(57)【要約】  【課題】  微生物の属する微生物叢の階層を微生物の塩基配列に基づいて判別することができる微生物の判別法を提供すること。  【解決手段】  この発明に係る微生物の判別方法は、（ａ）微生物の属する同一階層を構成する第１群の所定塩基数からなる第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する同一階層を構成する第１群以外の第２群の中の種の個数（以下、「群外一致数」という。）と、（ｂ）同一階層を構成する第１群の中で、第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する種の個数が第１群の全ての種の個数に対して占める割合（以下、「群内一致率」という。）、または上記群外一致数（ａ）だけに基づいて、微生物の属する階層、例えば種、属、科などを判別することができる。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の属する微生物叢の階層を該微生物の塩基配列に基づいて判別する微生物の判別法であって、
ａ）該微生物の属する同一階層を構成する第１群の所定塩基数からなる第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する該同一階層を構成する該第１群以外の第２群の中の種の個数（以下、「群外一致数」という。）と、
ｂ）該同一階層を構成する該第１群の中で、第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する種の個数が第１群の全ての種の個数に対して占める割合（以下、「群内一致率」という。）と、
に基づいて、該微生物の属する階層を判別することを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項２】
微生物の属する微生物叢の階層を該微生物の塩基配列に基づいて判別する微生物の判別法であって、該微生物の属する同一階層を構成する第１群の所定塩基数からなる第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する該同一階層を構成する該第１群以外の第２群の中の種の個数（以下、「群外一致数」という。）に基づいて、該微生物の属する階層を判別することを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の微生物の判別方法において、前記群外一致数が０個から２０個までであることを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の微生物の判別方法において、前記群外一致数が０個から１５個までであることを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の微生物の判別方法において、前記群外一致数が０個から１０個までであることを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の微生物の判別方法において、前記群外一致数が０個であることを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項７】
請求項１に記載の微生物の判別方法において、前記群内一致率が１００％から８０％まであることを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項８】
請求項１または７に記載の微生物の判別方法において、前記群内一致率が１００％から９０％まであることを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項９】
請求項１、７または８に記載の微生物の判別方法において、前記群外一致数が１００％であることを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の微生物の判別方法において、前記第１群の第１部分配列についての判別が終了したときは、前記第２群に属するそれぞれの群について実質的には同様に判別することを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の微生物の判別方法において、前記第１部分配列の所定塩基数は、微生物の階層判別に有意な塩基数であることを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の微生物の判別方法において、前記第１部分配列の所定塩基数は、前記第１群に属する微生物の塩基配列のｉ番目の塩基からＬ個からなる塩基数であることを特徴とする微生物の判別方法（ただし、ｉは１から始まる整数であって、該塩基配列を構成する塩基数に相当し、Ｌは１０〜５０の整数を意味する）。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の微生物の判別方法において、前記階層が属、科、目、綱または門であるときには、前記群内一致率と前記群外一致数との組合せに基づいて微生物の階層を判別することを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項１４】
請求項２ないし６のいずれか１項または請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の微生物の判別方法において、前記階層が種であるときには、前記群外一致数に基づいて微生物の階層を判別することを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項１５】
請求項１または請求項３ないし１３のいずれか１項に記載の微生物の判別方法において、前記階層が属、科、目、綱または門であるときには、前記群内一致率と前記群外一致数との組合せに基づいて表１に示すようにランク付けすることを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項１６】
請求項２ないし６のいずれか１項または請求項１４に記載の微生物の判別方法において、前記階層が種であるときには、前記群外一致数に基づいて表２に示すようにランク付けすることを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の微生物の判別方法において、請求項７に記載のランク付けした該群外一致数と請求項８に記載のランク付けした該群内一致率との組合せを、表３に示すようにさらにランク付けするとともに、前記所位塩基数の部分塩基配列を構成する塩基配列のｎ番目の塩基にランクに応じて表３に示すように記号を付すことを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の微生物の判別方法において、前記微生物の塩基配列がリポソームＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする微生物の判別方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１８のいずれか１項に記載の微生物の判別方法を使用して、微生物をその属する各階層に分類することを特徴とする微生物の分類方法。
【請求項２０】
請求項１ないし１８のいずれか１項に記載の微生物の判別方法または請求項１９に記載の微生物の分類方法に使用するプローブ。
【請求項２１】
請求項１ないし１８のいずれか１項に記載の微生物の判別方法または請求項１９に記載の微生物の分類方法に使用する微生物判別・分類用プローブ。
【請求項２２】
微生物の属する微生物叢の階層を該微生物の塩基配列に基づいて判別するプローブが、
ａ）該微生物の属する同一階層を構成する第１群の所定塩基数からなる第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する該同一階層を構成する該第１群以外の第２群の中の種の個数（以下、「群外一致数」という。）と、
ｂ）該同一階層を構成する該第１群の中で、第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する種の個数が第１群の全ての種の個数に対して占める割合（以下、「群内一致率」という。）との組合せ、または前記群外一致数だけに基づいて、選択されたプローブであることを特徴とするプローブ。
【請求項２３】
請求項２０ないし２２のいずれか１項に記載のプローブにおいて、前記プローブが、前記群外一致数と前記群内一致率との組合せに基づいて選択されたプローブであって、前記階層のうち属、科、目、綱または門である階層を判別することができるプローブであることを特徴とするプローブ。
【請求項２４】
請求項２０ないし２３のいずれか１項に記載のプローブにおいて、前記プローブが、前記群外一致数に基づいて選択されたプローブであって、前記階層のうち種である階層を判別することができるプローブであることを特徴とするプローブ。
【請求項２５】
請求項２０ないし２４のいずれか１項に記載のプローブにおいて、前記第１部分配列の所定塩基数は、前記第１群に属する微生物の塩基配列のｉ番目の塩基からＬ個からなる塩基数であることを特徴とするプローブ（ただし、ｉは１から始まる整数であって、該塩基配列を構成する塩基数に相当し、Ｌは１０〜５０の整数を意味する）。
【請求項２６】
ａ）微生物の属する同一階層を構成する第１群の所定塩基数からなる第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する該同一階層を構成する該第１群以外の第２群の中の種の個数（以下、「群外一致数」という。）と、
ｂ）該同一階層を構成する該第１群の中で、第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する種の個数が第１群の全ての種の個数に対して占める割合（以下、「群内一致率」という。）との組合せ、または前記群外一致数だけに基づいて選択されるプローブであって、同一階層を構成する全てのもしくは実質的に全ての群から選択されるプローブが同一階層を構成する全てのもしくは実質的に全ての群を網羅的に固定されているマイクロアレイであることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２７】
請求項２６に記載のマイクロアレイにおいて、前記プローブが、前記群外一致数に基づいてランク付けしたプローブまたは前記群外一致数と前記群内一致率との組合せに基づいてランク付けされたプローブであって、所定のランク付けされたプローブが固定されていることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載のマイクロアレイにおいて、前記群外一致数が０個から２０個までの許容度を持ってランク付けされたプローブが固定されていることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２９】
