(57)【要約】【課題】人体に安全性の高い歯周病の予防または治療のための経粘膜投与用ワクチンの提供。【解決手段】乳酸菌の表面にＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る抗原を提示させることで、経粘膜投与用ワクチンを得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原を発現させた乳酸菌を含む歯周病の予防または治療のための経粘膜投与用ワクチンであって、該抗原がＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る抗原である、歯周病の予防または治療のための経粘膜投与用ワクチン。
【請求項２】
抗原が、次の１）〜３）のいずれかに記載の蛋白質である請求項１に記載のワクチン。
１）Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの分子量４０−ｋＤａの外膜蛋白質（４０−ｋ−ＯＭＰ）
２）配列表の配列番号１に示す２２〜３４４番目のアミノ酸配列からなる蛋白質
３）配列表の配列番号１に示す２２〜３４４番目のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であって、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る蛋白質
【請求項３】
乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉである請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
抗原を発現させた乳酸菌がＮＩＴＥ  Ｐ−４１８である請求項１〜３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
抗原を発現させた乳酸菌が死菌または生菌である請求項１〜４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項６】
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの赤血球凝集活性を阻害する、歯周病の予防または治療のための請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項７】
経鼻投与用である請求項１〜６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のワクチンを用いる歯周病の予防または治療方法。
【請求項９】
次の１）〜３）のいずれかに記載の蛋白質をコードする塩基配列を含むシャトルベクター。
１）Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの分子量４０−ｋＤａの外膜蛋白質（４０−ｋ−ＯＭＰ）
２）配列表の配列番号１に示す２２〜３４４番目のアミノ酸配列からなる蛋白質
３）配列表の配列番号１に示す２２〜３４４番目のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であって、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る蛋白質
【請求項１０】
ポリ−γ−グルタミン酸シンテターゼ複合体を構成している遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣおよびｐｇｓＡのいずれか一つまたは二つ以上を含む表面発現用のベクターを含む請求項９に記載のシャトルベクター。
【請求項１１】
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの分子量４０−ｋＤａの外膜蛋白質（４０−ｋ−ＯＭＰ）をコードする塩基配列を含むシャトルベクターｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０。
【請求項１２】
配列表配列番号２に記載の塩基配列からなる請求項１１に記載のシャトルベクターｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は歯周病用免疫ワクチンに関する。さらに詳しくは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ポルフィロモナス・ジンジバリス：以下、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓとする）の外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る抗原を発現させた乳酸菌を含む、歯周病の予防または治療のための経粘膜投与用ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の歯周病治療は、既に進行してしまった歯周病に対する外科的な処置等が主流であった。しかし、近年、歯周病原性細菌、病原性因子などが明らかにされてきており、これらを対象とした新しい歯周病の治療および予防法が提供され始めている。
【０００３】
例えば、歯周病の発症および進展に深く関わり、歯周病の病原性細菌の一つとされるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓにおいて、その夾膜蛋白質がマウスにおいて抗体を誘導することから、ワクチンとして有効であることが示唆されている（例えば、非特許文献１参照）。
また、本発明者らは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに特異的な分子量４０−ｋＤａの外膜蛋白質（以下、４０−ｋ−ＯＭＰとする）を利用して、アジュバントと共に粘膜投与する粘膜免疫ワクチン（例えば、特許文献１参照）や経皮免疫ワクチン（例えば、特許文献２参照）を開発している。
【０００４】
