(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より１７４塩基対上流に存在する塩基（Ｇ／Ｃ）、同５９６塩基対上流に存在する塩基（Ｇ／Ａ）、同５７２塩基対上流に存在する塩基（Ｇ／Ｃ）、ＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基（Ｇ／Ａ）、同２３８塩基対上流に存在する塩基（Ｇ／Ａ）、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より５１１塩基対上流に存在する塩基（Ｃ／Ｔ）、同３１塩基対上流に存在する塩基（Ｃ／Ｔ）の７種の一塩基多型を同時検出する手段を提供する。【解決手段】上記に示す７種の一塩基多型を含む核酸領域を一度の操作で同時増幅するための、特定の塩基配列からなる核酸増幅用プライマーのセット及び上記に示す７種の一塩基多型において同時に一塩基伸長反応を行うための、特定の塩基配列からなる一塩基伸長用プライマーのセット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より１７４塩基対上流に存在する一塩基多型、（２）ヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より５９６塩基対上流に存在する一塩基多型、（３）ヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より５７２塩基対上流に存在する一塩基多型、（４）ヒトＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より３０８塩基対上流に存在する一塩基多型、（５）ヒトＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より２３８塩基対上流に存在する一塩基多型、（６）ヒトＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より５１１塩基対上流に存在する一塩基多型、及び（７）ヒトＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より３１塩基対上流に存在する一塩基多型の検出方法であって、
配列番号１〜１０に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーを用いて、標的核酸中の（１）〜（７）の一塩基多型を含む領域を同時に増幅してＤＮＡ産物を得る第１の工程、
第１の工程で得られたＤＮＡ産物を鋳型として、配列番号１１〜１７に示す塩基配列からなる一塩基伸長用プライマーとハイブリダイズさせて複合体を形成し、該複合体の７種の一塩基伸長用プライマーに標識ヌクレオチドを同時に付加する一塩基伸長反応を行うことにより標識産物を得る第２の工程、
を含む一塩基多型の検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の一塩基多型の検出方法において用いられる、配列番号１〜１０に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーのセット。
【請求項３】
請求項１に記載の一塩基多型の検出方法において用いられる、配列番号１１〜１７に示す塩基配列からなる一塩基伸長用プライマーのセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一塩基多型の検出方法、並びにこの方法で用いられる核酸増幅用プライマーのセット及び一塩基伸長用プライマーのセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子多型はある個人の特性全体を表すのみならず、様々な疾患や病態の原因や臨床経過に関わるという点で注目を集めている。一塩基多型（SNP）は、ヒトには１４２０万以上も認められている遺伝子多型であり、その中には疾患や病態の重症化予測因子として有用であるものがあると考えられている。また近年、一塩基多型を用いて、ある遺伝子の連鎖不均衡のブロック様構造が判明したり、ある一塩基多型と近傍の一塩基多型が連鎖関係をもつことでハプロタイプの多様性が限定されるということが明らかになった。すなわちある個人の多数の一塩基多型を同時に検出することで、その個人の遺伝的背景が判明するようになってきた。
【０００３】
以下に示すＩＬ−６（−１７４）、ＩＬ−６（−５９６）、ＩＬ−６（−５７２）、ＴＮＦ−α（−３０８）、ＴＮＦ−α（−２３８）、ＩＬ−１β（−５１１）、ＩＬ−１β（−３１）の７種の一塩基多型は、敗血症の重症化との関連性が示唆されており、集中治療領域においては、患者におけるこれらの一塩基多型を事前に検出して治療前診断に反映させるなど、これらの一塩基多型を解析することは非常に有用であると考えられている。
【０００４】
ＩＬ−６（−１７４）はヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より１７４塩基対上流に存在する塩基（Ｇ／Ｃ）である。この変異型はＩＬ−６の産生性が高いといわれており、これが敗血症の転帰に関連するという報告がある。
【０００５】
ＩＬ−６（−５９６）はヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より５９６塩基対上流に存在する塩基（Ｇ／Ａ)、ＩＬ−６（−５７２）はヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基(Ｇ／Ｃ)である。これら一塩基多型は、敗血症の重症化に何らかの関連性があると考えられている。
【０００６】
ＴＮＦ−α（−３０８）はヒトＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基（Ｇ／Ａ）である。この変異型は敗血症の易罹患性が高く、また死亡率もより高いと報告されている。
【０００７】
ＴＮＦ−α（−２３８）はヒトＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より２３８塩基対上流に存在する塩基（Ｇ／Ａ)、ＩＬ−１β（−５１１）はヒトＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より５１１塩基対上流に存在する塩基（Ｃ／Ｔ）、ＩＬ−１β（−３１）はヒトＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より３１塩基対上流に存在する塩基（Ｃ／Ｔ）である。これら一塩基多型は、敗血症患者の重症化に何らかの影響を与えていると考えられている。
【０００８】
敗血症に対する生体の反応は、上記の一塩基多型の１種又は一部を検討しただけでは臨床的には不十分であり、上記の一塩基多型の全てを検出することが必要であると考えられている。
【０００９】
一塩基多型の解析を行うために、様々な種類の解析方法が考案されてきた。これらには、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（非特許文献１参照）、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ法（非特許文献２参照）、一塩基伸長法等の解析方法がある。これらの解析方法は、単一の一塩基多型を複数の患者において解析する際には有用であるが、ある個人における複数の一塩基多型を解析するためには、目的の一塩基多型それぞれについて一連の煩雑な操作を繰り返して行う必要があるため、検出に要する時間が長くなるといった問題を抱えている。よって、緊急性を求められる集中治療領域においては、殆ど取り入れられていない。臨床応用を踏まえてリアルタイムでこのような一塩基多型解析を行うためには、多種の一塩基多型を迅速かつ簡便に検出可能な一塩基多型解析方法の考案が必要である。
【非特許文献１】Hayashi K: PCR-SSCP: ''a simple and sensitive method for detection of mutations in the genomic DNA.'' 「PCR Methods Appl」 1991, 1:34-38
【非特許文献２】Germer S, Holland MJ, Higuchi R: ''High-throughput SNP allele-frequency determination in pooled DNA samples by kinetic PCR.'' 「Genome Res」 2000, 10:258-266
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ＩＬ−６（−１７４）、ＩＬ−６（−５９６）、ＩＬ−６（−５７２）、ＴＮＦ−α（−３０８）、ＴＮＦ−α（−２３８）、ＩＬ−１β（−５１１）、ＩＬ−１β（−３１）の７種の一塩基多型の検出において、迅速かつ簡便な検出手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、（１）ヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より１７４塩基対上流に存在する一塩基多型、（２）ヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より５９６塩基対上流に存在する一塩基多型、（３）ヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より５７２塩基対上流に存在する一塩基多型、（４）ヒトＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より３０８塩基対上流に存在する一塩基多型、（５）ヒトＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より２３８塩基対上流に存在する一塩基多型、（６）ヒトＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より５１１塩基対上流に存在する一塩基多型及び（７）ヒトＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より３１塩基対上流に存在する一塩基多型、の（１）〜（７）の一塩基多型を検出する方法であって、
配列番号１〜１０に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーを用いて、標的核酸中の（１）〜（７）の７種の一塩基多型を含む領域を同時に増幅してＤＮＡ産物を得る第１の工程、
