(57)【要約】【課題】  物質の構造に関する情報の取得効率を向上し、測定及び物質同定の時間を短縮し、同定精度を向上することのできる安価な質量分析システムを提供する。【解決手段】  タンデム型質量分析装置を用いた質量分析システムにおいて、試料を所望の極性でイオン化し、イオンを解離して得られたフラグメントイオンを第一、あるいは、第二の質量分析部で測定し、その結果に基づき、第二の質量分析装置の極性を決定し、質量分析測定することを特徴とする質量分析システム、及び、質量分析方法を開示する。【選択図】  図２
2009068981.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料をイオン化するイオン源と、
イオンの軌道を偏向することでイオンの進行方向を決定するイオン偏向部と、
前記イオン偏向部から排出されたイオンを質量分析するための第１の質量分析部と、
前記第１の質量分析部とは極性の異なるイオンを分析する第２の質量分析部と、
少なくとも前記イオン源及び前記イオン偏向部の極性の切り替えを行う制御部を有し、
前記第１の質量分析部により得られた測定結果に基いて前記制御部は少なくとも前記イオン源及び前記イオン偏向部の極性を切り替え、前記第２の質量分析部により質量分析が行われることを特徴とする質量分析システム。
【請求項２】
請求項１に記載の質量分析システムにおいて、
前記第１又は第２の質量分析部は、飛行時間型質量分析装置であることを特徴とする質量分析システム。
【請求項３】
請求項１に記載の質量分析システムにおいて、
前記第１又は第２の質量分析部は、イオントラップ型質量分析装置であることを特徴とする質量分析システム。
【請求項４】
請求項１に記載の質量分析システムにおいて、
衝突励起解離手段と電子捕獲解離手段、または、電子移動解離手段を有することを特徴とする質量分析システム。
【請求項５】
請求項４に記載の質量分析システムにおいて、
前記制御部によって、前記衝突励起解離手段の極性の切り替えが行われることを特徴とする質量分析システム。
【請求項６】
請求項５に記載の質量分析システムにおいて、
前記イオン源、前記イオン偏向部、前記第１又は第２の質量分析部及び前記衝突励起解離手段の極性の切り替えを、測定中に行うことができることを特徴とする質量分析システム。
【請求項７】
請求項４に記載の質量分析システムにおいて、
前記衝突励起解離手段として、イオントラップ及びコリジョンセルを有することを特徴とする質量分析システム。
【請求項８】
請求項１に記載の質量分析システムにおいて、
前記イオン源と前記イオン偏向部との間に、特定の質量電荷比を有するイオンの単離手段を有することを特徴とする質量分析システム。
【請求項９】
請求項８に記載の質量分析システムにおいて、
前記制御部によって、前記単離手段の極性の切り替えが行われることを特徴とする質量分析システム。
【請求項１０】
請求項９に記載の質量分析システムにおいて、
前記単離手段の極性の切り替えを測定中に行うことができることを特徴とする質量分析システム。
【請求項１１】
請求項８に記載の質量分析システムにおいて、
前記イオンの単離手段がＱマスフィルターであることを特徴とする質量分析システム。
【請求項１２】
請求項＃に記載の質量分析システムにおいて、
試料をイオン化するイオン源の前段に、試料が分離される分離部を備えることを特徴とする質量分析装置。
【請求項１３】
極性を切り替えて質量分析することが可能な質量分析システムにおいて、
試料をイオン化するイオン源の前段に設けられた分離部によって試料を分離する工程と、
分離された試料を前記イオン源により所望の極性でイオン化する工程と、
生成された試料イオンを解離手段によって解離する工程と、
解離された試料イオンを質量分析部により第１の質量分析が行われる工程と、
前記第１の質量分析により目的のイオンが検出された場合、前記解離手段とは別の解離手段によって試料イオンの解離を行う工程と、
前記質量分析部により第２の質量分析が行われる工程とを有し、
前記第１の質量分析の結果に基いて、前記第２の質量分析における試料のイオン化極性が決定されることを特徴とする質量分析方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の質量分析方法において、
前記質量分析部として、飛行時間型質量分析装置、イオントラップ型質量分析装置のどちらか一方又は両方を用いて質量分析が行われることを特徴とする質量分析方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の質量分析方法において、
試料を前記イオン源により所望の極性でイオン化する工程と、
生成された試料イオンを衝突励起解離手段により衝突励起解離する工程と、
衝突励起解離によって生成されたフラグメントイオンの質量分析が行われる工程と、
質量分析により目的のフラグメントイオンが検出された場合、試料のイオン化極性を正に設定する工程と、
正の極性でイオン化された試料イオンを電子捕獲解離手段により電子捕獲解離する工程と、
電子捕獲解離によって生成されたフラグメントイオンの質量分析が行われる工程とを有することを特徴とする質量分析方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の質量分析方法において、
前記衝突励起解離手段として、イオントラップ及びコリジョンセルを用いることを特徴とする質量分析方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の質量分析方法において、
イオンの軌道を偏向することでイオンの進行方向を決定するイオン偏向部により、イオンを前記質量分析部、前記衝突励起解離部又は前記電子捕獲解離部に導くことを特徴とする質量分析方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の質量分析方法において、
