(57)【要約】【課題】ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）とのＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４の相互作用を阻害することができる化合物を提供する。【解決手段】ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）とのＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４の相互作用を阻害することができかつ配列番号：１の残基２〜９に対応する、コアアミノ酸配列、ＬｅｕＭｅｔＴｙｒＰｒｏＰｒｏＰｒｏＴｙｒＴｙｒを有するペプチド模倣物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２のアミノ酸配列を含み、配列番号：２のアミノ酸残基３と１２との間のＣｙｓ−Ｃｙｓジサルファイド架橋を介して環化されている化合物。
【請求項２】
配列番号：２のアミノ酸残基１〜１４に対してＮ末端側に１〜１０個のアミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記配列番号：２のアミノ酸残基１〜１４に対してＮ末端側に含まれる１〜１０個のアミノ酸が、正に帯電したアミノ酸である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
配列番号：２のアミノ酸残基１〜１４に対してＣ末端側に１〜１０個のアミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記配列番号：２のアミノ酸残基１〜１４に対してＣ末端側に含まれる１〜１０個のアミノ酸が、正に帯電したアミノ酸である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
配列番号：２のアミノ酸残基１〜１４に対してＮ末端側およびＣ末端側の両方に２つの正に帯電したアミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
配列番号：２のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）とのＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４の相互作用を阻害することができる、ペプチド模倣物、およびそれらの医薬組成物に関する。本発明は、また、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４の作動性および拮抗性を必要とする病理において活性な医薬組成物を製造するためのペプチド模倣物の使用、およびこのような病理を治療する方法に関する。
背景の技術の説明
Ｔ細胞抗原レセプター複合体（ＴＣＲ）に対するＭＨＣクラスＩＩの関係において提示される抗原の相互作用は、クローナル増殖を開始する一次シグナルをヘルパーＴ細胞に提供する。しかしながら、最適なＴ細胞の活性化は、ＴＣＲのエンゲイジメントに加えて、共同刺激シグナルを必要とする。いくつかの共同刺激分子は「第２シグナル」の開始において関係づけられてきたが、主要なシグナルの１つは抗原提示細胞の表面上に提示されたＢ７分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）の相互作用により提供されることが明らかとなった（第１図参照）。
【０００２】
細胞表面のＣＤ２８はタンパク質のＩｇスーパーファミリーの２０１アミノ酸の糖タンパク質のメンバーである（ＡｒｕｆｆｏおよびＳｅｅｄ、１９８７）。それは天然においてホモダイマーとして見出され、そしてヒトＴ細胞（すべてのＣＤ４＋  細胞およびＣＤ８＋  の約５０％の上）の表面上および事実上すべてのネズミＴ細胞上で構成的に発現される（ＬｉｎｓｌｅｙおよびＬｅｄｂｅｔｔｅｒ、１９９３）。その天然のリガンドＢ７−１またはＢ７−２（ＣＤ８０、ＣＤ８６）によるＣＤ２８のエンゲイジメントはＴ細胞に対する第２シグナルを生じ、そしてｍＲＮＡレベルおよび細胞表面の発現に関するＣＤ２８のダウンレギュレーションと一緒にＩＬ−２の産生を増加させる（Ｌｉｎｓｌｅｙ他、１９９３）。第２シグナルは抗原特異的Ｔ細胞が増殖するためにきわめて重要であると考えられる。第１シグナル（ＴＣＲシグナル）の存在におけるこの第２シグナルの干渉は、抗原特異的Ｔ細胞のアネルギー（非応答性）を生ずる（Ｌｉｎｓｌｅｙ他、１９９２）。ＣＤ２８がダウンモジュレートされる間に、密接に関係する糖タンパク質、ＣＴＬＡ−４、は付随的にアップレギュレートされる（Ｆｒｅｅｍａｎ他、１９９２）。一般に、ＣＤ２８は成長および分化のための正の共同刺激を送出すが、ＣＴＬＡ−４は引き続く細胞の活性化の事象の負のシグナルを発生させると考えられれている（概観については、Ｌｅｎｓｃｈｏｗ他、１９９６）。
【０００３】
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の双方はタンパク質のＢ７ファミリー、最も顕著にはＢ７−２およびＢ７−１に結合する（Ａｚｕｍａ他、１９９３）。Ｂ７−１に関すると、ＣＴＬＡ−４ＩｇはＣＤ２８Ｉｇよりも２０〜１００倍より高いアフィニティーで結合することが知られている（Ｌｉｎｓｌｅｙ他、１９９１）。
【０００４】
新しく単離されたヒトおよびネズミのＢ細胞は低いレベルのＢ７−２を発現するが、Ｂ７−１を発現しないが、活性化されると、双方のＢ７のレベルはアップレギュレートされる（Ｈａｔｈｃｏｃｋ他、１９９４）。
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究において、ＣＤ２８シグナリング経路を介するＴ細胞の共同刺激の遮断はＴ細胞の抗原特異的アネルギーを発生させることが証明された（Ｈａｒｄｉｎｇ他、１９９１；Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ他、１９９３；Ｌｉｎｓｌｅｙ他、１９９１）。
【０００６】
ＣＴＬＡ−４Ｉｇは、ＣＤ２８のシグナリング経路を遮断するｉｎ  ｖｉｖｏ効能を研究するために、広範な種類の動物モデルにおいて使用されてきている。最初のｉｎ  ｖｉｖｏ研究において、ＣＴＬＡ−４ＩｇはＴ細胞依存性抗原に対する体液性応答を抑制することができることが示された（Ｌｉｎｓｌｅｙ他、１９９２）。
【０００７】
他の研究において、ＣＤ２８共同刺激シグナルの遮断は、異種移植片の拒絶反応（Ｌｅｎｓｃｈｏｗ他、１９９２）、心臓同種異系移植片の拒絶反応（Ｔｕｒｋａ他、１９９２；Ｌｉｎ他、１９９３）、ネズミ全身的狼瘡（Ｆｉｎｃｋ他、１９９４；Ｃｈｕ他、１９９６）、移植片／宿主疾患（ＧＶＨＤ）（Ｗａｌｌａｃｅ他、１９５５）、および実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（Ｃｒｏｓｓ他、１９９５；Ｐｅｒｒｉｎ他、１９９５；Ａｒｉｍａ他、１９９６）の防止において有効であることが証明された。
【０００８】
同種異系移植時におけるＣＴＬＡ−４Ｉｇの投与は移植片の生存を延長するが、拒絶反応を防止することができない（Ｔｕｒｋａ他、１９９２）。移植後２日までＣＴＬＡ−４Ｉｇの投与を遅延した場合、同種異系移植片の長期間の生存ならびに引き続く同種異系抗原を使用するチャレンジに対する耐性が観察される（Ｌｉｎ他、１９９３；Ｓａｙｅｇｈ他、１９９５）。
【０００９】
Ｊｕｇｅ他（１９９６）は最近ＣＴＬＡ−４Ｉｇの作用のメカニズムを研究し、そしてタンパク質の遅延した投与がＴｈ１型サイトカインの８０〜９０％の減少を生じ、抗原特異的Ｔ細胞の拡大を５０％だけ鈍くすることを見出した。したがって、ＣＴＬＡ−４ＩｇはＴｈ１型およびＴｈ２型の応答の間の均衡を調節することができる。
【００１０】
結論すると、ＣＤ２８の共同刺激経路の遮断は免疫モジュレーションの有用な療法上のターゲットであることができるという豊富な証拠が存在する。現在、ＣＴＬＡ−４Ｉｇは乾癬の患者における相ＩＩの臨床試験にある。しかしながら、慢性の免疫療法のための実際のその使用は、それが非経口的にのみ投与され、そしてｍｇ／ｋｇの投与量を必要とすることによって制限される。
【００１１】
ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８の小さい分子の模倣物は大きい臨床的および商業的利点を有し、長い間感じられてきた必要性を表す。
【００１２】
ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の双方を使用する部位特異的突然変異誘発の研究は、タンパク質、ＭｅｔＴｙｒＰｒｏＰｒｏＰｒｏＴｙｒ（配列番号：３１）のＣＤＲ３領域におけるいくつかの主要な部位を含むヘキサペプチドのストレッチを、Ｂ７との相互作用における重大な接触部位として、関係づけた（Ｐｅａｃｈ他、１９９４）。
