(57)【要約】      （修正有）【課題】品種識別に利用できるDNAマーカーの情報がこれまで得られていなかったバレイショ品種について既存の品種と識別しうるDNAマーカーを特定し、それらのバレイショも含めた多種類のバレイショ品種を迅速かつ簡便に識別するための手段を提供することにある。【解決手段】バレイショのオリゴヌクレオチドから選択した特定の一対のオリゴヌクレオチドで構成されるバレイショ品種識別用プライマーセット、ならびに該プライマーセットを用いて試料から得られたDNAを鋳型としてPCR増幅を行い、増幅産物を検出することを含むバレイショ品種識別方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号２に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
【請求項２】
配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号３に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号４に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
【請求項３】
配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号５に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号６に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
【請求項４】
配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号７に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号８に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
【請求項５】
配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号９に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１０に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
【請求項６】
配列番号１１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１１に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１２に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショの品種識別用プライマーセット。
【請求項７】
配列番号１３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１３に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１４に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
【請求項８】
試料より抽出したDNAを鋳型とし、請求項１〜４に記載の４組のプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、得られた増幅産物を検出する工程を含む、バレイショ品種の識別方法。
【請求項９】
識別されるバレイショの品種が、シンシア、ドロシー、シェリー、メイクィーン、スタータ、サッシーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
試料より抽出したDNAを鋳型とし、請求項５〜７に記載の３組のプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、得られた増幅産物を検出する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
識別されるバレイショの品種が、シンシア、ドロシー、シェリー、コロール、チェルシー、メイクィーン、ホッカイコガネ、キタアカリ、ベニマル、デジマ、農林一号、スタータ、サッシー、クロスティ、ロザンナ、アローアである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜７に記載のバレイショ品種識別用プライマーセットを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バレイショの２０栽培品種から１６品種を迅速かつ簡便に識別する技術に関する。
【０００２】
バレイショには収穫物の外観が類似している品種が存在する。このような場合、生産物の品種混入を調査するためには、混入が疑われる塊茎を栽培して生育を調査することが必要であり、時間、面積、労力を要する。また、育成者権侵害の指摘・防止のためにも、収穫物のみならず生育中の植物体を材料に客観的かつ簡便に品種を識別する技術が望まれている。
【０００３】
PCR技術の確立以来、DNAの多型を評価する技術が種々開発され（特許文献１）、各種の作物においてそのような手法を利用することによる品種識別の方法が開発されている。バレイショではRAPD、SSR、ISSRなどの手法を用い品種を識別する試みがなされており（非特許文献１〜５）、これらの方法では特異的なDNAの存在あるいは長さ多型を利用し識別を行う。このような品種により多型を示す検出可能なDNA断片をDNAマーカーと称する。
【０００４】
DNAマーカーを用いれば上記の目的が達成されるが、新規に育成される品種や新規に導入される品種などDNAマーカーの情報が存在しない品種については新たにDNAマーカーを特定・探索する必要がある。現在、バレイショの栽培種は数多く知られているが、海外より導入されたスタータ、サッシー、クロスティ、ロザンナ、アローアについてはDNAマーカーの情報がない。
