(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子型の異なる種々のＨＣＶについて測定が可能で、かつ、ウイルス濃度が極めて少ない検体においても、定量的で高い増幅産物量を得ることができるプライマーとプローブとのセット、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ検出用キット、ならびにリアルタイム検出ＰＣＲ法によるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの検出方法の提供。【解決手段】プライマーとプローブとのセットは、特定の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基数１４〜２２のオリゴヌクレオチドからなるフォワード側プライマーと、特定の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基数１４〜２２のオリゴヌクレオチドからなるリバース側プライマーと、ドナー蛍光色素およびアクセプター蛍光色素が結合した、特定の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基数１６〜２７のオリゴヌクレオチドからなる蛍光プローブとのセットである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される配列と９０％以上の相同性を有する塩基数１４〜２２のオリゴヌクレオチドからなるフォワード側プライマーと、
配列番号２で示されるで示される配列と９０％以上の相同性を有する塩基数１４〜２２のオリゴヌクレオチドからなるリバース側プライマーと、
ドナー蛍光色素およびアクセプター蛍光色素が結合した、配列番号３で示される配列と９０％以上の相同性を有する塩基数１６〜２７のオリゴヌクレオチドからなる蛍光プローブと、
のセット。
【請求項２】
請求項１のセットを含む、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ検出用キット。
【請求項３】
検体、請求項１記載のフォワード側プライマー、請求項１記載のリバース側プライマー、および請求項１記載の蛍光プローブを含む液中でＰＣＲ反応を行ない、得られた蛍光強度に基づいて検体中のＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ量を測定することを含む、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマーとプローブとのセット、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＣ型肝炎ウイルス（本願明細書において「ＨＣＶ」ともいう。）ＲＮＡ検出用キット、ならびに、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＣＶ  ＲＮＡの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶの定量は、ＨＣＶ感染者の治療効果を観察するため、ならびに、輸血用血液あるいは移植用臓器を介したレシピエントのＨＣＶ感染を防ぐためのドナーのＨＣＶ感染の有無をチェックするための手段として重要である。
【０００３】
血清等の試料中のＨＣＶを定量する方法としては、例えば、試料より抽出したＨＣＶのＲＮＡを逆転写(ＲＴ)してｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡをＴａｑＭａｎ（商標）法等のリアルタイム検出ＰＣＲ法で定量する方法が挙げられる。
【０００４】
リアルタイム検出ＰＣＲ法は、ＨＣＶ  ＲＮＡの高感度検出法として有用であるが、リアルタイム検出ＰＣＲ法の性能を最大限発揮させるためには、用いるプライマーおよびプローブの選択が大変重要である。
【０００５】
しかし、リアルタイム検出ＰＣＲ法に用いるプライマー及びプローブの選択如何によっては、ある種のＨＣＶの遺伝子型で検出不良となったり、ウイルス量の少ない検体において増幅効率が低下して検出不良となったり、あるいは、定量性が損なわれることがある。
【特許文献１】特開２００３−１８９８６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、遺伝子型の異なる種々のＨＣＶについて測定が可能で、かつ、ウイルス濃度が極めて少ない検体においても、定量的で高い増幅産物量を得ることができるプライマーとプローブとのセット、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ検出用キット、ならびにリアルタイム検出ＰＣＲ法によるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、高感度なＤＮＡの増幅法であるＰＣＲ法に基づくＤＮＡの検出または定量法である、リアルタイム検出ＰＣＲ法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemistry; 特表平６−５０００２１号公報）を用いることにより、従来法よりも高感度にＨＣＶのＲＮＡを定量的に検出できると考えた。
【０００８】
しかしながら、このリアルタイム検出ＰＣＲ法においても、用いるプライマー及びプローブの選択の如何によっては、測定の感度及び／又は再現性について必ずしも満足できないことが判明した。そこで、鋭意研究の結果、特定のプライマー及びプローブを用いることにより、リアルタイム検出ＰＣＲ法の性能を最大限に引き出し、非常に高感度に、高い再現性をもってＨＣＶ  ＲＮＡを正確に定量することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明の一態様にかかるプライマーとプローブとのセットは、配列番号１で示される配列と９０％以上の相同性を有する塩基数１４〜２２のオリゴヌクレオチドからなるフォワード側プライマーと、配列番号２で示されるで示される配列と９０％以上の相同性を有する塩基数１４〜２２のオリゴヌクレオチドからなるリバース側プライマーと、ドナー蛍光色素およびアクセプター蛍光色素が結合した、配列番号３で示される配列と９０％以上の相同性を有する塩基数１６〜２７のオリゴヌクレオチドからなる蛍光プローブとのセットである。