【００１３】
欧州特許出願ＥＰ６８２，０３９号において、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合タンパク質がＢ７抗原との相互作用をブロックすることが開示されている。また、それには、配列ＭｅｔＴｙｒＰｒｏＰｒｏＰｒｏＴｙｒ（配列番号：３１）を包含する、アミノ酸のいずれかがＡｌａにより置換されている、ＣＴＬＡ−４突然変異体が開示されている。
【００１４】
国際特許出願ＷＯ９５／３３７７０号は、一般に、活性化されたＴ細胞の抗原特異的アポプトーシスを誘導する、Ｔ細胞表面の分子、特にＣＴＬＡ−４のリガンドに関する。このような結合のためのエピトープを構築する、ＣＴＬＡ−４フラグメントを含有する単離されたペプチドも開示され、特許請求されている。このようなエピトープは、アミノ配列ＰｒｏＰｒｏＴｙｒＴｙｒＬｅｕ（配列番号：３２）〔前述の報告されたヘキサペプチドＭｅｔＴｙｒＰｒｏＰｒｏＰｒｏＴｙｒ（配列番号：３１）と部分的にオーバーラップする〕を包含する。
【００１５】
最近、Ｇｌａｘｏにおける科学者は、この領域を模擬するために、双方の線状ならびにコンフォメーション的に拘束されたペプチドを使用することを試みた（Ｅｌｌｉｓ他、１９９６）。しかしながら、Ｇｌａｘｏの研究は生産的手掛かりを生成することができなかった。
【００１６】
本明細書における文献の引用は、このような文献が関係する先行技術であるか、あるいはこの出願の請求の範囲の特許性に対して考慮された材料であることを認めるものではない。文献の内容または日付に関する記載は出願時において出願人に入手可能である情報に基づいたものであって、このような記載の正しさに関して容認するものではない。
発明の要約
本発明の目的は、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４の生物学的に活性なペプチド模倣物を提供することによって、関係する技術、例えば、前述の技術、の欠陥を克服することである。
【００１７】
したがって、本発明は、ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）とのＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４の相互作用を阻害することができる、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４のペプチド模倣物を提供する。本発明のペプチド模倣物は配列番号：１の残基２〜９に対応するコア配列を含有し、環化することができ、そしてこれらのコア配列に対してＮ末端および／またはＣ末端の追加のアミノ酸残基を含むことができる。
【００１８】
本発明は、また、本発明によるペプチド模倣物と、薬学上許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
さらに、本発明において、ＣＤ８０およびＣＤ８６とのＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４の相互作用を阻害することによって改善される病理および障害を治療する方法が提供される。
発明の詳細な説明
本発明によるＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４の生物学的に活性なペプチド模倣物は、後述するように、「皮膚および骨」型デザインに基づく、分子モデル化法を使用して設計された。
【００２０】
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の双方は、単一のＩｇ可変ドメインから成る、ホモダイマーＩｇスーパーファミリーのメンバーである。既知の構造のブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）データベースの相同性の検索を実施し、そしてＩｇホモダイマー（コード−ＲＥＩ）の結晶化された例が見出された。モデル化の研究において使用した配列の整列を第２図に示す。
【００２１】
ＲＥＩ鋳型の側鎖の置換を使用して、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の双方のモデルを構築した。ＲＥＩにおけるＣＤＲ３ループの長さはＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４のいずれの対応する領域よりも２アミノ酸だけ短いので、適当な長さのＣＤＲ３ループ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎデータベース、ＰＤＢ１ＪＨＬ、ＥＮＴ、から入手した）を鋳型分子上にグラフト化した。複合−勾配機能を使用して、新しく構築されたモデルを収れん最小化させた。５サイクルのアニール化動力学（分子運動のエネルギー依存的シミュレーションおよび引き続くエネルギー的最小化の繰返し）を使用して、最終の最小化工程前の構造を最適化した。ＣＴＬＡ−４ホモダイマーのリボン線図を第３図に示す。
【００２２】
ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４のために使用した方法に類似の方法で、Ｂ７−１分子の分子モデルを構築した。ブルックヘブンのデータベースの検索から見出された最良の整列は、ＭＣＯ抗体のＩｇ重鎖の可変および定常ドメインであった。Ｂ７−１モデルの構築において使用した配列整列を第４図に示す。
【００２３】
Ｂ７−１のモデルを構成した後、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ２８）／Ｂ７−１複合体の試験的なモデルを構成した。いくつかのグループは、複合体形成に関係するＣＴＬＡ−４／Ｂ７表面を定めることを目的とした、広範な部位特異的突然変異誘発の研究を発表した（Ｐｅａｃｈ他、１９９４；１９９５；Ｇｕｏ他、１９９５）。これらの突然変異体はモデル化されたタンパク質上に整列され、そしてホモダイマー結合性複合体の形成における指針として使用された。簡素化のために、第５図はＢ７−１と相互作用するモノマーのＣＴＬＡ−４分子のみを示す。
【００２４】
ＣＤ２８共同刺激経路のインヒビターとしてＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４のペプチド模倣物を操作するとき、前述の分子モデルをデザインの鋳型として使用した。本発明によるペプチド模倣物は、ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）分子とのＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４の相互作用を阻害することができ、配列番号：１の残基２〜９に対応するコアアミノ酸配列、ＬｅｕＭｅｔＴｙｒＰｒｏＰｒｏＰｒｏＴｙｒＴｙｒを有する。このコアアミノ酸配列に加えて、配列番号：１のアミノ酸残基２〜９に対してＮ末端および／またはＣ末端の追加のアミノ酸残基を含むことができる。
【００２５】
好ましくは、配列番号：１により示されるように、コアアミノ酸配列に対してすぐＮ末端およびすぐＣ末端の双方にＣｙｓ残基が存在する。また、本発明のペプチド模倣物は環化されることが好ましい。本発明のこのような環化されたペプチド模倣物が配列番号：１の配列を含むとき、ペプチドの環化は好ましくは配列番号：１の残基１（Ｃｙｓ）と１０（Ｃｙｓ）との間のＣｙｓ−Ｃｙｓジサルファイド架橋を介して起こる。そうでなければ、ペプチド模倣物は、配列番号：１の残基２〜９に対応するコアアミノ酸配列の残基２（Ｌｅｕ）と残基９（Ｔｙｒ）とを架橋する、リンカー、例えば、合成的化学的リンカーを使用して、環化することができる。したがって、環化は好ましくは配列番号：１の残基２および残基９の１つのアミノ酸内で起こる。合成的化学的リンカーの他の例は下記のものを包含するが、これらに限定されない：Ｌｙｓ−Ａｓｐ塩架橋、ランタニド環化、Ｎ末端−Ｃ末端の環化、これらの化学的リンカーはＯｌｓｏｎ他（１９９３）およびその他に開示されている。
【００２６】
また、本発明のペプチド模倣物において、配列番号：１の残基２〜９に対応するコア配列に対してＮ末端に１１までの追加のアミノ酸残基が存在し、および／またはＣ末端に１１までの追加のアミノ酸が存在することが好ましい。より好ましくは、配列番号：１に対してＮ末端およびＣ末端の双方に２つの追加のアミノ酸残基が存在し、ここでこれらの追加のアミノ酸残基は正に帯電したアミノ酸残基である。配列番号：２のアミノ酸配列は、本発明の環化されたペプチド模倣物の好ましい態様の１例であり、ここで環化は配列番号：２の残基３および１２の間のＣｙｓ−Ｃｙｓジサルファイド架橋を介して起こっている。
