(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像を効率かつ迅速に行うことができ、スポット位置の特定等の解析処理のスピードを向上させる。【解決手段】そこで、蛍光画像解析方法は、ＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像を解析処理する方法であって、検出エリアを有するテンプレートを前記蛍光画像のスポットにあてはめるステップと、前記検出エリアにおいて枠をｎピクセルずつジャンプさせながら輝度を測定する概略ステップと、前記概略ステップで、各検出エリアにおいて輝度が検出された枠から上下各ｎピクセル、左右各ｎピクセルのブロック内にある枠について輝度を測定する詳細ステップと、を有する。【選択図】図１
2009204414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像を解析処理する方法であって、
検出エリアを有するテンプレートを前記蛍光画像のスポットにあてはめるステップと、
前記検出エリアにおいて枠をｎピクセルずつジャンプさせながら輝度を測定する概略ステップと、
前記概略ステップで、各検出エリアにおいて輝度が検出された枠から上下各ｎピクセル、左右各ｎピクセルのブロック内にある枠について輝度を測定する詳細ステップと、
を有することを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像解析方法。
【請求項２】
ＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像を解析処理する方法であって、
検出エリアを有するテンプレートを前記蛍光画像のスポットにあてはめるステップと、
前記検出エリアにおいて枠をｎピクセルずつジャンプさせながら輝度を測定する概略位置特定ステップと、
前記概略位置特定ステップで、各検出エリアにおいて最も高い輝度値が検出された枠を中心としてｎ×ｎピクセルのブロック内にある枠について輝度を測定する詳細位置特定ステップと、
を有し、前記詳細位置特定ステップで最も高い輝度値が検出された枠をスポットの中心位置として出力することを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像解析方法。
【請求項３】
前記概略位置特定ステップと前記詳細位置特定ステップを実行した後に、位置マーカーのスポットの中心位置が、推定される該位置マーカーの配置位置に検出されたか否かを判定する判定ステップを有することを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像解析方法。
。
【請求項４】
前記判定ステップにおいて位置マーカーのスポットの中心位置が、推定される該位置マーカーの配置位置にないと判断された場合は、前記テンプレートを回転補正して再び検出エリアをスポットにあてはめ、再度、前記概略位置特定ステップと前記詳細位置特定ステップを行うことを特徴とする請求項３に記載のＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像を解析する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、特許文献１にあるようなＤＮＡマイクロアレイのスポット位置の特定方法があった。この方法は、スキャン画像に２次元の画像フーリエ変換を施し、基本周波数からスポットの間隔を求めるものであり、概略のスポット位置を確定した後で、個々のスポットの位置に関して詳細な位置合わせを行うという処理をする。
【０００３】
この方法の利点は、いわゆるピン法と呼ばれるようなＤＮＡマイクロアレイの製造方法で作製されるプローブ位置が不安定なＤＮＡマイクロアレイであっても、非常に柔軟にスポットの位置が特定できる、というところにある。しかしながら、特許文献１にあるような従来方法では、スポットの位置の特定に非常に多くの時間がかかるという欠点があった。
【０００４】
一方、特許文献２に記載のインクジェットは非常に印字精度が高く、ＤＮＡマイクロアレイの製造に好適に用いることができる。しかし、ＤＮＡマイクロアレイ基板の表面には、プローブ以外にごみや汚れ等の異物が付着している場合があり、この異物はノイズ輝度として検出されてしまう。このようなＤＮＡマイクロアレイに特許文献１にあるような従来方法を適用してプローブの位置情報を得ようとすると、スポットの近傍に存在する高い輝度のノイズに引きずられてスポットの間隔や概略位置、詳細位置などがずれてしまうことがあるという欠点があった。
【特許文献１】米国特許第６４９８８６３号明細書
【特許文献２】特許第３５０７４６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ハイブリダイゼーションや洗浄のプロセスを制御することは非常に難しいので、このスポット近傍の輝度の高いゴミ、ノイズは除去するのが非常に困難となる。また、この輝度の高いゴミ、ノイズによるスポット位置のずれは、スポット位置特定方法の信頼性を非常に下げる要因となっており、人の目で見るとずれていることが一目瞭然にもかかわらず、特許文献１に記載の方法ではどうしても解決できない課題であった。つまり、ゴミや汚れに起因するノイズがあるＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像に対して、特許文献１に記載の従来方法を適用すると、正確なスポット間隔にもかかわらず、スポットの位置を誤って特定してしまう、という課題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の問題点を解決するために、本発明に係るＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像解析方法は、
ＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像を解析処理する方法であって、
検出エリアを有するテンプレートを前記蛍光画像のスポットにあてはめるステップと、
前記検出エリアにおいて枠をｎピクセルずつジャンプさせながら輝度を測定する概略ステップと、
前記概略ステップで、各検出エリアにおいて輝度が検出された枠から上下各ｎピクセル、左右各ｎピクセルのブロック内にある枠について輝度を測定する詳細ステップと、
を有することを特徴とする。
【０００７】
また、本発明に係るＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像解析方法は、
ＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像を解析処理する方法であって、
検出エリアを有するテンプレートを前記蛍光画像のスポットにあてはめるステップと、
前記検出エリアにおいて枠をｎピクセルずつジャンプさせながら輝度を測定する概略位置特定ステップと、
前記概略位置特定ステップで、各検出エリアにおいて最も高い輝度値が検出された枠を中心としてｎ×ｎピクセルのブロック内にある枠について輝度を測定する詳細位置特定ステップと、
を有し、前記詳細位置特定ステップで最も高い輝度値が検出された枠をスポットの中心位置として出力することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像を効率かつ迅速に行うことができる。したがって、スポット位置の特定等の解析処理のスピードを向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明について詳述する前に、本発明の蛍光画像解析方法が適用される装置構成及びスキャンした蛍光画像の例を以下に示し、説明する。
【００１０】
まず、図２は本発明に係わる蛍光画像解析方法が適用される情報処理装置の構成の例を示すブロック図である。蛍光画像解析方法は、例えば、外部記憶装置２０１、中央処理装置（ＣＰＵ）２０２、メモリ２０３、入出力装置２０４から構成される装置によって実行される。外部記憶装置２０１は、本発明の蛍光画像解析方法を実現するプログラムや、スキャンした蛍光画像等を保持する。また、生物種類判定結果を保持する機能を持たせることもできる。中央処理装置（ＣＰＵ）２０２は蛍光画像解析方法のプログラムを実行したり、すべての装置の制御を行なったりする。メモリ２０３は中央処理装置（ＣＰＵ）２０２が使用するプログラム、及びサブルーチンやデータを一時的に記録する。入出力装置２０４は、ユーザーとのインタラクションを行う。多くの場合、本発明の蛍光画像解析方法を実現するプログラム実行のトリガーはこの入出力装置を介してユーザーが出す。また、ユーザーが結果を見たり、プログラムのパラメータ制御をこの入出力装置を介して行う。
【００１１】
蛍光画像は、ＤＮＡマイクロアレイをスキャナーで画像として取り込むことにより得られる。ＤＮＡマイクロアレイに対して所定波長のレーザー光を照射して走査することにより、各スポットの蛍光を測定でき、スキャンして得られたＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像は、画像ファイルとして記憶装置に格納される。そして、解析処理において、その画像ファイルが読み込まれ、本発明の蛍光画像解析方法が実行される。なお、画像ファイルを介さずに、スキャナーにより読み込まれたＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像が順次解析システムに入力されてもよい。前記所定波長のレーザー光は、蛍光測定用の励起光源である。このレーザー光の波長は、例えば蛍光色素Ｃｙ３，Ｃｙ５に対応する励起波長を挙げることができる。また、画像ファイルは、例えば、グレイスケールＴｉｆｆフォーマット、Ｍｕｌｔｉ−ＩｍａｇｅＴｉｆｆフォーマット、ＪＰＥＧフォーマットなどを用いることができる。
【００１２】
次に、蛍光画像の一例を図３に示す。なお、図３では、蛍光強度の強いスポット程、より白い色で示している。図３に示すように、ＤＮＡマイクロアレイは、その基板上に、行方向および列方向に所定数、マトリクス状に個々のプローブが印字されてなる。図３では、縦１２×横１６（合計１９２個）のマトリックス状に、個々のプローブが印字されている。また、左右の横の列と上の行に存在する（１６＋１１＋１１）＝３８個のスポットが位置マーカーとしての役割を果たしている。なお、位置マーカーの基板上における配置位置は予め定められている。
【００１３】
一般に、近年の技術により作製されたＤＮＡマイクロアレイのスポット配置は非常に正確である。例えば特許文献２に記載のインクジェットは印字精度が高いため、このインクジェットにより作製されたＤＮＡマイクロアレイのスポットの配置位置は非常に正確である。このため、アレイの作製時の位置制御から逆算して、蛍光画像におけるスポット間（隣接するスポット同士の中心間）のピクセル値、スポットの直径のピクセル値などを求めることができる。ここで、、例えばアレイ基板の大きさが３ｃｍ×３ｃｍ、蛍光画像のスキャンの解像度が５μｍだとすると、入力画像のピクセル数は６０００×６０００となる。そして、例えばスポット間隔（隣接するスポットの中心の間隔）が２５０μｍ、スポットの直径が５０μｍだとすると、図３のＤＮＡマイクロアレイ（縦１２×横１６個）（合計１９２個）の全体は縦５６０ピクセル、横７６０ピクセルのスポットの相対位置を示すテンプレート（以下スポット配置テンプレートと呼ぶ）になる。
【００１４】
