(57)【要約】【課題】  光学活性体の生産方法として有利な立体選択性を有する生体触媒を用いた生物学的生産方法において、水に溶けにくいことから、基質濃度が上げられず工業的生産原料として不向きとされてきた芳香族アミノ酸アミドより、高い反応収率と立体選択性で光学活性芳香族アミノ酸および対掌体の関係にあった光学活性芳香族アミノ酸アミドを生産する方法を確立し提供する。【解決手段】  Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属若しくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物の菌体またはその処理物を用い、有機溶媒を溶存させた水溶液中、ｐＨ７．５〜１０．５の塩基性条件下で反応させることにより、難水溶性の芳香属アミノ酸アミドより光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドを効率的に生産することが可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属若しくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物の菌体またはその処理物を、有機溶媒水溶液中、ｐＨ７．５〜１０．５の塩基性条件下で生体触媒として作用させることにより、一般式（１）に示す芳香族アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解して、一般式（２）に示す光学活性芳香族アミノ酸および対掌体として含まれていた一般式（３）に示す光学活性芳香族アミノ酸アミドを得ることを特徴とする、光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
【化１】
2009278914.tif 000010
（但し、一般式（１）、（２）、（３）中のＲはフェニル基であり、フェニル基上の水素原子がハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６以下の酸素含有基または炭素数６以下の窒素含有基に置換していてもよい。）
【請求項２】
Ｍｙｃｏｐｌａｎａに属する微生物が、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａまたはＭｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａである、請求項１に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
【請求項３】
Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａが、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ  ＡＴＣＣ４９６７８である、請求項２に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
【請求項４】
Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａが、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ  ＡＴＣＣ４２７９Ｔ、ＮＣＩＢ９４３９Ｔ、４Ｎ−２７（Ｋ−２０８）またはＴＫ００６６である、請求項２に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
【請求項５】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに属する微生物が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓである、請求項１に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
【請求項６】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ  Ｐ−８６である、請求項５に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
【請求項７】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓがＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ＡＴＣＣ１９４２０Ｔである、請求項５に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
【請求項８】
有機溶媒水溶液中に含まれる有機溶媒がメタノール、エタノール、アセトンから選ばれる一種以上の有機溶媒である、請求項１に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
【請求項９】
有機溶媒水溶液中に含まれる有機溶媒の量が３０〜９０体積％である、請求項１に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
【請求項１０】
