(57)【要約】【課題】負極に少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼがポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により固定化される場合に、電流密度およびその維持率の向上を図ることができる燃料電池を提供する。【解決手段】正極２と負極１とが電解質層３を介して対向した構造を有し、負極１が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなる燃料電池において、固定化材におけるポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとの質量比を５：１〜８０：１、グルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼとの質量比を１：３〜２００：１、ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量を２１５００以上とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、
上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなり、
上記ポリ−Ｌ−リシンと上記グルタルアルデヒドとの質量比が５：１〜８０：１である燃料電池。
【請求項２】
上記電極がカーボンからなる請求項１記載の燃料電池。
【請求項３】
上記カーボンが多孔質カーボンである請求項２記載の燃料電池。
【請求項４】
上記プロトン伝導体が緩衝物質としてイミダゾール環を含む化合物を含む電解質からなる請求項３記載の燃料電池。
【請求項５】
上記イミダゾール環を含む化合物に塩酸、酢酸、リン酸および硫酸からなる群より選ばれた少なくとも一種の酸が添加されている請求項４記載の燃料電池。
【請求項６】
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなる燃料電池を製造する場合に、上記ポリ−Ｌ−リシンと上記グルタルアルデヒドとの質量比を５：１〜８０：１とするようにした燃料電池の製造方法。
【請求項７】
一つまたは複数の燃料電池を有し、
少なくとも一つの上記燃料電池が、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなり、上記ポリ−Ｌ−リシンと上記グルタルアルデヒドとの質量比が５：１〜８０：１であるものである電子機器。
【請求項８】
ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化され、
上記ポリ−Ｌ−リシンと上記グルタルアルデヒドとの質量比が５：１〜８０：１である酵素固定化電極。
【請求項９】
ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化された酵素固定化電極を製造する場合に、上記ポリ−Ｌ−リシンと上記グルタルアルデヒドとの質量比を５：１〜８０：１とするようにした酵素固定化電極の製造方法。
【請求項１０】
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、
上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなり、
上記ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量が２１５００以上である燃料電池。
【請求項１１】
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなる燃料電池を製造する場合に、上記ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量を２１５００以上とするようにした燃料電池の製造方法。
【請求項１２】
一つまたは複数の燃料電池を有し、
少なくとも一つの上記燃料電池が、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなり、上記ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量が２１５００以上であるものである電子機器。
【請求項１３】
ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化され、
上記ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量が２１５００以上である酵素固定化電極。
【請求項１４】
ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化された酵素固定化電極を製造する場合に、上記ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量を２１５００以上とするようにした酵素固定化電極の製造方法。
【請求項１５】
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、
上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなり、
上記グルコースデヒドロゲナーゼと上記ジアホラーゼとの質量比が１：３〜２００：１である燃料電池。
【請求項１６】
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなる燃料電池を製造する場合に、上記グルコースデヒドロゲナーゼと上記ジアホラーゼとの質量比を１：３〜２００：１とするようにした燃料電池の製造方法。
【請求項１７】
一つまたは複数の燃料電池を有し、
少なくとも一つの上記燃料電池が、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなり、上記グルコースデヒドロゲナーゼと上記ジアホラーゼとの質量比が１：３〜２００：１であるものである電子機器。
【請求項１８】
ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化され、
上記グルコースデヒドロゲナーゼと上記ジアホラーゼとの質量比が１：３〜２００：１である酵素固定化電極。
【請求項１９】
ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化された酵素固定化電極を製造する場合に、上記グルコースデヒドロゲナーゼと上記ジアホラーゼとの質量比を１：３〜２００：１とするようにした酵素固定化電極の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、燃料電池およびその製造方法ならびに酵素固定化電極およびその製造方法ならびに電子機器に関する。より詳細には、この発明は、負極に少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼがポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により固定化されている燃料電池およびその製造方法に適用して好適なものである。さらに、この発明は、この燃料電池に用いて好適な酵素固定化電極およびその製造方法ならびにこの燃料電池を用いる電子機器に関する。
【背景技術】
【０００２】
燃料電池は、正極（酸化剤極）と負極（燃料極）とが電解質（プロトン伝導体）を介して対向した構造を有する。従来の燃料電池では、負極に供給された燃料（水素）が酸化されて電子とプロトン（Ｈ+ ）とに分離し、電子は負極に渡され、Ｈ+ は電解質を通って正極まで移動する。正極では、このＨ+ が、外部から供給された酸素および負極から外部回路を通って送られた電子と反応してＨ2 Ｏを生成する。
【０００３】
このように、燃料電池は燃料の持つ化学エネルギーを直接電気エネルギーに変換する高効率な発電装置である。すなわち、燃料電池は、天然ガス、石油、石炭などの化石エネルギーが持つ化学エネルギーを使用場所や使用時によらずに、しかも高い変換効率で電気エネルギーとして取り出すことができる。このため、従来から大規模発電用途などとしての燃料電池の開発研究が活発に行われている。例えば、スペースシャトルに燃料電池が搭載され、電力と同時に乗組員用の水を補給できることや、クリーンな発電装置であることを証明した実績がある。
【０００４】
さらに、近年、固体高分子型燃料電池など、室温から９０℃程度の比較的低温の作動温度域を示す燃料電池が開発され、注目を集めている。このため、大規模発電用途のみならず、自動車の駆動用電源、パーソナルコンピュータやモバイル機器などのポータブル電源などの小型システムへの応用が模索されつつある。
このように、燃料電池は大規模発電から小規模発電まで幅広い用途が考えられ、高効率な発電装置として多くの注目を集めている。しかしながら、燃料電池では、燃料として通常、天然ガス、石油、石炭などを改質器により水素ガスに変換して用いているため、限りある資源を消費するという問題がある。また、燃料電池は、高温に加熱する必要があったり、白金（Ｐｔ）などの高価な貴金属の触媒を必要としたりするなどの問題もある。さらに、水素ガスやメタノールを直接燃料として用いる場合でも、その取り扱いには注意を要する。
【０００５】
そこで、生物内で行われている生体代謝が高効率なエネルギー変換機構であることに着目し、これを燃料電池に適用する提案がなされている。ここでいう生体代謝には、微生物体細胞内で行われる呼吸、光合成などが含まれる。生体代謝は、発電効率が極めて高く、また、室温程度の穏やかな条件で反応が進行するという特長を兼ね備えている。
例えば、呼吸は、糖類、脂肪、タンパク質などの栄養素を微生物または細胞内に取り込み、これらの化学エネルギーを次のようにして電気エネルギーに変換する機構である。すなわち、取り込まれた栄養素から、数々の酵素反応ステップを有する解糖系およびトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路を介して二酸化炭素（ＣＯ2 ）を生成する。この二酸化炭素を生成する過程でニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+ ）を還元して還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とすることで酸化還元エネルギー、すなわち電気エネルギーに変換する。さらに、電子伝達系においてこれらのＮＡＤＨの電気エネルギーをプロトン勾配の電気エネルギーに直接変換するとともに酸素を還元し、水を生成する。ここで得られた電気エネルギーは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）合成酵素を介して、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）からＡＴＰを生成し、このＡＴＰは微生物や細胞が生育するために必要な反応に利用される。このようなエネルギー変換は、細胞質ゾルおよびミトコンドリアで行われている。
【０００６】
また、光合成は、光エネルギーを取り込み、電子伝達系を介してニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+ ）を還元して還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）とすることで電気エネルギーに変換する過程で、水を酸化し酸素を生成する機構である。この電気エネルギーは、ＣＯ2 を取り込み炭素固定化反応に利用され、炭水化物の合成に利用される。
上述のような生体代謝を燃料電池に利用する技術としては、微生物中で発生した電気エネルギーを電子メディエーターを介して微生物外に取り出し、この電子を電極に渡すことで電流を得る微生物電池が報告されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００７】
しかしながら、微生物および細胞には化学エネルギーから電気エネルギーへの変換といった目的の反応以外にも不要な反応が多く存在するため、上述の方法では望まない反応に化学エネルギーが消費されて十分なエネルギー変換効率が得られない。
そこで、酵素を用いて所望の反応のみを行う燃料電池（バイオ燃料電池）が提案されている（例えば、特許文献２〜１３参照。）。このバイオ燃料電池は、燃料を酵素により分解してプロトンと電子とに分離するもので、燃料としてメタノールやエタノールのようなアルコール類あるいはグルコースのような単糖類あるいはデンプンのような多糖類を用いたものが開発されている。
【０００８】
このバイオ燃料電池においては、電極に対する酵素や電子メディエーターの固定化が非常に重要であり、出力特性、寿命、効率などに非常に大きな影響を与えることが知られている。従来、燃料としてグルコースを用いるバイオ燃料電池の負極においては、グルコースデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、電子メディエーターなどを電極に固定化することが知られている。一方、酵素などの固定化材として、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材が知られている（例えば、特許文献４参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−１３３２９７号公報
【特許文献２】特開２００３−２８２１２４号公報
【特許文献３】特開２００４−７１５５９号公報
【特許文献４】特開２００５−１３２１０号公報
【特許文献５】特開２００５−３１０６１３号公報
【特許文献６】特開２００６−２４５５５号公報
【特許文献７】特開２００６−４９２１５号公報
【特許文献８】特開２００６−９３０９０号公報
【特許文献９】特開２００６−１２７９５７号公報
【特許文献１０】特開２００６−１５６３５４号公報
【特許文献１１】特開２００７−１２２８１号公報
【特許文献１２】特開２００７−３５４３７号公報
【特許文献１３】特開２００７−８７６２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これまで、上述のバイオ燃料電池の負極において、上述の固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを電極上に固定化する場合のポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとの質量比に関しては詳細な検討はなされていなかった。同様に、グルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼとの質量比に関しても詳細な検討はなされていなかった。また、ポリ−Ｌ−リシンの分子量に関しても詳細な検討はなされていなかった。
ところが、本発明者らの研究によれば、これらがバイオ燃料電池の電流密度およびその維持率に大きな影響を与えることが分かった。
そこで、この発明が解決しようとする課題は、負極に少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが上記の固定化材により固定化される場合に、電流密度およびその維持率の向上を図ることができる燃料電池およびその製造方法を提供することである。
この発明が解決しようとする他の課題は、負極に少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが上記の固定化材により固定化される燃料電池の負極に適用して好適な酵素固定化電極およびその製造方法を提供することである。
この発明が解決しようとするさらに他の課題は、上記のような優れた燃料電池を用いた電子機器を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
詳細は後述するが、本発明者らは、負極に少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを上述の固定化材により固定化する場合のポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとの質量比に関し鋭意研究を行った。さらに、ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量やグルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼとの質量比に関しても鋭意研究を行った。その結果、これらの質量比および平均分子量には最適な範囲が存在することを見出し、この発明を案出するに至った。
