(57)【要約】【課題】α２,３-シアル酸転移酵素（ＳＴ３ＧａｌＩＶ）欠損非ヒト動物およびそれを用いたスクリーニング方法の提供【解決手段】ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスを作製し、該マウスが、不安、睡眠、記憶、成長、生殖、生体リズム等の生理現象に関係することを見出し、これら生理現象が関係する疾患の治療薬のスクリーニング方法を構築した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物。
【請求項２】
不安障害モデル動物、睡眠障害モデル動物、成長障害モデル動物、生殖障害モデル動物、または生体リズム障害モデル動物である、請求項1に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
不安障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１に記載の非ヒト動物に化合物を投与し、オープンフィールド試験を行い、該化合物を投与していない請求項１に記載の非ヒト動物と比較して四隅での滞在時間が減少したときに、該化合物を不安障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法。
【請求項４】
不安障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１に記載の非ヒト動物に化合物を投与し、恐怖条件付け試験を行い、該化合物を投与していない請求項１に記載の非ヒト動物と比較してフリージングが減少したときに、該化合物を不安障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法。
【請求項５】
不安障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、請求項４および請求項５に記載の方法を実施し、両方法で共に不安障害の治療に有用な化合物として選択された化合物を不安障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法。
【請求項６】
睡眠障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１に記載の非ヒト動物に化合物を投与し、脳波および／または筋電図の測定および／または行動の観察を行って、該化合物を投与していない請求項１に記載の非ヒト動物と比較して睡眠パターンが改善されたときに、該化合物を睡眠障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法。
【請求項７】
レム睡眠の障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１に記載の非ヒト動物に化合物を投与し、脳波および／または筋電図の測定および／または行動の観察を行って、該化合物を投与していない請求項１に記載の非ヒト動物と比較してレム睡眠の時間が増加したときに、該化合物をレム睡眠の障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法。
【請求項８】
成長障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１に記載の非ヒト動物に化合物を投与し、体重および／または体長の測定、および／または血中の成長ホルモン（Ｇｈ）および／またはＩＧＦ−１の濃度の測定を行って、該化合物を投与していない請求項１に記載の非ヒト動物と比較して体重および／または体長が増加したとき、および／または血中の成長ホルモン（Ｇｈ）および／またはＩＧＦ−１の濃度が増加したときに、該化合物を成長障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法。
【請求項９】
生殖障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１に記載の非ヒト動物に化合物を投与し、性周期および／または分娩の異常の有無の観察を行って、該化合物を投与していない請求項１に記載の非ヒト動物と比較して性周期および／または分娩の異常が改善されたときに、該化合物を生殖障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法。
【請求項１０】
生体リズム障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１に記載の非ヒト動物に化合物を投与し、性周期の観察、脳波および／または筋電図の測定および／または行動の観察を行って、該化合物を投与していない請求項１に記載の非ヒト動物と比較して性周期のリズムが改善し、および／または睡眠パターンが改善されたときに、該化合物を生殖障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法。
【請求項１１】
さらに、野生型の非ヒト動物に該化合物を投与して、該化合物が野生型動物に効果を示さないことを確認する工程を含む、請求項３−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤のインビボ薬効を測定する方法であって、請求項１に記載の非ヒト動物および野生型の非ヒト動物に被験物質を投与し、
ｉ）オープンフィールド試験
ｉｉ）恐怖条件付け試験
ｉｉｉ）脳波および／または筋電図の測定、および／または行動の観察
ｉｖ）体重および／または体長の測定、
ｖ）血中の成長ホルモン（Ｇｈ）またはＩＧＦ−１の濃度の測定、または、
ｖｉ）性周期および／または分娩の異常の観察
を行い、請求項１に記載の非ヒト動物に作用がなく、野生型の非ヒト動物が請求項１に記載の非ヒト動物の表現型を提示するときに、該被験物質をＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤として選択することを含む方法。
【請求項１３】
非ヒト動物が、マウスである、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項１４】
非ヒト動物が、マウスである、請求項３−１１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α２,３-シアル酸転移酵素（以下、ＳＴ３ＧａｌＩＶ）の遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物、好ましくは、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスに関する。また、本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた、不安障害または睡眠障害の治療に有用な化合物のスクリーニング方法、または、ＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤のin vivo（以下、インビボ）薬効を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアル酸は、糖蛋白質や糖脂質等の複合糖質の非還元末端に付加される単糖である。このシアル酸はCOOH基を持つため負電荷を有している。この性質により、シアル酸は細胞接着、分化、神経繊維の発達やレセプター認識等様々な生物学的過程に影響を与える（非特許文献１および非特許文献２参照）。また、脳において糖鎖構造が検討される中で、N-グリカンの４０％がシアル酸化されており、その４分の１がポリシアル酸化されているということ（非特許文献３参照）や、シアル酸を含む糖脂質であるガングリオシド含有量が他の組織に比べ脳では約５倍高く、また、その脳内のガングリオシド組成が哺乳動物間で保存されていることが報告されている（非特許文献４参照）。これらの報告は、脳においてシアル酸の重要性が高いことを示唆するものであるが、シアル酸の脳内での生理作用、特に病態との関係については、未だ十分に検討されていない。
【０００３】
シアル酸転移酵素は、CMP-シアル酸からシアル酸を受容体基質の非還元末端に転移する反応を触媒しており、哺乳類において現在２０種類が報告されている。また、これらの酵素群は、各酵素が合成する糖鎖構造によってα２，３−シアル酸転移酵素（ＳＴ３ＧＡｌＩ〜ＶＩ）、α２，６−シアル酸転移酵素（ＳＴ６ＧａｌＩ,ＩＩ）、α２，８−シアル酸転移酵素（ＳＴ８ＳｉａＩ〜ＶＩ）、ＧａｌＮＡｃα２，６−シアル酸転移酵素（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ〜ＶＩ）の４つのファミリーに分類されている。そして、これらの糖鎖構造はゴルジ体内で生合成される（非特許文献５および非特許文献６参照）。このα２，３−シアル酸転移酵素の中で、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃに基質特異性を示すＳＴ３ＧａｌＩＶは、全身の臓器で発現が確認されており、正常マウスでの発現は卵巣や精巣等の生殖器、唾液腺、肝臓等で高い（非特許文献７および非特許文献８参照）。脳での発現は低いが、確かであり、ＳＴ３ＧａｌＩＶは、脳において何らかの生理的機能を果たしていると考えられる。実際、てんかんモデルマウスでその発現が亢進することが報告されている（非特許文献９参照）。しかしながら、ＳＴ３ＧａｌＩＶが及ぼす生理作用、特に病態との関係については、未だ十分な検討がなされていない。
【非特許文献１】Rutishauser U.: Polysialic acid at the cell surface: biophysics in service of cell interactions and tissue plasticity., J. Cell Biochem., 70(3), 304-12, 1998
【非特許文献２】Muller D., et al.: PSA-NCAM is required for activity-induced synaptic plasticity., Neuron, 17(3), 413-422, 1996
【非特許文献３】Zamze S., et al.:Sialylated N-glycans in adult rat brain tissue., Eur. J. Biochem., 258(1), 243-270, 1998
【非特許文献４】Iwamori M., et al.: Comparative study on ganglioside compositions of various rabbit tissues.  Tissue-specificity in ganglioside molecular species of rabbit thymus., Biochem. Biophys. Acta., 665(2), 214-20, 1981
【非特許文献５】Tsuji S.: Molecular cloning and functional analysis of sialyltransferases.: J. Biochem (Tokyo), 120(1), 1-13, 1996
【非特許文献６】Takashima S., et al.: Molecular cloning and expression of a sixth type of alpha 2,8-sialyltransferase (ST8Sia VI) that sialylates O-glycans., J. Biol. Chem., 277(27), 24030-8, 2002
【非特許文献７】Kono M., et al.: Mouse beta-galactoside alpha 2,3-sialyltransferases: cmparison of in vitro substrate specificities and tissue  specific expression., Glycobiology, 7(4), 469-79, 1997
【非特許文献８】Ellies LG., et al.: Sialyltransferase specificity in selectin ligand formation, Blood, 100, 3618-25, 2002
