(57)【要約】【課題】物質間の相互作用を高感度に検出可能であると共に、安定に繰り返し使用することができるバイオセンサーを提供する。【解決手段】表面プラズモン共鳴に基づいて物質間の相互作用を検出するバイオセンサーにおいて、前記基板が、第一の金属元素としてのＡｇを９０モル％以上９９．９５モル％未満と、第二の金属元素としてのＡｕ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｂｉ、Ｎｄ、Ｔｉ、Ｓｂから選ばれる少なくとも１種を０．０５モル％以上１０モル％未満と、を含む金属薄膜を備えたバイオセンサー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴に基づいて生理活性物質の相互作用を検出するバイオセンサーにおいて、
第一の金属元素としてのＡｇを９０モル％以上９９．９５モル％未満と、
第二の金属元素としてのＡｕ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｂｉ、Ｎｄ、Ｔｉ、Ｓｂから選ばれる少なくとも１種を０．０５モル％以上１０モル％未満と、
を含む金属薄膜を備えたバイオセンサー。
【請求項２】
前記第二の金属元素が、Ａｕ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｂｉ及びＮｄのうち少なくとも２種である請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項３】
金属酸化物及び金属窒化物の少なくとも一方による保護層を、前記金属薄膜上に配置した請求項１又は請求項２記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記金属薄膜上に、アミノ基及び水酸基の少なくとも一方を有するアルカンチオール層を備えた請求項１〜請求項３のいずれか１項記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記金属薄膜が、プラスティック基板上に配置されている請求項１〜請求項４のいずれか１項記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記金属薄膜及び、センシング物質として該金属薄膜の表面に配置された前記生理活性物質を有する検出部と、
前記検出部に候補物質を供給する供給部と、
前記センシング物質と前記候補物質との結合の有無に基づいて、該候補物質がスクリーニングの目的物質か否かを判定するスクリーニング判定部と、
を備えた請求項１〜請求項５のいずれか１項記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われている。中でも、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術が好ましく用いられている。
ＳＰＲ測定技術は、チップの金属薄膜に全反射条件で入射させた光のうち金属薄膜中及びその外側まで染み出す近接場光が、金属薄膜上に誘起される表面プラズモンに吸収されることにより、反射光中にこれに対応した吸収ピークが出現する現象を利用している。金属薄膜上に接する有機機能膜に生体物質等が結合すると周辺の場の誘電率が変化する。この結果、表面プラズモンを励起できる光の波数ベクトルがずれ、反射光中に現れる吸収ピークの反射角度のシフト又は一定反射角度における反射光量の変化が生じることになる。ＳＰＲ測定技術は、これを測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法であり、金膜上に固定した生理活性物質と他の検体物質間の特異的な相互作用（結合）を高感度に検出する方法として知られている。
【０００３】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属薄膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
このような測定チップとしては、例えば、銅、銀、アルミニウム及び金からなる群より選ばれる自由電子金属の膜と、カルボキシメチル変性デキストラン等のヒドロゲルとを備えたものが知られている（例えば、特許文献１）。
このよう測定チップでは、アミノ基を含む生理活性物質を３次元的に固定化可能であるため、バイオセンサーの検出表面として優れた性能を示す。
【０００４】
一方、ＳＰＲ法は、前述したように表面プラズモンによる光の共鳴吸収を原理に用いる為、電気伝導性の高い、すなわち自由電子濃度の高い金属薄膜が、好ましく用いられている。特定角度の入射光のうち近接場光として金属薄膜中および近傍に染み出した光のうち、境界条件から、金属薄膜表面上を伝播する成分の表面プラズモンによる吸収は、膜の電気伝導性が高いほど大きくかつシャープな共鳴吸収線となって反射光中に現れるため、微小な角度変化に対しても大きな光量変化となり検出感度を上げることができる。このシャープさの指標としては、吸収線の半値幅を用いることができる。
【０００５】
電気伝導性の高い金属としては、金、銀、銅、プラチナ、アルミニウム等が知られているおり、中でも銀は、最も電気伝導性が高い金属として知られている。
しかしながら銀は、空気中の酸素や水に対し活性な物質であり、これらの影響で酸化しやすく安定性が保てないという性質がある。このため、実験室レベルでは用いることがあっても、創薬スクリーニング用途など産業用、応用としては、不向きと考えられており、一般には、銀ほどの電気伝導性ではないため感度は劣るものの酸化に対して比較的安定な金膜が用いられてきた。
【０００６】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、物質間の相互作用を高感度に検出可能であると共に、安定に繰り返し使用することができるバイオセンサーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下のとおりである。
