(57)【要約】【課題】本発明の目的は、ナノ粒子蛍光体（ナノメートルサイズの半導体物質の蛍光体粒子）として、公知例では得られない、好適な、高輝度、単分散のシリコンナノ粒子、それを含有するシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜、シリコンナノ粒子溶液、およびシリコンナノ粒子を標識材とした分子観察方法を提供することにある。【解決手段】半導体基板上に成膜された、シリコンナノ粒子を含有するシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜において、該シリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜の表面粗さＲｙが１０．０ｎｍ以上１００．０ｎｍ以下であることを特徴とするシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
半導体基板上に成膜された、シリコンナノ粒子を含有するシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜において、該シリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜の表面粗さＲｙが１０．０ｎｍ以上１００．０ｎｍ以下であることを特徴とするシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜。
【請求項２】
請求項１記載のシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜の中に含有され、かつ、平均粒径が１．０ｎｍ以上１０．０ｎｍ以下であることを特徴とするシリコンナノ粒子。
【請求項３】
請求項１記載のシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜を、酸化雰囲気下での３０分〜１０日放置の後、溶媒中での超音波処理により得られたことを特徴とするシリコンナノ粒子溶液。
【請求項４】
請求項３記載のシリコンナノ粒子溶液の中に含有され、平均粒径が１．０ｎｍ以上１０．０ｎｍ以下であることを特徴とするシリコンナノ粒子。
【請求項５】
請求項４記載のシリコンナノ粒子から構成される標識剤で標識された分子に励起光を照射し、発光を検出することにより該分子の同定を行うことを特徴とする単一分子観察方法。
【請求項６】
複数種類の分子を、異なる発光スペクトルをもつ請求項４記載のシリコンナノ粒子から構成される標識剤でそれぞれ標識し、該それぞれ標識した複数種類の分子に励起光を照射し、発光を検出することによって、同時に該複数種類の分子の同定を行うことを特徴とする分子観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ粒子蛍光体（ナノメートルサイズの半導体物質の粒子）として好適に用いることができる、シリコンナノ粒子や、それにかかわるシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜、シリコンナノ粒子溶液、および該シリコンナノ粒子を標識材とした分子観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の検出機材の高感度化や標識材料の高輝度化によって、単一分子の検出、同定、及び、運動の観察が可能になり、分析化学、分子生物学及びナノ構造体の解析に大きな役割を果たしてきている。
【０００３】
単一分子の観察に使用される標識材料として、蛍光色素やナノ粒子蛍光体が提案されている。特にナノ粒子蛍光体は蛍光色素に比べて、大きさや材質を選択することにより、およそ４００ｎｍ〜２０００ｎｍの範囲で比較的自由に発光ピーク波長を設定することができること、ストークスシフトを広くとることができ、励起光との重なりやバックグラウンドによるノイズ影響を小さくすることで検出能を高めることができること、また褪色が非常に少ないため、長時間の動体観察が可能であることなど、利点が非常に多い。
【０００４】
一般に、ナノメートルサイズの半導体物質で量子閉じ込め（ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）効果を示す物質は「量子ドット」と称されている。このような量子ドットは、半導体原子が数百個から数千個集まった１０数ｎｍ程度以内の小さな塊であるが、励起源から光を吸収してエネルギー励起状態に達すると、量子ドットのエネルギーバンドギャップに相当するエネルギーを放出する。したがって、量子ドットの大きさまたは物質組成を調節すると、エネルギーバンドギャップを調節することができて様々な水準の波長帯のエネルギーを利用することができる可能性があると考えられている。
【０００５】
しかしながら、量子ドットは、結晶構造をもち、粒径によりバンドギャップが変化するという性質を持ち、バンドギャップの変化に伴い発光波長が変化するため、個々の粒径のばらつきが、直接粒子毎の発光スペクトルのばらつきにつながる。これを回避するためには、単一スペクトルの粒子を分級するなど煩雑な操作が必要になるなどの原理的な問題を抱えている。
【０００６】
また、実際に利用されるナノ粒子蛍光体の場合も、粒径分布をもっており、各々の粒子の発光スペクトルや輝度にバラつきがあるため、一分子観察を行う際、安定した評価ができないことが課題となっている。
