(57)【要約】【課題】細胞の状態を、画像データに基づいて同期化する方法を提供することを目的とする。【解決手段】蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質をコードする遺伝子、蛍光物質又は発光物質が導入された複数の細胞を培養する工程と、  前記複数の細胞中の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、  コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて同一の細胞状態を示す細胞を抽出することにより前記複数の細胞の細胞状態を同期化する工程と、を含む、細胞状態同期化方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質をコードする遺伝子、蛍光物質又は発光物質が導入された複数の細胞を培養する工程と、
前記複数の細胞中の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、
コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて同一の細胞状態を示す細胞を抽出することにより前記複数の細胞の細胞状態を同期化する工程と、
を含む、細胞状態同期化方法。
【請求項２】
蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質をコードする遺伝子、蛍光物質又は発光物質が導入された複数の細胞を培養する工程と、
前記複数の細胞中の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、
コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて蛍光タンパク質又は発光タンパク質の発現開始時間データ又は蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質、蛍光物質若しくは発光物質の細胞内局在の変化時間データを取得し、該発現開始時間データ又は細胞内局在変化時間データに基づいて同一の細胞状態を示す細胞を抽出することにより、前記複数の細胞の細胞状態を同期化する工程と、
を含む、請求項１記載の細胞状態同期化方法。
【請求項３】
蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードする遺伝子が導入された複数の細胞を培養する工程と、
前記複数の細胞中の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、
コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて蛍光タンパク質の発現開始時間データを取得し、該発現開始時間データに基づいて前記複数の細胞の細胞周期を同期化する工程と、を含む、
細胞周期同期化方法である請求項１記載の細胞状態同期化方法。
【請求項４】
蛍光物質又は発光物質が導入された複数の細胞を培養する工程と、
前記複数の細胞中の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、
コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて蛍光物質若しくは発光物質の細胞内局在の変化時間データを取得し、該細胞内局在変化時間データに基づいて細胞死に関する細胞状態を同期化する工程と、を含む、
細胞死同期化方法である請求項１記載の細胞状態同期化方法。
【請求項５】
細胞に導入する蛍光物質が蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る２つの蛍光物質で標識したペプチドであって、カスパーゼにより切断され、カスパーゼにより切断されると蛍光共鳴エネルギー移動が起こらなくなり蛍光を発しなくなるペプチドであり、前記ペプチドの細胞内局在の変化時間データに基づいて、細胞内でのカスパーゼの活性を検出し、該活性を指標として細胞死に関する細胞状態を同期化する請求項４記載の細胞状態同期化方法。
【請求項６】
蛍光物質又は発光物質が導入された複数の細胞を培養する工程と、
前記複数の細胞中の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、
コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて蛍光物質又は発光物質の細胞内局在の変化時間データを取得し、該細胞内局在変化時間データに基づいて細胞分化に関する細胞状態を同期化する工程と、を含む、
細胞分化同期化方法である請求項１記載の細胞状態同期化方法。
【請求項７】
所定の刺激に供した、蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質をコードする遺伝子、蛍光物質又は発光物質が導入された細胞と前記刺激に供していない前記細胞とをそれぞれ培養する工程と、前記細胞の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて蛍光タンパク質又は発光タンパク質の発現開始時間データを取得し、該発現開始時間データに基づいて前記双方の細胞の細胞周期を同期化する工程と、を含み、前記刺激に対する細胞応答を細胞周期に関連して検出することを特徴とする、細胞応答検出方法。
【請求項８】
所定の刺激に供した、蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質をコードする遺伝子、蛍光物質又は発光物質が導入された細胞を培養する工程と、前記細胞の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて蛍光タンパク質又は発光タンパク質の発現開始時間データを取得し、該発現開始時間データに基づいて前記双方の細胞の細胞周期を同期化する工程と、を含み、前記刺激に対する細胞応答を細胞周期に関連して検出することを特徴とする、細胞応答検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、コンピュータ上で、細胞の細胞状態を同期化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞には、様々な細胞の状態が存在する。同じ細胞種であっても個々の細胞において、細胞状態は異なる。細胞状態とは、例えば、細胞周期における細胞の状態、細胞死（アポトーシス、ネクローシスなど）における細胞状態、分化における細胞状態などが挙げられる。
