(57)【要約】【課題】工業生産規模においてヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを生産する微生物を作製し、さらには、新規Ｆｃレセプター生産系を利用してヒト型ＦｃγＲＩ生産を行ない、該ＦｃγＲＩを提供すること。【解決の手段】ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドを調製し、当該ポリヌクレオチドが挿入されたプラスミドベクターをバチルス属細菌に形質転換することでヒト型ＦｃγＲＩを可溶化等の操作をせずに大量発現させることが可能となる。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド配列のうち、少なくとも６４番目から８６７番目のポリヌクレオチドのコドンがヒト型からバチルス属細菌型に変換されたことを特徴とする、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３のポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１に記載のヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドが挿入されたプラスミドベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のプラスミドベクターをバチルス属に属する細菌に形質転換することにより得られる、形質転換体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含むヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト型ＦｃレセプターのひとつであるＦｃγＲＩを、バチルス属に属する細菌を用いることで、可溶化等の操作をせずに大量発現させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。
【０００４】
ヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列、および遺伝子配列（配列番号１）はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されており、図１にヒト型ＦｃγＲＩの構造略図を示す。なお、図中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１のアミノ酸番号１のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９のバリン（Ｖａｌ）までが細胞外領域、配列番号１のアミノ酸番号２９０のロイシン（Ｌｅｕ）から３７４のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。
【０００５】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。
【０００６】
ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列（非特許文献４）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）あるいは動物細胞を利用した発現が報告されている。しかしながら、大腸菌を利用した発現系においてはＦｃγＲＩの細胞外領域タンパク質の発現量は極めて低く、また、発現されたタンパク質は菌体内発現のため、多くの場合発現したタンパク質は不溶性の封入体となる。封入体タンパク質は可溶化等の操作をすることにより、活性型タンパク質として調製することは可能であるが、煩雑な操作を必要とする。また、動物細胞を用いた系では、大腸菌以上の発現量が報告（非特許文献３）されているが培養に多大な時間を要し、かつ、生産性も高くない。
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
【非特許文献３】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【非特許文献４】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９
【非特許文献５】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２
【非特許文献６】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．、４７、４４１−４４５、２００６
【非特許文献７】Ｍａｓａｙａ  Ｎａｇａｏ等、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６１、６７０、１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は工業生産規模においてヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを高い生産性を以って生産する微生物を作製することである。さらには、新規Ｆｃレセプター生産系を利用してヒト型ＦｃγＲＩ生産を行ない、当該ヒト型ＦｃγＲＩを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、上記課題に関し鋭意検討した結果、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ遺伝子のコドンをヒト型からバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌型に変換後、変換したポリヌクレオチドを発現プラスミドベクターに挿入し、当該挿入されたプラスミドベクターにより形質転換されたバチルス属に属する細菌を用いて発現させることで、可溶化等の操作が不要な活性型ＦｃγＲＩを直接生産することができ、かつ、その発現量も飛躍的に向上することを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する：
（１）配列番号１に示すヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド配列のうち、少なくとも６４番目から８６７番目のポリヌクレオチドのコドンがヒト型からバチルス属細菌型に変換されたことを特徴とする、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド。
