(57)【要約】【課題】  本発明は、４波混合により試料から放出された誘導パラメトリック蛍光を検出することにより蛍光染色することなく多数の試料内物質を同時に検出することが可能な空間情報検出装置を提供する。【解決手段】  レーザからの照射光を２つの光路に分流し、一方の光路上で予め設定されたポンプ光を生成し、他方の光路上で予め設定されたプローブ光を生成する。また、これらの２つの光路は合流されてポンプ光とプローブ光とが空間的・時間的に重畳される。その後、重畳されたポンプ光とプローブ光とを収束させて試料を照射し、試料から放出される光から予め設定された波長の放出光を抽出して検出器で同時に検出する。このポンプ光は、試料内物質が多光子で電子共鳴が起こるような周波数ω１，ω２，…ωｎで設定され、試料からの放出光のうち抽出されるように予め設定する波長放出光は、ポンプ光の周波数ω１，ω２，…ωｎの和とプローブ光の周波数ωｎ＋１との差周波数ωｎ＋２＝（ω１＋ω２＋…ωｎ）−ωｎ＋１に近づくように設定される。【選択図】    図３
2009150649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の目的物質が放出する光を検出することにより試料内物質の空間情報を取得する空間情報検出装置であって、
超短パルス光を照射する光源と、
該光源からの照射光を２つの光路に分流する第１分流手段と、
前記第１分流手段により分けられた２つの光路のうち一方の光路上で予め設定されたポンプ光を生成するポンプ光生成手段と、
前記分流手段により分けられた２つの光路のうち他方の光路上で予め設定されたプローブ光を生成するプローブ光生成手段と、
前記２つの光路を合流させて前記ポンプ光と前記プローブ光とを空間的に重畳させる合流手段と、
前記合流手段で重畳された前記ポンプ光と前記プローブ光とを収束させて試料を照射する試料照射手段と、
前記試料照射手段により前記ポンプ光と前記プローブ光とを照射された試料から放出される光から予め設定された波長の放出光を抽出する目的放出光抽出手段と、
前記目的光抽出手段により抽出された波長光を検出する検出器とを備え、
前記予め設定されたポンプ光は、試料内物質が多光子で電子共鳴が起こるような周波数ω１，ω２，…ωｎで設定され、前記目的放出光抽出手段により抽出される予め設定された波長の放出光は、前記ポンプ光の周波数ω１，ω２，…ωｎの和と前記予め設定されたプローブ光の周波数ωｎ＋１との差周波数ωｎ＋２＝（ω１＋ω２＋…ωｎ）−ωｎ＋１に近づくように設定される、ことを特徴とする空間情報検出装置。
【請求項２】
前記ポンプ光生成手段及び／又は前記プローブ光生成手段は前記第１分流手段から前記合流手段までの光路の光路長を変化させる光路長伸縮手段を有することを特徴とする請求項１に記載の空間情報検出装置。
【請求項３】
前記予め設定されたポンプ光は２光子で電子共鳴が起こるような周波数ω１，ω２で設定されることを特徴とする請求項１又は２に記載の空間情報検出装置。
【請求項４】
前記予め設定されたポンプ光の周波数ω１，ω２は、同一の周波数ω１であることを特徴とする請求項３に記載の空間情報検出装置。
【請求項５】
前記プローブ光生成手段は、伝送される光から広帯域波長光を生成する光ファイバと該光ファイバから放出された広帯域波長光から予め設定された波長域の光を抽出するプローブ光抽出手段とを有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の空間情報検出装置。
【請求項６】
前記ポンプ光生成手段は、伝送される光の周波数変換を行う発振器を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の空間情報検出装置。
【請求項７】
前記ポンプ光生成手段は、伝送される光から広帯域波長光を生成する光ファイバを有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の空間情報検出装置。
【請求項８】
前記ポンプ光生成手段は、さらに前記光ファイバから放出された広帯域波長光から予め設定された波長域の光を抽出するポンプ光抽出手段を有することを特徴とする請求項７に記載の空間情報検出装置。
【請求項９】
前記ポンプ光生成手段は、伝送される光の周波数変換を行う発振器と、前記発発振器で変換された光を２つ以上の光路に分流する第２分流手段と、該第２分流手段により分流された光路のうち一つの光路を伝送する光から広帯域の波長光を生成する光ファイバと、を有し、
