(57)【要約】【課題】全身性疼痛疾患と同様の症状を発現し、全身性疼痛疾患の発症メカニズムや治療法の研究に好適に利用でき、安価かつ容易に製造可能な、全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物を提供すること。更に、中高年の女性に圧倒的に多く発症している全身性疼痛疾患の症状に対応し、雄と雌とで症状の差を有する全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物を提供すること。【解決手段】拘束ストレス、情動性ストレス及びＳＡＲＴストレスのうちいずれかを与えられた動物からなることを特徴とする全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物である。更に、前記モデル動物は、性腺を摘出されていることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
拘束ストレスを与えられた動物からなることを特徴とする全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物。
【請求項２】
情動性ストレスを与えられた動物からなることを特徴とする全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物。
【請求項３】
性腺を摘出されてなる請求項１から２のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項４】
室温環境と冷温環境との反復負荷によるストレスを与えられた動物からなり、性腺を摘出されてなることを特徴とする全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物。
【請求項５】
ストレスが、２回以上繰り返し与えられたストレスである請求項１から４のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項６】
ストレスが、３日間以上与えられたストレスである請求項１から５のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項７】
全身性疼痛疾患が、モルヒネ投与により改善されない疾患である請求項１から６のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項８】
全身性疼痛疾患が、慢性疲労症候群、過敏性腸症候群、緊張型頭痛、顎関節症、筋筋膜痛症候群、心的外傷後ストレス障害、うつ病性疼痛、脳卒中後疼痛、視床痛及び線維筋痛症のうちいずれかである請求項１から７のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項９】
動物に拘束ストレスを与える工程を含むことを特徴とする全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物の製造方法。
【請求項１０】
動物に情動性ストレスを与える工程を含むことを特徴とする全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物の製造方法。
【請求項１１】
ストレスを与える工程の前に、性腺を摘出する工程を含む請求項９から１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
動物から性腺を摘出する工程と、前記動物に室温環境と冷温環境との反復負荷によるストレスを与える工程を含むことを特徴とする全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物の製造方法。
【請求項１３】
ストレスを与える工程が２回以上繰り返される請求項９から１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
ストレスを与える工程が３日間以上行われる請求項９から１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
全身性疼痛疾患が、モルヒネ投与により改善されない疾患である請求項９から１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
全身性疼痛疾患が、慢性疲労症候群、過敏性腸症候群、緊張型頭痛、顎関節症、筋筋膜痛症候群、心的外傷後ストレス障害、うつ病性疼痛、脳卒中後疼痛、視床痛及び線維筋痛症のうちいずれかである請求項９から１５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項１から８のいずれかに記載のモデル動物を用いる全身性疼痛疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１８】
モデル動物に対して被験物質を投与する工程と、
前記被験物質を投与されたモデル動物に対して刺激を与え、疼痛を誘発させる工程と、
前記誘発された疼痛を測定する工程と、
前記被験物質が、前記疼痛を緩和したか否かを評価する工程と、を含む請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
機械刺激、熱刺激、化学刺激及び電気刺激のうち少なくとも１つにより疼痛を誘発させる請求項１８に記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
疼痛閾値及び刺激に対する応答の大きさのうち少なくとも１つを指標として疼痛を測定する請求項１８から１９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全身性疼痛疾患と同様の症状を発現し、全身性疼痛疾患の発症メカニズムや治療法の研究に好適に利用でき、安価かつ容易に製造可能な、全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物及びその製造方法、並びに、全身性疼痛疾患の治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疼痛は、しばしば急性疼痛と慢性疼痛に分類される。急性疼痛は、組織損傷に対する反応であって、生体への警告としての役割が強い。一方、慢性疼痛は、長期持続性疾患（例えば、癌、関節リウマチなど）の随伴が見られる場合もあるが、急性の組織損傷や長期持続性疾患が治癒したにも関わらず疼痛が継続される場合や、原因不明の理由により疼痛が継続される場合がある。
【０００３】
全身性疼痛疾患は、このような原因が特定できない慢性疼痛の一つであり、身体の広範囲に強い痛みを引き起こす原因不明の疾患である。また、全身性疼痛疾患は、中高年の女性に圧倒的に多く発症している。全身性疼痛疾患は、検査による生態的異常所見が難しく、また、慢性化する傾向が多くみられるため、難治性慢性疼痛として位置づけられている。一般に、軽度〜中度の疼痛の治療には、例えばＮＳＡＩＤなどの、非オピオイド鎮痛薬が用いられ、重度の疼痛の治療には、例えばモルヒネなどのオピオイド鎮痛薬が用いられている。しかしながら、全身性疼痛疾患は、このような治療薬でも症状を改善することができない。
【０００４】
全身性疼痛疾患の患者においては、慢性疼痛が日常生活や仕事に支障をきたすだけではなく、何科にかかればよいのかわからない、専門の医師が少なく検査によっても確定診断されない、治療薬がない、怠け病とみられるなど精神的な不安を抱えるケースも少なくない。事実、全身性疼痛疾患においては、痛み以外にも、疲労感、うつ、不安などの症状が合併されるケースが、数多く報告されている。
また、全身性疼痛疾患は、中高年の女性に圧倒的に多く発症しており、手術や事故による身体的外傷や、ストレスによる精神的要因が、発症の背景に大きく関与していることが分かっているが、具体的な発症メカニズムや治療法に関しては、ほとんど分かっていない。
【０００５】
一方、常温と寒冷環境を反復負荷させるストレス（ＳＡＲＴストレス）を与えられたモデル動物は、副交感神経優位型の自律神経失調症のモデル動物として一般に知られており、持続的低血圧、免疫バランスの異常、痛覚過敏など多種の異常が報告されている。更に、このＳＡＲＴストレスを与えられたモデル動物は、線維筋痛症をはじめとした全身性疼痛症候群のモデル動物としても有用であると言われている（非特許文献１参照）。
