(57)【要約】【課題】環境中や食品中に存在するＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を特異的に、迅速かつ簡便に検出するための方法を提供する。【解決手段】本発明は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌検出用ＰＣＲプライマーセットであって、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のｌａｃ遺伝子、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、およびＮ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子の特異的領域にアニーリング可能なプライマーセット、ならびにＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のｌａｃ遺伝子、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、およびＮ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子の特異的領域のＰＣＲ法による増幅を用いてＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を検出するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の（ｉ）ｌａｃ遺伝子、（ｉｉ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、および（ｉｉｉ）Ｎ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子の特異的領域にそれぞれアニーリング可能なプライマーを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌検出用ＰＣＲプライマーセットであって、以下のもの（ｉ）プライマーＴｈｌａｃ−Ｆ（配列番号１）、プライマーＴｈｌａｃ−Ｒ（配列番号２）、プライマーＴｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｆ（配列番号３）、およびプライマーＴｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｒ（配列番号４）、（ｉｉ）プライマーＴｈ１６Ｓ−Ｆ（配列番号５）、プライマーＴｈａｃｅ−Ｒ（配列番号６）、およびプライマーＴｈｓｉｓｕ−Ｒ（配列番号７）、ならびに（ｉｉｉ）プライマーＴｈｋｉｖ−Ｆ（配列番号８）、およびプライマーＴｈｋｉｖ−Ｒ（配列番号９）を含む、上記プライマーセット。
【請求項２】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌が、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｏｅｔｈｙｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｉｎｎｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｅｔｈｙｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｖｕｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｔｈｒａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｃｏｐｒｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉからなる群より選択される、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｉｎｎｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｅｔｈｙｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｔｈｒａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｃｏｐｒｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉからなる群より選択されるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌検出用ＰＣＲプライマーセットであって、プライマーＴｈｌａｃ−Ｆ（配列番号１）、プライマーＴｈｌａｃ−Ｒ（配列番号２）、プライマーＴｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｆ（配列番号３）、およびプライマーＴｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｒ（配列番号４）を含む、上記プライマーセット。
【請求項４】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｏｅｔｈｙｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｏｐｈｉｌｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉからなる群より選択されるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌検出用ＰＣＲプライマーセットであって、プライマーＴｈ１６Ｓ−Ｆ（配列番号５）、プライマーＴｈａｃｅ−Ｒ（配列番号６）、およびプライマーＴｈｓｉｓｕ−Ｒ（配列番号７）を含む、上記プライマーセット。
【請求項５】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｖｕｉ検出用ＰＣＲプライマーセットであって、プライマーＴｈｋｉｖ−Ｆ（配列番号８）、およびプライマーＴｈｋｉｖ−Ｒ（配列番号９）を含む、上記プライマーセット。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプライマーセットを使用して、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属菌の（ｉ）ｌａｃ遺伝子、（ｉｉ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、および／または（ｉｉｉ）Ｎ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子の特異的領域のＰＣＲ法による増幅を検出することを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を迅速かつ正確に検出するためのプライマーセットおよび方法に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明はＰＣＲ法においてＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のｌａｃ遺伝子、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、およびＮ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子の特異的領域の増幅を検出することによる、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出のためのプライマーセットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌は、偏性嫌気性の好熱性細菌であり、泥、温泉、熱水噴出口などの各種環境や精糖プラント、ビート抽出液などからの検出例が報告されている。また、加温販売されるミルクコーヒーやココアなどの低酸性缶詰飲料での腐敗事例において、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の分離例が報告されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。したがって、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌は、産業分野で非常に重要な菌種であると考えられている。
