(57)【要約】【課題】血清蛋白と二次抗体との非特異的結合によるバックグランドシグナルを抑制できることを特徴とする血中の特異抗体を測定する方法を提供すること。【解決手段】固相上の標的蛋白質と動物由来血清とを接触させることによって該標的蛋白質に血清中の抗体を結合させることを含む、血中の特異抗体を測定する方法において、ブロッキング剤として、上記血清が由来する動物とは異なる動物に由来する血清を用いることを特徴とする上記の方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相上の標的蛋白質と動物由来血清とを接触させることによって該標的蛋白質に血清中の抗体を結合させることを含む、血中の特異抗体を測定する方法において、ブロッキング剤として、上記血清が由来する動物とは異なる動物に由来する血清を用いることを特徴とする上記の方法。
【請求項２】
固相上の標的蛋白質が、組換え精製蛋白質であるか、標的蛋白質発現細胞上に発現している該標的蛋白質であるか、標的蛋白質発現細胞の可溶化液中の標的蛋白質である、または細胞外に分泌された細胞培養液中の標的分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該標的蛋白質に結合した血清中の抗体を、標識二次抗体を用いて検出することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
固相上の標的蛋白質に接触させる動物由来血清がマウス血清であり、ブロッキング剤としてマウス以外の動物の血清を用いる、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
ブロッキング剤として用いるマウス以外の動物の血清が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラット又はヒトの血清である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ブロッキング剤として用いるマウス以外の動物の血清が、ウシ又はヒツジの血清である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ブロッキング剤を、標的蛋白質が固定化されている固相に接触させることによって、及び／又は、ブロッキング剤を、標的蛋白質と接触させる動物由来血清に添加することによって、ブロッキングを行う、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
ブロッキング剤を、標的蛋白質と接触させる動物由来血清に添加することによって、ブロッキングを行う、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項９】
ブロッキング剤を、標的蛋白質が固定化されている固相に接触させるとともに、ブロッキング剤を、標的蛋白質と接触させる動物由来血清に添加することによって、ブロッキングを行う、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
動物由来血清に添加されるブロッキング剤の量が、動物由来血清に量に対して５〜２５重量％である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
標的蛋白質が上皮成長因子受容体（EGFR）であり、血中の抗EGFR抗体を測定する、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
血中の特異的ポリクローナル抗体又は動物に投与されたモノクローナル抗体を測定する、請求項１から１１の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中の特異抗体を測定する方法に関する。より詳細には、本発明は、試料として用いる血清が由来する動物とは異なる動物に由来する血清をブロッキング剤として用いることを特徴とする血中の特異抗体を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液や尿等の分析は、病態の診断や治療経過の判定に非常に有用であり、臨床検査の分野で重要な役割を果たしている。このような微量成分の分析方法として、該微量成分に対する抗体を用いて免疫学的に測定する方法が広く応用されている。免疫反応は抗原と抗体との間の特異的かつ高親和性の反応であり、抗体と抗原の平衡状態を標識抗原又は標識抗体とを用いて解析することにより測定対象の抗原を定量することができる。この標識として酵素を使用して酵素による化学増幅を利用したのが酵素免疫測定法である。
【０００３】
抗原発現細胞、あるいはその細胞可溶化液を用いて抗原−抗体反応を検出する免疫測定法は、細胞中の抗原量や、抗体の親和性を測定する系として用いられており、そのコンセプトは公知である(図１)。しかしながら、従来のcell-ELISA法においては、HRP（西洋ペルオキシダーゼ）やAP（アルカリフォスフォタ−ゼ）等の酵素標識２次抗体を用いて血中の特異的抗体量を検出する際には、血清蛋白と二次抗体の非特異的結合によるバックグランドシグナルを発することが知られており、微量抗体を測定することは困難であった。
【０００４】
