(57)【要約】【課題】緑膿菌バイオフィルム形成に特異的作用を有する新規なワクチン抗原体を提供する。また、従来の複数の抗生物質に対して耐性を持つ緑膿菌を含む細菌及びそのバイオフィルム形成に有効に作用するワクチン抗原体を提供する。【解決手段】緑膿菌バイオフィルム形成に対するワクチン抗原体において、細胞外領域を含むペプチドを大腸菌で発現させ、これを精製して得られる膜貫通型構造を持つ因子を主成分とする。そして、前記因子は、緑膿菌のOmp85ホモログであって、１４回膜貫通型構造を持つ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外領域を含むペプチドを大腸菌で発現させ、これを精製して得られる膜貫通型構造を持つ因子を主成分とする緑膿菌バイオフィルム形成に対するワクチン抗原体。
【請求項２】
前記因子は、緑膿菌のOmp85ホモログであって、１４回膜貫通型構造を持つ因子であることを特徴とする請求項１に記載の緑膿菌バイオフィルム形成に対するワクチン抗原体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑膿菌を含む細菌によるバイオフィルム形成を阻害するワクチン抗原体に関し、特に、緑膿菌バイオフィルム形成に対して有効に作用するワクチン抗原体に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑膿菌は、シュードモナス属に属するグラム陰性好気性桿菌であり、自然界のいたる所に常在生息する細菌である。緑膿菌は、健常者に感染することは稀であるが、免疫力の低下した人には感染する日和見感染の一種である緑膿菌感染症の原因となる。
【０００３】
この緑膿菌を含む細菌は、環境中何らかの生物又は非生物の固体表面に付着しバイオフィルムの状態で存在している場合が多い。バイオフィルムとは、微生物により形成される高次構造体であり、バイオフィルム内では嫌気性菌や好気性菌等の微生物が一種のコミュニティを形成していると考えられている。一般に、バイオフィルム内の細菌は、単独の場合よりも抗生物質や免疫に対する抵抗性が高い。
【０００４】
緑膿菌に作用する抗生物質の例としては、従来からゲンタマイシンやカルベニシリン等が知られている。また、緑膿菌バイオフィルムの主成分であるアルギン酸を分解する酵素の使用も提案されているが（例えば、特許文献１参照）、これらの抗生物質や酵素は、緑膿菌を含む細菌バイオフィルム形成に対しての阻害効果は弱い。さらに、近年の緑膿菌は、複数の薬剤耐性を併せ持ち、今まで使用されてきた抗生物質に対する強い抵抗性を持つに至って来ている。
【０００５】
細菌バイオフィルムの消毒方法としては、抗生物質や酵素の他に、化学処理（酸化殺菌剤、塩素、オゾン等）及び物理的処理（熱湯、機械的掻き取り）があるが、緑膿菌は、種々のグラム陰性菌の中でも特に薬剤に対して元来強い自然耐性を持ち、化学物質による処理（例えば、特許文献２を参照）や物理的処理は、処理対象を損傷することからも限界があった。
【特許文献１】特開平９−００９９６２号公報
【特許文献２】特開平７−３１６０５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このため、本発明は、緑膿菌バイオフィルム形成に特異的作用を有する新規なワクチン抗原体を提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、従来の複数の抗生物質に対して耐性を持つ緑膿菌を含む細菌及びそのバイオフィルム形成に有効に作用するワクチン抗原体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このため、本発明は、細胞外領域を含むペプチドを大腸菌で発現させ、これを精製して得られる膜貫通型構造を持つ因子（以下、本願ではこれを「Opr86」という）を主成分とする緑膿菌バイオフィルム形成に対するワクチン抗原体を提供するものである。
【０００９】
そして、前記膜貫通型構造を持つ因子Opr86は、緑膿菌のOmp85ホモログであって、１４回膜貫通型構造を持つ因子である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、緑膿菌バイオフィルム形成に特異的作用を有し、従来の複数の抗生物質に対して耐性を持つ緑膿菌を含む細菌及びそのバイオフィルム形成に有効に作用する、緑膿菌バイオフィルム形成に対するワクチン抗原体を得ることができたのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
前述したように、細菌は環境中で何らかの生物・非生物の固体表面に付着し高次構造体を形成するバイオフィルム状態で主に存在する。その中でも緑膿菌は日和見感染菌の一つとして知られており、そのバイオフィルム形成は嚢胞性繊維症など感染症の原因として問題視されている。緑膿菌は薬剤耐性株としても知られており、感染症の予防対策として有効な抗体が従来から求められているが、これまでに緑膿菌のバイオフィルムを抑制する特異的な抗体は知られていなかった。
【００１２】
全てのグラム陰性菌にホモログが存在する外膜タンパクOmp85はそれらの菌にとって生育必須な膜貫通型タンパクであり、様々な病原菌においてワクチンの抗原として研究されてきている。そこで、本願発明者は、これまでに、緑膿菌におけるOmp85ホモログである因子Opr86の機能を解析し、外膜タンパクの集合・輸送に関与する他、生育に必須な因子であることを明らかにしている。ここでは、Opr86抗体が緑膿菌バイオフィルム形成を抑制するワクチンとして有効であることについて言及する。
