(57)【要約】【課題】生体分子機能解析すべき対象細胞に遺伝子や薬理作用発現物質を効率良く導入したり、診断すべき特定部位へ特異的に診断薬を輸送したり、治療すべき病変部位へ治療薬を特異的に輸送したりして、細胞レベルでの作用機序の解明や適切な診療を可能にするドラッグデリバリーシステムに用いられる薬物輸送剤を提供する。【解決手段】薬物輸送剤は、コロイド粒子に、窒素含有複素環基と直鎖状又は分岐鎖状で飽和又は不飽和の脂肪族基とを有するキレーター化合物が含有され、該窒素含有複素環基が該コロイド粒子の表面から露出して金属イオンにキレートしており、該細胞の表面の細胞特異的に発現する特定分子に特異的に結合する認識タンパク質中のヒスチジン基が、コロイド粒子の周囲で該金属イオンにキレートしている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コロイド粒子に、窒素含有複素環基と直鎖状又は分岐鎖状で飽和又は不飽和の脂肪族基とを有するキレーター化合物が含有され、該窒素含有複素環基が該コロイド粒子の表面から露出して金属イオンにキレートしており、該細胞の表面の細胞特異的に発現する特定分子に特異的に結合する認識タンパク質中のヒスチジン基が、コロイド粒子の周囲で該金属イオンにキレートしていることを特徴とする薬物輸送剤。
【請求項２】
該コロイド粒子が、輸送すべき薬物を内包していることを特徴とする請求項１に記載の薬物輸送剤。
【請求項３】
該キレーター化合物中、該窒素含有複素環基がフェナントロリル基、ピリジル基、又はターピリジル基、該脂肪族基が炭素数６〜２０でアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であることを特徴とする請求項１に記載の薬物輸送剤。
【請求項４】
該キレーター化合物中、該窒素含有複素環基と該脂肪族基とが、ウレイル基、エーテル基、イミノ基、チオエーテル基、エステル基、アルキル基、若しくはアミド基を介して結合し、又は直接に結合していることを特徴とする請求項１に記載の薬物輸送剤。
【請求項５】
該キレーター化合物が、下記化学式（１）
【化１】
2009203228.tif 000007
（式（１）中、Ｒ１は炭素数６〜２０でアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基から選ばれる脂肪族基）で示される尿素誘導体、又は下記化学式（２）若しくは（３）
【化２】
2009203228.tif 000008
【化３】
2009203228.tif 000009
（式（２）及び（３）中、Ｒ２及びＲ３は炭素数５〜１９でアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基から選ばれる脂肪族基）で示されるアミド化合物であることを特徴とする請求項３に記載の薬物輸送剤。
【請求項６】
該金属イオンが、ニッケルイオン、コバルトイオン、及び／又は銅イオンであることを特徴とする請求項１に記載の薬物輸送剤。
【請求項７】
該認識タンパク質が、該ヒスチジン基を含有するオリゴペプチドに結合したタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の薬物輸送剤。
【請求項８】
該細胞表面の細胞特異的に発現する特定分子が糖鎖含有分子で、該認識タンパク質が該ヒスチジン基を含有するオリゴペプチドに結合したレクチン及び／又は糖鎖抗体であることを特徴とする請求項７に記載の薬物輸送剤。
【請求項９】
該レクチン及び／又は糖鎖抗体が、蛍光タンパク質融合タンパク質、又はコレラ毒素Ｂサブユニットであることを特徴とする請求項８に記載の薬物輸送剤。
【請求項１０】
該コロイド粒子が、リポソーム、エマルジョン、合成高分子コロイド粒子、生体分解性樹脂コロイド粒子であることを特徴とする請求項１に記載の薬物輸送剤。
【請求項１１】
該コロイド粒子が、リン脂質で形成されたリポソームであることを特徴とする請求項１に記載の薬物輸送剤。
【請求項１２】
該薬物が、遺伝子、診断薬、又は治療薬であることを特徴とする請求項２に記載の薬物輸送剤。
【請求項１３】
請求項１に記載の薬物輸送剤と非ヒト細胞及びヒト由来細胞のいずれかの細胞とを混在させて、薬物輸送剤中の認識タンパク質と該細胞の表面の特定分子とを結合させて該薬物輸送剤中の薬物を放出させることを特徴とする薬物輸送法。
【請求項１４】
下記化学式（１）
【化４】
2009203228.tif 000010
（式（１）中、Ｒ１は炭素数６〜２０でアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基から選ばれる脂肪族基）で示されることを特徴とする尿素誘導体。
【請求項１５】
Ｎ−フェナントロリルカルバミン酸エステルと、炭素数６〜２０でアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基から選ばれる脂肪族基を含有する長鎖脂肪族アミンとを、１×１０８〜１×１０１０Ｐａの高圧に晒して、エステル−アミド交換させることにより、前記化学式（１）で示される尿素誘導体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子や薬理作用発現物質等の薬物を標的とする器官や細胞へ輸送し、その機能を生化学的に解析したり診療したりするのに用いられるキレーター化合物含有薬物輸送剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
特定の遺伝子、診断薬や治療薬のような薬理作用発現物質等の薬物を細胞内へ導入し、それの細胞内での機能や、細胞内での動態や、細胞への影響を調べる生体分子機能解析が、広く行われている。このような生体分子機能解析の際、薬物を対象となる細胞へ特異的に効率良く導入することが重要である。
【０００３】
薬物導入手法として、薬物をカチオン性脂質に包含させ、対象細胞に貪食させるリポフェクション法が知られているが、貪食能がある細胞にしか適用できない。別な手法として、通電や超音波照射等の物理的手段により対象細胞に無作為に孔をあけ薬物を導入する電気穿孔法・超音波穿孔法も知られているが、細胞の種類によって導入効率に大きな差を生じるため、in  vivoで導入できる細胞が限られている。さらに別な手法として、顕微鏡下で対象細胞に一つずつ直接、薬物を注入するマイクロインジェクション法が、知られているが、導入操作に熟練を要し、熟練者でも１日当たり高々１００個の細胞への導入しかできず、しかもin  vivoでの導入が不可能である。
【０００４】
しかも非ウイルス性の手法は、一般的に導入効率が低かったり、細胞の特性によって効率が左右されたりする。また、細胞内に取り込まれる経路によって細胞内動態が変化したり、エンドサイトーシスを介して取り込まれるものはリソソームによって分解されたりするため、発現効率の改善が望まれていた。
【０００５】
ウイルスベクターを用いるという別な手法も知られている。ウイルスベクターとしてアデノウイルスやレトロウイルスなどのベクターが利用されるが、これらは遺伝子導入効率が非常に高い反面、ウイルス自身が毒性や抗原性を有していたり、導入できる遺伝子サイズが制限されたりするという問題がある。
【０００６】
本発明者らは、非特許文献１や非特許文献２に記載されているように、細胞表面に露出した糖鎖含有分子は、その糖鎖構造が、細胞の種類、発生段階、又は癌化によって変化することから、細胞を識別するのに適した生体分子であることを見出している。
【０００７】
生体分子機能解析や診療を行うために、このような特定の細胞の糖鎖を利用して細胞へ薬物を効率良く選択的に輸送する薬物輸送剤が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】本家孝一ら、「プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ(Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America)」、2002年、第99巻、p.4227-4232