しかしながら、前記ＳＡＲＴストレスを与えられたモデル動物は、温度変化を強いることによる身体的な負荷をかけるため予期しない副作用の併発の危険性があったり、安定した温度管理のできる低温飼育用の設備を必要とするために製造コストがかかったりする。更には、前記ＳＡＲＴストレスを与えられたモデル動物は、雄と雌とで症状の差がないために、中高年の女性に圧倒的に多く発症する全身性疼痛疾患の症状に対してより一層対応した、性差を有するモデル動物が求められている。
【０００６】
したがって、現在までのところ、全身性疼痛疾患と同様の症状を発現し、全身性疼痛疾患の発症メカニズムや治療法の研究に好適に利用でき、安価かつ容易に製造可能な、全身性疼痛疾患のモデル動物は、未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。更には、中高年の女性に圧倒的に多く発症している全身性疼痛疾患の症状に対応し、雄と雌とで症状の差を有する、全身性疼痛疾患のモデル動物は、未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｉｂｒｏｎｅｗｓ２００４（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｂｒｏ．ｊｐ／ｆｉｂｒｏｎｅｗｓ２００４．ｈｔｍ）、国際シンポジウム開かれる（第１回）、４段目
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、全身性疼痛疾患と同様の症状を発現し、全身性疼痛疾患の発症メカニズムや治療法の研究に好適に利用でき、安価かつ容易に製造可能な、全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物及びその製造方法、並びに、全身性疼痛疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。更には、中高年の女性に圧倒的に多く発症している全身性疼痛疾患の症状に対応し、雄と雌とで症状の差を有する、全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物及びその製造方法、並びに、全身性疼痛疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、拘束ストレス又は情動性ストレスを与えたマウスは、ＳＡＲＴストレスを与えたマウスと同様に、全身性でかつ慢性の疼痛を示し、全身性疼痛疾患のモデル動物として好適に利用できることを知見した。
また、マウスから性腺を摘出し、このマウスに対して拘束ストレス、情動性ストレス又はＳＡＲＴストレスを与えた場合には、卵巣を摘出した雌に比べて、精巣を摘出した雄において疼痛が緩和されており、性腺を摘出されたマウスは、中高年女性の発症率が高い全身性疼痛疾患のモデル動物として、より好適であることを知見した。さらに、情動性ストレスを与えたマウスでの精巣摘出による疼痛緩和は正常値レベルにまで達したことから、より臨床像に近いものであった。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  拘束ストレスを与えられた動物からなることを特徴とする全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物である。
＜２＞  情動性ストレスを与えられた動物からなることを特徴とする全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物である。
＜３＞  性腺を摘出されてなる＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のモデル動物である。
＜４＞  室温環境と冷温環境との反復負荷によるストレスを与えられた動物からなり、性腺を摘出されてなることを特徴とする全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物である。
＜５＞  ストレスが、２回以上繰り返し与えられたストレスである＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のモデル動物である。
＜６＞  ストレスが、３日間以上与えられたストレスである＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のモデル動物である。
＜７＞  全身性疼痛疾患が、モルヒネ投与により改善されない疾患である＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のモデル動物である。
＜８＞  全身性疼痛疾患が、慢性疲労症候群、過敏性腸症候群、緊張型頭痛、顎関節症、筋筋膜痛症候群、心的外傷後ストレス障害、うつ病性疼痛、脳卒中後疼痛、視床痛及び線維筋痛症のうちいずれかである請求項１から７のいずれかに記載のモデル動物である。
＜９＞  動物に拘束ストレスを与える工程を含むことを特徴とする全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物の製造方法である。
＜１０＞  動物に情動性ストレスを与える工程を含むことを特徴とする全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物の製造方法である。
＜１１＞  ストレスを与える工程の前に、性腺を摘出する工程を含む＜９＞から＜１０＞のいずれかに記載の製造方法である。
＜１２＞  動物から性腺を摘出する工程と、前記動物に室温環境と冷温環境との反復負荷によるストレスを与える工程を含むことを特徴とする全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物の製造方法である。
＜１３＞  ストレスを与える工程が２回以上繰り返される＜９＞から＜１２＞のいずれかに記載の製造方法である。
＜１４＞  ストレスを与える工程が３日間以上行われる＜９＞から＜１３＞のいずれかに記載の製造方法である。
＜１５＞  全身性疼痛疾患が、モルヒネ投与により改善されない疾患である＜９＞から＜１４＞のいずれかに記載の製造方法である。
＜１６＞  全身性疼痛疾患が、慢性疲労症候群、過敏性腸症候群、緊張型頭痛、顎関節症、筋筋膜痛症候群、心的外傷後ストレス障害、うつ病性疼痛、脳卒中後疼痛、視床痛及び線維筋痛症のうちいずれかである＜９＞から＜１５＞のいずれかに記載の製造方法である。
＜１７＞  ＜１＞から＜８＞のいずれかに記載のモデル動物を用いる全身性疼痛疾患の治療薬のスクリーニング方法である。
＜１８＞  モデル動物に対して被験物質を投与する工程と、
前記被験物質を投与されたモデル動物に対して刺激を与え、疼痛を誘発させる工程と、
前記誘発された疼痛を測定する工程と、
前記被験物質が、前記疼痛を緩和したか否かを評価する工程と、を含む＜１７＞に記載のスクリーニング方法である。
＜１９＞  機械刺激、熱刺激、化学刺激及び電気刺激のうち少なくとも１つにより疼痛を誘発させる＜１８＞に記載のスクリーニング方法である。
＜２０＞  疼痛閾値及び刺激に対する応答の大きさのうち少なくとも１つを指標として疼痛を測定する＜１８＞から＜１９＞のいずれかに記載のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、全身性疼痛疾患と同様の症状を発現し、全身性疼痛疾患の発症メカニズムや治療法の研究に好適に利用でき、安価かつ容易に製造可能な、全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物及びその製造方法、並びに、全身性疼痛疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供することができる。更には、中高年の女性に圧倒的に多く発症している全身性疼痛疾患の症状に対応し、雄と雌とで症状の差を有する、全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物及びその製造方法、並びに、全身性疼痛疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物）
本発明の全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物（以下、「モデル動物」と称する。）は、ストレスを与えられた動物からなることを特徴とする。
