(57)【要約】【課題】  外傷性神経障害および／または運動機能障害の治療薬、特に、脊髄損傷による外傷性神経障害および／または運動機能障害の治療薬を提供することを目的とする。【解決手段】  ケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体が脊髄損傷による外傷性神経障害および／または運動機能障害に対し改善効果を有し、外傷性神経障害および／または運動機能障害の治療薬として有用であることが見出された。すなわち、本発明によると、有効量のケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体を含む、外傷性神経障害および／または運動機能障害の治療薬が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体を含む外傷性神経障害の治療薬。
【請求項２】
有効量のケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体を含む運動機能障害の治療薬。
【請求項３】
運動機能障害が神経障害によるものである、請求項２に記載の治療薬。
【請求項４】
神経障害が脊髄損傷によるものである、請求項１または３に記載の治療薬。
【請求項５】
ケラタン硫酸オリゴ糖が、下記式で表されるいずれかの二糖、または、下記式で表される二糖のいずれかもしくは両方を繰り返し構成単位として含む偶数糖からなるオリゴ糖である、請求項１〜４のいずれかに記載の治療薬。
Gal(6S)-GlcNAc(6S)  または
Gal(6S)-GlcNAc
（式中、Ｇａｌはガラクトース残基を表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を表し、６Ｓは６位のヒドロキシル基が６−Ｏ−硫酸エステルとなっていることを表し、−はグリコシド結合を表す。）
【請求項６】
ケラタン硫酸オリゴ糖が、下記式で表されるいずれかのオリゴ糖である、請求項５に記載の治療薬。
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)  または
Gal(6S)β1-4GlcNAc
（式中、Ｇａｌはガラクトース残基を表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を表し、６Ｓは６位のヒドロキシル基が６−Ｏ−硫酸エステルとなっていることを表し、β１−４はβ１，４グリコシド結合を表し、β１−３はβ１，３グリコシド結合を表す。）
【請求項７】
ケラタン硫酸オリゴ糖の誘導体が、ヒドロキシル基におけるアシル化誘導体である、請求項１〜６のいずれかに記載の治療薬。
【請求項８】
ケラタン硫酸オリゴ糖の誘導体が、下記式で示される、請求項７に記載の治療薬。
【化１】
2009091248.tif 000004
（式中、Ｘ1〜Ｘ5は、それぞれ独立して、水素原子またはアシル基を表し、Ｙは水素原子またはＳＯ3Ｍを表し、Ｍは水素原子または１価〜３価の金属カチオンもしくは１価〜３価の塩基を表し、波線で示した結合はα−グリコシド配位またはβ−グリコシド配位の単結合を表す。）
【請求項９】
Ｘ1〜Ｘ5がいずれも炭素数１〜１０のアシル基であり、Ｍがアルカリ金属である、請求項８に記載の治療薬。
【請求項１０】
ケラタン硫酸オリゴ糖の誘導体が、下記式で示される、請求項９に記載の治療薬。
【化２】
2009091248.tif 000005
（式中、Ａｃはアセチル基を表し、Ｙは水素原子またはＳＯ3Ｎａを表し、波線で示した結合は、α−グリコシド配位またはβ−グリコシド配位の単結合を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外傷性神経障害および／または運動機能障害の治療薬、特に、脊髄損傷による外傷性神経障害および／または運動機能障害の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
浅利らは、ケラタン硫酸２糖である下記式で表されるＬ４にはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）発現抑制作用があることを報告している（非特許文献１）。
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)
（式中、Ｇａｌはガラクトース残基を表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を表し、６Ｓは６位のヒドロキシル基が６−Ｏ−硫酸エステルとなっていることを表し、β1-4はβ1-4グリコシド結合を表す。）
【０００３】
また、ＩＬ−１２は、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいては、高レベルに発現しており、Ｔリンパ球（ＣＤ４−ＣＤ８−）を不死化し、リンパ性器官（リンパ節および脾臓）を腫脹させることが知られている（非特許文献２）。さらに、Ｌ４を投与することで、血中ＩＬ−１２濃度に低下が見られ、Ｔリンパ球に細胞死が誘導され、リンパ性器官が縮小することが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
一方、脊髄損傷患者の精液では、ＩＬ−１２濃度が高くなっていることが報告されている（非特許文献３）。なお、脊髄損傷におけるＩＬ−１２の役割については不明である。
【０００５】
【特許文献１】特開平2-57182号公報
【特許文献２】国際公開第WO96/16166号パンフレット
【特許文献３】国際公開第WO96/16973号パンフレット
【特許文献４】特開2001-89493号公報
【非特許文献１】Xu H, Kurihara H, Ito T, Kikuchi H, Yoshida K, Yamanokuchi H, Asari A. The keratan sulfate disaccharide Gal(6S03) beta1,4-GlcNAc(6S03) modulates interleukin 12 production by macrophages in murine Thy-1 type autoimmune disease. J Biol Chem. 2005 May 27;280(21):20879-86.
