(57)【要約】      （修正有）【課題】同じ塩基配列情報を含む核酸断片が、同じ塩基長で効率よく増幅することを可能とする長塩基核酸増幅法を提供する。【解決手段】５’末端にリン酸基を修飾した複数のプライマー２，３を試料核酸１にハイブリダイズさせる工程、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う工程、相互に隣接する前記伸長産物同士をＤＮＡリガーゼを用いて結合させ前記試料核酸に相補的な複製鎖を生成させる工程、前記複製鎖を前記試料核酸から解離させる工程、を含む核酸増幅法。【選択図】図１
2009000035.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
5'末端にリン酸基を具備する複数のプライマーを試料核酸にハイブリダイズさせる第1の工程と、前記試料核酸にハイブリダイズしたプライマーからDNAポリメラーゼを用いて伸長反応を行う第2の工程と、相互に隣接する前記伸長産物同士をDNAリガーゼを用いて結合させ、前記試料核酸に相補的な複製鎖を生成する第3の工程と、前記複製鎖を前記試料核酸から解離させる第4の工程とを含む核酸増幅法。
【請求項２】
前記第1〜第4の工程をこの順で連続して行なった後、前記第4の工程で前記複製鎖を解離させた前記試料核酸を用いて前記第1〜第4の工程を繰り返すことを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅法。
【請求項３】
前記第1の工程と前記第2の工程の後に、前記伸長産物と前記試料核酸を解離する第5の工程を行い、前記第5の工程で前記伸長産物を解離させた前記試料核酸を用いて、前記第1、第2、第5の工程を繰り返した後、前記第1〜第3の工程を行うことを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅法。
【請求項４】
前記複数のプライマーは前記試料核酸特異的に設計されたものではないランダムプライマーであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
【請求項５】
前記DNAポリメラーゼは、鎖置換能を有さないことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
【請求項６】
前記DNAリガーゼは、平滑末端結合能を有さないことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
【請求項７】
前記DNAリガーゼは、耐熱性DNAリガーゼであることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
【請求項８】
5’末端にリン酸基を具備する複数のランダムプライマーからなるプライマーセット。
【請求項９】
5’末端にリン酸基を具備する複数のランダムプライマーと、鎖置換能を有しないDNAポリメラーゼと、平滑末端結合能を有さない耐熱性DNAリガーゼを含むことを特徴とする、核酸増幅用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム解析において有用な微量試料核酸を複製する方法に関し、特に同じ塩基配列情報を含む長塩基核酸断片が同じ塩基長で効率よく増幅される方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の進歩は、DNAもしくはRNAを取り扱う技術の発展と共に語られる。1985年、Kary Banks MullisらよってPCR (Polymerase Chain Reaction) 法 (非特許文献1) が見いだされ、分子生物学研究の分野に導入された。PCR法の出現によって、研究者らはDNAの鋳型の特定部位を指数関数的に増幅できるようになり、最終的にはウイルス同定から転写調節にいたるまで多くの研究分野に革命をもたらした。
【０００３】
しかしながら、ゲノムワイドなスケールでの分析が必要とされる今日では、従来のPCR法の技術だけでは不十分になってきている。例えば、遺伝子タイピングは病理研究の分野で日常的に用いられているが、この分野では遺伝子材料を十分量入手することが困難なため試験をするのに限界があり、研究成果の獲得に影響を及ぼすという問題が生じている。遺伝子タイピングに関わらず、創薬や機能ゲノミクスなど分子レベルの解析が行われる多くの分野で遺伝子材料の維持が研究成果の制約となっているが、従来のPCR法では標的となる配列の断片を増幅することはできても、その断片は全ゲノムを適切に表現できていないためこの問題を解決できていない。
【０００４】
