(57)【要約】【課題】検量線を求める際に、ユーザの操作ばらつきを抑え、正確な検量線を求める事のできる生体試料分析プレートを提供する。【解決手段】個数が既知の検量線作成の為に必要な抗体の個数を持つ抗体グループを検量線作成用ウェルの内部に予め形成された電極の上に複数配置されている検量線作成用ウェルと、生体サンプルを測定するための測定用ウェルとを備えた生体試料分析プレート。前記抗体グループは、請求項１記載の生体試料分析プレート。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
個数が既知の抗体グループを予め複数備えた検量線作成用ウェルと、
生体サンプルを測定するための測定用ウェルとを備えた生体試料分析プレート。
【請求項２】
個数が既知の抗原グループを予め複数備えた検量線作成用ウェルと、
生体サンプルを測定するための測定用ウェルとを備えた生体試料分析プレート。
【請求項３】
前記複数の抗体グループは、検量線作成の為に必要な抗体の個数を持つ抗体グループからなる請求項１記載の生体試料分析プレート。
【請求項４】
前記複数の抗原グループは、検量線作成の為に必要な抗原の個数を持つ抗原グループからなる請求項２記載の生体試料分析プレート。
【請求項５】
前記抗体グループは、前記検量線作成用ウェルの内部に予め形成された電極の上に配置されている請求項１記載の生体試料分析プレート。
【請求項６】
前記抗原グループは、前記検量線作成用ウェルの内部に予め形成された電極の上に配置されている請求項２記載の生体試料分析プレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たんぱく質などの分析をするための生体試料分析プレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫分析の代表的なものとしてＥＬＩＳＡ法がある。一般的なＥＬＩＳＡ法では抗体−抗原反応を用いたサンドイッチ法が実施される。サンドイッチ法は特定の抗原と特異的に結合するように作製された抗体と、測定のための標識剤を標識した抗体が用いられる。標識剤は測定原理の種類によって異なる。電気化学発光法であればルテニウム錯体、アクリジニウム誘導体など、発色法であればペルオキシダーゼやアルカリホスフォターゼなどが標識剤として用いられる。
【０００３】
ＥＬＩＳＡ法を用いた電気化学発光法では、試料の濃度に依存した光学的シグナルを得ることができる。濃度未知の試料の濃度を定量するためには、さらに、未知の試料と同様の容器内および測定プロトコルで、複数の濃度の異なる濃度既知の試料の光学的シグナルを得る。その結果より光学的シグナルと濃度の相関を表す検量線を作成し、その検量線上に濃度未知の試料の光学的シグナルを照らし合わせることにより、濃度を定量する手段がとられている。
【０００４】
ＥＬＩＳＡ法の一般的な手順としては、まず抗体を溶液状態でプラスチック製の容器に分注し、物理化学的な吸着反応により抗体を容器に固相化させる。過剰な抗体を洗浄の後、次に不必要な物理化学吸着による抗原や標識抗体などの物理化学的な吸着を抑えるため、ブロッキングと呼ばれる操作を行う。実際には、スキムミルク、牛血清アルブミンやゼラチンといった蛋白質の中から、用いた抗原、抗体の反応に影響を及ぼさない蛋白質溶液で抗体が結合している部分以外を覆うように吸着させる。このように準備された容器に対して抗原を含む溶液（一般的にはこれが試料と呼ばれる）を加え抗原抗体反応を起こさせる。次に標識剤を標識した抗体溶液を分注し容器−抗体−抗原−標識抗体の複合体を形成し、種々の測定法を用いて測定することで試料である抗原の量を測定する（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
これらの一連の操作において、操作が終了するごとに洗浄しなければならない。そのため、測定の開始から終了まで、一日から二日程度の時間を必要とする。 特に、最初の操作である容器への抗体固相化では、物理化学的な吸着を行うため、確実な吸着には１２時間以上かけて固相化しなければならない。
【０００６】
