(57)【要約】【課題】肝癌細胞の浸潤、転移の抑制に有効なＭＭＰ−７遺伝子発現抑制剤ならびに抑制技術を提供する。【解決手段】培養ヒト肝癌細胞の増殖に対する効果はＭＴＴアッセイにおいて評価し、また、試験管内インベイジョンアッセイにおいて癌転移能を評価する。さらに、その遺伝子発現が癌細胞の転移に関与することが知られているＭＭＰ−７遺伝子の転写量をＲＴ−ＰＣＲ法によって評価し、さらに、ＭＭＰ−７遺伝子のプロモーター領域にその結合部位を有する転写因子ＮＦ−κＢの結合活性のＴＰＡによる活性化の抑制作用をゲルシフトアッセイにおいて評価することにより、抑制作用がある物質として、イソフラキシジン（７−Ｈｙｄｒｏｘｙ−６，８−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ）を提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クマリン骨格を有し、ＭＭＰ−７遺伝子の発現を抑制することを特長とする遺伝子発現抑制剤
【請求項２】
そのクマリン骨格を有する物質がイソフラキシジンであることを特長とする請求項１にある遺伝子発現抑制剤
【請求項３】
クマリン骨格を有し、ＭＭＰ−７遺伝子の発現を抑制することを特長とする悪性腫瘍の治療剤あるいは予防剤
【請求項４】
そのクマリン骨格を有する物質がイソフラキシジンであることを特長とする請求項３にある悪性腫瘍の治療剤あるいは予防剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明は、特長あるクマリン構造を有し、転写因子ＮＦ−κＢを介する遺伝子発現を抑制制御することにより、疾病、とくに癌細胞の浸潤・転移を妨げることによる疾病の予防ならびに治療に寄与する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】  癌細胞の浸潤・転移のメカニズムとして、現在、大きく以下の３点が考えられている。即ち：
１）発ガンの約９割は上皮性細胞で起こるが、上皮性細胞同士はＥ−カドヘリンを介した細胞間接着により細胞の移動を制限している。悪性の癌細胞では、このカドヘリンを介した接着装置に異常があり、これにより原発部位からの離脱が可能となる（例えば非特許文献１参照）。
２）癌細胞は自らあるいは周辺の細胞から産生されるマトリックスプロテアーゼ（ＭＭＰ）を用いて、細胞外基質（ＥＣＭ）を分解し、上皮性細胞層の裏打ち構造である基底膜や、結合組織の浸潤を達成する。浸潤、転移に関与するＭＭＰとして、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７，あるいはＭＭＰ−９などが知られている。肝臓癌を含む消化器癌においては、特に、ＭＭＰ−７が癌細胞の浸潤、転移に関与している［例えば非特許文献２参照］。
３）遠隔臓器へ癌細胞が効率よく運ばれる為には、癌細胞がリンパ液や血流に入り込む必要がある。既存の血管内皮細胞が、癌細胞が産生するｖＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）などの血管新生因子によって、増殖、移動し、腫瘍血管となり、血流への癌細胞の出現が加速される［例えば非特許文献３参照］。
【非特許文献１】清水元治（１９９８）細胞工学  １７：５０８−５１２．
【非特許文献２】Ｍｏｒｉ，Ｍら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ，７５，１５１６−１５１９．
【非特許文献３】Ｈａｎａｈａｎ，Ｄら（１９９６）Ｃｅｌｌ，８６，３５３−３６４．
【０００３】  ＭＭＰの阻害は、癌細胞の浸潤、転移の抑制および予防に有効であると考えられ、ＭＭＰ阻害剤の開発が世界中で検討されている。即ちこれまで、癌細胞におけるＭＭＰ−２あるいはＭＭＰ−９の発現を阻害する作用物質が多く知られてきた。例えば、緑茶ポリフェノールであるカテキン類のエピガロカテキンガレート（例えば、非特許文献４参照）、コーヒー等の成分であるクロロゲン酸やコーヒー酸（例えば、非特許文献５参照）、ブドウ種子成分のプロアントシアニジン（例えば、非特許文献６参照）等である。
ＭＭＰ−７阻害物質については、非常に少ないが、食品成分として、上述のエピガロカテキンガレートや、柑橘類成分のノビレチンがＭＭＰ−７阻害作用を有することが報告された（例えば、非特許文献７参照）。しかしながら、それらの細胞毒性や、浸潤、転移に対する効果などはほとんどしられていない。
【非特許文献４】Ｋｉｍ，ＨＳら（２００４）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２４，７４７−７５４．
