依存し、すべてのペプチド結合を一様に開裂させるように衝突エネルギーを調整することは難しい。また衝突エネルギーによってはペプチド結合以外の部分での断片化も生じることがあり、解析作業を複雑なものにしている。
【０００６】
データベースサーチする際に、スペクトルをマッチさせるのではなく、化学的にアミノ酸配列を決定してペプチドを同定する方法もある。Ｎ末端からの配列情報はエドマン分解が標準的手法として認知されているが、アミノ基がブロックされている際には使用できない。また比較的時間がかかることもスループットを上げる際に問題となっている。一方、Ｃ末端側からの配列決定方法として無水酢酸による化学反応を基本として一連の反応より得られる反応産物の質量スペクトルからＣ末端アミノ酸配列情報を取得する方法もある。代表的な例としてアルカン酸無水物によるＣ末端アミノ酸の逐次分解反応が申請者らより報告されている。例えば、アルカン酸無水物（たとえば無水酢酸）蒸気に微量のパーフルオロアルカン酸（たとえばトリフルオロ酢酸）蒸気を混入させC末端アミノ酸を逐次的に分解する方法が提案されている（非特許文献１参照）。この手法によれば、スペクトルの複雑性を除去するためにＣ末端逐次分解前にペプチド群ないしペプチドに対して行うアシル化反応（前処理工程）とＣ末端逐次分解後に反応産物に対して行う含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物による加水分解処理（後処理工程）を行うことが有効であることも併せて記載されている。また別に、ゲル担体に保持されたペプチドに対してはピリジン水溶液による処理が後の逐次分解反応を触媒することも申請者らより報告されている（非特許文献２参照）。
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．４，１１−１９（２００４）
【非特許文献２】Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．６，２０２６−２０３３（２００６）
【特許文献１】国際公開第２００５−０７８４４７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ペプチドをデータベース上で同定する際、従来のＰＭＦ法、ＭＳ／ＭＳ法では同定しきれないペプチドが存在していた。これらの手法が持つ構造的な欠陥、すなわち、ペプチドが比較的小さい場合、得られる断片が少なくなり、ペプチドをデータベース上に特定するには情報量が少なすぎる場合がある、という欠陥があった。
【０００９】
このように、解析対象とするペプチドからより多くの情報量を取得し、データベース上のペプチドを特定することのできる簡便なペプチドの同定手法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、解析対象とするペプチドのアミノ酸配列を同定するペプチドの同定方法であって、
ペプチドのＣ末端からアミノ酸を逐次的に分解するとともに、Ｃ末端欠損ペプチドを得るステップと、
Ｃ末端欠損ペプチドを得るステップと並行して、解析対象とするペプチドを脱水処理により所定の位置で切断し、Ｎ末端のアミノ酸残基が分子内脱水された脱水型ペプチドを得るステップと、
Ｃ末端欠損ペプチドの分子量と、脱水型ペプチドの分子量とをそれぞれ測定するステップと、
Ｃ末端欠損ペプチドの分子量と、ペプチドの分子量との差を算出することにより、Ｃ末端欠損ペプチドの逐次的分解による分子量の減少量を求めるステップと、
減少量に対応する分子量を有するアミノ酸を選択することにより、ペプチドのＣ末端部を構成する所定の数のアミノ酸を同定し、データベースに記録された一連のアミノ酸配列からペプチドのＣ末端部と一致するＣ末端部を有する一連のアミノ酸配列を抽出するステップと、
抽出された一連のアミノ酸配列の中から脱水型ペプチドの測定結果に基づいて一のアミノ酸配列を選択するステップと、
を含むことを特徴とするペプチドの同定方法
が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、データベースから一のアミノ酸配列を選択して、解析対象となるペプチドを精度よく同定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１３】
図１は、本実施の形態に係るペプチドの同定方法を示すフローチャートである。本実施の形態は、解析対象とするペプチドのアミノ酸配列を同定するペプチドの同定方法である。本実施の形態の基本は、ステップ１０２と、ステップ１０５と、ステップ１０６と、ステップ１０７から構成される。ステップ１０２では、ペプチドのＣ末端からアミノ酸を逐次的に分解し、Ｃ末端からアミノ酸残基が欠損したＣ末端欠損ペプチドを得る（Ｃ末端逐次分解工程、Ｓ１０２）。また、このＣ末端逐次分解反応と並行して、脱水処理によりグルタミン酸のアミノ基側が分子内脱水されたピログルタミル化ペプチドが得られる。ステップ１０５では、Ｃ末端欠損ペプチドの分子量と、ピログルタミル化ペプチドの分子量とをそれぞれ測定する（質量分析工程、Ｓ１０５）。ステップ１０６では、Ｃ末端欠損ペプチドの分子量と、ペプチドとの分子量との差を算出することにより、Ｃ末端欠損ペプチドの逐次的分解による分子量の減少量を求める。つづいて、減少量に対応する分子量を有するアミノ酸を選択することにより、ペプチドのＣ末端から所定の数のアミノ酸を同定する。そして、データベースに記録された一連の既知アミノ酸配列の中から、同定された所定の数のアミノ酸から構成されるペプチドのＣ末端アミノ酸配列と一致するＣ末端アミノ酸配列を有する既知アミノ酸配列を抽出する（Ｃ末端アミノ酸配列解析工程、Ｓ１０６）。ステップ１０７では、ステップ１０６で抽出された既知アミノ酸配列の中からピログルタミル化ペプチドの測定結果に基づいて一の既知アミノ酸配列を選択する（グルタミン酸切断片帰属工程、Ｓ１０７）。
【００１４】
図１で示すように、ステップ１０２の前に、ステップ１０１を行ってもよい（前処理工程、Ｓ１０１）。ステップ１０１では、ペプチド中のセリン、トレオニン、チロシンのβ−ヒドロキル基をＯ−アシル化して保護する。また、リシンのε−アミノ基をＮ−アシル化して保護する。これにより、Ｃ末端逐次分解工程における切断等の副反応を抑制することができる。
【００１５】
ステップ１０２では、ペプチドをアルカン酸無水物と接触させることにより、Ｃ末端欠損ペプチドとピログルタミル化ペプチドとを得ることできる。アルカン酸無水物として、無水酢酸または酢酸を用いると好ましい。こうすることにより、Ｏ−アシル化およびＮ―アシル化とＣ末端逐次分解反応とを同時に行うことができる。したがって、セリン、トレオニンのβ−ヒドロキシ基、チロシンのフェノール基、リシンのε−アミノ基の保護を行いつつ、Ｃ末端逐次分解反応を行うことができる。また、ステップ１０１の手順が不要となり、簡便な方法でＣ末端アミノ酸を安定的に分解することが可能となる。また、ピログルタミル化反応も良好に進行させることができる。
【００１６】
