(57)【要約】【課題】本発明は、新たな自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法、並びに自己免疫疾患の診断方法を提供する。【解決手段】Ｕ１ＲＮＰの遺伝子スプライシング機能を阻害する物質を培養細胞又は実験動物に導入することにより自己免疫疾患を発症させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｕ１ＲＮＰの遺伝子スプライシング制御機能を阻害する物質を培養細胞又は実験動物に導入することにより自己免疫疾患を発症させることを特徴とする自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法。
【請求項２】
上記Ｕ１ＲＮＰの遺伝子スプライシング制御機能を阻害する物質は、Ｕ１ＲＮＰを認識する自己抗体であることを特徴とする請求項１に記載の自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法。
【請求項３】
上記自己抗体は、抗Ｕ１ＲＮＰ自己抗体又は抗Ｓｍ抗体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法。
【請求項４】
上記自己免疫疾患は、肺高血圧症併発混合性結合組織病、全身性エリテマトーデス、肺高血圧症、又は関節リウマチであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法。
【請求項５】
Ｕ１ＲＮＰによりスプライシングが制御される遺伝子に関して、遺伝子スプライシングの異常が起こっているか否かを検出することを特徴とする自己免疫疾患の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法、並びに自己免疫疾患の診断方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患である肺高血圧症併発混合性結合組織病（以下、「ＭＣＴＤ」ともいう）や、関節リウマチ（以下、「ＲＡ」ともいう）の患者では、血管新生因子アンギオポイエチン１（以下、「Ａｎｇ−１」ともいう）のアミノ酸配列において、２６９番目にグリシンが挿入されたスプライシングバリアント（以下、「２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアント」ともいう）が見られることが知られている（特許文献１及び特許文献２を参照）。
【０００３】
ＭＣＴＤ患者は、時として、肺高血圧症（pulmonary hypertension、以下「ＰＨ」ともいう）を併発し、患者を死に至らしめることがある。そのため、ＭＣＴＤ等の自己免疫疾患は、早期に発見し、治療することが求められている。
【０００４】
ＭＣＴＤの診断マーカーには、例えば、非特許文献１に記載されているように、抗Ｕ１ＲＮＰ自己抗体を用いることができる。抗Ｕ１ＲＮＰ自己抗体の標的であるＵ１ＲＮＰは、非特許文献２に記載されているように、スプライシング調節因子として機能することが知られている。
【０００５】
ところで、Ｕ１ＲＮＰは、抗Ｕ１ＲＮＰ自己抗体のみならず、非特許文献３に記載されているように、核内低分子ＲＮＡとタンパクの複合体であるｓｎＲＮＰに対する自己抗体である抗Ｓｍ抗体とも結合することが知られている。抗Ｓｍ抗体は、非特許文献４に記載されているように、全身性エリテマトーデス（以下、「ＳＬＥ」ともいう）患者の一部に、検出されることが知られている。
【特許文献１】特開２００３−２０４７９０号公報（平成１５（２００３）年７月２２日公開）
【特許文献２】特開２００６−２３０２４１号公報（平成１８（２００６）年９月７日公開）
【非特許文献１】Venables PJ. Mixed connective tissue disease. Lupus. 15(3):132-7 (2006)
【非特許文献２】Reed R. Mechanisms of fidelity in pre-mRNA splicing. Curr Opin Cell Biol. 12(3):340-5 (2000)
【非特許文献３】Migliorini P et al., Anti-Sm and anti-RNP antibodies.  Autoimmunity, 38 (1): 47-54 (2005)
【非特許文献４】Tan EM, Antinuclear Antibodies: Diagnostic Markers for Autoimmune Diseases and Probes for Cell Biology. Advances in Immunology.44: 93-151 (1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１及び特許文献２に開示されているように、ＭＣＴＤ患者やＲＡ患者において、Ａｎｇ−１の２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアントが有意に多いことは知られている。しかしながら、このスプライシングバリアントが、ＭＣＴＤやＲＡの発症にどのように関連しているかは全く知られていない。
