(57)【要約】【課題】ほ乳類抗菌ペプチドの発現を誘導及び／又は増強する作用を有する成分、それを有効成分として含有するほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物、該組成物を含有する飲食品、医薬品並びに医薬部外品を提供する。【解決手段】マコモタケ由来の水溶性画分を有効成分とすることを特徴とするほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物；かかる組成物を含有することを特徴とする飲食品、医薬品並びに医薬部外品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マコモタケ由来の水溶性画分を有効成分とすることを特徴とするほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物。
【請求項２】
前記マコモタケ由来の水溶性画分が陰イオン性を有することを特徴とする請求項１に記載のほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物。
【請求項３】
ヒト抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物であることを特徴とする請求項１又は２に記載のほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物。
【請求項４】
前記ヒト抗菌ペプチドがβヒトディフェンシン２であることを特徴とする請求項３に記載のほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物を含有することを特徴とする医薬部外品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物、該組成物を含有する飲食品、医薬品並びに医薬部外品に関する。
【背景技術】
【０００２】
無脊椎動物等の免疫機構をもたない生物は、生体防御機構として、抗菌性物質を産生し、細菌等の微生物の感染などから身を守っている。
また、免疫機構を持つ脊椎動物も、抗菌（抗微生物活性）ペプチドといわれる抗菌性物質を産生していることが知られている（非特許文献１参照）。この抗菌性ペプチドは、その大きさや構造はかなりの多様性を示すが、一般には、中性ｐＨで正電荷を有する膜活性両親媒性分子である。
ここで、「抗菌」又は「抗微生物活性」という用語は、微生物の成育を阻害する、又は不可逆的に阻止する化合物の能力を意味し、この種の阻害又は阻止は、殺微生物作用又は微生物阻止阻害を介するものとし得る。ここで「殺微生物作用」という用語は、標的微生物を殺傷する、又は取り返しのつかないように損傷を与えることのできる化合物の能力、「微生物阻止阻害」という用語は、微生物の死滅にまでは至らないが、その増殖及び生育を抑制することを意味する。
【０００３】
上記抗菌性ペプチドは、セクロピン類（ｃｅｃｒｏｐｉｎｓ）等の線状ペプチドと、ほ乳動物ディフェンシンやウシバクテネシン類（ｂｏｖｉｎｅ  ｂａｃｔｅｎｅｓｉｎｓ）等のシステインに富むペプチドの２つのファミリーに大別される。
例えば、ヒトのディフェンシンは、好中球や小腸粘膜のＰａｎｅｔｈ細胞の他に、体内の様々な組織で、恒常的に又は発達段階に一過性に発現することが知られている。ディフェンシンは好中球のアズール顆粒の主要構成成分であり、これまでにヒトではＨＮＰ−1、−２、−３及び−４の４種類のディフェンシンが単離され、その構造が決定されている。これらのディフェンシンは２９〜３４個のアミノ酸からなる塩基性ペプチドであり、６個のシステインと１個のグリシンが共通して保存されている遺伝子ファミリーを構成している。
また、小腸のＰａｎｅｔｈ細胞で発現しているディフェンシン（消化器ディフェンシン）としては、ヒトディフェンシン５及び６が知られており、その構造も決定されている（特許文献１参照）。
【０００４】
さらに上記のディフェンシン以外にも、システイン残基の位置の違いや発現している組織の違いによって、βディフェンシンと呼ばれるサブファミリーがある。βディフェンシンは、特に上皮系の細胞で主に発現しており、牛の気管抗微生物性ペプチド（ＴＡＰ）及び舌抗微生物性ペプチド（ＬＡＰ）、ヒトのβディフェンシン１（ｈＢＤ−１）等が知られている。
また、ヒト表皮ケラチノ（角化）細胞から発見されたヒトβディフェンシン２（ｈＢＤ−２）は、その転写のレベルが細菌の感染によって変化し、肺や気管等でも発現していることが分かっている（非特許文献２参照）。
【０００５】
ところで近年、免疫賦活という観点から、水生植物の一種であるマコモタケ中の成分がマクロファージ様細胞に作用するという報告がなされている。具体的には、マコモタケの抽出成分が、病原菌や腫瘍細胞を攻撃することが知られている一酸化窒素（ＮＯ）の産生を、マクロファージ様細胞において促進するという報告（特許文献２参照）である。
【特許文献１】特表平７−５０７２１３号公報
【特許文献２】特開２００７−１２６３８２号公報
【非特許文献１】ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．９７，ｎｏ．１６，８８５６−８８６１，２０００
