(57)【要約】      （修正有）【課題】１本の試験管内で、生物学的資源に由来する核酸の５’末端を単離するための方法を提供する。【解決手段】（ａ）非全長ＲＮＡ分子の５’のリン酸基を除去、（ｂ）キャッピング部位を５’完全ＲＮＡ分子から除去、適当な核酸を付加、の各ステップにより核酸末端を捕捉する。得られた修飾ＲＮＡはｃＤＮＡを得るために逆転写に付される。【効果】小規模のＲＮＡを含む、ｃＤＮＡライブラリーの構築、タギングおよび配列決定またはＲＮＡの減量を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
相容性バッファー中での試薬の順次添加に基づく、限られた量の出発材料に適する核酸末端を捕促する方法であって、
（ａ）非全長ＲＮＡ分子の５’のリン酸基を除去するステップと、
（ｂ）キャッピング部位を５’完全ＲＮＡ分子から除去するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で誘導されたこのような分子の５’末端にて適当な核酸を付加するステップと
を含み、
順次試薬を添加することにより、ステップの全てが１本の試験管内で完結することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記得られた、修飾されたＲＮＡは、ｃＤＮＡを得るために逆転写に付される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記得られたｃＤＮＡは、全長ｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記得られたｃＤＮＡは、前記ＲＮＡの前記末端に対応する配列タグを単離するために使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記得られた配列タグは、核酸コンカテマーの調製に使用される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記断片は、前記ＲＮＡの５’末端にて単離される、請求項４および５に記載の方法。
【請求項７】
５’および３’末端タグの両者は、５’−３’末端ジタグを作り出すために使用される、請求項４および５に記載の方法。
【請求項８】
前記得られたＤＮＡは、ハイスループット配列決定に使用される、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｃＤＮＡは、５’末端の検出に使用される、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
前記誘導体化された核酸またはその相補的核酸、あるいは置換を含むまたは置換を含まないそれらの誘導体は、さらなる分析のためにマトリックスに結合される、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１１】
マトリックスに結合された得られた核酸は、その配列を決定するために適切なシーケンサーに適用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
得られた核酸は、５’末端分子富化法により得られる５’末端ＲＮＡ分子に対応する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２に記載の全てのステップの組合せからなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜遺伝子発現解析＞
ゲノムは、あらゆる生物の発生およびホメオスタシスに関するきわめて重要な遺伝情報を含む。生物学的現象を理解するためには、このような遺伝情報が、所与の時点に細胞または組織で、いかに利用されるかということに関する知識が必要である。遺伝情報の利用および関連の制御パスウェイの誤りが、ヒトまたは植物および動物で疾患を引き起こした多くの例が知られている。したがって、同定された転写物の発現プロファイリングおよびアノテーションならびに遺伝情報をコントロールしている遺伝要素の特性決定を可能にする方法が必要である。ほとんどの発現研究は、現在は、in situハイブリダイゼーション、たとえばマイクロアレイ、または短いタグのハイスループット配列決定に基づく手法、たとえばＳＡＧＥ、ＣＡＧＥ、ＭＭＰＳのいずれかを使用し、その場合、両タイプの実験が、互いよりも明確な利点を有する。しかし、遺伝子発現の原因となる制御原理を理解するために、遺伝子発現を調節する遺伝要素に関する情報も得ることが望ましいこともある。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロアレイ実験には制限があるため、複数のｍＲＮＡサンプルから得られる、部分的配列（上述のタグ）に基づく、代替手法が遺伝子発見および発現プロファイリングに使用されている。いわゆるＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））法は、ｍＲＮＡ中の塩基配列に関する部分的情報を得るための能率的な方法として知られている（ベルキュレスク（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ）Ｖ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，４８４−４８７（１９９５）（これによって、参照することにより本明細書に組み込まれる））。この方法は、多数のｍＲＮＡの３’末端における塩基配列に関する情報を含む多数の短いＤＮＡ断片（最初は、約１０ｂｐ）を連結することによりＤＮＡコンカテマーを形成し、これらのＤＮＡコンカテマー中の塩基配列を決定する。近年、より長いＳＡＧＥタグのクローニングを可能にする、ＳＡＧＥの推奨バージョン、いわゆるＬｏｎｇＳＡＧＥが公表された（サハ（Ｓａｈａ）Ｓ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，５０８−１２（２００２）、米国特許出願第２００３０００８２９０号、米国特許出願第２００３００４９６５３号（全て、これによって、参照することにより本明細書に組み込まれる））。該ＳＡＧＥ方法は、特定の細胞、組織または生物で発現された遺伝子を分析するための重要な方法として、現在広く使用されており；またＳＡＧＥタグは、公的ドメインで、たとえばｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＡＧＥで、参照用に入手できる。
【０００３】
米国特許第６，３５２，８２８号；米国特許第６，３０６，５９７号；米国特許第６，２８０，９３５号；米国特許第６，２６５，１６３号；米国特許第５，６９５，９３４号（全て、これによって、参照により本明細書に援用する）は、超並列的サイン配列決定（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）または「ＭＰＳＳ」とも表示される、短い配列タグのハイスループット配列決定のための異なる手法を開示している。ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）Ｓ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，６３０−６３４（２０００）、およびブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７，１６５５−１６７０（２０００）（共に、これによって、参照することにより本明細書に組み込まれる）にさらに詳細に記述されている通り、単層のビーズ上の異なる酵素反応でサイクルを実行する極めて並列的な方法で、転写物の３’末端から優先的に短い配列が得られる。ＷＯ０３／０９１４１（これによって、参照することにより本明細書に組み込まれる）では、転写物の５’末端由来の短い配列の配列決定も可能にするために、前述の手法に対する変更が開示された。
【０００４】
前述の手法の大部分は、３’末端由来の配列タグの利用に焦点を合わせていたが、転写物の他の領域からの、特に５’末端からの配列タグも得るために、新規な手法が開発された。このような手法は、ＰＣＴ／ＪＰ０３／０７５１４、およびシラキ（Ｓｈｉｒａｋｉ）Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００，１５７７６−１５７８１（２００３）（共に、これによって、参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている。このいわゆるＣＡＧＥ（キャップ−分析−遺伝子−発現（Ｃａｐ−Ａｎａｌｙｓｉｓ−Ｇｅｎｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））手法は、ＳＡＧＥ技術と同様に、５’末端特異的タグのコンカテマーへのクローニングを可能にし、その場合、ＣＡＧＥタグは、転写物の検出およびそれらの発現プロファイリングを可能にするのみならず、転写調節に関する機構研究またはより高度の転写物アノテーションを可能にする、転写開始部位に関する情報をさらに提供する。５’末端特異的情報を含むコンカテマーをクローニングするための、後者の類似した手法は後に、多数の他の研究所によって、たとえばウォン（Ｈｗａｎｇ）Ｂ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，１６５０−１６５５（２００４）、ハシモト（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ）Ｓ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，１１４６−１１４９（２００４）、チャン（Ｚｈａｎｇ）Ｚ．およびディートリッヒ（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ）Ｆ．Ｓ．，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３３，２８３８−２８５１（２００５）、ならびにウェイ（Ｗｅｉ）Ｃ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，１１７０１−１１７０６（２００４）（全て、これによって、参照することにより本明細書に組み込まれる）にも発表されている。
【０００５】