前記合流手段は、前記第２分流手段により分流された光路を伝送するそれぞれのポンプ光を合流させて前記プローブ光に重畳させる、ことを特徴とした請求項１〜３のいずれか１項に記載の空間情報検出装置。
【請求項１０】
前記ポンプ光生成手段は、伝送される光を２つ以上の光路に分流する第２分流手段と、該第２分流手段により分流された光路のうち一つの光路を伝送する光から広帯域の波長光を生成する光ファイバと、前記第２分流手段により分流された光路のうち他の一つの光路を伝送する光の周波数変換を行う発振器と、を有し、
前記合流手段は、前記第２分流手段により分流された光路を伝送するそれぞれのポンプ光を合流させて前記プローブ光に重畳させる、ことを特徴とした請求項１〜３のいずれか１項に記載の空間情報検出装置。
【請求項１１】
前記光源が広帯域の波長光を生成し、又は前記光源から前記第１分流手段までの光路に光帯域の波長光を生成する光ファイバを配設し、
さらに、前記プローブ光生成手段は、前記第１分流手段から伝送される広帯域波長光から予め設定された波長域の光を抽出するプローブ光抽出手段を有し、前記ポンプ光生成手段は、伝送される光を２つ以上の光路に分流する第２分流手段と、該第２分流手段により分流された光路のうち一つの光路を伝送する光の周波数変換を行う発振器とを有し、
前記合流手段は、前記第２分流手段により分流された光路を伝送するそれぞれのポンプ光を合流させて前記プローブ光に重畳させる、ことを特徴とした請求項１〜３のいずれか１項に記載の空間情報検出装置。
【請求項１２】
前記試料照射手段は、少なくとも試料を載置するステージと該ステージを３次元移動させる駆動手段とを備えた試料移動手段を有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の空間情報検出手段。
【請求項１３】
前記試料照射手段は、１つ以上の試料を順次一方向に搬送する搬送手段を有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の空間情報検出手段。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料内の目的物質が放出する光を検出することにより試料内物質の空間情報を取得する空間情報検出装置、とりわけ所謂４光波混合過程における誘導パラメトリック蛍光を検出することによって試料内物質の空間情報を取得する顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体細胞等の観察、特に生体内のタンパク質を可視化することが求められており、これを実現すべく種々のタイプの光学顕微鏡が開発されている。このような顕微鏡として従来から蛍光顕微鏡が存在する。この顕微鏡は、観察試料の分子又は組織を蛍光染色した後に励起光を照射して発生する蛍光を観察することで観察試料分子等の空間分布を検出している。近年、このような蛍光顕微鏡において、３次元分解能向上のため超短パルス光レーザにより照射光として長波長の短いパルス光で試料分子等を２光子励起（又は多光子励起）し、その蛍光を観測する多光子励起蛍光顕微鏡が開発されている。
【０００３】
しかしながら、この顕微鏡  は放出される蛍光強度が低いため光の利用効率が悪く、高い３次元分解能で可視的に試料観測する顕微鏡を所望し難いという問題があった。また、この顕微鏡では蛍光性の試料、あるいは蛍光色素で染色しなければ観測することができないという問題も並存している。さらに、従来の多光子励起蛍光顕微鏡では試料内の複数物質を同時に観測することが困難であり、生体試料等においては物質相互間の相対動作を認識できないという問題も指摘されている。
【０００４】
また、近年、他の顕微鏡として、周波数の異なる２つ光パルスを試料内分子に同時に入射させ、その差周波により分子振動や回転準位を励起し、さらに上の仮想準位を励起することによって発せられるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ａｎｔｉｓｔｏｋｅｓ  Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：以下、「ＣＡＲＳ光」と称する）を観測するコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡（以下、「ＣＡＲＳ顕微鏡」と称する）が開発されている。
