(57)【要約】【課題】新規なヒト免疫不全ウイルス感染阻害剤ならびにエイズ予防及び治療薬を提供する。【解決手段】下記式（Ｉ）で表される化合物、その製薬上許容される塩、又はその水和物を有効成分として含有することを特徴とする、ヒト免疫不全ウイルス感染阻害剤：2009242247.tif 000008【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される化合物、その製薬上許容される塩、又はその水和物を有効成分として含有することを特徴とする、ヒト免疫不全ウイルス感染阻害剤：
【化１】
2009242247.tif 000007
【請求項２】
請求項１に記載の阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、エイズの治療または予防のための医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス感染阻害剤、及び当該阻害剤を含有する新しいタイプのエイズ予防薬及び治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ；エイズ）は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の感染によりＣＤ４陽性Ｔ細胞が破壊されて宿主の免疫機能を著しく低下させ、種々の合併症を引き起こすことが知られている。現在までに日本で承認されているエイズ治療薬は、ジドブジン（ＡＺＴ）、ジダノシン（ｄｄＩ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）等の核酸系逆転写酵素阻害薬、ネビラピン、エファビレンツ、デラビルジン等の非核酸系逆転写酵素阻害薬、及びインジナビル（クリキシバン）、サキナビル等のプロテアーゼ阻害薬である。これらの薬剤はエイズ治療に有効であるが、ＨＩＶ−１は変異が起こりやすく、治療を行う過程で薬剤耐性株が出現することが１つの問題点となっている。多種の薬剤を併用して用いる療法は、薬剤耐性株の出現を低下させる効果がある。しかし、現在利用可能な治療薬は上記のようにＨＩＶの逆転写酵素とプロテアーゼを標的とするものに限られるため多剤併用療法にも限界がある。従って、新しい分子標的に対するエイズ治療薬の開発が期待されている。
【０００３】
ＨＩＶ−１のアクセサリー遺伝子の一つであるｖｐｒは、９６個のアミノ酸からなり、ウイルス粒子に結合する１５キロダルトン（ｋＤａ）の核タンパク質をコードする。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及びＳＩＶ等の霊長類のレンチウイルスは、何れも非常によく保存されたＶｐｒ様タンパク質を含んでいる。ＨＩＶの複製に関連してＶｐｒタンパク質の多くの生物学的機能が報告されており、例えば、ＨＩＶを含む種々のレトロウイルスＬＴＲの転写を活性化したり、あるいは、Ｖｐｒは細胞周期のＧ2／Ｍ期で停止させる（例えば、非特許文献１及び２参照）。このＶｐｒの機能によりＧ2／Ｍ期で停止した細胞ではウイルスの複製が約２倍に増加することからＨＩＶの増殖に重要な役割を果たすと考えられる。さらに、ｖｐｒを欠損したＳＩＶに感染した霊長類を用いた生体内(in vivo)実験によれば、Ｖｐｒ機能が後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）の発症に重要であることも報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
従って、Ｖｐｒは抗エイズ薬の１つの標的タンパク質であることが提案されている。Ｖｐｒによって誘導される細胞周期停止がテトラサイクリンプロモータによって調節される細胞株が樹立され、この細胞を用いたスクリーニングによりある種のフラボノイド（ケルセチン）がＶｐｒタンパク質機能を阻害することが示された（例えば、非特許文献２参照）。また、出芽酵母でＶｐｒタンパク質を発現させると酵母の増殖を抑制することも報告されている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００５】
一方、ある種の糸状菌から単離された化合物がＶｐｒの細胞増殖停止能を阻害することおよび当該化合物がエイズ治療薬として用いられることが報告されている（例えば、特許文献１参照）。
また、宿主細胞内におけるＨＩＶ−１ ｍＲＮＡの生成において、４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群の生成を増加させ、および／または、２ｋｂフォームのｍＲＮＡ群の生成を減少させる活性を阻害する物質がＨＩＶ−１の増殖を抑制するための医薬組成物として使用できることが報告されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００６】
さらに、ヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染にはＶｐｒタンパク質とインポーチンαの相互作用が重要であり（例えば、非特許文献５および６参照）、Ｖｐｒタンパク質とインポ
