(57)【要約】【課題】複数の異なるディプロタイプが等しいジェノタイプを与え、相が確定できない場合に、二箇所のＳＮＰに対応する２種類のプローブに対するＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅなハイブリダイゼーションを利用してハプロタイピングを行う際に、より感度が高く、安定した結果を得る。【解決手段】  遺伝子多型アレルの一本鎖上での位置関係を示すハプロタイプを直接検出する方法であって、第一の変異領域に相補的なプローブと、第二の変異領域に相補的なプローブを組み合わせた連結した構成を持つ核酸プローブを用いる方法を提供する。【選択図】図１
2009195143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の変異領域ｘと第二の変異領域ｙとを含むターゲット核酸配列にハイブリダイズさせるための核酸断片であって、
該領域ｘに存在するＮ種類のアレルをｘｉ（ｉ＝１〜Ｎ）、該領域ｙに存在するＭ種類のアレルをｙｊ（ｊ＝１〜Ｍ）とするとき、ｘｉに相補的な配列ｓｉと、ｙｊに相補的な配列ｔｊとを含む配列（ｓｉ−ｔｊ配列）を有する核酸プローブ。
【請求項２】
第一の変異領域ｘがゲノム上に相同領域が複数存在するターゲット核酸の領域であり、第二の変異領域ｙが該相同領域には存在せずターゲット核酸の領域のみに存在する領域である、請求項１記載の核酸プローブ。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸プローブに、ターゲット核酸配列に含まれるｘｉ，ｙｊ以外の配列に相補的な核酸配列の１または複数を更に組み合わせることを特徴とする核酸プローブ。
【請求項４】
請求項１または２記載のプローブを固定した、核酸検出用担体。
【請求項５】
標的核酸の多型部位を検出する方法であって、
標的核酸と請求項４に記載の担体とを接触させ、前記担体上の前記プローブとハイブリダイズさせる工程と、
前記工程により前記プローブにハイブリダイズした標的核酸の有無または量を検出する工程と、
を有することを特徴とする多型部位の検出方法。
【請求項６】
前記ハイブリダイズさせる工程におけるハイブリダイゼーションの温度が、配列ｓｉおよびｔｊがそれぞれ固定された担体に対してはハイブリダイゼーションが起らないが、前記核酸プローブに対してはハイブリダイゼーションを起こす温度である、請求項５記載の核酸の多型部位の検出方法。
【請求項７】
請求項４に記載の担体と、標的核酸を標識するための標識物質と、を有することを特徴とする核酸検出用のキット。
【請求項８】
標的核酸の多型部位を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、
該標的核酸上の第一の変異領域及び第二の変異領域とをそれぞれ含む領域の２つの配列が、該標的核酸上の２つの領域間に存在する配列を排除して互いの末端で連結していることを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
遺伝子多型の検出と、それを用いた関連遺伝子探索を行う分野に関連する。また関連が実証された多型マーカーに関して、副作用などフェノタイプの予測を臨床で行う際にも用いられる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の多型とフェノタイプを関連付けることで、疾患感受性や副作用のマーカーとなる多型をスクリーニングする試みは、近年の多型検出技術の進歩とともに広く行なわれるようになっている。特に、３００万〜１０００万個とヒトゲノム中に大量に存在し、タイピングも比較的簡単なＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）は、ゲノムワイドな関連解析に必須の多型となっている。
【０００３】
近年複数のヒトゲノムのシーケンスが得られるようになり、その多型についても詳細に調べられるようになった。特に、２００５年に発表されたＨＡＰＭＡＰは、ゲノム中での連鎖不平衡地図を提供し、ＳＮＰを用いた関連解析に大きな影響を与えている。
【０００４】
ヒトゲノムは２倍体であるために、ＳＮＰのタイピングを行なった結果は２つのアレルを与える。例えばあるＳＮＰの野生型をＡ、変異型をＧとする（以後Ａ＞Ｇと表記）。ここで野生型とは集団内での頻度が多いアレル、変異型とは少ないアレルのことで、通常変異型の頻度が１％以上のものを多型とよぶ。このときＳＮＰタイピングの結果はＡＡ、ＡＧ、ＧＧの３種類であり、ＡＡ、ＧＧをホモ、ＡＧをヘテロという。このようにＳＮＰのタイピングを行なって得られる結果をジェノタイプとよぶ。
【０００５】
