(57)【要約】【課題】本発明は、生理学的条件下に高度に蛍光性であり、そして蛍光性オリゴヌクレオチドの化学的合成において使用できる新規なプテリジンヌクレオチドを提供する。【解決手段】本発明は、１または２以上のプテリジンヌクレオチドを含んでなる蛍光性オリゴヌクレオチドをさらに提供する。さらに、本発明は、DNA 増幅法において構成モノマーとして使用できるプテリジンヌクレオチドトリホスフェートを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記に示すように環の頂点１〜８をもつ式；
【化１】
2009091358.tif 000027
（式中、Ｒ11はＲ12と組合わされて二重結合により環の頂点４に結合する単一のオキソ酸素を形成するか、またはＲ13と結合して環の頂点３と４との間の二重結合を形成し、
Ｒ12はＲ11と組合わされないとき、NH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択される構成員であり、
Ｒ13はＲ11と結合しないとき、低級アルキルまたはＨであり、
Ｒ14はＨ、低級アルキルまたはフェニルから成る群より選択される構成員であり、
Ｒ15はＲ16と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合する単一のオキソ酸素を形成するか、またはＲ17と結合して環の頂点１と２との間の二重結合を形成し、こうして環の頂点２および４は集合的に最大１つのオキソ酸素を有し、
Ｒ16はＲ15と組合わされないとき、Ｈ、フェニル、NH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択される構成員であり、
Ｒ15がＲ16と組合わされないとき、Ｒ18はＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ15がＲ16と組合わされるとき、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はＨおよび低級アルキルから成る群より選択される構成員であり、そして
Ｒ17はＲ15と結合しないとき、かつＲ20はＲ18と結合しないとき、
【化２】
2009091358.tif 000028
であり、式中、
Ｒ21はＨ、トリホスフェート、および保護基から成る群より選択される構成員であり、
Ｒ22はＨ、OHおよび保護基で置換されたOHから成る群より選択される構成員であり、
Ｒ23はＨ、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ヘミスクシネート、固体の支持体に共有結合したヘミスクシネート、ジシクロヘキシルカーボジイミド、および固体の支持体に共有結合したジシクロヘキシルカーボジイミドから成る群より選択される構成員であり、
Ｒ13がＨでありかつＲ23がＨであるとき、Ｒ21はトリホスフェートであり、そして
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成しかつＲ23がＨであるとき、Ｒ21はトリホスフェートである）
を有する化合物。
【請求項２】
Ｒ14がＨ，CH3 およびフェニルから成る群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ14がＨおよびCH3 から成る群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ16が、Ｒ15と結合しないとき、Ｈ、フェニル、NH2 、および保護基で２置換されたNH2 から成る群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ16が、Ｒ15と結合しないとき、Ｈおよびフェニルから成る群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ18がＲ20と結合するとき、Ｒ19がＨおよびCH3 から成る群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ14がＨ，CH3 およびフェニルから成る群より選択される構成員であり、Ｒ16が、Ｒ15と結合しないとき、Ｈ、フェニルおよびNH2 から成る群より選択される構成員であり、そして、Ｒ18がＲ20と結合するとき、Ｒ19がＨおよびCH3 から成る群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ12がベンゾイル、イソブチリル、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、ジメチルアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルおよびジメチルアミノメチレンアミノから成る群より選択される保護基で１または２置換されたNH2 である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ12がジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニル、およびジメルチアミノメチレンアミノから成る群より選択される保護基で１置換されたNH2 である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ16がベンゾイル、イソブチリル、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、ジメチルアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルおよびジメチルアミノメチレンアミノから成る群より選択される保護基で１または２置換されたNH2 である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ16がジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニル、およびジメルチアミノメチレンアミノから成る群より選択される保護基で１置換されたNH2 である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ21がＨ、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリレン、およびジメチルアミノメチリデンから成る群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ21がジメトキシトリチル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリレン、およびジメチルアミノメチリデンから成る群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ22がＨ，OHおよび置換OHから成る群より選択される構成員であり、前記置換OHはトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、テトラヒドロピラン−１−イル、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル、１−（２−クロロ−４−メチル）フェニル−４−メトキシピペリジン−４−イル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｐ−ニトロフェニルエチルスルホニル、テトラヒドロピラニル、４−メトキシテトラヒドロピラニル、２−ニトロベンジル、９−フェニルキサンテン−９−イルおよびｐ−ニトロフェニルエチルから成る群より選択される構成員で置換されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ22がＨおよび置換OHから成る群より選択される構成員であり、前記置換OHがジメトキシトリチル、テトラヒドロピラン−１−イル、ｔ−ブチルジメチルシリル、２−ニトロベンジル、およびｐ−ニトロフェニルエチルから成る群より選択される構成員で置換されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
式中、
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、
Ｒ12がNH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択され、
Ｒ14がＨであり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がフェニルであり、
Ｒ18がＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化３】
2009091358.tif 000029
である、
請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
式中、
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、
Ｒ12がNH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択され、
Ｒ14がフェニルであり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がＨであり、
Ｒ18がＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化４】
2009091358.tif 000030
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
式中、
Ｒ11がＲ13と組合わされて二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソを形成し、
Ｒ13がCH3 であり、
Ｒ14がＨであり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がNH2 であり、
Ｒ18がＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化５】
2009091358.tif 000031
である、
請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
式中、
Ｒ11がＲ12と組合わされて二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ13がＨであり、
Ｒ14がＨであり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がNH2 および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択され、
Ｒ18がＲ19と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化６】
2009091358.tif 000032
である、
請求項１に記載の化合物。
【請求項２０】
式中、
Ｒ11がＲ12と結合して二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ13がＨであり、
Ｒ14がCH3 であり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がNH2 および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択され、
Ｒ18がＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化７】
2009091358.tif 000033
である、
請求項１に記載の化合物。
【請求項２１】
式中、
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、
Ｒ12がNH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択され、
Ｒ14がCH3 であり、
Ｒ15がＲ16と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ17が
【化８】
2009091358.tif 000034
であり、
Ｒ18がＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして
Ｒ19がCH3 である、
請求項１に記載の化合物。
【請求項２２】
式中、
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、
Ｒ12がNH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択され、
Ｒ14がＨであり、
Ｒ15がＲ16と結合して二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ17が
【化９】
2009091358.tif 000035
であり、
Ｒ18がＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして
Ｒ19がCH3 である、
請求項１に記載の化合物。
【請求項２３】
式中、
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、
Ｒ12がNH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択され、
Ｒ14がCH3 であり、
Ｒ15がＲ16と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ17が
【化１０】
2009091358.tif 000036
であり、
Ｒ18がＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして
Ｒ19がＨである、
請求項１に記載の化合物。
【請求項２４】
式中、
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、
Ｒ12がNH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択され、
Ｒ14がＨであり、
Ｒ15がＲ16と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ17が
【化１１】
2009091358.tif 000037
であり、
Ｒ18がＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして
Ｒ19がＨである、
請求項１に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ12がNH2 である、請求項16に記載の化合物。
【請求項２６】
式中、
Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そして
Ｒ23がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員である、
請求項16に記載の化合物。
【請求項２７】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、
請求項16に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ12がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項27に記載の化合物。
【請求項２９】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである、
請求項26に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ12がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項29に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｒ12がNH2 である、請求項17に記載の化合物。
【請求項３２】
式中、
Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そして
Ｒ23がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員である、
請求項17に記載の化合物。
【請求項３３】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、
請求項32に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒ12がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項33に記載の化合物。
【請求項３５】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである、
請求項32に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ12がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項35に記載の化合物。
【請求項３７】
Ｒ23がH,H−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員である、請求項18に記載の化合物。
【請求項３８】
式中、
Ｒ21がＨであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がＨである、
請求項37に記載の化合物。
【請求項３９】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、
請求項37に記載の化合物。
【請求項４０】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである、
請求項37に記載の化合物。
【請求項４１】
Ｒ16がNH2 である、請求項19に記載の化合物。
【請求項４２】
式中、
Ｒ16が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そして
Ｒ23がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員である、
請求項19に記載の化合物。
【請求項４３】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、
請求項42に記載の化合物。
【請求項４４】
Ｒ16がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項43に記載の化合物。
【請求項４５】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである、
請求項42に記載の化合物。
【請求項４６】
Ｒ16がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項45に記載の化合物。
【請求項４７】
Ｒ16がNH2 である、請求項20に記載の化合物。
【請求項４８】
式中、
Ｒ16が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そして
Ｒ23がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員である、
請求項21に記載の化合物。
【請求項４９】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、
請求項48に記載の化合物。
【請求項５０】
Ｒ16がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項49に記載の化合物。
【請求項５１】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである、
請求項48に記載の化合物。
【請求項５２】
Ｒ16がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項51に記載の化合物。
【請求項５３】
Ｒ12がNH2 である、請求項21に記載の化合物。
【請求項５４】
式中、
Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そして
Ｒ23がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員である、
請求項21に記載の化合物。
【請求項５５】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、
請求項54に記載の化合物。
【請求項５６】
Ｒ12がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項55に記載の化合物。
【請求項５７】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである、
請求項54に記載の化合物。
【請求項５８】
Ｒ12がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項57に記載の化合物。
【請求項５９】
Ｒ12がNH2 である、請求項22に記載の化合物。
【請求項６０】
式中、
Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そして
Ｒ23がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員である、
請求項22に記載の化合物。
【請求項６１】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、
請求項60に記載の化合物。
【請求項６２】
Ｒ12がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項61に記載の化合物。
【請求項６３】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである、
請求項60に記載の化合物。
【請求項６４】
Ｒ12がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項63に記載の化合物。
【請求項６５】
Ｒ12がNH2 である、請求項23に記載の化合物。
【請求項６６】
式中、
Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そして
Ｒ23がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員である、
請求項23に記載の化合物。
【請求項６７】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、
請求項66に記載の化合物。
【請求項６８】
Ｒ12がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項67に記載の化合物。
【請求項６９】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである、
請求項66に記載の化合物。
【請求項７０】
Ｒ12がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項69に記載の化合物。
【請求項７１】
Ｒ12がNH2 である、請求項24に記載の化合物。
【請求項７２】
式中、
Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そして
Ｒ23がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員である、
請求項24に記載の化合物。
【請求項７３】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、
請求項72に記載の化合物。
【請求項７４】
Ｒ12がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項73に記載の化合物。
【請求項７５】
式中、
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである、
請求項72に記載の化合物。
【請求項７６】
Ｒ12がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項75に記載の化合物。
【請求項７７】
式中、
Ｒ21がトリホスフェートであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がＨである、
請求項16に記載の化合物。
【請求項７８】
式中、
Ｒ21がトリホスフェートであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がＨである、
請求項17に記載の化合物。
【請求項７９】
式中、
Ｒ21がトリホスフェートであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がＨである、
請求項18に記載の化合物。
【請求項８０】
式中、
Ｒ21がトリホスフェートであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がＨである、
請求項19に記載の化合物。
【請求項８１】
式中、
Ｒ21がトリホスフェートであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がＨである、
請求項20に記載の化合物。
【請求項８２】
式中、
Ｒ21がトリホスフェートであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がＨである、
請求項21に記載の化合物。
【請求項８３】
式中、
Ｒ21がトリホスフェートであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がＨである、
請求項22に記載の化合物。
【請求項８４】
式中、
Ｒ21がトリホスフェートであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がＨである、
請求項23に記載の化合物。
【請求項８５】
式中、
Ｒ21がトリホスフェートであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がＨである、
請求項24に記載の化合物。
【請求項８６】
下記に示すように環の頂点１〜８をもつ式
【化１２】
2009091358.tif 000038
（式中、
Ｒ11はＲ12と組合わされて二重結合により環の頂点４に結合する単一のオキソ酸素を形成するか、またはＲ13と結合して環の頂点３と４との間の二重結合を形成し、
Ｒ12はＲ3 と組合わされないとき、NH2 であり、
Ｒ13はＲ11と結合しないとき、低級アルキルまたはＨであり、
Ｒ14はＨ、低級アルキルまたはフェニルから成る群より選択される構成員であり、
Ｒ15はＲ16と組合わされて二重結合により環の頂点２に結合する単一のオキソ酸素を形成するか、またはＲ17と結合して環の頂点１と２との間の二重結合を形成し、こうして環の頂点２および４は集合的に最大１つのオキソ酸素を有し、
Ｒ16はＲ15と組合わされないとき、Ｈ、フェニル、およびNH2 から成る群より選択される構成員であり、
Ｒ15がＲ16と組合わされないとき、Ｒ18はＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ15がＲ16と組合わされるとき、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はＨおよび低級アルキルから成る群より選択される構成員であり、そして
Ｒ17はＲ15と結合しないとき、かつＲ２０はＲ１８と結合しないとき、
【化１３】
2009091358.tif 000039
であり、式中、
Ｒ22はＨおよびOHから成る群より選択される構成員である）
を有するプテリジン誘導体である１種または２種以上のヌクレオチドモノマーを含んでなるオリゴヌクレオチド。
【請求項８７】
Ｒ14がＨ，CH3 およびフェニルから成る群より選択される、請求項86に記載の化合物。
【請求項８８】
Ｒ14がＨおよびCH3 から成る群より選択される、請求項86に記載の化合物。
【請求項８９】
Ｒ16が、Ｒ15と結合しないとき、Ｈ、フェニル、およびNH2 から成る群より選択される、請求項86に記載の化合物。
【請求項９０】
Ｒ16が、Ｒ15と結合しないとき、Ｈおよびフェニルから成る群より選択される、請求項86に記載の化合物。
【請求項９１】
Ｒ18がＲ20と結合するとき、Ｒ19がＨおよびCH3 から成る群より選択される、請求項86に記載の化合物。
【請求項９２】
Ｒ16がＨ，CH3 およびフェニルから成る群より選択される構成員であり、Ｒ16が、Ｒ15と結合しないとき、Ｈ、フェニルおよびNH2 から成る群より選択される構成員であり、そして、Ｒ18がＲ20と結合するとき、Ｒ19がＨおよびCH3 から成る群より選択される、請求項86に記載の化合物。
【請求項９３】
式中、
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、
Ｒ12がNH2 であり、
Ｒ14がＨであり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がフェニルであり、
Ｒ16がＲ19と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化１４】
2009091358.tif 000040
である、
請求項86に記載の化合物。
【請求項９４】
式中、
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、
Ｒ12がNH2 であり、
Ｒ14がフェニルであり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がＨであり、
Ｒ16がＲ19と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化１５】
2009091358.tif 000041
である、
請求項86に記載の化合物。
【請求項９５】
式中、
Ｒ11がＲ12と結合して二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ13がCH3 であり、
Ｒ14がＨであり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がNH2 であり、
Ｒ16がＲ19と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化１６】
