(57)【要約】【課題】本発明は、角層にダメージを有し、ヒトにおける敏感肌を反映した培養細胞モデルを構築すること、および該モデルを用いたバリア改善物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。【解決手段】ＰＰＡＲα、β／δ、γ、Ｅｌｏｖｌ１、３、４、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、およびＬＸＲαから選ばれる、少なくとも１種の因子の遺伝子の発現が抑制されてなる表皮細胞と、コラーゲンと線維芽細胞とを含む培養皮膚；コラーゲンゲル内で線維芽細胞を培養し、その上に前記因子の発現が抑制されてなる表皮細胞を播種し、さらに培養して角層を形成する前記培養皮膚の製造方法；評価物質が皮膚バリア機能改善するか否かの評価を行うにあたり、前記培養皮膚を用いることを特徴とするバリア機能改善物質のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体アルファ（ＰＰＡＲα）、ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体ベータ（ＰＰＡＲβ）、ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）、ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体デルタ（ＰＰＡＲδ）、超長鎖脂肪酸伸長因子１（Ｅｌｏｖｌ１）、超長鎖脂肪酸伸長因子３（Ｅｌｏｖｌ３）、超長鎖脂肪酸伸長因子４（Ｅｌｏｖｌ４）、ステロール調節エレメント結合タンパク質−１ｃ（ＳＲＥＢＰ−１ｃ）および肝臓エックス受容体アルファ（ＬＸＲα）からなる群から選ばれる、少なくとも１種の因子の遺伝子の発現が抑制されてなる表皮細胞と、コラーゲンと線維芽細胞とを含むことを特徴とする培養皮膚。
【請求項２】
コラーゲンゲル内で線維芽細胞を培養し、その上に前記因子の発現が抑制されてなる表皮細胞を播種し、さらに培養して角層を形成することを特徴とする、請求項１に記載の培養皮膚の製造方法。
【請求項３】
評価物質が皮膚バリア機能改善するか否かの評価を行うにあたり、請求項１に記載の培養皮膚を用いることを特徴とするバリア機能改善物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記培養皮膚に測定補助用のアダプターを取り付け、該培養皮膚の表面に評価物質を添加することを特徴とする、請求項３に記載のバリア機能改善物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
評価物質の培養皮膚における物質透過性と経皮水分蒸散量との定量的評価を含む請求項３または４に記載のバリア機能改善物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子改変培養皮膚、及びこれを用いた皮膚バリア機能改善物質のスクリーニング方法に関し、詳しくは、皮膚バリア機能の研究に適した遺伝子改変培養皮膚、及び該技術を用いる皮膚バリア機能改善物質の簡便なスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の最外層には、角層と呼ばれる約２０マイクロメートルの構造が存在し、皮膚内部からの水分の過剰な蒸散を防ぐと共に、外界からの皮膚への異物や刺激物の侵入を防ぐ働きをしている。このような働きを、皮膚のバリア機能と呼んでいる。
【０００３】
敏感肌とは、肌がかさつきやすい、肌がかゆくなりやすい、肌が赤くなりやすい、化粧品が合わないことが多い、などの症状で自覚される肌の総称である。皮膚科医と美容研究者は、「「平均的」な人々に比べて、接触によって刺激あるいはアレルギー反応を起こしやすい肌である。」と定義づけをしている（非特許文献１）。このような敏感肌の症状の発生においては、皮膚の最表面にある角層のバリア機能が低下することにより、皮膚中の水分が過剰に蒸散したり、外界から皮膚へ異物や刺激物が侵入しやすくなっていることが原因の一つと考えられている（非特許文献１）。
【０００４】
これまでバリア機能改善研究には、特異的に遺伝子を改変した動物の皮膚を用いた経皮吸収性試験法が用いられてきたが、評価に非常に時間がかかっていた。また、動物愛護の精神からも縮小傾向にあり、動物を使わない方法が望まれていた。
【０００５】
皮膚バリア機能には、角質層細胞間脂質、特にセラミドが重要であることが知られている（特許文献１参照）。そこで、特許文献２では、界面活性剤や有機溶剤に接触させてバリア機能を低下させた３次元的組織細胞培養物により保湿性を評価する方法が提案されている。しかし、有機溶剤等による処理では、セラミド以外の脂質成分も溶出し、更に組織が損傷するため、バリア機能そのものを厳密に解析することはできず、特異性の高い解析技術ではなかった。
