(57)【要約】【課題】マイクロ流路チップの流路内泡を消去できるマイクロ流路内泡除去方法と、その泡除去方法を使用し、凍結乾燥された試薬を被検査液体等に溶解混合した場合でも泡を消失することのできるマイクロ流路内溶解分散方法を提供することである。【解決手段】マイクロ流路内で発生する泡Ｘを除去するマイクロ流路内泡除去方法及びマイクロ流路内溶解分散方法であって、マイクロ流路に導入された液体Ｌ内の泡Ｘが浮上して流路内壁に付着維持できる程度以下の液体流速とし、泡が内包された液体の気液界面Ｌｖを、泡が流路内壁面の付着位置を維持できる流速で移動させて、液体進行方向後端の気液界面に泡を集める。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流路内で発生する泡を除去するマイクロ流路内泡除去方法であって、
マイクロ流路に導入された液体内の泡が浮上して前記流路内壁に付着維持できる程度以下の液体流速とし、
前記泡が内包された液体の気液界面を、泡が流路内壁面の付着位置を維持できる流速で移動させて、液体進行方向後端の気液界面に泡を集めるマイクロ流路内泡除去方法。
【請求項２】
前記マイクロ流路に導入された液体が２面の気液界面を有し、この気液界面の移動範囲が少なくとも前記泡の発生範囲よりも大きく移動する請求項１記載のマイクロ流路内泡除去方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載のマイクロ流路内泡除去方法を多孔質物質の溶解に使用するマイクロ流路内溶解分散方法であって、
前記多孔質物質が内部に担持された前記マイクロ流路内に溶液を前記多孔質物質の毛細管効果で浸透する速度よりも早い流速で導入して多孔質物質を溶解し、
前記溶液内の泡が浮上して前記流路内壁に付着維持できる程度以下の液体流速とし、
前記溶液のマイクロ流路内気液界面を、流路内壁面に付着した泡がその位置を維持できる流速で移動させて、液体後端の気液界面に泡を集めて消失させるマイクロ流路内溶解分散方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流路内で発生している泡を除去するマイクロ流路内泡除去方法と、その泡除去方法を多孔質物質の溶解に使用するマイクロ流路内溶解分散方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、微量の検体の分析や化学反応処理を安価に、且つ迅速に実現するシステムとして、マイクロ流路チップを使用する方法が提案されている。
【０００３】
前記マイクロ流路チップはこのチップへ液体を供給して検査を実行する検査装置に適用される物である。この検査装置として例えば特許文献１に開示される生化学処理装置等があり、チャンバとチャンバ間を連通する流路とを有する生化学反応カートリッジ（マイクロ流路チップ）を載置するステージと、流路を介して液体を移動させるための移動手段と、チャンバ内の液体の有無或いは液量を検出する検出手段と、検出手段により検出されたチャンバ内の液体の情報により液体の移動の結果を判定する判定手段とを設けることにより、前記マイクロ流路内で予備処理した検体を前記チャンバ内に誘導して、チャンバ内の検査試薬と検体との化学反応又は生化学反応から、検体の分析を行う。
【０００４】
前記マイクロ流路内ではチャンバ内に検査試薬を担持し、検体を含む溶液を導入するのであるが、この際、検査試薬と検体とが効率良く反応するように、検体に反応促進物質（試薬）を混合したり、あるいは検体中の特定成分を単離させたり溶解・増幅させるために検体に所定の反応物質を混合する予備処理などもある。
【０００５】
このような予備処理や分析用の反応処理に使う物質と検体とを混合させるマイクロ流路内混合方法として、予め、マイクロ流路の内壁面の一部に予備処理や分析用の反応処理に使う物質を乾燥状態で担架させておき、マイクロ流路に検体を流して、マイクロ流路内に担架された物質と検体との接触により、予備処理や分析用の反応処理用の物質を検体中に溶解させて混合させる方法が提案されている（例えば、特許文献２，３参照）。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１７０６５４号公報
