(57)【要約】【課題】従来の培養容器を用いた細胞培養環境は、顕微鏡観察系を含めた装置とその観察架台上の培養チャンバーの温度調節等を含めた機能からなる装置で構成されているが、その温度調節は培養チャンバー内の雰囲気温度という目安で行われているが、細胞試料近傍の温度を制御するものではなかった。しかし、最近では細胞の増殖、あるいは生死という根幹に係わる解明が待たれ、より精緻な培養環境を提供できる培養容器が求められていた。【解決手段】本発明は、透明導電膜材料の各特性を活かす、抵抗体及び導電膜を形成する事と、透過率を活かす事、形体からは足場構造体とする事、並びに物性としては抗菌作用とを利用する事である。更に培養の一要因である温度調節を、試料へ直接加熱が行える様にして温度制御を可能とする透明導電膜からなるヒーターと、その同一膜を利用してセンサーをシャーレ等細胞培養容器に加工配置するものの提供である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
付着性細胞を培養するための細胞培養容器本体に形成された透明導電膜を備えた該細胞培養容器において、前記透明導電膜はヒーター部と電流検出センサー部を備えた事を特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
請求項１記載の細胞培養容器において、前記容器本体の皿部は、前記細胞を付着させる為にボトム透明プレート部を備え、該ボトム透明プレートの下側には透明導電膜が形成され、その透明導電膜をヒーターとする抵抗回路形成と、さらに前記抵抗を所望する抵抗値を得る電流検出とするセンサーとを設けて、前記細胞の局所への加温を正確にする事を可能とする様に形成された一対の対向をなす縦溝からなる陽極側と陰極側の各々のスリットを設けた事を特徴とする細胞培養容器。
【請求項３】
請求項１記載の細胞培養容器において、前記容器本体の蓋部は、トップ透明プレート部を備え、該トップ透明プレートの上側には透明導電膜が形成され、その透明導電膜をヒーターとする抵抗回路形成を設けて、前記細胞容器の蓋部を防曇可能とする様に形成された事を特徴とする細胞培養容器。
【請求項４】
請求項１に記載する細胞培養容器であって、該容器の蓋部に炭酸ガスの注入筒とその排出筒、及び培養液の灌流注入筒とその排出筒とを備える事を特徴とする細胞培養容器。
【請求項５】
請求項２の細胞培養容器において、前記本体の皿部は、前記細胞を付着させる為にボトム透明プレート部を備え、該ボトム透明プレートの細胞が付着する面の上側に透明導電膜が形成され、その透明導電膜をヒーターとする抵抗回路形成と、さらに前記抵抗を所望する抵抗値を得る電流検出とするセンサーとを設けて、請求項２項に記載の該透明プレートの下側に透明導電膜が形成される構造と比較して前記細胞の局所への熱伝導及び加温を正確にする事を可能とする様に形成された一対の対向をなす縦溝からなる陽極側と陰極側の各々のスリットを設けた事を特徴とする細胞培養容器。
【請求項６】
請求項１又は２もしくは５の細胞培養容器において、電流を流すべく陽極と陰極との対の電極針を備え、該ボトム透明プレートの上側に透明導電膜面を形成し微弱電流を流す事を可能とする様に形成された事を特徴とする細胞培養容器。
【請求項７】
請求項１記載の細胞培養容器本体において、前記容器の皿部の外表面底部に直接透明導電膜を形成し、該透明導電膜をヒーターとする抵抗回路形成と、さらに前記抵抗を所望するする抵抗値を得る電流検出とするセンサー部とを設けて、前記細胞の局所への加温を正確にする事を可能とする様に形成された一対の対向をなす縦溝からなる陽極側と陰極側の各々のスリットを設けた事を特徴とし、さらに、前記本体の蓋部には、外表面上部に直接透明導電膜を形成し、該透明導電膜をヒーターとする抵抗回路形成を設けて、前記細胞容器の蓋部を防曇可能とする様に形成された事とを特徴とする細胞培養容器。
【請求項８】
請求項１記載の細胞培養容器本体の周囲には透明導電膜が形成され、該透明導電膜をヒーターとする抵抗回路形成と、さらに前記抵抗を所望する抵抗値を得る電流検出とするセンサーとを設けて、前記培養容器本体内の試料への加温を正確にする事を可能とする様に形成された一対の対向をなす縦溝からなる陽極側と陰極側の各々のスリットを設けた事を特徴とするマイクロウェルプレート、試験管又はフラスコである培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、培養環境の精度を改善する機能性を有する細胞培養容器に関するものである。透明導電膜からなるヒーター部を培養容器に取付けて、その容器の局所部を任意な温度で直接的に熱伝導を行わせ、その温度を制御し、且つ簡易及び安価な形態で提供するものである。その目的の一つは、測温及び監視とする温度センサーをヒーター発熱部の近傍又は同一パターン上に設けて、培養試料部の温度を正確に制御する事である。二つ目は、顕微鏡観察時において支障をきたさない様に培養容器の蓋部に防曇機能を設けたトップ透明プレートを設ける事である。三つ目は、シャーレ、ウェルプレート、試験管もしくはフラスコの表面又は胴体側の外周面もしくは底面に上記記載のヒーター部及びセンサー部を形成するものである。方法としては培養容器本体に透明導電膜の成膜を行い、次いで適切に機能化させる為にヒーター部又はセンサー部においてパターン加工を行うものである。
【背景技術】