【０００７】
また、非特許文献１に開示されているように、抗Ｕ１ＲＮＰ自己抗体は、ＭＣＴＤの診断マーカーとして利用可能であることは知られている。しかしながら、抗Ｕ１ＲＮＰ自己抗体が、ＭＣＴＤの発症に関与しているか否かについては、全く知られていない。
【０００８】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、Ａｎｇ−１の２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアントと、自己免疫疾患の発症との関係を明らかにすることにより、新たな自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法、並びに自己免疫疾患の診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、抗Ｕ１ＲＮＰ自己抗体のようなＵ１ＲＮＰの遺伝子スプライシング制御機能を阻害する物質が、遺伝子のスプライシング異常を引き起こすことにより、自己免疫疾患の病態が形成されることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の産業上有用な発明を包含する。
【００１０】
（１）Ｕ１ＲＮＰの遺伝子スプライシング機能を阻害する物質を培養細胞又は実験動物に導入することにより自己免疫疾患を発症させることを特徴とする自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法。
【００１１】
（２）上記Ｕ１ＲＮＰの遺伝子スプライシング機能を阻害する物質は、Ｕ１ＲＮＰを認識する自己抗体であることを特徴とする（１）に記載の自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法。
【００１２】
（３）上記自己抗体は、抗Ｕ１ＲＮＰ自己抗体又は抗Ｓｍ抗体であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法。
【００１３】
（４）上記自己免疫疾患は、肺高血圧症併発混合性結合組織病、全身性エリテマトーデス、肺高血圧症、又は関節リウマチであることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法。
【００１４】
（５）Ｕ１ＲＮＰによりスプライシングが制御される遺伝子に関して、遺伝子スプライシングの異常が起こっているか否かを検出することを特徴とする自己免疫疾患の診断方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明にかかる自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法では、以上のように、Ｕ１ＲＮＰの遺伝子スプライシング機能を阻害する物質を培養細胞又は実験動物に導入する。それゆえ、該培養細胞及び実験動物に自己免疫疾患の病態を形成させることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１７】
＜Ｉ．自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法＞
本発明にかかる自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法（以下、単に「モデル動物作製方法」ともいう）は、Ｕ１ＲＮＰの遺伝子スプライシング制御機能を阻害する物質（以下、「Ｕ１ＲＮＰ阻害物質」ともいう）を、培養細胞又は実験動物に導入する工程（以下、「Ｕ１ＲＮＰ阻害物質導入工程」ともいう）を含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。
【００１８】
上記Ｕ１ＲＮＰ阻害物質導入工程を含む構成によれば、Ｕ１ＲＮＰによりスプライシングが制御される遺伝子に対して、遺伝子スプライシング異常を誘発させることができる。その結果、上記培養細胞又は実験動物に自己免疫疾患の病態を形成させることができる。
【００１９】
つまり、本発明にかかるモデル動物の作製方法は、Ｕ１ＲＮＰ阻害物質を用いて、培養細胞又は実験動物における遺伝子スプライシング異常を誘発させて、該培養細胞又は実験動物に自己免疫疾患を発症させるものである。
【００２０】
本発明にかかるモデル動物作製方法により作製されたモデル細胞又はモデル動物は、自己免疫疾患の病態が形成されている。そのため、該モデル細胞又はモデル動物を用いることにより、自己免疫疾患の診断方法や治療方法、並びに診断キットや治療薬剤の開発に用いることができる。
【００２１】
本発明にかかるモデル動物作製方法によって発症させることが可能な自己免疫疾患は特に限定されるものではない。具体的には、例えば、肺高血圧症併発混合性結合組織病（以下、「ＭＣＴＤ」ともいう）、全身性エリテマトーデス、肺高血圧症、及び関節リウマチ（以下、「ＲＡ」ともいう）等を挙げることができる。
【００２２】
