(57)【要約】【課題】サンプルＤＮＡ調整の際やキャピラリー管内でサンプルＤＮＡが電気泳動する際に生じる再結合ＤＮＡの発生を無くし正確な定量分析が行えるＤＮＡ検出方法を提供することを目的する。【解決手段】特定の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡおよび／又は前記二本鎖ＤＮＡの塩基配列の一部が異なる二本鎖ＤＮＡとから成るサンプルＤＮＡを電気泳動させて分離するＤＮＡ検出方法において、ピロールイミダゾールポリアミドとポリエチレングリコールからなるコンジュゲートをキャピラリーに充填する工程と、前記コンジュゲートが充填された前記キャピラリー中に前記サンプルＤＮＡを注入する工程と、前記キャピラリーの両端に電圧を印加して前記サンプルＤＮＡを電気泳動させる工程と、を含むＤＮＡ検出方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡおよび／又は前記二本鎖ＤＮＡの塩基配列の一部が異なる二本鎖ＤＮＡとから成るサンプルＤＮＡを電気泳動させて分離するＤＮＡ検出方法において、
ピロールイミダゾールポリアミドとポリエチレングリコールからなるコンジュゲートをキャピラリーに充填する工程と、
前記コンジュゲートが充填された前記キャピラリー中に前記サンプルＤＮＡを注入する工程と、
前記キャピラリーの両端に電圧を印加して前記サンプルＤＮＡを電気泳動させる工程と、
を含むＤＮＡ検出方法。
【請求項２】
前記コンジュゲートは、［化１］の一般式で表される請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
【化１】
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但し、ＸはＮ−メチルピロールもしくは１−メチルイミダゾールであり、Ｒは任意の構造を示し、Ｚはポリエチレングリコールを示し、Ｌは任意の構造を示し、Ｌ’はＣＯ-ＮＨ-を示し、Ｌ’’は−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨ−を示し、nは４から８の範囲にあるものとする。
【請求項３】
前記コンジュゲートのポリエチレングリコールの重量平均分子量は、２、０００〜１５０、０００である請求項１又は請求項２に記載のＤＮＡ検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡにおける一部の塩基配列の違いを検出するＤＮＡ解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患と遺伝子の関係を正確に理解することが可能になり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。
【０００３】
特にＤＮＡのＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの略で「一塩基多型」と一般に称される。）が注目されている。それは、ＳＮＰが持つ特異性にある。ＳＮＰは、ヒトや動物に普遍に見られるが、同じ種でも個体によりＳＮＰが異なる。すなわちＳＮＰの違いを調べることにより、各個人の疾患に対する罹患率や薬剤に対する効果や感受性を予測し、個人に合わせた医療を行うことが出来る。さらには、ヒトや動物の親子関係の特定ができると考えられている。
【０００４】
このＳＮＰや一部の塩基配列が異なるＤＮＡを調べる方法として、アフィニティキャピラリー電気泳動法を利用した遺伝子診断装置と遺伝子診断方法がある。（例えば特許文献１を参照。）この方法は、まず目的配列に相補的なプローブＤＮＡに高分子化合物を結合させたコンジュゲートＤＮＡを作製する。このコンジュゲートＤＮＡは、高分子化合物のため、キャピラリー内で移動し難くなる性質を持つ。このコンジュゲートＤＮＡを電気浸透流が起きないようにコーティングされたキャピラリー管に充填し、陰極側から一本鎖のサンプルＤＮＡを注入して電圧を印加する。その際に、コンジュゲートＤＮＡと完全に相補的な配列を持ったサンプルＤＮＡは、充填したコンジュゲートＤＮＡとの相互作用により泳動が妨げられる。このときＳＮＰをもったサンプルＤＮＡと完全に相補的な配列を持ったサンプルＤＮＡとでコンジュゲートＤＮＡとのハイブリダイゼーションにおける親和性の差を電気泳動の移動度で比較することにより、ＳＮＰを持つＤＮＡを明瞭に識別出来る。
