(57)【要約】【課題】ＤＮＡの増幅及び分析を行える生体サンプル分析用プレートにおいて、増幅したＰＣＲ反応液を分析するためのサンプル定量部へと確実に移送することができる生体サンプル分析用プレートを提供する。【解決手段】反応チャンバーの底面中央部に柱を設けることにより、ワックスが固化する際に反応チャンバー中央部付近に孔が開くことを防ぐことが出来きる。従って、ワックスがＰＣＲ反応液の表面を均一に覆うことが出来るため、サンプル定量部への送液を確実に行うことが出来る。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
回転すべき中心軸と、
前記回転により分析すべき生体サンプルを送るための注入流路と、
前記注入流路に接続され底面に柱を持つ反応チャンバーと、
前記チャンバーから前記生体サンプルを送液するための送液流路と、
を備えた生体サンプル分析用プレート。
【請求項２】
前記生体サンプルは、ＤＮＡである請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項３】
前記生体サンプルは、ＲＮＡである請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項４】
前記注入流路は、前記生体サンプル分析用プレートの上面に配置されている請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項５】
前記反応チャンバーは、加熱することにより前記生体サンプルを熱変性するために使用される請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項６】
前記反応チャンバーは、熱融解するワックス塊を有する請求項５に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項７】
前記反応チャンバーは、前記中心軸に対し前記注入流路より外周側に位置する請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項８】
前記チャンバーに形成された柱は、前記底面の中央部に設けられた請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項９】
前記チャンバーに形成された柱は、前記生体サンプルと前記ワックスを前記底面に満たした際の液面高さよりも高い請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項１０】
前記送液流路は、前記底面に設けられた請求項９に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項１１】
前記送液流路は、前記生体サンプル分析用プレート回転時に前記生体サンプルが存在しない前記底面に設けられた請求項１０に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項１２】
前記送液流路は、前記生体サンプルに近い位置にある前記底面に設けられた請求項１１の生体サンプル分析用プレート。
【請求項１３】
前記送液流路は、前記注入流路よりも低い位置に設けられた請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ分析を行う生体サンプル分析用プレートに関し、より詳細には、遠心力を用いることでＤＮＡ増幅から分析までの一連の工程を自動化した生体サンプル分析用プレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学分野の発展に伴い、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。また、農畜産分野においても、品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されてきており、遺伝子はより身近なものとして取り上げられるようになってきた。
【０００３】
