(57)【要約】【課題】SMG-1と結合し、その活性を制御する新たなタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド、並びにこの新たなタンパク質の作用又はその発現を阻害する阻害剤のmRNAサーベイランス機構の抑制剤としての用途を提供すること。【解決手段】SMG-1と結合し、その活性を制御する新たなタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドを同定することに成功した。さらに、該タンパク質の遺伝子の発現を阻害することによりmRNAサーベイランス機構が抑制されることを見出し、このタンパク質の阻害剤又は上記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を含む、mRNAサーベイランス機構の抑制剤を提供した。【選択図】図４
2009011272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1)  配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(2)  上記(1)記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、SMG-1と結合し、SMG-1の酵素活性を阻害する活性を有するポリペプチド、又は
(3)  上記(1)若しくは(2)のポリペプチドのアミノ酸配列から成る領域を含むアミノ酸配列を有し、SMG-1と結合し、SMG-1の酵素活性を阻害する活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
上記(1)のポリペプチドである請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２記載のポリペプチドと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項５】
請求項２記載のポリペプチドの阻害剤又は該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現阻害剤を含む、mRNAサーベイランス機構の抑制剤。
【請求項６】
前記ポリペプチドの阻害剤が、該ポリペプチドと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片である請求項５記載の抑制剤。
【請求項７】
請求項２記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現阻害剤を含む、請求項５記載の抑制剤。
【請求項８】
配列番号１記載の塩基配列中の1nt〜2258ntの領域内に標的配列を有する、配列番号１記載の塩基配列を有するmRNAを特異的に切断する二本鎖RNA又は宿主細胞中で該二本鎖RNAを発現する組換えベクターを含む請求項７記載の抑制剤。
【請求項９】
前記二本鎖RNAが、siRNAである請求項８記載の抑制剤。
【請求項１０】
配列番号１記載の塩基配列中の256nt〜1815ntの領域内に標的配列を有する、請求項８又は９記載の抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、mRNAサーベイランス機構に関与する新規なタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド、並びに該タンパク質又はその遺伝子発現を阻害する阻害剤から成るmRNAサーベイランス機構の抑制剤に関する。mRNAサーベイランス機構の抑制剤は、mRNAサーベイランス機構を抑制することができるので、mRNAサーベイランス機構が原因で起きる遺伝病や、癌等の治療及び／又は予防剤として有用である。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の変異による表現型の異常の1/3程度は、遺伝子の塩基配列の置換、組換え及び／又は欠失などの変異により、結果的にタンパク質のコード領域にナンセンスコドンが出現してしまう形の異常であると言われている。このような遺伝子に由来するｍＲＮＡは、翻訳早期終止コドン(premature translation termination codon;PTC)に由来する途中で終わった異常なタンパク質をコードするが、通常、そのようなmRNAは検出されない。これは、異常な位置にナンセンスコドン(PTC)を有するmRNAを識別し、排除する機構を細胞が備えていることに起因する。この機構は、ナンセンスコドンに起因するmRNA分解機構、すなわち、ナンセンスコドン依存的ｍＲＮＡ分解(nonsense-mediated mRNA decay;NMD)、あるいは、mRNAサーベイランス機構と呼ばれ、ヒトの遺伝性疾患やがんなど、遺伝子異常に起因する疾患の症状に大きく反映していることが予想されている（非特許文献１）。
【０００３】
本願発明者らは、先に、mRNAサーベイランス機構に必要な、フォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼファミリーの１つの酵素であるSMG-1を同定し、そのアミノ酸配列及びそのcDNAの塩基配列を明らかにし、その酵素活性が異常終止コドン認識に必須であることを証明した（特許文献１、非特許文献２）。さらに、SMG-1遺伝子の発現を阻害するsiRNAを開発し、SMG-1の発現抑制によるmRNAサーベイランス機構の阻害を実証した（特許文献２、非特許文献３）。さらに、SMG-1のsiRNAによる阻害によりHeLa細胞の増殖を阻害できること、及び、一方で、SMG-1 siRNAは正常繊維芽細胞の増殖はほとんど阻害しないことを明らかにした（非特許文献４）。さらに、SMG-1のの酵素活性を試験管内、細胞内で測定するための、リン酸化基質特異モノクローナル抗体を作出した（非特許文献５）。また、SMG-1と結合し、その活性を制御するタンパク質SMG-8を同定した（特許文献３）。
【０００４】
【特許文献１】特開2003-38189号公報
【特許文献２】特開2005-21094号公報
【特許文献３】特開2004-97029号公報
【非特許文献１】Trends in Genetics, (UK), 1999, Vol.15, p.74-80
【非特許文献２】Yamashita A, Ohnishi T, Kashima I, Taya Y, Ohno S.  Human SMG-1, a novel phosphatidylinositol 3-kinase-related protein kinase, associates with components of the mRNA surveillance complex and is involved in the regulation of nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev. 15(17):2215-2228. 2001.