【０００６】
一方、クローディン１遺伝子（タイトジャンクション構成因子）を特異的にノックダウンした三次元培養皮膚モデルがあるが、この三次元培養皮膚は細胞間のタイトジャンクションを構成するクローディン機能が欠失しており、物質透過性、経皮投与性が向上しているものの、バリア機能の本質である「表面の角層構造」は正常であった。したがって、クローディン１遺伝子をノックダウンした三次元培養皮膚モデルは、敏感肌を反映したモデルとはいえず、バリア機能改善研究には適していない（特許文献３）。
【０００７】
また、表皮細胞中のタンパク質フィラグリンのプロセシングに関与するとされるマトリプターゼ遺伝子をノックダウンした三次元培養皮膚の報告では、マトリプターゼ遺伝子の抑制により角層の形態異常は示されているが、具体的にどの程度バリア機能が低下しているかは評価されておらず、評価方法についても言及されていなかった（非特許文献３）。
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  ＆  Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ，１０９：４３−５０，１９９４
【非特許文献２】Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１４：６８１−６８７，２０００
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４８：７６−８２，２００６
【特許文献１】特開２００２−１１４６６６号公報
【特許文献２】特開２００７−１２７４４４号公報
【特許文献３】特開２００３−２４５０６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上説明したように、皮膚バリア機能に関与する脂質関連成分の役割を解析するための培養細胞技術には、従来特異性が高くかつ簡便な方法がなかった。
【００１０】
本発明は、角層にダメージを有し、ヒトにおける敏感肌を反映した培養細胞モデルを構築すること、および該モデルを用いたバリア改善物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らが上記課題解決のために検討を重ねた結果、特定の遺伝子の発現量を抑制した培養皮膚では、角層特異的に形態的な異常が認められた。このため、本モデルは、角層の異常に起因する皮膚バリア機能低下の簡便なモデルとして使用できることを見出した。
【００１２】
また、これまで培養皮膚モデルを用いた、経皮水分蒸散量測定、物質透過性測定は、培養皮膚の強度が弱いため困難であったが、本発明では、それを達成する技術を開発した。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の発明を提供するものである。
〔１〕  ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体アルファ（ＰＰＡＲα）、ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体ベータ（ＰＰＡＲβ）、ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）、ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体デルタ（ＰＰＡＲδ）、超長鎖脂肪酸伸長因子１（Ｅｌｏｖｌ１）、超長鎖脂肪酸伸長因子３（Ｅｌｏｖｌ３）、超長鎖脂肪酸伸長因子４（Ｅｌｏｖｌ４）、ステロール調節エレメント結合タンパク質−１ｃ（ＳＲＥＢＰ−１ｃ）および肝臓エックス受容体アルファ（ＬＸＲα）からなる群から選ばれる、少なくとも１種の因子の遺伝子の発現が抑制されてなる表皮細胞と、コラーゲンと線維芽細胞とを含むことを特徴とする培養皮膚。
〔２〕  コラーゲンゲル内で線維芽細胞を培養し、その上に前記因子の発現が抑制されてなる表皮細胞を播種しさらに培養して角層を形成することを特徴とする、〔１〕に記載の培養皮膚の製造方法。
〔３〕  評価物質が皮膚バリア機能改善するか否かの評価を行うにあたり、〔１〕に記載の培養皮膚を用いることを特徴とするバリア機能改善物質のスクリーニング方法。
〔４〕  前記培養皮膚に測定補助用のアダプターを取り付け、該培養皮膚の表面に評価物質を添加することを特徴とする、〔３〕に記載のバリア機能改善物質のスクリーニング方法。
