(57)【要約】【課題】タンパク質の精製などに有用な新規ペプチド配列を提供する。【解決手段】下記アミノ酸配列を含むペプチドと目的タンパク質の融合タンパク質を作製し、金属酸化物または二酸化ケイ素を用いて該融合タンパク質を精製する。His-His-Cys-Arg-Xaa1-His-Xaa2-Xaa3-His-Xaa4-His-His-Arg-Cys-Xaa5-Xaa6（配列番号１）Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、およびXaa6は任意のアミノ酸を示す。【選択図】図６
2009136280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列を含むペプチド。
His-His-Cys-Arg-Xaa1-His-Xaa2-Xaa3-His-Xaa4-His-His-Arg-Cys-Xaa5-Xaa6（配列番号１：ここで、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、およびXaa6は任意のアミノ酸を示す）。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が下記のアミノ酸配列または同アミノ酸配列において１または２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された配列であって酸化亜鉛結合能を有する配列である、請求項１に記載のペプチド。
His-His-Cys-Arg-Gly-His-Thr-Val-His-Ser-His-His-Arg-Cys-Ile-Gly（配列番号２）
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項１または２に記載のペプチドと、該ペプチドに連結されたタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、請求項４に記載のベクターに、前記ペプチドと該目的タンパク質との融合タンパク質が発現されるように挿入して組換えベクターを作製し、得られた組換えベクターを宿主に導入して該融合タンパク質を発現させ、該融合タンパク質を回収することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【請求項９】
酸化亜鉛または酸化コバルトを用いて融合タンパク質を回収する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
金属酸化物または二酸化ケイ素を用いて融合タンパク質を回収する請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
請求項５に記載の融合タンパク質を含む試料に酸化亜鉛または酸化コバルトを接触させて、該試料中の融合タンパク質を酸化亜鉛または酸化コバルトに結合させ、酸化亜鉛または酸化コバルトに結合した融合タンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の精製方法。
【請求項１２】
請求項５に記載の融合タンパク質を含む試料に金属酸化物または二酸化ケイ素を接触させて、該試料中の融合タンパク質を金属酸化物または二酸化ケイ素に結合させ、金属酸化物または二酸化ケイ素に結合した融合タンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の精製方法。
【請求項１３】
酸化亜鉛または酸化コバルトの微粒子を含む、請求項５に記載の融合タンパク質を精製するためのアフィニティ担体。
【請求項１４】
金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子を含む、請求項５に記載の融合タンパク質を精製するためのアフィニティ担体。
【請求項１５】
酸化亜鉛または酸化コバルトの微粒子と、請求項４に記載のベクターを含む、タンパク質を発現させて精製するためのキット。
【請求項１６】
金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子と、請求項４に記載のベクターを含む、タンパク質を発現させて精製するためのキット。
【請求項１７】
生体試料に請求項５に記載の融合タンパク質を接触させて、該融合タンパク質と、生体試料中に存在する融合タンパク質結合因子との複合体を形成させ、該複合体を酸化亜鉛または酸化コバルトを用いて回収し、該複合体に含まれる結合因子を同定することを特徴とする、タンパク質結合因子の同定方法。
【請求項１８】
生体試料に請求項５に記載の融合タンパク質を接触させて、該融合タンパク質と、生体試料中に存在する融合タンパク質結合因子との複合体を形成させ、該複合体を金属酸化物または二酸化ケイ素を用いて回収し、該複合体に含まれる結合因子を同定することを特徴とする、タンパク質結合因子の同定方法。
【請求項１９】
表面に酸化亜鉛または酸化コバルトが付着した基材上に、該酸化亜鉛または酸化コバルトを介して請求項５に記載の融合タンパク質を固定化することを特徴とする、タンパク質の固定化方法。
【請求項２０】
表面に金属酸化物または二酸化ケイ素が付着した基材上に、該金属酸化物または二酸化ケイ素を介して請求項５に記載の融合タンパク質を固定化することを特徴とする、タンパク質の固定化方法。
【請求項２１】
請求項１または２のペプチドに対する抗体。
【請求項２２】
物質の固定化方法であって、該物質を請求項１または２に記載のペプチドに結合させ、得られた結合体を酸化亜鉛または酸化コバルトが付着した基材に接触させることにより、該物質を、該ペプチドを介して基材上に固定化することを特徴とする方法。
【請求項２３】
