(57)【要約】【課題】医師による処置や薬剤投与を必要としないＩＧＦシグナルの活性化方法の提供。【解決手段】患部又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とするＩＧＦシグナル伝達経路の活性化方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患部又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とするＩＧＦシグナル伝達経路の活性化方法。
【請求項２】
ＩＧＦＢＰ５の発現を減少させることによりＩＧＦシグナル伝達経路を活性化する請求項１記載の方法。
【請求項３】
患部又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とするＩＧＦＢＰ５の発現抑制方法。
【請求項４】
温熱刺激が、４０〜４３℃で３０〜６０分の温熱負荷である請求項１〜３の何れか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、さまざまな生体機能に関与するＩＧＦ(Insulin like growth factor)シグナル伝達経路を活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＧＦは、インスリン様作用をもつ血清中成分として１９７８年に同定され、その活性本体が２種類のポリペプチドであったことから、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２と命名された。どちらもインスリンと構造の似た７０アミノ酸からなっており、糖代謝促進作用についてはインスリンに似ているが、インスリンに比較して細胞増殖促進作用が強いという特徴を持っている。
【０００３】
現在では、ＩＧＦ−１は、出生後の成長ホルモンの主要な作用を媒介し、他の増殖因子との相互作用もあることから、発生、分化、発育といった一連の過程で重要な役割を担っていると考えられている。一方、ＩＧＦ−２は、ＩＧＦ−１と類似の作用を有するが、主に出生前に機能し、胎児の成長に主要な役割を果たしていると考えられている。
【０００４】
ＩＧＦの細胞増殖促進作用に関しては、多くの研究がなされており、ＩＧＦシグナル伝達経路として一連の関連分子が明らかになっている（非特許文献１）。このシグナルは、主にタンパク質のリン酸化によって伝達されており、ＩＧＦが膜上に存在するＩＧＦレセプターに結合すると、ホスホイノシチド−３−キナーゼ(PI3 kinase)が活性化し、Ａｋｔをリン酸化する。リン酸化により活性化されたＡｋｔのシグナルは、ｍＴＯＲ(mammalian target of rapamycin)、ｐ７０Ｓ６キナーゼ(p70 ribosomal S6 protein kinase)へとリン酸化によって伝達されていき、最終的にＳ６リボソームタンパク質がリン酸化によって活性化される。これにより、リボソームは翻訳を促進させるため、結果として細胞増殖が引き起こされる。また、ｍＴＯＲは翻訳を負に制御する４Ｅ−ＢＰ１(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1)の調節も行っていることが知られている。活性化したｍＴＯＲは４Ｅ−ＢＰ１を抑制することで、ｅＩＦ４Ｅ(eukaryotic translation initiation factor 4E)による翻訳を促進することから、この経路によっても細胞増殖が誘導される。
【０００５】
このようなＩＧＦシグナルは、全身における多くの代謝経路に関与しており、多くの組織・器官で機能するとともに、様々な疾病にも関与することが明らかになっている。
【０００６】
筋肉においては、ＩＧＦ−１レセプターを欠損させＩＧＦシグナルを阻害すると、インスリン抵抗性を引き起こすことが知られており、ＩＧＦシグナルは、インスリン様の作用を有するだけでなく、インスリンそのものの感受性を増加させることで糖代謝を調節することが報告されている（非特許文献２）。また、ＩＧＦ−１は筋肉におけるGlucose transporter 3 (GLUT3)の発現を調節することで、糖代謝を制御していることも報告されている（非特許文献３）。
【０００７】
また、ＩＧＦシグナルは、肌においては細胞の増殖・分化を調節しており、また角質化を予防することが知られている（非特許文献４）。実際にＩＧＦを活性成分とする美肌剤も報告されており（特許文献１）、また、ＩＧＦシグナルは皮膚の再生にも大きく関わっていることから、皮膚の老化保護やダメージへの処置法としてＩＧＦを用いた技術も報告されている（特許文献２及び３）。
【０００８】