【００１０】
本発明の一態様にかかるリアルタイム検出ＰＣＲ法によるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ検出用キットは、上記プライマーとプローブとのセットを含む。
【００１１】
本発明の一態様にかかるリアルタイム検出ＰＣＲ法によるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの検出方法は、検体、上記フォワード側プライマー、上記リバース側プライマー、および上記蛍光プローブを含む液中でＰＣＲ反応を行ない、得られた蛍光強度に基づいて検体中のＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ量を測定することを含む。
【発明の効果】
【００１２】
上記プライマーとプローブとのセットを用いて、リアルタイム検出ＰＣＲ法によってＨＣＶ  ＲＮＡを定量することにより、遺伝子型の異なる種々のＨＣＶについて測定が可能で、かつ、ウイルス濃度が極めて少ない検体においても、定量的で高い増幅産物量を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
１．プライマーとプローブとのセット
本発明の一実施形態にかかるプライマーとプローブとのセットは、フォワード側プライマーと、リバース側プライマーと、ドナー蛍光色素およびアクセプター蛍光色素が結合したオリゴヌクレオチドからなる蛍光プローブとのセットである。本実施形態に係るプライマーとプローブとのセットは、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ検出用キットに好適に使用できる。
【００１４】
１．１．プライマー
フォワード側プライマーは、配列番号１で示される配列と９０％以上の相同性を有する塩基数１４〜２２（好ましくは１８〜２２）のオリゴヌクレオチドからなる。
【００１５】
このフォワード側プライマーは、ＰＣＲ反応において、ＨＣＶ  ＲＮＡの５’末端の非翻訳領域の一部を増幅する機能を有する。フォワード側プライマーとしては、例えば、配列表の配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがより好ましい。
【００１６】
リバース側プライマーは、配列番号２で示される配列と９０％以上の相同性を有する塩基数１４〜２２（好ましくは１８〜２２）のオリゴヌクレオチドからなる。
【００１７】
このリバース側プライマーは、ＰＣＲ反応において、ＨＣＶ  ＲＮＡの５’末端の非翻訳領域の一部を増幅する機能を有する。リバース側プライマーとしては、例えば、配列表の配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがより好ましい。
【００１８】
１．２．蛍光プローブ
蛍光プローブは、ＨＣＶ  ＲＮＡの増幅を検出するためのものであり、３’末端がドナー蛍光色素で標識化されかつ５’末端がアクセプター蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）である。すなわち、蛍光プローブのオリゴヌクレオチド部分は、配列番号３で示される配列と９０％以上の相同性を有する塩基数１６〜２７のオリゴヌクレオチドからなる。
【００１９】
ドナー蛍光色素がアクセプター蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、一方、アクセプター蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されない。
【００２０】
ドナー蛍光色素およびアクセプター蛍光色素の種類は、蛍光共鳴エネルギー転移を示す蛍光色素のペアであれば特に制限されないが、ドナー蛍光色素としては、例えば、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のようなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、アクセプター蛍光色素としては、例えば、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素が好ましい。これら蛍光色素を結合したプローブは、当該業者ならば容易に知ることができ、プローブ合成の受託業者に合成を依頼して入手することができる。
【００２１】
２．Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの検出方法
本発明の一実施形態にかかるリアルタイム検出ＰＣＲ法によるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの検出方法は、検体、上記フォワード側プライマー、上記リバース側プライマー、および上記蛍光プローブを含む液中でＰＣＲ反応を行ない、得られた蛍光強度に基づいて検体中のＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ量を測定することを含む。
【００２２】
本実施形態にかかるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの検出方法では、上記フォワード側プライマーと、上記リバース側プライマーと、上記蛍光プローブとを用い、液中（被検試料中）の測定すべきＨＣＶ  ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定する。このリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は公知であり、そのための装置及びキットも市販されているので、このような市販の装置及びキットを用いて行なうことができる。
【００２３】
鋳型となるＨＣＶ  ＲＮＡは、ＨＣＶを含有する疑いのある検体、例えば、血清、血漿等の体液から従来のＰＣＲの場合と同様の方法で抽出、精製したものが使用でき、例えば、スマイテストＥＸ−Ｒ＆Ｄ（商品名、ゲノムサイエンス研究所製）などを用いて抽出した遺伝子を使用することができる。