前記イオン源と前記イオン偏向部との間に、特定の質量電荷比を有するイオンの単離手段を備えることを特徴とする質量分析方法。
【請求項１９】
試料をイオン化するイオン源の前段に設けられた分離部により分離された試料を、前記イオン源によりイオン化する工程と、
質量分析部により、生成された試料イオンの質量分析が行われる工程と、
前記質量分析部による質量分析結果から、目的の試料イオンの価数判定が行われる工程とを有し、
価数判定が可能なイオンは、特定の質量電荷比を有するイオンの単離手段により単離され、電子捕獲解離手段により電子捕獲解離され、前記質量分析部により質量分析が行われ、
価数判定ができないイオンは、価数判定が可能になるまで衝突励起解離手段により衝突励起解離が繰り返し行われることを特徴とする質量分析方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の質量分析方法において、
前記質量分析部は飛行時間型質量分析装置であることを特徴とする質量分析方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の質量分析方法において、
制御部によって、前記イオン源、前記質量分析部、前記イオンの単離手段及び前記衝突励起解離手段の極性の切り替えが行われることを特徴とする質量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
質量分析法を用いた生体高分子の構造解析方法と装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにはおよそ１０万種のタンパク質が存在すると言われている。タンパク質の機能は、プロテアーゼによる切断、糖鎖やリン酸基などの付加による活性・相互作用調節、ミリスチル化やパルミチル化などのアシル化による膜への局在化など、様々の翻訳後修飾により巧妙な調節を受けている。特に真核生物においては、遺伝子配列をもとに合成されたタンパク質がそのままの状態で機能を発揮することはむしろまれで、リボソーム上での合成後にその場で、あるいは細胞内での最終的な局在が決まるまでの様々の段階で多種多様な修飾を受ける。時間空間的に変化するこれらの生体高分子はゲノム情報のみでは決定できず、タンパク質を直接解析して初めて決定できる。
【０００３】
その構造解析手段の１つとして、質量分析法（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）がある。質量分析法を用いて、生体高分子を構成するアミノ酸がペプチド結合でつながったポリペプチド（ペプチドやタンパク質）の配列情報や翻訳後修飾情報を得ることができる。とくに高周波電場を用いたイオントラップやＱマスフィルターを用いた質量分析法や、飛行時間型質量分析法（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  ：ＴＯＦ）  は高速分析法のため、液体クロマトグラフィー装置などに代表される試料を分離する前処理手段との結合性がよい。そこで、多種類の試料を連続解析することが求められるプロテオーム解析などの目的に合致しており、幅広く使われている。
【０００４】
一般に質量分析法では、試料分子をイオン化して真空中に導入し（  または真空中でイオン化し）  、電磁場中におけるそのイオンの運動を測定することにより、対象とする分子イオンの電荷と質量の比（ｍ／ｚ）が測定される。得られる情報が質量と電荷の比という巨視的な量であるため、単に１度の質量分析操作では内部構造情報まで得ることは出来ない。そこで、タンデム質量分析法と呼ばれる方法が用いられる。すなわち、１回目の質量分析操作で試料分子イオンを選択し、単離する。このイオンをプリカーサーイオンとよぶ。つづいて、このプリカーサーイオンを何らかの手法で解離する。解離したイオンをフラグメントイオンと呼ぶ。そのフラグメントイオンをさらに質量分析することにより、フラグメントイオンの生成パターンの情報を得る。解離手法により、解離パターンの法則性があるので、プリカーサーイオンの配列構造を推察することが可能となる。とくに、アミノ酸を骨格とする生体分子の分析分野では、解離手法として衝突励起解離（  Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ−Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＣＩＤ）、赤外多光子吸収（Ｉｎｆｒａ−Ｒｅｄ−Ｍｕｌｔｉ−Ｐｈｏｔｏｎ−Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＩＲＭＰＤ）  そして、電子捕獲解離（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−Ｃａｐｔｕｒｅ−Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＥＣＤ）や電子移動解離（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ−Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＥＴＤ）が使われる。
【０００５】
