(57)【要約】【課題】寸法のばらつきが大きい生体物質検出用基板を使用しても、検出信号の低下を防ぐことの出来る生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出装置を提供することを目的とする。【解決手段】生体物質を緩衝剤中で満たされた検出用流路を移動させた際に得られる輸送反応を利用して前記生体物質の判別を行う生体物質検出用基板において、前記検出用流路を少なくとも一つ以上を有し、前記検出用流路の近傍に蛍光を発する回転対称形状の位置決めマーカを備えた生体物質検出用基板。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質を緩衝剤中で満たされた検出用流路を移動させた際に得られる輸送反応を利用して前記生体物質の判別を行う生体物質検出用基板において、
前記検出用流路を少なくとも一つ以上を有し、前記検出用流路の近傍に蛍光を発する回転対称形状の位置決めマーカを備えた生体物質検出用基板。
【請求項２】
前記位置決めマーカは、
その対称点が前記検出流路の中心と略一致するように前記検出用流路と前記検出用流路との間に配置された請求項１に記載の生体物質検出用基板。
【請求項３】
前記位置決めマーカは、
前記生体物質検出用基板に貫通孔を設け、前記貫通穴を覆うように前記検出用流路形成面と反対の面に蛍光シートを貼り付けて成る請求項２に記載の生体物質検出用基板。
【請求項４】
前記蛍光シートは、波長６３５ｎｍの励起光により波長６７０ｎｍ付近の蛍光を発する特性を持つ請求項３に記載の生体物質検出用基板。
【請求項５】
前記位置決めマーカは、
前記生体物質検出用基板に貫通孔を設け、前記貫通穴を覆うように前記検出用流路形成面に樹脂製フィルムを貼り付け、その樹脂製フィルムによって形成された貫通孔の底面のみに蛍光インクを塗布した請求項２に記載の生体物質検出用基板。
【請求項６】
前記蛍光インクは、波長６３５ｎｍの励起光により波長６７０ｎｍ付近の蛍光を発する特性を持つ請求項５に記載の生体物質検出用基板。
【請求項７】
請求項１に記載の生体物質検出用基板と、
前記位置決めマーカに励起光を照射してこの励起光による蛍光を検出するための光学ユニットと、
前記光学ユニットを前記生体物質検出用基板の中心から外周に向けて移動させるための駆動部と、
前記光学ユニットが検出した蛍光に応じて前記光学ユニットの照射光軸と前記位置決めマーカの中心とが一致するように前記駆動部に指令を行う信号解析部と、を備えた生体物質検出装置。
【請求項８】
前記信号解析部は、
前記駆動部により前記光学ユニットを内外周方向へ移動させながら、前記光学ユニットで検出した蛍光値が最大となる位置を求める、前記位置に移動するように前記駆動部に指令を行う請求項７に記載の生体物質検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡやタンパクその他の生体物質を検出する生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出装置に関し、より詳細には、脱着可能であり且つ測定制度の高い生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡやタンパク質などの生体物質を検出する手法として、蛍光標識を利用する蛍光検出法が採用されている。励起光源や光学フィルタや受光素子等からなる光学ユニットにより、ラジオアイソトープを使わず、安全、安価に生体物質の測定が可能であることから、蛍光検出法は酵素免疫測定、電気泳動、共焦点走査型蛍光顕微鏡法など、様々な生体物質の検出に応用されている。
【０００３】
蛍光検出法は、励起光を照射することで生体物質に標識した蛍光標識からの蛍光信号を検出することで生体物質の有無や量を測定する方法である。例えばＣｙ５は波長６３５ｎｍの励起光に対して、波長６７０ｎｍの蛍光を発する蛍光標識である。Ｃｙ５を標識した生体物質を検出するためには、試料へ６３５ｎｍの励起光を照射し、試料からの光を６７０ｎｍ付近の光のみ透過する光学フィルタを介して受光素子で検出する。蛍光標識には様々なものがあり、それぞれ蛍光標識の励起波長と蛍光波長に対応した励起光源と光学フィルタを選定することで、様々な蛍光標識を標識した生体物質を検出できる。