【００１２】
すなわち、上記課題を解決するために、
この発明は、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、
上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなり、
上記ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとの質量比が５：１〜８０：１である燃料電池である。
【００１３】
この発明はまた、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなる燃料電池を製造する場合に、上記ポリ−Ｌ−リシンと上記グルタルアルデヒドとの質量比を５：１〜８０：１とするようにした燃料電池の製造方法である。
【００１４】
この発明において、グルコースデヒドロゲナーゼ（特に、ＮＡＤ+ 依存型グルコースデヒドロゲナーゼ）は単糖類であるグルコースの酸化を促進し分解する酸化酵素である。ジアホラーゼは、このグルコースデヒドロゲナーゼによって還元される補酵素を酸化体に戻す補酵素酸化酵素である。負極には、グルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼに加えて好適には電子メディエーターも固定化され、必要に応じてさらに補酵素も固定化される。負極に固定化する補酵素は、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+ ）が用いられ、ジアホラーゼはこの補酵素の酸化酵素である。この場合、このジアホラーゼの作用により、補酵素が酸化体に戻るときに電子が生成され、補酵素酸化酵素から電子メディエーターを介して電極に電子が渡される。
【００１５】
一方、正極に酵素を固定化する場合、この酵素は、典型的には酸素還元酵素を含む。この酸素還元酵素としては、例えば、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどを用いることができる。いくつかの酸素還元酵素（マルチ銅オキシダーゼ）の詳細を表１に示す。この場合、正極には、好適には、酵素に加えて電子メディエーターも固定化される。電子メディエーターとしては、例えば、ヘキサシアノ鉄酸カリウム、フェリシアン化カリウム、オクタシアノタングステン酸カリウムなどを用いる。電子メディエーターは、好適には、十分に高濃度、例えば、平均値で０．６４×１０-6ｍｏｌ／ｍｍ2 以上固定化する。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
電子メディエーターとしては基本的にはどのようなものを用いてもよいが、好適には、キノン骨格を有する化合物、取り分け、ナフトキノン骨格を有する化合物が用いられる。このナフトキノン骨格を有する化合物としては各種のナフトキノン誘導体を用いることが可能である。具体的には、２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）、２−アミノ−３−メチル−１，４−ナフトキノン（ＡＭＮＱ）、２−メチル−１，４−ナフトキノン（ＶＫ３）、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）などが用いられる。キノン骨格を有する化合物としては、ナフトキノン骨格を有する化合物以外に、例えば、アントラキノンやその誘導体を用いることもできる。電子メディエーターには、必要に応じて、キノン骨格を有する化合物以外に、電子メディエーターとして働く一種または二種以上の他の化合物を含ませてもよい。キノン骨格を有する化合物、特にナフトキノン骨格を有する化合物を負極に固定化する際に用いる溶媒としては、好適にはアセトンが用いられる。このように溶媒としてアセトンを用いることにより、キノン骨格を有する化合物の溶解性を高めることができ、キノン骨格を有する化合物を負極に効率的に固定化することができる。溶媒には、必要に応じて、アセトン以外の一種または二種以上の他の溶媒を含ませてもよい。
【００１８】
正極または負極の電極の材料としては各種のものを用いることができるが、例えば、多孔質カーボン、カーボンペレット、カーボンフェルト、カーボンペーパーなどのカーボン系材料が用いられる。
プロトン伝導体としては、電子伝導性を持たず、プロトンのみ伝導するものである限り種々のものを用いることができ、必要に応じて選択される。具体的には、プロトン伝導体としては、例えば次のようなものが挙げられる。
・セロハン
・パーフルオロカーボンスルホン酸（ＰＦＳ）系の樹脂膜
・トリフルオロスチレン誘導体の共重合膜
・リン酸を含浸させたポリベンズイミダゾール膜
・芳香族ポリエーテルケトンスルホン酸膜
・ＰＳＳＡ−ＰＶＡ（ポリスチレンスルホン酸ポリビニルアルコール共重合体）
・ＰＳＳＡ−ＥＶＯＨ（ポリスチレンスルホン酸エチレンビニルアルコール共重合体）
・含フッ素カーボンスルホン酸基を有するイオン交換樹脂（ナフィオン（商品名、米国デュポン社）など）
【００１９】
プロトン伝導体として緩衝物質（緩衝液）を含む電解質を用いる場合には、高出力動作時において、プロトンを介する酵素反応により、プロトンの増減が電極内部または酵素の固定化膜内で起きても、十分な緩衝作用を得ることができることが望ましい。このように十分な緩衝作用を得ることができることにより、至適ｐＨからのｐＨのずれを十分に小さく抑えることができ、酵素が本来持っている能力を十分に発揮することができるようにすることができる。このためには、電解質に含まれる緩衝物質の濃度を０．２Ｍ以上２．５Ｍ以下にすることが有効であり、好適には０．２Ｍ以上２Ｍ以下、より好適には０．４Ｍ以上２Ｍ以下、さらに好適には０．８Ｍ以上１．２Ｍ以下とする。緩衝物質は、一般的には、ｐＫa が５以上９以下のものであれば、どのようなものを用いてもよい。具体例を挙げると、次の通りである。
・リン酸二水素イオン（Ｈ2 ＰＯ4 - ）
・２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（略称トリス（Ｔｒｉｓ））
・２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）
・カコジル酸
・炭酸（Ｈ2 ＣＯ3 ）
・クエン酸水素イオン
・Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）
・ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）
・Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）
・３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）
・Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）
・Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）
・Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（略称トリシン）
・グリシルグリシン
・Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（略称ビシン）
リン酸二水素イオン（Ｈ2 ＰＯ4 - ）を生成する物質は、例えば、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2 ＰＯ4 ）やリン酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）などである。緩衝物質としてはイミダゾール環を含む化合物も好ましい。このイミダゾール環を含む化合物の具体例を挙げると、次の通りである。
・イミダゾール
・トリアゾール
・ピリジン誘導体
・ビピリジン誘導体
・イミダゾール誘導体
イミダゾール誘導体の具体例を挙げると、次の通りである。
・ヒスチジン
・１−メチルイミダゾール
・２−メチルイミダゾール
・４−メチルイミダゾール
・２−エチルイミダゾール
・イミダゾール−２−カルボン酸エチル
・イミダゾール−２−カルボキシアルデヒド
・イミダゾール−４−カルボン酸
・イミダゾール−４，５−ジカルボン酸
・イミダゾール−１−イル−酢酸
・２−アセチルベンズイミダゾール
・１−アセチルイミダゾール
・Ｎ−アセチルイミダゾール
・２−アミノベンズイミダゾール
・Ｎ−（３−アミノプロピル) イミダゾール
・５−アミノ−２−（トリフルオロメチル) ベンズイミダゾール
・４−アザベンズイミダゾール
・４−アザ−２−メルカプトベンズイミダゾール
・ベンズイミダゾール
・１−ベンジルイミダゾール
・１−ブチルイミダゾール
緩衝物質としては、上に挙げたもののほか、２−アミノエタノール、トリエタノールアミン、ＴＥＳ（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid）、ＢＥＳ（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）などを用いてもよい。
上述の緩衝物質に加えて、例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ3 ＣＯＯＨ）、リン酸（Ｈ3 ＰＯ4 ）および硫酸（Ｈ2 ＳＯ4 ）からなる群より選ばれた少なくとも一種の酸を中和剤として加えてもよい。こうすることで、酵素の活性をより高く維持することができる。緩衝物質を含む電解質のｐＨは、好適には７付近であるが、一般的には１〜１４のいずれであってもよい。
【００２０】
この燃料電池の全体構成は必要に応じて選ばれるが、例えば、コイン型またはボタン型の構成とすることができる。この場合、好適には、酸化剤が透過可能な構造を有する正極集電体と燃料が透過可能な構造を有する負極集電体との間に形成された空間の内部に、正極、電解質および負極が収納された構造とする。また、この場合、典型的には、正極集電体および負極集電体の一方の縁が絶縁性の密封部材を介して正極集電体および負極集電体の他方に対してかしめられることで、正極、電解質および負極を収納する空間が形成されるが、これに限定されるものではない。例えば、必要に応じて他の加工方法によりこの空間を形成してもよい。正極集電体と負極集電体とは絶縁性の密封部材により互いに電気的に絶縁される。この絶縁性の密封部材としては、典型的には、シリコーンゴムなどの各種の弾性体からなるガスケットが用いられるが、これに限定されるものではない。これらの正極集電体および負極集電体の平面形状は必要に応じて選ぶことができるが、例えば、円形、楕円形、四角形、六角形などである。典型的には、正極集電体は一つまたは複数の酸化剤供給口を有し、負極集電体は一つまたは複数の燃料供給口を有するが、必ずしもこれに限定されるものではない。例えば、正極集電体の材料として酸化剤が透過可能なものを用いたりすることにより酸化剤供給口を形成しないでもよく、負極集電体の材料として燃料が透過可能なものを用いたりすることにより燃料供給口を形成しないでもよい。負極集電体は、典型的には、燃料保持部を有する。この燃料保持部は負極集電体と一体に設けてもよいし、負極集電体に対して着脱自在に設けてもよい。燃料保持部は、典型的には、密閉用の蓋を有する。この場合、この蓋を外して、燃料保持部に燃料を注入することができる。密閉用の蓋を用いないで、燃料保持部の側面などから燃料を注入するようにしてもよい。燃料保持部を負極集電体に対して着脱自在に設ける場合には、例えば、燃料保持部として、あらかじめ燃料が充填された燃料タンクや燃料カートリッジなどを取り付けてもよい。これらの燃料タンクや燃料カートリッジは、使い捨て形であってもよいが、資源の有効利用を図る観点より、燃料を充填することができるものが好ましい。また、使用済みの燃料タンクや燃料カートリッジを燃料が充填された燃料タンクや燃料カートリッジと交換してもよい。さらに、例えば、燃料保持部を燃料の供給口および排出口を有する密閉容器状に形成し、この供給口を介して外部から燃料を密閉容器内に連続的に供給することで燃料電池の連続使用が可能である。あるいは、燃料電池に燃料保持部を設けず、開放系の燃料タンクに入れられた燃料の上に燃料電池を負極側が下に、正極側が上になるようにして浮かべた状態で使用してもよい。
【００２１】
この燃料電池は、所定の中心軸の周りに、負極、電解質、正極および酸化剤が透過可能な構造を有する正極集電体が順次設けられており、燃料が透過可能な構造を有する負極集電体が負極と電気的に接続されて設けられている構造としてもよい。この燃料電池において、負極は、断面形状が円、楕円、多角形などの筒状であってもよいし、断面形状が円、楕円、多角形などの柱状であってもよい。負極が筒状である場合、負極集電体は、例えば負極の内周面側に設けてもよいし、負極と電解質との間に設けてもよいし、負極の少なくとも一端面に設けてもよいし、さらにはこれらの二箇所以上に設けてもよい。また、負極を、燃料を保持することができるように構成し、例えば負極を多孔質材料により形成し、この負極に燃料保持部を兼用させるようにしてもよい。あるいは、所定の中心軸上に柱状の燃料保持部を設けてもよい。この燃料保持部は、例えば、負極集電体が負極の内周面側に設けられる場合、この負極集電体により囲まれる空間そのものであってもよいし、この空間内に負極集電体とは別に設けられる燃料タンクや燃料カートリッジなどの容器であってもよい。この容器は着脱自在でも固定されたものでもよい。燃料保持部は、例えば、円柱状、楕円柱状、四角形、六角形などの多角柱状などであるが、これに限定されるものではない。電解質は、負極および負極集電体の全体を包み込むように袋状の容器に形成するようにしてもよい。こうすることで、燃料保持部に燃料を一杯に入れた場合、この燃料を負極の全体と接触させることができる。この容器のうちの少なくとも正極と負極との間に挟まれた部分を電解質により形成し、その他の部分はこの電解質と異なる材料により形成するようにしてもよい。この容器を燃料の供給口および排出口を有する密閉容器とし、この供給口を介して外部から燃料を容器内に連続的に供給することにより燃料電池の連続使用が可能である。負極としては、好適には、内部に燃料を十分に蓄えることができるようにするために、空隙率が大きいものが好ましく、例えば空隙率が６０％以上のものが好ましい。
【００２２】
正極および負極としてペレット電極を用いることもできる。このペレット電極は、例えば、カーボン系材料（特に、高導電性・高表面積を有する微細粉末カーボン材料が好ましい）を用いて次のように形成することができる。カーボン系材料としては、例えば、ＫＢ（ケッチェンブラック）などの高導電性を付与したものや、カーボンナノチューブ、フラーレンなどの機能性カーボン材料などを用いる。このカーボン系材料と、上述の酵素の粉末（あるいは酵素溶液）、補酵素の粉末（あるいは補酵素溶液）、電子メディエーターの粉末（あるいは電子メディエーター溶液）、固定化用のポリマーの粉末（あるいはポリマー溶液）などとを、めのう乳鉢などで混合する。必要に応じて、これらに加えてバインダー、例えばポリフッ化ビニリデンも混合する。この混合物を適宜乾燥させたものを所定の形状にプレス加工することなどによりペレット電極を形成することができる。このペレット電極の厚さ（電極厚）も必要に応じて決められるが、一例を挙げると５０μｍ程度である。例えば、コイン型の燃料電池を製造する場合には、上記のペレット電極形成用の材料を錠剤製造機により円形の形状にプレス加工することによりペレット電極を形成することができる。この円形のペレット電極の直径の一例を挙げると１５ｍｍであるが、直径はこれに限定されるものではなく、必要に応じて決められる。このペレット電極を形成する場合、所要の電極厚とするためには、例えば、ペレット電極形成用の材料に占めるカーボン量やプレス圧などを制御する。コイン型の電池缶に正極または負極を挿入する場合、例えば、これらの正極または負極と電池缶との間に金属メッシュスペーサーを挿入することでそれらの電気的接触を取るのが好ましい。
