(57)【要約】【課題】低酸素状態が関連する疾患、例えば癌や虚血性疾患において、ＤＥＣ１が関与する低酸素応答を解析し、それらの疾患の予防又は治療用の医薬組成物を提供する。【解決手段】本発明のＤＥＣ１介在性物質スクリーニング方法、又はＤＥＣ１非介在性物質スクリーニング方法により、低酸素応答の関連する疾患の治療又は予防に効果のある物質を容易にスクリーニングすることができる。またスクリーニングされた物質、又はＤＥＣ１の機能を促進又は抑制する物質を含む医薬組成物により、癌や虚血性疾患の治療又は予防が可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＥＣ１ノックアウト動物、又はＤＥＣ１ノックアウト細胞を用いることを特徴とする、ＤＥＣ１が制御する分子のスクリーニング方法。
【請求項２】
（ａ）ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞を培養する工程、
（ｂ）培養したＤＥＣ１ノックアウトマウス細胞及びＤＥＣ１発現細胞のタンパク質又はそのｍＲＮＡの発現を測定する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で測定したＤＥＣ１ノックアウトマウス細胞及びＤＥＣ１発現細胞のタンパク質又はそのｍＲＮＡの発現量を比較し、ＤＥＣ１が制御するタンパク質を判定する工程、
を含む請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）を低酸素下で行う、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＤＥＣ１介在性の低酸素応答を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）低酸素下でＤＥＣ１発現細胞及びＤＥＣ１ノックアウト細胞に、被検物質を接触させる工程、
（ｂ）前記ＤＥＣ１発現細胞及びＤＥＣ１ノックアウト細胞における、ＤＥＣ１が制御するタンパク質又はそのｍＲＮＡの発現を測定する工程、及び
（ｃ）前記タンパク質又はそのｍＲＮＡの発現量を比較し、被検物質の接触による発現量の変化がＤＥＣ１ノックアウト細胞より、ＤＥＣ１発現細胞において大きい被検物質を判定する工程、
を含む前記スクリーニング方法。
【請求項５】
前記ＤＥＣ１が制御するタンパク質が、ＣＡ９、Ｓｌｃ２ａ１、Ｖｅｇｆａ、Ｅｎｏ２、Ｌｒｐ２ｂｐ、Ｎｄｒｌ、Ｈｉｆ１ａ及びＨｉｆ２ａからなる群から選択されたタンパク質である、請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
ＤＥＣ１非介在性の低酸素応答を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）低酸素下でＤＥＣ１ノックアウト細胞に被検物質を接触させる工程、
（ｂ）前記ＤＥＣ１ノックアウト細胞における、低酸素応答タンパク質又はそのｍＲＮＡの発現を測定する工程、及び
（ｃ）被検物質の接触による前記低酸素応答タンパク質又はそのｍＲＮＡの発現量の変化より、低酸素応答を促進又は抑制する被検物質を判定する工程、
を含む前記スクリーニング方法。
【請求項７】
前記低酸素応答タンパク質が、ＣＡ９、Ｓｌｃ２ａ１、Ｖｅｇｆａ、Ｅｎｏ２、Ｌｒｐ２ｂｐ、Ｎｄｒｌ、Ｈｉｆ１ａ及びＨｉｆ２ａからなる群から選択されたタンパク質である、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
ＤＥＣ１の発現を抑制する化合物を有効成分として含むことを特徴とする、癌の予防又は治療用、あるいは癌の転移抑制用の医薬組成物。
【請求項９】
前記化合物がＤＥＣ１のｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるｓｉＲＮＡである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ干渉の標的ｍＲＮＡ領域が、配列番号２で表される塩基配列における第４０５番目〜第４２５番目の塩基配列、又は第４５５番目〜第４７５番目の塩基配列からなるｍＲＮＡである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分の長さが１５〜４０ヌクレオチドである請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分のアンチセンスＲＮＡ鎖が、配列番号４又は配列番号６で表される塩基配列からなるＲＮＡである請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分において、
（ａ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているｓｈＲＮＡ、
（ｂ）二重鎖ＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチド、又は
（ｃ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖の一方又は両方の３‘末端に、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドが結合し、突出末端を形成している二本鎖オリゴヌクレオチド、
である請求項９〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ＤＥＣ１の発現を促進する化合物を有効成分として含むことを特徴とする、虚血性疾患の治療用医薬組成物
【請求項１５】
前記虚血性疾患が、貧血、脳卒中、脳梗塞、虚血性心筋症、心筋梗塞症、虚血性心不全、閉塞性動脈硬化症である請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低酸素応答を制御する物質のスクリーニング方法及び低酸素応答を制御する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの細胞にとって低酸素状態は異常な状態であるが、多くの疾患において、組織や細胞が低酸素状態に曝されることがある。例えば、虚血性疾患である脳卒中、脳梗塞、虚血性心筋症、心筋梗塞症、虚血性心不全、閉塞性動脈硬化症等において、組織は低酸素状態におかれる。また、固形腫瘍の内部は血管の形成が不十分であり、低酸素状態にあることが知られている。特に悪性度の高い腫瘍組織では低酸素の程度が高く、それらの腫瘍細胞は、低酸素に対して抵抗性を示す性質を獲得している。
【０００３】
このような低酸素状態における生体内の細胞の分子レベルの解析により、例えば、エリスロポエチン（Epo）や血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor：VEGF）、carbonic anhydrase IX（以下、ＣＡ９と称する）などの、低酸素状態で活性化される多くの低酸素応答遺伝子やタンパク質が発見されてきており、これらの遺伝子やタンパク質の発現が、低酸素状態の関連する前記の疾患の病態に関連すると考えられている。更  一方、時計遺伝子の一つとして発見されたＤＥＣ１も、低酸素状態で誘導されることが報告されている（非特許文献１）。ＤＥＣ１は、ｂＨＬＨ転写因子であると考えられており、前記の低酸素応答遺伝子やタンパク質の転写に関与している可能性が考えられる。しかしながら、ＤＥＣ１と他の低酸素応答遺伝子やタンパク質との関連は、全く知られておらず、その他の低酸素応答を制御する遺伝子との関連もわかっていなかった。
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｌ  Ｃｈｍｉｓｔｒｙ）」（米国）２００１年、第２７６巻、ｐ．１５３０６−１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、低酸素状態においてＤＥＣ１遺伝子が、低酸素応答遺伝子をどのように制御しているかについて鋭意研究した結果、ＤＥＣ１遺伝子のノックアウトマウス、又はＤＥＣ１ノックアウト細胞を解析することにより、転写因子ＤＥＣ１が、多くの低酸素応答遺伝子の発現を促進していることを見いだし、また、驚くべきことに、転写因子ＤＥＣ１が、多くの低酸素応答遺伝子の発現を抑制していることを解明した。