一般式（１）、（２）、（３）中のＲが４−クロロフェニル基である、請求項１に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芳香族アミノ酸アミドから、光学活性芳香族アミノ酸および対掌体として含まれていた光学活性芳香族アミノ酸アミドを製造する方法に関する。さらに詳しくは、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属若しくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物の菌体またはその処理物を、有機溶媒水溶液中、ｐＨ７．５〜１０．５の塩基性条件下で生体触媒として作用させることにより、水に溶けにくい一般式（１）で示される芳香族アミノ酸アミドを立体選択的に効率よく加水分解して、一般式（２）で示される光学活性芳香族アミノ酸および対掌体として含まれていた一般式（３）で示される光学活性アミノ酸アミドを製造することを特徴とする、光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法に関する。光学活性芳香族アミノ酸や光学活性芳香族アミノ酸アミドは、薬理面で光学活性が要求される医薬品や農薬等の合成原料として、大変有用である。
【化１】
2009278914.tif 000002
（但し、一般式（１）、（２）、（３）中のＲはフェニル基であり、フェニル基上の水素原子がハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６以下の酸素含有基または炭素数６以下の窒素含有基に置換していてもよい。）
【背景技術】
【０００２】
従来、芳香環を有する光学活性芳香族アミノ酸誘導体の合成方法としては、光学活性フェニルグリシン誘導体の化学的手法による不斉合成法または生物学的手法による立体選択的な酵素反応法が知られている。前者の化学的手法による不斉合成法としては、ピバロイル基のような嵩高い基を有する２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ピバロイル−β−D−ガラクトピラノシルアミンをアルデヒドに作用させるＵｇｉ反応を経て、目的とする光学活性フェニルグリシンを合成する方法（例えば、非特許文献１〜４参照）がある。しかしながら、Ｕｇｉ反応は非常に活性の高い反応であるため、−７８〜０℃の低温下で温度制御しつつ行う必要があり、反応の実施は危険かつ困難性を伴う。また、Ｕｇｉ反応後には２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ピバロイル−β−D−ガラクトピラノシル基を切断し除去しなければならないため工程が煩雑になる問題点もある。さらに、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ピバロイル−β−D−ガラクトピラノシルアミンが高価であるため、工業的に実施するうえでコスト的に不利である。
【０００３】
一方、生物化学的手法としては、ヒダントイナーゼを利用したヒダントイン法（例えば、特許文献１、非特許文献５参照）が挙げられる。ヒダントイン法では５位置換ヒダントインにヒダントイナーゼを作用させて、立体選択的にヒダントインを加水分解し、光学活性カルバモイルアミノ酸を取得する。得られた光学活性カルバモイルアミノ酸をカルバモイラーゼや酸により処理することによって目的の光学活性アミノ酸が得られる。この方法は、未反応のヒダントインが容易にラセミ化するため、目的の光学活性カルバモイルアミノ酸のみを取得できる利点を有するが、ヒダントイナーゼは水系で基質に作用させるため、例えばフェニルグリシン誘導体のような水に溶けにくい基質では十分な溶解度を得ることができない。従って、低い基質濃度または基質が水に懸濁した状態で反応を行う必要があるため、反応速度も遅くなり生産性は低い。
一方、ミコプラーナ属の微生物を用いてアミノ酸アミドを立体選択的加水分解し、フェニルアラニンのような水に溶けにくい光学活性芳香族アミノ酸を取得した例もあるが（例えば、特許文献２参照）、この反応も水系で行われており、反応基質濃度が１％にも満たない低濃度であるため生産性が低い。
【０００４】
なお、ミコプラーナ属の微生物を用い、３０体積％のメタノール水溶液中で１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸アミドの立体選択的加水分解を行い、光学活性（４Ｒ）−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸を合成する方法がある（例えば、特許文献３参照）。しかしながら、水に溶けにくい芳香族アミノ酸に対しても同様に適用できるかについては何ら示されておらず、しかも、反応に対する有機溶媒濃度等の影響や効果についても示されていない。
【０００５】
さらに、水に溶けにくい基質への対応法として、樹脂に固定化したセリンプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．４．１６）を触媒に用い、有機溶媒と水の二層系で反応させる方法（例えば、非特許文献６参照）がある。この方法では、有機溶媒への溶解性を有するN−アシルアミノ酸エステルを基質として、立体選択的エステル加水分解を行う。この方法は固定化酵素の回収と再利用が可能という特徴を有するが、あらかじめDL混合アミノ酸のアシル化とエステル化が必要であること、および反応後に得られる光学活性N−アシルアミノ酸を再び加水分解しないと目的の光学活性アミノ酸が得られないという煩雑さを伴う。一方、水に溶けにくいが高温では安定なベンジルコハク酸エステルを、生体触媒を用いて有機溶媒存在下高温で立体選択的に加水分解する方法が報告されている（例えば、特許文献４参照）。しかしながら、この方法は熱分解を起こしやすいアミノ酸については適用できない。
【０００６】
その他、アミノニトリラーゼとアミダーゼの両酵素を有する菌（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＡＪ２７０）を使用し、ＤＬ体のアミノニトリルから、目的の光学活性アミノ酸を取得する方法が報告されている。しかしながら、当該菌のアミノニトリラーゼは立体選択性が低く不充分であるうえ、アミダーゼも立体選択性が低く対象となる基質の種類も限定されるという問題を有する。また、水中で反応させるため、基質濃度を上げられないという生産性に直結する問題点も有する。