〔５〕  評価物質の培養皮膚における物質透過性と経皮水分蒸散量との定量的評価を含む〔３〕または〔４〕に記載のバリア機能改善物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、皮膚バリア機能が低下したモデルとなりうる、培養皮膚が提供される。本発明の培養皮膚によれば、表皮バリア機能における因子の役割を特異的にかつ簡便に解析できる。また、本発明によれば、皮膚バリア機能を低下させた培養皮膚を効率的に製造するための製法も提供される。本発明の培養皮膚は、未知物質を添加することで、未知物質のバリア機能改善効果を評価しスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
〔培養皮膚〕
本発明の培養皮膚は、特定の遺伝子の発現が抑制された表皮細胞を含むことを特徴とする。すなわち、超長鎖脂肪酸伸長因子１（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｒｙ  ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ（ＦＥＮ１／Ｅｌｏ２，ＳＵＲ４／Ｅｌｏ３，  ｙｅａｓｔ）−ｌｉｋｅ  １：Ｅｌｏｖｌ  １）、超長鎖脂肪酸伸長因子３（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｒｙ  ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  （ＦＥＮ１／Ｅｌｏ２，ＳＵＲ４／Ｅｌｏ３，ｙｅａｓｔ）−ｌｉｋｅ  ３：Ｅｌｏｖｌ  ３）、超長鎖脂肪酸伸長因子４（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｒｙ  ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  （ＦＥＮ１／Ｅｌｏ２，ＳＵＲ４／Ｅｌｏ３，ｙｅａｓｔ）−ｌｉｋｅ  ４：Ｅｌｏｖｌ  ４）、ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲ）α、β／δ、γ、肝臓エックス受容体アルファ（ｌｉｖｅｒ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒα：ＬＸＲα）、ステロール調節エレメント結合タンパク質−１ｃ（ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １ｃ：ＳＲＥＢＰ−１ｃ）である。
【００１６】
この中でも、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δ、ＰＰＡＲγ、Ｅｌｏｖｌ  １、Ｅｌｏｖｌ  ３、Ｅｌｏｖｌ  ４がよい。
【００１７】
ＰＰＡＲα、β／δ（ＰＰＡＲβとＰＰＡＲδは同じものである）、γは、ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖誘導剤をリガンドとする核内受容体）の一種である。Ｅｌｏｖｌ１、３、４は超長鎖脂肪酸合成に関与する因子の一種である。ここで超長鎖脂肪酸とは炭素鎖長が２３以上の脂肪酸を意味し、いわゆる高級脂肪酸（炭素数１２〜２２）よりも長鎖の脂肪酸を意味する。ＳＲＥＢＰ−１ｃは転写因子の一つであり、コレステロールや中性脂肪を増加させ、高脂血症やインスリン抵抗性を誘発させるとされている。ＬＸＲαも転写因子の一つであり、Ｃｙｐ７Ａ１やＡＢＣ蛋白などコレステロール代謝に関連する遺伝子発現を促進する一方、中性脂肪合成に関与する転写因子ＳＲＥＢＰの転写も促進する。各因子を構成する遺伝子の塩基配列を含めた遺伝子情報は、ＮＣＢＩなどの遺伝子データベースから取得することができる。ＮＣＢＩの場合はＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ）から得ることができ、各遺伝子のＩＤは次の通りである。ＰＰＡＲα：５４６５、ＰＰＡＲβおよびδ：５４６７、ＰＰＡＲγ：５４６８、Ｅｌｏｖｌ１：６４８３４、Ｅｌｏｖｌ３：８３４０１、Ｅｌｏｖｌ４：６７８５、ＳＲＥＢＰ−１ｃ：６７２０、ＬＸＲα：１００６２。
【００１８】
本発明において表皮細胞としては、上記因子の遺伝子の発現が抑制されているものを用いる。遺伝子の発現が抑制されているとは、遺伝子本来の機能が抑えられているか又は喪失しているので、遺伝子産物が本来の遺伝子機能を発揮しないか、或いは遺伝子産物が得られない状態となっていることを意味する。遺伝子の抑制の代表的な方法として、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を挙げることができる。
【００１９】
