(57)【要約】【課題】骨形成を促進し、骨吸収を抑制する作用を有する骨形成促進剤を提供。【解決手段】オレウロペイン及び/又はヒドロキシチロソールを有効成分として含有する骨形成促進剤、並びにこの骨形成促進剤を有効成分として含有する医薬品組成物を提供する。また、骨形成促進剤製造のためのオレウロペイン及び/又はヒドロキシチロソールの使用を提供する。さらに、本発明は、オレウロペインを含有し、骨形成異常及び骨代謝異常の改善に用いられる旨を表示した食品組成物を提供する。【選択図】図６
2009227616.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オレウロペイン及び/又はヒドロキシチロソールを有効成分として含有する骨形成促進  剤。
【請求項２】
破骨細胞の形成抑制作用を有することを特徴とする請求項１記載の骨形成促進剤。
【請求項３】
骨芽細胞の石灰化促進作用を有することを特徴とする請求項２記載の骨形成促進剤。
【請求項４】
骨芽細胞の分化促進作用を有することを特徴とする請求項３記載の骨形成促進剤。
【請求項５】
請求項４記載の骨形成促進剤を有効成分として含有する医薬品組成物。
【請求項６】
オレウロペイン及び/又はヒドロキシチロソールを含有し、骨形成の促進に用いられる  ものである旨を表示した食品組成物。
【請求項７】
前記オレウロペイン及び/又はヒドロキシチロソールは、オリーブ抽出物由来であるこ  とを特徴とする請求項１記載の骨形成促進剤。
【請求項８】
骨形成促進剤製造のための前記オレウロペイン及び/又はヒドロキシチロソールの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成促進剤に関する。より詳しくは、オレウロペインを有効成分として含有する骨形成促進剤と、これを含有する医薬品組成物並びに食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、我が国において、６５才以上の人口の約１/３が骨粗鬆症を患っている。患者の約８割が閉経後の女性であることは、閉経後における性ホルモン量の変化及び男性に比べて骨量が少ないことなどが原因であると考えられる。
【０００３】
前記骨粗鬆症は、体積あたりの骨量、すなわち骨密度が減少し、骨折のリスクが増大する病気であり、加齢とともに発症頻度が増加する。骨粗鬆症は骨折のリスクが非常に高く、脊椎の圧迫骨折及び大腿頸部骨折の原因となる。
【０００４】
骨粗鬆症の原因は、複数の遺伝的要因及び生活習慣に関係する要因とからなり、これらの相互作用により発症することが知られている。その治療は主に投薬によって行われている。投薬その他の方法によって、骨量の増加を調節できれば、骨粗鬆症に代表される骨形成異常に関する疾患の治療にとって重要な知見を提供できる。
【０００５】
骨粗鬆症を代表とする骨代謝異常に関する疾患は、骨吸収及び骨形成のバランスがくずれることに起因する。正常骨組織は、骨の形成と破壊がバランスよく保たれており、いわゆる「骨のリモデリング」が盛んに行われている。骨粗鬆症では、骨吸収が骨形成を上回ることから、骨密度が減少し、骨の脆弱性が高まる。閉経後に発症する骨粗鬆症の多くは、エストロゲン欠乏によるものと考えられており、エストロゲンが不足することによって骨吸収が亢進することが知られている。
【０００６】
骨組織には、骨代謝に関与する骨芽細胞及び破骨細胞という細胞が存在し、「骨のリモデリング」に機能している。骨芽細胞は、骨形成過程に中心的な役割を果たす細胞である。発生的には、間葉系幹細胞由来であり、前骨芽細胞を経て骨芽細胞へと分化する。成熟した骨芽細胞は石灰化に関与する。骨芽細胞のうち１０〜２０％の細胞が骨細胞になることが知られている。
【０００７】
一方で、破骨細胞は、骨基質を溶解する過程に中心的な役割を果たす細胞である。発生的には、造血幹細胞由来であり、前駆破骨細胞を経て単核破骨細胞へと分化する。最終的には単核破骨細胞が融合し多核の成熟破骨細胞に分化し、骨吸収に関与する。
【０００８】
オレウロペイン、ヒドロキシチロソール及びチロソールの化学構造を、それぞれ図１に示す。これらは、オリーブ抽出物に含まれる主要な有効成分であり、ともにフラボノイドの一種である。ヒドロキシチロソールはオレウロペインの分解産物であり、チロソールは、ヒドロキシチロソールのOH基が一つ外れた構造を有する。
【０００９】
以下、本発明に関連する「オレウロペイン」及び「ヒドロキシチロソール」について説明する。
