(57)【要約】【課題】  ＮｏｔｃｈリガンドであるＤｅｌｔａ１を活用する技術、例えば、Ｄｅｌｔａ１の抗腫瘍効果を活用する免疫療法、が開発されている。しかし、Ｄｅｌｔａ１を活用する技術を実用化するために、高純度のヒトＤｅｌｔａ１を大量且つ簡便に製造するための方法は存在しなかった。【解決手段】  ヒトＤｅｌｔａ１とヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との融合タンパク質である、配列番号４示したアミノ酸配列からなるタンパク質を産生する細胞である、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４６０の形質転換体、及びこの形質転換体を用いた該融合タンパク質の製造方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＤｅｌｔａ１とヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との融合タンパク質である、配列番号４に示したアミノ酸配列からなるタンパク質を産生する細胞である、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４６０の形質転換体。
【請求項２】
請求項１の形質転換体を用いることを特徴とする、配列番号４に示したアミノ酸配列からなる、ヒトＤｅｌｔａ１とヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との融合タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮｏｔｃｈリガンドであるヒトＤｅｌｔａ１を産生する形質転換体に関する。更に詳細には、ヒトＤｅｌｔａ１とヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との融合タンパク質であって、配列番号４に示したアミノ酸配列からなるものを産生するＣＨＯ細胞である、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４６０の形質転換体、及びそれを用いた融合タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
用語「ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）」は、１９１７年にモルガン（T. H. Morgan）らによる、翅末端にＶ字の切り込み（notch）を有するショウジョウバエの記述において最初に用いられ、その遺伝子ＤＮＡの塩基配列は１９８５年に初めて報告された。ノッチ分子は、そのＮ末端を占めるシクナルペプチド、膜貫通（細胞外）ドメイン、細胞内ドメイン等からなる膜タンパク質ないしは膜貫通レセプターであり、発生や分化を制御するノッチの機能は細胞表面のリガンドにより活性化される。ノッチとそのリガンドは多数の細胞で発現され、哺乳類では４種のノッチ、Ｎｏｔｃｈ１〜Ｎｏｔｃｈ４、及び５種のノッチリガンド、Ｄｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、Ｄｅｌｔａ４、Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２が現在、知られている（非特許文献１）。
【０００３】
かかるノッチとそのリガンドの作用・機能に関しては、例えば、これらのシグナル伝達によるリンパ球分化の制御、即ち、造血幹細胞のＴ細胞やＢ細胞等への分化、ノッチとそのリガンドによるＴ細胞やＢ細胞への機能化の制御等（非特許文献２）、ノッチによる成熟Ｔ細胞への分化とその活性の支配（非特許文献３）、転写後修飾である糖鎖付加（glycosylation）によるノッチのシグナル伝達の制御（非特許文献１）等が、上記の通り、非特許文献１〜３において総説されている。
【０００４】
更に、前述した哺乳類のノッチとそのリガンド並びにこれ等の遺伝子の利用に関しては以下が知られている：全能性幹細胞培養用フィーダー（特許文献１）、幹細胞培養媒体（特許文献２）、骨髄移植や臓器移植等における拒絶反応やアレルギー反応の抑制（特許文献３）、骨粗鬆症や破骨細胞分化等の治療剤（特許文献４）、血管細胞調節剤（特許文献５）、細胞分化の制御（特許文献６）、前立腺細胞の増殖抑制（特許文献７）、細胞分化の抑制による前駆細胞の増幅（特許文献８）、Ｄｅｌｔａ又はＪａｇｇｅｄ遺伝子、及びアレルゲン、ＭＨＣ抗原、癌抗原等の遺伝子を移入した免疫担当細胞を用いるワクチン（特許文献９）、Ｄｅｌｔａを用いる臓器移植での拒絶反応の抑制剤や骨髄移植に伴う疾患の治療剤（特許文献１１）、ノッチリガンドと担体薬物との複合体を用いる癌、アレルギー、感染症等の免疫療法剤（特許文献１２）、サイトカインの発現調節剤（特許文献１３）、Ｄｅｌｔａ１とＪａｇｇｅｄ１による骨髄性白血病細胞株の増殖抑制（非特許文献４）等。
