(57)【要約】【課題】難治固形がんの増殖抑制効果を有し、その治療に有用な免疫・遺伝子複合治療方法及び当該治療方法に使用するための治療剤の提供。【解決手段】リンパ球減少を伴う処置及び／又は自家造血幹細胞移植を実施した後に、腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対してインターフェロン遺伝子治療を行うことを特徴とする固形がんの治療方法及びその治療方法に使用する治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者にリンパ球減少を伴う処置を実施する工程、及び患者の腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対してインターフェロン遺伝子投与を行う工程を包含することを特徴とするがんの治療方法。
【請求項２】
患者にリンパ球減少を伴う処置を実施する工程、患者に自家造血幹細胞移植を行う工程及び患者の腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対してインターフェロン遺伝子投与を行う工程を包含することを特徴とするがんの治療方法。
【請求項３】
リンパ球数減少を伴う処置が抗がん剤投与、免疫抑制剤投与及び／又は放射線照射である請求項１又は２記載の治療方法。
【請求項４】
インターフェロン遺伝子含有ベクターを用いてインターフェロン遺伝子投与が実施される請求項１〜３いずれか１項に記載のがんの治療方法。
【請求項５】
インターフェロンがインターフェロン−α及び／又はインターフェロンβである請求項１〜４にいずれか１項に記載のがんの治療方法。
【請求項６】
ベクターがアデノウイルスベクター及び／又はプラスミドベクターである請求項４記載のがんの治療方法。
【請求項７】
がんが固形がんである請求項１〜６いずれか１項に記載のがんの治療方法。
【請求項８】
リンパ球減少を伴う処置を実施された患者の腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対してインターフェロン遺伝子投与を行うための治療剤であって、インターフェロン遺伝子含有ベクターを含有することを特徴とするがん治療剤。
【請求項９】
リンパ球減少を伴う処置に続いて自家造血幹細胞移植を実施された患者の腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対してインターフェロン遺伝子投与を行うための治療剤であって、インターフェロン遺伝子含有ベクターを含有することを特徴とするがん治療剤。
【請求項１０】
インターフェロンがインターフェロン−α及び／又はインターフェロンβである請求項８又は９に記載のがんの治療剤。
【請求項１１】
ベクターがアデノウイルスベクター及び／又はプラスミドベクターである請求項８〜１０いずれか１項に記載のがんの治療剤。
【請求項１２】
リンパ球減少を伴う処置を実施された患者の腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対して投与されるがんの治療剤の製造における、インターフェロン遺伝子の使用。
【請求項１３】
リンパ球減少を伴う処置に続いて自家造血幹細胞移植を実施された患者の腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対して投与されるがんの治療剤の製造における、インターフェロン遺伝子の使用。
【請求項１４】
インターフェロン遺伝子がインターフェロン遺伝子含有ベクターとして用いられる請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項１５】
インターフェロンがインターフェロン−α及び／又はインターフェロンβである請求項１２〜１４いずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
ベクターがアデノウイルスベクター及び／又はプラスミドベクターである請求項１４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難治固形がんの増殖抑制効果を有し、その治療に有用な免疫・遺伝子複合治療方法及び当該治療方法に使用するための治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの治療には、外科治療、放射線治療、化学療法、免疫療法などが行われている。その中で、進行がんに対しては、抗がん剤を用いた化学療法が一般的である。抗がん剤の多くは、増殖の旺盛な細胞を傷害し、がん細胞だけでなく、正常な細胞も傷害することから、副作用が多い。例えば、抗がん剤に起因する骨髄抑制により血液毒性と呼ばれる副作用が生じることがあり、これにより末梢血中の好中球、血小板、リンパ球などが正常値以下に減少する。このような場合、一定の回復期間をおいて副作用の蓄積を最小限に抑えながら、投与を繰り返してなるべく大量の抗がん剤を投与することが有効であり、しばしば実施されている。通常、このような治療では複数の抗がん剤が併用される。
【０００３】
