(57)【要約】      （修正有）【課題】基体表面への夾雑物の非特異吸着を良好に防止すると共に標的物質を特異的に捕捉するためのグラフトポリマー含有基体およびその製造方法を提供する。【解決手段】グラフトポリマーが表面に形成された基体であって、前記グラフトポリマーがカルボキシル基、スクシンイミド基、アルデヒド基、エポキシ基、ブロモ基、アミノ基、あるいはマレイミド基のいずれかを含む官能基を有する構成単位を含むグラフトポリマー含有基体。【選択図】図１
2009286968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラフトポリマーが表面に形成された基体であって、前記グラフトポリマーが下記一般式（１）および一般式（２）で示される構成単位を含むことを特徴とするグラフトポリマー含有基体。
【化１】
2009286968.tif 000030
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は水素原子あるいはメチル基である。Ｒ４はカルボキシル基、スクシンイミド基、アルデヒド基、エポキシ基、ブロモ基、アミノ基、あるいはマレイミド基のいずれかを含む基である。Ｘは親水性の架橋スペーサーである。ｌ，ｍ，ｎは１以上の整数である。）
【請求項２】
前記Ｘが４ユニット以上のエチレングリコール重合体であることを特徴とする請求項１に記載のグラフトポリマー含有基体。
【請求項３】
前記Ｒ４の少なくとも一部に標的物質捕捉体が結合していることを特徴とする請求項１あるいは請求項２に記載のグラフトポリマー含有基体。
【請求項４】
基体表面にグラフトポリマーが形成されたグラフトポリマー含有基体の製造方法であって、下記一般式（３）あるいは一般式（４）で示されるモノマーをグラフト重合する工程、未反応の前記モノマーの末端を改変することによって、カルボキシル基、アルデヒド基、スクシンイミド基、アミノ基、マレイミド基、グリシジル基のいずれかの官能基を導入する工程、を含むことを特徴とするグラフトポリマー含有基体の製造方法。
【化２】
2009286968.tif 000031
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’は水素原子あるいはメチル基を示す。Ｘは親水性の架橋スペーサーを示す。）
【請求項５】
表面に重合開始剤を固定した基体表面に、前記一般式（３）あるいは一般式（４）で示されるモノマーをグラフト重合することを特徴とする請求項４に記載のグラフトポリマー含有基体の製造方法。
【請求項６】
前記Ｘが４ユニット以上のエチレングリコール重合体であることを特徴とする請求項４あるいは請求項５に記載のグラフトポリマー含有基体の製造方法。
【請求項７】
前記グラフト重合がリビング重合であることを特徴とする請求項４乃至６のいずれかの項に記載のグラフトポリマー含有基体の製造方法。
【請求項８】
前記リビング重合がリビングラジカル重合であることを特徴とする請求項４乃至７のいずれかの項に記載のグラフトポリマー含有基体の製造方法。
【請求項９】
検出領域を有する基体と、該基体の表面に存在するグラフトポリマーと、該重合体に結合する第一の標的物質捕捉体とを有し、グラフトポリマーが下記一般式（１）および一般式（２）で示される構成単位を含み、前記グラフトポリマーが有する未反応のモノマーの末端の少なくとも一部に、前記第一の標的物質捕捉体が結合していることを特徴とする標的物質検出素子。
【化３】
2009286968.tif 000032
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は水素原子あるいはメチル基である。Ｒ４はカルボキシル基、スクシンイミド基、アルデヒド基、エポキシ基、ブロモ基、アミノ基、あるいはマレイミド基のいずれかを含む基である。Ｘは親水性の架橋スペーサーである。ｌ，ｍ，ｎは１以上の整数である。）
【請求項１０】
請求項９に記載の標的物質検出素子と、標識物質と該標識物質の表面に存在する第二の標的物質捕捉体とからなる標識材料と、からなることを特徴とする標的物質検出キット。
【請求項１１】
前記検出領域が、磁性物質を検出することができる検出領域であり、前記標識物質が磁性物質であることを特徴とする請求項１０に記載の標的物質検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラフトポリマー含有基体、その製造方法および磁気バイオセンサに関し、特にグラフトポリマーからなる高分子膜に標的物質を捕捉する標的物質捕捉体を含むグラフトポリマー含有基体、前記標的物質捕捉体と相互作用する標的物質を高感度に測定する為のバイオセンサに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、検体中の標的物質を検出する手段として分子間の相互作用が用いられてきた。相互作用を用いた手段としては、一方の分子を標的物質捕捉体として基体表面上に固定し標的物質を含む検体を接触させることによって反応を行わせる方法が一般的である。
【０００３】
固定した標的物質捕捉体と相互作用する標的物質を定量的に測定するとき、基体表面の性質もしくは固定方法によっては、前記生体分子と相互作用した標的物質以外に、基体表面に非特異的に吸着した物質も同時に検出してしまう恐れがある。このことが、微量検出を必要とするセンサでは、最小検出感度を低下させる原因となる。そのため、非特異吸着を抑制しつつ、標的物質のみが検出される手法が必要とされている。
【０００４】
基体表面への非特異吸着を防止する技術として、非特許文献１には、ＯＥＧＭＡ（オリゴエチレングリコールメタクリレート）をモノマーとして原子移動ラジカル重合によりＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）センサ表面にＯＥＧＭＡポリマーを高密度に形成し、タンパク質の非特異吸着を防止する技術が開示されている。しかし、ＯＥＧＭＡポリマーに標的物質捕捉体を固定化するような工夫はなされていない。
【０００５】
一方、特許文献１には、バイオセンサ表面に生適合性多孔質マトリックスを形成した後、更に前記マトリックス上に存在するカルボキシル基に標的物質捕捉体を固定化し、夾雑物の非特異吸着を防止して標的物質を検出する技術が開示されている。
【特許文献１】特許第０２８１５１２０号公報
【非特許文献１】“ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ”、２００６，１６，６４０から６４８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１において、基体表面への生体分子の非特異吸着を防止する膜の形成方法とその非特異吸着防止の効果が報告されているが、しかしながら、その膜へ標的物質捕捉体を固定化する方法は記載されていない。
【０００７】
一方、特許文献１においては、バイオセンサ表面への生体分子の非特異吸着を防止した上で、標的物質捕捉体を固定し、標的物質のみを検出する方法が報告されているが、非特許文献１ほど、非特異吸着を防止する効果は高くない。
【０００８】
本発明は、この様な背景技術に鑑みてなされたものであり、基体上に高分子膜を形成し、その上に標的物質を捕捉する標的物質捕捉体を固定化することにより、夾雑物の非特異吸着を良好に防止すると共に標的物質を特異的に捕捉するためのグラフトポリマー含有基体およびその製造方法を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、上記のグラフトポリマー含有基体を用いて、標的物質のみを感度良く検出する標的物質検出素子および標的物質検出キットを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するグラフトポリマー含有基体は、グラフトポリマーが表面に形成された基体であって、前記グラフトポリマーが下記一般式（１）および一般式（２）で示される構成単位を含むことを特徴とする。
【００１１】
【化１】
2009286968.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は水素原子あるいはメチル基である。Ｒ４はカルボキシル基、スクシンイミド基、アルデヒド基、エポキシ基、ブロモ基、アミノ基、あるいはマレイミド基のいずれかを含む基である。Ｘは親水性の架橋スペーサーである。ｌ，ｍ，ｎは１以上の整数である。）
【００１３】
上記の課題を解決するグラフトポリマー含有基体の製造方法は、基体表面にグラフトポリマーが形成されたグラフトポリマー含有基体の製造方法であって、下記一般式（３）あるいは一般式（４）で示されるモノマーをグラフト重合する工程、未反応の前記モノマーの末端を改変することによって、カルボキシル基、アルデヒド基、スクシンイミド基、アミノ基、マレイミド基、グリシジル基のいずれかの官能基を導入する工程、を含むことを特徴とする。
【００１４】
【化２】
2009286968.tif 000004
【００１５】
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’は水素原子あるいはメチル基を示す。Ｘは親水性の架橋スペーサーを示す。）
【００１６】
上記の課題を解決する標的物質検出素子は、検出領域を有する基体と、該基体の表面に存在するグラフトポリマーと、該重合体に結合する第一の標的物質捕捉体とを有し、グラフトポリマーが下記一般式（１）および一般式（２）で示される構成単位を含み、前記グラフトポリマーが有する未反応のモノマーの末端の少なくとも一部に、前記第一の標的物質捕捉体が結合していることを特徴とする。
【００１７】
【化３】
2009286968.tif 000005
【００１８】
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は水素原子あるいはメチル基である。Ｒ４はカルボキシル基、スクシンイミド基、アルデヒド基、エポキシ基、ブロモ基、アミノ基、あるいはマレイミド基のいずれかを含む基である。Ｘは親水性の架橋スペーサーである。ｌ，ｍ，ｎは１以上の整数である。）
【００１９】
上記の課題を解決する標的物質検出キットは、前記標的物質検出素子と、標識物質と該標識物質の表面に存在する第二の標的物質捕捉体とからなる標識材料と、からなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のグラフトポリマー含有基体は、標的物質捕捉体を結合したグラフトポリマーからなる高分子膜が夾雑物の非特異吸着を極めて良好に防止して、標的物質を特異的に捕捉することができる。また、前記グラフトポリマー含有基体が、基体の検出領域に配置されている標的物質検出素子あるいは標的物質検出キットを用いると、高感度に標的物質を検出することができる。
【００２１】