【０００５】
上記に加えて、Ｄｅｌｔａの細胞外ドメインとＩｇＧのＦｃドメインとの融合タンパク質を用いるＩＬ４発現とＴｈ１／Ｔｈ２バランスの調節剤が知られている（特許文献１０）。また、Ｄｅｌｔａ１又はＤｅｌｔａ４とヒトＩｇＧのＦｃ部分との融合タンパク質がＣＤ８陽性Ｔリンパ球のＣＴＬへの分化を促進し、抗腫瘍効果が生じることも知られている（特許文献１４）。特許文献１４にはヒトＤｅｌｔａ１又はマウスＤｅｌｔａ１をヒトＩｇＧのＦｃ部分と融合した融合タンパク質を形質転換体によって産生することについて記載があるものの、実施例で実際に作製しているのはマウスＤｅｌｔａ１を用いた融合タンパク質のみである。この形質転換体は培養しても、１リットルの培養上清当たりわずか数ｍｇの融合タンパク質しか産生しない。
【０００６】
以上に見られる通り、ノッチリガンドであるＤｅｌｔａ１の作用機能の活用技術は既に、多様に開発されている。しかしながら、これらの技術を実用化する、例えば、Ｄｅｌｔａ１による抗腫瘍効果を活用する免疫療法を実施するために、高純度のＤｅｌｔａ１を大量且つ簡便に低コストで製造するための方法は未だ知られていない。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−３４
【特許文献２】ＷＯ０２／０１６５５６
【特許文献３】特開２００３−９３０４８
【特許文献４】特開２００１−１２２７９８
【特許文献５】特開平１０−３１６５８２
【特許文献６】特開２００４−６５２４３
【特許文献７】特表２００４−５２４２６９
【特許文献８】特表２０００−５１１０４３
【特許文献９】ＷＯ０４／０８３３７２
【特許文献１０】ＷＯ０４／０６２６８６
【特許文献１１】ＷＯ０４／０２２７３０
【特許文献１２】ＷＯ０３／０８７１５９
【特許文献１３】ＷＯ０３／０１１３１７
【特許文献１４】特開２００６−２４１０８７
【非特許文献１】Nature Reviews Molecular Cell Biology、 第4巻、 786-797、 October 2003.
【非特許文献２】Nature Immunology、 第5巻(3号)、 247-253、 March 2004.
【非特許文献３】Journal of Immunology、第173巻、7109-7113、 2004.
【非特許文献４】International Journal of Molecular Medicine、 第14巻 (2号)、 223-226、 2004.
【非特許文献５】Gene Therapy、 第7巻、 1063-1066、 2000.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＮｏｔｃｈリガンドであるＤｅｌｔａ１を活用する技術、例えば、Ｄｅｌｔａ１の抗腫瘍効果を活用する免疫療法、が開発されている。しかし、Ｄｅｌｔａ１を活用する技術を実用化するために、高純度のヒトＤｅｌｔａ１を大量且つ簡便に製造するための方法は存在しなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、上記の課題を解決するために、ヒトＤｅｌｔａ１とヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との融合タンパク質である、配列番号４に示したアミノ酸配列からなるタンパク質を産生する細胞である形質転換体を提供し、この形質転換体を用いて、Ｄｅｌｔａ１を融合タンパク質として製造する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の形質転換体は可溶型のＤｅｌｔａ１を大量に培地中に放出するので、その培養上清からＤｅｌｔａ１をＩｇＧのＦｃ部分との融合タンパク質として簡便且つ迅速に単離・精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（配列表の説明）
配列番号１：  ヒトＤｅｌｔａ１完全長遺伝子ＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション：ＮＭ＿００５６１８）がコードする、ヒトＤｅｌｔａ１完全長アミノ酸配列。
配列番号２：  本発明の形質転換体の作製に用いた、ヒトＤｅｌｔａ１の細胞外領域とヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分からなる融合タンパク質をコードする塩基配列。
