(57)【要約】【課題】植物由来で副作用が少なく、長期投与可能なスカベンジャー受容体発現抑制剤を提供すること目的とする。【解決手段】アブラナ科植物、特に大和マナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｌ．）由来のイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体（グルコシノレート）を含有するマクロファージにおけるスカベンジャー受容体発現抑制剤、ならびにスカベンジャー受容体発現抑制作用および単球接着分子発現抑制作用を併有することに基づくアテローム性動脈硬化症予防および治療剤、さらにはそれを配合してなる医薬品および飲食品などを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソチオシアネート化合物および／またはその配糖体を含有することを特徴とするスカベンジャー受容体発現抑制剤。
【請求項２】
前記イソチオシアネート化合物が、アリールアルキルイソチオシアネートである請求項１記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤。
【請求項３】
前記アリールアルキルイソチオシアネート化合物がフェネチルイソチオシアネートである請求項２記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤。
【請求項４】
前記イソチオシアネート化合物またはその配糖体がアブラナ科植物由来である請求項１〜３のいずれか１項記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤。  
【請求項５】
前記アブラナ科植物が大和マナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｌ．）である請求項４記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤。
【請求項６】
接着分子発現抑制作用を併有する請求項１記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤を配合してなる医薬品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤を配合してなる飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大和マナ由来のイソチオシアネート化合物またはその配糖体（グルコシノレート）を含有することを特徴とするスカベンジャー受容体発現抑制剤、ならびに接着分子発現抑制作用も併せ持ち、スカベンジャー受容体発現抑制作用と接着分子発現抑制作用に基づくアテローム性動脈硬化症予防および治療剤、さらにそれを配合してなる医薬品および飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化の種類にはアテローム性動脈硬化、細小動脈硬化、中膜石灰化硬化などのタイプがあるが、この中で最も頻度が高く、生活習慣病が深く関与しているのがアテローム性動脈硬化である。アテローム性動脈硬化症は、動脈の肥厚や脂質沈着を伴う血管機能の低下を主な特徴とする病変であり、不安定狭心症や心筋梗塞などの急性冠状動脈シンドロームおよび脳卒中を引き起こす主因となる炎症性疾患と理解されおり、その症状の発症と進展は、酸化低比重リポ蛋白（酸化ＬＤＬ）が主要因とされている（非特許文献１、２、３）。酸化ＬＤＬは、アテローム性動脈硬化症を加速するための動脈壁細胞の中のプロ炎症性サイトカインや接着分子の発現を含むさまざまの生物学的効果を持つ一方、単球のケモアトラクタントであり、更に内皮細胞に対する細胞障害作用を示す。動脈内の単球は、動脈内の接着分子を介して動脈内膜に集められた後に、マクロファージに分化して、いくつかの異なったスカベンジャー受容体（ＳＲｓ）を発現し、その受容体は酸化ＬＤＬの細胞内取り込みを促進する。さらに、マクロファージは酸化ＬＤＬを過度に不逆的に取込み、そしてフィードバック抑制メカニズムがないために、酸化ＬＤＬにより泡沫細胞に変換し沈着する（非特許文献１、４、５）。これにより動脈の一部が肥大しアテローム性動脈硬化となると考えられている。
【０００３】
一方、マクロファージに発現するスカベンジャー受容体ファミリーとしては、クラスＡ受容体（ＳＲ−Ａ）、ＣＤ３６やＳＲ−ＢＩなどのクラスＢ受容体、クラスＤ受容体のＣＤ６８、クラスＥ受容体のレクチン様酸化ＬＤＬ受容体−１（ＬＯＸ−１）およびクラスＧ受容体のＳＲ−ＰＳＯＸなどが報告されており、これら受容体がマクロファージの酸化ＬＤＬの細胞内取り込みに重要な役割を果たしている（非特許文献６）。他方では、アテローム性動脈硬化症発症には、スカベンジャー受容体発現／抑制が重要な役割を果たしていることが、トランスジェニック動物やノックアウト動物にて実験的に立証されている（非特許文献７、８、９）。
【０００４】
一方、近年、アブラナ科植物由来のイソチオシアネート及びその配糖体は、そのガン予防効果等様々な生理活性作用にて注目を集めており（非特許文献１０）、さらにごく最近、アメリカンクレス（Ｂａｒｂａｒｅａ  ｖｅｒｎａ）由来のフェネチルイソチオシアネートの抗炎症作用に関する特許出願が公開されたが（特許文献１）、スカベンジャー受容体発現抑制作用については報告がない。
【０００５】