【０００３】
細胞周期においては、G1期（間期１）、S期（DNA合成期）、G2期（間期２）、M期（有糸分裂期）、G0期（周期停止）などの細胞状態が考えられる。通常G1期、S期、G2期、M期の順に細胞周期がサイクルし、細胞周期が止まって分裂しない状態をG0期と呼ぶ。
【０００４】
細胞死においては、もっともよく知られているプロセスとして、アポトーシス、ネクローシスが挙げられる。アポトーシスの場合、カスパーゼの活性化、ミトコンドリア膜電位の低下、フォスファチジルセリンの細胞表面への露出、ＤＮＡの断片化、アポトーシス小体の形成、などの細胞状態が考えられる。ネクローシスの場合、細胞内小器官の膨大化、細胞の膨化、細胞破裂、炎症反応、などの細胞状態が考えられる（図１）。
【０００５】
分化においては、造血幹細胞の分化（図２）、神経幹細胞の分化（図３）、間葉系幹細胞の分化（図４）などが挙げられ、造血幹細胞の分化の場合、造血幹細胞、前赤芽球、赤芽球、赤血球、骨髄芽球、顆粒球前駆細胞、好塩基球、好酸球、好塩基球、リンパ芽球、リンパ球、単芽球、単球、巨核芽球、巨核球、血小板などの細胞状態が考えられる。神経幹細胞の分化の場合、神経幹細胞、神経上皮細胞、ニューロン前駆細胞、ニューロン、グリア前駆細胞、O-2A前駆細胞、放射状グリア、Type1アストロサイト、Type2アストロサイト、Type1前駆細胞、オリゴデンドロサイトなどの細胞状態が考えられる。間葉系幹細胞の分化の場合は、間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、骨髄間質細胞、Tenocyte、脂肪細胞などの細胞状態が考えられる。
【０００６】
なお、上記した細胞状態を、さらに細かく解析することで細胞状態を細かく区別をすることも可能である。例えば、同じニューロンでも、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンというように、細胞状態をマーカーを用いて詳細に調べることで状態を区別することができる。
【０００７】
従来は、「細胞死」、「分化」の解析において、薬剤添加、光刺激などによる外部からの刺激等を用いて、細胞死や分化の誘導を行ってきた。しかし、外部からの刺激に対する応答の早さは、個々の細胞レベルで異なっており、これらの細胞を大規模に同期させて解析するという手法は知られていない。
【０００８】
細胞周期においては血清飢餓や薬剤を用いて細胞周期を物理的に停止させる方法が挙げられる。しかしながら、当該方法では、細胞に対して多大なストレスを与えるため、細胞の状態が変化してしまう。すなわち、たとえ細胞を同期化させたとしても、細胞は本来の姿からかけ離れた状態となってしまう。
【０００９】
一方、今日においては、細胞を集団として観察する他に、単一の細胞の観察が盛んに行われている。このような単一細胞の観察方法は、「一細胞イメージング」と呼ばれる。今後、細胞の動的挙動をより明確にするためには細胞毎の変化を詳細に捉える必要があることから、細胞の観察方法において、一細胞イメージングが主流になると考えられる。
【００１０】
特許文献１には、細胞の初期状態と反応との相関関係をと調べることができる細胞観察装置及び細胞観察方法が開示されている。当該細胞観察方法では、複数の細胞を含む標本の画像から、個々の細胞の初期状態を認定し、また刺激を与えた後の反応を検出し、当該初期状態と反応との相関情報を生成する。また、当該細胞観察方法では、各細胞の細胞周期における分裂期は、細胞周期に連動した形態変化に基づいて特定している。しかしながら、特許文献１には、細胞の画像データに基づいて細胞の細胞周期を含む細胞状態を同期化させることについては開示されていない。
【００１１】
【特許文献１】特開2005-102538号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したように、従来の細胞の細胞状態を同期化させる方法では、同期化させたところで、本来の細胞状態を観察できない場合がある。
【００１３】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、細胞にストレスを与えることなく、細胞の細胞周期等の細胞状態を、画像データに基づいて同期化する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するため鋭意検討した結果、細胞が発現する蛍光タンパク質の発光開始時間と細胞分裂時間との相関関係から細胞周期の時期を特定できると共に、当該細胞の蛍光画像データに基づき細胞周期を同期化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
なお、蛍光タンパク質の代替として、発光タンパク質、蛍光又は発光する物質によりラベルされ、且つ細胞内において、細胞状態に応答しながら、一定の挙動を示す物質でも代用が可能である。また、本手法は細胞周期に限らず、様々な細胞状態を同期化することが可能である。
【００１６】
すなわち、本発明の態様は以下のとおりである。
[１]  蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質をコードする遺伝子、蛍光物質又は発光物質が導入された複数の細胞を培養する工程と、
前記複数の細胞中の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、
コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて同一の細胞状態を示す細胞を抽出することにより前記複数の細胞の細胞状態を同期化する工程と、
を含む、細胞状態同期化方法。
【００１７】
[２]  蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質をコードする遺伝子、蛍光物質又は発光物質が導入された複数の細胞を培養する工程と、
前記複数の細胞中の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、
コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて蛍光タンパク質又は発光タンパク質の発現開始時間データ又は蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質、蛍光物質若しくは発光物質の細胞内局在の変化時間データを取得し、該発現開始時間データ又は細胞内局在変化時間データに基づいて同一の細胞状態を示す細胞を抽出することにより、前記複数の細胞の細胞状態を同期化する工程と、
を含む、[１]の細胞状態同期化方法。
【００１８】
[３]  蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードする遺伝子が導入された複数の細胞を培養する工程と、
前記複数の細胞中の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、
コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて蛍光タンパク質の発現開始時間データを取得し、該発現開始時間データに基づいて前記複数の細胞の細胞周期を同期化する工程と、を含む、
細胞周期同期化方法である[１]の細胞状態同期化方法。
【００１９】
[４]  蛍光物質又は発光物質が導入された複数の細胞を培養する工程と、
前記複数の細胞中の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、
コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて蛍光物質若しくは発光物質の細胞内局在の変化時間データを取得し、該細胞内局在変化時間データに基づいて細胞死に関する細胞状態を同期化する工程と、を含む、
細胞死同期化方法である[１]の細胞状態同期化方法。
【００２０】
[５]  細胞に導入する蛍光物質が蛍光共鳴エネルギー移動を起こし得る２つの蛍光物質で標識したペプチドであって、カスパーゼにより切断され、カスパーゼにより切断されると蛍光共鳴エネルギー移動が起こらなくなり蛍光を発しなくなるペプチドであり、前記ペプチドの細胞内局在の変化時間データに基づいて、細胞内でのカスパーゼの活性を検出し、該活性を指標として細胞死に関する細胞状態を同期化する[４]の細胞状態同期化方法。
【００２１】
[６]  蛍光物質又は発光物質が導入された複数の細胞を培養する工程と、
前記複数の細胞中の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、
コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて蛍光物質又は発光物質の細胞内局在の変化時間データを取得し、該細胞内局在変化時間データに基づいて細胞分化に関する細胞状態を同期化する工程と、を含む、
細胞分化同期化方法である[１]の細胞状態同期化方法。
【００２２】
[７]  所定の刺激に供した、蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質をコードする遺伝子、蛍光物質又は発光物質が導入された細胞と前記刺激に供していない前記細胞とをそれぞれ培養する工程と、前記細胞の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて蛍光タンパク質又は発光タンパク質の発現開始時間データを取得し、該発現開始時間データに基づいて前記双方の細胞の細胞周期を同期化する工程と、を含み、前記刺激に対する細胞応答を細胞周期に関連して検出することを特徴とする、細胞応答検出方法。
【００２３】
[８]  所定の刺激に供した、蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質をコードする遺伝子、蛍光物質又は発光物質が導入された細胞を培養する工程と、前記細胞の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得する工程と、コンピュータにおいて、前記蛍光又は発光画像に基づいて蛍光タンパク質又は発光タンパク質の発現開始時間データを取得し、該発現開始時間データに基づいて前記双方の細胞の細胞周期を同期化する工程と、を含み、前記刺激に対する細胞応答を細胞周期に関連して検出することを特徴とする、細胞応答検出方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
本発明に係る方法は、蛍光若しくは発光タンパク質をコードする遺伝子、又は蛍光若しくは発光する物質によりラベルされ、且つ細胞内において、細胞状態に応答しながら、一定の挙動を示す物質が導入された複数の細胞を培養し、当該複数の細胞中の個々の細胞の蛍光又は発光画像を経時的に取得し、コンピュータにおいて、蛍光又は発光画像に基づいて蛍光又は発光タンパク質の発現開始時間データ発光タンパク質、蛍光物質若しくは発光物質の細胞内局在の変化時間データを取得し、該発現開始時間データ又は細胞内局在変化時間データに基づいて当該複数の細胞の状態を同期化する方法である。本発明に係る方法によれば、コンピュータ上で、簡便に細胞の細胞状態を同期化できる。
【００２６】
ここで、細胞状態とは、ある時点における細胞の物理化学的状態をいい、細胞全体若しくは細胞内器官等の細胞の部分の形態、細胞が発現・産生する物質、細胞内に存在する物質の変化（例えば、特定の物質の形成、活性化、複合体化、断片化など）、細胞の特定の刺激に対する反応性、細胞の電位などの物理学的特性等の細胞の特性の違いにより状態を特定することが可能である。特に本発明ではある時点での細胞状態が問題になるので、経時的に変化し得る細胞の特性のある時点の特性が問題になる。具体的には、例えば、細胞周期における細胞の状態、細胞死における細胞の状態、分化における細胞の状態等が挙げられる。細胞状態は、細胞形態、遺伝子の発現パターン、タンパク質の発現パターンを指標により判断することができ、細胞形態、遺伝子の発現パターン、タンパク質の発現パターンを同期化することにより、細胞状態を同期化することができる。
【００２７】
細胞状態の同期化とは、細胞集団中の複数の細胞の状態を同期化することをいい、すなわち特定の時点における状態に合わせることをいう。
【００２８】
上記の細胞状態の同期化の中でも、本発明は細胞周期の同期化に適している。
