(57)【要約】【課題】標的タンパク質に与える影響が最小限である蛍光タンパク質を提供すること。【解決手段】本発明は、天然存在の４量体ヘビイソギンチャク（Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａ）緑色蛍光タンパク質４９９（ＡｓＧＦＰ４９９）の２量体および単量体変異体、そのペプチド、ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドと、とりわけ細胞ベースアッセイまたは無細胞アッセイのセットアップにおける、細胞内蛍光マーカーとしてのそれらの使用とに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）λ３９６から４９０ｎｍの範囲の光で励起された際に緑色光を発し、
（ｂ）配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｃ）配列番号１との整列下で、以下の多重アミノ酸置換（残基位置は配列番号１を参照している）、すなわち
ｖｉｉｉ）Ｓ１０３Ｋ、
ｉｘ）Ｓ１０３Ｋ、Ｔ１５９Ｋ、およびＦ１７３Ｅ、
ｘ）Ｓ９４Ｔ、Ｓ１０３Ｋ、Ｔ１５９Ｋ、およびＦ１７３Ｅ、
ｘｉ）Ｓ１０３Ｋ、Ｒ１５０Ｅ、
ｘｉｉ）Ｓ１０３Ｋ、Ｆ１７３Ｅ、
ｘｉｉｉ）Ｓ９４Ｔ、Ｓ１０３Ｋ、Ｒ１５０Ｋ、Ｓ１７１Ｎ、およびＫ２０６Ｒ、
ｘｉｖ）Ｓ９４Ｔ、Ｓ１０３Ｋ、Ｒ１５０Ｉ、Ｓ１７１Ｎ、およびＫ２０６Ｒ
のうちの１つを示す、単離された蛍光タンパク質またはポリペプチド。
【請求項２】
水溶性であり、λ３９６から４９０ｎｍの範囲の光で励起された際に緑色光を発する能力を保持しており、請求項１に記載の置換のうちの少なくとも１つを示す、請求項１に記載のタンパク質またはポリペプチドの断片。
【請求項３】
配列番号２から８からなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質またはポリペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の蛍光タンパク質、ポリペプチド、またはその断片を特異的に認識し、結合できる抗体。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質もしくはポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子。
【請求項６】
配列番号１１から１７、もしくはその相補鎖、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリッド形成する配列から選択された、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
コドン使用頻度が哺乳動物細胞での発現用に最適化されている、請求項５または６に記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項５または６に記載の核酸分子を保持する発現ベクター。
【請求項９】
請求項５または６に記載の核酸分子または請求項８に記載の発現ベクターを含有する原核宿主細胞または真核宿主細胞。
【請求項１０】
細胞内の蛍光を検出する方法であって、
（ａ）請求項１から３のいずれかに記載の蛍光タンパク質、ポリペプチド、またはその断片を発現する細胞を用意する工程と、
（ｂ）前記細胞を、λ３９６から４９０ｎｍの範囲の光での励起に曝露する工程と、
（ｃ）蛍光を検出する工程と
を有する方法。
【請求項１１】
細胞内蛍光マーカーとしての、請求項１から３のいずれかに記載の蛍光タンパク質もしくはポリペプチドまたはその断片の使用。
【請求項１２】
細胞内または細胞小器官内の生体分子または化合物を標識化、位置決定、または検出するための、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
細胞に基づく、あるいは無細胞でのアッセイをセットアップするための、請求項１から３のいずれかに記載の蛍光タンパク質もしくはポリペプチドまたはその断片の使用。
【請求項１４】
前記アッセイがハイスループット型式で行われる、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
生物学的アッセイで使用するためのキットであって、適した容器の中に包装された、請求項１から３のいずれかに記載の蛍光タンパク質もしくはポリペプチドまたはその断片、および／または請求項４に記載の抗体、および／または請求項５から７に記載の核酸分子、および／または請求項８に記載の発現ベクターを含有するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然存在の４量体ヘビイソギンチャク（Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａ）緑色蛍光タンパク質４９９（ＡｓＧＦＰ４９９）｛Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎ、２０００年、＃２７；Ｎｉｅｎｈａｕｓ、２００６年、＃１７０｝の２量体および単量体変異体に関する。本発明の蛍光タンパク質は、真核細胞での高発現性、オリゴマー形成傾向の低下、スペクトルの改善、３７℃での高安定性、高水溶性、および低嵩高性（ｌｏｗ  ｂｕｌｋｉｎｅｓｓ）などの有利な特性、すなわちレポーター遺伝子技術および細胞の使用に基づく（細胞ベース）のアッセイにおけるそれらの使用をとりわけ魅力的なものとするすべての特徴を示す。本発明の蛍光タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドも、タンパク質相互作用の研究ならびに診断および医療用画像処理におけるタンパク質の標識化に有用である。
【背景技術】
【０００２】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ファミリーは蛍光タンパク質（ＦＰ）および色素タンパク質（ＣＰ）を包含し、これらの数は増加しつつある。現在までに、１００を超える数がクローニングまたは改変されており、それらの多くが、刺胞動物門（Ｃｎｉｄａｒｉａ  ｐｈｙｌｕｍ）の生物など、海洋無脊椎動物からのものとして記載または性質決定されたものである｛Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９６２年、＃１７４；Ｍｏｒｉｎ、１９７１年、＃１３；Ｗａｍｐｌｅｒ、１９７１年、＃１４；Ｍｏｒｉｎ、１９７４年、＃１６；Ｌａｂａｓ、２００２年、＃３０；Ｍａｔｚ、１９９９年、＃２８；Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎ、２０００年、＃２７；Ｌｕｋｙａｎｏｖ、２０００年、＃１１１；Ｇｕｒｓｋａｙａ、２００１年、＃９７｝。
【０００３】
色素タンパク質は、通常、小さな非ペプチド性分子または金属イオンなどの補欠分子族を必要とする｛Ｂｉｒｏｎ、２００３年、＃１６９｝が、これらのタンパク質とは異なりＧＦＰファミリーのタンパク質は、それらの光学特性を獲得するのに、分子酸素を除けば、外部物質を必要とせずに、それら自身の「補欠分子族」（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｇｒｏｕｐ）を合成する｛Ｈｅｉｍ、１９９４年、＃２２；Ｃｕｂｉｔｔ、１９９５年、＃２０；Ｒｅｉｄ、１９９７年、＃１７１）。
【０００４】
１９５５年に、Ｄａｖｅｎｐｏｒｔら｛Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ、１９５５年、＃３｝は、太平洋産のクラゲであるエクオレア  ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）を長波紫外線で照射することによって緑色蛍光が生じることを報告した。この生物から青色光発光タンパク質を精製する過程で、Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら｛Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ、１９６２年、＃１７３｝は、溶液中の緑色がかった光に気づいた。この青色蛍光タンパク質が有名な発光タンパク質であるエクオリンであり、緑色のものがＧＦＰであった。上記発光タンパク質はカルシウムイオンによって活性化されるが、カルシウムイオンは、上記タンパク質内に存在する３つのＥＦハンド構造に結合する。この構造は、カルシウム結合タンパク質の典型的なものである。これらのイオンの存在下で、エクオリンは立体配座変化を行い、それが、結合しているセレンテラジンの酸化を引き起こし、それに続いて、ＣＯ2の放出および４７０ｎｍでの青色光の発光が起こる。エクオレア  ビクトリアＧＦＰ（ＡｖＧＦＰ）は、クラゲの生物発光系の一部であり、エクオリンからの青色光を５０８ｎｍの緑色光に変換する２次放射体（ｓｅｃｏｎｄｒｙ  ｅｍｉｔｔｅｒ）の役割を果たす。実際、ＧＦＰは、Ｃａ2+で活性化されたエクオリンからλ最大＝４７０ｎｍの青色光を吸収し、その後すぐにλ最大＝５０８ｎｍの緑色光を発することによって、エネルギー移動アクセプターとして働く｛Ｍｏｒｉｓｅ、１９７４年、＃１７；Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９６２年、＃１７４｝。
【０００５】
Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔら｛Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ、１９７８年、＃１８｝は、ＧＦＰの分子量（Ｍｗ）を約２７ｋＤａと推算した。ＧＦＰ発見の４０年後に、野生型遺伝子のクローニング｛Ｐｒａｓｈｅｒ、１９９２年、＃５｝と共に突破口が開かれた。野生型遺伝子は、理論Ｍｗ値２６．９ｋＤａを有する２３８個のアミノ酸のタンパク質をコードし、後に、異なった系での発現が行われた｛Ｃｈａｌｆｉｅ、１９９４年、＃１９｝。これらの結果は、単独で発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）を形成するＧＦＰの独特な能力のおかげで、いかなる生物においてもＧＦＰが使用できるであろうことを示した。その発色団の形成は、元々エクオレア  ビクトリアに由来する酵素または他のタンパク質などの因子に依存しなかった。この遺伝子のタンパク質配列は、強力な発色団を内因的にコードしており、分子酸素を除いて、外部の基質も補助因子も必要としないことが明らかにされた｛Ｐｒａｓｈｅｒ、１９９２年、＃５；Ｃｏｄｙ、１９９３年、＃２１；Ｈｅｉｍ、１９９４年、＃２２｝。
【０００６】
ＧＦＰの結晶構造は、１９９６年に２つのグループによって別々に解明された｛Ｏｒｍｏ、１９９６年、＃２５、Ｙａｎｇ、１９９６年、＃２６｝。新規のタンパク質折り畳み構造が発見され、それはβ−カン（β−Ｃａｎ）と名付けられた｛Ｙａｎｇ、１９９６年、＃２６｝。この構造は、１本のα−ヘリックスが交差している１１の逆平行β−シートによって形成されるβ−バレルを必要とするものである。このヘリックスのほぼ中央には、Ｓ６５−Ｔ６６−Ｇ６７というトリペプチド配列が位置しており、自動触媒反応によって、発色団構造のバックボーンとして働く。この発色団それ自体は、ｐ−ヒドロキシベンジリデンイミダゾリドン環（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｏｎｅ  ｒｉｎｇ）である。
【０００７】
ＧＦＰは、遺伝子発現のレポーター、生細胞内でのタンパク質局在性をモニターする融合タグ、細胞系譜のトレーサー、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のパートナー、およびバイオセンサーとして、分子生物学および細胞生物学の重要なツールとなった｛Ｔｓｉｅｎ、１９９８年、＃２３；Ｋｅｎｄａｌｌ、１９９８年、＃２４｝。
【０００８】
野生型ＧＦＰは、その際立った有用性にもかかわらず、発現レベル、光感受性、低輝度、不溶性、および高濃度で２量体化する傾向の問題など、いくつかの限界を示す。これらの報告されている不利を克服するため、より可溶性であり、より光抵抗性であり、より明るく、かつ移動したスペクトル特性を有する変異体を得るために、変異誘発によって野生型ＧＦＰを改善する努力がなされた。
【０００９】
中程度または低程度のアミノ酸配列同一性にもかかわらず、すべてのＧＦＰ様タンパク質はβ−カン構造を共有している可能性が高く｛Ｍａｔｚ、２００２年、＃１０８｝｛Ｃｈｕｄａｋｏｖ、２００５年、＃１０６｝｛Ｅｖｄｏｋｉｍｏｖ、２００６年、＃１０３｝、配列の整列比較において、Ｔ６６、Ｇ６７など、発色団の一部であるアミノ酸、ならびにＲ９６および２２２Ｅなど、発色団と相互作用する他のアミノ酸（付番はＧＦＰによる）がそれらの蛍光タンパク質で保存されていることをさらに示した｛Ｂａｉｒｄ、２０００年、＃３５｝。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
花虫類（Ａｎｔｈｏｚｏａ）のＧＦＰ様タンパク質の大きな不利な点の１つは、それらがオリゴマー化する傾向にあることである｛Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ、２００４年、＃７９｝。このオリゴマー形成は、レポーター遺伝子またはバイオマーカーとしてのそれらの使用を狭めないが、融合タンパク質適用でのそれらの使用を妨げる。それらと融合した標的タンパク質は、嵩高な産物を形成し、とりわけ標的タンパク質自体がオリゴマーを形成する傾向を有する場合、細胞内でのそれらの転位または局在を妨げることがある。他のものは、オリゴマー形成によって活性化されることさえあり、オリゴマー蛍光タンパク質とのそれらの融合は、構成的に活性な標的タンパク質を生むこともあり、それが宿主細胞に害を及ぼすことがある｛Ｚａｃｈａｒｉａｓ、２００２年、＃５９｝。したがって、標的タンパク質に与える影響が最小限である蛍光タンパク質を見出すか、または構築することが、重要かつ必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の態様では、本発明は、
（ａ）λ３９６から４９０ｎｍの範囲の光で励起された際に緑色光を発し、
（ｂ）配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｃ）配列番号１との整列下で、以下の多重置換（残基位置は配列番号１を参照している）、すなわち
ｉ）Ｓ１０３Ｋ
ｉｉ）Ｓ１０３Ｋ、Ｔ１５９Ｋ、およびＦ１７３Ｅ
ｉｉｉ）Ｓ９４Ｔ、Ｓ１０３Ｋ、Ｔ１５９Ｋ、およびＦ１７３Ｅ
ｉｖ）Ｓ１０３Ｋ、Ｒ１５０Ｅ
ｖ）Ｓ１０３Ｋ、Ｆ１７３Ｅ
ｖｉ）Ｓ９４Ｔ、Ｓ１０３Ｋ、Ｒ１５０Ｋ、Ｓ１７１Ｎ、およびＫ２０６Ｒ
ｖｉｉ）Ｓ９４Ｔ、Ｓ１０３Ｋ、Ｒ１５０Ｉ、Ｓ１７１Ｎ、およびＫ２０６Ｒ
のうちの１つを示す、単離された蛍光タンパク質またはポリペプチドを提供する。
【００１２】
本発明には、上記に定義したタンパク質またはポリペプチドの断片も含まれ、前記断片は、水溶性であり、λ３９６から４９０ｎｍの範囲の光で励起された際に緑色光を発する能力を保持しており、上記に特定されている変異のうちの少なくとも１つを示す。