また、本発明のグラフトポリマー含有基体の製造方法は、前記グラフトポリマー含有基体を容易に作製することを可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明者らは、上記課題を解決するために、基体上にマルチビニルモノマーを高密度にグラフトさせることにより、架橋度の高いグラフトポリマーを作製し、前記グラフトポリマーに存在する未反応のビニル基を固定用官能基に改変したグラフトポリマー含有基体を見出した。本発明によれば、基体表面への生体分子の非特異吸着を極めて防止するのみならず、前記基体表面に標的物質捕捉体を固定することができる。
【００２３】
本発明に関わるグラフトポリマー含有基体の構成について図１に沿って説明する。図１は本発明のグラフトポリマー含有基体の一例を表す図である。重合開始剤１０を表面に固定した基体１２を、マルチビニルモノマー（図１中ではジビニルモノマー）を含む溶液に入れて重合する。マルチビニルモノマーの複数のビニル基が重合することにより、グラフトポリマーは架橋構造を形成する。その際、グラフトポリマー主鎖１４は、基体１２表面から略垂直に伸張した炭素−炭素結合によるものである。マルチビニルモノマーのＸ部分は架橋スペーサー１６となる。しかし、多くの場合においてマルチビニルモノマーの中には、特に伸張末端において未架橋となるものが生じる。つまり、グラフトポリマーの中には、未架橋モノマー１８のように、分子内のビニル基のうち一部が重合され、他端がフリーな状態となるものが存在する。未架橋モノマーのフリー末端を残存ビニル基と称する。残存ビニル基を固定用官能基２０に改変することで、所望の分子を固定することが可能となる。例えば、標的物質捕捉体２２のようなものを固定することができる。
【００２４】
グラフトポリマーに固定する分子の密度は、固定する分子の大きさ、あるいは、ビニル基の残存量によって変化する。後者の場合、使用するマルチビニルモノマー、および、ビニル基の残存量はグラフトポリマー形成時の反応条件によって変化させることができる。そのため、本発明によれば、固定分子の密度を自在に変化させることができるのである。
【００２５】
例えば、標的物質捕捉体として、抗体のような大きな分子を固定する場合、固定用官能基が多ければ、抗体分子が多点で結合するため、抗体本来の活性を低下させてしまう。抗体の活性を低下させないためには、固定用官能基ができるだけ少ない方が良い。そのためには、グラフトポリマーにおいては多くが架橋され、抗体分子の大きさ以上の間隔で固定用官能基が存在することが好ましい。
【００２６】
また、非特異吸着を防止するためには、架橋割合が高い方が良い。架橋することで三次元的な構造を形成する為、基板開始重合による一般的なポリマーブラシに比べて、非特異吸着をより防止しやすくなる。架橋されたグラフトポリマーは、他のグラフトポリマーやコート材料に比べ、非特異吸着防止能が高いことが明らかになっている。本発明では、このようなグラフトポリマーを応用することで、標的物質捕捉体を固定できるようになった。
【００２７】
本発明に係るグラフトポリマー含有基体は、グラフトポリマーが表面に形成された基体であって、前記グラフトポリマーが下記一般式（１）および一般式（２）で示される構成単位を含むことを特徴とする。
【００２８】
【化４】
2009286968.tif 000006
【００２９】
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は水素原子あるいはメチル基である。Ｒ４はカルボキシル基、スクシンイミド基、アルデヒド基、エポキシ基、ブロモ基、アミノ基、あるいはマレイミド基のいずれかを含む基である。Ｘは親水性の架橋スペーサーである。ｌ，ｍ，ｎは１以上の整数である。）
前記Ｘが４ユニット以上のエチレングリコール重合体であることが好ましい。
【００３０】
前記Ｒ４の少なくとも一部に標的物質捕捉体が結合していることが好ましい。
本発明に係るグラフトポリマー含有基体の製造方法は、基体表面に形成するグラフトポリマーの製造方法であって、下記一般式（３）あるいは一般式（４）で示されるモノマーをグラフト重合する工程、未反応の前記モノマーの末端を改変することによって、カルボキシル基、アルデヒド基、スクシンイミド基、アミノ基、マレイミド基、グリシジル基のいずれかの官能基を導入する工程、を含むことを特徴とする。
【００３１】
【化５】
2009286968.tif 000007
【００３２】
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’は水素原子あるいはメチル基を示す。Ｘは親水性の架橋スペーサーを示す。）
前記Ｘが４ユニット以上のエチレングリコール重合体であることが好ましい。
【００３３】
前記グラフト重合がリビング重合であることがより好ましい。
前記リビング重合がリビングラジカル重合であることがさらに好ましい。
次に、本発明のグラフトポリマー含有基体を具体的に説明する。
【００３４】
（基体）
本発明に用いる基体としては、金属、金属酸化物、シリコン、ガラス、プラスチックが挙げられるが、以上に限定されない。基体は、リビング重合の重合開始剤を固定でき、ビニル基改変に使用する化学物質および反応溶媒によって影響を受けにくいものであれば、いかなる材料でも良い。いずれの基体にしても、本発明に関するグラフトポリマーを表面に作製することにより、タンパクの非特異吸着の少ない表面を得ることができる。
【００３５】
基体表面に重合開始剤を固定する方法は特に限定されるものではない。例えば、基体が金属であれば、チオール化合物を含む重合開始剤を基体表面に結合するか、又は、前記基体をチオール化合物で前処理した後、続いて重合開始剤を結合する方法が好ましい。
【００３６】
基体表面が金属酸化物、シリコンあるいはガラスであれば、シランカップリング剤を含む重合開始剤を結合させればよい。あるいは、前記基体をシランカップリング剤で前処理した後、続いて重合開始剤を結合する方法が好ましい。
【００３７】
基体がプラスチックであれば、酸素プラズマ処理、ＵＶ処理等により表面を酸化してカルボキシル基を発現させた後、アミノ化合物を含む重合開始剤を結合するか、又はアミノ化合物で前処理した後、続いて重合開始剤を結合する方法が好ましい。
【００３８】
また、本発明の基体の表面は、平らなものであっても、曲線形のものでも構わない。但し、後に記載するグラフト密度は、平らな基体を前提としたものである。そのため、曲線形の基体表面に関しては、曲率を考慮してグラフトポリマー主鎖間の距離を計算することが好ましい。曲線形の基体の適用については後述する。
【００３９】
（マルチビニルモノマー）
本発明に用いられるモノマーは、下記一般式（３）あるいは一般式（４）で表される化合物である。
【００４０】
【化６】
2009286968.tif 000008
【００４１】
式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’は水素原子あるいはメチル基を示す。Ｘは親水性の架橋スペーサーを示す。
即ち、本発明のマルチビニルモノマーは、ビニル基、イソプロペニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基など炭素−炭素二重結合を複数有するものを使用する。上記には架橋スペーサーＸに２つあるいは３つの炭素−炭素二重結合が結合したものを記載しているが、架橋スペーサーＸに４以上の炭素−炭素二重結合が結合したものを、本発明のマルチビニルモノマーとして使用することもできる。
【００４２】
本発明では、一般式（３）あるいは一般式（４）で表される分子内の２つのビニル基間の長さを架橋スペーサー長とし、その間に直列に存在する原子数を原子鎖長とする。架橋スペーサー長はグラフトポリマー主鎖間の平均長さを超える長さであることが好ましい。本発明のグラフトポリマー主鎖とは、炭素−炭素結合の連続したもので、基体に対して略垂直に伸張した鎖を示す。また、一般式（４）などに示される炭素−炭素二重結合が分子内に３以上存在するマルチビニルモノマーを用いる場合は、そのうちの全ての組合せ間の原子鎖長がグラフトポリマー主鎖間距離を超えていることが好ましい。
【００４３】
（架橋スペーサー長）
グラフトポリマー主鎖間の平均長さは、グラフト密度から求められ、重合法によって大きく異なる場合が多い。そのため、本発明ではグラフト密度と架橋スペーサー長の関係について定義する。架橋スペーサー長の範囲は以下のように示される。
【００４４】
グラフトポリマー主鎖間の距離を２ｒ（ｎｍ）、１つのグラフトポリマー主鎖が占める面積をπｒ２としたとき、グラフト密度Ｄ＝（πｒ）−１（鎖／ｎｍ２）となる。このとき、使用するマルチビニルモノマーの架橋スペーサー長ＳＬ（Ｘ＋２）（ｎｍ）が２ｒよりも大きいことが重要である。即ち、
【００４５】
【数１】
2009286968.tif 000009
【００４６】
の範囲にあることで、グラフトポリマー主鎖の自由度を有したまま、マルチビニルモノマーの重合が可能となる。前記条件を用いて重合することにより、基体上に構築されたグラフトポリマー膜の架橋度は高くなる。その結果、グラフトポリマー膜は高いサイズ排除特性を有することが可能となる。また、反応後の残存ビニル基が減少する効果が得られる。また、重合時のマルチビニルモノマーの濃度を可能な限り下げることによって、さらに残存ビニル基が減少する効果が得られる。非特異吸着を防止する方策としては、重合基が減少することによって親水性が向上するため、上記の先行技術よりも好適である。
【００４７】
また、図２中の曲線は、式１から描かれる、本発明におけるグラフト密度Ｄに対する架橋スペーサー長ＳＬ（Ｘ＋２）の下限値である。即ち、本発明では図２中の曲線よりも上の範囲にある架橋スペーサー長を有するマルチビニルモノマーを使用することが好ましい。
【００４８】
好ましくは、図２中の曲線よりも０．３ｎｍ以上長い架橋スペーサー長を適用する。グラフトポリマー主鎖間の長さに対して２原子分程度長いマルチビニルモノマーを使用することにより、分子鎖の自由回転による反応の妨げが少なくなるため、反応効率が高くなる。より好ましくは、図２中の曲線よりも０．５ｎｍ以上長い架橋スペーサー長を適用する。グラフトポリマー全体の自由度が高くなり、非特異吸着防止能がさらに向上する。
【００４９】
また、基体が曲線形である場合は、グラフトポリマーの膜厚によって架橋スペーサー長は上下する。例えば、基体が微粒子であって、グラフトポリマーを含めた微粒子の半径が、基体微粒子の半径の（１＋ｒ）倍（ｒは基体微粒子の半径である。）であるとき、必要な架橋スペーサー長は図２に示されるＳＬ（Ｘ＋２）の（１＋ｒ）２倍となる。例えば、直径２００ｎｍの微粒子に対して１０ｎｍの膜厚のグラフトポリマーを微粒子表面に作製する場合は、図２のＳＬ（Ｘ＋２）よりも２１％長い架橋スペーサー長を使用することが好ましい。
【００５０】
（マルチビニルモノマーの原子鎖長）
図２の架橋スペーサー長の範囲をマルチビニルモノマーの原子鎖長に当てはめると、以下のように示される。
【００５１】
まず、各々の原子間距離から考える。架橋スペーサーにおける各原子間結合長の平均値をＢＡＶＥとすると、Ｘ原子鎖長ＣＬＸ（原子）について以下のような式が成り立つ。
