(57)【要約】【課題】オステオカルシンの高感度な免疫測定を可能とする新規な抗オステオカルシン抗体、並びに当該抗体を用いたオステオカルシンの高感度な免疫測定方法を提供することを解決すべき課題とした。【解決手段】抗オステオカルシン抗体の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列に少なくとも１以上のアミノ酸変異を導入することにより得られるアミノ酸配列からなりペプチドであって、オープンサンドイッチ免疫分析におけるオステオカルシンの検出感度が、上記アミノ酸変異の導入前のペプチドを用いた場合よりも向上していることを特徴とする、上記ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗オステオカルシン抗体の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列に少なくとも１以上のアミノ酸変異を導入することにより得られるアミノ酸配列からなりペプチドであって、オープンサンドイッチ免疫分析におけるオステオカルシンの検出感度が、上記アミノ酸変異の導入前のペプチドを用いた場合よりも向上していることを特徴とする、上記ペプチド。
【請求項２】
抗オステオカルシン抗体の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列において、少なくとも１以上の下記変異を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
（１）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の10番目のアミノ酸残基がバリンである変異；
（２）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の31番目のアミノ酸残基がセリンである変異；
（３）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の37番目のアミノ酸残基がイソロイシンである変異；
（４）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の58番目のアミノ酸残基がトレオニンである変異；
（５）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の69番目のアミノ酸残基がイソロイシンである変異；
（６）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の82番目のアミノ酸残基がアルギニンである変異；
【請求項３】
下記の何れかのペプチド。
（ａ）配列番号２に示す抗オステオカルシン抗体の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列において、少なくとも１以上の下記変異を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列の10番目のアミノ酸残基がバリンである変異；
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列の31番目のアミノ酸残基がセリンである変異；
（３）配列番号２に示すアミノ酸配列の37番目のアミノ酸残基がイソロイシンである変異；
（４）配列番号２に示すアミノ酸配列の58番目のアミノ酸残基がトレオニンである変異；
（５）配列番号２に示すアミノ酸配列の69番目のアミノ酸残基がイソロイシンである変異；
（ｂ）上記（ａ）に記載のペプチドのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなり、かつ抗オステオカルシン抗体の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列からなるペプチドとともにオステオカルシンを特異的に認識できるペプチド。
【請求項４】
下記の何れかのペプチド。
（ａ）配列番号５から７の何れかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号５から７の何れか記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなり、かつ抗オステオカルシン抗体の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列からなるペプチドとともにオステオカルシンを特異的に認識できるペプチド。
【請求項５】
下記の何れかのペプチド。
（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなり、かつ抗オステオカルシン抗体の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列からなるペプチドとともにオステオカルシンを特異的に認識できるペプチド。
【請求項６】
請求項１から５の何れかに記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む、組み換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項９】
請求項１から５の何れかに記載のペプチドを含む、オステオカルシン検出試薬。
【請求項１０】
請求項１から５の何れかに記載のペプチド、及び抗オステオカルシン抗体の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも含む、オステオカルシン検出キット。
【請求項１１】
請求項１から５の何れかに記載のペプチドと被験試料とを接触させることを含む、オステオカルシンの免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オープンサンドイッチ免疫測定に適した抗オステオカルシン抗体、及びそれを用いたオステオカルシンの免疫測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
わが国の骨粗しょう症患者は、現在、女性が約800万人、男性が約200万人の合計1000万人と推定され、この数字は高齢化に伴い増加していくと考えられる。重度の骨粗しょう症患者は寝たきりを余儀なくされるために、定期的な診断による早期発見が重要である。骨粗しょう症のマーカー分子として、オステオカルシン（Bone Gla Protein（BGP)）と呼ばれるアミノ酸49残基、分子量5900のビタミンK依存性カルシウム結合蛋白質が知られている。BGPは骨代謝回転（特に骨形成）と密接な関係があり、血中濃度を測定することにより、骨の代謝異常あるいは治療効果の指標となる。これまで、BGP検出は免疫測定が主流であったが（特許文献１〜５）、サンドイッチ法を用いていたためにBGP分解物（ペプチド）の測定は不可能であった。BGPは血液中で分解を受けるために、正確な骨代謝回転を評価するためには、BGPペプチドでの定量が望ましい（非特許文献１）。ペプチドの検出には、競合法による免疫測定法が適応可能であるが、血中BGP濃度は一ミリリットル当たり数ナノグラムと低いために、感度や再現性が問題となる。