次に、図４を用いて、枠を１ピクセルずつ移動させながら、スポット位置を探索する従来の方法について説明する。なお、以下の説明におけるスポット位置とは、スポットに属するピクセルのうち最も輝度値が高いピクセルの位置（座標）として説明する。
【００１５】
一番左上のスポット位置を基準位置として、そこからそれぞれのスポット位置をオフセット計算して、そこにスポットがあるとする。オフセット計算とはスポット配置テンプレートの位置を基準（普通は左上）として、スポット配置テンプレートに従い、スポットの絶対位置（＝スポット配置テンプレートの位置＋スポット間の相対位置）を導き出すことをいう。そして、例えば位置マーカー（図３の例だと３８個のスポット）に相当するピクセルの平均輝度や輝度中央値をそのスポット配置テンプレート位置のスコアとする。例えば、図４のように位置マーカーが4つある場合は、1つのスポット配置テンプレートにつき、４つのピクセルの平均輝度又は輝度中央ちをそのスポット配置テンプレート位置のスコアとする。そして、スポット配置テンプレートを１ピクセルずつ移動しながら前記スコアを計算していって、最もスコアが高い位置をスポット位置とする。なお、本発明の説明では、プローブの最も輝度が高い中央のピクセル位置を特定する方法について記述するが、特にこの方法に限定されるものではない。勿論、円形のプローブ形状を反映した複数ピクセルの計算をしてスコアを求めてもよいが、それだけ計算時間が必要となる。なお、スポット位置のデータは、ピクセル位置の座標、蛍光輝度の情報を含む。
【００１６】
図３に示したスポット配置と基板構成について、図４に示した従来方法でスポット位置を計算をすると、移動のループが５４４０×５２４０となり、非常に多くの計算時間が必要となる。更に、スキャン画像には微小な回転があるので、それを考慮すると更にその１０倍以上の時間が必要になる場合もある。この枠を１ピクセルずつ移動させながらスポット位置を求める従来の方法は、ＤＮＡマイクロアレイの品質が非常に高い場合、非常に信頼できるスポット位置の特定方法であるが、前記の説明の通り、計算時間が非常に必要となるという欠点があった。
【００１７】
本発明はこの欠点を克服するためになされたものであり、図５に示すように、枠の位置をｎピクセルずつジャンプしながらスポットに関する情報を概略的に求めておいて、次にその上下左右で１ピクセルずつずらしながら詳細に情報を求めるという方法である。
【００１８】
したがって、本発明に係る蛍光画像解析方法は、
ＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像を解析処理する方法であって、
検出エリアを有するテンプレートを前記蛍光画像のスポットにあてはめるステップと、
前記検出エリアにおいて枠をｎピクセルずつジャンプさせながら輝度を測定する概略ステップと、
前記概略ステップで、各検出エリアにおいて輝度が検出された枠から上下各ｎピクセル、左右各ｎピクセルのブロック内にある枠について輝度を測定する詳細ステップと、
を有することを特徴とする。
【００１９】
本発明により、ＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像の解析時間を短縮することができる。
【００２０】
以下、本発明の実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。
【００２１】
（実施形態１）
図９は、ＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像の概略図を示している。また、図１０は、解析処理において、ＤＮＡマイクロアレイの画像ファイルに対して適用されるテンプレートの一例を、図９に示した蛍光画像にあてはめた場合について示している。図１０に示すように、テンプレートは、例えば複数の検出エリア（８０３）に分けられており、この検出エリアの形状や間隔は、ＤＮＡマイクロアレイの個々のスポット（８０１）に対応するように適宜決定することができる。図１０では、縦９×横６（計５４個）のスポットの配置に対応するように、形状を四角形として検出エリアが配置されているが、特にこの例に限定されるものではない。各スポットの推定される位置（推定される配置位置）を基準として、スポットの検出エリアを設定する。検出エリアの形状は、たとえば、円形、楕円形、正方形、長方形でもよく、特に限定されるものではない。この検出エリアの間隔や大きさ、形状等は、印字するスポットの間隔や大きさ、形状等から適宜決定することができる。なお、図１０では、全てのスポットが各検出エリア内に入っている場合について示している。また、検出エリアの位置は、例えばＸＹ両方向において、例えば（ｍ、ｎ）（ｍ、ｎは整数）と表すことができる。
【００２２】
印字するスポットの形状を、例えば、半径ｒの円形とし、各スポット間隔（隣接するスポットの中心の間隔）をＤｓとする。その際、各スポットの検出エリアの形状を、例えば、正方形とし、その一辺のサイズＬａは、ｒ＜Ｌａ＜Ｄｓの範囲に選択することが好ましい。
【００２３】
図１１は、図１０における検出エリア（８０３）があてはめられたスポットの４箇所（８０４）を拡大した図である。そして、図１２は、検出エリアがあてはめられたスポットの１箇所を拡大表示した図である。検出エリアはピクセルに対応する枠（８０５）に分割されており、各枠の位置は例えば（ｘ、ｙ）（ｘ、ｙは整数）と表すことができる。
【００２４】
上述のように、本発明の蛍光画像の解析処理においては、読みとられたＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像中の個々のスポットが、解析ツールが提供するテンプレートの検出エリアに当てはめられる。そして、本発明では、その検出エリアにある全部の枠について蛍光輝度を測定するのではなく、まず、枠をｎピクセルずつジャンプしながら概略のスポットの形状や輝度等を把握してから、次に詳細にスポットの形状、輝度等について計算していく。
