(57)【要約】【課題】  固相担体に固定化した標識被検物質に及ぼす影響をできるだけ少なくして、バックグラウンドを重点的に下げることで、標識被検物質に由来するシグナル量、シグナル割合を高めることができる被検物質の測定方法を提供する。【解決手段】  溶液中でシグナル発生用物質と被検物質とを反応させる工程；１５０ｍＭ〜２．５Ｍの緩衝剤の存在下で、反応工程で得られた反応産物を含む溶液と固相担体とを接触させて、前記反応産物を前記固相担体に固定化する工程；及び前記固相担体に固定化された反応産物中のシグナル発生用物質に由来するシグナルを検出する工程を含む。【選択図】    図１
2009063464.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中でシグナル発生用物質と被検物質とを反応させる工程；
１５０ｍＭ〜２．５Ｍの緩衝剤の存在下で、反応工程で得られた反応産物を含む溶液と固相担体とを接触させて、前記反応産物を前記固相担体に固定化する工程；及び
前記固相担体に固定化された反応産物中のシグナル発生用物質に由来するシグナルを検出する工程
を含む被検物質の測定方法。
【請求項２】
前記緩衝剤は、トリス−塩酸緩衝剤、グッド緩衝剤、イミダゾール−酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、及び炭酸緩衝剤からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記緩衝剤は、有機化合物含有緩衝剤である請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記シグナル発生用物質は、蛍光物質である請求項１〜３のいずれかに記載の測定方法。
【請求項５】
前記蛍光物質は、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレセイン、オレゴングリーン、クマリン、エオシン、フェナントロリン、ピレン、及びローダミンからなる群より選択される少なくとも１種である請求項４に記載の測定方法。
【請求項６】
前記固相担体の材質は、ポリビニリデンフロライド、ニトロセルロース、セルロースアセテート、及びナイロンからなる群より選択される請求項１〜５のいずれかに記載の測定方法。
【請求項７】
固定化工程の後、前記固相担体に、ブロッキング剤を固定する工程をさらに含む請求項１〜６のいずれかに記載の測定方法。
【請求項８】
前記被検物質は、酵素反応によって生成した産物である請求項１〜７のいずれかに記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光物質等のシグナル発生用物質を用いて被検物質を測定する方法において、バックグラウンドを低減した測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光物質や標識用酵素等を用いて、タンパク質や核酸等を測定する方法として、ドットブロットやスロットブロット等の固相担体を用いるものが知られている。これらは、固相担体に蛍光物質等が結合した被検物質（標識被検物質）を固定化し、固定化された標識被検物質からのシグナルを用いて、被検物質を測定している。
【０００３】
例えば、特許文献１には、生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の活性を、固相担体を用いて測定する方法が記載されている。具体的には、ＣＤＫを含む試料に、ＣＤＫの基質及びアデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰγＳ）を添加し、ＣＤＫのキナーゼ反応によって、チオリン酸基が導入された基質を得る。次に、チオリン酸基が導入された基質（リン酸化基質）を蛍光物質で標識し、標識化されたリン酸化基質（標識リン酸化基質）を調製する。この調製した標識リン酸化基質を固相担体に固定化する。固定化後、固相担体に励起光を照射して、固相担体に固定化された標識リン酸化基質の蛍光量を測定する。そして、得られた測定結果からＣＤＫの活性を算出するという方法である。
【０００４】
ここで、標識リン酸化基質を調製する工程において、リン酸化基質と蛍光物質との反応液中には、過剰に添加された蛍光物質のうち、リン酸化された基質と結合しなかった蛍光物質（未反応の蛍光物質）が残存している。従って、標識リン酸化基質を固相担体に固定化する際に、未反応の蛍光物質も固相担体に非特異的に吸着されてしまう。固相担体に吸着された未反応の蛍光物質は、標識リン酸化基質中の蛍光物質と同様に、励起光により蛍光を発するため、バックグラウンドとして検出されることになる。
【０００５】
バックグラウンドを低減する検出方法としては、通常、ＴＢＳ−Ｔ溶液等の界面活性剤を含有する洗浄液を用いて、固相担体を洗浄する方法が挙げられる。また、近年、界面活性剤を含有する洗浄液を用いることなく、バックグラウンドを低減する検出方法として、固相担体に被検物質を固定化した後に、固相担体にさらにブロッキング剤を固定化する方法が提案されている（特許文献２）。
【特許文献１】特開２００２−３３５９９７
