(57)【要約】【課題】蛍光強度の変化を指標にして、ＮＭＤＡ受容体のリガンドの濃度を測定するバイオセンシング方法を提供するとともに、酸素が存在する状況下であっても高感度に亜酸化窒素を検出できるバイオセンサを提供すること。【解決手段】本発明は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質の蛍光の強度変化を指標にして、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体に結合するリガンドを検出する、バイオセンシング方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質の蛍光の強度変化を指標にして、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体に結合するリガンドを検出する、バイオセンシング方法。
【請求項２】
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）、グリシン又はグルタミン酸の存在下で、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体に結合するリガンドを検出する、請求項１記載のバイオセンシング方法。
【請求項３】
前記タンパク質は、配列表の配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１又は２記載のバイオセンシング方法。
【請求項４】
前記タンパク質は、蛍光分子によって修飾されている、請求項１〜３のいずれか一項記載のバイオセンシング方法。
【請求項５】
前記タンパク質を構成する１から数個のアミノ酸残基は、システイン残基に置換され、置換された前記システイン残基は、蛍光分子によって修飾されている、請求項１〜４のいずれか一項記載のバイオセンシング方法。
【請求項６】
前記リガンドは、亜酸化窒素である、請求項１〜５のいずれか一項記記載のバイオセンシング方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記記載のバイオセンシング方法を利用したバイオセンサであって、前記タンパク質を基質認識部に含む、バイオセンサ。
【請求項８】
請求項７記載のバイオセンサを含む、亜酸化窒素測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンシング方法、バイオセンサ及び亜酸化窒素測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体は、グルタミン酸受容体の一種であって、記憶や学習、さらには脳虚血などに深く関わる受容体であり、中枢神経系を中心に生体内に広く分布している。
【０００３】
ＮＭＤＡ受容体は、２種類のサブユニット（ＮＲ１とＮＲ２）から構成されており、ＮＲ１にはグリシンを受容するサイトがあり、ＮＲ２にはグルタミン酸を受容するサイトがある。
【０００４】
さらに、このＮＲ１及びＮＲ２には、それぞれ２つの基質結合ドメイン（Ｓ１領域とＳ２領域）があることが明らかとなっており、最近では、ＮＲ１のＳ１領域とＳ２領域をリンカーで結合したタンパク質を大腸菌の系で生産させ、得られたリコンビナントタンパク質を用いてＮＭＤＡ受容体の機能解析がなされている（非特許文献１）。また、笑気ガスとして古くから知られる亜酸化窒素は、ＮＭＤＡ受容体に結合し、ＮＭＤＡ受容体本来の機能を麻痺させていることも明らかとなっている。
【０００５】
一方、亜酸化窒素は、二酸化炭素の約３００倍の温室効果があり、京都議定書においては排出規制の対象となっている。このため、地球温暖化防止の観点から、大気中の亜酸化窒素の濃度を測定し、工場等から排出される亜酸化窒素の量を監視していくことが急務となっている。
【０００６】
亜酸化窒素の濃度は、ガスクロマトグラフで測定するのが一般的であり、他に簡易な方法がないのが現状である。しかしながら、最近になって、デンマークの研究グループが、亜酸化窒素を電気化学的に検出するセンサを開発し、亜酸化窒素の濃度を測定できることを報告している（非特許文献２）。このセンサは、金電極を用いて、−１Ｖ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌの還元電位で亜酸化窒素を計測するものである。
【０００７】
また、窒素酸化物の濃度を測定するためのバイオセンサとしては、硝酸を還元して亜酸化窒素を発生する微生物を電極に固定化した硝酸微生物センサや（非特許文献３）、硝酸還元酵素を還元型の電子メディエータとともに電極に固定した酵素センサ（非特許文献４）が報告され、いずれも硝酸還元反応を電気化学的に検出することによって硝酸の濃度を測定している。
【０００８】
【非特許文献１】Ｒａｉｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００３年、３０５巻、ｐ．４７６−４８３
【非特許文献２】Ｎｉｅｌｓら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８８年、５４巻、ｐ．２２４５−２２４９
【非特許文献３】Ｌａｒｓｅｎら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９６年、６２巻、ｐ．１２４８−１２５１
