(57)【要約】【課題】従来からある交配・栽培・選抜を繰り返す方法よりも少ない労力・時間で良登熟性の極穂重型イネを選抜する方法及びそれに使用するキットを提供する。【解決手段】この発明の極穂重型イネを選別する方法は、イネからDNAを抽出する抽出工程と、OsAGPS2遺伝子の翻訳開始点直前に位置する２個のシトシンの欠失を検出する検出工程とを含む方法である。また、この発明のキットは、PCR法を利用してこの発明の方法を実施するためのものであり、特定の塩基配列を有するプライマーセットを含んでいる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネからDNAを抽出する抽出工程と、OsAGPS2遺伝子の翻訳開始点直前に位置する２個のシトシンの欠失を検出する検出工程と、を含む良登熟性の極穂重型イネを選別する方法。
【請求項２】
ポリメラーゼ連鎖反応によりシトシンの欠失を検出する請求項１に記載の極穂重型イネを選別する方法。
【請求項３】
配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第１のプライマーセットを利用してポリメラーゼ連鎖反応を行う請求項２に記載の極穂重型イネを選別する方法。
【請求項４】
配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーと、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第２のプライマーセットを利用してポリメラーゼ連鎖反応を行う請求項２に記載の極穂重型イネを選別する方法。
【請求項５】
ポリメラーゼ連鎖反応により極穂重型イネを選別するためのキットであって、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第１のプライマーセットを含むキット。
【請求項６】
ポリメラーゼ連鎖反応により極穂重型イネを選別するためのキットであって、配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーと、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第２のプライマーセットを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、極穂重型イネを選別する方法などに関するものであり、特に良登熟性の極穂重型イネを選別する方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
イネの多収性育種を行なう主な戦略として、イネの穂一つ当たりの穎花数を増加させる戦略が採用されており、既にハイブリッドライスやNew Plant Typeなどと呼ばれる極穂重型イネが育種されている（非特許文献１を参照。）。
【０００３】
ただ、このような品種は、穎花数こそ増加しているものの、主に２次枝梗穎花数が増加しているため、穂全体の登熟性（籾に含まれる澱粉の量）が低く、必ずしも収量の増加にはつながっていなかった（非特許文献１、２を参照。）。そこで、収量を増加するためには低登熟性の改善が望まれている。
【０００４】
低登熟性の原因としては種々考えられているが、その主要なものとして、開花後の発育胚乳組織の同化産物吸収能力の低下、具体的には、光合成により作られたショ糖を澱粉に代謝する能力の低下が挙げられている。そして、この同化吸収能力は、発育胚中でショ糖から澱粉への代謝に関与する酵素、特にADPグルコースピロホスホリラーゼ（以下、AGPaseと省略する。）の活性と深い関連性があると考えられている（特許文献１を参照。）。
【０００５】
AGPaseは、澱粉合成の基質であるADPグルコースをグルコース-1-リン酸から生産し、大きさの異なる２つのサブユニットをそれぞれ２つずつ含む四量体の酵素であり、発育胚乳中のAGPaseの活性は、小サブユニットをコードするOsAGPS2遺伝子と、大サブユニットをコードするOsAGPL2によって制御されている（非特許文献３、４を参照。）と考えられている。
【０００６】
一方、良登熟性を有するイネの育種は、従来、（ａ）良登熟性のイネ同士を掛け合わせて厖大な数の系統を作ってその籾を収穫し、（ｂ）系統ごとに収穫した籾を塩水などの一定の比重に調整した液に浸けて、液に沈んだ籾の割合を計算し、（ｃ）沈んだ籾の割合の大きい系統を選抜する、ことを何度も繰り返すことによって行ってきた。
【０００７】
しかし、この交配・栽培・選抜による育種には、広大な圃場や多大な人力、相当の年月が必要であり、良登熟性イネの育種は容易ではなかった。また、イネの登熟性はイネの遺伝型によってのみ制御されるのではなく、非遺伝的な環境因子、例えば日照時間や栽培場所などの影響を受けるため、良登熟個体の選抜は容易ではなかった。
【特許文献１】特表２００５−５１７４３４号公報
【非特許文献１】Peng, S., K. G. Cassman, S. S. Virmani, J. Sheehy and G. S. Khush (1999) Yield potential trends of tropical rice since the release of IR8 and the challenge of increasing rice yield potential. Crop Sci. 39:1552-1559.
【非特許文献２】山本由徳・吉田徹志・榎本哲也・吉川義一 (1991)  日印交雑稲および半矮性インド型稲の籾数生産能率と登熟特性．日作紀 60:365-372.
【非特許文献３】Emes, M. J., C. G. Bowsher, C. Hedley, M. M. Burrell, E. S. F. Scrase-Field and I. J. Tetlow (2003) Starch synthesis and carbon partitioning in developing endosperm. Jour. Exp. Bot. 54: 569-575.