【００２９】
本発明においては、蛍光若しくは発光タンパク質をコードする遺伝子又は蛍光物質若しくは発光物質を細胞に導入し、細胞状態と蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質の発現又は蛍光物質若しくは発光物質から検出される光を関連付け、細胞から発生する光を指標に細胞状態を特定する。このためには、例えば、特定の細胞状態のときに蛍光タンパク質又は発光タンパク質が発現し、細胞から測定可能な光が発生するようにする。あるいは、特定の細胞状態のときに、細胞に導入した蛍光物質又は発光物質から光が発生するようにするか、又は蛍光物質又は発光物質が細胞内に局在し発生する光の測定が可能になるようにする。
【００３０】
このように細胞状態と蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質の発現又は蛍光物質若しくは発光物質から検出される光を関連付けることにより、例えば蛍光タンパク質又は発光タンパク質の発現開始時間データを得て、該発現開始時間データに基づいて同一の細胞状態を示す細胞を抽出することにより、前記複数の細胞の細胞状態を同期化することができる。また、蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質、蛍光物質若しくは発光物質の細胞内局在の変化時間データを得て、該細胞内局在変化時間データに基づいて同一の細胞状態を示す細胞を抽出することにより、前記複数の細胞の細胞状態を同期化することができる。ここで、蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質、蛍光物質若しくは発光物質の細胞内局在の変化時間データとは、蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質、蛍光物質若しくは発光物質の細胞内における経時的な移動、消長や局在に関するデータをいう。
【００３１】
以下、細胞状態を蛍光若しくは発光タンパク質をコードする遺伝子又は蛍光物質若しくは発光物質を用いてどのように特定するかを、種々の細胞状態について示す。
【００３２】
細胞周期の同期化
細胞周期には、G1期（間期１）、S期（DNA合成期）、G2期（間期２）、M期（有糸分裂期）、G0期（周期停止）などの細胞状態のサイクルがある。M期の核膜消失や有糸分裂、S期のDNAの合成などは大きな細胞の形態変化を伴う。細胞周期はサイクリン、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）などの細胞周期タンパク質及びRB、E2F、Myc、p53を含む他のタンパク質によって厳密に制御されている。
【００３３】
Rb（網膜芽細胞腫タンパク質）は非リン酸化時に遺伝子の転写を阻害する癌抑制タンパク質である。また、E2Fや他の転写因子にも結合し、それらが標的遺伝子の転写を活性化するのを妨ぐRbはS期及びM期の前にCDKによるリン酸化を受け、Rbと転写因子との結合が解く。E2FはDP1とヘテロ二量体を形成する転写因子のファミリーで、これらはG1及びG2期の多くの間、Rbに結合している。Rbがリン酸化を受けるとE2Fが解離し、応答配列に結合して、遺伝子発現を調節できるようになる。
【００３４】
c-Mycは多くの遺伝子の転写を調節する転写因子であり、S期への移行にとりわけ重要な役割を果たす。また、このタンパク質はいくつかのCDK複合体に対して正の制御を行い、CDKがRbなどのタンパク質をリン酸化する能力を高め、細胞周期を進行させる。
【００３５】
p53はDNA損傷発生時に細胞増殖を阻害する癌抑制タンパク質で、このタンパク質は他の転写因子に結合して働くが、それ自身も転写因子であり、注目すべきことに、細胞周期阻害タンパク質p21の発現を増加させる能力を有している。
【００３６】
上記した、細胞周期を制御する因子群の発現量や発現パターン（局在性など）を蛍光物質や発光物質によって可視化することで、細胞の状態を把握し定義することができる。例えば、細胞周期に関わる転写因子の活性の測定が可能となるレポータプラスミドの例としてはルシフェラーゼ発現プラスミド、EGFP発現プラスミドなどが挙げられる。レポータプラスミドが細胞内に導入されると蛍光タンパク質又は発光タンパク質が発現し、細胞の状態を可視化することができる。
【００３７】
例えば、クローンテックよりルシフェラーゼ遺伝子を用いた転写因子レポータが各種発売されており、これらのレポータプラスミドを用いて、AP1、CRE、E2F、ISRE、Myc、p53、Rb、SREなどの活性化を検出することが可能である。（参考：http://clontech.takara-bio.co.jp/product/catalog/006003005.shtml）。
【００３８】
また、ヒストンH3、Improtin αなどの細胞周期に依存して細胞内局在性を変化させる蛍光タンパク質を融合した配列をもつレポータプラスミドを用いることでも、細胞周期の状態を把握することは可能である。局在性を指標にした細胞周期の把握を行う場合、プラスミドではなく、タンパク質を直接導入してもよく、この場合、蛍光を示す物質（FITC、Cy3、Cy5など）でタンパク質を直接化学修飾してもよい。
【００３９】
蛍光タンパク質又は発光タンパク質を発現するプラスミドベクターを細胞にトランスフェクションした場合、タンパク質が翻訳されタンパク質が発光又は蛍光を開始する時間と細胞分裂時間が相関関係を示すので両者が関連付けられる。この手法を用いることによっても、細胞周期の時期を特定することが可能になる。
【００４０】
本発明において、細胞周期の同期化とは、コンピュータ上で、蛍光又は発光画像に基づいて、複数の細胞について、各細胞の同一の細胞状態を示した時間で位相を揃える、又は同一の細胞状態（同期）を示した細胞のみ抽出することをいう。
【００４１】
細胞死の同期化技術
細胞死においては、もっともよく知られているプロセスとして、アポトーシス、ネクローシスが挙げられる。アポトーシスの場合、カスパーゼの活性化、ミトコンドリア膜電位の低下、フォスファチジルセリンの細胞表面への露出、DNAの断片化、アポトーシス小体の形成、などの細胞状態が考えられる。ネクローシスの場合、細胞内小器官の膨大化、細胞の膨化、細胞破裂、炎症反応などの細胞状態が考えられる。
