(57)【要約】【課題】ピー．アエルギノーザの新規抗原、ならびにその用途を見出す。【解決手段】配列番号：２（Ｘａａ−Ｅ−Ｅ−Ｋ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｘａａ−Ａ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−Ｘａａ−Ｎ−Ａ）に記載のＮ末端配列を有する、請求項１に記載のタンパク質抗原、それを用いるピー・アエルギノーザの検出、ならびにそれを用いる主体の免疫応答の誘発。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、６０ｋＤａから６５ｋＤａの範囲の分子量を有するピー・アエルギノーザ由来の外膜タンパク質抗原であって、配列番号：２に記載の下記のＮ末端配列：
Xaa-Glu-Glu-Lys-Thr-Pro-Leu-Thr-Thr-Ala-Ala-Xaa-Ala-Pro-Val-Val-Xaa-Asn-Ala
[式中、Xaaは不明アミノ酸を表す]
を有するタンパク質抗原。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質を含む抗原組成物。
【請求項３】
一つ以上の他のピー・アエルギノーザ抗原をさらに含むものである、請求項２に記載の抗原組成物。
【請求項４】
ピー・アエルギノーザの検出及び／又は診断に使用するための、請求項１に記載のタンパク質、あるいは請求項２又は請求項３に記載の抗原組成物。
【請求項５】
ピー・アエルギノーザを検出する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のタンパク質、あるいは請求項２又は請求項３に記載の抗原組成物をテストすべき試料と接触させる工程、及び
（ｂ）ピー・アエルギノーザに対する抗体の存在を検出する工程、
を含んで成る方法。
【請求項６】
膿疱性線維症を患う主体におけるピー・アエルギノーザを検出する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のタンパク質、あるいは請求項２又は請求項３に記載の抗原組成物をその主体から得た生物試料と接触させる工程、及び
（ｂ）ピー・アエルギノーザに対する抗体の存在を検出する工程、
を含んで成る方法。
【請求項７】
該試料が粘液の試料である請求項５又は請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該粘液が唾液である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
検出がインビトロで行われるものである、請求項５〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ピー・アエルギノーザの検出における、請求項１に記載のタンパク質、あるいは請求項２又は請求項３に記載の抗原組成物の使用。
【請求項１１】
検出がイン・ビトロで行われるものである、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
請求項１に記載のタンパク質、あるいは請求項２又は請求項３に記載の抗原組成物を含んで成る、ピー・アエルギノーザの検出及び／又は診断に使用するためのキット。
【請求項１３】
請求項１に記載のタンパク質、あるいは請求項２又は請求項３に記載の抗原組成物を含んで成る、主体の免疫応答を引き出すことができる組成物。
【請求項１４】
該組成物がワクチン組成物である請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
さらに一つ以上のアジュバントを含んで成る請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載のタンパク質、あるいは請求項２又は請求項３に記載の抗原組成物の、医薬における使用。
【請求項１７】
請求項１に記載のタンパク質、あるいは請求項２又は請求項３に記載の抗原組成物の、免疫原組成物の調製における使用。
【請求項１８】
該免疫組成物がワクチンである請求項１７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシュードモナス  アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa) 由来の新規な抗原、医薬、特にワクチンの調製におけるその使用及び診断におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピー．アエルギノーザは桿状をしたグラム陰性の好気性かつ運動性の細菌である。それは易感染性主体中で重大な罹病率及び死亡率を惹き起こす環境的に普遍的に存在する細胞外の日和見病原体である。嚢胞性線維症、火傷、慢性気管支炎、気管支拡張症及び癌を患う主体では感染が特に重要である。
【０００３】