【非特許文献３】Kashima I, Yamashita A, Izumi N, Kataoka N, Morishita R, Hoshino S, Ohno M, Dreyfuss G, Ohno S. Binding of a novel SMG-1-Upf1-eRF1-eRF3 complex (SURF) to the exon junction complex triggers Upf1 phosphorylation and nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev. 20(3):355-367. 2006.
【非特許文献４】Usuki F, Yamashita A, Kashima I, Higuchi I, Osame M, Ohno S. Specific inhibition of nonsense-mediated mRNA decay components, SMG-1 or Upf1, rescues the phenotype of Ullrich disease fibroblasts.Mol Ther. 14(3):351-260. 2006.
【非特許文献５】Ohnishi T, Yamashita A, Kashima I, Schell T, Anders KR, Grimson A, Hachiya T, Hentze MW, Anderson P, Ohno S. Phosphorylation of hUPF1 induces formation of mRNA surveillance complexes containing hSMG-5 and hSMG-7. Mol Cell. 12(5):1187-1200. 2003.
【非特許文献６】Morita T, Yamashita A, Kashima I, Ogata K, Ishiura S, Ohno S. Distant N- and C-terminal domains are required for intrinsic kinase activity of SMG-1, a critical component of nonsense-mediated mRNA decay.  J Biol Chem. 282(11):7799-7808. 2007.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、SMG-1と結合し、その活性を制御する新たなタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド、並びにこの新たなタンパク質の作用又はその発現を阻害する阻害剤のmRNAサーベイランス機構の抑制剤としての用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、SMG-1と結合し、その活性を制御する新たなタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドを同定することに成功し、さらに、該タンパク質の遺伝子の発現を阻害することによりmRNAサーベイランス機構が抑制されることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、
(1)  配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(2)  上記(1)記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、SMG-1と結合し、SMG-1の酵素活性を阻害する活性を有するポリペプチド、又は
(3)  上記(1)若しくは(2)のポリペプチドのアミノ酸配列から成る領域を含むアミノ酸配列を有し、SMG-1と結合し、SMG-1の酵素活性を阻害する活性を有するポリペプチド
を提供する。
【０００８】
また、本発明は、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに本発明は、上記本発明の(1)のポリペプチドと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を提供する。さらに本発明は、上記本発明の(1)のタンパク質の阻害剤又は上記本発明のポリヌクレオチドの発現阻害剤を含む、mRNAサーベイランス機構の抑制剤を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、mRNAサーベイランス機構を制御するSMG-1と結合し、その酵素活性を阻害する新規なタンパク質であるSMG-9及びそれをコードするポリヌクレオチドが初めて提供された。さらに、下記実施例に具体的に記載するように、SMG-9のmRNAを切断するsiRNAを用いてSMG-9遺伝子の発現を阻害すると、ナンセンスmRNAの分解速度が低下する、すなわち、mRNAサーベイランス機構が抑制されることから、SMG-9の阻害剤又はその遺伝子の発現阻害剤は、mRNAサーベイランス機構を抑制することができる。mRNAサーベイランス機構機構が抑制されると、mRNAサーベイランス機構に起因することがわかっているある種の遺伝病や癌の治療や予防が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