【０００５】
【特許文献１】特許第2818486号
【非特許文献１】DNA フィンガープリンティング サービス（2007年4月11日更新）http://www2.kobe-u.ac.jp/~hosaka/japanese/fingerprinting/home.html
【非特許文献２】SSRマーカーによる国内産ばれいしょの品種識別  園学雑75別1, 327 (2006)
【非特許文献３】Mapping and characterization of new EST-derived microsatellites for potato (Solanum tuberosum L.) Theor Appl Genet 111: 456 (2005)
【非特許文献４】Selection of highly informative and user-friendly microsatellites (SSRs) for genotyping of cultivated potato Theor Appl Genet 108: 881 (2004)
【非特許文献５】Genetic diversity in European and Argentinian cultivated potatoes (Solanum tuberosum subsp. tuberosum) detected by inter-simple sequence repeats (ISSRs) Genome 45: 481 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の課題は、品種識別に利用できるDNAマーカーの情報がこれまで得られていなかったバレイショ品種について既存の品種と識別しうるDNAマーカーを特定し、それらのバレイショも含めた多種類のバレイショ品種を迅速かつ簡便に識別するための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、バレイショ組織から抽出したDNAについてRAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)法によって品種間の多型解析を行って識別マーカーとなりうるDNAマーカー候補を探索した結果、目的を達成することが可能と考えられる７つのDNAマーカー候補を選抜した。続いてそれらのDNAマーカー候補について塩基配列を決定し、得られた塩基配列から各DNAマーカー候補に特異的なプライマー１４種（配列番号１〜１４）を作成したところ、１４種のうち、８種のプライマー（配列番号１〜８）を用いてPCRにより検出される４つのDNAマーカーの有無により、バレイショ２０品種からこれまでDNAマーカーの情報がなかったスタータ、サッシーを含む６品種（シンシア、ドロシー、シェリー、メイクィーン、スタータ、サッシー）と、さらに、残り６種のプライマーを用いたPCRにより検出される３つのDNAマーカーの有無により、これまでDNAマーカーの情報がなかったクロスティ、ロザンナ、アローアを含む１０品種の合計１６品種（シンシア、ドロシー、シェリー、コロール、チェルシー、メイクィーン、ホッカイコガネ、キタアカリ、ベニマル、デジマ、農林一号、スタータ、サッシー、クロスティ、ロザンナ、アローア）を識別することできることを確認した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) 配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号２に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
(2) 配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号３に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号４に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
(3) 配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号５に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号６に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
(4) 配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号７に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号８に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
(5) 配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号９に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１０に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
(6) 配列番号１１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１１に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１２に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショの品種識別用プライマーセット。
