(57)【要約】【課題】卵白のアレルゲンを含む食品において、これらアレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても検出できる高感度な免疫学的な検出方法及びそれに用いられる検出キットを提供するものである。【解決手段】未変性及び変性の卵白アレルゲンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いるアレルゲンの検出方法であって、卵白主要タンパク質であるオボアルブミンを指標とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を用いることを特徴とする卵白アレルゲンの検出方法。
【請求項２】
還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識する抗オボアルブミンモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１及び／又はハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２であることを特徴とする請求項１記載の卵白アレルゲンの検出方法。
【請求項３】
さらに、未変性オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を用いることを特徴とする請求項１又は２記載の卵白アレルゲンの検出方法。
【請求項４】
未変性オボアルブミンを認識する抗オボアルブミンモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１及び／又はハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の卵白アレルゲンの検出方法。
【請求項５】
サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中のオボアルブミンを、１．０〜１０．０ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の卵白アレルゲンの検出方法。
【請求項６】
還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を備えたことを特徴とする卵白アレルゲン検出用キット。
【請求項７】
還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識する抗オボアルブミンモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１及び／又はハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２であることを特徴とする請求項６記載の卵白アレルゲン検出用キット。
【請求項８】
さらに、未変性オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を備えたことを特徴とする請求項６又は７記載の卵白アレルゲン検出用キット。
【請求項９】
未変性オボアルブミンを認識する抗オボアルブミンモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１及び／又はハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載の卵白アレルゲン検出用キット。
【請求項１０】
異なるエピトープを認識する２種のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６〜９のいずれか記載の卵白アレルゲン検出用キット。
【請求項１１】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１。
【請求項１２】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２。
【請求項１３】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１。
【請求項１４】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性及び変性の乳アレルゲン、未変性及び変性の卵白アレルゲン、未変性及び変性の小麦アレルゲン、未変性及び変性のそばアレルゲン、又は未変性及び変性の落花生アレルゲンを指標とした乳アレルゲンの検出方法や、それに用いられる乳アレルゲンの検出用キットに関する。
【０００２】
また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性の乳アレルゲンを定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、カゼインの主要タンパク質であるαｓ１カゼイン、あるいは、ホエーの主要たんぱく質であるβラクトグロブリンを指標としたアレルゲンの検出方法や、それに用いられるアレルゲンの検出用キットに関する。
【０００３】
また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性のオボアルブミンやオボムコイドの卵白アレルゲンを定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、オボアルブミン及び／又はオボムコイドを指標とした卵白アレルゲンの検出方法や、それに用いられる卵白アレルゲンの検出用キットに関する。
【０００４】
また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性の小麦アレルゲンを定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、小麦の主要タンパク質であるグリアジンを指標とした小麦アレルゲンの検出方法や、それに用いられる小麦アレルゲンの検出用キットに関する。
【０００５】
また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性のそばアレルゲンを定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質を指標としたそばアレルゲンの検出方法や、それに用いられるそばアレルゲンの検出用キットに関する。
【０００６】
また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性の落花生アレルゲンを定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、落花生の主要タンパク質であるＡｒａ ｈ１を指標とした落花生アレルゲンの検出方法や、それに用いられる落花生アレルゲンの検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００７】
自然環境の減少、車や工場などからの排気ガス、住宅事情等、或いは食べ物の変化など様々な因子により、現在では、３人に１人が何らかのアレルギー疾患をもつといわれている。特に、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題を生じている。これらの危害は死に至らせることがあり、未然に処置を施す必要がある。そのためには、表示を通じて消費者へ情報提供の必要性も高まっており、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会は、アレルギー物質として知られている８種の原材料を含む食品にあっては、それを含む旨の表示について合
意し、加盟国で各国の制度に適した表示方法を検討することとした（１９９９年６月）。日本では過去の健康危害などの程度、頻度を考慮して重篤なアレルギー症状を起した実績のある２４品目の食品について、その表示方法が定められた（２００２年４月より施行）。アレルギーを引き起こす食品としては、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母若しくはゼラチンなどが知られており、特に乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼインや、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリンや、卵白アレルゲン成分としてはオボアルブミンとオボムコイドや、小麦アレルゲンの主要成分としてグリアジンや、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質や、落花生の主要タンパク質であるＡｒａ ｈ１が知られている。
【０００８】
従来、アレルゲンの検出する方法としては、例えば、アレルゲンに特異的に反応するイムノグロブリンを定量する方法（特開平０５−２４９１１１号公報参照）や、抗原抗体複合体を含有する検体中の該抗原抗体複合体を酸処理等により解離させ、必要に応じてアルカリを用いて中和処理を行った後、該検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を測定する方法（特開平０７−１４０１４４号公報参照）等が知られている。
【０００９】
また、現在、乳、卵、小麦、そば、落花生の特定原材料を検出するための公定法として、加熱・非加熱複合抗原より得られるポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（特開２００３−１５５２９７号公報参照；以下「市販公定法Ａ」という）、あるいは精製抗原より得られたポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（以下「市販公定法Ｂ」という）が用いられている。これらは、特異的にアレルゲンを検出するために有効な方法であるが問題も多い。例えば、市販公定法Ａでは複合抗原を用いているため、何に対する抗体なのかが不明で、交差性が高く、例えば、イムノブロット法などによる抗原の同定ができず、また非特異反応が増える可能性がある。また、市販公定法Ｂでは、抗原が精製されているため抗体の特異性は明確であるものの、未変性の抗原を用いて作製された抗体を使用しているため、変性／未変性により抗体が結合する程度に違いがあるため、同じ添加量であっても、加熱前、加熱後での定量値が異なるという問題があった。特に、小麦は他の特定原材料（卵、乳、そば、落花生）の中でも過酷な加熱処理が施される場合が多い（例えばパン、唐揚げ等）ため、小麦アレルゲンは未変性から加熱変性まで、広範囲な状態で存在する。そこで、小麦アレルゲンを検出するためには、どの様な状態のアレルゲンに対して結合するかを明らかにしたモノクローナル抗体を作製し、その特性に応じて利用する必要がある。
【００１０】
さらに、卵の同定、定量に関しては、オボムコイドを指標として、すでにポリクローナル抗体を用いた方法（例えば、Int. Archs. Allergy appl. Immun., 75, 8-15, 1984参照）あるいはモノクローナル抗体を用いた方法（例えば、Nutr. Sci. Vitaminol. 45, 491-500, 1999参照）が知られている。また、オボムコイドを認識するモノクローナル抗体で、未変性オボムコイドと反応するが熱変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、熱変性オボムコイドと反応するが未変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、及び未変性オボムコイドと熱変性オボムコイドに反応するモノクローナル抗体を用いて、加熱変性状態をも識別してオボムコイドを定量し、卵アレルゲンの同定と正確な定量を可能とする免疫学的定量方法が報告されている（例えば、特開２００２−２５３２３０号公報参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、乳アレルゲン、卵白アレルゲン、小麦アレルゲン、そばアレルゲン、又は落花生アレルゲンを含む食品において、乳アレルゲン、卵白アレルゲン、小麦アレルゲン、そばアレルゲン、又は落花生アレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても検出できる高感度な免疫学的な検出方法及びそれに用いられる検出キット等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、特定原材料である乳、卵白、小麦、そば又は落花生の各アレルゲンを検出する方法について鋭意検討し、未変性及び変性の乳アレルゲン、未変性及び変性の卵白アレルゲン、未変性及び変性の小麦アレルゲン、未変性及び変性のそばアレルゲン、又は未変性及び変性の落花生アレルゲンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いると、これら特定原材料の各アレルゲンを検出することができることを見い出した。
【００１３】
特定原材料の一つである乳の検出方法の検討を行うに当たっては、カゼインの主要たんぱく質であるαｓ１カゼインを指標として、これに対するモノクローナル抗体（以下ＭＡｂと記す場合がある）を作出し、その中から未変性αｓ１カゼイン、尿素処理αｓ１カゼイン、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを認識することができるＭＡｂを複数選択し、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、未変性αｓ１カゼイン、尿素処理αｓ１カゼイン、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを、１００〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうるＭＡｂの組合わせを見い出した。また、これらのＭＡｂを用いると、食品中の乳アレルゲンがいかなる加工工程を経た場合にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品からの乳アレルゲンを検出しうることを確認した。
【００１４】
また、特定原材料の一つである乳の検出方法の検討を行うに当たって、ホエーの主要たんぱく質であるβラクトグロブリンを指標として、これに対するモノクローナル抗体を作出し、その中から未変性βラクトグロブリン、尿素処理βラクトグロブリン、還元カルボキシメチル化βラクトグロブリンを認識することができるＭＡｂを複数選択し、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、未変性βラクトグロブリン、尿素処理βラクトグロブリン、還元カルボキシメチル化βラクトグロブリンを、３０〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうるＭＡｂの組合わせを見い出した。また、これらのＭＡｂを用いると、食品中の乳アレルゲンがいかなる加工工程を経た場合にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品からの乳アレルゲンを検出しうることを確認した。
【００１５】
特定原材料の一つである卵白の検出方法の検討を行うに当たっては、精製オボアルブミンやオボムコイドに対するモノクローナル抗体を作出し、その中から未変性抗原に結合できるＭＡｂと、変性抗原に結合できるＭＡｂとをそれぞれ複数選択し、未変性抗原結合ＭＡｂ群と変性抗原結合ＭＡｂ群を組み合わせることで、抗原となるオボアルブミンやオボムコイドが変性／未変性のいかなる状態にあっても高感度で検出できることを見い出し、特に未変性抗原結合ＭＡｂ群と変性抗原結合ＭＡｂ群を組み合わせて用いた場合、未変性オボアルブミンやオボムコイドあるいは変性オボアルブミンやオボムコイドのみが存在する場合であっても、未変性抗原結合ＭＡｂ（群）単独使用や変性抗原結合ＭＡｂ（群）単独使用におけるよりも優れた検出感度で検出しうることを確認した。また、卵白アレルゲンであるオボアルブミンとオボムコイドに対するＭＡｂを組み合わせることにより、食品中の卵白がいかなる加工工程を経た場合にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品からの卵白アレルゲンを検出しうることを確認した。
【００１６】
特定原材料の一つである小麦の検出方法の検討を行うに当たっては、精製グリアジンに対するモノクローナル抗体を作出し、その中から未変性小麦グリアジン、還元カルボキシメチル化小麦グリアジン、０．１Ｍ酢酸可溶化小麦グリアジン、７０％エタノール可溶化小麦グリアジン、及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを認識することができるＭＡｂを複数選択し、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、未変性小麦グリアジン、還元カルボキシメチル化小麦グリアジン、０．１Ｍ酢酸可溶化小麦グリアジン、７０％エタノール可溶化小麦グリアジン、及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを、１０〜１００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうるＭＡｂの組合わせを見い出した。また、これらのＭＡｂを用いると、食品中の小麦アレルゲンがいかなる加工工程を経た場合にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品からの小麦アレルゲンを検出しうることを確認した。
【００１７】
特定原材料の一つであるそばの検出方法の検討を行うに当たっては、精製した２４ｋＤａタンパク質、又は精製した７６ｋＤａタンパク質に対するモノクローナル抗体を作出し、その中から２４ｋＤａタンパク質又は７６ｋＤａタンパク質を認識することができるＭＡｂを複数選択し、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、未加熱（未変性）、加熱（変性）のいかなる状態のそばタンパク質でも、高感度で分析できる未変性そばタンパク質に結合可能なＭＡｂと変性そばタンパク質に結合可能なＭＡｂの組合わせを見い出した。また、これらのＭＡｂを用いると、食品中のそばアレルゲンがいかなる加工工程を経た場合にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品からのそばアレルゲンを検出しうることを確認した。
【００１８】
特定原材料の一つである落花生の検出方法の検討を行うに当たっては、精製した未変性のＡｒａ ｈ１（以下「ＮＡｈ１」という場合がある）、又は精製したＡｒａ ｈ１を尿素とｍｌ２−メルカプトエタノールを用いて変性したＡｒａ ｈ１（以下「ＤＡｈ１」という場合がある）に対するモノクローナル抗体を作出し、その中からＮＡｈ１、ＤＡｈ１、未変性の落花生粗タンパク質（以下「ＮＰ−ｅ」という場合がある）、及び／又は尿素処理した落花生粗タンパク質（以下「ＤＰ−ｅ」という場合がある）を認識することができるＭＡｂを複数選択し、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、未加熱（未変性）、加熱（変性）のいかなる状態の落花生タンパク質でも、高感度で分析できるＭＡｂの組合わせを見い出した。また、これらのＭＡｂを用いると、食品中の落花生アレルゲンがいかなる加工工程を経た場合にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品からの落花生アレルゲンを検出しうることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明（乳アレルゲン）の２種類の抗αｓ１カゼインＭＡｂを用いた、各種状態のαｓ１カゼインに対するサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図２】本発明（乳アレルゲン）のＰａｓ１ＣＮ１およびＰａｓ１ＣＮ２の認識する小麦αｓ１カゼインの構成たんぱく質の相違を示す図である。
【図３】本発明（乳アレルゲン）のＰＬＧ２とＰＬＧ１のサンドイッチＥＬＩＳＡによる各種βラクトグロブリンに対する反応性を示す図である。
【図４】本発明（乳アレルゲン）のＰＬＧ２とＰＬＧ３のサンドイッチＥＬＩＳＡによる各種βラクトグロブリンに対する反応性を示す図である。
【図５】本発明（乳アレルゲン）のＭＡｂ混合系でのサンドイッチＥＬＩＳＡによる未変性ラクトグロブリンに対する反応性を示す図である。
【図６】本発明（乳アレルゲン）のＭＡｂ混合系でのサンドイッチＥＬＩＳＡによる尿素変性ラクトグロブリンに対する反応性を示す図である。
【図７】本発明（卵白アレルゲン）の試験１における各希釈段に対する抗オボアルブミンＭＡｂの反応性を示す図である。
【図８】本発明（卵白アレルゲン）の試験２における各希釈段に対する抗オボアルブミンＭＡｂの反応性を示す図である。
【図９】本発明（卵白アレルゲン）の試験３における各希釈段に対する抗オボアルブミンＭＡｂの反応性を示す図である。
【図１０】本発明（卵白アレルゲン）のＰＮＯＭ１およびＰＮＯＭ２のサンドイッチＥＬＩＳＡによる変性／未変性オボムコイドに対する反応性を示す図である。
【図１１】本発明（卵白アレルゲン）のＰＤＯＭ１およびＰＤＯＭ２のサンドイッチＥＬＩＳＡによる変性／未変性オボムコイドに対する反応性を示す図である。
【図１２】本発明（卵白アレルゲン）のＰＮＯＭ２とＰＤＯＭ２及びＰＮＯＭ１とＰＤＯＭ１による変性／未変性オボムコイドに対する反応性を示す図である。
【図１３】本発明（小麦アレルゲン）の２種類の抗グリアジンＭＡｂを用いた、各種状態のグリアジンに対するサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図１４】本発明（小麦アレルゲン）のＰＧＬ１およびＰＧＬ２の認識する小麦グリアジンの構成たんぱく質の相違を示す図である。
【図１５】本発明（そばアレルゲン）のＰＢＷ２およびＰＢＷ３のサンドイッチＥＬＩＳＡによる各種そば粗タンパク質に対する反応性を示す図である。
【図１６】本発明（そばアレルゲン）のＰＢＷ１およびＰＢＷ２のサンドイッチＥＬＩＳＡによる各種そば粗タンパク質に対する反応性を示す図である。
【図１７】本発明（そばアレルゲン）のＰＢＷ１、ＰＢＷ２及びＰＢＷ３のＭＡｂ混合系サンドイッチＥＬＩＳＡによる未変性そば粗タンパク質に対する反応性を示す図である。
【図１８】本発明（そばアレルゲン）のＰＢＷ１、ＰＢＷ２及びＰＢＷ３のＭＡｂ混合系サンドイッチＥＬＩＳＡによる変性そば粗タンパク質に対する反応性を示す図である。
【図１９】本発明（落花生アレルゲン）のＰＡｈ１−１およびＰＡｈ１−２のサンドイッチＥＬＩＳＡによる各種落花生粗タンパク質に対する反応性を示す図である。
【図２０】本発明（落花生アレルゲン）のＰＡｈ１−２およびＰＡｈ１−３のサンドイッチＥＬＩＳＡによる各種落花生粗タンパク質に対する反応性を示す図である。