しかし、これらのワクチンはアジュバントとして、コレラ毒素を用いるため、人への適用が不可能であった。また、無毒化したコレラ毒素を用いることも検討されているが、ヒトへの安全性は未だ確認されておらず、実際の使用において現実的ではない。これらに代替し得る他のアジュバントが現在のところ見つかっておらず、人体への安全性が高いワクチンの開発が望まれている。
【０００５】
アジュバントを付加する以外の免疫増強の方法として、抗原を乳酸菌の表面に提示させる乳酸菌ディスプレイ技術が開発されている（例えば、特許文献３参照）。この技術は食用で提供されている乳酸菌を用いることができるため、人体に安全であり、有用であると考えられる。しかし、歯周病の治療および予防を目的として、この技術を用いてワクチンを提供したという例は知られていない。
【非特許文献１】Ｈａｒｖｅｙ  Ｗ、  Ｇｕａｔ−Ｃｈｅｎ  Ｆ、  Ｇｏｒｄｏｎ  Ｄ、  Ｍｅｇｈｊｉ  Ｓ、  Ｅｖａｎｓ  Ａ、  Ｈａｒｒｉｓ  Ｍ  （１９８４）    Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｓ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｄｅｎｔａｌ  ｃｙｓｔ  ｉｎ  ｍａｎ．  Ａｒｃｈ．  Ｏｒａｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９、  ２２３−２２９
【特許文献１】特開２００３−２８６１９１号公報
【特許文献２】特開２００５−１７９３０１号公報
【特許文献３】特開２００７−１３１６１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、人体に安全性の高い歯周病の予防または治療のための経粘膜投与用ワクチンの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、乳酸菌の表面にＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る抗原を提示させることで抗原に対する免疫を増強でき、かつ、人体に安全性の高い歯周病の予防または治療に有効な経粘膜投与用ワクチンが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明のワクチンは、アジュバントとしてコレラ毒素を用いたワクチンと同程度の免疫増強効果を維持している。そして、本発明のワクチンは、口腔疾患に効果が高いとされる唾液中への分泌型ＩｇＡを十分に分泌できるため、歯肉溝滲出液へのＩｇＧの分泌とともに歯周病菌に対して免疫することができ、有用である。また、本発明のワクチンは、常温で長期保存することもできるため有用である。
【０００８】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１２）の歯周病の予防または治療のための経粘膜投与用ワクチンに関する。
（１）抗原を発現させた乳酸菌を含む歯周病の予防または治療のための経粘膜投与用ワクチンであって、該抗原がＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る抗原である、歯周病の予防または治療のための経粘膜投与用ワクチン。
（２）抗原が、次の１）〜３）のいずれかに記載の蛋白質である上記（１）に記載のワクチン。
１）Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの分子量４０−ｋＤａの外膜蛋白質（４０−ｋ−ＯＭＰ）
２）配列表の配列番号１に示す２２〜３４４番目のアミノ酸配列からなる蛋白質
３）配列表の配列番号１に示す２２〜３４４番目のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であって、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る蛋白質
（３）乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉである上記（１）または（２）に記載のワクチン。
（４）抗原を発現させた乳酸菌がＮＩＴＥ  Ｐ−４１８である上記（１）〜（３）のいずれかに記載のワクチン。
（５）抗原を発現させた乳酸菌が死菌または生菌である上記（１）〜（４）のいずれかに記載のワクチン。
（６）Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの赤血球凝集活性を阻害する、歯周病の予防または治療のための上記（１）〜（５）のいずれかに記載のワクチン。
（７）経鼻投与用である上記（１）〜（６）のいずれかに記載のワクチン。
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載のワクチンを用いる歯周病の予防または治療方法。
（９）次の１）〜３）のいずれかに記載の蛋白質をコードする塩基配列を含むシャトルベクター。
１）Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの分子量４０−ｋＤａの外膜蛋白質（４０−ｋ−ＯＭＰ）
２）配列表の配列番号１に示す２２〜３４４番目のアミノ酸配列からなる蛋白質
３）配列表の配列番号１に示す２２〜３４４番目のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であって、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る蛋白質
（１０）ポリ−γ−グルタミン酸シンテターゼ複合体を構成している遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣおよびｐｇｓＡのいずれか一つまたは二つ以上を含む表面発現用のベクターを含む上記(９)に記載のシャトルベクター。
（１１）Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの分子量４０−ｋＤａの外膜蛋白質（４０−ｋ−ＯＭＰ）をコードする塩基配列を含むシャトルベクターｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０。
