(57)【要約】【課題】有機溶媒を用いずにＭＥＬを効率よく回収する方法を提供するまた、ＭＥＬの取り扱い性を改善する方法、及び取り扱い性が改善されたＭＥＬを含有する資材を提供する。【解決手段】  マンノシルエリスリトールリピッド溶液中のマンノシルエリスリトールリピッドをシリカに吸着させ、マンノシルエリスリトールリピッドを吸着させたシリカを回収する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノシルエリスリトールリピッド溶液中のマンノシルエリスリトールリピッドをシリカに吸着させ、マンノシルエリスリトールリピッドを吸着させたシリカを回収することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピッドの回収方法。
【請求項２】
前記溶液がマンノシルエリスリトールリピッド生産菌の培養液であることを特徴とする、請求項１記載のマンノシルエリスリトールリピッドの回収方法。
【請求項３】
前記溶液にシリカを添加し、かつ混合することを特徴とする、請求項１又は２に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの回収方法。
【請求項４】
ろ材の表面にシリカを敷き、前記溶液をろ過することを特徴とする、請求項１又は２に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの回収方法。
【請求項５】
マンノシルエリスリトールリピッドがシリカに担持されていることを特徴とする、マンノシルエリスリトール含有シリカ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンノシルエリスリトールリピッド溶液から、マンノシルエリスリトールリピッドを回収する方法に関する。また、本発明は、マンノシルエリスリトールリピッドを含有する資材に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンノシルエリスリトールリピッド（以下「ＭＥＬ」ともいう。）は、マンノース、エリスリトール及び脂肪酸が結合した構造を有する糖脂質であり、微生物により生産されるバイオサーファクタントの一種として知られている。ＭＥＬは生分解性を有することから、環境負荷が小さいため、合成洗剤に代わる洗剤の成分として期待されている。また、ＭＥＬは、生体への適合性も高い。ＭＥＬは、細胞の分化誘導など数々の生理活性機能があることが報告され（非特許文献１〜３）、ＭＥＬのリポソームを形成する能力を利用した遺伝子導入など、ＭＥＬを先端医療へ適用する可能性（非特許文献４）も報告されている。
このように、ＭＥＬは多分野への適用が期待されおり、これまでＭＥＬの生産技術についても種々検討されている。近年では１００ｇ／Ｌもの生産性が達成されたとの報告がなされている（非特許文献５）。このように、近年ではＭＥＬの生産性向上について改良がなされてきた。一方、ＭＥＬの工業生産を念頭に置くと、低コストで高いＭＥＬの回収効率を達成すること、環境負荷を小さくすること、更には回収したＭＥＬの取り扱い性を改善することが不可欠である。
ＭＥＬの回収に関しては多くの文献に示されているが、有機溶媒を用いる方法が一般的である。このような方法においては、通常、培養液の数倍量の有機溶媒が使用される。有機溶媒を用いる方法では、有機溶媒の回収・再生、廃液処理に多大なコスト及びエネルギーが必要となる。また、この方法は、環境負荷が大きく好ましいものではない。
有機溶媒を用いないＭＥＬの回収方法としては、以下の方法が報告されている。特許文献１には遠心分離操作によりＭＥＬを回収する方法が示されている。しかしながら、ＭＥＬを生産する際の菌種の違い、生産されるＭＥＬ構造の微小な違いなどに起因する培養液性状の違いにより、遠心分離操作によりＭＥＬが分離・沈殿しない場合が多々存在する。また、特許文献２には有機酸共存下でＭＥＬを回収する方法が記載されている。しかしながら、添加に必要な有機酸はＭＥＬとほぼ等量であるため、多大なコストが必要である他、回収されるＭＥＬも有機酸を相当量含んだものとなる。
このように、従来知られているＭＥＬの回収方法は、コスト、環境負荷及び回収したＭＥＬの含有成分などの面で問題があり、工業生産への適用は現実的ではなかった。
一方、ＭＥＬは粘稠な物質であり、非常に取り扱い難い。これは、工業的に取り扱う上で大きな障害となる。これまでに、ＭＥＬの取り扱い性の改善について言及した文献は認められない。