【００１３】
好ましい実施形態では、本発明による蛍光タンパク質またはポリペプチドは、配列番号２から８からなる群から選択される。上記蛍光タンパク質の活性に負の影響を与えずに、そのアミノ酸配列を改変することができ、とりわけ、示された配列同一性制限内でのアミノ酸残基の保存的置換によって改変できる。加えて、蛍光活性を改変せずに、小さな部分を上記タンパク質配列から除去することもできる。
【００１４】
好ましい実施形態では、本発明による変異誘発を受ける蛍光タンパク質は、ヘビイソギンチャク種（Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａ）の生物から単離される。これらのタンパク質は、既知タンパク質に対して非常に低い配列相同性を示し、水溶性かつ温度安定性であり、３７℃で細菌内において６時間以内に誘導でき、かつ、その低嵩高性のおかげで、転位アッセイには特に適している。
【００１５】
別の態様では、本発明は、対象の蛍光タンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。適した抗体は、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギなどの宿主動物を、本発明の蛍光タンパク質のすべてまたは一部を含むペプチドで免疫化することによって取得される。上記免疫原は、完全なタンパク質を含むのでも、その断片および誘導体を含むものでもよい。抗体は、モノクローナルでも、ポリクローナルでも、単一鎖でも、多量体（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ）でもよく、従来の技法によって産生させることができる。
【００１６】
別の態様では、本発明は、上記に定義したタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、分類的に刺胞動物門（Ｃｎｉｄｏｒｉａ  ｐｈｙｕｍ）、花虫網（Ａｎｔｈｏｚｏａ  ｃｌａｓｓ）、六枚サンゴ亜網（Ｚｏａｎｔｈａｒｉａ  ｓｕｂｃｌａｓｓ）、イソギンチャク目（Ａｃｔｉｎａｒｉａ  ｏｒｄｅｒ）、ウメボシイソギンチャク科（Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｆａｍｉｌｙ）、ミナミウメボシイソギンチャク属（（Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｇｅｎｏｕｓ）、およびヘビイソギンチャク種（Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）に属する生物から単離された、ＡｓＧＦＰ４９９をコードする核酸分子の適切な改変によって取得できるポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１０（ヘビイソギンチャク種ルフェセンス（ｒｕｆｅｓｃｅｎｓ）変種のｗｔ−ＡｓＧＦＰ499コード配列）を提供する。
【００１７】
好ましい実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号１１から１７、その相補鎖、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリッド形成する核酸から選択される。
【００１８】
哺乳動物細胞での適切な発現を得るには、本発明による核酸配列は、コドン使用頻度の最適化を必要とする可能性がある。本発明による変異体は、そのコドン使用頻度が哺乳動物細胞での発現用に最適化されているｃＤＮＡ配列、好ましくは配列番号９から生成させることが好ましい。配列番号９は、配列番号１０（ｗｔ−ＡｓＧＦＰ499コード配列）のコドン使用頻度を改変することによって取得される。
【００１９】
本発明による蛍光タンパク質をコードするｃＤＮＡの断片、好ましくは配列番号１１から１７に記載のｃＤＮＡ、およびそれにハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドは、対象とする標的生物のｃＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。低ストリンジェンシー（ｌｏｗ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件では、例えば、５０℃および６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  塩化ナトリウム／０．０９Ｍ  クエン酸ナトリウム）でのハイブリッド形成ならびに１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）中での５５℃での洗浄が利用でき、一方、ストリンジェントな条件では、例えば、５０℃以上および０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ  塩化ナトリウム／１．５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）でよい。ハイブリダイゼーション手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら｛Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９年、＃１７５｝に記載されている。プライマーとして使用される場合、上記オリゴヌクレオチドは、標的分子における所望の領域を増幅するために、上記標的分子における異なった領域にハイブリッド形成するものでありうる。プローブまたはプライマーの長さに応じて、本発明によるハイブリッド形成核酸プローブまたはプライマーは、それらがハイブリッド形成する上記配列セグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％の相補性を有するものでありうる。好ましい実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、１０から３０個のヌクレオチドを含有する。
【００２０】
本発明のさらに別の態様は、示された核酸分子を含有する発現ベクターに関する。適したベクターには、ウイルス性および非ウイルス性のベクター、好ましくはプラスミドが含まれ、それらは、上記核酸配列を適切な宿主内にクローニング、増幅、発現、または形質移入するのに使用できる。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の核酸またはそのベクターを含む原核宿主細胞または真核宿主細胞を提供する。上記タンパク質の産生または細胞ベースのアッセイには、大腸菌、枯草菌、出芽酵母（Ｓ．  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、または脊椎動物などの高等生物の細胞、とりわけＣＯＳ−７細胞、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ−Ｋ１、アフリカツメガエル卵母細胞（Ｘｅｎｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅｓ）などの宿主細胞を使用することができる。
【００２２】
本発明は、そのゲノムが本発明による核酸分子を含有するトランスジェニック生物をさらに提供する。トランスジェニック生物は、その生物の細胞のうち１つまたは複数が本発明の異種核酸を含有する、細菌、ラン藻（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、真菌（ｆｕｎｇｉ）、植物、および動物を含めた原核生物または真核生物でありうる。本発明には、本明細書に開示した核酸を含有する胚幹（ＥＳ）細胞も含まれる。以前に報告されている通り、非ヒト哺乳動物、鳥または両生類を含めた非ヒトトランスジェニック動物を産生するのに、適切な繊維芽細胞−支持細胞層上、または白血病抑制因子（ＬＩＦ）もしくは他の適した成長因子の存在下で培養されたＥＳ細胞を用いることができる。Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＬｅａおよびＬｅｅｇｏｏｄ編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社）（１９９３年）、２７５〜２９５頁、およびＰｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ  （Ｏｋｓｍａｎ−ＣａｌｄｅｎｔｅｙおよびＢａｒｚ編集）（２００２年）、７１９頁に概説されている通り、トランスジェニック植物も産生できる。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、上記に定義した蛍光タンパク質を産生する方法に関し、この方法は、
（ａ）発現調節エレメント（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）に作用可能に連結した、本発明による核酸分子を用意する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の核酸を、その発現を可能にする条件下にある細胞に導入する工程と、
（ｃ）その発現産物を単離する工程と
を有する。
【００２４】
本発明の別の態様は、細胞内の蛍光を検出する方法であり、この方法は、
（ａ）本発明による蛍光タンパク質を発現する細胞を用意する工程と、
（ｂ）上記細胞を、λ４６０から４９０ｎｍの範囲の光での励起に曝露する工程と、
（ｃ）その蛍光を検出する工程と
を有する。
【００２５】
通常、本発明による蛍光タンパク質もしくはそれらのコード配列は、細胞内蛍光マーカーとして、とりわけ細胞内または細胞小器官（ｏｒｇａｎｅｌｌａ）内の生体分子もしくは化合物を標識、位置決定、もしくは検出するための蛍光マーカーとして、例えば細胞ベースのアッセイで使用するか、または無細胞調製物中でのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでそれらを使用することができる。上記無細胞調製物は水溶液であることが好ましい。
【００２６】
典型的適用では、蛍光レポート基（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）を発現する細胞のアレイを自動スクリーニングするツールとして、ペプチド（ターゲッティング配列など）もしくはタンパク質の細胞内位置を検出するためにそれらに融合されたマーカーとして、または例えばシグナル伝達の研究などで、細胞活性の指示体として上記蛍光タンパク質を用いる。具体的には、本発明のタンパク質は、シグナル伝達経路に関与するセカンドメッセンジャーを検出するために、ＰＫＣ−γ  Ｃａ結合ドメイン、ＰＫＣ−γ  ＤＡＧ結合ドメイン、ＳＨ２ドメイン、またはＳＨ３ドメインなどの特定のドメインに融合させることができる｛Ｃｈｕｄａｋｏｖ、２００５年、＃１０６｝。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明の蛍光タンパク質を用いる細胞ベースのアッセイは、光学的スクリーニング手段もしくは多サンプル分析に適した装置を使用するハイスループット（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）型式で、または顕微鏡画像処理および電子分析を使用することによって行う。
【００２８】
さらに別の実施形態では、創薬のためのスクリーニングおよびゲノム機能解析の分野で、多細胞の再編成および移動における変化を検出するための全細胞マーカーとして、対象のタンパク質を使用する。
【００２９】
対象の蛍光タンパク質は、米国特許第７０４９４００号に記載のプロテアーゼ切断アッセイでも用途がある。
【００３０】
さらに別の実施形態では、本発明のタンパク質は、局在性マーカーとの他の蛍光融合タンパク質の共局在性を検出するためのハイコンテントスクリーニングでも、細胞内蛍光タンパク質／ペプチドの動きの指示体として、または単独のマーカーとして使用できる。
【００３１】
さらに別の実施形態では、Ｃａ2+イオン指示薬、ｐＨ指示薬、リン酸化指示薬、またはマグネシウム、ナトリウム、カリウム、塩素イオン、ハロゲン化物などの他のイオンの指示薬など、原核細胞および真核細胞内でのバイオセンサーとして、対象の蛍光タンパク質が使用できる｛Ｃｈｕｄａｋｏｖ、２００５年、＃１０６｝。
【００３２】
対象のタンパク質の分泌型は、様々な異なった適用で使用でき、上記タンパク質に分泌リーダー配列を融合させることによって調製できる。
【００３３】
好ましい実施形態では、細胞生物学アッセイおよび分子生物学アッセイ、とりわけ遺伝子発現、タンパク質局在性および共局在性、タンパク質−タンパク質間相互作用、タンパク質−核酸相互作用、核酸−核酸間相互作用、ならびに細胞および細胞小器官の局在性および相互作用のアッセイにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ標識（またはレポーター分子）として、上記蛍光タンパク質を使用する。
【００３４】
さらに別の好ましい実施形態では、細胞内における、対象とする１つまたは複数のタンパク質の発現および／または移動の調節への試験物質の影響を検出するため、または試験物質に反応した、対象とするタンパク質の発現および発現調節配列の同時活性を検出するために、本発明の蛍光タンパク質を使用する。試験物質に反応した、細胞内における２つ以上の発現調節配列の活性は、本発明の蛍光タンパク質を使用することによって比較できる。そのような方法は、上記過程へのその影響を測定することになっている試験物質の存在下および非存在下で実施できる。
【００３５】
さらに別の実施形態では、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）で、細胞のマーカーとして本発明の蛍光タンパク質を使用し、上記細胞は、その後、蛍光活性化細胞選別装置で選別できるようになる。
【００３６】
加えて、対象のタンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法でも、ドナーおよび／またはアクセプターとして、第２の蛍光タンパク質または色素と組み合わせて使用できる。対象の蛍光タンパク質を利用するＦＲＥＴアッセイの特定の例には、哺乳動物２ハイブリッド系、転写因子２量体化、膜タンパク質多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、多タンパク質複合体形成（ｍｕｌｔｉ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などにおける、タンパク質−タンパク質間相互作用の検出が含まれる。
【００３７】
さらに別の実施形態では、ＢＲＥＴアッセイ（生物発光共鳴エネルギー移動：Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）で、対象の蛍光タンパク質を使用する。ＢＲＥＴは、生物発光性ドナーから蛍光アクセプタータンパク質へのエネルギー移動に基づくタンパク質−タンパク質間相互作用アッセイである。ＢＲＥＴシグナルは、ドナーによって発せられた光の量に対する、アクセプターによって発せられた光の量によって測定される｛Ｐｆｌｅｇｅｒ、２００６年、＃１９８｝。これらの２つの値の比率は、２つのタンパク質が接近するに従って増大する。