【０００２】  再生医療分野では万能細胞及びタンパク質等に関する基礎研究、臨床、創薬及び疾患治療の開発が進められ細胞培養試験、観察評価、分析法も進化している。併せて、その培養容器も高精度及び高機能化が求められている。【０００３】  培養環境の中でも温度環境は重要である。培養容器に就いても正確に温度の制御が可能となる温度環境に応えるものが望まれる。その容器に加熱手段として導電性ポリマーを用いた提案がある。
【特許文献１】特表２００３−５１２８０９しかしながら、この提案では従来の課題である発熱面の熱分布の不均一課題を克服するものではなく、さらにこの方法では顕微鏡による高倍率観察の対応がとれない。【０００４】  さらに培養容器の底の表面に温度応答性高分子を付着させその底面に発熱抵抗体を用いて温度制御をさせる提案もある。
【特許文献２】公開２００７−１７４９８２  この提案も（０００３）項と同様に高分子材料である事による成形上の課題からその肉厚の限界から４０〜１００倍という高倍率観察が可能となる様には底面が形成されない。また、加熱手段が細胞容器の近傍に有る事と、その温度監視となるセンサーに就いては提案されていないので、細胞試料面を正確に制御する法としては課題がある。この目的では細胞培養細胞の剥離、回収の為でありより正確な制御と高倍率観察を必要としない。さらに加熱手段に用いる発熱抵抗体も半導体製造法である露光装置などを用いる大かがりな製造手段を用いる提案である。これは、この高分子材料基材を外部加熱手段を用いて加温させる事であり、本発明の様に透明なプレートである発熱基材にセンサーを同時形成する提案とは異なる。【０００５】  他の側面として、顕微鏡下での培養細胞の観察時においては温度コントロールは重要で有り顕微鏡観察を阻害しない様に透明加熱ヒーターが用いられており、そのヒーター機能として以下の提案も有る。
【特許文献３】公開２００４−２０６０６９
【特許文献４】公開２００７−２１２６３３しかし、これらの方法では、顕微鏡ステージ上に設置する加熱板を通じて加熱をさせる為、シャーレ等の培養容器へは該容器を収納するその加熱板を構成するチャンバーを通じて加熱を行う間接的加熱となり、シャーレ内の培養試料を真に所定する温度で加熱すると云うには限界があった。即ち培養試料直下で所定する温度を達成する為にはより熱伝導ロスを少なくする方法を具備する培養容器が求められる。【０００６】  一方で、温度制御を行う為にはセンサーは必須であり、特に透明な薄膜センサーは光学顕微鏡観察向けには期待がされている。次の報告の中にＩＴＯセンサーが提案されているが、これらもフォトリソグラフィ法等の高価な装置を用いて作るので、更により安価で簡便な手法での製造も待たれていた。本発明者らは、レーザー加工法の一つであるレーザー加工法を用いて、ヒーター発熱面を形成する同一のＩＴＯ薄膜を温度センサー化する事で、重装備な装置と複雑な製法を用いる事無く低コストで対応できる製法を提案している。。
【非特許文献１】マイクロ加工技術を応用した深海用ＤＮＡ精製デバイスの開発（生産研究２００４年５０巻６号２９〜３２頁）
【０００７】  他の透明な薄膜温度センサーの例としては、ヒーターと同一基体上ではなくその反対する側に温度センサーを使用する報告がある。これは上の項（０００６）と同様な理由により、ヒーター部とセンサー部を別々な面に形成する等コストがかかる他、単独にセンサーを形成する提案である。本発明の様に透明導電膜を利用して加熱を主目的とするヒーターを形成し、その同一基板上にセンサーを設ける細胞培養容器として機能させる構造のものとは違いがある。
【特許文献５】公開平１０−３４０８０２
【０００８】  更に細胞培養時に於いては、細胞容器は常時加温されているので、シャーレの蓋内部に曇りを生じてしまい、倒立顕微鏡観察においても観察側の皿部底面に対物レンズを用い、その細胞培養器の蓋面からは透過光を照射する必要から顕微鏡観察に支障をきたす事もあった。【０００９】  本発明者らは、実登録３１４２５０７号において、樹脂製もしくはガラス製のスライドガラス基板及びバイオ基板に透明導電膜を成膜したヒーターを一体化させたものを提案し、且つヒーター部を均一発熱できるようにスリット形状加工を設けた抵抗回路を設け機能させるものを提供できることを開示し、又、このヒーターパターン回路の加工はレーザー装置で簡単に加工する事ができるものであった。【００１０】  更に特願２００７−２８５５４３号において、より発熱エリアを分画して、その分画エリア毎に異なった発熱ができるヒーターパターンとなる加工提案も行っている。１個の基板上に同時に複数の異種温度を発熱させるものである。【００１１】  しかし、これらの考案ないし該発明は、本来の特徴である直接加熱法をより正確に制御させる方法としての温度制御は従来のセンシング法に頼っており、その対応に課題を残していた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】  本発明の目的は、透明導電膜材料の各特性である、電気及び光学並びに物性形体を発揮できる様にする機能性を有する細胞培養容器の発明である。電気特性としては抵抗体及び導電膜を形成する事と、光学特性としてはその透過率を活かす事、形体からは細胞外基質の足場構造体とする事、並びに物性としては抗菌作用を利用する事である。【００１３】  抵抗体を活かして発熱ヒーターとして作用させるには、透明導電膜材料の一つであるインジウム酸化物とスズ酸化物の混合物であるＩＴＯを用いてヒーターとなるパターン部を形成する事と、その同一パターン部をその形成に用いた同一の装置を用いて透明なる温度センサー部を透明プレート上に形成する事である。