（２）前記ポリヌクレオチドが、配列番号３のポリヌクレオチドであることを特徴とする、（１）に記載のヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド。
（３）（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドが挿入されたプラスミドベクター。
（４）（３）に記載のプラスミドベクターをバチルス属に属する細菌に形質転換することにより得られる、形質転換体。
（５）（４）に記載の形質転換体を培養する工程を含むヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩポリペプチドの製造方法。
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１２】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す、ヒト型Ｆｃレセプターの一つであるＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド配列のうち、少なくとも６４番目から８６７番目のポリヌクレオチド（配列番号１のアミノ酸番号２２のアラニン（Ａｌａ）から２６９のバリン（Ｖａｌ）をコードするポリヌクレオチド）のコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドであり、好ましくは、上記６４番目から８６７番目のポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドが、配列番号３のポリヌクレオチドであることを特徴とする、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドである。
【００１３】
本発明のＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドは、ヒト型ＦｃγＲＩをコードする遺伝子のうち、少なくとも配列番号１の６４番目から８６７番目のポリヌクレオチド中に存在するバチルス属細菌におけるレアコドン（ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎ）を、コードするアミノ酸を同一のまま、バチルス属細菌の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換することにより得られる。なお、レアコドンとは、その宿主におけるコドンの使用頻度が少ないものをいう。宿主におけるコドンの使用頻度は、ゲノム遺伝子の塩基配列等の解析結果等から推測することが可能であり、例えば、バチルス属細菌の一種であるＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓにおけるレアコドンとしては、アミノ酸セリン（Ｓｅｒ）コドンのＵＣＡ、ロイシン（Ｌｅｕ）コドンのＣＵＡ、アルギニン（Ａｒｇ）コドンのＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ、イソロイシン（Ｉｌｅ）コドンのＡＵＡがあげられる。また、コドンの使用頻度の情報は公的データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）からも得ることができる。レアコドンから利用頻度の高いコドンへの変換は対応する塩基配列を変換することにより可能であり、塩基配列の変換はＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法など公知の変異導入法を利用することができるが、好ましい変換方法は、合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを組合わせたＤＮＡＷｏｒｋｓ法（非特許文献５）やＳｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ法（非特許文献６）である。上記方法では、ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を基にして、数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲ法により合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製することができる。なお、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのヒト型からバチルス属細菌型へのコドン変換は、実施例に記載のように、ヒト型ＦｃγＲＩ遺伝子配列（配列番号１）のすべてのレアコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換（配列番号２）しても良いし、一部のレアコドン、例えば配列番号１に示すポリヌクレオチド配列のうち６４番目から８６７番目にあるレアコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換（配列番号３）してもよい。
【００１４】
さらにヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドの５’末端側に、転写を開始するためのメチオニンをコードするオリゴヌクレオチドを付加しても良く、また上記記載のポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドを付加しても良い。ここに述べる、シグナルペプチドとは、細胞質内で発現したタンパク質が細胞膜を通過し、細胞膜外において分泌するためのポリペプチドであり、通常、当該タンパク質のＮ末端側に存在しており、細胞膜通過後、特定のプロテアーゼ酵素によって切断される。シグナルペプチドの例としては、配列番号１のアミノ酸番号１から１５、あるいは１から２０のペプチドをあげることができる。
【００１５】
