(57)【要約】【課題】  本発明は、原核細胞においてファージの感染や薬剤／酵素処理など外部からの直接的な刺激によらずに起こる溶菌に対して抵抗性を有する細胞、及びその作製方法を提供することをその目的とする。【解決手段】  上記課題の解決のため、本発明は、σＥ因子により発現調節を受けるｓＲＮＡ遺伝子（溶菌原因遺伝子）が破壊され、溶菌耐性という形質を獲得した細胞、及び溶菌原因遺伝子の塩基配列中にタンパク質をコードした遺伝子を挿入する工程と、前記タンパク質を発現させることにより非溶菌耐性細胞から溶菌耐性細胞を選別する工程を含むことを特徴とする溶菌耐性細胞の作製方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物において、ゲノム上に存在し下記の４つの条件を満たす遺伝子（以下、「溶菌原因遺伝子」という）が少なくとも１つ破壊されたことを特徴とする、原核生物の自己溶菌耐性細胞。
（１）全長が１００塩基以下の短い産物（ｓＲＮＡ）をコード
（２）σＥ因子（Ｓｉｇｍａ  Ｅ  Ｆａｃｔｏｒ）、またはσＥ因子と機能的に相同性を持つ転写調節因子により発現調節を受ける
（３）細胞内ではタンパク質に翻訳されずＲＮＡの状態で存在
（４）ｏｍｐ（Ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、またはｏｍｐ遺伝子と機能的に相同性を持つ遺伝子のｍＲＮＡと相補的に結合し、転写後調節因子として機能する
【請求項２】
破壊された溶菌原因遺伝子が配列番号１または配列番号２で表される塩基配列、または前記塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子である、請求項１に記載の自己溶菌耐性細胞。
【請求項３】
遺伝子の破壊が相同組換えによりなされた、請求項１または請求項２に記載の自己溶菌耐性細胞。
【請求項４】
原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項１から請求項３のうちいずれか１項に記載の自己溶菌耐性細胞。
【請求項５】
原核生物において、溶菌原因遺伝子の塩基配列中にタンパク質をコードした遺伝子を挿入する工程と、前記タンパク質を発現させることにより非溶菌耐性細胞から溶菌耐性細胞を選別する工程を含むことを特徴とする、請求項３または請求項４に記載の自己溶菌耐性細胞の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原核生物の溶菌耐性細胞に関し、詳しくは、ゲノム上の溶菌原因遺伝子が破壊されたことにより溶菌耐性を有する細胞及びその作製方法に関する。
【０００２】
本明細書において、「菌」とは原核生物一般を指す。また「溶菌」とは、原核生物の細胞が細胞壁の崩壊を伴って崩壊する現象を指す。更に、「溶菌耐性細胞」とはファージの感染や薬剤／酵素処理といった外部からの直接的な刺激によらず引き起こされる溶菌に対して耐性を有する細胞と定義される。更に、本明細書において「溶菌原因遺伝子」とは、下記の４つの条件を満たす遺伝子と定義される。
（１）全長が１００塩基以下の短い産物（ｓＲＮＡ）をコード
（２）σＥ因子（Ｓｉｇｍａ  Ｅ  Ｆａｃｔｏｒ）、またはσＥ因子と機能的に相同性を持つ転写調節因子により発現調節を受ける
（３）細胞内ではタンパク質に翻訳されずＲＮＡの状態で存在
（４）ｏｍｐ（Ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、またはｏｍｐ遺伝子と機能的に相同性を持つ遺伝子のｍＲＮＡと相補的に結合し、転写後調節因子として機能する
【背景技術】
【０００３】