【００１３】
＜ストレス＞
前記ストレスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、拘束性ストレス、情動性ストレス、ＳＡＲＴ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈｙｔｈｍ  ｉｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）ストレス、などが挙げられる。中でも、特に設備がなくても安価かつ容易にストレスを与えることができる点で、拘束性ストレスが好ましく、身体的な負荷をかけずにストレスを与えることができるので副作用の心配が少ない点で、情動性ストレスが好ましい。
【００１４】
前記ストレスが与えられる回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１回以上が好ましく、全身性疼痛疾患の症状が効果的に誘発される点で、２回以上繰り返し与えられることがより好ましく、５回以上繰り返し与えられることが更に好ましい。前記ストレスが２回以上繰り返し与えられる場合には、１日の中で繰り返しストレスが与えられてもよく、２日間以上かけて繰り返しストレスが与えられてもよい。
【００１５】
前記ストレスが与えられる１回あたりの時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１０分間以上が好ましく、１５分間〜２時間がより好ましく、３０分間〜１時間が更に好ましい。
前記ストレスが与えられる期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１日間以上が好ましく、全身性疼痛疾患の症状が効果的に誘発される点で、３日間以上がより好ましく、５日間以上が更に好ましい。前記ストレスが２日間以上与えられる場合には、ストレスが与えられる日が連続していてもよく、連続していなくてもよいが、全身性疼痛疾患の症状が効果的に誘発される点で、連続していることが好ましい。
【００１６】
以下、前記拘束性ストレス、前記情動性ストレス及び前記ＳＡＲＴストレスについて、詳細に説明する。
【００１７】
−拘束性ストレス−
前記拘束性ストレスとは、動物の行動の自由を制限することにより与えられるストレスである。
前記行動の自由を制限される動物の部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、全身、各関節（下肢、腕、指、首など）、などが挙げられる。中でも、全身性疼痛疾患の症状が効果的に誘発される点で、全身が好ましい。
【００１８】
前記拘束性ストレスが与えられる回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１回以上が好ましく、全身性疼痛疾患の症状が効果的に誘発される点で、２回以上繰り返し与えられることがより好ましく、５回以上繰り返し与えられることが更に好ましい。前記ストレスが２回以上繰り返し与えられる場合には、１日の中で繰り返しストレスが与えられてもよく、２日間以上かけて繰り返しストレスが与えられてもよい。
【００１９】
前記拘束性ストレスが与えられる１回あたりの時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１０分間〜６時間が好ましく、２０分間〜２時間がより好ましく、３０分間〜１時間が更に好ましい。
前記拘束ストレスが与えられる期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１日間以上が好ましく、全身性疼痛疾患の症状が効果的に誘発される点で、５日間以上がより好ましく、１週間以上が更に好ましい。前記拘束ストレスが２日間以上与えられる場合には、前記拘束ストレスが与えられる日が連続していてもよく、連続していなくてもよいが、全身性疼痛疾患の症状が効果的に誘発される点で、連続していることが好ましい。
【００２０】
−情動性ストレス−
前記情動性ストレスとは、特に身体的なストレスが与えられることなく、一時的で急激な感情の動きにより与えられるストレスである。
前記感情としては、動物がストレスと感じる感情である限り、特に制限はなく、例えば、恐怖、怒り、悲しみ、仲間への危害に対する共感などが挙げられる。
【００２１】
前記情動性ストレスが与えられる回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１回以上が好ましく、全身性疼痛疾患の症状が効果的に誘発される点で、２回以上繰り返し与えられることがより好ましく、３回以上繰り返し与えられることが更に好ましく、５回以上繰り返し与えられることが特に好ましい。前記ストレスが２回以上繰り返し与えられる場合には、１日の中で繰り返しストレスが与えられてもよく、２日間以上かけて繰り返しストレスが与えられてもよい。
【００２２】
前記情動性ストレスが与えられる１回あたりの時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１０分間〜３時間が好ましく、３０分間〜１時間がより好ましい。
前記情動性ストレスが与えられる期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１日間以上が好ましく、全身性疼痛疾患の症状が効果的に誘発される点で、３日間以上がより好ましく、５日間以上が更に好ましい。
前記情動性ストレスが２日間以上与えられる場合には、前記情動性ストレスが与えられる日が連続していてもよく、連続していなくてもよいが、全身性疼痛疾患の症状が効果的に誘発される点で、連続していることが好ましい。
【００２３】
−ＳＡＲＴストレス−
前記ＳＡＲＴストレスとは、動物を室温下と冷温下とに交互に置くことで与えられるストレスである。
前記室温としては、動物が特に寒冷を感じない温度である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、２０〜２６℃が好ましく、２３〜２５℃がより好ましく、２４℃が特に好ましい。
前記室温下に動物を置く１回当たりの時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、０．５〜１．５時間が好ましく、０．５〜１時間がより好ましく、０．５時間が特に好ましい。
【００２４】
前記冷温としては、動物が寒冷を感じる温度であり、かつ、前記室温未満である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、−３〜６℃が好ましく、０〜４℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。
前記冷温下に動物を置く１回当たりの時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、０．５〜１．５時間が好ましく、０．５〜１時間がより好ましく、０．５時間が特に好ましい。
【００２５】
前記ＳＡＲＴストレスが与えられる回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、室温から冷温に移す作業を１回と数えるとき、１回以上が好ましく、全身性疼痛疾患の症状が効果的に誘発される点で、２回以上繰り返し与えられることがより好ましく、４回以上繰り返し与えられることが更に好ましい。前記ストレスが２回以上繰り返し与えられる場合には、１日の中で繰り返しストレスが与えられてもよく、２日間以上かけて繰り返しストレスが与えられてもよい。
前記ＳＡＲＴストレスが与えられる期間としては、１日間以上が好ましく、全身性疼痛疾患の症状が効果的に誘発される点で、３日間以上がより好ましく、１週間以上が更に好ましい。前記拘束ストレスが２日間以上与えられる場合には、前記拘束ストレスが与えられる日が連続していてもよく、連続していなくてもよいが、全身性疼痛疾患の症状が効果的に誘発される点で、連続していることが好ましい。
【００２６】
＜動物＞
前記モデル動物の種としては、ヒト以外であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非ヒト哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類などが挙げられ、これらの中でも非ヒト哺乳類が好ましい。また、前記非ヒト哺乳類としては、特に制限はなく、例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、サルなどが挙げられる。