2009091358.tif 000042
である、
請求項86に記載の化合物。
【請求項９６】
式中、
Ｒ11がＲ12と結合して二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ13がＨであり、
Ｒ14がＨであり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がNH2 であり、
Ｒ18がＲ19と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化１７】
2009091358.tif 000043
である、
請求項86に記載の化合物。
【請求項９７】
式中、
Ｒ11がＲ12と結合して二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ13がＨであり、
Ｒ14がCH3 であり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がNH2 および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択され、
Ｒ18がＲ19と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化１８】
2009091358.tif 000044
である、
請求項86に記載の化合物。
【請求項９８】
式中、
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、
Ｒ12がNH2 であり、
Ｒ14がCH3 であり、
Ｒ15がＲ16と結合して二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ17が
【化１９】
2009091358.tif 000045
である、
Ｒ18がＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして
Ｒ19がCH3 である、
請求項86に記載の化合物。
【請求項９９】
式中、
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、
Ｒ12がNH2 であり、
Ｒ14がＨであり、
Ｒ15がＲ16と結合して二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ17が
【化２０】
2009091358.tif 000046
であり、
Ｒ18がＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして
Ｒ19がCH3 である、
請求項86に記載の化合物。
【請求項１００】
式中、
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、
Ｒ12がNH2 であり、
Ｒ14がCH3 であり、
Ｒ15がＲ16と結合して二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ17が
【化２１】
2009091358.tif 000047
であり、
Ｒ18がＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして
Ｒ19がＨである、
請求項86に記載の化合物。
【請求項１０１】
式中、
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、
Ｒ12がNH2 であり、
Ｒ14がＨであり、
Ｒ15がＲ16と結合して二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ17が
【化２２】
2009091358.tif 000048
であり、
Ｒ18がＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして
Ｒ19がＨである、
請求項86に記載の化合物。
【請求項１０２】
前記ヌクレオチドモノマーが前記オリゴヌクレオチドの３'末端に存在する、請求項86に記載の化合物。
【請求項１０３】
前記ヌクレオチドモノマーが前記オリゴヌクレオチドの５'末端に存在する、請求項86に記載の化合物。
【請求項１０４】
前記ヌクレオチドモノマーが１〜10ピリミジンモノマーにより囲まれている、請求項86に記載の化合物。
【請求項１０５】
５’−GTN TGG AAA ATC TCT AGC AGT −３’（配列識別No：２），
５’−GTG TNG AAA ATC TCT AGC AGT −３’（配列識別No：３），
５’−GTG TGN AAA ATC TCT AGC AGT −３’（配列識別No：４），
５’−GTG TGG AAA ATC TCT ANC AGT −３’（配列識別No：５），
５’−GTG TGG AAA ATC TCT AGC ANT −３’（配列識別No：６），
５’−GTG TNG AAA ATC TCT ANC AGT −３’（配列識別No：７），
５’−ACT GCT AGA NAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：８），
５’−ACT GCT ANA GAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：９），
５’−ACT NCT AGA GAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：10）および
５’−ACT GCT NGA GAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：11）、
から成る群より選択され、ここでＡはアデノシンヌクレオチドであり、Ｃはシトシンヌクレオチドであり、Ｇはグアノシンヌクレオチドであり、Ｔはチミジンヌクレオチドであり、そしてＮはプテリジンヌクレオチドであり、式中Ｒ11がＲ12と結合して二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ13がCH3 またはＨであり、Ｒ14がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ16がNH2 であり、Ｒ18がＲ19と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ20が
【化２３】
2009091358.tif 000049
であり、式中Ｒ22がＨである、請求項86に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光性DNA としてのプテリジンヌクレオチド類似体に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成オリゴヌクレオチドは、ゲノムおよび相補的DNA ライブラリーのスクリーニングのためのプローブとして、DNA 合成、配列決定、および増幅のプライマーとして、そしてDNA −タンパク質の相互作用の研究において、分子生物学において多数の用途を見出す。さらに、オリゴヌクレオチドプローブは、インサイチュ・ハイブリダイゼーションの技術を使用するin vitro遺伝子発現をアッセイするために有用であることが明らかになった。
【０００３】
DNA 配列決定法、蛍光性標識、および検出系における最近の改良は、これらの用途のすべてにおいて蛍光標識化オリゴヌクレオチドの使用を劇的に増加した。典型的には、オリゴヌクレオチドは蛍光性マーカーで、共有結合により直接（例えば、炭素リンカー）標識化するか、または間接的に標識化することができ、間接的標識化において、オリゴヌクレオチドを分子、例えば、ビオチンまたはジオキシゲニンに結合し、次いでこれを蛍光標識化した結合部分（例えば、ストレプチアビジンまたは標識化モノクローナル抗体）にカップリングさせる。
【０００４】
しかしながら、これらの蛍光標識化系は、蛍光性複合体およびそれらの結合部分が比較的大きいという欠点に悩まされる。大きい蛍光標識および関連するリンカーの存在は、配列決定におけるようにゲルを通して、または細胞の種々の区画を通して、オリゴヌクレオチドの移動度を変更することがある。
【０００５】
さらに、これらのマーカーの存在は、化学的相互作用または立体障害を通して、オリゴヌクレオチドと他の分子との相互作用を変更する。したがって、これらのマーカーの存在は、DNA と他の分子、例えば、タンパク質との相互作用の研究を困難とする。タンパク質−DNA の相互作用の研究は、相互作用が生物学における最も基本的メカニズムのあるものを含むので、非常に重要である。相互作用は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さに沿ったDNA ポリメラーゼまたは逆転写酵素の進行、AP１またはステロイドホルモン経路におけるように遺伝子転写の活性、またはHIV IN酵素により仲介されるようなウイルスDNA の宿主ゲノムの中への挿入を包含する。これらの理由で、ピリミジンまたはプリンヌクレオチドに構造が類似しかつオリゴヌクレオチドの中に組込むすることができる蛍光性成分を得ることは望ましい。このような成分は、オリゴヌクレオチドの大きさまたは化学的性質を変更しないで、オリゴヌクレオチド分子を蛍光性とすることが好ましい。
【０００６】
ヌクレオチドの多数の類似体が知られている。それらの中にはプテリジン誘導体がある。プリンヌクレオチドに構造的に類似する、これらの産物の合成法はよく知られている。事実、新しい生物学的に活性な化合物を発見する希望をもって、多数のプテリジン由来の類似体が合成されてきている。こうして、Pfleiderer（米国特許第 3,798,210号および米国特許第 3,792,036号）は、抗菌および抗ウイルス特性を有する多数のプテリジン−グリコシドを開示した。しかしながら、Pfleidererはこれらの化合物の蛍光性を研究しなかった。
【０００７】
同様に、Schmidt et al., Chem. Ber. 106 : 1952-1975 (1973)は、１系列のプテリジン誘導体をリボシド化してヌクレオチドグアノシンの構造類似体を生成することを記載しているが、Harris et al., Liebigs Ann. Chem. 1457-1468 (1981)は、アデノシンに構造的に類似するプテリジン誘導体の合成を記載している。再び、いずれの参考文献もヌクレオシドの蛍光性の測定を記載していない。
【０００８】
ルマジン誘導体を組込んだオリゴヌクレオチドの合成は、Bannwarth et al., Helvetica Chimica Acta. 74 : 1991-1999 (1991), Bannwarth et al., Helvetica Chimica Acta. 74 : 2000-2007 (1991)およびBannwarth et al.,(欧州特許出願第 0439036A2号）に記載された。Bannwarth et al.はルマジン誘導体をバソフェナンスロリン−ルテニウム複合体と組み合わせてエネルギー転移系として利用し、ここでルマジン誘導体はエネルギードナーとして作用し、そしてルテニウム複合体はエネルギーレセプターとして作用した。２つの化合物を接近させて蛍光を発生させるとき、エネルギー転移は起こった。この系は２つの基を有する分子の相互作用を研究するのためのメカニズムを提供した。しかしながら、この参考文献はオリゴヌクレオチドにおいてルマジン誘導体を単独で使用することを記載しなかった。さらに、Bannwarth は、ルマジン誘導体の主要な欠点は「・・・ルマジン発色団の長波長の吸収についての比較的低い吸光係数（ε＝8900m-1cm-1，324nm, pH6.9) 」であることを認識した。Bannwarth et al., Helv. Chim. Acta. 74 : 1991-1999 (1991) 。
【０００９】
本発明は、プリンヌクレオチドに構造が類似し、通常の生理学的条件下に高度に蛍光性であり、そしてオリゴヌクレオチドの化学的合成において使用するために適当である、多数のプテリジンヌクレオチドを提供することによって、これらの先行技術の制限を克服する。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、下記の形態のプテリジンヌクレオチドを提供する：
【化１】
2009091358.tif 000002
【００１１】
式中、Ｒ11はＲ12と組合わされて二重結合により環の頂点４に結合する単一のオキソ酸素を形成するか、またはＲ13と結合して環の頂点３と４との間の二重結合を形成し；
Ｒ12はＲ3 と組合わされないとき、NH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択される構成員であり；
Ｒ13はＲ11と結合しないとき、低級アルキルまたはＨであり；
Ｒ14はＨ、低級アルキルまたはフェニルであり；
【００１２】
Ｒ15はＲ16と組合わされて二重結合により環の頂点２に結合する単一のオキソ酸素を形成するか、またはＲ17と結合して環の頂点１と２との間の二重結合を形成し、こうして環の頂点２および４は集合的に最大１つのオキソ酸素を有し；そして
Ｒ16はＲ15と組合わされないとき、Ｈ、フェニル、NH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択される構成員である。Ｒ15がＲ16と組合わされないとき、Ｒ18はＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成する。Ｒ15がＲ16と組合わされるとき、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はＨまたは低級アルキルである。Ｒ17はＲ15と結合しないとき、かつＲ20はＲ18と結合しないとき、
【００１３】
【化２】
2009091358.tif 000003
【００１４】
の化合物であり、式中、記号Ｒ21は水素、保護基、またはトリホスフェートを表し；記号Ｒ22は水素、ヒドロキシル、または保護基で置換されたヒドロキシルを表し；そしてＲ23はＨ、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ヘミスクシネート、固体の支持体に共有結合したヘミスクシネート、ジシクロヘキシルカーボジイミド、および固体の支持体に共有結合したジシクロヘキシルカーボジイミドを表す。Ｒ13がＨでありかつＲ23がＨであるとき、Ｒ21はトリホスフェートであり、そしてＲ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成でありかつＲ23がＨであるとき、Ｒ21はトリホスフェートである。
【００１５】
これらの化合物は通常の生理学的条件下に高度に蛍光性であり、かつオリゴヌクレオチドの化学的合成において使用するために適当である。本発明は、さらに、これらのプテリジンヌクレオチドを組み込んだオリゴヌクレオチドを提供する。
さらに、本発明は、種々のDNA 増幅法において利用することができるプテリジンヌクレオチドトリホスフェートを提供する。DNA 増幅法において使用するとき、ヌクレオチドトリホスフェートは増幅されたDNA 配列の中に直接組込んでそれを蛍光性とする。これは増幅された生成物の存在または非存在についての急速なアッセイを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
特定の態様の説明
本明細書において使用するとき、用語「低級アルキル」は直鎖状または分枝鎖状であることができる飽和炭化水素（例えば、エチル、イソプロピル、ｔ−アミル、または２，５−ジメチルヘキシル）を意味する。好ましいアルキル基は１〜６個の炭素原子を含有するものである。この明細書および請求の範囲におけるすべての数の範囲は、それらの上限および下限を含むことを意図する。
【００１７】
用語「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド類似体、デオキシリボヌクレオチド類似体、または本発明のプテリジン誘導体を意味する。オリゴヌクレオチドの正確な使用は、多数の因子およびオリゴヌクレオチドの究極の機能または使用に依存する。一般に、化学的に合成したオリゴヌクレオチドは長さが２〜200 塩基の範囲であるが、オリゴヌクレオチドを一緒に結合してより長い配列することができることはよく知られている。本明細書おいて使用するとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、また、これらの長い配列を包含する。また、相補的配列とのハイブリダイゼーションによるか、または酵素的にプライマー伸長により、二本鎖ポリヌクレオチドをつくることができることは認識されている。オリゴヌクレオチドという用語は、この出願において使用するとき、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドを包含する。
【００１８】
用語「固体の支持体」は、ポリヌクレオチド合成において使用するモノマーのカップリングを可能とするように官能化されている固体の物質を意味する。固体の支持体は、典型的には、フラノース上の３'−炭素への共有結合を通してヌクレオシドモノマーにカップリングされている。固体の支持体の物質は、典型的には、ポリヌクレオチドの合成の間において非反応性であり、そして成長するポリヌクレオチドを定着する下層を単に提供する。固体の支持体は、ポリアクリロイルモルホリド、シリカ、コントロールされた孔のガラス（CPG)、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、およびカルボキシル変性テフロン（登録商標）を包含するが、これらに限定されない。
【００１９】
固相オリゴヌクレオチド合成における用語「切断」は、固体の支持体にオリゴヌクレオチドが結合する結合の破壊を意味する。典型的には、切断は取り付けられたオリゴヌクレオチドの３'−ヒドロキシルと固体の支持体との間のスクシネートエステル結合の加水分解を包含する。
【００２０】
用語「脱保護」は、オリゴヌクレオチドの複素環式塩基の還外アミンからの保護基の除去を意味する。典型的には、脱保護は還外アミンと、アミノ保護基、例えば、ベンゾイル、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、およびジメチルアミノメチレンアミノとから成るアミド部分の加水分解から成る。脱保護という用語は、また、オリゴヌクレオチドのホスフェートジエステル（インタヌクレオチドホスフェート）からの保護基の除去を意味する。このような保護基がメトキシであるとき、「脱保護」は、本明細書おいて使用するとき、それらの除去を包含しないことがある。その代わり、「チオレート」オリゴヌクレオチドの生成のために、標準的チオフェノールを含有する試薬を使用する追加の処理が望ましいことがある。
【００２１】
用語「プテリジンヌクレオチド」または「プテリジンモノマー」は、本明細書において、３'−ホスフェート基をもつ本発明のフラノシルプテリジン誘導体を意味するために使用する。適切に述べると、プテリジンはプリンまたはピリミジンではないので、フラノシルプテリジン誘導体はヌクレオチドではないことが認識される。しかしながら、フラノシルプテリジン誘導体はプリンヌクレオチドに構造的に類似し、そして本発明のフラノシルプテリジンはヌクレオチドと同一の方法で使用されるので、双方をヌクレオチドと呼ぶ。本明細書おいて使用するとき、プテリジンヌクレオチドまたはプテリジンモノマーはポリヌクレオチド合成において使用するために完全に保護することができるか、またはトリホスフェートとしてを使用するとき、またはオリゴヌクレオチドの中に組込むとき、脱保護することができる。
【００２２】
用語「ヌクレオチドモノマー」は、本明細書おいて使用するとき、プテリジンヌクレオチド、「標準的」ヌクレオチド；アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウラシル、またはこれらのヌクレオチドの誘導体を意味する。このような誘導体は、５−ブロモデオキシシチジン、５−ブロモ−デオキシウリジン、Ｎ6−メチル−デオキシアデノシンおよび５−メチル−デオキシシチジンを包含するが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書において使用するとき、用語「保護基」は、分子上の反応性基（例えば、ヒドロキシルまたはアミン）に結合するか、またはそれと置換される基を意味する。保護基は化学反応の１または２以上の段階の間の特定の基の反応を防止するように選択される。一般に、特定の保護基は、後の時間における除去を可能として、分子の中に存在する反応性基を変更しないで反応性基を回復するように選択される。保護基の選択は、保護すべき特定の基およびその基が暴露される化合物の関数である。保護基の選択は当業者によく知られている。参照、例えば、Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis 、第２版、John Wiley & Sons, Inc., Somerset, N. J. (1991) 、これは引用することによって本明細書の一部とされる。
【００２４】
本明細書おいて使用するとき、用語「保護されたアミン」は、アミノ保護基と反応したアミンを意味する。アミノ保護基は、誘導化プテリジンヌクレオチドの合成の間またはそのヌクレオチドを使用するDNA またはRNA の化学的合成の間のアミド官能基の反応を防止する。アミノ保護基は、分子の中に存在他の基を変更しなで、後の時間において除去してアミノ基を回復することかできる。例えば、還外アミンをジメチルホルムアミド−ジエチルアセタールと反応させて、ジメチルアミノメチレンアミノ官能基を形成することができる。アミノ保護基は、一般に、カルバメート、ベンジル基、イミデート、およびこの分野において知られている他の基を包含する。好ましいアミノ保護基は、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルまたはジメチルアミノメチレンアミノを包含するが、これらに限定されない。
【００２５】
用語「カップリング」は、一般に、DNA 合成において、１つのヌクレオチドモノマーを他のヌクレオチドモノマーに、またはオリゴヌクレオチドの５’末端に接合することを意味するために使用される。カップリングは、一般に、１つのヌクレオチドモノマーの３'−ホスフェートから第２モノマーまたはオリゴヌクレオチドの５'−ヒドロキシルへのホスホジエステル結合の形成により達成される。カップリングは、また、初期のヌクレオチドの固体の支持体への接合を意味する。
【００２６】
用語「キャッピング」は、縮合できず、次の誘導化されたヌクレオチドと首尾よくカップリングする未反応の５'−ヒドロキシル基をブロックする段階を意味する。これにより、引き続く反応が所望の配列の鎖を拡大することによってのみ進行することが保証される。典型的には、キャッピングは５'−ヒドロキシル官能基のアセチル化を包含する。通常、これは４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）により触媒された酸無水物により達成される。当業者に知られている他の試薬は適当である。
【００２７】
用語「合成サイクル」は、合成されるオリゴヌクレオチドの５'末端にヌクレオチドモノマーをカップリングさせるために必要な反応の順序を意味する。典型的には、合成サイクルは、オリゴヌクレオチドの末端上の５'−ヒドロキシル基の除去、ホスホジエステル結合を形成するためのヌクレオチドモノマーのホスファイト誘導体との反応、および引き続くカップリングが不成功であった場合の分子のキャッピングを包含する。
【００２８】
用語「通常の生理学的条件」は、本明細書において、生きている生物または細胞の内部において典型的である条件を意味する。いくつかの器官は極端な条件を提供することが認識されているが、生物の内部および細胞の内部の環境は通常pH７付近（すなわち、 pH6.5〜pH7.5)で変化し、主要な溶媒として水を含有し、そして０℃以上かつ50℃以下の温度において存在する。
【００２９】
本発明は、通常の生理学的条件下に高度に蛍光性でありかつ蛍光性オリゴヌクレオチドを製造するオリゴヌクレオチドの化学的合成において利用することができる、多数のプテリジンヌクレオチドを提供する。これらの蛍光性オリゴヌクレオチドは、例えば、ゲノムおよび相補的DNA ライブラリーのスクリーニングのためのプローブ、インサイチュ・ハイブリダイゼーションのためのプローブ、DNA合成、配列決定、および増幅のためのプライマー、そして DNA−タンパク質の相互作用を研究するためのモデルの基質を包含する多数の用途を有する。
【００３０】
１つの態様において、本発明のプテリジンヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの化学的合成において使用するために適当である。一般に、これは下記のステップを必要とする：プテリジン上の還外アミンのブロッキング；考える特定の合成化学に適当な反応性基をもつホスファイト部分の誘導化；および合成の間に除去できる保護基による５'−ヒドロキシル基のブロッキング、このブロッキングは成長するオリゴヌクレオチドの５'末端への誘導化ヌクレオチドの段階的カップリングを促進する。プテリジン誘導体の糖がリボースである場合、反応性２'−ヒドロキシル基をまた保護しなくてはならない。
好ましい態様において、本発明は下記の式Ｉのヌクレオチドモノマーを提供する：
【００３１】
【化３】
2009091358.tif 000004
【００３２】
これらのヌクレオチドモノマーは示すように環の頂点１〜８をもつプテリジン誘導体であり、式中、Ｒ11はＲ12と組合わされて二重結合により環の頂点４に接合する単一のオキソ酸素を形成するか、またはＲ13と結合して環の頂点３と４との間の二重結合を形成し、Ｒ12はＲ11と組合わされないとき、NH2 、および保護基NH2 で１または２置換されたNH2 であり、Ｒ13はＲ11と結合しないとき、低級アルキルまたはＨであり；Ｒ14はＨ、低級アルキルまたはフェニルであり、Ｒ15はＲ16と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合する単一のオキソ酸素を形成するか、またはＲ17と結合して環の頂点１と２との間の二重結合を形成し、こうして環の頂点２および４は集合的に最大１つのオキソ酸素を有し、そしてＲ16はＲ15と組合わされないとき、Ｈ、フェニル、NH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択される構成員である。
【００３３】
Ｒ15がＲ16と組合わされないとき、Ｒ18はＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成する。Ｒ15がＲ16と組合わされるとき、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はＨまたは低級アルキルである。Ｒ17はＲ15と結合しないとき、かつＲ20はＲ18と結合しないとき、式IIの化合物である。
【化４】
2009091358.tif 000005
式中、記号Ｒ21は水素、保護基またはトリホスフェートを表し、記号Ｒ22は水素、ヒドロキシル、または保護基で置換されたヒドロキシルを表し、そしてＲ23は水素、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ヘミスクシネート、固体の支持体に共有結合したヘミスクシネート、ジシクロヘキシルカーボジイミド、および固体の支持体に共有結合したジシクロヘキシルカーボジイミドを表す。Ｒ13がＨでありかつＲ23がＨであるとき、Ｒ21はトリホスフェートであり、そしてＲ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成しかつＲ23がＨであるとき、Ｒ21はトリホスフェートである。
【００３４】
他の好ましい態様において、Ｒ14は水素、メチルまたはフェニル、特に水素またはメチルである。
なお他の好ましい態様において、Ｒ16は、Ｒ15と結合しないとき、水素、フェニル、アミノ基、または保護基で２置換されたNH2 である。特に、Ｒ16は水素およびフェニルである。
【００３５】
しかも他の好ましい態様において、Ｒ18がＲ20と結合するとき、Ｒ19は水素またはメチルである。
なおしかも他の好ましい態様において、Ｒ14は水素、メチルおよびフェニルであり、Ｒ16は、Ｒ15と組合わされないとき、水素、フェニルまたはアミノであり、そしてＲ18がＲ20と結合するとき、Ｒ19は水素またはメチルである。
【００３６】
本発明の化合物の中で、９つの態様が特に好ましい。第１好ましい態様において、Ｒ11はＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ12はNH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 であり、Ｒ14は水素であり、Ｒ15はＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ16はフェニルであり、Ｒ18はＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ20は式IIである。この態様は式III により例示される。この態様の特に好ましい化合物は、Ｒ12がNH2 であるとき、式III により例示される。
【００３７】
【化５】
2009091358.tif 000006
【００３８】
第２態様において、Ｒ11はＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ12はNH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 であり、Ｒ14はフェニルであり、Ｒ15はＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ16は水素であり、Ｒ18はＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ20は式IIである。この態様は式IVにより例示される。この態様の特に好ましい化合物は、Ｒ12がNH2 であるとき、式IVにより例示される。
【００３９】
【化６】
2009091358.tif 000007
【００４０】
第３の好ましい態様において、Ｒ11はＲ12と組合わされて二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ13はCH3 であり、Ｒ14はＨであり、Ｒ15はＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ16はNH2 であり、Ｒ18はＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ20は式IIである。この態様は式Ｖにより例示される。この態様の１つの特に好ましい化合物は、式IIのＲ23がＨであり、そして特に式IIのＲ21，Ｒ22、およびＲ23のすべてがＨであるとき、式Ｖにより例示されるヌクレオシドである。
【００４１】
【化７】
2009091358.tif 000008
