(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫不全動物を用いず、かつ開腹手術によるがん細胞やがん組織の移植を行なうことなく、再現性よく効率的に消化器担がん動物を作成する方法を提供する。【解決手段】消化管担がんモデル動物の作成方法であって、発がん物質を経口投与する工程を含み、発がん物質の経口投与に先立って界面活性剤を経口投与する工程を含む方法。発がん物質としては、ニコチン酸アミドアルキルベンゼンスルホン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、ENNG、MNNG、エポキシ関連物質、ベンツピレン、硫黄酸化物質、アフラトキシンやピーアールトキシンに代表されるマイコトキシン（かび毒）が好ましく、飲水に混入して経口投与する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化管担がんモデル動物の作成方法であって、発がん物質を経口投与する工程を含み、発がん物質の経口投与に先立って界面活性剤を経口投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
発がん物質を飲水に混入して経口投与する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は消化管担がん動物の作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん研究の分野ではしばしばモデル実験としてマウスなどの小動物を用いる場合があるが、消化管にがんを自然発生する実験小動物は稀であり、消化管がん研究に利用が可能な消化管がんを自然発生する実験小動物あるいはそれに由来する材料は現状では極めて限られている(Adams, K.E. et al., J. Biomed. Opt., 89(1), pp.17-24, 2007; Raffel, D.M., et al., J. Med. Chem., 39(13), pp.2078-2088, 2007; Nagengast, W.B., et al., J. Nud. Med.10(4), pp.1313-1319, 2003)。この理由から、従来は、ヌードマウスやスキッドマウスといった免疫不全動物にヒト消化管がん由来組織又は培養株化胃癌細胞などを人為的に移植して担がんモデル動物を作製し、抗癌剤や治療法の検討などに利用している(Ghosh, A.R., et al., J. Environ. Biol., 242(3), pp.129-134、2006; Eray, O., et al., Ulus. Travma. Aci. Cerrahi. Derg., 12(4), pp.184-188, 2006; Ndoye, J.M., et al., Surg. Radiol. Anat., 33(7), pp.19, 2006; Ahsan, E., et al., Mol. Biol. Rep., 33(1), pp. 233-241, 2006; Odekunle, A., et al., J. Biomed. Sci., 16(4A), pp.233-246, 2006; Maqani, N., et al., Mol. Cancer Res., 21(4), pp.449-455, 2006; Ghayur, M.N., et al., Int. J. Food Sci. Nutr., 56(1), pp.65-73, 2006; Ichikawa, T., et al., Biomed. Res., 35(2), 117-124, 2006; Kim, J.H., et al., Radiographics, 38(3), pp.1101-1116, 2006; Ellmark, P., et al., Mol. Cell Proteomics., 40(3), 1243-1252, 2006 ）
【０００３】
しかしながら、免疫不全動物の低拒絶反応を利用してがん組織を該動物の表皮に作ることは容易であるものの、動物を開腹して消化管にがん細胞を植え付ける作業には高度な手技が必要であり、限られた熟練作業者しか行なうことができず、しかも1日に施術できる動物の数は5〜6匹程度であるという問題がある。また、通常は免疫不全動物の消化管を切開してがん細胞を移植し、もとの状態に戻して飼育する方法が一般的であるが、免疫不全動物を微生物の感染から守ることは非常に困難であり、移植後80%以上が生存しないという問題もある。さらに、免疫不全動物を飼育するには清浄な飼育環境が必要であり、そのための施設を建設するためには莫大な費用を必要とし、施設の増設も容易でないという大きな問題がある。