【非特許文献２】Ｊ．Ｈａｒｄｅｒ，ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，ＶＯＬ３８７，Ｐ８６１，１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生体防御という観点からは、上記のような抗菌性ペプチドの発現を誘導及び／又は増強する作用を有する成分を見い出すことができれば、生体防御の強化が可能な食品や、消化器系などの傷害の治療に有効な医薬品の開発が可能になるものと考えられ、非常に有用である。しかし、このような観点からの検討はまだ十分に行われていないのが現状である。また、マコモタケによる免疫賦活に関しても、実用に向けた検討が十分に為されているとは言えない。
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、ほ乳類抗菌ペプチドの発現を誘導及び／又は増強する作用を有する成分、それを有効成分として含有するほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物、該組成物を含有する飲食品、医薬品並びに医薬部外品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明者らは、ほ乳類抗菌ペプチドの発現を誘導及び／又は増強する作用を有する成分を検出するレポータープラスミドによる実験系を構築し、種々の成分をスクリーニングした結果、マコモタケ由来の水溶性画分が、抗菌ペプチドの発現を誘導及び／又は増強する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、上記課題を解決するため、
請求項１にかかる発明は、マコモタケ由来の水溶性画分を有効成分とすることを特徴とするほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物である。
請求項２にかかる発明は、前記マコモタケ由来の水溶性画分が陰イオン性を有することを特徴とする請求項１に記載のほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物である。
請求項３にかかる発明は、ヒト抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物であることを特徴とする請求項１又は２に記載のほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物である。
請求項４にかかる発明は、前記ヒト抗菌ペプチドがβヒトディフェンシン２であることを特徴とする請求項３に記載のほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物である。
【０００９】
請求項５にかかる発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載のほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物を含有することを特徴とする飲食品である。
請求項６にかかる発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載のほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物を含有することを特徴とする医薬品である。
請求項７にかかる発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載のほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物を含有することを特徴とする医薬部外品である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ほ乳類抗菌ペプチドの発現を誘導及び／又は増強できる。特に、本発明の組成物を含有する飲食品、医薬品又は医薬部外品を摂取したり投与したりすることによって、潜在的な微生物病原体、例えば、カビ、グラム陽性細菌又はグラム陰性細菌等に起因する感染症又は消化器系炎症等の予防や治療を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強組成物（以下、単に「組成物」と略記することがある）は、マコモタケ由来の水溶性画分を有効成分とすることを特徴とする。
本発明においてマコモタケとは、イネ科イネ亜目イネ族マコモ亜族マコモ族に属する植物のことを指す。そして、前記マコモ族に属する植物に黒穂菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）が寄生することで、茎が肥大化したものも含む。マコモタケは、周知の方法で生育させたものを用いることができる。
【００１２】
マコモタケ由来の水溶性画分は、例えば、マコモタケに水を加えて懸濁し、次いで抽出した後、固形分を分離することで調製できる。
【００１３】
マコモタケは乾燥体として用いるのが好ましい。乾燥体のマコモタケを用いることで、水溶性画分の抽出条件を精密に調整でき、水溶性画分を効率的に抽出できる。
マコモタケの乾燥は、凍結乾燥など周知の手法で行うことができる。