配列番号３：  配列番号２の塩基配列がコードする融合タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号４：  本発明の形質転換体が産生する、ヒトＤｅｌｔａ１の細胞外領域とヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分からなる、可溶性の融合タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号５：  本発明の形質転換体の作製に用いた、ベクターｐＭＫＩＴｎｅｏの塩基配列。
【００１２】
本発明者らは、上述の課題と実情に鑑み、長年にわたる深い洞察と試行錯誤の結果、配列番号４に示したアミノ酸配列からなる、ヒトＤｅｌｔａ１とヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との融合タンパク質を産生する形質転換体の作製に成功した（以下、本明細書においては、屡々、本発明の形質転換体を「Ｄ１Ｆｃ形質転換体」と称し、該形質転換体の産生する融合タンパク質を「Ｄ１−Ｆｃタンパク質」と称する）。この形質転換体は、２００７年１１月１４日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に寄託した。寄託微生物の受領日は２００７年１１月１６日であり、受領番号はＮＩＴＥ ＡＰ−４６０である（尚、微生物の識別表示は「ＤＩＦ  １４４」であるが、この細胞は本発明の「Ｄ１Ｆｃ形質転換体」と同一である）。本発明のＤ１Ｆｃ形質転換体は培養上清１リットル当たり２００ｍｇ以上の融合タンパクを産生する。従って、本発明の形質転換体を培養し、その培養上清を回収すれば、培養上清から簡便、迅速且つ大量に、高純度のＤｅｌｔａ１タンパク質を単離・精製することができる。
【００１３】
本発明によれば、前述の課題を解決するための手段として、次の（１）と（２）がそれぞれ提供される。
（１）ヒトＤｅｌｔａ１とヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との融合タンパク質である、配列番号４に示したアミノ酸配列からなるタンパク質を産生する細胞である、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４６０の形質転換体。
（２）上記１項の形質転換体を用いることを特徴とする、配列番号４に示したアミノ酸配列からなる、ヒトＤｅｌｔａ１とヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との融合タンパク質の製造方法。
【００１４】
本発明のＤ１Ｆｃ形質転換体は、以下の方法で作製した。
初めに、ヒトＤｅｌｔａ１とヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との融合タンパク質をコードする塩基配列を作製した。作製した塩基配列を配列番号２に示した。この塩基配列は、ヒトＤｅｌｔａ１の細胞外領域に相当するアミノ酸配列のＣ末端から４個のアミノ酸を除いたもの（配列番号１の１番〜５４１番アミノ酸）に、ＩｇＧとの融合のために２個のアミノ酸（AspとPro）を挿入したものをコードする塩基配列と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に相当するゲノムＤＮＡを連結したものである。
【００１５】
次に、融合タンパク質をコードする塩基配列をプラスミドベクターｐＭＫＩＴｎｅｏに挿入連係し、Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質発現ベクターを得た。本発明で使用したプラスミドベクターｐＭＫＩＴｎｅｏは、武部豊博士が開発したSRalphaプロモーターを利用して、丸山和夫博士が作製したベクターである［Takebe et.al. Mol. Cell Biol., 8, 466, 1988 及び Maruyama et al., Transfection of cultured mammalian cells by mammalian expression vectors, Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991) を参照］。ベクターの塩基配列は配列番号５に示した。
【００１６】
このようにして構築した発現ベクターで、米国、Bio-rad社のトランスフェクチンを用いたリポフェクション法により、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を形質転換した。ジェネティシン耐性を指標として形質転換された細胞である親株を選択し、それらを用いて限界希釈法による一次クローニングを実施した。その後、限界希釈法による二次クローニングを更に実施し、融合タンパク質生産性が親株の１．５〜２．５倍に上昇したサブクローンを取得した。
