(57)【要約】【課題】被検体となる化学物質がリチウムと同様の生理活性をもつことを検定する方法を提供すること。【解決手段】線虫の野生株とリチウム耐性変異株のリチウムに対する性質の差異を応用し、化学物質がリチウムと同様の生理活性を持つかどうかを判定する。すなわち任意の化学物質の存在下において、線虫の野生株が増殖不能であり、かつリチウム耐性変異株は増殖可能である場合には、その化学物質はリチウム様の活性を持つ可能性があると判定される。一方、両者が増殖不能になる場合にはリチウムとは異なる作用をもつものと推測される。この原理を任意の化学物質に適用しリチウムと同様の生理活性をもつかを検定する。【選択図】  図１
2009121834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線虫を利用したリチウム様の生理活性をもつ化学物質のスクリーニング方法であって、
線虫の野生株およびリチウム耐性変異株に対する被検試料の作用を確定させる工程を有し、
前記工程において、前記被検物質を前記野生株と前記リチウム耐性変異株に、それぞれ作用させることを特徴とするリチウム様の生理活性をもつ化学物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記被検試料の作用を確定する工程において、
前記被検試料の作用を前記野生株と前記リチウム耐性変異株、それぞれにおいて評価し、結果の差異を見ることによって、リチウム様生理活性の存在または非存在を確定することを特徴とする請求項１に記載のリチウム様の生理活性をもつ化学物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記リチウム様生理活性の存在または非存在の確定を、前記被検試料の作用を前記野生株およびリチウム耐性変異株の増殖の有無を見ることによって行うことを特徴とする請求項２に記載のリチウム様の生理活性をもつ化学物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記線虫が、セノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）である請求項１から３のいずれかに記載のリチウム様の生理活性をもつ化学物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記リチウム耐性変異株が、遺伝子Ｆ３２Ｇ８．４に突然変異を生じさせることにより、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を改変した、セノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）であることを特徴とする請求項４に記載のリチウム様の生理活性をもつ化学物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
生体に対するリチウム様の生理活性を示す物質のスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
躁うつ病あるいは双極性障害は、躁状態とうつ状態を繰り返す精神疾患である。発症率はうつ病より低いが、珍しい疾患ではなく、また若年で発症する例が多い。一旦回復しても、再発することが多く、生涯にわたる薬物投与による予防が必要とされている。躁うつ病の発症メカニズムは明らかでなく、その治療は炭酸リチウム、カルバマゼピン、バルプロ酸などの気分安定薬と呼ばれる一群の薬剤を用いた薬物療法を中心に行われている。これらの気分安定薬の中でリチウムは最も歴史が長く、その有効性について最も科学的検証がなされているが、その作用機構は明らかではない。また、リチウムは全般的には副作用の少ない薬物であるが、治療域と中毒域が近い為に血中濃度の定期的測定が必要であるほか、催奇形性があることから妊婦への投与は禁忌であり、心臓病や腎臓病をわずらう患者への投与には注意を要するとされている。一方、カルバマゼピンやバルプロ酸は元々てんかんの治療薬として用いられていたものであり、躁うつ病の治療を目的に開発されたものではなかった。従って、リチウムと同様の生理活性をもつ薬物を効率よくスクリーニングできればより副作用の少ない躁うつ病の治療薬開発につながる可能性があるが、
そのような薬物を簡便に、かつ系統的にスクリーニングする方法はなかった。
【０００３】