【００４２】
カスパーゼの活性化を検出するためのレポータ物質として、FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した基質物質が挙げられる。カスパーゼは1〜14までの14種類が見つかっており、それぞれ特定のペプチド配列を認識して切断する。例えば、カスパーゼ１はアミノ酸配列AYVHDAPVK（配列番号１）を、カスパーゼ３はアミノ酸配列DEVD（配列番号２）を、カスパーゼ８はアミノ酸配列IETD（配列番号３）を認識する。例えば基質配列の両端にCFPとYFPを結合した遺伝子配列をもつプラスミドをレポータとして導入することによって、カスパーゼが不活性時にはFRETが起こり黄色の蛍光を示し、活性化すると基質が切断され、FRETが起こらなくなり、青色の蛍光を示すという形で、カスパーゼの活性を蛍光色で検出することが可能である（特許第3692488号公報）。また、同様に基質の両端を蛍光物質でラベルし、これを細胞に導入することでも、同じようにFRETを用いたカスパーゼ活性の検出が可能である。色の変化を指標に、カスパーゼが活性化した時間に基づき、細胞状態の同期化が可能となる。他にもBidの両端に蛍光物質を接続し、Bidの切断をFRETで認識することによるアポトーシスのミトコンドリアパスウェイの解析にも応用ができる。
【００４３】
カルセインAMやカルセインオレンジなどの生細胞染色が可能な蛍光物質、蛍光物質でラベルされたアネキシン抗体による、アポトーシス前期のフォスファチジルセリンの細胞表面への露出の認識、PIなどのDNAインターカレーターを用いた死細胞やDNAの断片化の認識、NFκβやIκβの発現量を測定できる転写因子のレポータプラスミドを用いた炎症反応の測定などの手法を用いることによって、カスパーゼの活性化、ミトコンドリア膜電位の低下、フォスファチジルセリンの細胞表面への露出、DNAの断片化、アポトーシス小体の形成、細胞内小器官の膨大化、細胞の膨化、細胞破裂、炎症反応などの細胞状態を可視化することができる。
【００４４】
上記のように細胞死と蛍光物質又は発光物質の発光とを関連付けることにより、細胞死を同期化することが可能になる。
【００４５】
分化の同期化技術
分化においては、造血幹細胞の分化（図２）、神経幹細胞の分化（図３）、間葉系幹細胞の分化（図４）などが挙げられ、造血幹細胞の分化の場合、造血幹細胞、前赤芽球、赤芽球、赤血球、骨髄芽球、顆粒球前駆細胞、好塩基球、好酸球、好塩基球、リンパ芽球、リンパ球、単芽球、単球、巨核芽球、巨核球、血小板などの細胞状態が考えられる。神経幹細胞の分化の場合、神経幹細胞、神経上皮細胞、ニューロン前駆細胞、ニューロン、グリア前駆細胞、O-2A前駆細胞、放射状グリア、Type1アストロサイト、Type2アストロサイト、Type1前駆細胞、オリゴデンドロサイトなどの細胞状態が考えられる。間葉系幹細胞の分化の場合は、間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、骨髄間質細胞、Tenocyte、脂肪細胞などの細胞状態が考えられる。
【００４６】
それぞれの細胞状態を特定することができるレポータプラスミドやマーカーの設計が可能であり、細胞状態と蛍光物質又は発光物質を関連付けることができる。例えば、図３に示すように、様々なマーカーを認識する抗体や、転写因子レポーターを用いて、様々な細胞状態を可視化することが可能である。具体的には、例えばネスチン遺伝子の転写活性レポーター、I型コラーゲンに対する蛍光ラベルされた抗体などを利用することができる。
【００４７】
ネスチンは、胎生期の中枢神経系の形成過程での多潜性幹細胞（stem cell）に選択的に発現し、ニューロン（神経細胞）や星状膠細胞（アストロサイト）に分化が進むと発現は消失する。よって、ネスチンの転写レポーターの発色の変化によって、ニューロン（神経細胞）や星状膠細胞（アストロサイト）への分化の進行を検出することが可能である（分化が進むと発色が減衰する）。
【００４８】
I型コラーゲンは骨分化の初期分化マーカーになるため、I型コラーゲンの抗体によって、I型コラーゲンの染色を検出することで、分化の進行を検出することが可能である（分化が進むと細胞が発色する）。
【００４９】
蛍光又は発光物質は、蛍光又は発光タンパク質を含むいずれの蛍光又は発光物質を包含する。例えば、蛍光又は発光タンパク質の例としては緑色蛍光タンパク質(GFP)、強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)、赤色蛍光タンパク質(DsRed）、黄色蛍光タンパク質(YFP)、青色蛍光タンパク質(CFP)、ルシフェラーゼタンパク質などが挙げられる。また、蛍光又は発光物質の例としては、FITC、Cy3、Cy5、Hoechist3342、DAPI、PI、indo-1(AM)、BCECF(AM)、Fluorescein等によりラベルされた化合物（例えばDNA、RNA、タンパク質）、蛍光を示す物質（カルセインAM、カルセインオレンジ）などが挙げられる。蛍光又は発光物質は限定されず公知のものをすべて用いることができる。また、上記のように蛍光物質によるFRETやBRET（生物発光蛍光共鳴エネルギー移動）等の現象を用いることにより、特定の細胞内現象の発露を検出することも可能である。この場合、例えば、蛍光又は発光物質を用いて細胞状態と関連する物質を標識して用いてもよい。本発明においては、蛍光又は発光物質を用いて標識した核酸やタンパク質も蛍光又は発光物質という。
【００５０】
蛍光又は発光タンパク質をコードする遺伝子(以下、「蛍光又は発光タンパク質遺伝子」という。)は、例えば、当該遺伝子が由来する生物のゲノムDNAやcDNAを鋳型とし、当該遺伝子に特異的なプライマーセットを用いたPCRによって増幅し、調製することができる。
【００５１】
本発明に係る方法では、先ず蛍光又は発光タンパク質遺伝子を細胞に導入し、形質転換体を準備する。この際、蛍光又は発光タンパク質遺伝子は、適当なベクターのマルチクローニングサイト等に導入することで用意することができる。ベクターとしては、宿主細胞中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミド等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110、pTP5等）、酵母由来のプラスミド(例えばYEp13等のYEp系、YCp50等のYCp系)等が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルスベクターやバキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターも、ベクターとして用いることができる。