請求項２６ないし２８のいずれか１項に記載のマイクロアレイにおいて、前記群外一致数が０個から１０個までの許容度を持ってランク付けされたプローブが固定されていることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項３０】
請求項２６ないし２９のいずれか１項に記載のマイクロアレイにおいて、前記群外一致数が０個から２０個までの許容度および前記群内一致率が１００％から８０％までの許容度を持った組合せに基づいてランク付けされたプローブが固定されていることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項３１】
請求項２６または２７に記載のマイクロアレイにおいて、前記群外一致数が０個から１０個までの許容度および前記群内一致率が１００％から９０％までの許容度を持った組合せに基づいてランク付けされたプローブが固定されていることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項３２】
請求項３１に記載のマイクロアレイにおいて、前記群外一致数が０個であり、また前記群内一致率が１００％である組合せに基づいてランク付けされたプローブが固定されていることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項３３】
請求項２６ないし３２のいずれか１項に記載のマイクロアレイにおいて、前記同一階層と異なる階層を全てもしくは実質的に全て網羅するプローブを追加して結合していることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項３４】
請求項２６ないし３３のいずれか１項に記載のマイクロアレイにおいて、前記同一階層が属であり、前記群が種であることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項３５】
請求項２０ないし２５のいずれか１項に記載にプローブを、マイクロアレイに固相化などの慣用手段で固定してマイクロアレイを製造することを特徴とするマイクロアレイの製造方法。
【請求項３６】
請求項２６ないし３４のいずれか１項に記載のマイクロアレイを使用して微生物の判別もしくは分類をすることを特徴とするマイクロアレイの使用方法。
【請求項３７】
請求項１ないし１８のいずれか１項に記載に微生物の判別方法を使用して微生物をスクリーニングすることを特徴とする微生物のスクリーニング方法。
【請求項３８】
請求項２０ないし２５のいずれか１項に記載にプローブを使用して微生物をスクリーニングすることを特徴とする微生物のスクリーニング方法。
【請求項３９】
請求項２６ないし３４のいずれか１項に記載のマイクロアレイを使用して微生物をスクリーニングすることを特徴とする微生物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、微生物の属する分類学的階層を判別する微生物の判別方法に関するものである。更に詳細には、この発明は、微生物の属する分類学的階層をその塩基配列に基づいて判別することができる微生物の判別方法ならびに分類方法、それに使用するプローブならびにそれを結合したマイクロアレイなどに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細菌などの生物は、一般的には、生物を栄養培地で培養法により培養して、形成されたコロニー等の形態観察、グラム染色、酸素要求性、栄養要求性、生化学的検査などに基づいて同定・分類されてきた。しかし、この方法は、培養に時間と労力ならびに判別対象の微生物の適応した培地を選択する必要があることから多大の労力と費用を要する上に、その分類学的階層の判定に際して、コロニー等の形態観察などの客観的判定基準が無く、主観的観察結果などに基づく場合もあることから客観的判別が困難であり、信頼性に欠けることがあるなどの欠点がある。
【０００３】
現在では、環境中の全微生物からRNA、DNAなどの塩基配列を解析することができるようになったため、微生物の分類学的解析にも、分子生物学的手法が広く用いられるようになってきている。RNAやDNAの塩基配列に基づく生物の系統分類方法における系統分類指標としては、リボゾーマルRNA（rRNA）およびその遺伝子（rDNA）を用いる方法が一般に利用されてきている (非特許文献１)。これは、リボゾーマルRNA遺伝子がほとんど全ての微生物に普遍的に存在し、過去の進化（変異）の過程を類推するのに十分な量の情報を有し、かつ、種の違いを示す適当な差異を持つとともに、指標となりうるだけの多様性を有していることに基づいている。かかる rRNA およびその遺伝子（rDNA）を微生物の系統分類に使用する方法としては、その塩基配列を決定し、これを比較したり、またある分類群に特異的な配列をDNAプローブとして使用する方法があり、この方法は一般に既に利用されている。
【０００４】
なお、rDNAは、生物によってその大きさが異なっていて、その大きさにより、例えば23S、18S、16S、5S rDNA塩基配列などに分類されていて、かかる小サブユニットrDNA塩基配列を用いた広範囲の生物の系統樹を作成することができる。例えば、真核生物では18S
rDNA、原核生物では16S rDNA 塩基配列を用いた全生物の系統分類法が提案されている（非特許文献１）。このことから、現在では、塩基数が10、000以上の16S rDNA配列が決定され、日本のデータバンクや、GenBankなどの公的な遺伝子バンクに登録され利用されている。
【０００５】
これまでに蓄積された豊富な16S rDNA塩基配列などの小型サブユニット(small subunit) rDNA塩基配列は、それを比較することによって、ある特定の生物菌種・菌群に特異的な配列を提供することができる。かかる特異的な配列は、例えば、プライマーや、プローブとして用いることで、その標的となる特定の生物菌種・菌群を迅速にかつ高い確率で検出し特定することができる。
【０００６】
かかる小型のDNA配列からなる特定プローブの情報は、その微生物の属する群から他の群を区別したり、また所望の微生物群をその属する種、属などの階層に選択して分類したりして、様々な適用において決定的な役割を果たしている。
【０００７】
多くの役割のうちの１つ目の役割は、例えば、種々の環境での微生物の特長を調査することであり、その調査は、様々な環境下での物質循環ならびに微生物の役割を理解する上で有用である。また、かかる微生物の調査は、様々な環境で既に実施されていて、例えば、土壌（非特許文献２−１２）、重金属汚染堆積物（非特許文献１３）、スラッジ（非特許文献１４）、水（非特許文献１５、１６）、海浜砂（非特許文献１７）、南極大陸棚堆積物（非特許文献１８）、海生ネマトーデ（非特許文献１９）などについて調査されている。これらのいくつかの研究は、微生物群を属レベルに分類することができるプローブの重要性を示している。
【０００８】
さらにまた、人体内の微生物と疾患や感染症との関係を明確にするために、16SrDNAに基づいた調査も行われている。かかる調査としては、例えば、プラーク（非特許文献２０、２１）、胃腸粘膜（非特許文献２２）、排泄物（非特許文献２３、２４）、膣液（非特許文献２５）などの調査が既に実施されている。
【０００９】
２つ目の役割は、マイクロアレイ（例えば、DNAチップ）の設計に当たっての微生物DNAプローブの情報の役割である。マイクロアレイは、現在では、遺伝子発現分析のために一般的に使用されている（非特許文献２５）。またDNAマイクロアレイは、細菌コロニーの数と種類の大まかな構造を知ると共に、有害な細菌などの微生物を検出するためにも使用されている。
【００１０】
したがって、ヌクレオチド配列に基づく分子的方法は体系的でかつ強力である。その上、この分子的技法は、種々雑多な環境下の数多くの未培養微生物を評価できるという利点も有している。
【００１１】
なお、細菌などの微生物の分類は、プローブ探索の出発点であって、プローブは分類学的階層別に分類した群を別の群と区別する高い能力を有しているべきである。分子的技法についての数多くの研究によって、16S rDNAに基づく研究が微生物の分類にとって有効であることが示され、かつ、16S rDNAについて蓄積されたデータはタイプ菌株（タイプカルチャー）として登録されている。これらのデータを使用すれば、ほとんどの微生物を分類することが可能である。ある１種の細菌の属する種のその他の細菌との相同関係（ホモロジー）を特定できれば、その結果その細菌種を唯一選択することが可能である。しかしながら、高次の分類学的階層、つまり属(genus)、科(family)、目(order)、綱(class)、門(phylum)の１群を唯一選択するのは厄介である。このような選択を可能にするためには、その困難性を克服する新しい着想が必要である。
【非特許文献１】Nucleic AcidTechniques in Bacterial Systematics, John Wiley & Sons, England, 1991
【非特許文献２】谷口初美、福田和正ら、平成１４年度廃棄物処理等科学研究・研究報告書、平成１６（２００３）年５月発行
【非特許文献３】谷口初美、福田和正ら、平成１５年度廃棄物処理等科学研究・研究報告書、平成１６（２００４）年５月発行
【非特許文献４】谷口初美、福田和正ら、平成１６年度廃棄物処理等科学研究・研究報告書、平成１７（２００５）年５月発行
【非特許文献５】谷口初美、福田和正ら、平成１４〜１６年度廃棄物処理等科学研究・総合研究報告書、平成１７（２００５）年５月発行
【非特許文献６】Dunbar, J., L.O. Ticknor, and C. R. Kuske. 2000. Assessment of microbial diversity in foursouthwestern United  States soils by 16S rRNAgene terminal restriction fragment analysis. Appl. Environ. Microbiol.66:2943-2950
【非特許文献７】Furlong, M. A.,D. R. Singleton, D. C. Coleman, and W. B. Whitman. 2002. Molecular andculture-based analyses of prokaryotic communities from an agricultural soil andthe burrows and casts of the earthworm Lumbricus rubellus. Appl. Environ.Microbiol. 68:1265-1279.
