(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＩＶウイルス等由来のペプチドを提示した抗原が感染細胞上でどの様な提示動態及びCTL応答等を示すのかを、定量的・経時的に解析し、CTLのHIV感染制御機構を理解する為の手段等を提供すること。【解決手段】ＴＣＲの各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を対応する各ＣＤＲ領域内に有する抗体可変領域を含むポリペプチド、該ポリペプチドを構成成分としてなる、ＴＣＲと同様の抗原認識能を有する各種の抗体、それらの製造方法、並びに、HLAと標的抗原ペプチドとの複合体に対するプローブ、検出手段又は検査試薬。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＣＲの各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を対応する各ＣＤＲ領域内に有する抗体可変領域を含むポリペプチド。
【請求項２】
HLA class Iと結合したウイルスのタンパク質由来のペプチドに対して特異性を示すヒトＴ細胞のＴＣＲである、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ウイルスのタンパク質がＨＩＶウイルスのnefである、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＨＩＶウイルスのnefタンパク質由来のペプチドがアミノ酸配列：VPLRPMTYから成る、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
HLA class IがＨＬＡ−Ｂ３５である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列をＣＤＲ領域内に有する抗体重鎖の可変領域を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
抗体重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で表される、請求項６記載のポリペプチド。
【請求項８】
以下に示されるＴＣＲのβ鎖の各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列：
（１）ＣＤＲ１： SGHAT；（２）ＣＤＲ２：FQNNGV；及び（３）ＣＤＲ３：ASSLDLVSTEAFF、から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を有する請求項６又は７記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１０又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列から成る、請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＴＣＲα鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列をＣＤＲ領域内に有する軽鎖の抗体可変領域を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
抗体軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表される、請求項１０記載のポリペプチド。
【請求項１２】
以下に示されるＴＣＲのα鎖の各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列：
（１）ＣＤＲ１：TSGFYG；（２）ＣＤＲ２：NALDG；及び（３）ＣＤＲ３：AVTDNYGQNFV、から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を有する請求項１０又は１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号１２又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列から成る、請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項６〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド及び請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドから成る、ＴＣＲの抗原認識能を有するＦｖ抗体。
【請求項１５】
請求項６〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド及び請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む１本鎖ポリペプチドからなる、ＴＣＲの抗原認識能を有するｓｃＦｖ抗体。
【請求項１６】
抗体可変領域の各ＣＤＲ領域内にＴＣＲの対応する各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を移植し、得られたポリペプチドと該ＴＣＲの構造情報をホモロジーモデリングによりシミュレーションし、その結果に基づきＣＤＲループの位置を最適化することを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は抗体のアミノ酸配列の設計方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法に基づき設計したアミノ酸配列をコードする核酸分子。
【請求項１９】
配列番号１３で表される塩基配列から成る、請求項９記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２０】
配列番号１５で表される塩基配列から成る、請求項１３記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２１】
請求項１５記載のｓｃＦｖ抗体をコードする核酸分子。
【請求項２２】
請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の核酸分子を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２記載のベクターで形質転換された宿主細胞を培養し宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、一本鎖ポリペプチドを回収し、精製することを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は抗体の製造方法。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は抗体から成る、HLAと標的抗原ペプチドとの複合体に対するプローブ、検出手段又は検査試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、断片化された抗原由来のペプチドと主要組織適合性抗原複合体 (MHC)分子との複合体（pMHC）に対してTCR様の結合力（抗原認識能）を有する分子である、TCR様抗pHLA抗体、及びその構成成分であるポリペプチド、並びに、それらの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
獲得免疫の一つの応答である細胞性免疫を担うＴ細胞が抗原を認識して自身を活性化させるためには、抗原由来のペプチド、MHC分子、T細胞受容体 (TCR)の三者複合体の形成が重要となる。
【０００３】
抗原由来のペプチドは、外来抗原が細胞内で断片化されたもので、MHC分子のαへリックス間に結合し、この断片化されたペプチドとMHC分子との複合体（pMHC）をTCRが認識しているものといえる。CD8+T細胞のTCRはMHC Class I分子とその結合ペプチドを認識し、CD4+T細胞のTCRはMHC Class II分子とその結合ペプチドを認識している。
【０００４】
現在までに、X線結晶構造解析などの研究から、TCRはMHC分子と結合ペプチドに対して斜めに結合するという特性が明らかになった（非特許文献１）。また、結晶構造解析のデータの集積から、TCRの相補性決定領域3 (CDR3)と相補性決定領域1 (CDR1)の一部が主にペプチドに接触し抗原認識特異性に大きく関係し、一方でCDR1の一部と相補性決定領域2 (CDR2)はMHC分子のポケットを形成するαへリックスの認識に関っている（非特許文献２）。
【０００５】
TCRはT細胞の抗原認識に関与する受容体で、免疫反応の特性を決定する因子でもある。TCRにも形状によって、α鎖とβ鎖から構成されるαβ型と、γ鎖とδ鎖から構成されるγδ型があり、いずれもジスルフィド結合を介してヘテロ２量体を構成している。T細胞はαβ型とγδ型のどちらか一種類の受容体を発現し、細胞数で比較すると、αβ型の受容体を有するT細胞の方が圧倒的に多い。TCRを構成しているα鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖は、可変領域と定常領域からなる分子量40,000-50,000のポリペプチドで、可変領域がイムノグロブリンフォールドを形成している細胞膜貫通分子である。しかし、膜結合型の分子としては安定であるが、可溶性分子として調製した際の安定性は低く、その調製例は極僅かしかない。TCRのCDRは全6箇所あり、幅広い抗原レパートリーに対応すべく、遺伝子再編により多様性が創出されている。また、それらのCDRループは非常に柔軟性に富み、pMHCとの接触に伴い構造変化することが報告されている（非特許文献３及び非特許文献４）。それゆえ、抗体と比較して、結合に際しての構造的束縛によるエントロピー損失が大きいため、結合力が抗体の様には高くない。
【０００６】
一方、MHC分子はTCRに対して抗原由来のペプチドを提示する役割を有する。MHCとは、元より組織適合性に深く関与する膜結合型糖タンパク質をコードする遺伝子の総称である。ヒトのMHCは、ヒト白血球抗原(HLA: Human leukocyte antigen)と呼ばれる。本明細書の実施例では、ヒト由来のMHCを用いたため、以降、HLAと表記する。MHC分子はclass I分子とclass II分子と2種類に大別されるが、両者とも2本のポリペプチドが非共有結合によって会合したヘテロ２量体である。さらに、いくつかのアリル(対立遺伝子)の存在が報告されているが、MHC class I分子の構造は、class I領域にコードされている重鎖(α鎖)とβ2ミクログロブリンのヘテロ２量体である（非特許文献４）。分子の先端は、α1ドメインとα2ドメインにより溝(ポケット)が形成され、8-10残基のペプチド断片が結合する。一方で、MHC class II分子は、class II領域にそれぞれコードされたα鎖とβ鎖が、ヘテロ２量体を形成する。HLA class II分子も、先端のα1ドメインとβ1ドメインがポケットを構成し、13〜 （多くの場合〜17）残基のペプチド断片が結合する。
【０００７】
獲得免疫のもう一つの応答として液性免疫がある。これは、活性化された成熟B細胞が産生した抗体分子と抗原が複合体を形成し、食細胞の標的になる他、補体系による細胞・細菌の排除も誘発される。
【０００８】
抗体分子の基本的な構造は、約220残基のアミノ酸からなる軽鎖(L鎖)と約440残基のアミノ酸からなる重鎖(H鎖)が、互いにジスルフィド結合で連結されたヘテロ２量体である。L鎖、H鎖共に可変領域と定常領域から構成され、またヒンジ領域といわれる部分で分割すると、抗原に対して結合する役割を有する抗原結合フラグメントFab (Antigen-Binding Fragment) と、結晶性フラグメントFc (Crystallizable Fragment) に分かれる。これらは、それぞれ抗体の主要な機能を担う部分であり、前者が抗原に結合する能力、後者が抗原を排除するための作用を誘引する役割を持つ。多種の抗原に対応するための多様性は、可変領域(VL・VH)によって体現され、遺伝子再編と6箇所のCDR中への突然変異が多様性の基盤となっている。現在では、遺伝子工学の発展に伴い、哺乳動物細胞、大腸菌などを用いた組み替え抗体の産生が可能となった。さらに、抗体工学の発展により低分子でより生産性の高い抗体分子、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のヘテロ二量体であるFv、ＶＨ及びＶＬをペプチドリンカーで連結したscFvなどの分子形態が考案されてきた。
【０００９】
一般にH鎖の方がL鎖に比べ結合親和力が高いとされているが、片方だけでは完全な抗体分子が本来保持していた結合力を発揮できないことが殆どである。また、それぞれの可変領域を単独で存在させた場合の安定性を比較すると、VLは単量体としても安定に存在できるのに対し、VHは不安定で多量体形成をする傾向が観察される。
【００１０】
前述したTCRの可変領域と抗体の可変領域を比較すると、それぞれの3次構造、CDRとフレームワーク領域から構成されている点、CDRの位置などの観点から見て、両者は極めて類似しているといえる。また、抗体では、重鎖可変領域が主に結合力を創出している傾向があるように、TCRもα鎖がpMHCとの結合に重要であるとの報告例がある。
【００１１】
さて、我々を取り囲む、数ある難治性疾患の中でも、ヒト免疫不全ウイルス (HIV：Human Immunodeficiency Virus)を介した後天性免疫不全症候群 (AIDS：Acquired Immuno Deficiency Syndrome)は、アフリカ諸国を中心に世界的な大流行が報告されている。主として、当該地域でのHIVウイルスに対する知識の欠落や予防対策の遅れが指摘されるが、根治が難しい原因にはHIVウイルスの感染特性やAIDS発症に際するT細胞からの傷害回避なども大きく影響している。