【０００４】
従来、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出のためには増菌や分離培養などによる手法が行われているが、これらの手法は結果を得るまでに時間を要するという欠点を有する。高温発育性の嫌気性細菌については、糖分解能試験や酵素活性による分類法も報告されている（非特許文献１、非特許文献５）。また、高温発育性の嫌気性細菌であるクロストリジアを特殊な培地で検出する方法も報告されている（特許文献１）。
【０００５】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の菌種の確認には遺伝子を用いた方法が用いられている。例えば、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅し、その配列を確認するＤＮＡシーケンス法が広く知られている。また、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域および２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、その配列を確認するＤＮＡシーケンス法も報告されている。しかしながら、そのような方法は特別な機器が必要なうえ多大な時間と労力を要する（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３０４６９８号公報
【非特許文献１】Klingeberg, M.ら, FEMS Microbiol. Lett., 1990, 69: 145-152
【非特許文献２】Hollaus, F.ら, Int. Sugar J., 1973, 75, 237-241
【非特許文献３】Leigh, J.A.ら, Arch. Microbiol., 1981, 129: 275-280
【非特許文献４】駒木 勝、ソフト・ドリンク技術資料、２００１年２号、ｐ．１０３−１３６
【非特許文献５】Jean-Philippe, C.ら, Anaerobe, 2006, 12: 153-159
【非特許文献６】Xue, Y.ら, Int J Syst Evol Microbial., 2001, 51(4): 1335-1341
【非特許文献７】Ashraf, Iら, BioTechniques., 2001, 30: 414-420
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の迅速かつ簡便な検出を可能にするために、ＰＣＲ法によってＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を特異的に検出可能であるプライマーセットを提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の特異的遺伝子領域のＰＣＲ法による増幅により、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため検討を行った結果、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属菌のｌａｃ遺伝子、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、Ｎ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子の特異的領域に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ法により増幅することにより、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属菌を検体中から特異的、簡便かつ迅速に検出することを実現し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
（１）Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の（ｉ）ｌａｃ遺伝子、（ｉｉ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、および（ｉｉｉ）Ｎ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子の特異的領域にそれぞれアニーリング可能なプライマーを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌検出用ＰＣＲプライマーセットであって、以下のもの（ｉ）プライマーＴｈｌａｃ−Ｆ（配列番号１）、プライマーＴｈｌａｃ−Ｒ（配列番号２）、プライマーＴｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｆ（配列番号３）、およびプライマーＴｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｒ（配列番号４）、（ｉｉ）プライマーＴｈ１６Ｓ−Ｆ（配列番号５）、プライマーＴｈａｃｅ−Ｒ（配列番号６）、およびプライマーＴｈｓｉｓｕ−Ｒ（配列番号７）、ならびに（ｉｉｉ）プライマーＴｈｋｉｖ−Ｆ（配列番号８）、およびプライマーＴｈｋｉｖ−Ｒ（配列番号９）を含む、上記プライマーセット。
【００１１】
（２）Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌が、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｏｅｔｈｙｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｉｎｎｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｅｔｈｙｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｖｕｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｔｈｒａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｃｏｐｒｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉからなる群より選択される、上記（１）に記載のプライマーセット。
【００１２】
（３）Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｉｎｎｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｅｔｈｙｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｔｈｒａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｃｏｐｒｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉからなる群より選択されるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌検出用ＰＣＲプライマーセットであって、プライマーＴｈｌａｃ−Ｆ（配列番号１）、プライマーＴｈｌａｃ−Ｒ（配列番号２）、プライマーＴｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｆ（配列番号３）、およびプライマーＴｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｒ（配列番号４）を含む、上記プライマーセット。