第１の工程で得られたＤＮＡ産物を鋳型として、配列番号１１〜１７に示す塩基配列からなる一塩基伸長用プライマーとハイブリダイズさせて複合体を形成し、該複合体の７種の一塩基伸長用プライマーに標識ヌクレオチドを同時に付加する一塩基伸長反応を行うことにより標識産物を得る第２の工程を含む、
一塩基多型の検出方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、本発明の一塩基多型の検出方法において用いられる、７種の該一塩基多型を含む核酸領域を同時に増幅するための、配列番号１〜１０に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーのセットを提供する。
【００１３】
また、本発明は、本発明の一塩基多型の検出方法において用いられる、７種の該一塩基多型を同時に一塩基伸長するための、配列番号１１〜１７に示す塩基配列からなる一塩基伸長用プライマーのセットを提供する。
【００１４】
本明細書において、（１）ヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より１７４塩基対上流に存在する一塩基多型を「ＩＬ−６（−１７４）」と、（２）ヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より５９６塩基対上流に存在する一塩基多型を「ＩＬ−６（−５９６）」と、（３）ヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より５７２塩基対上流に存在する一塩基多型を「ＩＬ−６（−５７２）」と、（４）ヒトＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より３０８塩基対上流に存在する一塩基多型を「ＴＮＦ−α（−３０８）」と、（５）ヒトＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より２３８塩基対上流に存在する一塩基多型を「ＴＮＦ−α（−２３８）」と、（６）ヒトＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より５１１塩基対上流に存在する一塩基多型を「ＩＬ−１β（−５１１）」と、（７）ヒトＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より３１塩基対上流に存在する一塩基多型を「ＩＬ−１β（−３１）」と、それぞれ表記することがある。
【００１５】
ここで、それぞれカッコ内の数字は、転写開始点である開始コドンの最初の塩基を１としたときのゲノムＤＮＡ上の塩基位置を示す。各遺伝子におけるこれらの塩基位置は、公共のデータベースである「ＧｅｎＢａｎｋ」に登録されている公知の配列を基準として表される。具体的には、ＩＬ−６遺伝子は、アクセッション番号：ＮＭ０００６００、ＴＮＦ−α遺伝子はアクセッション番号：ＡＢ０４８８１８、ＩＬ−１β遺伝子はアクセッション番号：ＮＭ０００５７６として、それぞれ「ＧｅｎＢａｎｋ」に登録されている。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、上記（１）〜（７）の７種の一塩基多型を、迅速かつ簡便に検出することが可能となる。また、本発明により、上記の７種の一塩基多型を、高精度に検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、（１）ヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より１７４塩基対上流に存在する一塩基多型、（２）ヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より５９６塩基対上流に存在する一塩基多型、（３）ヒトＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より５７２塩基対上流に存在する一塩基多型、（４）ヒトＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より−３０８塩基対上流に存在する一塩基多型、（５）ヒトＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より２３８塩基対上流に存在する一塩基多型、（６）ヒトＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に存在する、転写開始点より５１１塩基対上流に存在する一塩基多型、（７）ヒトＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に存在する、プロモーター領域の転写開始点より３１塩基対上流に存在する一塩基多型、の７種の一塩基多型を一度に同時検出する方法である。これらの一塩基多型は、集中治療の対象となる患者におけるＩＬ−６血中濃度の異常高値に関連するものである。本発明の検出方法における第１の工程、及び第２の工程の概略を図１の模式図に示す。
【００１８】
第１の工程は、（１）〜（７）の一塩基多型を含む核酸領域を増幅するプライマーのセットを用いて、標的核酸中の該一塩基多型を含む領域を一度に同時増幅してＤＮＡ産物を得る工程である。ここでは、配列番号１〜１０に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーのセットを使用する。
【００１９】
本発明の第１の工程について具体的に説明する。
【００２０】
第１の工程は、標的核酸中の該一塩基多型を含む領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；polymerase chain reaction）による核酸増幅法により増幅する工程である。増幅用プライマーとして配列番号１〜１０に示す塩基配列からなる増幅用プライマーのセットを用い、患者血液から得られた標的核酸を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ＩＬ−６（−１７４）、ＩＬ−６（−５９６）、ＩＬ−６（−５７２）、ＴＮＦ−α（−３０８）、ＴＮＦ−α（−２３８）、ＩＬ−１β（−５１１）、ＩＬ−１β（−３１）を含む核酸領域を、一度に同時増幅することが可能となる。
【００２１】
ここで用いる核酸増幅用プライマーとして、配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーはＩＬ−６（−１７４）を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーはＩＬ−６（−１７４）を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーはＩＬ−６（−５９６）及びＩＬ−６（−５７２）を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーはＩＬ−６（−５９６）及びＩＬ−６（−５７２）を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーはＴＮＦ−α（−３０８）及びＴＮＦ−α（−２３８）を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーはＴＮＦ−α（−３０８）及びＴＮＦ−α（−２３８）を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーはＩＬ−１β（−５１１）を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーはＩＬ−１β（−５１１）を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーはＩＬ−１β（−３１）を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーはＩＬ−１β（−３１）を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。
【００２２】
配列番号１〜１０に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーは、一般に知られているポリヌクレオチドの合成法を適用することで得ることが可能である。
【００２３】
第１の工程で行うＰＣＲ反応の条件は、一般に行われるＰＣＲ反応の条件で良く、例えば、次のような反応条件を用いることが可能である。
最初の熱変性（９４℃・２分）×１サイクル、（変性９４℃・３０秒、アニーリング５９℃・３０秒、伸長反応６８℃・１分）×３５サイクル。
【００２４】
第２の工程は、第１の工程で得られたＤＮＡ産物を鋳型として、一塩基伸長用プライマーとハイブリダイズさせて複合体を形成し、該複合体の７種の一塩基伸長用プライマーに一塩基多型の塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを同時に付加する一塩基伸長反応を行うことにより標識産物を得る工程である。ここでは、配列番号１１〜１７に示す塩基配列からなる一塩基伸長用プライマーのセットを使用する。
【００２５】
本発明の一塩基多型の検出方法の第２の工程について具体的に説明する。
【００２６】
本発明の一塩基多型の検出方法の第２の工程において用いる一塩基伸長用プライマーは、標的核酸中の特定位置の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列である伸長プライマー配列部分と、標的核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列部分とからなる。図２に、一塩基伸長用プライマーを説明するための模式図を示す。例えば、ＩＬ−６（−１７４）においては、特定位置の塩基がＧまたはＣであるため、これに相補的な標識ヌクレオチド、例えば標識ｄｄＣＴＰまたは標識ｄｄＧＴＰが取り込まれたことにより得られる標識シグナルを判別することにより、特定位置の塩基配列を検出することが可能となる。
【００２７】
第２の工程において、一塩基伸長用プライマーとして配列番号１１〜１７に示す塩基配列からなる一塩基伸長用プライマーのセットを用い、第１の工程で得られたＤＮＡ産物を鋳型として一塩基伸長反応を行うことにより、ＩＬ−６（−１７４）、ＩＬ−６（−５９６）、ＩＬ−６（−５７２）、ＴＮＦ−α（−３０８）、ＴＮＦ−α（−２３８）、ＩＬ−１β（−５１１）、ＩＬ−１β（−３１）の塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを取り込んだ標識産物を得ることが出来る。
【００２８】
配列番号１１〜１７に示す塩基配列からなる一塩基伸長用プライマーは、一般に行われるポリヌクレオチドの合成法を適用することで得ることが可能である。
【００２９】