【図２１】本発明（落花生アレルゲン）のＰＡｈ１−１、ＰＡｈ１−２及びＰＡｈ１−３のＭＡｂ混合系サンドイッチＥＬＩＳＡによる未変性落花生粗タンパク質に対する反応性を示す図である。
【図２２】本発明（落花生アレルゲン）のＰＡｈ１−１、ＰＡｈ１−２及びＰＡｈ１−３のＭＡｂ混合系サンドイッチＥＬＩＳＡによる変性落花生粗タンパク質に対する反応性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の食品中のアレルゲンの検出方法としては、未変性及び変性の乳アレルゲン、未変性及び変性の卵白アレルゲン、未変性及び変性の小麦アレルゲン、未変性及び変性のそばアレルゲン、又は未変性及び変性の落花生アレルゲンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いるアレルゲンの検出方法であって、αｓ１カゼインの主要タンパク質であるαｓ１カゼイン、ホエーの主要たんぱく質であるβラクトグロブリン、卵白主要タンパク質であるオボアルブミンとオボムコイド、小麦の主要タンパク質であるグリアジン、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質、又は落花生の主要タンパク質であるＡｒａ ｈ１を指標とする食品等に含まれるアレルゲンの検出方法であれば特に制限されるものではない。
【００２１】
本発明の乳アレルゲンの検出方法としては、未変性乳アレルゲンを認識するモノクローナル抗体と、変性乳アレルゲンを認識するモノクローナル抗体とを併用する乳アレルゲンの免疫学的な検出方法であれば特に制限されず、また、本発明の乳アレルゲン検出用キットとしては、未変性乳アレルゲンを認識するモノクローナル抗体と、変性乳アレルゲンを認識するモノクローナル抗体とを備え、未変性乳アレルゲンを認識するモノクローナル抗体と変性乳アレルゲンとを認識するモノクローナル抗体とを併用する条件下で用いられる免疫学的なアレルゲン検出用キットであれば特に制限されないが、未変性乳アレルゲン及び／又は変性乳アレルゲンを認識するモノクローナル抗体として、それぞれ異なるエピトープを認識する２以上のモノクローナル抗体を備えたものが好ましい。かかる未変性乳アレルゲン及び／又は変性乳アレルゲンを認識するモノクローナル抗体として、抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体や抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体を具体的に例示することができる。ここで「乳アレルゲン」とは、乳カゼインの主要タンパク質であるαｓ１カゼイン及び／又はホエーの主要たんぱく質であるβラクトグロブリンを含むものをいう。
【００２２】
上記抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体としては、未変性αｓ１カゼイン、尿素処理αｓ１カゼイン、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを認識する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体、好ましくは、配列番号１で示されるαｓ１カゼインのアミノ酸配列の１３２番目から１９３番目までの領域を認識するモノクローナル抗体を挙げることができ、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２等を好適に例示することができる。また、Ｐａｓ１ＣＮ１とＰａｓ１ＣＮ２を組み合わせることで、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。例えば、これらの抗体を用いることで、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中の未変性αｓ１カゼイン及び尿素処理αｓ１カゼインを、１０〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することができる。
【００２３】
上記抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体として、未変性βラクトグロブリン、尿素処理βラクトグロブリン、還元カルボキシメチル化βラクトグロブリンを認識する抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体を挙げることができ、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２８１）が産生する抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰＬＧ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２８２）が産生する抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰＬＧ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２８３）が産生する抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰＬＧ３等を好適に例示することができる。また、ＰＬＧ２とＰＬＧ１や、ＰＬＧ２とＰＬＧ３や、ＰＬＧ２とＰＬＧ１およびＰＬＧ３を組み合わせることで、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。例えば、これらの抗体を用いることで、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中の未変性βラクトグロブリン及び尿素処理βラクトグロブリンを、３０〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することができる。
【００２４】
本発明の乳アレルゲンの検出方法においては、検体から、尿素と２−メルカプトエタノールを用いてカゼイン及び／又はホエータンパク質を抽出することが好ましく、また、未変性カゼインを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体及び変性カゼインを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体、並びに、未変性βラクトグロブリンを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体及び変性βラクトグロブリンを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体を用いることが好ましい。また、本発明の乳アレルゲン検出用キットにおいては、カゼイン及び／又はホエータンパク質を抽出するための尿素と２−メルカプトエタノールを含むものが好ましく、また、未変性カゼインを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体及び変性カゼインを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体、並びに、未変性βラクトグロブリンを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体及び変性βラクトグロブリンを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体を備えるものが好ましい。
【００２５】
本発明の卵白アレルゲンの検出方法としては、未変性卵白アレルゲンを認識するモノクローナル抗体と、変性卵白アレルゲンを認識するモノクローナル抗体とを併用する卵白アレルゲンの免疫学的な検出方法であれば特に制限されず、また、本発明の卵白アレルゲン検出用キットとしては、未変性卵白アレルゲンを認識するモノクローナル抗体と、変性卵白アレルゲンを認識するモノクローナル抗体とを備え、未変性卵白アレルゲンを認識するモノクローナル抗体と変性卵白アレルゲンとを認識するモノクローナル抗体とを併用する条件下で用いられる免疫学的なアレルゲン検出用キットであれば特に制限されず、未変性卵白アレルゲン及び／又は変性卵白アレルゲンを認識するモノクローナル抗体として、それぞれ異なるエピトープを認識する２以上のモノクローナル抗体を備えたものが好ましい。かかる未変性卵白アレルゲン及び／又は変性卵白アレルゲンを認識するモノクローナル抗体として、抗オボアルブミンモノクローナル抗体や抗オボムコイドモノクローナル抗体を具体的に例示することができる。ここで「卵白アレルゲン」とは、卵白の主要タンパク質であるオボアルブミン及び／又はオボムコイドを含むものをいう。
【００２６】
上記抗オボアルブミンモノクローナル抗体としては、未変性オボアルブミン及び／又は還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識する抗オボアルブミンモノクローナル抗体が好ましく、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２等を好適に例示することができる。また、ＰＮＯＡ１とＰＮＯＡ２等の抗未変性オボアルブミンモノクローナル抗体や、ＰＤＯＡ１とＰＤＯＡ２等の抗変性オボアルブミンモノクローナル抗体の組み合せ、特にＰＮＯＡ１とＰＮＯＡ２等の抗未変性オボアルブミンモノクローナル抗体とＰＤＯＡ１とＰＤＯＡ２等の抗変性オボアルブミンモノクローナル抗体を組み合わせることで、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。例えば、これらの抗体を用いることで、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中の未変性オボアルブミン及び／又は変性オボアルブミンを、１．０〜１０．０ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することができる。
【００２７】
上記抗オボムコイドモノクローナル抗体として、未変性オボムコイド及び／又は尿素変性オボムコイドを認識する抗オボムコイドモノクローナル抗体を挙げることができ、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７９）が産生する抗オボムコイドモノクローナル抗体ＰＮＯＭ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２８０）が産生する抗オボムコイドモノクローナル抗体ＰＮＯＭ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７７）が産生する抗オボムコイドモノクローナル抗体ＰＤＯＭ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７８）が産生する抗オボムコイドモノクローナル抗体ＰＤＯＭ２等を好適に例示することができる。また、ＰＮＯＭ１とＰＮＯＭ２等の抗未変性オボムコイドモノクローナル抗体や、ＰＤＯＭ１とＰＤＯＭ２等の抗変性オボムコイドモノクローナル抗体の組み合せ、特にＰＮＯＭ１とＰＮＯＭ２等の抗未変性オボムコイドモノクローナル抗体とＰＤＯＭ１とＰＤＯＭ２等の抗変性オボムコイドモノクローナル抗体を組み合わせることで、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。例えば、これらの抗体を用いることで、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中の未変性オボムコイド及び／又は変性オボムコイドを、１０〜１００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することができる。
【００２８】
本発明の卵白アレルゲンの検出方法においては、尿素と２−メルカプトエタノールを用いてオボアルブミン及び／又はオボムコイドを抽出することが好ましく、また、未変性オボアルブミンを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体及び変性オボアルブミンを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体、並びに、未変性オボムコイドを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体及び変性オボムコイドを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体を用いることが好ましい。また、本発明の卵白アレルゲン検出用キットにおいては、オボアルブミン及び／又はオボムコイドを抽出するための尿素と２−メルカプトエタノールを含むものが好ましく、また、未変性オボアルブミンを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体及び変性オボアルブミンを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体、並びに、未変性オボムコイドを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体及び変性オボムコイドを認識する１又は２以上のモノクローナル抗体を備えるものが好ましい。
【００２９】
本発明の小麦アレルゲンの検出方法としては、未変性小麦グリアジン及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを認識する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体を用いる小麦アレルゲンの免疫学的な検出方法や、未変性小麦グリアジン及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種類の抗小麦グリアジンモノクローナル抗体を併用する小麦アレルゲンの免疫学的な検出方法であれば特に制限されず、また、本発明の小麦アレルゲン検出用キットとしては、未変性小麦グリアジン及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを認識する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体を備えた免疫学的なアレルゲン検出用キットや、未変性小麦グリアジン及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種類の抗小麦グリアジンモノクローナル抗体を備えた免疫学的なアレルゲン検出用キットであれば特に制限されず、上記抗小麦グリアジンモノクローナル抗体としては、未変性小麦グリアジン、還元カルボキシメチル化小麦グリアジン、０．１Ｍ酢酸可溶化小麦グリアジン、７０％エタノール可溶化小麦グリアジン、及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを認識する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体が好ましく、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２等を好適に例示することができる。これらの抗体を組み合わせることで、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中の未変性小麦グリアジン、還元カルボキシメチル化小麦グリアジン、０．１Ｍ酢酸可溶化小麦グリアジン、７０％エタノール可溶化小麦グリアジン、及び変性剤で可溶化した小麦グリアジンを、１０〜１００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することができる。
【００３０】
本発明のそばアレルゲンの検出方法としては、未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体を用いるそばアレルゲンの免疫学的な検出方法や、未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種類の抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体を併用するそばアレルゲンの免疫学的な検出方法であれば特に制限されず、また、本発明のそばアレルゲン検出用キットとしては、未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体を備えた免疫学的なアレルゲン検出用キットや、未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種類の抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体を備えた免疫学的なアレルゲン検出用キットであれば特に制限されず、抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体としては、２４Ｄａタンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体、又は７６ｋＤａタンパク質及び未変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体が好ましく、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７２）が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７３）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７４）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ３等を好適に例示することができる。また、ＰＢＷ１等の２４Ｄａタンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体と、ＰＢＷ２等の７６ｋＤａタンパク質及び未変性そば粗タンパク質を認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体との組合せや、ＰＢＷ２とＰＢＷ３等の未変性そば粗タンパク質と加熱変性そば粗タンパク質を共に認識する抗そば粗タンパク質モノクローナル抗体との組み合わせ、中でも、これらのモノクローナル抗体の混合系として組み合わせることで、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、未変性そば粗タンパク質及び加熱変性そば粗タンパク質を、１０〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することができる。
【００３１】
さらに、本発明ののそばアレルゲンの検出方法においては、検体から、尿素と２−メルカプトエタノールを用いて加熱変性そば粗タンパク質を抽出することが好ましく、また、本発明のそばアレルゲン検出用キットとしては、検体からのそば粗タンパク質抽出剤としての、尿素と２−メルカプトエタノールが備えられているものが好ましい。
【００３２】
本発明の落花生アレルゲンの検出方法としては、未変性落花生Ａｒａ ｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａ ｈ１タンパク質を認識する抗Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体を用いる落花生アレルゲンの免疫学的な検出方法や、未変性落花生Ａｒａ ｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａ ｈ１タンパク質を認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種類の抗Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体を併用する落花生アレルゲンの免疫学的な検出方法であれば特に制限されず、また、本発明の落花生アレルゲン検出用キットとしては、未変性落花生Ａｒａ ｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａ ｈ１タンパク質を認識する抗落花生Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体を備えた免疫学的なアレルゲン検出用キットや、未変性落花生Ａｒａ ｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａ ｈ１タンパク質を認識し、かつ異なるエピトープを認識する２種類の抗落花生Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体を備えた免疫学的なアレルゲン検出用キットであれば特に制限されず、抗Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体としては、未変性Ａｒａ ｈ１タンパク質と未変性落花生粗タンパク質、及び／又は、尿素処理Ａｒａ ｈ１タンパク質と尿素処理落花生粗タンパク質を認識する抗Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体が好ましく、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６９）が産生する抗未変性Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７０）が産生する抗未変性Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−２、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７１）が産生する抗加熱変性Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−３等を好適に例示することができる。また、ＰＡｈ１−１等の未変性Ａｒａ ｈ１タンパク質と未変性落花生粗タンパク質を認識する抗Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体と、ＰＡｈ１−２等の未変性／変性Ａｒａ ｈ１タンパク質と未変性／変性落花生粗タンパク質を認識する抗Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体との組合せや、ＰＡｈ１−２とＰＡｈ１−３等の未変性／変性Ａｒａ ｈ１タンパク質と未変性／変性落花生粗タンパク質を認識する抗Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体同士の組み合わせ、中でも、これらのモノクローナル抗体の混合系として組み合わせることで、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、未変性落花生Ａｒａ ｈ１タンパク質及び加熱変性落花生Ａｒａ ｈ１タンパク質を、１０〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することができる。
