(57)【要約】【課題】微生物培養液中の無機塩を除去と同時に培養由来の不純物（タンパク質や多糖）を除去して、結晶化に有利な高純度の乳酸を分離する方法を提供することを課題とする。【解決手段】微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を分離する工程を含む乳酸の製造方法であって、（ａ）該培養液をナノフィルターに通じて濾過する工程、続いて（ｂ）乳酸を結晶化し単離する工程を含む、乳酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を分離する工程を含む乳酸の製造方法であって、（ａ）該培養液をナノフィルターに通じて濾過する工程、続いて（ｂ）乳酸を結晶化し単離する工程を含む、乳酸の製造方法。
【請求項２】
前記ナノフィルターの機能層がポリアミドを含む、請求項１に記載の乳酸の製造方法。
【請求項３】
前記ポリアミドが架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、化学式１で示される構成成分を含有することを特徴とする請求項２に記載の乳酸の製造方法。
【化１】
2009201506.tif 000007
（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ３、ｎは０から３までの整数を表す。）
【請求項４】
前記（ａ）工程における培養液のｐＨが６．９以下である、請求項１から３のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項５】
前記（ａ）工程における培養液の濾過圧が０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下である、請求項１から４のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項６】
前記培養液中の乳酸を乳酸塩として晶析してから、前記工程（ａ）に供する、請求項１から５のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項７】
前記（ｂ）工程において、２〜５℃／ｈで徐冷する、請求項１から６のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を単離する工程を含む、乳酸の製造方法に関する。詳しくは、微生物の発酵培養液をナノフィルターに通じることによって結晶化工程に適した純度の乳酸溶液が得られ、結晶化工程により、高光学純度、低着色度の乳酸を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、食品用、医薬用などといった用途の他に、生分解性プラスチックのモノマー原料として工業的用途にまで広く適用され、需要が増加している。２−ヒドロキシプロピオン酸、即ち乳酸は、微生物による発酵により生産されることが知られており、微生物はグルコースに代表される炭水化物を含有する基質を乳酸に変換する。乳酸は、カルボニルα位の炭素に結合している水酸基の立体により、（Ｌ）−体および（Ｄ）−体の光学異性体に分類される。微生物発酵によれば、微生物を適宜選択することにより（Ｌ）−体または（Ｄ）−体の乳酸を選択的に、または（Ｌ）−体及び（Ｄ）−体の混合体（ラセミ体）の乳酸を生産することができる。
【０００３】
微生物発酵による乳酸の生産は、一般に、培養液中にアルカリ性物質を添加することで、微生物発酵に最適なｐＨに保持されながら行われる。微生物発酵により生産された酸性物質である乳酸の多くは、アルカリ性物質が添加さているために、培養液中で乳酸の多くは乳酸塩として存在している。また当然であるが培養することで様々な副産物（タンパク質や多糖など）が発生する。
【０００４】
高純度の乳酸を得るためには結晶化工程が重要である。しかしながら結晶化工程を行うためには培養液中に存在する乳酸をフリー化することおよび可能な限り不純物を除去した状態にする必要がある。そのために従来は様々な工程を経て結晶化に適した乳酸水溶液を得ていた。
【０００５】
例えば、乳酸をフリー化させるためには金属陽イオン類（カルシウムイオン、ナトリウムイオンなど）を除去すればよい。こうした金属陽イオン類を除去する方法としては、イオン交換樹脂を用いる方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、イオン交換樹脂のイオン交換性能を保持するためには、定期的にイオン交換樹脂を再生する必要がある。例えばカルシウムイオン除去の場合、イオン交換樹脂の再生には大量の塩化ナトリウム水溶液を用いて行われるが、再生に伴い、大量の廃液が排出され、廃液処理に多額のコストがかかるという問題がある。さらに、繰り返しイオン交換樹脂の再生を行うとイオン交換樹脂の再生率が低下する上に、イオン交換性能が低下し、カルシウム塩の除去率が低下するという問題点があった。また不純物除去の観点からは例えばイオン化していない物質（タンパク質、多糖など）はイオン交換では取り除ききることができない。
【０００６】
