(57)【要約】【課題】高感度で定量性に優れた被検物質検出用リポソーム粒子分散物とその製造方法を提供する。また、当該リポソーム粒子分散物を用いた蛍光測定による検出方法を提供する。【解決手段】蛍光性色材と、該蛍光性色材を包接することができるホスト化合物を内包し、該ホスト化合物の一部もしくは全てが、ホスト化合物同士または脂質層中の化合物との間で架橋結合を形成しており、かつ表面に被検物質を認識する部位を有しているリポソームを含有することを特徴とする被検物質検出用リポソーム粒子分散物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光性色材と、該蛍光性色材を包接することができるホスト化合物を内包し、該ホスト化合物の一部もしくは全てが、ホスト化合物同士または脂質層中の化合物との間で架橋結合を形成しており、かつ表面に被検物質を認識する部位を有しているリポソームを含有することを特徴とする被検物質検出用リポソーム粒子分散物。
【請求項２】
前記リポソームに封入する前の蛍光性色材調製濃度が１０ｍＭを超える濃度であることを特徴とする請求項１に記載の被検物質検出用リポソーム粒子分散物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の被検物質検出用リポソーム粒子分散物の製造方法であって、架橋剤および重合開始剤の少なくとも一方を用いて架橋結合を形成することを特徴とする被検物質検出用リポソーム粒子分散物の製造方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の被検物質検出用リポソーム粒子分散物を用いたことを特徴とする蛍光測定による検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質検出用リポソーム粒子分散物、その製造方法、及びそれを用いた蛍光測定による検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌などの疾患に罹ると、動物の体内では特定の微量タンパク質の量が増減する現象が見られる。従って、疾患の種類や重篤度合いと、増減するタンパク質の種類に相関関係が見出される場合、動物の体内の該タンパク質の存在量を測定することにより、疾患の識別や悪性度の診断が可能である。このようなタンパク質の分析には迅速かつ高感度な分析方法が求められる。この免疫測定法（「イムノアッセイ」ともいう。）には様々な分析方法が用いられるが、抗体または抗原を酵素で標識したものを用いるＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ法：「酵素結合抗体法」）が広く使用されている。
【０００３】
一般に、ＥＬＩＳＡ法の感度は、概ねタンパク質０．００１〜０．１μｇといわれている。分析ステップとしては、被検物質のタンパク質との抗原抗体反応、二次抗体との抗原抗体反応、酵素反応による発色反応の３ステップから構成されている（例えば、特許文献１および２参照）。高感度化の手法としては、リポソームを利用した感度増幅が知られている（特許文献１および特許文献３参照）。
【０００４】
しかし酵素反応が必要であるため、比較的分析時間が長く、ＥＬＩＳＡ法よりさらに短時間で簡便な分析方法が望まれていた。
【０００５】
これを受けて近年では、標識物質として蛍光物質を用いる蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）法がしばしば使用されている。これは検出手段が蛍光測定であるため、酵素反応に比べ大幅に分析時間を短縮できる。実際に様々な蛍光ラベル化試薬が市販されているが、比較的安価で普及しているもの（例えばフルオレセインイソチオシアネート（「ＦＩＴＣ」ともいう。）など）では感度が充分ではなかった。
【０００６】
特許文献４ではリポソームに蛍光物質を内包することで高感度化をはかっているが、これはリポソームが破壊された後に蛍光を発するものであるので、蛍光物質の拡散によって必然的に空間的分解能の低下が起きてしまう。空間的分解能の向上の為にはリポソームに蛍光色素を内包させたまま検出を行う方がよいが、一般に蛍光色素には高濃度で消光する特性があるため、リポソーム中に多くの蛍光色素を内包させたまま蛍光を検出することは困難である。またこの方法では、リポソームからの色素の溶出によってＳ／Ｎ比が低下する問題や、色素の褪色によって定量性が不充分であるという問題があり、さらなる改善が求められていた。
【特許文献１】特開昭６３−５０２９５８号公報
【特許文献２】特表２０００−５０９４９４号公報
【特許文献３】特開２００３−１４９２４６号公報