【非特許文献１】ザ  ニュー  イングランド  ジャーナル  オブ  メディシン（Ｎ．  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ）、３２０巻，９１５−９２４頁、１９８９年
【非特許文献２】ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７２巻、２０９６３−２０９６６頁、１９９７年
【非特許文献３】プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカディミー  オブ  サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、９２巻、３８９３−３８９７頁、１９９５年
【非特許文献４】アメリカン  ジャーナル  オブ  パソロジィー（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．）、１０３巻、１８１−１９０頁、１９８１年
【非特許文献５】サーキュレイション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）、９１巻，２４８８−２４９６頁、１９９５年
【非特許文献６】カレント  オピニオン  イン  リピドロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．）、１６巻、５２５−５３５頁、２００５年
【非特許文献７】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３８６巻，２９２−２９６頁、１９９７年
【非特許文献８】アルテリオスクレオシス  スロンボシス  バスキュラー  バイオロジィー（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．）、２０巻、２５９３−２５９９頁、２０００年
【非特許文献９】ザ  ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲイション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）１０５巻、１０４９−１０５６頁、２０００年
【非特許文献１０】プロシーディングス・オブ・ザ・ニュートリション・ソサイアティ（Ｐｒｏｃ  Ｎｕｔｒ  Ｓｏｃ．）、第６５巻、６８−７５頁、２００６年
【特許文献１】国際公開第２００７／０２２４３４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、植物由来で副作用が少なく、持続的かつ予防的な摂取あるいは投与可能なスカベンジャー受容体発現抑制剤、ならびにスカベンジャー受容体発現抑制作用に基づくアテローム性動脈硬化症予防および治療剤、さらにはそれを配合してなる医薬品および飲食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記目的を達成すべく、植物由来でスカベンジャー受容体発現抑制作用を示す物質について鋭意検討した結果、大和マナ由来のイソチオシアネート化合物またはその配糖体がスカベンジャー受容体抑制作用を有すること、ならびに接着分子発現抑制作用を併有し、スカベンジャー受容体発現抑制作用と接着分子発現抑制作用に基づくアテローム性動脈硬化症予防および治療剤として有望であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）イソチオシアネート化合物および／またはその配糖体を含有することを特徴とするスカベンジャー受容体発現抑制剤；
（２）前記イソチオシアネート化合物が、アリールアルキルイソチオシアネートである（１）記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤；
（３）前記アリールアルキルイソチオシアネート化合物がフェネチルイソチオシアネートである（２）記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤；
（４）前記イソチオシアネート化合物またはその配糖体がアブラナ科植物由来である（１）〜（３）のいずれかに記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤；  
（５）前記アブラナ科植物が大和マナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｌ．）である（４）記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤；
（６）接着分子発現抑制作用を併有する（１）記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤；
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤を配合してなる医薬品；
（８）（１）〜（６）のいずれかに記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤を配合してなる飲食品；
（９）（１）〜（６）のいずれかに記載のスカベンジャー受容体発現抑制剤を含有するアテローム性動脈硬化予防および治療剤；