【００４２】
第４の好ましい態様において、Ｒ11はＲ12と組合わされて二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ13は水素であり、Ｒ14は水素であり、Ｒ15はＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ16はNH2 または保護基で１または２置換されたNH2 であり、Ｒ18はＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ20は式IIである。この態様は式VIにより例示される。この態様の特に好ましい化合物は、Ｒ16がNH2 であるとき、式VIにより例示される。
【００４３】
【化８】
2009091358.tif 000009
【００４４】
第５の好ましい態様において、Ｒ11はＲ12と組合わされて二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ13は水素であり、Ｒ14はCH3 であり、Ｒ15はＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ16はNH2 または保護基で１または２置換されたNH2 であり、Ｒ18はＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ20は式IIである。この態様は式VII により例示される。この態様の特に好ましい化合物は、Ｒ16がNH2 であるとき、式VII により例示される。
【００４５】
【化９】
2009091358.tif 000010
【００４６】
第６の好ましい態様において、Ｒ11はＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ12はNH2 または保護基で１または２置換されたNH2 であり、Ｒ14はCH3 であり、Ｒ15はＲ16と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ17は式IIであり、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はCH3 である。この態様は式VIIIにより例示される。この態様の特に好ましい化合物は、Ｒ12がNH2 であるとき、式VIIIにより例示される。
【００４７】
【化１０】
2009091358.tif 000011
【００４８】
第７の好ましい態様において、Ｒ11はＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ12はNH2 または保護基で１または２置換されたNH2 であり、Ｒ14は水素であり、Ｒ15はＲ16と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ17は式IIであり、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はCH3 である。この態様は式IXにより例示される。この態様の特に好ましい化合物は、Ｒ12がNH2 であるとき、式IXにより例示される。
【００４９】
【化１１】
2009091358.tif 000012
【００５０】
第８の好ましい態様において、Ｒ11はＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ12はNH2 であり、Ｒ14はCH3 であり、Ｒ15はＲ16と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ17は式IIであり、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はＨである。この態様は式Ｘにより例示される。この態様の特に好ましい化合物は、Ｒ12がNH2 であるとき、式Ｘにより例示される。
【００５１】
【化１２】
2009091358.tif 000013
【００５２】
第９の好ましい態様において、Ｒ11はＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ12はNH2 または保護基で１または２置換されたNH2 であり、Ｒ14はＨであり、Ｒ15はＲ16と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ17は式IIであり、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はＨである。この態様は式III により例示される。この態様の特に好ましい化合物は、Ｒ１２がNH2 であるとき、式ＸＩにより例示される。
【００５３】
【化１３】
2009091358.tif 000014
【００５４】
前述したように、プテリジンの還外アミンは一般にオリゴヌクレオチド合成の間に保護しなくてはならない。プテリジンの還外アミンのブロッキングために適当な保護基は、この分野において広く知られている。一般に、保護基はプテリジン誘導体を組込んだオリゴヌクレオチドの合成の間の還外アミンの望ましくない反応を防止するであろう。これらの基は望ましくない反応を防止するためにプテリジン誘導体の実際の合成の間に保護ことが必要であることはもちろん認識されている。保護基は、分子の他の反応性基を変更しないで、オリゴヌクレオチドの合成後除去してアミン基を回復することができるべきである。
【００５５】
典型的には、アミン基は、アシル化により、通常カルバメート、ベンジル基、イミデート、およびこの分野において知られている他の保護基により保護される。保護基の例は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、フェノキシアセチル、ジフェニルアセチル、イソブチリル、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、ジメチルアミノメチレンアミノ、ジメルチアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルおよびジメチルホルムアミド−ジエチルアセタール。ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルまたはジメチルアミノメチレンアミノは特に好ましい。多数の適当な保護基の説明については、下記の参考文献を参照のこと：Reese, Tetrahedron, 34 : 3143-3179 (1978) ; Ohtsuka et al., Nucleic Acids Res., 10 : 6553-6570 (1982) 、およびNarang, Tetrahedron 39 : 3-22 (1983)これらは引用することによって本明細書の一部とされる。
【００５６】
こうして、好ましい態様において、本発明は、Ｒ12およびＲ16が独立してベンゾイル、イソブチリル、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、ジメチルアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルおよびジメチルアミノメチレンアミノから成る群より選択される保護基で１または２置換されたNH2 である、式Ｉのヌクレオチドモノマーを提供する。特に、Ｒ12はジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニル、およびジメルチアミノメチレンアミノから成る群より選択される保護基で１置換されたNH2 である。
【００５７】
オリゴヌクレオチド合成の間に、プテリジンモノマーの５'−ヒドロキシル基をブロックして望ましくない反応を防止しなくてはならない。しかしながら、このブロッキング基は、また、合成の間に除去して、成長するオリゴヌクレオチドの５'末端への新しいモノマーの段階的カップリングを可能とすることができなくてはならない。適当な保護基はこの分野においてよく知られており、そしてトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリレン、およびジメチルアミノメチリデンを包含するが、これらに限定されない。ジメトキシトリチルは、５'−ヒドロキシル基のブロッキング基として一般に好ましい。
【００５８】
こうして、好ましい態様において、本発明は、Ｒ20が式IIであり、Ｒ21がＨ、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリレン、またはジメチルアミノメチリデンである、式Ｉのヌクレオチドモノマーを提供する。さらに詳しくは、Ｒ21はジメトキシトリチル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、またはジメチルアミノメチリデンである。
【００５９】
プテリジン誘導体の糖がリボフラノースである場合、２'−ヒドロキシル基をまた保護しなくてはならない。好ましい２'−ヒドロキシル基保護基は下記のものを包含するが、これらに限定されない；トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、テトラヒドロピラン−１−イル、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル、１−（２−クロロ−４−メチル）フェニル−４−メトキシピペリジン−４−イル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｐ−ニトロフェニルエチルスルホニル、テトラヒドロピラニル、４−メトキシテトラヒドロピラニル、２−ニトロベンジル、９−フェニルキサンテン−９−イルおよびｐ−ニトロフェニルエチルである。好ましい態様において、２'−ヒドロキシル基はｔ−ブチルジメチルシリル基で置換することによって保護されるであろう。
【００６０】
こうして、好ましい態様において、本発明は、Ｒ20が式IIであり、Ｒ22がＨ，OHまたは置換OHであり、前記置換OHはトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、テトラヒドロピラン−１−イル、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル、１−（２−クロロ−４−メチル）フェニル−４−メトキシピペリジン−４−イル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｐ−ニトロフェニルエチルスルホニル、テトラヒドロピラニル、４−メトキシテトラヒドロピラニル、２−ニトロベンジル、９−フェニルキサンテン−９−イルまたはｐ−ニトロフェニルエチルで置換されている、式Ｉのヌクレオチドモノマーを提供する。特に、Ｒ22はＨまたはジメトキシトリチル、テトラヒドロピラン−１−イル、ｔ−ブチルジメチルシリル、２−ニトロベンジルもしくはｐ−ニトロフェニルエチルで置換されたOHである。
【００６１】
本発明のβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト化合物は、オリゴヌクレオチド合成のモノマーとして好ましい。これらの化合物は、合成のプロトコールを変更しないで、大部分の商業的DNA 合成において一般に利用することができる。しかしながら、大規模の合成を望む場合、またはホスフェート結合の中に硫黄基または他の変更を加えたい場合、本発明のＨ−ホスホネート化合物は合成試薬として好ましいことがある。オリゴヌクレオチド合成に適当な他のホスファイト誘導体の合成および使用は、この分野においてよく知られている。これらはメチルホスホネート、ホスホロチオエート、およびホスホトリエステルを包含するが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明の好ましい態様は、プテリジンヌクレオチドがオリゴヌクレオチド合成において試薬として使用するために誘導化および保護されている化合物である。特に反応性還外アミンを保護し、そして３'−ヒドロキシルをＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトとして誘導化する。この方法において誘導体化された式III 〜ＸＩにより例示される化合物は特に好ましい。
【００６３】
こうして、好ましい第１態様は、Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ20が式IIであり、Ｒ23がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである、式III により例示される。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨでありそしてＲ23はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである。なお特に、Ｒ12はジメチルアミノメチレンアミノである。
【００６４】
好ましい第２態様は、Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ20が式IIであり、Ｒ23がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである、式IVにより例示される。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨでありそしてＲ23はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである。なお特に、Ｒ12はジメチルアミノメチレンアミノである。
【００６５】
好ましい第３態様は、Ｒ20が式IIでありそしてＲ23がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである、式IVにより例示される。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨでありそしてＲ23はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである。
【００６６】
好ましい第４態様は、Ｒ16が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ20が式IIであり、Ｒ23がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである、式VIにより例示される。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨでありそしてＲ23はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである。なお特に、Ｒ16はジメチルアミノメチレンアミノである。
【００６７】
好ましい第５態様は、Ｒ16が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ20が式IIであり、Ｒ23がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである、式VII により例示される。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨでありそしてＲ23はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである。なお特に、Ｒ16はジメチルアミノメチレンアミノである。
【００６８】
好ましい第６態様は、Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ17が式IIであり、Ｒ23がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである、式VIIIにより例示される。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨでありそしてＲ23はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである。なお特に、Ｒ12はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。
【００６９】
好ましい第７態様は、Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ17が式IIであり、Ｒ23がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである、式IXにより例示される。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨでありそしてＲ23はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである。なお特に、Ｒ12はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。
【００７０】
好ましい第８態様は、Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ17が式IIであり、Ｒ23がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである、式Ｘにより例示される。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨでありそしてＲ23はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである。なお特に、Ｒ12はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。
【００７１】
好ましい第９態様は、Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ17が式IIであり、Ｒ23がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである、式Ｘにより例示される。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨでありそしてＲ23はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである。なお特に、Ｒ12はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。
【００７２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、固相においてまた溶液中で合成することがきる。一般に、固相合成は好ましい。ホスファイトトリエステル、ホスホトリエステル、およびＨ−ホスホネートの化学によるオリゴヌクレオチドの固相合成の手法の詳細な説明は広く入手可能である。参照、例えば、Itakura 、米国特許第 4,401,796号；Caruthers et al.、米国特許第 4,458,066号および米国特許第 4,500,707号；Beaucage et al., Tetrahedron Lett., 22 : 1859-1862 (1981) ; Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103 : 3185-3191 (1981) ; Caruthers et al., Genetic Engineering, 4 : 1-17 (1982) ; Jones, chapter 2, Atkinson et al., chapter 3、およびSproar et al., chapter 4, Gait編、Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Washington D. C. (1984) ; Froehler et al., Tetrahedron Lett., 27 : 469-472 (1986) ; Froehler et al., Nucleic Acids Res., 14 : 5399-5407 (1986) ;Sinha et al., Tetrahedron Lett., 24 : 5843-5846 (1983)；およびSinha et al., Nucl. Acids Res., 12 : 4539-4557 (1984) これらは引用することによって本明細書の一部とされる。
【００７３】
一般に、カップリングサイクルにおいて利用する試薬の供給のタイミングおよび濃度は、商業的DNA 合成において使用する未修飾の商用ホスホルアミダイトについて典型的なプロトコールと異なる。これらの場合において、本発明のプテリジン誘導体を含有する溶液を、商業的合成装置（例えば、380B型、Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティー）上に余分のホスホルアミダイトのために設けられた口上の容器に単に添加することができる。しかしながら、特定の誘導化プテリジン化合物のカップリング効率が他のホスホルアミダイトより実質的に低い場合、合成を最適化するために試薬の供給のタイミングおよび濃度を変更することが必要であることがある。
【００７４】
低いカップリング効率を補正するためにオリゴヌクレオチド合成のプロトコールを最適化する手段は、この分野においてよく知られている。一般に、試薬の濃度または試薬の供給量を単に増加して、より高いカップリング効率を達成する。また、カップリング効率を決定する方法はよく知られている。例えば、５'−ヒドロキシル基がジメトキシトリチル（DMT)である場合、酸ステップ(DMT基を除去する）におけるDMT カチオン濃度を測定することによって、カップリング効率を決定することができる。
【００７５】
DMT カチオン濃度は、通常、酸性洗浄液を分光光度計でモニターすることによって決定される。酸／DMT 溶液は鮮明なオレンジ色である。また、カップリングが起こらなかった場合、キャッピングはオリゴヌクレオチドのさらにエクステンションを防止するので、例えば、毛管電気泳動またはHPLCを使用して、切形／全長のオリゴヌクレオチドの比を比較することによって、カップリング効率を推定することができる。
【００７６】
固相オリゴヌクレオチド合成は、多数の固体の支持体を使用して実施することができる。適当な支持体は、合成されたオリゴヌクレオチドにおいて３'末端塩基となるであろう保護されたモノマーを取り付ける官能基を提供する支持体である。支持体は、特定の合成化学において利用される試薬に対して不活性でなくてはならない。固体の支持体物質は、ポリアクリロイルモルホリド、シリカ、コントロールされた孔のガラス（CPG)、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、およびカルボキシル変性テフロン（登録商標）を包含するが、これらに限定されない。好ましい支持体は、アミノ官能化コントロールされた孔のガラスおよびカルボキシル官能化テフロン（登録商標）である。
【００７７】
固相オリゴヌクレオチド合成は、出発点として、固体の支持体にカップリングされた完全に保護されたモノマー（例えば、プテリジンヌクレオシド）を必要とする。このカップリングは典型的にはリンカーに共有結合した３'−ヒドロキシル（カップリングしたときオキソ）であり、次いでこれを固体の支持体に共有結合させる。次いで、第１合成サイクルはモノマーを、その３'−ホスフェートを介して、３'−５'ホスホジエステル結合を形成する縮合反応により結合ヌクレオシドの５'−ヒドロキシルにカップリングさせる。引き続く合成サイクルは、最後の結合ヌクレオシドの５'−ヒドロキシルにヌクレオチドモノマーを付加する。この方法において、オリゴヌクレオチドは３'→５'の方向に合成されて、固体の支持体にその３'末端を結合した「成長する」オリゴヌクレオチドを生成する。
【００７８】
固体の支持体にヌクレオシドモノマーを結合する多数の手段は当業者に知られているが、スクシネートまたはヘミスクシネートを通してコントロールされた孔のガラスに共有結合したモノマーは一般に好ましい。ヘミスクシネートを通してコントロールされた孔のガラスにカップリングした慣用の保護されたヌクレオシドは、多数の源から商業的に入手可能である（例えば、Glen Research 、米国バーモント州スターリング、Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティー、Pharmacia LKB 、米国ニュージャージイ州ピスカタウェイ）。
【００７９】
オリゴヌクレオチドの３'末端におけるプテリジンヌクレオチドの配置は、固体の支持体に結合した完全にブロックされたフラノシルプテリジンを使用してオリゴヌクレオチド合成を開始することを必要とする。好ましい態様において、プテリジンヌクレオチドの結合はまずプテリジンヌクレオチドをヘミスクシネートとして誘導化することによって達成される。次いで、縮合剤としてメシチレン−２−スルホニルクロライド／１−メチル−1H−イミダゾールを使用する縮合反応において、ヘミスクシネートをアミノ官能化されたコントロールされた孔のガラスに取り付けることができる。
【００８０】
多数の異なる反応性基で官能化されたコントロールされた孔のガラスは商業的に入手可能である（例えば、Sigma Chemicals 、米国ミゾリー州セントルイス）。同様なカップリングスキームは下記の参考文献に記載されている：Atkinson et al., chapter 3, Gait編、Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, IRL Press, Washington D. C. (1984)。また、トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロライド、イミダゾリド、トリアゾリドまたはさらにテトラゾリドを縮合剤として使用することができる。ジシクロヘキシルカーボジイミド（DCC)および構造類似体はまた適当なリンカーである。他のリンカーおよび適当な縮合剤は当業者によく知られている。
【００８１】
好ましい態様において、したがって、本発明は、５'−ヒドロキシルがヘミスクシネートとして誘導体化され、次いで固体の支持体に、特にコントロールされた孔のガラスに共有結合させることができる、プテリジンヌクレオチドを提供する。この方法において誘導化された式III 〜ＸＩにより例示される化合物は特に好ましい。
【００８２】
こうして、第１の好ましい態様において、本発明は、Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ20が式IIであり、Ｒ23がヘミスクシネート、または固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式III の化合物を提供する。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。なお特に、Ｒ12はジメチルアミノメチレンアミノである。
【００８３】
第２の好ましい態様において、本発明は、Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ20が式IIであり、Ｒ23がヘミスクシネート、または固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式IVの化合物を提供する。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。なお特に、Ｒ12はジメチルアミノメチレンアミノである。
【００８４】
第３の好ましい態様において、本発明は、Ｒ20が式IIであり、Ｒ23がヘミスクシネート、または固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式Ｖの化合物を提供する。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。
【００８５】
第４の好ましい態様において、本発明は、Ｒ16が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ20が式IIであり、Ｒ23がヘミスクシネート、または固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式VIの化合物を提供する。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。なお特に、Ｒ16はジメチルアミノメチレンアミノである。
【００８６】
第５の好ましい態様において、本発明は、Ｒ16が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ20が式IIであり、Ｒ23がヘミスクシネート、または固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式VII の化合物を提供する。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。なお特に、Ｒ16はジメチルアミノメチレンアミノである。
【００８７】
第６の好ましい態様において、本発明は、Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ17が式IIであり、Ｒ23がヘミスクシネート、または固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式VIIIの化合物を提供する。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。なお特に、Ｒ12はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。
【００８８】
第７の好ましい態様において、本発明は、Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ17が式IIであり、Ｒ23がヘミスクシネート、または固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式IXの化合物を提供する。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。なお特に、Ｒ12はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。
【００８９】
第８の好ましい態様において、本発明は、Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ17が式IIであり、Ｒ23がヘミスクシネート、または固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式Ｘの化合物を提供する。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。なお特に、Ｒ12はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。
【００９０】