【００１０】
「オレウロペイン（Oleuropein）」は、オリーブに含まれる成分であり、ポリフェノールの一種である。オレウロペインに関しては、その抗ウイルス活性、抗原虫活性、抗菌活性が注目されている。非特許文献１及び非特許文献２には、骨吸収促進モデルラットを用いた研究が開示されており、オレウロペインの経口投与によって、骨密度の減少が改善されることが報告されている。しかし、これらの報告には、オレウロペイン及びオリーブ由来の成分が、抗炎症作用により、骨密度の減少を抑制した旨を記載している。つまり、オレウロペインの効果は、抗炎症作用であることを示すのみで、骨形成及び骨吸収（「骨のリモデリング」）についての言及はなされていない。
【００１１】
「ヒドロキシチロソール（3,4-dihydroxyphenylethanol）」は、オレウロペインの分解物であり、オレウロペイン同様オリーブに含まれるポリフェノールの一種である。ヒドロキシチロソールは、血小板凝集に対する阻害活性を示し、また、メラニン生成抑制作用や過酸化脂質生成抑制作用を有することが知られている。特許文献１には、ヒドロキシチロソールをメラニン生成抑制剤の有効成分として又は過酸化脂質生成抑制剤の有効成分として含有することを特徴とする皮膚外溶剤及び浴用剤が開示されている。しかし、ヒドロキシチロソールが骨形成を促進させ、骨吸収を抑制する効果を有することは、本件が初めて開示する内容である。
【００１２】
【非特許文献１】”Olive oil  and  its  main  phenolic  micronutrient  (oleuropein)  prevent  inflammation-induced  bone  loss  in  the  ovariectomised rat.” British Journal of Nutrition, 2004, Vol. 92, p. 119-127
【非特許文献２】”Dose-response study of effect of oleuropein, an olive oil polyphenol, in an ovariectomy/ inflammation experimental model of bone loss in the rat.” Clinical Nutrition, 2006, Vol. 25, p. 859-868
【特許文献１】特開２００４−２６８３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述のように、骨形成異常を改善して正常な骨形成を促すことは、骨粗鬆症の治療、さらには骨代謝異常に関する治療のために、非常に重要な課題となっている。
【００１４】
そこで、本発明は、骨形成を促進する作用を有する骨形成促進剤を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題解決のために鋭意検討した結果、オレウロペイン及び/又はヒドロキシチロソールが骨吸収を抑制し得ることを見出した。また、それにとどまらず、オレウロペイン及び/又はヒドロキシチロソールが骨芽細胞の活性化を促進し、破骨細胞の形成を抑制することで、全体として骨形成を促進することを見出し、本願発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、オレウロペイン及び/又はヒドロキシチロソールを有効成分として含有する骨形成促進剤、並びにこの骨形成促進剤を有効成分として含有する医薬品組成物を提供するものである。併せて、本発明は、骨形成促進剤製造のためのオレウロペイン及び/又はヒドロキシチロソールの使用を提供する。また、本発明は、オレウロペイン及び/又はドロキシチロソールを含有し、骨形成異常及び骨代謝異常の改善に用いられる旨を表示した食品組成物を提供する。本発明において、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールはオリーブ抽出物由来とすることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、骨形成を促進する作用を有する骨形成促進剤が提供される。この骨形成促進剤の有効成分は、オリーブ抽出物由来とすることができるため、副作用が少なく安全性に優れたものである可能性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明者らは、実施例１〜３において詳しく後述するように、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールの作用として、骨芽細胞の分化活性を促進すること、又は破骨細胞の形成を抑制することを見出し、全体として骨形成を促進する作用を有することを明らかにした。