第２の工程で用いる一塩基伸長反応条件は、一般に行われる一塩基伸長反応の条件で良く、例えば、次のような反応条件を用いることが可能である。
最初の熱変性（９５℃・２分）×１サイクル、（変性９５℃・１５秒、一塩基伸長反応６０℃・３０秒）×３０サイクル。
【００３０】
第２の工程において付加する標識ヌクレオチドとしては、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）、即ちｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ若しくはｄｄＵＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、又は、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、即ちｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ若しくはｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを用いることができる。ジデオキシヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドのデオキシリボースの３’位の水酸基が水素基になっている物質で、ｄＮＴＰの代わりにｄｄＮＴＰが取り込まれるとそれ以上相補鎖が合成されなくなり、特異的なターミネーターの役割を果たす。
【００３１】
標的核酸中の特定位置の塩基配列を検出する場合には、図３に一例を示すように、４種類のｄｄＮＴＰを用い、これらのうち少なくとも１種類には識別可能な標識を付加したｄｄＮＴＰを用いる。一塩基伸長用プライマーから一塩基伸長反応が進行し、特定位置の塩基に相補的なｄｄＮＴＰが取り込まれて塩基伸長反応は一塩基で停止する。この際に取り込まれたｄｄＮＴＰの塩基の種類を、標識の存在の有無を確認して特定することにより、標的核酸中の該特定位置の塩基配列を決定することができる。一塩基伸長反応時に、相互に識別可能な複数の標識をそれぞれｄｄＮＴＰに付加してあれば、取り込まれたそれぞれの標識の存在を測定することにより、１種類から４種類の同時塩基配列分析も可能である。
【００３２】
第２の工程で用いるｄｄＮＴＰ又はｄＮＴＰに付加する識別可能な標識としては、公知の標識物が使用可能である。
【００３３】
識別可能な標識物としては、例えば、酵素、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質又は発光団などの標識物が挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５などのシアニン系蛍光色素のほか、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｒ６Ｇ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テキサスレッド等の蛍光物質が挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、３２Ｐ、３５Ｓなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。これらの中でも、酵素への取り込み効率を標識間で一定にするために、シアニン系蛍光色素や半導体微粒子を用いることが好ましい。
【００３４】
シアニン系蛍光色素としては、異なる励起、蛍光波長をもつＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などが市販されている（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））。Ｃｙ２は一般式１において、Ｘ＝Ｏ、ｎ＝１で表され、Ｃｙ３は一般式１において、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ３）２、ｎ＝１で表され、Ｃｙ５は一般式１において、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ３）２、ｎ＝２で表され、Ｃｙ７は一般式１において、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ３）２、ｎ＝３で表され、Ｃｙ３．５は一般式２おいて、ｎ＝１で表され、Ｃｙ５．５は一般式２おいて、ｎ＝２で表され、Ｃｙ３Ｂは一般式３で表される化学構造を有している。ここで、一般式１〜３においてＲおよびＲ’はヌクレオチドと結合する際に適宜選択されて用いられる官能基である。シアニン蛍光色素は、酵素の取り込み効率のばらつきを抑えることができることから好ましく用いることができる。本発明の一塩基多型の検出方法においては、励起、蛍光波長や蛍光シグナルの減衰を考慮すると、特にＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５を用いることが好適である。
【００３５】
【化１】
2009142175.tif 000002
【００３６】
【化２】
2009142175.tif 000003
【００３７】
【化３】
2009142175.tif 000004
【００３８】
半導体微粒子とは、III−V族原子やII−IV族原子から構成される半導体であって、量子ドットとも呼ばれる。量子サイズによって光学特性が変わることが知られており、多色蛍光標識物として用いられている。例えばＺｎＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＩｎＡｓ、ＩｎＰ、ＰｂＳ、Ｓｉ等が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＣｄＳｅは、結晶径を変えるだけで青から赤まで任意の可視光の波長を作り出すことができるので、好ましく用いられる。また、ＺｎＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＩｎＡｓ、ＩｎＰ、ＰｂＳ、Ｓｉ等は、ＺｎＳ、ＣｄＳによりコーティングすると蛍光消光が抑えられることから好ましい。
【００３９】
上記の標識物は、プライマーの一塩基伸長反応に影響を与えることがなければ、ｄｄＮＴＰ又はｄＮＴＰのどの位置に結合させてもよい。例えば、アデニン、グアニンの場合はプリン骨格の７位または８位、シトシンはピリミジン骨格の５位または６位、チミンはピリミジン骨格の６位、ウラシルのピリミジン骨格の５位または６位に結合させることができる。標識物の結合方法としては特に制限はなく、例えばＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）の「ＣｙＤｙｅカタログ」（２２頁）に記載されているような一般的な方法で標識体を結合することができる。また、市販されているＣｙ３標識ｄｄＮＴＰ、Ｃｙ５標識ｄｄＮＴＰ（（株）パーキンエルマージャパン）、Ｃｙ３標識ｄＮＴＰ、Ｃｙ５標識ｄＮＴＰ（（株）パーキンエルマージャパン）など、入手可能又は既知の標識物が結合されているｄｄＮＴＰ又はｄＮＴＰを用いることも出来る。
【００４０】
一塩基伸長反応にはポリメラーゼを用いるが、好ましくは耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いる。耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、温度サイクルで変性、アニール、塩基伸長の工程を複数回繰り返すことによって、取り込み効率の向上を図ることができる。より好ましくは、ジデオキシヌクレオチドの取り込み効率の高いことから、Thermo Sequenase DNA Polymerase（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））またはSequenase Version 2.0 T7 DNA Polymerase（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））が用いられる。
【００４１】
一塩基伸長反応後の標識産物を検出する方法として様々な方法が可能であるが、以下のような支持体による検出法を用いることが可能である。
【００４２】
この検出法は、第２の工程で得られた該標識産物中に含まれる一塩基伸長用プライマーにおけるタグ配列部分と選択的な結合が可能な核酸配列を有するタグ捕捉プローブを用いることにより実施できる。図４に一例を示すように、支持体上に固定化したタグ捕捉プローブと特異的に結合する塩基配列を有するタグ配列部分を用いて、一塩基伸長反応用プライマーをタグ配列を介して特異的に支持体上に捕捉する。このタグ捕捉プローブは、支持体に固定化し、バイオチップとして用いることが可能である。
【００４３】
ここで、バイオチップとは、生物の遺伝情報を解析するツールの総称であり、マイクロウェル、マイクロアレイ、ＤＮＡチップ等があるがこれに限らない。
【００４４】
本発明において用いることができるバイオチップとしては、特に構造に限定はないが、ノイズが低減し、ハイブリダイゼーション効率をあげる効果があることから、例えば、図５に示すようなカバーと支持体を有し、図６に示すような固定化領域に微細な凹凸構造を有する支持体を用いて、該凹凸構造の凸部上面にタグ捕捉プローブを固定化したバイオチップが好ましい。
【００４５】
バイオチップの支持体の材質としては特に制限はないが、例えば、金、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコンゴム、ゲルなどのポリマー、ビーズ、繊維、中空糸などを挙げることができる。好ましくは、成形が容易な合成ポリマーであり、ＰＭＭＡが、図６に示す微細な凹凸構造と組み合わせて好適に用いられる。
【００４６】
支持体の成形としては、ポリマー製の場合、射出成形法、ホットエンボス法などの方法、ガラスやセラミックの場合、サンドブラスト法などの方法を用いることができる。また、シリコンの場合は、半導体プロセスで使用される公知の方法が挙げられる。
【００４７】
支持体の凸部の上面への捕捉プローブの固定化は、支持体がポリマー製である場合、凸部上面を化学処理し、捕捉プローブと結合可能な官能基、例えばアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などを生成させ、これとプローブＤＮＡとを化学結合させることによって行うことができる。例えば支持体がＰＭＭＡ製である場合は、図７に例示するように、アルカリ性溶液及び／又は酸性溶液によって表面処理することにより支持体表面にカルボキシ基を生成させ、図８に例示するように、３’末端をアミノ化した捕捉プローブをこれと化学反応により縮合させることにより、固定化することができる。また、このような官能基の導入は、例えば該表面をプラズマ処理又は放射線処理（例えばγ線、電子線など）するか、これらの処理の後でさらにグラフト重合処理することによって極性基を導入したり、或いは、ポリカチオン（例えばポリーＬ−リシン、シランカップリング剤など）をコートしたりすることによって行うことができる。