【００１２】
実際、HIV由来タンパク質 nef に関して、HLA class Iの細胞表面発現を下方制御する、即ち、細胞傷害性T細胞(CTL)によるHIV感染細胞の障害を妨害する可能性が報告されており、nefタンパク質はウイルスエピトープの露出を防ぎ、より病態を進行させているものと考えられる。これまでの研究で、このnefタンパク質が有力なHIVエピトープであること、さらにHLA class Iへのnef由来ペプチドの提示動態と病態の進行状況により支配的に存在するCTL応答との関係性が示唆された。たとえば、HLA-B35というアリルに特異的なCTLでは、感染初期においてはVY8というペプチド（VPLRPMTY）を提示した抗原に最も強い応答を示す（非特許文献５）。
【００１３】
以上の点から、VY8というペプチドを提示した抗原が感染細胞上でどの様な提示動態を示し、尚且つ強いCTL応答を示すのかを、定量的に、経時的に解析することは、CTLのHIV感染制御機構を理解する上で非常に重要な知見を与えると言える。
【００１４】
この様なpHLA（HLAと抗原由来のペプチドとの複合体）に対するプローブとして、まず、天然に単離されたTCRを可溶性として調製した分子が考えられる。しかし、TCRは、本来、細胞膜結合型のタンパク質として存在し、さらにはT細胞表面上においてCD3抗原との複合体を形成することで、より安定化されているタンパク質である。それ故に、多くのクローンにおいて可溶性TCR分子の調製は困難を極める。これまでに、α鎖β鎖の膜貫通領域を除去し、C末端でのジスルフィド結合のみで可溶化状態を維持した例（非特許文献６）、リンカーでα鎖β鎖のドメインを連結し一本鎖TCRを構築した例 （非特許文献７）が報告されている。しかしながら、未だほとんどの可溶性TCRの調製は、依然としてその構築分子の安定性に大きな問題を抱えており、高親和性、高溶解性、高安定性を示すTCRの代替する分子の構築は、HIV研究に大きく寄与できると期待される。
【００１５】
現在、一般的に用いられる抗体の作製手法は、免疫化した動物から採取した抗体産生細胞をがん細胞と融合し不死化するハイブリドーマ法、大腸菌を宿主とするバクテリオファージのコートタンパク質にヒト抗体を提示させ、ファージ抗体プールから選択を行うファージ提示法がある。さらに、ヒト染色体を導入しヒト抗体を産生することが出来るマウスが開発された様に、現在でも抗体作製には大きな関心が注がれている。しかしながら、動物を免疫する手法やファージ提示法を用いた抗体作製手法は、エピトープがランダムになってしまう為、TCRエピトープを有するといった、ある特定の部位を認識する抗体の効率的な産生には向かないといえ、新規抗体作製手法の開発が必要とされている。
【００１６】
【特許文献１】特表２００６−５０６０５３号公報
【非特許文献１】Rui, S., Sara, E.S., Steve, S.G., Cole, T.T., James, M.S., Stanley, G.N. (1995) Evidence that the antigen receptors of cytotoxic T lymphocytes interact with a common recognition pattern on the H-2Kb molecule Immunity 3(5), 573-582
【非特許文献２】Lukasz, K.C., Phillip, D.H., Bridget, C.M., Mattew, R.C., David, M.K. (2005) High-affinity, Peptide-specific T Cell Receptors can be Generated by Mutations in CDR1, CDR2, CDR3 J.Mol.Biol 346, 223-239
【非特許文献３】Benjamin, E.W., George, F.G., Jessica, R.W., John E.L., John, I.B., Bent, K.J., Van der Merwe, P.A. (1999)   TCR Binding to Peptide-MHC Stabilizes a Flexible Recognition Interface Immunity 10, 357-365
【非特許文献４】Cristopher, K.G., Degano, M., Stanfield, R.L., Brunmark, A., Jackson M.R., Peterson P.A., Teyton, L., Wilson, L.A. (1996) An ab T Cell Receptor Structure at 2.5Å and Its Orientation in the TCR-MHC complex Science 274, 209-219
【非特許文献５】Ueno, T., Motozono, C., Dohki, S., Mwimanzi, P., Rauch, S., Facklar, O.T., Oka, S., Takiguchi, M. (2008) CTL-Mediated Selective Pressure Influences Dynamic Evolution and Pathogenic Functions of HIV Nef1 J.Immunol 108, 1107-1116
【非特許文献６】Jonathan, M.B., Meir, G., Penio, T.T., Emma, B., Malkit, S., Pieere, R., Bent, K.J. (2003) Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics Protein Eng. 16(9), 707-711
【非特許文献７】Kieke, M.C., Shusta, E.V., Boder, E.T., Teyton, L., Wittrup, K.D., Kranz, D.M. (1999) Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A  96, 5651-5656
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は上記の課題を解決することを目的とする。即ち、本発明の主な目的は、pMHCに対してTCR様の結合力（抗原認識能）を有する分子である、TCR様抗pHLA抗体、及びその構成成分であるポリペプチドを提供し、ＨＩＶウイルス等由来のペプチドを提示した抗原が感染細胞上でどの様な提示動態及びCTL応答等を示すのかを、定量的・経時的に解析し、CTLのHIV感染制御機構を理解する為の手段等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を進め、抗体可変領域とTCR可変領域の構造類似性に注目し、TCRのCDRを抗体分子のフレームワーク領域に移植する手法によるTCR様の結合力を有するポリペプチド分子を作製することによって、上記課題を解決し、本発明を完成させた。
【００１９】
即ち、本発明は以下に示す各態様に係るものである。
［態様１］ＴＣＲの各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を対応する各ＣＤＲ領域内に有する抗体可変領域を含むポリペプチド。
［態様２］HLA class Iと結合したウイルスのタンパク質由来のペプチドに対して特異性を示すヒトＴ細胞のＴＣＲである、態様１記載のポリペプチド。
［態様３］ウイルスのタンパク質がＨＩＶウイルスのnefである、態様２記載のポリペプチド。
［態様４］ＨＩＶウイルスのnefタンパク質由来のペプチドがアミノ酸配列：VPLRPMTYから成る、態様３記載のポリペプチド。
［態様５］HLA class IがＨＬＡ−Ｂ３５である、態様１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
［態様６］ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列をＣＤＲ領域内に有する抗体重鎖の可変領域を含む、態様１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
［態様７］抗体重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で表される、態様６記載のポリペプチド。
［態様８］以下に示されるＴＣＲのβ鎖の各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列：
（１）ＣＤＲ１： SGHAT；（２）ＣＤＲ２：FQNNGV；及び（３）ＣＤＲ３：ASSLDLVSTEAFF、から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を有する態様６又は７記載のポリペプチド。
［態様９］配列番号１０又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列から成る、態様８記載のポリペプチド。
［態様１０］ＴＣＲα鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列をＣＤＲ領域内に有する軽鎖の抗体可変領域を含む、態様１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
［態様１１］抗体軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表される、態様１０記載のポリペプチド。
［態様１２］以下に示されるＴＣＲのα鎖の各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列：
（１）ＣＤＲ１：TSGFYG；（２）ＣＤＲ２：NALDG；及び（３）ＣＤＲ３：AVTDNYGQNFV、から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を有する態様１０又は１１記載のポリペプチド。
［態様１３］配列番号１２又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列から成る、態様１２記載のポリペプチド。
［態様１４］態様６〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド及び態様１０〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドから成る、ＴＣＲの抗原認識能を有するＦｖ抗体。
［態様１５］態様６〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド及び態様１０〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む１本鎖ポリペプチドからなる、ＴＣＲの抗原認識能を有するｓｃＦｖ抗体。
［態様１６］抗体可変領域の各ＣＤＲ領域内にＴＣＲの対応する各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を移植し、得られたポリペプチドと該ＴＣＲの構造情報をホモロジーモデリングによりシミュレーションし、その結果に基づきＣＤＲループの位置を最適化することを含む、態様１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は抗体のアミノ酸配列の設計方法。
［態様１７］請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
［態様１８］態様１６に記載の方法に基づき設計したアミノ酸配列をコードする核酸分子。
［態様１９］配列番号１３で表される塩基配列から成る、態様９記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
［態様２０］配列番号１５で表される塩基配列から成る、態様１３記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
［態様２１］態様１５記載のｓｃＦｖ抗体をコードする核酸分子。
［態様２２］態様１７〜２１のいずれか一項に記載の核酸分子を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター。
［態様２３］態様２２記載のベクターで形質転換された宿主細胞を培養し宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、一本鎖ポリペプチドを回収し、精製することを含む、態様１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は抗体の製造方法。
［態様２４］態様１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
［態様２５］態様１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は抗体から成る、HLAと標的抗原ペプチドとの複合体に対するプローブ、検出手段又は検査試薬。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によって、pHLAに対してTCR様の結合力（抗原認識能）を有する分子である、TCR様抗pHLA抗体、及びその構成成分であるポリペプチドを製造し、その結合活性を評価し、確認することが出来た。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、ＴＣＲの各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を対応する各ＣＤＲ領域内に有する抗体可変領域を含むポリペプチド、即ち、TCR様抗pHLA抗体、及びその構成成分であるポリペプチド等に関する。