【００１３】
（４）Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｏｅｔｈｙｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｏｐｈｉｌｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉからなる群より選択されるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌検出用ＰＣＲプライマーセットであって、プライマーＴｈ１６Ｓ−Ｆ（配列番号５）、プライマーＴｈａｃｅ−Ｒ（配列番号６）、およびプライマーＴｈｓｉｓｕ−Ｒ（配列番号７）を含む、上記プライマーセット。
【００１４】
（５）Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｖｕｉ検出用ＰＣＲプライマーセットであって、プライマーＴｈｋｉｖ−Ｆ（配列番号８）、およびプライマーＴｈｋｉｖ−Ｒ（配列番号９）を含む、上記プライマーセット。
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載のプライマーセットを使用して、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属菌の（ｉ）ｌａｃ遺伝子、（ｉｉ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、および／または（ｉｉｉ）Ｎ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子の特異的領域のＰＣＲ法による増幅を検出することを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出方法。
（７）上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載のプライマーセットを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌検出用キット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のプライマーセットもしくはキットを用いたＰＣＲ法、または本発明の方法により、検体中のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を他のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ科細菌種から区別して特異的に、迅速かつ簡便に検出可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明を用いて検出可能なＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌としては、限定するものではないが、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｏｅｔｈｙｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｉｎｎｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｅｔｈｙｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｖｕｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｔｈｒａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｃｏｐｒｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉ、ならびにこれらの変異株が挙げられる。
【００１７】
本明細書中で用いる「ｌａｃ遺伝子」とは、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のβ−ｇｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅをコードする遺伝子を指す。該酵素は乳糖の利用や取り込みに関連する。
【００１８】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のひとつであるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｔｈｒａｎｉｉのｌａｃ遺伝子の塩基配列は、例えば登録番号ＡＪ３１６５５９としてＧｅｎＢａｎｋなどから入手可能である。また、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓのｌａｃ遺伝子の塩基配列は、例えば登録番号Ｅ１５１２８としてＧｅｎＢａｎｋなどから入手可能である。
【００１９】
本明細書中で用いる「１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子」とは、１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を指す。該遺伝子は、系統分類の指標として広く認められている。
【００２０】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｏｅｔｈｙｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｏｐｈｉｌｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、例えばそれぞれ登録番号Ｘ６９３３６、ＡＦ１２０４７９およびＹ１６９４０としてＧｅｎＢａｎｋなどから入手可能である。
【００２１】
本明細書中で用いる「Ｎ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子」とは、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素をコードする遺伝子を指す。該酵素は葉酸補酵素の１種で、細菌をはじめとする生物の生育において生理活性物質として作用する。
【００２２】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｖｕｉのＮ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子の塩基配列は、例えば登録番号ＡＦ２９５７０４としてＧｅｎＢａｎｋなどから入手可能である。
【００２３】
本発明者らは、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のｌａｃ遺伝子、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子およびＮ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子の塩基配列を他の細菌のものと比較し、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ科細菌のうち、これらの遺伝子中にＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌に特異的な配列が存在することを見出した。そして、そのような特異的領域の配列から、本発明の具体的なＰＣＲプライマーを設計した。ここで、「特異的な配列」または「特異的領域」とは、他の細菌と比較してＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌に固有の塩基配列またはそのような配列を有する領域を指す。