【非特許文献９】Matsuhashi H., et al.: Region-specific and epileptogenic-dependent expression of six subtypes of α-sialyltransferase in the adult mouse brain, J. Neurochem., 84, 53-66, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウス等のＳＴ３ＧａｌＩＶ遺伝子機能が欠損した非ヒト動物を提供し、ＳＴ３ＧａｌＩＶと病態との関係を解明すること、さらには、該病態の治療薬のスクリーニング方法およびＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスを作製し、該マウスが、不安、睡眠、成長、生殖、生体リズム等に関係する生理現象を表すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した、マウス、ラット等の齧歯目動物を含む非ヒト動物、不安障害モデル動物、睡眠障害モデル動物、成長障害モデル動物、生殖障害モデル動物、および生体リズム障害モデル動物等に関する。
また、本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した、マウス、ラット等の齧歯目動物を含む非ヒト動物を使用した不安障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、該非ヒト動物に化合物を投与し、オープンフィールド試験を行い、該化合物を投与していない該非ヒト動物と比較して四隅での滞在時間が減少したときに、該化合物を不安障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法；該非ヒト動物を使用した不安障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、該非ヒト動物に化合物を投与し、恐怖条件付け試験を行い、該化合物を投与していない該非ヒト動物と比較してフリージングが減少したときに、該化合物を不安障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法；該非ヒト動物を使用した睡眠障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、該非ヒト動物に化合物を投与し、脳波および／または筋電図の測定および／または行動の観察を行って、該化合物を投与していない該非ヒト動物と比較して睡眠パターンが改善されたときに、該化合物を睡眠障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法；該非ヒト動物を使用した成長障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、該非ヒト動物に化合物を投与し、体重および／または体長の測定、および／または血中の成長ホルモン（Ｇｈ）および／またはＩＧＦ−１の濃度の測定を行い、該化合物を投与していない該非ヒト動物と比較して体重および／または体長が増加したとき、および／または血中の成長ホルモン（Ｇｈ）および／またはＩＧＦ−１の濃度が増加したときに、該化合物を成長障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法；該非ヒト動物を使用した生殖障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、該非ヒト動物に化合物を投与し、性周期および／または分娩の異常の有無の観察を行い、該化合物を投与していない該非ヒト動物と比較して性周期および／または分娩の異常が改善されたときに、該化合物を生殖障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法；該非ヒト動物を使用した生体リズム障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、該非ヒト動物に化合物を投与し、性周期の観察、脳波および／または筋電図の測定および／または行動の観察を行い、該化合物を投与していない該非ヒト動物と比較して性周期のリズムが改善し、および／または睡眠パターンが改善されたときに、該化合物を生体リズム障害の治療に有用な化合物として選択することを含む方法；および該非ヒト動物を使用したＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤のインビボ薬効を測定する方法であって、該非ヒト動物および野生型の非ヒト動物に被験物質を投与し、ｉ）オープンフィールド試験、ｉｉ）恐怖条件付け試験、ｉｉｉ）脳波および／または筋電図の測定、および／または行動の観察、ｉｖ）体重および／または体長の測定、ｖ）血中の成長ホルモン（Ｇｈ）またはＩＧＦ−１の濃度の測定、または、ｖｉ）性周期および／または分娩の異常の観察、を行い、該非ヒト動物に作用がなく、野生型の非ヒト動物が該非ヒト動物の表現型を提示するときに、該被験物質をＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤として選択することを含む方法等に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明におけるＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した、マウスを含む齧歯目動物等の非ヒト動物、およびそれを用いた上記に例示したスクリーニング方法を実施することにより、不安障害、睡眠障害、成長障害、生殖障害、生体リズム障害等の治療に有用な化合物を見出すことができる。また、本発明に係るＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した、マウスを含む齧歯目動物等の非ヒト動物および野生型の非ヒト動物を使用することにより、ＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤のインビボ薬効を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（１）ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物
本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を提供する。本発明におけるＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、ＳＴ３ＧａｌＩＶをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化され、実質的な酵素活性を有するＳＴ３ＧａｌＩＶを発現する機能を失った非ヒト動物をいう。また、非ヒト動物とは、マウス、ラット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。該非ヒト動物がマウスのとき、非ヒト動物はノックアウトマウスである。より好ましくは、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物は、時期特異的及び／または組織特異的にＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能を不活性化した、非ヒトコンディショナルノックアウト動物であり、さらに好ましくは、コンディショナルノックアウトマウスである。
【０００９】
本発明における野生型の非ヒト動物とは、上記ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と同種、同系統の、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が正常で且つ健常な動物を意味し、同腹の動物が好ましく、さらには、同じ性別、同じ週齢の動物が好ましい。例えば、C57BL/6Jマウスを起源に上記非ヒト動物であるＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスを作製したときには、野生型の非ヒト動物は正常且つ健常なC57BL/6Jマウスを採用できる。以下、一例として、非ヒト動物がマウスの場合、つまりノックアウトマウスの場合につき、作製法を説明する。
【００１０】
ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの作製法
ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの作製法としては、ＳＴ３ＧａｌＩＶの機能を失ったノックアウトマウスを作製することができるものであればどのような作成法でもよいが、公知のジーンターゲッティング法（例えば、村松正實、山本雅編集、「実験医学別冊  新訂  遺伝子工学ハンドブック  改訂第３版」（１９９９年、羊土社発行）；  別冊 実験医学 ザ・プロトコールシリーズ 「ジーンターデティングの最新技術」（２０００年、羊土社）コンディショナルターゲティング法ｐ．１１５−１２０；バイオマニュアルシリーズ８ 「ジーンターゲティング」−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（１９９５年、羊土社）ｐ．７１−７７）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第３版，ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＰＲＥＳＳ，２００１年，４．８２−４．８５などを参照）により作製できる。
例えば、（ｉ）ＳＴ３ＧａｌＩＶをコードするｃＤＮＡをプローブとして、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ゲノムＤＮＡのＳＴ３ＧａｌＩＶ遺伝子を単離し、（ｉｉ）この遺伝子の適当なエクソンを含む部分を、適当な外来遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子）に置換してターゲッティングベクターを作製し、（ｉｉｉ）作製されたターゲットベクターをエレクトロポレーション法等によってＥＳ細胞（例えば、MS12ＥＳ細胞、129/SvJ由来のE14ＥＳ細胞、ＴＴ２細胞株、ＡＢ−１細胞株、Ｊ１細胞株、Ｒ１細胞株等）に導入し、（ｉｖ）相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択し、このＥＳ細胞系を用いて生殖系列のキメラマウスを作製し、（ｖ）野生型マウスと交配させることによって得られるヘテロ接合体マウス同士を交配させることによってＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウス、同腹の野生型マウスを作製することができる。
あるいは、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスは、例えば、（ｉ）ＳＴ３ＧａｌＩＶをコードするｃＤＮＡをプローブとして、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ゲノムＤＮＡのＳＴ３ＧａｌＩＶ遺伝子を単離し、（ｉｉ）ＳＴ３ＧａｌＩＶ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部をリコンビネース標的配列で挟んだ配列を有し、前記配列でＳＴ３ＧａｌＩＶ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部を相同組換えすることを特徴とするターゲティングベクターを作製し、（ｉｉｉ）胚性幹細胞に前記ターゲティングベクターを形質導入し、ＳＴ３ＧａｌＩＶ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部の相同組換えを生じさせ、（ｉｖ）前記相同組換えを生じた胚性幹細胞を用いて、リコンビネース標的配列を含む改変ＳＴ３ＧａｌＩＶ遺伝子を有する遺伝子改変マウスを作製し、そして（ｖ）前記遺伝子改変マウスを、リコンビネースタンパク質を発現する（好ましくは、時期特異的及び／又は組織特異的にリコンビネースタンパク質を発現する）リコンビネース発現遺伝子改変マウスと交配して、ＳＴ３ＧａｌＩＶタンパク質の発現が抑制された（好ましくは時期特異的及び／又は組織特異的に抑制された）、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスを作製することができる（特開2002-369639号公報、2006-141283号公報参照）。