【特許文献２】特開２００７−１２１２６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、固相担体に固定化した標識被検物質に及ぼす影響をできるだけ少なくして、バックグラウンドを重点的に下げることで、標識被検物質に由来するシグナル量、シグナル割合を高めることができる被検物質の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、シグナル発生用物質が結合した被検物質（標識被検物質）の固相担体への固定化工程について、種々の検討を行なった結果、標識被検物質を、高濃度の緩衝剤存在下で、固相担体に固定化することにより、バックグラウンドが低減することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明の被検物質の測定方法は、溶液中でシグナル発生用物質と被検物質とを反応させる工程；１５０ｍＭ〜２．５Ｍの緩衝剤の存在下で、反応工程で得られた反応産物を含む溶液と固相担体とを接触させて、前記反応産物を前記固相担体に固定化する工程；及び前記固相担体に固定化された反応産物中のシグナル発生用物質に由来するシグナルを検出する工程を含む。
【０００９】
前記緩衝剤は、トリス−塩酸緩衝剤、グッド緩衝剤、イミダゾール−酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、及び炭酸緩衝剤からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、有機化合物含有緩衝剤であることがより好ましい。
【００１０】
前記シグナル発生用物質は蛍光物質であることが好ましく、具体的には、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレセイン、オレゴングリーン、クマリン、エオシン、フェナントロリン、ピレン、及びローダミンからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００１１】
前記固相担体の材質は、ポリビニリデンフロライド、ニトロセルロース、セルロースアセテート、及びナイロンからなる群より選択されることが好ましい。
【００１２】
本発明の被検物質の測定方法は、固定化工程の後、前記固相担体に、ブロッキング剤を固定する工程をさらに含んでもよい。また、前記被検物質は、酵素反応によって生成した産物であってもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の被検物質の測定方法は、シグナル発生用物質により標識化された被検物質（反応産物）だけでなく、被検物質に結合しなかった未反応のシグナル発生用物質も含む反応溶液を、高濃度緩衝剤の存在下で固相担体に接触させることにより、反応産物の固定化の際に、未反応のシグナル発生用物質が固相担体に非特異吸着することを防止できるので、バックグラウンドシグナルを低減することができ、ひいては被検物質の測定感度を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の被検物質の測定方法は、溶液中でシグナル発生用物質と被検物質とを反応させる工程；１５０ｍＭ〜２．５Ｍの緩衝剤の存在下で、反応工程で得られた反応産物を含む溶液と固相担体とを接触させて、前記反応産物を前記固相担体に固定化する工程；及び前記固相担体に固定化された反応産物中のシグナル発生用物質に由来するシグナルを検出する工程を含む。
【００１５】
被検物質としては、シグナル発生用物質が結合でき、固相担体に固定化されるものであれば、特に限定されない。例えば、タンパク質、核酸、ホルモン、毒物などが挙げられ、これらのうち、タンパク質が好ましい。タンパク質としては、アミノ酸が多数連結してできた高分子化合物を有するものであれば、特に限定されない。例えば、抗原、抗体、酵素、及び酵素反応によって生成した産物等が挙げられる。ここで、酵素反応によって生成した産物を被検物質とすることで、酵素活性を測定することもできる。例えば、生体試料中のＣＤＫの活性を測定する場合、ＣＤＫとＣＤＫの基質とを反応させ、その反応産物であるリン酸化基質を被検物質として測定すればよい。
【００１６】
シグナル発生用物質は、被検物質と反応することで、被検物質と結合し、反応産物を得ることができるものであれば特に制限されるものではない。例えば、蛍光物質、標識用酵素、及び放射性物質等の標識物質や、標識抗体、標識抗原、及び標識アビジン等が挙げられる。これらのうち、シグナル発生用物質としては、蛍光物質、蛍光標識抗体、及び蛍光標識抗原が好ましく用いられる。
【００１７】
溶液中でシグナル発生用物質と被検物質とを反応させることで得られる反応産物、具体的にはシグナル発生用物質が結合した被検物質を、以下、標識被検物質と呼ぶ。シグナル発生用物質と被検物質とが結合する反応の例としては、抗原及び抗体を用いた反応（抗原抗体反応）、アビジン及びビオチンを用いた反応、相補的なＤＮＡ鎖を用いた反応、及び化学反応等が挙げられる。反応条件は、シグナル発生用物質や被検物質の種類に応じて、適宜設定すればよい。通常、被検物質とシグナル発生用物質を反応させる場合、十分に被検物質に結合できるように、過剰量のシグナル発生用物質が使用される。従って、反応後、反応産物を含む溶液には、標識被検物質の他、被検物質に結合していない未反応のシグナル発生用物質が含まれている。
【００１８】
抗原抗体反応を用いて、標識被検物質を得る方法としては、免疫染色法等が挙げられる。より具体的には、被検物質が抗原の場合、標識抗体をシグナル発生用物質として用い、抗原抗体反応により結合させることで、標識被検物質を得ることができる。
【００１９】
また、アビジンとビオチンの反応を用いて、標識被検物質を得る方法としては、ビオチン−アビジン法等が挙げられる。より具体的には、被検物質がビオチン標識したタンパク質の場合、標識アビジンをシグナル発生用物質として用い、アビジンとビオチンの反応により結合（アビジン−ビオチン結合）させることで、標識被検物質を得ることができる。
【００２０】