＜１＞  表面プラズモン共鳴に基づいて生理活性物質の相互作用を検出するバイオセンサーにおいて、第一の金属元素としてのＡｇを９０モル％以上９９．９５モル％未満と、第二の金属元素としてのＡｕ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｂｉ、Ｎｄ、Ｔｉ、Ｓｂから選ばれる少なくとも１種を０．０５モル％以上１０モル％未満と、を含む金属薄膜を備えたバイオセンサー。
＜２＞  前記第二の金属元素が、Ａｕ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｂｉ及びＮｄのうち少なくとも２種である＜１＞記載のバイオセンサー。
＜３＞  金属酸化物及び金属窒化物の少なくとも一方による保護層を、前記金属薄膜上に配置した＜１＞又は＜２＞記載のバイオセンサー。
【０００９】
＜４＞  前記金属薄膜上に、アミノ基及び水酸基の少なくとも一方を有するアルカンチオール層を備えた＜１＞〜＜３＞のいずれか記載のバイオセンサー。
＜５＞  前記金属薄膜が、プラスティック基板上に配置されている＜１＞〜＜４＞のいずれか記載のバイオセンサー。
＜６＞  前記金属薄膜及び、センシング物質として該金属薄膜の表面に配置された前記生理活性物質を有する検出部と、前記検出部に候補物質を供給する供給部と、前記センシング物質と前記候補物質との結合の有無に基づいて、該候補物質がスクリーニングの目的物質か否かを判定するスクリーニング判定部と、を備えた＜１＞〜＜５＞のいずれか記載のバイオセンサー。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、高感度に物質間の相互作用を検出可能であると共に、安定に繰り返し使用することができるバイオセンサーを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のバイオセンサーは、表面プラズモン共鳴に基づいて基板上の物質間の相互作用を検出するバイオセンサーにおいて、前記基板が、第一の金属元素としてのＡｇを９０モル％以上９９．９５モル％未満と、第二の金属元素としてのＡｕ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｂｉ、Ｎｄ、Ｔｉ、Ｓｂから選ばれる少なくとも１種を０．０５モル％以上１０モル％未満と、を含む金属薄膜を備えたものである。
本発明では、第一の金属元素として電気導電性の高いＡｇに、Ａｕ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｂｉ、Ｎｄ、Ｔｉ、Ｓｂから選ばれる少なくとも１種を微量に含んだ金属薄膜とすることにより、Ａｇのみで得られたバイオセンサーよりも高感度に物質間の相互作用を検出することができるだけでなく、安定性を向上させることができ、繰り返し使用することができることを見出した。
以下、本発明について説明する。
【００１２】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００１３】
本発明のバイオセンサーにおける金属薄膜は、第一の金属元素としてのＡｇを９０モル％以上９９．０５モル％未満と、第二の金属元素としてのＡｕ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｂｉ、Ｎｄ、Ｔｉ、Ｓｂから選ばれる少なくとも１種を０．０５モル％以上１０モル％未満と、を含むものである。
【００１４】
第一の金属元素としてのＡｇは、金属薄膜の主たる成分であり、主として感度向上に寄与することができる。一方、第二の金属元素は、Ａｕ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｔｉ、Ｂｉ、Ｎｄ，Ｓｂから選ばれる金属元素であり、本発明の金属薄膜に微量に含まれる金属成分である。第二の金属元素は、第一の金属元素を組み合わせることにより、Ａｇによる効果を安定して維持することができる。第二の金属元素が上記範囲であれば、第一の金属元素の酸化等による劣化を効果的に抑制することができると共に、感度を損なうことがない。
バイオセンサーとしての感度の観点から、金属薄膜は、９５モル％以上、９９．９モル％未満の第一の金属元素と、５．０モル％以上０．１モル％未満の第二の金属元素とで構成されることが好ましい。
【００１５】
第二の金属元素は、バイオセンサーとしての感度の観点から、Ａｕ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｔｉ、Ｂｉ、Ｎｄ，Ｓｂから選ばれる少なくとも２種を含有することが好ましく、特にＡｕ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｔｉからなる第一の群から選ばれる少なくとも１種と、Ｂｉ、Ｎｄ、Ｓｂからなる第二の群から選ばれる少なくとも１種とを組み合わせて含むことが好ましい。Ａｕ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｔｉは、いずれも高い導電性を示す電気伝導性に優れる金属材料であり、尚且つ耐腐食性に優れるという性質を有する。また、Ａｕ、Ｐｔ及びＴｉを選択した場合には、更に金属薄膜としての耐酸化性を向上させることができる。Ａｕ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｔｉからなる第一の群の金属元素を用いる場合には、０．５モル％以上５．０モル％以下で含まれることが好ましい。また、Ｂｉ、Ｎｄ、Ｓｂからなる第二の群の金属元素を用いる場合には、０．１モル％以上２モル％以下であることが好ましい。第二の金属元素の第一の群と第二の群とを組み合わせる場合には、合計の量が、上述したような第二の金属元素としての好ましい配合量となることが好ましい。
