(57)【要約】【課題】エレクトロポレーション法による細胞へ外来物質の確実な導入などに好適な流路を形成する。【解決手段】透明な基板２１の主面２１ａに、帯状を成す第１部分及び第１部分より広くされた第２部分を含む遮光パターンを導電膜２２として形成し、この基板の主面に絶縁性の樹脂膜２３を形成するための光硬化性樹脂を塗布する。次に、基板の光硬化性樹脂とは反対側の主面２１ｂから、基板に対して異なる角度で光を照射する。このとき、非透過領域が第１部分に対応する第１領域と、前記第２部分に対応する第２領域とし、第１領域が光硬化性樹脂内でのみ存在し、かつ、第２領域が基板側から光硬化性樹脂の基板と反対側の主面２３ａまで延在されるように光を照射し、光が透過した部分の光硬化性樹脂を硬化させる。この後に、光硬化性樹脂の非透過領域を除去することにより、基板と樹脂膜の間に横孔を形成すると共に、樹脂膜に横孔に連通する縦孔を形成する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明な基板の少なくとも一方の主面に、光の透過を阻止する遮光パターンを形成する第１のステップと、
前記基板の少なくとも前記一方の主面に光硬化性樹脂を塗布する第２のステップと、
前記基板に関して前記光硬化性樹脂とは反対側の主面から、前記基板に対して異なる角度で光を照射し、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性樹脂の前記光が透過した部分を硬化させる第３のステップと、
前記光硬化性樹脂の前記非透過領域を除去する第４のステップと、
を備え、
前記第１のステップにおいて、
前記遮光パターンが、所定幅の帯状を成す第１部分及び、該第１の部分に連続し、第１部分の幅方向に沿った領域が第１部分より広くされた第２部分を含んで形成され、
前記第３のステップにおいて、
前記非透過領域が、前記遮光パターンの前記第１部分に対応する第１領域と、前記遮光パターンの前記第２部分に対応する第２領域とを含み、
前記第１領域が、前記光硬化性樹脂内でのみ存在し、かつ、前記第２領域が前記基板側から前記光硬化性樹脂の前記基板と反対側の主面まで延在されるように前記光を照射する、流路の形成方法。
【請求項２】
前記光硬化性樹脂は、前記基板の前記一方の主面に塗布される、請求項１に記載の流路の形成方法。
【請求項３】
前記遮光パターンは、前記第１部分の長手方向の両端部に前記第２部分が形成されている、請求項１又は請求項２に記載の流路の形成方法。
【請求項４】
前記第１部分と前記第２の部分が形成された前記遮光パターンの組を、前記基板の前記一方の主面に複数組形成している、請求項３に記載の流路の形成方法。
【請求項５】
前記遮光パターンは、前記基板の一方の主面に導電材料が用いられて形成される、請求項１から請求項４の何れか１項に記載の流路の形成方法。
【請求項６】
前記請求項１から請求項５の何れか１項に記載された流路の形成方法によって流路が形成されたクランプ装置であって、
前記光硬化性樹脂の前記基板側の面を覆うベースと、
前記ベースによって閉塞される前記第１の領域に供給する負圧によって、前記第２領域が前記光硬化性樹脂の前記基板と反対側の主面まで延在されることにより形成される小孔に細胞を吸着する負圧源と、
を含むクランプ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の内部に外来物質を導入するための細胞内物質導入装置及び細胞の機能を評価するための細胞クランプ装置に係り、それらの装置の形成に特に好適な流路の形成方法及びクランプ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞内に遺伝子等の外来物質を導入するための手法としては、ガラスキャピラリーにより細胞１つ１つに注入するマイクロインジェクション法や、細胞懸濁波に電界を印加して細胞膜を可逆的に破壊・透過化することによるエレクトロポレーション法が用いられる。
【０００３】