【０００３】
近年、オープンサンドイッチ（OS）法と呼ばれる新しい免疫測定法による、非競合のBGP-C末端ペプチド測定法が開発された（非特許文献２）。オープンサンドイッチ（OS）法とは、抗原を特異的に認識する抗体のＶＨ領域ポリペプチドおよびＶＬ領域ポリペプチドを調製し、一方のポリペプチドをレポーター分子で標識して標識化ポリペプチドとし、他方のポリペプチドを固相に固定して固定化ポリペプチドとし、抗原含有試料および標識化ポリペプチドを固相に接触させ、固定化ポリペプチドに結合した標識化ポリペプチドのレポーター分子の量を測定する方法である。OS法は、VHとVLが抗原存在下において会合定数が増加する現象を利用した非競合免疫測定法であり、競合法よりも高い感度が得られるという利点を有する。すでに、抗BGP抗体であるKTM219を用いて、OS法によるBGP測定を行い、血中濃度と同程度の検出感度が得られている。しかし、実用化にはさらなる感度が求められている。
【０００４】
【非特許文献１】Bone 31, 2002, 62-69
【非特許文献２】Anal. Chem. 79 (16), 6193-6200 (2007)
【特許文献１】特開２００７−４５８３４号公報
【特許文献２】特開平９−３２９６００号公報
【特許文献３】特開平６−２８９０２０号公報
【特許文献４】特開平６−７８７８８号公報
【特許文献５】特開平７−５５８０４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来のBGP定量では、サンドイッチ法によって行われていたために、ほぼ全長のBGPの検出のみ可能であった。しかし、血中に放出されたBGPはプロテアーゼによる分解を受けて一部が検出不可能なペプチドとなるために、被験者のプロテアーゼ活性が高い場合には、血中濃度が低く見積もられる可能があるという問題があった。一方で、ペプチドの定量には、質量分析や高速液体クロマトグラフィーなどの機器分析や競合法による免疫測定法が利用されている。しかし、機器分析では、血清中に含まれる多様な成分の中から様々な長さを持つBGPペプチドを同定することは困難であり、また高価な機器を必要とするといった問題がある。また、競合法による免疫測定法では感度に問題がある。OS法による免疫測定法では、BGPペプチドの非競合的免疫測定法が可能であり、感度においても競合法より優れており、また高価な装置も必要とせず、簡易迅速診断が可能である。これまで、抗BGP抗体、KTM219を用いたOS免疫測定系が開発され、正常な血中BGP濃度と同程度の検出感度（約1 ng/ml）が得られている。しかしながら、実用化を考えた場合、更なる高感度化が必要であった。即ち、本発明は、オステオカルシン(BGP)の高感度な免疫測定を可能とする新規な抗オステオカルシン抗体、並びに当該抗体を用いたオステオカルシンの高感度な免疫測定方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これまでに抗BGP抗体KTM219のVH及びVLを用いたオープンサンドイッチELISAが報告され、BGPペプチドの非競合的検出が可能となった（文献Lim et al. Anal.Chem. 79, 6193 (2007)）。今回、BGPに対するオープンサンドイッチELISAの検出感度の向上を目指し、エラープローンPCRによってVH遺伝子断片にランダム変異を導入したVH(BGP)ライブラリーを作製した。VH(BGP)ライブラリーは、スクリーニングを効率化するために、ファージミドベクターに組み込み、ヘルパーファージとともに大腸菌に導入することで、バクテリオファージ粒子表面にVHが融合されたファージライブラリーとして発現させた。スクリーニングでは、大腸菌由来マルトース結合蛋白質（MBP）との融合蛋白質として発現され、さらにビオチン化修飾されたVL、及び抗原（BGPペプチド）にファージライブラリーを混合し、強い複合体を形成したVH提示ファージを、ストレプトアビジン固定化ビーズを使って回収した。上記の通り、VHにランダム変異を導入しセレクションを行った結果、OS−ELISA測定系での感度が約0.1 ng/mlにまで向上した変異体O2AG2（VHにN31S、V37I、S58T、H82Rの４つの変異を有する）、O2AH2（VHにE10V、T69Iの２つの変異を有する）、single mutant（VHにV37Iの変異を有する）、及びtriple mutant（VHにV37I、S58T、H82Rの３つの変異を有する）を得るにいたった。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、抗オステオカルシン抗体の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列に少なくとも１以上のアミノ酸変異を導入することにより得られるアミノ酸配列からなりペプチドであって、オープンサンドイッチ免疫分析におけるオステオカルシンの検出感度が、上記アミノ酸変異の導入前のペプチドを用いた場合よりも向上していることを特徴とする、上記ペプチドが提供される。
【０００８】
本発明によればさらに、抗オステオカルシン抗体の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列において、少なくとも１以上の下記変異を有するアミノ酸配列からなるペプチドが提供される。
（１）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の10番目のアミノ酸残基がバリンである変異；
（２）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の31番目のアミノ酸残基がセリンである変異；
（３）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の37番目のアミノ酸残基がイソロイシンである変異；
（４）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の58番目のアミノ酸残基がトレオニンである変異；
（５）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の69番目のアミノ酸残基がイソロイシンである変異；
（６）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の82番目のアミノ酸残基がアルギニンである変異；
【０００９】
本発明によればさらに、下記の何れかのペプチドが提供される。
（ａ）配列番号２に示す抗オステオカルシン抗体の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列において、少なくとも１以上の下記変異を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列の10番目のアミノ酸残基がバリンである変異；
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列の31番目のアミノ酸残基がセリンである変異；