本発明は、ヒト型ＦｃγＲＩを簡便に精製することを目的として、上記記載のポリヌクレオチドに、タグ（ｔａｇ）となるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加させてもよい。タグペプチドとしてはポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、ミックタグ（Ｃ−ｍｙｃ  ｔａｇ）等を例示することができる。付加させる位置は、上述のポリペプチドの生物活性を損なわない限りにおいて、Ｎ末端側、Ｃ末端側どちらでも構わない。上記記載のオリゴヌクレオチドへのタグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの付加は、当業者に周知の方法にて遺伝子工学的に作製することが可能である。
【００１６】
本発明の、コドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したヒト型ＦｃγＲＩポリヌクレオチドが挿入された遺伝子組換えプラスミドベクターは、上記記載のヒト型ＦｃγＲＩポリヌクレオチドを公知の発現プラスミドベクターの適当な位置に遺伝子工学的に挿入することにより、ヒト型ＦｃγＲＩが発現可能な遺伝子組換えプラスミドベクターを得ることができる。公知の発現プラスミドベクターとしては、例えば、バチルス属細菌の形質転換に利用されるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＷＶＯ１等をあげることができる。ここで述べる適当な位置とはプラスミドベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、あるいは伝達性に関わる領域を破壊しないような位置等を意味する。そして、上記記載の遺伝子組換えプラスミドベクターをバチルス属の属する細菌に形質転換して得られる形質転換体を培養することにより、ヒト型ＦｃγＲＩを発現させることがきる。
【００１７】
本発明で形質転換に用いる宿主細胞は、コドンの変換対象であるバチルス属に属する細菌であれば良く、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ等をあげることができる。特に、胞子形成関連遺伝子が破壊されており、かつ、菌体内プロテアーゼ遺伝子ｊｍｐや菌体外プロテアーゼ遺伝子ｅｍｐも破壊されている、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ（非特許文献７）を宿主細胞として用いるのが好ましい。また、上記バチルス属に属する細菌を変異処理することにより誘導されるバチルス属細菌変異株を利用することもできる。変異処理はニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル、紫外線、放射線等の当業者において周知の変異処理剤を利用して行なえばよい。
【００１８】
本発明の、バチルス属細菌への外来遺伝子の導入および発現のための手順、および方法は、実施例に記載した方法のほかにも、遺伝子工学の分野により慣用されているものを含み、具体的にはエレクトロポレーション法、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法等をあげることができる。
【００１９】
本発明の、ヒト型ＦｃγＲＩを生産するために用いられるバチルス属に属する細菌は、選択した宿主細胞の培養に好適な公知の培地で増殖させることができる。なお、本発明に用いる培地としては細菌が増殖し、ヒト型ＦｃγＲＩを生産し得るものであれば何れも使用してよく、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガン等が、ビタミン類としては酵母エキス、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。好ましい実施態様では、発現プラスミドベクターを含有するバチルス属細菌の増殖を選択的に可能にするために、培地は発現プラスミドベクターの構成を基にした選抜剤を含んでもよい。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のためにネオマイシンを培地に添加する。培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を加えてもよい。所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでも良い。バチルス属細菌増殖における培養温度は、約２０から４０℃、好ましくは２５から３５℃であり、より好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、約５から１０、好ましくは７．０である。
【００２０】
本発明の発現プラスミドベクターに宿主菌の細胞壁タンパク質由来のプロモータを用いる場合には、菌の生育が定常期に入ってから活発に働くため、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、対数増殖期から定常期に移行した後、引き続き培養することによりタンパク質を培養液中へ分泌発現させることができる。培養時間は２４から９６時間、好ましくは４０から５０時間であるが、最適な培養時間は培地成分、培養温度、および通気量といった条件により変化するため、発現したタンパク質の発現量や活性等を測定して決定するのが好ましい。
【００２１】
培養液から、本発明のヒト型ＦｃγＲＩを取得するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からヒト型ＦｃγＲＩを抽出すればよい。細胞質内で発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集め、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕し、ヒト型ＦｃγＲＩを抽出することができる。抽出タンパク質の中からヒト型ＦｃγＲＩを分離・精製するためには液体クロマトグラフィーを利用することができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を挙げることができる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより高純度なヒト型ＦｃγＲＩを調製することができる。
【００２２】