【０００５】
高分子化合物を結合させたコンジュゲートＤＮＡを用いて、サンプルＤＮＡのＳＮＰを判別するときは、サンプルＤＮＡとコンジュゲートＤＮＡを結合（以下、ハイブリという）させるためにサンプルＤＮＡを一本鎖の状態にする。サンプルＤＮＡは生体試料からゲノムＤＮＡを抽出し、蛍光色素を標識したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲで増幅した後、一本鎖に変性（サンプルＤＮＡ調整と呼ぶ。）する。調整したサンプルＤＮＡをコンジュゲートＤＮＡが充填されたキャピラリー管内に注入し、電気泳動により増幅されたＰＣＲ産物を検出部で光学的に検出する。
【特許文献１】特開２００２−３４０８５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の技術では、サンプルＤＮＡ調整の際やキャピラリー管内でサンプルＤＮＡが電気泳動する際に、ＰＣＲ産物が変性した相補鎖の一部とサンプルＤＮＡとが再結合して二本鎖に戻る現象が生じる。これらのサンプルＤＮＡを電気泳動により分離すると、コンジュゲートＤＮＡに結合しない非結合型ＤＮＡ、二本鎖に再結合した二本鎖になった再結合ＤＮＡ、コンジュゲートＤＮＡに結合する結合型ＤＮＡの順番でピークが検出される。この再結合ＤＮＡによるピーク値は、測定すべき非結合型ＤＮＡのピーク値に近い値であり、次に測定すべき結合型ＤＮＡピークよりも数倍も大きい値を示す。また、再結合ＤＮＡのピークが生じる位置は、条件により大きく移動するので、正確な測定が出来ないという課題を有していた。
【０００７】
本発明は、前記課題に檻みてなされたものであり、サンプルＤＮＡ調整の際やキャピラリー管内でサンプルＤＮＡが電気泳動する際に生じる再結合ＤＮＡの発生を無くし正確な定量分析が行えるＤＮＡ検出方法を提供することを目的する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従来の課題を解決するために、本発明のＤＮＡ検出方法は、特定の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡおよび／又は前記二本鎖ＤＮＡの塩基配列の一部が異なる二本鎖ＤＮＡとから成るサンプルＤＮＡを電気泳動させて分離するＤＮＡ検出方法において、ピロールイミダゾールポリアミドとポリエチレングリコールからなるコンジュゲートをキャピラリーに充填する工程と、前記コンジュゲートが充填された前記キャピラリー中に前記サンプルＤＮＡを注入する工程と、前記キャピラリーの両端に電圧を印加して前記サンプルＤＮＡを電気泳動させる工程とを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＤＮＡ検出方法によれば、サンプルＤＮＡを二本鎖ＤＮＡのまま検出することができるので再結合ＤＮＡが発生せず、測定の際に不要なノイズとなっていた再結合ＤＮＡのピークの発生を無くすことができる。そのため、これまで定量分析が困難であった非結合型ＤＮＡのピークと結合型ＤＮＡのピークを独立して計測することができ、さらに精密なＤＮＡ分析を可能にするものである。さらに、二本鎖ＤＮＡを直接検出することで、煩雑なサンプルＤＮＡの調製工程が不要となり、迅速にＤＮＡを検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明のＤＮＡ検出方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１１】
（実施の形態１）
最初に、特定の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡ及び／または特定の塩基配列の一部が異なる塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡから成るサンプルＤＮＡを電気泳動により分離して、それぞれの二本鎖ＤＮＡを検出する方法について説明する。
【００１２】