などに関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、植物由来のイソチオシアネートまたはその配糖体を含有することにより、副作用が少なく、持続的かつ予防的な摂取あるいは投与可能なスカベンジャー受容体発現抑制剤、ならびに接着分子抑制作用を併有し、これらの発現抑制作用に基づくアテローム性動脈硬化症の予防及び治療剤、さらにはそれを配合してなる医薬品および飲食品を提供されることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下において、本発明を詳細に説明する。本発明におけるイソチオシアネート化合物は、イソチオシアネート基を有し、スカベンジャー受容体発現抑制作用を有する限りその構造は限定されないが、アリールアルキルイソチオシアネートおよびアルケニルアルキルイソチオシアネートが好ましく、特にアリールアルキルイソチオシアネートが好ましい。  
【００１１】
アリールアルキルイソチオシアネートとしては、ベンジルイソチオシアネート、フェネチルイソチオシアネート、４−ハイドロオキシベンジルイソチオシアネートなどが挙げられるが、特にフェネチルイソチオシアネートが好ましい。
【００１２】
アルケニルアルキルイソチオシアネートとしては、アリルイソチオシアネート、３−ブテニルイソチオシアネート、４−ペンテニルイソチオシアネート、５−ヘキセニルイソチオシアネートなどが挙げられるが、特に３−ブテニルイソチオシアネートが好ましい。
【００１３】
これらイソチオシアネート化合物は、アブラナ科植物由来のイソチオシアネート化合物であるが、これらアブラナ科植物において、イソチオシアネート化合物は、配糖体（グルコシノレート）として存在している。イソチオシアネート配糖体は細胞内在ミロシナーゼ等の酵素と接触してイソチオシアネート化合物へ変換される。また、イソチオシアネート配糖体は、ヒトの腸内細菌によりイソチオシアネート化合物へ変換されることが知られている。
【００１４】
アブラナ科植物としては、ブロッコリー、ケール、キャベツ、ハクサイ、大和マナ、小松菜、カリフラワー、カブ、スズナなどのアブラナ属の植物体が好ましい。
【００１５】
このようにアブラナ科植物においては、イソチオシアネート配糖体として存在しているため、イソチオシアネート化合物として用いてもよいが、その配糖体（グルコシノレート）としてスカベンジャー受容体発現抑制剤、ならびにアテローム性動脈硬化症予防および治療剤として用いてもよい。さらにイソチオシアネート配糖体を用いる場合に、外在性のミロシナーゼを添加して用いてもよい。さらにはアブラナ科植物体、特に大和マナそのものを用いてもよい。
【００１６】
アブラナ科植物、特に大和マナからのイソチオシアネート化合物の抽出は、例えば、植物体をすりおろしなどによる粉砕ないし細断した後、植物内在性のミロシナーゼにより、イソチオシアネート配糖体からイソチオシアネート化合物を十分に生成させてから、適当な溶媒にて抽出することにより行うことができる。抽出溶媒としては、イソチオシアネート化合物の性質にもよるが、酢酸エチル、酢酸メチルなどのエステル類、ジエチルエーテル、エチルイソプロピルエーテルなどのエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタンなどのハロゲン系炭化水素、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコールなどのアルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類などの溶媒が用いられる。好ましくは、酢酸エチルが用いられる。
【００１７】
イソチオシアネート化合物は、試薬として市販されているものは購入により入手可能であるが、種々の化学合成によっても得られる。例えば、アミン化合物やシリルアミン化合物等から得られる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６，１６６−４（１９８５），Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，５３９（１９７０）等）。
【００１８】
一方、アブラナ科植物、特に大和マナからイソチオシアネート配糖体（グルコシノレート）の抽出は、例えば、あらかじめ植物体の内在性ミロシナーゼを加熱等により不活化し、続いてすりおろしなどによる粉砕ないし細断した後、ろ過し、ろ液をカラムクロマトグラフィーなどにより分離精製することにより、目的とするイソチオシアネート配糖体（グルコシノレート）が得られる。他方、イソチオシアネート配糖体（グルコシノレート）は、種々の化学的方法によっても得ることができる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３６，７７９−７８３（１９８０）等）。
【００１９】
本スカベンジャー受容体発現抑制剤、ならびにスカベンジャー受容体発現抑制作用に基づくアテローム性動脈硬化症予防および治療剤として用いる場合に、イソチオシアネート化合物としては、これらのイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体を、１種あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２０】
