(57)【要約】【課題】正極または負極に酵素とともに固定化する電子メディエーターの濃度の最適化により、電流密度あるいは出力密度の大幅な向上を図ることができるバイオ燃料電池およびその製造方法を提供する。【解決手段】正極２と負極１とが電解質層３を介して対向した構造を有し、正極２および負極１のうちの少なくとも一方が、少なくとも一種の酵素および少なくとも一種の電子メディエーターが固定化された電極からなるバイオ燃料電池において、電極に固定化する電子メディエーターの濃度を、溶液中での測定により求められる電子メディエーターの酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上とする。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、
上記正極および上記負極のうちの少なくとも一方が、少なくとも一種の酵素および少なくとも一種の電子メディエーターが固定化された電極からなり、
上記電極に固定化された上記電子メディエーターの濃度が、溶液中での測定により求められる上記電子メディエーターの上記酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上であるバイオ燃料電池。
【請求項２】
上記酵素がジアホラーゼ、上記電子メディエーターがキノン系電子メディエーター、上記電極に対する上記酵素および上記電子メディエーターの固定化方法がポリイオンコンプレックス法である請求項１記載のバイオ燃料電池。
【請求項３】
上記電子メディエーターがＶＫ3 、上記電極に固定化された上記電子メディエーターの濃度が４μＭ以上である請求項２記載のバイオ燃料電池。
【請求項４】
上記電子メディエーターがＡＣＮＱ、上記電極に固定化された上記電子メディエーターの濃度が２０μＭ以上である請求項２記載のバイオ燃料電池。
【請求項５】
上記電子メディエーターがＡＮＱ、上記電極に固定化された上記電子メディエーターの濃度が３６０μＭ以上である請求項２記載のバイオ燃料電池。
【請求項６】
上記電子メディエーターがＶＫ3 、上記電極に固定化された上記電子メディエーターの濃度が２８ｍＭ以上である請求項２記載のバイオ燃料電池。
【請求項７】
上記負極の上記電極に固定化された上記酵素が、単糖類の酸化を促進し分解する酸化酵素を含む請求項２記載のバイオ燃料電池。
【請求項８】
上記負極の上記電極に固定化された酵素が、上記単糖類の酸化に伴って還元された補酵素を酸化体に戻すとともに上記電子メディエーターを介して電子を上記負極に渡す補酵素酸化酵素を含む請求項７記載のバイオ燃料電池。
【請求項９】
上記単糖類がグルコース、上記酸化酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである請求項７記載のバイオ燃料電池。
【請求項１０】
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記正極および上記負極のうちの少なくとも一方が、少なくとも一種の酵素および少なくとも一種の電子メディエーターが固定化された電極からなるバイオ燃料電池を製造する場合に、上記電極に固定化された上記電子メディエーターの濃度が、溶液中での測定により求められる上記電子メディエーターの上記酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上になるようにするバイオ燃料電池の製造方法。
【請求項１１】
少なくとも一つのバイオ燃料電池を有し、
上記バイオ燃料電池が、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、
上記正極および上記負極のうちの少なくとも一方が、少なくとも一種の酵素および少なくとも一種の電子メディエーターが固定化された電極からなり、
上記電極に固定化された上記電子メディエーターの濃度が、溶液中での測定により求められる上記電子メディエーターの上記酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上であるものである電子機器。
【請求項１２】
少なくとも一種の酵素および少なくとも一種の電子メディエーターが固定化された電極からなり、
上記電極に固定化された上記電子メディエーターの濃度が、溶液中での測定により求められる上記電子メディエーターの上記酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上である酵素固定化電極。
【請求項１３】
少なくとも一種の酵素および少なくとも一種の電子メディエーターが固定化された電極を製造する場合に、上記電極に固定化された上記電子メディエーターの濃度が、溶液中での測定により求められる上記電子メディエーターの上記酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上になるようにする酵素固定化電極の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、バイオ燃料電池およびその製造方法ならびにこのバイオ燃料電池を電源に用いた電子機器ならびに酵素固定化電極およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ燃料電池は、触媒として酵素または微生物を用いることにより、糖や有機酸などの再生可能なエネルギー源、すなわち燃料の酸化と酸素（Ｏ2 ）の還元とを組み合わせて穏やかな条件（常温、中性のｐＨ）で発電することができる（例えば、非特許文献１〜１４参照。）。バイオ燃料電池は、リチウムイオン電池やダイレクトメタノール燃料電池などの現在の電池に比べて、より高エネルギー密度でより安全な次世代のエネルギーデバイスとして期待されている。医療用デバイス用の移植可能な電源として提案された小型のバイオ燃料電池の出力密度（ｐｏｗｅｒ  ｄｅｎｓｉｔｙ）は、機械的攪拌あるいはポンプのような燃料および酸素の対流システムを用いてもサブｍＷ／ｃｍ2 のオーダーであり、単一のバイオ燃料電池当たりの出力は数μＷに過ぎない（非特許文献１、１０参照。）。対流システムを用いない場合には、燃料および酸素の物質輸送速度の限界と電極上に固定化された触媒層における物質透過障壁とにより、出力密度は数桁程度減少するはずである（非特許文献１５参照。）。
【０００３】
携帯電子機器に必要な電力は、機器および動作条件にもよるが、少なくとも１００ｍＷであり、これは例えば携帯音楽プレイヤーなどの動作に十分である。そのような出力を得るために、本発明者らは、電子メディエーターが電極と酵素との間で電子を受け渡す電子メディエーター型バイオ燃料電池を提案している（例えば、特許文献１〜１２参照。）。
【０００４】
【非特許文献１】Heller,A.Miniature biofuel cells.Phys.Chem.Chem.Phys.6,209-216(2004)
【非特許文献２】Barton,S.C.,Gallaway,J. ＆ Atanassov,P.Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices.Chem.Rev.104,4867-4886(2004)
【非特許文献３】Palmore,G.T.R.＆ Whitesides,G.M.Microbial and enzymatic biofuel cells.ACS Symp.Ser.556,271-290(1994)
【非特許文献４】Kano,K.,Ikeda,T.Bioelectrocatalysis,Powerful means of connecting electrochemistry to biochemistry and biotechnology.Electrochemistry 71(2),86-99(2003)
【非特許文献５】Katz,E.,＆ Willner,I.A biofuel cell with electrochemically switchable and tunable power output.J.Am.Chem.Soc.125,6803-6813(2003)
【非特許文献６】Kamitaka,Y.,Tsujimura,S.,Setoyama,N.,Kajino,T., ＆ Kano,K.Fructose/dioxygen biofuel cell based on direct electron transfer-type bioelectrocatalysis.Phys.Chem.Chem.Phys.9(15),1793-1801(2007)
【非特許文献７】Palmore,G.T.R.,Bertschy,H.,Bergens,S.H. ＆ Whitesides,G.M.Amethanol/dioxygen biofuel cell that uses NAD(+)-dependent dehydrogenases as catalysts:Application of an electro-enzymatic method to regenerate nicotinamide adenine dinucleotide at low overpotentials,J.Electroanal.Chem.443,155-161(1998)
【非特許文献８】Topcagic,S.,＆ Minteer,S.D.Development of a membraneless ethanol/oxygen biofuel cell.Electrochimica Acta 51,2168-2172(2007)
【非特許文献９】Tsujimura,S., Fujita,M.,Tatsumi,H.,Kano,K.＆ Ikeda,T.Bioelectrocatalysis-based dihydrogen/dioxygen fuel cell operating at physiological pH.Phys.Chem.Chem.Phys.3,1331-1335(2001)
【非特許文献１０】Mano,N.,Mao,F.＆Heller,A.Characteristics of a miniature compartment-less grucose-O2 biofuel cell and its operation in a living plant.J.Am.Chem.Soc.125,6588-6594(2003)
【非特許文献１１】Togo,M.,Takamura,A.,Asai,T.,Kaji,H. ＆ Nishizawa,M.An enzyme-based microfluidic biofuel cell using vitamin K3-mediated glucose oxidation,Electrochimica Acta 52,4669-4674(2007)