図２は、本発明のＤＮＡ検出を行うＤＮＡ装置の構成を簡略に示したものである。図２において、キャピラリー１には、緩衝液が含まれたコンジュゲート１０が充填されており、陰電極２の側の端部にサンプルＤＮＡ９が充填されている。容器４と容器５には緩衝液６が内部に入っており、容器５には陽電極３が挿入されており、容器４には陰電極２が挿入されている。更に、容器４と容器５にはキャピラリー１の端部が挿入されている。キャピラリー１の容器５の側に検出部７があり、キャピラリー１を移動してきた特定の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡ、ならびに特定の塩基配列の一部が異なる塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを検出できる。陽電極３と陰電極２は電源制御部８に連結されており、電源制御部８によって所定の電圧を印加することができる。以上のように構成されたＤＮＡ検出装置について、以下その動作、作用を説明する。
【００１３】
まず、本発明の実施の形態のサンプルＤＮＡについて説明をする。本発明の実施の形態で解析するサンプルＤＮＡは、植物、動物、または人の細胞や血液等から入手したＤＮＡを鋳型にＰＣＲなどの方法を利用して目的のＤＮＡ部分を増幅する。これらのＰＣＲ産物は、後述するコンジュゲートがＰＣＲ産物の複数部位に結合しないような長さが適しており、４０ｂｐから１００ｂｐ程度が望ましい。この時、ＰＣＲを行うフォワード側のプライマーＤＮＡには５'末端に蛍光標識が付加されており、ＰＣＲでＤＮＡを増幅した際、片方の鎖の５'末端に標識剤が結合されたＰＣＲ産物が作製される。本実施の形態では蛍光標識がＣｙ５であるものとして説明する。
【００１４】
本発明のコンジュゲートに用いるピロールイミダゾールポリアミドは、二本鎖ＤＮＡに含まれる特定の塩基配列領域に対して特異的に結合することができる物質である。ピロールイミダゾールポリアミドを構成するピロール(Ｐｙ)部位とイミダゾール(Ｉｍ)部位との組み合わせにより、ピロールイミダゾールポリアミドは任意の塩基配列の二本鎖ＤＮＡに結合することができる。Ｉｍ／ＰｙペアはＧＣ塩基対を、Ｐｙ／ＩｍペアはＣＧ塩基対を、Ｐｙ／ＰｙペアはＡＴ塩基対もしくはＴＡ塩基対を認識し結合できることが知られている。例えば、図１に示すピロールイミダゾールポリアミドは、図３に示すようにＩｍ/Ｐｙペア、Ｉｍ／Ｐｙペア、Ｉｍ／Ｐｙペア、Ｐｙ／Ｉｍペアからなっている。よって、このピロールイミダゾールは５'−ＧＧＧＣ−３'・３'−ＣＣＣＧ−５'という塩基配列の二本鎖ＤＮＡ領域に結合することができる。
【００１５】
ピロールイミダゾールポリアミドは、ＩｍとＰｙとからなるペアの数を変えることにより、任意の長さのＤＮＡ塩基配列に特異的に結合することができる。しかしながら、ピロールイミダゾールポリアミドが結合する塩基対数が９以上であると、標的とする特定の塩基配列に対する結合力が高まることにより、標的とする特定の塩基配列に対して一塩基異なる塩基配列にも結合する可能性があるので好ましくない。一方、ピロールイミダゾールポリアミドが結合する塩基対数が３以下であると、標的とする特定の塩基配列の領域とその領域でない位置に存在する非標的の塩基配列にも結合する可能性があるので好ましくない。従って、ピロールイミダゾールポリアミドが結合する塩基対数は、４から８の範囲が望ましい。
【００１６】
コンジュゲートは、先に説明したピロールイミダゾールポリアミドとポリエチレングリコールとを結合させて作製する。ポリエチレングリコールは、電気泳動時にサンプルＤＮＡとコンジュゲートとの相互作用を十分に行うために、電気泳動時のサンプルＤＮＡの速度に対して遅い速度で電気泳動する物質であり、コンジュゲートがキャピラリーから流出しないような錘としての機能を持たせている。このため、ポリエチレングリコールの重量平均分子量は２、０００以上が好ましい。また、ポリエチレングリコールの分子量が大きすぎると、ピロールイミダゾールポリアミドとポリエチレングリコールとの反応時にポリエチレングリコールの反応溶液中での移動速度が低下する。そのため、ピロールイミダゾールポリアミドへの接触機会が少なくなり、ポリエチレングリコールのピロールイミダゾールポリアミドへの反応効率が低下してしまう。反応効率の低下を防ぐためには、ポリエチレングリコールの重量平均分子量は１５０、０００以下が良い。従って、本発明に用いるポリエチレングリコールの重量平均分子量は、２、０００以上から１５０、０００以下の範囲で用いることが好ましい。