【００３３】
さらに、本発明の落花生アレルゲンの検出方法においては、検体から、尿素と２−メルカプトエタノールを用いて加熱変性落花生粗タンパク質を抽出することが好ましく、また、本発明の落花生アレルゲン検出用キットとしては、検体からの加熱変性落花生粗タンパク質抽出剤としての、尿素と２−メルカプトエタノールが備えられているものが好ましい。
【００３４】
以上の本発明の免疫学的なアレルゲンの検出方法は、未変性／変性の乳アレルゲン、未変性及び変性の卵白アレルゲン、未変性及び変性の小麦アレルゲン、未変性及び変性のそばアレルゲン、又は未変性及び変性の落花生アレルゲン（以下「食物アレルゲン」ということがある）を含む試料を、標識化した抗食物アレルゲンＭＡｂと接触させ、あるいは標識化した抗体の存在下に食物アレルゲンＭＡｂと接触させ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識物質を用いて分離・測定する検出段階とからなり、かかる免疫反応段階における抗原抗体反応の方法も特に制限されず、例えば、以下の方法を例示することができる。
【００３５】
不溶性担体に結合した本発明の抗食物アレルゲンＭＡｂに試料中の食物アレルゲンを捕捉させた後に標識化抗ＩｇＧ抗体を反応させるサンドイッチ法や、不溶性担体に結合した抗食物アレルゲンＭＡｂと異なるエピトープを認識する標識抗食物アレルゲンＭＡｂ（第二抗体）を用いるサンドイッチ二抗体法や、不溶性担体に結合した抗食物アレルゲンＭＡｂに試料中の食物アレルゲンを標識化抗原の存在下で反応させる競合法や、食物アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する磁気ビーズ結合標識抗食物アレルゲンＭＡｂを作用させさせた後、磁力により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する磁気ビーズ法や、食物アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する標識抗食物アレルゲンＭＡｂを作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法や、金コロイド等で標識された抗食物アレルゲンＭＡｂと食物アレルゲンであるタンパク質が結合した抗原抗体複合体が試験ストリップ上を毛管現象等により移動する途中に、食物アレルゲンと結合する抗食物アレルゲンＭＡｂをあらかじめ固定しておき、抗原抗体複合体を補足させることで現れる着色ラインの有無によって定性分析するイムノクロマト法の他、二重免疫拡散法、放射免疫拡散法など公知の免疫測定法を利用することができるが、抗食物アレルゲンＭＡｂとして、それぞれ異なるエピトープを認識する２以上のモノクローナル抗体を用いる方法、例えば、食品中の未変性アレルゲン及び／又は変性アレルゲンが１００〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる高感度の点でサンドイッチ二抗体法が、定性的には簡便性からイムノクロマト法が好ましい。また、食肉製品等の食品試料中からアレルゲンを抽出する場合、尿素と２−メルカプトエタノールを用いることが望ましい。
【００３６】
上記抗原抗体反応において用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等を挙げることができ、また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管、ラテックスビーズ状等の種々の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は特に限定されるものでなく、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
【００３７】
本発明の食物アレルゲンの検出方法や食物アレルゲン検出用キットに用いられる抗食物アレルゲンＭＡｂの免疫グロブリンのクラス及びタイプは特に制限されないが、抗食物アレルゲンＭＡｂとして、ＩｇＧクラス、タイプκの抗体が好適に用いられる。また、モノクローナル抗体の形態としては、全抗体又はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ等の断片を用いることもできる。抗体の由来は特に限定されるものではないが、マウス、ラット、ヒト、兎、鶏等を挙げることができるが、作製の簡便性からマウスに由来するモノクローナル抗体が好適に用いられる。また、抗食物アレルゲンＭＡｂは、未変性又は変性のαｓ１カゼインで免疫した動物から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により調製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造することができる。
【００３８】
抗食物アレルゲンＭＡｂ産生ハイブリドーマは、例えば、未変性及び／又は変性の食物アレルゲンを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗食物アレルゲンＭＡｂ産生ハイブリドーマを作出することができる。上記の抗体産生細胞としては、例えば未変性及び／若しくは変性の食物アレルゲン又はこれを含有する組成物を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等を挙げることができる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えば未変性及び／又は変性の食物アレルゲンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。
【００３９】
細胞融合は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、抗食物アレルゲンＭＡｂを産生するハイブリドーマを得ることができる。また、αｓ１カゼイン等の未変性の食物アレルゲンのみを用いて免疫した抗免疫動物から、有利に抗変性食物アレルゲンＭＡｂを得ることができる場合もある。この場合、抗変性αｓ１カゼインＭＡｂ等の抗変性食物アレルゲンＭＡｂ産生ハイブリドーマをスクリーニングしてもよいし、あるいは、固相状態でのＥＬＩＳＡで未変性のαｓ１カゼイン等の未変性の食物アレルゲンに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択し、この抗体産生ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体から液相状態で未変性の食物アレルゲンに対してのみ特異的に反応する抗食物アレルゲンＭＡｂを得ることができる。前記のように、抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取することができるが、培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、例えば、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。
【００４０】
また、標識化抗体作製に用いられる標識物質としては、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質であればよく、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、金コロイド等を使用するのができ、酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等を、蛍光物質としては、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等を、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等を、放射性物質としては３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等を例示することができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、発光剤等が用いることができる。
【００４１】
本発明の食物アレルゲン検出用キットには、有効成分としての抗食物アレルゲンＭＡｂ、好ましくはそれぞれ異なるエピトープを認識する２以上の抗食物アレルゲンＭＡｂを含むが、これらは保存安定性の点から、溶液状態よりも凍結乾燥物として収容されていることが好ましく、検出用キットにはかかる抗食物アレルゲンＭＡｂ溶解する緩衝液や培養液の他、試料を調製するための緩衝液等を含んでいてもよい。また、より好ましい別の態様の本発明の抗食物アレルゲン検出用キットとしては、前記イムノクロマト法における試験ストリップを挙げることができる。この場合、異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つを、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体とすることが好ましい。
【００４２】
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１や、
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２８１）が産生する抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰＬＧ１や、
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２８２）が産生する抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰＬＧ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２８３）が産生する抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体ＰＬＧ３や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７９）が産生する抗オボムコイドモノクローナル抗体ＰＮＯＭ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２８０）が産生する抗オボムコイドモノクローナル抗体ＰＮＯＭ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７７）が産生する抗オボムコイドモノクローナル抗体ＰＤＯＭ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７８）が産生する抗オボムコイドモノクローナル抗体ＰＤＯＭ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６７）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６８）が産生する抗小麦グリアジンモノクローナル抗体ＰＧＬ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７２）が産生する抗２４ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７３）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７４）が産生する抗７６ｋＤａタンパク質モノクローナル抗体ＰＢＷ３や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６９）が産生する抗未変性Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７０）が産生する抗未変性Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７１）が産生する抗加熱変性Ａｒａ ｈ１タンパク質モノクローナル抗体ＰＡｈ１−３を挙げることができ、これらハイブリドーマは、平成１７（２００５）年２月２４日（受領日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受領されている。なお、上記Ｐａｓ１ＣＮ１（ＦＥＲＭ Ｐ−２０２０６）、Ｐａｓ１ＣＮ２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０２０７）、ＰＮＯＡ１（ＦＥＲＭ Ｐ−２０２０８）、ＰＮＯＡ２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０２０９）、ＰＧＬ１（ＦＥＲＭ Ｐ−２０２１０）、ＰＧＬ２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０２１１）は平成１６（２００４）年９月７日（受託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託されていたものである。
【００４３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
１．抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体の確立
１−１ 材料及び方法
１）αｓ１カゼイン（以下「αＣＮ」という）の調製
新鮮な牛乳よりZittle（1959）に従い、αＣＮの粗画分を得た。この粗画分をさらにＴＳＫ ｇｅｌ ＤＥＡＥ ６５０Ｓ（TOSOH）を用いて、５０ｍＭのイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．４）、４Ｍの尿素を含むＮａＣｌのリニアグラジエント（０から０．３Ｍ）により精製を行った。精製したαＣＮ画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行った。生理食塩水でこの凍結乾燥物の０．１％溶液を調製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μＬずつ分注し、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管し、抗原溶液とした。
【００４５】
２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のαＣＮが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のαＣＮが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【００４６】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でαＣＮを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗αＣＮ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【００４７】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％αＣＮ溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００mｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００４８】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗αＣＮ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりαＣＮに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ cell/wellとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６cells/wellとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。
クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００４９】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性αＣＮ（以下「Ｎ−αＣＮ」という）、尿素処理αＣＮ（以下「Ｄ−αＣＮ」という）、市販のカゼインナトリウムの未変性物（以下「Ｎ−ＣＮ」という）又は市販のカゼインナトリウムの尿素処理物（以下「Ｄ−ＣＮ」という）の４種類のたんぱく質に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。Ｄ−αＣＮは、精製αＣＮを１ｍｇ量り、５％ＥＤＴＡ１００μｌ、尿素６．０ｇ、２−メルカプトエタノール０．２ｍｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、蒸留水１．５ｍｌを加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。培養上清のＮ−αＣＮ、Ｄ−αＣＮ、Ｎ−ＣＮあるいはＤ−ＣＮに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにて調べた。
【００５０】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein Ｇカラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【００５１】
８）ＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoαＣＮobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【００５２】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【００５３】
１−２ 結果 
１）ＭＡｂの選択
乳の主要アレルゲンであるαｓ１カゼイン（αＣＮ）を特異的に認識する６種類のＭＡｂが得られた。これら６種類のＭＡｂにおける、それぞれ固相とした各抗原Ｎ−αＣＮ、Ｄ−αＣＮ、Ｎ−ＣＮ、又はＤ−ＣＮに対する特異性をダイレクトＥＬＩＳＡにより調べた。また、これらＭＡｂのクラス、サブクラスについても調べた。結果を表1に示す。表１中、＋は各固相抗原に対し陽性であることを、−は陰性であることを示す。表１に示されるように、全ての状態の抗原に結合するＭＡｂであるＰａｓ１ＣＮ１、Ｐａｓ１ＣＮ２、Ｐａｓ１ＣＮ３を選択した。
【００５４】
【表１】
2009244276.tif 000002
【００５５】
２）サンドイッチＥＬＩＳＡにおける組合せ条件
ダイレクトＥＬＩＳＡで選択したＰａｓ１ＣＮ１、Ｐａｓ１ＣＮ２、Ｐａｓ１ＣＮ３を用いて、全てのＭＡｂの組合わせについてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。Ｐａｓ１ＣＮ１、Ｐａｓ１ＣＮ２、Ｐａｓ１ＣＮ３をそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、αＣＮあるいはＣＮを検出するためのＭＡｂの組合せを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより選出した。その結果、Ｎ−αＣＮ、Ｄ−αＣＮ、Ｎ−ＣＮ、Ｄ−ＣＮを検出できる組合せとしてＰａｓ１ＣＮ１（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６３）とＰａｓ１ＣＮ２（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６４）を選択した。結果を図１に示す。
２．Ｐａｓ１ＣＮ１とＰａｓ１ＣＮ２の認識するエピトープ
αｓ１カゼイン溶液を、リシルエンドプロテアーゼで分解し、分解物をトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（分離ゲル１６．５％、濃縮ゲル５％）により分離した。分離したゲルを用いて、エレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写した。転写したＰＶＤＦ膜にＰａｓ１ＣＮ１とＰａｓ１ＣＮ２の培養上清（１／１０００）を反応させたのち、発色させて、認識するエピトープを確認した。結果を図２に示す。その結果、認識部位はＰａｓ１ＣＮ１とＰａｓ１ＣＮ２ともに、分子量約７０００、配列番号１で示されるαｓ１カゼインのアミノ酸配列の１３２番目から１９３番目までの領域を認識した。
【００５６】
３．サンドイッチＥＬＩＳＡによる食品中の変性および未変性カゼインの検出
上記１．で選択されたＰａｓ１ＣＮ１とＰａｓ１ＣＮ２の組合せにより、実際の食品中のカゼインを検出できるかを試みた。
【００５７】
３−１ 材料及び方法
１）モデル食肉製品の作製
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表２に示す配合にて各濃度のカゼインナトリウムを含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。
【００５８】
【表２】
2009244276.tif 000003
【００５９】
各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行い、７５℃で３０分の加熱を行った。
２）サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量分析
各モデル食肉製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプルを２ｇを量り取り、１Ｍ尿素および０．１％ ２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳＴを３８ｇ加え１００℃、一時間加熱処理を行った。冷却後、３，０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離を行い、上清０．５ｍｌにＰＢＳＴを９．５ｍｌ加え、ＥＬＩＳＡ用サンプルとした。検量線には同様に尿素・２−メルカプトエタノール処理を行ったカゼインナトリウムの段階希釈を用いた。また、分析用サンプルからＰＢＳＴを用いて抽出し、ＰＢＳＴ（ＰＢＳにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを０．５％加えたもの）に溶解したカゼインナトリウムを検量線とした尿素および２−メルカプトエタノールを用いない場合との比較を行った。
【００６０】
３−２ 結果