そこで、上記問題点を解決するために全ゲノム増幅を可能にする革新的な技法が1990年初期より開発されている。例えば、PEP（Primer Extension Preamplification）法 (非特許文献2)、 DOP（Degenerate Oligonucleotide-Primed）PCR法 (非特許文献3)、TPCR（Tagged PCR）法 (非特許文献4) は、初期に開発された全ゲノム増幅法である。いずれもアプローチとしては有望であることが証明されているが、増幅断片が比較的短い点（約500塩基長）や、鋳型の塩基配列情報に対して、得られる増幅産物の塩基配列情報に偏りがある点が問題となっていた。
【０００５】
その後、Genome Plex WGA (whole genome amplification) 法 (特許文献1)やMDA (multiple displacement Amplification)法 (非特許文献5)等の方法が開発された。これらの方法は初期の方法に比べて増幅塩基長が増大し、得られる増幅産物が再現する塩基配列情報の偏りも低減されたが、長さの異なる複数の増幅断片に同じ配列情報が共有されてしまう。このため、上記の全ゲノム増幅法による増幅産物を用いても増幅断片におけるの塩基配列情報の冗長性の差が解析結果へ影響する可能性が懸念されおり、これを解決する核酸の全ゲノム増幅法が求められている。
【０００６】
【特許文献１】特許文献1：US2003/0143599
【非特許文献１】非特許文献1：R. K. Saiki, et al., Science, 239, 487-491 (1988)
【非特許文献２】非特許文献2：KangPu Xu, et. al., Human Reproduction, 8 2206-2210 (1993))
【非特許文献３】非特許文献3：Hakan Telenius et.al. Genomics, 13, 718-725 (1992))
【非特許文献４】非特許文献4：Dietmar Grothues, et. al., Nucl. Acids Res. 21, 1321-1322 (1993)
【非特許文献５】非特許文献5：David L. Barker, et. al., Genome Res. 14, 901-907 (2004))
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の主な目的は、従来の全ゲノム増幅法の問題点を解決するために、同じ塩基配列情報を含む核酸断片の長さが常に同じとなる増幅を可能とする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、配列が特定されていない領域について、塩基配列情報に偏りがなく、長塩基の増幅産物が得られる核酸増幅法を開発した。この方法では、用いる複数のランダムプライマー全ての5'末端をリン酸基修飾することと、DNAポリメラーゼとDNAリガーゼを協調して反応させることで、未知の領域に対して同じ長さの核酸断片中に同じ塩基配列情報を含む長塩基核酸断片の増幅が可能となる。
【０００９】
すなわち、本発明は、5'末端にリン酸基を具備する複数のプライマーを試料核酸にハイブリダイズさせる第1の工程と、前記試料核酸にハイブリダイズしたプライマーからDNAポリメラーゼを用いて伸長反応を行う第2の工程と、相互に隣接する前記伸長産物同士をDNAリガーゼを用いて結合させ、前記試料核酸に相補的な複製鎖を生成する第3の工程と、前記複製鎖を前記試料核酸から解離させる第4の工程とを含む核酸増幅法に関する。
【００１０】
ある実施形態において、本発明の核酸増幅法は、前記第1〜第4の工程をこの順で連続して行なった後、前記第1の工程を行う。
【００１１】
別な実施形態において、本発明の核酸増幅法は、前記第1の工程と前記第2の工程の後に、前記伸長産物と前記試料核酸を解離する第5の工程を行い、前記第5の工程で前記伸長産物を解離させた前記試料核酸を用いて、前記第1、第2、第5の工程を繰り返した後、前記第1〜第3の工程を行う。
【００１２】
本発明で用いられる複数のプライマーは、前記試料核酸特異的に設計されたものではないランダムプライマーである。
【００１３】
また、本発明で用いられるDNAポリメラーゼは鎖置換能を有さないことが好ましく、またDNAリガーゼは、平滑末端結合能を有さないDNAリガーゼであり、耐熱性であることが好ましい。
【００１４】
本発明はまた、本発明の核酸増幅法に用いられる、5’末端にリン酸基を具備する複数のランダムプライマーからなるプライマーセットも提供する。
【００１５】