【特許文献４】特開平６−１６０３９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、高感度で定量性に優れた被検物質検出用リポソーム粒子分散物とその製造方法を提供することである。また、当該リポソーム粒子分散物を用いた蛍光測定による検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る上記課題は以下の手段により解決される。
【０００９】
１．蛍光性色材と、該蛍光性色材を包接することができるホスト化合物を内包し、該ホスト化合物の一部もしくは全てが、ホスト化合物同士または脂質層中の化合物との間で架橋結合を形成しており、かつ表面に被検物質を認識する部位を有しているリポソームを含有することを特徴とする被検物質検出用リポソーム粒子分散物。
【００１０】
２．前記リポソームに封入する前の蛍光性色材調製濃度が１０ｍＭを超える濃度であることを特徴とする前記１に記載の被検物質検出用リポソーム粒子分散物。
【００１１】
３．前記１または２に記載の被検物質検出用リポソーム粒子分散物の製造方法であって、架橋剤および重合開始剤の少なくとも一方を用いて架橋結合を形成することを特徴とする被検物質検出用リポソーム粒子分散物の製造方法。
【００１２】
４．前記１または２に記載の被検物質検出用リポソーム粒子分散物を用いたことを特徴とする蛍光測定による検出方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の上記手段により、高感度で定量性に優れた被検物質検出用リポソーム粒子分散物とその製造方法を提供することができる。また、当該リポソーム粒子分散物を用いた蛍光測定による検出方法を提供することができる。
【００１４】
すなわち、本発明では、被検物質を認識する部位を有するリポソーム中に蛍光色素とそれを包接できるシクロデキストリン等のホスト化合物を封入し、ホスト化合物同士またはホスト化合物と脂質層に含まれる物質とを架橋させることで、発光強度、色素溶出耐性、および耐褪色性を向上させ、さらには信号の安定化も達成できる。これにより高感度で定量性に優れた被検物質検出用リポソーム粒子分散物とその製造方法を提供することができる。また、当該リポソーム粒子分散物を用いた蛍光測定による検出方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の被検物質検出用リポソーム粒子分散物は、蛍光性色材と、該蛍光性色材を包接することができるホスト化合物を内包し、該ホスト化合物の一部もしくは全てが、ホスト化合物同士または脂質層中の化合物との間で架橋結合を形成しており、かつ表面に被検物質を認識する部位を有しているリポソームを含有することを特徴とする。この特徴は、請求項１〜４に係る発明に共通する技術的特徴である。
なお、本発明の実施態様としては、前記リポソームに封入する前の蛍光性色材調製濃度が１０ｍＭを超える濃度である態様にすることが好ましい。
【００１６】
また、本発明の被検物質検出用リポソーム粒子分散物の製造方法としては、架橋剤および重合開始剤の少なくとも一方を用いて架橋結合を形成する工程を有する製造方法であることが好ましい。
【００１７】
本発明の被検物質検出用リポソーム粒子分散物は、蛍光測定による検出方法に好適に用いることができる。
【００１８】
なお、本発明において、前記架橋結合の存否、架橋結合前駆体の残存は、赤外分光法、核磁気共鳴分光法によって確認することができる。
【００１９】
以下、本発明とその構成要素、および本発明を実施するための最良の形態・態様について詳細な説明をする。
【００２０】
《リポソームの脂質膜を構成する物質》
本発明に係るリポソームは、通常公知のリポソームと同様に脂質二重膜から形成されている。その脂質膜の成分として、一般にリン脂質が好ましく使用される。本発明に用いられるリン脂質は通常公知のもので制限はない。ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン等のリン脂質である。卵黄、大豆その他の動植物材料に由来するリン脂質、それらの水素添加物、水酸化物の誘導体といった半合成のリン脂質、または合成加工品など、限定されることなく用いられる。リン脂質の構成脂肪酸も特に限定されることはなく、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のどちらでもよい。
【００２１】