【０００５】
この顕微鏡では、試料分子への入射光の周波数差が試料分子固有の分子振動準位と共鳴したときにＣＡＲＳ光が増幅されるという光学原理を利用したものであり、試料分子に蛍光染色を行うことなく試料観測可能である点では有利であるが、その反面、観測対象となるＣＡＲＳ光の増強は２つの異なる周波数の入射光の差周波に依存し、観測されるＣＡＲＳ光も該入射光の差周波に依存するものであるため、実現化設計、特に目的試料分子が複数に亘る場合における調整の困難性が指摘されている。また、ＣＡＲＳ顕微鏡では、目的試料分子の分子振動準位との共鳴で増強されたＣＡＲＳ光を観測対象としており蛍光顕微鏡のように蛍光観測するものではないため、既存の蛍光染色技術を活用して観測光の選択、増強をすることもできないという問題もあった。
【特許文献１】特開２００２−１０７３０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上の事情に鑑みて、本発明は多数の目的試料物質を高感度、低侵襲に同時検出することができ、且つ試料物質への蛍光染色を必須としない顕微鏡等の空間情報検出手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、試料内の目的物質が放出する光を検出することにより試料内物質の空間情報を取得する空間情報検出装置を提供している。具体的には、長波長の短パルス光を照射する光源（例えば、実施形態におけるレーザ光源１を参照）と、光源からの照射光を２つの光路に分流する第１分流手段（例えば、実施形態におけるビームスプリッタＢＳ１）と、第１分流手段により分けられた２つの光路のうち一方の光路上で予め設定されたポンプ光を生成するポンプ光生成手段と、第１分流手段により分けられた２つの光路のうち他方の光路上で予め設定されたプローブ光を生成するプローブ光生成手段と、２つの光路を合流させて前記ポンプ光と前記プローブ光とを空間的に重畳させる合流手段（例えば、実施形態のビームスプリッタＢＳ２）と、合流手段で重畳されたポンプ光とプローブ光とを収束させて試料を照射する試料照射手段（例えば、実施形態の対物レンズ対９、ステージ１０、対物レンズ９ａ）と、試料照射手段により前記ポンプ光と前記プローブ光とを照射された試料から放出される光から予め設定された波長の放出光を抽出する目的放出光抽出手段（例えば、実施形態の対物レンズ９ｂ、フィルター１１）と、目的光抽出手段により抽出された波長光を検出する検出器（例えば、実施形態のフィルター１１）とを備え、予め設定されたポンプ光は、試料内物質が多光子で電子共鳴が起こるような周波数ω１，ω２，…ωｎで設定され、目的放出光抽出手段により抽出される予め設定された波長の放出光は、ポンプ光の周波数ω１，ω２，…ωｎの和と予め設定されたプローブ光の周波数ωｎ＋１との差周波数ωｎ＋２＝（ω１＋ω２＋…ωｎ）−ωｎ＋１に近づくように設定される（例えば、ポンプ光は、試料内物質が２光子で電子共鳴が起こるような周波数ω１，ω２で設定され、放出光は、ポンプ光の周波数ω１，ω２の和と予め設定されたプローブ光の周波数ω３との差周波数ω４＝ω１＋ω２−ω３に近づくように設定される）。
【０００８】
上記ポンプ光生成手段又はプローブ光生成手段は、第１分流手段から合流手段までの一方の光路の光路長を変化させる光路長伸縮手段を有することができる。また、予め設定されたポンプ光は２光子で電子共鳴が起こるような周波数ω１，ω２で設定されることが好ましい。予め設定されたポンプ光の周波数ω１，ω２は、同一の周波数ω１であることが好ましい。
【０００９】
また、プローブ光生成手段は、伝送される光から広帯域波長光を生成する光ファイバと該光ファイバから放出された広帯域波長光から予め設定された波長域の光を抽出するプローブ光抽出手段とを有することが好ましい。
【００１０】
ポンプ光生成手段は、伝送される光の周波数変換を行う発振器（ＯＰＯ：ｏｐｔｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ）を有しても良い。また、ポンプ光生成手段は、伝送される光から広帯域波長光を生成する光ファイバを有しても良く、この場合、光ファイバから放出された広帯域波長光から予め設定された波長域の光を抽出するポンプ光抽出手段を供えることや、光ファイバから放出された広帯域波長光から予め設定された波長域の光を抽出するポンプ光抽出手段を有することが考えられる。