【０００７】
一方、ナノ粒子蛍光体（ナノメートルサイズの半導体物質の蛍光体粒子）としてのシリコンナノ粒子や、それにかかわるシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜を形成する技術については種々開示されている（例えば、特許文献１〜４参照）。これらの技術はいずれも、スパッタリング法により基板上に、シリコンを含有する酸化ケイ素膜を形成する工程を含んではいる。しかしながら、いずれにも、その表面粗さについては言及されていない。ましてや、シリコンを含有する酸化ケイ素膜の表面粗さを考慮することにより（意図的に粗く制御することにより）、公知例では得られない高輝度、単分散のシリコンナノ粒子を得ることができることについては全く言及、開示されていない。
【特許文献１】特開２００４−２９６７８１号公報
【特許文献２】特開２００６−７００８９号公報
【特許文献３】特開２００７−６３３７８号公報
【特許文献４】特許３８３０８７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、本発明の目的は、ナノ粒子蛍光体（ナノメートルサイズの半導体物質の蛍光体粒子）として、公知例では得られない、優れて、高輝度、単分散のシリコンナノ粒子、該シリコンナノ粒子を含有するシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜、シリコンナノ粒子溶液、および該シリコンナノ粒子を標識材とした分子観察方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ナノ粒子蛍光体（ナノメートルサイズの半導体物質の蛍光体粒子）としてのシリコンナノ粒子や、それにかかわるシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜を形成する技術であり、基板上にスパッタリング法により、シリコンを含有する酸化ケイ素膜を形成する工程を含んでいる従来技術においては、その表面粗さについては従来言及されていなかったが、本発明者は鋭意検討した結果、シリコンを含有する酸化ケイ素膜の表面粗さを意図的に粗く制御することを考慮することにより、公知例では得られない優れて、高輝度、単分散のシリコンナノ粒子を得ることができることを見出し本発明を達成するに至ったものである。
【００１０】
即ち、
本発明の上記目的は、下記の構成により達成される。
【００１１】
１．半導体基板上に成膜された、シリコンナノ粒子を含有するシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜において、該シリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜の表面粗さＲｙが１０．０ｎｍ以上１００．０ｎｍ以下であることを特徴とするシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜。
【００１２】
２．１記載のシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜の中に含有され、かつ、平均粒径が１．０ｎｍ以上１０．０ｎｍ以下であることを特徴とするシリコンナノ粒子。
【００１３】
３．１記載のシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜を、酸化雰囲気下での３０分〜１０日放置の後、溶媒中での超音波処理により得られたことを特徴とするシリコンナノ粒子溶液。
【００１４】
４．３記載のシリコンナノ粒子溶液の中に含有され、平均粒径が１．０ｎｍ以上１０．０ｎｍ以下であることを特徴とするシリコンナノ粒子。
【００１５】
５．４記載のシリコンナノ粒子から構成される標識剤で標識された分子に励起光を照射し、発光を検出することにより該分子の同定を行うことを特徴とする単一分子観察方法。
【００１６】
６．複数種類の分子を、異なる発光スペクトルをもつ４記載のシリコンナノ粒子から構成される標識剤でそれぞれ標識し、該それぞれ標識した複数種類の分子に励起光を照射し、発光を検出することによって、同時に該複数種類の分子の同定を行うことを特徴とする分子観察方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ナノ粒子蛍光体（ナノメートルサイズの半導体物質の蛍光体粒子）として、公知例では得られない、優れて、高輝度、単分散のシリコンナノ粒子、該シリコンナノ粒子を含有するシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜、シリコンナノ粒子溶液、および該シリコンナノ粒子を標識材とした分子観察方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を実施するための最良の形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００１９】
本発明のシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜は、半導体基板上に成膜された、シリコンナノ粒子を含有するシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜において、該シリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜の表面粗さＲｙが１０．０ｎｍ以上１００．０ｎｍ以下であることを特徴とする。