免疫分析に用いる容器には、プレート、チューブ、ビーズなどの種類があり用途に応じて使用されている。それらの測定容器の中で、一度に多くの試料を分析する際には、９６ウェルプレートや３８４ウェルプレートが使用されている。これらの９６ウェルプレートや３８４ウェルプレートは、プレートの製造者側があらかじめプレートに過剰な量の抗体を固相化している。
【特許文献１】特開２００４−３４０８１８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記従来の構成では、検量線を求めるためには、濃度が異なる濃度既知のサンプルを用意するための検量線作成ウェルが多数必要であった。そのため、互いに濃度の異なる濃度既知の試料を、検量線作成ウェルの個数分、ユーザが充填しなければならない。この充填の操作は、検量線作成ウェルごとに同じ操作を行うが、操作回数が増えるに従いユーザの操作ばらつきにより正確な検量線が求め難いという課題を有していた。
【０００８】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、検量線を求める際に、ユーザの操作ばらつきを抑え、正確な検量線を求める事のできる生体試料分析プレートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記従来の課題を解決するために、本発明の生体試料分析プレートは、個数が既知の抗体グループを予め複数備えた検量線作成用ウェルと、生体サンプルを測定するための測定用ウェルとを備えていることを特徴としたものである。
【００１０】
また、本発明は、個数が既知の抗原グループを予め複数備えた検量線作成用ウェルと、生体サンプルを測定するための測定用ウェルとを備えることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の生体試料分析プレートによれば、検量線を作成する際にユーザの操作ばらつきを軽減して正確な検量線を求める事ができる。特に、ユーザがこの操作に慣れていない非熟練者でも経験を積んだ熟練者と同等以上の正確な検量線を作成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明の生体試料分析プレートの実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１３】
（実施の形態１）
図１は、本発明の第１の実施の形態における生体試料分析プレートの全体図を示す。図１（ａ）は、生体試料分析プレートの全体図を示しており、図１（ｂ）は、図１（ａ）のＡ-Ａ‘断面図を示している。
【００１４】
図１において、本実施例での生体試料分析プレート１０１は、Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ（以下、ＰＳと称す）樹脂を用いて作製し、その外形寸法は、横１２５ｍｍ×縦８５ｍｍである。生体試料分析プレート１０１には、図１に示すように検量線を作成するための検量線作成ウェル１０２とサンプルを測定するための測定用ウェル１０３とを持つ。本実施例における検量線作成ウェル１０２の寸法は、横５ｍｍ×縦７０ｍｍ×深さ１０ｍｍの長穴とし、生体試料分析プレート１０１内に並列に６つ配置した。また、測定用ウェル１０３の寸法は、直径５ｍｍ、深さ１０ｍｍのザグリ穴であり、測定用ウェル１０３に平行して６群を配置した。
【００１５】
図２に、本実施例における検量線作成ウェルの拡大図を示す。図２において、検量線作成ウェル１０２内には、第１の測定領域２０１、第２の測定領域２０２、第３の測定領域２０３、第４の測定領域２０４、第５の測定領域２０５、第６の測定領域２０６、第７の測定領域２０７、第８の測定領域２０８が検量線作成ウェル１０２の長手方向に配置されている。
【００１６】
図３に、本発明の第１の実施の形態における測定領域の詳細図を示す。図３のように、各測定領域には抗ＩｇＧ抗体３０１が固相化されている。抗ＩｇＧ抗体３０１は、ＢＳＡのみに特異的に結合するたんぱく質であり、市販品で濃度が既知の抗体である。固相化されている抗ＩｇＧ抗体の濃度は例えば、測定領域２０１が０、測定領域２０２が７．８ｎｇ／ｍｌ、測定領域２０３が１５．６３ｎｇ／ｍｌ、測定領域２０４が３１．２５ｎｇ／ｍｌ、測定領域２０５が６２．５ｎｇ／ｍｌ、測定領域２０６が１２５ｎｇ／ｍｌ、測定領域２０７が２５０ｎｇ／ｍｌ、測定領域２０８が５００ｎｇ／ｍｌのように、各測定領域で異なった濃度の抗ＩｇＧ抗体を固定化してある。