上記Ｕ１ＲＮＰ阻害物質は、特に限定されるものではないが、Ｕ１ＲＮＰに結合して、Ｕ１ＲＮＰの遺伝子スプライシング制御機能を阻害するものであることが好ましく、Ｕ１ＲＮＰと相乗的に標的遺伝子に結合するもの、より詳しくはＵ１ＲＮＰと相乗的に標的遺伝子に結合するものであることがより好ましい。このようなＵ１ＲＮＰ阻害物質としては、具体的には、例えば、Ｕ１ＲＮＰを認識する自己抗体を挙げることができる。また、該自己抗体としては、例えば、抗Ｕ１ＲＮＰ自己抗体、抗Ｓｍ抗体等を挙げることができる。
【００２３】
なお、本明細書において、「遺伝子スプライシング制御機能」とは、ＲＮＡがスプライシングされる際、そのスプライシングを制御する機能を指す。
【００２４】
上記Ｕ１ＲＮＰ阻害物質を投与する対象となる培養細胞及び実験動物は特に限定されるものではない。該実験動物は、非ヒト動物であることが好ましい。非ヒト動物としては、脊椎動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましい。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。これらの中で、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類が好ましく、マウス又はラットがより好ましい。上記培養細胞としては、上記例示した実験動物由来の培養細胞、及びヒト由来の培養細胞を挙げることができる。
【００２５】
上記Ｕ１ＲＮＰ阻害物質によって、スプライシング異常が誘発される遺伝子は特に限定されるものではなく、Ｕ１ＲＮＰによってスプライシングが制御されている遺伝子であればよい。このような遺伝子としては、以下に示すＵ１ＲＮＰ結合コンセンサスＲＮＡ配列を有する遺伝子を挙げることができる。
Ｕ１ＲＮＰ結合コンセンサスＲＮＡ配列：5’-AGGUAAGU-3'
上記遺伝子として、より具体的には、例えば、血管新生因子アンギオポイエチン１（以下、「Ａｎｇ−１」ともいう）遺伝子等を挙げることができる。
【００２６】
Ａｎｇ−１遺伝子のゲノム配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００１１４６に登録されている。Ａｎｇ−１のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）には、少なくとも２つのスプライシングバリアントが存在する。
【００２７】
具体的には、ＮＣＢＩアクセション番号Ｕ８３５０８に登録されている塩基配列の第３１０番目〜第１８０６番目までをオープンリーディングフレーム（以下、「ＯＲＦ」ともいう）とするスプライシングバリアントと、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＢ０８４４５４に登録されている塩基配列の第１番目〜第１４９４番目までをＯＲＦとするスプライシングバリアントである。
【００２８】
前者のスプライシングバリアントの翻訳産物であるタンパク質は、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１１３７及びＡＡＢ５０５５７に登録されているアミノ酸配列からなる。
【００２９】
一方、後者のスプライシングバリアントの翻訳産物であるタンパク質は、ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＢ９１３２５に登録されているアミノ酸配列からなる。
【００３０】
後者のスプライシングバリアントは、ＮＣＢＩアクセション番号Ｕ８３５０８に登録されている塩基配列における第１１１４番目〜第１１１６番目の塩基が欠損している点で、前者のスプライシングバリアントと異なる。
【００３１】
翻訳産物であるタンパク質における違いで言えば、後者のスプライシングバリアントの翻訳産物であるタンパク質は、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１１３７及びＡＡＢ５０５５７に登録されているアミノ酸配列の第２６９番目のグリシン残基が欠損している点で、前者のスプライシングバリアントの翻訳産物であるタンパク質と異なる。
【００３２】
以下、番号Ｕ８３５０８に登録されている塩基配列の第３１０番目〜第１８０６番目までをＯＲＦとするスプライシングバリアント及びその翻訳産物を、Ａｎｇ−１の２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアントともいう。
【００３３】
一方、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＢ０８４４５４に登録されている塩基配列の第１番目〜第１４９４番目までをＯＲＦとするスプライシングバリアント及びその翻訳産物を、Ａｎｇ−１の２６９番目グリシン欠損型スプライシングバリアントともいう。
【００３４】
後述の実施例に記載するように、ＭＣＴＤや、ＲＡのような自己免疫疾患に罹患している患者では、Ａｎｇ−１の２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアントを有する頻度が、健常者と比較して有意に多い。