【非特許文献５】Ｃｕｎｇ，ＴＷら（２００４）ＦＡＳＥＢ  Ｊ，１８，１６７０−１６８１．
【非特許文献６】Ｖａｙａｌｉｌ，ＰＫら（２００４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２５，９８７−９９５．
【非特許文献７】Ｋａｗａｂａｔａ，Ｋら（２００５）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６９，３０７−３１４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明の目的は、ＭＭＰ−７遺伝子発現を抑制し、もって癌の浸潤、転移を予防、ないしは治療するための素材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  本発明者らは、この課題を解決するために、まず、消化器癌においてはＭＭＰ−７の過剰発現が認められるという事実に注目した。【０００６】  ヒト肝癌細胞の培養系を用い、細胞毒性評価系、試験管内インベイジョンアッセイ系、ＭＭＰ−７遺伝子発現に対する影響を精査するためのＲＴ−ＰＣＲ法ならびにゲルシフトアッセイ評価系を併せて、細胞を障害せず、肝癌細胞の浸潤の抑制作用ならびにＭＭＰ−７遺伝子発現の抑制作用を有する物質を探索する手段を得た。
【発明の効果】
【０００７】  本発明者らは、以上の手段を用いて鋭意、課題の解決に努力した結果、驚くべき事に漢方生薬である五加皮の原料となるエゾウコギの一成分として知られるイソフラキシジンが、培養肝癌細胞に障害をもたらさず、ＭＭＰ−７遺伝子発現の抑制作用を有することを見いだした。【０００８】  イソフラキシジンはよく知られた食品・漢方生薬の素材であるエゾウコギの成分であり、人体に対する摂取の安全性については、すでに一定の評価が確立していること、それにもかかわらず、イソフラキシジンには、鎮静（例えば、非特許文献８参照）、抗炎症（例えば、非特許文献９参照）などの特性は知られていたが、癌に対する効果については、何も知られていなかったこと、さらに本発明において、細胞に対する障害性のない濃度において、過剰発現するＭＭＰ−７遺伝子発現に対する抑制作用、を示し得たことにより、本発明を完成した。
【非特許文献８】Ｎｉｓｈｉｂｅ，Ｓら（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，３８，６，１７６３−１７６５．
【非特許文献９】山崎泰助ら（２００４）Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏ―ｐｈｏｒｅｓｉｓ，４８，５５−５８．
【発明を実施するための形態】
【０００９】  本発明は、イソフラキシジンならびに該物質で代表されるクマリン構造を有する化合物をさまざまな形で提供することを可能とする食品ならびに医薬品実施されるものであり、由来する原料ならびに提供の方法によらない。
【００１０】  イソフラキシジンは、エゾウコギ抽出物中の有効成分であり、これらの抽出物も、食品・医薬品の原料として適している限り提供の手段となる。
【００１１】  さらに該物質は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる分離法などにより、高純度に精製し、また化学修飾することが可能であるが、精製した該物質ならびにその類縁物質は、その精製方法ならびに加工方法によらず、適宜な工程を経て医薬品あるいは食品素材として認可されるかぎり提供の手段となる。
【００１２】  さらに該物質は含有植物のエキス、あるいはその加工品として認可される限り、特定保険食品がその提供の手段となる。さらに該物質は乾燥状態で粉体であり、且つ水溶性であるため、錠剤、水溶液、ゲル、散剤等の剤型で提供することが可能である。さらに該物質は水溶液状態で耐熱性である限りにおいて、瓶缶に充填した保存性ある医薬品あるいは食品の素材として提供することが可能である。
【実施例】
【００１３】  以下に実験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実験例のみに限定されるものではない。以下の実験例においては、イソフラキシジンはＷａｋｏ＃０９９−０３６５１生薬試験用標準品を使用している。しかし同様の標品は他のルートからも入手可能であり、入手ルートあるいは標品の品位によらない。【００１４】  実験例  １  細胞毒性