具体的な中性リン脂質の例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストリルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルエノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。
【００２２】
これらのリン脂質は単独で使用してもよく、２種以上併用してもよい。
【００２３】
本発明のリポソームはコレステロール誘導体を含んでいても良い。コレステロール誘導体は上述の脂質二重膜を構成する成分となるが、その使用量としてはリン脂質１質量部に対して０．０５〜１．５質量部、好ましくは０．２〜１質量部、より好ましくは０．３〜０．８質量部の割合が望ましい。
【００２４】
本発明に係るリポソームは最終的に封入した化合物とリポソームの脂質膜に含まれる物質とを架橋させることを要件としており、架橋が可能な物質としてはアクリル酸エステル構造、メタクリル酸エステル構造、アクリルアミド構造、メタクリルアミド構造などの重合性基を有したリン脂質やコレステロール類、あるいは類似構造を備えた物質が挙げられ、例えば日本油脂製のＭＰＣモノマーが好適に用いられる。
【００２５】
また本発明に係るリポソームは脂質膜中には被検物質を認識する部位を導入可能な物質が含まれている必要があり、その物質はカルボン酸基、アミノ基などの反応性基、あるいはそこから誘導される反応性基を有していなければならない。例えばコレステリルヘミスクシネートなどである。
【００２６】
あるいは予め被検物質を認識する部位を備えた物質を用いても良い。例えば糖鎖で修飾されたコレステロールなどが挙げられる。但しその場合には架橋を行う際に変性等を起こさないものを用いる必要がある。
【００２７】
《リポソームへの封入物》
本発明に係るリポソームは、内包する物質（「リポソームへの封入物」とも表現する。）が少なくとも１種の蛍光性色材と少なくとも１種のホスト化合物を含んでいる。
【００２８】
（蛍光性色材）
本発明に係る蛍光性色材としては、従来公知の蛍光色素やランタノイド錯体が特に問題なく用いられる。
【００２９】
例えば、スチルベン色素、アクリドン色素、アゾベンゼン色素、ローダミン、フルオレセイン等のキサンテン色素、クマリン色素、シアニン色素、スクアリリウム色素、ダンシルアミド色素、ピレン、ペリレン、アントラセン等の多環芳香族色素、ＮＢＤ色素、ＢＯＤＩＰＹ色素などである。
【００３０】
具体例としては、Ｃ．Ｉ．ソルベントイエロー４４、Ｃ．Ｉ．ソルベントイエロー８２、Ｃ．Ｉ．ソルベントイエロー１１６、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド４３、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド４４、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド４５、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド４９、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド６０、ソルベントブルー５、ソルベントピンク、ソルベントグリーン７、ディスパーズイエロー１２１、ディスパーズイエロー１２４、ディスパーズイエロー８２、ディスパーズオレンジ１１、ディスパーズレッド５８、ディスパーズレッド６０ディスパーズブルー７、エオシン、クマリン１、クマリン２、クマリン６、クマリン７、クマリン６Ｈ、クマリン３０、クマリン１０２、クマリン１０６、クマリン１５２Ａ、クマリン１５３、クマリン３０７、クマリン３１１、クマリン３１４、クマリン３３４、等が挙げられる。
【００３１】
本発明に用いられる蛍光性色材としては、ホスト化合物に包接されやすいものが好ましく、疎水性の高い物質が好ましい。
【００３２】
（ホスト化合物）
ホスト化合物としては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン誘導体やカリックスアレーンの誘導体、ポルフィリンの誘導体などが挙げられ、シクロデキストリン誘導体またはカリックスアレーン誘導体が好ましい。
【００３３】
本発明に係るホスト化合物は、その少なくとも１種が架橋性基を持っている必要があり、例えば２−アミノ−β−シクロデキストリン（これはＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４６（２００５）７９０５−７９０７を参考に合成できる。）にメタクリル酸を縮合させることで、メタクリルアミド構造を有したシクロデキストリンを合成することができる。
【００３４】
（重合開始剤）