これらの技術の進歩を大きく飛躍させた技術としてＰＣＲ（Ｐｏｌｏｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によるＤＮＡ増幅技術が挙げられ、ＰＣＲによる増幅の有無を見ることによって判別することもできる。ＰＣＲ技術が広く普及して以来、ＰＣＲを迅速で簡便に行う技術が望まれている。
【０００４】
ＰＣＲは３つの温度工程からなる。二本鎖のＤＮＡを一本鎖へと解離させる工程（熱変性）、一本鎖に解離したＤＮＡに増幅したい部分の両端の配列と相補的な配列を有したプライマーを結合させる工程（アニーリング）、プライマーが結合した配列からＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ鎖を伸長させる工程（伸長反応）である。熱変性では９５℃で１分間温度をかけることによって、ＤＮＡを一本鎖の状態にする。アニーリングの工程では５０〜６０℃で３０秒間反応させることにより、増幅したい領域の末端部分にプライマーと呼ばれる２０塩基程度の短いＤＮＡを結合させる。伸長反応は７２℃の温度でポリメラーゼを鋳型に付加し、ＤＮＡ鎖の伸長を行う。これらの温度サイクルを２５〜４０回行うことで、サイクル数に応じて理論的には２の２５乗から４０乗倍に増幅できる。実質的には目的の領域を１０の６乗倍に増幅している。
【０００５】
ＰＣＲを行うためのＰＣＲ反応液は、増幅するためのポリメラーゼ、ポリメラーゼが最適な環境で働くためのｐＨや塩濃度を調整したバッファ、ｄＮＴＰ、両末端のプライマー、鋳型、トータルボリュームを調整する滅菌水で構成される。これらの試薬のうち、ポリメラーゼ、バッファ、ｄＮＴＰ、滅菌水はどのようなＤＮＡ断片を得たい場合でも共通の試薬であるが、両末端のプライマーと鋳型は増幅したい領域に合わせて用意する必要がある。また、ポリメラーゼは活性を失わないよう細心の注意が必要であり、通常はマイナス２０℃で保存されており、ＰＣＲを行う段階での調整が必要であった。
【０００６】
ＰＣＲを行うためにはこれらの試薬の調整を行う必要があるが、ＰＣＲの簡略化のために開発された二つのアプローチ方法がある。一つは温度工程を簡単にし、反応時間を短時間で済ませる方法である。７２℃で反応するポリメラーゼ（酵素）を改良し、６６℃の低温で反応ができるようになった。この酵素の開発によって、プライマーのアニール温度と伸長反応を同じ温度設定で行うことが出来、温度工程をひとつ減らすことが可能になった。また、もう一つは、乾燥状態でも失活しない酵素が開発され、従来、反応前の最終段階で調整しなければならなかった酵素の添加をあらかじめ混ぜて用意しておくことができるようになった。
【０００７】
これらの技術を利用したマイクロタスによるＰＣＲ装置の期待が高まっている。しかし、マイクロタスで行うＰＣＲは反応液の送液の制御が難しく、温度工程時に反応液が流路を移動したり、反応液が蒸発したりするという問題点があった。従来の小型の生体サンプル分析装置は、サンプルを注入する注入部とサンプルからＤＮＡを抽出する抽出チャンバーとＰＣＲ反応を行うＰＣＲチャンバーとを備えたプレートを用いて、ＰＣＲ増幅を自動で行う構成である。この生体サンプル分析装置は加熱機構と回転機構を持ち、プレート上のサンプル移送は遠心力と毛細管現象を利用している。ＰＣＲチャンバーへ接続される流路には、ワックスにより蓋をし、ＰＣＲ反応液の移送を制御できる構成になっている。抽出チャンバーに入った細胞はアルカリ細胞溶解液で溶解され、抽出チャンバーで抽出されたＤＮＡは回転により抽出チャンバーから増幅反応チャンバーへ移送される。この増幅チャンバーでは中和用の緩衝液が加えられた後、ＰＣＲに必要なｄＮＴＰや塩、緩衝液、酵素と溶出したＤＮＡを含む増幅溶液が加えられ、ＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応後は反応サンプルを検出する検出部を設けるか、または別の外部の装置で測定を行う（例えば、特許文献１参照。）。
【０００８】
