(57)【要約】【課題】溶離液における各成分の混合比の変化に対する試料の移動度Ｒfの変化率を予め得ておかなくても、適切な移動度Ｒf0となる溶離液条件でクロマトグラフィを実行することを可能とする。【解決手段】複数の成分を第1、第２の特定混合比でそれぞれ含む溶離液を用いたときの試料の移動度Ｒfの第1、第２の実測値を薄層クロマトグラフを行って求める。求められた移動度Ｒfの第1、第２の実測値を、それぞれ第1、第２の特定混合比に関連付けて格納する（Ｓ２）。そして、格納された第1、第２の実測値に基づいて、移動度Ｒfと溶離液の混合比との一対一の関係を決定する（Ｓ３）。次に、決定された関係から、特定移動度Ｒf0に対する溶離液の混合比を算出する（Ｓ４）。しかる後、算出された混合比を有する溶離液をカラムに送液する（Ｓ５）。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薄層クロマトグラフィの分離において、複数の成分を第1の特定混合比で含む溶離液を用いて分離を行ったときの試料の移動度Ｒfの第１の実測値、及び、前記複数の成分を前記第1の特定混合比とは異なる第２の特定混合比で含む溶離液を用いて分離を行ったときの試料の移動度Ｒfの第２の実測値を、それぞれ前記第1の特定混合比、及び、前記第２の特定混合比に関連づけて記憶するための実測値記憶手段と、
前記実測値記憶手段に記憶された、前記第1の特定混合比に対する移動度Ｒfの前記第1の実測値と、前記第２の特定混合比に対する移動度Ｒfの前記第２の実測値とに基づいて、特定移動度Ｒf0が得られる前記溶離液の混合比を求めるための混合比演算手段と、
前記混合比演算手段での演算結果に基づいて、試料の移動度Ｒfが前記特定移動度Ｒf0となるようにカラムに送液される前記溶離液の混合比を制御する制御信号を出力するための混合比制御手段とを備えていることを特徴とする液体クロマトグラフの制御装置。
【請求項２】
複数の成分を第1の特定混合比で含む溶離液を用いたときの試料の移動度Ｒfの第1の実測値を薄層クロマトグラフを行って求める第１の工程と
前記複数の成分を前記第1の特定混合比とは異なる第２の特定混合比で含む溶離液を用いたときの試料の移動度Ｒfの第２の実測値を薄層クロマトグラフを行って求める第２の工程と、
前記第１の工程で求められた移動度Ｒfの前記第1の実測値及び前記第1の実測値が求められた前記溶離液の前記第１の特定混合比と、前記第２の工程で求められた移動度Ｒfの前記第２の実測値及び前記第２の実測値が求められた前記溶離液の前記第２の特定混合比とに基づいて、特定移動度Ｒf0が得られる前記溶離液の混合比を求める第３の工程と、
前記第３の工程で求められた前記特定移動度Ｒf0が得られる混合比を有する前記溶離液をカラムに送液する第４の工程とを備えていることを特徴とする液体クロマトグラフィの実行方法。
【請求項３】
薄層クロマトグラフィの分離において、複数の成分を第１の特定混合比で含む溶離液を用いて分離を行ったときの試料の移動度Ｒfの第１の実測値、及び、前記複数の成分を前記第1の特定混合比とは異なる第２の特定混合比で含む溶離液を用いて分離を行ったときの試料の移動度Ｒfの第２の実測値を、それぞれ前記第１の特定混合比、及び、前記第２の特定混合比に関連づけて記憶するための実測値記憶手段、
前記実測値記憶手段に記憶された、前記第１の特定混合比に対する移動度Ｒfの前記第１の実測値と、前記第２の特定混合比に対する移動度Ｒfの前記第２の実測値とに基づいて、特定移動度Ｒf0が得られる前記溶離液の混合比を求めるための混合比演算手段、及び、
前記混合比演算手段での演算結果に基づいて、試料の移動度Ｒfが前記特定移動度Ｒf0となるようにカラムに送液される前記溶離液の混合比を制御する制御信号を出力するための混合比制御手段としてコンピュータを機能させるための液体クロマトグラフの制御プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移動相として液体溶媒（溶離液）を用いる液体クロマトグラフィに関し、より詳細には、液体クロマトグラフィを行う際の条件検討に関する。