【００１７】
図４に、本発明の第１の実施の形態における検量線の作成プロセスを示す。図４において、検量線作成プロセスは、ＳＴＥＰ１：抗ＩｇＧの充填、ＳＴＥＰ２：抗原抗体反応、ＳＴＥＰ３：洗浄、ＳＴＥＰ４：標識剤の充填、ＳＴＥＰ５：抗原抗体反応、ＳＴＥＰ６：洗浄、ＳＴＥＰ７：測定の７つのステップで構成される。次に、図５を用いて、本発明の第１の実施の形態における検量線の作成プロセスの詳細を説明する。
【００１８】
図５（ａ）に、検量線作成ウェルの長手方向の断面図を示す。図において、検量線作成ウェル１０２内には第１の測定領域２０１、第２の測定領域２０２、第３の測定領域２０３、第４の測定領域２０４、第５の測定領域２０５、第６の測定領域２０６、第７の測定領域２０７、第８の測定領域２０８があり、図３で説明したように、検量線を作成するために必要な濃度の抗ＩｇＧ抗体３０１を固定化してある。
【００１９】
次に図４で説明した各ＳＴＥＰを、図５（ｂ）から図５（ｈ）を用いて説明する。図５（ｂ）に、ＳＴＥＰ１（ＩｇＧの充填）の模式図を示す。図５（ｂ）において、ＳＴＥＰ１ではＩｇＧ５０１を検量線作成ウェル１０２に５０００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｌ充填する。ＩｇＧ５０１は、血漿中に最も豊富に含まれるたんぱく質で、生化学分野の実験において標準たんぱく質として使用されている。ＩｇＧ５０１は、固定化された抗ＩｇＧ抗体３０１に対して過剰量充填する。従来の９６穴ウェルプレートを用いて検量線を作成した場合、測定領域がウェルで区切られているため、ＩｇＧをウェル毎にピペッティング操作をしなければならない。しかし、本発明の生体試料分析プレート１０１を用いた場合には、１つのウェルに複数の測定領域が設置されているため、ＩｇＧの充填操作は、少なくとも１回でよい。したがって、各測定領域間でのピペッティング操作による作業誤差がない。
【００２０】
図５（ｃ）に、ＳＴＥＰ２（抗原抗体反応）の模式図を示す。図５（ｃ）において、ＳＴＥＰ２では、生体試料分析プレート１０１を６０分間、静置する。そうすることで、充填したＩｇＧ５０１と検量線作成ウェル上に固定化されている抗ＩｇＧ抗体３０１とが抗原抗体反応で特異的に結合する。
【００２１】
図５（ｄ）に、ＳＴＥＰ３（洗浄）の模式図を示す。図５（ｄ）において、ＳＴＥＰ３では、検量線作成ウェル１０２に洗浄液５０２を充填および廃棄する。洗浄液５０２には、水中の不純物を除去した超純水を用いる。洗浄操作は、検量線作成ウェル１０２に洗浄液５０２を１０００μｌ充填し、廃棄する作業を３回繰り返して完了する。洗浄液５０２の充填および廃棄により、抗原抗体反応しなかったＩｇＧ５０１を検量線作成ウェル１０２から除去する。
【００２２】
図５（ｅ）に、ＳＴＥＰ４（標識剤の充填）の模式図を示す。図５（ｅ）において、ＳＴＥＰ４では、検量線作成ウェル１０２に標識剤５０３を１０００ｍｌ充填する。標識剤５０３には、吸光法で一般的に用いられるＨＲＰ（ペルオキシダーゼ）を使用する。標識剤５０３はあらかじめ抗ＩｇＧ抗体３０１と結合されている。標識剤５０３は、固定化された抗ＩｇＧ抗体３０１に対して過剰量充填する。
【００２３】
図５（ｆ）に、ＳＴＥＰ５（抗原抗体反応）の模式図を示す。図５（ｆ）において、ＳＴＥＰ５では、生体試料分析プレート１０１を６０分間、静置あるいは揺動する。そうすることで、標識剤５０３に結合した抗ＩｇＧ抗体３０１とＩｇＧ５０１とが抗原抗体反応で特異的に結合する。
【００２４】
図５（ｇ）に、ＳＴＥＰ６（洗浄）の模式図を示す。図５（ｇ）において、ＳＴＥＰ６では、検量線作成ウェル１０２に洗浄液５０２を充填および廃棄する。洗浄操作は、洗浄液５０２を検量線作成ウェル１０２に１０００μｌ充填し、廃棄する作業を３回繰り返して完了する。洗浄液５０２の充填および廃棄により、抗原抗体反応しなかった標識剤５０３および標識剤５０３に結合している抗ＩｇＧ抗体３０１を検量線作成ウェル１０２から除去する。その後、発色開始剤ＴＭＢを各測定領域に１００μｌずつ充填し、５分間静置した後、停止剤ＨＣｌを各測定領域に１００μｌずつ充填する。