【０００４】
蛍光検出を行う場合、試料を支持する基板やセルが必要であるが、試料が微量な場合でも測定できるように、基板に微細な流路を形成したものを用いて検出を行う装置が出てきている。この装置では、流路内に蛍光標識を標識した試料と緩衝剤を充填した後、緩衝液に所定の電位勾配をかけて試料を電気泳動させ、泳動中の試料に励起光を照射して蛍光の強度分布を検出することにより、試料の泳動状態を観察することができる（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
また、従来の生体物質検出用基板は、基板上の流路部分以外を光学的に不透明とし、検出部から一定距離の位置に光学的に透明な位置検出孔を形成している。図７に従来の生体物質検出用基板を示す。ガラス製の生体物質検出用基板２００上に試料流路２０６と泳動流路２０７とがクロス部２０８で交差するように配置されている。試料流路２０６の両端には、それぞれ試料注入部２０２及び試料排出部２０３の液溜が設けられており、泳動流路２０７の両端には、それぞれ負電極部２０４と正電極部２０５との液溜が設けられている。
【０００６】
まず、負電極部２０４に緩衝剤を注入し外部ポンプで圧力をかけることで、負電極部２０４から泳動流路２０７を通って正電極部２０５までと、泳動流路２０７と試料流路２０６のクロス部２０８より試料流路２０６を通って試料注入部２０２と試料排出部２０３とへの全ての流路に緩衝剤を充填する。
【０００７】
次に、試料注入部２０２に蛍光標識で修飾された試料を注入した後、試料注入部２０２と試料排出部２０３に電圧を印加することによって、試料流路２０６を通って試料排出部２０３までの試料流路２０６に試料を充填する。このとき、泳動流路２０７上では試料流路２０６のクロス部のみに試料があるので、このクロス部により試料が定量される。その後、この定量された試料は、負電極部２０４と正電極部２０５とに電圧を印加することにより電気泳動を開始する。泳動中の試料に励起光を照射して試料から発せられる蛍光の強度分布を検出することにより、試料の分析を行うことができる。このとき、位置検出孔２０１を検出して位置検出孔２０１の位置を求め、そこより一定距離の位置の検出部２０９にて蛍光信号を検出することで測定精度の向上を図っている（例えば、特許文献２参照。）。
【特許文献１】特表２００５−０６４３３９号公報
【特許文献２】特開２００１−３０５０５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前記従来の構成では、生体物質検出用基板は、ガラスで作られているため熱収縮が少なく、位置検出孔と泳動流路の位置とを一定に保つことが出来る。ところが、生体物質検出用基板の材料をガラスに代えて樹脂にすると、成型前後の熱ストレスのため基板が収縮するため位置検出孔と泳動流路との位置がばらついてしまう。このようなばらつきを持つ生体物質検出用基板を生体物質検出装置に装着すると、生体物質検出用基板と生体物質検出装置内部の検出用光学ユニットとの相対位置がばらつくので、検出信号が低下するという課題を有していた。
【０００９】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、寸法のばらつきが大きい生体物質検出用基板を使用しても、検出信号の低下を防ぐことの出来る生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記従来の課題を解決するために、本発明の生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出装置は、生体物質を緩衝剤中で満たされた検出用流路を移動させた際に得られる輸送反応を利用して前記生体物質の判別を行う生体物質検出用基板において、前記検出用流路を少なくとも一つ以上を有し、前記検出用流路の近傍に蛍光を発する回転対称形状の位置決めマーカを備えたことを特徴とするものである。