【００１７】
コンジュゲートの合成方法は、例えば既知の手法であるペプチド及びタンパク質を化学的に合成する手法であるペプチド固相合成法を利用して行えば良い。ペプチド固相合成では、アミノ基などが修飾されたポリスチレン高分子ゲルのビーズなどの固相担体と、保護基の修飾されたＰｙもしくはＩｍモノマーユニットを用いる。モノマーユニットの詳細については後述する。まず、固相担体と、導入したいＰｙモノマーユニットもしくはＩｍモノマーユニットと、縮合剤であるＨＡＴＵ(０−(７−アゾベンゾトリアゾール−１−イル)−１、１、３、３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート)と、反応溶媒であるＤＩＥＡ(Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン)とを混合してモノマーユニットを固相担体に反応させる。次に、固相担体を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液で処理し、モノマーユニットの保護基を除去する。上述したモノマーユニットの反応と保護基の除去を繰り返して、目的とするピロールイミダゾールポリアミドを固相担体上で合成する。さらに、ＮＨＳ−ＰＥＧを反応させて、目的とするコンジュゲートを得る。最後に、強酸溶液処理により合成したコンジュゲートを固相表面から切り出すことで、コンジュゲートが得られる。合成方法の詳細については、特許文献等（例えば、国際公開番号ＷＯ２００３−０００６８３等）に記載されているので割愛する。
【００１８】
コンジュゲートの濃度は、特定の塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡおよび／又は特定の塩基配列の一部が異なる塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを良好に分離するために、サンプルＤＮＡの濃度に対して５０〜６００倍とするのが適当である。
【００１９】
以上のように作製されたコンジュゲートを緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ-Ｂｏｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０ｍＭ  ｐＨ  ７．４）に入れ、キャピラリーに注入する。このキャピラリーは、電気泳動の際に発生する電気浸透流が生じないようにするため、キャピラリーの内壁をアクリルアミドなどでコーティングするのが好ましい。電気浸透流の防止は、アクリルアミドなどによるコーティングに限ることなく、電気浸透流を抑制できるなら他の方法でも良い。例えば、市販品のコーティングキャピラリーを用いても良い。またキャピラリーは、電気浸透流が発生しない素材でできた、キャピラリーと同程度のサイズであるプラスチック製の微細流路でも良い。
【００２０】
サンプルＤＮＡのキャピラリーへの注入量は、サンプルＤＮＡの注入量が多すぎても少なすぎてもいけない。注入量が多すぎると、電気泳動時にサンプルＤＮＡがブロードしてしまいサンプルＤＮＡの電気泳動分離ができない場合がある。また注入量が少なすぎると、サンプルＤＮＡの注入動作を再現良く行うことは難しい。よって、サンプルＤＮＡのキャピラリーへの注入量は、キャピラリーの有効長の１／５〜１／１０が望ましい。電気泳動によりサンプルＤＮＡを陽電極側へ移動させることが出来るためのキャピラリーへの印加電圧および電流は、２５ｃｍ長のキャピラリーを使用した場合には、各々６ｋＶの電圧及び３〜１６μＡの電流が好ましい。
【００２１】
サンプルＤＮＡの検出は、プライマーのフォワード側の５'末端に標識された蛍光色素Ｃy５を介して検出される。検出部では、励起光（６３０ｎｍ）の照射、蛍光（６６０ｎｍ）の検出が可能な構成となっており、その励起・蛍光波長に対応する蛍光色素であるＣｙ５を検出すればサンプルＤＮＡの存在を検出することができる。