図３は、グルタミン酸のアミノ基側のペプチド結合で切断を受けて生じるピログルタミン酸の構造を示す図である。無水酢酸等の酸触媒または加熱条件により、グルタミン酸のγ−カルボキシ基が活性化され反応産物としてピログルタミン酸が得られる。アミノ基側で切断を受けたグルタミン酸は、脱水しており、ピログルタミル化している。グルタミン酸が分子内で脱水をおこし環状構造となる。
【００１７】
グルタミン酸の分子内脱水反応は、一般的に、高温下におくと発生する。また、酸触媒下におくことにより、反応速度を高めることができる。Ｃ末端逐次分解反応では、酢酸、ＴＦＡ等の有機酸を用いている。したがって、これらの有機酸が酸触媒として働く。この反応メカニズムは明らかではないが、図３で示す以下のようなメカニズムが予想される。すなわち、グルタミン酸が分子内脱水して分子内ピログルタミル化を起こす。つづいて、この分子内ピログルタミン酸の主鎖に由来するペプチド結合に加水分解が生じ、結果としてピログルタミン酸をＮ末端にもつ脱水ペプチドが形成される、と考えられる。
【００１８】
また、ステップ１０２の後に、ステップ１０３を行ってもよい（後処理工程、Ｓ１０３）。ステップ１０３では、Ｏ−アシル化を脱保護する。また、Ｃ末端逐次分解工程で形成された５−オキサゾロン環を加水分解する。こうすることにより、１個以上のアミノ酸残基が除去された後のペプチドのＣ末端に、確実にカルボキシ基を再生することができる。
【００１９】
ステップ１０３とステップ１０５の間に、ステップ１０４を行う（断片化工程、Ｓ１０４）。ステップ１０４では、ペプチドを所定の位置で切断する。これにより、ピログルタミル化ペプチドが所定の位置で切断されたピログルタミル化ペプチド断片が得られる。また、ステップ１０４では、Ｃ末端欠損ペプチドが所定の位置で切断されたＣ末端欠損ペプチド断片が得ることもできる。さらに、ペプチドのＮ末端を含むペプチド断片も得ることができる。ペプチドが断片化されることにより、分子量の大きいペプチドを解析対象とした場合であっても、より高感度で質量分析を行うことができる。
【００２０】
ステップ１０４では、プロテアーゼ処理することにより、ピログルタミル化ペプチドおよびＣ末端欠損ペプチド等のペプチドを所定の位置で切断することができる。プロテアーゼとしてトリプシンを用いると、アルギニンのカルボキシ側のペプチド結合を切断することができる。
【００２１】
ペプチドをアルギニンのカルボキシ基側のペプチド結合で切断することにより、質量分析において、ピログルタミル化ペプチドを、より高感度で検出することができる。したがって、ピログルタミル化ペプチドをより一層確実に分析することができる。
【００２２】
また、トリプシンを用いたペプチドの断片化は、塩基性アミノ酸残基のＣ末端側で選択的に生じるため、もとのペプチドとＣ末端アミノ酸が欠損したペプチドの切断位置を一致させることができる。このため、もとのペプチドに由来するＣ末端側の断片ペプチドは、Ｃ末端アミノ酸が欠損したペプチドに由来するＣ末端側の断片ペプチドのＣ末端側にさらに所定の数のアミノ酸残基が付加された配列となる。よって、これらの分子量を比較し、逐次分解による分子量の減少量を算出することにより、除去されたアミノ酸残基の種類を特定することが可能となる。
【００２３】
ここで、塩基性アミノ酸残基のうち、リシン残基はジメチル化、アセチル化等の天然の修飾を受けうる。修飾されたリシン残基はトリプシン消化を受けないことから、修飾の有無によりトリプシン消化により生じるペプチド断片が異なる。そこで、ステップ１０１においてリシン残基のε−アミノ基の保護を行うとともに、この保護基がステップ１０３で脱保護されないようにしている。こうすることにより、リシン残基のトリプシン感受性を消失させておくことができる。このため、アルギニン残基のＣ末端側ペプチド結合での選択的な断片化が可能となる。
【００２４】
よって、Ｃ末端側のアミノ酸が欠損した逐次分解生成物を、質量分析により一層好適な分子量範囲内の分子量を有するペプチド断片に分割することができる。したがって、Ｃ末端側ペプチド断片の分子量を調節する処理として、トリプシン処理を積極的に活用することができる。
【００２５】
ステップ１０４の断片化工程の後、試料を脱塩処理してペプチド断片を回収し、乾燥した後、質量分析装置を利用して、ペプチド断片の混合物に由来するイオン種の分子量を測定する。ここで、脱塩処理を行うことにより、回収、乾燥されるペプチド断片は、各種の塩を形成するものではなく、本来のペプチド部分単体とされている。そして、Ｃ末端の選択的な逐次分解によって得られる一連の反応生成物と、分解前のペプチドとを断片化処理で得られるペプチド断片のうち、それぞれのＣ末端側ペプチド断片の分子量同士を比較して、これらの差異に基づき、除去されたアミノ酸をＣ末端側から特定する。
【００２６】
質量分析工程（Ｓ１０５）に用いる質量分析装置として、たとえば、イオントラップ質量分析計、四重極型質量分析計、磁場型質量分析計、飛行時間（ＴＯＦ）型質量分析計、フーリエ変換型質量分析計などを用いることができる。また、イオン化法として、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、高速原子衝突イオン化（ＦＡＢ）法などが挙げられる。
【００２７】
このうち、たとえばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳが好適に用いられる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いることにより、イオン化過程において、ペプチド断片を構成するアミノ酸残基から一部の原子団が欠落することを抑制することができる。また、比較的高分子量のペプチド断片の測定を好適に行うことができる。また、測定対象のタンパク質を試料中からゲル電気泳動を用いて分離し、ゲル中で上述の処理を施した後、回収して測定に供する場合にも、対応する陰イオンと陽イオンの両方を測定可能である。これらのことから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いることにより、さらに再現性の高い分析を行うことができる。
【００２８】
以下、質量分析にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いる場合を例に、説明する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのイオン化過程では、ペプチド断片にプロトン（Ｈ+）が付加された陽イオン種と、ペプチド断片からプロトンが離脱された陰イオン種とをそれぞれ測定することが可能となる。本実施形態では、測定モードを選択し、陽イオン種と陰イオン種とをそれぞれ個別に測定する。
【００２９】
ここで、質量分析工程（Ｓ１０５）は、断片化工程（Ｓ１０４）の後に行われるので、断片化工程にトリプシンによるプロテアーゼ処理を採用するとＣ末端欠損ペプチドを構成するアミノ酸残基中にはアルギニン残基が含まれていない。一方、断片化工程（Ｓ１０４）で得られるピログルタミル化ペプチド断片にはプロトン受容能に富むグアニジノ基を持つアルギニン残基が含まれているため、これらに由来する陽イオン種の安定化が図られる。
【００３０】