【００１１】
本発明は、また、不安障害モデル動物である、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を提供する。不安障害モデル動物とは、動物、好ましくはヒトの不安障害の病態を反映した動物であり、該動物を用いて、不安障害のメカニズムの解明、不安障害の処置法、予防法の探索、治療薬および予防薬の評価および探索等が可能である。
本発明が提供する不安障害モデル動物は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が欠損していることに起因して不安が惹起されている。ＳＴ３ＧａｌＩＶは糖転移酵素であることから、多様な生理現象に関与している可能性があり、ＳＴ３ＧａｌＩＶ欠損から不安に至るメカニズムも多様であると推測される。一方、従来の不安障害モデル動物、例えば、ベンゾジアゼピン受容体逆作動薬等の薬剤投与により作成される不安障害モデル動物は、ベンゾジアゼピン受容体を介した単一のメカニズムで不安が惹起される。臨床での不安のメカニズムは複雑多様かつ高度であるので、この点、本発明が提供する不安障害モデル動物は、従来の薬剤投与により作成される不安障害モデル動物に比較して、臨床で認められる多様なメカニズムの不安をより反映した包括的な不安障害モデル動物である可能性があり、不安障害のメカニズムの解明に有用であると考えられる。
また、薬剤投与により惹起される不安は、薬剤投与という人為的操作が入るために、しばしば、処置動物間で惹起される不安の程度にバラツキが認められる。一方、本願発明が提供する不安障害モデル動物は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子の欠損という遺伝的バックグランドにより不安が惹起されるので、従来の薬剤投与により作成される不安障害モデル動物に比較して不安の程度にバラツキがない。このことは、不安障害治療薬および予防薬の評価において、大変有利である。
本発明が提供する不安障害モデル動物は、好ましくは、齧歯目動物であり、より好ましくは、マウスである。
【００１２】
不安障害とは、不安が強く、行動や心理的障害をもたらす症状を有する疾患であり、全般性不安障害、社会不安障害（社会恐怖）、パニック障害、ＰＴＳＤ、強迫性障害等を含むものであり、ＤＳＭ−ＩＶ（アメリカ精神医学会が発行する精神障害の診断・統計マニュアル、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorder）を参照して診断される疾患である。
全般性不安障害、社会不安障害、パニック障害、ＰＴＳＤ、強迫性障害等もＤＳＭ−ＩＶを参照にして診断される疾患であり、全般性不安障害とは、特殊な状況に限定されない、理由の定まらない不安が長期間続き、ついには日常生活にも支障をきたす疾患であり、パニック障害とは、突然、動悸などの自律神経症状と強い不安感に襲われる「パニック発作」を特徴とする疾患であり、ＰＴＳＤとは、過去に経験した心的外傷が原因で強い不安感に襲われることを特徴とする疾患であり、強迫性障害とは、強迫観念により、意味のない行動（強迫行為）をすることを特徴とする疾患である。
【００１３】
本発明は、さらに、睡眠障害モデル動物である、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を提供する。睡眠障害モデル動物とは、動物、好ましくはヒトの睡眠障害の病態を反映した動物のことであり、該動物を用いて、睡眠障害のメカニズムの解明、睡眠障害の処置法、予防法の探索、治療薬および予防薬の評価および探索等が可能である。本発明が提供する睡眠障害モデル動物の特徴の一つは、レム睡眠の時間が短いことである。本発明が提供する睡眠障害モデル動物は、好ましくは、齧歯目動物であり、より好ましくは、マウスである。
【００１４】
睡眠障害とは、入眠、睡眠に何らかの異常を伴う疾患である。本発明において、睡眠障害はレム睡眠の障害を含み、さらには、例えば、覚醒状態から短時間睡眠状態に陥り再び覚醒状態に戻るといった、自然でない睡眠状態を含む。レム睡眠の障害とは、自然でないレム睡眠の状態であり、レム睡眠の時間が短い状態を含む。
【００１５】
本発明は、さらにまた、成長障害モデル動物である、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を提供する。成長障害モデル動物とは、動物、好ましくはヒトの成長障害の病態を反映した動物のことであり、該動物を用いて、成長障害のメカニズムの解明、成長障害の処置法、予防法の探索、治療薬および予防薬の評価および探索等が可能である。本発明が提供する成長障害モデル動物は、従前の下垂体切除動物のように下垂体の機能が著しく損なわれたものではない。また、本発明が提供する成長障害モデル動物は、体重および体長の増加が野生型の非ヒト動物に比較して遅く、血漿中の成長ホルモン（Ｇｈ）およびＩＧＦ−１の濃度も低下している。本発明が提供する成長障害モデル動物は、好ましくは、齧歯目動物であり、より好ましくは、マウスである。
【００１６】
成長障害とは、成長に何らかの異常、例えば、身長および／または体重の増加の異常を伴う疾患である。本発明において、成長障害は、小人症（下垂体性小人症を含む）、およびターナー症候群、慢性腎不全、プラダーウィリー症候群および成人成長ホルモン分泌不全症における低身長、好ましくは、骨端線閉鎖を伴わない小人症（骨端線閉鎖を伴わない下垂体性小人症を含む）、および骨端線閉鎖を伴わない以下の疾患における低身長：ターナー症候群、慢性腎不全、プラダーウィリー症候群および成人成長ホルモン分泌不全症、を含む。体長とは、例えば、ヒトで言えば、身長に相当する。
【００１７】
本発明は、さらに、生殖障害モデル動物である、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を提供する。生殖障害モデル動物とは、動物、好ましくはヒトの生殖障害の病態を反映した動物のことであり、該動物を用いて、生殖障害のメカニズムの解明、生殖障害の処置法、予防法の探索、治療薬および予防薬の評価および探索等が可能である。本発明が提供する生殖障害モデル動物は、雌性の性周期が不規則となっている。また、本発明が提供する生殖障害モデル動物は、分娩異常が観察され、分娩されずに死産し、この傾向は高齢の動物により観察される。本発明が提供する生殖障害モデル動物は、好ましくは、齧歯目動物であり、より好ましくは、マウスである。
【００１８】
生殖障害とは、雄性および雌性にかかわらず生殖能力に何らかの異常があり、正常な胎児の出産が達成されない疾患、例えば、性周期、妊娠、および／または分娩の異常を伴う疾患である。また、本発明において、性周期とは、例えば、ヒトの場合、月経がはじまった日から、次の月経のはじまる前日までの月経周期、マウスの場合、発情期から次の発情期までの周期（発情前期→発情期→発情後期→休止期を含む）を含む概念であり、性周期の異常は、性周期が不規則となること、性周期のリズムが乱れること、性周期の周期が短くなることを含み、分娩の異常は、流産、早産、過期産および死産を含む。
【００１９】
本発明は、さらに、生体リズム障害モデル動物である、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を提供する。生体リズム障害モデル動物とは、動物、好ましくはヒトの生体リズム障害の病態を反映した動物のことであり、該動物を用いて、生体リズム障害のメカニズムの解明、生体リズム障害の処置法、予防法の探索、治療薬および予防薬の評価および探索等が可能である。本発明が提供する生体リズム障害モデル動物は、雌性の性周期が不規則となり、分娩時のリズム不全が認められる。また、本発明が提供する生体リズム障害モデル動物は、レム睡眠、ノンレム睡眠の周期が不規則であり、自然な睡眠リズムを表さず、レム睡眠の時間が短い。本発明が提供する生体リズム障害モデル動物は、好ましくは、齧歯目動物であり、より好ましくは、マウスである。
【００２０】
生体リズム障害とは、生体のリズム、例えば、サーカディアン・リズム、睡眠リズム、性周期、ホルモンの分泌リズム等に何らかの異常があり、正常な生理機能が損なわれている疾患である。
【００２１】
（２）オープンフィールド試験を利用する、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた不安障害の治療薬のスクリーニング方法
本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた不安障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
例えば、本発明が提供する不安障害の治療に有用な化合物のスクリーニング方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に化合物を投与し、オープンフィールド試験を行い、該化合物を投与していないＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較して四隅での滞在時間が減少したときに、該化合物を不安障害の治療に有用な化合物として選択することを含む。好ましくは、非ヒト動物は、マウスまたはラット等の齧歯目動物である。
【００２２】
不安障害とは、上記（１）で記載した通りである。
オープンフィールド試験は、四角形の装置という広い新規環境下において、動物が壁に触れ装置内の周辺部をより好んで歩行する習性を利用した試験で、ジアゼパム等のベンゾジアゼピン系抗不安薬を投与すると、装置中央部での探索行動が増加することから、装置の中央部での滞在時間の増加を不安の程度が減少している指標として、不安の程度を評価する試験方法である（山口  拓、吉岡  光弘、日薬理誌、２００７、１３０，１０５−１１１参照）。したがって、不安障害の治療に有用な化合物を投与した動物は、本試験系において、装置の四隅での滞在時間が減少し、中央部での滞在時間が増加する。
オープンフィールド試験は、上記のように、動物の生来の習性を利用した試験であり、病的な不安を惹起させて不安の程度を評価する試験法ではない。さらに、臨床で不安障害に有効とされている薬剤のうち、ベンゾジアゼピン系の抗不安薬は本試験系で抗不安効果を検出できるが、三環系抗うつ薬や不安障害治療の第１選択薬であるＳＳＲＩの抗不安効果は検出されず、中枢興奮薬などによっても自発運動量の亢進作用や装置中央部での探索行動の増加が認められることから、本試験系を用いた不安水準の評価は、他の試験系と複合的に評価することが推奨されている（山口  拓、吉岡  光弘、日薬理誌、２００７、１３０，１０５−１１１参照）。
本発明の不安障害の治療薬のスクリーニング方法は、不安感受性の高いことが恐怖条件付け試験でも認められた、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いることから、健常な野生型動物のみを用いた従来のオープンフィールド試験よりも優れた評価系であると考えられる。そして、本発明の不安障害の治療薬のスクリーニング方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いることにより、健常な野生型動物のみを用いた従来のオープンフィールド試験よりも評価ウィンドウ（被験化合物投与により変化可能な最大変化量）が大きく、より正確に抗不安効果の薬効を検出できる系である（例えば、図５で野生型（+/+）とST3GalIVノックアウトマウス(-/-）のそれぞれの黒カラムと白カラムの差を比べれば、ST3GalIVノックアウトマウスの差が野生型マウスの差よりも大きいので、抗不安薬の薬効をより大きな変化量で検出できる）。
【００２３】
本発明の不安障害の治療薬のスクリーニング方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に化合物を投与する工程を含む。投与は、適切な投与方法により行われれば、特に限定されないが、経口投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与等の投与方法が採用され得る。投与化合物、化合物の媒体、投与量、投与方法等の条件は、当業者が適宜設定できる。
【００２４】