また乳酸のフリー化としては、溶媒抽出により金属陽イオン類の除去を行った後に、結晶化工程を行う方法が開示されている（特許文献２）。しかしながら、抽出に用いる溶媒の処理リサイクルが必要になるうえ、その溶媒に溶解しない不純物（例えばタンパク質など）を除去することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００１−５０６２７４号公報（特許請求の範囲）
【特許文献２】特表２００４−５０９０９１号公報（特許請求の範囲）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述したしたような課題、すなわち、微生物発酵により乳酸を生産する場合において、培養液中の金属陽イオン類（無機塩）を除去と同時に培養由来の不純物（タンパク質や多糖）を除去するという課題を解決し、結晶化に有利な高純度の乳酸を分離する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ｐＨ６.９以下に調整した微生物発酵培養液を、ナノフィルターに通じることにより、培養液中のカルシウムイオンなどの金属陽イオンを高効率で除去し、なおかつ培養由来のタンパク質や多糖などを除去することができることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、次の（１）〜（７）から構成される。
【００１０】
（１）微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を分離する工程を含む乳酸の製造方法であって、（ａ）該培養液をナノフィルターに通じて濾過する工程、続いて（ｂ）乳酸を結晶化し単離する工程を含む、乳酸の製造方法。
【００１１】
（２）前記ナノフィルターの機能層がポリアミドを含む、（１）に記載の乳酸の製造方法。
【００１２】
（３）前記ポリアミドが架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、化学式１で示される構成成分を含有することを特徴とする（２）に記載の乳酸の製造方法。
【００１３】
【化１】
2009201506.tif 000002
【００１４】
（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ３、ｎは０から３までの整数を表す。）
（４）前記（ａ）工程における培養液のｐＨが６．９以下である、（１）から（３）のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【００１５】
（５）前記（ａ）工程における培養液の濾過圧が０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下である、（１）から（４）のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【００１６】
（６）前記培養液中の乳酸を乳酸塩として晶析してから、前記工程（ａ）に供する、（１）から（５）のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【００１７】
（７）前記（ｂ）工程において、２〜５℃／ｈで徐冷する、（１）から（６）のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、発酵培養液中に存在する金属陽イオン類（無機塩）および発酵培養液由来のタンパク質や多糖などを簡単な操作で効率的に除去することができるため、結晶化工程において乳酸結晶化を効率的に行うことができるとともに、化学純度、光学純度に優れた乳酸を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明で用いたナノフィルター膜分離装置の一つの実施の形態を示す概要図である。
【図２】本発明で用いたナノフィルター膜分離装置のナノフィルターが装着されたセル断面図の一つの実施の形態を示す概要図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２１】
微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を単離する工程を含む乳酸の方法であって、（ａ）該培養液をナノフィルターに通じて濾過する工程、続いて（ｂ）乳酸を結晶化し単離する工程を含むものである。
【００２２】
本発明の乳酸の製造方法で用いるナノフィルターとは、ナノ濾過膜（ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜）とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。
【００２３】
また、「ナノフィルターに通じて濾過する」とは、微生物の発酵培養により生産された乳酸を含む培養液を、ナノフィルターに通じて濾過し、溶解または固体として析出している無機塩を除去または阻止または濾別し、乳酸溶液を濾液として透過させることを意味する。ここで、無機塩には、培養液中に含まれる無機塩のいずれの形態のものも含まれ、また培養液中において溶解しているもの、培養液中に析出し若しくは沈殿して含まれているもののいずれも含まれる。
【００２４】
本発明で使用されるナノフィルターの素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。複合膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載の、ポリスルホンを膜素材とする支持膜にポリアミドの機能層からなるナノフィルターを構成させた複合膜を用いることができる。