特許文献１には、線虫を用いた毒性試験方法が開示されている。この方法では、鉛、水銀などの重金属や一部の生理活性物質の毒性物質に対して活性化される熱ショック・プロモーターを用いることで毒性を検査する方法である。しかし、線虫を用いて具体的な疾患に対する有効成分の候補物質をスクリーニングする方法は示されていない。
【特許文献１】特開平８−１１６９９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
リチウム様活性をもつ薬物をほ乳類などの高等動物を用いて探索するには、薬物効果を見るためのスクリーニング系が大規模になり、多くの時間を要し煩雑である上、経済的にも多額の費用を要する。そこで、リチウム様活性をもつ薬物を安価・簡便にスクリーニングできる方法の開発が望まれる。線虫特にセノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）は体長約１ｍｍの自活性土壌線虫の一種で、雌雄同体が自家受精で増殖する。世代交代に要する時間は２０℃で約３日と他の動物に比べ早く、雌雄同体１個体から約３００の子孫が生まれるので短期間に多数の個体を得ることができる。培養は寒天培地で大腸菌を餌に行なうので極めて簡単かつ低コストであり、線虫の体構造や動きの観察も容易にできる。線虫は動物であることから、ある程度の類縁性をもってヒトなど高等動物への薬物効果を推定することが可能である。また、薬物に対する感受性変異が比較的容易に得られることや遺伝子解析が容易かつ詳細に行えることなどから、薬物作用機構を理解するための優れたモデル実験動物になると考えられている。発明者らの観察によって、線虫はリチウム存在下で培養すると胚発生が完全に阻害され、その結果、増殖が停止することが分かった。その作用の分子メカニズムの詳細は明らかではないが、このリチウムが示す発生阻害作用を指標として、簡便で安価かつ短時間で実施可能な、リチウム様の生理活性をもつ薬物のスクリーニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明は、リチウム耐性変異株と野生株を、被検試料を含有する培地中で培養し、それぞれの線虫に対する作用の差異を観察することによって、前記被検試料のリチウム様生理活性の有無を判定することを特徴とする化学物質のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、野生株とリチウム耐性変異株に化学物質を作用させ、両者の反応性の差異を見ることで、従来より短時間で、熟練さや特別な観察眼を必要とせず比較的容易に、かつ信頼性高くリチウム様の生理作用をもつ化学物質のスクリーニングが可能になる。リチウムは躁うつ病の有効な治療薬として用いられているが、その作用機構は明らかではない。また、副作用も見られることから、リチウムと同様の生理作用をもつ他の化学物質の探索が期待される。本発明はこの問題に応えるものであり、リチウム様の生理作用をもつ化学物質を簡便かつ経済的にスクリーニングし、評価するのに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本願発明は、線虫を利用したリチウム様の生理活性をもつ化学物質のスクリーニング方法であって、線虫の野生株およびリチウム耐性変異株に対する被検試料の作用を確定させる工程を有し、
前記工程において、前記被検物質を前記野生株と前記リチウム耐性変異株に、それぞれ作用させることを特徴とするリチウム様の生理活性をもつ化学物質のスクリーニング方法である。リチウム様の生理活性をもつ化学物質としては、好ましくは、ヒトの躁うつあるいは双極性障害におけるリチウムの生理活性と同様の生理活性を有する化学物質である。また、リチウム様の生理活性をもつ可能性のある候補物質をスクリーニングすることもできる。
【０００８】
上記被検試料の作用を確定する工程は、被検試料の作用を線虫の野生株とリチウム耐性変異株、それぞれにおいて評価し、結果の差異を見ることによって、リチウム様生理活性の存在または非存在を確定することが好ましい。そして、リチウム様生理活性の存在または非存在の確定は、例えば、被検試料の作用を線虫の野生株およびリチウム耐性変異株の増殖の有無を見ることによって行うことができる。
【０００９】
また、本願のスクリーニング方法に用いる線虫として、セノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）を好適に用いることができる。
【００１０】