ここで、標識抗体や標識アビジン等は公知の手段によって作成することができる。例えば、抗体に蛍光色素であるフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を標識化する場合、抗体溶液をｐＨ８〜９に調製し、ＦＩＴＣ粉末を添加し、４時間５℃で反応させ、その後ゲル濾過で未反応の蛍光色素を除いて、蛍光標識抗体を得ることができる。
【００２１】
化学反応を用いて標識被検物質を得る方法としては、例えば、被検物質がアミノ基を有する場合、官能基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドやイソチオシアネート基、ニトロアリールハライド基、又は酸クロリド基を有するシグナル発生用物質を用いることで、化学反応に被検物質とシグナル発生用物質を結合させる方法がある。また、被検物質がチオール基を有する場合、官能基としてハロゲン化アルキル基、マレイミド基、又はアジリジン基を有するシグナル発生用物質を用いることで、化学反応により被検物質とシグナル発生用物質を結合させる方法がある。
【００２２】
更に、シグナル発生用物質と被検物質を、架橋剤で架橋することにより、シグナル発生用物質と被検物質とを結合させることもできる。例えば、チオール基とアミノ基を架橋する架橋剤としては、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート等が挙げられる。また、アミノ基とカルボキシル基を架橋する架橋剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等が挙げられる。
【００２３】
また、被検物質がシグナル発生用物質と結合するための官能基を有していない場合、被検物質にシグナル発生用物質との結合が可能な官能基を導入することもできる。例えば、被検出物質がキナーゼのリン酸化基質の場合、ＡＴＰに代えて、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（以下、ＡＴＰγＳとする）を用いることで、被検物質としてチオリン酸化基質を得ることができる。このチオリン酸基を有する被検物質に、チオール基と反応する官能基を有するシグナル発生用物質を反応させることで、被検物質のチオリン酸基の硫黄原子にシグナル発生用物質を結合させることができる。より具体的には、チオリン酸化基質０．１〜１ｍｇ／ｍｌを含む、ｐＨ７．５〜９．０、好ましくは８．５の溶液を調製する。次に、調製した溶液に、チオリン酸化基質１当量に対して１０〜１００当量の、チオール基と反応する官能基を持つシグナル発生用物質を添加する。その後、１０分〜２時間反応させることにより、標識被検物質を得ることができる。また、この反応は、チオール基を有する還元剤を用いることで、必要に応じて停止させることもできる。チオール基を有する還元剤としては、２−メルカプトエタノール、Ｄ型システイン、Ｌ型システイン、アセチルシステイン、２−メルカプトプロピオン酸、メルカプト酢酸、２−アミノエタンチオール、ジチオスレイトール、グルタチオン、ドデカンチオールなどが例示され、これらを単独又は混合して用いることができる。
【００２４】
上記蛍光物質としては、フルオレセイン、クマリン、エオシン、フェナントロリン、ピレン、ローダミンなどが挙げられる。尚、化学反応を用いて蛍光物質を被検物質に結合させる場合、被検物質が有する官能基に応じて、蛍光物質を適宜選択すればよい。例えば、被検物質がチオール基を有する場合には、チオール基と反応する官能基をもつ蛍光物質、例えば、アルキルハライド、マレイミド、アジリジン部位を有する蛍光物質が好ましく用いられる。このような蛍光物質としては、例えば、５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（５ＩＡＦ）、オレゴングリーンヨードアセトアミド（ＯＧＩ）、ヨードアセチル−フルオレセインイソチオシアネート、５−（ブロモメチル）フルオレセイン、フルオレセイン−５−マレイミド、６−ヨードアセトアミドフルオレセイン、４−ブロモメチル−７−メトキシクマリン、エオシン−５−ヨードアセトアミド、エオシン−５−マレイミド、エオシン−５−ヨードアセトアミド、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ブロモアセトアミド、１−ピレンブチリルクロリド、Ｎ−（１−ピレンエチル）ヨードアセトアミド、Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨードアセトアミド、（１−ピレンメチル）ヨードアセテート、ローダミンレッドＣ２マレイミドなどが例示される。
【００２５】
蛍光物質をシグナル発生用物質として使用した場合、特定の波長を有する光（励起光）を照射することにより発する蛍光がシグナルとなるので、蛍光量（又は蛍光強度）を測定すればよい。
【００２６】
標識用酵素としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどを用いることができる。例えば、被検物質が抗原の場合、シグナル発生用物質として標識用酵素で標識された抗体を用いることで、酵素標識された標識被検物質を得ることができる。また、被検物質がチオリン酸基を有する場合、被検物質のチオリン酸基の硫黄原子に標識用酵素を結合させることができる。より具体的には、ヨードアセチルビオチンを硫黄原子に導入し、その後、該ビオチン分子に親和性をもつアビジン分子に酵素が結合した分子を反応させることができる。
酵素標識された被検物質の測定は、標識用酵素との反応によって光学的に検出可能な物質が生じるような基質を作用させて、生じた生成物を光学的に測定する。
【００２７】