マイクロインジェクション法は、１つ１つの細胞に確実に外来物質を導入できるが、煩雑な微細操作を伴うため、大量の細胞を処理することは困難である。これに対し、エレクトロポレーション法は、大量の細胞を処理するのには向いている。例えば、特許文献１には、エレクトロポレーション法のための細胞用薬液注入器が開示されている。
【０００４】
また、細胞の持つ電気的特性や機械的特性や力学的刺激に対する応答を計測する手法として、パッチクランブ法が一般的である。例えば、ガラス管を熱間で引き抜いて作製したマイクロピペットを細胞表面に接触させて、細胞表面の電気特性の変化を計測する。
【０００５】
また、非特許文献２には、高アスペクト比の構造物を作製できるレジストＳＵ−８（ｍｉｃｒｏｈｅｍ社製）を用いて、網目状などのマイクロ構造を形成する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−３３７１７７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】U.Zimmermann,″Electrical breakdown,electropermeabi1ization and electrofusion″,Rev. Physiol.Biochem.   Pharmacol.   15、p. 175-345   (1986）
【非特許文献２】Hironobu Sato,Takayuki Kakinuma,Jeung Sang Go and Shuichi Shoji,″In-channel 3−D micromesh structures using maskless multi-angled exposures and their microfilter application", Sensors and Actuators A: Physical,Volume 111, Issue 1，1 March 2004,Pages 87−92
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
エレクトロポレーション法には、以下のような問題点がある。
【０００９】
一様電界Ｅの中に置かれた半径ａの細胞の細胞膜にかかる膜電圧Ｖｍ（θ）は、
Ｖｍ（θ）＝１．５×ａ×Ｅ×ｃｏｓθ      （１）
で与えられる。ただし、θは、電気力線と半径のなす角である。（非特許文献１参照）
式（１）は、細胞膜にかかる電圧の大きさは、電気力線の最上流側（北極：θ＝０）の位置および最下流側（南極：θ=π)の位置で最大となり、その値は細胞の半径ａに比例することを述べている。従って、細胞に一様な電界パルスを印加すると、北極および南極の位置での膜がまず破壊されることになる。
【００１０】
膜電圧が約１Ｖとなるような適度なパルス電圧が印加された場合は、この破壊はいわゆる可逆的破壊となり、膜は自復することが知られている。この可逆的破壊の過程で、膜の透過性が上昇するので、細胞周囲におかれた外来物質が細胞膜内へと取り込まれることになる。
【００１１】
しかしながら、過度の電圧が印加された場合は、膜の破壊は非可逆的で自復できず、破壊が膜全体に伝搬する結果、細胞自体が破壊され、細胞は死滅することになる。
【００１２】
ところで、この膜電圧は式（１）に示すように細胞の半径ａに比例する。一方、細胞は、その直径は一様ではなく、ある広がりをもった分布を持つのが通常である。従って、多数の細胞の懸濁波に一様なパルス電界を印加した場合には、ａ）大きい細胞には過大な膜電圧が発生し細胞自体が破壊されてしまう、ｂ）小さい細胞にかかる膜電圧は低すぎて膜の透過化か生じず、外来物質が導入されないということになる。すなわち、ある範囲の大きさの細胞のみにしか外来物質が導入できない。
【００１３】
ここから、細胞内物質導入装置としては、細胞の大きさに依存しないエレクトロポレーションにより、高効率の外来物質の導入を実現することが好ましい。
【００１４】