本発明により得られた精製したヒト型ＦｃγＲＩを、固定相に固定化することにより抗体を液相から吸着させ分離することができる。固定相としてはセルロース、アガロース等の多糖類、ガラス、セラミックス、あるいは、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン等のプラスチック素材を例示することができる。また、固相に固定したヒト型ＦｃγＲＩをカラムに充填することにより抗体に対するクロマトグラフィーゲルとしても利用することができる。また、ヒト血清を検体にすることにより特異性の高いイムノアッセイが可能であり各種診断材料としても利用することができる。
【発明の効果】
【００２３】
ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードする遺伝子のコドンを、ヒト型からバチルス属細菌型に変換し、当該ポリヌクレオチドが挿入されたプラスミドをバチルス属に属する細菌に形質転換させることで、ヒト型ＦｃγＲＩを可溶化等の操作なく大量に発現させることが可能となる。この発現系は、工業生産規模におけるヒト型ＦｃγＲＩの生産に有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１  ヒト型ＦｃレセプターをコードするＤＮＡ配列の設計
配列番号１に記載のヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩのアミノ酸配列を基にＤＮＡｗｏｒｋｓ法（非特許文献５）により、コドンをブレビバチルス属細菌型に変換した。該方法によりコドンを変換したヒト型ＦｃγＲＩの塩基配列（配列番号２）とコドン変換前のヒト型ＦｃγＲＩの塩基配列（配列番号１）を比較した結果を図２に示す。図２の通り、アミノ酸配列はそのままにＤＮＡ配列の変換が行われ、そのＤＮＡ配列間の類似性は７５％であった。
実施例２  ヒト型ＦｃレセプターをコードするＤＮＡ配列の作製
ヒト型ＦｃγＲＩ遺伝子のコドンをヒト型からブレビバチルス属細菌型に変換したＤＮＡ配列を以下の方法で作製した。
（１）ヒト型ＦｃγＲＩ遺伝子のコドンをヒト型からブレビバチルス属細菌型に変換したＤＮＡ配列を作製するための５２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。合成したオリゴヌクレオチドを配列番号４から５５に示す。
（２）（１）で合成したオリゴヌクレオチドから完全長のヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡを作製するために、二段階のＰＣＲを行なった。
（２−１）一段階目のＰＣＲの反応液は表１の通りで、反応条件は９４℃・５分の熱処理後、９４℃・３０秒間の第一ステップ、６２℃・３０秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、次いで、７２℃・７分の第四ステップである。表１中のＤＮＡミックスは５２種類の合成した５０ｐｍｏｌ／μＬのオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液である。
【００２５】
【表１】
2009201403.tif 000003
（２−２）二段階目のＰＣＲは一段階目のＰＣＲの反応液を用いて、表２の反応液組成で行なった。ＰＣＲプライマーの配列は、配列番号４（５’−ＡＴｇＴｇｇＴＴＣＴＴｇＡＣＡＡＣＴＣＴＣＣＴｇＣＴＴＴｇｇｇＴＣＣＣ−３’）と配列番号５５（５’−ＡｇＴＡｇＣｇＣＣＴＴｇＣｇｇＴＴＣＴＴＴＡＣｇＡＴｇＣＡＣｇＣＣＣＴＣＣ−３’）のオリゴヌクレオチドを用いた。反応条件は９４℃・５分の熱処理後、９４℃・３０秒間の第一ステップ、６５℃・３０秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、最後に、７２℃・７分の第四ステップである。
【００２６】
【表２】
2009201403.tif 000004
反応終了後０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンド（約１１００塩基対）を確認することができた。
（３）目的バンドをアガロースゲルから抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商品名）：キアゲン社製）後、抽出ＤＮＡの５’末端をリン酸化し、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＵＣ１９プラスミドベクターに挿入し、５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを添加したＬＢ寒天培地により大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。これをｐＢＢＦｃＲとした。図３に構造を示す。
実施例３  ヒト型ＦｃγＲＩ細胞外領域発現プラスミドベクターの作製
ヒト型ＦｃγＲＩの細胞外領域を発現させるために、以下に示す方法でヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドベクターの作製を行なった。
（１）ｐＢＢＦｃＲをテンプレートにし配列番号５６（５’−ＡＣＡＴｇ［ＣＣＡＴｇｇ］ＣＴＴＴＣｇＣＴｇＣＡｇｇＡＴＣＣｇＣＴｇＴＡＡＴＣＡＣＴＣＴｇＣＡｇＣＣＡＣ−３’：角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｃｏＩサイト）と配列番号５７（５’−ｇＣ［ＴＣＴＡｇＡ］ＣＴＡＡＴｇｇＴｇＡＴｇｇＴｇＡＴｇｇＴｇｇＡＣＴｇｇＡｇＴＡｇｇＣＡｇＴＴｇ−３’：角かっこ内の塩基は制限酵素ＸｂａＩサイト）のオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲを行ない、細胞外領域をコードするＤＮＡを増幅した。なお、ヒト型ＦｃγＲＩの調製および定量を行なうために、発現タンパク質のＣ末端側にポリヒスチジンタグが付加されるようにＰＣＲプライマーを設計した（配列番号５７）。反応条件は９４℃・５分の熱処理後、９４℃・３０秒間の第一ステップ、６５℃・３０秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、最後に、７２℃・７分の第四ステップである。反応液組成を表３に示す。
【００２７】
【表３】
2009201403.tif 000005
反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認することができた。