ＲＮＡｉとは、生物・細胞に、ある遺伝子と相同な２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が取り込まれることにより、その遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の相補的なｍＲＮＡが分解される現象である（Ｆｉｒｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ  ：  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：  ８０６−８１１，  １９９８）。ＲＮＡｉによれば、低濃度でも効果が期待でき、ｍＲＮＡを破壊するだけであるため、ゲノム遺伝子には全く影響を及ぼさない。また、操作が非常に簡単で短時間で結果が得られ、しかも経済的である。
【００２０】
本発明において使用することのできる表皮細胞は、哺乳動物のものであればよく、特に、マウス、ラット等の実験動物、ヒトなどに由来するものが好ましい。また、動物の月齢、性別も特に問わないほか、採取部位についても表皮細胞が存在する部位であれば特に問わない。さらに、クラボウ社製などの市販品を用いることもできる。
【００２１】
本発明の培養皮膚は、上記表皮細胞のほかに、コラーゲンと線維芽細胞を含む。コラーゲンは、Ｉ〜ＩＶ型のいずれであってもよい。また、ウシ、ブタ、ニワトリなどの動物から調製する事が可能であるが、市販のコラーゲン、例えば、Ｔｙｐｅ−ＩＰ（新田ゼラチン）なども使用できる。また、コラーゲンに代えて、例えば、収縮コラーゲンゲルや、ポリグリコール酸、ポリ乳酸などの合成高分子、ヒトや他の動物の真皮から生細胞を除去する事によって得られる無細胞真皮（例えば、アドマトリックスTM:株式会社ビーシーエス）などを使用することもできる。線維芽細胞は哺乳動物のものであればよく、特に、マウス、ラット等の実験動物、ヒトなどに由来するものが好ましい。また、動物の月齢、性別も特に問わないほか、採取部位についても線維芽細胞が存在する部位であれば特に問わない。さらに、クラボウ社製などの市販品を用いることもできる。
【００２２】
本発明の培養皮膚は、皮膚バリア機能が低下した敏感肌モデルとして有用である。また、遺伝子を低下させる対象である各因子の脂質の角層における機能について解析することも可能である。従来の有機溶媒を用いて脂質を皮膚から抽出する方法では培養皮膚から特定脂質のみを抽出することができないため、特定脂質だけが低下した培養皮膚を作製することはできない。
【００２３】
〔培養皮膚の作製〕
本発明の培養皮膚は、三次元構造を取るいわゆる三次元培養皮膚として構成されうる。三次元培養皮膚の調製方法は特に制限されないが、コラーゲンゲル内で線維芽細胞を培養し、その上に前記因子の発現が抑制されてなる表皮細胞を播種し、さらに培養して角層を形成することが望ましい。一例を挙げると、コラーゲンゲル内で線維芽細胞を培養し、その上に表皮細胞（角化細胞）を播種し、空気曝露により（表皮細胞の面が空気に暴露するようにして）重層化させて皮膚を再構成させることができる。コラーゲンゲル２．５ｍＬあたりの表皮細胞の播種量は、好ましくは５．０×１０5〜５．０×１０6個、より好ましくは１．０×１０6〜３．０×１０6個とすることができる。表皮細胞と線維芽細胞の播種比率は、好ましくは１：１〜１：１００、より好ましくは１：５〜１：５０とすることができる。また、重層化に要する培養期間は、通常は５日〜１４日、好ましくは７日〜１２日であり、培養温度は、通常は３０℃〜４５℃、好ましくは３５℃〜３９℃である。また、三次元培養皮膚は表皮のみの培養表皮シートと比較して強固であり、組織学的にも角層の形成が認められ、正常皮膚に近い構築を呈している。
【００２４】
〔バリア機能改善物質のスクリーニング方法〕
本発明の三次元培養皮膚は、バリア機能改善物質のスクリーニングに用いることができる。スクリーニングの際には、三次元培養皮膚に評価物質を添加するが、その際、皮膚に測定補助用のアダプターを取り付けて行うことが好ましい。
【００２５】
評価物質としては、化学物質、薬剤、天然物質等を挙げることができ、その成分についても特に問わない。
【００２６】
アダプターは、三次元培養皮膚の上（表皮側表面）に取り付けられるものであればよいが、三次元培養皮膚と測定器との接触を防ぐことができるものが好ましい。また、三次元培養皮膚と測定器の間の空間の機密性を保たせるものであることが好ましい。
【００２７】
アダプターを利用することにより、一定培養皮膚面積における物質透過性、経皮水分蒸散量を測定することが可能である。すなわち、三次元培養皮膚においては、測定器を直接三次元培養皮膚に接触させても、培養皮膚を損傷することなく、また、測定器の接触条件を一定に設定することができるので、経皮水分蒸散量の正確な測定が容易となる。また、アダプターをつけて測定を行うことにより、経皮水分蒸散量の測定値のばらつきを抑制する事ができる。物質透過性の測定は例えば実施例に示す条件で行うことができる。また、経皮水分蒸散量の測定は実施例に示す条件で行うことができる。
