(57)【要約】【課題】硫酸化ヒアルロン酸を用いて細胞を活性化させ、神経細胞への分化・成熟を促進することができる培地および培養方法を提供すること。【解決手段】細胞を培養して神経分化を誘導するための培地であって、硫酸化ヒアルロン酸を含有する培地を提供する。また、細胞を播種する播種工程Ｓ１と、前記細胞を培養して神経分化を誘導する分化誘導工程Ｓ２とを有する培養方法であって、前記播種工程Ｓ１または前記分化誘導工程Ｓ２において、細胞培養液に硫酸化ヒアルロン酸を添加する培養方法を提供する。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養して神経分化を誘導するための培地であって、硫酸化ヒアルロン酸を含有する培地。
【請求項２】
前記硫酸化ヒアルロン酸の分子量が２０万以上である請求項１に記載の培地。
【請求項３】
前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が０．４以上である請求項１または２に記載の培地。
【請求項４】
前記硫酸化ヒアルロン酸の濃度が１０μｇ／ｍＬ以上である請求項１から３のいずれかに記載の培地。
【請求項５】
ＦＧＦ−２をさらに含む請求項１から４のいずれかに記載の培地。
【請求項６】
前記ＦＧＦ−２の濃度が１０ｎｇ／ｍＬ以上である請求項５に記載の培地。
【請求項７】
前記細胞が未分化の細胞を含む請求項１から６のいずれかに記載の培地。
【請求項８】
前記細胞が外胚葉由来の細胞である請求項１から６のいずれかに記載の培地。
【請求項９】
前記細胞が神経組織由来の細胞である請求項１から６のいずれかに記載の培地。
【請求項１０】
細胞を播種する播種工程と、
前記細胞を培養して神経分化を誘導する分化誘導工程とを有する培養方法であって、
前記播種工程または前記分化誘導工程において、細胞培養液に硫酸化ヒアルロン酸を添加する培養方法。
【請求項１１】
前記分化誘導工程の後に、細胞間の結合を測定することにより神経分化を評価する評価工程を有する請求項１０に記載の培養方法。
【請求項１２】
前記硫酸化ヒアルロン酸の分子量が２０万以上である請求項１０または１１に記載の培養方法。
【請求項１３】
前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が０．４以上である請求項１０から１２のいずれかに記載の培養方法。
【請求項１４】
前記硫酸化ヒアルロン酸の濃度が１０μｇ／ｍＬ以上となるように添加される請求項１０から１３のいずれかに記載の培養方法。
【請求項１５】
前記播種工程または前記分化誘導工程のいずれかにおいて、細胞培養液にＦＧＦ−２がさらに添加される請求項１０から１４のいずれかに記載の培養方法。
【請求項１６】
前記ＦＧＦ−２の濃度が１０ｎｇ／ｍＬ以上となるように添加される請求項１５に記載の培養方法。
【請求項１７】
前記細胞が未分化の細胞を含む請求項１０から１６のいずれかに記載の培養方法。
【請求項１８】
前記細胞が外胚葉由来の細胞である請求項１０から１６のいずれかに記載の培養方法。
【請求項１９】
前記細胞が神経組織由来の細胞である請求項１０から１６のいずれかに記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地および培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
神経損傷箇所を修復するための神経組織再生は長年の研究課題とされており、神経再生のための神経細胞への分化誘導培養、および神経細胞への分化誘導を促す物質について様々な研究が行われている。
【０００３】
最近の研究により、神経系を構成するアストロサイト（星状膠細胞）等のグリア細胞（神経膠細胞）は、神経回路を物理的に維持するだけでなく、神経栄養因子の供給および神経伝達にも寄与する等、神経保護および神経形成に重要な役割を果たしていることが分かってきている（非特許文献１参照。）。
【０００４】