【００１８】
従って、本発明はこのオレウロペイン及び/又はヒドロキシチロソールを有効成分として含有する骨形成促進剤を提供するものである。
【００１９】
本発明の最も注目すべき点は、実施例２及び３において詳しく後述するように、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールによる骨形成作用は、骨芽細胞の活性化及び破骨細胞の形成抑制に起因することを明らかにできたことである。
【００２０】
ここで、本発明において「骨芽細胞の活性化」とは、骨芽細胞の増殖、分化、石灰化の３つの段階を総括する言葉として用いる。より具体的には、「骨芽細胞の活性化」とは、骨芽細胞が増殖し、分化成熟することにより、石灰化能を有し、骨形成を促進する過程を示す。これらは、骨芽細胞の分化については、分化マーカーであるアルカリホスファターゼ活性を指標とすることができ、骨形成の最終段階である石灰化は、成熟骨芽細胞のカルシウム沈着量によって測定できるものである。
【００２１】
また、本発明において「破骨細胞の形成」とは、破骨細胞が分化し、多核の成熟破骨細胞になることを示す。これらは、TRAP染色によって評価できるものである。
【００２２】
本発明に係る骨形成促進剤は、骨芽細胞の活性を促進し、破骨細胞の形成を抑制することで、結果的に骨形成を促進するものであると考えられる。
【００２３】
より具体的には、本発明者らは少なくともオレウロペインが骨芽細胞の分化を促すこと、さらにオレウロペイン及びヒドロキシチロソールが、成熟骨芽細胞による石灰化を促すことを証明した。一方で、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールが、破骨細胞の形成を抑制することを証明した。
【００２４】
つまり、本発明によって、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールの作用効果を細胞レベルで証明することができた。オレウロペイン及びヒドロキシチロソールの具体的な標的が、骨芽細胞及び破骨細胞であることは、骨形成促進剤の開発において非常に有用な知見を提供するものである。
【００２５】
従って、本発明に係る骨形成促進剤は、いわゆる「骨のリモデリング」に関して、骨形成に比べて骨吸収が亢進することによって起こる骨粗鬆症患者に適用して、正常な骨形成を促すことが可能となり、骨粗鬆症患者の治療に用いることができる。また、健常者に適用して、骨粗鬆症の予防をするためにも用いられ得る。
【００２６】
本発明に係る骨形成促進剤において、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールは、天然抽出物及びこの抽出物の精製物由来とすることができる。また、化学合成されたオレウロペイン等を使用することも当然に可能である。
【００２７】
オレウロペイン等を天然物抽出物から得る場合、特にオリーブからの抽出が好適である。オリーブは、地中海原産の常緑樹であり、その実から得られるオリーブオイルは古くから食用されている。オリーブオイルに関しては、その成分であるオレイン酸がLDLコレステロール量を低下させる作用を有することが広く知られている。
【００２８】
オレウロペイン等はオリーブ葉に多く含まれることがすでに知られており、水、アルコール等の有機溶媒や油等により、オリーブ葉からオレウロペイン等を含む抽出物を得ることができる。オリーブ抽出のための有機溶剤には、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、エーテル類、クロロホルム、及びジクロロメタン等を用いることができる。さらに、得られた抽出物を公知の方法で濃縮すれば、オレウロペイン等を精製物として得ることができる。
【００２９】