複数のＳＮＰについて考える。例えば２箇所のＳＮＰをＳＮＰ１、ＳＮＰ２としてそれぞれＡ＞Ｇ、Ｃ＞Ｔであるとする。２箇所のＳＮＰタイピングを行った結果（ジェノタイプ）が、ＳＮＰ１がＡＧヘテロ、ＳＮＰ２がＣＴヘテロであったとする。２箇所のＳＮＰが同一染色体上にあった場合、ＳＮＰ１とＳＮＰ２で物理的に連結されているアレルが何であるかによって、Ａ−Ｃ／Ｇ−Ｔの場合と、Ａ−Ｔ／Ｇ−Ｃの場合がありうる。このように、物理的に連結されている一本の染色体上に存在するＳＮＰの組み合わせをハプロタイプとよぶ。ここでＡ−Ｃ／Ｇ−Ｔの場合にはＡ−ＣとＧ−Ｔのハプロタイプをもつことになり、Ａ−Ｔ／Ｇ−Ｃの場合にはＡ−ＴとＧ−Ｃのハプロタイプを持つことになる。二本のハプロタイプ・ペアのことを、ディプロタイプと呼ぶ。ここでは、Ａ−Ｃ／Ｇ−Ｔというディプロタイプ、またはＡ−Ｔ／Ｇ−Ｃというディプロタイプになる。
【０００６】
ディプロタイプは完全情報であり、ディプロタイプが分ればジェノタイプを知ることができるが、ジェノタイプからディプロタイプは分らないこともある。例えば上記のＳＮＰ１：ＡＧヘテロ、ＳＮＰ２：ＣＴへテロの場合がそうであり、ディプロタイプがＡ−Ｃ／Ｇ−Ｔであるか、Ａ−Ｔ／Ｇ−Ｃであるかは判定できない。しかし世の中に知られている多数のＳＮＰタイピング手法によって得られるのはジェノタイプであり、そのためにディプロタイプ、またはその構成要素であるハプロタイプの情報は得られない場合がある。
【０００７】
遺伝子の情報とフェノタイプを関連付ける相関解析においては、完全情報であるディプロタイプが分ることが望ましい。しかし上記で示したように、ＳＮＰのタイピング結果からはディプロタイプが分らない場合がある。このとき一般に用いられるのはハプロタイプ推定アルゴリズムであり、複数の人のジェノタイプ結果から集団内に存在するハプロタイプ頻度を統計的に推定することができる（非特許文献１）。
【０００８】
しかし、実際に得られた多型マーカーを臨床現場で応用する場合には、各個体のディプロタイプを決定できる必要がある。例えばあるハプロタイプが副作用に関連する場合、ジェノタイピングの結果からは、上記ハプロタイプを含む／含まないの両方のディプロタイプが可能である場合、その副作用に関連する確率が低いとしても、無視して投薬することは危険を伴う。逆に危険性があるからといって投薬を行わない場合には、副作用はないがむしろ薬効が期待される人からも治療の機会を奪ってしまうことになる。
【０００９】
異なるディプロタイプが等しいジェノタイプを与える場合には、通常用いられているＳＮＰ検出結果を基に統計解析を行う手法では、実現可能なディプロタイプの事後確率分布を得られるだけで、ディプロタイプを１つに確定することはできない。
【００１０】
このように異なるディプロタイプが等しいジェノタイプを与える場合に、そのディプロタイプを決定する方法はいくつか知られている。最も一般的なのは家系情報を用いる方法であり、両親のＳＮＰタイピング結果から子供のディプロタイプが確定する。しかし、２箇所のＳＮＰ間で組み替えが起る可能性があり、また両親のジェノタイプによっては子供のディプロタイプが一意に決まらない場合もある。また両親のゲノムが必ずしも手に入るとは限らない。
【００１１】
これに対して、ゲノムから直接ディプロタイプを直接検出しようとする、いわゆるハプロタイピングの開発が進められている。代表的なハプロタイピングの手法としては、ゲノムを段階的に希釈することで一倍体からの情報を得ようとするもの（非特許文献２）がある。また、ハプロタイプを形成する２箇所のアレルがＰＣＲによる増幅産物中で物理的に連結されていることを利用して検出しようとするもの（特許文献１）などが知られている。その中で特に、二箇所のＳＮＰ部位に対応するプローブを一つの領域内に混合して固定し、それぞれのプローブとターゲットとの相互作用が強めあう効果（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅな相互作用）を利用した方法（特許文献２）が有効な手法として知られている。
【特許文献１】特開２００２−２７２４８２号公報
【特許文献２】米国特許６３０６６４３Ｂ１号明細書
【非特許文献１】Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ Ｌ， Ｓｌａｔｋｉｎ Ｍ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｖｏｌ.１２ ９２１−９２７，１９９５「Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ａ ｄｉｐｌｏｉｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」
