(57)【要約】【課題】今や国民病とされているアレルギーの予防・改善に有効（抗アレルギー機能を有する）かつ、安全性が高い乳酸菌及びその含有物を提供する事にある。さらには、抗アレルギー機能に加えて、抗自己免疫疾患機能、抗糖尿病機能、中性脂肪低減効果などを少なくとも１つは併せ持つ安全性が高い乳酸菌及びその含有物を提供すること。【解決手段】ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスの乳酸菌、エンテロコッカス・デュランス  ＫＲ−２１１株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−３９７）又はその変異体、乳酸菌であるロイコノストック・メセントロイデス・サブスピーシーズ・メセントロイデス  ＫＬＡＢ−２株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−３９３）又はその変異体、それらの乳酸菌株由来の成分を摂取すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスの乳酸菌。
【請求項２】
乳酸菌がラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＲ−０３７株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９５）又はその変異体である請求項１記載の乳酸菌。
【請求項３】
乳酸菌がラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＲ−１８８株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−３９６）又はその変異体である請求項１記載の乳酸菌。
【請求項４】
乳酸菌がラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＬＡＢ−４株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９４）又はその変異体である請求項１記載の乳酸菌。
【請求項５】
乳酸菌であるエンテロコッカス・デュランス  ＫＲ−２１１株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−３９７）又はその変異体。
【請求項６】
乳酸菌であるロイコノストック・メセントロイデス・サブスピーシーズ・メセントロイデス  ＫＬＡＢ−２株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−３９３）又はその変異体。
【請求項７】
請求項１〜６何れかに記載の乳酸菌株由来の成分。
【請求項８】
乳酸菌株由来の成分が、乳酸菌を煮沸水で抽出した残渣であることを特徴とする請求項７記載の乳酸菌株由来の成分。
【請求項９】
抗アレルギー機能を有する請求項１〜８何れかに記載の乳酸菌或いは乳酸菌株由来の成分を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項１０】
乳酸菌或いは乳酸菌株由来の成分を飲食品全体中０．００００１〜１００重量％含有することを特徴とする請求項９記載の飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗アレルギー機能を有する新規乳酸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年食生活の欧米化、住居環境、運動不足、過度のストレス等、生活環境の変化により、アレルギーやメタボリックシンドロームと言った、国民病の患者数並びにその予備軍数は年々増加傾向にある。
【０００３】
アレルギー疾患、なかでも花粉症やアトピー性皮膚炎は、患者数が年々増加傾向にあり、患者のＱＯＬの観点からも、治療・予防策が求められている。花粉症やアトピー性皮膚炎などのＩ型にグループ分けされるアレルギー性疾患は、生体内に侵入した物質をアレルゲンと認識し、ＩｇＥ抗体産生を誘導する事から始まる。再度アレルゲンが浸入すると、肥満細胞や顆粒球上のレセプター分子と結合したＩｇＥ抗体とアレルゲンが結合、その結果、肥満細胞や顆粒球より過剰なヒスタミンやロイコトリエンなどのケミカルメディエーターが放出され、喘息・皮膚炎・鼻水などのアレルギー症状を呈する。
【０００４】
現在では、これらケミカルメディエーターの遊離を抑えることでアレルギー症状を緩和する抗アレルギー剤、ケミカルメディエーターが末梢神経に情報伝達するのを阻害する抗ヒスタミン剤、炎症を抑えるステロイド剤などがあるが、これらの薬剤には副作用が認められ、使用方法や長期にわたる使用では安全性にも問題があるのが現状である。
【０００５】
また、糖尿病・高脂血症・高血圧などのいわゆる生活習慣病の患者数もまた、増加の一途をたどっている。これら疾患の原因は、食べ過ぎ、偏った食生活、運動不足、飲酒や喫煙等の好ましくない生活習慣の積み重ねで悪玉コレステロールが増えたり、善玉コレステロールが減ったり、血中の中性脂肪が増えたりすること等に起因すると考えられている。これら疾患の治療・予防方法として食事療法及び運動療法が有効な手段とされているが、療法を根気良く続ける事は難しく、心理的、肉体的苦痛を伴うことなく治療・予防する方法が求められている。
【０００６】
一方、乳酸菌を用いた発酵食品の中には、整腸作用や生活習慣病予防効果、免疫賦活効果などの健康効果を示すものがあり注目されている。例えば、ヨーグルトでは、発酵に用いた乳酸菌体や、発酵乳中の乳ペプチドがこれら健康機能を示す事が報告されている。現在では、乳酸菌や発酵食品の抗アレルギー機能（例えば特許文献１）、血中中性脂肪低減を含む抗高脂血症機能（特許文献２）、抗糖尿病機能（特許文献３）などが注目されている。それらの中でも、特に抗アレルギー機能が高いものとして特許文献４に記載のラクトバチルス・パラカゼイ・ＫＷ３１１０株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３４）が挙げられる。しかし、何れの乳酸菌の抗アレルギー機能はもとより他の機能もまだ充分なものとは言えない。
【特許文献１】特開平９−２９５９号公報
【特許文献２】特開平１０−２９８０８３号公報
【特許文献３】特開平１０−７５７７号公報