【００５２】
【数２】
2009286968.tif 000010
【００５３】
原子間結合の標準的な長さは、Ｃ−Ｃ単結合：０．１５４ｎｍ、Ｃ−Ｎ単結合：０．１４９ｎｍ、Ｃ−Ｏ単結合：０．１４３ｎｍである。また、上記結合の標準的な結合角は１０９．２８度であるため、各々の平均結合長に０．８１６（＝ｃｏｓ［（１８０−１０９．２８）／２］）を乗したものが有効な結合長となる。（有効数字３桁、以下同様）仮に、Ｃ−Ｃ単結合の繰返しにより架橋スペーサーが構成される場合、式２のＢに０．１２６（＝０．１５４×０．８１６）を代入することにより得られ、グラフト密度Ｄに対するＸ原子鎖長ＣＬＸの下限値は図３中の曲線のようになる。即ち、図３中の曲線よりも上の範囲にある原子鎖長を有するマルチビニルモノマーを使用することが好ましい。
【００５４】
近年、多くのモノビニルモノマーを用いたリビング重合によってなされるグラフト密度は、およそ０．５鎖／ｎｍ２である。モノビニルモノマーのグラフト密度がマルチビニルモノマーにも充当すると仮定した場合、式２あるいは図３によれば、Ｘが１３原子鎖長以上のマルチビニルモノマーが該当する。Ｘが１３原子鎖長以上であれば、架橋スペーサー長がグラフトポリマー主鎖間距離よりも長いために、未反応のビニル基の結合が制限されにくいと考えられる。そのため、各々のマルチビニルモノマーが架橋されやすく、ビニル基の残存が少なくなる。この場合、固定する分子に対してビニル基の残存数は適度であり、反応条件等によって所望の残存数に調節することも可能である。その結果、非特異吸着防止能は高く、固定した分子も機能しやすい。
【００５５】
一方、Ｘが１３原子鎖長よりもはるかに短いマルチビニルモノマー（例えば、Ｘ＜１１）を使用したときは、上記と異なる現象が起こる。即ち、一端のビニル基が結合すると、架橋スペーサー長が短いために他端のビニル基とグラフトポリマー主鎖が接触しにくくなると考えられる。前記他端のビニル基が反応できない間に、他のマルチビニルモノマーが結合することで、前記の他端のビニル基は結合できなくなり、未架橋の状態となる。そのため、各々のマルチビニルモノマーが架橋されにくく、ビニル基の残存が多くなる。この場合は、固定する分子に対して残存ビニル基が多くなりすぎるため、分子は多く固定されるが、非特異吸着が多いという点において仕様に適さないことが多い。
【００５６】
さらに、Ｘが１３原子鎖長に近いマルチビニルモノマー（例えば、Ｘ＝１２）を使用した場合には、非常に稀なケースとして、上記２例とは全く異なる現象が起こると考えられる。架橋スペーサー長とグラフトポリマー主鎖間距離がほぼ等しい長さにあるため、一端のビニル基が結合した後、直ちに他端のビニル基が隣接したグラフトポリマー主鎖に結合することが考えられる。グラフトポリマーの伸張は速く、架橋する割合も高くなるが、グラフトポリマー主鎖およびグラフトポリマー全体の自由度が損なわれることが予想される。そのため、各々のマルチビニルモノマーが極めて架橋されやすく、ビニル基の残存量が極めて少なくなるが、非特異吸着防止能は低いと考えられる。但し、分子を固定するために、高いマルチビニルモノマー濃度で重合した場合、残存ビニル基が若干増加する。その結果、グラフトポリマーが自由度を保ち、非特異吸着防止能が上がることが考えられる。また、分子を適度に固定できるため、固定した分子が機能しやすい。
【００５７】
なお、近年の技術により得られるグラフト密度に対する有効な原子鎖長について上述してきたが、技術の進歩によりグラフト密度が向上した際には、Ｘ原子鎖長のさらに短いモノマーを使用することもできる。
【００５８】
より好ましくは、図３中の曲線よりも２原子以上長いＸ原子鎖長を適用する。即ち、近年のリビング重合においては、Ｘが１５原子鎖長以上のマルチビニルモノマーを用いることにより、グラフトポリマー全体の自由度が高くなり、非特異吸着防止能がさらに向上する。また、架橋構造の網目の大きさが、非特異吸着を防止したい分子よりも大きくなり過ぎると、吸着を招く恐れがある。そのため、Ｘ原子鎖長があまりに長いマルチビニルモノマーを使用することは、本発明に適さないと考えられる。
【００５９】
図３中の曲線は、Ｃ−Ｃ単結合が連なった架橋スペーサーの場合の下限値であり、Ｃ−Ｎ単結合、あるいは、Ｃ−Ｏ単結合を有する場合は、その結合数に応じて下限値を上昇する。また、前記結合よりも短い結合を含む場合は親水性を低下させる。上記の３つの単結合よりも長い結合は数多く存在し、親水性を有するものもある。例えば、Ｐ−Ｏ単結合、Ｓ−Ｏ単結合などがあるが、そのような結合を含む場合は、結合距離と結合角を考慮して使用できるＸ原子鎖長の下限値を決めることができる。
【００６０】
上記では、本発明におけるマルチビニルモノマーの原子鎖長について定義した。しかし、グラフトポリマーを構築後、側鎖を切断できないもの、側鎖を切断すると主鎖も切断されてしまうものがある。この場合は、既に報告されている同じグラフト方法によるモノビニルモノマーのグラフト密度から、グラフトポリマー主鎖間の距離を予想することもできる。ある側鎖長（Ｙ）を有するモノビニルモノマーのグラフト密度のデータがあれば、そのおよそ２倍の長さのＸ原子鎖長（２Ｙ）を有するマルチビニルモノマーの密度が、前者のデータとほぼ同程度のグラフト密度を有すると予想することができる。
【００６１】
（親水性マルチビニルモノマー）
本発明において、マルチビニルモノマーが重合されたグラフトポリマーは親水性であるので、前記マルチビニルモノマーのＸは親水性の要素を持つものである。Ｘは親水性の架橋スペーサーを示す。Ｘには酸素原子あるいは窒素原子が含むものが好ましい。
【００６２】
Ｘの親水性の詳細については下記に示す。
Ｘの代表例としては、親水性が高く、かつ、最も汎用的に使用されているエチレングリコール重合体（以下、ＰＥＧと称す）が挙げられる。ＰＥＧの構造式を考慮すると、
ＢＡＶＥ＝（０．１５４×１＋０．１４３×２）／３×０．８１６＝０．１２０である。式２に代入することにより、ＰＥＧを側鎖に有するマルチビニルモノマーを使用したときのＸ原子鎖長ＣＬＸが式３で示される。
【００６３】
【数３】
2009286968.tif 000011
【００６４】
さらに、ＰＥＧユニット数をＵＬＰＥＧ（ｕｎｉｔ）とすると、ＣＬＸ＝３ＵＬＰＥＧ＋１より、
【００６５】
【数４】
2009286968.tif 000012
【００６６】
となる。
また、図４中の曲線は、式４から描かれる、本発明におけるグラフト密度Ｄに対する架橋スペーサー長ＵＬＰＥＧの下限値である。即ち、図４中の曲線よりも上の範囲にあるＰＥＧユニット数を有するマルチビニルモノマーを使用する。
【００６７】
但し、図４が充当するのはＰＥＧの両端に直接ビニル基、あるいは、イソプロペニル基がエーテル結合している場合に限られる。マルチビニルモノマーがＸ内にＰＥＧ以外の他の結合（エステル、アミドなど）を含む場合は、他の結合長さを加えたものを下限値とする。
【００６８】
本発明において使用できるＰＥＧ含有マルチビニルモノマーとしては、ポリエチレングリコールジビニルエーテル、ポリエチレングリコールジアリルエーテル、ポリエチレングリコールジイソプロペニルエーテル、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレートが挙げられるが、以上に限定されない。
【００６９】
好ましくは、４ユニット以上のＰＥＧを適用する。ＰＥＧが４ユニット以上であれば、一方のビニル基が反応しても、側鎖が長いことで未反応のビニル基の自由度が制限されにくいため、未反応のビニル基の反応効率が上昇する。また、ＰＥＧが４ユニット以上である場合、グラフトポリマーの主鎖と側鎖の割合を考慮すると、グラフトポリマー化したときに親水性となりやすい。
【００７０】
また、Ｘ内に部分的にＰＥＧを有するものもマルチビニルモノマーとして使用できる。例えば、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、エチレングリコールとテトラメチレングリコールとの共重合体、エチレングリコールとエチレンイミンとの共重合体、エチレングリコールとプロピレンイミンとの共重合体、エチレングリコールとテトラメチレンイミンとの共重合体、エチレングリコールとグリセロールとの共重合体、エチレングリコールとトリメチロールプロパンとの共重合体、エチレングリコールとペンタエリスリトールとの共重合体、エチレングリコールとトリエタノールアミンとの共重合体、エチレングリコールとトリス（２−アミノエチル）アミンとの共重合体、あるいは、上記化合物の誘導体などをＸ内に含むものが挙げられるが、以上に限定されない。
【００７１】
上記と同様に、エチレンイミン重合体をＸ内に有するものもマルチビニルモノマーとして使用できる。例えば、エチレンイミン重合体、エチレンイミンとエチレングリコールとの共重合体、エチレンイミンとプロピレングリコールとの共重合体、エチレンイミンとテトラメチレングリコールとの共重合体、エチレンイミンとプロピレンイミンとの共重合体、エチレンイミンとテトラメチレンイミンとの共重合体、エチレンイミンとグリセロールとの共重合体、エチレンイミンとトリメチロールプロパンとの共重合体、エチレンイミンとペンタエリスリトールとの共重合体、エチレンイミンとトリエタノールアミンとの共重合体、エチレンイミンとトリス（２−アミノエチル）アミンとの共重合体、あるいは、上記化合物の誘導体などをＸ内に含むものが挙げられるが、以上に限定されない。
【００７２】
また、Ｘ内に陽イオンあるいは陰イオンを含むマルチビニルモノマーも使用することができる。
陽イオンを含むマルチビニルモノマーを使用することにより、陽イオンを表面に帯びた分子の吸着を電荷的な反発で防止することができる。また、陰イオンを含むマルチビニルモノマーを使用しても、同様に陰イオンを表面に帯びた分子の吸着を防止することができる。
【００７３】
陽イオン含有マルチビニルモノマーとしては、アミン含有化合物、四級アンモニウムイオン含有化合物などが挙げられるが、以上に限定されない。
また、陰イオン含有マルチビニルモノマーとしては、カルボキシルイオン含有化合物、ホスフェイトイオン含有化合物、サルファイトイオン含有化合物などが挙げられるが、以上に限定されない。
【００７４】
Ｘ内に両性イオンを含むマルチビニルモノマーを使用することもできる。
マルチビニルモノマー分子内に陽イオンおよび陰イオンを有することにより、非特異吸着を効率的に防止することができる。既に、モノメタクリレートモノマーでは、ベタイン含有化合物、ホスホリルコリン含有化合物などがリビングラジカル重合され、非特異吸着防止効果があることが知られている。
【００７５】
両性イオン含有マルチビニルモノマーとしては、ベタイン含有化合物、ホスホリルコリン含有化合物、アミノ酸が連結してできた化合物などが挙げられるが、以上に限定されない。ベタインとは、正電荷と負電荷を同一分子内の隣り合わない位置に持ち、正電荷をもつ原子には解離しうる水素原子が結合しておらず（四級アンモニウム、スルホニウム、ホスホニウムなどのカチオン構造をとる）、分子全体としては電荷を持たない化合物（分子内塩）の総称である。