上記手法はいずれも、１つの配列タグのクローニングおよび配列決定に焦点を合わせている。したがって、このような手法はやはり、タグ配列決定の実行可能なスループットが限られている。加えて、このような手法は、偏りに論拠を与える可能性がある多くの操作段階を必要とする。特に増幅段階は、個々のＤＮＡ断片ごとに増幅率が異なるため、人為的結果ならびにタグ頻度の偏りを生じさせる可能性がある。当該分野における近年の進歩は、古典的な手法によって現在実行可能なものよりはるかにハイスループットで配列情報を得るための新規な方法を開拓するであろう。特に興味深いのは、メッツケル（Ｍｅｔｚｋｅｒ）Ｍ．Ｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１５，１７６７−１７７６（２００５）、クリング（Ｋｌｉｎｇ）Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１３３３−１３３５（２００５）およびシェンジャー（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ）Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５，３３５−３４４（２００４）（全て、これによって、参照することにより本明細書に組み込まれる）で最近概説されたような、単一ＤＮＡ分子の検出および配列決定のための新規な手法である。本発明は、他の用途にも使用することができる、単一分子検出および配列決定のためのＤＮＡ断片の獲得法に関する革新的な解決を提供する。したがって、本発明は、修飾されたＲＮＡ分子の５’末端に特異的な配列情報を得ることができるような方法で、ＲＮＡ分子を修飾する手段を提供する。したがって、本発明はまた、新規なハイスループット配列決定手法、およびたとえば発現プロファイリングにおけるそれらの使用も可能にする。さらに、本発明は、５’末端特異的情報タグに基づく発現プロファイリング研究を含むがその限りではない研究に、高い価値のあるさらなる手段を提供し、その上、それらは、薬剤開発、診断用薬、または法医学的研究を含むがその限りではない、商業的用途およびサービスのきわめて重要な成分である。
【０００６】
要するに、これらの制限から、発現プロファイリングさらに他の用途に適する可能性がある、ｍＲＮＡ  ｃＤＮＡの５’末端領域の選択の必要性が示唆される。
【０００７】
＜全長ｃＤＮＡ分子の単離＞
ｍＲＮＡの５’末端の分析およびクローニングは、全長ｃＤＮＡコレクションの調製における、またタンパク質コードｍＲＮＡおよび非コードＲＮＡを含むゲノムの発現部分を発見するための、基礎であった（カルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５年９月２日；３０９（５７４０）：１５５９−６３、ゲルハルト（Ｇｅｒｈａｒｄ）ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００４年１０月；１４（１０Ｂ）：２１２１−７、イマニシ（Ｉｍａｎｉｓｈｉ）ら，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．２００４年６月；２（６）：ｅ１６２）。全長ｃＤＮＡの獲得は、ゲノム構造および機能を有益に理解することおよびゲノム上の遺伝子をマッピングすることであった。さらに、全長ｃＤＮＡの獲得は、コードされたタンパク質を発現させるための手段であり、次にはこれを他の機能ベクターに移入することができる。たとえば、タンパク質をゲートウェイベクター（ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の商標である）クローニングして、タンパク質発現、精製、および多数の他の機能的研究に使用することができる。
【０００８】
さらに、５’末端の分析は、プロモーター同定と関連がある遺伝子発現の測定を可能にした（カルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら，印刷中のＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）。５’末端タグを捕捉することにより（ハーベス（Ｈａｒｂｅｒｓ）およびカルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５年７月；２（７）：４９５−５０２）、転写開始部位を、したがって遺伝子発現を調節するプロモーター領域を、同定することが可能になった。該プロモーター領域は、コアプロモーターおよび長距離調節要素に分けることができるが、該コアプロモーター（開始部位に近接しているもの）は非常に能率的に同定することができ、したがって、転写ネットワーク（転写調節要素間の通信）および発現ＲＮＡ等の、さらなる機能分析を容易にする。この分析は、「システム生物学」と別名で呼ばれる新分野の一部である。この哲理に続いて、この系の構成要素を全て考慮に入れ、その知識を統合するためには、生体系を理解することが不可欠である。
【０００９】
しかし、これまでは、こうした技術は比較的多量の出発材料を要求してきた（カルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００３年６月；１３（６Ｂ）：１２７３−８９、シラキ（Ｓｈｉｒａｋｉ）ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２００３年１２月２３日；１００（２６）：１５７７６−８１；コジウス（Ｋｏｄｚｉｕｓら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００３年６月；１３（６Ｂ）：１２７３−８９；ハシモト（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ）ら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４年９月；２２（９）：１１４６−９）。５’末端を捕促するための他の技術は、大規模な増幅を必要とし（たとえばＰＣＲ；スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）およびスガノ（Ｓｕｇａｎｏ），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００３；２２１：７３−９１）、したがって、（カルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００３年６月；１３（６Ｂ）：１２７３−８９）に概説されている通り、ｃＤＮＡの頻度の虚偽表示を引き起こす。
【００１０】
しかし、ＲＮＡ発現は、所与の組織を構成する様々な細胞で非常に異なる。組織は、幾つかの共通のＲＮＡおよび多くの非常に異なる細胞特異的ＲＮＡを発現する、多数の細胞によって構成される。したがって、組織を構成する異なる細胞を、それらの発現されたＲＮＡ、およびそれらのプロモーター使用について、別々に分析することができるように、少量の細胞から５’末端／全長ｃＤＮＡを調製および捕促することを可能にする新規な技術が必要である。これは、生体系の理解、および転写ネットワークの同定および薬剤によるそれらの混乱／調整を含む下流用途に不可欠である。
【００１１】
本発明で、我々は、全長ｃＤＮＡ分子または５’ｍＲＮＡの最初から始まる５’タグの獲得を簡便にする方法を説明する。
【００１２】
＜利用可能性＞
本発明の利用可能性は、限られた量の組織から全長ｃＤＮＡおよびＣＡＧＥ（キャップ−分析遺伝子発現）ライブラリーを作製することである。なぜならば、ＲＮＡの誘導体化に含まれる３ステップは沈殿を含まず、したがって、核酸損失が起こらないためである。別の実施形態では、ステップが簡略化され、ｃＤＮＡ／５’末端タグの調製中の、時間および作業負荷の大幅な節約を可能にするため、このプロトコールを、一般的なｃＤＮＡ調製にも使用することができる。ＲＮＡの５’末端を単離するステップから配列を決定するまでを含む本発明の全ステップの組合せは、キットまたは道具として使用される。本発明の流れの実施形態の１つを、図１として示す。
【発明の開示】
【００１３】
＜発明の概要＞
本発明は、クローニングおよび分析のために、核酸分子から断片を単離する方法に関する。したがって、本発明は、１つまたは複数の核酸分子を含有するサンプルの変換に関し、その場合、このような核酸分子または核酸分子の混合物は、ＤＮＡに変換されるであろう。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、核酸分子の操作に関し、その場合、このような核酸分子が線状一本鎖ＤＮＡの形態で調製されるであろう。したがって、本発明は、線状一本鎖ＤＮＡの調製および操作に関する。
【００１５】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＲＮＡ分子の５’末端における配列情報を導入するための、ＲＮＡ分子または複数のＲＮＡ分子の修飾に関する。したがって、本発明は、ＲＮＡの修飾に関し、その場合、ＲＮＡ分子に付加された情報が該ＲＮＡ分子の操作および／または分析に使用される。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、ＲＮＡをｃＤＮＡに転写することによる、未変成のＲＮＡ分子および／または修飾されたＲＮＡ分子の変換に関する。したがって、本発明は、一本鎖ＤＮＡ分子の合成および調製に関する。
【００１７】
少し異なる実施形態では、本発明は、配列情報を直接得るための、一本鎖ＤＮＡ分子の使用に関する。したがって、本発明は、一本鎖ＤＮＡ断片の規定領域、すなわち、上述の５’末端、から配列情報を得ることに関する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片の５’末端特異的配列情報は、ＲＮＡ分子の５’末端配列に関する。したがって、本発明は、ＲＮＡ分子から配列情報を得ることに関する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、コンピュータを利用した手段によるアノテーションおよび統計解析を可能にさせるためのタグの配列決定に関する。したがって、本発明は、遺伝子発見、遺伝子同定、遺伝子発現プロファイリング、およびアノテーションのための手段に関する。
【００１９】
少し異なる実施形態では、本発明は、コンピュータを利用した手段によるアノテーションおよび統計解析を可能にするためのタグの配列決定に関し、その場合、このようなタグは、ゲノム内の領域に由来するであろう。したがって、本発明は、ゲノム内の遺伝要素の特性決定に関する。
【００２０】
少し異なる実施形態では、本発明は、該末端核酸分子からのハイブリダイゼーションプローブの調製に関し、その場合、このような領域は、in situハイブリダイゼーションを用いて分析されるであろう。好ましい実施形態では、該in situハイブリダイゼーション実験は、タイル化アレイを利用するであろう。
【００２１】
