(57)【要約】【課題】  精度良く早期に癌細胞集団の存在リスクを予測することが可能な癌の早期遺伝子検査方法の提供。【解決手段】  検体から遊離ＤＮＡを抽出する抽出工程１０と、抽出された遊離ＤＮＡに存在する所定の遊離ＤＮＡに対して複数の特異的プライマーを用いて所定の遊離ＤＮＡを増幅させる増幅工程２０と、増幅された複数の所定の遊離ＤＮＡの増幅産物のサイズを測定する測定工程３０と、増幅産物のサイズに基づいて、癌細胞由来の遊離ＤＮＡの存在リスクを予測する予測工程４０とを備えた癌の早期遺伝子検査方法。【選択図】  図１
2009195186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された検体中に存在する遊離ＤＮＡを抽出する工程と、
抽出された前記遊離ＤＮＡ中に存在する所定の遊離ＤＮＡに対して複数の特異的プライマーを用いて前記所定の遊離ＤＮＡを増幅させると共に、増幅された複数の前記所定の遊離ＤＮＡの増幅産物のサイズを測定する工程とを備え、
前記増幅産物のサイズに基づいて、癌細胞集団の存在リスクを予測することを特徴とする癌の早期遺伝子検査方法。
【請求項２】
前記所定の遊離ＤＮＡは癌遺伝子及び／又は癌抑制遺伝子由来のＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１記載の癌の早期遺伝子検査法。
【請求項３】
前記所定の遊離ＤＮＡは前記癌細胞のアポトーシス及び／又はネクローシスによって産生されたＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１記載の癌の早期遺伝子検査方法。
【請求項４】
前記所定の遊離ＤＮＡは前記癌細胞を貪食したマクロファージ由来のＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１記載の癌の早期遺伝子検査方法。
【請求項５】
前記癌は、頭頸部癌、膵癌、甲状腺癌、胆道系癌、肺癌、非小細胞肺癌、腎癌、胃癌、肝癌、大腸癌、直腸癌、移行上皮癌、Ｍｅｒｋｅｌ細胞癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、白血病、食道癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、脳腫瘍、骨肉種、及び神経芽細胞種よりなる群の何れかであることを特徴とする請求項１乃至４の何れかに記載の癌の早期遺伝子検査方法。
【請求項６】
前記検体は前記被験者の血液、血漿、血清、尿、及び唾液よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１乃至５の何れかに記載の癌の早期遺伝子検査方法。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れかに記載の癌の早期遺伝子検査方法は、
抽出された前記遊離ＤＮＡの所定の濃度に基づき、癌細胞由来の前記遊離ＤＮＡの存在リスクを予測することを特徴とする癌の早期遺伝子検査方法。
【請求項８】
前記遊離ＤＮＡの所定の濃度は２０ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする請求項７記載の癌の早期遺伝子検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌の早期遺伝子検査方法に関するものである。さらに詳しくは、遊離ＤＮＡのサイズに基づく癌の早期遺伝子検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌は、重大な生活習慣病の一つであり、わが国においては死亡原因の第一位となっている。癌には環境的要因により発症・進展する癌もあれば、遺伝子的要因により発症・進展する癌も存在し、その発症要因、進行工程は多種多様である。遺伝子的要因により発症・進展する癌においては、大腸癌の多段階発癌メカニズムがよく知られている。大腸癌は、前癌病変としてのポリープ（腺腫）の状態から多段階的に悪性の大腸癌に進展する。この多段階で生じる癌は最初にＡＰＣ遺伝子という家族性大腸腺腫症と呼ばれる優性遺伝子性の病気の原因遺伝子が不活性化してポリープが生じた後、癌遺伝子の一つであるＲＡＳ遺伝子が突然変異することで細胞増殖作用が活性化し、次いでｐ５３癌抑制遺伝子が不活性化して悪性の大腸癌に進展する（非特許文献１）。このような癌遺伝子の異常な活性化（過剰発現）、本来なら細胞の癌化を抑制するはずの癌抑制遺伝子の不活性化（発現低下）は細胞の癌化の過程において観察される。これが、癌が遺伝子の変異、増幅、及び欠損が積み重なって生じる遺伝子の病気と言われる所以である。