【００１７】
本発明においては、更にこのサブクローンを無血清培地に馴化させて、本発明のＤ１Ｆｃ形質転換体を得た。この形質転換体は２００７年１１月１４日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に寄託した。寄託微生物の受領日は２００７年１１月１６日であり、受領日は２００７年１１月１６日、受領番号はＮＩＴＥ ＡＰ−４６０である（尚、微生物の識別表示は「ＤＩＦ  １４４」であるが、この細胞は本発明の「Ｄ１Ｆｃ形質転換体」と同一である）。
【００１８】
本発明のＤ１Ｆｃ形質転換体は、ヒトＤｅｌｔａ１をヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との融合タンパク質として産生する。全長ヒトＤｅｌｔａ１（配列番号１）は７２３個のアミノ酸からなるタンパク質であるが、本発明の形質転換体が培地中に放出するＤ１−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号４）に含まれるＤｅｌｔａ１は、配列番号１の第２２番〜第５４１番アミノ酸に相当するポリペプチドである。このポリペプチドは、Ｄｅｌｔａ１の細胞外部分（配列番号１の第２２番〜第５４５番）のＣ末端から４個のアミノ酸が欠失したものに相当する。Ｄｅｌｔａ１の細胞外部分だけでもＤｅｌｔａ１の機能を十分に発揮することが明らかになっている。更に、Ｄｅｌｔａ１の細胞外部分からなる配列は可溶性であるため、後述するように、純粋なタンパク質を多量に産生し精製する上で有利である。
【００１９】
尚、発現ベクターに導入した塩基配列には、Ｄｅｌｔａ１のＮ末端側のシグナル配列（配列番号１の第１番〜第２１番アミノ酸）をコードする塩基配列が含まれているが、融合タンパク質が細胞外に放出される際にシグナル配列は切断される。そのため、Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質にはシグナル配列は含まれていない。
【００２０】
ヒトＤｅｌｔａ１と融合させたヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分のアミノ酸配列と塩基配列は公知であり、種々の融合タンパク質の製造に当業界で用いられているものである。ヒトＤｅｌｔａ１やその部分配列を単独で産生するのではなく、ヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との融合タンパク質として産生することには、タンパク質の収量の増加、産生段階におけるタンパク質の安定性の向上、生体内における生物活性の増強、及び生体内での安定性の向上といった利点がある。
【００２１】
従来の方法でヒトＤｅｌｔａ１を得るためには、例えば、ヒト細胞を培養し、培養細胞を融解してＤｅｌｔａ１を単離・精製する。このような方法には、培地中に含まれる種々の成分のみならず、大量の細胞タンパク質からＤｅｌｔａ１を単離しなければならないという問題がある。従って、複数のタンパク質精製工程を経なければ、免疫療法に用いることが可能なほど高純度のＤｅｌｔａ１を得ることはできない。また、得られるＤｅｌｔａ１の量も非常に限られたものである。当然のことながら、Ｄｅｌｔａ１の製造にかかる費用も膨大なものとなるため、Ｄｅｌｔａ１を活用する技術を実用化するためには、高純度のＤｅｌｔａ１を大量且つ簡便に製造する方法が望まれていた。
【００２２】
このような状況下で本発明者らは、ヒトＤｅｌｔａ１を大量に培地中に放出する形質転換体の作製に成功した。本発明のＤ１Ｆｃ形質転換体はＤ１−Ｆｃ融合タンパク質を培地中に放出するので、Ｄ１Ｆｃ形質転換体を培養し、その培養上清からＤｅｌｔａ１を単離・精製することができる。この方法においては、細胞タンパク質の培地への混入は最小限に抑えられるので、簡単な精製工程で高純度のＤｅｌｔａ１を得ることができる。
【００２３】
次に本発明の形質転換体を用いた融合タンパク質の製造方法について説明する。