重合開始剤としては、従来公知のラジカル重合開始剤が特に問題なく用いられるが、水溶性の開始剤であることが好ましく、例えば、２，２−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジハイドロクロライドなどの熱重合開始剤や１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパン−１−オンなどの光重合開始剤が好適に用いられる。
【００３５】
（その他の封入物）
本発明に係るリポソームへの封入物は、任意で架橋剤を含んでいても良い。たとえばエチレングリコールジメタクリレート、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、トリス（２−アクリロイルオキシエチル）イソシアヌレートなどを用いることが出来る。
【００３６】
本発明に係るリポソームの封入物は、その他にスチレン、ジビニルベンゼン、アクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体など従来公知の重合性化合物を含んでいても良い。
【００３７】
本発明に係るリポソームの構成成分は、上記に限定されず、他の成分を加えることができる。その例としては、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２３，４２（１９８７）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５，６９４９（１９８８）等に記載のモノシアルガングリオキシドＧＭ１誘導体、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２１４５（１９８９）；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１４８，７７（１９９２）等に記載のグルクロン酸誘導体、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０２９，９１（１９９０）；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２６８，２３５（１９９０）等に記載のポリエチレングリコール誘導体が挙げられるが、これに限られるものではない。
【００３８】
《被検物質検出用リポソーム粒子分散物の製造方法》
本発明の被検物質検出用リポソーム粒子分散物の製造方法としては、リポソームの形成工程と被検物質を認識する部位の導入工程等を経て製造する方法が好ましい。以下、各工程について順次説明する。
【００３９】
（リポソームの形成方法）
本発明に係るリポソームは、当業者が利用可能ないかなる方法で形成してもよい。形成法の例としては、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９，４６７（１９８０）、”Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｏｓｔｒｏ編、ＭＡＲＣＥＬＬ  ＤＥＫＫＥＲ、ＩＮＣ．）等に記載されている。具体例としては、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、カルシウム融合法、凍結融解法、逆相蒸発法等が挙げられるが、これに限られるものではない。リポソームの構造は特に限定されず、ユニラメラ又はマルチラメラなどのいずれの形態でもよい。また、リポソームの内部に適宜の化合物の１種又は２種以上を配合することも可能である。
【００４０】
形成方法の一例を以下に示す。リン脂質、安定化剤、酸化防止剤等の構成成分を、フラスコ内のクロロホルム等の有機溶媒中で混合し、有機溶媒を留去した後、真空乾燥することによりフラスコ内壁に薄膜を形成させる。次に前記フラスコ内に蛍光性色材、ホスト化合物、重合開始剤、架橋剤などの封入物の水溶液を加え、激しく攪拌することにより、リポソーム分散液を得る。得られたリポソーム分散液を遠心分離し、上澄みをデカンテーションして封入されなかった化合物等を除去する。必要に応じ、更に、親水性高分子の脂質誘導体の溶液を加えて加温することにより、本発明に係るリポソームが得られる。
【００４１】
なお、親水性高分子の脂質誘導体の溶液を構成成分の混合時に加えることによっても、本発明のリポソームが得られる。
【００４２】
また、別の方法として、上記の構成成分を混合し、高圧吐出型乳化機により高圧吐出させることにより本発明に係るリポソームを得ることもできる。
【００４３】
上述のリポソームの形成品は、必ず有機溶媒を含んでいる。残留する有機溶媒、特にクロル系有機溶媒は完全に除去することが困難であり、生体に及ぼす悪影響が懸念される。