【特許文献４】特許第３５８５４８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、今や国民病とされているアレルギーの予防・改善に有効（抗アレルギー機能を有する）かつ、安全性が高い乳酸菌及びその含有物を提供する事にある。さらには、抗アレルギー機能に加えて、抗自己免疫疾患機能、抗糖尿病機能、中性脂肪低減機能などを少なくとも１つは併せ持つ安全性が高い乳酸菌及びその含有物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスの乳酸菌、並びにエンテロコッカス・デュランス  ＫＲ−２１１株、ロイコノストック・メセントロイデス・サブスピーシーズ・メセントロイデス  ＫＬＡＢ−２株が抗アレルギー機能並びに、抗自己免疫疾患機能、抗糖尿病機能、中性脂肪低減機能など少なくとも１つは併せ持つことを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明の第一は、ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスの乳酸菌に関する。好ましい実施態様は、乳酸菌がラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＲ−０３７株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９５）またはその変異体である上記記載の乳酸菌に関する。同じく別の好ましい実施態様は、乳酸菌がラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＲ−１８８株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−３９６）またはその変異体である上記記載の乳酸菌に関する。同じくまた別の好ましい実施態様は、乳酸菌がラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＬＡＢ４株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９４）またはその変異体である請求項１記載の乳酸菌に関する。本発明の第二は、乳酸菌であるエンテロコッカス・デュランス  ＫＲ−２１１株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−３９７）またはその変異体に関する。本発明の第三は、乳酸菌であるロイコノストック・メセントロイデス・サブスピーシーズ・メセントロイデス  ＫＬＡＢ−２株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−３９３）またはその変異体に関する。本発明の第四は、上記記載の乳酸菌株由来の成分に関する。好ましい実施態様は、乳酸菌株由来の成分が、乳酸菌を煮沸水で抽出した残渣であることを特徴とする上記記載の乳酸菌株由来の成分に関する。本発明の第五は、抗アレルギー機能を有する上記記載の乳酸菌或いは乳酸菌株由来の成分を含有することを特徴とする飲食品に関する。好ましい実施態様は、乳酸菌或いは乳酸菌株由来の成分を飲食品全体中０．００００１〜１００重量％含有することを特徴とする上記記載の飲食品に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、今や国民病とされているアレルギーの予防・改善に有効（抗アレルギー機能を有する）かつ、安全性が高い乳酸菌及びその含有物を提供できる。さらには、抗アレルギー機能に加えて、抗自己免疫疾患機能、抗糖尿病機能、中性脂肪低減機能などを少なくとも１つは併せ持つ安全性が高い乳酸菌及びその含有物を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。本発明の乳酸菌またはその変異体或いは該乳酸菌株由来の成分は、基本的に抗アレルギー機能を有し、そのレベルが非常に高いことが特徴である。さらにまた、該機能に加えて抗自己免疫疾患機能、抗糖尿病機能、中性脂肪低減機能などを少なくとも１つは併せ持つことが特徴である。また、該乳酸菌の変異体とは、自然突然変異によるもの、もしくは放射線や突然変異誘導物質などで人為的に突然変異を誘導させることで得られる菌体のことをいい、その変異体の内、上記乳酸菌の機能と同等の機能を有するものを意味する。
【００１２】
本発明における抗アレルギー機能とは、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）産生促進活性並びにインターロイキン４（ＩＬ−４）産生抑制活性し、ＩｇＥ抗体産生の抑制を示すことで、肥満細胞のヒスタミン遊離を抑制し、抗アレルギー効果が発揮される事を意味する。これらの機能を有する乳酸菌は、例えば、卵白アルブミン（ＯＶＡ）を抗原として免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を、ＯＶＡならびに被検菌とを添加した培地で培養し、脾細胞の産生したサイトカインを測定することで選別することが出来る。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＯＶＡを免疫することによりＩ型アレルギー反応を示すマウスであり、ＯＶＡ免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスより分離された脾細胞は、ＯＶＡを添加した培養液で培養すると、Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４を産生、Ｔｈ１型サイトカインであるＩＬ−１２を産生しないといったＴｈ２型優位な免疫応答を示す。それに対して、上記培養液に乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を添加すると、ＯＶＡ刺激に対してＴｈ１型サイトカインであるＩＬ−１２の産生量が促進され、Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４の産生が抑制されるといった、Ｔｈ１型優位な免疫応答を示す。このようにして、Ｔｈ２型に傾いた生体内免疫系において、抗原刺激に対する免疫応答をＴｈ１型免疫応答に変えることで抗原特異的ＩｇＥの産生量を抑えることが期待される乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を選別することが出来る。
【００１３】
更に、乳酸菌の抗アレルギー機能は、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を配合飼料全量中好ましくは０．０００１重量％〜１０．０重量％になるように混合、更に好ましくは０．０３重量％〜０．１重量％になるように混合させた配合飼料を与えたマウスにＯＶＡを免疫、２週間毎に免疫を続け、８週から１０週間後の血中総ＩｇＥ量を測定することで評価でき、ＩｇＥの産生量を抑える乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分をさらに選別することが出来る。
【００１４】
本発明の抗自己免疫疾患機能は、通常の方法に準じて、以下のように評価できる。まず、コラーゲン誘発関節炎モデルマウス（ＤＢＡ／１Ｊマウス）をウシＩＩ型コラーゲンで免疫し、関節炎を誘発したマウスに乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与する。そして、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を投与していないマウスの関節炎の発症率に対し、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与したマウスは、関節炎の発症率が低減していることを確認できるか否かで評価できる。即ち、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を投与していないマウスは４０〜４５日後にかけて関節炎を高確率で発症するのに対して、前記乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与したマウスは、関節炎の発症率が低減していることを確認できるか否かで評価でき、抗自己免疫疾患機能を有する乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を選別することができる。