リチウム耐性変異株は、線虫のゲノムがコードする遺伝子の塩基配列に突然変異を与えることにより、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を改変することにより得ることができる。具体的に線虫のリチウム耐性株の取得方法は例えば、次のように行うことができる。
【００１１】
２０ｍＭのＬｉＣｌを含む寒天培地上において線虫野生株のＬ４期幼虫を培養すると、成虫にまで成長し産卵するが、それらの卵は正常に発生せず、結果としてすべて死滅する。ＬｉＣｌ存在下において胚は細胞分裂を続けるが、分裂に要する時間が長くなり、形態形成がほとんど見られないという特徴を示した。本発明では線虫野生株を５０ｍＭのエチルメタンスルホン酸を用いて突然変異誘発した後、変異誘発した線虫を２０ｍＭのＬｉＣｌを含む寒天培地上で培養し、そこで増殖することが可能な線虫を選抜し、リチウム耐性変異株を得た。リチウム耐性変異株は２０ｍＭのＬｉＣｌ存在下でも、ほぼ正常に発生が進行し増殖した。この変異株の遺伝子解析から、突然変異はＢｅｓｔｒｏｐｈｉｎファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子Ｆ３２Ｇ８．４に存在することが明らかになった。本発明ではリチウムに対する野生株と耐性変異株の反応性の差異を利用して、被検物質がリチウム様の生理作用をもつことを検定する。被検物質を適当な濃度で含む寒天培地上で野生株と耐性変異株それぞれを培養し、野生株が増殖不能になり、一方、耐性変異株が増殖可能であった場合、被検物質はリチウム様生理活性をもつ可能性があると判定できる。また、両線虫株ともに増殖不能であった場合には、リチウム様生理活性以外の作用による影響と判定される。
【００１２】
本願方法によりスクリーニングされ得る化学物質は、スクリーニングに用いる個別のリチウム耐性株におけるリチウム耐性の作用機構において有効である化学物質が含まれる。よって、リチウム様生理活性物質には、躁うつあるいは双極性障害におけるリチウムの生理活性と同様の生理活性を有する化学物質の候補となるものを含み得る。
【実施例】
【００１３】
本発明の一実施例について図面を参照して説明する。
【００１４】
（実施例１．リチウム耐性変異株の作製）
線虫の野性株の胚発生は２０ｍＭのＬｉＣｌで完全に阻害され、受精卵は全く孵化せず、増殖は停止する（図１Ａ）。この性質を指標として、耐性変異の分離を行った。線虫（セノラブディティス・エレガンス）のＬ３〜Ｌ４幼虫期の野生株を５０ｍＭのエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）を含むＭ９緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４  ６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、  １ｍＭ  ＭｇＳＯ４）中で４時間培養し、変異を誘発した。処理した線虫から産まれた子供の世代（Ｆ１世代）を１，０００個体ずつ、５０枚のＮＧ寒天培地を入れた９ｃｍプレートで培養を継続した。処理した線虫の孫世代（Ｆ２世代）を各シャーレから約３，０００個体ずつ、２０ｍＭのＬｉＣｌを含むＮＧ寒天培地（ＮａＣｌ  ３ｇ、ペプトン  １０ｇＬ、寒天  １７ｇを９７５ｍｌの純水に添加し、オートクレーブ滅菌後、  コレステロール  ５ｍｇ／Ｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、  ０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２  および  １Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を２５ｍｌ添加して調製）に移し、さらに培養を行った。リチウムを含む培地上で成長・増殖できた個体を耐性変異株として分離した。以上の培養は全て２０℃で行った。今回、ＥＭＳで変異誘発後、約１５０，０００のＦ２個体をスクリーニングし、耐性変異体を分離した。耐性変異株をＬ４幼虫期から２０ｍＭ  ＬｉＣｌ存在下で培養すると成虫になり、産卵した。胚発生は正常に進行し、孵化幼虫が認められ、リチウム存在下でも増殖が確認された（図１Ｂ）。
【００１５】
（実施例２．リチウム耐性変異株の変異部位の決定）