【００２３】
ペレット電極の製造方法としては、上記の方法以外の方法を用いてもよい。例えば、カーボン系材料と、必要に応じてバインダーと、酵素固定化成分の混合溶液とを集電体などに適宜塗布し、乾燥させ、全体をプレス加工した後、所望の電極サイズに切り分けるようにしてもよい。酵素固定化成分は、酵素、補酵素、電子メディエーター、ポリマーなどである。また、混合溶液は、例えば、水系あるいは有機溶媒混合溶液である。
この燃料電池はおよそ電力が必要なもの全てに用いることができ、大きさも問わない。具体的には、この燃料電池は、例えば、電子機器、移動体（自動車、二輪車、航空機、ロケット、宇宙船など）、動力装置、建設機械、工作機械、発電システム、コージェネレーションシステムなどに用いることができる。この場合、用途などによって燃料電池の出力、大きさ、形状、燃料の種類などが決められる。
【００２４】
この発明はまた、
一つまたは複数の燃料電池を有し、
少なくとも一つの上記燃料電池が、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなり、上記ポリ−Ｌ−リシンと上記グルタルアルデヒドとの質量比が５：１〜８０：１であるものである電子機器である。
【００２５】
電子機器は、基本的にはどのようなものであってもよく、携帯型のものと据え置き型のものとの双方を含む。具体例を挙げると、例えば、携帯電話、モバイル機器、ロボット、パーソナルコンピュータ（デスクトップ型、ノート型の双方を含む）、ゲーム機器、カメラ一体型ＶＴＲ（ビデオテープレコーダ）、車載機器、家庭電気製品、工業製品などである。モバイル機器は、携帯情報端末機（ＰＤＡ）などである。
【００２６】
この発明はまた、
ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化され、
上記ポリ−Ｌ−リシンと上記グルタルアルデヒドとの質量比が５：１〜８０：１である酵素固定化電極である。
【００２７】
この発明はまた、
ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化された酵素固定化電極を製造する場合に、上記ポリ−Ｌ−リシンと上記グルタルアルデヒドとの質量比を５：１〜８０：１とするようにした酵素固定化電極の製造方法である。
以上の発明による電子機器、酵素固定化電極および酵素固定化電極の製造方法においては、この発明による燃料電池および燃料電池の製造方法に関連して説明したことが成立する。
【００２８】
この発明はまた、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、
上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなり、
上記ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量が２１５００以上である燃料電池である。
【００２９】
この発明はまた、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなる燃料電池を製造する場合に、上記ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量を２１５００以上とするようにした燃料電池の製造方法である。
【００３０】
この発明はまた、
一つまたは複数の燃料電池を有し、
少なくとも一つの上記燃料電池が、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなり、上記ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量が２１５００以上であるものである電子機器である。
【００３１】
この発明はまた、
ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化され、
上記ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量が２１５００以上である酵素固定化電極である。
【００３２】
この発明はまた、
ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化された酵素固定化電極を製造する場合に、上記ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量を２１５００以上とするようにした酵素固定化電極の製造方法である。
ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量を規定した上記の発明において、ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量とは、特に断らない限り、重量平均分子量（Ｍｗ）を意味する。ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量を２１５００以上とすることは、ポリ−Ｌ−リシンの重合度を１０３以上とすることと等価である。また、ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量を規定した上記の発明においては、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとの質量比を規定した上記の発明に関連して説明したことが成立する。
【００３３】
この発明はまた、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、
上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなり、
上記グルコースデヒドロゲナーゼと上記ジアホラーゼとの質量比が１：３〜２００：１である燃料電池である。
【００３４】
この発明はまた、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなる燃料電池を製造する場合に、上記グルコースデヒドロゲナーゼと上記ジアホラーゼとの質量比を１：３〜２００：１とするようにした燃料電池の製造方法である。
【００３５】
この発明はまた、
一つまたは複数の燃料電池を有し、
少なくとも一つの上記燃料電池が、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記負極が、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化されたものからなり、上記グルコースデヒドロゲナーゼと上記ジアホラーゼとの質量比が１：３〜２００：１であるものである電子機器である。
【００３６】
この発明はまた、
ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化され、
上記グルコースデヒドロゲナーゼと上記ジアホラーゼとの質量比が１：３〜２００：１である酵素固定化電極である。
この発明はまた、
ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材により少なくともグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼが電極上に固定化された酵素固定化電極を製造する場合に、上記グルコースデヒドロゲナーゼと上記ジアホラーゼとの質量比を１：３〜２００：１とするようにした酵素固定化電極の製造方法である。
グルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼとの質量比を規定した上記の発明においては、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとの質量比を規定した上記の発明に関連して説明したことが成立する。
【００３７】
上述のように構成されたこの発明においては、固定化材におけるポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとの質量比が５：１〜８０：１であることにより、電極からのグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼの溶出を防止することができる。また、固定化材におけるポリ−Ｌ−リシンの平均分子量が２１５００以上であることにより、同様に電極からのグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼの溶出を防止することができる。また、グルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼとの質量比が１：３〜２００：１であることにより、同様に電極からのグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼの溶出を防止することができる。
【発明の効果】
【００３８】
この発明によれば、電極に固定化されるグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼの溶出を防止することができることにより、電流密度およびその維持率の向上を図ることができ、優れた性能を有する燃料電池を得ることができる。そして、このように優れた燃料電池を用いることにより、高性能の電子機器を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池を示す略線図である。
【図２】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の負極の構成の詳細ならびにこの負極に固定化された酵素群の一例およびこの酵素群による電子の受け渡し反応を模式的に示す略線図である。
【図３】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行った実験の結果を示す略線図である。
【図４】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行った実験の結果を示す略線図である。
【図５】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行った実験の結果を示す略線図である。
【図６】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行った実験の結果を示す略線図である。
【図７】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行った実験の結果を示す略線図である。
【図８】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行った実験の結果を示す略線図である。
【図９】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行った実験の結果を示す略線図である。
【図１０】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行った実験の結果を示す略線図である。
【図１１】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行った実験の結果を示す略線図である。
【図１２】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行った実験の結果を示す略線図である。
【図１３】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行った実験の結果を示す略線図である。
【図１４】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行ったクロノアンペロメトリーの結果を示す略線図である。
【図１５】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行ったクロノアンペロメトリーの結果から得られた緩衝液濃度と得られる電流密度との関係を示す略線図である。
【図１６】図１４に示すクロノアンペロメトリーの測定に用いられた測定系を示す略線図である。
【図１７】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の評価のために行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。
【図１８】図１７に示すサイクリックボルタンメトリーの測定に用いられた測定系を示す略線図である。
【図１９】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池においてイミダゾールを含む緩衝液およびＮａＨ2 ＰＯ4 緩衝液を用いて行ったクロノアンペロメトリーの結果を示す略線図である。
【図２０】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池においてイミダゾールを含む緩衝液を用いた場合に大きな電流を定常的に得ることができるメカニズムを説明するための略線図である。
【図２１】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池においてＮａＨ2 ＰＯ4 緩衝液を用いた場合に電流が減少するメカニズムを説明するための略線図である。
【図２２】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池において種々の緩衝液を用いた場合の緩衝液濃度と電流密度との関係を示す略線図である。
【図２３】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池において種々の緩衝液を用いた場合の緩衝液濃度と電流密度との関係を示す略線図である。
【図２４】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池において種々の緩衝液を用いた場合の緩衝液の緩衝物質の分子量と電流密度との関係を示す略線図である。
【図２５】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池において種々の緩衝液を用いた場合の緩衝液のｐＫa と電流密度との関係を示す略線図である。
【図２６】この発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池の具体的な構成例を示す略線図である。
【図２７】この発明の第２の実施の形態によるバイオ燃料電池を示す上面図、断面図および裏面図である。
【図２８】この発明の第２の実施の形態によるバイオ燃料電池を示す分解斜視図である。
【図２９】この発明の第２の実施の形態によるバイオ燃料電池の製造方法を説明するための略線図である。
【図３０】この発明の第２の実施の形態によるバイオ燃料電池の使用方法の第１の例を説明するための略線図である。
【図３１】この発明の第２の実施の形態によるバイオ燃料電池の使用方法の第２の例を説明するための略線図である。
【図３２】この発明の第２の実施の形態によるバイオ燃料電池の使用方法の第３の例を説明するための略線図である。
【図３３】この発明の第３の実施の形態によるバイオ燃料電池およびその使用方法を示す略線図である。
【図３４】この発明の第４の実施の形態によるバイオ燃料電池を示す正面図および縦断面図である。
【図３５】この発明の第４の実施の形態によるバイオ燃料電池を示す分解斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下、発明を実施するための形態（以下「実施の形態」とする）について説明する。なお、説明は以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態（バイオ燃料電池）
２．第２の実施の形態（バイオ燃料電池）
３．第３の実施の形態（バイオ燃料電池およびその製造方法）
４．第４の実施の形態（バイオ燃料電池）
【００４１】
〈１．第１の実施の形態〉
［バイオ燃料電池］
図１はこの発明の第１の実施の形態によるバイオ燃料電池を模式的に示す。このバイオ燃料電池では、燃料としてグルコースを用いるものとする。図２は、このバイオ燃料電池の負極の構成の詳細ならびにこの負極に固定化された酵素群の一例およびこの酵素群による電子の受け渡し反応を模式的に示す。