オリーブには、その実、葉、花、茎、根のいずれの部分も用いることができ、これらは生の状態で用いてもよく、あるいは乾燥物を用いてもよい。このうち、オレウロペイン等は、特にオリーブ葉に多いため、剪定や伐採されたオリーブの葉を有効に利用してオレウロペイン等を抽出することができる。また、オリーブ実からオリーブオイルを搾油する際には大量の植物水、処理水及び絞りかすが発生するが、これからオレウロペイン等を抽出することもできる。さらに、オレウロペイン等はオリーブオイルにも含まれていることから、オリーブオイルから抽出し、場合によってはオリーブオイルそのものを利用してもよい。
【００３０】
上記のように、オリーブオイルは古くから食用されており、このことはオリーブ抽出物の高い安全性を示すものである。したがって、オリーブ抽出物由来のオレウロペイン等を有効成分とする本発明に係る骨形成促進剤、及びこれを含有する医薬品組成物、食品組成物には、次のような優位性がある。
【００３１】
本発明に係る医薬品組成物は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液又は懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。医薬組成物は、本発明に係る骨形成促進剤を、生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造される。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。
【００３２】
医薬組成物の投与量は、錠剤の種類、投与方法、投与対象の年齢や体重、症状等を考慮して決定されるものである。
【００３３】
また、本発明に係る食品組成物は、上記骨形成促進剤に、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等の通常食品原料として使用されているものを適宜配合することにより製造することができる。また、一般に食品材料として使用される米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、昆布、ワカメ、テングサなどと混合してもよい。
【００３４】
食品組成物としては、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、軽腸栄養食品等を挙げることができる。
【００３５】
本発明に係る食品組成物には、必要に応じて、骨形成促進に用いられるものである旨が表示される。
【実施例１】
【００３６】
＜オレウロペイン及びその誘導体の投与が骨密度へ与える効果に関する検討＞
オレウロペインの投与が骨密度に与える効果を調べるために、卵巣除去による骨吸収モデルマウスを用いた実験を行った。
【００３７】
動物には、Balb/cマウス（メス、6週齢）を用いた。骨吸収のモデルとして、卵巣除去マウスを用いた（「卵巣除去区」）。また、その対照実験として、卵巣を除去することなく、切開のみを行う、にせの手術を施した（以下「シャムオペレ―ション」と記載する）マウスを用いた（「対照区」）。
【００３８】
卵巣除去区及び対照区のマウスに対し、3日おきに被検物質としてオレウロペイン、ヒドロキシチロソール、チロソールを10 mg/kg body weightになるように経口投与し、実験開始から28日目にBMD（Bone Mineral Density）を測定した。BMDの測定には、実験動物用X線CT（LaTheta LCT-100, Aloka）を用い、骨密度は、大腿骨内における海綿骨の骨密度として計算した。
【００３９】
結果を「図２」に示す。（A）シャムオペレーションを行った場合（「対照区」）、（B）卵巣を除去した場合（「卵巣除去区」）、（C）卵巣を除去し、かつ、オレウロペイン、ヒドロキシチロソール、チロソールを投与した場合、の骨密度を示す。縦軸は、成長板から1.8ｍｍ内側部分における海綿骨の骨密度の値である。
【００４０】
（A）シャムオペレーションを行ったマウス（「対照区」）における骨密度の平均値は、約175 mg/cm3であった。（B）卵巣を除去しただけのマウス（「卵巣除去区」）における骨密度の平均値は、約50 mg/cm3、であった。卵巣除去区のマウスは、対照区のマウスと比べて、骨密度が約75％減少していた。一方で、（C）卵巣を除去し、かつ、オレウロペインを投与したマウスにおける骨密度の平均値は、約70 mg/cm3であった。また、ヒドロキシチロソールを投与した卵巣除去マウスの骨密度の平均は、約90 mg/cm3であった。オレウロペイン及びヒドロキシチロソールを投与した卵巣除去マウスにおいて、骨密度の減少が抑えられた。In vivoにおいては、ヒドロキシチロソールの方がオレウロペインに比べて、骨密度の減少を抑える効果が高いことがわかった。
