(57)【要約】【課題】従来のケージド化合物の製造方法は、活性に重要な官能基を予測するために合成、評価を繰り返す、いわばトライアンドエラー方式であり、その作業に多大な労力を必要とし、機能解析ツールの安定的、安価な提供が困難であるという問題点、及び、光解離性保護基で修飾できない側鎖官能基（アラニンやロイシン等）があるため、ケージド化して生理活性を制御できるペプチドやタンパク質が限定されるといった問題点を有する。【解決手段】本発明は、生理活性を有する生体高分子化合物のN末端あるいはC末端の一方に、選択的化学合成基対の一方の基と光切断性アミノ酸を、他方の末端に選択的化学合成基対の他方の基を合成し、分子内選択的化学反応 による分子内環状反応を行うことにより、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化して、生理活性を有する生体高分子の活性を阻害したケージド化合物の製造方法である。【選択図】  図２
2009029794.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性を有する生体高分子化合物のN末端あるいはC末端の一方に、選択的化学合成基対の一方の基と光切断性アミノ酸を、他方の末端に選択的化学合成基対の他方の基を合成し、分子内選択的化学反応 による分子内環状反応を行うことにより、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化して、生理活性を有する生体高分子の活性を阻害したことを特徴とするケージド化合物の製造方法。
【請求項２】
光切断性アミノ酸として、式
【化１】
2009029794.tif 000005
（式中、R1，R2，R3，R4,及びR5は、それぞれ独立に水素原子、ニトロ基、ハロゲン原子、メチル基、C2-6アルキル基、又はC1-6アルコキシ基を示し、nは0-6の整数を示す。）
で示されるアミノ酸を用いた請求項１に記載のケージド化合物の製造方法。
【請求項３】
選択的化学反応基対としてシステイン基とベンジルチオエステル基を用いる請求項１のケージド化合物の製造方法。
【請求項４】
選択的化学反応基対としてアジド基とアルキン基を用いる請求項１のケージド化合物の製造方法。
【請求項５】
生理活性を有する生体高分子化合物として、式
【化２】
2009029794.tif 000006
で示されるペプチドPKIを用いた請求項１に記載のケージド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性を有する生体高分子化合物（ペプチド、タンパク質等を含むペプチド類似高分子化合物）の機能解析を行うために、光切断性の保護基（”Cage”）で生理活性分子を保護して一時的にその活性を失わせ、光を照射して保護機能を解除し、生理活性分子を出現させることにより、生理活性物質が機能発現する時期と場所を制御することを可能としたケージド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な生命現象を担う生体高分子化合物の機能解析を行う上で、特定の生体高分子化合物の機能を制御する技術が利用される。現在までにRNAiやノックアウトなどの機能阻害法により、様々な生体高分子化合物の機能解析が進められてきたが、これらの方法は、生体高分子化合物が機能する場所や時間を制御することができないという問題があった。生体内における生体高分子化合物の機能解析において最も重要なことは、生体や生細胞において、その生体高分子化合物が実際に機能を発揮する場所と時間での解析であり、より高度な時空間的分解能を有する生体高分子化合物機能制御技術が求められていた。
【０００３】
そのような状況下、光によってその生理活性を制御できるケージド化合物を用いた生体高分子化合物機能制御技術が提案され、注目を集めている。ケージド化合物とは、光切断性の保護基（”Cage”）で生理活性分子を保護し、一時的にその活性を失わせた分子である。保護基が光エネルギーによって切断されると保護機能が解除されるため、光の照射により元の生理活性分子を出現させることができ、生理活性物質が機能発現する時期と場所を制御することが可能である。さらに原理的には、照射光量で、発現する量を調節することも可能なため、生理活性物質の時空間動態をリアルタイムで制御する有力な方法と考えられる。
【０００４】