下記実施例に具体的に記載するように、細胞からSMG-1を抽出し、SMG-1及びSMG-1に結合している蛋白質を蛋白質電気泳動により分離後、蛋白質染色を行い、SMG-1と共精製された蛋白質について、質量分析によりペプチド配列情報を得た。データベース検索により、得られたペプチド配列と一致するアミノ酸配列を持つ遺伝子としてSMG-9が同定された。さらに、SMG-9に対するsiRNAを用いてSMG-9の発現を抑制することにより、SMG-9の性質が明らかになった。下記実施例において具体的に記載されるように、SMG-9はSMG-1と結合し、その酵素活性を阻害する。
【００１１】
同定されたヒトSMG-9のcDNAの塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示し、このアミノ酸配列のみを取り出したものを配列番号２に示す。なお、SMG-9は、ゲノムプロジェクト、cDNAプロジェクトによりすでにその塩基配列及びアミノ酸配列が公共データベースに機能未知遺伝子として登録されている。しかしながら、SMG-9タンパク質は、これまで実際に取得されたことがなく、その機能も全くわかっていない。本発明により、SMG-9タンパク質が実際に取得され、その機能も明らかにされた。従って、SMG-9タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドは、実質的に本発明により初めて提供されたものと言える。
【００１２】
一般に、生理活性を有するポリペプチドは、該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、少数のアミノ酸が置換し、欠失し及び／又は挿入された場合であっても、その生理活性を維持する場合があることは当業者によって広く認められているところである。従って、本発明においても、
(1)  配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと同様、
(2)  配列番号２に記載のアミノ酸配列に対し９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、SMG-1と結合し、SMG-1の酵素活性を阻害する活性を有するポリペプチド
も本発明の範囲に含まれる。ここで、アミノ酸配列の「相同性」とは、両者のアミノ酸配列残基ができるだけ多く一致するように（必要ならばギャップを挿入する）両アミノ酸配列を整列させ、一致するアミノ酸残基を、全アミノ酸残基数（両者の配列で全アミノ酸残基数が異なる場合には長い方の配列の全アミノ酸残基数）で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトにより容易に算出することができる。なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys）、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、配列番号２のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、SMG-1と結合し、SMG-1の酵素活性を阻害する活性を維持できる可能性が高くなる。上記(2)のポリペプチドとしては、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１ないし数個（９個以下）のアミノ酸残基が置換され、欠失され、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有するものが好ましい。なお、本願明細書及び特許請求の範囲において、アミノ酸配列又は塩基配列を「有する」とは、アミノ酸又は塩基がそのような順序で並んでいるという意味である。従って、例えば、「配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する」とは、そのポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列に示される順序で並んだ520個のアミノ酸から成るという意味である。また、「ポリペプチド」は、複数のアミノ酸がペプチド結合により結合したものであり、タンパク質はポリペプチドに包含される。
