(57)【要約】      （修正有）【課題】未処理の軟骨組織における光透過性は低いという事実にも関わらず、膠原線維性結合組織の光酸化処理を可能にする方法を提供。【解決手段】膠原組織の光酸化処理方法において、光照射前に調整用水溶液５にて組織１を前処理する。この前処理段階にて溶液５に透過性を有する組織１を溶液５に含有される色素、特にメチレンブルーにて染色する。この色素は光により活性化され光酸化反応を触媒する。水よりも大きい屈折率を有する添加剤を調整用溶液５に加え、これにより前処理段階中に膠原組織１の光透過率を上昇させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光照射を行う前に未処理の膠原含有組織を水性の調整用溶液により前処理し、同溶液についての透過性を有する組織を、同溶液に含まれる色素によって染色し、この色素を光により活性化して光酸化反応を触媒させる、膠原含有組織の光酸化処理方法において、
水の屈折率、即ち２５℃にて１．３３３より大きい屈折率を有する添加剤が調整用溶液に加えられ、この添加剤により、前処理を行う間において組織の光透過率が増加させられることを特徴とする膠原含有組織の光酸化処理方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記添加剤の屈折率は１．４を上回ることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかに記載の方法において、処理された組織がインプラントとして患者に用いられる場合に実質的に非免疫原性であるように、酸素の存在下にて色素に触媒させて、光酸化により膠原組織を変性させることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、膠原組織の機械的荷重に耐え得る能力が増加するように、光酸化処理によって膠原線維が部分的に互いに架橋されていることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法において、１４〜１８℃にて、以下の３つの過程を経ることを特徴とする方法：
１）１〜５時間にわたって調整用溶液により組織を前処理し、
２）１０〜５０時間組織に光を照射し、
３）脱色溶液によって繰り返し洗浄することにより、膠原組織を脱色し添加剤を取り除く。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記調整用溶液はリン酸緩衝液とグリセリンとの混合液であり、モル濃度１／１５、ｐＨ７．４であるソレンソンのリン酸緩衝液が用いられ、グリセリンの含有率は容量当たり３０％であり、メチレンブルーの含有率は０．０１重量％であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５または６のいずれかに記載の方法において、前記脱色溶液はリン酸緩衝液であり、ここに容量当たり０〜５０％のエタノールが添加され、該リン酸緩衝液は、モル濃度１／１５、ｐＨ７．４であるソレンソンのリン酸緩衝液であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７までのいずれか１項に記載の方法において、光照射段階を通して、酸素を含有する調整用溶液に組織を浸漬することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記調整用溶液はポンプによって循環されることと、該循環される調整用溶液は循環回路中に設けられた冷却装置によって所定の温度に調整されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８または９のいずれかに記載の方法において、光照射が完了する段階に、酸素を含有する調整用溶液に組織を浸漬することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項５に記載の方法において、光照射は断続的に行われ、光照射段階には酸素を含有する脱色溶液に組織を浸漬し、中間段階には光照射を行うことなく組織を調整用溶液によって処理することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法に従って処理された骨層（３）と軟骨層（２）とを有する軟骨試料（１）。
【請求項１３】