【非特許文献２】本家孝一ら、「グリココンジュゲート  ジャーナル(Glycoconjugate  Journal)」、2004年、第21巻、第1-2号、p.59-62
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、生体分子機能解析すべき対象細胞に遺伝子や薬理作用発現物質等の薬物を効率良く導入して細胞レベルでの作用機序を解明したり、診断すべき特定部位へ特異的に診断薬を輸送し、又は治療すべき病変部位へ治療薬を特異的に輸送して、細胞レベルで適切に診療したりするのを可能にするドラッグデリバリーシステム用の薬物輸送剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載の薬物輸送剤は、コロイド粒子に、窒素含有複素環基と直鎖状又は分岐鎖状で飽和又は不飽和の脂肪族基とを有するキレーター化合物が含有され、該窒素含有複素環基が該コロイド粒子の表面から露出して金属イオンにキレートしており、該細胞の表面の細胞特異的に発現する特定分子に特異的に結合する認識タンパク質中のヒスチジン基が、コロイド粒子の周囲で該金属イオンにキレートしていることを特徴とする。
【００１１】
請求項２に記載の薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、該コロイド粒子が、輸送すべき薬物を内包していることを特徴とする。
【００１２】
請求項３に記載の薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、該キレーター化合物中、該窒素含有複素環基がフェナントロリル基、ピリジル基、又はターピリジル基、該脂肪族基が炭素数６〜２０でアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であることを特徴とする。
【００１３】
請求項４に記載の薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、該キレーター化合物中、該窒素含有複素環基と該脂肪族基とが、ウレイル基、エーテル基、イミノ基、チオエーテル基、エステル基、アルキル基、若しくはアミド基を介して結合し、又は直接に結合していることを特徴とする。
【００１４】
請求項５に記載の薬物輸送剤は、請求項３に記載されたもので、該キレーター化合物が、下記化学式（１）
【化１】
2009203228.tif 000002
（式（１）中、Ｒ１は炭素数６〜２０でアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基から選ばれる脂肪族基）で示される尿素誘導体、又は下記化学式（２）若しくは（３）
【化２】
2009203228.tif 000003
【化３】
2009203228.tif 000004
（式（２）及び（３）中、Ｒ２及びＲ３は炭素数５〜１９でアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基から選ばれる脂肪族基）で示されるアミド化合物であることを特徴とする。
【００１５】
請求項６に記載の薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、該金属イオンが、ニッケルイオン、コバルトイオン、及び／又は銅イオンであることを特徴とする。
【００１６】
請求項７に記載の薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、該認識タンパク質が、該ヒスチジン基を含有するオリゴペプチドに結合したタンパク質であることを特徴とする。
【００１７】
請求項８に記載の薬物輸送剤は、請求項７に記載されたもので、該細胞表面の細胞特異的に発現する特定分子が糖鎖含有分子で、該認識タンパク質が該ヒスチジン基を含有するオリゴペプチドに結合したレクチン及び／又は糖鎖抗体であることを特徴とする。
【００１８】
請求項９に記載の薬物輸送剤は、請求項８に記載されたもので、該レクチン及び／又は糖鎖抗体が、蛍光タンパク質融合タンパク質、又はコレラ毒素Ｂサブユニットであることを特徴とする。
【００１９】
請求項１０に記載の薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、該コロイド粒子が、リポソーム、エマルジョン、合成高分子コロイド粒子、生体分解性樹脂コロイド粒子であることを特徴とする。
【００２０】
請求項１１に記載の薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、該コロイド粒子が、リン脂質で形成されたリポソームであることを特徴とする。
【００２１】
請求項１２に記載の薬物輸送剤は、請求項２に記載されたもので、該薬物が、遺伝子、診断薬、又は治療薬であることを特徴とする
【００２２】
請求項１３に記載の薬物輸送法は、請求項１に記載の薬物輸送剤と非ヒト細胞及びヒト由来細胞のいずれかの細胞とを混在させて、薬物輸送剤中の認識タンパク質と該細胞の表面の特定分子とを結合させて該薬物輸送剤中の薬物を放出させることを特徴とする。
【００２３】
請求項１４に記載の尿素誘導体は、下記化学式（１）
【化４】
2009203228.tif 000005
（式（１）中、Ｒ１は炭素数６〜２０でアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基から選ばれる脂肪族基）で示されることを特徴とする。
【００２４】
請求項１５に記載の尿素誘導体を製造する方法は、Ｎ−フェナントロリルカルバミン酸エステルと、炭素数６〜２０でアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基から選ばれる脂肪族基を含有する長鎖脂肪族アミンとを、１×１０８〜１×１０１０Ｐａの高圧に晒して、エステル−アミド交換させることにより、前記化学式（１）で示される尿素誘導体を製造するというものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の薬物輸送剤は、リポソームのような人工小胞であるコロイド粒子にキレーター化合物を含有させ金属イオンを介し認識タンパク質をキレートさせることにより、特定の標的器官や標的細胞への指向性を発現するものである。またこの薬物輸送剤は、コロイド粒子が内包している薬物を効率良く放出して選択的に細胞へ輸送させることができるというものである。
【００２６】
この薬物輸送剤は、免疫系を回避しつつ、標的とする組織や細胞表面まで到達し、細胞膜を通過して細胞内に浸入し、さらに薬物輸送剤に内包された薬物が作用するオルガネラに輸送することができる。
【００２７】
この薬物輸送剤は、認識タンパク質がヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を融合させたタンパク質であると、Ｈｉｓ−ｔａｇがコロイド粒子から露出したキレーター化合物のＮｉ２＋やＣｏ２＋やＣｕ２＋の錯体と強く結合することから、標的に応じて適当な任意のタンパク質をリポソーム表面に付加することが可能となる。特にタンパク質として、細胞膜と特異的に結合するものが選択される。
【００２８】
この薬物輸送剤を用いた薬物導入法によれば、生体分子機能解析すべき対象細胞に遺伝子や薬理作用発現物質等の薬物を導入したり、診断すべき特定部位へ特異的に診断薬を輸送したり、治療すべき病変部位例えば神経細胞へ治療薬を特異的に輸送したりして、細胞レベルでの作用機序の解明や適切な診療を可能にする。
【００２９】
生体内では多種多様な細胞が存在するため、選択的に高い効率で導入するポジティブターゲッティングに加え、さらに積極的に対象を補足するアクティブターゲッティングが求められており、この薬物輸送剤は、その役割を果たすようにキレーター化合物と生体分子間の親和性を利用したものである。糖鎖は、細胞の種類や分化、又はがん化によって構造が大きく変化することから「細胞の顔」と呼ばれており、標的指向性を得るのに最適な分子である。そのため、この薬物輸送剤の実施例で示すように、キレーター化合物が組み込まれたリポソーム膜表面にＨｉｓ−ｔａｇ付加したレクチンを発現させ、これにより標的とする細胞表面の糖鎖を認識させて、特異的に結合させることができるようになったのである。