ーチンαとの結合を阻害する化合物をスクリーニングすることによりヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害する薬剤が得られることが報告されている（例えば、特許文献３参照）。
しかしながら、ＨＩＶ−１感染を阻害する低分子化合物はまだ十分知られておらず、優れた薬効を有する薬剤の開発が求められていた。
【特許文献１】特開2006-321759号公報
【特許文献２】国際公開第2005/032561号パンフレット
【特許文献３】特開2006-067994号公報
【非特許文献１】Curr. Biol. Vol. 6, pp.1096-1103. (1996)
【非特許文献２】Biochemical and Biophysical Research Communication Vol. 261, No. 2, pp.308-316. (1999)
【非特許文献３】J. Virol. Vol. 69, pp.4807-4813. (1995)
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, pp.2770-2774. (1995)
【非特許文献５】Journal of Virology, May 2007, p. 5284-5293, Vol. 81, No. 10
【非特許文献６】Journal of Virology, March 2005, p. 3557-3564, Vol. 79, No. 6
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＨＩＶの感染を阻害しうる新規なエイズ治療薬または予防薬を見出すことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を行った。その結果、ヘマトキシリン化合物がＶｐｒタンパク質とインポーチンαの相互作用を阻害してVprタンパク質の核移行を妨げること、さらには、HIVウイルスのマクロファージへの感染を阻害することを見出して本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明の第一の側面において、下記式（Ｉ）で表す化合物、その製薬上許容される塩、又はその水和物を有効成分として含有することを特徴とするヒト免疫不全ウイルス感染阻害剤が提供される。
【化１】
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【００１０】
本発明の他の側面において、前記阻害剤を有効成分として含有することを特徴とするエイズ治療薬またはエイズ予防薬が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のHIV感染阻害剤はエイズの発症予防薬又は治療薬として用いることができる。
本発明のHIV感染阻害剤は、ＨＩＶのVprタンパク質の核移行の阻害を介した感染阻害のみならず、Ｖｐｒタンパク質によるウイルス産生細胞のＧ２／Ｍ期停止を解除し、ウイルス産生能を低下させる効果(He, J. et al., (1995) J. Virol. 69, 6705-6711)やウイルス感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞のアポトーシスを阻害することにより、宿主免疫系に感染細胞に
対する細胞障害性リンパ球を誘導する効果(Finkel, T.H. et al., (1995) Nature Med., 1, 129-134)も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の阻害剤として有用な化合物には、下記式（Ｉ）で表す化合物、その製薬上許容される塩、又はその水和物が含まれる。
【化２】
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【００１３】
この化合物はヘマトキシリンとして知られている化合物であるが、ヘマトキシリンの用途は染色剤などが知られているのみであり、医薬としての用途は知られていない。
この化合物は分子内に不斉炭素原子を有するため光学異性体又はジアステレオマーなどの立体異性体が存在するが、本発明の範囲には純粋な形態の立体異性体のほか、任意の立体異性体の混合物またはラセミ体などが包含される。
【００１４】
式（I）で表される化合物は、「Ｖｐｒタンパク質」と「インポーチンα」の相互作用を阻害することにより、Ｖｐｒタンパク質の核移行を妨げ、HIVウイルスの感染を阻害する。したがって、式（I）で表される化合物はHIV感染阻害剤として使用することができる。
なお、「Ｖｐｒタンパク質」とは、ＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質（例えば、Ogawa K., et al., Journal of Virology, 1989, Vol. 63, No.9, p. 4110-4114, 及びGenBank Accession No. M28355、配列番号２）のことをいうが、ＨＩＶ−２、及びＳＩＶ等の霊長類のレンチウイルスにおいて非常によく保存されているＶｐｒ様タンパク質（Ｖｐｒ及び／又はＶｐｘ）を用いてもよい。