【００２０】
本発明のシリコンナノ粒子の平均粒径は１．０ｎｍ以上１０．０ｎｍ以下が好ましい。より好ましくは３．０ｎｍ以上８．０ｎｍ以下、特に好ましくは３．５ｎｍ以上７．０ｎｍ以下である。ここで、「平均粒径」とは、レーザー散乱法により測定される累積５０％体積粒径をいう。
【００２１】
（シリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜、シリコンナノ粒子）
本発明のシリコンナノ粒子の製造については、従来公知の種々の方法を用いることができる。大きく分類すると、液相法と気相法があるが、本発明においては気相法を用いることが好ましい。
【００２２】
気相法の製造方法としては、（１）対向する原料半導体を電極間で発生させた第一の高温プラズマによって蒸発させ、減圧雰囲気中において無電極放電で発生させた第二の高温プラズマ中に通過させる方法（例えば特開平６−２７９０１５号公報参照。）、（２）電気化学的エッチングによって、原料半導体からなる陽極からナノ粒子を分離・除去する方法（例えば特表２００３−５１５４５９号公報参照。）、（３）レーザーアブレーション法（例えば特開２００４−３５６１６３号参照。）、（４）高速スパッタリング法（例えば特開２００４−２９６７８１号参照）などが用いられる。また、原料ガスを低圧状態で気相反応させて、粒子を含む粉末を合成する方法も、好ましく用いられる。
【００２３】
スパッタリング法によるシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜の成膜、作製としては、例えば、真空チャンバー内にアルゴンガスを導入し、高周波コントローラによりイオン化されたアルゴンイオンをシリコンチップと石英ガラスからなるターゲット材料に衝突させ、これから放出された原子および分子を半導体基板上に堆積し（スパッタリング）、シリコン原子と酸素原子が混ざったアモルファス酸化ケイ素膜を先ず形成する。このとき、膜厚やシリコン混入量を適宜調整することが好ましく、通常スパッタリングの時間やシリコンチップの量を調整することが、好ましい。
【００２４】
次いで、得られたアモルファス酸化ケイ素膜を、アルゴン雰囲気中において、１０００℃付近の温度まで昇温し熱処理を行い、膜中のシリコン原子をナノサイズにまで凝集させることによって、本発明にとって所望の粒径を有する本発明のシリコンナノ粒子を含有する本発明にとって所望の表面粗さＲｙを有する本発明のシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜を作製することができる（アニール処理）。
【００２５】
表面粗さＲｙの制御はあらゆる手段をとることができるが、通常は、成膜後にさらに表面処理を施して意図する表面粗さにすることが必要である。例えば、得られたシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜を４０℃のフッ酸蒸気にさらす（フッ酸処理）、レーザー照射により酸化ケイ素膜を削り取る（レーザー処理）などが挙げられる。
【００２６】
表面粗さＲｙの測定法としては、種々の方法が挙げられるが、例えば、膜表面についてＡＦＭ（原子間力顕微鏡）像やＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）の膜断面像を撮影し、表面粗さＲｙを測定することができる。
【００２７】
ここで、「表面粗さＲｙ」とは、粗さ曲線から、その平均線の方向に基準長さＬだけ抜き取り、この抜き取り部分の平均線から最も高い山頂までの高さＹｐと最も低い谷底までの深さＹｖとの和である。基準長さＬは、傷とみなされるような並外れて高い山や深い谷のない部分から抜き取る。
【００２８】
本発明において、本発明のシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜は、半導体基板上に成膜されたシリコンナノ粒子を含有する酸化ケイ素膜の表面粗さＲｙが１０．０ｎｍ以上１００．０ｎｍ以下に制御することを特徴とする。好ましくは、１５．０ｎｍ以上５０．０ｎｍ以下であり、特に好ましくは、２０．０ｎｍ以上４０．０ｎｍ以下である。
【００２９】
上記のごとくして、本発明のシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜の中に含有される本発明のシリコンナノ粒子を作製することができる。
【００３０】
本発明のシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜の中に含有される本発明のシリコンナノ粒子は、平均粒径が１．０ｎｍ以上１０．０ｎｍ以下であることが好ましい。より好ましくは３．０ｎｍ以上８．０ｎｍ以下、特に好ましくは３．５ｎｍ以上７．０ｎｍ以下である。
【００３１】