物質の固定化方法であって、該物質を請求項１または２に記載のペプチドに結合させ、得られた結合体を金属酸化物または二酸化ケイ素が付着した基材に接触させることにより、該物質を、該ペプチドを介して基材上に固定化することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酸化亜鉛（ZnO）、酸化コバルト（Co3O4）、二酸化チタン（TiO2）、酸化鉄（Fe3O4）などの金属酸化物および二酸化ケイ素（SiO2）に特異的に結合する新規ペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ペプチドとタンパク質の融合タンパク質、該ペプチドを利用したタンパク質の精製方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を効率よく精製したり、相互作用などを解析したりするために、グルタチオン-S-トランスフェラーゼやポリヒスチジンなどのタグ配列を付加した融合タンパク質が作製され、使用されている。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質の場合、グルタチオンを結合させたアガロース担体などがタンパク質の精製や相互作用解析に使用され、ポリヒスチジン融合タンパク質の場合、ニッケルイオンを配位させたキレート基を結合させたアガロース担体などがタンパク質の精製や相互作用解析に使用されている(例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、いずれもタンパク質の担体への非特異的吸着が問題であり、ポリヒスチジン融合タンパク質を精製するための金属キレートカラムの場合は、保存中や使用中に金属イオンの脱離により、タンパク質吸着能が著しく低下すること、および、他のイオンによる中和・交換反応により、タンパク質吸着反応が阻害されることといった問題点もあった。したがって、より安価で効率よく精製等を行うことのできる方法が望まれていた。
【非特許文献１】Merck（Novagen）社カタログ  GST・Tag（登録商標）、His・Tag（登録商標）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明はタンパク質の精製や相互作用解析などに好適に利用できる新規ペプチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドが酸化亜鉛、酸化コバルト、二酸化チタン、酸化鉄などの金属酸化物または二酸化ケイ素に特異的に結合することを見出し、該ペプチドをタンパク質に付加することでタンパク質が効率よく精製できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
すなわち、本発明は下記アミノ酸配列を含むペプチドを提供する。
His-His-Cys-Arg-Xaa1-His-Xaa2-Xaa3-His-Xaa4-His-His-Arg-Cys-Xaa5-Xaa6（配列番号１：ここで、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、およびXaa6は任意のアミノ酸を示す）。
本発明はまた、前記アミノ酸配列が下記のアミノ酸配列または同アミノ酸配列において１または２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された配列であって酸化亜鉛結合能を有する配列である、前記ペプチドを提供する。
His-His-Cys-Arg-Gly-His-Thr-Val-His-Ser-His-His-Arg-Cys-Ile-Gly（配列番号２）
本発明はまた、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明はまた、前記ペプチドと、該ペプチドに連結されたタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。
本発明はまた、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明はまた、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、前記ベクターに、前記ペプチドと該目的タンパク質との融合タンパク質が発現されるように挿入して組換えベクターを作製し、得られた組換えベクターを宿主に導入して該融合タンパク質を発現させ、該融合タンパク質を回収することを特徴とする、タンパク質の製造方法を提供する。
本発明はまた、酸化亜鉛、酸化コバルト、二酸化チタン、酸化鉄などの金属酸化物または二酸化ケイ素を用いて融合タンパク質を回収する前記方法を提供する。
本発明はまた、前記融合タンパク質を含む試料に前記金属酸化物または二酸化ケイ素を接触させて、該試料中の融合タンパク質を前記金属酸化物または二酸化ケイ素に結合させ、前記金属酸化物または二酸化ケイ素に結合した融合タンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の精製方法を提供する。
本発明はまた、前記金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子を含む、前記融合タンパク質を精製するためのアフィニティ担体を提供する。
本発明はまた、前記金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子と、前記ベクターを含む、タンパク質を発現させて精製するためのキットを提供する。
本発明はまた、生体試料に前記融合タンパク質を接触させて、該融合タンパク質と、生体試料中に存在する融合タンパク質結合因子との複合体を形成させ、該複合体を前記金属酸化物または二酸化ケイ素を用いて回収し、該複合体に含まれる結合因子を同定することを特徴とする、タンパク質結合因子の同定方法を提供する。
本発明はまた、表面に前記金属酸化物または二酸化ケイ素が付着した基材上に、前記金属酸化物または二酸化ケイ素を介して前記融合タンパク質を固定化することを特徴とする、タンパク質の固定化方法を提供する。
本発明はまた、前記ペプチドに対する抗体を提供する。
本発明はまた、物質の固定化方法であって、該物質を前記ペプチドに結合させ、得られた結合体を前記金属酸化物または二酸化ケイ素が付着した基材に接触させることにより、該物質を、該ペプチドを介して基材上に固定化することを特徴とする方法を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のペプチドは、従来の遺伝子工学的手法または化学合成的手法により、タンパク質をはじめとしたあらゆる生体分子に融合・修飾することが可能であり、その前記金属酸化物および二酸化ケイ素への親和性により、融合した生体分子の構造と機能を維持した状態で前記金属酸化物または二酸化ケイ素の表面に生体分子を自己集積化できる。これにより、安価な酸化亜鉛などの金属酸化物または二酸化ケイ素を用いて簡便にタンパク質の精製や免疫沈降などを行うことができる。また、酸化亜鉛などの金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子をそのまま精製に使用することができるので、本発明のペプチドを有するタンパク質以外の非特異物質の吸着を抑制することができる。さらに、酸化亜鉛または酸化コバルトなどの金属酸化物は酸化還元不活性な金属酸化物のため安定であり、結合させたタンパク質の長期保存・機能維持にも優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のペプチドは下記アミノ酸配列を含む。