【００４２】
図１に示すように、このバイオ燃料電池は、負極１と正極２とが電子伝導性を持たず、プロトンのみ伝導する電解質層３を介して対向した構造を有する。負極１は、燃料として供給されたグルコースを酵素により分解し電子を取り出すとともにプロトン（Ｈ+ ）を発生する。正極２は、負極１から電解質層３を通って輸送されたプロトンと負極１から外部回路を通って送られた電子と例えば空気中の酸素とにより水を生成する。
【００４３】
負極１は、例えば多孔質カーボンなどからなる電極１１（図２参照）上に、グルコースの分解に関与する酸化酵素のほか、補酵素、補酵素酸化酵素、電子メディエーターなどが固定化材（図示せず）により固定化されたものである。ここで、グルコースの分解に関与する酸化酵素はグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）である。補酵素はグルコースの分解プロセスにおける酸化反応に伴って還元体が生成されるものであり、例えばＮＡＤ+ 、ＮＡＤＰ+ などである。補酵素酸化酵素は補酵素の還元体（例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨなど）を酸化するものであり、ジアホラーゼ（ＤＩ）である。電子メディエーターは、ジアホラーゼから補酵素の酸化に伴って生じる電子を受け取って電極１１に渡すためのものである。固定化材はポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）とグルタルアルデヒド（ＧＡ）とからなる。ここで、この固定化材におけるポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとの質量比は、好適には５：１〜８０：１に選ばれる。また、この固定化材におけるポリ−Ｌ−リシンの平均分子量は、好適には２１５００以上に選ばれる。また、電極１１に固定化するグルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼとの質量比は、好適には１：３〜２００：１に選ばれる。図２には、一例として、グルコースの分解プロセスにおける酸化反応に伴って還元体が生成される補酵素がＮＡＤ+ 、ジアホラーゼから補酵素の酸化に伴って生じる電子を受け取って電極１１に渡す電子メディエータがＡＣＮＱである場合が図示されている。
【００４４】
グルコースの分解に関与する酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を存在させることにより、例えば、β−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化することができる。
さらに、このＤ−グルコノ−δ−ラクトンは、グルコノキナーゼとフォスフォグルコネートデヒドロゲナーゼ（ＰｈＧＤＨ）との二つの酵素を存在させることにより、２−ケト−６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートに分解することができる。すなわち、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンは、加水分解によりＤ−グルコネートになる。Ｄ−グルコネートは、グルコノキナーゼの存在下、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とリン酸とに加水分解することでリン酸化されて、６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートになる。この６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートは、酸化酵素ＰｈＧＤＨの作用により、２−ケト−６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートに酸化される。
【００４５】
また、グルコースは上記分解プロセスのほかに、糖代謝を利用してＣＯ2 まで分解することもできる。この糖代謝を利用した分解プロセスは、解糖系によるグルコースの分解およびピルビン酸の生成ならびにＴＣＡ回路に大別されるが、これらは広く知られた反応系である。
単糖類の分解プロセスにおける酸化反応は、補酵素の還元反応を伴って行われる。この補酵素は作用する酵素によってほぼ定まっており、ＧＤＨの場合、補酵素にはＮＡＤ+ が用いられる。すなわち、ＧＤＨの作用によりβ−Ｄ−グルコースがＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化されると、ＮＡＤ+ がＮＡＤＨに還元され、Ｈ+ を発生する。
【００４６】
生成されたＮＡＤＨは、ジアホラーゼ（ＤＩ）の存在下で直ちにＮＡＤ+ に酸化され、二つの電子とＨ+ とを発生する。したがって、グルコース１分子につき１段階の酸化反応で二つの電子と二つのＨ+ とが生成されることになる。２段階の酸化反応では、合計四つの電子と四つのＨ+ とが生成される。
上記プロセスで生成された電子はジアホラーゼから電子メディエーターを介して電極１１に渡され、Ｈ+ は電解質層３を通って正極２へ輸送される。
【００４７】
電子メディエーターは電極１１との間で電子の受け渡しを行うもので、バイオ燃料電池の出力電圧は、電子メディエーターの酸化還元電位に依存する。つまり、より高い出力電圧を得るには、負極１側ではよりネガティブな電位の電子メディエーターを選ぶとよい。しかしながら、電子メディエーターの酵素に対する反応親和性、電極１１との電子交換速度、阻害因子（光、酸素など）に対する構造安定性なども考慮しなければならない。このような観点から、負極１に固定化する電子メディエーターは、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）やビタミンＫ３（ＶＫ３）などが好適である。そのほか、例えばキノン骨格を有する化合物、オスミウム（Ｏｓ）、ルテニウム（Ｒｕ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）などの金属錯体も電子メディエーターとして用いることができる。さらに、ベンジルビオローゲンなどのビオローゲン化合物、ニコチンアミド構造を有する化合物、リボフラビン構造を有する化合物、ヌクレオチド−リン酸構造を有する化合物なども電子メディエーターとして用いることができる。
【００４８】
電解質層３は負極１において発生したＨ+ を正極２に輸送するプロトン伝導体であり、電子伝導性を持たず、Ｈ+ を輸送することが可能な材料により構成されている。この電解質層３は、例えばすでに挙げたものの中から適宜選ばれたものを用いることができる。この場合、この電解質層３には、緩衝液としてイミダゾール環を有する化合物を緩衝物質として含むものが含まれている。このイミダゾール環を有する化合物は、例えばイミダゾールなどの、すでに挙げたものの中から適宜選ぶことができる。この緩衝物質としての、イミダゾール環を有する化合物の濃度は必要に応じて選ばれるが、好適には０．２Ｍ以上３Ｍ以下の濃度とする。こうすることで高い緩衝能を得ることができ、バイオ燃料電池の高出力動作時においても、酵素本来の能力を十分に発揮することができる。さらに、イオン強度（Ｉ．Ｓ．）は、あまり大きすぎても小さすぎても酵素活性に悪影響を与えるが、電気化学応答性も考慮すると、適度なイオン強度、例えば０．３程度であることが好ましい。ただし、ｐＨおよびイオン強度は、用いる酵素それぞれに最適値が存在し、上述した値に限定されない。
【００４９】
正極２は、例えば多孔質カーボンなどからなる電極上に酸素還元酵素および電極との間で電子の受け渡しを行う電子メディエーターが固定化されたものである。酸素還元酵素としては、例えば、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどを用いることができる。電子メディエーターとしては、例えばヘキサシアノ鉄酸カリウムの電離により生成されるヘキサシアノ鉄酸イオンを用いることができる。この電子メディエーターは、好適には、十分に高濃度、例えば、平均値で０．６４×１０-6ｍｏｌ／ｍｍ2 以上固定化する。
【００５０】
この正極２においては、酸素還元酵素の存在下で、電解質層３からのＨ+ と負極１からの電子とにより空気中の酸素を還元し水を生成する。
以上のように構成された燃料電池において、負極１側にグルコースがグルコース溶液などにより供給されると、このグルコースが酸化酵素を含む分解酵素により分解される。この単糖類の分解プロセスで酸化酵素が関与することで、負極１側で電子とＨ+ とを生成することができ、負極１と正極２との間で電流を発生させることができる。
【００５１】
次に、負極１として用いる酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極の単極での電気化学測定を行った結果について説明する。
この酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極は次のようにして作製した。
まず、以下のようにして各種の溶液を調製した。溶液調製用の緩衝溶液としては、１００ｍＭリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2 ＰＯ4 ）緩衝溶液（Ｉ．Ｓ．＝０．３、ｐＨ＝８．０）を用いた。
【００５２】
・ＧＤＨ酵素緩衝溶液（１）
ＧＤＨ（ＮＡＤ依存型、ＥＣ  １．１．１．４７  天野エンザイム製、７７．６Ｕ／ｍｇ）を１５ｍｇ秤量し、上記の１００ｍＭリン酸二水素ナトリウム緩衝溶液１００μＬに溶解させ、ＧＤＨ酵素緩衝溶液（１）とした。酵素を溶解させる緩衝溶液は直前まで４℃以下に冷蔵されていたものが好ましく、酵素緩衝溶液もできるだけ４℃以下で冷蔵保存しておくことが好ましい。
【００５３】
・ＤＩ酵素緩衝溶液（２）
ＤＩ（ＥＣ  １．６．９９．天野エンザイム製、１０３０Ｕ／ｍｇ）を１５ｍｇ秤量し、上記の１００ｍＭリン酸二水素ナトリウム緩衝溶液１００μＬに溶解させ、ＤＩ酵素緩衝溶液（２）とした。酵素を溶解させる緩衝溶液は直前まで４℃以下に冷蔵されていたものが好ましく、酵素緩衝溶液もできるだけ４℃以下で冷蔵保存しておくことが好ましい。
【００５４】
・ＮＡＤＨ緩衝溶液（３）
ＮＡＤＨ（シグマアルドリッチ製、Ｎ−８１２９）を４１ｍｇ秤量し、上記の１００ｍＭリン酸二水素ナトリウム緩衝溶液６４μＬに溶解させ、ＮＡＤＨ緩衝溶液（３）とした。
・ＡＮＱアセトン溶液（４）
２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）（合成品）を６．２ｍｇ秤量し、アセトン溶液６００μＬに溶解させ、ＡＮＱアセトン溶液（４）とした。
・ＰＬＬ水溶液（５）
ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（ＰＬＬ）（シグマアルドリッチ製、Ｐ−１５２４、Ｍｗ＝５１３ｋ）を適量秤量し、１．０ｗｔ％となるようにイオン交換水に溶解させ、ＰＬＬ水溶液（５）とした。
・ＧＡ水溶液（６）
グルタルアルデヒド（ＧＡ）（関東化学製、１７０２６−０２、５０％水溶液）を適量秤量し、０．１２５ｗｔ％となるようにイオン交換水に溶解させ、ＧＡ水溶液（６）とした。
【００５５】
上記のようにして作製した溶液（１）〜（４）を下記の量ずつ採取して混合し、この混合液をマイクロピペットなどを用いてグラッシーカーボン電極上に塗布した後、適宜乾燥を行い、酵素／補酵素／電子メディエーター塗布電極を作製した。グラッシーカーボン電極は、ＢＡＳ社製で、直径３ｍｍの電極部の周囲に厚さ１．５ｍｍのプラスチックが形成された直径６ｍｍのものである。
ＧＤＨ酵素緩衝溶液（１）：６．２μＬ（ＧＤＨの総質量は９３３μｇで単位面積当たりの質量は１３２μｇ／ｍｍ2 ）
ＤＩ酵素緩衝溶液（２）：３．１μＬ（ＤＩの総質量は４６７μｇで単位面積当たりの質量は６６．１μｇ／ｍｍ2 ）
ＮＡＤＨ緩衝溶液（３）：２．０μＬ
ＡＮＱアセトン溶液（４）：１８．７μＬ
【００５６】
上記の酵素／補酵素／電子メディエーター塗布電極上にＰＬＬ水溶液（５）を塗布した後、適宜乾燥を行い、続いてＧＡ水溶液（６）を塗布した後、適宜乾燥を行い、酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極を作製した。最終的に得られる固定化膜中のＰＬＬとＧＡとの質量比が１：２から８０：１の範囲で９段階になるようにＰＬＬ水溶液（５）およびＧＡ水溶液（６）の塗布量を変えて酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極を作製した。ただし、固定化膜のＰＬＬおよびＧＡの総質量は３１９μｇに固定した。また、ＧＤＨとＤＩとの質量比は２：１、ＧＤＨおよびＤＩの総質量は３１９μｇに固定した。ＮＡＤＨの質量は１．２８ｍｇ、ＡＮＱの質量は１９５μｇである。
【００５７】
こうして作製した酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極を、測定溶液を用い、参照電極Ａｇ｜ＡｇＣｌに対して、０．１Ｖと電子メディエーターの酸化還元電位より十分高い電位に設定し、クロノアンペロメトリー（ＣＡ）を行った。測定溶液としては、２．０Ｍイミダゾール／塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）（２．０Ｍのイミダゾールを塩酸でｐＨ７．０まで中和したもの）に燃料のグルコースを濃度が０．４Ｍとなるように溶解させたものを用いた。クロノアンペロメトリーを１時間（３６００秒）行った後の電流の測定結果を図３に示す。
【００５８】
図３から分かるように、ＰＬＬとＧＡとの質量比が５：１〜８０：１の範囲では１時間後でも約８０μＡ以上の高い電流が得られ、特に質量比が１６：１では１３０μＡと極めて高い電流が得られている。このことから、ＰＬＬとＧＡとの質量比を５：１〜８０：１とすることにより、高い電流およびその維持率が得られることが分かる。
また、別途行った実験により、ＰＬＬおよびＧＡの総質量は３００〜１５００μｇで高い電流が得られることが分かった。
【００５９】
次に、酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極におけるＧＤＨとＤＩとの質量比についての検討結果について説明する。
最終的に得られる固定化膜中のＧＤＨとＤＩとの質量比が１：３から１０：１の範囲で９段階になるようにＧＤＨ酵素緩衝溶液（１）およびＤＩ酵素緩衝溶液（２）の塗布量を変えて酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極を作製した。ただし、電極としては上記のものと同様なグラッシーカーボン電極を用いた。また、固定化膜中のＧＤＨおよびＤＩの総質量は６００μｇに固定した。また、ＰＬＬ水溶液（５）の塗布量は３０μＬ、ＧＡ水溶液（６）の塗布量は１５μＬとした。ＮＡＤＨの質量は１．２８ｍｇ、ＡＮＱの質量は１９５μｇである。
【００６０】
こうして作製した酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極に対し、上記と同様な測定溶液および条件を用いてクロノアンペロメトリー（ＣＡ）を行った。クロノアンペロメトリーを１時間（３６００秒）行った後の電流の測定結果を図４に示す。
図４から分かるように、ＧＤＨとＤＩとの質量比が１：３から４：１の範囲では１時間後でも６０μＡ以上の高い電流が得られ、特に質量比が２：１では８０μＡ以上の極めて高い電流が得られている。このことから、ＧＤＨとＤＩとの質量比を１：３〜４：１とすることにより、高い電流およびその維持率が得られることが分かる。なお、ＧＤＨとＤＩとの質量比を酵素の活性の単位（Ｕ）に換算すると、ＧＤＨは７７．６Ｕ／ｍｇ、ＤＩは１０３０Ｕ／ｍｇで換算可能であり、ＧＤＨとＤＩとの質量比１：３〜４：１は酵素活性比１：３９．８〜１：３．３と表すことができる。
また、別途行った実験により、ＧＤＨおよびＤＩの総質量は５００〜３０００μｇ、取り分け１０００〜２５００μｇで高い電流が得られることが分かった。
【００６１】
ここで、Ｕ（ユニット）は、酵素活性を示す一つの指標であり、例えば下記のように求めることができる。
＜ジアホラーゼ（ＤＩ）＞
・反応式
ＤＩ
ＮＡＤＨ＋ＤＣＩＰ（ox.)  ＋Ｈ +  →  ＮＡＤ+ ＋ＤＣＩＰ（red.)