【００２７】
−性腺が摘出された動物−
前記動物としては、性腺が摘出されていてもよく、摘出されていなくてもよいが、性腺が摘出されていることが好ましい。
ここで、性腺を摘出した動物にストレスを与えることにより、全身性疼痛疾患のモデル動物を製造したところ、卵巣を摘出した雌に比べて、精巣を摘出した雄において疼痛が緩和されることが、後記する実施例において明らかとなった。性腺を摘出された動物は、例えば閉経などにより性ホルモンの分泌が低下した高齢の患者に見立てることができ、卵巣を摘出した雌において相対的に疼痛が過敏であることは、全身性疼痛疾患の患者が高齢の女性に多いことに一致する。
即ち、性腺が摘出された動物にストレスを与えることにより製造されたモデル動物は、性腺が摘出されていないモデル動物に比べて、全身性疼痛疾患の発症メカニズム及び治療法の研究に対して、より有効であることが期待できる。
なお、前記性腺を摘出された動物を利用する代わりに、性ホルモンの合成乃至分泌を阻害する薬剤を動物に投与することで得られる、性ホルモンの合成乃至分泌が阻害された動物を利用してもよい。
【００２８】
＜用途＞
前記モデル動物は、全身性疼痛疾患と同様の症状を発現し、安価かつ容易に製造可能なので、全身性疼痛疾患の発症メカニズムや治療法の研究に好適に利用できる。前記全身性疼痛疾患の発症メカニズムや治療法の研究には、全身性疼痛疾患の治療薬のスクリーニングも含まれる。
【００２９】
−全身性疼痛疾患−
前記全身性疼痛疾患としては、全身性で慢性の疼痛を呈する疾患である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、線維筋痛症、慢性疲労症候群、過敏性腸症候群、緊張型頭痛、顎関節症、筋筋膜痛症候群、心的外傷後ストレス障害、うつ病性疼痛、脳卒中後疼痛、視床痛などが挙げられる。中でも、治療法が確立しておらず、全身性疼痛疾患の発症メカニズムや治療法の研究に対する需要が高い点で、モルヒネなどのオピオイド鎮痛剤が奏効しない疾患であることが好ましい。前記オピオイド鎮痛剤が奏効しない疾患としては、例えば、線維筋痛症、緊張型頭痛、視床痛などが挙げられる。
【００３０】
（全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物の製造方法）
全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物の製造方法は、少なくとも動物にストレスを与える工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
前記「動物にストレスを与える工程」については、前記（全身性疼痛疾患の非ヒトモデル動物）の項目における＜ストレス＞の項目で説明したものと同じであるので、説明を省略する。
【００３１】
前記その他の工程としては、例えば、性腺を摘出する工程などが挙げられる。
前記性腺を摘出する工程は、前記動物にストレスを与える工程の前に行ってもよく、動物にストレスを与える工程の後に行ってもよいが、誘発される症状において顕著な性差が現れる点で、前記動物にストレスを与える工程の前に行うことが好ましい。
【００３２】
（全身性疼痛疾患の治療薬のスクリーニング方法）
前記全身性疼痛疾患の治療薬のスクリーニング方法としては、前記モデル動物を用いる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記（ａ）〜（ｃ）工程を含むことが好ましく、必要に応じてその他の工程を含むことがより好ましい。
（ａ）工程：前記モデル動物に対して被験物質を投与する工程。
（ｂ）工程：前記被験物質を投与されたモデル動物に対して刺激を与え、前記刺激により誘発された疼痛を測定する工程。
（ｃ）工程：前記被験物質が、前記疼痛を緩和したか否かを評価する工程。
【００３３】
なお、前記治療薬とは、全身性疼痛疾患の症状のうち少なくとも１つの症状を予防乃至改善することができる薬剤を意味する。前記全身性疼痛疾患の症状としては、疾患に応じて変わりうるが、例えば、全身性疼痛、慢性疼痛などが代表的である。
【００３４】
＜（ａ）工程＞
−モデル動物−
前記（ａ）工程における前記モデル動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記拘束ストレスを与えられたモデル動物、前記情動性ストレスを与えられたモデル動物、前記ＳＡＲＴストレスを与えられたモデル動物などが挙げられる。前記モデル動物は、性腺が摘出されていてもよく、摘出されていなくてもよいが、性差を有する疾患に対する治療薬のスクリーニングに適している点で、性腺が摘出されたモデル動物が好ましい。
【００３５】
−被験物質−
前記（ａ）工程における前記被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製蛋白質、粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物などが挙げられる。
【００３６】
−投与−
前記被験物質の、前記モデル動物への投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、腹腔内投与、血液中への注射、飼料（餌）への添加、腸内への注入、脊髄内投与などが挙げられる。
また、前記被験物質の、前記モデル動物への投与量としても、特に制限はなく、例えば、投与対象生物の種類、被験物質の種類、副作用の程度などに応じて適宜選択することができる。一般的には、ヒトでの体重あたりの投与量を、前記投与対象生物に換算して投与することができ、当業者であれば、適切な投与量を選択することが可能である。
【００３７】
＜（ｂ）工程＞
−刺激−
前記（ｂ）工程における刺激方法としては、前記モデル動物に対して疼痛を誘発できる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、機械刺激、熱刺激、化学刺激、電気刺激などが挙げられる。
【００３８】
刺激する前記モデル動物の部位としては、前記モデル動物に対して疼痛を誘発できる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、頭頸部、体幹部、四肢、尾部、口腔、鼻腔、胃、腸、鼓膜などにおける、上皮、筋肉、神経などが挙げられる。前記部位は、１箇所を刺激してもよいし、２箇所以上を刺激してもよいが、全身性疼痛を評価できる点で、２箇所以上の刺激が好ましく、３箇所以上の刺激がより好ましい。
【００３９】
前記（ｂ）工程における疼痛の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、疼痛を感じ始めるときの刺激の大きさ（疼痛閾値）を指標とした測定；刺激に対する応答の大きさを指標とした測定；などが挙げられる。
【００４０】
前記（ｂ）工程における疼痛の測定期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１日間以上が好ましく、慢性疼痛を評価できる点で、１週間以上がより好ましく、２週間以上が更に好ましい。
【００４１】
＜（ｃ）工程＞
前記（ｃ）工程において、前記被験物質が、前記疼痛を緩和したか否かを評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記被験物質を投与しなかった場合（対照）と比較して、前記被験物質を投与した場合に、前記モデル動物が示す疼痛の程度が低減（緩和）されたときに、前記被験物質は、全身性疼痛疾患を予防乃至改善する活性を有すると評価することができる。
以上、前記（ａ）工程〜（ｃ）工程により、前記スクリーニング方法を行うことができる。前記スクリーニング方法によれば、高い精度で、かつ、効率的に、全身性疼痛疾患を予防乃至改善する物質をスクリーニングすることができる。更に、前記（ａ）工程において、性腺を摘出されたモデル動物を使用した場合には、全身性疼痛疾患の中でも症状に性差を有する疾患を予防乃至改善する物質を、より高い精度でスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００４２】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００４３】