【００３０】
またこの薬物輸送剤の原料となるキレーター化合物、とりわけ窒素含有複素環基と該脂肪族基とがウレイレン基を介して結合した尿素類縁体は、簡便かつ大量に製造できるから、医薬品や実験材料として用いられる薬物輸送剤の生産性の向上に資する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明を適用する薬物輸送剤を用いた薬物導入方法の概要を示す模式図である。
【図２】本発明を適用する薬物輸送剤に用いられるリポソームへのキレーター化合物の取り込みについての分析結果を示す図である。
【図３】本発明を適用する薬物輸送剤に用いられるリポソームにおける調製方法毎のＨｉｓ−ｔａｇＥＧＦＰ結合能についての分析結果を示す図である。
【図４】本発明を適用する薬物輸送剤に用いられるリポソームのためのコントラストの概要を示す図である。
【図５】本発明を適用する薬物輸送剤に用いられるリポソームのためのコントラストの電気泳動の結果を示す図である。
【図６】本発明を適用する薬物輸送剤に用いられるリポソームのためのタンパク質の電気泳動と精製との結果を示す図である。
【図７】本発明を適用する薬物輸送剤に用いられるリポソームのためのタンパク質の分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
本発明の薬物輸送剤は、以下のようにして製造される。
【００３４】
キレーター化合物の一例の合成方法を下記化学反応式（４）に示す。
【００３５】
【化５】
2009203228.tif 000006
【００３６】
先ず窒素含有複素環基である１,１０−フェナントロリル基と、エステル基を構成する短鎖アルキル基Ｒ４とを有するＮ−フェナントロリルカルバミン酸エステルに、長鎖アルキル基Ｒ１を有する脂肪族１級アミンを、密封条件下で、高圧条件に晒すと、エステル−アミド交換して、尿素誘導体が得られる。
【００３７】
短鎖アルキル基Ｒ４は、ハロゲン原子のような置換基で置換されていてもよい炭素数１〜６の飽和の脂肪族基例えば２,２,２−トリクロロエチル基が挙げられる。脂肪族基である長鎖アルキル基Ｒ１は、直鎖状又は分岐鎖状で炭素数６〜２０の飽和のアルキル基例えばｎ−ヘキサデシル基、直鎖状又は分岐鎖状で炭素数６〜２０の不飽和のアルケニル基やアルキニル基が挙げられる。高圧条件は、１×１０８〜１×１０１０Ｐａ、好ましくは加熱しながら０．８〜１．５×１０９Ｐａ、より好ましくは１００℃加熱しながら０．８×１０９Ｐａ（０．８ＧＰａ）に、塩基性下例えばトリエチルアミン存在下、１時間〜１週間、好ましくは２日間、晒すというものである。
【００３８】
キレーター化合物として、窒素含有複素環基であるフェナントロリル基と脂肪族基とが、ウレイレン基（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−）を介して結合した尿素誘導体の例を示したが、エーテル基（−Ｏ−）、イミノ基（−ＮＨ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、エステル基（−ＣＯ−Ｏ−又は−Ｏ−ＣＯ−）、又はアミド基（−ＣＯ−ＮＨ−又は−ＮＨ−ＣＯ−）を介して結合したものであってもよい。例えば５−ヒドロキシ−１,１０−フェナントロリンと脂肪族ハライドや脂肪酸とを反応させてエーテル誘導体やエステル誘導体にしたり、５−メルカプト−１,１０−フェナントロリンと脂肪族ハライドとを反応させてチオエーテル誘導体にしたり、１,１０−フェナントロリン−５−カルボン酸と脂肪族アルコールや脂肪族アミンとを反応させて別なエステル誘導体やアミド誘導体にしたり、５−アミノ−１,１０−フェナントロリンから第２アミン誘導体や別なアミド誘導体にしたりしたものである。
【００３９】
キレーター化合物は、窒素含有複素環基と脂肪族基とが直接、結合したものであってもよく、例えば窒素含有複素環化合物にＷｉｔｔｉｇ反応等により増炭することによって得られる。
【００４０】
キレーター化合物は、窒素含有複素環基が、複数、例えば２〜３の窒素を有する基、例えばフェナントロリル基で例示される縮合多環式複素環基、ピリジル基、ターピリジル基で例示される複素環集合基であるものであってもよい。例えば前記化学式（２）で示されるアミド化合物は、ジ（２−ピリジル）アミンと、脂肪酸ハロゲン化物とノアミド化反応によって得られる。前記化学式（３）で示されるアミド化合物も、同様にアミド化反応によって得られる。
【００４１】
このようなキレーター化合物と、コロイド原料のリン脂質であるホスファチジルコリンと細胞へ導入すべき薬物とを混合して、コロイド粒子であるリポソームの懸濁液を得る。キレーター化合物中の脂肪族基がリポソームの外套に埋没し、窒素含有複素環基がその表面から露出し、薬物がリポソームの内空に内包されている。
【００４２】
キレーター化合物とコロイド原料と薬物との重量比は、１〜５：１０〜５０：０．００１〜０．２であることが好ましい。薬物輸送剤は、１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の懸濁液であってもよい。
【００４３】
コロイド粒子として、リポソームの例を示したが、より具体的には、ＳＵＶリポソーム(small  unilamellar  vesicle  liposome：小さな単ラメラ小胞リポソーム)、ＲＥＶリポソーム（reversephase  evaporation  vesicle  liposome：逆相蒸発法リポソーム）、又はＭＬＶリポソーム（multilamellar  vesicle  liposome：多重ラメラ小胞リポソーム）が挙げられる。エマルジョン例えば脂肪の懸濁液、合成高分子コロイド粒子例えば平均粒径約２００ｎｍ程度のポリスチレンビーズの懸濁液、生体分解性樹脂コロイド粒子例えばポリ乳酸粒子の懸濁液であってもよい。薬物は、診断薬であってもよく、合成医薬品、薬理活性タンパク質のような天然物由来医薬品で例示される治療薬であってもよく、ＤＮＡ断片、ベクター、組換えベクターのような遺伝子であってもよい。
【００４４】
リポソームは、例えば、以下のようにして調製される。
【００４５】
（ＳＵＶ(small  unilamellar  vesicles)の調製）
リポソームは、「ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー(Journal  of  Molecular  Biology)」、1965年、第13巻、p.238-252のBanghamらによる所謂バンガム法に準じて調製した。先ず、２０μｍｏｌの１,２−ジパルミトイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホクロリン（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3phosphocholine：ＤＰＰＣ）（日本油脂株式会社製）と、１０μｍｏｌのコレステロール（和光純薬工業株式会社製）と、必要に応じキレーター化合物とを、ナスフラスコ中で１０ｍｌのクロロホルム／メタノール混合液（２：１，ｖ／ｖ）に溶かし、エバポレーターで溶媒を減圧留去して乾固させと、ナスフラスコの底に、脂質フィルムが得られた。それに、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、７０℃のウォーターバスで３時間振盪した。なお、フルオロセイン  イソチオシアネート（Fluorescein  isothiocyanate：ＦＩＴＣ）（ＳＩＧＭＡ社製）を内封する際には、ＰＢＳの代わりに、３μＭのＦＩＴＣ／ＰＢＳの２ｍＬを用いて水和した。作製されたＭＬＶ（multilamellar  vesicles）は、凍結融解法により、ＬＵＶ（large  unilamellar  vesicles）化した。さらにエクストルーダーMini-Extruder  set（ＡＶＡＮＴＩ社製）を用いてＬＵＶをＳＵＶ化し、平均粒径１００ｎｍに調製した。