【００１６】
従って、上記の第二の金属からなる群から選択された少なくとも１種とすれであれば、大きな表面プラズモン吸収モードを達成しやすく好ましい。中でもＡｕが特に好ましい。一方、Ｂｉ、Ｎｄ、Ｓｂは、Ａｇと混ぜるとしばしば表面に局在しやすく、結果として表面エネルギーを下げ、またＡｇの酸化を効果的に防止することができる。中でも、Ｎｄ、Ｂｉが特に好ましい。
【００１７】
金属薄膜と後述する基板との間には、基板への付着性を考慮して、クロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００１８】
金属薄膜の膜厚は任意であるが、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍ以下であれば、媒質の表面プラズモン現象を充分検出することができる。また、第二の金属元素からなる保護層を設ける場合の第一の金属元素単独の層は、金属薄膜全体として、この範囲内となればよい。上記のようにＡｕ、Ｐｔ及びＴｉからなる群より選択された少なくとも１つを単独で用いる場合には、保護層として第一の金属からなる薄膜表面上に被覆してもよい。この場合、第二の金属元素の相の厚みとしては、１ｎｍから５０ｎｍとすることができる。さらにクロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００１９】
本発明のバイオセンサーでは、上記金属薄膜上に、金属酸化物層及び金属窒化物層の少なくとも一方の保護層を有していてもよい。金属酸化物層ないし金属窒化物層に用いられる金属の具体例としては、Ａｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｎｂ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｇａ等が挙げられるが、特にＳｉが好ましく用いられる。金属酸化物層又は金属窒化物層の膜厚は任意であるが、０．１ｎｍ以上５０ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２０】
金属薄膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。例えば酸素雰囲気下での金属のスパッタ蒸着方法などが好ましく用いられる。
【００２１】
金属薄膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属薄膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属薄膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。
本発明で使用することができる基板としては、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。特に、検体化合物のスクリーニングシステムを想定した場合、基盤部分は、プリズム等の光学部品として機能しかつ低コスト化が求められる為、プラスティック製が好ましい。また、このような基板は、好ましくは偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。具体的には、シクロオレフィンポリマー等が好ましく用いられる。
【００２２】
本発明のバイオセンサーには、金属薄膜上に生理活性物質を固定するための層が設けられている。静置活性物質を固定化するための層としては、自己組織化膜及び親水性ポリマー層から選択された少なくとも１つの層からなることが好ましく、これらの層を共に備えることが更に好ましい。自己組織化膜としては、アミノ基及び水酸基の少なくとも一方を有するアルカンチオール有機層を挙げることができ、親水性ポリマー層としては、活性化されたカルボキシル基を含有する親水性ポリマーであることが、生理活性物質の固定化能の観点から好ましい。
【００２３】
本発明において金属薄膜は、アミノ基及び水酸基の少なくとも一方を有するアルカンチオール有機層で被覆された後、活性化されたカルボキシル基を含有する親水性ポリマーを、上記アルカンチオール有機層と反応させてもよい。これにより、生理活性物質を固定化し得るポリマー層としてのヒドロゲルを簡便に作製することができる。
【００２４】
本発明においてアミノ基及び水酸基の少なくともいずれか一方を有するアルカンチオール有機層で金属薄膜２５を被覆する方法は、公知の方法を使用することができるが、操作が簡便なことから、自己組織化膜（ＳＡＭｓ）を用いた被覆法が好ましい。
自己組織化膜（ＳＡＭｓ）を用いた金属薄膜の被覆法は、ハーバード大のＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ教授らにより精力的に展開されており、その詳細は例えばＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ，１０５，１１０３−１１６９（２００５）に報告されている。
金属として主に銀を用いた場合、有機層形成化合物として一般式（１）（一般式（１）において、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を用いることにより、Ａｇ−Ｓ結合とアルキル鎖同士のvan der Waals力に基づき、配向性を持つ単分子膜が自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金属基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作成される。一般式１においてＸ＝ＮＨ２またはＯＨである化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基及びまたは水酸基を有するアルカンチオール有機層で金属表面を被覆することが可能となる。
