(57)【要約】【課題】従来の局在プラズモン共鳴現象を利用したセンサーを用いた方法と比べて検出感度を向上させた標的物質の検出方法を提供すること。【解決手段】検体中の標的物質を検出する方法であって、局在プラズモン共鳴を誘起し得る微小金属構造体を互いに隔離して基体表面に配置し且つ基体表面に微小金属構造体と隔離して第１プローブを配置した検査素子と、局在プラズモン共鳴を誘起し得る微小金属構造体と第２プローブの複合体とを用意する。第１プローブが標的物質を介して第２プローブと複合体を形成する反応により検査素子表面に固定化されると、第１プローブおよび第２プローブのそれぞれに固定される微小金属構造体が近接しプラズモン共鳴波長が大きく変化するため、標的物質を感度よく検出することができる。【選択図】図１
2009150708.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の標的物質の有無、もしくは量を検出する方法であって、
局在プラズモン共鳴を誘起し得る第１の微小金属構造体と第１プローブとが互いに隔離されて基体表面に配置された検査素子を用意する工程と、
局在プラズモン共鳴を誘起し得る第２の微小金属構造体を第２プローブに固定した標識用試薬を用意する工程と、
前記検査素子に配置された第１プローブが前記標的物質を介して前記標識用試薬が有する第２プローブと複合体を形成する反応を行う工程と、
前記複合体を形成した検査素子の光学的特性を検出する工程と、
を含むことを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項２】
前記複合体は、前記第１プローブと第２プローブが空間的に前記標的物質の異なる領域を捕捉することにより形成されることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
検体中の標的物質の有無、もしくは量を検出する方法であって、
局在プラズモン共鳴を誘起し得る第１の微小金属構造体と第１プローブとが互いに隔離されて基体表面に配置された検査素子を用意する工程と、
局在プラズモン共鳴を誘起し得る第２の微小金属構造体を第２プローブに固定した標識用試薬を用意する工程と、
前記標的物質および前記標識用試薬が有する第２プローブが共に存在する条件下で、前記標的物質および前記第２プローブの各々が前記第１プローブと複合体を形成する反応を行う工程と、
前記検査素子の光学的特性を検出する工程と、を含み、
前記第２プローブは、前記標的物質と競合して、前記第１プローブに捕捉される物質であることを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項４】
前記第２プローブとして、前記標的物質を用いる請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
局在プラズモン共鳴を誘起し得る第１の微小金属構造体と、標的物質を捕捉する第１プローブとが互いに隔離されて配置された基体を備える検査素子と、
局在プラズモン共鳴を誘起し得る第２の微小金属構造体と第２プローブとを備える標識用試薬と、
を有することを特徴とする標的物質の有無、もしくは量を検査する検査キット。
【請求項６】
前記第１プローブおよび第２プローブは、空間的に前記標的物質の異なる領域を捕捉するものである請求項５に記載の検査キット。
【請求項７】
前記第２プローブは、前記標的物質と競合して、前記第１プローブに捕捉される物質である請求項５に記載の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質の検出方法及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトをはじめとするさまざまな生物のゲノム等の塩基配列解析が精力的に進められ、その結果として、遺伝子やタンパク質など、標的物質の検出を通して、遺伝病、癌、感染症、生活習慣病等の診断、治療方針の決定、治療後の管理、予後予想等が行われるようになってきた。
【０００３】
これら標的物質の検出に使用されるセンサー技術として、局在プラズモン共鳴を利用したセンサーが知られている。このセンサーは、基体の表面に金属微粒子が固定された構造のデバイスを検査素子として用い、その検査素子の金属微粒子に光を照射する手段と、金属微粒子で反射または透過した光を分光して波長ごとの強度を測定する手段により構成される。
【０００４】
局在プラズモン共鳴は、光の波長よりも小さい金属微粒子に光が照射された場合に、金属微粒子内の自由電子が特定の波長の光の電場に共鳴して振動を始める現象である。電子が振動を始め、局在プラズモン共鳴が誘起されると、金属微粒子周辺に強い電場が生じ、その特定波長（共鳴波長）における散乱や吸収が著しく増大する。
【０００５】