培養液に添加したイソフラキシジンがヒト肝癌細胞株ＨｕＨ−７（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）およびＨｅｐＧ２（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）に対して示す毒性をＭＴＴ法により検討した。９６ウェルプレートにＨｕＨ−７細胞あるいはＨｅｐＧ２細胞を播種後、翌日、各濃度（０−１００μＭ）のイソフラキシジン添加培地において２４−４８時間培養した。培地は血清無添加のＲＰＭＩ−１６４０を使用した。
図１に示す様に、２４時間培養では、ＨｕＨ−７細胞において、各濃度（１６−１００μＭ）のイソフラキシジンの添加によって示される毒性効果には統計的有意差を認めなかった。４８時間培養では、１００μＭのイソフラキシジンの添加により、若干の毒性傾向が認められた（データー省略）。
ＨｅｐＧ２においてもほぼ同様の結果が得られた（データー省略）。
以下にイソフラキシジンの特異的な遺伝子発現抑制について実験例を述べるが、以上の結果は、このような特異的な遺伝子発現抑制が、イソフラキシジンのＨｕＨ−７細胞およびＨｅｐＧ２細胞に対する細胞毒性効果によるものでないこと証左するものである。【００１５】  実験例  ２  細胞浸潤
試験管内インベイジョンアッセイにはマトリゲルでコートされた多孔質膜を装置した培養インサート（ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用した。培養インサートを含む２４ウエルプレートにＨｕＨ−７細胞を播種３日目、各濃度（０−１００μＭ）のイソフラキシジン添加培地において２時間前培養後、ＴＰＡ（１２−Ｏ−［ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ  １３−ａｃｅｔａｔｅ］）（８０μＭ）およびイソフラキシジン添加培地において４８時間培養した。培地は１０％血清添加のＲＰＭＩ−１６４０を使用した。
表１中、ＴＰＡ−／＋、イソフラキシジン０μＭの条件で、マトリゲルを通過した面積当りの細胞数は、ＴＰＡ＋で増加し、ＴＰＡ添加により、ＨｕＨ−７細胞の細胞浸潤が誘導されることが示された。このような細胞浸潤は、イソフラキシジン（６６μＭ）添加において抑制され、さらに１００μＭ添加において顕著に抑制された。以上の結果は、イソフラキシジンはＨｕＨ−７のＴＰＡ誘導細胞浸潤に対し、抑制作用を有することを示している。【００１６】
【表１】
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【００１７】実験例  ３  ＭＭＰ−７遺伝子発現（１）
ＭＭＰ−７遺伝子発現におよぼすイソフラキシジンの影響について検討するにあたり、実験に適した肝癌細胞株の選別を目的として、各種細胞株ＨｕＨ−７、ＨｅｐＧ２、ＨＬＥ（ＪＣＲＢより入手）およびヒト正常二倍体細胞株ＩＭＲ−９０（ＪＣＲＢより入手）を用いてＭＭＰの発現パターンをＲＴ−ＰＣＲ法により比較検討した。シャーレ（１．８ｃｍ２）に細胞を播種後、細胞がプラトーに達した時点で、発癌プロモーターであるＴＰＡ（１０，８０μＭ）添加あるいは非添加により２４時間培養した。培地は血清無添加のＲＰＭＩ−１６４０を使用した。細胞から抽出された２μｇのＴｏｔａｌＲＮＡを用い、逆転写酵素により１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄのｃＤＮＡを合成した。これを鋳型とし、ＭＭＰ−７に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。なおＧ３ＰＤＨを内部標準とした。ＰＣＲ反応終了後、反応液１０μｌを１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド染色により増幅断片を確認した。図２に示すように、ＭＭＰ−７の発現は正常細胞であるＩＭＲ−９０では認められなかったが、肝癌細胞３株で認められた。ＨｕＨ−７およびＨｅｐＧ２においては、ＴＰＡ添加による顕著な発現誘導が認められた。Ｇ３ＰＤＨの発現に変動はなかった。ＭＭＰ−７は癌細胞自身が産生し、癌の浸潤、転移において特に重要なＭＭＰとされている。以上の結果をふまえ、本実験におけるイソフラキシジンの影響は、ＨｕＨ−７とＨｅｐＧ２を用いて検討することとした。【００１８】実験例  ４  ＭＭＰ−７遺伝子発現（２）
