(57)【要約】      （修正有）【課題】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の、保存安定性を著しく向上させた組成物、および該組成物を用いたポリオールの測定試薬を提供する。【解決手段】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、環状アミノ酸と、非還元糖またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質と、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物と、界面活性剤と、を含むポリオール脱水素酵素組成物、および該組成物を用いたポリオールの測定試薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、
環状アミノ酸と、
非還元糖またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質と、
２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物と、
界面活性剤と、
を含む、ポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項２】
前記ポリオール脱水素酵素は、グリセロール脱水素酵素であることを特徴とする、請求項１に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項３】
前記環状アミノ酸は、エクトインおよびヒドロキシエクトインの少なくとも一方を含む、請求項１または２に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項４】
前記非還元糖は、トレハロースおよびラフィノースの少なくとも一方を含み、前記アミノグリコシド系抗生物質は、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項５】
前記金属化合物は、カルシウムを含む化合物およびマグネシウムを含む化合物からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項６】
前記界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）（トライトン）Ｘ−１００である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物を含む、ポリオール測定試薬。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物をポリオールと反応させる段階を有する、ポリオールの定量方法。
【請求項９】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に、環状アミノ酸と、非還元糖またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質と、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物と、界面活性剤と、を安定化剤として添加する段階を有する、ポリオール脱水素酵素組成物の製造方法。
【請求項１０】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に、環状アミノ酸と、非還元糖またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質と、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物と、界面活性剤と、を安定化剤として添加して、酵素組成物を得る段階と、前記酵素組成物を凍結乾燥する段階と、を有する、ポリオール脱水素酵素組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ」または単に「ポリオール脱水素酵素」とも称する）の保存安定性、特に凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の保存安定性を向上させたポリオール脱水素酵素組成物、当該組成物を含むポリオール測定試薬、および当該組成物を用いたポリオールの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素は、バクテリアの細胞膜に存在し、グルコノバクター属の細菌などから抽出、精製する方法が知られており、グリセロールやソルビトール、マンニトールなどの定量に利用されている。
【０００３】
従来から、例えば、グリセロールに関しては、下記式（１）および式（２）で示すように、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロール−３―リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）またはグリセロール−３―リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）とを用いることによる定量方法が知られている。
【０００４】
【化１】
2009201436.tif 000002
【０００５】
しかしながら、この方法は二種類の酵素を用いるため反応が煩雑であるという問題点がある。さらに、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いた場合は溶存酸素の影響を受けるという問題点がある。また、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【０００６】
溶存酸素の影響を受けず、一種類の酵素を用いる方法としては、下記式（３）で示すようにＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いる方法が知られている。
【０００７】
【化２】
2009201436.tif 000003
【０００８】
しかしながら、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは、補酵素結合型酵素ではないため、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。
【０００９】
より安価で簡便なグリセロールの定量方法として、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）を用いる方法がある。この方法は、下記式（４）の反応によって行われるため、溶存酸素の影響を受けない、反応が簡便で複数の酵素を用いる必要がない、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がないなどのメリットがある。
【００１０】
【化３】
2009201436.tif 000004
【００１１】
しかしながら、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、膜結合型酵素であるため、保存安定性が悪いという問題点がある。このため、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上させることが重要な課題となる。
【００１２】
従来から酵素の安定化剤としては、牛血清アルブミン、人血清アルブミン、卵白アルブミンなどのタンパク質、グルコース、トレハロース、ラフィノースなどの糖、グリセロール、エチレングリコールなどの多価アルコール、アルギニン、グルタミン酸などのアミノ酸、カルシウムイオンやマグネシウムイオンなどの塩類、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノールなどの還元剤などが知られている。しかし、これらの安定化剤が、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して効果があるかは知られていない。
【００１３】
特許文献１には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨと類似する、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むグルコース脱水素酵素に対して、（ｉ）アスパラギン酸、グルタミン酸、α―ケトグルタル酸、リンゴ酸、α―ケトグルコン酸、α―サイクロデキストリンおよびこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、ならびに（ｉｉ）アルブミンを含む安定化剤を添加することにより、従来に比べてはるかに安定な酵素組成物が得られることが開示されている。
【００１４】