マコモタケは、任意の形態で用いることができるが、粉砕してから懸濁に供しても良い。粉砕物の大きさは抽出条件に応じて適宜選択すれば良い。そして、マコモタケは公知の手法で粉砕すれば良い。
【００１４】
マコモタケに加える水の量は特に限定されないが、マコモタケ乾燥体質量の２倍以上の質量の水を加えることが好ましい。このようにすることで、水溶性画分の抽出に適した懸濁液を容易に調製できる。
また、マコモタケの水懸濁液において、該懸濁液の容量（ｌ）に対するマコモタケの乾燥体換算質量（ｋｇ）の比率は、０．１〜２０％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、０．５〜１０％（ｗ／ｖ）であることがより好ましく、１〜５％（ｗ／ｖ）であることが特に好ましい。このような範囲とすることで、水溶性画分を効率的に抽出できる。
【００１５】
水溶性画分の抽出条件は、目的に応じて適宜選択し得るが、加熱条件下で攪拌しながら抽出するのが好ましい。
加熱時の温度は、懸濁液の沸点以下であれば良く、懸濁液中のマコモタケ含有量にもよるが、通常０〜１２０℃が好ましく、５０〜１２０℃がより好ましく、８０〜１１０℃が特に好ましい。
加熱時間は、加熱時の温度に応じて適宜選択すれば良いが、例えば、温度が上記範囲である場合には、５〜６０分が好ましく、５〜３０分がより好ましく、５〜１５分が特に好ましい。
抽出条件を上記範囲とすることで、水溶性画分を効率的に抽出できる。
【００１６】
抽出後に固形分を分離する方法は特に限定されず、例えば、デカンテーション、遠心分離、ろ過、フィルタープレス等、公知の固液分離の手法を単独で又は組み合わせて適用すれば良い。
具体的には、デカンテーションを行う場合は、抽出液を静置して固形分を自然沈降させた後に上澄みを回収する方法でも良いし、抽出液を遠心分離して上澄みを回収する方法でも良い。
遠心分離を行う場合は、例えば、デラバルやシャープレス等の連続方式の遠心分離機やバッチ方式の遠心分離機等、通常の遠心分離機を用いる方法で水溶性画分を回収すれば良い。
ろ過を行う場合には、減圧ろ過及び常圧ろ過のいずれかで、水溶性画分を回収すれば良い。
【００１７】
分離により得られる水溶性画分には、ほ乳類抗菌ペプチドの発現を誘導及び／又は増強する成分（以下、「活性成分」と略記することがある）が含有される。本発明の組成物は、前記水溶性画分を有効成分として含有する。
【００１８】
水溶性画分は、固形分から分離した後、そのまま本発明の組成物に含有させても良いし、適宜必要に応じて、洗浄、濃縮、乾燥等の後処理や精製を単独で又は組み合わせて行ってから、本発明の組成物に含有させても良い。また、水溶性画分をそのまま本発明の組成物としても良い。
水溶性画分には、前記活性成分以外にも核酸や多糖類等、生体由来の水溶性成分が含有され得るが、活性成分以外のこれら成分が含有された状態で本発明の組成物に用いても良い。ここで、「組成物に用いる」とは、本発明の組成物に含有させるか又はそのまま本発明の組成物とすることを指し、これは以下においても同様である。
【００１９】
洗浄は、例えば、水溶性画分に有機溶媒を添加して攪拌し、有機層中に不純物を抽出することで行うことができる。
濃縮は、例えば、水溶性画分を好ましくは加温しながら減圧することで行うことができる。又は、逆浸透膜などのろ過膜を用いて行っても良い。
乾燥は、例えば、水溶性画分を凍結乾燥することで行うことができる。
【００２０】
精製は、例えば、水溶性画分を結晶化に供することで行うことができる。又は各種樹脂を用いて、カラムクロマトグラフィーにより行っても良い。あるいは、限外ろ過膜、精密ろ過膜等のろ過膜を用いて行っても良い。
これらのなかでも本発明においては、水溶性画分の精製をカラムクロマトグラフィーにより行うことが好ましい。そして、用いる樹脂は陰イオン交換樹脂が好ましい。主たる前記活性成分は、陰イオン性を有しており、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより効率的に分画できる。
【００２１】
ここで例示した水溶性画分の回収方法によれば、活性成分として特に、ヒト抗菌ペプチドの発現を誘導及び／又は増強する成分を含有するものが好適に得られる。ここでヒト抗菌ペプチドとしては、ヒトβディフェンシン２（以下、ｈＢＤ−２と略記する）が例示できる。ｈＢＤ−２の活性成分は、陰イオン性を有する。
【００２２】
先に述べたように、特開２００７−１２６３８２号公報においては、マコモタケの抽出成分が、マクロファージ様細胞において一酸化窒素（ＮＯ）の産生を促進し、免疫賦活作用を示すことが開示されている。
これに対して本発明は、マコモタケの抽出成分が、ほ乳類抗菌ペプチドの発現を誘導及び／又は増強する作用を有することを初めて開示するものである。従来、一酸化窒素の産生と、ほ乳類抗菌ペプチドの発現との間に何らかの関係があるとの報告は一切無く、したがって、本発明における活性成分は、従来知られているマコモタケの上記抽出成分とは全く異なる新規なものと考えられる。
また従来、例えば、常に病原菌体等が直接接触し得る消化管上皮細胞に、マコモタケの抽出成分が影響を及ぼすとの報告は一切無いが、本発明においては、結腸由来上皮細胞（以下、Ｃａｃｏ−２と略記する）を用いて、消化管上皮細胞においてマコモタケの抽出成分がｈＢＤ−２を誘導し得ることを始めて開示するものである。さらに本発明における主たる前記活性成分は、マコモタケ由来の水溶性成分として従来報告例のない陰イオン性を有する物質である。これらのことも、本発明における活性成分が新規なものであることを裏付けるものである。