【非特許文献２】Xu H, Kurihara H, Ito T, Nakajima S, Hagiwara E, Yamanokuchi H, Asari A. IL-12 enhances lymphoaccumulation by suppressing cell death of T cells in MRL-lpr/lpr mice. J Autoimmun. 2001 Mar;16(2):87-95.
【非特許文献３】Basu S, Aballa TC, Ferrell SM, Lynne CM, Brackett NL. Inflammatory cytokine concentrations are elevated in seminal plasma of men with spinal cord injuries. J Androl. 2004 Mar-Apr;25(2):250-4.
【非特許文献４】Kubota, M., Yoshida, K., Tawada, A., and Ohashi, M. (2000) Eur. J. Mass Spectrom. 6, 193？203
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、外傷性神経障害および／または運動機能障害の治療薬、特に、脊髄損傷による外傷性神経障害および／または運動機能障害の治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一の側面によると、有効量のケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体を含む外傷性神経障害の治療薬が提供される。本発明の他の側面によると、有効量のケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体を含む、運動機能障害治療薬が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者等は、ラット脊髄損傷モデルを用いて、ケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体の脊髄損傷に対する作用を検討した。この結果、驚くべきことに、以下に詳細に説明するように、ケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体が脊髄損傷による運動機能障害に対し改善効果を有し、外傷性神経障害および／または運動機能障害の治療薬として有用であることが見出された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施の形態によって、限定されるものではない。
【００１０】
上記したように、本発明によると、有効量のケラタン硫酸オリゴ糖またはその誘導体を含む、外傷性神経障害および／または運動機能障害の治療薬が提供される。
【００１１】
本発明において、「ケラタン硫酸オリゴ糖」（以下、ＫＳオリゴ糖とも言う）は、ケラタン硫酸の基本構造（一般に、ガラクトース残基またはガラクトース−６−Ｏ−硫酸残基と、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸残基とが交互にグリコシド結合した構造であるが、特に限定されない。）を含む二糖以上のオリゴ糖である。また、ＫＳオリゴ糖は、シアル酸（ノイラミン酸のアシル誘導体）残基および／またはフコース残基を含んでいても良い。通常は、シアル酸残基は、α２，３またはα２，６グリコシド結合でガラクトース残基に結合し、フコース残基は、α１，３グリコシド結合でＮ−アセチルグルコサミン残基に結合する。
【００１２】
本発明におけるオリゴ糖とは、通常、多糖の分野においてオリゴ糖と称される範囲の構成糖物質を含む。特に、オリゴ糖とは２〜１０糖から成る糖ポリマーが好ましく、２〜６糖から成るものがより好ましく、２〜４糖から成るものが更に好ましい。中でも特に２糖から成るものが好ましい。
【００１３】
ＫＳオリゴ糖は、例えばケラタン硫酸を酵素的または化学的に分解して得られる生成物であっても良く、また例えばＮ−アセチルラクトサミンが１単位以上結合してなるオリゴ糖などを硫酸化して得られる化合物であっても良い。この様なケラタン硫酸オリゴ糖の中でも、ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖（ケラタン硫酸由来のオリゴ糖）が好ましく、ケラタン硫酸をエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素で分解して得られる分解生成物がより好ましい。
【００１４】