ピー．アエルギノーザの成分について、免疫応答の同定、ワクチン候補の検索及び診断テストのための適当な成分の探索に関心が集中した。ピー．アエルギノーザの外膜はリポポリサッカライド内毒素、ホスホリピド及びタンパク質などの毒素を含んでいる。ピー．アエルギノーザの種々の外膜タンパク質（Ｏｐｒ）はアルファベットによる命名システムで命名されてきた。幾つかのタンパク質がこのスキームにより特徴付けられてきたが、それらの一部のものの発現は一過性に過ぎず、栄養素の利用可能性、培養条件及び抗生物質の存在などに大きく左右される。今日、Ｆ、Ｈ２及びＩと呼ばれる３種の主要なＯｐｒがピー．アエルギノーザのすべての株に共通な抗原として認識されておりそしてすべての株で高いコピー数で発現される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ピー．アエルギノーザの新規抗原、ならびにその用途を見出すことが本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らはピー．アエルギノーザの外膜調製物から一つのタンパク質を今回同定し、Ｐａ６０と命名した。このタンパク質のアミノ−末端配列はこれまでに特性が解明された他のタンパク質のどれとも配列相同性を示さない（ゲンバンク・データの調査）。このタンパク質は抗原性であり、ピー．アエルギノーザのクリアランス（浄化値）の上昇をもたらす保護的免疫応答を誘発することができる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ピー．アエルギノーザの新規抗原性タンパク質が提供され、これを用いてピー．アエルギノーザを検出することができ、対象における保護的免疫応答を誘発することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
このようにして、本発明は第１の側面で、ピー．アエルギノーザ由来のタンパク質抗原であって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき約６０ｋＤａから約６５ｋＤａの範囲の分子量を持つタンパク質抗原を提供する。
【０００８】
好ましい態様では、このタンパク質は配列番号：１に記載の下記のＮ−末端配列：
？−Ｅ−Ｅ−Ｋ−？−？−Ｌ−？−？−？−？−？−？−？−Ｖ−Ｖ−？−Ｎ−Ａ、
を持っており、そして、好ましくは配列番号：２に記載の下記のＮ末端配列：
？−Ｅ−Ｅ−Ｋ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−？−Ａ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−？−Ｎ−Ａ。
を持っている。
？は不明のアミノ酸を表し、Ｘａａとも表示される。
【０００９】
この全タンパク質の一部又は断片はそれ自体抗原であり得る。従って、第２の側面では本発明は本発明のタンパク質の抗原性断片を提供する。特に、この抗原性断片は上記のようなＮ−末端配列を含むものである。
【００１０】
熟練者はその抗原性をなお維持させながらこの断片の配列に一部変更を加えることが可能であることを認めるであろう。この断片及び／又はこの断片の変異体 (variants) を抗原性についてテストするには熟練者に良く知られた方法を使用することができる。このような変異体も本発明の一部を構成する。
【００１１】
本発明の抗原性タンパク質又はその断片は精製調製物又は単離調製物として単独で提供することも、あるいは他のピー．アエルギノーザの抗原性タンパク質との混合物の一部として提供することもできる。
【００１２】
従って、第３の側面において本発明は、本発明のタンパク質の一つ以上及び／又はその抗原性断片の一つ以上を含む抗原組成物を提供する。このような組成物はピー．アエルギノーザの検出及び／又は診断に使用することができる。一つの態様では、この組成物は付加的なピー．アエルギノーザ抗原の一つ以上を含んでいる。
【００１３】
第４の側面では、本発明はピー．アエルギノーザを検出及び／又は診断する方法であって、
（ａ）本発明の抗原性タンパク質、又はその抗原性断片、又は抗原組成物をテスト対象である試料と接触させる工程、及び
（ｂ）ピー．アエルギノーザに対する抗体の存在を検出する工程、
を含む方法を提供する。
【００１４】
特に、本発明のタンパク質、その抗原性断片又は抗原組成物はＩｇＧ抗体を検出するために使用することができる。テスト対象の試料としては、生物試料、例えば、血液又は唾液の試料が適当である。
【００１５】
第５の側面では、本発明はピー．アエルギノーザの検出及び／又は診断における本発明の抗原性タンパク質、その抗原性断片又は抗原性組成物の使用を提供する。その検出及び／又は診断はイン・ビトロで行うことが好ましい。
【００１６】
本発明の抗原性タンパク質、その抗原性断片又は抗原組成物はピー．アエルギノーザのイン・ビトロにおける検出及び／又は診断に使用するためのキットの一部として提供することができる。こうして、第６の側面では、本発明はピー．アエルギノーザの検出及び／又は診断に使用するためのキットであって、本発明の抗原性タンパク質、その抗原性断片又は抗原組成物を含むキットを提供する。
【００１７】