初めに、Ｄ１Ｆｃ形質転換体を培養し、その培養上清を回収する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞であるＤ１Ｆｃ形質転換体が増殖し、Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質が培地中に放出される限り、使用する培地に特に限定はなく、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養に用いられる市販の培地を使用することができる。本発明のＤ１Ｆｃ形質転換体は無血清培地に馴化されているので、融合タンパク質への血清の混入を防止する上で、無血清培地で培養することが好ましい。培地には、必要に応じて種々のアミノ酸、ビタミン類、イースト抽出液、大豆加水分解物や糖類などを添加してもよい。また、Ｄ１Ｆｃ形質転換体の培養方法にも限定はなく、回分培養、流加培養、連続培養のいずれでもかまわない。培養条件についても、Ｄ１Ｆｃ形質転換体が増殖し、変異などが誘発されない限り特に限定はないが、例えば、空気流通下において、ｐＨが約６．６〜７．８、好ましくは約６．８〜７．５であり、培養温度が約３０〜３８℃、好ましくは３５〜３７℃の条件下で、２日〜２週間、好ましくは３日〜１２日間、撹拌培養することができる。
【００２４】
Ｄ１Ｆｃ形質転換体の１回の培養で培地中に蓄積されるＤ１−Ｆｃ融合タンパク質の量は培地の組成や培養条件などによっても異なるが、通常、２００ｍｇ／リットル（Ｌ）以上である（図２を参照）。Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質の生産を目的にＤ１Ｆｃ形質転換体を培養する場合には、細胞数を指標として培養上清の回収時期を決定することができる。また、培養中に培養上清の一部を採取し、公知の方法、例えばＥＬＩＳＡなどによって融合タンパク質の蓄積量を測定し、充分な量の融合タンパク質が検出された時点で培養上清を回収することもできる。
【００２５】
Ｄ１Ｆｃ形質転換体の培養液から培養上清を回収する方法に特に限定はなく、当業界で細胞を培養液から分離するために用いる方法を実施すればよい。例えば、遠心分離や濾過などによって培養液から細胞を分離して培養上清を回収することができる。
【００２６】
Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質を培養上清から単離・精製する方法に特に限定はなく、公知のタンパク質精製方法を実施すればよい。具体的には、回収した培養上清から、例えば、塩析、有機溶媒による沈殿、市販のゲルや樹脂への吸着脱着を用いるバッチ法やカラム精製等でＤ１−Ｆｃ融合タンパク質を単離すればよい。Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質はヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との融合タンパク質なので、ヒトＩｇＧのＦｃ部分と結合することが知られるプロテインＡやプロテインＧを用いた公知の精製方法、例えば、プロテインＡアフィニティーカラムやプロテインＧアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで容易に高度な精製が可能である。
【００２７】
更に本発明においては、培養上清のみならず、培養した形質転換体を融解し、細胞融解物からＤ１−Ｆｃ融合タンパク質を抽出することもできる。この場合、細胞内から得られるタンパク質はシグナル配列を含む融合タンパク質、即ち、配列番号３のアミノ酸配列からなるものである。
【００２８】
本発明の形質転換体から単離・精製したＤ１−Ｆｃ融合タンパク質は、アンプルやバイアル瓶等に分注し、液体又は乾燥品（凍結乾燥品）の形状で、密封された状態で保存及び提供することができる。
【００２９】
上記のような方法で得たＤ１−Ｆｃ融合タンパク質は様々な技術に活用することができる。例えば、Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質はＣＤ８陽性Ｔリンパ球のＣＴＬへの分化を促進し、抗腫瘍効果を生じる。抗腫瘍効果は、腫瘍細胞を皮下に注入ないしは移植したマウスにＤ１−Ｆｃ融合タンパク質を投与して、腫瘍細胞の増殖により拡大する腫瘍径（円状の腫瘍細胞領域の直径）を計測することで評価することができる。
【００３０】
以下、実施例及び参考例を挙げて、本発明の構成と効果を具体的に説明する。但し、この発明は、これ等の実施例及び参考例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
（１）Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質発現ベクターの構築
ヒトＤｅｌｔａ１とヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との融合タンパク質をコードする塩基配列を作製した。具体的には、ヒトＤｅｌｔａ１の細胞外部分に相当するアミノ酸配列のＣ末端から４個のアミノ酸を除いたもの（即ち、配列番号１の１番〜５４１番アミノ酸）に、ＩｇＧとの融合のために２個のアミノ酸（AspとPro）を挿入したアミノ酸配列をコードする塩基配列と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に相当するゲノムＤＮＡを連結して、融合タンパク質をコードする配列番号２の塩基配列を構築した。