タンパク質解析分野において、現在もっとも広く使われている手法がＣＩＤである。プリカーサーイオンに運動エネルギーを与えてガスと衝突させる。衝突により分子振動が励起されて、分子鎖の切れやすい部分で解離する。また、最近使われるようになった方法がＩＲＭＰＤである。プリカーサーイオンに赤外レーザ光を照射して、多数の光子を吸収させる。分子振動が励起されて、分子鎖の切れやすい部位で解離する。解離部位は図１２に示す。ａ，ｂ，ｃはＮＨ２末端側を含む分子、ｘ，ｙ，ｚはＣＯＯＨ末端側を含む分子である。ＣＩＤやＩＲＭＰＤで切れやすい部位は、アミノ酸配列からなる主鎖のうち、ａ  −  ｘ、ｂ  −  ｙで命名されている部位である。ａ−  ｘ、ｂ  −  ｙの部位であっても、アミノ酸配列パターンによっては切れにくい場合があるために、ＣＩＤ  やＩＲＭＰＤのみでは完全な構造解析ができないことが知られている。そのために、酵素などを用いた前処理が必要になり、高速な分析を妨げている。また、翻訳後修飾を受けた生体高分子では、ＣＩＤ  やＩＲＭＰＤを用いると、翻訳後修飾されたポリペプチド側鎖が切れやすい傾向がある。側鎖が切れやすいため、失われた質量から修飾分子種と修飾されているかどうかの判定は可能である。ただし、どのアミノ酸部分で修飾されていたかという修飾部位に関する重要な情報は失われる。
【０００６】
一方、ＥＣＤやＥＴＤは、アミノ酸配列に依存せず（  ただし例外として環状構造であるプロリン残基は切断しない）、アミノ酸配列の主鎖上のｃ  −  ｚ部位の１  箇所を切断する。そのために、タンパク質分子を質量分析的手法のみで完全解析出来る。また、側鎖を切断しにくいという特徴をもっていることから、翻訳後修飾の研究・解析の手段として適している。このために、近年特に注目を受けているのがこのＥＣＤやＥＴＤという解離手法である。
【０００７】
ＥＣＤやＥＴＤはプラスに帯電した多価イオンに対してのみ解離可能である。ＥＣＤはプラスに帯電した分子にマイナスに帯電した電子を捕獲させることによって分子が解離する原理を利用している。そのため、マイナスに帯電している分子では解離できず、プラスの一価イオンでは、ニュートラルな分子になってしまうため、質量分析装置で検出できない。
【０００８】
また、ＥＣＤの反応効率は電荷の二乗に比例すると言われているため、非常に高い価数になるタンパク質では効率よく解離できる。このため、最近ではトップダウンと呼ばれる解析が注目されている。トップダウン解析は、タンパク質を酵素消化し、ペプチド断片化する手法（ボトムアップ）と対照的であり、タンパク質を直接質量分析する手法である。ボトムアップ解析では、分析されたペプチドが生体内でタンパク質として存在していたのか、あるいは分解物として存在していたのかを特定することはできない。一方、トップダウン解析では、生体試料を直接分析するため、その特定も可能となる。
【０００９】
現時点で、ＥＣＤはフーリエ変換型質量分析装置（ＦＴ−ＩＣＲ）と高周波イオントラップで実現されている（非特許文献１）。ＦＴ−ＩＣＲでは、分解能８０００００程度、ｐｐｂの質量精度をもつが、超伝導磁石を用いて、平行強磁場（数テスラ以上）が必要となるため、高価かつ大型であり、１つのスペクトルを得るために、必要な測定時間は数秒から１０秒かかり、スペクトルを得るために必要なフーリエ解析に１０秒程度必要である。都合、数１０秒必要となる。そのため、１０秒程度で１つのピークが現れる液体クロマトグラフィーとの結合性は良いとは言えない。一方、高周波イオントラップはＴＯＦと結合すると、ＦＴ−ＩＣＲには及ばないが、高分解能（１５０００程度）で高い質量精度（ｐｐｍ）でデータ測定が可能である。さらに、小型、安価である上、高速測定が可能であるため、液体クロマトグラフィーとの結合性が良い（非特許文献２）。
【００１０】
このように、質量分析装置や液体クロマトグラフィーの進化、さらにデータベースの充実によって大規模タンパク質解析が実現しつつある。しかし、それでも一度に分析できるタンパク質としては、せいぜい数千種類が限度である。そのため、すべてのタンパク質を対象にするのではなく、特定の集団だけを相手にするいわゆる「フォーカスド・プロテオーム」が昨今の主流になりつつある。
【００１１】
例えば、代表的な翻訳後修飾であるリン酸にフォーカスした分析が盛んに行われている。リン酸化物を分析するには２つの課題がある。一つ目として、リン酸化物は非リン酸化物に比べ、数倍から数百倍イオン化効率が低くなることがある。２つめとして、ＣＩＤを解離手法とする場合、タンパク質のままでは解離が困難なため、酵素消化によって、ペプチド断片化する必要がある。分子量４００００のタンパク質が酵素消化により４００断片のペプチドに分解されたと仮定すると、全タンパク質のおよそ３０％存在していたリン酸化物は、酵素消化により存在比は０．０８％以下になると試算される（非特許文献３）。
【００１２】
この２つの制限により、ペプチド断片化した生体試料サンプルをそのまま質量分析してもリン酸化ペプチドが同定できることはほとんどない。そこで、現在、リン酸化ペプチドを特異的に検出するために、ＣＩＤに特徴的である翻訳後修飾部位の脱離を利用した手法が使われている。ＣＩＤによるタンデム質量分析法では、リン酸化ペプチドからリン酸基だけが失われたフラグメントイオンと、リン酸基に由来するフラグメントイオンが生成する。リン酸基に注目してリン酸化ペプチドを探索する手法はプリカーサーイオンスキャン法と呼ばれる。  
プリカーサーイオンスキャン法は、特定のフラグメントイオンを生成する全てのプリカーサーイオンをスキャンする測定方法である。１台目の質量分離部ＭＳ−１のスキャンで透過したイオンを、コリジョンセルでＣＩＤを実施し、得られたフラグメントイオンの中で、特定のｍ／ｚのイオンのみを２台目の質量分離部ＭＳ−２で検出する。このようにして、ＭＳ−２で特定のフラグメントイオンが検出された時、ＭＳ−１を通過したプリカーサーイオンを特定する。リン酸基を特異的に検出する場合は、ネガティブモードで、ｍ／ｚ７９（ＰＯ３−）イオンをＭＳ−２で検出する（非特許文献４）。
【００１３】