放射性物質としては、３２Ｐなどが挙げられる。例えば、検査対象がＣＤＫのようなキナーゼの場合には、３２Ｐ標識したＡＴＰを用いてリン酸化反応させることにより、３２Ｐ標識されたリン酸化基質を被検物質として得ることができる。この場合、３２Ｐがシグナルとなるので、リン酸化基質中の３２Ｐ量を、オートラジオグラフィー又はシンチレーションカウンターなどで測定すればよい。
【００２８】
固相担体に標識被検物質を固定化する際、１５０ｍＭ〜２．５Ｍの緩衝剤の存在下で、標識被検物質を含む溶液と固相担体とを接触させる。すなわち、緩衝剤の濃度が１５０ｍＭ〜２．５Ｍである標識被検物質を含む溶液（固定化用溶液）と固相担体を接触させればよい。ここで、緩衝剤の濃度としては、１５０ｍＭ〜２．５ｍ、好ましくは２００ｍＭ〜２．０Ｍ、より好ましくは４００ｍＭ〜２．０Ｍ、特に好ましくは８００ｍＭ〜１．７Ｍである。尚、２種以上の緩衝剤が固定化用溶液に含まれる場合、緩衝剤の濃度は、固定化用溶液に含まれる全ての緩衝剤を合計した最終濃度をいう。
【００２９】
具体的には、別途容器で調製した標識被検物質を含む溶液に、緩衝剤の最終濃度が上記範囲となるように、緩衝剤を混合し、混合液を固相担体上にアプライする。あるいは固相担体に、標識被検物質を含む溶液及び緩衝剤を別々に添加し、固相担体と接触させる溶液における緩衝剤の最終濃度が上記範囲となるようにしてもよい。
【００３０】
つまり、緩衝剤の存在下での固定化は、固相担体に、標識被検物質を含有する反応液と緩衝液とを添加することによって行なっても良い。また、予め標識被検物質を含有する反応液と緩衝剤とを混合して、標識被検物質の緩衝剤溶液（固定化用溶液）を調製し、この緩衝剤溶液（固定化用溶液）を固相担体と接触させることにより行なってもよい。好ましくは、まず標識被検物質と緩衝剤との混合液を調製し、これを固相担体と接触させる方法である。
【００３１】
緩衝剤としては、固定化に使用される固相担体や、固相担体に固定化される標識被検物質等の種類に応じて、適宜選択することができる。特に、被検物質が安定化して存在できるｐＨを維持可能な緩衝剤を選択することが好ましい。緩衝剤の具体例としては、トリス−塩酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤やＭＯＰＳ緩衝剤等のグッド緩衝剤、イミダゾール−酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、及びリン酸緩衝剤などを用いることができる。なかでも、トリス−塩酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤やＭＯＰＳ緩衝剤等のグッド緩衝剤、イミダゾール−酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤等の有機化合物含有緩衝剤が好ましい。特に好ましい緩衝剤としては、トリス−塩酸緩衝剤及びグッド緩衝剤が挙げられる。また、グッド緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳ緩衝剤及びＭＯＰＳ緩衝剤が好ましい。なお、緩衝剤は、１種類を単独で、又は２種以上を混合して使用することができる。
【００３２】
上記固定化用溶液には、緩衝剤の他、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩が含まれていても良い。これらの無機塩は、被検物質のタンパク質の立体構造の安定化などに寄与することができる。
【００３３】
反応産物の固相担体への固定化は、固相担体及び標識被検物質等の種類に応じて、公知の方法を用いることができる。例えば、ドットブロットやスロットブロットが挙げられる。固相担体としては、反応産物を固定化することができるものであればよく、市販のブロッティング用メンブレンを用いることができる。メンブレンの材質としては、例えばポリビニリデンフロライド（ＰＶＤＦ）、ニトロセルロース、ナイロン（例えば、カルボキシル基やアルキル基を置換基として有してもよいアミノ基が導入された修飾ナイロン）、セルロースアセテートなどが挙げられる。
【００３４】
固定化の際、固定化用溶液の緩衝剤濃度を１５０ｍＭ〜２．５Ｍとすることで、標識被検物質のシグナルに影響を殆ど与えることなく、バックグラウンドを小さくできる。すなわち、標識被検物質について測定したシグナルからバックグラウンドを控除した、標識被検物質からの特異的なシグナル値を大きくすることができる。明確な機構は明らかではないが、固相化溶液に含まれる、未反応のシグナル発生用物質と緩衝剤は、競合的に固相担体に吸着するため、高濃度緩衝剤共存下では、緩衝剤が多く固相担体に吸着し、未反応のシグナル発生用物質の固相担体への非特異吸着を低減したのではないかと考えられる。
【００３５】
通常、固相担体へ標識被検物質の固定化に使用される緩衝剤濃度は、緩衝剤能を十分に発揮できる２５〜１００ｍＭ程度である。これに対し、本発明では、緩衝能として必要とされる緩衝剤濃度よりも高い濃度の緩衝剤存在下で固定化するところに特徴がある。
【００３６】
固定化後、緩衝剤で固相担体を洗浄することが好ましい。洗浄に使用される緩衝剤としては、一般的に洗浄に用いられる１５０ｍＭ未満の緩衝剤が使用できる。また、上記固相担体への固定化で使用した高濃度（１５０ｍＭ〜２．５Ｍ）の緩衝剤を用いることもできる。洗浄液には、緩衝剤の他、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩が含まれていても良い。これらの無機塩は、被検物質のタンパク質の立体構造の安定化などに寄与することができる。但し、洗浄液中には、界面活性剤は使用しないことが好ましい。界面活性剤を含む洗浄液で洗浄すると、標識被検物質も洗い流してしまうおそれがあるためである。