また、パッチクランプ法では、多くて２から３個のガラス管を細胞に接続することか限界であり、細胞内の物質移動や細胞間の物質移動およびより小さな細胞内・細胞間の作用を計測することは困難であり、細胞クランプ装置としては、細胞を多くの部位でクランプすることが好ましい。
【００１５】
このような細胞内物質導入装置や細胞クランプ装置では、流路を形成する必要がある。一般には、主面に溝を形成した基板に他の基板を接合する方法で流路が形成される。しかし、この方法では、基板の反りなどにより接合不良が生じやすく、流路を効率よく形成することが困難である。
【００１６】
本発明は、斯かる実情に鑑み、流路を効率よく形成することができる流路の形成方法及び形成された流路を用いたクランプ装置を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した流路の形成方法を提供する。
【００１８】
流路の形成方法は、透明な基板の少なくとも一方の主面に、光の透過を阻止する遮光パターンを形成する第１のステップと、前記基板の少なくとも前記一方の主面に光硬化性樹脂を塗布する第２のステップと、前記基板に関して前記光硬化性樹脂とは反対側の主面から、前記基板に対して異なる角度で光を照射し、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性樹脂の前記光が透過した部分を硬化させる第３のステップと、前記光硬化性樹脂の前記非透過領域を除去する第４のステップと、を備え、前記第１のステップにおいて、前記遮光パターンが、所定幅の帯状を成す第１部分及び、該第１の部分に連続し、第１部分の幅方向に沿った領域が第１部分より広くされた第２部分を含んで形成され、前記第３のステップにおいて、前記非透過領域が、前記遮光パターンの前記第１部分に対応する第１領域と、前記遮光パターンの前記第２部分に対応する第２領域とを含み、前記第１領域が、前記光硬化性樹脂内でのみ存在し、かつ、前記第２領域が前記基板側から前記光硬化性樹脂の前記基板と反対側の主面まで延在されるように前記光を照射する。
【００１９】
上記方法において、遮光パターンは、第１部分が複数であっても、第２部分が複数であってもよい。さらには、複数組の第１部分及び第２部分を備えてもよい。また、上記方法によれば、主面に溝を形成した基板に他の基板を接合する場合に比べ、流路の形成が簡単である。
【００２０】
好ましくは、前記第１のステップにおいて、前記基板の一方の主面に、導電材料を用いて前記遮光パターンを形成する。前記第２のステップにおいて、前記基板の前記一方の主面に前記光硬化性樹脂を塗布する。この場合、小孔の開口に対向する部分から流路に沿って延在する導電パターンを同時に形成することかできる。この導電パターンは、電極や電気配線として用いることができる。
【００２１】
このような本発明が適用されるクランプ装置は、前記請求項１から請求項５の何れか１項に記載された流路の形成方法によって流路が形成されたクランプ装置であって、前記光硬化性樹脂の前記基板側の面を覆うベースと、前記ベースによって閉塞される前記第１の領域に供給する負圧によって、前記第２領域が前記光硬化性樹脂の前記基板と反対側の主面まで延在されることにより形成される小孔に細胞を吸着する負圧源と、を含む。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の流路の形成方法によれば、流路を効率よく形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】細胞内物質導入装置の構成を示す断面図である。（実施例１）
【図２】細胞内物質導入装置の構成を示す断面図である。（実施例２）
【図３】細胞クランプ装置の最小構成単位を示す説明図である。（実施例３）
【図４】照射の説明図である。（実施例３）
【図５】細胞クランブ装置の構成を示す断面図である。（実施例４）
【図６】細胞クランプ装置の構成を示す平面図である。（実施例５）