天然より得られるケラタン硫酸は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基の多くが硫酸化されており、ガラクトース残基の６位のヒドロキシル基は一部硫酸化されていることが多い。ＫＳオリゴ糖は、このケラタン硫酸を上述の様に分解して得られるケラタン硫酸オリゴ糖でも構わないが、本発明のＫＳオリゴ糖としては、Ｎ−アセチルグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基は硫酸化されていてもされていなくても良く、ガラクトース残基の６位のヒドロキシル基は硫酸化されているものがより好ましい。
【００１５】
すなわち、ＫＳオリゴ糖は、下記式で表される二糖のいずれかであるか、または、当該二糖のいずれかもしくは両方を繰り返し構成単位として含む偶数糖からなるオリゴ糖であることが好ましい。
Gal(6S)-GlcNAc(6S)  または
Gal(6S)-GlcNAc
（式中、Ｇａｌはガラクトース残基を表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を表し、６Ｓは６位のヒドロキシル基が６−Ｏ−硫酸エステルとなっていることを表し、−はグリコシド結合を表す）
【００１６】
ＫＳオリゴ糖は、特に好ましくは、下記式１〜式３で表されるいずれかのオリゴ糖である。
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)  式１
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)  式２
Gal(6S)β1-4GlcNAc  式３
（式中、Ｇａｌはガラクトース残基を表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を表し、６Ｓは６位のヒドロキシル基が６−Ｏ−硫酸エステルとなっていることを表し、β1-4はβ1-4グリコシド結合を表し、β1-3はβ1-3グリコシド結合を表す。）
【００１７】
なお、式１で表されるオリゴ糖をＬ４Ｌ４、式２で表されるオリゴ糖をＬ４、式３で表されるオリゴ糖をＬ３とも言う。前述の様に式１〜式３で表されるオリゴ糖にＮ−アセチルノイラミン酸などのシアル酸残基が結合していても良く、この様なシアル酸含有ケラタン硫酸オリゴ糖としては、下記のものが例示される。
SA-Gal(6S)-GlcNAc(6S)  および
SA-Gal(6S)-GlcNAc(6S)-Gal(6S)-GlcNAc(6S)
（式中、ＳＡはシアル酸残基を表し、Ｇａｌはガラクトース残基を表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を表し、６Ｓは６位のヒドロキシル基が６−Ｏ−硫酸エステルとなっていることを表し、−はグリコシド結合を表す。）
【００１８】
本明細書において、ケラタン硫酸オリゴ糖の「誘導体」は（以下、ＫＳオリゴ糖誘導体とも言う）、通常には、ＫＳオリゴ糖のヒドロキシル基の水素原子の少なくとも１つ（好ましくは全ヒドロキシル基の１０％以上）が、アシル基により置換されたもの（部分または完全Ｏ−アシル化誘導体）を包含する。
【００１９】
さらに、ＫＳオリゴ糖およびＫＳオリゴ糖誘導体は、電離した状態のもの、プロトンまたはカチオンが付加した構造のものを包含する。従って、（カチオンが付加した）ＫＳオリゴ糖およびＫＳオリゴ糖誘導体は、薬学的に許容され得るその塩も包含する。
【００２０】
薬学的に許容され得る塩とは、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学的に許容されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
ＫＳオリゴ糖誘導体において、ＫＳオリゴ糖のヒドロキシル基の水素原子を置換するアシル基は、好ましくは炭素数１〜１０のアシル基、より好ましくは炭素数１〜１０の脂肪族または芳香族のアシル基、すなわちヘテロ原子を含むこともあるアルカノイル基またはアロイル基である。その例としては、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリフルオロアセチル、メトキシアセチル、プロピオニル、ｎ−ブチリル、（Ｅ）−２−メチルブテノイル、イソブチリル、ペンタノイル、ベンゾイル、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾイル、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾイル、２，４，６−トリメチルベンゾイル、ｐ−トルオイル、ｐ−アニソイル、ｐ−クロロベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイルなどの基が挙げられる。ＫＳオリゴ糖誘導体が複数のアシル基を有する場合には、それらのアシル基は互いに同一でも異なっていても良い。なお、ＫＳオリゴ糖の還元末端糖の１位のヒドロキシル基の水素原子がアシル基により置換されている場合、そのＯ−アシル基の配位は、α−グリコシド配位またはβ−グリコシド配位のいずれでもよいが、α−グリコシド配位であることが好ましい。