さらに、本発明の抗原性タンパク質又はその抗原性断片はピー．アエルギノーザに対する免疫応答を誘発するために使用することができる。こうして、さらなる側面で、本発明は医薬品における本発明の抗原、その断片又は本発明の抗原性組成物の使用を提供する。
【００１８】
一層さらなる側面では、本発明は主体において免疫応答を惹き出すことができる組成物であって、本発明のタンパク質又はその抗原性断片の一つ以上を含む組成物を提供する。この組成物はワクチン組成物であることが適当であり、必要があれば一つ以上の適当なアジュバントを含んでもよい。このようなワクチン組成物は予防的なワクチン組成物でも治療的なワクチン組成物であってもよい。
【００１９】
本発明のワクチン組成物は一つ以上のアジュバントを含むことができる。当技術分野で良く知られたアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムなどの無機ゲルやフロイントの不完全アジュバントなどの油中水エマルションが挙げられる。他の有用なアジュバントは熟練者に良く知られている。
【００２０】
一層さらなる側面では、本発明は、
（ａ）免疫原性組成物、好ましくはワクチンの調製における、本発明のタンパク質又はその抗原性断片の一つ以上の使用、
（ｂ）主体に免疫応答を誘発させるための、このような免疫原性組成物の使用、及び
（ｃ）主体におけるピー．アエルギノーザ感染の治療又は予防方法であって、本発明のタンパク質、抗原性断片の少なくとも一つ又は抗原組成物の有効量を、好ましくはワクチンとして、主体に投与する工程を含む方法、
を提供する。
【００２１】
本発明の各側面の好ましい特性は必要な変更を加えて他の側面のそれぞれにも成り立つ。
【００２２】
本発明は下記の実施例を参照してここに記述されるが、これらの実施例はいかなる意味でも本発明を制限するものと解すべきではない。
【００２３】
実施例は図１を参照する。図１は、Ｐａ６０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【実施例１】
【００２４】
実施例１：タンパク質の精製
シュードモナス  アエルギノーザ細菌、株３８５（Ｐａ３８５）を１００枚の寒天平板の一晩培養物から平板をこすって収穫し、その後、４℃で  10,000×ｇ、10分の遠心分離により２回洗浄した。緩衝化両性３−１４洗剤での外膜成分の抽出及びエタノール沈澱により外膜の粗調製物を得た。
【００２５】
この外膜抽出物を凍結乾燥しそして出発緩衝液（20ｍＭトリス、ｐＨ 8.5) に再懸濁した。この調製物をＱ2 カラム（バイオラド）と塩化ナトリウム勾配を用いるアニオン交換クロマトグラフィーにかけてタンパク質を溶出させた。カラムから溶出した画分を分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質含量をまず測定した。これからＰａ６０の溶出プロフィルを決定した。このプロフィルは引き続き行うクロマトグラフィー処理からＰａ６０を含む画分を集めてさらに精製することを可能とした。これらの画分を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥し、最少量の蒸留水に再懸濁し、そしてさらにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）還元性緩衝液（62.5ｍＭトリス、ｐＨ 6.8、 10 ％ (v/v)グリセロール、 2％ (w/v)ＳＤＳ、5％ (v/v)β−メルカプトエタノール、 1.2×10−３％ (w/v)ブロモフェノール・ブルー）の４倍容量中に溶解した。このＳＤＳ調製物を 37 ℃で少なくとも 30 分間インキュベートした後、電気泳動カラムのスタッキングゲルの上に載せた。
【００２６】
Ｐａ６０は調製用ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて精製した。調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥはバイオラド・モデル４９１プレップ・セルを用い、９％ Ｔ−１．４２％Ｃアクリルアミド／ビス（Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミド）分離用ゲルと２８ｍｍ（内径）カラム中で重合させた１０ｍｌの４％Ｔ−０．３６％Ｃアクリルアミド／ビス・スタッキングゲルとを用いて行った。このカラムから溶出した画分を凍結乾燥により濃縮し、分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質含量を分析した。この条件を用いて単離したＰａ６０はＳＤＳを含んでおり、これは引き続いて行ったリン酸カリウム沈澱により除去した。Ｐａ６０を含む画分をプールし、透析した後、タンパク質濃度を測定した。
【００２７】
このタンパク質の分析的同定は、勾配１０〜１５％か又は均一な１２．５％かのアクリルアミドゲル及びクーマシー染色又は銀染色を用いる分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実施した。タンパク質濃度はピアス・ミクロ・ＢＣＡ検定を用いて測定した。