（１２）配列表配列番号２に記載の塩基配列からなる上記（１１）に記載のシャトルベクターｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により得られたワクチンは、従来のアジュバントとしてコレラ毒素を用いたワクチンと比較すると人体への安全性が高く、かつ、同程度の免疫増強効果を維持しており有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の「ワクチン」とは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る歯周病の予防または治療のための経粘膜投与用ワクチンのことをいう。
本発明において、ワクチンは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る抗原を含むものであれば、いずれのものも用いることができる。本発明で誘導される免疫には、細胞性免疫と体液性免疫のいずれも含む。
【００１１】
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る抗原としては、例えば、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質である４０−ｋ−ＯＭＰが挙げられる。また、配列表の配列番号１に示される２２〜３４４番目のアミノ酸配列を有する蛋白質や、このアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であって、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る蛋白質等が挙げられる。さらに、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質や、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質であって、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る蛋白質等が挙げられる。
【００１２】
本発明の「ワクチン」を得るために、乳酸菌に抗原を発現させるには、乳酸菌ディスプレイ技術を用いる事が好ましい。乳酸菌ディスプレイ技術とは、ポリ−γ−グルタミン酸シンテターゼ複合体を構成している遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣおよびｐｇｓＡのいずれか一つまたは二つ以上を含む表面発現用のベクターを用いて外来タンパク質を乳酸菌の表面に発現させる技術である。
【００１３】
本発明の表面発現用のベクターは、ポリ−γ−グルタミン酸シンテターゼ複合体を構成している遺伝子のうち、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣまたはｐｇｓＡのいずれか一つまたは二つ以上を含む表面発現用のベクターであればいずれのものも用いる事ができる。ｐｇｓＡを含むものであることが好ましく、ｐｇｓＡを含む形質転換ベクターｐＫＴ１を用いることが特に好ましい。
そして、この表面発現用のベクター中に、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る蛋白質をコードする遺伝子を挿入することによりシャトルベクターを構築し、これを用いて形質転換した乳酸菌を培養することで、本発明の抗原を発現させた乳酸菌を得ることができる。
【００１４】
本発明のシャトルベクターは、乳酸菌の表面に抗原を発現させることができるシャトルベクターであればいずれのものも用いる事ができるが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの分子量４０−ｋＤａの外膜蛋白質（４０−ｋ−ＯＭＰ）、配列表の配列番号１に示す２２〜３４４番目のアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列表の配列番号１に示す２２〜３４４番目のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であって、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る蛋白質のいずれかをコードする塩基配列を含むシャトルベクターであることが好ましい。
さらに、ポリ−γ−グルタミン酸シンテターゼ複合体を構成している遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣおよびｐｇｓＡのいずれか一つまたは二つ以上を含む表面発現用のベクターを含むシャトルベクターであることが好ましく、特に、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの分子量４０−ｋＤａの外膜蛋白質（４０−ｋ−ＯＭＰ）をコードする塩基配列を含むシャトルベクターｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０であることが好ましい。シャトルベクターｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０の塩基配列を配列表配列番号２に示した。
【００１５】
抗原を発現させる乳酸菌としては、人体に安全な乳酸菌であればいずれも用いる事ができる。例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属や、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属等が挙げられ、具体的な種としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉやＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ等が挙げられる。このうち、一般的に広く食品の発酵に使用されており安全性が高いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉを用いる事が特に好ましい。