これを培養容器そのものに取付ける事で、正確に細胞試料面の温度環境を構築できる。さらに培養容器を収納させる加温用チャンバーを不要にできる事である。尚、透明導電膜材料は、ＺｎＯ、ＴｉＯ２などの透明酸化物の材料を用いる事もできる。【００１４】  この温度センサーを用いて、ヒーター面の発熱部温度を検出してフィードバックさせる事により温度コントロールを容易に行なわせる事である。【００１５】  またセンサーを低コストで製造する加工法としては、発熱部を均一化させる目的として使用するスリット加工回路形成に用いたレーザー加工法を採用する事で対応できる。【００１６】  培養試料の局所を正確に直接加温制御するには、ヒーター面を測温する課題が有り、ヒーターとセンサーが同一面上に形成されたボトム透明プレートを、培養容器であるシャーレ又はウェルプレートの皿部に適切に取り付ける事である。【００１７】  さらに、ヒーターとセンサーとなる透明導電膜パターンを培養容器の表面、胴体側外周面もしくは底部に適切に取り付ける事である。【００１８】  本発明の目的の二つ目は、このヒーターとなる透明導電膜パターンが形成されたトップ透明プレートを用いて、シャーレ又はウェルプレートの蓋となる部分に搭載すると、防曇用途にも対応できるようにしたものを提供することである。この場合、シャーレ又はウェルプレートの各々の蓋に直接その透明導電膜パターンを形成する事もできる。【００１９】  請求項１記載の透明プレートは顕微鏡観察用のカバーガラスとしての役割も兼ねる事から、低屈折率、高透過率の性能を満足させる石英又はホウケイ酸ガラスもしくは光学性能を有する樹脂製のものを提供する事である。【００２０】  さらに、他の目的は培養容器の細胞付着面側に形成する透明導電膜の電気導電性に着目して、電気化学手法に対応する培養容器を提供する事である。併せて細胞付着面側に細胞外基質となるその接着因子としての機能の一つである足場構造となる該培養容器を提供する事である。【００２１】  一方本発明の該細胞容器はそれを収納させる培養チャンバーを不要とする小型培養容器となるという特長を有しており、特に顕微鏡下の経時観察では、温度環境の他に、生存環境としての炭酸ガスフラン器を必要とし、これらを組込み培養装置とする小型化が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００２２】  本発明の請求項１に係るものは、付着性細胞を培養するための細胞培養容器本体に形成された透明導電膜を備えた該細胞培養容器において、前記透明導電膜はヒーター部と電流検出センサー部備えた事を特徴とする細胞培養容器とするものである。該細胞培養容器本体は、孔開け加工を行ったものにボトム透明プレートが取付けた形体と、孔開け加工がされていない形体とからなる。。【００２３】本発明の請求項２に係るものは、細胞培養容器であるシャーレの皿部に孔開け加工を行ってその孔を塞ぐ様にして皿の底部を形成するボトム透明プレートからなるものである。該ボトム透明プレートは、裏面に透明導電膜を成膜加工がされ、さらにその透明導電膜をヒーターとする抵抗回路形成と、さらに前記抵抗を所望する抵抗値を得る電流検出とするセンサーを設けてある。ヒーターパターン回路とセンサー回路を同一基板上に設ける事により、より正確なヒーターエリア部の温度情報が得られる。該ボトム透明プレートの回路パターンの特徴は、一対の対向をなす縦溝からなる陽極側と陰極側の各々のスリットを設けた事を特徴とする細胞培養容器である。ここで用いる細胞培養容器の本体シャーレは、ポリスチレン等の樹脂製のものを使用する。【００２４】  本発明の請求項３に係るものは、細胞培養容器であるシャーレの蓋部に孔開け加工を行ってその孔を塞ぐ様にして蓋上部を形成するトップ透明プレートから製造するものである。該トップ透明プレートは、表面に透明導電膜を成膜加工がされ、さらにその透明導電膜をヒーターとする抵抗回路形成を設けた事を特徴とする細胞培養容器である。  本項の目的は、蓋部が結露すると、正立顕微鏡観察に支障をきたしたり、又、倒立顕微鏡観察法においては顕微鏡のステージ上側からの照明光を阻害する事になり観察に支障をきたしていたが、蓋部にヒーター回路を設ける事で防曇用となる事である。上記００２３項とは異なり、防曇機能のみであるから、センサー回路と均一発熱させるヒーター回路は不要であり、該防曇機能とするには皿の底部を形成するボトム透明プレートによるヒーター温度より上回る発熱とすればよい。【００２５】  本発明の請求項４に係るものは、細胞培養容器にあっては、培養庫で培養していた細胞を顕微鏡下で経時的観察する必要がある時には、生存させる培養環境として、温度以外にｐＨ（水素濃度イオン指数）を管理する手段としての炭酸ガス供給と灌流が必要となる事がある。これらに対応すべく、該細胞培養容器であるシャーレの蓋部に炭酸ガスの注入筒と排出筒と、灌流注入筒と排出筒とを簡易に取付けられる様にしたものである。該注入及び排出筒は、その外径は４ｍｍ前後とし耐腐食性の材質のもので製造する。その使用はシリコン製又はナイロン製チューブ（図示しない）等に連結して使用する。【００２６】  本発明の請求項５に係るものは、請求項２項に記載の該ボトム透明プレートの下側に透明導電膜が形成される構造と比較して、前記細胞の局所への熱伝導及び加温をより遅滞無く正確にする事を可能とする様に、該ボトム透明プレートの細胞が付着する面の上側に透明導電膜が形成された該細胞培養容器である。