【０００７】
【特許文献１】特開平９−１８７２８６号公報
【特許文献２】特開平１−２７７４９９号公報
【特許文献３】ＰＣＴ  ＷＯ２００２／０４８３８３パンフレット
【特許文献４】特開平１０−２４８５６１号公報
【非特許文献１】Ｋｕｎｚ  Ｈｏｒｓｔ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０（２），６５１（１９８８）．
【非特許文献２】Ｋｕｎｚ  Ｈｏｒｓｔ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４４（１７），５４８７（１９８８）．
【非特許文献３】Ｋｕｎｚ  Ｈｏｒｓｔ，Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎａｌｅｎ  ｄｅｒ  Ｃｈｅｍｉｅ，（７），６４９（１９９１）．
【非特許文献４】Ｚｈｏｕ  Ｇｕｏｂｉｎ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，３７（１），６５（２００５）．
【非特許文献５】Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｒｉａ  Ｊ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，８（１），８５（１９９７）．
【非特許文献６】Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｓｃｈｕｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２７，４２０（１９８５）．
【非特許文献７】Ｍｅｉ−Ｘｉａｎｇ  Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７，６５４２（２００２）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、光学活性体の生産方法として有利な立体選択性を有する生体触媒を用いた生物学的生産方法において、水に溶けにくいという性質を有するがために基質濃度が上げられず工業的生産原料として不向きとされてきた芳香族アミノ酸アミドより、高い反応収率と立体選択性で光学活性芳香族アミノ酸および対掌体の関係にあった光学活性芳香族アミノ酸アミドを生産する方法を確立し提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
水に溶けにくい芳香族アミノ酸アミドを高濃度に含む基質溶液を調製し、そこから高い収率と立体選択性で効率よく光学活性アミノ酸や光学活性アミノ酸アミドを生産するためは、基質溶解性が高くかつ使用する生体触媒に対する阻害作用が少ない有機溶媒を見出すとともに、そのような有機溶媒を含んだ反応系においても優れた活性を示す生体触媒を見出して、反応系を確立する必要がある。
【００１０】
従来のアミノ酸アミド加水分解酵素は、水単独の系では高活性であっても、アルコールやアセトン等の有機溶媒存在下では容易に失活してしまい利用できないことから、本発明者らは前記要件に適う有機溶媒と、そのような有機溶媒を含ませた反応系においても高い反応収率と立体選択性を示す微生物のスクリーニングを行った。その結果、メタノールやエタノールなどのアルコール類、アセトンやメチルエチルケトンなどのケトン類、テトラヒドロフランやジオキサンなどのエーテル類を含ませた反応系でも優れた触媒活性を示すアミノ酸アミド加水分解菌株を発見した。また、このようにして見出した有機溶媒や微生物由来の生体触媒を用い、ｐＨ７．５〜１０．５の塩基性条件下で反応させることにより、高い収率と立体選択性で光学活性芳香族アミノ酸と残った対掌体であった光学活性芳香族アミノ酸アミドを効率よく生成させ分離取得できることを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
即ち、本発明は、一般式（１）に示す側鎖Ｒがフェニル基からなる芳香族アミノ酸アミドから、光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸を効率的に生産するための、以下の１）〜１０）に示す製造方法に関する。
１）Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属若しくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物の菌体またはその処理物を、有機溶媒水溶液中、ｐＨ７．５〜１０．５の塩基性条件下で生体触媒として作用させることにより、一般式（１）に示す芳香族アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解して、一般式（２）に示す光学活性芳香族アミノ酸および対掌体として含まれていた一般式（３）に示す光学活性芳香族アミノ酸アミドを得ることを特徴とする、光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
【化２】
2009278914.tif 000003
（但し、一般式（１）、（２）、（３）中のＲはフェニル基であり、フェニル基上の水素原子がハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６以下の酸素含有基または炭素数６以下の窒素含有基に置換していてもよい。）