第９の好ましい態様において、本発明は、Ｒ12が保護基で１または２置換されたNH2 であり、そしてＲ17が式IIであり、Ｒ23がヘミスクシネート、または固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式Ｘの化合物を提供する。特に、式IIのＲ21はジメトキシトリチルであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。なお特に、Ｒ12はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。
【００９１】
還外アミンがｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルにより保護されている態様において、脱保護試薬は、また、３'末端ヌクレオシドを固体の支持体に結合するトリスクシニルスペーサーのエステル官能基を切断することができる。この場合において、Stengele et al., Tetrahedron Lett., 18 : 2549-2552 (1990)(これは引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されているカップリングスキームは好ましい。
【００９２】
この方法において、固体の支持体（ジヒドロキシプロピル−CPG, 500Åおよび1400Å，Fluka AG、スイス国、カタログNo. 27754, 27764, 2770) をまずN,N'−カルボニルジイミダゾールと反応させ、次いで脂肪族第２アミンスペーサーとして1,6−ビスメチルアミノヘキサンと反応させる。次いでこの化合物を適当に保護された２'−ヌクレオシド−３'−Ｏ−スクシネートとカップリングさせ、引き続いて固体の支持体の遊離ヒドロキシル基を酢酸無水物および４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）とカップリングさせる。このリンカーはｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルおよびｐ−ニトロフェニルエチレン基について使用した脱保護条件下に完全に安定であるが、マトリックスからの切断は通常濃アンモニア中の加水分解条件下に２時間より短い時間で達成することができる。
【００９３】
いったん全長のオリゴヌクレオチドが合成されると、保護基を除去し（オリゴヌクレオチドを脱保護し）、次いで使用する前にオリゴヌクレオチドを固体の支持体から切断する。（テフロン（登録商標）の固体の支持体を使用する場合、オリゴヌクレオチドを支持体に永久的に取り付けてアフィニティーカラムを調製することができる。）切断および脱保護は同時にまたは任意の順序で順次に実施することができる。２つの手法は介在させ、こうしていくつかの保護基をオリゴヌクレオチドから除去した後、それを固体の支持体から切断し、そして他の基を溶液中で切断したオリゴヌクレオチドから脱保護する。
【００９４】
事象の順序は存在する特定のブロッキング基、固体の支持体の特定の結合、および合成を実施する個人の好みに依存する。脱保護が切断に先行する場合、保護基を固体の支持体に結合したままであるオリゴヌクレオチドから洗浄除去することができる。逆に、切断に引き続いて脱保護を実施する場合、除去した特定の基はオリゴヌクレオチドとともに溶液の中に残るであろう。しばしばオリゴヌクレオチドは使用する前にこれらの保護基から単離することが必要であろう。
【００９５】
好ましい態様、および大部分の商業的DNA 合成において、５'−ヒドロキシル上の保護基を合成の最後の段階において除去する。次いでオリゴヌクレオチドを固体の支持体から切断し、残りの脱保護基を溶液中で実施する。５'−ヒドロキシル保護基の除去は、典型的には、次のヌクレオチドモノマーのカップリング前に末端の５’−ヒドロキシル基を除去するために、合成を通じて利用する同一試薬で処理することをちょうど必要とする。５’−ヒドロキシル保護基はジメトキシトリチル基である場合、脱保護は酢酸、ジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸を使用する処理により達成することができる。
【００９６】
典型的には、まず固相支持体に取り付けられたオリゴヌクレオチド（塩基不安定性結合）を切断剤に約１〜２時間暴露し、こうしてオリゴヌクレオチドが固体の支持体から解放されるようにし、次いで解放されたオリゴヌクレオチドを含有する切断試薬を少なくとも20〜60分間約80〜90℃に加熱し、こうして還外アミンに取り付けられた保護基を除去することによって、還外アミンの切断および脱保護の双方を実施する。また、脱保護ステップはより低い温度において実施することができるが、より大きい時間の間実施しなくてはならない。（例えば、加熱は５時間の間55℃であることができる）。
一般に、好ましい切断および脱保護は濃アンモニアである。
【００９７】
オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドでありそして２'−ヒドロキシル基がｔ−ブチルジメトキシトリチルシリル（TBDMS)によりブロックされている場合、後者の基はテトラブチルアンモニウムフルオライドを使用して合成の終わりにおいて除去することができる。Wu et al., J. Org. Chem. 55 : 4717-4724 (1990)参照。フェノキシアセチル基はアルコール中で無水アンモニアを使用して除去することができる（これらの条件下にTBDMS 基は安定であり、そしてオリゴヌクレオチドは切断されない）。シチジンのベンゾイル保護基は、また、アルコール中の無水アンモニアで除去される。
【００９８】
還外アミンをｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニル基で保護しそして固体の支持体へのカップリングがスクシネートヌクレオシドと縮合した1,6−ビス−メチルアミノヘキサンを介する場合、アミノ基は好ましくは１ＭのDBU(1,8−ジアザ−ビシクロ〔5.4.0〕−ウンデク−７−エン）を使用する処理により脱保護される。次いで、固体の支持体からのオリゴヌクレオチドの切断は濃アンモニアを使用する処理により達成される。
【００９９】
脱保護に対するこの後者のアプローチを使用する場合、それぞれ、アミドおよびアミンの保護のためにｐ−ニトロフェニルエチルおよびｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニル基を使用して保護されたプテリジン、アデニン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウラシル、および修飾されたヌクレオチドモノマーを使用してオリゴヌクレオチドを合成することが好ましい。Barone et al., Nucleic Acids Res. 12 : 4051-4061 (1984) を引用するStengeleおよびPfleiderer, Tetrahedron Lett., 31 : 2549-2552 (1990)を参照のこと。次いで、単一の脱保護のプロトコールはオリゴヌクレオチドのすべての構成ヌクレオチドを脱保護するであろう。
【０１００】
切断されそして完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドは多数の用途において直接使用することができる（凍結乾燥または蒸発させて脱保護試薬を除去した後）か、または使用前に精製することができる。脱保護工程において除去された保護基から、そして最も重要なことには、次のヌクレオチドとカップリングできなかったオリゴヌクレオチドを合成の間にキャッピングするとき形成した切形オリゴヌクレオチドから、全長のオリゴヌクレオチドを単離するために、合成オリゴヌクレオチドの精製は一般に望ましい。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドの精製技術は当業者によく知られている。方法は下記のものを包含するが、これらに限定されない：シリカプレート上の薄層クロマトグラフィー（TLC)、ゲル電気泳動、大きさ分画（例えば、Sephadexカラムを使用して）、逆相高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）およびアニオン交換クロマトグラフィー（例えば、モノＱカラム、Pharmacia-LKB 、米国ニュージャージイ州ピスカタウェイ、を使用する）。オリゴヌクレオチドの精製の説明については、下記の参考文献を参照のこと：McLaughlin et al., chapter 5、およびWu et al., chapter 6, Gait編、OligonucleotideSynthesis : A Practical Approach, IRL Press, Washington D. C. (1984)。
【０１０２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列に対して内部または末端における、配列の１または２以上の位置にプテリジンヌクレオチドを含有する。本発明のオリゴヌクレオチドは１または２以上の位置に単一のプテリジン誘導体を含有することができるか、または２またはそれ以上の異なるプテリジン誘導体を含有することができる。オリゴヌクレオチドは完全にプテリジンヌクレオチドから成るか、または天然に存在するおよび／または修飾されたヌクレオチドを含有することができる。
【０１０３】
修飾されたヌクレオチドは当業者によく知られており、そして下記のものを包含するが、これらに限定されない：イノシン、５−ブロモデオキシシチジン、５−ブロモ−デオキシウリジン、Ｎ6−メチル−デオキシアデノシンおよび５−メチル−デオキシシチジン。これらのヌクレオチドのホスホルアミダイトの形態は、例えば、下記の会社を包含する多数の源から商業的に入手可能である：Applied Biosystems, Inc.、米国カリフォルニア州フォスターシティー、Clonetech 、米国カリフォルニア州パロアルト、およびGlen Research 、米国バーモント州スターリング。
【０１０４】
好ましい態様において、本発明は、下記式ＸIIを有する１種または２種以上のヌクレオチドモノマーを含んでなるオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０５】
【化１４】
2009091358.tif 000015
【０１０６】
ヌクレオチドモノマーは示すように環の頂点１〜８をもつプテリジン誘導体であり、式中Ｒ16，Ｒ18、およびＲ19は式Ｉについて記載されている通りであるが、ただし保護基は排除されている。こうして、Ｒ12は、Ｒ11と組合わされないとき、NH2 であり、そしてＲ16はＲ15と組合わされないとき、Ｈ、フェニル、またはNH2 であり、Ｒ17は、Ｒ15と結合しないとき、そしてＲ20はＲ18と結合しないとき、式ＸIII の化合物である。
【０１０７】
【化１５】
2009091358.tif 000016
【０１０８】
式中、記号Ｒ22は水素またはヒドロキシルを表す。
好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは式ＸIIのモノマーを含んでなり、式中Ｒ14は水素、メチルまたはフェニル、特に水素またはメチルである。
他の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは式ＸIIのモノマーを含んでなり、式中Ｒ16はＲ15と結合しないとき、水素、フェニル、またはアミノ基であり、特に水素およびフェニルである。
【０１０９】
なお他の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは式ＸIIのモノマーを含んでなり、式中Ｒ18がＲ20と結合するとき、Ｒ19は水素またはメチルである。
さらに好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは式ＸIIのモノマーを含んでなり、式中Ｒ14は水素、メチル、またはフェニルであり、Ｒ16は水素、フェニルまたはアミノであり、そして、Ｒ18がＲ20と結合するとき、Ｒ19は水素またはメチルである。
【０１１０】
本発明の組成物の中で、９つのヌクレオチドモノマーの１または２以上のを含んでなるオリゴヌクレオチドは特に好ましい。第１の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ11はＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ12はアミノ基であり、Ｒ14は水素であり、Ｒ15はＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ16はフェニルであり、Ｒ18はＲ19と組合わされて環の頂点７に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ20は式ＸIVである。このヌクレオチドモノマーは式ＸIVにより例示され、式中Ｒ22はOHであり、より好ましくは、Ｒ22はＨである。
【０１１１】
【化１６】
2009091358.tif 000017
【０１１２】
第２の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ11はＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ12はNH2 であり、Ｒ14はフェニルであり、Ｒ15はＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ16は水素であり、Ｒ18はＲ19と組合わされて環の頂点７に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ20は式ＸIII である。このヌクレオチドモノマーは式ＸＶにより例示され、式中Ｒ22はＨであり、より好ましくは、Ｒ22はＨである。
【０１１３】
【化１７】
2009091358.tif 000018
【０１１４】
第３の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ11はＲ12と結合して環の頂点４に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ13はCH3 であり、Ｒ14はＨであり、Ｒ15はＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ16はNH2 であり、Ｒ18はＲ19と組合わされて環の頂点７に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ20は式ＸIII である。このヌクレオチドモノマーは式ＸVIにより例示され、式中Ｒ22はＨまたはOHであり、より好ましくは、Ｒ22はＨである。
【０１１５】
【化１８】
2009091358.tif 000019
【０１１６】
第４の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ11はＲ12と結合して環の頂点４に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ13はＨであり、Ｒ14はＨであり、Ｒ15はＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ16はNH2 であり、Ｒ18はＲ19と組合わされて環の頂点７に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ20は式ＸIII である。このヌクレオチドモノマーは式ＸVIIIにより例示され、式中Ｒ22はＨまたはOHであり、より好ましくは、Ｒ22はＨである。
【０１１７】
【化１９】
2009091358.tif 000020
【０１１８】
第５の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ11はＲ12と組合わされて環の頂点４に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ13は水素であり、Ｒ14はCH3 であり、Ｒ15はＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ16はNH2 であり、Ｒ18はＲ19と組合わされて環の頂点７に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ20は式ＸIII である。このヌクレオチドモノマーは式ＸVIIIにより例示され、式中Ｒ22はＨまたはOHであり、より好ましくは、Ｒ22はＨである。
【０１１９】
【化２０】
2009091358.tif 000021
【０１２０】
第６の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ11はＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ12はNH2 であり、Ｒ14はCH3 であり、Ｒ15はＲ16と組合わされて環の頂点２に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ17は式ＸIII であり、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はCH3 である。このヌクレオチドモノマーは式ＸIXにより例示され、式中Ｒ22はＨまたはOHであ、より好ましくは、Ｒ22はＨである。
【０１２１】
【化２１】
2009091358.tif 000022
【０１２２】
第７の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ11はＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ12はNH2 であり、Ｒ14はＨであり、Ｒ15はＲ16と組合わされて環の頂点２に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ17は式ＸIII であり、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はCH3 である。このヌクレオチドモノマーは式ＸＸにより例示され、式中Ｒ22はＨまたはOHであり、より好ましくは、Ｒ22はＨである。
【０１２３】
【化２２】
2009091358.tif 000023
【０１２４】
第８の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ11はＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ12はNH2 であり、Ｒ14はCH3 であり、Ｒ15はＲ16と組合わされて環の頂点２に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ17は式ＸIII であり、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はＨである。このヌクレオチドモノマーは式ＸＸＩにより例示され、式中Ｒ22はＨまたはOHであり、より好ましくは、Ｒ22はＨである。
【０１２５】
【化２３】
2009091358.tif 000024
【０１２６】
第９の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ11はＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ12はNH2 であり、Ｒ14はＨであり、Ｒ15はＲ16と組合わされて環の頂点２に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ17は式ＸIII であり、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はＨである。このヌクレオチドモノマーは式ＸＸIIにより例示され、式中Ｒ22はＨまたはOHであり、より好ましくは、Ｒ22はＨである。
【０１２７】
【化２４】
2009091358.tif 000025
【０１２８】
オリゴヌクレオチド配列中の特定のプテリジンヌクレオチドおよびそれらの位置の選択は、オリゴヌクレオチドを意図する特定の用途に依存するであろう。当業者は認識するように、プテリジン誘導体の蛍光シグナルはpHおよび付近の分子の特定の化学により影響を受けるであろう。一般に、付近のプリンは付近のピリミジンよりも多くシグナルをクエンチングする傾向があるであろう。プリンは主要な付近の物質としてシグナルを厳しくクエンチングし、そして２次付近の物質としてさえ有意な作用を有する。第３プリンはクエンチャーとして強力ではない。さらに、ヌクレオチドの末端付近においてシグナルのクエンチングは最小となる。
【０１２９】
したがって、完全なオリゴヌクレオチドから強いシグナルを望む場合、プテリジンヌクレオチドは末端にまたはその付近に位置し、そして１または２以上のピリミジンに隣接してシグナルのクエンチングを減少することが好ましい。逆に、オリゴヌクレオチドを切断する（例えば、エンドヌクレアーゼにより）ときのみオリゴヌクレオチドがシグナルを提供することを望む場合、プテリジン誘導体をクエンチング基（プリン）に密接させるが、オリゴヌクレオチドを切断するとき、クエンチング塩基からプテリジンを含有する鎖を分離することが期待された位置に配置し、これにより蛍光シグナルを解放することが好ましい。後者のアプローチは実施例12に例示されている。
【０１３０】
したがって、１つの態様において、プテリジンヌクレオチドは３'末端に位置するが、他の実施態様において、プテリジンヌクレオチドは本発明のオリゴヌクレオチドの５'末端に位置する。
なお他の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは１〜10ピリミジンモノマーにより囲まれているプテリジンヌクレオチドのモノマーを含んでなる。
【０１３１】
本発明のオリゴヌクレオチドは短い一本鎖の配列に限定されない。当業者は認識するように、オリゴヌクレオチドの合成は典型的にはほぼ200 塩基の上限を有するが、多数のオリゴヌクレオチドを一緒に結合してより長い配列を形成することができる。さらに、相補的配列を有するオリゴヌクレオチドを一緒にハイブリダイゼーションして二本鎖の分子を形成することができる。オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションおよび結合して長い二本鎖の分子を形成する方法はよく知られている。参照、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1985)。
【０１３２】
本発明のプテリジン誘導体は、天然に存在するプリンに構造的に類似する。オリゴヌクレオチドの中に組込むとき、プテリジン誘導体は蛍光性標識として作用するが、現在入手可能な蛍光性標識と同程度に厳しくはオリゴヌクレオチドの生理的および化学的性質を変更しない。ある場合において、混乱は非常に小さいので、酵素機能にとって重要であることが知られている部位において置換を行ったときでえ、酵素を触媒とする反応を可能とする酵素基質としてオリゴヌクレオチドは作用することができる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは DNA−タンパク質の相互作用の研究において特に有用である。
【０１３３】
１つのこのような相互作用は、DNA とウイルス組込み（IN）タンパク質との間の相互作用により例示される。インテグラーゼは、ヒトゲノムの中へのHIV ウイルス遺伝子の組込みに関係づけられたウイルス組込みタンパク質である。Engleman et al., Cell, 67 : 1211-1221 (1991)。したがって、インテグラーゼは細胞のHIV 感染に対して重要であるように思われ、そしてエイズ抗ウイルスの研究にとって極めて重要な標的を提供することがある。
【０１３４】
特定のDNA 配列（５'−GTG TGG AAA ATC TCT AGC AGT −３'、配列識別No：１）は、HIV インテグラーゼ酵素のための有効なモデルとして使用されてきている。同上。この酵素は、段階的方法で、宿主細胞のゲノムの中へのHIV ゲノムの調製および実際の挿入を達成する機能をする。このメカニズムにおける第１ステップは、配列の配列の３'末端からジヌクレオチドを切断して５'オーバーハングを残すように思われる。
【０１３５】
本発明の多数のプテリジンヌクレオチド（例えば、式Ｖまたは式VIにより例示される化合物）はグアノシンに構造的に類似するので、インテグラーゼにより切断されるジヌクレオチドにおいてグアノシンの代わりに使用することができる。完全なDNA 配列において、付近のプリンはプテリジンヌクレオチドのシグナルをクエンチするであろう。インテグラーゼによる鎖からのヌクレオチドの切断はクエンチされた蛍光シグナルを解放し、そして蛍光の増加の検出により反応の実時間のモニターを可能とする。これはインテグラーゼ酵素の活性についての簡単かつ急速なアッセイを提供する。
【０１３６】
したがって、なお他の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、 HIV−１DNA のＵ５末端をつくり、インテグラーゼの基質として作用し、そして下記の配列から成る群より選択される：
５'−GTN TGG AAA ATC TCT AGC AGT −３’（配列識別No：２），
５'−GTG TNG AAA ATC TCT AGC AGT −３’（配列識別No：３），
５'−GTG TGN AAA ATC TCT AGC AGT −３’（配列識別No：４），
５'−GTG TGG AAA ATC TCT ANC AGT −３’（配列識別No：５），
５'−GTG TGG AAA ATC TCT AGC ANT −３’（配列識別No：６），
５'−GTG TNG AAA ATC TCT ANC AGT −３’（配列識別No：７），
５'−ACT GCT AGA NAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：８），
５'−ACT GCT ANA GAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：９），
５'−ACT NCT AGA GAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：10）および
５'−ACT GCT NGA GAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：11）。
【０１３７】
ここでＡはアデノシンヌクレオチドであり、Ｃはシトシンヌクレオチドであり、Ｇはグアノシンヌクレオチドであり、Ｔはチミジンヌクレオチドであり、そしてＮは式ＸVI、式ＸVII 、または式ＸVIIIのプテリジンヌクレオチドであり、式中Ｒ22はＨまたはOHであり、より好ましくは、Ｒ22はＨである。
【０１３８】
もちろん、プテリジンヌクレオチドおよびプテリジンオリゴヌクレオチドは、多数の関係においてDNA と他の分子との相互作用を研究するために利用することができる。例えば、式ＸIX，ＸＸ，ＸＸＩ、およびＸＸIIのプテリジンヌクレオチドは、他の特許請求した化合物の大部分とのエネルギー転移を達成することができる。これらの化合物は宿主ゲノムの中への外来DNA の挿入をモニターするために使用することができ、ここでヌクレオチドを含有するDNA 鎖は他の特許請求した化合物の１つを含有するDNA 鎖に対して近接させる。これはエネルギー転移を発生させ、その結果新しい不連続のシグナルを放射させる。
【０１３９】
当業者は認識するように、本発明のプテリジン誘導体は、また、ほとんど任意の生物学的分子を標識化するための蛍光標識として単に使用することかできる。未保護のプテリジン単独は、直接に、またはリンカーまたはスペーサーを通して、プテリジン１Ｎまたは８Ｎにより、標識化しようとする組成物に結合することができる。また、プテリジンヌクレオシドは蛍光標識として使用することができる。プテリジンヌクレオシドは、好ましくは５'−ヒドロキシル、３'−ホスフェート、または２'−ヒドロキシル（リボフラノースの場合において）を通して直接、またはリンカーを通して、標識化しようとする組成物に結合することができる。このような標識化組成物は、生物学的分子、例えば、抗体、リガンド、細胞表面レセプター、および酵素を包含するが、これらに限定されない。
【０１４０】
in vitroまたはin vivo において係合標識化されたオリゴヌクレオチドを検出する方法は当業者によく知られている。これらの手段は、直接可視化、蛍光顕微鏡検査、フルオロメーター、写真的検出、画像増強を使用する検出、光電子倍増管、ビデオカメラなどを包含するが、これらに限定されない。もちろん、特定の方法は特定の実験に依存する。例えば、オリゴヌクレオチドを酵素活性について、または１対の分子の間のエネルギー転移についてのアッセイとして使用する場合、反応はフルオロメーターにより溶液中で実施することができる。オリゴヌクレオチドをインサイチュ・ハイブリダイゼーションのプローブとして使用する場合、画像獲得システム（例えば、蛍光顕微鏡と画像処理システムとの組み合わせを有するCCDビデオカメラ）を使用して検出を実施することができる。
【０１４１】
本発明のヌクレオチドトリホスフェート化合物は、DNA 増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（Innis, et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Application, Academic Press, Inc. San Diego, (1990)) 、リガーゼ連鎖反応（LCR)（参照、Wu et al., Genomics, 4 : 560 (1989), Landegren, et al., Science, 241 : 1077 (1988)およびBarringer, et al., Gene, 89 : 117 (1990))、転写増幅（参照、Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.), 86 : 1173 (1989))および自己持続配列複製（参照、Guatelli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.), 87 : 1874 (1990) においてDNA 合成のモノマーとして利用することができる。本発明のプテリジンヌクレオチドを利用する増幅は、特定のDNA 配列について急速なアッセイを提供する。特定のDNA 配列の存在または非存在が病理的症状（例えば、AIDS）の診断である場合、プテリジンヌクレオチドトリホスフェートを使用する増幅は極端に感受性の急速な診断道具を提供する。
【０１４２】