【００２７】本発明の請求項６に係るものは、請求項２の該細胞培養容器において��電流を流すべく陽極と陰極との対の電極針を備え、該ボトム透明プレートの上側に透明導電膜面を形成し微弱電流発生装置（図示しない）を用いて微弱電流を流す事を可能とする様に形成された事を特徴とする細胞培養容器である。電極針は接触端子径が１ｍｍ内外の小径のコンタクトプローブを用いる。  本項の目的は、細胞培養を行う面である該ボトム透明プレートの上側の透明導電膜面に微弱電流を流す事で、新たな電気化学的な培養実験を開拓するものである。【００２８】  本発明の請求項７に係るものは、該培養容器へ該トップ透明プレート又は該ボトム透明プレートを用いる事なく直接、透明導電膜の成膜とパターン形成するもので、光学顕微鏡観察の対物レンズの６０〜１００倍の高倍率観察には適さないが、各々の透明プレート加工が不要となるので低コストで供給できる。【００２９】  本発明の請求項８に係るものは、シャーレの他の細胞培養容器であるマイクロウェルプレート又は試験管もしくはフラスコの培養容器に同様な加工をなしたものである。【００３０】  本発明の上記各請求項に係るものは、細胞培養容器に透明導電膜を成膜加工を行い、発熱エリアとなるヒーターパターンと温度センサーパターンをレーザー加工装置により形成することである。その導電性に着目して、ヒーターパターン回路とセンサー回路を同一基板上に設ける事により、より正確な発熱エリア部の温度情報が得られる。尚該透明プレートの形状は矩形又は円形で対応する。【００３１】  ヒーターとして機能するのは、印加する電圧制御によりヒーター端子間の抵抗値に電力負荷が加わり電流値の変動が生じる事から、ヒーター温度を設定するには、印加する電流と電圧の比例関係に於いて設定される。その時の電流値と比例関係にある発熱温度との相関関係を利用するものである。予めその所定温度を得る必要な電圧を印加し、この時センサーにより電流を計測検出し、温度に換算して、電圧を調整する事で温度制御を行う。端子間の抵抗値を測定する事から、この関係を用いて温度センサーとして利用するものである。【００３２】  本発明は、透明な温度センサーの提案であるが、従来のその製法は（０００６）項記載のようにマスク製造を伴う重装備なフォトリソグラフィ設備を用いて製造する提案であったが、下記に述べるレーザー加工装置装置を用いる事で低コストで製造できるメリットを有する。以下に低コストでセンサー回路を形成するレーザー法を用いた透明センサー部の形成を提案する。その形成は、（１）センサー部を単独で設ける方法（図１０）、（２）センサー部をヒーターパターンとなる内部に設ける方法（図１１）、並びに（３）ヒーター発熱部とその発熱部の端子部をセンサー制御部として利用する方法（図１２）が考えられるが、使用目的又は製造目的に併せて選択すれば良い。本案ではレーザー加工とするパターンは一対の対向をなす縦溝からなる陽極側と陰極側の各々のスリット形成を行う提案である。【００３３】  成膜加工する透明導電膜であるＩＴＯの透過率は約８０％なので、これを改善する為に反射防止膜を透明導電膜の上に積層形成して透過率を改善させる事もできる。
【発明の効果】
【００３４】  本発明は、外部加熱装置を用いる間接加熱法では無く、観察培養細胞を直接加熱ができ、その熱伝導を効率良く伝える局所直接加熱法の為に、培養細胞直下を所定の設定された培養温度にする事ができる。【００３５】  本発明は、細胞培養には加温が伴う事により蓋部が結露するが、防曇目的とする透明ヒーターを形成しているので、正立顕微鏡観察又は倒立顕微鏡観察法を阻害する事なく観察ができる。【００３６】  本発明は、培養容器であるシャーレ等にヒーターを取り付け培養容器に一体化させて、更にその機能向上の為に温度フィードバック用の透明な温度センサーを設ける事により、温度制御を容易にするものとなるので、シャーレの蓋を開けて測温する事も無く、別途外部温度センサーを付加する必要も無くなり、構成としてもシンプルとなる。又、センサーパターンは成膜されているヒーターと同材質の為、透明性が得られるので顕微鏡観察による支障が無くなる。【００３７】  ヒーター部を発熱均一目的でスリット加工によるヒーターパターン化と、センサーパターン加工が同一のレーザー加工装置を使用する事になり、さらに同一工程で製造する事による為製造コストが安価となる。【００３８】  本発明は、細胞培養を行う面上に形成される透明導電膜面に微弱電流を流す事で、電気刺激による細胞制御又は神経細胞等の電気生理実験等の新たな電気化学的な培養実験を光学顕微鏡観察下で行えるものである。更に細胞培養面に形成された導電膜面に細胞外細胞外基質となるその接着因子としての機能の一つである足場構造となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】  以下、図面を用いて本発明の非限定的な実施例を基に説明を行う。【００４０】  図１（Ａ）は、上記記載の該トップ透明プレート１をシャーレ蓋部に、該ボトム透明プレート３５を皿部に各々取り付けたものの斜視図である。（Ｂ）はその断面図である。培養容器であるシャーレ容器３は、その蓋部と皿部は事前に孔開け開口されており、それを塞ぐ様に該トップ透明プレート１及び該ボトム透明プレート３５を有した構造である。【００４１】  該シャーレ容器３の形体は、外径が３５ｍｍ、深さ１０ｍｍからなる円筒形である。