また、特許文献２には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、および界面活性剤を安定化剤として添加することにより、ポリオール脱水素酵素組成物が得られることが開示されている。
【特許文献１】特開２００１−２２４３６８号公報
【特許文献２】特開２００７−２５９８１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、上記特許文献１に記載の安定化剤では、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させることはできない。
【００１６】
また、上記特許文献２に記載の酵素組成物では、３７℃で１週間保存した際の酵素活性の残存活性が８０％前後であり、酵素の保存安定性が十分であるとはいえない。このため、酵素の保存安定性をさらに向上させる必要がある。
【００１７】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、酵素の保存安定性が向上したポリオール脱水素酵素組成物を提供することを目的とする。また、本発明の他の目的は、正確にポリオールを定量できる上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を含むポリオール測定試薬、および上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を用いたポリオールの定量方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記従来の問題点に鑑み、鋭意研究を積み重ねた結果、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に対して、環状アミノ酸、非還元糖またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物、および界面活性剤を添加することにより、ポリオール脱水素酵素の安定性、特に凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の安定性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、環状アミノ酸と、非還元糖またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質と、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物と、界面活性剤と、を含む、ポリオール脱水素酵素組成物である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）の経時的な酵素活性の低下、特に凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止し、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を著しく向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
本発明の一形態によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、環状アミノ酸と、非還元糖またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質と、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物と、界面活性剤と、を含む、ポリオール脱水素酵素組成物が提供される。
【００２３】
本発明において、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）は、いずれのポリオールを基質としてもよく、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に制限されない。例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも好ましくは、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、およびマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）を基質とし、より好ましくはグリセロールを基質とする。
【００２４】
本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールと電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨが好適に使用できる電子受容体としては、フェリシアン化カリウム、フェナジニウムメチルサルフェートおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、Ｗｕｒｓｔｅｒ’ｓ  ｂｌｕｅ、ニトロテトラゾリウムブルーなどが挙げられる。
【００２５】
本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨとしては、従来公知の酵素をいずれも好ましく使用することができる。該酵素は例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など、様々な細菌が生成することが知られている。本発明では、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生することができる菌（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌」とも称する）が生成するいずれのＰＱＱ依存性ＰＤＨも好適に使用することができるが、これらの中でも特に、グルコノバクター属に由来するＰＱＱ依存性ＰＤＨを好適に使用することができる。さらに、入手の容易さから、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ  ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ  ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ  ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等を使用することができる。
【００２６】
また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌であれば、これらの自然突然変異株または人為突然変異株を使用してもよい。人為突然変異処理方法は、当業者に周知の方法によって、同様にしてもしくは適宜修飾してまたはこれらの方法を適宜組合せて適用することができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）が使用され、特にグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ  ３２９１が好ましく使用される。
【００２７】
上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌からＰＱＱ依存性ＰＤＨを得るための具体的な方法は、特に制限されず、例えば、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌を栄養培地に培養し、該培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する方法が挙げられる。
【００２８】
上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、グリセロール、ソルビトールなどが使用される。窒素源としては、例えば、ペプトン類、肉エキス、酵母エキスなどの窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの無機窒素含有物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムなどが使用される。その他、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。上記の炭素源、窒素源、無機物、およびその他の必要な栄養素は、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００２９】