このため、質量分析において、陽イオン種を測定した結果と、陰イオン種を測定した結果とを比較すると、Ｃ末端欠損ペプチド断片とピログルタミル化ペプチド断片とは、その相対強度が異なる挙動を示す。この現象を利用すれば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置によって測定される複数種のピーク中より、一連のペプチド断片に起因するピークを識別し、特定することが可能となる。
【００３１】
陽イオン種の質量分析スペクトル中では、Ｃ末端にアルギニン残基を有するペプチド断片群に起因するピーク強度が相対的に強くなる。一方、アルギニン残基の存在してないＣ末端側ペプチド断片は、プロトン供与能を示すカルボキシ基をそのＣ末端に有する。このため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置で測定される陽イオン種の質量分析スペクトル中において、ピログルタミル化ペプチド断片群に起因するピーク強度が相対的に強くなる。また、陰イオン種の質量分析スペクトル中において、Ｃ末端欠損ペプチド断片群に起因するピーク強度が相対的に強くなる。
【００３２】
したがって、陰イオン種による質量分析によりＣ末端欠損ペプチド断片の分子量を測定することができる。また、陽イオン種による質量分析により、ピログルタミル化ペプチド断片の分子量を測定することができる。また、陽イオン種による質量分析により、ペプチドのＮ末端を含み、Ｃ末端がアルギニンで切断されたペプチド断片の分子量も測定することができる。また、陽イオン種による質量分析では、質量精度のより高いリフレクターモードを好適に使用することができる。これにより、ピログルタミル化ペプチド断片を精度のよく測定することができる。
【００３３】
なお、ステップ１０５の質量分析に供するペプチド断片の長さは、たとえば２０〜３０アミノ酸残基以下とすることができる。こうすることにより、質量分析の際に、ペプチド断片のイオン化を確実に行うことができる。
【００３４】
ステップ１０６では、陰イオン種による質量分析の結果を用いて、Ｃ末端欠損ペプチドの分子量と、ペプチドとの分子量との差を算出することにより、Ｃ末端欠損ペプチドの逐次的分解による分子量の減少量を求める。
【００３５】
一連のＣ末端欠損ペプチドに対応する陰イオン種は、陰イオン種による分子量測定において相対的に大きな強度を与えるため、陰イオン種により測定された分子量に基づいて、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を簡便な方法で容易に把握することができる。このため、もとのペプチドからＣ末端１残基欠損ペプチド、Ｃ末端２残基欠損ペプチド、以下、順次Ｃ末端ｎ残基欠損ペプチド（ｎは自然数）までの各Ｃ末端欠損ペプチドについて、アミノ酸残基１個の欠損により生じる分子量の減少量を算出し、この減少量をアミノ酸残基の分子量と比較すれば、Ｃ末端からのアミノ酸配列を決定することができる。
【００３６】
そして、データベースに記録された一連の既知アミノ酸配列の中から、同定された所定の数のアミノ酸から構成されるペプチドのＣ末端アミノ酸配列と一致するＣ末端アミノ酸配列を有する一群の既知アミノ酸配列を抽出する。データベースには、タンパク質やペプチドのアミノ酸配列情報が格納されている。
【００３７】
同定するＣ末端残基のアミノ酸は任意の個数でよいが、より多くのアミノ酸を同定すれば、データベースから抽出する一群の既知アミノ酸配列の数を少なくすることができ、ステップ１０７の帰属工程が容易になる。
【００３８】
ステップ１０７では、陽イオン種による質量分析の結果を用いて、ピログルタミル化ペプチド断片の分子量を同定する。ピログルタミル化ペプチド断片のＮ末端はグルタミン酸で切断を受け、かつ、ピログルタミン酸に変換されている。ピログルタミン酸は、グルタミン酸が分子内で脱水されることにより生じるため、グルタミン酸より脱水した分、分子量が小さく観測される。すなわち、水の分子量（１８Ｄａ）に相当する分、分子量が小さく観測される。
【００３９】
また、陽イオン種による質量分析では、ペプチドのＮ末端を含み、Ｃ末端がアルギニンで切断されたペプチド断片も検出することができる。
【００４０】
ピログルタミル化ペプチド断片の分子量、Ｎ末端がグルタミン酸であることおよびＣ末端がアルギニンであることの情報に基づき、ピログルタミル化ペプチドのアミノ酸配列の帰属を行う。具体的には、ステップ１０６で抽出された既知アミノ酸配列を参照し、ピログルタミル化ペプチド断片のアミノ酸配列を含むもっとも確からしい一の既知アミノ酸配列を選択する。
【００４１】
ピログルタミル化ペプチド断片は、リシンのε−アミノ基がＮ−アシル化されている。したがって、既知アミノ酸配列のリシンもＮ−アシル化されたものとして分子量を算出する。また、既知アミノ酸配列のＮ末端のアミノ基もＮ−アシル化されたものとして分子量を算出する。
【００４２】
一の既知アミノ酸配列を選択できれば、解析対象となるペプチドのアミノ酸の配列は、選択した既知アミノ酸配列に相当することになる。したがって、解析対象のペプチドのアミノ酸配列を同定することができる。一方、一の既知アミノ酸配列を選択できない場合は、ステップ１０６に戻り、同定するペプチドのＣ末端アミノ酸残基の個数を増やす。これにより、データベースから抽出する既知アミノ酸配列をさらに絞り込むことができる。
【００４３】
以下、本実施の形態に係るペプチドの同定方法を利用したタンパク質の解析方法を図１に従って具体的に説明する。
【００４４】
解析対象となるペプチドに対してＣ末端逐次分解反応を施し、該ペプチドのＣ末端部において複数残基アミノ酸が外れた一連の反応産物の作成を行う。図１に示すように、Ｃ末端逐次分解反応においては副反応を抑制するためにあらかじめアシル化処理を行い、アミノ基、水酸基をＮ−アシル、Ｏ−アシル化する前処理工程（Ｓ１０１）を設ける場合がある。Ｃ末端逐次分解工程（Ｓ１０２）後はスペクトルを良好にするために残存する５−オキサゾロン環やＯ−アシル化をうけたセリン、スレオニン、チロシンの水酸基を加水分解するためアルカリ処理を行う（後処理工程、Ｓ１０３）場合がある。これらの工程を経て得られた反応産物に対してアミノ酸に特異的な断片化法を施し（Ｓ１０４）、ペプチドを質量分析の可能な大きさに断片化し、質量分析を行う（Ｓ１０５）。この際、Ｃ末端部分のアミノ酸配列と内部のグルタミン酸で切断を受け、ピログルタミン酸となった断片の分子量の測定を行う。こうして得られた情報はデータベース内にあるペプチドの同定のために有効に利用される。具体的には、得られたＣ末端のアミノ酸配列情報により、ある程度ペプチドを絞り込む（Ｓ１０６）。たとえば、４残基のアミノ酸配列が確定すると、ペプチドの候補は（１／２０）×（１／２０）×（１／２０）×（１／２０）に絞り込まれる。つぎに絞り込まれたペプチドに対して、グルタミン酸がピログルタミン酸に変換されたと仮定して、観測結果とマッチするペプチド断片を生成しうるかどうかをサーベイし（Ｓ１０７）、もっとも観測事実を説明できるペプチドを第一候補として、データベースサーチを終了する。
【００４５】
Ｃ末端逐次分解反応については、公知の技術（たとえば、特開２００３−２７９５８１、特許文献１）を用いる。
【００４６】