大腸菌や乳酸菌など種々の原核生物は、その物質生産能の多様性や培養の容易さなどから、組み換えタンパク質の大量発現、代謝産物の蓄積、発酵などを通じ種々の有用物質生産に利用されてきた。これらの生物を用いた物質生産は、通常、適当な培地・培養液に菌株を接種した後、菌の増殖と共役的に行われるのが特徴である。菌の増殖は前期の対数増殖期（Ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）と後期の定常期（Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  Ｐｈａｓｅ）に分けることができ、対数増殖期には活発な増殖と物質生産能を示し、一方で定常期には菌の増殖が停止し、代謝活性も低下することが知られている。また、定常期に特徴的に見られる現象として、増殖した菌の溶菌（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｙｓｉｓ）が起こることが知られている。溶菌自体はバクテリオファージなどが感染した細菌などで普遍的に観察される現象であるが、培養が定常期に到達した細菌の細胞集団においては、ファージの感染や薬剤／酵素処理といった外部からの直接的な刺激によらず、自己溶菌が起こることが明らかにされてきた（非特許文献１）。
培養液中における溶菌の現象は、高濃度の培養を妨げるばかりでなく、溶菌により細胞の内容物の放出を伴い、特に細菌を用いた物質生産においては、放出された核酸やタンパク質など目的物以外の好ましくない物質が培養液中に大量に混入する原因となり、目的物の精製のために多大なコストが生じるなど大きな問題になっていた。
【０００４】
細菌などの溶菌の問題を解決するための手段としては、これまで、主にバクテリオファージを用いた研究により、ファージ耐性菌とその作出方法（特許文献１）、ファージ溶菌耐性を持つ納豆菌の自然変異株（特許文献２）などが知られているが、これはファージ感染後の溶菌に対する抵抗性であって、他の要因による溶菌には適用できないという問題があった。また溶菌に係る遺伝子として、ある種のプラスミドにコードされたｋｉｌ遺伝子とその作用機序が解析され（非特許文献２）、これに対する抵抗性を有した系（特許文献３）などが開示されているが、プラスミドを持たない系には適用できないという問題点があった。更に溶菌に係る遺伝子としてエンドリシン、トランスグリコシラーゼ、リゾチーム等の遺伝子を大腸菌ゲノム中に導入し、効果的に溶菌を誘導する系も開示されているが（特許文献４）、これらは積極的に溶菌を起こす遺伝子を導入するものであって、その抑制が溶菌の抑制につながるというものではなかった。ファージ感染やプラスミドなどが関与しない定常期における自己溶菌が、原核生物の内在的な因子（遺伝子）の働きにより引き起こされると考えられることから、これらの自己溶菌に広く適用可能な手段を提供するものとして、溶菌及び溶菌の抑制に関与する遺伝子を解明し、ひいては溶菌という現象を起こさせず、高濃度に培養可能な溶菌耐性を有する原核生物の作製が望まれていた。
【０００５】
【特許文献１】特開昭６４−０８０２８０  バクテリオファージ耐性菌の作成方法
【特許文献２】特開平１０−２１５８６１  ファージ耐性納豆菌及びその納豆
【特許文献３】特開昭６３−２０２３７５  微生物細胞から蛋白質を放出するための系
【特許文献４】ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂ．Ａｐｐ．２００６００４３９３  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ
【非特許文献１】Ｋａｂｉｒ  Ｓ．ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ  Ｍ．２００５．Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  Ｄｅａｔｈ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：５５−６７．
【非特許文献２】Ｍｉｋｓｃｈ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６７：１４３−１５０．
【非特許文献３】Ｎｉｔｔａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：５２３１−５２３７．
【非特許文献４】Ｓｈｉｍｏｎｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：ａｒｔ．ｎｏ．１３８．
【非特許文献５】Ｅｄｄｙ  Ｓ．Ｒ．２００１．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２（１２）：９１９−９２９．
【非特許文献６】Ｖｏｇｅｌ  Ｊ．＆Ｐａｐｅｎｆｏｒｔ  Ｋ．２００６．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９：６０５−６１１．
【非特許文献７】Ａｌｂａ  Ｂ．Ｍ．＆Ｇｒｏｓｓ  Ｃ．Ａ．２００４．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５２（３）：６１３−６１９．
【非特許文献８】Ｏｎｕｆｒｙｋ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８７（１３）：４５５２−４５６１．
【非特許文献９】Ｕｄｅｋｗｕ  Ｋ．Ｉ．＆Ｗａｇｎｅｒ  Ｅ．Ｇ．Ｈ．２００７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３５（４）：１２７９−１２８８．
【非特許文献１０】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．
【非特許文献１１】Ｂｅｃｋｗｉｔｈ  Ｊ．１９９５．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：４１２１−４１３０．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の現状に鑑み、本発明は、原核細胞においてファージの感染や薬剤／酵素処理など外部からの直接的な刺激によらずに起こる自己溶菌に対して抵抗性を有する細胞、及びその作製方法を提供することをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題の解決のため、本発明者らは、大腸菌を材料に用いて培養の定常期における種々の遺伝子発現を詳細に解析し、その中でσＥと呼ばれる転写調節因子が定常期における溶菌に深く関わっていることを明らかにした（非特許文献３）。従って、σＥ因子を破壊または変質させれば自己溶菌を防げる可能性が考えられるが、σＥ因子には一般的に、種々の遺伝子のプロモーターを認識しＲＮＡ合成を開始させるなど重要な役割があり、これ自体を破壊することは有効でない。そこで本発明者らは更に、σＥ因子のターゲットとなっている種々の遺伝子を検討し、この中でｏｍｐ（Ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる膜タンパク質をコードした遺伝子の転写後調節に係る、短い分子のＲＮＡ（ｓＲＮＡ）をコードした遺伝子を破壊することで、大腸菌細胞が溶菌耐性という新たな形質を獲得するという事実を見いだした。通常、タンパク質をコードする遺伝子の長さは３００ｂｐ程度から数ｋｂｐ程度であるが、近年の遺伝子発現解析の結果、タンパク質をコードしない（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）、１００ｂｐ以下の短いＲＮＡが細胞内に多数存在することが明らかとなり、更にこれらの機能解析の結果、一部のｓＲＮＡについては転写後調節因子（Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）としての機能を有することが明らかにされつつある（非特許文献４，５）。本発明者らは、大腸菌の熱ショックをはじめとする環境ストレス応答において機能する、転写調節因子の一種σＥ因子（ｒｐｏＥ遺伝子）に着目し、溶菌時におけるσＥ因子の機能解析、更にはσＥ因子の調節を受ける「下流」の遺伝子の解析を進め、σＥ因子の制御を受けるｓＲＮＡ遺伝子に変異を生じさせ破壊することによって、自己溶菌に対して耐性を有する細胞を作製できることを見いだし、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち本発明の第１の態様は、原核生物において、ゲノム上に存在し下記の４つの条件を満たす遺伝子（以下、「溶菌原因遺伝子」という）が少なくとも１つ破壊されたことを特徴とする、原核生物の自己溶菌耐性細胞を提供する。