さらに例えば、特開２００７−１２６３８２号公報に記載の発明においては、試験例で示されている通り、組成物中におけるマコモタケの濃度が０．２５％(ｖ／ｖ)となった場合に効果を発揮したのに対し、本発明においては、後記する実施例で示すように、組成物中におけるマコモタケの濃度が０．００５％(ｗ／ｖ)の場合でも効果を発揮する。すなわち、本発明における活性成分は、低濃度で作用する点で極めて優れたものである。
【００２３】
ここでは、抽出後に固形分を分離して得られた水溶性画分を本発明の組成物に用いる例を示したが、例えば、固形分を分離することなく抽出後の液をそのまま本発明の組成物に用いても良い。
【００２４】
本発明の組成物中における前記活性成分の含有量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択し得る。
例えば、本発明の組成物が液状、特に水溶液である場合には、該組成物中における前記活性成分の濃度は、０．００３ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましく、０．０１５ｍｇ／ｍｌ以上であることがより好ましく、０．０３ｍｇ／ｍｌ以上であることが特に好ましく、０．１５ｍｇ／ｍｌ以上であることが最も好ましい。
先に述べたように、マコモタケの水懸濁液において、該懸濁液の容量（ｌ）に対するマコモタケの乾燥体換算質量（ｋｇ）の比率が好ましい範囲にある時は、得られる水溶性画分中には、通常、１〜２０ｍｇ／ｍｌ程度の濃度で、前記活性成分を主成分とする水溶性成分が含有されている。この値を参考に、組成物中における前記活性成分の含有量を調整できる。
【００２５】
本発明の組成物には、活性成分を一種単独で含有させても良いし、二種以上の活性成分を組み合わせて含有させても良い。二種以上の活性成分を組み合わせて含有させる場合、その組み合わせは、目的に応じて適宜選択し得る。
【００２６】
本発明の組成物は、前記活性成分以外に、本発明の効果を損なわない範囲で目的に応じて適宜、可溶化したタンパク質、アミノ酸、アミノペプチド又はオリゴ糖等の糖類等を含有させることができる。
【００２７】
本発明の組成物の形態は、目的に応じて適宜選択でき、公知の手法により、例えば、固形状、液状、ゾル状、ゲル状、粉末状又は顆粒状等とすることができる。
【００２８】
本発明の飲食品、医薬品及び医薬部外品は、上記本発明の組成物を含有することを特徴とする。そして本発明の飲食品、医薬品及び医薬部外品は、前記組成物を含有させる点を除けば、公知の方法で製造できる。
【００２９】
本発明の飲食品中における前記組成物の含有量は、飲食品の種類により適宜選択できる。飲食品が、例えば、チョコレート、錠菓、キャンディー、キャラメル、ケーキ、クッキー、ビスケット、アイスクリーム、清涼飲料、パン、お粥、ドレッシング、タレ・ソース、珍味等である場合には、前記組成物の含有量は、０．００５〜２０質量％であることが好ましい。含有量が０．００５質量％未満の場合には、充分な抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強効果が得られないことがある。また含有量が２０質量％を超える場合には、飲食品の風味が損なわれることがある。
【００３０】
本発明の飲食品中に前記組成物以外に、例えば、賦形剤、着色料、甘味料、酸化防止剤、酸味料、ビタミン類等を含有させて、錠剤、顆粒状等の形態の食品とすることもできる。この場合、飲食品中における前記組成物の含有量は、０．０１〜９０質量％であることが好ましい。
【００３１】
本発明の医薬品中における前記組成物の含有量は、医薬品の使用目的、患者の年齢及び体重、あるいは求められる治療効果の程度等に応じて適宜選択できるが、通常、１回当りの投与量が前記組成物換算で好ましくは０．１〜１０００ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇとなるように、前記組成物が含有されていると良い。投与量が組成物換算で０．１ｍｇ未満の場合には、充分な抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強効果が得られないことがある。投与量の上限が組成物換算で１０００ｍｇであれば、十分な抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強効果が得られる。
【００３２】
本発明の医薬品の形態は、任意に選択できる。例えば、錠剤、粉末、顆粒、カプセル剤、ゲル又はゾル等の剤型；塩及び緩衝剤によって緩衝化した溶液、懸濁液又は乳濁液等の液体製剤；リポゾームで包摂した製剤等が挙げられる。
前記塩としては、アルカリ金属のハロゲン化物、アルカリ土類金属のハロゲン化物、リン酸塩及び硫酸塩等が例示できる。より具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム等が例示できる。
また、前記緩衝剤としては、クエン酸塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、トリス等が例示できる。