次に、融合タンパク質をコードする塩基配列をプラスミドベクターｐＭＫＩＴｎｅｏ（配列番号５）のEcoRIサイト（gaattc；2,994番塩基〜2,999番塩基）とNotIサイト（gcggccgc；3,387塩基〜3,394番塩基）の間に挿入連係し、Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質発現ベクターを得た。
【００３２】
（２）Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質産生細胞の樹立
上記（１）項で構築した発現ベクターで、米国、Bio-rad社のトランスフェクチンを用いたリポフェクション法により、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を形質転換した。具体的には、６ウェルマルチプレートディッシュにＣＨＯ−Ｋ１細胞を播種し、ＣＯ2インキュベーター（培養温度：３６．５±０．５℃、炭酸ガス濃度：５．０±０．２％）で１日間培養した。培養には、５００ｍｌのＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（米国、Sigma製）に５５．６ｍｌの非動化ウシ胎児血清を加えたものを使用した。７０〜９０％コンフルエントに達した、播種細胞密度が４×１０5細胞／ｍｌのディッシュに４００μｌのトランスフェクチン・プラスミドＤＮＡ複合体を滴下し、２０〜２４時間培養することで、プラスミドＤＮＡを細胞に導入した。
【００３３】
形質転換された細胞は選択マーカーであるジェネティシン耐性を獲得するので、ジェネティシン耐性株をペニシリンカップ法又は９６ウェルマルチプレートディッシュから選択した。選択にはジェネティシン（米国、Sigma製のＧ８１６８）を使用し、その濃度は８００ｍｇ／Ｌとした。その結果、合計３０株のジェネティシン耐性株を分離し、それらの中から、Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質の生産速度及び増殖性の高い１９株を選択した（培地中のＤ１−Ｆｃ融合タンパク質は後述するＥＬＩＳＡ法で定量した）。この１９株を更にフラスコで培養し、培地中のＤ１−Ｆｃ融合タンパク質の蓄積量が高い株を一次クローニング実施株として選択した。
【００３４】
一次クローニングは限界希釈法で実施した。具体的には、１０細胞／ｍｌの細胞浮遊液を調製し、９６ウェルマルチプレートディッシュに０．１ｍｌ／ウェルずつ播種し、６日間培養した。各ウェルに選択培地（５００ｍｌのＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地に５５．６ｍｌの非動化ウシ胎児血清を加え、更にジェネティシン８００ｍｇ／Ｌを添加したもの）を０．１ｍｌ添加して更に８日間培養した。単一コロニーを形成したウェルから培養上清を採取し、Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質蓄積量を測定した。生産量の高い株を選択し、そこから増殖性及びＤ１−Ｆｃ融合タンパク質の生産速度が特に高い株を選択して二次クローニングを行った。二次クローニングは上述と同様の限界希釈法で実施し、Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質の生産性と増殖性が共に高い形質転換体を選択した。
【００３５】
（３）Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質産生細胞の無血清培地への馴化
二次クローニング分離株を以下の条件下で馴化培養に付して、無血清培地で培養可能なＤ１−Ｆｃ融合タンパク質産生細胞を樹立した。
【００３６】
馴化培養には、上述した選択培地と無血清培地であるＥＸ−ＣＥＬＬ ３０２（米国、ＳＡＦＣの１４３２４−１０００Ｍ）を使用し、この２つの培地を以下のように混合して細胞の継代に使用した：選択培地（５０％）＋無血清培地（５０％）で２継代、選択培地（１０％）＋無血清培地（９０％）で３継代、選択培地（５％）＋無血清培地（９５％）で３継代、そして無血清培地で１０継代。