（２）目的バンドをアガロースゲルから抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商品名）：キアゲン社製）後、抽出ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩにより消化し、これらの制限酵素により事前に消化したｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社製）とライゲーションし、５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを添加したＬＢ寒天培地により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し調製した。これをｐＮＣＢＢＦｃＲとした。図４にｐＮＣＭＯ２プラスミドベクターのマルチクローニングサイト周辺の塩基配列、図５に上記に記載したプラスミドベクターｐＮＣＢＢＦｃＲの作製方法の概略を示す。
（３）並行して、ヒト型ＦｃγＲＩの細胞外領域をコードするヒト型コドンのＤＮＡを用いた発現ベクターも作製した。挿入断片の作製はＰＣＲで行ない、Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＴＣ１１９８４１プラスミドベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）をテンプレートとし、配列番号５８（５’−ＣｇＣ［ｇｇＡＴＣＣ］ｇＣＡｇＴｇＡＴＣＡＣＴＴＴｇＣＡｇＣＣＴＣＣＡＴｇｇｇ−３’：角かっこ内の塩基は制限酵素ＢａｍＨＩサイト）と配列番号５９（５’−ｇＣ［ＴＣＴＡｇＡ］ＣＴＡＡＴｇｇＴｇＡＴｇｇＴｇＡＴｇｇＴｇｇＡＣＡｇｇＡｇＴＴｇｇＴＡＡＣＴｇｇ−３’：角かっこ内の塩基は制限酵素ＸｂａＩサイト）のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した。なお、ヒト型ＦｃγＲＩの調製および定量を行なうために、発現タンパク質のＣ末端側にポリヒスチジンタグが付加されるようにＰＣＲプライマーを設計した（配列番号５９）。ＰＣＲは９４℃・５分の熱処理後、９４℃・３０秒間の第一ステップ、６５℃・３０秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、最後に、７２℃・７分の第四ステップである。反応液組成を表４に示す。
【００２８】
【表４】
2009201403.tif 000006
反応終了後０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認することができた。
（４）目的バンドをアガロースゲルから抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商品名）：キアゲン社製）後、抽出ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩにより消化し、これらの制限酵素により事前に消化したｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社製）とライゲーションし（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（商品名）：タカラバイオ社製）、５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを添加したＬＢ寒天培地により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し調製した。これをｐＮＣＨＵＦｃＲとした。図６に、上記に記載したプラスミドベクターｐＮＣＨＵＦｃＲの作製方法の概略を示す。
実施例４  配列の確認
実施例３において作製したｐＮＣＢＢＦｃＲ  およびｐＮＣＨＵＦｃＲプラスミドベクターに挿入したＤＮＡの配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（商品名）（ＰＥアプライドバイオシステム社）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名）（ＰＥアプライドバイオシステム社）にて解析した。なお、配列番号６０（５’−ＣｇＣＴＴｇＣＡｇｇＡＴＴＣｇｇ−３’）と６１（５’−ＣＡＡＴｇＴＡＡＴＴｇＴＴＣＣＣＴＡＣＣＴｇＣ−３’）に示すオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００２９】
解析の結果、ｐＮＣＢＢＦｃＲおよびｐＮＣＨＵＦｃＲに挿入したＤＮＡの塩基配列は設計通りであることを確認した。ｐＮＣＢＢＦｃＲおよびｐＮＣＨＵＲｃＲにより発現されるヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号６２および６３にそれぞれ示す。それぞれの配列にはｐＮＣＭＯ２プラスミドベクター上のシグナル配列を含めている。
実施例５  形質転換体の培養
ｐＮＣＢＢＦｃＲプラスミドベクターを１０μｇ／ｍＬの抗生物質ネオマイシンを添加したＴＭ寒天培地（表５）によりＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ  ＳＰ３株（タカラバイオ社製）に形質転換した。
【００３０】
【表５】
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３７℃で１８時間培養後、出現した任意のコロニーを選択し１０μｇ／ｍＬの抗生物質ネオマイシンを添加したＴＭ液体培地１ｍＬを含む試験管に接種した。表６にＴＭ液体培地の組成を示す。
【００３１】
【表６】
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激しく撹拌しながら３０℃で４８時間培養後、遠心分離操作（１００００ｒｐｍ、１０分間）により菌体と培養上清に分離した。ｐＢＢＨＵＦｃＲプラスミドベクターについても同様に操作し、任意にコロニーから培養上清を調製した。
実施例６  形質転換体の抗体結合活性評価
実施例５で調製した形質転換体の培養上清をＥＬＩＳＡ反応により抗体結合活性を評価した。