【非特許文献１２】Chaudhuri,S.K.＆ Lovley,D.R.Electricity generation by direct oxidation of glucose in mediatorless microbial fuel cells,Nature Biotech.21(10),1229-1232(2003)
【非特許文献１３】Logan,B.E.,Aelterman,P.,Hamelers,B.,Rozendal,R.,Schroeder,U.,Keller,J.,Freguia,S.,Verstraete,W. ＆ Rabaey,K. Microbial fuel cells:Methodology and technology.Environmental Science  ＆ Technology 9(3),5181-5192(2006)
【非特許文献１４】Bullen,R.A.,Arnot,T.C.,Lakeman,J.B. ＆ Walsh,F.C. Biofuelcells and their development.Biosens.Bioelectron.21,2015-2045(2006)
【非特許文献１５】Sato,A.,Kano,K. ＆ Ikeda,T.Diaphorase/naphtoquinone derivative-modified electrode as an anode for diffusion-controlled oxidation of NADH in electrochemical cells.Chem.Lett.32,880-881(2003)
【特許文献１】特開２００４−７１５５９号公報
【特許文献２】特開２００５−１３２１０号公報
【特許文献３】特開２００５−３１０６１３号公報
【特許文献４】特開２００６−２４５５５号公報
【特許文献５】特開２００６−４９２１５号公報
【特許文献６】特開２００６−９３０９０号公報
【特許文献７】特開２００６−１２７９５７号公報
【特許文献８】特開２００６−１５６３５４号公報
【特許文献９】特開２００７−１２２８１号公報
【特許文献１０】特開２００７−３５４３７号公報
【特許文献１１】特開２００７−８７６２７号公報
【特許文献１２】特開２００７−１８８８１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述の電子メディエーター型バイオ燃料電池においては、より一層の電流密度の向上、あるいは、出力密度の向上が望まれていた。
そこで、この発明が解決しようとする課題は、正極または負極に酵素とともに固定化する電子メディエーターの濃度の最適化により、電流密度あるいは出力密度の大幅な向上を図ることができるバイオ燃料電池およびその製造方法ならびにこのバイオ燃料電池の正極または負極に用いて好適な酵素固定化電極およびその製造方法を提供することである。
この発明が解決しようとする他の課題は、上記のような優れたバイオ燃料電池を用いた電子機器を提供することである。
上記課題および他の課題は本明細書の記述によって明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、この発明を案出するに至った。
本発明者らの知る限り、これまで、バイオ燃料電池の正極または負極において酵素とともに固定化する電子メディエーターを高濃度化し、かつ、固定化層内で拡散で移動しえて、かつ、酵素活性を高く維持する方法に関してはほとんど検討されていなかったが、本発明者らの研究によれば、これらがバイオ燃料電池の電流密度およびその維持率に大きな影響を与えることが分かった。そして、電極上に固定化された触媒層中の電子メディエーターの濃度の最適化を図るべく実験的および理論的に鋭意検討を行った結果、その電子メディエーターの濃度を、溶液中での測定により求められる電子メディエーターの酵素に対するミカエリス定数Ｋm （電子メディエーターを基質とする酵素反応のミカエリス定数Ｋm ）の１０倍以上とすることが有効であるという結論に至り、この発明を案出するに至った。このように電極上に固定化された触媒層中の電子メディエーターの濃度をＫm の１０倍以上とすることにより、電流値はほぼ最大電流値に達する。
【０００７】
すなわち、上記課題を解決するために、第１の発明は、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、
上記正極および上記負極のうちの少なくとも一方が、少なくとも一種の酵素および少なくとも一種の電子メディエーターが固定化された電極からなり、
上記電極に固定化された上記電子メディエーターの濃度が、溶液中での測定により求められる上記電子メディエーターの上記酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上であるバイオ燃料電池である。
このバイオ燃料電池においては、電子メディエーターが固定化層内をスムーズに拡散で移動し、かつ、電子メディエーターとともに固定化された酵素の活性も高く維持することができる。
【０００８】
第２の発明は、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記正極および上記負極のうちの少なくとも一方が、少なくとも一種の酵素および少なくとも一種の電子メディエーターが固定化された電極からなるバイオ燃料電池を製造する場合に、上記電極に固定化される上記電子メディエーターの濃度が、溶液中での測定により求められる上記電子メディエーターの上記酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上になるようにするバイオ燃料電池の製造方法である。
【０００９】
第３の発明は、
少なくとも一つのバイオ燃料電池を有し、
上記バイオ燃料電池が、
正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、
上記正極および上記負極のうちの少なくとも一方が、少なくとも一種の酵素および少なくとも一種の電子メディエーターが固定化された電極からなり、
上記電極に固定化された上記電子メディエーターの濃度が、溶液中での測定により求められる上記電子メディエーターの上記酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上であるものである電子機器である。
【００１０】
正極または負極の電極の材料としては、一般的には炭素多孔質材料が用いられ、具体的には、例えば、多孔質カーボン、カーボンペレット、カーボンフェルト、カーボンファイバー、カーボンペーパーなどが多く用いられるが、取り分け、カーボンフェルトは表面積が特に大きい点、および、取り扱いが容易である点、で好ましい。正極または負極の電極の材料としては炭素多孔質材料以外の材料を用いてもよい。
【００１１】
正極および負極の電極が炭素多孔質電極である場合、正極の電極と負極の電極との厚さおよび表面積（窒素（Ｎ2 ）ガス吸着表面積）の比には最適範囲がある。この比は好適には１：１〜３、より好適には１：２〜２．５である。一例を挙げると、正極の電極と負極の電極との厚さの比は１：２．３３、正極の電極と負極の電極との表面積の比は１：２である。また、特に負極の電極の体積（空隙を含む）と負極の酵素／電子メディエーター固定化層の体積との比にも最適範囲があり、この比は５０〜３０：１である。一例を挙げると、この比は４０．３：１である。
【００１２】
正極および負極の電極に固定化される酵素は、種々のものであってよく、使用する燃料などに応じて適宜選ばれる。
負極の電極に固定化される酵素は、例えば、燃料としてグルコースのような単糖類を用いる場合には、単糖類の酸化を促進し分解する酸化酵素を含み、通常はこれに加えて酸化酵素によって還元される補酵素を酸化体に戻す補酵素酸化酵素を含む。この補酵素酸化酵素の作用により、補酵素が酸化体に戻るときに電子が生成され、補酵素酸化酵素から電子メディエーターを介して電極に電子が渡される。酸化酵素としては例えばＮＡＤ+ 依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、補酵素としては例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+ ）が、補酵素酸化酵素としては例えばジアホラーゼ（ＤＩ）が用いられる。
【００１３】
燃料として多糖類（広義の多糖類であり、加水分解によって２分子以上の単糖を生じる全ての炭水化物を指し、二糖、三糖、四糖などのオリゴ糖を含む）を用いる場合には、好適には、上記の酸化酵素、補酵素酸化酵素、補酵素および電子メディエーターに加えて、多糖類の加水分解などの分解を促進し、グルコースなどの単糖類を生成する分解酵素も固定化される。多糖類としては、具体的には、例えば、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、マルトース、スクロース、ラクトースなどが挙げられる。これらは単糖類が二つ以上結合したものであり、いずれの多糖類においても結合単位の単糖類としてグルコースが含まれている。なお、アミロースとアミロペクチンとはデンプンに含まれる成分であり、デンプンはアミロースとアミロペクチンとの混合物である。多糖類の分解酵素としてグルコアミラーゼを用い、単糖類を分解する酸化酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた場合には、グルコアミラーゼによりグルコースにまで分解することができる多糖類、例えばデンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、マルトースのいずれかを含むものであれば、これを燃料として発電することが可能となる。なお、グルコアミラーゼはデンプンなどのα−グルカンを加水分解しグルコースを生成する分解酵素であり、グルコースデヒドロゲナーゼはβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化する酸化酵素である。好適には、多糖類を分解する分解酵素も負極上に固定化される構成とし、最終的に燃料となる多糖類も負極上に固定化される構成とする。
【００１４】
また、デンプンを燃料とする場合には、デンプンを糊化してゲル状の固形化燃料としたものを用いることもできる。この場合、好適には、糊化したデンプンを酵素などが固定化された負極に接触させ、あるいは負極上に酵素などとともに固定化する方法をとることができる。このような電極を用いると、負極表面のデンプン濃度を、溶液中に溶解したデンプンを用いた場合よりも高い状態に保持することができ、酵素による分解反応がより速くなり、出力が向上するとともに、燃料の取り扱いが溶液の場合よりも容易で、燃料供給システムを簡素化することができ、しかもバイオ燃料電池を天地無用とする必要がなくなるため、例えばモバイル機器に用いたときに非常に有利である。