【０００３】
【非特許文献１】永田親義著，「がんはなぜ生じるかー原因と発生のメカニズムを探るー」，講談社，２００７年１２月，ｐ１９８
【０００４】
現在、癌の検査法として、例えば、ＭＲＩ（磁気共鳴画像），ＰＥＴ（ポジトロン断層撮像法），ＳＰＥＣＴ（単一光子放射断層撮影），Ｘ線ＣＴ（Ｘ線コンピュータ断層撮影）等の画像診断法が多用されている。これらの画像診断法は、基本的に正常組織と病変組織との違いを探し出すことで癌を検出する方法であり、病変組織を視認することができるため、確度の高い癌の検査法だと言える。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記画像診断法における画像診断可能な検出レベルは、５ｍｍ以上の大きさにまで発達した癌細胞集団であり、このレベルにまで達した癌細胞は浸潤や血管新生を伴う悪化したレベルである。したがって、癌の早期発見や早期治療の観点から、画像診断法では不可能な検出レベル（５ｍｍ以下）の癌細胞集団を検出することが可能な検査方法が望まれている。上述したように、癌は種々の遺伝子異常を伴うことから、これらの遺伝子異常を検出することで、癌の早期発見及び早期治療が可能となると考えられる。
【０００６】
本発明は上記実情に鑑みてなされたものであり、本発明の課題は、精度良く早期に癌細胞集団の存在リスクを予測することが可能な癌の早期遺伝子検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者等は、鋭意研究を進めた結果、ヒトの血液等の体液中に存在する遊離ＤＮＡに着目し、所定の遊離ＤＮＡのサイズに基づいて癌細胞集団の存在を予測することが可能であることを見出し、本発明の癌の早期遺伝子検査方法の完成に至った。
【０００８】
即ち、本発明にかかる癌の早期遺伝子検査方法は、被験者から採取された検体中に存在する遊離ＤＮＡを抽出する工程と、抽出された遊離ＤＮＡに存在する所定の遊離ＤＮＡに対して複数の特異的プライマーを用いて所定の遊離ＤＮＡを増幅させると共に、増幅された複数の所定の遊離ＤＮＡの増幅産物のサイズを測定する工程とを備え、増幅産物のサイズに基づいて、癌細胞由来の遊離ＤＮＡの存在リスクを予測することを特徴とする。
【０００９】
本発明の癌の早期遺伝子方法では、検体に存在する遊離ＤＮＡから、所定の遊離ＤＮＡに対して特異的な塩基配列を有するプライマーを用いて増幅反応を行うことにより、標的とする遊離ＤＮＡとしての癌遺伝子及び／又は癌抑制遺伝子を効率良く検出することができる。また、増幅された遊離ＤＮＡは所定のサイズを有しており、このサイズを指標とすることで、容易に癌細胞集団の存在を予測することができる。
【００１０】
さらに、本発明にかかる癌の早期遺伝子検査方法で標的とする遊離ＤＮＡは、癌細胞のアポトーシス及び／又はネクローシスによって産生されたものであることを特徴とする。さらにまた、本発明の癌の早期遺伝子検査方法で標的とする遊離ＤＮＡは、癌細胞を貪食したマクロファージ由来のものであることを特徴とする。
【００１１】
一般的に、癌細胞集団は約１ｍｍのサイズまでは、血管新生なしでも増殖することができるが、それ以上のサイズにまで増殖すると栄養が癌細胞に供給されない。その結果、癌細胞がアポトーシス又はネクローシスを誘発し、また新たな血管を作り出すシグナルを血管に伝達する。このアポトーシス又はネクローシスによって、癌細胞のＤＮＡは細胞外に放出され、遊離ＤＮＡとして毛細血管に入りこむと考えられている。また、癌細胞集団は、１ｍｍ以下でも細胞組織に存在するマクロファージにより異物として認識され、貪食される。マクロファージに貪食された癌細胞集団は消化され、細胞膜や細胞小器官の残骸と共にＤＮＡが排出され、当該ＤＮＡは遊離ＤＮＡとして毛細血管に入り込むと考えられている。さらに、多数の癌細胞集団を貪食したマクロファージ自身がアポトーシスを起こすため、その過程においても癌細胞集団由来のＤＮＡが排出され、当該ＤＮＡは遊離ＤＮＡとして毛細血管に入り込むと考えられている。したがって、遊離ＤＮＡは、癌細胞集団が１ｍｍ以下のサイズの早期段階においても存在していると考えられ、当該遊離ＤＮＡを標的分子として用いることにより、１ｍｍ以下の癌細胞集団の存在を予測することが可能となる。