例えば、PCR 増幅を使用する場合、問題のDNA 配列をフランキングするDNA 配列に対して相補的である１対のPCR プライマーを選択する。適切な標的配列が試料の中に存在する場合、プライマーの間のDNA 配列を増幅されるであろう。この増幅されたDNA 配列はプテリジンヌクレオチドトリホスフェートを含有するであろう。増幅された配列は、混合物の中に残留するモノマーから、簡単な大きさ分画（例えば、NAP カラム、 Pharmacia−LKB 、米国ニュージャージイ州ピスカタェイ）またはよく知られている他の技術により分離することができる。次いで、増幅された配列の存在または非存在は、残留する混合物の蛍光を測定することによって直ちに検出することができる。
【０１４３】
また、蛍光偏光（FP）の測定を使用して、プライマーおよびヌクレオチドモノマーからのPCR 生成物の分離を必要としないで、陽性または陰性のPCR 反応を検出することができる。この技術はプテリジンヌクレオチドのモノマー、またはプテリジンヌクレオチドのモノマーを組込んだ比較的短い、各々約25塩基対のプライマーを使用する。PCR 法が完結した後、得られる混合物をFPを使用して、励起波長の偏光ビームを混合物に通過させることによって分析する。
【０１４４】
標的配列が出発混合物の中に存在しない場合、蛍光性プライマーは溶液の中に比較的小さい一本鎖の断片として残留するか、または蛍光性ヌクレオチドモノマーは溶液の中に比較的小さい分子として残留するであろう。モノマーまたは短いプライマー断片は、比較的散乱した、非偏光の蛍光を放射するであろう。対照的に、標的配列が存在する場合、プテリジンモノマーまたは蛍光性プライマーは励起シグナルに対して応答していっそうゆっくり動く、より大きい二本鎖のセグメントの中に組込まれ、そして混合物が放射する蛍光はいっそう偏光されているであろう。参照、欧州特許（EP）第382433号、これはこの技術を詳細に記載している。
【０１４５】
したがって、本発明は式Ｉのプテリジンヌクレオチドトリホスフェートを提供する。式III 〜ＸＩのトリホスフェート化合物は特に好ましい。したがって、第１の好ましいトリホスフェートは式III であり、式中Ｒ12はNH2 であり、そしてＲ20は式IIであり、式中Ｒ21はトリホスフェートであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はＨである。
第２の好ましいトリホスフェートは式IVであり、式中Ｒ12はNH2 であり、そしてＲ20は式IIであり、式中Ｒ21はトリホスフェートであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はＨである。
【０１４６】
第３の好ましいトリホスフェートは式Ｖであり、式中Ｒ20は式IIであり、式中Ｒ21はトリホスフェートであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はＨである。
第４の好ましいトリホスフェートは式VIであり、式中Ｒ16はNH2 であり、そしてＲ20は式IIであり、式中Ｒ21はトリホスフェートであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はＨである。
【０１４７】
第５の好ましいトリホスフェートは式VII であり、式中Ｒ16はNH2 であり、そしてＲ20は式IIであり、式中Ｒ21はトリホスフェートであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はＨである。
第６の好ましいトリホスフェートは式VIIIであり、式中Ｒ12はNH2 であり、そしてＲ17は式IIであり、式中Ｒ21はトリホスフェートであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はＨである。
【０１４８】
第７の好ましいトリホスフェートは式IXであり、式中Ｒ12はNH2 であり、そしてＲ17は式IIであり、式中Ｒ21はトリホスフェートであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はＨである。
第８の好ましいトリホスフェートは式Ｘであり、式中Ｒ12はNH2 であり、そしてＲ17は式IIであり、式中Ｒ21はトリホスフェートであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はＨである。
【０１４９】
第９の好ましいトリホスフェートは式ＸＩであり、式中Ｒ12はNH2 であり、そしてＲ17は式IIであり、式中Ｒ21はトリホスフェートであり、Ｒ22はＨであり、そしてＲ23はＨである。
【０１５０】
本発明の追加の面は、前述のアッセイの実施において有用なキットに関する。これらのキットは種々の形態を取ることができ、そして配列の特定の増幅プライマーおよび１または２以上のプテリジンヌクレオチドトリホスフェートを含有する１または２以上の容器を含んでなる。キットの他の任意の成分は、例えば、ポリメラーゼ、モノマーを増幅された混合物から分離するために使用する手段、およびPCR または他の増幅反応のための適当な緩衝液を包含する。上記成分に加えて、キットはまた前述の方法を実施するための説明書を含有することができる。
【０１５１】
特許請求するプテリジンヌクレオチドは、当業者によく知られている標準的方法により合成することができる。一般に、保護されたプテリジン誘導体を４−クロロベンゾイルまたはパラトルエンスルホニルエステルとして保護された３'−または５'−ヒドロキシルを有するクロロフラノースと反応させて、プテリジンヌクレオシドを生成する。参照、例えば、Kiriasis et al., p. 49-53, Chemistry and Biology of Pteridines, Kisliuk およびBrown 編、Elsevier North Holland, Inc., N. Y. (1979), Schmid et al., Chem. Ber. 106 : 1952-1975 (1973), Pfleidere 、米国特許第 3,798,210号、Pfleidere 、米国特許第 3,792,036号、Herris et al., Liebigs Ann. Chem., 1457-1468 (1981) 、これらは種々のプテリジンヌクレオシドの合成を例示し、そして引用することによって本明細書の一部とされる。参照、また、実施例１〜４、これらはプテリジンヌクレオシドの合成を記載している。カップリング後、保護基を除去し、５'−ヒドロキシルをそのジメトキシトリチルエーテルに交換する。引き続いて５'−ヒドロキシルをＨ−ホスホネート、ホスホアミダイト、またはヘミスクシネートに変換すると、所望の化合物が得られる。
【０１５２】
還外アミンまたは保護されたアミンを生成物において望む場合、それはいくつかの段階の任意の段階において導入することができる。例えば、出発プテリジンは、それ以上の操作の前に保護アミン置換基を含有することができる（例えば、式III の化合物を参照のこと）。また、アミンは後の段階においてオキソ部分をチオンに変換し、次いでアンモニアでアミン化することによって導入することができる（例えば、式III のホスホアミダイトの合成を記載する実施例８を参照のこと）。アミンを導入するなお他の方法は、２位にメチルチオ置換基を有する出発プテリジンを使用する（例えば、式Ｖのホスホアミダイトの合成を記載する実施例７を参照のこと）。所望のクロロフラノースとのカップリング後、保護基を除去し、メチルチオ基をアンモニアと置換する。
【０１５３】
ヌクレオシドの５'−ヒドロキシルを保護基（好ましくはジメトキシトリチル）でブロックする。保護基をカップリングする手段は当業者によく知られている。特に、ジメトキシトリチル基のカップリングは実施例６〜９において例示されている。簡単に述べると、これは乾燥ピリジン中のヌクレオシドとジメトキシトリチルクロライドとの反応により達成される。他のプロトコールは一般に当業者に知られている。参照、例えば、Atkinson et al., chapter 3, Gait編、Oligonucleotide Synthesis : A Practical Aproach (IRL Press, Washington, D. C., 1984)、これは引用することによって本明細書の一部とされる。
【０１５４】
プテリジンヌクレオチドの３'−ヒドロキシルは、この分野においてよく知られている方法を使用して、そのそれぞれのヘミスクシネート（上に定義したCPG へのカップリングのために）、ホスホアミダイト、Ｈ−ホスホネート、またはトリホスフェートに変換することができる。例えば、ヌクレオシド３'−ヒドロキシルのヘミスクシネートへの変換は、無水コハク酸との反応により達成することができる。Atkinson et al., chapter 3, Gait編、Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach (IRL Press, Washington, D. C., 1984) （これは引用することによって本明細書の一部とされる）は、コントロールされた孔のガラスの官能化およびヌクレオシド−３'−Ｏスクシネートの合成およびカップリングを記載している。
【０１５５】
ヌクレオシドをホスホアミダイトに変換する方法は、また、当業者によく知れている。参照、例えば、Atkinson et al., chapter 3, Gait編、Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach (IRL Press, Washington, D. C., 1984) （これは引用することによって本明細書の一部とされる）、これはMcBride およびCaruthers, Tetrahedron Lett., 24 : 245 (1983) 。他のアプローチは実施例７および８において例示されており、ここにおいてヌクレオシドをβ−シアノエチル−ビス−ジイソプロピルホスファンとテトラゾール中で反応させる。ホスホアミダイトの引き続く単離はそれらの実施例に記載されている。
【０１５６】
同様に、ヌクレオシドをＨ−ホスホネートに変換する手段は、また、当業者によく知られている。１つアプローチにおいて、三臭化リン（III ）誘導体を使用して、ヌクレオシドの３’−ヒドロキシルホスフィチレートを直接ホスフィチル化する。さらに詳しくは、リン（III ）トリイミダゾリドを使用して、３'−ヒドロキシルをホスフィチル化することができる。この方法は、Garegg et al., Chemica Scripta, 25 : 280-282 (1985) およびTocik et al., NucleicAcids Res., 18 : 193 (1987)(それらの双方は引用することによって本明細書の一部とされる）に詳細に記載されている。
【０１５７】
同様に、トリス−（1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−２−プロピル）ホスファイトを使用してリボヌクレオシド−Ｈ−ホスホネートを製造することは、Sakatsume et al., Nucleic Acids Res., 17 : 3689-3697 (1989)(これは引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されている。ジオキシヌクレオシド−Ｈ−ホスホネートを製造する同一の試薬の使用は、Sakatsume et al., Nucleic Acids Res., 18 : 3327-3331 (1990)(これは引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されている。Ｈ−ホスホネートを製造する３’−ヒドロキシルの誘導化の他のアプローチは、Sekine et al., J. Org. Chem., 47 : 571-573 (1982) ; Marugg et al., Tetrahedron Lett., 23 : 2661-2664 (1986) 、およびPon et al.,Tetrahedron Lett., 26 : 2525-2528 (1985)の中に見出すことができる。
【０１５８】
３'−ヒドロキシルのトリホスフェートとしての誘導化は、当業者に知られている多数の手段により達成することができる。プテリジンヌクレオシドが酵素基質として活性するために十分な自然ヌクレオチドに対する類似体を有する場合、モノホスフェートを後述するように化学的に合成し、次いで、それぞれ適当なヌクレオチドモノホスフェートおよびジホスフェートキナーゼを使用して、酵素的にジホスフェートに、次いでトリホスフェートに変換することができる。
【０１５９】
また、ヌクレオシドはトリホスフェートとして化学的に誘導化することができる。これはヌクレオシドをトリメチルホスフェートおよびPOCl3 と反応させ、次いでトリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝液を添加してヌクレオチドモノホスフェートを生成し、次いでこれをクロマトグラフィーにより精製することができる。次いでヌクレオチドモノホスフェートをカルボニルイミダゾールを使用して活性化し、トリブチルアンモニウムピロホスフェートとカップリングしてヌクレオチドトリホスフェートを生成する。次いでヌクレオチドトリホスフェートをトリエチルアンモニウム塩より安定なナトリウム塩として沈澱させ、分解なしに貯蔵することができる。ヌクレオシドのヌクレオチドトリホスフェートへの誘導化は、実施例10において詳細に説明されている。
【０１６０】
本発明のプテリジン誘導体の合成は実施例に詳細に記載されている。特に、式III ，VI，IX，ＸおよびＸＩのプテリジンヌクレオチドの合成は、それぞれ、実施例１〜５において例示されている。式IV，Ｖ，VIIIおよびVII のプテリジンヌクレオチドホスホアミダイトの合成は、実施例６〜９において例示されている。プテリジンヌクレオシドのプテリジンヌクレオチドトリホスフェートへの変換は、実施例10において例示されている。特許請求するプテリジンヌクレオチドの１つを組込んだジオキシオリゴヌクレオチドの合成、切断および脱保護は実施例11において例示されている。最後に、インテグラーゼ活性についてのアッセイにおける特許請求するオリゴヌクレオチドの使用は実施例12において例示されている。下記の実施例により、本発明を例示するが、これらの実施例は本発明を限定しない。
【実施例】
【０１６１】
実施例１. 式III のヌクレオシド：４−アミノ−２−フェニル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−７−オン（５）の合成
ａ）イソニトロソマロノニトリルの銀塩（１）
工程（ｂ）において使用するイソニトロソマロノニトリルの銀塩の合成は、Longo, Gazz. Chim. Ital., 61 : 575 (1931) に記載された。酢酸およびH２O(１／１）の 120mlの溶液に、20ｇ（0.3mole)（Fluka AG、スイス国）を添加した。この混合物を、マロノニトリルが溶解するまで加熱および撹拌した。次いでこの混合物を０℃に冷却し、 100mlのH２O 中の23ｇ（0.33mole）の亜硝酸ナトリウムの溶液を撹拌しながらゆっくり添加した。次いでこの溶液を室温において暗所で12時間撹拌した。このオレンジ色溶液に、 100mlのH２O中の52ｇ(0.3mole）の溶液を添加した。生ずる沈殿を集め、低い真空下に濾過し、エーテルで洗浄し、次いでデシケーター中でP4O10 の存在下に真空下に乾燥すると、１が59.7ｇ（99％の収率、融点＞ 350℃）。
【０１６２】
ｂ）２−フェニル−４，６−ジアミノ−５−ニトロソピリミジン（２）
２−フェニル−4,6−ジアミノ−５−ニトロソピリミジンの合成は、Taylor et al., J. Am. Chem. Soc., 81 : 2442-2448（1959）に記載された。小さい部分、0.11moleの微細なイソニトロソマロノニトリルの銀塩（１）を、 100mlのメタノール中の 0.1moleのベンゾアミジンハイドロハライドの撹拌溶液に添加した。添加の完結後、１時間撹拌した。この時まで、黄色銀塩は消失し、白色ハロゲン化銀の重い沈殿が分離した。反応混合物を濾過し、黄色濾液を室温において減圧下に蒸発乾固した。粗生成物の収率はほぼ定量的であった。酢酸エチルから再結晶化させると、イソニトロソマロノニトリルの純粋なベンゾアミジン塩が淡黄色結晶の形態で得られた（融点 151−150 ℃）。C10H5N5Oについての分析、計算値：Ｃ，55.8；Ｈ，4.2 ；Ｎ，32.5。実測値：Ｃ，55.7；Ｈ，4.0 ；Ｎ，32.6。
【０１６３】
10mlの２ｇのα−ピコリン中のイソニトロソマロノニトリルのベンゾアミジン塩の混合物を 125〜130 ℃に 0.5時間加熱した。塩は急速に溶解し、この混合物の色は除々に緑色になった。次いで反応混合物を冷却し、H2O で希釈した。放置後濾過すると、２が２−フェニル−5,6−ジアミノ−５−ニトロソピリミジンの青色がかった結晶として得られた（融点 243−244 ℃）。C10H9N5Oについての分析、計算値：Ｃ，55.8；Ｈ，4.2 ；Ｎ，32.5。実測値：Ｃ，55.9；Ｈ，3.9 ；Ｎ，32.6。
【０１６４】
ｃ）４−アミノ−２−フェニル−プテリジン−７−オン（３）
４−アミノ−２−フェニル−プテリジン−７−オンは、Harris et al., Liebigs Ann. Chem. 1457-1468 (1981)に記載された。 200mlのメタノールに、2.15ｇ（10mole）の２−フェニル−４，６−ジアミノ−５−ニトロソピリミジン（２）を添加した。反応が止むまで（ほぼ２時間）、５％炭素担持パラジウム触媒の存在下に水素を使用して混合物を撹拌機中で室温において水和した。無色の溶液を濾過し、20mlのH2O 中の１ｇのNaの溶液と一緒にし、加熱沸騰させ、次いで活性炭で処理し、熱時濾過した。濾液を氷酢酸でpH５にし、放置し、冷却した。沈殿をジメチルホルムアミドから再結晶化させると、３が 1.0ｇの褐色がかった結晶として得られた（42％の収率、融点 330−332 ℃) 。
【０１６５】
ｄ）４−アミノ−２−フェニル−８−〔２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−β−Ｄ−リボフラノシル〕プテリジン−７−オン（４）
1.0ｇ(4.2mole）の４−アミノ−２−フェニル−プテリジン−７−オン（３）および数個の結晶の硫酸アンモニウムの混合物を、 100mlのヘキサメチルジシラザン（HMDS）中で還流下に４時間加熱した。冷却後、HMDSを真空下に蒸留し、残留物をう100mの乾燥トルエン中に溶解した。この混合物に、2.17ｇ(4.6mole）の２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−α−Ｄ−リボフラノシルクロライド（実施例３におけるようにして製造した、トルイル誘導体について工程（ａ））および 0.476ｇ(2.3mole）の銀過塩素酸塩を添加した。次いでこの溶液を無水条件下に室温において24時間撹拌し、次いで 200mlのCH2Cl2で希釈した。生ずるAgCl沈殿をシリカで濾過し、濾液を 100mlの飽和水性炭酸水素ナトリウム溶液で処理し、次いで 100mlの飽和塩化ナトリウム溶液で処理した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、次いで濾液を蒸発させた。
【０１６６】
残留物を少量の酢酸エチル中に溶解し、シリカゲルのカラム上に置き、次いでｎ−ヘキサン／酢酸エチル5:1を溶離した。主要な画分を集め、蒸発させ、残留物をCHCl３  ／メタノールから２回再結晶化させると、４が1.43ｇ（54％の収率）の無色の結晶として得られた（融点 175−178 ℃）。C31H23Cl2N5O6 (632.5）についての分析：Ｃ，58.87 ；Ｈ，3.67；Ｎ，11.07 。実測値：Ｃ，58.62 ；Ｈ，3.74；Ｎ，11.10 。
【０１６７】
ｅ）４−アミノ−２−フェニル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−７−オン（５）
50mlの無水メタン中の10mgのナトリウムの溶液に、 0.632ｇ（１mmol）の４−アミノ−２−フェニル−８−〔２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−β−Ｄ−リボフラノシル〕プテリジン−７−オン（４）を添加した。この溶液を室温において１時間撹拌した。次いでこの溶液を AcOHの添加により中和し、次いで蒸発させた。残留物をメタノール／H2O から再結晶化させると、５が 0.323ｇ（91％の収率）の無色の結晶（融点 169−172 ℃）。C17H17N5O4 (355.4）についての分析：Ｃ，57.46 ；Ｈ，4.81；Ｎ，19.71 。実測値：Ｃ，57.04 ；Ｈ，4.88；Ｎ，20.01 。
【０１６８】
実施例２. 式IVのヌクレオシド：２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル−イソキサントプテリン（15）の合成
2,4,5−トリアミノ−６−ベンジルオキシ−ピリミジン（９）の合成、工程（ａ）〜（ｄ）は、Pfeiderer et al., Chem. Ber., 94 : 12-18（1961）に記載された。
ａ）６−クロロ−2,4−ジアミノ−ピリミジン（６）
500ml)新しく蒸留したPOCl3 に80〜90℃の温度において、 100ｇの2,4−ジアミノ−６−オキソ−ジヒドロピリミジン（Aldrich、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）を添加した。この混合物を、ほぼ２時間後、混合物が完全に溶解するまで、還流下に蒸留した。残留POCl3 を真空を使用して吸引し、残留するシロップ状物を氷上にゆっくり排出した。高度に酸性の溶液を濃アルミン酸ナトリウム溶液で冷却し、最後の段階において固体状炭酸ナトリウムを使用して、注意して中和した。完結したとき、溶液の合計の体積はほぼ1800mlである。冷却すると、黄色がかった沈殿が分離し、これを吸引し、真空デシケーター中で乾燥した。大部分非有機塩を含有する最終生成物を３回沸騰させ、各回１リットルのアセトン（活性炭を添加した）を使用する。抽出液を冷却し、生ずる透明な沈殿を集める。濾液を蒸発させると、追加の画分が得られる。
【０１６９】
ｂ）2,4−ジアミノ−６−ベンジルオキシ−ピリミジン（７）
100mlのベンジルアルコール中の 3.8ｇの溶液を、油浴中で、21.6ｇの６−クロロ−２，４−ジアミノ−ピリミジン（６）とともに 160℃において３時間加熱する。余分のアルコールを真空下に蒸留する。
【０１７０】
ａ）油状残留物を温水でよく洗浄し、これによりゴム状物質が得られる。この温かい溶液を温かい30％酢酸中に溶解し、活性炭で脱色し、希薄アンモニアでpH６にする。ゆっくり冷却すると、油状塊が最初に分離し、次いで結晶質物質が分離する。結晶を撹拌、デカンテーションおよび濾過により凝固した油状物から分離する。次いで油状残留物を数回加熱および冷却して結晶化させる。プールした画分を、それらがいったん真空デシケーター中で乾燥させると、少量のクロロホルム中に溶解し、次いで活性炭および酸化アルミニウムで処理し、再び−20℃以下の温度に強く凍結することによって分離する。この方法を数回反復した後、クロマトグラフィー的に純粋な７が得られる。
【０１７１】
ｂ）別精製法において、アルコールを含有しない反応残留物をベンゾール中に溶解し、活性炭で処理し、濾液をよく蒸発させる。冷却したとき、分離する生成物をベンゾールから数回再結晶化させると、７が得られる。
【０１７２】
ｃ）５−ニトロソ−2,4−ジアミノ−６−ベンジルオキシ−ピリミジン（８）
250mlの温かい30％酢酸中の16ｇの2,4−ジアミノ−６−ベンジルオキシ−ピリミジン（７）の溶液に、25mlのH2O 中の７ｇの亜硝酸ナトリウムの溶液を添加する。亜硝酸ナトリウムの溶液を70〜80℃に保持し、連続的に撹拌しながら滴下する。ヨウ化カリウム澱粉紙が陽性の反応を示すまで、亜硝酸ナトリウム溶液を添加する。紫−赤色の沈殿を冷却し、吸引し、次いでエタノールまたはアセトンから再結晶化させると、８が得られる。
【０１７３】
ｄ）2,4,5−トリアミノ−６−ベンジルオキシ−ピリミジン（９）
ナトリウムジチオナイトを 300mlのH2O 中の17ｇの５−ニトロソ−2,4−ジアミノ−６−ベンジルオキシ−ピリミジン（８）の懸濁液に50℃において、赤色ニトロソ化合物が完全に還元されるまで、少しずつ添加する。水性アンモニアの添加により、遊離塩基を分離させる。粗生成物を冷却し、吸引し、活性炭および微量のナトリウムジチオナイトを添加した水から結晶化させると、９が得られる。
【０１７４】
ｅ）2,4−ジアミノ−６−ベンジルオキシ−５−エトキシカルボニルメチレンイミノ−ピリミジン（10）
2,4−ジアミノ−６−ベンジルオキシ−５−エトキシカルボニルメチレンイミノ−ピリミジンの合成は、PfleidererおよびReisser, Chem. Ber., 95 : 1621−1628 (1961) に記載されている。 250mlのH2O 中の2.39ｇの2,4,5−トリアミノ−６−ベンジルオキシ−ピリミジン（９）の懸濁液を、室温において３ｇのエチルグリオキシレート−ヘミエチルアセタール中で３時間撹拌する。生ずる鮮明な黄色沈殿を低い真空下に濾過し、洗浄し、 100℃の温度において乾燥する。沈殿をエタノールから再結晶化させると、10が得られる。
【０１７５】
ｆ）２−アミノ−４−ベンジルオキシプテリジン−７−オン（11）
２−アミノ−４−ベンジルオキシプテリジン−７−オンの合成は、PfleidererおよびReisser, Chem. Ber., 95 : 1621-1628 (1961)に記載されている。 190mlのエタノール中１ｇの2,4−ジアミノ−６−ベンジルオキシ−５−エトキシカルボニルメチレンイミノ−ピリミジン（10）の溶液に30mlの１N NaHCO3を添加する。この溶液を還流下に１時間蒸留し、この溶液を少量の残留する未溶解物質から加熱分離する。20mlの氷酢酸で濾液を酸性化することによって沈殿するプテリジンを冷却後吸引し、ベンジルアルコールから再結晶化させると、11が得られる。
【０１７６】
ｇ）４−ベンジルオキシ−２−（N,N−ジメチルアミノメチレンイミノ）−プテリジン−７−オン（12）
100mlの無水DMF に、2.88ｇ（10.7mmol）の２−アミノ−４−ベンジルオキシプテリジン−７−オン（11）および1.92ml（11.2mmol）のN,N−ジメチルホルムアミドジエチルアセタールを添加する。この混合物を室温において４時間撹拌し、その時間までに混合物は透明な溶液となる。DMF を高真空下に50℃以下において蒸留する。次いでこの残留物に、１mlのメタノールおよび50mlのジエチルエーテルの溶液を添加する。10分後、沈殿を集める。濾液を再び蒸発乾固し、生ずる残留物を10mlのジエチルエーテル中で撹拌すると、第２沈殿が得られる。沈殿をプールし、高真空下に乾燥すると、12が得られる。
【０１７７】
ｈ）４−ベンジルオキシ−２−（N,N−ジメチルアミノメチレンイミノ）−８−（２−デオキシ−3,5−ジ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（13）
3.24ｇ（10mmol）の４−ベンジルオキシ−２−（N,N−ジメチルアミノメチレンイミノ）−プテリジン−７−オン（12）に、 100mlの無水アセトニトリルを添加する。次いで1.87ml（12.5mmol）のDBU を添加し、この溶液を約10分後透明になるまで撹拌する。この溶液に、 4.5ｇ（11mmol）の１−クロロ−２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リボフラノースを除々に添加する。次いで30分間撹拌する。生ずる沈殿を集めると、乾燥後、α，β−アノマー混合物が得られる。濾液を蒸発乾固し、残留物を 100mlのCH2Cl2 中に溶解し、H2O で２回洗浄してDBU を除去する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで蒸発させる。生ずる残留物をトルエン／酢酸エチル１／３中のシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製する。主要な画分を集め、蒸発させると、α，β−アノマー混合物が得られる。両方の収穫物をプールし、酢酸エチル／メタノール20／１から再結晶化させると、13が得られる。
【０１７８】
ｉ）８−（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−イソキサントプテリン（14）
100mlのメタノール中に、3.38ｇ（５mmol）の４−ベンジルオキシ−２−（N,N−ジメチルアミノメチレンイミノ）−８−（２−デオキシ−3,5−ジ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（13）を溶解させる。次いで 0.2ｇの５％炭素担持パラジウムを添加し、この混合物を水素雰囲気下に１日間震盪させる。触媒を濾過し、濾液を蒸発乾固させる。残留物をメタノールから再結晶化させると、14が得られる。
【０１７９】
ｊ）８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−イソキサントプテリン（15）
30mlのメタノール中のアンモニアの飽和溶液に、 1.0ｇ（２mmol）の８−（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−イソキサントプテリン（14）を添加する。この混合物を室温において一夜撹拌する。次いでこの溶液を蒸発乾固し、残留物を少量のH2O から数滴の酢酸の添加により再結晶化させる。冷却すると、15が得られる。
【０１８０】
実施例３. 式IXのヌクレオシド：４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−メチル−プテリジン−２−オン（23）の合成
ａ）２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リボフラノシル−クロライド（16）
工程（ｅ）において使用する２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リボフラノシルクロライドは、Hoffer, Chem. Ber., 93 : 2777-2781 (1960) に記載されている。 243mlのメタノールに、13.6ｇ(0.1mole）の２−デオキシ−Ｄ−リボース（Aldrich 、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）および27mlの１％メタノール性 HClを添加する。この混合物を12〜15分間密閉放置してメチルグルコシドを形成する。次いで、 3.5ｇの炭酸銀を混入してすべての炭化水素を直ちに結合させる。
【０１８１】