【００３３】
本発明の医薬品中には、上記各成分以外に、公知の薬学的に許容し得る適当なキャリア、賦形剤、又はその他の添加物等を適宜含有させることができる。
【００３４】
本発明の医薬品は、例えば、経口投与；静脈内、皮下、筋肉内又は腹膜内注射；鼻咽頭への噴霧・塗布等により投与できる。
【００３５】
本発明の医薬品部外品中における前記組成物の含有量は、０．１〜１００質量％であることが好ましく、０．１〜８０質量％であることがより好ましい。含有量が１質量％未満の場合には、充分な抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強効果が得られないことがある。
【００３６】
本発明の医薬部外品としては、溶液、懸濁液、乳濁液、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、スプレー等が例示できる。
【００３７】
本発明において、ほ乳類抗菌ペプチドの発現誘導及び／又は増強効果を確認する方法としては、例えば、ほ乳類抗菌ペプチドを発現し得る各種培養細胞を、前記水溶性画分の存在下で培養し、ほ乳類抗菌ペプチドの発現を制御するプロモーターを用いたレポータージーンアッセイ、ほ乳類抗菌ペプチドのｍＲＮＡを測定する定量ＲＴ−ＰＣＲ法、抗菌試験、免疫測定等を行う公知の方法が挙げられる。ここで、例えば、ほ乳類抗菌ペプチドを発現し得る培養細胞としては、ヒト結腸由来上皮細胞Ｃａｃｏ−２等が、ほ乳類抗菌ペプチドとしては、ｈＢＤ−２等が挙げられる。
【実施例】
【００３８】
以下、具体的実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）
原料マコモタケとしてイネ科イネ亜目イネ族マコモ亜族マコモ族に属する植物の凍結乾燥体２．５ｇを水で１００ｍｌに懸濁し、２．５％（ｗ/ｖ）マコモタケ懸濁液を作製し、１００℃、１０分間の加熱処理を行った。
【００４０】
このマコモタケ懸濁液を常温（２０＋／−１５℃）まで冷却した（サンプルＡ）。次に１００００×ｇで１０分間遠心分離し、水溶性画分を回収した（サンプルＢ）。この水溶性画分には、前記活性成分を主成分とする水溶性成分が９．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含有されていた。さらに不溶性画分を回収し、水を添加して分離前の体積に調製した（サンプルＣ）。
【００４１】
レポータージーンアッセイ実験に用いるｈＢＤ−２の発現を測定するために、レポータープラスミドを以下の手順で作製した。
上記ｈＢＤ−２のプロモーターをＰＣＲ法で増幅させるのに必要な配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーＡ、配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーＢを用いて、ヒトゲノムを鋳型にＰＣＲ法により、ｈＢＤ−２プロモーターを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、同様に制限酵素ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＧＬ４．１７（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＤＱ１８８８３７）に挿入した。このレポータープラスミドを、以下、「ｐＧＬ−ｈＢＤ２ｐ」と略記する。ｐＧＬ−ｈＢＤ２ｐは、ホタルルシフェラーゼを発現し、その発現量はｈＢＤ−２プロモーターの強度に由来する。
【００４２】
なお、上記プライマーの塩基配列は、ｈＢＤ−２の遺伝子配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０７１２１６）を参考に設計し、プライマーＡ及びＢの５’末端には、それぞれ制限酵素ＸｈｏＩ認識配列、ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加した。
【００４３】
４８ウエルマルチプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）でコンフルエントにまで培養したヒト結腸由来上皮細胞Ｃａｃｏ−２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）２×１０４細胞に、１８０ｎｇのレポータープラスミドｐＧＬ−ｈＢＤ２ｐ、２０ｎｇのｐＧＬ４．７４（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ７３８２３０）をリポフェクション法により導入し、上記のサンプルＡをそれぞれ、マコモタケ乾燥体の濃度に換算してその終濃度が０．００１、０．００５、０．０１及び０．０５％（ｗ／ｖ）となるようにそれぞれ添加した。サンプルＢ、サンプルＣを添加する場合は、サンプルＡ相当量を添加した。サンプル添加後１２時間、３７℃、５．０％ＣＯ２雰囲気下で培養した。内部標準として用いたｐＧＬ４．７４は、プロモーターとしてｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  （ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーターが挿入されているレポータープラスミドであり、ウミシイタケルシフェラーゼを発現する。各実験区はＮ＝２で測定を行った。