【００３７】
また、上述した固定化工程の後に、さらに固相担体にブロッキング処理を行なうことが好ましい。ブロッキング処理後にシグナルを検出することで、よりバックグラウンドを低減することができる。ブロッキング処理とは、固相担体にブロッキング剤を固定化する処理のことである。ブロッキング処理に用いられるブロッキング剤としては、アルブミン、カゼイン、グロブリン、ゼラチンなどが例示され、これらを単独又は混合して用いることができる。アルブミンを用いる場合、その由来とする動物は特に限定されず、例えばウシ、ヤギ、ウサギ、ヒトなどを由来とするアルブミンを用いることができる。アルブミンとしては、ＢＳＡを用いることが好ましい。また、市販品の各種ブロッキング剤を用いることも可能である。ブロッキング処理は１回でもよいし、複数回に分けて行ってもよい。
【００３８】
ブロッキング処理により、さらにバックグラウンド低減効果が図ることができ、結果として、Ｓ／Ｎ比が向上する。
【００３９】
ブロッキング処理には、ブロッキング剤を溶解したブロッキング溶液を用いることが好ましい。ブロッキング溶液は、ブロッキング剤の他に緩衝剤を含有させてもよい。
【００４０】
被検物質の定量は、検出された反応産物中のシグナル発生用物質に由来するシグナルの強度に基づいて算出することにより行なうことができる。被検物質の定量に際しては、検量線を用いることが好ましい。検量線は、シグナル発生用物質を結合させた既知量のタンパク質を、上記と同様に固相担体に固定化し、このシグナル強度を測定することによって作成される。検量線に用いられるタンパク質は、例えば、グロブリン、アクチンなどを用いることができる。
【００４１】
また、上述のブロッキング剤を固定化することによって、さらに検量線の傾きを大きくすることができる。つまり、被検物質の検出の際の測定値の分解能が向上することができる。即ち、緩衝剤存在下で固相担体に固定化した後、さらに、ブロッキング処理して作成された検量線を用いると、より正確に被検物質の定量を行うことができる。
【００４２】
本発明の測定方法は、被検物質自体の定量だけでなく、酵素反応によって生成される産物を被検物質として定量することで、酵素の活性を測定することもできる。活性を測定する酵素としては、例えば、キナーゼ、ペプチダーゼ、ポリメラーゼなどが挙げられ、特にキナーゼが好ましい。酵素の活性の測定は、酵素とその基質とを反応させることで得られる、酵素反応生成物の量を測定し、その測定結果を酵素の活性値とすることができる。例えば、キナーゼの活性を測定する場合、リン酸化された基質の量を測定すればよい。また、キナーゼの活性を測定する際に、キナーゼと反応する基質に蛍光物質が結合できるような官能基を有していない場合、ＡＴＰに代えて、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオアルカリホスフェート）（ＡＴＰγＳ）を使用して、リン酸基の代りにチオリン酸基を導入することができる。上述のように、このチオリン酸基にシグナル発生用物質が結合できる。
【００４３】
活性測定の対象となり得るキナーゼとしては、具体的には、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（例えば、ミオシンＬ鎖キナーゼ、ｅＥＦ２−キナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼなど）、サイクリックヌクレオチドレギュレイテッドキナーゼ、ＣＤＫ（例えば、ＣＤＫ１，ＣＤＫ２，ＣＤＫ３，ＣＤＫ４，ＣＤＫ５，ＣＤＫ６，ＣＤＫ７、ＣＤＫ８など）等が例示される。
【００４４】
活性測定の対象となる酵素がＣＤＫ１又はＣＤＫ２である場合、被検物質として用いられる基質は、ヒストンＨ１又は網膜芽細胞腫タンパク質（Retinoblastoma Protein：以下、Ｒｂとする）であることが好ましい。また、酵素がＣＤＫ４又はＣＤＫ６である場合は、基質としてＲｂを用いることが好ましい。ＣＤＫ４又はＣＤＫ６の基質としては、硫黄原子を含まないアミノ酸（システイン及びメチオニン以外のアミノ酸）から構成されるタンパク質が好ましく用いられる。Ｒｂのようなシステイン残基を含むタンパク質の場合、システイン残基をアラニンなどの硫黄原子を含まないアミノ酸に置換して用いればよい。基質中のシステインやメチオニンを、硫黄原子を含まないアミノ酸に置換する方法としては、ＰＣＲ法や部分点突然変異法などの公知の方法を用いて行うことができる。
【００４５】
検査対象酵素が分解酵素である場合は、酵素反応後の分解産物を被検物質としてもよいし、さらに分解産物に特異的に結合する抗体を被検物質としてもよい。
【００４６】
なお、本実施形態の被検物質の測定方法及び酵素活性測定方法の各工程は、手動で実行されてもよいし、装置等を用いて自動的に実行されてもよい。
【実施例】
【００４７】
〔被検物質の調製〕
ＣＤＫ２の酵素活性を測定するために、基質としてヒストンＨ１を使用し、被検物質として、以下の方法により、キナーゼ酵素反応生成物であるチオリン酸化ヒストンＨ１を調製した。
【００４８】
９６穴フィルタープレート（親水性ＰＶＤＦメンブレン、ミリポア社）に免疫沈降用緩衝液（０．１ｗ／ｖ％、ＮＰ４０、及び５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．４）を含む）を８０μｌ収容し、ここに、抗ＣＤＫ２抗体（サンタクルズ社）２μｇ及びプロテインＡをコートしたセファロースビーズ（ＧＥヘルスケア社）を分散させた免疫沈降用緩衝液５０ｖ／ｖ％を３０μｌ加えた。