His-His-Cys-Arg-Xaa1-His-Xaa2-Xaa3-His-Xaa4-His-His-Arg-Cys-Xaa5-Xaa6（配列番号１）
ここで、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、およびXaa6は任意のアミノ酸を示す。
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、およびXaa6として好ましいアミノ酸は以下のとおりである。
Xaa1はGly、Ala
Xaa2はSer、Thr、Tyr、Cys
Xaa3、Val、Met、Ile、Leu、Phe
Xaa4、Ser、Thr、Tyr、Cys
Xaa5、Val、Met、Ile、Leu、Phe
Xaa6はGly、Ala
【０００８】
配列番号１のアミノ酸配列として好ましくは、下記のアミノ酸配列が挙げられる。
His-His-Cys-Arg-Gly-His-Thr-Val-His-Ser-His-His-Arg-Cys-Ile-Gly（配列番号２）
ただし、酸化亜鉛結合能を維持する限り、配列番号２において、１または２個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を有するものであってもよい。
【０００９】
本発明のポリヌクレオチドは上記ペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドは上記ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するものであればよく、各アミノ酸に対応する任意のコドンを連結させた配列とすることができる。例えば、配列番号２のペプチドをコードするポリペプチドとして、配列番号５の塩基番号５２１５〜５２６２の配列が挙げられる。
【００１０】
本発明のベクターは上記ポリヌクレオチドを含むベクターであり、好ましくは、プロモーター配列の下流に発現可能に上記ポリヌクレオチドが配置され、さらにその下流に目的タンパク質をコードする遺伝子（目的遺伝子）を組み込むための制限酵素認識部位（好ましくはマルチクローニングサイト）が配置された構造を有するベクターである。制限酵素認識部位に目的遺伝子を本発明のペプチドをコードする塩基配列と翻訳の読み枠が合うように連結し、適当な宿主に導入することにより、本発明のペプチドと目的タンパク質の融合タンパク質を発現させることができる。
本発明のベクターは、エシェリヒア・コリなどの原核細胞用、哺乳動物用、ウイルスベクター、酵母用、あるいは無細胞翻訳系用などとすることができ、上記プロモーター配列、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび制限酵素認識部位を含むユニットをそれぞれの宿主用のベクターに組み込むことによって宿主に応じたベクターとすることができる。
【００１１】
本発明のペプチドに連結されるタンパク質の種類は特に制限されず、任意のタンパク質を用いることができるが、例えば、酵素、受容体、サイトカイン、転写因子などが挙げられる。
公知の配列あるいは自ら同定した配列にもとづいてクローニングを行い、それを本発明のベクターの制限酵素認識部位に本発明のペプチドをコードする塩基配列と翻訳の読み枠が合うように連結して組み換えベクターを作製し、それを宿主に導入することにより、融合タンパク質が得られる。なお、読み枠が合うように連結されていれば、ペプチドと目的タンパク質の間にスペーサー配列が含まれてもよい。スペーサー配列としては、ペプチドの酸化亜鉛結合性およびタンパク質の活性を阻害しない限り、他のペプチドタグやプロテアーゼ認識配列などが例示される。
なお、融合タンパク質は化学的結合によって本発明のペプチドと目的タンパク質を結合させたものでもよく、化学的結合の態様としては、タンパク質のアミノ末端アミノ基を介して本発明のペプチドを結合させる態様が例示される。
【００１２】
宿主細胞からの融合タンパク質の回収は本発明のペプチドと金属酸化物または二酸化ケイ素との親和性を利用して行うことができる。融合タンパク質が分泌生産される場合や無細胞翻訳系を使用してタンパク質を生産する場合は、培養上清や無細胞翻訳系の上清を金属酸化物または二酸化ケイ素と接触させることで融合タンパク質を特異的に吸着させて回収することができる。また、融合タンパク質が宿主細胞内で生成するときは、細胞を破砕し、細胞抽出液から回収することもできる。なお、融合タンパク質が分泌生産されるように分泌シグナルを融合タンパク質に付加してもよい。
【００１３】
本発明のタンパク質の精製方法は、前記融合タンパク質を含む試料に金属酸化物または二酸化ケイ素を接触させて該試料中の融合タンパク質を金属酸化物または二酸化ケイ素に結合させ、金属酸化物または二酸化ケイ素に結合した融合タンパク質を回収することを特徴とする。すなわち、金属酸化物または二酸化ケイ素をアフィニティ担体として使用し、精製を行うものである。
融合タンパク質を回収した後に、金属酸化物または二酸化ケイ素に結合した融合タンパク質を溶出させることで純粋な融合タンパク質が得られる。
融合タンパク質を含む試料としては、上述したような培養上清や細胞抽出液などが挙げられる。
金属酸化物または二酸化ケイ素に接触させる方法としては、バッチ式に試料と金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子を混合する方法や、金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子を充填したカラムに試料を負荷する方法などが例示される。カラムは遠心分離ができるようなスピンカラムとすることもできるし、チップの先端に金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子を敷き詰め、融合タンパク質を含む試料を押出して金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子の層を通過させる態様とすることもできる。金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子を用いる場合、その粒径は精製スケールなどに応じて任意に選択されるが、数十ｎｍ〜１０μｍのものを用いることが好ましい。金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子としては、例えば、市販のものを使用することができる。