透明な濾過溶液を真空下に沸騰させると、シロップ様コンシステンシーが得られ、真空下に沸騰を反復する同時に少量の乾燥ピリジンを添加して、残留するメタノールを分離する。最後に、混合物を80mlのピリジン中に溶解し、34ｇ（0.22mole）のｐ−トルイルクロライドでアシル化する。次いでこの混合物を40〜50℃に２時間加熱するか、または室温において一夜放置する。水を添加し、次いで混合物 200mlのエーテルで分配する。次いでエーテル溶液をH２O 、次いで希薄硫酸、次いで炭酸水素カリウム溶液で洗浄してピリジンを除去する。次いで混合物を真空下に沸騰して、蜂蜜−黄色のシロップ状物を形成する。このシロップ状物から、結晶化した３，５−ジ−ｐ−トルイル−メチル−２−デオキシ−Ｄ−リボフラノシドをシード添加により得ることができる。
【０１８２】
クロライドを単離するために、シロップ状物を20〜50mlの氷酢酸中に溶解し、この溶液を80mlの塩化水素で飽和させた酢酸と一緒にビーカーに入れる。この溶液を10℃に保持し、塩化水素導入して、混合物を約10分間後濃厚な結晶質ペーストに固化させる。30分以内に、結晶質物質をフィルター上で低い真空下に無水エーテルで洗浄する。洗浄工程は好ましくは２回反復する。次いで、この物質を真空デシケーター中でソーダライムおよび五酸化リンで乾燥し、そしてこの物質は数週間この状態で安定に止まる。所望ならば、２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リボフラノシル−クロライド（16）をトルエンまたは四塩化炭素から再結晶化させる。
【０１８３】
ｂ）２−ヒドロキシ−4,6−ジアミノピリミジンサルフェート（17）
4,6−ジアミノ−２−ヒドロキシ−ピリミジンサルフェートの合成は、Bendich et al., J. Amer. Chem. Soc., 70 : 3109-3113(1948)に記載されている。5.40ｇの4,6−ジアミノ−２−チオピリミジン（Aldrich 、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）および 5.5ｇのクロロ酢酸に、75mlの沸騰するH2O を添加する。この溶液を1.25時間還流させる。冷却しないで、 9.5mlの18Ｎ硫酸を添加し、還流をさらに１時間続ける。ノーライトを添加し、冷却すると、17が得られる。
【０１８４】
ｃ）4,6−ジアミノ−５−ホルミルアミノ−２−ヒドロキシ−ピリミジン（18）
4,6−ジアミノ−５−ホルミルアミノ−２−ヒドロキシ−ピリミジンの合成は、Pfleiderer, Chem. Ber. 90 : 2272-2276 (1957)に記載されている。54mlのホルムアミドに９ｇの４，６−ジアミノ−２−ヒドロキシ−ピリミジンサルフェート（17）および4.5 ｇの亜硝酸ナトリウムを添加する。この溶液を60℃に加熱し、10mlのギ酸を滴下する。これは赤色懸濁液を形成し、これを 110℃にさらに加熱する。黄色化が得られるまで、少量のナトリウムジチオナイトを添加する。この時間の間に、温度は 130℃を超えてはならない。この混合物を冷却し、沈殿を高真空下に濾過する。最後に、18を大量のH２O （動物活性炭を含む）から再結晶化させる。
【０１８５】
ｄ）4,5,6−トリアミノ−ピリミジン−２−オン塩酸塩（19）
4,5,6−トリアミノ−ピリミジン−２−オン塩酸塩の合成は、Pfleiderer, Chem. Ber. 90 : 2272-2276 (1957)に記載されている。３ｇの4,6−ジアミノ−５−ホルミルアミノ−２−ヒドロキシ−ピリミジン（18）に、50mlの10％〜15％のメタノール性 HClを添加する。この溶液を７時間還流させ、次いで放冷する。冷却すると、混合物を低い真空下に濾過し、次いでアルコール中で洗浄し、乾燥チャンバー中で乾燥する。次いでこの塩酸塩を室温においてH2O 中に溶解し、１Ｎアンモニアの添加により中和する。生ずる沈殿を集め、エタノールで洗浄し、乾燥チャンバー中で乾燥すると、19が得られる。
【０１８６】
ｅ）４−アミノ−７−メチル−プテリジン−２−オン（20）
50mlの水中に、1.77ｇ（0.01mole）の4,5,6−トリアミノ−ピリミジン−２−オン塩酸塩（19）を溶解する。溶液のpHを５に調節し、次いで４mlの40％水性メチルグリオキサル（FLUKA AG、スイス国）を添加し、この溶液を還流下に30分間加熱する。生ずる沈殿を集め、大量のH2O から再結晶化させると、20が得られる。
【０１８７】
ｆ）４−ベンゾルアミノ−７−メチル−プテリジン−２−オン（21）
20mlのピリジン中に、1.63ｇ（0.01mole）の４−アミノ−７−メチル−プテリジン−２−オン（20）を溶解する。次いで3.12ｇ（0.02mole）の塩化ベンゾイルを、混合物を撹拌しながら滴下する。この混合物を80℃に30分間加熱し、次いで氷上に注ぐ。生ずる沈澱を集め、エタノールおよびエーテルで洗浄し、次いでDMF から再結晶化させると、21が得られる。
【０１８８】
ｇ）４−ベンゾイルアミノ−１（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−メチル−プテリジン−２−オン（22）
60mlの無水アセトニトリルに、2.83ｇ（0.01mmol）の４−ベンゾイルアミノ−７−メチル−プテリジン−２−オン（21）を添加する。次いで 1.5ml（11mmol）の 1.8−ジアザビシクロ〔5.4.0〕ウンデク−７−エン（DBU)を添加し、この混合物を室温において15分間撹拌する。撹拌後4.26ｇ（11mmol）の２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リボフラノシルクロライドを溶液に添加し、室温において１時間撹拌する。次いでこの溶液を蒸発乾固し、残留物をCHCl3 中に溶解し、重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥する。小さい体積に濃縮した後、物質を酢酸エチル／アセトン４／１中のシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製する。主要な画分を蒸発させ、残留物をエタノールから再結晶化させると、22が得られる。
【０１８９】
ｈ）４−アミノ−１（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−メチル−プテリジン−２−オン（23）
50mlの飽和メタノール性アンモニアに、1.65ｇ(0.005mole）の４−ベンゾイルアミノ−１−（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−メチル−プテリジン−２−オン（22）を添加する。この混合物を室温において一夜撹拌する。次いで混合物を蒸発乾固し、残留物をエタノール／H2O 20：１から再結晶化させると、２３が得られる。
【０１９０】
実施例４. 式Ｘのヌクレオシド：４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メチル−プテリジン−２−オン（28）の合成
ａ）メチルグリオキサルモノアルドキシム（24）
メチルグリオキサルアルドキシムは、G. Charrier Gazz. Chim.Italy 37 : 145 (1907) のプロトコールに従い合成することができる。30mlの酢酸／H2O 溶液（1/1）に 5.8ｇ(0.1mole）のアセトンを添加する。次いでこの溶液を０℃に冷却する。20mlのH2O 中の 7.6ｇ（0.11mole）の亜硝酸ナトリウムの溶液を撹拌しながら滴下する。次いでこの溶液を室温においてさらに３時間撹拌し、次いで真空下に注意して蒸発させる。残留物をベンゼンで抽出し、部分的に蒸発させると、24が無色の結晶として得られる。結晶を高真空下に昇華によりさらに精製することができる。
【０１９１】
ｂ）４−アミノ−６−メチル−プテリジン−２−オン（25）
50mlのH2O に、1.77ｇ（0.01mole）の4,5,6−トリアミノ−ピリミジン−２−オン塩酸塩（19）（実施例３参照）を添加する。pHを５に調節し、混合物を撹拌しながら、1.74ｇ（0.02mole）のメチルグリオキサルモノアルドキシム（24）を添加する。対応するシッフ塩基の生ずる沈澱を集め、次いで25mlの80％硫酸中に溶解し、30分間 100℃に加熱する。冷却した後、この混合物を氷上に注ぎ、次いでNaHCO３により注意して中和し、これにより沈澱が形成する。生成物を濾過し、次いで大量のH2O から再結晶化させると、25が得られる。
【０１９２】
ｃ）４−ベンゾイルアミノ−６−メチル−プテリジン−２−オン（26）
４−ベンゾイルアミノ−６−メチル−プテリジン−２−オンの合成は、実施例３、工程（ｄ）におけるようにして、４−アミノ−６−メチル−プテリジン−２−オン（25）を４−アミノ−７−メチル−プテリジン−２−オン（20）の代わりに使用して実施する。
【０１９３】
ｄ）４−ベンゾイルアミノ−１−（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メチルプテリジン−２−オン（27）
４−ベンゾイルアミノ−１−（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メチルプテリジン−２−オンの合成は、実施例3 、工程（ｅ）におけるようにして、４−ベンゾイルアミノ−６−メチル−プテリジン−２−オン（26）を４−ベンゾイルアミノ−７−メチル−プテリジン−２−オン（21）の代わりに使用して実施する。
【０１９４】
ｅ）４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メチル−プテリジン−２−オン（28）
４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メチル−プテリジン−２−オン（27）の合成は、実施例３、工程（ｆ）におけるようにして、４−ベンゾイルアミノ−１−（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メチルプテリジン−２−オン（27）を４−ベンゾイルアミノ−１（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−メチル−プテリジン−２−オン（22）の代わりに使用して実施する。
【０１９５】
実施例５. 式ＸＩのヌクレオシド：４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−２−オン（32）の合成
ａ）4,5,6−トリアミノ−２−ヒドロキシピリミジンサルフェート（29）
化合物17、4,6−ジアミノ−２−ヒドロキシ−ピリミジンサルフェートは、実施例３工程（ｅ）に記載するように合成する。17の4,5,6−トリアミノ−２−ヒドロキシピリミジンサルフェート（29）への変換は、Bendich et al., J. Amer. Chem. Soc., 70 :3109-3113 (1948)に記載されている。110mlの氷酢酸および 110mlのH2O の混合物に、15.3ｇの非常に微細な17を添加する。
【０１９６】
この混合物を約５℃に保持し、25mlのH2O 中の11.0ｇの亜硝酸ナトリウムを一定に撹拌しながら添加する。カーマイン赤色の沈澱を２時間後に集め、３つの小さい部分の冷却H２O で洗浄する。湿潤沈澱を 400mlのH2O の中に懸濁させ、この混合物を３分間沸騰させ、その期間内に物質は漂白される。この溶液に、53mlの18Ｎ硫酸を注意して添加する。この混合物を数分間沸騰させ、ノーライト処理後、濾過し、冷却すると、29が得られ、これは２Ｎ硫酸から再結晶化させることができる。
【０１９７】
ｂ）４−アミノ−プテリジン−２−オン（30）
４−アミノ−プテリジン−２−オンの合成は、Taylor et al., J. Amer. Chem. Soc. 71 : 2538-2541 (1949)に記載されている。冷却NaOHでpH５に調節した50mlのH2O 中の 2.0ｇ（0.0084mole）の4,5,6−トリアミノ−２−ヒドロキシピリミジンサルフェート（29）の溶液に、 3.0ｇ（0.0113mole）のグリオキサルビサルファイトを添加する。反応混合物を加熱沸騰させ、pHを９に調節し、15分間沸騰させる。希塩酸で中和し、冷却し、濾過した後、薄黄褐色固体状物をH2O で、次いでアセトンで洗浄し、真空下に乾燥する。この固体状物を熱 0.5N NaOH中に溶解し、次いでノーライトで処理する。次いで熱濾液を酢酸で酸性化する。最後に、 0.5Ｎ酢酸から再結晶化させると、30が得られる。
ｃ）４−アミノ−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−２−オン（31）
20mlのヘキサメチルジシラザン（HMDS）に2.98ｇ（0.02mole）の４−アミノ−プテリジン−２−オン（30）を添加する。この混合物を還流下に、湿気を排除して、24時間加熱すると、透明な溶液が得られる。過剰のHMDSを真空下に除去すると、１−トリメチルシリルアミノ−２−トリメチルシリルオキシ−プテリジンが粘性油状物として得られる。
【０１９８】
残留物を 200mlのベンゼン中に溶解し、次いで9.37ｇ(0.022mole）の２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リボフラノシルクロライド、４ｇのHgO 、および４ｇのHgBr2 を添加し、この混合物を５時間還流させる。冷却後、沈澱を濾過し、濾液を蒸発乾固し、残留物を 100mlのCHCl3 中に溶解する。この溶液を２回 100mlの20％Klで抽出する。次いで有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、再び蒸発させ、残留物を少量の酢酸エチル中に溶解し、酢酸エチル／アセトン７：３を使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにかける。第１画分は過剰の糖を含有し、第２画分はα−アノマーを含有し、そして最後の溶出画分はβ−デオキシリボシドを含有する。蒸発させ、残留物をエタノールから再結晶化させると、31が得られる。
【０１９９】
ｄ）４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−２−オン（32）
0.51ｇ（１mmol）の４−アミノ−１−（２−デオキシ3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−２−オン（31）に、50mlの0.0005Ｎナトリウムメトキシドを添加する。この混合物を室温において24時間撹拌する。次いで、この混合物をAcOHで中和し、蒸発乾固し、２回H2O と共蒸発させる。次いで残留物を50mlのエタノールから再結晶化させると、32が得られる。
【０２００】
実施例６. 式IVのヌクレオシドのホスホアミダイト：４−アミノ−６−フェニル−８−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（41）の合成
４，６−ジアミノ−５−ニトロソ−ピリミジンの合成、工程（ａ）〜（ｃ）は、Evans et al., J. Chem. Soc., 4106 (1956)に記載された。
【０２０１】
ａ）4,6ジアミノピリミジン−２−スルフィン酸（33）
２N NaOH(200ml）中の50ｇの4,6−ジアミノ−２−メルカプトピリミジン（Aldrich 、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）の溶液に、 750mlの３％過酸化水素溶液を添加した。この溶液を20℃より低い温度に維持した。撹拌をさらに30分間続け、透明な薄黄色溶液を酢酸（約50ml）で酸性化した。沈澱をH２O で洗浄し、空気乾燥すると、33が58ｇ（95％の収率）の灰色アモルファス酸が得られた（融点 168−170 ℃分解）。分析のために、試料を希薄水性アンモニア中に溶解し、酢酸で再沈澱させた。C4H6N4O2Sについての分析：実測値：Ｃ，27.6；Ｈ，3.5 ；Ｎ，32.2。実測値：Ｃ，27.8；Ｈ，3.8 ；Ｎ，32.2。
【０２０２】
ｂ）4,6−ジアミノ−ピリミジン塩酸塩（34）
2.5Ｎエタノール性塩化水素(150ml）を含有する 500mlの乾燥エタノールに、50ｇの４，６−ジアミノピリミジン−２−スルフィン酸（33）を添加した。この混合物を30分間震盪した。次いでこの混合物を０℃に冷却し、１時間後、結晶を取り出し、エーテルで洗浄し、乾燥すると、23ｇの薄黄色針状結晶が得られた（融点 196−198 ℃）。もとの濾液を 250mlに濃縮し、次いで 750mlのエーテルを添加すると、それ以上の収穫物の15ｇのほとんど白色の針状結晶が得られた（融点 203−204 ℃）。C4H6N4HClについての分析：実測値：Ｃ，32.8；Ｈ，4.8 ；Ｎ，24.2。実測値：Ｃ，33.3；Ｈ，4.8 ；Ｎ，24.1。
【０２０３】
次いでスルフィン酸（５ｇ）を室温において塩酸（15ml，ｄ1.18）に少しずつ添加した。反応は激しく、二酸化硫黄が自由に発生した。塩酸を生ずるスラリーから減圧下に除去した。残留物をアセトンで、次いでエーテルで洗浄すると、4.05ｇの７が得られた（融点 195℃）。試料をスピリットから再結晶化させると、融点は 201−202 ℃上昇した。
【０２０４】
ｃ）4,6−ジアミノ−５−ニトロソ−ピリミジン（35）
250mlの２N HClに、 8.0ｇ（55mmol）の4,6−ジアミノ−ピリミジン塩酸塩（34）を添加した。4,6−ジアミノ−ピリミジン塩酸塩を溶解させた。次いでこの溶液を０℃に冷却し、15mlのH2O中に溶解した 4.2ｇ（61mmol）のNaNO2 の溶液を20分以内に撹拌しながら滴下した。０℃においてさらに30分間撹拌し、次いで室温において２時間撹拌した。紫色の溶液をNaHCO3で中和し、沈澱を集め、H2O およびエタノールで洗浄し、乾燥すると、35が 6.3ｇ（82％の収率）の青−紫色の結晶質粉末状物として得られた（融点＞ 350℃）。
【０２０５】
ｄ）４−アミノ−６−フェニル−プテリジン−７−オン（36）
４−アミノ−６−フェニル−プテリジン−７−オンの合成は、Harris et al., Liebigs Ann. Chem. 1457-1468 (1981)に記載された。50mlの無水エタノール中の 0.5Naの溶液に、1.38ｇ（10mmol）の4,6−ジアミノ−５−ニトロソ−ピリミジン（35）および 2.0ｇのフェニル酢酸エチルエステルを添加した。この物質を溶解させ、次いで溶液を還流下に１時間加熱した。沈降した沈澱を冷却し、集めた。次いで沈澱を100 H２O中で加熱し、不溶性ニトロソ化合物から濾過し、次いで希塩酸でpH２に酸性化した。いったんゼラチン状生成物が沈澱すると、それが微結晶質の状態に到達するまで、それを加熱した。次いでゼラチン状生成物をジメチルホルムアミドから再結晶化させると、36が結晶として得られた（融点＞ 320℃）。C12H9N5Oについての分析：実測値：Ｃ，60.24 ；Ｈ，3.79；Ｎ，29.28 。実測値：Ｃ，60.35 ；Ｈ，3.78；Ｎ，29.53 。
【０２０６】
ｅ）４−N,N−ジメチルアミノメチレンイミノ−６−フェニル−プテリジン−７−オン（37）
400mlの乾燥DMF 、2.39ｇ(10mmole）の４−アミノ−６−フェニル−プテリジン−７−オン（36）および 2.5mlのN,N−ジメチルホルムアミド−ジエチルアセタールの混合物を60℃において５時間撹拌した。この溶液を真空下に蒸発乾固し、残留物をイソプロパノールから再結晶化させると、37が2.83ｇ（96％の収率）の無色の結晶として得られた（融点 284−286 ℃）。C15H14N6O(294.3）についての分析：Ｃ，61.21 ；Ｈ，4.79；Ｎ，28.55 。実測値：Ｃ，60.88 ；Ｈ，5.00；Ｎ，28.15 。
【０２０７】
ｆ）４−N,N−ジメチルアミノメチレンイミノ−６−フェニル−８−〔２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−β−Ｄ−リボフラノシル〕プテリジン−７−オン（38）
60mlの乾燥アセトニトリルに2.94ｇ（10mmol）の４−N,N−ジメチルアミノメチレンイミノ−６−フェニル−プテリジン−７−オン（37）および1.49ml（11mmol）の1,8−ジアザビシクロ〔5.4.0〕ウンデク−７−エン(DBU）を添加した。この溶液を透明になるまで15分間撹拌した。この溶液に、4.72ｇ（11mmol）の２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−α−Ｄ−リボフラノシルクロライド（トリイル誘導体についての実施例３、工程（ａ）におけるようにして製造した）を添加した。次いでこの溶液を室温において２時間撹拌し、その期間内に黄色がかった沈澱が形成した。この固体状沈澱を集め、CHCl3／メタノールから再結晶化させると、38が 5.3ｇ（83％の収率）の黄色がかった結晶として得られた（融点 171−174 ℃）。C34H28Cl2N6O6 ・1/2H2O (696.6）についての分析：Ｃ，58.62 ；Ｈ，4.05；Ｎ，12.06。実測値：Ｃ，58.71 ；Ｈ，4.16；Ｎ，11.91 。
【０２０８】
ｇ）４−アミノ−６−フェニル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−７−オン（39）
25mlの無水メタノール中の70mgのK２CO３  から成るの溶液に、４−N,N−ジメチルアミノメチレンイミノ−６−フェニル−８−〔２−デオキシ−3,5-ジ-O-(4-クロロベンゾイル)-β−Ｄ−リボフラノシル〕プテリジン−７−オン（38）を添加した。次いで 0.7mlの濃アンモニアをこの懸濁液に添加した。この溶液を室温において２日間撹拌した後AcOHの添加により中和し、生ずる黄色沈澱(0.2ｇ，56％の収率）を集めた。濾液を蒸発乾固し、残留物をメタノールから再結晶化させると、39が他の0.12ｇ（34％の収率）の黄色結晶として得られた（融点 163℃分解）。C17H17N5O4・1/2H2O（364.4)についての分析：Ｃ，56.32 ；Ｈ，4.97；Ｎ，19.22 。実測値：Ｃ，56.16 ；Ｈ，4.75；Ｎ，19.14 。
【０２０９】
ｈ）４−アミノ−６−フェニル−８−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（40）
10mlの無水ピリミジン中の 0.355ｇ（１mmol）の４−アミノ−６−フェニル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−７−オン（39）の溶液に、多少のモレキュラーシーブおよび 0.407ｇ(1.2mmol）のジメトキシトリチルクロライドを添加した。この溶液を室温において12時間撹拌した。残留物を30mlのCH2Cl2中に溶解し、次いでNaHCO3の飽和溶液、次いでNaClの飽和溶液で抽出した。
【０２１０】
有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで再び抽出し、残留物をシリカゲルのカラムのクロマトグラフィーかけ、トルエン／EtOAc 1:1で溶離した。生成物の画分を蒸発させ、再び少量のCH2Cl2中に溶解し、次いでｎ−ヘキサンに撹拌しながら滴下し、真空デシケーター中で乾燥すると、40が0.46ｇ（70％）の黄色結晶粉末状物として得られた（融点 114℃分解）。C38H35N5O6（657.7)についての分析：Ｃ，69.39 ；Ｈ，5.36；Ｎ，10.64 。実測値：Ｃ，68.91 ；Ｈ，5.67；Ｎ，10.44 。
【０２１１】
ｉ）４−アミノ−６−フェニル−８−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン−３'−Ｏ−（β−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（41）
15mlのCH2Cl2中の 0.657ｇ（ａmmol）の４−アミノ−６−フェニル−８−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（40）の溶液に、 0.452ｇ(1.5mmol）の２−シアノエチル−ビス−N,N−ジイソプロピルアミノ−ホスファンおよび35mg(0.5mmol）のテトラゾールを添加した。次いでこの混合物をアルゴン雰囲気下に室温において12時間撹拌した。
【０２１２】
反応溶液を15mlのCH2Cl2で希釈し、次いでNaHCO3およびNaClの飽和溶液で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させた。残留物をシリカゲルのカラムのクロマトグラフィーにかけ、少量のトリエチルアミンを含有するトルエンEtOAc 3:2で溶離した。生成物の画分を 100mlのｎ−ヘキサンに撹拌しながら滴下すると、0.78ｇ（91％）の微結晶質粉末状物として得られた（融点＞100 ℃分解）。C47H52N7O7P（858.0)についての分析：Ｃ，65.80 ；Ｈ，6.11；Ｎ，11.43 。実測値：Ｃ，66.13 ；Ｈ，6.20；Ｎ，11.03 。
【０２１３】
実施例７. 式Ｖのホスホアミダイト：（３−メチル−８−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イソキサントプテリン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト）（51）の合成
ａ）２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキソ−ピリミジン（42）
２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキソピリミジンの合成は、Johns et al., J. Biol. Chem., 14 : 381-387 (1913) に記載された。NaOHの10％溶液の 100mlに、25ｇの４−アミノ−２−メルカプト−６−オキソピリミジン粉末(Aldrich、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）を添加した。この溶液に、25ｇの工業用ジメチルサルフェートを少しずつ添加し、各添加後よく震盪した。
【０２１４】
ある場合において、生ずる沈澱が濃厚になり過ぎて混合が不可能となったので、溶液をH２O で希釈ことが必要であった。混合物を室温において15分間放置した後、それは酸性反応を示し、沈澱を吸引濾過した。このようにして得られたメルカプトピリミジンをまだ湿潤している間にフラスコに取り出し、 200mlのアルコールを添加し、この混合物をアルコールのベンゾイルペルオキシドに加熱した。次いで、フラスコを冷却し、室温において１時間放置した。濾過すると、20〜25ｇの純粋な42が得られた。これは計算重量の75〜90％であった。
【０２１５】
ｂ）４−アミノ−１−メチル−２−メチルチオ−６−オキソジヒドロピリミジン（43）
４−アミノ−１−メチル−２−メチルチオ−６−オキソジヒドロピリミジンの合成は、Johns et al., J. Biol. Chem., 20 : 153-160 (1915) に記載された。65mlの１Ｎ水酸化カリウムの溶液に、10ｇの２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキソ−ピリミジン（42）を添加した。この溶液に、９ｇのジメチルサルフェートを添加すると同時にこの溶液を頻繁に振盪することによって撹拌した。白色の結晶質沈澱がほとんど直ちに形成し始め、これはすぐに非常に大量となった。
【０２１６】
溶液がリトマスに対して酸性となるとすぐに、結晶を吸引濾過した。濾液をNaOHで中和し、蒸発乾固した。残留物を冷水で洗浄し、固体状物を濾過し、既に得られた結晶に添加した。次いで一緒に固体状物を希薄アンモニアで粉砕して、未変化の２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキソ−ピリミジンを溶解し、その少量は存在することがわかった。アンモニア中に溶解しない残留物の部分は、融点とエーテル中の溶解度が異なる２つの化合物から成っていた。低い融点を有する化合物はエーテルに非常に可溶性であったが、高い融点を有する化合物はこの溶媒にほとんど不溶性であった。したがって、いずれもこれらの化合物を互いに分離する。手段として働いた。
【０２１７】
エーテル中に可溶性の化合物は２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−メトキシピリミジンであった。次いで固体状残留物をアルコールから再結晶化させると、43が細長いプリズムとして得られた（収率＝60％、融点 255℃）。C6H9ON3Sについて分析：Ｎ，24.57。実測値：Ｎ，24.71 。
【０２１８】
ｃ）６−アミノ−３−メチル−２−メチルチオ−５−ニトロソ−ピリミジン−４−オン（44）
６−アミノ−３−メチル−２−メチルチオ−５−ニトロソ−ピリミジン−４−オン（＝４−アミノ−１−メチル−２−メチルチオ−５−ニトロソ−６−オキソジヒドロピリミジン）の合成は、Schneider et al., Chem. Ber. 107 : 3377-3394 (1974) に記載された。１リットルの30％酢酸中の４−アミノ−１−メチル−２−メチルチオ−６−オキソジヒドピリミジン（43）の懸濁液に、 100mlのH2O中の50ｇの亜硝酸ナトリウムの溶液を滴下した。この混合物を室温においてさらに１時間撹拌し、次いで冷蔵庫中で一夜冷却した。沈澱を集め、H2O で洗浄し、次いでアセトンで洗浄し、 100℃において乾燥した。これにより、 119.5ｇ（92％）のクロマトグラフィー的に均一な粗生成物が得られた（融点 230℃分解）。この物質の１ｇを 240mlのH2O から再結晶化させると、44が0.52ｇの青色結晶として得られた（融点 234℃分解）。
【０２１９】
ｄ）5,6−ジアミノ−３−メチル−２−メチルチオ−ピリミジン−４−オン（45）
4.0ｇ（0.02mole）の６−アミノ−３−メチル−２−メチルチオ−５−ニトロソ−ピリミジン−４−オン（44）に、40mlの20％水性硫化アンモニウム溶液を添加した。この混合物を還流下に30分間加熱した。冷却後、沈澱を集め、少量のエタノールで洗浄し、デシケーター中で乾燥すると、45が2.72ｇ（75％収率）の無色の結晶として得られた（融点 211−212 ℃）。
【０２２０】
ｅ）１−メチル−２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキソ−ジヒドロピリミジン−アゾチメン炭酸−５エチルエステル（46）
１−メチル−２−メチルメルカプト−4,5−ジアミノ−６−オキソ−ジヒドロピリミジン（5,6−ジアミノ−３−メチル−２−メチルチオ−ピリミジン−４−オン）からの３−メチル−２−メチルチオ−プテリジン−4,7−ジオンの合成、工程ｃおよびｄは、Pfleiderer, Chem. Ber. 91 : 1670 (1958) に記載された。この溶液を室温に冷却し、次いで６ｇのエチルグリオキシレート−ヘミエチルアセタールと一緒にした。直ちに生ずる濃厚な沈澱を１時間後取り出し、エタノールから再結晶化させると、46ｇの８ｇの鮮明な黄色結晶が得られた（融点 178℃）。C10H14N4O3S・H2O：Ｃ，41.66 ；Ｈ，5.59；Ｎ，19.44 。実測値：Ｃ，42.18 ; Ｈ，5.75；Ｎ，19.32 。