ＤＣＩＰ（ox.)の消失を分光光度法により波長６００ｎｍで測定する。
1 Ｕ( ユニット) は、下記の条件下において１分当たり１μｍｏｌのＤＣＩＰ（ox.)を還元する酵素量として定義することができる。
【００６２】
・試薬
溶液Ａ：６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
溶液Ｂ：ＮＡＤＨ溶液
８５．１ｍｇのβ−ＮＡＤＨ（Oriental Yeast Co.,Ltd. 製) を脱イオン水１０ｍＬに溶解させる。
溶液Ｃ：2,6-Dichlorophenolindophenol（ＤＣＩＰ）溶液
２．３５ｍｇＤＣＩＰナトリウム塩２水和物を水に溶解させる。
溶液Ｄ：酵素溶液
２０ｍｇのDiaphorase“Amano ”を冷却した脱イオン化水に溶解させる。
酵素溶液の濃度は、ΔＯＤ／ｍｉｎが０．０２０±０．００５となるように調製する。
【００６３】
・測定方法
溶液Ａ：２．５ｍＬ、溶液Ｂ：０．２５ｍＬ、溶液Ｃ：０．２５ｍＬ、をピペットでキュベット容器（ｄ＝１０ｍｍ）に入れ、３０±０．１℃で５分保存する。次に、溶液Ｄ：０．１ｍＬをピペットでそのキュベット容器に入れ、その反応溶液を直ちによく混合する。この混合液を３０±０．１℃で保存する。それから、溶液Ｄを添加後、正確に０．５分、１分に、波長６００ｎｍで反応溶液の吸光度（Ａ０．５とＡ１．０）を測定する。ブランクとして、酵素溶液Ｄの代わりに、脱イオン水をピペットで別のキュベット容器（ｄ＝１０ｍｍ）に入れ、同様の方法で吸光度（Ａｂ０．５とＡｂ１．０）を測定する。
【００６４】
・計算方法
下記の計算式を用いてジアホラーゼの重量当たりのユニット（Ｕ／ｍｇ）を定義する。
ジアホラーゼ活性（Ｕ／ｍｇ）
＝［｛（Ａ０．５−Ａ１．０）−（Ａｂ０．５−Ａｂ１．０）｝／０．５］
×（１／１９．０）×３．１０×（Ｄｍ／０．１）
ただし、
０．５：反応時間
１９．０：ＤＣＩＰのミリモル吸光係数（波長６００ｎｍ）
３．１：反応溶液の最終体積
０．１：酵素溶液の体積
Ｄｍ：酵素溶液の希釈倍数
【００６５】
＜グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）＞
・反応式
ＧＤＨ
β−Ｄグルコース＋ＮＡＤ+   →  Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+ 
ＮＡＤＨの生成を分光光度法により波長３４０ｎｍで測定する。
1 Ｕ( ユニット) は、下記の条件下において１分当たり１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成する酵素量として定義する。
【００６６】
・試薬
溶液Ａ：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
溶液Ｂ：０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ＫＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ７．０）
溶液Ｃ：基質溶液
６．７５ｇのグルコースを脱イオン水に溶解し、２５ｍＬの溶液を作製する。基質溶液は、調製後３０分以上たったものを使用する。室温で２週間までのものに限る。
溶液Ｄ：ＮＡＤ溶液
４０ｍｇのβ−ＮＡＤ（Oriental Yeast Co., Ltd.製) を１ｍＬの脱イオン水に溶解させる。２〜８℃で、１週間までのものに限る。
溶液Ｅ：酵素溶液
２０ｍｇのGlucose Dehydrogenase "Amano" を冷却した溶液Ｂに溶解させる。酵素溶液の濃度は、ΔＯＤ／ｍｉｎが１００±０．０２０となるように調製する。
【００６７】
・測定方法
溶液Ａ：２．７ｍＬ、溶液Ｃ：０．２ｍＬ、溶液Ｄ：０．１ｍＬをピペットでキュベット容器（ｄ＝１０ｍｍ）に入れ、２５±０．１℃で５分保存する。次に、溶液Ｅ：０．０５ｍＬをピペットでそのキュベット容器に入れ、その反応溶液を直ちによく混合する。この混合液を２５±０．１℃で保存する。それから、溶液Ｅを添加後、正確に２分、５分に、波長３４０ｎｍで反応溶液の吸光度（Ａ２とＡ５）を測定する。ブランクとして、酵素溶液Ｄの代わりに、溶液Ｂをピペットで別のキュベット容器（ｄ＝１０ｍｍ）に入れ、同様の方法で吸光度（Ａｂ２とＡｂ５）を測定する。
【００６８】
・計算方法
下記の計算式を用いてグルコースデヒドロゲナーゼの重量当たりのユニット（Ｕ／ｍｇ）を定義する。
グルコースデヒドロゲナーゼ活性（Ｕ／ｍｇ）
＝［｛（Ａ５−Ａ２）−（Ａｂ５−Ａｂ２）｝／３］×（１／６．２２）×３．０５×（Ｄｍ／０．０５）
ただし、
３：反応時間
６．２２：ＮＡＤＨのミリモル吸光係数（波長３４０ｎｍ）
３．０５：反応溶液の最終体積
０．０５：酵素溶液の体積
Ｄｍ：酵素溶液の希釈倍数
【００６９】
酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極におけるＧＤＨとＤＩとの質量比について、上記の測定より広範囲に、かつクロノアンペロメトリー（ＣＡ）ではなくリニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）の測定に基づいて検討した。
最終的に得られる固定化膜中のＧＤＨとＤＩとの質量比が１：３００から４００：１の範囲で２４段階になるようにＧＤＨ酵素緩衝溶液（１）およびＤＩ酵素緩衝溶液（２）の塗布量を変えて酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極を作製した。ただし、電極としては上記のものと同様なグラッシーカーボン電極を用いた。固定化膜のＧＤＨおよびＤＩの総質量は６００μｇに固定した。また、ＰＬＬ水溶液（５）の塗布量は３０μＬ、ＧＡ水溶液（６）の塗布量は１５μＬとした。ＮＡＤＨの質量は１．２８ｍｇ、ＡＮＱの質量は１９５μｇである。
【００７０】
こうして作製した酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極に対し、測定溶液を用い、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）（−０．６〜＋０．３Ｖ、１ｍＶ／ｓ）を行った。測定溶液としては、２．０Ｍイミダゾール／塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）（２．０Ｍのイミダゾールを塩酸でｐＨ７．０まで中和したもの）に燃料のグルコースを濃度が０．４Ｍとなるように溶解させたものを用いた。ＬＳＶの−０．３Ｖおよび−０．２５Ｖにおける電流の測定結果を図５に示す。
【００７１】
図５から分かるように、ＧＤＨとＤＩとの質量比が１：３から３０：１の範囲では約１５０μＡ以上の高い電流が得られ、特に質量比が５：１では約２５０μＡ以上の最も高い電流が得られている。このことから、ＧＤＨとＤＩとの質量比を１：３〜３０：１とすることにより、高い電流およびその維持率が得られることが分かる。
【００７２】
次に、酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極におけるＰＬＬの平均分子量についての検討結果について説明する。
ＰＬＬ水溶液（５）のＰＬＬの粘度平均分子量（Ｍｖ）を０．５〜５１３ｋ（５００〜５１３０００）の範囲で変えて上記と同様にして酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極を作製した。ただし、電極としては上記のものと同様なグラッシーカーボン電極を用いた。また、ＰＬＬとしては、粘度平均分子量で命名したシグマアルドリッチ製のものを用いた。固定化膜のＧＤＨの質量は９３３μｇ、ＤＩの質量は４６７μｇ、ＮＡＤＨの質量は１．２８ｍｇ、ＡＮＱの質量は１９５μｇである。また、ＰＬＬ水溶液（５）の塗布量は２８μＬ、ＧＡ水溶液（６）の塗布量は１４μＬとした。
【００７３】
こうして作製した酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極に対し、上記と同様な測定溶液および条件を用いてクロノアンペロメトリー（ＣＡ）を行った。クロノアンペロメトリーを１時間（３６００秒）行った後の電流の測定結果を図６Ｂに示す。
図６Ｂから分かるように、ＰＬＬの粘度平均分子量が２５ｋ（２５０００）以上では１時間後でも１３μＡ以上の高い電流が得られている。このことから、ＰＬＬの粘度平均分子量を２５ｋ（２５０００）以上とすることにより、高い電流およびその維持率が得られることが分かる。後述のように、粘度平均分子量２５０００は重量平均分子量約２１５００に相当するから、ＰＬＬの重量平均分子量を２１５００以上とすることにより、高い電流およびその維持率が得られると言える。
【００７４】
一方、こうして作製した酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極に対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲルを用いたゲル電気泳動法。試料液中の分子の電荷密度の制御のために硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）を系に添加して電気泳動を行う。）によりＧＤＨおよびＤＩの溶出率の解析を行った。その結果を図６Ａに示す。
図６Ａから分かるように、ＰＬＬの粘度平均分子量が２５ｋ（２５０００）以上では１時間後でもＧＤＨおよびＤＩとも溶出が抑えられており、ＰＬＬの粘度平均分子量が２５ｋ（２５０００）以上では高い電流が得られる図６Ｂの結果と対応している。
【００７５】
以上はグラッシーカーボン電極を用いた場合の結果であるが、次に多孔体カーボン（ＰＣ）電極を用いて上述と同様な評価を行った結果について説明する。
最初に以下のようにして各種の溶液と導電性塗料（カーボン系材料）を塗布した多孔体カーボン電極とを調製した。溶液調製用の緩衝溶液としては、１００ｍＭリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2 ＰＯ4 ）緩衝溶液（Ｉ．Ｓ．＝０．３、ｐＨ＝８．０）を用いた。
【００７６】
・ＧＤＨ酵素緩衝溶液（１）
ＧＤＨ（ＮＡＤ依存型、ＥＣ  １．１．１．４７  天野エンザイム製、７７．６Ｕ/ ｍｇ）を１５ｍｇ秤量し、上記の１００ｍＭリン酸二水素ナトリウム緩衝溶液１００μＬに溶解させ、ＧＤＨ酵素緩衝溶液（１）とした。酵素を溶解させる緩衝溶液は直前まで４℃以下に冷蔵されていたものが好ましく、酵素緩衝溶液もできるだけ４℃以下で冷蔵保存しておくことが好ましい。
【００７７】
・ＤＩ酵素緩衝溶液（２）
ＤＩ（ＥＣ  １．６．９９．天野エンザイム製, １０３０Ｕ/ ｍｇ）を１５ｍｇ秤量し、１００ｍＭリン酸二水素ナトリウム緩衝溶液１００μＬに溶解させ、ＤＩ酵素緩衝溶液（２）とした。酵素を溶解させる緩衝溶液は直前まで４℃以下に冷蔵されていたものが好ましく、酵素緩衝溶液もできるだけ４℃以下で冷蔵保存しておくことが好ましい。
【００７８】
・ＮＡＤＨ緩衝溶液（３）
ＮＡＤＨ（シグマアルドリッチ製、Ｎ−８１２９）を４１ｍｇ秤量し、上記の１００ｍＭリン酸二水素ナトリウム緩衝溶液６４μＬに溶解させ、ＮＡＤＨ緩衝溶液（３）とした。
・ＡＮＱアセトン溶液（４）
２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）（合成品）を６．２ｍｇ秤量し、アセトン溶液６００μＬに溶解させ、ＡＮＱアセトン溶液（４）とした。
・ＰＬＬ水溶液（５）
ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（ＰＬＬ）（シグマアルドリッチ、Ｐ−１５２４、Ｍｗ＝５１３ｋ）を適量秤量し、４．０ｗｔ％となるようにイオン交換水に溶解させ、ＰＬＬ水溶液（５）とした。
・ＧＡ水溶液（６）
グルタルアルデヒド（ＧＡと略）（和光純薬、０７１−０２０３１、１０％水溶液）を適量秤量し、０．０６２５ｗｔ％となるようにイオン交換水に溶解させ、ＧＡ水溶液（６）とした。
【００７９】
・導電性塗料を塗布した多孔体カーボン（ＰＣ）電極
導電性塗料を２−ブタノン（和光純薬、１３３−０２５０６）に体積５：１の割合で希釈し、１ｃｍ角に切り抜いた多孔体カーボン電極上に乾燥後、約１０５〜１０８ｍｇになるように塗布し、一晩乾燥した。導電性塗料は、天然黒鉛を１３〜１８％、バインダーとしてポリビニルブチラールを３〜８％、カーボンブラックを８．４％、有機溶媒としてメチルイソブチルケトンを６９．４８％含有するものである。多孔体カーボン電極はサイズが１ｃｍ×１ｃｍ×２ｍｍ、空隙率が６０％、重量が約９５〜９８ｍｇである。
【００８０】
上述のように導電性塗料を塗布した多孔体カーボン電極の上面および底面に対して２０分ずつオゾン洗浄処理を行う。上記のようにして作製した溶液（１）〜（４）を下記の量ずつ採取して混合し、この混合液をマイクロピペットなどを用いてオゾン洗浄処理を行った多孔体カーボン電極の上面および底面に半分量ずつ塗布した。この後、４０℃で１５分間ドライオーブン中で乾燥を行い、酵素／補酵素／電子メディエーター塗布電極を作製した。
【００８１】