試料と金属酸化物または二酸化ケイ素を接触する前に金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子を生理的緩衝液で平衡化しておくことが好ましい。生理緩衝液はタンパク質の性質などによって任意に選択して使用することができるが、リン酸緩衝液やトリス緩衝液などが例示される。
また、非特異吸着を抑制するために、平衡化の後に、ブロッキングを行うことが好ましい。ブロッキング液はウシ血清アルブミンなど公知のものを使用することができる。
試料と金属酸化物または二酸化ケイ素を接触する際は室温でもよいが、タンパク質の活性を失わせないために低温で行うことが好ましい。
試料と金属酸化物または二酸化ケイ素を接触させた後、低濃度の界面活性剤を含む洗浄液などを用いて洗浄を行い、次いで、融合タンパク質を溶出させる。
溶出液としては、例えば、高濃度の塩、アルギニン、イミダゾールなどの水溶液が使用できる。
【００１４】
本発明のキットは、金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子と、上述したような本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、タンパク質を発現させて精製するためのキットである。金属酸化物または二酸化ケイ素の微粒子を充填したスピンカラムや精製用カラムを含むものであってもよい。本発明のキットはさらに、溶出液、洗浄液、平衡化液、ブロッキング液などを含むものであってもよい。
【００１５】
本発明のタンパク質結合因子の同定方法は、生体試料に前記融合タンパク質を接触させて、該融合タンパク質と、生体試料中に存在する融合タンパク質結合因子との複合体を形成させ、該複合体を金属酸化物または二酸化ケイ素を用いて回収し、該複合体に含まれる結合因子を同定することを特徴とする。
生体試料としては、ペプチド、タンパク質、細胞抽出液、組織抽出液、細胞の培養上清などが例示される。同定方法は公知の方法が利用できるが、例えば、電気泳動、抗体染色、アミノ酸配列分析、質量解析などが例示される。
【００１６】
本発明のタンパク質の固定化方法は、表面に金属酸化物または二酸化ケイ素が付着した基材上に、該金属酸化物または二酸化ケイ素を介して上記融合タンパク質を固定化することを特徴とする。基材としては金属酸化物または二酸化ケイ素を付着させることができるものであれば特に制限されないが、ガラスプレート、プラスチックプレート、ガラスビーズ、プラスチックビーズなどが挙げられる。プレートやビーズ表面への金属酸化物または
二酸化ケイ素の付着は物理吸着によるものであることが好ましい。金属酸化物または二酸化ケイ素そのものが基材であってもよい。本発明のタンパク質の固定化方法によれば、複数のタンパク質が本発明のペプチド配列を介して固定化されたプロテインチップを得ることもでき、そのようなプロテインチップはタンパク質の相互作用などに好適に使用できる。
【００１７】
なお、本発明のペプチドを利用すればタンパク質やペプチド以外の物質、例えば、核酸や生理活性化合物、糖鎖などを基材に固定化することもできる。すなわち、核酸や生理活性化合物、糖鎖などに本発明のペプチドを化学的に結合させ、これを金属酸化物または二酸化ケイ素が表面に付着した基材上に接触させることで、本発明のペプチドを介してこれらの物質を基材に固定化することができる。
【００１８】
本発明の抗体は本発明のペプチドに対する抗体である。本発明のペプチドを特異的に認識するものである限り、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体でもよい。
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のペプチドを含む免疫原でマウスやウサギなどの非ヒト哺乳動物を免疫し、その抗血清から本発明のペプチドを特異的に認識する抗体を回収することによって得ることができる。BSAやKLHなどのキャリアタンパク質に結合させて免疫に使用してもよい。抗体はプロテインＡなどによって精製することができる。
モノクローナル抗体は、例えば、本発明のペプチドを含む免疫原でマウスなどの非ヒト哺乳動物を免疫し、該哺乳動物から単離したリンパ球をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマが産生する抗体の中から、本発明のペプチドを特異的に認識する抗体を選択することによって得ることができる。モノクローナル抗体には、Ｆ（ａｂ'）2化抗体、Ｆ（ａｂ'）化抗体、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）およびミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）などのモノクローナル抗体のフラグメントも含まれる。
本発明の抗体は本発明のペプチドを含む融合タンパク質の検出や免疫沈降やELISAなどに使用できる。
【実施例】
【００１９】
特開２００７−２９０６１に開示されたランダムペプチドライブラリーを用いて酸化亜鉛結合配列のスクリーニングを行ったところ、His-His-Cys-Arg-Gly-His-Thr-Val-His-Ser-His-His-Arg-Cys-Ile-Gly（配列番号２）の配列を有するペプチドが得られた。以下、この配列を用いて実験を行った。
【００２０】
＜実験1 ペプチド-コアストレプトアビジン融合タンパク質の発現の確認＞
ここでは、ペプチド-コアストレプトアビジン融合タンパク質(P-cSA : pH6-cSA, cP1-cSA, およびcP1A2-cSA)発現用プラスミドを新規に構築した(ここでのコアストレプトアビジンcSAは、C末端からの20アミノ酸が削除してあるため、野生型ストレプトアビジンSAよりも分子量が小さくなっている。その結果、融合タンパク質として利用する場合、より効率的な翻訳と十分な発現量及びタンパク質の水溶性の向上が期待できる)。
【００２１】
＜1. pET-NHis-cSA＞