【００２２】
アシル化されたＫＳオリゴ糖は、有機溶媒、脂質に対する溶解性の向上、生体膜透過性の増大、経口投与した場合の消化管吸収量の増大等の利点を有するため、特に好ましい。
【００２３】
本発明において、ＫＳオリゴ糖またはＫＳオリゴ糖誘導体は、好ましくは、下記式４で示される化合物である。なお、下記式４において便宜上、Ｍが付加している構造を記載したが、溶液中では電離している場合があり、この様に電離している場合は、スルホン酸基はマイナスイオンの状態になる。
【００２４】
【化１】
2009091248.tif 000002
（式中、Ｘ1〜Ｘ5は、それぞれ独立して、水素原子またはアシル基を表し、Ｙは水素原子またはＳＯ3Ｍを表し、Ｍは水素原子または１価〜３価の金属カチオンもしくは１価〜３価の塩基を表し、波線で示した結合はα−グリコシド配位またはβ−グリコシド配位の単結合を表す。）
【００２５】
アシル基が置換したＫＳオリゴ糖誘導体は、好ましくは、上記式４においてＸ1〜Ｘ5の全てがアセチル基である。特に好ましくは、下記式５で示される誘導体である。
【００２６】
【化２】
2009091248.tif 000003
（式中、Ａｃはアセチル基を表し、Ｙは水素原子またはＳＯ3Ｎａを表し、波線で示した結合は、α−グリコシド配位またはβ−グリコシド配位の単結合を表す。）
【００２７】
本発明にかかる治療薬において、ＫＳオリゴ糖またはその誘導体は、単一の種からなっていても、混合物であってもよい。例えば上記式４中の波線で示した部分がα−グリコシド配位である物質であってもよく、β−グリコシド配位である物質であってもよく、これらの混合物であってもよい。
【００２８】
ＫＳオリゴ糖は、例えばケラタン硫酸、好ましくは高硫酸化ケラタン硫酸の緩衝溶液にエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素、例えばバチルス属細菌由来のケラタナーゼ（ＩＩ）（特許文献１、特開平2-57182号公報）、またはバチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株由来のケラタン硫酸分解酵素（特許文献２、国際公開第WO96/16166号）を作用させて分解した後、得られた分解物を分画することにより得ることが出来る。得られたオリゴ糖は通常の分離精製方法、例えばエタノール沈殿、ゲル濾過および陰イオン交換クロマトグラフィーにより、目的のオリゴ糖を分離精製することが出来る。
【００２９】
この様な製造方法の例は、特許文献３（国際公開第WO96/16973号）に記載されている。なお、原料となるケラタン硫酸は、主としてガラクトースまたはガラクトース−６−Ｏ−硫酸とＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸との二糖の繰り返し構造で構成される。ケラタン硫酸は、動物種および器官などによって硫酸含量が異なっているが、通常はサメなどの軟骨魚類、クジラ、ウシなどの哺乳動物の軟骨、骨や角膜などの生原料から製造されるものを用いることが出来る。
【００３０】
原料として使用されるケラタン硫酸は、通常入手出来るものであればよく、特に制限されないが、構成糖であるガラクトース残基が硫酸化された高硫酸化ケラタン硫酸（構成二糖あたり１．５〜２分子の硫酸基を含む高硫酸化ケラタン硫酸をケラタンポリ硫酸と言うこともある）を用いることが好ましい。また、ガラクトース残基の硫酸基の位置として６位が好ましい。この様な高硫酸化ケラタン硫酸は、例えば、サメなどの軟骨魚類のプロテオグリカンから取得出来る。また市販されているものを使用することも出来る。
【００３１】
この様にして得られたＫＳオリゴ糖の硫酸基含量を、糖鎖の公知の脱硫酸化方法や硫酸化方法によって適宜調整したものを、本発明に使用されるＫＳオリゴ糖として用いても良い。
【００３２】
ＫＳオリゴ糖誘導体を作るに際し、ＫＳオリゴ糖のヒドロキシル基の水素原子のアシル基による置換は、糖のヒドロキシル基の保護のために通常に行われるアシル化方法に従って行うことが出来る。例えば、導入すべきアシル基の反応性誘導体（アシル基に対応するカルボン酸の無水物（例えば、アセチル基を導入する場合は、無水酢酸、プロパノイル基を導入する場合は、無水プロピオン酸）、カルボン酸、ハロゲン化物など）と、適当な反応溶媒（ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、クロロホルム、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、水、およびこれらの混合物など）中でＫＳオリゴ糖を常法によって反応させることによってアシル基を導入することが出来る。必要に応じて、ピリジン等の塩基触媒の存在下で反応させることも出来る。