【従来の技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィにおいては、カラム内に充填された固定相内に、複数の溶媒が混合された溶離液である移動相に溶解された試料が通過される。このとき、カラム内に導入された試料内の各成分は固定相との相互作用や移動相との親和性等により、それぞれカラムを通過する時間が異なるため、カラムから排出される時点では各成分が分離される。固定相との相互作用が強い、又は移動相との親和性の弱い物質がカラム中に長く留まり、カラムから遅く排出されることとなる。
【０００３】
上記示した液体クロマトグラフィと同じ原理により行われる薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）がある。薄層クロマトグラフィでは、薄層とされたカラム内の固定相に用いられる物質に試料が１滴垂らされ、この薄層が移動層となる溶離液中に浸漬される。そして、毛管現象により溶離液が薄層に吸い上げられると共に試料が吸い上げられる作用により、試料の溶離液に対する移動度Ｒfを求めることができる。このようにして任意の溶媒比の溶離液で行われるＴＬＣにて求められる移動度Ｒfが、液体クロマトグラフィの分離度Ｒsに相関性があることが知られている。
【０００４】
例えば、特許文献１の液体クロマトグラフィの制御装置は、溶離液の各成分の混合比と試料の移動度Ｒfとの関係が比例関係であること、及び、溶離液の各成分の混合比に対する試料の移動度Ｒfの変化率は、同じ溶離液種であれば、試料の種類が変わっても同じであるという知見に基づいてなされたもので、薄層クロマトグラフの分離において複数の成分を特定混合比で含む溶離液を用いて分離を行ったときの試料の移動度Ｒfの実測値と、その溶離液における各成分の混合比の変化に対する試料の移動度Ｒfの変化率とに基づいて、特定移動度Ｒf0が得られる溶離液の混合比を求め、その結果に基づいて、試料の移動度Ｒfが特定移動度Ｒf0となるようにカラムに送液される溶離液の混合比を制御する。
【特許文献１】特開２００３−２４０７６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載された液体クロマトグラフィの制御装置は、特定移動度Ｒf0が得られる溶離液の混合比を求めるために、複数の成分を特定混合比で含む溶離液を用いて薄層クロマトグラフの分離を行ったときの試料の移動度Ｒfの実測値に加えて、その溶離液における各成分の混合比の変化に対する試料の移動度Ｒfの変化率を予め得ておく必要がある。従って、液体クロマトグラフィの制御装置を提供する製造者は、ユーザが使用する全ての種類の溶離液に関して、それぞれの溶離液における各成分の混合比の変化に対する試料の移動度Ｒfの変化率を予め得ておかなければならず、非常に煩雑な作業を要することとなる。また、所定の溶離液における各成分の混合比の変化に対する試料の移動度Ｒfの変化率が当該制御装置に与えられているため、ユーザは、所定の溶離液とは異なる新たな溶離液を使用して液体クロマトグラフィを実行することは不可能である。
【０００６】
本発明は上記問題に鑑みなされたものであり、溶離液における各成分の混合比の変化に対する試料の移動度Ｒfの変化率を予め得ておかなくても、適切な移動度Ｒf0となる溶離液条件でクロマトグラフィを実行することができる液体クロマトグラフィの制御装置、液体クロマトグラフィの実行方法及び液体クロマトグラフィの制御プログラムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に記載の液体クロマトグラフィの制御装置は、薄層クロマトグラフィの分離において、複数の成分を第1の特定混合比で含む溶離液を用いて分離を行ったときの試料の移動度Ｒfの第１の実測値、及び、前記複数の成分を前記第1の特定混合比とは異なる第２の特定混合比で含む溶離液を用いて分離を行ったときの試料の移動度Ｒfの第２の実測値を、それぞれ前記第1の特定混合比、及び、前記第２の特定混合比に関連づけて記憶するための実測値記憶手段と、前記実測値記憶手段に記憶された、前記第1の特定混合比に対する移動度Ｒfの前記第1の実測値と、前記第２の特定混合比に対する移動度Ｒfの前記第２の実測値とに基づいて、特定移動度Ｒf0が得られる前記溶離液の混合比を求めるための混合比演算手段と、前記混合比演算手段での演算結果に基づいて、試料の移動度Ｒfが前記特定移動度Ｒf0となるようにカラムに送液される前記溶離液の混合比を制御する制御信号を出力するための混合比制御手段とを備えていることを特徴としている。