がんの中でも造血器悪性腫瘍に対する治療法として、上記の化学療法や放射線療法と組み合わせて造血幹細胞移植がよく行われる。この際、患者はリンパ球減少状態に陥るが、Ｔ細胞数を維持するために、残ったあるいは移植されたＴ細胞は急速に増殖する（これをHomeostatic Proliferation；ＨＰという）。正常状態ではアフィニティの低い自己抗原はＴ細胞の増殖を誘導できないが、ＨＰの際には、リンパ球の増殖に必要なシグナル閾値が低下しているため、自己抗原もＴ細胞の増殖を誘導できる。もともと、がん抗原はアフィニティの低い自己抗原である。ＨＰの際にリンパ球ががん抗原に暴露されると、がん抗原に対して傷害性を示すリンパ球の増殖が促され、がんに対する免疫反応が誘導されると考えられている（非特許文献１、２）。そして、自家造血幹細胞移植においても、免疫抑制性環境が破壊されて新鮮な免疫系の再構築が行われる際に、腫瘍特異的抗原の認識が促進されることによって抗腫瘍効果が得られることが明らかとなっている。
【０００４】
インターフェロン（ＩＦＮ）は抗ウイルス活性、細胞増殖抑制効果や腫瘍特異的免疫賦活等の種々の生理作用を有することから、タンパク製剤として１０年以上前に開発され、Ｃ型ウイルス肝炎の他、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、腎がん、黒色腫などの悪性腫瘍、さらに多発性硬化症などの多様な疾患の治療薬として広く使用されている。ＩＦＮの中で、タイプＩ−ＩＦＮと分類されているＩＦＮ−αとＩＦＮ−βは、共通のレセプターを介してその効果を発揮する。また、ＩＦＮ−αには特異性の点から１０種類以上のサブタイプが知られている。現在、ＩＦＮ−αとＩＦＮ−βの医薬品が上市されている。これらのタンパク製剤は皮下又は筋肉内投与によりに全身投与されるが、多彩な生理活性による全身の副作用（発熱、だるさ、疲労、頭痛、筋肉痛、けいれんなどのインフルエンザ様症状、致命的なものとして間質性肺炎）が問題となることが多い。
【０００５】
ＩＦＮ−αを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＩＦＮα）が、単回の腫瘍局所投与により膵がんに対して有効であること、全身的毒性が非常に少ないことが動物モデルにおいて報告されている（非特許文献３、４、特許文献１）。
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０２６０１６７号明細書
【非特許文献１】Dummer et al. J Clin Invest 110:185-192, 2002
【非特許文献２】Hu et al. Cancer Research 62:3914-3919, 2002
【非特許文献３】Ohashi M et al. British J Cancer 93:441-449, 2005
【非特許文献４】Hara H et al. Cancer Science 98:455-463, 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
化学療法や放射線療法、それらの後の造血幹細胞移植は、リンパ球の著明な減少を伴うが、その回復の過程で免疫細胞による腫瘍特異的抗原の認識が促進されることから、抗腫瘍効果が得られる。しかし、これらの抗腫瘍効果は持続しないことが臨床上の問題である。抗がん剤もがん細胞を殺傷すると共に、正常細胞も障害するものが多く、リンパ球等の血中の細胞が殺傷されそれらの数が減少する。リンパ球等の回復を図るために抗がん剤の投与を休止せざるをえない場合もある。抗がん剤による治療においても再発は未解決の大きな問題である。
【０００８】
ＩＦＮは抗ウイルス活性、細胞増殖抑制効果や腫瘍特異的免疫賦活等の種々の生理作用を有することから、多彩な生理活性による全身の副作用が問題となることが多い。しかし、ＩＦＮ遺伝子含有ベクターを腫瘍内又はその近傍に投与することにより、局所で強くＩＦＮを発現させ、その濃度を上げることにより、有害事象を回避しつつより有効な治療効果を得ることができる。さらに、局所投与により全身投与で起こる副作用を抑えながら、全身的に免疫賦活作用を発揮させることができる。
【０００９】
本発明は、このＩＦＮ遺伝子発現用ベクターの腫瘍内又はその近傍への局所投与による腫瘍特異的免疫賦活効果とリンパ球減少を伴うがんの処置方法及び／又はそれらの後の自家造血幹細胞移植を合理的に組み合わせることで、相乗的に難治固形がんに対する特異的抗腫瘍免疫効果を促進せしめることが目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明を概説すれば、本発明の第一の発明は、患者にリンパ球減少を伴う処置を実施する工程、及び患者の腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対してＩＦＮ遺伝子投与を行う工程を包含することを特徴とするがんの治療方法に関する。
【００１１】