反応が進行する際に想定される解析対象のペプチドの様子を図２に示す。すなわち、解析対象となるターゲットペプチドに対して、たとえば無水酢酸処理等により前記Ｃ末端逐次分解反応を遂行する。これにより、得られる化学処理済みのペプチドは、Ｃ末端側からアミノ酸が連続的にはずれたものとなる。したがって、欠損数の異なるＣ末端欠損ペプチドの分子量の差分が配列情報となる。Ｃ末端逐次分解反応の際、たとえばアルカン酸無水物として無水酢酸、アルカン酸として酢酸を使用した場合、該ペプチドの反応産物は一般に、Ｎ末端のアミノ基およびリシン残基のアミノ基はすべてアシル化を受けて、Ｎ−アセチル化の状態となる。また、Ｏ−アセチル化を受けていたセリン、スレオニン、チロシンの水酸基はすべて前記後処理工程による加水分解をうけ、フリーの水酸基となっている。該ペプチドのＣ末端部分は数残基が外れた状態となり、残余している５−オキサゾロン環は前記後処理工程による加水分解をうけ通常のカルボキシ基が形成されている。
【００４７】
この段階で該反応産物に対して断片化処理を施す。たとえばトリプシンが望ましく使用される。トリプシンが適用された場合、図２に示すとおり該ペプチドのＣ末端逐次分解反応産物はアルギニンのＣ末端側で切断される。トリプシンのもうひとつの切断アミノ酸であるリシンは該反応の結果定量的にアセチル化を受けているのでトリプシンによっては認識されず、切断を受けることはない。したがって、断片化後のペプチド断片群は次の２つのグループに大別される。すなわち、（１）該ペプチドの内部フラグメントでそのＣ末端部分がアルギニンであるペプチド断片。（２）該ペプチドのＣ末端部分でアルギニンを含まず、かつ、Ｃ末端はＣ末端逐次分解反応の結果一定ではなく、さまざまな数のアミノ酸が切断してなるミクスチャーの状態のペプチド断片群。（２）のペプチド断片群の個々のペプチド断片のＮ末端のアミノ酸はトリプシンによる切断片であるため特定のアミノ酸にそろっているが、どのアミノ酸であるかはわからない。なお、図２では、Ｒはアルギニンを示し、Ｐｙｒはピログルタミン酸を示している。
【００４８】
前記断片化されたペプチド断片群（１）（２）のミクスチャーを一括して質量分析にかける。この場合、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳが好適に使用される。質量分析は、ポジティブイオンモード（陽イオン種）とネガティブイオンモード（陰イオン種）の両方で行う。ポジティブイオンモードで測定した場合、アルギニンの効果があるため（１）のペプチド断片群が非常に強く観測される。この際、少なからず、グルタミン酸のアミノ基側での開裂の結果生じたピログルタミン酸をＮ末端にもち、Ｃ末端にはアルギニンを持つペプチドが観察される。一方ネガティブイオンモードで測定した際は、（２）のペプチド断片群が比較的強く観察され、これらのイオン種はＣ末端逐次分解反応によりＣ末端側からいくつかのアミノ酸が欠落したペプチド断片群であるから、スペクトルはラダー状を呈し、ピーク間の質量差はすなわちＣ末端からのアミノ酸配列を反映したものとなる。このようにして、解析対象のペプチドのいくつかの内部フラグメントの分子量（グルタミン酸のアミノ基側で切断を受けたフラグメントはそのグルタミン酸はピログルタミン酸へ変換されている）とＣ末端のアミノ酸配列およびＣ末端ペプチド断片の分子量が同時に得られることになる。
【００４９】
つまり、（１）のペプチド群はアルギニンが末端に必ず存在するのでポジティブモード測定時に強く観測される。一部はグルタミン酸で切断を受けて、かつ、グルタミン酸はピログルタミン酸（Ｐｙｒ）に変換されている。これも、Ｃ末端部分はアルギニンなので非常に強く観測される。一方、（２）のＣ末端部アミノ酸が逐次分解されたペプチド群はアルギニンがないのでネガティブモードによる測定時、相対的に強調される。
【００５０】
前記解析で得られたＣ末端アミノ酸配列とＣ末端ペプチド断片の分子量は解析対象のペプチドをデータベース上で絞り込む際に使用される。一般には配列の一残基が決定されると候補は１／２０に減少するので、決定されたＣ末端アミノ酸配列数に応じてデータベース中のペプチドの数は指数関数的に絞り込まれる。さらにＣ末端ペプチド断片の分子量が特定されることからもデータベース中のペプチドの候補数は大幅に絞り込まれることになる。
【００５１】
絞り込まれたペプチドをさらに絞り込むためにポジティブイオンモードで非常に強く観測されるペプチド断片が有効に利用される。これらのペプチド断片のＣ末端は前記の通りアルギニンであることが化学的に保証されている。また該ペプチド断片のＮ末端は通常通りトリプシンによりアルギニンのＣ末端側で切断を受けたものか、あるいは、前記のとおり、グルタミン酸で切断を受け、かつ、ピログルタミン酸に変換されている（グルタミン酸より脱水した分（１８Ｄａ）分子量が小さく観測される）ものと推定されるので、前記Ｃ末端配列とＣ末端ペプチド断片の分子量により絞り込まれた候補からこのようなポジティブイオンモードで強く観測されるペプチド断片を生成しうるペプチドをサーベイすることにより、ペプチドの同定がより高精度になされる。
【００５２】
図３にはグルタミン酸のアミノ基側で切断を受けて生じるピログルタミン酸の構造を図示した。分子内で脱水をおこし環状構造となるので、アミノ末端のアミノ酸がグルタミン酸とした場合の分子量より１８Ｄａ小さくなる。トリプシンにより断片化処理を行うと図２に示すとおり、該脱水体ペプチド断片のＣ末端はアルギニンとなるので、ポジティブイオンモードで非常に強く観察される。また、この特徴を生かすため、測定感度は劣るものの測定精度のより高いリフレクターモードが好適に使用される。
【００５３】
以上のように、本実施の形態に係る方法によれば、化学的Ｃ末端配列解析法とＧｌｕ−Ｎ開裂反応を組み合わせたペプチドのデータベースサーチ方法を提供することができる。
【００５４】
本実施の形態に係る方法は、ペプチドの配列をデータベースサーチする際の化学的手法を組み合わせた高精度化に関する。より具体的には、ペプチドのＣ末端側からの逐次分解反応によって得られるペプチドのＣ末端配列とその際同時に副反応産物として生じるグルタミン酸のアミノ基側でのペプチド結合の開裂反応、およびその最終反応産物であるピログルタミン酸を検出することで解析対象のペプチドのデータベースサーチをより高精度に行うものである。
【００５５】
本実施の形態に係る方法は、ペプチドのＣ末端アミノ酸の逐次的分解という信頼性の高い化学的手法の効果を最大限データベースサーチに利用することを特徴とする。すなわち、ペプチドのＣ末端アミノ酸逐次分解反応によるペプチドのＣ末端部が逐次的にアミノ酸単位で分解されて形成される反応産物を酵素的あるいは化学的に分解して得られる反応産物を質量分析にかけ、スペクトルの測定を行うが、このさいネガティブイオンモードで測定されるスペクトルにあってはＣ末端配列情報の取得を行うと同時に、ポジティブイオンモードで測定されるスペクトルにあってはＣ末端アミノ酸逐次分解反応の副反応産物であるグルタミン酸のアミノ基側での開裂、および、開裂の際形成されるピログルタミン酸の帰属を行うことでデータベースサーチをより精度の高いものとしている。
【００５６】
つづいて、本実施の形態の効果について説明する。
【００５７】