【００３８】
さらに別の適用では、上記蛍光タンパク質を蛍光タイマーとして使用し、上記タイマーでは、上記蛍光タンパク質のエイジングに随伴した、ある蛍光色から別の蛍光色（例えば緑色から赤色）への転換を用いて、遺伝子発現の活性化／非活性化を測定する。
【００３９】
蛍光タンパク質を光学画像処理手順と併用することによって、疾患過程に関する知識が向上し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物効果の、より効率的な評価によって、ヒト医学における新規な診断および治療適用が可能となる。とりわけ、分子画像処理分野は、比較的単純な設備を用いた非侵襲性かつ無放射線照射の方法で、疾患に関連した分子事象の可視化および定量化の両方を可能にする｛Ｌｉｃｈａ、２００５年、＃１７６｝｛Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ、２００２年、＃１７７｝。
【００４０】
さらに別の態様では、本発明は、本発明によるアッセイまたは方法をセットアップおよび実行するのに適当なキットを提供する。上記キットは、通常、本発明によるタンパク質もしくは核酸、とりわけ配列番号２から８のタンパク質および／もしくは配列番号１１から１７のポリヌクレオチドを含有するか、または安定的もしくは誘導可能プロモーターの制御下で本発明の蛍光タンパク質を発現するベクターおよび／もしくは細胞調製物、ならびにアッセイを実行するのに適した試薬を含有しうる。上記キットは、ｃＤＮＡと、ＰＣＲによって核酸を産生できるオリゴヌクレオチドプライマーとを含有しうる。キットの構成物は、通常、緩衝溶液などの適した保存媒体中に存在し、適した容器内に包装される。上記キットは、提供されるタンパク質に特異的な抗体も含みうる。
【００４１】
以下の実験セクションで、本発明をより詳細に例示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
（実施例１）
哺乳動物細胞での発現のためのＡｓＧＦＰ499の最適化
ＡｓＧＦＰ499の野生型遺伝子であるｗｔＡｓＧＦＰ499（配列番号１０）のコドン使用頻度を、高発現哺乳類遺伝子のコドンバイアスに適合させた（配列番号９）。加えて、ＧＣ含量が非常に高い（＞８０％）領域および非常に低い（＜３０％）領域は可能な限り回避した。効率的な翻訳開始のために、開始コドンの上流にコザックコンセンサス配列を導入した（ＧＥＮＥＡＲＴ社、独国レーゲンスブルク（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）所在）。
【００４３】
（実施例２）
細菌および哺乳動物細胞での発現のための蛍光タンパク質（ＰＦｓ）のクローニング
本発明者らは以下の細菌株、すなわち遺伝子型（Ｆ-  ｍｃｒＡ  Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０ｌａｃＺΔＭ１５  ΔｌａｃＸ７４  ｒｅｃＡ１  ａｒａΔ１３９  Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ｇａｌＵ  ｇａｌＫ  ｒｐｓＬ  （ＳｔｒR）ｅｎｄＡ１  ｎｕｐＧ）を有するＴｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と、遺伝子型（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ  Ｆ-  ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳ（ｒB-  ｍB-）ｄｃｍ+  Ｔｅｔr  ｇａｌ  λ（ＤＥ３）ｅｎｄＡ  Ｈｔｅ）を有するＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）株と、を用いた。それは、前者が高い形質転換効率を有し、エンドヌクレアーゼ活性およびプラスミド増殖が低く、後者が高タンパク質発現およびクローニング手順の両方に関して理想的であるためである。高形質転換効率を有するＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞を得るために、本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ装置のマニュアル（ＢｉｏＲａｄ社）に記載されている、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞の調製および電気的形質転換を行うための標準プロトコールに従った。形質転換効率は、ｐＵＣ１８  ＤＮＡベクターおよびｐＥＴ  ＤＮＡベクターを用いることによって試験した。
【００４４】
細菌発現ベクターのクローニング
ＰＣＲ反応中でＰｆｕ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社、スイス国所在）を使用して、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国所在）、およびｐｃＤＮＡ３−ｈＡｓＧＦＰ499ベクターから、ＥＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ２、およびｈＡｓＧＦＰ499（配列番号９）のコード配列を、制限部位がそれぞれ隣接しているプライマー対（ＰＲＩＭＭ社、イタリア国所在）で増幅させた。ＰＣＲ産物を制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で消化し、予め切断してあるｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングした。この結果得られたベクターで、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄエレクトロコンピテント細菌を形質転換した。細菌をカナマイシンＬＢ／寒天上、３７℃で終夜培養した。蛍光コロニーは、倒立蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０）を用い、目視により検出した。
【００４５】
哺乳動物発現ベクターのクローニング
本発明者らは、細胞内での蛍光強度を、最適化されていないバージョンのｗｔ−ＡｓＧＦＰ４９９と比較するため、最適化されたｗｔ−ＡｓＧＦＰ４９９（ｈＡｓＧＦＰ４９９）およびその変異体ＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ）のコード配列を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内にクローニングした。本発明者らは、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位を用いて、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１融合ベクター内のＥＧＦＰを、ｈＡｓＧＦＰ499およびその変異体のコード配列でそれぞれ置換した。蛍光タンパク質（ＦＰ）と融合しているＮＦＡＴｃ１のシャトリング（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）挙動を調査するために、本発明者らは、ＮＦＡＴｃ１のコード配列をＦＰ（ｐｃＤＮＡ３−ＮＦＡＴｃ１）｛Ｃｈｉｎ、１９９８年、＃１４６｝にインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）で挿入した。ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター内のＥＧＦＰを、ｈＡｓＧＦＰ499およびその変異体のコード配列でそれぞれ置換することによって、ＦＡＣＳ用の選択マーカーとしてのｈＡｓＧＦＰ４９９およびその変異体の適合性を試験した。この結果得られたベクターで、Ｔｏｐ１０化学的コンピテント細菌を形質転換した。細菌は、適切な抗生物質ＬＢ／寒天プレート上、３７℃で終夜培養した。
【００４６】
プラスミド産生には、適切な抗生物質を含有するＬＢ培地３ｍＬ中で、２２０ｒｐｍで振盪させることによって、単一コロニーを３７℃で終夜培養した。細菌ペレットを回収した後、Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、プラスミドを抽出した。クローニングされた産物の精度は、制限酵素を用いてＤＮＡを消化するか、または配列決定用に送る（ＰＲＩＭＭ社）ことによって検査した。
【００４７】
本発明者がクローニング用にここで用いたプライマー対（オリゴヌクレオチド）を表１に示す。
【００４８】
【表１】
2009011316.tif 000002
【００４９】
（実施例３）
変異誘発
部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）技法は、関連タンパク質への影響を研究するために、遺伝子内に特定の変異を意図的に生成させる制御された過程である。しかし、対象とするタンパク質の結晶構造、本発明者らの場合にはＡｓＧＦＰ499の構造が未知である場合には、部位特異的変異誘発の結果は予測し難しいものとなる。ＧＦＰ様タンパク質は同じβ−カン構造を共有していると考えられているので、ＡｓＧＦＰ499のオリゴマー形成に重要な残基を予測するために、本発明者らは、ＧＦＰファミリーの他の蛍光タンパク質および色素タンパク質の既存のデータ、配列、および結晶構造を用いた。ＳＤＭは、製造業社の指示に従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて行った。簡潔に要約すると、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社、スイス国所在）を用いて、ＰＣＲによって、哺乳動物バージョンのＡｓＧＦＰ499またはその変異体を含有するベクターｐＥＴ２８ａ（＋）を、適合した変異原性プライマー対で完全に合成した。親の鋳型は、メチル化ＤＮＡおよび半メチル化ＤＮＡのみを選択的に消化するＤｐｎＩで除去した。その後、この結果生じた、所望の変異を含有するニック入りＰＣＲベクターで、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄエレクトロコンピテント細菌を形質転換した。すべての変異を、配列決定によって確認した。
【００５０】
ｐＥＴ２８ａ（＋）はランダム変異誘発には理想的なベクターではないので、ｐＲＳＥＴＢベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。ＳＤＭによって事前に生成されたＡｓＧＦＰ499（Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｅ）変異体およびＡｓＧＦＰ499（Ｓ１０３Ｋ／Ｔ１５９Ｋ／Ｆ１７３Ｅ）変異体を、表１に示すプライマー対（配列番号２０および２１）を用いて、制限部位ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩの間に再クローニングした。上記と同一のプライマー対を使用し、ＧｅｎｅｍｏｒｐｈキットＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、エラープロンＰＣＲを行った｛Ｍｉｙａｚａｋｉ、２００３年、＃１５４｝。ニック入りＰＣＲベクターで形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ細菌は、アンピシリンＬＢ／寒天プレート上、３７℃で終夜培養した。目的とする変異体はｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター内に再クローニングした。
【００５１】
本発明者らがＳＤＭに用いた変異原性プライマー対を表２に示す。
【００５２】
【表２】
2009011316.tif 000003
【００５３】
【表３】
2009011316.tif 000004
【００５４】
（実施例４）
タンパク質の産生および精製
蛍光コロニーを取り上げ、３７℃、シェーカー上、適切な抗生物質を含有する２ｍＬの液体ＬＢ培地中で終夜培養した。新たな培地５ｍＬに、終夜細菌培養物を播種し、Ａ600  ０．６〜０．８まで培養した。ＩＰＴＧを０．５ｍＭまで添加することによって、ＦＰ発現を２３℃、３０℃、または３７℃（温度の選択は変異体に応じたものだった）で誘導した。細胞を終夜インキュベートした後、適切なタンパク質産生および／またはスペクトルシフト変種を確認するために、懸濁液の小滴（５０μｌ）を、蛍光測定（Ｓａｆｉｒｅ２、Ｔｅｃａｎ社）用に９６ウェルプレート（ＭＴＰ）に移した。４ｍＬの培養物を遠心分離し、その後、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０μｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ、および無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、独国所在）が添加されている２００μＬ  ＢＰＥＲ−ＩＩ（Ｐｉｅｒｃｅ社）溶液でペレットを溶解した。最後に、細菌溶解物を遠心分離し、上清をシュードネイティブ（ｐｓｅｕｄｏ−ｎａｔｉｖｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ｛ベアード、２０００年、＃３５｝で分析した。
【００５５】
大規模タンパク質精製には、カナマイシンを含有するＬＢ培地２００ｍＬに、蛍光細菌の終夜培養を播種し、ＯＤ600nmが０．６〜０．８に達するまで、３７℃で培養した。タンパク質産生は、５００μＭ  ＩＰＴＧで誘導した。上述の通り、試料を溶解させ、遠心分離し、その後、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でタンパク質精製を行った。この上清を１ｍＬ  Ｈｉｓ−Ｔｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に添加した。固定されたＮｉ2+イオンに結合したＨｉｓタグ付きタンパク質を含有するカラムは、変動的な濃度（１０〜４００ｍＭ）のイミダゾールを含有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８緩衝液を用いた多段階手順で洗浄した。タンパク質を溶離させた後、Ａｍｉｃｏｎ１０フィルターユニット用いて、上記イミダゾール緩衝液を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４に交換した。ＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いてタンパク質濃度を測定し、生化学的性質決定にさらに使用した。
【００５６】
（実施例５）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