【００２５】
つまり、本発明の蛍光画像解析方法は、個々のスポットについて、概略の情報を取得する概略ステップと、詳細に情報を取得する詳細ステップから構成される。情報としては、スポットの位置や輝度、形状等が含まれる。以下、概略ステップ、詳細ステップについて説明する。
【００２６】
概略ステップでは、個々のスポットの情報について大まかに情報を取得するため、検出エリアの枠をｎピクセルずつ飛ばしながら情報（例えば、輝度）を取得する。図１３は、図１２を例に挙げた場合において、概略ステップでｎを５とした場合に測定する枠を示す。図１３では、あるスポットの検出エリアについて、概略ステップにおいて測定した１２１枠のうち、４９枠において輝度が観測されている。なお、図１３では、測定を開始する位置を検出エリアの一番左上にある枠としたが、とくにこれに限定されるものではなく、どの枠でもよい。ここで、この概略ステップにおけるジャンプするピクセル数（ｎ）は少なくとも２以上の整数である。そして、少なくともスポットの直径（２ｒ）に相当するピクセル数以下であることが望ましい。なぜならば、ｎをスポットの直径（２ｒ）を超えるピクセル数に設定して概略ステップを実行すると、スポットをまたがって枠が移動する可能性があるからである。ｎの値としては、スポットに内接する正方形の一辺（２ｒ／√２）に対応するピクセル数より小さい値とすることがより好ましく、スポットの半径（ｒ）に対応するピクセル数より小さい値とすることがさらに好ましい。
【００２７】
各ピクセルにおいて、「輝度が検出される」とは、スポット以外の領域で観測される「バックグランド値」を基準として、その「バックグランド値」を超える「輝度」が観測される状態を意味する。
【００２８】
また、他の例として、図１４には、図１２の場合において、概略ステップでｎを８とした場合に測定する枠を示す。
【００２９】
そして、次に、詳細ステップにおいて、概略ステップで輝度が観測された全ての枠について、その枠から（その枠を含んで）上下各ｎピクセル、左右各ｎピクセルの中にある枠について輝度を測定する。なお、重複する枠については１回測定すればよい。概略ステップで輝度が観測された枠から上下各ｎピクセル、左右各ｎピクセルのブロックを測定すれば、スポット内にある全ての枠について情報を得ることができるからである。
【００３０】
スポットに関して得られた情報はどのような形で出力されても構わない。例えば、スポットの蛍光輝度は、平均輝度や輝度中央値として表示することができる。また、例えば、スポット位置は、スポットに属する枠のうち中央部にある枠のピクセル座標として表示することができる。
【００３１】
このような概略ステップと詳細ステップを組み合わせて画像を解析することにより、スポット内に属する枠全てについて、効率的に情報を得ることができ、蛍光画像の解析時間の短縮を図ることができる。
【００３２】
（実施形態２）
次に、図面に基づいて本発明の第２の実施形態について説明する。第２の実施形態は、最も高い輝度を示すスポットの中心の座標（以下、スポット中心位置と略す）を求めるのに好適な本発明に係る実施形態である。一般にスポットの中心になるほど輝度が高くなる。
【００３３】
図１５は、第２の実施形態によるＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像解析方法の処理手順を説明するフローチャートである。
【００３４】
システムの入力は、例えば蛍光画像をスキャンして得られた画像データにより行われる。出力は、スポット中心位置、つまり、個々のスポットにおいて最も輝度が高い枠のピクセル座標となる。例えば、｛検出エリア（ｍ、ｎ）、ピクセル位置（ｘ、ｙ）｝というように出力することができる。
【００３５】
次に、スポット中心位置の概略位置を求めるループ（以下、概略位置特定ループと略す）について説明する。
【００３６】
この概略位置特定ループ（１０２）では、枠をｎピクセルずつジャンプさせ移動させながら、その枠の輝度を求める（図５）。そして、位置の評価（１０３）で、現在測定対象となっている枠の輝度値とそれまでに得られた概略位置特定ループにおける最大輝度値とを比較する。そして、測定対象となっている枠の輝度値がそれまでに得られている最大輝度値を超えた場合は、概略位置の更新（１０４）となる。つまり、最終的に、概略位置特定ループの終了（１０６）時点で、最も高い輝度値を示す枠の位置（座標）が概略位置（１０５）に格納されることになる。
【００３７】
このようにすることで、概略位置（最大スコアを示したピクセルの座標）から上下左右ｎピクセルの範囲内に、スポット中心位置が入ることになる。ここで、上下左右ｎピクセルとは、概略位置を中心とする縦ｎ×横ｎのブロックに入るピクセルのことである。
【００３８】
例えば、図１３を例に挙げて説明する。図１３では、概略位置特定ループにおいて輝度値を測定した１２１枠のうち、輝度が観測された枠（８０７）は４９枠であり、そのうち最も中心（８０９）に近い枠（８０８）は、最大輝度値を示す。そして、最大輝度値を示した枠（８０８）を中心に縦５×横５のピクセルからなるブロック内にスポットの中心が入っている。
【００３９】
この概略位置特定ループにおけるジャンプするピクセル数（ｎ）については、少なくともスポットの直径（２ｒ）に相当するピクセル数以下であることが望ましい。なぜならば、ｎをスポットの直径（２ｒ）を超えるピクセル数に設定して概略位置特定ループ（１０２）を実行すると、スポットをまたがって枠が移動する可能性があるからである。ｎの値としては、スポットに内接する正方形の一辺（２ｒ／√２）に対応するピクセル数より小さい値とすることがより好ましく、プローブの半径（ｒ）に対応するピクセル数より小さい値とすることがさらに好ましい。例えば、上述した例のようにスポットの直径が５０μｍ（２ｒ＝１０）の場合においては、ｎは１０〜２とすることができ、７〜３とすることが好ましく、５〜４とすることがより好ましい。