オープンフィールド試験の測定用装置は、特に限定されないが、四角形のケージおよび滞在場所記録装置を含む装置を採用できる。好ましくは、マウスの場合、ケージは透明なプラスチックでできており、広さは４５ｃｍＸ５５ｃｍであり、高さは、マウスが容易に飛び越えられない程度の適切な高さである。滞在場所記録装置は、滞在場所が記録され、四隅の滞在時間を計測できれば限定されないが、録画機能付きビデオカメラまたはAUTOMEXII（東海医理科製）等を採用できる。ケージは、適切な広さに分割し、動物の滞在時間を測定する四隅または中央部を予め設定する。四隅の大きさは、当業者が適切に設定できるが、例えば、広さは４５ｃｍＸ５５ｃｍのケージの場合は、四隅のそれぞれは、各ケージの角を含む11.25ｃｍＸ13.75ｃｍの大きさと設定できる。中央部の大きさも、当業者が適切に設定でき、例えば、広さは４５ｃｍＸ５５ｃｍのケージの場合は、ケージの壁に接触してない、４５ｃｍＸ５５ｃｍの四角形の重心（対角線の交点）を含む11.25ｃｍＸ27.5ｃｍの大きさと設定できる。
オープンフィールド試験の試行数、動物数、スケジュール等の実験スケジュールは当業者が適宜設定できる。
【００２５】
オープンフィールド試験の結果、化合物を投与したＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物が、化合物を投与しない（または、化合物の媒体のみ投与した）ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較して、四隅での滞在時間が減少したとき、該化合物を不安障害の治療に有用な化合物として選択する。
あるいは、オープンフィールド試験の結果、化合物を投与したＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物が、化合物を投与しない（または、化合物の媒体のみ投与した）ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較して、中央部での滞在時間が増加したとき、該化合物を不安障害の治療に有用な化合物として選択する。
場合により、本発明の不安障害の治療薬のスクリーニング方法は、さらに、野生型の非ヒト動物、好ましくはマウスに該化合物を投与して、該化合物が野生型動物に効果を示さないことを確認する工程を含めてもよい。これにより、異常に不安感受性の亢進した動物にのみその異常な不安を緩解し、正常動物には作用を及ぼさない、より優れた不安障害の治療に有用な化合物として選択することができる。
【００２６】
（３）恐怖条件付け試験を利用する、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた不安障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法
本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた不安障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
例えば、本発明が提供する不安障害の治療に有用な化合物のスクリーニング方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に化合物を投与し、恐怖条件付け試験を行い、該化合物を投与していないＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較してフリージングが減少したときに、該化合物を不安障害の治療に有用な化合物として選択することを含む。好ましくは、非ヒト動物は、マウスまたはラット等の齧歯目動物である。
【００２７】
不安障害とは、上記（１）で記載した通りである。
恐怖条件付け試験は、文脈的恐怖条件付け試験または恐怖条件付けストレス試験とも呼ばれ、一定条件下で回避不可能な電撃ショック（電気刺激）を実験箱の床グリッドから負荷して、その電撃ショックを経験した実験箱で条件付けを行い（恐怖体験は、実験箱内の内装や床グリッドへの触覚、または電撃ショックの前に提示される音刺激により認知される）、再び実験動物に同じ条件を提示すること（電撃ショックを与えた同じ実験箱に入れたり、電撃ショックの前に提示したのと同じ音刺激を提示したりすること）によって引き起こされる心理的ストレス反応を測定することで、不安状態を評価する試験である。この心理的ストレス反応の１つとして、電撃ショックを与えなくてもラットは呼吸運動以外の体動を示さない無動状態のまま身体をすくませるという防御反応、すなわち「すくみ行動（フリージング）」を示す。フリージングは、恐怖や不安の指標とみなされ、フリージングが多く出現するほどその程度は強く、少なく出現するほど弱いと考えられる。フリージングの発現は、条件付けを行う際の、電撃ショックの強度、音刺激の強度や実験箱内の照明強度等にも左右されるが、これらを含む実験環境、実験条件は、当業者が適宜設定できる。また、フリージングの判定は、目視でも可能であるが、ビデオカメラを用いた画像処理による自動解析システムを用いてもよい。
恐怖条件付け試験は、臨床で不安障害に適用のある、ベンゾジアゼピン系抗不安薬、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体作動薬、ＳＳＲＩ等の多くの薬物の抗不安作用を検出できる系であり、不安の評価系として大変有用である（Japanese Journal of Psychosomatic Medicine Vol. 37, No.3, pp.223-229等参照)。
本発明の不安障害の治療薬のスクリーニング方法では、不安感受性の高いＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いることから、健常な野生型動物のみを用いた恐怖条件付け試験よりもより大きな評価ウィンドウが得られるので、従来の恐怖条件付け試験よりも優れた評価系である。
【００２８】
本発明の不安障害の治療薬のスクリーニング方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に化合物を投与する工程を含む。投与は、適切な投与方法により行われれば、特に限定されないが、経口投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与等の投与方法が採用され得る。投与化合物、化合物の媒体、投与量、投与方法等の条件は、当業者が適宜設定できる。
【００２９】
恐怖条件付け試験の測定装置は、特に限定されず、当業者が適切なものを選択できる。
また、試験の試行数、動物数、スケジュール等の実験スケジュールについても、当業者が適宜設定できる。
【００３０】
恐怖条件付け試験の結果、化合物を投与したＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物が、化合物を投与しない（または、化合物の媒体のみ投与した）ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較して、フリージングが減少したとき、該化合物を不安障害の治療に有用な化合物として選択する。
場合により、本発明の不安障害の治療薬のスクリーニング方法は、さらに、野生型の非ヒト動物、好ましくはマウスに該化合物を投与して、該化合物が野生型動物に効果を示さないことを確認する工程を含めてもよい。これにより、異常に不安感受性の亢進した動物にのみその異常な不安を緩解し、正常動物には作用を及ぼさない、より優れた不安障害の治療に有用な化合物として選択することができる。
【００３１】
また、（２）で記載したオープンフィールド試験を利用する、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた不安障害の治療薬のスクリーニング方法と、（３）で記載した恐怖条件付け試験を利用する、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた不安障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法を、並行して、または、連続的に実施して、両方法で共に不安障害の治療に有用な化合物として選択された化合物を不安障害の治療に有用な化合物として選択することにより、より精度の高いスクリーニングが可能になる。
【００３２】
（４）ＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤を含む学習・記憶増強剤、認知機能促進剤、記憶維持増強剤または抗痴呆薬
恐怖条件付け試験は、学習・記憶の評価系ともなり得（山口  拓、吉岡  光弘、日薬理誌、２００７、１３０，１０５−１１１；  田熊  一敞ら、日薬理誌、２００７、１３０，１１２−１１６参照）、フリージングが多く出現すれば、学習・記憶が増強されているとも評価できる。ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物が、記憶を必要とする実験スケジュールで行う恐怖条件付け試験において、野生型非ヒト動物よりもフリージングが多く出現すれば、ＳＴ３ＧａｌＩＶ欠損は、学習・記憶、認知の機能、または記憶維持を高める可能性が示唆される。したがって、そのような場合には、本発明は、学習・記憶、認知機能、または記憶維持が高められた、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を提供し得る。好ましくは、本発明は、学習・記憶、認知機能、または記憶維持が高められた、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、ラット等の齧歯目動物を提供し得る。より好ましくは、本発明は、学習・記憶、認知機能、または記憶維持が高められた、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスを提供し得る。さらに、ＳＴ３ＧａｌＩＶ欠損が、学習・記憶、認知の機能、または記憶維持を高める可能性が示唆された場合には、本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤を含む学習・記憶増強剤、認知機能促進剤、記憶維持増強剤または抗痴呆薬を提供し得る。
抗痴呆薬には、アルツハイマー病、脳血管性痴呆等の痴呆を処置および／または予防するための医薬が含まれる。
【００３３】
ここで、ＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの酵素活性を阻害する物質であり、低分子化合物に限定されず、ペプチド、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡを含み、さらには、ＳＴ３ＧａｌＩＶのアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはsiRNAを含む。
ＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤を含む医薬組成物およびその投与方法は、当業者が適宜設定できる。
ＳＴ３ＧａｌＩＶのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびsiRNAは、適切なベクター、例えばアデノウイルスベクターに、神経細胞で発現可能なように組み込まれてもよい。
【００３４】
（５）ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた睡眠障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法
本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた睡眠障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
例えば、本発明が提供する睡眠障害の治療に有用な化合物のスクリーニング方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に化合物を投与し、脳波および／または筋電図の測定および／または行動の観察を行って、該化合物を投与していないＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較して睡眠パターンが改善されたときに、該化合物を睡眠障害の治療に有用な化合物として選択することを含む。好ましくは、非ヒト動物は、マウスまたはラット等の齧歯目動物である。
【００３５】