【００１２】
本発明にかかる癌の早期遺伝子検査方法で予測可能な癌は、頭頸部癌、膵癌、甲状腺癌、胆道系癌、肺癌、非小細胞肺癌、腎癌、胃癌、肝癌、大腸癌、直腸癌、移行上皮癌、Ｍｅｒｋｅｌ細胞癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、白血病、食道癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、脳腫瘍、骨肉種、及び神経芽細胞種よりなる群の何れかであることを特徴とする。
【００１３】
本発明の癌の早期遺伝子検査方法では、標的とする遊離ＤＮＡの候補配列を変えることにより上記した癌細胞集団の存在を予測することが可能である。
【００１４】
また、本発明にかかる癌の早期遺伝子検査方法では、被験者から単離する検体として、血液、血清、血漿、尿、及び唾液よりなる群から選択することができる。
【００１５】
したがって、検体の採取に時間を要せず、被験者の検査にかかる拘束時間を低減することができる。また、選択する検体によっては、検体の採取に伴う肉体的苦痛を伴わない。
【００１６】
さらにまた、本発明にかかる癌の早期遺伝子検査方法では、抽出した遊離ＤＮＡの濃度を測定する濃度検定工程を備えることを特徴とする。なお、このときの遊離ＤＮＡの濃度閾値は２０ｎｇ／ｍｌ以上とすることができる。
【００１７】
抽出された遊離ＤＮＡの濃度パラメータ、つまり、癌細胞集団の存在を予測するパラメータとして、遊離ＤＮＡの濃度を２０ｎｇ／ｍｌ以上と設定することにより、癌細胞の存在リスクの予測精度をさらに向上させることが可能となる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の癌の早期遺伝子検査方法によれば、精度良く早期に癌細胞集団の存在を予測することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について図面を用いて詳細に説明する。
【００２０】
[第１の実施形態]
図１は、本発明の第１の実施形態にかかる癌の早期遺伝子検査方法の処理工程を説明するフローチャートである。
本発明の第１の実施形態にかかる癌の早期遺伝子検査方法では、検体から遊離ＤＮＡを抽出する抽出工程１０と、抽出された遊離ＤＮＡに存在する所定の遊離ＤＮＡに対して複数の特異的プライマーを用いて所定の遊離ＤＮＡを増幅させる増幅工程２０と、増幅された複数の所定の遊離ＤＮＡの増幅産物のサイズを測定する測定工程３０と、増幅産物のサイズに基づいて、癌細胞由来の遊離ＤＮＡの存在リスクを予測する予測工程４０とが行われる。
【００２１】
抽出工程１０は、被験者の検体から遊離ＤＮＡを抽出する工程である。ここで、検体とは被験者から採取される液体検体であり、本発明に用いられる被験者の検体としては、血液、血漿、血清、尿、及び唾液よりなる群の何れかを用いることができる。この群の中で特に限定はされないが、好ましくは血液から血球成分を除去した血漿を検体として用いるのが好ましい。血漿は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって、規定量の血液を所定の時間、遠心分離して調整することができる。血漿からの遊離ＤＮＡの抽出は、特に規定はされないが、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって抽出することができる。例えば、市販のＤＮＡ抽出キットを用いる場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００２２】