２）Ｍｙｃｏｐｌａｎａに属する微生物が、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａまたはＭｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａである、１）に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
３）Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａが、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ  ＡＴＣＣ４９６７８である、２）に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
４）Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａが、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ  ＡＴＣＣ４２７９Ｔ、ＮＣＩＢ９４３９Ｔ、４Ｎ−２７（Ｋ−２０８）またはＴＫ００６６である、２）に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
５）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに属する微生物が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓである、１）に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
６）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ  Ｐ−８６である、５）に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
７）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓがＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ＡＴＣＣ１９４２０Ｔである、５）に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
８）有機溶媒水溶液中に含まれる有機溶媒がメタノール、エタノール、アセトンから選ばれる一種以上の有機溶媒である、１）に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
９）有機溶媒水溶液中に含まれる有機溶媒の量が３０〜９０体積％である、１）に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
１０）一般式（１）、（２）、（３）中のＲが４−クロロフェニル基である、１）に記載の光学活性芳香族アミノ酸および光学活性芳香族アミノ酸アミドの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明で用いる微生物の菌体またはその処理物は、有機溶媒水溶液中で、一般式（１）で示される高濃度の芳香族アミノ酸アミドのアミド結合を、高い反応率かつ立体特異性で加水分解する生体触媒活性を有するものである。これによって、原料の芳香族アミノ酸アミドから、目的とする光学活性芳香族アミノ酸と対掌体の関係にあり加水分解作用を受けなかった光学活性芳香族アミノ酸アミドを、効率的に製造することが可能になる。本発明の方法を用いることによって、医薬品原料として重要な、例えば、光学活性フェニルグリシン誘導体のような光学活性芳香族アミノ酸を、経済的に製造し供給することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の原料基質となる芳香族アミノ酸アミドは、一般式（１）に示される側鎖Ｒにフェニル基を有する芳香族アミノ酸アミドである。該フェニル基は、フェニル基の一つ以上の水素原子がハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６以下の酸素含有基または炭素数６以下の窒素含有基等に置換していてもよい。また、反応に使用するアミノ酸アミドは、塩酸、硫酸若しくは硝酸等の鉱酸塩、または水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム若しくは水酸化カリウム等の塩基塩の形態でもよいが、反応後の塩の除去の手間を省略するためからも遊離体の形態であることが好ましい。
【００１４】
本発明の、一般式（１）で示されるアミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する活性を有する微生物またはその処理物は、アミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する活性を有しており、かつ有機溶媒を含む水混合溶媒系でも高い活性を保持するものが相応しい。このような生体触媒活性を有する微生物としては、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物、具体的にはＭｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓが挙げられる。
【００１５】