さらに本発明は、本発明の核酸増幅法に用いられる、5’末端にリン酸基を具備する複数のランダムプライマーと、鎖置換能を有しないDNAポリメラーゼと、平滑末端結合能を有さない耐熱性DNAリガーゼを含む核酸増幅用キットも提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により同一塩基配列情報を含む長塩基核酸断片の増幅が可能となり、通常のゲノムサンプルと同様の解析を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の第1の発明フローを図1に示す。本発明は長塩基核酸断片（例えば、通常のPCR法では増幅困難な10000塩基長以上、好ましくは100000塩基長以上の核酸）を増幅するための方法であって、一本鎖試料核酸1の塩基配列に対して相補的な配列を有し、かつ5'末端がリン酸基修飾されているプライマー2、3が一本鎖試料核酸1にハイブリダイズする第1の工程と、第1の工程でハイブリダイズしたプライマーからDNAポリメラーゼを用いて伸長反応を行う第2の工程と、第2の工程で得られた隣接した伸長産物4、5をDNAリガーゼで結合する第3の工程と、一本鎖試料核酸1とハイブリダイズしている複製鎖6を熱変性により解離させる第4の工程とを有することを特徴とする。
【００１８】
プライマーからの伸長産物をDNAリガーゼで結合することによって同じ塩基配列情報を含む核酸断片の長さにばらつきが生じず、かつDNAポリメラーゼでの伸長限界塩基長以上の核酸断片を得ることが可能となる。
【００１９】
本発明の第2の発明フローを図2に示す。本発明は長塩基核酸断片を増幅するための方法であって、一本鎖試料核酸1の塩基配列に対して相補的な配列を有し、かつ5'末端がリン酸修飾されているプライマー2、3が、一本鎖試料核酸1にハイブリダイズする第1の工程と、第1の工程でハイブリダイズしたプライマーからDNAポリメラーゼを用いて伸長反応を行う第2の工程と、第2の工程で得られた隣接した伸長産物4、5をDNAリガーゼで結合する第3の工程と、一本鎖試料核酸1とハイブリダイズしている複製鎖6を熱変性により解離させる第4の工程とを有し、第4の工程で得られた一本鎖試料核酸1を鋳型として用いて第1、第2、第3、第4の工程を連続して繰り返すことを特徴とする遺伝子増幅方法に関する。
【００２０】
本発明の第3の発明フローを図3に示す。本発明は長塩基核酸断片を増幅するための方法であって、一本鎖試料核酸1および5'末端がリン酸修飾されているプライマー2、3が、一本鎖試料核酸1にハイブリダイズする第1の工程と、第1の工程でハイブリダイズしたプライマーからDNAポリメラーゼを用いて伸長反応を行う第2の工程と、第2の工程で得られた隣接した伸長産物4、5を一本鎖試料核酸1から解離させる第5の工程を連続して繰り返し、その後、隣接した伸長産物4、5をDNAリガーゼで結合する第3の工程を有することを特徴とする遺伝子増幅方法に関する。
【００２１】
本発明の第2、3のフローである各工程を連続して繰り返す方法を用いることによって、従来のPCR法で増幅可能な鋳型量と同程度ほどの試料核酸濃度でも、数百倍以上に増幅することができるため、微量の試料核酸を複製することが可能となる。また、第3のフローにおいて、最終産物を一本鎖試料核酸にする必要がある場合は、一本鎖試料核酸1とハイブリダイズしている複製鎖6を熱変性により解離させる工程を加えればよい。
【００２２】
本発明の第1、第2、第3の発明フローにおいて、第1の工程で用いるプライマーの数は、2つ以上の複数であって、フォワード及びリバースは問わない。また、鋳型の配列が特定できない場合は複数種類のランダムプライマーを用いて反応することによって、鋳型特異的な配列を持つプライマーを用意することなく未知配列の長塩基核酸断片の増幅が可能となる。
【００２３】
なお、ここで言うランダムプライマーとは、通常6〜30量体のヌクレオチドからなり、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）を無作為の配列に結合させた合成プライマーであって、鋳型特異的に設計されたものではない。このランダムプライマーのいずれかが、第1、第2、第3の発明フローにおいて反応する際に、一本鎖試料核酸に相補的に結合して二本鎖構造を形成し、鋳型複製の開始点となる。なお、ランダムプライマーとしては、通常用いられているものを選択すればよく、例えばオペロン社から市販されている10量体ランダムプライマーや、和光純薬社から市販されているＤＮＡオリゴマーセット（12量体）等を挙げることができる。
【００２４】