【００５２】
蛍光又は発光タンパク質遺伝子を含むベクターは、宿主細胞において機能的な制御領域(例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等)を適宜含むことができる。ベクターにおいて、蛍光タンパク質遺伝子は、制御領域の制御下に配置される。プロモーターとしては、例えば構成的プロモーター、細胞周期特異的プロモーター等が挙げられる。構成的プロモーターとは、宿主細胞の生育条件とは無関係に制御下にある遺伝子を発現させるプロモーターをいう。構成的プロモーターとしては、例えばサイトメガロウィルス（CMV）プロモーター、シミアンウィルス（SV40）プロモーター、EF1αプロモーター、ユビキチンC(UbC)プロモーター、ラウス肉腫ウィルス(RSV)プロモーター、鶏βアクチン(CAG)プロモーターが挙げられる。一方、細胞周期特異的プロモーターとは、細胞周期の特定の時期に制御下にある遺伝子を発現させるプロモーターをいう。細胞周期特異的プロモーターとしては、例えば、CDK（cyclin-dependent kinase）やサイクリンのプロモータ等が挙げられる。
【００５３】
ベクターに、蛍光又は発光タンパク質遺伝子を挿入するには、先ず精製された蛍光又は発光タンパク質遺伝子を含むDNA断片を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに作動可能に連結する方法等が採用される。また、ベクターと蛍光タンパク質遺伝子のそれぞれ一部に相同な領域を持たせることにより、PCR等を用いたin vitro法又は酵母等を用いたin vivo法によって両者を連結する方法であってもよい。
【００５４】
あるいは、蛍光又は発光タンパク質遺伝子を含むベクターは、市販のものであってよい。例えば、EGFP遺伝子をCMVプロモーターの制御下に含むpEGFP-N1ベクターがタカラバイオ株式会社より市販されている。
【００５５】
次いで、蛍光又は発光タンパク質遺伝子を含むベクターを細胞中に導入することにより、形質転換体を得ることができる。ここで、細胞としては、例えば、動物細胞(例えば、初代培養)、又は細胞系(Hela細胞、COS細胞、Vero細胞、CHO細胞、マウスL細胞等))、酵母(例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae))、細菌(例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属する細菌)、昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)及び植物細胞(例えば、アブラナ科に属する植物の細胞)が挙げられる。
【００５６】
動物細胞へのベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００５７】
酵母へのベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００５８】
細菌へのベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００５９】
昆虫細胞へのベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００６０】
植物細胞へのベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等が挙げられる。
【００６１】
蛍光タンパク質遺伝子が細胞に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体から調製されたDNAを鋳型とし、蛍光タンパク質遺伝子に特異的なプライマーを用いて、PCRを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法を採用してもよい。
【００６２】
次いで、得られた形質転換体を、形質転換に使用した細胞に応じた培地に播種し、定法により培養する。
【００６３】
蛍光又は発光物質そのものの細胞の導入は、蛍光又は発光物質により異なり、それぞれに応じて適切な方法で導入することができる。例えば、DNA又はRNAを骨格とした蛍光又は発光物質は、ベクターと同様の方法で細胞に導入することができる。蛍光又は発光タンパク質の場合は、タンパク質導入用試薬を用いればよく、例えば市販のものを用いればよい。市販のタンパク質導入試薬としては、例えばCHARIOT（商標）(Active motif社）、Pro-Deliver（OZ Biosciences社）、BioPorter（商標）(Sigma社）、Profect P1、P2(Targetingsystems社）等が挙げられる。また、細胞膜を通過し得る特定のペプチド配列を蛍光又は発光タンパク質に付加し、それを培地に添加することにより細胞へ導入することができる。細胞膜を通過し得るペプチドとしては、HIV-1/TATの細胞通過ドメイン、HIV-1/Revペプチド、FHV/coat(35-49)ペプチド等がある。さらに、カルセイン等の細胞膜浸透性の化合物を細胞内に導入しようとする蛍光物質又は発光物質に添加することにより、浸透により細胞内に導入することができる。
【００６４】
当該培養の際に、各形質転換体(細胞)又は蛍光若しくは発光物質を導入した細胞を個々に蛍光顕微鏡に供し、経時的に蛍光画像を取得し、時系列データ又は細胞内局在変化時間データを得る。蛍光画像取得期間は、例えば、１〜２日間、好ましくは遺伝子導入直後〜２日間である。また、蛍光画像取得の間隔は、２０〜３０分間、好ましくは５〜１０分間である。蛍光顕微鏡の設定は、細胞が発現する蛍光タンパク質又は細胞に導入した蛍光若しくは発光物質に応じて行われる。例えば、蛍光タンパク質がEGFPである場合には、蛍光顕微鏡の設定は、励起波長として、４８８nmの波長を与えられること、検出として５０８nmの波長を検出できること、光毒性を誘導しないような低強度の励起光であることである。また、蛍光顕微鏡と共に、各細胞の位置や細胞分裂等を把握するために各細胞を位相差顕微鏡下で観察してもよい。蛍光顕微鏡画像と位相差顕微鏡画像とを重ね合わせることにより両画像における同一の細胞を特定できる。