【００１６】
本発明の抗原を発現させた乳酸菌として、具体的にはＮＩＴＥ  Ｐ−４１８等が挙げられる。
抗原を発現させた乳酸菌は生菌、死菌のいずれも用いる事ができる。これらの乳酸菌はワクチンとしての効果以外にも、乳酸菌本来が持つ免疫賦活化能や生体に対する効果を付与できるため有用である。
さらに死菌は、このような乳酸菌本来の機能を示しつつ、組換え体が不活化されているため、組換え体による影響を心配する必要がない。また、組換え生物とはみなされないため、カルタへナ法の範疇には入らず、取り扱いが簡単である。
このように本発明の抗原を発現させた乳酸菌は、人体に安全であり、かつ、良い働きをする菌であることから、プロバイオテクス乳酸菌として食品等に利用することもできる。
【００１７】
本発明のワクチンは、抗原を発現させた乳酸菌をそのまま用いる事ができる。また、必要に応じて、液剤、懸濁剤、粉末剤等に製剤化したものを本発明のワクチンとして用いることもできる。液剤としては、抗原を発現させた乳酸菌を精製水、緩衝液などに溶解したものなどが挙げられる。懸濁剤としては、抗原を発現させた乳酸菌をメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カゼインなどと一緒に精製水、緩衝液などに懸濁させたものなどが挙げられる。粉末剤としては、抗原を発現させた乳酸菌をメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどとともによく混合したものなどが挙げられる。これらの製剤には、通常使用されている吸収促進剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤、防湿剤、保湿剤、溶解剤などを必要に応じて添加することができる。
【００１８】
本発明のワクチンは、経粘膜投与用であり、経鼻または経口により投与することが好ましい。経鼻または経口投与は、従来の注射免疫と比べて次の１）〜３）のメリットを有するため好ましい。１）血清中に抗体応答が誘導される以外に、唾液等の分泌液中にも抗体応答が誘導される。病原性微生物の侵入経路が分泌液を産生する粘膜組織であることを考えると、微生物の侵入を入口で阻止できることになり有用である。２）注射免疫の場合に発生する可能性のある針刺し事故、重篤な副作用等を避けることができる。３）注射ワクチンでは滅菌注射筒、注射針等の準備が必要であるが、それに比べてワクチン接種が簡便である。
さらに、経鼻投与は生体の反応性・感度が高いという点で好ましく、経口投与は利便性が高いという点で好ましい。本発明のワクチンは、通常、液状あるいは粉末状の形態で、鼻腔内あるいは口腔内に滴下、噴霧あるいはスプレーすることにより投与することができる。
【００１９】
本発明のワクチンは、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、通常成人１人当たり、一回１００ｍｇ〜５０００ｍｇの範囲、好ましくは１００ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲で、数週間から数ヶ月に亘って、１２回〜１５回投与することが好ましい。
本発明のワクチンは、経粘膜投与することにより、唾液、鼻腔液等および血清の双方に外膜蛋白質特異的抗体の産生が誘導され、さらには、産生されたこれらの特異的抗体は、歯周病の発症および進展に深く関わっているＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの赤血球凝集活性を有意に阻害する。従って、本発明のワクチンは、歯周病の予防または治療用の粘膜免疫ワクチンとして極めて有効である。
【００２０】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
＜経粘膜投与用ワクチンの作製＞
次の１〜５または１〜６の工程により、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの外膜蛋白質に対する免疫応答を惹起させ得る抗原を発現した乳酸菌を得て、これを有効成分とするワクチンを作製した。
【００２２】
１．大腸菌−乳酸菌用シャトルベクターｐＬＣＥ３の作製
大腸菌／乳酸菌シャトルベクターの構築のために、大腸菌レプリコンｐＭβ１とエリスロマイシン耐性遺伝子（Ｅｒｍ）を含有する領域をｐＬＣ４９４由来（特願２００５−２７８８３０：出願人岡山大学・ジェノラックＢＬ）の反復領域およびｒｅｐＡ遺伝子と連結した。
構築した大腸菌／乳酸菌シャトルベクターをヒートショック法で大腸菌（ＤＨ５α）へ形質転換し、その後アルカリ溶解法によって単離した。この大腸菌／乳酸菌シャトルベクターをｐＬＣＥ３と命名し、図１ａ．に示した。ｐＬＣＥ３ベクターの塩基配列は配列表配列番号３に示した。
【００２３】
２．形質転換ベクターの構築
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌株由来のポリγグルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうちｐｇｓＡ（特表２００５−０５０００１号公報）を用いて、歯周病菌のタンパク質抗原ｐｇ４０を表層発現させることのできる形質転換ベクターを構築した。