また、血中のＩＧＦ−１が上昇している人の中に、多毛症になる者が認められることから、ＩＧＦシグナルは発毛、育毛にも関与していることが知られている（非特許文献５）。ラットの毛周期の退行期にはＩＧＦ−１の発現が低下することや（非特許文献６）、細胞分裂が盛んな毛母細胞において、ＩＧＦ−１の受容体が高発現していること（非特許文献７）、ＩＧＦ−１が毛胞の増殖・分化を調節することも報告されている（非特許文献８）。また、すでにＩＧＦ−１を有効成分とする育毛剤や（特許文献４）、ＩＧＦ−１活性を有する毛母細胞活性化剤が報告されている（特許文献５）。
【０００９】
以上のように、ＩＧＦは生体内の様々な代謝経路や疾病に関与することが知られているが、その作用はＩＧＦに結合するタンパク質Insulin like growth factor binding protein （ＩＧＦＢＰ）により調節されており、ＩＧＦＢＰは現在までにＩＧＦＢＰ１からＩＧＦＢＰ６までの６種類が同定されている。
ＩＧＦＢＰの機能的役割については、正確にはわかっていない部分も多いが、主にＩＧＦシグナルの抑制または促進であり（非特許文献９及び１９）、６種類のＩＧＦＢＰは様々な臓器や器官で機能している。
【００１０】
ＩＧＦＢＰ１は、そのノックアウトマウスの研究から、肝炎・肝障害などによる肝細胞のアポトーシス抑制作用を有することが報告されている（非特許文献１１）。また、ＩＧＦＢＰ１を高発現するトランスジェニックマウスは、野生型マウスよりも脂肪量が少なく、脂肪細胞サイズも小さいことから、ＩＧＦＢＰ１が脂肪細胞におけるＩＧＦ−１の作用を抑制し、分化を阻害することも報告されている（非特許文献１２）。
【００１１】
また、ＩＧＦＢＰ１同様、ＩＧＦＢＰ２を高発現するトランスジェニックマウスも脂肪量が減少し、体重増加が抑制されたことから、ＩＧＦＢＰ２もＩＧＦ−１による脂肪細胞の分化・増殖を抑制していると考えられている（非特許文献１３）。また、この様な作用を有することからＩＧＦＢＰ２は肥満やインスリン抵抗性から生体を防御しているとの報告もなされている（非特許文献１４）。ＩＧＦＢＰ２は、前立腺癌発症時に高発現する遺伝子の一つであることから、癌にも関与していると考えられており（非特許文献１５）、グリオーマ細胞では、ＩＧＦＢＰ２が血小板由来増殖因子や癌遺伝子Ｋ−ｒａｓと協同的に働くことで、癌の進行を促進していることが報告されている（非特許文献１６）。
【００１２】
ＩＧＦＢＰ３は、循環系ではもっとも多く存在するＩＧＦＢＰであり、血中のＩＧＦ−１のほとんどがＩＧＦＢＰ３およびacid-labile subunit (ALS)と結合して存在している(非特許文献１７)。ＩＧＦＢＰ３ノックアウトマウスは野生型マウスと表現型にあまり差が認められなかったが、（非特許文献１８）。ＩＧＦＢＰ３トランスジェニックマウスにおいて、角化細胞の増殖が遅れたことから、ＩＧＦＢＰ３は角化細胞の増殖・分化に関与していると考えられている（非特許文献１９）。また、in vitroでの試験から、アポトーシス誘導にも関与するとされている(非特許文献２０および３０)。
【００１３】
ＩＧＦＢＰ４は、骨細胞が産生するＩＧＦＢＰの中では最も多く、ＩＧＦ−１による骨芽細胞の増殖作用や骨形成作用を阻害すると考えられている（非特許文献２２および３２）。また、ＩＧＦＢＰ４は、子宮の生理機能にも関与するとされており、着床から胚発生、性周期の調節などに関与すると報告されている（非特許文献３３及び３４）。
【００１４】
ＩＧＦＢＰ６は、その機能があまり明らかになっていないが、ＩＧＦ−１よりもＩＧＦ−２に結合することで、ＩＧＦ−２の作用を抑制することから、胎生期の発生や成長に関与していると考えられている（非特許文献２６）。
【００１５】
ＩＧＦＢＰ５は毛髪の形成や成長に関与することが報告されている。毛髪の成長は、主にｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）シグナルによって制御されており、特に、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１３及びＦＧＦ−２２は、毛包細胞において発現し、毛髪成長を制御していることが報告されている（非特許文献２７、２８及び２９）。これらのＦＧＦのうち、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０はその受容体であるfibroblast growth factor receptor 2-IIIb(FGFR2-IIIb)を介してシグナルが伝達されるが、マウスにＩＧＦＢＰ５を強制発現させるとＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂを介したシグナルが抑制され、毛が減少することが報告されており、ＩＧＦＢＰ５はＦＧＦシグナルを調節することで毛髪の成長や形態形成に関与していると考えられている（非特許文献３０）。また、内毛根鞘と毛髄質特異的にＩＧＦＢＰ５を発現するトランスジェニックマウスを作成したところ、そのマウスの毛が屈曲していたことから、ＩＧＦＢＰ５は直毛や縮毛など毛髪のタイプの決定にも関与することが報告されている（非特許文献３１）。