ヒアルロン酸は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の安定性および弾性に寄与し、脳の細胞外マトリクスの形成にも重要な役割を果たしてしていることが知られている。
また、硫酸化の程度を変化させて合成されたヒアルロン酸が、ラットの骨芽細胞において、細胞の増殖および分化に影響することが報告されている（非特許文献２参照。）。
【非特許文献１】Ishibashi T et al, "Astrocytes promote myelination in response  to electrical impulses", Neuron, vol.49, 2006 p. 823&#8211;832
【非特許文献２】Misao Nagahata et al, "A novel function of N-cadherin and Connexin43:marked enhancement of alkaline phosphatase activity in rat calvarial osteoblastexposed to sulfated hyaluronan", Biochemical and Biophysical Research Communications,vol. 315, No. 3, March 12, 2004, p. 603-611
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、硫酸化されたヒアルロン酸が、ラットの骨芽細胞以外の細胞について、増殖・分化にどのような影響があるかについては報告されていない。
【０００６】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、硫酸化ヒアルロン酸を用いて細胞を活性化させ、神経細胞への分化・成熟を促進することができる培地および培養方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、細胞を培養して神経分化を誘導するための培地であって、硫酸化ヒアルロン酸を含有する培地を提供する。
【０００８】
アストロサイトは、活性化されると脱分化して神経前駆細胞となり、オリゴデンドロサイトやアストロサイトのようなグリア細胞および神経細胞（ニューロン）へと再び分化するといわれている。
発明者らは、硫酸化ヒアルロン酸を用いた細胞培養を行うことにより、アストロサイト等のグリア細胞および神経前駆細胞を含む未分化な細胞を活性化させ、神経細胞の増殖・分化を促進できることを見出した。
【０００９】
硫酸化ヒアルロン酸は、その硫酸基の部分が細胞間の相互作用に影響を及ぼして神経栄養因子等の活性化因子の産生・伝達を促進し、そのヒアルロン酸の部分が神経栄養因子等の神経組織の成熟に関わる因子を高濃度に吸着することから、硫酸化ヒアルロン酸を用いることにより、栄養価が非常に高い環境で細胞を培養することができる。
よって、本発明によれば、神経細胞への分化・成熟を著しく促進できるという効果を奏する。また、硫酸化ヒアルロン酸は室温で保存が可能な安定した物質であるため、品質管理が容易であるという利点がある。
【００１０】
上記発明においては、前記硫酸化ヒアルロン酸の分子量が２０万以上であるであることとしてもよい。
発明者らは、分子量が数万程度の硫酸化ヒアルロン酸と比較して、分子量が１０万を超える硫酸化ヒアルロン酸は、神経栄養因子等の活性化因子の産生・伝達を促進して細胞間の相互作用に及ぼす影響がより大きいことを見出した。
よって、本発明によれば、硫酸化ヒアルロン酸を一定量以上の分子量で合成することにより、小さな分子量の硫酸化ヒアルロン酸と比較して、より大きな効果を得ることができる。
【００１１】
上記発明においては、前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が０．４以上であることとしてもよい。好ましくは、前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が１．０以上であることとする。