【０００４】
一方、発がん物質であるN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)を界面活性剤であるTween60とともに飲水に添加して35週間投与することにより、腺胃にがんが発生することが報告されている(橋本ら、日本組織細胞化学会総会プログラムおよび抄録集、 No.19 (19781101) p. 46、日本組織細胞化学会)。しかしながら、この方法は長期の投与を必要とするという問題がある。
【非特許文献１】日本組織細胞化学会総会プログラムおよび抄録集、 No.19 (19781101) p. 46、日本組織細胞化学会。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は消化管担がん動物の作成方法を提供することにあり、より具体的には、免疫不全動物を用いず、開腹手術によるがん細胞やがん組織の移植を行なうことなく、再現性よく効率的に消化器担がん動物を作成する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、免疫不全動物ではない通常の動物を用い、消化管を切開することなく飲水に発がん物質を混ぜて飼育することにより担がん動物を作成するにあたり、発がん物質の投与前に界面活性剤を投与しておくと再現性よく簡便に担がん動物を作成でき、しかもがん発生までの期間を従来の1/4以下に短縮できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００７】
すなわち、本発明により、消化管担がんモデル動物の作成方法であって、発がん物質を経口投与する工程を含み、発がん物質の経口投与に先立って界面活性剤を経口投与する工程を含むことを特徴とする方法が提供される。
本発明の好ましい態様によれば、発がん物質を飲水に混入して経口投与する上記の方法；動物がイヌ、ミニブタ、ウサギ、ラット、モルモット、又はマウスである上記の方法；腫瘍の形成部位が口腔、食道、胃、十二指腸、小腸結腸、回腸、大腸、又は直腸である上記の方法が提供される。
別の観点からは、上記の方法により作成された担がんモデル動物が本発明により提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、免疫不全動物でなく普通の動物を使用することにより、動物施設に特に清浄域を設けることなく、設備投資を大幅に減少させることができ、また動物の消化管を切開することなくモデル動物を作成することができるので、熟練した手技が必要ではなく、飲水に発がん物質を投入することにより作業者が発がん物質に直接触れることなく作業を行なえるという利点もある。本発明の方法により消化管担がんモデル動物を作成した場合、がん発生率はほぼ100%であり、かつ作成中の死亡率はほぼ0%であることから、実験に使用する動物数を最小にとどめることができる。また、がんの発生までの日数を大幅に短縮することができ、かつ腫瘍発生の確率も高まるという優れた利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
動物の種類は特に限定されないが、例えば、イヌ、ネコ、サル（主にアカゲザル、カニクイザル）、養トン、ミニブタ（主に、クラウン、Nibs、ゲッチンゲン、ユカタン）、ウサギ、モルモット、ラット、又はマウスなどを用いることができる。これらのうち、ミニブタ、ウサギ、モルモット、ラット、又はマウスが好ましく、さらに好ましくはモルモット、ラット、又はマウスを用いることができる。
【００１０】