【００２２】
ＴＣＲを提供するＴ細胞の種類、特異性（反応性）等に関して特に制限はない。例えば、ＨＩＶウイルス等の各種ウイルスに対する特異性を有する各種のヒトＴ細胞を例示することが出来る。例えば、HLA class Iと結合したウイルスのタンパク質に由来する（即ち、それらが断片化された）ペプチド、特に、nefタンパク質等のＨＩＶウイルスのタンパク質に由来するペプチドに対して特異性を示すヒトＴ細胞を挙げることが出来る。又、HLA class Iのアリルの例として、例えば、HLA-B35, HLA-A2, HLA-A24, HLA-B7, 及びHLA-B51等を挙げることが出来る。更に、HLA class IIと結合した各種ウイルスに由来のタンパク質に由来するペプチドを標的抗原として提示する、樹状細胞、単球、マクロファージ等の各種の抗原提示細胞に対して特異性を有するナイーブＴ細胞又はエフェクターＴ細胞等であり得る。
【００２３】
抗体及びＴＣＲにおける遺伝子再編における多様性創出機能の類似性から、ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列をＣＤＲ領域内に有する抗体重鎖の可変領域を含むポリペプチド、及び、ＴＣＲα鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列をＣＤＲ領域内に有する軽鎖の抗体可変領域を含むポリペプチドが、安定した構造及び高い結合活性等の点から好適である。
【００２４】
ＴＣＲの各ＣＤＲを移植する相手方となる上記抗体（鋳型抗体）は、その構造が安定していること、組換え細胞における発現系が確立していること、可変領域のアミノ酸配列が既に決定されていること等を考慮して、公知の任意の抗体から適宜、選択することができる。又、これら抗体の由来にも特に制限はなく、ヒト、ラット及びマウス等の哺乳動物由来の抗体から適宜選択することが出来るが、特に、ヒト体内に投与した際の抗原性等を考慮してヒト由来の抗体が好ましい。
【００２５】
本発明のポリペプチドに含まれるＣＤＲの好適例として、実施例に示すような、ＨＩＶウイルスのnefタンパク質に由来する「VPLRPMTY」というアミノ酸配列を有するぺプチド(VY8)とHLA-B35とが結合した複合体に特異的に反応する細胞傷害性Ｔ細胞クローンのＴＣＲに含まれるＣＤＲを挙げることが出来る。即ち、例えば、以下に示されるＴＣＲのα鎖の各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列：
（１）ＣＤＲ１：TSGFYG；（２）ＣＤＲ２：NALDG；及び（３）ＣＤＲ３：AVTDNYGQNFV、から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、又は、
以下に示されるＴＣＲのβ鎖の各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列：
（１）ＣＤＲ１： SGHAT；（２）ＣＤＲ２：FQNNGV；及び（３）ＣＤＲ３：ASSLDLVSTEAFF、から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましい。
【００２６】
尚、「ポリペプチド」とはアミノ酸の重合体である分子を意味し、それに含まれるアミノ酸の数に特に制限はないが、通常、１万〜数万程度の分子量を有するものである。
【００２７】
尚、ポリペプチドは、アフィニティクロマトグラフィを用いて効率的に精製できるように、当業者に公知の任意のペプチドタグ（例えば、ｃ−ｍｙｃタグ及びＨｉｓ−ｔａｇ）を付加して改変されたものでも良い。その他、必要に応じて、シグナルぺプチド及びリンカーペプチド等の任意の構造を付加することも可能である。更に、実施例に記載されているように、アビジンタグを本発明ポリペプチドに融合させることによって、ストレプトアビジン（streptavidin）を介した多価抗体を作製することも可能である。
【００２８】
上記のリンカーペプチド等は、組換え技術等の遺伝子工学的手法及びペプチド化学合成等の当業者に公知の任意の技術手段を用いて、本発明の一本鎖ポリペプチド又はｓｃＦｖを構成する一本鎖ポリペプチド内に適宜導入することが出来る。
【００２９】
上記本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は当業者に公知の任意の方法で設計することが出来る。即ち、抗体可変領域の各ＣＤＲ領域内にＴＣＲの対応する各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を移植し、必要に応じて、得られたポリペプチドと該ＴＣＲの構造情報をホモロジーモデリングによりシミュレーションし、その結果に基づき、ＣＤＲループの位置を最適化することにより、本発明のポリペプチド又は抗体のアミノ酸配列を設計することが可能である。
【００３０】
ここで、ホモロジーモデリング及びＣＤＲループの位置を最適化自体は当業者に公知の手法、例えば、SWISS-MODEL等を利用して行うことが出来る。又、ＣＤＲループの位置の最適化は、例えば、実施例にも記載されているように、元の抗体（鋳型抗体）が持っていたCDR配列の一部を挿入したり、その一部のアミノ酸残基を適宜削除したり、更には、該抗体FR領域にある残基を削除したりすることによって、本発明のポリペプチドにおけるＣＤＲループの位置を調整することにより行われる。このような３次元イムノグロブリンモデルに関しては、例えば、WO92/22653に記載されている。
【００３１】
このような方法によって設計された本発明のポリペプチドの好適例として、ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列をＣＤＲ領域内に有する抗体重鎖の可変領域を含むポリペプチドとして配列番号１０又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、及び、ＴＣＲα鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列をＣＤＲ領域内に有する軽鎖の抗体可変領域を含むポリペプチドとして配列番号１２又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを挙げることが出来る。
【００３２】
更に本発明は、このようなポリペプチドを構成成分としてなる、ＴＣＲと同様の抗原認識能を有する各種の抗体にも係る。このような抗体の例として、例えば、Ｆｖ抗体及びｓｃＦｖ抗体を挙げることが出来る。尚、ｓｃＦｖについては、Rosenburg and Moore (Ed.), “The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", Vol. 113, Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)等を参照することができる。
【００３３】
更に、Ｆａｂ抗体分子、各種の二重特異性抗体（BsAb）、及びBsAbの一種であるダイアボディ抗体（WO2007/108152号パンフレット、特開２００４−２４２６３８号公報等参照）も本発明における抗体の一形態として挙げることが出来る。
【００３４】
本発明のポリペプチド又は抗体をコードする核酸分子を作製する場合には、以下の実施例に記載されているように、予め設計されたアミノ酸配列に基づきオーバーラップPCR法により全合成することができる。尚、「核酸」とは、一本鎖ポリペプチドをコードする分子であれば、その化学構造及び取得経路に特に制限はなく、例えば、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡ等を含む。
【００３５】
具体的には、cDNAライブラリーから、文献記載の配列に基づいてハイブリダイゼーションにより、あるいはポリメラーゼチェインリアクション(PCR) 技術により単離されうる。一旦単離されれば、DNA は発現ベクター中に配置され、次いでこれを、大腸菌（E. coli ）細胞、COS 細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞) 、またはイムノグロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞にトランスフェクションさせ、該組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させることができる。PCR 反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えば R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et al., Science, 239: 487, 1988 ; H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed., “DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ; M. A. Innis et al. ed., “PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York (1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、PCR 法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
【００３６】
ハイブリダイゼーションについてはL. Grossman et al. (ed.), “Methods in Enzymology", Vol. 29 (Nucleic Acids and Protein Synthesis, Part E), Academic Press, New York (1974) などを参考にすることができる。DNA など核酸の配列決定は、例えばSanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977)などを参考にすることができる。また一般的な組換えDNA 技術は、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (ed.), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)及び D. M. Glover et al. (ed.), “DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) などを参考にできる。
【００３７】
更に、ポリペプチドの上記の活性に実質的な影響を及ぼさない限り、例えば、FR領域において、数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドでも良い。このような欠失、置換又は付加されるアミノ酸を有するポリペプチドをコードする核酸分子は、例えば、部位特異的変異導入法（点突然変異導入及びカセット式変異導入等）、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の核酸の改変方法を適宜組み合わせて、容易に作製することが可能である。
【００３８】
ここで、核酸の「改変」とは、得られたオリジナルの核酸において、アミノ酸残基をコードする少なくとも一つのコドンにおける、塩基の挿入、欠失または置換を意味する。例えば、オリジナルのアミノ酸残基をコードするコドンを、別のアミノ酸残基をコードするコドンにより置換することにより一本鎖ポリペプチドを構成するアミノ酸配列自体を改変する方法がある。
【００３９】
又は、アミノ酸自体は変更せずに、その宿主細胞にあったコドン（至適コドン）を使用するように、一本鎖ポリペプチドをコードする核酸を改変することも出来る。このように至適コドンに改変することによって、宿主細胞内におけるポリペプチドの発現効率等の向上を図ることが出来る。
【００４０】
上記の配列番号１４及び配列番号１６で表されるアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする好適な核酸分子のヌクレオチド配列を、夫々、配列番号１３及び配列番号１５で示す。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、当業者に公知の方法、例えば、遺伝子工学的手法又は化学合成等の各種手段を用いて製造することが出来る。遺伝子工学的手法としては、例えば、上記核酸分子を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクターを作製し、当業者に公知の適当な方法でこのベクターで宿主細胞を形質転換せしめ、該形質転換された宿主細胞を培養して宿主細胞中で該核酸分子を発現せしめ、得られたポリペプチドそれを回収し、精製することによって製造することが出来る。Ｆｖ抗体を構成する２種類のポリペプチドをコードする核酸分子を夫々含む２種類のベクターは同一の宿主細胞に導入するか、又は、２種類のポリペプチドの夫々をコードする２種類の核酸分子を同一のベクターに含有させることも可能である。
【００４２】