○ pET32c(Novagen社製)のマルチクローニングサイト上流におけるTrx-tag, His-tag, thrombin cleavage site, S-tag, enterokinase cleavage siteの配列を、NdeIとBamHIによる消化により除去し、代わりにHis-tagをコードする配列(5'-tatgcaccaccaccaccaccacgg-3'：配列番号９)を挿入することでpET-NHisを構築した。さらに、そのpET-NHisのBamHIとEcoRIサイトの間に、Streptomyces avidinii由来のストレプトアビジン(SA)をコードする配列を挿入することで、pET-NHis-SAを構築した。さらに、pET-NHis-SAのSpeIとBglIIサ
イトの間に、ストレプトアビジンのC末端から20アミノ酸を削除するための配列(5'-ctagtaggtcatgacacctttaccaaggttaagccttctgctgctagcca-3'：配列番号１０)を挿入することで、目的のpET-NHis-cSAを構築した。このpET-NHis-cSA は、N末端にHis-tag配列を有する新規コアストレプトアビジン(野生型より小さな分子量でありながら、ビオチン結合能を有するストレプトアビジン)を発現することが可能なプラスミドである。pET-NHis-cSAの塩基配列を配列番号３に、コードされる融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００２２】
＜2. pET-cP1-cSA＞
○ 上記で構築したpET-NHis-cSAのNdeIとBamHIサイトの間に、cP1ペプチドをコードする配列(5'-tatggcccaccattgtcgcggccatactgttcattcccaccatcgctgtattggtagtgg-3'：配列番号１１)を挿入することで、pET-cP1-cSAを構築した。このpET-cP1-cSA は、N末端にcP1配列を有する新規コアストレプトアビジンを発現することが可能なプラスミドである。pET-cP1-cSAの塩基配列を配列番号５に、コードされる融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００２３】
＜3. pET-cP1A2-cSA＞
○ 上記で構築したpET-NHis-cSAのNdeIとBamHIサイトの間に、cP1A2ペプチドをコードする配列(5'-tatggcccaccattgtgcaggccatactgttcattcccaccatgcatgtattggtagtgg-3'：配列番号１２)を挿入することで、pET-cP1A2-cSAを構築した。このpET-cP1A2-cSA は、N末端にcP1A2配列を有する新規コアストレプトアビジンを発現することが可能なプラスミドである。pET-cP1A2-cSAの塩基配列を配列番号７に、コードされる融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００２４】
さらに、FLAGタグ配列を付加したプライマー（5'-tcattacttgtcgtcatcgtccttgtagtccaagatctggctagca-3'：配列番号１３）と上記のプラスミドを鋳型としたPCRにより、ペプチド-コアストレプトアビジン-FLAG融合タンパク質(P-cSA-FLAG : pH6-cSA-FLAG, cP1-cSA-FLAG, cP1A2-cSA-FLAG)をコードする直鎖状DNAを調製した。
【００２５】
そして、これらDNAを無細胞転写＆翻訳溶液(PURE system : ポストゲノム社製)と混合し、37℃でインキュベーションすることにより、目的の融合タンパク質P-cSA-FLAGを1時間程度の短時間で合成した。
【００２６】
次に、P-cSA-FLAGを翻訳した溶液のSDS-PAGE(図１)を行い、溶液中における各P-cSA-FLAGの生成と相対的な合成量の比較をした。
この結果から、今回新規に構築した融合タンパク質P-cSA-FLAGは、無細胞転写＆翻訳溶液を利用した簡便な操作により、可溶化したタンパク質として短時間で発現できることが明らかとなった。(通常、大腸菌培養によりストレプトアビジンの発現を行うと、大腸菌に対して毒性が高く、大量に発現されないだけでなく、そのほとんどは不溶化してしまうため、リフォールディング操作も必要となる)
【００２７】
さらに、SDS-PAGEの後、そのゲルからタンパク質をPVDF膜に転写した。そして、融合タンパク質P-cSA-FLAGに対して抗FLAG抗体-HRP（Horse radish peroxidase）複合体（Sigma社製）を結合させた後、HRPと発色基質との反応を行った。
その結果、SDS-PAGE(図１)で確認したバンドと同じ位置にのみ、発色バンドを観測した(図2)。つまり、今回発現したすべての融合タンパク質は、プラスミドの設計通り、C末端にFLAGタグ配列を有することが明らかとなった。
【００２８】
＜実験2 ペプチド-コアストレプトアビジン融合タンパク質の構造とビオチン結合活性の確認＞
本来、野生型ストレプトアビジンは、単量体で発現すると同時に安定な四量体構造を形成することで、強力なビオチン結合活性(解離定数KD = 〜10-15)を示す。
ここでは、無細胞転写＆翻訳溶液により発現したP-cSA-FLAGのNative-PAGE(図3)とウエスタンブロッティング(図4)を行った。
その結果、四量体を形成しているストレプトアビジン(レーン1)とほぼ同位置に、P-cSA-FLAG由来のバンド(レーン2, 3, 4)を確認した(今回のバンド検出は、抗ストレプトアビジン抗体-HRP複合体とHRP反応による発色現象を利用している)。それゆえ、今回調製したP-cSA-FLAGも野生型と同様、四量体構造を形成していることが明らかとなった。
【００２９】
さらに、ビオチンを固定化した96 wellプレート(PIERCE社製)の各wellごとに、TBS-T溶媒で希釈した各種タンパク質溶液を添加・静置・洗浄した後、抗ストレプトアビジン抗体-HRP複合体（ROCKLAND社製）の添加とHRP反応による発色反応を行った(図5)。その結果、すべてのP-cSA-FLAG は、ストレプトアビジンと同様のビオチン結合活性を有していることが明らかとなった。
【００３０】
＜実験3 ペプチド-コアストレプトアビジン融合タンパク質の酸化亜鉛結合活性の評価＞
ここでは、融合タンパク質P-cSA-FLAGの酸化亜鉛結合活性をELISAにより評価するため、図6Aに示したスキームと以下のプロトコルIに従い実験を行った。
＜プロトコルI＞