【非特許文献１】Journal of Immunological Methods 191, 171, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、血清蛋白と二次抗体との非特異的結合によるバックグランドシグナルを抑制できることを特徴とする血中の特異抗体を測定する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、試料として用いる血清が由来する動物とは異なる動物に由来する血清をブロッキング剤として用いることによって、血清蛋白と二次抗体との非特異的結合によるバックグランドシグナルを抑制できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、固相上の標的蛋白質と動物由来血清とを接触させることによって該標的蛋白質に血清中の抗体を結合させることを含む、血中の特異抗体を測定する方法において、ブロッキング剤として、上記血清が由来する動物とは異なる動物に由来する血清を用いることを特徴とする上記の方法が提供される。
【０００８】
好ましくは、固相上の標的蛋白質は、組換え精製蛋白質であるか、標的蛋白質発現細胞上に発現している該標的蛋白質であるか、標的蛋白質発現細胞の可溶化液中の標的蛋白質であるか、または細胞外に分泌された培養液中の標的分子である。
好ましくは、該標的蛋白質に結合した血清中の抗体を、標識二次抗体を用いて検出する。
好ましくは、固相上の標的蛋白質に接触させる動物由来血清がマウス血清であり、ブロッキング剤としてマウス以外の動物の血清を用いる。
【０００９】
好ましくは、ブロッキング剤として用いるマウス以外の動物の血清は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラット又はヒトの血清である。
好ましくは、ブロッキング剤として用いるマウス以外の動物の血清は、ウシ又はヒツジの血清である。
好ましくは、ブロッキング剤を、標的蛋白質が固定化されている固相に接触させることによって、及び／又は、ブロッキング剤を、標的蛋白質と接触させる動物由来血清に添加することによって、ブロッキングを行う。
【００１０】
好ましくは、ブロッキング剤を、標的蛋白質と接触させる動物由来血清に添加することによって、ブロッキングを行う。
好ましくは、ブロッキング剤を、標的蛋白質が固定化されている固相に接触させるとともに、ブロッキング剤を、標的蛋白質と接触させる動物由来血清に添加することによって、ブロッキングを行う。
【００１１】
好ましくは、動物由来血清に添加されるブロッキング剤の量は、動物由来血清に量に対して５〜２５重量％である。
好ましくは、標的蛋白質が上皮成長因子受容体（EGFR）であり、血中の抗EGFR抗体を測定する。
好ましくは、血中の特異的ポリクローナル抗体又は動物に投与されたモノクローナル抗体を測定する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、血清サンプル中に異種の血清を加えることにより、特異的シグナルを減弱させることなく、血中蛋白と二次抗体の非特異的結合を低減することを特徴としている。これにより血中の特異的抗体量を高感度で測定することが可能となる。通常は、BSA、スキムミルク、抗体タンパク質などでブロッキングを行うが、血清サンプルには種々のタンパク質が混在しており、それらの非特異的吸着を抑制するには必ずしも十分ではなかった。本発明では、血清成分に近いブロッキング剤を用いることによって、血清蛋白と二次抗体との非特異的結合によるバックグランドシグナルを抑制することが可能になり、これにより血中の特異的抗体量を高感度で測定することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。
本発明は、固相上の標的蛋白質と動物由来血清とを接触させることによって該標的蛋白質に血清中の抗体を結合させることを含む、血中の特異抗体を測定する方法において、ブロッキング剤として、上記血清が由来する動物とは異なる動物に由来する血清を用いることを特徴とする方法である。
【００１４】
固相上の標的蛋白質としては、組換え精製蛋白質でもよいし、標的蛋白質発現細胞上に発現している該標的蛋白質でもよいし、標的蛋白質発現細胞の可溶化液中の標的蛋白質でもよいし、または細胞培養液中の標的蛋白質でもよい。即ち、図１の細胞ELISAに示す通り、固相上に標的蛋白質発現細胞を固定することによって、固相上に標的蛋白質を設置することができる。あるいは、図１の細胞可溶化液サンドイッチELISAに示す通り、捕捉抗体を固定化した固相に、標的蛋白質発現細胞の可溶化液を接触させることによって、標的蛋白質を固相上に固定化してもよい。標的蛋白質発現細胞を用いる場合、10,000〜40,000細胞、又は100〜500 μgの標的蛋白質発現細胞を用いることができる。
【００１５】
標的蛋白質の種類は特に限定されず任意の蛋白質を選択できるが、例えば、種々のサイトカン及びサイトカイン受容体、ケモカイン及びその受容体、その他成長因子と成長因子受容体（上皮成長因子、血管内皮細胞成長因子、インスリン様成長因子、肝細胞成長因子等を含む）を挙げることができる。
【００１６】
本発明においては、固相上の標的蛋白質と動物由来血清とを接触させることによって該標的蛋白質に血清中の抗体を結合させる。次いで、好ましくは、標的蛋白質に結合した血清中の抗体を、標識二次抗体を用いて検出する。標識二次抗体としては、上記動物由来血清の動物と同一の動物に由来する抗体であって、検出可能な標識で標識した抗体を用いることができる。例えば、上記動物由来血清がマウス血清である場合には、標識した抗マウスIgG抗体を用いることができる。