本実施の形態によれば、解析対象のペプチドに対して所定の化学的処理を施し、かつ、質量分析法を利用することにより、より多くの配列情報を取得してデータベースから一のアミノ酸配列を選択することができる。したがって、解析対象となるペプチドのアミノ酸配列を精度よく同定することができる。
【００５８】
具体的には、本実施の形態によれば、解析対象とするペプチドからＣ末端欠損ペプチドとピログルタミル化ペプチドとを得ることにより、Ｃ末端欠損ペプチドの分子量の測定結果とピログルタミル化ペプチドの分子量の測定結果とに基づいてデータベースに記録された一連の既知アミノ酸配列の中から、効率よく簡便に一の既知アミノ酸配列を選択することができる。したがって、精度よくペプチドのアミノ酸配列を同定することができる。
【００５９】
従来の技術では、Ｃ末端欠損ペプチドのみの質量分析結果に基づいて、アミノ酸配列の分析を行うものであった。そのためデータベースを利用したペプチドのアミノ酸配列の解析を行う場合、情報量が足りないという問題があった。しかしながら、本実施の形態によれば、Ｃ末端欠損ペプチドを生成するとともにグルタミン酸を切断し、ピログルタミル化されたペプチドを得ることにより、ピログルタミル化されたペプチドの質量分析によって得られる情報を利用することができる。したがって、アミノ酸配列のデータベースを利用して精度よくペプチドのアミノ酸配列を同定することができる。
【００６０】
また、本実施の方法によれば、ペプチドの、特に有効ペプチド断片の生成個数が少数に限られることの多い低分子量のペプチドのデータベースサーチの精度が格段に向上する。
【００６１】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００６２】
たとえば、以下の各態様も、本発明の範囲内として有効である。
（１）解析対象とするペプチドをデータベース検索により同定する手法の一つであり、少なくとも次に示す化学反応とその反応に特徴的なペプチド結合の切断反応を応用して、データベース検索を遂行することを特徴とする、ペプチドの同定方法；すなわち、解析対象とするペプチドに対してＣ末端逐次分解反応を施して該ペプチドのＣ末端部において複数個のアミノ酸が遊離した一連の反応生成物を作成し、該反応生成物に対して特定のアミノ酸で断片化するプロテアーゼ処理ないし化学反応処理を施し、該断片化処理により得られたペプチド断片群に対して、質量分析を行い、ネガティブイオンモードによる質量分析においては該ペプチドのＣ末端アミノ酸配列情報およびＣ末端ペプチド断片の分子量情報を取得し、ポジティブイオンモードによる質量分析においては該ペプチドのグルタミン酸切断断片を副反応に伴う質量変化を考慮しつつデータベース中の配列データに対して帰属操作を行い、二つのイオンモードで得られる情報をあわせてデータベースサーチを行うことにより、解析対象であるペプチドの同定を行うデータベースサーチ方法。
（２）前記Ｃ末端逐次分解反応はアルカン酸無水物に対してアルカン酸またはパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる溶液を乾燥ペプチドに滴下し、１０℃〜６０℃に設定される温度において１〜１６時間に設定される時間反応させることを特徴とするペプチドのデータベースサーチ方法。
（３）前記Ｃ末端逐次分解反応は解析対象となるペプチドがゲル単体に保持されている際は、アルカン酸無水物にアルカン酸またはパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる溶液を双極性非プロトン性溶媒に溶解してなる溶液によりゲル単体を無水的に膨潤せしめ、アルカン酸無水物によるＣ末端逐次分解反応をゲル担体中に保持されたペプチドにたいして１０℃〜６０℃に設定される温度において１〜１６時間の反応させることを特徴とするペプチドのデータベースサーチ方法。
（４）前記Ｃ末端逐次分解反応はアルカン酸無水物に対してアルカン酸またはパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる溶液から蒸発するガス状の試薬が閉鎖経路を通じて解析対象のペプチドに到達し、Ｃ末端逐次分解反応を１０℃〜６０℃に設定される温度において１〜１６時間の任意の時間反応させることを特徴とするデータベースサーチ方法。
（５）前記Ｃ末端逐次分解反応において、アルカン酸無水物に対してアルカン酸を添加してなる溶液を用い、解析対象となるペプチドに対してＣ末端逐次分解反応に先行して、ペプチドに存在する可能性のあるアミノ基のＮ−アシル化、水酸基のＯ−アシル化を施すことにより、不要な副反応を極力排除する保護反応を前処理として行うことを特徴とするデータベースサーチ方法。
（６）前記Ｃ末端逐次分解反応において、ピリジン水溶液処理にてＣ末端逐次分解反応を短時間で達成する触媒処理を施すデータベースサーチ方法。
（７）前記Ｃ末端逐次分解反応において、Ｃ末端部に残存する５−オキサゾロン、水酸基に入っているＯ−アシル基を加水分解するために含窒素芳香環化合物または第３級アミン水溶液を５０℃〜１００℃、１時間〜８時間の範囲で選択される後処理工程を含むことを特徴とするデータベースサーチ方法。
（８）前記Ｃ末端逐次分解反応において使用するアルカン酸無水物は無水酢酸であることを特徴とするデータベースサーチ方法。
（９）前記Ｃ末端逐次分解反応において使用するアルカン酸は酢酸であることを特徴とするデータベースサーチ方法。
（１０）前記Ｃ末端逐次分解反応の後、反応産物を断片化する際に使用する手法として、トリプシンによる断片化を行うことを特徴とするデータベースサーチ方法。
（１１）前記化学反応産物の質量分析においてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを使用し、同一反応産物に対してポジティブイオンモード、ネガティブイオンモード両方の測定を行い、ポジティブイオンモードにおいてはグルタミン酸のアミノ基側での切断および切断産物がピログルタミン酸に変換されることを予期して測定される各イオンのｍ／ｚをデータベースと照合する工程と、ネガティブイオンモードにおいては該ペプチドのＣ末端アミノ酸配列を抽出してデータベースと照合する工程とを併せ持つことを特徴とするデータベースサーチ方法。
（１２）前記パーフルオロアルカン酸が、０．３〜２．５の範囲内の酸解離定数（ｐＫａ）を有し、炭素数２〜４のパーフルオロアルカン酸であることを特徴とするデータベースサーチ方法。
（１３）前記パーフルオロアルカン酸がトリフルオロ酢酸であることを特徴とするデータベースサーチ方法。
（１４）前記後処理工程に使用される第三級アミン化合物がジメチルアミノエタノールであることを特徴とするデータベースサーチ方法。
【実施例】
【００６３】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲は、かかる実施例により何ら限定されるものではない。
【００６４】
本発明の有効性を検証する目的で、ゲル担体上に担持されている１５３アミノ酸からなるヘムタンパク質、ウマ由来のミオグロビンについて、そのタンパク質部分グロビン・ペプチド鎖のＣ末端逐次分解反応を行った。
【００６５】