【非特許文献４】Ｆｅｒｒｅｙｒａら、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４年、６４巻、１号、ｐ．６１−７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインから構成されるタンパク質にリガンドが結合すると、当該タンパク質の自家蛍光が変化することについては一切知られていなかった。
【００１０】
また、上記の非特許文献２に記載された亜酸化窒素を電気化学的に検出するセンサは、電極反応に選択性がなく、測定時に酸素が存在すると酸素に対しても同時に反応してしまうという問題点を有していた。さらに、これまでに亜酸化窒素のバイオセンサに関する報告はなかったため、亜酸化窒素の濃度を正確に測定するには、測定試料をサンプリングし、ガスクロマトグラフのような大型の機器で測定する必要があった。
【００１１】
そこで本発明の目的は、蛍光強度の変化を指標にして、ＮＭＤＡ受容体のリガンドの濃度を測定するバイオセンシング方法を提供するとともに、酸素が存在する状況下であっても高感度に亜酸化窒素を検出できるバイオセンサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質の蛍光の強度変化を指標にして、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体に結合するリガンドを検出する、バイオセンシング方法を提供する。
【００１３】
これまで、ＮＭＤＡ受容体のアンタゴニストやアゴニストといったＮＭＤＡ受容体のリガンドをスクリーニングするには、例えば、レセプター・リガンド・バインディングアッセイのように、リガンドの候補物質を予め標識し、ＮＭＤＡ受容体と相互作用させ、当該候補物質の標識を指標にしてＮＭＤＡ受容体と候補物質の結合を評価する方法が主流であった。しかしながら、上記のバイオセンシング方法によれば、リガンドの候補物質を標識することなく、予め調製したＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインから構成されるタンパク質と相互作用させ、同タンパク質の蛍光変化を指標として簡易にスクリーニングできる。
【００１４】
上記バイオセンシング方法は、ＮＭＤＡ、グリシン又はグルタミン酸の存在下で、ＮＭＤＡ受容体に結合するリガンドを検出する方法であることが好ましい。
【００１５】
ＮＭＤＡ、グリシン又はグルタミン酸の存在下で、ＮＭＤＡ受容体のリガンドをスクリーニングすれば、リガンドの結合部位や作用様式についての情報が得られ、ＮＭＤＡ受容体のリガンドを検出する上でも、さらなる高感度の検出が実現できる。
【００１６】
上記のＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質は、配列表の配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質であることが好ましい。
【００１７】
配列表の配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質は、ＮＭＤＡ、グリシン又はグルタミン酸に対する反応性が安定しているため、ＮＭＤＡ受容体のリガンドを高感度に検出できる。
【００１８】
上記のＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質は、蛍光分子によって修飾されていることが好ましい。
【００１９】
上記タンパク質を適当な環境応答性蛍光色素によって修飾すれば、ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質が発する蛍光の強度を強めることができ、ＮＭＤＡ受容体がリガンドと結合することによって生じる構造変化に反映した蛍光強度の変化についてもより高感度に検出できる。
【００２０】
上記のＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質を構成する１から数個のアミノ酸残基は、システイン残基に置換され、置換されたシステイン残基は、蛍光分子によって修飾されていることが好ましい。
【００２１】
上記タンパク質を適当な環境応答性蛍光色素によって修飾する際、まず、同タンパク質を構成する１から数個のアミノ酸残基をシステイン残基に置換し、そこにシステイン残基に特異的に結合する蛍光色素を添加すれば、配列特異的に蛍光色素を結合させることができ、ＮＭＤＡ受容体のリガンドをさらに高感度に検出できる。
【００２２】
上記のリガンドは、亜酸化窒素であることが好ましい。すなわち、上記のバイオセンシング方法は、亜酸化窒素を検出するためのバイオセンサに利用でき、電気化学的に亜酸化窒素を検出するセンサの原理と比べて、亜酸化窒素を高感度に検出でき、酸素が存在する状況下においても安定的に亜酸化窒素の濃度を測定できるからである。
【００２３】
また本発明は、上記のバイオセンシング方法を利用したバイオセンサであって、上記タンパク質を基質認識部に含むバイオセンサを提供する。
【００２４】
上記のバイオセンサは、これまで簡易かつ実用的な測定方法がなかった亜酸化窒素を、酸素が存在する状況下においても正確に検出できる。
【００２５】