少し異なるもう１つの実施形態では、本発明は、核酸分子の全長クローニングに関する。別の実施形態では、該タグから得られるような配列情報は、プライマーデザインに使用され、その場合、このようなプライマーは、増幅反応で核酸分子を増幅するために使用される。このような方法で、転写された領域ならびにゲノム断片を増幅およびクローニングすることは、本発明の範囲内であり、その場合、このような断片は、遺伝要素、上述のプロモーター領域を含んでもよい。
【００２２】
したがって、本発明は、たとえば生体サンプルの特性決定のために、必要に応じて核酸分子およびそれらの短い断片の分析手段を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
＜発明の詳細な説明＞
本発明は、生体サンプルからのＲＮＡ／核酸分析に関する。用語「生体サンプル」は、微生物、動物、および植物を含む生物、ならびに複製を宿主生物に依存するウイルスおよびプリオンを含むあらゆる種類の感染粒子から得られるあらゆる種類の材料を包含する。そのようなものとしての「生体サンプル」は、研究調査、開発、診断または治療の目的で、患者、動物、植物または感染粒子から得られるあらゆる種類の材料を包含する。したがって、本発明は、特定の核酸分子またはそれらの起源の使用に限定されず、本発明は、所与の核酸の研究および操作に応用されたり使用されたりする一般的な手段を提供する。本発明を実施するために使用されるこのような核酸分子は、２００１年、ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス発行の、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．およびラッシュエル（Ｒｕｓｓｕｅｌｌ）Ｄ．Ｗ．著、分子クローニング、研究室マニュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ.ａｎｄ  Ｒｕｓｓｕｅｌｌ  Ｄ.Ｗ.,Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ,Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ,Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ,Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ,２００１）に記載のものを含むが、これに限定されない当業者に周知の方法で、獲得または調製することができる。
【００２４】
ＲＮＡは、このような分子が、二本鎖ＲＮＡ部分を含む二次構造を形成する可能性がある場合でも、本発明の目的上、一本鎖核酸分子と考えられる。特に、ＲＮＡは、本発明の目的上、リボヌクレオチドからなり、ある特定の配列または該ＲＮＡの起源と関係のない、あらゆる形態の核酸分子を包含する。したがって、ＲＮＡは、人工的なシステムによりｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されていても、転写されていなくてもよく、スプライシングされていてもスプライシングされていなくてもよく、不完全にスプライシングされていてもプロセッシングされていてもよく、その天然起源から独立していても、合成により得られても、人工的にデザインされた鋳型、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡから誘導されてもよく、またはそれらの任意の混合物であってもよい。さらに正確に言えば、表現「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、「核酸」、および「配列」は、核酸材料自体を包含するため、特定の配列情報、ベクター、ファージミドまたは他の特定的な核酸分子に限定されない。
【００２５】
ＲＮＡの大きな区分は、キャッピングされたＲＮＡとキャッピングされていないＲＮＡである。キャッピングされていないＲＮＡは、回収されず、サンプル中のＲＮＡの大部分を構成する（種の少なくとも９５％）。このような理由で、本発明の目的上、出発ＲＮＡ型は、キャッピング部位の存在によってグループに分けるべきである。
【００２６】
ｍＲＮＡは通常、キャッピング部位およびポリＡテールを有するＲＮＡを指し、全体の１〜３％を構成し、またタンパク質をコードする。もう１種のキャッピングされた分子はｎｃ−ＲＮＡであり、これはコードしておらず、不十分にポリアデニル化されているが、キャップ構造を有する。合わせて、これらの２つは、細胞中のＲＮＡ分子の５％以下を構成する。したがって、我々は、「総ＲＮＡ」および「キャッピングされたＲＮＡ」に言及するが、総ＲＮＡは、最高約５％のキャッピングされたＲＮＡを含む。例として大まかに言うと、約１分子／２０分子のＲＮＡがキャッピングを含む。したがって、類似した数のキャッピングされた分子を処理するためには、「キャッピングされたＲＮＡ」画分より、はるかに多量の「総ＲＮＡ」を使用しなければならない（約２０倍）。この差異は、はるかに大きい割合の使用可能分子を含む、総ＲＮＡの使用と、キャップ選択またはポリＡ選択されたＲＮＡの使用を区別するために重要である。
【００２７】
固体マトリックスは、本書を通して、任意の形状を有してもよい、ビーズおよび表面を含む、不定のサイズを有する固形物を意味する。中でも、磁気ビーズ、被覆ビーズを含むビーズ、およびガラス、プラスチック、シリカ、テフロン（登録商標）または他の適当な任意の材料で構成されたスライドがあるが、その限りではない。こうしたマトリックスは、不活性であっても反応性であってもよく、たとえば、ストレプトアビジン、抗体、反応性化学基、または１つまたは複数の修飾または塩基および／またはバックボーン配列を有する核酸の誘導体の、任意の形態の核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ハイブリッド分子）で被覆されていてもよい。本書では、「マトリックス」、「表面」、「固体表面」の定義は、溶液状ではない物体への結合性核酸を指し、また核酸単離または捕促あるいはさらなる操作を可能にさせるため、同義的に使用される。
【００２８】
＜現行のクローニング用プロトコール＞
しかし、上記技術の１つの大きい制限は、小規模サンプルで有効である能力であり、本法の利用可能性を低減する。ＲＮＡは制限因子であったが、プロトコールは、５０μｇの総ＲＮＡから変化する、最小量のＲＮＡを必要とする。数百ナノグラム未満のキャッピングされたＲＮＡでは、全長ｍＲＮＡの捕促は報告されていない（μｍの総ＲＮＡを必要とする）。
【００２９】
キャッピング部位を介して全長ｃＤＮＡを捕促するためにこれまで使用されてきた方法は幾つかあり、本記載内での総括的な文献レビューは不可能である。ここでは、主要であるが代表的な方法のみを記述する。ほとんどの方法は、５’末端に存在する、ｍＲＮＡ（または他の非コードＲＮＡ）のキャップ構造の存在を巧みに利用する。ｃＤＮＡの調製が、ポリＡテールからの３’末端上で開始するとき、この部分を介してｃＤＮＡを選択することにより、全長ｃＤＮＡを捕促することが可能になる。ｃＤＮＡにハイブリダイズしたＲＮＡを保護する全長ｃＤＮＡが無ければ、これは、ＲＮＡのリボヌクレアーゼ消化によって促進される可能性がある。
【００３０】
＜ＲＮＡ上のキャップ部分の誘導体化によるキャップ修飾剤＞
これらの方法は、キャップ・トラッピング（カルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）およびハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９；３０３：１９−４４）およびジェンセット（Ｇｅｎｓｅｔ）の特許（米国特許第５，９６２，２７２号、米国特許第６，０２２，７１５号を含む。これらの方法は、能率よくｍＲＮＡ／ＲＮＡの５’末端を捕促するのに非常に有効であった（報告によると最高９５％の効率、参考文献）。これらの方法は、１μｇの総ＲＮＡより多い、比較的多量の高出発ＲＮＡ材料から始まる（カルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．２００３年６月；１３（６Ｂ）：１２７３−８９）。
これらの方法群は、１μｇ未満の総ＲＮＡには使用できない。
【００３１】
＜キャップ結合性タンパク質／ペプチド（エダリー（Ｅｄｅｒｙ）ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５年６月；１５（６）：３３６３−７１）＞
もう１つの方法は、第一鎖ｃＤＮＡ後、キャップ結合性タンパク質を介した、キャッピング部位の捕促に基づく。これに関して、５’末端からのｃＤＮＡを捕促するために、該キャップ結合性タンパク質が使用される。代替バージョンは、キャップ結合性抗体で、あるいは、抗体の他の断片またはファージディスプレー抗体でも、ＲＮＡを捕捉することを含むであろう。
【００３２】
この方法（エダリー（Ｅｄｅｒｙ）ら、エダリー（Ｅｄｅｒｙ）ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５年６月；１５（６）：３３６３−７１）は、数マイクログラム（μｇ）のｍＲＮＡのみを用いて使用されたが、キャップ結合性タンパク質を固体支持マトリックスに結合することが困難なため、普及しなかった。
【００３３】
＜オリゴキャッピングに基づく方法（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）およびスガノ（Ｓｕｇａｎｏ），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００３；２２１：７３−９１）＞
この方法群は、５’末端キャップを、異なるプライマー配列（オリゴヌクレオチド）と置換することに基づくが、これは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子であってもよい。複合化５’末端に達するｃＤＮＡのみがさらなる操作、たとえば第２鎖ｃＤＮＡへのコピーおよびＰＣＲに付される。この方法群はまた、比較的低効率という欠点があり、ＲＮＡライブラリーに十分な材料を得る前に、多数のＰＣＲサイクルを必要とするという評判を得た。これらの方法では、数マイクログラム（μｇ）以上のＲＮＡが使用されてきた。
【００３４】
＜キャップスイッチ法（チュー（Ｚｈｕ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００１年４月；３０（４）：８９２−７．）＞