また、本発明者は、ＤＥＣ１ノックアウトマウス、又はＤＥＣ１ノックアウト細胞を用いることにより、ＤＥＣ１が制御する分子をスクリーニングすることが可能であり、更に、ＤＥＣ１介在性、又はＤＥＣ１非介在性の低酸素応答を制御する物質のスクリーニングが可能であることを見出した。そして、ＤＥＣ１に作用する化合物、例えば、ＤＥＣ１のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡにより、ＤＥＣ１のｍＲＮＡの発現を特異的に抑制し、このような化合物を含む医薬組成物によって、癌及び虚血性疾患の治療又は予防をすることができることを見出した。
本発明はこうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明は、ＤＥＣ１ノックアウト動物、又はＤＥＣ１ノックアウト細胞を用いることを特徴とする、ＤＥＣ１が制御する分子のスクリーニング方法に関する。
本発明によるＤＥＣ１が制御する分子のスクリーニング方法の好ましい態様においては、（ａ）ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞を培養する工程、（ｂ）培養したＤＥＣ１ノックアウトマウス細胞及びＤＥＣ１発現細胞のタンパク質又はそのｍＲＮＡの発現を測定する工程、及び（ｃ）工程（ｂ）で測定したＤＥＣ１ノックアウトマウス細胞及びＤＥＣ１発現細胞のタンパク質又はそのｍＲＮＡの発現量を比較し、ＤＥＣ１が制御するタンパク質を判定する工程、を含むものである。
本発明によるＤＥＣ１が制御する分子のスクリーニング方法の別の好ましい態様においては、前記工程（ａ）を低酸素下、又は放射線照射下で行う。
【０００６】
また、本発明はＤＥＣ１介在性の低酸素応答を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法であって、（ａ）低酸素下でＤＥＣ１発現細胞及びＤＥＣ１ノックアウト細胞に、被検物質を接触させる工程、（ｂ）前記ＤＥＣ１発現細胞及びＤＥＣ１ノックアウト細胞における、ＤＥＣ１が制御するタンパク質又はそのｍＲＮＡの発現を測定する工程、及び（ｃ）前記タンパク質又はそのｍＲＮＡの発現量を比較し、被検物質の接触による発現量の変化がＤＥＣ１ノックアウト細胞より、ＤＥＣ１発現細胞において大きい被検物質を判定する工程、を含む前記スクリーニング方法にも関する。
本発明によるＤＥＣ１介在性の低酸素応答を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法の好ましい態様においては、前記ＤＥＣ１が制御するタンパク質が、ＣＡ９、Ｓｌｃ２ａ１、Ｖｅｇｆａ、Ｅｎｏ２、Ｌｒｐ２ｂｐ、Ｎｄｒｌ、Ｈｉｆ１ａ及びＨｉｆ２ａからなる群から選択されたタンパク質である。
また、本発明はＤＥＣ１非介在性の低酸素応答を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法であって、（ａ）低酸素下でＤＥＣ１ノックアウト細胞に被検物質を接触させる工程、（ｂ）前記ＤＥＣ１ノックアウト細胞における、低酸素応答タンパク質又はそのｍＲＮＡの発現を測定する工程、及び（ｃ）被検物質の接触による前記低酸素応答タンパク質又はそのｍＲＮＡの発現量の変化より、低酸素応答を促進又は抑制する被検物質を判定する工程、を含む前記スクリーニング方法にも関する。
本発明によるＤＥＣ１非介在性の低酸素応答を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法の好ましい態様においては、前記低酸素応答タンパク質が、ＣＡ９、Ｓｌｃ２ａ１、Ｖｅｇｆａ、Ｅｎｏ２、Ｌｒｐ２ｂｐ、Ｎｄｒｌ、Ｈｉｆ１ａ及びＨｉｆ２ａからなる群から選択されたタンパク質である。
【０００７】
更に、本発明はＤＤＥＣ１の発現を抑制する化合物を有効成分として含むことを特徴とする、癌の予防又は治療用、あるいは癌の転移抑制用の医薬組成物にも関する。
本発明による医薬組成物の好ましい態様においては、前記化合物がＤＥＣ１のｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるｓｉＲＮＡである。
本発明による医薬組成物の別の好ましい態様においては、前記ＲＮＡ干渉の標的ｍＲＮＡ領域が、配列番号２で表される塩基配列における第４０５番目〜第４２５番目の塩基配列、又は第４５５番目〜第４７５番目の塩基配列からなるｍＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分の長さが１５〜４０ヌクレオチドであり、特には、前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分のアンチセンスＲＮＡ鎖が、配列番号４又は配列番号６で表される塩基配列からなるＲＮＡである。
本発明による医薬組成物の別の好ましい態様においては、前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分において、（ａ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているｓｈＲＮＡ、（ｂ）二重鎖ＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチド、又は（ｃ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖の一方又は両方の３‘末端に、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドが結合し、突出末端を形成している二本鎖オリゴヌクレオチド、
である。
【０００８】
また、本発明はＤＥＣ１の発現を促進する化合物を有効成分として含むことを特徴とする、虚血性疾患の治療用医薬組成物にも関する。
本発明による虚血性疾患の治療用医薬組成物の好ましい態様においては、前記虚血性疾患が、貧血、脳卒中、脳梗塞、虚血性心筋症、心筋梗塞症、虚血性心不全、閉塞性動脈硬化症である。
本明細書において「低酸素応答」とは、通常の大気の酸素濃度２１％より低い状態になった場合に、生体や細胞に起こる応答、例えば、遺伝子及び／又はタンパク質の発現の促進又は抑制を意味する。また、「低酸素応答遺伝子」及び「低酸素応答タンパク質」とは、通常の大気の酸素濃度２１％より低い状態になった場合に、生体や細胞において、発現が促進又は抑制される遺伝子又はタンパク質を意味する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＤＥＣ１が制御している遺伝子及び／又はタンパク質をスクリーニングすることが可能であり、更に、ＤＥＣ１介在性又はＤＥＣ１非介在性の低酸素応答を促進又は抑制する物質を、容易にスクリーニングすることが可能である。
また、本発明によれば、ｂＨＬＨ転写因子であるＤＥＣ１の発現を制御することにより、低酸素応答遺伝子の発現を抑制、又は促進することが可能であり、例えば、ＤＥＣ１のｍＲＮＡの発現を抑制するｓｉＲＮＡを含む本発明の医薬組成物により、低酸素応答に関連する疾患、癌及び虚血性疾患の治療及び予防を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．ＤＥＣ１が制御する分子のスクリーニング方法
本発明のＤＥＣ１が制御する分子のスクリーニング方法において、ＤＥＣ１ノックアウト動物、又はＤＥＣ１ノックアウト細胞を用いることが可能である。
【００１１】