さらに特許文献１の技術を改良して、同一プレート上でＤＮＡの増幅から検出までを行える生体サンプル分析用プレートが考えられる。この生体サンプル分析用プレートでは、熱溶解したワックス層を蓋として用いてＰＣＲ反応液の蒸発を防ぎ、回転機構を用いて送液を行う。図７に、この生体サンプル分析用プレートの流路パターンの模式図を示す。流路パターンには、ＰＣＲ反応を行うための反応チャンバー６とＰＣＲ後のＰＣＲ反応液を分析するためのサンプル定量部７とが配置され、送液流路１５により接続されている。図８に反応チャンバー６の断面図を示す。ＰＣＲ反応中は、生体サンプル分析用プレートを回転させ、遠心力により反応チャンバー６の外周側へＰＣＲ反応液２０を保持する（図８上図）。ＰＣＲ反応液２０よりも比重の軽いワックス２１を熱融解させ、ＰＣＲ反応液２０の液面に蒸発防止膜を形成する。ＰＣＲ反応後は生体サンプル分析用プレートの回転を停止させ、ＰＣＲ反応液２０及びワックス２１を反応チャンバー６の底面に移動させ、加熱をやめることでワックス２１を凝固させる（図８下図）。生体サンプル分析用プレートを再度回転させることにより、凝固したワックス２１と底面に挟まれたＰＣＲ反応液２０の一部は流路１５を通り、サンプル定量部７へ送液される。正電極１１及び負電極１２に電圧を印加して、緩衝液で満たされた流路１３において電気泳動を行うことによりＤＮＡ検出を行う。
【特許文献１】特表２００３−５０２６５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、前記従来の構成では、ＰＣＲ増幅後のＰＣＲ反応液２０を移送するために遠心終了後はワックス２１への加熱を止めなければならない。そのため、加熱終了後、ワックスは固化すが、このワックス２１がＰＣＲ反応液２０の表面に均一に覆わず、チャンバー６の中央部を残して固化してしまう。その結果、図９に示すようにチャンバー６の表面のワックス２１層に孔が開き、ＰＣＲ反応液２０が露出してしまう。この状態でチャンバー６内のＰＣＲ反応液２０の送液を行えば、チャンバー６の中央部に開いたワックス２１の孔を通してＰＣＲ反応液２０が移動するため、送液流路７に必要量のＰＣＲ反応液２０を移送できないという課題を有していた。
【００１０】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、遠心後のＰＣＲ産物の送液を確実に行うことのできる生体サンプル分析用プレートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記従来の課題を解決するために、本発明の生体サンプル分析用プレートは、回転すべき中心軸と、前記回転により分析すべき生体サンプルを送るための注入流路と、前記注入流路に接続され底面に柱を持つ反応チャンバーと、前記チャンバーから前記生体サンプルを送液するための送液流路と、を備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の生体サンプル分析用プレートによれば、一つのプレート上でＤＮＡの増幅から分析まで行う際、増幅したＰＣＲ反応液を分析するためのサンプル定量部へと確実に移送することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に、本発明の生体サンプル分析用プレートの実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１４】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１における生体サンプル分析用プレート１０１を示す平面図であり、図２はその拡大図での一つの流路パターン１０２を示した図である。図１を用いて、生体サンプル分析用プレート１０１の説明をする。生体サンプル分析用プレート１０１の材質はアクリル系の樹脂であり、厚みは５ｍｍである。生体サンプル分析用プレート１０１の両面に、深さ５０μｍの流路やチャンバーとなる溝や孔が形成されている。さらにその上面に厚さ５０μｍのアクリル製フィルム、下面に５００μｍのアクリル製プレートを接着することで密閉流路を形成している。また、生体サンプル分析用プレート１０１の軸心１０３には、生体サンプル分析用プレート１０１を生体サンプル分析装置に固定するための孔が設けられている。本発明の実施の形態１においては、生体サンプル分析用プレート１０１には８つの流路パターン１０２が設けられている構成を例としている。
【００１５】