なお、上記バイオセンサは、酸素が存在しても安定した応答性を保った状態で亜酸化窒素の濃度を測定できるため、アッセイに必要な緩衝液、亜酸化窒素の標準溶液及び測定マニュアル等をセットにした亜酸化窒素測定キットとしても利用できる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のバイオセンシング方法によれば、ＮＭＤＡ受容体のリガンドとなる候補物質を標識することなく、予め調製したＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインから構成されるタンパク質と相互作用させ、生じる蛍光変化を指標にして、ＮＭＤＡ受容体のリガンドを簡易にスクリーニングできる。また本発明のバイオセンサは、これまで簡易かつ実用的な測定方法がなかった亜酸化窒素を、酸素が存在する状況下においても正確に検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２８】
（バイオセンシング方法）
本発明のバイオセンシング方法は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質の蛍光の強度変化を指標にして、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体に結合するリガンドを検出することを特徴としている。
【００２９】
ここで、「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域」とは、ＮＭＤＡ受容体サブユニットであるＮＲ１及びＮＲ２が有している基質結合ドメインであって、ＮＲ１においては、基質であるグリシンと、ＮＲ２においては、グルタミン酸と結合するのに必須の領域である。
【００３０】
また、「ＮＭＤＡ受容体に結合するリガンド」とは、ＮＭＤＡ受容体に特異的に結合する物質のことであって、ＮＭＤＡ受容体のアゴニストやアンタゴニストとなり得る物質のことを意味している。例えば、ＮＭＤＡ、グリシン、グルタミン酸、亜酸化窒素等を例示できる。
【００３１】
ＮＲ１のＳ１領域としては、ヒトでは、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸から第１５１番目のアミノ酸までの領域が該当し、ラットでは、配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸から第１５１番目のアミノ酸までの領域が該当する。ＮＲ１のＳ２領域としては、ヒトでは、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５４番目のアミノ酸から第２９１番目のアミノ酸までの領域が該当し、ラットでは、配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列の第１５４番目のアミノ酸から第２９１番目のアミノ酸までの領域が該当する。
【００３２】
ＮＲ２のＳ１領域としては、ヒトでは、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸から第１３９番目のアミノ酸までの領域が該当し、ラットでは、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸から第１３９番目のアミノ酸までの領域が該当する。ＮＲ２のＳ２領域としては、ヒトでは、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の第１４２番目のアミノ酸から第２８３番目のアミノ酸までの領域が該当し、ラットでは、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列の第１４２番目のアミノ酸から第２８３番目のアミノ酸までの領域が該当する。
【００３３】
上記の「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」は、ＮＭＤＡ受容体サブユニットであるＮＲ１又はＮＲ２をコードする遺伝子の塩基配列情報を利用して、分子生物学的手法を用いた方法により、組換えタンパク質として調製できる。ＮＲ１又はＮＲ２をコードする遺伝子の起源としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ニワトリを例示でき、ヒト又はラット由来であることが好ましい。
【００３４】
ＮＲ１又はＮＲ２をコードする遺伝子は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載された方法に従って、目的とする動物種のｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリーからクローニングできる。
【００３５】
また、ＮＲ１又はＮＲ２をコードする遺伝子は、例えば、目的とする動物細胞から抽出したトータルＲＮＡ又はポリＡ＋ＲＮＡを鋳型として、ＮＲ１又はＮＲ２をコードする遺伝子の塩基配列情報を基にＲＴ−ＰＣＲ法で合成でき、さらには、これらの遺伝子の部分配列をＤＮＡ合成機で化学合成し、酵素的手法及びサブクローニングの手法を使ってつなぎ合わせることによっても取得できる。
【００３６】
より具体的には、ＮＲ１又はＮＲ２をコードする遺伝子の中のＳ１領域をコードする塩基配列からなるＤＮＡ断片とＳ２領域をコードする塩基配列からなるＤＮＡ断片を、Ｎ末からＳ１−リンカー配列−Ｓ２となるように、リンカー配列で連結させたキメラ遺伝子を構築し、大腸菌やバキュロウイルスの系でリコンビナントタンパク質として生産できる。リンカー配列は、得られたリコンビナントタンパク質がグリシン又はグルタミン酸と結合能を保持するようにＳ１領域とＳ２領域を連結するものであればよいが、Ｇｌｙ−Ｔｈｒと翻訳されるリンカー配列が特に好ましい。
【００３７】