【非特許文献１】Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｒａｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｉｏｎ  ｔｒａｐ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００４  Ａｕｇ  １；７６（１５）：４２６３−６．
【非特許文献２】Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ  ：ＡＳＭＳ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（２００６）ＷＯＢ．
【非特許文献３】実験医学  Ｖｏｌ．２３  Ｎｏ．１９  ２００５，ｐ２９５１−２９５６
【非特許文献４】プロテオミクス実験プロトコール（秀潤社）ｐ１５６−１６８
【非特許文献５】Ｋｉｓａｂｕｒｏ  Ｄｅｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｏ−ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ｎｅｇａｔｉｖｅ−  ａｎｄ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ  ｍｕｌｔｉ−ｓｔａｇｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｃａｐｔｕｒｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｉｏｎ  ｔｒａｐ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  ＲＡＰＩＤ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＭＡＳＳ  ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ  ２００７；２１：６９１−６９８．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
タンパク質やペプチドの定性解析では、アミノ酸配列の同定だけでなく、翻訳後修飾の種類や修飾物の構造あるいは修飾部位の同定が求められる。サンプルは貴重であるため、効率よく最大限のアウトプットを獲得することが求められる。また、一連の解析をできるだけ短時間に行うこと、すなわち、高スループットが求められている。
【００１５】
前述したように、代表的なフォーカスドプロテオームであるリン酸化をターゲットにした解析では、ＣＩＤを用いたプリカーサー・スキャン法によって、リン酸化ペプチドを特異的な探索を実施する。リン酸基はマイナスに帯電するため、ネガティブモードで測定する必要がある。探索の結果、リン酸化ペプチドが検出された場合、リン酸化ペプチドイオンを単離し、ＣＩＤによって定性解析を試みる。しかし、ＣＩＤによる解析では、リン酸基が解離し修飾箇所の特定には至らないケースが多々存在する。その場合、貴重なサンプルを用いて再分析する。再分析はポジティブモードでイオン化し、ＥＣＤやＥＴＤでのイオン解離によって定性解析される。
【００１６】
重要な翻訳後修飾の１つである糖鎖をもつペプチドの解析においては、ポジティブモードで測定した場合、簡単にフコースやシアル酸などの単糖の解離が観察される。一方、ネガティブモードでは糖鎖の解離は観察されない。このため、まず、糖鎖ペプチドはネガティブモードでイオン化される。糖鎖ペプチドをCIDすると、糖鎖が優先的に解離し、糖鎖だけが解離したフラグメントイオンが観察される。これらにより、糖鎖構造解析が可能となる。しかし、CIDすることで糖鎖はポリペプチド側鎖から脱離してしまうため、どのアミノ酸に修飾していたかという情報は失われる。そこで、再分析が実施される。今度は一部糖鎖は脱離してしまうが、ポジティブモードでイオン化し、ECDやETDで解析することによってアミノ酸配列情報や修飾部位を同定する(RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY 2007;21:691-698.)。
【００１７】
また、最近注目されているトップダウン解析では、１０価以上のプリカーサーイオンに対して、ＥＣＤやＥＴＤを実施しなければならない。その解析にはプリカーサーイオンの分子量やＥＣＤで解離した結果得られたフラグメントイオンの分子量が判明しなければ、構造解析することはできない。分子量（ｍ）はイオンのｍ／ｚ値と同位体ピーク間隔からｚが判明し、ｍを算出する。多価になるほど、狭くなる同位体ピーク間隔を判別するためには、高分解能な装置が必要である。
【００１８】
以上のように、イオン解離手法としては一般的に広く汎用されているＣＩＤだけでなく、ＣＩＤと相補的なイオン解離手法であるＥＣＤを使用することで初めて解析可能となる生体高分子が多数存在する。また、糖鎖解析例のように、ポジティブ、ネガティブ両極性での測定ができないと定性解析が成立しないものも存在する。液体クロマトグラフと接続した場合、各イオンピークは１０秒程度しか検出されない。その間に両極性での分析、あるいは、ＥＣＤとＣＩＤなど相補的なイオン解離手段が使用できる高スループットな装置が重要視される。さらに、トップダウン解析に対応可能な高分解能な装置も合わせて求められる。
【００１９】
イオン源、Ｑマスフィルター、イオントラップなどは数十ｍｓ程度で容易に極性を変換できるため、両極性測定可能な装置が製品化されている。また、ＥＴＤとＣＩＤを同一装置内で利用できる装置も製品化されている。
【００２０】