サンドイッチＥＬＩＳＡによるモデル食肉製品中のカゼインナトリウムの分析について、尿素および２−メルカプトエタノールを用いた結果を表３に、また、ＰＢＳＴのみで抽出した結果を表４に示す。
【００６１】
【表３】
2009244276.tif 000004
【００６２】
【表４】
2009244276.tif 000005
【００６３】
以上の結果から、尿素および２−メルカプトエタノールを抽出液に加えた場合に、高い回収率でモデル食肉製品中のカゼインナトリウムを検出可能であり、ＰＢＳＴ抽出では非常に低い回収率となった。これらのことから、食品中からのカゼインナトリウムの抽出には尿素および２−メルカプトエタノールを用いることが有効であり、その場合に利用するＭＡｂの特性には、尿素可溶化カゼインに結合可能であることが必要であることが明らかとなった。
【００６４】
４．イムノクロマトによる変性および未変性カゼインナトリウムの検出
４−１材料および方法
１）金コロイド標識およびコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰａｓ１ＣＮ１のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッドに６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【００６５】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようＰａｓ１ＣＮ２のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【００６６】
３）イムノクロマトストリップの組立と評価
上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドをそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。被検液としては、上記調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。
【００６７】
４−２ 結果
Ｐａｓ１ＣＮ２および金コロイド標識Ｐａｓ１ＣＮ１の組合せによりカゼインナトリウムは加熱、非加熱に係わらず５０ｐｐｂ（食品中２ｐｐｍ）まで検出することができた。この結果から、製造工程中に混入した未変性カゼインナトリウムが対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。
【００６８】
市販のアレルゲン検出用イムノクロマトストリップでは、ブランクとして０．０１Ｍの尿素のみを含むＰＢＳを滴下したところ、非特異的なバンドが生じてしまい、擬陽性となってしまった。これでは、加熱などにより変性した食品たんぱく中から効率よくアレルゲンを抽出するためのたんぱく質変性剤を使用できず、アレルゲンとして検出できる対象が極めて狭い範囲に限られてしまう危険性が考えられた。
【００６９】
５．抗βラクトグロブリンモノクローナル抗体の確立
５−１ 材料及び方法
１）βラクトグロブリン（以下「βＬＧ」ということがある）の調製
新鮮な牛乳よりZittle（1959）に従い、ホエーの粗画分を得た。この粗画分をさらにＴＳＫ ｇｅｌ ＤＥＡＥ ６５０Ｓ（TOSOH）を用いて、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５）、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０から０．４Ｍ）により精製を行った。精製したβＬＧ画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行い、未変性βＬＧ（以下「N−βＬＧ」ということがある）とした。このN−βＬＧを１０ｍｇ量り、１．４Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％のＥＤＴＡ１００μｌ、尿素１．２ｇ、２−メルカプトエタノール３３μｌを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行い、さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行い、還元カルボキシメチル化βＬＧ（以下「Ｒ−βＬＧ」ということがある）とした。生理食塩水でこれらの凍結乾燥物の０．１％溶液を調製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注し、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管し、抗原溶液とした。
【００７０】
２）免疫
供試動物として、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のN−βＬＧ又はＲ−βＬＧが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、２週間の間隔で３回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のN−βＬＧ又はＲ−βＬＧが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【００７１】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でN−βＬＧ又はＲ−βＬＧを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗N−βＬＧ抗体価及び抗Ｒ−βＬＧ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【００７２】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％のN−βＬＧ溶液又はＲ−βＬＧ溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００mｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００７３】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗N−βＬＧ抗体又は抗Ｒ−βＬＧ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりN−βＬＧ又はＲ−βＬＧに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９cell/wellとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６cells/wellとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００７４】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、N−βＬＧ、Ｒ−βＬＧ及び尿素処理βＬＧ（以下「Ｄ−βＬＧ」という）の３種類のたんぱく質に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。Ｄ−βＬＧは、N−βＬＧを１ｍｇ量り、６．０ｇの尿素、０．２ｍｌの２−メルカプトエタノール、１ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）、１．５ｍｌの蒸留水を加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。培養上清のN−βＬＧ、Ｒ−βＬＧあるいはＤ−βＬＧに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにて調べた。
【００７５】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein Ｇ カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【００７６】
８）ＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
抗N−βＬＧＭＡｂ又は抗Ｒ−βＬＧＭＡｂの特性を決定するために、固相法を用いた。固相法として、N−βＬＧ、Ｒ−βＬＧ又はＤ−βＬＧをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原に抗N−βＬＧＭＡｂ又は抗Ｒ−βＬＧＭＡｂを作用させる方法を用いた。ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoαＣＮobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【００７７】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【００７８】
５−２ 結果 
１）抗N−βＬＧＭＡｂと抗Ｒ−βＬＧＭＡｂの特性とクラス、サブクラス
N−βＬＧに対する特異性を持つＭＡｂ１３種類を得た。それぞれ固相の抗原に対する特異性を表５に示した。
【００７９】
【表５】
2009244276.tif 000006
【００８０】
２）サンドイッチＥＬＩＳＡにおける組合せ条件
固相の抗原に対し陽性反応を示した各ＭＡｂをそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、N−βＬＧ及びＤ−βＬＧを検出するためのＭＡｂの組合せを、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。その結果、N−βＬＧ及びＤ−βＬＧを検出できる組合せとして、プレート固定化抗体ＰＬＧ２（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２８２）と、ビオチン化抗体ＰＬＧ１（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２８１）又はＰＬＧ３（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２８３）を選択した。ＰＬＧ２とＰＬＧ１のサンドイッチＥＬＩＳＡによるN−βＬＧ及びＤ−βＬＧに対する反応性の結果を図３に示す。また、ＰＬＧ２とＰＬＧ３のサンドイッチＥＬＩＳＡによるN−βＬＧ及びＤ−βＬＧに対する反応性を図４に示す。
【００８１】
３）ＭＡｂ混合系でのＮ−βＬＧ、Ｄ−βＬＧの検出
サンドイッチＥＬＩＳＡにより選択した組合せ（固相にＰＬＧ２、ビオチン化にＰＬＧ１およびＰＬＧ３）を用い、Ｎ−βＬＧとＤ−βＬＧの検出感度を確認したところ、図５及び図６に示すように、ＭＡｂ混合系でＮ−βＬＧ、Ｄ−βＬＧともにＭＡｂ混合系の方が吸光値は高く、検出感度を上げることが可能であることが明らかとなった。
【００８２】
６．サンドイッチＥＬＩＳＡによる食品中のホエータンパク質の検出
上記１．で選択されたＰＬＧ２とＰＬＧ１、及びＰＬＧ２とＰＬＧ３の組合せにより、実際の食品中のホエータンパク質質を検出できるかを試みた。
【００８３】
６−１ 材料及び方法
１）モデル食肉製品の作製
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表６に示す配合にて各濃度のホエータンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行い、７５℃で３０分の加熱を行った。
【００８４】
【表６】
2009244276.tif 000007
【００８５】
２）サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量分析
各モデル食肉製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル１ｇを量り取り、１０Ｍ尿素および０．１％の２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳＴ（ＰＢＳにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを０．５％加えたもの）を１９ｇ加え、ホモジナイザーにて３０秒攪拌した。その後、１００℃で１時間加熱処理を行った。冷却後、３，０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離を行い、上清０．５ｍｌにＰＢＳＴを９．５ｍｌ加え、ＥＬＩＳＡ用サンプルとした。検量線には同様に１０Ｍ尿素及び０．１％の２−メルカプトエタノール処理を行ったホエータンパク質の段階希釈を用いた。また、分析用サンプルからＰＢＳＴを用いて抽出し、ＰＢＳＴに溶解したホエータンパク質を検量線とした尿素及び２−メルカプトエタノールを用いない場合との比較を行った。
【００８６】
６−２ 結果
サンドイッチＥＬＩＳＡによるモデル食肉製品中のホエータンパク質の分析について、尿素および２−メルカプトエタノールを用いて抽出したモデル食肉製品中のホエータンパク質の分析結果を表７に、また、ＰＢＳＴのみで抽出したモデル食肉製品中のホエータンパク質の分析結果を表８に示す。
【００８７】
【表７】
2009244276.tif 000008
【００８８】
【表８】
2009244276.tif 000009
【００８９】
以上の結果から、尿素および２−メルカプトエタノールを抽出液に加えた場合に、高い回収率でモデル食肉製品中のホエータンパク質を検出可能であり、ＰＢＳＴ抽出では検出できなかった。これらのことから、食品中からのホエータンパク質の抽出には尿素および２−メルカプトエタノールを用いることが有効であり、その場合に利用するＭＡｂの特性には、尿素で変性させたβＬＧに結合可能であることが必要であることが明らかとなった。
【００９０】
７．イムノクロマトによる変性および未変性カゼインナトリウムの検出
７−１ 材料および方法
１）金コロイド標識およびコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＬＧ１及びＰＬＧ３のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝２．０になるよう調製し、１：１の割合で混合した。ガラスウール製コンジュゲートパッドに６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【００９１】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようＰＬＧ２のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で３７℃で１時間ブロッキング後、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄し乾燥させた。
【００９２】
３）イムノクロマトストリップの組立と評価
上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドをそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。被検液としては、上記２．で調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。
【００９３】
７−２ 結果
メンブレン塗布ＭＡｂであるＰＬＧ２、および金コロイド標識ＭＡｂであるＰＬＧ１＋ＰＬＧ３の組合せにより、ホエータンパク質は加熱、非加熱に係わらず５０ｐｐｂ（食品中２ｐｐｍ）まで検出することができた。この結果から、製造工程中に混入したホエーたんぱく質が対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。
【００９４】
市販のアレルゲン検出用イムノクロマトストリップでは、ブランクとして０．１Ｍ尿素、０．２％２−ＭＥを含むＰＢＳを滴下したところ、非特異的なバンドが生じてしまい、擬陽性となってしまった。これでは、加熱などにより変性した食品たんぱく中から効率よくアレルゲンを抽出するためのたんぱく質変性剤を使用できず、アレルゲンとして検出できる対象が極めて狭い範囲に限られてしまう危険性が考えられた。
【実施例２】
【００９５】
１．変性／未変性オボアルブミンに結合可能なＭＡｂの確立
１−１ 材料及び方法
１）ニワトリオボアルブミン（以下「ＯＡ」ということがある）の調製
新鮮なニワトリ卵より卵白のみを採取し、泡立てないように均質化後、等量の飽和硫酸アンモニウムを加え、濾紙Ｎｏ．１（アドバンテック東洋）で濾過した。そして、得られたろ液に０．５Ｍの硫酸を添加しｐＨ４．６に調整後、一晩放置した。８，０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離により得られた沈殿を蒸留水に溶解し、同じ方法で再結晶化し、粗ＯＡ画分を得た。粗ＯＡはさらに、TSK gel DEAE 650S（Tosoh）を用いたイオン交換クロマトグラフィにより精製した。移動相には５０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．４）を用い、ＮａＣｌの０から０．３ＭのリニアグラジェントによりＯＡを分画し、透析による脱塩後、凍結乾燥を行った。この凍結乾燥ＯＡを用い、生理食塩水で０．１％のＯＡ溶液を作製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管した。
【００９６】
２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）４尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＯＡが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＯＡが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。なお、抗変性ＯＡＭＡｂを得る場合、最終免疫のみに後述する還元カルボキシメチル化ＯＡを用いた。
【００９７】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＯＡを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＯＡ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【００９８】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％ＯＡ溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００mｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００９９】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＯＡ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＯＡに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ cell/wellとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６cells/wellとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【０１００】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性ＯＡ（以下「ＮＯＡ」ということがある）あるいは還元カルボキシメチル化ＯＡ（以下「ＲＣＭＯＡ」ということがある）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。ＲＣＭＯＡは、精製ＯＡ（上記凍結乾燥物）を１０ｍｇ量り、１．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％のＥＤＴＡ１００μｌ、１．２ｇの尿素、３３μｌの２−メルカプトエタノールを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行った。さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行い、ＲＣＭＯＡとした。培養上清のＮＯＡあるいはＲＣＭＯＡに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにより調べた。
【０１０１】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【０１０２】
８）ＭＡｂの特性とＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
抗ＯＡＭＡｂの特性を決定するために、固相法と液相法を用いた。固相法として、ＮＯＡ又はＲＣＭＯＡをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原（ＮＯＡ又はＲＣＭＯＡ）に抗未変性／変性ＯＡＭＡｂを作用させる方法を用い、また、液相法として、ウサギ抗ＯＡポリクローナル抗体をあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、このポリクローナル抗体にＮＯＡ又はＲＣＭＯＡを結合させた状態で、抗未変性／変性ＯＡＭＡｂを作用させる方法を用いた。また、ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【０１０３】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【０１０４】
１−２ 結果
１）抗ＯＡＭＡｂの特性とクラス、サブクラス
ＮＯＡに対する特異性を持つＭＡｂ９種類、及び、ＲＣＭＯＡに対する特異性を持つＭＡｂ１０種類を得た。それぞれ液相あるいは固相の抗原に対する特異性を表９に示した。
【０１０５】
【表９】
2009244276.tif 000010
2009244276.tif 000011
【０１０６】
２）組合せ条件
ＮＯＡを検出するためのＭＡｂあるいはＲＣＭＯＡを検出するためのＭＡｂの組合せは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。その結果、ＮＯＡでは３０１Ｂ５と３１６Ｇ１や３０４Ｅ４（ＰＮＯＡ１；ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６５）と３０６Ｂ２（ＰＮＯＡ２；ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６６）、ＲＣＭＯＡでは１１７Ｆ９と１１９Ｄ１１や９４８Ｇ１１（ＰＤＯＡ１；ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７５）と９６２Ｂ８（ＰＤＯＡ２；ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７６）を高い組合せとして選択した。