共鳴波長は金属微粒子の周辺にある物質の屈折率に依存する。周辺にある物質の屈折率が大きいほど共鳴波長は長波長側にシフトし、反射光の散乱や吸収は増大する。したがって、標的となる物質が金属微粒子に吸着あるいは堆積し得る状態で光を照射し、その光の反射または透過光強度の測定を行えば、前記光の強度の変化が観察されたことをもって標的物質を検出することができる。
【０００６】
このようなセンサーを用いて、溶液中に分散する標的物質を検出する方法として、標的物質側にも金属微粒子を結合させておく方法が提案されている（特許文献１参照）。この方法では、標的物質が検査素子の表面に吸着された際に、検査素子側の金属微粒子と標的物質側の金属微粒子とが近接した状態となる。局在プラズモンの共鳴波長は金属微粒子間の近接状態によっても変化するため、標的物質側にも金属微粒子が結合されていることで、共鳴波長の変化を観察しやすくなる。
【特許文献１】特開２００５−１９５４４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
標的物質の濃度や分子量が低く、その検出が困難な場合は、特許文献１に記載されるように金属微粒子などをラベル剤として用いることが有効であるが、局在プラズモン共鳴センサーにこれを応用する場合、検査素子上に固定された微小金属構造体の電場強度の分布を考慮する必要がある。
【０００８】
一般に、光が基体面に対し垂直に入射された際に生じる局在プラズモン共鳴の場合、基体表面に配置された微小金属構造体の電場強度分布は、基体面に対し平行（ＸＹ軸方向）に強く分布する。それゆえ特許文献１に記載されるように、金属微粒子を基体面の微小金属構造体に対し垂直（Ｚ軸方向）にラベルするのではなく、基体表面の微小金属構造体に対し平行にラベルすることで、基体上の微小金属構造体が持つ強い電場を有効に活用することができ、より高感度に標的物質の検出が可能となる。
【０００９】
よって、本発明の目的は、上記課題点を克服するものであり、局在プラズモン共鳴センサーの検出感度を向上させる方法と検査キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第一の検出方法は、
検体中の標的物質の有無、もしくは量を検出する方法であって、局在プラズモン共鳴を誘起し得る第１の微小金属構造体と第１プローブとが互いに隔離されて基体表面に配置された検査素子を用意する工程と、
局在プラズモン共鳴を誘起し得る第２の微小金属構造体を第２プローブに固定した標識用試薬を用意する工程と、
前記検査素子に配置された第１プローブが前記標的物質を介して前記標識用試薬が有する第２プローブと複合体を形成する反応を行う工程と、
前記複合体を形成した検査素子の光学的特性を検出する工程と、
を含むことを特徴とする標的物質の検出方法である。
【００１１】
本発明の第二の検出方法は、
検体中の標的物質の有無、もしくは量を検出する方法であって、
局在プラズモン共鳴を誘起し得る第１の微小金属構造体と第１プローブとが互いに隔離されて基体表面に配置された検査素子を用意する工程と、局在プラズモン共鳴を誘起し得る第２の微小金属構造体を第２プローブに固定した標識用試薬を用意する工程と、前記標的物質および前記標識用試薬が有する第２プローブが共に存在する条件下で、前記標的物質および前記第２プローブの各々が前記第１プローブと複合体を形成する反応を行う工程と、
前記検査素子の光学的特性を検出する工程と、を含み、
前記第２プローブは、前記標的物質と競合して、前記第１プローブに捕捉される物質であることを特徴とする標的物質の検出方法である。
【００１２】
本発明の検査キットは、
局在プラズモン共鳴を誘起し得る第１の微小金属構造体と、標的物質を捕捉する第１プローブとが互いに隔離されて配置された基体を備える検査素子と、
局在プラズモン共鳴を誘起し得る第２の微小金属構造体と第２プローブとを備える標識用試薬と、
を有することを特徴とする標的物質の有無、もしくは量を検査する検査キットである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法及び検査キットを用いることによって、局在プラズモンセンサーの検出感度が不足するような低濃度や低分子の標的物質を、高感度に検出することができる。
【００１４】
また、局在プラズモンセンサー素子のもつ、電場強度の分布を有効に利用することができ、高感度に標的物質を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、検体中の標的物質の有無、もしくは量を検出する方法であって、局在プラズモン共鳴を誘起し得る第１の微小金属構造体と第１プローブとが互いに隔離されて基体表面に配置された検査素子を用意する工程と、局在プラズモン共鳴を誘起し得る第２の微小金属構造体を第２プローブに固定した標識用試薬を用意する工程と、検査素子に配置された第１プローブが標的物質を介して標識用試薬が有する第２プローブと複合体を形成する反応を行う工程と、複合体を形成した検査素子の光学的特性を検出する工程と、を含むことを特徴とする標的物質の検出方法である。