（３）配列番号２に示すアミノ酸配列の37番目のアミノ酸残基がイソロイシンである変異；
（４）配列番号２に示すアミノ酸配列の58番目のアミノ酸残基がトレオニンである変異；
（５）配列番号２に示すアミノ酸配列の69番目のアミノ酸残基がイソロイシンである変異；
（ｂ）上記（ａ）に記載のペプチドのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなり、かつ抗オステオカルシン抗体の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列からなるペプチドとともにオステオカルシンを特異的に認識できるペプチド。
【００１０】
本発明によればさらに、下記の何れかのペプチドが提供される。
（ａ）配列番号５から７の何れかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号５から７の何れか記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなり、かつ抗オステオカルシン抗体の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列からなるペプチドとともにオステオカルシンを特異的に認識できるペプチド。
【００１１】
本発明によればさらに、下記の何れかのペプチドが提供される。
（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなり、かつ抗オステオカルシン抗体の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列からなるペプチドとともにオステオカルシンを特異的に認識できるペプチド。
【００１２】
本発明によればさらに、上記した本発明のペプチドをコードする核酸が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の核酸を含む、組み換えベクターが提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の組換えベクターにより形質転換された形質転換体が提供される。
【００１３】
本発明によればさらに、上記した本発明のペプチドを含む、オステオカルシン検出試薬が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明のペプチド、及び抗オステオカルシン抗体の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも含む、オステオカルシン検出キットが提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明のペプチドと被験試料とを接触させることを含む、オステオカルシンの免疫測定方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗体をオープンサンドイッチELISAに用いた場合、検出感度が、従来の抗BGP抗体であるKTM219よりも１０倍程度向上した。その結果、正常人の血中BGP濃度の下限値以下の約0.1ng/mlの抗原に対しても十分な感度が得られるようになり、再現性の高い実用的なBGPペプチド診断キットを提供することができる。さらに血中BGP濃度は、変形性骨炎、副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、悪性腫瘍の骨転移、多発性骨髄腫、慢性関節リウマチなどによっても増加するが、副甲状腺機能低下症、甲状腺機能低下症、クッシング症候群などでは逆に血中濃度の低下が誘発されることが明らかになっている。従来のサンドイッチ法では測定可能な濃度域が二桁程度であったために、低濃度側と高濃度側に測定可能域を調節した２つの測定系が必要であった。しかしながら、本発明による高感度化によって、オープンサンドイッチ法の測定可能域が0.1〜1000ng/mlへと拡張されたことで、骨粗しょう症患者とクッシング症候群患者を同じ測定系で診断することが可能になった。また、本発明のオープンサンドイッチ測定系を用いることで、BGP分解物の高感度定量が可能になったことから、分解物と未分解BGPの両者を合わせた全BGP定量が可能となるだけでなく、限外ろ過膜などによって分離した分解物と未分解物をそれぞれ定量することで、血中内BGP分解速度などを評価することも可能になり、基礎医学研究分野においても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明のペプチドは、抗オステオカルシン抗体の重鎖可変領域（VH）に相当するペプチドであり、抗オステオカルシン抗体の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列に少なくとも１以上のアミノ酸変異を導入することにより得られるアミノ酸配列からなりペプチドであって、オープンサンドイッチ免疫分析におけるオステオカルシンの検出感度が、上記アミノ酸変異の導入前のペプチドを用いた場合よりも向上していることを特徴とする。
【００１６】
本発明のペプチドの具体例としては、抗オステオカルシン抗体の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列において、少なくとも１以上の下記変異を有するアミノ酸配列からなるペプチドである。
（１）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の10番目のアミノ酸残基がバリンである変異；
（２）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の31番目のアミノ酸残基がセリンである変異；
（３）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の37番目のアミノ酸残基がイソロイシンである変異；
（４）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の58番目のアミノ酸残基がトレオニンである変異；
（５）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の69番目のアミノ酸残基がイソロイシンである変異；
（６）Kabatの番号付け系で上記 VHのアミノ酸配列の82番目のアミノ酸残基がアルギニンである変異；
【００１７】
Kabatの番号付け系とは、Kabat らによるEUインデックス（Kabat et. al., Sequences of proteins of Immunological Interest, NIH, 1991 Fifth edition）による番号付け系を示す。
【００１８】
本発明で用いることができる抗オステオカルシン抗体の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列の一例としては、配列番号２に示すアミノ酸配列を挙げることができる。また、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなり、かつ抗オステオカルシン抗体の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列からなるペプチドとともにオステオカルシンを特異的に認識できるペプチドを用いることもできる。