【非特許文献２】Ｄｉｎｇ Ｃ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ Ｃ：ＰＮＡＳ Ｖｏｌ１００  ７４４９−７４５３，２００３「Ｄｉｒｅｃｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈ Ｍ１−ＰＣＲ」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特許文献２では、二箇所のＳＮＰ部位に対応した各２種のプローブ（野生型・変異型）を混合し、二箇所のＳＮＰの組み合わせに一致した場合にのみターゲットがハイブリダイゼーションをする効果を利用してハプロタイピングを行う手法が提案されている。しかし２種類のプローブを一つの領域に固定する場合に、同一領域内とはいえ２種類のプローブが固定される位置をコントロールすることはできない。つまり領域内をより細かくみるならば、局所的に２種のプローブ濃度にゆらぎがみられる可能性は高い。またプローブ間の距離をコントロールすることができないために、ターゲットが二箇所でハイブリダイゼーションを行う際に、適した位置に二種類のプローブが存在するとは限らない。よって常に安定した状態で２種類のプローブに対し、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅなハイブリダイゼーションを行うことが難しかった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、２種類のプローブを混合して固定するのではなく、タンデムに連結した状態で一本の長いプローブとして合成し、それを基板上に固定する方法を提供する。これにより２種類のプローブは常に連結された状態で、１対１で存在することになり、２種類のプローブそれぞれにハイブリダイゼーションする場合に、それぞれのＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅな相互作用の効果を安定して引き出すことが可能になる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、複数の異なるディプロタイプが等しいジェノタイプを与え、相が確定できない場合に、二箇所のＳＮＰに対応する２種類のプローブに対するＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅなハイブリダイゼーションを利用してハプロタイピングを行う際に、より感度が高く、安定した結果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明における核酸プローブは、第一の変異領域ｘと第二の変異領域ｙとを含むターゲット核酸配列にハイブリダイズさせるための核酸断片であって、上記変異領域ｘに存在するＮ種類のアレルをｘｉ（ｉ＝１〜Ｎ）、上記変異領域ｙに存在するＭ種類のアレルをｙｊ（ｊ＝１〜Ｍ）とするとき、ｘｉおよびｙｊのそれぞれに相補的な配列ｓｉおよび配列ｔｊとを組み合わせた配列（ｓｉ−ｔｊ配列）を有することを特徴とする。各変異領域に相補的な配列（ｓｉおよびｔｊ）を有するそれぞれのプローブを作製し、混合して固定するのではなく、検出しようとする変異領域の両方の相補的な配列をタンデムに連結した状態で一本の長いプローブとして作製する。
【００１６】
本発明における核酸プローブは一本の長いプローブであるため、２種類のプローブは常に連結されていることから、常に１対１で存在することになる。したがって２種類のプローブが常に安定した状態でコントロールできる。つまり、例えば第一の変異領域がゲノム上のターゲット核酸配列に相同領域が複数存在する標的領域であり、第二の変異領域が上記相同領域には存在せずターゲット核酸配列の領域のみに存在する場合にも、好適に本発明の核酸プローブを用いることができる。そして、それぞれのプローブとターゲット核酸との相互作用が強めあう効果を利用して核酸を検出することが可能となる。
【００１７】
本発明における核酸プローブは上記ｓｉ−ｔｊ配列に、更にターゲット核酸配列に含まれる上記ｘｉ，ｙｊ以外の配列に相補的な核酸配列の１または複数を組み合わせることが可能である。このような配列として、例えば３番目の変異領域に対するハプロタイピングを目的として第三の変異領域に存在するアレルの配列を更に組み合わせることができる。
【００１８】
また、上記プローブを固定する担体としては、目的とする固相−液相反応を行うことができる特性を満たすものであればよい。例えば、ガラス基板、プラスチック基板、シリコンウェハー等の平面基板、凹凸のある三次元構造体、ビーズのような球状のもの、棒状、紐状、糸状のもの等を担体として用いることができる。さらに、その担体の表面はプローブの固定化が可能なように処理されたものであってもよい。特に、表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものは、ハイブリダイゼーション反応の過程でプローブが安定に結合している為に、再現性の点で好ましい形態である。
【００１９】
本発明の標的核酸の多型部位を検出する方法は、以下の工程により行うことができる。
【００２０】
標的核酸と本発明における核酸プローブを固定した担体とを接触させ、担体上のプローブとハイブリダイズさせる工程と、上記工程によりプローブにハイブリダイズした標的核酸の有無または量を検出する工程。
【００２１】
より詳細には、