実施例１で得られたリチウム耐性変異株において変異した遺伝子および変異部位を以下のように決定した。この変異が生じた遺伝子の染色体上での位置を知るために２点および３点交配実験を行った。交配実験の方法はジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７７、７１、１９７４）に記載されている。２点交配の結果、この遺伝子は第Ｖ染色体上に位置することが明らかになった。さらに、第Ｖ染色体上のマーカー遺伝子ｕｎｃ−４２、ｓｍａ−１およびｄａｆ−１１を組み合わせて３点交配を行った結果、変異はｕｎｃ−４２とｄａｆ−１１のほぼ中央付近に位置することが推測された。
【００１６】
リチウム耐性に関わる遺伝子をクローニングするために、この染色体領域を断片化しクローニングしたコスミド・クローンを変異株にマイクロインジェクションし、リチウムに対する耐性をレスキューし、感受性に戻すことができるクローンを探索した。その結果、隣接するコスミド・クローンＦ３２Ｇ８とＦ２５Ｄ１がリチウム耐性変異をレスキューすることを見いだした。両クローンが重なり合う染色体領域には５個のオープン・リーディング・フレームが予測されるが、これらのうちＦ３２Ｇ８．４のコード領域にのみレスキュー活性が存在していた。
【００１７】
また、リチウム耐性変異株と野生株のＦ３２Ｇ８．４領域を塩基配列決定し比較したところ、タンパク質をコードするエクソンに１塩基の置換を見いだした。これらの結果から、Ｆ３２Ｇ８．４の変異が線虫にリチウム耐性の表現型を与えていると結論した。Ｆ３２Ｇ８．４によってコードされるタンパク質（図２）はヒトの遺伝性黄斑変性症の原因遺伝子とされるＢｅｓｔｒｏｐｈｉｎと類似している。Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎは最近になり塩素イオン・チャネルであることが報告されているが、このことと線虫のリチウム感受性との関連性は不明である。具体的には、本発明のリチウム耐性変異株は、図２における野生株のＦ３２Ｇ８．４の塩基配列の２１５番目のT（チミン）が、C（シトシン）に変換されている。その結果、本発明のリチウム耐性変異株のＦ３２Ｇ８．４のアミノ酸配列は、図２における野生株の７２番目のF（フェニルアラニン）が、S（セリン）に変換されている。なお、Ｆ３２Ｇ８．４の変異した塩基およびアミノ酸の配列は、図４、及び配列表（塩基およびアミノ酸それぞれ配列番号３および４）に記載している。
【００１８】
（実施例３．様々な陽イオンの線虫に対する作用）
線虫の野生株あるいは実施例１で得られたリチウム耐性変異株をＬ４幼虫からリチウムを含むカリウム、セシウム、アンモニウムイオン等の各陽イオンのクロライド塩を含む寒天培地上で培養した。いずれの塩も濃度は２０ｍＭとし、培養は２０℃で行った。
【００１９】
リチウム以外の陽イオンの塩を含む培地では野生株とリチウム耐性変異株ともに成虫になり次世代の子孫が孵化してくる。一方、ＬｉＣｌ存在下において野性株から培地上に産み出された胚は発生を完全にブロックされ、全く孵化しない。１匹の親個体から孵化してくる子孫の個体数を計数した結果を図３に示す。ＫＣＬ、ＮＨ４ＣｌあるいはＣｓＣｌは野生株とリチウム耐性変異株のいずれの産子数や孵化率に影響を与えない。しかし、２０ｍＭのＬｉＣｌの存在下では野生株においては全ての卵が異常になり、孵化幼虫は全く見られない。一方、耐性変異株はリチウムの影響は皆無ではないが、孵化幼虫が認められ、増殖が確認された。乳酸リチウムを用いても、同じ結果が見られた。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】野生株とリチウム耐性変異株に対するＬｉＣｌ（２０ｍＭ）の作用を観察した顕微鏡写真である。（Ａ）野性株。（Ｂ）リチウム耐性変異株。矢印：親個体。矢じり：孵化幼虫。（Ａ）では、胚発生は完全に停止し培地上には米粒状の多くの異常卵が見られる。一方、（Ｂ）では多数認められる孵化幼虫が（Ａ）では全く見られない。
【図２】リチウム感受性に関与する遺伝子Ｆ３２Ｇ８．４の野生株の塩基配列とコードするタンパク質のアミノ酸配列。
【図３】様々な陽イオンの線虫に対する影響を示すグラフである。
【図４】リチウム感受性に関与する遺伝子Ｆ３２Ｇ８．４の本発明の変異株の塩基配列とコードするタンパク質のアミノ酸配列。
【図１】
2009121834.tif 000003
【図２】
2009121834.tif 000004
【図３】
2009121834.tif 000005
【図４】
2009121834.tif 000006
【配列表】
2009121834000001.app