【００１５】
メタノールを燃料とする場合には、触媒としてメタノールに作用してホルムアルデヒドに酸化するアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）と、ホルムアルデヒドに作用して蟻酸に酸化するホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦａｌＤＨ）と、蟻酸に作用してＣＯ2 に酸化する蟻酸デヒドロゲナーゼ（ＦａｔｅＤＨ）とにより三段階の酸化プロセスを経て、ＣＯ2 まで分解される。すなわち、メタノール１分子当たり三つのＮＡＤＨが生成されることになり、六つの電子が生成される。
【００１６】
エタノールを燃料とする場合には、触媒としてエタノールに作用してアセトアルデヒドに酸化するアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）と、アセトアルデヒドに作用して酢酸に酸化するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｌＤＨ）とにより、二段階の酸化プロセスを経て、酢酸まで分解される。すなわち、エタノール１分子につき二段階の酸化反応により合計４電子が生成されることになる。
なお、エタノールは、メタノールと同様にＣＯ2 まで分解する方法をとることもできる。この場合は、アセトアルデヒドに対してアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡａｌＤＨ）を作用させてアセチルＣｏＡとした後、ＴＣＡ回路に渡される。ＴＣＡ回路でさらに電子が生成される。
【００１７】
負極の電極に酵素とともに固定化される電子メディエーターとしては基本的にはどのようなものを用いてもよいが、好適には、キノン系電子メディエーター、より具体的には、キノン骨格を有する化合物、取り分け、ナフトキノン骨格を有する化合物が用いられる。このナフトキノン骨格を有する化合物としては各種のナフトキノン誘導体を用いることが可能であるが、具体的には、例えば、２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）、２−アミノ−３−メチル−１，４−ナフトキノン（ＡＭＮＱ）、２−メチル−１，４−ナフトキノン（ＶＫ3 ）、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）などが用いられる。キノン骨格を有する化合物としては、ナフトキノン骨格を有する化合物以外に、例えば、アントラキノンやその誘導体を用いることもできる。電子メディエーターには、必要に応じて、キノン骨格を有する化合物以外に、電子メディエーターとして働く一種または二種以上の他の化合物を含ませてもよい。
【００１８】
電子メディエーターとして２−メチル−１，４−ナフトキノン（ＶＫ3 ）を用いる場合には、好適には、電極に固定化する電子メディエーターの濃度を４μＭ以上とする。また、電子メディエーターとして２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）を用いる場合には、好適には、電極に固定化する電子メディエーターの濃度を２０μＭ以上とする。また、電子メディエーターとして２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）を用いる場合には、好適には、電極に固定化する電子メディエーターの濃度を３６０μＭ以上とする。
【００１９】
正極の電極に固定化される酵素は、典型的には酸素還元酵素を含む。この酸素還元酵素としては、例えば、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどを用いることができる。正極の電極に酵素に加えて固定化される電子メディエーターとしては、例えば、ヘキサシアノ鉄酸カリウム（Ｋ3 ［Ｆｅ（ＣＮ）6 ］）、フェリシアン化カリウム、オクタシアノタングステン酸カリウムなどを用いる。
【００２０】
酵素、補酵素、電子メディエーターなどを負極および正極の電極に固定化するための固定化材としては、各種のものを用いることができるが、好適には、例えば、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）をはじめとしたポリカチオンまたはその塩とポリアクリル酸（例えば、ポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＡｃＮａ））をはじめとしたポリアニオンまたはその塩とを用いて形成されるポリイオンコンプレックスや、グルタルアルデヒド（ＧＡ）とポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）とを組み合わせたものを用いてもよいし、他のポリマーを用いてもよい。
【００２１】
プロトン伝導体（セパレータ）としては種々のものを用いることができ、必要に応じて選択されるが、具体的には、例えば、セロハン、不織布、パーフルオロカーボンスルホン酸（ＰＦＳ）系の樹脂膜、トリフルオロスチレン誘導体の共重合膜、リン酸を含浸させたポリベンズイミダゾール膜、芳香族ポリエーテルケトンスルホン酸膜、ＰＳＳＡ−ＰＶＡ（ポリスチレンスルホン酸ポリビニルアルコール共重合体）や、ＰＳＳＡ−ＥＶＯＨ（ポリスチレンスルホン酸エチレンビニルアルコール共重合体）、含フッ素カーボンスルホン酸基を有するイオン交換樹脂（ナフィオン（商品名、米国デュポン社）など）などからなるものが挙げられる。
【００２２】
例えば、プロトン伝導体（セパレータ）としてセロハンを用い、正極はカーボンなどの多孔質材料に酵素および電子メディエーターを固定化したものにより構成して大気から酸素を取り込むことができるようにし、電極内への酸素の供給を向上させ、電流値の大幅な向上を達成している（特許文献６参照。）。
【００２３】
プロトン伝導体として緩衝物質（緩衝液）を含む電解質を用いる場合には、高出力動作時において、プロトンを介する酵素反応により、プロトンの増減が電極内部または酵素の固定化層内で起きても、十分な緩衝作用を得ることができ、至適ｐＨからのｐＨのずれを十分に小さく抑えることができ、酵素が本来持っている能力を十分に発揮することができるようにするために、電解質に含まれる緩衝物質の濃度を０．２Ｍ以上２．５Ｍ以下にすることが有効であり、好適には０．２Ｍ以上２Ｍ以下、より好適には０．４Ｍ以上２Ｍ以下、さらに好適には０．８Ｍ以上１．２Ｍ以下とする。緩衝物質は、一般的には、ｐＫa が５以上９以下のものであれば、どのようなものを用いてもよいが、具体例を挙げると、リン酸二水素イオン（Ｈ2 ＰＯ4 - ）、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（略称トリス）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、カコジル酸、炭酸（Ｈ2 ＣＯ3 ）、クエン酸水素イオン、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（略称トリシン）、グリシルグリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（略称ビシン）などである。リン酸二水素イオン（Ｈ2 ＰＯ4 - ）を生成する物質は、例えば、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2 ＰＯ4 ）やリン酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）などである。緩衝物質としては、イミダゾール環を含む化合物も好ましい。このイミダゾール環を含む化合物は、具体的には、イミダゾール、トリアゾール、ピリジン誘導体、ビピリジン誘導体、イミダゾール誘導体（ヒスチジン、１−メチルイミダゾール、２−メチルイミダゾール、４−メチルイミダゾール、２−エチルイミダゾール、イミダゾール−２−カルボン酸エチル、イミダゾール−２−カルボキシアルデヒド、イミダゾール−４−カルボン酸、イミダゾール−４，５−ジカルボン酸、イミダゾール−１−イル−酢酸、２−アセチルベンズイミダゾール、１−アセチルイミダゾール、Ｎ−アセチルイミダゾール、２−アミノベンズイミダゾール、Ｎ−（３−アミノプロピル) イミダゾール、５−アミノ−２−（トリフルオロメチル) ベンズイミダゾール、４−アザベンズイミダゾール、４−アザ−２−メルカプトベンズイミダゾール、ベンズイミダゾール、１−ベンジルイミダゾール、１−ブチルイミダゾール）などである。緩衝物質としては、２−アミノエタノール、トリエタノールアミン、ＴＥＳ（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid）、ＢＥＳ（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic
acid）などを用いてもよい。緩衝物質を含む電解質のｐＨは、好適には７付近であるが、一般的には１〜１４のいずれであってもよい。必要に応じて、これらの緩衝物質も、上記の酵素や電子メディエーターの固定化層に固定化してもよい。
【００２４】
このバイオ燃料電池は、およそ電力が必要なもの全てに用いることができ、大きさも問わないが、例えば、電子機器、移動体（自動車、二輪車、航空機、ロケット、宇宙船など）、動力装置、建設機械、工作機械、発電システム、コージェネレーションシステムなどに用いることができ、用途などによって出力、大きさ、形状、燃料の種類などが決められる。
電子機器は、基本的にはどのようなものであってもよく、携帯型のものと据え置き型のものとの双方を含むが、具体例を挙げると、携帯電話、モバイル機器、ロボット、パーソナルコンピュータ、ゲーム機器、車載機器、家庭電気製品、工業製品などである。
【００２５】
第４の発明は、
少なくとも一種の酵素および少なくとも一種の電子メディエーターが固定化された電極からなり、
上記電極に固定化された上記電子メディエーターの濃度が、溶液中での測定により求められる上記電子メディエーターの上記酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上である酵素固定化電極である。
【００２６】
第５の発明は、
少なくとも一種の酵素および少なくとも一種の電子メディエーターが固定化された電極を製造する場合に、上記電極に固定化される上記電子メディエーターの濃度が、溶液中での測定により求められる上記電子メディエーターの上記酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上になるようにする酵素固定化電極の製造方法である。