（製造例１）
製造例１では、マウスにＳＡＲＴストレスを与えることで、全身性疼痛疾患のモデル動物を製造した。
マウスとしては、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ系雄性マウス  ６週齢（２０〜２２ｇ）を、各群８〜１６匹用いた。
【００４４】
−ストレス負荷群（ＳＡＲＴストレスを与えられたマウス）−
図１は、ＳＡＲＴストレスを与えられたマウスの製造方法を説明するための概念図である。
図１に示すように、マウスを、１６時３０分（これをストレス前日とする。）から４℃下で飼育し、翌１０時（ストレス１日目）から３０分毎に室温（２４℃）と冷温（４℃）との環境下で１６時３０分まで繰り返し環境を変えて飼育し、その後、再び４℃下で飼育した。これをストレス２日目も繰り返し、ストレス３日目の１０時に２４℃に戻した。２４℃に戻してから、１時間の適応時間が経過した時点（ストレス３日目の１１時）でストレス負荷終了とした。このとき、ストレス３日目をストレス後１日目とした。なお、前記ストレス負荷期間中は、固形の餌と水分補給のための寒天をゲージ内に常において、自由に摂取できる環境にした。
【００４５】
−正常対照群−
上記ストレス負荷群において、ストレス負荷期間中（ストレス１日目の１６時３０分〜ストレス３日目の１１時）、常に２４℃で飼育したこと以外は、上記ストレス負荷群と同様にして飼育することにより、正常対照群のマウスを製造した。
【００４６】
（比較製造例１）
製造例１のストレス負荷群において、ストレス負荷期間中（ストレス１日目の１６時３０分〜ストレス３日目の１１時）、常に４℃で飼育したこと以外は、製造例１のストレス負荷群と同様にして飼育することにより、比較製造例１のマウスを製造した。
【００４７】
（製造例２）
製造例２では、マウスに拘束ストレスを与えることで、全身性疼痛疾患のモデル動物を製造した。
マウスとしては、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ系雄性マウス  ６週齢（２０〜２２ｇ）を、各群８〜１０匹用いた。
【００４８】
−ストレス負荷群（拘束ストレスを与えられたマウス）−
図２は、拘束ストレスを与えられたマウスの製造方法を説明するための概念図である。
図２に示すように、空気腔を開けた５０ｍｌのコニカルチューブ内にマウスを押し込め、マウスを３０分間拘束した。このとき、マウスとコニカルチューブ内壁との隙間が少なくなるように、ティッシュペーパーを詰めてマウスを固定した。また、コニカルチューブが転倒するのを防ぐため、外側はビニルテープで固定した。この作業を、１日に１回ずつ、５日間連続して行った。その後、１日間の適応時間が経過した時点（ストレス後１日目）でストレス負荷終了とした。なお、前記ストレス負荷期間中（コニカルチューブ中は除く）は、固形の餌と水分は、自由に摂取できる環境にした。
【００４９】
−正常対照群−
上記ストレス負荷群において、ストレス負荷期間中、前記コニカルチューブを用いて拘束ストレスを与える作業を行わなかったこと以外は、上記ストレス負荷群と同様にして飼育することにより、正常対照群のマウスを製造した。
【００５０】
（製造例３）
製造例３では、マウスに情動性ストレスを与えることで、全身性疼痛疾患のモデル動物を製造した。
マウスとしては、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ系雄性マウス  ６週齢（２０〜２２ｇ）を、各群１３〜２０匹用いた。
【００５１】
−ストレス負荷群（情動性ストレスを与えられたマウス）−
図３は、情動性ストレスを与えられたマウスの製造方法を説明するための概念図である。
図３に示すように、床から一定条件で電気刺激を与えるコミュニケーションボックスを、透明な板で９つに区切り、区切られた空間の床上に互いに交互になるように絶縁の板を置いた。２ｍＡで１秒間の電気刺激が、１時間に１２０回ランダムに与えられえる設定にして、電気を流した。このとき、絶縁の板の上に配置されたマウスは、自分自身が電気刺激されることはないが、電気刺激されるマウスに囲まれるように配置されているために、心理的（情動性）ストレスが与えられる。この作業を、１日に１回ずつ、５日間連続して行った。その後、１日間の適応時間が経過した時点（ストレス後１日目）でストレス負荷終了とした。なお、前記ストレス負荷期間中（コミュニケーションボックス中は除く）は、固形の餌と水分は、自由に摂取できる環境にした。
【００５２】
−正常対照群−
上記ストレス負荷群において、ストレス負荷期間中、前記コミュニケーションボックスを用いて情動性ストレスを与える作業を行わなかったこと以外は、上記ストレス負荷群と同様に飼育することにより、正常対照群のマウスを製造した。
【００５３】
（比較製造例２）
製造例３のストレス負荷群において、ストレス負荷期間中、前記コミュニケーションボックスを用いて情動性ストレスを与える代わりに、前記コミュニケーションボックス内に他のマウスを配置せずに、直接的に電気刺激を与えたこと以外は、製造例３のストレス負荷群と同様に飼育することにより、比較製造例２のマウスを製造した。
【００５４】
（実施例１）
実施例１では、製造例１〜３及び比較製造例１〜２で製造したマウスについて、慢性疼痛を評価した。慢性疼痛の評価方法としては、機械刺激誘発性疼痛試験により経時的な疼痛閾値を評価した。なお、前記機械刺激誘発性疼痛試験は、デジタル式ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ法に従って行った。
【００５５】
＜方法＞
−機械刺激誘発性疼痛試験−
プラスチックチップをマウスの足底部に押しやり、その回避応答までの重量閾値をデジタル測定した。結果を図４〜８に示す。
【００５６】
＜結果＞
図４〜８は、機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であって、図４は、製造例１のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であり、図５は比較製造例１のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であり、図６は、製造例２のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であり、図７は、製造例３のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であり、図８は、比較製造例２のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【００５７】
図４〜８において、縦軸（ＰＷＴ）は、測定された重量閾値（ｇ）を示す。横軸は、ストレス負荷開始前（ｐｒｅ）、ストレス負荷期間（ｓｔｒｅｓｓ）及びストレス後（ｐｏｓｔ  ｓｔｒｅｓｓ）における経過日数を示す。このとき、ストレス３日目はストレス後１日目に相当する。そして、図４〜８において、「ｓｔｒｅｓｓ（■）」とはストレス負荷群を示し、「ｃｏｎｔｒｏｌ（□）」とは、その正常対照群を示す。
【００５８】
図４に示すように、製造例１のストレス負荷群（ＳＡＲＴストレスを与えられたマウス）においては、ストレス後１日目から、機械刺激誘発性疼痛の閾値低下、即ち、疼痛過敏が観察された。この疼痛過敏は、少なくとも１９日以上持続した。一方で、製造例１の正常対照群においては、機械刺激誘発性疼痛の経日的な閾値低下は観察されなかった。
図５に示すように、製造例１のストレス負荷群と同様のストレス期間を、常に冷温（４℃）下で飼育した低温ストレスマウス（比較製造例１）においては、ストレス後１日目には機械刺激誘発性疼痛の閾値低下、即ち、疼痛過敏が観察されるが、ストレス後３日目には回復傾向を示し慢性的な疼痛過敏は示さなかった。
【００５９】
図６に示すように、製造例２のストレス負荷群（拘束ストレスを与えられたマウス）においては、ストレス後１日目から、機械刺激誘発性疼痛の閾値低下、即ち、疼痛過敏が観察された。この疼痛過敏は、少なくとも１５日以上持続した。一方で、製造例２の正常対照群においては、機械刺激誘発性疼痛の経日的な閾値低下は観察されなかった。
【００６０】