２００ｍＭ  ＤＴＴを含有する５×ＳＤＳ試料緩衝液と１：５で混合された加熱タンパク質試料（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）または非加熱タンパク質試料（シュードネイティブＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、１６％トリス−グリシン  ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添加し、ｐＨ８の１×トリス−グリシン−ＳＤＳ緩衝液中で分離させた。タンパク質分子量マーカーとして、着色ＳｅａＢｌｕｅ  ｐｌｕｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、（Ｈｉｓ6）タグ付きＤｓＲｅｄ２（四量体）、およびＥＧＦＰ（単量体）を用いた。分離の後、ゲルをＵＶ光で照射して蛍光バンドを確認し、クマシーブルーで染色した。染色されたゲルを図１および図２に示す。
【００５７】
結果と結論
ｗｔ  ＡｓＧＦＰ４９９は、＞６４ｋＤの分子量を有する四量体として移動する（図２Ａ  レーン４）。反対に、ＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ）は、≦５０ｋＤａの分子量を有する２量体として移動し、さらに低い分子量に向けてかすかなタンパク質スメア（ｓｍｅａｒ）を示す（図２Ａレーン（Ｌａｎｅ）５）。変異体ＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ／Ｔ１５９Ｋ／Ｆ１７３Ｅ）、ＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｔ１５９Ｋ／Ｆ１７３Ｅ）、およびＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｉ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）は、単量体のＥＧＦＰに匹敵する移動を示す（図２Ａレーン３、６、７、および１０）。これは、単量体タンパク質の、計画上の理論的分子量である約２８ｋＤａと一致し、変異体が単量体変異体であることを確認するものである。ＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３／Ｒ１５０Ｅ）およびＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３／Ｆ１７３Ｅ）は、部分的に単量体の性質を示す（図２Ａレーン８および図１Ａレーン４）。２量体による高さにあるバンドは、ＵＶ照射の下で明確な蛍光を示した。ランダム変異体であるＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｋ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）に関しては、はっきりとしたバンドは観測できない（図２Ａレーン９）。２量体の高さから単量体の高さまでのタンパク質スメアが見える。したがって、これは、部分的に単量体の性質を示している。
【００５８】
ゲルに添加する前にタンパク質試料を加熱した場合、いかなる蛍光バンドも見られなかった。クマシーブルーで染色した後で、＞２２ｋＤａの分子量の単量体タンパク質バンドが検出可能となる（図１Ｂおよび２Ｂ）。
【００５９】
（実施例６）
スペクトル研究
ＴＥＣＡＮ  Ｓａｆｉｒｅ２分光蛍光計を用いて室温で蛍光スペクトルを計測した。３５０ｎｍから４９０ｎｍまでの範囲の励起スキャンを４９９ｎｍの固定発光波長で測定し、４５０ｎｍ〜６００ｎｍまでの範囲の発光スキャンを４００ｎｍおよび４８３ｎｍの固定励起波長で測定した。
【００６０】
結果と結論
すべての蛍光タンパク質の励起スペクトルは、２つのλmaxを示している（図３〜９）。最初のピークは、約４００ｎｍであり、第２のピークは約４８３ｎｍである。４００ｎｍの励起ピークは発色団がプロトン化されている状態の結果であり、４８３のピークは脱プロトン化されている状態のものである｛Ｎｉｅｎｈａｕｓ、２００６年、＃１７０｝。野生型タンパク質と比較して、変異体は、スペクトル特性の改善を示している。それらは、脱プロトン化された状態がより多い。単量体変異体ＡｓＧＦＰ499（Ｓ１０３Ｋ＋Ｔ１５９Ｋ＋Ｆ１７３Ｅ）は、両方の遷移状態とも多いようにみえる（図１０）。
【００６１】
（実施例７）
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
精製された（Ｈｉｓ6）タグ付き蛍光タンパク質の見かけの分子量を、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に接続した較正済みＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でのＳＥＣを用いて測定した。ＵＶ−９００検出器を用いて、同時に３つの波長（２８０、４００および４８０）で吸光度を記録した。０．５ｍＬ／分の流速によって、精製されたタンパク質溶液（２ｍｇ／ｍＬ）１００μｌを、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するｐＨ８の１０ｍＭトリス緩衝液中で分離した。
【００６２】
結果と結論
ＳＥＣ実験は、濾過されたすべての変異体およびＥＧＦＰが野生型タンパク質およびＤｓＲｅｄ２より小さなサイズであり（図１１〜２１）、したがって、２量体および／または単量体の性質を表していることを示した。シュードネイティブＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で２量体バンドおよび単量体バンド、またはタンパク質スメアを示すＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３／Ｒ１５０Ｅ）変異体およびＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｋ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）変異体は、ここでは分離されて、部分的に単量体として存在しているようである。驚いたことに、シュードゲル上で単量体として移動したＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｉ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）は、ここでも２量体および単量体の存在を示す類似の溶出プロフィルを示している（図１７〜１９）。エクオレア  ビクトリア由来の野生型ＧＦＰに関して報告されたように、ある特定のタンパク質濃度では、これらのタンパク質は、２量体化する傾向がある可能性が高い。
【００６３】
溶離容積および計算された見かけの分子量を下記表３に要約する。
【００６４】
【表４】
2009011316.tif 000005
【００６５】
（実施例８）
哺乳動物細胞への形質移入
ｐｃＤＮＡ３またはｐＩＲＥＳ２ベクターにクローニングされたＦＰの発現には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた。細胞には、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６試薬（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて形質移入した。形質移入の８時間後に、細胞内で一時的に発現された蛍光タンパク質を、倒立顕微鏡ＩＸ７０（Ｏｌｙｍｐｕｓ社）を通して観察した。蛍光タンパク質を安定的に発現する細胞をＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によって選別し、少なくとも３カ月間、培養物中に維持した。
【００６６】
ｈＡｓＧＦＰ４９９またはその変異体を含有する融合ベクター内にクローニングされたＮＦＡＴｃ１の発現には、ＨｅＬａ細胞を用いた。細胞には、前述の通り形質移入した。２４時間後に、倒立顕微鏡ＩＸ７０（Ｏｌｙｍｐｕｓ社）を通して、細胞内で一時的に発現された融合タンパク質を観察することができた。抗生物質耐性クローンを、２ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇ４ｌ８）で選択し、０．８でｍｇ／ｍＬで維持した。融合タンパク質を安定的に発現する細胞は、遺伝子発現を増大させるためにヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるＴＳＡ（トリコスタチンＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１日前に処理し、ＦＡＣＳ選別に使用した。
【００６７】
結果と結論
ｐｃＤＮＡ３−ＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ）で安定的に形質移入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ｗｔ−ＡｓＧＦＰ４９９およびｈＡｓＧＦＰ４９９より蛍光が強いようである（図２２）。明らかに、哺乳動物バージョン（ｈＡｓＧＦＰ４９９）は野生型のもの（ｗｔ−ＡｓＧＦＰ４９９）より、細胞内で強く発現される。しかし、本発明者らが変異体（ｈＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ））を哺乳動物バージョンと比較した場合には、上記変異体の方が、より蛍光が強いようである。それは、ｈＡｓＧＦＰ４９９より多く発現されているか、より可溶性であるか、または量子収量がより高い可能性があると本発明者らは考える。
【００６８】
選択マーカーとして、上記変異体は、ｈＡｓＧＦＰ４９９と比較して、より適していることを、ＦＡＣＳ選別の結果（図２３および２４）は示している。哺乳動物ベクターであるｐＩＲＥＳ２−ｈＡｓＧＦＰ（Ｓ１０３Ｋ）、ｐＩＲＥＳ２−ｈＡｓＧＦＰ（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｋ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）、およびｐＩＲＥＳ２−ｈＡｓＧＦＰ（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｉ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ｈＡｓＧＦＰ４９９タンパク質を発現する細胞より、選別された細胞の量が３〜１０倍多いことを示している。そして、本発明者らがそれらの蛍光強度を比較する場合には、上記変異体は、ｈＡｓＧＦＰ４９９より蛍光が強いようである（図２４）。
【００６９】
ＮＦＡＴｃ１−ＤｓＲｅｄ２およびＮＦＡＴｃ１−ＡｓＧＦＰ４９９融合タンパク質を一時的に発現するＨｅＬａ細胞は、細胞質内における凝集を示す（図２５）。これに反して、上記変異体は、ＥＧＦＰと同様なパターンの分布を示す。これらの細胞では、融合タンパク質が細胞質中に均質に分布している。以前に報告された通り、標的タンパク質と融合しているオリゴマー蛍光タンパク質は、それらの生理的局在性が改変していることがある。本発明者らの変異体は２量体の性質および部分的に単量体の性質を示すが、ＮＦＡＴｃ１の局在性は影響されていないようである。
【００７０】
（実施例９）
ＦＰと融合しているＮＦＡＴｃ１の転位（位置移動）アッセイ
第１日に、上記融合タンパク質を安定的に発現するＨｅＬａ細胞をＴＳＡで処理した。翌日、カルシニューリン（ＣａＮ）阻害剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）またはＦＫ５０６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）の存在化または非存在下に、これらの細胞をイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）またはＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で刺激した。本発明者らは、共焦点顕微鏡を用いてＮＦＡＴｃ１の転位した位置をモニターするか、倒立蛍光顕微鏡ＩＸ７０（Ｏｌｙｍｐｕｓ社）を用いて画像を撮影した。
【００７１】
カルシウムイオンの細胞内レベルの増大は、細胞質から核内へのＮＦＡＴｃ１の転位を刺激する｛Ｒａｏ、１９９７年、＃５０｝。陽性対照として、ＮＦＡＴｃ１と融合しているＥＧＦＰを本発明者らは用いた。一時的発現（図２５）と同様に、安定的に発現された融合タンパク質も細胞質中に広範に分布する。１μＭイオノマイシン（Ｉｏｎｏ）での刺激の後、融合産物は核に移行する（図２６）。この過程はほぼ２０分かかる。しかし、ｈＡｓＧＦＰ499と融合しているタンパク質を発現する細胞は凝集体を示す。１μＭイオノマイシンで刺激した後には、かかる転位はみられない（図２６）。
【００７２】
ＮＦＡＴｃ１−ｈＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ）融合タンパク質を安定的に発現するＨｅＬａ細胞は、細胞質中の均質な分布を示す。１μＭイオノマイシンまたは１００μＭ  ＡＴＰでの刺激は、核内へのＮＦＡＴｃ１の転位を引き起こす。この転位がＮＦＡＴｃ１によって起こるのかどうかを試験するために、本発明者らは、阻害剤であるＣｓＡまたはＦＫ５０６  ５μＭと共に上記細胞を１時間早くインキュベートし、その後、再度、１μＭイオノマイシンまたは１００μＭ  ＡＴＰで上記細胞を処理した。両方の阻害剤とも、刺激物質の存在下でさえ、融合タンパク質の転位を完全に阻止した（図２７および２８）。
【００７３】
試薬
他のすべての化学物質は、標準的供給源から入手したものであり、試薬グレードまたはそれを超えるグレードのものであった。
【００７４】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】（Ａ）はクマシー染色されたシュードネイティブＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。（Ｂ）はクマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図２】（Ａ）はクマシー染色されたシュードネイティブＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。（Ｂ）はクマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図３】ｗｔＡｓＧＦＰ499の正規化された励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。破線は固定λEm＝４９９ｎｍで計測された励起スペクトル、実線はλEx＝４８３ｎｍでの発光スペクトル、点線はλEm＝４００ｎｍでの発光スペクトルを示す。
【図４】変異体蛍光タンパク質であるＡｓＧＦＰ499（Ｓ１０３Ｋ）の正規化された励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。破線は固定λEm＝４９９ｎｍで計測された励起スペクトル、実線はλEx＝４８３ｎｍでの発光スペクトル、点線はλEm＝４００ｎｍでの発光スペクトルを示す。