【図７】柱状支持部材の構成を示す斜視図である。（実施例６）
【図８】細胞クランプ装置に柱状支持部材を用いたときの構成を示す要部断面である。（実施例６）
【図９】細胞クランプ装置に柱状支持部材を用いた計測の説明図である。（実施例６）
【図１０】柱状支持部材の製作方法の説明面である。（実施例６）
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態として実施例について図１〜図１０を参照しながら説明する。
【００２５】
まず、細胞内物質導入装置について、図１及び図２を参照しながら説明する。
【００２６】
図１に示すように、細胞内物質導入装置１０ａは、小孔１を持つ絶縁性薄膜２の両側に、バッファー（例えば生理食塩水）を満たしたチャンバー３および外来物質４の水溶液を満たしたチャンバー５があり、各々に電極６および７が接触している。８は電極を保持するためのスペーサで、電極とともにチャンバー壁を兼ねている。小孔１のバッファーを満たしたチャンバー３の側に、細胞９を吸引固定し、電極６と７の間にパルス電圧を印加する。なお、絶縁性薄膜２は、電極６、７間の流体を分離する必要があるが、特にチャンバー５が小孔１の部分を除いて密閉されている場合には、細胞９を小孔１に吸引固定することが容易になる上、チャンバー５からの液漏れもなくなる。
【００２７】
絶縁性薄膜２は、例えば、ＳｉＯ２膜である。具体的には、Ｓｉ基板を熱酸化することにＳｉＯ２膜を形成し、ＳｉＯ２膜にフォトレジストを塗布してマスクパターンを転写した後、現像を行い、ＳｉＯ２膜の小孔１となる部分をエッチングし、最後に、Ｓｉ基板をエッチング等により除去することにより、ＳｉＯ２膜の絶縁性薄膜２が得られる。Ｓｉ基板を全部除去するのではなく一部を残し、残したＳｉ基板で絶縁性薄膜２を支持するようにしてもよい。
【００２８】
または、有機薄膜に、レーザーまたはフォトリソグラフィーによって小孔を開口したものを、絶縁性薄膜２として用いることも可能である。
【００２９】
図１において点線で示したように、絶縁性薄膜２の厚さをｄ、誘電率をε、一対の電極６，７の間隔をＬ、チャンバー３，５内の流体の抵抗率をρとした時、系の時定数τ＝ερＬ／ｄが１０ミリ秒以下となるように、絶縁性薄膜２の厚さｄ、誘電率ε、一対の電極６，７の間隔Ｌ、チャンバー３，５内の流体の抵抗率ρを選んだ条件下では、電気力線１０は絶縁性薄膜２を通過することができないので、小孔１を通ることになる。すなわち、電気力線１０が収束するため、小孔の位置での電界強度が、溶液中での電界強度に比べて極めて強くなる。これにより、細胞膜の小孔に接している部分にのみ、エレクトロポレーションすなわち膜の透過化が生じ、チャンバー５の中にある外来物質４が、拡散または電気泳動により、細胞内へと導入されることになる。
【００３０】
十分な電界の集中を得て、細胞膜の小孔に接する部分のみを透過化するためには、小孔が細胞直径に比して十分小さいこと、特に細胞直径の１／３以下であることが望ましい。この時、小孔に接する部分の細胞膜にかかる膜電圧は、小孔部分の電界集中によってのみ決まり、細胞の直径に依存しない。すなわち、本装置を用いれば、細胞の直径に依存しない外来物質の導入か可能になる。
【００３１】
ここで、一対の電極６，７間に１０Ｖ以下の適度なパルス電圧を選択すれば、小孔１に接した部分の膜が可逆的に破壊され、自復するため、細胞に大きなダメージを与えることなく外来物質の導入が可能になる。溶液中に懸濁された細胞にパルス電圧を印加する通常のエレクトロポレーションの場合には、細胞膜の部分的破壊が細胞全体に伝搬して、細胞全体の破壊・死滅につながるが、本装置の場合には、細胞膜が絶縁性薄膜に固定されているので、小孔部分から発生する破壊の伝搬が生じにくい。さらに積極的にこの伝搬を防止するためには、小孔周辺の薄膜に細胞接着性の表面修飾を施すことが有効で、それを行うための物質としては、たとえば細胞付着性修飾剤ＢＡＭ（Biocompatible  Anchor  for  Membrane；日本油脂株式会社）、ポリーＤ−リジン（poly−Ｄ−lysine）、リン酸塩(phosphates)、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；fetal  bovine  serum）が例示される。このことにより、本法は、通常のエレクトロポレーションに比して、細胞を死滅させずに印加できる電圧の許容範囲が広く、ひいては高い効率での外来物質導入が行える。