大きな課題は液体クロマトグラフでの分析が可能な高速で高分解能な装置である。前述したように超高分解能装置であるＦＴ−ＩＣＲはスループットが低いため、液体クロマトグラムを用いた解析には向かない。しかし、最近、Ｏｒｂｉｔｒａｐと呼ばれる磁場型の装置が市販された。この装置は高スループット（１スキャン／秒）で、高分解能（５００００）な装置で、液体クロマトグラムとの接合性もよい。しかし、非常に高価である。安価で高分解能な装置を製作するにはＴＯＦが最適である。しかし、ＴＯＦの極性切り替え制御はイオントラップのように容易にできるものではない。非常に大きな電圧が必要になり、高価な装置になってしまう。最近、０．１秒程度でＴＯＦの極性変換が可能な装置が市販されたが、高価な装置である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明のタンデム型質量分析装置を用いた質量分析システムでは、試料をイオン化するイオン源と、イオンの軌道を偏向することでイオンの進行方向を決定するイオン偏向部と、イオン偏向部から排出されたイオンを質量分析するための第１の質量分析部と、第１の質量分析部とは極性の異なる第２の質量分析部と、少なくともイオン源及びイオン偏向部の極性の切り替えを行う制御部を有し、第１の質量分析部により得られた測定結果に基いて前記制御部は少なくともイオン源及びイオン偏向部の極性を切り替え、第２の質量分析部により質量分析が行われる。
【００２２】
本発明の質量分析方法では、極性を切り替えて質量分析することが可能な質量分析システムにおいて、試料をイオン化するイオン源の前段に設けられた分離部によって試料を分離する工程と、分離された試料をイオン源により所望の極性でイオン化する工程と、生成された試料イオンを第１の解離手段によって解離する工程と、解離された試料イオンを質量分析部により第１の質量分析が行われる工程と、第１の質量分析により目的のイオンが検出された場合、第１の解離手段とは別の解離手段によって試料イオンの解離を行う工程と、質量分析部により第２の質量分析が行われる工程とを有し、第１の質量分析の結果に基いて、第２の質量分析における試料のイオン化極性が決定する。
【００２３】
本発明の質量分析システム及び質量分析方法では、貴重なサンプルを無駄にすることなく、正負両極性での２つの質量分析部を用いた一連の相補的な解析を短時間で行うことができる。
【００２４】
質量分析部として、安価で高分解能な装置にするため、ＴＯＦを用いる。ただし、分析中にＴＯＦの極性を切り替えると大きな電圧やシステムが必要になり、高価な装置になるという問題がある。もう一方の質量分析部として、イオントラップを用いる。イオントラップは数十ｍ秒程度で極性を切り替えることができ、安価である上、ＣＩＤによるＭＳｎ機能も有する。しかし、イオントラップ内で解離を実施した場合、低分子は共鳴振動し、イオントラップから排出されてしまう。そのため、リン酸基（９８  ｍ／ｚ）などの低分子は検出できない。そのため、コリジョンセルを用いる。コリジョンセルはイオンの単離はできないが、低分子が排出されないという利点がある。その他、ＥＣＤを実施するためのＥＣＤセル、極性切り替え可能なイオン源と同じく極性切り替え可能なイオンを単離するためのＱマスフィルターを用いる。また、他の解離手段としてＥＴＤを用いても良い。
【００２５】
以上の装置構成から、ＴＯＦの極性を分析中に切り替えることなく両極性での測定が可能となり、安価な質量分析システムで高分解能・高スループットな質量分析が可能となる。
【００２６】
また、本発明のタンデム型質量分析装置を用いた質量分析システムでは、試料分離して得られた特定物質をイオン化し、プリカーサーイオンの価数の判定を行う。価数を判定できた場合は、そのイオンに対し、ＥＣＤで解離して詳細分析を実行し、価数を判定できない場合は、そのプリカーサーイオンをＣＩＤで解離し、フラグメントイオンの価数の判定を行い、価数判定できたフラグメントに対し、ＥＣＤで解離して詳細分析を実行することで、従来では分析できなかった分子量の大きなタンパク質に対して、構造解析が可能になる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によると、両極性測定可能であり、相補的なＣＩＤとＥＣＤでのイオン解離が実施可能である安価で高分解能な装置を提供できる。また、質量分析による物質の同定において、物質の構造に関する情報を取得する効率が向上し、測定及び物質同定の時間が短縮され、同定精度が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
図１に、本発明に基づく質量分析システムの構成例を示す。分析対象の試料１は、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）またはＬＣ２の前処理により分離される。分離された試料は、イオン源３においてイオン化され、質量分析装置に導入される。導入されたイオンはＱマスフィルター４で単離され、単離された特定のイオン（あるいは全イオン）はＱディフレクター５から、ＬＩＴ６、ＥＣＤセル８、あるいはコリジョンセル９に排出される。Ｑディフレクター５では、全方向へのイオンの移動が可能である。例えば、ＥＣＤセル８に導入されたイオンは、ＥＣＤで解離し、リニアイオントラップ（ＬＩＴ）６、あるいは、コリジョンセル９に導かれる。ＬＩＴ６、コリジョンセル９ではイオンをＣＩＤで解離することが可能である。ＬＩＴ６、コリジョンセル９から排出されたイオンはＬＩＴ検出器７またはＴＯＦ検出器１１でイオンの質量電荷比ｍ／ｚに応じて分離される。ＴＯＦ検出器１１の前段には高分解能であるＴＯＦが存在する。また、ＬＩＴはＭＳｎ機能をもつ。
【００２９】