本実施例では、解析対象試料となるウマ・ミオグロビンを、ポリアクリルアミド・ゲルを利用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりゲル電気泳動して、バンドとして、そのグロビン・ペプチド鎖を分離した後、本発明にかかる解析方法で生成される該ペプチドにかかる情報、すなわち、Ｃ末端アミノ酸配列情報、Ｃ末端ペプチド断片分子量およびピログルタミン酸を含む内部ペプチド断片の分子量情報の取得について述べる。
【００６６】
（ゲル電気泳動法による単離）
市販されているウマ・ミオグロビン標品について、１μｇ／μＬの濃度でグロビン・ペプチド鎖部分のみを含有するペプチド溶液を調製した。なお、該ウマ・ミオグロビンのグロビン・ペプチド鎖部分には、ヒト・ミオグロビンと異なり、システイン残基は存在しないが、仮に、ヒト・ミオグロビンなどのように、システイン残基を内在するペプチドに対しては、該システイン残基のスルファニル基（−ＳＨ）の酸化による、−Ｓ−Ｓ−結合の形成を回避するため、２−スルファニルエタノール（ＨＳ−Ｃ２Ｈ４−ＯＨ：２−メルカプトエタノール）、ＤＴＴ（ジチオトレイトール：トレオ−１，４−ジスルファニル−２，３−ブタンジオール）などの還元性試薬を添加するなどして、予め酸化防止処理を施した。場合によっては、予め、システイン残基のスルファニル基（−ＳＨ）に対して、カルボキシメチル化などの保護を施した。
【００６７】
このペプチド溶液を、ゲル濃度１２．５質量％のポリアクリルアミド・ゲル上に電気泳動し、泳動処理後、クーマシー・染色により、目的とするグロビン・ペプチド鎖のバンドを特定した。本例では、かかる染色バンド部のゲルを切り出し、ゲル切片を以下の一連の操作に供した。
【００６８】
（ゲルのピリジン溶液処理）
ゲル切片を、気密性を有するチューブに入れ、２０体積％濃度のピリジン水溶液１ｍＬを注入し、２時間攪拌した。こうすることにより引き続き行われる脱水処理の結果ゲル内にわずかに残存するピリジンの触媒効果によりＣ末端逐次分解反応を実用的な短時間のうちに終了した。これは、引き続き行われる脱水処理の結果ゲル内にわずかに残存するピリジンの触媒効果と考えられる。
【００６９】
（ゲルの脱水処理）
ピリジン処理したゲル切片を、気密性を有するチューブ中に入れ、アセトニトリル１ｍＬを注入し、１５分間攪拌した。その後、前記アセトニトリルを棄て、新たに、アセトニトリル１ｍＬを注入し、更に１５分間攪拌した。このアセトニトリルを利用する、ゲル中に含浸する水の抽出処理を、合計３回行い、ゲルの脱水処理を行った。脱水処理によりゲル体積の収縮が生じた。
【００７０】
（Ｃ末端逐次分解処理操作）
次にチューブ中で、脱水処理済みのゲル切片に、３０体積％濃度の無水酢酸のホルムアミド溶液１ｍＬを注入した。乾燥雰囲気下で、密栓したチューブを攪拌しつつ、該容器全体の温度を、５０℃に加熱し、かかる温度に、３時間保持する。この加熱保持の間に、当初、体積収縮しているゲルは、溶媒ホルムアミドの浸潤に従って、再膨潤し、本来の体積に復した。この再膨潤したゲル中に担持されているグロビン・ペプチド鎖に対して、溶質の無水酢酸が、前記加熱温度で作用する結果、ペプチドのＮ末端アミノ基に選択的なアセチル化反応が進行した。加えて、ペプチド鎖内に含有される、リシン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）−ＣＯ−）のε位のアミノ基へのＮ−アセチル化、同時に、セリン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＯ−）やトレオニン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ）−ＣＯ−）に存在するヒドロキシ基に対するＯ−アセチル化、チロシン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＯＨ）−ＣＯ−）のフェノール性ヒドロキシ基へのＯ−アセチル化がなされた。
【００７１】
この再膨潤したゲル中に担持されているペプチド鎖Ｃ末端に対して、無水酢酸を前記加熱温度で作用させることで、ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸の選択的分解反応が進行した。具体的には、ペプチドのＣ末端において、５−オキサゾロン環形成を介し、ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸の逐次的分解反応が進行すると推定される。
【００７２】
このＣ末端アミノ酸の逐次的な分解反応が進行し、ゲル中には、段階的にＣ末端アミノ酸が除去された、一連の反応産物と、初段の５−オキサゾロン構造への変換時点に留まっている、アセチル基による修飾・保護を施した元のペプチド鎖とが含まれた混合物が、ゲル担体に担持された状態で残される。かかるＣ末端アミノ酸の逐次的分解処理を終えた後、容器内に残留する、未反応の無水酢酸を含むホルムアミド溶液を除去し、次に説明される加水分解処理を行った。
【００７３】
（加水分解処理）
反応産物が含まれる混合物が担持されている状態のゲル切片を入れた前記容器内に、ＤＭＡＥ（（ＣＨ３）２Ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）１０体積％濃度の水溶液１ｍＬを注入した。密栓した該容器を攪拌しつつ、１５分間この状態を保持した。この操作を３回行い、最後にさらに１ｍＬの該水溶液を注入した。容器全体の温度を、６０℃に加熱し、かかる温度に、２時間保持した。加水分解処理の目的は、前記混合物中に存在する反応産物ペプチドのＣ末端が、カルボキシ基に変換されたもの以外に、５−オキサゾロン構造に留まったもの、あるいは、非対称型酸無水物への変換まで進行したものも含まれた混合物状態となっているため、これらに加水分解処理を施し、ペプチドのＣ末端をカルボキシ基となった状態へとそろえることである。加えて、塩基性窒素含有有機化合物が塩基触媒として機能することに伴い、アセチル基による修飾・保護を施したペプチド鎖上の、セリン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＯ−）やトレオニン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ）−ＣＯ−）に存在するヒドロキシ基に対するＯ−アセチル化保護は加水分解され、脱保護がなされた。また、チロシン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＯＨ）−ＣＯ−）のフェノール性ヒドロキシ基へのＯ−アセチル化保護の加水分解も、同様に進んだ。但し、用いる有機塩基の塩基性は高くないため、Ｎ−アセチル化保護の脱保護は進まず、最終的に後処理工程後には、より高い選択性を持って、Ｎ末端のアミノ基に対するＮ−アセチル化、リシン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）−ＣＯ−）のε位のアミノ基へのＮ−アセチル化が残るものとなる。場合によっては、チロシン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＯＨ）−ＣＯ−）のフェノール性ヒドロキシ基へのＯ−アセチル化が、極僅かに残るものとなった。