【特許文献２】特開２００４−１９４６５２号公報
【特許文献３】特開２００６−１３３００３号公報
【特許文献４】特開平６−５４８９７号公報
【特許文献５】ＷＯ２００３／０６１６８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
マイクロ流路チップの流路内に予め乾燥状態の試薬を担架させておくための乾燥方法として、特に酵素等の変質・失活しやすいものを乾燥後長期間保存可能にするためには、凍結乾燥が有効である。しかし、流路内に凍結乾燥された試薬は多孔質構造であるため、被検査液体等を導入し、これを溶解すると多数の微小な気泡が発生し、例えば最終工程で試薬を光学的に検査する場合、気泡の存在が大きな障害となり、正確な検査ができない問題が生じる。
そこで、凍結乾燥物質を溶解する際に発泡を抑制する方法として引用文献４、５では減圧状態で溶解する方法が開示されている。しかし、この方法をマイクロ流路チップの流路内に担架された凍結乾燥物質に適用すると装置が複雑になってしまう問題がある。
また、マイクロ流路チップの流路内では各所で混合などの過程で予想外の気泡が発生する場合もあり、この流路内の泡を消去することが求められている。
【０００８】
そこで、本発明の目的は上記課題を解消することに係り、マイクロ流路チップの流路内泡を消去できるマイクロ流路内泡除去方法と、その泡除去方法を使用し、凍結乾燥された試薬を被検査液体等に溶解混合した場合でも泡を消失することのできるマイクロ流路内溶解分散方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（１）本発明の上記課題の解決は、マイクロ流路内で発生する泡を除去するマイクロ流路内泡除去方法であって、
マイクロ流路に導入された液体内の泡が浮上して前記流路内壁に付着維持できる程度以下の液体流速とし、
前記泡が内包された液体の気液界面を、泡が流路内壁面の付着位置を維持できる流速で移動させて、液体進行方向後端の気液界面に泡を集めるマイクロ流路内泡除去方法により達成される。
【００１０】
上記構成によれば、マイクロ流路に導入された液体内の泡浮上させて前記流路内壁に付着させ、泡が内包された液体の気液界面を、泡が流路内壁面の付着位置を維持できる流速で移動させることで、移動する液体進行方向後端の気液界面に泡が引きずられ、集積される。このように集積した泡は、気液界面で気体側に曝されることとなり、次第に消滅する。従って、マイクロ流路内に気泡のない良好な液体を流すことができる。
【００１１】
（２）なお、好ましくは、上記（１）に記載のマイクロ流路内泡除去方法において、前記マイクロ流路に導入された液体が２面の気液界面を有し、この気液界面の移動範囲が少なくとも前記泡の発生範囲よりも大きく移動する構成とすると良い。
このような構成にすると、２つの気液界面の液体進行方向後端の移動によって、気液界面に泡が引きずられ、集積されつつ消滅していく。そして、この気液界面の移動範囲が少なくとも泡の発生範囲よりも大きくすることで、液体内の泡をすべて集積、消滅させることができ、マイクロ流路内に気泡のない良好な液体を得ることができる。
【００１２】
（３）また、好ましくは、上記（１）又は（２）に記載のマイクロ流路内泡除去方法を多孔質物質の溶解に使用するマイクロ流路内溶解分散方法であって、
前記多孔質物質が内部に担持された前記マイクロ流路内に溶液を前記多孔質物質の毛細管効果で浸透する速度よりも早い流速で導入して多孔質物質を溶解し、
前記溶液内の泡が浮上して前記流路内壁に付着維持できる程度以下の液体流速とし、
前記溶液のマイクロ流路内気液界面を、流路内壁面に付着した泡がその位置を維持できる流速で移動させて、液体進行方向後端の気液界面に泡を集めて消失させる構成とすると良い。
【００１３】