【００４８】
本発明において用いることができるバイオチップにおいては、支持体とカバーの間の凹部にはビーズ６を含むことができる（図６）。ビーズ６が存在することによって、液の効率よい攪拌が可能となり、その結果、反応促進効果がもたらされる。ビーズのサイズは、支持体の凹部に複数個のビーズが自由に動きうるようなサイズであれば該凹部の形状に合わせて適宜選択できるが、例えば直径数十〜数百μｍである。ビーズの材質は特に限定されず、例えば、ガラス、セラミック（例えばイットリア安定化ジルコニア）、ステンレス等の金属、ナイロンやポリスチレンなどのポリマーなどが挙げられる。これらの中でも、化学的に安定であり比重も大きいことからセラミックのビーズが好ましい。
【００４９】
本発明のにおいて用いることができる上記バイオチップは、通常、固定化領域（スポット）毎に捕捉プローブをそれぞれ一種類ずつ固定化して作製することができる。
【００５０】
本発明において用いるバイオチップ上で、捕捉プローブと一標識を付加された一塩基伸長用プライマーとをハイブリダイゼーションし、余剰物を洗浄することにより、標識産物をバイオチップ上に特異的に捕捉することができる。この場合のハイブリダイゼーションは、一般にはストリンジェントな条件下で行われる。そのような条件は、限定されないが、例えば３０〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液による洗浄を含むことができる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む溶液（ｐＨ７．２）である。
【００５１】
上記方法で捕捉した標識産物中に含まれる標識の存在又はシグナル強度を測定することにより、標識の存在又はシグナル強度を指標として特定位置の塩基配列を解析することが出来る。
【００５２】
分析したい標的核酸中の特定位置の塩基配列が一塩基である場合には、ｄｄＮＴＰの塩基の種類を、標識の存在の有無を確認して特定することにより、標的核酸中の該特定位置の塩基配列を分析することができる。つまり、特定位置の塩基に相補的なｄｄＮＴＰの標識の存在、即ち相補的なｄｄＮＴＰの標識シグナルが測定されれば、該特定位置に該塩基が存在すると判断することができる。
【００５３】
標的核酸の試料には、血液、尿、唾液等の体液が含まれるが、体液以外の任意の試料を使用し得る。試料が固体であれば、酵素処理、界面活性剤又は有機溶媒の添加等の適切な方法で液体に溶解させればよい。
【００５４】
上記の他にも、本発明の方法を適用する標的核酸の試料は、随意に変更することができる。例えば、細胞を株化して大量培養したり、末梢血を多めに取得したりすることで本方法に必要なヒトゲノムＤＮＡを大量に調製することにより、直接ゲノムＤＮＡ試料とすることができる。また、少量のゲノムＤＮＡを取得し、例えばＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）の試薬キットＧenomiPhiのようなWＧＡ法（Whole Ｇenome ＡmplifiＣＡＴion ）で、非特異的にゲノムＤＮＡを増幅した試料を用いてもよい。また、ＰＣＲ法や、マルチプレックスＰＣＲ法、アシンメトリックＰＣＲ法のようなプライマーを用いて特定の塩基配列を増幅したものを試料としてもよい。特に、ゲノムＤＮＡなどを用いる場合は、予め分析したい特定位置の塩基配列を含む領域をＰＣＲなどで増幅しておいてもよい。例えば、酵素的に増幅する方法により得られた二本鎖試料の場合は、９５℃まで加熱してから４℃に急冷して１本鎖化したり、塩濃度のきわめて低い溶液中で９５℃まで加熱し断片化したり、超音波で断片化したり、制限酵素で切断したりして、１本鎖化及び／又は断片化操作を加えたものを試料としてもよい。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例によって本発明について更に具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されないものとする。
【００５６】
以下の実施例、比較例に用いた該一塩基多型の存在する遺伝子領域を増幅する増幅用プライマー、および該一塩基多型を検出するための一塩基伸長用プライマーは、オペロンバイオテクノロジー株式会社に依頼し合成した。
【００５７】
（実施例１）
ＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より１７４塩基上流に存在する塩基（Ｇ／Ｃ）、ＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より５９６塩基対上流に存在する塩基(Ｇ／Ａ)、ＩＬ−６遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基(Ｇ／Ｃ)と、ＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基（Ｇ／Ａ）と、ＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より２３８塩基対上流に存在する塩基(Ｇ／Ａ)、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より５１１塩基対上流に存在する塩基（Ｃ／Ｔ）と、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に存在する一塩基多型で、転写開始点より３１塩基対上流に存在する塩基（Ｃ／Ｔ）を、同時に分析した。
【００５８】
分析は、以下の手順（１）〜（８）に沿って行った。
【００５９】
手順（１）オリゴヌクレオチドの準備
ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より１７４塩基対上流に存在する塩基（Ｇ／Ｃ）を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、また配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００６０】
ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５９６塩基対上流に存在する塩基(Ｇ／Ａ)と同５７２塩基対上流に存在する塩基(Ｇ／Ｃ)との両方を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、また配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００６１】
ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基（Ｇ／Ａ）と同２３８塩基対上流に存在する塩基(Ｇ／Ａ)との両方を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、また配列番号6に示す塩基配列らなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００６２】
ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より５１１塩基対上流に存在する塩基（Ｃ／Ｔ）を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、また配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００６３】
ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より３１塩基対上流に存在する塩基（Ｃ／Ｔ）を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、また配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００６４】
ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より１７４塩基対上流に存在する塩基を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００６５】
ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５９６塩基対上流に存在する塩基を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして、配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００６６】
ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００６７】
ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００６８】
ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より２３８塩基対上流に存在する塩基を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００６９】
ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より５１１塩基対上流に存在する塩基を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００７０】
ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より３１塩基対上流に存在する塩基を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００７１】
ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号１８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００７２】
ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号１９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００７３】
手順（２）タグ補足プローブ固定化用支持体の作製