【００４４】
本発明に使用するリポソームを形成するには、上記の問題点を回避できる方法として、超臨界もしくは亜臨界の二酸化炭素を使用するリポソーム形成法を利用することが好ましい。二酸化炭素の臨界温度が３１．１℃、臨界圧力が７．３８×１０6Ｐａ（７５．３ｋｇ／ｃｍ2）と比較的扱いやすく、大気圧下で不活性なガスゆえ残存しても人体に無害であり、高純度流体が安価で容易に入手できるなどといった理由により好適である。本発明に係る形成方法で使用する超臨界状態（亜臨界状態を含む）の二酸化炭素の好適な圧力は、７．８５×１０6〜４．９０×１０7Ｐａ（８０〜５００ｋｇ／ｃｍ2）、好ましくは８．８３×１０6〜３．９２×１０7Ｐａ（９０〜４００ｋｇ／ｃｍ2）、より好ましくは９．８１×１０6〜１．９６×１０7Ｐａ（１００〜２００ｋｇ／ｃｍ2）である。また好適な臨界状態の二酸化炭素ガスの温度としては、３２〜２００℃、好ましくは３５〜１００℃、さらに好ましくは４０〜８０℃である。これらの範囲内で、温度および圧力を適宜選択して組み合わせることにより、超臨界状態（亜臨界状態を含む）とするのがよい。
【００４５】
本発明に係る超臨界二酸化炭素使用するリポソームの調製方法は、具体的に以下のようにして行なわれる。圧力容器に液体二酸化炭素を加え、上記の好適な圧力および温度のもとにある超臨界状態もしくは亜臨界状態にする。超臨界（もしくは亜臨界）状態の二酸化炭素に本発明に係るリポソーム膜構成物質を溶解するか、あるいは予めこれらの化合物を加えた圧力容器に液体二酸化炭素を加え、次いで温度、圧力を調整して超臨界状態にして溶解してもよい。
【００４６】
その際、溶解助剤を添加すると、膜脂質成分の超臨界二酸化炭素への溶解が短時間で充分に行われるため、形成されるリポソームにおける一枚膜リポソームの比率が高くなる。
【００４７】
溶解助剤として、低級アルコール、グリコール、グリコールエーテルなどを１種または２種以上併用することが望ましい。例えばアルコール類を超臨界二酸化炭素の０．１〜１０質量％、好ましくは、１〜８質量％の割合で助溶媒として使用するのがよい。より好ましい解助剤としては、安全性の観点からエタノールである。
【００４８】
引き続き生成した脂質混合物に、本発明に係る蛍光性色材、ホスト化合物、重合開始剤、架橋剤、必要に応じて公知の製剤助剤などの封入物（以下、単に封入物とも表す）を含む水溶液を連続的に添加して、水相／二酸化炭素エマルジョンを形成する。系内を減圧して二酸化炭素を排出すると、本発明に係る封入物を内包するリポソームが分散している水性分散液が生成する。
【００４９】
上記封入物のリポソーム内への内包化の割合は、リポソーム用脂質の総量と封入物を含む水溶液との比率によっても左右される。リポソームの円滑な形成、ならびにその脂質膜内への封入物の効率的な内包化には、使用する脂質総量と封入物を含有する水溶液との比率もまた調整する必要がある。この脂質総量とは、リポソーム膜を構成するリン脂質類、架橋可能な部位を有するリン脂質またはコレステロールなどの脂質類、被検物質を認識する部位を導入可能なリン脂質またはコレステロールなどの脂質類、その他ステロール類、及びその他の添加した脂質類すべてを対象とした総和の質量である。上記水溶液１リットル（Ｌ）に対して、脂質総量が５〜１５０ｍｍｏｌｅｓの範囲、好ましくは３０〜１２０ｍｍｏｌｅｓの範囲、より好ましくは５０〜１００ｍｍｏｌｅｓの範囲の割合でリポソーム膜構成物質を含む溶媒を混合する。そうした場合、本発明に係る封入物のリポソーム内への内包化は良好に進行し、結果的にその封入物の保持効率も向上する。
【００５０】
次にリポソーム粒子の粒径（サイズ）およびその分布について詳述する。
【００５１】
本発明に係るリポソーム粒子の中心粒径は、１００〜３００ｎｍであることが好ましい。ここで、「中心粒径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒子径を指している。なお、粒子径または粒径は、粒子の直径を意味する。粒径の調整は、処方またはプロセス条件で行なうことができる。例えば、上記の超臨界の圧力を大きくすると形成されるリポソーム粒径は小さくなる。リポソームの粒子径の分布をより狭い範囲に揃えるには、作製されるリポソームの懸濁液を一定サイズの孔径を有する濾過膜、好ましくはポリカーボネート膜などに強制的に透過させてもよい。この場合、濾過膜として０．０５〜０．４μｍ、好ましくは０．１〜０．４μｍ、さらに好ましくは０．１５〜０．２μｍの孔径のフィルターを装着した静圧式押出し装置に通すことにより、リポソーム多重層膜の脂質膜枚数を減らすとともに、中心粒径として１００〜３００ｎｍの最適寸法を有する均一なリポソームを効率よく調製することができる。
