(57)【要約】【課題】  固相担体上において、蛍光集合体を安定に標識することにより、高感度な被検物質の検出方法を提供すること。【解決手段】  脂質二分子膜から成る小胞体であるリポソームの表面に蛍光物質を修飾することにより、リポソームを蛍光集合体から成る標識物質として用いることを特徴とする被検物質の検出方法。並びに、固相担体表面の修飾およびリポソームの構成成分により、リポソームを固相担体上に安定に存在させることを特徴とする被検物質の検出方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面に固定化した被検物質を、標識物質を用いて検出する方法であって、
該標識物質はリン脂質、極性を有する脂質、該被検物質に特異的に結合する化合物を修飾したリン脂質、コレステロールおよび糖質から構成される脂質二分子膜から成る小胞体であることを特徴とする被検物質の検出方法。
【請求項２】
前記被検物質が核酸、ウイルスまたはタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の被検物質の検出方法。
【請求項３】
前記蛍光物質がダンシルアミノ酸、ピレン、フルオレセイン、ローダミンまたはそれらの誘導体の一種であることを特徴とする請求項１に記載の被検物質の検出方法。
【請求項４】
前記被検物質に特異的に結合する化合物がビオチンであることを特徴とする請求項１に記載の被検物質の検出方法。
【請求項５】
前記被検物質に特異的に結合する化合物が抗体であることを特徴とする請求項１に記載の被検物質の検出方法。
【請求項６】
前記糖質がグルコース、スクロースおよびトレハロースのいずれか一種または複数種であることを特徴とする請求項１に記載の被検物質の検出方法。
【請求項７】
基板表面に固定化した被検物質を、標識物質として脂質二分子膜を用いて検出する方法であって、該基板表面に親水基を有する化合物が固定され、該脂質二分子膜の構成成分が極性を有する脂質を有し、該脂質二分子膜の平均粒子径が５０〜５００ｎｍの一枚膜構造であることを特徴とする被検物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相担体上において脂質二分子膜から成る小胞体であるリポソームを標識物質として用いた、被検物質の検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
基板上に被検物質となる被検物質を固定化することにより、免疫反応またはハイブリダイゼーション反応を利用して目的物質を検出する方法は、広く利用されている。従来、これらの検出方法は、放射性物質を標識物質として用いることにより行われてきた。しかしながら、放射性物質を用いた検出方法は、放射性物質が健康に有害な影響をおよぼす危険性があり、また測定が特殊な施設に限られてしまう。
【０００３】
これに対し、蛍光色素や酵素などの非放射性物質を標識物質として用いた検出方法の開発が行われている。しかしながら、非放射性物質を標識物質として用いた検出方法の検出感度は、放射性物質を標識物質として用いた検出方法に比べ不十分である。このため、非放射性物質の標識物質を集合体として用いることにより、検出方法の高感度化が行われている。そして、標識物質の集合体として、脂質二分子膜から成る小胞体であるリポソームが用いられている。
【０００４】
例えば、特許文献１では、被検物質に対する抗体を表面に修飾したリポソームの内水相に、多量の蛍光物質を封入することにより、抗原抗体反応の標識物質として用いる方法が開示されている。この方法は、補体を用いてリポソームを破壊した後、リポソーム内部から放出した蛍光物質を検出することにより、抗原を定量する方法である。この方法はマイクロウェルプレートのような液相における検出方法としては有用な方法である。しかしながら、ＤＮＡマイクロアレイのように表面が平坦な固相上に固定化した被検物質を検出する方法においては、リポソーム内部から放出した標識物質が拡散するため、被検物質の検出が正確に行われない。
【０００５】
一方、特許文献２においては、表面に抗体および蛍光物質を修飾したリポソームを第二の抗原抗体反応を用いたリンカーを介して抗原に標識する方法が開示されている。本法はリポソームを破壊せずに直接検出することが可能なため、スポット状に固定化した被検物質の検出が可能である。しかしながら、本法を用いた場合、固相担体においてリポソームが標識物質として安定に存在することが困難である。
【特許文献１】特開昭６１−２５０５５８号公報
【特許文献２】特開平８−２９４２２号公報