【００２８】
結果
Ｐａ６０は、上記の方法により、他のピー．アエルギノーザ・タンパク質からの分離に成功した。図１はこのタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の位置を示す。
【実施例２】
【００２９】
実施例２：Ｐａ６０のＮ−末端の配列決定
Ｎ−末端アミノ酸分析を行うため、Ｐａ６０はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからこのタンパク質を含む領域を切り取ることにより調製した。このゲル部分をオーストラリア国、キャンベラにある、オーストラリアン・ナショナル・ユニバーシティのバイオモレキュラー・リソース・ファシリティー及びオーストラリア国、ＮＳＷ、ノース  ライドにあるマクォーリー・ユニバーシティのＭＵＣＡＢ・サービシーズの両方に送付した。
【００３０】
結果
一つのＮ−末端アミノ酸配列が得られ、その最初の１９個のアミノ酸のうちの１６個が同定された。残りの残基については、可能性がある（possible) アミノ酸が同定された。確度が高い同定（probable identification)については不確実さが残る。
【００３１】
配列：
１  ２  ３  ４  ５  ６    ７  ８  ９    10
確定                    Ｅ  Ｅ  Ｋ            Ｌ
確度が高い                          Ｔ  Ｐ        Ｔ  Ｔ    Ａ
可能性がある        Ｓ              Ａ  L/S       Ａ  I/D   Ｗ
11    12    13  14  15  16  17  18  19
確定                                    Ｖ  Ｖ      Ｎ  Ａ
確度が高い          Ａ          Ａ  Ｐ
可能性がある        F/L   G/S   Ｎ  Ｄ
【００３２】
これは配列番号：１に記載の下記の確定したアミノ酸を持つ一つの配列を提供する。
１−２−３−４−５−６−７−８−９−10−11−12−13−14−15−16−17−18−
？−Ｅ−Ｅ−Ｋ−？−？−Ｌ−？−？−？−？−？−？−？−Ｖ−Ｖ−？−Ｎ−
19
Ａ
【００３３】
確度の高いアミノ酸を含めると、配列番号：２に記載の下記の配列が得られる。
１−２−３−４−５−６−７−８−９−10−11−12−13−14−15−16−17−18−
？−Ｅ−Ｅ−Ｋ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−？−Ａ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−？−Ｎ−
19
Ａ
？は不明のアミノ酸を表し、Ｘａａとも表示される。
【実施例３】
【００３４】
実施例３：免疫処置後のラットモデルにおける細菌のクリアランス
ＳＰＦ（specific pathogen free) 雄ラットに、第１日目にパイアー斑内（intra-Peyer's patch (IPP))免疫処置を行い、そして生細菌のチャレンジを１４日目に行った。これらの動物を麻酔で鎮静化した。腹部中央線切開により小腸を露出させ、２７−ゲージの針を用いてパイアー斑のそれぞれにこの抗原を漿膜下に注射した。この免疫処置用のタンパク質（Ｐａ６０）をフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）とリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）の１：１比の中にｍｌ当たり２００又は８００μｇのタンパク質を乳化させることにより調製し、そして各動物に総接種量それぞれ１０又は４０μｇのタンパク質を投与した。動物は免疫処置後１４日目に生細菌（細菌数５×１０８  ＣＦＵ）で４時間チャレンジした。細菌はニュートリエント・アガー平板上で５％ＣＯ２  中、３７℃で一晩生育させ、回収し、洗浄し、そしてＰＢＳ中に所望の濃度で再懸濁した。細菌は気管内カニューレにより肺内に導入し、そして４時間後にそのラットを安楽死させた。血液を集め、血清の部分標本を抗体分析のため−２０℃で貯蔵した。肺を５×２ｍｌのＰＢＳで灌流することにより洗浄し、そして貯めた洗浄液（ＢＡＬ）について細菌の数を測定した。肺洗浄に続いて、その肺を切除し、ホモジナイズして、細菌の数を測定した。肺洗浄中の細胞百分率数を測定するため、サイトスピンスライド (cytospin slides)を調製した。肺洗浄中に存在する総細胞数はトリパン・ブルーでの染色及び血球計を用いるカウントにより計算した。
【００３５】
結果
Ｐａ６０で免疫化されそしてＰａ３８５相当株の生細菌で１４日目にチャレンジされたラットは細菌クリアランスの上昇を示した。１０μｇ又は４０μｇのＰａ６０で免疫化されたラットは両方とも、４時間後にＢＡＬと肺の両方で回収された細菌の数は非−免疫グループよりも少なかった（表１）。
【００３６】
Ｐａ６０で免疫化された動物のＢＡＬ中にはより多くの数の食細胞が存在し、これらの動物における細菌クリアランスの上昇と相関していた（表２）。