【００３３】
また、必要により、アシル化の程度を調整してもよく、この調整は、上記のアシル化方法において部分的にアシル化を行うか、または、アシル化されたＫＳオリゴ糖からアシル基を部分的に除去することによって行うことが出来る。アシル基の除去は、メタノール性アンモニア、濃アンモニア水、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを用いて加水分解することによって行うことが出来る。得られた誘導体は、逆相高速液体クロマトグラフィー等で精製することが出来る。
【００３４】
本発明にかかる治療薬の有効成分であるＫＳオリゴ糖またはその誘導体は、医薬として使用出来る程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を含まないものであることが好ましい。
【００３５】
本発明にかかる治療薬は、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、マウス、ラット等の哺乳動物における外傷性神経障害および／または運動機能障害を治療、進行抑制または予防するのに有効である。特に、本発明にかかる治療薬は、運動機能障害が神経障害によるものである場合に好適である。さらに、本発明にかかる治療薬は、神経障害が脊髄損傷によるものである場合に好適である。脊髄損傷としては、外傷性脊髄損傷（椎体関節の脱臼または亜脱臼、脊椎骨折（線状骨折、圧迫骨折、圧挫骨折、完全横断損傷、不完全横断損傷、Brown-Sequard 型損傷、急性脊髄前半部損傷、急性脊髄中心部損傷、高位頚髄損傷等）、脊椎変性疾患（脊椎症等）、脊椎炎症性疾患（脊椎炎、慢性関節リウマチ等）、腫瘍（脊髄腫瘍、脊椎腫瘍等）、血管性疾患（脊髄出血、隋外血管障害による脊髄麻痺等）、脊髄炎（クモ膜炎、ウイルス性脊髄炎、細菌性脊髄炎等）、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症等が挙げられる。脊髄損傷による神経障害としては、下半身の運動機能障害、半身不随、下半身麻痺、知覚障害、自律神経機能障害、反射の喪失、性機能の低下等が挙げられる。神経障害による運動機能障害としては、神経障害に基づいて起こるショック、呼吸麻痺、知覚麻痺、運動麻痺、反射の消失、自律神経麻痺等が挙げられる。なお、本発明にかかる治療薬は、純然とした治療目的のみならず、疾患の予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）等を目的として適用することができる。
【００３６】
本発明においては、対象となる疾患の性質や進行状況、投与方法などに応じて、任意の剤形を適宜選択することが出来る。すなわち、本発明の治療薬は、注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内など）、経鼻、経口、経皮、吸入などにより投与することができ、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することが出来る。選択しうる剤形も特に限定されず、例えば、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤など）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、スプレー剤、吸入剤などから広く選択することが出来る。また、これらの製剤調製にあたり、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧調整剤、pH調整剤、その他着色剤、崩壊剤など、通常医薬に用いられる成分を使用することが出来る。
【００３７】
本発明の治療薬中の有効成分であるＫＳオリゴ糖またはその誘導体の配合量ならびに投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、患者の体重、年齢、性別などに応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、ＫＳオリゴ糖の臨床量としては成人１人１日１回あたり５０〜５０００ｍｇが例示される。
【００３８】
本発明の治療薬の有効成分であるＫＳオリゴ糖の安全性については、特許文献３（国際公開第WO96/16973号）において示されており、その誘導体については、特許文献４（特開2001-89493号公報）に記載の実施例から安全性が推定される。
【実施例】
【００３９】