【図５】変異体蛍光タンパク質であるＡｓＧＦＰ499（Ｓ１０３Ｋ／Ｔ１５９Ｋ／Ｆ１７３Ｅ）の正規化された励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。破線は固定λEm＝４９９ｎｍで計測された励起スペクトル、実線はλEx＝４８３ｎｍでの発光スペクトル、点線はλEm＝４００ｎｍでの発光スペクトルを示す。
【図６】変異体蛍光タンパク質であるＡｓＧＦＰ499（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｔ１５９Ｋ／Ｆ１７３Ｅ）の正規化された励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。破線は固定λEm＝４９９ｎｍで計測された励起スペクトル、実線はλEx＝４８３ｎｍでの発光スペクトル、点線はλEm＝４００ｎｍでの発光スペクトルを示す。
【図７】変異体蛍光タンパク質であるＡｓＧＦＰ499（Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｅ）の正規化された励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。破線は固定λEm＝４９９ｎｍで計測された励起スペクトル、実線はλEx＝４８３ｎｍでの発光スペクトル、点線はλEm＝４００ｎｍでの発光スペクトルを示す。
【図８】変異体蛍光タンパク質であるＡｓＧＦＰ499（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｋ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）の正規化された励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。破線は固定λEm＝４９９ｎｍで計測された励起スペクトル、実線はλEx＝４８３ｎｍでの発光スペクトル、点線はλEm＝４００ｎｍでの発光スペクトルを示す。
【図９】変異体蛍光タンパク質であるＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｉ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）の正規化された励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。破線は固定λEm＝４９９ｎｍで計測された励起スペクトル、実線はλEx＝４８３ｎｍでの発光スペクトル、点線はλEm＝４００ｎｍでの発光スペクトルを示す。
【図１０】ｗｔＡｓＧＦＰ499およびその変異体の正規化された励起スペクトルのオーバーレイを示す図である。
【図１１】組換え体ｈｉｓタグ付きＤｓＲｅｄ２のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。点線は２８０ｎｍ（タンパク質）、破線は４００ｎｍ（プロトン化された発色団）、実線は４８０ｎｍ（脱プロトン化された発色団）における吸光度を示す。クロマトグラムは２８０ｎｍのピークによって正規化されている。
【図１２】組換え体ｈｉｓタグ付きＥＧＦＰのサイズ排除クロマトグラムを示す図である。点線は２８０ｎｍ（タンパク質）、破線は４００ｎｍ（プロトン化された発色団）、実線は４８０ｎｍ（脱プロトン化された発色団）における吸光度を示す。クロマトグラムは２８０ｎｍのピークによって正規化されている。
【図１３】組換え体ｈｉｓタグ付きｗｔ−ＡｓＧＦＰ４９９のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。点線は２８０ｎｍ（タンパク質）、破線は４００ｎｍ（プロトン化された発色団）、実線は４８０ｎｍ（脱プロトン化された発色団）における吸光度を示す。クロマトグラムは２８０ｎｍのピークによって正規化されている。
【図１４】組換え体ｈｉｓタグ付きＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ）のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。点線は２８０ｎｍ（タンパク質）、破線は４００ｎｍ（プロトン化された発色団）、実線は４８０ｎｍ（脱プロトン化された発色団）における吸光度を示す。クロマトグラムは２８０ｎｍのピークによって正規化されている。
【図１５】組換え体ｈｉｓタグ付きＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ／Ｔ１５９Ｋ／Ｆ１７３Ｅ）のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。点線は２８０ｎｍ（タンパク質）、破線は４００ｎｍ（プロトン化された発色団）、実線は４８０ｎｍ（脱プロトン化された発色団）における吸光度を示す。クロマトグラムは２８０ｎｍのピークによって正規化されている。
【図１６】組換え体ｈｉｓタグ付きＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｔ１５９Ｋ／Ｆ１７３Ｅ）のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。点線は２８０ｎｍ（タンパク質）、破線は４００ｎｍ（プロトン化された発色団）、実線は４８０ｎｍ（脱プロトン化された発色団）における吸光度を示す。クロマトグラムは２８０ｎｍのピークによって正規化されている。
【図１７】組換え体ｈｉｓタグ付きＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｅ）のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。点線は２８０ｎｍ（タンパク質）、破線は４００ｎｍ（プロトン化された発色団）、実線は４８０ｎｍ（脱プロトン化された発色団）における吸光度を示す。クロマトグラムは２８０ｎｍのピークによって正規化されている。
【図１８】組換え体ｈｉｓタグ付きＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｋ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。点線は２８０ｎｍ（タンパク質）、破線は４００ｎｍ（プロトン化された発色団）、実線は４８０ｎｍ（脱プロトン化された発色団）における吸光度を示す。クロマトグラムは２８０ｎｍのピークによって正規化されている。
【図１９】組換え体ｈｉｓタグ付きＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｉ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。点線は２８０ｎｍ（タンパク質）、破線は４００ｎｍ（プロトン化された発色団）、実線は４８０ｎｍ（脱プロトン化された発色団）における吸光度を示す。クロマトグラムは２８０ｎｍのピークによって正規化されている。
【図２０】組換え体ｈｉｓタグ付きｗｔ−ＡｓＧＦＰ４９９、ＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ）、およびＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ／Ｔ１５９Ｋ／Ｆ１７３Ｅ）のオーバーレイサイズ排除クロマトグラムを示す図である。点線は２８０ｎｍ（タンパク質）、破線は４００ｎｍ（プロトン化された発色団）、実線は４８０ｎｍ（脱プロトン化された発色団）における吸光度を示す。クロマトグラムは２８０ｎｍのピークによって正規化されている。
【図２１】組換え体ｈｉｓタグ付きｗｔ−ＡｓＧＦＰ４９９、ＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ）、およびＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｔ１５９Ｋ／Ｆ１７３Ｅ）のオーバーレイサイズ排除クロマトグラムを示す図である。点線は２８０ｎｍ（タンパク質）、破線は４００ｎｍ（プロトン化された発色団）、実線は４８０ｎｍ（脱プロトン化された発色団）における吸光度を示す。クロマトグラムは２８０ｎｍのピークによって正規化されている。
【図２２】哺乳動物ベクターであるｐｃＤＮＡ３−ＡｓＧＦＰ４９９、ｐｃＤＮＡ３−ｈＡｓＧＦＰ４９９、ｐｃＤＮＡ３−ｈＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ）で安定的に形質移入されたＣＨＯ  Ｋ１細胞を示す図である。
【図２３】哺乳動物発現ベクターであるｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ２−ｈＡｓＧＦＰ４９９、ｐＩＲＥＳ２−ｈＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ）、ｐＩＲＥＳ２−ｈＡｓＧＦＰ（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｋ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）、およびｐＩＲＥＳ２−ｈＡｓＧＦＰ（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｉ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）で形質移入され、蛍光タンパク質を安定的に発現する、ＦＡＣＳ分析によって選別された緑色ＣＨＯ−Ｋ１細胞の量（％）を示すヒストグラムである。
【図２４】哺乳動物発現ベクターであるｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ２−ｈＡｓＧＦＰ４９９、ｐＩＲＥＳ２−ｈＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ）、ｐＩＲＥＳ２−ｈＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｋ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）、およびｐＩＲＥＳ２−ｈＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｉ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）で安定的に形質移入された、ＦＡＣＳによるＣＨＯ−Ｋ１細胞の蛍光強度（計数：ｃｏｕｎｔ）を示すヒストグラムである。表中に蛍光強度を要約する。
【図２５】哺乳動物融合ベクターであるｐＮＦＡＴｃ１−ＥＧＦＰ、ｐＮＦＡＴｃ１−ＤｓＲｅｄ２、ｐＮＦＡＴｃ１−ｈＡｓＧＦＰ４９９−Ｎ１、ｐＮＦＡＴｃ１−ｈＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ）、ｐＮＦＡＴｃ１−ｈＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｋ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）−Ｎ１、およびｐＮＦＡＴｃ１−ｈＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ９４Ｔ／Ｓ１０３Ｋ／Ｒ１５０Ｉ／Ｓ１７１Ｎ／Ｋ２０６Ｒ）−Ｎ１で一時的に形質移入されたＨｅＬａ細胞を示す図である。
【図２６】哺乳動物融合ベクターであるｐＮＦＡＴｃ１−ＥＧＦＰ−Ｎ１（画像はＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０蛍光顕微鏡で撮影した）およびｐＮＦＡＴｃ１−ｈＡｓＧＦＰ４９９−Ｎ１（画像はライカ共焦点顕微鏡で撮影した）で安定的に形質移入されたＨｅＬａ細胞での、イオノマイシンで刺激した後での転位アッセイを示す図である。
【図２７】カルシニューリン阻害剤であるＣｓＡおよびＦＫ５０６の存在下における、哺乳動物融合ベクターであるｐＮＦＡＴｃ１−ｈＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ）−Ｎ１で安定的に形質移入されたＨｅＬａ細胞での、イオノマイシンで刺激した後での転位アッセイを示す図である。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０蛍光顕微鏡で撮影した。
【図２８】カルシニューリン阻害剤であるＣｓＡおよびＦＫ５０６の存在下における、哺乳動物融合ベクターであるｐＮＦＡＴｃ１−ｈＡｓＧＦＰ４９９（Ｓ１０３Ｋ）−Ｎ１で安定的に形質移入されたＨｅＬａ細胞での、ＡＴＰで刺激した後での転位アッセイを示す図である。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０蛍光顕微鏡で撮影した。
【図１】
2009011316.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009011316.tif 000012
【図８】
2009011316.tif 000013
【図９】
2009011316.tif 000014
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
2009011316000001.app
【外国語明細書】
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2009011316.tif 000065
SEQUENCE LISTING
<110>  AXXAM S.p.A
<120>  Fluorescent proteins and methods of use thereof
<130>  1808eur
<160>  51    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  228
<212>  PRT
<213>  Anemonia sulcata
<400>  1
Met Tyr Pro Ser Ile Lys Glu Thr Met Arg Val Gln Leu Ser Met Glu 
1               5                   10                  15      
Gly Ser Val Asn Tyr His Ala Phe Lys Cys Thr Gly Lys Gly Glu Gly 
20                  25                  30          
Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Ser Leu Asn Ile Thr Ile Thr Glu Gly 
35                  40                  45              
Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ser His Ala Phe Gln Tyr 
50                  55                  60                  
Gly Ile Lys Val Phe Ala Lys Tyr Pro Lys Glu Ile Pro Asp Phe Phe 
65                  70                  75                  80  
Lys Gln Ser Leu Pro Gly Gly Phe Ser Trp Glu Arg Val Ser Thr Tyr 
85                  90                  95      
Glu Asp Gly Gly Val Leu Ser Ala Thr Gln Glu Thr Ser Leu Gln Gly 
100                 105                 110         
Asp Cys Ile Ile Cys Lys Val Lys Val Leu Gly Thr Asn Phe Pro Ala 
115                 120                 125             
Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Cys Gly Trp Glu Pro Ser Thr 
130                 135                 140                 
Glu Thr Val Ile Pro Arg Asp Gly Gly Leu Leu Leu Arg Asp Thr Pro 
145                 150                 155                 160 
Ala Leu Met Leu Ala Asp Gly Gly His Leu Ser Cys Phe Met Glu Thr 
165                 170                 175     
Thr Tyr Lys Ser Lys Lys Glu Val Lys Leu Pro Glu Leu His Phe His 
180                 185                 190         
His Leu Arg Met Glu Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Trp Lys Thr Val 
195                 200                 205             
Glu Gln His Glu Ser Val Val Ala Ser Tyr Ser Gln Val Pro Ser Lys 
210                 215                 220                 
Leu Gly His Asn 
225             
<210>  2
<211>  228
<212>  PRT
<213>  Unknown
<220>
<223>  AsGFP499 mutant
<400>  2
Met Tyr Pro Ser Ile Lys Glu Thr Met Arg Val Gln Leu Ser Met Glu 
1               5                   10                  15      
Gly Ser Val Asn Tyr His Ala Phe Lys Cys Thr Gly Lys Gly Glu Gly 
20                  25                  30          
Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Ser Leu Asn Ile Thr Ile Thr Glu Gly 
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Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ser His Ala Phe Gln Tyr 
50                  55                  60                  
Gly Ile Lys Val Phe Ala Lys Tyr Pro Lys Glu Ile Pro Asp Phe Phe 
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Lys Gln Ser Leu Pro Gly Gly Phe Ser Trp Glu Arg Val Ser Thr Tyr 
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Glu Asp Gly Gly Val Leu Lys Ala Thr Gln Glu Thr Ser Leu Gln Gly 
100                 105                 110         
Asp Cys Ile Ile Cys Lys Val Lys Val Leu Gly Thr Asn Phe Pro Ala 
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Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Cys Gly Trp Glu Pro Ser Thr 
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Glu Thr Val Ile Pro Arg Asp Gly Gly Leu Leu Leu Arg Asp Thr Pro 
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Ala Leu Met Leu Ala Asp Gly Gly His Leu Ser Cys Phe Met Glu Thr 
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Thr Tyr Lys Ser Lys Lys Glu Val Lys Leu Pro Glu Leu His Phe His 
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His Leu Arg Met Glu Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Trp Lys Thr Val 
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Glu Gln His Glu Ser Val Val Ala Ser Tyr Ser Gln Val Pro Ser Lys 
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Leu Gly His Asn 
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Gly Ser Val Asn Tyr His Ala Phe Lys Cys Thr Gly Lys Gly Glu Gly 
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Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ser His Ala Phe Gln Tyr 
50                  55                  60                  
Gly Ile Lys Val Phe Ala Lys Tyr Pro Lys Glu Ile Pro Asp Phe Phe 
65                  70                  75                  80  
Lys Gln Ser Leu Pro Gly Gly Phe Ser Trp Glu Arg Val Ser Thr Tyr 
85                  90                  95      
Glu Asp Gly Gly Val Leu Lys Ala Thr Gln Glu Thr Ser Leu Gln Gly 
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Ala Leu Met Leu Ala Asp Gly Gly His Leu Ser Cys Glu Met Glu Thr 
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Thr Tyr Lys Ser Lys Lys Glu Val Lys Leu Pro Glu Leu His Phe His 
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His Leu Arg Met Glu Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Trp Lys Thr Val 
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Glu Gln His Glu Ser Val Val Ala Ser Tyr Ser Gln Val Pro Ser Lys 
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Leu Gly His Asn 
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Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ser His Ala Phe Gln Tyr 
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Gly Ile Lys Val Phe Ala Lys Tyr Pro Lys Glu Ile Pro Asp Phe Phe 
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Lys Gln Ser Leu Pro Gly Gly Phe Ser Trp Glu Arg Val Thr Thr Tyr 
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Glu Asp Gly Gly Val Leu Lys Ala Thr Gln Glu Thr Ser Leu Gln Gly 
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Leu Gly His Asn 
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Gly Ser Val Asn Tyr His Ala Phe Lys Cys Thr Gly Lys Gly Glu Gly 
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Gly Ile Lys Val Phe Ala Lys Tyr Pro Lys Glu Ile Pro Asp Phe Phe 
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Glu Thr Val Ile Pro Glu Asp Gly Gly Leu Leu Leu Arg Asp Thr Pro 
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Ala Leu Met Leu Ala Asp Gly Gly His Leu Ser Cys Phe Met Glu Thr 
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Thr Tyr Lys Ser Lys Lys Glu Val Lys Leu Pro Glu Leu His Phe His 
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Leu Gly His Asn 
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Leu Gly His Asn 
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Gly Ile Lys Val Phe Ala Lys Tyr Pro Lys Glu Ile Pro Asp Phe Phe 
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Glu Thr Val Ile Pro Ile Asp Gly Gly Leu Leu Leu Arg Asp Thr Pro 
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180                 185                 190         
His Leu Arg Met Glu Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Trp Arg Thr Val 
195                 200                 205             
Glu Gln His Glu Ser Val Val Ala Ser Tyr Ser Gln Val Pro Ser Lys 
210                 215                 220                 
Leu Gly His Asn 
225             
<210>  9
<211>  687
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  wt AsGFP499 coding sequence adapted to mammalian codon usage
<400>  9
atgtacccca gcatcaagga gaccatgcgg gtgcagctga gcatggaggg cagcgtgaac     60
taccacgcct tcaagtgcac cggcaagggc gagggcaagc cctacgaggg cacccagagc    120
ctgaacatca ccatcaccga gggcggaccc ctgcctttcg ccttcgacat cctgagccac    180