（１）試料中のターゲット核酸を標識物質で標識し、一本鎖とする工程、
（２）標識され一本鎖となった標的核酸を本発明における核酸プローブを固定した担体にハイブリダイズさせる工程、
（３）ハイブリダイズした標的核酸の量を標的物質のシグナル強度により検出する工程、
を有することが好ましい。
【００２２】
標識物質としては、蛍光標識を挙げることができ、ＤＮＡ検出の分野では、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エチジウムブロマイド、フルオロセインなどが好ましく用いられる。また、標的核酸を検出するために、標識物質以外にもハイブリッド体のイオン化電位を検出する方法などを用いることも可能である。また、（２）におけるハイブリダイゼーションの温度は、配列ｓｉおよびｔｊのそれぞれを有するプローブの場合ではハイブリダイゼーション反応が起こらない温度であることが好ましい。例えば、本発明のｓｉ−ｔｊ配列を有する核酸プローブにおけるハイブリダイゼーション温度は、配列ｓｉおよびｔｊのそれぞれを有するプローブにおけるその温度と比較して５℃から１５℃高い温度になるように設定することが好ましい。
【００２３】
更に、本発明のプローブを固定した核酸検出用担体と標的核酸を標識するための標識物質とを少なくとも用いて、核酸検出用のキットを構成することもできる。以下に、図面に基づいて本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２４】
図１は、本発明における核酸プローブの構成模式図を示す。第一の変異領域ｘに相補的なｓｉ配列ａ）と第二の変異領域ｙに相補的なｔｊ配列ｂ）がタンデムに連結していることを示している。すなわち、標的核酸上の第一の変異領域及び第二の変異領域とをそれぞれ含む領域の２つの配列が、該標的核酸上の２つの領域間に存在する配列を排除して互いの末端で連結しているオリゴヌクレオチドプローブとして構成されている。ｃ）はターゲット核酸配列であり、本発明の核酸プローブとハイブリイズしている。
【００２５】
一つの染色体上に存在する２箇所のＳＮＰ（ＳＮＰ１，ＳＮＰ２）を考える（図２）。ＳＮＰ１の野生型をＡ、変異型をＴとし、ＳＮＰ２の野生型をＧ、変異型をＣとする。ＳＮＰ１に対してＡ／Ｔのヘテロ、ＳＮＰ２に対してＧ／Ｃのヘテロである場合には、図２のａ）とｂ）とで示した２種類があるが、この２種類は通常のＳＮＰタイピングやシーケンサーによる方法では判別することができない。このような状況を相が確定しないという。このような場合に、ハプロタイピングを行い、相を確定させる手法を以下のように提供する。
【００２６】
まず、ＳＮＰ１の判定に用いる２種類のプローブを考える。これは通常のＳＮＰタイピングで用いられるものであり、ＳＮＰ１が野生型であった場合に相補となるオリゴ配列とＳＮＰ１が変異型であった場合に相補となるオリゴ配列となる。これらプローブをＳＮＰ１ｗ、ＳＮＰ１ｍとする。同様にＳＮＰ２に対応したプローブをＳＮＰ２ｗ、ＳＮＰ２ｍとする。これらプローブの長さは通常２０ｂｐ前後である。
【００２７】
これら４種類のプローブ配列から２種類を以下のように選択し、それらをタンデムに連結した合成プローブを作成する。これらプローブは上記２０ｂｐのプローブが連結されたものであるために、４０ｂｐ前後の長さとなる。
Ｐ１  ：  ＳＮＰ１ｗ＋ＳＮＰ２ｗ
Ｐ２  ：  ＳＮＰ１ｗ＋ＳＮＰ２ｍ
Ｐ３  ：  ＳＮＰ１ｍ＋ＳＮＰ２ｗ
Ｐ４  ：  ＳＮＰ１ｍ＋ＳＮＰ２ｍ。
【００２８】
ここで上記連結プローブＰ１およびＰ２はＳＮＰ１の野生型をもつターゲットとハイブリダイズし、Ｐ３およびＰ４はＳＮＰ１の変異型をもつターゲットとフルマッチでハイブリダイズする。同様に、Ｐ１およびＰ３はＳＮＰ２の野生型、Ｐ２およびＰ４はＳＮＰ２の変異型をもつターゲットとフルマッチでハイブリダイズする。
【００２９】
しかし２箇所を同時に考えると、Ｐ１は図２のａ）１の場合には２箇所ともフルマッチでハイブリダイズするが、ａ）２、ｂ）３の場合には一箇所のみとフルマッチではハイブリダイズすることになる。同様にＰ２はｂ）３と、Ｐ３はａ）２と、Ｐ４はｂ）４とのみ、二箇所がフルマッチでハイブリダイズする。
【００３０】
今ハプロタイピングによって判別したいのは、図２のａ）とｂ）の場合である。
【００３１】
二箇所が同時にハイブリダイズする場合の結合強度が、一箇所のみでハイブリダイズする場合の単なる二倍ならば（図３）、例えばａ）の１がハイブリダイズした場合の輝度はＰ１を１とするとＰ２とＰ３が０．５となる。ａ）の２がハイブリダイズした場合はＰ４が１、Ｐ２、Ｐ３が０．５となるので、１と２が等量混合したａ）の輝度はＰ１〜Ｐ４すべてで１となる。
【００３２】
これに対してｂ）の３がハイブリダイズした場合の輝度はＰ２が１、Ｐ１とＰ４が０．５となり、４がハイブリダイズした場合の輝度はＰ３が１、Ｐ１とＰ４が０．５となるため、３と４が等量混合したｂ）の輝度はＰ１〜Ｐ４で１となる。すなわち、ａ）とｂ）で輝度プロファイルに差がでないことになり、ａ）とｂ）を判別することはできない（図３）。
