(57)【要約】【課題】赤血球を粒子径によって分離するのではなく、経時的な分離能力低下の発生を防止して、細胞懸濁液内の赤血球を効率的かつ短時間に分離する。【解決手段】細胞懸濁液にヒドロキシエチル基を含む凝集剤を添加する添加ステップＳ１と、該添加ステップＳ１において凝集剤が添加された細胞懸濁液を流動させる流動ステップＳ２と、細胞懸濁液内に電極を配置し、該電極に高周波電圧を加えて細胞懸濁液内に高周波不平等電界を発生させ誘電泳動発生ステップＳ３とを備える赤血球の分離方法を提供する。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液にヒドロキシエチル基を含む凝集剤を添加する添加ステップと、
該添加ステップにおいて凝集剤が添加された細胞懸濁液を流動させる流動ステップと、
細胞懸濁液内に電極を配置し、該電極に高周波電圧を加えて細胞懸濁液内に高周波不平等電界を発生させる誘電泳動発生ステップとを備える赤血球の分離方法。
【請求項２】
前記凝集剤がヒドロキシエチル澱粉である請求項１に記載の赤血球の分離方法。
【請求項３】
細胞懸濁液にヒドロキシエチル基を含む凝集剤を添加する添加ステップと、
該添加ステップにおいて凝集剤が添加された細胞懸濁液を流動させる流動ステップと、
細胞懸濁液内に高周波不平等電界を発生させる誘電泳動発生ステップと、
前記高周波不平等電界により保持されずに通過した細胞懸濁液を回収する回収ステップとを備える移植材の製造方法。
【請求項４】
前記凝集剤がヒドロキシエチル澱粉である請求項３に記載の移植材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球の分離方法および移植材の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、骨髄あるいは末梢血などの赤血球と造血幹細胞および／または造血前駆細胞を含む細胞集団から、赤血球を除去する赤血球除去システムが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この赤血球除去システムは、赤血球を通過させ白血球を捕捉するフィルタに細胞懸濁液を通過させた後、フィルタに捕捉された白血球を回収するようになっている。
【０００３】
【特許文献１】特開平９−５６８１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の赤血球除去システムは、フィルタに通過させられる細胞懸濁液内に含まれている赤血球と白血球の大きさの違いによって、フィルタの透孔を通過できない大きさの白血球を捕捉し、それより小さい赤血球を通過させるものであるため、フィルタの目詰まりにより経時的に分離能力が低下してしまうという不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、赤血球を粒子径によって分離するのではなく、経時的な分離能力低下の発生を防止して、細胞懸濁液内の赤血球を効率的かつ短時間に分離することができる赤血球の分離方法および移植材の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、細胞懸濁液にヒドロキシエチル基を含む凝集剤を添加する添加ステップと、該添加ステップにおいて凝集剤が添加された細胞懸濁液を流動させる流動ステップと、細胞懸濁液内に電極を配置し、該電極に高周波電圧を加えて細胞懸濁液内に高周波不平等電界を発生させ誘電泳動発生ステップとを備える赤血球の分離方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、添加ステップにおいて細胞懸濁液にヒドロキシエチル基を含む凝集剤を添加することにより、細胞懸濁液に含まれる赤血球を凝集させ、大きな塊を形成することができる。そして、このようにして赤血球の大きな塊を含む細胞懸濁液を流動ステップにおいて流動させ、誘電泳動発生ステップにおいて電極に高周波電圧を加えて細胞懸濁液内に高周波不平等電界を発生させることにより、細胞懸濁液内の各粒子に誘電泳動力を作用させる。
【０００８】
各粒子に作用する誘電泳動力は粒子の粒径に応じて変化するので、凝集して大きな塊となった赤血球には大きな誘電泳動力が作用し、その極性によって電極に引きつけられあるいは電極から遠ざけられる。一方、凝集していない単核球細胞のように小さい粒子には小さい誘電泳動力しか作用せず、電極への吸着あるいは排斥力は赤血球と比較して弱くなる。その結果、細胞懸濁液の流動速度および高周波電圧の大きさを適宜調節すると、作用する誘電泳動力の差によって、赤血球を他の粒子から分離することができる。