【００１３】
さらに、生理活性を有するポリペプチドの一端又は両端に他のポリペプチドが結合された場合（例えば融合タンパク質のような場合）でも、その生理活性が維持されることが多いことも広く知られている。従って、上記した(1)又は (2)のポリペプチドのアミノ酸配列から成る領域を含むアミノ酸配列を有し、SMG-1と結合し、SMG-1の酵素活性を阻害する活性を有するポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
なお、あるポリペプチドがSMG-1と結合するか否かは、下記実施例に具体的に記載するように、SMG-1と抗SMG-1抗体との免疫沈降物中にSMG-9が存在するか否かを調べることにより判定することができ、免疫沈降物中にSMG-9が存在するか否かは、抗SMG-9抗体を用いた免疫染色により調べることができる。また、あるポリペプチドがSMG-1の活性を阻害するか否かは、下記実施例に具体的に記載するように、該ポリペプチドの共存下におけるSMG-1による基質のリン酸化を指標とし、該ポリペプチドの量を減少させた場合にSMG-1による基質のリン酸化が促進するか否かに基づき判定することができる。
【００１５】
本発明は、上記した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをも提供する。ポリヌクレオチドはDNAでもRNAでもよく、ポリペプチドをコードできる人工核酸でもよい。上記の通り、上記(1)のポリペプチドをコードするcDNAの配列が配列番号１に示されている。
【００１６】
本発明のポリヌクレオチドは、その塩基配列が明らかになっており、上記(1)のポリペプチドをコードするcDNAのクローンが市販されているので、例えば、それを鋳型としたPCRによりcDNAを増幅することにより容易に調製することができる。また、本発明のポリペプチドは、該cDNAを市販の発現ベクターのマルチクローニング部位に挿入して組換えベクターを得、該ベクターを宿主細胞に導入して上記cDNAを発現させる、遺伝子工学的手法により容易に生産することができる。
【００１７】
下記実施例に具体的に記載するとおり、SMG-9遺伝子の発現を阻害すると、mRNAサーベイランス機構が抑制される。一方、ポリペプチドに対する抗体は常法により作製することができ、この抗体をポリペプチドに作用させることによりその生理活性を阻害することが可能なことも周知である。例えば、SMG-1のリン酸化基質に対するモノクローナル抗体及びその作製方法が非特許文献５に記載されている。特に、下記実施例で作出したようなポリクローナル抗体には、ポリペプチドの全露出エピトープに対する抗体が含まれるので、ほぼ確実にポリペプチドの生理活性を阻害することができる。従って、本発明のポリペプチドは、少なくとも本発明のポリペプチドの活性を阻害する抗体を作出するための免疫原としての用途を有する。また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを遺伝子工学的手法により生産するために有用である。
【００１８】
本発明はまた、上記本発明の(1)のポリペプチド、すなわち、SMG-9と抗原抗体反応する抗体及びその抗原結合性断片を提供する。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。抗原結合性断片は、抗体のFabやF(ab')2断片等のように、対応抗原と抗原抗体反応可能な断片である。これらの抗原結合性断片は、周知の通り、抗体をパパインやペプシンのようなタンパク質分解酵素で処理することにより得られる。また、遺伝子工学的に生産した抗体やその抗原結合性断片も本発明の範囲に包含される。
【００１９】
本発明の抗体は、SMG-9又はその部分断片を免疫原として用いる周知の方法により作製することができる。すなわち、SMG-9又はその部分断片を、例えばフロイントのアジュバントのようなアジュバントと共に動物に免疫する。部分断片の場合、サイズは８アミノ酸以上は必要であり、好ましくは２０アミノ酸以上である。部分断片の場合は、免疫原性を高めるために、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、カゼイン、ウシ血清アルブミン(BSA)等のキャリアタンパク質に結合したものや、下記実施例に記載するように、他のタンパク質との融合タンパク質を用いることもできる。ポリクローナル抗体は、免疫後（免疫は好ましくは２回以上行なう）、動物から抗血清を回収し、周知のアフィニティ精製等により免疫グロブリンを回収することにより得ることができる。抗血清をそのまま用いることも可能である。上記のように、ポリクローナル抗体には、SMG-9の全露出エピトープに対する抗体が含まれるので、ほぼ確実にSMG-9の生理活性を阻害することができる。