【００１１】
さらに本発明の生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出装置は、請求項１に記載の生体物質検出用基板と、前記位置決めマーカに励起光を照射してこの励起光による蛍光を検出するための光学ユニットと、前記光学ユニットを前記生体物質検出用基板の中心から外周に向けて移動させるための駆動部と、前記光学ユニットが検出した蛍光に応じて前記光学ユニットの照射光軸と前記位置決めマーカの中心とが一致するように前記駆動部に指令を行う信号解析部と、を備えたことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出装置によれば、生体物質検出用基板の検出用流路の近傍に位置決め用の貫通孔を設けることで検出用光学ユニットを検査流路に容易に一致させることができるので、検出信号の低下を招かず高感度で高精度な生体物質検出性能を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に、本発明の生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出用装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１４】
（実施の形態１）
図１（ａ）は生体物質検出用基板１を示す平面図であり、図１（ｂ）はその拡大図での一つの泳動ユニット３を示した図である。
【００１５】
図１（ａ）を用いて、生体物質検出用基板１の説明をする。生体物質検出用基板１の材料はアクリル系の樹脂であり、厚みは２ｍｍである。流路形成面には深さ５０μｍの流路やリザーバーとなる溝が掘られ、さらにその上面に厚さ５０μｍのアクリル製フィルムを接着して密閉流路を形成する。また、生体物質検出用基板１の中心２には、生体物質検出用基板１を生体物質検出装置に固定するための孔が設けられている。本実施の形態においては、生体物質検出用基板１には８つの泳動ユニット３が設けられている構成を例としている。
【００１６】
図１（ｂ）を用いて、生体物質検出用基板１の泳動ユニット３について詳細に説明する。
【００１７】
泳動ユニット３には、緩衝剤を注入するための緩衝剤注入部４と、生体物質を注入するサンプル注入部５が形成されている。サンプル注入部５は、流路６によりサンプル保持部７と接続されており、サンプル保持部７は流路８によりバッファ部９と接続されている。正電極１１は、流路１０により緩衝剤注入部４と接続されており、さらに、流路１４によりサンプル保持部７と接続している。負電極１２は、流路１０により緩衝剤注入部４と接続されており、さらに、流路１３によりサンプル保持部７と接続されている。
【００１８】
生体物質は、判別したいＳＮＰｓ部位を含む約６０塩基長の１本鎖ＤＮＡであり、蛍光物質（Ｃｙ５）で標識されている。サンプル注入部５へ注入された生体物質は、流路６を通りサンプル保持部７まで移動し、一定量の生体物質がサンプル保持部７に保持される。一定量を超える生体物質は、流路８を通りバッファ部９まで移動する。
【００１９】
電気泳動するための緩衝剤としてＤＮＡコンジュゲートを準備する。ＤＮＡコンジュゲートとは、６〜１２塩基長１本鎖ＤＮＡの５’末端に高分子のリニアポリマーが共有結合したものである。さらにＤＮＡは、正常型に対しては相補であるが変異型に対しては相補ではない配列であり、正常型ＤＮＡに対しての結合力が強く、変異型ＤＮＡに対しての結合力が弱い特性がある。また、電気泳動した場合、５’末端に結合した。リニアポリマーがおもりとなり泳動速度がかなり遅いという特性もある。緩衝剤注入部４へ注入された緩衝剤は、流路１０より正電極１１および負電極１２へ移動し、さらに、流路１３および流路１４を満たす。
【００２０】