第１プローブが標的物質を介して第２プローブと形成する複合体は、前記第１プローブと第２プローブが空間的に前記標的物質の異なる領域を捕捉することにより形成されることが好ましい。このような構成として、標的物質が抗原であり、第１プローブが一次抗体、第２プローブが二次抗体である場合が挙げられる。この際、一次抗体、二次抗体はそれぞれ、抗原における別の領域を捕捉する。例えば、一次抗体が捕捉する抗原の領域と、二次抗体が捕捉する抗原の領域が、別の抗原決定基であれば、本発明に適用可能である。また、それぞれが捕捉する抗原の領域が同一の抗原決定基であっても、例えば、抗原が多量体を形成している場合は本発明に適用可能である。即ち、抗原決定基によるものではなく、第一の標的物質捕捉体と第二の標的物質捕捉体が、空間的に標的物質の異なる領域を捕捉すれば、本発明の効果を得ることが可能となる。
【００１６】
更に本発明は、検体中の標的物質の有無、もしくは量を検出する方法であって、局在プラズモン共鳴を誘起し得る第１の微小金属構造体と第１プローブとが互いに隔離されて基体表面に配置された検査素子を用意する工程と、局在プラズモン共鳴を誘起し得る第２の微小金属構造体を第２プローブに固定した標識用試薬を用意する工程と、前記標的物質および前記標識用試薬が有する第２プローブが共に存在する条件下で、前記標的物質および前記第２プローブの各々が前記第１プローブと複合体を形成する反応を行う工程と、前記検査素子の光学的特性を検出する工程と、を含み、前記第２プローブは、前記標的物質と競合して、前記第１プローブに捕捉される物質であることを特徴とする標的物質の検出方法である。この態様では、第２プローブとして、標的物質を用いることができる。
【００１７】
検査素子が備える微小金属構造体を第１の微小金属構造体とし、標識用試薬が備える微小金属構造体を第２の微小金属構造体とする。但し、この名称は検査素子と標識用試薬のいずれに含まれるかを区別するために用いるものであって、それぞれの微小金属構造体として異なるものを用いることを意味するものではない。
【００１８】
本発明の特長は、上記の検査素子と標識用試薬とを用いる方法において、第２の微小金属構造体が検査素子の基体上に保持される際に、基体平面に対し平行（ＸＹ軸）方向に第１の微小金属構造体と第２の微小金属構造体とが近接することができることである。これにより、微小金属構造体近傍の誘電率により大きな変化が生じ、この誘電率の変化を局在プラズモン共鳴を利用して測定を行うことで、標的物質の有無を高感度に検出することを可能とする。
【００１９】
本発明に係る測定方法の一例の概略を、図を用いて説明する。なお、図に示す検査素子を用いる場合には、例えば、以下の手順に従って本発明の検出方法を実施することができるが、この手順に限定されるものではない。
【００２０】
図１は本発明に係る測定方法の概略を、サンドイッチアッセイを例に説明するものである。
【００２１】
図１（ａ）は本実施形態における検査素子１２を示すものである。検査素子１２は局在プラズモン共鳴を誘起し得る第１の微小金属構造体１が互いに隔離された状態で基体４に整列またはランダムに配置されており、さらに前記微小金属構造体以外の基体の表面には、第１プローブ３が整列またはランダムに配置されている。また、基体４の表面および第１の微小金属構造体１の表面は、非特異吸着防止剤２で覆われている。（第１プローブの固定）
図１（ｂ）は、前記第１プローブ３が標的物質６を介して第２プローブ５と複合体を形成する際の概念図を示すものである。前記第２プローブ５には、第２の微小金属構造体７が固定されている。
【００２２】
図１（ｃ）は、標的物質６の有無により第１の微小金属構造体１と第２の微小金属構造体７からなる微小金属構造体間距離の変化について示すものである。検体中に標的物質６が含まれている場合、第１プローブ３と第2プローブ５が標的物質６を介して複合体を形成する。このとき、図1（ｃ）に示すように、第２の微小金属構造体が複合体を形成することで、微小金属構造間の距離８が短くなる。一方、検体中に前記標的物質６が含まれていない場合は、前記複合体を形成しないため、微小金属構造体間の距離９は変化しない。
【００２３】
つまり、検査素子１２側の微小金属構造体１と標的物質５側の微小金属構造体７とが近接した状態となり、更に、基体４平面に対し平行（ＸＹ軸）方向に微小金属構造体７が近接するため、微小金属構造体近傍の誘電率に大きな変化が生じ、この誘電率の変化を、局在プラズモン共鳴を利用して測定を行うことで、標的物質の有無を高感度に検出することが可能となる。
【００２４】
図２は本発明に係る測定方法の概略を、競合アッセイを例に説明するものである。
【００２５】
図２（ａ）は本実施形態における検査素子１２を示すものである。検査素子１２は局在プラズモン共鳴を誘起し得る第１の微小金属構造体１が互いに隔離された状態で基体４に整列またはランダムに配置されており、さらに前記微小金属構造体以外の基体の表面には、標的物質を捕捉可能な第１プローブ３が整列またはランダムに配置されている。また、基体４の表面および第１の微小金属構造体１の表面は、非特異吸着防止剤２で覆われている。