【００３３】
ここで、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅな相互作用について考える。Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅとは、２つもしくはそれ以上の反応が相互に影響を及ぼしあい（強めあい）１＋１＝２とはならず、２以上の結果をもたらすことを意味し、たんぱく質の相互作用など複数の生体物質が複合体を形成する過程などでよく見られる現象である。
【００３４】
上記のプローブの例でいうならば、二箇所でハイブリダイズするプローブの輝度と、一箇所でハイブリダイズするプローブの輝度を比較した場合に、前者が後者よりも２倍以上の強さとなる状況をＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅなハイブリダイゼーションとよぶ。
【００３５】
この点から図３、図４をみると、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅなハイブリダイゼーションによって、二箇所でフルマッチの場合は、一箇所でフルマッチの場合の２倍となるのではなく、より強め合ってターゲットがプローブにハイブリダイズすることがわかる。図３は、図２のａ）１、２、ｂ）３、４が一本ずつハイブリダイズした場合と、等量で混合した場合である。Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅなハイブリが起こらない場合、ａ）とｂ）は等しいプロファイルを与え、判別できない。一方、図４は、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅなハイブリが起こる場合であり、ａ）とｂ）は異なるプロファイルを与えるために判別することができる。
【００３６】
Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅなハイブリダイゼーション反応が起る環境で検出を行うことができれば、ａ）の１がハイブリダイズした場合にはＰ１の輝度＞＞それ以外のプローブの輝度、２ではＰ４の輝度＞＞それ以外のプローブの輝度となる。同様にｂ）の３がハイブリダイズした場合にはＰ２の輝度＞＞それ以外のプローブの輝度、４ではＰ３の輝度＞＞それ以外のプローブの輝度となる。よってａ）の場合にはＰ１とＰ４がＰ２とＰ３に比べて優位に高輝度になるのに対して、ｂ）の場合にはＰ２とＰ３がＰ１とＰ４に比べて優位に高輝度となるために、ａ）とｂ）の判別をすることが可能になる。
【実施例】
【００３７】
（実施例１）
次に、本発明の実施例について説明する。
代謝酵素ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は遺伝子内に複数のＳＮＰ箇所をもつことが知られている。このうちスタートコドンから１００番目に存在するＳＮＰであるＣ１００Ｔと３１０番目に存在するＧ３１０Ｔについて、ハプロタイプを検出するプロトコルを説明する。
まず、それぞれの多型を検出するプローブを以下のように設計した。
【００３８】
【表１】
2009195143.tif 000003
【００３９】
但し本提案においては、プローブのＴｍ計算時の条件は以下の値を用いた。なお、Ｔｍ値は最近接塩基対法から求めることができる。
【００４０】
【表２】
2009195143.tif 000004
【００４１】
これらの配列は、それぞれを基板上に固定して作製したＤＮＡチップにより、Ｃ１００Ｔ、Ｇ３１０ＴのＳＮＰが検出できることを確認している。但しこの場合のハイブリダイゼーションは、以下の（ハイブリダイゼーション溶液）の項に記載の方法で準備された溶液を、９２℃に加温し２分間保持したあと、さらに５０℃で４時間保持して行った。その後、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて、４０℃で洗浄をし、さらに２×ＳＳＣを用いて２０℃で洗浄した。
【００４２】
次にこれらの配列をＣ１００Ｔ−Ｇ３１０Ｔの順番に連結した以下のようなプローブを設計し、これを基板上に固定することによってマイクロアレイを作製する。ここではプローブ核酸をインクジェット方式（特開平１１−１８７９００号公報）で基板担体上に固定化したＤＮＡマイクロアレイを用いた実施例について述べるが、この方法に限定されるものではない。
【００４３】
【表３】
2009195143.tif 000005
【００４４】
（マイクロアレイの構成）
プローブの固定は特開平１１−１８７９００号公報に詳細が示されているように、表面処理を行った基板にインクジェットにより５’末端をチオール化されたオリゴＤＮＡを吐出する方法を用いる。ここでプローブとなるＤＮＡはシグマ  アルドリッチ  ジャパン（株）から購入したものである。
【００４５】
（ターゲットの準備）