分離されたイオンは、イオン検出部７または１１で検出され、イオン価数判定部１６で決定された価数は各イオンのｍ／ｚ値と共に全体処理部２１でデータ整理・処理され、その分析結果である質量分析データはデータ表示部２０にて表示される。この一連の質量分析過程、すなわち、試料の分離、イオン化、質量分析装置内のイオン輸送、及び、解離、質量分離、及び、イオン検出、データ処理の全体を全体情報処理部２１で制御する。パラメータ入力部２０からユーザの必要な情報であるイオンモード決定部１５、解離方法決定部１７、Ｑディフレクター方向決定部１８、解離物イオン、ニュートラルロス決定部１９を入力する。
【００３０】
イオン源３、Ｑマスフィルター４、Ｑディフレクター５、ＬＩＴ６、コリジョンセル９、ＴＯＦ１０は制御部１２によって制御され、ポジティブ、ネガティブへの切り替えが可能である。
ただし、ＴＯＦ部１０の極性切り替え制御は短時間で実施できるものは高価な装置になるため、ＴＯＦ部１０の極性は、サンプル分析前に切り替え可能とした方が良い。
【００３１】
以下に本発明の実施例を示す。
【実施例１】
【００３２】
代表的な翻訳後修飾であるリン酸化にフォーカスしたプロテオーム解析の実施例を示す。多数存在する非リン酸化物からリン酸化物を探索し、定性解析を実施するまでのフローチャートを図２に示す。
【００３３】
分析開始前の極性は、イオン源３、Ｑマスフィルター４、Ｑディフレクター５、コリジョンセル９、ＴＯＦ１０はネガティブ、ＬＩＴ６はポジティブである。ＥＣＤセル８は原理上いつでもポジティブである。
【００３４】
液体クロマトグラフ２で分離された試料１はネガティブモードでイオン化され４３、Ｑマスフィルター、Ｑディフレクター、コリジョンセルを通過し、ＴＯＦでイオンを検出する（ＭＳ１）。次に、ＭＳ１で検出されたイオンの中から特定のプリカーサーイオンをＱマスフィルターで選択する４４。選択されたプリカーサーイオンはＱディフレクターを通過し、コリジョンセルでＣＩＤを実施する４５。ＣＩＤによって生成したフラグメントイオンはＴＯＦ部で検出される４７。ＬＩＴ６でＣＩＤを実施することは可能であるが、１００ｍ／ｚ程度の小さなフラグメントイオンは高周波電圧の影響により共鳴振動し、ＬＩＴ内に保持できないため検出できない。よってコリジョンセル９でＣＩＤを実施する必要がある。
【００３５】
Ｑマスフィルター４で選択したイオンの中にリン酸化物が含まれていた場合、ＣＩＤによって脱離したリン酸基（７９ｍ／ｚ）が検出される。このＣＩＤによるＭＳ２解析結果は定性解析に重要な情報が含まれているが、不十分な情報であることが予想される。図３にリン酸化ペプチド３３をＣＩＤで解析した場合の模式的なスペクトルを示す。ＣＩＤではリン酸基を優先的に解離するため、リン酸化物イオン３１とリン酸基のみを失ったペプチドのみであるニュートラルロス３２が検出される。ＣＩＤでは、アミノ酸配列と修飾部位の特定が困難である。
【００３６】
そこで、詳細な定性解析をＥＣＤで実施するため、リン酸基イオンが検出された場合４８、ネガティブモードからポジティブモードに切り替える４９。切り替える箇所はイオン源、Ｑマスフィルター、Ｑディフレクターである。
【００３７】
次に、Ｑマスフィルターに導入されたイオンの中から、ネガティブモードで検出されたリン酸化物イオンの質量電荷比＋２の位置に存在するイオンをＱマスフィルターで選択する５０。
【００３８】
ポジティブモードでイオン化した場合、ネガティブモードで検出されたリン酸化物イオンは、通常質量電荷比が＋２された位置でイオンが検出される。というのは、ネガティブモードでは、多くの場合、Ｈ+（プロトン）を失い、イオンになる。一方、ポジティブモードでは、プロトンが付加し、イオンとなる。分子量Ｍの物質がｘ価数でイオン化すると、ネガティブモードでは質量電荷比（Ｍ−ｘＨ）／ｘのイオンが検出される。一方、ポジティブモードでは、質量電荷比（Ｍ＋ｘＨ）／ｘのイオンが検出される。両者の差は２Ｈとなる。水素の分子量は１であるため、差は２となる。
【００３９】
Ｑマスフィルター４で単離されたイオンはＱディフレクター５を介し、ＥＣＤセル８に導入さる。そこでＥＣＤを実施し５１、フラグメントイオンは再びＱディフレクター５を介し、ＬＩＴ検出器７でフラグメントイオンを検出する５３。図４にＥＣＤで解析した場合の模式的なスペクトルを示す。ＥＣＤではリン酸基を解離することなく、ペプチド結合のみを解離するため、アミノ酸配列と修飾部位の特定が可能である。
【００４０】
ＥＣＤによって得られたフラグメント情報は、ＣＩＤによって得られたフラグメント情報とともに詳細に解析し、アミノ酸配列や修飾部位の特定を行う５４。
【００４１】
従来、リン酸化ポリペプチドの探索、ＣＩＤによる構造解析、ＥＣＤによる構造解析など、独立に分析を行っていたが、本装置構成、本方法により、短時間で分析結果を得ることが可能である。
【実施例２】
【００４２】
糖鎖ポリペプチドにフォーカスしたプロテオーム解析の実施例を示す。ネガティブモードで糖鎖構造解析を実施し、ポジティブモードでアミノ酸配列と糖鎖修飾箇所を同定するまでのフローチャートを図５に示す。
【００４３】
分析開始前の装置の極性は、イオン源３、Ｑマスフィルター４、Ｑディフレクター５、ＬＩＴ６はネガティブ、コリジョンセル９、ＴＯＦ１０はポジティブである。ＥＣＤセル８は原理上いつでもポジティブである。
【００４４】
液体クロマトグラフ２で分離された試料１はネガティブモードでイオン化され、Ｑマスフィルター４、Ｑディフレクター５、ＬＩＴ６を通過し、ＬＩＴ検出器７でイオンを検出する（ＭＳ１）。次に、ＭＳ１で検出されたイオンの中から糖鎖ポリペプチドのプリカーサーイオンをＱマスフィルター４で単離する８３。単離されたプリカーサーイオンはＱディフレクター５を通過し、ＬＩＴ６でＣＩＤを実施する８４。ＣＩＤによって生成したフラグメントイオンはＬＩＴ検出器７で検出される（ＭＳ２／ＣＩＤ）５３。
【００４５】