【００４６】
（キレーターリポソーム（ＣｈＬｉｐｏ）の作製・精製）
ＳＵＶへのキレーター化合物の取り込みは、「ジャーナル  オブ  コントロールド  リリース(Journal  of  Controlled  Release)」、2005年、第108巻、p.453-459の記載に準じたフィルムローディング法で行った。２μｍｏｌのキレーター化合物を、５ｍｌのクロロホルム／メタノール混合液（２：１，ｖ／ｖ）に溶かし、溶媒を減圧留去して、フィルム化しキレーター化合物のフィルムを調製した。別途調製したＳＵＶの２ｍｌをキレーター化合物のフィルム上に加え、７０℃で３時間、インキュベートした。得られたＣｈＬｉｐｏを回収し、１／２０量の１ＭのＮｉＳＯ４を加え、４℃で３０分間、ローテーターを用いて振盪し、キレーター化合物にＮｉ２＋を結合させた。その後、結合していないＮｉ２＋イオンを取り除くため、ＰＢＳに対して透析した。透析後のサンプルを回収し、Ｈｉｓ−ｔａｇタンパク質を加え、スクロース密度勾配遠心法で分離した。ＰＢＳに溶かした５００μｌの６４％スクロースに、得られたサンプルを３００μｌ加えて４０％になるよう調整し、ボトムから４０％、３０％、５％のスクロースを８００μｌずつ重層した。そのサンプルを超遠心機にセットし、スウィングローターにより２００,０００ｇ、４℃で、４時間の遠心分離を行った。遠心分離後、サンプルを上部から、２００μｌずつ分画したフラクションを得た。各フラクションのコレステロールの定量には、コレステロール定量キットＴ−ＣｈｏｌＥ（和光純薬工業株式会社製；商品名）を使用した。各フラクションのコレステロール量は、リポソーム量の目安となるものである。
【００４７】
（リコンビナントタンパク質のコンストラクト作製）
コレラトキシンは、ＡサブユニットとＢサブユニットとから成るＡ１Ｂ５型のタンパク質である。Ｂサブユニット（ＣＴＢ）は、細胞膜表面の糖脂質であるガングリオシドＧＭ１を認識して結合するレクチンである。リポソーム作製の各段階を検討するため、蛍光タンパク質であるＶｅｎｕｓとＣＴＢの融合タンパク質であるＶｅｎｕｓ−ＣＴＢ（ＶＣＴＢ）を産生するためのコンストラクトを作製した。Vibrio  cholerae569株由来のコレラトキシンＢサブユニット遺伝子を用いた。Ｖｅｎｕｓ遺伝子を含んだプラスミドＤＮＡ(pQE30-venus  A206K-161-297)は、「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー(Journal  of  Biological  Chemistry)」、2005年、第280巻、p.24072-24084に記載されたものである。
【００４８】
蛍光タンパク質であるＶｅｎｕｓとＣＴＢのキメラタンパク質ＶＣＴＢの遺伝子が組み込まれた大腸菌発現用プラスミドｐＱＥ３０−ＶＣＴＢから、ＶＣＴＢをコードしている部分をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。５’末端と３’末端に、夫々ＮｃｏＩとＳｍａＩとの制限酵素サイト（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ中、夫々下線で表記）をつけ、小麦胚芽ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳用ｐＩＶＥＸベクター（Ｒｏｃｈｅ社製）へサブクローニングを行った。プライマーは、配列表の配列番号１及び２に示される以下のものを用いた。
【００４９】
配列番号１：〔ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ〕
Forward：VCTB/Nco  I/F  primer
5'-tggatccatggtgagcaagggcgagg-3'    (下線部ccatggがＮｃｏＩ)
Ｔｍ値66.8
【００５０】
配列番号２：〔ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ〕
Reverse：VCTB/tta/Sma  I/R  primer
5'-ctaattcccgggtaaatttgccatact-3'    (下線部cccgggがＳｍａＩ)
Ｔｍ値59.0
【００５１】
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒに組み込んだＮｃｏＩの配列中にあるATGが開始コドンとなる。またｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒに組み込んだＳｍａＩの３’側の隣にあるtaaは、本来のＣＴＢで終止コドンだったが、ここより下流にＨｉｓ−ｔａｇの配列があるため、ｔｔａ→ｔａａに一塩基置換したプライマーを作製した。
【００５２】
また、ＶＣＴＢ遺伝子を組み込んだ後、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒのcccgggをＸｍａＩで開き、「アナリティカル  ケミストリー(Analytical  Chemistry)」、2006年、第78巻、p.3072-3079に準じたｄｏｕｂｌｅ  Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｌｉｎｋｅｒの合成オリゴヌクレオチドを組み込んだ。組み込んだｌｉｎｋｅｒの配列は以下の通りである。配列表の配列番号３と、その相補鎖とを表記してある。
【００５３】
5'−CCCGGGGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCCATCATCATCATCATCATC−3'
3’−CCCGCCGCCGTCGCCGCCGCCGTCGGTAGTAGTAGTAGTAGTAGGGCCC−5'
GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerHisHisHisHisHisHis
【００５４】
（リコンビナントタンパク質の発現・分離・精製）
ｐＩＶＥＸベクターに組み込んだＶｅｎｕｓ−ＣＴＢ遺伝子の発現をin  vitroのタンパク合成キットであるRTS  500  Wheat  Germ  CECF  kit（Ｒｏｃｈｅ社製；商品名）で行った。インキュベーションには、Thermomixer  comfort（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製；商品名）を使用して、３７℃、９００ｒｐｍで２４時間振盪した。
【００５５】
精製はコバルトレジンを担体としたTALON  RESIN（タカラバイオ株式会社；商品名）を、５００μｌ用い、タンパク質のＨｉｓ−ｔａｇへ特異的に結合するアフィニティークロマトグラフィーで精製した。合成直後のサンプルを、結合用緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．０）の１０ｍｌに希釈し、さらに同じ緩衝液で平衡化したカラムにサンプルを通した。洗浄用緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．０）でカラムを洗浄し、溶出用緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．０）で溶出を行い、５００μｌずつに分画してフラクションを得た。溶出した各フラクションについて、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアセチルアミド  ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で確認し、ピークのフラクションのみを回収後、ＰＢＳに対する透析で脱塩を行った。
【００５６】
