(57)【要約】【課題】簡便かつ迅速に胃癌の判定を行う方法や、胃癌の判定用キット等を提供すること。【解決手段】本発明者らは、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロット法で胃癌患者血漿中のＫＩＡＡ１１９９タンパクを癌特異的に検出できることを見い出すとともに、ＥＬＩＳＡ法を確立し、胃癌患者又は正常人から採取した血液サンプル中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを測定した。その結果、胃癌患者の血液サンプルでは、正常人と比較して有意に高い値が得られたことから、上記ウエスタンブロット法及びＥＬＩＳＡを用いてＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することにより胃癌の判定が可能になった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする胃癌の判定方法。
【請求項２】
被検試料が、血液、又は血清若しくは血漿であることを特徴とする請求項１記載の胃癌の判定方法。
【請求項３】
ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドと特異的に結合する分子を用いて、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする請求項１又は２記載の胃癌の判定方法。
【請求項４】
ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合する分子が、抗体又はアプタマーであることを特徴とする請求項３記載の胃癌の判定方法。
【請求項５】
ＥＬＩＳＡ法又はウエスタンブロット法により、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする請求項４記載の胃癌の判定方法。
【請求項６】
直接ＥＬＩＳＡ法又はサンドウィッチＥＬＩＳＡ法により、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする請求項４又は５記載の胃癌の判定方法。
【請求項７】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む直接ＥＬＩＳＡ法により、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする請求項４〜６いずれか記載の胃癌の判定方法。
（Ａ）生体から採取した血液から血液サンプルを調製する工程；
（Ｂ）血液サンプルをマイクロプレートに分注し、血液サンプル固相化プレートを作製する工程；
（Ｃ）血液サンプル固相化プレートに、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを特異的に認識する抗体を反応させた後、標識二次抗体を反応させる工程；
【請求項８】
ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合する分子を備えたことを特徴とする胃癌の判定用キット。
【請求項９】
ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合する分子が、抗体及び／又はアプタマーであることを特徴とする請求項８記載の胃癌の判定用キット。
【請求項１０】
ＥＬＩＳＡ法又はウエスタンブロット法により、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする請求項９記載の胃癌の判定用キット。
【請求項１１】
直接ＥＬＩＳＡ法又はサンドウィッチＥＬＩＳＡ法により、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする請求項９又は１０記載の胃癌の判定用キット。
【請求項１２】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む直接ＥＬＩＳＡ法により、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することができるように、さらにマイクロプレート及び標識二次抗体を備えたことを特徴とする請求項９〜１１いずれか記載の胃癌の判定用キット。
（Ａ）生体から採取した血液から血液サンプルを調製する工程；
（Ｂ）血液サンプルをマイクロプレートに分注し、血液サンプル固相化プレートを作製する工程；
（Ｃ）血液サンプル固相化プレートに、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを特異的に認識する抗体を反応させた後、標識二次抗体を反応させる工程；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする胃癌の判定方法や、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することができる胃癌判定用キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本と東南アジアでは、胃癌は消化管の悪性腫瘍の中で最も多く、また、世界でも、癌死亡率では第２位を占めている。胃癌の予後は、診断技術や治療法の発達により改善しているが、進行胃癌の場合の予後は良いとはいえず、胃漿膜にまで浸潤した胃癌の予後は、５年生存率で３５％と低い。また、進行癌の治癒的切除の後に起こる再発の主原因は腹膜播種である。この腹膜播種再発においてはいまだに有効な治療法がなく、５年生存率は５％以下と報告されている。胃癌細胞の悪性な特性のうち、腹膜への転移は特に複雑な現象であり、多くのステップと多くの遺伝子が関与している。これまでの報告によれば、胃癌の腹膜播種には、接着分子関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子や他の遺伝子が深く関与しているとされており、胃癌の腹膜播種を始めとする胃癌の転移のメカニズム解明には、さらなる研究が必要であるとされている。