【００２５】
【化１】
2009145189.tif 000002
【００２６】
アミノ基及び水酸基の少なくともいずれか一方を有するアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他のアルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のWhitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている(Langmuir17,2841-2850,5605-5620,6336-6343(2001))。本発明において、アミノ基及び水酸基の少なくとも一方を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。
【００２７】
本発明において、アミノ基及び水酸基の少なくともいずれか一方を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとを混合する場合、アミノ基及び水酸基の少なくとも一方を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能である。非特異吸着抑制能を減少させる観点から、アミノ基及び水酸基の少なくとも一方を有するアルカンチオールと、親水性基を有するアルカンチオールとの混合比は、１／１〜１／１，０００，０００の範囲であることが好ましく、１〜１／１，０００の範囲であることがより好ましく、１〜１／１０の範囲であることがさらに好ましい。活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水性基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。
【００２８】
上記アルカンチオールには、Northwestern大学のGrzybowski教授らによる総説(Curr. Org. Chem., 8,1763-1797(2004).)およびその引用文献に基づいて合成された化合物を用いてもよく、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Aldrich社、SensoPath Technologies社、Frontier Scientific Inc.社等から購入可能である。
【００２９】
本発明で用いることができる親水性ポリマーとしては、ゼラチン、アガロース、キトサン、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、セルロース又はこれらの誘導体、例えばカルボキシメチル誘導体、又は水膨潤性有機ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール又はこれらの誘導体などを挙げることができる。
【００３０】
本発明で使用可能な親水性ポリマーとしては更に、カルボキシル基含有合成ポリマーおよびカルボキシル基含有多糖類が挙げられる。カルボキシル基含有合成ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびこれらの共重合体、例えば特公昭５４−３４３２７号第３５頁右下から第１１行目〜３６頁左上から７行目、特公昭５８−１２５７７号第１０１頁左上１行目〜第１０２頁左上１行目、特公昭５４−２５９５７号第２１８頁右下から２行目〜第２２０頁左下から８行目、特開昭５９−５３８３６号第３頁右上第２行目〜第６頁左下第９行目、特開昭５９−７１０４８号第３頁左下第１行目〜第５頁左上第３行目に記載されているようなメタクリル酸共重合体、アクリル酸共重合体、イタコン酸共重合体、クロトン酸共重合体、マレイン酸共重合体、部分エステル化マレイン酸共重合、水酸基を有するポリマーに酸無水物を付加させたものなどが挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等が挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるＣＭＤ、ＣＭＤ−Ｌ、ＣＭＤ−Ｄ４０（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。
【００３１】
カルボキシ基を有するポリマーは、好ましくはカルボキシル基を含有する多糖類であり、より好ましくはカルボキシメチルデキストランである。
【００３２】
本発明に用いるカルボキシル基を含有するポリマーの重量平均分子量は特に制限されないが、重量平均分子量が１０００〜５００００００であることが好ましく、重量平均分子量が１００００〜２００００００であることがより好ましく、重量平均分子量が１０００００〜１００００００であることがさらに好ましい。この範囲より重量平均分子量が小さい場合には生理活性物質の固定量が小さくなってしまい、この範囲より重量平均分子量が大きい場合には高い溶液粘度のため取り扱いが困難となる。
【００３３】
上記したような親水性ポリマーは、本明細書中で説明されているような自己組織化膜又は疎水性ポリマーを介して基板に固定してもよいし、あるいはモノマーを含む溶液から直接基板上に形成させることもできる。さらに、上記した親水性ポリマーは架橋することもできる。親水性ポリマーの架橋は当業者に自明である。
【００３４】
カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法、特開２００６−５８０７１号公報に記載の方法（即ち、特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いてカルボキシル基を活性化する方法）、特開２００６−９０７８１号公報に記載の方法（即ち、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物を用いてカルボキシル基を活性化する方法）等を好ましく用いることができる。これらの手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを、アミノ基を有する基板と反応させることで、本発明のバイオセンサーを製造することが可能となる。
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として含窒素化合物を用いる方法がある。
【００３５】
本発明において活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーは、薄膜状態で基板と反応させることが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。これらの薄膜形成法については、「コーティング技術の進歩」原崎勇次著、総合技術センター（１９８８）、「コーティング技術」技術情報協会（１９９９）、「水性コーティングの技術」シーエムシー（２００１）、「進化する有機薄膜  成膜編」住べテクノリサーチ（２００４）、「高分子表面加工学」岩森暁著、技報堂出版（２００５）、等に説明されている。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【００３６】
カルボキシル基を含有するポリマーは、公知の方法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化され、アミノ基を有する生理活性物質を固定化することが可能となる。カルボン酸を活性化する手法としては、特開２００６−５８０７１号公報  段落番号「００１１」〜「００２２」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いて活性化することによりカルボン酸アミド基を形成する方法）、並びに特開２００６−９０７８１号公報  段落番号「００１１」〜「００１９」に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとした後に、アミンと反応させることによりカルボン酸アミド基を形成する方法）を好ましく用いることもできる。
【００３７】
本発明のバイオセンサーでは、金属薄膜を有する基板に生理活性物質を固定化し、生理活性物質と試料中の測定対象物との相互作用を検出することができる。
本発明のバイオセンサーにおいて、基板上に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００３８】
固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００３９】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原２６、８６、５５、１１１、１５７などに対する抗体等を使用することができる。
【００４０】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００４１】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００４２】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００４３】
上記生理活性物質は、適当な溶解液に溶解して生理活性物質含有溶液として基板上へ供給される。このときの生理活性物質含有溶液の濃度は、対象となる生理活性物質の種類及び分子量等によって適宜変更することができるが、一般に、０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００４４】
上記のようにして生理活性物質を基板上に固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００４５】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００４６】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００４７】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００４８】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを、入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００４９】
この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００５０】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００５１】
上述した表面プラズモン測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質（生理活性物質）に結合する特定物質（目的物質）を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には、本発明にかかる金属薄膜上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００５２】