第４および第５の発明においては、上記以外のことは、その性質に反しない限り、第１および第２の発明に関連して説明したことが成立する。
【００２７】
上述のように構成されたこの発明においては、正極または負極の電極に酵素とともに固定化する電子メディエーターの濃度が、溶液中での測定により求められる電子メディエーターの酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上と十分に高いことにより、電子メディエーターは、固定化層内に止まりながら固定化層内を拡散により容易に移動することができ、電子メディエーターを介した酵素と電極との間の電子の受け渡し反応を迅速に行うことができる。
【発明の効果】
【００２８】
この発明によれば、正極または負極に酵素とともに固定化する電子メディエーターの濃度の最適化により、電流密度あるいは出力密度の大幅な向上を図ることができるバイオ燃料電池を実現することができる。そして、この優れたバイオ燃料電池を電源に用いることにより、高性能の電子機器などを実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、この発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。
図１はこの発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池を模式的に示す。このバイオ燃料電池では、燃料としてグルコースを用いるものとする。図２は、このバイオ燃料電池の負極および正極の構成の詳細ならびにこの負極および正極における電子の受け渡し反応を模式的に示す。
【００３０】
図１に示すように、このバイオ燃料電池は、負極１と正極２とがプロトンのみ伝導する電解質層３を介して対向した構造を有する。負極１は、燃料として供給されたグルコースを酵素により分解して電子を取り出すとともにプロトン（Ｈ+ ）を発生する。正極２は、負極１から電解質層３を通って輸送されたプロトンと負極１から外部回路を通って送られた電子と例えば空気中の酸素（Ｏ2 ）とにより水を生成する。
【００３１】
負極１は、例えば炭素多孔質材料などからなる電極１１（図２参照）上に、グルコースの分解に関与する酵素と、グルコースの分解プロセスにおける酸化反応に伴って還元体が生成される補酵素（例えば、ＮＡＤ+ 、ＮＡＤＰ+ など）と、補酵素の還元体（例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨなど）を酸化する補酵素酸化酵素（例えば、ジアホラーゼ（ＤＩ））と、補酵素酸化酵素から補酵素の酸化に伴って生じる電子を受け取って電極１１に渡す電子メディエーターとが、所定の固定化材により固定化されて構成されている。符号１２はこの固定化層を示す。十分な触媒電流密度を得るためには、負極１において、これらの酵素、補酵素および電子メディエーターをそれらの生物学的および電気化学的活性を減少させずに電極１１上に密に固定化することが重要である。
【００３２】
グルコースの分解に関与する酵素としては、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を用いることができる。この酸化酵素を存在させることにより、例えば、β−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化することができる。
さらに、このＤ−グルコノ−δ−ラクトンは、グルコノキナーゼとフォスフォグルコネートデヒドロゲナーゼ（ＰｈＧＤＨ）との二つの酵素を存在させることにより、２−ケト−６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートに分解することができる。すなわち、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンは、加水分解によりＤ−グルコネートになり、Ｄ−グルコネートは、グルコノキナーゼの存在下、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とリン酸とに加水分解することでリン酸化されて、６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートになる。この６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートは、酸化酵素ＰｈＧＤＨの作用により、２−ケト−６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートに酸化される。
【００３３】
また、グルコースは上記分解プロセスのほかに、糖代謝を利用してＣＯ2 まで分解することもできる。この糖代謝を利用した分解プロセスは、解糖系によるグルコースの分解およびピルビン酸の生成ならびにＴＣＡ回路に大別されるが、これらは広く知られた反応系である。
【００３４】
単糖類の分解プロセスにおける酸化反応は、補酵素の還元反応を伴って行われる。この補酵素は作用する酵素によってほぼ定まっており、ＧＤＨの場合、補酵素にはＮＡＤ+ が用いられる。すなわち、ＧＤＨの作用によりβ−Ｄ−グルコースがＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化されると、ＮＡＤ+ がＮＡＤＨに還元され、Ｈ+ を発生する。
【００３５】
生成されたＮＡＤＨは、ジアホラーゼ（ＤＩ）の存在下で直ちにＮＡＤ+ に酸化され、二つの電子とＨ+ とを発生する。したがって、グルコース１分子につき１段階の酸化反応で二つの電子と二つのＨ+ とが生成されることになる。２段階の酸化反応では、合計四つの電子と四つのＨ+ とが生成される。
上記プロセスで生成された電子はジアホラーゼから電子メディエーターを介して電極１１に渡され、Ｈ+ は電解質層３を通って正極２へ輸送される。
【００３６】
電子メディエーターは電極１１との電子の受け渡しを行うもので、バイオ燃料電池の出力電圧は、電子メディエーターの酸化還元電位に依存する。つまり、より高い出力電圧を得るには負極１側ではよりネガティブな電位の電子メディエーターを選ぶとよいが、電子メディエーターの酵素に対する反応親和性、電極１１との電子交換速度、阻害因子（光、酸素など）に対する構造安定性なども考慮しなければならない。このような観点から、負極１の電極１１に酵素、補酵素とともに固定化する電子メディエーターとしては、好適には、キノン系電子メディエーター、取り分けナフトキノン骨格を有する電子メディエーター、例えば、２−メチル−１，４−ナフトキノン（ＶＫ3 ）、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）などが用いられる。
【００３７】
電極１１上に固定化する電子メディエーターの濃度は、溶液中での測定により求められるこの電子メディエーターの、電極１１上に固定化される酵素、取り分け補酵素酸化酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上に選ばれている。例えば、補酵素酸化酵素としてジアホラーゼを用いる場合、電極１１上に固定化する電子メディエーターの濃度は、電子メディエーターとしてＶＫ3 を用いるときには４μＭ以上、電子メディエーターとしてＡＣＮＱを用いるときには２０μＭ以上、電子メディエーターとしてＡＮＱを用いるときには３６０μＭ以上に選ばれる（後述の表１参照。）。
【００３８】
電解質層３は負極１において発生したＨ+ を正極２に輸送するプロトン伝導体であり、電子伝導性を持たず、Ｈ+ を輸送することが可能な材料により構成されている。この電解質層３は、例えばすでに挙げたものの中から適宜選ばれたものを用いることができる。この場合、この電解質層３には、緩衝液として例えばリン酸二水素イオン（Ｈ2 ＰＯ4 - ）を緩衝物質として含むもの、例えばリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2 ＰＯ4 ）などや、イミダゾール環を有する化合物などを緩衝物質として含むものなどが含まれている。この緩衝物質の濃度は必要に応じて選ばれるが、好適には０．２Ｍ以上２Ｍ以下の濃度含ませる。こうすることで高い緩衝能を得ることができ、バイオ燃料電池の高出力動作時においても、酵素本来の能力を十分に発揮することができる。さらに、イオン強度（Ｉ．Ｓ．）は、あまり大きすぎても小さすぎても酵素活性に悪影響を与えるが、電気化学応答性も考慮すると、適度なイオン強度、例えば０．３程度であることが好ましい。ただし、ｐＨおよびイオン強度は、用いる酵素それぞれに最適値が存在し、上述した値に限定されない。なお、緩衝液は、通常は、電解質層３だけでなく、負極１および正極２にも染み込んでいる。
【００３９】
上記の酵素、補酵素および電子メディエーターを電極１１上に固定化するための固定化材としては、好適には、例えば、ポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＡｃＮａ）とポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）とを組み合わせたポリイオンコンプレックスが用いられるが、これに限定されるものではない。
【００４０】
正極２は、内部に空隙を有する材料、取り分け炭素多孔質材料、例えばカーボンフェルト、多孔質カーボンなどからなる電極２１上に酸素還元酵素およびこの電極２１との間で電子の受け渡しを行う電子メディエーターが固定化されたものである。符号２２はこの固定化層を示す。酸素還元酵素としては、例えば、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどを用いることができる。電子メディエーターとしては、例えばヘキサシアノ鉄酸カリウムＫ3 ［Ｆｅ（ＣＮ）6 ］の電離により生成されるヘキサシアノ鉄酸イオンＦｅ（ＣＮ）6 4-/3- を用いることができる。
この正極２においては、酸素還元酵素の存在下で、電解質層３からのＨ+ と負極１からの電子とにより空気中の酸素を還元し水を生成する。
【００４１】
図２には、一例として、負極１において、グルコースの分解に関与する酵素がグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコースの分解プロセスにおける酸化反応に伴って還元体が生成される補酵素がＮＡＤ+ 、補酵素の還元体であるＮＡＤＨを酸化する補酵素酸化酵素がジアホラーゼ（ＤＩ）、補酵素酸化酵素から補酵素の酸化に伴って生じる電子を受け取って電極１１に渡す電子メディエータがＶＫ3 であり、正極２において、酸素還元酵素がビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）、電極２１から電子を受け取り、酸素還元酵素に電子を受け渡す電子メディエーターがＦｅ（ＣＮ）6 4-/3- である場合が図示されている。