(1) 酸化亜鉛ナノ粒子（Aldrich社製）水溶液(0.5 mg/ml)をガラスプレート（MATSUNAMI社製）上に添加・室温静置(2.5 h)することで酸化亜鉛固定化プレートを作製する。その後、TBS-T（Tris-buffered saline-Tween20）溶媒により表面を洗浄する。
(2) TBS-Tを用いて調製した0.2% Block Ace（大日本住友製薬社製）をプレート上に添加・室温静置(0.5 h)することで、基板表面をブロッキングする。その後、TBS-Tにより表面を洗浄する。
(3) 以下の条件で調製した各タンパク質溶液を酸化亜鉛固定化プレート上に添加する。
図6B-1 : SA (2μM) 1.0μl ＋ PBS 4.0μl
図6B-2 : SA (2μM) 2.0μl ＋ PBS 3.0μl
図6B-3 : pH6-cSA翻訳溶液 0.68μl ＋ PBS 4.32μl
図6B-4 : cP1-cSA翻訳溶液 1.4μl ＋ PBS 3.6μl
図6B-5 : cP1A2-cSA翻訳溶液 1.4μl ＋ PBS 3.6μl
図6B-6 : DHFR翻訳溶液 1.4μl ＋ PBS 3.6μl (ネガティブコントロール)
(3, 4, 5における翻訳溶液の使用量は、翻訳終了後のPAGEとウエスタンブロッティングの結果から算出した各タンパク質濃度の相対比を基準にして設定した。また、1, 2のSA濃度条件は、3, 4, 5より高くなるように設定してある。)
そして、室温静置(0.5 h)の後、TBS-Tにより表面を洗浄する。
(4) TBS-Tにより調製した1.0% Block Aceをプレート上に添加・室温静置(0.5 h)し、基板表面を再度ブロッキングする。その後、TBS-Tにより表面を洗浄する。
(5) TBS-Tを用いて1/4000希釈した抗ストレプトアビジン抗体-HRP複合体溶液 4.0 μlを添加し、室温にて静置(0.5 h)する。その後、TBS-Tにより表面を洗浄する。
(6) BM solution (Roche社製) 20.0 μlの添加により、HRP発色反応を開始する。その後、HCl溶液20.0 μlを添加することで発色反応を停止する。
(7) プレート上の発色現象を撮影する(この時点で、SAが基板上に存在していれば黄色を呈する。また、酸化亜鉛に結合しているタンパク質量の増加に伴い、発色強度も増加する傾向を示す)。
【００３１】
その結果(図6B)、cP1-cSA翻訳溶液を添加したパネル4に強い発色現象を観測したことから、cP1-cSAが酸化亜鉛に最も強くかつ特異的に結合していることが明らかとなった。
【００３２】
次に、P-cSA-FLAGが酸化亜鉛と結合した状態において、ビオチン結合活性を保持してい
ることを確認するため、図7Aに示すスキームと上記のプロトコルIに従い実験を行った(但し、ここでの実験は、プロトコルIの(5)において、抗ストレプトアビジン抗体-HRP複合体溶液の代わりに、TBS-Tを用いて1/1000に希釈したBiotin化HRP（PIERCE社製）溶液4.0 μlを使用した)。
その結果(図7B)、cP1-cSAが酸化亜鉛に結合している場合のみ発色現象が観測された。つまり、cP1-cSAは、cP1ペプチドを介して酸化亜鉛に結合しているだけでなく、その表面上において四量体構造が維持されているため、ビオチン結合活性を示したものと考えられる。それゆえ、cP1ペプチドと融合したタンパク質は、自身のタンパク質構造を保持したまま、酸化亜鉛表面に強力に結合することが可能であることがわかった。
【００３３】
＜実験4 融合タンパク質cP1-cSAの酸化亜鉛結合条件と低分子溶出条件の検討＞
ここでは、実験3の図7Aに示したスキームと下記のプロトコルIIに従い、融合タンパク質cP1-cSAの酸化亜鉛結合における溶媒及びペプチド構造の影響について検討した。
＜プロトコルII＞
(1) 酸化亜鉛ナノ粒子水溶液(0.5 mg/ml)をガラスプレート上に添加・室温静置(2.5 h)することで酸化亜鉛固定化プレートを作製する。その後、TBS-T溶媒により表面を洗浄する。
(2) TBS-Tを用いて調製した0.5% BSAをプレート上に添加・室温静置(0.5 h)することで、基板表面をブロッキングする。その後、TBS-Tにより表面を洗浄する。
(3) 以下の条件で調製したcP1-cSA溶液を酸化亜鉛固定化プレート上に添加する。
図8B-1 : cP1-cSA翻訳溶液1.0μl ＋ TBS 4.0μl
図8B-2 : cP1-cSA翻訳溶液1.0μl ＋ PBS 4.0μl
図8B-3 : 還元剤TCEP (1mM) 1.0μl ＋ cP1-cSA翻訳溶液1.0μl ＋ PBS 3.0μl
そして、室温静置(0.5 h)の後、TBS-Tにより表面を洗浄する。
(4) TBS-Tにより調製した2.0% BSAをプレート上に添加・室温静置(0.5 h)し、基板表面を再度ブロッキングする。その後、TBS-Tにより表面を洗浄する。
(5) TBS-Tを用いて1/1000に希釈したBiotin化HRP溶液4.0 μlを添加し、室温にて静置(0.5 h)する。その後、TBS-Tにより表面を洗浄する。
(6) BM solution (Roche社製) 20.0 μlの添加により、HRP発色反応を開始する。その後、HCl溶液20.0 μlを添加することで発色反応を停止する。
(7) プレート上の発色現象を撮影する(この時点で、cP1-SAが基板上に存在していれば黄色を呈する)。
【００３４】
図8B-1と図8B-2の比較から、溶媒組成が異なった場合においても、cP1-cSAは酸化亜鉛に対する結合活性を有していることが明らかとなった。また、PBS溶媒の代わりにTris-HCl(20mM, pH 7.4)溶媒、NaCl(300 mM)を含有したAcONa(50 mM, pH 5.0)溶媒を用いても、cP1-cSAの酸化亜鉛結合活性は同様に保持されていることも判明している。
さらに、強力な還元剤TCEPを溶液中に添加した場合、cP1-cSA のcP1ペプチド配列中の二つのシステイン基は還元を受けるため、ペプチド内ジスルフィド結合は形成されないと考えられる。しかし、図8B-3における発色現象の観測から、cP1-cSAの酸化亜鉛結合活性は維持されていた。つまり、ペプチド配列の二つのシステイン基によるジスルフィド結合が形成されていても、形成されていなくても、cP1の酸化亜鉛結合活性には大きな影響を与えないことが明らかとなった。
以上の結果から、cP1-cSAは、幅広いpH領域、様々な溶媒組成、還元状況においても、目的の酸化亜鉛結合活性を発現することができることを証明した。今回、実験的に解明されたcP1の性質は、今後のあらゆるタンパク質との融合とそれらの酸化亜鉛表面上への固定化において、必要不可欠な特異的機能であることは明らかである。