【非特許文献８】Hartmann, M.,and F. Widmer. 2006. Community structure analyses are more sensitive todifferences in soil bacterial communities than anonymous diversity indices.Appl. Environ. Microbiol. 72:7804-7812
【非特許文献９】Martin-Laurent,F., L. Philippot, S. Hallet, R. Chaussod, J. C. Germon, G. Soulas, and G.Catroux. 2001. DNA extraction from soils: old bias for new microbial diversityanalysis methods. Appl. Environ. Microbiol. 67:2354-2359.
【非特許文献１０】5Zhou, J., M.E. Davey, J. B. Figueras, E. Rivkina, D. Gilichinsky, and J. M. Tiedje. 1997.Phylogenetic diversity of a bacterial community determined from Siberian tundrasoil DNA. Microbiology 143:3913-3919.
【非特許文献１１】Zhou, J., B.Xia, H. Huang, A. V. Palumbo, and J. M. Tiedje. 2004. Microbial diversity andheterogeneity in sandy subsurface soils. Appl. Environ. Microbiol.70:1723-1734.
【非特許文献１２】Zhou, J., B.Xia, D. S. Treves, L. Y. Wu, T. L. Marsh, R. V. O'Neill, A. V. Palumbo, and J.M. Tiedje. 2002. Spatial and resource factors influencing high microbialdiversity in soil. Appl. Environ. Microbiol. 68:326-334.
【非特許文献１３】Gillan, D. C.,B. Danis, P. Pernet, G. Joly, and P. Dubois. 2005. Structure of sediment-associatedmicrobial communities along a heavy-metal contamination gradient in the marineenvironment. Appl. Environ. Microbiol. 71:679-690.
【非特許文献１４】Fang, H. H., T.Zhang, and H. Liu. 2002. Microbial diversity of a mesophilic hydrogen-producingsludge. Appl Microbiol Biotechnol 58:112-118.
【非特許文献１５】Cho, J. C., andS. J. Kim. 2000. Increase in bacterial community diversity in subsurfaceaquifers receiving livestock wastewater input. Appl. Environ. Microbiol.66:956-965.
【非特許文献１６】Reardon, C. L.,D. E. Cummings, L. M. Petzke, B. L. Kinsall, D. B. Watson, B. M. Peyton, and G.G. Geesey. 2004. Composition and diversity of microbial communities recoveredfrom surrogate minerals incubated in an acidic uranium-contaminated aquifer.Appl. Environ. Microbiol. 70:6037-6046.
【非特許文献１７】Kowalchuk, G.A., J. R. Stephen, W. De Boer, J. I. Prosser, T. M. Embley, and J. W.Woldendorp. 1997. Analysis of ammonia-oxidizing bacteria of the betasubdivision of the class Proteobacteria in coastal sand dunes by denaturinggradient gel electrophoresis and sequencing of PCR-amplified 16S ribosomal DNAfragments. Appl. Environ. Microbiol. 63:1489-1497.
【非特許文献１８】Bowman, J. P.,and R. D. McCuaig. 2003. Biodiversity, community structural shifts, andbiogeography of prokaryotes within Antarctic continental shelf sediment. Appl.Environ. Microbiol. 69:2463-2483.
【非特許文献１９】Polz, M. F., C.Harbison, and C. M. Cavanaugh. 1999. Diversity and heterogeneity of epibioticbacterial communities on the marine nematode Eubostrichus dianae. Appl.Environ. Microbiol. 65:4271-4275.
【非特許文献２０】Diaz, P. I., N.I. Chalmers, A. H. Rickard, C. Kong, C. L. Milburn, R. J. Palmer, Jr., and P.E. Kolenbrander. 2006. Molecular characterization of subject-specific oralmicroflora during initial colonization of enamel. Appl. Environ. Microbiol. 72:2837-2848.
【非特許文献２１】Paster, B. J.,S. K. Boches, J. L. Galvin, R. E. Ericson, C. N. Lau, V. A. Levanos, A.Sahasrabudhe, and F. E. Dewhirst. 2001. Bacterial diversity in humansubgingival plaque. J. Bacteriol. 183:3770-3783.
【非特許文献２２】Bik, E. M., P.B. Eckburg, S. R. Gill, K. E. Nelson, E. A. Purdom, F. Francois, G.Perez-Perez, M. J. Blaser, and D. A. Relman. 2006. Molecular analysis of thebacterial microbiota in the human stomach. Proc. Natl. Acad. Sci. USA103:732-737.
【非特許文献２３】Eckburg, P. B.,E. M. Bik, C. N. Bernstein, E. Purdom, L. Dethlefsen, M. Sargent, S. R. Gill,K. E. Nelson, and D. A. Relman. 2005. Diversity of the human intestinalmicrobial flora. Science 308:1635-1638.
【非特許文献２４】Suau, A., R.Bonnet, M. Sutren, J. J. Godon, G. R. Gibson, M. D. Collins, and J. Dore. 1999.Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities revealsmany novel molecular species within the human gut. Appl. Environ. Microbiol. 65:4799-4807.
【非特許文献２５】Fredricks, D.N., T. L. Fiedler, and J. M. Marrazzo. 2005. Molecular identification ofbacteria associated with bacterial vaginosis. N.Engl. J. Med. 353:1899-1911.
【非特許文献２６】Schena M,Shalon D, Davis RW, Brown PO. (1995). Quantitative monitoring of geneexpression patterns with a complementary DNA microarray. Science. Oct 20; 270(5235): 467-70.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、本発明者らは、微生物群を体系的に探索する新着想に基づいて微生物の属する分類学的階層を判別する手法を鋭意検討した結果、各微生物のリボゾーマル遺伝子には、菌種・菌群に共通の部分塩基配列が存在していて、その共通部分塩基配列を比較検討することによって、微生物の分類学的階層を判別して、その属する階層に分類できることを見出して、この発明を完成した。
【００１３】
したがって、この発明は、微生物の有するリボゾーマルDNA またはRNAの部分塩基配列の一致する所定塩基数について、下記に定義する群外一致数と群内一致率の許容度に基づいて、微生物を判別することからなる判別する微生物の判別方法を提供することを主な目的としている。
【００１４】
また、この発明は、上記群外一致数単独の許容度または上記群外一致数と群内一致率との許容度の組合せに基づいて選択した部分塩基配列から構成されるプローブならびに微生物判別・分類に有用なプローブを提供することを別の目的としている。
【００１５】
さらに、この発明は、上記プローブを固相化などの手段によって結合したマイクロアレイを提供することをさらに別の目的としている。
また、この発明のその他の目的ならびに課題は、本明細書の記載から明らかになるものと理解することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この発明の上記目的を達成するために、この発明は、微生物の分類学的階層を該微生物の塩基配列に基づいて判別する微生物の判別方法であって、
ａ）該微生物の属する同一階層を構成する第１群の所定塩基数からなる第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する該同一階層を構成する該第１群以外の第２群の中の種の個数（以下、「群外一致数」という。）の許容度と、
ｂ）該同一階層を構成する該第１群の中で、第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する種の個数が第１群の全ての種の個数に対して占める割合（以下、「群内一致率」という。）の許容度との組合せまたは群外一致数の許容度だけに基づいて、該微生物の属する階層を判別する微生物の判別方法を提供する。なお、上記群外一致数と上記群内一致率とは、それぞれ微生物の属する分類学的階層に有意に判別することができる許容度を持って設定されている。
【００１７】
この発明の好ましい態様として、該第１部分配列の所定塩基数が、該第１群に属する微生物の塩基配列のｉ番目の塩基からＬ個からなる塩基数として設定されている微生物の判別方法が提供される（ただし、ｉは１から始まる整数であって、該塩基配列を構成する塩基数に相当し、Ｌは、微生物の分類学的階層判別に有意であれば、特に限定されるものではないが、一般的には１０〜５０、好ましくは１０〜４０、さらに好ましくは１５〜３０の整数であるのがよい）。
【００１８】
この発明の好ましい態様として、群外一致数の許容度は、群外一致数が０個から２０個まで、好ましくは０個から１０個まで、更に好ましくは０個から５個まで、特に好ましくは０個であるのがよい。また、この発明の好ましい態様として、群内一致率の許容度は、群内一致率が１００％から８０％まで、好ましくは１００％から９０％まで、更に好ましくは１００％であるのがよい。
【００１９】
この発明は、さらに好ましい態様として、該階層が種であるときには、該群外一致数の許容度に基づいて、例えば表１に示すようにランク付けする微生物の判別方法を提供する。
【００２０】
この発明は、さらに好ましい態様として、該階層が属、科、目、綱または門であるときには、該群内一致率と群外一致数のそれぞれの許容度の組合せに基づいて、例えば表２に示すようにランク付けすることからなる微生物の判別方法を提供する。
【００２１】
この発明は、さらに好ましい態様として、ランク付けした該群外一致数と該群内一致率との組合せを、例えば表３に示すようにさらにランク付けするとともに、該所定塩基数の部分塩基配列を構成する塩基配列のｎ番目の塩基にランクに応じて表３に示すように記号を付すことからなる微生物の判別方法を提供する。
【００２２】