【００３５】
すなわち、Ａｎｇ−１の２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアントは、自己免疫疾患の発症要因と１つである。
【００３６】
後述の実施例に記載するように、Ａｎｇ−１の２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアントは、Ｕ１ＲＮＰがもつ遺伝子スプライシングの制御機能が阻害されることにより、発生頻度が高くなる。
【００３７】
以上、上記Ｕ１ＲＮＰ阻害物質によって、スプライシング異常が誘発される遺伝子の一実施形態について説明した。本発明はこれに限定されるものではない。すなわち、Ｕ１ＲＮＰによって遺伝子スプライシングが制御されており、Ｕ１ＲＮＰを阻害することにより、複数のスプライシングバリアントを生じうる遺伝子であればよい。
【００３８】
なお、本明細書において、「塩基配列」とは、「核酸配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドの配列として示される。また、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの「塩基配列」は、ＤＮＡ分子又はポリヌクレオチドに対してのデオキシリボヌクレオチドの配列を意図し、そしてＲＮＡ分子又はポリヌクレオチドに対してのリボヌクレオチドの対応する配列（ここで特定されるデオキシヌクレオチド配列における各チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドのウリジン（Ｕ）によって置き換えられる）を意図する。
【００３９】
本発明において、上記Ｕ１ＲＮＰ阻害物質を、培養細胞又は実験動物に導入する方法は特に限定されるものではなく、導入するＵ１ＲＮＰ阻害物質に応じて、適切な方法を選択すればよい。例えば、上記Ｕ１ＲＮＰ阻害物質である抗体を培養細胞に導入する場合、従来公知の細胞内抗体導入試薬を用いて、培養細胞内に上記Ｕ１ＲＮＰ阻害物質を導入することができる。
【００４０】
上記細胞内抗体導入試薬としては、例えば、細胞内抗体導入試薬PULSin(Polyplus transfection社)を挙げることができる。
【００４１】
また、別の実施形態として、上記Ｕ１ＲＮＰ阻害物質を実験動物に導入する場合、例えば、経口、直腸、静脈内、非経口、筋肉内及び皮下経路等で、Ｕ１ＲＮＰ阻害物質を実験動物に投与することにより、該Ｕ１ＲＮＰ阻害物質を該実験動物に導入することができる。
【００４２】
本発明には、本発明にかかるモデル動物作製方法を実施するために利用可能な自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製キット（以下、単に「モデル動物作製キット」ともいう）が含まれる。
【００４３】
本発明にかかるモデル動物作製キットは、その具体的な構成は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、上記Ｕ１ＲＮＰ阻害物質を含むキットが挙げられる。また、上記Ｕ１ＲＮＰ阻害物質を培養細胞又は実験動物に導入するための試薬や器具を含んでいてもよい。
【００４４】
このようなモデル動物作製キットによれば、自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫モデル動物を効率よく作製することができる。
【００４５】
＜ＩＩ．自己免疫疾患の診断方法＞
本発明にかかる自己免疫疾患の診断方法は、Ｕ１ＲＮＰによりスプライシングが制御される遺伝子に関して、遺伝子スプライシングの異常が起こっているか否かを検出する工程（以下、「遺伝子スプライシング異常検出工程」ともいう）を含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。なお、上記Ｕ１ＲＮＰによりスプライシングが制御される遺伝子については、上説したので、ここでは、詳細な説明を省略する。
【００４６】
本発明にかかる自己免疫疾患の診断方法によれば、被験者から分離したサンプルを用いて、特定の遺伝子におけるスプライシングの異常を検出するだけで、簡便に自己免疫疾患を発症しているか否かを診断することができる。つまり、本発明にかかる自己免疫疾患の診断方法は、換言すれば、被験者から分離したサンプルを用いて、自己免疫疾患を診断するためのデータを取得する方法ということもできる。
【００４７】
上記遺伝子スプライシング異常検出工程は、より具体的には、Ｕ１ＲＮＰによりスプライシングが制御される遺伝子に関して、自己免疫疾患の発症要因となる遺伝子スプライシング異常が起こっているか否かを検出する工程である。
【００４８】
例えば、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子として、Ａｎｇ−１遺伝子を用いる場合、上記遺伝子スプライシング異常検出工程では、被験者において、上説したＡｎｇ−１の２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアントが生じているか否かを検出することが好ましい。