【００６５】
蛍光顕微鏡は、蛍光画像を取得(撮像)するために、ビデオカメラ、CCDカメラ、等を具備する。蛍光又は発光画像の取得は、具体的には、細胞に対して特定の励起光を当てながら、細胞を高倍率（x4-x100）で適切な露出時間でカメラ撮像、又はビデオ撮影をする。
【００６６】
次いで、得られた蛍光又は発光画像データをコンピュータに入力する。入力された蛍光画像データに基づいて、各細胞の細胞周期の位相等の細胞状態を合わせ、同期化する。具体的には、得られた蛍光又は発光画像の中から細胞を個別に認識し細胞毎に蛍光又は発光輝度の強さ、細胞の大きさ、細胞の位置、細胞の形態などの細胞に関する情報を特定する。次に細胞の大きさや蛍光又は発光輝度を補正し時系列データを取得する。細胞毎に蛍光又は発光輝度が検出される時間が異なりこの差が細胞状態の時間差、例えば、細胞周期の位相差を示すため、細胞状態の同調化には蛍光又は発光輝度が検出される時間を認識し揃えることによって達成できる。
【００６７】
例えば、蛍光又は発光タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を用いて細胞周期の同期化を行う場合、形質転換体において、構成的プロモーターの制御下に蛍光又は発光タンパク質遺伝子が存在する場合には、細胞周期((G0期→)G1期→S期→G2期→M期)におけるM期からG1期への移行期に蛍光又は発光タンパク質遺伝子が発現されることとなる。すなわち、当該時期に形質転換体において蛍光又は発光タンパク質が発現され、当該形質転換体は蛍光又は発光を発することとなる。細胞周期は、細胞の種類に応じて様々であるが、２４時間程度のサイクルである。従って、蛍光又は発光の発光開始時点を基準にすれば、細胞周期の各時期を特定することができる。あるいは、形質転換体において、細胞周期特異的プロモーターの制御下に蛍光又は発光タンパク質遺伝子が存在する場合には、特定の細胞周期の時期に、蛍光又は発光タンパク質遺伝子が発現されることとなる。この場合には、蛍光又は発光の発光開始時間が細胞周期の特定の時期の開始時間を表すこととなる。従って、当該蛍光又は発光の発光開始時点を基準とし、蛍光又は発光タンパク質の発現開始時間を揃えることで、同様に細胞周期の各時期を特定することができる。具体的には、１細胞単位の認識により、特定の状態を示す細胞のみを抽出し、同期している細胞データのみ用いることにより（特定の状態を示さない細胞データは捨てる）、又は１細胞単位の認識を行い、個々の細胞が特定の状態を示した時間が様々である場合、様々な時間を同一の時間とみなすことにより細胞状態を同期化する。
【００６８】
さらに、上述した本発明に係る方法に準じて、所定の刺激に対する細胞応答を細胞周期等の細胞状態に関連して検出することができる。刺激としては、例えば、薬剤(例えば、抗癌剤等)投与、が挙げられる。
【００６９】
先ず、蛍光若しくは発光タンパク質遺伝子又は蛍光若しくは発光物質が導入された細胞を用意する。次いで、当該細胞を所定の刺激に供する。一方、当該刺激に供しない細胞も用意する。さらに、上記の細胞状態同期化方法に準じて、双方の細胞の細胞状態を同期化する。細胞状態が同期化された細胞の情報を比較することで、特定の細胞状態、例えば細胞周期の特定の時期における、刺激に対する細胞応答(例えば、細胞の形態変化や遺伝子発現変化)を検出することができ、細胞応答をより鋭敏に観測することができる。
【００７０】
あるいは、蛍光若しくは発光タンパク質遺伝子又は蛍光若しくは発光物質が導入された細胞を、刺激に供せず、上記の細胞状態同期化方法に準じて、蛍光画像を取得する。次いで、同一の細胞を所定の刺激に供し、同様に、蛍光画像を取得する。双方の細胞の蛍光画像を用いて、細胞状態を同期化することで、同様に、特定の細胞状態、例えば細胞周期の特定の時期における、刺激に対する細胞応答を検出することができる。
【００７１】
さらに蛍光又は発光物質を用いた場合、その蛍光物質の局在性や、強度の変化、波長の変化を指標にして、特定の細胞状態、例えば特定の細胞周期の各時期を特定することが可能である。
【００７２】
上記手法は任意の刺激に対して培養細胞のすべてが応答あるいは不応答する場合は非常に高感度で検出することができる。しかしながら任意の刺激に対して細胞群はその中の一部が応答し、残りは不応答である。すなわち同一細胞集団内においてその反応は細胞毎に多様である。これは遺伝子導入、刺激を供する方法が確率的であることに起因するため、これを避けるための有効的な手法は存在しない。そこで、同一集団内からさらに任意の刺激に対して、応答、不応答群をその特徴にしたがって分離する必要がある。クラスタリングでは細胞集団をその特徴にしたがって分離分割する手法であり細胞応答を鋭敏に検出するためには有効な手法である。
【００７３】
以上に説明した本発明によれば、細胞にストレスを与えることなく、細胞の状態を、蛍光又は発光画像に基づいて同期化できる。また、本発明によれば、所定の刺激に対する細胞応答を、特定の細胞状態、例えば細胞周期の特定の時期に関連して検出することができる。このような検出は、薬剤スクリーニング等に応用することができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７５】
〔実施例１〕Hela細胞における細胞分裂開始時間とEGFP発光開始時間との相関
1. 材料及び方法
1-1. 培養及びトランスフェクション
本実施例では、Hela細胞を用いた。Hela細胞を24ウェル培養プレートに1ウェル当たり2×104個で播種し、5％CO2下で37℃で培養した。
【００７６】
次いで、Hela細胞の培養物に対して、pEGFP-N1ベクター(タカラバイオ株式会社製)をLipofectamineTM LTX( インビトロジェン 製)を用いてトランスフェクトした。なお、当該pEGFP-N1ベクターは、構成的プロモーターであるCMVプロモーターの制御下にEGFPをコードする遺伝子を含むものである。
【００７７】
1-2. 画像取得及び蛍光分析