【００４１】
以上の結果から、オレウロペインが卵巣除去マウスにおいて、骨密度の減少を抑え、骨密度の回復に効果を有することが確認できた。一方で、ヒドロキシチロソールは、骨密度の減少を抑えるという点において、オレウロペインよりも顕著な効果を有することが、初めて証明できた。
【実施例２】
【００４２】
＜オレウロペイン及びヒドロキシチロソールの骨芽細胞に対する作用の検討＞
骨芽細胞は増殖、分化、石灰化等によって、骨形成に重要な役割を果たすことが知られている。そこで、骨芽細胞に対するオレウロペイン及びヒドロキシチロソールの作用機構を知るために、骨芽細胞株を用いたin vitroでの実験を行った。
【００４３】
骨芽細胞の細胞株であるMC3T3-E1細胞を用いて、骨芽細胞の増殖及び分化、石灰化に関する実験を行った。対照実験として、オリーブ抽出物に含まれるアピゲニンを用いた。
【００４４】
アピゲニンは、オリーブ抽出物に含まれる主要な有効性分であり、オレウロペインとともにフラボノイドの一種である。アピゲニンの化学構造を以下（II）に示す。
【００４５】
【化１】
2009227616.tif 000003
【００４６】
骨芽細胞株の培養条件を以下に示す。10%牛胎児由来血清を含むα-MEMにペニシリン、ストレプトマイシンをそれぞれ50ユニット/ml、50μg/ml加えた。細胞は5％二酸化炭素存在下、37度で培養した。骨芽細胞株は70％コンフレントになったところで、0.05%トリプシン溶液を用いて細胞をはがし、以下の実験のために、96-well plate及び12-well plateに捲いた。
【００４７】
（１）骨芽細胞の増殖率を測定するためにMTTアッセイを行った。骨芽細胞を1x103個/wellになるように96-well  plateに捲き、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールを10-6M〜10-4 Mの濃度になるように各wellに添加した。オレウロペイン及びヒドロキシチロソールを添加してから、45時間後及び69時間後に、基質として3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H tetrazolium bromideを適量添加し、分光光度計を用いて、570 nmの吸光度を測定した。対照実験として同じフラボノイドの一種であるアピゲニンを用いた実験を行った。
【００４８】
その結果を「図３（a）（b）（c）」に示す。縦軸は570 nmにおける吸光度を示す。値が大きいほど増殖活性が高いことを示す。オレウロペイン及びヒドロキシチロソールを添加してから45時間後において、骨芽細胞の増殖に顕著な変化はみられなかった。オレウロペイン及びヒドロキシチロソールを添加してから69時間後においても、10-6M〜10-5 Mの範囲における骨芽細胞の増殖には影響がなかった。一方、アピゲニンは5× 10-6 Mでも骨芽細胞の増殖活性を抑えることが分かった。
【００４９】
以上の結果から、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールは、骨芽細胞の増殖に関して10-５ Mまでの濃度で顕著な作用を示さないことがわかった。骨芽細胞は、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールによって増殖が促進することはなかった。
【００５０】
（２）骨芽細胞の分化に対するオレウロペイン等の効果を知るために、アルカリホスファターゼ活性を測定した。骨芽細胞を3.8x104個/wellになるように12-well plateに捲き、3日間培養した。その後、オレウロペインを10-6M〜10-4 Mの濃度になるように各wellに添加した。3日おきにオレウロペインを含む培地を交換して、12日から15日の間に以下の方法で、アルカリホスファターゼ活性を測定した。対照として前述のアピゲニンを用いた実験を行った。
【００５１】
細胞を10 mM Tris-HCl (pH7.2)溶液で洗浄し、各wellに1 mlの50 mM Tris-HCl (pH7.2)、0.1% Triton X-100を含む溶液を加え、15秒間sonicateした。アルカリホスファターゼ活性は、基質としてp-nitrophenyl phosphateを用いて、通常の方法に従って行った。タンパク質の測定には、BCA protein assay kit (Pierce Chemical Co.)を用いた。