また該容器はポリスチレン等の樹脂で製造され、その蓋部と皿部の中央部分に、被培養細胞（図示しない）をできるだけ多く付着できるようにその外径を大きくとり、２０ｍｍ内外の開口部３１が設けられている。【００４２】  さらにその蓋部１２と皿部１３には、各々の外側に各々の開口部３１を塞ぐ為に、該トップ透明プレート１及び該ボトム透明プレート３５をシリコン系の硬化型接着剤を介して連結する。該トップ透明プレート１及び該ボトム透明プレート３５の形体は顕微鏡観察用のカバーガラス並みの厚さ１７０μｍ内外、外径３０ｍｍ内外とし、材質は光学品質の高いホウケイ酸硝子もしくは樹脂製を使用する。  接着剤材料としては、ガラス並の屈折率（１．６）を有するシリコーン系の光硬化性又は熱硬化性樹脂を用いる事もできる。例えば株式会社ＡＤＥＫＡ製のナノハイブリッドシリコーン材料はその一例である。【００４３】  また該ボトム透明プレートの下面３５ｂには、被細胞への局所加温が正確に行えるように、レーザー加工法によりヒーター作用とセンサー作用とする為のスリットパターンが設けられている。【００４４】  蓋部１２の結露防止用とする為に、その開口部３１ａを塞ぐ為に、上記記載の項００３８及び００３９と同様に蓋部の上面１２に該トップ透明プレート１をシリコン系の硬化型接着剤を介して連結する。尚該トップ透明プレートの上面１ａには、レーザー加工法によりヒーターとする為のスリットパターンが設けられている。【００４５】  図２（Ａ）は、上記記載のシャーレのその容器の蓋部に炭酸ガスの注入筒とその排出筒、及び培養液の灌流筒とその排出筒とを備えたものの斜視図である。（Ｂ）はその断面図である。本培養容器３を用いて炭酸ガス及び培養液を循環させる灌流の培養システムは図１５記載にするが、炭酸ガス注入筒３７及び灌流注入筒３９とその炭酸ガス排出筒３８及び灌流排出筒４０を備える培養容器である。これらへの流入には図示しない細径のチューブを接続して使用するものである。該注入筒とその排出筒の形体は外径は４ｍｍ前後とし耐腐食性の材質のもので製造する。その使用はシリコン、又はナイロン製又はシリコン製チューブ（図示しない）等に連結して使用する。この注入筒を通じて生理活性作用のある、酸素及びオゾン等の気体を供給する事ができる。【００４６】  図３は、前記容器３の皿部１３の開口部３１ｂに取付けられた上記記載の該ボトム透明プレートの上面３５ａと、該容器の内面１３ａと下面１３ｂ及び外周辺部１３ｃとに透明導電膜を先ず成膜し、次いでレーザー加工によりヒーターパターンとセンサーパターン加工を行い形成し、さらに前記容器３の蓋部は前記���０４２項と同様に形成するものの断面図である。シャーレの１３ａ及び１３ｂ並びに１３ｃには図示しない導通用の電極端子をレーザー加工にて行う。これは皿部１３の該ボトム透明プレートの上面３５ａである細胞付着面に発熱エリアを設けるものである。【００４７】  図４（Ａ）は、前記容器３の蓋部の内面１２ｂと、底部１３にあっては該ボトム透明プレート３５が取り付けられている該皿部の内面１３ａ及び下面１３ｂ並びに外周辺側面部１３ｃと、該ボトム透明プレートの上面３５ａと該下面３５ｂとに、透明導電膜を先ず成膜がなされ、次いでレーザー加工によりヒーターパターンとセンサーパターン加工を行い形成するものの斜視図である。（Ｂ）はその断面図である。【００４８】  また図４（Ａ）は、前記容器３の蓋部の内面１２ｂに透明導電膜加工がなされているが、該蓋部の外面１２ａには、透明性の抗菌剤がコート６０がされているものの斜視図である。（Ｂ）はその断面図である。該容器に用いるポリスチレン樹脂は細胞が付着し易いものであり、逆に他の細胞の侵入等に対処する様に該前記容器本体の一部、本例では該蓋部の外面１２ａに酸化チタンＴｉＯ２等を用いてコートするものである。【００４９】  この他に、図３又は図４において、該ボトム透明プレートの上面３５ａに用いる透明導電膜１５は塗布法によるＩＴＯインク（微粒子）を用いる事ができる。該透明導電膜の特徴は、ナノ単位の粒子径の粒度分布状態からなり、導電性という特性の他に、その表面状態の微粒子の凹凸性状を利用して、細胞外細胞外基質となるその接着因子となる足場構造とするものである。【００５０】  同様に、図３又は図４において、該ボトム透明プレートの上面３５ａに用いる導電膜にはダイヤモンド様炭素膜であるＤＬＣ膜を用いる事もできる。これは上記記載００４９項と同様にこのＤＬＣ膜も細胞培養の足場構造として利用するものである。【００５１】  図５は、電流を流すべく陽極５２と陰極５３との対の電極針を備え、皿部に取付けられている該ボトム透明プレートのト側３５ａに透明導電膜面を形成し微弱電流発生装置（図示しない）を用いて微弱電流を流す事を可能とするものの断面図である。電極針は接触端子径が１ｍｍ内外の小径のコンタクトプローブを用いる。また該ボトム透明プレートの下面３５ｂには、被細胞への局所加温が正確に行えるように、レーザー加工法によりヒーターとセンサーとする為のスリットパターンが設けられている。【００５２】  図６は、図１記載の前記容器３の皿部１３に取付けられている該ボトム透明プレートの下面３５ｂ側のヒーターとセンサーとする為スリットパターンが設けられている面に反射防止膜を形成するものである。【００５３】  図７（Ａ）は、前記容器３の蓋部の上面１２ａと皿部の下面１３ｂに透明導電膜を先ず成膜し、次いでレーザー加工によりヒーターパターンとセンサーパターン加工を行い形成するものの斜視図である。