【０１０７】
２．サンドイッチＥＬＩＳＡによる変性及び未変性抗原の検出
２−１ 材料及び方法
ＮＯＡ溶液は、精製ＯＡをＰＢＳで１００ｐｐｂ溶液となるように調製し、３倍の希釈段を作製した（希釈段Ａ）。一方、ガラス試験管に精製ＯＡを１ｍｇ量り、６ｇの尿素、０．２ｍｌの２−メルカプトエタノール、１ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）、１．５ｍｌの蒸留水を加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。冷却後、１００ｍｌ容メスフラスコに移し、ＰＢＳで１００ｍｌにメスアップした。これをさらにＰＢＳで１００倍希釈し、尿素変性ＯＡ（以下「ＵＤＯＡ」という）１００ｐｐｂ溶液とした。さらに尿素濃度を０．０１Ｍに保ちながら３倍の希釈段を作製した（希釈段Ｂ）。また、ＮＯＡ１００ｐｐｂ溶液とＵＤＯＡ１００ｐｐｂ溶液を等量ずつ混ぜ（ＮＯＡ及びＵＤＯＡは各５０ｐｐｂ溶液となる）、尿素濃度を０．００５Ｍに保ちながら３倍の希釈段を作製した（希釈段Ｃ）。また、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試した条件を表１０に示す。コーティングＭＡｂ濃度は単独の場合は２５μｇ／ｍｌに、また混合した場合には各１２．５μｇ／ｍｌとし、合計で２５μｇ／ｍｌとなるようにした。
【０１０８】
【表１０】
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【０１０９】
２−２ 結果
図７に示すように、未変性ＯＡを対象とした（試験１）では３０１Ｂ５単独と、３０１Ｂ５と１１９Ｄ１１の混合の曲線はほとんど重なったが、１０ｐｐｂ以下のより希薄な状態において３０１Ｂ５単独よりも３０１Ｂ５と１１９Ｄ１１の混合の曲線では若干混合の方が吸光値は高く、検出感度が上げられる可能性が考えられた。また、変性ＯＡを対象とした（試験２）のＵＤＯＡでは、３０１Ｂ５単独では吸光値が認められず、３０１Ｂ５及び３１６Ｇ１はＵＤＯＡに関与しないものと考えられたが、１１９Ｄ１１単独と３０１Ｂ５と１１９Ｄ１１の混合の曲線では明らかに混合の方が吸光値は高く、ＭＡｂを混合することにより検出感度を上げることができるものと考えられた（図８）。これは未変性／変性ＯＡを対象とした（試験３）でも認められ、３０１Ｂ５単独よりも３０１Ｂ５と１１９Ｄ１１の混合の方が明らかに吸光値が高かった（図９）。試験１〜３のいずれの場合も、単独でコーティングされた抗体濃度は２５ｇ／ｍｌであり、混合ではそれぞれ半分の濃度の１２．５mｇ／ｍｌであったことから、ＭＡｂの種類を増やす混合系を用いることで、抗体濃度が同じあるいは少なくても、より抗原の検出感度を上げることが可能であることが明らかとなった。
【０１１０】
３．イムノクロマトによる変性及び未変性ＯＡの検出
３−１ 材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるように１１９Ｄ１１及び３１６Ｇ１のＭＡｂ単独あるいは混合溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（日本ミリポア社製）に６８μｌ／ｃｍ2となるよう塗布し、乾燥させた。
【０１１１】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるよう１１７Ｆ９及び３０１Ｂ５のＭＡｂ単独あるいは混合溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【０１１２】
３）イムノクロマトストリップの組立と評価
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。被検液としては、上記２．で調製したＮＯＡ並びにＵＤＯＡを適宜希釈して用いた。
【０１１３】
３−２ 結果
３０１Ｂ５及び金コロイド標識３１６Ｇ１の組合せによりＮＯＡは１０ｐｐｂまで検出することができたが、ＵＤＯＡは１ｐｐｍでも検出できなかった。一方、１１７Ｆ９及び金コロイド標識１１９Ｄ１１の組合せにより、ＵＤＯＡは１０ｐｐｂまで検出することができたが、ＮＯＡは１ｐｐｍでも検出できなかった。これに対して、３０１Ｂ５及び１１７Ｆ９の固定化抗体混合物、並びに３１６Ｇ１及び１１９Ｄ１１の金コロイド抗体混合物を用いたイムノクロマトストリップを作製した場合、変性ＯＡあるいは未変性ＯＡを１０ｐｐｂまで検出可能であった。この様に変性ＯＡに結合可能なＭＡｂと未変性ＯＡに結合可能なＭＡｂを組み合わせることにより、製造工程中に混入した未変性卵白が対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。
【０１１４】
市販の卵アレルゲン検出用イムノクロマトストリップでは、ブランクとして０．０１Ｍの尿素のみを含むＰＢＳを滴下したところ、非特異的なバンドが生じてしまい、擬陽性となってしまった。これでは卵白アレルゲン検査において、熱などにより不溶化した卵白アレルゲンを抽出するためのたんぱく質変性剤である尿素を使用できず、アレルゲンとして検出できる対象が極めて狭い範囲に限られてしまう危険性が考えられた。
【０１１５】
４．変性／未変性オボムコイドに結合可能なＭＡｂの確立
４−１ 材料及び方法
１）ニワトリオボムコイド（以下「ＯＭ」という）の調製
新鮮なニワトリ卵より卵白のみを採取し、泡立てないように均質化後、等量の０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．８）と混合した。さらに０．１Ｍ酢酸緩衝液に対し透析後、８，０００ｒｐｍ×２０分遠心し、上精を回収した。さらに、TSK gel DEAE 650S（Tosoh）を用いたイオン交換クロマトグラフィにより精製した。移動相には５０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．４）を用い、ＮａＣｌの０から０．３ＭのリニアグラジェントによりＯＭを分画し、透析による脱塩後、凍結乾燥を行い、これを未変性ＯＭ（以下「ＮＯＭ」ということがある）とした。この精製ＯＭを１ｍｇ量り、６ｇの尿素、０．２ｍｌの２−メルカプトエタノール、１ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）、１．５ｍｌの蒸留水を加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行い尿素変性ＯＭ（以下「ＤＯＭ」ということがある）とした。生理食塩水でこれらの凍結乾燥物の０．１％溶液を調製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管した。
【０１１６】
２）免疫
供試動物として、それぞれ６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）４尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮＯＭ又はＤＯＭが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮＯＭ又はＤＯＭが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【０１１７】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＮＯＭ又はＤＯＭを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＯＭ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.製）を用いた。
【０１１８】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％ＮＯＭ溶液又はＤＯＭ溶液１００mｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００mｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μMのアミノプテリン、１６μMのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【０１１９】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＮＯＭ抗体又は抗ＤＯＭ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＮＯＭ又はＤＯＭに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９cell/wellとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０6cells/wellとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【０１２０】
６）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０6cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【０１２１】
７）ＭＡｂの特性とＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
抗ＮＯＭＭＡｂ及び抗ＤＯＭＭａｂの特性を決定するために、固相法と液相法を用いた。固相法として、ＮＯＭ又はＤＯＭをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化されたＮＯＭ又はＤＯＭにＭＡｂを作用させる方法を用い、また、液相法として、ウサギ抗オボムコイドポリクロナール抗体をあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、このポリクロナール抗体にＮＯＭ又はＤＯＭを結合させた状態で、ＭＡｂを作用させる方法を用いた。また、ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【０１２２】
８）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０mｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【０１２３】
４−２ 結果
１）抗ＮＯＭＭＡｂ及び抗ＤＯＭＭａｂの特性とクラス、サブクラス
ＮＯＭに対する特異性を持つＭＡｂ７種類、ＤＯＭに対する特異性を持つＭＡｂ１０種類を得た。それぞれ液相あるいは固相の抗原に対する特異性を表１１に示した。
【０１２４】
【表１１】
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【０１２５】
２）組合せ条件
ＮＯＭを検出するためのＭＡｂの組合せは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。その結果、４７Ｅ５（ＰＮＯＭ１；ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７９）と５０Ａ１２（ＰＮＯＭ２；ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２８０）とを高い組合せとして選択した。また、上記、１０個のモノクローナル抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、最も感度の高い６２８Ｅ１（ＰＤＯＭ１；ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７７）と６４８Ａ９（ＰＤＯＭ２；ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７８）とを高い組合せとして選択した。
【０１２６】
３）サンドイッチＥＬＩＳＡによる各モノクローナル抗体とＯＭの反応性
ＰＮＯＭ１およびＰＮＯＭ２のサンドイッチＥＬＩＳＡでは、未変性オボムコイドは検出できたが、変性オボムコイドはまったく検出できなかった（図１０）。また、ＰＤＯＭ１およびＰＮＯＭ２のサンドイッチＥＬＩＳＡでは、変性ＯＭを検出できたが、未変性ＯＭでは１０〜１００ｐｐｂの間で、感度が低かった（図１１）。しかし、プレート抗体としてＰＮＯＭ２及びＰＤＯＭ２を用い、ビオチン抗体としてＰＮＯＭ１及びＰＤＯＭ１を用いる各モノクローナル抗体を組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡでは、特に未変性ＯＭの１０〜１００ｐｐｂで検出感度の向上が認められた（図１２）。
５．イムノクロマトによるＯＭを指標とした卵白の検出
【０１２７】
５−１ 材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＮＯＭ１のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（日本ミリポア社製）に６８μｌ／ｃｍ2となるよう塗布し、乾燥させた。
【０１２８】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようＰＮＯＭ２のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。 
【０１２９】
３）イムノクロマトストリップの組立と評価
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。被検液としては、凍結乾燥卵白粉末の０．１％溶液をそれぞれ室温、５０℃、７５℃、１００℃で１時間処理したものを適宜希釈して用いた。
【０１３０】
５−２ 結果
ＰＮＯＭ１及び金コロイド標識ＰＮＯＭ２の組み合わせにより、室温及び５０℃で１時間処理した卵白溶液は１０ｐｐｂまで検出できた。また、７５、１００℃で１時間処理した卵白は、１００ｐｐｂまで検出することができた。この結果から、１００℃で１時間に相当する加熱処理をされた食品では、尿素の様な変性剤を用いなくても、この抗ＯＭＭＡｂのイムノクロマトストリップを用いることで、卵白として１００ｐｐｂまでは、簡便な抽出により検出可能であった。しかし、１００℃を越えた熱処理ではＯＭのイムノクロマトでは検出できないため、上記のように尿素による可溶化処理が必要であった。
【０１３１】
６．抗ＯＡＭＡｂと抗ＯＭＭＡｂとの併用効果
６−１ 方法
上記の結果より、ＰＮＯＡ１、ＰＤＯＡ１及びＰＮＯＭ１の固定化抗体混合物、並びにＰＮＯＡ２、ＰＤＯＡ２及びＰＮＯＭ２の金コロイド抗体混合物を用いたイムノクロマトストリップを上記のように作製し、卵白の検出を試みた。
【０１３２】
６−２ 結果
ＰＮＯＡ１とＰＮＯＡ２、ＰＤＯＡ１とＰＤＯＡ２およびＰＮＯＭ１とＰＮＯＭ２の組み合わせは、それぞれ上記に示したように目的の変性／未変性オＯＡあるいはＯＭをそれぞれの感度で検出することが可能であった。このことから、加工食品の製造過程において未加熱状態の場合には未変性ＯＡ及びＯＭに対するＭＡｂが反応し、５０から１００℃の場合には、未変性／変性ＯＡ、及びＯＭに対するＭＡｂが反応、それ以上の場合には尿素による可溶化処理により変性ＯＡが反応する卵白の検出方法を開発することができた。
【実施例３】
【０１３３】
１．変性／未変性小麦グリアジンに結合可能なＭＡｂの確立
１−１ 材料及び方法
１）小麦グリアジン（以下「ＧＬ」という）の調製
小麦粉に２倍量のｎ−ブタノールを加え脱脂を行い、一晩風乾した。得られた脱脂小麦粉に０．１％塩化ナトリウム溶液を２倍量加え、１０，０００ｒｐｍ×１５分遠心分離した。得られた沈殿に２０倍量の０．０１Ｎ酢酸を加え、撹拌後、１０，０００ｒｐｍ×１５分遠心分離した。得られた上清を蒸留水で透析し、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物に７０％となるようにエタノールを加え、１０，０００ｒｐｍ×１５分遠心分離した。得られた上清を蒸留水で透析し、粗ＧＬ画分を得た。粗ＧＬ画分はさらに、Sephacryl S-200HR（Amersham Biosciences）を用いたゲルろ過により精製した。移動相には０．１Ｎ酢酸を用いてＧＬを分画し、蒸留水に透析後、凍結乾燥を行った。生理食塩水でこの凍結乾燥物の０．１％溶液を調製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注し、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管し、抗原溶液とした。
【０１３４】
２）免疫
供試動物として、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＧＬが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＧＬが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【０１３５】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＧＬを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＧＬ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【０１３６】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％ＧＬ溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００mｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【０１３７】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＧＬ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＧＬに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ cell/wellとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６cells/wellとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【０１３８】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性ＧＬ（以下「ＮＧＬ」という）あるいは還元カルボキシメチル化ＧＬ（以下「ＲＣＭＧＬ」という）、０．１Ｍ酢酸可溶化ＧＬ（以下「ＡＧＬ」という）、７０％エタノール可溶化ＧＬ（以下「ＥＧＬ」という）、変性剤で可溶化したＧＬ（以下「ＤＧＬ」という）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。ＲＣＭＧＬは、精製ＧＬを１０ｍｇ量り、１．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％ＥＤＴＡ１００μｌ、１．２ｇ尿素、３３μｌの２−メルカプトエタノールを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行った。さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行い、ＲＣＭＧＬとした。培養上清のＮＧＬ、ＲＣＭＧＬ、ＡＧＬ、ＥＧＬ及びＤＧＬに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにより調べた。
【０１３９】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【０１４０】
８）ＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【０１４１】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【０１４２】
２−２ 結果 
１）ＭＡｂの選択
小麦の主要アレルゲンであるグリアジン（ＧＬ）は、水に不溶性で、酢酸やエタノールに溶けるタンパク質である。そこで、ＰＢＳに溶かしたＧＬ（ＮＧＬ）、還元カルボキシメチル化ＧＬ（ＲＣＭＧＬ）、０．１Ｍ酢酸可溶化ＧＬ（ＡＧＬ）、７０％エタノール可溶化ＧＬ（ＥＧＬ）、変性剤で可溶化したＧＬ（ＤＧＬ）を調製し、どの状態のＧＬに特異的に結合するＭＡｂであるかを検証した。抗ＧＬＭＡｂの各状態のＧＬに対するダイレクトＥＬＩＳＡの結果を表１２に示す。表１に示されるように、全ての状態のＧＬに結合するＭＡｂであるＰＧＬ１（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６７）、ＰＧＬ２（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６８）、ＰＧＬ４、ＰＧＬ７を選択した。
【０１４３】
【表１２】
2009244276.tif 000014
【０１４４】
２）サンドイッチＥＬＩＳＡにおける組合せ条件
ダイレクトＥＬＩＳＡで選択したＰＧＬ１、ＰＧＬ２、ＰＧＬ４、ＰＧＬ７を用いて、全てのＭＡｂの組合わせについてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。グリアジンはＮＧＬ、ＲＣＭＧＬ、ＡＧＬ、ＥＧＬ、ＤＧＬを用いた。その結果、いずれの状態のＧＬでも最も高く検出できたのは、ＰＧＬ１とＰＧＬ２の組合わせであった。ＰＧＬ１とＰＧＬ２を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を図１３に示す。その他の組み合わせについてはサンドイッチＥＬＩＳＡにて全てのＧＬを検出できない、または検出感度が極めて低かった。以上の結果から、食品に様々な状態で含まれるＧＬを検出するＭＡｂとして、ＰＧＬ１とＰＧＬ２を選択した。
【０１４５】
２．ＰＧＬ１とＰＧＬ２の認識するエピトープの相違
イムノブロッティングで、各抗体が認識するエピトープを限定するため、Ａ−ＰＡＧＥとエレクトロブロッティングに続いてイムノブロッティングを行った。まず、小麦グリアジンをLafiandra,D.&Kasarda,D.D.に従いＡ−ＰＡＧＥ（Cereal Chemistry,,62,314-319,1985）により分離した。分離したゲルを用いて、エレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写した。転写したＰＶＤＦ膜にＰＧＬ１とＰＧＬ２の培養上清（１／１０００）を反応させたのち、発色させて、認識するエピトープを確認した。その結果、図１４に示されるように、ＰＧＬ１で認識されるタンパク質分解バンドがＰＧＬ２では認識されなかった。このことから、ＰＧＬ１とＰＧＬ２とは異なるエピトープを認識することがわかった。