【００２８】
本発明において用いることのできるアダプターのサイズは、培養皮膚の形状、測定器の形状によって選択することができる。アダプターの形状としては、円筒、直方形などを用いることが可能であるが、培養皮膚の形状に沿ったものが望ましく、円筒が望ましい。また、アダプターの寸法としては、作製された三次元培養皮膚の面積と同等又は小さいものであれば良く、かつ、水分蒸散量の測定器との間の機密性を保てるものであればよい。例えば、６ウェル用のカルチャーインサート上に培養皮膚を作成した場合には、内径１ｃｍ、高さ０．５ｃｍのプラスチック円筒を用いることができる。アダプターを培養皮膚に取り付ける方法は特に限定されないが固定することが好ましい。固定することにより機密性を保つことができる。固定の方法としては、アロンα（東亜化成社製）のような、強力な接着剤を用いることもできるし、ワセリン等、密閉性の高い基材を用いることもできる。
【００２９】
測定にあたり、アダプター内には評価物質とあわせて標識物質を添加することができる。添加できる標識物質としては、ウラニンやローダミンのような蛍光物質や、トルイジンブルーなどの色素、あるいは、放射線同位体などを用いることができる。測定方法は、添加物質により自由に選択することができる。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例における材料、および実施条件は以下の通りである。
＜細胞の準備＞
・線維芽細胞
線維芽細胞（クラボウ社製）を７５ｃｍ2の培養フラスコ（スミロン社製）に３．３×１０5ｃｅｌｌｓ／フラスコとなるように播種し、１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、シグマ社製）を含有したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、シグマ社製）で培養した。１日おきに培地交換を行い、７０〜８０％コンフルエントになるまで細胞を培養した。
【００３１】
・表皮細胞
表皮細胞（クラボウ社製）を７５ｃｍ2の培養フラスコに３．３×１０5ｃｅｌｌｓ／フラスコとなるように播種し、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（クラボウ社製)で培養した。１日おきに培地交換を行い、７０〜８０％コンフルエントになるまで細胞を培養した。
【００３２】
＜遺伝子のターゲット配列＞
本実施例において用いる因子の遺伝子発現抑制のターゲット配列を、表１に示した。これらのターゲット配列は、ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ）から、前述のＧｅｎｅ  ＩＤに基づき入手した配列情報から設計したものである。
【００３３】
なお、下記の表１および表２における核酸配列中、アデニン：Ａ、チミン：Ｔ、グアニン：Ｇ、シトシン：Ｃを示す。また、配列の向きは、文字列の左側がリボースの５’末端側、文字列の右側がリボースの３’末端側を示す。
【００３４】
【表１】
2009278906.tif 000002
【００３５】
＜ターゲット配列に対するｓｉＲＮＡ＞
表１に示したターゲット配列に対する、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、キアゲン社から購入して、使用した。
【００３６】
＜遺伝子発現の抑制＞
ターゲット遺伝子の発現抑制は、以下のような方法で実施した。
【００３７】
試験管に１．５ｍＬのＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を分注し、表１に記載の各配列を有する２０μＭ  ｓｉＲＮＡを３０μＬ加え、穏やかに懸濁し、ｓｉＲＮＡサンプルを調製した。一方、別の試験管に１．５ｍＬのＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を分注し、そこに３０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン社製）を添加し、穏やかに懸濁した。５分間室温で放置後、前述のｓｉＲＮＡサンプルと混ぜ、穏やかに懸濁し２０分間室温で放置した。最後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００とｓｉＲＮＡの混合サンプル３ｍＬを、７０〜８０％コンフルエントに達した表皮細胞に培地交換と同時に添加し、２４時間、３７℃で培養した。
【００３８】