キャップスイッチ法は、ＲＮＡの５’末端、特にキャッピング部位における、トリヌクレオチドＧＧＧの付加に基づく。ポリＡテールを担持しない、リボソームＲＮＡの混入を最小限に抑えるために、該ｃＤＮＡを、オリゴ−ｄＴでプライムした。この方法は、キャップ操作を必要としないため、特に魅力的である。この方法を使用すれば、研究者は、単一細胞を使用してｃＤＮＡプローブを作製することができた。しかし、この方法にはまだ２つの問題があった。１つは、該キャップスイッチは効率が低く、ＰＣＲを必要とすることである。長い挿入物のＰＣＲ増幅は、短いｍＲＮＡに由来する、より短いＰＣＲ産物に打ち負かされるため、長いｃＤＮＡクローンはほとんど回収されないので、ＰＣＲに基づく全長ｃＤＮＡライブラリー作製は、問題が多い。もうひとつの不都合は、３つのＧヌクレオチドがｃＤＮＡの５’末端に付加されることである。これらを５’末端タギング技術に使用すれば、５’末端タグを切断するためにクラスＩＩ  Ｓ制限酵素を使用することによって、３塩基（２０塩基のうち、タギングｃＤＮＡ末端の説明については、下文を参照）が有用な情報として失われるであろう。このことは、これらをゲノム上にマッピングするとき、特に重要である（ゲノム上の、タグのマッピング参照）。
【００３５】
全長ｃＤＮＡ合成のための他の方法は、従来の技術の全般的な改良により構成される。簡単な方法は、サイズに基づいて、ｃＤＮＡを単に選択することである。サイズに基づく長いｃＤＮＡの選択。長いｃＤＮＡ分子は、短いｃＤＮＡ分子より、非切断型ｃＤＮＡ分子である公算がはるかに大きい（たとえば、ノムラ（Ｎｏｍｕｒａ）ら，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．１９９４；１（５）：２２３−９参照）。
【００３６】
ｃＤＮＡを追尾するための古典的な方法からなるもう１つの例は（オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびベルグ（Ｂｅｒｇ），Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８２年２月；２（２）：１６１−７０）、全長ｃＤＮＡを捕促するのに有用である。あるいは、または上記技術の１ずれか１つと組み合せた、全長ｃＤＮＡ調製物の第一鎖に含まれる、改良された逆転写酵素、たとえば、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩおよびスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））は、全長ｃＤＮＡを多く含んだｃＤＮＡライブラリーを作製するために有用である。しかし、後者は、豊富に同定された５’末端は、真の転写開始部位であるという、はるかに高い確実性を与え、はるかに高率の全長クローン（９５％以上）を含有する可能性があるため、選択された全長ｃＤＮＡをキャッピングするためには、全長ｃＤＮＡを多く含むライブラリー（最高６０〜７０％のｃＤＮＡが全長である可能性がある）から識別することが重要である。したがって、我々は、「キャップ選択された」または「全長選択された」に言及する必要がある。
【００３７】
もう１つの重要な定義は、真の全長分子の５’末端を同定する、厳密な正確度である。真の全長方法は、完璧な正確度で転写開始部位（ＴＳＳ）を同定する。真の全長方法は、上掲されているが、最初の塩基は、ｃＤＮＡ中に存在し、他の配列、たとえば、リンカーまたは付加配列（たとえば、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８２年２月；２（２）：１６１−７０のオカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびベルグ（Ｂｅｒｇ）で使用された、キャップスイッチまたはテイリング手法（ｔａｉｌｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）で使用されたＧＧＧ）から切り離すことができる。
【００３８】
キャップスイッチは、単一細胞を含む、減少した量のサンプルの５’末端を捕捉するために使用できるが（ガスチンシッヒ（Ｇｕｓｔｉｎｃｉｃｈ）ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００４年４月６日；１０１（１４）：５０６９−７４．）、望ましくない配列（該ＧＧＧ）を付加し、これが該手法の有用性を減じる。たとえば、タグに基づくプロファイリングに５’末端ｃＤＮＡを使用するのであれば、その場合、その後の連結およびハイスループット配列決定のために２０塩基タグを生じさせるためにｃＤＮＡの５’末端が使用され（ハーベス（Ｈａｒｂｅｒｓ）およびカルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ），Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５年７月；２（７）：４９５−５０２によって概説されている通り）、こうした３塩基は、このようなタグにおけるｍＲＮＡの配列を不都合に置換するであろう。１７塩基は、哺乳動物のゲノムでは、めったに独特ではないが、２０塩基は、たいてい独特である傾向があるため、これは、ゲノム上へマッピングを大いに妨げるであろう、（タグの長さおよびマッピング能原理は、ハーベス（Ｈａｒｂｅｒｓ）およびカルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ），Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５年７月；２（７）：４９５−５０２の概説で検討されている）。
【００３９】
常習的なクローニング方法としては、ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）−ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）法（ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）およびホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ），Ｇｅｎｅ．１９８３年１１月；２５（２−３）：２６３−９）などがある。この場合、ｍＲＮＡの５’末端までｃＤＮＡが合成されるときでも、第２鎖の調製は、ＲＮａｓｅＨ切断、それに続くＤＮＡポリメラーゼＩによる第２鎖合成および得られたＤＮＡ断片の連結を必要とする。第２鎖の重合機構は、伸長可能な３’−ＯＨ基を有する、５’末端におけるプライマーを必要とする。これは、残存ＲＮＡにより提供されるが、最も上流の（キャッピング部位に近い）ｃＤＮＡをプライムするのに適当な３’−ＯＨ基はない。したがって、簡便なため、それ以外の点では魅力的である、ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）−ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）プロトコールを使用するとき、キャッピング部位を確認する、最初の１０〜５０塩基対は、失われる。該ｃＤＮＡは、事実、キャッピング部位にまで及ぶ第１鎖ｃＤＮＡの部分を除去しなければならない、エキソヌクレアーゼ処理後に、クローニングされる。この方法で得られるライブラリーは、準全長であるかもしれないが、真のキャッピング部位を決して確認しないため、全長ではない。
【００４０】
既存の方法の、この短い要約は、ｃＤＮＡクローニングまたはタギング手法のために、ｃＤＮＡ、または全長ｃＤＮＡを捕捉するために望ましい５’末端ｃＤＮＡを、効率よく作ることができる方法の欠如を浮き彫りにする。既存の方法は、全て組み合せた
−ナノグラム（ｎｇ）以下のＲＮＡから全長ｃＤＮＡを捕促することができる能力
−望ましくないホモポリマー・テイル（たとえばＧＧＧ）を付加しないこと
−正確な５’末端を捕捉すること
−損失をさけるために、１本の試験管内での簡便化されたプロトコール
−操作の簡便化されたプロトコール拡張性
に必要な、これらの特徴の少なくとも１つを欠く。
【００４１】
＜新規なワンチューブ（ＯＮＥ-ｔｕｂｅ）発明＞
用語「核酸」は、本書では、天然の核酸、人工的に合成または調製された核酸、自然発生的な事象により、または当業者に周知の手法を介して、少なくとも１つまたは複数の修飾が導入された、修飾された核酸を包含するためにも使用される。
【００４２】
同様に、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、ハイブリダイゼーションプローブとして、特異的に機能することが可能であり、そのようなものとして、本発明の目的上、またはこのようなプローブが関連核酸分子の検出に使用される実験で、このようなプローブおよび標的分子が、個々の位置における、自然発生的な突然変異または人工的に導入された突然変異によって識別可能な場合でも、「相補的な配列」として関連している。
【００４３】
我々は、全長ｃＤＮＡ単離、５’末端タグ単離、５’末端富化ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ単離およびこれらの記述に限定されない他の分析用途に適当な、全長ｍＲＮＡ分子の５’末端を代表する核酸に、１つの核酸を加える、ワンチューブ（ＯＮＥ−ＴＵＢＥ）構想という斬新な方法を開発した。該方法は、１本の試験管内に、ＲＮＡ、またはＲＮＡの混合物に添加される一連の試薬を有することに基づく。
【００４４】
これらのｍＲＮＡは、細胞、組織、またはＲＮＡを含有する任意の他の生物学的ソースに由来してもよい。一実施形態では、これらのＲＮＡは、ヒト、動物または植物組織または細胞系に由来し、また全ＲＮＡ、またはサイズ、ＲＮＡ特徴（たとえば：大部分のｍＲＮＡにおけるポリＡテールの存在）のいずれかで選択された、ＲＮＡ画分、細胞コンパートメント（たとえば、核ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、ポリソームＲＮＡ、膜結合ポリソームＲＮＡ、および他のリボ核タンパク質複合体に属するＲＮＡ）で構成されていてもよい。
【００４５】
別の実施形態は、ＲＮＡは、血液または血清等の、他の生体液に由来してもよい。たとえば、ＲＮＡは、個人の血液からのウイルスＲＮＡまたは他の潜在的寄生生物を含んでもよい。こうしたｍＲＮＡの５’末端を捕捉することにより、潜在的寄生生物の診断が可能になるであろう。
【００４６】
別の実施形態では、ＲＮＡは、切断された組織からフローソートされた細胞を含む精製細胞から得られる。これらは、フローソーティングにより選択可能な蛍光抗体で標識された細胞、または哺乳動物の実験で頻繁に使用される、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）等の、マーカーの遺伝子導入発現によって標識される細胞のいずれであってもよい。
【００４７】
代替の、これらの細胞は、レーザー・キャプチャー・マイクロディセクションにより、それらの形態または他の標識に基づいて選択することができる。
【００４８】
これらは、この出願のためにＲＮＡを抽出するための唯一の方法ではなく、本発明の潜在的利用性に関する例にすぎない。