【０１４６】
３．イムノクロマトによる変性及び未変性ＧＬの検出
３−１ 材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＧＬ１（又はＰＧＬ２）溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（日本ミリポア社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【０１４７】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようＰＧＬ２（又はＰＧＬ１）溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【０１４８】
３）イムノクロマトストリップの組立と評価
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。
【０１４９】
被検液としては、小麦粉に２０倍量のＰＢＳＴ（ＰＢＳにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを０．５％加えたもの）を加え４℃で一晩撹拌し、遠心分離後に脱脂処理した上清を回収し、透析後、凍結乾燥したものを小麦粉抽出物として調製した。調製した小麦粉抽出物を用いて、未変性のもとしてＰＢＳで希釈したもの、変性のものとして変性剤で可溶化したものを用いた。
【０１５０】
３−２ 結果
サンドイッチＥＬＩＳＡにより様々な状態のＧＬを検出できたことから、より簡易な検出方法としてイムノクロマトによる検出系を構築し、評価した。評価にあたっては、現在市販されているアレルゲン検出キットと同じ抗体を用いている市販Ａ及び市販Ｂと比較した。結果を表１３に示す。なお、表１３中、「非特異反応」は、緩衝液のみを供したときに陽性と判定されたとき「あり」とした。その結果、市販Ａでは、未変性小麦粉抽出物は検出できたが、変性小麦粉抽出物は非特異反応が見られ判定できなかった。また、市販Ｂでは、未変性小麦粉抽出物では１ｐｐｍでも検出できず、変性小麦粉抽出物は非特異反応が見られ判定できなかった。本発明のキットを用いる方法では、未変性小麦粉抽出物、変性小麦粉抽出物のどちらも５０ｐｐｂ程度まで検出することができた。また、変性小麦粉抽出物での非特異反応は見られなかった。
【０１５１】
【表１３】
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【０１５２】
次に、実際の食品からのアレルゲン検出を想定して、市販の食パンを用いて評価した。評価にあたっては、現在市販されているアレルゲン検出キットを用いる市販Ａ及び市販Ｂと比較した。結果を表１４に示す。なお、表１４中、「非特異反応」は、緩衝液のみを供したときに陽性と判定されたとき「あり」とした。食パンのたんぱく質は約８％であるため、以下の濃度は８％を全量抽出したと仮定した数字となる。評価した結果、市販Ａでは、未変性食パンを４ｐｐｍ以下の濃度では検出できず、変性食パンでは非特異反応が見られ、判定できなかった。市販Ｂでは、４ｐｐｍ程度は検出できたものの、それ以外の濃度では検出できず、また変性食パンでは非特異反応が見られ、判定できなかった。本発明のキットを用いる方法では、未変性食パン、変性食パンのどちらも４０ｐｐｂ程度の低濃度でも検出ができ、変性では非特異反応もなく、検出できることがわかった。
【０１５３】
【表１４】
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【実施例４】
【０１５４】
１．抗２４ｋＤａタンパク質ＭＡｂ及び抗７６ｋＤａタンパク質ＭＡｂの確立
１−１ 材料及び方法
１）そば２４ｋＤａタンパク質ＭＡｂ及び抗７６ｋＤａタンパク質の調製
市販そば粉に５倍量の精製水を加え、攪拌後１２０００ｒｐｍで遠心分離を行い沈殿を得た。得られた沈殿に１Ｍ塩化ナトリウムを５倍量加え、攪拌後１２０００ｒｐｍで遠心分離を行い、上清を得た。上清を透析により脱塩し、凍結乾燥を行って得られた画分をそば粗タンパク質画分とした。このそば粗タンパク質画分をさらにプレップセル９６０（BioRad）を用いて精製を行った。２４ｋＤａタンパク質の精製は、そば粗タンパク質画分を２．０％ＳＤＳと５％２−メルカプトエタノールが含まれるサンプルバッファーに溶解後、９５℃で４分間加熱したものをサンプルとして供試し、アクリルアミド１２％分離ゲルを用いたプレップセル９６０にて分画し、２４ｋＤａタンパク質を得た。７６ｋＤａタンパク質の精製は、そば粗タンパク質画分を２．０％ＳＤＳが含まれ、２−メルカプトエタノールが含まれないサンプルバッファーに溶解したものをサンプルとして供試し、アクリルアミド１２％分離ゲルを用いたプレップセル９６０にて分画し、７６ｋＤａタンパク質を得た。得られた各画分は透析後、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥を用い、生理食塩水で０．１％の２４ｋＤａタンパク質溶液及び０．１％の７６ｋＤａタンパク質溶液それぞれを作製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管した。
【０１５５】
２）免疫
供試動物として、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％の２４ｋＤａタンパク質溶液及び０．１％の７６ｋＤａタンパク質溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％の２４ｋＤａタンパク質溶液及び０．１％の７６ｋＤａタンパク質溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【０１５６】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫で２４ｋＤａタンパク質溶液又は７６ｋＤａタンパク質溶液を注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗２４ｋＤａタンパク質抗体価及び抗７６ｋＤａタンパク質抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【０１５７】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％の２４ｋＤａタンパク質溶液又は０．１％の７６ｋＤａタンパク質溶液それぞれ１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００mｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【０１５８】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗２４ｋＤａタンパク質抗体又は７６ｋＤａタンパク質抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡにより２４ｋＤａタンパク質又は７６ｋＤａタンパク質に対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ cell/wellとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６cells/wellとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【０１５９】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、２４ｋＤａタンパク質、７６ｋＤａタンパク質、ＰＢＳで希釈したそば粗タンパク質（以下「ＮＢＷ」ということがある）、あるいは変性剤により可溶化したそば粗タンパク質（以下「ＤＢＷ」ということがある）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。そば粗タンパク質は、そば粉に２０倍量のＰＢＳＴを加え４℃で一晩撹拌し、遠心分離後に脱脂処理した上清を回収し、透析後、凍結乾燥したものをそば粉抽出物として調製した。変性剤による可溶化は、そば粗タンパク質を１０ｍｇ量り、尿素６ｇ、２−メルカプトエタノール０．２ｍｌ、 ５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、蒸留水１．５ｍｌを加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行い、これをＤＢＷとした。培養上清の２４ｋＤａタンパク質、７６ｋＤａタンパク質、ＮＢＷ、及びＤＢＷに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにて調べた。
【０１６０】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【０１６１】
８）ＭＡｂの特性とＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
抗２４ｋＤａタンパク質ＭＡｂ又は抗７６ｋＤａタンパク質ＭＡｂの特性を決定するために、固相法を用いた。固相法として、２４ｋＤａタンパク質、７６ｋＤａタンパク質、ＮＢＷ又はＤＢＷをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原に抗２４ｋＤａタンパク質ＭＡｂ又は７６ｋＤａタンパク質ＭＡｂを作用させる方法を用いた。また、ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【０１６２】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【０１６３】
１−２ 結果
１）抗２４ｋＤａタンパク質ＭＡｂと７６ｋＤａタンパク質ＭＡｂの特性とクラス、サブクラス
２４ｋＤａタンパク質に対する特異性を持つＭＡｂ５種類、及び、７６ｋＤａタンパク質に対する特異性を持つＭＡｂ４種類を得た。それぞれ固相の抗原に対する特異性を表１５及び表１６に示した。
【０１６４】
【表１５】
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【０１６５】
【表１６】
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【０１６６】
２）組合せ条件
固相の抗原に対し陽性反応を示した各ＭＡｂをそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、ＮＢＷおよびＤＢＷを検出するためのＭＡｂの組合せを、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。その結果、ＮＢＷを検出できる組合せとして、プレート固定化抗体ＰＢＷ２（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７３）とビオチン化抗体ＰＢＷ３（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７４）を、また、ＤＢＷを検出できる組み合わせとして、プレート固定化抗体ＰＢＷ１（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７２）とビオチン化抗体ＰＢＷ２を選択した。ＰＢＷ２およびＰＢＷ３のサンドイッチＥＬＩＳＡによる各種そば粗タンパク質に対する反応性の結果を図１５に示す。また、ＰＢＷ１およびＰＢＷ２のサンドイッチＥＬＩＳＡによる各種そば粗タンパク質に対する反応性を図１６に示す。
【０１６７】
３）ＭＡｂ混合系でのＮＢＷ、ＤＢＷの検出
サンドイッチＥＬＩＳＡにより選択したＭＡｂを混合し、ＮＢＷ、ＤＢＷの検出感度を確認した。すなわち、ＮＢＷでは、プレート固定化抗体をＰＢＷ２単独とした場合と、ＰＢＷ１およびＰＢＷ２を混合した場合で、ビオチン化ＰＢＷ３を二次抗体として比較した。また、ＤＢＷでは、高い検出感度であったプレート固定化抗体ＰＢＷ１、ビオチン化ＰＢＷ２の組み合わせと、ＰＢＷ１およびＰＢＷ２を混合したプレート固定化抗体と、ビオチン化ＰＢＷ３を二次抗体とした場合を比較した。図１７及び図１８に示すように、ＮＢＷ、ＤＢＷともにプレート抗体を混合した方が吸光値が高く、検出感度を上げることが可能であることが明らかとなった。
【０１６８】
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【０１６９】
２．サンドイッチＥＬＩＳＡによる食品中のＮＢＷ、ＤＢＷの検出
上記１．で選択されたＰＢＷ１、ＰＢＷ２、ＰＢＷ３の組合せにより、実際の食品中のそば粗タンパク質を検出できるかを試みた。
【０１７０】
２−１ 材料及び方法
１）モデル食肉製品の作製
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表１７に示す配合にて各濃度のそば粗タンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行い、７５℃で３０分の加熱を行った。
【０１７１】
【表１７】
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【０１７２】
２）サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量分析
（モデル塩漬肉）
各モデル塩漬肉を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル１ｇを量り取り、ＰＢＳＴ１９ｇを加えホモジナイザーにて３０秒攪拌した。３，０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを０．５ｍｌ測り取り、ＰＢＳＴを９．５ｍｌ加え、ＥＬＩＳＡ用サンプルとした。検量線には同様にＰＢＳＴを用いたそば粗タンパク質の段階希釈を用いた。
（モデル加熱製品）
各モデル加熱製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル１ｇを量り取り、１％ＳＤＳ、１％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳ １９ｇを加えホモジナイザーにて３０秒攪拌した。その後、１００℃１時間加熱処理を行った。冷却後３，０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを０．５ｍｌ測り取りＰＢＳＴを９．５ｍｌ加え、ＥＬＩＳＡ用サンプルとした。検量線には同様にＳＤＳ、２−メルカプトエタノール処理を行ったそば粗タンパク質の段階希釈を用いた。
【０１７３】
２−２ 結果
サンドイッチＥＬＩＳＡによるモデル食肉製品中のそば粗タンパク質の分析について、モデル塩漬肉の結果を表１８に、また、モデル加熱製品の結果を表１９に示す。
【０１７４】
【表１８】
2009244276.tif 000021
【０１７５】
【表１９】
2009244276.tif 000022
2009244276.tif 000023
【０１７６】
以上の結果から、モデル塩漬肉のように未加熱のそば粗タンパク質でも、モデル加熱製品のような加熱変性したそば粗タンパク質でも、高い回収率でそば粗タンパク質を検出可能であった。これらのことから、未変性そばタンパク質に結合可能なＭＡｂと変性そばタンパク質に結合可能なＭＡｂを組み合わせることにより、未加熱（未変性）、加熱（変性）のいかなる状態のそばタンパク質でも、高感度で分析できることがわかった。
【０１７７】
３．イムノクロマトによる変性及び未変性そば粗タンパク質の検出
３−１ 材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＷ３ＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（日本ミリポア社製）に６８μｌ／ｃｍ2となるよう塗布し、乾燥させた。
【０１７８】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで８ｍｇ／ｍｌとなるようＰＢＷ１とＰＢＷ２のＭＡｂ溶液を調製し、１：１の割合で混合したものをニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ スキムミルクを含む１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で３７℃、１時間ブロッキング後、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄し乾燥させた。
【０１７９】
３）イムノクロマトストリップの組立と評価
上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドをそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。非検液としては、上記２．で調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。
【０１８０】
３−２ 結果
メンブレン塗布ＭＡｂ ＰＢＷ１＋ＰＢＷ２、および金コロイド標識ＭＡｂ ＰＢＷ３の組合せにより、そばタンパク質は加熱、非加熱に係わらず５０ｐｐｂ（食品中２ｐｐｍ）まで検出することができた。この結果から、製造工程中に混入したそばタンパクが対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。
【０１８１】
市販のアレルゲン検出用イムノクロマトストリップでは、ブランクとして０．１Ｍ尿素＋０．２％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを滴下したところ、非特異的なバンドが生じてしまい、擬陽性となってしまった。これでは、加熱などにより変性した食品タンパク中から効率よくアレルゲンを抽出するためのタンパク質変性剤を使用できず、アレルゲンとして検出できる対象が極めて狭い範囲に限られてしまう危険性が考えられた。
【実施例５】
【０１８２】
１．抗Ａｒａ ｈ１ＭＡｂの確立
１−１ 材料及び方法
１）Ａｒａ ｈ１タンパク質の調製
市販生落花生に５倍量の２０ｍＭ bis-tris-propane buffer（ｐＨ７．２）を加え、室温で２時間攪拌後３０００×ｇで遠心分離を行い沈殿および油分を除去した。得られた水溶性画分を再度１００００×ｇで遠心分離を行い上清を得た。上清をさらにＳｏｕｒｃｅ Ｑ（アマシャム ファルマシア）を用いて、２０ｍＭのbis-tris-propane buffer（ｐＨ７．２）、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０〜１Ｍ）により精製を行った。精製したＡｒａ ｈ１画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行い、未変性Ａｒａ ｈ１（以下ＮＡｈ１と記す）とした。また、変性Ａｒａ ｈ１（以下ＤＡｈ１と記す）はＮＡｈ１を１０ｍｇ量り、尿素６ｇ、２−メルカプトエタノール（以下２−ＭＥと記す）０．２ｍｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．６）１ｍｌ、蒸留水１．５ｍｌを加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。その後透析し、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥を用い、生理食塩水で０．１％のＤＡｈ１溶液及び０．１％のＤＡｈ１溶液それぞれを作製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管した。
【０１８３】
２）免疫
供試動物として、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮＡｈ１溶液及び０．１％のＤＡｈ１溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、２週間の間隔で３回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＮＡｈ１溶液及び０．１％のＤＡｈ１溶液がそれぞれ５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量ずつ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【０１８４】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＮＡｈ１溶液又はＤＡｈ１溶液を注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＮＡｈ１抗体価及び抗ＤＡｈ１抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【０１８５】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％のＮＡｈ１溶液又は０．１％のＤＡｈ１溶液それぞれ１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００mｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【０１８６】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＮＡｈ１抗体又はＤＡｈ１抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＮＡｈ１又はＤＡｈ１に対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ cell/wellとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６cells/wellとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【０１８７】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、ＮＡｈ１、ＤＡｈ１、あるいは落花生粗タンパク質の未変性物（以下ＮＰ−ｅと記す）、尿素処理（以下ＤＰ−ｅと記す）の４種類に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。なお、ＮＰ−ｅは落花生に５倍量の２０ｍＭbis-tris-propane buffer（ｐＨ７．２）を加え、室温で２時間攪拌後遠心分離を２回行い得られた上清を透析した後、凍結乾燥したものとした。また、ＤＰ−ｅはＮＰ−ｅを１０ｍｇ量り、尿素６ｇ、２−ＭＥ０．２ｍｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、蒸留水１．５ｍｌを加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行ったものとした。培養上清のＮＡｈ１、ＮＰ−ｅ、ＤＡｈ１あるいはＤＰ−ｅに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにて調べた。