一方、モノクローナル抗体は、常法であるKohlerとMilsteinの方法により作製することができる。免疫後の動物から脾細胞やリンパ球のような抗体細胞を回収し、マウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマとし、HAT培地で培養してハイブリドーマのみを選択し、得られたハイブリドーマのうち、SMG-9と結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることにより、SMG-9と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。このハイブリドーマの培養上清や、これを腹腔内に移植した動物の腹水中から本発明のモノクローナル抗体を回収することができる。SMG-9の生理活性を阻害するモノクローナル抗体は、上記スクリーニングにおいて、単にSMG-9と結合するのみならず、SMG-9と結合することによりSMG-9の生理活性、すなわち、SMG-1と結合し、SMG-1の酵素活性を阻害するモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより得ることができる。
【００２０】
本発明の抗体は、免疫染色や免疫測定によるSMG-9の検出又は定量用試薬としての用途を有する。また、本発明の抗体のうち、ポリクローナル抗体や、SMG-9の生理活性を阻害するモノクローナル抗体は、SMG-9の阻害剤として用いることができ、後述のように、mRNAサーベイランス機構の抑制剤として用いることができる。
【００２１】
上記の通り、また、下記実施例に具体的に記載するとおり、SMG-9遺伝子の発現を阻害すると、mRNAサーベイランス機構が抑制される。従って、SMG-9の阻害剤又はSMG-9をコードする遺伝子の発現を阻害する阻害剤は、mRNAサーベイランス機構の抑制剤としての用途を有する。
【００２２】
SMG-9の阻害剤は、SMG-9の生理活性（すなわち、SMG-1に結合し、SMG-1の酵素活性を阻害する活性）を阻害する物質であり、好ましい例として、SMG-9に対する抗体を挙げることができる。SMG-9に対する抗体は上記したとおりである。上記の通り、本発明のポリクローナル抗体は、SMG-9の阻害剤として機能する。また、本発明のモノクローナル抗体のうち、SMG-9の生理活性を阻害するモノクローナル抗体もSMG-9の阻害剤として機能する。
【００２３】
SMG-9をコードする遺伝子の発現を阻害する阻害剤としては、SMG-9をコードするmRNAを標的とするiRNA、好ましくはsiRNAを挙げることができる。iRNAは、標的となるmRNAと相補的な鎖を含む二本鎖RNAであり、標的となるmRNAと結合してこれを切断するものである。siRNAは、サイズが21〜23塩基程度の短い(small)iRNAである。siRNAは、サイズが小さいので合成が容易で、それによるmRNAの切断部位を設定し易いので好ましい。siRNAによる遺伝子発現の抑制技術は、既に周知であり、mRNAの配列（cDNA配列）さえ提示すれば、それを標的とするsiRNAを設計し、そのsiRNAを発現ベクターに組み込んだ組換えベクターを作製するサービスを行なっている業者が多数存在するほどである。従って、cDNAの配列は配列番号１に記載したとおりであるので、それに対するsiRNAは当業者であれば容易に設定することができる。簡単に説明すると、siRNAは標的とするmRNAと相補的な鎖を含む二本鎖RNAで、そのサイズは通常、21〜23塩基であり、通常、二本鎖RNAの両端にそれぞれハングオーバーを有する。ハングオーバーのサイズは、それぞれ１塩基〜２塩基であり、ハングオーバー部分はデオキシヌクレオチドでもよい。また、mRNAとの相補性は、完全な相補性が好ましいが、１〜２塩基程度のミスマッチがあっても十分な切断作用を発揮する場合も多い。また、ハングオーバー部分は相補的でなくてもよい。siRNAは、mRNAの塩基配列中のaaに続く19〜21塩基として設定することが好ましい場合が多く、gc含量が50%前後（通常45〜55%程度）のものが好ましい。また、成熟タンパク質で切断される部分に設定されないように、5'末端から50塩基以上離れた部位に設定することが多い。
【００２４】
SMG-9をコードするmRNAを標的とするsiRNAは、配列番号１記載の塩基配列中の1nt〜2258ntの領域内に標的配列を有する、配列番号１記載の塩基配列を有する。配列番号１記載の塩基配列中、2258ntよりも下流の領域はポリＡテールであり、この部分を標的配列とするものは使用できない。また、「領域内に標的配列を有する」とは、その領域内にsiRNAの二本鎖部分のうちの１本鎖と同一又はmRNAを切断可能な程度に相同な配列が存在するという意味である。mRNAの非翻訳領域は、遺伝子間で配列の違いが大きくないことがあるので、より特異的にSMG-9をコードするmRNAを切断するためには、標的配列が配列番号１中のコード領域内、すなわち、256nt〜1815ntの領域内に存在することが好ましい。下記実施例で実際に用いたsiRNAの塩基配列を配列番号３及び配列番号４に示す。これらのsiRNAは、配列番号１で示される塩基配列のそれぞれ1157nt〜1175nt及び861nt〜879ntに相補的な鎖を含み、両者とも両端にそれぞれdt（デオキシチミジル酸）から成る２塩基ずつのハングオーバーを有するものである。