図１に、キレーター化合物を付加したリポソームにＮｉを加え、Ｈｉｓタグ融合タンパク質として、Ｈｉｓタグレクチンを固定化したキレーター化合物付加リポソーム（Ｃｈｌｉｐｏ）レクチン複合体の模式図を示す。同図で示すように、このリポソームの懸濁液に、ニッケル塩水溶液を加えると、リポソームの表面から露出した窒素含有複素環基にニッケルイオンがキレートし固定される。さらに、標的細胞の表面の糖鎖含有分子へ結合するレクチンや糖鎖抗体に６〜１０残基のヒスチジン含有オリゴペプチドを結合させたＨｉｓタグ融合タンパク質である糖鎖認識タンパク質を、リポソームに固定されたニッケルイオンへ、キレートさせ、薬物輸送剤とする（同図（ａ）、（ｂ）参照）。これにより、標的細胞表面の特定の糖鎖含有分子を認識するＨｉｓタグ融合タンパク質が、リポソーム表面に現れる。
【００５７】
薬物輸送剤を標的細胞の近傍に投与すると、このＨｉｓタグ融合タンパク質が、標的細胞の細胞膜の表面から露出した糖鎖含有分子の糖鎖に結合して架橋する（同図(c)参照）。
【００５８】
必要に応じ、リポソームに内包された薬物が、例えば、リポソームから滲出したり溶出したり放出されたりして、終には細胞へ導入される。
【００５９】
細胞膜の糖鎖含有分子は、Ｎ−ステアリルスフィンゴシンのようなＮ−アシルスフィンゴシンのセラミド（Ｃｅｒ）に糖が結合したＧｌｃＣｅｒ、ＬａｃＣｅｒ、ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１のようなスフィンゴ糖脂質（ガングリオシド）が挙げられる。ＧＭ１は神経細胞で大量に発現するスフィンゴ糖脂質である。
【００６０】
細胞表面にこれらの糖鎖は特定の細胞に特異的に発現している。従ってこの薬物を導入する方法は、糖鎖を利用して細胞特異的なトランスフェクション法である。
【００６１】
レクチンや糖鎖抗体は、蛍光タンパク質であるグリーン  フルオロセント  プロテイン（ＧＦＰ）やＶｅｎｕｓ等との融合タンパク質、又はコレラ毒素Ｂサブユニットが好ましい。コレラ毒素Ｂサブユニットは、とりわけＧＭ１と特異的な結合能を有している。
【００６２】
この薬物を輸送する方法によれば、例えばＧＭ１が豊富に存在する神経細胞を標的細胞とし、従来のリポフェクション法や電気穿孔法で不十分であった導入効率を、飛躍的に向上させることができる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明の薬物輸送剤を実際に調製し、それの物性、動態について検討した例を示す。
【００６４】
先ず、キレーター化合物を、以下のようにして合成した。
【００６５】
（実施例１）
(1.1  キレーター化合物の合成)
市販の５−ニトロ−１,１０−フェナントロリン３００ｍｇ（１．３３ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのエタノールに加え、さらに、ヒドラジン一水和物０．３９ｍＬ（７．９８ｍｍｏｌ）とパラジウム−炭素２４ｍｇとを加えた。それを７０℃で５時間加熱した。反応混合物を濾過し、濾液から溶媒を減圧留去した。炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層からクロロホルムで抽出し、有機層を乾燥し、溶媒を減圧留去すると、赤味がかった黄色の固体の粗生成物が得られた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、クロロホルム：イソプロピルアミン（９：１）の溶出溶媒で精製すると、黄色固体の５−アミノ−１,１０−フェナントロリン１９０ｍｇが収率７３％で得られた。
【００６６】
この５−アミノ−１,１０−フェナントロリン１９０ｍｇ（０．９７ｍｍｏｌ）と乾燥した塩化メチレン１０ｍＬとの混合物を氷浴で冷却しつつ緩やかに撹拌させた。それへ同温で、トリクロロエチル  クロロホルメート０．１６ｍＬ（１．１６ｍｍｏｌ）を加え、さらにピリジン０．１６ｍＬ（１．９４ｍｍｏｌ）を加え、１時間反応させた後、室温まで昇温させた。それをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、クロロホルム：イソプロピルアミン（９：１）の溶出溶媒で精製すると、カルバメートであるＮ−フェナントロリルカルバミン酸２,２,２−トリクロロエチルエステルを６５％の収率で得た。
【００６７】
このカルバメート１５０ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ：１モル当量）、ｎ−ヘキサデシルアミン１３７．６ｍｇ（０．５７ｍｍｏｌ：１．２モル当量）、トリエチルアミン６．５μＬ（０．０５ｍｍｏｌ：０．１モル当量）、及びテトラヒドロフラン１．６ｍＬの混合物を、ポリテトラフルオロエチレン製の容器に入れて密閉し、加圧装置（光高圧機器株式会社製；製品番号ＨＲ−１５型）を用いて０．８ＧＰａの高圧に加圧しつつ、１００℃で４８時間反応させた。溶媒を減圧留去すると、深紅の固体の粗生成物が得られた。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、クロロホルム：イソプロピルアミン（５：１）の溶出溶媒で精製すると、Ｎ−ヘキサデカニル−Ｎ'−１,１０−フェナントロリン−５−イルウレアの結晶が、２５％の収率で得られた。これを、塩化メチレン−ジエチルエーテル−ヘキサン混合溶媒から再結晶した。
【００６８】
(1.2  キレーター化合物の同定)
薄層クロマトグラフィーによるRf値及び融点の物性と、フーリエ変換赤外分光光度法（FTIR）、1H及び13C核磁気共鳴スペクトル測定法（NMR）による分光学的データとを示す。これらの結果は、Ｎ−ヘキサデカニル−Ｎ'−１,１０−フェナントロリン−５−イルウレアの化学構造を支持する。
Rf  0.48  (展開溶媒  クロロホルム:イソプロピルアミン  =  4:1)
融点  81-83℃
FTIR(KBr)  ν  3341,  1635,  1573  cm-1
1H-NMR(400MHz，CDCl3)  δ  0.87(3H,  m),  1.25(26H,  m),  1.48(2H,  m),  2.78(1H,  m),  3.27(2H,  m),  6.15(1H,  br),  7.16(1H,  m),  7.48(1H,  dd,  J=7.6,  4.4Hz),  8.05(1H,  m),  8.06(1H,  s),  8.33(1H,  m),  8.74(1H,  m),  8.91(1H,  m)
【００６９】
次に、得られたキレーター化合物を用いて薬物輸送剤を調製し、その物性についての理化学的評価、動態についての生化学的評価を行った。
【００７０】
（実施例２）
先ず、一般的培養方法、一般的評価方法を2.1〜2.6に示す。
【００７１】
(2.1  細胞の培養方法)
ＨｅＬａ細胞は、Dulbecco's  modified  Eagle  medium(D-MEM)High  Glucose  with  L-Glutamine  and  Phenol  Red(和光純薬工業株式会社製：商品名)に、５％牛胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたものを用いて、３７℃で培養したものである。
【００７２】
(2.2  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法)
発現タンパク質の解析をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認することにより、行った。濃縮ゲル４．５％、分離ゲル１５％のアクリルアミドゲルを作製し、サンプルバッファーには２−メルカプトエタノールを加えた。泳動後、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）によりタンパク質を染色した。
【００７３】