なお、本発明において、シリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜の中に含有されるシリコンナノ粒子の平均粒径は本来３次元で求める必要があるが、微粒子過ぎるため難しく、現実には二次元画像で評価せざるを得ないため、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真の撮影シーンを変えて数多く撮影し平均化することで求めることが好ましい。従って、本発明において、当該平均粒径は、ＴＥＭを用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めて、その算術平均を平均粒径とした。ＴＥＭで撮影する粒子数としては１００個以上が好ましく、１０００個の粒子を撮影するのが更に好ましい。本願においては、１０００個の粒子の算術平均を平均粒径とした。
【００３２】
本発明のシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜は、酸化雰囲気下（好ましくは酸素濃度１０％以上の雰囲気下）に放置、好ましくは３０分〜１０日間、より好ましくは１時間〜７日間放置した後、水やその他の溶媒、好ましくはエタノール等のアルコール類中で超音波処理を行うことにより膜中のシリコンナノ粒子を取り出して、シリコンナノ粒子溶液（分散液）とすることができる。
【００３３】
《シリコンナノ粒子の応用》
本発明のシリコンナノ粒子は、膜中から取り出すことにより、種々の技術分野における単一分子分析に応用できる。すなわち、シリコンナノ粒子で標識された分子に励起光を照射し、発光を検出することにより当該分子の同定を行うことを主眼とする単一分子観察方法に利用することができる。
【００３４】
また、単一分子観察方法において、異なる発光スペクトルをもつ本発明のシリコンナノ粒子で複数種類の分子をそれぞれ標識し、該分子に励起光を照射することによって、同時に複数種類の分子の同定を行うこともできる。なお、適用可能な複数種類の分子としては、化学組成は同じであるが化学構造の異なる構造異性体等も含む。
【００３５】
以下において、代表的な応用例について説明する。
【００３６】
〈生体物質標識剤とバイオイメージング〉
本発明のシリコンナノ粒子は半導体ナノ粒子蛍光体の集合体として、生体物質蛍光標識剤に適応することができる。また、標的（追跡）物質を有する生細胞もしくは生体に本発明に係る標識剤を生体物質蛍光標識剤として添加することで、標的物質と結合もしくは吸着し、該結合体もしくは吸着体に所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて蛍光半導体微粒子から発生する所定の波長の蛍光を検出することにより、上記標的（追跡）物質の蛍光動態イメージングを行うことができる。すなわち、本発明に係る標識剤は生体物質蛍光標識剤として、バイオイメージング法（生体物質を構成する生体分子やその動的現象を可視化する技術手段）に利用することができる。
【００３７】
〈シリコンナノ粒子の親水化処理〉
本発明のシリコンナノ粒子表面は、通常、疎水性であるため、例えば生体物質標識剤として使用する場合は、このままでは水分散性が悪く、粒子が凝集してしまう等の問題があるため、該表面を親水化処理することが好ましい。
【００３８】
親水化処理の方法としては例えば、表面の親油性基をピリジン等で除去した後に粒子表面に表面修飾剤を化学的および／または物理的に結合させる方法がある。表面修飾剤としては、親水基として、カルボキシル基・アミノ基を持つものが好ましく用いられ、具体的にはメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、アミノプロパンチオールなどがあげられる。具体的には、例えば、シリコンナノ粒子１０-5ｇをメルカプトウンデカン酸０．２ｇが溶解した純水１０ｍｌ中に分散させて、４０℃、１０分間攪拌し、表面を処理することでシリコンナノ粒子の表面をカルボキシル基で修飾することができる。
【００３９】
〈生体物質標識剤〉
本発明に係る標識剤は生体物質標識剤として用いることができ、上述した親水化処理されたシリコンナノ粒子と、分子標識物質とを有機分子を介して結合させて得られる。
【００４０】
〈分子標識物質〉
本発明に係る標識剤は分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合および／または反応することにより、生体物質の標識が可能な生体物質標識剤として用いることができる。
【００４１】
該分子標識物質としては例えば、ヌクレオチド鎖、抗体、抗原およびシクロデキストリン等が挙げられる。
【００４２】
〈有機分子〉
本発明に係る標識剤は生体物質標識剤として用いることができ、親水化処理されたシリコンナノ粒子と、分子標識物質とが有機分子により結合されている。該有機分子としてはシリコンナノ粒子と分子標識物質とを結合できる有機分子であれば特に制限はないが、例えば、タンパク質中でも、アルブミン、ミオグロビンおよびカゼイン等、またタンパク質の一種であるアビジンをビオチンと共に用いることも好適に用いられる。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
【００４３】
具体的には、シリコンナノ粒子をメルカプトウンデカン酸で親水化処理した場合は、有機分子としてアビジンおよびビオチンを用いることができる。この場合親水化処理されたシリコンナノ粒子のカルボキシル基はアビジンと好適に共有結合し、アビジンがさらにビオチンと選択的に結合し、ビオチンがさらに分子標識物質と結合することにより生体物質標識剤となる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４５】