ここで、「複製可能な発現ベクター(replicable expression vector)」および「発現ベクター(expression vector) 」は、DNA（通常は二本鎖である）の断片(piece) をいい、該DNAは、その中に外来のDNAの断片を挿入せしめることができる。外来のDNAは、異種DNA (heterologous DNA)として定義され、このものは、対象宿主細胞においては天然では見出されないDNA である。ベクターは、外来DNAまたは異種DNA を適切な宿主細胞に運ぶために使用される。一旦、宿主細胞中に入ると、ベクターは、宿主染色体DNA とは独立に複製することが可能であり、そしてベクターおよびその挿入された（外来）DNA のいくつかのコピーが生成され得る。さらに、ベクターは外来DNAのポリペプチドへの翻訳を可能にするのに不可欠なエレメントを含む。従って、外来DNAによってコードされるポリペプチドの多くの分子が迅速に合成されることができる。
【００４３】
このようなベクターは、適切な宿主中で DNA配列を発現するように、適切な制御配列(control sequence)とそれが機能するように(operably)（即ち、外来DNAが発現できるように）連結せしめられたDNA配列を含有する DNA構築物(DNA construct) を意味している。そうした制御配列としては、転写(transcription) させるためのプロモーター、そうした転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、リアデニル化配列、及び転写や翻訳(translation) の終了を制御する配列等が挙げられる。更にベクターは、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子（選択遺伝子）、シグナル配列、リーダー配列等を必要に応じて適宜含むことが出来る。これらの各種配列又は要素は、外来DNAの種類、使用する宿主細胞、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することが出来る。
【００４４】
該ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、あるいは単純にゲノムの挿入体(genomic insert)等の任意の形態が可能である。一旦、適切な宿主の中に形質転換で導入せしめられると、該ベクターは宿住のゲノムとは独立して複製したり機能するものであり得る。又は、該ベクターはゲノムの中に組み込まれるものであってもよい。
【００４５】
宿主細胞としては当業者に公知の任意の細胞を使用することができるが、例えば、代表的な宿主細胞としては、大腸菌(E. coli) 等の原核細胞、及び、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞) 、ヒト由来細胞などの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞等の真核細胞が挙げることができる。  
【００４６】
これら宿主細胞の形質転換は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション、パーティクルガン、（エレクトロ）ポレーション法等の、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。
【００４７】
こうして上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞において発現された一本鎖ポリペプチドは、好ましくは一般に分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるが、それが分泌シグナルを持たずに直接に産生された場合には宿主細胞溶解物から回収することが出来る。該ポリペプチドが膜結合性である場合には、適当な洗浄剤（例えば、トライトン-X100) を使用して膜から遊離せしめることができる。
【００４８】
精製操作は当業者に公知の任意の方法を適宜組み合わせて行うことが出来る。例えば、遠心分離、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム等）、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、及びアフィニティクロマトグラフィーによって好適に精製される。アフィニティクロマトグラフィーは、一本鎖ポリペプチドが有するぺプチドタグとの親和力を利用した効率が高い好ましい精製技術の一つである。
【００４９】
尚、回収されたポリペプチドは不溶性画分に含まれていることも多いために、精製操作は、ポリペプチドを可溶化し変性状態にした上で行うことが好ましい。この可溶化処理は、エタノールなどのアルコール類、グアニジン塩酸塩、尿素などの解離剤として当業者に公知の任意の薬剤を使用して行うことが出来る。更に、こうして精製されたポリペプチドを会合（巻き戻し）せしめ、形成されたＦｖ抗体等を分離して回収することも可能である。
【００５０】
会合処理は、単独のポリペプチドを適切な空間的配置に戻すことによって、所望の生物活性を有する状態に戻すことを意味する。従って、会合処理は、ポリペプチド同志あるいはドメイン同志を会合した状態に戻すという意味も有しているので「再会合」ともいうことができるし、所望の生物活性を有するものにするという意味で、再構成ということもでき、或いは、リフォールディング (refolding)とも呼ぶことが出来る。会合処理は当業者に公知の任意の方法で行うことが出来るが、例えば、透析操作により、一本鎖ポリペプチドを含むバッファ溶液中の変性剤（例えば、塩酸グアニジン）の濃度を段階的に下げる方法が好ましい。この過程で、凝集抑制剤、及び酸化剤を反応系に適宜添加することによって、酸化反応の促進を図ることも可能である。形成されたＦｖ抗体等の分離及び回収も当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。
【００５１】
本発明のポリペプチド又は抗体は、HLAと標的抗原ペプチドとの複合体に対するプローブとしての使用することが出来る。特に、がん抗原もHLAに提示されることが明らかとなっており、CTLはその抗原認識に基づいてがん細胞を攻撃している。従って、本発明のポリペプチド又は抗体は、腫瘍（がん）細胞に対するプローブ、検出手段または検査試薬として使用することが可能である。このような目的のために、本発明のポリペプチド又は抗体に、酵素、タンパク質、蛍光物質、磁気ビーズ、及び、放射性標識物質等の当業者に公知の任意の標識物質を適当な方法で付与することが出来る。更に、このような標識物質を介して、本発明のポリペプチド又は抗体が多量体の形態を取ることも可能である。
【００５２】
以下の実施例に示されているように、本発明のポリペプチド又は抗体TCR様の結合力を有するので、本発明のポリペプチド又は抗体、核酸、ベクター、及び形質転換された宿主細胞から成る群から選ばれたものは、医薬組成物の有効成分として有用である。
【００５３】
本発明の医薬組成物の有効成分の有効量は、例えば治療目的、腫瘍の種類、部位及び大きさ等の投与対象における病状、患者の諸条件、及び投与経路等によって当業者が適宜決めることが出来る。典型的な１回の投与量又は日用量は、上記の条件に応じ、可能ならば、例えば当分野で既知の腫瘍細胞の生存又は生長についての検定法を使用して、まずインビトロで、そして次に、人間の患者のための用量範囲を外挿し得る適切な動物モデルで、適当な用量範囲を決定することもできる。本
【００５４】
発明の医薬組成物には、有効成分の種類、薬剤形態、投与方法・目的、投与対象の病態等の各種条件に応じて、有効成分に加えて当業者に周知の薬学上許容し得る各種成分（例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、等）を適宜添加することが出来る。本発明の医薬組成物は、上記各種条件に応じて、錠剤、液剤、粉末、ゲル、及び、噴霧剤、或いは、マイクロカプセル、コロイド状分配系（リポソーム、マイクロエマルジョン等）、及びマクロエマルジョン等の種々薬剤形態をとり得る。
【００５５】
投与方法としては、静脈内、腹腔内、脳内、脊髄内、筋肉内、眼内、動脈内、特には胆管内、又は病変内経路による注入又は注射、及び持続放出型システム製剤による方法が挙げられる。本発明の活性物質は、輸液により連続的に、または大量注射により投与されることができる。
【００５６】
持続放出製剤は、一般的には、そこから本発明の活性物質をある程度の時間放出することのできる形態のものであり、持続放出調製物の好適な例は、蛋白質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性担体を含み、該担体は、例えばフィルムまたはマイクロカプセル等の成型物の形態のものである。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法、例えば日本薬局方解説書編集委員会編、第十三改正  日本薬局方解説書、平成８年７月10日発行、株式会社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜選択して製造することができる。
【００５８】
なお、明細書及び図面において、用語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【００５９】
以下に実施例を参照して本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
【００６０】
全ての実施例は、特に指摘が無い場合には、当業者にとり周知である標準的な技術を用いて実施した。例えば、DNA クローニングでは J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, “Molecular Cloning", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) 及び D. M. Glover et al. ed., “DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ; 特にPCR 法では、H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed.,“DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995)   及び M. A. Innis et al. ed.,“PCR Protocols", Academic Press, New York (1990)に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書(protocols) や添付の薬品等を使用している。
【００６１】
以下の実施例に用いた実験手法は以下の通りである。
形質転換：
１．原理
大腸菌をCa2+ などで処理し、外来のプラスミドを取り込ませやすくしたコンピテントセルに、プラスミドを取り込ませることで大腸菌に新たな遺伝情報を導入する。この際、ヒートショックによりプラスミドを取り込ませる方法と、電圧を大腸菌にかけて瞬間的に大腸菌に穿孔をあけて取り込ませるエレクトロポレーションによる方法がある。形質転換には主にヒートショック法が用いられるが、エレクトロポレーションには形質転換効率がよいという利点があるため、ライブラリーの作製などに用いられる。
【００６２】
２．準備するもの
・ヒートショックによる形質転換
コンピテントセル  JM109株又はBL21 (DE3)株
プラスミド  約10 ng
LB/Amp(+)寒天培地プレート
1.6 ml LB培地試験管培地.
・エレクトロポレーションによる形質転換
大腸菌DH12S
プラスミド  約10ng
エレクトロポレーター
キュベット
無菌エッペンドルフチューブ
【００６３】
３．ヒートショック法による形質転換
コンピテントセルにプラスミドを約10 ng加え、氷中に30 min静置する。42℃で90 secヒートショックを行った後、氷中に移し、2 min静置する。LB培地を800μl 加え、37℃で60 min振盪する。室温で6000 rpm、5 min遠心を行い、100μl 程度残して上清を破棄する。残った培地溶液で菌体ペレットを懸濁し、クリーンベンチ内で、LB/Amp (+)のプレートに塗布する。菌体がJM109株ならば37℃、BL21株ならば28℃に12〜16時間静置する。
【００６４】
４．ポレーションによる形質転換
大腸菌DH12S株40μlとプラスミド1μlを無菌したエッペンドルフチューブで混合し、キュベットに移して、氷中にて15min静置。装置を、1500V、25mA、50μF、150Ωにセットする。装置にキュベットをセットし、パルスをかける。すばやく800 μlのLB培地を入れ、無菌エッペンドルフチューブに移し、1時間、37℃でキュアリング。Amp濃度(0.1  mg/ml)20mlLB培地に植え継ぎ、引き続き培養を行う。
【００６５】
植菌と植え継ぎ、発現誘導：
１．原理
大量培養する場合、プレート上の大腸菌のコロニーを試験管である程度増やしておいてから、坂口フラスコに植え継ぐ。分泌発現系の場合、発現誘導をかける前に培地を新しい2×YT培地に換えると、タンパク質の発現量が向上する。また2×YT培地はタンパク質に富んだ培地なので塩析のときに、目的のタンパク質と一緒に共沈し、目的タンパク質の収量が向上する。
【００６６】
pETシステムおよびtac、lac系の発現系では、IPTG（イソプロピル-b-D(-)-チオガラクトピラノシド）によって発現誘導されるまでは、過剰に生産されるlacリプレッサーがlacオペロンに結合するために、lacオペロンの下流に配している目的タンパク質の発現は抑制されている。IPTGを投入することによってlacリプレッサーはIPTGと結合し、lacオペロンに結合しなくなるため、lacオペロンの下流に配している目的タンパク質の発現が開始される。lacリプレッサーは本来ラクトースを認識するが、ラクトースを用いた場合、大腸菌の持つb‐ガラクトシダーゼにより分解されてしまい、発現誘導物質として長期間働かないので、b‐ガラクトシダーゼによる分解を受けないIPTGを用いる。
【００６７】
２．準備するもの
・植菌
3ml LB試験管培地