生体物質の電気泳動を行うため、正電極１１および負電極１２との間に電圧を印加する。電圧の印加は、正電極１１および負電極１２より緩衝剤に接触するように針状の電極を挿入した状態で行う。電圧印加により、流路１３および流路１４に電場が発生して、サンプル保持部７に保持された生体物質は流路１４中を電気泳動する。
【００２１】
ＤＮＡの検出は、蛍光標識（Ｃｙ５）を修飾したＤＮＡを６３５ｎｍの光で励起し、６７０ｎｍ付近の光検出によって、流路１４中を電気泳動するＤＮＡサンプルの状態を検出することで行った。さらには、電気泳動する流路１４を円弧状としたことで、生体物質検出用基板１を回転させることにより、流路１４中を電気泳動するＤＮＡサンプルの分布を測定する。
【００２２】
次に、生体物質検出用基板１に設けた位置決めマーカを説明する。位置決めマーカは、生体物質検出用基板上１の泳動ユニット３と隣接する泳動ユニットとの間で、１５に示す位置に設ける。本実施例では、位置決めマーカの形状をφ０．５ｍｍの円形状とし、流路１４と置決めマーカの中心とが同心円上になるように配置した。図１（ｂ）での泳動ユニット３の点Ａおよび点Ｂにおける断面図を図２に示す。ここで流路１４が形成された面をａ面とし、その反対の面をｂ面とする。図２に示す位置決めマーカは、円筒状の貫通孔１５と蛍光を発するシート１６から成り、蛍光を発するシート１６は、この貫通孔１５を覆うようにｂ面側に貼り付けられている。貫通孔１５のサイズは、ここではφ０．５ｍｍとした。
【００２３】
また、蛍光シートは、波長６３５ｎｍの励起光により、波長６７０ｎｍ付近の蛍光を発する特性を持ち、光量はＤＮＡサンプルと同程度であり、０．５μＷ励起したとき、数１０ｐＷ蛍光する。その理由は、光量が大きすぎるとオーバーレンジになり、位置決めを行うことができないためである。
【００２４】
貫通孔１５および流路１４は同心円上にあることより、生体物質検出用基板１の成型後の収縮、および、フィルム貼付時の熱収縮が発生したとしても、貫通孔１５および流路１４は同心円上に位置する。よって、貫通孔１５の位置を検出して、蛍光を検出する装置と貫通孔１５との相対位置を合わせることにより、蛍光を検出する装置と流路１４の内外周方向の位置を合わせることが出来、流路１４中において電気泳動するＤＮＡサンプルの蛍光検出信号を低下させることなく検出することが出来る。
【００２５】
以上のように、本実施の形態１において、流路１４と同心円上で、かつ、流路１４の延長線上に貫通孔１５を設け、生体物質検出用基板１の流路形成面の反対面に蛍光シートを貼付し、蛍光を検出する装置により貫通孔１５の位置を蛍光検出することにより、寸法のばらつきが大きい生体物質検出用基板を使用しても、生体物質検出用基板と蛍光を検出する装置との相対位置のばらつきを防ぐことができる。
【００２６】
（実施の形態２）
図３は、図１（ｂ）の泳動ユニット３の点Ａおよび点Ｂにおける断面図である。図３において、流路１４、貫通孔１５を設け、ａ面にアクリル製フィルム１７を接着する。実施の形態１の構成と異なるところは、アクリル製のフィルム１７の貫通孔１５部分に、蛍光を発するインク１８を塗布した点である。インク１８は、ｂ面側より塗布し、塗布するエリアは、貫通孔１５を覆う程度である。インク１８をｂ面より塗布することの利点は、貫通孔１５をインク１８の塗布が覆う場合、ａ面側からは、インク１８の位置およびサイズが、貫通孔１５と一致する点である。例えば、生体検出用基板の流路形成面から塗布する場合には、位置決めマーカの位置を認知して、印刷する必要があり、印刷位置が位置決めマーカの位置とずれる可能性がある。しかし、ｂ面よりインクを塗布することにより、位置精度よく、簡易に、位置決めマーカを形成することが可能である。また、インク１８は、波長６３５ｎｍの励起光により波長６７０ｎｍ付近の蛍光を発する特性を持ち、光量はＤＮＡサンプルと同程度であるとする。
【００２７】
貫通孔１５の位置を検出して、蛍光を検出する装置と貫通孔１５との相対位置を合わせることにより、蛍光を検出する装置と流路１４の内外周方向の位置を合わせることが出来、流路１４中において電気泳動するＤＮＡサンプルの蛍光検出信号を低下させることなく検出することが出来る。