【００２２】
以上、説明したように、本実施の形態１のＤＮＡ検出方法により、再結合ＤＮＡの発生を回避し、ノイズとなるピークの発生を無くすことができる。また、サンプルＤＮＡの調製が不要となるため、迅速にＤＮＡを検出することができる。
【００２３】
以下、本発明の具体的実施例を実施例１として詳細に説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
（実施例１の作製）
〔ＰＣＲ産物の調整〕
ＰＣＲの増幅はＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて増幅した。鋳型は、麦の一種であるマンネンボシと、マンネンボシの一塩基変異体であるイチバンボシを用いた。フォワード側のプライマーは蛍光色素、ここではＣｙ５で標識した、５’−（Ｃｙ５）−ＣＡＡＧＣＡＴＧＴＣＧＣＡＴＣＧＡＡＡＣ−３'（フォワードプライマー、配列表１）を、リバース側のプライマーは５’−ＴＧＣＴＧＣＴＴＧＧＣＧＡＧＧＴＡＣ−３'（リバースプライマー、配列表２）を、それぞれ終濃度５００ｎＭになるように加えた。
【００２４】
反応サイクルは以下のとおりである。９５℃―１０分、（９５℃−３０秒、５５℃―３０秒、７２℃―３０秒）３０サイクル、７２℃―５分。これにより、以下に示す配列を有するマンネンボシ、イチバンボシの５０ｂｐのＰＣＲ産物を作製した。
【００２５】
・マンネンボシのＰＣＲ産物
５'−ＣＡＡＧＣＡＴＧＴＣＧＣＡＴＣＧＡＡＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＣＧＣＣＧＴＡＣＣＴＣＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡ−３’(マンネンボシＰＣＲ産物、配列表３)
・イチバンボシのＰＣＲ産物
５'−ＣＡＡＧＣＡＴＧＴＣＧＣＡＴＣＧＡＡＡＣＧＣＣＣＧAＧＣＣＧＣＣＧＴＡＣＣＴＣＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡ−３’(イチバンボシＰＣＲ産物、配列表４)
〔モノマーユニットの合成〕
固相合成に用いたＰｙモノマーユニット３０、Ｉｍモノマーユニット３１は、図６に示す手順に従って合成した。なお、反応及び精製に用いた試薬、溶媒は市販のものを用いた。用いた試薬の略号は以下の通りである。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）。
【００２６】
（１）１−メチル−２−トリクロロアセチルピロール（２２）の合成：トリクロロアセチルクロリド（２００．０ｇ、１．１０ｍｏl）の塩化メチレン（６００ｍｌ）溶液中に２０（９０．３ｇ、１．１０ｍｏｌ）の塩化メチレン（２００ｍｌ）溶液を３時間かけて滴下した。この際に、窒素ガスを溶液中に噴霧し、反応の際に発生する塩化水素を除去した。一晩撹拌した後、溶媒を減圧下留去した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル−ヘキサン（１：１０、ｖ／ｖ）溶出部よりトリクロロアセチル体２２（１８９．７ｇ、７６％）を得た。
【００２７】
（２）１−メチル−４−ニトロ−２−トリクロロアセチルピロール（２４）の合成：２２（４５．２ｇ、０．２００ｍｏｌ）の無水酢酸（２００ｍｌ）溶液を−４０℃に冷却し、同温下発煙硝酸（１８．５ｍｌ、０．３６０ｍｏｌ）を滴下した。室温で２時間撹拌した後、イソプロパノールを加え、析出した固体をろ別し、ニトロ体２４（２７．２ｇ）を得た。更にろ液を減圧下留去して得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル−ヘキサン（１：１０、ｖ／ｖ）溶出部より更に２４（１０．７ｇ）を得た。（総収率７０％）
（３）１−メチル−４−ニトロ−２−トリクロロアセチルイミダゾール（２５）の合成：トリクロロアセチルクロリド（３６．３ｇ、０．２０ｍｏｌ）の塩化メチレン（１２０ｍｌ）溶液中に２１（１６．４ｇ、０．２０ｍｏｌ）の塩化メチレン（８０ｍｌ）溶液を２時間かけて滴下した。４時間撹拌した後、氷冷下トリエチルアミン（２０．２ｇ、０．２０ｍｏｌ）を滴下した。溶媒を減圧下留去した後、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル−ヘキサン（１：１、ｖ／ｖ）溶出部よりトリクロロアセチル体２３（２３．２ｇ、５１％）を得た。