試料液中の被検体（候補物質）が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて候補物質がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００５３】
なお、候補物質とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を、全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特開２００３−１７２６９４）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００５４】
上述したようなスクリーニングに本発明のバイオセンサーを用いる場合には、例えば、前記金属薄膜及びセンシング物質として該金属薄膜の表面に配置された前記生理活性物質を有する検出部と、前記検出部に候補物質を供給する供給部と、前記センシング物質と前記候補物質との結合の有無に基づいて、該候補物質がスクリーニングの目的物質か否かを判定するスクリーニング判定部と、を備えたバイオセンサーとしてもよい。
ここでスクリーニング判定部は、例えば屈折率の変化に基づいてスクリーニングの目的物質か否かを判定する。
【００５５】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、公知の各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
本発明のバイオセンサーは、作成後の保存に関しては、速やかに窒素雰囲気等で封入し用いることが好ましい。窒素雰囲気での封入方法としては、水分透過率１０−２ｇ／ｍ２・４０℃９０％以下の防湿性能を有する防湿フィルム中に好ましく保管することができる。
【００５６】
本発明にかかるバイオセンサーにおける金属薄膜は、測定ユニットの誘電ブロックに固定され、一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが交換可能に形成されていてもよい。以下にその例を示す。
図１は、ＳＰＲを利用した測定に用いられる測定チップ１５の分解斜視図である。測定チップ１５は、透明な誘電体である全反射プリズム２０と、この全反射プリズム２０の上に取り付けられる流路部材３０とで構成される。流路部材３０には、複数の流路３１が、長手方向に設けられている。なお、流路３１の断面がなるべく一定であれば、流路３１の底面形状としては特に限定されない。例えば、底面形状は、直線形状、蛇行形状、円弧形状などを挙げることができる。
【００５７】
全反射プリズム２０は、長尺な台形柱状に形成されたプリズム本体２１と、このプリズム本体２１の一端に設けられた把持部２２と、プリズム本体２１の他端に設けられた突出部２３とからなる。この全反射プリズム２０は、例えば、押し出し法などによって型成形されるものであり、プリズム本体２１、把持部２２、突出部２３の各部は、一体に成形されている。
【００５８】
プリズム本体２１は、下底よりも上底の方が長い略台形の縦断面を有しており、底面側面から照射された光を上面２１ａに集光する。プリズム本体２１の上面２１ａには、ＳＰＲを励起するための金属薄膜２５が設けられている。金属薄膜２５は、流路部材３０の各流路３１と対面するように長方形状をなしており、上述したように、例えば、蒸着法などによって成形される。
【００５９】
金属薄膜２５の上には、ポリマー層２６が設けられている。ポリマー層２６は、生理活性物質を固定させるための結合基を有するものであり、このポリマー層２６を介して金属薄膜２５上に生理活性物質が固定される。
上述したように、ポリマー層２６は、生理活性物質を固定化するための層であり、自己組織化膜形成分子、親水性ポリマー、又はその組み合わせから構成することができるが、親水性ポリマーを使用することが好ましい。特に好ましい態様によれば、自己組織化膜形成分子と親水性ポリマーの組み合わせから構成することができる。
【００６０】
図２は、上記測定チップ１５を備えたバイオセンサーの一例としてのスクリーニング用のバイオセンサー１０の概略図である。
バイオセンサー１０は、金属薄膜２５上にセンシング物質として生理活性物質Ｐが固定された測定チップ１５と、測定チップ１５に対して光を照射する光射出部４０と、測定チップ１５からの反射光を受光する受光部５０と、受光部５０から光情報からスクリーニングを行うスクリーニング判定部６０とを備えている。
光射出部４０は、光ビームＬを発生させる光源４０Ａと、光ビームＬを全反射プリズム２０に対して、全反射プリズム２０と金属薄膜２５との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させるレンズユニット４０Ｂで構成されている。
【００６１】
測定チップ１５には、上述したように、試料中のスクリーニングの候補物質を、金属薄膜２５上に固定された生理活性物質Ｐへ供給するために、流路部材３０によって供給部としての流路３１が形成されている。なお、供給部としては、流路３１に対して試料液を送液する図示しない送液手段が備えられているものであってもよい。
受光部５０は、測定チップ１５の全反射プリズム２０と金属薄膜２５との上記界面で全反射した光ビームＬを平行光化するレンズユニット５０Ａと、レンズユニット５０Ａで平行光化された光ビームＬを検出する光検出部５０Ｂとで構成されている。この光検出部５０Ｂとしては、例えば、フォトダイオードアレイやＣＣＤなどが適用可能である。
【００６２】
スクリーニング判定部６０は受光部５０に接続されており、受光部５０で検出された光に基づいて上述したように屈折率を計算し、この屈性率から、測定チップ１５の金属薄膜２５上の生理活性物質Ｐと試料中の候補物質との相互作用特性を求め、候補物質がスクリーニングの目的物質か否かを判定する。判定は、スクリーニングの目的に応じて変更可能であり、例えば、候補物質の中から、生理活性物質Ｐと相互作用する物質を目的物質として抽出してもよく、また生理活性物質Ｐと相互作用しない物質を目的物質として抽出してもよい。
