(57)【要約】      （修正有）【課題】微量な試料によって、簡便、迅速にかつ高い再現性で皮脂中の脂肪酸成分を定量性をもって分析できる方法を提供すること。【解決手段】熱分解ガスクロマトグラフ法を用い、メチル化剤の存在下で皮脂を熱分解すれば、遊離脂肪酸や、エステルを構成する脂肪酸基は、メチル化され、それぞれの脂肪酸メチルエステルとなり、この脂肪酸メチルエステルの量を測定することを特徴とする皮脂中の脂肪酸含量の分析方法。この方法は、肌の状態の研究や、その状態の診断に使用できるものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱分解ガスクロマトグラフ法を用い、メチル化剤の存在下皮脂を熱分解し、検出された脂肪酸メチルエステルの量を測定することを特徴とする皮脂中の脂肪酸含量の分析方法。
【請求項２】
熱分解をキューリーポイント型熱分解装置により行うことを特徴とする請求項１に記載の皮脂中の脂肪酸含量の分析方法。
【請求項３】
脂肪酸のメチル化を水酸化テトラメチルアンモニウムを用いて行うことを特徴とする請求項１または２に記載の皮脂中の脂肪酸含量の分析方法。
【請求項４】
熱分解を、１５０〜３８５℃の範囲の温度で行う請求項１ないし３の何れかに記載の皮脂中の脂肪酸含量の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮脂中の脂肪酸含量の分析方法に関し、更に詳細には、熱分解ガスクロマトグラフ法を使用して、皮脂中の遊離脂肪酸およびエステルとなっている脂肪酸基をメチル化する皮脂中の脂肪酸含量の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮脂は、外的刺激からの保護や皮膚の柔軟性を保つなど重要な機能を有しており、その構成脂質の種類と大まかな構成比が知られている。近年、遊離脂肪酸と毛穴の目立ちの関係や皮脂組成と敏感肌の関係など、皮脂組成が肌状態に与える影響が報告されており、より詳細な皮脂の構成成分の分析が求められている。
【０００３】
従来、皮脂の分析方法としては、薄層クロマトグラフ法、ペーパークロマトグラフ法、液体クロマトグラフ法、ガスクロマトグラフ法などが用いられていたが、試料が大量に必要であったり、試料の煩雑な前処理が必要であるという問題や、再現性が低く、また分析に長時間を要するなどの問題点があった。
【０００４】
このような問題を解決するために、熱分解マススペクトル法または熱脱着マススペクトル法を用いる皮膚存在物質の分析方法が提案されている（特許文献１）。しかしながら、この方法では分析対象の明らかな特定の成分を分析することはできるが、皮脂を構成する脂質の脂肪酸構成など詳細な皮脂組成を分析することはできなかった。
【０００５】
また、酵素を用いて皮脂を分析する方法が提案されている（特許文献２）。しかしながら、この方法では、皮脂中のグリセリン脂肪酸エステルや遊離脂肪酸等を定量することができるが、脂質を構成する他の成分に含まれる脂肪酸を分析することはできず、また迅速性に欠けるものであった。
【０００６】
【特許文献１】特開平９−２４３６３６号公報
【特許文献２】特開平７−１１５９９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、微量な試料によって、簡便、迅速にかつ高い再現性で皮脂中の脂肪酸成分を詳細に分析できる方法の開発が求められており、このような方法を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる実情に鑑み、本発明者らは皮脂成分中の脂肪酸の分析に関し、鋭意検討した結果、メチル化剤の存在下で皮脂を熱分解すれば、遊離脂肪酸や、エステルを構成する脂肪酸基は、メチル化され、それぞれの脂肪酸メチルエステルとなって検出されることを知った。そして、この脂肪酸メチルエステル量と、皮脂中の遊離脂肪酸およびエステルを構成する脂肪酸基の量との相関関係が高いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、熱分解ガスクロマトグラフ法を用い、メチル化剤の存在下皮脂を熱分解し、検出された脂肪酸メチルエステルの量を測定することを特徴とする皮脂中の脂肪酸含量の分析方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の皮脂中の脂肪酸含量の分析方法は、微量の皮脂試料によって、簡便、迅速に、かつ高い再現性で、皮脂の構成脂肪酸を定量性をもって分析することができるものである。