実施例１
《シリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜の作製》
（スパッタリングによる成膜）
真空チャンバー内にアルゴンガスを導入し、高周波コントローラによりイオン化されたアルゴンイオンをシリコンチップと石英ガラスからなるターゲット材料に衝突させ、これから放出された原子および分子を半導体基板上に堆積し（スパッタリング）、シリコン原子と酸素原子が混ざったアモルファス酸化ケイ素膜を形成した。このとき、表１に示すように膜厚やシリコン混入量を調整した。
【００４６】
（アニール処理）
得られた酸化ケイ素膜を、アルゴン雰囲気中において、表１に示す温度まで急速に昇温し熱処理を行い、膜中のシリコン原子をナノサイズまで凝集させた（アニール処理）。熱処理時間も表１に示す。
【００４７】
（フッ酸処理）
得られたシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜を４０℃のフッ酸蒸気にさらすことで、表面処理を行う（フッ酸処理）。このときのフッ酸液面と酸化ケイ素膜との距離及び処理時間を表１に示す。フッ酸処理後の膜表面について、ＡＦＭ像（原子間力顕微鏡像）を、走査型プローブ顕微鏡（セイコーインスツルメンツ社製ＳＰＩ３８００Ｎ）にて撮影し、表面粗さＲｙを測定した。測定結果を表１に示す。
【００４８】
（粒径測定、平均粒径）
得られたシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜のＴＥＭ像（透過型電子顕微鏡像）を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて断層撮影し、各１，０００個のシリコンナノ粒子を実測して、分散液中のシリコンナノナノ粒子の平均粒径（算術平均値）を求めた。測定結果を表１に示す。
【００４９】
（発光スペクトルの半値幅、極大発光波長、相対発光ピーク強度）
得られたシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜について、分光蛍光光度計（日立ハイテク製Ｆ−７０００）を用いて波長２８０ｎｍの励起光を照射して発生する蛍光スペクトルを測定した。発光スペクトルの半値幅、極大発光波長、相対発光ピーク強度を表２に示す。相対発光ピーク強度は、シリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜試料３を１００とすることにより求めた相対値として示す。
【００５０】
（シリコンナノ粒子の分離および単一粒子の観察）
得られたシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜を大気中で１時間放置した後、エタノール中に投入して１０分間の超音波洗浄器を用いて攪拌処理を行った。それぞれの溶液について、近接場光走査型光学顕微鏡を用いて、波長２８０ｎｍで励起させたときのシリコンナノ粒子の一粒子毎の発光スペクトルを観察した。各溶液で１００個のシリコンナノ粒子について各々の粒子の発光スペクトルを測定し、発光ピーク強度の標準偏差を算出した。極大発光波長の標準偏差（変動幅）とあわせて、測定結果を表２に示す。
【００５１】
【表１】
2009227703.tif 000002
【００５２】
【表２】
2009227703.tif 000003
【００５３】
表２から明らかなように、本発明のシリコンナノ粒子の場合には、その発光スペクトルが、相対発光ピーク強度が大きくかつ半値幅が小さい、また、極大発光波長、発光ピーク強度、の標準偏差（バラツキ）が小さい、特に、粒子毎の発光ピーク強度の標準偏差が小さくバラツキが少ない。このことから、本発明のシリコンナノ粒子は、単一分子観察の標識材料用として優れていることがわかる。
実施例２
実施例１において作製、分離、した各種シリコンナノ粒子を、メルカプトウンデカン酸０．２ｇを溶解した１０ｍｌ純水中に、１×１０-5ｇ分（相当量）を再分散させ、４０℃、１０分間攪拌することで表面が親水化処理されたナノ粒子を得た。
【００５４】
その後、表面が親水化処理された各種ナノ粒子の水溶液それぞれにアビジン２５ｍｇを添加し４０℃で１０分間攪拌を行い、アビジンコンジュゲートナノ粒子を作製した。
【００５５】
得られたアビジンコンジュゲートナノ粒子溶液にビオチン化された塩基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを混合、攪拌し、ナノ粒子でラベリングされたオリゴヌクレオチドを作製した。
【００５６】
さまざまな塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを固定化したＤＮＡチップ上に上記のラベリングしたオリゴヌクレオチドを滴下、洗浄したところ、ラベリングされたオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列をもつＤＮＡチップ上のオリゴヌクレオチドのスポットのみが、紫外線照射によりシリコンナノ粒子の粒径に依存して異なる色の発光をすることが確認された。
【００５７】
このことより、本発明に係るシリコンナノ粒子でのオリゴヌクレオチドのラベリングが可能なことを確認した。