100mg/mlアンピシリン溶液
滅菌済み爪楊枝
・植え継ぎ
250ml 2×YT培地
100mg/mlアンピシリン溶液
・発現誘導
集菌瓶
0.5M IPTG
100mg/mlアンピシリン溶液
【００６８】
３．植菌
クリーンベンチ内で、終濃度0.1mg/ml になる様に100mg/mlアンピシリン溶液を3ml試験管培地に。コローを爪楊枝でつつき試験管の中に放り込む。（このときにサテライトをつつかないようにする。）試験管の口とふたをバーナーであぶり、ふたをする。28℃で一晩（16時間以上）ふる。
【００６９】
４．植え継ぎ
以下の操作をクリーンベンチ内でおこなう。
ふた付の坂口フラスコの口をバーナーで軽くあぶり、ふたを取る。アンピシリン溶液を終濃度0.1 mg/mlになるように入れる。試験管の口をバーナーで軽くあぶる。試験管の中のcultureを坂口フラスコの中に流し込む。坂口フラスコの口とふたをバーナーで軽くあぶり、ふたをする。28℃で振盪培養する。O.D.600 = 0.8となったところで、0.8 M IPTGを終濃度1mMになるように入れる。28℃、120min-1ぐらいで一晩ふる。
【００７０】
可溶性画分からの回収：
１．原理
目的のタンパク質が十分に大腸菌の外に分泌される場合、まず菌体と培地上清に分離した後、培地上清は硫酸アンモニウムで塩析する。
【００７１】
２．準備するもの
硫酸アンモニウム  
(培地上清重量の60％(w/w)。全て加えると80％飽和になる)
PBS
【００７２】
３．塩析と塩析したタンパク質の可溶化
まず菌体を含んだ培地を集菌瓶に移し、4℃、7000rpm、20分で遠心し、菌体と培地上清を分離する。
続いて、以下の操作を4℃で行う。
スターラーで攪拌しながら少しずつ硫酸アンモニウムを加え、4 ℃で8時間以上置く。塩析したサンプルを集菌瓶にあけ、4 ℃、7000 rpm、50 min遠心し、上清を捨てる。各集菌瓶に50 mM Tris-HCl/ 200 mM NaClを10ml程度加え、沈殿が浸るようにして、4℃、1昼夜静置する。可溶化したサンプルを透析膜に移し、50 mM Tris-HCl/ 500 mM NaClに対して透析を行うことで、硫酸アンモニウムを除去する。透析したサンプルをファルコンチューブに回収し、4℃、7000rpm、20min遠心し、上清を用いて(His)6-tag精製を行う。イミダゾールを除去するために、PBSに対して透析を行う。
【００７３】
不溶性画分からのタンパク質の回収と巻き戻し：
１．原理
分泌発現系の大腸菌菌体内に不溶性として存在するタンパク質はpel-Bシグナルペプチドの働きで細胞膜の外へ放出される過程で膜に引っ掛かったものが大半を占めている。菌体内膜画分タンパク質の分子内ジスルフィド結合は、大腸菌シャペロニンの働きにより正しく形成されていると考えられており、ゆえにタンパク質変性剤のみで可溶化して回収し、変性在を除去して巻き戻しを行う。
【００７４】
２．分泌発現系不溶性画分の回収と巻き戻し
菌体を超音波破砕(sonication)し(170W、15 min)、菌体破砕液を10000 rpm、40 minで遠心分離し、沈殿を回収する。培養液1 L当たりの沈殿に、10 mlの6 M塩酸グアニジン/ 20mM Tris-HCl/500mM NaCl/5mM imidazoleを加え、一晩つける。10000 rpm、30 minで遠心分離し、上清を用いて(His)6-tag精製を行う。溶出画分のタンパク質濃度を測り、7.5μM以下に希釈し、3M、2M、1M、0.5M、0M塩酸グアニジン/50 mM Tris-HCl/200mM NaCl/1mM EDTAで段階透析法による巻き戻しを行う。塩酸グアニジン濃度が1MからはL-アルギニン塩酸塩を0.4Mとなるように加える。
【００７５】
金属キレート(His)6-tagアフィニティークロマトグラフィー：
１．原理
微生物を用いて大量調製した目的蛋白質はそのN末端またはC末端に融合発現させた6つのヒスチジン残基からなる(His)6-tagを利用して簡便かつ迅速に精製を行うことが可能である。ヒスチジン残基の側鎖のイミダゾール環はpH 8.0において1つの非共有電子対を持ち、それを2価の正電荷を持つ遷移金属イオン（Co2＋、Ni2＋、Cu2＋、Zn2＋）に配位することができる。その親和性により(His)6-tagを持った蛋白質は金属イオンを固定化したクロマトグラフィー担体に特異的に吸着し分離される。吸着した目的蛋白質は50mM〜1Mのimidazoleを含むbufferを流すことで溶出される。
【００７６】
２．準備するもの
・Binding Buffer：サンプルロード前のpre-washおよびwashに使用。
5 mM imidazole
6M Gu-HCl
PBS  pH 7.9
・Wash Buffer：washに使用。
20mM imidazole又は 40mM imidazole
6M Gu-HCl
PBS pH 7.9
・ Elute Buffer：eluteに使用。
100mM imidazole、200mM imidazole 又は300mM imidazole
6M Gu-HCl
PBS pH 7.9
・8 x Charge Buffer：Ni2＋の固定に使用。
400 mM   NiSO4  in H2O
ミリQ水に溶解させる。PBSを用いると塩が析出するので注意。
実際には0 mM imidazole, 6 M Gu-HCl, PBS (pH7.9)と、500mM imidazole (もしくは1M imidazole), 6M Gu-HCl, PBS(pH7.9)をストックし、二種類のBufferを混合することにより、各imidazole濃度Bufferを作製する。
【００７７】
３．操作
樹脂を混ぜて均一にし、カラムに注ぎ、静置する。10 mlのBinding Bufferでpre-washを行うが、カラムに溶液を注ぐときにはピペッティングで行い、カラム表面を乱さないようにする。つづいて、サンプルをロードし、溶出液は(素通り画分)として回収する。10mlのwash Bufferでwashを行い、溶出液は(wash画分)として回収する。elute bufferを加え、ファルコンチューブに回収する。各々の画分の280nmにおける吸光度を測定し、適当量をSDS-PAGEのサンプルとして調製し分析する。
【００７８】
ファージ調製：
１．原理
本研究ではヘルパーファージ / ファージミド系によるファージ提示系を採用しており、ファージミドによる形質転換の他にヘルパーファージの感染によるコートタンパクの供給が必要である。培地上に分泌された繊維状バクテリオファージM13はPEG6000の存在下で沈殿でき、ペレットをバッファーで溶解することにより可溶性ファージを調製する。
【００７９】
２．準備するもの
・ファージミド
・大腸菌 (DH12S, JM109)
・ヘルパーファージ M13K07
・LB培地
・アンピシリン
・カナマイシン
・20% Polyethylene glycol (PEG)6000 2.5M NaCl
・Blocking Buffer (Super BlockTM Blocking Buffer in PBS:PIERCE)
・Tween20
【００８０】
３．操作
目的のファージミドを用いてエレクトロポレーションにより大腸菌DH12S株を形質転換し、1時間のcuringを行った後、終濃度100μg/mlのアンピシリンを含む20ml LB培地で4〜5h培養する。ヘルパーファージ M13K07 (1×1011 cfu/ml)を20μl加え、100rpmで1h振盪する。カナマイシンを終濃度50μg/mlになるよう加え、O/Nで振盪培養する。4℃ 7000rpmで20min遠心して菌体を回収し、回収した培地に5mlの20%PEG6000/2.5MNaClを加え、氷中に1h静置する。4℃, 10000rpmで 20min遠心し、丁寧に上清を取り除いた後、沈殿を850μlの Blocking Buffer-Tに溶解する。
【００８１】
バイオパニング：
１．原理
膨大な数の抗体ライブラリーの中から目的のクローンを獲得するには、何らかの選択法を用いてファージ抗体のスクリーニングを行う必要がある。主な手法として、イムノチューブや、マグネットビーズを用いた手法等が利用さているが、いずれも精製された抗原に対する選択手法である。ここでは、pMHCに対してスクリーニングを行う手法として、これまでの報告及び当研究室で利用されているマグネットビーズを用いたパニング操作を参考にして行った手法について述べる。
【００８２】
２．準備するもの
・調製したファージ抗体（通常PEG沈後、850μl PBSに溶解）
・PBS  
・PBS-T（0.05%Tween20(v/v))
・Blocking Buffer
・20ｍM MES Buffer (pH7.0)
・可溶性VL断片（10μg/ml）
・JM109グリセロールストック
・20ml LB培地
・0.1mg/ml Amp(+)LBプレート(角型2号シャーレ)
・50mg/ml Kanamycin
・ビオチン化pMHC
【００８３】
３．操作
抗体可変領域を提示させたファージ抗体ライブラリーを調製する。PBS洗浄を施したマグネットビーズにBlocking Buffer 800μlと、抗原pMHC分子1μg入れ、緩やかに1時間撹拌し、抗原を固定化する。マグネットビーズを固定化しながら上清を除去し、ビオチン化されていない抗原を除去するためBlocking Buffer-Tで3回洗浄する。調製したファージライブラリーを加え、1h振盪する。オープンサンドイッチ法を採用する場合は、この時点で、可溶性VLを1μg加える。上清を除去し、Blockng Buffer-Tで洗浄する(5分×5回)。洗浄液をPBS-Tに変更し、再度5分×5回洗浄する。PBSで一度洗浄し、その後、10%グリシン-塩酸(pH 2.0)を750 μl投入し、10分振盪する。回収したファージに250μlを混合し中和を行った後、O.D.600=0.3〜0.5に培養した大腸菌JM109培養液 (LB 20 ml）に加え感染させる（100/minで1h振盪）。50mlファルコンチューブに移し、室温、6000 rpmで15 min遠心した後、沈殿を角型LBプレート(Amp+)にプレーティングする。一晩プレート培養した後、  プレートに滅菌したLB培地3ml程度を加え、よくスプレッディングする。ピペットマンで回収し、LB 20mlに移し、ファージライブラリーを再調製する。以上の操作を数ラウンド繰り返す。2ndラウンド以降は、抗原を結合していない系に投入し1h振盪し、非特異吸着するファージを除去した。
【００８４】
ELISA：
１．原理
一次抗体を抗原に結合させ、酵素標識した二次抗体で計量する手法がELISA（enzyme linked immunosorbent assey）である。本研究ではオープンサンドイッチELISAを測定系とし、酵素標識した検出抗体としてanti-c-myc mouse monoclonal IgG HRP conjugateを用い、発光度を定量的に測定した。
【００８５】
２．準備するもの
・PBS
・PBS-T（0.05%Tween20 (v/v)）
・Blocking Buffer
・可溶性VL断片（10μg/ml）
・一次抗体anti-c-myc mouse monoclonal IgG HRP conjugate（PBSで2000倍希釈）
・ストレプトアビジン
・ビオチン化pMHC
・ECLTM  Western Blotting Detection Reagent
・96穴プレート
・Fluorescan
【００８６】
３．操作
96穴プレートにストレプトアビジン溶液 (1 mg/ml)を100μl/wellで投入し、一晩静置して固定化する。ストレプトアビジン溶液を回収し、Blocking Bufferを200μl/well投入し、1h静置する。ビオチン化した抗原を投入し、1h静置することで抗原を固定化する。PBS-Tでビオチン化していない抗原を取り除いた後、培養した菌体の破砕液上清と培地上清を投入し、1h緩やかに振盪させて抗体と抗原を結合させる。上清を除いた後、PBS-Tで5分×5回洗浄する。PBSで希釈した一次抗体を投入し、1h穏やかに振盪する。上清を除いた後、PBS-Tで5分×5回洗浄する。Western Blotting Reagentを加えてFluorescanにより発光強度を測定する
【００８７】
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)：
１．原理
蛋白質をポリペプチド鎖にして分離する方法。SDSがポリペプチドに結合してマイナスの電荷を与えるため、ポリペプチド鎖の本来の電荷に関わりなくプラス極方向に泳動され、分子量に応じて蛋白質を分離できる。
【００８８】
２．準備するもの
・30％アクリルアミド溶液 (100ml)
acrylamide              29.2g
bis-acrylamide            0.8g
ddH2O               to 100ml
・lower gel buffer (pH8.8) (100ml)
Tris             18.17g (1.8M)
SDS                    0.40g
・upper gel buffer (pH6.8) (100ml)
Tris              6.06g (0.8M)
SDS                    0.40g
・10％過硫酸アンモニウム(APS)
APS                    10mg
H2O                   100μl
・N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)
・2-propanol
・100％ TCA (W/v)
・2%DOC (デオキシコール酸ナトリウム: sodium deoxycholate)
・sample buffer (pH6.8) (100ml)