【００２５】
これらの中でも高耐圧性と高透水性、高溶質除去性能を兼ね備え、優れたポテンシャルを有する、ポリアミドを機能層とした複合膜が好ましい。操作圧力に対する耐久性と、高い透水性、阻止性能を維持できるためには、ポリアミドを機能層とし、それを多孔質膜や不織布からなる支持体で保持する構造のものが適している。また、ポリアミドナノフィルターとしては、多官能アミンと多官能酸ハロゲン化物との重縮合反応により得られる架橋ポリアミドの機能層を支持体に有してなる複合ナノフィルターが適している。
【００２６】
ポリアミドを機能層とするナノフィルターにおいて、ポリアミドを構成する単量体の好ましいカルボン酸成分としては、例えば、トリメシン酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸、トリメリット酸、ピロメット酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、ジフェニルカルボン酸、ピリジンカルボン酸などの芳香族カルボン酸が挙げられるが、製膜溶媒に対する溶解性を考慮すると、トリメシン酸、イソフタル酸、テレフタル酸、およびこれらの混合物がより好ましい。
【００２７】
前記ポリアミドを構成する単量体の好ましいアミン成分としては、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、ベンジジン、メチレンビスジアニリン、４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、ジアニシジン、３，３’，４−トリアミノビフェニルエーテル、３，３’，４，４’−テトラアミノビフェニルエーテル、３，３’−ジオキシベンジジン、１，８−ナフタレンジアミン、ｍ（ｐ）−モノメチルフェニレンジアミン、３，３’−モノメチルアミノ−４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、４，Ｎ，Ｎ’−（４−アミノベンゾイル）−ｐ（ｍ）−フェニレンジアミン−２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾイミダゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾオキサゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾチアゾール）等の芳香環を有する一級ジアミン、ピペラジン、ピペリジンまたはこれらの誘導体等の二級ジアミンが挙げられ、中でもピペラジンまたはピペリジンを単量体として含む架橋ポリアミドを機能層とするナノフィルターは耐圧性、耐久性の他に、耐熱性、耐薬品性を有していることから好ましく用いられる。より好ましくは前記架橋ピペラジンポリアミドまたは架橋ピペリジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドであり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドである。また、前記化学式（１）中、ｎ＝３のものが好ましく用いられる。架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とするナノフィルターとしては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載のものが挙げられ、具体例として、架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式（１）中、ｎ＝３のものを構成成分として含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製の架橋ピペラジンポリアミド系ナノフィルターのＵＴＣ６０が挙げられる。
【００２８】
ナノフィルターは一般にスパイラル型の膜エレメントとして使用されるが、本発明で用いるナノフィルターも、スパイラル型の膜エレメントとして好ましく使用される。好ましいナノフィルターエレメントの具体例としては、例えば、酢酸セルロース系のナノろ過膜であるＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ナノフィルターのＧＥｓｅｐａ、ポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノフィルターのＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノフィルターのＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノフィルターモジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０が挙げられ、より好ましくはポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノフィルターのＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノフィルターのＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノフィルターモジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０であり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノフィルターモジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０である。