以下に、本発明の実施例を、添付図面を参照しながら説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施例によって限定されるものではない。
【００４０】
［材料および方法］
〔Ｌ４の調整〕
Ｌ４は、Ｘｕらの方法（非特許文献１）に準じて、以下のように、ケラタン硫酸をケラタナーゼＩＩで分解後、陰イオン交換クロマトグラフィーにて分画することで調製した。
【００４１】
ＫＳオリゴ糖（Ｌ４）は、サメのヒレ由来のケラタン硫酸（生化学工業）のケラタナーゼＩＩによる分解産物から、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル−パーミエーションクロマトグラフィーの一連のステップにより単離した。当該オリゴ糖は、キャピラリー電気泳動および質量分析法により同定した（非特許文献４）。
【００４２】
キャピラリー電気泳動は、紫外線検出器を有するQuanta 4000キャピラリー電気泳動システム(Waters)を用いて行った。キャピラリー電気泳動システムは、試料を陽極に載せ、通常の極性で使用した。ランニングバッファーとして、５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）を用いた。試料は、Waters社の石英ガラスキャピラリーチューブ（チューブが上記検出器を通過する領域以外は外部が被覆されている。内径７５μｍ，長さ６０ｃｍ）を用いて分離し、分析した。試料を導入する前に、キャピラリーチューブは、０．５Ｍの水酸化ナトリウム、蒸留水、およびランニングバッファーにより、手動でリンスした。試料は１０秒の注入期間で静水圧によりロードした。実験は定電圧（１２ｋＶ）で行った。溶出物は、１８５ｎｍでモニターした。データの分析は、Waters社のソフトウェアMillenium 32（バージョン3.06.01）を用いて行った。
【００４３】
得られた糖は、トキシカラーＬＳセット（生化学工業）を用いて、血球抽出物アッセイ(Limulus amebocyte lysate)によりエンドトキシンを確認した。Ｌ４が含むエンドトキシンは、０．０３ｐｇ／ｍｇ以下であった。
【００４４】
〔脊髄損傷モデル作製および試験物質投与〕
以下のように、脊髄損傷モデル（ピンセット挫滅モデル）を作製した。実験動物として、１２週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラットを用いた。動物はペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ体重）麻酔下に、頸部から臀部にかけて電気バリカンで剪毛し、７０％エタノールおよびイソジン（明治製菓株式会社製）で清拭した。背部皮膚を切開し、Ｔ５からＴ１０胸椎を露出後、第六胸椎（Ｔ６胸椎）を半椎弓切除し、硬膜に小切開を加えた。キシロカイン（アストラゼネカ製）で局所麻酔後、Ｔ６の位置でピンセット（先端を０．３ｍｍに加工）をその先端が椎体に届くまで刺入して、両側から１０秒間はさむことによって脊髄を坐滅させた。
【００４５】
損傷後、直ちにチューブの先端（ＯＤ：０．３ｍｍ）を損傷部頭部側の硬膜下に留置し、Ｌ４（６μＬ）をマイクロシリンジ（２５μＬ、(株)伊藤製作所）を用いて硬膜内投与した。損傷部に周囲組織との隔離のために、ゼラチンスポンジ（Gelform、ファルマシア社製）を置き、創部を縫合し、飼育ケージに戻した。
【００４６】
〔行動学的評価〕
脊髄損傷後、７日間毎日、後肢運動機能検査を行った。Bassoらの方法に準じ、Basso-Beeattie-Bresnahan（ＢＢＢ）スケールを用いて、２人の試験者が盲目的に独立して評価を行い、その平均点を最終評点とした。なお、ＢＢＢスケールとは、２１段階に細分化された評点を用い、動物をオープンフィールド内で自由に歩行させ、後肢運動機能の回復を計測する評価方法である。後肢の自発的運動が全くみられない場合、評点は０となり、正常な後肢の運動がみられる場合は、評点は２１となる。
【００４７】
〔脊髄誘発電位測定〕
脊髄損傷後７日に、ハロタン麻酔（導入４．０％、維持１．０％）下で実験動物に気管内挿管し、実験動物を筋弛緩剤で非動化し、腹臥位に頭部を固定し、人工呼吸器により維持した。実験動物に、第２／３頸椎間および第１３胸椎／第１腰椎間からカテーテル電極を挿入し、筋電計（Counterpoint、ダンテック）を用いて、最大上刺激（刺激頻度：１Ｈｚ、持続期間：０．０５ｍｓ）し、脊髄誘発電位（ＳＣＥＰ）を測定した。得られた電位の評価は第１電位の振幅を指標とした。脊髄誘発電位の上昇は、損傷部の回復を意味する。
【００４８】
〔統計学的評価〕
ＢＢＢスコアにはノンパラメトリックTukeyの多重比較検定を用いた。
【００４９】
［結果］