【００２４】
反応では、まず、ＨＣＶ  ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。増幅ＤＮＡは、プローブと相補的な領域を含んでいるため、プローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズする。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プローブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とする伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解される。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド部分に結合されているドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素とがバラバラになり、アクセプター蛍光色素に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されていたドナー蛍光色素からの蛍光強度が増加する。同時に、アクセプター蛍光色素に由来する蛍光強度は、ドナー蛍光色素からのエネルギー転移を得られなくなり減少する。一方、被検試料中にＨＣＶ  ＲＮＡが存在しない場合には、ＲＴ−ＰＣＲによるＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡにハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによって加水分解されることもない。このため、ドナー蛍光色素からの蛍光は、アクセプター蛍光色素により抑制されたままであり、蛍光強度は変化しない。従って、蛍光強度の変化を測定することにより、被検試料中のＨＣＶ  ＲＮＡを検出することが可能である。
【００２５】
本実施形態にかかるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの検出方法では、蛍光強度をリアルタイムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣＲ反応を行なう。測定されるドナー色素に由来する蛍光強度は、あるサイクル数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そして、被検試料中のＨＣＶのＲＮＡの量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、ＲＮＡ量が未知の試料のＲＮＡの定量は、５０回の増幅サイクルにおいて、蛍光強度が一定の基準値（Threshhold:Th）を越えたサイクル数（Ｔｈサイクル数）を求め、ＲＮＡ濃度既知の試料の希釈系列を同時に測定して作製された、ＲＮＡ量対Ｔｈサイクル数の検量線に外挿することによって求めることができる。
【００２６】
３．実施例
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２７】
３．１．実施例１
３．１．１．プライマーの調製
配列番号１に示される２０ｍｅｒのオリゴＤＮＡを準備し、フォワード側プライマーとした。また、配列番号２に示される２０ｍｅｒのオリゴＤＮＡを準備し、リバース側プライマーとした。
【００２８】
３．１．２．蛍光プローブの調製
配列番号３に示される２５ｍｅｒのオリゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡを結合した蛍光プローブ（ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）を準備した。
【００２９】
３．１．３．反応液の調製
上記プライマー、蛍光プローブ及びQuantiTect Probe RT-PCR Kit（商品名、株式会社キアゲン製）を用いて、反応チューブ１本あたり、下記に示すＰＣＲ反応液を調製した。
【００３０】
［ＰＣＲ反応液組成］
２×QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix            ２５μｌ
QuantiTect Probe RT Mix                         ０．５μｌ
25mM MgCl2                                        ６４μｌ
PCRグレード蒸留水                             ４．０６μｌ
フォワード側プライマー（１００μＭ）            ０．２μｌ
リバース側プライマー（１００μＭ）              ０．２μｌ
蛍光プローブ（１００μＭ）                    ０．０４μｌ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
合計                                            ６４０μｌ
【００３１】
３．１．４．検体由来ＨＣＶ  ＲＮＡの調製
ウイルス濃度既知のＣ型肝炎ウイルス陽性血清（１×１０4IU/mL）をＣ型肝炎ウイルス陰性血清で希釈し、ウイルス濃度１×１０４、１×１０３、１×１０２、１×１０１ＩＵ／ｍＬの検体を調製した。各検体およびＣ型肝炎ウイルス陰性血清１００μｌに対して、スマイテストＥＸ−Ｒ＆Ｄ（商品名、ゲノムサイエンス研究所社製ＤＮＡ抽出試薬）の酵素溶液１５μｌ、共沈剤溶液５μｌ、検体希釈液３８０μｌを加え撹拌し、５５℃で４５分間反応した。次に、蛋白溶解液２５０μｌを加え撹拌した後、５５℃で２０分間反応した。同チューブにイソプロパノール６００μｌを加えて撹拌し、４℃で２０分間静置した後、１２０００×ｇで１０分間遠心した。次いで、５００μｌの７０％エタノールで２回洗浄後乾燥し、上記のＰＣＲ反応溶液２０μｌで溶解し、測定用テストチューブに充填した。
【００３２】