本発明の第1、第2、第3の発明フローにおいて、第2の工程で用いるDNAポリメラーゼは、耐熱性を有し、かつ鎖置換能を有さないものが好ましい。そのようなDNAポリメラーゼとしては、例えば、Pfu DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼI、ΔTth DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、Kod DNAポリメラーゼ、Pyrobest（登録商標） DNAポリメラーゼ等を挙げることができる。
【００２５】
本発明の第1、第2、第3の発明フローにおいて、第3の工程で用いるDNAリガーゼは、平滑末端を結合せず、かつ耐熱性を有するものが好ましい。これは、核酸断片同士が非特異的にDNAリガーゼにより結合されるのを防ぐためである。また耐熱性を有する必要性については、本発明では比較的塩基長の長い核酸（例えば、通常PCR法で増幅可能な10000塩基以上、好ましくは100000塩基以上）を増幅するため、比較的高温（60-90℃程度）での反応が必要になるからである。そのようなDNAリガーゼとしては、例えば、Pfu DNAリガーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Rma DNAリガーゼ、Tsc DNAリガーゼ、E.coli DNAリガーゼ等を挙げることができる。
【００２６】
本発明においては、第1、第2、第3のフローに関して温度サイクル反応及び恒温反応のいずれを用いても良い。また、本発明の第1、第2、第3の発明フローにおいて、鋳型となる核酸配列はRNA配列であってもよく、DNAは一本鎖、二本鎖のいずれも使用できる。なお、二本鎖DNAが鋳型となる場合は、二本鎖DNAを一本鎖に変性する前処理工程の後に本発明の方法を行えばよい。
【実施例】
【００２７】
以下に、本発明の実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
【００２８】
〔実施例1〕
1.実施例1で使用したオリゴヌクレオチドプライマー。
プライマー1：
5'-AACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCT‐3' (配列番号1)
プライマー2：
5'-ACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCG-3' (配列番号2)
プライマー3：
5'-AAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTA-3' (配列番号3)
【００２９】
本発明の第1、2の発明フローに従い、DNAポリメラーゼとDNAリガーゼを協調させて伸長反応と結合反応を同一温度サイクルで行うことによって（以下協調反応）長塩基核酸断片の作製が可能かどうかを確認するために、協調反応により得られた増幅産物を電気泳動により解析した。
【００３０】
鋳型はpET21aベクターDNA（TAKARA）を制限酵素HpaIで処理したもの（濃度：25ng/μL)を用い、上記1.に記載のプライマーを増幅時のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した。プライマー1はpET21aベクターDNAのHpaI切断部位を1塩基目とした時の1〜30塩基と相補的な配列をもつフォワードプライマー、プライマー2は1801〜1830塩基と相補的な配列をもつフォワードプライマー、プライマー3は、3601〜3630塩基と相補的な配列をもつフォワードプライマーである。プライマー1、2、3はいずれも5'末端にリン酸基が標識されている。
【００３１】
増幅反応組成としては、DNAポリメラーゼにはPfu Ultra Hih-Fidelity DNAポリメラーゼ（STRATAGENE）、DNAリガーゼ及び反応バッファーにはPfu DNAリガーゼ（STRATAGENE）及び添付のバッファーを用いた。使用した酵素の使用量は各酵素のマニュアルを、dNTP、プライマー量はPfu DNAポリメラーゼのマニュアルに従った。
【００３２】
図4に本発明による反応フローを示す。試料核酸、プライマー、酵素、試薬等を含んでいる反応液7を、協調反応装置8により95℃ 5分間で熱変性し、95℃ 30秒、37℃ 30秒、70℃ 4分、95℃ 30秒、70℃ 10分の反応を24サイクル行った。得られた反応産物を1.5％アガロースゲルにて電気泳動を行い、アガロースゲルをSYBR Gold（Molecular Probes）にて染色して反応産物を検出装置9で検出した。協調反応装置8にはGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を、検出装置9にはFluorImager595（GE Healthcare）を用いた。
【００３３】