【非特許文献４】Ohdan, T., P. G. Francisco, Jr, T. Sawada, T. Hirose, T. Terao, H. Satoh and Y. Nakamura (2005) Expression profiling of genes involved in starch synthesis in sink and source organs of rice. J. Exp. Bot. 56: 3229-3244.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、この発明は、従来からある交配・栽培・選抜を繰り返す方法よりもよりも少ない労力・時間で良登熟性の極穂重型イネを選抜する方法及びそれに使用するキットを提供すること、を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、AGPaseを構成する２つのサブユニットをコードする遺伝子、すなわちOsAGPS2遺伝子とOsAGPL2遺伝子と、イネの登熟性との関連性について鋭意検討したところ、OsAGPS2遺伝子の翻訳開始点直前に位置する２個のシトシンの欠失がAGPaseの活性及びイネの登熟性と関係あることに気がついた。
【００１０】
すなわち、この発明の請求項１にかかる方法は、イネからDNAを抽出する抽出工程と、  OsAGPS2遺伝子の翻訳開始点直前に位置する２個のシトシンの欠失を検出する検出工程とを含む良登熟性の極穂重型イネを選別する方法である。
【００１１】
この発明の請求項２にかかる方法は、請求項１に記載の極穂重型イネを選別する方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応によりシトシンの欠失を検出する方法である。
【００１２】
この発明の請求項３にかかる方法は、請求項２に記載の極穂重型イネを選別する方法であって、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第１のプライマーセットとを利用してポリメラーゼ連鎖反応を行う方法である。
【００１３】
この発明の請求項４にかかる方法は、請求項２に記載の極穂重型イネを選別する方法であって、配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーと、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第２のプライマーセットとを利用してポリメラーゼ連鎖反応を行う方法である。
【００１４】
この請求項５にかかるキットは、ポリメラーゼ連鎖反応により極穂重型イネを選別するためのキットであって、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第１のプライマーセットを含むキットである。
【００１５】
この請求項６にかかるキットは、ポリメラーゼ連鎖反応により極穂重型イネを選別するためのキットであって、配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーと、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第２のプライマーセットを含むキットである。
【発明の効果】
【００１６】
この発明の方法やキットによって、イネの登熟性の良否判定を効率的に行うことができるので、良登熟性の極穂重型イネをより容易に育種できるようになった。これにより、より多くの米を安定して栽培できるようになり、世界的な人口増加による飢餓の抑制に貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
この発明は、極穂重型イネを選別する方法及びそれに使用するキットに関するものである。そこで、これらについて以下に詳説する。
【００１８】
１.極穂重型イネを選別する方法
この発明の方法による極穂重型イネの選別は、（１）イネからDNAを抽出し、（２）このDNA上にあるOsAGPS2遺伝子の翻訳開始点直前に位置する２個のシトシンが欠失しているか否かを決定することによって行う。そこで、（１）、（２）について以下に詳説する。
【００１９】
（１）DNAの抽出
イネの葉や籾などから、切断部位の少ない、すなわち充分に長いゲノムDNAを抽出する工程である。抽出方法としては、前記条件を満たせば特に限定することなく、公知の方法を使用することができる。具体的には、CTAB法や簡便法などを挙げることができる。なお、簡便法の詳細については、「吉田晋弥、塩飽邦子、“米粒からの簡易DNA抽出法とRAPDによる酒米の品種判別”、中国農業試験場 平成１０年度  研究成果情報、インターネット＜URL:http://www.affrc.go.jp/seika/data_cgk/h10/seibutu/cgk98004.html＞」に記載されている。
【００２０】
（２）シトシン欠失の検出
OsAGPS2遺伝子の翻訳開始点直前に位置する２個のシトシン欠失の検出は、塩基多型を検出できる公知の方法であれば特に限定することなく利用することができる。具体的には、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、PCR反応と省略する。）を利用する方法、塩基配列を決定する方法、LAMP法、サザンハイブリダイゼーション法等のハイブリダイゼーション法などSNPsを検出する方法等が挙げられる。