【００４２】
以上のように構成されたバイオ燃料電池の動作時（使用時）において、負極１側にグルコースが供給されると、このグルコースが酸化酵素を含む分解酵素により分解される。この単糖類の分解プロセスで酸化酵素が関与することで、負極１側で電子とＨ+ とを生成することができ、負極１と正極２との間で電流を発生させることができる。バイオ燃料電池から外部への電流の取り出しのためには、例えば、電極１１と電解質層３との間および電極２１と電解質層３との間にそれぞれＴｉメッシュなどの集電体（図示せず）が設けられる。
【００４３】
このバイオ燃料電池の負極１の評価のために行った実験の結果について説明する。
ＢＡＳ  Ｉｎｃ．から購入した直径３ｍｍのグラッシーカーボン（ＧＣ）電極の表面を粒径０．０５μｍのアルミナ粉末で研磨し、蒸留水で洗浄した後、このＧＣ電極上に、以下の手順でＧＤＨ、ＮＡＤＨ、ＤＩおよびＶＫ3 を、ポリアニオンとしてのＰＡＡｃＮａとポリカチオンとしてのポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）との間の静電相互作用を用いるポリイオンコンプレックス法により固定化した。
【００４４】
ＧＣ電極上に１０μｌのＰＬＬ水溶液（２％（ｗ／ｖ））、８μｌのＧＤＨ溶液（０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ＮａＨ2 ＰＯ4 緩衝液）（ｐＨ７．０）中で１Ｕ／μｌ）、８μｌのＤＩ溶液（リン酸緩衝液中で１０Ｕ／μｌ）、２μｌのＮＡＤＨ溶液（リン酸緩衝液中で０．９μｍｏｌ／μｌ）、４μｌのＶＫ3 溶液（アセトン中で０．２９Ｍ）および４μｌのＰＡＡｃＮａ水溶液（０．０６６％（ｗ／ｖ））を上記の順序で添加した。各添加工程の後に４０℃で１０分間乾燥を行った。電気化学測定を行う前に、こうして固定化層が形成されたＧＣ電極（以下においてはＧＣバイオ負極と呼ぶ）を蒸留水で５分リンスした。
【００４５】
ＧＤＨとしてはBacillus sp.由来のＧＤＨ（ＥＣ１．１．１．４７）、ＤＩとしてはBacillus stearothermophilus 由来のＤＩ（ＥＣ．１．６．９９．−）を用い、いずれもＡｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｃ．（Ｊａｐａｎ）から購入し、さらなる精製を行わずに使用した。ＮＡＤＨ、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ、Ｍｗ＝約９３８００）およびポリアクリル酸ナトリウム塩（ＰＡＡＮａ、Ｍｗ＝約２４００００）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．から購入した。ＶＫ3 はＮａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．（Ｊａｐａｎ）から購入した。
【００４６】
電気化学測定を行う前の固定化層の厚さを共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００−ＢＸ６，Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏ．Ｊａｐａｎ）を用いて求めたところ、乾燥状態で５３μｍであった。図３にこの共焦点顕微鏡像（実際にはカラー写真）を示す。この共焦点顕微鏡像では、ＶＫ3 の蛍光に対応するオレンジ色の部分が観察される。クレーター状の構造は乾燥過程で発生したものと思われる。固定化層の厚さは、この固定化層の最上面とＧＣ電極の表面との間の焦点の差から求められたものである。
【００４７】
このＧＣバイオ負極を作用電極として用いてサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を行った。サイクリックボルタンメトリーは、１４８０マルチスタット（Ｍｕｌｔｉ−Ｓｔａｔ）（Ｓｏｌａｒｔｏｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を用いて三電極システムで室温にて測定溶液の対流を行わずに行った。実験に用いた電気化学測定用電池を図４に示す。図４に示すように、容器３１内に測定溶液（電解質溶液）３２を入れ、この測定溶液３２内に作用電極３３としてＧＣバイオ負極、対向電極３４としてＰｔ板、参照電極３５としてＡｇ｜ＡｇＣｌ｜飽和ＫＣｌ電極を浸漬し、これらの作用電極３３、対向電極３４および参照電極３５に電気化学測定装置（図示せず）を接続した。対向電極３４は容器３１の底にセットした。測定溶液３２の体積は１ｍｌとした。測定溶液３２としては、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、グルコースを０ｍＭ（Ａ）、１０ｍＭ（Ｂ）、２０ｍＭ（Ｃ）、３０ｍＭ（Ｄ）、４０ｍＭ（Ｅ）、５０ｍＭ（Ｆ）、１００ｍＭ（Ｇ）含ませたものを用いた。緩衝液中のＯ2 は測定前にＨ2 Ｏが飽和したＡｒガスでバブリングすることにより除去した。
【００４８】
図５にサイクリックボルタンメトリーの結果を示す。図５中の挿入図は、このサイクリックボルタンメトリーの定常電流値に対するグルコース濃度依存性を示す図である。図５に示すように、測定溶液３２中にグルコースが存在しないときには、−０．１７Ｖｖｓ．Ａｇ｜ＡｇＣｌの中点電位を有する固定化されたＶＫ3 の一対の酸化および還元波が得られた（図５の波Ａ）。測定溶液３２中にグルコースが存在するときには、グルコース酸化の触媒波が現れ（図５の波Ｂ−Ｇ）、グルコース濃度が増加すると電流が増加する。２０ｍＭより大きいグルコース濃度では、ＧＣバイオ負極は０．４Ｍのグルコースで最大電流密度０．７ｍＡ／ｃｍ2 の定常波を示した。この場合、反応速度は酵素反応によって決まると考えられる。波の形状はＣＶの複数回の掃引の間中変化せず、これはＧＤＨ、ＮＡＤＨ、ＤＩおよびＶＫ3 の４成分がＧＤＨおよびＤＩの酵素活性を保持したまま固定化層内に安定にかつ密に固定化されていることを示す。
【００４９】
さらに電流密度を増加させるために、電極１１としてＧＣの代わりに、表面積が大きくグルコースの輸送を妨げないので好ましいカーボンファイバー（ＣＦ）シートを用い、ＧＣバイオ負極と同様な方法でＧＤＨ、ＮＡＤＨ、ＤＩおよびＶＫ3 を固定化した。具体的には、ＧＣバイオ負極の作製に用いた各溶液の１４倍の体積の溶液を４枚のＣＦシートを積層したものに添加し、ＧＣバイオ負極と同じ条件で乾燥を行った。以下においては、こうして固定化層が形成されたＣＦシートをＣＦバイオ負極と呼ぶ。ＣＦシートとしてはＴｏｒａｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｊａｐａｎ）から購入したもの（ＢＯ０５０，７５０μｍ厚）を用い、これを１０ｍｍ角にカットした。２００℃で２時間脱ガスを行ったＣＦシートのＢＥＴ比表面積は、Ｂｅｌｓｏｒｐ−Ｍａｘ機器（ＢＥＬ  Ｊａｐａｎ  Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）を用いた７７Ｋでの窒素吸着−脱離等温分析により０．１７ｍ2 ／ｇと求められた。４枚の積層された１０ｍｍ角のＣＦシートの全表面積は２０．４ｃｍ2 と求められた。ＣＦシート上への固定化層の吸着を改善するために、ＧＤＨ、ＮＡＤＨ、ＤＩおよびＶＫ3 を固定化する前にオゾン処理装置（ＵＶ．ＴＣ．１１０（ＢＩＯＦＯＲＣＥ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｉｎｃ．））を用いてＣＦシートをオゾン処理した。電気化学測定を行う前のＣＦバイオ負極の厚さは２．１１ｍｍであった。この厚さは、クーラントプルーフマイクロメーター（coolant-proof micrometer) （Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．２９３，Ｍｉｔｕｔｏｙｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎ）を用いて２６．５Ｎ／ｃｍ2 の圧力下で測定した。
【００５０】
このＣＦバイオ負極を作用電極として用いてクロノアンペロメトリー（ＣＡ）を行った。クロノアンペロメトリーは、１４８０マルチスタット（Ｍｕｌｔｉ−Ｓｔａｔ）（Ｓｏｌａｒｔｏｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を用いて三電極システムで室温にて測定溶液の対流を行わずに行った。実験に用いた電気化学測定用電池を図６に示す。図６に示すように、容器４１内に測定溶液（電解質溶液）４２を入れ、この測定溶液４２内に作用電極４３としてＣＦバイオ負極、対向電極４４としてＰｔワイヤー、参照電極４５としてＡｇ｜ＡｇＣｌ｜飽和ＫＣｌ電極を浸漬し、これらの作用電極４３、対向電極４４および参照電極４５に電気化学測定装置（図示せず）を接続した。作用電極４３としてのＣＦバイオ負極は容器４１の底にセットした。作用電極４３としてのＣＦバイオ負極との電気的接触のための集電体４６としてＴｉメッシュを用いた。このＴｉメッシュはＴｈａｎｋ−Ｍｅｔａｌ  Ｃｏ．（Ｊａｐａｎ）から購入した。集電体４６にはセパレータとしてセロハン膜４７を取り付けた。セロハン膜４７としてはＦｕｔａｍｕｒａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｊａｐａｎ）から購入したものを用いた。測定溶液３２の体積は３ｍｌとした。測定溶液４２としては、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にグルコースを０．４Ｍ含ませたものを用いた。緩衝液中のＯ2 は測定前にＨ2 Ｏが飽和したＡｒガスでバブリングすることにより除去した。こうしてクロノアンペロメトリーを０．１Ｖで１分間行った後の触媒電流密度の値は、ＣＦ電極の推定された表面積はＧＣ電極のそれに比べて約２０倍も大きいにもかかわらず、ＧＣバイオ負極上の触媒電流密度の値より５．９倍大きいだけであった。この結果から、ＣＦバイオ負極上の触媒電流密度が低いのは、ＣＦバイオ負極におけるプロトン拡散が不十分であるためであると推定した。このようにＣＦバイオ負極におけるプロトン拡散が不十分であると、グルコース酸化反応（グルコース→グルコノラクトン＋２Ｈ+ ＋２ｅ- ）による固定化層内のプロトン濃度の増加を引き起こし、ＧＤＨおよびＤＩの酵素活性を低下させると考えられる。
【００５１】