【００２８】
以上のように、本実施の形態２においては、流路１４と同心円上で、かつ、流路１４の延長線上に貫通孔１５を設け、生体物質検出用基板１の流路形成面の反対面に蛍光を発するシート１６を貼付し、光学ユニット４１により貫通孔１５の位置を蛍光検出することにより、寸法のばらつきが大きい生体物質検出用基板を使用しても、生体物質検出用基板と蛍光を検出する装置との相対位置のばらつきを防ぐことができる。
【００２９】
（実施の形態３）
図４は、本発明の実施の形態１におけるＤＮＡサンプル判別のための蛍光検出および位置決めを行う生体物質検出装置を示す構成図である。
【００３０】
図４において、４１は、以下の部品で構成された光学ユニットである。光源３０には、波長６３５ｎｍのレーザーダイオードを用いる。この光源は、ＤＮＡを標識する蛍光物質Ｃｙ５の吸収波長域で蛍光物質Ｃｙ５を励起できる励起パワーであれば良い。ダイクロイックミラー３１は、波長６３５ｎｍ付近の光を反射して波長６７０ｎｍ付近の光を透過する特性を持つ。そのため、励起光はダイクロイックミラー３１で反射される。反射された励起光は、対物レンズ３２により平行光にされ、生体物質検出用基板３４上の流路３３へ照射される。流路３３中のＤＮＡサンプルに標識された蛍光物質は、対物レンズ３２より照射された励起光を受けて蛍光を発する。この蛍光は、対物レンズ３２、ダイクロイックミラー３１、集光レンズ３５を通り、フォトダイオード３６で受光される。
【００３１】
次に、蛍光検出用流路１４と光学ユニット４１との位置決め方法について詳細に説明する。本実施例で使用する生体物質検出用基板３４は、実施の形態１に示す貫通穴１５に蛍光シート１６を備えた生体物質検出用基板を用いるが、実施の形態２に示す生体物質検出用基板を用いても同様の位置決めを行うことができる。
【００３２】
最初に生体物質検出用基板３４を生体物質検出装置に装着すると、駆動部３７はステッピングモータから構成されており、生体物質検出用基板３４を初期位置に移動する。この初期位置の検出は、一般に行われている生体物質検出用基板３４を載置するトレイの裏面に反射板を貼り、その反射光を反射型フォトセンサにより検出すれば良い。次に、位置決めマーカの位置と光学ユニット４１からの出射光軸とをほぼ一致させるために、この初期位置を基準に予め設定したステップ数だけ生体物質検出用基板３４を回転させる。
【００３３】
その後、光学ユニット４１から出射した励起光を貫通穴１５部に貼り付けた蛍光シート１６へ照射し、蛍光シート１６から発せられる蛍光を光学ユニット４１により検出する。駆動回路３９で光学ユニット４１を内外周方向へ移動させるアクチュエータ４０を駆動し、光学ユニット４１を生体物質検出用基板３４に対して内外周方向へ移動させながら、信号解析部３８でフォトダイオード３６から得られる蛍光シート１６の検出信号をモニターする。
【００３４】
図５に、光学ユニット４１が貫通孔１５を通過した際に得られる蛍光シート１６からの蛍光値（検出信号）と光学ユニット４１位置との関係を示す。図５に示すように、貫通孔１５と光学ユニット４１との位置が一致すると検出信号は最大値５０となり、それ以外では、検出信号は小さくなる。従って解析部３８でフォトダイオード３６から得られる蛍光シート１６の検出信号をモニターすることで、光学ユニット４１と貫通孔１５との位置を検出することが出来る。
【００３５】
さらに、流路１４と光学ユニット４１との位置決め方法について説明する。蛍光シート１６からの蛍光を検出し、アクチュエータ４０により光学ユニット４１を移動させる。この検出信号と位置情報を一組として、検出信号の最大値を求めることにより、貫通穴１５と光学ユニット４１との位置を合わせることが出来る。
【００３６】