（１）全長が１００塩基以下の短い産物（ｓＲＮＡ）をコード
（２）σＥ因子（Ｓｉｇｍａ  Ｅ  Ｆａｃｔｏｒ）、またはσＥ因子と機能的に相同性を持つ転写調節因子により発現調節を受ける
（３）細胞内ではタンパク質に翻訳されずＲＮＡの状態で存在
（４）ｏｍｐ（Ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、またはｏｍｐ遺伝子と機能的に相同性を持つ遺伝子のｍＲＮＡと相補的に結合し、転写後調節因子として機能する
【０００９】
本発明の第２の態様は、破壊された溶菌原因遺伝子が配列番号１または配列番号２で表される塩基配列、または前記塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子である、第１の態様に記載の自己溶菌耐性細胞を提供する。
【００１０】
本発明の第３の態様は、遺伝子の破壊が相同組換えによりなされた、第１または第２の態様に記載の自己溶菌耐性細胞を提供する。
【００１１】
本発明の第４の態様は、原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、第１から第３の態様のうちいずれか１つに記載の自己溶菌耐性細胞を提供する。
【００１２】
本発明の第５の態様は、原核生物において、溶菌原因遺伝子の塩基配列中にタンパク質をコードした遺伝子を挿入する工程と、前記タンパク質を発現させることにより非溶菌耐性細胞から溶菌耐性細胞を選別する工程を含むことを特徴とする、第３または第４の態様に記載の自己溶菌耐性細胞の作製方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明を利用することにより、大腸菌をはじめ発酵産業に利用されている原核生物において、定常期における自己溶菌に対する耐性が付与された細胞を提供することが可能となる。下記実施例でも述べる通り、本発明の遺伝子を変異させることは細胞そのものの生存や生育には負の影響を与えず、これまでと同様の生産効率を有しかつ溶菌による細胞内容物の混入が抑えられた培養−物質生産系を構築することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明を実施するための最良の形態を述べる。本発明の第１の態様における自己溶菌耐性細胞は、原核生物において本来溶菌原因遺伝子を有しており、当該遺伝子が正常に機能しなくなることにより、原核生物が自己溶菌耐性という形質を獲得する。本発明の提供する溶菌原因遺伝子は大腸菌のσＥ因子の機能解析を通じて同定された遺伝子であり、その実体はタンパク質をコードせず細胞内でＲＮＡの状態で機能するｓＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）の一種である。本発明の提供する自己溶菌耐性細胞において破壊される溶菌原因遺伝子は、前記４つの条件を満たす遺伝子であればよく、その塩基配列などで本発明は限定されるものではない。すなわち転写調節因子であるσＥ因子（Ｓｉｇｍａ  Ｅ  ｆａｃｔｏｒ，σ２４も同義）、細胞膜に存在するＯｍｐ（Ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とも大腸菌でよく解析が進んでいる遺伝子であるが、σＥ因子は原核生物に広く知られた転写調節因子であり、本発明におけるσＥ因子とはｒｐｏＥ遺伝子及びその機能的ホモログも含むものである。ここで、本発明の提供する自己溶菌耐性細胞の作製に際し、このσＥ因子の遺伝子そのものを破壊することは、σＥ因子が種々の遺伝子の発現を調節するいわば「上流側」の調節因子であり、その破壊は溶菌だけでなく他の様々な生理活性、すなわちストレス応答やリポタンパク質の発現調節（非特許文献７、８）などにも大きな影響を与えるおそれがあるため、より下流側で溶菌の制御に直接またはそれに近い関連性をもつ遺伝子を破壊することが重要である。