なお、シリカ（ＳｉＯ2）は、主として珪砂を原料として化学的に反応させて造られる。シリカはその高い安全性と物理化学的特性から、塗料、インキ、プラスチック、接着剤、ろ過助剤、固結防止剤、食品香料担体、歯磨、化粧品、入浴剤、紙、化粧品等の用途に広範に使用されている。
【０００３】
【非特許文献１】Eur. J. Biochem., 268, 374(2001)
【非特許文献２】J. Biol. Chem., 276, 39903(2001)
【非特許文献３】J. Biosci. Bioeng., 94, 187(2002)
【非特許文献４】Biocheml. Biophys. Res. Commun.., 289, 57(2001)
【非特許文献５】Biotechnol. Lett., 14, 305(1992)
【特許文献１】特開2004-254595号公報
【特許文献２】特開2007-252280号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、低コストで、ＭＥＬの回収効率が高く、かつ環境負荷が小さいＭＥＬの回収方法を提供することを課題とする。また、ＭＥＬの取り扱い性を改善する方法、及び良好な取り扱い性を有するＭＥＬを含有する資材を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、前記課題を解決すべく研究を行った結果、ＭＥＬ溶液中のＭＥＬをシリカに吸着させ、ＭＥＬを吸着させたシリカを回収することにより、ＭＥＬを効率よく回収できることを知見した。また、ＭＥＬをシリカに担持させることにより、取り扱い易くなることを知見した。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【０００６】
（１）マンノシルエリスリトールリピッド溶液中のマンノシルエリスリトールリピッドをシリカに吸着させ、マンノシルエリスリトールリピッドを吸着させたシリカを回収することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピッドの回収方法（以下、「本発明のＭＥＬの回収方法」ともいう。）。
（２）前記溶液がマンノシルエリスリトールリピッド生産菌の培養液であることを特徴とする、（１）記載のマンノシルエリスリトールリピッドの回収方法。
（３）前記溶液にシリカを添加し、かつ混合することを特徴とする、（１）又は（２）に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの回収方法。
（４）ろ材の表面にシリカを敷き、前記溶液をろ過することを特徴とする、（１）又は（２）に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの回収方法。
（５）マンノシルエリスリトールリピッドがシリカに担持されていることを特徴とする、マンノシルエリスリトール含有シリカ（以下、「本発明のＭＥＬ含有シリカ」ともいう。）。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＭＥＬの回収方法は、有機溶媒を用いることなく、ＭＥＬを効率よく回収することを可能とする。特に、本発明は、ＭＥＬ溶液のＭＥＬ濃度に関係なく、効率よくＭＥＬを回収することを可能とする。また、本発明のＭＥＬの回収方法は、低コストであり、環境負荷も小さく、工業生産への適用が可能である。
また、本発明のＭＥＬ含有シリカは、取り扱い性に優れる。さらに、生体にも安全であることから、種々の用途への適用が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のＭＥＬ回収方法は、マンノシルエリスリトールリピッド溶液中のマンノシルエリスリトールリピッドをシリカに吸着させ、マンノシルエリスリトールリピッドを吸着させたシリカを回収することを特徴とする。
マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）は、マンノース、エリスリトール及び脂肪酸が結合した、下記一般式（１）で示される構造を有する糖脂質である。
【０００９】
【化１】
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【００１０】