【００１９】
本発明において「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列」における「数個」とは、具体的には１〜２０個、好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましく１又は２個である。
【００２０】
本発明のペプチドは、当該ペプチドをコードする核酸を発現ベクターに組み込み、ベクターを適当な宿主細胞に導入し、細胞もしくは細胞の培養上清から回収、精製することにより得ることができる。ベクターとしては、宿主細胞で自律的に増殖できるか、又は宿主細胞の染色体に組み込まれ得るファージ又はプラスミドを使用することができる。プラスミドDNAとしては、大腸菌、枯草菌又は酵母に由来するプラスミドなどを用いることができ、ファージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。また、本発明においては、ファージミドベクターを使用することは好適である。ファージミドベクターは繊維状ファージゲノムの一部を含むようにして作製されたプラスミドであるために、ファージミドベクターを用いて大腸菌を形質転換した後、更にヘルパーファージに感染させる必要がある。これによって粒子形成のためのコート蛋白質が供給されて、ヘルパーファージ粒子とファージミド粒子が混合したファージが得られる。またより簡便な方法として、必要なＤＮＡ配列を含むファージベクターを利用することもまた可能である。ファージベクターの場合には、当該ファージベクターを大腸菌に感染させることによって直接ファージを得ることが可能であり、ヘルパーファージを使用する必要はない。
【００２１】
形質転換に使用する宿主としては、例えば、細菌（大腸菌など）、酵母、動物細胞（COS細胞、CHO細胞等）、昆虫細胞などを挙げることができるが、本発明のペプチドを発現できるものであれば特に限定されるものではない。宿主の形質転換の方法も特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リポフェクション法などが挙げられ、また各種市販のトランスフェクション試薬を用いて行うこともできる。
【００２２】
形質転換体を培養後、本発明のペプチドが細胞内に生産される場合には、細胞を破砕することにより本発明のペプチドを回収することができる。また、本発明のペプチドが細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去する。その後、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロースなどを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用いることによって、本発明のペプチドを単離精製することができる。
【００２３】
本発明においては、上記した本発明のペプチド（即ち、抗オステオカルシン抗体の重鎖可変領域（VH））と被験試料とを接触させることによって、オステオカルシンを免疫学的に測定することができる。例えば、抗オステオカルシン抗体の重鎖可変領域（VH及び軽鎖可変領域（VL）をコードする遺伝子を有するベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞外に分泌された抗体可変領域のＶＨ断片又はＶＬ断片の一方を含むタンパク質及び抗体可変領域のＶＨ断片又はＶＬ断片の他方を提示するファージを回収し、回収された抗体可変領域のＶＨ断片又はＶＬ断片の一方を含むタンパク質、及び抗体可変領域のＶＨ断片又はＶＬ断片の他方を提示するファージに、抗原を接触させて、ＶＨ断片、ＶＬ断片及び抗原の複合体を検出することによって、VHポリペプチドとVLポリペプチド間の相互作用を評価することができる。ＶＨ断片、ＶＬ断片及び抗原の複合体検出は、以下に説明するオープンサンドイッチイムノアッセイで行うことができる。
【００２４】
蛋白質性の抗原は、サンドイッチ法と呼ばれる２種類の抗体を使う方法で測定されることが一般的である。サンドイッチ法は、抗原に同時に結合できる２種類の抗体を用意する必要があるが、特異性と感度が高いという利点を有している。しかし、分子量1000以下の小分子は小さすぎて、二種類の抗体でサンドイッチすることが困難である。即ち、分子量1000以下の小分子は抗原決定基が一つしかない単価抗原であるため、二種類の抗体でサンドイッチすることが困難となる。そのためこのような小分子は通常、競合法と呼ばれる方法で測定される。しかし競合法は、条件設定が難しく、感度が低い、測定操作にかなりの注意深さが必要、といった難点を有している。
【００２５】
このような欠点のない、小分子でも非競合的に測定できる方法として、本発明者らは、オープンサンドイッチイムノアッセイという免疫測定法を報告している。この方法は基本的に、「抗体の可変領域（抗原結合部位）は抗原がないと不安定だが、抗原が結合すると安定化される」という原理を利用した方法である。抗体はH鎖とL鎖の２本の鎖で構成されるが、それぞれの抗原結合部位は ＶＨ, ＶＬと呼ばれこれらが抗原を認識できる最小単位である可変領域Fvを構成する。最近ではファージ提示法などを用いて容易にＶＨとＶＬをコードする遺伝子断片をクローニングすることができるが、ＶＨとＶＬの間の結合は非共有的で多くの場合不安定であり、これらをペプチドで結んで一本鎖抗体(scFv)として使われる場合がほとんどである。
【００２６】
本発明者らは、この不安定なFvが、抗原が結合すると安定化する場合があり、それを利用すれば抗原濃度を簡便かつ迅速に、さらに感度よく測定できることを見出した。すなわち、ＶＬ断片をプレートに固定化しておき、これにＶＨ断片にファージあるいはアルカリフォスファターゼを結合させたものと抗原を含むサンプルとを混ぜて一回洗浄した後にプレートに固定化されたファージあるいは酵素の量を測定すれば、それば抗原量と非常によい相関を示すことを見いだしている(UEDA, H. et al. Nature Biotechnol. 14, 1714-1718(1996))。
【００２７】
本発明によれば、例えば以下のような測定キットを作製することが可能である。
（１）抗オステオカルシン抗体のＶＬ断片をビオチン・アビジン相互作用を利用して、または物理的吸着を利用してチューブあるいはマイクロプレートに固定化する。
（２）抗オステオカルシン抗体のＶＨ断片とレポーター酵素（例えばアルカリフォスファターゼ）との融合蛋白質を作製しておき、これをサンプルと共にＶＬを固定化した固相と一定時間接触させる。
（３）洗浄後、固相化された酵素活性を測定し、サンプル中の抗原濃度の指標とする。
【００２８】
また、以下の測定キットを作製することも可能である。
（１）抗オステオカルシン抗体のＶＨ断片とＶＬ断片を互いに吸収・蛍光スペクトル重なる二種類の蛍光色素（例えばフルオレセインとローダミン）で標識しておく。
