(57)【要約】【課題】カイコ由来細胞を利用して有用タンパク質を培地中やカイコ体内に蓄積させることが行われているが、多くのカイコ由来細胞にカイコマキュラ様ウイルスが存在することが報告された。カイコ由来細胞を利用して有用タンパク質を製造する際に、ウイルス安全性保証を高めるために、カイコマキュラ様ウイルスを除去または不活化する方法を提供する。  【解決手段】カイコ由来細胞を使用して有用タンパク質を製造する際に、製造工程中間製品をクロマトグラフィーで処理することで、含まれるカイコマキュラ様ウイルスを除去することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カイコ由来細胞を使用して有用タンパク質を製造する際に、カイコ由来細胞に混入したカイコマキュラ様ウイルスが含まれる製造工程中間製品をクロマトグラフィーで処理することを特徴とするカイコマキュラ様ウイルスの除去方法。
【請求項２】
クロマトグラフィーがブルーセファロースまたは銅キレートセファロースであることを特徴とするカイコマキュラ様ウイルスの除去方法。
【請求項３】
有用タンパク質の製造が、有用タンパク質をコードする遺伝子により組換えられた遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスをカイコ由来細胞に接種することを特徴とする請求項１または２記載のカイコマキュラ様ウイルスの除去方法。
【請求項４】
有用タンパク質の製造が、有用タンパク質をコードする遺伝子により組換えられた遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスをカイコ虫体に接種することを特徴とする請求項１または２記載のカイコマキュラ様ウイルスの除去方法。
【請求項５】
カイコ虫体がカイコ幼虫またはカイコ蛹であることを特徴とする請求項４記載のカイコマキュラ様ウイルスの除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カイコ由来細胞を利用して有用タンパク質を製造する際に、カイコ由来細胞に存在しているカイコマキュラ様ウイルスを除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カイコ由来細胞を用いて遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスを作製し、その遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスをカイコ由来細胞やカイコ虫体に接種して、有用タンパク質を培地中やカイコ体内に蓄積させることが行われている（特許文献１）。しかしながら、多くのカイコ由来細胞にカイコマキュラ様ウイルス（以下ＢｍＭＬＶと略称する）が存在することが報告された（非特許文献１）。そのため、有用タンパク質の製造工程にカイコ由来細胞を使用する際には、ＢｍＭＬＶに関する安全性保証のために、ＢｍＭＬＶを不活化または／かつ除去することが課題となる。
【特許文献１】特許第２６２１６５６号公報
【非特許文献１】Ｋａｔｓｕｍａら著、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７９巻、５５７７−５５８４ページ（２００５年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、カイコマキュラ様ウイルスの不活化または除去が可能となれば、カイコ由来細胞を利用した有用タンパク質の生産法のウイルス安全性保証のレベルは向上し、カイコ由来細胞を利用した生産法による有用タンパク質の量産の道は更に広がると期待される。
本発明の目的は、カイコ由来細胞を利用して有用タンパク質を製造する際に、ＢｍＭＬＶを除去する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、カイコマキュラ様ウイルスを含んだ有用タンパク質をクロマトグラフィー操作することにより、カイコマキュラ様ウイルスを効率的に除去することに成功し、カイコ由来細胞を用いて有用タンパク質を生産する方法を確立し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、カイコ由来細胞を使用して有用タンパク質を製造する際に、カイコ由来細胞に混入したカイコマキュラ様ウイルスが含まれる製造工程中間製品をクロマトグラフィーで処理することを特徴とするカイコマキュラ様ウイルスの除去方法。を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、以下に説明するとおり、カイコ由来細胞を使用して有用タンパク質を製造する際に効率よくＢｍＭＬＶを除去することができ、生産された有用タンパク質のウイルス安全性保証レベルを高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明の最良の実施形態の例を説明する。