Tris           0.76g (62.8mM)
SDS                    2.30g
100% glycerol            8ml
・10 x bromophenol blue 溶液 (BPB溶液)
BPB                     1mg
100% grycerol             100μl
H2O                     900μl
これをサンプル調製時に10 xとして使う。
・β-mercaptoethanol
・acetone
・10 x running buffer (1L)
Tris                     30g
glycine                 144g
SDS                     10g
・染色液
coomassie brilliant blue R-280   2.8g
methanol                   280ml
acetic acid                   80ml
H2O                        200ml
・脱染液
methanol              100ml
acetic acid             100ml
H2O                   800ml
・ゲル板
・クリップ
・スペーサー
・コーム
・泳動槽
・染色・脱染用ケース
・ハイブリバッグ
【００８９】
３．ゲルの作製
ゲル板をエタノールと水できれいに拭いた後、スペーサーを挟んでゲル板を組む。必要とする組成のlower gel溶液を調製し、10％APS 35μl、TEMED 5μl (それぞれゲル１枚分の量)を加えてよく混ぜてから、流し込む。2-propanolを重層させ、ゲルを重合させた後、2-propanolを除去し、upper gel溶液を調製する。10%APS 、TEMED を加えてよく混ぜてから、ゲル板に流し込み、コームを挿入する。
【００９０】
４．サンプル調製
サンプルは、1サンプルあたりの蛋白質が8μg前後になるように調製する。もしこれに十分な濃度の蛋白質溶液であるならば以下のように調製する。満たない場合はサンプルの濃縮を行う。
sample                       x μl
H2O                       (8-x) μl 
sample buffer                12μl 
10 x BPB溶液                 2μl
β-mercaptoethanol             1μl
total                          20μl 
これらの試料を混合し100℃で5分煮沸する。
サンプルの濃度が不足した場合は、TCAによる濃縮操作をエッペンにサンプルを入れtotal 1mlになるように水を加える。2％ DOCを8μl 加えエッペンを上下にし、よく混合する。100％ TCAを70μl 加え、よく混合し、10分室温で放置。12000rpm、10分冷却遠心した後、上清をていねいに取り除き、アセトンを800μl 加える。12000rpm、5分遠心した後、上清をていねいに取り除き、dry upする。水を5μl 加え、上記のsampleとする。
【００９１】
５．泳動
スペーサーをはずしてゲル板を組み、running bufferを満たした泳動槽に立てる。泳動槽の上方からもrunning bufferを注ぎ、サンプルをアプライする。定電圧100Vで泳動し、BPBのマーカーが先端に来たら泳動を中止する。
【００９２】
６．染色および脱染
ゲル板からゲルを外し、ケースに入れ、染色液を入れた後1時間ほど静置する。染色液を戻し、ゲルを軽く洗った後、脱染液を入れる。
【００９３】
ウェスタンブロッティング（Western blotting）：
１．原理
SDS-PAGE後、メンブレンに蛋白質を吸着させ、目的とする蛋白質の特異抗体をプローブとして、目的蛋白質を検出する方法。目的蛋白質の有無、定量、見かけの分子量の解析などに用いられる。検出方法として放射性同位体を用いる方法もあるが、本実施例ではhorseradish peroxidaseによるルミノールの酸化化学発光で検出を行っている。
【００９４】
２．準備するもの
・transfer buffer
Tris                    21.2g
glycine                100.9g
H2O                 to 800ml
＊この状態で保存し、使用する際に20 vol%となるようにmethanolを加える。
・PBS-T (0.05% Tween20/PBS)
・blocking buffer (8% skim milk (DIFCO))
・検出抗体(HRP conjugate)
・ECLTM Western blotting detection kit (Amersham Pharmacia)
・転写装置
・メンブレン(ECLTM Nitrocellulose membrane)
・ろ紙(Whatman 3MM)
【００９５】
３．操作
Lower gelの大きさのろ紙2枚とメンブレン1枚、および大きめのろ紙(スペーサーを覆う大きさ)を1枚をtransfer bufferに浸す。SDS-PAGE後のlower gelをtransfer bufferに30分浸す。転写装置にろ紙、ろ紙、メンブレン、ゲル、大きいろ紙の順に重ね、定電流170mAで40分転写。メンブレンをblocking bufferに1時間つけ、PBS-Tで3回washする(15分、5分、5分)。メンブレンを検出抗体に30分つけ、PBS-Tで3回washする(15分、5分、5分)。メンブレンをキムワイプで拭いた後、ECLTM Western blotting detection kitのdetection reagent 1および2を、それぞれ1mlずつメンブレン上に加え1分静置する。detection reagentをキムワイプでよく拭き取り、LAS1000で撮影する。
【００９６】
表面プラズモン共鳴(SPR) ：
１．原理
定量的な結合活性評価のもう一つの手段として、表面プラズモン共鳴による実験を行った。本手法は、分子が結合した不活性金属板に光を照射し、表面プラズモン波とエバネッセント波が共鳴する際（表面プラズモン現象）の入射光と反射光の角度の差（SPR角度）を測定するものである。不活性金属板上の分子に違う分子が結合し、不活性金属板の質量が増加するのに伴ってSPR角度は大きくなるので、これを追うことにより、相互作用の観測が可能となる。
【００９７】
２．準備するもの
・表面プラズモン共鳴（SPR）
活性化試薬
EDC(N-エチル-N’-（3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドヒドロクロライド)
NHS（N-ヒドロキシスクシニルイミド）
100μg/ml ストレプトアビジン
10mM酢酸緩衝液
1Mエタノールアミンヒドロクロライド
センサーチップ（CM5）
【００９８】
３．操作
ストレプトアビジンを超純水に濃度1mg/mlとなるように溶かす。固定化の前にストレプトアビジン溶液に１M酢酸ナトリウム溶液（ｐH5.0）を終濃度10mMとなるように加え、アミノカップリングキットを用いてアミノカップリング法により、シクロメチルデキストラン上に固定化する。この上にアナライトサンプルを流して固定化し、さらにリガンド溶液を流す。
【実施例１】
【００９９】
本実施例では、標的抗原として、VPLRPMTYからなるアミノ酸配列を有するぺプチド(VY8)がHLA class I の一種であるHLA-B35に提示されたクローンを採用した。対して、コントロールとしては、RPQVPLRPMTYという配列のペプチドを提示したHLA-B35を用いた。VY8を提示したpHLAについては既に、X線結晶構造解析が終了し、構造が既知なこと(Smith, K.J., Reid, S.W., Stuart, D.I., McMichael, A.J., Jones, E.Y., Bell, J.I. (1996) An altered position of the alpha 2 helix of MHC class I is revealed by the crystal structure of HLA-B*3501 Immunity 4, 203 -213)、及び、この抗原を提示した細胞に対しに非常に強い細胞傷害性を示すCTLがクローニングされており（非特許文献５）、これらTCRのCDRが高感度な可能性が高いことを重要視し、標的抗原として決定した。
【０１００】
VY8を提示した抗原に対し高感度なCTLクローン間で、TCA-α鎖に高い相同性を示すものが確認されており、このうちの139というTCRのCDRを移植することとした。このクローンはαβ型のTCRを発現しており、以下、139クローンのTCRのα鎖の塩基配列とアミノ酸配列、及びβ鎖のアミノ酸配列とヌクレオチド配列を夫々、図１及び図２に記載する。
【０１０１】
次に、ＴＣＲのＣＤＲを移植する抗体として、配列相同性の高い抗体クローンよりも、構造安定性、大腸菌発現系における発現量を重視して、本発明者らによって作製された既存の抗体の中から、最も該当するクローンとして、ヒト抗体である金表面認識抗体G4B10をVHドメインとして採用した。同様の理由からVLドメインとして、ヒト抗体である抗PHB抗体3d3をVＬドメイン採用した。これら各領域のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を、ぞれぞれ、図３及び図４に示す。
【０１０２】
一般にTCRと抗原の結合活性は低いと考えられるため、その柔軟性を考慮したとしても、pHLAとの結合に際しての大幅な構造変化は、余計なエネルギー障壁となり、結合力の消失に繋がる恐れが想起された。この想定の下、CDRの移植前後で、可能な限りループの位相が一致するように移植することが必要だと考えた。そこで、以下の事項に留意して、TCR様抗体の構築に当たった。
［設計時の留意点］
１．遺伝子再編における多様性創出機構の類似性から、抗体VHドメインにTCRのβ鎖のCDR、抗体VLドメインにTCRのα鎖のCDRを移植
２．CDRと抗体でアミノ酸配列のナンバリングが等しくなるように移植
３．SWISS-MODEL(http;//SWISS-MODEL.expasy.org//)を用いたホモロジーモデリングにより鋳型TCRと作製したTCR様抗体の構造情報をシミュレーションし、SWISS PDB Viewerにて重ねあわせ、CDRの位置を調節
４．移植CDRループの長さが短ければ鋳型抗体が持っていたCDR配列の一部を挿入し、長すぎたならば適宜アミノ酸残基を削除
５．それでもCDRループが長すぎる、もしくは、CDR領域の開始位置がずれている場合は、抗体FR領域にある残基を削除しながら、CDRループの位相を最適化
【０１０３】
以下の表１及び表２に、対応する139のα鎖及び抗PHB抗体3d3のVＬドメインにおける各CDRのアミノ酸配列、並びに、対応する139のβ鎖及び抗体G4B10のVHドメインの各CDRのアミノ酸配列を示す。
【０１０４】
【表１】
2009278927.tif 000003
【０１０５】
【表２】
2009278927.tif 000004
【０１０６】
まず、上記の設計時の留意点１〜３を踏まえた上でTCR様抗体の一次配列を設計した（Mutant VH1：配列番号９）。更に、抗体G4B10のＶＨ領域の各ＣＤＲに139β鎖の対応する各ＣＤＲを移植した結果、CDR1の開始点のずれ、CDR2とCDR3のループがTCRのモデルより長いと予測されたため、いずれも調整の必要性があると考えた。
まずCDR１に対しては、抗体のFR領域1のC末端側を5残基分削除した。CDR2に対しては、CDRの開始点のずれを修正するため、抗体のフレームワーク領域の49位のGly残基を削除した。さらにCDRループの短小化を図るため、抗体由来のCDRが残る領域から2残基分の削除を考えた。抗体パラトープの付近のアミノ酸残基は、柔軟性の維持はもとより、より立体障害性の低いものが望ましいと考え、45位47位のアスパラギン酸を除去した。最後にCDR3に対しては、C末端のF108とF109が、TCRパラトープではなく、CDR領域を支える役割を担っていると考え、片方を削除した。調整後、CDRのループ形状をかなり近接させることができた。再設計後のアミノ酸配列とホモロジーモデリングを行った結果得られたアミノ酸配列（Mutant VH2：配列番号１０）を以下に示す。四角枠で囲まれたアミノ酸配列がTCRの各CDR由来のものであり、下線が付されたアミノ酸配列が抗体由来の各CDR由来のものである。
【０１０７】
【表３】
2009278927.tif 000005
【０１０８】
【表４】
2009278927.tif 000006
【０１０９】
同様にして、抗PHB抗体3d3のＶＬ領域の各ＣＤＲに139α鎖の対応する各ＣＤＲを移植してTCR様抗体の一次配列を設計した（Mutant VL1：配列番号１１）。CDR1、CDR3は大凡近接したループ形状をとることが予測されたため、CDR2のみの調整を考えた。今度は、CDRループが短いために、鋳型抗体のCDRに含まれるアミノ酸残基を用いてループを再構築した。再設計後のアミノ酸配列とホモロジーモデリングを行った結果得られたアミノ酸配列（Mutant VL2：配列番号１２）を以下に示す。四角枠で囲まれたアミノ酸配列がTCRの各CDR由来のものであり、下線が付されたアミノ酸配列が抗体由来の各CDR由来のものである。
【０１１０】
【表５】
2009278927.tif 000007
【０１１１】
【表６】
2009278927.tif 000008
【０１１２】