【００５２】
その結果を「図４（a）（b）（c）」に示す。縦軸はアルカリホスファターゼ活性を示す。オレウロペインを添加してから14日目の骨芽細胞は、コントロールに比べて、アルカリホスファターゼ活性が高いことがわかった。オレウロペインの濃度依存的にアルカリホスファターゼ活性が増加することが示された。また、ヒドロキシチロソールを添加した骨芽細胞では、アルカリホスファターゼ活性の変化はみられなかった。一方で、アピゲニンを添加した骨芽細胞では、濃度依存的にアルカリホスファターゼ活性が減少することがわかった。
【００５３】
以上の結果から、オレウロペインは骨芽細胞において、濃度依存的にアルカリホスファターゼ活性を促進することから、骨芽細胞の分化を促進することが示された。ヒドロキシチロソールは骨芽細胞の分化に大きく関与しないことがわかった。また、アピゲニンは骨芽細胞の分化に対して促進的に働くことはなかった。このことから、オレウロペインの作用はオリーブ由来のフラボノイドに関する一般的な効果ではなく、オレウロペインに特異的な効果であることが示唆された。
【００５４】
（３）骨芽細胞の石灰化に対するオレウロペイン等の効果を知るために、カルシウム沈着量を測定した。骨芽細胞を3.8x104個/wellになるように12-well plateに捲き、3日間培養した。その後、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールを10-6M〜10-4 Mの濃度になるように各wellに添加した。3日おきにオレウロペインを含む培地を交換して、15日後、18日後に以下の方法で、カルシウム沈着量を測定した。対照として前述のアピゲニンを用いた実験を行った。
【００５５】
細胞をPBSで洗浄し、各wellに1 mlの2 N HCl溶液を加え、一晩、穏やかに攪拌し沈着したリン酸カルシウム塩を脱灰した。遊離したカルシウムイオンは、Wako Pure Chemical Industriesにて製造販売されているCalcium C kitを用いて測定した。
【００５６】
その結果を「図５（a）（b）（c）」示す。縦軸はカルシウム沈着量を示す。オレウロペイン及びヒドロキシチロソールを添加してから15日目及び18日目の骨芽細胞は、コントロールに比べて、カルシウム沈着量が多いことがわかった。また、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールの濃度依存的にカルシウム沈着量が増加することが示された。一方で、アピゲニンを添加した骨芽細胞では、濃度依存的にカルシウム沈着量が減少することがわかった。
【００５７】
以上の結果から、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールは骨芽細胞において、濃度依存的に石灰化を促進することが示された。しかしながら、アピゲニンは骨芽細胞の分化に対して促進的に働くことはなかった。このことから、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールの骨芽細胞石灰化に対する効果は、オリーブ由来のフラボノイドに関する一般的な効果ではなく、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールに特異的な効果であることが強く示唆された。
【実施例３】
【００５８】
＜オレウロペインの破骨細胞に対する作用の検討＞
骨吸収において、破骨細胞は骨組織を溶解し、骨破壊に重要な役割を果たすことが知られている。そこで、破骨細胞に対するオレウロペイン等の効果を知るために、培養破骨細胞を用いたin vitroでの実験を行った。以下に破骨細胞前駆細胞（脾臓細胞）の分離方法及び破骨細胞の分化誘導方法を示す。
【００５９】
動物には、ddYマウス（オス、6週齢）を用いた。マウスの脾臓細胞分画に対
して、0.83% Ammonium chlorideを含む10 mM Tris-HCl (ph7.4)を加え、血球系の細胞を取り除いた。このように分離した脾臓由来の細胞を2.4x105個/wellになるように96-well plateに捲き、破骨細胞分化に関与するサイトカイン50 ng/ml human sRANKL及び30 ng/ml M-CSFを添加し、7日間培養した。サイトカインを含む培地は3日おきに交換した。