また本発明の第二の発明は、患者にリンパ球減少を伴う処置を実施する工程、患者に自家造血幹細胞移植を行う工程及び患者の腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対してＩＦＮ遺伝子投与を行う工程を包含することを特徴とするがんの治療方法に関する。
【００１２】
本発明の第一又は第二の発明の態様において、リンパ球数減少を伴う処置としては抗がん剤投与、免疫抑制剤及び／又は放射線照射があげられる。また抗がん剤投与としては、フルオロウラシル、メトトレキセート、ゲムシタビン、フルダラビン、ブレオマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、イリノテカン、エトポシド、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、及びシクロフォスファミドからなる群より選択される少なくとも１つの抗がん剤の投与が挙げられ、免疫抑制剤等としては、アザチオプリン、ミゾリビン、ミコファノール酸モフェチル、メトトレキサート、シクロスポリン、タクロリムス、塩酸グスペリムス、及びムロモナブ−ＣＤ３からなる群より選択される少なくとも１つの免疫抑制剤の投与が挙げられる。また本発明の第一又は第二の発明の態様において、ＩＦＮ遺伝子投与はＩＦＮ遺伝子含有ベクターを用いたＩＦＮ遺伝子投与が挙げられ、当該ベクターとしては使用されるＩＦＮ遺伝子を局所で高発現させるために適したベクターであればよく、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクターの使用が挙げられ、またリポソーム封入されたプラスミドベクターの使用が挙げられる。更に本発明の第一又は第二の発明の態様において、ＩＦＮとしてはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βが挙げられる。なお本発明の第一又は第二の発明の態様において、がんは固形がんが挙げられ、例えば本発明により難治固形がんである大腸がんや腎がんなどの治療方法が提供される。
【００１３】
本発明の第三の発明は、リンパ球減少を伴う処置を実施された患者の腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対してＩＦＮ遺伝子投与を行うための治療剤であって、ＩＦＮ遺伝子含有ベクターを含有することを特徴とするがん治療剤に関し、本発明の第四の発明は、リンパ球減少を伴う処置に続いて自家造血幹細胞移植を実施された患者の腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対してＩＦＮ遺伝子投与を行うための治療剤であって、ＩＦＮ遺伝子含有ベクターを含有することを特徴とするがん治療剤に関する。
【００１４】
本発明の第三、第四の発明の態様において、ＩＦＮとしてはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βが挙げられる。またベクターとしては使用されるＩＦＮ遺伝子を局所で高発現させるために適したベクターの形体のものであればよく、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクターの使用が挙げられ、またリポソーム封入されたプラスミドベクターの使用が挙げられる。
【００１５】
本発明の第五の発明は、リンパ球減少を伴う処置を実施された患者の腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対して投与されるがんの治療剤の製造におけるＩＦＮ遺伝子の使用に関し、本発明の第六の発明は、リンパ球減少を伴う処置に続いて自家造血幹細胞移植を実施された患者の腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対して投与されるがんの治療剤の製造におけるＩＦＮ遺伝子の使用に関する。
【００１６】
本発明の第五、第六の発明の態様において、本発明は固形がんの増殖を抑制することができる治療剤の製造に用いることができる。前記の態様では、ＩＦＮ遺伝子はＩＦＮ遺伝子含有ベクターであってもよい。またＩＦＮとしてはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βが挙げられる。また、ベクターとしては使用されるＩＦＮ遺伝子を局所で高発現させるために適したベクターの形体のものであればよく、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクターの使用が挙げられ、またリポソーム封入のプラスミドベクターの使用が挙げられる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明はリンパ球減少を伴う処置及び／又は自家造血幹細胞移植を実施した後に、腫瘍内又は腫瘍近傍の局所に対してＩＦＮ遺伝子治療を行うことを特徴とする固形がんの治療方法及びその治療方法に使用する治療剤などを提供する。