上記フィルタープレートの３２ウェルずつに、測定用試料として、リコビナントＣＤＫ２（アップステート社）１０ｎｇ／１５０μＬ、リコビナントＣＤＫ２（アップステート社）２０ｎｇ／１５０μＬを、添加した。
【００４９】
測定用試料の添加後、４℃で２時間振盪し、ＣＤＫ２と抗ＣＤＫ２抗体とを反応させた。
反応後、ウェル内のビーズをビーズ洗浄液Ａ（１ｗ／ｖ％、ＮＰ−４０、及び５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）含む）で２回洗浄した後、ビーズ洗浄液Ｂ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）含む）で１回洗浄し、ビーズ洗浄液Ｃ（５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．４）含む）で１回洗浄した。
次に、ＣＤＫ２の基質溶液（１０μｇヒストンＨ１（カルビオケム社）、２ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ（カルビオケム社）、５４ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した。基質溶液は、各ウェルに収容した混合液の総量が５０μＬとなるように調節して添加した。添加後、３７℃で３０分間振盪して、キナーゼ反応を行ない、ヒストンＨ１にチオリン酸基を導入した。
キナーゼ反応後、２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離を行ない、濾液を回収した。この濾液は、被検物質（チオリン酸化された基質（ヒストンＨ１））含有液である。
【００５０】
〔被検物質の蛍光物質による標識〕
上記で調製した被検物質含有液に、シグナル発生用物質である５−ＩＡＦ溶液（１．０３ｍＭ  ５−ＩＡＦ、１５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．４）、及び５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）を添加して、アルミホイルで遮光し、２５℃で２０分間振盪することにより、チオリン酸基を導入した基質（チオリン酸化基質）の硫黄原子に５−ＩＡＦを結合させた。尚、５−ＩＡＦとチオリン酸基との反応停止は、２−メルカプトエタノールの添加により行なった。
【００５１】
〔固相担体への固定化における緩衝剤効果〕
実施例１：トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）における濃度の検討
５−ＩＡＦが結合したチオリン酸化基質１．７６μｇを含む試料４８μＬを、トリス塩酸濃度の異なるＴＢＳ（２５ｍＭ，５０ｍＭ、２００ｍＭ、１０００ｍＭ、２０００ｍＭ、３０００ｍＭ、４０００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）１８０μＬと混合し、固定化用溶液たるサンプル溶液を調製した。これにより、各サンプル溶液の、緩衝剤の最終濃度は、それぞれ３３．９ｍＭ、５３．７ｍＭ、１７２ｍＭ、８０４ｍＭ、１５９０ｍＭ、２３８０ｍＭ、３１８０ｍＭとなる。
【００５２】
この各サンプル溶液２００μＬを、固相担体となる９６穴フィルタープレート（疎水性ＰＶＤＦメンブレン、ミリポア社）に注入することで、各ウェルの固相担体（疎水性ＰＶＤＦメンブレン）に、５−ＩＡＦが結合したチオリン酸化基質を固定化した。
チオリン酸化基質が固定化された各ウェルを、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）２００μＬで５回洗浄した。
その後、蛍光イメージングアナライザＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（バイオラッド社）を用いてフィルタープレートの蛍光分析を行ない、蛍光強度を測定した。蛍光強度は蛍光カウント値（単位＝ＣＮＴ）として表示した。
【００５３】
コントロールとして、リコビナントＣＤＫ２を添加しなかった以外は、上記被検物質調製法に従って濾液を回収し、この濾液に、シグナル発生用物質（５−ＩＡＦ）を、同様に添加した溶液を用いた。得られたコントロール溶液を、上記と同様にして、緩衝剤存在下で固相担体と接触させ、洗浄した後、蛍光強度を測定し、得られた蛍光カウント値（ＣＮＴ）をバックグラウンドとした。
【００５４】
トリス塩酸の各最終濃度におけるチオリン酸化基質含有液について、控除値及びＳ／Ｎ比を算出した。算出の計算式を以下に示す。コントロールのＣＮＴがバックグラウンドに該当し、控除値は被検物質からのシグナル（特異的シグナル）に該当する。
控除値＝各サンプル液のＣＮＴ−コントロールのＣＮＴ
Ｓ／Ｎ比＝各サンプル液のＣＮＴ／コントロールのＣＮＴ
【００５５】
さらに、トリス塩酸の最終濃度が３３．９ｍＭ（添加したＴＢＳのトリス塩酸濃度２５ｍＭ）のときの値を１として、トリス塩酸の各最終濃度における控除値及びＳ／Ｎ比の相対指数を求めた。これらの結果を表１に示す。また、トリス塩酸濃度の最終濃度と控除値の相対指数との関係を図１に、トリス塩酸濃度（最終濃度）とＳ／Ｎ比の相対指数との関係を図２に、それぞれ示す。尚、図１及び図２中、縦軸は、控除値又はＳ／Ｎ比の相対指数であり、横軸は、トリス塩酸の最終濃度である。また、各濃度における棒グラフの左側がＣＤＫ１０ｎｇ／１５０μＬ、右側がＣＤＫ２０ｎｇ／１５０μＬを用いて調製した各サンプル溶液についての測定結果である。
【００５６】
【表１】
2009063464.tif 000003