このような構成にすると、多孔質物質の毛細管効果で浸透する速度よりも早い流速でマイクロ流路内に溶液を導入して多孔質物質を溶解することで、発生する気泡を小型に抑える。そして、溶液の流速を抑えて溶液内の泡を浮上させて流路内壁に付着させる。次に、溶液のマイクロ流路内気液界面を、流路内壁面に付着した泡がその位置を維持できる流速で移動させて、液体進行方向後端の気液界面に泡を集めて消失させる。
従って、多孔質物質を溶解する際に発生する泡を、特別な装置を用意しなくとも抑制することができる。また、マイクロ流路チップの流路内での予想外の気泡の発生にも対応することが可能となる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るマイクロ流路内泡除去方法と、マイクロ流路内溶解分散方法によれば、マイクロ流路に導入された液体内の泡（特に、凍結乾燥物質などの多孔質物質を被検査液体等の溶液に溶解する際に発生する泡）を特別な装置を用意しなくとも消去・抑制することができる。また、マイクロ流路チップの流路内での予想外の気泡の発生にも対応することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明に係るマイクロ流路内泡除去方法を好適な実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
図１は本発明に係るマイクロ流路チップの流路の一部を示す平面図である。
混合部Ｅ０はマイクロ流路の一部であり、図１では左から導入された液体Ｌには多数の微少気泡が含まれた状態である。この、混合部Ｅ０へ液体Ｌ導入時に気泡が確認されると、混合部Ｅ０内の液体Ｌの流速を、少なくとも液体内の泡が浮上して混合部Ｅ０内壁に付着する速度以下とする。このような泡が浮上する状態としては、内部での渦流も発生していない状態が必要であり、そのような状態となると、液体Ｌに内包されている泡は停滞無く重力方向へ浮上し、混合部Ｅ０内壁に付着する。
【００１６】
図２（ａ）は図１の流路の気液界面部分を重力方向上方から見た部分拡大図、図２（ｂ）は図２（ａ）の中心線Ｍの断面図である。
図２（ｂ）のように、混合部Ｅ０内で液体Ｌに内包されて重力方向上方へ浮上した多数の泡Ｘは、図２（ａ）のように、気液界面Ｌｖを境にして液体Ｌ側の内壁に付着する。
このように、泡Ｘがある程度混合部Ｅ０内壁に付着した状態となった時点で、気液界面Ｌｖを液面後退方向へ移動させて液体進行方向後端側とする。この時、泡Ｘが混合部Ｅ０ｋ内壁面の付着位置を維持できる程度以下の液体流速とする。すると、移動する気液界面Ｌｖの液体Ｌ側には泡Ｘが引きずられ集積される。このように集積した泡は、気液界面Ｌｖで気体側に曝されることとなり、次第に消滅する。従って、泡Ｘの付着していない位置まで気液界面Ｌｖを移動することで、マイクロ流路内の液体を気泡のない良好なものとすることができる。なお、混合部Ｅ０ｋ内の液体Ｌが２つの気液界面Ｌｖに挟まれている場合、泡Ｘの付着している範囲以上に移動させることも可能である。
【００１７】
次に、試薬担架流路に試薬が固化・担架された状態の実際のマイクロ流路チップでのマイクロ流路内溶解分散方法について実施形態を示す図を用いて説明する。
図３は本発明に係るマイクロ流体チップの分解斜視図、図４はマイクロ流路チップの上面視を（ａ）、下面視を（ｂ）に表した平面図である。
マイクロ流体チップ１００は、図３に示すように、流路基板２１と、この流路基板２１の一方の面（下面）２２に貼着される蓋材２３とにより構成されている。流路基板２１は、熱可塑性の高分子ポリマーの射出成形により製作される。使用する高分子ポリマーは、特に限定されないが、光学的に透明であり、耐熱性が高く、化学的に安定であり、射出成形が容易なものが望ましく、ＣＯＰ、ＣＯＣ、ＰＭＭＡ等が好適である。光学的に透明とは、検出に用いる励起光や蛍光の波長において透過性が高く、散乱が小さく、自家蛍光が少ないことである。チップ１００は、蛍光を検出可能とする透光性を有していることで、検出試薬に例えばサイバーグリーンが用いられ、反応によって増幅された２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることで発する蛍光が測定可能となる。これにより、ターゲットとする遺伝子配列の存在の有無が検出可能となる。