【００７６】
また、アシッドホスホオキシポリエチレングリコールモノメタクリレートおよびジエチルアミノエチルモノメタクリレートを混合してできるメタクリロイルポリエチレングリコールアシッドホスフェイトジエチルアミノエチルメタクリレートハーフ塩のように、酸塩基反応によって生じるマルチビニルモノマーも本発明において使用することができる。
【００７７】
尚、上記に挙げたもののうち、複数のマルチビニルモノマーを混合して重合することによりグラフトポリマーを形成しても構わない。また、上記のマルチビニルモノマーと所望のモノビニルモノマーを混合することによりグラフトポリマーを形成しても構わない。
【００７８】
（親水性）
本発明におけるグラフトポリマーの親水性は、グラフトポリマー表面の水に対する接触角が６０°以下を示すものであり、好ましくは、４０°以下を示すものである。
【００７９】
ユニット毎の親水性の定義として、以下のような前例がある。水素結合アクセプター（ＨＢＡ；ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｂｏｎｄ  ａｃｃｅｐｔｏｒ）数が６以上であるか、水素結合ドナー（ＨＢＤ；ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｂｏｎｄ  ｄｏｎｏｒ）数が５以上であるか、あるいは該スペーサー１分子あたりのＨＢＡ数およびＨＢＤ数の総計が９以上の化合物である。またこれらの条件を２つもしくは全て満たすような化合物であってもよい。好ましくは、ＨＢＡ数は９以上であり、ＨＢＤ数は６以上である。（特許文献：国際公開番号ＷＯ２００４／０２５２９７）
【００８０】
ここで、水素結合アクセプター数（ＨＢＡ数）とは、含まれる窒素原子（Ｎ）と酸素原子（Ｏ）の総数であり、水素結合ドナー数（ＨＢＤ数）とは、含まれるＮＨとＯＨの総数である（Ｃ．Ａ．Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２３（１９９７）３−２５）。
【００８１】
本発明においては、前記一般式（１）あるいは一般式（２）で示されるマルチビニルモノマーの架橋スペーサーＸが、１３原子鎖長以上であり、かつ前記ＨＢＡ数およびＨＢＤ数を満たすものであっても良い。
【００８２】
（架橋構造）
マルチビニルモノマーを使用してリビング重合を行う場合、マルチビニルモノマーの側鎖が直ちにスペーサーとなって自然に架橋構造が構築される。これは、リビング重合が、ポリマーの生長末端が常に重合活性であり（ｌｉｖｉｎｇであり）、鎖の長さのそろったポリマーが得られる、という特徴を持つためである。しかし、架橋度についてはモノマーの鎖長とグラフト密度により大きく変化する。架橋度は、重合されたマルチビニルモノマーの全ビニル基に対して、残存ビニル基の割合を求めることによって明確になる。残存ビニル基の割合は、後に示す分光学的手法によって求められる。本発明のグラフトポリマーは、残存ビニル基が１５％以下であることが好ましい。残存ビニル基が１５％以上であれば、表面の反応活性が高いため、基体表面への生体分子および標識物質などの非特異吸着が起こるからである。
【００８３】
より好ましくは、残存ビニル基が２％以上１５％以下である。残存ビニル基が２％未満である場合、グラフトポリマー主鎖間距離とマルチビニルモノマーの架橋スペーサー長が同程度であることが考えられる。グラフトポリマーの伸張は速く、架橋度も高くなるが、グラフトポリマー主鎖およびグラフトポリマー全体の自由度が損なわれると考えられる。その結果、基体表面への生体分子および標識物質などの非特異吸着が起こる場合がある。残存ビニル基が２％以上１５％以下の間にあるグラフトポリマーであれば、より高い非特異吸着防止能を有すると考えられる。
【００８４】
グラフトポリマーの膜厚は、基体表面からのポリマーの結合による膜厚として常識的な範囲であれば、いかなる厚さでも良い。好ましくは、０．５ｎｍ以上である。０．５ｎｍ未満であれば、サイズ排除効果が得られず、非特異吸着が起こりやすい、あるいは、重合開始剤の大きさによっては、グラフトポリマーが不在となる。
【００８５】
さらに好ましい膜厚は、０．５ｎｍ以上１０ｎｍ以下である。本発明のグラフトポリマーによって構築される膜は、膜内の多くが架橋構造である。つまり、三次元的な架橋構造を有するため、基体に対して縦方向に伸張するだけのモノビニルモノマーのグラフト膜と比較すると極薄い膜厚でもサイズ排除効果を有する。このことは、多くのバイオセンサで有利に用いられる。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）、あるいは磁気センサにおいては、素子表面が最も感度の高い部分である。しかし、このようなバイオセンサにおいて非特異吸着を防止することは必須である。そのため、従来は数十ｎｍから数百ｎｍの膜厚を必要とする。本発明を使用すれば、高い感度の部分のロスを最小限とし、非特異吸着を効率的に防止することができる。
【００８６】
（グラフト密度）
モノビニルモノマーから得られる通常のポリマーブラシであれば、グラフト密度は、グラフトポリマー主鎖が１ｎｍ２あたり何鎖存在するかを、膜厚と延びきり鎖長から算出することで得られる（第５６回高分子学会予稿集ｐ．２に掲載）。本発明の架橋性グラフト膜に関しては、架橋スペーサー部分を切断した後、同方法にてグラフト密度を求めてもよい。
【００８７】
本発明において、グラフトポリマー主鎖が０．１鎖／ｎｍ２以上の密度である状態を高いグラフト密度と定義する。このような高いグラフト密度では、以下に示すマルチビニルモノマーの末端ビニル基の多くを重合させることによって、密な架橋構造を作製することができる。好ましくは、グラフト密度が０．３鎖／ｎｍ２以上であれば、多くの共雑タンパク質を物理的に排除できるような、より密な架橋構造を作製することができる。さらに好ましくは、０．４鎖／ｎｍ２以上であれば、短鎖のテトラエチレングリコールジメタクリレートのような比較的安価で市販されているマルチビニルモノマーを使用しても、グラフトポリマー主鎖および親水性スペーサーの自由度を保持することができる。グラフトポリマー主鎖および親水性スペーサーの自由度を高くすることにより、非特異吸着防止能を高めることができる。
【００８８】
高いグラフト密度は、リビング重合法によって達成することができる。また、リビング重合開始基の数を、目的とするグラフト密度になるように調整することができる。
好ましくは、リビングラジカル重合が使用される。多くのモノビニルモノマーを用いたリビングラジカル重合によってなされるグラフト密度は０．５鎖／ｎｍ２程度であることが知られている。
【００８９】
以下にリビングラジカル重合法の詳細を記載する。
（リビングラジカル重合）
一般的にリビングラジカル重合によれば、合成されるポリマーの分子量分布が小さく、かつ基体上に高密度にポリマー層をグラフト化することができる。よって、適当な鎖長のマルチビニルモノマーをリビングラジカル重合すれば、基体上の開始点に各々のビニル基が反応し、基体上に高密度な架橋膜を設けることが可能となる。リビングラジカル重合法としては、以下の重合のいずれかを利用した方法などを挙げることができる。
（１）有機ハロゲン化物などを開始剤とし、遷移金属錯体を触媒とする原子移動ラジカル重合（Ａｔｏｍ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＡＴＲＰ）。
（２）ニトロキシド化合物などのラジカル捕捉剤を用いるニトロキシド媒介重合（Ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＮＭＰ）。
（３）ジチオカルバメイトなどのラジカル捕捉剤を用いる光イニシエーター重合。
【００９０】
本発明においてはいずれの方法によりグラフトポリマー含有基体を製造してもよいが、制御の容易さなどから原子移動ラジカル重合を利用するのが好ましい。
【００９１】
（原子移動ラジカル重合）
リビングラジカル重合が原子移動ラジカル重合の場合、化学式１から３に示すような有機ハロゲン化物、又は化学式４に示すようなハロゲン化スルホニル化合物を重合開始剤として用いることができる。
【００９２】
【化７】
2009286968.tif 000013
【００９３】
原子移動ラジカル重合開始剤が導入された基体を反応溶媒に加えた後、マルチビニルモノマー、遷移金属錯体を添加し、反応系を不活性ガスで置換して原子移動ラジカル重合を行う。これによって、グラフト密度を一定に保持しながら重合を進行させることができる。つまり、重合をリビング的に進行させ、グラフトポリマーを基体上にほぼ均等に成長させることができる。
【００９４】
反応溶媒としては、特に限定されないが、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ピリジン、水、メタノール、エタノール、プロパノ−ル、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、シクロヘキサノール、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、イソプロピルセロソルブ、ブチルセロソルブ、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、トリオキサン、テトラヒドロフラン等を使用することができる。これらは単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。
【００９５】
不活性ガスとして、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
使用する遷移金属錯体はハロゲン化金属とリガンドからなる。ハロゲン化金属の金属種としては、原子番号２２番のＴｉから３０番のＺｎまでの遷移金属が好ましく、更に、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕが好ましい。その中でも、塩化第一銅、臭化第一銅が好ましい。
【００９６】
リガンドとしては、ハロゲン化金属に配位可能であれば特に限定されないが、例えば、２，２’−ビピリジル、４，４’−ジ−（ｎ−ヘプチル）−２，２’−ビピリジル、２−（Ｎ−ペンチルイミノメチル）ピリジン、（−）−スパルテイン、トリス（２−ジメチルアミノエチル）アミン、エチレンジアミン、ジメチルグリオキシム、１，４，８，１１−テトラメチル−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン、１，１０−フェナントロリン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン、ヘキサメチル（２−アミノエチル）アミン等を使用することができる。
【００９７】
遷移金属錯体の添加量は、マルチビニルモノマーに対して、０．００１から１０重量％、好ましくは０．０５から５重量％である。