【００４９】
上記遺伝子スプライシング異常検出工程において、上記遺伝子におけるスプライシング異常を検出する方法は特に限定されるものではない。
【００５０】
具体的には、例えば、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子のｍＲＮＡ（もしくはｃＤＮＡ）の塩基配列又はその部分配列を解読することにより、該遺伝子におけるスプライシング異常を検出することができる。
【００５１】
より具体的に説明すると、例えば、まず、被験者の細胞より抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製する。次に、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子のｃＤＮＡ又はその部分領域を、ＰＣＲ等の従来公知の核酸増幅方法を用いて、増幅させる。その後、得られた核酸増幅産物をダイレクトシークエンスすることによって、又は、サブクローニングしたのち、当該ＰＣＲ産物部分をシークエンスすることによって、当該遺伝子の特定領域の塩基配列を決定する。
【００５２】
これにより、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子におけるスプライシング異常の有無を知ることができる。
【００５３】
例えば、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子として、Ａｎｇ−１遺伝子を用いる場合、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１１３７又はＡＡＢ５０５５７に登録されているアミノ酸配列の第２６９番目のアミノ酸残基であるグリシン残基をコードする３塩基の有無から、Ａｎｇ−１遺伝子におけるスプライシング異常の有無を知ることができる。
【００５４】
この場合、上記グリシン残基をコードする３塩基が存在すれば、Ａｎｇ−１遺伝子においてスプライシング異常が起こっていると判定することができる。一方、上記グリシン残基をコードする３塩基が存在しなければ、Ａｎｇ−１遺伝子においてスプライシング異常が起こっていないと判定することができる。
【００５５】
また、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子の特定領域（好ましくは、スプライシング異常により塩基配列に変化が生じる領域）における塩基配列の相違を、オリゴヌクレオチドプローブを用いることによって検出することができる。
【００５６】
このような方法によれば、例えば、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子として、Ａｎｇ−１遺伝子を用いる場合、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１１３７又はＡＡＢ５０５５７に登録されているアミン酸配列の第２６９番目のアミノ酸残基であるグリシン残基をコードする３塩基の有無を知ることができる。
【００５７】
このようにプローブに用いる方法としては、例えば、Ａｎｇ−１遺伝子の特定領域の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをチップ上に固定してＤＮＡチップを構成し、当該ＤＮＡチップを遺伝子型解析用に用いる実施形態が挙げられる。この場合、オリゴヌクレオチドプローブの長さとしては、スプライシング異常により塩基配列に変化が生じる領域を含む７〜５０ヌクレオチドであることが好ましく、１０〜３０ヌクレオチドであることがより好ましく、１５〜２５ヌクレオチドであることがさらに好ましい。
【００５８】
上記遺伝子スプライシング異常検出工程の別の実施形態として、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物であるタンパク質のアミノ酸配列又はその部分配列を解読することにより、該遺伝子におけるスプライシング異常を検出することができる。
【００５９】
より具体的に説明すると、この実施形態では、例えば、まず、被験者の細胞や組織より、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を抽出する。その後、必要に応じて、該タンパク質を精製し、一般的なタンパク質のシークエンス方法に準じ、該タンパク質のアミノ酸配列を決定する。
【００６０】
こうして決定したアミノ酸配列をもとに、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子におけるスプライシング異常の有無を検出することができる。
【００６１】
例えば、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子として、Ａｎｇ−１遺伝子を用いる場合、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１１３７又はＡＡＢ５０５５７に登録されているアミン酸配列の第２６９番目のアミノ酸残基であるグリシン残基の有無から、Ａｎｇ−１遺伝子におけるスプライシング異常の有無を知ることができる。