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、固相担体表面を親水性にすることにより、固相表面にリポソームを標識物質として安定に存在させることを可能とする被検物質の検出方法である。また、リポソーム表面の極性付与および糖質修飾により、固相担体上におけるリポソームの破壊を防ぐことを特徴とする被検物質の検出方法である。
【０００７】
本発明の方法によれば、リポソームのような流動性を持つ小胞体が固相担体上に安定に標識されるため、蛍光集合体を標識物質とする検出反応の高感度化が可能となる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、平坦な基板から成るプローブ担体において、リポソームを用いた蛍光集合体を安定に標識することが可能となり、検出の高感度化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明におけるリポソームを用いた蛍光集合体は、リン脂質、表面に蛍光物質および被検物質に特異的に結合する化合物を修飾したリン脂質、極性を有する脂質、糖質およびコレステロールを構成成分とすることにより、リポソームの安定性を高めるものである。また、固相担体表面を親水性にすることにより、リポソームを固相においても安定に存在することを可能にするものである。
【００１０】
リポソームの構成成分となる脂質の総濃度は脂質安定性の点から１０〜１００μｍｏｌ／ｍｌであることが望ましい。また、結果の再現性を高めるため、リポソームの平均粒子径は５０〜５００ｎｍの一枚膜構造であるであることが望ましい。蛍光物質および被検物質に特異的に結合する化合物を修飾したリン脂質の濃度は、結合効率およびリポソーム安定性の点から脂質の総濃度に対して０．１〜０．５％であることが望ましい。極性を有する脂質の濃度はリポソームの安定性の点から脂質の総濃度に対して５〜１０％であることが望ましい。コレステロールの濃度はリポソーム安定性向上の点から脂質の総濃度に対して３０〜５０％であることが望ましい。糖質の濃度はリポソーム安定性向上の点から脂質の総濃度に対して、１〜１０倍程度であることが望ましい。リポソーム表面に結合する蛍光物質の数はリポソーム安定性の点から１００〜１００００であることが望ましい。
【００１１】
基板上に固定する化合物の官能基は水酸基であることが望ましい。ただし、親水性を有する化合物であれば、この限りではない。
【００１２】
本発明の一形態につき、図１を用いて説明する。
【００１３】
基板１には、被検物質および被検物質に対して特異的に結合し得る物質との複合体が固定されている。この複合体は、基板１の固定された被検物質に特異的に結合し得る物質を反応させることにより得ることができる。被検物質としては、例えば核酸、ウイルスまたはタンパク質を用いることができる。被検物質が核酸の場合、複合体は相補配列間のハイブリダイゼーションである。被検物質が抗原の場合、複合体は免疫反応による抗原抗体複合体である。被検物質に特異的に結合し得る物質の末端にはリポソーム標識体と結合可能な架橋物質が標識されている。架橋物質標識後、蛍光修飾リポソーム標識体を添加することにより、複合体にリポソームから成る蛍光集合体を標識する。架橋物質はビオチンおよびアビジンが一般的であるが、本発明はこれによって限定されるものではない。蛍光物質は蛍光修飾リン脂質として市販されているダンシルアミノ酸、ピレン、フルオレセイン、ローダミンまたはそれらの誘導体を用いることができる。
【００１４】
リポソームの構成成分としては、リン脂質としてホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、などを挙げることができる。また、極性を与える脂質として、カチオン性を付与する場合はステアリルアミンを、アニオン性を付与する場合はホスファチジルグリセロールを用いることができる。抗体をリポソーム表面に修飾する場合は、リン脂質にホスファチジルエタノールアミンを用いて公知の方法で修飾することができる（文献Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ,１９９３,９，２４２−２５８）。糖質はグルコース、スクロースまたはトレハロースの一種または複数種を用いることができる。
【００１５】
基板表面を親水性にするためには、マレイミド基を修飾した基板上にヒドロキシアルカンチオールを反応させることにより、基板表面に親水基を有する化合物が固定され、可能となる。基板の基材としては、ガラスプレートを用いることができる。
【実施例】
【００１６】
図１に示す構成を有する蛍光標識法を用いて被検物質の検出を行った。
【００１７】
［実施例１］
（１）基板作成
プローブ担持担体の基材として、１インチ×３インチの合成石英ガラス基板を用いた。セミクリーンＫＧ（横浜油脂工業株式会社製）の１ｗｔ％水溶液に浸漬し、超音波を２分間照射した。さらに純水に浸漬して同様に超音波を２分間照射し、エアナイフで乾燥させた。さらにエキシマランプにてＵＶを２分間照射し、清浄面を有する基板を用意した。