また、この発明は、他の形態として、上記群外一致数と群内一致率が微生物の分類学的階層を有意に判別することができる許容度を持ってそれぞれ設定されているプローブを提供するとともに、該プローブが該微生物の属する分類学的階層を判別し、該階層に分類するための微生物判別・分類用プローブを提供する。
【００２３】
具体的には、この発明は、ａ）該微生物の属する同一階層を構成する第１群の所定塩基数からなる第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する該同一階層を構成する該第１群以外の第２群の中の種の個数と、ｂ）該同一階層を構成する該第１群の中で、第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する種の個数が第１群の全ての種の個数に対して占める割合とに基づいて、該微生物の属する分類学的階層を判別・分類することができる部分塩基配列からなっているプローブおよび微生物判別・分類用プローブを提供する。
【００２４】
更に具体的には、この発明に係るプローブおよび微生物判別・分類用プローブは、第１部分配列の所定塩基数が、該微生物の属する分類学的階層を有意に判別・分類することができる塩基数であり、該微生物の塩基配列のｉ番目の塩基からＬ個からなる塩基数である（ただし、ｉは１から始まる整数であって、該塩基配列を構成する塩基数に相当し、Ｌは、微生物の分類学的階層を有意に判別・分類する塩基数であって、一般的には１０〜５０、好ましくは１０〜４０、さらに好ましくは１５〜３０の整数を意味する）。
【００２５】
また、この発明は、上記（ａ）群外一致数単独の許容度に応じてランク付けしたプローブもしくは微生物判別・分類用プローブと、上記（ａ）群外一致数の許容度と、（ｂ）群内一致率の許容度との組合せに応じてランク付けしたプローブもしくは微生物判別・分類用プローブを固定したマイクロアレイを提供する。この発明の好ましい態様として、この発明は、所定のランクもしくはそのランク以上の濫掘消したプローブもしくは微生物判別・分類用プローブを固定したマイクロアレイを提供する。
【００２６】
さらに、この発明の好ましい態様として、判定対象の微生物の属する分類学的階層を有意に判別・分類することができるように、微生物を同一階層を構成する全ての群もしくは実質的に全ての群を網羅する上記プローブまたは微生物判別・分類用プローブを固定しているマイクロアレイが提供される。
なお、本明細書中で使用する「実質的に全ての群」という用語またはこれに関連する用語は、同一階層を構成する全ての群のうち、この発明の目的に適う必要十分な数からなる群を意味していて、全ての群を使用した場合と実質的に同一の効果を奏することができる数からなる群を意味している。
【００２７】
その上、この発明の好ましい態様として、判定対象の微生物の属する分類学的階層をさらに有意に判別・分類することができるように、微生物を同一階層を構成する全ての群もしくは実質的に全ての群を網羅する上記プローブまたは微生物判別・分類用プローブに加えて、該微生物の属する属の更に上位階層を構成する全ての群もしくは実質的に全ての群を網羅する上記プローブまたは微生物判別・分類用プローブの少なくとも２種類の上記プローブまたは微生物判別・分類用プローブを固定しているマイクロアレイが提供される。
【００２８】
この発明はまた、上記プローブまたは微生物判別・分類用プローブを、マイクロアレイに固相化などの慣用手段で固定してマイクロアレイを製造するマイクロアレイの製造方法を提供するとともに、製造されたマイクロアレイを使用して微生物の属する分類学的階層を判別もしくは分類をするマイクロアレイの使用方法を提供する。
その上、この発明は、上記微生物の判別方法、プローブおよび／またはマイクロアレイを使用して微生物のスクリーニングをすることからなる微生物のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【００２９】
この発明の微生物判別方法は、各微生物のrDNAの小さい塩基配列からなるプローブを用いて各微生物の属する分類学的階層を判別・分類することができるという効果がある。また、この発明の微生物判別方法を用いれば、サンプル中に存在する各菌群に属する菌種の全てを網羅して判別して検索できるという効果もある。
【００３０】
また、この発明は、任意のプローブ長で、16S
rDNAは勿論のこと、16S rDNA以外の任意の遺伝子に対しても良好なプローブを探索でき、かつ、その評価をランク付けておこなうことができるという効果がある。
【００３１】
さらに、この発明は、プローブをマイクロアレイに実装するに当たって、全菌叢の菌種を網羅してマイクロアレイ上に配置すると共に、全菌叢の菌種を区別して選択することができるという効果もある。しかも、上記パラメーターの許容度の高いプローブを選択することによって微生物の判別の精度を上げることができる。また、この発明では、準備する塩基配列の長さをほぼ一定に、例えば５５０ｂｐ程度に揃えることができることから、微生物の判別の精度をほぼ一定にすることができるとともに、その塩基配列がプローブとハイブリダイゼーションする部位を設計することも可能である。その上、プローブのＣＧ含量の割合が揃うようにプローブを選択することもできるという効果もある。
【００３２】
その上、この発明は、菌種の属する属と種とを同時に判別することによって、その判別の精度を上げることができる。また、マイクロアレイに属と種とを網羅するように一緒にプローブを配置することによって、属と種とを同時に高精度に判別できるという効果もある。
【００３３】
この発明によれば、菌の機能は属レベルではほとんど同じで決まっていることが多いことから、微生物の属する属を指定して検索することによって、ある機能のみをもつ菌を判別することも可能である。また、微生物は、種レベルでは、種を判別するプローブで検索することができない場合でも、属レベルでは同じ配列を持つ可能性が多いことから、微生物を属レベルで検索することによって、未知の菌も判別することができる可能性が大きくなるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
この発明は、微生物の属する分類学的階層、つまり種（species)、属(genus)、科(family)、目(order)、綱(class)ならびに門(phylum)を判別し、その微生物の分類学的階層に分類することができる新規な微生物の判別方法に関する。つまり、この発明に係る微生物の判別方法は、微生物の塩基配列の共通する部分塩基配列を基準にして、微生物の属する分類学的階層を判別・分類することを特徴としている。
【００３５】
この発明の微生物の判別方法は、微生物を判別するパラメータとして、その微生物のrDNAの部分配列を、下記に定義する群外一致数(Coincidence Number of Outside Group: CNOG)と、(Coincidence Rate Inside Group: CRIG) とを使用している。
【００３６】
本明細書で使用する「群外一致数」(CNOG)という用語は、測定対象の微生物の属する同一階層を構成する第１群の所定塩基数からなる第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する該同一階層を構成する該第１群以外の第２群の中の種の個数を意味している。
【００３７】
より具体的には、「群外一致数」とは、例えば、ある属（genus）に属するある種（species）の微生物の16SrDNAの一定の塩基数からなる部分塩基配列と同一の部分配列を有する、同一属（genus）または他属（genus）に属する他の種（species）の個数を意味する。同様に、ある科（family）に属するある種（species）の微生物のrDNAの部分塩基配列と同一の部分配列を有する同一科（family）または他の科（family）に属する種（species）の個数を意味する。科（family）以上の上位階層についても同様である。
【００３８】
更に具体的には、例えば、ある属（genus）に属するある種（species）の微生物の16S rDNAの一定の塩基数からなる部分塩基配列と同一の部分塩基配列を有する、同一属（genus）または他属に属する他の種（species）が存在しないこと、つまり、群外一致数が「０」であることを意味している。換言すると、群外一致数が「０」である共通の部分塩基配列を有する微生物は、同一階層の同一群に非常に高い確率で属しているといえる。したがって、群外一致数が「０」である共通部分配列は、この発明の目的である微生物の属する階層を判別することに有効に使用できるといえる。
【００３９】
同様に、ある群に属する微生物の部分塩基配列の群外一致数が「１〜５」であることは、その微生物の部分塩基配列と同一の部分塩基配列を有する菌種が、別群に１〜５種類存在する可能性が大きいことを意味している。しかしながら、この程度の可能性は、微生物の階層判断においては、問題になることは少ないと判断することができる。
【００４０】
一方、群外一致数が「１１〜２０」や「２０より以上」である場合は、その微生物の部分塩基配列と同一の部分塩基配列を有する、別群に属する微生物が１１〜２０種または２０種以上それぞれ存在する可能性があることを意味している。このように群外一致数が大きい部分配列は、この発明の目的である微生物の判別方法には、判別能力が低いと判断することができる。
【００４１】
したがって、この発明において定める群外一致数の許容度は、例えば、その群外一致数が０個から２０個まで、好ましくは０個から１５個まで、より好ましくは０個から１０個まで、更に好ましくは０個から５個まで、特に好ましくは０個であるのがよい。また、この発明の目的によっては、その下限を増減させてもよく、また場合によっては更に細分化しても、またより大きな数で分類してもよい。
【００４２】
他方、本明細書で使用する「群内一致率」（CRIG）という用語は、同一階層を構成する第１群の中で、第１部分塩基配列と一致する部分塩基配列を有する種の個数が第１群の全ての種の個数に対して占める割合を意味している。
【００４３】
より具体的には、「群内一致率」とは、例えば、ある属（genus）に属するある種（species）の微生物のrDNAの一定塩基数からなる部分配列と同一の部分配列を有する菌種が、同一属（genus）に属する全ての菌種（species）の個数に対して存在する割合を意味する。また、属の上位階層である科について説明すると、ある科のある種のrDNAの部分配列が、その科の他の種に対して存在する割合を意味している。更に上位の階層の場合も同様である。
【００４４】
さらに具体的に説明すると、ある群、例えば属（genus）の菌種のrDNAの部分配列の群内一致率が１００％であるということは、その群に属する全菌種が、かかる同一の部分塩基配列を有していること意味している。換言すると、ある群に属する微生物の部分塩基配列の群内一致率が１００%であるということは、その群の菌種の全てがかかる同一の共通部分配列を有していることを意味し、かかる微生物は、同一階層に属していると非常に高い確率で推定できることを意味している。その他の階層についても同様である。
【００４５】
ただし、上記のような群内一致率が１００%である部分配列を有するある階層の群と同じ階層に属する他の群にも、同一部分配列を有する微生物が存在する可能性がある。そこで、この発明においては、かかる可能性を調べるために、もう１つのパラメータである上記群外一致数を群内一致率と組み合わせることによって、微生物の属する階層をある許容度をもって判別することを可能にしている。
【００４６】
例えば群内一致率１００%と、群外一致数０とを組み合わせた場合、群内一致率が１００%である共通部分配列を有する群は１つしかないことを示している。この場合、群が例えば属（genus）である場合、かかる共通部分配列を有する微生物は、全て単一の同一属（genus）に属していることがほぼ１００%という高許容度で特定することができる。また、群内一致率１００%と、群外一致数１とを組み合わせた場合、群内一致率が１００%である共通部分配列を有する群が２つある可能性があることを示している。同様に、その他の組合せも同様である。したがって、この発明においては、目的によってどの程度の許容度が妥当であるかを決めることによって、群内一致率と群外一致数とを組み合わせるのがよい。つまり、微生物の厳密な判別が要求される場合は、例えば、群内一致率１００%と群外一致数０もしくは１程度とを組み合わせたり、またはあまり厳密な判別が要求されない場合は、例えば、群内一致率１００％未満から９０％と、群外一致数０もしくは１〜１０とを組み合わせることも可能である。
【００４７】
したがって、この発明において定める群内一致率の許容度は、例えば、その群内一致率が１００％から８０％まで、好ましくは１００％から９０％まで、より好ましくは１００％であるのがよい。また、この発明の目的によっては、その下限を増減させてもよく、また場合によっては更に細分化しても、またより大きな数で分類してもよい。
【００４８】
この発明において、微生物の属する分類学的階層の判別を簡潔にするために、上記群外一致数単独の許容度、または群内一致率と群外一致数との許容度の組合せに基づいてそれぞれランク付けするのがよい。この許容度は、目的によって適宜変更するのがよいが、本発明における微生物の分類学的階層の判別においては、例えば、下表１ならびに表２のようにそれぞれ許容度を持ってランク分けをすることができる。
【００４９】
【表１】
2009072168.tif 000002
【００５０】
【表２】
2009072168.tif 000003
【００５１】
ここで、この発明において使用する微生物の塩基配列の部分塩基配列について説明する。この発明においては、バージェイズ・マニュアル（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Edition）に菌種名が記載され、タイプカルチャーとして登録されている全菌種の16S rDNA塩基配列の所定塩基数（L）からなる各部分配列について、その群内一致率と群外一致数がそれぞれ決定される。