【００３２】
なお、本発明の細胞内物質導入装置は図１に示した構造に限定されるものではなく、小孔を持つ絶縁性薄膜の両側に２つの電極と接するあるいは電極を浸漬した溶液がありさえすれば、スベーサ８や電極６，７によってチャンバー壁を構成する必要もなく、チャンバー３とチャンバー５が電気的に絶縁されていない構造でも、電気力線の集中は生ずるので、適用可能である。細胞の固定も吸引に限定されるものではなく、重力による沈降、電気泳動、誘電泳動を利用することも可能である。
【００３３】
図２は、本発明による、外来物質の細胞への同時並列導入の例である。絶縁性薄膜１１多数の小孔１２を設け、各々に細胞１３を固定して、電極１４と１５の間にパルス電圧を印加することにより、外来物質１６をすべての細胞内に同時に導入することができる。したがって、大量並列測定や、細胞膜電位の同時計測が可能である。
【００３４】
本発明の細胞内物質導入装置によれば、細胞の直径に依存しないエレクトロポレーションが実現されるので、細胞が広い粒径分布を持つ場合にも、高い効率での外来物質の導入が行える。また、細胞内外の溶液組成が任意にとれ、コンダクタンスが大きく、膜透過性がない物質や、caged物質（光などで励起・分離し発現する物質）以外の物質に対する測定が可能である。
【００３５】
次に、細胞クランプ装置について、図３〜図１０を参照しながら説明する。
【００３６】
図３に、細胞クランブ装置の最小構成単位２０ｓの要部構成を示す。
【００３７】
細胞クランプ装置は、透明な基板２１の上面２１ａに、絶縁性の樹脂からなる樹脂膜２３が配置されている。
【００３８】
基板２１の上面２１ａには、光の透過を阻止するとともに導電性を有する導電膜２２が形成されている。導電膜２２は、細長い第１部分２２ｙと、第１部分２２ｙの両端に連続しかつ第１部分２２ｙの延在方向に対して略直角方向に広がった略長円形状の第２部分２２ｘ，２２ｚとを含む。導電膜２２は、第１部分２２ｙ又は第２部分２２ｘ，２２ｚに接続された他の部分を含んでもよい。
【００３９】
樹脂膜２３の上面２３ａには、開口２４ｓ，２６ｓが形成され、例えば、一方の開口２４ｓに細胞を固定し、他方の開口２６ｓからシリンジポンプや真空ポンブなどで吸引を行う。樹脂膜２３には、開口２４ｓ，２６ｓに連続する小孔２４ｔ，２６ｔと、小孔２４ｔ，２６ｔに連通する連通孔２５ｔとが形成されている。小孔２４ｔ，２６ｔは、それぞれ、導電膜２２の第２部分２２ｘ，２２ｚに対応して形成され、導電膜２２の第２部分２２ｘ，２２ｚは小孔２４ｔ，２６ｔの底面となる。連通孔２５ｔは、導電膜２２の第１部分２２ｙに対応して形成され、導電膜２２の第１部分２２ｙは連通孔２５ｔの底面となる。
【００４０】
次に、製造方法について、図４を参照しながら説明する。図４は、大略、導電膜２２の細長い第１部分２２ｙが延在する方向に見た断面図である。
【００４１】
まず、透明な基板２１の上面２１ａに、所定パターンの導電膜２２を形成する。具体的には、基板２１にはガラス基板を用いる。基板２１にＳｉ基板や樹脂基板を用いてもよい。導電膜２２は、基板２１にフォトレジストを塗布し、マスクパターンを転写した後、現像し、Ａｌを蒸着することにより形成する。Ｐｔ、Ａｕ、Ａｇなど、Ａｌ以外の金属を蒸着してもよい。また、蒸着以外の方法によってもよい。
【００４２】
次いで、基板２１の上面２１ａに光硬化性の樹脂膜２３（具体的には、microchem社製のネガレジストであるＳＵ−８）を塗布する。
【００４３】