ｏｍｐもまた原核生物、特にグラム陰性の原核生物でよく保存された遺伝子であり、本発明におけるｏｍｐとはこれらの機能的なホモログを包含するものである。上記の条件を満たす具体的な例として実施例でも述べるｍｉｃＡ、ｒｙｂＢは、ｏｍｐの転写後調節因子として発見された遺伝子であるが（非特許文献６、９）、その具体的な機能、特に溶菌との関連は明らかではなかった。本発明はｏｍｐの転写後調節因子として機能するｓＲＮＡ遺伝子、好ましくはｍｉｃＡ、ｒｓｅＸ、ｒｙｂＢ、またはこれらと機能的な相同性を有するｓＲＮＡをコードした全長１００ｂｐ以下の短い遺伝子を、溶菌原因遺伝子と見なし、当該遺伝子を破壊した菌を自己溶菌耐性細胞として提供するものである。
【００１５】
上記の溶菌原因遺伝子の例として、配列番号１で表される塩基配列、またはこれと８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるｍｉｃＡ遺伝子またはこの機能的なホモログは、好適な例である。同様に配列番号２で表される塩基配列、またはこれと８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるｒｙｂＢ遺伝子またはこの機能的なホモログも、本発明の溶菌原因遺伝子の例として好適である。これらの遺伝子はいずれも、σＥ因子により転写制御を受け、ｏｍｐ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するｓＲＮＡという共通項を持った遺伝子の例である。
【００１６】
本明細書における自己溶菌とは、ファージの感染や酵素または薬剤など外部からの直接的な刺激によらないで起こる溶菌をいうが、これは一般にσＥ因子依存的に起こる、本発明の提供する溶菌原因遺伝子はσＥ因子の作用の下流にあり、溶菌のみを効果的に抑制することが可能である。また、本発明における菌とは、広く原核生物一般を指すが、この中でもグラム陰性の細菌、すなわちサルモネラなどの腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シュードモナス、モラクセラ、ヘリコバクター、ステノトロフォモナス、ビブリオ、酢酸菌、レジオネラなどのプロテオバクテリアのグループ、シアノバクテリア、ナイセリア、ヘモフィルス、クレブシエラ、ブルセラ、ボルデテラ、スピロヘータなどはσＥ因子またはそのホモログ、ｏｍｐまたはそのホモログが存在することが知られており、本発明の手法を用いて自己溶菌耐性細胞を作製するための好適な例であり、中でも大腸菌は種々の物質生産に利用されており、その溶菌を抑制することは有益である。
【００１７】
本発明においては、溶菌原因遺伝子が正常に機能しなくなることにより細胞が自己溶菌耐性という新たな形質を獲得するが、当該遺伝子を正常に機能させなくする具体的な手段としては、ＲＮＡ干渉やアンチセンス鎖をコードしたプラスミドの導入、ゲノム上の当該配列の破壊など、分子生物学分野で通常用いられるものの中から適宜選択すればよく、本発明がこれらの手段に限定されるものではない。この中でも特に形質の安定性などの観点から、ゲノム上の当該遺伝子の塩基配列中に他の塩基配列を挿入して破壊する手法、特に相同組換えを用いた破壊手法が効果的である。
【００１８】
上記態様における自己溶菌耐性細胞の作製方法としては、溶菌原因遺伝子の配列中にタンパク質をコードした遺伝子を挿入する工程と、このタンパク質の発現を検出することにより非溶菌耐性細胞から溶菌耐性細胞を選別する工程を含んだ作製方法が有効である。導入される遺伝子は、当該遺伝子を導入する細胞が通常発現しているタンパク質と区別可能なタンパク質（レポータータンパク質）であって、発光、発色、栄養要求性、抗生物質耐性など、分子遺伝学分野において通常用いられるものの中から適宜選択すればよく、その種類によって本発明が限定されるものではないが、選別の容易さの観点から抗生物質耐性が特に好適である。用いられる抗生物質の種類も分子遺伝学分野において通常用いられるものの中から適宜選択すればよく、本発明を限定するものではないが、例えば大腸菌を用いた系で利用されるカナマイシン、アンピシリンなどが好適である。以下に本発明の実施例を述べるが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