これまでに、（Kaplan, J. H. et al., Biochemistry, 1978, 17, 1929;  Wieboldt,   R.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 8752-6; Adams, S.R. et al., Chem. Biol.,1997, 4, 867-878.）に示すように、ATPやグルタミン酸、カルシウムイオンをはじめとする低分子量の生理活性物質を対象にケージド化合物の開発が進められてきたが、最近、（Wood, J. S.et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 7145-7146; Zou, K. et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 8220-8229; Tatsu, Y. et al., FEBS Lett., 2002, 525(1-3):20-4; 特許第2863834[発明の名称：ケージドペプチド、発明者：達吉郎、茂里康、湯元昇、吉川暹]; 達 吉郎,茂里 康,湯元 昇、生物物理 45(3), 161-164(2005)）に示すように、ケージドペプチドやケージドタンパク質といった高分子化合物を対象としたケージド化合物が提案された。ペプチドやタンパク質は、低分子量生理活性物質と比べ、特異的かつ洗練された生理活性機能を有するため、これらのケージド化合物は、様々な細胞機能解明のための有力なツールとして期待されている。
【０００５】
ペプチドやタンパク質等の生体高分子化合物のケージド化について、上記文献に示される従来方法としては、生理活性を一時的に抑制するために、特定の側鎖官能基、或は主鎖アミドに着目し、そこに直接的に光切断性官能基を結合させるという、低分子量生理活性物質のケージド化とほぼ同様の方法を用いている
【０００６】
図１（a），（b），（c），（d）を用いて、従来方法により目標とする生体高分子化合物をケージド化する手順を説明する。
【０００７】
図１（a）は、生体高分子化合物として、12個のアミノ酸（A1）〜（A12）の配列を有するペプチド（P）を模式的に示す。
【０００８】
図１（b）は、活性に重要なアミノ酸残基を予測するプロセスを示す。このプロセスでは、目標ペプチド（P）を構成するアミノ酸（A1）〜（A12）に対して、活性に重要な（1つあるいは複数の）官能基を予測するために、（A1）の位置から順次（A2）〜（A4）・・と置換用標準アミノ酸（TA）（たとえばアラニン）で置換した変異体（P1）〜（P4）・・を合成し、活性の変化を比較する（アラニンスキャン）。
【０００９】
図１（c）は、予測されたアミノ酸に光切断性保護基を導入したペプチドを合成し、活性を評価するプロセスを示す。このプロセスでは、図１（b）のプロセスで予測された活性に重要な官能基に対して、光切断性保護基（Ph）を導入し、合成されたペプチド（CP1)〜（CP4）・・・の活性化を評価する。このプロセスでは、光切断性保護基（Ph）で修飾できない側鎖官能基（アラニンやロイシン等）があるため、目標とする生体高分子化合物がこれらの側鎖官能基を有する場合にはケージド化することができない。
【００１０】
図１(d)は、目標とする活性が阻害されたケージドペプチドを決定するプロセスを示す。このプロセスでは、図１（c）のプロセスでの合成，評価の結果から、目的とする活性が消失しているケージドペプチド（CP）を選定し、決定する。ここでは、アミノ酸（A4）,（A11）に光切断性保護基（Ph）を導入したときに活性が低下したものとしてケージドペプチド（CP）を例示する。
【非特許文献１】Kaplan, J. H. et al., Biochemistry, 1978, 17, 1929
【非特許文献２】Wieboldt, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 8752-6
【非特許文献３】Adams, S.R. et al., Chem. Biol.,1997, 4, 867-878
【非特許文献４】Wood, J. S.et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 7145-7146
【非特許文献５】Zou, K. et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 8220-8229
【非特許文献６】Tatsu, Y. et al., FEBS Lett., 2002, 525(1-3):20-4
【非特許文献７】達 吉郎,茂里 康,湯元 昇、生物物理 45(3), 161-164(2005)
【特許文献１】特許2863834号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上説明した従来のケージド化合物の製造方法は、活性に寄与する官能基を予測するために、合成、評価を繰り返す、いわゆるトライアンドエラー方式であり、決定までに多大な労力を必要とし、機能解析ツールとしてケージド化合物を安定的、安価に提供することが困難であるという問題点を有し、また、光切断性保護基で修飾できない側鎖官能基（アラニンやロイシン等）があるため、ケージド化して生理活性を制御できる生体高分子化合物に制約を受けるといった問題点を有する。
【００１２】