【０００７】
本発明の有用タンパク質としては特に限定されないが、クロマトグラフィー操作に対して安定なタンパク質が好ましい。そのようなタンパク質としては種々報告され、今後も多くのものが報告されるであろうが、それらへの応用が可能である。例えば、イヌインターフェロン−γ、ヒトインターフェロン−β、ネコインターフェロン−ω、マウスインターフェロン−βなどのインターフェロン類が挙げられる。
【０００８】
使用するクロマトグラフィーはどのようなクロマトグラフィーでも用いることができる。例をあげるならば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、などがあげられるが、好ましくはブルーセファロースクロマトグラフィー、銅キレートクロマトグラフィーである。      
【０００９】
本発明は、製造のいずれかの工程でカイコ由来細胞を使用する有用タンパク質の製造方法であれば適用できる。例えるならば、有用タンパク質をコードする遺伝子を単離し、それを市販の核多角体病ウイルスのゲノム中に挿入し、ＢＭ−Ｎ細胞などのカイコ培養細胞に感染させることで、遺伝子組換えウイルスを作製し、それをＢＭ−Ｎ細胞、カイコ幼虫やカイコ蛹などのカイコ虫体に接種して有用タンパク質を製造する方法に適用できる。核多病体病ウイルスは昆虫に感染し、多角体と呼ばれる構造体を昆虫細胞内に蓄積させるウイルスであり、そのタンパク質合成能力の高さから、遺伝子組み換えタンパク質の製造に用いられている。またその他の例として、遺伝子組換えカイコ細胞、遺伝子組換えカイコ虫体を用いた有用タンパク質の製造法にも適用できる。
【００１０】
クロマトグラフィー操作を行う工程は、カイコ由来細胞が有用蛋白質を産生した後の製造工程中のどの段階でも可能である。細胞培養で有用タンパク質を製造する場合であれば、培養終了後の培養液でも、精製工程の中間工程製品でも可能であるし、また、カイコ虫体で有用タンパク質を製造する場合であれば、カイコの抽出液でも、精製工程の中間工程製品でもクロマトグラフィー処理することが可能である。またクロマトグラフィーに用いる溶離液はどのような溶媒をもとに調製することも可能であるが、好的には水溶液が用いられる。また溶離液の溶質についても特に限定はなく、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムの塩化物、リン酸塩、酢酸塩、硫酸塩などの塩類、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、Tween20などの界面活性剤といった溶離液に溶解する化合物であればいかなるものでも含むことができる。またそのｐＨについても特に限定はない。
【００１１】
クロマトグラフィーを行う温度については、特に限定はないが、作業環境を考慮して０℃〜４０℃が望ましい。目的タンパク質の安定性が低い場合には、低温であることが好ましく、その場合、４℃〜１６℃の環境で行われる。
【実施例】
【００１２】
実施例１
（１）ＢｍＭＬＶ液の調製
マキュラ様ウイルスは、感染が確認されているカイコＢｍＮ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８９１０）より調製した。１０％牛胎児血清を含むＴＣ−１００培地で培養したＢｍＮ細胞20×１０７個に20ｍＬの燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、超音波処理により細胞を破砕後、6000Ｇ、15分、４℃で遠心し、その上清を0.22μｍのフィルターで濾過してマキュラ様ウイルス液を得た。
【００１３】
（２）マキュラ様ウイルスの検出
各クロマトともアプライ画分、素通り画分、溶出各分について、マキュラ様ウイルスの検出試験に供した。ＰＣＲチューブに２７μＬずつ蒸留水を入れ、サンプルを３μＬ注入し、ピペッティングにより十分攪拌した。このチューブからさらに３μＬを別のチューブに加えることで繰り返し希釈を行い、各サンプルとも１０〜１０５倍に段階希釈した。
【００１４】
各希釈サンプルをCell-to-Signalキット（Ambion）を用いて逆転写し、Premix Ex-Taq（タカラバイオ）、配列番号１および配列番号２のプライマーを用いてＰＣＲを行った。1.5％アガロースゲル電気泳動を行い、360bp付近にバンドが見られたものをマキュラ様ウイルス陽性とし、３回の測定のうち２回以上得られた結果をそのサンプルの測定結果とした。なお、測定は１サンプルにつき３回行った。