【００２６】
図２（ｂ）は、標的物質６と前記第２プローブ５が競合的に前記第１プローブ３と複合体を形成する反応の概念図を示すものである。前記第２プローブには、第２の微小金属構造体７が固定されている。  図２（ｃ）は、標的物質６の有無により形成される複合体の概念図を示すものである。検体中に標的物質６が含まれている場合、標的物質６と前記第１プローブ３が複合体を形成する（１１）。一方、検体中に前記標的物質６が含まれていない場合は、前記第２プローブ５が前記第１プローブと複合体を形成する（１０）。
【００２７】
つまり本発明は、サンドイッチアッセイや競合アッセイなど、種々の反応により、検査素子１２側の微小金属構造体１と標的物質５側の微小金属構造体７とが近接した状態となり、更に、基体４平面に対し平行（ＸＹ軸）方向に微小金属構造体７が近接するため、微小金属構造体近傍の誘電率に大きな変化が生じる。よって、この誘電率の変化を、局在プラズモン共鳴を利用して測定を行うことで、標的物質の有無を高感度に検出することが可能となる。
【００２８】
また、図１および図２では、本発明に係る測定方法をサンドイッチアッセイおよび競合アッセイを例に示しているが、この二つの測定方法に限定されるものではなく、その他にもハイブリダイゼーション反応、ライゲーション反応、光架橋反応など、種々の反応を利用可能である。
【００２９】
次に本発明の検査素子、キットについて詳細に説明する。
【００３０】
＜第１プローブ・第２プローブ・検体の種類＞
本発明において、プローブとは、標的物質の検出を行うために利用する試薬であり、標的物質を直接捕捉する物質（以下、標的物質捕捉体）であってもよいし、標的物質と競合して標的物質捕捉体により捕捉される物質（捕捉体結合性物質ともいう）であってもよい。競合するとは、標的物質および捕捉体結合性物質が共に存在する条件では、一つの標的物質捕捉体においては、いずれかの物質とのみ結合する場合をいう。標的物質捕捉体は、好ましくは、標的物質に特異的に結合する物質であることが好ましい。
【００３１】
検査素子が備えるプローブを第１プローブとし、標識用試薬が備えるプローブを第２プローブとする。第１プローブと第２プローブは、異なる物質であってもよいし、同じ物質であってもよい。第１プローブとしては、標的物質捕捉体が好ましい。第２プローブとしては、サンドイッチアッセイでは標的物質捕捉体が好ましく、競合アッセイでは捕捉体結合性物質が好ましい。
【００３２】
第１および第２プローブとしては、核酸、たんぱく質、ペプチド、アミノ酸、糖、細胞、抗体、抗原、酵素、受容体、環境ホルモンなどが挙げられる。また核酸であれば、ＰＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれも利用でき、更に一本鎖および二本鎖のいずれの核酸も利用できる。
【００３３】
また、本発明の検出方法を適用することのできる検体は、標的物質を含む可能性がある限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料あるいは、環境由来の試料を挙げることができる。生物学的試料としては、例えば、動物の体液（例えば、血液、血清、血漿、ずい液、汗、唾液、尿など）もしくは、毛髪、排泄物、臓器、組織、または動植物それ自体もしくは、それらの乾燥体などを挙げることができる。環境由来の試料としては、例えば、河川水、湖沼水、もしくは海水、土壌などを挙げることができる。
【００３４】
＜微小金属構造体＞
微小金属構造体の形状は、局在プラズモン共鳴を利用した測定を行うことができるものであれば何でも良く、例えば、球形、ロッド型、針状、中空素子、異なる金属の層状構造、誘電体との層状構造、チューブ型等の形状とすることができる。また、局在プラズモン共鳴測定を行うことができるのであれば、例えば、凹凸、突起を有していてもよい。
【００３５】
また、前記微小金属構造体を構成する材料は、局在プラズモン共鳴が生じうる金属元素であればよく、限定されるものではないが、その中でも金、銀、銅、白金、アルミニウムもしくはそれらの合金などが好ましい。
【００３６】
本発明では、検査素子が備える微小金属構造体を第１の微小金属構造体とし、標識用試薬が備える微小金属構造体を第２の微小金属構造体とする。
【００３７】
本発明に係る第１および第２微小金属構造体の大きさは、局在プラズモン共鳴を誘起し得る大きさであればどのようなものでも利用できるが、５ｎｍ〜１４５０ｎｍの範囲内にあることが好ましい。
【００３８】
＜検査素子＞
本発明で用いる、第１の微小金属構造体が互いに隔離されて基体表面に配置された検査素子とは、局在プラズモン共鳴を誘起し得る光学デバイスを意味している。図４に本実施形態に用いる検査素子１２の概念図を示す。本実施形態の検査素子１２は、標的物質および第２プローブと複合体を形成し得る第１プローブ３と、局在プラズモン共鳴を誘起し得る第１の微小金属構造体１と、基体４で構成されている。