【００２５】
siRNAはそのまま投与することもできるが、該siRNAを発現するDNAを哺乳動物細胞用の発現ベクターに組み込み、得られた組換えベクターを投与することにより、細胞内でsiRNAを生産させSMG-9の遺伝子発現を抑制してもよい。哺乳動物細胞用の発現ベクターは種々市販されており、それらのマルチクローニング部位に上記DNAを挿入することができる。なお、上記の通り、siRNAを発現するDNAを組み込んだ発現ベクターを作製する業者のサービスも利用できる。
【００２６】
mRNAサーベイランス機構の抑制剤は、mRNAサーベイランス機構の存在に起因する疾患の治療及び／又は予防剤として用いることができる。このような疾病としては、例えば特許文献２に記載されている通り、遺伝性疾患であるウルリッヒ病やデセンヌ型筋ジストロフィー症や、体細胞変異によって生じる癌等を挙げることができる。特に、SMG-1のsiRNAによってSMG-1遺伝子の発現を阻害してmRNAサーベイランス機構を抑制することにより、癌細胞株であるHeLa細胞の増殖が抑制され、正常繊維芽細胞の増殖はほとんど阻害されないこと（非特許文献４）から、mRNAサーベイランス機構の抑制が、癌細胞の増殖抑制に有効であると考えられ、従って、本発明の抑制剤は、制癌剤として機能すると考えられる。
【００２７】
なお、本発明のmRNAサーベイランス機構の抑制剤をmRNAサーベイランス機構の存在に起因する疾患の治療及び／又は予防剤、すなわち、医薬として用いる場合、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、経直腸、癌組織内への直接注射等の非経口投与や経口投与を採用することができるが非経口投与が好ましい。
【００２８】
投与量は、疾患の種類や程度、患者の状態や体重等に応じて適宜選択されるが、例えば、固形癌の治療に用いる場合、抑制剤が抗体の場合には、その投与量は、成人１日当たり通常、1mg/体表面積〜1000mg/体表面積程度、特に10mg/体表面積〜500mg/体表面積程度であり、抑制剤がsiRNAの場合、その投与量は、成人(体重60kg)１日当たり通常、0.01mg/kg〜10mg/kg程度、特に0.1mg/kg〜5mg/kg程度、siRNAを発現する組換えベクターの場合、治療全体を通して成人１日当たり0.01mg/kg〜10mg/kg程度、特に0.1mg/kg〜5mg/kg程度であるが、投与量はもちろんこれらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明のmRNAサーベイランス機構の抑制剤を医薬として用いる場合には、常法に従い、通常用いられている医薬の形態に製剤することができる。例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。特に、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。また、本発明の医薬は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００３０】
また、本発明のmRNAサーベイランス機構の抑制剤は、遺伝子変異のスクリーニング系に用いることもできる。すなわち、mRNAサーベイランス機構の阻害により、変異遺伝子由来のmRNA(通常mRNAサーベイランス機構で分解される)を増加させることにより、正常な状態ではmRNAサーベイランス機構により分解されてしまうために検出できない変異遺伝子まで検出することができる。変異全体の約1/3を占める異常終止コドンの生じる遺伝子変異の検出についてこの技術が利用することができる。
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
１．  SMG-9の同定と調製
(1)  ヒトHeLa-TetOff細胞から、SMG-1を回収した。これは1 x 108個の細胞由来の細胞溶解液から25μgのSMG-1ポリクローナル抗体を用いてSMG-1を免疫沈降法により回収することにより行なった。得られたSMG-1及びSMG-1と結合しているタンパク質をSDS-PAGEにかけ、泳動バンドをPVDF膜に転写した。PVDF膜を金コロイド染色し、染色された蛋白質を膜ごと切り出し、質量分析によりアミノ酸配列情報を取得した。データベース検索により、得られたペプチド配列と一致するアミノ酸配列を持つ遺伝子としてSMG-9を同定した。同定されたSMG-9の遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を配列番号１に示し、アミノ酸配列のみを取り出して配列番号２に示す。