発がん物質の種類も特に限定されないが、水に混ぜることのできる物質を好適に使用することができ、例えば、赤色2号、赤色3号、赤色104号、赤色105号、赤色106号、緑色3号、青色1号、青色2号、亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩、ソルビン酸ナトリウム（ソルビン酸塩）、ソルビン酸カリウム、プロビレングリコール（PG）、ポリエチレングリコール、トリエタノールアミン、ジプチルヒドロキシトルエン（BHT）、ブチルヒドロキシアソニール（BHA）、没食子プロビルオルト・フェニル・フェノール（OPP）、チアベンダゾール（TBZ）、クロルキシレール、パラクロロフェノールエストラジオール、エストロン、卵胞ホルモン、エチニルエストラジオール、酢酸コルチゾン、ジエチルスチルベストロール、過酸化水素サッカリン、サッカリンナトリウム  重合リン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム（ポリリン酸塩）、酸性ピロリン酸カルシウム、酸性ピロリン酸ナトリウム、臭素酸カリウム（イーストフード）、ニコチン酸、ニコチン酸アミドアルキルベンゼンスルホン酸塩（ABS）、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（LAS）、高級アルコール類、アルキルエーテル硫酸塩（AES）、N-エチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(ENNG）、N-メチル-N'-ニトロ-ニトロソグアニジン（MNNG）、エポキシ関連物質、ベンツピレン、硫黄酸化物質、アフラトキシンやピーアールトキシンに代表されるマイコトキシン（かび毒）などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００１１】
これらのうち、ニコチン酸アミドアルキルベンゼンスルホン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、ENNG、MNNG、エポキシ関連物質、ベンツピレン、硫黄酸化物質、アフラトキシンやピーアールトキシンに代表されるマイコトキシン（かび毒）が好ましく、MNNG、ENNG、又はマイコトキシンが特に好ましい。
【００１２】
これらの発がん物質はそれ自体を経口投与してもよいが、経口投与に際して発がん物質を飲水に混入して水溶液又は水懸濁液を調製して用いることが好ましい。水難溶性又は水不溶性の発がん物質については、例えば、抗生物質を添加した滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて遠心操作を加えながら洗浄後、再度PBSに懸濁し、大量の水に混ぜて使用する形態などを挙げることができるが、この形態に限定されることはない。通常は発がん物質を飲水に混入して水溶液又は水懸濁液として動物に経口投与することができる。発がん物質の経口投与量は発がん物質の種類や動物の種類により適宜選択可能であるが、一般的には、一日あたり0.1〜100 mg程度である。経口投与は単回でもよいが、一般的には繰り返し行なうことが好ましい。飲水に発がん物質を混入して数日から数ヶ月間飼育することにより、効率的に消化管担がん動物を作成することができる。飲水中の発がん物質の濃度は発がん物質の種類に応じて適宜選択可能であるが、通常は0.01〜10 mg/ml程度の濃度である。
【００１３】
発がん物質の経口投与に先立って界面活性剤を経口投与しておくことにより、発がんまでの日数を短縮し、効率的かつ確実に消化器担がん動物を作成することができる。界面活性剤の種類は特に限定されないが、例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム(LAS)、アルキル硫酸エステルナトリウム(AS)、アルファスルホ脂肪酸エステル塩(SF又はα-SF)、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩(AES)、アルファオレフィンスルホン酸塩(AOS)、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルトリメチルアンモニウム塩、カチオンLQ、Tween-10、Tween-20、Tween-30、Tween-50、Tween-80、Tween-100、HCO-10、HCO-20、HCO-40、TCO-60、TCO-80、TCO-100などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらのうち、Tween群とHCO群が好ましく、より好ましくはHCO-60又はHCO-100を用いることができる。界面活性剤は発がん物質の経口投与に先立って胃ゾンデなどにより強制的に経口投与しておくか、又は飲水に添加することにより経口投与することができるが、強制的に経口投与することが好ましい。界面活性剤は発がん物質の経口投与の直前(例えば数分前ないし数時間前)に経口投与することが好ましいが、例えば、発がん物質の経口投与に先立って数日前から一日一回ないし数回の割合で経口投与することも可能である。界面活性剤の投与量は界面活性剤の種類により適宜選択可能であるが、例えば、0.1〜100 mg/kg程度であり、10 mg/kg程度が好ましい。発がん物質の経口投与に先立って界面活性剤を経口投与する操作に加えて、発がん物質の経口投与と同時に界面活性剤を経口投与することもできる。例えば、飲水中に発がん物質とともに界面活性剤を添加しておくこともできる。