【００６０】
破骨細胞の分化に対するオレウロペイン等の効果を知るために、TRAP染色を行った。破骨細胞を2.4x105個/wellになるように96-well plateに捲き、破骨細胞分化に関与するサイトカイン50 ng/ml human sRANKL及び30 ng/ml M-CSFを添加し、７日間培養した。同時に、オレウロペイン及びヒドロキシチロソール、チロソールを10-5M〜10-4 Mの濃度になるように各wellに添加した。3日おきにオレウロペイン及びその誘導体を含む培地を交換して、7日目に以下の方法で、TRAP染色を行った。対照として前述のアピゲニンを添加する実験を行った。
【００６１】
TRAP染色は、細胞を3.6% ホルムアルデヒドで固定した後、50 mM sodium acetate buffer，40 mM potassium sodium tartrate buffer （pH5.0），0.01％ naphthol AS-MX phosphate，0.03 ％ fast red violet LB saltで細胞を20分間染色した．染色液除去後，蒸留水で洗浄し光学顕微鏡（Olympus CK40）下にTRAP陽性の多核細胞を観察した。
【００６２】
その結果を「図６（a）（b）」に示す。写真はTRAP染色した細胞の写真を示す。（A）オレウロペインを添加した破骨細胞、（B）ヒドロキシチロソールを添加した破骨細胞、（C）チロソールを添加した破骨細胞について示す。オレウロペイン及びその誘導体を添加した培養破骨細胞において、TRAP陽性細胞（破骨細胞）形成が阻害されることが分かった。特に、オレウロペインを添加した破骨細胞は、強く破骨細胞形成を抑制することが示された。
【００６３】
オレウロペイン及びその誘導体は、破骨細胞形成を抑制する効果を有することがわかった。中でもオレウロペインが最も破骨細胞の形成を強く抑制することが示された。一方で、アピゲニンを添加した破骨細胞では、オレウロペインと同じ濃度で破骨細胞の形成抑制はみられなかった。このことから、オレウロペイン等の破骨細胞形成阻害に対する効果は、オリーブ由来のフラボノイドに関する一般的な効果ではなく、オレウロペイン及びその誘導体に特異的な効果であることが強く示唆された。
【００６４】
以上、本発明者らは、実施例１〜３に示したように、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールの作用として、骨芽細胞の分化活性を促進し、一方で、破骨細胞の形成を抑制する効果を有することを見出した。オレウロペイン及びその誘導体は全体として骨形成を促進する作用を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明に係る骨形成促進剤は、骨形成を促すために、医薬品組成物、食品組成物などとして好適に利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】オレウロペインの代謝産物について示す図である。
【図２】卵巣除去による骨吸収モデルマウスにおけるオレウロペインの効果を示す図である。成長板より1.8ｍｍ内側の部分における海綿骨の骨密度を測定した。「sham」：卵巣を除去することなく、切開手術のみを行ったマウス、「OVX」：卵巣を除去しただけのマウス、「Oleuropein」：卵巣を除去後、オレウロペインを投与したマウス、「Hydroxytyrosol」：卵巣除去後、ヒドロキシチロソールを投与したマウス、「Tyrosol」:卵巣除去後、チロソールを投与したマウス
【図３】骨芽細胞の増殖に対するオレウロペイン（a）、ヒドロキシチロソール（b）、アピゲニン（c）の効果について示す図である。
【図４】骨芽細胞分化に対するオレウロペイン（a）、ヒドロキシチロソール（b）、アピゲニン（c）の効果について示す図である。
【図５】（a）骨芽細胞の石灰化に対するオレウロペイン（a）、ヒドロキシチロソール（b）、アピゲニン（c）の効果について示す図である。
【図６】（a）破骨細胞形成に対するオレウロペイン及びオレウロペイン誘導体の効果について示すTRAP染色像の図である。（b）オレウロペイン及びその誘導体による破骨細胞形成数についてします図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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