【０００８】
請求項２に記載の液体クロマトグラフィの実行方法は、複数の成分を第1の特定混合比で含む溶離液を用いたときの試料の移動度Ｒfの第1の実測値を薄層クロマトグラフを行って求める第１の工程と前記複数の成分を前記第1の特定混合比とは異なる第２の特定混合比で含む溶離液を用いたときの試料の移動度Ｒfの第２の実測値を薄層クロマトグラフを行って求める第２の工程と、前記第１の工程で求められた移動度Ｒfの前記第1の実測値及び前記第1の実測値が求められた前記溶離液の前記第１の特定混合比と、前記第２の工程で求められた移動度Ｒfの前記第２の実測値及び前記第２の実測値が求められた前記溶離液の前記第２の特定混合比とに基づいて、特定移動度Ｒf0が得られる前記溶離液の混合比を求める第３の工程と、前記第３の工程で求められた前記特定移動度Ｒf0が得られる混合比を有する前記溶離液をカラムに送液する第４の工程とを備えていることを特徴としている。
【０００９】
上記の構成によると、任意の第１の特定混合比における試料の移動度Ｒfと、第１の特定混合比とは異なる第２の特定混合比における試料の移動度Ｒfを、それぞれ薄層クロマトグラフィで求めておけば、所望の特定移動度Ｒf0での溶離液の混合比を知ることができる。そのため、溶離液における各成分の混合比の変化に対する試料の移動度Ｒfの変化率を予め得ておかなくても、薄層クロマトグラフィを２回行うことで、最適の分離度Ｒsが得られる適切な移動度Ｒf0となる溶離液条件でクロマトグラフィを実行することができる。従って、製造者は、ユーザが使用する全ての種類の溶離液に関して、それぞれの溶離液における各成分の混合比の変化に対する試料の移動度Ｒfの変化率を予め得ておかなくてもよいため、煩雑な作業が不要となる。また、ユーザは、薄層クロマトグラフィを２回行うことで、いかなる溶離液を使用したクロマトグラフィも実行可能である。
【００１０】
また、請求項３に記載の液体クロマトグラフの制御プログラムは、コンピュータを請求項１のような液体クロマトグラフの制御装置として機能させることが可能なプログラムであり、請求項１と同様の作用効果を奏する。なお、請求項３に記載されているプログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ、ＦＤ、ＭＯなどのリムーバブル型記録媒体やハードディスクなどの固定型記録媒体に記録して配布可能である他、有線又は無線の電気通信手段によってインターネットなどの通信ネットワークを介して配布可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の好適な実施の形態を、図１〜図７に基づいて以下に説明する。
【００１２】
図１において、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）に用いられるＴＬＣ装置１を示す。ＴＬＣ装置１は、試料３が表面に１滴垂らされ吸着されたシリカゲル薄層板２と、容器５に貯留された溶離液４とを備えている。尚、試料３、シリカゲル薄層板２を形成するシリカゲル、及び溶離液４は、後述する液体クロマトグラフィに用いられるのと同等のものである。
【００１３】
図３において、液体クロマトグラフ装置１１を示す。液体クロマトグラフ装置１１は、溶媒Ａが貯留された容器１２と、溶媒Ｂが貯留された容器１３と、溶媒Ａと溶媒Ｂとが連結された位置に設けられた電磁弁１４と、溶離液４が貯留される混合器１５と、ポンプ１６と、インジェクター１７と、カラム１８と、検出器１９と、フラクションコレクター２０とが、この順に配置され経路が形成されている。そして、電磁弁１４に液体クロマトグラフ制御装置２１が接続されている。