gccttccagt acggcatcaa ggtgttcgcc aagtacccca aggagatccc cgacttcttc    240
aagcagagcc tgcctggcgg cttcagctgg gagagagtga gcacctacga ggacggcggc    300
gtgctgagcg ccacccagga gaccagcctg cagggcgatt gcatcatctg caaggtgaag    360
gtgctgggca ccaactttcc tgccaacggc cccgtgatgc agaagaaaac ctgcggctgg    420
gagcccagca ccgagaccgt gatccccaga gatggcggcc tgctgctgag agacacccct    480
gccctcatgc tggccgacgg cggccacctg agctgcttta tggagaccac ctacaagagc    540
aagaaggagg tgaagctgcc cgagctgcac tttcaccacc tgcggatgga gaagctgaac    600
atcagcgacg actggaaaac cgtggagcag cacgagagcg tggtggccag ctacagccag    660
gtgccaagca agctgggcca caattga                                        687
<210>  10
<211>  687
<212>  DNA
<213>  Anemonia sulcata
<400>  10
atgtatcctt ccatcaagga aaccatgcgc gttcagcttt ctatggaggg tagtgttaac     60
taccacgcct tcaagtgcac tggaaaagga gagggaaaac catacgaagg cacccaaagc    120
ctgaatatta caataactga aggaggtcct ctgccatttg cttttgacat tctgtcacac    180
gcctttcagt atggcatcaa ggtcttcgcc aagtacccca aagaaattcc tgacttcttt    240
aagcagtctc tacctggtgg tttttcttgg gaaagagtaa gcacctatga agatggagga    300
gtgctttcag ctacccaaga aacaagtttg cagggtgatt gcatcatctg caaagttaaa    360
gtccttggca ccaattttcc cgcaaacggt ccagtgatgc aaaagaagac ctgtggatgg    420
gagccatcaa ctgaaacagt catcccacga gatggtggac ttctgcttcg cgataccccc    480
gcacttatgc tggctgacgg aggtcatctt tcttgcttca tggaaacaac ttacaagtcg    540
aagaaagagg taaagcttcc agaacttcac tttcatcatt tgcgtatgga aaagctgaac    600
ataagtgacg attggaagac cgttgagcag cacgagtctg tggtggctag ctactcccaa    660
gtgccttcga aattaggaca taactga                                        687
<210>  11
<211>  687
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  mutagenized AsGFP499 coding sequence
<400>  11
atgtacccca gcatcaagga gaccatgcgg gtgcagctga gcatggaggg cagcgtgaac     60
taccacgcct tcaagtgcac cggcaagggc gagggcaagc cctacgaggg cacccagagc    120
ctgaacatca ccatcaccga gggcggaccc ctgcctttcg ccttcgacat cctgagccac    180
gccttccagt acggcatcaa ggtgttcgcc aagtacccca aggagatccc cgacttcttc    240
aagcagagcc tgcctggcgg cttcagctgg gagagagtga gcacctacga ggacggcggc    300
gtgctgaagg ccacccagga gaccagcctg cagggcgatt gcatcatctg caaggtgaag    360
gtgctgggca ccaactttcc tgccaacggc cccgtgatgc agaagaaaac ctgcggctgg    420
gagcccagca ccgagaccgt gatccccaga gatggcggcc tgctgctgag agacacccct    480
gccctcatgc tggccgacgg cggccacctg agctgcttta tggagaccac ctacaagagc    540
aagaaggagg tgaagctgcc cgagctgcac tttcaccacc tgcggatgga gaagctgaac    600
atcagcgacg actggaaaac cgtggagcag cacgagagcg tggtggccag ctacagccag    660
gtgccaagca agctgggcca caattga                                        687
<210>  12
<211>  687
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  mutagenized AsGFP499 coding sequence
<400>  12
atgtacccca gcatcaagga gaccatgcgg gtgcagctga gcatggaggg cagcgtgaac     60
taccacgcct tcaagtgcac cggcaagggc gagggcaagc cctacgaggg cacccagagc    120
ctgaacatca ccatcaccga gggcggaccc ctgcctttcg ccttcgacat cctgagccac    180
gccttccagt acggcatcaa ggtgttcgcc aagtacccca aggagatccc cgacttcttc    240
aagcagagcc tgcctggcgg cttcagctgg gagagagtga gcacctacga ggacggcggc    300
gtgctgaagg ccacccagga gaccagcctg cagggcgatt gcatcatctg caaggtgaag    360
gtgctgggca ccaactttcc tgccaacggc cccgtgatgc agaagaaaac ctgcggctgg    420
gagcccagca ccgagaccgt gatccccaga gatggcggcc tgctgcttag agacaaacct    480
gccctcatgc tggccgacgg cggccacctg agctgcgaga tggagaccac ctacaagagc    540
aagaaggagg tgaagctgcc cgagctgcac tttcaccacc tgcggatgga gaagctgaac    600
atcagcgacg actggaaaac cgtggagcag cacgagagcg tggtggccag ctacagccag    660
gtgccaagca agctgggcca caattga                                        687
<210>  13
<211>  687
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  mutagenized AsGFP499 coding sequence
<400>  13
atgtacccca gcatcaagga gaccatgcgg gtgcagctga gcatggaggg cagcgtgaac     60
taccacgcct tcaagtgcac cggcaagggc gagggcaagc cctacgaggg cacccagagc    120
ctgaacatca ccatcaccga gggcggaccc ctgcctttcg ccttcgacat cctgagccac    180
gccttccagt acggcatcaa ggtgttcgcc aagtacccca aggagatccc cgacttcttc    240
aagcagagcc tgcctggcgg cttcagctgg gagagagtga ccacctacga ggacggcggc    300
gtgctgaagg ccacccagga gaccagcctg cagggcgatt gcatcatctg caaggtgaag    360
gtgctgggca ccaactttcc tgccaacggc cccgtgatgc agaagaaaac ctgcggctgg    420
gagcccagca ccgagaccgt gatccccaga gatggcggcc tgctgcttag agacaaacct    480
gccctcatgc tggccgacgg cggccacctg agctgcgaga tggagaccac ctacaagagc    540
aagaaggagg tgaagctgcc cgagctgcac tttcaccacc tgcggatgga gaagctgaac    600
atcagcgacg actggaaaac cgtggagcag cacgagagcg tggtggccag ctacagccag    660
gtgccaagca agctgggcca caattga                                        687
<210>  14
<211>  687
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  mutagenized AsGFP499 coding sequence
<400>  14
atgtacccca gcatcaagga gaccatgcgg gtgcagctga gcatggaggg cagcgtgaac     60
taccacgcct tcaagtgcac cggcaagggc gagggcaagc cctacgaggg cacccagagc    120
ctgaacatca ccatcaccga gggcggaccc ctgcctttcg ccttcgacat cctgagccac    180
gccttccagt acggcatcaa ggtgttcgcc aagtacccca aggagatccc cgacttcttc    240
aagcagagcc tgcctggcgg cttcagctgg gagagagtga gcacctacga ggacggcggc    300
gtgctgaagg ccacccagga gaccagcctg cagggcgatt gcatcatctg caaggtgaag    360
gtgctgggca ccaactttcc tgccaacggc cccgtgatgc agaagaaaac ctgcggctgg    420
gagcccagca ccgagaccgt gatccccgaa gatggcggcc tgctgctgag agacacccct    480
gccctcatgc tggccgacgg cggccacctg agctgcttta tggagaccac ctacaagagc    540
aagaaggagg tgaagctgcc cgagctgcac tttcaccacc tgcggatgga gaagctgaac    600
atcagcgacg actggaaaac cgtggagcag cacgagagcg tggtggccag ctacagccag    660
gtgccaagca agctgggcca caattga                                        687
<210>  15
<211>  687
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  mutagenized AsGFP499 coding sequence
<400>  15
atgtacccca gcatcaagga gaccatgcgg gtgcagctga gcatggaggg cagcgtgaac     60
taccacgcct tcaagtgcac cggcaagggc gagggcaagc cctacgaggg cacccagagc    120
ctgaacatca ccatcaccga gggcggaccc ctgcctttcg ccttcgacat cctgagccac    180
gccttccagt acggcatcaa ggtgttcgcc aagtacccca aggagatccc cgacttcttc    240
aagcagagcc tgcctggcgg cttcagctgg gagagagtga gcacctacga ggacggcggc    300
gtgctgaagg ccacccagga gaccagcctg cagggcgatt gcatcatctg caaggtgaag    360
gtgctgggca ccaactttcc tgccaacggc cccgtgatgc agaagaaaac ctgcggctgg    420
gagcccagca ccgagaccgt gatccccaga gatggcggcc tgctgctgag agacacccct    480
gccctcatgc tggccgacgg cggccacctg agctgcgaga tggagaccac ctacaagagc    540
aagaaggagg tgaagctgcc cgagctgcac tttcaccacc tgcggatgga gaagctgaac    600
atcagcgacg actggaaaac cgtggagcag cacgagagcg tggtggccag ctacagccag    660
gtgccaagca agctgggcca caattga                                        687
<210>  16
<211>  687
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  mutagenized AsGFP499 coding sequence
<400>  16
atgtacccca gcatcaagga gaccatgcgg gtgcagctga gcatggaggg cagcgtgaac     60