【００２９】
本発明の乳酸の製造方法で用いるナノフィルターの膜分離性能としては、温度２５℃、ｐＨ６．５に調整した塩化ナトリウム水溶液（５００ｍｇ／Ｌ）を０．７５ＭＰａの濾過圧で評価したときの塩除去率が４５％以上のものが好ましく用いられる。ここでいう塩除去率は前記塩化ナトリウム水溶液の透過水塩濃度を測定することにより、式１によって算出することができる。
【００３０】
塩除去率＝１００×｛１−（透過水中の塩濃度／供給水中の塩濃度）｝・・・（式１）。
【００３１】
また、ナノフィルターの透過性能としては、０．３ＭＰａの濾過圧において、膜単位面積当たりの塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）の透過流量（ｍ３／ｍ２／ｄａｙ）が０．５以上０．８以下のナノフィルターが好ましく用いられる。膜単位面積当たりの透過流量（膜透過流束）の評価方法としては、透過液量および透過液量を採水した時間および膜面積を測定することで、式２によって算出することができる。
【００３２】
膜透過流束（ｍ３／ｍ２／ｄａｙ）＝透過液量／膜面積／採水時間・・・（式２）。
【００３３】
（ａ）工程に供する培養液のｐＨは、６．９以下であることが好ましい。ナノフィルターは、溶液中にイオン化している物質の方が、イオン化していない物質に比べて除去または阻止しやすいことが知られていることから、培養液のｐＨを６．９以下とすることで、乳酸が培養液中で解離して乳酸イオンとして存在している割合を少なくし、乳酸が透過しやすくなる。また、ｐＨが２．０未満である場合、ナノフィルターの損傷に影響するおそれがあることから、ｐＨは２以上であることが好ましい。より好ましくは、培養液をｐＨ５以下ｐＨ２以上とする。さらに、乳酸のｐＫａが３．８６であることから、ｐＨを３．８６以下とする場合、乳酸イオンと水素イオンに解離していない乳酸の方が培養溶液中に多く含まれるため、効率的に乳酸をナノフィルターに透過することができることから、より好ましい。なお、培養液のｐＨ調整は微生物発酵時であっても、微生物発酵後であってもよい。
【００３４】
（ａ）工程に供する培養液中の乳酸の濃度は、特に限定されないが、高濃度であれば、透過液中に含まれる乳酸の濃度も高いため、濃縮する時間を短縮することができることからコスト削減に好適であり、例えば１０ｇ／Ｌ以上１００ｇ／Ｌ以下が好ましい。
【００３５】
（ａ）工程においては圧力をかけてもよく、その濾過圧は、０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲で好ましく用いられる。濾過圧が０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるおそれがある。また、濾過圧が０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下で用いれば、膜透過流束が高いことから、乳酸溶液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。
【００３６】
（ａ）工程における、乳酸のナノフィルター透過性の評価方法としては、乳酸透過率を算出して評価することができる。乳酸透過率は、高速液体クロマトグラフィーに代表される分析により、原水（培養液）中に含まれる乳酸濃度（原水乳酸濃度）および透過液（乳酸含有溶液）中に含まれる乳酸濃度（透過液乳酸濃度）を測定することで、式３によって算出することができる。
【００３７】
乳酸透過率（％）＝（透過液乳酸濃度／原水乳酸濃度）×１００・・・（式３）。
【００３８】
（ａ）工程における、溶解または固体として析出している無機塩の除去、阻止または濾別の程度を評価する方法としては、無機イオン除去率（阻止率）を算出することで評価する方法が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。無機塩阻止率（除去率）は、イオンクロマトグラフィーに代表される分析により、原水（培養液）中に含まれる無機塩濃度（原水無機塩濃度）および透過液（乳酸溶液）中に含まれる無機塩の濃度（透過液無機塩濃度）を測定することで、式４によって算出することができる。
【００３９】
無機塩除去率（％）＝（１−（透過液無機塩濃度／原水無機塩濃度））×１００・・・（式４）。
【００４０】