これに対して、従来のアミノ酸アミド加水分解活性を有する微生物、例えば、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ属やＰｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物由来の菌体またはその処理物を生体触媒として用いた場合は、メタノールやエタノールなどのアルコール類、アセトンやメチルエチルケトンなどのケトン類、テトラヒドロフランやジオキサンなどのエーテル類が、水混合溶媒中に有機溶媒として５体積％以上含まれると、生体触媒が失活しアミノ酸アミドの加水分解活性が著しく低下する。
【００１６】
一方、本発明者らが見出した微生物、即ち、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物、特にＭｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ  ＡＴＣＣ４９６７８、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ  ＡＴＣＣ４２７９Ｔ、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ  ＮＣＩＢ９４３９Ｔ、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ  ４Ｎ−２７（Ｋ−２０８）、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ  ＴＫ００６６、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ  Ｐ−８６、  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ＡＴＣＣ１９４２０Ｔの菌体またはその処理物を生体触媒として用いた場合には、基質となる芳香族アミノ酸アミドの溶解性を高めるため有機溶媒を高濃度に含ませた水混合溶媒を反応系に用いた場合でも、高い生体触媒活性を保持することが可能となる。
なお、上記の微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株や細胞融合株、または遺伝子組換え法等の遺伝学的手法により誘導される組換え株等の何れの株であっても上記能力を有するものであれば、本発明に使用できる。
【００１７】
これら微生物の培養は通常、資化し得る炭素源、窒素源、各微生物に必須の無機塩、栄養等を含有させた培地を用いて行われる。培養時のｐＨは４〜１０の範囲であり、温度は２０〜５０℃である。培養は1日〜１週間程度好気的に行われる。このようにして培養した微生物は、菌体または該菌体の処理物、例えば培養液、分離菌体、菌体破砕物、さらには精製した生体触媒として反応に使用される。また、常法に従って菌体またはその処理物を固定化して生体触媒して使用することもできる。
【００１８】
原料の一般式（１）で示されるアミノ酸アミドに対する微生物の菌体または菌体処理物の使用量は、乾燥菌体に直して重量比で０．０００１〜３倍量の範囲になるように添加することが好ましく、０．００１〜１倍量の範囲になるようにすることがより好ましい。重量比が０．０００１倍量を下回る場合には反応速度が遅いため、処理に長時間を要することになる。３倍量を超える場合には反応時間は短くなるものの、生体触媒としての利用効率の面から好適とは言えず、しかも反応後の菌体または菌体処理物の分離に労力を要することとなり工業的に不利となる。
【００１９】
基質濃度を上げ生産効率を高めるため、有機溶媒を水に添加する。その際に使用される有機溶媒は水との相溶性を有し、かつ一般式（１）で示す芳香族アミノ酸アミドに対して反応性を有さないことが必要である。そのような例としては、メタノールやエタノールなどのアルコール類、アセトンやメチルエチルケトンなどのケトン類、テトラヒドロフランやジオキサンなどのエーテル類が挙げられ、そのうちでもメタノール、エタノール、アセトンまたはテトラヒドロフランが好ましい。
【００２０】
水に添加する有機溶媒の量は水溶液中の濃度として３０〜９０体積％の範囲が好ましく、３０〜７０体積％の範囲がより好ましい。有機溶媒の水溶液中の濃度が３０体積％を下回っていても生体触媒反応は進行するが、アミノ酸アミドの溶解度が落ちるために効率的とは言いがたい。例えば、４−クロロフェニルグリシンアミドを基質とした場合、メタノール３０体積％水溶液は基質を５重量％溶解することが可能であるが、有機溶媒を含まない水の場合は、基質濃度は１重量％にしか満たない。従って、生体触媒反応を水のみで行った場合、反応を完結することが出来ても酵素反応一回あたりの光学活性４−クロロフェニルグリシ取得量は、メタノール３０体積％水溶液を用いた場合の五分の一に過ぎない。一方、有機溶媒濃度が７０体積％を超える場合は、過剰量の有機溶媒の存在によって菌体または菌体処理物の生体触媒活性が損なわれ、反応速度が著しく低下することになる。
【００２１】
反応温度は１０〜６０℃の範囲が好ましい。有機溶剤の含有量が少ない場合には高温域である４０〜６０℃の範囲が好ましく、例えば、メタノール３０体積％の水溶液中では、５０℃において好適に反応が進行する。一方、有機溶剤の含有量が多い場合には低温域である１０〜４０℃の範囲が好ましく、例えば、メタノール７０体積％の水溶液中では、３０℃において好適に反応が進行する。反応温度が１０℃を下回る場合は反応速度が遅いため処理時間が長くなり不利となる。一方、反応温度が６０℃を超える場合は、菌体または菌体処理物の生体触媒活性が失活により低下し、アミノ酸アミドの非酵素的分解も随伴するようになるので光学純度が低下し不利となる。また、工程間で反応液の昇温、冷却に多くのエネルギーを必要とするようになり不利となる。
【００２２】