本発明は、生体高分子化合物の生理活性に寄与する官能基を予測するための多大な労力を必要とせず、また、側鎖官能基の種類による制約を受けることなく多様な生体高分子化合物をケージド化することのできる製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために本発明は、生理活性を有する生体高分子化合物のN末端あるいはC末端の一方に、選択的化学合成基対の一方の基と光切断性アミノ酸を、他方の末端に選択的化学合成基対の他方の基を合成し、分子内選択的化学反応による分子内環状反応を行うことにより、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化して、生理活性を有する生体高分子の活性を阻害したものである。
【００１４】
また本発明は、光切断性アミノ酸として、式
【化１】
2009029794.tif 000003
（式中、R1, R2, R3, R4, 及びR5は、それぞれ独立に水素原子、ニトロ基、ハロゲン原子、メチル基、C2〜6アルキル基、又はC1-6アルコキシ基を示し、nは0-6の整数を示す。）
で示されるアミノ酸を用いたものである。
【００１５】
さらに本発明は、選択的化学合成基対として、システイン基とベンジルチオエステル基を用いたものである。
【００１６】
さらに本発明は、選択的化学合成基対として、アジド基とアルキン基を用いたものである。
【００１７】
さらに本発明は、生理活性を有する生体高分子化合物として、式
【化２】
2009029794.tif 000004
で示されるペプチドPKIを用いたものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化して、生理活性を有する生体高分子の活性を阻害したケージド化合物の製造方法であるから、生体高分子化合物を、その分子配列上の官能基の位置に関係なくケージド化することができ、活性に寄与する官能基を特定する労力を必要としないため、ケージド化合物を安定的、安価に提供できるという効果を奏する。また本発明は、側鎖官能基を直接的に光切断性保護基で修飾することなくケージド化合物を得るものであるため、官能基の種類に制約を受けず、多様な生体高分子化合物の生理活性機能を利用した機能解析ツールや医療応用薬剤を提供する機会を増やすことができるという効果を奏する。
【００１９】
また本発明は、生理活性を有する生体高分子化合物のN末端あるいはC末端に選択的化学合成基対のひとつの基と光切断性アミノ酸を、他方の末端に選択的化学合成基対の他方の基を合成し、分子内選択的化学合成により分子内環状反応するものであるから、環状化反応が効率よく進行し、側鎖官能基の保護が必要なく、特異的に進行するため実用上有用性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明者等は、生理活性を有する生体高分子化合物を環状化することによりその生理活性が阻害されることを見出し、さらに、この環状化反応に光切断性のアミノ酸を導入すれば、光照射により環状化が解除されて生理活性が機能発現するケージドペプチドが得られることを予見し、これにしたがって、実験を行い、本発明が実現可能であり、期待通りの効果を奏することを確認した。
【００２１】
以下、図２、図３を用いて本発明のケージド化合物の製造方法の具体例を説明する。
【００２２】
なお、本発明は、以下の実施例で具体的に示す物質や反応方法、反応条件などに限定されるものではなく、技術的思想の範囲内において、その他の適宜な物質や反応方法、反応条件などに置換えることができる。
【００２３】
図２（a），（b）,（c）には、光切断性アミノ酸として3-アミノ-（2-ニトロフェニル）プロパン酸（図４）を選択し、また、選択的化学反応基対としてシステイン基とベンジルチオエステル基を選択して、分子内選択的化学反応による分子内環状反応を行うことにより、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化する具体例を示す。
【００２４】
図２（a）には、生理活性を有する直鎖状ペプチド（P）のN末端（Pn）とC末端（Pc）に、システイニル光切断性アミノ酸（Cys-Anp）とグリシンベンジルチオエステル（Gly-SBn）をそれぞれ合成したときの構造を示す。
【００２５】
図２（b）には、適切な反応条件のもとで、上記システイン基とベンジルチオエステル基を反応（縮合反応）させ、光切断性アミノ酸（Anp）を組み込んで環状化した環状ペプチド（CCP）を得ることを示す。選択的化学反応基対であるシステイン基とベンジルチオエステル基を用いた分子内選択的化学反応は、中性緩衝液中で効率よく進行する。この反応は、側鎖官能基の保護が必要なく、特異的に進行するため実用的にきわめて有用である。
【００２６】
次いで、図２（c）に示すように、得られた環状化ペプチド（CCP）は、光照射を受けることにより、アミノ酸（Am）の窒素−炭素結合（J-NC）が切断されて環状化が解除され、元の生理活性を有する直鎖状ペプチド（P）を含んだ直鎖状化合物となる。
