(57)【要約】【課題】新規な化学物質を資源として提供すること。【解決手段】下記式で示される化合物とする。2009242266.tif 000033【選択図】図１
2009242266.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で示されるフザニンＡ。
【化１】
2009242266.tif 000025
【請求項２】
下記式で示されるフザニンＢ。
【化２】
2009242266.tif 000026
【請求項３】
下記式で示されるフザニンＣ。
【化３】
2009242266.tif 000027
【請求項４】
下記式で示されるフザニンＤ。
【化４】
2009242266.tif 000028
【請求項５】
下記式で示されるフザニンＡ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する薬剤。
【化５】
2009242266.tif 000029
【請求項６】
下記式で示されるフザニンＢ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する薬剤。
【化６】
2009242266.tif 000030
【請求項７】
下記式で示されるフザニンＣ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する薬剤。
【化７】
2009242266.tif 000031
【請求項８】
下記式で示されるフザニンＤ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する薬剤。
【化８】
2009242266.tif 000032
【請求項９】
癌の治療薬である請求項４、５、６又は７記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物であるフザニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤに関し、更には、これらを用いた薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の我々の生活において、天然の動植物、微生物等の体内に含まれる化学物質（以下「天然物」という。）として見出されたもののうち人体に有用な効果をもたらすものは生薬、医薬品の有効成分として使用されている。また、このようなものは更に有用な医薬品を開発するための研究材料としても様々な役割を有しており、非常に重要なものとなっている。
【０００３】
このように、人体に有益な効果をもたらす天然物の探索に関する報告としては、例えば下記非特許文献１に、変形菌からビスインドール化合物、ナフトキノン化合物、グリセリド化合物等を抽出した報告がある。
【０００４】
【非特許文献１】石橋正己、“未利用菌類の資源化：変形菌からの天然物探索”、有機合成化学協会誌、２００３年、第６１巻、第２号、１５２〜１６３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら一方で、天然物の探索が多数の者によって行なわれているにもかかわらず、探索の材料として検討、調査されたものは、地球上の全生物種の中で１０％にも満たないといわれている。
【０００６】
本発明は、新規な化学物質を資源として提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一手段に係るフザニンＡは、下記式で示される。
【化１】
2009242266.tif 000003
【０００８】
また、本発明の他の一手段に係るフザニンＢは、下記式で示される。
【化２】
2009242266.tif 000004
【０００９】
また、本発明の他の一手段に係るフザニンＣは、下記式で示される。
【化３】
2009242266.tif 000005
【００１０】
また、本発明の他の一手段に係るフザニンＤは、下記式で示される。
【化４】
2009242266.tif 000006
【００１１】
また、本発明の他の一手段に係る薬剤は、下記式で示されるフザニンＡ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する。
【化５】
2009242266.tif 000007
【００１２】
また、本発明の他の一手段に係る薬剤は、下記式で示されるフザニンＢ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する。
【化６】
2009242266.tif 000008
【００１３】
また、本発明の他の一手段に係る薬剤は、下記式で示されるフザニンＣ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する。
【化７】
2009242266.tif 000009
【００１４】
また、本発明の他の一手段に係る薬剤は、下記式で示されるフザニンＤ及びその塩の少なくともいずれかを有効成分として含有する。
【化８】
2009242266.tif 000010
【００１５】