【００１６】
また、アデノウイルスを用いてマウスにＩＧＦＢＰ５を高発現させると、ウイルスの容量依存的に、コラーゲン沈着の増加と皮膚結合組織密度の増加が起こり、皮膚の線維化が促進することから、ＩＧＦＢＰ５は、皮膚の線維化にも関与すると考えられている（非特許文献３２）。
【００１７】
以上のように、ＩＧＦＢＰはＩＧＦシグナルを制御することにより、さまざまな臓器、器官で細胞の分化や増殖の調節を行っている。したがって、ＩＧＦＢＰを調節することで、ＩＧＦシグナルを制御することができると考えられ、斯かる技術は美肌や育毛等に有用であると考えられる。
【００１８】
しかしながら、ＩＧＦシグナル伝達系制御に関する既存の方法の多くは、ＩＧＦそのものを用いたり、オリゴヌクレオチドを用いたりするものであり、安全性や有効性、利便性の面で大きな課題があった。また、核酸やタンパク質、その他剤などを用いることなく、ＩＧＦシグナルを活性化する方法はこれまでに知られていなかった。
【特許文献１】特開平８−１３３９４３号公報
【特許文献２】特表２００６−５１０６７９号公報
【特許文献３】特表２００４−５０２７８８号公報
【特許文献４】特公平４−６０５６７号公報
【特許文献５】特開２０００−１５４１１８号公報
【非特許文献１】Butler AA, et al. (1998) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 121 : 19-26
【非特許文献２】Clemmons DR. (2006) Curr Opin Pharmacol. 6 : 620-625
【非特許文献３】Copland JA, et al. (2007) Biochim Biophys Acta. 69 : 631-640
【非特許文献４】Sadagurski M, et al. (2006) Mol Cell Biol. 26 : 2675-2687
【非特許文献５】Freinkel N. (1987) Verh Dtsch Ges Inn Med. 93 : 266-274
【非特許文献６】Little JC, et al. (1994) J Invest Dermatol. 103 : 715-720
【非特許文献７】Hodak E, et al. (1996) J Invest Dermatol. 106 : 564-570
【非特許文献８】Weger N, Schlake T. (2005) J Invest Dermatol. 125 : 873-882
【非特許文献９】Cohen P, Rosenfeld RG. (1994) Curr Opin Pediatr. 6 : 462-467
【非特許文献１０】Beattie J, et al. (2006) Biochem J. 395 : 1-19
【非特許文献１１】Leu JI, et al. (2003) J Clin Invest. 111 : 129-139
【非特許文献１２】Rajkumar K, et al. (1999) J Endocrinol. 162 : 457-465
【非特許文献１３】Hoeflich A, et al. (1999) Endocrinology 140 : 5488-5496
【非特許文献１４】Wheatcroft SB, et al. (2007) Diabetes 56 : 285-294
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【非特許文献１６】Dunlap SM, et al. (2007) Proc Natl Acad Sci U S A. 104 : 11736-11741
【非特許文献１７】Ooi GT, et al. (1997) Mol Endocrinol. 11 : 997-1007
【非特許文献１８】Murphy LJ, et al. (1995) Prog Growth Factor Res. 6 : 425-432
【非特許文献１９】Edmondson SR, et al. (2005) Br J Dermatol. 152 : 225-230
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【非特許文献２２】Miyakoshi N, et al. (1999) Endocrinology. 140 : 5719-5728
【非特許文献２３】Miyakoshi N, et al. (2001) Endocrinology. 142 : 2641-2648
【非特許文献２４】Henemyre C, Markoff E (1998) Biol Reprod. 58 : 801-806
【非特許文献２５】Henemyre C, Markoff E (1999) Mol Reprod Dev. 52 : 350-359
【非特許文献２６】Lipinski RJ, et al. (2005) Dev Dyn. 233 : 829-836