有機溶媒を含む反応混合液のｐＨはガラス電極式ｐＨ計による測定値として塩基性であるｐＨ７．５〜１０．５の範囲、好ましくはｐＨ８〜１０の範囲、より好ましくはｐＨ９〜１０範囲が望ましい。なお、反応基質として遊離体の芳香属アミノ酸アミドを使用した場合には、溶液ｐＨが９〜１０となるため、酸や塩基の添加によるｐＨ調整が必要なくかつ反応後の塩の除去も必要なくなるので都合がよい。ｐＨ７．５を下回る場合は、菌体または菌体処理物の触媒活性が低下し反応が殆ど進行しなくなる。一方、ｐＨ１０．５を上回る場合は、塩基による非酵素的な加水分解反応が無視できなくなり、見掛け上の反応率は高くなるものの光学純度が低下してしまうため不都合である。
【００２３】
次いで、反応終了液から、例えば、遠心分離機または限外濾過膜等を用いた通常の固液分離手段により微生物菌体やその処理物を除く。また、塩が存在する場合には電気透析やイオン交換樹脂を用いることにより脱塩を行うとよい。このようにして得られた溶液を濃縮した後、濃縮液に光学活性芳香族アミノ酸に対する貧溶媒を添加して、光学活性芳香族アミノ酸を優先的に析出させる。このとき用いる有機溶媒はアミノ酸が不溶でアミノ酸アミドが可溶のものであれば特に制限はないが、例えば、アルコール類が挙げられ、その例として２−メチル−１−プロパノール、ｉｓｏ−プロパノール、ｎ−プロパノール、ｉｓｏ−ヘプタノールまたは２−エチル−１−ヘキサノールなどが挙げられる。また、アルコール以外の有機溶媒としては、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、アセトンまたはテトラヒドロフランなどが挙げられる。
【００２４】
結晶として析出した一般式（２）で示される光学活性芳香族アミノ酸を遠心または濾過などの公知の方法により分離することによって、溶液中に溶解している一般式（３）で示される光学活性芳香族アミノ酸アミドと分けることができる。一方、結晶として析出した光学活性芳香族アミノ酸を除いた母液から、光学活性芳香族アミノ酸アミドを得ることができる。即ち、得られた母液をそのまままたは濃縮した後に塩酸、硫酸、硝酸などの鉱酸を添加することにより光学活性アミノ酸アミドの酸塩を析出させ、遠心または濾過などの公知の分離法により回収する。次いで、得られた光学活性アミノ酸アミドの酸塩に水を加え還流下に加水分解した後、必要に応じて再結晶、電気透析、イオン交換樹脂処理などの脱塩処理を行うことにより、一般式（２）で示される光学活性芳香族アミノ酸に対して鏡像関係にある光学活性芳香族アミノ酸を得ることができる。
本発明の方法によって、例えば、Ｒが４−ハロゲン置換フェニル基であり難水溶性である４−クロロフェニルグリシンアミドから、同じく難水溶性のＬ−４−クロロフェニルグリシンおよびD−４−クロロフェニルグリシンを製造することができる。
【実施例】
【００２５】
実施例および比較例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例にのみ限定されるものではない。  
なお、基質の芳香族アミノ酸アミド、反応生成物である光学活性芳香族アミノ酸、光学活性芳香族アミノ酸アミドの量または光学純度は以下のHPLC条件で測定した。
（１）反応率の測定
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  Ｒ４−１８（４．６φ×２５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃，  検出：２２０ｎｍ吸収
溶離液：過塩素酸５０ｍＭ水溶液，  流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
（２）光学純度の測定
カラム：Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ  ＯＡ−５０００（１５０ｍｍ）
カラム温度：３０℃，  検出：２５４ｎｍ吸収
溶離液：２ｍＭ硫酸銅水溶液／ｉｓｏ−プロパノール（９５／５），  流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
【００２６】
実施例１
（１）Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ  ＡＴＣＣ４９６７８の培養
水に溶けにくい芳香族アミノ酸アミドを有機溶剤存在下でも効率良く立体選択的に加水分解することが判明したＭｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ  ＡＴＣＣ４９６７８を表１に示す培地に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。得られた培養液を遠心離し濃縮菌体液２６ｇを得た（表１）。
表１．培地組成（下記組成液を２０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整して使用した）
グルコース                                  １０ｇ
ポリペプトン                                ５ｇ
酵母エキス                                  ５ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                                  １ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                        ０．０４ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ                          １ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                          １ｍｇ