【００５２】
まず、GenBankなどの公的機関に登録されているタイプカルチャーの16S rDNAライブラリーを、２種類の共通プライマー（ユニバーサルプライマー）で切断する。この発明で使用することができる共通プライマーとしては、例えば、下記の配列のプライマーが挙げられる。
プライマー１：5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’（配列番号２２０７）
プライマー２：5’-CCGTCAATTCCTTTAAGTTT-3’（配列番号２２０８）
プライマー３：5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’（配列番号２２０９）
【００５３】
この発明においては、例えば、約1600bpのオリジナル16S rDNA（3463塩基）から約550bpの配列を抽出し、続いてこの抽出配列から、記号N、Y、Rなどの不明瞭な塩基を有する細菌をフィルタリングによって全て除外し、塩基配列がA、C、GおよびTだけからなる菌種（species）２２０６種を抽出した。菌種（species）２２０６種は、属（genus）６９７属、科（family）１８６科、目（order）７５目、綱（class）３１綱、門（phylum）２２門に分類される。しかし、これらの数値は、例えば、未知菌種の発見やタイプカルチャーの塩基配列の特定などによって変わることがあり得ることも留意すべきであり、この場合には、変化した値もこの発明の趣旨に包含されることは明白であることも留意すべきである。
【００５４】
上記のようにして抽出したある菌種(第ｍ種)（ｍ＝１〜２２０６。ただし、この数字は上記に説明したように、タイプカルチャーの種類や登録rDNA塩基配列などの変更などにより変わることがある）または菌群（以下、「菌種・菌群」ともいう）の塩基配列を選択すると共に、その塩基配列のｉ番目（ｉ＝１〜ｎ）からＬ個（例えば、Ｌ＝約１０〜５０）の部分配列を選択して、この部分配列が残りの全ての菌種・菌群に存在するかどうかを解析する。なお、記号「ｉ＝１」は、各菌種・菌群の塩基配列の第１番目の塩基番号を意味し、また「ｉ＝ｎ」は、各菌種・菌群の塩基配列の第ｎ番目（つまり、塩基配列の最終番目）の塩基番号を意味する。また、「Ｌ＝約１０〜５０」は、塩基数が連続する約１０〜５０個であることを意味している。ただし、記号「Ｌ」は、微生物の判別に有意に利用可能である限り、特に限定されるものではなく、任意にその数を決めることが可能であるが、この発明においては、例えば、約１０〜５０、好ましくは１２〜４０、より好ましくは１３〜２５であるのがよい。
【００５５】
このようにして選択したある菌種・菌群の塩基配列のｉ番目（ｉ＝１）、つまり、その塩基配列の最初の塩基（ｉ＝１）からＬ個（例えば、Ｌ＝約１０〜５０）の連続する部分配列について、その群外一致数を解析する。つまり、部分配列（ｉ＝１）と同一の部分配列を有する菌種・菌群が、残り全ての菌種・菌群の何個に存在するか、その菌種・菌群の個数をコンピュータで解析する。その結果、その個数が「０」であれば、その群外一致数は「０個」と定義する。同様に、その個数が１、２、・・・２０個より以上の個数であれば、その群外一致数はそれぞれ「１個」、「２個」、・・・、「２０個より以上」であると定義する。
【００５６】
上記部分配列（ｉ＝１）についての解析が完了すると、次にその塩基配列の２番目（ｉ＝２）の部分配列について同様に残りの全ての菌種・菌群について解析する。このように上記塩基配列を構成する塩基について順次解析して、最終番目（ｉ＝ｎ）の塩基についての解析を完了する。これによって、第（ｍ＝１）菌種・菌群の塩基配列を構成するすべての塩基について群外一致数を特定する。
【００５７】
上記のようにして、上記第（ｍ＝１）菌種・菌群について全ての塩基についての解析が完了すると、次に、別の菌種（ｍ＝２）または菌群の塩基配列について、そのｉ番目（ｉ＝１〜ｎ）からＬ個（例えば、Ｌ＝約１０〜５０）の部分配列全てについて、上記菌種（ｍ＝１）または菌群と同様に、その部分配列が残り全ての菌種・菌賊軍に存在するかどうかを解析する。このようにして第（ｍ＝２）菌種・菌群の塩基配列の全ての部分配列について群外一致数を決定する。
【００５８】
このようにして第（ｍ＝２）種の塩基配列の全ての部分配列についての群外一致数の解析が完了すると、続いて、菌種（ｍ＝３〜２２０６）または菌群の各塩基配列について、そのｉ番目（ｉ＝１〜ｎ）からＬ個（例えば、Ｌ＝約１０〜５０）の全ての部分配列について、上記と同様に解析する。このようにして、それぞれの菌種（ｍ＝３〜２２０６）または菌群の塩基配列の全ての部分配列について群外一致数を決定する。
【００５９】
次に、上位層の階層についての群外一致数ならびにそれらのランク付けについて、属を例にとって説明する。
まず、ある属（ｋ＝１〜６９７。なお、この発明における属の総数は、タイプカルチャーの種類や登録16S rDNAの変更などにより変わることがある）に属する１菌種の塩基配列のｉ番目（ｉ＝１〜ｎ）からＬ個（例えば、Ｌ＝約１０〜５０）の部分配列が、当該属中の他の菌種に存在するかどうかを、上記と同様に解析する。この解析によって、各部分配列が存在する同一属に属する菌種の個数から、この菌種の個数が同一属中の全菌種の総数の何％に相当するかを計算して、群内一致率を算出する。
【００６０】
上記と同様にして、上記属（ｋ＝１）以外の属（ｋ＝２〜６９７）に属する全ての菌種について解析して、その属の群外一致数と群内一致率を算出する。さらに同様にして、属より上位階層についても群外一致数と群内一致率を解析する。
【００６１】
この発明においては、上記のようにして解析した各階層の菌種・菌群の群外一致数と群内一致率について、表１および表２に従ってランク付けをするのがよい。具体的には、菌種(species)の場合には、その下位階層がないことから、菌種の群外一致数単独について表１に従ってランク付けを行う。また、菌種(species)より上位階層の場合には、群外一致数と群内一致率との組合せに基づいて表２に従ってランク付けをする。なお、ランクならびに許容度は、目的に応じて変更することができることは当然のことであり、適宜決定するのがよい。
【００６２】
菌種の塩基配列について上記のようにランク付けした例として、菌種Holophaga foetida（配列番号１）の塩基配列を参考までに下記に示す。
【００６３】
【表３】
2009072168.tif 000004
また、例えば、科の塩基配列について群外一致数と群内一致率との組合せにランク付けした例を下記に示す。
【００６４】
【表４−１】
2009072168.tif 000005
【００６５】
【表４−２】
2009072168.tif 000006
【００６６】
【表４−３】
2009072168.tif 000007
【００６７】
このようにして、全ての種、属、科、目、綱、門の全部分配列についての群内一致率ならびに群外一致数の判定およびそれぞれのランク付けが完了すると、表５および表６に従って全部分配列に記号付けを行う。部分配列に対するこの記号付けは、各部分配列の先頭の塩基１個に該当する記号を付すことによって行う。その結果を図１〜図５８８に示している。
【００６８】
【表５】
2009072168.tif 000008
【００６９】
【表６】
2009072168.tif 000009
【００７０】
例えば、配列番号１のAcidobacteriaceae、 Holophaga、Holophaga foetidaの最初の塩基から１部分（下記１２０塩基分参照）L=23の場合を例として上表に従って更に詳細に説明する。
【００７１】
【表７】
2009072168.tif 000010
【００７２】
つまり、上記部分塩基配列（なお、対応する塩基配列は別表に記号で記載されている。以下同じ）において、最初の部分配列（第１番目の塩基から始まる塩基数２３個の部分塩基配列（プローブ長：L=23)。以下同じ）の第１番目の塩基の記号は「０」である。このことは、その第１番目の塩基から塩基数２３個の部分配列は、表５に示すように、種、属および科レベルのランクはいずれも０であること、つまり種、属および科レベルでの群内一致率が８０％未満であるか、あるいは、群外一致数が２０より大であることを意味している。
【００７３】
同様に、２番目の部分配列における最初の塩基（つまり、２番目の塩基）の記号も０である。したがって、この２番目の部分配列の種、属および科レベルのランクはいずれも０であることを意味している。また、例えば、上記塩基配列の１５番目の記号は「ｕ」であるから、表５を参照すると、種レベルのランクは３〜１、属レベルのランクは７〜１、科レベルのランクは７〜１である。つまり、このことは、種レベルの群外一致数が６〜２０であること、属レベルならびに科レベルの群内一致率が１００％〜８０％、群外一致数が０〜２０であることを意味している。
【００７４】
さらに、例えば、上記塩基配列の６７番目の記号は「Ａ」であるから、表５を参照すると、種レベルのランクは５、属レベルのランクは９、科レベルのランクは９である。つまり、このことは、種レベルの群外一致数が０であること、属レベルならびに科レベルの群内一致率が１００％、群外一致数が０であることを意味している。換言すると、上記塩基配列の６７番目の記号「Ａ」から始まる２３個の塩基数からなる部分配列を有する菌種全ては、同一種、同一属ならびに同一科に属する菌種であると極めて高い確率で分類することができる。他の部分配列についても同様である。
【００７５】
また、塩基数、つまりプローブ長が、例えば１５個（Ｌ＝１５）、１９個（Ｌ＝１９）、３０個（Ｌ＝３０）であっても実質的に同様にして、微生物の全ての菌種について、その属する分類学的階層を判別することが可能である。なお、塩基数が例えば１５個、１９個、３０個である場合は、上記に記載した塩基数が２３個（Ｌ＝２３）の場合と同様に各塩基配列の部分配列の比較ならびにランク付けを行って、同様に処理して判別に供することになる。その他の塩基数についても実質的には同じである。
【００７６】
なお、１例として、同一菌種Actinomycetaceae、Actinobaculum、Actinobaculum suis （配列番号３）について、塩基数が２３個（Ｌ＝２３）と１５個（Ｌ＝１５）との場合のランク付け（記号の表記）の違いを表８−１と表８−２にそれぞれ示す。
【００７７】
【表８−１】
2009072168.tif 000011
【００７８】
【表８−２】
2009072168.tif 000012
【００７９】
上記したように、部分配列の塩基数が異なると、微生物の塩基配列を構成する各塩基に対する群内一致率と群外一致数の特定が異なる場合があるが、この場合でも、上記で説明したプローブ長Ｌ＝２３の場合と同様にして、微生物の判別に適用することができる。つまり、この発明において、部分塩基配列の塩基数、つまりプローブ長が異なった場合には、目的群一致数（つまり、判別対象の塩基配列と一致する塩基配列を有する微生物群の数）は多少異なるが、上記に規定するプローブ長の範囲内においては、微生物の判別という目的に充分適っている。
【００８０】
以下に、プローブ長Ｌ＝２３、Ｌ＝１９およびＬ＝１５の場合において、２２０６菌種について目的群一致数は次のようになる。
例えば、プローブ長Ｌ＝２３の場合、群外一致数の許容度のランクがランク５の時、目的群一致数は１７９９菌種（８２％）、ランク４の時３６３菌種（１６％）となる。このことは、群外一致数の許容度のランクをランク５および４に設定することにより、全２２０６菌種の９８％に相当する２１６２菌種を判別することができることを意味している。
【００８１】
これに対して、プローブ長Ｌ＝１９の場合、群外一致数の許容度のランクがランク５および４のとき、目的群ヒット数はそれぞれ１７７０菌種（８０％）および３８６菌種（１８％）となり、プローブ長をＬ＝１９に設定したときには、群外一致数の許容度のランクをランク５および４に設定することにより、全２２０６菌種の９８％に相当する２１５６菌種を判別することができることになる。
同様に、プローブ長がＬ＝１５である場合、群外一致数の許容度のランクがランク５および４のとき、目的群ヒット数はそれぞれ１７３２菌種（７９％）および４０６菌種（１８％）となり、プローブ長をＬ＝１５に設定したときには、群外一致数の許容度のランクをランク５および４に設定することにより、全２２０６菌種の９７％に相当する２１３８菌種を判別することができることになる。
【００８２】
他方、プローブ長Ｌ＝２３の場合において、属（６９７属）、科（１８６科）、目（７５目）、綱（３１綱）および門（２２門）について、群外一致数と群内一致率とのそれぞれの許容度の組合せに基づくランク９ならびに８毎の目的群一致数（率）は次のようになる。
先ず、属についての目的群一致数（率）は、ランク９のとき５７４属（８２％）、またランク８のとき８１属（１２％）となり、ランク９と８に設定することにより６９７属の９４％を判別することができることになる。
【００８３】
科についても、同様に、その目的一致数（率）は、ランク９のとき８８科（４７％）、ランク８のとき２８科（１５％）となり、ランク９と８に設定することにより１８６科の６２％を判別することができることになる。
また、目、綱ならびに門についての目的一致数（率）は、目についてはランク９のとき２７目（３６％）、ランク８のとき１０目（１３％）となり、７５目の４９％、綱についてはランク９のとき１２綱（３８％）、ランク８のとき３綱（１０％）となり、３１綱の３８％、また門についてはランク９のとき８門（３６％）、ランク８のとき２門（１０％）となり、２２門の４６％を判別可能であることになる。
【００８４】
この発明において、上記のようにして規定される部分塩基配列から構成されるプローブは、微生物の属する微生物叢の階層を該微生物の塩基配列に基づいて判別することができる。この発明に係るプローブの塩基配列は、上記群外一致数単独の許容度に基づいて、または上記群外一致数と上記群内一致率とのそれぞれの許容度との組合せに基づいて選択することができる。