【非特許文献２７】du Cros DL (1993) J Invest Dermatol 101 : 106-113
【非特許文献２８】du Cros DL, et al. (1993) J Cell Sci 105 : 667-674,
【非特許文献２９】Rosenquist TA, Martin GR (1996) Developmental Dynamics 205:379-386
【非特許文献３０】Schlake T. (2005) Development. 132 : 2981-2990
【非特許文献３１】Schlake T. (2005) Mech Dev. 122 : 988-997
【非特許文献３２】Yasuoka H, et al. (2006) Arthritis Rheum. 54 : 3001-3010
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、美肌や育毛等を主目的としたＩＧＦシグナル伝達経路の活性化方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、生体への負荷が小さく、容易に実施できるＩＧＦシグナル伝達経路の抑制方法について検討したところ、生体に安全な温度で温熱刺激を与えることにより、ＩＧＦＢＰ５の遺伝子発現が低下し、ＩＧＦシグナルを活性化できることを見出した。
【００２１】
すなわち、本発明は以下の１）〜４）の発明に係るものである。
１）患部又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とするＩＧＦシグナル伝達経路の活性化方法。
２）ＩＧＦＢＰ５の発現を減少させることによりＩＧＦシグナル伝達経路を活性化する上記１）の方法。
３）患部又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とするＩＧＦＢＰ５の発現抑制方法。
４）温熱刺激が、４０〜４３℃で３０〜６０分の温熱負荷である上記１）〜３）の何れかの方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の方法は、生体への負荷が小さく、医師による処置や薬剤投与を必要とせず、エステシャン等が容易に実施できる。従って、本発明によれば、簡易且つ安全にＩＧＦシグナルを活性化でき、育毛や皮膚性状の維持・改善を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明のＩＧＦシグナル伝達経路の活性化方法は、育毛や皮膚性状の維持・改善を図るものであり、医療目的以外の目的、主に美容を目的として行われるものであって、いわゆる医療行為を含むものではない。
【００２４】
後記実施例に示すとおり、マウスに温熱刺激を与えることにより、ＩＧＦＢＰ５の遺伝子発現が有意に低下する（図１）。従って、温熱刺激はＩＧＦＢＰ５の発現を低下させることによって、ＩＧＦシグナル伝達経路の活性化を図ることができ、これによって育毛、美肌、また表皮の角化抑制等の諸現象の制御が可能であると考えられる。
【００２５】
本発明に用いる温熱刺激としては、ヒト又は動物の患部、すなわちＩＧＦシグナル伝達経路の活性化が必要な部位（臓器・器官）、もしくは全身に外部から温熱負荷を与えるのが好ましい。
人の場合、少なくとも３８℃以上の温熱負荷を３０分以上、好ましくは４０〜４３℃の温熱負荷を３０〜６０分与えるのがよい。
【００２６】
温熱刺激は、最低1週間に1回、好ましくは３日に1回とし、この温熱刺激を1回もしくは複数回繰り返すことにより行うことができる。
【００２７】
温熱刺激は、ＩＧＦシグナル伝達経路の活性化が可能な温熱負荷手段を用いて行えばよいが、好適には、既存の温熱負荷装置又は器具を用いて、上記の温熱負荷を与えるのがよい。
【００２８】
熱負荷装置・器具は、ヒト又は動物の患部又は全身に温熱刺激を加えることができ、その熱量、温度が制御可能であれば、どのような熱負荷装置又は器具を用いてもよい。
【００２９】
温熱負荷装置・器具の熱源は、通常ガス、電気等であり、熱源で作られた熱の搬送手段は、パイプ、電線等が挙げられる。これらの熱をヒト、動物等に伝える媒体としては、気体、液体、伝熱性のある固体等が挙げられる。例えば、温熱負荷装置として、電源を必要とするエアーインキュベーターである場合、電気により発生させた熱を、電線やパイプで搬送し、気体を媒体として生体に熱を伝えればよい。また、超音波振動や、マイクロ波による温熱負荷等も、本発明の温熱負荷法として用いることができる。
また、熱を発生する市販の温熱カイロ類や温熱貼布剤を用いることもできる。
【実施例】
【００３０】
試験動物はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢  ♂）（日本クレア）を用いた。