タグ補足プローブを固定化する支持体を以下のようにして作製した。公知の方法であるＬＩＧＡ（LiThoGrAphie GAlvAnoformunG AbformunG）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するＰＭＭＡ製のタグ捕捉プローブ固定化用の支持体を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させており、支持体は黒色である。この黒色支持体の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、支持体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００７４】
支持体（図５及び図６の符号１）の形状は、大きさが縦７５ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、支持体の中央部分を除き表面は平坦であった。支持体の中央に、縦１０．０ｍｍ、横１２．５ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．１５ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの凸部を２５６（１６×１６）箇所設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ（２５６箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、２５６個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ３μｍ以下であった。さらに、凹凸部凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．５６ｍｍであった。
【００７５】
手順（３）タグ捕捉プローブの固定化
手順（２）で得たＰＭＭＡ支持体を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、支持体表面にカルボキシル基を生成した。この反応スキームを図７に示す。
【００７６】
タグ捕捉プローブ（２２塩基、３’末端アミノ化）を、それぞれ純水に０．３ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。支持体に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、支持体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍＧ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をアレイヤー（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ  Ｓｔａｍｐ―ＩＩ）で支持体凸部上面の全てにスポットした。次いで、支持体を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。この反応スキームを図７に示す。
【００７７】
手順（４）カバーの作製、及び装着、ビーズの充填
射出成型法により貫通孔（図５及び図６の符号）を４つ有するカバー（図５及び図６の符号；外周部にオーバーハング構造有り）を作製した。手順（３）で得られたタグ捕捉プローブ（図５及び図６の符号５）を固定化した支持体にＰＤＭＳを塗布し（図５及び図６の符号）、その上に作製したカバー２を装着して４２℃で２時間硬化させ、タグ捕捉プローブを固定化したバイオチップを作製した（図５）。このバイオチップに、カバーの貫通孔４から直径１８０μｍのジルコニアビーズ（図５の符号６；東レ（株）製）を２０ｍｇ装填した（図６）。
【００７８】
手順（５）特定すべき一塩基多型を含む領域のＰＣＲによる増幅
核酸抽出キット「ＱＩＡｍｐ」（キアゲン）により患者血液（検体番号１）より抽出したヒトゲノムＤＮＡ試料から、配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてＩＬ−６遺伝子の転写開始点より１７４塩基対上流に存在する塩基を含む領域を、配列番号３及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５９６塩基対上流に存在する塩基及び同５７２塩基対上流に存在する塩基を含む領域を、配列番号５及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基及び同２３８塩基対上流に存在する塩基を含む領域を、配列番号７及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より５１１塩基対上流に存在する塩基を含む領域を、配列番号９及び配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より３１塩基対上流に存在する塩基をＰＣＲで同時に増幅した。
【００７９】
これらのＤＮＡ試料は、通常の塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により、目的とする領域が各々増幅されていることが確認できた。また、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より１７４塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５９６塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基はＣ／Ｇ、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より２３８塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ａ、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より−５１１番目に存在する塩基はＣ／Ｔ、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より−３１番目に存在する塩基はＣ／Ｔであることを確認した。
【００８０】
ＰＣＲにはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績）を用い、メーカー指定の条件で３５サイクルの増幅反応を実施した。もっとも、このＰＣＲは単に標的核酸中の特定領域を増幅することが目的であるため、ＰＣＲの方法や酵素の種類に特段の制限はない。その後、ＧＦＸ PＣR ＤＮＡ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））により精製し、余剰のｄＮＴＰｓを除いた。
【００８１】
ここで、ＰＣＲには、常法に従い、３ｎＭプライマーミックス（配列番号１〜１０）  ５μｌ、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−  ５μｌ、２ｍＭｄＮＴＰｓ  ５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ３μｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １ｕｎｉｔｓ、抽出ＤＮＡ溶液  １００ｎｇを、純粋で５０μｌにメスアップしたものを用いた。また、ＰＣＲは、９４℃・２分、９４℃・３０秒／５９℃・３０秒／６８℃・１分を３５サイクル行い、反応後は４℃で保存した。
【００８２】
手順（６）特異的なｄｄＮＴＰの取り込み反応
ＰＣＲ産物を一塩基伸長反応の鋳型とし、配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてＩＬ−６遺伝子の転写開始点より１７４塩基対上流に存在する塩基を、配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５９６塩基対上流に存在する塩基を、配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基を、配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基を、配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より２３８塩基対上流に存在する塩基を、配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より５１１塩基対上流に存在する塩基を、配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より３１塩基対上流に存在する塩基を、標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして一塩基伸長反応を行った。
【００８３】
手順（５）で得られたＰＣＲ産物に、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、Ｃｙ３またはＣｙ５で標識されたｄｄＮＴＰ（Ｃｙ３−ｄｄＮＴＰまたはＣｙ５−ｄｄＮＴＰ）、非標識ｄｄＮＴＰ、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを加え、ｄｄＮＴＰの取り込みを行った。検出したい塩基種がＧまたはＡである場合、Ｃｙ５−ｄｄＵＴＰ、Ｃｙ３−ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰを、検出したい塩基種がＧまたはＣである場合、Ｃｙ５−ｄｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＡＴＰを、検出したい塩基種がＣまたはＴである場合、Ｃｙ３−ｄｄＧＴＰ、Ｃｙ５−ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰを使用した。
【００８４】
また、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにはサンガー法に広く使用されている改変型Ｔ７  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を使用した。
【００８５】
ここで、ｄｄＮＴＰｓ取り込み反応には、Ｇ／Ａ判別系である場合は、０．３μＭ  ＩＬ−６−５９６一塩基伸長用プライマー（配列番号１２）、ＴＮＦα−２３８一塩基伸長用プライマー（配列番号１５）の混合溶液  １μｌ、ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ  ２μｌ、ＰＣＲ産物（カラム精製後）６００ｎｇ、１０μＭ Ｃｙ５−ｄｄＵＴＰ  １μｌ、１０μＭＣｙ３−ｄｄＣＴＰ  １μｌ、１０μＭ ｄｄＧＴＰ  １μｌ、１０μＭ ｄｄＡＴＰ  １μｌ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １．０  ｕｎｉｔを、純粋で２０μｌにメスアップしたものを用いた。