【００４９】
本発明は、ＲＮＡが、「核酸」で特異的に標識されるまで、１本の試験管内で、該ＲＮＡの５’末端に試薬を加えることに基づく。該ｍＲＮＡは、キャッピング部位を有することで知られ、この場合、このキャッピング部位は、別の核酸分子、一般的には、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド（しかし、ＲＮＡ／ペプチド核酸ハイブリッド等の、他の核酸が適当なこともある）で選択的に置換されるであろう。該ＲＮＡの５’末端に付いた核酸は、一般的なＤＮＡ配列決定作業で既に使用されている核酸のα−チオ誘導体等の、非通常の塩基および非通常のバックボーンの組込を含む、様々な方法で修飾することが可能である。こうした核酸は、さらなる選択のための標識された色素（ｄｉｅｓ）、および他の結合基、たとえばビオチンまたはジゴキシゲニンも含んでもよい。換言すれば。
【００５０】
ｍＲＮＡの５’末端に付いた核酸配列は、長さに制限はないが、ほとんどのアプリケーションで、能率的なプライミングを可能にするために、少なくとも１５ヌクレオチド長、かつ１００塩基以下になるように都合よく構築されるが、これは、オリゴヌクレオチド合成に難題を突きつける。しかし、これらは結果に対する制限ではなく、付帯的な操作（たとえばプライミング）およびオリゴヌクレオチドＲＮＡ合成の実際的制限である。
【００５１】
ＤＮＡの５’末端を結合する核酸は、一本鎖であろうが、部分的に完全に二本鎖核酸でもある。部分的二本鎖は、ある一定の条件で（シバタ（Ｓｈｉｂａｔａ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００１年６月；３０（６）：１２５０−４に記載されているような）、付加したヌクレオチドによるｍＲＮＡの５’末端の誘導体化に役立つ。
【００５２】
結局、ＲＮＡの５’末端を結合する、こうした核酸は、単一型の分子であってもよく、多数の異なる核酸であってもよい。
【００５３】
一実施形態では、標的ＲＮＡを、１本の試験管内に入れ、サンプル精製を必要とせず、３つの理論的に異なるステップに付す：（１）非全長ｍＲＮＡ分子のマスキング、（２）キャッピング部位分子の反応性分子への変更、および（３）処理されたＲＮＡ分子の、プライミング核酸への付着。
【００５４】
酵素、または酵素活性を示すためにここで使用される用語は、このような成分の作用または活性を記述するために本明細書で使用されるが、このような成分が完全に純粋であることを必要としない。したがって、このような酵素、酵素活性、またはそれらと他の成分との混合物を含有する混合物、関連した作用または関連のない作用は、本発明の範囲内である。
【００５５】
＜オリゴキャッピングのための伝統的なプロトコールの限界および原理＞
上記反応（１）〜（３）は通常、オリゴキャッピングプロトコールで、各ステップにおける、プロテアーゼ消化および／またはフェノールおよび他の有機溶媒抽出に続くアルコール沈殿による、徹底的な精製によって実行される。代替の、かつ毒性の低い方法を使用できるが、全ての精製ステップが、許容できないサンプル損失を引き起こす。有機（フェノール、クロロホルム）抽出およびその後のエタノール沈殿の間に少量のＲＮＡが失われるため、このような理由で、この手順（標準オリゴキャッピング方法としても知られる）は、非常に低いＲＮＡ濃度で使用できなかった。
【００５６】
このような冗長かつ面倒な抽出は、異なるｐＨ、バッファーおよび条件で作用する酵素の使用、および次のステップで、当然の妨害でそれらを不活化できないことによって得られる。たとえば、上記ステップ（１）は、約ｐＨ８のアルカリ性で作用する、細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）を必要とした。上記ステップ２に進む前に、この酵素を不活化しなければならない。不活化されれば、ステップ２で得られる全長ｍＲＮＡからリン酸基を除去するであろう（以下参照）。しかし、６５℃での穏やかな熱ショックで、ＢＡＰを熱不活化することはできないため、これは容易に達成されない。代わりに、６５℃におけるＢＡＰの至適活性（ｐＨ８で、ＲＮＡアルカリ分解も引き起こすであろう）。したがって、他の以前の研究は、有機抽出を必要とした。
【００５７】
ステップ２では、該キャップが、タバコ酸ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）で除去され、次いでｐＨ６で使用される。ＴＡＰは、５’末端で未変性であるＲＮＡ（これはｍＲＮＡを含むが、新規な非コードＲＮＡ群も含む）のキャップ構造を除去し、代わりにリン酸基を残す。ステップ１および２の後、リン酸を含む分子のみが全長ＲＮＡ分子、または少なくとも無傷の配列およびそれらの５’末端を担持する他の分子に対応する。その他のＲＮＡ分子の全てが、反応（３）の基質ではない、５’末端にＯＨ基を含む。ＴＡＰは、ステップ３におけるＲＮＡリガーゼに必要な基質であるＡＴＰを分解することにより、このステップを妨害するため、ステップ１〜３が行われる前に、不活化されなければならない（以下参照）。したがって、やはりこのステップの最後に、時間がかかり、かつサンプルの損失を引き起こす、有機抽出および次の沈殿を必要とする。
【００５８】
反応番号３は、ＲＮＡリガーゼである。酵素ＲＮＡリガーゼは、５’末端にて、ＲＮＡ分子，またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ分子を付加する。記述の通り、ＲＮＡリガーゼは、全長ＲＮＡ５’末端と付加される核酸（通常はオリゴヌクレオチド）の３’末端ＯＨ基との間の連結を触媒するために必要なエネルギーを提供するために、基質としてのＡＴＰを必要とする。この反応は、様々な温度で、通常はＤＮＡ損傷を最小限に抑えるために低温で、ｐＨ７．５または８で実施される。
【００５９】
＜反応（１）〜（３）の上記制限の克服＞
我々の方法で、我々は、（ａ）他の核酸精製ステップに代えることなく、時間がかかる、サンプル損失を引き起こす、または高価であるため、歓迎されない、フェノール／クロロホルムおよびエタノールを用いた多数の抽出／精製ステップの必要条件をいかにして克服するかという構想を紹介する。（ｂ）我々は、多数のバッファー変更の必要条件をいかにして克服するかという構想を紹介し、また（ｃ）我々は、溶液から除去せずに、酵素を不活化する条件を確認することによって該酵素を変化させる必要をいかにして克服するかという構想を紹介する。これによって、少量のサンプルで機能させることも可能なためやはり有用である、「ワンチューブ」全長ＲＮＡ連結を可能にし、あらゆるサイズのサンプルで研究所操作を簡略化することができ、また人件費および材料費を節減する。
【００６０】
１本の試験管内で、反応（１）〜（３）を可能にするために我々が講じた方策は、次の通りである。
【００６１】
１）一般的な研究室手順に反して、我々は、減少したバッファー濃度および塩分濃度で十分に機能する、この方法の初めに使用される酵素を含む、方法を確認した。
２）我々は、バッファーおよびモディファイア・バッファー（ｍｏｄｉｆｉｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ）を含む、一連の条件を使用する構想を打ち立てた。これは、全ての酵素に驚くほど最適な、ステップ（１）〜（３）を通してバッファー濃度の漸増を可能にする。換言すれば、我々は、テストして、残存する微量のバッファー、および上流反応からの不活化された酵素は、下流反応を阻害しないことが分かった。
３）酵素組合せを含みかつステップ（１）および（２）で必要な酵素をステップ３の間に不活性にさせることを可能にする条件を使用する構想を打ち立てた。
４）原初のオリゴキャッピング方法の場合と同様に、精製されたｍＲＮＡ画分の代わりに総ＲＮＡを使用するときも、該方法を可能にするために、我々は、このような組合せの試薬が、十分に高い効率で機能する条件を使用する構想を打ち立てた。これにより、非常に少量のＲＮＡからでもｃＤＮＡを得ることが可能になった。
５）我々は、二価金属をしばしば含有しているバッファーの存在下、高いｐＨでＲＮＡを加熱したとき、さらなる問題点であるため、酵素不活化中に６５℃でＲＮＡが分解されないことにより、最適バッファー条件およびｐＨ条件を発見するための条件を使用する構想を打ち立てた。
【００６２】
一実施形態では、熱感受性である、酵素ホスファターゼを首尾よく使用する。好ましくは、我々がステップ１で使用したのは、ステップ１の後、不活化に有用な高温でも、ＲＮＡを損傷しないバッファー中、６５℃で不活化することができるアンタークティック・ホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）であるが、この酵素に限定されない。このようなバッファーは、結果として７．５より低いｐＨになり、二価イオンを欠いていた。特に、こうした要件に合う低塩分酸性バッファーは、特に有用であろう。該ホスファターゼの不活化後、さらに精製せずに、ピロホスファターゼ活性または同等の活性の付加を含む、次の反応と相性のよい修飾されたバッファー。好ましくは、我々はＴＡＰ酵素（実施例１参照）を使用してきた。反応後、本発明は、たとえば、ＲＮＡを損傷しない別のバッファー中での熱不活化による、ＲＮＡを分解しない、ピロホスファターゼ活性の不活化に言及する。最終的に、および我々は、外因性核酸を該ＲＮＡの５’末端に連結するために、酵素の活性に合う条件を作り出す。別のモディファイア・バッファーを添加することにより実現することが可能である。添加される外因性核酸は、様々なタイプのものであってもよいが、たとえば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドであってもよい。ｍＲＮＡの５’末端への、外因性核酸の付加を実施するために好ましい酵素は、優先的に核酸リガーゼである。これは、ＤＮＡリガーゼであってもよいが、優先的にＲＮＡリガーゼ、たとえばＴ４ＲＮＡリガーゼまたは他の熱安定性ＲＮＡリガーゼである。これは、たとえば、オリゴヌクレオチドでＲＮＡをタギングする最終ステップを推進できる。好ましい実施形態では、我々は、低濃度で穏やかな酸性のバッファーを使用することによって、該方法を通してＲＮＡを分解しない。
【００６３】
このような修飾されたＲＮＡは、次いで、様々な下流用途に使用することができる。１つの用途では、全長ｃＤＮＡは、３’末端テール上のＲＮＡをオリゴｄＴプライマーでプライミングすることによって得ることができる。５’末端オリゴヌクレオチドに達する分子のみが、第２鎖ｃＤＮＡのためにプライミングされることができ、したがって、５’末端および３’末端の両者を含むｃＤＮＡを得る。次いで、標準手順にしたがって、こうした全長ｃＤＮＡを、さらに処理してクローニングすることができる。
【００６４】