【００５７】
表１及び図１から明らかなように、サンプル溶液（固定化用溶液）のトリス塩酸の最終濃度が１７２ｍＭ〜１．５９Ｍの場合に、控除値（標識被検物質由来の特異的シグナル）が顕著に高くなる。一方、一般的に固相担体への固定化に使用されるトリス塩酸の最終濃度である、３３．９ｍＭ及び５３．７ｍＭでは控除値に変化はない。また、トリス塩酸の最終濃度が２．３８Ｍ及び３．１７Ｍのように、過剰に高濃度となると、逆に控除値は顕著に低下した。
【００５８】
また、表１及び図２から明らかなように、サンプル溶液のトリス塩酸の最終濃度が、８０４ｍＭ〜２．３８Ｍの場合に、Ｓ／Ｎ比が顕著に高くなる。また、控除値と同様に、一般的に固相担体への固定化に使用されるトリス塩酸の最終濃度である、３３．９ｍＭ及び５３．７ｍＭではＳ／Ｎ比に変化はない。更に、トリス塩酸の最終濃度が３．１７Ｍになると、Ｓ／Ｎ比は逆に低下した。
【００５９】
このことから、トリス塩酸の最終濃度が、１５０ｍＭ〜２．５Ｍ程度の際に、顕著にバックグラウンド低減の効果を得ることができ、２００ｍＭ〜２．０Ｍ、特に８００ｍＭ〜１．７Ｍの場合に控除値（被検物質由来の特異的シグナル）及びＳ／Ｎ比ともに顕著に向上することが明らかとなった。
【００６０】
実施例２：ＨＥＰＥＳにおける濃度の検討
上記で調製した、５−ＩＡＦで標識したチオリン酸化基質（ヒストンＨ１）を用いて、緩衝剤ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨを用いた場合のバックグラウンドの低減効果を調べた。
すなわち、実施例１において使用した緩衝剤を、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（２５ｍＭ，５０ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、２０００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）１８０μｌに変更し、緩衝剤（トリス塩酸及びＨＥＰＥＳ）の最終濃度が３３．９ｍＭ、５３．７ｍＭ、１７２ｍＭ、４０９ｍＭ、８０４ｍＭ、１５９０ｍＭとなるサンプル溶液（固定化用溶液）を調製した。それ以外は実施例１と同様にして、標識チオリン酸化基質を固定化した。固定化後、実施例１と同様に、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）２００μＬで５回洗浄し、その後、蛍光強度を測定した。
【００６１】
コントロール溶液（ＣＮＫ０ｎｇ／１５０μＬ）についても同様にして、測定用サンプルを調製した。
【００６２】
実施例１と同様に、控除値、Ｓ／Ｎ比の測定結果、及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを混合したときの測定結果に対する相対指数を求めた結果を、表２に示す。また、緩衝剤の最終濃度と控除値の指数との関係を図３、緩衝剤の最終濃度とＳ／Ｎ比の指数との関係を図４に、それぞれ示す。尚、表２、図３及び図４において、最終濃度とあるのは、サンプル溶液（固定化用溶液）に含まれる緩衝剤（具体的には、トリス塩酸及びＨＥＰＥＳ）の合計濃度（緩衝剤の最終濃度）である。すなわち、使用したＨＥＰＥＳと、標識被検物質含有液に含まれていたトリス塩酸（基質溶液、蛍光物質含有液の溶媒として用いられていたトリス塩酸）を含んだ最終濃度を示している。また、図３及び図４中、縦軸は、控除値又はＳ／Ｎ比の指数であり、横軸は、最終濃度である。各濃度における棒グラフの左側がＣＤＫ１０ｎｇ／１５０μＬ、右側がＣＤＫ２０ｎｇ／１５０μＬを用いて調製した被検物質含有液についての測定結果である。
【００６３】
【表２】
2009063464.tif 000004
【００６４】
表２及び図３からわかるように、バックグラウンドの値は、緩衝剤の最終濃度が４０９ｍＭ以上で顕著に減少し、控除値が向上した。そして、表２及び図４からわかるように、緩衝剤の最終濃度が４０９ｍＭ以上でＳ／Ｎ比が顕著に向上した。このことから、通常用いられる高濃度の緩衝剤を用いることにより、シグナルのカウント値及びＳ／Ｎ比が向上することがわかる。
【００６５】
実施例３：ＭＯＰＳにおける濃度の検討
上記で調製した、５−ＩＡＦで標識したチオリン酸化基質（ヒストンＨ１）を用いて、緩衝剤ＭＯＰＳ−ＮａＯＨを用いた場合のバックグラウンドの低減効果を調べた。
すなわち、実施例１において使用した緩衝剤を、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（２５ｍＭ，５０ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、２０００ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）１８０μｌに変更し、緩衝剤（トリス塩酸及びＭＯＰＳ）の最終濃度が３３．９ｍＭ、５３．７ｍＭ、１７２ｍＭ、４０９ｍＭ、８０４ｍＭ、１５９０ｍＭとなるサンプル溶液（固定化用溶液）を調製した。それ以外は実施例１と同様にして、標識チオリン酸化基質を固定化した。固定化後、実施例１と同様に、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）２００μＬで５回洗浄し、その後、蛍光強度を測定した。
【００６６】
コントロール溶液（ＣＮＫ０ｎｇ／１５０μＬ）についても同様にして、測定用サンプルを調製した。
【００６７】