【００２７】
図３（a），（b）,（c）には、光切断性アミノ酸として3-アミノ-（2-ニトロフェニル）プロパン酸（図４: Anp）を選択し、また、選択的化学反応基対としてアジド基とアルキン基を選択して、分子内選択的化学反応による分子内環状反応を行うことにより、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化する具体例を示す。
【００２８】
図３（a）には、生理活性を有する直鎖状ペプチド（P）のN末端（Pn）とC末端（Pc）に、（2-アジド酢酸：光切断性アミノ酸）（N3-Gly-Npp）と（プロパルギルグリシン  propargyl glycine）（Pag-NH2）をそれぞれ合成したときの構造を示す。
【００２９】
図３（b）には、適切な反応条件のもとで、上記アルキル基とアルキン基を反応させ、光切断性アミノ酸（Am）を組み込んで環状化した環状ペプチド（CCP）を得ることを示す。選択的化学反応基対であるアルキル基とアルキン基を用いた分子内選択的化学反応は1価の銅触媒の存在下で効率よく進行する。アルキル基とアルキン基の反応は、クリックケミストリーと呼ばれ、特異的に進行するため実用的にきわめて有用である。クリックケミストリーの参考文献として、たとえば、R. A. Turner, A. G. Oliver, R. S. Lokey, Org. Lett., 9, 5011-5014 (2007)がある。
【００３０】
次いで、図３（c）に示すように、得られた環状化ペプチド（CCP）は、光照射を受けることにより、アミノ酸（Am）の窒素−炭素結合（J-NC）が切断されて環状化が解除され、元の生理活性を有するペプチド（P）を含んだ直鎖状化合物となる。                  
【実施例】
【００３１】
図５に、この実施例において用いる生体高分子化合物として、プロテインキナーゼA（PKA）の阻害ペプチド（PKI）（Ac-Gly-Arg-Thr-Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-lle-NH2）（配列番号１）を示す。また、この実施例では、光切断性アミノ酸として、図４に示す3-アミノ-（2-ニトロフェニル）プロパン酸を選択し、選択的化学反応基対としてシステイン基とベンジルチオエステル基を選択し、ペプチド（PKI）のC末端（Pc）とN末端（Pn）に、システイニル光切断性アミノ酸（Cys-Anp）とグリシンベンジルチオエステル（Gly-SBn）を導入（常法により個相合成）して得られた直鎖状化合物（図６）を、中性緩衝液中で希薄条件下処理することで分子内選択的化学反応法により分子内環状化反応させ、アミノ酸（Anp）が組み込まれた環状化高分子化合物を得る（図７）。得られた環状ペプチドに紫外光を照射すると、アミノ酸（Anp）のO-ニトロフェニル基の窒素-炭素結合（J-NC）が分解して、元の生理活性ペプチド（PKI）のN末端に2-ニトロソフェニルカルボニルメチル基（Npc）が、C末端にはグリシルシステイニルアミド（Gly-Cys-NH2）が結合した鎖状ペプチドとなる（図８）。
【００３２】
図９(a),(b),(c),(d)を用いて、以上の実施例における環状ペプチドの合成プロセスをさらに詳細に説明する。なお、アミノ酸（Anp）は、既知物質であるため、合成の説明は省略した。
【００３３】
１）C末端アミノ酸の導入 （図９（a））：
(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)-グリシン（Fmoc-Gly-OH；119mg, 400μmol)とジイソプロピルエチルアミン（DIPEA：105μL, 600μmol)とベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-（ジメチルアミノ）-ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート(PyBOP；208mg, 400μmol)をジメチルホルムアミド(DMF； 2mL)に溶解し、4-スルファミルブチリル  AMレジン(1.10 mmol/g, Novabiochem) (91mg, 100μmol)に加え、反応混合物を、室温で15時間震盪し、Fmoc-グリシンを担持したレジン（式１）を得る。
【００３４】
２）ペプチドの合成と、N末端システイニルアミノ酸（Cys-Anp）の導入（図９（b））