睡眠障害とは、入眠、睡眠に何らかの異常を伴う疾患である。本発明において、睡眠障害はレム睡眠の障害を含み、さらには、例えば、覚醒状態から短時間睡眠状態に陥り再び覚醒状態に戻るといった自然でない睡眠状態、覚醒、ノンレム睡眠、レム睡眠の時間および周期性が自然な状態と異なる睡眠状態を含む。場合により、睡眠障害は、他の疾患、例えば不安障害を伴ってもよい。レム睡眠の障害とは、自然でないレム睡眠の状態であり、レム睡眠の時間が短い状態を含む。
【００３６】
脳波および筋電図の測定および解析は、特に限定されないが、例えば、脳内および皮下の適切な場所に電極を埋め込み、Vital Recorder（KISSEI COMTEC）を用い脳波および筋電図を測定することができ、脳波解析研究用プログラムSleepSign（KISSEI COMTEC）を用い、脳波のδ波、θ波、α波、スピンドルの各波長の比率を求め、これと筋電図の大きさ、およびマウスの行動を記録したビデオ画像から、覚醒、レム睡眠、睡眠の各状態を特定し、睡眠パターンを解析することができる。
行動の観察は、特に限定されないが、終日に渡り、ビデオカメラ、デジタルビデオカメラ等の撮影手段により撮影を行い、ビデオ、ＤＶＤ等の記録媒体に録画し、その録画映像を目視により解析することにより、行うことができる。例えば、録画映像の目視により、動物が覚醒状態か否かを判断できる。
本発明の睡眠障害の治療薬のスクリーニング方法では、自然でない睡眠状態を呈する、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いることから、健常な野生型動物のみを用いた睡眠障害の治療薬のスクリーニング方法よりも優れた試験系である。また、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物のレム睡眠の時間が、野生型非ヒト動物に比較し有意に減少することから、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いる本発明は、レム睡眠の障害の治療に有用な化合物をスクリーニングするという新規な方法を提供する。
【００３７】
本発明の睡眠障害の治療薬のスクリーニング方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に化合物を投与する工程を含む。投与は、適切な投与方法により行われれば、特に限定されないが、経口投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与等の投与方法が採用され得る。投与化合物、化合物の媒体、投与量、投与方法等の条件は、当業者が適宜設定できる。
【００３８】
脳波および筋電図の測定、行動の観察、およびそれらの解析等の条件、試験の試行数、動物数、スケジュール等の実験スケジュールについては、当業者が適宜設定できる。
【００３９】
脳波および／または筋電図の測定、および／または行動の観察およびそれらの解析を行った結果、化合物を投与したＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物が、化合物を投与しない（または、化合物の媒体のみ投与した）ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較して、睡眠パターンが改善されたとき、該化合物を睡眠障害の治療に有用な化合物として選択する。ここで、睡眠パターンが改善されたとは、睡眠、レム睡眠、覚醒の移行（睡眠パターン）が、より自然な状態に近づくことであり、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物の睡眠パターンが改善されたとは、睡眠、レム睡眠、覚醒の周期と時間が、野生型の非ヒト動物に近づくことをいう。
また、脳波および／または筋電図の測定、および／または行動の観察およびそれらの解析を行った結果、化合物を投与したＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物が、化合物を投与しない（または、化合物の媒体のみ投与した）ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較して、レム睡眠の時間が増加したとき、該化合物はレム睡眠の障害の治療に有用な化合物として選択される。
場合により、本発明における睡眠障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法は、さらに、野生型の非ヒト動物、好ましくはマウスに該化合物を投与して、該化合物が野生型動物に効果を示さないことを確認する工程を含めてもよい。これにより、異常な睡眠を呈する動物にのみその異常な睡眠を改善し、正常動物には作用を及ぼさない、より優れた睡眠障害の治療に有用な化合物として選択することができる。
【００４０】
（６）ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた成長障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法
本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた成長障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
例えば、本発明が提供する成長障害の治療に有用な化合物のスクリーニング方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に化合物を投与し、体重および／または体長の測定、および／または血中の成長ホルモン（Ｇｈ）および／またはＩＧＦ−１の濃度の測定を行って、該化合物を投与していないＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較して体重および／または体長、および／または血中の成長ホルモン（Ｇｈ）および／またはＩＧＦ−１の濃度が増加したときに、該化合物を成長障害の治療に有用な化合物として選択することを含む。好ましくは、非ヒト動物は、マウスまたはラット等の齧歯目動物である。
【００４１】
体重および体長の測定および解析は、特に限定されず、例えば、体重計、体長計等を用いて行うことができる。
血中の成長ホルモン（Ｇｈ）およびＩＧＦ−１の濃度の測定は、特に限定されないが、例えば、動物から採血された血液サンプルより血清または血漿を得、その中のＧｈまたはＩＧＦ−１の濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて測定できる。
本発明の成長障害の治療薬のスクリーニング方法は、従来より使用されている下垂体切除動物を用いた系に比較し、手術等の複雑な処置の介入が少ないので、よりバラツキの少なく、精度および再現性の良いスクリーニング結果を得ることができる。
【００４２】
本発明の成長障害の治療薬のスクリーニング方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に化合物を投与する工程を含む。投与は、適切な投与方法により行われれば、特に限定されないが、経口投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与等の投与方法が採用され得る。投与化合物、化合物の媒体、投与量、投与方法等の条件は、当業者が適宜設定できる。
【００４３】
体重および体長の測定、血中の成長ホルモン（Ｇｈ）およびＩＧＦ−１の濃度の測定、およびそれらの解析等の条件、試験の試行数、動物数、スケジュール等の実験スケジュールについては、当業者が適宜設定できる。
【００４４】
体重および／または体長の測定、および／または血中の成長ホルモン（Ｇｈ）および／またはＩＧＦ−１の濃度の測定およびそれらの解析を行った結果、化合物を投与したＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物が、化合物を投与しない（または、化合物の媒体のみ投与した）ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較して、体重および／または体長、および／または血中の成長ホルモン（Ｇｈ）および／またはＩＧＦ−１の濃度が増加したとき、該化合物を成長障害の治療に有用な化合物として選択する。
場合により、本発明における成長障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法は、さらに、野生型の非ヒト動物、好ましくはマウスに該化合物を投与して、該化合物が野生型動物に効果を示さないことを確認する工程を含めてもよい。これにより、異常な成長を呈する動物にのみその異常な成長を改善し、正常動物には作用を及ぼさない、より優れた成長障害の治療に有用な化合物として選択することができる。
【００４５】
（７）ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた生殖障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法
本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた生殖障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
例えば、本発明が提供する生殖障害の治療に有用な化合物のスクリーニング方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に化合物を投与し、性周期および／または分娩の異常の有無の観察を行って、該化合物を投与していないＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較して性周期および／または分娩の異常が改善されたときに、該化合物を生殖障害の治療に有用な化合物として選択することを含む。好ましくは、非ヒト動物は、マウスまたはラット等の齧歯目動物である。
【００４６】
性周期の異常の有無の観察は、特に限定されず、例えば、膣垢等を用いて行うことができる。
分娩の異常の有無の観察は、特に限定されず、例えば、妊娠の日数を計測し、場合により、切開により胎児の生死を観察することにより行うことができる。
本発明の生殖障害の治療薬のスクリーニング方法は、従来より使用されている正常動物を薬物等で処置することにより性周期を異常にした動物を用いた系に比較し、薬物処置等の人為的処置の介入が少ないので、よりバラツキが少なく、精度および再現性の良いスクリーニング結果を得ることができる。
【００４７】
本発明の生殖障害の治療薬のスクリーニング方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に化合物を投与する工程を含む。投与は、適切な投与方法により行われれば、特に限定されないが、経口投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与等の投与方法が採用され得る。投与化合物、化合物の媒体、投与量、投与方法等の条件は、当業者が適宜設定できる。
【００４８】
性周期および分娩の異常の有無の観察、およびそれらの解析等の条件、試験の試行数、動物数、スケジュール等の実験スケジュールについては、当業者が適宜設定できる。
【００４９】
性周期および／または分娩の異常の有無の観察およびそれらの解析を行った結果、化合物を投与したＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物が、化合物を投与しない（または、化合物の媒体のみ投与した）ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較して、性周期および／または分娩の異常が改善されたとき、該化合物を生殖障害の治療に有用な化合物として選択する。
場合により、本発明における生殖障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法は、さらに、野生型の非ヒト動物、好ましくはマウスに該化合物を投与して、該化合物が野生型動物に効果を示さないことを確認する工程を含めてもよい。これにより、異常な生殖を呈する動物にのみその異常な生殖を改善し、正常動物には作用を及ぼさない、より優れた生殖障害の治療に有用な化合物として選択することができる。
【００５０】
（８）ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた生体リズム障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法