これは透明プレートを用いないでシャーレそのものへ発熱エリアとセンサーを設けるものである。（Ｂ）はその断面図である。【００５４】  図８（Ａ）は、６穴用のウェルプレート４１において、前記ボトム透明プレート３５を該皿部の底面に取り付け、さらに前記トップ透明プレート１を該蓋部の上面に取り付けたものの平面図である。（Ｂ）はその断面図である。一般的なウェルプレート４１の形体は８５ｍｍｘ１２７ｍｍの外径寸法であり、前記ウェルプレートでは３５ｍｍ径のウェルを６個配置するものの例である。【００５５】  図９（Ａ）は、試験管の表面及周辺側面部に透明導電膜を先ず成膜し、次いでレーザー加工によりヒーターパターンとセンサーパターン加工を行い形成するものの上面図である。（Ｂ）はその斜視図である。【００５６】  図１０は、温度センサー部５を単独で設ける方法の一例であり、印加させる陽極側端子６及び陰極側端子７とからなる発熱部４とセンサー部５を搭載した、パターンの平面図である。レーザー加工法により、スリットパターン部３０を形成すると発熱は所望する所に起こす事が可能となる。ヒーター４中心部の発熱を高める事が可能になる。【００５７】  透明ヒーター部４を形成する方法は、本発明者らが実願２００７−３６３７、特願２００７−２８５５４３号において記載した方法で行うもので、そのヒーターとなる発熱部の温度均一化の為にレーザー加工装置を用いて陽極側スリット３０ａと陰極側スリット３０ｂとなる加工を行ってパターン化を行う。【００５８】  センサー部５は、ヒーターとして最もよく活用される部位の近傍に加工配置し、センサーの両端には検出端子部Ａ（８）、と検出端子Ｂ（９）を設ける。以下に透明導電膜材料であるＩＴＯを用いて透明な温度センサーとなる製造法を示す。【００５９】  パターンを形成する該ボトム透明プレート３５又は容器本体皿部１３に、発熱部４とセンサー部５となる様に設計を行い各々図示したその範囲が作用できる回路パターンとする。【００６０】  例えば、生細胞の生存保温温度として約４０度の保温を目指す発熱抵抗回路を形成するには、透明導電膜であるＩＴＯを先ず、シート抵抗値１０Ω／□以下で成膜し、その成膜面に必要とする端子間抵抗値になる様にレーザー加工装置にてスリットパターン３０となる加工回路を作る。【００６１】  水溶液が約８０％封入されている３５ｍｍ径シャーレを用いて、それを加熱容器として機能を発揮できる能力は、表１に示す。これから判る様に発熱部に必要なヒーターＷ数は１０Ｗ以下のものを用いれば良い。この時、３５ｍｍ径のシャーレ内の培養液量は７０６５ｍｍ３であり、１０Ｗ時に要求される熱量（Ｗｘ秒ｓｅｃ）は５７８Ｊ（ジュール）となる。一方２．２Ｗ時は１５０Ｊである。尚表１は、発熱部に必要なヒーター能力を定める時のシュミレーションである。これは設定する端子間抵抗値を決め、その時必要とされる、Ｗ数、電圧、電流値の相関関係である。又、ヒーターの昇温性能を定めるのは、１分間の上昇温度という要素である。【００６２】
【表１】
2009201509.tif 000003
【００６３】  ヒーター能力２．２Ｗ、端子間抵抗値１０Ωの場合は、１分間の上昇温度は、Ｊ／水（比熱ｘ体積）から求められ、５．０８℃となる。この時の測定値は表２に示す。各測定温度位置は、図示の図１の３２（▲１▼）、３３（▲２▼）、３４（▲３▼）である。【００６４】
【表２】
2009201509.tif 000004
【００６５】  この時のヒーター能力２．２Ｗの実測値及び設定値との関係をしめしたものは表３データとなる。【００６６】
【表３】
2009201509.tif 000005
【００６７】  このデータから判る事はヒーター能力が低いと実温度は約７分を経過すると飽和温度に達してしまい、設定値に対して実温度との比較は５℃程低い温度となる。これは他の要因として放熱ロス等が生じてしまうと予想され、ヒーター性能を重視する時は次項に示すものが推奨される。【００６８】  次いで、印加を行う両電極である陽極側端子部６と陰極側端子部７を発熱部とに区分するスリットである６ａ、６ｂ、７ａ、７ｂと発熱部のスリット部位３０ａ及び３０ｂをレーザー加工装置を用いて除去を行う。図のグレー部は除去されない透明導電膜による発熱部であリ、除去部は、空白で示されているスリット部である。【００６９】  更に、温度センサー部５の作用させるパターンは、該ボトム透明プレート３５のサイズを２０ｘ２０ｍｍ、印加電源として想定３Ｖとする時、図１０の様になる。水平回路１０と波形回路１１からなる回路を形成し、３Ｖ、１５０ｍＡの印加を基にすると、発熱温度２０℃では、端子間抵抗値は、２０Ω、３０度では、３０Ω、４０度では、５０Ωというパラメータが得られる。これを実現するには、図１０記載の様に、検出端子長さ（Ｌ１＋Ｌ２＋Ｌ３）を２０ｍｍ、その端子幅（Ｗ１）を３ｍｍ、端子水平部の（Ｗ２）１．５ｍｍ、長さ（Ｌ１又はＬ２）５ｍｍ、山谷からなる波形を５山とし、端子幅（Ｗ３）０．５ｍの回路を形成すると良い。両端に検出端子Ａ（８）と検出端子Ｂ（９）を設ける。【００７０】  図１１は、温度センサー部５を発熱部４となる内部に設ける方法の平面図である。これはヒーター発熱部４のより近傍へ温度センサー部を配置形成するものである。【００７１】本例では、先に記載した００５９項から００６９項と同様の設計する事で対応できる。【００７２】  図１２は、本例は発熱部４とその発熱部印加させる端子部をセンサー制御部として利用する方法の平面図である。