【００１８】
次にポリプロピレン製容器に入れたアミノシランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ−９０３；信越化学工業（株）社製）と洗浄済みのガラス基板をポリカーボネート製チャンバに密閉封入し、１０分間ダイアフラムポンプでチャンバ内の空気をシランカップリング剤蒸気と置換した後、常温で３０分間シランカップリング剤蒸気に該ガラス基板を暴露した。次に、常圧クリーンオーブン内で１２０℃、１時間ベーキングを行い、純水で未反応のシランカップリング剤を洗浄除去して、アミノシランカップリング剤処理された基板を得た。
【００１９】
次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（Ｄｏｊｉｎ社製；以後、ＥＭＣＳと略す）を０．０１ｗｔ％になるように１,４−ジオキサンに溶解させた。次にそのＥＭＣＳジオキサン溶液に上記アミノシランカップリング剤処理された基板を３０分間浸漬して、基板表面のアミノ基とＥＭＣＳを反応させた。続いて、ジオキサンで未反応のＥＭＣＳを除去洗浄し、ドラフト内でジオキサンをエアー除去して、表面にマレイミド基を導入した基板を得た。
【００２０】
（２）プローブＤＮＡの合成
本実施例においてプローブは、検出しようとする標的核酸の全部または一部に対して相補的な塩基配列を有し、該標的核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズ（交雑反応）することで標的核酸を検出する１本鎖核酸を用いた。ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号１および、配列番号１の一本鎖核酸を合成した。なお配列番号１の一本鎖ＤＮＡ末端にはＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いる事によってメルカプト基を導入した。続いて通常の脱保護を行い、ＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験に用いた
５’ＨＳ−ＣＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣ  ３’（配列番号：１）。
【００２１】
（３）蛍光修飾リポソームの調製
ジパルミトイルホスファチジルコリン(１５．７６μｍｏｌ)、ステアリルアミン(４μｍｏｌ)、コレステロール(２０μｍｏｌ)、ビオチン修飾ホスファチジルエタノールアミン(０．０４μｍｏｌ)、ローダミン修飾ホスファチジルエタノールアミン(０．２μｍｏｌ)を溶解したクロロホルム溶液を１００ｍｌのナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて窒素雰囲気および４０℃の条件下において２時間減圧乾燥することにより、ナス型フラスコの内壁面に脂質薄膜を形成した。次に、スクロースを５０ｍＭ溶解したＭＯＰＳ緩衝塩溶液(１０ｍＭ ＭＯＰＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２)１ｍｌをナス型フラスコに添加した後、ボルテックスミキサーを用いて、１０分間振とうすることにより、多重層リポソームを形成した。この溶液を、ＡＶＥＳＴＩＮ社製リポソーム調整器ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ−Ｂａｓｉｃを用いて、ポアサイズ５０ｎｍのポリカーボネートフィルターに通過させることにより、１枚膜リポソームを調製した。調製後、４℃、１５０００ｇの条件で１０分間遠心分離を行うことにより、リポソームとリポソーム未形成の脂質を分離した。
【００２２】
リポソームの粒子径は光散乱法を用いて測定した。測定装置はＺｅｔａｓｉｚｅｒ３０００（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ.製）を用いた。調製直後におけるリポソームの平均粒子径は、糖の有無に関わらず約８０ｎｍであった。また、４℃で保存した場合、リポソームの平均粒子径は調製１週間後においてもほとんど変化しなかった。粒子径と既報（文献Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ, ９, １９９３，２４２−２５８)による脂質の表面積より、本実施例で調製したリポソームは、表面に約２０００分子の蛍光物質が結合していることが明らかとなった。
【００２３】
（４）プローブの固定および基板表面修飾