【００８５】
上記のように群外一致数単独の許容度に基づいて選択されるプローブを使用することによって、その微生物の属する階層のうち種である階層を判別することができる。また、上記群外一致数と上記群内一致率との組合せに基づいて選択されるプローブを使用することによって、その微生物の属する階層のうち属、科、目、綱または門である階層を判別することができる。
【００８６】
更に詳細には、上記のように規定される部分配列をプローブとして使用することによって、該プローブの塩基配列に相補的なヌクレオチド配列がDNAもしくはRNAサンプル中に存在するか検出することが可能である。したがつて、この発明のプローブを目的に応じて適切に選択すれば、DNAもしくはRNAサンプル中に存在する該プローブの塩基配列に相補的なヌクレオチド配列を検出することができる。つまり、例えば、ある属の菌種がサンプル中に存在するかどうかを調査するのが目的の場合は、その属中の全菌種に共通の部分配列を共通プローブとして選択することにより、サンプル中に存在する共通プローブの塩基配列に相補的なヌクレオチド配列を持つ菌種を検出することができる。表４に示した部分塩基配列を例にすると、例えば、６７番目の記号「A」を有する塩基から連続する塩基数２３個の塩基配列を持つプローブを利用することによって、Holophaga属に属する全ての菌種を検出することが可能である。
【００８７】
別の方法としては、上記部分配列と相補的配列を持つプローブを人工的に合成して使用するのがよい。この場合には、上記部分配列を有する塩基配列がプローブにハイブリダイゼーションすることによって、最終的に上記部分配列を持つ菌種を検出することが可能となる。
【００８８】
この発明において、目的のプローブを特定して検出するために、プローブを標識するのがよい。プローブの標識方法にしても、同位元素や免疫マーカーで行う方法が一般的であるが、標識方法については当該技術分野で慣用されている常法で行うことができ、特に制限されるものではない。標識プローブは、加熱などの手段にて変性してDNA単鎖に分離し、標的DNAもしくはRNAをハイブリダイゼーションさせることができる。
【００８９】
目的のプローブを検出には、標的DNAもしくはRNAをメンブレンに固相化してもよく、またin situでおこなってもよい。この場合、DNA配列やRNA転写物はオートラジオグラフィーやイメージングなどの加視化技法などの当該技術分野で慣用されている常法で加視化などして観察することができる。
【００９０】
また、この発明に係るプローブは、マイクロアレイなどの高密度アレイとしてガラススライドやチップなどの不活性担体表面に固相化し、このプローブに標的DNAをハイブリダイゼーションすることもできる。これらの高密度アレイはいずれも当該技術分野で慣用されている手法により製造することができる。例えば、DNAチップの作成方法としては、半導体産業で使用されているリソグラフィー技術を用いてチップ上にDNAプローブを合成・精製する方法、予め合成したDNAプローブをチップ上にスポット状に形成する方法、インクジェット技術を用いてDNAプローブをチップ上にマトリツクッスアレイ状に形成する方法などが知られている。
【００９１】
上記のように作成されたマイクロアレイには、該群外一致数の許容度単独に基づいてまたは該群外一致数と該群内一致率のそれぞれの許容度の組合せに基づいて選択される部分塩基配列からなるプローブが慣用手段によって例えば固定化されているのがよい。
【００９２】
この発明に係るマイクロアレイにおいて、同一階層を構成する全てのもしくは実質的に全ての群から選択されるプローブが同一階層を構成する全てのもしくは実質的に全ての群を網羅的に固定化されているのがよい。換言すると、例えば、判別対象の微生物の種名を検索する場合には、マイクロアレイには、該群外一致数の許容度単独に基づいて選択される部分塩基配列からなるプローブであって、同一階層である種を構成する全てのもしくは実質的に全ての群が網羅的に固定化されている。つまり、この発明において、各細菌のオリジナル16SrDNA（３４６３塩基）から抽出・フィルタリングされた２２０６菌種またはそれ以下の数の菌種であっても、実質的に全ての菌種が有する部分塩基配列からなるプローブを網羅的に配置したマイクロアレイを使用することによって、判別対象の微生物の種名を特定することができる。
【００９３】
他方、この発明に係るマイクロアレイを使用して判別対象の微生物の属種名を検索するためには、マイクロアレイには、群外一致数と群内一致率のそれぞれの許容度に基づいて、その微生物の属する属（階層）を構成する全てのまたは実質的に全ての属（群）から選択される部分塩基配列からなる全てのもしくは実質的に全てのプローブが網羅的に例えば固定化されているのがよい。
なお、判別対象の微生物が属する属よりも上位の階層を判別するためには、同様にプローブを配置したマイクロアレイを使用することによって行うことができる。
【００９４】
この発明において、微生物の判別精度を高めるためには、使用するマイクロアレイには、例えば、上記群外一致数の許容度または上記群外一致数と上記群内一致率とのそれぞれの許容度の組合せに基づいてランク付けされた部分塩基配列のうち、そのランクが所定のランクよりも高い部分塩基配列からなるプローブを配置するのがよい。
【００９５】
この発明に係るマイクロアレイは、上記群外一致数が０個から２０個まで、好ましくは０個から１０個まで、より好ましくは０個から５個まで、特に好ましくは０個の許容度を持ってランク付けされたプローブが固定されているのがよい。
【００９６】
また、この発明に係るマイクロアレイは、上記群外一致数が０個から２０個まで、好ましくは０個から１０個まで、より好ましくは０個の許容度と、上記群内一致率が１００％から８０％まで、好ましくは１００％から９０％まで、より好ましくは１００％の許容度との組合せに基づいてランク付けされたプローブが固定されているのがよい。
【００９７】
さらに、この発明に係るマイクロアレイには、上記同一階層と異なる階層を全てもしくは実質的に全て網羅するプローブが追加して結合されているのがよい。その上、上記マイクロアレイにおいて、例えば、上記同一階層が属である場合は、上位階層は属の上位階層である科であることを意味している。その他の場合も同様である。
【００９８】
更に詳細には、例えば、この発明の目的がHolophaga
foetida 等の菌種の検索である場合は、各菌種を代表するプローブ、つまり、表１に示すような上記群外一致数のうち高い許容度の群外一致数でランク（例えば、ランク５および４）付けした塩基（ｉ番目）から塩基数（例えば、Ｌ＝２３）からなるプローブを、全菌種を網羅するように選択して、マイクロアレイ上に配置するのがよい。なお、この発明においては、現時点では２２０６菌種について網羅しているが、今後未知菌種の同定などによりタイプカルチャーが増加したりして菌種の数が変化して現在の菌種総数も変化する場合でも、この発明の範囲に包含されることは当然である。また、菌種総数が変化すれば、その菌種が属する階層も変化する場合があることも当然である。
【００９９】
この発明が上記菌種より上位の階層、つまり属、科、目、綱および／または門に属する菌を検出することが目的である場合には、各階層を代表するプローブ、つまり、表１および２のいずれかに示すような上記群内一致率と群外一致数との組合せのうち高い許容度のランク（例えば、ランク９、８および７）付けした塩基（ｉ番目）から塩基数（例えば、Ｌ＝２３）からなるプローブを、各階層の全てを網羅するように選択して、マイクロアレイ上に配置するのがよい。
【０１００】
したがって、この発明は、種のみを探索する目的であれば、種だけを特定可能なようにプローブを配置したマイクロアレイを提供することができるとともに、種と属とを同時に検索する目的であれば、種と属とを同時に特定可能なようにプローブを配置したマイクロアレイを提供することもできる。同様に、属より上位の階層で区別して微生物を判別する目的であれば、かかる階層に属する微生物を特定できるようにプローブを配置したマイクロアレイを提供することもできる。
【０１０１】
現在では、数万単位のプローブを配置したマイクロアレイも製造することができることから、この発明でも、全階層を同時に探索できるように、全階層を網羅する全てのプローブを同一アレイに配置したマイクロアレイも提供することができる。
【０１０２】
この発明に係る上記態様を使用することにより、既知の微生物はもちろんのこと、未知の微生物もスクリーニングすることができる。特に、未知の微生物のスクリーニングを考えると、微生物は、例えば、同じ属に属するものであれば、分類学的に同じ特徴的塩基配列を有していることが多いことから、属レベルで探索した場合、同一属に属し、菌種名が未知の菌種をスクリーニングすることができる。このような未知菌種が探索できれば、その菌種を更に特定することができ、その菌種が有用な菌であるか、または有害な菌であるかなどその微生物の詳細な情報を調べることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
この発明に係る微生物の判別方法は、各階層レベルで微生物を判別することができることから、ある特定の機能を有する菌がサンプル中に存在するかどうかを、例えば属レベルで探索することによって、有用菌や有害菌など、更には未知菌のスクリーニングにも利用することができる。
また、この発明に係るプローブは、各階層レベルで微生物を判別することができることから、DNAチップなどのマイクロアレイに例えば固定化することにより簡便にかつ迅速に微生物を判別することができることから、微生物を使用・応用する分野に幅広く利用することができると期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図３０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図３１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図３２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図３３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図３４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図３５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図３６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図３７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図３８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図３９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図４０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図４１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図４２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図４３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図４４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図４５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図４６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図４７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図４８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図４９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図５０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図５１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図５２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図５３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図５４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図５５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図５６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図５７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図５８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図５９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図６０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図６１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図６