図７に示すように、製造例３のストレス負荷群（情動性ストレスを与えられたマウス）においては、ストレス後１日目から、機械刺激誘発性疼痛の閾値低下、即ち、疼痛過敏が観察された。この疼痛過敏は、少なくとも１５日以上持続した。一方で、製造例３の正常対照群においては、機械刺激誘発性疼痛の経日的な閾値低下は観察されなかった。
図８に示すように、製造例３のストレス負荷群と同様のストレス期間を、情動性ストレスを与えずに直接的に電気刺激を負荷したマウス（比較製造例２）においては、ストレス後１日目から、機械刺激誘発性疼痛の閾値低下、即ち、疼痛過敏が観察されるが、ストレス後８日目には回復傾向を示し慢性的な疼痛過敏は示さなかった。
【００６１】
実施例１の結果によれば、ＳＡＲＴストレスを与えられたマウス、拘束ストレスを与えられたマウス及び情動性ストレスを与えられたマウスは、いずれも慢性疼痛を呈することが示された。一方で、冷温ストレスを与えられたマウス及び電気刺激を与えられたマウスは、慢性疼痛を示さなかった。
【００６２】
（実施例２）
−熱刺激誘発性疼痛試験−
実施例２では、製造例１〜３で製造したマウスについて、熱刺激誘発性疼痛試験を行った。なお、前記熱刺激誘発性疼痛試験は、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｐａｗ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ法に従って行った。
【００６３】
＜方法＞
ガラス板の上にマウスを置き、下から一定の熱刺激を与えた時の回避応答までの時間を測定した。結果を図９〜１１に示す。
【００６４】
＜結果＞
図９〜１１は、熱刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であって、図９は、製造例１のマウスに対するストレス後１日目及び１５日目における熱刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であり、図１０は、製造例２のマウスに対するストレス後１５日目の熱刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であり、図１１は、製造例３のマウスに対するストレス後１日目の熱刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
図９〜１１において、縦軸（ＰＷＬ）は、回避応答までの時間（ｓｅｃ）を示し、横軸における「Ｓｔｒｅｓｓ」とはストレス負荷群を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」とはその正常対照群を示す。
【００６５】
図９の左のグラフに示すように、製造例１のストレス負荷群（ＳＡＲＴストレスを与えられたマウス）では、ストレス後１日目の閾値が６．３８±０．１２秒であり、その正常対照群の閾値が１０．０７±０．１７秒であることと比べると、有意に下がることが確認された。また、図９の右のグラフに示すように、製造例１のストレス負荷群（ＳＡＲＴストレスを与えられたマウス）では、ストレス後１５日目の閾値が６．２８±０．４８秒であり、その正常対照群の閾値が１０．１±０．５５秒であることと比べると、有意に下がることが確認された。
即ち、製造例１のストレス負荷群（ＳＡＲＴストレスを与えられたマウス）は、熱刺激誘発性疼痛試験においても、慢性的な疼痛過敏が観察された。
【００６６】
図１０に示すように、製造例２のストレス負荷群（拘束ストレスを与えられたマウス）では、ストレス後１５日目の閾値が６．７２±０．２秒であり、その正常対照群の閾値が９．９９±  ０．２８秒であることと比べると、有意に下がることが確認された。
即ち、製造例２のストレス負荷群（拘束ストレスを与えられたマウス）は、熱刺激誘発性疼痛試験においても、慢性的な疼痛過敏が観察された。
【００６７】
図１１に示すように、製造例３のストレス負荷群（情動性ストレスを与えられたマウス）では、ストレス後１日目の閾値が６．８９±０．３８秒であり、その正常対照群の閾値が９．２４±０．３１秒であることと比べると、有意に下がることが確認された。また、この閾値の低下は、ストレス４日目から観察され、少なくとも１５日間以上持続した（図示せず）。
即ち、製造例３のストレス負荷群（情動性ストレスを与えられたマウス）は、熱刺激誘発性疼痛試験においても、慢性的な疼痛過敏が観察された。
【００６８】
（実施例３）
−化学刺激誘発性試験−
実施例３では、製造例１〜３で製造したマウスについて、化学刺激誘発性試験を行った。なお、前記化学刺激誘発性試験は、酢酸ライジング法に従って行った。
【００６９】
＜方法＞
０．９％酢酸をマウスに腹腔内投与してからの２０分間、マウスがライジング行動を行う頻度を計測した。なお、９７％酢酸を生理食塩水に希釈することで０．９％酢酸を調製した。ライジング行動とは、マウスが痛みを感じたときにライジングする（体をのばす）行動を意味する。結果を図１２〜１４に示す。
【００７０】
＜結果＞
図１２〜１４は、化学刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であって、図１２は、製造例１のマウスに対するストレス後１日目及び１５日目における化学刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であり、図１３は、製造例２のマウスに対するストレス後１５日目の化学刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であり、図１４は、製造例３のマウスに対するストレス後１日目の化学刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
図１２〜１４において、縦軸（ｗｒｉｔｈｉｎｇ）は、ライジング行動の頻度を示し、横軸における「Ｓｔｒｅｓｓ」とはストレス負荷群を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」とは正常対照群を示す。
【００７１】
図１２の左のグラフに示すように、製造例１のストレス負荷群（ＳＡＲＴストレスを与えられたマウス）では、ストレス後１日目の頻度が４９±０．５回であり、その正常対照群が３１±１回であることと比べると、有意に過敏応答を生じることが確認された。また、図１２の右のグラフに示すように、製造例１のストレス負荷群（ＳＡＲＴストレスを与えられたマウス）において、ストレス後１５日目の頻度が３９±０．５回であり、その正常対照群が３０±３回であることと比べると、有意に慢性的な過敏応答を生じることが確認された。
即ち、製造例１のストレス負荷群（ＳＡＲＴストレスを与えられたマウス）は、化学刺激誘発性疼痛試験においても、慢性的な疼痛過敏が観察された。
【００７２】
図１３に示すように、製造例２のストレス負荷群（拘束ストレスを与えられたマウス）では、ストレス後１５日目の頻度が３９±２回であり、その正常対照群の頻度が３２±０．９回であることと比べると、有意に過敏応答を生じることが確認された。
即ち、製造例２のストレス負荷群（拘束ストレスを与えられたマウス）においては、化学刺激誘発性疼痛試験においても、慢性的な疼痛過敏が観察された。
【００７３】
図１４に示すように、製造例３のストレス負荷群（情動性ストレスを与えられたマウス）では、ストレス後１日目の頻度が４１±２回であり、その正常対照群の頻度が３１±２回であることと比べると、有意に過敏応答を生じることが確認された。また、この頻度の上昇は、少なくとも１５日間以上持続した（図示せず）。
即ち、製造例３のストレス負荷群（情動性ストレスを与えられたマウス）化学刺激誘発性疼痛試験においても、慢性的な疼痛過敏が観察された。
【００７４】
（実施例４）
−電気刺激誘発性試験−
実施例４では、製造例１〜３で製造したマウスについて、電気刺激誘発性試験を行った。
【００７５】
＜方法＞
ｎｅｕｒｏｍｅｔｅｒ（電気刺激装置）を用いて、低い値からマウスの右脚に一定感覚で刺激を与えていき、脚が初めて反応したときの値を測定した。また、与える電気の周波数を５Ｈｚ、２５０Ｈｚ、２，０００Ｈｚに変え、それぞれの周波数において同じ測定を行った。結果を図１５〜１７に示す。
【００７６】
＜結果＞