上記(２)で合成したＤＮＡ断片（配列番号：１）をグリセリン１５重量％、尿素１５重量％、ジエチレングリコール９重量％、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥ１００;川研ファインケミカル（株）社製）０．０１重量％を含む水溶液に溶解した。ＤＮＡ断片の濃度は０．１ｎＭ〜１０μＭとなるように調製した。
【００２４】
これらのＤＮＡ断片を含む水溶液それぞれを市販のインクジェットプリンター（キヤノン（株）製、型番ＢＪＦ−８５０）を改造した装置で、上記(１)の方法によって作製したスライドガラスに別々にスポッティングした。この際、１５倍のルーペによる観測ではサテライトスポット（液体が固相表面に着弾したときの飛沫に由来するスポット）は観測されなかった。
【００２５】
プローブを含む溶液をインクジェット法にてスポッティングしたスライドガラスを室温で３０分間放置した後、１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝溶液(ｐＨ７．０)で洗浄した。さらに純水で洗浄後、スピンドライを行うことにより、スライドガラスを乾燥した。
【００２６】
次に、スライドガラスを１０μＭの６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール溶液に室温で３０分間浸漬し、スライドガラス表面に６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオールを固定化した。
【００２７】
（５）ハイブリダイゼーション
基板に結合させたＤＮＡと相補的な配列を持つ、２５ｍｅｒのビオチン標識ＤＮＡをシグマアルドリッチジャパン株式会社に依頼して合成した。ビオチン標識ＤＮＡを１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に最終濃度１μＭとなるように溶解し、得られた溶液２ｍｌを基板とともにハイブリパックに封入し、ハイブリダイゼーション反応を４５℃で２時間行った。その後、基板を１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液を用いて、未反応物質を洗い流した。
【００２８】
（６）リポソーム標識
ハイブリダイゼーション後、１μＭのストレプトアビジン溶液２ｍｌを基板とともにハイブリパックに封入し、室温で３０分反応させることにより、ハイブリッド形成したビオチン修飾ＤＮＡにストレプトアビジンを結合した。その後、基板を１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて未結合のストレプトアビジンを洗い流した。
【００２９】
次に、１μＭに希釈した上記(３)で調製した蛍光修飾リポソーム溶液２ｍｌを基板とともにハイブリパックに封入し、室温で３０分反応させることにより、プローブ担体にリポソーム蛍光集合体を標識した。その後、基板を１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて未結合の蛍光修飾リポソームを洗い流した。
【００３０】
リポソーム標識体との輝度比較のため、１μＭのローダミン修飾ストレプトアビジン溶液２ｍｌを基板とともにハイブリパックに封入し、室温で３０分反応させることにより、ハイブリッド形成したビオチン修飾ＤＮＡにローダミン修飾ストレプトアビジンを結合した。
【００３１】
（７）蛍光測定
リポソーム標識後のプローブ担体を蛍光検出装置(Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ)を用いて蛍光測定を行った（蛍光測定波長５３２ｎｍ）。
【００３２】
標識体結合時における蛍光強度をシグナル強度、標識体未結合時における蛍光強度をブランク強度と定義した。リポソームを標識体として用いた場合は、リポソーム標識後に非イオン性の界面活性剤（本実施例では０．０１重量％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用）を用いてリポソームを崩壊した後の蛍光強度をブランク強度とした。そして、ブランク強度に対して３倍のシグナル強度が得られるプローブ担体濃度を検出下限とした。
【００３３】
ローダミン修飾ストレプトアビジンを標識した場合におけるプローブＤＮＡの検出下限は２５ｎＭであった。これに対し、ローダミン修飾リポソームを標識した場合におけるプローブＤＮＡの検出下限は５ｎＭとなり、リポソームを標識体として用いることにより、検出感度が５倍向上したことが明らかとなった。
【００３４】