【００６２】
この場合、上記グリシン残基が存在すれば、Ａｎｇ−１遺伝子においてスプライシング異常が起こっていると判定することができる。一方、上記グリシン残基が存在しなければ、Ａｎｇ−１遺伝子においてスプライシング異常が起こっていないと判定することができる。
【００６３】
また、別の方法として、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の各スプライシングバリアントを特異的に認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法やウェスタンブロット法などの免疫化学的手法を用いて、スプライシング異常を検出することもできる。
【００６４】
さらに、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を単離し、直接又は必要に応じ、酵素等で切断し、アミノ酸の等電点を指標にしてスプライシング異常を検出したり、質量分析により測定される質量の差からスプライシング異常を検出したりすることもできる。
【００６５】
本発明にかかる自己免疫疾患の診断方法では、上説したスプライシング異常の検出方法を単独で行ってもよいし、複数の方法を行ってもよい。
【００６６】
本発明には、本発明にかかる自己免疫疾患の診断方法を実施するために利用可能な自己免疫疾患の診断キットも含まれる。
【００６７】
本発明にかかる自己免疫疾患の診断キットの構成は特に限定されるものではなく、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子又はその翻訳産物であるタンパク質において、特定の塩基又はアミノ酸の有無を検出できる試薬を少なくとも含んでいればよい。
【００６８】
そのような試薬としては、例えば、プライマー、プローブ、及び抗体などを挙げることができる。これらの試薬は、単独で含まれてもよく、また、複数が組み合わされて含まれていてもよい。さらに、本発明にかかる自己免疫疾患の診断キットは、上記例示する試薬に加えて、その他の試薬を組み合わせることによっても得ることができる。
【００６９】
具体的には、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いて、スプライシング異常を検出するキットとしては、当該遺伝子もしくはその一部の特定領域、好ましくはスプライシング異常により塩基配列が変化する領域を増幅できるように設計されたプライマーや、特定のスプライシングバリアントに特異的にハイブリダイズするプローブを含み、さらに、制限酵素、マクサムギルバート法及びサンガー法などの塩基配列決定法に利用される試薬などを１つ以上組み合わせたキットが挙げられる。
【００７０】
なお、かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素、プローブなど標識するために使用する試薬（例えば、標識がビオチンの場合には、アビジン酵素結合物及び酵素基質及び発色団）等を挙げることができる。さらに、適当な緩衝液及び洗浄液等が含まれていてもよい。
【００７１】
また、スプライシング異常を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を用いて該遺伝子のスプライシング異常を検出するキットとしては、例えば、特定のスプライシングバリアントを特異的に認識する抗体を含み、さらに、当該抗体を用いて、スプライシング異常により変化するアミノ酸残基の有無を検出するために用いる試薬や器具などを１つ以上組み合わせたキットが挙げられる。
【００７２】
かかる試薬としては、例えば、抗体を標識するために使用する試薬（例えば、標識がビオチンの場合には、アビジン酵素結合物及び酵素基質及び発色団）、上記抗体を１次抗体として用いる場合、それに対応する２次抗体、ブロッキング試薬等を挙げることができる。また、かかる器具としては、例えば、タイタープレート等を挙げることができる。さらに、適当な緩衝液や洗浄液などが含まれていてもよい。
【００７３】
このようなキットによれば、簡便に自己免疫疾患を診断するためのデータを取得することができる。医療従事者は、本発明にかかるキットを用いて得られたデータに基づいて、被験者が自己免疫疾患を発症していることを診断することができる。
【００７４】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７５】
本発明について、実施例、並びに図１〜図３に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、及び改変を行うことができる。
【００７６】
〔実施例１：Ａｎｇ−１の２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアントの頻度解析〕
ＭＣＴＤ患者及びＲＡ患者において認められるＡｎｇ−１の２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアントの頻度を解析した。