【００２８】
（４）メチル  ４−ニトロ−１−メチルピロール−２−カルボン酸エステル（２６）の合成：２４（３２．４ｇ、０．１２ｍｏｌ）のメタノール（１４０ｍｌ）溶液中にＤＭＡＰ（０．５０ｇ、４．５５ｍｍｏｌ）を加えた、４０分撹拌した。その後沈殿をろ別し、メタノールで洗浄し２６（１８．９ｇ）を得た。ろ液は溶媒を減圧下留去した後、同様の操作を繰り返し、更に２６（２．３ｇ）を得た。（総収率９７％）
（５）メチル  ４−ニトロ−１−メチルイミダゾール−２−カルボン酸エステル（２７）の合成：２５（７０．０ｇ、２５６ｍｍｏｌ）のメタノール（５００ｍｌ）溶液中にＤＭＡＰ（０．５００ｇ、４．５５ｍｍｏｌ）を加えた後、２時間撹拌した。その後沈殿をろ別し、ジエチルエーテルで洗浄し２７を得た。ろ液は減圧下留去した後、同様の操作を２回繰り返し、２７（４６．０ｇ、９７％）を得た。
【００２９】
（６）１−メチル−４−アミノピロール−２−カルボン酸メチルエステル塩酸塩（２８）の合成：２６（１５．３ｇ、８３．０ｍｍｏｌ）をメタノールとジクロロメタン（１５０ｍｌ、１：２、ｖ／ｖ）混合溶媒に溶解し、１０％パラジウム炭素（３ｇ）を加え懸濁させ、水素雰囲気下で２日間撹拌した。その後、セライトに通してろ過してパラジウム炭素を除去し、ろ液に１０％塩酸を加えた。生じた沈殿をろ別し、２８（４．７１ｇ）を得た。更にろ液を減圧下留去した後、酢酸エチル−メタノールで再結晶を行い２８（６．８６ｇ）を得た。（総収量  １１．６ｇ、７３％）
（７）１−メチル−４−アミノイミダゾール−２−カルボン酸メチルエステル塩酸塩（２９）の合成：２７（２０．０Ｇ、１０８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３００ｍｌ）溶液に１０％パラジウム炭素（５ｇ）を加え懸濁させ、水素雰囲気下で１日間撹拌した。その後セライトに通してろ過してパラジウム炭素を除去し、ろ液に１０％塩酸を加え酸性にした。沈殿物をろ取し、２９（１９．８ｇ、９６％）を得た。
【００３０】
（８）Ｐｙモノマーユニットである４−［（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−１−メチル−２−ピロールカルボン酸（３０）の合成：２８（１０．９ｇ、５７．２ｍｍｏｌ）を蒸留水（８０ｍｌ）に溶解させ、水酸化ナトリウム（９．２ｇ）を加えた。一晩撹拌した後、１Ｎ塩酸で中和し、減圧下留去した。残査を水とエチレングリコールジメチルエーテルの混合溶媒（１００ｍｌ、１：１、ｖ／ｖ）に溶解し、次の反応に用いた。この溶液に、炭酸ナトリウム（５．３ｇ）を溶解させた後、９−フルオレニルメチルクロロホーメート（１７．８ｇ、６８．６ｍｍｏｌ）加えた。一晩撹拌した後、沈殿をろ別し、３０（１２．３ｇ、３４．１ｍｍｏｌ）を得た。更にろ液を１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液とジエチルエーテルの混合溶液（１：１、ｖ／ｖ）に加えた。沈殿はろ別し、更に３０（３．４ｇ）を得た。水層は１０％塩酸で酸性にした後、酢酸エチルで抽出した。その有機層を減圧下留去し、ヘキサン−ジオキサンで再結晶し、Ｐｙモノマーユニットである３０（１．６ｇ）を得た（総収量  １７．３ｇ、８４％）。
【００３１】
（９）Ｉｍモノマーユニットである４−［（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸（３１）の合成：２９（８．２４ｇ、４１．９ｍｍｏｌ）を蒸留水（６０ｍｌ）に溶解させ、水酸化ナトリウム（４．２ｇ）を加えた。一晩撹拌した後、１Ｎ塩酸で中和し、減圧下留去した。残査を水とエチレングリコールジメチルエーテルの混合溶媒（２００ｍｌ、１：１、ｖ／ｖ）に溶解し、次の反応に用いた。この溶液に、炭酸水素ナトリウム（１４．１ｇ）を溶解させた後、９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカルボナート（１６．９ｇ、５０．１ｍｍｏｌ）を加えた。一晩撹拌した後、沈殿をろ別し、３１（１０．８ｇ、２９．７ｍｍｏｌ）を得た。更にろ液を１０％塩酸で酸性にした後、生じた沈殿をろ別し、その沈殿を酢酸エチルで洗浄してＩｍモノマーユニットである３１（１．２ｇ、３．３０ｍｍｏｌ）を得た（総収量  １２．０ｇ、７９％）。