本発明の乳酸の製造方法において、（ａ）工程により得られる乳酸溶液を、さらに（ｂ）乳酸を結晶化し単離する工程に供することで、高化学純度、高光学純度の乳酸を得ることができる。結晶化工程は従来知られている方法を用いればよく、例えば冷却（冷却結晶化）、濃縮（蒸発結晶化）により乳酸を過飽和状態にすれば良い。すなわち、ナノフィルターに通じた乳酸溶液をエバポレーターに代表される濃縮装置で加熱濃縮し、水を蒸発させることで乳酸濃度を上げ、乳酸濃度として９０％以上まで濃縮することが好ましく、より好ましくは９５％以上まで濃縮することで乳酸結晶の回収率を向上させることができる。さらにこの高温になった高濃度乳酸溶液を好ましくは２から５℃／ｈ、より好ましくは２℃／ｈの冷却速度で４℃以上１５℃以下になるまで冷却することで過飽和されている乳酸が結晶となって析出する。析出した乳酸結晶は遠心分離、または定性濾紙を用いた吸引濾過等によって回収することができる。また、結晶を回収した後の母液は、培養液、ナノフィルターによる濾過工程、乳酸晶析工程等、各工程にリサイクルすることができ、トータルの乳酸回収率を高めることができる。
【００４１】
また前記（ａ）工程の前に、培養液中の乳酸を乳酸塩として析出させ、定性濾紙等により濾別回収する晶析工程に供してもよい。乳酸塩の好ましい形態としては、乳酸カルシウム塩、乳酸マグネシウム塩、乳酸バリウム塩、乳酸リチウム塩、乳酸ナトリウム塩、乳酸カリウム塩、乳酸アンモニウム塩等の乳酸無機塩が挙げられ、これらの混合物であってもよい。乳酸を含む培養液を晶析工程に供することで、培養液中に含まれる発酵由来の糖、タンパク質など多くの不純物をあらかじめ除去することができ、その後の（ａ）工程におけるナノフィルターによる不純物除去効率をさらに高めることができる。また、晶析工程に供する前に、培養液をエバポレーターや逆浸透膜に代表される濃縮装置を用いて濃縮してもよい。培養液を濃縮することで、溶液中の乳酸の濃度を高めることができ、晶析工程における乳酸塩の回収効率を高めることができることから好ましい。
【００４２】
さらに、晶析工程で回収した乳酸塩に酸性物質を添加した後、前記工程（ａ）に供することで乳酸を高効率で回収することができる。添加する酸性物質としては、硫酸、塩酸、炭酸、リン酸、硝酸などが挙げられる。具体的には、例えば乳酸カルシウムを含有する溶液に硫酸を添加し、該溶液中のカルシウム成分を難溶性硫酸塩である硫酸カルシウムとして沈殿、濾別する工程を行い、その濾液（乳酸を含む分離液）をナノフィルターに通じることで、より効果的にカルシウム成分を除去または阻止し、後段の結晶化工程でより高純度な乳酸を高収率で回収することができる。
【００４３】
上記の通り得られた乳酸の光学純度は、乳酸溶液を高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）により分析することで評価することができる。また、乳酸結晶の着色度は、乳酸水溶液のＡＰＨＡ単位色数により評価することができる。なお、ＡＰＨＡ単位色数（ハーゼン単位色数）は、ＪＩＳＫ００７１−１（１９９８年１０月２０日制定）の測定法に従って求められる値である。
【００４４】
以下、本発明の乳酸の製造方法に供される微生物の発酵培養による乳酸生産について説明する。
【００４５】
微生物の発酵培養による乳酸生産に使用する発酵原料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物である乳酸を良好に生産させうるものであればよく、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなども使用される。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。
【００４６】
本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素（例えば、アミノ酸など）を必要とする場合には、その栄養物をそれ自体もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて使用してもよい。
【００４７】
本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言う。培養液に追加する発酵原料の組成は、目的とする乳酸の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
【００４８】
本発明では、微生物の培養は、好ましくは通常ｐＨ３−８、温度２０−４０℃の範囲で行われる。培養液のｐＨはアルカリ性物質、好ましくは塩基性のカルシウム塩によって上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節することができる。塩基性カルシウム塩としては、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化カルシウム、酢酸カルシウムなどが好ましく用いられる。
【００４９】
微生物の培養において、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００５０】
本発明で使用される微生物については特に制限はないが、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、乳酸菌、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌などが挙げられる。動物細胞、昆虫細胞等の培養細胞も、本発明で使用される微生物に含まれる。前記微生物の中でも、酵母、乳酸菌および大腸菌のいずれかから選択されることが好ましい。使用する微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