重合温度は、１０℃から１００℃の範囲であり、好ましくは、２０℃から８０℃の範囲である。
【００９８】
重合終了後、基体をろ過、デカンテーション、沈殿分別、遠心分離等の適切な方法によって分離精製して、グラフトポリマー含有基体を得ることができる。
【００９９】
（ニトロキシド媒介重合）
リビングラジカル重合がニトロキシド媒介重合である場合、化学式５から７に示すようなニトロキシド化合物を重合開始剤として用いることができる。
【０１００】
【化８】
2009286968.tif 000014
【０１０１】
ニトロキシド媒介重合開始剤が導入された基体を反応溶媒に加えた後、マルチビニルモノマーを添加し、反応系を不活性ガスで置換してニトロキシド媒介重合を行う。これによって、グラフト密度を一定に保持しながら重合を進行させることができる。つまり、重合をリビング的に進行させ、グラフトポリマーを基体上にほぼ均等に成長させることができる。
【０１０２】
反応溶媒としては特に限定されないが、前記した同様の溶媒を使用することができる。また、それらを単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。
不活性ガスとして、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
【０１０３】
重合温度は、１０℃から１２０℃の範囲であり、好ましくは、２０℃から１００℃の範囲である。重合温度が４０℃未満では、形成されるグラフトポリマーが低分子量であったり、あるいは重合が進行し難いので好ましくない。
【０１０４】
重合終了後、基体をろ過、デカンテーション、沈殿分別、遠心分離等の適切な方法によって分離精製して、グラフトポリマー含有基体を得ることができる。
【０１０５】
（光イニシエーター重合）
リビングラジカル重合が光イニシエーター重合である場合、化学式８に示すようなＮ，Ｎ−ジチオカルバミン系化合物を重合開始剤として用いることができる。
【０１０６】
【化９】
2009286968.tif 000015
【０１０７】
光イニシエーター重合開始剤が導入された基体を反応溶媒に加えた後、マルチビニルモノマーを添加し、反応系を不活性ガスで置換して光照射することによって光イニシエーター重合を行う。これによって、グラフト密度を一定に保持しながら重合を進行させることができる。つまり、重合をリビング的に進行させ、グラフトポリマーを基体上にほぼ均等に成長させることができる。
【０１０８】
反応溶媒としては特に限定されないが、前記した同様の溶媒を使用することができる。また、それらを単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。
不活性ガスとして、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
【０１０９】
照射する光の波長は、使用する光イニシエーター重合開始剤の種類によって異なる。化学式９に例示する光イニシエーター重合開始剤を有する基体表面にグラフト化する場合、反応系に３００ｎｍから６００ｎｍの波長を示す光を照射することによって光イニシエーター重合が良好に進行する。
【０１１０】
重合温度は、副反応を防止するため、室温あるいはそれ以下の温度であることが好ましい。ただし、同様の効果が得られる範囲においてこの温度領域に限定されるわけではない。
【０１１１】
重合終了後、基体をろ過、デカンテーション、沈殿分別、遠心分離等の適切な方法によって分離精製して、グラフトポリマー含有基体を得ることができる。
【０１１２】
（ビニル基の改変）
重合により得られたグラフトポリマーの残存ビニル基の改変は、基体の特性を失わない範囲で、物理的あるいは化学的反応により行われる。
【０１１３】
標的物質捕捉体を固定するために、残存ビニル基をカルボキシル基、スクシンイミド基、アルデヒド基、エポキシ基、ブロモ基、アミノ基、あるいはマレイミド基などの固定用官能基に改変することが可能である。以下に、残存ビニル基の固定用官能基への改変方法を示す。
【０１１４】
例えば、カルボキシル基への改変は、反応式１に示すように、過マンガン酸カリウムおよび酸を用いた酸化により行われる。
【０１１５】
【化１０】
2009286968.tif 000016
【０１１６】
また、スクシンイミド基への改変は、反応式２に示すように、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）および／あるいはＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）によるカルボキシル基のスクシンイミド化により行われる。
【０１１７】
【化１１】
2009286968.tif 000017
【０１１８】
上記以外に他の方法においても、カルボキシル基およびスクシンイミド基への改変は可能である。しかし、上記の反応工程は安全かつ容易であり、スクシンイミド基は標的物質捕捉体のアミノ基と結合し、直ちに標的物質捕捉体を固定することができるため、反応式１および反応式２の方法を用いることが好ましい。
【０１１９】
また、アルデヒド基への改変は、反応式３に示すように、オゾン酸化により行われる。
【０１２０】
【化１２】
2009286968.tif 000018
【０１２１】
アルデヒド基は標的物質捕捉体のアミノ基と結合し、直ちに標的物質捕捉体を固定することができる。
また、エポキシ基への改変は、反応式４に示すように、過酸を用いた酸化により行われる。
【０１２２】
【化１３】
2009286968.tif 000019
【０１２３】
エポキシ基は標的物質捕捉体のカルボキシル基と結合し、直ちに標的物質捕捉体を固定することができる。
また、ブロモ基への改変は、反応式５に示されるように、臭化水素を用いたＭａｒｋｏｖｎｉｋｏｖ付加、あるいは逆Ｍａｒｋｏｖｎｉｋｏｖ付加により行われる。（反応式５には逆Ｍａｒｋｏｖｎｉｋｏｖ付加を示す。）
【０１２４】
【化１４】
2009286968.tif 000020
【０１２５】
ブロモ基は標的物質捕捉体のヒドロキシル基およびチオール基と結合し、直ちに標的物質捕捉体を固定することができる。
また、アミノ基への改変は、反応式６に示されるように、反応式５の生成物にエタノールアミンを置換させることにより行われる。
【０１２６】
【化１５】
2009286968.tif 000021
【０１２７】
また、マレイミド基への改変は、反応式７に示されるように、反応式６の生成物にエタノールアミンを置換させることにより行われる。
【０１２８】
【化１６】
2009286968.tif 000022
【０１２９】
マレイミド基は標的物質捕捉体のチオール基と結合し、直ちに標的物質捕捉体を固定することができる。
以上、残存ビニル基の固定用官能基への改変方法を示したが、これらは改変方法の一部を示すものであり、以下の方法には限定されないものである。
【０１３０】
（グラフトポリマーの評価方法）
本発明において、基体表面はグラフトポリマーによって改質される。よって、基体の表面を分析する、あるいは、基体表面に構築されたグラフトポリマーを部分的に分解したものを分析することにより、グラフトポリマーが評価できる。
【０１３１】
グラフトポリマーの親水性は、例えば水に対する接触角を測定することで評価できる。
グラフトポリマーの架橋度およびビニル基の改変は、赤外線吸収（ＩＲ）分光法、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）法などの方法により、反応したマルチビニルモノマーのうち未反応のＣ−Ｃ二重結合の割合を分析することで評価できる。とりわけ、赤外高感度反射（Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ−Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、以下ＩＲ−ＲＡＳ）法は、基体上の薄膜を高感度に分析することが可能である。ＩＲ−ＲＡＳ法は偏光の反射を検出することによって一般的に薄膜の配向を分析する手法であるが、本発明のグラフトポリマーに関しては、数ｎｍ〜数十ｎｍの膜厚に対して比例したピークが得られることがわかっている。そのため、残存ビニル基を測定する手段としては有用である。例えば、マルチビニルモノマーがアクリレートあるいはメタクリレートであれば、カルボニル基由来のピークを内部標準とすることで、残存ビニル基の定量が可能である。
【０１３２】
また、グラフトポリマーの歪みと応力の関係をレオメータなどで分析することで架橋構造であるか否かを評価できる。
グラフトポリマーの密度の評価方法は、例えば以下のように評価できる。膜厚をエリプソメトリーを用いて測定し、かつ、グラフトポリマー構築前後の基体の重量を測定する。架橋スペーサーを切断し、グラフトポリマーを基体から切断後、グラフトポリマー主鎖の分子量をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定する。以上の測定から得られる膜厚、グラフトポリマー主鎖の分子量および分子数から、密度が評価できる。
【０１３３】
グラフトポリマーの構築に使用されたマルチビニルモノマーの長さおよび種類は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、赤外線吸収（ＩＲ）分光法、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）法、あるいは飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）などの組合せにより評価することができる。また、原子力間顕微鏡（ＡＦＭ）との組合せで評価することも可能である。
【０１３４】
グラフトポリマーへのタンパクの非特異吸着防止効果については、蛍光観察、蛍光測定、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、ＳＰＲ、ＬＳＰＲ、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）、磁気センサなどによって評価することが可能である。
【０１３５】
（標的物質検出素子）
次に、本発明の標的物質検出素子について説明する。
本発明に係る標的物質検出素子は、検出領域を有する基体と、該基体の表面に存在するグラフトポリマーと、該重合体に結合する第一の標的物質捕捉体とを有し、グラフトポリマーが下記一般式（１）および一般式（２）で示される構成単位を含み、前記グラフトポリマーが有する未反応のモノマーの末端の少なくとも一部に、前記第一の標的物質捕捉体が結合していることを特徴とする。
【０１３６】
【化１７】
2009286968.tif 000023
【０１３７】