「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」としては、ヒト由来のタンパク質の場合は、配列表の配列番号１又は２に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましく、ラット由来のタンパク質の場合は、配列表の配列番号３又は４に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。
【００３８】
但し、「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」には、配列表の配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体も含まれ、このような変異体としては、１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、又は付加され、グリシン又はグルタミン酸との結合能を保持している変異体が挙げられる。
【００３９】
なお、リコンビナントタンパク質として生産した「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」の精製は、当業者であれば公知である常法のタンパク質の精製方法に従って行うことができる。例えば、培養した形質転換細胞をフレンチプレス又は超音波破砕器などで破砕し、遠心分離して得られた上清（当該酵素を含む粗酵素溶液）を、イオン交換クロマトグラフィーやハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの精製手段で分画すればよい。
【００４０】
「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」の自家蛍光及び同タンパク質に修飾されている蛍光色素由来の蛍光、ＮＭＤＡ、グリシン若しくはグルタミン酸の存在下において生じる同タンパク質の自家蛍光強度の変化、ＮＭＤＡ受容体のリガンドの存在下で同リガンドと結合することにより生じる自家蛍光及び同タンパク質に修飾されている蛍光色素由来の蛍光強度の変化、並びにグリシン又はグルタミン酸の存在下においてＮＭＤＡ受容体のリガンドと結合することにより生じる蛍光強度の変化は、蛍光測定装置（例えば、蛍光分光光度計）で測定でき、ＮＭＤＡ受容体のリガンドは、以下の検出方法で検出できる。
【００４１】
まず、コントロール溶液に「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」を加え、一定時間静置した後に、上記タンパク質から発せられる自家蛍光の最大蛍光強度を測定しコントロール値とする。次に、目的とするＮＭＤＡ受容体のアンタゴニストの候補物質を含むサンプル溶液に「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」を加え、１〜２分間静置し、上記タンパク質から発せられる自家蛍光の最大蛍光強度を測定しリガンド測定値とする。こうして得られたリガンド測定値をコントロール値と比較し、最大蛍光強度に変化が認められた場合に上記の候補物質は、ＮＭＤＡ受容体のリガンドであると判定できる。すなわち、ＮＭＤＡ受容体のリガンドと結合することにより生じる蛍光の強度変化を指標にして、ＮＭＤＡ受容体のリガンドを検出できる。
【００４２】
上記バイオセンシング方法は、ＮＭＤＡ、グリシン又はグルタミン酸の存在下で、ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質の蛍光の強度変化を指標にして、ＮＭＤＡ受容体に結合するリガンドを検出することも可能である。
【００４３】
具体的には、まず、一定濃度のＮＭＤＡ、グリシン又はグルタミン酸を含むコントロール溶液に「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」を加え、一定時間静置した後に、上記タンパク質から発せられる自家蛍光の最大蛍光強度を測定しコントロール値とする。次に、目的とするＮＭＤＡ受容体のアンタゴニストの候補物質を含むサンプル溶液に「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」を加え、１〜２分間静置し、そこに、上記と同じ濃度になるようにＮＭＤＡ、グリシン又はグルタミン酸を加え、一定時間静置した後に、上記タンパク質から発せられる自家蛍光の最大蛍光強度を測定しリガンド測定値とする。こうして得られたリガンド測定値をコントロール値と比較し、最大蛍光強度に変化が認められた場合に上記の候補物質は、ＮＭＤＡ受容体のリガンドであると判定できる。すなわち、ＮＭＤＡ、グリシン又はグルタミン酸の存在下でＮＭＤＡ受容体のリガンドと結合することにより生じる蛍光の強度変化を指標にして、ＮＭＤＡ受容体のリガンドを検出できる。
【００４４】
上記の「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」は、蛍光分子によって修飾されていることが好ましい。
【００４５】
修飾する蛍光分子としては、例えば、アクリロダン（６−ａｃｒｙｌｏｙｌ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｎａｐｈｔａｌｅｎｅ）、ＭＩＡＮＳ（２−（４’−ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌａｎｉｌｉｎｏ）−ｎａｐｈｔａｌｅｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）等を例示できる。蛍光分子による修飾方法は特に制限はなく、当該技術分野で通常に使用されている修飾方法が利用できる。