増幅工程２０は、複数の特異的プライマーを用いて遊離ＤＮＡ中に存在する所定の遊離ＤＮＡを増幅させる工程である。ここで、本明細書で用いる「所定の遊離ＤＮＡ」とは、後述する増幅反応により増幅させる標的遊離ＤＮＡを指す。また、本明細書で用いる「特異的プライマー」とは、２つ以上、好ましくは３つ以上、より好ましくは８つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む配列を含む。この特異的プライマーは所定の遊離ＤＮＡの５’末端側配列と実質的に相補的であり、所定の遊離ＤＮＡに対してプライマー伸張反応を開始することができる。また、本実施形態における特異的プライマー配列は所定の遊離ＤＮＡの配列に応じて、当業者により容易に設計することができる。この特異的プライマー配列の設計において、本実施形態においては、特に限定はされないが、例えば、細胞死抑制遺伝子（Ｂｃｌ２遺伝子）由来の遊離ＤＮＡの配列に相補的なプライマー配列を設計することができる。この場合、例えば、Ｂｃｌ２遺伝子においては、５２０ｂｐ，８５３ｂｐ，１２８１ｂｐのサイズに相当する配列に相補的な特異的プライマー配列を設計するのが好ましい。選択した所定の遊離ＤＮＡの配列を鋳型として、当該配列に相補的な複数の特異的プライマーを用いた増幅反応は、特に限定はされないが、公知あるいはそれに準じるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われる。このＰＣＲ反応において用いられるＤＮＡポリメラーゼ等をはじめとする重合試薬は当業者により自由に選択でき、また、反応条件は使用される重合試薬に応じて当業者により容易に設定することができる。
【００２３】
測定工程３０は、増幅工程２０において増幅された所定の遊離ＤＮＡのサイズを既知あるいはそれに準じたゲル電気泳動方法により測定する工程である。この測定工程３０で用いられるゲル電気泳動法は特に限定はされないが、例えば２％アガロースゲル電気泳動法により、増幅産物のサイズを測定することができる。また、ここで、市販のアガロースゲルを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法により、ＰＣＲ反応による増幅産物のサイズを測定することができる。本実施形態においては、５２０ｂｐ，８５３ｂｐ，１２８１ｂｐのサイズに相当するＢｃｌ２遺伝子の部分配列が増幅工程２０においてＰＣＲ反応により増幅されたか否かを確認することができる。
【００２４】
予測工程４０は、測定工程３０において観察された増幅産物のサイズに基づいて、癌細胞由来の遊離ＤＮＡの存在リスクを予測する工程である。癌細胞集団の存在の予測における予測基準は、増幅工程２０において増幅された遊離ＤＮＡのサイズに基づいて行うことができる。つまり、癌患者（癌細胞集団）由来の遊離ＤＮＡは、癌細胞のアポトーシスやネクローシスに起因して長鎖の遊離ＤＮＡが産生されるため、比較的サイズが大きい遊離ＤＮＡを検出することで、癌細胞由来の遊離ＤＮＡの存在リスクを予測することができる。ここでの予測基準としての遊離ＤＮＡのサイズは、特に限定はされないが、１００ｂｐ以上であり、好ましくは３００ｂｐ以上、より好ましくは５００ｂｐ以上である。例えば、予測基準を３００ｂｐとし、増幅工程２０においてＰＣＲ反応により増幅された所定の遊離ＤＮＡのサイズが３００ｂｐ以上であることが測定工程３０において確認された場合、癌細胞由来の遊離ＤＮＡの存在リスクは高いと予測することができる。一方、増幅工程２０においてＰＣＲ反応により増幅された所定の遊離ＤＮＡのサイズが３００ｂｐ未満であることが測定工程３０において確認された場合、癌細胞由来の遊離ＤＮＡの存在リスクは低いと予測することができる。
【００２５】
以上のように、第１の実施形態によれば、被験者から採取された検体中の所定の遊離ＤＮＡのサイズに基づいて癌細胞集団の存在リスクを予測することが可能となる。
【００２６】
[第２の実施形態]
図２は、本発明の第２の実施形態にかかる癌の早期遺伝子検査方法の処理工程を説明するフローチャートである。第２の実施形態にかかる癌の早期遺伝子検査方法においては、検体から遊離ＤＮＡを抽出した後、抽出された遊離ＤＮＡの濃度を測定する工程が新たに加えられる。これは、Ｊａｈｒ，Ｓ．等の報告にもあるように、癌患者から採取された血漿中には、健常者（約数ｎｇ／ｍｌ〜１３ｎｇ／ｍｌ程度）のものと比較して、少なくとも数十倍量の遊離ＤＮＡが有意差をもって存在している知見に基づくものである（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：１６５９−１６６５，２００１）。そこで、本発明の第２の実施形態にかかる癌の早期遺伝子検査方法では、検体から遊離ＤＮＡを抽出する抽出工程５０と、抽出された遊離ＤＮＡの濃度を測定する濃度検定工程６０と、抽出された遊離ＤＮＡに存在する所定の遊離ＤＮＡに対して複数の特異的プライマーを用いて所定の遊離ＤＮＡを増幅させる増幅工程７０と、増幅された複数の所定の遊離ＤＮＡの増幅産物のサイズを測定する測定工程８０と、増幅産物のサイズに基づいて、癌細胞由来の遊離ＤＮＡの存在リスクを予測する予測工程９０とが行われる。