図２を用いて、生体サンプル分析用プレート１０１の流路パターン１０２について詳細に説明する。流路パターン１０２には、ＰＣＲ反応液を注入するためのＰＣＲ反応液注入部１０５と、緩衝剤を注入するための緩衝剤注入部１０４と、ＰＣＲ反応を行うための反応チャンバー１０６と、ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液を定量するサンプル定量部１０７と、バッファ部１０８と、正電圧の印加部である正電極部１１１と、負電圧の印加部である負電極部１１２と、これらを接続する流路とからなる。
【００１６】
図３に、図２における反応チャンバー１０６の破線Ａ−Ａ’の断面図を示す。図３を用いて、反応チャンバー１０６の形状について詳細に説明する。アクリル製プレート１０１の上面にアクリル製フィルム１１７、下面にアクリル製プレート１１８を貼り付けて流路を形成している。ＰＣＲ反応液注入部１０５と反応チャンバー１０６を接続する注入流路１１４が形成される面を上面とし、サンプル定量部１０７と反応チャンバー１０６を接続する送液流路１１５が形成される面を下面とする。本発明の実施の形態１では下面をチャンバー１０６の底面とする。反応チャンバー１０６底面の中央部付近には柱１１６が形成されている。送液流路１１５は、生体サンプル分析用プレート回転時に前記生体サンプルが存在しない底面側に形成されている。
【００１７】
以下に本発明による生体サンプルのＤＮＡをＰＣＲ法により自動増幅した後、ＰＣＲ産物を測定するまでの動作の流れを説明する。生体サンプルは、植物、動物、または人の細胞や血液等から抽出したＤＮＡまたはＲＮＡを使用する。本発明の実施の形態１では、ＤＮＡを用いた。ＰＣＲのために使用する溶液は、分析したいＤＮＡを含む生体サンプルと、ＤＮＡを増幅するための酵素と、酵素が最適環境で作用するためのｐＨや塩濃度を調整するためのバッファと、ｄＮＴＰ、プライマーとを含有するＰＣＲ反応液である。プライマーは、生体サンプルの中で増幅したい領域の末端の配列を持つ配列を選択し、蛍光物質等の標識剤を修飾している（本発明の実施の形態１ではＣｙ５を修飾した。）。酵素にはＴａｇポリメラーゼを使用する。以上の試薬を調整し、ＰＣＲ反応液を準備する。
【００１８】
次に、緩衝剤としてポリマー溶液を準備する。ポリマーは分子篩効果を持つものなら何でも良く、例えば、アクリルアミドポリマーやＰＥＧ、デキストラン、セルロースなどが挙げられる。本発明の実施の形態１では、ＰＥＧ（分子量５０万）を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．４）で３．５％になるように希釈し、一晩静置した後、０．４５μｍ以下のフィルターでろ過したものを使用する。
【００１９】
試料の準備が終わったところで、ポリマー溶液およびＰＣＲ反応液をプレート１０１内へ注入する。ポリマー溶液はピペッター等により定量を緩衝剤注入部１０４へ分注する。ＰＣＲ反応液も同様に定量をサンプル注入部１０５へ分注する。分注量としては、流路パターンのスケールにより異なるが本実施の形態１においては、ポリマー溶液は１８マイクロリットル、ＰＣＲ反応液は３０マイクロリットルとする。
【００２０】
次に、プレート１０１をモータ等に固定して、軸心１０３を軸に回転を行う（例えば、本発明の実施の形態１では回転数２０００ｒｐｍ。）。この時分注されたポリマー溶液とＰＣＲ反応液は、遠心力により外周方向へと移動する。緩衝剤注入部１０７内のポリマー溶液は流路１０９と流路１１０を通り正電極部１１１と負電極部１１２へ等分され正電極部１１１へ移動したポリマー溶液はさらに流路１１３を通りサンプル定量部１０７まで移動する。負電極部１１２へ移動したポリマー溶液も同様に流路１１３を通りサンプル定量部１０７まで移動する。                                                                
【００２１】
図４は回転開始後、ポリマー溶液の移動が停止した状態を示す図である。斜線で示す部分がポリマー溶液であり、ポリマー溶液は、正電極部１１１および負電極部１１２の６割程度まで充填されており、流路１１３を満たしサンプル定量部１０７で合流している。また、正電極部１１１と負電極部１１２内に存在するポリマー溶液の液面高さとサンプル定量部１０７の液面高さは、プレートの中心１０３を中心とする同一円周上となる。