【００４６】
また、上記の「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」を構成する１から数個のアミノ酸残基は、システイン残基に置換され、さらに、置換されたシステイン残基が、蛍光分子によって修飾されていればより好ましい。
【００４７】
アミノ酸残基のシステイン残基への置換は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載された遺伝子工学的な手法を用いて、「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」をコードする遺伝子に変異を導入し、当該遺伝子の翻訳産物を大腸菌やバキュロウイルスの系で生産すれば得ることができる。尚、システイン残基へ置換するアミノ酸残基の数は、１〜２個が好ましい。
【００４８】
上記のバイオセンシング方法では、ＮＭＤＡ受容体のリガンドとして、亜酸化窒素を検出することができ、従来法ではできなかった簡易でかつ高感度な亜酸化窒素の検出を可能にしている。亜酸化窒素の検出は、上記のＮＭＤＡ受容体のリガンドの検出と同じ手順で実施できる。
【００４９】
（バイオセンサ）
以下に、本発明のバイオセンサについて詳細に説明する。
【００５０】
「バイオセンサ」とは、生物が持つ優れた物質認識能を利用した化学センサのことであり、主に、基質認識部と信号変換部からなるセンサのことである。基質認識部には、酵素、抗体、脂質膜、一本鎖ＤＮＡなどのバイオ素材が使用され、測定対象である基質を認識して何らかの変化（物質変化、色変化、吸発熱、質量変化など）を起こし、この変化を検出可能にするものである。
【００５１】
本発明のバイオセンサは、上記のバイオセンシング方法を利用したバイオセンサであって、ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質、を基質認識部に含むことを特徴としている。
【００５２】
基質認識部に含まれる「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」は、ＮＭＤＡ受容体のリガンドと結合できるため、上述したＮＭＤＡ受容体のリガンドの検出方法に記載した手順でＮＭＤＡ受容体のリガンドを検出できる。
【００５３】
「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」としては、ヒト由来のタンパク質の場合は、配列表の配列番号１又は２に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましく、ラット由来のタンパク質の場合は、配列表の配列番号３又は４に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。
【００５４】
上記のバイオセンサは、亜酸化窒素を検出するものであることが好ましく、標準濃度の亜酸化窒素を含有する溶液により作製したキャリブレーションカーブに従って、被検試料中の亜酸化窒素濃度を計算できる。
【００５５】
本発明のバイオセンサの第一の態様としては、光ファイバと、光ファイバに結合された基質認識部とを備えることが好ましい。
【００５６】
すなわち、バイオセンサは、光ファイバの一端に基質認識部が形成されており、バイオセンサの使用時には、基質認識部において、「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」にＮＭＤＡ受容体のリガンドが結合することとなる。この場合、基質認識部が捉えた変化は、信号変換部等へ伝わり、そこで変換された信号（例えば、電気信号）が検出部で検出されることとなる。
【００５７】
具体的には、まず、亜酸化窒素の濃度を測定する被検試料の所定量を、バイオセンサの基質認識部に供給する。被検試料としては、例えば、ＮＭＤＡ受容体のリガンドの候補物質、亜酸化窒素を含む液体が適宜用いられる。
【００５８】
被検試料を基質認識部へ供給する形態は特に制限されないが、試料溶液の場合は、所定量を基質認識部に対して直接滴下してもよいし、被検試料の中に基質認識部を浸漬してもよい。
【００５９】
この場合、一定時間、基質認識部に試料溶液が接触することにより、「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」にＮＭＤＡ受容体のリガンドや亜酸化窒素が結合する。その結果、上記タンパク質から発せられる蛍光がリガンド非存在下とは異なった強度に変化する。したがって、試料溶液で測定された最大蛍光強度と、亜酸化窒素を含まないコントロール溶液の測定値とを比較することにより、ＮＭＤＡ受容体のリガンドや亜酸化窒素を検出できる。
【００６０】
また、別の測定方法においては、一定時間、基質認識部に試料溶液が接触することにより、「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」にＮＭＤＡ受容体のリガンドや亜酸化窒素が結合し、引き続き、ＮＭＤＡ、グリシン又はグルタミン酸を含む溶液に基質認識部を接触させた場合に、「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」とＮＭＤＡ、グリシン又はグルタミン酸との結合で生じる蛍光強度に変化を与えることとなる。したがって、一定濃度のＮＭＤＡ、グリシン又はグルタミン酸を含むコントロール溶液に対して測定された「ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質」の自家蛍光の最大蛍光強度と、試料溶液の測定値とを比較することにより、ＮＭＤＡ受容体のリガンドや亜酸化窒素を検出できる。