３．１．５．ＲＴ−ＰＣＲ反応
テストチューブをリアルタイム検出ＰＣＲ装置であるＰｒｉｓｍ  ７７００（商品名、アプライドバイオシステムズ社）にセットし、以下の条件で定量ＲＴ−ＰＣＲ反応を行なった。なお、ＰＣＲサイクルを５０回繰り返した。
【００３３】
逆転写反応                          ５０℃、３０分間
初期活性化ステップ                  ９５℃、１５分間
ＰＣＲ  変性                        ９４℃、２０秒間
ＰＣＲ  エクステンション            ６０℃、６０秒間
【００３４】
本実施例において、リアルタイム検出ＲＴ−ＰＣＲのサイクル数を横軸に、蛍光値を縦軸にとってプロットした結果を図１に示す。図１より、それぞれの被検試料について、ある一定のサイクル数を過ぎるまでは蛍光強度に変化は見られないが、あるサイクル数を過ぎると蛍光強度が急に増加することがわかる。そして、この蛍光強度の急激な増加が始まるサイクル数は、被検試料中のＨＣＶのＲＮＡ濃度が大きいほど小さいことがわかる。５０サイクル後の各検体の蛍光強度値を、１×１０４ＩＵ／ｍＬの検体の蛍光値を１００％として相対値で表１に示す。
【００３５】
表１によれば、濃度１×１０１ＩＵ／ｍＬの検体の相対蛍光値は６０．９％であり、蛍光値０のＨＣＶ陰性検体と明確に判別できたことが理解できる。
【００３６】
また、本実施例において、出発検体のウイルス濃度の常用対数を横軸に、一定の閾値を超えたサイクル数を縦軸にとってプロットした結果を図２に示す。図２に示すように、検体のウイルス濃度（ＩＵ／ｍＬ）の常用対数と上記閾値を超えたサイクル数との間には、ウイルス濃度１×１０４〜１×１０１ＩＵ／ｍＬの非常に低濃度の範囲でも直線関係が得られ（相関係数１．０００）、このことは、極低濃度のウイルス濃度の検体まで、非常に精度よくウイルスＲＮＡの定量が可能であることを示している。
【００３７】
【表１】
2009201457.tif 000002
【００３８】
３．２．比較例１
実施例１で用いたプライマー対および蛍光プローブの代わりに、配列番号４に示す２０ｍｅｒからなるオリゴヌクレオチドをフォワード側プライマーとして用い、配列番号５に示す２４ｍｅｒからなるオリゴヌクレオチドをリバース側プライマー用い、かつ、配列番号６に示す２４ｍｅｒのオリゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡを結合した蛍光プローブを用いた以外は、実施例１と同様に定量ＲＴ−ＰＣＲ反応を行なった。
【００３９】
配列番号４に示すオリゴヌクレオチドからなるフォワード側プライマーおよび配列番号５に示すオリゴヌクレオチドからなるリバース側プライマーは、実施例１と同様に、ＨＣＶ  ＲＮＡの５’末端の非翻訳領域の一部を増幅するためのプライマーであり、Young等、J.Clin.Microbiol.31(4),882-886 1993にて使用された既知の配列ある。
【００４０】
配列番号６で示されるオリゴＤＮＡからなる蛍光プローブは、上記のプライマー対で増幅されるＨＣＶ配列の中から、ソフトウエア（Ｐｒｉｏｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）１．５）により選定されたものであり、実施例１と同様に、オリゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡを結合したものである。
【００４１】
本比較例において、リアルタイム検出ＲＴ−ＰＣＲのサイクル数を横軸に、蛍光値を縦軸にとってプロットした結果を図３に示す。
【００４２】
図３に示したように、比較例１のプライマーおよび蛍光プローブを用いた場合、ＨＣＶ−ＲＮＡの増幅に由来する蛍光の上昇高が実施例１に比較して小さかった。各検体の蛍光値を、実施例１の濃度１×１０４ＩＵ／ｍＬの検体の蛍光値を１００％としたときの相対値を表１に示す。
【００４３】
比較例１における濃度１×１０４ＩＵ／ｍＬの検体の相対強度値は３３．８％と小さな値に留まった。濃度１×１０２ＩＵ／ｍＬの検体では相対強度値は８．９％とＨＣＶ濃度の減少とともにさらに低下し、濃度１×１０１ＩＵ／ｍＬの検体では０％となってしまい、ＨＣＶ−ＲＮＡの検出が出来なかった。
【００４４】
以上の結果は、リアルタイム検出ＰＣＲにおいては、プライマーおよび蛍光プローブの選択の如何によって、蛍光のエネルギー転移の効率やＤＮＡの増幅効率が異なり、核酸の検出感度が左右されることを示しており、より具体的には、本発明の蛍光プローブおよびプライマーを用いることによって、リアルタイム検出ＰＣＲ法を用いてＨＣＶ  ＲＮＡを極めて優れた感度で検出できたことを示している。
【００４５】
したがって、本発明のＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ検出用キットおよびＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの検出方法によれば、ＨＣＶ  ＲＮＡを高感度で正確かつ簡便に定量できることが理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、実施例１において、リアルタイム検出ＲＴ−ＰＣＲのサイクル数を横軸に、蛍光値を縦軸にとってプロットした結果を示す。
【図２】図２は、実施例１において、出発検体のウイルス濃度の常用対数を横軸に、一定の閾値を超えたサイクル数を縦軸にとってプロットした結果を示す。
【図３】図３は、比較例１において、リアルタイム検出ＲＴ−ＰＣＲのサイクル数を横軸に、蛍光値を縦軸にとってプロットした結果を示す。
【図１】
2009201457.tif 000003
【図２】
2009201457.tif 000004
【図３】
2009201457.tif 000005
【配列表】
2009201457000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月29日(2009.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009201457000001.app