（2.3  ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）方法）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥが終わった後、ゲルをポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）メンブレンImmobilon-P  transfer  membrane（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製；商品名）に転写し、ウエスタンブロットを行った。ブロッキングには、５ｗ／ｖ％スキムミルク（雪印乳業株式会社製）をＴＢＳＴ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ２０）で懸濁したブロッキング溶液を、使用した。一次抗体は、ウサギａｎｔｉ−コレラトキシン（ＣＴ）をブロッキング溶液で１／５０００に希釈し、室温で２時間（又は4℃で一晩）、振盪した。二次抗体は、anti-rabbit  IgG  peroxidase  conjugate（ＳＩＧＭＡ社製；商品名）を、ブロッキング溶液で１／２００００に希釈し、室温で２時間（又は4℃で一晩）、振盪した。その後、ペルオキシダーゼ活性について、Immobilon  Western  Chemiluminescent  HRP  Substrate（ＭＩＬＬＩＰＯＬＥ社製；商品名）を使用し、発光をフィルムに現像した。
【００７４】
（2.4  フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）法）
１０ｃｍディッシュに９０％コンフルエントとなったＨｅＬａ細胞（≒５×１０６ｃｅｌｌ）をトリプシン処理（１．５ｍｌ、５分間、３７℃）して剥し、７．５ｍｌの培地（D-MEM  High  glucose（和光純薬工業株式会社製；商品名）、５％ＦＢＳ、ペニシリンの１００ｕｎｉｔ、ストレプトマイシンの１００μｇ）を加えた。１２００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を捨て去り、ＰＢＳの５ｍｌで懸濁した。更に一回遠心して細胞を沈殿させ、ＰＢＳの２．５ｍｌでよく懸濁し、各５００μｌずつ計４本を、ＦＡＣＳチューブに分注した。懸濁した細胞に、ＶＣＴＢタンパク質の２μｇ、又は前記のキレーターリポソーム（ＣｈＬｉｐｏ）の作製・精製のようにして調製したリポソーム１００μｌを加え、そのまま氷上で、５分間インキュベートし、細胞と結合させた。１２００ｒｐｍで３分間、遠心させた後、ＰＢＳに懸濁させた。フローサイトメトリー用チューブに移し、解析はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製；商品名）を用いて行った。なお、一連の操作を氷上で行った。
【００７５】
（2.5  酵素結合免疫吸着法（Enzyme-Linked  ImmunoSorbent  Assay：ＥＬＩＳＡ））
ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートであるImmulon  1B  Flat  Bottom  Microtiter  Plates（Ｔｈｅｒｍｏ社製；商品名）に、クロロホルム／メタノール混合液（２：１，ｖ／ｖ）で調製した糖脂質を、５ｎｍｏｌずつ分注した。そのまま風乾して、有機溶媒を完全に蒸散させた。1時間後、各ウェルに、ＰＢＳＴ（上記のＰＢＳに０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたもの）を１５０μｌずつ加え、軽く振盪して２回洗浄した。ＰＢＳＴを捨て去り、次いで、ＰＢＳＴに溶かした５ｖ／ｖ％スキムミルク（雪印乳業株式会社製）を、１００μｌずつ各ウェルに分注し、室温で１時間放置しブロッキングさせた。１時間後、１５０μｌのＰＢＳＴで４回洗い、ＰＢＳに溶かした２０ｎｇ／μｌのＣＴＢタンパク質又はＶｅｎｕｓ−ＣＴＢタンパク質を、２０μｌずつ加えた。ネガティブコントロールには、ブロッキングで用いた５％スキムミルクを使用した。ＰＢＳＴで４回洗い、一次抗体は、ウサギ  ａｎｔｉ−ＣＴを５％スキムミルクで１／１０００倍希釈し、各ウェルへ５０μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗い、二次抗体はanti-rabbit  IgG  peroxidase  conjugate（ＳＩＧＭＡ社製；商品名）を、５ｖ／ｖ％スキムミルクで１／１０００に希釈し、各ウェルへ５０μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。４回洗浄した後、発色反応を行った。ＥＬＩＳＡバッファー（８０ｍＭのクエン酸リン酸バッファー、ｐＨ５．０）の１０ｍｌに、３,３,５,５’−テトラメチルベンジジンタブレット（ＳＩＧＭＡ社製；商品名）を溶かし、Ｈ２Ｏ２の５μｌを加えたものを調製し、それを各ウェルへ５０μｌずつ加えた。３７℃でインキュベートし、１５分後に、１ＭのＨ２ＳＯ４を等量加え、反応を止めた。発色測定は、波長４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、行った。
【００７６】
（2.6  免疫染色と共焦点顕微鏡観察）
共焦点顕微鏡の観察用ディッシュとして３５ｍｍのGlass  Bottom  Dish（松波硝子工業株式会社製；商品名）を用いた。それに予めＨｅＬａ細胞を８０〜９０％コンフルエント（≒５×１０５ｃｅｌｌ）の状態に培養しておいた。培地を捨て去り、ＰＢＳの２ｍｌで洗い、それを２回繰返し行った。４％パラホルムアルデヒドの１ｍｌで細胞を固定し、そのまま１０分間室温でインキュベートした。ＰＢＳの２ｍｌで固定液を２回洗い、室温で１０％ヤギ血清によるブロッキングを行った。１時間後、ＰＢＳの２ｍｌで２回洗い、ＰＢＳの１ｍｌに、前記のキレーターリポソーム（ＣｈＬｉｐｏ）の作製・精製のようにして調製したリポソーム２００μｌを加えて、細胞にかけた。３０分後、ＰＢＳで洗い、７０％グリセロールで封入し、共焦点レーザー顕微鏡Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０００（オリンパス株式会社製；商品名）で観察した。
【００７７】
次に、具体的実施方法、及びその結果を2.7〜2.12に示す。
【００７８】
（2.7  リポソームへのキレーター化合物の取り込み）
リン脂質であるＤＰＰＣとコレステロールとキレーター化合物を混ぜて有機溶媒に溶解させた後、脂質フィルムを作製してから、水和させるという所謂バンガム法で、ＤＰＰＣとコレステロールを基材とし、キレーター化合物としてＮ−ヘキサデカニル−Ｎ'−１,１０−フェナントロリン−５−イルウレアを組み込んだリポソーム（ＣｈＬｉｐｏ）を作製した。組み込まれたキレーター化合物がＮｉ２＋を介してＨｉｓ−ｔａｇタンパク質を捕捉するか否かを調べるために、Ｈｉｓ−ｔａｇ標識した緑色蛍光タンパク質Ｈｉｓ−ｔａｇ  ＥＧＦＰを用いて、ＣｈＬｉｐｏとの結合実験を行った。ＣｈＬｉｐｏに、ＮｉＳＯ４を加え、又は加えずに、Ｈｉｓ−ｔａｇ  ＥＧＦＰを結合させた後、スクロース密度勾配遠心法で分離した。分離後、１２フラクションに分画し、それらのコレステロール量と蛍光強度とを測定した。
【００７９】
ＣｈＬｉｐｏに含まれるコレステロールの量を測定することにより、リポソームを含むフラクションを、同定することができる。その結果を示す図２（Ａ）から明らかな通り、リポソームは第３フラクションに分画されていた。さらに目視観察したところ、第３フラクションは白濁層が確認されたことから、そこに、リポソームが含まれていると同定された。
【００８０】
また、ＣｈＬｉｐｏの蛍光強度を測定することにより、Ｎｉ２＋を介してＣｈＬｉｐｏにＨｉｓ−ｔａｇ  ＥＧＦＰが配位結合しキレート錯体を形成しているリポソームを含むフラクションを、同定することができる。その結果を示す図２（Ｂ）から明らかな通り、ＣｈＬｉｐｏにＮｉＳＯ４とＨｉｓ−ｔａｇ  ＥＧＦＰとを加えた場合は、第３フラクションに蛍光が認められ、Ｈｉｓ−ｔａｇ  ＥＧＦＰが結合したキレート錯体を形成していることが確かめられた。一方、ＮｉＳＯ４を加えなかった場合は、リポソームを含んでいる第３フラクションに蛍光が認められず、Ｈｉｓ−ｔａｇ  ＥＧＦＰがＣｈＬｉｐｏに結合していないことが確かめられた。なお、ＣｈＬｉｐｏのキレート錯体に結合しなかった遊離のＨｉｓ−ｔａｇ  ＥＧＦＰは、第８以降のフラクションに分画されていた。