一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2は、任意の脂肪族アシル基である。該脂肪族アシル基の炭素数は、一般的には３〜２５である。これらの脂肪族アシル基は、直鎖状のものも分岐状のものも含まれ、飽和のものも不飽和のものも含まれる。また、Ｒ3及びＲ4は、一方がアセチル基であり、他方が水素であるか、両方がアセチル基である。なお、Ｒ3及びＲ4が共にアセチル基であるものはＭＥＬ−Ａ、Ｒ3が水素であり、Ｒ4がアセチル基であるものはＭＥＬ−Ｂ、Ｒ3がアセチル基であり、Ｒ4が水素であるものはＭＥＬ−Ｃ、Ｒ3及びＲ4が共に水素であるものはＭＥＬ−Ｄと呼ばれる。
【００１１】
ＭＥＬは、シュードザイマ（Pseudozyma）属、カンディダ（Candida）属、クルツマノマイセス（Kurtzmanomyces）属、ウスティラゴ（Ustilago）属、シゾネラ（Shizonella）属等に属するＭＥＬ生産菌により生産される。従って、ＭＥＬ溶液は、好ましくはＭＥＬ生産菌の培養液である。
シリカの形状は特に制限されないが、吸着面積を大きくする観点から、好ましくは粒状である。粒状のシリカの平均粒径は、好ましくは１〜１０００μｍである。また、シリカのフタル酸ジブチル（ＤＢＰ）の吸油量は、好ましくは１００ｇ／１００ｇ以上、更に好ましくは２００ｇ／１００ｇ以上である。シリカは市販されており、例えば、Sipernat、Carplex (いずれもデグサジャパン株式会社製)などを用いることができる。
【００１２】
ＭＥＬ溶液中のＭＥＬをシリカに吸着させるためには、ＭＥＬ溶液とシリカを接触させればよく、その方法は特に制限されない。
例えば、シリカをＭＥＬ溶液に添加し、混合することにより、ＭＥＬ溶液中のＭＥＬをシリカに吸着させることができる。この場合のシリカの添加量は、ＭＥＬ溶液のＭＥＬ濃度に応じて調節することができるが、ＭＥＬ濃度の好ましくは０．２〜３０質量倍、さらに好ましくは０．３〜２０質量倍の濃度となる添加量である。また、シリカをＭＥＬ溶液に添加する前又は後であって、混合前に、遠心分離、デカンテーション等により、ＭＥＬ溶液を濃縮することも好ましい。濃縮は、ＭＥＬ濃度が１０〜９０質量％程度となるように行うことが好ましい。
続いて、ＭＥＬを吸着させたシリカは、ろ過等の方法により回収することができる。ろ過に用いるろ材として、ろ紙、ろ布、ガラスフィルター等が挙げられる。ろ材は、シリカの粒径に応じて選択することができる。また、ろ過の手段として、遠心ろ過、真空ろ過、吸引ろ過等の減圧ろ過、フィルタープレス等の加圧ろ過などが挙げられる。
また、シリカが添加された培養液をスプレードライにより処理する事も可能である。
【００１３】
また、ろ材の表面にシリカを敷き、ＭＥＬ溶液をろ過することにより、ＭＥＬ溶液中のＭＥＬをシリカに吸着させると同時にＭＥＬを吸着させたシリカを回収することもできる。この場合のろ材、ろ過の手段、ろ過の条件は、上記と同様のものを用いることができる
。ろ材の表面に敷くシリカの量は、ＭＥＬの好ましくは０．２〜３０質量倍、さらに好ましくは０．３〜２０質量倍である。また、ＭＥＬ溶液のろ過前に予め、ＭＥＬ溶液を濃縮しておくことも好ましい。この場合の好ましい濃縮率は、上記と同様である。
【００１４】
ＭＥＬを吸着させたシリカは、回収後、取り扱い性を容易にする観点から乾燥することが好ましい。また、スプレードライにより回収と乾燥を同時に行っても構わない。
【００１５】
本発明のＭＥＬ含有シリカは、シリカにＭＥＬが担持されていることを特徴とする。ここで、「担持」とは、ＭＥＬがシリカの表面に付着している状態、シリカ表面を被覆している状態、シリカの内部に含まれている状態の全てを含む。担体となるシリカは、前記のとおりである。本発明のＭＥＬ含有シリカは、ＭＥＬ及びシリカを混合することにより得ることができる。中でも上述したＭＥＬの回収方法を用いて製造する方法が好ましい。この際、ＭＥＬを吸着したシリカを回収した後、乾燥することが好ましい。また、吸着に用いたシリカの形状、大きさなどによっては、粉砕などを行ってもよい。
ＭＥＬの担持量は、用途に応じて調節できるが、シリカに対して好ましくは０．１〜５質量倍、さらに好ましくは０．２〜３質量倍である。
本発明のＭＥＬ含有シリカは、医薬原料、化粧品原料、食品原料、畜産飼料、殺菌剤、農薬など、種々の分野で使用することが可能である。
【実施例】
【００１６】
１．試料及び分析
（１）試験用ＭＥＬサンプルの調製
（前培養）
ポテトデキストロース培地１０ｍｌを試験管に入れ、シリコン栓をした。オートクレーブ滅菌後、Pseudozyma aphidis NBRC 10182を植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。NBRC 1012は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に登録されている株である。