【００３９】
基体４の形状と材質は、局在プラズモン共鳴測定を行うことが可能であれば特に制限されるものではない。例えば、平面構造体、多孔質構造体、微粒子集合体、柱状構造体、中空カラム構造体、凸状構造体、凹状構造体、突起状構造体、繊維状構造体などから選ばれる形状であってもよい。また、基体を構成する材質としては、例えばガラスやプラスチックなどがあげられる。
【００４０】
本発明に係る微小金属構造体は基体上で金属構造体同士が互いに隔離されて配置されることが好ましいが、さらに好ましくは５ｎｍ〜２０００ｎｍの間隔で隔離されることが好ましい。
【００４１】
また、第１の微小金属構造体を作製する際には、微細加工技術等を利用することができる。例えば、前記基体上に金属薄膜を真空蒸着法やスパッタ法などで成膜し、その上に電子線レジストをスピンコートにより成膜する。その後、電子線描画装置で露光し、現像、エッチング等を行うことで、基体上に第１の微小金属構造体を形成することができる。また、金属薄膜から微小金属構造体を形成する際は、前記電子線描画装置の他、集束イオンビーム加工装置、Ｘ線露光装置あるいは紫外線露光装置など、種々の微細加工技術等を利用できる。
【００４２】
第１プローブの基体表面への固定および第２プローブの第２微小金属構造体への固定は、既知のオリゴヌクレオチド、抗原、抗体、たんぱく質の固定化方法等を利用することができる。例えば第１プローブを基体に固定化する場合、予め基体表面をシラン剤等でアミノ化、カルボキシル化、チオール化させておくことで、種々の第１プローブを吸着法、カップリング反応等により固定することができる。
【００４３】
基体に第１プローブを固定する場合には、基体に設けられる微小金属構造体に第１プローブが配置されないようにすることが必要である。よって、微小金属構造体を配置する前に第１プローブを固定する場合は、微小金属構造体を配置する位置に第１プローブが結合しないようにしておくことが好ましい。また、第１プローブを基板に固定する前に微小金属構造体が設けられている場合は、微小金属構造体に第１プローブが結合せず、基体表面のみに結合するように処理を行なうことが好ましい。
【００４４】
また、第２プローブを微小金属構造体に固定化する場合、硫黄原子を持つ有機物が金などの金属表面に硫黄原子を介して共有結合することを利用する方法が挙げられる。この場合、予め第２プローブにチオール基を導入しておき、微小金属構造体と混合することで、第２プローブを固定することができる。さらに、予めストレプトアビジンを微小金属構造体や基体に吸着させ、ビオチン修飾プローブをストレプトアビジンに選択的に結合させて固定化する方法等も用いることができる。
【００４５】
前記固定化溶液の滴下には、所定の微小金属構造体にのみ試薬を滴下することが可能な位置制御機能を有するノズルを持った装置（例えば、ＤＮＡアレイヤー、インクジェット装置など）を用いてもよい。
【００４６】
＜標識用試薬＞
標識用試薬は、第２プローブと第２の微小金属構造体とを有する。第２プローブは第２の微小金属構造体に固定されていることが好ましい。
【００４７】
第２プローブとして捕捉体結合性物質を備える標識用試薬を用いる場合、標識用試薬を検体液に混合して検査素子と接触させることにより、捕捉体結合性物質は標的物質と競合して検査素子のプローブに結合するため、検体中の標的物質の量が多くなるほど、検査素子に保持される第２の微小金属構造体の数は少なくなる。また、捕捉体結合性物質は標的物質と同一であってもよい。
【００４８】
一方、標識用試薬として、標的物質と結合可能なプローブ（標的物質捕捉体）と第２の微小金属構造体との複合体を用いる場合について説明する。この構成の標識用試薬を用いて第１プローブが標的物質を介して第２プローブと複合体を形成する反応を行うことにより、検査素子上に第２の微小金属構造体が保持される。そのため、検体中の標的物質の量が多くなるほど、検査素子に保持される第２の微小金属構造体の数は多くなる。前記複合体を形成させるための反応の工程として、例えば、次の３つの方法を挙げることができる。第１の方法では、検体液と検査素子とを接触させることにより、検査素子上の第１プローブと標的物質とを結合させる工程と、標的物質を保持する検査素子と標識用試薬とを接触させることにより、検査素子上の第１プローブに結合した標的物質に第２プローブを結合させる工程とを有する。第２の方法では、検体液と標識用試薬とを混合して検査素子と接触させることにより、第１プローブが標的物質を介して第２プローブと複合体を形成する工程を有する。第３の方法では、検体液と標識用試薬とを混合することにより、標識用試薬の第２プローブを介して第２の微小金属構造体と標的物質との複合体を形成させる工程と、第２の微小金属構造体と標的物質との複合体を分離する工程と、第２の微小金属構造体と標的物質との複合体と検体素子とを接触させることにより、第１プローブが標的物質を介して第２プローブと複合体を形成する工程を有する。
【００４９】