ＤＥＣ１ノックアウト動物は、ブタ、ヒツジ、又はげっ歯類などの非ヒト動物で作製することが可能であるが、好ましくは、マウス又はラットである。ノックアウトマウスの作成法は、例えば村松正實・山元雅編、実験医学別冊  新遺伝子工学ハンドブック改定第３版、羊土社、１９９９年９月１０日発行、ｐ．２３９−２４５に記載されている。
例えば、以下のように、ＤＥＣ１ノックアウトマウスを作成することができる。ターゲットベクターを作製するために、ＤＥＣ１遺伝子の一部又は全部を、例えばネオマイシン耐性遺伝子等マーカー遺伝子で置換し、３’末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子等を導入する。この作製されたターゲティングベクターを制限酵素で切断し、線状化した後に、エレクトロポレーション法によって受精卵やＥＳ細胞に導入する。この受精卵又はＥＳ細胞をＧ４１８等の抗生物質を用いて培養し、相同的組換えを起こした細胞を選択する。選択した組換えＥＳ細胞をマイクロインジェクション法等によりマウスの胚盤胞内に導入し、仮親の子宮に戻すことによってキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配することにより、ＤＥＣ１ノックアウトマウスを得ることができる。ＤＥＣ１遺伝子がノックアウトされているかどうかは、例えば、得られたマウスの血清細胞からＲＮＡを単離してノザンブロット法等により調べるか、又はマウスのＤＥＣ１タンパク質の発現をウエスタンブロット法等により調べることにより判定することができる。
【００１２】
ノックアウト細胞は、例えばヒューらの報告に従って作成することが可能である（Hu, Y.ら (1999) Science 284:316-320; Li, Q.ら (1999) Genes Dev 13:1322-1328; Takeda, K.ら, Science 284:313-316；Gene targeting-a practical approach (2000) 第２編, Oxford University Press）。具体的には、ＤＥＣ１ノックアウト細胞は、前記のＤＥＣ１ノックアウトマウスから作製することが可能であり、ＤＥＣ１ノックアウトマウス組織などから細胞を単離し、培養細胞として樹立することができる。例えば、ＤＥＣ１ノックアウトマウスの１４．５日胚から線維芽細胞を単離し、ＤＥＣ１ノックアウト細胞として用いることが可能である。また、その他の細胞として、株化細胞のＤＥＣ１遺伝子サイレンシングによりノックダウン細胞を得ることもできる。
【００１３】
本発明のＤＥＣ１が制御する分子のスクリーニング方法（以下、ＤＥＣ１制御分子スクリーニング方法と称することがある）の好ましい態様においては、
（ａ）ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞を培養する工程、
（ｂ）培養したＤＥＣ１ノックアウトマウス細胞及びＤＥＣ１発現細胞のタンパク質又はそのｍＲＮＡの発現を測定する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で測定したＤＥＣ１ノックアウトマウス細胞及びＤＥＣ１発現細胞のタンパク質又はそのｍＲＮＡの発現量を比較し、ＤＥＣ１が制御するタンパク質を判定する工程を含む。
【００１４】
工程（ａ）で用いるこことのできるＤＥＣ１発現細胞は、正常なＤＥＣ１の遺伝子を有している細胞であれば、特に限定されるものではないが、ＤＥＣ１の発現の有無を除いては、前記ＤＥＣ１ノックアウト細胞と遺伝的な背景が同じものが好ましい。本発明のスクリーニング方法において、ＤＥＣ１以外の要因を除くことができるからである。例えば、ＤＥＣ１ノックアウト細胞として、ＤＥＣ１ノックアウトマウスの１４．５日胚から線維芽細胞を用いる場合は、ＤＥＣ１ノックアウトマウスと同じ系統の野生型マウスの１４．５日胚から作製した線維芽細胞を用いることが好ましい。また、株化細胞のＤＥＣ１遺伝子サイレンシングにより得られたＤＥＣ１ノックアウト細胞を用いる場合には、ＤＥＣ１遺伝子サイレンシングされていない親株の細胞を用いることが好ましい。
【００１５】
工程（ｂ）において測定されるＤＥＣ１ノックアウトマウス細胞及びＤＥＣ１発現細胞のタンパク質又はそのｍＲＮＡとしては、任意のタンパク質又はそのｍＲＮＡを測定することができる。特定のタンパク質又はそのｍＲＮＡを測定することによって、ＤＥＣ１の関与する分子を決定することも可能であるし、網羅的にタンパク質又はそのｍＲＮＡを測定することによって、ＤＥＣ１の関与する分子を決定することも可能である。
【００１６】
タンパク質の測定方法は、公知の方法であれば特に限定されるものではないが、網羅的なタンパク質の測定方法としては、例えば、プロテインチップ、プロテインアレイなどの方法を挙げることができる。また、特定のタンパク質の発現を測定する方法としては、ウエスタンブロット法ドットブロット法、スロットブロット法、又は固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）を用いることも可能である。
【００１７】
また、ｍＲＮＡの測定法としては、その発現量を測定できる測定法であれば、特に限定されるものではなく、当業者に公知の方法を用いることが可能である。具体的には、ｍＲＮＡを直接測定するノザンブロット分析、ドットブロット法、及びＲＮＡｓｅプロテクション法並びにｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し分析するＲＴ−ＰＣＲ法（例えば、リアルタイムＰＣＲ法）、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、ノザンブロット分析法を挙げることができる。更に、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、及びクロスハイブリダイゼーション法等をｍＲＮＡの発現の解析に用いることも可能であるが、最も好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、及びＤＮＡチップ法である。
【００１８】
以下に、ｍＲＮＡの発現解析の方法として、ＲＴ−ＰＣＲ法を例として説明する。まず、ｍＲＮＡの解析のためには、ＲＮＡの抽出を行う。ｍＲＮＡの抽出は、公知の方法を用いることが可能であり、例えば、塩酸グアニジンフェノールクロロホルム（ＡＧＰＣ）法やＡＧＰＣ変法、或いはＲＮＡが結合するカラムを用いた市販のＲＮＡ抽出用キットなどを用いることが可能である。また、市販のＲＮＡ抽出キットとしては、ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）などを用いることもできる。
【００１９】
抽出したｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ法で測定することが可能である。ＲＴ−ＰＣＲ法は、ｃＤＮＡ合成後に、ＰＣＲを行ってもよいが、リアルタイムＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、及びサイバーグリーン法）で、ｍＲＮＡから直接測定することも可能であり、微量なＤＮＡを高感度かつ定量的に検出できるという点で好ましい。目的のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡを逆転写し、これらの遺伝子を特異的に増幅するプライマーを用い、ＰＣＲにより増幅する。増幅産物は、電気泳動等により分離し、定量することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法、例えば、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を用いる場合には、５’端を蛍光色素（レポーター）で、３’端を蛍光色素（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出を行う。前記プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側に設定したプライマーによってＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが５’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。