馴化培養の培養容器はＴ−２５フラスコ（3103-025、日本国、ＩＷＡＫＩ製）、培養液量は５ｍｌ、目標播種細胞密度は１〜５×１０5細胞／ｍｌとし、培養温度が３６．５±０．５℃、炭酸ガス濃度が５．０±０．２％の条件下で、１代の培養日数を２〜５日とした。継代は、細胞数のカウントから求めた生存率が９０％以上の時に行い、培養上清は回収して、Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質の蓄積量を後述するＥＬＩＳＡ法で測定した。尚、継代培養中に細胞が浮遊化した場合は、トリプシン処理を行わずに１２５ｍｌ三角フラスコで培養した。付着伸展した細胞と浮遊細胞が混在する場合は、浮遊細胞のみを採取し、生細胞密度を計測して継代した。
【００３７】
こうして得られた形質転換体をＤ１Ｆｃ形質転換体と命名し、平成１９年１１月１４日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に寄託した。寄託微生物の受領日は２００７年１１月１６日であり、受領番号はＮＩＴＥ ＡＰ−４６０である（尚、微生物の識別表示は「ＤＩＦ  １４４」であるが、この細胞は本発明の「Ｄ１Ｆｃ形質転換体」と同一である）。
【００３８】
（４）Ｄ１Ｆｃ形質転換体の培養
上記（３）項で作製したＤ１Ｆｃ形質転換体を５Ｌ培養槽（日本国、（株）バイオットのＢＣＰ−０７）を用いて培養した。培地として無血清培地であるＥＸ−ＣＥＬＬ ３０２（米国、ＳＡＦＣの１４３２４−１０００Ｍ）に最終濃度４ｍＭのＬ−グルタミン−２００ｍＭ溶液（米国、ＳＡＦＣの５９２０２−１００Ｍ）、１００×ＨＴ溶液を１／１００量、及び最終濃度８００ｍｇ／Ｌのジェネティシンを加えたものを使用し、フェドバッチ培養で実施した。培養容量は培養開始時４Ｌ、培養温度は３６．７±０．１℃、攪拌数４９ｒｐｍ、ｐＨ目標値７．３±０．１とし、溶存酸素濃度目標値を２０％±１０％、播種細胞密度は２×１０5細胞／ｍｌで１２日間培養し、培養３、５、７、９及び１１日目に次の流加培地を添加した。
培養３、５と７日目に添加した流加培地：０．５ｍｌのアミノ酸濃縮物（米国、ＳＡＦＣの６０９９０−１０００Ｍ）、０．５ｍｌのビタミン類（米国、ＳＡＦＣの６０９８９−１０００Ｍ）、０．２ｍｌの大豆加水分解物（米国、ＳＡＦＣの５８９０３−１００Ｍ）、１ｍｌの２００ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液と１ｍｌの２００ｇ／Ｌ グルコース溶液；及び
培養９と１１日目に添加した流加培地：０．５ｍｌのアミノ酸濃縮物、０．５ｍｌのビタミン類、０．２ｍｌの大豆加水分解物、１ｍｌの２００ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液と０．５ｍｌの２００ｇ／Ｌ グルコース溶液。
【００３９】
溶存酸素濃度は上面あるいは培養液内に酸素を供給することで制御した。ｐＨについては、上昇した場合は上面へ炭酸ガスを供給し、下降した場合は１．５ｍｏｌ／Ｌの炭酸ナトリウムを添加することで制御した。細胞密度及び生存率は、培養槽内から採取した細胞浮遊液を細胞オートアナライザーで分析することにより測定した。また培養３日目以降、上清中のＤ１−Ｆｃ融合タンパク質の蓄積量を、以下に詳述するＥＬＩＳＡによって測定した。
【００４０】
（５）ＥＬＩＳＡ法によるＤ１−Ｆｃ融合タンパク質の定量
一次抗体溶液として、ウサギ抗ヒトＩｇＧ（デンマーク国、Dako Cytomation製、Polyclonal Rabbit Anti-human IgG, Code No. A0423）をＰＢＳ（−）により２４００倍に希釈したものを使用した。一次抗体溶液１００μｌを９６穴マイクロタイタープレート（日本国、ナルジェ  ヌンク  インターナショナル株式会社製、NUNC-Immunoplate F96 CERT. MAXISORP、製品番号４３９４５４）の各ウェルに添加し、２〜８℃で一晩静置することで一次抗体をウェルに被覆した。ウェル内の液を除去した後、プレートを清浄紙にたたいて液をきった。ウェルを洗浄するために、３００μｌの洗浄液［０．５ｇのＴｗｅｅｎ２０に１０００ｍｌのＰＢＳ（−）を加えたもの］をプレートの全ウェルに加え、ウェル内の液を除去した後に、プレートを清浄紙にたたいて液をきるという洗浄操作を合計３回繰り返した。次に、プレートの各ウェルに２００μｌのブロッキング液［１．０ｇのウシ血清アルブミンに１００ｍｌのＰＢＳ（−）を加え溶解したもの］を添加し、室温で６０分間静置した。上述と同様の洗浄操作を合計３回繰り返して余分なブロッキング液を除去した。
【００４１】
単離精製されたヒトＤｅｌｔａ１とＩｇＧの融合タンパク質であるヒトＤｅｌｔａ１−Ｉｇ標準原液（ロット番号０５０１２１、濃度１．０８ｍｇ／ｍｌ、東大病院より入荷）を標準物質として使用し、それを検体希釈液［０．２ｇのＢＳＡ（フラクションＶ）及び０．１ｇのＴｗｅｅｎ２０に２００ｍｌのＰＢＳ（−）を加えたもの］で希釈して、検量線作成のための標準溶液を作製した。標準溶液のＤｅｌｔａ１−Ｉｇ濃度は、４００、２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５及び０ｎｇ／ｍｌとした。試料溶液（形質転換体の培養上清を検体希釈液で希釈したもの）と標準溶液をそれぞれ２つのウェルに添加し、プレートを室温で６０分間静置した後、上述と同様の洗浄操作を合計３回繰り返した。