【００２７】
本発明によるペプチド模倣物は、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４、配列番号：１９、および配列番号：２０から成る群より選択される１以上のアミノ酸配列をさらに含むことができ、これらは互いにおよび／または配列番号：１の配列または配列番号：１の残基２〜９に対応する配列と直接または適当な合成的化学的リンカーを通して結合することができる。本発明のペプチド模倣物は、また、１以上の生物活性中心のフラグメント、例えば、薬剤の設計において普通に使用されているフラグメントが、コアアミノ酸配列に対してＮ末端および／またはＣ末端の追加のアミノ酸と組み合わせて、またはそれらの代わりに存在する、ペプチド模倣物を包含することを意図する。
【００２８】
本発明のペプチド模倣物はＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８分子のフラグメントではなく、特別に設計され、引き続いて実施例の節において報告する生物学的試験の結果に基づく多数の可能性の中から選択されたことは注目に値する。
【００２９】
使用された戦略は、Ｂ７とのＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４タンパク質の潜在的接触表面を同定しかつ利用すること、ならびにホモダイマーの適当な提示を潜在的に崩壊させる手段として、ホモダイマーの形成を仲介する役目をするＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４分子の領域を選択することである。
【００３０】
モデル化されたＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４分子の６つの領域が、ペプチドの設計のための潜在的ターゲットとして同定された（表１参照）。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
第１の領域は、タンパク質の末端領域に相当する。これはアミノ酸の細長い（β鎖）ストレッチであり、そしてコンフォメーションの拘束の導入が不可能である。アミノ末端はＣＤＲ３領域の下に直接横たわり、そしてＢ７接触表面の一部分を形成することが予測される。
【００３３】
第２の領域は、タンパク質のＣＤＲ１類似部分に相当する。ＣＤＲ１ドメインは部位特異的突然変異誘発の研究によりＢ７に対する結合に関係することが示された（Ｐｅａｃｈ他、１９９４）。ＣＤＲ１領域は緊密なβ回転を形成せず、むしろゆるく形成されたループを形成するので、この領域に密接に類似する、コンフォメーション的に拘束されたペプチドを設計することは困難である。ここで使用された戦略は、この領域から設計された拘束されたペプチドに対して最大の柔軟性を与えることであった。
【００３４】
ホモダイマーを一緒に保持することが予測される、主要な接触部位の１つを表す残基４０〜４５の間のループ領域に対して、第３の組のペプチドを作った。細胞表面上に発現された機能的ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４は主としてホモダイマーの形態である（Ｂ７へのモノマーの提示の多少の掛かり合い存在しうるという、いくつかの証拠が存在する）ので、これらの類似体を使用する目的はホモダイマーの形成を崩壊することであった。
【００３５】
Ｂ７接触表面の一部分であることが予測されないが、主要な表面の暴露されたループを構築する、６０〜６５ループ（配列番号：１５、１６および１７）から、第４の組のペプチドを誘導した。現在の相互作用のモデルに従い、この領域から設計されたペプチドは生物学的活性をもたないであろう。これらの類似体のいずれかが生物学的活性を表示した場合、現在のモデルの相互作用は正しくなかったことが明らかである。
【００３６】
残基７０〜７５により形成されたループはＢ７との接触に直接的に関係することが予測される。３つの類似体はこの領域から合成された（表１、配列番号：１８、１９および２０参照）。ＡＴ１３２は拘束された天然の配列を表す。この類似体のモデル化は、意図するループが安定に形成されないことを示唆した。この不安定性を補正するために、プロリン（比較的剛性の、回転促進残基）を導入して高度に柔軟性なグリシル残基を置換することによって、ＡＴ１３３は設計された。ＡＴ１３５はＡＴ１３３のより短い類似体であり、７０〜７５ループの中央部分にフランクする残基の寄与をプローブすることを意図する。
【００３７】
最後に、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８のＣＤＲ３類似領域を利用した（配列番号：２１〜３０）。ＣＴＬＡ−４Ｉｇのこの領域における単一の部位特異的突然変異は、Ｂ７に対する結合を完全に阻害する（Ｐｅａｃｈ他、１９９４）。しかしながら、この領域からの類似体の設計は多少のむずかしい操作の問題を提示した。この領域からの中央のヘキサペプチドは、ＭｅｔＴｙｒＰｒｏＰｒｏＰｒｏＴｙｒ（配列番号：３１）である。これらは比較的疎水性の残基であり、そして三重のプロリンストレッチはコンフォメーション的に剛性である。ＣＴＬＡ−４／Ｂ７複合体の分子モデルにより、この領域は深い接触の部分であることが予測される。経験により、タンパク質−タンパク質の相互作用の最も有効なインヒビターは、結合事象の初期の「握手」の部分をまねる、静電的に活性な「誘導」配列を必要とする傾向がある。結局、類似体のＣＤＲ３パネルの操作において、種々の異なるアプローチを使用した。タンパク質のＣＤＲ３領域の回りの表面区域の分析において、それは正に帯電した電位により取り囲まれていることが示された。したがって、類似体の末端に向かってリジン、アルギニンおよびヒスチジンを組込んで、この正の電位をまね、かつ合成されたペプチドの溶解度の特性を促進させた。
【００３８】
ＡＴ１９９の特定の場合において、ハイブリッドの類似体を設計した。いくつかの異なる戦略をこの類似体の設計の中に組込んだ。第１に、類似体のアミノ末端およびカルボキシ末端の双方をフランクするシステインに隣接させて、４つの高度に帯電した（正に）残基を組込んだ。疎水性残基は親水性残基から離れる方向に動く傾向があるので、この設計は、また、ＭｅｔＴｙｒＰｒｏＰｒｏＰｒｏＴｙｒ（配列番号：３１）ループを正に帯電した残基から離れる方向に分離し、かつＣＤＲ３回転の正しい形成を促進することを意図した。天然のタンパク質中のＣＤＲ３領域に対して空間的に並列されかつＢ７に対する結合に関係する残基をまねるように、フランキング残基を選択した。それらは、また、静電的接触の重要な部位を表す。類似体のアミノ末端におけるアルギニンは、天然のタンパク質におけるＡｒｇ３３の模擬物である。ペプチドのカルボキシ末端におけるヒスチジン残基は、ＣＤＲ３領域の直接下に横たわるタンパク質のアミノ末端におけるＨｉｓ２を模擬することを意図する。
【００３９】
ペプチドＡＴ２００およびＡＴ２０１は、ＡＴ１９９の対照として設計された。以前に、Ｐｅａｃｈ他（１９９４）は、ＣＤＲ３領域におけるアラニン残基に対するメチオニン残基の単一の置換がＢ７に対するＣＴＬＡ−４Ｉｇの結合を完全に阻害することを示した。したがって、ＭｅｔがＡｌａ残基で置換されている以外、ＡＴ２００は配列がＡＴ１９９と同一である。また、Ｍｅｔが柔軟なＧｌｙ残基で置換されている以外、ＡＴ２０１は配列がＡＴ１９９と同一である。
【００４０】
本発明のペプチド模倣物は、この分野においてよく知られている任意の方法により、特に自動化固相ペプチド合成および引き続くクロマトグラフィーの精製により、製造することができる。さらに詳しくは、実施例の節に開示されている方法は、このようなペプチドの製造および好ましくは環化に従うことができる。
【００４１】
本発明によるＣＤ８０およびＣＤ８６とのＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４の相互作用の阻害により改善される病理および障害を治療する医薬組成物は、活性成分として、実質的に精製されたペプチド模倣物を含有する。ペプチド模倣物が配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４、配列番号：１９、および配列番号：２０のアミノ酸配列の１以上を含むかどうかに依存して、本発明による医薬組成物は、ペプチド模倣物の中に既に存在しない配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４、配列番号：１９、および配列番号：２０から選択されるアミノ酸配列を有する１以上の別のペプチドをさらに含むことができる。
