(57)【要約】【課題】標的蛋白質と被験物質との相互作用の分析方法において、放射線同位体を用いること無く、また洗浄・遠心なしでハイ・スループット・スクリーニングを可能にする方法を提供すること。【解決手段】標的蛋白質及び／又は標的蛋白質含有細胞膜分画を被覆した直径３０〜１５０μｍのビーズと、蛍光標識された被験物質とを接触させ、該標的蛋白質と該被験物質との相互作用により生成する蛍光をフローサイトメトリー分析により測定することを含む、標的蛋白質と被験物質との相互作用を分析する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的蛋白質及び／又は標的蛋白質含有細胞膜分画を被覆した直径３０〜１５０μｍのビーズと、蛍光標識された被験物質とを接触させ、該標的蛋白質と該被験物質との相互作用により生成する蛍光をフローサイトメトリーにより測定することを含む、標的蛋白質と被験物質との相互作用を分析する方法。
【請求項２】
前記ビーズが、ポリスチレンビーズ又はアガロースビーズである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビーズの直径が70から120μｍである、請求項1又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的蛋白質が、受容体蛋白質である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記被験物質が、タンパク質、ペプチド、抗体、又は低分子化合物である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的蛋白質と被験物質との相互作用（例えば、抗原と抗体との相互作用など）の分析方法に関する。より詳細には、本発明は、蛍光をフローサイトメトリー又は蛍光イメージャー分析により測定することを特徴とする、標的蛋白質と被験物質との相互作用の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原と抗体を含むリガンド−受容体の相互作用の測定、及びその相互作用を抑制する化合物の測定にはシンチレーション近接アッセイ(Scintillation Proximity Assay; SPA)が広く用いられている。SPAは、抗原タンパク質或いは抗原蛋白を含有する細胞膜タンパク質をフロオロファアを含有するプラスチックビーズなどの微小ビーズに固定化し、それに放射性同位体標識抗体や放射性同位体標識リガンドなどの被験物質を加え、分析物が結合パートナーと特異的に結合した結果ビーズの表面近くに局在化した際、プラスチックビーズと放射性分析物の近接により発生するビーズ内のフロオロファアの蛍光を測定する方法である（特許文献１）。
【０００３】
SPAは様々な分析目的のために開発および利用されてきた。SPAはラジオイムノアッセイ、競合アッセイ、酵素のカイネティックアッセイ、リガンド／レセプターおよび抗原／抗体の相互作用の研究、ならびに細胞プロセスの研究に利用されてきた。SPAには対象となる分析物に対する高い特異性が与えられる一方で、対象となる反応に特異的な結合システムを開発する時間および経費、放射性同位体を用いるために特殊な実験室や放射性同位体取り扱い技術が必要とされ汎用性の高いアッセイ方法ではなかった。
【０００４】
一方、フローサイトメトリーは，測定対象の細胞等の測定対象物質を含むサンプル液を，フローセルにおいてシース液の層流の中心側に流し，光学検出部においてレーザ光を測定対象物質に照射して，それによって生じる散乱光と蛍光を測定することにより，測定対象物質の大きさや構造等を測定するものである。光学検出部における測定のパラメータとしては，前方散乱光，側方散乱光及び蛍光がある。前方散乱光では測定対象物質の大きさが，また側方散乱光及び蛍光により，測定対象物質の構造等が測定できる（特許文献２）。
【０００５】
フローサイトメトリーには，測定のみを目的として構成されたものや，測定と共に測定対象物質の分取を行うように構成されたものがあり，近来，生化学物質の測定等の各種の目的で使用されている。抗原発現細胞と蛍光標識リガンドを用いたリガンド-抗原の相互作用を測定するフローサイトメトリー法においては、5-20umの抗原発現細胞を用いるため、細胞の大きさに感度が制限され、感度的に不利であった。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第4,568,649号
【特許文献２】特開2007-101412号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、標的蛋白質と被験物質との相互作用の分析方法において、放射線同位体を用いること無く、SAP法と同様に洗浄・遠心なしでリガンド−受容体の相互作用を抑制する化合物のハイ・スループット・スクリーニングを可能にする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、フローサイトメーターで高感度に検出可能な直径３０〜１５０μｍのビーズに、標的蛋白質及び／又は標的蛋白質含有細胞膜分画を被覆し、これに蛍光標識された被験物質を接触させ、該標的蛋白質と該被験物質との相互作用により生成する蛍光をフローサイトメトリー分析により測定することによって、標的蛋白質と被験物質との相互作用を分析できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明によれば、標的蛋白質及び／又は標的蛋白質含有細胞膜分画を被覆した直径３０〜１５０μｍのビーズと、蛍光標識された被験物質とを接触させ、該標的蛋白質と該被験物質との相互作用により生成する蛍光をフローサイトメトリー分析により測定することを含む、標的蛋白質と被験物質との相互作用を分析する方法が提供される。