【００１８】
このマイクロ流路チップ１００は、検査装置（図示せず）にセットされて使用され、一回の使用後に廃棄される。本実施の形態は、検体である血液（全血）がマイクロ流体チップ１００に注入される。マイクロ流体チップ１００は、検査装置にセットされることで、チップ外部からの物理的作用力によって検体液がハンドリングされ、例えば一塩基多型の複数ターゲット遺伝子が検査されるものであり、特開２００５−１６０３８７に示されているような、ターゲット配列の核酸を等温で特異的に増幅するための反応とその検出をチップ１上で実現可能とするものである。これにより、例えば、標的核酸を増幅してこれを検出することで、感染症の原因となる病原体に特異的な標的核酸の増幅及び検出が可能となり、検体中の該病原体の存否等が判定可能となる。
【００１９】
本実施の形態において、物理的作用力は、液流路の始点と終点に設けたポート部ＰＴからエア供給又はエア吸引することにより発生する空気圧作用力（空圧駆動力）である。したがって、液流路内に供給された液体が、液流路の始点と終点とに作用されるエア供給又はエア吸引により、液流路内の所望位置へ移動制御可能となる。この際、液体は、始点と先端部、後端部と終点との間に介在する気体に挟持された状態で保持され、引っ張り力の作用により途中で分断されることがない。
【００２０】
流路基板２１の他方の面（上面）２８には掘り込み２９，３１が形成され、掘り込み２９，３１は被加熱部Ｂ、反応部Ｆに対応して位置している。また、流路基板２１の下面２２には図２に示すように、上記の第１ポートＰＴ−Ａ、第２ポートＰＴ−Ｄ、第３ポートＰＴ−Ｂ、第４ポートＰＴ−Ｃに連通する開口３３，３５，３７，３９が設けられている。流路基板２１は、外形が例えば縦横Ｗ２，Ｗ１が５５×９１ｍｍであり、厚みｔが２ｍｍ程度で形成される。
【００２１】
蓋材２３は、流路基板２１の流路面（下面２２）に形成されたポート、セル、流路（溝）に蓋をするための部材であり、蓋材２３と流路基板２１は接着剤や粘着剤により接合される。蓋材２３としては、流路基板同様、光学的に透明であり、耐熱性が高く、化学的に安定であるシート状の高分子ポリマーを用いる。本実施の形態では、プラスチックフィルムにシリコン系粘着剤を塗布したものを使用した。更に、流路の幅としては、１ｍｍであり、混合部など一部でそれよりも太くする部分もある。
【００２２】
流路基板２１には、液体に必要な操作をするためのポート、セル、流路等が構成されている。すなわち、流路基板２１は、生体細胞を含む検体液と前処理試薬（第１液）とを投入する第１ポートＰＴ−Ａと、反応増幅試薬（第２液）を投入する第２ポートＰＴ−Ｄと、流路内に空気圧を供給する第３ポートＰＴ−Ｂと、減圧される流路終端の第４ポートＰＴ−Ｃと、第１ポートＰＴ−Ａから投入された検体液と前処理試薬とを混合して第１混合液を生成する第１の流路（検体混合部）Ａと、第１混合液を加熱して生体細胞よりＤＮＡを抽出し１本鎖に分解する第２の流路（被加熱部）Ｂと、被加熱部Ｂで処理された第１混合液に反応増幅試薬を合流させる第３の流路（試薬合流部）Ｃと、試薬合流部Ｃで合流された第２混合液が通過することにより溶解が進む酵素（第１固体）を固化実装した第４の流路（酵素保持部）Ｄと、酵素保持部Ｄで処理される第２混合液への酵素の混合を助長する第５の流路（酵素混合部）Ｅと、酵素混合部Ｅに接続され、流路内に固化実装されたプライマー（第２固体）の溶解、加熱によるＤＮＡ増幅、ＤＮＡ増幅の検出を同一位置で行う複数の第６の流路（反応部）Ｆと、反応部Ｆの流路に接続され酵素混合部Ｅで処理された第２混合液を反応部Ｆの複数の反応検出セル２７それぞれに定量分注するための第７の流路（定量分注流路）Ｇとを備える。
【００２３】
図５は、第１混合部と第２混合部の拡大図である。
混合部Ｅは、図４及び５に示すように、第２ポートＤから順に第１混合部Ｅ１と第２混合部Ｅ２とが配置されてなる。