このようにすることで、より培養細胞の細胞活性を高めることができ、成熟した神経細胞を培養することができる。
また、上記発明においては、前記硫酸化ヒアルロン酸の濃度が１０μｇ／ｍＬ以上であることとしてもよい。
【００１２】
上記発明においては、前記培地がＦＧＦ−２（塩基性線維芽細胞増殖因子）をさらに含むこととしてもよい。
発明者らは、上記硫酸化ヒアルロン酸を用いた細胞培養において、さらにＦＧＦ−２を加えることにより、アストロサイト等のグリア細胞および神経前駆細胞を含む未分化な細胞をさらに活性化させ、神経細胞への増殖・分化を促進し、より成熟させることが可能なことを見出した。
【００１３】
一般的に、細胞が分化する際には、細胞の増殖が停止するとされている。しかし、上記硫酸化ヒアルロン酸およびＦＧＦ−２を用いて培養すれば、細胞を分化誘導して神経細胞へと成熟させながら、同時に増殖させることも可能であるという大きな効果を奏する。
本発明によれば、より成熟した神経細胞を大量に増殖させて移植に用いることができ、より高い治療効果を得ることができる。
好ましくは、前記ＦＧＦ−２の濃度が１０ｎｇ／ｍＬ以上であることとする。
【００１４】
上記発明においては、前記細胞が未分化の細胞を含むこととしてもよい。
このようにすることで、例えば、完全に神経細胞へと分化する前に移植する等、未分化の細胞が有する再生能力を用いて治療効果を高めることができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記細胞が外胚葉由来の細胞であってもよい。
このようにすることで、外胚葉由来の細胞に含まれる未分化な細胞および前駆細胞等を神経細胞へと分化誘導することができる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記細胞が神経組織由来の細胞であってもよい。
このようにすることで、神経組織中の神経前駆細胞および脱分化したアストロサイトを神経細胞へと分化誘導することができる。
【００１７】
また、本発明は、細胞を播種する播種工程と、前記細胞を培養して神経分化を誘導する分化誘導工程とを有する培養方法であって、前記播種工程または前記分化誘導工程において、細胞培養液に硫酸化ヒアルロン酸を添加する培養方法を提供する。
本発明によれば、播種時または培養工程の途中のいずれかから神経細胞への分化誘導を開始することができる。よって、細胞を活性化させ、神経細胞へと分化させる時期を選択することができる。
【００１８】
上記発明においては、前記分化誘導工程の後に、細胞間の結合を測定することにより神経分化を評価する評価工程を有することとしてもよい。
細胞間の結合であるギャップ結合は、隣り合う上皮細胞をつないで小さいイオンや分子を通過させる。並んだ２つの細胞の細胞膜にはコネクソンと呼ばれるタンパク複合体が複数並んでおり、橋渡し構造をなしている。このコネクソンがチャネルとなって、無機イオンや分子量１０００程度の小さい分子が隣接細胞の細胞質間を移動できる。
【００１９】
発明者らは、このようなコネクソンを介してなる細胞間のギャップ結合を評価することにより、神経細胞への分化を評価することが可能であることを見出した。
上記ギャップ結合により、神経組織の成熟を促す神経栄養因子を細胞間で伝達することができる。よって、ギャップ機能の活性化の程度と上記神経栄養因子の伝達による神経細胞の成熟の程度との相互関係により、神経細胞への分化の程度を評価することができる。
本発明によれば、少量のサンプルで簡易に神経細胞への分化を評価でき、移植に適した神経分化の状態であるかについて確認してから移植を行うことができる。
【００２０】
上記発明においては、前記硫酸化ヒアルロン酸の分子量が２０万以上であることとしてもよい。
硫酸化ヒアルロン酸を一定量以上の分子量となるように合成することにより、小さな分子量の硫酸化ヒアルロン酸と比較して、より大きな効果を得ることができる。