【表１】
2009029825.tif 000002
【表２】
2009029825.tif 000003
【実施例４】
【００３７】
実施例４：臨床診断的研究
メルボルンのロイアル・チルドレンズ・ホスピタルから膿疱性線維症と診断された子供達から、この研究のための試料が提供された。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）と血清を幼児で診断された時からの患者から３〜４年の期間にわたって集めた。これらの試料はピー・アエルギノーザの臨床状態に基づいてグループに分けられた。
【００３８】
グループ１：膿疱性線維症でない対照（喘音を持つ子供達の年齢に合わせる）、
グループ２：ピー・アエルギノーザについては陰性、
グループ３：上部呼吸器でピー・アエルギノーザを単離、下部呼吸器ではピー・アエルギノーザは陰性、
グループ４：下部呼吸器ではピー・アエルギノーザは浄化（次のＢＡＬ試料では陰性）、そして
グループ５：連続したＢＡＬ試料中でピー・アエルギノーザが陽性。
【００３９】
ＢＡＬ試料及び血清試料中のＰａ６０に対する抗体を測定するため、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。ポリソルブ・ミクロタイター・ウエルを１μｇ／ｍｌの濃度の精製Ｐａ６０で被覆した。このプレートはインキュベーションの各工程の間に0.05％のトウィーン20を含むＰＢＳで５回洗浄した。このウエルをＰＢＳ−0.05％トウィーン20中のスキムミルクで６０分間ブロックした。ウエルを分析のためブロッキング緩衝液で希釈した血清試料又はＢＡＬ試料と共に９０分間インキュベートした。使用した複合免疫グロブリンはラビット・抗−ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭであった。ウエルは複合免疫グロブリンと共に９０分間インキュベートした。ついでこのプレートを発色させた。ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭは抗体を定量するために使用した。
【００４０】
結果
ピー・アエルギノーザ感染が発生すると、抗体タイターの増加が観察された。膿疱性線維症でない対照グループ及び非感染の膿疱性線維症患者はＰａ６０に対するタイターが無視できるほどであった。Ｐａ６０に対するＩｇＧのタイターの増加が、特に、ＢＡＬから連続的にピー・アエルギノーザが培養された患者（グループ５）で観察された。このＢＡＬではＩｇＡタイターの有意の増加が観察された。
【表３】
2009029825.tif 000004
【実施例５】
【００４１】
実施例５：Ｐａ６０でラットを粘膜免疫化した後シュードモナス・アエルギノーザで肺にチャレンジ。
小腸のパイアー斑（ＩＰＰ）に１０μｇのＰａ６０を投与してＤＡラットをＰａ６０で免疫化した。このＰａ６０はフロイントの不完全アジュバントで乳化して送達した。ＩＰＰ後１４日目に、免疫化したラット全てにリン酸緩衝化食塩水中のＰａ６０の１０μｇで気管内（ＩＴ）ブーストを行った。ＩＴブースト後７日目に、免疫グループと未処置対照グループにＩＴを介して５×１０８  ＣＦＵのピー・アエルギノーザ生菌を投与してチャレンジした。チャレンジ後４時間でこのラットを殺しそして分析用に試料を集めた。
【００４２】
結果
細菌のクリアランス
【表４】
2009029825.tif 000005
【００４３】
１４日目にＩＴブーストを行ったＩＰＰ免疫化ラットは、ＢＡＬ及び肺組織の両方からピー・アエルギノーザを有意にクリア（浄化）した。
【００４４】
感染に対する白血球の補強
【表５】
2009029825.tif 000006
【００４５】
Ｐａ６０で免疫化したラットは、細菌チャレンジの後、より急速に肺に白血球を補強した。ＢＡＬ中で回収された白血球のほとんど全ては多形核好中球（ＰＭＮｓ）か又はマクロファージであった。気管支肺胞空間への白血球の初期補強は細菌のクリアランスと相関した。
【００４６】
抗体応答
【表６】
2009029825.tif 000007
【００４７】
Ｐａ６０に対する血清抗体が免疫化したラット中で検出された。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭの有意のタイターが認められた。
【表７】
2009029825.tif 000008
【００４８】
Ｐａ６０に対する抗体は免疫化した動物のＢＡＬ中で検出された。
Ｐａ６０に特異的なＩｇＧとＩｇＡの両方で有意のタイターが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、診断試薬の製造の分野、免疫療法の医薬の分野、感染の研究の分野などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、Ｐａ６０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１】
2009029825.tif 000009
【配列表】
2009029825000001.app