難治固形がんである大腸がんや腎がんなどに対して、本発明はリンパ球減少を伴う処置及び／又は自家造血幹細胞移植後に、ＩＦＮ遺伝子を導入することにより、相乗的で強力な抗腫瘍効果を得ることができる。この抗腫瘍効果は、ＩＦＮ遺伝子を導入していない離れた部位の皮下腫瘍においても認められ、全身性の抗腫瘍免疫反応を誘導できる点においても格別の効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下本発明を具体的に説明する。
【００１９】
本発明において、リンパ球減少を伴う処置としては、抗がん剤や免疫抑制剤の投与、放射線照射、それらを組合わせた造血幹細胞移植のための前治療などが挙げられる。抗がん剤としては、フルオロウラシル、メトトレキセート、ゲムシタビン、フルダラビン、ブレオマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、イリノテカン、エトポシド、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、及びシクロフォスファミドからなる群より選択される少なくとも１つの抗がん剤が挙げられ、免疫抑制剤等としては、アザチオプリン、ミゾリビン、ミコファノール酸モフェチル、メトトレキサート、シクロスポリン、タクロリムス、塩酸グスペリムス、及びムロモナブ−ＣＤ３からなる群より選択される少なくとも１つの免疫抑制剤が挙げられる。また造血幹細胞移植のための前治療としては、放射線照射、チオテパ、シクロフォスファミド、ウサギ抗胸腺グロブリン等を組合せた前治療が挙げられる。
【００２０】
本発明において、患者にリンパ球減少を伴う処置を実施することによるリンパ球数の減少とは、処置前と比較して血中のリンパ球数が減少していることを意味する。例えば、血中のリンパ球数が成人で１０００個／μＬ以下、小児で３０００個／μＬ以下に減少している状態を意味する。
【００２１】
本発明において実施される自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ：Hematopoietic Stem Cell Transplantation）は、白血病等の造血器悪性腫瘍の治療法として実施される場合が多い。本明細書において用いる「自家」なる用語は、個体が同一であることをいう。また、自家造血幹細胞移植は、同じ種に属しかつ同一の遺伝的背景を有する同系動物による同系造血幹細胞移植により再現することができ、動物実験による評価においてしばしば同様の手法が使用されている。従って、本明細書において、自家造血幹細胞移植は同一の個体に由来する造血幹細胞の移植に限定されるものではなく、同系の個体に由来する造血幹細胞の移植を包含する。自家造血幹細胞移植において使用される造血幹細胞は、抗癌剤の投与により寛解導入後、骨髄から採取する、又は末梢血より採取する方法がある。後者の方法においては、幹細胞動員効果のある薬剤（シタラビン、シクロフォスファミド、エトポシド等）と顆粒球増殖因子（Ｇ−ＣＳＦ）を併用して末梢血中に動員させて、成分採血装置を用いて採取すればよい。自家造血幹細胞移植は必要充分量の造血幹細胞を移植すればよく、通常、ＣＤ３４陽性細胞数で患者の体重１ｋｇあたり２．０×１０６個以上を移植すればよい。
移植の前には、移植前治療とよばれる抗がん剤と免疫抑制剤、そして放射線治療を組合わせた処置が移植の７日から４日前にかけて行われ、これにより腫瘍細胞の完全除去を目指す。この前治療には、ＣＢＶ（シクロフォスファミド、ＢＣＮＵ、エトポシド）、ＢＥＡＭ（ＢＣＮＵ、エトポシド、シタラビン、メルファラン）の薬剤の組合わせ、メルファラン単独などが使用され、この前治療により、骨髄の破壊と共に、末梢血中のリンパ球を始めとする血液細胞も大きく減少する。
【００２２】
また本発明はＩＦＮ遺伝子含有ベクターを有効成分とする本発明の方法に使用する抗がん剤又は難治固形がん治療キットを提供する。
本明細書において、ＩＦＮはＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βである。ＩＦＮ−αは特異性の点から１３種類のサブタイプ（α1, 2, 4, 5, 6他）が知られており、いずれか一つに限定されることはない。ＩＦＮ−βはβ１のみが知られている。これらのＩＦＮをコードする遺伝子はいずれも公知の遺伝子であり、常法に従って調製すればよい。また本発明に使用するベクターとしてはＩＦＮ遺伝子を局所で高発現させるために適したベクターの形態のものであればよく、ウイルスベクター、非ウイルスベクターの両方を使用することができる。ウイルスベクターとしては、例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクターが挙げられ、また非ウイルスベクターとしてはリポソーム（カチオニックリポソーム、膜融合リポソーム等）、リガンド結合ポリリジン、カチオニックポリマー（ポリエチレニミン等）等を組み合わせたプラスミドベクターが例示される。さらに、プラスミドベクターをそのまま局所に投与してもよい（ｎａｋｅｄ−ＤＮＡ法）。これらのベクターとしては公知のベクターを用い、常法に従い、ＩＦＮ遺伝子を組み込めばよい。なおウイルスベクターの場合は非増殖型が好ましい。アデノウイルスベクターとしては、各種血清型が知られており、特に限定はないが、２型、５型や３５型由来のものが好ましい。非増殖型としては、Ｅ１領域を欠損させたものが好ましい。センダイウイルスベクターとしては、融合遺伝子（Ｆ）欠損したＳｅＶ／ｄＦが好ましい。