（２）これらをサンプルと混合し、５分程度おいて短波長側の蛍光色素のみを励起光で励起する。二種類の蛍光色素由来の蛍光強度を測定することで、ＶＨ／ＶＬの会合による蛍光エネルギー移動現象を検出することができる。二つの蛍光強度の比をサンプル中の抗原濃度の指標とする。この方法では前の方法に比べて、短時間で洗浄操作なしに抗原濃度が測定できる。
【００２９】
また、以下の測定キットを作製することもまた可能である。
（１）抗オステオカルシン抗体のＶＨ断片とＶＬ断片を、それぞれ単体では活性がないか、低いが近接させると活性の増大する二種類の酵素断片（例えばＬａｃＺ△αおよびＬａｃＺ△ω）との融合蛋白質として大腸菌で発現させ、精製しておく。
（２）二種類の融合蛋白質とサンプルを混合し、一定時間おいたのち基質（例えば発光基質Galacton Plus, Tropix, Bedford, MA）と混合し、融合蛋白質複合体の活性を測定することでサンプル中の抗原濃度の指標とする。この方法では、前の２つの方法に比べてはるかに高感度に抗原濃度を測定することが可能であり、また洗浄操作を含まない。
【００３０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例で使われる略語は以下の通りである。
2YT：1.6%バクトトリプトン、1% イーストエクストラクト、0.5% NaClを含む培地
2YTAG： 100 μg/mlアンピシリン及び 1% グルコースを含む2YT 
2YTAK：100 μg/mlアンピシリン、50μg/mlカナマイシン及び 0.1% グルコース を含む2YT
2YTAGプレート： 100 μg/ml アンピシリン及び 1% グルコース を含む2YT寒天培地
LB: 1%バクトトリプトン、0.5% イーストエクストラクト、0.5% NaClを含む培地
LBAC: 100 μg/mlアンピシリン及び 34 μl/mlクロラムフェニコールを含むLB
LBACプレート: 100 μg/mlアンピシリン及び 34 μl/mlクロラムフェニコールを含むLB寒天培地
LBAG: 100 μg/mlアンピシリン及び 1% グルコースを含むLB
LBACGプレート: 100 μg/mlアンピシリン及び 34 μl/mlクロラムフェニコール、1% グルコースを含むLB寒天培地
LBAGプレート：100 μg/mlアンピシリン及び 1% グルコースを含むLB寒天培地
SOC：2%バクトトリプトン、0.5% イーストエクストラクト、0.05% NaCl、2.5 mM KCl、20 mMグルコース、10 mM MgCl2を含む培地
PBS：137 mM NaClと2.7 mM KClを含む10 mM phosphate buffer(pH 7.2)
2% MPBS:2%(w/v)スキムミルクを含むPBS
5% IBPBS：5%(v/v)イムノブロック（大日本住友製薬，大阪）を含むPBS
20% IBPBS：20%(v/v)イムノブロックを含むPBS
PBST：0.1% triton-X100を含むPBS
TE：1 mM EDTAを含む10 mM Tris-HCl(pH 8.0)
TAEバッファー：1 mM EDTAを含む40mM Tris-acetate(pH 8.3) 
TALONバッファー：300 mM NaClを含む50 mMリン酸ナトリウム（pH7.0）
TALON溶出液：500 mMイミダゾールを含むTALONバッファー(pH7.0)
IPTG：イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド
PCIA：フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）の混合物
PEG/NaCl：20% Polyethylene glycol 6000、2.5 M NaCl
DMSO：ジメチルスルホキシド、dimethyl sulfoxide
BGPC8：BGPのC末端8アミノ酸残基からなる合成ペプチド（アミノ酸配列：YRRFYGPV）
【００３２】
すべての実験において、Milli-Q (Millipore Co., Billerica, MA)にて精製した水を用いた。以下、milliQ水と表記する。通常の試薬は特に表記のあるもの以外は、シグマ(St. Louis, MO)、ナカライテスク(京都)、和光純薬（大阪）、関東化学（東京）のものを使用した。オリゴDNAはテキサスジェノミクスジャパン（東京）、またはInvitrogen（東京）にて合成した。
Polymerase chain reaction (PCR)には、T3000 thermocycler (Biometra, Goettingen Germany)を、DNA配列決定には、CEQTM 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Fullerton, CA)を使用した。
【００３３】
大腸菌TG-1及びBL21(DE3)(pLysS)の遺伝子型は以下の通り。
TG-1: supE, hsd Δ5, thi, Δ(lac-proAB)/F' [traD36, proAB+, lacIq, lacZ ΔM15]
BL21(DE3)(pLysS)：F-, ompT, hsdSB(rB- mB-), gal(λcI 857, ind1, Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm(DE3)［pLysS, Camr］
【００３４】
PCRに用いたプライマー配列を以下に示す。
M13RV: 5'-caggaaacagctatgac-3'（配列番号９）
VH1for2Not : 5'-ctcatgcggccgctgaggagacggtgaccgtggtccc-3'（配列番号１０）
pHENseq: 5'-ctatgcggccccattca-3' （配列番号１１）
【００３５】
実施例１：MBP-VLの調製
MBP-VLは、プラスミドpMAL-VL(文献Lim et al. Anal.Chem. 79, 6193 (2007)参照)を大腸菌BL21(DE3)(pLysS)にヒートショック法で形質転換し、発現させた。プラスミド1 μl（約100 ng）とBL21(DE3)(pLysS)コンピテントセル100 μlを混合し氷上30min静置した後、42℃ 45秒ヒートショックしすぐに２分氷上静置した。その後、SOC培地200 μlを加え30分キュアリングし、LBACプレートに塗布して37℃で一晩培養した。
【００３６】
生じたコロニーを4 mlのLBACGに植菌し、30℃で一晩振とう培養を行った。少量培養した培養液4mlを1000 mlのLBACに加え、30℃で振とうし大量培養を行った。O.D.が0.5〜0.6になったところで1000 mM IPTG 400 μl を加え、さらに16℃で一晩時間振とう培養した。菌体培養液を遠心分離機でそれぞれ上清と大腸菌のペレットに分離した後、上清からは硫安沈殿法で、ペレットからは超音波菌体破砕で、それぞれMBP-VLを以下のように回収した。
【００３７】