【００１４】
一般的には、経口投与によって作成した初代の担がん動物を実験に供することができる。経口投与開始時、経口投与期間中、及び経口投与終了後に注意深く動物を経過観察し、がん細胞の増殖による影響が顕著になるようであれば、動物をエーテル麻酔下で屠殺・解剖し、腫瘍を無菌的に回収してピンセットなどを用いて細胞を物理的にほぐし、滅菌PBSに懸濁して別の動物に継代移植することも可能である。数代の動物で腫瘍の移植を繰り返す間に、移植された動物の生存期間が短縮する場合、あるいは腫瘍が他臓器への転移性を獲得した場合や腫瘍が未分化型細胞集団に変化し、又は分裂像の増加など悪性化の指標となる変化が認められた場合には、そのがん細胞又はがん組織を選択して移植継代することができる。このようにして、より悪性度の高いがんを担持した動物を作成することができる。
【００１５】
がん細胞を継代培養する場合には、一般的には市販の細胞培養液のみのいわゆる無血清培地にて培養し、このような条件下でも生存しうる細胞のみを選抜する。生き残った細胞について、市販の細胞培養液にウシ胎児血清を加えたものを基本培養液とし、これを分注した培養用のプラスティックディッシュに細胞を懸濁して、37℃のCO2インキュベーター内に静置して増殖させる。細胞がディッシュ底面に接着した後、およそ3〜4日おきに培養液の交換を行うことができる。細胞が増殖してディッシュ全体に拡がるようであれば、細胞をはがして、さらにディッシュによる継代を続けることが望ましい。細胞の増殖が安定化した段階でクローニングを行うことができる。増殖した細胞集団から限界希釈法、カップ法、又は軟寒天法等により細胞が1個ずつになるように分離し、それぞれをマイクロプレート1ウェル内に移して培養を続け、細胞1個から増殖した細胞群をそれぞれ独立したクローンとすることができる。その後、さらにそれぞれのクローンについて継代培養を繰り返し、増殖が安定したものを株化細胞とすることができる。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
ICR雄性マウス(6週齢、日本チャールスリバー)を30匹購入し、1週間にわたり順化飼育を行った。体重により通常の手順で10匹ずつ3つの群に分けた。第一の群では発がん素物質としてN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG、和光純薬社製、1203-09)を1 mg/mlの濃度で飲水に混ぜて自由飼育した（実験群A）。第二の群では発がん物質としてN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG、和光純薬社製)を1 mg/mlの濃度で飲水にまぜ、さらに界面活性剤HCO-100（和光純薬製、1043-01）を1 mg/mlの濃度で飲水に混ぜて自由飼育した（実験群B）。第三の群では、界面活性剤HCO-100（和光純薬社製、1043-01）10 mg/kgを強制経口投与し、その6 時間後に実験群Aと同じ環境で飼育を継続した（実験群C）。14日間飼育後に動物を解剖し、消化管に腫瘍を形成した個体の割合を調べた。結果を図1に示す。界面活性剤を投与した後に発がん物質を投与する方法によれば14日間で全ての個体に腫瘍発生が認められた（実験群C：腫瘍発生率100%）。一方、発がん物質のみの投与（実験群A）、及び発がん物質と界面活性剤の同時投与（実験群B）では腫瘍発生個体は半分以下であった。
【００１７】
例２
雄性ヌードマウス（5週齢、10匹、日本チャールスリバー）とICR雄性マウス（5週齢、10匹）を購入し、１週間にわたり順化した後、ヌードマウス全例について胃及び・小腸を切開し、上皮にがん細胞A431（ヒト大腸がん：Ono, M., et al., Mol. Cancer Ther., 96(8), pp.465-472, 2004）を移植し、縫合後飼育を続けた。ICRマウスに関しては例１の実験群Cと同様の処理を行った。両マウスについて生存率と腫瘍発生率を比較した。結果を図2に示す。生存率及び腫瘍発生率ともICRマウス群の方が高い割合を示した。