本発明の第1、2の発明フローによる電気泳動結果を図5の電気泳動イメージ10に示す。レーン1はHi-Lo DNAマーカー（アベテック）、レーン2は100bp ラダー（Invitrogen）、レーン3は上記反応産物、及びレーン4は鋳型を添加せずに同様の反応を行ったネガティブコントロールを示す。その結果、レーン3では5443塩基長からなる鋳型と同様の位置にバンド11が確認されたがレーン4ではバンドが確認されなかった。また、レーン3では約1800塩基長からなる未結合の伸長産物バンド12も確認された。これらの結果は、本発明の第1、2の方法において、協調反応を行った場合目的の増幅断片が得られることを示し、本発明により長塩基核酸断片の増幅が可能であることが確認できた。
【００３４】
〔実施例2〕
1.実施例2で使用したオリゴヌクレオチドプライマー。
プライマー4：（AE07）
5'-GGAAAGCGTC‐3' (配列番号4)
プライマー5：（AA12）
5'-GGACCTCTTG-3' (配列番号5)
プライマー6：（AZ17）
5'-CACGCAGATG‐3' (配列番号6)
プライマー7：（AA20）
5'-TTGCCTTCGG-3' (配列番号7)
プライマー8：（AE02）
5'-TCGTTCACCC-3' (配列番号8)
【００３５】
本発明の第1、2の発明フローにおいて、プライマーにランダムプライマーを用いた場合も同様に目的の増幅産物が得られるかどうかを確認するため、反応後の産物を電気泳動により解析した。
【００３６】
鋳型はpET21aベクターDNA（TAKARA）を制限酵素HpaIで処理したもの（濃度：25ng/μL)を用い、上記1.に記載のプライマーを増幅時のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した。ランダムプライマーはオペロン社から市販されているプライマー（AA12、AA20、AE02、AE07、AZ17）5種類をT4 Polynucleotide Kinase (TAKARA)を用いて5'末端をリン酸基修飾したものを用いた。リン酸基修飾反応のプロトコルは酵素のマニュアルに従った。
【００３７】
増幅反応組成としては、DNAポリメラーゼにはPfu DNAポリメラーゼ（STRATAGENE）、DNAリガーゼにはPfu DNAリガーゼ（STRATAGENE）及び反応バッファーにはPfu DNAリガーゼ（STRATAGENE）及び添付のバッファーを用いた。使用した酵素の使用量は各酵素のマニュアルを、dNTP、プライマー量はPfu DNAポリメラーゼのマニュアルに従った。
【００３８】
図4に本発明による反応フローを示す。試料核酸、プライマー、酵素、試薬等を含んでいる反応液7を、協調反応装置8により95℃ 5分間で熱変性し、95℃ 30秒、37℃ 30秒、70℃ 2分、95℃ 30秒、70℃ 10分の反応を24サイクル行った。得られた反応産物を1.5％アガロースゲルにて電気泳動を行い、アガロースゲルをSYBR Gold（Molecular Probes）にて染色して反応産物を検出装置9で検出した。協調反応装置8にはGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を、検出装置9にはFluorImager595（GE Healthcare）を用いた。
【００３９】
実施例2の電気泳動結果を図6の電気泳動イメージ13に示す。レーン1はHi-Lo DNAマーカー（アベテック）、レーン2は100bp ラダー（Invitrogen）、レーン3は上記反応産物、及びレーン4は鋳型を添加せずに同様の反応を行ったネガティブコントロールを示す。その結果、レーン3では鋳型の塩基長と同等の5443塩基長の位置にバンド14が確認されたが、レーン4ではバンドが確認されなかった。この結果は、本発明の第1、2の方法において、ランダムプライマーを用いた場合も目的の増幅断片が得られることを示し、本発明により非特異領域の長塩基核酸断片の増幅が可能であることが確認できた。
【００４０】
〔実施例3〕
1．実施例3で使用したオリゴヌクレオチドプライマー。
プライマー1：
5'-AACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCT‐3' (配列番号1)
プライマー2：
5'-ACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCG-3' (配列番号2)
プライマー3：
5'-AAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTA-3' (配列番号3)
【００４１】