ＧＤＨ酵素緩衝溶液（１）：５３．５μＬ（ＧＤＨの総質量は８．００ｍｇで投影面積当たりの質量は８．００ｍｇ／ｃｍ2 ）
ＤＩ酵素緩衝溶液（２）：１３．４μＬ（ＤＩの総質量は２．００ｍｇで投影面積当たりの質量は２．００ｍｇ／ｃｍ2 ）
ＮＡＤＨ緩衝溶液（３）：６．００μＬ（ＮＡＤＨの総質量は３．８４ｍｇで投影面積当たりの質量は３．８４ｍｇ／ｃｍ2 ）
ＡＮＱアセトン溶液（４）：７４．８μＬ（ＡＮＱの総質量は７８０μｇで投影面積当たりの質量は７８０μｇ／ｃｍ2 ）
【００８２】
上記の酵素／補酵素／電子メディエーター塗布電極の上面および底面にＰＬＬ水溶液（５）を下記の量の半分量ずつ塗布した後、４０℃で１５分間ドライオーブン中で乾燥を行った。それから、その電極の上面および底面にＧＡ水溶液（６）を下記の量の半分量ずつ塗布した後、４０℃で１５分間ドライオーブン中で乾燥を行い、酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極を作製した。
ＰＬＬ水溶液（５）：６９．０μＬ（ＰＬＬの総質量は２．７６ｍｇで投影面積当たりの質量は２．７６ｍｇ／ｃｍ2 ）
ＧＡ水溶液（６）：６７．２μＬ（ＧＡの総質量は４２．０μｇで投影面積当たりの質量は４２．０μｇ／ｃｍ2 ）
【００８３】
最終的に得られる固定化膜中のＰＬＬとＧＡとの質量比が１：１から８０：１の範囲で１２段階になるようにＰＬＬ水溶液（５）およびＧＡ水溶液（６）の塗布量を変えて上述の酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極を作製した。ただし、固定化膜中のＧＤＨとＤＩとの質量比は４：１、ＧＤＨおよびＤＩの総質量は１０ｍｇ、ＮＡＤＨの質量は５．１２ｍｇ、ＡＮＱの質量は７８０μｇ、ＰＬＬおよびＧＡの総質量は２．８ｍｇに固定した。
【００８４】
この酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極に対し、測定溶液を用い、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）（−０．６〜＋０．３Ｖ、１ｍＶ／ｓ）を行った。測定溶液としては、２．０Ｍイミダゾール／塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）（２．０Ｍのイミダゾールを塩酸でｐＨ７．０まで中和したもの）に燃料のグルコースを濃度が１．０Ｍとなるように溶解させたものを用いた。電流密度（電極の投影面積当たりの電流密度）の測定結果を図７に示す。
【００８５】
図７から分かるように、ＰＬＬとＧＡとの質量比が５：１〜８０：１の範囲では３０ｍＡ／ｃｍ2 以上の高い電流密度が得られ、特に質量比が６５：１では最も高い電流密度が得られている。このことから、ＰＬＬとＧＡとの質量比を５：１〜８０：１とすることにより、高い電流およびその維持率が得られることが分かる。
また、別途行った実験により、ＰＬＬおよびＧＡの総質量は１〜３ｍｇで高い電流密度が得られることが分かった。
【００８６】
次に、酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極におけるＧＤＨとＤＩとの質量比についての検討結果について説明する。
最終的に得られる固定化膜中のＧＤＨとＤＩとの質量比が１：３から１０：１の範囲で７段階になるようにＧＤＨ酵素緩衝溶液（１）およびＤＩ酵素緩衝溶液（２）の塗布量を変えて酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極を作製した。ただし、電極としては上記のものと同様な多孔体カーボン電極を用いた。固定化膜のＧＤＨおよびＤＩの総質量は５．５８ｍｇに固定した。また、ＰＬＬ水溶液（５）の塗布量は７０μＬ、ＧＡ水溶液（６）の塗布量は７６μＬとした。ＮＡＤＨの質量は５．１２ｍｇ、ＡＮＱの質量は７８０μｇである。
【００８７】
こうして作製した酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極を２枚重ねたものに対し、測定溶液を用い、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）（−０．５〜＋０．３Ｖ、１ｍＶ／ｓ）を行った。測定溶液としては、２．０Ｍイミダゾール／塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）（２．０Ｍのイミダゾールを塩酸でｐＨ７．０まで中和したもの）に燃料のグルコースを濃度が０．４Ｍとなるように溶解させたものを用いた。ＬＳＶの−０．３Ｖおよび−０．２５Ｖにおける電流密度の測定結果を図８に示す。
【００８８】
図８から分かるように、ＧＤＨとＤＩとの質量比が１：１から１０：１の範囲では４０ｍＡ／ｃｍ2 以上の高い電流密度が得られ、特に質量比が４：１では５０ｍＡ／ｃｍ2 程度の極めて高い電流密度が得られている。このことから、ＧＤＨとＤＩとの質量比を１：１〜１０：１とすることにより、高い電流およびその維持率が得られることが分かる。なお、ＧＤＨとＤＩとの質量比を酵素の活性の単位（Ｕ）に換算すると、ＧＤＨは７７．６Ｕ／ｍｇ、ＤＩは１０３０Ｕ／ｍｇで換算可能であり、ＧＤＨとＤＩとの質量比１：１〜１０：１は酵素活性比１：１３．３〜１：１．３３と表すことができる。
また、別途行った実験により、ＧＤＨおよびＤＩの総質量は５〜１５ｍｇで高い電流が得られることが分かった。
【００８９】
酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極におけるＧＤＨとＤＩとの質量比について、上記の測定より広範囲に、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）の測定に基づいて検討した。
最終的に得られる固定化膜中のＧＤＨとＤＩとの質量比が１：３００から４００：１の範囲で１３段階になるようにＧＤＨ酵素緩衝溶液（１）およびＤＩ酵素緩衝溶液（２）の塗布量を変えて酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極を作製した。ただし、電極としては上記のものと同様な多孔体カーボン電極を用いた。固定化膜のＧＤＨおよびＤＩの総質量は５．５８ｍｇに固定した。また、ＰＬＬ水溶液（５）の塗布量は７０μＬ、ＧＡ水溶液（６）の塗布量は７６μＬとした。ＮＡＤＨの質量は５．１２ｍｇ、ＡＮＱの質量は７８０μｇである。
【００９０】
こうして作製した酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極に対し、測定溶液を用い、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）（−０．６〜＋０．３Ｖ、１ｍＶ／ｓ）を行った。測定溶液としては、２．０Ｍイミダゾール／塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）（２．０Ｍのイミダゾールを塩酸でｐＨ７．０まで中和したもの）に燃料のグルコースを濃度が０．４Ｍとなるように溶解させたものを用いた。ＬＳＶの−０．３Ｖおよび−０．２５Ｖにおける電流密度の測定結果を図９に示す。
【００９１】
図９から分かるように、ＧＤＨとＤＩとの質量比が１：３から２００：１の範囲では１５ｍＡ／ｃｍ2 以上の高い電流密度が得られ、特に質量比が４：１〜１０：１では２８〜３２ｍＡ／ｃｍ2 程度の極めて高い電流密度が得られている。このことから、ＧＤＨとＤＩとの質量比を１：３から２００：１とすることにより、高い電流およびその維持率が得られることが分かる。
また、別途行った実験により、ＧＤＨおよびＤＩの総質量は５〜１５ｍｇで高い電流が得られることが分かった。
【００９２】
次に、酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極におけるＰＬＬの平均分子量についての検討結果について説明する。
ＰＬＬ水溶液（５）のＰＬＬの粘度平均分子量（Ｍｖ）を０．５〜５１３ｋ（５００〜５１３０００）の範囲で変えて上記と同様にして酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極を作製した。ただし、電極としては上記のものと同様な多孔体カーボン電極を用いた。また、ＰＬＬとしては、粘度平均分子量で命名したシグマアルドリッチ製のものを用いた。固定化膜のＧＤＨの質量は３．７３ｍｇ、ＤＩの質量は１．８７ｍｇ、ＮＡＤＨの質量は５．１２ｍｇ、ＡＮＱの質量は７８０μｇである。また、ＰＬＬ水溶液（５）の塗布量は７６μＬ、ＧＡ水溶液（６）の塗布量は７６μＬとした。
【００９３】
こうして作製した酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極を、測定溶液を用い、参照電極Ａｇ｜ＡｇＣｌに対して、０．１Ｖと電子メディエーターの酸化還元電位より十分高い電位に設定し、クロノアンペロメトリー（ＣＡ）を行った。測定溶液としては、２．０Ｍイミダゾール／塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）（２．０Ｍのイミダゾールを塩酸でｐＨ７．０まで中和したもの）に燃料のグルコースを濃度が０．４Ｍとなるように溶解させたものを用いた。クロノアンペロメトリーを１時間（３６００秒）行った後の電流の測定結果を図１０Ｂに示す。
図１０Ｂから分かるように、ＰＬＬの粘度平均分子量が２５ｋ（２５０００）以上では１時間後でも４ｍＡ／ｃｍ2 以上の高い電流密度が得られている。このことから、ＰＬＬの粘度平均分子量を２５ｋ（２５０００）以上とすることにより、高い電流およびその維持率が得られることが分かる。後述のように、粘度平均分子量２５０００は重量平均分子量約２１５００に相当するから、ＰＬＬの重量平均分子量を２１５００以上とすることにより、高い電流およびその維持率が得られると言える。
【００９４】
一方、こうして作製した酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極に対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＧＤＨおよびＤＩの溶出率の解析を行った。その結果を図１０Ａに示す。
図１０Ａから分かるように、ＰＬＬの粘度平均分子量が２５ｋ（２５０００）以上では１時間後でもＧＤＨおよびＤＩとも溶出が抑えられており、ＰＬＬの粘度平均分子量が２５ｋ（２５０００）以上では高い電流が得られる図１０Ｂの結果と対応している。
【００９５】
次に、ゲル浸透クロマトグラフィー（Gel Permeation Chromatography,ＧＰＣ）によりＰＬＬの分子量分布測定を行った結果について説明する。この結果より、ＰＬＬの粘度平均分子量と重量平均分子量との関係を求めることができる。
（ａ）標準ＰＥＧおよびＰＥＯを用いた較正曲線の作成
実験操作
以下の条件においてゲル浸透クロマトグラフィーを行い、標準ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および標準ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を用いた較正曲線を作成した。
【００９６】
・カラム  ＴＳＫGel Ｇ５０００ＰＷＸＬ−ＣＰ
・溶離液  ０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．８）
・流速    ０．５ｍＬ／ｍｉｎ
・温度    ２５℃
・検出    示差屈折率（ＲＩ）
・サンプル体積    ２０μｌ
・サンプル濃度    １．０ｍｇ／ｍＬ（溶媒  水［１％エタノール］）
・サンプル
標準ＰＥＧ：Ｆｌｕｋａ      ８１２８８  ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ）ＳＴＡＮＤＡＲＤ  １０００
標準ＰＥＯ：東ソー（株）  ０５７７３  ＴＳＫ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Poly(ethylene
oxide)SE-2,5,8,15,30,70,150
【００９７】
図１１に標準ＰＥＧおよびＰＥＯのＧＰＣチャートを示す。ここで、図１１の縦軸のＲＩは示差屈折率検出器の出力電圧を示す。
図１１に示す標準ＰＥＧおよびＰＥＯの溶出時間と重量平均分子量（Ｍｗ）とから図１２に示す較正曲線を作成した。
【００９８】
（ｂ）ＧＰＣによるＰＬＬサンプルの分子量分布測定
次に、実際にＰＬＬサンプルの分子量分布測定を行った。
実験操作
以下の条件においてゲル浸透クロマトグラフィーを行い、標準ＰＥＧおよび標準ＰＥＯを用いた較正曲線を作成した。
【００９９】
・カラム  ＴＳＫGel Ｇ５０００ＰＷＸＬ−ＣＰ
・溶離液  ０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．８）
・流速    ０．５ｍＬ／ｍｉｎ
・温度    ２５℃
・検出    ＲＩ
・サンプル体積    ２０μｌ
・サンプル濃度    １．０ｍｇ／ｍＬ（溶媒  水）