【００６１】
（亜酸化窒素測定キット）
本発明の亜酸化窒素測定キットは、上記のバイオセンサを含むことを特徴としている。
【００６２】
上記の亜酸化窒素測定キットは、亜酸化窒素の濃度の測定に必要な上記のバイオセンサに加えて、緩衝液、亜酸化窒素の標準溶液及び測定マニュアル等をセットにしたものが挙げられ、亜酸化窒素の濃度の測定に必要なその他の試薬や器具等を含むものであってもよい。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６４】
（実施例１）：ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質の調製
まず、ヒト及びラットのＮＭＤＡ受容体サブユニットであるＮＲ１及びＮＲ２遺伝子の塩基配列を基に、それぞれのＳ１領域とＳ２領域をＧｌｙ−Ｔｈｒリンカーで結合させたタンパク質をコードする遺伝子を構築した。
【００６５】
ヒトＮＲ１のＳ１領域とＳ２領域をＧｌｙ−Ｔｈｒリンカーで結合させたタンパク質をコードするキメラ遺伝子は、配列表の配列番号５に示した通りであり、このキメラ遺伝子から翻訳されるタンパク質をヒトＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号１）と名付けた。ヒトＮＲ２のＳ１領域とＳ２領域をＧｌｙ−Ｔｈｒリンカーで結合させたタンパク質をコードするキメラ遺伝子は、配列表の配列番号６に示した通りであり、このキメラ遺伝子から翻訳されるタンパク質をヒトＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号２）と名付けた。
【００６６】
また、ラットＮＲ１のＳ１領域とＳ２領域をＧｌｙ−Ｔｈｒリンカーで結合させたタンパク質をコードするキメラ遺伝子は、配列表の配列番号７に示した通りであり、このキメラ遺伝子から翻訳されるタンパク質をラットＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号３）と名付けた。ラットＮＲ２のＳ１領域とＳ２領域をＧｌｙ−Ｔｈｒリンカーで結合させたタンパク質をコードするキメラ遺伝子は、配列表の配列番号８に示した通りであり、このキメラ遺伝子から翻訳されるタンパク質をラットＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号４）と名付けた。
【００６７】
上記のキメラ遺伝子は、ヒト及びラットのＮＲ１及びＮＲ２遺伝子の塩基配列を基に、Ｓ１領域及びＳ２領域をコードする塩基配列からなるＤＮＡ断片をそれぞれＲＴ−ＰＣＲ法で合成し、Ｓ１領域とＳ２領域がＧｌｙ−Ｔｈｒリンカーで連結されるように化学合成したリンカーでライゲーションすることにより調製した。
【００６８】
上記の各キメラ遺伝子は、Ｃ末端にＨｉｓ  Ｔａｇが付加するように発現ベクターに組み込み、大腸菌に形質転換後、目的とするヒトＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号１）、ヒトＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号２）、ラットＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号３）及びラットＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号４）を発現するクローンを培養し、集菌された菌体から各リコンビナントタンパク質を調製した。
【００６９】
具体的には、まず、集菌された菌体を洗浄後、２０％ショ糖／３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、遠心分離後のペレットに５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加え攪拌し、遠心分離後にペリプラズム画分を調製した。その後、ペリプラズム画分を緩衝液Ａ（１０ｍＭ  イミダゾールを含む３００ｍＭ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  Ｎａ−リン酸緩衝液、ｐＨ８．０）で一晩透析し、５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社）を充填したカラムで上記の各リコンビナントタンパク質を精製した(平衡化バッファー：緩衝液Ａ＋１０ｍＭ  イミダゾール、洗浄バッファー：緩衝液Ａ＋２０ｍＭ  イミダゾール、溶出バッファー：緩衝液Ａ＋２５０ｍＭイミダゾール)。
【００７０】
得られたヒトＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号１）、ヒトＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号２）、ラットＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号３）及びラットＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号４）は、ＳＤＳ―ＰＡＧＥによる分析の結果、目的とする分子量の位置に確認され、十分な精製が行われたことが確認された。
【００７１】