【００１７】
二次抗体の標識の種類は特に限定されないが、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジンあるいは放射性同位体等が挙げられ、より具体的には、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉ若しくは131Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、または化学発光物質などが挙げられる。
【００１８】
本発明では、ブロッキング剤として、固相上の標的蛋白質と接触させる血清（即ち、測定対象試料として用いる血清）が由来する動物とは異なる動物に由来する血清を用いることを特徴とする。例えば、固相上の標的蛋白質に接触させる動物由来血清がマウス血清である場合には、ブロッキング剤としてマウス以外の動物の血清を用いることができ、この場合、好ましくはウシ、ヒツジ、ヤギ、ラット又はヒトの血清を用いることができる、特に好ましくはウシ又はヒツジの血清を用いることができる。
【００１９】
ブロッキング剤の使用方法としては、標的蛋白質が固定化されている固相に接触させる方法、及び／又は、ブロッキング剤を、標的蛋白質と接触させる動物由来血清に添加する方法の何れでもよく、上記方法の両方又は何れか一方を採用することができる。好ましい態様は上記両方を採用することである。動物由来血清に添加されるブロッキング剤の量は本発明の効果が達成できる限り特に限定されないが、好ましくは動物由来血清に量に対して５〜２５重量％である。
【００２０】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
実施例１：ELISAに用いる2次抗体の非特異的吸着を低減する条件の同定
（方法）
ELISAプレートに、表１に示す各種ブロッキング剤を200μL/well加えて、１時間室温でインキュベートした。PBSで2回洗浄した。マウス血清をPBSで100倍希釈して、50μL/well加えて、室温で２時間インキュベートした。PBSで3回洗浄した。PBSで5000倍希釈した二次抗体（HRP標識抗マウスIgG抗体）（GE Healthcare, #NA931-1ML）を50μL/well加えて、２時間室温でインキュベートした。PBSで3回洗浄した。TMB発色液（scytek lab, #TM4999）を100μL/well加えた。反応停止液（scytek lab, # TSB999）を100μL/well加え、450nmの吸光度を測定した。結果を図２に示す。
【００２２】
【表１】
2009229074.tif 000002
【００２３】
実施例２：Protein Aに対するマウス抗体（血清中に存在）を検出する際の、10%ヒツジ血清のブロッキング効果
（方法）
固相化バッファー（Sigma, #C3041-50CAP）に、標的蛋白質に対する抗体（マウスではない種の抗体）を希釈して、ELISAプレートに50μl/well加えた。PBSで2回洗浄した。ELISAプレートに、10%ヒツジ血清（PBSで希釈）または５％BSA（PBSで希釈）を200μL/well加えて、１時間室温でインキュベートした。その後、0.05%のTween-20を含むPBS(PBS-tween)で2回洗浄した。その後、標的タンパク質発現細胞の可溶化液或いは、標的タンパク質を含む細胞外液を50μL/well加え、２-３時間室温でインキュベートした。PBS-tweenで３回洗浄後、標的蛋白質に対するマウス抗体を含んだマウス血清サンプル（対照として、Protein Aに対するマウス抗体を含まないマウス血清サンプルも用いた。Blankとして、用いている。図の「抗体なしの血清サンプル」がこれである）を、PBSまたは10％ヒツジ血清で100倍希釈する。それを、50μL/well加えて、室温で２時間インキュベートした。PBS-tweenで3回洗浄した。PBSで5000倍希釈した二次抗体（HRP標識抗マウスIgG抗体）（GE Healthcare, #NA931-1ML）を50μL/well加えて、２時間室温でインキュベートした。PBS-tweenで3回洗浄した。TMB発色液（scytek lab, #TM4999）を100μL/well加えた。反応停止液（scytek lab, # TSB999）を100μL/wel加え、450nmの吸光度を測定した。結果を図３に示す。５％BSAに代えて10%ヒツジ血清を用いることによって、シグナル/ノイズ（S/N）比は、1.4 から 4.6 に向上した。
【００２４】
実施例３：
組換え精製蛋白質、標的蛋白質発現細胞の可溶化液中の標的蛋白質、または細胞培養液中の標的分子ではなく、標的蛋白質を細胞上に発現している細胞そのものを用いた細胞ELISAにおいても、上記実施例２と同様の結果を得た。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、細胞ＥＬＩＳＡ及び細胞可溶化液ＥＬＩＳＡの概要を示す。
【図２】図２は、表１内の各条件におけるバックグラウンド（非特異的吸着）の値を示す。
【図３】図３は、Protein Aに対するマウス抗体（血清中に存在）を検出する際の、10%ヒツジ血清のブロッキング効果を示す。
【図１】
2009229074.tif 000003
【図２】
2009229074.tif 000004
【図３】
2009229074.tif 000005