第１混合部Ｅ１は、液体が流動する方向の垂直断面積が他の流路における垂直断面積に比して大きい第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂと、第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂより垂直断面積が小さい第２流路部１１３，１１５とが交互に形成されている。すなわち、上流側から前段の第１流路部１１１Ａ、前段の第２流路部１１３、後段の第１流路部１１１Ｂ、後段の第２流路部１１５の順で配設されている。
【００２４】
また、第２混合部Ｅ２は、液体が流動する方向の垂直断面積が他の流路における垂直断面積に比して大きい第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄと、第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄより垂直断面積が小さい第２流路部１１７，１１９とが交互に形成されている。すなわち、上流側から前段の第１流路部１１１Ｃ、前段の第２流路部１１７、後段の第１流路部１１１Ｄ、後段の第２流路部１１９の順で配設されている。
【００２５】
第１混合部Ｅ１における第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの垂直断面積は、第２混合部Ｅ２における第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄの垂直断面積より小さく形成されている。本実施の形態では、各混合部内の深さ（図４の紙面垂直方向深さ）を同一とし、図５に示すように、第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの幅Ｗａを、第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄの幅Ｗｂより小さく（Ｗａ＜Ｗｂ）形成している。また、第１混合部Ｅ１における第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの流路方向長さＬａは、第２混合部Ｅ２における第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄの流路方向長さＬｂより長く（Ｌａ＞Ｌｂ）形成している。本実施の形態では、第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂ，１１１Ｃ，１１１Ｄが互いに平行に形成され、第２流路部１１３，１１５，１１７，１１９が上記第１流路部を連結するように形成されているが、これに限らず、任意の配置であって構わない。
【００２６】
第１流路部１１１Ａと１１１Ｂとの間の第２流路部１１３には、酵素保持部Ｄが配置される。酵素保持部Ｄは、混合部Ａと同様に、液体が流動する方向に沿って広幅流路部１１５Ａと狭幅流路部１１５Ｂとが交互に形成された流路で構成される。広幅流路部１１５Ａの一部は試薬保持用のセルとなり、ポリミラーゼとデキストリンの水溶解液を点着後、凍結乾燥により乾燥、固化した試薬５７と、MutSとデキストリンの水溶液を点着後、凍結乾燥により乾燥、固化させた試薬５９がそれぞれ保持される。
酵素混合部Ｅでは、血液、前処理試薬、反応増幅試薬の合流液を第１混合部Ｅ１の第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの間を往復させることにより、第１の酵素である試薬５７、第２の酵素である試薬５９を溶解し、前記合流液を混合する。
【００２７】
酵素保持部Ｄの試薬５７，５９が保持された広幅流路部１１５Ａの上流と下流の流路は、その保持部より細くなっており、乾燥固化した試薬５７，５９の流路への密着力が無い場合でも、チップ１００の保存、運搬等の振動により固化試薬５７，５９が剥がれ落ちて前後の流路へ流出してしまうことを防いでいる。
【００２８】
次に、以上のような、マイクロ流路チップにおける本発明のマイクロ流路内溶解分散方法を説明する。