（実施例２）：グリシン又はグルタミン酸の存在下で、ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質が発する自家蛍光の検出
実施例１で得られたヒトＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号１）、ヒトＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号２）、ラットＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号３）及びラットＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号４）が、グリシン又はグルタミン酸の存在下で発する自家蛍光の検出を蛍光分光光度計で試みた。
【００７２】
まず、所定量のグリシンを含む溶液に、ヒトＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号１）又はラットＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号３）を加え、一定時間静置し、蛍光波長及びアミノ酸配列中に存在するトリプトファン残基の自家蛍光に由来する最大蛍光強度の変化を測定した。
【００７３】
次に、上記と同じ濃度のグルタミン酸を含む溶液に、ヒトＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号２）又はラットＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号４）を加え、一定時間静置し、蛍光波長及びアミノ酸配列中に存在するトリプトファン残基の自家蛍光に由来する最大蛍光強度の変化を測定した。
【００７４】
その結果、ヒトＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号１）及びラットＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号３）は、グリシンの濃度に依存して蛍光強度の増加が見られ、ヒトＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号２）及びラットＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号４）は、グルタミン酸の濃度に依存して蛍光強度の増加が見られた。
【００７５】
（実施例３）：ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質による亜酸化窒素の検出
実施例１で得られたヒトＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号１）、ヒトＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号２）、ラットＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号３）及びラットＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号４）を用いて、自家蛍光特性の変化に基づく、亜酸化窒素の検出を行った。
【００７６】
まず、所定量のグリシンを含むコントロール溶液に、ヒトＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号１）又はラットＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号３）を加え、一定時間静置し、蛍光波長及びアミノ酸配列中に存在するトリプトファン残基の自家蛍光に由来する最大蛍光強度の変化を測定し、コントロール値とした。
【００７７】
次に、予め調製した各濃度の亜酸化窒素溶液に、ヒトＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号２）又はラットＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号４）を加え、１〜２分間静置し、そこに、上記と同じ濃度となるようにグリシンを加えて一定時間静置し、蛍光波長及びアミノ酸配列中に存在するトリプトファン残基の自家蛍光に由来する最大蛍光強度の変化を測定し、亜酸化窒素溶液測定値とした。
【００７８】
こうして得られた亜酸化窒素溶液測定値をコントロール値と比較した結果、亜酸化窒素濃度に依存して最大蛍光強度に変化が認められた。
【００７９】
なお、亜酸化窒素によって最大蛍光強度が変化した上記の結果は、グリシンの代わりにグルタミン酸を用い、ヒトＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号１）又はラットＮＲ１  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号３）の代わりにヒトＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号２）又はラットＮＲ２  Ｓ１−ＧＴ−Ｓ２（配列番号４）を用いた場合であっても観察された。  
【００８０】
以上の結果より、ＮＭＤＡ受容体サブユニットの基質結合ドメインであるＳ１領域とＳ２領域を含むタンパク質をバイオセンシング分子として使用できることが明らかとなり、ＮＭＤＡ受容体リガンドのスクリーニングや亜酸化窒素の検出に利用できることが示唆された。
【配列表】
2009063497000001.app