なお、上記の薬剤は、限定されるわけではないが、癌の治療薬として有用であることが期待される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、新規な化学物質を資源として提供することができる。特に、本発明に係る化学物質は、癌細胞に対し細胞増殖抑制作用を発揮するため、例えば癌の治療薬として利用が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態についての記載にのみ狭く解釈されるものではない。
【００１８】
本発明の一形態に係るフザニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、下記にそれぞれ示される。
【化９】
2009242266.tif 000011
【化１０】
2009242266.tif 000012
【化１１】
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【化１２】
2009242266.tif 000014
【００１９】
本実施形態に係るフザニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、後述の実施例から明らかなように、放線菌Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ、好ましくは放線菌Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＩＦＭ  １０９１７株から抽出することができるが、これに限定されず、合成することも可能である。
【００２０】
本実施形態に係るフザニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、癌細胞に対し細胞増殖抑制作用を発揮するため、薬剤、例えば癌の治療薬として利用が期待される。なおフザニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを癌の治療薬として利用する場合、フザニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ並びにこれらの塩のうち少なくともいずれかを有効成分として含有しておくことが好ましい。
【００２１】
また、本実施形態に係る癌の治療薬は、上記フザニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ並びにこれらの塩のうち少なくともいずれかの他、薬学的に許容しうる通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤（例えば蒸留水）、ｐＨ緩衝剤（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合成分を含有させることができる。
【００２２】
またこの癌の治療薬は、患者の性別、体重、症状に見合った適切な投与量を経口的又は非経口的に投与することができる。経口的な投与としては、通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁液、油剤、乳化剤等の投与形態を採用することができる。また、非経口的な投与としては、通常用いられる投与形態、例えば上記の液剤、懸濁液等にしたものを直接患部に投与する方法、注射等により投与する形態を採用することができる。
【実施例】
【００２３】
本実施例では、放線菌Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＩＦＭ  １０９１７株からフザニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを抽出し、検討した結果を示す。図１に、フザニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの単離についてのスキームの概略を示しておく。
【００２４】
まず、富山県富山市の土壌から放線菌Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＩＦＭ  １０９１７株を分離し、ワックスマン寒天培地（グルコース２％、ペプトン０．５％、肉エキス０．５％、酵母エキス０．３％、塩化ナトリウム０．５％、炭酸カルシウム０．３％、寒天１．５％）へ播種し、２８℃で１週間培養した。そしてコロニー及び胞子の形成を確認した後、これらをかきとり坂口フラスコ中のワックスマン液体培地（グルコース２％、ペプトン０．５％、肉エキス０．５％、酵母エキス０．３％、塩化ナトリウム０．５％、炭酸カルシウム０．３％）に播種し、２８℃で３日間振盪培養を行なった。その後、菌株を大量に培養するため、新たに調整したワックスマン液体培地（グルコース２％、ペプトン０．５％、肉エキス０．５％、酵母エキス０．３％、塩化ナトリウム０．５％、炭酸カルシウム０．３％）に上記の前培養した培養液を播種し、カブ型フラスコを用い２８℃で５日間振盪培養を行なった。培養後、得られた培養液３Ｌを遠心分離し、菌体と上清に分けた。そして菌体はメタノールで抽出を行い、菌体メタノール抽出物を得た。また上清は酢酸エチル及びブタノールを用いて溶媒分配し、各可溶部を得た。
【００２５】