靭帯または腱から採取され、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法に従って処理された膠原含有組織。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、前記色素はメチレンブルーであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項２に記載の方法において、前記添加剤はグリセリンであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光照射を行う前に膠原含有組織を調整用水溶液により前処理し、これにより同溶液に対して透過性を有する組織を同溶液に含まれる色素、特にメチレンブルーによって染色し、この色素を光により活性化して光酸化反応を触媒させる、膠原含有組織の光酸化処理方法に関する。膠原含有組織とは、例えば、軟骨組織、及び靭帯または腱の組織である。本発明は、本発明の方法によって処理されたこれらの型の組織に関する。
【背景技術】
【０００２】
膠原含有組織（特に心膜組織）の光酸化処理は、特許文献１に開示されている。この方法では、光によって活性化される色素分子の触媒作用を受けて、膠原線維から遊離したチロシン、トリプトファン及び／またはヒスチジン基が酸素と反応し、その結果、膠原線維が結合する。効果的な色素としては、メチレンブルー、メチレングリーン、ベンガルピンク、リボフラビン、プロフラビン、フルオレセイン、エオシン及びピリドキサール−５−リン酸が挙げられる。
【０００３】
軟骨組織は、独立して生長する軟骨細胞を除けば、膠原線維と高分子プロテオグリカンとの結合組織であり、その成分の約７５％は水である。このような組成であることから、軟骨は、軟質で弾性を有する有孔透過性組織である。組織内に含まれる水は、外部の水と容易に置換可能である。水、または水溶液に溶解された物質の置換は、拡散だけでなく対流によっても可能であり、組織の圧縮及び膨張による容積の変化に関連する。軟骨組織の調整用及び色素による染色において、組織が十分な透過性を備えていることが前提である。これは、靭帯または腱についても同様である。
【０００４】
植え込み型心臓人工弁の製造において、心膜から採取された組織の光酸化処理を行う際に周知の方法が用いられている。心膜組織は局所的な組織であり薄壁をなし−厚さ約０．５ｍｍ−両側からの照射が可能である。
【０００５】
膠原線維が光酸化処理によって変性するという事実は、コラゲナーゼを用いて証明することが可能である。この酵素は未処理の組織を溶解して分離し、その結果、組織の機械的な統合性を喪失させる。しかしながら、光酸化処理を行った後には、コラゲナーゼによるこの「消化」は、処理前と同等の活性を示すことはない。
【０００６】
光酸化処理によって膠原線維は部分的に互いに架橋され、これにより組織の機械的な負荷に耐え得る能力が向上する。更に、処理済みの組織をインプラントとして用いたときに免疫防御反応が起こらない、または軽度に留まる程度に、膠原線維は色素の触媒作用下での光酸化によって変性される。
【０００７】
心臓弁または心膜の場合と同様に、膝関節の外科処置用インプラントとして、軟骨を調製したものを用いることが可能になるよう期待されている。膝軟骨は厚さ２〜３ｍｍで、骨上にて生長する。インプラントとして有用とするためには、軟骨組織は、これに関連する骨の一部とともに用いられるべきである。このことは、露出された面の側からのみ、組織に照射を行うことができることを意味する。従って、光は３ｍｍの深さまで組織を透過することが可能でなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，１４７，５１４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、このような組織における光透過性はかなり低いということが実験にて明らかにされている。
従って、本発明の目的は、未処理の軟骨組織における光透過性は低いという事実にも関わらず、膠原線維性結合組織の光酸化処理を可能にする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
光照射を行う前に未処理の膠原含有組織を調整用水溶液により前処理し、これにより同溶液に対して透過性を有する組織を同溶液に含まれる色素、特にメチレンブルーによって染色し、この色素を光により活性化して光酸化反応を触媒させる、本発明の膠原含有組織の光酸化処理方法によって、前述の課題を解決する。
【００１１】
膠原線維及びプロテオグリカンは散在する複数の中心を形成し、このため、光は軟骨組織の周縁部位にのみ効率よく透過する。散在する中心における屈折率が部位によって大幅に異なることから、光散乱が生じる。従って、本発明は、適切な物質を添加することにより、散在する各中心間の間隙を満たす水の屈折率を上昇させ、組織内の屈折率を均等にするという思想に基づく。この目的に用いられ得る添加剤は、例えば、ジエチレングリコール（２０℃における屈折率ｎ＝１．４４７）またはグリセリン（ｎ＝１．４７４）である。
【００１２】