コントロールには、オフターゲット効果がないことが確認されている、市販のコントロール用ｓｉＲＮＡ（ＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ．  １０２７２８０）キアゲン社製）を用いた。
【００３９】
＜遺伝子発現抑制効果の確認＞
ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現の抑制効果の確認は、各因子の遺伝子発現量を定量することにより行った。
【００４０】
前述の遺伝子発現抑制操作を行った細胞をトリプシン（クラボウ社製）でフラスコから剥離し、細胞を溶解した後ＲＮｅａｓｙ（キアゲン社製）を用いて、ＲＮＡを調製した。その後ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。遺伝子の発現量は、ＧｅｎｅＡｍｐ５７００（ＡＢＩ社製）を用いたリアルタイムＰＣＲによって定量した。表２に各遺伝子の発現量を定量するために用いたプライマーを記載した。プライマーはシグマ社に合成を依頼し、購入して用いた。
【００４１】
【表２】
2009278906.tif 000003
【００４２】
＜三次元培養皮膚の作製＞
三次元培養皮膚の作製は、下記の手順に沿って行った。前述の７０〜８０％コンフルエントになった線維芽細胞をトリプシンによりフラスコから剥離した後、５倍濃縮のＤＭＥＭに懸濁し、１ｍＬあたり１×１０5ｃｅｌｌｓとなるように、１０％ＦＢＳを含んだコラーゲンＴｙｐｅ−ＩＰ（新田ゼラチン社製）に穏やかに懸濁し、６ウェル用のカルチャーインサート（０．２２μｍ  ｐｒｅ  ｓｉｚｅ：ファルコン社製）に２．５ｍＬ分注した。３７℃で２時間放置した後、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地をゲル上に２ｍＬ、外部ウェルに２ｍＬ分注し、ゲルを２時間平衡化した。
【００４３】
その後、平衡化した培地を取り除き、前述のように各遺伝子につき遺伝子抑制操作を行った表皮細胞を１ｍＬあたり１．５×１０6ｃｅｌｌｓとなるようにＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に懸濁し、２ｍＬをゲル上に播種した。３７℃で１８時間培養した後、培地を回収し、外部ウェルにＢｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＰＥ、クラボウ社製）を除いたＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に１．３ｍＭの塩化カルシウム（シグマ社製）、１０μｇ／ｍＬのトランスフェリン（シグマ社製）、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（シグマ社製）、０．１％ＢＳＡ（シグマ社製）を添加した培地を２ｍＬ分注し、３７℃で９日間培養した。培地交換は同じ培地を用いて１日おきに行った。
【００４４】
＜経皮水分蒸散量を指標とした三次元培養皮膚のバリア機能の評価＞
三次元培養皮膚のバリア機能を評価するために、経皮水分蒸散量を測定した。すなわち、培養後の三次元培養皮膚をカルチャーインサートから形を崩さないようゆっくりと取り出し、生理食塩水を浸したろ紙の上にのせた。ろ紙はホットプレート上に置き、３７℃で温めた。三次元培養皮膚の上に内径１ｃｍ、高さ０．５ｃｍのプラスチック円筒をアロンα（東亜化成社製）で貼り付けた。この円筒にＶａｐｏ  ｍｅｔｅｒ（Ｄｅｌｆｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）の測定部分を挿入し、経皮水分蒸散量を測定した。測定は室温２２度、湿度５０％で行った。
【００４５】
＜物質透過性を指標とした三次元培養皮膚のバリア機能の評価＞
三次元培養皮膚のバリア機能を評価するために、物質透過性を測定した。すなわち、培養後の三次元培養皮膚をカルチャーインサートごと取り出し、内径２ｃｍのフランツセル上にアロンαで貼り付けた。フランツセル内を生理食塩水で満たし、浴槽で３７℃に保温し、フランツセル内にスターラーバーを入れ生理食塩水を攪拌した。三次元培養皮膚の上に、標識物質を載せるためのアダプター（内径１ｃｍ、高さ０．５ｃｍのプラスチック円筒）をアロンαで貼り付けた。円筒内に蛍光物質であるウラニンを２５０μＬ添加し、フランツセル内に流出してくる蛍光色素を経時的にサンプリングした。透過した蛍光量はパワースキャンＨＴ（大日本製薬社製）を用いて測定した。経過時間に対するウラニンの透過量の傾きを角層のバリア機能として数値化した。
【００４６】
＜遺伝子抑制三次元培養皮膚を用いたサンプル化合物（バリア機能改善物質）の評価＞