【００３５】
次に、図8Aに示したスキームと下記のプロトコルIIIに従い、酸化亜鉛に結合した融合タンパク質cP1-cSAの低分子による溶出条件について検討を行った。
＜プロトコルIII＞
(1) 酸化亜鉛ナノ粒子水溶液(0.5 mg/ml)をガラスプレート上に添加・室温静置(2.5 h)することで酸化亜鉛固定化プレートを作製する。その後、TBS-T溶媒により表面を洗浄する。
(2) TBS-Tを用いて調製した0.5% BSAをプレート上に添加・室温静置(0.5 h)することで、基板表面をブロッキングする。その後、TBS-Tにより表面を洗浄する。
(3) 以下の条件で調製したcP1-cSA溶液を酸化亜鉛固定化プレート上に添加する。
図8B-4 : cP1-cSA翻訳溶液1.0μl ＋ PBS 4.0μl
図8B-5 : cP1-cSA翻訳溶液1.0μl ＋ PBS 4.0μl
図8B-6 : cP1-cSA翻訳溶液1.0μl ＋ PBS 4.0μl
そして、室温静置(0.5 h)の後、TBS-Tにより表面を洗浄する。
(4) cP1-cSAが結合している酸化亜鉛固定化プレート上に、以下の溶液を添加する。
図8B-4 : イミダゾール(200mM)含有PBS溶液 15.0μl
図8B-5 : イミダゾール(400mM)含有PBS溶液 15.0μl
図8B-6 : アルギニン(200mM)含有PBS溶液 15.0μl
そして、室温静置(10分)の後、TBS-Tにより表面を洗浄する。
(5) TBS-Tにより調製した2.0% BSAをプレート上に添加・室温静置(0.5 時間)し、基板表面を再度ブロッキングする。その後、TBS-Tにより表面を洗浄する。
(6) TBS-Tを用いて1/1000に希釈したBiotin化HRP溶液4.0 μlを添加し、室温にて静置(0.5 時間)する。その後、TBS-Tにより表面を洗浄する。
(7) BM solution (Roche社製) 20.0 μlの添加により、HRP発色反応を開始する。その後、HCl溶液20.0 μlを添加することで発色反応を停止する。
(8) プレート上の発色現象を撮影する(この時点で、cP1-cSAが基板上に存在していれば黄色を呈する。また、酸化亜鉛と結合しているタンパク質量の減少に伴い、発色強度も減少する傾向を示す)。
【００３６】
上記プロトコルIIIの(4)で添加したイミダゾール及びアルギニンは、cP1ペプチド配列中のヒスチジとアルギニンに対応しており、cP1ペプチドと酸化亜鉛との結合を競争的に阻害する。そのため、これら低分子の添加により、プロトコルIIIの(3)で酸化亜鉛に結合しているcP1-cSAを溶出することが可能であることがわかった。事実、図8B-4と図8B-5の結果から、イミダゾール濃度が上昇するに従い、cP1-cSAが溶出される現象が観測された。さらに、図8B-6の結果から、イミダゾールよりも低濃度のアルギニンで目的のタンパク質のほとんどを溶出することに成功した。
以上、様々な条件におけるcP1-cSAの酸化亜鉛に対する結合の観測及び、各種低分子による効率的溶出の結果は、cP1ペプチドによるタンパク質の固定化と溶出の一連の動作が可能であり、タンパク質精製技術への応用に十分な知見と情報を与えるものとなった。
【００３７】
＜実験5  ペプチド-コアストレプトアビジン融合蛋白質の各種金属(無機)酸化物ナノ粒子に対する結合活性の評価＞
ここでは、融合蛋白質P-cSA-FLAGの各種金属(無機)酸化物ナノ粒子に対する結合活性をウエスタンブロッティング法により評価するため、図9Aに示したスキームと以下のプロトコルIVに従い実験を行った。
＜プロトコルIV＞
(1) 0.2％ Block Ace含有TBS-T溶液中において各種金属(無機)酸化物ナノ粒子を超音波処理により懸濁し、４℃で一晩攪拌することでナノ粒子溶液A(2 mg/ml, 1ml)を調製する。そして、遠心操作を利用してPBS-T溶媒による粒子表面の洗浄操作を数回行った後、PBSに溶解したナノ粒子溶液B(1 mg/ml, 50μl)を調製した。
(2) ナノ粒子溶液Bに、以下の条件で調整した各蛋白質溶液を添加し、4℃で1 h攪拌する(図9A-a)。
図9B-1 : SiO2(Aldrich社製, 粒径15 nm)溶液 50μl ＋ cP1-cSA溶液 1μl (cP1-cSA翻訳
液0.33μlを含有するPBS溶液)
図9B-2 : SiO2(Aldrich社製, 粒径15 nm)溶液 50μl ＋ pH6-cSA溶液 1μl (pH6-cSA翻訳液0.17μlを含有するPBS溶液)
図9B-3 : TiO2(Wako社製, 粒径80 nm)溶液 50μl ＋ cP1-cSA溶液 1μl (cP1-cSA翻訳液0.33μlを含有するPBS溶液)
図9B-4 : TiO2(Wako社製, 粒径80 nm)溶液 50μl ＋ pH6-cSA溶液 1μl (pH6-cSA翻訳液0.17μlを含有するPBS溶液)
図9B-5 : Fe3O4(Aldrich社製, 粒径<50 nm)溶液 50μl ＋ cP1-cSA溶液 1μl (cP1-cSA翻訳液0.33μlを含有するPBS溶液)
図9B-6 : Fe3O4 (Aldrich社製, 粒径<50 nm)溶液 50μl ＋ pH6-cSA溶液 1μl (pH6-cSA翻訳液0.17μlを含有するPBS溶液)
図9B-7 : Co3O4 (Aldrich社製, 粒径<50 nm)溶液 50μl ＋ cP1-cSA溶液 1μl (cP1-cSA翻訳液0.33μlを含有するPBS溶液)
図9B-8 : Co3O4 (Aldrich社製, 粒径<50 nm)溶液 50μl ＋ pH6-cSA溶液 1μl (pH6-cSA翻訳液0.17μlを含有するPBS溶液)
なお、cP1-cSA翻訳溶液とpH6-cSA翻訳溶液の希釈率は、希釈勾配をつけた各翻訳液をあらかじめ調製し、それらのウエスタンブロッティングにおける発光評価を基にして算出した蛋白質の相対濃度比により決定している。つまり、上記の希釈溶液中の各蛋白質は、ほぼ同等の濃度となるように設定してある。
【００３８】
(3) 遠心操作と併せて、PBS-T溶媒による粒子表面の洗浄操作を行い、粒子表面に非特異的に吸着した蛋白質を除去する(図9A-b)。そして、蛋白質が固定されたナノ粒子をSDS-PAGE用バッファーに懸濁し、加熱処理(95℃, 3 min)をした溶液をサンプルとして電気泳動(SDS-PAGE)・ウエスタンブロッティングを行った(図9A-c)。