【００１４】
容器１２には溶媒Ａが、容器１３には溶媒Ｂが貯留されている。尚、用いられる溶媒は２種類に限定されず、使用状態・目的に応じて数を増やしてもよい。一般に、溶媒Ａ・溶媒Ｂには、非極性分子と極性分子との組合せで用いられる。
【００１５】
ポンプ１６は、液体クロマトグラフ装置１１の回路において、容器１５・電磁弁１４を介して溶媒Ａ・溶媒Ｂを汲み上げる。電磁弁１４は、液体クロマトグラフ制御装置２１からの制御信号により、汲み上げられる溶媒を溶媒Ａ又は溶媒Ｂから選択する。電磁弁１４での各溶媒の選択時間に応じて混合器１５内での溶媒Ａ、Ｂの混合比が決定される。混合器１５は、汲み上げられた溶媒Ａ及び溶媒Ｂが一旦貯留され、溶離液１０とされる。この溶離液１０は、後述するように、算出された混合比を有するものである。
【００１６】
インジェクター１７は、試料３を有しており、溶離液１０が通過することで試料３が送出されるようになっている。この試料３は、図１における試料３と同じものである。尚、インジェクター１７は１本に限定されず、選択的に経路を選ぶことができる並設された複数のインジェクターとし、複数の試料について連続的に作業を行うことも可能である。
【００１７】
カラム１８には固定相が充填されており、試料３を含んだ混合溶媒１０が通過することで液体クロマトグラフが行われる。この固定相としては、図１におけるシリカゲル薄層板２を形成するシリカゲルが用いられている。尚、カラムは１本に限定されず、選択的に経路を選ぶことができる並設された複数のカラムとし、複数種類の液体クロマトグラフィを行うことも可能である。
【００１８】
検知器１９は、カラム１８にて行われる液体クロマトグラフの結果の検出を行う。そして、フラクションコレクター２０は、複数の試験管を有しており、検知器１９の分析結果により、試料３に含まれる成分毎に各試験管に分取されるようになっている。
【００１９】
また、液体クロマトグラフ制御装置２１は、例えば汎用のパーソナルコンピュータなどの情報処理装置によって構成されており、図４に示すように、混合比演算部２２ａ及び混合比制御部２２ｂを有するＣＰＵ２２と、実測値記憶部２５ａを有するメモリ２５と、ハードディスク２６と、入出力部２８とを備えている。入出力部２８には、例えばキーボードやマウスなどから構成された入力部２９と、液体クロマトグラフィの実行過程における様々な情報をオペレータに知らせるためのディスプレイ３０と、ＣＰＵの混合比制御部２２ｂからの指示に基づいて電磁弁１４の開閉信号を送出する電磁弁操作部３１とが接続されている。
【００２０】
ハードディスク２６には、一実施の形態による液体クロマトグラフの制御プログラムを含む各種のソフトウェアが記憶されている。そして、これらのハードウェア及びソフトウェアが組み合わされることによって、上述の各部２２ａ、２２ｂ、２５ａが構築されている。なお、このプログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ、ＦＤ、ＭＯなどのリムーバブル型記録媒体に記録しておくことにより、任意のコンピュータにインストールすることが可能である。
【００２１】
実測値記憶部２５ａは、薄層クロマトグラフィの分離において複数の成分を第１の特定混合比で含む溶離液を用いて分離を行ったときの試料の移動度Ｒfの実測値、及び、当該複数の成分を第１の特定混合比とは異なる第２の特定混合比で含む溶離液を用いて分離を行ったときの試料の移動度Ｒfの実測値を、それぞれ第１の特定混合比、及び、第２の特定混合比に関連づけて記憶する。実測値記憶部２５ａに記憶すべきこれらのデータは、液体クロマトグラフ装置１１を用いて液体クロマトグラフィを行う前に予め薄層クロマトグラフィを行って得られたものであって、オペレータによって入力部２９から入力されてよい。
【００２２】