次いで、矢印４４ａ，４４ｂで示すように、基板２１の下面２１ｂ側（すなわち、基板２１に関して樹脂膜２３とは反対側）から、基板２１の下面２１ｂに対して異なる角度で光を照射し、樹脂膜２３の光が透過した部分を硬化させる。
【００４４】
このとき、光を照射する方向４４ａ，４４ｂは、導電膜２２の細長い第１部分２２ｙが延在する方向から見ると、基板２１の下面２１ｂに対して斜めに傾き、かつ、互いに略対称となる２方向である。矢印４４ａで示す方向から光を照射したとき、樹脂膜２３内には、導電膜２２によって影となり、光が透過しない領域４４ｔが形成される。一方、矢印４４ｂで示す方向から光を照射したとき、樹脂膜２３内には、導電膜２１ｓによって影となり、光が透過しない領域４４ｓが形成される。２つの影の領域４４ｓ，４４ｔか重なり合う領域４４ｋは、光が全く透過しない非透過領域となる。樹脂膜２３は、非透過領域４４ｋ以外の部分が硬化する。
【００４５】
具体的には、紫外線の照射方向に対して基板２１を±４５°傾けて配置した状態で、露光装置を用いて紫外線の平行光を、基板２１側から樹脂膜２３に照射した後、樹脂膜２３のＳＵ−８が硬化を開始する温度よりも高い温度（例えば、９５℃）まで加熱する。
【００４６】
次いで、樹脂膜２３の非透過領域４４ｋを除去する。樹脂膜２３がＳＵ−８の場合には、現像液に浸して、樹脂膜２３の非透過領域４４ｋを溶出させる。
【００４７】
非透過領域４４ｋは、導電膜２２に沿って延在する。非透過領域４４ｋは、導電膜２２の第１部分２２ｙに対応する第１領域と、導電膜２２の第２部分２２ｘ，２２ｚに対応する第２領域と含む。
【００４８】
導電膜２２の第１部分２２ｙの幅か狭いので、非透過領域４４ｋの第１領域は、樹脂膜２３内において断面三角形となり、樹脂膜２３内のガラス基２１板側にのみ延在する。そのため、非透過領域４４ｋの第１領域に対応して断面三角形のトンネル状の連通孔（横孔) ２５ｔが形成される。
【００４９】
一方、導電膜２２の第２部分２２ｘ，２２ｚの幅が広いので、非透過領域４４ｋの第２領域は、樹脂膜２３内において樹脂膜２３の上面２３ａにまで達する断面台形となり、樹脂膜２３内の基板２１側から反対側の上面２３ａまで延在する。そのため、樹脂膜２３の上面２３ａに開口２４ｓ，２６ｓが形成され、非透過領域４４ｋの第２領域に対応して、大略、円錐台状の小孔（縦孔) ２４ｔ，２６ｔが形成される。
【００５０】
例えば、基板２１にガラス基板を用い、樹脂膜２３にＳＵ−８を用い、導電膜２２としてＡｌを蒸着することにより、樹脂膜２３の膜厚が１０μｍ、連通孔２５ｔの幅が５μｍ、開口２４ｓの直径が３μｍ、開口２６ｓの直径が６μｍとなる細胞クランブ装置を製作することができる。
【００５１】
上記の製造方法は、基板を化学的、物理的にエッチングしたり、溝を形成した基板を接合したりする一般的なマイクロチャネル（流路）の形成方法に比べ、大規模な製造装置が不要であり、製造工程が簡単であり、製造コストも少なくてすむ。したがって、流路を効率よく形成することができる。また、流路の形成と同時に、電極や電気配線も形成することができる。
【００５２】
細胞クランプ装置は、複数の小孔及び連通孔を備えることにより、細胞の複数の部位を小孔で固定した状態で、種々の用途に用いることができる。
【００５３】
図５に示すように、細胞クランプ装置２０が、第１組の小孔２４ａ，２６ａ及び連通孔２５ａと、第２組の小孔２４ｂ，２６ｂ及び連通孔２５ｂとを備える場合、小孔２６ａ，２６ｂに設けたシリンジポンプ２８ａ，２８ｂで矢印２９ａ，２９ｂで示すように吸引し、細胞８０の２つの部位を小孔２４ａ，２４ｂに固定し、小孔２４ａ，２４ｂを通る電流を、導電膜２２ａ，２２ｂ、外部端子２２ｐ，２２ｑを介して電流計３０ａ，３０ｂで計測する。
【００５４】
細胞クランプ装置２０は、細胞の上方に電極を配置すれば、細胞内物質導入装置として用いることもできる。例えば、細胞の一方の部位から外来物質を導入し、細胞の他方の部位での応答を検知すれば、ギャップ結合を有する物質輸送（イオン、小分子(ｃＡＭＰ，ｃＧＭＰ他）の通過）を測定することができる。