（材料と培養法）本発明の実施例として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０株を用いた。菌株はＬＢ液体培地（１％  バクトトリプトン、０．５％  酵母抽出物、０．５％  ＮａＣｌ）を用い、温度３７℃、振とう１００ｔｉｍｅｓ／ｍｉｎ、好気的環境の条件下にて培養した。細胞の増殖実験においては、予め培養しておいた菌入り培養液を新しいＬＢ培養液に０．１％の分量となるよう接種し、増殖（Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ）は培養液の懸濁度（ＯＤ６００）の一定時間ごとの値により測定した。本実施例において用いた抗生物質の最終濃度は以下の通りである。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）
【００２０】
（遺伝子操作）Ｗ３１１０株にσＥ因子を強発現させる目的で、プラスミドｐＢＡＤ２４（非特許文献１１）にプロモーター領域を含むσＥ遺伝子を導入したｐＢＡＤＰＲＯＥプラスミドを作製し、これをＷ３１１０株に導入した。形質転換細胞はｐＢＡＤ２４プラスミドに予めコードされているアンピシリン耐性によりスクリーニングした。ｐＢＡＤＰＲＯＥプラスミドは、アラビノースの存在下で導入した遺伝子（ここではσＥ遺伝子）を誘導発現するベクターであり、ここで構築した系は定常期に達した細胞にアラビノースを添加することによってσＥ因子を大量に発現させ、溶菌を誘導する系である。大腸菌ゲノム条のｍｉｃＡ遺伝子の破壊は、非特許文献１０に記載の相同組換え法によって行った。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子（ｋｍ）の５’上流にｍｉｃＡ遺伝子の５’側の配列を、３’下流にｍｉｃＡ遺伝子の３’側の配列を結合した相同組換え用ＤＮＡ断片を調製し、これを細胞に導入してゲノム上のｍｉｃＡ遺伝子との間に相同組換えを起こさせ、ｍｉｃＡ遺伝子を破壊した（ｍｉｃＡ：：ｋｍで表す）。遺伝子破壊細胞はカナマイシン耐性によりスクリーニングした。ｒｙｂＢ遺伝子の破壊（ｒｙｂＢ：：ｋｍで表す）もｍｉｃＡ遺伝子と同じ方法で行った。
【００２１】
（溶菌の誘導）約３０ｍｌのＬＢ培養液に実験に用いた各株を接種し、６時間ごとに培養液のＯＤ６００を計測して増殖曲線用のデータとした。実験に用いた株を表１に示す。Ａ．はＷ３１１０株をプラスミドｐＢＡＤ２４で形質転換したものであり、プラスミド自体の効果を確認するための対照として用いた。Ｂ．はＷ３１１０株をプラスミドｐＢＡＤＲＰＯＥにより形質転換したものであり、アラビノース添加によりσＥ因子を大量発現し溶菌を起こす系である。Ｃ．及びＤ．はそれぞれｍｉｃＡ遺伝子破壊株（ｍｉｃＡ：：ｋｍ）をｐＢＡＤ２４（Ｃ．）、ｐＢＡＤＲＰＯＥ（Ｄ．）により形質転換したものである。Ｅ．及びＦ．はそれぞれ、ｒｙｂＢ遺伝子破壊株（ｒｙｂＢ：：ｋｍ）をｐＢＡＤ２４（Ｅ．）、ｐＢＡＤＲＰＯＥ（Ｆ．）により形質転換したものである。各サンプルについて、培養開始後１２時間後にアラビノースを添加して６０時間まで培養を行い、６時間ごとのＯＤ６００を基に増殖曲線を作成した。
【表１】
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【００２２】
各株の誘導実験の結果を、図１に示す。グラフ縦軸は培養液中の菌体密度の指標としてのＯＤ６００値を、横軸は培養開始からの時間経過（ｈ）をそれぞれ示す。またグラフ中のシンボル―●―はＡ．を、―○―はＢ．を、―▲―はＣ．を、―△―はＤ．を、―■―はＥ．を、―□―はＦ．をそれぞれ表している。また矢印ａｒａで示した時点（１２時間）でアラビノースを添加した。Ａ．で示す野生型の増殖曲線では、培養開始から１８時間で定常期に達し、３６時間まで定常期が続いた後ゆるやかに菌体密度が低下しており、これは自然状態で起こる溶菌の結果と考えられた。一方Ｂ．で示すσＥ大量発現株では、ＯＤ６００値が極大に達した１８時間後から急激に菌体密度が低下し、培養開始後６０時間ではＡ．の野生型のＯＤ６００値が４．１であったのに対してＢ．では１．９にまで低下していた。これは大量発現したσＥ因子が溶菌を誘導した結果と考えられた。