【００８６】
Ｇ／Ｃ／Ｔ判別系である場合は、０．３μＭ  ＩＬ６−１７４一塩基伸長用プライマー（配列番号１１）、ＩＬ６−５７２一塩基伸長用プライマー（配列番号１３）、ＴＮＦα−３０８一塩基伸長用プライマー（配列番号１４）、ＩＬ−１β−５１１一塩基伸長用プライマー（配列番号１６）、及びＩＬ−１β−３１一塩基伸長用プライマー（配列番号１７）の混合溶液  １μｌ、ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ  ２μｌ、ＰＣＲ産物（カラム精製後）６００ｎｇ、１０μＭ Ｃｙ５−ｄｄＣＴＰ  １μｌ、１０μＭＣｙ３−ｄｄＧＴＰ  １μｌ、１０μＭ  Ｃｙ５−ｄｄＡＴＰ  １μｌ、１０μＭ ｄｄＴＴＰ  １μｌ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒaｓｅ  １．０  ｕｎｉｔ
を、純粋で２０μｌにメスアップしたものを用いた。また、ｄｄＮＴＰｓ取り込み反応は、９５℃・２分、９５℃・１５秒／６０℃・３０秒を３０サイクル行い、反応後は４℃で保存した。
【００８７】
手順（７）ハイブリダイゼーション
手順（６）の取り込み反応液９．４μｌ（Ｇ／Ａ判別系反応溶液４．７μｌ、およびＧ／Ｃ／Ｔ判別系反応溶液４．７μｌの混合溶液）を９５℃で５分間熱変性し、氷中で急冷した。これにハイブリダイゼーション用反応溶液を３０．６μｌ加え、マイクロピペットを用いてハイブリダイゼーション用の溶液４０μｌを貫通孔より注入した。その後、封止材としてＰＥＴテープで貫通孔を塞ぎ、チャンバー（ＴａＫａＲa製、ＴａＫａＲａ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ  ５  Ｎｏ．ＴＸ７１１）にセットした。シェイカー（ＥＹＥＬＡ製、Ｍｕｌｔｉ  Ｓｈａｋｅｒ  ＭＭＳ）にチャンバーを固定化し、４２℃、２時間インキュベートした。シェイカーの回転数は２５０ｒｐｍとし、シェイカーの回転面とチャンバーが平衡になるようにした。
【００８８】
インキュベート後、支持体からカバーとＰＤＭＳを脱離後に支持体を洗浄、乾燥した。
【００８９】
手順（８）蛍光強度の測定
ＤＮＡチップ用のスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ, ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ, Ｂｏｓｔｏｎ, ＭＡ）に手順（７）の処理後の支持体をセットし、蛍光強度の測定を行った。測定条件は、レーザー出力７０％、フォトマルチプレイヤー感度をコントロール反応におけるＣｙ３およびＣｙ５の蛍光シグナル強度が同程度となるように調整した。ここでの蛍光強度とはスポット内の蛍光強度の平均値である。
【００９０】
得られた蛍光シグナルの色（取り込まれた蛍光標識ｄｄＮＴＰｓ）、および強度から特定位置の塩基配列の分析を行った。ホモ型、ヘテロ型の判定は、得られた蛍光シグナルのＣｙ３／Ｃｙ５値を、コントロール反応において得られたＣｙ３／Ｃｙ５値(Ｃｙ３／Ｃｙ５ ｃｏｎｔ)で除することにより得られた値R =（Ｃｙ３／Ｃｙ５）／（Ｃｙ３／Ｃｙ５ ｃｏｎｔ）によって行った。０．２＜R＜５である場合をヘテロ型、R＜０．２、またはR＞５である場合をホモ型とする判定基準を設定した。
【００９１】
ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より１７４塩基対上流に存在する塩基、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５９６塩基対上流に存在する塩基、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より２３８塩基対上流に存在する塩基、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より５１１塩基対上流に存在する塩基、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より３１塩基対上流に存在する塩基の同時分析により得られた蛍光シグナルから、Ｒ値を各々計算した。Ｒ値による一塩基多型判定結果を表１に示す。
【００９２】
ＩＬ−６（−１７４）から検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝０．０６という値が得られた。０．２＜Ｒであり、かつＣｙ５シグナル強度（Ｃｙ５−ｄｄＣＴＰ）≫Ｃｙ３シグナル強度（Ｃｙ３−ｄｄＧＴＰ）であり、この一塩基伸長反応ではｄｄＣＴＰが特異的に取り込まれていることから、この一塩基多型はＧ／Ｇホモ型であると判定した。この結果は塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【００９３】
ＩＬ−６（−５９６）から検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝１６．７１という値が得られた。Ｒ＞５であり、かつＣｙ３シグナル強度（Ｃｙ３−ｄｄＣＴＰ）≫Ｃｙ５シグナル強度（Ｃｙ５−ｄｄＵＴＰ）であり、この一塩基伸長反応ではｄｄＣＴＰが特異的に取り込まれていることから、Ｇ／Ｇホモ型であると判定した。これは塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出がされたことが確認できた。
【００９４】
ＩＬ−６（−５７２）についても同様に、検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝０．２２という値が得られた。０．２＜Ｒ＜５であり、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＣＴＰの両者が取り込まれていることから、この一塩基多型はＣ／Ｇヘテロ型であると判定した。これは塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致し、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【００９５】
ＴＮＦ−α−３０８についても同様に行い、この一塩基多型はＧ／Ｇホモ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【００９６】
ＴＮＦ−α（−２３８）についても同様に行い、この一塩基多型はＧ／Ａヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致たため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【００９７】
ＩＬ−１β（−５１１）についても同様に行い、この一塩基多型はＣ／Ｔヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【００９８】
ＩＬ−１β（−３１）についても同様に行い、この一塩基多型はＣ／Ｔヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【００９９】
以上の結果から、７種の一塩基多型が同時に精度良く検出可能であることが判明した。
【０１００】
（実施例２）
用いた患者血液が検体番号２であること以外は、実施例１の手順（１）〜（８）と同様に行った。ＰＣＲ増幅後に得られたこれらのＤＮＡ試料は、通常の塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により、目的とする領域が各々増幅されていることが確認できた。また、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より１７４番目塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５９６塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基はＣ／Ｃ、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ａ、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より２３８塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より５１１塩基対上流に存在する塩基はＣ／Ｔ、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より３１塩基対上流に存在する塩基はＣ／Ｔであることを確認した。塩基配列の分析結果を表１に示す。
【０１０１】
ＩＬ−６（−１７４）から検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝０．０５という値が得られた。０．２＜Ｒであり、かつＣｙ５シグナル強度（Ｃｙ５−ｄｄＣＴＰ）≫Ｃｙ３シグナル強度（Ｃｙ３−ｄｄＧＴＰ）であり、この一塩基伸長反応ではｄｄＣＴＰが特異的に取り込まれていることから、この一塩基多型はＧ／Ｇホモ型であると判定した。この結果は塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１０２】
ＩＬ−６（−５９６）から検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝１３．８０という値が得られた。Ｒ＞５であり、Ｃｙ３シグナル強度（Ｃｙ３−ｄｄＣＴＰ）≫Ｃｙ５シグナル強度（Ｃｙ５−ｄｄＵＴＰ）であり、この一塩基伸長反応ではｄｄＣＴＰが特異的に取り込まれていることから、Ｇ／Ｇホモ型であると判定した。これは塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１０３】
ＩＬ−６（−５７２）についても同様に、検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝３５５．５という値が得られた。Ｒ＞５であり、ｄｄＧＴＰが特異的に取り込まれていることから、この一塩基多型はＣ／Ｃホモ型であると判定した。これは塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１０４】
ＴＮＦ−α（−３０８）についても同様に行い、この一塩基多型はＧ／Ａヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１０５】