従って、例えば、肌の状態の研究や、その状態の診断に使用できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の対象である皮脂は、一般にグリセリド類、遊離脂肪酸、スクワレン、ワックスエステル、コレステロールおよびコレステロールエステルの６種類の脂質から構成され、それぞれの脂質はまた種々の脂肪酸やアルコールなどから構成されている。本発明では、上記皮脂中の遊離脂肪酸およびエステル中に存在する脂肪酸基（以下、「脂肪酸類」という）を分析する。
【００１２】
本発明の分析方法は、熱分解ガスクロマトグラフ法を用いて皮脂中の脂肪酸類を分析するものであるが、この熱分解ガスクロマトグラフ法(以下、「熱分解ＧＣ」と略記することがある)とは、試料を高温で熱分解することにより分解または揮発させ、次いでこの分解生成物または揮発成分をガスクロマトグラフ法で分離し、質量分析計や、ＦＩＤ検出器によって検出するものである。本発明法では、この熱分解において、試料にメチル化剤を添加してメチル化すること（反応熱分解）が重要である。
【００１３】
本発明方法においては、上記のように脂質の構成成分をメチル化し、これにより生ずる脂肪酸メチルエステルを検出することが必要である。メチル化された皮脂の構成脂質を構成する脂肪酸が検出される温度とは、メチル化による反応熱分解によって、皮脂中の脂肪酸類が脂肪酸メチルエステルとして検出される温度である。具体的な温度としては、例えば、１５０〜３８５℃の範囲であり、好ましくは２８０℃またはその近傍の温度である。
【００１４】
また、上記メチル化に用いるメチル化剤としては、三フッ化ホウ素（ＢＦ３）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）や水酸化トリメチルスルホニウム（ＴＭＳＨ）が挙げられるが、水酸化テトラメチルアンモニウムが不飽和脂肪酸を検出しやすいために好ましく用いられる。
【００１５】
上記熱分解に用いる装置としては、例えば加熱炉型やキューリーポイント型などが挙げられるが、原理的に最も正確な加熱温度が得られるという利点があるため、キューリーポイント型の熱分解装置を用いることが好ましい。このキューリーポイント型熱分解装置とは、鉄、ニッケル、コバルトもしくはそれらの合金でできた強磁性体ホイル（パイロホイル）に高周波エネルギーを供給することによって誘電加熱され、その熱によってパイロホイル内部に設置した試料を熱分解するものであり、瞬時に試料を所定の温度まで加熱することが可能である。加熱温度は用いる金属に依存し、金属の種類を選択することによって加熱温度を適宜設定することができる。
【００１６】
次に上記熱分解により生成した脂肪酸メチルエステルは、ガスクロマトグラフ法によって分離される。このガスクロマトグラフ法の条件は、内径２５０〜５３０μｍ、長さ１５〜３０ｍ程度の分離カラムを使用し、ヘリウムをキャリアーガスとして、各カラムに最適な速度で用いて、５０℃〜３００℃の温度条件で行うことができる。
【００１７】
さらに、ガスクロマトグラフによって分離された脂肪酸メチルエステルは、質量分析計によって検出され、パイログラムとマススペクトルが得られる。質量分析計におけるイオン化方法としては、例えば、電子イオン化法（ＥＩ）、化学イオン化法（ＣＩ）等が例示でき、検出器としては、例えば、四重極型、単収束磁場変更型、イオントラップ型、二重収束型、飛行時間型などが挙げられる。
【００１８】
上記脂肪酸メチルエステルからの脂肪酸類の定量分析は、いくつかの濃度既知の遊離脂肪酸を、同じ条件で熱分解して得られる脂肪酸メチルエステルのピーク面積を元に、濃度との間で検量線を作成し、これと試料皮脂のピーク面積と比較することにより行うことができ、皮脂中の脂肪酸含量を求めることができる。
【００１９】
以上説明した本発明の脂肪酸含量の分析方法に必要な皮脂試料の量は、上記全ての熱分解温度条件に対して１００μｇ程度にすぎない。したがって、試料の採取にあたっては、濾紙やあぶらとり紙等の紙類を被験者の皮膚に直接当てることにより皮脂を吸着させる吸着法などで必要な量を得ることができ、被験者への負担を低減することができる。