taccacgcct tcaagtgcac cggcaagggc gagggcaagc cctacgaggg cacccagagc    120
ctgaacatca ccatcaccga gggcggaccc ctgcctttcg ccttcgacat cctgagccac    180
gccttccagt acggcatcaa ggtgttcgcc aagtacccca aggagatccc cgacttcttc    240
aagcagagcc tgcctggcgg cttcagctgg gagagagtga ccacctacga ggacggcggc    300
gtgctgaagg ccacccagga gaccagcctg cagggcgatt gcatcatctg caaggtgaag    360
gtgctgggca ccaactttcc tgccaacggc cccgtgatgc agaagaaaac ctgcggctgg    420
gagcccagca ctgagaccgt gatccccaaa gatggcggcc tgctgctgag agacacccct    480
gccctcatgc tggccgacgg cggtcacctg aactgcttta tggagaccac ctataagagc    540
aagaaggagg tgaagctgcc cgagctgcac tttcaccacc tgcggatgga gaagctgaac    600
atcagcgacg actggagaac cgtggagcag catgagagcg tggtggccag ctacagccag    660
gtgccaagta agctgggcca caattga                                        687
<210>  17
<211>  687
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  mutagenized AsGFP499 coding sequence
<400>  17
atgtacccca gcatcaagga gaccatgcgg gtgcagctga gcatggaggg cagcgtgaac     60
taccacgcct tcaagtgcac cggcaagggc gagggcaagc cctacgaggg cacccagagc    120
ctgaacatca ccatcaccga gggcggaccc ctgcctttcg ccttcgacat cctgagccac    180
gccttccagt acggcatcaa ggtgttcgcc aagtacccca aggagatccc cgacttcttc    240
aagcagagcc tgcctggcgg cttcagctgg gagagagtga ccacctacga ggacggcggc    300
gtgctgaagg ccacccagga gaccagcctg cagggcgatt gcatcatctg caaggtgaag    360
gtgctgggca ccaactttcc tgccaacggc cccgtgatgc agaagaaaac ctgcggctgg    420
gagcccagca ctgagaccgt gatccccata gatggcggcc tgctgctgag agacacccct    480
gccctcatgc tggccgacgg cggtcacctg aactgcttta tggagaccac ctataagagc    540
aagaaggagg tgaagctgcc cgagctgcac tttcaccacc tgcggatgga gaagctgaac    600
atcagcgacg actggagaac cgtggagcag catgagagcg tggtggccag ctacagccag    660
gtgccaagca agctggggca caattga                                        687
<210>  18
<211>  28
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  18
cggcagccat atgtacccca gcatcaag                                        28
<210>  19
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  19
gcggatcctt atcaattgtg gcccag                                          26
<210>  20
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  20
taaggatccg atgtacccca gcatc                                           25
<210>  21
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  21
catggtacct caattgtggc ccag                                            24
<210>  22
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  22
cttggtacca tgtaccccag catc                                            24
<210>  23
<211>  35
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  23
tagagtcgcg gccgctcaat tgtgccccag cttgc                                35
<210>  24
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  24
ccgggatcca ccggtcgcca ccatgtaccc cagcatcaag                           40
<210>  25
<211>  35
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  25
tagagtcgcg gccgctcaat tgtgccccag cttgc                                35
<210>  26
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  26
taccccagca tcaaggagac c                                               21
<210>  27
<211>  35
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  27
tagagtcgcg gccgctcaat tgtgccccag cttgc                                35
<210>  28
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  28
gaggtaccat gccaagcacc agctttc                                         27
<210>  29
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  29
ctggatcccg gaaaaagcac cccacgc                                         27
<210>  30
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  30
gggagagagt gaccacctac gaggac                                          26
<210>  31
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  31
gtcctcgtag gtggtcactc tctccc                                          26
<210>  32
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  32
gagtgagcac ctacggcgac ggcggcgtg                                       29
<210>  33
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  33
cacgccgccg tcgccgtagg tgctcactc                                       29
<210>  34
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  34
ggcggcgtgc tgaaggccac ccaggag                                         27
<210>  35
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  35
ctcctgggtg gccttcagca cgccgcc                                         27
<210>  36
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  36
accgtgatcc ccgaggatgg cggcctg                                         27
<210>  37
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  37
caggccgcca tcctcgggga tcacggt                                         27
<210>  38
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  38
gcctgctgct gggcgacacc cctgcc                                          26
<210>  39
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  39
ggcaggggtg tcgcccagca gcaggc                                          26
<210>  40
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  40
tgctgcttag agacaaacct gccctcatgc                                      30
<210>  41
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  41
gcatgagggc aggtttgtct ctaagcagca                                      30
<210>  42
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  42
tgctgcttag agacgcacct gccctcatgc                                      30
<210>  43
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  43
gcatgagggc aggtgcgtct ctaagcagca                                      30
<210>  44
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  44
cggcggccac ctagcatgct ttatggagac                                      30
<210>  45
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  45
gtctccataa agcatgctag gtggccgccg                                      30
<210>  46
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  46
cacctgagct gccacatgga gaccacc                                         27
<210>  47
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  47
ggtggtctcc atgtggcagc tcaggtg                                         27
<210>  48
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  48
cacctgagct gcgccatgga gaccacc                                         27
<210>  49
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  49
ggtggtctcc atggcgcagc tcaggtg                                         27
<210>  50
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  50
cacctgagct gcgagatgga gaccacc                                         27
<210>  51
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Unknown
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  51
ggtggtctcc atctcgcagc tcaggtg                                         27
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