【００４２】
本発明によるペプチド模倣物を予防剤、治療剤または診断剤として好都合に使用することができる病理および疾患の例は、免疫系の疾患および癌である。特定の非限定的再は、自己免疫疾患、例えば、乾癬、多発性硬化症、エリテマトーデス、糖尿病、慢性関節リウマチ、および充実器官および細胞の移植片を包含する移植片の拒絶反応の療法を包含する。
【００４３】
本発明のそれ以上の目的および利点は、下記の記載において明らかとなるであろう。
【００４４】
本発明の１つの態様は、ＣＤ８０およびＣＤ８６とのＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４の相互作用の阻害により改善される病理および障害を発生する危険にある患者に、あるいはこのような病理および障害を既に示す患者に、薬理学的に活性な量の本発明のペプチドを投与することである。
【００４５】
活性成分と適合性の任意の投与の経路を使用することができるが、非経口的投与は、全身的効果を短い期間で達成することができるので、特に好ましい。非経口的投与は多数の異なる経路により実施することができ、このような経路下記のものを包含するが、これらに限定されない：皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、脳内、鼻内、経口、経皮、または経頬の経路。
【００４６】
理解されるように、投与すべきペプチドの量は、年齢、性別、健康、体重、同時の治療の種類、および治療の頻度に依存するであろう。当業者は理解しかつ決定するように、個々の患者に対して投与量は調節されるであろう。投与量は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重であることができる。
【００４７】
活性成分および適当なベヒクルを含有する非経口的使用のための医薬組成物は、注射可能な形態で製造することができる。非経口的使用のためのベヒクルはこの分野においてよく知られており、そして、例えば、水、生理食塩水および生理学的緩衝液を包含する。ベヒクルは、溶液の安定性および等張を維持するために、少量の賦形剤を含有することができる。
【００４８】
医薬組成物の調製は、通常の理学療法に従い実施することができ、そして好ましくはペプチドの含量は１０ｍｇ／ｍｌ〜１，０００ｍｇ／ｍｌの範囲であろう。
【００４９】
下記の実施例および添付図面により、本発明を詳細に説明する。これらはいかなる方法おいても本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。
【００５０】
実施例１：ペプチドの合成
後述するように、標準的Ｆｍｏｃ手順を使用して、３４のペプチドの合成し、ここで略号は次の通りである：
アセトニトリル（ＡＣＮ）、ベンジル（ＢＺＬ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、５，５’−ジチオビス［２−ニトロ安息香酸］（ＤＴＮＢ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、２−［１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル］−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニル（ＰＭＣ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、トリフェニルメチル（ＴＲＴ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ヘプタ−フルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）。
【００５１】
樹脂
使用した主要な樹脂は、リンクアミドメチルベンジルヒドリルアミン樹脂であり、これはＣ末端のアミドを使用してペプチドを合成するための標準的支持体である。Ｃ末端の遊離カルボン酸の終了を必要とするペプチドについて、結合した第１のＦｍｏｃアミノ酸を有するワング（Ｗａｎｇ）樹脂を使用する。ワング樹脂はｐ−ベンジルオキシベンジルのハンドルを含有し、Ｆｍｏｃ固相合成の戦略によりペプチド酸を製造するための支持体である。双方の型の樹脂をノババイオケム（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｍ）から購入した。
【００５２】
合成において使用したアミノ酸
【００５３】
【表２】
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【００５４】
鎖の組立て
最初にアプライド・バイオシステムス・インコーポレーテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）の４３１Ａ型ペプチド合成装置またはレイニン・シンフォニー・マルチプルペプチド合成装置（Ｒａｉｎｉｎ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｈｅｓｉｚｅｒ）を使用してＦＭＯＣ法により、保護されたペプチド鎖を組立てる。双方の合成装置は塩基−不安定性ＦＭＯＣアミノ酸を利用し、適当な側鎖保護基、Ｎ末端の脱保護のためのに２０％のピペリジンおよびアミノ酸の活性およびカップリングのためにＨＢＴＵを使用する。
【００５５】
切り放し／抽出
側鎖の保護基を除去し、そしてペプチドから樹脂から解放するために使用する標準的切り放しカクテル：混合物Ａ：９５％のＴＦＡ、５％の脱イオン水。
【００５６】
アルギニン、メチオニン、トリプトファンまたはトリチル保護基（システイン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン）を有するアミノ酸を含まないペプチドについて：混合物Ｂ：８２．５％のＴＦＡ、５％のフェノール、５％の脱イオン水、５％のチオアニソール、２．５％のエタンジチオール。
【００５７】
アルギニンまたはメチオニンを含有するペプチドについて：混合物Ｂ’：８７％のＴＦＡ、４．３％の脱イオン水、４．３％のチオアニソール、４．３％のエタンジチオール。
【００５８】
アルギニンまたはメチオニンを有するペプチドのための別のカクテル：混合物Ｃ：９５％のＴＦＡ、２．５％の脱イオン水、２．５％のエタンジチオール。
【００５９】
アルギニンまたはメチオニンを含まず、トリプトファンまたはトリチル保護基を含有するペプチドについて：切り放し反応は２０ｍｌのガラス容器の中に入れられ、氷浴中で冷却された、１００ｍｇ〜１ｇのペプチド−樹脂を使用することによって実施される。切り放しカクテルを調製し、また、氷浴中で冷却し、次いでペプチド−樹脂にほぼ１０ｍｌの最終体積となるように添加した。容器を氷浴から取出し、室温に放温する。容器にキャップをし、反応混合物を室温において１．５時間撹拌する。１．５時間後、中程度〜粗い多孔度のフィルターを通して溶液を真空濾過して、ほぼ３０ｍｌの冷ＭＴＢＥ（メチル−ｔ−ブチルエーテル）中に入れる。反応器を１ｍｌのＴＦＡで洗浄し、同一フィルターを通して濾過して冷ＭＴＢＥ中に入れる。次いで全体の懸濁液を５０ｍｌの遠心管に移し、室温において２０００ｒｐｍでほぼ１０分間遠心する。上清を吸引し、沈澱を４０ｍｌの冷ＭＴＢＥの中に再懸濁させ、再び遠心する。この工程をさらに１回反復する。最終の上清を吸引し、沈澱を窒素で処理して、残留するエーテルの大部分を蒸発させる。次いでペプチドを２０〜３０ｍｌの１％〜１０％の酢酸水溶液中に溶解し、ほぼ１００〜１５０ｍｌに脱イオン水で希釈し、シェル凍結させ、凍結乾燥する。
【００６０】
実施例２：環化
ジサルファイド結合のために２つのシステインを使用して設計されたペプチドを、これらの２つの方法の１つにおいてプロセスする。粗製のペプチドが分析用ＨＰＬＣにより少なくとも６５％の純度であり、有意な二次ピーク（主生成物の＞２０％）が存在しない場合、ペプチドをまず環化し、次いで精製する。これは設備において製造されるペプチドの約９０％を構成する。粗製のペプチドが有意な二次欠失生成物を有する場合、それを最初に精製し、次いで環化し、次いで再精製する。
【００６１】
環化の方法は空気酸化によるジサルファイド結合の形成である。２５ｍｇ〜１００ｍｇの粗製のペプチドをまず脱イオン水中に６〜１０ｍｌ／ｍｇペプチドの比で溶解させる。撹拌しながら、溶液のｐＨを１．０ＭのＮＨ４  ＨＣＯ３  （ｐＨ８．５）でほぼ８．３に上昇させる。この溶液を室温において十分に撹拌して容器の底部付近に到達する渦を発生させながら、一夜撹拌する。次の日（ほぼ１８〜２４時間）に、分析用逆相ＨＰＬＣにより保持時間の特徴的変化およびジサルファイド結合のための２８０ｎｍにおける吸収について、ペプチドの環化を検査する。次いで溶液を凍結乾燥し、貯蔵するか、あるいは調製用逆相ＨＰＬＣ上に直接負荷することによって精製する。