実施例１と同様に、控除値、Ｓ／Ｎ比の測定結果、及び２５ｍＭ  ＭＯＰＳを混合したときの測定結果に対する相対指数を求めた結果を、表３に示す。また、最終濃度と控除値の指数との関係を図５、最終濃度とＳ／Ｎ比の指数との関係を図６に、それぞれ示す。尚、表３、図５及び図６において、最終濃度とあるのは、実施例２と同様に、サンプル溶液（固定化用溶液）に含まれる全ての緩衝剤（具体的には、トリス塩酸及びＭＯＰＳ）の合計濃度（最終濃度）である。すなわち、使用したＭＯＰＳと標識被検物質含有液に含まれていたトリス塩酸（基質溶液、蛍光物質含有液の溶媒として用いられていたトリス塩酸）を含んだ最終濃度を示している。図５及び図６中、縦軸は、控除値又はＳ／Ｎ比の指数であり、横軸は、最終濃度である。また、各濃度における棒グラフの左側がＣＤＫ１０ｎｇ／１５０μＬ、右側がＣＤＫ２０ｎｇ／１５０μＬを用いて調製した被検物質含有液についての測定結果である。
【００６８】
【表３】
2009063464.tif 000005
【００６９】
表３及び図５からわかるように、バックグラウンドの値が緩衝剤の最終濃度が４０９ｍＭ以上で顕著に減少し、控除値が向上した。そして、表３及び図６からわかるように、緩衝剤の最終濃度が４０９ｍＭ以上でＳ／Ｎ比が顕著に向上した。このことから、通常用いられるよりも高濃度の緩衝剤を用いることにより、シグナルのカウント値及びＳ／Ｎ比が向上することが分かる。
【００７０】
〔ブロッキング剤によるブロッキング処理効果〕
実施例４：ＢＳＡによるブロッキング処理効果と緩衝剤濃度  
実施例３と同様に、希釈用緩衝剤としてＭＯＰＳ（２５ｍＭ，５０ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、２０００ｍＭ、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）を使用し、緩衝剤（トリス塩酸及びＭＯＰＳ）の最終濃度が３３．９ｍＭ、５３．７ｍＭ、１７２ｍＭ、４０９ｍＭ、１５９０ｍＭとなるサンプル溶液を調製し、標識チオリン酸化基質を固相担体へ固定化した。
【００７１】
固定化後、実施例３と同様に、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）２００μＬで５回洗浄し、次いで、４％ＢＳＡ２００μｌで６回洗浄した（ブロッキング処理）。ブロッキング処理後、蛍光強度を測定した。コントロール溶液についても同様に固相担体へ固定化した後、ブロッキング処理を行なった後、蛍光強度を測定した。
【００７２】
実施例３と同様に、控除値、Ｓ／Ｎ比を求めた結果を、表４に示す。参考のために、表４にブロッキング処理を行なわなかった実施例３の結果を併記する。また、最終濃度とＳ／Ｎ比（指数）の関係を図７に示す。図７中、横軸は最終濃度、縦軸はＳ／Ｎ比の指数（相対値）を示す。また、各濃度における棒グラフの左側がＣＤＫ１０ｎｇ／１５０μＬ、右側がＣＤＫ２０ｎｇ／１５０μＬを用いて調製した被検物質含有液についての測定結果である。尚、ここで、最終濃度とは、実施例３と同様に、サンプル溶液に含まれる全ての緩衝剤（具体的には、トリス塩酸及びＭＯＰＳ）の合計濃度（最終濃度）である。すなわち、ＭＯＰＳと標識被検物質含有液に含まれていたトリス塩酸（基質溶液、蛍光物質含有液の溶媒として用いられていたトリス塩酸）とを含んだ最終濃度を示している。
【００７３】
【表４】
2009063464.tif 000006
【００７４】
表４からわかるように、ＢＳＡによるブロッキング処理によりバックグラウンドが低減するが、緩衝剤の最終濃度が８０４ｍＭ以上でＳ／Ｎ比が顕著に向上した。このことから、ブロッキング処理を行なう場合においても、通常用いられるよりも高濃度の緩衝剤を用いることにより、バックグラウンドシグナルをさらに低減させ、Ｓ／Ｎ比が向上することがわかる。
【００７５】
以上の結果から、高濃度の緩衝剤を用いて固定化することで、標識被検物質からの特異的シグナル及びＳ／Ｎ比を向上させることが明らかとなった。また、ブロッキング剤と併用することにより、更なるバックグラウンドの低減が可能となり、Ｓ／Ｎ比の向上を図ることができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の測定方法は、固相担体に標識被検物質を固定化するに際して、被検物質との結合に利用されなかった未反応のシグナル発生用物質が、固相担体に非特異的に吸着することによるバックグラウンドを低減することができる。本発明の測定方法は、Ｓ／Ｎ比が向上するので、被検物質の定量における測定感度を高くすることができる。さらに、本発明の測定方法は、被検物質として酵素反応生成物を用いることにより、正確な酵素活性の測定をすることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】実施例１における緩衝剤濃度と控除値の関係を示すグラフである。
【図２】実施例１における緩衝剤濃度とＳ／Ｎ比との関係を示すグラフである。
【図３】実施例２における緩衝剤濃度と控除値との関係を示すグラフである。
【図４】実施例２における緩衝剤濃度とＳ／Ｎ比との関係を示すグラフである。
【図５】実施例３における緩衝剤濃度と控除値との関係を示すグラフである。
【図６】実施例３における緩衝剤濃度とＳ／Ｎ比との関係を示すグラフである。
【図７】実施例４における緩衝剤濃度とＳ／Ｎ比との関係を示すグラフである。
【図１】
2009063464.tif 000007
【図２】
2009063464.tif 000008
【図３】
2009063464.tif 000009
【図４】
2009063464.tif 000010
【図５】
2009063464.tif 000011
【図６】
2009063464.tif 000012
【図７】
2009063464.tif 000013