【００４０】
次に、詳細位置特定ループ（１０７）について説明する。
【００４１】
位置の評価（１０８）は、概略位置特定ループにおける位置の評価（１０３）のステップと同じ論理ルーチンとなる。また、１０９のベスト位置の更新は１０４のステップと同じ論理ルーチンとなる。
【００４２】
具体的に説明すると、詳細位置特定ループ（１０７）では、概略位置特定ループで確定した概略位置から上下左右ｎピクセルの範囲で、１ピクセルずつ枠を移動させ、輝度を測定する。つまり、合計ｎ×ｎピクセル数、枠を移動させることになる。前述したように、概略位置特定ループで求めた概略位置を中心に上下左右ｎピクセルの範囲にスポット中心位置が入っている。したがって、この範囲において最大スコアを示すピクセルの座標（ベスト位置）を求めることにより、スポット中心位置を詳細に求めることができる。なお、上下左右ｎピクセルとは、概略位置を中心とする縦ｎ×横ｎのブロックに入るピクセルのことである。
【００４３】
最終的に、詳細位置特定ループを終了し（１１１）終了すると、正確なスポット中心位置がベスト位置（１１０）に格納されていることになる。なお、概略位置特定ループで行う処理内容を概略位置特定ステップと、詳細位置特定ループで行う処理内容を詳細位置特定ステップと表現することもできる。
【００４４】
例えば、表１３に示した検出エリアは、縦が５４個、横が５２個の枠からなっている。この検出エリアについて従来の方法により各枠の輝度を測定すると、２８０８個の枠について測定しなければならない。一方、本発明に係る解析方法を利用すると（測定開始枠は一番左上の枠）、概略位置特定ループでは１１×１１＝１２１枠、詳細位置特定ループでは５×５−１＝２４枠、計１２１＋２４＝１４５枠を測定するのみで済む。したがって、本発明に係る画像解析方法は従来方法よりも格段に解析スピードを向上させることができる。
【００４５】
（実施形態３）
図１は、第３の実施形態によるＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像解析方法の処理手順を説明するフローチャートである。第３の実施形態は、前記第２の実施形態に回転ループを加え回転補正を行う形態である。出力は、第２の実施形態と同様に、スポット中心位置（１１０）、つまり、個々のスポットについて、もっとも輝度が高いスポットの中心の位置を示すピクセル座標となる。
【００４６】
本実施形態のＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像解析方法は３つのネストしたループで構成される。３つのループとは、回転ループ（１０１）、概略位置特定ループ（１０２）及び詳細位置特定ループ（１０７）である。基本的にはこの３つのループを全部巡回した後で、スポット中心位置が決定される。実施形態２にさらに回転ループを加えることで回転補正を行うことができ、より正確なスポット中心位置を求めることができる。スキャン画像は微小な回転成分を含んでいる場合が多いので、正確なスポット中心位置の特定には回転のループ（１０１）が必要となる場合が多い。つまり、ＤＮＡマイクロアレイ上の各スポットの蛍光強度を算出し、正確な解析を実行するためには、画像上の個々のスポットに対して、予め定義されている、ＤＮＡマイクロアレイに配置された個々の検出エリアが正しく設定される必要がある。つまり、読み取られた画像を正しく解析するためには、個々のスポットに対して対応する個々の検出エリアが正しく当てはめられる必要がある。しかし、何らかの理由によりずれが生ずる場合があるため、このズレを回転補正し、対応するテンプレートの検出エリアに個々のスポットが正しく設定されるようにすることが好ましい。例えば、画像データを例えば０．１度ずつ２０回ループすることによって、マイナス１度からプラス１度の回転補正ができる。
【００４７】
従来は、例えば縦軸、横軸の画像ピクセル値の加算を行い、ヒストグラムを解析することによって、予め画像の回転を行う方法が主流だった。しかしながら、この方法は位置マーカーが図３のように一列に並んでいる場合しか適用できない。例えば斜めに位置マーカーが並んでいるプローブレイアウトや、非常に少ない数の位置マーカーしか含んでないプローブレイアウトだと利用できないという欠点があった。これに対して、本発明の方法であれば、どんな位置マーカーレイアウトでも正確に位置が求められる。
【００４８】
次に、本発明に係るスポット中心位置の特定方法について、図１のフローチャートを用いて説明する。
【００４９】
まず、システムの入力は、例えば蛍光画像をスキャンして得られた画像データにより行われ、解析処理が開始される。
【００５０】
次に、１０２のスポット中心位置の概略位置を求めるループ（概略位置特定ループ）について説明する。この概略位置特定ループでは、枠をｎピクセルずつジャンプさせて移動させ、その枠の輝度値を求める。各枠について輝度値を求めるステップは１０３である。そして、現在測定対象となっている枠の輝度値とそれまでに得られた概略位置特定ループにおける最大輝度値とを比較するステップが概略位置の更新（１０４）となる。こうすることで、最終的に、概略位置特定ループの終了（１０６）時点で、最も高い輝度値を示す枠の位置（ピクセル座標）が概略位置（１０５）に格納されることになる。このようにすることで、概略位置（最大スコアを示したピクセルの座標）から上下左右ｎピクセルの範囲内に、スポット中心位置（そのスポットに属する枠のうち最大輝度値を示すピクセルの位置）が入ることになる。ここで、上下左右ｎピクセルとは、概略位置を中心とする縦ｎ×横ｎのブロックに入るピクセルを示す。