【００２４】
本発明のプライマーは、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の遺伝子中に存在する特異的領域にアニーリング可能な配列を有する限り、その配列において特に限定されない。しかし、好ましいプライマーは、それぞれ配列番号１〜９に示される塩基配列を有するプライマーである。
【００２５】
配列番号１〜９に示される配列とは、具体的には以下のものである：
配列番号１：ＧＡＣＡＧＡＧＧＴＴＡＴＡＡＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＴＧ
配列番号２：ＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＣＣＡＡＧＴ
配列番号３：ＡＣＣＣＡＡＡＡＡＧＣＣＧＡＡＡＡＧＡＴ
配列番号４：ＣＣＣＡＧＣＣＣＡＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴ
配列番号５：ＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＧＴＡＧＴＴＡＧ
配列番号６：ＧＣＣＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＣＣＧＣＣＴＴＧ
配列番号７：ＧＴＣＧＡＧＣＧＡＴＴＣＡＧＡＧＧＴＣＧＧ
配列番号８：ＡＣＴＧＴＴＧＧＴＴＴＡＧＧＣＧＡＴＧＣ
配列番号９：ＴＧＣＡＴＧＧＡＡＡＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡ
【００２６】
ＰＣＲ法のプライマーとして用いることができるオリゴヌクレオチドは、自動化オリゴヌクレオチド合成機などを用いて合成することができ、そのようなオリゴヌクレオチドの合成法は当業者には公知である。
【００２７】
本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ法の実施により、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を他のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ科細菌種から区別して（すなわち特異的に）検出することができる。ここで、「特異的に」とは、検出反応が他のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ科細菌種に対して陰性であることを意味する。
【００２８】
本明細書中で用いる「ＰＣＲ法」、「ＰＣＲ反応」とは、ポリメラーゼ連鎖反応を指す。当該反応は公知であるため、当業者であれば該反応を適宜実施することができる。ＰＣＲ反応の具体的な実施については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９５）などに記載されている。
【００２９】
ＰＣＲ法の反応は、一般的には、初期変性ステップ；変性、アニーリング、および伸長の各ステップを含むサイクルを繰り返すことによる増幅ステップ；ならびにさらなる伸長ステップを含む。変性、アニーリングおよび伸長の各ステップのための温度および時間は、用いるポリメラーゼ、プライマー配列、増幅対象の断片の長さなどに依存して変わりうるが、当業者であれば容易に決定することができる。また、増幅ステップにおいてアニーリングおよび伸長を同じ温度で行うシャトルＰＣＲ（二段階温度ＰＣＲ）の使用も有利である。そのようなＰＣＲ反応条件は、例えば、「ＰＣＲ法最前線」（蛋白質核酸酵素臨時増刊号、関谷ら(編)、１９９６年、共立出版）などの文献に詳細に記載されている。
【００３０】
ＰＣＲ法の実施に必要な試薬は当業者には公知であり、上記文献にも記載されている。プライマーおよび鋳型ＤＮＡ以外のそのような試薬としては、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ｐｆｕポリメラーゼなどの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス、および好適なバッファーが挙げられる。
【００３１】
本発明では、限定するものではないが、ＰＣＲ法としてリアルタイムＰＣＲ法を用いるのが有利である。リアルタイムＰＣＲ法に用いるＰＣＲ反応試薬としては、例えば、タカラバイオ社から市販されているＤＮＡ増幅試薬キットであるＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（但し、プライマーセットを除く）が挙げられる。該キットを用いる場合のＰＣＲ反応液は、例えば、滅菌蒸留水を７．１μＬ、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑを１０μＬ、Ｔｈｌａｃ−Ｆ、Ｔｈｌａｃ−Ｒ、Ｔｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｆ、Ｔｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｒ、Ｔｈ１６Ｓ−Ｆ、Ｔｈａｃｅ−Ｒ、Ｔｈｓｉｓｕ−Ｒ、Ｔｈｋｉｖ−Ｆ、Ｔｈｋｉｖ−Ｒの各プライマー（各２０μＭ）を各０．１μＬ、検体液（鋳型ＤＮＡ）２μＬを加え、全量２０μＬとして調製する。
【００３２】
ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩを用いるリアルタイム反応ＰＣＲ法の場合、ポリメラーゼ反応によって合成された２本鎖ＤＮＡに、反応液中に含まれるインターカレーター（ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ）が結合すると蛍光を発する。この蛍光強度を測定することで核酸増幅の有無を確認することができる。核酸増幅が観察されるならば、標的遺伝子が存在することを意味し、結果としてＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌陽性（＋）であることが示される。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的遺伝子が不存在であることを意味し、結果としてＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌陰性（−）であることが示される。
【００３３】
また、本発明の方法においてサーマルサイクラーによる通常のＰＣＲ反応を行う場合は、当該ＰＣＲ反応が適切に行われる限り限定するものではないが、例えば、タカラバイオ社から市販されているＤＮＡ増幅試薬キットであるＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ試薬（但し、プライマーセットを除く）を利用することができる。その場合、ＰＣＲ反応液は、例えば、滅菌蒸留水を１４．３μＬ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑバッファーを２μＬ、ｄＮＴＰミックス（各２．５ｍＭ）を１．６μＬ、Ｔｈｌａｃ−Ｆ、Ｔｈｌａｃ−Ｒ、Ｔｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｆ、Ｔｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｒ、Ｔｈ１６Ｓ−Ｆ、Ｔｈａｃｅ−Ｒ、Ｔｈｓｉｓｕ−Ｒ、Ｔｈｋｉｖ−Ｆ、Ｔｈｋｉｖ−Ｒの各プライマー（各２０μＭ）を各０．１μＬ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを０．２μＬ、検体液（鋳型ＤＮＡ）１μＬを加え、全量２０μＬとして調製する。