まず、ポリγグルタミン酸合成遺伝子の１つであるｐｇｓＡ遺伝子を含む発現カセットＰ−ｌｄｈ  ＵＴＬＳ（神戸大学より分譲を受けた）−ｐｇｓＡ−ｌｉｎｋｅｒ領域を鋳型とし、配列表配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドおよび配列表配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドを各プライマーとして用いたＰＣＲ反応〔９５℃・５分／（９５℃・１分／５５℃・３０秒／７２℃・３０秒：３０サイクル）／７２℃・１分／１５℃〕を行った。増幅させた遺伝子領域の両端は、両プライマーにて制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩの認識配列を含有するように構成した。反応終了後はＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔａｃｔ  Ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社）を用いて増幅断片を精製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで消化した。その後、同じ制限酵素で処理したｐＬＣＥ３へ導入し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。この形質転換ベクターをｐＫＴ１と命名し、図１ｂ．に示した。
【００２４】
３．シャトルベクターｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０の構築
次に、４０−ｋ−ＯＭＰをコードするｐｇ４０遺伝子を鋳型として使用し、配列表配列番号６に記載のオリゴヌクレオチドおよび配列表配列番号７に記載のオリゴヌクレオチドを各プライマーとして用いたＰＣＲ反応〔９５℃・５分／（９５℃・１分／５５℃・３０秒／７２℃・２分：３０サイクル）／７２℃・２分／１５℃〕を行った。鋳型として用いた４０−ｋ−ＯＭＰをコードするｐｇ４０遺伝子の塩基配列を配列表配列番号８に示した。
増幅させた遺伝子領域の両端は、両プライマーにて制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩの認識配列を含有するように構成した。反応終了後はＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔａｃｔ  Ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社）を用いて増幅断片を精製し、制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化した。その後、同じ制限酵素で処理したｐＫＴ１へ導入し、シャトルベクターを構築した。構築されたシャトルベクターは、ｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０と命名し、図２に示した。このシャトルベクターｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０の塩基配列は配列表配列番号２に示した。
構築したシャトルベクターｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０をヒートショック法にて大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。得られた形質転換株をＬＢ液体培地で培養し、菌体を回収後、Ｗｉｚｅａｒｄ  （登録商標）Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にてシャトルベクターｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０を抽出した。
【００２５】
４．乳酸菌の形質転換
上記３．にて抽出したシャトルベクターｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０を、種々のプロトコール（Ｂｅｒｔｈｉｅｒ，Ｆ．ら、Ｃｏｆｆｅｙ，Ａ．ら、ＧＡＳＳ  ＯＮ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｓｅｒｒｏｒ，Ｐ．ら、）に従って、エレクトロポレーションによって、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９株へ形質転換を行った。
即ち、ＤＮＡとコンピテント乳酸菌とを混合し、これらを氷上で３０秒間維持した。形質転換する細胞試料を０．１ｃｍキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移し、そしてジーンパルサー（ピーク電圧１．５ｋＶ；静電容量２５ｕＦ；抵抗２００Ω；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で形質転換した。次いで形質転換した乳酸菌を２０ｕｇ／ｍｌエリスロマイシンを含有するＭＲＳ寒天培地上に播種し、生細胞を選抜した。形質転換で得られた乳酸菌のコロニーは、コロニーＰＣＲによりシャトルベクターｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０の導入が確認された。
【００２６】
５．ｐｇｓＡ−ｐｇ４０の発現確認
ｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０形質転換株のタンパク質発現を確認するためにウエスタンブロッティング法を実施した。
まず、上記４．で得られた形質転換体をＭＲＳ液体培地で３７℃の設定温度で２４時間培養し、７０００ｒｐｍ，１０分間の遠心分離にて菌体を回収した。回収した菌体はＰＢＳ緩衝液にて洗浄後、超音波破砕機（出力４、２分間×２回／トミー精工社）にて破砕した。その破砕液をサンプルバッファーに懸濁後１００℃で１０分間熱変性させＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後、ＰＶＤＦメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。ＰＶＤＦメンブランをブロッキング緩衝溶液（ＰＢＳ、５％スキムミルク）で１時間振とうし、ブロッキングさせた後、ｐｇ４０ポリクローナル抗体（日本大学より分譲を受けた）を１次抗体として３７℃で１時間反応させた。反応終了後、メンブランをＴＢＳＴ緩衝溶液にて洗浄し、ビオチン標識された抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ社）を２次抗体として３７℃で１時間反応させた。反応終了後、メンブランを洗浄しＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ  ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｖｅｃｔｏｒ社）にてアビジン化し、さらにＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ  ＤＡＢ／Ｎｉ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｖｅｃｔｏｒ社）にて発色させｐｇｓＡ−ｐｇ４０融合タンパク質の発現を確認した。結果を図３に示した。