【００２０】
前記工程（ｃ）では、ＤＥＣ１ノックアウトマウス細胞及びＤＥＣ１発現細胞のタンパク質又はそのｍＲＮＡの発現量を比較する。ＤＥＣ１ノックアウトマウス細胞における発現が、ＤＥＣ１発現細胞における発現より低いタンパク質、又はそのｍＲＮＡはＤＥＣ１により、発現が促進されている分子であると考えられる。一方、ＤＥＣ１ノックアウトマウス細胞における発現が、ＤＥＣ１発現細胞における発現より高いタンパク質、又はそのｍＲＮＡはＤＥＣ１により、発現が抑制されている分子であると考えられる。
【００２１】
本発明のＤＥＣ１が制御する分子のスクリーニング方法の好ましい態様においては、前記工程（ａ）を低酸素下、又は放射線の照射下で行うことができる。特には、低酸素下で培養を行うことによって、ＤＥＣ１が制御する低酸素応答タンパク質及び／又は低酸素応答遺伝子をスクリーニングすることができる。低酸素状態は、大気圧の酸素濃度である２１％より低ければ特に限定されないが、２０〜０．０１％であり、好ましくは１０〜０．１％であり、より好ましくは５〜１％であり、最も好ましくは１％である。
【００２２】
本発明のＤＥＣ１制御分子スクリーニング方法により、通常の酸素濃度（２１％）において、ＤＥＣ１によりそのｍＲＮＡの発現が促進されているタンパク質として、ＣＡ９、enolase 2（以下、Ｅｎｏ２と称する）、solute carrier family 2（facilitated glucose transporter）、member 1（以下、Ｓｌｃ２ａ１と称する）、LRP2 binding protein（以下、Ｌｒｐ２ｂｐと称する）、Ｖｅｇｆａ、hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit（以下、Ｈｉｆ１ａと称する）を挙げることができる。また、通常の酸素濃度（２１％）において、ＤＥＣ１によりそのｍＲＮＡの発現が抑制されているタンパク質として、hypoxia-inducible factor 2, alpha subunit（以下、Ｈｉｆ２ａと称する）を挙げることができる。また、通常の酸素濃度（２１％）では、ＤＥＣ１により、そのｍＲＮＡの発現が影響されないタンパク質としてN-myc downstream regulated-like（以下、ＮｄｒＩと称する）を挙げることができる。
【００２３】
本発明のＤＥＣ１制御分子スクリーニング方法により、低酸素状態（例えば、１％）において、ＤＥＣ１によりそのｍＲＮＡの発現が促進されているタンパク質として、ＣＡ９、Ｓｌｃ２ａ１、Ｌｒｐ２ｂｐ、Ｖｅｇｆａ、Ｈｉｆ１ａを挙げることができる。また、低酸素状態（例えば、１％）において、ＤＥＣ１によりそのｍＲＮＡの発現が抑制されているタンパク質として、Ｅｎｏ２、Ｎｄｒ１、及びＨｉｆ２ａを挙げることができる。
【００２４】
２．ＤＥＣ１介在性の低酸素応答を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法
本発明のＤＥＣ１介在性の低酸素応答を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法（以下、ＤＥＣ１介在性物質スクリーニング方法と称することがある）は、前記ＤＥＣ１ノックアウト動物及びＤＥＣ１の発現が正常な野生型動物を比較すること、又はＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１の発現が正常なＤＥＣ１発現細胞を比較することによって行うことができるが、操作の容易性などから、ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１の発現が正常なＤＥＣ１発現細胞を用いることが好ましい。
ＤＥＣ１介在性物質スクリーニング方法は、
（ａ）低酸素下でＤＥＣ１発現細胞及びＤＥＣ１ノックアウト細胞に、被検物質を接触させる工程、
（ｂ）前記ＤＥＣ１発現細胞及びＤＥＣ１ノックアウト細胞における、ＤＥＣ１が制御するタンパク質又はそのｍＲＮＡの発現を測定する工程、及び
（ｃ）前記タンパク質又はそのｍＲＮＡの発現量を比較し、被検物質の接触による発現量の変化がＤＥＣ１ノックアウト細胞より、ＤＥＣ１発現細胞において大きい被検物質を判定する工程を含むことができる。
【００２５】
本明細書において、ＤＥＣ１介在性の低酸素応答とは、ＤＥＣ１の制御を介して起きる低酸素応答を意味する。一方、後述のＤＥＣ１非介在性の低酸素応答とは、ＤＥＣ１の制御を介さずに起きる低酸素応答を意味する。
【００２６】
前記工程（ａ）における低酸素下とは、ＤＥＣ１制御分子スクリーニング方法における低酸素状態と同じ条件を用いることができる。前記低酸素状態で、ＤＥＣ１発現細胞及びＤＥＣ１ノックアウト細胞に被検物質を接触させることができる。被検物質の接触は、細胞と被検物質が接触するものであれば特に、その方法も時間も限定されるものではないが、例えば、培養細胞に被検試料を接触させることにより実施することができ、具体的には培養細胞の培養液中に被検試料を添加すればよい。また、被検物質の効果を判定するために、被検物質と接触しない対照の細胞を設定しておくことが好ましい。これによって、被検物質の効果を明確に判断することができる。
【００２７】
前記工程（ｂ）においては、被検物質と接触したＤＥＣ１発現細胞及びＤＥＣ１ノックアウト細胞におけるＤＥＣ１に制御されるタンパク質又はそのｍＲＮＡを測定する。ＤＥＣが制御するタンパク質として、例えば、低酸素下においてＤＥＣ１がその発現を促進するタンパク質としては、ＣＡ９、Ｓｌｃ２ａ１、Ｌｒｐ２ｂｐ、Ｖｅｇｆａ、Ｈｉｆ１ａを挙げることができ、また、そのｍＲＮＡの発現が抑制されているタンパク質として、Ｅｎｏ２、Ｎｄｒ１、及びＨｉｆ２ａを挙げることができる。これらのタンパク質又はそのｍＲＮＡを測定することにより、被検物質の効果を判断することが可能である。タンパク質又はそのｍＲＮＡの測定方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができるが、具体的には、前記ＤＥＣ１制御分子スクリーニング方法において用いることのできる方法を挙げることができる。
【００２８】
ＤＥＣ１介在性物質スクリーニング方法においては、前記工程（ｃ）で、被検物質の接触による発現量の変化がＤＥＣ１ノックアウト細胞より、ＤＥＣ１発現細胞において大きい被検物質を選択することが好ましい。ＤＥＣ１ノックアウト細胞ではＤＥＣ１が機能していないため、被検物質によって前記のタンパク質又はそのｍＲＮＡの発現が変化した場合は、ＤＥＣ１を介さずに被検物質が直接、低酸素応答遺伝子や低酸素応答タンパク質に作用していると考えられるためである。従って、被検物質の接触によるタンパク質又はそのｍＲＮＡの発現量の変化がＤＥＣ１ノックアウト細胞より、ＤＥＣ１発現細胞において大きい被検物質を選択することによって、ＤＥＣ１介在性の低酸素応答に関連する被検物質をスクリーニングすることができる。
【００２９】
３．ＤＥＣ１非介在性の低酸素応答を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法
本発明のＤＥＣ１非介在性の低酸素応答を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法（以下、ＤＥＣ１非介在性物質スクリーニング方法と称することがある）は、前記ＤＥＣ１ノックアウト動物、又はＤＥＣ１ノックアウト細胞を用いることによって行うことができるが、操作の容易性などから、ＤＥＣ１ノックアウト細胞を用いる方法が好ましい。