【００７７】
具体的には、ＭＣＴＤもしくはＲＡ患者末梢血から常法によりトータルＲＮＡを抽出、逆転写反応を行いoligo dTプライマーによる1st strand cDNAを合成した。これを鋳型に用い、Ａｎｇ−１エクソン４−５にかけて設定した下記のプライマー及び下記条件による２段階ＲＴ−ＰＣＲによりＡｎｇ−１のｃＤＮＡの一部分を単離した。なお、上記の反応に使用したプライマーは、以下に示す通りである。
センスプライマーＦ１：5'-CCACCACAACAGTGTCCTT-3'（配列番号１）
センスプライマーＦ２：5'-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3'（配列番号２）
アンチセンスプライマーＲ１：5'-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3'（配列番号３）。
【００７８】
また、２段階ＲＴ−ＰＣＲの条件は、以下の通りである。まず、第１段階目のＲＴ−ＰＣＲにおける反応液は、５００μｇ／ｍｌ鋳型ｃＤＮＡ １μｌ、Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（ＡＢＩ社）５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2（ＡＢＩ社）３μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ（ＡＢＩ社）５μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー（センスプライマーＦ１及びアンチセンスプライマーＲ１）１μｌ、AmpliTaq Gold DNA-Polymerase （ＡＢＩ社）０．５μｌ、及び滅菌水３３．５μｌを混合して調製した。
【００７９】
第１段階目のＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９５℃で１２分の行程を１サイクル行った後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で１分の行程を３０サイクル行う反応条件とした。
【００８０】
第２段階目のＲＴ−ＰＣＲは、鋳型として第１段階目のＲＴ−ＰＣＲで得られた産物を用い、プライマーとしてセンスプライマーＦ２及びアンチセンスプライマーＲ１を用いたことを除いて、反応液組成及び反応条件とも、第１段階目のＲＴ−ＰＣＲと同一の条件で行った。
【００８１】
得られた断片はＡＢＩ３７７型シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社）により鎖長解析を行い、２６９番目グリシン（ＧＧＴ３塩基）挿入の有無を判定した。
【００８２】
その結果、表１に示すように、χ二乗検定の結果、ＲＡ患者群及びＭＣＴＤ患者群では、健常者（表１中、controlと記載）と比較して、２６９番目グリシン挿入型Ａｎｇ−１の頻度が有意に高いことが明らかとなった。
【００８３】
【表１】
2009136229.tif 000002
【００８４】
なお、図１には、Ａｎｇ−１の２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアントの典型例を示す。
【００８５】
〔実施例２：Ｕ１ＲＮＰタンパク質とＡｎｇ−１ ＲＮＡとの共益的な相互作用の解析〕
実施例１で、ＲＡ患者群及びＭＣＴＤ患者群においてＡｎｇ−１の２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアントの頻度が顕著に高いことが明らかとなったため、ＭＣＴＤの診断マーカーであり、スプライシング調節因子であるＵ１ＲＮＰと結合する抗Ｕ１ＲＮＰ自己抗体と、Ａｎｇ−１ ｍＲＮＡとの相互作用を調べた。
【００８６】
具体的には、Ａｎｇ−１のエクソン４からイントロン４の正常配列を有する部分短鎖ＲＮＡを、Ｈｅｘ蛍光標識を加えて人工合成した。なお、人工合成したＲＮＡの配列は以下の通りである。
合成ＲＮＡ：5’-UCCACAACCUUGUCAAUCUUUGCACUAAAGAAGGUGGUAA-3’（配列番号４）。
【００８７】
上記合成ＲＮＡを用いて、Ａｎｇ−１ＲＮＡ、Ｕ１ＲＮＰタンパク質及びＩｇＧの結合反応を３７℃で、２時間行った。なお、ＩｇＧは、ＭＣＴＤ患者及び健常者末梢血からIgG purification kit-G（同仁堂）を用いて抽出した。また、反応液の組成は、上記合成ＲＮＡ（配列番号４）を１００ｐｍｏｌ、リコンビナントＵ１ＲＮＰタンパク質（ＳＣＩＰＡＣ社）０．１５μｇ、抽出ＩｇＧ ０．１μｇ、ＴＥＢｕｆｆｅｒ  トータル１００μｌとした。
【００８８】
結合反応後、Microcon YM-100（ミリポア社）により限外濾過を行い、タンパク及び抗体結合ＲＮＡを除去した。タンパク質／抗体未結合ＲＮＡをＡＢＩ３１３０型シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社）により鎖長解析を行い蛍光量から半定量解析を行った。
【００８９】