次に、得られた酢酸エチル可溶部について、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０を担体とするカラム（φ２０×２９０ｍｍ）に付し、メタノールを用いて溶出し、溶出順に１Ａから１Ｆの各画分を得た。また、上記溶出した１Ｃ（４６３．９ｍｇ）についてＳｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０Ｎを担体とするカラム（φ３０×１６０ｍｍ）に付し、ヘキサン−酢酸エチル混合溶液及びメタノールを用いて溶出し、溶出順に２Ａから２Ｉの各画分を得た。更に、上記溶出した２Ｄ（７４．２ｍｇ）について下記表１に示すＨＰＬＣ条件（１）を用いてＨＰＬＣによる分画を行い、フザニンＡ（１４．５ｍｇ）、Ｂ（２３．２ｍｇ）、Ｃ（１．５ｍｇ）及びＤ（１．８ｍｇ）をそれぞれ単離した。
【表１】
2009242266.tif 000015
【００２６】
（フザニンＡ）
フザニンＡは油状物質として単離された。フザニンＡに対して高分解能ＦＡＢＭＳを行い、［Ｍ＋Ｋ］＋と推測されるｍ／ｚ３０４．０９７６のピークを観測した。この結果、分子式をＣ１４Ｈ１９ＮＯ４と決定した。
【００２７】
また、フザニンＡに対して赤外吸収測定（以下「ＩＲ測定」という。）を行い、赤外吸収スペクトル（以下「ＩＲスペクトル」という。）を得た。この結果、３３６９、１７３３ｃｍ−１にそれぞれヒドロキシ基、カルボニル基に由来する吸収をそれぞれ観測した。
【００２８】
また、フザニンＡに対して紫外吸収測定（以下「ＵＶ測定」という。）を行い、紫外吸収スペクトル（以下「ＵＶスペクトル」という。）を得た。この紫外吸収測定は、メタノールを溶媒として濃度を０．１ｍｏｌ／ｌ、セル長を１ｃｍとして行なった。この結果、２３２ｎｍに吸収ピークを有しており、芳香族化合物又は共役二重結合化合物であることが推定できた。図２に、フザニンＡにおけるＵＶスペクトルを示しておく。
【００２９】
また、フザニンＡに対し、旋光角［α］Ｄの測定を行った。この結果、旋光角は＋３０．０度であり、光学活性を有することが確認できた。なお下記表２に、旋光角、高分解ＦＡＢＭＳ、ＵＶ測定、ＩＲ測定の結果を示しておく。
【表２】
2009242266.tif 000016
【００３０】
また、フザニンＡに対し、１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲの測定も行った。この結果を表３、図３及び図４に示す。１Ｈ  ＮＭＲでは２つのメチル基と約１５Ｈｚの結合定数を有する４つのトランスオレフィン水素のシグナルを観測することができ、１３Ｃ  ＮＭＲでは２個のメチル基、６個のオレフィン炭素を含む１４本のシグナルを観測することができた。なお、カルボニル炭素のシグナルがδｃ１５５．９ｐｐｍと通常より高磁場側に観測されたこと及びＨＲＦＡＢＭＳの結果より、本化合物は分子内にカルボニル炭素に窒素原子、酸素原子が隣接したカルバメート構造を有することが推定された。
【表３】
2009242266.tif 000017
【００３１】
また、フザニンＡに対し、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹも求めた。このスペクトルを図５乃至図７に示す。この結果、本化合物は共役ジエンを有する直鎖構造及びカルバメート基を含む五員環と３−メチルテトラヒドロピリジン環の縮合関縮合環構造を有することが判明した。本化合物の立体化学については、ＮＯＥ実験より２α位の水素と３位の水素、６位の水素と２β位の水素、６位の水素と７位の水素の間にＮＯＥ相関が観察されたことから、縮合環部分の相対立体配置を決定した。また絶対立体配置については、本化合物のビス（Ｓ）−ＭＴＰＡエステル及びビス（Ｒ）−ＭＴＰＡエステルを調整し、改良Ｍｏｓｈｅｒ法による検討及びＮＯＥ相関データを総合して、本化合物の３位、６位、７位及び１２位の絶対立体配置を３Ｒ、６Ｓ、７Ｒ、１２Ｒと決定した。
【００３２】
以上の結果より、フザニンＡの構造を上記式で示すように決定した。
【００３３】
（フザニンＢ）    
フザニンＢは油状物質として単離された。フザニンＢに対して高分解能ＦＡＢＭＳを行い、［Ｍ＋Ｈ］＋と推測されるｍ／ｚ２６６．１４０３のピークを観測した。この結果、分子式をＣ１４Ｈ１９ＮＯ４と決定した。
【００３４】
また、フザニンＢに対してＩＲ測定を行い、ＩＲスペクトルを得た。この結果は非常に上記フザニンＡに類似しており、３３６９、１７３３ｃｍ−１にそれぞれヒドロキシ基、カルボニル基に由来する吸収をそれぞれ観測した。
【００３５】
また、フザニンＢに対してＵＶ測定を行い、ＵＶスペクトルを得た。このＵＶ測定は、メタノールを溶媒として濃度を０．２ｍｏｌ／ｌ、セル長を１ｃｍとして行なった。この結果は上記フザニンＡに類似していた。すなわち２３２ｎｍに吸収ピークを有しており、芳香族化合物又は共役二重結合化合物であることが推定できた。図８に、フザニンＡにおけるＵＶスペクトルを示しておく。
【００３６】
また、フザニンＡに対し、旋光角［α］Ｄの測定を行った。この結果、旋光角は−１９．０度であり、光学活性を有することが確認できた。なお下記表４に、旋光角、高分解ＦＡＢＭＳ、ＵＶ測定、ＩＲ測定の結果を示しておく。
【表４】
2009242266.tif 000018
【００３７】
また、フザニンＢに対し、１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲの測定も行った。この結果を表５、図９及び図１０に示す。なお１Ｈ  ＮＭＲスペクトルも上記フザニンＡと類似していたが、６位、７位、８位の水素の化学シフト値が、フザニンＡのそれと比較して０．３〜０．５ｐｐｍ異なることが確認された。