【００２５】
図５（ｈ）に、ＳＴＥＰ７（測定）の模式図を示す。図５（ｈ）において、ＳＴＥＰ７では、測定器５０４を使用して、測定領域に存在するＩｇＧ５０１の量に依存した光学的シグナルを得る。測定器５０４は、４５０ｎｍの光を各測定領域に照射し、透過した光を測定することにより吸光度を測定することができる。
【００２６】
従来の９６穴ウェルプレート（比較例）と、本願発明の生体試料分析プレート（実施例）を用いて、同一の試料を、同一の条件下において吸光度測定をし、検量線を作成した。比較例のプレートを用いた検量線作成においては、試料として濃度が１５．６２５〜２５０（ｎｇ／ｍｌ）のＩｇＧを使用した。また、比較例のプレートには、あらかじめ濃度が５０００（ｎｇ／ｍｌ）の抗ＩｇＧ抗体が固定化されている。実施例のプレートを用いた検量線作成においては、試料として濃度が５０００（ｎｇ／ｍｌ）のＩｇＧを使用した。また、実施例のプレートには、あらかじめ濃度が１５．６２５〜２５０（ｎｇ／ｍｌ）の抗ＩｇＧ抗体が固定化されている。試料充填後は、図５で示したとおり、洗浄、標識剤の充填、抗原抗体反応、洗浄、測定の順で吸光度を測定する。吸光度測定には、日本モレキュラーデバイス社製マルチプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘを用いた。表１に、比較例と実施例のプレートを用いて得た吸光度とＩｇＧ濃度と吸光度との相関係数（Ｒ自乗値）を示す。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
表１に示した実験結果より、明らかなように実施例の相関係数は比較例のそれに比べても０．０２程度高い値を示している。これは、本発明による実施例が、従来法で行われていた検量線作成方法と同等以上の精度を持つことを示している。また、本実施例での検量線作成のための工程は、予め検量線作成ウェルに５種類の濃度の抗ＩｇＧ抗体を固定化しているため、比較例と比べて１／５の作業時間で検量線を作成することが出来る。また、一度の操作で検量線を作成することが出来るので、検量線を作成する際にユーザの操作ばらつきが無く、正確な検量線を求める事ができる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明にかかる生体試料分析プレートは、検量線を作成する際にユーザの操作ばらつきを軽減して正確な検量線を求める事ができる。特に、ユーザがこの操作に慣れていない非熟練者でも経験を積んだ熟練者と同等以上の正確な検量線を作成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】（ａ）生体試料分析プレートの全体図（ｂ）Ａ-Ａ‘断面図
【図２】本発明の実施の形態１における検量線作成ウェルを示す拡大図
【図３】本発明の実施の形態１における測定領域の詳細図
【図４】本発明の実施の形態１における検量線の作成プロセスを示す図
【図５】（ａ）検量線作成ウェルの断面図（ｂ）ＳＴＥＰ１（ＩｇＧの充填）の模式図（ｃ）ＳＴＥＰ２（抗原抗体反応）の模式図（ｄ）ＳＴＥＰ３（洗浄）の模式図（ｅ）ＳＴＥＰ４（標識剤の充填）の模式図（ｆ）ＳＴＥＰ５（抗原抗体反応）の模式図（ｇ）ＳＴＥＰ６（洗浄）の模式図（ｈ）ＳＴＥＰ７（測定）の模式図
【符号の説明】
【００３１】
１０１  生体試料分析プレート
１０２  検量線作成ウェル
１０３  測定用ウェル
２０１  第１の測定領域
２０２  第２の測定領域
２０３  第３の測定領域
２０４  第４の測定領域
２０５  第５の測定領域
２０６  第６の測定領域
２０７  第７の測定領域
２０８  第８の測定領域
３０１  抗ＩｇＧ抗体
５０１  ＩｇＧ
５０２  洗浄液
５０３  標識剤
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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