タギング核酸は、さらなる機能的適用を可能にする、様々な配列部分を担持することができる。たとえば、タギング核酸は、制限酵素を含むことができ、またポリメラーゼ配列または組み換え配列を含むことができる。こうした配列は、核酸ハイブリダイゼーション、タンパク質−エピトープ相互作用、または任意の他の化学的相互作用を用いて、ＲＮＡ／核酸ハイブリッド、およびその誘導体のさらなる精製にも使用することができる。核酸または誘導体を結合する方法は、例としての引用に過ぎず、上記方法に限定されない。
【００６５】
あるいは、該５’末端オリゴヌクレオチドは、クラス−ＩＩｓ制限酵素の制限部位を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドであってもよい。こうした酵素は、配列を認識するが、それらの認識配列外で切断する；適切にデザインすれば、クラスＩＩｓ制限酵素ＭｍｅＩは、ｃＤＮＡ内部で２０／１８塩基を切断して、５’末端タグ（別名５’−ＳＡＧＥまたはＣＡＧＥ）を作ることができる（参考文献：ハシモト（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ）ら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４年９月；２２（９）：１１４６−９；コジウス（Ｋｏｄｚｉｕｓ）ら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６年３月；３（３）：２１１−２２）。この実施形態では、該５’末端タグを単離して結合し、ハイスループット配列決定用のコンカテマーを形成する；コンカテマーは、費用効果がはるかによい配列決定の利用を可能にする。こうしたコンカテマーは、ピロシーケンスに基づく４５４ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）配列決定機のプロセスに適当なリンカーを用いた連結後、直接に配列決定してもよく、またサンガー法または任意の適切なシーケンサーによる従来の配列決定に適するプラスミドクローニングベクター、たとえばインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手可能なｐＺｅｒｏプラスミド等に、クローニングしてもよい。本発明による「タグ」は、本発明の方法で調製されるような、核酸分子の任意の領域であってもよく、ここで、本書で使用される用語「タグ」は、それが天然の核酸、人工的に合成または調製された核酸、自然発生的な事象によって、または当業者に周知の手法を介して、少なくとも１つまたは複数の修飾が導入された、修飾された核酸に由来しようと、核酸断片を包含する。さらに、用語「タグ」は、ある特定の配列情報またはそれらの組成ではなく、核酸分子それ自体に関連する。
【００６６】
一実施形態では、第１鎖プライマーは、オリゴｄＴプライマーであってもよいばかりではなく、３’位に、ランダム配列、たとえば６または９ランダム塩基を含むプライマーであってもよい。この核酸プライマーは、その５’末端に、次には特異的プライミングに使用することができる配列特異的オリゴヌクレオチドも含んでもよい。
【００６７】
別の実施形態では、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）として知られるプロトコールで、真実の５’末端配列を決定するために、このような修飾されたＲＮＡを使用することができ、通常のｒａｃｅ手順よりはるかに速いという明白な利点がある。
【００６８】
代替実施形態では、こうした修飾されたＲＮＡ分子を、直ちに、またはそれらの修飾後、たとえば第一鎖全長ｃＤＮＡへの転写後に、固体支持体に結合することができ、またこのような固体マトリックスに固定された後、次の操作、たとえばこうしたＲＮＡ分子の一次配列を理解するために、さらに使用することができる。
【００６９】
別の実施形態では、５’末端を、ＲＮＡポリメラーゼ等の、ポリメラーゼ用のプロモーターを担持する核酸と結合する。これによって、ハイブリッド分子、またはそれらの誘導体が、ＲＮＡ転写を推進し、したがって、独自の分子またはその一部を複製することが可能になる。この分子は、ＲＮＡ分子の一部または完全なＲＮＡ分子を含んでもよく、またさらなる核酸配列も含んでもよい。
【００７０】
次いで、ｃＤＮＡ作製または５’末端発現プロファイリングのために、技術者に、再生可能な方法でｍＲＮＡの５’末端を単離させるために、この方法を使用して、数ある成分の中でも特に、適切なｐＨの試薬（化学薬品）および組合せ、核酸および酵素を含むキットを製造することができる。
【００７１】
別の実施形態では、本発明は、一本鎖ならびに二本鎖ＤＮＡ分子を取り扱う方法を包含する。二本鎖ＤＮＡは、それぞれが、デオキシリボヌクレオチドにより形成された２本のポリマーで構成され、該２本のポリマーは、会合してダイマー分子を形成することを可能にする互いに実質的に相補的な配列を有する、核酸分子を意味する。該２本のポリマーは、デオキシリボヌクレオチド内の、適合する塩基対間で形成される特異的水素結合により互いに結合している。会合するための適合する相補的ＤＮＡ分子を持たない、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドによって形成される１本のポリマー鎖のみで構成されるＤＮＡ分子は、たとえ、このような分子が、二本鎖ＤＮＡ部分を含む二次構造を形成する可能性があっても、本発明の目的上、一本鎖ＤＮＡ分子であると考えられる。本明細書で同義的に使用されるとき、用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖、コードまたは非コード、相補的または相補的でない、およびセンスまたはアンチセンスと関係なく、ＲＮＡまたはＤＮＡを含み、またそれらのハイブリッド配列も含む。特に、用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、転写されるまたは転写されない、スプライシングされるまたはスプライシングされない、不完全にスプライシングされるまたはプロセッシングされる、その起源から独立している、体材料からクローニングされる、または合成を用いて得られる、ゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡを包含する。
【００７２】
異なる態様において、本発明は、分析のために、核酸分子から断片を単離する方法に関する。したがって、本発明は、１つまたは複数の核酸分子を含むサンプルの変換に関し、その場合、このような核酸分子または核酸分子の混合物は、ＤＮＡに変換されるであろう。本発明を実施するために、核酸分子は、天然のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡサンプル、人工的な起源のものである、既存のＤＮＡライブラリーに由来してもよく、またはそれらの混合物である。本発明は、個々の核酸分子または複数の核酸分子の使用に限定されないが、本発明は、このような複数性が自然に生じるかどうかとは無関係に、刺激的なライブラリーに由来するか、または人工的に作られる、個々の核酸分子または複数の核酸分子で実施することができる。さらに、本発明は、その起源または性質と関係なく、あらゆる核酸分子を処理することができる。したがって、天然の核酸分子と比較するとき、該核酸分子は全長分子、またはその断片であり得ることは、本発明の範囲内である。その上さらに、ランダム・プロセッシングにより、またはある一定の配列を優先して酵素活性を用いた核酸分子の標的化された解析（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）により、または転写領域内のエキソンおよびイントロンを含むが、それには限定されない核酸分子の構造に基づく断片化を可能にするであろう手段によって、このような核酸分子断片を調製できるであろうことは予見できる。したがって、本発明は、ある特定の出発材料の使用に限定されない。本発明は、ＤＮＡのみの使用に依存せず、技術に精通している人は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）Ｄ．Ｗ．，前掲（これによって、参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている手法を含むがその限りではない、ＲＮＡをＤＮＡに変換するための異なる手法を知るであろう。ＲＮＡをＤＮＡに変換した後、原初のＲＮＡと同じまたは相補的な配列を有する一本鎖または二本鎖のＤＮＡ分子、上述のｃＤＮＡを得ることができる。このようなｃＤＮＡ分子は一般に、線状ＤＮＡの形で調製され、その場合、２つの開放端は、それらの操作を可能にする。しかし、ｃＤＮＡがベクターにクローニングされる場合でも、本技術に訓練された人は、このようなベクターから挿入物を放出させて、線状ＤＮＡに変換するために必要な手段について知っている。
【００７３】
別の実施形態では、上述の、ＲＮＡの５’末端におけるプライミング部位の導入を使用して、結果として生じる核酸を、その後結合する。配列の一部を、ＲＮＡを表面に結合するために使用し、また別の部分を、配列決定の準備をするために使用することにより、このようなオリゴヌクレオチドを、操作および分析のためにＲＮＡ分子を特異的に捕促するために使用する。あるいは、該オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、または結果として得られるｃＤＮＡを、表面に連結するための、また解決に向けて、既知の配列のプライマーを配列決定した後、得られた結果を直接配列決定のために使用するための、タグとして使用することができる。このような捕捉された核酸は、配列決定、複製、増幅ならびに化学的および酵素的修飾を含むが、これに限定されない、さらなる操作および分析のために使用することができる。
【００７４】
あるいは、複合型５’ＲＮＡ／ＲＮＡからの第一鎖ｃＤＮＡからなる核酸は、さらなる固相操作、たとえば単一分子配列決定のために、そのまま、またはハイブリッドヌクレオチドを介して、固体マトリックスに結合することができる。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、得られた核酸ハイブリッドを、単分子レベルで直接重合および配列決定反応をプライムすることができる別の固定されたプライマーで捕獲する。これにより、前例のない配列決定スループットを、１つの細胞上に適用することができる。
該配列の、該ｍＲＮＡの５’末端に対応する核酸への結合は、必ずしも核酸リガーゼに依存せず、全長ｃＤＮＡを捕促する他の方法、たとえばビオチン化したキャップトラッパー群の技術（カルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）およびハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９；３０３：１９−４４）または他の同等の方法で行えることに注目することは重要である。