（本培養）
イオン交換水、大豆油  ８％、NaNO3  0.2%、KH2PO4  0.02%、MgSO4・7H2O  0.02%、yeast extract 0.1% からなる培地５０ｍｌを５００ｍｌ Erlenmeyerフラスコに入れ、シリコン栓をしてオートクレーブにて滅菌した。Erlenmeyerフラスコに先述したPseudozyma aphidis NBRC 10182の前培養液を加え、３０℃／２２０ｒｐｍにて１０日間振とう培養を行った。
（試験用ＭＥＬサンプルの調製）
上記培養液５０ｍｌに１N  HCｌを加え、培養液をｐH３に調整した後、遠心分離により上清を取り除いた。沈殿部に純水５０ｍｌを加え撹拌した後、もう一度遠心分離操作を行い沈殿部を回収した。沈殿部を１０ｍｌのメタノールに溶解させた後、更に１０ｍｌのヘキサンを加え洗浄を行った（３回）。洗浄後のメタノール溶液に水１０ｍｌを加え、そこからクロロホルム１０ｍｌにてMELの抽出操作を行った（３回）。クロロホルム層を合せて溶媒を留去し、ＭＥＬの粗精製物を得て、試験用ＭＥＬサンプルとした（図８）。試験用ＭＥＬサンプルのＭＥＬ含有量は、ＨＰＬＣ分析の結果、８７質量％であった（図１）。
【００１７】
（標準ＭＥＬサンプルの調製）
上記ＭＥＬの粗精製物１ｇを少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムにて分画した。クロロホルム５００ｍｌ、クロロホルム／酢酸エチル＝４／１  ５００ｍｌ、アセトン  ５００ｍｌ、メタノール  ５００ｍｌを順次流して分画した。
各画分を薄層クロマトグラフィーにて展開し（展開溶媒 CHCl3/CH3OH/水 : 65/15/2）、下記文献1)に記述されたRf値の分画（各種MELが示すRf値、Rf = 0.52, 0.58, 0.63, 0.77）を選別し、それらをまとめて標準ＭＥＬサンプルとした。
文献1) Agric. Biol. Chem., 54(1),31-36, 1990
【００１８】
（２）ＭＥＬ含有培養液の調製
本培養の培養時間を５日間とした以外は、上記（１）と同様に操作を行い、ＭＥＬを含有した培養液を調製した。
【００１９】
（３）シリカ
カープレックス♯６７(吸油量（DBP）:265ｇ/100g)、カープレックス♯１１２０(吸油量（DBP）:250g/100g)（いずれもデグサジャパン株式会社製）を使用した。
（４）ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析は、下記の条件にて実施した。
カラム：Inertsil  SIL-100A 4.6mmI.D×250mm
移動相：Ａ, CH3OH; Ｂ, CHCl3
グラジエント： Ａ / Ｂ ； 0/100 → 75/25（15min）
検出器：蒸発光散乱検出器
（５）薄層クロマトグラフィー分析
薄層クロマトグラフィー分析は、以下の組成の展開溶媒にて実施した。
展開溶媒  CHCl3：CH3OH：NH3水 / 65：15：2
【００２０】
２．試験
（１）ろ過法
（ｉ）ＭＥＬ水溶液（実施例１）
上記１．（１）で調製した試験用ＭＥＬサンプルを用い、１質量％ＭＥＬ溶液（懸濁液）を５０ｍｌ調製した。径４７ｍｍのガラスフィルターＧＳ−２５（アドバンテック東洋製、フィルター細孔直径１μｍ）をブフナーロートに装着し、その上にカープレックス♯６７（平均粒径７．３μｍ）又はカープレックス♯１１２０（平均粒径８．８μｍ）を５ｇ敷き詰めた。ここにＭＥＬ溶液を注ぎ、水流アスピレーターにより吸引ろ過を行った。続いて、得られたろ物を乾燥した（図６）。
ろ液  １ｍｌ、乾燥したろ物０．１ｇをサンプリングし、それぞれから酢酸エチル  １ｍｌを用い、ＭＥＬの抽出操作を行った。ろ物は、ＭＥＬのシリカへの吸着が均一となるよう撹拌してサンプリングした。それぞれ抽出操作後の酢酸エチル抽出液  ５μｌを薄層クロマトグラフィーにて展開した（図２）。これを、ＭＥＬの標準サンプルが示すＲｆ値と比較した。
図２に示されるように、カープレックス♯６７を用いた場合も、カープレックス♯１１２０を用いた場合も、ろ液の酢酸エチル抽出液からはＭＥＬの標準サンプルが示すＲｆ値を示すスポットは確認されなかった。一方、いずれの場合も、ろ物の酢酸エチル抽出液からは前記Ｒｆ値を示すスポットが確認された。これより、ＭＥＬ水溶液中のＭＥＬが、充分にシリカに吸着されたことが分かった。