σＥ因子を大量発現させたｍｉｃＡ破壊株（Ｄ．）では、溶菌の程度がＢ．に比べて遙かにゆるやかであり、６０時間後におけるＯＤ６００値が４．０とＡ．に近い値であり、ｍｉｃＡ遺伝子の破壊によってσＥ因子の大量発現による溶菌が抑えられていることが示された。同様にσＥ因子を大量発現させたｒｙｂＢ破壊株（Ｆ．）についても、ｍｉｃＡ破壊株に比べて低いものの溶菌の抑制が観察され、６０時間後のＯＤ６００値は３．７とＢ．に比べれば遙かに高かった。ｍｉｃＡ破壊株、ｒｙｂＢ破壊株はともに、σＥ因子による溶菌に対して耐性を持つ株であることが示された。
更に、σＥ因子を大量発現していないｍｉｃＡ破壊株（Ｃ．）については、６０時間後のＯＤ６００値が５．０と野生型に比べても高い値を示し、このことから自然状態における溶菌に対しても抵抗性を持つことが示唆された。ｒｙｂＢ破壊株（Ｄ．）についても野生株と同様のＯＤ６００値を示した。
Ａ．からＦ．のいずれの株においても、極大に達するまでの増殖曲線には明瞭な差が見られず、ｍｉｃＡ、ｒｙｂＢいずれの遺伝子破壊株も細胞の増殖そのものには大きな影響が無いことが示された。
【００２３】
（溶菌に伴い培養液中に溶出するタンパク質の分析）培養開始後１２時間、３６時間、６０時間の各時点について、Ａ，Ｂ（野生型），Ｃ，Ｄ（ｍｉｃＡ破壊株）のそれぞれから０．３ｍｌの培養液を採取し、１４０００ｒｐｍで２分間遠心して菌体などを完全に沈澱させ、上清を得た。この上清にトリクロロ酢酸（終濃度５％）を加えてタンパク質を沈澱させ、遠心して上清を除き、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）にタンパク質を再懸濁して、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、溶菌により培養液中に溶出したタンパク質の分析を行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２−図４に示す。各図レーンＭは分子量マーカーを示し、左端の数字が各マーカーの分子量（ｋＤａ）を示している。図２は野生型の結果であり、ｐＢＡＤ２４形質転換株（Ａ）とｐＢＡＤＲＰＯＥ形質転換株（Ｂ）のそれぞれの培養において培養液中に溶出するタンパク質を示している。対照のＡ．では、１２，３６，６０時間後のいずれにおいても明瞭なタンパク質のバンドが見られなかったが、σＥ因子を大量発現したＢ．では３６時間、６０時間後に多くのタンパク質のバンドが確認され、σＥ因子により溶菌が誘導され大量のタンパク質が培養液中に溶出していることが示された。
一方、ｍｉｃＡ遺伝子破壊株（図３）においては、ｐＢＡＤ２４形質転換株（Ｃ）、ｐＢＡＤＲＰＯＥ形質転換株（Ｄ）のいずれにおいても大量のタンパク質のバンドは観察されず、特にＤ．のσＥ因子大量発現系においてＢ．の様なタンパク質の溶出が観察されないことから、σＥ因子が大量に発現している様な条件下でも溶菌が起こっていないことが示された。更に、ｒｙｂＢ遺伝子破壊株（図４）においても、ｍｉｃＡ遺伝子破壊株と同様、培養液中に放出されるタンパク質が観察されず、ｒｙｂＢ遺伝子破壊によっても溶菌が抑制されることが示された。これらの結果から、ｍｉｃＡをはじめとする溶菌原因遺伝子を破壊することにより、本発明の提供する溶菌耐性細胞を作製可能である事が明らかとなった。
【実施例２】
【００２４】
（σＥ因子を大量発現しない系における検討）溶菌原因遺伝子の破壊が定常期における溶菌に与える影響を、プラスミドを持たない野生型とｍｉｃＡ破壊株、ｒｙｂＢ破壊株のそれぞれについて検討した。野生型としてはＷ３１１０株を用い、ゲノム上のｍｉｃＡ遺伝子を相同組換えにより破壊しカナマイシン耐性遺伝子を挿入したｍｉｃＡ破壊株（ｍｉｃＡ：：ｋｍ）とｒｙｂＢ破壊株（ｒｙｂＢ：：ｋｍ）を実施例１と同様にして作製し、ＬＢ培地にて培養を行い、１２時間ごとの培養液のＯＤ６００値を計測して増殖曲線を作成した。培養条件などは実施例１に準じた。