【００１１】
また、ポンプ光ω１、ω２、ω３それぞれ異なる周波数に設定する光学系として、第１として（図３及びこれを参照する実施形態の説明参照）、ポンプ光生成手段は、伝送される光の周波数変換を行う発振器と、発振器で変換された光を２つ以上の光路に分流する第２分流手段と、第２分流手段により分流された光路のうち一つの光路を伝送する光から広帯域の波長光を生成する光ファイバとを有し、合流手段は、第２分流手段により分流された光路を伝送するそれぞれのポンプ光を合流させてプローブ光に重畳させる光学系が提供される。
【００１２】
第２として（図４及びこれを参照する実施形態の説明参照）、ポンプ光生成手段は、伝送される光を２つ以上の光路に分流する第２分流手段と、第２分流手段により分流された光路のうち一つの光路を伝送する光から広帯域の波長光を生成する光ファイバと、第２分流手段により分流された光路のうち他の一つの光路を伝送する光の周波数変換を行う発振器とを有し、合流手段は、第２分流手段により分流された光路を伝送するそれぞれのポンプ光を合流させてプローブ光に重畳させる光学系も提供される。
【００１３】
さらに、第３として（図５及びこれを参照する実施形態の説明参照）、光源が広帯域の波長光を生成し（図５に示さず）、又は光源から第１分流手段までの光路に光帯域の波長光を生成する光ファイバを配設し（図５参照）、  さらに、プローブ光生成手段は、第１分流手段から伝送される広帯域波長光から予め設定された波長域の光を抽出するプローブ光抽出手段を有し、ポンプ光生成手段は、伝送される光を２つ以上の光路に分流する第２分流手段と、第２分流手段により分流された光路のうち一つの光路を伝送する光の周波数変換を行う発振器とを有し、合流手段は、第２分流手段により分流された光路を伝送するそれぞれのポンプ光を合流させてプローブ光に重畳させる光学系も提供される。
【００１４】
また、本発明は試料照射手段の具体的構成も提供している。例えば、少なくとも試料を載置するステージと該ステージを３次元移動させる駆動手段とを備えた試料移動手段を有する構成や、セルソータのごとき１つ以上の試料を順次一方向に搬送する搬送手段を有する構成も提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の空間情報検出装置（顕微鏡等）によれば多光子、とりわけ試料内物質を電子励起準位を２光子のポンプ光ω１、ω２（ω２＝ω１も含む）で共鳴させ、ポンプ光で電子励起された目的物質にプローブ光ω３を照射することでω１＋ω２−ω３の周波数の誘導パラメトリック蛍光ω４を放出される構成を採用している。この光学系を採用すれば、目的物質ごとに設定される誘導パラメトリック蛍光をポンプ光に依存させ、プローブ光にあまり依存させないこととなるので、複数の目的物質を蛍光染色せずに同時に検出する方法として非常に有利である。また、この光学系における励起・発光は全てコヒーレントな状態で行われ、発光も入射光に対してコヒーレントであり、発光は励起光と同様のパルスになるという特性を得ることもできる。
【００１６】
また、本発明装置ではポンプ光を広帯域波長光にすることができるので上記試料からの放出光（誘導パラメトリック蛍光）の周波数がプローブ光に依存しないことと相俟って、同時に多数（理論的には無数）の目的物質ごとに異なる周波数の誘導パラメトリック蛍光放出を容易に検出することができる。さらに、本発明装置は、共鳴効果を起こす対象を電子励起準位としているため広義には蛍光増強技術（非蛍光染色でありながら）といえ、誘導パラメトリック蛍光が増強するようにポンプ光を設定しておけば、誘導パラメトリック蛍光と同時に２光子蛍光を観察することも可能であり、ＣＡＲＳ顕微鏡ではできなかった試料内物質を蛍光染色し観察する従来の観察手法を同時に踏襲することもでき、非常にユーザビリティが高い。さらに、出力光が入射光と同様の超短光パルスを生成するため、同期検出やヘテロダイン増幅にも好ましい。
【００１７】
さらに、本発明装置では、同一試料の走査検出のみならず、複数の試料に含まれる特定物質を順次検出する試料照射手段も提供されており、複数患者の生体細胞に特定物質が含まれているかを検出する場合等においても迅速な検出方法を提供することができる。以下、本発明の具体的な実施形態を例示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