次に、このようにして設計したTCR様抗体の構成成分である各ポリペプチドのフレームワーク（FR）領域に当たる領域では鋳型抗体由来の塩基配列とし、移植したCDR領域については大腸菌における最も使用頻度の高いコドンを選択し、TCR様抗pHLA抗体のＶＨ領域（gG4B10：図５）及びＶＬ領域（g3d3：図６）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を決定した。こうして決定したヌクレオチド配列に基づき、下記に示すプライマーを用いてOverlap extension PCRによりTCR様抗pHLA抗体の各領域をコードする遺伝子の全合成を行った。
【０１１３】
その後、それぞれの遺伝子を10pmolになるようにマイクロチューブ内に混同し、ポリメラーゼ KOD+ を用いて、アニーリング温度57℃~58℃でPCR反応を行った2％のアガロースゲルを用いた電気泳動を経て、目的と思われるDNA断片を切り出し、精製した。その精製産物と、上記プライマーの内の両端に当たるプライマーB1、B6、A1、A6を用いてそれぞれ 2nd PCRを行った。その後、1st PCRと同様に、2%のアガロースゲルを用いて切り出し精製を行った。 精製した遺伝子断片と分泌発現ベクターpRA2を、Nco I / Sac IIで、一晩、消化した。消化物を0.8%アガロースゲル電気泳動により、切り出し精製した。その後、それぞれの断片を用いてライゲーションを行ない、遺伝子を挿入した本発明のベクターを作製した。以上のベクター構築の概要を図７に示す。
【０１１４】
139-B1  （配列番号１７）
NNNNCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGTCAGTGAAAATTTCCTGCAAG
139-B2   （配列番号１８）   
TGTCCCGGGGCCTGACGCACCCAGTTGATCCAGTAGGTCGCATGGCCGCTTCCAGACGCCTTGCAGGAAATTTTCACTGACGCGCC
139-B3    （配列番号１９）  
TGCGTCAGGCCCCGGGACAAGGGCTTGAATGGATGTTTCAGAACAACGGCGTGTCTACCCGTTATAGCCCGTCCTTCCAGGG
139-B4 （配列番号２０）  
GTCGTCAGAACGCAGGCGGCTCAGTTCCATGTAGGCGGTGCTGGTGGAGGTGTCACGGGTCATGGTGACACGGCCCTGGAAGGACGGGCTATAACG
139-B5（配列番号２１）  
AGCCGCCTGCGTTCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGCAGCCTGGATCTGGTGAGCACCGAAGCGTTTTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACC
139-B6（配列番号２２）  
NNNNACCCGCGGAACCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTGCCTTGGC
139-A1（配列番号２３）  
NNNNCCATGGCCGACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC
139-A2 （配列番号２４）  
GGGCTTTCCCTGGTTCATGTTGATACCAATGTAAATAGCCATAAAAGCCGCTGGTTGCCCGGCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAG
139-A3 （配列番号２５）  
GGTATCAACATGAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAACGCGCTGGATGGCAATTTGCAAGGTGGGGTCACATCAAGGTTCAG
139-A4 （配列番号２６）  
GTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGTTGCAGAGTGCTGATGGTGAGAGTGAAATCTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAACCTTGATGTGACCCCACCTTG
139-A5 （配列番号２７）  
GCACTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTGCGGTGACCGATAACTATGGCGAGAACTTTGTGTTCGGCGGGACCAAAGTGGATATCAAAC
139-A6 （配列番号２８）  
NNNNCCGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCGCCGAA
【実施例２】
【０１１５】
［TCR様抗体Fv断片の大量調製］
TCR様抗pHLA抗体のVL及びVHを実施例１で得られた発現ベクターを用いて、夫々、単独に調製し、後にこれらを混同してTCR様抗体Fvを作製した。ます、各ベクターでBL21(DE3)株を形質転換し、250mlスケールでO.D.600≒0.8まで振盪培養した。その後、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)を終濃度1mMになる様に添加することで発現誘導を行った。菌体内不溶性顆粒としての発現を認めたため、5mM イミダゾール、6M塩酸グアニジンを含むTris-HCl溶液で可溶化した。金属キレートアフィニティークロマトグラフィーで精製を行った後の100mM イミダゾール溶出画分について、ラウリル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により精製度を確認した（図８）。
【０１１６】
SDS-PAGEの結果より、VH、VL断片とも高純度に精製されていると判断した。この溶出画分をそれぞれ40μMずつになるように等量混合し、段階透析法による巻き戻し操作を行った。可溶化率は約60％であった。
【０１１７】
巻き戻し産物に対して、Superdex75を用いたゲルろ過クロマトグラフィーとSDS-PAGEを行い、多量体形成を解析した。結果を、図９及び図１０に示す。図９の（２）の溶出画分にてVL及びVH断片が等量程度確認され、この溶出画分をFvとし、作製したTCR様抗体が天然の抗体のFvと同じようにヘテロな２量体を形成することを確認した。また、（３）では、VH及びVLドメインの単量体が検出され、CDR移植後も単独で安定に存在可能な様子が観測された。
【０１１８】
続いて、CDスペクトル測定により、調製したFvの２次構造の形成を評価した。結果を以下の図１１に示す。TCR様抗体Fvはゲルろ過後の２量体画分を濃縮し、測定に用いた。コントロールとして、培地上清に分泌発現し、２次構造が保証されている金表面認識抗体Fv G4B10-b2を採用した。なお、２次構造によるスペクトル吸収の違いにより、以下の表３に示されるような特徴的な波形が現れた。
【０１１９】
【表７】
2009278927.tif 000009
【０１２０】
コントロールとして用いたFvが、βシート由来の217nm近傍の極小を顕著に表した。一方、調製したTCR様抗体は、この近傍に明確な極大極小は確認できなかったものの、200nm付近の波形は通常のランダムコイルとも異なる挙動を示した。これは、精製産物の中に複数の構造が混在していること、もしくは、Fvが若干ランダム構造化している事を示唆している。この現象が、CDRの移植に伴うb構造総量の減少に伴うものか、濃縮作業中に変性した分子に起因するのかはこの段階では判断できない。ゲルろ過直後では完全なヘテロ２量体として存在することを確認し、一定量のβシートの存在を予測した。これらに加え、ランダムコイルの含有を示唆する結果と考えられる。
【実施例３】
【０１２１】
［一本鎖抗体scFvの調製］
実施例２の結果から、TCR様抗pHLA抗体のVH-VLドメイン間相互作用の補完が、より2次構造に富む分子の構築に繋がると考えた。具体的には、VH-VL間をポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体scFvを構築、構造的束縛により弱いVH-VL間相互作用が助長され、会合状態が改善されると考えられるために、次に、一本鎖抗体scFvの構築を試みた。
【０１２２】
まず、TCR様抗体VHドメインについては、139-B1と139-B6という前述したプライマーを用いて遺伝子部分の遺伝子増幅を行った。TCR様抗体VLドメインについては、VHのC末端側の配列、G3リンカー(Gly4Ser)3、VL断片のN末端をコードしたプライマーG4B10-3d3scFv3rdを設計し、これと、139-A6により遺伝子増幅を行った。それぞれのPCR増幅断片と139-B1、139-A6を用いて、2nd PCRを行った。増幅された断片をNco I / Sac IIにて消化、分泌発現ベクターpRA1にクローニングを行った。構築した一本鎖抗体scFvのベクターマップを図１２に示す。
【０１２３】
G4B10-3d3scFv3rd （配列番号２９）
CACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGGGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGGTCGGGCGGTGGCGGATCCGACATCGTGATGACCCAGTCTCCATC
【０１２４】
こうして構築した一本鎖抗体ベクターを用いて大腸菌BL21(DE3)株を形質転換し、250mlスケールで、O.D.600≒0.8まで振盪培養を行った。IPTGを終濃度1mMになる様に添加し、発現誘導を行った。菌体内不溶性画分としての発現を確認したため、5mM イミダゾール 6Mグアニジン塩酸塩を含むTris-HCl溶液で可溶化を行った。金属キレートクロマトグラフィーによる精製を行い、その100mMイミダゾール溶出画分を用いてSDS-PAGEを行い、精製度を確認したところ、高純度なタンパク質溶液として調製できたことをSDS-PAGEにより確認した（図１３）。
【０１２５】
この100mMイミダゾール溶出画分を10μMに希釈した後、段階透析法を用いて巻き戻し操作を行った。巻き戻し産物を用いて、Superdex75によるゲルろ過クロマトグラフィー（図１４）及びSDS-PAGE（図１５）を行った。この結果から、（４）及び（５）の溶出画分が単量体と考えられ、作製したTCR様抗体scFvが単量体として調製できたことが明らかとなった。
【０１２６】
次に、TCR様抗体scFv単量体の溶出画分を濃縮後、CDスペクトル測定を行い、その2次構造を評価した。結果を以下の図１６に示す。コントロールとしては、CDRを移植しない状態のscFv  (G4B10-G3リンカー-3d3) をTCR様抗体の巻き戻しと同条件で調製し、測定に用いた。リンカーでVH-VLドメインを連結したscFvでは、Fvに比べ200nm付近のb構造を示す上昇が明確に観測され、β構造がより豊富な分子を調製できたといえる。
【実施例４】
【０１２７】
［一本鎖抗体scFvの調製］
次に、リガンドとして基板に固定化できるようなTCR様抗体scFvを調製を試みた。VH及びVL両ドメインに含まれるリジン残基で、尚且つ溶媒表面に側鎖を出す残基は少なく、アミンカップリングにより抗体を固定化した際には結合能の喪失や構造変化を引き起こす恐れが想起された。そこでビオチン融合タグ上に豊富に存在するLys残基をアミンカップリングの際に支配的に結合させれば、ヘテロ２量体構造の維持と良好な配向性が達成できると考えビオチンタグ融合ベクターを用いてscFvを調製した。
【０１２８】
まず、実施例１にて構築したベクターをNco I/Sac IIで消化した後、ビオチンタグ融合ベクターpRA biotagに組み替え、更に、このビオチンタグ融合ベクターに含まれるVH断片に代えてscFvの遺伝子を挿入したベクターを構築した。菌体内不溶性顆粒としての発現を確認し、5mMイミダゾール、6Mグアニジン塩酸塩を含んだTris-HCl溶液で可溶化後、実施例３と同様の手順に従いscFvを調製した。精製後の可溶化率は約100%であった。
【０１２９】
金属キレートクロマトグラフィーを行った際の各溶出画分を用いたSDS-PAGEと、Superdex75を用いたゲルろ過クロマトグラフィーを行った結果を図１８及び図１９に示す。ビオチン融合抗体scFv が単量体として調製出来たことを確認した (図１９、（３）、（４）)。更に、ゲルろ過クロマトグラフィー後の各フラクションのSDS-PAGEの結果を示す（図２０）。調製したscFv単量体の溶出画分を用いて、1/8モル当量のstreptavidin (SIGMA)と混合し、さらに4℃にて一晩穏やかに振盪混和することによって、４量体作製を行った。その後、superdex200によるリクロマトグラフィーを行った結果を図２１に示す。scFvを用いた場合には、Fvが解離する恐れが無いことから、サイズ排除画分に排斥されず溶出された＊のフラクションはscFvの４量体と予想される。
【実施例５】
【０１３０】
［TCR様抗体scFvを用いた結合活性評価］
pHLA ４量体をアナライトとして添加した。pHLA ４量体の作製手順は、1/8モル当量のstreptavidinを1時間毎10回に分けて投入し、その後一晩転倒混和ことで得た。ゲルろ過を経て調製したscFv単量体をアミンカップリングによりセンサーチップに3306RU固定した。SPR試験の結果を以下の図２２に示す。
【０１３１】
固定化したTCR様抗体scFvはアナライトであるpHLA ４量体に対し濃度依存的（pHLA ４量体濃度が高くなるにつれ、Responseの値も高くなる）な結合活性を示した。結合曲線のモデルフィッティングを試みたが、通常の結合モデルと異なるため適合しなかった。1:1のLangumuirの結合モデルと比較すると、インジェクト直後の早い結合と早い解離、インジェクト中に観測される遅い結合と遅い解離という2相の結合が複合したセンサーグラムであると示唆される。