上記１〜５の工程によって得られたｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０形質転換株をそのまま（生菌）、または死菌としてワクチンに用いた。この株の死菌化工程は、以下６．に示した。
【００２７】
６．ｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０形質転換株の死菌化
上記１〜５の工程によって得られたｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０形質転換株は、特開２００７−１３１６１０号公報に記載の方法により死菌化した。即ち、乳酸菌の基本培地に０．１〜１重量％の界面活性剤および０．０１〜０．１重量％の炭酸塩を加え、培養時に培養液のｐＨを６．０〜７．０に保持しながら培養した後、培養液を８０〜１２０℃において５〜３０分間熱処理することで死菌化した。
【実施例２】
【００２８】
＜経粘膜投与用ワクチンの免疫応答誘導能の確認＞
１．材料と方法
１）マウス
マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）８週齢雌は、三協ラボサービス株式会社から購入した。
２）経粘膜投与用ワクチン
上記の実施例１で作製したｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０形質転換株の死菌の凍結乾燥標品をワクチンとして用いた。
３）免疫方法
ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、粘膜免疫投与用ワクチン（以下、ＢＬＳ（ＰＧ４０）とする）（１ｍｇ／２０μｌ）を溶解したリン酸緩衝液をマウスの鼻腔に片鼻１０μｌずつ滴下して、週３回（３日連続）、計１２〜１５回投与した。コントロールとして形質転換していないＬｂ．ｃａｓｅｉ  Ｌ−４９株（以下、ＢＬＳとする）を用い、比較として４０−ｋ−ＯＭＰ（以下、ＰＧ４０とする）を用いてマウスの鼻腔に同様に投与した。
【００２９】
４）特異的抗体の検出
ＢＬＳ（ＰＧ４０）で免疫したマウスの唾液における抗原特異的ＩｇＡ抗体価、また、血清における抗原特異的ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体価をＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて測定した。抗体価は、免疫群（ＢＬＳ（ＰＧ４０）またはＰＧ４０）とコントロール群（ＢＬＳ）を段階希釈して各ウェルの吸光度を比較し、値の差が０．１以上を示したウェルの最大希釈濃度とした。抗原特異的な抗体産生細胞数は、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）法を用いて測定した。各ウェルのスポット数を顕微鏡（ＯＬＩＭＰＵＳ  ＳＺＨ１０）にて算定した。
【００３０】
５）唾液腺からのリンパ球の分離調整
免疫したマウスから摘出した唾液腺を、コラゲナーゼ（０．３ｍｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ  １６４０で３７℃、２０分、３回処理し、得られた細胞浮遊液を４００×ｇ、８分間遠心沈殿した。次に、１００％Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、２％ＮＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で希釈し、５０％  Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液に調整して細胞を浮遊させた。また、７５％  Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液を調整した後、７５％  Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液に５０％  Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液を重層し、２０℃で６００×ｇ、２０分間遠心沈殿させた。その後、７５％  Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液と５０％  Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液の間の層からリンパ球を分離、洗浄し、トリパンブルーを加え、血球算定板にてリンパ球を測定した。得られたリンパ球は、２％ＮＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０に浮遊させ４００×ｇ、８分間遠心沈殿した。洗浄後、血球算定板にてリンパ球数を測定した。
【００３１】
２．結果
１）特異的抗体産生能
ＢＬＳ（ＰＧ４０）の経鼻免疫によって、粘膜系で抗原特異的な免疫応答が効果的に誘導されているかを測定するために、ＢＬＳ（ＰＧ４０）を週３回（３日連続）、計１２〜１５回経鼻投与し、最初に投与した日から３週間経過後、４週間経過後および５週間経過後の唾液中の抗原特異的なＩｇＡ抗体価を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した結果を図４ａ．に示した。