(7) 配列番号１３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１３に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１４に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
(8) 試料より抽出したDNAを鋳型とし、(1)〜(4)に記載の４組のプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、得られた増幅産物を検出する工程を含む、バレイショ品種の識別方法。
(9) 識別されるバレイショの品種が、シンシア、ドロシー、シェリー、メイクィーン、スタータ、サッシーである、(8)に記載の方法。
(10) 試料より抽出したDNAを鋳型とし、(5)〜(7)に記載の３組のプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、得られた増幅産物を検出する工程をさらに含む、(8)に記載の方法。
(11) 識別されるバレイショの品種が、シンシア、ドロシー、シェリー、コロール、チェルシー、メイクィーン、ホッカイコガネ、キタアカリ、ベニマル、デジマ、農林一号、スタータ、サッシー、クロスティ、ロザンナ、アローアである、(10)に記載の方法。
(12) (1)〜(7)に記載のバレイショ品種識別用プライマーセットを含むキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、特定のバレイショ品種を識別できるDNAマーカーを増幅することができるバレイショ品種識別用プライマーセットが提供される。このプライマーセットを用いることにより、圃場での栽培や特性調査を行うことなく、労力、面積及び時間を必要とせずに、バレイショ品種の識別を迅速かつ簡便に行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．バレイショ品種識別用プライマーセット
本発明のバレイショ品種識別用プライマーセットは、バレイショ品種識別の指標となる７つのDNAマーカーを増幅することのできる下記の(a)〜（g)の７組のプライマーセットである。
(a) 配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号２に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
(b) 配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号３に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号４に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
(c) 配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号５に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号６に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
(d) 配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号７に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号８に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
(e) 配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号９に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１０に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
(f) 配列番号１１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１１に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１２に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショの品種識別用プライマーセット。
(g) 配列番号１３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１３に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは配列番号１４に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、バレイショ品種識別用プライマーセット。
【００１１】
上記のプライマーセットを構成するオリゴヌクレオチドは、各DNAマーカーの両端（フォワード、リバース）に位置する塩基配列に相補的な１９〜２３塩基の連続したオリゴヌクレオチドである。プライマーの設計は、市販のソフトウェア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ;ソフトウェア開発株式会社）を用いて行えばよい。
【００１２】
また、上記のプライマーセットを構成するオリゴヌクレオチドのうち、「配列番号１〜１４に記載の塩基配列のうち連続する１０塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチド」は、「配列番号１〜１４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド」の変異オリゴヌレオチドであって、バレイショ品種識別用プライマーとしての機能を保持している限り、連続する１０塩基以外の塩基の種類、連続する１０塩基の変異オリゴヌレオチドの存在部位（３’末端側、５’末端側）について特に制限はない。また、変異オリゴヌクオチドの全長は、１５〜３０塩基程度が好ましい。