【０００３】
胃癌を始めとする癌の検出・診断方法として、血中の腫瘍マーカーを計測する方法が挙げられる。腫瘍マーカーは、腫瘍細胞が産生する物質、又は腫瘍に対する反応により正常細胞が産生する物質であり、これらの物質のうち、血中や尿中で増加する物質を計測することによって、腫瘍の診断を簡便な体外診断により行うことができる。
【０００４】
腫瘍マーカーとしては、乳癌患者の胸部組織と正常人の胸部組織で差異的に発現する遺伝子を使用した悪性腫瘍、特に乳癌を予想、診断、予後判定、予防および処置するための新規な組成物、方法および使用や（例えば、特許文献１参照。）や、肝炎ウイルスの感染に起因し慢性肝炎又は肝硬変を発症した患者に対し、肝炎ウイルスに感染した患者のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列を評価することによって肝臓癌の発癌リスクを評価する方法（例えば、特許文献２参照。）や、その遺伝子産物がＣＬＬ細胞及び前立腺癌細胞の新生物性又は腫瘍形成性増殖を抑制するｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６のコピー数、変異状態又は遺伝子発現を検出することによる慢性リンパ性白血病又は前立腺癌の診断方法（例えば、特許文献３参照。）や、無症候性期又は初期段階の患者における発癌過程の存在を検出するのに適当な迅速な癌の診断方法や、癌患者の血清中に存在する炭酸脱水酵素IIの活性化化合物（腫瘍マーカー）、前記癌の診断方法によって、無症候性期または初期段階の患者の癌を検出することを特徴とする癌の処置方法；ならびに該癌の診断方法を行うためのキット（例えば、特許文献４参照。）等が知られている。
【０００５】
また、胃癌に関しては、既知のＩ型コラーゲンのＣ端非３重鎖テロペプチド（ＩＣＴＰ）の発現量の変動をマーカーにすることを特徴とする、進行胃癌、特にスキルス胃癌の適切な診断マーカー（例えば、特許文献５参照。）や、従来のＲＬＧＳ法に比較して少量のＤＮＡサンプルを用い簡便で、迅速、安価に癌患者の予後が良好か否かを診断することのできる技術を確立するものであって、癌部または非癌部組織検体より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、その割合に基づいて胃癌をはじめ、種々の癌疾患の予後が良好か否かを判断する方法（例えば、特許文献６参照。）や、転移性結腸直腸癌あるいは原発性及び／又は転移性の胃癌又は食道癌をスクリーニング・診断するための試薬、キット及び方法や、その患者を処置するためにインビボでイメージングするための化合物や組成物、その治療や予防のための薬物、遺伝子療法薬およびアンチセンス化合物を運搬するための組成物、ワクチンおよび方法（例えば、特許文献７参照。）や、細胞の生体エネルギー的指数を作成するため、構造タンパク質及びミトコンドリアの呼吸（それぞれ例えば、ｈｓｐ６０やチトクロームオキシダーゼのサブユニットＩおよびＩＶ）に関して、ミトコンドリアの生体エネルギー的機能のタンパク質（Ｈ＋−ＡＴＰ合成酵素のβ−触媒サブユニットなど）の発現についての研究を使用すること、そしてグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素及びピルビン酸キナーゼＭなどの細胞の解糖経路のタンパク質の発現に関連する前記ミトコンドリア生体エネルギー指数（β−ＡＴＰａｓｅ／ｈｓｐ６０比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩ比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩＶ比）を使用することからなる、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための方法（例えば、特許文献８参照。）等が提案されている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１５９６４０号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１０２９号公報
【特許文献３】特表２００６−５０６４６９号公報
【特許文献４】特表２００１−５２４８１５号公報
【特許文献５】特開２００１−３３４６０号公報
【特許文献６】特開２００２−１１２７９９号公報
【特許文献７】特表２００３−５３２３８９号公報
【特許文献８】特表２００５−５２６９８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、被験試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することにより、簡便かつ迅速に胃癌の判定を行う方法や、胃癌の判定用キット等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、胃癌患者の胃の癌部位（胃癌組織）と非癌部位（胃正常組織）における遺伝子の発現量を網羅的に比較検討し、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子を含む１２０の遺伝子が、胃癌組織において著しく強く発現していることを既に見いだしている（特願２００６−３０６０５７）。そこで、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を確立し、胃癌患者及び正常人から採取した血液サンプル中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを測定したところ、胃癌患者の血液サンプルでは、正常人と比較して有意に高い測定値が得られた。