【００３２】
〔コンジュゲートの合成〕
得られたモノマーユニット３０、３１を用いて、各種ピロールイミダゾールポリアミドの合成を行った。合成プロトコールを表１に示す。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
固相合成はペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｐｉｏｎｅｅｒ）を用いて行った。固相担体はＦｍｏｃ−β−アラニンがプレロードされた市販のＷａｎｇ  Ｒｅｓｉｎを用いた。また、ＨＡＴＵ、ＤＩＥＡ及びＰｙ・Ｉｍのモノマーユニットは、固相担体の活性末端に対して４当量用いた。合成前に固相担体をＤＭＦに３０分膨潤させた後、Ｐｉｏｎｅｅｒの合成カラムに詰めた。合成はまず、担体にプレロードされているβ−アラニンのＦｍｏｃ基を、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で５分間処理することにより脱保護した。その後、担体をメタノールで５０秒間洗浄し、導入したいＰｙもしくはＩｍのモノマーユニット、ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡをカラムに通し、６０分間サイクルさせた後、メタノールで再度４０秒間洗浄した。これら脱保護、伸長というサイクルを一サイクルとして、モノマーユニットを目的とするポリアミドの配列通りに順に縮合させた。その後、脱保護を同様に行った後、ＤＭＦ溶液中で、ポリアミドの４等量となる分子量２０、０００のＰＥＧ−ＮＨＳを室温で６時間反応させて、ポリアミドにＰＥＧを修飾した。反応終了後、固相担体をカラムから取り出し、減圧乾燥を行った後、５０ｍｌのナスフラスコ中に移し、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、２．５％水を５ｍｌ加えて３０分間撹拌し、担体から切り出しを行った。精製は０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルを用いたＨＰＬＣにより行い、図１に示すコンジュゲート１１(０．１１ｇ)を得た。得られたコンジュゲート１１をＴｒｉｓ-Ｂｏｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０ｍＭ(ｐＨ  ７．４)で溶解し、コンジュゲートが１０ｕＭとなるように調製した。
【００３５】
〔キャピラリー電気泳動によるＳＮＰ測定〕
図２は、本実施例１にて説明したＤＮＡ検出を行う蛍光キャピラリー電気泳動装置の構成を示したものである。容器４と容器５には緩衝液６(Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０ｍＭ  ｐＨ  ７．４)が内部に入っており、容器５には陽電極３が挿入されており、容器４には陰電極２が挿入されている。更に、容器４と容器５にはキャピラリー１の端部が挿入されている。キャピラリー１は、キャピラリー内壁がコーティングされた内径１００ｕｍキャピラリー管(大塚電子製)を使用した。そして、緩衝液６(Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅr  ｐＨ  ７．４)を含むコンジュゲート１１を充たしたキャピラリー１に、図２に示すようにサンプルＤＮＡ９（マンネンボシ  ２．５ｕＭ、イチバンボシ  ５．０ｕＭ）を注入した。次に、陰電極２・陽電極３間に、電源制御部８により、６ｋＶの電圧を印加して、測定温度２５度にてキャピラリー１内のサンプルＤＮＡ９を電気泳動させ、サンプルＤＮＡ９中の結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡの、コンジュゲート１１に対する親和性の差によって、サンプルＤＮＡ９を分離した。なお、検出部７において、プライマーＤＮＡに標識しておいた蛍光色素Ｃｙ５に対してレーザー励起光６３０ｎｍを照射し、Ｃｙ５から発せられる蛍光を波長６６０ｎｍにてフォトマルチプライヤーで検出した。図４に、本実施例１でのサンプルＤＮＡを測定したグラフを示す。