【００６２】
精製
１．逆相調製用ＨＰＬＣ
注：特質がいっそう疎水性である傾向があるペプチドは、ＴＦＡの代わりにＨＦＢＡを使用して精製して、最終生成物のクロマトグラフィーによる分割を改良する。
【００６３】
条件：システム−ウォーターズデルタ・プレプ（ＷａｔｅｒｓＤｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ）４０００  カラム−Ｖｙｄａｃ逆相Ｃ１８、１０μｍ、２．２×２５ｃｍ
（Ｃａｔ  Ｎｏ．２１８ＴＰ１０２２）
緩衝液−Ａ：水／０．１％ＴＦＡ  Ｂ：アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ
流速−１５ｍｌ／分
検出−ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）４８４ＵＶ検出器、２２０ｎｍ
勾配−可変、通常０．３３％Ｂ／分〜１．０％Ｂ／分
５０〜１００ｍｇのペプチドを２００ｍｌの水性０．１％ＴＦＡ中に溶解することによって、凍結乾燥された粗製のペプチドを製造する。既にｐＨ８〜８．５の溶液中の環化されたペプチドをまず純粋なＴＦＡで失活させて、ｐＨを２〜３の範囲の低下させる。次いでペプチド溶液を「Ａ」緩衝液溜ラインを通して調製用カラム上に直接負荷し、そして勾配のプログラムを開始する。収集された画分をオートサンプラーの分析用ＨＰＬＣシステム上に一夜展開させる。ピークの積分により＞９５％の純度であると判定されたオーバーラップする画分をプールし、凍結乾燥する。
【００６４】
セプ・パク（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）精製
条件：装置−ベイカー（Ｂａｋｅｒ）固相抽出
１２口のマニホールド
カラム−ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）Ｖａｃ  １２ｃｃ  ２ｇのセプ・パクカラム
緩衝液−Ｈ２  Ｏ／０．１％ＴＦＡ
２０％、３０％、５０％、９９．９％のアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液
１５〜２５ｍｇのペプチドを８ｍｌの水性０．１％ＴＦＡ中に溶解することによって、粗製のペプチドを製造する。セプ・パクカラムをまず３０ｍｌの９９．９％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡでコンディショニングし、次いで３０ｍｌのＨ２  Ｏ／０．１％ＴＦＡでコンディショニングする。ペプチド溶液を負荷し、次いでＨ２  Ｏ／０．１％ＴＦＡでさらに洗浄し、２０％または３０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ緩衝液で溶離する。最後に、５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡで洗浄して、完全な溶離を保証し、比較する。負荷の体積、Ｈ２  Ｏ洗浄液、２０％〜３０％アセトニトリルおよび５０％アセトニトリルの体積を別々に収集し、分析用ＨＰＬＣで検査する。次いで溶離されたペプチド溶液を脱イオン水で３：１に希釈し、凍結乾燥する。
【００６５】
実施例３：特徴づけ
１．分析用逆相ＨＰＬＣ（最終生成物の均質性を検査するため）
条件：システム−ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）５００ポンプ、７１７オートサンプラー多波長ＵＶ検出器
カラム−Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８、５μｍ、０．４５×２５ｃｍ
（Ｃａｔ  Ｎｏ．２１８ＴＰ５４）
緩衝液−Ａ：Ｈ２  Ｏ／０．１％ＴＦＡ  Ｂ：ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ
流速−１ｍｌ／分
検出−２１４ｎｍ、２８０ｎｍ
勾配−可変、２％Ｂ／分
０．２〜１．０ｍｇのペプチドを水性０．１％ＴＦＡ中に０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解することによって、精製された凍結乾燥されたペプチド試料を製造する。１５〜１８μｌをカラム上に注入し、０〜５０％ＡＣＮの勾配プログラムにより２５分で溶離する。クロマトグラムのデータを収集し、ウォーターズ・エクスパート−イーズ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｅｘｐｅｒｔ−ｅａｓｅ）ソフトウェアシステムで貯蔵する。
２．質量分析（均質性および共有結合の構造を検査するため）
システム：パーセプティブ・バイオシステムス・ボイアイガー・エライト（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ）
型：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックスアシステッドレーザー脱着／イオン化飛行時間）
マトリックス：アルファ−シアノ４−ヒドロキシケイ皮酸（Ｓｉｇｍａ、Ｃ−２０２０）、６７％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中の１０ｍｇ／ｍｌ
ペプチド試料を５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中で１〜１０μｍｏｌの濃度で調製する。分析プレートのウェルに０．５μｌのペプチド試料を適用し、次いで０．５μｌのマトリックス溶液を適用し、乾燥させる。分析プレートを機械の中に装填し、試料を走査し、反射遅延抽出法により分析する。各試料について、３２〜１２８のレーザーショットからの集積データの信号を収集し、分析する。各実験は目盛定めのために標準ペプチドを有する試料のウェルを含む。
３．エルマン試薬試験（ジサルファイド結合の環化を検査するため）
２８０ｎｍの波長における高い吸収のために、その波長におけるＨＰＬＣ  ＵＶ検出により、トリプトファンまたはチロシンを含有するペプチドのジサルファイド結合の環化を検査することができない。システイン側鎖の遊離スルフヒドリル基の存在についてのエルマン試薬試験は、ジサルファイド結合の形成の別のインジケーターである。
【００６６】
ペプチドを反応緩衝液（０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８）中で０．５ｍｍｏｌの濃度において調製する。同一反応緩衝液中で、エルマン試薬、ＤＴＮＢ、を４ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、そしてシステイン塩酸塩一水和物の標準を０．５ｍｍｏｌの濃度で調製する。２５０μｌの試料、５０μｌのエルマン試薬および２．５ｍｌの反応緩衝液を混合し、室温において１５分間インキュベートする。また、反応緩衝液のブランク試料およびシステインの標準試料を試験する。黄色は遊離スルフヒドリル基の存在を示す。
【００６７】
実施例４：ヒト混合リンパ球の応答（ＭＬＲ）
ＰＢＬＳの単離：ドナーから全血をインターステイト・ブラッド・バンク（ＩｎｅｒｓｔａｔｅＢｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ、テネシー州メンフィス）から入手した。ＣＤＣ／ＮＩＨマニュアルＢｉｏｓａｆｅｔｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、第３版、１９９３、ｐ．１０において、潜在的に感染性の血液検体について推奨されるように、生物安全性２の汚染設備において、血液の試料を取扱った。フィコール−ハイパーク精製により、赤血球および顆粒球から末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。全末梢血をＰＢＳ中で１：２に希釈し、３０ｍｌを５０ｍｌのポリプロピレン管中の１５ｍｌのフィコール−ハイパーク上にオーバーレイした。管を２５℃において４００×ｇで３０分間回転させた。遠心後、上の血漿層と下のフィコール層との間の界面を収集し、細胞をＲＰＭＩ  １６４０中で２回洗浄し、トリパンブルーを使用して生存可能な計数を測定した。アッセイにおいてレスポンダーとして使用すべき細胞を、刺激因子の細胞のミトマイシンＣ処理が完結するまで、氷上で貯蔵した。
刺激因子のミトマイシンＣ処理