上記1-1.のトランスフェクション後に、EGFPの蛍光強度を蛍光顕微鏡(オリンパス社製、型番：IX81)及び位相差顕微鏡(オリンパス社製、型番：IX81)によって時系列的(連続的)に2日間モニタリングし、蛍光画像及び位相差画像を各ウェルについて15分又は20分おきに取得した。Hela細胞の細胞分裂の位相差画像を図５に示す。また、EGFPを発現するHela細胞の蛍光画像を図６に示す。
【００７８】
次いで、得られた蛍光画像において、各細胞を独立に認識し、各細胞からのEGFPの蛍光強度を測定した。具体的には、得られた蛍光画像を、蛍光画像解析ソフトウェアを用いて、当該蛍光画像における単一の細胞を独立に認識し、その細胞からのEGFPの蛍光強度、細胞サイズ及び細胞位置を測定した。
【００７９】
1-3. データプレプロセシング
上記1-2.の蛍光画像より以下の3パラメーターを抽出した。
開始時間＝EGFP発現(発光)の開始時間(分(単位))
終了時間＝蛍光画像解析ソフトウェアがHela細胞を認識する終了時間(分(単位))
認識時間＝終了時間−開始時間＋1
【００８０】
換言すれば、開始時間はEGFPの蛍光強度が増加し、最適化された閾値を超えた最初の時間である。また、終了時間は蛍光画像解析ソフトウェアがHela細胞を認識できなくなった最初の時間である。これらのパラメーターを用いて、任支持時間が2サイクル以上（１サイクルは実験に依存するが例えば１５分あるいは２０分）のHela細胞を選択した。次に、各細胞の蛍光強度を以下の式に従って標準化した。
【００８１】
【数１】
2009072155.tif 000002
【００８２】
(式中、Ii(t)stdは、時間tにおける第i番目の細胞の標準化された蛍光強度である。Ii(t)は、時間tにおける第i番目の細胞の蛍光強度である。max(Ii)は、i番目の細胞の最大の蛍光強度である。min(Ii)は、i番目の細胞の最小の蛍光輝度である(文献名：Bioinformatics 2005, vol.22, pp.843-848 Hakamada et al.)。）
【００８３】
1-4. 細胞分裂時間
細胞分裂時間は、位相差画像を用いて決定した。M期において、親細胞(Hela細胞)が2つの娘細胞へ分裂する前に、親細胞は培養プレートの底から遊離するので、分裂細胞を他の細胞から容易に識別することができた。
【００８４】
1-5. 特徴抽出
EGFP蛍光強度の時系列データの特徴を抽出するために、k-平均クラスタリングを当該時系列データに適用した。また、ユークリッド距離を非類似度として用いた。さらに、シルエット値を用いて、適当なクラスター数を評価した(文献名：J. Comput. Appl. Math Roussew 1987 vol.20, pp53-65))。シルエット値(s(i))をクラスター間の非類似度として定義した。
【００８５】
例えば、データセットにおいていずれかの対象iを取り、当該対象がクラスターAに属するとする。クラスターAが対象iとは独立した対象を含む場合に、次の計算を行う。
【００８６】
a(i)＝クラスターAの全ての他の対象に対する対象iの平均類似度
次いで、クラスターCを考慮し、次の計算を行う。
【００８７】
d(i,C)＝クラスターCにおける全ての他の対象に対する対象iの平均類似度
d(i,C)(全てのクラスターCについて:クラスターCはクラスターAではない)を計算した後、b(i)を以下のように定義する。
【００８８】
【数２】
2009072155.tif 000003
【００８９】
(式中、min d(i,C)は自身を含まないクラタメンバと任意のデータiとの距離の内最小のもの  である)
さらに、a(i)及びb(i)を用いて、s(i)を以下のように定義する。
【００９０】
【数３】
2009072155.tif 000004
【００９１】
(式中、max{a(i),b(i)}はa(i)とb(i)のうちどちらか大きい値である)
シルエット値は-1〜1であり、シルエット値が1に近いほど、対象データはより適当なクラスターに属することとなる。
【００９２】
2. 結果
Hela細胞の細胞分裂と当該細胞におけるEGFP発光(発現)までの時間との間の相関を図７に示す。図７において、縦軸はEGFP発現開始時間(分)であり、横軸は細胞分裂開始時間(分)である。また、実線(黒塗りの四角のプロット)と破線(黒塗りの菱形のプロット)は、それぞれ独立して行った実験の結果である。さらに、重相関係数（R2）は２回の実験それぞれにおいて0.9238、0.9691であった。
【００９３】
また、Hela細胞の細胞分裂からEGFP発光(発現)までの時間の分布を図８に示す。図８において、縦軸は細胞数であり、横軸はEGFP発現開始時間(分)である。
【００９４】
図７に示すように、Hela細胞の細胞分裂の開始時間とEGFPの蛍光が始めて観察された時間とを散布図にし、両者の相関を一次の線形近似によって行った。その結果、細胞分裂開始時間と蛍光発光開始時間との間には、相関係数0.9以上という非常に強い相関があることが分かった。このことから、EGFP遺伝子が発現するタイミングには細胞分裂後一定の時間であることが分かった(図８)。よって、EGFP発現開始時間をそろえることにより、細胞周期が同調したデータを取得できる。また、繰り返し実験を行い、再現性を確認したところ、再現性が非常に高いことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】細胞死における細胞状態を示す図である。
【図２】造血幹細胞の分化を示す図である。
【図３】神経幹細胞の分化を示す図である。
【図４】間葉系幹細胞の分化を示す図である。
【図５】Hela細胞の細胞分裂の位相差画像を示す図である。
【図６】EGFPを発現するHela細胞の蛍光画像を示す図である。
【図７】Hela細胞の細胞分裂の開始時間とEGFPの蛍光が始めて観察された時間との関係を示す図である。
【図８】Hela細胞の細胞分裂からEGFP発光(発現)までの時間の分布を示す図である。
【図１】
2009072155.tif 000005
【図２】
2009072155.tif 000006
【図３】
2009072155.tif 000007
【図４】
2009072155.tif 000008
【図５】
2009072155.tif 000009
【図６】
2009072155.tif 000010
【図７】
2009072155.tif 000011
【図８】
2009072155.tif 000012
【配列表】
2009072155000001.app