Ｈ２Ｏ                                      １０００ｍＬ
（２）芳香族アミノ酸アミドの加水分解
試験管でラセミ体の４−クロロフェニルグリシンアミド０．０２ｇを各種組成の有機溶媒水溶液に溶解して基質溶液１ｇを調製した。各々の基質溶液に、（１）で取得したＭｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ  ＡＴＣＣ４９６７８の濃縮菌体液を０．００５ｇずつ添加し、振盪下３０℃で２４時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで測定したところ、何れもＬ−４−クロロフェニルグリシンアミドに対し、高い収率で加水分解が進行した。また、加水分解により生成した４−クロロフェニルグリシンは何れの試験区でもＬ体であり、９９％ｅｅ以上の光学純度を示した（表２）。
【表２】
2009278914.tif 000004
【００２７】
実施例２
（１）その他菌株の培養
実施例１のＭｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ  ＡＴＣＣ４９６７８と同様に、スクリーニングによって選抜したＭｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ  ＡＴＣＣ４２７９Ｔ、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ  ＮＣＩＢ９４３９Ｔ、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ  ４Ｎ−２７（Ｋ−２０８）、ＴＫ００６６、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ  Ｐ−８６、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ＡＴＣＣ１９４２０Ｔの各菌株を、表１に示した培地に接種し振盪下３０℃で３日間培養した。得られた培養液を遠心分離し濃縮菌体液を取得した（表３）。
【表３】
2009278914.tif 000005
（２）芳香族アミノ酸アミドの加水分解  
試験管でラセミ体の４−クロロフェニルグリシンアミド０．０２gを下表４に示す組成の有機溶媒水溶液に溶解して基質溶液１ｇを調製した。各々の基質溶液に、上記（１）で取得した各濃縮菌体液を０．００５ｇずつ添加し、振盪下３０℃で２４時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで測定したところ、何れもＬ−４−クロロフェニルグリシンアミドに対し高い収率で加水分解が進行した。また、何れも加水分解により生成した４−クロロフェニルグリシンはＬ体であり、９９％ｅｅ以上の光学純度を示した（表４）。
【表４】
2009278914.tif 000006
【００２８】
比較例１
（１）Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  Ｆｌａｖｕｓ  ＮＣＩＢ１００７１Ｔの培養
アミノ酸アミド加水分解活性を有する微生物Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  Ｆｌａｖｕｓ  ＮＣＩＢ１００７１Ｔを表１に示す培地に接種し、３０℃で４８時間振盪培養した。得られた培養液を遠心離し濃縮菌体液１０ｇを得た（表５）。
表５．培地組成（下記組成液を２０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整して使用した）
グルコース                      １０ｇ
ポリペプトン                      ５ｇ
酵母エキス                        ５ｇ
KH2PO4                          １ｇ
MgSO4・７H2O                ０．４ｇ
FeSO4・７H2O                ０．０１ｇ
MnCl2・４H2O                ０．０１ｇ
水                                １L
（２）芳香族アミノ酸アミドの加水分解
試験管でラセミ体の４−クロロフェニルグリシンアミド０．０２ｇを実施例１に示す表２と同様の各種組成の有機溶媒水溶液に溶解して基質溶液１ｇを調製した。各々の基質溶液に、（１）で取得したＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  Ｆｌａｖｕｓ  ＮＣＩＢ１００７１Ｔの濃縮菌体液を０．０５ｇずつ添加し振盪下３０℃で２４時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで測定したところ、何れも４−クロロフェニルグリシンアミドの加水分解は進行しなかった。
【００２９】
実施例３  
５０ｍＬナスフラスコへ、ラセミ体の４−クロロフェニルグリシンアミド０．２ｇを仕込み、あらかじめメタノール３０ｍＬと水７０ｍＬを混合しておいた溶媒を分注し２０ｇの混合溶解液を調製した。さらに、ＨＯＲＩＢＡ  ｐＨメータＦ−８Ｅにて混合溶解液のｐＨを測定しながら２０％水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨを８〜１０に調整した基質溶液を用意した。これらの基質溶液に、参考例１で取得したＭｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ  ＡＴＣＣ４９６７８の濃縮菌体液を０．０５ｇ添加し、３０℃にて２４時間振盪下で反応させた。反応液をＨＰＬＣで分析し反応の進行度および立体選択性を測定したところ、何れもＬ−４−クロロフェニルグリシンアミドに対し高い収率で加水分解が進行した。また、何れも加水分解により生成した４−クロロフェニルグリシンはＬ体であり、９９％ｅｅ以上の光学純度を示した（表６）。