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は水素原子あるいはメチル基である。Ｒ４はカルボキシル基、スクシンイミド基、アルデヒド基、エポキシ基、ブロモ基、アミノ基、あるいはマレイミド基のいずれかを含む基である。Ｘは親水性の架橋スペーサーである。ｌ，ｍ，ｎは１以上の整数である。）
【０１３８】
図５は、本発明における標的物質検出素子を示す概略図である。
基体１２は検出領域２６を有する。
検出領域２６は、捕捉した標的物質を検出する領域である。検出領域には、捕捉した標的物質に由来する信号を伝達する材質から構成されなければならない。例えば、検出方法が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）あるいは局在プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）であれば、表面プラズモンを発生する材質を表面に含まなければならない。検出方法が水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）であれば、吸着した物質の重さに比例して振動数が変化する材質を含まなければならない。
【０１３９】
検出方法が電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）であれば、電流を通し、微細加工が可能な材質から構成されなければならない。検出方法が磁気センサであれば、軟磁性体のように比較的簡単に磁極が消えたり反転したりする材質を含む必要がある。検出方法が電気化学であれば、電気化学反応を阻害しない広い電位領域を有する材質で表面を形成することが好ましい。検出方法が吸光検出であれば、検出する波長光を透過する材質でできていることが好ましい。検出方法が蛍光検出あるいは発光検出であれば、検出する波長光を吸収しない材質でできていることが好ましい。
【０１４０】
検出領域の材質としては、金、銀、銅、白金、水晶、シリコン、ゲルマニウム、酸化亜鉛、酸化チタン、酸化シリコン、酸化インジウム、硫化カドミウム、セレン化カドミウム、ガリウム砒素、パーマロイ（Ｎｉ−Ｆｅ合金）、Ｃｏ−Ｆｅ−Ｂ合金、水銀、カーボン、ダイヤモンド、ガラス、あるいはプラスチックなどが挙げられるが、以上に限定されない。
【０１４１】
これら検出領域の材質は、標的物質の検出方法によって使い分けられることが多い。検出方法としてＳＰＲを用いる場合は、検出領域の材質が金、銀、銅、あるいは白金などの金属であることが好ましい。好ましくは金である。検出方法としてＱＣＭを用いる場合は、検出領域の材質が水晶であることが好ましい。検出方法としてＦＥＴを用いる場合は、検出領域の材質として、シリコン、ゲルマニウム、酸化亜鉛、酸化チタン、酸化シリコン、酸化インジウム、硫化カドミウム、セレン化カドミウム、ガリウム砒素などが挙げられる。以上のように、検出方法として、ＳＰＲ、ＱＣＭあるいはＦＥＴを使用すれば、標的物質を非標識で検出することができる。
【０１４２】
また、検出方法として磁気センサを用いる場合は、検出領域の材質がパーマロイ（Ｎｉ−Ｆｅ合金）あるいはＣｏ−Ｆｅ−Ｂ合金に代表される軟磁性体であることが好ましい。検出方法として電気化学を用いる場合は、検出領域の材質が金、白金、水銀、カーボン、あるいはダイヤモンドであることが好ましい。検出方法として吸光検出、蛍光検出あるいは発光検出を用いる場合は、検出領域の材質がガラスあるいはプラスチックであることが好ましい。
【０１４３】
検出領域２６は、基体１２の表面に存在していても良いし、基体１２の内部に存在していても良い。例えば、検出領域２６が基体１２の表面に存在するケースとして、ＳＰＲ、電気化学が挙げられる。ＳＰＲであれば、表面プラズモンを発生する金属薄膜を基体の表面に形成しなければならない。金属薄膜上にグラフトポリマーを形成することで、本発明の標的物質検出素子を作製することができる。電気化学であれば、金属を作用電極の少なくとも表面に形成しなければならない。
【０１４４】
一方、検出領域２６が基体１２の内部に存在してもよいケースとして、ＱＣＭ、ＦＥＴ、あるいは磁気センサが挙げられる。ＱＣＭでは、水晶の表面に形成された金薄膜上にグラフトポリマーを形成することで、本発明の標的物質検出素子を作製することができる。ＦＥＴでは、電流を通す材質からなる構造体の表面にグラフトポリマーを形成することで、本発明の標的物質検出素子を作製することができる。磁気センサでは、パーマロイ（Ｎｉ−Ｆｅ合金）あるいはＣｏ−Ｆｅ−Ｂ合金を含む複数層の表面に形成された層上にグラフトポリマーを形成することで、本発明の標的物質検出素子を作製することができる。
【０１４５】
なお、図５では、基体１２の表面が検出領域２６である例として、基体１２が複数の層からなり、該層のうちの基体１２の表面を含む層が検出領域２６である場合を例に挙げて記載している。しかしながら、基体１２は、前記例に限られず、複数の層のうちの表面を含まない層であっても良いし、基体１２が一つの層で形成されており、基体１２全体が検出領域２６となる構成であっても良い。
【０１４６】
（標的物質検出キット）
次に、本発明の標的物質検出キットについて説明する。
本発明に係る標的物質検出キットは、前記標的物質検出素子と、標識物質と該標識物質の表面に存在する第二の標的物質捕捉体とからなる標識材料と、からなることを特徴とする。
【０１４７】
前記検出領域が、磁性物質を検出することができる検出領域であり、前記標識物質が磁性物質であることが好ましい。
【０１４８】
図６に本発明における標的物質検出キットの概略図を示す。
標的物質検出キットは、標的物質検出素子２８と、標識材料３４とからなる。
標的物質検出素子２８は、本発明の第二の標的物質検出素子と同様であるが、標的物質検出素子２８が有する検出領域２６は標識材料３４が有する標識物質材料を感知することができる検出領域である。
【０１４９】
標識材料３４は、標識物質３０と、標識物質の表面に存在する第二の標的物質捕捉体３２と、からなる。
標識物質３０としては、金コロイド、ラテックスビーズ、ルミノール、ルテニウム、酵素、放射性物質、蛍光物質、および磁性物質などが挙げられる。蛍光物質の具体例としては、量子ドット、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰおよびその誘導体）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、フルオレセイン、およびＡｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ５６８）が挙げられる。酵素の具体例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。磁性物質の例としては、フェライトが挙げられる。フェライトは、生理活性条件下で十分な磁性を有し、溶媒中で酸化等の劣化が起こりにくいことから好ましい。フェライトは、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、及びこれらのＦｅの一部を他の原子で置換した複合体から選択される。他の原子としては、Ｌｉ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｃａ、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｔａ、Ｗの少なくともいずれかが挙げられる。また、標識物質は、以上に挙げた材料の複合体であっても構わない。
【０１５０】
標識物質３０の形状としては、粒子形状、注状、星状などが挙げられるが、粒子形状であることが好ましい。粒子形状である場合、平均粒径は、１ｎｍから１００μｍが好ましく、更に３ｎｍから１０μｍが好ましい。尚、標識物質が粒子形状である場合は、平均粒径は動的光散乱法で測定できる。
【０１５１】
磁性物質としては、例えば、Ｄｙｎａｌ社から市販されているダイナビーズ、ｍｉｃｒｏｍｏｄ社から市販されているｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ、ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ、メルク社から市販されているエスタポール等を使用することができる。
【０１５２】
第二の標的物質捕捉体３２は、標識物質３０の表面に固定されており、標的物質検出素子２８が有する第一の標的物質捕捉体２４と同様、標的物質３６を捕捉する機能を有する。したがって、第二の標的物質捕捉体３２の例としては、第一の標的物質捕捉体２４の例として挙げたものと同様である。なお、第二の標的物質捕捉体３２と第一の標的物質捕捉体２４とは、標的物質３６の異なる部分を捕捉する必要がある。その場合、第二の標的物質捕捉体３２と第一の標的物質捕捉体２４とで標的物質３６をサンドイッチした形態の複合体が形成される。また、例えば、第二の標的物質捕捉体３２と第一の標的物質捕捉体２４がモノクローナル抗体であれば、異なる種類のものでなければならない。しかし、ポリクローナル抗体であれば、同一の種類であっても良いし、異なる種類であっても良い。２つの標的物質捕捉体のうち、一方をモノクローナル抗体とし、他方をポリクローナル抗体とする場合もある。
【０１５３】
具体的には、標的物質検出素子２８の表面に配置された第一の標的物質捕捉体２４に標的物質３６が捕捉され、第一の標的物質捕捉体２４に捕捉された標的物質３６を、更に、標識材料３４が有する第二の標的物質捕捉体３２が捕捉する。すなわち、第一の標的物質捕捉体２４−標的物質３６−第二の標的物質捕捉体３２の複合体が形成され、標識材料３４が標的物質検出素子２８の検出領域２６の近傍に配置される。検出領域２６の近傍に配置された標識材料３４が有する標識物質３０は検出領域２６で検知され、検出領域２６における標識物質３０の検知は標的物質検出素子２８の電気的もしくは物理的なシグナルの変化として現れる。この標的物質検出素子２８のシグナルの変化を利用して、標的物質の有無もしくは数が検知される。
【０１５４】
なお、ここでは、第一の標的物質捕捉体２４により、標的物質３６が捕捉された後に、標的物質３６が第二の標的物質捕捉体３２により捕捉される場合を想定して記載している。しかしながら、第二の標的物質捕捉体３２によって標的物質３６が捕捉された後に、第二の標的物質捕捉体３２によって捕捉された標的物質３６が第一の標的物質捕捉体２４によって捕捉されても良い。
【０１５５】
このような標的物質検出素子２８と標識物質３０との組み合わせとしては、次のようなものが挙げられる。例えば、標的物質検出素子２８が磁気センサ素子であれば、標識物質３０は磁性物質である。標的物質検出素子２８が電極であれば、標識物質３０は酵素である。標的物質検出素子２８がマイクロタイタープレートであれば、標識物質３０は金コロイド、ラテックスビーズ、ルミノール、ルテニウム、酵素、放射性物質、あるいは蛍光物質である。
【０１５６】
なお、前述したように、標的物質検出素子２８が磁気センサ素子である場合、磁気センサ素子は、検出領域２６の近傍に位置する磁性物質の有無、数を検知することができる。このような場合、標的物質検出素子２８としては、磁性の変化を検出する検出領域を有するものであり、例えば、磁気抵抗効果素子、ホール効果素子、超電導量子干渉計素子などを好適に用いることができる。