【００２１】
なかでも、精度が高く簡便であることから、PCR反応を利用する方法、すなわち、抽出したDNAの一部をPCR法によって増幅したのち電気泳動することにより塩基多型を検出する方法が好ましい。
【００２２】
PCR反応を利用する方法に使用するプライマーは、少なくともOsAGPS2遺伝子の翻訳開始点付近の塩基配列を増幅するように設計・合成されていなければならない。しかし、プライマーの長さ（塩基数）や付加的な塩基配列、プライマーへの化学修飾については用途や実験結果を見ながら自由に調整すればよい。
【００２３】
ここで、具体的なプライマーセットとして、表１に示す３つのプライマーの組み合わせである次の２つが例示できる。まず、OsAGPS2遺伝子の翻訳開始点直前の２つのシトシンが存在する場合に鋳型DNAと結合するforward側プライマー（CC-inF）と、reverse側のプライマー（CC-R）との組み合わせである第１のプライマーセットが挙げられる。つぎに、翻訳開始点直前の２つのシトシンが存在しない場合に鋳型DNAと結合するforward側プライマー（CC-deF）と、前記reverse側のプライマー（CC-R）との組み合わせである第２のプライマーセットが挙げられる。
【００２４】
【表１】
2009072142.tif 000002
【００２５】
なお、PCR反応の条件、具体的には熱変性工程、アニーリング工程、伸張工程の温度や反応時間、反応サイクル数などについては、対象となる鋳型やプライマーに応じて実験結果を見ながら調整すればよい。また、電気泳動の条件、具体的には泳動用ゲルを構成するゲル化剤の種類と濃度、緩衝液の構成、泳動電圧、泳動時間などについても、PCR産物の大きさなどに応じて実験結果を見ながら調整すればよい。
【００２６】
２．キット
PCR法に必要な各構成要素、例えば、DNAポリメラーゼ、プライマーセット、dNTP、緩衝溶液などは市販のものを別々に購入して使用してもよい。しかし、これらを組み合わせて予めキットとしておけば、各構成要素を別々に購入する手間を省き、PCR反応をより容易に行うことができる。
【実施例１】
【００２７】
以下、この発明について実施例に基づいてより詳細に説明するが、以下の実施例により、この発明の特許請求の範囲は如何なる意味においても制限されるものではない。
【００２８】
１.使用した品種
コシヒカリ、中生新千本、アケノホシ、農林22号、ヤマビコ、アキツホ、アキニシキ、あきろまん（以上、日本型）、タカナリ、密陽23号、Kinandang Puti、南京11号、Surjamkhi、IR65598-112-2、IR65564144-51、Kasalath（以上、インド型）のイネ16品種を使用した。
【００２９】
２．実験方法
（１）登熟性試験
上記の各品種を2006年の5月17日に粒状培土（くみあい粒状培土、宇部興産）中に播種・育苗し、6月13日に近畿大学生物理工学部実験水田に、各品種1列12株で5列、1株1本植え、列間30cm、株間15cmとなるように移植した。なお、基肥として移植直前にN:P:K=6:6:6g/m2を施用し、追肥によって全施肥量をN:P:K=12:10:10g/m2とした。
【００３０】
移植以降、通常栽培管理の下で栽培して出穂日を計測したのち、出穂後40〜45日目に代表的な穂を、各品種を移植したプロット（小区画）の中央に位置する列の６株から各株当り５穂採取した。
【００３１】
このうち4穂については、株ごとに穎花を穂端部側１次枝梗上穎花、穂端部側2次枝梗上穎花、穂基部側１次枝梗上穎花、穂基部側2次枝梗上穎花に分類した。なお、穂端部側と穂基部側は、1次枝梗を穂軸に沿った着生位置によって端部側1/2と基部側1/2に分類した。また、1次枝梗数が奇数の場合には端部側の方を多くした。
【００３２】
つぎに、これらの穎花の登熟性を、穂全体の穎花、1次枝梗上の穎花、2次枝梗上の穎花、穂端部側の穎花、穂基部側の穎花ごとに、比重1.00以上の穎花の割合（以下、精籾歩合と省略する。なお、単位は％である。）及び比重1.15以上の穎花の割合（以下、良登熟歩合と省略する。なお、単位は％である。）を、対応する比重の塩水によって籾を選別することにより求めた。また、各株から採取した残りの穂を用いて、穂当り穎花数を調査した。
【００３３】
（２）塩基多型の検出
前記品種の分げつ盛期の葉身を採取し、DNAをCTAB法によって抽出し、抽出したDNAのうちの8ngを鋳型にしてPCR反応を行なった。そして、得られたPCR産物を1%アガロースゲル（1×TAEバッファ）中で電気泳動した。
【００３４】
なお、PCR反応には、OsAGPS2遺伝子の翻訳開始点直前の２つのシトシンが存在する場合にDNAを増幅する前記第１のプライマーセットと、OsAGPS2遺伝子の翻訳開始点直前の２つのシトシン欠失している場合にDNAを増幅する前記第２のプライマーセット、の２つのプライマーセットを使用した。
【００３５】