【００３３】
(2)   (1)によって同定された蛋白質情報を基に、I.M.A.G.E Consortiumのヒト全長cDNAクローンを検索し、SMG-9に該当するクローン (IMAGE:4131601)をOpen Biosystems社(日本代理店：フナコシ)から購入した。購入したクローンをテンプレートに、PCRで蛋白質コード領域を増幅したものを発現ベクター（pSR- HA、非特許文献２，非特許文献３）に導入した。PCRに用いたフォワード側プライマーの塩基配列は、tctgagtctggacacagtcagcctgであり、リバース側プライマーの塩基配列はtcaggccagcaggcggctgtacであった。得られた組換えベクターを、ヒトHeLa Tet-off細胞（clontech社製）に導入し、発現させてSMG-9を生産させ、該細胞から常法(非特許文献２,非特許文献３)によりSMG-9を精製した。
【００３４】
２．  SMG-9の性質
(1)  SMG-9はSMG-1と結合する
HeLa-TetOff細胞（Clontech社）の溶解液から２種類の抗SMG-1ポリクローナル抗体(#1、#2)を用いてSMG-1を免疫沈降した。抗SMG-1#1, 抗SMG-1#2抗体はそれぞれ、SMG-1の3076a.a.から3542a.a.、864a.a.から1054a.a.（「a.a.」は、アミノ酸配列のＮ末端から数えて何番目のアミノ酸であるかを示し、従って、「3076a.a.」はＮ末端から数えて3076番目のアミノ酸配列を示す）に対する抗体であり、すでに公知の物を使用した(非特許文献３)。1 x 107個のHeLa TetOff細胞を細胞溶解液F(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.25 M ショ糖, 1mM DTT, 1% Triton X-100（商品名）, 0.5% Nonidet P-40（商品名）, 150 mM NaCl, 100 μg/mL RNaseA, phosphatase inhibitor cocktail (Sigma), protease inhibitor cocktail (Roche) を含む)に溶解し、コントロールIgG(正常ウサギIgG), 抗SMG-1抗体#1, 抗SMG-1抗体#2を用いて定法(非特許文献２、３)により免疫沈降を行った。免疫沈降物及び免疫沈降前の細胞溶解液をウェスタンブロット法にかけた。ウェスタンブロット法は、抗SMG-1ポリクローナル抗体(#1、#2)、抗SMG-9ポリクローナル抗体、抗PABP(polyA binding protein) モノクローナル抗体(clone 10E10, SIGMA)を用い、蛋白質の検出は、ECL (Amersham)を用いてマニュアルに従い行った。なお、ウェスタンブロット法に用いた抗SMG-9ポリクローナル抗体は、配列番号２に示すアミノ酸配列の21a.a.から75a.a.をコードする領域とGST(グルタチオンＳトランスフェラーゼ）融合タンパク質をウサギに免疫して得た抗血清をアフィニティー精製することにより作製した。
【００３５】
結果を図１に示す。図１に示される通り、いずれの抗SMG-1ポリクローナル抗体を用いた場合にも、SMG-1免疫沈降物中にSMG-9の共沈降が確認された。一方で、mRNA結合蛋白質PABPの共沈降は検出されなかった。このことから、SMG-9はSMG-1と結合することが確認された。
【００３６】
(2)   SMG-9はSMG-1の酵素活性を阻害する
SMG-9がSMG-1の酵素活性を制御する可能性を検討するため、SMG-9を発現抑制したHeLa TetOff細胞由来SMG-1と、通常のHeLa TetOff細胞由来SMG-1の酵素活性を比較した。SMG-9の発現抑制はSMG-9に対するsiRNAを細胞に導入することにより行った。具体的には、配列番号１の1157nt〜1175ntに設定したsiRNA（SMG-9#1、図２）を、RNAifect (商品名、Qiagen社製)を用いて細胞に導入した。導入は、RNAifect (商品名）のマニュアル通りに行なった。コントロールとしては、SMG-9とは全く無関係なsiRNA(NS)（配列番号５、Qiagen社製）を細胞に導入した。
【００３７】