アッセイにおいてレスポンダーとして使用すべき、前述したように単離された、ＰＢＭＣを完全培地（１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２ｍＭグルタミン酸、５０μＭ２−メルカプトエタノールおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン−１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ  １６４０）中で２〜４×１０６  細胞／ｍｌに調節し、そして３７℃の水浴中でミトマイシンＣ（２５μｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。処理後、細胞を５体積の完全培地で３回洗浄し、トリパンブルーを使用して生存可能な計数を測定した。オートロガス刺激対照を構成するために、多少のレスポンダー細胞をまた前述したように処理した。
ＣＴＬＡ−４Ｉｇおよびペプチド
精製されたＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合タンパク質を、Ｓｔｅｕｒｅｒ他、１９９５に記載されているように、Ｔ．Ｓｔｒｏｍ博士（Ｂｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、マサチュセッツ州ボストン）から提供されたＮＳ−１細胞系統から、無菌のＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌ溶液として製造した。このタンパク質を−８０℃において凍結貯蔵した。融解したとき、アリコートを４℃において貯蔵した。精製されたペプチドを既知の手順に従い凍結乾燥した。ペプチドを無菌のＰＢＳ、ｐＨ７．４中で２ｍＭの濃度で再構成し、マイクロフージ管の中にアリコートを採り、−２０℃において凍結貯蔵した。アッセイのために、ペプチドをアリコートを融解し、完全培地中で２００μＭに希釈した。
混合リンパ球応答アッセイ（ヒト）
一方向同種異系混合リンパ球応答（ＭＬＲ）アッセイのために、９６ウェルの丸底プレート中でレスポンダー細胞を１０５  細胞／ウェルでプレートし、刺激因子細胞を５×１０４  細胞／ウェルでプレートした。細胞を抗ＣＤ４  Ａｂ  Ｌｅｕ  ３Ａ（１μｇ／ｍｌ−０．０６μｇ／ｍｌ）の連続希釈物と三重反復実験において、またはイソ型合致対照Ａｂとインキュベートした。シクロスポリンＡを１μｇ／ｍｌにおいて追加の対照として使用した。
【００６８】
ＣＴＬＡ−４Ｉｇを連続希釈し、１０μｇ／ｍｌ〜０．１５μｇ／ｍｌを試験した。ペプチドを直接、あるいは０．５μｇ／ｍｌにおける一定スパイクインの投与量のＣＴＬＡ−４Ｉｇの存在において試験した。プレートを３７℃において加湿５％ＣＯ２  雰囲気中の７日間インキュベートした。
【００６９】
ウェルを  ３Ｈ−Ｔｄｒ（１μＣｉ／ウェル）でアッセイの最後の１８時間の間パルスすることによって、細胞の増殖を測定した。プレートをトムテク（Ｔｏｍｔｅｃ）プレート収集器で収集し、そしてワラック（Ｗａｌｌａｃ）マイクロベータプレート＋リーダーで計数を測定した。
マイトジェン刺激アッセイ
これらのアッセイのために、フィコール−ハイパーク精製したＰＢＭＣ（１０５  細胞／ウェル）を平らな底の９６ウェルの組織培養プレート中で示された濃度のフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；５、２．５、１．２５、０．５μｇ／ｍｌ）と３７℃において加湿５％ＣＯ２  ／空気のインキュベーター中で３日間インキュベートした。細胞を種々の濃度のＣＴＬＡ−４Ｉｇ、精製された抗ＣＤ８０ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ８６ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）、およびペプチド１９９および２０１（１００μＭ〜１２．５μＭで連続希釈された）の存在または不存在においてアッセイ期間の間インキュベートした。
【００７０】
ウェルを  ３Ｈ−Ｔｄｒ（１μＣｉ／ウェル）でアッセイの最後の６時間の間パルスすることによって、細胞の増殖を測定した。プレートをトムテク（Ｔｏｍｔｅｃ）プレート収集器で収集し、そしてワラック（Ｗａｌｌａｃ）マイクローブプレート＋リーダーで計数を測定した。
【００７１】
実施例５：ネズミＭＬＲ
刺激因子としてＣ５７Ｂ１／６マウスの脾細胞およびレスポンダーとしてＢａｌＢ／ｃ脾細胞を使用して、一方向ネズミＭＬＲを実施した。
マウス脾細胞の単離
６〜８週齢のマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メイン州バールハーバー）から、脾臓を切除した。細胞を無菌のつや消しガラスのスライドを使用して莢膜から分離し、冷ＲＰＭＩ  １６４０中で１回洗浄した。脾細胞懸濁液を冷Ｔｒｉｓ塩化アンモニウム緩衝液（２ｍｌ／脾臓）で氷上で３分間処理することによって、赤血球を溶解した。溶解後、細胞を５体積の完全培地（１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２ｍＭグルタミン酸、５０μＭ２−メルカプトエタノールおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン−１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１ｍＭの非必須アミノ酸を含有するＲＰＭＩ  １６４０）中で２回洗浄した。
【００７２】
完全培地中で細胞濃度を３×１０６  細胞／ｍｌに調節し、細胞を３７℃においてＴ−７５フラスコ中で１．５〜２時間インキュベートすることによって、プラスチック付着性細胞をＢａｌＢ／ｃマウスの脾細胞から除去した。インキュベーション後、フラスコをおだやかに洗浄することによって、非付着性細胞を収集し、回収％を測定した（６０〜７０％）。刺激因子のミトマイシンＣ処理が完結するまで、ＢａｌＢ／レスポンダー細胞を氷上で貯蔵した。
刺激因子のミトマイシンＣ処理
赤血球溶解後、Ｃ５７Ｂ１／６マウスの脾細胞を完全培地中で２〜４×１０６  細胞／ｍｌに調節し、そして３７℃において加湿５％ＣＯ２  ／空気の雰囲気中でミトマイシンＣ（５０μｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。処理後、細胞を５体積の完全培地で３回洗浄し、トリパンブルーを使用して生存可能な計数を測定した。
【００７３】
オートロガス刺激対照を構成するために、多少のレスポンダー細胞をまた前述したように処理した。混合リンパ球応答アッセイ（ネズミ）
アッセイのために、レスポンダーおよび刺激因子の細胞を９６ウェルの丸底プレート中で１０５  細胞／ウェルでプレートした。細胞を抗ＣＤ４Ａｂ（５０ｎｇ／ｍｌ〜０．０５ｎｇ／ｍｌ）の連続希釈物と三重反復実験において、またはイソ型合致対照Ａｂとインキュベートした。シクロスポリンＡを１μｇ／ｍｌにおいて追加の対照として使用した。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ペプチド１９９および２０１を連続希釈し、１００μＭ〜１．５６μＭの最終濃度において試験した。１０μｇ／ｍｌから連続希釈したＣＴＬＡ−４ＩｇをＭＬＲ阻害のための陽性の対照として使用した。
【００７４】
適当なスクランブルしたペプチドの対照およびマトリックスの対照をアッセイ毎にインキュベートした。ウェルを  ３Ｈ−Ｔｄｒ（１μＣｉ／ウェル）でアッセイの最後の６時間の間パルスすることによって、細胞の増殖を測定した。前述したように、プレートを収集し、そして組込まれた計数を計数を測定した。
【００７５】
実施例６：ヒトＭＬＲ中のペプチドの生物学的スクリーニングおよびＣＴＬＡ−４Ｉｇ結合アッセイ
合計３４のペプチドをヒトＭＬＲにおけるリンパ球増殖の阻害について試験した。各ペプチドをＭＬＲにおいて１２．５〜１００μＭの範囲の投与量で試験した。ＭＬＲ中のリンパ球増殖（ｃｐｍｓ）を阻害する能力に依存してペプチドに＋および−を割り当てることによって、各ペプチドの活性を同定した。
【００７６】
試験したペプチドのすべての濃度が＜１５％のｃｐｍの変化を与えた場合、−を割り当てた。
【００７７】
ペプチドにより引き起こされた阻害の程度に依存して、＋、＋＋、または＋＋＋を割り当て、ここで
試験したペプチドの濃度が＞２０％のｃｐｍの変化を与えた場合、＋を割り当て、
試験したペプチドが投与量依存的方法で＞２５％のｃｐｍの変化を与えた場合、＋＋を割り当て、そして