かくして得られたイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体は、単独で摂取することは可能であるが、各種飲食品に添加してあるいは医薬組成物として使用することができる。具体的には、菓子、パン類、麺類の固形食品あるいはジュースや健康茶等の飲料品に添加して、または粉末状、顆粒状、カプセル状および錠剤などの医薬品・医薬部外品等の組成物として用いることができる。なお、各種飲食品に添加する場合、アブラナ科植物自体、特に大和マナ自体を用いても良い。即ち、大和マナをそのまま用いても良いが、細断あるいは粉末化したもの、ペースト状化したもの、ホモジナイズ化して不溶物をろ過したろ液、又はそのろ液を濃縮したもの等種々の形態のものが用いられる。
【００２１】
本発明のイソチオシアネート化合物は、マクロファージにおいてスカベンジャー受容体発現抑制作用を有するが、マクロファージに発現するスカベンジャー受容体ファミリーとしては、ＳＲ−Ａ，ＬＯＸ−１，ＳＲ−ＰＳＯＸ，ＣＤ３６，ＣＤ６８，ＣＬＡ−１などが知られており、ＴＨＰ−１ヒト単球細胞において腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）や１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ（ＴＰＡ）により誘引発現させることができることが知られている。スカベンジャー受容体の発現抑制作用は、公知の方法（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８０（１３）、３３２１−８（２００６））により測定することが出来る。例えば、ＴＨＰ−１細胞を試験化合物とビークルで前処理し、次いでＴＰＡを処理して各種スカベンジャー受容体のｍＲＮＡの発現量を、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ法）により増殖しブランクと比較することにより測定することができる。
【００２２】
本発明のイソチオシアネート化合物は、単球におけて接着分子の発現も抑制するが、単球の表面上に発現する接着分子としては、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂなどが知られており、ＴＨＰ−１ヒト単球細胞におけるＴＰＡ等により誘引発現、およびイソチオシアネート化合物の発現抑制作用は、上記のスカベンジャー受容体の場合と同様にして行うことができる。
【００２３】
本発明のスカベンジャー受容体発現抑制剤は、マクロファージにおけるスカベンジャー受容体発現を抑制するため、動脈内膜における泡沫細胞の沈着に伴うアテローム性のプラーク発生を抑制することにより、アテローム性動脈硬化症の発症および進展を抑制する。従って動脈硬化症に起因する疾患、すなわち不安定狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患、脳卒中、脳血栓などの脳血管障害などにも有効である。さらにスカベンジャー受容体過剰発現に基づく諸症状の改善に有効である。
【００２４】
本発明のイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体を治療目的あるいは予防的目的の医薬として用いる場合の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および投与される患者の年齢、体重、症状によって異なるが、成人１日当たり好ましくは０．００１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００２５】
一方、イソチオシアネート化合物および／またはその配糖体、ならびにそれを含有するアブラナ科植物体を飲食品として用いる場合の有効成分の摂取量は、好ましくは０・０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【実施例】
【００２６】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することが出来ることは言うまでもない。
【００２７】
本実施例で用いられる機器は次の通りである。吸光度計はＳｍａｒｔ  Ｓｐｅｃ ３０００（商標）（ＲＮＡ定量用、Ｂｉｏ  Ｒａｄ）；遠心機はＨＩＭＡＣ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（１５ｍＬ遠沈管用、ＨＩＴＡＣＨＩ）、ＫＵＢＯＴＡ  ３６１５（１．５〜２ｍＬチューブ用、ＫＵＢＯＴＡ）、ＨＳＩＡＮＧＴＡＩ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（５０ｍＬ遠沈管用、ＡＳ  ＯＮＥ）、ＴＯＭＹ  ＨＦ−１２０（０．５ｍＬチューブ用、ＴＯＭＹ）；細胞培養はＳＬＩ−１７０Ｄ（ＥＹＥＬＡ）、ＢＮＰ−１１０Ｍ（ＥＳＰＥＣ）；ＲＴ−ＰＣＲ用はＴｈｅｒｍａｌａ  ｃｙｃｌｅｒ；ＰＴＣ−１００（商標）Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；電気泳動装置はＭｕｐｉｄ−２（ＡＤＶＡＮＣＥ）；撮影はＡＥ−６９１４型プリントグラフ、卓上紫外線照射装置（ＡＴＴＯ）が用いられた。
【００２８】
実施例１  （大和マナからフェネチルイソチオシアネートの単離）