【００１３】
図１は、本発明に係る緑膿菌におけるOpr86の構造を示す模式図である。緑膿菌PAO1株のOpr86は、この図に示すように１４回膜貫通型構造である。
抗原の候補として細胞外領域を含むペプチド（o-Opr86）を、大腸菌で大量発現させ精製を行った。ここで、図１の灰色で示した部位は精製したペプチドの領域を示している。
【００１４】
図２は精製したペプチドの電気泳動写真である。
この精製されたo-Opr86を抗原とし、ウサギのポリクローナル抗体作製を行ったところ、この作製されたo-Opr86抗血清は、PAO1菌体を抗原として得た抗血清と同様に細胞表層への結合が確認された。
【００１５】
図３は、免疫染色電子顕微鏡観察による抗血清のPAO1細胞への付着の有無を示す（Bar＝1μm）。ここで、図３（ａ）は、PAO1抗血清、図３（ｂ）は、o-Opr86抗血清、図３（ｃ）は、非免疫血清の場合を示している。これらの図より明らかなように、PAO1抗血清、o-Opr86抗血清の場合は細胞表面との結合が認められ、一方、非免疫血清では認められなかった。このように、PAO1細胞を標的としたo-Opr86抗体の実用性が確認された。
【００１６】
そこで、本発明者は、ポリクローナル抗体を用いた緑膿菌バイオフィルムの制御を目的として更なる解析を行った。具体的には、抗血清から精製した免疫グロブリンG（IgG）をPAO1株と反応させた条件下で、細菌の浮遊増殖及びバイオフィルム形成を定量した。
【００１７】
図４は、本発明の精製免疫グロブリンG（IgG）のPAO1株に対する浮遊増殖への影響を示す図である。ここで、横軸はLB培地中におけるIgGの濃度、縦軸は培地中の生菌数を表わす。なお、図４中、コントロールIgGは非免疫血清から精製したIgGである。またPBSはリン酸緩衝生理食塩水である。
【００１８】
図４に示すように、富栄養培地における浮遊静置培養では、PAO1抗体及びo-Opr86抗体ともに生育への顕著な影響は観察されなかった。
【００１９】
図５は、本発明の精製免疫グロブリンG（IgG）のPAO1株に対するバイオフィルム形成への抑制効果を示す図である。ここで、横軸はLB培地中におけるIgGの濃度、縦軸はバイオフィルム形成量を表わす。なお、図中のコントロールIgGは非免疫血清から精製したIgGである。またPBSはリン酸緩衝生理食塩水である。
【００２０】
図５に示すように、マイクロタイタープレートによるバイオフィルム形成においては、o-Opr86抗体は、PAO1抗体同様にその形成の抑制が確認された。この効果は培地中のIgG濃度が200μg/ml以上の時に有効である。
【００２１】
図６は、本発明の精製免疫グロブリンG（IgG）の濃度が400μg/mlの場合の各培地におけるバイオフィルム形成の抑制効果を示す図である。写真はバイオフィルムを形成させた後、染色させたウェルを表わす。富栄養培地としてはLB培地を、貧栄養培地としてはM63培地（炭素源としてグルコース及びカザミノ酸、またはアルギニン）を用いた。
【００２２】
図５から明らかなように、Opr86抗体によるバイオフィルム制御は富栄養・貧栄養両培地において観察され、バイオフィルムの形成に有利な培地においても効果が発揮されることが分かる。
【００２３】
図７は、本発明の精製免疫グロブリンG（IgG）の濃度が400μg/mlの場合における細菌のガラス表面への付着能を示す図である（各パネルサイズは105μm×105μm）。バイオフィルムの形成は、固体表面の付着及び細胞外マトリクス生成が主な要素となっている。抗体反応条件におけるPAO1細胞のガラス表面への付着を観察したところ、この図７に示すように、PAO1抗体及びo-Opr86抗体において細胞の付着能の抑制効果が確認された。この結果から、抗体の細胞表面への結合が細菌の物質表面付着を阻害する事でバイオフィルム形成を抑制している事が示された。
【００２４】
さらに、この抗体の緑膿菌臨床株における有用性を検討した。図８は、緑膿菌PAO1株及び臨床株における各抗体のバイオフィルム抑制効果を示す図である。LB培地、免疫グロブリンG（IgG）濃度400μg/mlで培養を行った。この結果、図８から明らかなように、臨床株においてもo-Opr86抗体によるバイオフィルム形成の抑制が確認された。
【００２５】
このように、o-Opr86抗体は緑膿菌バイオフィルム形成に対するワクチン抗原として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】緑膿菌におけるOpr86の構造を示す模式図である。
【図２】精製したペプチドの電気泳動写真である。
【図３】免疫染色電子顕微鏡観察による抗血清のPAO1細胞への付着の有無を示す図である（Bar＝1μm）。
【図４】本発明の精製免疫グロブリンG（IgG）のPAO1株に対する浮遊増殖への影響を示す図である。
【図５】本発明の精製免疫グロブリンG（IgG）のPAO1株に対するバイオフィルム形成への抑制効果を示す図である。
【図６】本発明の精製免疫グロブリンG（IgG）の濃度が400μg/mlの場合の各培地におけるバイオフィルム形成の抑制効果を示す図である。
【図７】本発明の精製免疫グロブリンG（IgG）の濃度が400μg/mlの場合における細菌のガラス表面への付着能を示す図である（各パネルサイズは105μm×105μm）。
【図８】緑膿菌PAO1株及び臨床株における各抗体のバイオフィルム抑制効果を示す図である。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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