【００２１】
上記発明においては、前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が０．４以上であることとしてもよい。好ましくは、前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が１．０以上であることとする。
また、上記発明においては、前記硫酸化ヒアルロン酸濃度が１０μｇ／ｍＬ以上となるように添加されることとしてもよい。
【００２２】
上記発明においては、前記播種工程または前記分化誘導工程のいずれかにおいて、細胞培養液にＦＧＦ−２がさらに添加されることとしてもよい。
このようにすることで、神経細胞に分化させながらさらに増殖を促進することができ、より成熟した治療効果の高い細胞を多く得ることができる。
好ましくは、前記ＦＧＦ−２濃度が１０ｎｇ／ｍＬ以上となるように添加されることとする。
【００２３】
上記発明においては、前記細胞が未分化の細胞を含むこととしてもよい。
このようにすることで、例えば、完全に神経細胞へと分化する前に移植する等、未分化の細胞が有する再生能力を用いて治療効果を高めることができる。
また、上記発明においては、前記細胞が外胚葉由来の細胞であってもよく、神経組織由来の細胞であってもよい。
このようにすることで、完全に未分化な細胞から分化誘導培養を開始することと比較して、神経細胞への成熟が早期に行われ、より早く移植に用いることができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、硫酸化ヒアルロン酸を用いて細胞を活性化させ、神経細胞への分化・成熟を促進することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に、本発明の実施形態に係る培地および培養方法について説明する。
本発明の第１の実施形態に係る培地は、例えば、組織から単離された神経前駆細胞およびアストロサイトを活性化し神経細胞へと分化誘導するための培地である。
つまり、神経細胞用培地に硫酸化ヒアルロン酸を加えた培地を用いた培養により、神経細胞への分化誘導が行われる。
【００２６】
上記培地を用いることにより、上記神経前駆細胞およびアストロサイト含むグリア細胞が活性化されて、神経栄養因子の産生や細胞間結合が促進され、神経栄養因子の伝達が増大することにより、神経前駆細胞および脱分化したアストロサイトを成熟したグリア細胞および神経細胞等に分化誘導することができる。
【００２７】
本発明の第２の実施形態に係る培地は、例えば、組織から単離された神経前駆細胞や神経幹細胞等の未分化な細胞を含む細胞群を活性化させて神経細胞へと分化誘導しながら増殖させるための培地である。
つまり、神経細胞用培地に硫酸化ヒアルロン酸およびＦＧＦ−２を加えた培地を用いた培養により、細胞の増殖および神経細胞への分化誘導が行われる。
【００２８】
上記培地を用いることにより、上記神経前駆細胞や神経幹細胞等の未分化な細胞が活性化されて神経系細胞に分化誘導され、成熟したグリア細胞および神経細胞等を得ることができるだけでなく、同時にこれらの細胞を増殖させることができる。
【００２９】
本発明の第３の実施形態に係る培養方法は、例えば、組織から単離された神経前駆細胞や神経幹細胞等の未分化な細胞を含む細胞群について、ＦＧＦ−２を添加した神経細胞用培地に播種して培養を開始する播種工程Ｓ１と、硫酸化ヒアルロン酸を添加する分化誘導工程Ｓ２を備える培養方法である。
つまり、硫酸化ヒアルロン酸およびＦＧＦ−２を加えた培地を用いた培養方法により、細胞の増殖および神経細胞への分化誘導が行われる。
【００３０】
上記培養方法により、ＦＧＦ−２を添加して培養する播種工程で細胞を増殖させ、硫酸化ヒアルロン酸を添加して培養する分化誘導工程Ｓ２で上記細胞群を活性化させて神経細胞へ分化させることができ、分化した神経細胞を大量に得ることができる。