混合比演算部２２ａは、実測値記憶部２５ａに記憶された、第１の特定混合比に対する移動度Ｒfの実測値と、第２の特定混合比に対する移動度Ｒfの実測値とに基づいて、特定移動度Ｒf0が得られる溶離液の混合比を求める。混合比演算部２２ａでの詳細な動作については後述する。
【００２３】
混合比制御部２２ｂは、混合比演算部２２ａでの演算結果に基づいて、試料の移動度Ｒfが特定移動度Ｒf0となるようにカラムに送液される溶離液の混合比を制御する制御信号を出力する。この制御信号は入出力部２８から電磁弁操作部３１に供給される。
【００２４】
ディスプレイ３０には、図５に示すように、グラフ５１と、グラフ５２と、グラジエント条件表５３とが表示される。
【００２５】
グラフ５１は、混合器１５からカラム１８に供給される溶離液１０の混合比（Ｂ／Ａ＋Ｂ）の時間変化を表したものであり、横軸が経過時間、縦軸が溶離液に含まれる溶媒Ｂの割合である。横軸には、時間巾５４がＷ（ｗａｉｔ）、Ｇ（ｇｒａｄｉｅｎｔ）、Ｔ（ｔｏｐ）、ＦＷ（ｆｏｒｗａｒｄ ｗａｓｈ）、ＥＱ（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）の順に設定されている。グラフ５２は、横軸が経過時間、縦軸が吸光度である。グラフ５２は試料３の溶出曲線であり、試料３に含まれる成分がカラム１８から排出されたときに成分の濃度に応じて突出した値を示す。グラジエント条件表５３は、時間巾毎の、溶離液１０に含まれる溶媒Ａと溶媒Ｂとの混合比が表示されている。尚、時間巾Ｇにおいては、Ｗでの混合比を徐々にＴでの混合比にまで直線的に増加させる。
【００２６】
次に、本発明の液体クロマトグラフの実行方法の一実施の形態について説明する。
【００２７】
（第１、第２の工程）まず、溶媒Ａ・溶媒Ｂを第１の特定混合比で含む溶離液４を用いたときの試料３の移動度Ｒfの実測値、及び、溶媒Ａ・溶媒Ｂを第１の特定混合比とは異なる第２の特定混合比で含む溶離液４を用いたときの試料３の移動度Ｒfの実測値を、オペレータが薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を行って求める。
【００２８】
ＴＬＣでは、まず、図２（ａ）に示すように、試料３が１滴垂らされた状態のシリカゲル薄層２が、図１に示すように溶離液４中に浸漬される。すると、毛管現象により混合溶液４がシリカゲル薄層２に吸い上げられてゆく。これに伴い、試料３も上方に移動する。溶離液４及び試料３の移動が終了すると、図２（ｂ）に示すように、試料３は試料３´の位置に移動する。このとき、試料３の混合溶液４中に浸漬される前の位置から、溶離液４が上端まで上った距離を１．０として、その１．０に対する試料３´までの距離の比が移動度Ｒfとして求められる。
【００２９】
（第３の工程）以下の工程は液体クロマトグラフ制御装置２１において行われる。液体クロマトグラフ制御装置２１のＣＰＵ２２は、図６のステップＳ１において、第１、第２の工程のＴＬＣで得られた移動度Ｒfの２つの実測値が入力部２９から入力されたかどうかを繰り返して判断する。そして、移動度Ｒfの２つの実測値が入力された場合には（Ｓ１：ＹＥＳ）、ステップＳ２において、移動度Ｒfの各実測値と共に、その実測値が求められたときにおける混合溶液４の溶媒Ａと溶媒Ｂとの混合比（特定混合比）をメモリ２５の実測値記憶部２５ａに記憶する。
【００３０】
次に、ステップＳ３において、混合比演算部２２ａは、実測値記憶部２５ａに記憶された、第１の特定混合比に対する移動度Ｒfの実測値と、第２の特定混合比に対する移動度Ｒfの実測値とに基づいて、溶離液の混合比と移動度Ｒfとの関係を一対一に定める。つまり、混合比を横軸に移動度Ｒfを縦軸にとったグラフである図７に示すように、実測値記憶部２５ａに記憶された、第１の特定混合比Ｘ1に対する移動度Ｒfの実測値Ｒf1、及び、第２の特定混合比Ｘ2に対する移動度Ｒfの実測値Ｒf2を用いて、座標（Ｘ1，Ｒf1）及び座標（Ｘ2，Ｒf2）を通過する直線６３を、実際に移動度Ｒfと混合比との関係を表すものとする。
【００３１】