まず、本発明の具体的な実施形態を説明するにあたって基本原理となる非線形光学効果、特に一例としての４波混合について概説する。４波混合は、４つの電磁波を伴う非線形過程に帰属されるものであり、また３次の非線形光学過程であり３次の非線形感受率に支配される特性を有している。この３次の非線形光学効果とは、３つの周波数ω１，ω２，ω３の光を物質に入射すると、ω４−＝ω１±ω２±ω３  の周波数をもつ光が放出される現象であるが、２次の非線形光学効果と異なり分子の反転対称性の有無に拘わらず全ての物質で生じる反面、２次の非線形光学効果に比してその効果が弱いという特徴を有する。しかしながら、その効果の脆弱性は、レーザにより高いピーク強度の入射光を使用し、物質の共鳴効果を利用することで解決することができ、３次の非線形光学効果を検出することを可能とするものである。
【００１９】
ここでは具体的説明として、上述するＣＡＲＳ顕微鏡の基本光学過程となるＣＡＲＳ過程と本発明の顕微鏡の基本光学過程として定義された誘導パラメトリック蛍光過程について図６〜７を参照しつつ概説することで４波混合における３次の非線形光学過程の説明に代替する。まず、図６はＣＡＲＳ過程のエネルギー準位を略示している。この図においてω１はポンプ光としての入射光の周波数、ω３はポンプ光ω１に重畳するプローブ光としての入射光の周波数、ω４はＣＡＲＳ光の周波数である。具体的には、超短パルス光レーザにより試料表面又は内部の同一分子にポンプ光ω１とプローブ光ω３とを同時に集光入射させ、この２つの光波の周波数差  Ω＝ω１−ω３  が試料分子の分子振動数に一致することによって発せられるＣＡＲＳ光ω４を観測する。ＣＡＲＳ過程では、２光子のポンプ光ω１とプローブ光ω３との差周波数Ωが試料分子が固有に有する分子振動準位と共鳴（試料分子固有の分子振動数と一致）すると発せられるＣＡＲＳ光が増強する特徴を有するので、出力光波長（ＣＡＲＳ光波長）を設計する際にポンプ光及びプローブ光の両者の相関をもって設計する必要があり、出力光波長がポンプ光やプローブ光と近づくと波長による分光で出力光を抽出することができない場合がある等、適切な波長選択をすることが難しくなる。また、ＣＡＲＳ過程では共鳴が生じる帯域幅が狭い分子振動共鳴に依存するためスペクトル幅をもったパルスを用いて効率良くＣＡＲＳ光を観測することも難しくなる。
【００２０】
これに対して、誘導パラメトリック蛍光過程ではこのような問題が解決される。図７を参照すれば、誘導パラメトリック蛍光過程のエネルギー準位を略示している。ここでもω１はポンプ光としての入射光の周波数、ω３はポンプ光ω１に重畳するプローブ光としての入射光の周波数、ω４は出力光の周波数である。具体的には、２光子励起可能な超短パルス光レーザにより試料表面又は内部の同一分子にポンプ光ω１を集光入射させて試料分子の電子励起準位を励起し、同時重畳的にプローブ光ω３を集光入射させることで励起された試料分子に強い電場を付与して発光するω４＝２ω１−ω３の出力光を観測する。誘導パラメトリック蛍光信号は、２光子のポンプ光ω１が試料分子が固有に有する電子励起準位と共鳴すると増強する特徴を有するので、ポンプ光の波長に依存するがプローブ光には依存しない。従って、上記ＣＡＲＳ過程の場合と相異し、プローブ光の波長を変化させるだけで誘導パラメトリック蛍光波長を自由に設計することができ、観測し易い出力光波長を選択することができる（出力光の波長選択が容易である）。また、誘導パラメトリック蛍光過程では電子共鳴が生じる帯域幅がＣＡＲＳ過程における分子振動共鳴が生じる帯域よりも広いため、スペクトル幅をもったパルスを用いて効率良く誘導パラメトリック蛍光を観測することができる。
【００２１】
次に、この誘導パラメトリック蛍光過程を活用した本発明の顕微鏡（誘導パラメトリック蛍光顕微鏡）の実施形態を詳細に説明する。図１は、本発明の顕微鏡（以下、「誘導パラメトリック蛍光顕微鏡」と称する）の光学系の基本例（後述の図２）に基づく具体的構成例である。図１に示す誘導パラメトリック蛍光顕微鏡は、まず光源としてフェムト秒オーダ〜数十フェムト秒オーダの超短パルスレーザなどから構成されるレーザ光源１を使用している。レーザ光源をこのようなフェムト秒オーダ〜数十フェムト秒オーダの超短パルスレーザ、すなわち数十フェムト秒オーダ以下の超短パルスレーザから構成することにより、これらの高い出力光強度に起因して極めて高い光信号強度を得ることができる。