発熱用とセンサー制御用の二つの印加方法を採用する。発熱用端子部である陽極側端子６及び陰極側端子７はこの時センサー制御端子部である検出端子Ａ（８）及び検出端子Ｂ（９）と兼用させる。即ち端子兼検出部Ａ（５６）及び端子兼検出部Ｂ（５７）の抵抗は高抵抗（例として５０Ω）とし、発熱部４の抵抗はそれより低い低抵抗（例として３０Ω）とするパターン加工を行う。本図では陽極側のスリット３０ａ、陰極側のスリット３０ｂ、陽極側のスリットの３０ｃ１及び３０ｃ２、陰極側のスリットの３０ｄ１及び３０ｄ２である。【００７３】  図１３は、図１２記載した２系統の回路図である。対向する電源回路を発熱用回路５８と制御用回路５９と交互に切り替えて使用するものである。図示しないヒーター電源を用いて印加し、発熱部４の所望する温度にする為に電圧を制御する。対向する陽極側端子６及び陰極側端子７に電圧を印加して発熱をさせ、切り替えて端子兼検出部Ａ（５６）及び端子兼検出部Ｂ（５７）の電流を監視計測して、発熱部４の電圧にフィードバックをかけるものである。【００７４】  以上の設計に基づき、レーザー装置を用いてヒーターパターンもしくはセンサーパターンをレーザーカッティング（トリミングとも云う）加工を行う。【００７５】  図１４は、当該シャーレ容器３を用いて加温させる使用方法を示した断面図���ある。但し、印加をする電源部は図示を省いてある。ヒーターとセンサーが一体化された図１記載のシャーレ容器３を、電源と接続されている電極路２２を通じて、倒立顕微鏡用試料搭載ホルダーリング部２３と一体となっている皿部固定ホルダー１７内に挿入を行い、電極が対応する所定の位置に圧接固定をして使用するものである。本例は倒立顕微鏡を想定したもので、下部に対物レンズ２４が配置されている。【００７６】  皿部固定ホルダー１７内のホルダー側電極Ａ（１８）ホルダー側電極Ｂ（１９）とからなる電極部へ、当該シャーレ容器３上の発熱部の陽極側端子（６）及び陰極側端子（７）を圧接固定して印加を行うものである。【００７７】  次に蓋部固定ホルダー２５を被せて、当該シャーレ蓋１２の圧接固定を行う。この時、蓋部固定ホルダー２５の上・蓋部固定ホルダー電極Ａ（２６）及び上・蓋部固定ホルダー電極Ｂ（２７）と、電極パッドＡ（２０）電極パッドＢ（２１）とを、圧接固定して印加を行うものである。【００７８】  皿部固定ホルダー１７内のホルダー側検出端子Ａ（２８）ホルダー側検出端子Ｂ（２９）０を用いて検出を行うものである。【００７９】  セットが完了したら、図示しない電源部を用いて印加を行う。【００８０】  図１５は、ヒーター能力２．２Ｗ、端子間抵抗値１０Ωの温度特性図である。【００８１】  図１６は、本発明のヒーターとセンサーが組込まれた培養容器を倒立顕微鏡下で使用する時の概略斜視図である。従来の大型のガスボンベを用いる装置では、培養条件を変える為に実験毎に対応するのでは煩雑であり、即ち高圧ガス容器の取り扱いに由来するので当然の事に装置が大型化していた。本発明を用いる事で培養試験環境装置の小型化が図る事ができ、顕微鏡観察する机上のスペースを有効に活用できる。【００８２】  当該シャーレ３をその固定するホルダー１７へ収納させて、それを倒立顕微鏡の対物レンズ真上の架台上に配置し、図示しない電源につなぎ、炭酸ガス供給ユニット４６から、炭酸ガスをチューブ４７を通じてコントローラ５０へ供給して、ここで培養に適した濃度をセンシングして、そのセンシング値を培養に適する濃度（約５％）とする様に炭酸ガス供給ユニット４６で微調整を行い、チューブ４８を通じて当該シャーレ３内へ供給するものである。チューブ４９は排出用である。灌流に使用する循環装置は図示を省いてある。【００８３】  炭酸ガス供給ユニット４６に用いるガス源は小型ミニガスシリンダー６１を用い、例として日本炭酸瓦斯社製のミニガスカートリッジＮｏ．６（７４ｇ）を使用とする。この寸法は長さ１３４ｍｍｘ胴径４０ｍｍと小型であり、１００％濃度の圧縮ガスを開放するとその容量は約３７Ｌである。細胞培養では５％前後濃度の炭酸ガスとする為には空気と混合させパ−ジメーター方式のフローメーター６２を用い、図示を省いてあるレギュレーター又はフローコントローラーで制御を行う。流入させるチューブは４ｍｍ口径前後とし、材質はナイロン又はフレキ管を使用する。【００８４】  炭酸ガス使用圧は０．１ＭＰａ前後とし、５％前後の混合ガス流量を０．２Ｌ／ｍｉｎの仕様とする場合は、空気ガス容量（１９０ｍＬ／ｍｉｎ）と炭酸ガス（１０ｍＬ／ｍｉｎ）を混合して流入さ��る。この条件で当該小型ミニガスシリンダー１本で、数日間の使用ができ、当該ガス源は形体が小型故複数個設置する事で長期間使用が可能となる。【００８５】  長期間の細胞培養には培養液のｐＨを一定する事が重要であり、例えばｐＨ７．４に維持する為には炭酸ガス濃度を５％にする必要がある。コントローラ５０では、温度制御は００７２項記載の様に印加して行うが、炭酸ガス濃度はセンサーを用いて濃度監視する事ができる。例として濃度センサー６３は、ＶＡＩＳＡＲＡ社製のモデルＧＭＭ１１１が使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】（Ａ）は該シャーレ容器に、該透明プレートをシャーレ蓋部及び皿部に取り付けたものの斜視図である。（Ｂ）はその断面図である
【図２】（Ａ）は、上記記載のシャーレの該容器の蓋部に炭酸ガスの注入筒とその排出筒、及び培養液の灌流筒とその排出筒とを備えたものの斜視図である。（Ｂ）はその断面図である。