定法(非特許文献２、非特許文献５、非特許文献６)に従いSMG-1の酵素活性を測定した。概略すると、細胞を細胞溶解液Fに溶解し、上記SMG-1抗体で免疫沈降後、酵素活性測定緩衝液 (10 mM Hepes-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl, 10% (w/v)グリセロール, 10 mM MnCl2, 50 mM β-グリセロフォスフェート, 1 mM DTT, 100nMオカダ酸(商品名、sigma社製), protease inhibitor cocktail (Sigma) )中で、GST-Upf1-S1096 ペプチド(（GSTにUpf1のSer1096を含むペプチドを融合したタンパク質、非特許文献２、非特許文献６）を基質として、30℃で５分または１５分間酵素反応を行った。反応後、SDS-PAGEにより蛋白質を展開し、GST-Upf1-S1096に取り込まれた[γ-32P] ATPのシグナルを検出することでSMG-1の酵素活性を測定した。
【００３８】
結果を図３に示す。図３に示されるように、SMG-9を発現抑制した細胞由来SMG-1は通常の細胞由来SMG-1に比べ高い酵素活性を示した。この結果は、SMG-9がSMG-1の酵素活性を阻害する蛋白質であることを示すものである。
【００３９】
(3)   SMG-9はナンセンスmRNAの分解を制御する
SMG-9がmRNAサーベイランス制御に関わる可能性を検討するため、SMG-9発現抑制下における異常終止コドンを有するβ-globin mRNAの分解速度を解析した。具体的には、テトラサイクリン応答配列（TRE）によりβ-globinの発現を制御するプラスミド（β-globin遺伝子レポータープラスミド(異常終止コドン（PTC)あり、もしくは無し) pTRE（商品名、clontech社製）から調製、特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献５）と、SMG-9に対するsiRNA（配列番号１の1157nt〜1175ntに設定したsiRNA（SMG-9#1、図２、配列番号３）及び配列番号１の861nt〜879ntに設定したsiRNA（SMG-9#1、図２、配列番号３）もしくはコントロールsiRNA（NS、配列番号５、Qiagen社製）をHeLa TetOff細胞に導入した。48時間後に50μg/mlのドキシサイクリンによりTRE由来の転写を停止後、経時的にRNAを回収し、ノーザンブロット法によりbeta-globin mRNA量を観察した。より具体的には、1.8 x 106個のHeLa TetOff細胞に、RNAifect（商品名、Qiagen社製）を用いて上記siRNAを、Polyfect（商品名、Qiagen社製）を用いてβ-globin遺伝子発現プラスミド(特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献５）を導入し、定法に従って全RNAを回収し、ノーザンブロット解析を行った(非特許文献２、非特許文献３、非特許文献５）。
【００４０】
結果を図４に示す。図４中、グラフ左は３回の実験、右は２回の実験結果の平均値により作成した。図４に示されるように、SMG-9の発現抑制により、異常終止コドンを有するβ-globin mRNAの分解速度が低下し、通常約120分であった半減期が約180分と長くなった。一方で、SMG-9の発現抑制は正常なβ-globin mRNAの分解速度には影響を与えなかった。この結果は、SMG-9がmRNAサーベイランス制御に関わることを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】抗SMG-1抗体を用いたSMG-1の免疫沈降物のウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例で用いた、SMG-9に対する２種類のsiRNAの構造を示す図である。
【図３】図３の左の図は、HeLa-TetOff細胞にSMG-9に対するsiRNAもしくは コントロールsiRNA (NS)をそれぞれ導入し、細胞内在性SMG-1を免疫沈降し、免疫沈降したSMG-1による基質GST-Upf1-S1096のリン酸化を、GST-Upf1-S1096に取り込まれた[γ-32P] ATPのシグナルを検出した結果を示す図であり、右側の図は、測定結果を、横軸に反応時間（分）、縦軸に基質リン酸化レベルをとって表わしたグラフである。
【図４】HeLa-TetOff細胞にβ-globin遺伝子レポータープラスミド(異常終止コドン（PTC)あり、もしくは無し)および2種類のSMG-9に対するsiRNAまたはコントロール siRNA（NS)を導入し、48時間後にβ-globin mRNAの転写を抑制し、mRNAの分解速度をノーザンブロットにより解析した結果を示す図である。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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