本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いた生体リズム障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
例えば、本発明が提供する生体リズム障害の治療に有用な化合物のスクリーニング方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に化合物を投与し、性周期の観察および／または脳波および／または筋電図の測定および／または行動の観察を行い、該化合物を投与していないＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較して性周期のリズムおよび／または睡眠パターンが改善されたときに、該化合物を生体リズム障害の治療に有用な化合物として選択することを含む。好ましくは、非ヒト動物は、マウスまたはラット等の齧歯目動物である。
【００５１】
性周期の観察は、特に限定されず、例えば、膣垢等を用いて行うことができる。
分娩の異常の有無の観察は、特に限定されず、例えば、妊娠の日数を計測し、切開により胎児の生死を観察することにより行うことができる。
脳波および筋電図の測定および解析は、特に限定されないが、例えば、脳内および皮下の適切な場所に電極を埋め込み、Vital Recorder（KISSEI COMTEC）を用い脳波および筋電図を測定することができ、脳波解析研究用プログラムSleepSign（KISSEI COMTEC）を用い、脳波のδ波、θ波、α波、スピンドルの各波長の比率を求め、これと筋電図の大きさ、およびマウスの行動を記録したビデオ画像から、覚醒、レム睡眠、睡眠の各状態を特定し、睡眠パターンを解析することができる。
行動の観察は、特に限定されないが、終日に渡り、ビデオカメラ、デジタルビデオカメラ等の撮影手段により撮影を行い、ビデオ、ＤＶＤ等の記録媒体に録画し、その録画映像を目視により解析することにより、行うことができる。例えば、録画映像の目視により、動物が覚醒状態か否かを判断できる。
本発明の生体リズム障害の治療薬のスクリーニング方法は、従来より使用されている正常動物を薬物等で処置することにより性周期を異常にした動物を用いた系に比較し、薬物処置等の人為的処置の介入が少ないので、よりバラツキが少なく、精度および再現性の良いスクリーニング結果を得ることができる。
【００５２】
本発明の生体リズム障害の治療薬のスクリーニング方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に化合物を投与する工程を含む。投与は、適切な投与方法により行われれば、特に限定されないが、経口投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与等の投与方法が採用され得る。投与化合物、化合物の媒体、投与量、投与方法等の条件は、当業者が適宜設定できる。
【００５３】
性周期の観察および／または脳波および／または筋電図の測定および／または行動の観察、およびそれらの解析等の条件、試験の試行数、動物数、スケジュール等の実験スケジュールについては、当業者が適宜設定できる。
【００５４】
性周期の観察および／または脳波および／または筋電図の測定および／または行動の観察およびそれらの解析を行った結果、化合物を投与したＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物が、化合物を投与しない（または、化合物の媒体のみ投与した）ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と比較して、性周期のリズムおよび／または睡眠パターンが改善されたとき、該化合物を生体リズム障害の治療に有用な化合物として選択する。なお、性周期のリズムとは、性周期の規則性を含む概念であり、例えば、周期を構成している要素（例えば、ヒト女性であれば、卵胞期、排卵期、黄体期、月経期等、マウスであれば、発情前期、発情期、発情後期、発情休止期等）が、一定且つ正常な期間で周期的に繰り返されることを意味する。したがって、「性周期のリズムが改善された」とは、性周期が正常化することを含み、例えば、周期を構成している要素の周期性が正常化することを意味する。
場合により、本発明における生体リズム障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法は、さらに、野生型の非ヒト動物、好ましくはマウスに該化合物を投与して、該化合物が野生型動物に効果を示さないことを確認する工程を含めてもよい。これにより、異常な生体リズムを呈する動物にのみその異常な生体リズムを改善し、正常動物には作用を及ぼさない、より優れた生体リズム障害の治療に有用な化合物として選択することができる。
【００５５】
（９）ＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤のインビボ薬効を測定する方法
本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤のインビボ薬効を測定する方法を提供する。
例えば、本発明が提供するＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤のインビボ薬効を測定する方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物および野生型の非ヒト動物に被験物質を投与し、
ｉ）オープンフィールド試験
ｉｉ）恐怖条件付け試験、
ｉｉｉ）脳波および／または筋電図の測定、および／または行動の観察
ｉｖ）体重および／または体長の測定、
ｖ）血中の成長ホルモン（Ｇｈ）またはＩＧＦ−１の濃度の測定、または、
ｖｉ）性周期および／または分娩の異常の観察
を行い、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に作用がなく、野生型の非ヒト動物がＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物の表現型を提示するときに、該被験物質をＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤として選択することを含む。好ましくは、非ヒト動物は、マウスまたはラット等の齧歯目動物である。
インビボ薬効とは、インビボ試験で検出される薬理作用のことであり、ＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤のインビボ薬効には、不安惹起作用、学習・記憶増強作用、認知機能促進作用、記憶維持増強作用、レム睡眠時間減少作用を含む睡眠パターン障害作用、体重および／または体長の増加抑制作用、血中の成長ホルモン（Ｇｈ）またはＩＧＦ−１の濃度抑制作用、性周期および／または分娩の異常等が含まれる。
【００５６】
ＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの酵素活性を阻害する物質であり、特に限定されず、低分子化合物、ペプチド、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡを含み、さらには、ＳＴ３ＧａｌＩＶのアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはsiRNAを含む。
【００５７】
オープンフィールド試験、恐怖条件付け試験、脳波および筋電図の測定、行動の観察、体重および体長の測定、血中の成長ホルモン（Ｇｈ）またはＩＧＦ−１の濃度の測定、性周期および／または分娩の異常の観察は、上記（２）−（８）で記載したように、当業者が適宜実施することができる。
【００５８】
本発明のＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤のインビボ薬効を測定する方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物および野生型の非ヒト動物に被験物質を投与する工程を含む。被験物質の投与方法は、当業者が適宜設定でき、特に限定されないが、経口投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与等の投与方法が採用され得る。投与物質、被験物質の媒体、投与量等の条件も、当業者が適宜設定できる。
被験物質は、ＳＴ３ＧａｌＩＶの酵素活性を阻害する可能性のある物質であり、特に限定されず、低分子化合物、ペプチド、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡを含み、さらには、ＳＴ３ＧａｌＩＶのアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはsiRNAを含む。
ＳＴ３ＧａｌＩＶのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびsiRNAは、適切なベクター、例えばアデノウイルスベクターに、神経細胞で発現可能なように組み込まれて投与されてもよい。
【００５９】
オープンフィールド試験、恐怖条件付け試験、または脳波および／または筋電図の測定、行動の観察、体重および体長の測定、血中の成長ホルモン（Ｇｈ）またはＩＧＦ−１の濃度の測定、および／または、性周期および／または分娩の異常の観察の結果、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に作用がなく、野生型の非ヒト動物がＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物の表現型を提示するときに、該被験物質をＳＴ３ＧａｌＩＶ阻害剤として選択する。
ここで、表現型とは、行動薬理学的に認められる形質を含むものであり、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物の表現型を提示するとは、ＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と同様の、不安惹起作用、学習・記憶増強作用、認知機能促進作用、記憶維持増強作用、レム睡眠時間減少作用を含む睡眠パターン障害作用、体重および／または体長の増加抑制作用、血中の成長ホルモン（Ｇｈ）またはＩＧＦ−１の濃度抑制作用、性周期および／または分娩の異常等を発現することをいう。
【００６０】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものでない。
【実施例】
【００６１】
実施例１：全身でＳＴ３ＧａｌＩＶを欠損するノックアウトマウスの作成
（Ｉ）ターゲッティングベクターの構築
ＳＴ３ＧａｌＩＶ欠損マウスを作成するために、ゲノムフラグメントをC57BL/6Jライブラリー（BACライブラリー、BAC Resources PAC）から単離した。図１に示すように、ターゲッティングベクターを構築した。
10.5kbFspI-SnaBIフラグメントを最初に単離し、pBluscript SK+(A32)にライゲーションした。そして、SpeI-XhoIフラグメントを単離し、pBluscript SK+(C12)にライゲーションした。C12を、エクソン２と３の間のイントロン領域にHindIIIサイトが挿入され、エクソン３と４の間のイントロン領域にEcoRVサイトが挿入されるように改変した（DC3）。loxp（３９mer  プライマーペア）をDC3プラスミドのHindIIIサイトに挿入し、loxp-frp-pgkneoプラスミドより単離した、SsPIサイトを有する2.0 kb Not I-Xho Iフラグメント(loxP-frt-pgkneo)を、DC3プラスミドのEcoRVサイトに挿入した（DC311_F7)。DC311_F7プラスミド中の5.0 kb Bcl I-Xho Iフラグメントを、A32プラスミドのBcl I-Xho Iサイトに挿入した（GD6)。最後に、pMC1DTpA (Transgenic Res 1999, 8:215-21, Yanagawa et al)の1.2 kb Not Iフラグメントを、GD6プラスミドのNotIサイトに挿入した（HH5; 13.6 kbフラグメント）。
（ＩＩ）ＳＴ３ＧａｌＩＶ-/-マウスの作成