【００５１】
この概略位置特定ループにおけるジャンプするピクセル数（ｎ）については、少なくともスポットの直径（２ｒ）に相当するピクセル数以下であることが望ましい。なぜならば、ｎをスポットの直径（２ｒ）を超えるピクセル数に設定して概略位置特定ループ（１０２）を実行すると、スポットをまたがって枠が移動する可能性があるからである。ｎの値としては、スポットに内接する正方形の一辺（２ｒ／√２）に対応するピクセル数より小さい値とすることがより好ましく、プローブの半径（ｒ）に対応するピクセル数より小さい値とすることがさらに好ましい。例えば、上述した例のようにスポットの直径が５０μｍ（２ｒ＝１０）の場合においては、ｎは１０〜２とすることができ、７〜３とすることが好ましく、５〜４とすることがより好ましい。
【００５２】
次に、詳細位置特定ループ（１０７）について説明する。
【００５３】
位置の評価（１０８）は、概略位置特定ループにおける位置の評価（１０３）のステップと同じ論理ルーチンとなる。また、１０９のベスト位置の更新は１０４のステップと同じ論理ルーチンとなる。
【００５４】
具体的に説明すると、詳細位置特定ループ（１０７）では、概略位置特定ループで確定した概略位置から上下左右ｎピクセルの範囲で、１ピクセルずつ枠を移動させ、輝度を測定する。つまり、合計ｎ×ｎピクセル数、枠を移動させることになる。前述したように、概略位置特定ループで求めた概略位置から上下左右ｎピクセルの範囲にスポット中心位置が入っている。したがって、この範囲において最大輝度値を示すピクセルの座標（ベスト位置）を求めることにより、スポット中心位置を詳細に求めることができる。
【００５５】
最終的に、詳細位置特定ループを終了し（１１１）、回転ループを終了する（１１２）と、正確なスポット位置がベスト位置（１１０）に格納されていることになる。
【００５６】
ＤＮＡマイクロアレイ上に配置した位置マーカーの配置は、前もって決定されている。また、各スポット間隔（隣接するスポットの中心の間隔）Ｄｓも決まったいる。従って、ＤＮＡマイクロアレイ上に配置した位置マーカーの位置に対して、上述するオフセット計算によって、推定された配置位置（所定の配置位置）が算定される。
【００５７】
なお、回転ループを終了させるか否かは、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ上に配置した位置マーカーが所定の配置位置に正しく検出されたか否かを判定することにより、判断することができる。
【００５８】
なお、位置マーカーとしては、ＤＮＡマイクロアレイをスキャナーによりスキャンした際に、蛍光シグナルを発する物質によるマークであればよい。例えば、自家蛍光物質、核酸吸着物質、あるいはハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部にハウスキーピングジーン若しくはその断片を含む核酸を用いることができる。その際、これら核酸に施されている蛍光標識による蛍光シグナルが利用される。
【００５９】
例えば、位置マーカーのパターン配列や位置座標等の情報は、予めテンプレートに関する属性情報の１つとして、ファイルに登録することができる。これら位置マーカーの蛍光強度および位置座標の判定を実行することによって、終了（１１２）するか否かを判断することができる。
【００６０】
（実施形態４）
次に、実施形態１のプローブ位置の特定方法における計算速度を更に高速化する方法について、図６のフローチャートを用いて説明する。
【００６１】
図６では、図１と比べて、概略位置特定ループにおいてある値（＝十分信頼できるスコア。例えばバックグラウンドが50だった時、1000など）以上のスコアを得た場合には、概略位置特定ループを抜けて詳細位置特定ループへ移るステップ「概略位置チェック」６０１が加わっている。ここで述べたスコアとは、「位置の評価」で得られたスコアであり、図５で説明した位置マーカープローブに相当する場所のピクセルの平均輝度や輝度中央値である。
【００６２】
つまり、概略位置特定ループにおいて得られたスコアがある閾値を超えた場合には、必ず概略位置がプローブの中のどこかに存在することが保証されるならば、詳細位置特定ループへ移動してもよいわけである。例えば、ハイブリダイゼーションの条件が非常に良く、ノイズが非常に少ない場合や、位置マーカーの数が非常に多い場合などは、１０３の位置の評価ステップで求めるスコアが高くなることは非常に稀となる。この場合、ある値よりスコアが高くなると図５のようにプローブの円の中のどこかに１０５の概略位置が存在する可能性が高くなる。
【００６３】
（実施形態５）
さらに、実施形態１におけるプローブ位置の特定を更に正確にする方法について、図７のフローチャートを用いて説明する。
【００６４】
図７では、詳細位置特定ループで求めたスポット位置についてその適合性の評価を行い、正確なスポット位置が特定できたと判断された場合は、全てのループ（回転ループ、概略位置特定ループ、詳細位置特定ループ）を抜ける処理「プローブ形状チェック」７０１が加わっている。この「プローブ形状チェック」について、図８を用いて詳しく説明する。
【００６５】
図８において、９０１はスポットの中心が属する枠（以下、スポット中心枠）で、９０２はスポットの周辺位置にある枠（以下、スポット周辺枠と略す）である。例えば、スポット周辺枠（９０２）は、輝度が観測されなかった枠に接っしている輝度が観測された枠とすることができる。
【００６６】
例えば、スポット周辺枠（９０２）の輝度の（標準偏差／平均）が０．１以下で、かつ、（スポット中心枠の輝度値／スポット周辺枠の輝度値の平均）が３以上５未満である場合、スポット中心位置は正確であると判定することができる。例えば、全ての位置マーカーのスポットにおいて、上記判定条件に適合したら、スポット中心位置は正確だと判断し、全てのループを抜ける。