【００７６】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドの非存在下で、該ＲＮＡを自己連結させることができるが、該リボソームＲＮＡ（過剰）は主として、脱リン酸化および脱キャッピング後にｍＲＮＡの５’末端を連結する。該リボソームのＲＮＡ配列部分は、重合のプライミング、物理的固定または単離のための他の核酸の結合を含むが、それに限定されない、第２鎖ｃＤＮＡのプライミングおよび誘導核酸のさらなる精製のために使用することができる。次いで、これらを、４５４ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）配列決定機のような超並列的シーケンサー用の基質として使用することも可能であろう。
【００７７】
さらなる実施形態では、核酸の、ＲＮＡ分子の５’末端への結合に由来する核酸が、直接配列決定反応に使用されるであろう。これは、本特許で請求される方法に対する制限ではなく、利用できる全長捕促法のいずれかで得られるであろう。好ましい実施形態では、該核酸は、（マーガリーズ（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ）ら，Ｎａｔｕｒｅ．２００５年９月１５日；４３７（７０５７）：３７６−８０．）に記載されている、単一分子エマルジョンＰＣＲ増幅に適する２つの異なる配列を含む。
【００７８】
さらなる実施形態では、ビオチンの場合には、ストレプトアビジンまたはアビジンであろう、マトリックスにさらに結合するために、該核酸の全５’末端を含む情報を担持する核酸を、ビオチン、または他の反応性化学基等の部分で標識する。他の反応性化学基をカップリングに使用できるため、これは、これに限定されない。このような補足された核酸は、次いで、配列決定、複製、増幅ならびに化学的および酵素的修飾を含むがその限りではない、さらなる操作および分析に使用される。
【実施例１】
【００７９】
＜５’−由来のＲＮＡ分子のライブラリー作成＞
この実施例は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いた、ＲＮＡ分子の５プライム末端の誘導体化のための代表的なプロトコールである。全ての反応は、シリコン処理した５００μｌマイクロチューブ中で、核酸損失を避けるために毎回シリコン処理したチップを使用して、実施される。
【００８０】
ＲＮＡサンプルを、先ず脱リン酸化する。ＲＮＡ（たとえば１ｎｇ〜１μｇ）を、２μｇのグリコーゲンと一緒に、総体積５μｌで、チューブに入れる。反応バッファーは、通常濃度の１／１０であり、すなわち、５ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−プロパン−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１ｍＭ  ＺｎＣｌ2、２５℃でｐＨ６．０である。グリコーゲンは、操作中に、ＲＮＡがプラスチックに付着するのを避けるのに役立つ。サンプルを、６５℃で５分間変性させて、後で除去されるリン酸基を露出させ、３７℃に２分間保った後、アンタークティック・ホスファターゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））（２．５単位）を加える。サンプルを３７℃で３時間〜一晩処理する。一晩脱リン酸化により、リン酸基の９８〜９９％を除去することが可能になる。最終濃度０．６Ｍのトレハロースの存在下、４５℃で、短時間のインキュベーションも実施でき、これが、４５℃における活性を高める。
【００８１】
次いで、アンタークティック・ホスファターゼを６５℃で不活化させるが、これを行う前に、二価イオンをキレート化しなければならない。このため、（０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％β−メルカプトエタノール、および０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００）の溶液０．５５μｌを加える。この酵素は、二価イオンをキレート化し、次のＴＡＰ処理に適当な環境を作り出す。該アンタークティック・ホスファターゼはまた、バッファーのＥＤＴＡによっても阻害される。最終的な不活化は、６５℃で５〜１５分間実施される。
【００８２】
これに脱キャッピングが続くが、タバコ酸ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）０．２μｌ（２単位）の単純付加である。また、２０単位／実験まで、ＴＡＰを増量することも可能である。該反応は２時間実施され、続いて、このバッファー中、６５℃で１５分間、熱不活化が行われ、その後、サンプルを氷上に動かす。場合により、ベタイン（１Ｍ）も加えてもよく、これは、ＧＣが多く含まれるＲＮＡ中の二次構造を融解するのに役立つが、これは任意である。この処理後は、ＴＡＰはもうＡＴＰを分解しない。ＡＴＰは、次のステップに必要である。次いで、任意の配列の「キャッピングＲＮＡ」オリゴヌクレオチド、たとえば[…ａｄｄ]を、５μＭオリゴヌクレオチドの濃度で加えることによって、連結が実施される。Ｔｐ６．７５μｌの反応、２μｌのＲＮＡリガーゼ（５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（２５℃でｐＨ８.０）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ）を加える。ＤＴＴは、ＴＡＰを阻害する。場合により、１ｍＭ濃度でヘキサアミノコバルト・クロリド（ＨＣＣ）も加えてもよいが、これは任意であり必要ではない。次いで、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）を最終濃度２５％で加え、ＡＴＰを１２５μＭ濃度で、最後に１０単位のＴ４ＲＮＡリガーゼを加える。このような条件で、結果として生じる先のバッファーの混合物は、連結ステップに対して抑制的ではない。
【００８３】
次いで、該サンプルを、２０℃で２時間〜一晩（１６時間）連結する。このとき、該ＲＮＡは、オリゴヌクレオチドでキャップされ、これを、全長ｃＤＮＡ調製等の、他の実施例に載っているような異なるテストに使用することができる。
【００８４】
様々なステップにおける各酵素の活性およびバッファーを図２に示す。
（Ａ）：アンタークティック・ホスファターゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））の活性の評価。５’リン酸化オリゴリボヌクレオチドは、下記のバッファー中、３７℃で１２０分間脱リン酸化した（１）：アンタークティック・ホスファターゼ（ＡＰ）１×。（２）：ＡＰ  ０．５×  （３）：ＡＰ  ０．１×  （４）：Ｈ２Ｏ  （５）：タバコ酸ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）  ０．１×  （６）：ＴＡＰ  ０．５×  （７）：ＴＡＰ  １×  （８）：ＴＡＰ  ０．５×  ＋  ＡＰ  ０．５×。次に、該オリゴリボヌクレオチドを、Ｔ４キナーゼおよびγ−３２Ｐ−ＡＴＰで放射標識し、ＰＡＧＥで分析した。先の脱リン酸化がなければ、５’リン酸のため、放射標識は不可能である。ポジティブコントロール（９）：５’ＯＨオリゴリボヌクレオチド。ネガティブコントロール（１０）：５’リン酸化オリゴリボヌクレオチド。ＡＰバッファー：ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により提供された。ＴＡＰバッファー：エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）により提供された。
【００８５】
（Ｂ）タバコ酸ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ））の活性の評価。γ−３２Ｐ−ＡＴＰを、下記のバッファー中で、２Ｕ  ＴＡＰ（コントロールレーン２、５、および７を除く）とインキュベートした（１）：Ｈ2０  （２）、（３）および（４）：ＴＡＰ  １×  （５）、（６）および（７）：Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ  １×  （ファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））  ＋  ＴＡＰ  ０．２５×  ＋  ＡＰ  ０．２５×。ネガティブコントロール：（２）および（５）、酵素なし。熱不活化コントロール（７）：ＴＡＰを１５分間加熱してから、放射性ＡＴＰとインキュベートした。該ＡＴＰは、レーン３および４（反復）ではＴＡＰにより分解されたが、他のバッファー中または熱不活化後は、分解されなかった。
【００８６】
（Ｃ）微量のＡＰおよびＴＡＰバッファーの存在下での、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（ＲＮＬ、ファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））の活性の評価。放射標識したオリゴリボヌクレオチドを、非標識オリゴリボヌクレオチドの存在下でインキュベートした。連結は、ポリアクリルアミドゲルにおける電気移動度のシフトをもたらす結果となった。反応は、ＡＰ、ＴＡＰおよびＲＮＬの存在下および非存在下で行われた。（１）：ＡＰ、ＴＡＰ、ＲＮＬ  （２）：ＴＡＰ、ＲＮＬ  （３）：ＡＰ、ＲＮＬ  （４）：ＡＰ、ＴＡＰ  （５）：ＲＮＬ  （６）：ＴＡＰ  （７）：ＡＰ  （８）：酵素なし。連結は、混合バッファー中で起こり、またＴＡＰの残りで損なわれない。
【実施例２】
【００８７】
＜実施例１における上記ワンチューブでキャップされたｍＲＮＡからの全長ｃＤＮＡの製造＞