【００１３】
バレイショ栽培品種２０品種のうち、上記のプライマーセットを用いたPCRによって識別しうるバレイショ品種には、シンシア、ドロシー、シェリー、コロール、チェルシー、メイクィーン、ホッカイコガネ、キタアカリ、ベニマル、デジマ、農林一号、スタータ、サッシー、クロスティ、ロザンナ、アローアの１６品種が含まれる。また、バレイショ栽培品種２０品種のうち、上記１６品種以外のニシユタカ、トヨシロ、ダンシャク、さやかの４品種については、ニシユタカとトヨシロ、ダンシャクとさやかの間の識別はできないものの、上記１６品種とは異なると判定できる。
【００１４】
上記のプライマーセットは、識別すべき品種、識別すべき品種の数、識別の目的によって、全てを用いる必要はなく、例えば、プライマーセット(a)〜(d)の４組だけ用いてもよい。具体的には、プライマーセット(a)〜(d)を用いてPCR増幅を行い、後記表３の４つのDNAマーカーが全部検出されることが確認された場合、被検対象がシンシアであるといえる。
【００１５】
プライマーとなる上記オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるDNA自動合成装置を利用して合成することが可能である。
【００１６】
上記のプライマーセットはキット化することもできる。本発明のキットには、上記の (a)〜（g)の７組のプライマーセットを含むものであればよく、識別すべき品種、識別すべき品種の数、識別の目的によって、これらのプライマーセットの中から適当なセットを適宜選択して用いればよい。また、当該キットには、必要に応じて、DNA抽出用試薬、PCR用緩衝液やDNAポリメラーゼ等のPCR用試薬（プライマーを除く）、染色剤電気泳動用ゲル等の検出用試薬、説明書などを含んでいてもよい。
【００１７】
２．バレイショ品種の識別方法
本発明のバレイショ品種の識別方法は、試料より抽出したDNAを鋳型とし、上記のプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、得られた増幅産物を検出することを含む。本方法によって識別可能なバレイショ品種は、前記のとおりである。
【００１８】
本発明のバレイショ品種識別方法は、下記の一次検定および二次検定の２つの工程からなる。二次検定は必要となる場合のみ実施すればよい。
【００１９】
（一次検定）
プライマーセット(a)〜(d)を混合してPCR増幅を行い、反応産物を電気泳動により分離し可視化することにより、４つのDNAマーカーそれぞれの存在を検定する。この検定により、シンシア、ドロシー、シェリー、コロール、チェルシー、メイクィーン、ホッカイコガネ、キタアカリ、ニシユタカ、トヨシロ、ダンシャク、さやか、ベニマル、デジマ、農林一号、スタータ、サッシー、クロスティ、ロザンナ、アローアの２０品種から、シンシア、ドロシー、シェリー、メイクィーン、スタータ、サッシー６品種を識別することが可能である。本一次検定では(i)クロスティとコロール、(ii)ニシユタカとトヨシロ、(iii)ロザンナとホッカイコガネ、(iv)ダンシャク、さやか、ベニマル、キタアカリ、(v)チェルシーとアローア、(vi)デジマと農林一号の６組の品種はそれぞれ４つのDNAマーカーの有無について同一の結果を示す。
【００２０】
（二次検定）
上記の一次検定で識別できない品種の識別が必要な場合は、以下のようにして行う。 (i)クロスティとコロールと(v)チェルシーとアローアを識別するには、プライマーセット（e)を用いてPCR増幅を行い、反応産物を電気泳動により分離し可視化することにより、このDNAマーカーの存在を検定すればよい。(iii)ロザンナとホッカイコガネを識別する場合は、プライマーセット(f)を用いてPCR増幅を行い、反応産物を電気泳動により分離し可視化することにより、このDNAマーカーの存在を検定すればよい。(iv)デジマと農林一号を識別する場合は、プライマーセット(g)を用いてPCR増幅を行い、反応産物を電気泳動により分離し可視化することにより、このDNAマーカーの存在を検定すればよい。(iv)ダンシャク、さやか、ベニマル、キタアカリを識別する場合は、プライマーセット（f)を用いてPCR増幅を行い、反応産物を電気泳動により分離し可視化するとともに、プライマーセット（g)のプライマーを用いてPCR増幅を行い、反応産物を電気泳動により分離し可視化することにより、これら２つのDNAマーカーの存在を検定すればよい。ただしダンシャクとさやかは両DNAマーカーとも検出されるので相互の識別はできない。
【００２１】
RAPD解析によれば、例えば、上記２０品種からアローアあるいはコロールを識別しようとした場合最少のPCR反応で識別できる可能性があるがそれでもPCR反応を２回行う必要がある（後記実施例１参照）。これに対し、本発明の方法によれば、１回のPCR反応により上記２０品種の中からシンシア、ドロシー、シェリー、メイクィーン、スタータ、サッシーの６品種の識別が可能であり（後記実施例２参照）、３回のPCR反応により上記２０品種の中からシンシア、ドロシー、シェリー、コロール、チェルシー、メイクィーン、ホッカイコガネ、キタアカリ、ベニマル、デジマ、農林一号、スタータ、サッシー、クロスティ、ロザンナ、アローアの１６品種の明確な識別が可能となる（後記実施例３参照）。
【００２２】
本発明方法の具体的手順について以下に説明する。まず、被検試料となるバレイショの組織からDNAを抽出する。バレイショの組織としては、例えば、葉（幼葉、成葉）、塊茎、根などを用いることができる。
【００２３】