【００６７】
なお、実施形態４（図６）又は実施形態５（図７）のような割り込み処理を入れた場合、枠を移動する方法で全体の計算時間が大きく変わってくる。多くの場合、蛍光画像をスキャンする条件として、大体枠がスポット中央にくるようにスキャンする。このような条件の元では、図１の１０２のループの開始位置を中央しておいて、それから上下、左右に±ｎピクセルずつずらす方がトータルの計算時間が早くなる。
【００６８】
Ｃ＋＋言語でそれを説明すると横方向をx軸、縦方向をy軸とした場合
for(int x=0; x<X#Max; x+=n)
[       for(int y=0; y<Y#Max; y+=n)
[
処理
]
]
というループではなく、
for(int i=0; i<X#Max/n; i++)
[
int x = X#Max/2 + ((i%2)*2)-1)*i/2*n;
for(int j=0; j<Y#Max/n; j++)
[
int y = Y#Max/2 + ((j%2)*2)-1)*j/2*n;
処理
]
]
という処理をする。なお、X#Max、Y#Maxはそれぞれ横方向、縦方向の最大値である。
【００６９】
また、移動に関して概略位置を特定し、その後で詳細位置を特定する方法を説明してきたが、この処理を回転に関して同じように応用することも可能である。つまり、例えば０．１度ずつ回転させてベストな回転角度を求めた後で、ベストな回転角度の（±０．０２度×ｎ）ずつ回転させながら詳細な回転角度を求めることもできる。図１の場合、１０１の回転ループが１０２、１０５の２重のネストになることになる。また、図６、図７で述べた割り込み処理を入れることも可能である。
【００７０】
次に、正確なプローブ位置を実現するＤＮＡマイクロアレイの作製方法および実験手法の一例について記載する。
【００７１】
＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞
［１］ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ：２５ｍｍｘ７５ｍｍｘ１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で２０分超音波洗浄をおこなった。次に８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間基板を浸した。再度純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の石英ガラス基板を用意した。
【００７２】
［２］表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）（以下ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のＭＣＳを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００７３】
［３］プローブＤＮＡ
作製した微生物検出用プローブを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００７４】
［４］ＢＪプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意したプローブを上記の混合溶媒に規定濃度なるように溶解した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０  キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００７５】
なお、ここで用いたバブルジェットプリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液を約１２０マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００７６】
続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、１枚のガラス基板に対して、印字操作を行い、アレイを作製した。印字が確実に行われていることを確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
【００７７】
［５］洗浄
３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖ＤＮＡが固定したＤＮＡマイクロアレイを得た。
【００７８】
＜検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）＞
検体となる微生物ＤＮＡの増幅、および、標識化反応を以下に示す。
Premix PCR 試薬（TAKARA ExTaq）  25μl
Template Genome DNA               2μl  (100ng)
Forward Primer mix                2μl  (20pmol/tube each)
Reverse Primer mix                2μl  (20pmol/tube each) 
Cy-3 dUTP (1mM)                   2μl  (2nmol/tube)
H20                              17μl
Total                            50μl
上記組成の反応液を以下のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。
95℃            10 min.