【０００９】
この場合において、本発明によれば、従来のフィルタのように透孔の大きさによって赤血球を分離するのではなく、誘電泳動力の差によって赤血球を分離するので、目詰まりの発生を防止し、経時的な分離能力の低下を防止することができる。
【００１０】
上記発明においては、前記凝集剤がヒドロキシエチル澱粉であることが好ましい。
ヒドロキシエチル澱粉によれば、効率的に赤血球を凝集させることができるとともに、生体親和性が高く、細胞懸濁液内に有害な物質を含有させずに済む。
【００１１】
また、本発明は、細胞懸濁液にヒドロキシエチル基を含む凝集剤を添加する添加ステップと、該添加ステップにおいて凝集剤が添加された細胞懸濁液を流動させる流動ステップと、細胞懸濁液内に高周波不平等電界を発生させる誘電泳動発生ステップと、前記高周波不平等電界により保持されずに通過した細胞懸濁液を回収する回収ステップとを備える移植材の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明によれば、添加ステップにおいて細胞懸濁液にヒドロキシエチル基を含む凝集剤を添加することにより、細胞懸濁液に含まれる赤血球を凝集させ、大きな塊を形成する。凝集した大きな塊には誘電泳動発生ステップにおいて大きな誘電泳動力が作用するので、流動ステップにより流動させると誘電泳動力によってその場に保持される。一方、小さい粒子には小さな誘電泳動力が作用して流れに乗って通過する。そして、回収ステップにおいて通過した小さい粒子を含む細胞懸濁液を回収することにより、赤血球を除去した高純度の移植材を製造することができる。
上記発明においては、前記凝集剤がヒドロキシエチル澱粉であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、赤血球を粒子径によって分離するのではなく、経時的な分離能力低下の発生を防止して、細胞懸濁液内の赤血球を効率的かつ短時間に分離することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の一実施形態に係る赤血球の分離方法および移植材の製造方法について、図１〜図６を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る移植材の製造方法は、図１に示されるように、例えば、ヒトから採取した骨髄液等の移植用細胞懸濁液から赤血球を分離除去する分離ステップＳ１と、赤血球を分離除去した後の細胞懸濁液を回収する回収ステップＳ２とにより移植材を製造する方法である。
【００１５】
本実施形態に係る赤血球の分離方法は、上記分離ステップＳ１であって、図２に示されるように、例えば、ヒトから採取した骨髄液透の移植用細胞懸濁液にヒドロキシエチル澱粉（凝集剤）を添加する添加ステップＳ１１と、該添加ステップＳ１１においてヒドロキシエチル澱粉を添加した移植用細胞懸濁液を流動させる流動ステップＳ１２と、該流動ステップＳ１２により流動している移植用細胞懸濁液内に高周波不平等電界を発生させる誘電泳動発生ステップＳ１３とを備えている。
【００１６】
流動ステップＳ１２および誘電泳動発生ステップＳ１３は、細胞懸濁液を流路内に流動させ、流路を遮るように流路内に配置された電極に高周波電圧を加えることにより行われるようになっている。電極は、例えば、図３に示されるように、複数の直棒状電極部１ａ，１ｂを平行に間隔をあけて配列してなる２つの櫛歯状電極１Ａ，１Ｂを、各櫛歯状電極１Ａ，１Ｂの直棒状電極部１ａ，１ｂが交互に配置されるように配置することにより構成されている。図中符号２は電源である。
【００１７】
このような櫛歯状電極１Ａ，１Ｂに高周波電圧を加えると、図４に示されるように、電界強度の勾配を有する高周波不平等電界が発生するようになっている。図４は電界強度を等高線により示しており、電界強度は、直棒状電極部１ａ，１ｂに近いほど強く、離れる程弱くなっている。
【００１８】
また、このような電極に加える高周波電圧の大きさに対して、発生する誘電泳動力により細胞懸濁液中の粒子が電極近傍に保持される保持率が変化し、その傾向は、図５に示されるように粒子の大きさによって変化する。
【００１９】