試験したペプチドが投与量依存的方法で＞５０％のｃｐｍの変化を与えた場合、＋＋＋を割り当てた。ＭＬＲに加えて、これらの３４のペプチドを、また、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ／Ｂ７結合アッセイにおいて評価し、ここでＣｅｓｓ  Ｂ細胞上のＢ７に対するＣＴＬＡ−４Ｉｇの結合に影響を与える、これらのペプチドの能力をＦＡＣＳ分析により検査した。
【００７８】
ＭＬＲを使用するときのように、Ｃｅｓｓ  Ｂ細胞に対するＣＴＬＡ−４Ｉｇの結合に影響を与えるペプチドの能力に依存して各ペプチドに＋および−を割り当て、ここで−は結合の変化がないことを表し、＋は結合の＜１０％の小さい変化を表し、そして＋＋は結合の＞２０％変化を表す。ＭＬＲおよびＢ７結合の分析結果を表３に示す。
【００７９】
【表３】
2009029833.tif 000005
【００８０】
各ペプチドからのデータをバイアスなしで分析し、こうしてペプチドが＋１または−を割り当てられたかどうかを決定するとき、以前のアッセイからの結果を考慮しなかった。
【００８１】
上記表から理解できるように、小さい数のみのペプチドはこれらのアッセイのいずれにおいても活性を示した。ＭＬＲまたは結合アッセイにおいて活性を示したペプチド（ＡＴ＃：１０６、１０７、１２８、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１９９）を数回再試験して、最初の観測が再現性であるかどうかを決定した。
【００８２】
この分析の累積結果に基づいて、ＭＬＲまたは結合アッセイ、または双方において半再現性の阻害を示したペプチドをそれ以上の分析のために選択した。選択されたペプチドはＡＴ１０６、１２８、１３３、１３５、および１３６、および後に、ＡＴ１９９であった。
一次スクリーニングからの陽性のペプチドの分析（ＡＴ１０６、１２８、１３３、１３５、および１３６）
ペプチドＡＴ１０６、１２８、１３３、１３５、および１３６は一次スクリーニングの間にＭＬＲおよび／または結合アッセイにおいて多少の活性を示したので、これらのペプチドをそれ以上の分析のために使用した。これらのペプチドを、単独で、あるいは組合わせで、ＭＬＲおよび結合アッセイにおいて再試験した。２回のＭＬＲにおいて、これらのペプチドそれら自体のいずれも２００μＭまでの濃度においてＭＬＲに対して首尾一貫した作用をもたなかった。これらの同一ペプチドは、Ｃｅｓｓ  Ｂの結合アッセイにおいて分析したとき、ＣＴＬＡ−４Ｉｇの結合に対する作用を示さなかった。
ＡＴ１９９の同定および評価
我々のスクリーニングの努力の過程の間に、最後の３つの試験したペプチドはペプチド１９９、２００、および２０１であった。１００μＭまでの投与量範囲におけるＡＴ１９９、２００、および２０１の活性を比較する２つのヒトＭＬＲの結果を第６図および第７図に示す。
【００８３】
一方のＭＬＲにおいて理解できるように、ＡＴ１９９は約７０％だけリンパ球の増殖を阻害したが、他方のＭＬＲにおいて、それは約３０％だけ阻害した。リンパ球の増殖の程度（３０，０００ｃｐｍ）は双方のアッセイにおいて同一であった。このＭＬＲにおけるより低い濃度のＡＴ１９９について我々は説明しなかったが、同様な傾向がＣＴＬＡ−４Ｉｇについて観測され、そしてこれらの傾向はＭＬＲを発生させるために使用した細胞の開始の関数であろう。ＡＴ１９９が双方ＭＬＲを効果的に阻害しなかったことは、このペプチドが細胞障害性ではなく、そしてＡＴ１９９の活性が生物学的で有意であることを示唆する。ＡＴ１９９を合計６回のヒトＭＬＲアッセイにおいて試験し、そしてそれは６つのうちの５つにおいて活性であった。
【００８４】
これらの類似体の各々の質量分析において、期待した質量が得られたが、ＡＴ１９９は有意な比率の線状生成物（３２％）を含有した。
【００８５】
ＡＴ１９９の観測された活性は合成の人工物のためではないことが示され、そして再折りたたみされた類似体または遊離の線状形態の類似体のとちらががＭＬＲにおいて見られた阻害挙動をなすかを区別するために、ＡＴ１９９の３つの新しいバッチを製造した。
【００８６】
ＡＴ１９９．２ＡはＡＴ１９９．１の再合成物であり、ここで再折りたたみ条件を５日間に延長し、そして再折りたたみ緩衝液のｐＨをｐＨ８．５からｐＨ１０．０に上昇させて、この手順の効率を促進した。
【００８７】
ＡＴ１９９．２Ｂをヨードアセトアミドで処理して、純粋に線状の類似体を精製した。この手順は遊離のスルフヒドリルを硫黄の簡単なアルキル化により修飾し、こうしてシステインを立体障害性でないようにするが、システインは反応性ではなく、またジサルファイド架橋の形成のために利用されないようにした。
【００８８】
ＡＴ１９９．３は、もとのプロトコールを変化なしで使用した、ＡＴ１９９．１の再合成物であった。表４に、合成されたＡＴ１９９の類似体の要約を示し、そして共有結合的に環化された集団と遊離の線状の集団との間の均衡を確認する定量的エルマン反応の結果を示す。
【００８９】
【表４】
2009029833.tif 000006
【００９０】
ＡＴ１９９の新しく合成されたバッチを使用して、ＡＴ１９９の線状集団または環化された集団のどちらがこの類似体を使用する活性に関係するかどうかをいっそう詳しく処理した（注−同定手順を使用しので、ＡＴ１９９．３がＡＴ１９９．１よりも効率的に環化された理由は不明瞭である）。遊離のスルフヒドリルを含有する線状ペプチドの集団は、もとのバッチに関して、ＡＴ１９９．３類似体におけるより１桁減少した。前のＭＬＲにおいて観測された活性が遊離の線状類似体のためであった場合、ＡＴ１９９．３における活性の劇的減少が見られることが期待されるであろう。アルキル化されたＡＴ１９９．２Ｂに関連する阻害のプロフィルは、観測された活性がコンフォメーション的にの特異性に関係するするか否かを我々に教示することができるであろう。
ヒトＭＬＲにおけるＡＴ１９９．３、ＡＴ１９９．２ＡおよびＡＴ１９９．２Ｂの評価
前述したように、ＡＴ１９９の他の合成を実施する（１９９．３）と同時に、ＡＴ１９９の線状（１９９．２Ｂ）および完全に環化された（１９９．２Ａ）バージョンを発生させた。これらのペプチドを、異なるヒトＭＬＲにおいて、ペプチドＡＴ２０１との比較においてかつＣＴＬＡ−４Ｉｇ（０．５μｇ／ｍｌ）の存在および不存在において評価した。
【００９１】
ＡＴ１９９．３およびＡＴ１９９．２Ａは、１００μＭで１つのＭＬＲにおいて、それぞれ、ＭＬＲ３０％および５０％阻害し、そして他のＭＬＲにおいて、それぞれ、７０％および２５％阻害した。ＡＴ１９９．２Ｂは、他方において、ＭＬＲにおいて試験したより高い濃度（１００μＭ）で＜１０％阻害した。この結果から、ＡＴ１９９は活性であるためには環化されたコンフォメーションを必要とすると我々は結論する。
【００９２】
また、これらのペプチドを他の２つのＭＬＲにおいて活性について試験し、ここでＣＴＬＡ−４Ｉｇを０．５μｇ／ｍｌでスパイクインした。これらの研究の１つの結果を第８図に示す。
【００９３】
ＡＴ１９９．３は、０．５μｇ／ｍｌのＣＴＬＡ−４Ｉｇを添加したとき、ＣＴＬＡ−４Ｉｇそれ自体を超えてＭＬＲを阻害した。また、ＡＴ１９９．２ＡはＣＴＬＡ−４Ｉｇと組み合わせて添加したとき加法的であったが、ＡＴ１９９．２Ｂおよびペプチド２０１はＣＴＬＡ−４Ｉｇと組み合わせて添加したとき作用をもたなかった。これらの結果が示すように、環化されたＡＴ１９９はヒトＭＬＲの阻害において活性を有し、ＣＴＬＡ−４Ｉｇの作用を増強することができる。
ネズミＭＬＲにおけるＡＴ１９９の評価
ＣＴＬＡ−４Ｉｇの一次配列はヒトとマウスとの間で非常に類似する。ネズミＣＴＬＡ−４Ｉｇをこれらの研究において使用してヒトＭＬＲを阻害した。したがって、ＡＴ１９９の活性をネズミＭＬＲについて試験した。この研究の結果を第９図に示す。
【００９４】
ＡＴ１９９．３はネズミＭＬＲを約８５％阻害し、これは１０μｇ／ｍｌのＣＴＬＡ−４Ｉｇそれ自体による阻害に類似した。この同一アッセイにおいてペプチド２０１はわずかに約２５％阻害した。したがって、ＣＴＬＡ−４Ｉｇと同様に、ＡＴ１９９はヒトおよびヒトの双方の系において活性であるように思われる。
ＡＴ１９９および２０１ペプチドの毒性の評価
ＡＴ１９９の活性がＭＬＲにおけるリンパ球の増殖に対する特異的作用のためであるか、あるいは一般にリンパ球の増殖の非特異的阻害（すなわち、毒性）であるかどうかを決定するために、ＡＴ１９９の毒性をＴＨＰ−１、Ｊｕｒｋａｔ、および休止および活性化されたＰＢＬに対して試験した。これらの実験の結果を第１０図に示す。
【００９５】
第１０図において見られるように、ＴＨＰ−１、Ｊｕｒｋａｔ、および休止する一次ＰＢＬの阻害は１００μＭのＡＴ１９９の存在において観測されなかった。
【００９６】