【０１８８】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【０１８９】
８）ＭＡｂの特性とＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
抗ＮＡｈ１ＭＡｂ又は抗ＤＡｈ１ＭＡｂの特性を決定するために、固相法を用いた。固相法として、ＮＡｈ１、ＤＡｈ１、ＮＰ−ｅ又はＤＰ−ｅをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原に抗ＮＡｈ１ＭＡｂ又はＤＡｈ１ＭＡｂを作用させる方法を用いた。また、ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【０１９０】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【０１９１】
１−２ 結果
１）抗ＮＡｈ１ＭＡｂとＤＡｈ１ＭＡｂの特性とクラス、サブクラス
ＮＡｈ１に対する特異性を持つＭＡｂ７種類、及び、ＤＡｈ１に対する特異性を持つＭＡｂ３種類を得た。それぞれ固相の抗原に対する特異性を表２０及び表２１に示した。
【０１９２】
【表２０】
2009244276.tif 000024
【０１９３】
【表２１】
2009244276.tif 000025
【０１９４】
２）組合せ条件
固相の抗原に対し陽性反応を示した各ＭＡｂをそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、ＮＰ−ｅおよびＤＰ−ｅを検出するためのＭＡｂの組合せを、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。その結果、ＮＰ−ｅを検出できる組合せとして、プレート抗体にＰＡｈ１−２（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７０）とビオチン抗体にＰＡｈ１−１（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２６９）、また、ＤＰ−ｅを検出できる組合せとしてプレート抗体にＰＡｈ１−２とビオチン抗体にＰＡｈ１−３（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２７１）の組合せを選択した（図１９と図２０）。
３）ＭＡｂ混合系でのＮＰ−ｅ、ＤＰ−ｅの検出
固相にＰＡｈ１−２（細胞寄託番号）、ビオチン化にＰＡｈ１−１（細胞寄託番号）およびＰＡｈ１−３（細胞寄託番号）を混合し、ＮＰ−ｅ、ＤＰ−ｅの検出感度を確認した。それぞれのＭＡｂ濃度は５０μｇ／ｍｌに設定した。その結果、ＭＡｂ混合系でＮＰ−ｅ、ＤＰ−ｅともに検出することが可能であった（図２１と図２２）。
２．サンドイッチＥＬＩＳＡによる食品中の落花生粗タンパク質の検出
上記１．で選択されたＰＡｈ１−１、ＰＡｈ１−２およびＰＡｈ１−３の組合せにより、実際の食品中の落花生粗タンパク質を検出できるかを試みた。
【０１９５】
２−１ 材料及び方法
１）モデル食肉製品の作製
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表２２に示す配合にて各濃度の落花生粗タンパク質を含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行い、７５℃で３０分の加熱を行った。
【０１９６】
【表２２】
2009244276.tif 000026
2009244276.tif 000027
【０１９７】
２）サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量分析
（モデル塩漬肉）
各モデル塩漬肉を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル１ｇを量り取り、ＰＢＳＴ１９ｇを加えホモジナイザーにて３０秒攪拌した。３０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを０．５ｍｌ測り取り、ＰＢＳＴを９．５ｍｌ加え、ＥＬＩＳＡ用サンプルとした。検量線には同様にＰＢＳＴに溶解した落花生粗タンパク質の段階希釈を用いた。
（モデル加熱製品）
各モデル加熱製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプル１ｇを量り取り、１Ｍ尿素および０．１％２−ＭＥを含むＰＢＳ １９ｇを加えホモジナイザーにて３０秒攪拌した。その後、１００℃で１時間加熱処理を行った。冷却後３０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離を行い、上清をろ紙でろ過したものを０．５ｍｌ測り取りＰＢＳＴを９．５ｍｌ加え、ＥＬＩＳＡ用サンプルとした。検量線には同様に１Ｍ尿素および０．１％ ２−ＭＥ処理を行った落花生粗タンパク質の段階希釈を用いた。また、分析用サンプルからＰＢＳＴを用いて抽出し、ＰＢＳＴに溶解した落花生粗タンパク質を検量線とした尿素および２−ＭＥを用いない場合との比較を行った。
【０１９８】
２−２ 結果
サンドイッチＥＬＩＳＡによるモデル食肉製品中の落花生粗タンパク質の分析について、モデル塩漬肉の結果を表２３に、モデル加熱製品の結果を表２４に、また、ＰＢＳＴのみで抽出した結果を表２５に示す。
【０１９９】
【表２３】
2009244276.tif 000028
【０２００】
【表２４】
2009244276.tif 000029
【０２０１】
【表２５】
2009244276.tif 000030
【０２０２】
以上の結果から、モデル塩漬肉のように未加熱の落花生粗タンパク質でも、モデル加熱製品のような加熱変性した落花生粗タンパク質でも、高い回収率で落花生粗タンパク質を検出可能であった。これらのことから、未変性タンパク質に結合可能なＭＡｂと変性タンパク質に結合可能なＭＡｂを組み合わせることにより、未加熱（未変性）、加熱（変性）のいかなる状態の落花生タンパク質でも、高感度で分析できることがわかった。また、食品中からの落花生粗タンパク質の抽出には尿素および２−ＭＥを用いることが有効であり、尿素で変性させたＡｈ１に結合可能であることが必要であることが明らかとなった。
【０２０３】
３．イムノクロマトによる未変性および変性落花生粗タンパク質の検出
３−１ 材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＡｈ１−１とＰＡｈ１−３のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００mｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝２．０になるよう調製し、１：１の割合で混合した。ガラスウール製コンジュゲートパッドに６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【０２０４】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようＰＡｈ１−２のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％スキムミルクを含む１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で３７℃、１時間ブロッキング後、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄し乾燥させた。
【０２０５】
３）イムノクロマトストリップの組立と評価
上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドをそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。非検液としては、上記２．で調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。
【０２０６】
３−２ 結果
メンブレン塗布ＭＡｂ ＰＡｈ１−２、および金コロイド標識ＭＡｂ ＰＡｈ１−１とＰＡｈ１−３ の組合せにより、落花生粗タンパク質は加熱、非加熱に係わらず５０ｐｐｂ（食品中２ｐｐｍ）まで検出することができた。この結果から、製造工程中に混入した落花生タンパク質が対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。
【０２０７】
市販のアレルゲン検出用イムノクロマトストリップでは、ブランクとして０．０１Ｍ尿素、０．２％２−ＭＥを含むＰＢＳを滴下したところ、非特異的なバンドが生じてしまい、擬陽性となってしまった。これでは、加熱などにより変性した食品タンパク中から効率よくアレルゲンを抽出するためのタンパク質変性剤を使用できず、アレルゲンとして検出できる対象が極めて狭い範囲に限られてしまう危険性が考えられた。
【産業上の利用可能性】
【０２０８】
本発明によると、食品等に含まれる乳アレルゲン、卵白アレルゲン、小麦アレルゲン、そばアレルゲン、落花生アレルゲンについての免疫学的な検出方法において、これらアレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても正確に定性かつ定量的に検出することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年8月20日(2009.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を用いることを特徴とする卵白アレルゲンの検出方法。
【請求項２】
還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２であることを特徴とする請求項１記載の卵白アレルゲンの検出方法。
【請求項３】
さらに、未変性オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を用いることを特徴とする請求項１又は２記載の卵白アレルゲンの検出方法。
【請求項４】
未変性オボアルブミンを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２であることを特徴とする請求項３記載の卵白アレルゲンの検出方法。
【請求項５】
サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中のオボアルブミンを、１．０〜１０．０ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の卵白アレルゲンの検出方法。
【請求項６】
還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を備えたことを特徴とする卵白アレルゲン検出用キット。
【請求項７】
還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２であることを特徴とする請求項６記載の卵白アレルゲン検出用キット。
【請求項８】
さらに、未変性オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を備えたことを特徴とする請求項６又は７記載の卵白アレルゲン検出用キット。
【請求項９】
未変性オボアルブミンを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２であることを特徴とする請求項８記載の卵白アレルゲン検出用キット。
【請求項１０】
異なるエピトープを認識する２種のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６〜９記載の卵白アレルゲン検出用キット。
【請求項１１】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１。
【請求項１２】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２。
【請求項１３】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１。
【請求項１４】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性及び変性の卵白アレルゲンを指標としたアレルゲンの検出方法や、それに用いられるアレルゲンの検出用キットに関する。
【０００２】
また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性のオボアルブミンを定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、オボアルブミンを指標とした卵白アレルゲンの検出方法や、それに用いられる卵白アレルゲンの検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００３】
自然環境の減少、車や工場などからの排気ガス、住宅事情等、或いは食べ物の変化など様々な因子により、現在では、３人に１人が何らかのアレルギー疾患をもつといわれている。特に、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題を生じている。これらの危害は死に至らせることがあり、未然に処置を施す必要がある。そのためには、表示を通じて消費者へ情報提供の必要性も高まっており、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会は、アレルギー物質として知られている８種の原材料を含む食品にあっては、それを含む旨の表示について合意し、加盟国で各国の制度に適した表示方法を検討することとした（１９９９年６月）。日本では過去の健康危害などの程度、頻度を考慮して重篤なアレルギー症状を起した実績のある２４品目の食品について、その表示方法が定められた（２００２年４月より施行）。アレルギーを引き起こす食品としては、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母若しくはゼラチンなどが知られており、特に乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼインや、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリンや、卵白アレルゲン成分としてはオボアルブミンとオボムコイドや、小麦アレルゲンの主要成分としてグリアジンや、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質や、落花生の主要タンパク質であるＡｒａ ｈ１が知られている。
【０００４】
従来、アレルゲンを検出する方法としては、例えば、アレルゲンに特異的に反応するイムノグロブリンを定量する方法（特開平０５−２４９１１１号公報参照）や、抗原抗体複合体を含有する検体中の該抗原抗体複合体を酸処理等により解離させ、必要に応じてアルカリを用いて中和処理を行った後、該検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を測定する方法（特開平０７−１４０１４４号公報参照）等が知られている。
【０００５】
また、現在、乳、卵、小麦、そば、落花生の特定原材料を検出するための公定法として、加熱・非加熱複合抗原より得られるポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（特開２００３−１５５２９７号公報参照；以下「市販公定法Ａ」という）、あるいは精製抗原より得られたポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（以下「市販公定法Ｂ」という）が用いられている。これらは、特異的にアレルゲンを検出するために有効な方法であるが問題も多い。例えば、市販公定法Ａでは複合抗原を用いているため、何に対する抗体なのかが不明で、交差性が高く、例えば、イムノブロット法などによる抗原の同定ができず、また非特異反応が増える可能性がある。また、市販公定法Ｂでは、抗原が精製されているため抗体の特異性は明確であるものの、未変性の抗原を用いて作製された抗体を使用しているため、変性／未変性により抗体が結合する程度に違いがあるため、同じ添加量であっても、加熱前、加熱後での定量値が異なるという問題があった。特に、小麦は他の特定原材料（卵、乳、そば、落花生）の中でも過酷な加熱処理が施される場合が多い（例えばパン、唐揚げ等）ため、小麦アレルゲンは未変性から加熱変性まで、広範囲な状態で存在する。そこで、小麦アレルゲンを検出するためには、どの様な状態のアレルゲンに対して結合するかを明らかにしたモノクローナル抗体を作製し、その特性に応じて利用する必要がある。
【０００６】
さらに、卵の同定、定量に関しては、オボムコイドを指標として、すでにポリクローナル抗体を用いた方法（例えば、Int. Archs. Allergy appl. Immun., 75, 8-15, 1984参照）あるいはモノクローナル抗体を用いた方法（例えば、Nutr. Sci. Vitaminol. 45, 491-500, 1999参照）が知られている。また、オボムコイドを認識するモノクローナル抗体で、未変性オボムコイドと反応するが熱変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、熱変性オボムコイドと反応するが未変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、及び未変性オボムコイドと熱変性オボムコイドに反応するモノクローナル抗体を用いて、加熱変性状態をも識別してオボムコイドを定量し、卵アレルゲンの同定と正確な定量を可能とする免疫学的定量方法が報告されている（例えば、特開２００２−２５３２３０号公報参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、卵白アレルゲンを含む食品において、卵白アレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても検出できる高感度な免疫学的な検出方法及びそれに用いられる検出キット等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特定原材料である卵白アレルゲンを検出する方法について鋭意検討し、未変性及び変性の卵白アレルゲンを認識する各２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体を用いると、特定原材料の卵白アレルゲンを検出することができることを見い出した。
【０００９】
特定原材料の一つである卵白の検出方法の検討を行うに当たっては、精製オボアルブミンに対するモノクローナル抗体を作出し、その中から未変性抗原に結合できるＭＡｂと、変性抗原に結合できるＭＡｂとをそれぞれ複数選択し、未変性抗原結合ＭＡｂ群と変性抗原結合ＭＡｂ群を組み合わせることで、抗原となるオボアルブミンが変性／未変性のいかなる状態にあっても高感度で検出できることを見い出し、特に未変性抗原結合ＭＡｂ群と変性抗原結合ＭＡｂ群を組み合わせて用いた場合、未変性オボアルブミンあるいは変性オボアルブミンのみが存在する場合であっても、未変性抗原結合ＭＡｂ（群）単独使用や変性抗原結合ＭＡｂ（群）単独使用におけるよりも優れた検出感度で検出しうることを確認した。また、卵白アレルゲンであるオボアルブミンに対するＭＡｂを組み合わせることにより、食品中の卵白がいかなる加工工程を経た場合にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品からの卵白アレルゲンを検出しうることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明（卵白アレルゲン）の試験１における各希釈段に対する抗オボアルブミンＭＡｂの反応性を示す図である。
【図２】本発明（卵白アレルゲン）の試験２における各希釈段に対する抗オボアルブミンＭＡｂの反応性を示す図である。
【図３】本発明（卵白アレルゲン）の試験３における各希釈段に対する抗オボアルブミンＭＡｂの反応性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の卵白アレルゲンの検出方法としては、還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を用いることを特徴とする卵白アレルゲンの検出方法であれば特に制限されず、さらに、未変性オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を用いることが好ましい。また、本発明の卵白アレルゲン検出用キットとしては、還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を備えたことを特徴とする免疫学的なアレルゲン検出用キットであれば特に制限されず、さらに、未変性オボアルブミンを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種の抗オボアルブミンモノクローナル抗体を備えたものが好ましい。ここで「卵白アレルゲン」とは、卵白の主要タンパク質であるオボアルブミンを含むものをいう。
【００１２】
上記未変性オボアルブミンを認識する抗オボアルブミンモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２を挙げることができ、また、上記還元カルボキシメチル化オボアルブミンを認識する抗オボアルブミンモノクローナル抗体として、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２等を好適に例示することができる。また、ＰＮＯＡ１とＰＮＯＡ２等の抗未変性オボアルブミンモノクローナル抗体や、ＰＤＯＡ１とＰＤＯＡ２等の抗変性オボアルブミンモノクローナル抗体の組み合せ、特にＰＮＯＡ１とＰＮＯＡ２等の抗未変性オボアルブミンモノクローナル抗体とＰＤＯＡ１とＰＤＯＡ２等の抗変性オボアルブミンモノクローナル抗体を組み合わせることで、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。例えば、これらの抗体を用いることで、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中の未変性オボアルブミン及び／又は変性オボアルブミンを、１．０〜１０．０ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することができる。
【００１３】