【００２２】
また、レーザ光の光路には、ハーフミラーＨＭ１とミラーＭ１との間にプリズム対３が設けられる。このプリズム対３を往復入射することでレーザ光の分散を補償することとができる。さらに、プリズム対３により分散補償されたレーザ光の光路は９０度変換されて所定の光学系を構成すべくミラーＭ１〜Ｍ５が設けられ、ミラーＭ１〜Ｍ５を経由した光はビームスプリッタＢＳ１に入射される。なお、レーザ１の後光路には光は系の反射戻り光を防止するためにアイソレータ２を設けることが好ましい。
【００２３】
次に、ビームスプリッタＢＳ１への入射光は、２分割され、一方の光はミラーＭ６、対物レンズ６−１を介して光ファイバ（ｐｈｏｔｏｎｉｃ  ｃｒｙａｔａｌ  ｆｉｂｅｒ、以下、「ＰＣＦ」と称する）７に入射される。このＰＣＦ７に超短パルスのレーザ光が入射されるとＰＣＦの内部で非線形光学効果が生じ、広帯域パルス光を発生させる。その後、フィルター８により広帯域パルス光から所望する波長光を抽出してプローブ光が形成され、ミラー７を介してビームスプリッタＢＳ２に入射される。なお、プローブ光を抽出するフィルター８は、例えば抽出する中心波長と半値全幅が既知の干渉フィルターと遮断波長が既知のロングパスフィルター（又はショートパスフィルター）とを組み合わせて構成される。なお、伝送光はＰＣＦを透過すると広帯域波長光を生成するが同時にパルス幅を拡大させるのでＰＣＦ７後の光路上で分散補償する光学系を付与する必要がある（以下述べる実施形態においても、ＰＣＦを透過させた場合には該分散補償が必要となるが、これについては既知の技術であるため説明を省略する）。
【００２４】
また、ビームスプリッタＢＳ１で２分割（分流）された、他方の光は、ポンプ光を生成する。詳細には、リトロリフレクター（３枚のミラーにより入射光を逆方向に反射させる光素子）４に入射・反射され、ビームスプリッタＢＳ２まで到達し、前述のポンプ光と空間的に重畳される。また、リトロリフレクター４は図示しない時間遅延ステージ上に配置され、該ステージの往復動に応じてビームスプリッタＢＳ２までの光路長が変化する。その結果、時間遅延ステージ（ディレイライン）を調整すればポンプ光とプローブ光を時間的に重畳することができる。その後、重畳された光はミラーＭ８により反射されて対物レンズ対９ａ，９ｂに照射される。
【００２５】
また、対物レンズ対９ａ、９ｂの間に試料が介挿され、この試料に対物レンズ９ａにより収束されたレーザ光が照射されると焦点近傍の物質が電子励起され、前述する誘導パラメトリック蛍光が生じる。そして、対物レンズ９ｂから出射した光のうち誘導パラメトリック蛍光の波長成分のみを抽出する。この誘導パラメトリック蛍光は前述するようにポンプ光ω１とブローブ光ω３とから決定される周波数ω４（＝２ω１−ω３）を有するため既知の波長λ４（＝１／ω４）であり、フィルター１１を該波長のみ透過するように設定することとで抽出することができる（このフィルター１１の構成例は前述するフィルター８を参照）。そして、抽出された誘導パラメトリック蛍光をイメージインテンシアファイア付きＣＣＤ等の検出器１２に入射し、受光された誘導パラメトリック蛍光は検出器１２で電気信号に変換された後、コンピュータ（図示せず）に送られ、所定の演算処理を受ける。その結果、前記誘導パラメトリック蛍光が３次元的に解析され、この解析結果としての目的試料物質の状態が３次元的に所定の画面上に映し出される。
【００２６】
なお、図１には試料が対物レンズ対９ａ，９ｂ間で往復動可能なようにステージ１０により位置決めされている様子が示されているが、これは誘導パラメトリック蛍光過程が対物レンズ９ａにより収束されたレーザ光の焦点近傍で生じるため（非線形光学過程であるため）目的試料物質に焦点を一致させるように試料の深さ方向及び平面方向に走査可能（３次元走査可能）であることを示したものである。従って、観測しようとする試料内の目的物質の電子励起準位と共鳴する２光子のポンプ光ω１を設定し、ステージ１０を往復動させるとレーザ光の焦点近傍に目的物質が存在すれば増強された誘導パラメトリック蛍光が観測され、フィルター１１を介して検出器１２で検出されることとなる。
【００２７】