【００１５】
また、上記マウスの病態変化を観察する事で、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分の更なる抗自己免疫機能を評価することができる。即ち、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を投与していないマウスは、関節炎病態スコアが上昇し続けるのに対し、前記乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与したマウスは、病態スコアが上昇せずに安定しているか否かで評価でき、上記評価と同様に抗自己免疫疾患機能を有する乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を選別することができる。
【００１６】
本発明の抗糖尿病機能は、２型糖尿病モデルマウス（ＫＫ−Ａｙマウス）の糖負荷試験による血糖値の経時的推移を測定することで評価する事ができる。即ち、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分の代わりに水を経口投与したマウスは、糖負荷試験により上昇した血糖値の経時的降下が鈍いのに対して、前記乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与したマウスは、糖負荷試験により上昇した血糖値が速やかに低下することを確認できるか否かで評価でき、抗糖尿病機能を有する乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を選別することができる。
【００１７】
本発明の中性脂肪低減機能は、２型糖尿病モデルマウス（ＫＫ−Ａｙマウス）に乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与したマウスの血液中中性脂質量を測定する事で評価できる。即ち、通常食を与えたマウス血液中中性脂肪量と比べ、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を混合した混合食を与えたマウスの血液中中性脂肪量は有意に低下していることを確認できるか否かで評価する事ができ、中性脂肪低減機能を有する乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を選別することができる。
【００１８】
本発明において、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＲ−０３７株（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis KR-037）は、ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスに属する乳酸菌の中でも優れた抗アレルギー機能を有し、それに加えて中性脂肪低減機能を有しているため好ましい。該株は、発酵乳より分離された乳酸菌であり、ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９５（受託番号）として独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されている。また、ＫＲ−０３７株の変異体も同等の機能を有する限り、本発明の技術範囲に属する。さらには、ＫＲ−０３７株又はその変異体由来の成分も同等の機能を有する限り、本発明の技術範囲に属する。なお、本発明においてＫＲ−０３７株の同定は、乳酸菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端の塩基より５４４番目の塩基までについてシーケンスし、ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティス標準株と９０％以上の相同性があれば、ＫＲ−０３７株はラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスと同定できる。
【００１９】
本発明において、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＲ−１８８株（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis KR-188）は、ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスに属する乳酸菌の中でも優れた抗アレルギー機能を有し、それに加えて中性脂肪低減機能を有しているため好ましい。該株は、発酵乳より分離された乳酸菌であり、ＮＩＴＥ  Ｐ−３９６（受託番号）として独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。また、ＫＲ−１８８株の変異体も同等の機能を有する限り、本発明の技術範囲に属する。さらには、ＫＲ−１８８株又はその変異体由来の成分も同等の機能を有する限り、本発明の技術範囲に属する。なお、本発明において乳酸菌株の同定は、乳酸菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端の塩基より５４４番目の塩基までについてシーケンスし、ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティス標準株と９０％以上の相同性があれば、ＫＲ−１８８株はラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスと同定できる。
【００２０】
本発明において、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＬＡＢ−４株（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis KLAB-4）は、ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスに属する乳酸菌の中でも優れた抗アレルギー機能を有し、それに加えて優れた抗自己免疫疾患機能と抗糖尿病機能を有しているため好ましい。該株は、パン種より分離された乳酸菌であり、ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９４（受託番号）として独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されている。また、ＫＬＡＢ−４株の変異体も同等の機能を有する限り、本発明の技術範囲に属する。さらには、ＫＬＡＢ−４株又はその変異体由来の成分も同等の機能を有する限り、本発明の技術範囲に属する。なお、本発明において乳酸菌株の同定は、乳酸菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端の塩基より５４４番目の塩基までについてシーケンスし、ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティス標準株と９０％以上の相同性があれば、ＫＬＡＢ４株はラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスと同定できる。