【０１５７】
（標的物質および第一の標的物質捕捉体）
第一の標的物質捕捉体２４としては、標的物質３６と相互作用することにより、標的物質３６を、捕捉、あるいは変換を行う分子であれば良い。このような第一の標的物質捕捉体２４としては、例えば、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体などが挙げられる。具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、抗体フラグメント、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプター、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは生体物質を捕捉、あるいは変換することができる抗体、抗体フラグメント、あるいは酵素である。
【０１５８】
標的物質３６は、第一の標的物質捕捉体２４と反応する物質であればいかなるものでもよい。より好ましくは生体物質である。生体物質としては、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体から選択される生体物質が含まれ、更に詳しくは、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質から選択される生体分子を含んでなるものであり、具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプタ、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質の何れかから選択された物質を含むものであれば、如何なる物質にも本発明を適用することができる。更には、前記の「生体物質」を産生する細菌や細胞そのものも、本発明が対象とする「生体物質」として標的物質となり得る。
【０１５９】
したがって、これら標的物質３６と第一の標的物質捕捉体２４との相互作用としては、例えば、「抗原−抗体反応」、「抗原−アプタマー（特定構造を有するＲＮＡ断片）」「リガンド−レセプター相互作用」、「ＤＮＡハイブリダイゼーション」「ＤＮＡ−タンパク質（転写因子等）相互作用」、「レクチン−糖鎖相互作用」等が挙げられる。標的物質３６と第二の標的物質捕捉体２８との相互作用に関しても同様である。
【実施例】
【０１６０】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有する磁気バイオセンサが得られる範囲で自由に変えることができる。
【０１６１】
実施例１
（金薄膜基板上にＡＴＲＰ開始剤を導入する工程）
ＳＩＡｋｉｔ  Ａｕ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）の金薄膜基板をアセトン、イソプロピルアルコール、超純水中で順次超音波洗浄を行った。前記金薄膜基板を窒素パージにて乾燥後、ＵＶ／Ｏ３洗浄装置  ＵＶ−１（サムコ株式会社製）中にセットし、１２０℃、１０分の条件でＵＶ／Ｏ３洗浄を行った。再び前記金薄膜基板を超純水中に浸し、超音波洗浄を行った。
【０１６２】
洗浄された金基板薄膜を化学式９で示されるＡＴＲＰ（原子移動ラジカル重合）開始剤を含むエタノール溶液中で浸漬することで、ＡＴＲＰ開始剤で自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ，以下ＳＡＭ）が形成された金薄膜基板を作製した。尚、窒素パージにて乾燥後、ＳＡＭの膜厚をエリプソメーター  Ｍ−２０００（Ｊ．Ａ．Ｗｏｏｌｌａｍ社製）で測定すると、１．８６±０．０８ｎｍであった。
【０１６３】
【化１８】
2009286968.tif 000024
【０１６４】
（ＡＴＲＰ開始剤によるＳＡＭ表面にグラフトポリマーを構築する工程）
ＳＡＭ形成基板を反応用シュレンク管に入れ、壁面に当たらないよう固定した。次いで、シュレンク管を氷水中に浸し、２，２’−ビピリジル、化学式１０で示されるノナエチレングリコールジアクリレートモノマー（以下ＮＥＧＤＡ、新中村化学工業株式会社製、ＮＫエステルＡ−４００）、メタノール／超純水（４／１＝ｗ／ｗ）を加えた。シュレンク管内にシリンジで窒素を封入することにより反応系内を窒素置換した。臭化第一銅を加え、さらに窒素置換した後、２３℃にてＡＴＲＰを開始した。２４時間反応後、大気に暴露することによって反応を終了させた。
【０１６５】
【化１９】
2009286968.tif 000025
【０１６６】
反応終了後、メタノール洗浄、超純水洗浄を経て、ＮＥＧＭＡで架橋されたグラフトポリマー含有基体を得た。窒素パージにて乾燥後、グラフトポリマーの膜厚を上記同様に測定すると、２．３±０．１ｎｍであった（但し、ＳＡＭの膜厚を除く）。また、水に対する接触角を測定すると、２５±２°であった。
【０１６７】
（グラフトポリマーの酸化処理工程）
１８−クラウン−６を溶かしたメタノールに、酢酸、過マンガン酸カリウム溶液を加え、溶液全体が赤紫色に変化したことを確認した。得られたＮＥＧＭＡのグラフトポリマー含有基体を溶液に浸し、一晩撹拌した。メタノール洗浄を経て、酸化処理されたグラフトポリマーを得た。窒素パージにて乾燥後、グラフトポリマーの膜厚を上記同様に測定すると、２．１±０．１ｎｍであった（但し、ＳＡＭの膜厚を除く）。また、水に対する接触角を測定すると、１２±２°であった。尚、グラフトポリマー含有基板表面の酸化前後のＩＲ−ＲＡＳ分析結果を図７に示す。酸化後の分析結果において、１３００ｃｍ−１付近のビニル基由来のピークが消失し、３３００ｃｍ−１付近のカルボキシル基由来のピークが出現していることから、グラフトポリマーが酸化されていることがわかる。
【０１６８】
（酸化されたグラフトポリマーの機能評価）
ＳＰＲを原理とするＢｉａｃｏｒｅＸ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）にて抗原抗体反応と非特異的吸着量を測定した。酸化されたＮＥＧＤＡのグラフトポリマーを用いてＳＩＡｋｉｔ  Ａｕ付属の方法によりセンサーチップを作製し、規定の方法によりＢｉａｃｏｒｅＸに挿入した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて規定の方法により基板表面や流路を洗浄後、５μｌ／ｍｉｎの流速でセンサーグラムを開始した。ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）およびＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の混合水溶液を流し、グラフトポリマー表面を活性化した。次に、Ａｎｔｉ−ｈＣＧ（抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）溶液を流し、グラフトポリマー表面に６５９ＲＵ固定した。さらに、エタノールアミン溶液を流すことで、活性基を失活させた。流速を２０μｌ／ｍｉｎに変えた後、１μｇ／ｍｌのｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗原、ロート製薬社製）溶液を２分間流した。ｈＣＧの反応量として、タンパク溶液を流し終えて５分後のシグナルと流す前のシグナルの差を測定したところ、１０５ＲＵであった。固定抗体の残存活性を見積もったところ、固定抗体の４８％が抗原を捕捉したことが確認された。
【０１６９】
また、血清レベルの夾雑タンパク濃度における非特異吸着を確認するため、上記のｈＣＧ溶液の代わりに１％ＢＩｇＧ（Ｂｏｖｉｎｅ  ＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ）溶液を２分間流した。ＢＩｇＧの非特異吸着量として、タンパク溶液を流し終えて５分後のシグナルと流す前のシグナルの差を測定したところ、３７ＲＵであった。
【０１７０】
実施例２
（金薄膜基板上にＡＴＲＰ開始剤を導入する工程）
ＳＩＡｋｉｔ  Ａｕ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）の金薄膜基板をアセトン、イソプロピルアルコール、超純水中で順次超音波洗浄を行った。前記金薄膜基板を窒素パージにて乾燥後、ＵＶ／Ｏ３洗浄装置  ＵＶ−１（サムコ株式会社製）中にセットし、１２０℃、１０分の条件でＵＶ／Ｏ３洗浄を行った。再び前記金薄膜基板を超純水中に浸し、超音波洗浄を行った。
【０１７１】
洗浄された金基板薄膜を化学式９で示されるＡＴＲＰ（原子移動ラジカル重合）開始剤を含むエタノール溶液中で浸漬することで、ＡＴＲＰ開始剤で自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ，以下ＳＡＭ）が形成された金薄膜基板を作製した。尚、窒素パージにて乾燥後、ＳＡＭの膜厚をエリプソメーター  Ｍ−２０００（Ｊ．Ａ．Ｗｏｏｌｌａｍ社製）で測定すると、１．８６±０．０８ｎｍであった。
【０１７２】
【化２０】
2009286968.tif 000026
【０１７３】
（ＡＴＲＰ開始剤によるＳＡＭ表面にグラフトポリマーを構築する工程）
ＳＡＭ形成基板を反応用シュレンク管に入れ、壁面に当たらないよう固定した。次いで、シュレンク管を氷水中に浸し、２，２’−ビピリジル、化学式１３で示されるエトキシ化グリセリントリアクリレートモノマー（新中村化学工業株式会社製、Ａ−ＧＬＹ−２０Ｅ）、メタノール／超純水（４／１＝ｗ／ｗ）を加えた。シュレンク管内にシリンジで窒素を封入することにより反応系内を窒素置換した。臭化第一銅を加え、さらに窒素置換した後、２３℃にてＡＴＲＰを開始した。２４時間反応後、大気に暴露することによって反応を終了させた。
【０１７４】
【化２１】
2009286968.tif 000027
【０１７５】
反応終了後、メタノール洗浄、超純水洗浄を経て、ＮＥＧＭＡで架橋されたグラフトポリマー含有基体を得た。窒素パージにて乾燥後、グラフトポリマーの膜厚を上記同様に測定すると、１．９±０．２ｎｍであった（但し、ＳＡＭの膜厚を除く）。また、水に対する接触角を測定すると、２９±２°であった。
【０１７６】
（グラフトポリマーの酸化処理工程）
１８−クラウン−６を溶かしたメタノールに、酢酸、過マンガン酸カリウム溶液を加え、溶液全体が赤紫色に変化したことを確認した。得られたＮＥＧＭＡのグラフトポリマー含有基体を溶液に浸し、一晩撹拌した。メタノール洗浄を経て、酸化処理されたグラフトポリマーを得た。窒素パージにて乾燥後、グラフトポリマーの膜厚を上記同様に測定すると、１．７±０．２ｎｍであった（但し、ＳＡＭの膜厚を除く）。また、水に対する接触角を測定すると、１５±３°であった。グラフトポリマー含有基板表面の酸化前後のＩＲ−ＲＡＳ分析結果を行った。酸化後の分析結果において、１３００ｃｍ−１付近のビニル基由来のピークが消失し、３３００ｃｍ−１付近のカルボキシル基由来のピークが出現していることから、グラフトポリマーが酸化されていることがわかった。