ＩＦＮ遺伝子は、投与部位の細胞内でＩＦＮを発現できるよう、適当なプロモーターの制御下にベクターに組み込まれる。前記のプロモーターとしては、特に限定するものではないが、ＣＡＧプロモーター［Gene、第108巻、193-200（1991）］、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター等が挙げられる。さらに、ターミネーターやエンハンサーなどの公知の調節因子をベクターに付加してもよい。
固形がんとは本発明の治療方法が有効なものであればよく限定はないが、例えば難治固形がんである大腸がん、腎がん、膵臓がん、食道がん、膀胱がん、前立腺がん、メラノーマ、頭部がん、頸部がん、胃がん、肺がん、肝細胞がんであり、これらに対して増殖抑制効果等を示し、有効である。
【００２３】
腫瘍内又はその周辺へのＩＦＮ遺伝子の局所投与量は、有効性を示す投与量であればよく、使用するＩＦＮ遺伝子含有ベクターにより適宜決定することができる。例えばＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００３）１０，７６５−７７３記載の方法に従い調製したＩＦＮ−α遺伝子含有のアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＩＦＮα）の場合その投与量は、腫瘍重量当たり１×１０４〜１×１０１１ｐfu／ｇであり、さらに好ましくは、１×１０６〜１×１０１０ｐｆｕ／ｇである。
また、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β遺伝子含有のプラスミドベクター（ＩＦＮ−α発現プラスミド及びＩＦＮ−β発現プラスミド）の場合、その投与量は、腫瘍重量当たり０．０１〜２０，０００μｇ／ｇであり、さらに好ましくは、０．１〜２，０００μｇ／ｇである。
ＩＦＮ遺伝子の局所への投与は単回でもよく、適切な間隔をおいて複数回実施してもよい。投与回数は腫瘍の種類や大きさ、その他の条件を考慮して適宜設定することができる。
【００２４】
ＩＦＮ遺伝子含有ベクターの被験者への投与方法は腫瘍内又は腫瘍近傍の局所への投与であり、投与製剤は用いるＩＦＮ遺伝子含有ベクターに適した注射用の製剤の形態とすることが好適である。前記の製剤は、例えば、ウイルスベクターの場合は、薬学的に許容される担体を配合した溶液製剤として製造することができる。一つの態様として、注射用蒸留水、生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水にアデノウイルスベクターを懸濁した製剤が例示される。さらに前記の製剤は有効成分の安定化を図るための成分（グリセロール、糖類等）、浸透圧を調整するための成分、抗菌剤等を含有してもよい。
【００２５】
本発明により、腫瘍内又は腫瘍近傍部位へのＩＦＮ遺伝子導入で発現するＩＦＮの作用によって腫瘍が死滅し、がん抗原の露出が起こり、がん抗原に対するリンパ球の増殖が促され、がんに対する免疫応答が誘導できる。また発現されたＩＦＮ自体の作用によりリンパ球の活性化と増殖が起こる。さらに、ＩＦＮ−α遺伝子導入による腫瘍特異的免疫反応が誘導され、ＨＰの抗腫瘍効果が相乗的に増強・持続される。また、造血幹細胞移植により、免疫抑制性の環境が破壊され、新たな免疫システムが再構築される。そして、このＩＦＮ遺伝子導入により腫瘍内で発現するＩＦＮの作用と、自家造血幹細胞移植の相乗作用により腫瘍特異的免疫が顕著に増強される。以上に述べた作用により、がん（腫瘍）はその増殖が抑制され、また、縮退する。
【００２６】
例えばＡｄ−ＩＦＮα遺伝子治療の特徴は、Ａｄ−ＩＦＮαを腫瘍内に局注する方法により腫瘍細胞に著明な細胞死を誘導する直接的な抗腫瘍効果とともに、ＮＫ細胞や細胞傷害性Ｔ細胞の活性化や抗原提示細胞の活性化・成熟促進による全身性の特異的腫瘍免疫効果の誘導、および腫瘍血管新生の抑制など、多様な抗腫瘍機序を発揮できる点である。すなわち、Ａｄ−ＩＦＮα遺伝子治療により、局所での強力な腫瘍制御と、全身性の転移に対する対策をとることができる。また、腫瘍内に発現したＩＦＮ−αは血中にはほとんど漏出しないために、安全性が高いことも、Ａｄ−ＩＦＮα遺伝子治療の有用性のひとつである。
実際の臨床では、固形がんが免疫治療に抵抗性を示す場合も多い。制御性Ｔ細胞の誘導やサイトカインの影響により、腫瘍が免疫抑制性の環境を獲得している事に起因するが、この従来の免疫治療の問題は自家造血幹細胞移植を併用することにより解決された。造血幹細胞移植により免疫抑制性の環境を完全に破壊した後に新たな免疫系を再構築することで、免疫治療の効果を高めることが可能になった。さらに、自家造血幹細胞移植により抗腫瘍効果が発揮され、腫瘍内へのＩＦＮ−α遺伝子導入等の免疫遺伝子治療を複合することにより、（１）腫瘍細胞死を誘導して腫瘍抗原の暴露を促す、（２）抗原提示細胞での腫瘍抗原提示を強化する、（３）特異的リンパ球を活性化するといった機序で、強力で持続的な抗腫瘍効果を誘導できる。自家造血幹細胞移植は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症がない点で安全性にも優れており、動物実験でも有害事象は認められていない。