【００３４】
通常よく用いられるサーマルサイクラーを用いたＰＣＲ法の場合、１０μＬ程度のＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動などに供することで、核酸増幅の有無を確認することができる。目的とする増幅部分と同じ分子量での核酸増幅が観察されるならば、標的遺伝子が存在することを意味し、結果としてＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌陽性（＋）であることが示される。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的遺伝子が不存在であることを意味し、結果としてＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌陰性（−）であることが示される。
【００３５】
本発明のキットの構成要素としては、本発明のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌検出用プライマーの他に、耐熱性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス、バッファーおよび使用説明書などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
核酸増幅によるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の同定のための検体としては、限定するものではないが、食品検体、例えば乳およびその製品、野菜類、茶葉、果汁、液糖、缶詰など、ならびに環境検体、例えば土壌、水、拭き取り検体などを用いることができる。
【００３７】
このような検体をＰＣＲ法において検体として用いる場合には、検体中に存在する菌体の濃縮、分離、菌体からの核酸放出、核酸の濃縮などの操作を前処理として行うこともできる。菌体の濃縮および分離の方法は適宜選択することができ、ろ過、遠心分離などが知られている。食品検体や環境検体などに存在する菌体からの核酸の放出は、例えばＬｙｓｏｚｙｍｅやＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋなどによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を放出させることにより行うことができる。また、特に食品検体の場合、必要があれば、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿、遠心分離などにより核酸のさらなる精製を行い、該核酸を最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ、該溶解液を鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（Ｗｅｒｎａｒｓ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９１，７０：１２１−１２６；Ｇｏｌｂａｎｇ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．，１９９６，４９：８６１−８６３）。
【００３８】
例えば、食品中にＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌が存在すると考えられる場合には、該食品中に存在する細菌を適切な培地で増菌培養し、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して上記プライマーを用いたＰＣＲ反応を行い、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌遺伝子中の特異的領域を増幅することにより、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を検出することができる。
【００３９】
本発明のＰＣＲ法によるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出法は、食品や環境試料などの検査対象物に存在するＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の有無を迅速に判定することができる検出法として用いることができる。特に、該方法は、乳製品、野菜類などでのＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の汚染の検出のために使用することができる。
【００４０】
また、本発明のＰＣＲ法による検出法はＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の増殖を検知する方法にも応用することができる。食品やその原料、環境試料などがある条件下において放置される場合に、それらの中に存在するＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の増殖の有無については、例えば本発明の方法をリアルタイム反応ＰＣＲ法を用いて行うことにより、迅速に判定することが出来る。
【００４１】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
１．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応に用いる各試薬の内容は次のとおりである。ＰＣＲ反応試薬はタカラバイオ社製のＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑを用いた。ＰＣＲ反応液は、滅菌蒸留水を７．１μＬ、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑを１０μＬ、Ｔｈｌａｃ−Ｆ、Ｔｈｌａｃ−Ｒ、Ｔｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｆ、Ｔｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｒ、Ｔｈ１６Ｓ−Ｆ、Ｔｈａｃｅ−Ｒ、Ｔｈｓｉｓｕ−Ｒ、Ｔｈｋｉｖ−Ｆ、Ｔｈｋｉｖ−Ｒの各プライマー（各２０μＭ）を各０．１μＬ、検体液（鋳型ＤＮＡ）２μＬを加え、全量２０μＬとして調製した。調製に際しては、タカラバイオ社、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥｘＴａｑ試薬キット（カタログ番号：ＲＲ０４１Ａ）の添付説明書に従った。
【００４３】
ＰＣＲ反応は、ロシュ社製のライトサイクラーを用い、シャトルＰＣＲ（二段階温度ＰＣＲ）として行った。反応条件は、タカラバイオ社製のＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑの添付説明書に従った。具体的には、初期変性としての９５℃、１０秒（２０℃／秒）に続いて、９５℃、５秒（２０℃／秒）；６０℃、２０秒（２０℃／秒）を１サイクルとして３５サイクルを行い、最後に、融解曲線分析を、９５℃、０秒（２０℃／秒）；６５℃、１５秒（２０℃／秒）；９５℃、０秒（０．１℃／秒）に設定して行った。カッコ内は温度変化速度を表す。反応終了後に、増幅曲線と融解曲線を確認し、ＰＣＲ産物の増幅の有無を判定した。増幅曲線の立ち上がりが認められたものをＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌陽性、増幅曲線が認められないものを陰性とした。
【００４４】