HH5ターゲッティングベクターをMS12ES細胞（C57BL/6J由来）にエレクトロポレーションにより導入した。G418抵抗性のESクローンを、３つのプローブを用いたサザンブロッティングにより正確なＳＴ３ＧａｌＩＶ遺伝子座ターゲッティングからスクリーニングした。プローブは、235bpフラグメント(3’側)、220bpフラグメント(内部)、299bpフラグメント(5’側)をPCRにより、それぞれ、Df77/Dr45 (プローブN)、Df90/Dr91 (プローブR)、およびDf71/Dr72 (プローブF)プライマーペア(フォワードプライマー/リバースプライマー)を用いて増幅した。
Df77: 5’-GTTAGTTAGCTGTTGCCCGGTT-3’（配列番号１）
Dr45: 5’-CTTGTTGGAGGCATCTGGATAG-3’（配列番号２）
Df90: 5’-GGAGACAGCCATGCAGGAGAAG-3’（配列番号３）
Dr91: 5’-AACTTGAATTCCTCCTCCTTCT-3’（配列番号４）
Df71: 5’-AGAGTACACTGTAACTGGTCTG-3’（配列番号５）
Dr72: 5’-ACTCAGTGCCAGCTCTGTAGAT-3’（配列番号６）
【表１】
2009201501.tif 000002
ターゲッティング配列を有するES細胞を、標準的な手法により、C57BL/6Jblastcysts（MS12）に注入した。キメラをC57BL/6Jマウスと交配させた。ターゲットした遺伝子座を伝達する生殖系列を有する子孫を内部繁殖させた（targetedマウス）。そして、targetedマウスから得た精子をC57 Bl/6Jマウスの卵にインビトロで受精させ、ＣＡＧ−プロモーター−Ｃｒｅ−ポリプラスミドを、受精卵に注入し、そして２細胞期を子宮に移植した。ＳＴ３ＧａｌＩＶ遺伝子座を欠損するマウスを、また、C57BL/6Jマウスと交配させた。さらに、プロモーター−frep-ポリＡ注入プラスミドを受精卵に注入し、そして、freptaseがターゲット遺伝子座において、floxで挟まれたneo遺伝子を取り除くように、２細胞期を子宮に移植した。組織特異的ＳＴ３ＧａｌＩＶ欠損マウスが、Ｃｒｅ−ｌｏｘｐ系により得られた。
【００６２】
実施例２：ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの組織化学的解析
１３〜１５週齢のＳＴ３ＧａｌＩＶのホモ欠損型、ヘテロ欠損型、野生型マウスを潅流固定後、脳のパラフィン封埋を行い、冠状断面の切片を作成し、ヘマトキシリン−エオジン染色、抗ＧＡＦＰ抗体による染色、TUNEL法による染色を行った。
その結果、海馬歯状回におけるアストロサイトの増生や、大脳皮質帯状回における神経細胞の萎縮、さらには小脳の層構造異常を観察した（図３）。
【００６３】
実施例３：ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの行動学的解析
（Ｉ）オープンフィールド試験
AUTOMEXII（東海医理科製）を用いて８〜９週齢のＳＴ３ＧａｌＩＶのホモ欠損型、ヘテロ欠損型、野生型マウスについて試行を実施した。AUTOMEXの床（45cmX55cm）を図４のように１２マス（Ａ〜Ｌマス）に分割してオープンフィールドを作製した。マウスを図４の位置に投入し、５分間の観察中、マウスの滞在した位置と滞在秒数を記録した。マウスの体（頭部側）が半分以上マスに入った状態を滞在している位置として記録した。５分間の観察の後、外に出して５分間休憩させた。以上の５分間観察→５分間休憩という試行を３回おこなった（図４）。３回目の５分間の観察結果を図５に示した。本試行は、オープンフィールドに馴化していないマウスを用いた。記録した秒数は四隅（Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｌ）とそれ以外（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ）の２グループに分けて各グループの平均秒数（四隅：（Ａ＋Ｄ＋Ｉ＋Ｌ）／４Ｘ１２；それ以外：（Ｂ＋Ｃ＋Ｅ＋Ｆ＋Ｇ＋Ｈ＋Ｊ＋Ｋ）／８Ｘ１２）を算出した。統計解析は、one-way ANOVAの後、Turkeyの多重比較試験により行った。
その結果、野生型に比べてホモやヘテロの方が、四隅とそれ以外での滞在秒数の差が大きく、四隅に移動する傾向が強く（図５）、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスは新しい環境に対して不安が惹起されやすい傾向にあることが示唆された。
これにより、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスが不安障害のモデル動物として有用であることが示され、さらに、ＳＴ３ＧａｌＩＶの阻害剤のin vivo薬効が、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスおよび野生型マウスを用いたオープンフィールド試験により評価できることが示された。
また、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスを用いたオープンフィールド試験が不安障害に有用な化合物のスクリーニング方法、好ましくは、ＳＴ３ＧａｌＩＶ欠損が惹起する不安障害に有用な化合物のスクリーニング方法に利用可能であることが示唆された。
【００６４】
（ＩＩ）恐怖条件付け試験
８〜９週齢のＳＴ３ＧａｌＩＶのホモ欠損型または野生型マウスを、電気グリッドを設置したチャンバーに入れ、６０秒後、１２０ｄＢ、１０秒の音を提示し、その直後に０．５Ｖ、１秒の電気刺激を与えた。さらに、２０秒後（すなわち、ケージに入れてから９０秒後）、再び１２０ｄＢ、１０秒の音を提示し、その直後に０．５Ｖ、１秒の電気刺激を与えた。条件付けの２日後、マウスをケージに入れ、６０秒後および９０秒後に１２０ｄＢ、１０秒の音を呈示し、ケージに入れてから１８０秒間における、フリージングを呈したマウスの割合を測定した。なお、フリージングとは、呼吸に関する動きを除いて、骨格筋とひげが動かない状態とした。統計解析は、two-way Factorial ANOVAにより行った。
その結果、野生型に比べてホモの方が、フリージングが有意に増加することが認められ（図６）、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスが野生型より、より不安状態となることが示された。これにより、ＳＴ３ＧａｌＩＶの阻害剤のin vivo薬効が、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスおよび野生型マウスを用いた恐怖条件付け試験により評価できることが示された。なお、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスは、野生型マウスに比較し、音により条件付けられる恐怖条件付け試験でフリージングが増加し、文脈記憶により条件付けられる恐怖条件付け試験でフリージングが増加しなかったことから、ＳＴ３ＧａｌＩＶが扁桃体依存性の情動記憶に関与していることが示された。
また、臨床で、全般性不安障害、パニック障害、ＰＴＳＤ、強迫性障害および社会不安障害等を含む不安障害およびうつ病の治療に有効なSSRIが本試験と同様の恐怖条件付け試験でフリージングを有意に抑制すること、恐怖条件付け試験が不安障害の治療剤の評価系として有用であること（Japanese Journal of Psychosomatic Medicine Vol. 37, No.3, pp.223-229等参照)から、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスが、全般性不安障害、パニック障害、ＰＴＳＤ、強迫性障害および社会不安障害等を含む不安障害のモデル動物として有用であることが示された。さらに、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスを用いた恐怖条件付け試験が、全般性不安障害、パニック障害、ＰＴＳＤ、強迫性障害および社会不安障害等を含む不安障害の治療に有用な化合物のスクリーニング方法、好ましくは、ＳＴ３ＧａｌＩＶ欠損が惹起する全般性不安障害、パニック障害、ＰＴＳＤ、強迫性障害および社会不安障害等を含む不安障害の治療に有用な化合物のスクリーニング方法に利用可能であることが示された。
【００６５】
（ＩＩＩ）脳波解析
１）脳波測定用電極の作製
脳波電極用に15mmに切ったステンレス線（COONER WIRE Inc製）を２本用意し、ステンレス線の先端の片側のコーティングを0.5〜1mm剥離し、リン酸を塗布した後１０分間放置した。続いてステンレス線にはんだを付け（以下、予備はんだ）、その後再びリン酸を塗布し１０分間放置した。脳波計測用ネジ電極（以下、ビス）（Biotex Kyoto製）にもリン酸を塗布後１０分間放置した。リン酸を塗布したステンレス線とビスをはんだづけした後、はんだづけをした反対側のステンレス線の先端のコーティングを剥離し、リン酸塗布後１０分間放置し予備はんだを行い、再びリン酸を塗布し１０分間放置した。同時に、マウス用コネクター（Biotex Kyoto製）にも予備はんだを行い、ステンレス線とコネクタをはんだづけした。続いて、筋電図測定用に20mmに切ったステンレス線を２本用意し、脳波電極のときと同様にステンレス線を準備し、コネクタとはんだづけをした。全てのはんだづけが終了後、２液混合のエポキシ樹脂を混合し、真空ポンプで引いて樹脂中の気泡をなくした後、はんだづけの箇所を隠すように塗り固め、常温で１日乾燥させ固着させた。
【００６６】
２）脳波測定用電極の設置手術
マウスに小動物用インフルラン麻酔器（メディカルエイジェント）にて麻酔を施した後、歯科用ドリル（MINITOR製）を用いて、bregmaから1mm前方、1.5mm右側とlambdaから1mm前方、1.5mm右側の２カ所の頭蓋骨に穴を開け、ビスを一巻き半回して埋め込んだ。その後、筋電図測定用のステンレス線２本を頚背側部の皮下に可能な限り左右に離して挿入した。その後コネクタをアロンアルファ（登録商標）により頭蓋骨に仮固定し、歯科用セメント（ジーシー社製）にて完全に固定した。手術後１週間期間を空けてからVital Recorder（KISSEI COMTEC製）を用いて脳波および筋電図を２４時間測定した。
【００６７】
３）脳波解析ソフトを用いての解析
測定した脳波は、脳波解析研究用プログラムSleepSign（KISSEI COMTEC）を用いて解析をおこなった。SleepSignにより、脳波を0.5〜4Hzのδ波、4〜9Hzのθ波、9〜13Hzのα波、13Hz以上のスピンドルの４パターンに分類し、各波長の比率と筋電図の大きさ及びマウスの行動を記録したビデオ画像から、Ｗ（覚醒状態）、Ｒ（レム睡眠状態）、Ｓ（睡眠状態）の３パターンに分類し、ＫＯマウスと野生型の睡眠の傾向を解析した。
その結果、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスは睡眠が分断され長時間の睡眠が野生型に比べて少ないことや、レム睡眠に特徴的に見られるθ波の波形が見られず、レム睡眠の時間が野生型に比べて少ないことが確認された（図７および図９）。また、覚醒状態から短時間睡眠状態に陥り再び覚醒状態に戻るといった状況、覚醒、レム睡眠、ノンレム睡眠の時間および周期性が野生型と異なり、より乱れていることも確認された。よって、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスが睡眠障害を示していることが認められた。
これにより、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスが、レム睡眠の障害を含む睡眠障害のモデル動物として有用であることが示され、ＳＴ３ＧａｌＩＶの阻害剤のin vivo薬効が、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスおよび野生型マウスの睡眠パターンの解析により評価できることが示された。
また、ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの睡眠パターンの解析が、睡眠改善剤、例えば、レム睡眠の改善剤のスクリーニング方法、好ましくは、ＳＴ３ＧａｌＩＶ欠損が惹起する睡眠障害、例えばレム睡眠障害に対する改善剤のスクリーニング方法に有用であることが示された。
【００６８】
実施例４：ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの体長および体重の測定