92℃            45 sec.
55℃            45 sec.
72℃            45 sec.
72℃            10 min.
反応終了後、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いてＰｒｉｍｅｒを除去した後、増幅産物の定量を行い、標識化検体（2nd PCR Products）とした。
【００７９】
＜ハイブリダイゼーション＞
＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製したＤＮＡマイクロアレイと＜検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）＞で作製した標識化検体を用いて検出反応を行った。
【００８０】
（ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング）
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）を１ｗｔ％となるように１００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、この溶液に＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、０．１ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２ｘＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ，Ｃ6Ｈ5Ｎａ3・２Ｈ2Ｏ）  ３０ｍＭ、ｐ．Ｈ．７．０）で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
【００８１】
（ハイブリダイゼーション）
水切りしたＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Genomic Solutions Inc.   Hybridization Station）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００８２】
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
6 x SSPE / 10% Form amide / Target (2nd PCR Products  全量)
(6xSSPE: NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H. 7.4)
＜ハイブリダイゼーション条件＞
65 ℃  3min  →  92℃  2min  →  45℃  3hr  →  Wash  2ｘSSC / 0.1% SDS  at 25℃  →  Wash  2 x SSC at 20℃  → (Rinse with H2O  :  Manual)  →  Spin dry
＜蛍光測定＞
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡマイクロアレイをＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）を用いで蛍光測定を行った。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本発明の第３の実施形態を表すフローチャートである。
【図２】本発明のＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像解析方法が適用される情報処理装置の構成を示すブロック図である。
【図３】ＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像解析方法で扱う蛍光画像の一例を表す図である。
【図４】従来のスポット位置の特定方法を説明する図である。
【図５】本発明の概略位置特定ループを説明する図である。
【図６】本発明の実施形態４を表すフローチャートである。
【図７】本発明の実施形態５を表すフローチャートである。
【図８】スポット形状の適合度を数値化するステップを説明する図である。
【図９】ＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像の一例を示す概略図である。
【図１０】ＤＮＡマイクロアレイの画像ファイルに対して適用されるテンプレートの一例を、図９に示した蛍光画像にあてはめた場合について示す概略図である。
【図１１】図１０における検出エリアがあてはめられたスポットの４箇所を拡大した図である。
【図１２】図１１における検出エリアがあてはめられたスポットの１箇所を拡大表示した図である。
【図１３】図１２の場合において、概略ステップでｎを５とした場合に測定する枠を示す図である。
【図１４】図１２の場合において、概略ステップでｎを８とした場合に測定する枠を示す図である。
【図１５】本発明の実施形態２を表すフローチャートである。
【符号の説明】
【００８４】
１０１  回転ループ
１０２  概略位置特定ループ
１０３  位置の評価（概略位置特定ループ）
１０４  概略位置の更新
１０５  概略位置
１０６  概略位置特定ループ終了
１０７  詳細位置特定ループ
１０８  位置の評価（詳細位置特定ループ）
１０９  ベスト位置の更新
１１０  ベスト位置
１１１  詳細位置特定ループの終了
１１２  回転ループの終了
２０１  外部記憶装置
２０２  中央処理装置（ＣＰＵ）
２０３  メモリ
２０４  入出力装置
６０１  概略位置チェック
７０１  プローブ形状チェック
８０１  スポット
８０２  アレイ基板
８０３  検出エリア
８０４  検出エリアがあてはめられたスポットの４箇所
８０５  枠（１ピクセルに相当）
８０６  概略ステップで測定対象となる枠
８０７  概略ステップで輝度を示した枠
８０８  概略ステップで最も高い輝度を示した枠
８０９  スポットの中心にあたる枠
９０１  スポット中心枠
９０２  スポット周辺枠
９０３  スポット
【図１】
2009204414.tif 000003
【図２】
2009204414.tif 000004
【図３】
2009204414.tif 000005
【図４】
2009204414.tif 000006
【図５】
2009204414.tif 000007
【図６】
2009204414.tif 000008
【図７】
2009204414.tif 000009
【図８】
2009204414.tif 000010
【図９】
2009204414.tif 000011
【図１０】
2009204414.tif 000012
【図１１】
2009204414.tif 000013
【図１２】
2009204414.tif 000014
【図１３】
2009204414.tif 000015
【図１４】
2009204414.tif 000016
【図１５】
2009204414.tif 000017