【００５２】
具体的には、各種の静圧式押出し装置、例えば「エクストルーダー」（商品名、日油リポソーム製）などを使用して、フィルターを強制的に透過させる。フィルターは、ポリカーボネート系、セルロース系などのタイプを適宜使用することができる。このような「押出し」操作工程を取り入れることにより、上記サイジングに加えて、リポソーム分散液の交換、濾過滅菌も併せて可能になるという利点もある。引き続きリポソーム分散液を、遠心分離、ゲル濾過などの方法により未保持の薬剤を除去して精製したり、濃縮、希釈、凍結乾燥などの操作を任意に行ってもよい。本発明に係るリポソームの中心粒径は、通常５０〜３００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍ、より好ましくは５０〜１３０ｎｍである。
【００５３】
本発明に係るリポソームは、粒子が形成された後のいずれかのタイミングで架橋反応（重合反応）を起こさせる必要がある。重合反応は従来公知の方法が特に問題なく用いられる。
【００５４】
（被検物質を認識する部位の導入方法）
本発明に係るリポソームは表面に被検物質を認識する部位を備えている必要がある。
【００５５】
リポソーム形成時から予め被検物質を認識する部位を備えている場合以外は、リポソーム形成後、表面に被検物質を認識する部位を導入する。
【００５６】
被検物質を認識する部位を導入する方法としては、いかなる方法を用いても良く、例えばリポソーム粒子の分散液に、液に対しては安定で、リポソーム上のある部位に対して反応性を持ち、反応後結合を作るような被検物質を認識する部位の導入剤を反応させる方法が挙げられる。この際必要に応じて、縮合剤、触媒などを用いても良い。抗体の修飾については「酵素免疫測定法第３版」（石川栄治等編、医学書院）などが参考になる。
【００５７】
例えばリポソーム上の（コレステリルスクシネートなどの）カルボキシル基に被検物質を認識する部位としてビオチンを修飾する場合、リポソーム粒子の水分散液にビオチン化試薬（ＥＺ−ＬｉｎｋＲ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ−Ａｍｉｎｅ（テクノケミカル社製）など）とＷＳＣなどの縮合剤を加えて縮合反応を行うことで、ビオチン化試薬のアミノ基部位とリポソーム上のカルボキシル基とをペプチド結合で繋ぐことができる。
【００５８】
《被検物質の検出法への応用》
本発明の被検物質検出用リポソーム粒子分散物を用いた検出法（単に「本発明の検出法」とも表現する。）における、被検物質は、該被検物質を認識する物質が存在する物質であれば、特に限定されることはない。被検物質の認識において、特異的な認識であればより好ましい。
【００５９】
被検物質と、該被検物質を特異的に認識する物質の関係の一例としては、免疫学的な関係にある物質が挙げられる。具体的には、抗原と抗体の関係が挙げられる。抗原と抗体の関係において、被検物質が抗原である場合、該抗原を特異的に認識する物質は抗体であり、被検物質が抗体である場合、該抗体を特異的に認識する物質は抗原である。
【００６０】
また、被検物質を特異的に認識する物質は、被検物質を間接的に認識できる物質であってもよい。即ち、被検物質を特異的に認識する物質を認識することのできる物質であってもよい。具体的には、被検物質を認識する抗体（一次抗体）を認識することのできる抗体（二次抗体）が挙げられる。
【００６１】
二次抗体として、被検物質を認識できる一次抗体作製に用いた動物種に特異的な抗体を認識することのできる抗体を用いることにより、該動物種で一次抗体を作製可能な様々な被検物質に対して共通してこの同じ二次抗体を使用することが可能となる。本発明の検出法を利用したキットを作製する上で、この二次抗体を表面に有する微粒子は有用である。
【００６２】
上記抗体を作製するために用いる動物としては、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等が挙げられる。抗体としては、動物に免疫することによって得られるポリクローナル抗体でも、ハイブリドーマ法から得られるモノクローナル抗体でもよい。ポリクローナル抗体を用いる場合には、動物として取り扱いやすいウサギ抗体が好ましい。
【００６３】
抗原としての被検物質として、例えば血液中などに微量に存在するタンパク質ホルモン、活性ペプチド、オータコイド、腫瘍マーカー、免疫グロブリン等の生体成分や薬剤等が挙げられるが、これらに限定されることはなく、被検物質に対する抗体を作製できるもの等であれば特に制限はない。
【００６４】