前記ＤＥＣ１非介在性物質スクリーニング方法は、
（ａ）低酸素下でＤＥＣ１ノックアウト細胞に被検物質を接触させる工程、
（ｂ）前記ＤＥＣ１ノックアウト細胞における、低酸素応答タンパク質又はそのｍＲＮＡの発現を測定する工程、及び
（ｃ）被検物質の接触による前記低酸素応答タンパク質又はそのｍＲＮＡの発現量の変化より、低酸素応答を促進又は抑制する被検物質を判定する工程、
を含むことができる。前記のように、ＤＥＣ１非介在性の低酸素応答とは、ＤＥＣ１の制御を介さずに起きる低酸素応答を意味する。
【００３０】
前記工程（ａ）における低酸素下とは、ＤＥＣ１制御分子スクリーニング方法における低酸素状態と同じ条件を用いることができる。前記低酸素状態で、ＤＥＣ１ノックアウト細胞に被検物質を接触させることができる。被検物質の接触は、細胞と被検物質が接触するものであれば特に、その方法も時間も限定されるものではないが、例えば、培養細胞に被検試料を接触させることにより実施することができ、具体的には培養細胞の培養液中に被検試料を添加すればよい。また、被検物質の効果を判定するために、被検物質と接触しない対照の細胞を設定しておくことが好ましい。これによって、被検物質の効果を明確に判断することができる。
【００３１】
前記工程（ｂ）においては、被検物質と接触したＤＥＣ１ノックアウト細胞における低酸素応答タンパク質又はそのｍＲＮＡを測定する。低酸素応答タンパク質として、例えば、Ｅｐｏ、ＣＡ９、Ｓｌｃ２ａ１、Ｌｒｐ２ｂｐ、Ｖｅｇｆａ、Ｈｉｆ１ａ、Ｅｎｏ２、Ｎｄｒ１、及びＨｉｆ２ａを挙げることができる。これらのタンパク質又はそのｍＲＮＡを測定することにより、被検物質の効果を判断することが可能である。タンパク質又はそのｍＲＮＡの測定方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができるが、具体的には、前記ＤＥＣ１制御分子スクリーニング方法において用いることのできる方法を挙げることができる。
【００３２】
前記工程（ｃ）において、低酸素応答タンパク質又はそのｍＲＮＡの発現量の変化より、ＤＥＣ１非介在性の低酸素応答を促進又は抑制する被検物質を判定することができる。ＤＥＣ１ノックアウト細胞においては、ＤＥＣ１が発現していないため、ＤＥＣ１が介在しない低酸素応答に関連するタンパク質やｍＲＮＡの変化を特異的に検出することが可能である。
【００３３】
３．本発明の医薬組成物
本発明の医薬組成物は、有効成分として本発明のＤＥＣ１介在性物質スクリーニング方法、又はＤＥＣ１非介在性物質スクリーニング方法で得ることのできる物質を有効成分として含むことができる。また、ＤＥＣ１のｍＲＮＡの発現又はＤＥＣ１タンパク質の発現を抑制又は促進することのできる、ｓｉＲＮＡ、抗体、ベクターを含むことができる。以下に、ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物について、具体的に説明する。
【００３４】
ヒトＤＥＣ１タンパク質のｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に、マウスＤＥＣ１タンパク質のｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。ＲＮＡ干渉の標的は、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるＤＥＣ１のｍＲＮＡであれば特に限定されるものではないが、配列番号２で表される塩基配列における第４０５番目〜第４２５番目の塩基配列、又は第４５５番目〜第４７５番目の塩基配列を含むｍＲＮＡ領域であることが好ましく、第４０５番目〜第４２５番目の塩基配列、又は第４５５番目〜第４７５番目目の塩基の塩基配列からなるＲＮＡ領域（以下、標的ｍＲＮＡ領域と称する）であることが、最も好ましい。
【００３５】
二重鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１９〜２５塩基、最も好ましくは１９〜２１塩基である。二重鎖ＲＮＡ部分には、そのままｓｉＲＮＡとして機能するものも含まれるが、細胞内でＤｉｃｅｒにより切断されて、ｓｉＲＮＡとしてＲＮＡ干渉を誘導することのできる二重鎖ＲＮＡ部分も含むことができる。
【００３６】
二重鎖ＲＮＡ部分のアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＤＥＣ１のｍＲＮＡに細胞内でハイブリダイズできるものであれば、限定されず、前記標的ｍＲＮＡ領域の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ部分（以下、標的相補ＲＮＡ部分と称する）の塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＲＮＡ部分からなるＲＮＡ部分を含むＲＮＡであることができるが、好ましくは、ＤＥＣ１のｍＲＮＡの標的ｍＲＮＡに対して、完全に相補的な５‘−UAGUAAGUUUGAGAUGUUCGG−３’（配列番号４）又は５‘−UCGUUAAUCCGGUCACGUCUCG−３’（配列番号６）で表される塩基配列からなるＲＮＡ部分を含むＲＮＡ鎖であり、最も好ましくは、配列番号４又は配列番号６で表される塩基配列からなるＲＮＡ鎖である。
【００３７】
アンチセンスＲＮＡ鎖は、前記標的相補ＲＮＡ部分以外のＲＮＡ部分を含むことができ、そのＲＮＡ部分は、特に限定されるものではないが、ＤＥＣ１のｍＲＮＡであって、標的ｍＲＮＡ領域以外のＤＥＣ１のｍＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ部分が好ましい。また、アンチセンスＲＮＡ鎖の塩基配列は、標的ｍＲＮＡ領域における塩基配列に対して８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の相同性を有する。また、アンチセンスＲＮＡ部分は、ｓｉＲＮＡの全体のＧＣ含量が７０％以下、好ましくは３０〜７０％、３０〜６０％程度となるように設計されるのが好ましい。
【００３８】
二重鎖ＲＮＡ部分のセンスＲＮＡ鎖は、アンチセンスＲＮＡ鎖と細胞内でハイブリダイズすることのできるＲＮＡであれば、限定されず、例えば、アンチセンスＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＲＮＡ鎖であることができ、好ましくは、アンチセンスＲＮＡの塩基配列に対して、完全に相補的な５‘−GAACAUCUCAAACUUACUACU−３’（配列番号３）又は５‘−GACGUGACCGGAUUAACGAGU−３’（配列番号５）で表される塩基配列からなるＲＮＡ部分を含むＲＮＡ鎖であり、最も好ましくは、配列番号３又は配列番号５で表される塩基配列からなるＲＮＡ鎖である。
【００３９】
また、センスＲＮＡ鎖は、前記標的ＲＮＡ部分以外のＲＮＡ部分を含むことができ、そのＲＮＡ部分は、特に限定されるものではないが、ＤＥＣ１のｍＲＮＡであって標的ｍＲＮＡ領域以外のＤＥＣ１のｍＲＮＡ塩基配列からなるＲＮＡ部分が好ましい。
【００４０】
本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖のＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチドも含まれ、このようなｓｉＲＮＡは十分なＲＮＡｉ活性を示す。
【００４１】
また、本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖のＲＮＡ部分と、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングとからなり、突出末端を形成する二本鎖オリゴヌクレオチドも含まれる。前記オーバーハング部分は、それぞれ、５塩基以下の任意のヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）であるが、２塩基のヌクレオチドが好ましい。ｓｉＲＮＡの３’側オーバーハングを構成するリボヌクレオチドとしては、例えば、ｕ（ウリジン）、ａ（アデノシン）、ｇ（グアノシン）、又はｃ（シチジン）のヌクレオチドを用いることができ、３’側のオーバーハングを構成するデオキシリボヌクレオチドとしては、例えば、ｄｔ（チミジン）、ｄａ（デオキシアデノシン）、ｄｇ（デオキシグアノシン）、又はｄｃ（デオキシシチジン）のヌクレオチドを用いることができる。