また、図１の実施形態は多種の試料内物質を観測することも可能である。前述するように誘導パラメトリック蛍光過程ではポンプ光により集光点近傍の電子励起準位を励起することで出力強度を増強するため観測光である誘導パラメトリック蛍光の出力強度がポンプ光に依存し、プローブ光にはあまり依存しない性質を有している。この点を図１の顕微鏡に照らしてみると、レーザ１からの照射光の周波数を変化させてもプローブ光はＰＣＦ７により一旦、広帯域パルスに生成された後、フィルター８で所望波長のみ抽出されるため固定である。すなわち、図１の実施形態ではポンプ光を変化させてもプローブ光は固定させることができる。従って、ポンプ光ω１を生成してもプローブ光ω３が共通であるため放出される誘導パラメトリック蛍光の周波数ω４は２ω１−ω３であり、ポンプ光の周波数（又は波長）に対応して一対一に誘導パラメトリック蛍光が決定されるものであるため、異なる複数のポンプ光を設定すれば電子共鳴準位の異なる複数の試料内物質を容易に観測することができる。
【００２８】
以上の光学系における試料までの主構成と光路を伝送される光の周波数とを略示したものが図２に示されている（後述の他の光学系で比較参照するための理解を助ける図であり、参照番号は図１と重複する）。
【００２９】
また、図１及び図２の実施形態では試料は３次元移動可能なステージ１０に位置決めされており、該ステージを移動させることで試料内の任意３次元位置において目的物質が存在するかを検出して検出器でイメージングする所謂３次元走査検出の構成が示されているが、本発明の実施形態はこれに限定されるものではない。例えば、対物レンズ対９ａ，９ｂ間にセルソータのごとき管状の運搬器を設け、この中に複数の試料を流すことも可能である。この場合、流される複数試料のぞれぞれにレーザ光の焦点が位置するように位置決めすれば焦点通過した時点で目的物質が存在すれば誘導パラメトリック蛍光を発することとなり試料内に目的物質（複数でも良い）が含まれているか否かを迅速に検出することが容易である。
【００３０】
上記説明で目的試料物質に対応して異なる周波数のポンプ光を設定することを言及したが、この複数のポンプ光をさらに多数のポンプ光に拡大設定することも可能である。具体的に説明すれば、図２の光学系では入射光として２光子のポンプ光ω１とプローブ光ω３とを重畳することで放出光ω３と誘導パラメトリック蛍光ω４を得る過程を活用しているが、他の実施形態では２光子のポンプ光のいずれか１つをＰＣＦにより広帯域パルス光（例えば波長が３９０ｎｍ〜１６００ｎｍに広がった白色パルス光）にし、該広帯域パルスから所望波長（周波数ω２）を抽出することで、誘導パラメトリック蛍光ω４を放出させることも考えられる。
【００３１】
ここで、図３の光学系を参照すればレーザ１からの照射光の周波数をプローブ光ω３とし、を入射光ω１のうち一つの周波数をω２とし、放出光ω３と観測対象となる誘導パラメトリック蛍光ω４を放出させる光学系が示されている。この過程の場合、レーザ１の照射光が分流され、一方の光路でそのままプローブ光ω３として伝送される。また、他方の光路ではＯＰＯ２０で周波数がω１に変換された後にビームスプリッタＢＳ３により分流され、一の光路ではそのまま伝送されポンプ光ω１を生成し、他の光路ではＰＣＦ２２により広帯域波長光ω２のポンプ光が生成されている。従って、ポンプ光ω１と複数の所望波長（周波数ω２＝ω２１、ω２２、ω２３、ω２４、…）を含んだ広帯域パルス光としてのポンプ光ω２とが試料に同時照射され、前述の図１及び図２に示すように共通周波数ω３のプローブ光を同期させて試料照射するので、放出される誘導パラメトリック蛍光の周波数はそれぞれの目的物質ごとに固定のω４＝ω１＋ω２−ω３となる。従って、観測試料内で空間情報を取得したい物質ごとにそれぞれ電子励起準位の周波数ω１＋ω２を仮定し、誘導パラメトリック蛍光ω４＝ω１＋ω２−ω３設定しておけば、集光点近傍で放出される光のうち設定された周波数ω４（対応する波長）が検出されるとこれに対応する物質情報が集光点近傍に位置することを検出することが可能となる。換言すれば、図３の実施形態によればポンプ光として広帯域パルスを使用することにより一度に試料内の複数物質の空間情報を同時に検出することが可能となる。なお、複数の目的物質にそれぞれ対応する誘導パラメトリック蛍光は設定された周波数に基づく波長を抽出すべく、ファルター１１の代替として分光器を設ける又はＰＣＦの後にフィルター（図２のフィルター８のごとき）を設けることが好ましい。
【００３２】