また、前記硫酸化ヒアルロン酸およびＦＧＦ−２の添加時期は上記実施形態に限定されるものではなく、前記播種工程Ｓ１において、前記硫酸化ヒアルロン酸およびＦＧＦ−２を両方加えた培地に細胞を播種して培養を開始してもよく、前記分化誘導工程Ｓ２において前記硫酸化ヒアルロン酸とＦＧＦ−２とを両方添加して培養することとしてもよい。
【００３１】
本発明の第４の実施形態に係る培養方法は、例えば、組織から単離された神経前駆細胞およびアストロサイトを含む細胞群を播種する播種工程Ｓ１と、硫酸化ヒアルロン酸およびＦＧＦ−２を添加して培養する分化誘導工程Ｓ２と、アストロサイトを含むグリア細胞を活性化および神経細胞への分化を評価するために細胞間の連結を形成するギャップ結合を測定する、ＳＬＤＴ（Scrape-loading and dye transfer：色素移行）法による評価を行う評価工程Ｓ３とを有する培養方法である。
【００３２】
上記培地および上記培養方法により活性化されたグリア細胞および神経分化誘導された細胞について、細胞間の連結を測定することにより、神経細胞への分化の程度を評価することができ、治療の目的に合わせて適切な程度に分化培養された神経細胞を移植に用いることができる。
【００３３】
なお、培養に用いた細胞は上記実施形態のものに限定されるものではなく、神経系の細胞へと分化し得る、いかなる未分化な細胞であってもよく、神経系の前駆細胞であってもよい。
【００３４】
次に、硫酸化ヒアルロン酸の合成方法の一実施例について以下に述べる。
図１は、ヒアルロン酸（Ｈｙａ）および硫酸化ヒアルロン酸（ＳＨｙａ）について、二糖の繰り返し単位の構造を示している。
合成された硫酸化ヒアルロン酸において、繰り返し単位あたりの導入された硫酸基の数は特に限定されるものではなく、２糖残基あたり１〜４個の硫酸基を含むことができる。
【００３５】
硫酸化ヒアルロン酸の合成は、分子量１．５×１０６のヒアルロン酸溶液、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）−ＳＯ３複合体およびＴＭＡ（トリメチルアミン）−ＳＯ３複合体を用いて化学的に硫酸基をヒアルロン酸に導入し、ＤＭＦ−ＳＯ３複合体およびＴＭＡ−ＳＯ３複合体の配合を変化させることにより硫酸化度の異なる硫酸化ヒアルロン酸を作成した。
【００３６】
具体的には、ＤＭＦ（和光純薬工業株式会社製）の１０％ヒアルロン酸溶液にＤＭＦ−ＳＯ３複合体を加えて混合し、０℃で１４時間攪拌した。この反応溶液を希釈し、中和し、アセトンにより析出させた。この析出物を蒸留水に再び溶かしたのちに透析することにより硫酸化ヒアルロン酸を得た。
同様に、ＴＭＡ（Aldrich Chemical 社製）の１０％ヒアルロン酸溶液にＴＭＡ−ＳＯ３複合体を加えて混合し、６０℃で４８時間攪拌した。この析出物から上記と同様の方法により硫酸化ヒアルロン酸を得た。
なお、硫酸化ヒアルロン酸の合成方法は上記実施例に限定されるものではなく、当業者がなしえる公知の合成方法であってもよい。
【００３７】
次に、上述のようにして合成された硫酸化ヒアルロン酸の細胞毒性について確認するために、前記硫酸化ヒアルロン酸を用いて培養した細胞の生存率について以下に述べる。
図２は、上述の方法により硫酸化度が０．４または１．０で合成された硫酸化ヒアルロン酸についての細胞毒性試験の評価を示す。０．１，１，１０，５０，１００μｇ／ｍＬの硫酸化ヒアルロン酸を、１％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）入りＭＥＭ培地に加えて培地として用い、Ｖ７９細胞（チャイニーズハムスター由来細胞）を３７℃、７日間培養してコロニー形成阻害試験を行った。
図２に示されるグラフについて、横軸は硫酸化ヒアルロン酸の濃度を示しており、縦軸は硫酸化ヒアルロン酸を加えていないコントロールと比較した細胞生存率を示している。
【００３８】