【００８１】
これらのことから、Ｎｉ２＋依存的にＣｈＬｉｐｏとＨｉｓ−ｔａｇ  ＥＧＦＰとが、結合することが、分かった。
【００８２】
このキレーター化合物であるＮ−ヘキサデカニル−Ｎ'−１,１０−フェナントロリン−５−イルウレアは、長鎖アルキル基と複素環基とを有するから、その化学構造上、非常に脂溶性が高いものである。そのため、それと、リン脂質及びコレステロールとが含まれた脂質フィルムを水和させてリポソームを作製するバンガム法では、そのキレーター化合物が水和の際に析出して結晶化する結果、リポソームへのキレーター化合物の取り込み量がさほど多くなく、しかも微小なポアサイズの膜を通過させてリポソームの粒径を均一にするエクストルージョン操作の際に、その膜に析出した結晶が目詰まりしてしまい、通過し難くなってしまう。
【００８３】
（2.8  フィルムローディング法によるキレーター化合物の効率的な取り込み）
脂溶性が高いキレーター化合物を効率的にリポソームに組み込むために、キレーター化合物のフィルムにＳＵＶを加えるというフィルムローディング法によりリポソームを調製した。前記バンガム法とフィルムローディング法とにより調製したリポソームへのキレーター化合物の取り込み量を比較した。キレーター化合物の取り込み量を直接定量することができないので、リポソームに結合したＨｉｓ−ｔａｇ  ＥＧＦＰによる蛍光強度を夫々測定し、キレーター化合物の取り込み量の目安とした。その結果を、図３に示す。図３から明らかな通り、両方法で作製したリポソームとも、第３フラクションに、ピークが認められた。フィルムローディング法によりリポソームは、バンガム法によるものよりも、約２．７５倍の蛍光強度を示した。このことから、脂溶性が高いキレーター化合物をリポソームに高濃度で取り込むには、バンガム法よりもフィルムローディング法でリポソームを調製することが有効であることが分かった。しかも、フィルムローディング法は、エクストルージョン操作を行った後にキレート化合物を取り込ませるのであるから、エクストルージョンの膜がキレーター化合物で目詰まりせず、生産効率よくＣｈＬｉｐｏを作製することができた。
【００８４】
また、バンガム法は、リポソーム構成脂質であるリン脂質とキレーター脂質を全部一緒に混ぜて溶かしてから乾固させたフィルムを、水和するものであるから、リン脂質二重膜を形成しているリポソームが、その内側の膜も外側の膜も、均一な組成となっている。それに対し、フィルムローディング法は、予め作製されたリポソームに、高温でアモルファスな状態のキレーター化合物を後で取り込ませるものであるから、外側の膜に多くのキレーター化合物が取り込まれる結果、機能が向上し、Ｈｉｓ−ｔａｇタンパク質と結合することができる。
【００８５】
そこで、以降の実験には、フィルムローディング法で作製したＣｈＬｉｐｏを用いた。
【００８６】
（2.9  蛍光タンパク質ＶｅｎｕｓとコレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）とのキメラタンパクの作製）
蛍光タンパク質であるＶｅｎｕｓとＣＴＢとの融合タンパク質であるＶｅｎｕｓ−ＣＴＢ（ＶＣＴＢ）を産生するためのコンストラクトを、作製した。コンストラクトには、Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  ＣＥＣＦ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）でタンパク質合成を行うためのベクターｐＩＶＥＸ１．３を用いた。ｐＩＶＥＸ１．３ベクターは、図４（Ａ）に概要図として示すように、Ｃ末端にｌｉｎｋｅｒとＨｉｓ−ｔａｇが組み込まれるｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成用のベクターである。先ず、ｐＩＶＥＸ１．３のＮｃｏＩサイトとＳｍａＩサイトとを切断して開き、３１９４ｂｐのＤＮＡ断片を得た。インサートは、ｐＱＥ３０−ＶＣＴＢのプラスミドからＶＣＴＢ遺伝子をＰＣＲで増幅し、１０４５ｂｐのＤＮＡを増幅し、その増幅したＤＮＡ断片の両末端に組み込んだ制限酵素サイトを切断し、１０３０ｂｐのインサートを、前記ベクターに組み込んだ。
【００８７】
図４（Ｂ）に模式図として示すように、得られたコンストラクトのＳｍａＩサイトをＸｍａＩで切断し、そこにリンカーとＨｉｓ６をコードする合成オリゴヌクレオチド４８ｂｐを組み込んだ。作製したＣｈＬｉｐｏにＶＣＴＢが結合する際、Ｈｉｓ−ｔａｇを介して結合すると考えられるため、ｐＩＶＥＸベクターは、組み込んだ遺伝子にリンカーとＨｉｓ−ｔａｇの配列とを付加しさらに１セットのＨｉｓ６リンカーを加えてより自由度を高くしたｄｏｕｂｌｅ−Ｈｉｓ６−ｔａｇをタンパク質に付加することにより、リポソームに固定化されたＶＣＴＢがより効率的に働くと考えられる。
【００８８】
作製したコントラストを確認するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果を図５（Ａ）に示す。同図中、レーンＭはマーカーであるλHind  III/EcoR  I、レーン１は環状のプラスミド、レーン２はＳｍａＩでシングルカットしたもの、レーン３は制限酵素認識サイトＮｃｏＩとＳｍａＩとでインサートを切り出したものを示している。同図から明らかな通り、作製したコンストラクトｐＩＶＥＸ１．３−ＶＣＴＢ／ｄｏｕｂｌｅ−Ｈｉｓ６は、１０３０ｂｐのインサートと、４８ｂｐのリンカー及びタグとの配列が入っており、全長４２７２ｂｐのプラスミドであった（同図のレーン１及び２）。また、組み込んだインサートを切り出したところ、組み込んだ断片が認められた（同図のレーン３）。
【００８９】
作製したＶＣＴＢコンストラクトの予想されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４のように３文字表記で示されるものであって１文字表記では、
>1.3VCTB/W-His6
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKLICTTGKLPV
PWPTLVTTLGYGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYETRA
EVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFK
IRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSKLSKDPNEKRDHMVLL
EFVTAAGITLGMDELYTPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITF
KNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAA
ISMANLPGGGGSGGGSHHHHHHPGGGSHHHHHH＊
で示される。第一の下線部分はＶｅｎｕｓの配列、それと第二の下線部分との間はＣＴＢの配列、第二の下線部分は追加で挿入したリンカーとＨｉｓ６の配列を示している。
【００９０】
（2.10  リコンビナントＶＣＴＢの発現と精製）
タンパク質の発現には、大腸菌よりもフォールディングが正確で、かつコドン使用頻度が広いと言われている小麦胚溶解分離物Wheat  Germ  Lysateのin  vitroタンパク質合成キットを用いた。発現したＶＣＴＢタンパク質の予想される質量は、４１,１５７Ｄａである。産生したＶＣＴＢタンパク質を、TALON  RESIN（タカラバイオ株式会社；商品名）で精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔとにより確認した。その結果を図６に示す。