【表５】
2009242266.tif 000019
【００３８】
また、フザニンＢに対し、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹも求めた。このスペクトルを図１１乃至図１３に示す。この結果フザニンＢは上記フザニンＡと同一の平面構造を有することが判明した。またここで本化合物の立体構造を明らかにするため、まずＮＯＥ実験による検討を行った。この結果、２α位の水素と３位の水素、６位の水素と２β位の水素、６位の水素と８位の水素の間にＮＯＥ相関が観察されたことから、本化合物はフザニンＡと比較し７位の早退相対立体配置が異なることが判明した。また、絶対立体配置については、本化合物のビス（Ｓ）−ＭＴＰＡエステル及びビス（Ｒ）−ＭＴＰＡエステルを調整し、改良Ｍｏｓｈｅｒ法による検討及びＮＯＥ相関データを総合して、本化合物の３位、６位、７位及び１２位の絶対立体配置を３Ｒ、６Ｓ、７Ｓ、１２Ｓと決定した。
【００３９】
以上の結果より、フザニンＢの構造を上記式で示すように決定した。
【００４０】
（フザニンＣ）
フザニンＣは油状物質として単離された。フザニンＣに対してＨＲＥＩＭＳを行い、［Ｍ＋］と推測されるｍ／ｚ２１９．１２９３のピークを観測した。この結果、分子式をＣ１３Ｈ１７ＮＯ２と決定した。
【００４１】
また、フザニンＣに対してＩＲ測定を行い、ＩＲスペクトルを得た。この結果、３３５０ｃｍ−１にヒドロキシ基に由来する吸収を観測した。
【００４２】
また、フザニンＣに対しＵＶ測定を行い、ＵＶスペクトルを得た。この紫外吸収測定は、ＣＨＣｌ３を溶媒として濃度を０．０５ｍｏｌ／ｌ、セル長を１ｃｍとして行なった。この結果、３１４．０ｎｍ、２６９ｎｍにそれぞれ吸収ピークを有しており、芳香族化合物又は共役二重結合化合物であることが推定できた。図１４に、フザニンＣにおけるＵＶスペクトルを示しておく。
【００４３】
また、フザニンＣに対し、旋光角［α］Ｄの測定を行った。この結果、旋光角は＋３４．５度であり、光学活性を有することが確認できた。なお下記表６に、旋光角、高分解ＦＡＢＭＳ、ＵＶ測定、ＩＲ測定の結果を示しておく。
【表６】
2009242266.tif 000020
【００４４】
また、フザニンＣに対し、１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲの測定も行った。この結果を表７、図１５及び図１６に示す。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルでは、２つのメチル基、１５Ｈｚ前後の結合定数を有するトランス配置の４個のオレフィン水素のシグナル（δＨ６．００、６．５７、６．８２、７．４０−７．４５ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ）が観測された。また１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルでは、２つのメチル基１２０〜１５５ｐｐｍに４つのオレフィン炭素と５つの芳香族炭素のシグナルが観測された。また本化合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルでは２位水素の化学シフト値がδＨ８．４１と低磁場に観測されたことから、複素環はピリジンであり、窒素原子が２位に隣接していると推定された。
【表７】
2009242266.tif 000021
【００４５】
また、フザニンＣに対し、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹも求めた。ＨＭＢＣのスペクトルを図１７に示す。本化合物はＨＭＢＣスペクトルの詳細な解析により、３−メチルピリジン環の２位にトランス配置の共役ジエンと隣接ジオール構造を有する側鎖が結合した構造を有することが判明した。１１位及び１２位の立体化学については、トランス配置の二重結合に隣接したジオール構造を有する化合物の結合乗数定数と１１位と１２位の水素間の結合定数の比較により決定した。すなわち、トランス配置の二重結合に隣接したジオール構造を有する化合物において、１，２−ジオールのヒドロキシ基がａｎｔｉ配置のとき、それぞれのヒドロキシ基と同じ炭素に結合している水素間の結合乗数定数は３Ｈｚ、ｓｙｎは一配置のときは６．２Ｈｚであることが分かっている。本化合物の１１位、１２位の水素間の結合定数は６．５Ｈｚであったため、１１位、１２位のヒドロキシ基はｓｙｎ配置であることが示唆され、１１位、１２位の相対立体配置をそれぞれ１１Ｒ＊、１２Ｒ＊と決定した。
【００４６】
以上の結果より、フザニンＣの構造を上記式で示すように決定した。
【００４７】
（フザニンＤ）
フザニンＤは油状物質として単離された。フザニンＣに対してＨＲＥＩＭＳを行い、［Ｍ＋］と推測されるｍ／ｚ２１９．１２４２のピークを観測した。この結果、分子式をＣ１３Ｈ１７ＮＯ２と決定した。
【００４８】
また、フザニンＣに対してＩＲ測定、ＵＶ測定を行い、ＩＲスペクトル、ＵＶスペクトルを得た。この結果はフザニンＡとほぼ同様であった。図１８に、フザニンＤにおけるＵＶスペクトルを示しておく。
【００４９】
また、フザニンＤに対し、旋光角［α］Ｄの測定を行った。この結果、旋光角は−３２．９度であり、光学活性を有することが確認できた。なお下記表８に、旋光角、ＨＲＥＩＢＭＳ、ＵＶ測定、ＩＲ測定の結果を示しておく。