製造業者（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））による記載通りにマイクロコンＹＭ−１００フィルターを使用して、上記のようなサンプルを脱塩することができる。連結されたＲＮＡに、水およびインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により得ることができる逆転写酵素（ＲＴ）プライマーを加える。反応２０μｌに対して、プライマーＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＣＣＵ  ＣＧＡ  ＧＣＣ  ＵＡＧ  ＧＵＣ  ＣＧＡ  Ｃ  ８００ｎｇ（配列番号１）を使用し、ソルビトール−トレハロース混合物３μｌを加える（３．３Ｍ  原液、最終ＲＴ反応を行うとき、最終濃度０．５Ｍソルビトールおよび４％トレハロース。ＲＮＡ−プライマー混合物を、６５℃で１０分間加熱し、次いで、残りの試薬を調製するとき氷上保存する。次いで、２×  ＧＣバッファー（カルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ），シラキ（Ｓｈｉｒａｋｉ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載）１１μｌ、次いで１０ｍＭ  ｄＮＴＰ原液１μｌ、および最後に、ＭＭＬＶ逆転写酵素（リボヌクレアーゼＨマイナス（Ｒｎａｓｅ  Ｈｍｉｎｕｓ），ファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）１μｌを予め混合する）。該ＧＣバッファー系は、製造業者が推奨するバッファーで代替することができる。この反応をＲＮＡサンプルと混合し、２５℃で２分間（サンプルをアニールするため）、４２℃で３０分間、５２℃で１０分間、５６℃で１０分間、インキュベートしてから、反応を止める。この方法で、原初のｍＲＮＡの５’末端に及ぶｃＤＮＡが高頻度で得られる。これをさらに精製／処理することができる。たとえば、プロテイナーゼＫで処理することができる（最終濃度１０ｍＭ  のＥＤＴＡと一緒に、２０μｇ添加、続いて９５℃で１５分間、ＲＮＡおよびプロテイナーゼ不活化）。次いで、このサンプルをＣｌ４Ｂ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）−ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に使用して、サイズを分画したり、プライマーを除去したりすることができる。
【００８８】
次いで、ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅する。該ｃＤＮＡに、タカラ（Ｔａｋａｒａ）ＥＸ−タグ・バッファーを、最終濃度１×で加え、次いで、ｄＮＴＰ（最終濃度：それぞれ２００μＭ）、５’オリゴヌクレオチド（配列：ａｃｃ  ｔｃｇ  ａｇｃ  ｃｔａ  ｇｇｔ  ｃｃｇ  ａｃ；配列番号２）および３’末端オリゴヌクレオチド（配列：ｃａ  ｇｃｇ  ｔｃｃ  ｔｃａ  ａｇｃ  ｇｇｃ  ｃｇｃ；配列番号３）（各オリゴヌクレオチド、濃度４００ｎＭ）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、および最終濃度５０ｍＭのＫＣｌを加える。成分を、ホットスタートで、次いで５分間後に９４℃で混合し、サンプルを９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および６８℃で１．５分間を、３０サイクル、インキュベートした。これによって、完全で、かつ標準技術に従って平滑末端化して、プラスミドベクターにクローニングすることができる、５’末端ｃＤＮＡが生じる（分子クローニングおよび配列決定に関する一般的情報については、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、参照）。
【００８９】
この方法で単離されたｃＤＮＡクローンの完全５’末端配列の１例をここに示す（配列番号４）：
>１ ｔｇｔａａａａｃｎａｃｇｇＣＣａＧｔＧａＡＴｇｔａａａＡＣＧＡＣＧｇｃＣＡｇｔＧＡＡＴｔｇＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡｇｇｇＣｇａａＴｔＧｇｇｃｃｇｃｔＡｃｃｇｇｃｃｇｃｃａｔｇｇｃｃｇｃｇｇｇＴａｔｔａｃｃｔｃｇａｇｃｃｔａｇｇｔｃｇａｃａｃｃｔｃｇａｇｃｃｔａｇｇｔｃｃｇａｃａｔｃｇｃｔｔｃｔｃｇｇｃｃｔｔｔｔｇｇｃｔａａｇａｔｃａａｇｔｇｔａｇｔａｔｃｔｇｔｔｃｔｔａｔｃａｇｔｔｔａａｔａｔｃｔｇａｔａｃｇｔｃｃｔｃｔａｔｃｃｇａｇｇａｃａａｔａｔａｔｔａａａｔｇｇａｔｔｔｔｔｇｇａａｇｔａｇｇａｇｔｔｇｇａａｔａｇｇａｇｃｔｔｇｃｔｃｃｇｔｃｃａｃｔｃｃａｃｇｃａｔｃｇａａｃｃｔｇｇｃｇＧｃｃｇｃｔｔｇａｇｇａｃｇｃｔｇｔｇｃｇａｇｇｔｇｇｔｇｔｇｔｔｇａｇｔａｇｃｇｔｇｔｃｇｔｇａａｔｃａｃｔａｇｔｇｃｇＧｃｃｇｃｃｔｇｃａｇｇｔｃｇａｃｃａｔａｔｇｇＧａｇａｇｃｔｃｃｃａａｃｇｃｇｔｔｇｇａＴｇＣａＴａｇＣＴｔｇａｇｔａｔｔｃＴＡｔａｇｔｇｔｃａｃｃｔａａａｔａｇｃｔｔｇｇｃｇｔａａｔｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃｔｇｔｇｔｇａａａｔｔｇｔｔａｔｃｃｇｃｔａ
【００９０】
これは、ベクター配列（１〜１０４）、複製された５’プライマーおよびＵ２  ｓｎＲＮＡ（キャッピングされた、塩基１４５〜２９７を形成）に続いて、３’プライマー（ＡＣＴＣＡＡＣＡＣＡＣＣＡＣＣＴＣＧＣＡＣＡＧＣ；配列番号５）、およびベクター配列を含む。
【実施例３】
【００９１】
＜ＲＡＣＥ実験への適用＞
キャッピングされたＲＮＡは、下記の通りＲＮＡオリゴヌクレオチドが異なる配列を有するという唯一の違いはあるが、実施例１の場合と同様に調製することができる。実施例１の方法に続いてＰＣＲを使用することにより、５’末端ＲＡＣＥ増幅（５’末端の急速増幅）することが可能である。実験は、以下の通りに実施した。肝臓からの総ＲＮＡ  ５００ｎｇを、ワンチューブ・オリゴ・キャッピングに付し、続いて、未反応のオリゴリボヌクレオチドを除去し、ランダムプライマーで逆転写した。５’末端を、遺伝子特異的プライマー（ＴＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＴＴＴＣＧＡＣＧＡＧＴＣＡ；配列番号６）およびオリゴ−キャップに相補的なプライマー（ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ；配列番号７）で増幅した。
【００９２】
実験を、図３に示す。（１）：ワンチューブ（ＯＮＥ−Ｔｕｂｅ）キャッピング後のフェノール−クロロホルム精製。（２）：ワンチューブ（ＯＮＥ−Ｔｕｂｅ）キャッピング後のマイクロコンＹＭ−１００（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））精製。（３）ワンチューブ（ＯＮＥ−Ｔｕｂｅ）キャッピング後のフェノール−クロロホルム精製、ワンチューブ（ＯＮＥ−Ｔｕｂｅ）キャッピング中はＴＡＰなし。（４）ＰＣＲ反応のネガティブコントロール。
【実施例４】
【００９３】
＜４５４または他のマトリックスへの適用＞
実施例１および２の場合と同様に、ｃＤＮＡを調製する。しかし、実施例４用に調製するオリゴヌクレオチドは、該ＲＮＡの３’および５’末端に異なるアダプターを有するために、丁寧にデザインされている：（アダプターＡ：ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＡＧ（配列番号８）；アダプターＢ：／５ＢｉｏＴＥＧ／ＣＣＵＡＵＣＣＣＣＵＧＵＧＵＧＣＣＵＵＧＣＣＵＡＵＣＣＣＣＵＧＵＵＧＣＧＵＧＵＣＵＣＡＧ（配列番号９））。アダプターＢは、「オリゴ・キャッピング」配列として使用され、Ａは、第一鎖合成のためにオリゴ−ランダムプライマーに結合するために使用される。第一鎖合成後、材料を、Ｃｌ−４Ｂスピンカラムを通過させて、過剰の未反応プライマーを分離する。次にサンプルを、エマルジョン−ＰＣＲに、次いで４５４−ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）配列決定機に関する記述（マーガリーズ（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ）ら，Ｎａｔｕｒｅ．２００５年９月１５日；４３７（７０５７）：３７６−８０）通りに配列決定反応に付す。これによって、１回の実行で数十万の配列を獲ることが可能になる。
【実施例５】
【００９４】
＜５’末端配列決定タグへの適用＞
実施例１および２の場合と同様にｃＤＮＡを獲て、（コジウス（Ｋｏｄｚｉｕｓ）ら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６年３月；３（３）：２１１−２２）に記載されているような、当業者に明白な標準プロトコールを使用して第２鎖ｃＤＮＡが獲られるまでサンプルを処理する。次いで、ｃＤＮＡをＭｍｅＩで切断し、続いて第２リンカーの付加、増幅、精製およびコンカテマーの作製を行う。このよう手順に関する詳細なプロトコールは、他所、たとえば（コジウス（Ｋｏｄｚｉｕｓ）ら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６年３月；３（３）：２１１−２２）に、記載されている。次いで、こうした配列決定タグはさらに、配列決定および遺伝子境界の同定（カルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５年９月２日；３０９（５７４０）：１５５９−６３）、該遺伝子の発現プロファイリングおよびプロモーター（ハーベス（Ｈａｒｂｅｒｓ）およびカルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ），Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５年７月２（７）：４９５−５０２）に使用することができる。
【実施例６】
【００９５】
＜固体表面に結合した配列決定ＤＮＡ＞
実施例１および２の場合と同様にｃＤＮＡを獲て、（コジウス（Ｋｏｄｚｉｕｓ）ら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６年３月；３（３）：２１１−２２）に記載されているような当業者に明白な標準プロトコールを使用して、第一鎖ｃＤＮＡが獲られるまでサンプルを処理する。次に、該核酸を、米国特許出願ＵＳ  ２００６００１２７９３号、ＵＳ  ２００６００１２７８４号、ＵＳ  ２００６０００８８２４号に記載のような固相マトリックス、およびこのような技術に基づく機器に付着させる。
【００９６】
引用した資料：
【表１】
2009072062.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明の流れの実施形態の例を示す。
【図２】様々なステップにおける各酵素の活性およびバッファーを示す。
【図３】実施例３の結果を示す。
【図１】
2009072062.tif 000003
【図２】
2009072062.tif 000004
【図３】
2009072062.tif 000005
【配列表】
2009072062000001.app
【外国語明細書】
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