バレイショからのDNAの抽出は、核酸抽出法として当業者に公知のいかなる方法を用いてもよく、例えば、フェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）法、アルカリSDS法等が挙げられる。また、これらの方法は適宜改変して行ってもよく、試薬メーカーより販売されている各種DNA抽出キットを用いてもよい。試料の種類によっては、メンブランフィルターによる濾過やホモジナイズを行う。
【００２４】
DNAの抽出後、クロロホルム／イソアミルアルコール処理、イソプロパノール沈澱、フェノール／クロロホルムによる除蛋白、エタノール沈澱などの精製処理を行ってもよい。
【００２５】
次に、上記の操作で得られたDNA試料を鋳型とし、前記のプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、得られた増幅産物（DNAマーカー）の有無を検出する。PCR増幅は常法に従って行えばよく、上記のプライマーセットを用いる以外は特に制限はなく、PCR反応液の組成、PCR条件（温度サイクル、サイクルの回数等）は、各プライマーセットを用いたPCRにおいて高感度でPCR増幅産物を得られるような条件を予備実験等により当業者であれば適切に選択及び設定することができる。例えば、鋳型となるDNA0.1〜100ng、10×PCR反応用緩衝液、プライマー各0.25〜1μM、DNAポリメラーゼ（Taq ポリメラーゼ、TthDNAポリメラーゼなど）0.25〜2.5U、dNTP各250μMを混合した後、全液量が10〜100μlとなるように希釈したものについて、94〜96℃ 5分×1サイクル、（94〜96℃ 30秒、52〜58℃ 30秒、70〜74℃ 1分）×30サイクル、70〜74℃ 5分×1サイクルで反応を行う。これは一例にすぎず、PCR反応液の組成、反応温度や時間は、プライマーとなるオリゴヌクレオチド配列の長さや塩基組成などに応じて適宜設定することができる。これらPCRの一連の操作は、市販のPCRキットやPCR装置を利用して、その操作説明書に従って行うことができる。
【００２６】
各DNAマーカーは、各プライマーセットのPCR増幅産物を電気泳動により分離することにより当該位置にバンドとして検出されるものである。それらマーカーの有無からバイレイショ品種を識別することが可能となる。電気泳動方法としては、アガロースゲル、変性及び非変性のアクリルアミドゲルを用いる方法のいずれでもよい。バンドの検出はエチジウムブロマイド染色により行うことが一般的であるが、蛍光色素（FAM,NED,HEX等）を付加したプライマーを用いた場合は、蛍光発色を指標として行ってもよい。
【００２７】
本発明の方法を実施するにあたっては、上記のバレイショ品種と、その品種が有するDNAマーカーを関連付けた対応表を作成し、被検バレイショ品種から抽出したDNAを上記のプライマーセットを用いて増幅して得られた検出結果と照合することによって品種を判定すればよい。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）RAPD法によるバレイショ品種識別
(1) 被検バレイショ品種
被検バレイショ品種として、シンシア、ドロシー、シェリー、コロール、チェルシー、メイクィーン、ホッカイコガネ、キタアカリ、ニシユタカ、トヨシロ、ダンシャク、さやか、ベニマル、デジマ、農林一号、スタータ、サッシー、クロスティ、ロザンナ、アローアの20品種を用いた。
【００２９】
(2) DNA試料の調製
DNA試料の調製は、文献（細胞工学 別冊 植物細胞工学シリーズ2「植物のPCR実験プロトコール」秀潤社(1995) 47〜48ページに記載のWalbot, V. and Warren, C. (1988) Mol. Gen. Genet. 211, 27）に記載の方法を参考に一部改変した方法を用い、以下のようにして行った。
【００３０】
DNA抽出のための試料として上記20品種のバレイショの葉または塊茎を用いた。なお、本実施例で用いた品種の塊茎は株式会社ジャパンポテト（〒104-0033東京都中央区新川二丁目９番7号 ラールアライビル４Ｆ、TEL:03-5541-5335）から入手可能である。葉の場合は直径1cm程を採取、塊茎の場合は皮を剥き内部の健全な部分3〜5mm角（約50mg）をメスで切り取って用いた。試料を1.5mlチューブに入れ、マイクロペッスルで磨砕し、組織が崩れたらDNA抽出バッファー500μl（15 % シュクロース、50mM Tris-HCl (pH 8.0)、50mM EDTA、500mM NaCl）を添加して完全に組織がなくなるまで磨砕した。磨砕は液体窒素を用いずに行った。磨砕後の試料を4℃、4000rpmで5分間遠心した後、上清を除去し、2T1E（20mM Tris-HCl (pH8.0)、10mM EDTA）300μl、10% SDS 40μlを加え、ボルテックスでよく混合し、70℃で20分間処理した。その後、7.5M 酢酸アンモニウム 150μlを添加し、さらにボルテックスでよく混合して氷上に30分間おいた。その後、4℃、15000rpmで10分間遠心し、上清を新しい1.5mlチューブに移し、イソプロパノール700μlを加え転倒混和した。さらに、20℃、8000rpmで5分間遠心し上清を除去し70% エタノール500μlを加えて転倒混和した。20℃、15000rpmで5分間遠心し、上清を除去しエタノール臭がなくなるまで乾燥させた。 TE バッファー（10mM Tris-HCl (pH8.0)、1mM EDTA）200μlを加えDNAを溶解し、さらに 70℃ 15分処理によりDNAを完全に溶解させた。
【００３１】
(3) RAPD解析