ＴＮＦ−α（−２３８）についても同様に行い、この一塩基多型はＧ／Ｇホモ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１０６】
ＩＬ−１β（−５１１）についても同様に行い、この一塩基多型はＣ／Ｔヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１０７】
ＩＬ−１β（−３１）についても同様に行い、この一塩基多型はＣ／Ｔヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１０８】
以上の結果から、７種の一塩基多型が同時に精度良く検出可能であることが判明した。
【０１０９】
（実施例３）
用いた患者血液が検体番号３であること以外は、実施例１の手順（１）〜（８）と同様に行った。ＰＣＲ増幅後に得られたこれらのＤＮＡ試料は、通常の塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により、目的とする領域が各々増幅されていることが確認できた。また、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より１７４塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５９６塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基はＣ／Ｃ、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より２３８塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より５１１塩基対上流に存在する塩基はＴ／Ｔ、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より３１塩基対上流に存在する塩基はＣ／Ｃであることを確認した。塩基配列の分析結果を表１に示す。
【０１１０】
ＩＬ−６（−１７４）から検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝０．０１という値が得られた。０．２＜Ｒであり、かつＣｙ５シグナル強度（Ｃｙ５−ｄｄＣＴＰ）≫Ｃｙ３シグナル強度（Ｃｙ３−ｄｄＧＴＰ）であり、この一塩基伸長反応ではｄｄＣＴＰが特異的に取り込まれていることから、この一塩基多型はＧ／Ｇホモ型であると判定した。この結果は塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１１１】
ＩＬ−６（−５９６）から検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝１７８．９という値が得られた。Ｒ＞５であり、Ｃｙ３シグナル強度（Ｃｙ３−ｄｄＣＴＰ）≫Ｃｙ５シグナル強度（Ｃｙ５−ｄｄＵＴＰ）であることから、この一塩基伸長反応ではｄｄＣＴＰが特異的に取り込まれており、Ｇ／Ｇホモ型であると判定した。これは塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた
ＩＬ−６（−５７２）についても同様に、検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝２２．９という値が得られた。Ｒ＞５であり、ｄｄＧＴＰが特異的に取り込まれていることから、この一塩基多型はＣ／Ｃホモ型であると判定した。これは塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致たため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１１２】
ＴＮＦ−α（−３０８）についても同様に行い、この一塩基多型はＧ／Ｇホモ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１１３】
ＴＮＦ−α（−２３８）についても同様に行い、この一塩基多型はＧ／Ｇホモ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１１４】
ＩＬ−１β（−５１１）についても同様に行い、この一塩基多型はＴ／Ｔホモ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１１５】
ＩＬ−１β（−３１）についても同様に行い、この一塩基多型はＣ／Ｃホモ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１１６】
以上の結果から、７種の一塩基多型が同時に精度良く検出可能であることが判明した。
【０１１７】
（実施例４）
用いた患者血液が検体番号４であること以外は、実施例１の手順（１）〜（８）と同様に行った。ＰＣＲ増幅後に得られたこれらのＤＮＡ試料は、通常の塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により、目的とする領域が各々増幅されていることが確認できた。また、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より１７４塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５９６塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｃ、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より２３８塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より５１１塩基対上流に存在する塩基はＣ／Ｔ、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より３１塩基対上流に存在する塩基はＣ／Ｔであることを確認した。塩基配列の分析結果を表１に示す。
【０１１８】
ＩＬ−６（−１７４）から検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝０．０２という値が得られた。０．２＜Ｒであり、かつＣｙ５シグナル強度（Ｃｙ５−ｄｄＣＴＰ）≫Ｃｙ３シグナル強度（Ｃｙ３−ｄｄＧＴＰ）であり、この一塩基伸長反応ではｄｄＣＴＰが特異的に取り込まれていることから、この一塩基多型はＧ／Ｇホモ型であると判定した。この結果は塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１１９】
ＩＬ−６（−５９６）から検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝１５５．７という値が得られた。Ｒ＞５であり、Ｃｙ３シグナル強度（Ｃｙ３−ｄｄＣＴＰ）≫Ｃｙ５シグナル強度（Ｃｙ５−ｄｄＵＴＰ）であることから、この一塩基伸長反応ではｄｄＣＴＰが特異的に取り込まれており、Ｇ／Ｇホモ型であると判定した。これは塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１２０】
ＩＬ−６（−５７２）についても同様に、検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝０．５１という値が得られた。０．２＜Ｒ＜５であり、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＣＴＰの両者が取り込まれていることから、この一塩基多型はＧ／Ｃヘテロ型であると判定した。これは塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１２１】
ＴＮＦ−α（−３０８）についても同様に行い、この一塩基多型はＧ／Ｇホモ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致し、一塩基多型検出が精度良く行われたことが確認できた。ＴＮＦ−α（−２３８）についても同様に行い、この一塩基多型はＧ／Ｇホモ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１２２】
ＩＬ−１β−５１１についても同様に行い、この一塩基多型はＣ／Ｔヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１２３】
ＩＬ−１β（−３１）についても同様に行い、この一塩基多型はＣ／Ｔヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１２４】
以上の結果から、７種の一塩基多型が同時に精度良く検出可能であることが判明した。
【０１２５】
（比較例１）
ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基を分析するための一塩基伸長用プライマーとして、配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの代わりに配列番号１９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたこと以外は、実施例１の手順（１）〜（８）と同様に行った。ＰＣＲ増幅後に得られたこれらのＤＮＡ試料は、通常の塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により、目的とする領域が各々増幅されていることが確認できた。また、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より１７４塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５９６塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｃ、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より２３８塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ａ、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より５１１塩基対上流に存在する塩基はＣ／Ｔ、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より３１塩基対上流に存在する塩基はＣ／Ｔであることを確認した。塩基配列の分析結果を表１に示す。
【０１２６】