硫酸化度が０．４の場合、硫酸化ヒアルロン酸の濃度が１００μｇ／ｍＬであってもコントロールと変わらず細胞生存率（cell viability）が高いことが分かる。また、硫酸化度が１．０の場合、硫酸化ヒアルロン酸の濃度が１０μｇ／ｍＬで培養した場合は、コントロールと変わらず高い細胞生存率を示している。また、硫酸化ヒアルロン酸の濃度が１００μｇ／ｍＬの場合は細胞生存率が少し低下しているが、７５％程度の高い細胞生存率を維持している。
このことから、硫酸化ヒアルロン酸は細胞毒性が非常に低い物質であるといえる。よって、硫酸化ヒアルロン酸を加えて培養を行っても、細胞の生存率に影響を与えることなく高い細胞生存率を維持しながら細胞培養が可能であるといえる。
【００３９】
次に、本発明に係る培地および培養方法の一実施例について、図３から図１１を参照して説明する。
硫酸化ヒアルロン酸およびＦＧＦ−２を加えて培養した細胞の増殖能について以下に述べる。
図３は、硫酸化度が０．４または１．０の硫酸化ヒアルロン酸濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、また、ＦＧＦ−２濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した培地用いて培養した正常ヒトアストロサイト（ＮＨＡ）の増殖についてのグラフを示す。正常ヒトアストロサイトは１％ＦＢＳ入りアストロサイト基本培地（ＡＢＭ）を用いて、２日に一度培地交換をしながら３７℃で８０日間培養した。
【００４０】
図３（ａ）および図３（ｂ）に示されるように、硫酸化度が０．４の硫酸化ヒアルロン酸１０μｇ／ｍＬで培養した細胞は、硫酸化ヒアルロン酸を加えていないコントロール培地を用いて培養した細胞と同様の増殖がみられた。
よって、硫酸化ヒアルロン酸を培養開始時または培養途中で加えても、アストロサイトの増殖能に影響を与えることなく細胞を培養することができるといえる。
硫酸化度が１．０の硫酸化ヒアルロン酸１０μｇ／ｍＬで培養した細胞は、硫酸化ヒアルロン酸を加えていないコントロールと比較して、培養初期は増殖率が少し低下していたが、培養５０日目以降にはコントロールと同様の増殖がみられた。
【００４１】
また、図３（ａ）および図３（ｂ）に示されるように、硫酸化ヒアルロン酸に加えてＦＧＦ−２を添加して培養すると、コントロールと比較して、培養３０日目以降に細胞数が大幅に増加していることが分かる。また図３（ｃ）に示されるように、ＦＧＦ−２のみを添加して培養した場合も、コントロール培養と比較して、培養３０日目以降にかけて細胞が大幅に増殖していることが分かる。
よって、ＦＧＦ−２を培養開始時または培養途中に加えることにより、アストロサイトの増殖能を高めることができ、硫酸化ヒアルロン酸に加えてＦＧＦ−２を添加して培養した場合も、アストロサイト等の神経系細胞の増殖能を高めて培養することができる。
【００４２】
次に、硫酸化ヒアルロン酸およびＦＧＦ−２を加えた培地による培養方法により、上述のように培養した上記正常ヒトアストロサイトの分化誘導に伴う形態変化について図４から図６を参照して以下に述べる。
培養５日目では、図４に示されるように、硫酸化度が１．０の硫酸化ヒアルロン酸１０μｇ／ｍＬで培養した細胞、および硫酸化度が０．４または１．０の硫酸化ヒアルロン酸１０μｇ／ｍＬに加えてＦＧＦ−２を１０ｎｇ／ｍＬを添加して培養した細胞は形態変化がみられ、細胞に突起状の形態が現れていることがわかる。
【００４３】
培養１０日目では、図５に示されるように、硫酸化度が０．４または１．０の硫酸化ヒアルロン酸１０μｇ／ｍＬに加えてＦＧＦ−２を１０ｎｇ／ｍＬを添加して培養した細胞において特に大きな形態変化がみられ、細胞の形態が星状化していることがわかる。
一方、ＦＧＦ−２のみを１０ｎｇ／ｍＬ添加した場合は、硫酸化ヒアルロン酸およびＦＧＦ−２を加えないコントロールと比較して形態変化はみられない。また、硫酸化ヒアルロン酸のみを加えて培養した細胞は、コントロールと比較して形態変化が少しずつ現れて始めている状態である。
よって、硫酸化ヒアルロン酸とＦＧＦ−２とを組み合わせて添加することにより、細胞を活性化させ、神経細胞への分化・成熟をより促進することができるといえる。