検体は、ＰＳＣ（Ｐｈａｒｍａ  ＳＮＰ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）由来の抽出ＤＮＡをヒューマンサイエンス研究資源バンク（ＨＳＲＲＢ）より購入した。本実験で用いるにあたり、あらかじめＣＹＰ２Ｄ６を含む５．１ｋｂｐの領域を以下のプライマー（“Ｎｏｖｅｌ  Ｎｏｎｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＹＰ２Ｄ６  Ｇｅｎｅ”  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１９（４）：ＳＮＰ１９（３１３）ＳＮＰ２５（３１９）２００４）を用いて増幅し、シーケンサー（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）により配列を取得した。
【００４６】
【表４】
2009195143.tif 000006
【００４７】
但し本提案においては、プライマーのＴｍ計算時の条件は以下の値を用いた。
【００４８】
【表５】
2009195143.tif 000007
【００４９】
以下では、ＰＳＣ検体の中から５種類の検体に着目して検討を行っている。
【００５０】
【表６】
2009195143.tif 000008
【００５１】
すでに比較のためにシーケンスを取得してあるので、各検体のＣ１００Ｔ，Ｇ３１０Ｔ位置におけるジェノタイプの結果とアレルは上記のようであった。ＣＹＰ２Ｄ６に関しては、遺伝子全体のアレルに関する情報がデータベース化（Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  Ａｌｌｅｌｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｃｙｐａｌｌｅｌｅｓ.ｋｉ.ｓｅ／）されているために、その内容を参考にした。
【００５２】
アレル（＊１，＊２，＊１０）毎のＣ１００Ｔ、Ｇ３１０ＴのＳＮＰは以下のようになっている。
【００５３】
【表７】
2009195143.tif 000009
【００５４】
上記プライマー（２Ｄ６−ＤＰＫｕｐ、２Ｄ６−ＤＰＫｌｏｗ）を用いて、２Ｄ６のエキソン領域全体を含む５．１ｋｂｐを増幅する反応（ＰＣＲ）の例を以下に示す。この増幅産物は以下の実施例において、テンプレートとして使用している。また上記でシーケンスを取得する際にも、このテンプレートを用いた。増幅反応液組成の例を以下に示す。
【００５５】
−−ＰＣＲ溶液組成−−
Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ                              ０．２５μｌ
Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ（５０ｎｇ／ｕｌ）                        １μｌ
Ｆｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（１ｕＭ）        ３μｌ
ｄＮＴＰ  （２．５ｍＭ）                                  ４．５μｌ
ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ                                        １２．５μｌ
Ｈ2Ｏ                                                     ０．７μｌ
Ｔｏｔａｌ                                                  ２５μｌ。
【００５６】
上記組成の反応液を以下の温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行った。
【００５７】
【表８】
2009195143.tif 000010
【００５８】
反応終了後、電気泳動（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ：  Ａｇｉｌｅｎｔ社製）により、増幅産物の定量を行い、８ｎｇ／ｕｌに超純水で希釈した。
【００５９】
次に、Ｃ１００ＴとＧ３１０Ｔを含む５００ｂｐ程度の領域を以下のプライマーを用いて増幅した。
【００６０】
【表９】
2009195143.tif 000011
【００６１】
ここでＦｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒの配列は上に示したものだが、５’末端Ｃｙ３標識のＦｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ＋５’末端リン酸化のＲｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒの組み合わせと、５’末端Ｃｙ３標識のＲｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ＋５’末端リン酸化のＦｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒの組み合わせの二種類でＰＣＲを行った。これにより、その後の片鎖化処理により、Ｃｙ３標識された鎖のみが残り、リン酸化された鎖は分解され、一本鎖のターゲットとハイブリダイゼーション反応を行うことになる。