【００９１】
同図（Ａ）に、精製したＶＣＴＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。同図（Ａ）中、レーンＭはマーカー、レーンＣは反応液（１０ｍｌ中の１０μｌ）、レーンＰはカラム素通りフラクション（１０ｍｌ中の１０μｌ）、レーン１〜３は精製したＶＣＴＢの３μｌ、１μｌ、０．５μｌを夫々流した場合である。同図（Ｂ）に、精製したＶＣＴＢのＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの結果を示す。同図（Ｂ）は、精製したＶＣＴＢの１μｌを流した場合である。一次抗体はａｎｔｉ−ＣＴを１／１００００に希釈し、二次抗体はanti-rabbit  IgG  peroxidase  conjugate（ＳＩＧＭＡ社製；商品名）を１／２００００に希釈し、反応させた。フィルムへの露光時間は、５秒間である。精製されたタンパク質がコレラ毒素の構造を持つことを確認するために抗コレラ毒素抗体でＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを行ったところ、同図（Ｂ）のように所期のバンドが認められ、同図（Ａ）及び（Ｂ）から明らかなように、目的の位置にバンドが確認された。しかし、同図（Ａ）での反応液を流したレーンＣとカラム素通りフラクションを流したレーンＰとを比較すると、目的の位置にあるバンドが減少しており、resinへ吸着していることが、分かった。
【００９２】
タンパク質量を多くすると多少の夾雑物が見られたため（不図示）、ＶＣＴＢタンパク質濃度決定は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準タンパク質として用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドの濃さからデンシトメーターで定量した。なお、デンシトメーターには、ソフトウェアのＩｍａｇｅＪを用いた。
【００９３】
同図（Ｃ）に、ＶＣＴＢの蛍光強度を測定した結果を示す。同図（Ｃ）は、TALON  resinのカラムから溶出する際に各５００μｌずつ１２フラクションに分画し夫々のフラクションのＶＣＴＢの蛍光強度を蛍光プレートリーダーFluoroskan（Ｔｈｅｒｍｏ社製；商品名）で測定したものである。溶出後の各フラクションの蛍光強度を測定したところ、同図（Ｃ）に示すように、第１及び第２フラクションに、強い蛍光が認められた。
【００９４】
（2.11  ＶＣＴＢの活性測定とＣｈＬｉｐｏ−ＶＣＴＢの作製）
ＶＣＴＢはＨｉｓ−ｔａｇを含む蛍光タンパク質とレクチンとの融合タンパク質であるため、夫々の活性を維持している必要がある。ＶＣＴＢの蛍光活性とＧＭ１結合活性について検証した。
【００９５】
先ずＧＭ１とＶＣＴＢの結合活性を確認するために、ＥＬＩＳＡを行った。５ｎｍｏｌの糖脂質ＧＭ１、ＧＭ３、ｓｅｍｉｎｏｌｉｐｉｄをコートしたウェル、及びネガティブコントロールとして何もコートしていないウェル（ｎｏｎ−ｌｉｐｉｄ）に、ＶＣＴＢの４００ｎｇと抗コレラ毒素抗体を順次加え、各ウェルでの結合量をＨＲＰ標識二次抗体で検出した。その結果を図７（Ａ）の棒グラフで示す。左縦軸は、ＨＲＰ反応時の４５０ｎｍの吸光度を示す。同時に各ウェルの蛍光強度を測定した。その結果を図７（Ａ）の折れ線グラフで示す。右縦軸は蛍光を示す。同図（Ａ）の横軸最右に示すように、ＧＭ１＋ＣＴＢでは、先と同様に５ｎｍｏｌのＧＭ１を固定し、ＶＣＴＢを加える前に１５倍量（モル比）のＣＴＢで処理することにより、著しいＶＣＴＢの結合阻害が認められた。また、抗コレラ毒素抗体とＨＲＰ標識二次抗体を用いた検出では阻害に用いたＣＴＢが大量に結合していた。
【００９６】
次に精製後のＶＣＴＢと、ＧＭ１を発現しているＨｅＬａ細胞との結合能を確認するために、フローサイトメトリーの測定を行った。生きたままのＨｅＬａ細胞と４℃で２０分間結合させ、FACSCalibur（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）により解析した。その結果を図７（Ｂ）に示す。同図（Ｂ）中、横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数である。左側データ曲線は細胞懸濁液のみの場合を示し、右側のデータ曲線は細胞懸濁液にＶＣＴＢを加えた場合を示す。同図（Ｂ）から明らかなように、蛍光強度の移動が認められた。
【００９７】
これらのことから、リコンビナントＶＣＴＢはＧＭ１結合活性と蛍光活性を有することが実証された。
【００９８】
次に、合成したＶＣＴＢタンパク質を用いて、ＣｈＬｉｐｏへの結合を確認するために、前記のリポソームへのキレーター化合物の取り込みでのＣｈＬｉｐｏとの結合実験と同様に、コレステロール量と蛍光強度とを測定した。その結果を図７（Ｃ）及び（Ｄ）に示す。同図（Ｃ）及び（Ｄ）から明らかなように、ＶＣＴＢがＮｉ２＋に依存してＣｈＬｉｐｏに結合していた。
【００９９】
キレーター化合物がＮｉ２＋依存的にＨｉｓ−ｔａｇ  ＥＧＦＰや、Ｈｉｓ−ｔａｇ  ＶＣＴＢのＣｈＬｉｐｏへ結合していたことから、キレーター化合物はリポソーム膜上に固定化されていてもキレート錯体を形成することができていた。しかもＨｉｓ−ｔａｇを介していても、ＥＧＦＰやＶＣＴＢの蛍光活性に影響がなかった。リポソーム膜上に分子を固定化することができるＣｈＬｉｐｏは、膜上でタンパク質を正常に働かせることが重要である。細胞表面には細胞を特徴づける分子が多数表現されているので、ＣｈＬｉｐｏに表現されるタンパク質を適切に選ぶことにより、さまざまな細胞に対して標的指向性を得ることができる。
【０１００】
（2.12  ＣｈＬｉｐｏ−ＶＣＴＢ又はＣｈＬｉｐｏ−ＥＧＦＰとＨｅＬａ細胞との結合）
ＣｈＬｉｐｏ−ＶＣＴＢ及びＣｈＬｉｐｏ−ＥＧＦＰの何れかのリポソームとＨｅＬａ細胞との結合を確認するために、共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った。先ず、生きたままの細胞に血清中でリポソームを加え、４℃で２０分間処理した。ＰＢＳで３回洗い、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定した。室温で１０分間処理し、固定液を捨て去り、ＰＢＳで２回洗浄した。観察には、共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ１０００（オリンパス株式会社製；商品名）を用いた。ＣｈＬｉｐｏ−ＶＣＴＢの処理をしたＨｅＬａ細胞ではドット状の蛍光が認められた。これに対しＶＣＴＢの代わりにＥＧＦＰを結合させたＣｈＬｉｐｏ−ＥＧＦＰの処理をしたＨｅＬａ細胞では、蛍光が殆んど認められなかった。
【０１０１】
このことから、ＣｈＬｉｐｏ−ＶＣＴＢには、ＧＭ１を発現するＨｅＬａ細胞への特異的な結合能があることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明の薬物輸送剤及びそれを用いた薬物導入方法は、生体分子機能解析すべき非ヒト細胞やヒト由来細胞に遺伝子や薬理作用発現物質を効率良く導入して、細胞内での機能や細胞内での動態や細胞への影響を調べ、細胞レベルでの作用機序を明らかにするのに用いられる。
【０１０３】
また、薬物輸送剤は、患者の診断すべき特定部位へ特異的に診断薬を輸送したり、治療すべき神経細胞や癌病巣のような病変部位へ治療薬を特異的に輸送したり、再生すべき部位へ薬物を特異的に輸送したりして、適切な診療をするのにも用いられる。
【０１０４】
この薬物輸送剤の原料は簡便かつ大量に純度良く製造されるから、薬物輸送剤は、生化学的研究や診療に汎用でき有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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