【００２０】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制限されるものではない。
【００２１】
実  施  例  １
脂質の熱分解ＧＣ分析での検量線作成：
遊離脂肪酸の標準溶液について、下記条件で熱分解およびメチル化を行い、次いでガスクロマトグラフ（ＧＣ）により、各脂肪酸メチルエステルを検出し、脂肪酸濃度と脂肪酸メチルエステルのピーク面積から検量線を作成した。遊離脂肪酸の標準溶液としては、ラウリン酸（C12:0）、ミリスチン酸（C14:0）、パルミチン酸(C16:0)およびオレイン酸(C18:1)の各々をクロロホルムにて溶解したものを用いた。
【００２２】
（  熱分解条件  ）
熱分解装置：キューリーポイント型パイロライザー（日本分析工業）
加熱温度：２８０℃
熱分解時間：５秒
メチル化剤：水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）
【００２３】
（  ＧＣ条件  ）
カラム：ＨＰ−５（３０ｍ×０.３２ｍｍ ｉ.ｄ. ０.２５μｍ）
温度条件：５０℃（２分）−（１０℃／分）→  ３２０℃（１３分）
流  量：Ｈｅ（１ｍＬ／分）、・スプリット比：１：５０、・注入口：２５０℃
検  出：ＦＩＤ（３２０℃）
【００２４】
得られた検量線を、図１〜図４に示す。何れも遊離脂肪酸濃度と、脂肪酸メチルエステルの面積との間の相関性が高く、遊離脂肪酸の分析に利用できることが示された。
【００２５】
実  施  例  ２
モデル皮脂についての定量分析：
下記表１に示すような、皮脂の構成脂質に近い脂質組成のモデル皮脂を調製し、これについて、反応熱分解ＧＣで分析した場合に検出される脂肪酸成分を調べた。熱分解条件およびＧＣ条件は、実施例１と同一である。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
定量値も表１中に示したが、遊離脂肪酸、ワックスエステルおよびコレステロールエステルでは、ほぼ配合量に近い値が得られ、定量試験法として利用可能であることが明らかになった。なお、トリグリセリドについては、補正係数（０.８）で割ることにより、本発明方法を定量方法が利用可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明の分析方法は、皮脂について迅速、簡便に高い再現性で、その構成脂肪酸成分の定量分析をすることができるものである。したがって、皮脂組成に関して、迅速に多量なデータの取得を可能とすることができ、医薬品や化粧料の分野において有利に利用できるものである。
【００２９】
特に、本発明者らが先に出願した方法（特願２００７−６０８９５）とあわせて評価することにより、皮脂組成について、定性的、定量的な情報を迅速に得ることが出来る。すなわち、熱分解の温度条件の内、少なくとも、３１５℃、５９０℃、反応熱分解（２８０℃）の三条件にて測定することで、皮脂組成の情報が得られる。つまり、３１５℃にて測定を行うことにより、遊離脂肪酸が検出される。５９０℃にて測定を行うことにより、全ての成分の帰属が可能である。反応熱分解（２８０℃）によって、構成する脂肪酸が確認できる。
【００３０】
例えば、５９０℃の結果より、各成分の帰属ができ、脂肪酸基を持たない、スクワレン、コレステロールなどの確認が可能である。また、グリセリド由来の指標ピークとなる炭化水素のピークの確認より、グリセリド由来の脂肪酸が推測できる。更に、反応熱分解（２８０℃）から得られるこれらの結果と、３１５℃からの結果の比較により遊離脂肪酸、ワックスエステル、グリセリン類、各々の脂肪酸基を同定することができる。これに本発明の脂肪酸メチルエステルからの定量結果を組み合わせることで、各成分の定量が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ラウリン酸（C12:0）についての検量線を示す図面である。
【図２】ミリスチン酸（C14:0）についての検量線を示す図面である。
【図３】パルミチン酸(C16:0)についての検量線を示す図面である。
【図４】オレイン酸(C18:1)についての検量線を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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