【００３６】
（比較例の作成）
比較例として、図７に示すコンジュゲートを用いたＤＮＡ検出方法を挙げる。測定すべきサンプルＤＮＡは、本実施例１と同一の蛍光標識されたＰＣＲ産物を変性処理し得られた一本鎖ＤＮＡを使用し、図２と同一の装置にて測定を行った。測定結果を図５に示す。
【００３７】
〔本実施例１と比較例との対比〕
比較例では、図５に示すように、時間の早い方からプライマーのピーク、非結合型ＤＮＡのピーク、再結合ＤＮＡのピーク、結合型ＤＮＡのピークが検出されている。再結合ＤＮＡのピーク値は、非結合型ＤＮＡのピーク値の７４％強の蛍光強度を示し、正確な測定が行われ難いことを示している。一方、本発明の実施例１では、図４に示すように、時間の早い方から、プライマーのピーク、非結合型ＤＮＡのピーク、結合型ＤＮＡのピークが検出されているが、再結合ＤＮＡのピークが消失している。これは、本発明によるコンジュゲートが、従来の一本鎖から成るコンジュゲートに比べ、不要なピークを大幅に抑制できる効果があることを示している。
【００３８】
以上説明したように、本実施例１のＤＮＡ検出方法により、再結合ＤＮＡの発生を回避し、ノイズとなるピークの発生を無くすことができた。また、サンプルＤＮＡの調整が不要となるため、迅速にＤＮＡを検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明にかかるＤＮＡ検出方法は、ＳＮＰ測定においてノイズピークの発生を防止し、ピークの定量性と感度向上に有用である。また、本発明は、マイクロチップを利用した小型ＳＮＰ検出装置への転用が期待され、本発明を利用したＰｏｃｔ(Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ)による遺伝子の迅速診断も可能になると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明におけるコンジュゲート１１の構造式を示した図
【図２】本発明におけるＤＮＡ検出を行う装置の構成を簡略に示した図
【図３】本発明におけるコンジュゲート１１のＤＮＡへの結合を概念的に示した図
【図４】本発明の実施例１を適用した時のサンプルＤＮＡを測定したときに検出される波形を示したグラフ
【図５】従来の方法である比較例で調製したサンプルＤＮＡを測定したときに検出される波形を示したグラフ
【図６】本実施例１におけるＰｙモノマーユニット３０、Ｉｍモノマーユニット３１の合成スキームを示した図
【図７】従来の方法におけるコンジュゲートの構造式を示した図
【符号の説明】
【００４１】
１  キャピラリー
２  陰電極
３  陽電極
４  第１容器
５  第２容器
６  緩衝液
７  検出部
８  電源制御部
９  サンプルＤＮＡ
１０、１１  コンジュゲート
２０  １−メチルピロール
２１  １−メチルイミダゾール
２２  １−メチル−２−トリクロロアセチルピロール
２３  １−メチル−２−トリクロロアセチルイミダゾール
２４  １−メチル−４−ニトロ−２−トリクロロアセチルピロール
２５  １−メチル−４−ニトロ−２−トリクロロアセチルイミダゾール
２６  メチル４−ニトロ−１−メチルピロール−２−カルボン酸エステル
２７  メチル４−ニトロ−１−メチルイミダゾール−２−カルボン酸エステル
２８  １−メチル−４−アミノピロール−２−カルボン酸メチルエステル塩酸塩
２９  １−メチル−４−アミノ−イミダゾール−２−カルボン酸メチルエステル塩酸塩
３０  ４−[（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ]−１−メチル−２−ピロールカルボン酸
３１  ４−[(９−フルオレニルメトリキカルボニル)アミノ]−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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