【００１８】
例３
上記ICRマウスで発生した胃がんについて、外科手術を用いた肉眼的診断によって胃腫瘍の存在を確認した。それぞれのマウスをアルミニューム製のケージに個別に収容して、市販の固型飼料（CMF：オリエンタル酵母工業社製）と水道水を自由に与えて飼育した。そのうち腹部が膨満し動きの鈍くなった病態末期の個体を、エーテル麻酔下にて屠殺解剖した。その際腹腔内に貯留した腹水を注射筒にて無菌的に吸引採取した。この個体には胃腫瘍由来の腹腔内播種が確認された。採取した腹水を軽く遠心し（150r.p.m., 10分間）、上清を捨て沈渣部の細胞画分を回収した。
【００１９】
この画分に抗生物質（ペニシリンGカリウム：萬有製薬社製、及び硫酸ストレプトマイシン：明治製菓社製、それぞれ50万単位及び1 g力価/Lの濃度）を添加した滅菌PBSを適当量加え、ピペッティングと遠心操作を加えながら数回洗浄後、再度滅菌PBS約50 mlに懸濁し、雄性ヌードマウス(5週齢)にそれぞれ約1 mlずつ腹腔内接種により移植した。接種動物は胃腫瘍原発動物と同様に、それぞれ個別にケージに収容し、固型飼料と水道水を自由に与えて飼育を続けた。接種後5週から6週にかけて動物が次々と死亡したため、生き残った動物をエーテル麻酔下にて屠殺解剖した。剖検では腹水の貯留が認められなかったので、接種部位皮下の腫瘤を無菌的に採取し、滅菌PBSを入れたシャーレ内で有鉤ピンセットなどを用いて19G注射針を通過するように細かくほぐした。この細胞を遠心管に集め、遠心操作とピペッティングを加えながら滅菌PBSで数回洗浄した。
【００２０】
病理組織所見において、この転移巣は比較的大型の核と核小体を有しほぼ同形態を呈する単一種の細胞からなる集団を形成し、その中に多くの分裂像が観察されたことから活発な増殖状態にあると考えられた。この腫瘍細胞を移植継代し、14日後のヌードマウスを解剖したところ、約20 mlの腹水が採取された。そこでこの腹水中の細胞成分を インビトロ培養系の初代細胞として用いた。採取した腹水を軽く遠心して上清を捨て、遠心管底部の細胞画分に抗生物質を添加した滅菌PBSを適当量加えて再度懸濁洗浄した。この操作を数回繰り返した後、得られた細胞画分を市販の液体培地（血清を含まないRPMI 1640培地：シグマ社製）に細胞数が102/ml個程度になるように分散させ、線維芽細胞が接着しにくい非コーティング−プラスティックディッシュ（CORNING社製又はNUNC社製）に入れ37℃のCO2インキュベーター内（95% 空気/5% CO2）に静置して培養を開始した。
【００２１】
約１週間後、上記培養条件において生存している細胞のみを選抜するため、培養液に浮遊する細胞成分は培養液の遠心処理により、また培養ディッシュにはりついているものは0.25% トリプシン−0.02% EDTA溶液によりディッシュからはがしたものを遠心処理により集めた。これらをRPMI 1640液体培地に10%の割合でウシ胎児血清（FCS：旭テクノグラス社）を添加した培養液で数回遠心操作を加えながら洗浄し、デイッシュ当たりの細胞数が107〜108個になるように同培養液に分散した。この細胞分散液を細胞培養用にコーティングされた新しいプラスティックディッシュ（CORNING社製又はNUNC社製）に蒔いた。ディッシュを上記同様の条件に設定されたCO2インキュベーター内に静置して細胞を増殖させた。細胞の増殖が認められたディッシュについては増殖の程度にあわせ3〜7日毎に培養液の交換及び細胞の収集・継代を繰り返した。ディッシュを倒立顕微鏡下で観察しながら、ディッシュ底面に沈んできた細胞を、先端を極細に加工した手製の滅菌ガラス管を用いて、1個ずつ別々に採取した。この操作により樹立株を得た。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】例1において消化管に腫瘍を形成した個体の割合を調べた結果を示した図である。
【図２】例2においてヌードマウス群（移植群）とICR雄性マウス群（例1と同様にして腫瘍を形成した群）について生存率と腫瘍発生率を比較した結果を示した図である。
【図１】
2009136185.tif 000002
【図２】
2009136185.tif 000003