この問題を解決するために、本発明者らは、グルコース濃度が０．４Ｍの電解質溶液中の緩衝液の濃度の効果を調べた。図７に緩衝液濃度による電流密度の変化を調べた結果を示す。測定は図６に示す電気化学電池を用いて上記と同様に行った。図７に示すように、緩衝液濃度が１．０Ｍまで増加すると１分間のクロノアンペロメトリー後の電流密度は増加した。電流密度は緩衝液濃度が１．０ＭのときにＧＣバイオ負極上の電流密度より約１５倍も大きい最大値１０．５ｍＡ／ｃｍ2 に達した後、緩衝液濃度が１．０Ｍより増加すると徐々に減少した。測定中にＣＦバイオ負極内の溶液のｐＨ変化をモニターした。ｐＨの測定には、平坦な表面を有するｐＨメーター（ＴＹＰＥ  ＰＣＥ３０８Ｓ−ＳＲ，Ｔｏｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）を用いた。このｐＨ測定の結果を図８に示す。図８中、●は緩衝液濃度が０．１Ｍ、▲は緩衝液濃度が１．０Ｍ、■は緩衝液濃度が２．０Ｍである。図８に示すように、このｐＨ測定の結果、緩衝液濃度が０．１Ｍのとき、５分間の間に、ｐＨは６．８５から６．２０に低下した。これは、緩衝液濃度が１．０ＭのときのｐＨの低下（６．８５→６．６２）または緩衝液濃度が２．０ＭのときのｐＨの低下（６．８５→６．７９）より顕著である。図９に示すように、ｐＨの低下は、ｐＨに依存する酵素活性の低下により、ＣＦバイオ負極上の電流密度の減少を引き起こす。これらの結果は、より高い濃度の緩衝液はＣＦバイオ負極中のｐＨ低下を抑えることを明確に示す。図９中、●は１分後、▲は５分後である。
【００５２】
一方、緩衝液濃度が１．０〜２．０Ｍと高いときには、１分間のクロノアンペロメトリー後の電流密度は減少した。これは、図１０に示すように、溶液中のＧＤＨおよびＤＩの酵素活性は緩衝液濃度が０．４Ｍから２．０Ｍに増加すると低下することによると考えられる。図１０中、●はＧＤＨ、▲はＤＩである。ただし、図１０においては、０．４Ｍの緩衝液濃度におけるＧＤＨおよびＤＩの酵素活性をそれぞれ１００％としている。以上のことから、二つの律速過程、すなわちより低い緩衝液濃度（＜１．０Ｍ）での不十分なプロトン拡散およびより高い緩衝液濃度（＞１．０Ｍ）での触媒活性の低下、があることが分かる。ＣＦ電極上の固定化層は、緩衝液濃度が最大２．０Ｍまでは安定であることが分かっている。
【００５３】
図３に示すＧＣバイオ負極の共焦点顕微鏡像は多量のＶＫ3 が均一に固定化されていることを示唆する。図１１は、図４に示す電気化学測定用電池を用いて電位−０．６Ｖ〜＋０．６Ｖ間におけるサイクリックボルタンメトリーを掃引速度ｖを変えて行った結果を示す。掃引速度ｖは、５０ｍＶ／ｓ（Ａ）、２０ｍＶ／ｓ（Ｂ）、１０ｍＶ／ｓ（Ｃ）、５ｍＶ／ｓ（Ｄ）、２ｍＶ／ｓ（Ｅ）、１ｍＶ／ｓ（Ｆ）の６段階に変えた。測定溶液３２としては、グルコースを含まない０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。図１１に示すように、グルコースが存在しないとき、酸化還元波は、ＧＣバイオ負極上に固定化されたＶＫ3 の酸化還元反応に起因するものである。掃引速度ｖの平方根ｖ1/2 に対するピーク電流の線形依存性（図１１の挿入図）は、ＶＫ3 は乾燥状態で５３μｍの厚さを有する固定化層内に拡散することができることを示す。固定化層中のＶＫ3 の濃度は、還元体のＶＫ3 の酸化から計算されたファラデー電気（２．８ｍＣ／ｃｍ2 ）により２．８ｍＭと決定された。
【００５４】
固定化層中のＶＫ3 の濃度の求め方（電気化学的手法）を詳細に説明する。ＧＣバイオ負極を十分に脱酸素された測定溶液（リン酸緩衝液）中にて、十分な時間、電解還元（−０．６Ｖｖｓ．Ａｇ｜ＡｇＣｌ）を行い、ＶＫ3 の酸化還元電位より十分貴な電位（０．６Ｖｖｓ．Ａｇ｜ＡｇＣｌ）で定電流測定を行った。こうして得られた時間に対する電流応答曲線において、初期の表面充電電流領域を除き、固定化層（厚さｄ）内での拡散領域において、下記のコットレル式（Cottrell equation)のフィッティングにより、ＶＫ3 の濃度Ｃおよび拡散係数Ｄを求めた。ｎ＝２（文献値）、Ａ＝０．０７１ｃｍ2 、ｄ＝５３μｍとした。
【００５５】
コットレル式：  ｉ（ｔ）＝ｎＦＡＣ（Ｄ／πｔ）1/2             （１）
ｉ：電流、ｔ：時間、ｎ：電子数、Ｆ：ファラデー定数、
Ａ：電極表面積、Ｃ：濃度、Ｄ：拡散係数
【００５６】
ＶＫ3 以外の電子メディエーターの濃度も上記と同様にして求めることができる。さらに、電子メディエーターの濃度の求め方としては、上記の電気化学的手法以外に、固定化されている電子メディエーターを化学的または物理的手法を用いて溶媒中に溶出させ、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーを用いて濃度を求める方法もある。
【００５７】
ここで、電子メディエーターを基質とする酵素反応のミカエリス定数Ｋm 、速度定数ｋcat の測定方法について説明する。
ミカエリス定数Ｋm および速度定数ｋcat の間には次の電気化学的な式が成立する（R. Matsumoto et al,J.Electroanal.Chem.535(2002)37)。
【００５８】
【数１】
2009049012.tif 000003
【００５９】
ただし、Ｉs lim はサイクリックボルタンメトリーにより得られる曲線のフラット部の電流値、ｎM は電子メディエーターの電子数、ｎs は基質の電子数、Ｆはファラデー定数、Ａは電極表面積、ＤM は基質の拡散係数、［Ｅ］は酵素濃度、［Ｍ］* は電子メディエーターの濃度である。
【００６０】
図１２は、十分量のＮＡＤＨおよびＤＩが溶液中に存在する状態で、電子メディエーターとしてＡＮＱを用い、その濃度を変化させてサイクリックボルタンメトリーを行った結果を示す。図１２の曲線のフラット部の電流を電子メディエーターの濃度に対してプロットしたものを図１３に示す。
【００６１】
図１４は、十分量のＮＡＤＨおよびＤＩが溶液中に存在する状態で、電子メディエーターとしてＶＫ3 、ＡＣＮＱ、ＡＮＱを用い、それらの濃度［Ｍ］* を０．２ｍＭに固定してサイクリックボルタンメトリーを行った結果を示す。図１４の曲線のフラット部の電流を電子メディエーターの濃度に対してプロットしたものを図１５に示す。
【００６２】
式（２）および図１２〜図１５からＫm 、ｋcat を求めた結果を表１に示す。こうして求めたＫm の１０倍の値は、ＶＫ3 は４μＭ、ＡＣＮＱは２０μＭ、ＡＮＱは３６０μＭである。
【００６３】
【表１】
2009049012.tif 000004
【００６４】
次に、このバイオ燃料電池の正極２の評価のために行った実験の結果について説明する。
ＣＦバイオ負極の作製に用いたものと同じＣＦシートを２枚積層したＣＦ電極上に、以下の手順でＢＯＤおよびＫ3 ［Ｆｅ（ＣＮ）6 ］をＰＬＬを用いて固定化した。
ＣＦ電極上に、８０μｌのＫ3 ［Ｆｅ（ＣＮ）6 ］水溶液（０．１Ｍ）、８０μｌのＰＬＬ水溶液（１％（ｗ／ｖ））および８０μｌのＢＯＤ溶液（５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で５０ｍｇ／ｍｌ）を上記の順序で添加した。各添加工程の後に３０℃で１０分間乾燥を行った。電気化学的測定の前にこうして固定化層が形成されたＣＦ電極（以下においてはＣＦバイオ正極と呼ぶ）を蒸留水で５分リンスした。ＣＦバイオ負極と同様な方法で電気化学測定の前のＣＦバイオ正極の厚さを測定したところ、０．９０５ｍｍであった。
【００６５】
ＢＯＤとしては、Myrothecium sp. 由来のＢＯＤ（ＥＣ１．３．３．５）をＡｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｃ．（Ｊａｐａｎ）から購入し、さらなる精製を行わずに使用した。Ｋ3 ［Ｆｅ（ＣＮ）6 ］はＷａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．（Ｊａｐａｎ）から購入した。ＰＬＬ（Ｍｗ＝約８０００）はＰｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｌｔｄ．（Ｊａｐａｎ）から購入した。
【００６６】
ＣＦバイオ正極への酸素（Ｏ2 ）の物質輸送の効率を評価するために、図１６および図１７に示す二種類の電気化学測定用電池を作製した。図１６に示す電気化学測定用電池においては、容器５１内に入れられた測定溶液（電解質溶液）５２がその底部でセロハン膜５３と接触している。セロハン膜５３の測定溶液５２と反対側の面にＣＦバイオ正極が作用電極５４として接触している。作用電極５４にはＴｉメッシュ５５が電気的に接続されている。作用電極５４としてのＣＦバイオ正極は容器５６内に入れられた測定溶液（電解質溶液）５７中に漬かっており、Ｏ2 は外部の空気からこの測定溶液５７を通って作用電極５４としてのＣＦバイオ正極に供給される。測定溶液５２の体積は３ｍｌ、測定溶液５７の体積は２ｍｌである。測定溶液５２中に対向電極５８としてＰｔワイヤー、参照電極５９としてＡｇ｜ＡｇＣｌ｜飽和ＫＣｌ電極を浸漬し、これらの作用電極５４、対向電極５８および参照電極５９に電気化学測定装置（図示せず）を接続した。この電気化学測定用電池は、作用電極５４としてのＣＦバイオ正極が測定溶液５７中に漬かっているという意味で浸水型（ｓｉｎｋ−ｔｙｐｅ）電池と呼ぶ。一方、図１７に示す電気化学測定用電池においては、容器６１内に入れられた測定溶液（電解質溶液）６２がその底部でセロハン膜６３と接触している。セロハン膜６３の測定溶液６２と反対側の面にＣＦバイオ正極が作用電極６４として接触している。この場合、セロハン膜６３は、ＣＦバイオ正極への測定溶液６２の供給を制御する役割を有する。作用電極６４にはＴｉメッシュ６５が電気的に接続されている。作用電極６４としてのＣＦバイオ正極は空気に露出している。従って、Ｏ2 は空気からＴｉメッシュ６５を介して作用電極６４としてのＣＦバイオ正極内に拡散することができる。測定溶液６２の体積は３ｍｌである。測定溶液６２中に対向電極６６としてＰｔワイヤー、参照電極６７としてＡｇ｜ＡｇＣｌ｜飽和ＫＣｌ電極を浸漬し、これらの作用電極６４、対向電極６６および参照電極６７に電気化学測定装置（図示せず）を接続した。この電気化学測定用電池は、作用電極６４としてのＣＦバイオ正極が空気に露出しているという意味で空気開放型（ｏｐｅｎ−ａｉｒ  ｔｙｐｅ）電池と呼ぶ。
【００６７】