【００２１】
本発明の乳酸菌であるエンテロコッカス・デュランス  ＫＲ−２１１株（Enterococcus durans KR-211）は、優れた抗アレルギー機能を有している。該株は、発酵乳より分離された乳酸菌であり、ＮＩＴＥ  Ｐ−３９７（受託番号）として独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。また、ＫＲ−２１１株の変異体も同等の機能を有する限り、本発明の技術範囲に属する。さらには、ＫＲ−２１１株又はその変異体由来の成分も同等の機能を有する限り、本発明の技術範囲に属する。なお、本発明において乳酸菌株の同定は、乳酸菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端の塩基より５３６番目の塩基までについてシーケンスし、エンテロコッカス属デュランス種標準株と９０％以上の相同性があれば、ＫＲ−２１１株はエンテロコッカス属デュランス種と同定できる。
【００２２】
本発明の乳酸菌であるロイコノストック・メセントロイデス・サブスピーシーズ・メセントロイデス  ＫＬＡＢ−２株（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides KLAB-2）は、優れた抗アレルギー機能を有し、それに加えて優れた抗自己免疫疾患機能を有しているため好ましい。該株は、発酵乳より分離された乳酸菌であり、ＮＩＴＥ  Ｐ−３９３（受託番号）として独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。また、ＫＬＡＢ−２株の変異体も同等の機能を有する限り、本発明の技術範囲に属する。さらには、ＫＬＡＢ−２株又はその変異体由来の成分も同等の機能を有する限り、本発明の技術範囲に属する。なお、本発明において乳酸菌株の同定は、乳酸菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端の塩基より５３５番目の塩基までについてシーケンスし、ロイコノストック属メセントロイデス種亜種メセントロイデス標準株と９０％以上の相同性があれば、ＫＬＡＢ−２株はロイコノストック属メセントロイデス種亜種メセントロイデスと同定できる。
【００２３】
本発明の乳酸菌又はその変異体の培養には、それらが生育可能な培地であればいかなる培地を使用してもよく、培養方法については、試験管培養、フラスコ培養、発酵槽による培養等により培養することができ、特に制限されるものではないが、たとえば乳酸菌培養に一般的に使用されているＭＲＳ培地を用い、一般的な条件で通常の乳酸菌培養を行えばよい。
【００２４】
本発明の乳酸菌は、それらを摂取することで、前記の各機能が発揮されるが、乳酸菌またはその変異体としては生菌でもいいし、死滅菌でもよく、そのまま直接摂取する事もできるし、飲食品に混合、添加して摂取する事もできる。飲食品としては、特に限定はしないが例えば、食用油脂組成物、調理油類、スプレー油類、バター類、マーガリン類、ショートニング類、ホイップクリーム類、濃縮乳類、ホワイトナー類、ドレッシング類、ピックル液類、パン類、ケーキ類、パイ類、クッキー類、和菓子類、スナック菓子類、油菓子類、チョコレート及びチョコレート菓子類、米菓類、ルウ類、ソース類、たれ類、トッピング類、塩などの調味料類、氷菓類、うどんなどの麺類、ベーカリーミックス類、フライ食品類、ハンバーグ，ハムなどの加工肉製品類、サラダ、こんにゃく、豆腐などの加工食品、かまぼこなどの水産練り製品類、冷凍アントレ類、畜産冷凍食品、農産冷凍食品などの冷凍食品類、米飯類、ジャム類、チーズ、チーズフード、チーズ様食品、ガム類、キャンディー類、発酵乳類、缶詰類、ジュース，アルコール飲料，インスタントコーヒーなどの飲料類を含む一般食品形態の他、カプセル剤や錠剤などのサプリメント形態で、特定保健用食品、栄養機能食品などの保健機能食品や、健康食品、栄養補助食品などの機能性食品などが挙げられる。また本発明の乳酸菌を飲食品に利用する場合、栄養強化を目的として、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅなどの各種ビタミン類やミネラル類を添加、併用して用いることもできる。ここで生菌とは、生きたままの乳酸菌のことであり、死滅菌とは、加熱、加圧、薬物処理などにより殺菌処理をした菌体のことであり、菌体処理物とは、磨砕や破砕、抽出などによる液状物化、濃縮、ペースト化、乾燥（スプレードライ、凍結乾燥、真空乾燥、ドラム乾燥から選ばれる少なくとも一つ）、希釈から選ばれる少なくとも一つの処理を施した処理物のことである。本発明の乳酸菌或いは乳酸菌株由来の成分を含有することを特徴とする飲食品においては、乳酸菌或いは乳酸菌株由来の成分を飲食品全体中０．００００１〜１００重量％含有することが好ましく、より好ましくは０．１〜１００重量％、さらに好ましくは１０〜１００重量％である。
【００２５】
本発明の効果は、乳酸菌株由来の成分、即ち乳酸菌の抽出残渣を用いても上記乳酸菌またはその変異体と同様の効果を得ることができるが、ここで抽出残渣とは、菌体を煮沸水などで処理し、菌体からエキスを抽出した後の残渣を遠心分離により回収した沈殿物のことである。この抽出残渣を、上記と同様にそのまま直接摂取する事もできるし、飲食品に混合、添加して摂取することもできる。
【実施例】
【００２６】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２７】
＜抗アレルギー機能の評価＞
乳酸菌の抗アレルギー機能は、ＯＶＡを抗原として免疫したアレルギーマウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス）の脾細胞をＯＶＡと乳酸菌で共培養した際に産生されるサイトカインを測定し、ＩＬ−４の産生を抑制し、ＩＬ−１２産生を促進することができているか否かで評価した。
【００２８】
更に、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分の抗アレルギー機能は、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与したマウスにＯＶＡを経時的に免疫し、血清中ＩｇＥを測定し、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を投与していないマウスの血清中ＩｇＥ量は、経時的に増加するのに対して、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与したマウスの血清中ＩｇＥ量は、経時的増加が見られるか否かで評価した。
【００２９】
＜アトピー性皮膚炎改善機能の評価＞
乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与したアトピー性皮膚炎モデルマウス（Ｎｃ／Ｎｇａ系ＳＰＦ雄性マウス）に、ピクリルクロライドを背部および左右の耳介（内外両側）に塗布することでマウスにアトピー性皮膚炎を誘発させ、皮膚炎スコアならびに耳介厚を調べた。乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を投与していないマウスは、皮膚炎スコアならびに耳介厚が経時的に増加するのに対して、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与したマウスの皮膚炎スコアならびに耳介厚の経時的増加が見られるか否かで評価した。
【００３０】
＜抗自己免疫疾患機能の評価＞
乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分の抗自己免疫疾患機能は、コラーゲン誘発関節炎モデルマウス（ＤＢＡ／１Ｊマウス）をウシＩＩ型コラーゲンで免疫し、関節炎を誘発したマウスに乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与し、４０〜４５日後の関節炎の発症率を調べた。乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を投与していないマウスは、４０〜４５日後にかけて関節炎を１００％に近い高確率で発症するのに対して、上記乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与したマウスは、関節炎の発症率が明らかに低減しているか否かで評価した。
【００３１】
また、上記マウスの病態スコアの経時変化を観察することで、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分の更なる抗自己免疫疾患機能を評価した。乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を投与していないマウスは、関節炎病態スコアが上昇しつづけるのに対し、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与したマウスの病態スコアは、上昇しないか、上昇してもその程度が低いか否かで評価した。
【００３２】
＜抗糖尿病機能の評価＞
乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分の抗糖尿病機能は、２型糖尿病モデルマウス（ＫＫ−Ａｙマウス）の糖負荷試験による血糖値の経時的推移を測定することで評価した。即ち、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分の代わりに水を経口投与したマウスは、糖負荷試験により上昇した血糖値の経時的降下が鈍いのに対して、上記乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与したマウスは、糖負荷試験により上昇した血糖値が速やかに低下するか否かで評価した。
【００３３】
＜中性脂肪低減機能の評価＞
乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分の中性脂肪低減機能は、２型糖尿病モデルマウス（ＫＫ−Ａｙマウス）の血液中中性脂質量を測定することで評価した。即ち、乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分の代わりに水を経口投与したマウスの血液中中性脂質量と比べて、上記乳酸菌或いは乳酸菌株由来成分を経口投与したマウスの血液中中性脂肪量は有意に低下しているか否かで評価した。
【００３４】
（実施例１〜５）  各乳酸菌の調製
表１に記載の乳酸菌はそれぞれ、ＭＲＳ培地（ＭＲＳブイヨン（関東化学社製）５２ｇを１Ｌの水に溶解し、１２１℃、１５分オートクレーブ滅菌したもの）で４８時間培養し、細胞を滅菌した蒸留水で３回洗浄後、凍結乾燥した。凍結乾燥菌体は、１ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ（−）（商品名：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ社製）で懸濁、沸騰浴中で１０分間殺菌後遠心分離して得られた残渣を再びＰＢＳ（−）に懸濁、乳酸菌液１〜５（数字は実施例番号に対応）を調製した。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
（実施例６〜１０）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能（ＩＬ−４産生抑制ならびにＩＬ−１２産生促進）の測定
本実験には、５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを１週間の馴化飼育後用いた。アレルギーモデルマウスは、１００μｇのＯＶＡと２ｍｇの水酸化アルミニウムゲルを混合し、生理食塩水で２００μｌとした抗原液を、腹腔内に免疫（一次免疫）、一週間後更に同量の抗原液を腹腔内に免疫（二次免疫）することで作製した。二次免疫より１週間後、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定、抗体価の確認を行った。抗体価の上昇が確認されたマウスより脾細胞を調製後、２．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地（商品名：ＲＰＭＩ１６４０、Ｓｉｇｍａ社製）に懸濁、抗原刺激としてＯＶＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、表１にある５種の各乳酸菌（１μｇ／ｍｌ）を加えた。脾細胞は、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで培養、７日間培養後の上清を回収し、上清に含まれるＩＬ−４ならびにＩＬ−１２をＥＬＩＳＡ法（製品名：Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）にて測定し、その測定値を評価値とした。それらの結果は表１に示した。
【００３７】
（比較例１）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能（ＩＬ−４産生抑制ならびにＩＬ−１２産生促進）の測定
ネガティブコントロールとして、乳酸菌を添加せず、ＰＢＳ（−）を用いたこと以外は、実施例６〜１０と同様にして抗アレルギー機能の測定を行った。結果は表１にまとめた。
【００３８】
（比較例２）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能（ＩＬ−４産生抑制ならびにＩＬ−１２産生促進）の測定
ポジティブコントロールとして、乳酸菌を添加せず、Ｔｈ１活性化能を有する免疫賦活剤ピシバニール（中外製薬社製）１μｇ／ｍｌを用いた以外は、実施例６〜１０と同様にして抗アレルギー機能の測定を行った。結果は表１にまとめた。
【００３９】
（比較例３）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能（ＩＬ−４産生抑制ならびにＩＬ−１２産生促進）の測定