第１混合部Ｅ１における第１流路部１１１Ａを通った液体は、酵素保持部Ｄ位置の多孔質物質の試薬５７，５９を溶解することとなる。この時の流速としては、通常３０００μｌ／ｍｉｎ（流速３０００ｍｍ／ｓ）程度により、多孔質物質の毛細管効果で浸透する速度よりも早い流速でマイクロ流路内に溶液を導入して多孔質物質を溶解することで、発生する気泡を小型に抑える。
次いで、試薬５７，５９を溶解した液体全てを第１流路部１１１Ｂまで導入する。このとき、液体内には図１及び２で示したような泡が発生している可能性が高い。そこで、流速を減速し又は流れを停止させ、液体内の泡を浮上させ第１流路部１１１Ｂ内壁に付着させる。次に、流速を５０〜２００μｌ／ｍｉｎ（流速５０〜２００ｍｍ／ｓ）程度まで下げた状態で気液界面Ｌｖを液面後退方向へ移動させる。この流速で後退させることにより、第１流路部１１１Ｂ内壁面に付着した泡がその位置を維持することが可能となる。
【００２９】
すると、移動する気液界面Ｌｖの液体Ｌ側には泡が引きずられ集積される。このように集積した泡は、気液界面Ｌｖで気体側に曝されることとなり、次第に消滅する。この気液界面Ｌｖをすくなくとも第１流路部１１１Ｂから第１流路部１１１Ａまで移動させることで、完全に泡を消滅させることができる。
実際には、この後、更に反転して、第２混合部Ｅ２まで液体を移動させるが、その前に、泡の消滅を完全とするために第１流路部１１１Ａと第１流路部１１１Ｂとの間を往復させる処理を実行することもできる。
このように、前段の第１流路部１１１Ａおよび後段の第１流路部１１１Ｂの各容積は、第２ポートＰＴ−Ｄから送液される１回分の液体全体を収容可能な容積とすることが好ましく、送液される液体全体の容積の８０％以上であることが好ましい。また、液体の粘性は高すぎると泡の消去や試薬の溶解にも支障をきたすので、１ｍＰａ・ｓ程度が必要である。
【００３０】
従って、凍結乾燥物質を溶解する際に発生する泡を、特別な装置を用意しなくとも抑制することができる。また、マイクロ流路チップの流路内での予想外の気泡の発生にも対応することが可能となる。
なお、図示例では各混合部Ｅ１，Ｅ２で第１流路部がそれぞれ２つずつ設けてあるが、これに限らず、さらに複数の第１流路部が第２流路部と交互に形成されていてもよい。
【００３１】
なお、本発明に係るマイクロ流路内混合方法の適用は、上記実施の形態に示したマイクロ流路チップ１の反応検出セル３７における被混合物質相互の混合に限らない。毛細管状の所謂マイクロ流路内で２種又はそれ以上の複数種の被混合物質相互を混合する状況であれば、同様に適用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明に係るマイクロ流路チップの流路の一部を示す平面図である。
【図２】（ａ）は図１の流路の気液界面部分を重力方向上方から見た部分拡大図、（ｂ）は図２（ａ）の中心線Ｍの断面図である。
【図３】本発明に係るマイクロ流体チップの分解斜視図である。
【図４】マイクロ流路チップの上面視を（ａ）、下面視を（ｂ）に表した平面図である。
【図５】第１混合部と第２混合部の拡大図である。
【符号の説明】
【００３３】
２１  流路基板
２２  上面
２３  蓋材
２８  下面
２９，３１  掘り込み
５７，５９  試薬
１００  マイクロ流体チップ
１１１Ａ、１１１Ｂ，１１１Ｃ，１１１Ｄ  第１流路部
１１３，１１５，１１７，１１９  第２流路部
Ａ  検体混合部（第１の流路）
Ｂ  被加熱部（第２の流路）
Ｃ  試薬合流部（第３の流路）
Ｄ  酵素保持部（第４の流路）
Ｅ  酵素混合部（第５の流路）
Ｅ０  混合部
Ｅ１  第１混合部
Ｅ２  第２混合部
Ｆ  反応部（第６の流路）
Ｇ  定量分注流路（第７の流路）
Ｌｖ  気液界面
Ｒａ，Ｒｂ，Ｒｃ，Ｒｄ  ラベル（閉塞部材）
ＰＴ−Ａ  第１ポート
ＰＴ−Ｂ  第３ポート
ＰＴ−Ｃ  第４ポート
ＰＴ−Ｄ  第２ポート
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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