市販の試薬キット（Ready-To-Go RAPD Analysis Beads、 GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）を用い添付のプロトコールに従ってRAPD解析を行った。下記表１に記載のプライマー１，３，４，５，６，７については、キットに付属のチューブ（Analysis Beads入り）に(1)で調製したDNA試料1μl、プライマー（25pmol）1.25μl、ミリQ水22.75μlを添加し混合したのち、0.2mlチューブに移してPCR増幅を行った。プライマー２についてのみ、キットに付属のチューブ（Analysis Beads入り）に、プライマー（25pmol）2.5μl、TaKaRa Ex Taqに添付されているバッファー2.5μl、TaKaRa Ex Taq （タカラバイオサイエンス株式会社）0.25μl、ミリQ水42.75μlを添加し混合したのち、0.2mlチューブに半量(24μl)を移して(1)で調製したDNA試料1μlを加えPCR増幅を行った。PCR増幅の条件は、95℃ 5分間×1サイクル、（95℃ 1分間、36℃ 1分間、72℃ 2分間）×45サイクルに設定した。反応を行った後、RAPD反応産物10μlを2％アガロースゲルにて30分間（100V）泳動した。なお、アガロースは1×TAEバッファー（Tris-base 4.84 g/l、酢酸 1.14 ml/l、0.5M EDTA 2 ml/l）に溶解して調製し、電気泳動用緩衝液として1×TAEバッファーを用いた。泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロマイド(0.5μg/ml)溶液で20分間染色し、UV下でその多型を確認した。
【００３２】
【表１】
2009000071.tif 000002
【００３３】
図１にRAPD解析の結果、表２にその結果のまとめを記載した。
【００３４】
【表２】
2009000071.tif 000003
【００３５】
表２に示されるように、７回のRAPD解析により、バレイショ品種シンシア、ドロシー、シェリー、コロール、チェルシー、メイクィーン、ホッカイコガネ、キタアカリ、ニシユタカ、トヨシロ、ダンシャク、さやか、ベニマル、デジマ、農林一号、スタータ、サッシー、クロスティ、ロザンナ、アローアの計２０品種から、マーカーが共通するニシユタカとトヨシロ、キタアカリとさやかの４種を除く計１６品種を識別することが可能であった。ただし、（＋）の結果のようにRAPD解析では結果が判然としない場合があった。また、DNAマーカー以外の増幅産物があるため結果の解析を誤らせることも予想された。
【００３６】
（実施例２）  バレイショ品種識別のための一次検定
DNA試料は実施例１で抽出したものを用いた。プライマーは下記の８種のオリゴヌレクオチドを混合して用いた。
【００３７】
配列番号１：5'-GACCGTTAAACTCCGCGCT-3'
配列番号２：5'-CTGAAATGAGGCATAGTTGATT-3'
配列番号３：5'-CACACTTTTTCTTTAGACTTCACT-3'
配列番号４：5'-ATCAAGGATCACATGGACAGC-3'
配列番号５：5'-ATATTTGGAGAGATGACAACC-3'
配列番号６：5'-CATACGATCAGTTAAATCAGTAC-3'
配列番号７：5'-TAAGAGCCCTGAGTGTTTTAC-3'
配列番号８：5'-AACATGACAAGGGTGGATAAC-3'
【００３８】
DNA 試料1μl、TaKaRa Ex Taqに添付されているバッファー2μl、dNTPs(2.5mM) 2μl、プライマー（20μM）8種3.74μl（配列番号１，２各0.75μl、配列番号３，４各0.5μl、配列番号５，６各0.37μl、配列番号７，８各0.25μl）、TaKaRa Ex Taq （タカラバイオサイエンス株式会社）0.1μl、ミリQ水11.16μlを混合しPCR増幅を行った。PCR増幅の条件は、95℃ 5分間×1サイクル、（95℃ 30秒間、55℃ 30秒間、72℃ 1分間）×30サイクル、72℃ 5分間×1サイクルで行った。反応を行った後、そのPCR産物10μlを2％アガロースゲルにて30分間（100V）泳動した。なお、アガロースゲル電気泳動および増幅産物の可視化は実施例１と同様に行った。
【００３９】
この結果、図２に示すような多型が観察された。各DNAマーカーの有無をまとめると表３のとおりであった。
【００４０】
【表３】
2009000071.tif 000004
【００４１】
上記結果から明らかなように、２０品種、すなわちシンシア、ドロシー、シェリー、コロール、チェルシー、メイクィーン、ホッカイコガネ、キタアカリ、ニシユタカ、トヨシロ、ダンシャク、さやか、ベニマル、デジマ、農林一号、スタータ、サッシー、クロスティ、ロザンナ、アローアから、６品種、すなわちシンシア、ドロシー、シェリー、メイクィーン、スタータ、サッシーを識別することが可能であった。しかしながら、本一次検定では(i)クロスティとコロール、(ii)ニシユタカとトヨシロ、(iii)ロザンナとホッカイコガネ、(iv)ダンシャク、さやか、ベニマル、キタアカリ、(v)チェルシーとアローア、(vi)デジマと農林一号の６組の品種はそれぞれ４つのDNAマーカーの有無について同一の結果を示した。
【００４２】
（実施例３） バレイショ品種識別のための二次検定
DNA試料は実施例１で抽出したものを用いた。プライマーは、下記に示す６種のオリゴヌレクオチドから選ばれる２種のオリゴヌレクオチドのセット（配列番号９と１０のオリゴヌクレオチドのセット、配列番号１１と１２のオリゴヌクレオチドのセット、配列番号１３と１４のオリゴヌクレオチドのセット）を用いた。
【００４３】
配列番号９：5'-TCTATATGGAGCAACCACCTA-3' 
配列番号１０：5'-TGACTTCACAAATGTTGTAGAGT-3'
配列番号１１：5'-GTCCACACGGGATGAGGCT-3'
配列番号１２：5'-GTCCACACGGTCCAAGATATA-3'      
配列番号１３：5'-TGGGGGACTCCAAATCACTAT-3'      
配列番号１４：5'-TGGGGGACTCAGGGCCGA-3'
【００４４】