特許第３５８５４８７号と比較するために、乳酸菌を用いたポジティブコントロールとして、実施例１〜５の乳酸菌の代わりに、抗アレルギー活性を有するとされる乳酸菌ラクトバチルス・カゼイ・Ｌ１４株（乳業技術協会、ラクトバチルス・パラカゼイ・ＫＷ３１１０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３４と同一）を用いた以外は、実施例６〜１０と同様にして抗アレルギー機能の測定を行った。なお、Ｌ１４株は、実施例１〜５と同様の方法で調製したものを用いた。結果は表１にまとめた。
【００４０】
表１は、アレルギーモデルマウス脾細胞のＯＶＡと乳酸菌の共培養に対するＩＬ−４、ＩＬ−１２の産生量を示したものである。乳酸菌を添加しなかった比較例１において、アレルギーモデルマウス脾細胞はＯＶＡ刺激に対して、ＩＬ−４の産生を誘導し、ＩＬ−１２の産生量は検出限界以下と、強いＴｈ２型免疫応答を示した。一方、ピシバニールを用いた比較例２において、アレルギーモデルマウス脾細胞は、ＯＶＡ刺激に対して、ＩＬ−４の産生抑制、ＩＬ−１２の産生誘導を示す、Ｔｈ１型免疫応答を示した。また、Ｌ１４株を用いた比較例３の乳酸菌において、比較例２と同様Ｔｈ１型免疫応答を示した。実施例６〜１０における各乳酸菌群の中では、ＩＬ−４の産生抑制、ＩＬ−１２の産生誘導を示した。このことから、実施例６〜１０の乳酸菌には、Ｔｈ１型免疫応答を誘導する強い抗アレルギー活性を有していた。また、比較例３の乳酸菌と比較して、ＩＬ−１２の産生活性は約２倍、ＩＬ−４の産生も同程度から２分の１であることより、抗アレルギー活性レベルが高いことがわかった。
【００４１】
（実施例１１）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能（ＩｇＥ抗体産生抑制）の測定
まず、実施例１で調製したＫＲ−０３７株の凍結乾燥菌体を０．０５重量部とと賦形剤（商品名：パインデックス＃２  松谷化学社製）０．４５重量部を予め良く混合し、製剤を作製した。作製した製剤０．５重量部と、粉末マウス飼料（製品名：ＣＥ−２  オリエンタル酵母社製）９９．５重量部を混合し、ＫＲ−０３７株の含有量が０．０５％の乳酸菌混合飼料を調製した。
【００４２】
５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー）を１週間の馴化飼育した後、上記調製乳酸菌混合飼料の投与を開始し（平均約１．５ｍｇ／日の乳酸菌を自由摂取）、その開始日より１週間後（Ｄａｙ７）に１００μｇのＯＶＡと２ｍｇの水酸化アルミニウムゲルを混合し、生理食塩水で２００μｌとした抗原液を、腹腔内に免疫した。同様にして、２週間後（Ｄａｙ１４）、４週間後（Ｄａｙ２８）、６週間後（Ｄａｙ４２）、８週間後（Ｄａｙ５６）にＯＶＡ抗原液を免疫した。そして、血中総ＩｇＥ量測定のために、３週間後（Ｄａｙ２１）、５週間後（Ｄａｙ３５）、７週間後（Ｄａｙ４９）、９週間後（Ｄａｙ６３）にマウス頸静脈より採血した。採血した血液を遠心分離により血清を回収し、免疫グロブリンＥ／ＥＩＡキット「ヤマサ」（ヤマサ醤油社製）を用いて血清中に含まれる総ＩｇＥ量を測定した。各測定値は表２に示した。
【００４３】
【表２】
2009142266.tif 000003
【００４４】
（実施例１２）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能（ＩｇＥ抗体産生抑制）の測定
実施例２で調製したＫＲ−１８８株の凍結乾燥菌体を用いた以外は、実施例１１と同様にして、回収した血清中に含まれる総ＩｇＥ量を測定した。各測定値は表２に示した。
【００４５】
（実施例１３）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能（ＩｇＥ抗体産生抑制）の測定
実施例３で調製したＫＲ−２１１株の凍結乾燥菌体を用いた以外は、実施例１１と同様にして、回収した血清中に含まれる総ＩｇＥ量を測定した。各測定値は表２に示した。
【００４６】
（実施例１４）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能（ＩｇＥ抗体産生抑制）の測定
実施例４で調製したＫＬＡＢ−２株の凍結乾燥菌体を用いた以外は、実施例１１と同様にして、回収した血清中に含まれる総ＩｇＥ量を測定した。各測定値は表２に示した。
【００４７】
（実施例１５）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能（ＩｇＥ抗体産生抑制）の測定
実施例５で調製したＫＬＡＢ−４株の凍結乾燥菌体を用いた以外は、実施例１１と同様にして、回収した血清中に含まれる総ＩｇＥ量を測定した。各測定値は表２に示した。
【００４８】
（比較例４）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能（ＩｇＥ抗体産生抑制）の測定
乳酸菌の凍結乾燥菌体を添加しない粉末マウス飼料（製品名：ＣＥ−２  オリエンタル酵母社製）を用いた以外は、実施例１１と同様にして、回収した血清中に含まれる総ＩｇＥ量を測定した。各測定値は表２に示した。
【００４９】
（比較例５）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能（ＩｇＥ抗体産生抑制）の測定
乳酸菌の変わりにラクトバチルス・パラカゼイ・ＫＷ３１１０株からなる健康補助食品（製品名：ノアレカプセル、キリンヤクルトネクストステージ株式会社製）０．０７５重量部と粉末マウス飼料９９．９２５重量部とを混合した乳酸菌混合飼料を用いた以外は、実施例１１と同様にして、回収した血清中に含まれる総ＩｇＥ量を測定した。各測定値は表２に示した。
【００５０】
なお、実施例１１〜１５、比較例４〜５の実験間における、マウスの体重、総摂餌量に差は認められなかった。
【００５１】
表２の結果より、以下のことがわかった。飼料に乳酸菌を混合していないコントロール群（比較例４）と比べて、Ｄａｙ６３の時点で比較例５の飼料を与えたマウスの血中総ＩｇＥ量は減少していた。また、同様に実施例１１〜１５のマウスの血中総ＩｇＥ量も同様に、比較例４のコントロールと比べて、Ｄａｙ６３時点での血中総ＩｇＥ量が減少していた。また、比較例５と実施例１１〜１５の間に明らかな有意差は見られなかったことから、実施例１〜５の乳酸菌群は、比較例５の乳酸菌同様、抗アレルギー活性の高い乳酸菌であることが確認できた。なお本実験における総ＩｇＥ量の変化は、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の変化と考えられることから、本発明の乳酸菌群の抗アレルギー効果が認められたことを示しているといえる。
【００５２】
（実施例１６）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー（抗アトピー性皮膚炎）機能の測定
まず、実施例１で調製したＫＲ−０３７株の凍結乾燥菌体０．３３重量部と粉末マウス飼料（製品名：ＣＥ−２  日本クレア社製）９９．６７重量部を混合し、調整した上記乳酸菌の含有量が０．３３重量％の乳酸菌混合飼料を調製した。
【００５３】