【００６２】
（片鎖化処理）
前述の増幅したＰＣＲ産物を用い、片鎖化処理を行って一本鎖のターゲットをつくる。反応は上記の定量結果を参考に、溶液中に５０ｎｇの増幅産物を含むように調整する。またコントロールとして、Ｓｔｒａｎｄａｓｅ  λ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅの代わりに、Ｓｔｒａｎｄａｓｅ  λ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅを１００倍に希釈した溶液を加えて反応を行う。
【００６３】
−片鎖化反応溶液組成−
ＰＣＲ産物５０ｎｇ  ＋  Ｈ2Ｏ                       ８μｌ
１０ｘＳｔｒａｎｄａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ              １μｌ
Ｓｔｒａｎｄａｓｅ  λ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ      １μｌ
Ｔｏｔａｌ                                        １０μｌ。
【００６４】
上記組成の反応液を３７℃で２０分保持した後、精製用カラム（ＱＵＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：  ＱＵＩＧＥＮ社製）を用いてプライマー等を除去する。精製終了後、電気泳動（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ：Ａｇｉｌｅｎｔ社製）により産物の定量を行う。このとき、片鎖化された産物ではシグナルは観察されない。よって上記で等量のＰＣＲ産物を加え、酵素の代わりに酵素を１００倍に希釈した溶液を加えたコントロールの産物量（モル濃度）と等しい量が片鎖化されて存在するとして、以下のハイブリダイゼーション反応を行う。
【００６５】
（ハイブリダイゼーション）
水切りしたＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行う。ハイブリダイゼーション装置を用いずに、スライドガラスとハイブリダイゼーション用のチャンバーを用いてマニュアルで反応を行ってもよい。
【００６６】
（ハイブリダイゼーション溶液）
以下にハイブリダイゼーション溶液の組成の一例を示す。
６×ＳＳＰＥ ／ １０％  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ ／ ターゲット（未知検体由来の核酸）（ＰＣＲ後片鎖化した産物 ０．５ｎＭ） ／ ０．０５％  ＳＤＳ
前述の増幅後片鎖化した産物０．１ｎＭ相当をバッファー（ＳＳＰＥ）に溶かし、最終濃度が１０％になるようにＦｏｒｍａｍｉｄｅを加える。この溶液に最終濃度が０．０５％になるようにＳＤＳ溶液を加え、ハイブリダイゼーション溶液とする。なお、バッファー（ＳＳＰＥ）の濃度は、最終溶液の状態で６×ＳＳＰＥとなるように予め計算しておく。
【００６７】
上記ハイブリダイゼーション溶液を、９２℃に加温し２分間保持したあと、さらに６２℃で４時間保持した。その後、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて、５０℃で洗浄をした。さらに２×ＳＳＣを用いて２０℃で洗浄を行い、必要に応じて通常のマニュアルに従い純水でリンス、スピンドライ装置で水切りを行った。
【００６８】
（蛍光測定）
上記ＤＮＡマイクロアレイを、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）を用いて、以下の条件で蛍光測定を行った。蛍光測定波長をＣｙ３およびＣｙ５測定波長とし、蛍光測定値が３００００以下となるように励起光の強さを調整して測定した。
【００６９】
（スポット解析）
蛍光測定結果の画像を、マイクロアレイ用のデータ解析ソフトＡｒｒａｙＰｒｏ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製）で解析を行い、各スポットに対する輝度値のデータを得た。
【００７０】
（結果）