【００７４】
かかる加水分解処理工程を終えた後、容器内に残留する水溶液を除去し、容器中にアセトニトリル１ｍＬを注入し、１５分間攪拌した。その後、前記アセトニトリルを棄て、新たにアセトニトリル１ｍＬを注入し、更に１５分間攪拌した。このアセトニトリルを利用する、ゲル中に含浸する水溶液の抽出処理を、合計３回行い、再膨潤ゲル中の脱水処理を行う。脱水処理に伴い、ゲル体積の収縮が生じた。
【００７５】
（トリプシン消化によるペプチド断片化）
ウマ・ミオグロビンのグロビン・ペプチド鎖は、１５３アミノ酸からなる（配列番号１）ため、質量分析における、適正な分子量範囲を逸脱しており、トリプシン消化によるペプチド断片化処理を行った。
【００７６】
具体的には、前記の加水分解処理を施し、脱水処理済みのゲル切片を入れた容器内に、トリプシン含有水溶液を加え、ゲル担体上に担持されている状態のままペプチド鎖の断片化を行った。前記トリプシン含有水溶液は、重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８）中に、トリプシンを０．０６７μｇ／μＬの濃度で含有しており、トリプシン消化は３７℃で１６時間酵素反応を行った。その際、脱水処理されていたゲルは、溶媒水の浸潤に従って速やかに再膨潤し本来の体積に復した。この再膨潤したゲル中に担持されているペプチド鎖、反応産物に対して、前記緩衝液とともに、ゲル中に浸入するトリプシンを前記加熱温度で作用させることで、トリプシンに特異的な酵素消化が進行した。
【００７７】
なお、ペプチド鎖、反応産物は、前記加水分解処理工程における脱保護によっても、Ｎ末端のアミノ基に対するＮ−アセチル化、リシン残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）−ＣＯ−）のε位のアミノ基へのＮ−アセチル化は保持された状態であり、トリプシン消化によっては、前記Ｎ−アセチル化リシン残基のＣ末側ペプチド結合の切断はなされず、アルギニン残基のＣ末側ペプチド結合切断が進行した。このウマ・ミオグロビンのグロビン・ペプチド鎖が有するアミノ酸配列は既に判明している。
【００７８】
図４は、ウマ・ミオグロビンのシークエンスを示す図である。図４に示すようにアルギニン残基のＣ末側ペプチド結合切断に伴い、１５３アミノ酸からなる元のペプチド鎖は、１−３１（配列番号２）、３２−１３９（配列番号３）、１４０−１５３（配列番号４）の各部分アミノ酸配列を含む断片に、トリプシン消化を受けた。なお、図４には、Ｃ末端逐次分解反応操作に伴い、Ｎ−アセチル化保護が施されるリシン残基およびアミノ末端を持つ残基番号１のグリシンを下線で示し、さらには、トリプシン消化による、アルギニン残基のＣ末側ペプチド結合切断で生じる、Ｎ末側の１−３１とＣ末側の１４０−１５３の各部分アミノ酸配列を大文字で示す。３２−１３９の部分のアミノ酸配列を小文字で示す。
【００７９】
ターゲットペプチドは、リシンのε位のアミノ基がＮ−アセチル化されているため、ウマ・ミオグロビンのリシンもアセチル化されたものとして質量を計算する。また、ターゲットペプチドのＮ末端もＮ−アセチル化されている。したがって、ウマ・ミオグロビンのグリシンもアセチル化されたものとして質量を計算する。
【００８０】
トリプシン消化によって断片化されると、これらのペプチド断片は、ゲル担体からの溶出を生じ易くなり、容器内のトリプシン溶液中に溶出した。なお、かかるトリプシン消化処理工程では、前記１４０−１５３アミノ酸の部分アミノ酸配列を含むＣ末端断片とともに、上述するＣ末端アミノ酸の逐次的分解処理で生成される一連の反応産物に由来するＣ末端断片も、容器内のトリプシン溶液中に溶出した。すなわち、該トリプシン消化処理は、長いアミノ酸長のペプチド鎖から、そのＣ末端部分を、質量分析に適合する所望の分子量範囲のペプチド断片とするとともに、かかるペプチド断片を、ゲル中から高い収率で溶出、回収した。
【００８１】
かかるトリプシン消化処理工程を終えた後、ゲル中から容器内のトリプシン溶液中に溶出する断片化されたペプチド断片を回収した。回収されたペプチド断片の混合物を含む溶液について、脱塩処理を施した後、真空乾燥処理を行った。
【００８２】
（加水分解処理、トリプシン消化によるペプチド断片化済みの反応産物の特定）
以上の一連の処理を施して得られる、加水分解処理、ペプチド断片化済みの反応産物とグロビン・ペプチド鎖のＣ末端断片との混合物について、質量分析法により、含有される各ペプチド断片の分子量の測定を行った。
【００８３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置を利用し、各ペプチド断片の分子量を反映する主イオン種ピークの質量測定を行った。なお、かかるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置を利用する測定では、イオン種の分別は、負帯電イオン種を検出器へ導く、所謂ネガティブイオンモードの測定と、正帯電イオン種を検出器へ導く、所謂ポジティブイオンモードの測定との双方を行った。すなわち、各ペプチド断片の分子量を反映する主イオン種として、ポジティブイオンモードの測定において、プロトン（Ｈ＋）が付加された陽イオン種、ネガティブイオンモードの測定において、プロトン（Ｈ＋）が離脱した陰イオン種の、対応する二種のスペクトルを得た。
【００８４】
図５は、ウマ・ミオグロビンを逐次分解後トリプシン消化を行い、得られたペプチド断片群をネガティブイオンモード（リニアモード）で測定してＣ末端配列情報を観測した質量分析ペクトルである。図５に示すネガティブイオンモードの測定では、ポジティブイオンモードでの測定結果との比較から相対的な強度が増加するピークとして、１４０−１５３、１４０−１５２、１４０−１５１、１４０−１５０、１４０−１４９の５本のピークが観測され、配列情報としてＣ末端側から「ＧＱＦＧ」と４残基の配列が推定された。また、トリプシンによる断片化操作の結果得られたＣ末端フラグメントは１６３４．６の分子量をもつことが確認できた。これらの情報はデータベースサーチの際に利用された。すなわち、解析対象となるペプチドのＣ末端フラグメントは１６３４．６としてネガティブイオンモードで観測される分子量を持つこと、このペプチド断片のＮ末端のアミノ酸のアミノ基側にあったトリプシンにより切断を受けたアミノ酸はアルギニンであったはずであること、このペプチド断片あるいは解析対象のペプチドのＣ末端アミノ酸配列はアミノ基側から「ＧＦＱＧ」であること、などがデータベースサーチの際に利用された。なお、データベース検索の際にはリシン残基はアセチル化を受けているものとして検索を行った。この検索によりペプチドの候補群が１次候補群として絞り込まれた。
【００８５】
表１に、測定されたピークの質量値、元のグロビン・ペプチド鎖のＣ末端断片に起因するピークの質量値、質量値の差異、ならびに、それから特定される各反応産物断片において除去されているアミノ酸、および、各反応産物の形態を示す。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