【００２２】
次にＰＣＲ反応液のＰＣＲ反応と移動について説明する。ＰＣＲ反応は、反応チャンバー１０６において行われる。図５は、ＰＣＲ反応中、ＰＣＲ反応後、サンプル定量部への送液後、それぞれの場合の反応チャンバー１０６内の状態を示す。
【００２３】
図５（ａ）に、ＰＣＲ反応中の反応チャンバー１０６内の状態を示す。本発明の実施の形態１では、直径は６ｍｍ深さ４ｍｍの内容積を持つ反応チャンバー１０６を作成した。また、柱１１６は、反応チャンバー１０６の中心に直径２ｍｍで高さは４ｍｍのものを作成した。ＰＣＲ反応液の液量は３０μＬ、ワックスの質量は１４ｍｇとした。ＰＣＲ反応液注入部１０５へ注入されたＰＣＲ反応液１２０は、生体サンプル分析用プレート１０１を回転させさせることで生じる遠心力によって反応チャンバー１０６へ移送される。生体サンプル分析用プレート１０１の回転を継続させたまま、９５℃で１分、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒という熱サイクルを２５サイクルから４０サイクル行う。５０℃以下の融点をもつワックス１２１は、予め反応チャンバー１０６に封入されており、熱サイクルの加熱により融解する。生体サンプル分析用プレート１０１の回転により遠心力が生じているため、ＰＣＲ反応液１２０及び熱融解したワックス１２１は反応チャンバー１０６内の外周側へ寄せられる。ＰＣＲ反応液１２０よりも比重が軽いワックス１２１の層がＰＣＲ反応液１２０の液面に形成され、このワックス１２１の層が蒸発防止膜となる。
【００２４】
図５（ｂ）に、ＰＣＲ反応後の反応チャンバー１０６内の状態を示す。ＰＣＲ反応後、生体サンプル分析用プレート１０１の回転を停止させると、ＰＣＲ反応液１２０及びワックス１２１は反応チャンバー１０６の側面から底面へ移動する。このとき、ワックス１２１は柱１１６を伝わって、反応チャンバー１０６の底面に均一に拡がる。その結果、ＰＣＲ反応液１２０よりも比重の軽いワックス１２１の層が上に形成される。その後、加熱を停止して、ワックス１２１が凝固する温度まで生体サンプル分析用プレート１０１を冷却する。本発明の実施の形態１では、５０℃になるまで冷却した。
【００２５】
反応チャンバー１０６の底面に柱を設けない場合では、ワックス１２１がＰＣＲ反応液１２０の表面に均一に覆わず、チャンバー中央部付近を残して固化してしまい、ワックス１２１層に孔が開いてしまった。しかし、本発明の実施の形態１ではチャンバー中央部に柱を設けることでワックス１２１層中央部付近に孔が開くことを防ぐことが出来た。
【００２６】
ここで、本発明の実施の形態１では柱の高さをチャンバーの深さと同じにしたが、ＰＣＲ反応液とワックスをチャンバー底面に満たした際の液面高さ以上であればよい。また、本発明の実施の形態１では柱１１６の形状を円柱としたが、柱１１６の高さが液面高さ以上であればその限りではなく、多角形であってもよい。
【００２７】
図５（ｃ）に、サンプル定量部への送液後の反応チャンバー１０６内の状態を示す。図５（ｂ）の状態から、生体サンプル分析用プレート１０１を再度回転させる。この回転によって生じる遠心力により、固化したワックス１２１の層と反応チャンバー１０６の底面との間に挟まれたＰＣＲ反応液１２０のうち送液流路１１５よりも内周側を送液流路１１５へと送液する。送液流路１１５を通ったＰＣＲ反応液１２０は、サンプル定量部１０７で一定量が保持され、一定量以上は送液流路１１５を通りバッファ部１０８へと移動する。
【００２８】
図６はプレートの回転を停止した後の状態を示す図である。ＰＣＲ反応液１２０はサンプル定量部１０７において流路１１３から充填されたポリマー溶液と接している。また、ＰＣＲ反応液１２０は、サンプル定量部１０７を残してすべてバッファ部１０８へ移送されている。
【００２９】
以上により、サンプル定量部１０７に一定量のＰＣＲ反応液を残留させることができ、サンプル定量部１０７のＰＣＲ反応液が分析をする最終試料となる。
【００３０】