【００４２】
前記オーバーハングとしては、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端に、それぞれ独立して、１又は２塩基のｕ又はｄｔが付加されたオーバーハングが好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に、それぞれ独立して、１又は２塩基のｕ又はｄｔが付加されたオーバーハングがより好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に、２塩基のｕ又はｄｔが付加されたオーバーハングが特に好ましい。更に、具体的なオーバーハングとしては、例えばｃｕ−３’、ｇｇ−３’、ｇｕ−３’、ｕｇ−３’ｕｃ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’などの塩基配列が挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；以下、ｓｈＲＮＡと称する）が含まれる。ｓｈＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡ部分を形成する前記センスＲＮＡ鎖とアンチセンス鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合し、前記センスＲＮＡ鎖とアンチセンス鎖が二本鎖構造を形成している。ヘアピンループを形成するＲＮＡ部分の鎖長及び塩基配列は、ヘアピンループを形成することができるものである限り、限定されるものではないが、鎖長は好ましくは３〜２３であり、例えば、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ（配列番号２６）、ＣＣＡＣＣ、ＣＵＣＧＡＧ、ＣＣＡＣＡＣＣ、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＡＵＧ、ＣＣＣ及びＵＵＣＧからなる群より選択される少なくともひとつの塩基配列からなるＲＮＡを挙げることができる。
【００４４】
ｓｉＲＮＡは、公知の製造方法、例えば、化学合成、又は酵素合成法により製造することもできるし、あるいは、後述するように適当な発現ベクターに挿入し、遺伝子工学的に製造することもできる。ベクターは、哺乳動物細胞内でＤＥＣ１のｍＲＮＡの発現を抑制することのできるｓｉＲＮＡを発現させるためのベクターであり、前記細胞内で効率良くｓｉＲＮＡを発現できるものであれば、骨格となるベクターは、特に限定されるものではない。前記骨格となるベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、直鎖状２本鎖ＤＮＡベクター並びに、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを挙げることができる。
【００４５】
本発明のｓｉＲＮＡ及びベクターは、医薬組成物として、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、又はカチオン脂質法を用いて目的の組織、又は細胞内に導入することが可能である。骨格となるベクターとして、ウイルスベクターを用いる場合は、目的の細胞へのウイルスベクターの感染によってｓｉＲＮＡを導入することが可能である。
【００４６】
前記ｓｉＲＮＡ、あるいはｓｉＲＮＡを投与対象内で発現可能なベクターは、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ＤＥＣ１が関与する疾患、例えば癌の治療のために、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に、有効量で投与することができる。前記ｓｉＲＮＡ、あるいは、本発明のｓｉＲＮＡを投与対象内で発現可能なベクターは、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ＤＥＣ１の発現細胞の増殖を抑制することにより、癌を治療又は予防することができる。
【００４７】
本発明の医薬組成物の治療又は予防の対象である癌の種類は、特に限定されることはないが、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病及び脳腫瘍を挙げることができる。また、本発明の医薬組成物は、癌の転移抑制のために用いることができる。
【００４８】
また、本発明の医薬組成物の治療又は予防の対象である虚血性疾患は特に限定されるものではないが、例えば、貧血、脳卒中、脳梗塞、虚血性心筋症、心筋梗塞症、虚血性心不全、閉塞性動脈硬化症、及び出血性ショックに伴う虚血性臓器障害を挙げることができるが、特には、脳梗塞及び虚血性心疾患に効果がある。
【００４９】
本発明の医薬の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００５０】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の医薬は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００５１】
本発明の医薬は、これに限定されるものではないが、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で、有効成分を含有することができる。
本発明の医薬を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５３】
《実施例１：ＤＥＣ１ノックアウトマウスの作製》
ＤＥＣ１ノックアウトマウスは、クラボウへの委託で作製した。
（１）ターゲティングベクターの構築
ＤＥＣ１をコードする内在性遺伝子を相同組換えにより不活性化（ノックアウト）するためのターゲティングベクターを構築した。
【００５４】
（２）ターゲティングベクターのＥＳ細胞への導入
１５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地中で培養したマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）をトリプシンで処理して単一細胞とした後、リン酸緩衝液で３回洗浄して細胞濃度を１×１０７細胞／ｍＬに調製した。細胞懸濁液１ｍＬあたり２５μｇの前記ターゲティングベクターを加え、エレクトロポレーションを行った。１０ｃｍシャーレに１×１０７細胞のＥＳ細胞を播種し、維持培地中で１日培養した後、培地をＧ４１８（２５０μｇ／ｍＬ）及び２μＭのガンシクロビルを含有する選択培地に交換した。以後２日毎に培地交換を行い培養した。ターゲティングベクター導入から１０日目に、マイクロピペットを用いて、顕微鏡下でネオマイシン耐性ＥＳ細胞クローンを取得した。得られたＥＳ細胞クローンを、Ｆｅｅｄｅｒ細胞を敷いた２４穴プレートで培養することにより、ネオマイシン耐性ＥＳ細胞のレプリカを取得した。
【００５５】
（３）ノックアウトＥＳ細胞のスクリーニング
得られたネオマイシン耐性ＥＳ細胞について、相同組換えによるＤＥＣ１をコードする遺伝子の破壊が起こっているか否かをＰＣＲにより確認した。ＰＣＲには、ネオマイシン耐性遺伝子の配列に基づいて設計、合成したプライマーを用いた。ネオマイシン耐性ＥＳ細胞について、ゲノミックＤＮＡを抽出し、それらを鋳型とし、ネオマイシン耐性プライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００５６】