【０２２１】
ｆ）３−メチル−２−メチルチオ−プテリジン−４，７−ジオン（47）
200mlの 0.5N NaHCO3に、８ｇの１−メチル−２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキソ−ジヒドロピリミジン−アゾメチン炭酸−５エチルエステル（46）を添加した。この溶液を30分間還流させた。この透明な溶液を動物活性炭で処理し、次いでpH１に加熱酸性化した。いったん冷却すると、沈澱を集め、H２O から再結晶化させると、47が 4.5ｇの３−メチル−２−メチルチオ−ピリミジン−4,7−ジオンの薄黄色結晶として得られた（融点 292−294℃）。C8H8N4O2S：Ｃ，42.86 ；Ｈ，3.60；Ｎ，24.99 。
実測値：Ｃ，42.70 ；Ｈ，3.58；Ｎ，24.73 。
【０２２２】
ｇ）３−メチル−２−メチルチオ−８−〔２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−（４ｔ−クロロ−β−Ｄ−リボフラノシル〕プテリジン−４，７−ジオン（48）
３−メチル−２−メチルチオ−プテリジン−４，７−ジオン（47）の結晶を、高真空下に 100℃において乾燥炉中で乾燥した。次いで 5.6ｇ（25mmol）の乾燥した結晶を、 250mlの無水アセトニトリル中にアルゴン雰囲気下に、12.9ｇの２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−Ｄ−リボフラノシルクロライド（トリイル誘導体について実施例３、工程（ａ）におけるようにして製造した）とともに懸濁させた。
【０２２３】
次いで３mlのヘキサメチルジシラザンおよび２mlのトリエチルシリルクロライドを添加した。この混合物を30分間撹拌し、次いで 7.4mlのSnCl4 を２分以内に滴下した。正確に20分の反応後、この混合物を1200mlの重炭酸ナトリウムの冷却した飽和水溶液の中にゆっくり注いだ。次いで溶液を３回各 200mlの酢酸エチルで抽出した。プールした有機層をNaClで飽和溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発乾固し、３回CH２Cl２とともに共蒸発させた。
【０２２４】
主としてα，β−アノマーヌクレオシド混合物から成る生ずる残留物を分別結晶化により分離した。第１の結晶化を 200mlのメタノール／350ml の酢酸エチルで実施した。生ずる沈澱を再び 200mlのメタノール／280ml の酢酸エチルから再結晶化させ、次いで生ずる固体状物をもう一度 200mlのメタノール／500ml の酢酸エチルから再結晶化させると、4.45ｇの純粋なα−ヌクレオシドから成る無色の結晶が得られた（融点 188−191 ℃，29％収率）。濾液を一緒にし、蒸発させ、残留物を 100mlのメタノール／130ml の酢酸エチルから再結晶化させると、 1.8ｇのα，β−混合物が得られた（12％収率）。その濾液を再び蒸発乾固し、残留物を50mlの酢酸エチル／50mlのエーテルから再結晶化させると、48が6.79ｇ（44％の収率）のクロマトグラフィー的に純粋な結晶質β−ヌクレオシドとして得られた（融点 130−133 ℃）。C27H22Cl2O7S：Ｃ，52.52；Ｈ，3.59；Ｎ，9.07。実測値：Ｃ，52.45 ；Ｈ，3.61；Ｎ，8.90。
【０２２５】
ｈ）３−メチル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イソキサントプテリン（２−アミノ−３−メチル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−４，７−ジオン）（49）
100mlの乾燥アセトニトリル中の 3.3ｇ（４mmol）の３−メチル−２−メチルチオ−８−〔２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−（４ｔ−クロロ−β−Ｄ−リボフラノシル〕プテリジン−４，７−ジオン）（48）の溶液を、 100mlの飽和メタノール性アンモニアに室温において添加した。少量の不溶性物質を濾過し、濾液を蒸発乾固した。メタノールとの２回の共蒸発後、沈澱を20mlの温かいメタノール中に溶解した。次いで50mlのエチルエーテルを添加し、この混合物をアイスボックス中で３日間冷却した。沈澱を集め、60℃において真空下に乾燥すると、49が1.46ｇ（88％収率）の無色の結晶として得られた（融点＞250 ℃）。C12H15N5O5・1/2H2Oについての分析：Ｃ，45.28 ；Ｈ，5.07；Ｎ，22.00 。実測値：Ｃ，45.55 ；Ｈ，5.07；Ｎ，21.92 。
【０２２６】
ｉ）３−メチル−８−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イソキサントプテリン（50）
3.1ｇ（10mmol）の３−メチル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イソキサントプテリン（49）に、50mlの乾燥ピリジンを添加した。次いでこの溶液を共蒸発させた。共蒸発を各50mlの乾燥ピリジンで３回反復した。次いで残留物を50mlの乾燥ピリジン中に懸濁させた。この溶液に、 5.1ｇ（15mmol）のジメトキシトリチルクロライドを添加し、トリメチルシリル室温において撹拌した。10分後、透明溶液が得られ、10mlのメタノールの添加により反応を停止させた。この溶液を蒸発させ、残留物をCH2Cl2中に溶解し、次いで重炭酸ナトリウムの５％水溶液で２回抽出した。
【０２２７】
有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾液を再び蒸発させた。残留物を少量のCH２Cl２／メタノール中に溶解し、フラッシュクロマトグラフィーのためにシリカゲルのカラム（３×20cm、トルエン／酢酸エチルとともにパックされた）上に置いた。溶媒混合物の勾配を適用して、精製を達成しなくてはならなかった： 500mlのトルエン／酢酸エチル1:1， 2.5リットルの酢酸エチル、１リットルの酢酸エチル／メタノール99：１および２リットルの酢酸エチル／メタノール98：２。酢酸エチル／メタノール中の物質の画分を蒸発させ、高真空下に乾燥すると、50が 3.9ｇ（63％）の無色のアモルファス固体状物として得られた。C33H33N5O7・1/2H2Oについての分析：Ｃ，63.86 ；Ｈ，5.52；Ｎ，11.28 。実測値：Ｃ，63.90 ；Ｈ，5.82；Ｎ，10.86 。
【０２２８】
ｊ）３−メチル−８−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イソキサントプテリン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル,Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（51）
3.06ｇ(4.9mmol）の３−メチル−８−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イソキサントプテリン（50）および0.18ｇ（25mmol）のテトラゾールの懸濁液を、アルゴン雰囲気下に、 2.2ｇ(7.3mmol）のβ−シアノエトキシ−ビス−ジイソプロピルホスファンとともに撹拌した。この懸濁液は30分後透明となり、反応を４時間後に停止させた。反応溶液を重炭酸ナトリウムの５％水溶液で１回抽出し、次いで有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾液を蒸発乾固させた。シリカゲルのカラム（３×20cm）上のフラッシュクロマトグラフィーにより、 200mlのヘキサン／酢酸エチル２：１、次いで２リットルのヘキサン／酢酸エチル1:1中において、精製を実施した。生成物の画分を集め、蒸発乾固し、高真空下に乾燥すると、51が2.38ｇ（59％の収率）の無色のアモルファス固体状物として得られた。C42H50N7O8P・H2O（820.8)についての分析：Ｃ，61.45 ；Ｈ，6.26；Ｎ，11.94 。
実測値：Ｃ，61.56 ；Ｈ，6.47；Ｎ，11.51 。
【０２２９】
実施例８. 式VIIIのホスホルアミダイト：（６，７−ジメチル−４−〔２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル）アミノ−１−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシ−トリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−２−オン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（59）の合成
ａ）4,5−ジアミノウラシル−塩酸塩（52）
物を水蒸気浴上で還流下に激しく撹拌しながら４時間加熱した。約２時間後、反応混合物を実際に固体状物となり、撹拌を停止しなくてはならない。反応時間の終わりにおいて、１リットルの熱（80℃）H2O を反応混合物に添加し、撹拌を再開する。完全に溶解した後、撹拌混合物を80℃に15分間加熱し、次いで氷酢酸でリトマスに対して中和する。追加の氷酢酸（75ml）を添加し、次いで70mlのH2O 中に溶解した64.8ｇ（0.94mole）の亜硝酸ナトリウムを注意して添加した。バラ赤色のニトロソ化合物は膨張した沈澱としてほとんど直ちに分離し、これをは撹拌機をほとんど停止させた。数分後、ニトロソ化合物を濾過により除去し、少量の氷水で２回洗浄した。湿潤物質を３リットルのフラスコに戻し、 460mlの温かいH2O(50℃）を添加した。
【０２３０】
スラリーを水蒸気浴上で加熱しながら撹拌し、ニトロソ化合物の赤色が完全に消失するまで、固体状ナトリウムヒドロサルファイトを添加した。次いで、追加の30ｇのナトリウムヒドロサルファイトを添加し、薄黄褐色懸濁液を加熱しながらさらに15分間撹拌し、放冷した。密なジアミノウラシル重亜硫酸塩を冷却した溶液から濾過し、H2O でよく洗浄し、部分的に乾燥した。
【０２３１】
粗生成物はその塩酸塩への変換により容易に精製された。重亜硫酸塩を広口の１リットルのフラスコに移し、生ずる混合物のコンシステンシーが機械的撹拌を可能とするまで、濃塩酸を添加した(100〜200ml の酸）。スラリーを水蒸気浴上で撹拌しながら１時間加熱した。黄褐色のジアミノウラシル塩酸塩を焼結ガラスの漏斗上に濾過し、アセトンでよく洗浄し、五酸化リンの存在下に真空乾燥すると、 104〜124 ｇの52（68〜81％）が得られた。
【０２３２】
ｂ）6,7−ジメチルルマジン（53）
6,7−ジメチルルマジンの合成は、Pfleiderer et al., Chem. Ber., 106 : 3149-3174 (1973) に記載されている。50mlのH2O ，20mlのエタノール、および１mlの濃HCl から成るの溶液に、20mlのジアセチルを添加した。この溶液を加熱沸騰させ、 450mlのH2O 中の20ｇの4,5−ジアミノウラシル塩酸塩（52）の溶液の数滴をゆっくり添加した。この混合物を還流下に２時間加熱し、アイスボックス中で冷却し、生ずる沈澱（18.7ｇ）を集めた。沈澱が溶解するまで希薄アルミン酸ナトリウム溶液を添加した 500mlのH2O 中に沈澱を溶解することによって、沈澱を精製した。溶液を活性炭を通して濾過し、次いで濾液を沸騰する希薄酢酸の中に滴下した。冷却後、混合物を 100℃の温度において減圧下に乾燥すると、53が17.0ｇ（79％の収率）の事実上無色の結晶として得られた（融点＞360 ℃）。
【０２３３】
ｃ）6,7−ジメチル−１−（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）ルマジン（54）
6,7−ジメチル−１−（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）ルマジンの合成は、Ritzmannet al., Liebigs Ann. Chem., 1217-1234 (1977)に記載されている。50mlのヘキサメチルジシラザンに、7.68ｇの6,7−ジメチルルマジン（53）および数個の硫酸アンモニウム結晶を添加した。この溶液が透明となるまで、これを還流下に約24加熱した。次いで過剰のヘキサメチルジシラザンを真空下に蒸留除去した。残留物を 220mlの無水ベンゾール中に溶解し、16ｇの3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロライドを添加し、この溶液を室温において乾燥条件下に１週間撹拌した。
【０２３４】
この溶液に、５mlのメタノールを添加した。この溶液を蒸発乾固し、残留物を 200mlのメタノールから再結晶化させた。ほぼDC純粋な6,7−ジメチル−１−（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−チオルマジン（β−異性体）を沈澱させた。 300mlのメタノールからのこの第１画分の更新した再結晶化は、2.36ｇの純粋なβ異性体を与えた。濾液を精製し、蒸発乾固し、次いでシリカゲルのカラム（70×５cm）のクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム／メタノール（30:1）を使用した。第１の主要な画分は、それを無色のアモルファス固体状物に蒸発させた後、 6.5ｇのDC純粋な6,7−ジメチル−１−（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−チオルマジン（β−異性体）を与えるように思われる。
【０２３５】
引き続く混合した画分をまた蒸発乾固させ、 100mlのメタノールから再結晶化させ、次いで追加の2.67ｇのβ異性体の無色の結晶が沈澱した（融点 154−155 ℃）。濾液を再び蒸発乾固させ、シリカゲルのカラム(900ｇ）上に注ぎ、クロロホルム／アセトン（９：１）で展開した。追加の 2.7ｇのα異性体がより大きいＲF 値を有する主要な画分から得られ、そして追加の0.43ｇのβ異性体が低いＲF 値を有する画分から得られた。合計の収量は5.46ｇ（25％）の無色の結晶（融点 154−155 ℃）の形態のβ異性体および 9.2ｇ（43％）のアモルファス固体状物（融点 126−132 ℃）としてα異性体として得られた（融点54から成っていた。α−およびβ−Ｄ−アノマーの帰属は、Ritzman et al.の論文後に、Cao et al., Helv. Chim. Acta., 75 : 1267-1273 (1992)により逆転されたことに注意すべきである。
【０２３６】
ｄ）6,7−ジメチル−１−（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−チオルマジン（55）
20mlのトルエン中の 0.871ｇ(1.6mmol）の6,7−ジメチル−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）ルマジン（54）および 0.403ｇ（１mmol）のラウェッソン（Lawesson) 試薬の混合物を20時間還流させた。次いでこの混合物を蒸発させ、残留物を20mlのCH2Cl2の中に取り、次いで重炭酸ナトリウムの飽和溶液で２回処理した。水性相を３回各10mlのCH2Cl2で抽出し、一緒にした抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、再び蒸発させた。残留物を 150mlのメタノールから再結晶化させると、55が0.65ｇ（75％収率）のオレンジ色結晶として得られた（融点 166−168 ℃）。C29H28N4O6S・H2O（578.6)についての分析：Ｃ，60.20 ；Ｈ，5.22；Ｎ，9.68。実測値：Ｃ，60.43 ；Ｈ，5.06；Ｎ，9.72。
【０２３７】
ｅ）４−アミノ−6,7−ジメチル−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−２−オン（56）
オートクレープ中で、25mlのメタノール中のアンモニアの飽和溶液中の0.42ｇ（0.75mmol）の6,7−ジメチル−１−（２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−チオルマジン（55）を 100℃に16時間加熱した。冷却後、溶液を蒸発させ、残留物をCH2Cl2で処理した。固体状物質を集め、エーテルで洗浄し、高真空下に乾燥すると、56が 0.207ｇ（91％の収率）の無色の結晶粉末状物として得られた（融点＞℃分解）。C13H17N5O4・H2Oについての分析：Ｃ，49.36 ；Ｈ，5.74；Ｎ，22.14 。実測値：Ｃ，49.17 ；Ｈ，5.47；Ｎ，21.80 。
【０２３８】
ｆ）6,7−ジメチル−４−〔２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル〕アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−２−オン（57）
80mlの無水DMF 中の1.54ｇ（５mmol）の４−アミノ−6,7−ジメチル−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−２−オン（56）および1.87ｇ（６mmol）の１−メチル−３−〔２（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル〕イミダゾリウムクロライド（参照、Himmelsbach, et al. Tetrahedron 40 : 59 (1984)これは引用することによって本明細書の一部とされる）の混合物を室温において一夜撹拌した。この溶液に、 100mlのH２O を撹拌しながらゆっくり添加した。次いでこの溶液を冷却し、沈澱を吸引により集め、メタノールおよびエーテルで洗浄し、デシケーター中で乾燥すると、57が 2.0ｇ（80％の収率）の無色の結晶として得られた（融点 154−155 ℃）。C22H24N6O8・H2Oについての分析：Ｃ，59.96 ；Ｈ，5.01；Ｎ，16.21 。実測値：Ｃ，50.51 ；Ｈ，5.15；Ｎ，15.84 。
【０２３９】
ｇ）6,7−ジメチル−４−〔２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル〕アミノ−１−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−２−オン（58）
2.0ｇ（４mmol）の6,7−ジメチル−４−〔２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル〕アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−２−オン（57）から、結晶を20mlの無水ピリジンとともに２回共蒸発させることによって、水を除去した。残留物を 100mlの乾燥ピリジン中に溶解し、これに1.63ｇ(4.8mmol）のジメトキシトリチルクロライドを添加した。
【０２４０】
次いでこの混合物を室温において18時間撹拌した。反応を10mlのメタノールの添加によりクエンチングし、次いで蒸発させ、最後に残留物をCH2Cl2中に溶解した。この溶液を重炭酸ナトリウムの飽和溶液で処理した。分離後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、再び蒸発させた。残留物を少量のCHCl3 中に溶解し、シリカゲルのカラム上に置き、次いでトルエン／酢酸エチル4:1〜1:1の勾配で溶離した。主要な画分がトルエン／酢酸エチル２：で得られ、蒸発させると、58が2.84ｇ（88％の収率）の無色のアモルファス固体状物として得られた。C43H42N6O10についての分析：Ｃ，64.33 ；Ｈ，5.27；Ｎ，10.47 。実測値：Ｃ，64.51 ；Ｈ，5.23；Ｎ，10.24 。
【０２４１】
ｈ）6,7−ジメチル−４−〔２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル〕アミノ−１−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシ−トリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−２−オン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（59）
40mlの乾燥CH2Cl2および20mlの乾燥アセトニトリルに、 1.0ｇ（1.25mmol）の6,7−ジメチル−４−〔２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル〕アミノ−１−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−２−オン（58）、44mg（0.63mmol）のテトラゾールおよび 0.754ｇ(2.5mmol）のβ−シアノエトキシ−ビス−ジイソプロピル−ホスファンを撹拌しながら添加した。
【０２４２】
18時間後、この溶液を50mlのCH2Cl2で希釈し、次いで重炭酸ナトリウムの飽和溶液で抽出し、有機層硫酸ナトリウムで乾燥し、最後に蒸発させた。残留物を少量のCH2Cl2中に溶解し、次いでシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製し、トルエン／酢酸エチル4:1〜1:1の勾配を使用した。主要な画分を蒸発させ、高真空下に乾燥すると、59が0.98ｇ（78％の収率）のアモルファス固体状物として得られた。C52H59N8O11(1003.1)についての分析：Ｃ，52.27 ；Ｈ，5.93；Ｎ，11.17 。実測値：Ｃ，62.00 ；Ｈ，6.01；Ｎ，10.65 。
【０２４３】
実施例９. 式VII のホスホルアミダイト：２−アミノ−６−メチル−４−ｐ−ニトロフェニルエチル−８−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン−３'−Ｏ−（β−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（71）の合成
５，６−ジアミノ−２−メチルチオ−ピリミジン−４−オン（２−メチルメルカプト−４，５−ジアミノ−６−オキソピリミジン）の合成、工程（ａ）〜（ｃ）は、Jons et al., J. Biol. Chem., 14 : 381-388 (1913)に記載されているように実施した。
【０２４４】
ａ）２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキシ−ピリミジン）（42）
２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキシピリミジンの合成は、Jons et al., J. Biol. Chem., 14 : 381-388 (1913)に記載されており、そして実施例６、工程（ａ）に例示されている。
【０２４５】
ｂ）２−メチルメルカプト−４−アミノ−５−ニトロソ−６−オキソピリミジン（60）
350mlのH2O に、20ｇの２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキソピリミジン（42）および 5.1ｇのNaOHを添加した。40mlの水中の亜硝酸ナトリウムの溶液を添加した。次いで、この混合物を17ｇの氷酢酸の徐々の添加により酸性化した。形成する沈澱は白色であったが、短時間で青色に変化した。混合物を室温において一夜放置し、次いで沈澱を濾過し、冷水で洗浄し、乾燥しないで、２−メチルメルカプト−4,5−ジアミノ−６−オキソピリミジンの製造に使用した。ニトロソ誘導体の収率はほとんど定量的であった。それはわずかに熱水またはアルコール中に可溶性であり、ベンゼン中で可溶性ではなかった。それはアルカリ中で赤色溶液を形成し、そして酸中で青色溶液を形成した。一部分を分析のためにアンモニア中に溶解し、酢酸で沈澱させることによって精製した。この物質は溶融せず、約 255℃において分解し始めた。C5HO2N4Sについての分析：Ｎ，30.10 。実測値：Ｎ，30.16 。
【０２４６】
ｃ）5,6−ジアミノ−２−メチルチオ−ピリミジン−４−オン（61）
１リットルのフラスコに、50mlの硫化アンモニウムの10％溶液を添加した。この溶液を水蒸気浴上で加熱した。前の実験において得られた湿潤２−メチルメルカプト−４−アミノ−５−ニトロソ−６−オキソ−ピリミジン（60）を徐々に添加した。ニトロソ化合物が過剰に存在することを示すように溶液が赤色になったとき、硫化アンモニウムをまた添加した。硫化アンモニウムは過剰に存在したとき、溶液は黄色であった。ニトロソ化合物のすべてが還元されたとき、過剰の硫化アンモニウムの添加は回避すべきであるか、または得られたジアミノ化合物は高度に着色するであろう。
【０２４７】
ｄ）６−エトキシカルボニルメチル−２−メチルチオ−プテリジン−4,7−ジオン（62）
17.2ｇ(0.1mole）の5,6−ジアミノ−２−メチルチオ−ピリミジン−４−オン（61）および22.6ｇのナトリウムエチルオキサリルアセテートの混合物を、 200mlの氷酢酸中で80℃に30分間加熱した。冷却後、沈澱を集め、H２O で洗浄し、乾燥した。次いで粗物質を再びEtOH／H2O 1:1中で加熱することによって溶解させ、 170mlの飽和NaHCO3を添加した。熱溶液を活性炭で処理し、濾液をゆっくり 200mlの熱氷酢酸中に撹拌しながら注いだ。黄色沈澱を濾過し、H2O およびエタノールで洗浄し、 100℃において乾燥すると、62が18.9ｇ（64％）の輝く結晶として得られた（融点 213℃）。C11H12N4O4S（296.3)についての分析：Ｃ，44.59 ；Ｈ，4.08；Ｎ，18.91 。実測値：Ｃ，44.49 ；Ｈ，4.03；Ｎ，18.88 。
【０２４８】
ｅ）６−メチル−２−メチルチオ−プテリジン−4,7−ジオン（63）
120mlの 2.5N NaOH中の19.7ｇ（66.5mmol）の６−エトキシカルボニルメチル−２−メチルチオ−プテリジン−4,7−ジオン（62）の溶液を80℃において30分間撹拌した。熱溶液を活性炭で処理し、濾過し、濾液を50mlの熱氷酢酸の中にゆっくり添加した。沈澱を冷却後集め、H２O およびアセトンで洗浄し、 100℃において乾燥すると、63が14.3ｇ（96％）の黄色結晶粉末状物として得られた（融点 275℃分解）。C8H8N4O2S（224.3)についての分析：Ｃ，42.85 ；Ｈ，3.60；Ｎ，24.99 。実測値：Ｃ，42.79 ；Ｈ，3.59；Ｎ，25.06 。
【０２４９】
ｆ）６−メチル−２−メチルチオ−８−（3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−4,7−ジオン（64）
240mlの無水アセトニトリル中の 4.0ｇ(17.83mmol）の６−メチル−２−メチルチオ−プテリジン−4,7−ジオン（63）の懸濁液に、８ml（53.6mmol）のDBU を添加した。この混合物を室温において30分間撹拌した。生ずる透明な溶液に、4.62ｇ（11.9mmol）の3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−α−Ｄ−リボフラノシルクロライド（16）を添加し、次いで混合物を室温において湿気を排除して６時間撹拌した。
【０２５０】
この溶液に、 100mlのジクロロメタン中の 2.4mlの氷酢酸を添加した。この溶液を５分間撹拌し、次いで減圧下に蒸発乾固させると、シロップ状物が得られ、これをシリカゲルのカラム（16×8.5cm)のクロマトグラフィーにかけ、まず 3.5リットルのトルエン／酢酸エチル1:1、次いで 2.5リットルのトルエン／アセトン１：２、最後に３リットルのジクロロメタン／メタノール 100：３で溶離した。生成物の画分を集め、蒸発させ、残留物をトルエンから再結晶化させると、64が2.12ｇ（31％）の無色の結晶として得られた（融点 196−197 ℃）。Ｃ29Ｈ28Ｎ4O7S（576.6)についての分析：Ｃ，60.41 ；Ｈ，4.89；Ｎ，9.72。実測値：Ｃ，60.26 ；Ｈ，4.96；Ｎ，9.68。
【０２５１】
ｇ）６−メチル−２−メチルチオ−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（65）
75mlのジオキサン中の2.19ｇ(3.8mmol）の６−メチル−２−メチルチオ−８−（３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−４，７−ジオン（64），9.95ｇ（5.69mmol）のｐ−ニトロ−フェニルエタノールおよび1.52ｇ（5.69mmol）のトリフェニルホスファンの溶液に、1.16ｇ(5.7mmol）のエチルアゾジカルボキシレートを添加した。この混合物を室温において 2.5時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、残留物をシリカゲルのカラム(5.3×15cm）のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、 300mlのトルエン、 250mlのトルエン／酢酸エチル8:1および 650mlのトルエン酢酸エチル６：１を使用した。生成物の画分を集め、蒸発乾固し、残留物CH２Cl２／AcoEt から再結晶化させると、65が2.31ｇ（85％の収率）の無色の結晶として得られた（融点 122−125 ℃）。C37H35N5O9S（727.8)についての分析：Ｃ，61.23 ；Ｈ，4.86；Ｎ，9.65。実測値：Ｃ，61.18 ；Ｈ，4.95；Ｎ，9.67。
【０２５２】
ｈ）６−メチル−２−メチルスルホニル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（65）
100mlの無水CH2Cl2中の2.27ｇ（3.13mmol）の６−メチル−２−メチルチオ−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（65）の溶液に、撹拌しながら1.35ｇ（＞6.25mmol）のｍ−クロロ過安息香酸（80〜90％の純度）を添加した。24時間撹拌した後、この溶液を減圧下に10mlに濃縮し、ｍ−クロロ過安息香酸の沈澱を濾過し、CH2Cl2（92×５ml）で洗浄し、次いで双方の濾液を蒸発させた。残留物をシリカゲルのカラム(5.3×14cm）上に置き、生成物をトルエン／AcOEt 5:2で溶離した。生成物の画分を小さい体積に濃縮し、これにより66は溶液の中から外に結晶化して 2.4ｇ（86％）の無色の結晶が得られた（融点 193℃）。C37H35N5O11S（757.8)についての分析：Ｃ，58.65 ；Ｈ，4.66；Ｎ，9.24。実測値：Ｃ，58.77 ；Ｈ，4.69；Ｎ，9.30。
【０２５３】
ｉ）２−アミノ−６−メチル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（67）