７週齢のＮｃ／Ｎｇａ系ＳＰＦ雄性マウス（日本チャールズリバー）を１週間の馴化飼育した後、上記乳酸菌混合飼料の投与を開始（平均１０ｍｇ／日の乳酸菌を自由摂取）、開始日より１日後（Ｄａｙ１）にマウスをイソフラン麻酔し、剃毛した腹部および足蹠に感作用ＰｉＣｌ溶液（５％（ｗ／ｖ）ＰｉＣｌ溶液（エタノール／アセトン＝４：１））、１５０μｌを塗布した。アトピー性皮膚炎の誘発は感作後４日（Ｄａｙ５）にマウスの背部および左右の耳介（内外両側）に誘発用ＰｉＣｌ溶液（０．８％（ｗ／ｖ）ＰｉＣｌ溶液（オリーブ油））、１５０μｌを塗布することで行った。このアトピー性皮膚炎誘発操作を１週間毎に７回実施した。感作開始日（Ｄａｙ１）より週２回、皮膚の状態を観察し、ヒトのアトピー性皮膚炎の臨床状評価基準に基づき、掻痒症、発赤・出血、浮腫、擦傷・組織欠損、痂皮形成・乾燥の５項目に関して、無症状（０点）、軽度（１点）、中等度（２点）、高度（３点）と点数化し、加算したものを皮膚炎トータルスコアとして評価した。また、試験開始日（Ｄａｙ０）より、週１回、マイクロメーターを用いて耳介厚の測定を行った。各測定結果を図１、図２に示した。
【００５４】
（比較例６）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー（抗アトピー性皮膚炎）機能の測定
乳酸菌の凍結乾燥菌体を添加しない粉末マウス飼料を用いた以外は、実施例１６と同様にして、トータルスコア、耳介厚を測定した。各測定結果は図１、図２に示した。
【００５５】
なお、実施例１６、比較例６の実験間における、マウスの体重、総摂餌量に差は認められなかった。
【００５６】
図１、図２の結果より、以下のことがわかった。飼料に乳酸菌を混合していないコントロール群（比較例６）は、４回目のアトピー性皮膚炎誘発以降トータルスコアならびに耳介厚が上昇していくのに対して、ＫＲ−０３７株の乳酸菌を混合した飼料を与えた群（実施例１６）のマウスにおいて、トータルスコア、耳介厚とも上昇は抑えられ、トータルスコアでは５回目のアトピー性皮膚炎誘発以降で、耳介厚ではＤａｙ３５以降で有意に上昇を抑制した。以上の結果から、本発明の乳酸菌の抗アトピー性皮膚炎効果が認められたことを示しているといえる。
【００５７】
（実施例１７）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌群の抗自己免疫疾患機能の測定
コラーゲン誘発関節炎モデルマウスであるＤＢＡ／１Ｊマウス（８週齢  雄性）を本実験に用いた。関節炎誘発には、ウシＩＩ型コラーゲン（コスモバイオ社製）を０．０５Ｍ酢酸に溶解して２．７ｍｇ／ｍｌに調製し、容量換算で同量のＦｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｂａｎｔ（和光純薬工業社製）を混合した関節炎誘発用コラーゲン液１５０μｌを背皮内注射（Ｄａｙ０）し、１４日後（Ｄａｙ１４）に、Ｄａｙ０と同様の関節炎誘発用コラーゲン液１５０μｌを尾根部皮内へ免疫する事で、関節炎発症を誘発した。７日後（Ｄａｙ７）より、実施例４の乳酸菌（ＫＬＡＢ−２株）を、４．０×１０8ｃｅｌｌ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙになるようにＰＢＳ（−）に懸濁し、プラスチック製マウス用経口ゾンデ及び、１ｍＬツベルクリン注射筒を用いて強制投与した。
【００５８】
関節炎病態の指標は、関節炎病態スコアで評価した。関節炎病態スコアは、前後左右の肢の病態を４段階で評点化（０：変化なし、１：足指の腫脹、２：足指および足裏の腫脹、３：足全体の腫脹、４：重度の腫脹）して加算、更に骨変性の有る場合には１を加算して評価した。上記評価を、４４日後（Ｄａｙ４４），４６日後（Ｄａｙ４６），４８日後（Ｄａｙ４８）に行い、結果を表３に示した。
【００５９】
【表３】
2009142266.tif 000004
【００６０】
（実施例１８）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌群の抗自己免疫疾患機能の測定
強制投与した乳酸菌を実施例５の乳酸菌（ＫＬＡＢ−４株）に変えた以外は、実施例１７と同様にして、関節炎病態を関節炎病態スコアで評価し、上記評価を、４４日後（Ｄａｙ４４），４６日後（Ｄａｙ４６），４８日後（Ｄａｙ４８）に行い、結果を表３に示した。
【００６１】
（比較例７）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌群の抗自己免疫疾患機能の測定
乳酸菌を投与せず、ＰＢＳ（−）のみ強制投与した以外は、実施例１７と同様にして、関節炎病態を関節炎病態スコアで評価し、上記評価を、４４日後（Ｄａｙ４４），４６日後（Ｄａｙ４６），４８日後（Ｄａｙ４８）に行い、結果を表３に示した。
【００６２】
コラーゲン誘発関節炎マウスにおける関節炎の発症率の経時変化（表３）より、乳酸菌は投与せずにＰＢＳ（−）のみを強制投与した比較例７マウス（ｎ＝６）は、４４日後（Ｄａｙ４４）で６６％のマウスの肢に腫脹が確認され、４６日後（Ｄａｙ４６）で全てのマウスで関節炎の発症が確認された。一方、実施例１７（n＝６）のマウスにおいて、４４日後（Ｄａｙ４４）での発症率は３３％、４８日後（Ｄａｙ４８）においても発症率は３３％であった。また、実施例１８のマウス（ｎ＝５）において、４６日後（Ｄａｙ４６）で初めて発症が確認され、その発症率は、２０％であり、４８日後（Ｄａｙ４８）においても２０％であった。これらより、実施例４、実施例５の乳酸菌には、抗自己免疫疾患効果を有していることがわかった。
【００６３】
また表４には、各群におけるマウスの病態スコアの変化を示した。比較例７のマウスの平均スコアは４４日後（Ｄａｙ４４）で、１．３であったが、４日後の４８日後（Ｄａｙ４８）には、２．５まで上昇した。また、実施例１７のマウスでは、病態スコアは、０．４（４４日後（Ｄａｙ４４））から２．５（４８日後（Ｄａｙ４８））まで上昇していた。実施例１８のマウスでは、病態スコアが４６日後（Ｄａｙ４６）で０．２、４８日後（Ｄａｙ４８）においても０．２と病態スコアの上昇は見られなかった。以上より、特に実施例１８の乳酸菌は、関節炎の発症抑制機能並びに病態の進行を遅らせる機能を有していた。
【００６４】
【表４】
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【００６５】
（実施例１９）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌の抗糖尿病機能の測定
まず、実施例５で調製したＫＬＡＢ−４株の凍結乾燥菌体を０．１重量部と脱脂粉乳４．９重量部、粉末マウス飼料（製品名：ＭＦ  オリエンタル酵母社製）を９５重量部混合し、ＫＬＡＢ−４株の含有量が混合飼料全体中０．１重量％の乳酸菌混合飼料を調製した。次いで遺伝的に２型糖尿病を自然発症するＫＫ−Ａｙマウス（６週齢、オス  日本クレア社製）を１週間の馴化飼育した後、上記調製乳酸菌混合飼料の投与を開始し（平均約３ｍｇ／日の乳酸菌を自由摂取）、その開始日より４週間後に糖負荷試験によるマウスの糖尿病評価を行った。糖尿病の評価は、１８時間絶食後、採血を行い（０分）、０．３ｇ／ｍｌに調製したマルトース水溶液をマウス当たり１００μｌ経口投与し、１５、３０、６０、９０、及び１２０分後に採血を行い、各々の血液サンプル中の血糖値を簡易式血糖測定器（商品名：グルテストエース  三和化学研究所社製）を用いて測定した。各測定値は図３に示した。