試験したＥＳ細胞クローンのうち、目的のＰＣＲ産物が得られたクローンについてゲノミックサザンブロッティングを行い、更に選抜及び確認をした。ゲノミックＤＮＡを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩで消化後、アガロースゲルで電気泳動を行った。これをナイロンメンブランにトランスファーし、ＤＥＣ１のゲノミックＤＮＡ配列により作製したプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行った。前記プローブは、相同組み換えが起こる部位より外側の配列であって、変異型ゲノムと通常型ゲノムをサイズ的に見分けられるような部位の配列を基に設計した。その結果、変異型と通常型の２本のバンドが確認されたＥＳ細胞クローンを下記に述べるノックアウトマウスの作製に用いた。
【００５７】
（４）ノックアウトマウスの作製
ＤＥＣ１をコードする内在性遺伝子が相同組換えによりノックアウトされたＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ６マウス（日本チャールズリバー製）の雄雌を交配して得た胚盤胞に１胚あたり１５個ずつ注入（マイクロインジェクション）した。注入直後に、偽妊娠処理してから２．５日目の仮親ＩＣＲマウス（日本クレア製）の子宮に子宮の片側あたり約１０個ずつの胚盤胞を移植した。その結果、毛色への貢献度が８０％以上のキメラマウスが得られた。得られたキメラマウスを正常C57BL6マウスと交配し、ES細胞由来の毛色遺伝子によるアグーチ（agouti）色のマウスを得た
【００５８】
《実施例２：ＤＥＣ１ノックアウト細胞による低酸素応答性遺伝子のスクリーニング》
【００５９】
（Ａ）ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞（野生型）の作製
DEC1ノックアウトマウスの14.5日目の胎仔を取り出し、頭部と内臓を除いた後にトリプシン／EDTAで30分処理した後にメッシュで濾過した。それを３継代培養してＤＥＣ１ノックアウト細胞を樹立した。
【００６０】
（Ｂ）ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞の培養
前記（Ａ）で作製したＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細を２１％酸素条件及び１％酸素条件で培養した。ＤＭＥＭ培地を用い、ＣＯ２１０％、３７℃で、２４時間培養した。
（Ｃ）トータルＲＮＡ抽出
それぞれの細胞、約３５万個をトライゾールで処理して回収し、トータルＲＮＡ７μｇを回収した。得られたトータルＲＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。
【００６１】
（Ｄ）リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡの発現量の測定
ＲＮＡ０．５μｇを用いて、ロッシュＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙキットの説明書に従って、ＣＡ９、Ｓｌｃ２ａ１、Ｌｒｐ２ｂｐ、Ｖｅｇｆａ、Ｈｉｆ１ａ、Ｅｎｏ２、Ｎｄｒ１、Ｈｉｆ２ａについて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。それぞれの測定に用いたプライマーは以下のとおりである。ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅは、以下に記載のキットに添付のものを用いた。
ＣＡ９センスプライマー：５‘−ｇｃｔｇｔｃｃｃａｔｔｔｇｇａａｇａａａ−３’（配列番号７）
ＣＡ９アンチセンスプライマー：５‘−ｔｃｃａａａｃｃｔｇｇｇａｔｃｔｃａａｔ−３’（配列番号８）
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ  ｐｒｏｂｅ  ＃６９
Ｓｌｃ２ａ１センスプライマー：５‘−ａｔｇｇａｔｃｃｃａｇｃａｇｃａａｇ−３’（配列番号９）
Ｓｌｃ２ａ１アンチセンスプライマー：５‘−ｃｃａｇｔｇｔｔａｔａｇｃｃｇａａｃｔｇｃ−３’（配列番号１０）
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ  ｐｒｏｂｅ  ＃５２
Ｖｅｇｆａセンスプライマー：５‘−ａａａａａｃｇａａａｇｃｇｃａａｇａａａ−３’（配列番号１１）
Ｖｅｇｆａアンチセンスプライマー：５‘−ｔｔｔｃｔｃｃｇｃｔｃｔｇａａｃａａｇｇ−３’（配列番号１２）
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ  ｐｒｏｂｅ  ＃１
Ｅｎｏ２センスプライマー：５‘−ｃａｃｔａａｃｇｔｇｇｇｇｇａｔｇａａ−３’（配列番号１３）
Ｅｎｏ２アンチセンスプライマー：５‘−ｃａｃｃａｇｃｔｃｃａａｇｇｃｔｔｃ−３’（配列番号１４）
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ  ｐｒｏｂｅ  ＃８０
Ｌｒｐ２ｂｐセンスプライマー：５‘−ｇｇｃｃａａｃｔｃｔａｔｔｔｔｇａａｇａｇｇ−３’（配列番号１５）
Ｌｒｐ２ｂｐアンチセンスプライマー：５‘−ｔｃｃｔａｇｃｔｇａｔａａａｔｔｇｃｔｔｇａｔｇ−３’（配列番号１６）
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ  ｐｒｏｂｅ  ＃２
Ｎｄｒｌセンスプライマー：５‘−ｇｇｔａｇｔｔｇｇａｇａｃａａｃｔｃｔｃｃｔｇ−３’（配列番号１７）
Ｎｄｒｌアンチセンスプライマー：５‘−ｔｔｃｇｔｔｇｇｇｔｃｃａａｔｔｔａｇａａ−３’（配列番号１８）
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ  ｐｒｏｂｅ  ＃８９
Ｈｉｆ１ａセンスプライマー：５‘−ｃａｔｇａｔｇｇｃｔｃｃｃｔｔｔｔｔｃａ−３’（配列番号１９）
Ｈｉｆ１ａアンチセンスプライマー：５‘−ｇｔｃａｃｃｔｇｇｔｔｇｃｔｇｃａａｔａ−３’（配列番号２０）
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ  ｐｒｏｂｅ  ＃１８
Ｈｉｆ２ａセンスプライマー：５‘−ｇａｇｃａａｃｔａｃｃｔｇｔｔｃａｃｃａａａ−３’（配列番号２１）
Ｈｉｆ２ａアンチセンスプライマー：５‘−ｔｃａｔｃｇａａｇｔｔｃｔｇｇｃｔｔｃｃ−３’（配列番号２２）
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ  ｐｒｏｂｅ  ＃６３
それぞれのｍＲＮＡの発現の結果を図１〜図８に示す。ｍＲＮＡの発現量は、ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞を２１％酸素条件、及び１％酸素条件の４種類の条件における一番低いｍＲＮＡの発現量を１としたときの相対的な値で示した。
【００６２】
酸素濃度２１％では、ＤＥＣ１発現細胞において、ＤＥＣ１ノックアウト細胞より発現が高いｍＲＮＡは、ＣＡ９、Ｓｌｃ２ａ１、Ｌｒｐ２ｂｐ、Ｖｅｇｆａ、Ｈｉｆ１ａ、Ｅｎｏ２であり、ＤＥＣ１発現細胞とＤＥＣ１ノックアウト細胞で発現が影響されないｍＲＮＡはＮｄｒ１であり、ＤＥＣ１発現細胞において、ＤＥＣ１ノックアウト細胞より発現が低いｍＲＮＡは、Ｈｉｆ２ａであった。
また、酸素濃度１％では、ＤＥＣ１発現細胞において、ＤＥＣ１ノックアウト細胞より発現が高いｍＲＮＡは、ＣＡ９、Ｓｌｃ２ａ１、Ｌｒｐ２ｂｐ、Ｖｅｇｆａ、Ｈｉｆ１ａであり、ＤＥＣ１発現細胞において、ＤＥＣ１ノックアウト細胞より発現が低いｍＲＮＡは、Ｅｎｏ２、Ｎｄｒ１、及びＨｉｆ２ａであった。特に、低酸素条件においてＤＥＣ１ノックアウト細胞と比較してＤＥＣ１発現細胞においてＣＡ９の発現が高く、ＣＡ９の発現は、ＤＥＣ１によって促進されているものと考えられた。