【００５５】
図６に、多数の小孔３４ａ〜３４ｈを設けた細胞クランプ装置３０の構成を示す。
【００５６】
細胞クランプ装置３０は、最小構成単位の細胞クランプ装置２０ｓと同様に、透明なガラス基板３２に、ガラス基板３２より小さい絶縁性樹脂の樹脂膜３３が配置されている。樹脂３３には、複数組の細胞固定用の小孔３４ａ〜３４ｈ、連通孔３５ａ〜３５ｈ、吸引用の小孔３６ａ〜３６ｈが形成されている。ガラス基板３２上に形成される導電膜は、細胞固定用の小孔３４ａ〜３４ｈ、連通孔３５ａ〜３５ｈ、吸引用の小孔３６ａ〜３６ｈを形成する部分のほか、これらの部分から延長された延長部分３２ａ〜３２ｈと、延長部分３２ａ〜３２ｈの端部に設けられた外部端子３１ａ〜３１ｈとを含む。
【００５７】
細胞クランブ装置３０は、光硬化性樹脂の樹脂膜３３に異なる角度で光を照射することによって、細胞固定用の小孔３４ａ〜３４ｈ、連通孔３５ａ〜３５ｈ、吸引用の小孔３６ａ〜３６ｈが形成されるか、同時に、ガラス基板３２上に形成される導電膜の延長部分３２ａ〜３２ｈに対応して流路が形成される。そのため、延長部分３２ａ〜３２ｈはできるだけ幅を狭くすることが好ましい。また、延長部分３２ａ〜３２ｈに対応して形成される流路は、例えばクリップ等で樹脂膜３３を押さえて塞ぐことが好ましい。
【００５８】
細胞クランプ装置３０は、細胞８０の複数の部位をクランブした状態で、種々の計測や細胞８０に対する操作のために用いることができる。
【００５９】
細胞クランブ装置は、図７〜図１０に示すように、柱状支持部材５０とともに用いることもできる。
【００６０】
図７に示すように、柱状支持部材５０は、板状のペース部５２と、ベース部５２の上面５２ａから突出した複数の柱状の突起部５４と、各突起部５４の先端５４ａからベース部５２の下面５２ｂまで貫通する貫通孔５６とを有する。
【００６１】
柱状支持部材５０は、例えば図１０に示す方法で作製することができる。すなわち、図１０（ａ）に示すように、透明なガラス基板６０の一方の主面６０ａに、リング状の遮光パターン６２を形成する。次いで、図１０（ｂ）に示すように、ガラス基板６０の上面６０ａに光硬化性樹脂６４（例えば、ネガレジストＳＵ−８）をスピンコートした後、矢印６１で示すように、ガラス基板６０の下面６０ｂ側から、ガラス基板６０の下面６０ｂに垂直方向に、平行光を露光し、樹脂６４内の光が透過した部分を硬化させる。次いで、図１０（ｃ）に示すように、樹脂６４の未露光部分を除去し、筒状の空間６５を形成する。次いで、図１０（ｃ）に示すように、樹脂６４の上面６４ａに、所定厚さで樹脂６６（例えば、ＰＤＭＳ；Polydimethylsiloxane)を塗布し、樹脂６６を筒状の空間６５に充填した後、樹脂６６を硬化させる。そして、図１０（ｄ）に示すように、樹脂６６を樹脂６４から分離する。このとき、樹脂６６には、筒状の突起部６７が形成されるが、突起部６７の中心孔６８は非貫通の状態であるので、最後に、中心孔６８底をレーザーで加工し、中心孔６８を貫通させる。
【００６２】
図８に示すように、柱状支持部材５０は、細胞クランプ装置３０の樹脂膜３３に沿って配置される。このとき、柱状支持部材５０の各突起部５４は、それぞれ、ベース部５２を介して、樹脂膜３３の上面に形成された小孔３４の開口に対向し、柱状支持部材５０の貫通孔５６は、細胞クランプ装置３０の小孔３４と連通する。細胞クランプ装置３０の小孔３６からシリンジボンプ３８により矢印３９で示すように吸引し、連通孔３５、小孔３４、貫通孔５６を介して、柱状支持部材５０の突起部５４の先端５４ａに、細胞を吸着することができる。
【００６３】
このとき、図９に示すように、細胞８０は、柱状支持部材５０のベース部５２から浮いた状態で、複数の部位か柱状支持部材５０の突起部５４で支持される。柱状支持部材５０の突起部５４が適宜な剛性を有するように構成し、突起部５４の先端の変位を、カメラ５８で撮影し、撮影画像を分析することによって、細胞８０の各部位の変位を計測する。あるいは、導電膜３７、外部端子３１を介して、細胞８０の支持部位を通る電流を計測する。例えば、細胞８０の周囲に一定濃度の試薬や分子などを瞬時に導入し、このときの細胞８０の応答（細胞外濃度ジャンプ）を計測する。