以上のように、いずれの標識用試薬の構成であっても、本発明に用いる検査素子が備えるプローブが第１の微小金属構造体を除く基体表面に固定されていることより、第２の微小金属構造体は、基体平面に対し平行（XY軸）方向に第１の微小金属構造体と近接することになる。よって、上記のいずれの標識用試薬を用いても、微小金属構造体近傍の誘電率変化をより大きく変化させるという本発明の効果を有する。その結果、この誘電率の変化を局在プラズモン共鳴を利用して測定を行うことで、標的物質の有無を高感度に検出することを可能とする。
【００５０】
＜検査キット＞
次に本発明および本実施形態の検査キットについて説明する。
【００５１】
本発明の検査キットは、
（１）標識用試薬
（２）検査素子
を少なくとも備えていることを特徴とする。
【００５２】
本発明の検査キットに備わる検査素子とは、本発明の検出方法において開示した検査素子と同じものである。ここで標識用試薬とは、少なくとも第２プローブと第２の微小金属構造体を１つ以上備えているものである。また前記試薬は、乾燥状態、溶液状態でもよく、反応促進試薬などが添加されていても構わない。
【００５３】
検査キットの一つの態様として、局在プラズモン共鳴を誘起し得る第１の微小金属構造体と、標的物質を捕捉する第１プローブとが互いに隔離されて配置された基体を備える検査素子と、局在プラズモン共鳴を誘起し得る第２の微小金属構造体と第２プローブとを備える標識用試薬とを有する構成とすることができる。この場合に設けられる第１および第２プローブの組合せとして、第１プローブおよび第２プローブが空間的に標的物質の異なる領域を捕捉するものを用いてもよいし、あるいは、第２プローブが、標的物質と競合して、第１プローブに捕捉される物質を用いることができる。
【００５４】
本発明の検査キットは、第１の微小金属構造体１と第２微小金属構造体７とが、標的物質６との反応により近接した状態となり、更に、基体４平面に対し平行（ＸＹ軸）方向に微小金属構造体７が近接するため、微小金属構造体近傍の誘電率に大きな変化が生じ、この誘電率の変化を、局在プラズモン共鳴を利用して測定を行うことで、標的物質の有無を高感度に検出する検査キットである。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００５６】
（実施例１）
本実施例は、基体として９６穴プレートを用い、第１の微小金属構造体として金微粒子を基体上に固定化し、さらに基体表面に第１プローブを固定化して検査素子を作製後、この検査素子を用いて標的物質を反応させ、最後に第２プローブでラベルし、局在共鳴プラズモン測定により標的物質の有無、もしくは量を検出するサンドイッチアッセイの例である。
【００５７】
＜検査素子の作製＞
９６穴アミノ化プレート（住友ベークライト製）に、平均粒径１００ｎｍの金微粒子の溶液（田中貴金属社製）を純水で３０％に希釈した溶液を導入し、室温で２４時間浸漬させ、純水で洗浄した後、チッソガスで乾燥することで第１の微小金属構造体を表面に有する基体を作製する。その後、前記プレートの各ウェルに５ｍｇ/ｍｌのＰＥＧ−ＳＨ試薬（平均分子量５０００、日本油脂製）を１００μｌずつ添加し、３０℃で２時間反応させ、第１の微小金属構造体表面特異的に非特異吸着防止膜を形成させる。
【００５８】
次に前記プレートの各ウェルに１０μｇ/ｍｌのＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｆ(ｃ)（ＲＯＣＫＬＡＮＤ 社製）を１００μｌずつ添加し、４℃で一晩反応させ、基体表面に固定化し、この抗体を第１プローブとする。この第１プローブは、微小金属構造体には配置されず、基体表面のみに配置されている。
【００５９】
その後、前記プレートの各ウェルに１％ カゼイン（テクノケミカル製）を１００μｌずつ添加し、３０℃で２時間反応させ、基体表面に非特異吸着防止膜を形成させる。
【００６０】
＜標識用試薬の調製＞
平均粒径１００ｎｍの金微粒子の溶液（田中貴金属社製）を１８ｍｌ分取し、１００ｍｇ/ｍｌのＢＳＡ溶液を２ｍｌ加えた後、３０℃で２時間反応させ、前記金微粒子にＢＳＡを吸着させる。
【００６１】
次に、前記金属微粒子溶液を４０００ｇで３０分間、遠心分離し、溶液を２ｍＭ Ｂｏｒａｘ 溶液２０ｍｌと置換する。
【００６２】
その後、再度４０００ｇで３０分間、遠心分離を行い、溶液をリン酸緩衝液１０ｍｌと置換し、このＢＳＡ吸着金微粒子を標識用試薬溶液とする。  ＜検出反応＞
標的物質としてＡｎｔｉ−ＢＳＡ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ 社製）を用い、Ａｎｔｉ−ＢＳＡの希釈溶液（１×１０-3〜１０-13ｇ/ｍｌ）を調整し、検査素子（前記９６穴プレート）の各ウェルに１００μｌずつ添加する。その後、３７℃で２時間反応させ、第１プローブと反応させる。
【００６３】
次に、前記標識用試薬溶液を各ウェルに１００μｌずつ添加し、３７℃で２時間反応させ、第１プローブおよび標的物質と複合体を形成させる。