【００２７】
抽出工程５０は、被験者の検体から遊離ＤＮＡを抽出する工程である。ここで、検体とは被験者から採取される液体検体であり、本発明に用いられる被験者の検体としては、血液、血漿、血清、尿、及び唾液よりなる群の何れかを用いることができる。この群の中で特に限定はされないが、好ましくは血液から血球成分を除去した血漿を検体として用いるのが好ましい。血漿は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって、規定量の血液を所定の時間、遠心分離して調整することができる。血漿からの遊離ＤＮＡの抽出は、特に限定はされないが、公知あるいはそれに準じる方法に従って抽出することができる。例えば、市販のＤＮＡ抽出キットを用いる場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００２８】
濃度検定工程６０は、被験者の検体から抽出された遊離ＤＮＡの濃度を測定する工程である。遊離ＤＮＡの濃度検定は、特に規定はされないが、公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。例えば、市販の濃度検定キットを用いる場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ここでの予測基準としての遊離ＤＮＡの濃度閾値は、特に限定はされないが、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ以上である。
【００２９】
増幅工程７０は、複数の特異的プライマーを用いて遊離ＤＮＡ中に存在する所定の遊離ＤＮＡを増幅させる工程である。ここで、本明細書で用いる「所定の遊離ＤＮＡ」とは、後述する増幅反応により増幅させる標的遊離ＤＮＡを指す。また、本明細書で用いる「特異的プライマー」とは、２つ以上、好ましくは３つ以上、より好ましくは８つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む配列を含む。この特異的プライマーは所定の遊離ＤＮＡの５’末端側配列と実質的に相補的であり、所定の遊離ＤＮＡに対してプライマー伸張反応を開始することができる。また、本実施形態における特異的プライマー配列は所定の遊離ＤＮＡの配列に応じて、当業者により容易に設計することができる。この特異的プライマー配列の設計において、本実施形態においては、特に限定はされないが、例えば、細胞死抑制遺伝子（Ｂｃｌ２遺伝子）由来の遊離ＤＮＡの配列に相補的なプライマー配列を設計することができる。この場合、例えば、Ｂｃｌ２遺伝子においては、５２０ｂｐ，８５３ｂｐ，１２８１ｂｐのサイズに相当する配列に相補的な特異的プライマー配列を設計するのが好ましい。選択した所定の遊離ＤＮＡの配列を鋳型として、当該配列に相補的な複数の特異的プライマーを用いた増幅反応は、特に限定はされないが、公知あるいはそれに準じるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われる。このＰＣＲ反応において用いられるＤＮＡポリメラーゼ等をはじめとする重合試薬は当業者により自由に選択でき、また、反応条件は使用される重合試薬に応じて当業者により容易に設定することができる。
【００３０】
測定工程８０は、増幅工程７０において増幅された所定の遊離ＤＮＡのサイズを既知あるいはそれに準じたゲル電気泳動方法により測定する工程である。この測定工程８０で用いられるゲル電気泳動法は特に限定はされないが、例えば２％アガロースゲル電気泳動法により、増幅産物のサイズを測定することができる。また、ここで、市販のアガロースゲルを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法により、ＰＣＲ反応による増幅産物のサイズを測定することができる。本実施形態においては、５２０ｂｐ，８５３ｂｐ，１２８１ｂｐのサイズに相当するＢｃｌ２遺伝子の部分配列が増幅工程２０においてＰＣＲ反応により増幅されたか否かを確認することができる。
【００３１】