【００１５】
電気泳動の結果、段階希釈により陽性となる希釈段階数をウイルスのタイターとし、ウイルスクリアランスの判定を行った。
【００１６】
（３）ブルークロマトグラフィーによるカイコマキュラ様ウイルス除去
ブルーセファロース（ＧＥヘルスサイエンス）をカラムに５ｍＬ容量となるように詰め、連続２回のＢｍＭＬＶ添加サンプルの精製を行った。ＢｍＭＬＶ添加サンプルは特許第2513909号公報の実施例２と同様の方法で得られたネコインターフェロンを１×１０６Ｕ／ｍＬ含むカイコ体液８５ｍＬに５ｍＬの（１）で調製したＢｍＭＬＶ液を加えて調製した。
【００１７】
ＢｍＭＬＶ添加サンプル８５ｍＬをカラムに通液し、通過した液（ＢＴ画分）を採取した。通液に供したＢｍＭＬＶ添加サンプルは一部保管しＢＡ画分とした。カラム通液後、洗浄液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８））５０ｍＬをカラムに通液し、続いて溶出液１（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）−０．５Ｍ塩化ナトリウム）５０ｍＬ、溶出液２（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）−１Ｍ塩化ナトリウム）５０ｍＬを通液し、カラムから出てくる画分を分取した。通液はすべて５〜１２．５ｍＬ／ｈｏｕｒの流速で行った。
【００１８】
各画分をタンパク質定量（BCA法）およびＳＤＳ電気泳動したところ、溶出液２で溶出された画分に、約２５ｋＤのネコインターフェロンのバンドが検出されたので溶出画分（ＢＲ画分）とした。
【００１９】
ＢＡ、ＢＴ、ＢＲ画分中のウイルス量をＲＴ−ＰＣＲ法で測定した結果を表１に示す。その結果、ウイルスの大部分はクロマトグラフィーに吸着せず通過しており、吸着後溶出されるネコインターフェロンを含むＢＲ画分中にはカイコマキュラ様ウイルスが２桁除去されていることがわかった。
【００２０】
【表１】
2009201490.tif 000002
【００２１】
（４）銅キレートクロマトグラフィーによるカイコマキュラ様ウイルス除去
キレートセファロース（ＧＥヘルスサイエンス）をカラムに２ｍＬ容量となるように詰め、連続２回の銅イオンキレート化、ＢｍＭＬＶ添加サンプルの精製を行った。
ＢｍＭＬＶ添加サンプルは（３）に記載の方法でカイコ体液より精製し得られたネコインターフェロン溶出画分１７５ｍＬに５ｍＬの（１）で調製したＢｍＭＬＶ液を加えて調製した。
【００２２】
ＢｍＭＬＶ添加サンプル１７０ｍＬを銅イオンキレート後のカラムに通液し、通過した液（ＣＴ画分）を採取した。通液に供したＢｍＭＬＶ添加サンプルは一部保管しＣＡ画分とした。その後、洗浄液（５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）−０．５Ｍ塩化ナトリウム）４０ｍＬをカラムに通液し、続いて溶出液１（５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．９）−０．５Ｍ塩化ナトリウム）４０ｍＬ、溶出液２（５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．６）−０．５Ｍ塩化ナトリウム）ｍＬを通液し、カラムから出てくる画分を分取した。通液はすべて      ８〜１２ｍＬ／ｈｏｕｒの流速で行った。
【００２３】
各画分をタンパク質定量（BCA法）およびＳＤＳ電気泳動したところ、溶出液２で溶出された画分に、約２５ｋＤのネコインターフェロンのバンドが検出されたので溶出画分（ＣＲ画分）とした。
【００２４】
ＣＡ、ＣＴ、ＣＲ画分中のウイルス量をＲＴ−ＰＣＲ法で測定した結果を表２に示す。その結果、ウイルスはクロマトグラフィーに吸着するものの、吸着後溶出されるネコインターフェロンを含むＣＲ画分中にも溶出しなかった。その結果、ＣＲ画分中では、当初のＣＡ画分に比べて、カイコマキュラ様ウイルスが２桁〜３桁除去されていることがわかった。
【００２５】
【表２】
2009201490.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明は、遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスを用いた有用タンパク質の製造に限らず、形質転換カイコ細胞や形質転換カイコを用いた有用タンパク質の製造に応用することができるが、その応用範囲が、これらに限られるものではない。
【配列表】
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