７日齢のマウスの尾よりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを用いて、ホモ、ヘテロまたは野生型の遺伝子型を確認した。９日齢で同腹子の授乳個体数を６匹に統一し、９日齢から１０週齢まで２日に一度、体重および体長を測定し、成長曲線を作成した。その結果、雄性および雌性ともに、ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスが、野生型、ヘテロ型に比較し、体重および体長の抑制作用が認められ、特に２５−５７日齢で顕著な体重および体長の抑制が認められた（図１０および図１１）。統計学的処理は、Two-way Factorial ANOVAにより行い、p<0.0001を有意差ありとした。
【００６９】
実施例５：ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの血漿中のＧｈ、ＩＧＦ−１濃度の測定
３、４、６および８週齢の成長抑制の著しい雄性ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスおよび雄性野生型マウス（C57BL/6Jマウス）の眼窩静脈より採血し、2500rpm、10分間遠心分離した。得られた血漿における成長ホルモン（Gh）（SPI-BIO A05104-96wells）およびインスリン様成長因子（IGF-1）の濃度を、ELISA（Ｒ＆Ｄsystems Quantikine No.MG100）を用いて測定した。その結果、ホモ型は野生型に比較し、Ｇｈ分泌量は減少傾向を示し、ＩＧＦ−１分泌量は有意に減少した（図１２）。なお、統計学的処理は、Two-way Factorial ANOVAにより行い、p<0.0001を有意差ありとした。
【００７０】
実施例６：ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの生殖能力の検討
（Ｉ）雄性ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの生殖能力の検討
１２週齢の雄性ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスおよび野生型マウスを、１０週齢の雌性野生型マウス（C57BL/6j）とそれぞれ交配させた。その結果、雄性ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスと雄性野生型マウスを用いた場合の両方で、正常な出産が確認された。したがって、雄について、ＳＴＳＧａｌＩＶ欠損による生殖能力への影響は認められなかった。
【００７１】
（ＩＩ）雌性ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの生殖能力の検討
雌性ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの生殖能力を、１）膣垢検査による性周期の観察、２）膣栓の確認による交配の確認、３）腹部拡張の確認による受胎の確認、および４）分娩または胎児の死亡の確認により検討した。
１）膣垢検査による性周期の観察
２６〜３３週齢の雌性ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウス、および野生型マウスにつき、１ヶ月間、膣垢検査を行った。膣垢検査は、常法に従い、膣内を濾紙でスメアし、得られた膣内貯留物を顕微鏡で観察することにより、発情前期、発情期、発情後期、または発情休止期を判別した。そして、発情後期から次の発情後期までに日数を測定した。
その結果、野生型マウスに比較し、ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスは、発情前期、発情期、発情後期、そして発情休止期で構成される性周期が規則的でなく、不順であった（図１３）。また、野生型マウスに比較し、ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの発情後期から次の発情後期までに日数は有意に少なかった（図１３）。なお、統計処理はMann-Whitney U-testを用い、p<0.05で有意とした。したがって、ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスでは、性周期の異常が認められた。
２）膣栓の確認による交配の確認
膣垢検査により性周期を判断し、発情前期とわかった雌を午後７時に野生型の雄と同居させて翌朝７時に膣栓の有無により交配を確認した。その結果、8-12週齢のマウス、および31-38週齢のマウス共に、野生型マウスと比較してホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスは、交配確率が高い傾向が認められたが、有意な差ではなかった。したがって、ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスでは、交配は野生型マウスと同様に正常であった。
【００７２】
３）腹部拡張の確認による受胎の確認
膣栓が確認されたマウスの腹部拡張により受胎を確認した。その結果、8-12週齢のマウス、および31-38週齢のマウス共に、野生型マウスと比較してホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスは、受胎確率が低い傾向が認められたが、有意な差ではなかった（図１４）。したがって、ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスでは、受胎は野生型マウスと同様に正常であった。
４）分娩または胎児の死亡の確認
受胎が確認されたマウスの出産を確認するか、または、出産を確認できなかったマウスは、腹部を切開し、胎児の生死および子宮の状態を確認した（図１５）。その結果、妊娠の確認された野生型のマウス３匹は、正常通り１８−２０日の妊娠期間を経て出産した。一方、ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスは、５匹が妊娠したものの、最終的に分娩に至らず母胎内で死亡した例も認められた。特に高齢（３１−３８週齢）のホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスで妊娠期間の延長が認められ、高齢のホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスのうち１匹は、妊娠２１日目に３匹、妊娠２２日目に１匹、妊娠２３日目に２匹、妊娠２５日目に２匹を死産し、妊娠２７日目に解剖したときには、子宮にて２匹の胎仔が死亡していた。また、高齢のホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスのうちもう１匹は、妊娠２１日目に４匹を出産し（生存、ただし翌日１匹死亡）、妊娠２２日目に２匹を死産（胎盤がついたまま分娩された）した。このような妊娠期間の延長の原因の１つには、分娩の異常、例えば、生体リズムとしての分娩リズムの異常があるものと考えられた。結果を表１に記載する。
【００７３】
【表２】
2009201501.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明のＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウス作成のために構築されたターゲッティングベクターを示す。ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスを作成するために、ゲノムフラグメントをC57BL/6Jライブラリー（pBACe3.6中のBACライブラリー）から単離した。図１に表されるようにターゲッティングベクターを構築した。リニアライズしたターゲッティングベクターをMS12胎生幹細胞にエレクトロポレーションによって導入し、G418抵抗性のES細胞を得た。キメラマウスをターゲッティングベクターが導入されたES細胞（Targeted）から作成した。ＣＡＧ−プロモーター−Ｃｒｅプラスミドをターゲッティングベクターが導入されたマウス精子由来の受精卵に導入し、ＳＴ３ＧａｌＩＶ欠損マウスを得た。
【図２】サザンブロットハイブリダーゼーションの結果を示す。w/wは野生型、w/targetedはターゲッティングベクターをヘテロに有するマウス、w/floxedはターゲッティングベクターからneo遺伝子を除いた遺伝子をヘテロに有するマウス、w/-はヘテロ接合型ＳＴ３ＧａｌＩＶ欠損マウス、-/-はホモ接合型ＳＴ３ＧａｌＩＶ欠損マウスを表す。
【図３】帯状回および海馬の組織化学的検討結果を示す。帯状回の紡錘状層で、顆粒細胞の代わりに多くの萎縮した細胞が存在する（矢印）。ＳＴ３ＧａｌＩＶ欠損マウス（+/-および-/-）の歯状回多型細胞層でGFAP陽性アストロサイトの増殖が認められた。
【図４】オープンフィールド試験の装置、実験スケジュールを示す。
【図５】ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスのオープンフィールド試験の結果を示す。ＳＴ３ＧａｌＩＶ欠損マウス（+/-および-/-）は、野生型（+/+）より四隅に移動する傾向が認められ、ストレスに対し強い感受性を示した。
【図６】ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの恐怖条件付け試験の結果を示す。
【図７】ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの脳波解析等により得られた睡眠パターンを示す。各カラムは上から睡眠（薄い褐色（＄で示す褐色））、レム睡眠（濃い褐色（＃で示す褐色））、覚醒（黒色）を表す。ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスは、野生型マウスよりレム睡眠（＃）の時間が短いことが示された。
【図８】ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの筋電図解析の一例を示す。Ｒはレム睡眠状態を、Ｗは覚醒状態を、Ｓは睡眠状態を表す。
【図９】ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスと野生型マウスのレム睡眠時間の比較を示す。
【図１０】雌性ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウス、雌性ヘテロ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウス、および雌性野生型マウスの体重および体長の変化を示す。
【図１１】雄性ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウス、雄性ヘテロ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウス、および雄性野生型マウスの体重および体長の変化を示す。
【図１２】ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスと野生型マウスの血漿Ｇｈ濃度およびIGF-1濃度の比較を示す。
【図１３】野生型マウスと雌性ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの発情後期から次の発情後期までの日数をそれぞれ示す（左図）。野生型マウスと雌性ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの発情前期（図中「前」）、発情期（図中「中」）、発情後期（図中「後」）、発情休止期（図中「休」）への移行をそれぞれ示す（右図）。
【図１４】8-12週齢の野生型マウスおよび雌性ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの受胎確率をそれぞれ示す（左図）。31-38週齢の野生型マウスおよび雌性ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの受胎確率をそれぞれ示す（右図）。
【図１５】雌性ホモ型ＳＴ３ＧａｌＩＶノックアウトマウスの腹部より取り出した死産仔（左写真）および子宮（右写真)、さらに、野生型マウスの子宮（中写真）を示す
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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