上清約1000 mlに硫安430gを加えて、4℃で一晩攪拌した後、遠心分離によってMBP-VLを含む不溶物を回収し、30 mlのTALON バッファーに懸濁した。ペレットは、30 mlのTALONバッファーに懸濁し、ふた付50 ml遠沈チューブに移して、ソニケーターで菌体破砕し、遠心分離によってMBP-VLを含む上清を回収した。
【００３８】
上記で得られたMBP-VLを含む溶液は、TALONバッファーに対して透析した後、TARON affinity resin (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) 600 μlに加えた。4℃、20分間ローテーターで攪拌した後、約2,000 gの遠心分離によってresinを回収し、さらにTALONバッファーを加えて10分間攪拌した後同様にresinを回収した。その後、TALON溶出液を加えて、MBP-VLを含む上清を回収した後、PBSにバッファー交換し16%グリセロールで−80℃保存した。発現精製した蛋白はSDS-PAGEより確認を行った。
【００３９】
実施例２：MBP-VLのビオチン化
精製した1 mlのMBP-VL溶液（PBSバッファー、500 μg/ml）に対して、17.9 μlのビオチン化試薬（PEO4-Biotin（PIERCE Biotechonolgy, Rockford, IL））を加えて、4℃にて２時間反応を行った。反応後、透析を行うことで未反応のビオチン試薬を除去した。
【００４０】
実施例３：野生型VH（BGP）をコードするファージミドベクターの調製
まず、spFv(BGP)9A/pKST2(文献Lim et al. Anal.Chem. 79, 6193 (2007)参照)を鋳型としてPCRを行い、抗BGP抗体KTM219のVH断片を調製した。
PCRの条件は、以下の通りである。
【００４１】
反応液組成
spFv(BGP)9A/pKST2 (約100 μg/ml)                               1 μl
フォワードプライマーVH1for2Not (50 μM)                        1 μl
リバースプライマーM13RV (50 μM)                               1 μl
10x Ex taq buffer (Mg2+ 20 mM) (Takara bio, 大津)              10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each) (Takara bio)                        8μl
5 U/μl Ex Taq DNA polymerase (Takara bio)                     1 μl
milliQ 水                                                      78 μl
【００４２】
反応サイクル
1、94℃ 5 min
2、94℃ 30 sec 
3、55℃ 30 sec 
4、72℃ 30 sec 
(2から4を25回)
5、72℃ 10 min
6、16℃  ∞
【００４３】
PCR産物(VH(BGP))は、1.5％アガロースゲル（TAEバッファー）で電気泳動した後、400bp付近のバンドを切り出して、WizardR SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Co., Madison, WI)を用いて抽出した。続いて、Nco I及びNot Iサイトで切断するために、得られた100 μlのVH断片(2 μg)に、1 μl Nco I (RocheApplied Science, Basel,
Switzerland, 10 U)、1 μl Not I (Roche Applied Science 10 U)、4 μl 10x BSA溶液、4 μl 10x Hバッファー（Roche Applied Science）、15 μl milliQ水を添加し、37℃で一晩静置した。制限酵素処理されたVH断片は、上記と同様にアガロースゲル電気泳動、DNA抽出を行い、 25 μlのmilliQ水に溶解した。VH断片(約100 μg/ml)とpIT2ベクター(約870 μg/ml、MRC Cambridge)を、それぞれ2 μl混合し、2.5 μl T4 DNA ligase (Takara bio, 1250 U)、10 μl 10xT4 buffer (Takara bio)、83 μl milliQ水を添加して、16℃にて一晩反応させた。制限酵素を完全に失活させるために等量のPCIAと混合した後、DNAを含む上清（74 μl）を回収し、7.4 μlの3 M酢酸ナトリウムと148 μlのエタノールを加えて、-80℃で20分静置、11,600 g 4℃ 20分の遠心分離の後、得られた沈殿を70% エタノールで洗浄し、乾燥後20 μlのmilliQ水に懸濁した。続いて、100 μlのエレクトロポレーション用TG-1コンピテントセルに対して4 μlのライゲーション反応液を加え、電気穿孔法によってライゲーション産物を細胞内に導入した後、直ちにSOC 900 μlを添加し、37℃にて30分間インキュベーションを行った。その後2YTAGプレートに塗布し、一晩37℃で培養して得られたコロニーを4 mlの2YTAGで一晩培養し、遠心分離によって集菌した大腸菌からQIAquick miniprep kit(Qiagen, Hilden, Germany)にてプラスミドDNAを抽出し、Beckman Coulter社のプロトコールに従ってシーケンス決定を行い、図１の遺伝子構造を確認した。
【００４４】
実施例４：ライブラリーの作製
spFv(BGP)9A/pKST2を鋳型としてエラープローンPCRを行い、ランダム変異が導入された抗BGP抗体KTM219のVH断片を調製した。
エラープローンPCRの条件は、以下の通りである。
【００４５】
反応液組成
spFv(BGP)9A/pKST2 (約100 μg/ml)                           2 μl
フォワードプライマーVH1for2Not (50 μM)                    2 μl
リバースプライマーM13RV (50 μM)                           2 μl
10x Ex taq buffer (Mg2+ free) (Takara bio)                 20 μl
10 mM MnCl2                                                10 μl
100 mM dATP                                                0.7 μl
100 mM dCTP                                                0.8 μl
100 mM dGTP                                                0.4 μl