【００４４】
培養後、レポータープラスミドにより発現したホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼに、基質 Ｄｕａｌ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの発光量をそれぞれ測定した。発光量の測定には、ＡＲＶＯＴＭ  １４２０  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いた。この発光強度を測定することにより、ｈＢＤ−２の発現強度を確認することができる。
【００４５】
各レポータープラスミドからのルシフェラーゼ発現量を求めた。この時、ネガティブコントロールのホタルルシフェラーゼ発光量を、内部標準であるウミシイタケルシフェラーゼ発光量で割った値を１とした。結果を図１に示す。図１（ａ）はサンプルＡ〜Ｃの各終濃度における測定結果を示し、図１（ｂ）はサンプルＡ〜Ｃの終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）における測定結果を示す。
【００４６】
図1から、マコモタケ由来の水溶性画分を含有するサンプルＡ及びＢを添加することにより、ｈＢＤ−２プロモーターの発現誘導及び／又は増強効果が認められた。
一方、不溶性画分のみを含有するサンプルＣを添加した場合では、ｈＢＤ−２プロモーターの誘導及び／又は増強効果がサンプルＡ及びＢと比較して弱かった。ポジティブコントロールに用いたＩＬ−１  ａｌｐｈａを１０ｎｇ／ｍｌの終濃度で添加した実験区では、約２０倍の活性となった（図１（ｂ））。
【００４７】
（実施例２）
マコモタケ由来の水溶性画分からｈＢＤ−２プロモーターの発現を誘導及び／又は増強する活性成分を絞り込むため、水溶性画分を陰イオン交換カラムＨｉｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）で分画した。まず、マコモタケを乾燥体換算で２．５％（ｗ／ｖ）を含有する７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ８．０を調製し、陰イオン交換カラムに吸着させた。さらに、塩濃度を１Ｍ  ＮａＣｌまで順次上昇させて活性成分を溶出した。得られた画分を、塩濃度の薄い順にＢ−１〜Ｂ−１６と命名した。そして、マコモタケを乾燥体換算で０．０５％（ｗ／ｖ）となる濃度で添加し、実施例１と同様にレポーターアッセイを行った。その結果を図２に示す。図２より、ＮａＣｌ濃度が０．０５Ｍから０．４Ｍのときに溶出する画分（Ｂ−４〜Ｂ−６）に誘導及び／又は増強活性があることが判明した。また吸着せずにカラムを通過する画分には、誘導及び／又は増強活性は認められなかった。よって活性成分は、ｐＨ８．０において陰イオン性を示す物質であることが判明した。また、陰イオン交換カラムで分離後の各画分を１．５％アガロースで電気泳動後、ＳＹＢＲ  ＧＯＬＤで染色し、各画分における核酸の有無を調査した。その結果を表１に示す。表１より、核酸はＢ−１１〜Ｂ−１５の画分に認められた。このことから、活性成分は核酸ではないことが確認された。
【００４８】
【表１】
2009091288.tif 000002
【００４９】
（実施例３）
マコモタケ由来の水溶性画分から活性成分を絞り込むため、水溶性画分を限外ろ過カラムＹＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ，分画分子量約１００００）を用いて分画した。それぞれの限外ろ過膜の透過液及び非透過液を、マコモタケ乾燥体の濃度に換算して０．０５％(ｗ／ｖ)となる濃度で細胞に添加し、実施例１と同様にレポーターアッセイを行った結果、ｈＢＤ−２プロモーターの発現誘導及び／又は増強効果はＹＭ−１０の非透過液に認められた。結果を図３に示す。よって、主たる活性成分は分子量が１００００以上であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、感染症又は消化器系炎症等の予防薬や治療薬の開発に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例１における、ｈＢＤ−２プロモーターの発現誘導及び／又は増強試験の結果を示すグラフであり、（ａ）はサンプルＡ〜Ｃの各終濃度における測定結果を、（ｂ）はサンプルＡ〜Ｃの終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）における測定結果をそれぞれ示す。
【図２】実施例２における、陰イオン交換カラムによる各画分についての、ｈＢＤ−２プロモーターの発現誘導及び／又は増強試験の結果を示すグラフである。
【図３】実施例３における、限外ろ過後の透過液及び非透過液についての、ｈＢＤ−２プロモーターの発現誘導及び／又は増強試験の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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