室温２３±２℃、湿度５５±１０％、１２時間の明暗サイクル（明期；ＡＭ７：００〜ＰＭ７：００）下で１週間飼育した後、平均体重が等しくなるように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをコントロール群（５匹）と加温群（５匹）の２群に分けた。加温群のマウスは、４１℃のヒートチャンバーに１時間入れることで温熱刺激を与え、その後はコントロール群と同様に飼育を行った。温熱刺激時には、ヒートチャンバー内で４１℃の水を自由摂取できるようにした。尚、飼育期間中、すべてのマウスに、ＣＥ−２固形食を自由摂食させるとともに、水道水を自由飲水させた。
【００３１】
温熱刺激から１２時間後、コントロール群、加温群それぞれのヒラメ筋、ひふく筋を採取した。定量的PCRに用いる遺伝子発現解析用サンプルは、１ｍＬのＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）内でホモジナイズ後、−８０℃で凍結保存した（Ｎ＝５）。
【００３２】
遺伝子発現解析用のサンプルからのＲＮＡの調製は、ＩＳＯＧＥＮのマニュアルに従った。
【００３３】
調製したＲＮＡは濃度をそろえ、６５℃、１０分間の熱処理を行い、急冷後に使用した。逆転写には、１２５ｎｇ相当のＲＮＡを使用し、２０μＬの反応液（１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  II（Roche）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Roche）、１ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（Takara），２．５ｍＭ  Ｏｌｉｇｏ  ｄ（Ｔ）１８  ｍＲＮＡ  ｐｒｉｍｅｒ（New England Biolabs）、１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Takara））を調製した。反応は４２℃，６０分→５２℃、３０分→９９℃、５分→４℃で行い、得られたｃＤＮＡは、使用時まで−２０℃で保存した。また、定量的ＰＣＲのスタンダード用として、５００ｎｇ相当のＲＮＡを使用し、同様の反応系で逆転写を行った。
【００３４】
逆転写反応によって得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７５００  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems）にて定量的ＰＣＲを行った。スタンダード用ｃＤＮＡを７段階希釈したものをスタンダードとして、作成した標準曲線に基づき、定量を行った。得られた解析結果は３６Ｂ４の発現量を内部標準として補正し、相対的ｍＲＮＡ発現量として表した。反応液は、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Applied Biosystems）  ２５μＬ、１００μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  １μＬ、１００μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  １μＬ、ｄＨ２Ｏ  ２２μＬ、ｃＤＮＡ  １μＬ、となるように調製した。定量的ＰＣＲの温度条件は５０℃２分、９５℃１０秒の後、９５℃１５秒と６０℃１分の反応を４０サイクル繰り返した。
【００３５】
ＩＧＦシグナル伝達経路に関与する遺伝子、ＩＧＦＢＰ５を定量的ＰＣＲにて測定した。表１に、定量的ＰＣＲに用いたプライマーの配列を示す。
【００３６】
【表１】
2009278888.tif 000002
【００３７】
試験結果は平均値±標準偏差(Average(Ave)±standard deviation(SD))で表し、コントロール群を1とした相対値で示した。有意差検定はｔ−ｔｅｓｔを用いて行い、ｐ値が０．０５未満のものを統計学的有意差があるとした。
【００３８】
定量的ＰＣＲを行った結果、温熱刺激によって、ヒラメ筋及びひふく筋においてＩＧＦＢＰ５の遺伝子発現が有意に低下することが明らかになった（図１及び図２）。
【００３９】
以上のことから、温熱刺激はＩＧＦＢＰ５遺伝子の発現を低下させることによって、ＩＧＦシグナル伝達経路を活性化させると考えられた。従って、温熱刺激は、育毛、美肌、また表皮の角化抑制等の諸現象の制御に有効であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】温熱刺激を負荷した場合のヒラメ筋におけるＩＧＦＢＰ５遺伝子の発現量を示す図。
【図２】温熱刺激を負荷した場合のひふく筋におけるＩＧＦＢＰ５遺伝子の発現量を示す図。
【図１】
2009278888.tif 000003
【図２】
2009278888.tif 000004
【配列表】
2009278888000001.app