100 mM dTTP                                                2.7 μl
2% Triton-X100                                             10 μl
5 U/μl Taq DNA polymerase (Takara bio)                    3.2 μl
milliQ 水                                                  141.2 μl
【００４６】
反応サイクル
1、94℃ 5 min
2、94℃ 1 min
3、55℃ 1 min
4、72℃ 1 min
(2から4を30回)
5、72℃ 10 min
6、16℃  ∞
【００４７】
PCR産物(VH(BGP)ライブラリー)は、1.5％アガロースゲル（TAEバッファー）で電気泳動した後、400bp付近のバンドを切り出して、WizardR SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて抽出した。続いて、Nco I及びNot Iサイトで切断するために、得られた100 μlのVH(BGP)ライブラリー(11 μg)に、4 μl Nco I (Roche Applied Science 40 U)、4 μl Not I (Roche Applied Science40 U)、15 μl 10x BSA溶液、15 μl 10x Hバッファー（Roche Applied Science）、12 μl milliQ水を添加し、37℃で一晩静置した。制限酵素処理されたVH(BGP)ライブラリーは、上記と同様にアガロースゲル電気泳動を行い、DNA抽出を行った。さらにVH(BGP)ライブラリー溶液72 mlは、上記と同様にPCIA処理、エタノール沈殿を行った後、15 μl milliQに溶解した（収量 4.35 μg）。
【００４８】
VH(BGP)ライブラリーを組み込むベクターは、以下の通り作製した。
まず、pIT2(66 μg, 200 μl)のNco I及びNot I処理を行った。また、セルフライゲーションによる寄与を軽減させたる目的で、Nco IとNot I間に含まれるXho Iサイトでの切断も同時に行った。制限酵素処理は、10 μl Nco I (Roche Applied Science 100 U)、3 μl Not I (Roche Applied Science120 U)、3 μl Xho I (Roche Applied Science40 U)、30 μl 10x BSA溶液、30 μl 10x Hバッファー（Roche Applied Science）、19 μl milliQ水を添加し、37℃で6時間静置した。処理後は、上記と同様に、アガロースゲル電気泳動、DNA抽出、PCIA処理、エタノール沈殿を行い、26 μgの制限酵素処理ベクターを得た。
【００４９】
VH(BGP)ライブラリーとpIT2ベクターのライゲーション反応と形質転換は、以下の通り行った。
VH(BGP)ライブラリー(290 μg/ml)とpIT2ベクター(870 μg/ml)を、それぞれ2.3、2.1 μlもしくは2.3、6.9 μl混合し、2.5 μl T4 DNA ligase (1250 U)、10 μl 10xT4 buffer、83 μl milliQ水を添加して、16℃にて一晩反応させた。その後、上記と同様に、PCIA処理、エタノール沈殿を行い、20 μlのmilliQ水に懸濁した。続いて、100 μlのエレクトロポレーション用TG-1コンピテントセルに対して4 μlのライゲーション反応液を加え、電気穿孔法によってライゲーション産物を細胞内に導入した後、直ちにSOC 900 μlを添加した。同じ操作を合計5回繰り返し、すべて混合した後、37℃にて30分間インキュベーションを行った。その後、一部をサンプリングして、残りにDMSO 377 μlを加えて-80℃にて保存した。サンプリングした形質転換体を2YTAGプレートに塗布し、一晩37℃の培養で得られたコロニー数から、形質転換体は合計1.3 x 108クローン得られたことが見積もられた。またいくつかのコロニーを4 mlの2YTAGで一晩培養し、遠心分離によって集菌した大腸菌からQIAquick miniprep kitにてプラスミドDNAを抽出し、シーケンスを決定した。その結果、VH遺伝子当たり3.3個の置換が導入されており、またフレームシフト変異は約20％のクローンに起こっていることが明らかとなった。
【００５０】
上記で保存した形質転換体（VH（BGP）/pIT2ライブラリー）を、1000 mlの2YTAGに植菌して、37℃にて培養し、OD600が約0.5になった時点で培養液80 mlを分取し、KM13 helper phage（6.8 x 1011 cfu）を添加した。30℃30分間静置した後、3,300 gで菌体を遠心分離して、上清を捨て、320 ml 2YTAKに再懸濁し、バッフル付フラスコで30℃16時間、200 rpmで攪拌した。さらに、3,300 gの遠心分離によって回収した上清  320 mlに対して、80 mlのPEG/NaClを加えて、氷上で2時間静置した。その後、3,300 g 30分遠心分離によって得たペレットを10 ml TEにて懸濁し、11,600 g 10分遠心して大腸菌を取り除き、上清（VH(BGP)phageライブラリー）を回収した。
【００５１】
実施例５：オープンサンドイッチ-パニング
VH(BGP)phageライブラリーから、抗原存在下にて、VLとの相互作用の強いクローンをセレクションするために、以下のようなオープンサンドイッチ-パニングを行った。
まず、VH(BGP)phageライブラリー（1010 cfu）とビオチン化MBP-VL溶液（終濃度0.5 mg/ml）12.5 μl、BGPC8(終濃度1 ng/ml)を含む250 μlの2% MPBSを調製し、室温30分間ローテーターで攪拌した後、60分間静置した。その間に、ストレプトアビジン固定化マグネチックビーズ（Dynal Biotech, Oslo, Norway）懸濁液12 μlを2% MPBS 200 μlと混合して、室温60分間静置した後、マグネチックセパレーター(12-Tube Magnet(Qiagen))を用いてビーズを回収した。そこに、上記のVH(BGP)phageライブラリーとビオチン化MBP-VL溶液、BGPC8の混合液を添加し、室温15分間ローテーターで攪拌した。その後回収したビーズをPBS-Tで三回洗浄し、200 μlの1mg/ml Trypsin溶液を加えて、15 分間室温ローテーターで攪拌した。ファージ溶出液を半分に分け、一方をグリセロールストックへ、一方には900 μlのTG-1培養液（OD600 = 0.4）を加えて、37℃で30分静置し、11,600 gで10分間遠心した。ペレット（ファージ感染TG-1）は、50 ml 2TYAGに懸濁し、OD600が約0.4になるまで、37℃で培養した。その後、半分はグリセロールストックへ、残りは上記の通りヘルパーファージを加えて、抗体提示ファージを調製し、2ラウンド目のパニングを行った。2ラウンド目のファージ溶出液で感染させたTG-1は2YTAGプレートに播種し、得られた多数のコロニーは、それぞれ4 ml LBAGに懸濁して上記の通りシーケンスを行うとともに、上記の通りファージを調製し、モノクローナルVH提示ファージを得た。