２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図６３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図６４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図６５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図６６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図６７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図６８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図６９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図７０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図７１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図７２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図７３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図７４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図７５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図７６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図７７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図７８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図７９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図８０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図８１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図８２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図８３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図８４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図８５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図８６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図８７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図８８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図８９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図９０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図９１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図９２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図９３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図９４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図９５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図９６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図９７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図９８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図９９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１００】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１０１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１０２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１０３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１０４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１０５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１０６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１０７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１０８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１０９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１１０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１１１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１１２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１１３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１１４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１１５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１１６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１１７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１１８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１１９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１２０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１２１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１２２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１２３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１２４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１２５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１２６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１２７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１２８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１２９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１３０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１３１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１３２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１３３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１３４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１３５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１３６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１３７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１３８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１３９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１４０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１４１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１４２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１４３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１４４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１４５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１４６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１４７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１４８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１４９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１５０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１５１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１５２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１５３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１５４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１５５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１５６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１５７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１５８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１５９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１６０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１６１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１６２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１６３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１６４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１６５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１６６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１６７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１６８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１６９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１７０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１７１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１７２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１７３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１７４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１７５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１７６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１７７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１７８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１７９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１８０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１８１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１８２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１８３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１８４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１８５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１８６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１８７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１８８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１８９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１９０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１９１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１９２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１９３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１９４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１９５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１９６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１９７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１９８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図１９９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２００】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２０１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２０２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２０３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２０４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２０５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２０６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２０７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２０８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２０９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２１０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２１１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２１２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２１３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２１４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２１５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２１６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２１７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２１８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２１９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２２０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２２１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２２２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２２３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２２４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２２５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２２６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２２７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２２８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２２９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２３０】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２３１】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２３２】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２３３】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２３４】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２３５】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２３６】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２３７】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２３８】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
【図２３９】微生物の塩基配列を記号で表記した図。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５５３】
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【図５５４】
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【図５５５】
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【図５５６】
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【図５５７】
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【図５５８】
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【図５５９】
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【図５６０】
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【図５６１】
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【図５６２】
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【図５６３】
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【図５６４】
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【図５６５】
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【図５６６】
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【図５６７】
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【図５６８】
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【図５６９】
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【図５７０】
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【図５７１】
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【図５７２】
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【図５７３】
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【図５７４】
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【図５７５】
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【図５７６】
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【図５７７】
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【図５７８】
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【図５７９】
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【図５８０】
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【図５８１】
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【図５８２】
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【図５８３】
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【図５８４】
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【図５８５】
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【図５８６】
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【図５８７】
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【図５８８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年10月22日(2008.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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