【００６３】
また、本発明のバイオセンサーは、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を、導波路を用いて検出するバイオセンサーとして用いることができる。この場合、基板表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフィルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。
【００６４】
この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平６−２７７０３号広報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図、米国特許第６，８２９，０７３号の第６欄の３１行目から第７欄の４７行目および第９図Ａ，Ｂに記載されている。
【００６５】
また、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表２００７−５０１４３２号、図１）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。
【００６６】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６７】
［実施例１］
（試料の作成）
本実施例は、タンパク質を固定するためのセンサーチップの作製に関するものである。
（１−１）試料１（比較例１）の作成
表面プラズモン共鳴吸収を用いたバイオセンサーシステムである富士フイルム株式会社製ＡＰ３０００システムのセンサースティックに用いられているシクロオレフィンポリマー製プリズム表面にアルゴンスパッター蒸着装置を用いて厚み50nmの金薄膜を形成した。
（１−２）試料２（比較例２）の作成
試料１と全く同様にしてただしスパッター蒸着のターゲットとして銀を用いて厚み50nmの銀薄膜を形成した。
【００６８】
（１−３）試料３〜試料８（本発明）
試料１、２と同様にしてただしスパッター蒸着のターゲットとして表１の合金ターゲットを用いて各々50nmの合金薄膜を形成した。膜厚は、エリプソメーターを用いてスパッター条件を把握し制御した。
【００６９】
【表１】
2009145189.tif 000003
【００７０】
（１−４）試料９〜試料１６
試料１〜試料８と同様にスパッター蒸着した金属薄膜上に、真空を破らずに、酸素雰囲気下でＳｉをスパッター蒸着し、２０ｎｍのＳｉＯ２薄膜を形成し、保護層としてのしＯ２薄膜を有する試料９〜試料１６を得た。
【００７１】
（２−１）ＯＨ基を有する基板の作成
上述の金属薄膜及びＳｉＯ２薄膜を作成したセンサースティック試料１〜試料１６を用いて、以下の表面処理を行った。
センサースティックを１２分間、ＵＶオゾン処理を行った後、５．０ｍＭの１６−ヒドロキシヘキサデカンチオール（Frontier Scientific社製）を溶解したエタノール／水（80/20）混合溶液中に浸漬し、４０℃の振盪インキュベーターで２０分間インキュベートした後、水で５回、５０ｍｌのエタノール／水（８０／２０）で５回、５０ｍｌの水で５回洗浄した。
【００７２】
（２−２）エピクロロヒドリンによる処理
２０ｍｌの０．４Ｍ水酸化ナトリウム、２０ｍｌのジエチレングリコールジメチルエーテル、２．０ｍｌのエピクロロヒドリンの混合溶液中に、上記基板を浸漬し、２５℃の振盪インキュベーター中で４時間反応後、５０ｍｌのエタノールで２回、５０ｍｌの水で５回洗浄した。
【００７３】
（２−３）デキストランによる処理
水４０．５ｍｌ、デキストラン（T500, Pharmacia）１３．５ｇ、１Ｍ水酸化ナトリウム４．５ｍｌの混合溶液中に、上記基板を浸漬し、２５℃の振盪インキュベーターで２０時間反応後、５０ｍｌの５０℃の水で１５回洗浄した。
【００７４】
（２−４）ブロモ酢酸による処理
ブロモ酢酸３．５ｇ、２Ｍ水酸化ナトリウム溶液２７ｇの混合溶液中に、上記基板を浸漬し、２８℃の振盪インキュベーターで１６時間反応後、水洗した。再度、ブロモ酢酸溶液による１６時間反応、水洗を行った。
【００７５】
（３）アミノ基を有する基板の作成
金属薄膜を形成したセンサースティックを１２分間、ＵＶオゾン処理を行った後、８ｍＬのエタノールと２ｍＬの超純水に４５μｍｏｌの11-Hydroxy-1-undecanethiol（Aldrich社製）と４μｍｏｌ  の16-Mercaptohexadecanoic acid（Aldrich社製）を溶解させた溶液中で４０℃１時間反応させ、エタノールで１回、超純水で１回洗浄した。上記基板上にＥＤＣ（０．４Ｍ）／ＮＨＳ（０．１Ｍ）混合溶液を１００μｌ滴下し、室温で１５分反応させ活性化した後、超純水で１回洗浄した。上記基板に１，２−ビス（アミノエトキシ）エタンを５０μｌ滴下し、室温で１時間反応させた後、超純水で１回洗浄した。
【００７６】
（４−１）ＣＭＤの活性エステル化
超純水に０．５重量％となるようにＣＭＤ（名糖産業製：分子量１００万）を溶解した後、全量反応した場合にカルボキシル基の２％が活性化される計算量のEDC（1-(3-Dimethylaminopropyl)  -3-ethylcarbodiimide）（０．４Ｍ）／ＮＨＳ（N-Hydroxysuccinimide）（０．１Ｍ）混合溶液を加え、室温で５分間攪拌した。
【００７７】
（４−２）活性エステル化ＣＭＤの基板への結合
（３）で作成された基板の上に、（４−１）で作成された活性エステル化されたＣＭＤ溶液を２００μｌ滴下し、７０００ｒｐｍで４５秒スピンコートすることで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で１時間反応させた後、０．１ＮのＮａＯＨで１回、超純水で１回洗浄することで、更に固定化膜を備えた試料１７〜試料３２を得た。