また、図４の光学系を参照すれば図３の光学系の変形例が示されている。具体的には、レーザ１からの照射光を分流し一方の光路ではプローブ光ω３を生成し、他の光路をさらに分流してポンプ光ω１、ω２を生成する点では上記図３と同様であるが、図４の光学系の場合、図３においてビームスプリッタＢＳ３より前の光路上にＯＰＯ２０を配設する変わりにビームスプリッタＢＳ３で分流された後にＰＣＦ２４が配設される光路以外の光路上にＯＰＯ２６を配設する構成を採用している。また、図５の光学系も図３の光学系の変形例であり、レーザ１からの照射光を分流し、ポンプ光ω１、ω２、プローブ光ω３を生成する点では上記図３と同様であるが、図５の光学系の場合、レーザ１からの放出光が分流される前にＰＣＦ２８で広帯域波長光に変換している。この場合、ＰＣＦ２８の放出光ω１が分流されて、プローブ光生成側の光路ではフィルター８により波長抽出されてプローブ光ω３が放出され、ポンプ光生成側では、ブームスプリッタＢＳ３で分流した後、一方の光路はレーザ光そのまま周波数ω１を伝送し、もう一方の光路ではＯＰＯ３０を配設しポンプ光ω２を生成している。また、図６ではレーザ１の放出光からＰＣＦ２８で広帯域波長光を生成する構成が示されているが、原始的に広帯域波長光を放出しているレーザ１の場合はＯＰＯ２８による周波数変換は不要である。
【００３３】
さらに、上記説明では試料内物質自体の放出蛍光（誘導パラメトリック蛍光）を検出し、試料内物質の空間情報を取得する方法が提供されたが、既知の２光子蛍光観察と併用することも可能である。既知の２光子蛍光観察とは観測対象物質（分子）を蛍光試料で染色し、長波長の短パルス光を蛍光試料に励起光として照射することで放出される蛍光を検出する観察方法である。これを本発明と併用するには、まず誘導パラメトリック蛍光が増強されるポンプ光を選択し、プローブ光と共に蛍光試料へ入射し、蛍光試料から発生する蛍光を検出する。このようにすれば蛍光試料の電子共鳴特性が既知のものであるためポンプ光が電子共鳴を起こす適切な波長であるか否かを判断することができ、顕微鏡としての精度を向上させることができる。
【００３４】
その他、特に図示しないが図１及び図２の変形例（図７の光学過程を利用する態様）としてレーザ光の周波数をω３としてプローブ光生成側の光路にそのまま伝送し、ポンプ光生成側の光路においてＰＣＦにより広帯域波長光（周波数ω１）を生成する光学系も考えられる。また、これも図示しないが図３（及び図４〜５の変形例（図８の光学過程を利用する態様）としてレーザ光の周波数をプローブ光生成側の光路にそのまま伝送しプローブ光ω３を生成し又はプローブ光生成側の光路でＯＰＯにより特定周波数ω３に変換してプローブ光ω３を生成し、ポンプ光生成側の光路においてＰＣＦにより広帯域波長光（周波数ω１，ω２）を生成する光学系も考えられる。
【００３５】
なお、上述する図１の光学系の説明（段落(００２３)参照）においてポンプ光とプローブ光とを時間的に重畳する方法が示されたが、図３〜５の光学系のように３つの光路上のポンプ光及びプローブ光を時間的に重畳させる場合の光学系例を図９に参照しておく。この場合、２本の光路を一方の時間調整ステージで時間調整し、調整された２光と残りの光を他の時間ステージにより時間調整することとしている。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の実施形態の光学系例を示している。
【図２】図１の光学系例の主たる構成の略図である。
【図３】本発明の他の光学系例を示した略図である。
【図４】図３の光学系例の変形例である。
【図５】図３の光学系例の他の変形例である。
【図６】ＣＡＲＳ顕微鏡の基本原理であるＣＡＲＳ過程を示している。
【図７】本発明の空間情報検出装置の基本原理である誘導パラメトリック蛍光過程の一態様を示している。
【図８】図７の誘導パラメトリック蛍光過程の変形態様の一つを示している。
【図９】３つの光路を伝送する光を時間的に重畳させる方法の一例を示した略図である。
【符号の説明】
【００３７】
１…光源（レーザ）
７，２２，２４，２８…光ファイバ（ＰＣＦ）
８…フィルタ
９…試料照射手段
１２…検出器
２０，２６，３０…発振器（ＯＰＯ）
ＢＳ１，ＢＳ３…分流手段（ビームスプリッタ）
ＢＳ４…合流手段（ビームスプリッタ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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