培養は、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は２０℃〜５０℃、好ましくは２２℃〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。培養ｐＨは４〜９、好ましくは５〜８である。これら以外の条件下でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日が好ましい。上記培養により、菌体内にＰＱＱ依存性ＰＤＨが蓄積される。なお、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨは、上記培養によって得られた酵素であっても、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。
【００３０】
次いで、得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法などを用いることができる。抽出したＰＱＱ依存性ＰＤＨの精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などを用いることができる。なお、これらの方法で得られる部分精製酵素や精製酵素液は、そのままの形態で使用しても、または化学修飾された形態で使用してもよい。本発明において、化学修飾された形態のＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する場合には、上記の方法で得られる培養物由来のＰＱＱ依存性ＰＤＨを、例えば、特開２００６−２７１２５７号公報に記載されるような方法などを用いて適宜化学修飾して使用することができる。なお、化学修飾方法は、上記公報に記載の方法に限定されるものではない。
【００３１】
本発明に用いられる環状アミノ酸は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の酵素組成物の保存安定性を向上させうる。
【００３２】
本発明に用いられる環状アミノ酸の具体例としては、エクトイン、ヒドロキシエクトイン、プロリン、ヒドロキシプロリンなどが挙げられる。これらの中でも、エクトインまたはヒドロキシエクトインが好ましい。これらの環状アミノ酸は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３３】
本発明の酵素組成物に含まれる環状アミノ酸の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、酵素組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは１０〜５００質量％、より好ましくは５０〜４００質量％、最も好ましくは１００〜３００％である。１０質量％以上であれば、安定化剤としての効果が十分に発揮されるため好ましい。一方、５００質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められ、また、本発明のポリオール脱水素酵素組成物を緩衝液などで再溶解する際に環状アミノ酸を溶解することができる。
【００３４】
本発明に用いられる非還元糖またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の酵素組成物の保存安定性を向上しうる。
【００３５】
本発明において、「非還元糖」とは、遊離性のアルデヒド基やケトン基をもたないために還元性を有しない糖類を意味する。このような還元糖としては、上記したような性質を有するものであればよく、例えば、還元基同士の結合したトレハロース型小糖類、糖類の還元基と非糖類が結合した配糖体、糖類に水素添加して還元した糖アルコールなどがある。より具体的には、スクロース、トレハロース、ラフィノース等のトレハロース型少糖類；アルキル配糖体、フェノール配糖体、カラシ油配糖体等の配糖体；およびアラビトール、キシリトール、ソルビトール等の糖アルコールなどが挙げられる。これらのうち、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの基質となる糖アルコールは、好ましくない場合がある。これらのうち、トレハロース、ラフィノース、スクロースが好ましく、特にトレハロースおよびラフィノースが好ましい。これらの還元糖は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３６】
本発明において、「グアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質」とはグアニジノ基を有するアミノ糖を含む配糖体抗生物質を意味する。このようなアミノグリコシド系抗生物質として、具体的には、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンが挙げられる。これらのグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３７】
本発明の酵素組成物に含まれる非還元糖またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、酵素組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは、１〜２００質量％、より好ましくは５〜１００質量％である。１質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、２００質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められる。
【００３８】
本発明に用いられる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の組成物の保存安定性を向上させうる。
【００３９】
本発明に用いられる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物としては、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上でき、かつ、２価のイオンを形成する化合物であれば特に制限されない。上記２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の具体的な例としては、マグネシウム、カルシウム、バリウム、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケル、水銀、鉛および亜鉛などの２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物が挙げられる。中でも、マグネシウムを含む化合物およびカルシウムを含む化合物からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。また、上記２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の形態は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上できるものであれば特に制限されないが、例えば、上記金属のフッ化物、塩化物、臭化物、もしくはヨウ化物などのハロゲン化物、上記金属の硫酸塩、上記金属の硝酸塩、または上記金属のリン酸塩などが挙げられる。これらの中でも、塩化物、硫酸塩、および硝酸塩からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。なお、これら２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物は単独で使用されても、また２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。
【００４０】
本発明の酵素組成物に含まれる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは、１〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％である。１質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、３０質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められ、また、本発明の組成物を緩衝液等で再溶解する際、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物を溶解できる。
【００４１】
本発明に用いられる界面活性剤は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の組成物の保存安定性を向上させうる。
【００４２】
