(57)【要約】      （修正有）【課題】ウイルス濃度が極めて少ない検体であってもＨＢＶ−ＤＮＡを確実に捕捉できるＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ捕捉用プローブおよびプローブ固定化固相担体を提供する。【解決手段】Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ捕捉用プローブは、特定な配列からなる複数のオリゴヌクレオチドについて、いずれかの配列から選択される連続する１０塩基以上に対して８０％以上の配列相同性を有する塩基配列を含む塩基数１５〜８０のオリゴヌクレオチドである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１２で示されるいずれかの配列から選択される連続する１０塩基以上に対して８０％以上の配列相同性を有する塩基配列を含む塩基数１５〜８０のオリゴヌクレオチドである、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ捕捉用プローブ。
【請求項２】
請求項１記載のＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ捕捉用プローブが固定化された、プローブ固定化固相担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（本願明細書において「ＨＢＶ」ともいう。）ＤＮＡ捕捉用プローブ、および該プローブが固定化された固相担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＢＶの定量は、ＨＢＶ感染者の治療効果を観察するため、ならびに、輸血用血液あるいは移植用臓器を介したレシピエントのＨＢＶ感染を防ぐためのドナーのＨＢＶ感染の有無をチェックするための手段として重要である。
【０００３】
血清等の試料中のＨＢＶを定量する方法としては、例えば、試料中のＨＢＶ−ＤＮＡを磁性粒子などの担体を用いて捕捉し、捕捉したＨＢＶ−ＤＮＡをＴａｑＭａｎ（商標）法等のリアルタイム検出ＰＣＲ法で定量する方法が挙げられる。この場合、ウイルス濃度が極めて少ない検体であっても、ＨＢＶ−ＤＮＡを確実に捕捉できることが好ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ウイルス濃度が極めて少ない検体であってもＨＢＶ−ＤＮＡを確実に捕捉できるＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ捕捉用プローブおよびプローブ固定化固相担体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様にかかるＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ捕捉用プローブは、配列番号１〜１２で示されるいずれかの配列から選択される連続する１０塩基以上に対して８０％以上の配列相同性を有する塩基配列を含む塩基数１５〜８０のオリゴヌクレオチドである。
【０００６】
本発明の一態様にかかるプローブ固定化固相担体は、上記Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ捕捉用プローブが固定化されている。
【発明の効果】
【０００７】
上記Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ捕捉用プローブを用いることにより、ウイルス濃度が極めて少ない検体においても、ＨＢＶ−ＤＮＡを確実に捕捉することができる。
【０００８】
より具体的には、上記Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ捕捉用プローブが固定化されたプローブ固定化固相担体を用いてＨＢＶ−ＤＮＡを捕捉することにより、ウイルス濃度が極めて少ない検体であっても、ＨＢＶ−ＤＮＡを確実に捕捉することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ捕捉用プローブ
本発明の一実施形態にかかるＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ捕捉用プローブ（以下「ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブ」ともいう。）は、配列番号１〜１２で示されるいずれかの配列から選択される連続する１０塩基以上に対して８０％以上（好ましくは９０％以上）の配列相同性を有する塩基配列を含む塩基数１５〜８０（好ましくは２５〜４５）のオリゴヌクレオチドである。ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブは、市販のものを用いても良いし、公知の合成方法により合成してもよい。
プローブＢＡ：５’−ＴＣＣＴＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＣＧＧＧＧＴＴＴＴＴＣＴ−３’（配列番号１）
プローブＢＢ：５’−ＣＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＣＧＧＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡＣＡＡ−３’（配列番号２）
プローブＢＣ：５’−ＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧＧ−３’（配列番号３）
プローブＢＤ：５’−ＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴＴＴＴＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣＴＣＴ−３’（配列番号４）
プローブＢＥ：５’−ＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡ−３’（配列番号５）
プローブＢＦ：５’−ＣＣＴＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＴＡＣＴＡＧ−３’（配列番号６）
プローブＢＧ：５’−ＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＴＴＴＧＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＡＴＡＴＧＧＡＴＧＡＴ−３’（配列番号７）
プローブＢＨ：５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＴ−３’（配列番号８）
プローブＢＩ：５’−ＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＧＡＴＣＣＡＴＡＣＴＧＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴＡＧＣＣＧＣＴＴＧ−３’（配列番号９）
プローブＢＪ：５’−ＣＣＧＴＧＴＧＣＡＣＴＴＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣＡＣＧＴＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡ−３’（配列番号１０）
プローブＢＫ：５’−ＴＧＴＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＴＴＴＧＧＧＧＣ−３’（配列番号１１）
プローブＢＬ：５’−ＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＧＡＡＧ−３’（配列番号１２）
ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブを例えばプローブ固定化固相担体（例えば磁性粒子）の表面に固定化して、検体を含む試料中で該捕捉用プローブとＨＢＶ−ＤＮＡとをハイブリダイズさせることにより、極めて低濃度にて検体中のＨＢＶ−ＤＮＡを捕捉することができる。検出対象となるＨＢＶ−ＤＮＡは、ＨＢＶを含有する疑いのある検体、例えば、血清、血漿等の体液中に含まれているものである。
【００１０】
また、ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブを用いて捕捉されたＨＢＶ−ＤＮＡは、例えば、リアルタイム検出ＰＣＲ法によって定量することができる。例えば、ＨＢＶ−ＤＮＡを捕捉した磁性粒子と、フォワード側プライマーと、リバース側プライマーと、蛍光プローブ（３’末端がドナー蛍光色素で標識化されかつ５’末端がアクセプター蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ））とを含む系内でＰＣＲ反応を行ない、得られた蛍光強度に基づいて検体中のＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ量を測定することができる。このリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は公知であり、そのための装置及びキットも市販されているので、このような市販の装置及びキットを用いてリアルタイム検出ＰＣＲ法を行なうことができる。
【００１１】
２．プローブ固定化固相担体
本発明の一実施形態にかかるプローブ固定化固相担体は、上記ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブが固定化されている。
【００１２】
固相担体としては、例えばクロマトグラフィ担体や診断薬として使用可能な担体粒子、例えばＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイとして使用可能なチップ（基板）などが挙げられる。
【００１３】
本実施形態にかかるプローブ固定化固相担体は、ＨＢＶを検出するための固相担体（より具体的には、ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブが表面に固定化された磁性粒子）であることがより好ましい。ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブを磁性粒子に固定化する方法としては、例えば、３’末端がアミノ基で修飾されたＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブをカルボキシル基含有磁性粒子と反応させる方法や、３’末端がビオチン化されたＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブをアビジン化磁性粒子と反応させる方法が挙げられる。
【００１４】
３．実施例
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１５】
３．１．ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブを有する磁性粒子の作製
３．１．１．ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブ
ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブとして、上記配列番号１〜１２で示される配列ＢＡ〜ＢＬを用いた。
【００１６】
３．１．２．ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブの磁性粒子への固定化
３’末端がアミノ基で修飾されたＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブをカルボキシル基含有磁性粒子と反応させる方法および３’末端がビオチン化されたＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブをアビジン化磁性粒子と反応させる方法の２通りの方法により、ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブが固定化された磁性粒子を作製した。
【００１７】
（ａ）３’末端がアミノ基で修飾されたＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブをカルボキシル基含有磁性粒子と反応させることによる、ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブの磁性粒子への固定化
カルボキシル基含有磁性粒子（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）  Ｍ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ（ＪＳＲ株式会社製））１ｗｔ％分散液５００μｌをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。０．０００１Ｎ塩酸により３回洗浄した後、５００μｌの０．０００１Ｎ塩酸に分散し、３’末端がアミノ化されたＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブ（プローブＢＡ）１００μＭ溶液を５μｌおよびＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）０．２５ｍｇを加え、１０℃に設定した恒温槽で１５時間攪拌した。その後、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。０．５ｍＭＥＤＴＡおよび１．０ＭＮａＣｌを含む５ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）にて３回洗浄後５０μｌの５ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーに分散して、アミド結合を介してＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブ（プローブＢＡ）が結合されたプローブ固定化磁性粒子（ａｍ−ＢＡ）の分散液（１０重量％）を得た。
【００１８】
また、アミド結合を介してＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブ（プローブＢＢ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＧ、ＢＨ、ＢＩ、ＢＪ、ＢＫ、ＢＬ）が結合されたプローブ固定化磁性粒子（ａｍ−ＢＢ、ａｍ−ＢＣ、ａｍ−ＢＤ、ａｍ−ＢＥ、ａｍ−ＢＦ、ａｍ−ＢＧ、ａｍ−ＢＨ、ａｍ−ＢＩ、ａｍ−ＢＪ、ａｍ−ＢＫ、ａｍ−ＢＬ）を同様の方法にて得た。
【００１９】
（ｂ）３’末端がビオチン化されたＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブをアビジン化磁性粒子と反応させることによる、ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブの磁性粒子への固定化