図６は、位置決めマーカと光学ユニット４１との位置決め時の信号解析の流れを示すフローチャート図である。光学ユニット４１のｙ方向の位置をｙと定義する。フォトダイオード３６で受光された光の信号を信号解析部３８へ信号Ｉyとして入力する。アクチュエータ４０により、光学ユニット４１のｙ方向の位置を＋０．１ｍｍ移動させ、フォトダイオード３６で受光された光の信号を信号解析部３８へ信号Ｉy+0.1として入力する。信号Ｉyと信号Ｉy+0.1の大小比較をし、信号Ｉy+0.1が大きい場合はｄｙ＝＋０．１ｍｍ、信号Ｉy+0.1が小さい場合はｄｙ＝−０．１ｍｍと定義する。
【００３７】
信号Ｉn＝Ｉy+0.1+(dy*n)と定義し、ｎの初期値は０である。アクチュエータ４０により、光学ユニット４１の位置を+ｄｙ移動させ、フォトダイオード３６で受光された光の信号を信号解析部３９へ信号Ｉn+1として入力する。信号Ｉnよりも信号Ｉn+1が大きい場合、アクチュエータ４０により光学ユニット４１を＋ｄｙだけ移動させ、フォトダイオード３６での受光した信号Ｉn+1と移動前の信号Ｉnとの比較を繰り返す。信号Ｉn+1よりも信号Ｉnが大きい場合、アクチュエータ４０により、光学ユニット４１の位置を−ｄｙだけ移動させる。その位置がフォトダイオード３６で受光された光が最大強度となる位置であると判定し、位置ｙ＋０．１＋ｎ＊ｄｙが貫通孔の位置であると判定できる。
【００３８】
ＤＮＡサンプルの測定は、駆動部３７により生体物質検出用基板３４を回転させ、流路１４の蛍光をスキャンすることにより行う。貫通穴１５と流路１４は同心円上に配置されており、貫通孔１５の位置を検出して、蛍光を検出する装置と貫通孔１５との相対位置を合わせることにより、蛍光を検出する装置と流路１４の内外周方向の位置を合わせることが出来、流路１４中において電気泳動するＤＮＡサンプルの蛍光検出信号を低下させることなく検出することが出来る。
【００３９】
以上のように、本実施の形態３においては、生体物質判別のための蛍光検出装置を用いて、生体物質検出用基板１上の貫通孔１５と光学ユニットの位置を合わせることにより、流路１４と光学ユニット４１との位置を合わせることが出来る。その結果、寸法のばらつきが大きい生体物質検出用基板を使用しても、生体物質検出用基板と蛍光を検出する装置との相対位置のばらつきを防ぐことができる。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明に係る生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出装置は、位置決めマーカを検出用の光学ユニットを別途設けることなく、生体物質検出用基板の検出流路位置を検出することができるので、生体物質検出用基板の位置決めとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】（ａ）本発明の実施の形態１における生体物質検出用基板の構成図（ｂ）本発明の実施の形態１における泳動ユニットを示す拡大図
【図２】本発明の実施の形態１における生体物質検出用基板の断面図
【図３】本発明の実施の形態２における生体物質検出用基板の断面図
【図４】本発明の実施の形態３における生体物質検出装置の構成図
【図５】本発明の実施の形態３における位置決めマーカの検出波形を示す図
【図６】本発明の実施の形態３おける位置決め方法のフローチャート
【図７】従来の生体物質検出用基板の構成図
【符号の説明】
【００４２】
１    生体物質検出用基板
２    中心
３    泳動ユニット
３    緩衝剤注入部
４    サンプル注入部
１４  流路
１５  貫通孔
１６  蛍光シート
１８  インク
３０  光源
３１  ダイクロイックミラー
３２  対物レンズ
３５  集光レンズ
３６  フォトダイオード
３８  信号解析部
３９  駆動回路
４０  アクチュエータ
【図１】
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【図２】
2009063470.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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