・サンプル        粘度平均分子量で命名したＰＬＬ（シグマアルドリッチ製）
ＰＬＬ  ０．５−２．０ｋ    Ｐ８９５４
ＰＬＬ  １４ｋ              Ｐ６５１６
ＰＬＬ  ２５ｋ              Ｐ７８９０
ＰＬＬ  ８４ｋ              Ｐ１２７４
ＰＬＬ  １６３ｋ            Ｐ１３９９
ＰＬＬ  ３２９ｋ            Ｐ１５２４
ＰＬＬ  ５１３ｋ            Ｐ１５２４
使用したＰＬＬサンプルのデータを表２に示す。
【０１００】
【表２】
2009245930.tif 000004
【０１０１】
図１３に標準ＰＥＧおよびＰＥＯのＧＰＣチャートを示す。
図１３に示すＰＬＬサンプルの溶出時間と図１２に示す較正曲線とからＰＬＬサンプルの重量平均分子量（Ｍｗ）を算出し、その重合度も求めた。表３にＰＬＬサンプルのＧＰＣ測定結果をまとめて示す。
【０１０２】
【表３】
2009245930.tif 000005
【０１０３】
表３から分かるように、ＰＬＬの粘度平均分子量２５ｋ（２５０００）は重量平均分子量２１５８１、すなわち約２１５００に相当し、ＰＬＬの重合度で言うと１０３に相当する。
【０１０４】
次に、正極２に酸素還元酵素としてＢＯＤを固定化し、イミダゾールと塩酸とを混合してｐＨ７に調整したものを緩衝液として用いた場合における電流値の維持向上の効果について説明する。表４および図１４に、この場合にイミダゾールの濃度を変えて測定したクロノアンペロメトリーの結果を示す。また、図１５に電流値（表４および図１４の３６００秒後の電流密度の値）の緩衝液濃度（緩衝液中の緩衝物質の濃度）依存性を示す。表４および図１４には、比較のために、緩衝液として１．０ＭのＮａＨ2 ＰＯ4 ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）を用いた場合の結果も併せて示す。この測定は、図１６に示すように、正極２上にフィルム状のセロハン２１を載せ、このセロハン２１に緩衝液２２を接触させた状態で行った。正極２としては、次のようにして作製される酵素／電子メディエーター固定化電極を用いた。まず、多孔質カーボンとして市販のカーボンフェルト（ＴＯＲＡＹ製  ＢＯ０５０）を用い、このカーボンフェルトを１ｃｍ角に切り抜いた。次に、ヘキサシアノ鉄酸イオン（１００ｍＭ）を８０μｌ、ポリ−Ｌ−リシン（１ｗｔ％）を８０μｌ、ＢＯＤ溶液を８０μｌ（５０ｍｇ／ｍｌ）を上記のカーボンフェルトに順に染み込ませ、乾燥することで酵素／電子メディエーター固定化電極を得た。こうして作製した酵素／電子メディエーター固定化電極を２枚重ねて正極２とした。
【０１０５】
【表４】
2009245930.tif 000006
【０１０６】
表４および図１４から分かるように、ＮａＨ2 ＰＯ4 濃度が１．０Ｍでは、初期電流は出るが、３６００秒後には電流は大幅に減少してしまう。これに対し、特にイミダゾール濃度が０．４Ｍ、１．０Ｍおよび２．０Ｍでは、３６００秒後にも電流の低下はほとんど見られない。図１５から分かるように、イミダゾール濃度が０．２〜２．５Ｍの範囲では濃度に対して電流値が直線的に増加する。また、ＮａＨ2 ＰＯ4 ／ＮａＯＨ緩衝液とイミダゾール／塩酸緩衝液とはともにｐＫa が７付近、酸素溶解度もほぼ同じにもかかわらず、同じ濃度の緩衝液においてイミダゾールが存在する場合、大きな酸素還元電流が得られた。
【０１０７】
上記のようにしてクロノアンペロメトリーを３６００秒間行った後、電位−０．３〜＋０．６Ｖ間におけるサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を行った。その結果を図１７に示す。ただし、この測定は、図１８に示すように、上記と同様な酵素／電子メディエーター固定化電極からなる正極２を作用極とし、これを透気性のＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）メンブレン２３上に載せ、この正極２に緩衝液２２を接触させた状態で行った。緩衝液２２内に対極２４および参照電極２５を浸漬し、作用極としての正極２、対極２４および参照電極２５に電気化学測定装置（図示せず）を接続した。対極２４としてはＰｔ線、参照電極２５としてはＡｇ｜ＡｇＣｌを用いた。測定は大気圧で行い、測定温度は２５℃とした。緩衝液２２としては、イミダゾール／塩酸緩衝液（ｐＨ７、１．０Ｍ）とＮａＨ2 ＰＯ4 ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７、１．０Ｍ）との２種類を用いた。
図１７より、緩衝液２２としてイミダゾール／塩酸緩衝液（ｐＨ７、１．０Ｍ）を用いた場合には、極めて良好なＣＶ特性が得られていることが分かる。
以上のことから、測定系を変えても、イミダゾール緩衝液に優位性があることが確認された。
【０１０８】
図１９は、正極２にＢＯＤを固定化し、２．０Ｍのイミダゾール／塩酸緩衝液および１．０ＭのＮａＨ2 ＰＯ4 ／ＮａＯＨ緩衝液を用いて上記の方法と同様に行ったクロノアンペロメトリーの結果を、その間の電極表面上のｐＨの測定結果とともに示したものである。ただし、イミダゾール／塩酸緩衝液のｐＫa は６．９５、伝導度は５２．４ｍＳ／ｃｍ、酸素溶解度は０．２５ｍＭ、ｐＨは７である。また、ＮａＨ2 ＰＯ4 ／ＮａＯＨ緩衝液のｐＫa は６．８２（Ｈ2 ＰＯ4 - ）、伝導度は５１．２ｍＳ／ｃｍ、酸素溶解度は０．２５ｍＭ、ｐＨは７である。図１９から分かるように、２．０Ｍのイミダゾール／塩酸緩衝液を用いた場合には、１．０ＭのＮａＨ2 ＰＯ4 ／ＮａＯＨ緩衝液を用いた場合に比べて約１５倍も高い電流密度が得られている。また、図１９より、電流の変化は電極表面上のｐＨ変化とほぼ一致していることが分かる。これらの結果が得られる理由について図２０および図２１を参照して説明する。
【０１０９】
図２０および図２１は、電極３１にＢＯＤ３２をポリイオンコンプレックスなどの固定化材３３により、電子メディエーター３４とともに固定化した様子を示す。図２０に示すように、２．０Ｍのイミダゾール／塩酸緩衝液を用いた場合には、十分に多くのプロトン（Ｈ+ ）が供給されることにより高い緩衝能が得られ、ｐＨが安定することで高い電流密度が定常的に得られると考えられる。これに対し、図２１に示すように、１．０ＭのＮａＨ2 ＰＯ4 ／ＮａＯＨ緩衝液を用いた場合には、Ｈ+ の供給量が少ないことにより緩衝能が不十分であるため、ｐＨが大きく増加してしまうことで電流密度が減少してしまうものと考えられる。
【０１１０】
図２２および図２３は種々の緩衝液を用いた場合の３６００秒（１時間）後の電流密度の緩衝液濃度に対する変化を示す。図２２および図２３から分かるように、イミダゾール環を有する化合物を含む緩衝液を用いた場合には、ＮａＨ2 ＰＯ4 を含む緩衝液などの他の緩衝液を用いた場合に比べ、総じて高い電流密度が得られており、特に緩衝液濃度が高くなるほどその傾向が顕著となる。また、図２２および図２３より、緩衝物質として２−アミノエタノール、トリエタノールアミン、ＴＥＳあるいはＢＥＳを含む緩衝液を用いた場合にも、高い電流密度が得られており、特に緩衝液濃度が高くなるほどその傾向が顕著となることも分かる。
図２４および図２５に、図２２および図２３に示す緩衝液を用いた場合の３６００秒後の電流密度を緩衝物質の分子量およびｐＫa に対してプロットしたものを示す。
【０１１１】
次に、緩衝液として以下のものを用いた場合にＢＯＤの活性の比較を行った実験の結果の一例について説明する。
・２．０Ｍイミダゾール／塩酸水溶液（２．０Ｍイミダゾールを塩酸でｐＨ７．０まで中和した溶液）（２．０Ｍイミダゾール／塩酸緩衝液）
・２．０Ｍイミダゾール／酢酸水溶液（２．０Ｍイミダゾールを酢酸でｐＨ７．０まで中和した溶液）（２．０Ｍイミダゾール／酢酸緩衝液）
・２．０Ｍイミダゾール／リン酸水溶液（２．０Ｍイミダゾールをリン酸でｐＨ７．０まで中和した溶液）（２．０Ｍイミダゾール／リン酸緩衝液）
・２．０Ｍイミダゾール／硫酸水溶液（２．０Ｍイミダゾールを硫酸でｐＨ７．０まで中和した溶液）（２．０Ｍイミダゾール／硫酸緩衝液）
【０１１２】
ＢＯＤの活性の測定は、ＡＢＴＳ（2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)を基質として用い、反応進行に伴う波長７３０ｎｍの光の吸光度変化（ＡＢＴＳの反応物の増加に由来する）を追跡することにより行った。測定条件は表５に示すとおりである。なお、ＢＯＤ濃度は活性測定の際、波長７３０ｎｍの光の吸光度変化が１分間当たり０．０１〜０．２程度となるように調製した。反応はＡＢＴＳを含む、表５の各種緩衝液（２９８０〜２９９５μＬ）に酵素溶液（５〜２０μＬ）を加えることで開始した。
【０１１３】
【表５】
2009245930.tif 000007
【０１１４】
酵素活性の測定結果を、２．０Ｍイミダゾール／塩酸水溶液（ｐＨ７．０）中における活性を１．０とした場合の相対活性値として表６に示す。
【０１１５】
【表６】
2009245930.tif 000008
【０１１６】
表６より、イミダゾール／酢酸水溶液、イミダゾール／リン酸水溶液およびイミダゾール／硫酸水溶液を用いた場合の酵素活性はイミダゾール／塩酸水溶液を用いた場合の酵素活性に比べて高いことが分かる。特に、イミダゾール／硫酸水溶液を用いた場合の酵素活性は際立って高い。
【０１１７】
このバイオ燃料電池の具体的な構成例を図２６ＡおよびＢに示す。
図２６ＡおよびＢに示すように、このバイオ燃料電池は、負極１と正極２とが緩衝物質を含む電解質層３を介して対向した構成を有している。負極１は、上記のようにカーボン電極上に酵素、補酵素および電子メディエータを固定化したものである。正極２は、上記のようにカーボン電極上に酵素および電子メディエータを固定化したものである。この場合、正極２の下および負極１の上にそれぞれＴｉ集電体４１、４２が置かれ、集電を容易に行うことができるようになっている。符号４３、４４は固定板を示す。これらの固定板４３、４４はねじ４５により相互に締結され、それらの間に、正極２、負極１、電解質層３およびＴｉ集電体４１、４２の全体が挟み込まれている。固定板４３の一方の面（外側の面）には空気取り込み用の円形の凹部４３ａが設けられ、この凹部４３ａの底面に他方の面まで貫通した多数の穴４３ｂが設けられている。これらの穴４３ｂは正極２への空気の供給路となる。一方、固定板４４の一方の面（外側の面）には燃料装填用の円形の凹部４４ａが設けられ、この凹部４４ａの底面に他方の面まで貫通した多数の穴４４ｂが設けられている。これらの穴４４ｂは負極１への燃料の供給路となる。この固定板４４の他方の面の周辺部にはスペーサー４６が設けられており、固定板４３、４４をねじ４５により相互に締結したときにそれらの間隔が所定の間隔になるようになっている。
図２６Ｂに示すように、Ｔｉ集電体４１、４２の間に負荷４７を接続し、固定板４４の凹部４４ａに燃料として例えばリン酸緩衝液にグルコースを溶かしたグルコース溶液を入れて発電を行う。
【０１１８】
以上のように、この第１の実施の形態によれば、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとからなる固定化材によりグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを負極１に固定化する際のそれらの質量比およびポリ−Ｌ−リシンの平均分子量を最適化している。具体的には、ポリ−Ｌ−リシンとグルタルアルデヒドとの質量比を５：１〜８０：１としている。また、ポリ−Ｌ−リシンの平均分子量を２１５００以上としている。また、グルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼとの質量比を１：３〜２００：１としている。こうすることにより、電流密度およびその維持率が高い高性能のバイオ燃料電池を実現することができる。このバイオ燃料電池は、各種の電子機器、移動体、発電システムなどの電源に適用して好適なものである。
【０１１９】
〈２．第２の実施の形態〉
［バイオ燃料電池］
次に、この発明の第２の実施の形態によるバイオ燃料電池について説明する。
図２７Ａ、ＢおよびＣならびに図２８はこのバイオ燃料電池を示し、図２７Ａ、ＢおよびＣはこのバイオ燃料電池の上面図、断面図および裏面図、図２８はこのバイオ燃料電池の各構成要素を分解して示す分解斜視図である。
【０１２０】
図２７Ａ、ＢおよびＣならびに図２８に示すように、このバイオ燃料電池においては、正極集電体５１と負極集電体５２との間に形成された空間の内部に正極２、電解質層３および負極１が収納されている。これらの正極２、電解質層３および負極１は、その上下が正極集電体５１と負極集電体５２とにより挟まれている。これらの正極集電体５１、負極集電体５２、正極２、電解質層３および負極１の隣同士のものは互いに密着している。この場合、これらの正極集電体５１、負極集電体５２、正極２、電解質層３および負極１は円形の平面形状を有し、このバイオ燃料電池の全体も円形の平面形状を有する。
【０１２１】