図４ａ．から分かるように、ＰＧ４０で免疫した群の唾液中には、抗体価の上昇は認められなかった。しかしながら、ＢＬＳ（ＰＧ４０）で免疫した群の唾液中には顕著な抗原特異的抗体価が検出された。
ＢＬＳ（ＰＧ４０）で免疫した群の抗原特異的抗体価は、アジュバントとしてコレラ毒素を用いた４０−ｋ−ＯＭＰのワクチンと同程度の免疫増強効果を示していることから（参考文献、図１Ａ参照）、本発明のＢＬＳ（ＰＧ４０）が、アジュバントとしてコレラ毒素を用いた従来のワクチンと同程度の免疫増強効果を維持していることが確認された。
また、経鼻免疫したマウスの血清中の抗原特異的抗体価の測定結果を図５に示した。図５から分かるように、ＰＧ４０で免疫した群、ＢＬＳ（ＰＧ４０）で免疫した群ともに血清中に抗原特異的ＩｇＧ、ＩｇＡ抗体価の上昇が認められた。なお、図４ａ．および図５は、１群４匹のマウスを用いて計３回行った時の平均値および標準偏差を示している。
参考文献：特開２００３−２８６１９１号公報
【００３２】
２）抗原特異的抗体産生細胞数の測定
ＢＬＳ（ＰＧ４０）の経鼻免疫によって得られた唾液中のＩｇＡ抗体が唾液腺由来の抗体産生細胞から誘導されたものであるか、あるいは血清からのコンタミネーションであるかを明確にするために、ＢＬＳ（ＰＧ４０）を週３回（３日連続）、計１２〜１５回経鼻投与し、最初に投与した日から５週間経過後の唾液腺の抗原特異的抗体産生細胞数の測定をＥＬＩＳＰＯＴ法により行った結果を図４ｂ．に示した。コントロールとしてＢＬＳ、比較としてＰＧ４０を用いた。
図４ｂ．から分かるように、ＢＬＳ（ＰＧ４０）で免疫した群の唾液腺内に、顕著な数の抗原特異的ＩｇＡ抗体産生細胞が検出された。なお、図４ｂ．は、１群４匹のマウスを用いて計３回行った時の平均値および標準偏差を示している。
ＢＬＳ（ＰＧ４０）で免疫した群の抗原特異的抗体産生細胞数は、アジュバントとしてコレラ毒素を用いた４０−ｋ−ＯＭＰのワクチンを用いた場合の唾液腺における抗原特異的抗体産生細胞数と同程度であることから（参考文献、図２Ａ参照）、本発明のＢＬＳ（ＰＧ４０）が、アジュバントとしてコレラ毒素を用いた従来のワクチンと同程度の免疫増強効果を維持していることが確認された。
【実施例３】
【００３３】
＜Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの赤血球凝集活性に対する阻害効果の確認＞
１．材料と方法
１）ベジクルの採取
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ３８１を培養し、ベジクルを含む培養上清を採取してｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．）にて濃縮した。濃縮後、０．５  ｍＭのｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌを含む５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで透析し、遠心沈澱にてベジクルを回収した。
２）抗体の精製
マウスの血清からＨｉＴｒａｐ（登録商標）ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ  ｃｏｌｕｍｎ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＩｇＧ抗体（以下、ＢＬＳ＋ＰＧ４０とする）を精製した。
【００３４】
３）赤血球凝集試験
９６穴マイクロタイタープレートのウェルに各濃度（０、５０、１００、１５０μｇ／ｍｌ）のＢＬＳ＋ＰＧ４０によって３７℃で１時間、前培養したベジクル浮遊液（０．５μｇ／５０μｌ）と１％マウス赤血球浮遊液（５０μｌ）を混和後、３７℃で１時間培養した。培養後のウェル内の赤血球凝集の有無を確認した。
【００３５】
２．結果
凝集試験の結果を図６に示した。図６から分かるように、ＢＬＳ＋ＰＧ４０を無添加または５０μｌ添加した場合赤血球は凝集されるが、ＢＬＳ＋ＰＧ４０を１００または１５０μｌ添加した場合には赤血球の凝集が起こらなかった。従って、ＢＬＳ＋ＰＧ４０は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの赤血球凝集活性を阻害することが明らかにされた。
【００３６】
以上より、本発明のワクチンは経粘膜投与することにより、血清のＩｇＧ、ＩｇＡ抗体価を上昇させ、また、唾液中の抗原特異的ＩｇＡ抗体価を上昇させる効果を示した。そして、誘導された抗原特異的抗体はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの赤血球凝集活性を顕著に抑制することから、歯周病の予防または治療に有効なワクチンであるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明により得られたワクチンは、人体への安全性が高く、歯周病の予防または治療用のワクチンとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ａ．シャトルベクターｐＬＣＥ３を示した図である（実施例１）。ｂ．発現ベクターｐＫＴ１を示した図である（実施例１）。
【図２】シャトルベクターｐＫＴ１／ｐｇｓＡ−ｐｇ４０を示した図である（実施例１）。
【図３】ｐｇｓＡ−ｐｇ４０融合タンパク質の発現を確認した図である（実施例１）。
【図４】ａ．抗原特異的抗体産生能を示した図である（実施例２）。ｂ．抗原特異的抗体産生細胞数を示した図である（実施例２）。
【図５】抗原特異的抗体産生能を示した図である（実施例２）。
【図６】Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの赤血球凝集活性に対する阻害効果を示した図である（実施例３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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