本発明の第3の発明フローにおいて、DNAポリメラーゼとDNAリガーゼを用いた長塩基核酸断片の作製が可能かどうかを確認するために、反応産物を電気泳動により解析した。
【００４２】
鋳型はpET21aベクターDNA（TAKARA）を制限酵素HpaIで処理したもの（濃度：25ng/μL)を用い、上記1.に記載のプライマーを増幅時のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した。プライマー1はpET21aベクターDNAのHpaI切断部位を1塩基目とした時の1〜30塩基と相補的な配列をもつフォワードプライマー、プライマー2は1801〜1830塩基と相補的な配列をもつフォワードプライマー、プライマー3は、3601〜3630塩基と相補的な配列をもつフォワードプライマーである。プライマー1、2、3はいずれも5'末端にリン酸基が標識されている。
【００４３】
増幅反応組成としては、DNAポリメラーゼにはPfu DNAポリメラーゼ（STRATAGENE）、DNAリガーゼ及び反応バッファーにはPfu DNAリガーゼ（STRATANEGE）及び添付のバッファーを用いた。使用した酵素の使用量は各酵素のマニュアルを、dNTP、プライマー量はPfu DNAポリメラーゼのマニュアルに従った。
【００４４】
図7に本発明による反応フローを示す。試料核酸、プライマー、酵素、試薬等を含んでいる反応液15を、伸長/結合反応装置16により、95℃ 5分間で熱変性、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 4分の反応を30サイクル行って伸長反応を行い、その後70℃で4時間反応して伸長産物の結合反応を行った。得られた反応産物を1.5％アガロースゲルにて電気泳動を行い、アガロースゲルをSYBR Gold（Molecular Probes）で染色して反応産物を検出装置17で検出した。伸長/結合反応装置16にはGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を、検出装置17にはFluorImager595（GE Healthcare）を用いた。
【００４５】
実施例3の電気泳動結果を図8の電気泳動イメージ18に示す。レーン1は100bp ラダー（Invitrogen）、レーン2は鋳型のみ、レーン3は70℃ 4時間の結合反応を行わなかった反応産物、レーン4は結合反応を行った反応産物を泳動した結果を示す。その結果、レーン2の長さ5443塩基長からなる鋳型のバンド19と同じ位置に、レーン3ではバンド20、レーン4ではバンド22が確認された。バンド20と22を比較すると、バンド22の反応産物が明らかに増加している。また、レーン3、4において、いずれも未結合の伸長産物1800塩基長と1843塩基長からなる2本のバンド21、23が確認された。以上の結果は、本発明の第3のフローにより目的の増幅断片が得られることを示し、本発明により長塩基核酸断片の増幅が可能であることが確認できた。
【００４６】
〔実施例4〕
1.実施例4で使用したオリゴヌクレオチドプライマー。
プライマー4：（AE07）
5'-GGAAAGCGTC‐3' (配列番号4)
プライマー5：（AA12）
5'-GGACCTCTTG-3' (配列番号5)
プライマー6：（AZ17）
5'-CACGCAGATG‐3' (配列番号6)
プライマー7：（AA20）
5'-TTGCCTTCGG-3' (配列番号7)
プライマー8：（AE02）
5'-TCGTTCACCC-3' (配列番号8)
【００４７】
本発明の第3の発明フローにおいて、プライマーにランダムプライマーを用いた場合も同様に目的の増幅産物が得られるかどうかを確認するため、反応後の産物を電気泳動により解析した。
【００４８】
鋳型はpET21aベクターDNA（TAKARA）を制限酵素HpaIで処理したもの（濃度：25ng/μL)を用い、上記1.に記載のプライマーを増幅時のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した。ランダムプライマーはオペロン社から市販されているプライマー（AA12、AA20、AE02、AE07、AZ17）5種類をT4 Polynucleotide Kinase (TAKARA)を用いて5'末端をリン酸基修飾したものを用いた。リン酸基修飾反応のプロトコルは酵素のマニュアルに従った。
【００４９】