【００４４】
培養２０日目では、図６に示されるように、培養開始時と比較して細胞体が大きくなり、拡張していることがわかる。
硫酸化度が０．４の硫酸化ヒアルロン酸１０μｇ／ｍＬに加えてＦＧＦ−２を１０ｎｇ／ｍＬを添加して培養した細胞は、薄くなった細胞体が星状に形態変化している。
【００４５】
一方、硫酸化度が１．０の硫酸化ヒアルロン酸１０μｇ／ｍＬを添加して培養した細胞は、細胞体が薄く拡張することなく、部分的な星状化もみられる。
また、硫酸化度が１．０の硫酸化ヒアルロン酸１０μｇ／ｍＬに加えてＦＧＦ−２を１０ｎｇ／ｍＬを添加して培養した細胞は、細胞体が薄く拡張することなく、細胞形態の星状化が顕著に現れていることがわかる。
【００４６】
次に、硫酸化ヒアルロン酸およびＦＧＦ−２を加えた培地による培養方法により、上述のように培養した上記正常ヒトアストロサイトの分化誘導に伴う遺伝子レベルでの発現およびタンパク質レベルでの発現の変化について図７から図１１を参照して以下に述べる。
図７は、正常ヒトアストロサイトについて、ＧＦＡＰ（グリア細胞繊維性酸性タンパク質）およびＮｅｓｔｉｎ（ネスチン）のｍＲＮＡの発現を示すグラフである。ＧＦＡＰは成熟したアストロサイト等のグリア細胞の指標とされており、Ｎｅｓｔｉｎは神経前駆細胞を含む未分化な細胞（幹細胞）の指標とされている。
【００４７】
図７に示されるように、硫酸化ヒアルロン酸およびＦＧＦ−２を加えないコントロールと比較して、硫酸化度が１．０の硫酸化ヒアルロン酸を１０μｇ／ｍＬおよびＦＧＦ−２を１０ｎｇ／ｍＬとなるように、それぞれについて添加した場合であっても、両方添加した場合であっても、ＧＦＡＰおよびＮｅｓｔｉｎの両方について、有意にｍＲＮＡの発現が増加している。
硫酸化ヒアルロン酸とＦＧＦ−２とを両方添加した場合に、ＧＦＡＰについてもＮｅｓｔｉｎについても、それぞれについて添加した場合と比較して、さらに高く発現していることがわかる。
【００４８】
図８は、正常ヒトアストロサイトについての抗体染色を示している。ＧＦＡＰタンパク質を発現している細胞について細胞質が染色されていることを示している。コントロールの細胞が確認できるように、細胞核はすべての細胞について染色されている。
硫酸化度が１．０の硫酸化ヒアルロン酸を１０μｇ／ｍＬおよびＦＧＦ−２を１０ｎｇ／ｍＬとなるようにそれぞれについて添加した場合、コントロールと比較してＧＦＡＰの発現が高くなっていることがわかる。
【００４９】
さらに、硫酸化ヒアルロン酸とＦＧＦ−２とを両方添加した場合は、それぞれについて添加した場合と比較して、ＧＦＡＰが最も高く発現していることがわかる。
よって、硫酸化ヒアルロン酸とＦＧＦ−２とを組み合わせて添加することにより、細胞を活性化させ、神経細胞への分化・成熟をより促進することができるといえる。
【００５０】
次に、正常ヒトアストロサイトについて、ＳＬＤＴ法により、細胞と細胞どの連結、つまりギャップジャンクション依存性細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）の評価を行った。
具体的には、培養したコンフルエント状態の細胞表面にカミソリで直線的に切れ目をつけて、蛍光色素を加えた。次に洗浄を行い、蛍光顕微鏡で観察した。また、蛍光色素が細胞間のギャップ結合により流入した長さをイメージスキャナにより測定した。
【００５１】
図９は上記ＳＬＤＴ法による、硫酸化度が１．０の硫酸化ヒアルロン酸１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬを添加して培養した場合のギャップ結合の評価を示している。
図９（ａ）に示されるように、硫酸化度が１．０の硫酸化ヒアルロン酸１０μｇ／ｍＬを添加して培養した場合には、蛍光色素が細胞に流入した長さが有意に長くなっており、図９（ｂ）に示される蛍光顕微鏡写真からも、コントロールと比較して、細胞間の連結を通じて流入している蛍光色素量が多いことがわかる。