また、「インポーチンα」としては、配列番号４のタンパク質が例示される。
【００１５】
用語「製薬上許容される塩」とは、製薬上許容できる無毒の塩基又は酸から調製される塩を意味する。本発明に係る化合物が酸性である場合には、その対応する塩、例えば、カルシウム塩またはマグネシウム塩のようなアルカリまたはアルカリ土類金属塩、またはアンモニウム塩、またはメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリンまたはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンのような有機塩基との塩である。本発明に係る化合物が十分に塩基性である場合には、その酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸またはマレイン酸のような無機酸または有機酸との酸付加塩が挙げられる。
【００１６】
本発明に係る化合物はまた、プロドラッグの形であってもよい。様々な形のプロドラッグ、例えば、生体内加水分解性エステルが、当該技術分野において知られている。生体内での加水分解性誘導体には、特に、ヒト体内で酸化されまたは還元されて親化合物を生じることができる薬学的に許容しうる誘導体、またはヒト体内で加水分解して親化合物を生じるエステルが含まれる。このようなエステルは、試験中の化合物を、例えば試験動物に静脈内投与した後、試験動物の体液を調べることによって同定することができる。ヒドロキシに適した生体内加水分解性エステルには、アセチルが含まれる。
【００１７】
（本発明の医薬組成物）
本発明のHIV感染阻害剤は、医薬として投与する場合、そのまま又は医薬的に許容される無毒性かつ不活性の担体と共に医薬組成物としてヒトを含む哺乳動物に投与される。経口投与のための好適な担体は、緩衝剤、香料等のような微量成分を含有してもよい。医薬組成物中の担体の量は通常は全体の５〜９５％の範囲内にあるが、剤型に応じて大幅に変更することができる。好適な担体としては、スクロース、ペクチン、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、落花生油、オリーブ油、水等を含む。
【００１８】
本発明の医薬組成物を、エイズの感染者（無症候期患者）の予防又はエイズ発症後の患者の治療を目的としてヒトに投与する場合は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤等として経口的に、または注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等として非経口的に投与することができる。また、本発明の阻害剤の有効量を、その剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤等の医薬用添加剤を必要に応じて混合し、医薬組成物とすることができる。注射剤の場合には、適当な担体とともに滅菌処理を行って製剤とする。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、単一の治療剤として又は他の治療剤と組み合わせて用いることができる。本発明のＨＩＶ感染阻害剤と組み合わせることができる薬剤としては、ＨＩＶの逆転写酵素阻害剤やプロテアーゼ阻害剤の他、種々のサイトカイン類などの免疫賦活剤、低分子干渉ＲＮＡを含むリポソーム製剤等も含まれる。これら医薬組成物の投与量は、疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、または体重によっても異なり、最終的には医師の判断に委ねられるが、成人に経口で投与する場合、通常、０．１−１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、１−２０ｍｇ／ｋｇ／日、非経口で投与する場合、通常、０．０１−１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．１−２ｍｇ／ｋｇ／日を投与する。これを１回あるいは数回に分割して投与すればよい。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００２１】
＜タンパク質の発現と精製＞
プラスミドGST-N17C74-GFP-His6およびGST-Importin α-His6, はJournal of Virology, March 2005, p. 3557-3564, Vol. 79, No. 6に記載の配列にポリヒスチジン(His6)タグを付加して構築した。