【００６４】
＜第２の微小金属構造体を使用しない局在プラズモン共鳴センサー（従来法）＞
従来法の検査素子は下記の手順により作製する。
【００６５】
まず、９６穴アミノ化プレート（住友ベークライト製）に、平均粒径１００ｎｍの金微粒子の溶液（田中貴金属社製）を純水で３０％に希釈した溶液を導入し、室温で２４時間浸漬させ、純水で洗浄した後、チッソガスで乾燥することで第１の微小金属構造体を表面に有する基体を作製する。
【００６６】
次に前記プレートの各ウェルに１０μｇ/ｍｌのＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｆ(ｃ)（ＲＯＣＫＬＡＮＤ 社製）を１００μｌずつ添加し、４℃で一晩反応させ、基体表面に固定化し、この抗体を第１プローブとする。この第1プローブは、基体表面および微小金属構造体上に配置されている。
【００６７】
その後、前記プレートの各ウェルに１％ カゼイン（テクノケミカル製）を１００μｌずつ添加し、３０℃で２時間反応させ、基体表面に非特異吸着防止膜を形成させる。
【００６８】
標的物質としてＡｎｔｉ−ＢＳＡ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ 社製）を用い、Ａｎｔｉ−ＢＳＡの希釈溶液（１×１０-3〜１０-13ｇ/ｍｌ）を調整し、検査素子（前記９６穴プレート）の各ウェルに１００μｌずつ添加する。その後、３７℃で２時間反応させ、基体表面および微小金属構造体上に配置されている第１プローブと反応させる。
【００６９】
＜光学的特性の検出＞
次に、検出装置の例を説明する。尚、本実施例は検査素子を透過した光により検出を行う例である。
【００７０】
図３（ａ）は本実施例による検出方法を模式的に示した図である。また、図示しない検出装置は、検査チップの保持機構、光源、受光素子を備える。
【００７１】
検出時の光源１３の位置は、図３（ａ）に模式的に示すように、検査チップに測定光１４を照射しえる位置にあり、受光素子１５の位置は検査素子１２を透過した測定光１４の特性を検出しうる位置にある。尚、この他に、図示しない分光検出器が受光素子に備えられていても構わない。さらには、図示しないが、検出した特性変化を演算する演算装置、検出結果を表示する表示手段等が備えられていることが好ましい。
【００７２】
次に、Ａｎｔｉ−ＢＳＡを検出する例を説明する。
【００７３】
まず、前記検査素子を用いて前記検出反応を行い、前述したように検査素子、光源、受光素子を配置し、第１および第２の微小金属構造体からなるスペクトルを検出する。
【００７４】
前記検出反応によるスペクトルの変化は、局在表面プラズモン共鳴状態の変化に由来するものであり、前記検査素子上に第２の微小金属構造体が間接的に結合したことを意味する。よって、スペクトル変化を検出することで、検体中のＡｎｔｉ−ＢＳＡの有無および量を検知することが可能となる。
【００７５】
図５に実施例１で得られるＡｎｔｉ−ＢＳＡの検量線１７を示す。比較として、第２の微小金属構造体を使用しない局在プラズモン共鳴センサー（従来法）により得られるＡｎｔｉ−ＢＳＡの検量線１８を示す。従来法と比べ、本発明は検出感度が向上していることが分かる。
【００７６】
尚、ここではスペクトルの変化と記載したが、このスペクトル変化は、最大値をもつ波長でのスペクトルピークの変化でもよいし、スペクトルピーク波形の半値幅等ピーク形状の変化をもちいてもよい。さらには、一つあるいは、複数の波長点での光強度をもちいても構わない。
【００７７】
（実施例２）
本実施例は、基体として石英基板を用い、第１の微小金属構造体として金ドットパターンを基体上に形成し、さらに基体表面に標的物質を捕捉するプローブを固定化して検査素子を作製する。この検査素子とプローブ結合性物質を用いて標的物質との競合反応を行い、局在プラズモン共鳴測定により、標的物質の有無、もしくは量を検出する競合アッセイの例である。
【００７８】
＜検査素子の作製＞
石英ウェハー（７２×２６×０．５ｍｍ、シンエツ製）に、微細加工技術を用いて金ドットパターン（ドットの大きさ：平均長軸長さ３６．６ ｎｍ、平均短軸長さ７.２ｎｍ、平均アスペクト比５．０、平均ドット間隔５００ｎｍ）を形成させ、この金ドットを第１の微小金属構造体とする。
【００７９】
次にアミノ基を有するシランカップリング剤を用いて基体表面をアミノ化する。さらに、前記基体に５ｍｇ/ｍｌのＰＥＧ−ＳＨ試薬（分子量５０００、日本油脂製）を１００μｌずつ添加し、３０℃で２時間反応させ、第１の微小金属構造体表面に非特異吸着防止膜を形成させる。
【００８０】
次に前記基体に１０μｇ/ｍｌのＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｆ(c)（ＲＯＣＫＬＡＮＤ 社製）を１００μｌずつ添加し、４℃で一晩反応させ、基体表面に固定化し、この抗体を標的物質を捕捉する第１プローブとする。この第１プローブは、微小金属構造体表面には固定されず、基体表面のみに配置されている。