その結果を図２に示す。なお、図２は、Ｕ１ＲＮＰ及びＵ１ＲＮＰ抗体未結合Ａｎｇ−１ＲＮＡ量は投入した全ＲＮＡの蛍光量に対する比率で示した図である。Ｕ１ＲＮＰタンパク質にＵ１ＲＮＰ抗体価の高い（５００以上）患者由来ＩｇＧ（ＭＣＴＤ Ｈｉｇｈ）を加えた場合、抗体価の低い（７４．７）患者（ＭＣＴＤ Ｌｏｗ）及び健常者２名のＩｇＧを加えた場合と比較して、タンパク質／抗体未結合ＲＮＡが減少した。このことから、Ｕ１ＲＮＰタンパク質とＵ１ＲＮＰ抗体とが相乗的にＡｎｇ−１ＲＮＡに結合することが明らかになった。
【００９０】
〔実施例３：抗Ｕ１ＲＮＰ自己抗体の導入によるＡｎｇ−１スプライシングのかく乱〕
実施例２で、Ｕ１ＲＮＰタンパク質とＵ１ＲＮＰ抗体とが相乗的にＡｎｇ−１ＲＮＡに結合することが明らかになったため、次に、抗Ｕ１ＲＮＰ自己抗体を培養細胞内へ導入したときのＡｎｇ−１発現パターンへの影響を調べた。
【００９１】
具体的には、市販抗Ｕ１ＲＮＰ抗体（American Research Products社）を細胞内抗体導入試薬PULSin(Polyplus transfection社)を用いてJurkat細胞に導入した。２４時間培養後、常法によりトータルＲＮＡを抽出した。次に、抽出したＲＮＡを用いて逆転写反応を行い、Oligo dTプライマーによる1st stand cDNAを合成した。このｃＤＮＡを鋳型に用い、Ａｎｇ−１エクソン４−５にかけて設定したプライマー及び下記条件による２段階ＲＴ−ＰＣＲによりＡｎｇ−１のｃＤＮＡの一部分を単離した。
【００９２】
なお、上記の反応のプライマーとしては、実施例１で用いたセンスプライマーＦ１及びＦ２、並びにアンチセンスプライマーＲ１を用いた。
【００９３】
また、２段階ＲＴ−ＰＣＲの条件は、以下の通りとした。まず、第１段階目のＲＴ−ＰＣＲにおける反応液は、５００μｇ／ｍｌ鋳型ｃＤＮＡ １０μｌ、Ｅｘ−Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ社）５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）４μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー（センスプライマーＦ１及びアンチセンスプライマーＲ１）１μｌずつ（計２μｌ）、Ｅｘ−Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社）０．５μｌ、及び滅菌水２８．７５μｌを混合して調製した。
【００９４】
第１段階目のＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９４℃で３０秒、４８℃で３０秒及び７２℃で２分の行程を３５サイクル行う反応条件とした。
【００９５】
第２段階目のＲＴ−ＰＣＲは、鋳型として第１段階目のＲＴ−ＰＣＲで得られた産物１μｌを用い、プライマーとしてセンスプライマーＦ２及びアンチセンスプライマーＲ１を用い、さらに滅菌水の量を３７．７５μｌとしたことを除いて、反応液組成及び反応条件とも、第１段階目のＲＴ−ＰＣＲと同一の条件で行った。
【００９６】
得られた断片はＡＢＩ３１３０型シークエンサーにより鎖長解析を行い、２６９グリシン挿入の有無を判定した。
【００９７】
その結果、図３に示すように、抗Ｕ１ｓｎＲＮＰ抗体を加えた場合、コントロール抗体を加えた場合と比較して、細胞内への抗体導入に関わらずＡｎｇ−１の２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアントが発現しやすいことが明らかになった。
【００９８】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
以上のように、本発明では、Ｕ１ＲＮＰの遺伝子スプライシング制御機能を阻害する物質を培養細胞又は実験動物に導入するため、該培養細胞又は実験動物に自己免疫疾患を発症させることができる。したがって、本発明は、自己免疫疾患のモデル系の構築に用いることができるだけではなく、該モデル系を用いた自己免疫疾患の治療薬剤の製造開発、自己免疫疾患の診断法や診断キットの製造開発など、医療分野、医薬品分野に広く用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、本発明にかかる実施例において、Ａｎｇ−１の２６９番目グリシン挿入型スプライシングバリアントにおける２６９番目グリシン近傍領域の配列解析及び鎖長解析を行った結果を示す図である。図の右側は、配列解析の結果であり、左側は、鎖長解析の結果である。
【図２】図２は、本発明にかかる実施例において、Ｕ１ＲＮＰ及びＵ１ＲＮＰ抗体未結合Ａｎｇ−１ ＲＮＡ量を示す図である。
【図３】図３は、本発明にかかる実施例において、抗Ｕ１ＲＮＰ自己抗体の導入により、Ａｎｇ−１ ＲＮＡのスプライシングがかく乱されることを示す図である。
【図１】
2009136229.tif 000003
【図２】
2009136229.tif 000004
【図３】
2009136229.tif 000005
【配列表】
2009136229000001.app