増幅反応組成としては、DNAポリメラーゼにはPfu DNAポリメラーゼ（STRATAGENE）、DNAリガーゼにはPfu DNAリガーゼ（STRATANEGE）、バッファーにはPfu cloneバッファー（200mM Tris-HCl (pH8.8)、20mM MgSO4、100mM KCl、100mM (NH4)2SO4、1％ TritonX-100、1mg/mL nuclease-free BSA、5mmol ATP)を用いた。使用した酵素の使用量は各酵素のマニュアルを、dNTP、プライマー量はPfu DNAポリメラーゼのマニュアルに従った。
【００５０】
図7に本発明による反応フローを示す。試料核酸、プライマー、酵素、試薬等を含んでいる反応液15を、伸長/結合反応装置16により、95℃ 5分間で熱変性、95℃ 30秒、37℃ 30秒、72℃ 2分の反応を30サイクル行って伸長反応を行い、その後70℃で4時間反応して伸長産物の結合反応を行った。得られた反応産物を1.5％アガロースゲルにて電気泳動を行い、アガロースゲルをSYBR Gold（Molecular Probes）で染色して反応産物を検出装置17で検出した。伸長/結合反応装置16にはGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を、検出装置17にはFluorImager595（GE Healthcare）を用いた。実施例4の電気泳動結果を図9の電気泳動イメージ24に示す。レーン1はHi-Lo DNAマーカー（アベテック）、レーン2は100bp ラダー（Invitrogen）、レーン3は上記反応産物、及びレーン4は鋳型を添加せずに同様の反応を行ったネガティブコントロールを示す。その結果、レーン3では鋳型の塩基長と同等の5443塩基長の位置にバンド25が確認されが、レーン4ではバンドが確認されなかった。この結果は、本発明の第3の方法において、ランダムプライマーを用いて目的の増幅断片が得られることを示し、本発明を用いて非特異領域の長塩基核酸断片の増幅が可能であることが確認できた。
【００５１】
〔実施例5〕
1.実施例5で使用したオリゴヌクレオチドプライマー。
プライマー2：
5'-ACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCG-3' (配列番号2)
プライマー9：
5'-TAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTT-3' (配列番号9)
2.実施例5で行ったPCR反応組成
KOD Dash buf（×1）、鋳型（実施例2反応産物を5ul、pET21a/HpaIを10ng）、primers （10pmol each）、dNTPs （0.2mM）、enzyme （1.88U）
【００５２】
本発明の第1、2の発明フローにおいて得られた反応産物を鋳型として用いた反応結果と、通常の試料核酸を用いた反応結果が同等かを確認するために、上記2つをPCR法の鋳型に用いて得られた反応産物を電気泳動にて解析した。
【００５３】
鋳型は実施例2で得られた反応産物とpET21aベクターDNA（TAKARA）を制限酵素HpaIで処理したもの（濃度：10ng/μL)を用い、上記1.に記載のプライマーを増幅時のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した。プライマー2はpET21aベクターDNAのHpaI切断部位を1塩基目とした時の1801〜1830塩基と相補的な配列をもつフォワードプライマー、プライマー9は3601〜3630塩基と相補的な配列をもつリバースプライマである。プライマー2、9はいずれも5'末端にリン酸基が標識されている。
【００５４】
PCR組成としては、上記2.に示した組成を用い、DNAポリメラーゼにはKOD Dash DNAポリメラーゼ（TOYOBO）を用いた。
【００５５】
図10に本実施例の反応フローを示す。鋳型、ランダムプライマー、酵素、試薬等を含んでいる反応液26を、PCR装置27により94℃ 4分間で熱変性し、94℃ 30秒、60℃ 2秒、74℃ 30秒の反応を24サイクル行った。得られた反応産物を1.5％アガロースゲルにて電気泳動を行い、アガロースゲルをSYBR Gold（Molecular Probes）にて染色して反応産物を検出装置28で検出した。PCR装置27にはGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を、検出装置28にはFluorImager595（GE Healthcare）を用いた。実施例5の電気泳動結果を図11の電気泳動イメージ29に示す。レーン1は100bp ラダー（Invitrogen）、レーン2はpET21aベクターDNA（TAKARA）を制限酵素HpaIで処理したものを鋳型として用いた反応産物、レーン3は実施例2の反応産物を鋳型として用いた同様の反応産物、レーン4は鋳型を添加せずに同様の反応を行ったネガティブコントロールを示す。