【表８】
2009242266.tif 000022
【００５０】
また、フザニンＤに対し、１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲの測定も行った。この結果を表９、図１９に示す。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルはフザニンＣとよく類似していたが、１１位（δＨ４．２２、Ｊ＝６．７Ｈｚ）及び１２位（δＨ３．９２、Ｊ＝６．５Ｈｚ）の化学シフト値がフザニンＣと比較して低磁場側へ移行し、これらの結合定数も異なっていた。
【表９】
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【００５１】
また、フザニンＤに対し、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹも求めた。このスペクトルを図２０乃至図２２に示す。本化合物はＨＭＢＣスペクトルの詳細な解析により、フザニンＡＣと同様の平面構造であると決定した。また本化合物の立体化学については、フザニンＣと同様にトランス配置の二重結合に隣接したジオール構造を有する化合物の結合定数と１１位と１２位の水素間の結合定数は３．８Ｈｚであったため、１１位、１２位のヒドロキシ基はａｎｔｉ配置であることが示唆され、１１位及び１２位の相対立体配置をそれぞれ１１Ｓ＊、１２Ｒ＊と決定した。
【００５２】
以上の結果より、フザニンＣＤの構造を上記式で示すように決定した。
【００５３】
（細胞増殖阻害活性）
次に、上記単離したフザニンＤについて、ヒト大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１）及びヒトた胃がん細胞株ＡＧＳに対する細胞増殖阻害活性を検討した。この結果を下記表１０に示す。この結果、フザニンＤはＤＬＤ１に対して細胞増殖阻害活性を示し、そのＩＣ５０値は４１．２μＭであった。一方、フザニンＤは正常細胞株である２９３Ｔには細胞増殖阻害活性を有しておらず選択性を有していることが確認できた。
【表１０】
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【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は新規化合物を有効成分とし、薬剤として産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】実施例におけるフザニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの単離スキームの概略を示す図である。
【図２】実施例におけるフザニンＡのＵＶスペクトルである。
【図３】実施例におけるフザニンＡの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図４】実施例におけるフザニンＡの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。
【図５】実施例におけるフザニンＡに関するＨＭＱＣスペクトルである。
【図６】実施例におけるフザニンＡに関するＨＭＢＣスペクトルである。
【図７】実施例におけるフザニンＡに関する１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルである。
【図８】実施例におけるフザニンＢのＵＶスペクトルである。
【図９】実施例におけるフザニンＢの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図１０】実施例におけるフザニンＢの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。
【図１１】実施例におけるフザニンＢに関するＨＭＱＣスペクトルである。
【図１２】実施例におけるフザニンＢに関するＨＭＢＣスペクトルである。
【図１３】実施例におけるフザニンＢに関する１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルである。
【図１４】実施例におけるフザニンＣのＵＶスペクトルである。
【図１５】実施例におけるフザニンＣの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図１６】実施例におけるフザニンＣの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。
【図１７】実施例におけるフザニンＣに関するＨＭＢＣスペクトルである。
【図１８】実施例におけるフザニンＤのＵＶスペクトルである。
【図１９】実施例におけるフザニンＤの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２０】実施例におけるフザニンＤに関するＨＭＱＣスペクトルである。
【図２１】実施例におけるフザニンＤに関するＨＭＢＣスペクトルである。
【図２２】実施例におけるフザニンＤに関する１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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