アビジン化磁性粒子（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）  Ｍ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＪＳＲ株式会社製））１ｗｔ％分散液５００μｌをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。０．５ｍＭＥＤＴＡおよび１．０ＭＮａＣｌを含む５ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）にて３回洗浄した後、５００μｌの０．５ｍＭＥＤＴＡおよび１．０ＭＮａＣｌを含む５ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に分散し、３’末端がビオチン化されたＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブ（プローブＢＡ）１００μＭ溶液を５μｌ加え、室温下３０分間攪拌した。その後、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。０．５ｍＭＥＤＴＡおよび１．０ＭＮａＣｌを含む５ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）にて３回洗浄した後、５０μｌの５ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーに分散し、ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブ（プローブＢＡ）がビオチン−アビジン結合により結合した磁性粒子（ｂｉ−ＢＡ）分散液（１０重量％）を得た。
【００２０】
また、プローブＢＢ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＧ、ＢＨ、ＢＩ、ＢＪ、ＢＫ、ＢＬがそれぞれビオチン−アビジン結合により結合したプローブ固定化磁性粒子（ｂｉ−ＢＢ、ｂｉ−ＢＣ、ｂｉ−ＢＤ、ｂｉ−ＢＥ、ｂｉ−ＢＦ、ｂｉ−ＢＧ、ｂｉ−ＢＨ、ｂｉ−ＢＩ、ｂｉ−ＢＪ、ｂｉ−ＢＫ、ｂｉ−ＢＬ）を同様の方法で得た。
【００２１】
３．２．ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブ固定化磁性粒子によるＨＢＶ−ＤＮＡの抽出および検出
３．２．１．ＨＢＶ−ＤＮＡの抽出
上記工程で調製されたＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブ固定化磁性粒子を用いて、ヒト血漿中からＨＢＶ−ＤＮＡを抽出した。濃度既知のＨＢＶを含有するヒト血漿の検体を、正常なヒト血漿を用いて希釈して、１０倍ずつの希釈列を調製した。これらの希釈された血漿０．１ｍｌずつからＨＢＶ−ＤＮＡを抽出した。
【００２２】
まず、血漿０．１ｍｌをチューブにとり、検体希釈液（１％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ、２００ｍＭＮａＣｌ、２％  ２−メルカプトエタノール、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））３８０μｌ、および１０％デキストランＴ２０００（アマシャム社製）５μｌを加えて攪拌した後、５５℃で３０分間静置した。次に、８Ｍグアニジン塩酸塩２５０μｌを加え攪拌した後５５℃で１５分間静置した。その後、９５℃で１０分間静置した後室温まで冷却した。次に上記工程で調製されたＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブを有する磁性粒子分散液（１０重量％）１０μｌを加え、室温で１０分間攪拌した後、磁気スタンドにて磁気分離し液体を除去した。その後、０．０１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液にて粒子を１回洗浄した後、４０μｌのＤＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ水に分散し、ＨＢＶ−ＤＮＡを含む磁性粒子分散液を得た。この磁性粒子分散液をテンプレートとして、そのままリアルタイム検出ＰＣＲ増幅反応処理にかけた。
【００２３】
３．２．２．リアルタイム検出ＰＣＲによる増幅および検出
反応チューブ一本当り下記表１に示す反応液を調製し、上記で抽出されたＨＢＶ−ＤＮＡを含む磁性粒子分散液４０μｌを加えてリアルタイム検出ＰＣＲを行った。
【００２４】
［反応液の組成］
ＰＣＲグレード蒸留水                            ３２．２μｌ
１０×ｂｕｆｆｅｒ                                  １０μｌ
ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）                              １０μｌ
ｄＡＴＰ（１０ｍＭ）                                  １μｌ
ｄＧＴＰ（１０ｍＭ）                                  １μｌ
ｄＣＴＰ（１０ｍＭ）                                  １μｌ
ｄＴＴＰ（１０ｍＭ）                                  １μｌ
フォワード側プライマー（１００μＭ）                  １μｌ
リバース側プライマー（１００μＭ）                    １μｌ
ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ  （２５μＭ）        ０．４μｌ
ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）０．４μｌ
ＲＯＸレファレンスダイ（インビトロジェン（株）社製）  １μｌ
合計                                                ６０μｌ
フォワード側プライマー、リバース側プライマー、およびＴａｑＭａｎ（商標）プローブは特表２００５−５０５２８９記載の下記の配列を有するものを使用した。
フォワード側プライマーの配列：５’−ＡＴＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＣＧＧＡ−３’（配列番号１３）
リバース側プライマーの配列：５’−ＡＧＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣ−３’（配列番号１４）
ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの配列：５’−［ＦＡＭ］ＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴ［ＴＡＭＲＡ］−３’（配列番号１５）
ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよび１０×ｂｕｆｆｅｒは、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロッシュ・ダイアグノスティック株式会社製）付属の試薬を用いた。
【００２５】
反応チューブをリアルタイム検出ＰＣＲ装置であるＰｒｉｓｍ  ７７００（商品名、アプライドバイオシステムズ社）にセットし、以下の条件で定量ＰＣＲ反応を行なった。
初期活性化ステップ        ９５℃      １５分間
ＰＣＲ  変性              ９５℃      １５秒間
ＰＣＲ  エクステンション  ６０℃      ６０秒間
このＰＣＲサイクルを５０回繰り返した。
【００２６】
５０サイクルまでに蛍光強度が指数関数的に増加したものを陽性、増加しなかったものを陰性と判断した。各磁性粒子を用いて得られた実験結果を以下の表１に示す。表１によれば、上記ＨＢＶ−ＤＮＡ捕捉用プローブを有する磁性粒子は、少なくとも１０個／０．１ｍｌ血漿のウイルスを含むサンプルからＢ型肝炎ウイルスを捕捉できることが理解できる。
【００２７】
【表１】
2009201361.tif 000002
【配列表】
2009201361000001.app