(4) サンプルをゲルから転写したPVDFメンブレンをブロッキング・洗浄し、TBS-Tを用いて調製した抗FLAG抗体-HRP複合体溶液に浸し、室温にて振盪(0.5 h)する。
(5) TBS-Tで洗浄した後、ECL Advance Western Blotting Detection kit(Roche社製)の発光試薬を適量添加(メンブレン表面を覆うことの出来る量)することで、HRPによる発光反応を開始する。その後、メンブレン上の発光現象を撮影する(この時点で、金属(無機)酸化物ナノ粒子に融合蛋白質が固定化されていた場合、発光現象として観測できる。また、ナノ粒子に結合している蛋白質量の増加に伴って発色強度も増加する傾向を示す)。
【００３９】
その結果(図9B)、cP1-cSA-FLAGは、いずれの金属(無機)酸化物に対しても結合する機能を有することが明らかとなった(特にTiO2に対する結合性が高い)。また、コントロールのpH6-cSA-FLAGに比べて明確に強い発光現象を示したことから、cP1ペプチドの金属(無機)酸化物に対する結合性は、cP1のアミノ酸配列に依存的に発現される特殊機能であることも判明した。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】各翻訳溶液のSDS-PAGEの結果を示す図（CBB染色：写真）。M, 1, 2, 3, 4, 5は、それぞれ分子量マーカー、市販（Sigma社製）のストレプトアビジン(20 μM) 0.5μl、pH6-cSA翻訳溶液 3.0μl、cP1-cSA翻訳溶液 3.0μl、cP1A2-cSA翻訳溶液 3.0μl、DHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）翻訳溶液 3.0μlに対応している(矢印は、各タンパク質に由来するバンド)。
【図２】抗FLAG抗体-HRPを用いたウエスタンブロットの結果を示す図（写真）。M, 1, 2, 3, 4, 5は、それぞれ、分子量マーカー、市販のストレプトアビジン(0.5 μM) 1.0μl、pH6−cSA翻訳溶液(1/4希釈) 1.0μl、cP1-cSA翻訳溶液(1/4希釈) 1.0μl、cP1A2-cSA翻訳溶液(1/4希釈) 1.0μl、DHFR翻訳溶液(1/4希釈) 1.0μlである。
【図３】各翻訳溶液のNative-PAGEの結果を示す図（CBB染色：写真）。M, 1, 2, 3, 4, 5は、それぞれ分子量マーカー、ストレプトアビジン(0.8 μM) 1.0μl、pH6-cSA翻訳溶液 0.8μl、cP1-cSA翻訳溶液 0.8μl、cP1A2-cSA翻訳溶液 0.8μl、DHFR翻訳溶液 0.8μlに対応する。
【図４】抗SA抗体-HRPを用いたウエスタンブロットの結果を示す図（写真）。M, 1, 2, 3, 4, 5は図３と同じである。
【図５】ビオチン固定化プレートを用いた各種タンパク質のビオチン結合活性の評価系の模式図（左）と測定結果を示す図（右：写真）。右図のレーン1, 2, 3, 4, 5, 6に添加した各種タンパク質溶液(80 μl)は、それぞれストレプトアビジン(0.2 μM) 1.0μl、pH6-cSA翻訳溶液 30μl、cP1-cSA翻訳溶液 30μl、cP1A2-cSA翻訳溶液 30μl、DHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）翻訳溶液 30μl、PBS溶液 1.0μlを含有している。
【図６】ペプチド-コアストレプトアビジン融合タンパク質の酸化亜鉛結合活性とビオチン結合活性のELISA評価系（抗SA抗体-HRP）の模式図（A）と測定結果を示す図（B：写真）。Bにおいては、レーン１: SA (2μM) 1.0μl ＋ PBS 4.0μl、レーン２：SA (2μM) 2.0μl ＋ PBS 3.0μl、レーン３：pH6-cSA翻訳溶液 0.68μl ＋ PBS 4.32μl、レーン４：cP1-cSA翻訳溶液 1.4μl ＋ PBS 3.6μl、レーン５：cP1A2-cSA翻訳溶液 1.4μl ＋ PBS 3.6μl、レーン６：DHFR翻訳溶液 1.4μl ＋ PBS 3.6μl (ネガティブコントロール)である。
【図７】ペプチド-コアストレプトアビジン融合タンパク質の酸化亜鉛結合活性とビオチン結合活性のELISA評価系（ビオチン化HRP）の模式図（A）と測定結果を示す図（B：写真）。Bにおいては、レーン１: SA (2μM) 1.0μl ＋ PBS 4.0μl、レーン２：pH6-cSA翻訳溶液 0.68μl ＋ PBS 4.32μl、レーン３：cP1-cSA翻訳溶液 1.4μl ＋ PBS 3.6μl、レーン４：cP1A2-cSA翻訳溶液 1.4μl ＋ PBS 3.6μl、レーン５：DHFR翻訳溶液 1.4μl ＋ PBS 3.6μl (ネガティブコントロール)、レーン６：pH6-cSA翻訳溶液1.4μl ＋ PBS3.6μlである。
【図８】ペプチド-コアストレプトアビジン融合タンパク質の酸化亜鉛結合と溶出における条件検討の系の模式図（A）と測定結果を示す図（B：写真）。B（レーン１〜３）では、それぞれ、TBS 4.0μl（レーン１）、PBS 4.0μl（レーン２）、還元剤TCEP (1mM)1.0μl ＋PBS 3.0μl（レーン３）に希釈したcP1-cSAを酸化亜鉛に固定し、Biotin化HRPで検出した。レーン４〜６では酸化亜鉛で固定化したcP1-cSAをイミダゾール(200mM)含有PBS溶液 15.0μl（レーン４）、イミダゾール(400mM)含有PBS溶液 15.0μl（レーン５）、アルギニン(200mM)含有PBS溶液 15.0μl（レーン６）で洗浄し、Biotin化HRPで検出した。
【図９】ペプチド-コアストレプトアビジン融合タンパク質の各種金属(無機)酸化物ナノ粒子への結合活性のウエスタンブロット評価系の模式図（A）と測定結果を示す図（B：写真）。Bにおいては、レーン１: SiO2 ＋ cP1-cSA、レーン２：SiO2 ＋ pH6-cSA、レーン３：TiO2＋ cP1-cSA、レーン４：TiO2 ＋ pH6-cSA、レーン５：Fe3O4 ＋ cP1-cSA、レーン６：Fe3O4 ＋ pH6-cSA、レーン７：Co3O4 ＋ cP1-cSA、レーン８：Co3O4 ＋ pH6-cSA。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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