【０１７７】
（酸化されたグラフトポリマーの機能評価）
ＳＰＲを原理とするＢｉａｃｏｒｅＸ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）にて抗原抗体反応と非特異的吸着量を測定した。酸化されたＮＥＧＤＡのグラフトポリマーを用いてＳＩＡｋｉｔ  Ａｕ付属の方法によりセンサーチップを作製し、規定の方法によりＢｉａｃｏｒｅＸに挿入した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて規定の方法により基板表面や流路を洗浄後、５μｌ／ｍｉｎの流速でセンサーグラムを開始した。ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）およびＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の混合水溶液を流し、グラフトポリマー表面を活性化した。次に、Ａｎｔｉ−ｈＣＧ（抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）溶液を流し、グラフトポリマー表面に８０５ＲＵ固定した。さらに、エタノールアミン溶液を流すことで、活性基を失活させた。流速を２０μｌ／ｍｉｎに変えた後、１μｇ／ｍｌのｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗原、ロート製薬社製）溶液を２分間流した。ｈＣＧの反応量として、タンパク溶液を流し終えて５分後のシグナルと流す前のシグナルの差を測定したところ、２０２ＲＵであった。固定抗体の残存活性を見積もったところ、固定抗体の７５％が抗原を捕捉したことが確認された。
【０１７８】
また、血清レベルの夾雑タンパク濃度における非特異吸着を確認するため、上記のｈＣＧ溶液の代わりに１％ＢＩｇＧ（Ｂｏｖｉｎｅ  ＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ）溶液を２分間流した。ＢＩｇＧの非特異吸着量として、タンパク溶液を流し終えて５分後のシグナルと流す前のシグナルの差を測定したところ、１０ＲＵであった。
【０１７９】
比較例１
センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）を規定の方法によりＢｉａｃｏｒｅＸに挿入した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて規定の方法により基板表面や流路を洗浄後、５μｌ／ｍｉｎの流速でセンサーグラムを開始した。ＮＨＳ溶液およびＥＤＣ溶液の混合溶液を流し、チップ表面を活性化した。次に、Ａｎｔｉ−ｈＣＧ溶液を流し、チップ表面に４９８ＲＵ固定した。さらに、エタノールアミン溶液を流すことで、活性基を失活させた。流速を２０μｌ／ｍｉｎに変えた後、１μｇ／ｍｌのｈＣＧ溶液を２分間流した。ｈＣＧの反応量として、タンパク溶液を流し終えて５分後のシグナルと流す前のシグナルの差を測定したところ、５４ＲＵであった。固定抗体の残存活性を見積もったところ、固定抗体の３２％が抗原を捕捉したことが確認された。
【０１８０】
また、血清レベルの夾雑タンパク濃度における非特異吸着を確認するため、上記のｈＣＧ溶液の代わりに１％ＢＩｇＧ溶液を２分間流した。ＢＩｇＧの非特異吸着量として、タンパク溶液を流し終えて５分後のシグナルと流す前のシグナルの差を測定したところ、１９７ＲＵであった。
【０１８１】
実施例３
本実施例は、第一の標的物質捕捉体としてＰＳＡ（前立腺特異抗原）を捕捉する一次抗体を含む高分子膜が検出領域に形成された磁気バイオセンサと、第二の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する二次抗体を備えたマグネタイトからなる磁気マーカーを作製し、磁気バイオセンサとしてＰＳＡを検出する例である。尚、磁気バイオセンサの検出方式としては、磁気抵抗効果素子を使用する。
【０１８２】
（磁気マーカーの作製）
まず、第二の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する二次抗体を有する磁気マーカーを作製する。
【０１８３】
マグネタイト粒子（平均粒径１００ｎｍ）を乾燥窒素雰囲気下、加熱処理した後、無水トルエンに分散させる。このマグネタイト粒子／トルエン分散液に、シランカップリング剤であるアミノプロピルトリメトキシシランを添加し、マグネタイト粒子表面にアミノ基を導入する。次に、第二の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する二次抗体を固定化する為にグルタルアルデヒド架橋剤を用いて、前記アミノ基と二次抗体のアミノ基を共有結合させ、第二の標的物質捕捉体をマグネタイト粒子表面に固定化することができる。
以上の操作を経ることで、第二の標的物質捕捉体を備えた磁気マーカーを得ることができる。
【０１８４】
（磁気バイオセンサの作製）
次に、第一の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を有する高分子膜が検出領域に形成された磁気バイオセンサを作製する。
【０１８５】
まず、図６のように、磁気バイオセンサの検出領域上面にＡｕ膜を形成する。本実施例では、検出方式としては、磁気抵抗効果素子を使用するため、前記検出領域は磁気抵抗効果膜を意味する。
【０１８６】
次に、検出領域であるＡｕ表面に高分子膜を形成する。まず、化学式１１で示される原子移動ラジカル重合開始剤を含むエタノール溶液にＡｕ膜を侵漬し、前記開始剤とＡｕ膜を反応させて、Ａｕ膜表面に原子移動ラジカル重合開始剤を導入することができる。
【０１８７】
【化２２】
2009286968.tif 000028
【０１８８】
次に、原子移動ラジカル重合開始剤を導入した検出領域を水−メタノール混合溶媒（体積比４：１）に浸漬させた後、ＣｕＢｒ、２，２’−ビピリジルを加える。凍結真空脱気により反応系内の酸素を除去した後、窒素で置換し、化学式１２で示されるＮＥＧＭＡモノマーを原子移動ラジカル重合により所定時間反応させる。重合後、メタノール洗浄、次いで水洗浄を経て、検出領域上にＮＥＧＤＡのグラフトポリマー（化学式１２の重合体）を得ることができる。
【０１８９】
【化２３】
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【０１９０】
次に、１８−クラウン−６を溶かしたメタノールに、酢酸、過マンガン酸カリウム溶液を加え、溶液全体が赤紫色に変化したことを確認する。検出領域を溶液に浸し、一晩撹拌する。メタノール洗浄を経て、グラフトポリマーが酸化処理された検出領域を得ることができる。
【０１９１】
次に、高分子膜の側鎖カルボキシル基に第一の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化する。まず、ＮＨＳとＥＤＣの混合水溶液を同様に塗布する。これらの操作により、高分子膜の側鎖カルボキシル基にスクシンイミド基（活性エステル基）が露出することになる。前記スクシンイミド基と一次抗体のアミノ基を反応させ、第一の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化することができる。その後、高分子膜上の未反応のスクシンイミド基は、エタノールアミンによって失活させる。
【０１９２】
以上の操作により、検出領域において、第一の標的物質捕捉体としてＰＳＡを捕捉する一次抗体が固定化された高分子膜を備えた磁気バイオセンサを作製することができる。
【０１９３】
（ＰＳＡの検出）
上記操作において作製される磁気マーカーと磁気バイオセンサを用い、以下の操作を行うことで、前立腺癌のマーカーとして知られているＰＳＡの検出を試みることができる。
【０１９４】
１）標的物質（抗原）であるＰＳＡ、及び夾雑物であるＢＳＡとＩｇＧを含むリン酸緩衝液に上記磁気バイオセンサの検出領域を浸す。
２）未反応のＰＳＡと夾雑物をリン酸緩衝液で洗浄する。
【０１９５】
３）磁気マーカーを含むリン酸緩衝生理食塩水に工程１）及び２）が終了した上記磁気バイオセンサの検出領域を浸し、５分間インキュベートする。
４）未反応の磁気マーカーをリン酸緩衝液で洗浄する。
【０１９６】
上記操作によって、標的物質（抗原）が第一の標的物質捕捉体、第二の標的物質捕捉体により捕捉され、磁気マーカーが図６に示すように磁気バイオセンサの検出領域に固定化される。つまり、検体中に抗原が存在しない場合には、磁気マーカーは磁気バイオセンサの検出領域上に固定化されないので、磁気マーカーの有無を検出することによって、抗原の検出が可能である。また、固定化された磁気マーカーの数を検出することによって、検体中に含まれる抗原の量を間接的に知ることも可能である。
【０１９７】
本実施例の磁気バイオセンサにおける検出領域の高分子膜において、架橋性のグラフトポリマーが検体に含まれる夾雑物や標的物質（抗原）の非特異吸着を防止することによってノイズを抑え、標的物質を高感度に検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１９８】
本発明のグラフトポリマー含有基体は、基体表面への生体分子および標識物質などの非特異吸着を防止する能力に優れ、かつ、標的物質捕捉体を固定することができるため、バイオセンサ材料として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】本発明のグラフトポリマー含有基体の一例を表す概略図である。
【図２】本発明におけるグラフトポリマーのグラフト密度に対する架橋スペーサー長の関係の一例を示す図である。
【図３】本発明におけるグラフトポリマーのグラフト密度に対するＸ原子鎖長の関係の一例を示す図である。
【図４】本発明の実施例におけるグラフトポリマーのグラフト密度に対するＰＥＧ鎖長の関係の一例を示す図である。
【図５】本発明に係る標的物質検出素子の一例を示す概略図である。
【図６】本発明に係る標的物質検出キットの一例を示す概略図である。
【図７】本発明の実施例におけるＩＲ−ＲＡＳ分析結果を示す図である。
【符号の説明】
【０２００】
１０  重合開始剤
１２  基体
１４  グラフトポリマー主鎖
１６  架橋スペーサー
１８  未架橋モノマー
２０  固定用官能基
２２  標的物質捕捉体
２４  第一の標的物質捕捉体
２６  検出領域
２８  標的物質検出素子
３０  標識物質
３２  第二の標的物質捕捉体
３４  標識材料
３６  標的物質
３８  夾雑物
４０  グラフトポリマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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