収穫した大和マナ４０ｇを細断後、ＰＢＳ（２００ｍＬ）を加えて、５秒間ホモジナイズし１０分放置した後に、ガーゼろ過を行なった。ろ液をＣＨＣｌ３にて抽出し、抽出液を乾燥後減圧濃縮すると油状物が得られた。得られた油状物（１．５ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ｎ−Ｈｅｘａｎｅ）にて精製するとフェネチルイソチオシアネートが１６ｍｇ得られた。本品は、ＨＰＬＣ分析（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ  ＡＱ−３０２カラム、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７０：３０、１．０ｍＬ／ｍｉｎ、２４４ｎｍ）及び１Ｈ−ＮＭＲ分析の結果、共に標品（東京化成より購入のフェネチルイソチオシアネート）と完全に一致した。
【００２９】
実施例２  （フェネチルイソチオシアネートのスカベンジャー受容体発現抑制活性）
（１）ｍＲＮＡ抽出
ヒト単球由来ＴＨＰ−１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）で３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で培養した。対数増殖期に維持したＴＨＰ−１細胞を１２  ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈに１．５  ｘ  １０６  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。フェネチルイソチオシアネート（最終濃度：２、１０μＭ）あるいはＤＭＳＯ（０．５％ｖ／ｖ）を添加して３７℃で３０分培養後、ＴＰＡ（３０ｎＭ）で刺激し、３７℃で２４時間培養した。培養後、細胞をＰＢＳ（１ｍＬ）で２回洗浄し、ＲＬＴ  ｂｕｆｆｅｒ（１％２−メルカプトエタノール含有）を各ｗｅｌｌに３５０μＬずつ加えた。セルスクレーパーで細胞懸濁液をかき集め、ＱＩＡＳｈｒｅｄｄｅｒ（商標）に移し、１２，０００ｒｐｍで２分間遠心した。得られたろ液に同量（３５０μＬ）の７０％ＥｔＯＨを加え、約１０回ゆっくりとピペッティングした。全量（７００μＬ）をＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに添加し、１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心してろ液を捨てた。次にＢｕｆｆｅｒ  ＲＷ  Ｉ（３５０μＬ）をｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに入れ、１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心してろ液を捨てた。ＤＮａｓｅ溶液（ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＤＤ＝１：７）８０μＬをｓｐｉｎ  ｃｕｌｕｍｎのｓｉｌｉｃａ−ｇｅｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅの真ん中に直接当るように加えて室温で３０分間放置した。Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＷ  Ｉ（３５０μＬ）を添加し、１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心してろ液を捨てた。Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＰＥ（５００μＬ）を添加し、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心した。Ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎの周りについているｂｕｆｆｅｒをキムタオルできれいに拭き取り、１．５ｍＬ容ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  チューブに移し、３７℃のインキュベーターで１５分間乾燥させた。ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水（２５μＬ）をｓｉｌｉｃａ−ｇｅｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅに直接当るように添加し、５分間室温で放置した後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心し、ろ液（ＲＮＡ溶液）を得た。
【００３０】
ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅチューブにＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を２４５μＬ入れて、そこに上述した操作により得たＲＮＡ溶液を５μＬ加え（５０倍希釈）、ピペッティングした後、１００μＬをＵＶ測定用ｃｅｌｌに入れ、ＲＮＡ濃度を測定した。
【００３１】
（２）逆転写（ＲＴ）反応
ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅチューブに表１で示すプライマー混合物を以下の組成で調製し（必要分＋１）、０．５ｍＬ容マイクロチューブに１２．５μＬずつ分注した。  
【００３２】
【表１】
2009029727.tif 000002
【００３３】