図５に、本実施例における各株の増殖曲線を示す。グラフ縦軸はＯＤ６００値を、横軸は培養開始からの時間経過を示し、シンボル―●―は野生型を、―△―はｍｉｃＡ破壊株を、―□―はｒｙｂＢ破壊株をそれぞれ表している。野生型では培養開始から２４時間で定常期に達しその後ゆるやかにＯＤ６００値が減少したが、ｍｉｃＡ破壊株、ｒｙｂＢ破壊株とも２４時間以降のＯＤ６００値の減少が見られなかった。すなわち、σＥ因子を大量発現しない系においても、ｍｉｃＡ破壊株、ｒｙｂＢ破壊株はともに定常期における溶菌に対して耐性を有していることが示された。
【００２５】
（タンパク質の溶出の検討）実施例１のタンパク質の溶出の検討では、野生型でのタンパク質の溶出が観察されなかったため、１００ｍｌスケールの培養系から採取する培養液の量を実施例１の１０倍の３ｍｌとして、培養開始後１２時間、３６時間、６０時間において培養液中に溶出するタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて検出した。タンパク質試料の調製方法は実施例１に記載の方法に準じた。
図６に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図中レーンＭは分子量マーカーを表しており、左端の数字は各マーカーの分子量（ｋＤａ）を表している。野生型であるＷ３１１０レーンでは、６０時間後の試料でタンパク質のバンドが多数観察された。採取する培養液の分量を増やすことで６０時間後における溶菌をタンパク質レベルで検出できた。一方、ｍｉｃＡ破壊株であるＷ３１１０（ｍｉｃＡ：：ｋｍ）レーン及びｒｙｂＢ破壊株であるＷ３１１０（ｒｙｂＢ：：ｋｍ）レーンでは、ｍｉｃＡ破壊株の６０時間後でわずかにタンパク質のバンドが観察されるもののその分量は野生型に比べ遙かに少なく、定常期に自然条件下で起こる溶菌に対してもこれらの遺伝子破壊株が耐性を持っていることが明らかとなった。
これらの結果から、本発明の提供する溶菌耐性株が、通常の培養条件下において定常期に起こる溶菌に対しても耐性を有していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明は、大腸菌をはじめとする原核生物を用いた物質の生産において、培養定常期における溶菌を起こさない細胞及びその作製方法を提供するものである。定常期における溶菌は目的とする生産物の精製コストの増大に結びついており、本発明を用いることで有用物質を低コストで生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の溶菌耐性細胞（ｍｉｃＡ遺伝子破壊株、ｒｙｂＢ遺伝子破壊株）の増殖曲線を、野生型と比較して示す。
【図２】σＥ因子を大量発現する野生株の培養において、培養液中に溶出するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図３】σＥ因子を大量発現するｍｉｃＡ遺伝子破壊株の培養において、培養液中に溶出するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図４】σＥ因子を大量発現するｒｙｂＢ遺伝子破壊株の培養において、培養液中に溶出するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図５】σＥ因子を大量発現しない系における野生型とｍｉｃＡ遺伝子破壊株、ｒｙｂＢ遺伝子破壊株の増殖曲線を示す。
【図６】σＥ因子を大量発現しない系における野生型、ｍｉｃＡ遺伝子破壊株、ｒｙｂＢ遺伝子破壊株の培養において、培養液中に溶出するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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