ＡＴ１９９をＰＨＡ活性化されたＰＢＬの阻害について試験した。ＰＨＡ活性化は、ＣＤ２８経路に特異的にターゲッティングされず、リンパ球の活性化に使用されたＰＨＡの濃度に依存してこの経路に対する多少の依存性を有する。ＣＤ２８のシグナリングに対するフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）活性化のＡＴ１９９の作用を決定するために、ＣＴＬＡ−４Ｉｇを各アッセイに含めた。
【００９７】
代表的なＰＨＡの活性化に対するＡＴ１９９の作用を第１１図に示す。第１１図において理解できるように、１０μｇ／ｍｌのＣＴＬＡ−４Ｉｇは双方の濃度ＰＨＡ（２．５および５μｇ／ｍｌ）のＰＨＡの活性化を約４０〜５０％だけ阻害した。他方において、ＡＴ１９９はこの実験においてＰＨＡ活性化の阻害に対してわずかに小さい作用をを有し、この特定のドナーからのリンパ球のＰＨＡ活性化がＣＤ２８経路を通して部分的にのみ働いていたことを示唆した。したがって、ＡＴ１９９はリンパ球に対して毒性ではなく、Ｂ７／Ｂ２８経路に対して作用するＣＴＬＡ−４Ｉｇよりも低い潜在能力を有するように思われる。
【００９８】
ＣＤＲ３ドメイン誘導されたＡＴ１９９は、ＭＬＲそれ自体において、有意な、再現性ある阻害を示すことがアッセイされた、３４の類似体のうちの唯一のペプチドであった。阻害は投与量依存性であり、５０〜１００μＭの間の見掛けのＩＣ５０を示した。Ｐｅａｃｈ他（１９９４）は、ヒトＣＴＬＡ−４のＣＤＲ３領域におけるＡｌａへの単一のＭｅｔ置換がＢ７に結合するペプチドの能力を壊滅させることを示した。この観察に基づいて、ＭｅｔがＡｌａ（ＡＴ２００）またはＧｌｙ（ＡＴ２０１）に交換された、ＡＴ１９９の２つの対照のペプチドを合成した。これらの単一のアミノ酸配列の変化以外、対照のペプチドはＡＴ１９９と同一であった。これらの対照のペプチドはＭＬＲのいずれをもそれらがアッセイされたＡＴ１９９と同程度に多く阻害しなかった。したがって、ＡＴ１９９はＭＬＲを阻害する能力において配列特異性を示すように思われる。
【００９９】
ＡＴ１９９をヨードアセトアミドで処理して、ジサルファイド架橋を形成できないように、ペプチド上の硫黄をアルキル化した。この線状ペプチドＡＴ１９９．２Ｂは、ＭＬＲの増殖に対して作用をもたなかった。したがって、ＡＴ１９９はコンフォメーション的にの特異性を有するように思われる。
【０１００】
ＡＴ１９９およびその対照の類似体を、明白な毒性および非特異的阻害についてアッセイした。ペプチドをＴＨＰ−１細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞および一次末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の増殖培地に添加した。これらの細胞培養物のいずれの増殖に対しても作用は観測されず、ＭＬＲにおいて観測された阻害は毒性のためではないことが示された。
【０１０１】
阻害の予測されないメカニズムについて試験するために、ＰＢＬのＰＨＡ刺激を使用して、ＡＴ１９９をアッセイした。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）は赤インゲンマメから抽出されたレクチンであり、５つのテトラマーの糖タンパク質の混合物である。ＰＨＡはアクセサリー細胞の存在において種々の重大なＴ細胞表面分子、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８およびＬＦＡ−１と架橋することによって、Ｔ細胞を刺激する（しかしＢ細胞を刺激しない）（Ｇｅｐｐｅｒｔ、１９９２）。この刺激におけるＣＤ２８の関与は、ＰＨＡによる架橋の程度に依存する。ＰＨＡの適当な濃度において、細胞表面のレセプターの同時のエンゲイジメントは、特異的共同刺激シグナル、例えば、ＣＤ２８の必要性をバイパスさせることができる増殖の応答を生ずる。これはＰＨＡ突然変異誘発のＣＴＬＡ−４Ｉｇの阻害を検査することによって、モニターすることができる。ＭＬＲが劇的に阻害される同一条件下で、ＡＴ１９９はＰＨＡ刺激されたＴ細胞を阻害しなかった。したがって、このデータはＴ細胞の活性化の特定の面に向けられた生物学的効果と一致する。
【０１０２】
３４のペプチドを使用して本明細書において報告されたデータから、ＣＤ２８依存的ヒト免疫応答を単独で阻害する少なくとも１つのペプチド（ＡＴ１９９）が単離されたことを結論することができる。
【０１０３】
本発明を完全に説明したが、理解されるように、当業者は本発明の精神および範囲から逸脱しないでかつ不都合な実験を実施しないで、広い範囲の同等のパラメーター、濃度、および条件の範囲内で本発明を実施することができる。
【０１０４】
本発明をその特定の態様に関して説明したが、それ以上の変更が可能であることが理解されるであろう。この出願は、一般に、本発明の原理に従い、本発明が関係する技術の範囲内の既知の慣用の実施から思い浮かぶような、この開示からの逸脱を包含し、添付された請求の範囲に従う、前述の必須の特徴に適用できる、本発明の任意の変形、使用、または適応を包含することを意図する。
【０１０５】
本明細書において引用するすべての参考文献は、雑誌の論文および要約、公開または非公開の米国特許出願および外国特許出願、発行された米国特許および外国特許、または任意の他の参考文献は、すべてのデータ、表、図面、および引用された参考文献において提示されたテキストを含めて、完全に引用することによって本明細書の一部とされる。さらに、本明細書において引用する参考文献内に引用された参考文献の全体の内容もまた完全に引用することによって本明細書の一部とされる。
【０１０６】
既知の方法の工程、慣用法の工程、既知の方法または慣用法の言及は、関係する技術において、本発明の任意の面、記載または態様が開示され、教示されているか、あるいは示唆されていることをいかなる方法においても認めることではない。
【０１０７】
特定の態様の以上の説明は本発明の一般的特質を完全に明らかにしているので、この分野の技量（本明細書において引用する参考文献の内容を包含する）を適用することによって、不都合な実験を実施しないで、本発明の一般概念から逸脱しないで、種々の応用、例えば、特定の態様を容易に変更および／または適応させることができる。したがって、このような適応および変更は、本明細書において提示した教示および指針に基づいて、開示された態様の意味および範囲内に入ることを意図する。本明細書における語句および用語は限定ではなく、説明を目的とするので、この明細書の用語および語句は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書において提示された教示および指針に照らして当業者により解釈されるべきであることを理解すべきである。
【０１０８】
参考文献
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【０１３８】
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【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】第１図は、ヘルパーＴ細胞の活性化の掛かり合いを概略的に図解する。
【図２】第２図は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４の分子のモデル化に使用されるＣＤ２８（配列番号：３３）、ＣＴＬＡ−４（配列番号：３４）、およびＲＥＩ（配列番号：３５）のアミノ酸配列の整列を示す。
【図３】第３図は、ＲＥＩ鋳型をベースとするＣＴＬＡ−４ホモダイマーのリボン線図形の分子のモデルを示す。
【図４】第４図は、ＭＣＯ抗体（配列番号：３７）のＩｇＧ重鎖を有するＢ７−１タンパク質（配列番号：３６）のアミノ酸配列整列を示す。
【図５】第５図は、ＣＴＬＡ−４モノマー／Ｂ７−１タンパク質複合体のリボン線図を示す。
【図６】第６図は、ヒトＭＬＲ（Ａ対Ｂ）におけるＡＴ１９９、２００および２０１ペプチドの評価の棒グラフを示す。
【図７】第７図は、ヒトＭＬＲ（Ｂ対Ａ）におけるＡＴ１９９、２００および２０１ペプチドの評価の棒グラフを示す。
【図８】第８図は、ヒトＭＬＲ（Ａ対Ｂ）におけるＡＴ１９９環化および線状ペプチドの評価の棒グラフを示す。
【図９】第９図は、ネズミＭＬＲにおけるＡＴ１９９および２０１ペプチドの評価の棒グラフを示す。
【図１０】第１０図は、ＴＨＰ−１、ＪｕｒｋａｔおよびＰＢＬ細胞におけるＡＴ１９９および２００ペプチドの毒性試験の棒グラフを示す。
【図１１】第１１図は、ＰＢＬのＰＨＡ仲介刺激に対するＡＴ１９９および２００ペプチドの作用の棒グラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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