【図３】該シャーレ容器の皿部のボトム透明プレートの細胞が付着する面上側に透明導電膜が形成された細胞培養容器の断面図である。
【図４】図４（Ａ）は、該シャーレ容器の蓋部内面、及び皿部の内面及び下面並びに外周辺側面部、さらに皿部に取付けられているボトム透明プレートの両面に透明導電膜とヒーターとセンサー加工をなすものであり、蓋部外面には抗菌剤がコートされているものの斜視図である。（Ｂ）はその断面図である。
【図５】図５は、該シャーレ容器において電極針を備え、皿部に取付けられている該ボトム透明プレートの上面に微弱電流を流す事を可能とするものの断面図である。
【図６】図６は、該シャーレ容器においてそのボトム透明プレート下面側に反射防止膜を形成したものの断面図である。
【図７】図７（Ａ）は、該シャーレ容器において透明プレートを用いないでシャーレそのものへ発熱部とセンサーを設けるものの斜視図である。（Ｂ）はその断面図である。
【図８】図８は透明プレートを各々、６穴用のウェルプレートの皿部の底面と、蓋部の上面に取り付けたものの平面図である。（Ｂ）はその断面図である。
【図９】図９（Ａ）は、試験管の表面及周辺側面部に発熱部とセンサーパターン加工を行い形成するものの上面図である。（Ｂ）はその斜視図である。
【図１０】図１０は、センサー部を単独で設ける方法であり、発熱部とセンサーとからなるパターンの平面図である。
【図１１】図１１は、センサー部を発熱部となる内部に設ける方法の平面図である。
【図１２】図１２は、発熱部とその発熱部を印加させる端子部をセンサー制御部として利用する方法の平面図である。
【図１３】図１３は、図１２記載した２系統の回路図である。
【図１４】図１４は、図１記載のシャーレを固定して印加、検出する為のホルダー概要断面図である。
【図１５】図１５は、図１記載のシャーレのヒーター能力２．２Ｗ、端子間抵抗値１０Ωの性能のものの温度特性図である。
【図１６】図１６は、本発明のヒーターとセンサーが組込まれた図１記載の培養容器を倒立顕微鏡下で使用する時の参考斜視図である。ポンプ等の循環装置は図示を省いてある。
【符号の説明】
【００８７】１．トップ透明プレート
１ａ．トップ透明プレート上面
１ｂ．トップ透明プレート下面
２．矩形スライドガラス基板
３シャーレ容器
４．発熱部（透明ヒーター部）
５．温度センサー部
６．陽極側端子
７．陰極側端子
８．検出端子Ａ
９．検出端子Ｂ
１０．水平回路
１１．波形回路
１２．シャーレ蓋
１２ａ．シャーレ蓋上面
１２ｂ．シャーレ蓋下面
１３．シャーレ皿
１３ａ．シャーレ皿内面
１３ｂ．シャーレ皿下面
１３ｃ．シャーレ皿外周面
１４．培養液
１５．透明導電膜
１６．反射防止膜
１７．皿部固定ホルダー
１８．ホルダー側電極Ａ
１９．ホルダー側電極Ｂ
２０．電極パッドＡ
２１．電極パッドＢ
２２．電源供給回路
２３．顕微鏡用試料搭載ホルダーリング
２４．対物レンズ
２５．上・蓋部固定ホルダー
２６．上・蓋部固定ホルダー電極Ａ
２７．上・蓋部固定ホルダー電極Ｂ
２８．ホルダー側検出端子Ａ
２９．ホルダー側検出端子Ｂ
３０．スリットパターン部
３０ａ．陽極側のスリット
３０ｂ．陰極側のスリット
３０ｃ１、３０ｃ２．陽極側のスリット
３０ｄ１、３０ｄ２．陰極側のスリット
３１．シャーレ開孔部
３１ａ．シャーレ開孔部上
３１ｂ．シャーレ開孔部下
３２．温度測定ポイント（底部端）
３３．温度測定ポイント（底部中心）
３４．温度測定ポイント（水溶液中心部）
３５．ボトム透明プレート
３５ａ．ボトム透明プレート上面
３５ｂ．ボトム透明プレート下面
３６．透明導電膜
３７．炭酸ガス注入筒
３８．炭酸ガス排出筒
３９．灌流注入筒
４０．灌流排出筒
４１．ウェルプレート
４２．ウェル
４３．試験管
４４．試験管胴部
４５．倒立顕微鏡
４６．炭酸ガス供給チューブ
４７．炭酸ガス供給チューブ１
４３．試験管
４４．試験管胴部
４５．倒立顕微鏡
４６．炭酸ガス供給チューブ
４７．炭酸ガス供給チューブ１
４８．炭酸ガス供給チューブ２
４９．炭酸ガス排出チューブ
５０．コントローラ
５１．透明導電面
５２．微小電極用針（＋）
５３．微小電極用針（−）
５４．検出端子Ｃ
５５．検出端子Ｄ
５６．端子兼検出部Ａ
５７．端子兼検出部Ｂ
５８．発熱回路
５９．制御回路
６０．抗菌コート
６１．小型ミニガスシリンダー
６２．フローメーター
６３．炭酸ガス濃度センサー
【図１】
2009201509.tif 000006
【図２】
2009201509.tif 000007
【図３】
2009201509.tif 000008
【図４】
2009201509.tif 000009
【図５】
2009201509.tif 000010
【図６】
2009201509.tif 000011
【図７】
2009201509.tif 000012
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2009201509.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
2009201509.tif 000017
【図１３】
2009201509.tif 000018
【図１４】
2009201509.tif 000019
【図１５】
2009201509.tif 000020
【図１６】
2009201509.tif 000021