ＢＰＥを除いたＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に１．３ｍＭの塩化カルシウム（シグマ社製）、１０μｇ／ｍＬのトランスフェリン（シグマ社製）、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（シグマ社製）、０．１％のＢＳＡ（シグマ社製）を添加した培地２ｍＬに、評価サンプル化合物を０．０１ｐｐｍとなるように添加した。次に、培養９日後の三次元培養皮膚の培地交換時に、前述の通り調製したサンプル添加済み培地を外部ウェルに分注した。１日おきに同じ培地で培地交換し５日間培養し、前述の方法で経皮水分蒸散量と物質透過性を測定し、各サンプル化合物のバリア機能改善効果を評価した。
【００４７】
実施例１〜８並びに比較例１＜遺伝子発現抑制効果＞
ｓｉＲＮＡで各遺伝子の発現を抑制した結果を、表３に示した。遺伝子発現抑制率は、コントロール用ｓｉＲＮＡの遺伝子発現量に対する各ｓｉＲＮＡ作用細胞の遺伝子発現量の差から求めた。
【００４８】
（遺伝子発現抑制効果の判定基準）
二重丸：遺伝子発現抑制率８０％以上
○：遺伝子発現抑制率６０〜８０％未満
△：遺伝子発現抑制率４０〜６０％未満
×：遺伝子発現抑制率４０％未満
【００４９】
【表３】
2009278906.tif 000004
【００５０】
表３に示した通り、比較例１のコントロールに対して、実施例１〜８においては、いずれのｓｉＲＮＡを作用させた場合も十分な遺伝子発現抑制効果が確認された。
【００５１】
実施例９〜１６及び比較例２＜遺伝子改変三次元培養皮膚の経皮水分蒸散量＞
ｓｉＲＮＡにより目的因子の遺伝子発現を抑制した三次元培養皮膚の経皮水分蒸散量を測定した結果を、表４に示した。三次元培養皮膚は培養９日後のものを用いた。コントロールとして、コントロール用ｓｉＲＮＡを作用させた三次元培養皮膚の経皮水分蒸散量を測定した。水分蒸散量上昇率はコントロールの経皮水分蒸散量に対する、各実施例における経皮水分蒸散量の割合で求めた。経皮水分蒸散量上昇率が高いほど、皮膚バリア機能が低下していることを示す。
【００５２】
（皮膚バリア機能低下効果の判定基準）
二重丸：経皮水分蒸散量上昇率１５０％以上
○：経皮水分蒸散量上昇率１２０〜１５０％未満
△：経皮水分蒸散量上昇率１００〜１２０％未満
×：経皮水分蒸散量上昇率１００％未満
【００５３】
【表４】
2009278906.tif 000005
【００５４】
表４に示した通り、実施例９〜１６において、いずれのｓｉＲＮＡを作用させた三次元培養皮膚においても、比較例２に比べ、経皮水分蒸散量の上昇が確認された。特に、ＰＰＡＲδ、Ｅｌｏｖｌ  １、Ｅｌｏｖｌ  ３、Ｅｌｏｖｌ  ４遺伝子を抑制したときに、経皮水分蒸散量上昇率が高かった。
【００５５】
これらのことから、実施例９〜１６のいずれの因子の遺伝子発現を抑制した場合にも、バリア機能の低下した三次元培養皮膚を作製できたことが確認できた。
【００５６】
実施例１７〜２４及び比較例３＜遺伝子改変三次元培養皮膚の物質透過性＞
ｓｉＲＮＡにより目的遺伝子を抑制した三次元培養皮膚の物質透過量を測定した結果を、表５に示した。三次元培養皮膚は培養９日後のものを用いた。コントロールとして市販コントロール用ｓｉＲＮＡを作用させた三次元培養皮膚の物質透過量を示した。物質透過量上昇率は、コントロールにおける経過時間と物質透過量の傾きに対する、各実施例の経過時間と物質透過量の傾きの割合で求めた。物質透過量上昇率が高いほど、バリア機能が低下していることを示す。
【００５７】
（物質透過量によるバリア機能の評価）
二重丸：物質透過量上昇率１５０％以上
○：物質透過量上昇率１２０〜１５０％未満
△：物質透過量上昇率１００〜１２０％未満
×：物質透過量上昇率１００％未満
【００５８】
【表５】
2009278906.tif 000006
【００５９】
表５に示した通り、実施例１７〜２４において、いずれのｓｉＲＮＡを作用させた三次元培養皮膚においてもコントロールに比べ、物質透過率の上昇が確認された。特にＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγ、Ｅｌｏｖｌ  １、Ｅｌｏｖｌ  ３、Ｅｌｏｖｌ  ４を抑制したときの物質透過量上昇率が高かった。
【００６０】
これらのことから、実施例１７〜２４に記載のいずれの因子の遺伝子発現を抑制した場合にも、バリア機能の低下した三次元培養皮膚を作製できたことが確認できた。
【００６１】
以上の表４、表５の結果より、各因子の遺伝子発現を改変した表皮細胞を用いて作製した三次元培養皮膚は、経皮水分蒸散量及び物質透過量の増加を示したことにより、皮膚バリア機能の低下を確認できた。したがって、遺伝子改変三次元培養皮膚は、皮膚バリア機能が低下している敏感肌のモデルとなる。