本発明者らは、このように、単に、固形がんに対するＡｄ−ＩＦＮα遺伝子治療を行うだけでなく、自家造血幹細胞移植との複合療法に発展させ、難治固形がんに対して高い抗腫瘍効果を発揮する新たな免疫遺伝子・細胞複合療法を提供する。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明について実施例をもって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１
マウスに致死量の放射線を照射後、骨髄細胞とＴ細胞を静注して、移植マウスでのＴ細胞の増殖を促すと、大腸がん、腎がんなどの皮下腫瘍の増殖は明らかに抑制され、自家造血幹細胞移植が抗腫瘍効果を発揮することが示されている。しかし、自家造血幹細胞移植単独あるいはＡｄ−ＩＦＮα遺伝子導入単独では、腫瘍の抑制効果は認められるものの、最終的にマウスの生存率を延長することはできない。そこで、造血幹細胞移植後早期の免疫系の再構築が起こっている時期に、Ａｄ−ＩＦＮα遺伝子を投与すると、投与された部位の皮下腫瘍の増殖が著明に抑制されるばかりか、投与部位から離れた部位の皮下腫瘍においても増殖抑制効果が長期間にわたって認められ、マウスの生存率を有意に延長できることを明らかとした。なお、遺伝的に全く同一の同系マウスによる同系造血幹細胞移植は、自家造血幹細胞移植を再現することができる。
以下詳細に記載する。
（１）動物と移植
７〜９週令のメスＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ、Ｌｙ−１．２）マウス（チャ―ルスリバー社製）は滅菌環境下で飼育した。動物実験は国立がんセンターの動物実験指針に従い、動物実験倫理委員会の承認のもと行なった。ＢＡＬＢ／ｃマウスには移植の日に致死量（９Ｇｙ）の全身放射線照射を行った。照射されたマウスに、ドナーＢＡＬＢ／ｃ由来の５×１０６個のＴ細胞除去骨髄細胞と２×１０６個の脾臓のＴ細胞を、総量０．２ｍｌのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ溶液（日水製薬社製）に懸濁して静注した（ＨＳＣＴ）。骨髄細胞はドナーマウスの大腿骨と脛骨を５％の牛胎児血清（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．製）を添加したＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）で洗い流すことによって分離し、脾臓細胞はピンセットで脾臓をほぐすことによって調製した。赤血球の溶血後、骨髄細胞と脾臓細胞はそれぞれ抗Ｔｈｙ−１．２磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）とともに４℃、１５分間インキュベートしたのち、骨髄細胞からはＴ細胞の除去、脾臓細胞からはＴ細胞の選別をＡｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて各々行なった。骨髄細胞からは９０％以上のＴ細胞が除去された。
【００２９】
（２）腫瘍細胞と組換えアデノウイルスベクター
ＣＴ２６とＲｅｎｃａはそれぞれ、免疫原性の低いＢＡＬＢ／ｃ由来の大腸がん細胞株および腎がん細胞株であり、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。両方の細胞株がＭＨＣクラスＩ分子（Ｈ−２ＫｄとＨ−２Ｄｄ）をよく発現していることをフローサイトメトリーで確認した。細胞を１０％のウシ胎児血清、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、および０．１５％の重炭酸ナトリウムを含むＲＰＭＩで維持した。
マウスＩＦＮ−αを発現する組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ−ｍＩＦＮ）、アルカリホスファターゼｃＤＮＡを組み込んだ組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＡＰ）、遺伝子を組み込まないアデノウイルスベクター（Ａｄ−ΔＥ１）をＡｏｋｉ  Ｋら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．、５、ｐ．２２４‐２３１（１９９９）およびＳｕｚｕｋｉ  Ｋら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、Ｖｏｌ．１０、ｐ．７６５−７７３（２００３）に従い各々準備した。これらの組換えアデノウイルスはＡｄ５ウイルスの３Ｅ領域を欠損し、サイトメガロウィルスのイミディエート・アーリー（immediate early）・エンハンサー配列と、チキンβ−アクチン／ウサギβ−グロブリン・プロモータのハイブリッドであるＣＡＧプロモーターを有している。