【００１０】
好ましくは、前記ビーズは、ポリスチレンビーズ又はアガロースビーズである。
好ましくは、前記ビーズの直径は70から120μｍである。
好ましくは、前記標的蛋白質は、受容体蛋白質である。
好ましくは、前記被験物質は、タンパク質、ペプチド、抗体、又は低分子化合物である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による標的蛋白質と被験物質との相互作用の分析方法は、放射性同位体を用いるために特殊な実験室や放射性同位体取り扱い技術が必要とされないため汎用性が高い。また、抗原発現細胞と蛍光標識リガンドを用いたリガンド−抗原の相互作用を測定する通常のフローサイトメトリー法では、5〜20μｍの抗原発現細胞を用いるが、本発明による標的蛋白質と被験物質との相互作用の分析方法においては、用いるビーズのサイズを大きくすることによって高感度な測定を達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明で用いるビーズは一般に市販されている生化学測定用ビーズ（マイクロスフィア，マイクロビーズ，ビーズ等として称されている）のうち直径３０〜１５０μｍのものを適宜用いることができる。このうち好ましいものはポリスチレンビーズ又はアガロースビーズであり、最も好ましくはアガロースビーズである。ビーズの直径としては、更に好ましくは７０〜１２０μｍである。
【００１３】
これらのビーズは，例えば、表面にカルボキシル基をコーティングして、末端をアミノ化したタンパク質をビーズの表面に結合させるように構成してもよい。このような構成を採ることにより、フローサイトメトリーを利用した測定に用いることができる。
【００１４】
本発明で用いる標的蛋白質の種類は特に制限されない。標的蛋白質及び標的蛋白質含有細胞膜分画は、当業界において公知の方法で得ることができる。また、標的蛋白質及び／又は標的蛋白質含有細胞膜分画によるビーズの被覆も、当業界において公知の方法で行うことができる。標的蛋白質としては、例えば、受容体蛋白質を用いることができる。また標的蛋白質含有細胞膜分画として得るのに好ましい蛋白質としては、7回膜貫通型受容体が挙げられる。
【００１５】
また、本発明で用いる被験物質の種類も特に制限されず、タンパク質、ペプチド、抗体、又は低分子化合物などが挙げられる。上記した被験物質は、蛍光標識されている。本発明で用いる蛍光標識物質の種類は、フローサイトメトリーで検出できるものであれば特に限定されず、例えば、フィコエリスリン（ＰＥ）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）が挙げられるが、この他にも、エチジウムブロマイド（Ethidium bromide）、プロピジウムアイオダイド（Propidium iodide）、ヘキスト（Hoechst）33258/33342、DAPI、アクリジンオレンジ(Acridine orange) 、クロモマイシン(Chromomycin) 、ミトラマイシン(Mithramycin) 、オリボマイシン(Olivomycin)、パイロニン(Pyronin) Y 、チアゾールオレンジ(Thiazole orange) 、ローダミン(Rhodamine) 101 イソチオシアネート(isothiocyanate)、BCECF 、BCECF-AM、C.SNARF-1 、C.SNARF-1-AMA 、エクオリン(Aequorin)、Indo-1、Indo-1-AM 、Fluo-3、Fluo-3-AM 、Fura-2、Fura-2-AM 、オキソノール(Oxonol)、ローダミン(Rhodamine) 123 、 10-N-ノニ−アクリジンオレンジ(nony-acridine orange)、フルオレセイン(Fluorescein) 、フルオレセインジアセテート(Fluorescein diacetate) 、カルボキシフルオレセイン(Carboxyfluorescein)(CF)、カルボキシフルオレセインジアセテート(Carboxyfluorescein diacetate)(CFDA)、カルボキシジクロロフルオレセイン(Carboxydichlorofluorescein)(CDCF)、カルボキシジクロロフルオレセインジアセテート(Carboxydichlorofluorescein diacetate)(CDCFDA)などが挙げられる。
【００１６】
フローサイトメトリーで検出する時に用いる蛍光標識抗体は、抗体に直接上記蛍光物質を結合させてもよいし、抗体にはビオチンを標識しておき、蛍光物質にはアビジンを結合させてもよい。これらの標識化のプロトコールは、プロトコール集である「Current Protocols in Cytometry」(ISAC(The International Society for Analytical Cytology))の４．２．章 Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodyに記載されている。また、同様の内容はインターネット上からも見ることが可能であり、アドレス（ http://www.drmr.com/abcon /）のConjugation of monoclonal antibodies にも詳しく記載されているので、この方法に従って標識化可能である。