予測工程９０は、測定工程８０において観察された増幅産物のサイズに基づいて、癌細胞由来の遊離ＤＮＡの存在リスクを予測する工程である。癌細胞集団の存在の予測における予測基準は、増幅工程７０において増幅された遊離ＤＮＡのサイズに基づいて行うことができる。つまり、癌患者（癌細胞集団）由来の遊離ＤＮＡは、癌細胞のアポトーシスやネクローシスに起因して長鎖の遊離ＤＮＡが産生されるため、比較的サイズが大きい遊離ＤＮＡを検出することで、癌細胞由来の遊離ＤＮＡの存在リスクを予測することができる。ここでの予測基準としての遊離ＤＮＡのサイズは、特に限定はされないが、１００ｂｐ以上であり、好ましくは３００ｂｐ以上、より好ましくは５００ｂｐ以上である。例えば、予測基準を３００ｂｐとし、増幅工程７０においてＰＣＲ反応により増幅された所定の遊離ＤＮＡのサイズが３００ｂｐ以上であることが測定工程８０において確認された場合、癌細胞由来の遊離ＤＮＡの存在リスクは高いと予測することができる。一方、増幅工程７０においてＰＣＲ反応により増幅された所定の遊離ＤＮＡのサイズが３００ｂｐ未満であることが測定工程８０において確認された場合、癌細胞由来の遊離ＤＮＡの存在リスクは低いと予測することができる。
【００３２】
以上のように第２の実施形態によれば、第１の実施形態の効果に加え、さらに被験者から採取された検体中の所定の遊離ＤＮＡの濃度を測定することにより、癌細胞集団の存在リスクの予測精度をすることが可能となる。
【００３３】
なお、本発明においては、上記の記載に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において適宜変更可能である。例えば、本発明の癌の早期遺伝子検査方法に加えて、例えば細胞の癌化の過程で生じる癌遺伝子や癌抑制遺伝子の点変異（ポイントミューテーション）をＤＮＡシーケンス法により解析する工程を加えてもよい。また、癌細胞では、特定の癌抑制遺伝子のプロモータ領域がメチル化されることから、このプロモータ領域のメチル化をメチレーション特異的ＰＣＲ法により検出する工程を加えてもよい。さらにまた、一般的に癌細胞では、癌遺伝子や腫瘍マーカー遺伝子の発現上昇が見られることから、癌遺伝子や腫瘍マーカー遺伝子の発現をＤＮＡマイクロアレイにより解析する工程を加えてもよい。このようなマルチプル遺伝子検査方法によれば、さらに精度良く癌細胞集団の存在リスクを予測することが可能となる。また、これらの遺伝子異常の個々について、それぞれ特定の組織部位に見られる場合が多数あり、これらの多種多用な遺伝子異常の検査による結果を元に癌細胞が存在している組織・器官部位を同定する可能性が高まると期待される。
【００３４】
[実施例]  被験者の検体中に存在する特定のサイズの遊離ＤＮＡと癌細胞集団の存在との関係
本実施例では、癌患者１０人と、健常者８人から採取した血漿に存在する特定のサイズの遊離ＤＮＡと癌細胞集団の存在との関係を考察した。
【００３５】
（１）全血液から血漿の分離
血液が入った検体チューブを２，４００Ｇで１０分間、室温で遠心分離した。次いで、得られた上清を１．５ｍｌチューブに移して、１，４００Ｇで３０分間、室温で遠心分離した。ここで、得られた上清を検体として以下の工程に用いた。
【００３６】
（２）検体からの遊離ＤＮＡの抽出
検体からの遊離ＤＮＡの抽出は、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付された使用説明書に基づいて遊離ＤＮＡの抽出を行った。
【００３７】
（３）検体から抽出された遊離ＤＮＡの濃度測定
Ｑｕａｎｔ−ｉｔ  ＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に含まれるＱｕａｎｔｉ−ｉＴ（登録商標）  ＲｅａｇｅｎｔとＱｕａｎｔｉ−ｉＴ（登録商標）  Ｂｕｆｆｅｒとを量比１：２００で混合した混合液１９０μｌに対して１０μｌのスタンダード溶液（０ｎｇ／μｌ，１０ｎｇ／μｌ）を混合し、ボルテックスで２，３秒攪拌した。この混合液を室温で２分放置した後、Ｑｕｂｉｔフルオロメーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定し、スタンダード補正を行った。次に、前述した混合液に遊離ＤＮＡの抽出液１０μｌを混合し、ボルテックスで２，３秒攪拌した。この混合液を室温で２分放置した後、Ｑｕｂｉｔフルオロメーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定し、遊離ＤＮＡの濃度を測定した。