【００５２】
よって、硫酸化ヒアルロン酸を加えて培養することにより、ギャップ機能が上昇して細胞間のギャップ結合の形成が促進されて神経栄養因子等が伝達され、アストロサイト等の活性化および神経細胞への分化が促進されていることがわかる。
また、上記細胞について、細胞間の情報伝達を介して細胞間の恒常性維持に働くことが知られているコネキシン（Ｃｘ）遺伝子の発現を測定したところ、アストロサイトに特異的に発現するＣｘ２６，Ｃｘ４３およびアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに特異的に発現するＣｘ３２の遺伝子発現がみられた（図示せず）。
【００５３】
図１０および図１１は、アストロサイトについて各神経栄養因子のｍＲＮＡの発現を示している。
ＦＧＦ−２のみを１０ｎｇ／ｍＬで添加して培養した場合は、Ｍｉｄｋｉｎｅ（ヘパリン結合性の成長因子）およびＮＧＦ（神経成長因子）については、コントロールと比較して、有意なｍＲＮＡの発現がみられたが、ＦＧＦ−２、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）およびＩＧＦ-１（インスリン様増殖因子Ｉ）については、有意なｍＲＮＡの発現はみられなかった。
【００５４】
硫酸化度が１．０の硫酸化ヒアルロン酸１０μｇ／ｍＬのみを添加した場合は、ＦＧＦ−２、Ｍｉｄｋｉｎｅ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびＩＧＦ-１の全てについて有意なｍＲＮＡの発現がみられた。
【００５５】
硫酸化度が１．０の硫酸化ヒアルロン酸１０μｇ／ｍＬに加えてＦＧＦ−２を１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加して培養した場合は、コントロールと比較して、ＢＤＮＦについては有意なｍＲＮＡの発現がみられなかったが、ＮＧＦおよびＩＧＦ-１については有意なｍＲＮＡの発現がみられた。ＦＧＦ−２およびＭｉｄｋｉｎｅについては、硫酸化ヒアルロン酸またはＦＧＦ−２を単独で添加した場合よりも、コントロールと比較して、さらに有意なｍＲＮＡの発現がみられた。
【００５６】
このことから、硫酸化ヒアルロン酸とＦＧＦ−２とを目的に応じて組み合わせて添加し、細胞培養を行うことにより、神経栄養因子の産生がより活性化され、アストロサイトを含むグリア細胞等の神経系細胞をより活性化することができ、神経細胞への分化・成熟をより促進することができるといえる。
したがって、活性化された増殖能の高い細胞および成熟した細胞を得ることができ、これらの細胞を用いることにより、治療効果の高い神経再生のための移植を行うことができる。
なお、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において適宜変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ヒアルロン酸および硫酸化ヒアルロン酸の構造を示す。
【図２】硫酸化ヒアルロン酸についての細胞毒性試験の評価を示すグラフである。
【図３】細胞の増殖を示すグラフである。
【図４】分化誘導に伴う細胞の形態変化を示す顕微鏡写真である。
【図５】分化誘導に伴う細胞の形態変化を示す顕微鏡写真である。
【図６】分化誘導に伴う細胞の形態変化を示す顕微鏡写真である。
【図７】ＧＦＡＰおよびＮｅｓｔｉｎのｍＲＮＡの発現を示すグラフである。
【図８】ＧＦＡＰについての抗体染色を示す顕微鏡写真である。
【図９】ギャップ結合の評価を示す（ａ）グラフおよび（ｂ）顕微鏡写真である。
【図１０】神経栄養因子のｍＲＮＡの発現を示すグラフである。
【図１１】神経栄養因子のｍＲＮＡの発現を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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