GST-N17C74-GFP-His6は、インポーチンαと結合するαへリックス領域を含むVprの核移行の最小構成ドメインであるVprのＮ末端から１７〜７４番目のアミノ酸残基によって形成される領域（特開2006-067994号公報：配列番号２の１７〜７４番目のアミノ酸残基）に、GST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）タグと、GFP（Green fluorescence protein）タグと、His6タグの融合タンパク質を発現させるためのプラスミドである。また、GST-Importin α-His6はImportin αと、GSTタグと、ポリヒスチジンタグの融合タンパク質（GST-Impα-His6）を発現させるためのプラスミドである。
【００２２】
上記各プラスミドで大腸菌を形質転換して組換え大腸菌を得た。得られた組換え大腸菌を培養することによって各融合タンパク質を発現させた。得られた融合タンパク質をGSTカラムを用いて精製した。GST-N17C74-GFP-His6をPreScission protease (Amersham Biosciences)で切断して、N17C74-GFP-His6を得た（Vpr-GFP-His6）。また、GST-N17C74-GFP-His6をTEV protease (Invitrogen)で切断して、GST-N17C74を得た。また、GST-Importin α-His6をPreScission protease で切断して、Importin α-His6を得た。
【００２３】
ＨＩＶ−１ゲノムを含む組み込み前複合体が免疫細胞の核膜を通過するためにはＶｐｒタンパク質の核移行が重要であり、このＶｐｒタンパク質の核移行はインポーチンαによって媒介される。そこで、Ｖｐｒタンパク質とインポーチンαの相互作用を測定する系としてELISAアッセイとGSTプルダウンアッセイを構築し、化合物が両タンパク質の相互作用を阻害するかについて調べた。
＜GSTプルダウンアッセイ＞
試験化合物を含むPBS/1 % BSA中で、N17C74-GFP-His6を、あらかじめglutathione-Sepharose 4FF beads (Amersham Pharmacia Biotech)に吸着させたGST-Impα-His6と4℃で1時間反応させた。ビーズをPBS/0.1 % Triton Xで6回洗浄した後、98℃で5分加熱してビーズに結合したタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質をSDS-PAGE (15 % polyacrylamide)で分離し、PVDF膜 (Immobilon; Millipore, Bedford, Mass.) に転写してイムノブロット解析した。膜をPBS/5 % skim milkで1時間ブロッキングした後、抗GFPモノクローナル抗体（MBL）と反応させた。PBS/0.05 % Tween20で洗浄した後、HRP結合抗マウスIgGと反応させた。検出は、SuperSignalTM West Pico Chemiluuminescent substrate (Pierce,
Rockford, Ill)を用いて行った。
【００２４】
＜ELISAアッセイ ＞
50 mM NaHCO3 (pH9.8)に溶解した抗GSTモノクローナル抗体 (SIGMA) をコラーゲンコートマイクロプレート（NUNC）の各ウェルに加え、4℃で6時間コートした。ウェルをPBS/0.1% Tween20で洗浄し、PBS / 5% BSAでブロッキング（30℃、2時間）した後、PBS/5% BSA に溶解したGSTまたはGST-N17C74 を0.5 μg/ウェルで添加し、化合物の存在下または非存在下にて4℃で2時間インキュベートした。ウェルを洗浄した後、PBS/5% BSA に溶解したImportin α-His6 を1.0 μg/ウェルで添加し、4℃で2時間インキュベートした。その後、溶液を除去し、プレートをPBS / 0.1% Tween20で洗浄した後、ワサビペルオキシダーゼ結合抗Hisモノクローナル抗体（Invitrogen）を加えて22℃で1時間インキュベートした。マイクロプレートをPBS / 0.1% Tween20で3回洗浄した後、50μl のtetra methyl benzidine (TMB) (Pierce) を添加した。37℃で30分インキュベートした後、反応停止液を加えて VprとImportin αとの結合の程度をELISA plate reader (WALAC)でOD450を測定することにより調べた。
【００２５】
＜核移行アッセイ＞
In vitroでの核移行アッセイは、ジギトニン処理ＨｅＬａ細胞とVpr-GFP-His6とGST-Importin α-His6を用いて行った。カバーガラス上に８０％コンフルエンスに培養したＨｅＬａ細胞を、核移行解析用バッファー（TB; 20 mM HEPES-KOH(pH 7.3), 110 mM 酢酸カリウム、2 mM 酢酸マグネシウム、5 mM 酢酸ナトリウム、2 mM EGTA、1 mM dithiothreitol）中、４０μｇ／ｍｌジギトニン（Fluka AG)で4℃、５分間処理して透過性にした。試験化合物を含む核移行解析用バッファー中に、それぞれ終濃度で１μＭとなるようにVpr-GFP-His6とGST-Importin α-His6を添加し、４０μｌを試験サンプルとして細胞に添加した。核移行反応を２８℃で、１５分間進行させた後、氷冷した核移行解析用バッファーで細胞を３回洗浄し、４％ホルムアルデヒドを含む核移行解析用バッファー中、氷上で３０分間固定した。グルセロールで包埋して作製した標本について、GFPの蛍光を共焦点レーザースキャニング顕微鏡（ラディアンス２１００、バイオラッド）で観察した。