正極集電体５１は、正極２で発生した電流を集めるためのものであり、この正極集電体５１から外部に電流が取り出される。また、負極集電体５２は、負極１で発生した電流を集めるためのものである。これらの正極集電体５１および負極集電体５２は、一般的には、金属や合金などにより形成されるが、これに限定されるものではない。正極集電体５１は偏平でほぼ円筒状の形状を有する。負極集電体５２も偏平でほぼ円筒状の形状を有する。そして、正極集電体５１の外周部５１ａの縁が、リング状のガスケット５６ａおよびリング状の疎水性樹脂５６ｂを介して負極集電体５２の外周部５２ａに対してかしめられることにより、正極２、電解質層３および負極１を収納する空間が形成されている。ガスケット５６ａは、例えば、シリコーンゴムなどの絶縁性の材料からなる。また、疎水性樹脂５６ｂは、例えばポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）などからなる。疎水性樹脂５６ｂは、正極２、正極集電体５１およびガスケット５６ａにより囲まれた空間に、これらの正極２、正極集電体５１およびガスケット５６ａに密着した状態で設けられている。この疎水性樹脂５６ｂにより、燃料の正極２側への過剰な染み込みを効果的に抑制することができる。電解質層３の端部は正極２および負極１の外側に延在しており、ガスケット５６ａと疎水性樹脂５６ｂとの間に挟まれている。正極集電体５１は、その底面の全面に複数の酸化剤供給口５１ｂを有し、これらの酸化剤供給口５１ｂの内部に正極２が露出している。図２７Ｃおよび図２８には１３個の円形の酸化剤供給口５１ｂが図示されているが、これは一例に過ぎず、酸化剤供給口５１ｂの個数、形状、大きさおよび配置とも適宜選ぶことができる。負極集電体５２も、その上面の全面に複数の燃料供給口５２ｂを有し、これらの燃料供給口５２ｂの内部に負極１が露出している。図２８には９個の円形の燃料供給口５２ｂが図示されているが、これは一例に過ぎず、燃料供給口５２ｂの個数、形状、大きさおよび配置とも適宜選ぶことができる。
【０１２２】
負極集電体５２は負極１と反対側の面に円筒形状の燃料タンク５７を有する。この燃料タンク５７は負極集電体５２と一体に形成されている。この燃料タンク５７の中に、使用する燃料（図示せず）、例えば、グルコース溶液やこれにさらに電解質を加えたものなどが入れられる。この燃料タンク５７には円筒形状の蓋５８が取り外し可能に取り付けられている。この蓋５８は、例えば、燃料タンク５７に嵌め込まれ、あるいは、ねじ止めされるようになっている。この蓋５８の中央部には円形の燃料供給口５８ａが形成されている。この燃料供給口５８ａは、例えば、図示省略した密封シールを貼り付けたりすることなどにより密封される。
このバイオ燃料電池の上記以外の構成は、その性質に反しない限り、第１の実施の形態と同様である。
【０１２３】
［バイオ燃料電池の製造方法］
次に、このバイオ燃料電池の製造方法の一例について説明する。この製造方法を図２９Ａ〜Ｄに示す。
図２９Ａに示すように、まず、一端が開放した円筒形状の正極集電体５１を用意する。この正極集電体５１の底面の全面には複数の酸化剤供給口５１ｂが形成されている。この正極集電体５１の内部の底面の外周部の上にリング状の疎水性樹脂５６ｂを載せ、この底面の中央部の上に、正極２、電解質層３および負極１を順次重ねる。
【０１２４】
一方、図２９Ｂに示すように、一端が開放した円筒形状の負極集電体５２上に円筒形状の燃料タンク５７を一体に形成したものを用意する。この負極集電体５２には全面に複数の燃料供給口５２ｂが形成されている。この負極集電体５２の外周面の縁にＵ字状の断面形状のガスケット５６ａを取り付ける。そして、この負極集電体５２をその開放部側を下にして負極１の上にかぶせ、正極集電体５１とこの負極集電体５２との間に、正極２、電解質層３および負極１を挟む。
【０１２５】
次に、図２９Ｃに示すように、こうして正極集電体５１と負極集電体５２との間に正極２、電解質層３および負極１を挟んだものを、かしめ機の台６１の上に載せる。そして、押圧部材６２により負極集電体５２を押圧して正極集電体５１、正極２、電解質層３、負極１および負極集電体５２の隣同士を互いに密着させる。この状態でかしめ具６３を下降させて正極集電体５１の外周部５１ａの縁をガスケット５６ａおよび疎水性樹脂５６ｂを介して負極集電体５２の外周部５２ａに対してかしめる。このかしめを行う際には、ガスケット５６ａが徐々に潰れて正極集電体５１とガスケット５６ａとの間および負極集電体５２とガスケット５６ａとの間に隙間ができないようにする。また、この際、疎水性樹脂５６ｂも徐々に圧縮されて正極２、正極集電体５１およびガスケット５６ａと密着するようにする。こうすることで、正極集電体５１と負極集電体５２とがガスケット５６ａにより互いに電気的に絶縁された状態でそれらの内部に、正極２、電解質層３および負極１を収納する空間が形成される。この後、かしめ具６３を上昇させる。
【０１２６】
こうして、図２９Ｄに示すように、正極集電体５１と負極集電体５２との間に形成された空間の内部に正極２、電解質層３および負極１が収納されたバイオ燃料電池が製造される。
次に、燃料タンク５７に蓋５８を取り付け、この蓋５８の燃料供給口５８ａより燃料および電解質を注入した後、この燃料供給口５８ａを密封シールを貼り付けたりすることにより閉じる。ただし、燃料および電解質は、図２９Ｂに示す工程で燃料タンク５７に注入してもよい。
【０１２７】
このバイオ燃料電池においては、燃料タンク５７に入れる燃料として例えばグルコース溶液を用いる場合、負極１は、供給されたグルコースを酵素により分解して電子を取り出すとともに、Ｈ+ を発生する。正極２は、負極１からそれぞれ電解質層３を通って輸送されたＨ+ と負極１から外部回路を通って送られた電子と例えば空気中の酸素とにより水を生成する。そして、正極集電体５１と負極集電体５２との間に出力電圧が得られる。
【０１２８】
図３０に示すように、このバイオ燃料電池の正極集電体５１および負極集電体５２にそれぞれメッシュ電極７１、７２を形成してもよい。この場合、メッシュ電極７１の穴を通して外部の空気が正極集電体５１の酸化剤供給口５１ｂに入り、メッシュ電極７２の穴を通って燃料が蓋５８の燃料供給口５８ａから燃料タンク５７に入る。
【０１２９】
図３１は２個のバイオ燃料電池を直列接続した場合を示す。この場合、一方のバイオ燃料電池（図中、上のバイオ燃料電池）の正極集電体５１と他方のバイオ燃料電池（図中、下のバイオ燃料電池）の蓋５８との間にメッシュ電極７３を挟む。また、この場合、メッシュ電極７３の穴を通って外部の空気が正極集電体５１の酸化剤供給口５１ｂに入るようになっている。燃料の供給は燃料供給システムを用いて行うことも可能である。
【０１３０】
図３２は２個のバイオ燃料電池を並列接続した場合を示す。この場合、一方のバイオ燃料電池（図中、上のバイオ燃料電池）の燃料タンク５７と他方のバイオ燃料電池（図中、下のバイオ燃料電池）の燃料タンク５７とをそれらの蓋５８の燃料供給口５８ａ同士が一致するように互いに接触させる。そして、これらの燃料タンク５７の側面から電極７４を引き出す。また、上記一方のバイオ燃料電池の正極集電体５１と上記他方のバイオ燃料電池の正極集電体５１とにそれぞれメッシュ電極７５、７６を形成する。これらのメッシュ電極７５、７６は互いに接続する。メッシュ電極７５、７６の穴を通って外部の空気が正極集電体５１の酸化剤供給口５１ｂに入る。
【０１３１】
この第２の実施の形態によれば、燃料タンク５７を除くとコイン型またはボタン型のバイオ燃料電池において、第１の実施形態と同様な利点を得ることができる。また、このバイオ燃料電池においては、正極集電体５１と負極集電体５２との間に正極２、電解質層３および負極１を挟み、正極集電体５１の外周部５１ａの縁をガスケット５６を介して負極集電体５２の外周部５２ａに対してかしめるようにしている。これにより、各構成要素同士を均一に密着させることができるので、出力のばらつきを防止することができるとともに、各構成要素間の界面から燃料や電解質などの電池溶液が漏液するのを防止することができる。また、このバイオ燃料電池は製造工程が簡単である。また、このバイオ燃料電池は小型化が容易である。さらに、このバイオ燃料電池は、燃料としてグルコース溶液やデンプンを用い、使用する電解質のｐＨを７付近（中性）に選ぶことにより、万が一、燃料や電解質が外部に漏れても、安全である。
また、現在実用化されている空気電池では、燃料および電解質を製造時に添加する必要があり、製造後に添加することは困難である。これに対し、このバイオ燃料電池では、製造後に燃料および電解質を添加することが可能であるので、バイオ燃料電池は現在実用化されている空気電池に比べて製造が容易である。
【０１３２】
〈３．第３の実施の形態〉
［バイオ燃料電池］
次に、この発明の第３の実施の形態によるバイオ燃料電池について説明する。
図３３に示すように、この第３の実施の形態においては、第２の実施の形態によるバイオ燃料電池から、負極集電体５２に一体に設けられた燃料タンク５７を取り除く。さらに、正極集電体５１および負極集電体５２にそれぞれメッシュ電極７１、７２を形成したものを用い、開放系の燃料タンク５７に入れられた燃料５７ａの上にこのバイオ燃料電池を負極１側が下に、正極２側が上になるようにして浮かべた状態で使用する。
この第３の実施の形態の上記以外のことは、その性質に反しない限り、第１および第２の実施の形態と同様である。
この第３の実施の形態によれば、第１および第２の実施の形態と同様な利点を得ることができる。
【０１３３】
〈４．第４の実施の形態〉
［バイオ燃料電池］
次に、この発明の第４の実施の形態によるバイオ燃料電池について説明する。第２の実施の形態によるバイオ燃料電池がコイン型またはボタン型であるのに対し、このバイオ燃料電池は円筒型である。
図３４ＡおよびＢならびに図３５はこのバイオ燃料電池を示し、図３４Ａはこのバイオ燃料電池の正面図、図３４Ｂはこのバイオ燃料電池の縦断面図、図３５はこのバイオ燃料電池の各構成要素を分解して示す分解斜視図である。
【０１３４】
図３４ＡおよびＢならびに図３５に示すように、このバイオ燃料電池においては、円柱状の燃料保持部７７の外周に、それぞれ円筒状の負極集電体５２、負極１、電解質層３、正極２および正極集電体５１が順次設けられている。この場合、燃料保持部７７は、円筒状の負極集電体５２により囲まれた空間からなる。この燃料保持部７７の一端は外部に突き出ており、この一端には蓋７８が取り付けられている。図示は省略するが、燃料保持部７７の外周の負極集電体５２にはその面の全体に複数の燃料供給口５２ｂが形成されている。また、電解質層３は負極１および負極集電体５２を包む袋状になっている。電解質層３と燃料保持部７７の一端の負極集電体５２との間の部分は例えばシール部材（図示せず）などによりシールされており、この部分から燃料が外部に漏れないようになっている。
【０１３５】
このバイオ燃料電池においては、燃料保持部７７に燃料および電解質を入れる。これらの燃料および電解質は負極集電体５２の燃料供給口５２ｂを通って負極１に到達し、この負極１の空隙部に浸透することにより、この負極１の内部に蓄えられるようになっている。負極１の内部に蓄えることができる燃料の量を多くするためには、負極１の空隙率は例えば６０％以上とすることが望ましいが、これに限定されるものではない。
【０１３６】
このバイオ燃料電池においては、耐久性向上のために、正極集電体５１の外周面に気液分離層を設けてもよい。この気液分離層の材料としては、例えば、防水性透湿性素材（ポリテトラフルオロエチレンを延伸加工したフィルムとポリウレタンポリマーとを複合化した素材）（例えば、ＷＬゴア＆アソシエイツ社製のゴアテックス（商品名））を用いる。このバイオ燃料電池の各構成要素同士を均一に密着させるために、好適には、この気液分離層の外側または内側に、外部から空気が透過可能な網目構造を有する伸縮性ゴム（バンド状でもシート状でも可）を巻き付けてこのバイオ燃料電池の構成要素の全体を締め付ける。
この第４の実施の形態の上記以外のことは、その性質に反しない限り、第１および第２の実施の形態と同様である。
この第４の実施の形態によれば、第１および第２の実施の形態と同様な利点を得ることができる。
【０１３７】
以上、この発明の実施の形態について具体的に説明したが、この発明は、上述の実施の形態に限定されるものではなく、この発明の技術的思想に基づく各種の変形が可能である。
例えば、上述の実施の形態において挙げた数値、構造、構成、形状、材料などはあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれらと異なる数値、構造、構成、形状、材料などを用いてもよい。
【符号の説明】
【０１３８】
１…負極、２…正極、３…電解質層、１１…電極、４１、４２…Ｔｉ集電体、４３、４４…固定板、４７…負荷、５１…正極集電体、５１ｂ…酸化剤供給口、５２…負極集電体、５２ｂ…燃料供給口、５６ａ…ガスケット、５６ｂ…疎水性樹脂、５７…燃料タンク、５８…蓋、７１、７２、７３…メッシュ電極、７７…燃料保持部、７８…蓋
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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