DNA 試料1μl、TaKaRa Ex Taqに添付されているバッファー2μl、dNTPs (2.5mM) 2μl、プライマー（20μM）各DNAマーカーについて２種各0.5μl、TaKaRa Ex Taq （タカラバイオサイエンス株式会社） 0.1μl、ミリQ水13.9μlを混合しPCR増幅を行った。PCR増幅の条件、アガロースゲル電気泳動および増幅産物の可視化は実施例１と同様に行った。
【００４５】
この結果、図３に示すような多型が観察された。一次検定で識別できなかった（i)クロスティとコロール、(ii)ニシユタカとトヨシロ、(iii)ロザンナとホッカイコガネ、(iv)ダンシャク、さやか、ベニマル、キタアカリ、(v)チェルシーとアローア、(vi)デジマと農林一号のうち、(i)クロスティとコロールおよび(v)チェルシーとアローアは配列番号９，１０のオリゴヌクレオチドを用いた二次検定により識別が可能であった（図３Ａ）。(iii)ロザンナとホッカイコガネは配列番号１１，１２のオリゴヌクレオチドを用いた二次検定により識別が可能であった（図３Ｂ）。(vi)デジマと農林一号は配列番号１３，１４のオリゴヌクレオチドを用いた二次検定により識別が可能であった（図３Ｃ）。(iv)ダンシャク、さやか、ベニマル、キタアカリのうち配列番号１１，１２のオリゴヌクレオチドおよび配列番号１３，１４のオリゴヌクレオチドを用いた二次検定によりベニマルとキタアカリの識別が可能であった（図３Ｄ，Ｅ）。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１−１】RAPD解析結果を示す。Ａはプライマー１を用いたPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真、Ｂはプライマー２を用いたPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真、Ｃはプライマー３を用いたPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真、Ｄはプライマー４を用いたPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真である（図１−１のＡ〜Ｄ中、M：分子量マーカー（φX174 HinCII消化物）、1:シンシア、2:シェリー、3:チェルシー、4:コロール、5:ロザンナ、6:アローア、7:スタータ、8:クロスティ、9:サッシー、10:ニシユタカ、11:デジマ、12:ホッカイコガネ、13:キタアカリ、14:ダンシャク、15:メイクィーン、16:ドロシー、17:さやか、18:ベニマル、19:トヨシロ、20:農林一号を示す）。
【図１−２】RAPD解析結果を示す。Ｅはプライマー５を用いたPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真、Ｆはプライマー６を用いたPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真、Ｇはプライマー７を用いたPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真である（図１−２のＥ〜Ｇ中、M：分子量マーカー（φX174 HinCII消化物）、1:シンシア、2:シェリー、3:チェルシー、4:コロール、5:ロザンナ、6:アローア、7:スタータ、8:クロスティ、9:サッシー、10:ニシユタカ、11:デジマ、12:ホッカイコガネ、13:キタアカリ、14:ダンシャク、15:メイクィーン、16:ドロシー、17:さやか、18:ベニマル、19:トヨシロ、20:農林一号を示す）。
【図２】一次検定の結果を示す（M：分子量マーカー（φX174 HinCII消化物）、1:シンシア、2:スタータ、3:クロスティ、4:コロール、5:ニシユタカ、6:トヨシロ、7:ロザンナ、8:ホッカイコガネ、9:ダンシャク、10:さやか、11:ベニマル、12:キタアカリ、13:ドロシー、14:シェリー、15:チェルシー、16:アローア、17:デジマ、18:農林一号、19:サッシー、20:メイクィーン）。
【図３】二次検定の結果を示す。  Ａ：配列番号９，１０のオリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真（M：分子量マーカー（φX174 HinCII消化物）、1:クロスティ、2:コロール、3:チェルシー、4:アローア）  Ｂ：配列番号１１，１２のオリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真(M：分子量マーカー（φX174 HinCII消化物）、5:ロザンナ、6:ホッカイコガネ)  Ｃ：配列番号１３，１４のオリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真（M：分子量マーカー（φX174 HinCII消化物）、7:デジマ、8:農林一号）  Ｄ：配列番号１１，１２のオリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真（M：分子量マーカー（φX174 HinCII消化物）、9:ダンシャク、10:さやか、11:ベニマル、12:キタアカリ）  Ｅ：配列番号１３，１４のオリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真（M：分子量マーカー（φX174 HinCII消化物）、9:ダンシャク、10:さやか、11:ベニマル、12:キタアカリ）
【図１−１】
2009000071.tif 000005
【図１−２】
2009000071.tif 000006
【図２】
2009000071.tif 000007
【図３】
2009000071.tif 000008
【配列表】
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