前記界面活性剤の種類は特に制限されず、膜タンパク質の可溶化に一般的に使用されているものであればよい。具体的には、例えばＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、オクチルグルコシド、コール酸ナトリウムなどが挙げられ、これらは単独で使用しても、２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。これらの中でも、酵素活性の低下を抑制するという観点から、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００がより好ましい。
【００４３】
本発明の酵素組成物に含まれる界面活性剤の量は、酵素の安定性が向上できる量であれば特に限定されないが、組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは１〜５００質量％、より好ましくは１〜３００質量％である。１質量％以上であれば、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを安定化させる効果が得られ、一方、５００質量％以下であれば、凍結乾燥後の酵素組成物の粘度が高くなりすぎないため好ましい。
【００４４】
本発明の酵素組成物の形態は特に制限されず、例えば粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体状；液状、乳液状等の溶液状；またはペースト状等の半固体状などの、任意の形態でありうる。中でも、本発明の効果が顕著に発揮されることから、固体状の形態であることが好ましい。
【００４５】
本発明の酵素組成物は、酵素活性の低下を抑制するという観点から、本発明の酵素組成物が安定なｐＨの緩衝液を含むことが好ましい。このような緩衝液としては、所望のｐＨを有するものであれば公知の緩衝液が適宜使用でき、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸緩衝液、トリス―塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＯＰＳもしくはＨＥＰＥＳなどのＧＯＯＤ緩衝液、グリシン―ＮａＯＨもしくはグリシルグリシン―ＮａＯＨなどのアミノ酸系緩衝液、ホウ酸緩衝液、またはイミダゾール緩衝液などが用いられる。これらの中でも、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、ＭＯＰＳなどのＧＯＯＤ緩衝液、またはグリシルグリシン―ＮａＯＨが好ましい。また、上記緩衝液の濃度は特に制限されないが、好ましくは１〜５００ｍＭ、より好ましくは５〜４００ｍＭ、より好ましくは５〜３００ｍＭである。上記緩衝液のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、好ましくは４．０〜１１．０、より好ましくは５．０〜１０．０の範囲である。
【００４６】
本発明の酵素組成物は、本発明の目的を損なわない範囲内で、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール等の還元剤、ピロロキノリンキノンなどを所望に応じて含有することができる。
【００４７】
本発明の酵素組成物の製造方法は、特に制限されず、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、環状アミノ酸、非還元糖またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物、および界面活性剤を添加する方法により得られうる。
【００４８】
具体的な例としては、例えば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に、環状アミノ酸と、非還元糖またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質と、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物と、界面活性剤と、を安定化剤として添加する段階を有する、ポリオール脱水素酵素組成物の製造方法である。かかる方法によりポリオール脱水素酵素組成物は、ポリオール脱水素酵素の安定性を向上することができる。
【００４９】
上記方法において、各成分の添加順序も特に制限されず、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、各成分を順次添加してもよく、各成分を同時に添加してもよい。
【００５０】
本発明の酵素組成物が粉末状とする場合は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、環状アミノ酸、非還元糖またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物、および界面活性剤を添加して得た溶液状の酵素組成物を凍結乾燥等によって粉末状にすることができる。この際、凍結乾燥の方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。また、酵素組成物の凍結乾燥する段階は上記の安定化剤を添加して酵素組成物を得る段階の直後に行ってもよく、または安定化剤を添加して酵素組成物を得る段階と酵素組成物の凍結乾燥する段階との間に他の工程を行ってもよい。
【００５１】
本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、ポリオール脱水素酵素の安定性を向上することができ、特に、凍結乾燥時のＰＱＱ依存性ＰＤＨの失活を抑えるとともに、凍結乾燥後のＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を有意に向上させることができる。特に、環状アミノ酸としてエクトインおよび／またはヒドロキシエクトインを用い、非還元糖としてトレハロースおよび／またはラフィノース、またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質としてストレプトマイシンおよび／またはジヒドロストレプトマイシンを用い、２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物としてカルシウムを含む化合物および／またはマグネシウムを含む化合物を用い、さらに界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ（登録商標）（トライトン）Ｘ−１００を用いる場合に、上記効果が顕著に得られる。
【００５２】
本発明の別の一形態によれば、本発明の上記形態の酵素組成物を含むポリオール測定試薬が提供される。また、本発明の別の一形態によれば、本発明の上記形態の酵素組成物をポリオールと反応させることを特徴とする、ポリオールの定量方法が提供される。本発明の酵素組成物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールの定量に優れるため、ポリオール測定試薬として好適に使用することができる。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは補欠分子族としてＰＱＱを有するため、あえてＰＱＱを反応系に添加することなく、ポリオールを定量することができる。
【００５３】
本発明において「ポリオール」とは、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）を意味する。本発明で用いられるポリオールとしては、特に制限されないが、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、またはラクチトールなどのニ糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、またはリビトールなどのペンチトール、マンニトール、またはソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。これらの中でも、好ましくはグリセロールである。
【００５４】
本発明のポリオール測定試薬は、ポリオールを定量するための試薬であり、ポリオール脱水素酵素組成物中にＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む。ポリオール脱水素酵素として、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する点に特徴がある。例えば特許公報第３０４１８４０号、特許公報第３４５０９１１号、特許公報第３４９４３９８号などに記載されるポリオール測定で使用するポリオール脱水素酵素として、本発明の酵素組成物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用することができる。
【００５５】