回収ステップＳ２は、電極近傍に形成されている高周波不平等電界に保持されなかった成分、すなわち、電極近傍を通過して下流側に流れてきた赤血球を除く全ての成分を回収するようになっている。
【００２０】
本実施形態に係る赤血球の分離方法によれば、移植用細胞懸濁液にヒドロキシエチル澱粉を添加する添加ステップＳ１１により、移植用細胞懸濁液内に含有されている赤血球が特異的に凝集させられる。例えば、ヒドロキシエチル澱粉を６％濃度となるように移植用細胞懸濁液に添加すると、図６に示されるように、赤血球が凝集する。各凝集塊は、１０個以上の赤血球が凝集したもので、単一の赤血球と比較するとその粒径は２倍以上となっている。図６（ａ）はヒドロキシエチル澱粉添加前、図６（ｂ）は添加後の状態を示している。
【００２１】
そして、このようにして添加ステップＳ１においてヒドロキシエチル澱粉を添加した移植用細胞懸濁液を流動ステップＳ２において流路に流動させ、誘電泳動発生ステップＳ３において流路内に高周波不平等電界を形成する。これにより、細胞懸濁液内の各粒子にはその誘電泳動特性および粒径に応じた誘電泳動力が作用することになる。特に、粒径による誘電泳動力の変化は図５に示されるように非常に大きいので、凝集することにより大きくなった赤血球の塊には、凝集していない他の粒子、例えば、単核球細胞透と比較して非常に大きな誘電泳動力が作用する。
【００２２】
すなわち、流路内を流動する途中において、高周波不平等電界により大きな誘電泳動力を受ける赤血球の凝集塊は、流れに逆らって電極近傍に保持され、より小さい誘電泳動力を受ける単核球細胞等は、電極近傍に保持されることなく流れに乗って流動し続ける。その結果、移植用細胞懸濁液内から効果的に赤血球を分離除去することができる。
【００２３】
この場合において、本実施形態に係る赤血球の分離方法によれば、粒子の大きさを利用して透孔を通過できるかできないかにより分離する従来のフィルタによる方法とは異なり、同じ粒子の大きさによるものであっても、誘電泳動力の相違を利用するものであり、透孔を利用しないので、透孔の目詰まりの発生を防止して、経時的に分離能力が低下する不都合の発生を防止することができる。
【００２４】
さらに、従来のフィルタ方式では、フィルタの透孔を通過できずにフィルタに捕捉された白血球を回収するために、捕捉後にフィルタに通過させる流れを変更する必要があるが、本実施形態に係る移植材の製造方法よれば、電極に保持されずに通過した単核球細胞等をそのまま回収するだけで、赤血球を含まない移植材を得ることができる。すなわち、従来のフィルタによる場合のようなバッチ処理ではなく、細胞懸濁液を一方向に流動させるだけの連続的な処理によって移植材を製造することができるという利点がある。
【００２５】
なお、本実施形態においては赤血球を凝集させる凝集剤として、ヒドロキシエチル澱粉を用いた。ヒドロキシエチル澱粉は生体適合性が高く、移植材の中に混入していても細胞や移植部位に有害とはならないためである。しかしながら、これに限定されるものではなく、他のヒドロキシエチル基を含む凝集剤を使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の一実施形態に係る移植材の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の製造方法に用いられる赤血球の分離方法を示すフローチャートである。
【図３】図２の分離方法において使用される電極例を示す図である。
【図４】図３の電極の周囲に形成される高周波不平等電界を等高線で示す図である。
【図５】図４の高周波不平等電界によって電極近傍に保持される粒子の粒径と電圧と保持質との関係を示すグラフである。
【図６】図２の赤血球の分離方法における凝集ステップにより、赤血球が凝集している様子を示す顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【００２７】
Ｓ１１  添加ステップ
Ｓ１２  流動ステップ
Ｓ１３  誘電泳動発生ステップ
Ｓ２  回収ステップ
１ａ，１ｂ  直棒状電極部（電極）
１Ａ，１Ｂ  櫛歯状電極（電極）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2009195171.tif 000007
【図６】
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