ＢＢＢスケールを用いた後肢運動機能検査においても、生食投与群と比較して、脊髄損傷後７日に、Ｌ４の６０μｇ／匹での投与で有意な後肢運動機能の回復（Ｐ＜０．００１）が認められた（図１、２）。脊髄誘発電位では、生食投与群と比較して、Ｌ４の６０μｇ／匹での投与でＳＣＥＰ振幅の回復傾向が認められた（図３）。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ピンセット挫滅法によるラット脊髄損傷モデルにおける後肢運動機能に対するＬ４の作用を示す。脊髄損傷処理およびＬ４投与後の日数と後肢運動機能（ＢＢＢスコア）との関係を示す。
【図２】図２は、ピンセット挫滅法によるラット脊髄損傷モデルにおける後肢運動機能に対するＬ４の作用を示す。脊髄損傷処理およびＬ４投与後の７日目の後肢運動機能（ＢＢＢスコア）を示す。
【図３】図３は、ピンセット挫滅法によるラット脊髄損傷モデルにおける脊髄誘発電位に対するＬ４の作用を示す。脊髄損傷処理およびＬ４投与後の７日目の脊髄誘発電位を示す。
【図１】
2009091248.tif 000006
【図２】
2009091248.tif 000007
【図３】
2009091248.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成18年1月19日(2006.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
【特許文献１】特開平2-57182号公報
【特許文献２】国際公開第WO96/16166号パンフレット
【特許文献３】国際公開第WO96/16973号パンフレット
【特許文献４】特開2001-89493号公報
【非特許文献１】Xu H, Kurihara H, Ito T, Kikuchi H, Yoshida K, Yamanokuchi H, Asari A. The keratan sulfate disaccharide Gal(6S03) beta1,4-GlcNAc(6S03) modulates interleukin 12 production by macrophages in murine Thy-1 type autoimmune disease. J Biol Chem. 2005 May 27;280(21):20879-86.
【非特許文献２】Xu H, Kurihara H, Ito T, Nakajima S, Hagiwara E, Yamanokuchi H, Asari A. IL-12 enhances lymphoaccumulation by suppressing cell death of T cells in MRL-lpr/lpr mice. J Autoimmun. 2001 Mar;16(2):87-95.
【非特許文献３】Basu S, Aballa TC, Ferrell SM, Lynne CM, Brackett NL. Inflammatory cytokine concentrations are elevated in seminal plasma of men with spinal cord injuries. J Androl. 2004 Mar-Apr;25(2):250-4.
【非特許文献４】Kubota, M., Yoshida, K., Tawada, A., and Ohashi, M. (2000) Eur. J. Mass Spectrom. 6, 193-203
【非特許文献５】Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC, A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats., J. Neurotauma, 1995 Feb, 12(1), p1-21.
【非特許文献６】Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC, Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection., Exp. Neurol., 1996 Jun, 139(2), p244-56
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
〔行動学的評価〕
脊髄損傷後、７日間毎日、後肢運動機能検査を行った。Bassoらの方法（非特許文献５，６参照）に準じ、Basso-Beeattie-Bresnahan（ＢＢＢ）スケールを用いて、２人の試験者が盲目的に独立して評価を行い、その平均点を最終評点とした。なお、ＢＢＢスケールとは、２１段階に細分化された評点を用い、動物をオープンフィールド内で自由に歩行させ、後肢運動機能の回復を計測する評価方法である。後肢の自発的運動が全くみられない場合、評点は０となり、正常な後肢の運動がみられる場合は、評点は２１となる。