参考例１  乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
乳酸生産能力を持つ酵母株を下記のように造成した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することでＬ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造社製）、あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【００５３】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen社製）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen社製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【００５４】
上記操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲによりＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにしてヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）を得た。
【００５５】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子及びＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【００５６】
得られた形質転換細胞がヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のように行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＹＥＡＳＴ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ２０００  ＥＤＩＴＩＯＮ、  ＣＳＨＬ  ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
【００５７】
カラム：Shim-Pack SPR-H（株式会社島津製作所製）、移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、検出方法：電気伝導度、温度：４５℃。
【００５８】
また、Ｌ−乳酸およびＤ−乳酸の濃度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【００５９】
カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー株式会社製）、移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ、温度 ：３０℃。
【００６０】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は式５で計算される。ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【００６１】
光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）・・・（式５）。
【００６２】
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がＬ−乳酸生産能力を持つことを確認した。得られた形質転換細胞を酵母ＳＷ−１株として、続く実施例に用いた。
【００６３】
参考例２  バッチ発酵によるＬ−乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を行い、その乳酸生産性を評価した。表１に示す乳酸発酵培地を用い、バッチ発酵試験を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。参考例２の運転条件を以下に示す。
【００６４】
反応槽容量（乳酸発酵培地量）：２（Ｌ）、  温度調整：３０（℃）、反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）、反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）、ｐＨ調整：１Ｎ  水酸化カルシウムによりｐＨ４に調整。
【００６５】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。温度調整、ｐＨ調整を行い、発酵培養を行った。この時の菌体増殖量は、６００ｎｍでの吸光度で１５であった。回分発酵の結果を表２に示す。
【００６６】
【表１】
2009201506.tif 000003
【００６７】
【表２】
2009201506.tif 000004
【００６８】
実施例１  ナノフィルターを通じた乳酸溶液の結晶化