次に、電気泳動を行う。電気泳動は正電極部１１１に正電極、負電極部１１２に負電極を、プレート１０１の外部からフィルムを突き破って挿入して、ポリマー溶液と接触させる。そして数百Ｖの電圧を印加する。すると、流路１１３およびサンプル定量部１０７において電界が発生し、サンプル定量部１０７に一定量残存したＰＣＲ反応液は流路１１３中を正電極側（図６中Ａ方向）へ移動する。
【００３１】
ＤＮＡの検出は、蛍光標識（Ｃｙ５）を修飾したＤＮＡを６３５ｎｍの光で励起し、６７０ｎｍ付近の光検出によって、流路１１３中を電気泳動するＰＣＲ反応液の状態を検出し、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅の有無を確認する。さらには、電気泳動する流路１１３を円弧状としたことで、生体サンプル分析用プレート１を回転させることにより、流路１１３中を電気泳動するＤＮＡサンプルの分布を測定する。
以上のように、本発明の実施の形態１０１においては、反応チャンバー１０６の底面の中央部付近に柱を設けた。この柱を設けることにより、ワックス層が固化する際に孔が開くことを防ぐことが出来る。ＰＣＲ反応液１２０の上のワックス層に孔が開くことなく覆うことにより、サンプル定量部１０７への送液を確実に行うことが出来る。サンプル定量部１０７へ充填されたＰＣＲ反応液は、電気泳動を行い、ＤＮＡ解析される。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
ＤＮＡの増幅から検出までの自動装置の実現のため、同一プレート上でＤＮＡ増幅と検出が行える生体サンプル分析用プレートが必要であり、そのプレートにおけるサンプル液の保持及び送液は非常に重要である。本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、サンプル液のチャンバー間の送液を確実に行えるので、生体サンプル分析用プレートの用途を飛躍的に広げるため有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の実施の形態１における生体サンプル分析用プレートを示す図
【図２】本発明の実施の形態１における生体サンプル分析用プレートに形成される流路パターンを示す図
【図３】本発明の実施の形態１における生体サンプル分析用プレートの反応チャンバーの断面を示す図
【図４】本発明の実施の形態１における生体サンプル分析用プレートにポリマー溶液を充填した状態を示す図
【図５】本発明の実施の形態１における生体サンプル分析用プレートの反応チャンバー内でのＰＣＲ反応液の状態を閉めす図
【図６】本発明の実施の形態１における生体サンプル分析用プレートにおいてＰＣＲ反応液をサンプル定量部に定量した状態を示す図
【図７】従来の生体サンプル分析用プレートの流路パターンを示す図
【図８】従来の生体サンプル分析用プレートの反応チャンバーの断面図
【図９】ＰＣＲ反応終了後の反応チャンバーの表面を示す図
【符号の説明】
【００３４】
４  緩衝剤注入部
５  ＰＣＲ反応液注入部
６  反応チャンバー
７  サンプル定量部
８  バッファ部
９  流路
１０  流路
１１  正電極部
１２  負電極部
１３  流路
１４  注入流路
１５  送液流路
２０  ＰＣＲ反応液
２１  ワックス
１０１  生体サンプル分析用プレート
１０２  流路パターン
１０３  軸心
１０４  緩衝剤注入部
１０５  ＰＣＲ反応液注入部
１０６  反応チャンバー
１０７  サンプル定量部
１０８  バッファ部
１０９  流路
１１０  流路
１１１  正電極部
１１２  負電極部
１１３  流路
１１４  注入流路
１１５  送液流路
１１６  柱
１１７  アクリル製フィルム
１１８  アクリル製プレート
１１９  ポリマー溶液
１２０  ＰＣＲ反応液
１２１  ワックス
【図１】
2009168544.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2009168544.tif 000008
【図７】
2009168544.tif 000009
【図８】
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【図９】
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