さらに、上記ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法により、血液サンプル中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドの発現を調べた結果、胃癌患者の血液サンプルに強いシグナルが検出された。以上の結果から、上記ＥＬＩＳＡ法及びウエスタンブロット法を用いて、血液中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドの検出又は定量することにより簡便かつ迅速に胃癌の判定が可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする胃癌の判定方法や、（２）被検試料が、血液、又は血清若しくは血漿であることを特徴とする上記（１）記載の胃癌の判定方法や、（３）ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドと特異的に結合する分子を用いて、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする上記（１）又は（２）記載の胃癌の判定方法や、（４）ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合する分子が、抗体又はアプタマーであることを特徴とする上記（３）記載の胃癌の判定方法や、（５）ＥＬＩＳＡ法又はウエスタンブロット法により、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする請求項４記載の胃癌の判定方法や、（６）直接ＥＬＩＳＡ法又はサンドウィッチＥＬＩＳＡ法により、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする上記（４）又は（５）記載の胃癌の判定方法や、（７）（Ａ）生体から採取した血液から血液サンプルを調製する工程と、（Ｂ）血液サンプルをマイクロプレートに分注し、血液サンプル固相化プレートを作製する工程と、（Ｃ）血液サンプル固相化プレートに、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを特異的に認識する抗体を反応させた後、標識二次抗体を反応させる工程とを含む直接ＥＬＩＳＡ法により、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする上記（４）〜（６）いずれか記載の胃癌の判定方法に関する。
【００１０】
また本発明は、（８）ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合する分子を備えたことを特徴とする胃癌の判定用キットや、（９）ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合する分子が、抗体及び／又はアプタマーであることを特徴とする上記（８）記載の胃癌の判定用キットや、（１０）ＥＬＩＳＡ法又はウエスタンブロット法により、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする上記（９）記載の胃癌の判定用キットや、（１１）直接ＥＬＩＳＡ法又はサンドウィッチＥＬＩＳＡ法により、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする上記（９）又は（１０）記載の胃癌の判定用キットや、（１２）（Ａ）生体から採取した血液から血液サンプルを調製する工程と、（Ｂ）血液サンプルをマイクロプレートに分注し、血液サンプル固相化プレートを作製する工程と、（Ｃ）血液サンプル固相化プレートに、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを特異的に認識する抗体を反応させた後、標識二次抗体を反応させる工程とを含む直接ＥＬＩＳＡ法により、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量することができるように、さらにマイクロプレート及び標識二次抗体を備えたことを特徴とする上記（９）〜（１１）いずれか記載の胃癌の判定用キットに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、血液サンプルの胃癌マーカーポリペプチドＫＩＡＡ１１９９を検出又は定量することにより、血液サンプルの採取源が胃癌患者であるかどうかを非常に簡便かつ迅速に判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の胃癌の判定方法としては、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量する方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドと特異的に結合する分子を用いて、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量する方法を挙げることができ、上記被検試料としては、血液、血清、血漿等の血液由来のサンプルや、リンパ液、尿、唾液等を例示することができ、なかでも、血液、血清、血漿等の血液由来のサンプルを好適に例示することができる。また、本発明の胃癌の判定用キットとしては、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量するための、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合する分子を備えたキットであれば特に制限されるものではない。そして、上記ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合する分子としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合する抗体や、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合するアプタマー（核酸分子）等を好適に例示することができる。