図１８に、図１６に示す浸水型電池を用いて静止状態で行ったクロノアンペロメトリーの結果（曲線Ａ）および図１７に示す空気開放型電池を用いて静止状態で行ったクロノアンペロメトリーの結果（曲線Ｂ）を示す。測定溶液５２、５７、６２としては、１．０Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に０．４Ｍのグルコースを含ませたものを用いた。測定は０Ｖｖｓ．Ａｇ｜ＡｇＣｌで行った。図１８中の挿入図は、図１７に示す空気開放型電池を用い、０Ｖにおける１分間のクロノアンペロメトリー後の電流密度をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の濃度を変えて測定した結果を示す。図１８に示すように、測定溶液５７を通してＯ2 が供給される浸水型電池では、ＣＦバイオ正極上の電流密度は１. ０Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の０Ｖでのクロノアンペロメトリー中に急速に減少し、１分間のクロノアンペロメトリー後の電流密度はゼロに近づいた（曲線Ａ）。この電流密度の著しい減少はＯ2 の供給が不十分であることによる。水溶液中に溶解したＯ2 の濃度および拡散係数はそれぞれ０．２２９ｍＭおよび２．０７±０．６６×１０-5ｃｍ2 ／ｓである。これに対し、空気開放型電池の電流密度は１分間のクロノアンペロメトリー後で１４．１ｍＡ／ｃｍ2 であった（図１８の曲線Ｂ）。これは、空気中の濃度（９ｍＭ）および気体中の拡散係数（１０-1ｃｍ2 ／ｓのオーダー）は水溶液中のそれらの値に比べてはるかに高いため、十分なＯ2 が空気からＣＦバイオ正極に供給されることによる。このことから、空気開放型電池はＯ2 の供給に有効であることを示す。実際、空気開放型電池のＣＦバイオ正極内の水分量を測定したところ、図１９に示すような結果が得られ、１分間のクロノアンペロメトリー後に８．２８ｍｇ／ｃｍ2 に過ぎなかった。これは、空気からＣＦバイオ正極への酸素の物質輸送を促進し、固定化層内での有効な酵素反応を起こさせるためにはＣＦバイオ正極が部分的に湿っている状況が重要であることを示す。水分量の測定は、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ法および湿度計（ＣＡ−２００，Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。
【００６８】
ＣＦバイオ正極上の電流密度は緩衝液濃度にも依存する（図１８の挿入図）。この緩衝液濃度の変化による電流密度の変化のプロファイルは、図７に示すＣＦバイオ負極上のそれと非常に似ている。ここでは、最適値は酵素、電極、固定化層および電解質の種類に本来的に依存するものの、最適値は同様に緩衝液濃度が１．０Ｍのときである。これは、それぞれ図８、図９および図１０と同様な測定結果である図２０、図２１および図２２に示すように、不十分なプロトン拡散とＣＦバイオ負極における酵素の活性の低下との間のトレードオフの関係により説明することができる。図２０中、●は緩衝液濃度が０．１Ｍ、▲は緩衝液濃度が１．０Ｍ、■は緩衝液濃度が２．０Ｍである。図２１中、●は１分後、▲は５分後である。
【００６９】
図２３に示すように、ＣＦバイオ負極７１とＣＦバイオ正極７２との間にセロハン膜７３が挟まれたパッシブ型のバイオ燃料電池を作製した。容器７４内に燃料溶液（電解質溶液）７５を入れ、この燃料溶液７５の底にＣＦバイオ負極７１がセットされている。ＣＦバイオ負極７１との電気的接触のための集電体７６およびＣＦバイオ正極７２との電気的接触のための集電体７７としてＴｉメッシュを用いた。燃料溶液７５中に参照電極７８としてＡｇ｜ＡｇＣｌ｜飽和ＫＣｌ電極を浸漬した。燃料溶液７５の体積は３ｍｌとした。このバイオ燃料電池を評価するために、燃料溶液７５として０．４Ｍのグルコースを含む１．０Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）が使用された。図２４にこのバイオ燃料電池の出力特性を示す。このバイオ燃料電池の出力密度（図２４の▲）はこのバイオ燃料電池の各電圧における１分間のクロノアンペロメトリー後の電流密度（図２４の●）から求められた。最大出力密度は０．３Ｖで１．４５±０．２４ｍＷ／ｃｍ2 、開放電圧は０．８Ｖ、短絡電流密度は１１ｍＡ／ｃｍ2 であった。
【００７０】
図２５および図２６は、それぞれ図２３に示すバイオ燃料電池の発電中のＣＦバイオ負極７１およびＣＦバイオ正極７２の電流密度−電位曲線（●）を、図６に示す電気化学測定用電池におけるＣＦバイオ負極および図１７に示す電気化学測定用電池におけるＣＦバイオ正極の電流密度−電位曲線（○）と比較して示したものである。図２５および図２６に示すように、バイオ燃料電池の各電位において求められたＣＦバイオ負極７１上の電流密度およびＣＦバイオ正極７２上の電流密度はそれぞれ、図６に示す電気化学測定用電池におけるＣＦバイオ負極上の電流密度および図１３に示す電気化学測定用電池におけるＣＦバイオ正極上の電流密度とほぼ同等であった。これは、図２３に示すバイオ燃料電池においては、ｍＡオーダーの電流密度でさえも、電池抵抗による電圧降下が無視しうる程小さいことを意味する。
【００７１】
以上のように、この第１の実施形態によれば、負極１の電極１１上に酵素とともに固定化する電子メディエーターの濃度を、溶液中での測定により求められるこの電子メディエーターの、電極１１上に固定化される酵素、取り分け補酵素酸化酵素に対するミカエリス定数Ｋm の１０倍以上としている。例えば、補酵素酸化酵素としてジアホラーゼを用いる場合、電極１１上に固定化する電子メディエーターの濃度を、電子メディエーターとしてＶＫ3 を用いるときには４μＭ以上、電子メディエーターとしてＡＣＮＱを用いるときには２０μＭ以上、電子メディエーターとしてＡＮＱを用いるときには３６０μＭ以上に選んでいる。このため、電子メディエーターは、固定化層１２内に止まりながら固定化層１２内を拡散により容易に移動することができ、電子メディエーターを介したジアホラーゼと電極１１との間の電子の受け渡し反応を迅速に行うことができ、しかも固定化層１２の酵素の活性を維持することができるので、酵素、補酵素および電子メディエーターによる電極反応を効率よく定常的に行うことができる。このため、バイオ燃料電池の電流密度あるいは出力密度の向上を図ることができる。加えて、電解質層３が十分に高い濃度の緩衝液を含むことにより、十分な緩衝能を得ることができる。このため、バイオ燃料電池の高出力動作時において、プロトンを介する酵素反応により、プロトンの増減が固定化層１２または電極１１の内部で起きても、十分な緩衝能を得ることができ、酵素の周囲の電解質のｐＨの至適ｐＨからのずれを十分に小さく抑えることができる。このため、酵素が本来持っている能力を十分に発揮することができ、酵素、補酵素、電子メディエーターなどによる電極反応を効率よく定常的に行うことができる。さらに、正極２としてＣＦバイオ正極を用いることにより、電極２１上の固定化層２２に外部の空気から酸素を効率的に供給することができる。以上により、静止条件下で１０ｍＡ／ｃｍ2 を超える電流密度が得られ、例えば４０ｃｍ3 の電池体積で５０ｍＷの出力が得られる高出力のパッシブ型のバイオ燃料電池を実現することができる。このバイオ燃料電池は、携帯音楽プレイヤーなどの携帯型電子機器の電源に適用して好適なものである。
【００７２】
次に、この発明の第２の実施形態によるスタック型バイオ燃料電池ユニットについて説明する。
図２７および図２８に示すように、このスタック型バイオ燃料電池ユニットにおいては、スペーサー８１、正極集電体８２、正極８３、電解質層８４、負極８５、負極集電体８６、スペーサー８７、負極集電体８８、負極８９、電解質層９０、正極９１、正極集電体９２およびスペーサー９３が順次積層されており、スペーサー８１、９３の外側が固定板９４、９５により挟み込まれ、これらの固定板９４、９５同士がねじ（図示省略）などにより締結されることで各構成要素が互いに固定されている。正極８３と負極８５とが電解質層８４を介して対向した構造により第１のバイオ燃料電池９６が構成され、正極９１と負極８９とが電解質層９０を介して対向した構造により第２のバイオ燃料電池９７が構成されている。スペーサー８１、正極８３、負極８５、スペーサー８７、負極８９、正極９１およびスペーサー９３は互いにほぼ同一の形状および大きさを有し、例えば長方形の板状に形成されるが、これに限定されるものではない。この場合、負極集電体８６と負極集電体８８とは一体に形成されているが、これに限定されるものではない。正極集電体８２、負極集電体８６および正極集電体９２はそれぞれ細長く延びた端子８２ａ、８６ａ、９２ａを有する。符号９８は燃料保持容器を示す。この燃料保持容器９８の中に使用する燃料、例えばグルコース溶液などが入れられる。この燃料保持容器９８は電解質層８４、９０と一体化されており、全体として密閉された袋状の形状を有する。電解質層８４、９０と一体化したこの袋状の燃料保持容器９８により、負極８５、負極集電体８６、スペーサー８７、負極集電体８８および負極８９が包み込まれており、負極８５、８９と接触した状態で燃料が保持されるようになっている。負極集電体８６の端子８６ａはこの燃料保持容器９８の外に出ている。この端子８６ａと燃料保持容器９８との間の部分は例えばシール部材（図示せず）などによりシールされており、この部分から燃料が外部に漏れないようになっている。この燃料保持容器９８を上記の積層方向から見たときの形状の一例を図２９に示す。
【００７３】
スペーサー８１、８３は、少なくとも酸化剤を含む気体、例えば空気や酸素などの気体を外部から取り入れる機能およびこの気体の拡散機能を有する。具体的には、これらのスペーサー８１、９３はこの気体が透過可能な構造を有し、例えば電気的に絶縁性の物質、具体的にはプラスチックなどからなる。これらのスペーサー８１、９３は、好適には、その全体にわたって連通した空隙を有し、いずれかの面に供給された気体が他の面から出てくることが可能に構成されるが、これに限定されるものではなく、少なくともスペーサー８１、９３のうちそれぞれ正極８２、９１と対向している面以外のいずれかの面に供給された気体がこの正極８２、９１と対向している面から出てくるような構造であればよい。より具体的には、これらのスペーサー８１、９３は、例えば、各面に多数の貫通孔を規則的あるいは不規則な配置で形成したものであり、各貫通孔の形状や径は同一であっても異なっていてもよい。図３０に、スペーサー８１に多数の貫通孔８１ａを規則的に形成した一例を示す。スペーサー９３も同様である。これらのスペーサー８１、９３は、例えばアクリル板を用いて容易に形成することが可能である。
【００７４】
スペーサー８７は、例えばグルコース溶液などの燃料を保持する、いわば燃料タンクとしての機能およびこの燃料の拡散機能を有する。具体的には、このスペーサー８７は燃料が透過可能な構造を有し、例えば電気的に絶縁性の物質、具体的にはプラスチックなどからなる。このスペーサー８７は、好適には、その全体にわたって連通した空隙を有し、いずれかの面に供給された燃料が他の面から出てくることが可能に構成されるが、これに限定されるものではなく、少なくともこのスペーサー８７のうち負極８５、８９と対向している面以外のいずれかの面に接触した燃料がこの負極８５、８９と対向している面から出てくるような構造であればよい。より具体的には、スペーサー８７は、例えば、各面に多数の貫通孔を規則的あるいは不規則な配置で形成したものであり、各貫通孔の形状や径は同一であっても異なっていてもよい。このスペーサー８７の具体例は例えば図３０に示すものと同様である。このスペーサー８７は、スペーサー８１、９３と同様に、例えばアクリル板を用いて容易に形成することが可能である。