その結果、レーン2およびレーン3では目的の反応産物の位置である1800塩基長にバンド30、バンド31が確認された。以上の結果は、本発明の方法において得られた反応産物が、通常の試料核酸を用いた反応により得られる結果と同等であることを示し、本発明を用いて試料核酸の複製が可能であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によれば、未知の領域に対して、同一塩基配列情報を含む長塩基核酸断片の増幅が可能となる。したがって、本発明は、全ゲノム解析を必要とするライフサイエンス分野等において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図1は、本発明の第1の発明フローを示した図である。
【図２】図2は、本発明の第2の発明フローを示した図である。
【図３】図3は、本発明の第3の発明フローを示した図である。
【図４】図4は、本発明による反応フローを示した図である。
【図５】図5は、pET21aベクターDNAを鋳型として用いて、本発明の第1、2の発明フローよる増幅産物を電気泳動で解析した結果を示した図である。
【図６】図6は、pET21aベクターDNAを鋳型として用いて、ランダムプライマーを用いた本発明の第1、2の発明フローによる増幅産物を電気泳動で解析した結果を示した図である。
【図７】図7は、本発明法による反応フローを示した図である。
【図８】図8は、pET21aベクターDNAを鋳型として用いて、本発明の第3の発明フローよる増幅産物を電気泳動で解析した結果を示した図である。
【図９】図9は、pET21aベクターDNAを鋳型として用いて、ランダムプライマーを用いた本発明の第3の発明フローによる増幅産物を電気泳動で解析した結果を示した図である。
【図１０】図10は、本発明法による反応フローを示した図である。
【図１１】図11は、pET21aベクターDNAおよび実施例2で得られた反応産物を鋳型として用いて、PCR産物を電気泳動で解析した結果を示した図である。
【符号の説明】
【００５８】
1…試料核酸
2、3…プライマー
4…プライマー2からの伸長産物
5…プライマー3からの伸長産物
6…DNAリガーゼにより結合された複製鎖
7、15…試料核酸、プライマー、酵素、試薬反応液等を含む反応液
8…協調反応装置
9、17、28…検出装置
10、13、18、24、29…電気泳動イメージ
11、12、14、19、20、21、22、23、25、30、31…増幅バンド
16…伸長/結合反応装置
26…鋳型、プライマー、酵素、試薬反応液等を含む反応液
27…PCR装置
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
配列番号1 ‐人工配列の説明：本発明の増幅法で使用する、pET21aベクターDNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号2 ‐人工配列の説明：本発明の増幅法で使用する、pET21aベクターDNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号3 ‐人工配列の説明：本発明の増幅法で使用する、pET21aベクターDNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号4 ‐人工配列の説明：本発明の増幅法で使用するランダムオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号5 ‐人工配列の説明：本発明の増幅法で使用するランダムオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号6 ‐人工配列の説明：本発明の増幅法で使用するランダムオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号7 ‐人工配列の説明：本発明の増幅法で使用するランダムオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号8 ‐人工配列の説明：本発明の増幅法で使用するランダムオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号9 ‐人工配列の説明：本発明の増幅法で使用する、pET21aベクターDNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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