鋳型ＤＮＡは、表１に示された１４種のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌および１４種の他のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ科細菌から抽出したＤＮＡを用いた。
【００４５】
２．プライマーの設計
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のｌａｃ遺伝子、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、およびＮ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子の配列を他の細菌のものと比較し、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌に特異的な配列を有するＰＣＲプライマーを設計した。
（ｉ）配列番号１〜４：Ｔｈｌａｃ−Ｆ（配列番号１）、Ｔｈｌａｃ−Ｒ（配列番号２）、Ｔｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｆ（配列番号３）、およびＴｈｌａｃｃｅｌｌ−Ｒ（配列番号４）のプライマーセットを、ｌａｃ遺伝子の特異的領域を増幅するように設計した。
（ｉｉ）配列番号５〜７：Ｔｈ１６Ｓ−Ｆ（配列番号５）、Ｔｈａｃｅ−Ｒ（配列番号６）、およびＴｈｓｉｓｕ−Ｒ（配列番号７）のプライマーセットは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特異的領域を増幅するように設計した。
（ｉｉｉ）配列番号８および９：Ｔｈｋｉｖ−Ｆ（配列番号８）、およびＴｈｋｉｖ−Ｒ（配列番号９）のプライマーセットは、Ｎ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子の特異的領域を増幅するように設計した。
【００４６】
３．結果（１）
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のプライマーセットを個々に用いてＰＣＲ反応を行った結果は以下の通りである。表１に結果をまとめた。
【００４７】
表１に示したＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌１４種および他のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ科細菌について、上記（ｉ）のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った結果、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｉｎｎｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｅｔｈｙｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｔｈｒａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｃｏｐｒｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉの１０菌種のみについて核酸の増幅が認められ、他のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ科細菌種では増幅が認められなかった。
【００４８】
上記（ｉｉ）のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った結果、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｏｅｔｈｙｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｏｐｈｉｌｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉについて核酸の増幅が認められ、他のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ科細菌種では増幅が認められなかった。
【００４９】
上記（ｉｉｉ）のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った結果、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｖｕｉのみについて核酸の増幅が認められ、他のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ科細菌種では増幅が認められなかった。
【００５０】
上記のように、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のｌａｃ遺伝子、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、またはＮ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子に対して設計された各プライマーセットは、それぞれ標的とした遺伝子を保有するＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を検出可能であり、他のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ科細菌種との交差性は認められなかった。また、これらのプライマーセットを用いた検出結果を併せると、検査した１４種すべてのＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を網羅することができた。
【００５１】
４．結果（２）
そこで、配列番号１〜９に示される配列を有するプライマーすべてを混合し、ＰＣＲ反応を行った。その結果、検査した１４種のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のみについて増幅が認められ、他のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ科細菌種では増幅が認められなかった。
【００５２】
このことから、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のｌａｃ遺伝子、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、およびＮ１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子に対して設計された本発明の各プライマーセットを同時に用いてＰＣＲ反応を行うことにより、検体中のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を特異的に、迅速かつ簡便に検出しうることが示された。
【００５３】
【表１】
2009136245.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のプライマーセットおよびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出法は、食品や環境試料などの検査対象中のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の有無を、特異的に、迅速かつ簡便に判定することができる。したがって、本発明は、乳製品、野菜類、缶詰などでのＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の汚染の検出に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号１〜９：プライマー
【配列表】
2009136245000001.app