本発明の卵白アレルゲンの検出方法においては、尿素と２−メルカプトエタノールを用いてオボアルブミンを抽出することが好ましく、また、未変性オボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体及び変性オボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体を用いることが好ましい。また、本発明の卵白アレルゲン検出用キットにおいては、オボアルブミンを抽出するための尿素と２−メルカプトエタノールを含むものが好ましく、また、未変性オボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体及び変性オボアルブミンを認識する２種類のモノクローナル抗体を備えるものが好ましい。
【００１４】
以上の本発明の免疫学的なアレルゲンの検出方法は、未変性及び変性の卵白アレルゲン（以下「食物アレルゲン」ということがある）を含む試料を、標識化した抗オボアルブミンＭＡｂと接触させ、あるいは標識化した抗体の存在下にオボアルブミンＭＡｂと接触させ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識物質を用いて分離・測定する検出段階とからなり、かかる免疫反応段階における抗原抗体反応の方法も特に制限されず、例えば、以下の方法を例示することができる。
【００１５】
不溶性担体に結合した本発明の抗オボアルブミンＭＡｂに試料中の食物アレルゲンを捕捉させた後に標識化抗ＩｇＧ抗体を反応させるサンドイッチ法や、不溶性担体に結合した抗オボアルブミンＭＡｂと異なるエピトープを認識する標識抗オボアルブミンＭＡｂ（第二抗体）を用いるサンドイッチ二抗体法や、不溶性担体に結合した抗オボアルブミンＭＡｂに試料中の卵白アレルゲンを標識化抗原の存在下で反応させる競合法や、卵白アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する磁気ビーズ結合標識抗オボアルブミンＭＡｂを作用させた後、磁力により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する磁気ビーズ法や、卵白アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する標識抗オボアルブミンＭＡｂを作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法や、金コロイド等で標識された抗オボアルブミンＭＡｂと食物アレルゲンであるオボアルブミンが結合した抗原抗体複合体が試験ストリップ上を毛管現象等により移動する途中に、オボアルブミンと結合する抗オボアルブミンＭＡｂをあらかじめ固定しておき、抗原抗体複合体を補足させることで現れる着色ラインの有無によって定性分析するイムノクロマト法の他、二重免疫拡散法、放射免疫拡散法など公知の免疫測定法を利用することができるが、抗オボアルブミンＭＡｂとして、それぞれ異なるエピトープを認識する２以上のモノクローナル抗体を用いる方法、例えば、食品中の未変性アレルゲン及び／又は変性アレルゲンが１００〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる高感度の点でサンドイッチ二抗体法が、定性的には簡便性からイムノクロマト法が好ましい。また、食肉製品等の食品試料中からアレルゲンを抽出する場合、尿素と２−メルカプトエタノールを用いることが望ましい。
【００１６】
上記抗原抗体反応において用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等を挙げることができ、また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管、ラテックスビーズ状等の種々の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は特に限定されるものでなく、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
【００１７】
本発明の卵白アレルゲンの検出方法や卵白アレルゲン検出用キットに用いられる抗オボアルブミンＭＡｂの免疫グロブリンのクラス及びタイプは特に制限されないが、抗オボアルブミンＭＡｂとして、ＩｇＧクラス、タイプκの抗体が好適に用いられる。また、モノクローナル抗体の形態としては、全抗体又はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ等の断片を用いることもできる。抗体の由来は特に限定されるものではないが、マウス、ラット、ヒト、兎、鶏等を挙げることができるが、作製の簡便性からマウスに由来するモノクローナル抗体が好適に用いられる。また、抗オボアルブミンＭＡｂは、未変性又は変性のオボアルブミン等で免疫した動物から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により調製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造することができる。
【００１８】
抗オボアルブミンＭＡｂ産生ハイブリドーマは、例えば、未変性及び／又は変性のオボアルブミンを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗オボアルブミンＭＡｂ産生ハイブリドーマを作出することができる。上記の抗体産生細胞としては、例えば未変性及び／若しくは変性のオボアルブミン又はこれを含有する組成物を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等を挙げることができる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えば未変性及び／又は変性のオボアルブミンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。
【００１９】
細胞融合は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、抗オボアルブミンＭＡｂを産生するハイブリドーマを得ることができる。また、オボアルブミン等の未変性の食物アレルゲンのみを用いて免疫した抗免疫動物から、有利に抗変性オボアルブミンＭＡｂを得ることができる場合もある。この場合、抗変性オボアルブミンＭＡｂ等の抗変性食物アレルゲンＭＡｂ産生ハイブリドーマをスクリーニングしてもよいし、あるいは、固相状態でのＥＬＩＳＡで未変性のオボアルブミン等の未変性の食物アレルゲンに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択し、この抗体産生ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体から液相状態で未変性のオボアルブミンに対してのみ特異的に反応する抗オボアルブミンＭＡｂを得ることができる。前記のように、抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取することができるが、培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、例えば、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。
【００２０】
また、標識化抗体作製に用いられる標識物質としては、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質であればよく、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、金コロイド等を使用するのができ、酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等を、蛍光物質としては、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等を、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等を、放射性物質としては３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等を例示することができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、発光剤等が用いることができる。
【００２１】
本発明の食物アレルゲン検出用キットには、有効成分としての抗オボアルブミンＭＡｂ、好ましくはそれぞれ異なるエピトープを認識する２以上の抗オボアルブミンＭＡｂを含むが、これらは保存安定性の点から、溶液状態よりも凍結乾燥物として収容されていることが好ましく、検出用キットにはかかる抗オボアルブミンＭＡｂを溶解する緩衝液や培養液の他、試料を調製するための緩衝液等を含んでいてもよい。また、より好ましい別の態様の本発明の抗食物アレルゲン検出用キットとしては、前記イムノクロマト法における試験ストリップを挙げることができる。この場合、異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つを、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体とすることが好ましい。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＮＯＡ２や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７５）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７６）が産生する抗オボアルブミンモノクローナル抗体ＰＤＯＡ２を挙げることができ、これらハイブリドーマは、平成１７（２００５）年２月２４日（受領日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。
【００２３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
１．変性／未変性オボアルブミンに結合可能なＭＡｂの確立
１−１ 材料及び方法
１）ニワトリオボアルブミン（以下「ＯＡ」ということがある）の調製
新鮮なニワトリ卵より卵白のみを採取し、泡立てないように均質化後、等量の飽和硫酸アンモニウムを加え、濾紙Ｎｏ．１（アドバンテック東洋）で濾過した。そして、得られたろ液に０．５Ｍの硫酸を添加しｐＨ４．６に調整後、一晩放置した。８，０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離により得られた沈殿を蒸留水に溶解し、同じ方法で再結晶化し、粗ＯＡ画分を得た。粗ＯＡはさらに、TSK gel DEAE 650S（Tosoh）を用いたイオン交換クロマトグラフィにより精製した。移動相には５０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．４）を用い、ＮａＣｌの０から０．３ＭのリニアグラジェントによりＯＡを分画し、透析による脱塩後、凍結乾燥を行った。この凍結乾燥ＯＡを用い、生理食塩水で０．１％のＯＡ溶液を作製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管した。
【００２５】
２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）４尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＯＡが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のＯＡが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。なお、抗変性ＯＡＭＡｂを得る場合、最終免疫のみに後述する還元カルボキシメチル化ＯＡを用いた。
【００２６】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でＯＡを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗ＯＡ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【００２７】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％ＯＡ溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００mｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００２８】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ＯＡ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりＯＡに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ cell/wellとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６cells/wellとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００２９】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性ＯＡ（以下「ＮＯＡ」ということがある）あるいは還元カルボキシメチル化ＯＡ（以下「ＲＣＭＯＡ」ということがある）に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。ＲＣＭＯＡは、精製ＯＡ（上記凍結乾燥物）を１０ｍｇ量り、１．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、５％のＥＤＴＡ１００μｌ、１．２ｇの尿素、３３μｌの２−メルカプトエタノールを加え２．５ｍｌに定容した後、窒素ガス置換を行い、３７℃、１時間の還元処理を行った。さらに、１ＭのＮａＯＨ３００μｌに溶解した８９ｍｇのモノヨード酢酸を加え窒素ガス置換した後、室温で１時間のカルボキシメチル化を行い、ＲＣＭＯＡとした。培養上清のＮＯＡあるいはＲＣＭＯＡに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにより調べた。
【００３０】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein G カラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【００３１】
８）ＭＡｂの特性とＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
抗ＯＡＭＡｂの特性を決定するために、固相法と液相法を用いた。固相法として、ＮＯＡ又はＲＣＭＯＡをあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、この固定化された抗原（ＮＯＡ又はＲＣＭＯＡ）に抗未変性／変性ＯＡＭＡｂを作用させる方法を用い、また、液相法として、ウサギ抗ＯＡポリクローナル抗体をあらかじめ細胞培養用プレートのウェル内に固定し、このポリクローナル抗体にＮＯＡ又はＲＣＭＯＡを結合させた状態で、抗未変性／変性ＯＡＭＡｂを作用させる方法を用いた。また、ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoglobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【００３２】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【００３３】
１−２ 結果
１）抗ＯＡＭＡｂの特性とクラス、サブクラス
ＮＯＡに対する特異性を持つＭＡｂ９種類、及び、ＲＣＭＯＡに対する特異性を持つＭＡｂ１０種類を得た。それぞれ液相あるいは固相の抗原に対する特異性を表１に示した。
【００３４】
【表１】
2009244276.tif 000053
【００３５】
２）組合せ条件
ＮＯＡを検出するためのＭＡｂあるいはＲＣＭＯＡを検出するためのＭＡｂの組合せは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。その結果、ＮＯＡでは３０１Ｂ５と３１６Ｇ１や３０４Ｅ４（ＰＮＯＡ１；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６５）と３０６Ｂ２（ＰＮＯＡ２；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６６）、ＲＣＭＯＡでは１１７Ｆ９と１１９Ｄ１１や９４８Ｇ１１（ＰＤＯＡ１；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７５）と９６２Ｂ８（ＰＤＯＡ２；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２７６）を高い組合せとして選択した。
【００３６】
２．サンドイッチＥＬＩＳＡによる変性及び未変性抗原の検出
２−１ 材料及び方法
ＮＯＡ溶液は、精製ＯＡをＰＢＳで１００ｐｐｂ溶液となるように調製し、３倍の希釈段を作製した（希釈段Ａ）。一方、ガラス試験管に精製ＯＡを１ｍｇ量り、６ｇの尿素、０．２ｍｌの２−メルカプトエタノール、１ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）、１．５ｍｌの蒸留水を加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。冷却後、１００ｍｌ容メスフラスコに移し、ＰＢＳで１００ｍｌにメスアップした。これをさらにＰＢＳで１００倍希釈し、尿素変性ＯＡ（以下「ＵＤＯＡ」という）１００ｐｐｂ溶液とした。さらに尿素濃度を０．０１Ｍに保ちながら３倍の希釈段を作製した（希釈段Ｂ）。また、ＮＯＡ１００ｐｐｂ溶液とＵＤＯＡ１００ｐｐｂ溶液を等量ずつ混ぜ（ＮＯＡ及びＵＤＯＡは各５０ｐｐｂ溶液となる）、尿素濃度を０．００５Ｍに保ちながら３倍の希釈段を作製した（希釈段Ｃ）。また、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試した条件を表２に示す。コーティングＭＡｂ濃度は単独の場合は２５μｇ／ｍｌに、また混合した場合には各１２．５μｇ／ｍｌとし、合計で２５μｇ／ｍｌとなるようにした。
【００３７】
【表２】
2009244276.tif 000054
【００３８】
２−２ 結果
図１に示すように、未変性ＯＡを対象とした（試験１）では３０１Ｂ５単独と、３０１Ｂ５と１１９Ｄ１１の混合の曲線はほとんど重なったが、１０ｐｐｂ以下のより希薄な状態において３０１Ｂ５単独よりも３０１Ｂ５と１１９Ｄ１１の混合の曲線では若干混合の方が吸光値は高く、検出感度が上げられる可能性が考えられた。また、変性ＯＡを対象とした（試験２）のＵＤＯＡでは、３０１Ｂ５単独では吸光値が認められず、３０１Ｂ５及び３１６Ｇ１はＵＤＯＡに関与しないものと考えられたが、１１９Ｄ１１単独と３０１Ｂ５と１１９Ｄ１１の混合の曲線では明らかに混合の方が吸光値は高く、ＭＡｂを混合することにより検出感度を上げることができるものと考えられた（図２）。これは未変性／変性ＯＡを対象とした（試験３）でも認められ、３０１Ｂ５単独よりも３０１Ｂ５と１１９Ｄ１１の混合の方が明らかに吸光値が高かった（図３）。試験１〜３のいずれの場合も、単独でコーティングされた抗体濃度は２５ｇ／ｍｌであり、混合ではそれぞれ半分の濃度の１２．５mｇ／ｍｌであったことから、ＭＡｂの種類を増やす混合系を用いることで、抗体濃度が同じあるいは少なくても、より抗原の検出感度を上げることが可能であることが明らかとなった。
【００３９】
３．イムノクロマトによる変性及び未変性ＯＡの検出
３−１ 材料及び方法
１）金コロイド標識及びコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるように１１９Ｄ１１及び３１６Ｇ１のＭＡｂ単独あるいは混合溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッド（日本ミリポア社製）に６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【００４０】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるよう１１７Ｆ９及び３０１Ｂ５のＭＡｂ単独あるいは混合溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【００４１】
３）イムノクロマトストリップの組立と評価
上記で作製したコンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。被検液としては、上記２．で調製したＮＯＡ並びにＵＤＯＡを適宜希釈して用いた。
【００４２】
３−２ 結果
３０１Ｂ５及び金コロイド標識３１６Ｇ１の組合せによりＮＯＡは１０ｐｐｂまで検出することができたが、ＵＤＯＡは１ｐｐｍでも検出できなかった。一方、１１７Ｆ９及び金コロイド標識１１９Ｄ１１の組合せにより、ＵＤＯＡは１０ｐｐｂまで検出することができたが、ＮＯＡは１ｐｐｍでも検出できなかった。これに対して、３０１Ｂ５及び１１７Ｆ９の固定化抗体混合物、並びに３１６Ｇ１及び１１９Ｄ１１の金コロイド抗体混合物を用いたイムノクロマトストリップを作製した場合、変性ＯＡあるいは未変性ＯＡを１０ｐｐｂまで検出可能であった。この様に変性ＯＡに結合可能なＭＡｂと未変性ＯＡに結合可能なＭＡｂを組み合わせることにより、製造工程中に混入した未変性卵白が対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。
【００４３】
市販の卵アレルゲン検出用イムノクロマトストリップでは、ブランクとして０．０１Ｍの尿素のみを含むＰＢＳを滴下したところ、非特異的なバンドが生じてしまい、擬陽性となってしまった。これでは卵白アレルゲン検査において、熱などにより不溶化した卵白アレルゲンを抽出するためのたんぱく質変性剤である尿素を使用できず、アレルゲンとして検出できる対象が極めて狭い範囲に限られてしまう危険性が考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明によると、食品等に含まれる卵白アレルゲンについての免疫学的な検出方法において、これらアレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても正確に定性かつ定量的に検出することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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