【００６２】
実施例２５〜３０及び比較例４〜５＜遺伝子抑制三次元培養皮膚のバリア機能改善物質スクリーニング系としての評価＞
以上の結果から、上述の各遺伝子を抑制した遺伝子改変三次元培養皮膚は、遺伝子改変していないコントロールの三次元培養皮膚と比較して、経皮水分蒸散量及び物質透過量が亢進しており、バリア機能の低下を示している。
【００６３】
このような皮膚バリア機能の低下している遺伝子改変三次元培養皮膚が、バリア機能改善物質のスクリーニングに使用できるかどうかを判定するため、既知のバリア機能改善物質を用いて評価した。
【００６４】
方法は、ＰＰＡＲαおよびＥｌｏｖｌ  ４の各因子の遺伝子発現を抑制した遺伝子改変三次元培養皮膚の表面に、既知のバリア機能改善物質を添加し、遺伝子改変三次元培養皮膚において亢進した、経皮水分蒸散量と物質透過量が、未改変の三次元培養皮膚と比較し、どの程度近づくかを、回復率で判定した。
【００６５】
その結果を、表６に示した。経皮水分蒸散量回復率と物質透過性回復率は以下の式で計算した。
【００６６】
（式）
経皮水分蒸散量回復率（％）＝（Ｂ−Ｃ）÷（Ｂ−Ａ）×１００
物質透過性回復率（％）＝（Ｅ−Ｆ）÷（Ｅ−Ｄ)×１００
Ａ：遺伝子を抑制していない三次元培養皮膚の経皮水分蒸散量
Ｂ：遺伝子を抑制し、化合物を添加していない三次元培養皮膚（各遺伝子の比較例）の経皮水分蒸散量
Ｃ：遺伝子を抑制し、化合物を添加した三次元培養皮膚（各遺伝子の実施例）の経皮水分蒸散量
Ｄ：遺伝子を抑制していない三次元培養皮膚の物質透過性
Ｅ：遺伝子を抑制し、化合物を添加していない三次元培養皮膚（各遺伝子の比較例）の物質透過性
Ｆ：遺伝子を抑制し、化合物を添加した三次元培養皮膚（各遺伝子の実施例）の物質透過性
【００６７】
（バリア機能の改善効果の判定基準）
二重丸：回復率が９０％以上
○：回復率が３０〜９０％未満
△：回復率が１０〜３０％未満
×：回復率が１０％未満
【００６８】
【表６】
2009278906.tif 000007
【００６９】
（表６の脚注）
シグリタゾン：シグマ社より購入
リノール酸：和光純薬工業（株）より購入
ウルソール酸：和光純薬工業（株）より購入
【００７０】
表６に示した通り、敏感肌の低下したバリア機能を改善すると報告されている、シグリタゾン、リノール酸及びウルソール酸をＰＰＡＲα、Ｅｌｏｖｌ  ４の各因子の遺伝子発現を抑制した遺伝子改変三次元培養皮膚において評価した結果、経皮水分蒸散量及び物質透過量の抑制効果が認められ、バリア機能の改善効果が確認できた。
【００７１】
したがって、上記結果から、本発明の遺伝子改変三次元培養皮膚を用いることにより、表皮のバリア機能を改善する物質をスクリーニングすることが可能であることが示された。
【００７２】
比較例６および７＜オクルーディンまたはカテプシンＤの遺伝子発現が抑制された三次元培養皮膚＞
実施例１〜８の各遺伝子に代えてカテプシンＤ（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ）とオクルーディン（Ｏｃｃｌｕｄｉｎ）の遺伝子を用いた他は同様にして、遺伝子発現を抑制し、遺伝子改変三次元培養皮膚を作製した。カテプシンＤはプロテアーゼであるがＣＥ（コーニファイドエンベロープ）の成熟にも関与する因子である。オクルーディンはタイトジャンクションの構成因子であり、各遺伝子のターゲット配列、リアルタイムＰＣＲ用プライマーは、それぞれ表７および表８に示した。なお、各遺伝子の配列情報はＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ）から得た。カテプシンＤのＧｅｎｅ  Ｉ．Ｄは１５０９、オクルーディンのＧｅｎｅ  ＩＤは４９５０である。
【００７３】
【表７】
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【００７４】
【表８】
2009278906.tif 000009
【００７５】
ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制率を前記の実施例と同様に評価したところ、両遺伝子とも８０％以上であった（二重丸）。また、各遺伝子発現抑制された三次元培養皮膚のバリア機能を前記の実施例と同様に評価したところ、水分蒸散量、物質透過性はいずれも評価△であり、コントロールと同等であった。これらのことから、本発明の培養皮膚は特定の遺伝子の発現が抑制されているために、ヒトにおける敏感肌を反映し、皮膚バリア機能改善物質のスクリーニングに有用であることが明らかとなった。
【配列表】
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