【００１３】
上記ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等のほか、これら抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等を例示することができるが、配列番号１に示されるＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドの全部又はその一部を抗原として、ウサギに免疫することより作製されたポリクローナル抗体ＫＩＡＡ−Ａ２を好例として具体的に示すことがきる。また、上記ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量する方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光方法法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法、ウエスタンブロット法等の公知の免疫学的測定方法であれば特に制限されないが、なかでもＥＬＩＳＡ法、又はウエスタンブロット法を好例として挙げることができ、さらに好ましい方法としてＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。また、上記ＥＬＩＳＡ法としては、直接ＥＬＩＳＡ法、間接ＥＬＩＳＡ法、サンドウィッチＥＬＩＳＡ法等の既知のＥＬＩＳＡ法であれば得に制限されるものではないが、なかでも、（Ａ）生体から採取した血液から血液サンプルを調製する工程と、（Ｂ）血液サンプルをマイクロプレートに分注し、血液サンプル固相化プレートを作製する工程と、（Ｃ）血液サンプル固相化プレートに、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを特異的に認識する抗体を反応させた後、標識二次抗体を反応させる工程とを含む直接ＥＬＩＳＡ法など、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合する抗体を一次抗体として用いる直接ＥＬＩＳＡ法を好例として挙げることができる。また、上記ＥＬＩＳＡ法に用いる標識二次抗体としては、Ｃｙ３，Ｃｙ５，ＦＩＴＣ，ローダミン等の蛍光標識二次抗体や、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ等の酵素標識二次抗体等を例示することができ、なかでもＨＲＰ標識二次抗体を好例として挙げることができる。
【００１４】
上記ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合するアプタマーとしては、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに特異的に結合するＤＮＡやＲＮＡ等の核酸アプタマーを好適に例示することができるが、これら核酸アプタマーの作製・探索方法としては種々の公知方法を用いることができるが、中でもＳＥＬＥＸ法（S.D. Jayasena, 1999, Clin. Chem., 45: 1628-1650）やin vitro selection法（Ellington AD, Szostak JW, "In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.", Nature, 1990 Aug 30;346(6287):818-22.）を好適に例示することができる。例えば、インビトロでの選択および増幅の反復法によってオリゴヌクレオチドの非常に大きなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法であるＳＥＬＥＸ法によってＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに結合する核酸アプタマーは、容易に選択することができる。ライブラリーは典型的には、２つの固定された配列領域がフランキングした１０１４〜１０１５のランダムＤＮＡ配列を含み、固体支持体に固定されている標的分子に結合する配列は、簡単な洗浄工程によって結合していない配列から分離することができ、標的に結合した配列の集団を、２つの固定された配列領域に対するプライマーを使用してＰＣＲにより増幅する。この濃縮されたライブラリーを、次の選択／増幅サイクルに使用することができ、より濃縮されたライブラリーから標的核酸の配列情報を得るために、クローニングした後、配列を決定することによって、目的とする核酸アプタマーを同定することができる。
【００１５】
本発明の胃癌の判定方法においては、上記ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出又は定量する方法により、被検試料中にＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドの存在が検出された場合や、被検試料中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチド発現量が正常対照試料と比較して高い場合に、被検試料の採取源が胃癌患者であると評価できる。
【００１６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
（ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに結合する抗体の作製）