参考例２と同様の条件で乳酸発酵した培養液２０Ｌ（乳酸濃度１３ｇ／Ｌ）を８，０００ｇで１５分間遠心分離することで菌体を取り除いた。次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記で得られた培養液２０Ｌを注入した。ナノフィルターモジュール２（架橋ピペラジンポリアミドナノフィルターモジュールＳＵ−６１０、東レ株式会社製）を専用ベッセルにセットし、高圧ポンプ３の圧力を２ＭＰａに調整して運転し、非透過液４、透過液５を回収した。透過液５には、５．６ｇ／Ｌの乳酸が含まれていた。このナノフィルターを通じた乳酸溶液（１０Ｌ）を、ロータリーエバポレーター（東京理化社製）を用いて、減圧下（０．１バール）、８０℃で水を蒸発させて濃縮した。水の蒸発が観測されなくなったところで、大気開放し常圧にもどした。この溶液を２℃／ｈの冷却速度で２２時間かけて１５℃まで冷却した。冷却過程で、溶液温度が４０℃になったところで乳酸の種結晶１ｇを添加した。こうして得られた乳酸結晶を遠心分離で固液分離にて回収した後、乾燥させたところ４９．２ｇ（結晶工程収率８６％）の乳酸結晶を得ることができた。得られた乳酸結晶０．２ｇに超純水１０ｍＬを添加して完全に溶解させ、乳酸の光学純度を参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析し、式５に従って算出した結果、光学純度は９９．９％であった。また、乳酸結晶９ｇを超純水１ｇに完全に溶解させて９０％乳酸水溶液を調整し、着色度を比色計（日本電色工業株式会社製）によりＡＰＨＡ単位色数として分析したところ、ＡＰＨＡは１４であった。
【００６９】
比較例１  ナノフィルターを通さない乳酸溶液の結晶化
参考例２と同様の条件で乳酸発酵した培養液２０Ｌ（乳酸濃度１３ｇ／Ｌ）を８，０００ｇで１５分間遠心分離することで菌体を取り除いた。次いで、このナノフィルターを通さない乳酸溶液（１０Ｌ）を、ロータリーエバポレーター（東京理化社製）を用いて、減圧下（０．１バール）、８０℃で水を蒸発させて濃縮した。水の蒸発が観測されなくなったところで、大気開放し常圧にもどした。この溶液を２℃／ｈの冷却速度で２２時間かけて１５℃まで冷却した。冷却過程で、溶液温度が４０℃になったところで乳酸の種結晶１ｇを添加した。こうして得られた乳酸結晶を遠心分離で固液分離にて回収した後、乾燥させたところ１８ｇ（結晶工程収率１３％）の乳酸結晶を得ることができた。得られた乳酸結晶０．２ｇに超純水１０ｍＬを添加して完全に溶解させ、乳酸の光学純度を参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析し、式５に従って算出した結果、光学純度は９９．９％であった。また、乳酸結晶９ｇを超純水１ｇに完全に溶解させて９０％乳酸水溶液を調整し、着色度を比色計（日本電色工業株式会社製）によりＡＰＨＡ単位色数として分析したところ、ＡＰＨＡは４６であった。
【００７０】
実施例２〜５  様々な素材のナノフィルターを通じた乳酸溶液の結晶化
参考例２と同様の条件で乳酸発酵した培養液２０Ｌ（乳酸濃度１３ｇ／Ｌ）を８，０００ｇで１５分間遠心分離することで菌体を取り除いた。次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記で得られた培養液２０Ｌを注入した。図２の符号７に示される９０φナノフィルターとして、架橋ピペラジンポリアミドナノフィルター“ＵＴＣ６０”（ナノフィルター１；東レ株式会社製）、架橋ピペラジンポリアミドナノフィルター“ＮＦ−４００”（ナノフィルター２；フィルムテック製）、ポリアミドナノフィルター“ＮＦ９９”（ナノフィルター３；アルファラバル製）、酢酸セルロースナノフィルター“ＧＥｓｅｐａ”（ナノフィルター４；ＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）をそれぞれステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、高圧ポンプ３の圧力を２ＭＰａに調整して運転し、非透過液４、透過液５を回収した。透過液５に含まれる乳酸濃度は実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）を用いて分析した。また、原水槽１、透過液５に含まれる、カルシウムイオンの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）により以下の条件で分析し、カルシウムイオンの除去率を計算した。
【００７１】
カルシウムイオン；カラム（ＣＳ１２Ａ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（２０ｍＭメタンスルホン酸）、温度（３５℃）。
【００７２】
このナノフィルターを通じた乳酸溶液（１Ｌ）を、ロータリーエバポレーター（東京理化社製）を用いて、減圧下（０．１バール）、８０℃で水を蒸発させて濃縮した。水の蒸発が観測されなくなったところで、大気開放し常圧にもどした。この溶液を２℃／ｈの冷却速度で２２時間かけて１５℃まで冷却した。冷却過程で、溶液温度が４０℃になったところで乳酸の種結晶０．１ｇを添加した。こうして得られた乳酸結晶を遠心分離で固液分離にて回収した後、乾燥することで乳酸結晶を得た。得られた乳酸結晶の重量を測定して結晶工程収率を算出し、乳酸の光学純度、９０％乳酸水溶液の着色度を実施例１と同様の条件でそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）、比色計（日本電色工業株式会社製）を用いて分析した。結果を表３に示す。