撹拌しながら、1.89ｇ(2.5mmol）の６−メチル−２−メチルスルホニル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（65）に、気体NH3 を80分間泡立てて通入した。次いでこの溶液を蒸発させ、２回CH2Cl2とともに共蒸発させ、生ずる残留物をシリカゲルのカラム(5.5×８cm）上に置き、クロマトグラフィーにかけ、トルエン／AcOEt ５：２で溶離した。生成物の画分を小さい体積に濃縮し、これにより67は溶液の中から外に結晶化して1.68ｇ（97％）の無色の結晶が得られた（融点 208−209 ℃）。C36H34N6O9（694.7)についての分析：Ｃ，62.24 ；Ｈ，4.93；Ｎ，12.10 。実測値：Ｃ，61.98 ；Ｈ，4.94；Ｎ，12.14 。
【０２５４】
ｊ）２−アミノ−６−メチル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（68）
30mlのCH2Cl2および60mlのMeOH中の1.17ｇ（1.69mmol）の２−アミノ−６−メチル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（67）の溶液に、0.45ｇ（3.37mmol）のナトリウムチオフェノレートを添加した。この溶液を室温におて16時間撹拌した。次いで11ｇのフラッシュシリカゲルを反応混合物に添加し、減圧下に蒸発させた。生ずる混合物をCH2Cl2／MeOH混合物(500mlの 100:1， 300mlの50:1および9:1）で前もって平衡化したシリカゲルのカラム(5.3×8.5cm)上に置いた。生成物の画分をプールし、蒸発させると、68が0.63ｇ（81％）の微結晶質粉末状物として得られた（融点＞220 ℃分解）。C20H22N6O7 （458.4)についての分析：Ｃ，52.40 ；Ｈ，4.84；Ｎ，18.34 。実測値：Ｃ，52.31 ；Ｈ，4.76；Ｎ，18.22 。
【０２５５】
ｋ）２−アミノ−６−メチル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−４，７−ジオン〔６−メチル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−イソキサントプテリン（69）
15mlのピリジン中の 0.195ｇ(0.425mmol）の２−アミノ−６−メチル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（68）の溶液に、1.12ml（1.14mmol）のDBU を添加した。この溶液を室温において３時間撹拌した。次いでこの溶液を減圧下に蒸発させ、残留物を25mlのH2O 中に溶解し、CH2Cl2（３×25ml）で洗浄した。水性相をHClによりpH７に中和し、次いで小さい体積（５ml）に濃縮した。この混合物をアイスボックスの中に入れ、69は0.84ｇ（71％）の無色の結晶として得られた（融点 300℃分解）。C12H15N5O3・1/2H2O（318.3)についての分析：Ｃ，44.28 ；Ｈ，5.06；Ｎ，22.00 。実測値：Ｃ，45.42 ；Ｈ，4.91；Ｎ，21.86 。
【０２５６】
ｌ）２−アミノ−６−メチル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（70）
15mlの無水ピリジン中の0.57ｇ（1.22mmol）の２−アミノ−６−メチル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−4,7−ジオン〔６−メチル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−イソキサントプテリン（69）の溶液に、 0.454ｇ（1.34mmol）のジメトキシトリチルクロライドを添加した。
【０２５７】
この混合物を室温において 1.5時間撹拌した。次いで、５mlのMeOHを添加し、この溶液を５分間撹拌し、次いで 100mlのCH2Cl2で希釈した。生ずる溶液を 100mlの飽和NaHCO3溶液で洗浄し、H2O (100ml）で２回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、残留物をクロマトグラフィーのためにシリカゲルのカラム（３×15ml）上に置き、トルエン／AcOEt 1:1で溶離した。生成物の画分を蒸発させると、70が 0.5ｇ（54％）の固体状泡状物として得られた。C40H40N6O9（760.8)についての分析：Ｃ，63.14 ；Ｈ，5.30；Ｎ，11.05 。実測値：Ｃ，63.06 ；Ｈ，5.21；Ｎ，10.91 。
【０２５８】
ｍ）２−アミノ−６−メチル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン−３'−Ｏ−（β−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（71）
15mlの無水CH2Cl2中の0.76ｇ（１mmol）の２−アミノ−６−メチル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（70）の溶液に、アルゴン雰囲気下に、0.425ｇ(1.5mmol）の２−シアノエチル−ビス−N,N−ジイソプロピルアミノ−−ホスファンおよび35mg(0.5mmol）のテトラゾールを添加した。この溶液を室温において12時間撹拌した。次いでこの混合物を15mlのCH2Cl2で希釈し、１回10mlの飽和NaHCO3溶液で、２回飽和NaCl溶液で抽出した。
【０２５９】
有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、残留物をクロマトグラフィーのためにシリカゲルのカラム上に置き、少量のトリエチルアミンを含有するトルエン／AcOEt で溶離した。生成物の画分を集め、蒸発させると、黄色がかった泡状物が得られ、これを少量のトルエン中に溶解し、 100mlのｎ−ヘキサンの中に撹拌しながら滴下すると、吸引濾過および乾燥後、71が 0.865ｇ（90％）の黄色がかった粉末状物として得られた（融点＞150 ℃分解）。C50H57N8O10P（960.9)についての分析：Ｃ，62.97 ；Ｈ，5.98；Ｎ，12.32 。実測値：Ｃ，62.81 ；Ｈ，5.88；Ｎ，12.20 。
【０２６０】
実施例10. ２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル−プテリジン−５’−トリホスフェートの一般的合成
ａ）トリエチルアンモニウムプテリジン−２'−デオキシリボヌクレオシド−５'−モノホスフェート（72）
15mlのトリメチルホスフェートに、 6.5mMの適当なプテリジン−β−Ｄ−２'−デオキシリボヌクレオシドを添加する。すべての湿気を排除して、この混合物を−６℃に冷却する。次いでこの混合物を撹拌し、 1.5ml（16.3mmol）のPOCl3 を５分かけて滴下し、次いで混合物を０℃において２時間撹拌して透明溶液を得る。この溶液に、 120mlの 0.5Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩の緩衝液pH7.5 を添加する。この溶液を15分間撹拌し、次いで真空蒸発させる。メタノールとともに数回共蒸発させた後、残留物H2O 中に溶解し、DEAE−セファデックスカラム(2.5×80cm；HCO3型）上に置く。０〜0.3 Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩の緩衝液pH7.5 の直線の勾配を使用してクロマトグラフィーを実施し、８〜10リットルの緩衝液を使用する。
【０２６１】
主要な画分は 0.2〜0.3 Ｍの緩衝液濃度において溶離される。この画分を30℃において真空蒸発させ、次いで生ずる残留物をメタノールとともに数回共蒸発させる。高真空下に乾燥すると、固体状物72が得られる。
【０２６２】
ｂ）トリエチルアンモニウムプテリジン−２'−デオキシリボヌクレオシド−５'−トリホスフェート（73）
トリエチルアンモニウムプテリジン−２'−デオキシリボヌクレオシド−５'−モノホスフェート（58）（１mmol）を無水ピリジンとともに３回共蒸発させ、次いで10mlの無水ジメチルホルムアミド（DMF)中に溶解する。無水条件下に 0.8ｇ（５mmol）のカルボニルジイミダゾールを添加した後、この溶液を一夜撹拌する。0.33mlの無水メタノールを溶液に添加し、１時間撹拌することによって、過剰のカルボニルジイミダゾールをクエンチングする。
【０２６３】
この溶液に、50mlの無水DMF 中の５mMのｔ−ブチルアンモニウムピロホスフェートの懸濁液を添加する。次いでこの混合物を室温において連続的20時間撹拌する。生ずる沈澱を濾過し、DMF で洗浄し、濾液を高真空下に30℃において蒸発させる。残留物をメタノールおよびH2O とともに数回共蒸発させ、次いでH2O 中に溶解し、DEAE−セファデックスカラム(2.5×80cm；HCO3型）上に置き、トリエチルアンモニウム重炭酸塩の緩衝液pH7.5 の直線の勾配で溶離し、約10リットルを使用する。生成物は 0.7Ｍの緩衝液濃度の画分の中に溶離される。画分をポリし、次いでメタノールとともに数回共蒸発させる。次いで混合物を高真空下に乾燥すると、73がアモルファス固体状物として得られる。
【０２６４】
ｃ）ナトリウムプテリジン−２'−デオキシリボヌクレオシド−５'−トリホスフェート（74）
10mlの無水メタノールの中に、 0.5mMのトリエチルアンモニウムプテリジン−２'−デオキシリボヌクレオシド−５'−トリホスフェート（73）を溶解する。この溶液を撹拌し、 1.5当量のアセトン中の１Ｎ NaI溶液をゆっくり滴下してナトリウム塩の沈澱を形成する。この懸濁液を 100mlのアセトンで希釈し、30分撹拌し、次いで固体状物を磁器の漏斗を通して吸引により集める。固体状物を小さい部分のアセトンで洗浄し、高真空下に乾燥すると、74が得られ、これはトリエチルアンモニウム塩よりも安定であり、分解しないで貯蔵することができる。
【０２６５】
実施例11. プテリジン誘導体を含有するオリゴヌクレオチドの合成
下記のオリゴヌクレオチドをABI DNA 合成装置（380B型、Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー）により合成した：
オリゴ１：  ５'−GTN TGG AAA ATC TCT AGC AGT −３’（配列識別No：２），
オリゴ２：  ５'−GTG TWG AAA ATC TCT AGC AGT −３’（配列識別No：３），
オリゴ３：  ５'−GTG TGN AAA ATC TCT AGC AGT −３’（配列識別No：４），
オリゴ４：  ５'−GTG TGG AAA ATC TCT ANC AGT −３’（配列識別No：５），
オリゴ５：  ５'−GTG TGG AAA ATC TCT ANC ANT −３’（配列識別No：６），
オリゴ６：  ５'−GTG TNG AAA ATC TCT ANC AGT −３’（配列識別No：７），
オリゴ７：  ５'−ACT GCT AGA NAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：８），
オリゴ８：  ５'−ACT GCT ANA GAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：９），
オリゴ９：  ５'−ACT NCT AGA GAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：10）および
オリゴ10：  ５'−ACT GCT NGA GAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：11）。
各オリゴヌクレオチドにおいて、１または２以上のグアノシンを式ＸＶのプテリジンデオキシリボヌクレオチド（Ｎと表示する）で置換した。
【０２６６】
プテリジンヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを合成するために、ジメトキシトリチルでブロックしたプテリジンホスホルアミダイトをDNA 合成装置上のボトルの口＃５の中に入れた。
【０２６７】
濃アンモニアの処理によりオリゴヌクレオチドの固体の支持体から切断し、アンモニア溶液を55℃に５時間加熱することによって脱保護した。次いで試料をスピード・バク・コンセントレーター（Speed Vac Concentrator) (Savant 、米国ニューヨーク州ファーミングデール）中で蒸発乾固させた。19:1の20％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により、オリゴヌクレオチドを精製した。バンドを紫外線吸収により検出し、切除し、粉砕およびソーキング方法により 0.3Ｍの酢酸ナトリウムpH5.2 の中に溶離した。最後に、MgCl2 を添加して 0.1 Mの濃度を達成し、試料をエタノール中で沈降させた。
【０２６８】
TRIS緩衝液pH7.8 中のオリゴヌクレオチドの蛍光分析は、下表１に示す相対的量子を明らかにした。 360nmの励起波長を使用して、蛍光測定を行った。硫酸キニンを標準として使用し、測定をフルオロメーター（8000型、 SLM−Aminco、米国イリノイ州アーバナ）。
【０２６９】
【表１】
2009091358.tif 000026
【０２７０】
実施例12. プテリジン誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを利用するインテグラーゼ活性の実時間検出
オリゴヌクレオチド５’−GTGTGGAAAATCTCTAGCANT −３’（配列No：６）およびその相補体５’−ACTGCTAGAGATTTTCCACAC −３’を実施例11の方法に従い合成した。次いでオリゴヌクレオチドを一緒に 100mMのNaCl溶液中で85℃に加熱し、この溶液を室温にゆっくり冷却することによってアニーリングした。これにより、モデルの基質の二本鎖DNA 分子が形成した：
５'−GTG TGG AAA ATC TCT AGC ANT −３’（配列識別No：６）
３'−CAC ACC TTT TAG AGA TCG TCA −５’（配列識別No：12）
ここでＮはプテリジンヌクレオチドを表す。
【０２７１】
HIV−１インテグラーゼｐ−トルオイル−(3.5pmol／反応）を大腸菌（Escherichia coli) の発現ベクターを介して、Bushmann etal., Science, 249 : 1555-1558 (1990)に記載されているように、生産した。タンパク質は−70℃において１ＭのNaCl／20mMのHepes, pH7.6／１mMのEDTA／１mMのジチオスレイトール／20％のグリセロール（wt／vol)中で貯蔵した。
【０２７２】
ストックｐ−トルオイル−（0.44mg／ml）をまずタンパク質貯蔵緩衝液（１ＭのNaCl／20mMのHepes, pH7.6／１mMのEDTA／１mMのジチオスレイトール／20％（wr／vol)グリセロール）中で1:3に希釈した。引き続く酵素の希釈は反応緩衝液（25mMの Mops, pH7.2／7.5mM のMnCl2／ウシ血清アルブミン、 100μｇ／ml／10mMの２−メルカプトエタノール）中で１：20であった。反応体積は60μｌであった。最終の反応混合物は50mMのNaCl，１mMのHepes,50μＭのEDTAおよび50μＭのジチオスレイトール、10％（et／vol)のグリセロール、7.5mM のMnCl2, 0.1mg／mlウシ血清アルブミン、10mMの２−メルカプトエタノール、および20mMのMOPS, pH7.2 を含有した。
【０２７３】
反応を酵素の添加により開始し、フルオロメーター（8000型、 SLM−Aminco、米国イリノイ州アーバナ）を使用して蛍光強度の変化を観測することによって、実時間において10〜20分間モニターした。励起波長は 360nmであり、そして放射波長は 460nmであった。
インテグラーゼは上記に示すモデル基質と反応して、下記の配列を生成した：
５'−GTG TGG AAA ATC TCT AGC A −３’  ＋NT
３'−CAC ACC TTT TAG AGA TCG TCA −５’
プテリジンヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの中に組込んだとき、プテリジンヌクレオチドの蛍光はかなりクェンチングした（0.14の量子収量）。切断反応はこの反応はこのクエンチを解放し、シグナルの４倍増加を生じた（モノマーについて0.88の量子収量）。したがって、蛍光の増加を測定することによって、インテグラーゼの活性はアッセイされた。
【配列表】
2009091358000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月20日(2008.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記に示すように環の頂点１〜８をもつ式；
【化１】
2009091358.tif 000050
（式中、
Ｒ11はＲ12と組合わされて二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ13はＨであり、
Ｒ14はＨ、低級アルキルまたはフェニルから成る群より選択される構成員であり、
Ｒ15はＲ16と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合する単一のオキソ酸素を形成するか、またはＲ17と結合して環の頂点１と２との間の二重結合を形成し、こうして環の頂点２および４は集合的に最大１つのオキソ酸素を有し、
Ｒ16はＲ15と組合わされないとき、Ｈ、フェニル、NH2 、および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択される構成員であり、ここで、当該保護基は、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、フェノキシアセチル、ジフェニルアセチル、イソブチリル、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、ジメチルアミノメチレンアミノ、ジメルチアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルおよびジメチルホルムアミド−ジエチルアセタールからなる群から選択され、
Ｒ15がＲ16と組合わされないとき、Ｒ18はＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ15がＲ16と組合わされるとき、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はＨおよび低級アルキルから成る群より選択される構成員であり、そして
Ｒ17は、Ｒ15と結合しないとき下記の構造を表し、またＲ20は、Ｒ18と結合しないとき下記構造を表し、
【化２】
2009091358.tif 000051
式中、
Ｒ21はＨ、トリホスフェート、および保護基から成る群より選択される構成員であり、ここで、当該保護基は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリレンおよびジメチルアミノメチリデンからなる群から選択され、
Ｒ22はＨ、OHおよび保護基で置換されたOHから成る群より選択される構成員であり、ここで、当該保護基は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、テトラヒドロピラン−１−イル、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル、１−（２−クロロ−４−メチル）フェニル−４−メトキシピペリジン−４−イル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｐ−ニトロフェニルエチルスルホニル、テトラヒドロピラニル、４−メトキシテトラヒドロピラニル、２−ニトロベンジル、９−フェニルキサンテン−９−イルおよびｐ−ニトロフェニルエチルからなる群から選択され、
Ｒ23はＨ、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ヘミスクシネート、固体の支持体に共有結合したヘミスクシネート、ジシクロヘキシルカーボジイミド、および固体の支持体に共有結合したジシクロヘキシルカーボジイミドから成る群より選択される構成員であり、
Ｒ13がＨでありかつＲ23がＨであるとき、Ｒ21はトリホスフェートであり、そして
Ｒ11がＲ13と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成しかつＲ23がＨであるとき、Ｒ21はトリホスフェートである）
を有する化合物。
【請求項２】
Ｒ11がＲ12と組合わされて二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ13がＨであり、
Ｒ14がＨであり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がNH2 および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択され、
Ｒ18がＲ19と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化３】
2009091358.tif 000052
である、
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ11がＲ12と組合わされて二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ13がＨであり、
Ｒ14がCH3 であり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がNH2 および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択され、
Ｒ18がＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化４】
2009091358.tif 000053
である、
請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
下記の式（Ｖ）：
【化５】
2009091358.tif 000054
（式中、
R21は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチレン及びジメチルアミノメチリデンからなる群から選択され、
R22は、Ｈ又はOHであり、そして
R23は、Ｈ、Ｈ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、メチルホスホネート、ホスホルチオエート、ホスホトリエステル、ヘミスクシネート、固体の支持体に共有結合したヘミスクシネート、ジシクロへキシルカルボジイミド、および固体の支持体に共有結合したジシクロへキシルカルボジイミドから成る群より選択される構成員である）
で表される化合物。
【請求項５】
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がＨである、
請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がβ−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、
請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ21がジメトキシトリチルであり、
Ｒ22がＨであり、そして
Ｒ23がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである、
請求項４に記載の化合物。
【請求項８】
下記に示すように環の頂点１〜８をもつ式：
【化６】
2009091358.tif 000055
（式中、
Ｒ11はＲ12と組合わされて二重結合により環の頂点４に結合する単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ13は、低級アルキルまたはＨであり、
Ｒ14はＨ、低級アルキルまたはフェニルから成る群より選択される構成員であり、
Ｒ15はＲ16と組合わされて二重結合により環の頂点２に結合する単一のオキソ酸素を形成するか、またはＲ17と結合して環の頂点１と２との間の二重結合を形成し、こうして環の頂点２および４は集合的に最大１つのオキソ酸素を有し、
Ｒ16はＲ15と組合わされないとき、Ｈ、フェニル、およびNH2 から成る群より選択される構成員であり、
Ｒ15がＲ16と組合わされないとき、Ｒ18はＲ19と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ15がＲ16と組合わされるとき、Ｒ18はＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ19はＨおよび低級アルキルから成る群より選択される構成員であり、そして
Ｒ17は、Ｒ15と結合しないとき下記の構造を表し、またＲ20は、Ｒ18と結合しないとき下記構造を表し、
【化７】
2009091358.tif 000056
であり、式中、
Ｒ22はＨおよびOHから成る群より選択される構成員である）
を有するプテリジン誘導体である１種または２種以上のヌクレオチドモノマーを含んでなるオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
式中、
Ｒ14がＨであり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がフェニルであり、
Ｒ16がＲ19と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化８】
2009091358.tif 000057
である、
請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ14がフェニルであり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がＨであり、
Ｒ16がＲ19と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化９】
2009091358.tif 000058
である、
請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ11がＲ12と結合して二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ13がＨであり、
Ｒ14がCH3 であり、
Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、
Ｒ16がNH2 および保護基で１または２置換されたNH2 から成る群より選択され、
Ｒ18がＲ19と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そして
Ｒ20が
【化１０】
2009091358.tif 000059
である、
請求項８に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ14がCH3 であり、
Ｒ15がＲ16と結合して二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ17が
【化１１】
2009091358.tif 000060
である、
Ｒ18がＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして
Ｒ19がCH3 である、
請求項８に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ14がＨであり、
Ｒ15がＲ16と結合して二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ17が
【化１２】
2009091358.tif 000061
であり、
Ｒ18がＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして
Ｒ19がCH3 である、
請求項８に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ14がCH3 であり、
Ｒ15がＲ16と結合して二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、
Ｒ17が
【化１３】
2009091358.tif 000062
であり、
Ｒ18がＲ20と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして
Ｒ19がＨである、
請求項８に記載の化合物。
【請求項１５】
５’−GTN TGG AAA ATC TCT AGC AGT −３’（配列識別No：２），
５’−GTG TNG AAA ATC TCT AGC AGT −３’（配列識別No：３），
５’−GTG TGN AAA ATC TCT AGC AGT −３’（配列識別No：４），
５’−GTG TGG AAA ATC TCT ANC AGT −３’（配列識別No：５），
５’−GTG TGG AAA ATC TCT AGC ANT −３’（配列識別No：６），
５’−GTG TNG AAA ATC TCT ANC AGT −３’（配列識別No：７），
５’−ACT GCT AGA NAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：８），
５’−ACT GCT ANA GAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：９），
５’−ACT NCT AGA GAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：10）および
５’−ACT GCT NGA GAT TTT CCA CAC −３’（配列識別No：11）、
から成る群より選択され、ここでＡはアデノシンヌクレオチドであり、Ｃはシトシンヌクレオチドであり、Ｇはグアノシンヌクレオチドであり、Ｔはチミジンヌクレオチドであり、そしてＮはプテリジンヌクレオチドであり、式中Ｒ11がＲ12と結合して二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ13がCH3 またはＨであり、R14がＨであり、Ｒ15がＲ17と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ16がNH2 であり、Ｒ18がＲ19と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ20が
【化１４】
2009091358.tif 000063
であり、式中Ｒ22がＨである、請求項８に記載の化合物。