次に、ネガティブモードからポジティブモードに切り替える４９。切り替える箇所はイオン源３、Ｑマスフィルター４、Ｑディフレクター５である。
【００４６】
一般的に糖鎖ポリペプチドをポジティブモードでイオン化したり、イオンを単離したりすると糖鎖の一部が離脱することがあるが、イオントラップの代わりにＱマスフィルター５を用いることにより、糖鎖の脱離は抑制されると考える。
【００４７】
ポジティブモードでイオン化し８８、ネガティブモードで分析した糖鎖ポリペプチドのイオンをＱマスフィルター４で選択する８９。このときで同じ価数のイオンを単離する場合、質量電荷比で＋２の位置に検出される。
【００４８】
Ｑマスフィルター４で選択されたイオンはＱディフレクター５を介し、ＥＣＤセル８に導入される。そこでＥＣＤを実施し５１、フラグメントイオンは再びＱディフレクター５を介し、コリジョンセル９を通過し、ＴＯＦ検出器１１でフラグメントイオンを検出する（ＭＳ２／ＥＣＤ）４７。
【００４９】
ネガティブモードでＣＩＤすることによって得られたフラグメントイオンから糖鎖構造情報が得られる８６。ポジティブモードでＥＣＤすることによって得られたフラグメントから、アミノ酸配列情報や修飾部位情報が得られる５４。両者の情報から詳細な解析を行う。
【００５０】
ここで、具体例を図６，７に示す。図６は糖鎖修飾ペプチド由来負イオン（脱プロトン化分子）のＣＩＤ分析データである。このデータの前駆イオンは、ｍ／ｚ値が９５４．９の［Ｍ−２Ｈ］２−である。ここで、Ｍは糖鎖修飾ペプチド分子を、Ｈは水素原子を表し、このイオンは２個プロトンが失われた２価イオンである。この前駆イオンをＣＩＤによりＭＳ二／ＣＩＤ分析したデータが図６（Ｂ）に示されている。図６（Ｂ）の右上に糖鎖修飾部の模式図を示す。ここで、ＢやＣはグリコシド結合の部位で解離したイオンを表す。波線はペプチドを表し、ひし形はＮｅｕ５Ａｃ（Ｎアセチルノイラミン酸、分子量３０９．１）、黒丸はＧａｌ（ガラクトース、分子量１８０．０５）、四角はＧｌｃＮＡｃ（Ｎアセチルグルコサミン、分子量２２１．０８）、三角はＦｕｃ（フコース、分子量１６４．０６）を示す。また、破線は解離部位を示す。
【００５１】
単糖同士のグリコシド結合は脱水反応であるため、糖鎖部分の分子量は各単糖の分子量の総和からグリコシド結合１つ当たり水の分子量１８が失われた値となる。図６（Ｂ）で検出された質量電荷比８１９．３（１価、分子量８２０．３）は４つの単糖の分子量の合計は３０９．１＋１８０．０５＋２２１．０８＋１６４．０６＝８７４．２９から３つのグリコシド結合１８×３＝５４を引いた値となる。つまり、分子量は８７４．２９−５４＝８２０．２９となる。Ｃ3と一致することが分かる。このイオンＣ3を前駆イオンに選択し、ＣＩＤによりＭＳ３／ＣＩＤ分析を実施して得られたデータが図６（Ｃ）である。これにより、糖鎖構造が明らかできた。
【００５２】
次に、同じ糖鎖ペプチドをポジティブモードでイオンし、ＥＣＤの結果得られたＭＳ２／ＥＣＤ分析データを図７に示す。ＥＣＤでは、ペプチド結合の特定の部位で解離し、ｃイオンやｚイオンが検出される点が特徴的である。右上に、糖鎖修飾ペプチドの構造、及び、検出イオンを示す。水平方向に並んだアルファベットはアミノ酸配列を示す。このＭＳ２／ＥＣＤ分析データに対し、データベース検索を実施した結果、図に示されるように、アミノ酸配列情報が得られる多数のｃイオンやｚイオンが検出され、元のタンパク質が同定された。さらに、Ｃ末端から７つ目のセリン（Ｓ）に糖鎖が修飾されていることもデータベース検索の結果から明らかになった。このデータの前駆イオンはｍ／ｚが６３８．３の［Ｍ＋３Ｈ］３＋である。なお、ＥＣＤのＭＳ２／ＥＣＤ分析データでは、前駆イオンの電子捕獲再結合により、電荷数だけが低減したイオン（［Ｍ＋３Ｈ］２＋、［Ｍ＋３Ｈ］+）も検出される。
【００５３】
このように、従来、独立に２回分析することによって得られていた、糖鎖構造、アミノ酸配列、修飾箇所が本発明により一度の分析で可能となる。さらにサンプル消費の低減にもつながる。
【実施例３】
【００５４】
試料としてタンパク質を用いたプロテオーム解析の実施例のフローチャートを図８に示す。
【００５５】
本実施例では装置の極性をすべてポジティブにするが、ポジティブとネガティブを混合させたり、ネガティブのみにしたり、分析途中で切り替えることも可能である。
【００５６】
液体クロマトグラフ２で分離された試料１はポジティブモードでイオン化され、Ｑマスフィルター４、Ｑディフレクター５、コリジョンセル９を通過し、ＴＯＦ検出器１１でイオンを検出する（ＭＳ１）４７。ここで、分析対象となるある一定強度以上のイオンの価数判定を実施する１０７。イオンを構成する分子には一定の割合で同位体元素が含まれるため、同位体を含む一連のイオンも同時に観察される。そのｍ／ｚ軸における間隔は１／ｚとなることにより、イオンの価数を判定することが可能である。どの程度、価数判定できるかは装置性能、特に質量分解能に依存する。ここで価数判定可能なイオンとは、その装置で価数判定できる価数以下のイオンを指す。例えば、６価まで信頼性をもって価数判定可能な装置であれば、６価以下のイオンが存在するかを探索する。
【００５７】
ＭＳ１の模式図を図９に示す。価数判定可能なイオンはＱマスフィルターで単離される１０８。単離されたプリカーサーイオンはＱディフレクター５を通過し、ＥＣＤセル８でＥＣＤを実施する５１。ＥＣＤによって生成したフラグメントイオンは、再び、Ｑディフレクター５に排出され、ＴＯＦ検出器１１でイオンを検出する（ＭＳ２／ＥＣＤ）１０９。
【００５８】
ＭＳ１で価数判定できないタンパク質が検出された場合、Ｑマスフィルター５であるプリカーサーイオンを単離し１１４、Ｑリフレクター５を介し、ＬＩＴ６でＣＩＤを実施する１１５。フラグメント化したイオンはＴＯＦ検出器１１でイオンを検出する１１０。