（１）９６穴のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に５０μｇ/ｍＬから段階的に希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１８時間静置することにより固定した。
（２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を施した。
（３）同様に、ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、実施例５で調製した任意のコロニー由来の培養上清を１００μＬ添加し、固定化した抗体であるヒトガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。
（４）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３２】
結果を図７に示す。図７の通り、ｐＮＣＢＢＦｃＲにより形質転換されたバチルス属細菌由来の培養上清の抗体結合活性はｐＮＣＨＵＦｃＲのものに比べて有意に高いことが分かった。すなわち、ヒト型ＦｃγＲＩを宿主バチルス属細菌において発現させる場合、同タンパク質をコードする塩基配列のコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換した遺伝子の方がバチルス属細菌宿主にとっては高発現であった。また、実施例５で調製した形質転換体を用いて発現させたヒト型ＦｃγＲＩは、可溶化等の操作をしなくても抗体結合性を持った活性型のタンパク質が得られたことから、実施例５で調製した形質転換体を用いた当該タンパク質の生産方法は従来技術である大腸菌や動物細胞を用いた系と比較し、当該タンパク質の生産に有用なものといえる。
実施例７  ｐＮＣＢＢＦｃＲにより形質転換されたバチルス属細菌の培養経時変化
実施例５で評価した任意のコロニーの中から最も抗体結合活性の高かったクローンを選択しフラスコにより培養した。すなわち、１０μｇ／ｍＬの抗生物質ネオマイシンを添加した２００ｍＬのＴＭ液体培地（表６）を添加した５００ｍＬ容のバッフル付フラスコに高活性クローンを接種し、１５０ｒｐｍの撹拌により３０℃で培養した。適当な時間、培養液をサンプリングし実施例６と同様に培養上清を調製し、実施例６と同様に抗体結合活性を評価した。結果を図８に示した。図８の通り、ヒト型ＦｃγＲＩは培養約２４時間から生産され培養５３時間で最も多く生産されることが分かった。
実施例８  ウエスタンブロッティング法によるＦｃレセプターの検出
実施例７で調製した培養上清をＳＤＳ―ＰＡＧＥ電気泳動に供し、ウエスタンブロッティング法による検出を行なった。
（１）培養上清１０μＬとメルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液１０μＬを混合し、９８℃、５分間の熱処理後、１０から２０％グラジエントのポリアクリルアミドゲルを使用した電気泳動を行なった。
（２）ＣＢＢ染色後、４％のスキンミルクにより事前にブロッキングしたＰＶＤＦメンブランに転写した（１５０ｍＡ、１２０分間）。
（３）０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で２０００倍希釈した抗ＣＤ６４（ＦｃレセプターＦｃγＲＩの別名）抗体（ｇｏａｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ抗体）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、３０℃で２時間反応させた。
（４）反応終了後、０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液を用いて洗浄し、二次抗体である抗ｇｏａｔＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体−ＨＲＰ標識（ＺＹＭＥＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を２０００倍希釈し添加、反応させた。
（５）０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で洗浄後、電気泳動ゲル１枚あたり２ｍＬのＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を添加し、メンブラン上で５分間静置後、フィルムを感光させた。
【００３３】
現像結果を図９に示す。図９の通り、培養２４時間後から１００時間後までの間にサンプリングした調製液からヒト型ＦｃγＲＩが検出された。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの構造を示す図である。
【図２】ヒト型ＦｃγＲＩのヒト型コドンおよびバチルス属細菌型コドン間の塩基配列を比較した図である。図中、ＢａｃｉｌｌｕｓＦｃγＲＩがバチルス属細菌型コドンに変換したヒト型ＦｃγＲＩの塩基配列（配列番号２）、ＨｕｍａｎＦｃγＲＩがコドン変換前のヒト型ＦｃγＲＩの塩基配列（配列番号１）である。
【図３】プラスミドベクターｐＢＢＦｃＲの構造を示す図である。
【図４】プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２マルチクローニングサイトの塩基配列を示す図である。
【図５】プラスミドベクターｐＮＣＢＢＦｃＲの作製方法を示す図である。
【図６】プラスミドベクターｐＮＣＨＵＦｃＲの作製方法を示す図である。
【図７】実施例５で調製した形質転換体（ヒト型コドン由来、またはバチルス属細菌型コドン由来）を用いて発現させたヒト型ＦｃγＲＩの抗体結合活性を比較した図である。
【図８】バチルス属細菌によるヒト型ＦｃγＲＩの生産を示す図である。
【図９】ウエスタンブロッティング法によるヒト型ＦｃγＲＩの検出結果を示す図である。なお、図中のレーン番号は、１が培養２４時間後、２が３３時間後、３が４８時間後、４が５８時間後、５が１００時間経過後の培養上清に対して、抗ＣＤ６４抗体により検出した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月30日(2009.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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