図１５〜１７は、電気刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であって、図１５は、製造例１のマウスに対するストレス後１日目の電気刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であり、図１６は、製造例２のマウスに対するストレス後１５日目の電気刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であり、図１７は、製造例３のマウスに対するストレス後１日目の電気刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
図１５〜１７において、縦軸（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（μＡ））は、脚が初めて反応したときの値を示し、横軸における「Ｓｔｒｅｓｓ」とはストレス負荷群を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」とは正常対照群を示す。
【００７７】
図１５に示すように、製造例１のストレス負荷群（ＳＡＲＴストレスを与えられたマウス）とその正常対照群とを比較するとき、５Ｈｚの電気刺激では閾値に変化は見られなかったものの（ストレス負荷群＝７０±１０μＡ／正常対照群＝７８±７μＡ）、２５０Ｈｚ及び２，０００Ｈｚでは閾値に変化が見られた（２５０Ｈｚ：ストレス負荷群＝９２±８μＡに対し、正常対照群＝１７０±１０μＡ、２，０００Ｈｚ：ストレス負荷群＝２６７±１０μＡに対し、正常対照群＝３３４±１２μＡ）。
即ち、製造例１のストレス負荷群において疼痛を誘発させるにはＡβ及びＡσ線維が重要であり、また、製造例１のストレス負荷群は、その正常対照群に比べ、有意に過敏応答を生じることが確認された。
【００７８】
図１６に示すように、製造例２のストレス負荷群（拘束ストレスを与えられたマウス）とその正常対照群とを比較して、５Ｈｚの電気刺激では閾値に変化は見られなかったものの（ストレス負荷群＝７５．３±１１μＡ／正常対照群＝７４±１μＡ）、２５０Ｈｚ及び２，０００Ｈｚでは閾値に変化が見られた（２５０Ｈｚ：ストレス負荷群＝１００±５μＡに対し、正常対照群＝１８５±１５μＡ、２，０００Ｈｚ：ストレス負荷群＝２４３±９μＡに対し、正常対照群＝３１０±１０μＡ）。
即ち、ストレス誘発性疼痛にはＡβ及びＡσ線維が重要であり、製造例２のストレス負荷群は、その正常対照群に比べ、有意に過敏応答を生じることが確認された。
【００７９】
図１７に示すように、製造例３のストレス負荷群（情動性ストレスを与えられたマウス）とその正常対照群とを比較して、５Ｈｚの電気刺激では閾値に変化は見られなかったものの（ストレス負荷群＝７０±６．２μＡ／正常対照群＝７６．３±７．９μＡ）、２５０Ｈｚ及び２，０００Ｈｚでは閾値に変化が見られた（２５０Ｈｚ：ストレス負荷群＝１２０±５．７μＡに対し、正常対照群＝１６５±６．７μＡ、２，０００Ｈｚ：ストレス負荷群＝２４５±９．６μＡに対し、正常対照群＝３５３±４．９μＡ）。
即ち、ストレス誘発性疼痛にはＡβ及びＡσ線維が重要であり、製造例３のストレス負荷群は、その正常対照群に比べ、有意に過敏応答を生じることが確認された。
【００８０】
実施例１〜４の結果から、ＳＡＲＴストレス、拘束ストレス又は情動性ストレスを与えたマウスは、刺激部位が異なる、機械刺激誘発性疼痛試験、熱刺激誘発性疼痛試験、化学刺激誘発性疼痛試験及び電気刺激誘発性疼痛試験のいずれにおいても高い過敏応答を示し、痛みが全身性に引き起こされていることが示された。
【００８１】
（製造例４）
＜ＳＡＲＴストレスが与えられた性腺摘出マウスの製造＞
製造例４では、マウスから性腺を摘出し、この性腺を摘出したマウスに対してＳＡＲＴストレスを与えることで、全身性疼痛疾患のモデル動物を製造した。
マウスとしては、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ系雄性マウス  ６週齢（２０〜２２ｇ）を、各群におおいて、雄性マウス１６匹、雌性マウス１６匹用いた。
【００８２】
−性腺摘出群−
雌性マウスの卵巣をペントバルビタール麻酔下で摘出する手術を行った。マウスの背部の皮膚および腹膜を切断して卵巣および卵管をとりだし、子宮角を結紮して摘出した。一方、雄性マウスでは腹部の皮膚および腹膜を切断して精巣および周辺の精巣上頭を含めた部位を、精管を結紮して摘出した。術部を絹糸で縫合した後、覚醒まで３７℃に保温した。手術後、３週間おいてストレス負荷を開始した。
【００８３】
−偽手術群−
雌性マウスの背部の皮膚および腹膜を切断して、そのまま切断部位を絹糸で縫合し、覚醒まで３７℃に保温した。雄性マウスでは腹部の皮膚および腹膜を切断して、そのまま切断部位を絹糸で縫合した。手術後、３週間おいてストレス負荷を開始した。
【００８４】
−ストレス負荷群（ＳＡＲＴストレスを与えられた性腺摘出マウス）−
前記性腺摘出群及び前記偽手術群のそれぞれに対し、製造例１のストレス負荷群と同様の方法によりＳＡＲＴストレスを与え、ＳＡＲＴストレスを与えられた性腺摘出マウスを製造した。
−−正常対照群−−
前記性腺摘出群及び偽手術群のそれぞれを、製造例１の正常対照群と同様の方法により飼育し、正常対照群のマウスを製造した。
【００８５】
（製造例５）
＜拘束ストレスが与えられた性腺摘出マウスの製造＞
製造例５では、マウスから性腺を摘出し、この性腺を摘出したマウスに対して拘束ストレスを与えることで、全身性疼痛疾患のモデル動物を製造した。
マウスとしては、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ系雄性マウス  ６週齢（２０〜２２ｇ）を、各群におおいて、雄性マウス１６匹、雌性マウス１６匹用いた。
【００８６】
−ストレス負荷群（拘束ストレスを与えられた性腺摘出マウス）−
製造例４と同様の方法により作製した性腺摘出群及び偽手術群のそれぞれに対し、製造例２のストレス負荷群と同様の方法により拘束ストレスを与え、拘束ストレスを与えられた性腺摘出マウスを製造した。
−−正常対照群−−
製造例４と同様の方法により作製した性腺摘出群及び偽手術群のそれぞれを、製造例２の正常対照群と同様の方法により飼育し、正常対照群のマウスを製造した。
【００８７】
（製造例６）
製造例６では、マウスから性腺を摘出し、この性腺を摘出したマウスに対して情動性ストレスを与えることで、全身性疼痛疾患のモデル動物を製造した。
マウスとしては、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ系雄性マウス  ６週齢（２０〜２２ｇ）を、各群におおいて、雄性マウス１６匹、雌性マウス１６匹用いた。
【００８８】
−ストレス負荷群（情動性ストレスを与えられた性腺摘出マウス）−
製造例４と同様の方法により作製した性腺摘出群及び偽手術群のそれぞれに対し、製造例３のストレス負荷群と同様の方法により情動性ストレスを与え、情動性ストレスを与えられた性腺摘出マウスを製造した。
−−正常対照群−−
製造例４と同様の方法により作製した性腺摘出群及び偽手術群のそれぞれを、製造例３の正常対照群と同様の方法により飼育し、正常対照群のマウスを製造した。
【００８９】
（実施例５）
実施例５では、製造例４〜６で製造したマウスについて、慢性疼痛を評価した。慢性疼痛の評価方法としては、機械刺激誘発性疼痛試験により経時的な疼痛閾値を評価した。なお、前記機械刺激誘発性疼痛試験は、デジタル式ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ法に従って行った。
【００９０】
＜方法＞
−機械刺激誘発性疼痛試験−
プラスチックチップをマウスの足底部に押しやり、その回避応答までの重量閾値をデジタル測定した。結果を図１８〜２０に示す。
【００９１】
＜結果＞
図１８〜２０は、機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であって、図１８は、製造例４のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であり、図１９は、製造例５のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図であり、図２０は、製造例６のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【００９２】