この工程では、上記（式１）のレジンに対し、通常のFmoc法によりペプチド鎖を固相合成する。各アミノ酸は、レジンに対して3当量用いた。縮合にはジイソプロピルエチルアミン（DIPEA；6当量)、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-（ジメチルアミノ）-ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート（PyBOP；3当量)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT；3当量)を用い、ジメチルホルムアミド（DMF）中で反応を行った。次の工程で行うヨードアセトニトリルによるレジンの活性化は、塩基条件下で行うため、N末端のシステインのみ、塩基条件下で脱保護されないtert-ブトキシカルボニル（Boc）をアミノ基の保護基として用いた。結果として、（式２）に示すように、システイニル-光切断性アミノ酸（Cys-Anp）をC末端に、グリシンをN末端にそれぞれ有するペプチド（PKI）（配列番号１）が得られた。
【００３５】
３）レジンの活性化（図９（c））
ペプチドが結合している（式２）のレジン(6μmol)をN-メチル-2-ピロリドン（NMP）で5回洗浄した。その後、N-メチル-2-ピロリドン（NMP；120μL)、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA；5.2μL, 30μmol)、ヨードアセトニトリル（8.8μL, 120μmol）を加え、遮光して室温で18時間震盪した。溶液を濾過して除いた後、N-メチル-2-ピロリドン（NMP）で5回、ジクロロメタンで5回洗浄し、（式３）に示すように、レジンの水素をシアン基に置換し、活性化をおこなった。
【００３６】
４）直鎖状ペプチドベンジルチオエステルの合成（図９（d））
ジメチルホルムアミド（DMF；120μL)、ベンジルメルカプタン（5.6μL, 48μmol）を、（式３）のレジン（6μmol）に加え、室温で48時間撹拌した。撹拌後の溶液を濾過し、その濾液を減圧下で留去した。脱保護用反応液（250μL; トリフルオロ酢酸（TFA）:H2O：エタンジチオール（EDT）:トリイソプロピルシラン（TIPS）=94.5:2.5:2.5:1）を丸底フラスコ中のペプチドに加え、室温で2時間攪拌した。濃縮した後、氷冷した蒸留エーテルを加えた。生じた沈殿を氷冷エーテルで3回洗浄し、（式４=図６）で示すペプチドベンジルチオエステル（MALDI-MS:1459[M+H]＋）を得た。
【００３７】
上記（式４）で示すペプチドベンジルチオエステルのHPLCクロマトグラムを図１０に示す。26分経過付近でピークが2本見られるのは、用いた3-アミノ-（2-ニトロフェニル）プロパン酸（Anp）がラセミ体であるために、得られたペプチドがジアステレオマーの混合物となっているためである。目的とするペプチドのピークが主生成物として得られたため、精製は行わず、次の工程に進んだ。
【００３８】
５）環状ペプチドの合成（図９（e））
（式４）で示すペプチドベンジルチオエステルを水（500μL）に溶かし、エチレンジアミン四酢酸（EDTA；1mM）、ベンゼンチオール (0.02％v/v)、ベンジルメルカプタン (0.02％v/v)を含む、0.1Mリン酸緩衝液 (pH7.6, 10mL)中に、5分間かけて滴下した。その溶液を0℃で1.5時間攪拌し、光切断性アミノ酸（Anp）を組み込んだ環状ペプチド（式５=図７）の合成を進行させた。合成が進んだところで溶液の凍結乾燥を行い、HPLCにより精製した。
[HPLC精製条件] カラムはInertsil PREP-ODS (20×250mm)を用いた。検出は、220nmの吸光度を用いた。溶離液として、0.1% TFA/H2O と0.1% TFA/CH3CNを用い、リニア−グラジエントを行った（MALDI-MS：1335[M+H] +）。
【００３９】
図１１に、環状化反応後、精製操作前のHPLCクロマトグラムを示す。溶出時間26分付近に存在した原料のピークはほぼ完全に消失し、溶出時間20分付近に目的物のピークが現れている（50分付近の2本のピークは、反応に用いたベンゼンチオールとベンジルメルカプタンである）。環状化反応の収率は、約80％であった。環状ペプチドの合成において、選択的化学反応基対であるシステイン基とベンジルチオエステル基による分子内選択的化学反応は、中性緩衝液中で効率よく進行し、側鎖官能基の保護が必要なく、特異的に進行するため実用的にきわめて有用である。なお環状ペプチド合成法（ネイティブケミカルライゲーション（Native Chemical Ligation）を用いる方法）は次の文献に報告されている（J. A. Camarero, T. W. Muir, Chem. Commun. 1997, 1369.）。
【００４０】