《実施例３：ｓｉＲＮＡによるＤＥＣ１のｍＲＮＡの発現抑制》
【００６３】
（Ａ）ｓｉＲＮＡの作製
以下のｓｉＲＮＡを合成した（株式会社RNAiに委託）
ｍＤＥＣ１−１センス：５‘−ＧＡＡＣＡＵＣＵＣＡＡＡＣＵＵＡＣＵＡＣＵ−３’（配列番号３）
ｍＤＥＣ１−１アンチセンス：５‘−ＵＡＧＵＡＡＧＵＵＵＧＡＧＡＵＧＵＵＣＧＧ−３’（配列番号４）
ｍＤＥＣ１−２センス：５‘−ＧＡＣＧＵＧＡＣＣＧＧＡＵＵＡＡＣＧＡＧＵ−３’（配列番号５）
ｍＤＥＣ１−２アンチセンス：５‘−ＵＣＧＵＵＡＡＵＣＣＧＧＵＣＡＣＧＵＣＵＣ−３’（配列番号６）
コントロールのｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社のＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡを使用した。
それぞれ、ｍＤＥＣ１−１センス及びｍＤＥＣ１−１アンチセンス、ｍＤＥＣ１−２センス及び
ｍＤＥＣ１−２アンチセンス、並びにコントロールセンス及びコントロールアンチセンスを、アニーリングし、２本鎖のｓｉＲＮＡとした。
得られたｓｉＲＮＡ２５  ｐｍｏｌを、Lipofectamine 2000を用いて、前記実施例２の（Ａ）で作製したＤＥＣ１発現細胞（繊維芽細胞）にトランスフェクションによって導入した。４８時間培養後に、前記実施例２の（Ｃ）の操作を繰り返し、細胞からトータルＲＮＡを抽出した。プライマーとして、以下のＤＥＣ１のｍＲＮＡを測定するプライマーを用いたことを除いては、前記実施例２の（Ｄ）の操作を繰り返し、ＤＥＣ１のｍＲＮＡの発現を測定した。
ＤＥＣ１センスプライマー：５‘−ATCAGCCTCCTTTTTGCCTTC−３’（配列番号２３）
ＤＥＣ１アンチセンスプライマー：５‘−AGCATTTCTCCAGCATAGGCAG−３’（配列番号２４）
ＴａｑＭａｎ  プローブ：5’FAM-TTCTATCTCATCCCACCATCGGCCAC-TAMRA-3’（配列番号２５）
【００６４】
その結果、ｍＤＥＣ１−１をトランスフェクションした細胞では、コントロールであるｓｉＲＮＡと比較すると、ＤＥＣ１のｍＲＮＡ量が有意に減少していた（図９）。同様に、ｍＤＥＣ１−２をトランスフェクションした細胞では、コントロールに比べてＤＥＣ１のｍＲＮＡ量が有意に減少していた（図９）。
【００６５】
《比較例１》
また、比較例として４種類のＤＥＣ１に対するｓｉＲＮＡの効果を調べた。ｓｉＲＮＡとして、以下の配列のｓｉＲＮＡを用いたことを除いては、前記実施例３の操作を繰り返し、ＤＥＣ１のｍＲＮＡの発現の抑制効果を測定した。
ｍＤＥＣ１ａセンス：５‘−AGAGACGUGACCGGAUUAATT−３’（配列番号２７）
ｍＤＥＣ１ａアンチセンス：５‘−UUAAUCCGGUCACGUCUCUTT−３’（配列番号２８）
ｍＤＥＣ１ｂセンス：５‘−GACAGCAAGGAAACUUACATT−３’（配列番号２９）
ｍＤＥＣ１ｂアンチセンス：５‘−UGUAAGUUUCCUUGCUGUCTT−３’（配列番号３０）
ｍＤＥＣ１ｃセンス：５‘−AAGAGACGUGACCGGAUUATT−３’（配列番号３１）
ｍＤＥＣ１ｃアンチセンス：５‘−UAAUCCGGUCACGUCUCUUTT−３’（配列番号３２）
ｍＤＥＣ１ｄセンス：５‘−GCCGUGGACUUGAAAGAGATT−３’（配列番号３３）
ｍＤＥＣ１ｄアンチセンス：５‘−UCUCUUUCAAGUCCACGGCTT−３’（配列番号３４）
結果を図１０に示す。実施例３で用いたｓｉＲＮＡと比較して、これらのｓｉＲＮＡは、ＤＥＣ１のｍＲＮＡの発現抑制効果が見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明のＤＥＣ１制御分子スクリーニング方法により、ＤＥＣ１が制御するタンパク質をスクリーニングすることが可能である。また、ＤＥＣ１介在性物質スクリーニング方法、又はＤＥＣ１非介在性物質スクリーニング方法により、低酸素応答性に関与する物質のスクリーニングが可能である。またスクリーニングされた物質、又はＤＥＣ１の機能を促進又は抑制する物質を含む医薬組成物により、癌や虚血性疾患の治療又は予防が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】酸素濃度２１％と酸素濃度１％（低酸素条件）において、ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞を培養した場合の、ＣＡ９のｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで測定した結果である。
【図２】酸素濃度２１％と酸素濃度１％（低酸素条件）において、ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞を培養した場合の、Ｅｎｏ２のｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで測定した結果である。
【図３】酸素濃度２１％と酸素濃度１％（低酸素条件）において、ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞を培養した場合の、ＳＬｃ２ａのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで測定した結果である。
【図４】酸素濃度２１％と酸素濃度１％（低酸素条件）において、ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞を培養した場合の、Ｌｒｐ２ｂｐのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで測定した結果である。
【図５】酸素濃度２１％と酸素濃度１％（低酸素条件）において、ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞を培養した場合の、Ｎｄｒ１のｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで測定した結果である。
【図６】酸素濃度２１％と酸素濃度１％（低酸素条件）において、ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞を培養した場合の、ＶｅｇｆａのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで測定した結果である。
【図７】酸素濃度２１％と酸素濃度１％（低酸素条件）において、ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞を培養した場合の、Ｈｉｆ１ａのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで測定した結果である。
【図８】酸素濃度２１％と酸素濃度１％（低酸素条件）において、ＤＥＣ１ノックアウト細胞及びＤＥＣ１発現細胞を培養した場合の、Ｈｉｆ２ａのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで測定した結果である。
【図９】ｓｉＲＮＡ（ｍＤＥＣ１−１又はｍＤＥＣ１−２）を、ＤＥＣ１発現細胞に導入した場合のＤＥＣ１のｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示す。
【図１０】ｓｉＲＮＡ（ｍＤＥＣ１ａ、ｍＤＥＣ１ｂ、ｍＤＥＣ１ｃ、又はｍＤＥＣ１ｄ）を、ＤＥＣ１発現細胞に導入した場合のＤＥＣ１のｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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