図１８〜２０において、左のグラフは、偽手術群（Ｓｈａｍ）についての結果を示すグラフであり、右のグラフは、性腺摘出群（Ｇｏｎａｄｅｃｔｏｍｙ）についての結果を示すグラフである。
図１８〜２０において、縦軸（ＰＷＴ）は、測定された重量閾値（ｇ）を示す。横軸は、ストレス負荷開始前（ｐｒｅ）、ストレス負荷期間（ｓｔｒｅｓｓ）及びストレス後（ｐｏｓｔ  ｓｔｒｅｓｓ）における経過日数を示す。
図１８〜２０において、黒四角（■）はＳＡＲＴストレスが与えられた雄を、黒丸（●）はＳＡＲＴストレスが与えられた雌を、白四角（□）は正常対照群の雄を、白丸（○）は正常対照群の雌を、示す。
【００９３】
図１８の右のグラフに示すように、製造例４のＳＡＲＴストレスを与えられた性腺摘出マウス（■及び●）は、ストレス後１日目から、機械刺激誘発性疼痛の閾値低下、即ち、疼痛過敏が観察された。これらの疼痛過敏は、少なくとも１２日以上持続した。一方で、その正常対照群（□及び○）においては、機械刺激誘発性疼痛の閾値低下が観察されなかった。
【００９４】
更に、図１８の右のグラフにおいて、製造例４のＳＡＲＴストレスを与えられた性腺摘出マウス（■及び●）のうち、精巣を摘出された雄のマウス（■）と、卵巣を摘出された雌のマウス（●）とを比較した。卵巣を摘出された雌のマウス（●）に比べ、精巣を摘出された雄のマウス（■）において、機械刺激誘発性疼痛の閾値上昇、即ち、疼痛過敏の緩和が観察された。具体的には、ストレス後１日目において、精巣を摘出された雄マウスと卵巣を摘出された雌マウスとの間には、有意な性差が認められた。回復時期においては、共に１２日以上過敏を生じたまま変化は見られなかった。上記の性差は、統計的に有意であった。
一方で、図１８の左のグラフに示すように、偽手術群においては、性差が観察されなかった。
【００９５】
図１９の右のグラフに示すように、拘束ストレスを与えられた性腺摘出マウス（■及び●）は、ストレス後１日目から、機械刺激誘発性疼痛の閾値低下、即ち、疼痛過敏が観察された。これらの疼痛過敏は、少なくとも１５日以上持続した。一方で、その正常対照群（□及び○）においては、機械刺激誘発性疼痛の閾値低下が観察されなかった。
【００９６】
更に、図１９の右のグラフにおいて、製造例５の拘束ストレスを与えられた性腺摘出マウス（■及び●）のうち、精巣を摘出された雄のマウス（■）と、卵巣を摘出された雌のマウス（●）とを比較した。卵巣を摘出された雌のマウス（●）に比べ、精巣を摘出された雄のマウス（■）において、機械刺激誘発性疼痛の閾値上昇、即ち、疼痛過敏の緩和が観察された。具体的には、精巣を摘出された雄のマウスではストレス後２２日目にはストレス負荷開始日と同じ疼痛閾値にまで回復するが、雌マウスでは、依然として疼痛過敏を示したままであった。上記の性差は、統計的に有意であった。
一方で、図１９の左の図で示すように、偽手術群においては、性差が観察されなかった。
【００９７】
図２０の右のグラフに示すように、情動ストレスを与えられた性腺摘出マウス（■及び●）は、ストレス後１日目から、機械刺激誘発性疼痛の閾値低下、即ち、疼痛過敏が観察された。これらの疼痛過敏は、少なくとも１５日以上持続した。一方で、その正常対照群（■及び●）においては、機械刺激誘発性疼痛の閾値低下が観察されなかった。
【００９８】
更に、図２０の右のグラフにおいて、製造例６の情動性ストレスを与えられた性腺摘出マウス（■及び●）のうち、精巣を摘出された雄のマウス（■）と、卵巣を摘出された雌のマウス（●）とを比較した。卵巣を摘出された雌のマウス（●）に比べ、精巣を摘出された雄のマウス（■）において、機械刺激誘発性疼痛の閾値上昇、即ち、疼痛過敏の緩和が観察された。具体的には、精巣を摘出された雄のマウスでは１５日目にはストレス負荷開始日と同じ疼痛閾値にまで回復するが、雌マウスでは、依然として疼痛過敏を示したままであった。上記の性差は、統計的に有意であった。
一方で、図２０の左のグラフで示すように、偽手術群においては、性差が観察されなかった。
また、情動性ストレスを与えられたマウスにおいては、精巣摘出により、疼痛が正常値レベルにまで緩和されたことから、情動性ストレスを与えられたモデル動物は、他のモデル動物に比べてより臨床像に近いことが示された。
【００９９】
実施例３の結果によれば、ＳＡＲＴストレスを与えられた性腺摘出マウス、拘束ストレスを与えられた性腺摘出マウス及び情動性ストレスを与えられた性腺摘出マウスは、いずれも、卵巣を摘出された雌のマウスに比べ、精巣を摘出された雄のマウスにおいて、疼痛過敏が緩和されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明のモデル動物は、全身性疼痛疾患と同様の症状を発現し、安価かつ容易に製造可能であるので、全身性疼痛疾患の発症メカニズムや治療法の研究に好適に利用できる。特に、全身性疼痛疾患の治療薬をスクリーニングするためのモデル動物として好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、ＳＡＲＴストレスを与えたマウスの製造方法を説明するための概念図である。
【図２】図２は、拘束ストレスを与えたマウスの製造方法を説明するための概念図である。
【図３】図３は、情動性ストレスを与えたマウスの製造方法を説明するための概念図である。
【図４】図４は、製造例１のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図５】図５は、比較製造例１のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図６】図６は、製造例２のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図７】図７は、製造例３のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図８】図８は、比較製造例２のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図９】図９は、製造例１のマウスに対するストレス後１日目及び１５日目における熱刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、製造例２のマウスに対するストレス後１５日目の熱刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図１１】図１１は、製造例３のマウスに対するストレス後１日目の熱刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図１２】図１２は、製造例１のマウスに対するストレス後１日目及び１５日目における化学刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図１３】図１３は、製造例２のマウスに対するストレス後１５日目の化学刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図１４】図１４は、製造例３のマウスに対するストレス後１日目の化学刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図１５】図１５は、製造例１のマウスに対するストレス後１日目の電気刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図１６】図１６は、製造例２のマウスに対するストレス後１５日目の電気刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図１７】図１７は、製造例３のマウスに対するストレス後１日目の電気刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図１８】図１８は、製造例４のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図１９】図１９は、製造例５のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図２０】図２０は、製造例６のマウスに対する機械刺激誘発性疼痛試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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