上記に従ってＰＳＣサンプル＃７２４についてハイブリダイゼーションを行った結果を図５に示す。ａ）はアンチセンス鎖プローブとセンス鎖ターゲット（ＦＣｙ３）、ｂ）はセンス鎖プローブとアンチセンス鎖ターゲット（ＲＣｙ３）の結果を示している。＃７２４はＣ１００Ｔ、Ｇ３１０Ｇ双方について野生型のホモ（ｗｗ）であることがシーケンス結果から確認されている。図５を見ると、センス鎖プローブ、アンチセンス鎖プローブ共にＣ１００Ｔ野生型−Ｇ３１０Ｔ野生型を連結したプローブ（１００−３１０Ｓｗｗ、１００−３１０Ａｗｗ）のみが、輝度が有意に高くなることが分かる。
【００７１】
同様に、サンプル＃２０２７のハイブリダイゼーション結果を図６に示す。＃２０２７はシーケンス結果からＣ１００Ｔ、Ｇ３１０Ｇ双方について変異型のホモ（ｍｍ）であることが確認されている検体である。図６に示したように、センス鎖プローブ、アンチセンス鎖プローブ共にＣ１００Ｔ変異型−Ｇ３１０Ｔ変異型を連結したプローブ（１００−３１０Ｓｍｍ、１００−３１０Ａｍｍ）のみが有意に輝度が高くなることが示されている。
【００７２】
次に、サンプル＃３１７のハイブリダイゼーション結果を図７に示す。＃３１７はシーケンス結果からＣ１００Ｔ、Ｇ３１０Ｇ双方についてヘテロ（ｗｍ）であり、他のＳＮＰ箇所のジェノタイピング結果及びＣＹＰ２Ｄ６のデータベースよりアレル＊１／＊１０である。これは、＃７２４がアレル＊１／＊１、＃２０２７がアレル＊１０／＊１０であることを考えると、Ｃ１００Ｔ野生型−Ｇ３１０Ｔ野生型と、Ｃ１００Ｔ変異型−Ｇ３１０Ｔ変異型のヘテロとなる検体である。そのハイブリダイゼーション結果は図７に示すように、Ｃ１００Ｔ野生型−Ｇ３１０Ｔ野生型を連結したプローブと、Ｃ１００Ｔ変異型−Ｇ３１０Ｔ変異型を連結したプローブに高い輝度が見られる。
【００７３】
このように、２箇所のＳＮＰ部位Ｃ１００ＴとＧ３１０Ｔの判別に用いられるプローブを連結したプローブを固定した基板によって、二箇所のＳＮＰ部位のハプロタイプを検出できることが示された。このとき、Ｃ１００Ｔ、Ｇ３１０Ｔそれぞれのプローブを固定した基板で、それぞれのＳＮＰをタイピングする際は、５０℃でハイブリダイゼーションを行ったのに対して、連結プローブを用いた本実施例では、６２℃と１２℃高い温度でハイブリダイゼーションを行っている。これにより、一箇所のみでフルマッチのハイブリダイゼーションを行うプローブに対しての結合は、二箇所でフルマッチのハイブリダイゼーションを行うプローブに比較して有意に弱く（＜１／２）、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅな効果を見ることができる。
【００７４】
（実施例２）
実施例１と同様の方法で、ＰＳＣサンプル＃３０９と＃２１２についてもハイブリダイゼーションを行った。＃３０９はシーケンス結果からＣ１００Ｔについては野生型ホモ（ｗｗ）、Ｇ３１０Ｇについてヘテロ（ｗｍ）であり、他のＳＮＰ箇所のジェノタイピング結果及びＣＹＰ２Ｄ６のデータベースよりアレル＊１／＊２である。また＃２１２はＣ１００Ｔについてはヘテロ（ｗｍ）、Ｇ３１０Ｇについて変異片型ホモ（ｍｍ）であり、アレル＊２／＊１０である。アレル＊２に関しては、日本人中での頻度があまり高くはないために、今回検討したＰＳＣ３０検体中に＊２／＊２となるサンプルは存在しなかった。
【００７５】
＃３０９と＃２１２のハイブリダイゼーション結果をそれぞれ図８、図９に示す。＃３０９に関しては、Ｃ１００Ｔ野生型−Ｇ３１０Ｔ野生型を連結したプローブ（１００−３１０Ｓｗｗ、１００−３１０Ａｗｗ）と、Ｃ１００Ｔ野生型−Ｇ３１０Ｔ変異型を連結したプローブ（１００−３１０Ｓｗｍ、１００−３１０Ａｗｍ）に高い輝度が見られる。また＃２１２に関しては、Ｃ１００Ｔ野生型−Ｇ３１０Ｔ変異型を連結したプローブと、Ｃ１００Ｔ変異型−Ｇ３１０Ｔ変異型を連結したプローブ（１００−３１０Ｓｍｍ、１００−３１０Ａｍｍ）に高い輝度が見られる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の構成を示す模式図である。
【図２】ＳＮＰとハプロタイプの関係を示す図である。
【図３】Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅなハイブリが起らない場合の輝度模式図である。
【図４】Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅなハイブリダイゼーションが起こる場合の輝度模式図である。
【図５】ＰＳＣ＃７２４（＊１／＊１）のハイブリダイゼーション結果を示すグラフである。
【図６】ＰＳＣ＃２０２７（＊１０／＊１０）のハイブリダイゼーション結果を示すグラフである。
【図７】ＰＳＣ＃３１７（＊１／＊１０）のハイブリダイゼーション結果を示すグラフである。
【図８】ＰＳＣ＃３０９（＊１／＊２）のハイブリダイゼーション結果を示すグラフである。
【図９】ＰＳＣ＃２１２（＊２／＊１０）のハイブリダイゼーション結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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