【００８１】
その後、前記基体の各ウェルに1％ カゼイン（テクノケミカル製）を１００μｌずつ添加し、３０℃で２時間反応させ、基体表面の非特異吸着防止膜を形成させる。
【００８２】
＜標識用試薬の調製＞
金ナノロッド溶液（ロッド形状：平均長軸長さ３６．６ ｎｍ、平均短軸長さ７.２ｎｍ、平均アスペクト比５．０、三菱マテリアル製）を１８ｍｌ分取し、第２プローブとして、１００μｇ/ｍｌのＡｎｔｉ−ＢＳＡ溶液（ＲＯＣＫＬＡＮＤ 社製）を２ｍｌ加えた後、３０℃で２時間、反応させる。次に、前記混合液を４０００Ｇで３０分間、遠心分離し、溶液を２ｍＭ−Ｂｏｒａｘ ２０ｍｌと置換する。その後、再度４０００ｇで３０分間、遠心分離を行い、溶液をリン酸緩衝液１０ｍｌと置換し、このＡｎｔｉ−ＢＳＡ固定化金ナノロッドを標識用試薬とする。本実施例では、第２プローブとして、標的物質と同一の物質を用いる。
【００８３】
＜検出反応＞
標的物質であるＡｎｔｉ−ＢＳＡ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ 社製）の希釈溶液（１×１０-3〜１０-13ｇ/ｍｌ）を調整する。次に、前記検査素子の各ウェルに、前記Ａｎｔｉ−ＢＳＡの希釈溶液を５０μｌずつ添加し、その後、前記検査素子の各ウェルに、前記標識用試薬溶液を５０μｌずつ添加する。３７℃で２時間、標識用試薬が備える第２プローブと標的物質とで競合反応を行う。
【００８４】
＜光学的特性の検出＞
次に、検出装置の例を説明する。尚、本実施例は検査素子を反射した光により検出を行う例である。
【００８５】
図３（ｂ）は本実施例による検出方法を模式的に示した図である。また、図示しない検出装置は、検査チップの保持機構、光源、受光素子を備える。
【００８６】
検出時の光源１３の位置は、図３（ｂ）に模式的に示すように、検査チップに測定光１６を照射しえる位置にあり、受光素子１５の位置は検査素子１２を反射した測定光１６の特性を検出しうる位置にある。尚、この他に、図示しない分光検出器が受光素子に備えられていても構わない。さらには、図示しないが、検出した特性変化を演算する演算装置、検出結果を表示する表示手段等が備えられていることが好ましい。
【００８７】
次に、Ａｎｔｉ−ＢＳＡを検出する例を説明する。
【００８８】
まず、前記検査素子を用いて前記検出反応を行い、前述のように検査素子、光源、受光素子を配置し、第１および第２の微小金属構造体のスペクトルを検出する。
【００８９】
前記検出反応によるスペクトルの変化は、局在表面プラズモン共鳴状態の変化に由来するものであり、前記検査素子上に第２の微小金属構造体が間接的に結合したことを意味する。よって、スペクトル変化を検出することで、検体中のＡｎｔｉ−ＢＳＡの有無および量を検知することが可能となる。
【００９０】
本実施例でも、従来法と比較し、Ａｎｔｉ−ＢＳＡを高感度に検出することができる。
尚、ここではスペクトルの変化と記載したが、このスペクトル変化は、最大値をもつ波長でのスペクトルピークの変化でもよいし、スペクトルピーク波形の半値幅等ピーク形状の変化をもちいてもよい。さらには、一つあるいは、複数の波長点での光強度をもちいても構わない。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明の一実施形態にかかる検査方法（サンドイッチアッセイ）の概念図である。
【図２】本発明の一実施形態にかかる検査方法（競合アッセイ）の概念図である。
【図３】本発明にかかる検査チップにおける局在プラズモン共鳴を利用した検出原理の概念図である。（ａ）透過光タイプ（ｂ）反射光タイプ
【図４】本発明にかかる検査素子の概念図である。
【図５】本発明にかかる検査素子を用いたＡｎｔｉ−ＢＳＡの検査例である。
【符号の説明】
【００９２】
１．    第１の微小金属構造体
２．    非特異吸着防止剤
３．    第１プローブ
４．    基体
５．    第２プローブ
６．    標的物質
７．    第２の微小金属構造体
８．    標的物質が結合した場合の微小金属構造体間距離
９．    標的物質が結合していない場合の微小金属構造体間距離
１０．  第２の微小金属構造体７が修飾された第2プローブと第１プローブの複合体
１１．  標的物質と第１プローブの複合体
１２．  検査素子
１３．  光源
１４．  測定光（検査素子透過後）
１５．  受光素子
１６．  測定光（検査素子反射後）
１７．  本発明によるＡｎｔｉ−ＢＳＡ検量線
１８．  従来法（非標識ＬＳＰＲ測定）によるＡｎｔｉ−ＢＳＡ検量線
【図１】
2009150708.tif 000003
【図２】
2009150708.tif 000004
【図３】
2009150708.tif 000005
【図４】
2009150708.tif 000006
【図５】
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