図１２に、得られた環状ペプチドのＰＫＡ阻害活性を、PKAの基質ペプチドとして知られるKemptide（Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly）（配列番号２）のリン酸化率をHPLCを用いて測定した結果を示す。図のグラフ（a）は、環状化ペプチド（図７，図９（e））に紫外光を照射したとき、時間経過と共に阻害活性が上昇することを示す。即ち、ペプチド（PKI）が環状化により、その生理活性が阻害されていたものが、光照射で環状化が解除されることにより、元の生理活性ペプチド（PKI）を含む鎖状ペプチドの状態（図８）となり、活性が発現することが確認された。「直鎖状インヒビターの阻害活性」として示す値（au=約0.76）は、直鎖状PKAインヒビター（Ac-GRTGRRNAI（配列番号1）-NH2）の活性数値を示し、環状化ペプチドに対する20分光照射により、活性がインヒビターの活性の95％（au=約0.72）まで回復することが確認された。なお、活性を回復するための紫外線照射時間は、照射光のエネルギー強度を上げることにより短縮することが可能であり、照射部位の深さ、光透過率などの状況に応じて光種別（紫外光やレーザーなど）や強度を選択し、目的に応じて使い分けて用いれば良い。
【００４１】
一方、光切断により生じるニトロソ基等の阻害活性への影響の有無を調べるため、上記生理活性ペプチド（PKI）と同様な手順により、阻害活性を持たないコントロールペプチド（Ac-Gly-Arg-Thr-Leu-Arg-Arg-Ala-Ala-Leu-NH2）（配列番号３）を環状化した後に光照射してアミノ酸を分解し、ニトロソ基を生じさせて活性を測定したところ、図１２のグラフ（b）に示すように、時間が経過しても活性の上昇は全く見られなかった。このことから、光分解により生じるニトロソ基等は活性機能へ影響せず、図１２のグラフ（a）に示す活性の上昇は、生理活性ペプチド（PKI）の環状化解除により生じたものであることが確認された。
【００４２】
他の生体高分子化合物においても、上記ペプチド（PKI）の場合の環状化プロセスと同様に、それぞれの生体高分子化合物のN末端あるいはC末端に、図３に例示するような光切断性アミノ酸と選択的化学反応基を結合させ、その後に分子内環状化反応を生じさせて、光切断性アミノ酸を組み込んだケージド高分子化合物を得ることができ、これによってさまざまな機能研究や薬剤、治療方法の進展が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】（a）,（b）,（c）,（d）は、従来のケージド高分子化合物の製造プロセスを示す図である。
【図２】（a），（b）,（c）は、光切断性アミノ酸として3-アミノ-（2-ニトロフェニル）プロパン酸を選択し、また、選択的化学反応基対としてシステイン基とベンジルチオエステル基を選択して、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化する具体例を示す図である。
【図３】（a），（b）,（c）は、光切断性アミノ酸として3-アミノ-（2-ニトロフェニル）プロパン酸を選択し、また、選択的化学反応基対としてアジド基とアルキン基を選択して、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化する具体例を示す図である。
【図４】光切断性アミノ酸の具体例の化学構造式を示す図である。
【図５】生理活性生体高分子化合物の具体例としてPKIの化学構造式を示す図である。
【図６】PKIのN末端にCys-Anpを、C末端にGlyのベンジルチオエステルを合成した直鎖ペプチドの化学構造式を示す図である。
【図７】図６の直鎖ペプチドを環状化してケージド化したときの化学構造式を示す図である。
【図８】図７の環状化したケージドペプチドに光照射して直鎖状になったペプチドの化学構造式を示す図である。
【図９】（a）,（b）,（c）,（d）は、図５〜図７に示すペプチドの環状化プロセスに関して、さらに詳細に合成プロセスを説明する図を示す図である。
【図１０】は、図９（d）の工程で得られたペプチドベンジルチオエステルのHPLCクロマトグラムを示す図である。
【図１１】は、環状化反応後、精製操作前のHPLCクロマトグラムを示す図である。
【図１２】本発明のケージド高分子化合物に光照射したときの生理活性の時間変化を示すグラフ（a）および、生理活性を持たないコントロールペプチドを光切断性アミノ酸を組み込んで環状化し、それに光照射したときの生理活性の時間変化を示すグラフ（b）を示す図である。
【符号の説明】
【００４４】
P：生理活性ペプチド
A1，A2，A3，A4，・・・，A12：アミノ酸基
TA：アラニン（置換アミノ酸）
P1，P2，P3，P4：アラニンによってアミノ酸基を置換したペプチド
Ph：光分解性アミノ酸（保護基）
CP1，CP2，CP3，CP4：光切断性アミノ酸を合成したペプチド
CP：生理活性の阻害を確認されたケージドペプチド
CCP：環状化ケージドペプチド
PKI：PKA阻害ペプチド
Pn：直鎖状生体高分子化合物のN末端
Pc：直鎖状生体高分子化合物のC末端
Anp：環状化高分子化合物に組み込まれた光切断性アミノ酸
J-NC：光照射によって切断される窒素-炭素結合部 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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