ＩＬ−６（−１７４）から検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝０．０４という値が得られた。０．２＜Ｒであり、かつＣｙ５シグナル強度（Ｃｙ５−ｄｄＣＴＰ）≫Ｃｙ３シグナル強度（Ｃｙ３−ｄｄＧＴＰ）であり、この一塩基伸長反応ではｄｄＣＴＰが特異的に取り込まれていることから、この一塩基多型はＧ／Ｇホモ型であると判定した。この結果は塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１２７】
ＩＬ−６（−５９６）から検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝３１．６という値が得られた。Ｒ＞５であり、Ｃｙ３シグナル強度（Ｃｙ３−ｄｄＣＴＰ）≫Ｃｙ５シグナル強度（Ｃｙ５−ｄｄＵＴＰ）であることから、この一塩基伸長反応ではｄｄＣＴＰが特異的に取り込まれており、Ｇ／Ｇホモ型であると判定した。これは塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１２８】
ＩＬ−６（−５７２）についても同様に、検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝０．２３という値が得られた。０．２＜Ｒ＜５であり、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＣＴＰの両者が取り込まれていることから、この一塩基多型はＧ／Ｃヘテロ型であると判定した。これは塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１２９】
ＴＮＦ−α（−３０８）についても同様に、検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝０．５１という値が得られた。０．２＜Ｒ＜５であり、ｄｄＣＴＰ、およびｄｄＵＴＰの両者が取り込まれていることから、この一塩基多型はＧ／Ａヘテロ型であると判定したが、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ、およびＴａｑＭａｎ法）により得られた結果はＧ／Ｇホモ型であり、両者の結果が合致せず、一塩基多型が正しく検出されないことが明らかとなった。
【０１３０】
ＴＮＦ−α（−２３８）についても同様に行い、この一塩基多型はＧ／Ａヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致し、一塩基多型検出が精度良く行われたことが確認できた。ＩＬ−１β（−５１１）についても同様に行い、この一塩基多型はＣ／Ｔヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型検出が精度良く行われたことが確認できた。ＩＬ−１β（−３１）についても同様に行い、この一塩基多型はＣ／Ｔヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致し、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１３１】
以上の結果から、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基を分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号１９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いると、ＴＮＦ−α（−３０８）における一塩基多型が正しく検出されないため、一塩基伸長用プライマーとして不適切であることが判明した。
【０１３２】
（比較例２）
用いた患者血液が検体番号３であり、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基を分析するための一塩基伸長用プライマーとして、配列番号１３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに配列番号１８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いたこと以外は、実施例１の手順（１）〜（８）と同様に行った。ＰＣＲ増幅後に得られたこれらのＤＮＡ試料は、通常の塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により、目的とする領域が各々増幅されていることが確認できた。また、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より１７４塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５９６塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基はＣ／Ｃ、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より３０８塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、、ＴＮＦ−α遺伝子の転写開始点より２３８塩基対上流に存在する塩基はＧ／Ｇ、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より５１１塩基対上流に存在する塩基はＴ／Ｔ、ＩＬ−１β遺伝子の転写開始点より３１塩基対上流に存在する塩基はＣ／Ｃであることを確認した。塩基配列の分析結果を表１に示す。
【０１３３】
ＩＬ−６（−１７４）から検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝０．０２という値が得られた。０．２＜Ｒであり、かつＣｙ５シグナル強度（Ｃｙ５−ｄｄＣＴＰ）≫Ｃｙ３シグナル強度（Ｃｙ３−ｄｄＧＴＰ）であり、この一塩基伸長反応ではｄｄＣＴＰが特異的に取り込まれていることから、この一塩基多型はＧ／Ｇホモ型であると判定した。この結果は塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１３４】
ＩＬ−６（−５９６）から検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝６５．４４という値が得られた。Ｒ＞５であり、Ｃｙ３シグナル強度（Ｃｙ３−ｄｄＣＴＰ）≫Ｃｙ５シグナル強度（Ｃｙ５−ｄｄＵＴＰ）であることから、この一塩基伸長反応はｄｄＣＴＰが特異的に取り込まれており、Ｇ／Ｇホモ型であると判定した。これは塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１３５】
ＩＬ−６（−５７２）についても同様に、検出されたＣｙ３、Ｃｙ５シグナルからＲ値を算出したところ、Ｒ＝０．５７という値が得られた。０．２＜Ｒ＜５であり、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＣＴＰの両者が取り込まれていることから、この一塩基多型はＧ／Ｃヘテロ型であると判定したが、これは塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ、およびＴａｑＭａｎ法）により得られた結果はＣ／Ｃホモ型であり、両者の結果が合致せず、一塩基多型が正しく検出されないことが明らかとなった。
【０１３６】
ＴＮＦ−α（−３０８）についても同様に行い、この一塩基多型はＧ／Ｇホモ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１３７】
ＴＮＦ−α（−２３８）についても同様に行い、この一塩基多型はＧ／Ｇヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１３８】
ＩＬ−１β（−５１１）についても同様に行い、この一塩基多型はＴ／Ｔヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１３９】
Ｌ−１β（−３１）についても同様に行い、この一塩基多型はＣ／Ｃヘテロ型であると判定し、塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により得られた結果と合致したため、一塩基多型が正しく検出されたことが確認できた。
【０１４０】
以上の結果から、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より５７２塩基対上流に存在する塩基を分析するための一塩基伸長用プライマーとして、配列番号１８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いると、ＩＬ−６（−５７２）における一塩基多型が正しく検出されないため、一塩基伸長用プライマーとして不適切であることが判明した。
【０１４１】
【表１】
2009142175.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】一塩基多型検出における第１工程及び第２工程の模式図である。
【図２】一塩基伸長用プライマーの模式図と、該一塩基伸長用プライマーの標的核酸へのハイブリダイゼーションを例示する模式図である。
【図３】一塩基伸長用プライマーに、特定位置の一塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を例示する模式図である。
【図４】支持体に固定化されたタグ捕捉プローブを用いて、一塩基伸長用プライマーを含む標識産物を特異的に捕捉する工程を例示する模式図である。
【図５】支持体とカバーとを含むタグ捕捉プローブが固定化された本発明のバイオチップの概略を例示する斜視図及び断面図である。
【図６】本発明のタグ捕捉プローブが固定化されたバイオチップの一例の断面図である。
【図７】ＰＭＭＡ支持体の表面処理により支持体表面にカルボキシ基を生成させ化学反応スキームである。
【図８】ＰＭＭＡ支持体表面のカルボキシ基とアミノ化プローブＤＮＡとの縮合反応スキームである。
【符号の説明】
【０１４３】
１  支持体
２  カバー
３  接着層（ＰＤＭＳ）
４  貫通孔
５  支持体に固定化されたタグ捕捉プローブ
６  ビーズ
【図１】
2009142175.tif 000006
【図２】
2009142175.tif 000007
【図３】
2009142175.tif 000008
【図４】
2009142175.tif 000009
【図５】
2009142175.tif 000010
【図６】
2009142175.tif 000011
【図７】
2009142175.tif 000012
【図８】
2009142175.tif 000013
【配列表】
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