先の測定濃度により算出した、１μｇに相当するＲＮＡ溶液を各０．５ｍＬ容マイクロチューブに加え、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水で１８．５μＬに調整した。軽く攪拌した後、遠心し、ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒの次のプログラム（３０℃で１０分、５５℃で３０分、９９℃で５分、５℃５分を１サイクル）でＲＴ反応を行なった。調製したｃＤＮＡ溶液は−２０℃で保存した。
【００３４】
（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
表２で示す試薬（ＳＧｍｉｘ）を調製し、１．５ｍＬ容ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅチューブに１ｍＬずつ分注し、−２０℃で保存した。
【００３５】
【表２】
2009029727.tif 000003
【００３６】
（２）で得られたｃＤＮＡ溶液１μＬを表２で示す試薬（ＳＧｍｉｘ）や表４で示す各種プライマーを表３で示す割合にて混合し、調製した混合液をｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒにて各々表５のプログラムを行った。具体的にＬＯＸ−１の場合を例とすると、（２）で得られたｃＤＮＡ溶液１μＬとＳＧｍｉｘ  ４５μＬに５’−ＡＣＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号１；Ｓｅｎｓｅ−ｐｒｉｍｅｒ）と５’−ＣＡＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＧＡＧＣＡＡＧＧＧ−３’（配列番号２；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｐｒｉｍｅｒ）のプライマー溶液を各２．５μＬ加え、調製した混合液を軽く攪拌した後、遠心し、ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒにて次のプログラムを行った（熱変性９６℃５分後、熱変性９６℃４０秒、アニーリング６０℃３０秒、伸長反応７２℃９０秒を３８サイクルした後、５℃で５分間放置した）。そのＰＣＲ産物は２５１ｂｐであった。
なお、内部コントロールとしてのＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｈｙｄｒｏｇｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子検出用のプライマーとして、配列番号１７および配列番号１８のプライマー対を用いた。
【００３７】
【表３】
2009029727.tif 000004
【００３８】
【表４】
2009029727.tif 000005
【００３９】
【表５】
2009029727.tif 000006
【００４０】
（４）電気泳動
１０  ｘ  ＢＬＵＥＪＵＩＣＥ  ｇｅｌ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを２μＬとり、ＰＡＲＡＦＩＬＭの上にスポットを作った。該スポットと（３）にて得られた試料溶液８μＬ（分子量マーカーは４μＬ）をピペッティングして、ゲルに付した。１００Ｖで泳動後、ゲルを４０μＬのＳＹＢＲＯＲ  Ｇｏｌｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ溶液（１μＬ／ｍＬ  ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）に浸して３０分間振盪した。取り出したゲルにトランスイルミネーターにてＵＶを照射し、写真を撮影した。その結果を図１に示す。撮影した写真のバンド強度は、画像解析ソフトＮＩＨ  ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅで解析した。その結果を図２に示す。図１および図２から、ＰＥＩＴＣにより殆どのスカベンジャー受容体の発現が抑制され、特にＬＯＸ−１、ＳＲ−ＡおよびＣＤ３６の発現が強く抑制されること、さらに接着分子ＣＤ１８およびＣＤ１１ｂの発現も抑制されることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明により、植物由来のイソチオシアネートまたはその配糖体を含有することにより、副作用が少なく、持続的かつ予防的な摂取あるいは投与可能なスカベンジャー受容体発現抑制剤、ならびにスカベンジャー受容体発現抑制作用に基づくアテローム性動脈硬化症予防および治療剤、さらにそれを配合してなる医薬品および飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実施例２における、スカベンジャー受容体と接着分子発現へのＰＥＩＴＣの影響を調べるためのＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図
【図２】ＰＥＩＴＣによるスカベンジャー受容体および接着分子発現への効果を示すグラフ。コントロール（ＢＬ）を１として、更に内部標準（ＧＡＰＤＨ）で補正してある。
【図１】
2009029727.tif 000007
【図２】
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【配列表】
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