膠原組織を光酸化処理するための本発明の方法において、光を照射する前に組織を調整用水溶液により前処理する。この前処理において、同溶液に対する透過性を有する組織は、同溶液に含まれる色素、特にメチレンブルーによって染色される。この色素は光によって活性化され、光酸化反応を触媒する。本発明の方法では、水の屈折率（２５℃におけるｎ＝１．３３３）より大きい屈折率を有する物質が調整用溶液に加えられる。この添加剤により、抗原組織は前処理において、より高い光透過性を備えることができる。
【００１３】
従属請求項２〜１１は、本発明の好ましい実施形態及び／または本発明の方法における特定の観点に関する。請求項１１〜１３は、本発明の方法により処理された組織試料について記載されている。
【００１４】
光酸化処理は以下の３つの過程からなる方法により実施される。温度は、１４〜１８℃に維持されることが好ましい。
１）  １〜５時間の調整用溶液による膠原組織の前処理。
２）  １０〜５０時間の膠原組織における光照射。
３）  脱色溶液により繰り返し洗浄することによる膠原組織の脱色及び添加剤の除去。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、未処理の軟骨組織における光透過性は低いという事実にも関わらず、膠原線維性結合組織の光酸化処理を可能にする方法が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】光酸化処理を行うための実験装置を示す全体図。
【図２】組織の厚さと膠原組織の透過率との関係を示す線図。
【図３】グリセリンを含有する調整用溶液による前処理後の組織の透過率を示す線図。
【図４】（ａ）〜（ｅ）はそれぞれ組織中の色素拡散の定量分析結果を示す線図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に図を参照し、本発明を詳細に説明する。図１に示す実験装置において、軟骨層２と骨層３とからなる試料１は、透明な密閉容器４内にて溶液５によって全体を繰り返し洗浄される。試料１にランプ６を用いて光を照射する（冷光ハロゲンランプ、７５Ｗ，１２Ｖ，照射角度１０゜）。
【００１８】
溶液５は蠕動ポンプ８によって循環回路７内を循環し、冷却装置９内にて所定温度（１６℃）に維持される。溶液５は複数のホース部材７ａ，７ｂを介して容器４に流入し、かつ容器４から流出する。溶液５は原則的に調整用溶液であり、これによって光照射前に試料１を前処理する。軟骨試料１の代わりに、靭帯または腱試料を用いることも可能である。
【００１９】
溶液５はソレンソンによるリン酸緩衝液、グリセリン（Ｃ３Ｈ８Ｏ３、分子量Ｍ＝９２ｇ／モル）及びメチレンブルー（Ｃ１６Ｈ１８ＣｌＮ３Ｓ・３Ｈ２Ｏ、Ｍ＝３２０ｇ／モル＋水）からなる。ソレンソンによるリン酸緩衝液の重量モル濃度は１／１５、ｐＨは７．４であり、精製水（ナノプール（Ｎａｎｏｐｕｒ））と、１．７８７ｇ／ｌのリン酸水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、Ｍ＝１３６ｇ／モル）と、９．５３２ｇ／ｌのリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｍ＝１７８ｇ／モル）とからなる溶液である。メチレンブルーは毒性を有さない（種々の医学的手法によって実証可能）ことから、これを色素として選択することは特に有利である。好適な含有比は、約３０％容量のグリセリンと、０．０１重量％のメチレンブルーとである。
【００２０】
例えば、屠殺したウシの肩関節から、外科学において周知のオシレーティングソー（ｏｓｚｉｌｌｉｅｒｅｎｄｅｎＳａｅｇｅ）を用いて軟骨を骨と共に切除する（約１０ｘ１０ｘ５ｍｍ）ことによって、試料１を採取する。試料１を緩衝溶液に浸漬し、冷却保存する（約４℃）。
【００２１】
光酸化処理を行う間、照射光の光量子により色素分子を励起状態にする。この状態で、色素分子は酸素または水と反応し、中間産物が生成される。この中間産物が膠原（またはその他のタンパク）における微量のアミノ酸と反応する間、色素分子は未変化で遊離する。色素分子は、この光酸化過程において触媒作用を有する。
【００２２】
しかしながら、光の影響下では、色素分子の非可逆的変化である脱色もまた生じる。そこで、組織に色素分子を継続的に供給するため、対策を講じる必要がある。試料１では、光照射の間、調整用溶液中で連続洗浄することにより、色素分子を一貫して供給する。組織及び溶液５間における物質交換、即ち、完全に脱色された色素を未変化色素と置換することにより、組織内の色素が部分的に新しい色素に置換される。約２４時間毎に、反応溶液全体を新鮮な溶液と置換する。
【００２３】
より低い温度では光酸化速度は遅くなり、より高い温度では膠原組織は熱による損傷を受ける。色素によって、光は吸収され熱に変換される。光酸化反応は発熱反応である。従って、約１４〜１８℃の範囲にある最適温度にて処理を行うために、循環される溶液５を継続的に冷却する必要がある。