ＫＩＡＡ１１９９タンパクを示す配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２０２〜２２０のアミノ酸配列のＮ末端にシステインを付加したアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号２）、アミノ酸番号６１２〜６２７のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号３）、及びアミノ酸番号１１５９〜１１７６のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号４）の計３つのペプチドを合成した。これらのペプチドに対するポリクローナル抗体の作製を株式会社免疫生物研究所に依頼したところ、各々のペプチドを免疫した３羽のウサギから抗血清が得られた。抗血清を段階的に希釈した希釈液と、各々のペプチドを固定したプレートとを用いてアッセイを行ったところ、抗血清中の抗体と各々のペプチドとの反応が確認された。なお、抗血清中の抗体と各々のペプチドとの反応は、抗血清を２０４８００倍に水で希釈した希釈液を用いた場合にも確認された。
【実施例２】
【００１８】
（ＥＬＩＳＡ法によるＫＩＡＡ１１９９ポリペプチド測定系の確立）
実施例１で作製したポリクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ法によるＫＩＡＡ１１９９ポリペプチド測定系を確立した。プラスミドベクターに全長ＫＩＡＡ１１９９とＧＦＰの融合遺伝子を組み込み、ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入を行った。ＫＩＡＡ１１９９を過剰発現する細胞株（２９３ＫＩＡＡＧＦＰ）を培養し、その培養上清を回収した。回収した培養上清を１００μｌ〜０．００１μｌ含むように固相化用サンプルを調製し、マイクロプレート（polystyrene  microplate、Ｒ＆Ｄ社製）に分注し、４℃で１２時間インキュベートした。０．０５％tween20を含むＰＢＳで、３回洗浄したのち、バッファー（１％アルブミンを含むＰＢＳ ）で１００倍希釈した抗ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチド抗体ＫＩＡＡ−Ａ２を加え、室温で２時間インキュベートした。次に、０．０５％tween20を含むＰＢＳで、３回洗浄した後、バッファー（ＰＢＳ＋１％アルブミン）で２００倍希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を加え、室温で２時間インキュベートした。０．０５％tween20を含むＰＢＳで、３回洗浄した後、Substrate solutionを加え、室温で２０分インキュベートした。Ｏ．Ｄ．値（５７０ｎｍ）を、吸光度計（日本モレキュラーデバイス社製）により測定した。図１に結果を示すように、固相化した培養上清の量に依存して、吸光度が高くなった。
【実施例３】
【００１９】
（血液の採取と保存）
原発性の切除不能胃癌、又は転移性の切除不能胃癌に対し５−ＦＵ（ＴＳ−１，メソトレキセート／５−ＦＵを含む）若しくはシスプラチン・イリノテカン併用療法が行われた患者で、かつ、文書でインフォームド・コンセントの得られた患者２例を検体の採取源とした。採取した血液検体を遠心し、血漿に分離し、−８０度で保存した。
【００２０】
（ＥＬＩＳＡ法によるＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドの測定）
凍結血漿検体を氷上で融解し、５倍希釈してマイクロプレートに５０ｍｌづつ分注し、４度で１２時間静置した。血液サンプルを固相化したプレートを用い、実施例２と同様の方法でＥＬＩＳＡを行い、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを測定した。測定の結果を図２に示す。バックグラウンドで補正すると、５倍程度癌の検体で上昇していた。
【００２１】
また、抗ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチド抗体ＫＩＡＡ−Ａ２を用いたウエスタンブロット法により、凍結血漿検体中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを検出した。１レーンにつきタンパク量３０μｇとなるように血漿サンプルを調製し、一次抗体として５００倍希釈したＫＩＡＡ−Ａ２を、二次抗体として１０００倍希釈した抗ウサギＩｇＧ抗体をそれぞれ用い、シグナルの検出にはECL western blotting detection system（GE healthcare社）使用した。その結果、図３に示すように、胃癌患者由来の血漿において、予想されるＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドの分子量（１５３ｋＤａ）とほぼ一致する位置に強いシグナルが検出されたことから、ウエスタンブロット法でもＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドの検出が可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の胃癌の測定法により、生体から採取された血液サンプル中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを測定した結果を示す図である。
【図２】本発明の胃癌の測定法の概略を示すとともに、２９３ＫＩＡＡＧＦＰ細胞株培養上清中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドをＥＬＩＳＡを用いて測定した結果を示す図である。
【図３】健常人および胃癌患者の血漿中のＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドを、ウエスタンブロット法を用いて測定した結果を示す図である。
【図１】
2009276153.tif 000002
【図２】
2009276153.tif 000003
【図３】
2009276153.tif 000004
【配列表】
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