本発明の定量方法に用いられるポリオールを含む試料としては、食品、血清、血漿または全血などが挙げられる。また、本発明の酵素組成物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは血清、血漿、または全血などの中性脂肪測定にも使用することができる。すなわち、これらの試料に含まれる中性脂肪は、例えば、リポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールとに分解されるが、ここで生じたグリセロールを上記のＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いて定量することができる。精神病治療患者および透析患者においては、中性脂肪測定時に遊離グリセロールが問題になるが、本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用して、グリセロールを予め消去するか、またはその量を測定しておくことにより、真の中性脂肪値を求めることが可能となる。なお、本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨは溶液中に界面活性剤を含んでいてもポリオールを正確に定量することができる。
【実施例】
【００５６】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を何ら制限するものではない。なお、本発明において、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、下記方法により測定した。
【００５７】
（酵素活性）
５０μＭ  ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロインドフェノール）、０．２ｍＭ  ＰＭＳ（１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェイト）、および４５０ｍＭ  グリセロールを含んだ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に、酵素溶液を加えた。この溶液中の酵素と基質の反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。ここで、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。
【００５８】
［実施例１、２、比較例１〜６］
ソルビトール  ２ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス  ０．３ｇ／１００ｍＬ、肉エキス  ０．３ｇ／１００ｍＬ、コーンスティープリカー  ０．３ｇ／１００ｍＬ、ポリペプトン  １ｇ／１００ｍＬ、尿素  ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／１００ｍＬ、およびＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／１００ｍＬからなり、ｐＨが７．０である培地１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。
【００５９】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ  ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。
【００６０】
次に、上記と同じ組成で調製した培地５Ｌを８Ｌ容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で５０分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液２４０ｍＬを移した。これを、４００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎ、３０℃の条件で２６時間培養した。
【００６１】
所定時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して集菌し、緩衝液で懸濁後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、得られた上清を超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）して、膜画分を沈殿物として得た。
【００６２】
この膜画分を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し、終濃度が１ｇ／１００ｍＬとなるようにＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を加え、４℃で２時間撹拌した。超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）し、上清を０．１ｇ／１００ｍＬ  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析し、これを可溶化膜画分とした。
【００６３】
この可溶化膜画分をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にてＲｅｓｏｕｒｃｅＱ  ６ｍＬで夾雑するグルコース脱水素酵素を除いたポリオール脱水素酵素活性画分を得た。この画分を０．１ｇ／１００ｍＬ  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析することにより、比活性１７Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品を得た。これをグルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨと称する。
【００６４】
次いで、該グルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨ（比活性１７．０Ｕ／ｍｇ蛋白、蛋白濃度：０．６２５ｍｇ／ｍＬ）４０ｍＬに、終濃度０．２ｇ／１００ｍＬになるように１ｇ／１００ｍＬ  グルタルアルデヒド溶液  １０ｍＬを加え、２０℃で６０分間穏やかに撹拌した。
【００６５】
次いで、０．５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を５０ｍＬ加え、２０℃で３０分間反応させることにより架橋反応を停止した。反応終了後、０．１ｇ／１００ｍＬ  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で一晩透析することにより低分子量の夾雑物を取り除きこれを修飾ＰＤＨとした。
【００６６】
このようにして得られた修飾ＰＤＨを限外ろ過に濃縮した。得られた濃縮修飾ＰＤＨ（比活性１７Ｕ／ｍｇ蛋白、蛋白濃度２．０ｍｇ／ｍＬ）１００質量％に対して、表１に記載の成分を、表１に記載の割合となるようにそれぞれ加え、凍結後、凍結乾燥を２４時間行い粉末状の酵素組成物を得た。この際、凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を測定した。得られた酵素組成物を３７℃で１週間インキュベートした後に、酵素活性を測定した。凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を表１に示す。
【００６７】
【表１−１】
2009201436.tif 000005
【００６８】
【表１−２】
2009201436.tif 000006
【００６９】
上記表１に示される結果から、環状アミノ酸（エクトイン、ヒドロキシエクトイン）と、非還元糖（トレハロース、ラフィノース）またはグアニジノ基を有するアミノグリコシド系抗生物質（ジヒドロストレプトマイシン、ストレプトマイシン）と、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物（ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２）と、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）とを組み合わせることによって、上記いずれか１種、２種、または３種を組み合わせた場合と比べて、凍結乾燥による酵素の失活を有意に抑制できることが確認された。
【００７０】
以上の結果から、本発明の酵素組成物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を有意に向上でき、凍結乾燥による酵素活性の低下を有意に抑制することができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の凍結乾燥後の経時的な酵素の安定性を向上させることが可能であるため、本発明の酵素組成物は、正確にポリオールを定量することにおいて好適に使用できる。