さらに、ステップＳ４では、混合比演算部２２ａが、液体クロマトグラフ装置１１で試料の分取を行う際に必要とされる特定移動度Ｒf0に対する混合比を、ステップＳ３で定められた一対一の関係に基づいて算出する。例えば、図５のグラフ５１に示すようなグラジエント処理を行う場合、混合比演算部２２ａは、図７に示すように、時間巾「Ｗ」及び「Ｔ」のときの各特定移動度Ｒf0w、Ｒf0tに対する混合比Ｘw、Ｘtを直線６３に基づいて求める。このようにして求められた混合比は、メモリ２５内の所定領域に書き込まれ、図５のグラジエント条件表５３に示すようにディスプレイ３０に表示される。
【００３２】
なお、ステップＳ４において、グラフ５１に示す溶離液１０の混合比の時間変化がさらに算出されてもよい。
【００３３】
（第４の工程）ステップＳ５において、混合比制御部２２ｂは、ステップＳ４で求められた混合比を有する溶離液１０が所定時間だけカラム１８に送液されるような制御信号を電磁弁操作部３１に順次出力する。電磁弁操作部３１はこの制御信号に基づいて電磁弁１４を開閉させる信号を電磁弁１４に供給する。これにより、カラム１８内での試料の移動度Ｒfを、確実に特定移動度Ｒf0又はその近傍とすることができるので、良好な試料の分離を行わせることができる。
【００３４】
以上説明した本実施の形態によると、任意の第１の特定混合比における試料の移動度Ｒfと、第１の特定混合比とは異なる第２の特定混合比を、それぞれ薄層クロマトグラフィで求めておけば、所望の特定移動度Ｒf0での溶離液の混合比を知ることができる。そのため、溶離液における各成分の混合比の変化に対する試料の移動度Ｒfの変化率を予め得ておかなくても、薄層クロマトグラフィを２回行うことで、適切な移動度Ｒf0となる溶離液条件でクロマトグラフィを実行することができる。従って、製造者は、溶離液における各成分の混合比の変化に対する試料の移動度Ｒfの変化率を予め得ておかなくてもよいため、多種の溶離液での変化率を求めるという煩雑な作業が不要となる。また、ユーザは、薄層クロマトグラフィを２回行うことで、いかなる溶離液を使用したクロマトグラフィも実行可能である。
【００３５】
以上、本発明の好適な実施の形態について説明したが、本発明は上述の実施の形態に限られるものではなく、特許請求の範囲に記載した限りにおいて様々な設計変更が可能なものである。例えば、液体クロマトグラフ装置１１の具体的な構成は様々な形態に変更することができる。また、液体クロマトグラフ制御装置２１のハードウェア構成は任意に変更可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＴＬＣを行う装置を示す斜視図である。
【図２】ＴＬＣを行う際のシリカゲル薄層板の模式図であり、（ａ）はＴＬＣ前、（ｂ）はＴＬＣ後をそれぞれ示している。
【図３】本発明が適用される液体クロマトグラフ装置を示す模式図である。
【図４】本発明の一実施の形態による液体クロマトグラフ制御装置のブロック図である。
【図５】図４に示す液体クロマトグラフ制御装置のディスプレイへの表示例を描いた図面である。
【図６】本発明の一実施の形態による液体クロマトグラフの実行方法のフローチャートである。
【図７】混合比を横軸に、移動度Ｒfを縦軸にとったグラフである。
【符号の説明】
【００３７】
１  ＴＬＣ装置
２  シリカゲル薄層板
３  試料
４  溶離液
５  容器
１１  液体クロマトグラフ装置
１２、１３  容器
１４  電磁弁
１５  混合器
１６  ポンプ
１７  インジェクター
１８  カラム
２０  フラクションコレクター
２１  液体クロマトグラフ制御装置
２２  ＣＰＵ
２２ａ  混合比演算部（混合比演算手段）
２２ｂ  混合比制御部（混合比制御手段）
２５  メモリ
２５ａ  実測値記憶部（実測値記憶手段）
２６  ハードディスク
２８  入出力部
２９  入力部
３０  ディスプレイ
３１  電磁弁操作部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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