【００４２】
二次抗体としてパーオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ（γ鎖）・ウサギポリクローナル抗体（デンマーク国、Dako Cytomation製、Code No. A0406，１．１ｍｇ／ｍｌ）を用い、それを上述した検体希釈液で４０００倍に希釈したものを二次抗体溶液とした。各ウェルに１００μｌの二次抗体溶液を添加して室温で６０分間静置した後、上述と同様の洗浄操作を合計３回繰り返した。次に、基質溶液１００μｌをプレートの各ウェルに添加した。基質溶液は、１錠のＯＰＤ錠（１０ｍｇのｏ-フェニレンジアミン二塩酸塩／錠、日本国、和光純薬工業製）に２５ｍｌのＯＰＤ溶解液（クエン酸一水和物 １０．５ｇとリン酸水素二ナトリウム十二水和物 ３５．８ｇを水に溶かし、５００ｍｌとしたもの）を加えて溶かし、使用直前に５μｌの過酸化水素水（３０％）を加えて混合したものである。プレートをプレートシールで覆い、更にアルミホイルで遮光し、室温で２０分間静置して酵素反応を実施した。プレートの各ウェルに２ｍｏｌ／Ｌの硫酸溶液１００μｌを添加し、マイクロプレートミキサー（日本国、ＩＷＡＫＩ製のＭＰＸ９６）で攪拌することで、酵素反応を停止した。
【００４３】
次に、マイクロプレートリーダー（米国、モレキュラーデバイス製のＥｍａｘ）を用いて波長４９０ｎｍ（Ａ1）及び６５０ｎｍ（Ａ2）における吸光度を測定した。横軸にＤｅｌｔａ１−Ｉｇの濃度をとり、縦軸に吸光度（Ａ1−Ａ2）をとって、標準溶液の濃度と吸光度をグラフ上にプロットすることで、４−パラメーター法による検量線を作成した。この検量線を用いて各試料溶液の吸光度から、Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質の濃度を求めた。
【００４４】
本発明のＤ１Ｆｃ形質転換体の培養結果を図１と２に示した。図１には細胞増殖と生存率の経時変化を示し、図２には培養上清中のＤ１−Ｆｃ融合タンパク質の蓄積量の経時変化を示した。培養７日目の到達細胞密度は、３７×１０5細胞／ｍｌであり、培養１２日目のＤ１−Ｆｃ融合タンパク質の蓄積量は２１４ｍｇ／Ｌと非常に高かった。
【参考例１】
【００４５】
Ｄｅｌｔａ１−Ｆｃ融合タンパク質による抗腫瘍作用
３，０００ｒａｄの放射線照射した腎癌細胞３Ｔ１を１×１０7細胞／ドーズ、腹腔内接種することにより８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。免疫１０日後に、各マウスの背中の皮下に３Ｔ１を移植した。次いで、最初の免疫の日から３日の間隔で５０μｇ／ドーズのＤ１−Ｆｃ融合タンパク質を各マウスの腹腔内に投与した。その後、マウスの腫瘍径を経時的に測定した。この結果、融合タンパク質を投与していない比較対照群に比べ、Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質の投与群では明らかに腫瘍径が小さかった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の形質転換体を用いることによって、高純度のヒトＤｅｌｔａ１を大量且つ簡便に製造することができる。高純度のヒトＤｅｌｔａ１を低コストで提供することによって、Ｄｅｌｔａ１を活用する様々な技術（例えば、Ｄｅｌｔａ１の抗腫瘍効果を活用する免疫療法）の実用化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Ｄ１Ｆｃ形質転換体の細胞増殖と生存率の経時変化を示す。
【図２】Ｄ１Ｆｃ形質転換体の培養上清における、Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質の蓄積量の経時変化を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
配列番号２：  Ｄ１−Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ
配列番号３：  合成構築物
配列番号４：  可溶性のＤ１−Ｆｃ融合タンパク質
配列番号５：  プラスミドベクターｐＭＫＩＴＮｅｏ
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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