【００７３】
【表３】
2009201506.tif 000005
【００７４】
実施例６〜９  乳酸カルシウムの晶析工程を経た乳酸の製造
（培養液中の乳酸カルシウムの晶析）
参考例２と同様の条件で乳酸発酵した培養液２０Ｌ（乳酸濃度１３ｇ／Ｌ）を８，０００ｇで１５分間遠心分離することで菌体を取り除いた。また、乳酸の結晶化工程における光学純度の向上効果について検証することを目的として、この培養液５０ＬにＤ−乳酸（和光純薬株式会社製）６．６ｇを添加して光学純度を意図的に低下させ、光学純度９８．０％のＬ−乳酸含有培養液を調製した。この培養液（５０Ｌ）を、ロータリーエバポレーター（東京理化社製）を用いて、減圧下（０．１バール）、８０℃で培養液が７Ｌとなるまで濃縮した。次いで、濃縮した培養液を１０℃で２４時間かけて冷却し、乳酸カルシウムを析出させた。析出した乳酸カルシウムは、定性濾紙Ｎｏ２（アドバンテック株式会社製）を用いて吸引濾過により回収し、０．５Ｌの超純水で洗浄した。乳酸カルシウム（含水）の回収量は１．１ｋｇであった。
【００７５】
（酸性物質添加による解離乳酸溶液の調製）
前記乳酸カルシウム１ｋｇに超純水１０Ｌを添加して溶解し、乳酸カルシウム水溶液とした。次いで、ｐＨが２．６になるまで濃硫酸（和光純薬工業株式会社製）を滴下後、１時間２５℃で攪拌し、溶液中の乳酸カルシウムを乳酸と硫酸カルシウムに変換した。次いで、沈殿した硫酸カルシウムを定性濾紙Ｎｏ２（アドバンテック株式会社製）を用いて吸引濾過により、沈殿物を濾別し、濾液１０Ｌを回収した。透過液中の乳酸濃度を参考例１と同様の条件で測定した結果、４８ｇ／Ｌであった。また、原水槽１、透過液５のカルシウムイオンは実施例２〜５と同様の条件で、硫酸イオンは以下の条件でイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）を用いて分析した。
【００７６】
硫酸イオン；カラム（ＡＳ４Ａ−ＳＣ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（１．８ｍＭ炭酸ナトリウム／１．７ｍＭ炭酸水素ナトリウム）、温度（３５℃）。
【００７７】
（ナノフィルターを通じた乳酸溶液の結晶化）
前記乳酸溶液２Ｌ（乳酸濃度４８ｇ／Ｌ）を用いた以外は、実施例２〜５と同様の条件でナノフィルター１〜４を用いて乳酸溶液の濾過実験を行った。透過液５を回収し、透過液中の乳酸の光学純度を実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）を用いて分析した。
【００７８】
このナノフィルターを通じた乳酸溶液（１Ｌ）を、実施例２〜５と同様の条件で乳酸の結晶化工程に供した。得られた乳酸結晶の重量を測定して結晶工程収率を算出し、乳酸の光学純度、９０％乳酸水溶液の着色度を実施例１と同様の条件でそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）、比色計（日本電色工業株式会社製）を用いて分析した。結果を表４に示す。
【００７９】
【表４】
2009201506.tif 000006
【００８０】
比較例２  乳酸カルシウムの晶析工程を含む、ナノフィルターを通さない乳酸溶液の結晶化
参考例２と同様の条件で乳酸発酵した培養液２０Ｌ（乳酸濃度１３ｇ／Ｌ）を実施例６と同様、乳酸カルシウムの晶析工程、酸性物質添加工程に供して、解離乳酸溶液４８ｇ／Ｌを得た。この乳酸溶液（１Ｌ）を、ロータリーエバポレーター（東京理化社製）を用いて、減圧下（０．１バール）、８０℃で水を蒸発させて濃縮したところ、濃縮過程で硫酸カルシウムが析出した。水の蒸発が観測されなくなったところで、大気開放し常圧にもどした。この溶液を２℃／ｈの冷却速度で２２時間かけて１５℃まで冷却した。冷却過程で、溶液温度が４０℃になったところで乳酸の種結晶０．１ｇを添加した。析出物を固液分離にて回収したところ、該析出物は乳酸と硫酸カルシウムの混合物として得られたため、乳酸結晶の分離回収には至らなかった。
【００８１】
以上の実施例及び比較例の結果から、ナノフィルターに通じることにより、結晶化工程に適した乳酸水溶液が得られることが明らかとなった。また、培養液をナノフィルターに通じる前に、乳酸塩の晶析工程に供することで、結晶化工程の収率が向上し、さらに、化学純度、光学純度に優れた乳酸を得ることが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の乳酸の製造方法により得られる乳酸は、食品、医薬品のほか、生分解性プラスチックであるポリ乳酸のモノマー原料として好適に用いられる。
【符号の説明】
【００８３】
１  原水槽
２  ナノフィルターモジュールまたはナノフィルターが装着されたセル
３  高圧ポンプ
４  非透過液の流れ
５  透過液の流れ
６  高圧ポンプにより送液された培養液の流れ
７  ナノフィルター
８  支持板
【図１】
2009201506.tif 000008
【図２】
2009201506.tif 000009
【配列表】
2009201506000001.app