セシウム・クロライド法でウイルスを精製し、精製ウイルスを滅菌されたＢｉｏ−ＧｅｌＰ−６  ＤＧクロマトグラフィー・カラム（Ｅｃｏｎｏｐａｃ  ＤＧ１０、ＢｉｏＲａｄ社製）で脱塩した後、貯蔵のため１３％グリセロール／ＰＢＳ溶液で希釈した。すべてのウイルス調製物についてＰＣＲアッセイによりＥ１＋アデノウイルスの混入が無いことを確認した。
【００３０】
（３）生体へのＩＦＮ−α遺伝子投与
５×１０６個のＲｅｎｃａ細胞あるいは１×１０６個のＣＴ２６細胞を、全量５０μＬＰＢＳに調製し、マウス脚に皮下注射した。皮下腫瘍の生着・増殖を確認し（直径０．６ｃｍ以下）、５０μｌのＡｄ−ｍＩＦＮα又は対照ベクター（５×１０６ＰＦＵ）を腫瘍内に単回投与した。腫瘍の最短径（ｒ）と最長径（ｌ）を測定し、腫瘍体積をｒ２ｌ／２として測定した。
【００３１】
（４）リンパ球減少したマウスでの大腸がんの増殖抑制
最初に、Ｔ細胞のＨＰがリンパ球が減少したマウスにおいて、抗腫瘍免疫を誘導することができるかどうか調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに致死量（９Ｇｙ）の放射線を照射した後に、同系のＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄細胞とＴ細胞を静脈内注射し、３日後に１×１０６のＣＴ２６大腸がん細胞を脚の皮下に移植した。腫瘍の増殖は、同系造血幹細胞移植マウスにおいて、かなり抑制された（図１）。放射線非照射の、リンパ球が減少していないマウスにリンパ球輸注（ＬＩ）をすると、腫瘍移植後１４日目で若干の抗腫瘍効果が認められたものの、腫瘍増殖は速く２４日目に対照マウスの腫瘍増殖に追いついた。このことからＴ細胞の増殖が造血幹細胞移植マウスの抗腫瘍免疫に重要な役割を果たしていることが示唆された。
【００３２】
（５）皮下腫瘍へのマウスＩＦＮ−α遺伝子投与の抗腫瘍効果
ＩＦＮ−α遺伝子導入治療の生体での抗腫瘍効果を調べるために、様々な量のＡｄ−ｍＩＦＮを、ＲｅｎｃａおよびＣＴ２６皮下腫瘍内に投与した。Ａｄ−ｍＩＦＮの１回の投与で、用量依存的に両方の腫瘍の顕著な増殖抑制効果が認められた（図２）。
【００３３】
（６）同系造血幹細胞移植後早期にＩＦＮ−α遺伝子投与を行うことによる、相乗的抗腫瘍効果の誘導
次に、同系造血幹細胞移植後早期の免疫再構築が起こっている時期に、ＩＦＮ−α遺伝子投与を行うことによる抗腫瘍効果を検討した。実際の臨床では、造血幹細胞移植が行われる時には、レシピエントは再発あるいは残存腫瘍細胞を有している。その臨床状況に合致するために、並びに、腫瘍細胞に対する放射線照射の影響を避けるため、レシピエントマウスには放射線照射の直後にＣＴ２６細胞を皮下移植し、次いで骨髄細胞とＴ細胞の静脈内移植を行なった。その後、５×１０６ＰＦＵのＡｄ−ｍＩＦＮαを皮下ＣＴ２６腫瘍に投与した。高用量のＡｄ−ｍＩＦＮαを腫瘍内に投与すると、Ａｄ−ｍＩＦＮα単独で強い抗腫瘍効果を発揮してしまい、移植マウスにおけるＩＦＮ−α遺伝子導入との相乗効果が不明瞭となる。そこで、この実験では、Ａｄ−ｍＩＦＮαの抗腫瘍効果を抑えるために、低用量のＡｄ−ｍＩＦＮαを使用した（図３ａと３ｂ）。５日目の腫瘍容積は６０〜１００ｍｍ３であった。腫瘍の増殖はナイーブマウスと比較して移植マウスで抑制されており、そして移植マウスにおいてはＩＦＮ−α遺伝子導入による腫瘍抑制が顕著に増強された（図３ａ）。これらの結果は免疫再構築中の腫瘍内ＩＦＮ−α遺伝子導入によって、相乗的抗腫瘍効果が誘導されたことを示している。
腫瘍局所ＩＦＮ−α遺伝子投与が遠隔部位の腫瘍に対して抗腫瘍効果を発揮できるかどうかを評価するために、Ｒｅｎｃａ細胞を同系造血幹細胞移植時に両足の皮下に移植し、その５日後に右脚の腫瘍にのみＡｄ−ｍＩＦＮベクターの投与を行なった。ＩＦＮ−α遺伝子投与により、ベクターが投与された右脚の腫瘍と同様に、ベクターを投与していない左脚の腫瘍の増殖も有意に抑制された（図３ｂ）。この結果は、腫瘍内ＩＦＮ−α遺伝子投与が自家造血幹細胞移植レシピエントにおいて、全身性の抗腫瘍免疫を誘導できることを示している。
【００３４】
（７）ＩＦＮ−α遺伝子投与による自家ＨＳＣＴレシピエントの生存期間延長
次に、自家造血幹細胞移植レシピエントにおける腫瘍内ＩＦＮ−α遺伝子投与の生存延長効果について検討した。腫瘍接種後３０日目までにおいて、同系造血幹細胞移植レシピエントでは、対照のアデノウイルスを投与した場合でも有意な腫瘍増殖抑制が認められたが、その後急速に腫瘍が増殖するために、生存期間の延長は認められなかった（図４）。一方、腫瘍内ＩＦＮ−α遺伝子導入複合群では、同系造血幹細胞移植の抗腫瘍効果を有意に増強した。皮下腫瘍は４３％で消失し、レシピエントマウスの生存期間を明らかに延長した（図４）。平均生存期間は、造血幹細胞移植と腫瘍内ＩＦＮ−α遺伝子導入複合群では７６．２日と、それ以外のコントロール群や治療群（Ｎｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ群：５３．７日、Ａｄ−ＡＬＰ群：５４．８日、Ａｄ−ＩＦＮ群：５６．５日、ＨＳＣＴ群：５３．１日、ＨＳＣＴ＋Ａｄ−ＡＬＰ群：５５．９日）と比べて、２０日間以上も延長した。治療したマウスに有害事象は認められなかった。