【００１７】
以下、本発明の好ましい実施態様について例示する。先ずビーズと標的蛋白質（あるいは、標的蛋白質を含む細胞膜タンパク質）を結合させる。次に、この標的蛋白質を結合させたビーズを、蛍光物質で直接又は間接的に標識した特異抗体或いは特異リガンドと混合、及び洗浄した後、フローサイトメトリーにて検出する。本発明の方法では大きさと蛍光により目的物質を検出することができるため、特異性の高い抗体或いはリガンドを使用する際には、標的蛋白質結合ビーズと蛍光物質の反応後の洗浄操作を必ずしも必要としないことも特徴の一つである。
【００１８】
本発明でいう「フローサイトメトリー」は、上述のビーズと蛍光標識された被検物質の混合液を、高速でフローセル中を通過させ、光学的な手法によっての計測を行う方法を指す。試料が微細管を通過する過程で発する蛍光を高感度検出器によって測定する。即ち、フローサイトメトリーでは、通常、数十μｍ〜数百μｍ内径程度の微細な管状のフローセルに被検液を流しながらこれに励起光を照射し、流動する被検液中で発せられる蛍光を受光し検出する。本発明はフローサイトメトリーに代えて、例えば蛍光分光光度計、蛍光プレートリーダー、蛍光顕微鏡、蛍光イメージャーといった蛍光測定機器を使用することができる。測定時の励起波長およびバンド幅は当業者であれば適宜選択することができる。これらのうち特に好ましいものはイメージ画像を統計的に処理できるような蛍光顕微鏡であり、具体的にはIN Cell Analyzer 1000(GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社)を用いても検出が可能である。
【００１９】
本発明による標的蛋白質と被験物質との相互作用を分析する方法を利用して、標的蛋白質と被験物質との相互作用を阻害する物質をスクリーニングすることも可能である。即ち、標的蛋白質及び／又は標的蛋白質含有細胞膜分画を被覆した直径３０〜１５０μｍのビーズと、蛍光標識された被験物質とを接触させ、該標的蛋白質と該被験物質との相互作用により生成する蛍光をフローサイトメトリー分析により測定する際に、標的蛋白質と被験物質との相互作用を阻害する可能性のある候補物質を存在させておくことができる。そして、標的蛋白質と被験物質との相互作用を阻害する可能性のある候補物質を存在させない場合と比較して、標的蛋白質と被験物質との相互作用を低下させる作用を有する物質を、標的蛋白質と被験物質との相互作用を阻害する物質として選択することができる。
【実施例】
【００２０】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。なお、本実施例では上皮成長因子受容体(EGFR)を検出対象としたが、抗体及び抗原を選択することで他のリガンド−受容体の相互作用の検出も同様に可能である。即ち、以下の実施例に示す材料、試薬、割合、操作等は、本発明の精神から逸脱しない限り適宜変更することができ、本発明の範囲は以下に示す具体例に制限されるものではない。
【００２１】
実施例では、Becton Dickinson社製のフローサイトメトリー、FACSCalibur（登録商標）を用いた。励起波長４８８ｍの空冷アルゴンレーザー（出力１５ｍＷ）で励起し、ＰＭＴにて検出する系である。測定条件は、FLUID controlをLowに設定し、蛍光（ＦＬ１）及び散乱光（ＦＳＣ、ＳＳＣ）の設定は以下の通りとした。
【００２２】
【表１】
2009229075.tif 000002
【００２３】
組換えVEGFR2蛋白質(Abcam社)0.3μg, 3μg, 30μgとポアサイズ150umのナイロンメッシュによりろ過された1×104 個（50ul）のアガロース・ビーズ （Vector laboratories社）を加え、90分間室温で静置した。その後、フルオレセインで標識したマウス抗ヒトVEGFR2モノクローナル抗体（Cell Sciences社）又は陰性コントロールのマウスポリクローナル抗体を150ng加え(最終3ug/ml)、50μl PBS(Invitrogen社) 中で60分間室温でインキュベートした後、PBS 100ul を加え、FACS用チューブ（BDファルコン社）に移し、FACSCaliburにより蛍光強度を測定した。測定結果を図１に示す。図１に示す通り、フルオレセインで標識したマウス抗ヒトEGFRモノクローナル抗体を用いた場合は、抗体なしの場合又は陰性コントロールのマウスポリクローナル抗体を用いた場合と比較して、高い相対的蛍光強度が得られた。これらの結果から、標的蛋白質と該被験物質との相互作用により生成する蛍光をフローサイトメトリー分析により測定することによって標的蛋白質と被験物質との相互作用を分析できることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、VEGFR2蛋白質0.3μg、3μg又は30μgを用いた場合のフローサイトメトリー分析における相対的蛍光強度を示す。
【図１】
2009229075.tif 000003