【００６６】
（実施例２０）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による発酵乳の抗糖尿病機能の測定
乳酸菌ＫＬＡＢ−４株を用いて調製した発酵乳粉末５重量部と、粉末マウス飼料（製品名：ＭＦ  オリエンタル酵母社製）９５重量部を混合して乳酸菌混合飼料を調製した以外は、実施例１９と同様にして評価した。なお上記発酵乳粉末は、以下の方法で作製した。１０％還元脱脂乳を９０℃達温殺菌、３７℃になるまで冷却後、予め１０％還元脱脂乳で培養していた乳酸菌ＫＬＡＢ４株を、１重量％添加、３７℃で４８時間発酵させ発酵乳を作成した。作製した発酵乳は、菌数測定用寒天培地（商品名：ＢＣＰ加プレートカウントアガール、日水製薬株式会社製）を用いて菌数測定をし、重曹でｐＨを６．８付近に調整し、凍結乾燥した。
【００６７】
（比較例８）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌の抗糖尿病機能の測定
乳酸菌を混合しない粉末マウス飼料（製品名：ＭＦ  オリエンタル酵母社製）を用いた以外は、実施例１９と同様にして評価した。
【００６８】
（比較例９）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌の抗糖尿病機能の測定
乳酸菌の代わりに脱脂粉乳５重量部と粉末マウス飼料（製品名：ＭＦ  オリエンタル酵母社製）９５重量部を混合して用いた以外は、実施例１９と同様にして評価した。
【００６９】
糖尿病モデルマウスにおける糖負荷試験の結果を図３に示した。飼料に乳酸菌を混合していないコントロール群（比較例７）や、飼料に脱脂粉乳を混合したコントロール群（比較例９）と比べて、実施例１９、実施例２０のマウス血糖値は経時的に降下しており、糖負荷後２０〜４０分で最大血糖値を示すも、１２０分での血糖値は、０分での血糖値（空腹時血糖）レベルまで降下していた。
【００７０】
本実験で用いたＫＫ−Ａｙマウスは自然発症的に糖尿病を発病するマウスで、比較例８〜９のマウスでは、マルトース負荷により上昇した血糖値の経時的降下が見られなかったのに対して、実施例１９〜２０のマウスはマルトース負荷１２０分後の血糖値は空腹時血糖まで降下していたことから、乳酸菌ＫＬＡＢ−４株の抗糖尿病効果が認められたことを示しているといえる。
【００７１】
（実施例２１）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌の中性脂肪低減機能の測定
乳酸菌の中性脂肪低減機能は、２型糖尿病モデルマウスであるＫＫ−Ａｙマウスを６週齢で購入し、マウス飼料（製品名：ＣＥ−２  オリエンタル酵母社製）と滅菌水を自由摂取で２週間馴化飼育し、８週齢で実験に用いた。実験開始日より３週間、実施例１で調製した乳酸菌ＫＲ−０３７株の凍結乾燥菌体を６．６７重量％になるように蒸留水で調製した乳酸菌液を毎日マウス体重１ｋｇ当たり７．５ｍｌになるよう、プラスチック製マウス用経口ゾンデ及び、１ｍＬツベルクリン注射筒を用いて強制投与した（平均約２０ｍｇ／日の乳酸菌を強制投与）。また、実験期間中マウスはマウス用飼料（製品名：ＣＥ−２  オリエンタル酵母社製）ならびに滅菌水を自由摂取とした。２週間の連続強制投与後、血液を回収、血清中中性脂肪を測定キット（トリグリセライトＥ−テストワコー  和光純薬工業社製）を用いた測定した。測定値は表５に示した。
【００７２】
【表５】
2009142266.tif 000006
【００７３】
（実施例２２）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌の中性脂肪低減機能の測定
強制投与に用いる乳酸菌を実施例２で調製した乳酸菌ＫＲ−１８８株の凍結乾燥菌体を用いた以外は実施例２１と同様にして、回収した血清中に含まれる中性脂肪量を測定した。測定値は表５に示した。
【００７４】
（実施例２３）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌の中性脂肪低減機能の測定
強制投与に用いる乳酸菌を実施例３で調製した乳酸菌ＫＲ−２１１株の凍結乾燥菌体を用いた以外は、実施例２１と同様にして、回収した血清中に含まれる中性脂肪量を測定した。測定値は表５に示した。
【００７５】
（比較例１０）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌の中性脂肪低減機能の測定
強制投与に乳酸菌を混合していない蒸留水を用いた以外は、実施例２１と同様にして、回収した血清中に含まれる中性脂肪量を測定した。測定値は表５に示した。
【００７６】
（比較例１１）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌の中性脂肪低減機能の測定
強制投与に用いる乳酸菌の代わりに、インスリン抵抗性改善薬であり、血中中性脂肪を下げる効果のある、ピオグリタゾン（武田薬品工業社製）が０．４重量％になるように蒸留水で調製したものを用いた以外は実施例２１と同様にして、回収した血清中に含まれる中性脂肪量を測定した。測定値は表５に示した。
【００７７】
（比較例１２）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による乳酸菌の中性脂肪低減機能の測定
乳酸菌の変わりにラクトバチルス・パラカゼイ・ＫＷ３１１０株からなる健康補助食品（製品名：ノアレカプセル、キリンヤクルトネクストステージ株式会社製）を１０重量％になるように蒸留水で調製した乳酸菌液を用いた以外は実施例２１と同様にして回収した血清中に含まれる中性脂肪量を測定した。測定値は表５に示した。
【００７８】
なお、実施例２１〜２３、比較例１０〜１２いずれの実験においても、マウスの体重、総摂餌量に差は認められなかった。
【００７９】
表５の結果より、以下のことがわかった。乳酸菌を投与していない比較例１０のマウスの血中中性脂肪と比べて、中性脂肪低減効果を有するピオグリタゾンを強制投与した比較例１１のマウス血中中性脂肪は、低下しており、ピオグリタゾンの中性脂肪低減作用が確認された。また、実施例１の乳酸菌を強制投与した実施例２１のマウス、実施例２の乳酸菌を強制投与した実施例２２のマウスにおいても、比較例１１のマウス同様、血中中性脂肪量は低下していた。一方、実施例２３のマウス血中中性脂肪は低下していなかった。また、比較例１２のマウスの血中中性脂肪量も低下していなかった。
【００８０】
こられの結果より、実施例１と実施例２の乳酸菌の中性脂肪低減効果が認められたことを示しているといえる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】アトピー性皮膚炎を誘発したマウスの皮膚炎トータルスコアの経時変化。
【図２】アトピー性皮膚炎を誘発したマウスの耳介厚の経時変化。
【図３】マルトース水溶液を経口投与してから１５、３０、６０、９０、及び１２０分後の血糖値。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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