【００３５】
（８）腫瘍内へのＩＦＮ−α発現プラスミド投与又はＩＦＮ−β発現プラスミド投与による相乗的抗腫瘍効果の誘導
次に、アデノウイルスベクターの代わりに、ＩＦＮ−α発現プラスミド又はＩＦＮ−β発現プラスミドをリポソームと混合して腫瘍内に注入し、自家造血幹細胞移植の抗腫瘍効果を増強できるか検討した。まず、ＩＦＮ−α発現プラスミド、ＩＦＮ−β発現プラスミドをMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press)に従って調製した。ＩＦＮ−α発現プラスミドは、前記実施例１−（２）に記載するアデノウイルスベクターＡｄ−ｍＩＦＮを調製する時に使用したプラスミドベクターであり、ｐＡＴ１５３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｌ０８８５３）をバックボーンとして、アデノウイルスゲノム０〜１ｍｕ、ＣＡＧプロモーター、ＩＦＮ−α遺伝子及びアデノウイルスゲノム９〜１６ｍｕを有する。また、ＩＦＮ−β発現プラスミドは、ＩＦＮ−α発現プラスミドのＩＦＮ−α遺伝子がＩＦＮ−β遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｘ１４４５５）に置き換わっている。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに９Ｇｙの致死量の放射線を照射後に、ＣＴ２６細胞を脚の皮下に移植し、骨髄細胞とＴ細胞を静脈内注射した。７日後、９日後、１１日後に、ＩＦＮ−α又はＩＦＮ−β発現プラスミドをリポソームと混合して腫瘍内に直接注入した。プラスミドとリポソームの混合体は、ＰＢＳバッファーに溶解した１０μｇのＩＦＮ−α又はＩＦＮ−β発現プラスミドを含む２５μＬの溶液を、０．１５ｍＭのリポソーム（ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ、Ｖｉｃａｌ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）２５μＬと混合して調製し、この溶液の全量を投与した。投与開始時の腫瘍容積は、６０〜１００ｍｍ３であった。放射線を照射せず、骨髄細胞とＴ細胞を移植していないナイーブマウスにおいては、ＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βプラスミド１０μｇの抗腫瘍効果は明らかではなかった（図５）。しかし、骨髄細胞とＴ細胞を移植したマウスでは、腫瘍内にＩＦＮ−α又はＩＦＮ−β発現プラスミドを注入することにより、ＣＴ２６皮下腫瘍の増殖は顕著に抑制され、相乗的抗腫瘍効果を発揮することが示された（図５）。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
リンパ球減少を伴う処置である自家造血幹細胞移植を実施した後のリンパ球の回復途中に、固形がんの腫瘍内又はその近傍にＩＦＮ−α遺伝子を投与することにより、抗腫瘍効果を持続的に強く促進できることを見出した。本発明は難治性固形がんの治療において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】骨髄細胞及びＴ細胞の同系造血幹細胞移植は、致死量の放射線照射を受けたマウスの皮下腫瘍の増殖を明らかに抑制することを示す図である。９Ｇｙ（致死量）の放射線照射後、マウスに骨髄細胞とＴ細胞を移植した。対照として、放射線非照射のマウスに対し未処置（ｃｏｎｔｒｏｌ）のまま、またはＴリンパ球輸注（ＬＩ）を行った。（ｎ＝４−６）
【図２】Ｒｅｎｃａ及びＣＴ２６皮下腫瘍へのマウスＩＦＮ−α遺伝子投与の直接的な抗腫瘍効果を示す図である。皮下腫瘍を脚に作製し、様々な量のＡｄ−ｍＩＦＮ又はコントロールウイルス（Ａｄ−ΔＥ１またはＡｄ−ＡＰ）を腫瘍内に一回投与した。（ｎ＝５−６）
【図３】ＩＦＮ−α遺伝子投与が同系造血幹細胞移植マウスで抗腫瘍効果を高めることを示す図である。（ａ）ＣＴ２６細胞を同系造血幹細胞移植の直前に右脚に接種し、そして、５日後に、Ａｄ−ｍＩＦＮをＣＴ２６腫瘍に投与した。（ｎ＝７−８）（ｂ）Ｒｅｎｃａ細胞を同系造血幹細胞移植の直前に両脚に接種し、そして、５日後に、Ａｄ−ｍＩＦＮを右脚の腫瘍のみに投与した。（ｎ＝７−８）
【図４】免疫再構築時のＩＦＮ−α遺伝子投与は移植マウスの生存を延長させることを示す図である。ＩＦＮ−α遺伝子導入は同系造血幹細胞移植マウスの生存を明らかに延長させる。Ａｄ−ＩＦＮαベクターの腫瘍内投与後、マウスの生存期間を観察した。（ｎ＝７−８）
【図５】ＩＦＮ発現プラスミドの投与は同系造血幹細胞移植マウスで抗腫瘍効果を高めることを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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