【００７５】
正極集電体８２、９２は、それぞれ正極８３、９１で発生した電流を集めるためのものであり、端子８２ａ、９２ａから外部に電流が取り出される。これらの正極集電体８２、９２は、これらを介して正極８３、９１に対する酸化剤を含む気体の供給を可能にするため、この気体が透過可能な構造を有する導電体により形成され、具体的には、例えば、チタンなどの金属製のメッシュにより形成される。同様に、負極集電体８６、８８も、それぞれ負極８５、８９で発生した電流を集めるためのものであり、端子８６ａから外部に電流が取り出される。これらの負極集電体８６、８８は、これらを介して負極８５、８９に対する燃料の供給を可能にするため、この燃料が透過可能な構造を有する導電体により形成され、具体的には、例えば、正極集電体８２、９２と同様にチタンなどの金属製のメッシュにより形成される。
【００７６】
負極８５、８９は第１の実施形態における負極１と同様な構成を有し、正極８３、９１は第１の実施形態における正極２と同様な構成を有する。
固定板９４、９５は、例えば、ねじなどにより相互に締め付けることで燃料電池の上記の各構成要素を相互に確実に固定することができるようにするために、高弾性の材料、例えば硬質アルミニウムのような金属などにより構成されるが、これに限定されるものではない。固定板９４、９５をねじで締め付ける位置は、燃料電池の各構成要素に均一に力を加えることができるように選ぶのが望ましい。
【００７７】
以上のように構成されたスタック型バイオ燃料電池ユニットにおいては、燃料保持容器９８に入れる燃料として例えばグルコース溶液を用いる場合、負極８５、８９は、供給されたグルコースを酵素により分解して電子を取り出すとともに、Ｈ+ を発生する。正極８３、９１は、負極８５、９９からそれぞれ電解質層８４、９０を通って輸送されたＨ+ と負極８５、８９から外部回路を通って送られた電子と例えば空気中の酸素とにより水を生成する。そして、正極８３と負極８５とが電解質層８４を介して対向した構造の第１のバイオ燃料電池８６の端子８２ａと端子８６ａとの間に出力電圧が得られるとともに、正極９１と負極８９とが電解質層９０を介して対向した構造の第２のバイオ燃料電池９７の端子９２ａと端子８６ａとの間に出力電圧が得られる。このため、例えば、このスタック型バイオ燃料電池ユニットの端子８６ａと端子８２ａおよび端子９２ａとの間に負荷を接続した場合、第１のバイオ燃料電池９６の出力電流と第２のバイオ燃料電池９７の出力電流との合計の出力電流をこの負荷に流すことができる。
【００７８】
以上のように、この第２の実施形態によれば、酸化剤を含む気体が透過可能なスペーサー８１、正極集電体８２、正極８３、電解質層８４、負極８５、負極集電体８６、燃料が透過可能なスペーサー８７、負極集電体８８、負極８９、電解質層９０、正極９１、正極集電体９２および酸化剤を含む気体が透過可能なスペーサー９３が順次積層され、さらに負極８５、負極集電体８６、スペーサー８７、負極集電体８８および負極８９が包み込まれるように燃料保持容器９８が設けられてスタック型バイオ燃料電池ユニットが構成されているので、正極８３、９１への酸化剤を含む気体の供給と負極８５、８９への燃料の供給とが可能な状態で第１のバイオ燃料電池９６と第２のバイオ燃料電池９７とを最もコンパクトな形で一体化することができる。そして、このスタック型バイオ燃料電池ユニットによれば、従来に比べて大きな出力電流および電力を得ることができ、例えば８０ｃｍ3 以上の電池体積で１００ｍＷ以上の出力を得ることができ、大幅な高出力化を図ることができる。実際に、このスタック型バイオ燃料電池ユニットを電源に用いて携帯音楽プレイヤーやラジコンカーなどを動かすことに成功した。
【００７９】
以上、この発明の実施形態について具体的に説明したが、この発明は、上述の実施形態に限定されるものではなく、この発明の技術的思想に基づく各種の変形が可能である。
例えば、上述の実施形態において挙げた数値、構造、構成、形状、材料などはあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれらと異なる数値、構造、構成、形状、材料などを用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池を示す略線図である。
【図２】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の負極および正極の構成の詳細ならびにこの負極および正極における電子の受け渡し反応を模式的に示す略線図である。
【図３】この発明の第１の実施形態において作製した固定化層の共焦点顕微鏡像を示す図面代用写真である。
【図４】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の負極の評価のために作製したＧＣバイオ負極を用いた電気化学測定用電池を示す略線図である。
【図５】図４に示す電気化学測定用電池を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。
【図６】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の負極の評価のために作製したＣＦバイオ負極を用いた電気化学測定用電池を示す略線図である。
【図７】図６に示す電気化学測定用電池を用いて行ったクロノアンペロメトリーの結果から得られた緩衝液濃度に対する電流密度の依存性を示す略線図である。
【図８】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の負極の評価のために作製したＣＦバイオ負極を用いて行ったクロノアンペロメトリー中のＣＦバイオ負極内のｐＨの変化を示す略線図である。
【図９】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の負極の評価のために作製したＣＦバイオ負極を用いて行ったクロノアンペロメトリー中のＣＦバイオ負極のリン酸緩衝液のバルク溶液の初期ｐＨに対する相対電流の依存性を示す略線図である。
【図１０】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の負極の評価のために行った実験から得られた緩衝液濃度に対するＧＤＨおよびＤＩの相対活性の依存性を示す略線図である。
【図１１】図４に示す電気化学測定用電池を用いて掃引速度を変えて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。
【図１２】十分量のＮＡＤＨおよびＤＩが溶液中に存在する状態で、ＡＮＱの濃度を変えてサイクリックボルタンメトリーを行った結果を示す略線図である。
【図１３】図１２に示すサイクリックボルタンメトリーの結果から得られたＡＮＱの濃度に対する電流の依存性を示す略線図である。
【図１４】十分量のＮＡＤＨおよびＤＩが溶液中に存在する状態で、ＶＫ3 、ＡＣＮＱおよびＡＮＱを用いてサイクリックボルタンメトリーを行った結果を示す略線図である。
【図１５】図１４に示すサイクリックボルタンメトリーの結果から得られたＶＫ3 、ＡＣＮＱおよびＡＮＱの濃度に対する電流の依存性を示す略線図である。
【図１６】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の正極の評価のために作製したＣＦバイオ正極を用いた浸水型電気化学測定用電池を示す略線図である。
【図１７】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の正極の評価のために作製したＣＦバイオ正極を用いた空気開放型電気化学測定用電池を示す略線図である。
【図１８】図１６に示す浸水型電気化学測定用電池および図１７に示す空気開放型電気化学測定用電池を用いて行ったクロノアンペロメトリーの結果を示す略線図である。
【図１９】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の正極の評価のために作製したＣＦバイオ正極内の水分量の測定結果を示す略線図である。
【図２０】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の正極の評価のために作製したＣＦバイオ正極を用いて行ったクロノアンペロメトリー中のＣＦバイオ正極内のｐＨの変化を示す略線図である。
【図２１】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の正極の評価のために作製したＣＦバイオ正極を用いて行ったクロノアンペロメトリー中のＣＦバイオ正極のリン酸緩衝液のバルク溶液の初期ｐＨに対する相対電流の依存性を示す略線図である。
【図２２】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の正極の評価のために、ＢＯＤおよびＫ3 ［Ｆｅ（ＣＮ）6 ］を溶液中に存在させ、ＧＣ電極を用いた実験から得られた緩衝液濃度に対する相対電流の依存性を示す略線図である。
【図２３】この発明の第１の実施形態によるバイオ燃料電池の評価のために作製した電気化学測定用電池を示す略線図である。
【図２４】図２３に示す電気化学測定用電池を用いて測定された電流および出力の電圧特性を示す略線図である。
【図２５】図２３に示す電気化学測定用電池の動作中の負極の電流の電位特性を示す略線図である。
【図２６】図２３に示す電気化学測定用電池の動作中の正極の電流の電位特性を示す略線図である。
【図２７】この発明の第２の実施形態によるスタック型バイオ燃料電池ユニットを示す断面図である。
【図２８】この発明の第２の実施形態によるスタック型バイオ燃料電池ユニットを示す分解斜視図である。
【図２９】この発明の第２の実施形態によるスタック型バイオ燃料電池ユニットの燃料保持容器を示す側面図である。
【図３０】この発明の第２の実施形態によるスタック型バイオ燃料電池ユニットのスペーサーの一例を示す斜視図である。
【符号の説明】
【００８１】
１…負極、２…正極、３…電解質層、１１、２１…電極、１２、２２…固定化層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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