ヒト肝癌細胞株ＨｕＨ−７およびＨｅｐＧ２が発現するＭＭＰ−７の遺伝子発現におよぼすイソフラキシジンの影響について、ＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。実験群として、細胞を高密度（５ｘ１０４／ｃｍ２）に播いた群（以下高密度群）と低密度（１ｘ１０４／ｃｍ２）に播いた群（以下低密度群）を用意した。シャーレ（１．８ｃｍ２）にＨｕＨ−７あるいはＨｅｐＧ２を播種後、３日後にイソフラキシジンによる抑制実験を実施した。各濃度（０−１００μＭ）のイソフラキシジン添加培地において２時間前処理後、ＴＰＡ（８０μＭ）およびイソフラキシジン添加培地において２４時間培養した。培地は血清無添加のＲＰＭＩ−１６４０を使用した。
図３に示す様に、ＨｕＨ−７では、両実験群において、ＴＰＡの添加によりＭＭＰ−７遺伝子発現の誘導が認められたが、各濃度（１６−１００μＭ）のイソフラキシジンの添加により、顕著な抑制が認められた。また抑制の程度は高密度群と比較して、低密度群のほうが強い傾向が認められた。  ＨｅｐＧ２においても、イソフラキシジンの添加（３３−１００μＭ）により、ＴＰＡにより誘導されたＭＭＰ−７遺伝子発現は濃度依存的に抑制が認められ、高密度群と比較して、低密度群において顕著な抑制が認められた（データー省略）。以上より、イソフラキシジンはヒト培養肝癌細胞において細胞密度依存性にＭＭＰ−７遺伝子発現を抑制することが明らかとなった。これらの事実は、イソフラキシジンによるＭＭＰ−７遺伝子発現の抑制は転写レベルで起きていることを示唆するとともに、イソフラキシジンがヒト肝癌細胞の浸潤、転移の抑制に有効なＭＭＰ−７遺伝子発現抑制剤となる可能性を示すものである。【００１９】実験例  ５  転写活性
転写因子のＮＦ−κＢおよびＡＰ−１は、ＭＭＰ−７のプロモーター領域に結合し、転写を活性化させる代表的な転写因子である。イソフラキシジンによるＭＭＰ遺伝子発現の抑制が、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１のプロモーター領域への結合阻害に起因するか否かを明らかにするため、ゲルシフトアッセイにより、上記転写因子のＤＮＡ結合活性におよぼす影響について検討した。実験例４でのＲＴ−ＰＣＲ法による実験と同様な条件により培養したＨｕＨ−７およびＨｅｐＧ２から核抽出物を調製後、ジゴキシゲニンで標識したＮＦ−κＢおよびＡＰ−１結合部位配列プローブと２０分間反応させ、その反応液を６％非変性アクリルアミド、０．２５％ＴＢＥバッファーで約２時間電気泳動を行った。泳動後、ゲルをナイロン膜に転写させ、化学発光検出によりシグナルを検出した。図４に示すように（ＨｕＨ−７）、イソフラキシジンはＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を６６−１５０μＭの濃度で抑制した。イソフラキシジンはＡＰ−１のＤＮＡ結合活性に対しては影響を示さなかった。ＨｅｐＧ２においても同様の結果が得られた（データー省略）。したがって、ＲＴ−ＰＣＲ法により確認されたＭＭＰ−７の遺伝子発現の抑制は、転写因子ＮＦ−κＢの抑制を介する可能性が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＨｕＨ−７の増殖におよぼすイソフラキシジンの影響。縦軸：イソフラキシジン２４時間添加後の対照群に対する細胞数の相対値  横軸：培養液中に添加されたイソフラキシジンの濃度（μＭ）
【図２】ヒト肝癌ならびに正常二倍体細胞株におけるＭＭＰ−７遺伝子発現におよぼすＴＰＡによる誘導の影響。ＨｅｐＧ２，ＨｕＨ−７，ＨＬＥ，ヒト肝臓癌細胞株；ＩＭＲ−９０，ヒト正常二倍体細胞株  ＴＰＡ（１０，８０μＭ）；Ｇ３ＰＤＨ（内部標準）
【図３】ＨｕＨ−７におけるＴＰＡ誘導ＭＭＰ−７遺伝子発現におよぼすイソフラキシジンの影響―接種細胞密度の影響―  １．ＴＰＡ，イソフラキシジンともなし；２．ＴＰＡ（８０μＭ）のみ；３．ＴＰＡ＋イソフラキシジン１６μＭ（イソフラキシジン２時間前処理）；４．ＴＰＡ＋イソフラキシジン３３μＭ（イソフラキシジン２時間前処理）；５．ＴＰＡ＋イソフラキシジン６６μＭ（イソフラキシジン２時間前処理）；６．ＴＰＡ＋イソフラキシジン１００μＭ（イソフラキシジン２時間前処理）Ｇ３ＰＤＨ（内部標準）
【図４】ＨｕＨ−７における転写因子（ＡＰ−１ならびにＮＦ−κＢ）結合活性に対するイソフラキシジンの影響。１．ＴＰＡ（８０μＭ）のみ；２．ＴＰＡ＋イソフラキシジン６６μＭ；３．ＴＰＡ＋イソフラキシジン１００μＭ；４．ＴＰＡ＋イソフラキシジン１５０μＭ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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