【００６４】
柱状支持部材５０と細胞クランプ装置３０とを組み合わせることによって、細胞８０の複数の部位を安定して支持することができる。また、柱状支持部材５０の突起部５４の先端５４に細胞を吸着することにより、細胞８０の支持部位がずれないように支持することができる。また、柱状支持部材５０の突起部５４のたわみによって、細胞８０に対する拘束が少なく、細胞８０は高い自由度で動くことができる。したがって、細胞８０の各部位の状態を正確に計測することができる。
【００６５】
以上に説明したように、細胞内物質導入装置は、細胞の大きさに関係なくエレクトロポレーションが行えるため、高効率の外来物質の導入が実現される。また、絶縁性薄膜の上に多数の小孔を配列することにより、大量の細胞に同時並列的に外来物質を導入することができる。
【００６６】
また、細胞クランプ装置は、細胞を多くの部位でクランプすることが可能である。
【００６７】
さらに、細胞クランブ装置を製作する流路の形成方法は、流路を効率よく形成することができる。この流路の形成方法は、細胞クランプ装置に限らず、種々の分野に広く適用することができる。
【００６８】
なお、本発明は、上記した実施の形態に限定されるものではなく、種々変更を加えて実施することができる。
【００６９】
例えば、光硬化性樹脂に、ネガレジストの代わりに、ポジレジストを用いてもよい。この場合、遮光パターンは反転すればよい。遮光パターンは、導電膜以外でもよく、流路形成後に除去するようにしてもよい。
【００７０】
また、流路の形成を行うための遮光パターンを、一方の主面に光硬化性樹脂を塗布した透明な基板の他方の主面に形成し、遮光パターンを介して光硬化性樹脂に異なる角度で光を照射してもよい。また、遮光パターンを有するマスク部材を、一方の主面に光硬化性樹脂を塗布した透明な基板の他方の主面に沿って配置し、マスク部材の遮光パターンを介して光硬化性樹脂に異なる角度で光を照射してもよい。いずれの場合も、照射した光が透過しない非透過領域は、遮光パターンから離れた状態で、遮光パターンに沿って延在する。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の細胞内物質導入装置及び細胞クランプ装置は、分子生物学をはじめ、生理学・再生医科学・医療・創薬の分野の研究方法を一新するものであると同時に、ポイントオブケアーやテーラーメード医療をより簡便かつ低侵襲に行うことを可能にするデバイスである。また、本発明の流路の形成方法は、細胞クランプ装置、μＴＡＳ（Total  Ana1ysis  Systems)など、ＭＥＭＳ技術を利用したマイクロデバイスやマイクロ構造物などの製作に用いることができる。
【符号の説明】
【００７２】
１    小孔
２    絶縁性薄膜
６，７    電極
９    細胞
１０ａ,１０ｂ    細胞内物質導入装置
１１    絶縁性薄膜
１２    小孔
１４，１５    電極
２０    細胞クランプ装置
２１    基板
２２，２２ａ，２２ｂ    導電膜
２３    樹脂膜
２４ｓ    開口
２４ａ，２４ｂ，２４ｔ    小孔（縦孔）
２５ａ，２５ｂ，２５ｔ    連通孔（横孔）
３０    細胞クランプ装置
３２    基板
３３    樹脂膜
３４ａ〜３４ｈ    小孔（縦孔）
３５ａ〜３５ｈ    連通孔（横孔）
５０    柱状支持部材
５２    ベース部
５４    突起部
５４ａ    先端
５６    貫通孔
８０    細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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