図６には図５の測定で使用した同じペプチド断片混合物をポジティブイオンモードで高精度が出るリフレクターモードを使用して測定した結果の質量分析スペクトルを示す。図６は、ウマ・ミオグロビンを逐次分解後トリプシン消化を行い、得られたペプチド断片群をポジティブイオンモードで測定して、ピログルタミン酸をＮ末端に持つペプチドを高精度（リフレクターモード）で測定して得られる。「Ｔ」はトリプシンの自己消化物断片を示す。
【００８８】
３本のピークが逐次分解特異的なグルタミン酸のアミノ基側での切断とその結果形成されるピログルタミン酸をＮ末端に、またアルギニンをＣ末端側にもつペプチド断片として観測された。図６中の「Ｔ」はトリプシンの自己消化物を示す。トリプシンの自己消化物ペプチド断片の分子量は公知であるから解析作業からはあらかじめ除外された。残りの３本のピークは対応するペプチド断片が「Ｎ末端がピログルタミン酸でＣ末端がアルギニンである」ものと仮定して前記ペプチドの１次候補群の中からトリプシンによる断片化処理により生じうるかどうか絞り込んだ。３本のピークはまたグルタミン酸の切断を伴わずアルギニンのカルボキシ基側での切断のみで生じている可能性も考慮した。
【００８９】
こうすることにより前記ペプチドの１次候補群の中からウマ・ミオグロビンがもっとも確からしいものとして２次的に絞り込まれた。
【００９０】
図７には高分子量領域（２８００−３３００）での測定結果得られた質量分析スペクトルを示す。図７は、ウマ・ミオグロビンを逐次分解後トリプシン消化を行い、得られたペプチド断片群をネガティブイオンモード（図７（ａ））、ポジティブイオンモード（図７（ｂ））で測定した結果のスペクトルを示す。高分子量領域（２８００−３３００）測定のためリニアイオンモードを使用した結果である。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４はＰ０（（ｐｙｒＥ）ＷＱＱＶＬＮＶＷＧＫＶＥＡＤＩＡＧＨＧＱＥＶＬＩＲ［６−３１］）の２つのトリプトファンが酸化して得られたピークで、それぞれ１酸化体、２酸化体、３酸化体、４酸化体を示す。この場合、ネガティブイオンモードでは観測されないピークがポジティブイオンモードで５本観察されており、それぞれＰ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４と示したピークの観測されたｍ／ｚは２９９９．８（Ｐ０）、３０１５．２（Ｐ１）、３０３２．１（Ｐ２）、３０４８．１（Ｐ３）、３０６４．１（Ｐ４）であった。これらのピークも上述の通りグルタミン酸で断片化を受けてピログルタミン酸化しＣ末端側にはアルギニンをもつペプチド断片として帰属でき、データベース検索に有効に利用された。なお、pyrEはピログルタミン酸を示す。［］内は残基番号である。また、図７（ｂ）中、２９９９．８０は、観測値を示す。
【００９１】
前記実施例のデータベースサーチについてより詳しく記述する。まず、図４の結果および表１の結果から観測対象となっているペプチドのＣ末端配列は「ＧＦＱＧ」となっていることが推定される。この条件でデータベース検索を行うと、各種生物由来のミオグロビン５４個、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  由来のＰｒｏｔｅｉｎ−Ｌ−ｉｓｏａｓｐａｒｔａｔｅ  Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１この合計５５個のペプチドが候補としてヒットした。なおデータベースはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｖｅｒ．  ４１を使用した。図４の結果からはＣ末端ペプチド断片の分子量が１６３４．６と観測されていることから、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌ−ｉｓｏａｓｐａｒｔａｔｅ  Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅは候補から外れることがわかった。なぜならＰｒｏｔｅｉｎ−Ｌ−ｉｓｏａｓｐａｒｔａｔｅ  Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅのＣ末端断片の配列は「ＧＤＥＩＩＩＫＤＣＧＰＶＡＦＶＰＬＶＧＫＥＧＦＱＧ」であり、リシンがアセチル化を受けているものとしてその分子量は２６７１．３６、その観測値は２６７０前後となるはずだからである。この値をもつピークは観察されなかった。したがって１次候補として各種生物由来のミオグロビン５４個が選択された。
【００９２】
次に図６の結果からは観察対象のペプチドは６１１．２７、５４６．３９、１４８９．６５というポジティブイオンモードで強調されるペプチド断片が生成されることがわかった。１次候補のなかからこれらの事実を反映するペプチドの選別をおこなうと、次の６種の動物に絞られた。すなわち、ウマ、ヨーロッパカワウソ、タヌキ、ユーラシアビーバー、南米ナキウサギ、ウサギである。これらの候補のうち、図７に示したＰ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４に該当するペプチド断片に該当する分子量をもつピークを算出できるのはウマのみであることがわかった。図７のピーク、Ｐ０は「ｐｙｒＥＷＱＱＶＬＮＶＷＧＫＶＥＡＤＩＡＧＨＧＱＥＶＬＩＲ」に該当した。Ｎ末端はピログルタミル化、リシンはすべてアセチル化を受けているとすると分子量は２９９７．６となる。内部にあるトリプトファン（Ｗ）は容易に１酸化（＋１６）、２酸化（＋３２）を受けることが広く知られている。該ペプチド断片にはトリプトファンが２つあるので３酸化、４酸化も観測されるはずである。事実、これら酸化ピークがＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４に対応した。
【００９３】
以上のように、Ｃ末端逐次分解反応により得られる反応産物をトリプシンで断片化し、Ｃ末端欠損ペプチド断片、ピログルタミル化ペプチド断片等を得ることによりＣ末端アミノ酸配列、Ｃ末端断片ペプチドの分子量、グルタミン酸がピログルタミル化した切断片の帰属、などを行うことにより、データベース中のペプチド群の中から、特定のペプチドの同定が可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】実施の形態に係るペプチドの同定方法のフローチャートを示す図である。
【図２】実施の形態に係るペプチドの同定方法を説明する図である。
【図３】実施の形態に係る脱水型ペプチドの構造の一部を示す図である。
【図４】ウマ・ミオグロビンのアミノ酸配列を示す図である。
【図５】実施例に係るペプチドの質量分析スペクトルを示す図である。
【図６】実施例に係るペプチドの質量分析スペクトルを示す図である。
【図７】実施例に係るペプチドの質量分析スペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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