【００３８】
（４）ＰＣＲ法により所定の遊離ＤＮＡの増幅及びアガロースゲル電気泳動によるサイズ測定
所定の遊離ＤＮＡとして、ＧＡＰＤＨ遺伝子及びＢｃｌ２遺伝子に対して特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＧＡＰＤＨ遺伝子においては、１００ｂｐ，３５０ｂｐのサイズに相当する配列を選択した。また、Ｂｃｌ２遺伝子においては、５２０ｂｐ，８５３ｂｐ，１２８１ｂｐのサイズに相当する配列を選択した。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応によって増幅されたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＡＰＤＨ遺伝子の１００ｂｐ，３５０ｂｐの遺伝子又はＢｃｌ２遺伝子の５２０ｂｐ，８５３ｂｐ，１２８１ｂｐの遺伝子がＰＣＲ反応により増幅されているか否かをアガロースゲル電気泳動により分離・観察されたバンドを指標に判断した。
【００３９】
（５）結果
１０人の癌患者（ＷＪ００１〜ＷＪ０１０）から採取した血漿からＧＡＰＤＨ遺伝子由来の１００ｂｐ，３５０ｂｐの遺伝子又はＢｃｌ２遺伝子由来の５２０ｂｐ，８５３ｂｐ，１２８１ｂｐの遺伝子がＰＣＲ反応によって増幅されたか否かの結果をまとめたのが表１である。この表１では、アガロースゲル電気泳動による分離・観察された遺伝子を○とした。
【表１】
2009195186.tif 000003
【００４０】
表１から明らかなように、概ね全てのＧＡＰＤＨ遺伝子由来の１００ｂｐ，３５０ｂｐの遺伝子及びＢｃｌ２遺伝子由来の５２０ｂｐ，８５３ｂｐ，１２８１ｂｐの遺伝子が観察された。ＧＡＰＤＨ遺伝子由来の１００ｂｐ，３５０ｂｐの遺伝子が増幅されていることから、本ＰＣＲ反応は問題なく進行したことが確かめられた。この中で、特に、Ｂｃｌ２遺伝子由来の５２０ｂｐの遺伝子の増幅が顕著であり、さらに、５人の癌患者においてＢｃｌ２遺伝子由来の８５３ｂｐの遺伝子、７人の癌患者においてＢｃｌ２遺伝子由来の１２８１ｂｐの遺伝子が増幅されていた。
【００４１】
図３の上段のグラフは癌患者から採取した血漿に含まれるＧＡＰＤＨ遺伝子由来の１００ｂｐ，３５０ｂｐの遺伝子又はＢｃｌ２遺伝子由来の５２０ｂｐ，８５３ｂｐ，１２８１ｂｐの遺伝子のＰＣＲ反応による増幅結果を示したグラフであり、図３の下段のグラフは健常者から採取した血漿に含まれるＧＡＰＤＨ遺伝子由来の１００ｂｐ，３５０ｂｐの遺伝子又はＢｃｌ２遺伝子由来の５２０ｂｐ，８５３ｂｐ，１２８１ｂｐの遺伝子のＰＣＲ反応による増幅結果を示したグラフである。このグラフでは、縦軸に被験者数（検体数）を示し、横軸にアガロースゲル電気泳動による分離・観察された遺伝子のサイズを示す。この両グラフから明らかなように、ＧＡＰＤＨ遺伝子由来の１００ｂｐ，３５０ｂｐの遺伝子については、癌患者と健常者との間には大きな差異はなく、ＰＣＲ反応は問題なく進行したことが確かめられた。Ｂｃｌ２遺伝子由来の５２０ｂｐ，８５３ｂｐ，１２８１ｂｐの遺伝子に関しては、５２０ｂｐの遺伝子が健常者において若干増幅されているものの、８５３ｂｐ及び１２８１ｂｐの増幅は癌患者のみ認められた。これは、血漿中に放出された特定のサイズの遊離ＤＮＡと癌細胞集団の存在との関係には相関関係があり、特定のサイズの遊離ＤＮＡの増幅パターンから癌細胞集団の存在を予測することが可能であることを裏付けている。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】第１の実施形態にかかる処理工程を説明するフローチャートである。
【図２】第２の実施形態にかかる処理工程を説明するフローチャートである。
【図３】被験者の検体中に存在する特定のサイズの遊離ＤＮＡと癌細胞集団の存在との関係を説明する図である。
【符号の説明】
【００４３】
１０  抽出工程
２０  増幅工程
３０  測定工程
４０  予測工程
５０  抽出工程
６０  濃度検定工程
７０  増幅工程
８０  測定工程
９０  予測工程
【図１】
2009195186.tif 000004
【図２】
2009195186.tif 000005
【図３】
2009195186.tif 000006