【０１３２】
一般的なTCR-pHLA相互作用は早い結合解離速度という特性を示すとされ、TCRのCDR特性の反映としては、前者が目的の結合相として合致する。しかし、Rheinneckerらの多価化と結合速度の検証は多価化に伴う結合相の複雑化という知見を与える（Rheinnecker, M., Hardt, C., Ilag, L.L., Kufer, P., Gruber, R., Hoess, A., Lupas, A., Rottenberger, C., Plueckthun, A., Pack, P. (1996) Multivalent antibody fragments with high functional affinity for a tumor-associated carbohydrate antigen J.Immunol 157(7) 2989-2997）。よって、後者の結合も衝突頻度などの要因から目的の結合が変化したものであると捉えることが出来得る。
【実施例６】
【０１３３】
［streptavidin融合ビーズを用いたフローサイトメトリー (FCM)］
実施例５、TCR様抗体scFvの結合活性が示されたので、FCMを用いた測定系においてscFvの結合活性を確認した。Andersonらが報告したstreptavidin融合ビーズを用いたFCMにTCR様抗体４量体を適用した（Anderson, L.N., Haines, L.R., Pearson, T.W. (2003) An Effective and Rapid Methods for Functional Characterization of Immunoadsorbents Using POROS Beads and Flow Cytometry J.Proteome 3, 228-234）。実施例４にて構築したscFvの４量体画分と、pHLAを固体化したstreptavidin融合ビーズを用いて結合活性の検出を行った。ビーズは、結合容量より過剰に用意した抗原pHLA溶液と1時間混合し、PBS-Tween20 (0.5%)で2度洗浄した。多価抗体の作製は、PE標識したstreptavidin (Invitrogen) を用いて行った。scFv ４量体とpHLA+ビーズを氷中で混合し、ビーズの蛍光強度をFACS Caliber (Becton Dickinson)を用いて検出した。得られた結果を図２３に示す。FCMにおいても、TCR様抗体scFvが標的抗原に対する結合活性を有していることが支持された。更に、strreptavdinによる非特異結合が支配的ではないこと、TCR様抗体scFvがstreptavidinに対して非特異相互作用をする可能性が新たに示された。
【０１３４】
同様の実験を、Fvを用いて行った。結果を図２４に示す。Fvを用いた解析では、pHLAに対して弱く結合する様子が確認されるが、scFvに対して非常に劣るといえる。よってこの実験結果もリンカーでの結合が有効だったことを反映した結果といえる。
【実施例７】
【０１３５】
［pHLA単量体をアナライトとして用いたSPR試験］
図２２よりTCR様抗体scFvの結合活性が確認されたが、2相の結合を帰属出来ず速度論的解析には適合しない結合曲線となった。前述の様に遅い結合解離速度を示す結合相が多価効果に由来することを裏付け、さらには結合活性評価に耐え得る結合曲線を得る為に、アナライトをpHLA単量体としたSPR試験を行った。またscFvの固定化に関しても、より穏和な状態で固定化するためビオチンを融合したscFv上でStreptavidinを介して基板に固定、さらに測定温度も検出温度の最低推奨温度の10℃とすることで固定化scFvの変性を極力抑える様に設定した。得られたセンサーグラムを図２５及び図２６に示す。
【０１３６】
本測定系においても、TCR様抗体scFvと標的pHLAが有意な結合を示すことを確認した。また、解離の早い結合相が顕著な濃度依存性を示し、これをTCR様の結合とした。図２５を用いて、1:1 Langumuirの結合モデルとのフィッティングを行ったが適合しなかった。しかし、結合解離の早い結合相を、多価効果を含まないTCR様の結合と帰属したことから、平衡状態でのスキャッチャードプロットからの結合解離平衡定数の解析を試みた。
【０１３７】
図２７では、結合が平衡に達する時間の短縮のため高濃度のアナライト溶液を調製し測定を行った。濃度依存的（pHLA単量体濃度が高くなるにつれ、Responseの値も高くなる）な結合活性を示すことが確認された。インジェクト終了直前を平衡値とみなしてスキャッチャードプロットを行い、KD =1.2×10-4 Mの結合パラメータを得た。図２８にスキャッチャードプロットの結果を示す。
【０１３８】
図２６において、結合の平衡状態を得るために、アナライト濃度、インジェクト時間、抗原固定化量を工夫したが平衡状態を作り出すに至らなかった。平衡状態に至らない原因として、pHLAのstreptavidinに対する非特異相互作用が考えられる。経験的にpHLAとstreptavidinが非特異相互作用することが知られており、実際、SPR試験によりTCRとpHLAの相互作用を解析したJonesらの報告、Weberらの報告を見ると、完全な平衡状態でないセンサーグラムを基に結合解離平衡定数を算出している（Jones, L.L., Brophy, S.E., Bankovich, A.J., Colf, L.A., Hanick, N.A., Garcia, K.C., Kranz, D.M. (2006) Engineering and Characterization of a Stabilized a1/a2 Module of the Class I Major Histcompatibility Complex Product Ld  J.Mol.Biol 281(35), 25734-25744； Weber, K.S., Donermeyer, D.L., Allen, P.M., Kranz, D.M. (2005) Class II-restricted T cell receptor engineered in vitvo for higher affinity retains peptide specificity and function  Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102(52), 19033-19038）。本実施例でも同様にインジェクト終了直前を擬似的な平衡状態と仮定してスキャッチャードプロットを作成した。結果を図２８に示したが、各々の結合値の間での相関が見られ算出された解離平衡定数に一定の正確性が加味されていると考える。
【実施例８】
【０１３９】
［TCR様抗体の抗原特異性評価］
TCR様抗体scFvの抗原特異性評価を同様のSPR試験測定系にて行った。本項では、アナライト濃度を39μMと一定に固定し、標的pHLA (VY8)とコントロールpHLA (RY11)を添加した。RY11のアミノ酸配列は「RPQVPLRPMTY」である。結果を図２９に示す。
【０１４０】
標的pHLA特異的な結合速度の早い結合相を確認した。しかし、コントロールとしたpHLAではその結合相は観測されなかった。この測定結果は、TCR様抗体scFvが提示ペプチド3残基分の違いを判別する特異性を有することを示し、結合の速度の早い結合がTCR様の結合様式であるという上記の帰属を支持するものといえる。
【０１４１】
また、遅い結合速度を示す結合相についても、標的抗原とコントロールで差異が見られた。一般的にTCRとpHLAの間には一定の交差活性があると知られており、TCR様抗体も同様の交差活性を示す可能性がある。同時にWu らが提唱しているTCR-pHLA相互作用の 2段階結合様式も従属するならば、ペプチド以外の共通部分であるHLAa鎖との相互作用を検出している可能性もある（Wu, L.C., Tuot, D.S., Lyons, D.S., Garcia K.C., Davis, M.M. (2002) Two-step binding mechanism for T-cell receptor recognition of peptide MHC Nature 418, 552-6
）。実際に、VY8を提示したpHLAの結晶構造解析データと、それを基に簡単なモデリングを行ったRY11の構造ではペプチドの立体構造に違いがあることが示唆され、この結合相はTCR様ではないもののペプチド収容溝を形成するαヘリックス付近が関与していると考える。この様に、TCR様抗体scFvは、3残基のアミノ酸の違いを判別する特異性を有することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
HLA class IはCTLによる免疫反応の中で重要な役割を担う。最近の報告から、がん抗原もHLAに提示されることが明らかとなっており、CTLはその抗原認識に基づいてがん細胞を攻撃している。従って、同様の機序を本発明のポリペプチドから構成されるＴＣＲの抗原認識能を有するｓｃＦｖ抗体等のTCR様抗pHLA抗体が担い、抗体依存性細胞傷害活性の誘起によるがん細胞傷害効果を期待できる。また、免疫寛容機能の低下により発症する自己免疫疾患や移植医療の課題である移植断片に対する拒絶反応もpHLAが主要因であり、このようなTCR様抗pHLA抗体がアンタゴニスト抗体として作用を示すことが出来れば、炎症緩和効果が得られると考える。この様に、本発明のポリペプチド及びTCR様抗pHLA抗体は分子標的治療やドラッグデリバリーなどにも応用できる可能性を秘めている。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】139クローンのTCRのα鎖のアミノ酸配列ヌクレオチド配列（配列番号１）とアミノ酸配列（配列番号２）を示す。四角枠で囲まれたアミノ酸配列が各CDRである。
【図２】139クローンのTCRのβ鎖のヌクレオチド配列（配列番号３）とアミノ酸配列（配列番号４）を示す。四角枠で囲まれたアミノ酸配列が各CDRである。
【図３】金表面認識抗体G4B10のVHドメインのヌクレオチド配列（配列番号５）アミノ酸配列（配列番号６）を示す。四角枠で囲まれたアミノ酸配列が各CDRである。
【図４】抗PHB抗体3d3 VＬドメインのヌクレオチド配列（配列番号７）アミノ酸配列（配列番号８）を示す。四角枠で囲まれたアミノ酸配列が各CDRである。
【図５】TCR様抗pHLA抗体のＶＨ領域の塩基配列（配列番号１３）及びアミノ酸配（配列番号１４）を示す。四角枠で囲まれたアミノ酸配列が各CDRである。
【図６】TCR様抗pHLA抗体のＶＬ領域の塩基配列（配列番号１５）及びアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。四角枠で囲まれたアミノ酸配列が各CDRである。
【図７】本発明のポリペプチドを発現するベクター構築の概要を示す。
【図８】菌体内不溶性顆粒としての発現産物を可溶化し、ラウリル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により精製度を確認した結果を示す。
【図９】巻き戻し産物に対するSuperdex75を用いたゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す。
【図１０】巻き戻し産物のゲルろ過クロマトグラフィー後のSDS-PAGEの結果を示す。
【図１１】調製したTCR様抗pHLA抗体FvをCDスペクトル測定した結果を示す。
【図１２】一本鎖抗体scFvのベクターの構造を示す。
【図１３】TCR様抗体scFvである発現産物を可溶化し、ラウリル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により精製度を確認した結果を示す。
【図１４】TCR様抗体scFvの巻き戻し産物に対するSuperdex75を用いたゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す。
【図１５】TCR様抗体scFvの巻き戻し産物のゲルろ過クロマトグラフィー後のSDS-PAGEの結果を示す。
【図１６】調製したTCR様抗体scFvをCDスペクトル測定した結果を示す。
【図１７】ビオチンタグ融合ベクターの構造を示す。
【図１８】ビオチン融合抗体scFvである発現産物を可溶化し、ラウリル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により精製度を確認した結果を示す。
【図１９】ビオチン融合抗体scFvの巻き戻し産物に対するSuperdex75を用いたゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す。
【図２０】ビオチン融合抗体scFvの巻き戻し産物のゲルろ過クロマトグラフィー後のSDS-PAGEの結果を示す。
【図２１】４量体のsuperdex200によるリクロマトグラフィーの結果を示す。
【図２２】TCR様抗体scFv ４量体を用いたビーズ標識実験の結果を示す。
【図２３】TCR様抗体scFv ４量体を用いたビーズ標識実験の結果を示す。
【図２４】TCR様抗体Fv ４量体を用いたビーズ標識実験の結果を示す。
【図２５】pHLA単量体をアナライトとした測定系でのSPR試験の結果を示す。
【図２６】pHLA単量体をアナライトとした測定系でのSPR試験(リファレンスセル指し引き後)の結果を示す。
【図２７】平衡値算出に向けたpHLA単量体をアナライトとしたSPR試験の結果を示す。
【図２８】スキャッチャードプロットの結果を示す。
【図２９】TCR様抗体scFvの抗原特異性評価の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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