【００２１】
（ｉｉ）ＭＥＬ含有培養液（実施例２）
上記１．（２）で調製したＭＥＬ含有培養液を用いた以外は、実施例１と同様に操作し、ろ液とろ物におけるＭＥＬの存在を、薄層クロマトグラフィーにて確認した（図３）。なお、上記ＭＥＬ含有培養液  １ｍｌから酢酸エチル  １ｍｌを用い、抽出操作を行ったサンプルを対照とした。
図３に示されるように、カープレックス♯６７を用いた場合も、カープレックス♯１１２０を用いた場合も、ろ液の酢酸エチル抽出液からはＭＥＬの標準サンプルが示すＲｆ値を示すスポットが確認されなかった。一方、いずれの場合も、ろ物の酢酸エチル抽出液からは前記Ｒｆ値を示すスポットが確認された。なお、対照のサンプルからは、前記Ｒｆ値を示すスポットが確認された。これより、ＭＥＬ含有培養液中のＭＥＬが、充分にシリカに吸着されたことが分かった。
【００２２】
（２）混合法
（ｉ）ＭＥＬ水溶液（実施例３）
上記１．（１）で調製した試験用ＭＥＬサンプルを用い、１質量％ＭＥＬ溶液（懸濁液）を２０ｍｌ調製した。このＭＥＬ溶液に、カープレックス♯６７又はカープレックス♯１１２０を２．０ｇ添加し、Ｖｏｒｔｅｘを使用して試験管中で１分間攪拌した。攪拌後、吸引ろ過により、ろ物を回収した。続いて、得られたろ物を乾燥した（図７）。
ろ液  ０．５ｍｌ、乾燥したろ物  ０．０５ｇをサンプリングし、それぞれから酢酸エチル  ０．５ｍｌを用いＭＥＬの抽出操作を行った。ろ物は、ＭＥＬのシリカへの吸着が均一となるよう撹拌してサンプリングした。それぞれ抽出操作後の酢酸エチル  ５μｌを薄層クロマトグラフィーにて展開した（図４）。これを、ＭＥＬの標準サンプルが示すＲｆ値と比較した。
図４に示されるように、カープレックス♯６７を用いた場合も、カープレックス♯１１２０を用いた場合も、ろ液の酢酸エチル抽出液からはＭＥＬの標準サンプルが示すＲｆ値を示すスポットは確認されなかった。一方、いずれの場合も、ろ物の酢酸エチル抽出液からは前記Ｒｆ値を示すスポットが確認された。これより、シリカを水溶液に添加し、混合する方法によっても、ＭＥＬ水溶液中のＭＥＬが、充分にシリカに吸着されたことが分かった。
【００２３】
（ｉｉ）ＭＥＬ含有培養液（実施例４）
上記１．（２）で調製したＭＥＬ含有培養液を用いた以外は、実施例３と同様に操作し、ろ液とろ物におけるＭＥＬの存在を、薄層クロマトグラフィーにて確認した（図５）。なお、上記ＭＥＬ含有培養液  １ｍｌから酢酸エチル  １ｍｌを用い、抽出操作を行ったサンプルを対照とした。
図５に示されるように、カープレックス♯６７を用いた場合も、カープレックス♯１１２０を用いた場合も、ろ液の酢酸エチル抽出液からはＭＥＬの標準サンプルが示すＲｆ値を示すスポットは確認されなかった。一方、いずれの場合も、ろ物の酢酸エチル抽出液からは前記Ｒｆ値を示すスポットが確認された。なお、対照のサンプルからは、前記Ｒｆ値を示すスポットが確認された。これより、シリカを水溶液に添加し、混合する方法によっても、ＭＥＬ水溶液中のＭＥＬが、充分にシリカに吸着されたことが分かった。
【００２４】
（３）扱いやすさの改善
上記実施例１及び３にて得られた、乾燥したろ物の写真を図６及び７に、上記１．（１）にて得られた試験用ＭＥＬサンプルの写真を図８に示す。図８に示されるように、ＭＥＬは、粘稠であり、非常取り扱い難いが、シリカに吸着させることで図６及び７に示されるような粉体とすることが可能であり、取り扱い易くなる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】試験用ＭＥＬサンプルのＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。
【図２】実施例１で得られたろ液及びろ物の薄層クロマトグラフィー分析の結果を示す写真である。
【図３】実施例２で得られたろ液及びろ物の薄層クロマトグラフィー分析の結果を示す写真である。
【図４】実施例３で得られたろ液及びろ物の薄層クロマトグラフィー分析の結果を示す写真である。
【図５】実施例４で得られたろ液及びろ物の薄層クロマトグラフィー分析の結果を示す写真である。
【図６】実施例１にて得られた、乾燥したろ物の写真である。
【図７】実施例３にて得られた、乾燥したろ物の写真である。
【図８】試験用ＭＥＬサンプルの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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