【表６】
2009278914.tif 000007
【００３０】
比較例２
５０ｍＬナスフラスコへラセミ体の４−クロロフェニルグリシンアミド０．２ｇを仕込み、あらかじめメタノール３０ｍＬと水７０ｍＬを混合しておいた溶媒を分注し、２０ｇの混合溶解液を調製した。さらに、ＨＯＲＩＢＡ  ｐＨメータＦ−８Ｅにて混合溶解液のｐＨを測定しながら、濃塩酸または２０％水酸化ナトリウム水溶液を添加して、ｐＨを３、７、１１に調整した基質溶液を用意した。これらの基質溶液に実施例１で取得したＭｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ  ＡＴＣＣ４９６７８の濃縮菌体液を０．０５ｇ添加し、３０℃にて２４時間振盪下反応させた。反応液をＨＰＬＣで分析し反応の進行度および立体選択性を測定したところ、ｐＨ３，７の酸性条件下では４−クロロフェニルグリシンアミドの加水分解は殆ど進行しなかった。一方、ｐＨ１１の強塩基性条件下では４−クロロフェニルグリシンアミドの加水分解は見掛け上良好に進行したが、生成物はラセミ体の４−クロロフェニルグリシンであり、強塩基性条件における非酵素的な加水分解反応が起こり、立体選択性が失われていた（表７）。
【表７】
2009278914.tif 000008
（a）はＬ−４−クロロフェニルグリシンアミド基準の反応率を示す。
（b）はＤ−４−クロロフェニルグリシンアミド基準の反応率を示す。
【００３１】
実施例４
ラセミ体の４−クロロフェニルグリシンアミド１ｇを、メタノール３０体積％含有水溶液に溶解し５０ｇの基質溶液を得た。この基質溶液に、実施例１と同様にして得られたＭｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ  ＡＴＣＣ４９６７８の菌体濃縮液０．２５ｇを添加し、攪拌下３０℃で２４時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで分析したところ、原料中のＬ−４−クロロフェニルグリシンアミドの全量が加水分解しＬ−４−クロロフェニルグリシンになっていた。反応液から限外濾過によって菌体成分を除いた後、得られた限外濾過液をエバポレータで濃縮し、さらに４０℃で真空乾燥して白色乾固物を取得した。この白色乾固物にイソプロパノール１０ｍＬ加え３０分間攪拌して懸濁させた後、吸引濾過によって濾過ケーキを回収した。濾過ケーキはアセトン１０ｍＬにてリンスを行った後、４０℃にて真空乾燥を行った。その結果、白色粉末としてＬ−４−クロロフェニルグリシン０．４８ｇを取得した。原料のＬ−４−クロロフェニルグリシンアミド基準で９６％の収率であった。また、取得したＬ−４−クロロフェニルグリシンの光学純度は９９％ｅｅであった。なお、結晶取得時に使用する添加溶媒をイソプロパノールからアセトニトリル、１，４−ジオキサン、ｎ−プロパノールまたはテトラヒドロフランに換えてＬ−４−クロロフェニルグリシンの収率および光学的純度に対する影響を確認した。
１，４―ジオキサンにおいて回収率９８％と若干高かった以外は光学純度を含めて何れの添加溶媒でも変わりがなかった。
【００３２】
実施例５
実施例４の吸引濾過時に回収されたイソプロパノール濾液に、３６％濃塩酸０．２８ｇを添加し、Ｄ−４−クロロフェニルグリシンアミドを塩酸塩として析出させた。析出した塩酸塩を吸引濾過にて回収し、１０ｍＬのアセトンで洗浄後、４０℃にて真空乾燥した。取得したＤ−４−クロロフェニルグリシンアミド塩酸塩は０．５１ｇであり、ラセミ体中のＤ−４−クロロフェニルグリシンアミド基準で８６％の回収率であった。さらに、Ｄ−４−クロロフェニルグリシンアミド塩酸塩に３６％濃塩酸１０ｇを加え、還流下、反応を１時間行った。この操作によりＤ−４−クロロフェニルグリシンアミドは全量、加水分解され、Ｄ−４−クロロフェニルグリシンと塩化アンモニウムを含む溶液が得られた。反応液をエバポレートで濃縮し、さらに４０℃で真空乾燥を行いＤ−４−クロロフェニルグリシンを含む白色粉末を取得した。取得した白色粉末にエタノール９０ｇを添加し懸濁させ、室温にて３０分撹拌した後、懸濁液を吸引濾過しＤ−４−クロロフェニルグリシンを回収した。回収したＤ−４−クロロフェニルグリシンを４０℃で真空乾燥し、白色粉末として０．３４ｇのＤ−４−クロロフェニルグリシンを取得した。ラセミ体中のＤ−４−クロロフェニルグリシンアミド基準で回収率は６８％であった。また、取得したＤ−４−クロロフェニルグリシンの光学純度は９９％ｅｅであった。
【００３３】
実施例６
メタノール水溶液を溶媒として、実施例１と同様に基質溶液１ｇを調製し、各々の基質溶液にＭｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ  ＡＴＣＣ４９６７８の菌体濃縮液を０．００５ｇずつ添加し、振盪下４０、５０、６０℃で２４時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで測定したところ、何れもＬ−４−クロロフェニルグリシンアミドに対し高い収率で加水分解が進行した。各々の反応温度およびメタノール・水混合液中での酵素反応結果を表５に示す。また、何れも加水分解により生成した４−クロロフェニルグリシンはＬ体であり、９９％ｅｅ以上の光学純度を示した（表８）。
【表８】
2009278914.tif 000009