【００２４】
光酸化反応の間、水素イオンが遊離する。従って、約７〜８の範囲にある最適ｐＨにて処理を行うために、緩衝液（ソレンソンによるリン酸緩衝液）を用いる必要がある。
光酸化反応の間、酸素が用いられる。基本的に、通常、反応溶液に含まれる酸素の量で十分である。付加的に酸素を注入しても、本発明の処理方法において、いかなる改良点も得られない。
【００２５】
メチレンブルーは、濃度０．０１重量％にて用いられることが好ましい。これより低い濃度では光酸化処理速度が過剰に遅くなり、これより高い濃度では反応溶液及び組織の外側領域に過剰な光が吸収され、組織全体、特に組織のより深い部分に到達する光が不足する結果になる。
【００２６】
メチレンブルーは比較的少ない分子量（Ｍ＝３２０ｇ／モル）を有することから、この色素は膠原組織内によく拡散する。この事実は、マイクロセクションによる試験にて確認されている。
【００２７】
メチレンブルーの吸収極大６６５ｎｍにて、膠原組織の透過率を測定した。この測定のため、３０〜２１０μｍの厚さを有する複数のミクロトーム切片を調製した。測定結果を図２に示す。Ｔは透過率を示し、ｘは測定に用いた切片の厚さを示す。Ｔを示す数値は対数スケールを用いて記録されている。○は、周知の方法に従い前処理を行った軟骨組織における測定結果を示す。●は、グリセリンを容量当たり８０％の含有率にて添加剤として用いて、本発明の方法に従い前処理を行った軟骨組織における測定結果を示す。
【００２８】
図３は、透過率Ｔのグリセリンの含有率ａに対する依存度を示す。△は層厚さ９０μｍにおける数値、○は層厚さ１８０μｍにおける数値を示す。図２及び図３に示すように、本発明の方法に従い組織を前処理することによって光透過率が大幅に向上し、少なくとも５倍上昇し得る。従って、関節軟骨の光酸化処理が可能になる。
【００２９】
光酸化処理を行った後、脱色溶液で繰り返し洗浄することによって膠原組織を脱色し、同時に添加剤を除去する。好ましくは、前述のソレンソンによるリン酸緩衝液の脱色溶液を用いる。色素の溶解度を増加させるために、このリン酸緩衝液に５０％容量までのエタノールが添加され得る。
【００３０】
図４（ａ）〜（ｅ）に基づき、組織の染色について、更にいくつかの観点から説明することが可能である。これらの図では色素の濃度をｃ、骨表面（ｘ＝０）からの距離をｘとして、ｃをｘの関数として示す。軟骨組織は、０＜ｘ＜ｓの範囲に配置され、反応溶液または脱色溶液はｘ＞ｓの位置に配置される。
【００３１】
図４（ａ）は前処理中の脱色予備段階における色素濃度ｃと骨表面からの距離ｘとの関係を示す。矢印５０は、拡散による色素の移動方向を示す。図４（ｂ）に示すように、前処理が完了した際、色素の均質な拡散を伴う均衡が保持されなければならない。矢印５１は組織の表面ｘ＝ｓにおいて、なお物質交換が起きていることを示す。これにより、組織内における完全に脱色された色素分子の置換が行われる。
【００３２】
光酸化処理後の脱色における色素濃度ｃと骨表面からの距離ｘとの関係を図４（ｃ）及び図４（ｄ）に示す。脱色開始後しばらくは、組織のより深い領域における色素の濃度は比較的高く維持されることから、この脱色段階において、更に、濃度ｃが鎖線により示される曲線５５に到達するまで、光照射を継続して行うことが可能である。従来技術ではより深い領域における光酸化処理効率は、表面により近い領域における効率を大幅に下回っていたことから、脱色中も継続して光照射を行い得ることは有利である。
【００３３】
この改良点を発展させて、更に有利な本発明の変法を考えることが可能である。断続的な光照射、即ち、光照射段階において同時に軟骨組織を脱色し、中間段階において光照射を行うことなく軟骨組織を調整用溶液によって処理し再染色することが可能である。組織の再染色における色素濃度ｃと骨表面からの距離ｘとの関係を図４（ｅ）に示す。
【００３４】
光酸化処理を施した軟骨組織をインプラントとして用いる場合は、患者において免疫防御反応が全く生じないか、または軽度に抑えられる程度に膠原線維変性が留まるように組織処理を行うべきである。また、光酸化処理を行うことによって、軟骨組織はより高い機械的荷重に耐え得る能力を得る。
【００３５】
軟骨試料に光を照射する場合は、照射は一側のみからしか効果がないが、本発明の方法に従って靭帯及び腱に光照射を行う場合は両側または全側からの照射が可能である。
【符号の説明】
【００３６】
１…試料、２…軟骨層、３…骨層、４…透明密閉容器、５…調整用溶液、６…ランプ、７…循環回路、７ａ，ｂ…ホース部材、８…蠕動ポンプ、９…冷却装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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