次に、ブランク強度の比較を行った。リポソーム未標識のブランク強度を１とした場合、糖修飾リポソームおよび基板表面に親水性化合物を結合した場合のブランク強度は１．８、糖未修飾のリポソームを用いた場合のブランク強度は３．８、基板表面に親水性化合物を結合しなかった場合のブランク強度は８．５、糖未修飾および基板表面に親水性化合物を結合しなかった場合のブランク強度は１１．７となり、糖修飾および基板表面への親水性化合物結合により、リポソームが基板上に安定に存在することが明らかとなった。
【００３５】
［実施例２］
（１）抗原抗体複合体の形成
ウサギＩｇＧ試料溶液(分子量約１５０．０００) １μｌを実施例１(１)で作成した合成石英ガラス基板上に滴下した。滴下した抗原の濃度は０．１ｎＭ〜１０μＭとなるように調製した。室温で基板を乾燥後、１０μＭの６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール溶液に室温で３０分間浸漬することにより、基板表面に６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオールを固定化した。
【００３６】
次に１０μＭのビオチン結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体溶液１μｌをウサギＩｇＧのスポット上に滴下し、３７℃で１時間インキュベートを行った。その後、基板を１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて未結合の抗体を洗い流した。
【００３７】
（２）リポソーム標識
抗原抗体反応後、１０μＭのストレプトアビジン溶液１μｌを抗原抗体複合体のスポット上に滴下し、室温で３０分反応させることにより、抗原抗体複合体にストレプトアビジンを結合した。その後、基板を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて未結合のストレプトアビジンを洗い流した。
【００３８】
次に、１０μＭに希釈した実施例１(３)で調製した蛍光修飾リポソーム溶液１μｌを抗原抗体複合体のスポット上に滴下し、室温で３０分反応させることにより、抗原抗体複合体にリポソーム蛍光集合体を標識した。その後、基板を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて未結合の蛍光修飾リポソームを洗い流した。
【００３９】
リポソーム標識体との輝度比較のため、１０μＭのローダミン修飾ストレプトアビジン溶液１μｌを抗原抗体複合体のスポット上に滴下し、室温で３０分反応させることにより、抗原抗体複合体にローダミン修飾ストレプトアビジンを結合した。
【００４０】
（３）蛍光測定
リポソーム標識後の抗原抗体複合体を蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）を用いて蛍光測定を行った（蛍光測定波長５３２ｎｍ）。
【００４１】
実施例１と同様に、標識体結合時における蛍光強度をシグナル強度、標識体未結合時における蛍光強度をブランク強度と定義した。リポソームを標識体として用いた場合は、リポソーム標識後に非イオン性の界面活性剤(本実施例では０．０１重量％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用)を用いてリポソームを崩壊した後の蛍光強度をブランク強度とした。そして、ブランク強度に対して３倍のシグナル強度が得られるプローブ担体濃度を検出下限とした。
【００４２】
ローダミン修飾ストレプトアビジンを標識した場合における抗原の検出下限は５０ｎＭであった。これに対し、ローダミン修飾リポソームを標識した場合における抗原の検出下限は２５ｎＭとなり、リポソームを標識体として用いることにより、検出感度が２倍向上したことが明らかとなった。
【００４３】
次に、ブランク強度の比較を行った。リポソーム未標識のブランク強度を１とした場合、糖修飾リポソームおよび基板表面に親水性化合物を結合した場合のブランク強度は１．４、糖未修飾のリポソームを用いた場合のブランク強度は３．２、基板表面に親水性化合物を結合しなかった場合のブランク強度は６．７、糖未修飾および基板表面に親水性化合物を結合しなかった場合のブランク強度は１０．８となり、糖修飾および基板表面への親水性化合物結合により、リポソームが基板上に安定に存在することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明のリポソームを蛍光標識体として用いた、遺伝子検出法の概略図である。
【符号の説明】
【００４５】
１  基板
２  プローブ物質
３  ターゲット物質
４  ビオチン
５  ストレプトアビジン
６  リポソーム
７  糖質
８  蛍光物質
９  親水性化合物
【図１】
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【配列表】
2009244101000001.app