【００７８】
［実施例２］
（感度・表面プラズモン吸収線の評価）
実施例１で作成した試料１〜試料１６を試料作成の翌日、富士フイルム（株）社製の表面プラズモン共鳴装置であるＡＰ3000を一部改造し、これにセットして、共鳴吸収線の半値幅を相対評価したところ、表２の結果を得た。半値幅は、金薄膜を用いた試料１のものを１００として相対値で表した。評価した光源の波長は、８３０ｎｍのスーパールミネッセントダイオードを用いた。
【００７９】
【表２】
2009145189.tif 000004
【００８０】
表２に明らかな様に本発明のセンサースティックは、金膜からなる比較試料１に対し、狭い半地幅を持つ為に、高い検出感度を有することが確認できた。
【００８１】
［実施例３］
（耐久性の評価）
実施例１で作成したセンサースティック試料を３０℃６０％の環境で３日間保管した後、実施例２と同様の実験を行った。
比較例である試料２と１０の試料の共鳴吸収線は、強度が著しく低下してしまい、測定に用いることができなかった。本発明の試料３〜８、１１〜１６は、共鳴吸収線の狭い半値幅を維持しつつピーク強度低下の程度が著しく抑制されており、特に１１〜１６が顕著であった。
【００８２】
【表３】
2009145189.tif 000005
【００８３】
［実施例４］
（長期保存性能）
実施例１で作成したセンサースティック試料３〜８、１１〜１６を作成後速やかに窒素雰囲気等で封入した。窒素雰囲気には、水分透過率０．５×１０−２ｇ／ｍ２・４０℃９０％  の防湿性能を有する防湿フィルムを用いた。６℃で６ヶ月間保管したあと実施例２と同様の実験を行った。
本発明の試料３〜８、１１〜１６は、作成直後とほぼ同様の共鳴吸収線を示した。
【００８４】
［実施例５］
本実施例は、実施例１で得られたセンサースティック試料１７〜３２に対するタンパク質の固定に関するものである。タンパク質としては、ＣＡ（Carbonic Anhydrase：SIGMA社製）を用いた。用いたＣＡは、ATTO社のAE-8150を用いた電気泳動実験で、同時測定したマーカー（Broad pI Kit, pH 3.5-9.3：Amersham Biosciences社製）との比較から、等電点が5.8程度であることを確認した。１ｍｇのＣＡを１ｍｌのＨＢＳ−ＥＰバッファー（ビアコア社製、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），０．１５ＭのＮａＣｌ，０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０，３ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解した溶液を１０μｌ秤量し、９０μｌの酢酸バッファー（ビアコア社製、ｐＨ５．０）を加えることで、０．１ｍｇ／ｍｌのＣＡ溶液（ｐＨ５．０，０．１ｍｇ／ｍｌ）を調整した。
【００８５】
実施例１で作成した試料１７〜３２を、富士フイルム（株）社製の表面プラズモン共鳴装置であるＡＰ3000にセットし、０．４ＭのＥＤＣおよび０．１ＭのＮＨＳを含む水溶液、ＣＡ溶液（ｐＨ５．０，０．１ｍｇ／ｍｌ）、エタノールアミン溶液（ビアコア社）を、各々５分間流した後、１０ｍＭのＮａＯＨを１分間×２回流した場合の固定化について検討した。ランニングバッファーはＨＢＳ−Ｎバッファー（ビアコア社製、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ）を用いた。
【００８６】
市販のＣＭＤ結合表面や従来作成法により作成されたＣＭＤ結合表面よりもタンパク固定量の大きなＣＭＤ結合表面が、本発明により簡便に作成可能であることが証明された。
【００８７】
［実施例６］
本実施例は、実施例１で得られたセンサーチップに対するタンパク質のプレコンセントレーション（濃縮・固定）に関するものである。タンパク質としては、ＢＳＡ（Bovine  Serum  Albumin：SIGMA社製）を用いた。用いたＢＳＡは、ATTO社のAE-8150を用いた電気泳動実験で、同時測定したマーカー（Broad pI Kit, pH 3.5-9.3：Amersham Biosciences社製）との比較から、等電点が６．１程度であることを確認した。１ｍｇのＢＳＡを１ｍｌのＨＢＳ−ＥＰバッファー（ビアコア社製、ｐＨ７．４）に溶解した溶液を１０μｌ秤量し、９０μｌの酢酸バッファー（ビアコア社製、ｐＨ５．０）を加えることで、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液（ｐＨ５．０，０．１ｍｇ／ｍｌ）を調整した。
【００８８】
実施例１で作成した試料３〜８、１１〜１６を富士フイルム株式会社製の表面プラズモン共鳴装置であるＡＰ3000にセットし、ＢＳＡ溶液（ｐＨ５．０，  ０．１ｍｇ／ｍｌ）を５分間流した場合のプレコンセントレーションについて検討し、良好な結果を得た。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明の一実施形態にかかる測定チップの概略構成を示す分解斜視図である。
【図２】本発明の一実施形態にかかるバイオセンサーの概略構成を示す分解斜視図である。
【符号の説明】
【００９０】
１０  バイオセンサー
１５  測定チップ
２０  全反射プリズム
２１  プリズム本体
２５  金属薄膜
２６  ポリマー層
３０  流路部材
３１  流路
４０  光射出部
５０  受光部
６０  スクリーニング判定部
【図１】
2009145189.tif 000006
【図２】
2009145189.tif 000007