【００５２】
実施例６：モノクローナルファージOS-ELISA
上で得られたモノクローナルVH提示ファージを用いてOS-ELISAを行った。
1 μg/mlのMBP-VLを含むPBS溶液をFalcon3912マイクロプレートに1ウェルあたり100 μlずつ分注し、4℃で一晩静置した。マイクロプレートから溶液を廃棄した後、そこに20% IBPBSを200μl加え、室温で2時間置いてブロッキングを行った。次いで、マイクロプレートをPBS-Tで洗浄した後、上記で得られた1010 cfu/ml VH提示ファージと様々な濃度（0〜100 ng/ml）のBGPC8含む5% IBPBSを100 μl加え室温で、60分間静置した。ここまでの操作で固定化されたVH提示ファージを検出するために、マイクロプレートをPBS-T洗浄後、5% IBPBSで1/5000に希釈したHRP/anti-M13 Monoclonal Conjugate（GE Healthcare UK Ltd., Amersham Place, England）を100 μl加え室温で１時間静置した。その後マイクロプレートをPBS-Tで三回洗浄した後、あらかじめ調製した酵素反応溶液（50 ml 100 mM 酢酸ナトリウム pH6.0、500 μl 10 mg/ml TMBZ（in DMSO）、10 μl H2O2）を各wellへ100μlずつ添加して反応を開始した。暗所で約5分間反応させた後、3.2N H2SO4を50 μlずつ添加して反応を止め、プレートリーダーで450 nmの吸光度を測定した（対照は655 nm）。その結果、野生型抗BGP抗体VH提示ファージを用いたモノクローナルファージOS-ELISAでは検出感度が約1 ng/mlであるのに対して、２つのクローン（O2AG2、O2AH2）ではそれぞれ約0.01 ng/ml、0.1 ng/mlと、有意に検出感度が改善されていることが明らかとなった（図２、図３）。シーケンスの結果、O2AG2のVH（配列番号５）には、N31→S、V37→I、S58→T、H82→Rの４つのアミノ酸変異が、またO2AH2のVH（配列番号８）にはE10→V、T69→Iの２つのアミノ酸変異が確認された。
【００５３】
O2AG2で観察された４つの変異のうち、V37→Iの変異のみを野生型に導入したsingle mutant（配列番号６）、V37→I及びS58→T、H82→Rの３つの変異を導入したtriple mutant（配列番号７）を、以下の通り作製した。
まず、それぞれ４つの変異部位を含むDNA断片を、野生型及びO2AG2をコードするpIT2を鋳型とするPCRによって増幅した。条件を以下に示す。
【００５４】
反応液組成
（鋳型） (約100 μg/ml)                           1 μl
フォワードプライマーpHENseq(100 μM)              0.5 ml
リバースプライマーM13RV (100 μM)                 0.5 μl
10x Ex taq buffer (Mg2+ 20 mM) (Takara bio)       10 μl
dNTP mixture (2.5 mM each) (Takara bio)           8 μl
5 U/μl Ex Taq DNA polymerase (Takara bio)        1 μl
milliQ 水                                         79 μl
【００５５】
反応サイクル
1、96℃ 2 min
2、94℃ 30 min 
3、55℃ 30 min 
4、72 18 sec 
(2から4を25回)
5、72℃ 5 min
6、16℃  ∞
【００５６】
PCR産物はそれぞれWizardR SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて精製した後、O2AG2から増幅した37番目を含むDNA断片と、野生型から増幅したそれ以外の３つのDNA断片をそれぞれ当量混合し、以下の条件でoverlap extension PCRを行った。用いたプライマーはM13RVおよびpHENseqであった。
【００５７】
DNA断片混合物                                      4 μl
10x Ex taq buffer (Mg2+ 20 mM) (Takara bio)        10 μl
dNTP mixture (2.5 mM each)                         8 μl
5 U/μl Ex Taq DNA polymerase (Takara bio)         2 μl
milliQ 水                                          76 μl
【００５８】
反応サイクル
1、94℃ 5 min
2、94℃ 30 sec 
3、56℃ 30 sec 
4、72℃ 40 sec 
(2から4を15回)
5、プライマーを各100 μM 1μl、およびEx taq (Takara bio) 1 μlを添加
6、94℃ 5 min
7、58℃ 30 sec
8、72℃ 40 sec 
(6から8を35回)
9、72℃ 5 min
10、16℃  ∞
【００５９】
また、同様に野生型から増幅した31番目を含むDNA断片と、O2AG2から増幅したそれ以外の３つのDNA断片を混合して、overlap extension PCRを行った。用いたプライマーはM13RVおよびpHENseqであった。
【００６０】
その結果、得られたsingle mutantとtriple mutantのVH断片を、上記と同様にファージミドベクターpIT2に挿入し、同様にモノクローナルファージOS-ELISAを行った（図２）。その結果、アミノ酸変異は、検出感度の改善に相加的な寄与を示していることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、野生型VH（BGP）をコードするファージミドベクターの構造を示す。
【図２】図２は、モノクローナルVH提示ファージを用いてオープンサンドイッチELISAを行った結果を示す。
【図３】図３は、モノクローナルVH提示ファージを用いてオープンサンドイッチELISAを行った結果を示す。
【図４】図４は、抗BGP抗体であるKTM219のVHドメイン（塩基配列を配列番号１に示し、アミノ酸配列を配列番号２に示す）及びVLドメイン（塩基配列を配列番号３に示し、アミノ酸配列を配列番号４に示す）を示す。
【図１】
2009278908.tif 000002
【図２】
2009278908.tif 000003
【図３】
2009278908.tif 000004
【図４】
2009278908.tif 000005
【配列表】
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