その他、本発明の検出法における、被検物質と、該被検物質を特異的に認識する物質として、酵素と基質、酵素と阻害剤、ホルモンと受容体、レクチンと糖鎖、ＤＮＡとＲＮＡ、ＤＮＡとＤＮＡ、血清アルブミンと色素ブルー、酵素と補酵素、タンパク質とコンビナトリアルリガンドペプチド等の、様々な組み合わせのものを挙げることができる。酵素と補酵素の組み合わせの例としては、酸化還元酵素と補酵素ＮＡＤＨの組み合わせ等を挙げることができる。
【００６５】
本発明の検出法においては、ＥＬＩＳＡ測定用に調製された被検物質をそのまま使用することができる。また、被検物質を担体に固定化して用いてもよい。被検物質を固定化する担体としては、被検物質を固定化可能な担体であれば、特に限定されることはない。
【００６６】
上記担体の形状としては、膜状、チップ状、アレイ状、ビーズ状のもの等が挙げられる。上記担体の素材例としては、被検物質を固定化可能な素材であれば特に限定されないが、ポリビニリデンフルオリド、ニトロセルロース、ナイロン等が挙げられる。
【００６７】
担体の孔径は、本発明の微粒子の粒子径に合わせて適宜選定すればよい。本発明の微粒子の粒子径よりも大きい孔径の担体を用いることにより、検出感度を向上させることができる。また、担体として、細胞を用いることもできる。即ち、被検物質を細胞表層に発現している細胞を担体として挙げることができ、該細胞は遺伝子組換えにより被検物質を発現するように改変されたものであってもよい。
【００６８】
本発明の検出法は、ドットブロッティング法、ウエスタンブロッティング法、サザンブロッティング法、ノザンブロッティング法、などの様々な測定法に適用でき、またラボオンアチップ、イムノクロマトチップなどの形で使用することができる。
【００６９】
本発明の検出においては従来公知の蛍光検出法、分析機器が特に問題なく使用できる。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７１】
〔リポソーム粒子分散物の製造方法Ａ〕
ジパルミトイルホスファチジルコリン（５０ｎｍｏｌ）（日本油脂株式会社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−６０６０）、コレステリルヘミスクシネート（１００ｎｍｏｌ）及びＰＥＧ−リン脂質（１０ｎｍｏｌ）（日本油脂株式会社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ）、ＭＰＣモノマー（日本油脂株式会社製、３ｎｍｏｌ）をＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２５（１２），１５００（１９８２）記載の方法によりナス型フラスコ内でクロロホルムに溶解して均一溶液とした後、溶媒を減圧で留去してフラスコ底面に薄膜を形成した。この薄膜を真空で乾燥後、表１及び表２に記載の蛍光性色材、ホスト化合物、重合開始剤、架橋剤を表１及び表２に記載の割合で、かつ蛍光性色材が表１、表２記載の濃度になるように調製した水溶液を５ｍｌを注入した。次に超音波照射（Ｂｒａｎｓｏｎ社製、Ｎｏ．３５４２プローブ型発振器、０．１ｍＷ）を氷冷下５分実施することにより、リポソーム粒子の分散液を得た（表１及び表２に示す。）。得られた分散液を６０℃まで加熱し、８時間重合を行った後、その温度でアドバンテック社製のセルロース系フィルター、１．０μｍで加圧濾過した。その後、ＥＺ−ＬｉｎｋＲ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ−Ａｍｉｎｅ（テクノケミカル社製、１０ｎｍｏｌ）とＷＳＣ（１０ｎｍｏｌ）を加え室温で６時間反応させ、得られた試料をスペクトラプロ社製、バイオテックＲＣ透析チューブに封入し、多量の生理食塩水（９．０×１０-1質量％、１０００ｇ）中に浸して透析を行い、リポソーム内に取り込めなかった物質を除去した。
【００７２】
〔リポソーム粒子分散物の製造方法Ｂ〕
ジパルミトイルホスファチジルコリン（５０ｎｍｏｌ）（日本油脂株式会社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−６０６０）、コレステリルヘミスクシネート（１００ｎｍｏｌ）及びＰＥＧ−リン脂質（１０ｎｍｏｌ）（日本油脂株式会社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ）、ＭＰＣモノマー（日本油脂株式会社製、３ｎｍｏｌ）の混合物をステンレス製の特製オートクレーブに仕込み、オートクレーブ内を６０℃に加熱し、次いで液体二酸化炭素１３ｇを加えた。撹拌を行いながら、４．９０×１０6Ｐａ（５０ｋｇ／ｃｍ2）であったオートクレーブ内の圧力を、オートクレーブ内の体積を減ずることにより、１．