【００２６】
＜感染アッセイ＞
Journal of Virology, May 2007, p. 5284-5293, Vol. 81, No. 10に記載の方法に従い、ヒト末梢血単核球より単球を単離し、マクロファージに分化させることにより、マクロファージを調製した。
マクロファージ指向性分子クローンpYK-JRCSFを293T細胞にFugene（ロシュ）を用いて導入後、２４時間および４８時間後に上清を回収し、p24ELISA法（HIV-1 p24gag ELISA kit (RETRO TEC; ZeptoMetrix, NY)）によってウイルス量を定量してストックウイルスと
した。
ウイルス感染は、２４ウエルプレート培養したマクロファージにｐ２４量として２ｎｇのウイルスを接種し、37℃で3時間感染させた。その後、3回洗浄し、２４ウエルプレート（Nunc）に移し、１０％仔牛胎児血清を添加したRPMI1640培地（sigma）にて、化合物の存在下、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で培養した。8日後に、上清を採取し、p24ELISA法にてウイルス産生を測定した。
【００２７】
＜細胞傷害アッセイ＞
化合物の細胞傷害性を調べるために、ミトコンドリアの脱水素活性に基づくMTTアッセイを行った。Molt4T細胞株を、最終濃度0.75 mg/mlのMTT存在下、化合物を含む培地中で37℃で2時間インキュベートした。その後、細胞を90 % isopropanol, 10 % TritonX-100および1% HClを含む溶液で溶解し、37℃で24時間インキュベートした。生成したMTT formazanを、マイクロプレートリーダー(Wallac ARVO SX 1420, Perkin-Elmer)を用いて定量した（励起波長570nm、発光波長655nm）。
【００２８】
＜結果＞
２０００個以上の化合物について、ELISAアッセイにてVprとインポーチンαの結合阻害活性を調べたところ、表１のように、４９個の化合物が得られた。それらの化合物をGSTプルダウンアッセイによるＶｐｒタンパク質とインポーチンαの相互作用阻害活性をさらに評価した結果、１１個の化合物が得られた。そして、核移行アッセイにより、２個の化合物がVprの核移行を阻害することがわかった。
【００２９】
【表１】
2009242247.tif 000005
【００３０】
２つの化合物のうちの１つはヘマトキシリンであった。ヘマトキシリンのELISAアッセイとGSTプルダウンアッセイの結果を図１に示す。図１より、ヘマトキシリンがVprとインポーチンαの結合を阻害することがわかる。
【化３】
2009242247.tif 000006
ヘマトキシリン（H化合物）
【００３１】
図２に示されるように、ヘマトキシリンはVprタンパク質の核移行を阻害することが確認された。
【００３２】
また、ヘマトキシリンがHIV感染を実際に阻害するかを感染アッセイで調べた結果、図３に示されるように、ヘマトキシリンは、マクロファージへのHIVの感染を阻害することも確認された。また、図４に示されるようにMolt4T細胞株において細胞障害性が低いことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】（A）GST-N17C74とImportin α-His6を用いたELISAアッセイの結果を示す図（写真）。Impβはポジティブコントロールのインポーチンβであり、Hがヘマトキシリン。（B）GST-Impα-His6とVpr-GFP-Hisを用いたGSTプルダウンアッセイの結果を示す図（写真）。GFPのレーンはGFPをGST-Impα-His6と反応させたものを示す。コントロールとしては反応液に溶媒のみを加えた。その結果、化合物（ヘマトキシリン）は、濃度依存的（１μM、10μM、100μM）にImpαとVprの結合を阻害した。
【図２】ジギトニン処理ＨｅＬａ細胞を用いた核移行アッセイの結果を示す図（写真）。化合物（ヘマトキシリン）は、濃度依存的（１μM、10μM、100μM）にVprの核移行を阻害した。
【図３】マクロファージへの感染アッセイの結果を示す図。横軸は化合物の濃度（μM）を示す。●と■はいずれもヘマトキシリンの結果であり、アッセイに用いたマクロファージの由来が異なる。
【図４】細胞傷害アッセイの結果を示す図。横軸は化合物の濃度（μM）を示す。
【図１】
2009242247.tif 000009
【図２】
2009242247.tif 000010
【図３】
2009242247.tif 000011
【図４】
2009242247.tif 000012
【配列表】
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