また、PCR反応の反応液は、終濃度が、それぞれ1×PCR Buffer、1.6mM MgCl2、0.2mM dNTPs、0.02U rTaq DNA polymerase （Fermentas社）、0.75μM プライマーセットとなり、全量が8.0μlとなるように調整した。
【００３６】
さらに、PCR反応は、94℃で2分間のヒートスタート処理し、変性工程は94℃ 30秒間、アニーリング工程は第１のプライマーセットを使用した場合には62℃で30秒間、第２のプライマーセットを使用した場合には57℃で30秒間、伸長工程は72℃で30秒間ずつ行い、これら変性工程、アニーリング工程、伸張工程からなる反応サイクルを40サイクル繰り返したのち、72℃で10分間処理することによって行った。
【００３７】
３．実験結果
（１）塩基多型
電気泳動の結果を図１及び図２に示す。なお、図１は第１のプライマーセットを使用した場合の電気泳動写真であり、図２は第２のプライマーセットを使用した場合の電気泳動写真である。また、電気泳動写真中の各レーンは、左端がサイズマーカー(100bp DNA Ladder)であり、左からコシヒカリ、中生新千本、アケノホシ、農林22号、ヤマビコ、アキツホ、タカナリ、密陽23号、Kinandang Puti、南京11号、Surjamkhi、アキニシキ、あきろまん、IR65598-112-2、IR65564144-51、Kasalathの各品種に由来するPCR産物である。
【００３８】
これらの図から、コシヒカリ、中生新千本、アケノホシ、農林22号、ヤマビコ、アキツホ、タカナリ、Surjamkhi、アキニシキ、あきろまん、IR65598-112-2、IR65564144-51、Kasalathではシトシンが欠失の欠失が認められなかったのに対して、密陽23号、Kinandang Puti、南京11号ではシトシンの欠失が認められた。
【００３９】
したがって、日本型ではOsAGPS2遺伝子の翻訳開始点直前の２つのシトシンの欠失している品種が認められなかったのに対して、インド型ではOsAGPS2遺伝子の翻訳開始点直前の２つのシトシンが存在する品種と欠失している品種の両方が認められた。
【００４０】
（２）登熟性試験
前記16品種のうち、穂当り穎花数がほぼ200以上となった極穂重型品種は、アケノホシ、タカナリ、密陽23号、Kinandang Puti、南京11号、IR65598-112-2、であった。そこで、これら６品種の精籾歩合を表２に、良登熟歩合を表３にそれぞれ示す。
【００４１】
なお、表２、３中のWは穂全体の穎花、Pは1次枝梗上の穎花、Sは2次枝梗上の穎花、Tは穂端部側の穎花、Bは穂基部側の穎花をそれぞれ意味している。また、表中のCCin はOsAGPS2遺伝子の翻訳開始点直前の２つのシトシンが存在している品種を、CCdelは欠失している品種をそれぞれ意味している。
【００４２】
【表２】
2009072142.tif 000003
【００４３】
【表３】
2009072142.tif 000004
【００４４】
表２及び表３からは、２つのシトシンの存在するアケノホシと２つのシトシンの欠失している密陽23号、Kinandang Puti、南京11号の3品種との登熟能力に関する差異は、どの穂内穎花着生位置でも不明確であった。この原因としては、精籾歩合でも良登熟歩合でも、登熟能力が劣ると報告されているアケノホシが例年に比べて登熟が良好であったことが考えられる。
【００４５】
そこで、２つのシトシンの欠失が登熟に及ぼす影響を詳細に解析するため、6品種間の精籾歩合および良登熟歩合に関する偏差平方和を、直交比較によって２つのシトシンの欠失している3品種（CCdel）と２つのシトシンの存在する3品種（CCin）の間の差で説明できる部分と、説明できず群内変異による部分とに分割した。精籾歩合についての分割結果を表４に、良登熟歩合について分割結果を表５にそれぞれ示す。
【００４６】
【表４】
2009072142.tif 000005
【００４７】
【表５】
2009072142.tif 000006
【００４８】
精籾歩合及び良登熟歩合のいずれにおいても、２つのシトシンの欠失している3品種は２つのシトシンの存在する3品種よりも高い登熟程度を示した。しかし、表４に示すように、精籾歩合における登熟程度の差はいずれの穂内穎花着生位置でも有意なものでなく、品種間偏差平方和に占める比較による偏差平方和の割合（以下、寄与率と省略する。）も数パーセント以内に留まった。
【００４９】
これとは反対に、良登熟歩合について、１次枝梗上穎花を除く全ての穂内穎花着生位置で、２つのシトシンの欠失している品種は２つのシトシンの存在する品種よりも有意に良い登熟性を示すことが明らかとなった。また、比較による寄与率も11.6%から47.1%にまで及んだ。これらの結果から、今回使用した極穂重型品種の良登熟歩合は、OsAGPS2の翻訳開始点直前に位置する2つのシトシンの欠失によって有意な増加を示すことが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】第１のプライマーセットを使用した場合の電気泳動写真である。
【図２】第２のプライマーセットを使用した場合の電気泳動写真である。
【図１】
2009072142.tif 000007
【図２】
2009072142.tif 000008
【配列表】
2009072142000001.app