１８×１０7Ｐａ（１２０ｋｇ／ｃｍ2）にまで上げて、二酸化炭素を超臨界状態にし、撹拌しながら脂質類を分散・溶解させた。さらに撹拌しながら、表１及び表２に記載の蛍光性色材、２−アミノ−β−シクロデキストリンのＮ−メタクリレート体（ホスト化合物１）、重合開始剤、架橋剤を表１及び表２に記載の割合で、かつ蛍光性色材が表１及び表２に記載の濃度になるように調製した水溶液を５ｍｌ、定量ポンプで連続的に５０分間かけて注入した。注入終了後、系内を減圧して二酸化炭素を排出し、リポソーム粒子の分散液を得た（表１及び表２に示す。）。得られた分散液を６０℃まで加熱し、８時間重合を行った後、その温度でアドバンテック社製のセルロース系フィルター、１．０μｍで加圧濾過した。その後、ＥＺ−ＬｉｎｋＲ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ−Ａｍｉｎｅ（テクノケミカル社製、１０ｎｍｏｌ）とＷＳＣ（１０ｎｍｏｌ）を加え室温で６時間反応させ、得られた試料をスペクトラプロ社製、バイオテックＲＣ透析チューブに封入し、多量の生理食塩水（９．０×１０-1質量％、１０００ｇ）中に浸して透析を行い、リポソーム内に取り込めなかった物質を除去した。
【００７３】
【表１】
2009145049.tif 000002
【００７４】
【表２】
2009145049.tif 000003
【００７５】
《リポソーム粒子分散物の評価》
（蛍光強度の評価）
リポソーム封入前の溶液の蛍光強度を測定し、同条件で測定した封入後の蛍光強度と比較した。
○：封入後の蛍光強度が、封入前の値を上回る。
×：封入後の蛍光強度が、封入前に対し同等以下である。
【００７６】
（色素溶出性の評価）
表３に記載の各微粒子分散液を１週間室温で静置したのちに上澄み液を取り出し、蛍光強度を測定した。これを室温静置前に採取しておいた上澄み液の蛍光強度（初期値）と比較することで色材の微粒子からの溶出性を判断し、以下の要領で評価した。
◎：静置後の上澄みの蛍光強度の値が初期値と同等以下である。
○：静置後の上澄みの蛍光強度の値が初期値を上回り、初期値の１．２倍以下である。
×：静置後の上澄みの蛍光強度の値が初期値の１．２倍を上回っている。
【００７７】
結果を表３に示す。この結果より本発明のリポソーム粒子分散物は色素の溶出性に問題がないことがわかる。
【００７８】
（耐褪色性の評価）
リポソーム粒子分散物をそれぞれ同一濃度に調製し、１００Ｗ水銀ランプにて光を照射後、蛍光光度計にて蛍光強度を測定し、信号の時間安定性を評価した。照射前・照射時間２０秒・照射時間４０秒・照射時間１分の各サンプルについて測定を行い、照射前の蛍光強度に対するそれぞれの時間での蛍光強度比が８５％以上ある場合◎、８５％を下回り７０％以上である場合には○、７０％を下回る場合×として、表３に記載した。この結果より本発明のリポソーム粒子分散物は褪色に強く、定量性に優れていることがわかる。
【００７９】
（検出方法への応用）
ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ストレプトアビジン結合ビーズ（磁気ビーズ）を被検物質とし、該ビーズの分散液を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、その１０倍希釈液、１００倍希釈液もそれぞれ調製した。被検試料５ｍｌに対し、参照のビオチン化フルオレセイン溶液（２００ｐｍｏｌ／ｍｌ）５ｍｌ、あるいは各分散液（合成時に用いたビオチン化試薬が全て使われたと仮定して、ビオチン当量が２００ｐｍｏｌ／ｍｌとなるように水を加えて調液済み。）５ｍｌと混合し、１時間振盪を行った。その後、磁石を利用してビーズを集め、上澄み５ｍｌだけを取り除き、ＰＢＳ５ｍｌを加えて１５分間振盪し、再び上澄み５ｍｌを取り除いた。この、水を加えて振盪し上澄みを抜く一連の洗浄操作を７回繰り返し、最後に水を加えて１０ｍｌの分散液となるように調製した。その後各試料の蛍光強度を測定し、検出可能かどうかを判断した。この結果を表３に示す。この結果より本発明の微粒子分散液は物質の検出方法として好適に用いることができ、検出感度も極めて良好であることがわかる。
【００８０】
（信号の安定性の評価）
上記検出法を５回繰り返し、検出結果のバラツキを評価した。
○：５回とも同じ結果だったもの
△：５回中１回だけ結果が異なったもの
×：５回中２回以上結果が異なったもの
結果を表３に示す。この結果より本発明のリポソーム粒子分散物は信号の安定性が高く、定量性に優れていることがわかる。
【００８１】
【表３】
2009145049.tif 000004