【００５９】
ここで、ある一定強度以上のイオンに対して価数判定を実施する１１７。検出されたフラグメントイオンの中に価数判定可能なイオンが存在する場合（図１０）、Ｑマスフィルター４でプリカーサーイオンを単離、ＬＩＴ６でＣＩＤを実施し、先ほど検出されたフラグメントイオンを単離する１１８。単離したイオンはＱディフレクター５を介し、ＥＣＤセル８でＥＣＤを実施し７０、再び、Ｑディフレクター５に排出し、ＴＯＦ検出器１１でイオンを検出する（ＭＳ３／ＥＣＤ）１１９。
【００６０】
ＭＳ２／ＣＩＤに価数判定できるイオンが存在しない場合は、さらにＭＳ３／ＣＩＤを実施し、価数判定できるイオンが検出されるまで、ＭＳｎを繰り返す。あるいは、ＭＳ２／ＣＩＤで検出されたほかのイオンに対し、ＭＳ３／ＣＩＤを実施する。
【００６１】
ＭＳ１で価数判定できたプリカーサーイオンは修飾物の種類や修飾部位の特定が期待できる。一方、価数判定できなかったプリカーサーイオンはＣＩＤによって部分分解した結果得られた一部に対してのみ、ＥＣＤを実施しているため、タンパク質を完全に解析したことにはならないが、タンパク質を同定することは可能である。
【００６２】
また、上記装置構成において、あるプリカーサーイオンに対し、ＣＩＤとＥＣＤを実施することで、多くの定性解析情報を得ることが可能である。
たとえば、ＣＩＤだけでは解離が不十分であると判断した場合、同じプリカーサーイオンに対し、ＥＣＤを実施する。あるいは、あるプリカーサーイオンに対してＥＣＤを実施し、情報が不十分だと判断した場合、ＣＩＤを実施する。
【００６３】
このように、１つの解離方法では充分なフラグメントが得られない場合、もう１つの解離方法を実施することによって、分析精度の向上が期待できる。
【００６４】
また、１つのペプチドに対して、両極性のデータを所得することも可能である。
【００６５】
本発明により、従来では分析できなかった分子量の大きなタンパク質に対して、一部分であるが、構造解析が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明に基づく質量分析システムの装置構成例を示す図。
【図２】ＣＩＤによってリン酸化物を探索し、ＥＣＤで物質同定するフローの概略図。
【図３】リン酸化ペプチドをＣＩＤで解離した結果得られた質量スペクトルの例。
【図４】リン酸化ペプチドをＥＣＤで解離した結果得られた質量スペクトルの例。
【図５】糖鎖ポリペプチドの物質同定フローの概略図。
【図６】ネガティブモードにおける糖鎖ペプチドの糖鎖構造解析例、（Ｂ）ＭＳ２（ＣＩＤ）、（Ｃ）ＭＳ３（ＣＩＤ）。
【図７】ポジティブモードでＭＳ２（ＥＣＤ）実施による糖鎖ペプチドのアミノ酸配列、及び、糖鎖修飾箇所の同定例。
【図８】試料としてタンパク質を用いた場合の物質同定フローの概略図。
【図９】ＭＳ１のイオン検出例。
【図１０】ＭＳ２／ＣＩＤ実施後のイオン検出例。
【図１１】ポリペプチドの解離パターン。
【符号の説明】
【００６７】
１：試料導入、２：試料分離（ＬＣまたはＧＣ）、３：イオン化（ポジティブまたはネガティブ）、４：Ｑマスフィルター、５：Ｑディフレクター、６：リニアイオントラップ（ＬＩＴ）、７：質量スペクトル検出器１、８：ＥＣＤセル、９：コリジョンセル、１０：ＴＯＦ部、１１：質量スペクトル検出器２、１２：質量分析装置制御部、１３：全体処理部、１４：解析手段決定部、１５：イオンモード決定部、１６：イオン価数判定部、１７：解離方法決定部、１８：Ｑリフレクター方向決定部、１９：解離物イオン、及び、ニュートラルロス決定部、２０：データ表示部／パラメーター入力部、３１：リン酸基イオン、３２：リン酸基だけが離脱したプリカーサーイオン、３３：解離しなかったプリカーサーイオン、４３：ネガティブでのイオン化、４４：Ｑマスフィルターでプリカーサーイオンの単離、４５：コリジョンセルでのＣＩＤ、４７：ＴＯＦ検出器での検出、４８：フラグメントイオンの中にリン酸基イオン（７９ｍ／ｚ）が存在するかの判定、４９：リン酸基イオンが検出された場合のみ、イオン源、Ｑマスフィルター、Ｑディフレクターのポジティブへの切り替え、５０：Ｑマスフィルターにおけるポジティブイオン化したリン酸化ポリペプチドの単離、５１：ＥＣＤセルでのＥＣＤ、５３：ＬＩＴ検出器での検出、５４：アミノ酸配列と修飾部位の同定、８３：Ｑマスフルターで糖鎖ポリペプチドの単離、８４：ＬＩＴ内でのＣＩＤ、８６：ネガティブイオンモードでのＣＩＤによる糖鎖の構造解析、８８：ポジティブモードでのイオン化、８９：  ＬＩＴでＣＩＤを実施したプリカーサーイオンをＱマスフィルターで再度単離、１０７：ＭＳ１のスペクトルの中に価数判定できるイオンが存在するか判定、１０８：価数判定できたプリカーサーイオンの単離、１０９：ＴＯＦ検出器での検出（ＭＳ２／ＥＣＤ）、１１０：ＴＯＦ検出器での検出（ＭＳ２／ＣＩＤ）、１１４：ＬＩＴでＣＩＤ、１１７：ＣＩＤを実施した結果得られたスペクトルの中に価数判定できるフラグメントイオンが存在するか判定、１１９：ＴＯＦ検出器での検出（ＭＳ３≦／ＥＣＤ）１２３：ＣＩＤを実施し、価数判定できたフラグメントイオンに対し、ＥＣＤを実施し、アミノ酸配列を同定、１２４：ＣＩＤを実施した結果得られたスペクトルの中に価数判定できるフラグメントイオンが存在しない場合、その中のフラグメントイオンに対してさらにＣＩＤを実施。
【図１】
2009068981.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009068981.tif 000010
【図９】
2009068981.tif 000011
【図１０】
2009068981.tif 000012
【図１１】
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