(57)【要約】【課題】  単分子のポリヌクレオチド鎖を鋳型とした配列解析法やパイロシークエンス法等の配列解析において、特別なプライマーを作製することなく、鋳型核酸上のプライマー結合部位から離れた所望の領域（例えば、プライマー結合部位と配列情報が必要な領域の間にポリ（Ａ）領域が介在するｍＲＮＡやｃＤＮＡ配列上のコーディング領域等）の解析を効率よく行なうための手段の提供。【解決手段】配列解析まえに、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの４種のヌクレオチドのうちいずれかを欠いた状態でＤＮＡ伸長反応を行い、その反応系から欠損している塩基の手前までプライマーを伸長しておく。この反応を欠損塩基の種類を変えながら繰り返した後、ＤＮＡ伸長反応を利用した配列解析を行う。【選択図】図１
2009011230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む塩基配列解析方法：
１）プライマーを解析対象核酸にハイブリダイズさせる；
２）前記解析対象核酸を、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうち少なくとも１種の塩基を欠いた反応試薬を添加し、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応を行なう；
３）前記伸長反応後、前記反応試薬を洗浄する；
４）核酸伸長反応を利用した配列解析反応を行なうことにより、前記解析対象核酸上のプライマー結合部位から離れた所望の領域の配列決定を行なう。
【請求項２】
前記２）及び３）の工程を欠損塩基の種類を変えて複数回行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記解析対象核酸がポリ(Ａ)領域を有するｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡであり、プライマーがオリゴ(ｄＴ)プライマーであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記解析対象がポリ（Ａ）領域を有するｍＲＮＡであり、プライマーがオリゴ（ｄＴ）プライマーであって、ｄＴＴＰ以外の少なくとも１種の塩基を欠いた反応系で伸長反応を行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記解析対象が、ｍＲＮＡ由来の、ポリ（Ｔ）領域を有するｃＤＮＡであり、プライマーがオリゴ（ｄＡ）プライマーであって、ｄＡＴＰ以外の少なくとも１種の塩基を欠いた反応系で伸長反応を行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
欠損塩基の種類を変えて、伸長反応を複数回行うことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
欠損塩基の種類を変えて、伸長反応を複数回行うことを特徴とする、請求項５に記載の方法。 
【請求項８】
前記解析対象核酸の増幅を行うことなく所望の領域の配列決定を行なうことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
以下の工程を含む塩基配列解析方法：
１）オリゴ(ｄＡ)プライマーを、ｍＲＮＡ由来の、ポリ(Ｔ)領域を有するｃＤＮＡにハイブリダイズさせる；
２）前記ｃＤＮＡにＤＮＡポリメラーゼとｄＡＴＰを加えて、伸長反応を行なう；
３）前記伸長反応後、ＤＮＡポリメラーゼとｄＡＴＰを反応系から除去する；
４）核酸伸長反応を利用した配列解析反応を行なうことにより、配列決定を行なう。
【請求項１０】
以下の工程を含む塩基配列解析方法：
１）オリゴ(ｄＴ)プライマーをポリ(Ａ)領域を有するｍＲＮＡにハイブリダイズさせる；
２）前記ｍＲＮＡにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとｄＴＴＰを加えて、伸長反応を行なう；
３）前記伸長反応後、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとｄＴＴＰを反応系から除去する；
４）核酸伸長反応を利用した配列解析反応を行なうことにより、配列決定を行なう。
【請求項１１】
解析対象核酸上のプライマー結合部位から離れた所望の領域の配列決定を行なうための塩基配列解析装置であって：
前記解析対象核酸のプライマーからの伸長反応及び配列解析反応を行なうためのチャンバーと；
４種の基質塩基及び反応に必要な試薬を格納するための容器及び保管ユニットと；
前記基質塩基及び解析に必要な試薬を、少なくとも１種の塩基を欠いた状態で任意に組み合わせて前記チャンバーへ供給するための試薬供給システムと；
前記チャンバー内の温度を制御するための加温冷却システムと；
前記配列解析反応を検出するための検出システムと；
前記検出結果を解析するための解析システムとを含むことを特徴とする塩基配列解析装置。
【請求項１２】
さらに４種の標識ｄＮＴＰを格納するための容器を含む、請求項１１に記載の塩基配列解析装置。
【請求項１３】
解析対象核酸上のプライマー結合部位から離れた所望の領域の配列決定を行なうための塩基配列解析装置であって：
前記解析対象核酸のプライマーからの伸長反応及び配列解析反応を行なうためのチャンバーと；
少なくとも１種の塩基を欠いた状態の基質塩基混合試薬１種以上、反応に必要な試薬、及び、４種のｄＮＴＰ又は４種の標識ｄＮＴＰをそれぞれ格納するための容器及び保管ユニットと；
前記保管ユニット内の試薬を前記チャンバーに供給するための試薬供給システムと；
前記チャンバー内の温度を制御するための加温冷却システムと；
前記配列解析反応を検出するための検出システムと；
前記検出結果を解析するための解析システムとを含むことを特徴とする塩基配列解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は塩基配列解析法に関する。より詳しくは、単分子シーケンシングやパイロシーケンシング等の塩基伸長反応を利用した核酸解析方法により、解析対象核酸上のプライマー結合部位から離れた領域の配列決定を行うための塩基配列解析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ、ＲＮＡの塩基配列決定法は重要な技術である。通常は、予め配列決定用のＤＮＡ断片又は断片群に蛍光標識をほどこした試料を調製し、電気泳動した後又は電気泳動中に分子量分離展開パターンを計測して解析する。具体的には、電気泳動分離に先立ち、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行する。分析すべき試料ＤＮＡの既知の塩基配列部分と相補的な約２０塩基長のオリゴヌクレオチドを合成し蛍光体を標識する。このオリゴヌクレオチドをプライマーとし、約1ピコモルの試料ＤＮＡと相補鎖結合させて、ポリメラーゼにより相補鎖伸長反応を実行する。このとき基質として、４種のデオキシヌクレオチド３リン酸、即ち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びこれらに加えて、例えば、ｄｄＡＴＰ等を加える。ｄｄＡＴＰが相補鎖伸長で取り込まれると、それ以上相補鎖が伸長しないため、アデニン（Ａ）で終結する様々な長さの断片が調製される。      
【０００３】
上記反応でｄｄＡＴＰの代わりに、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰを各々加えた反応を行なう。但し、各反応で用いるプライマーは、塩基配列は同じであるが、蛍光を分光して互いに識別できる４種の蛍光体で標識する。以上の４種の反応物を混合すると、試料ＤＮＡに相補的な数100塩基長までの１塩基ずつ長さが異なる断片が、末端の塩基種に応じて異なる４種の蛍光体で標識されて得られる。これをキャピラリーゲル電気泳動により１塩基の分解能で分離する。試料は分離されながら泳動され、短いものから順にレーザ照射される。発光蛍光を複数のフィルターを用いて分光しながら計測すると、４種の蛍光体の蛍光強度の時間変化から、全ての断片の末端塩基種を短い断片から順に決定できるというものである。なお、プライマーを蛍光標識せずに、ｄｄＡＴＰ〜ｄｄＴＴＰ（ｄｄＮＴＰ）をそれぞれ異なる蛍光体で標識した標識ｄＮＴＰを使ってもよい。
【０００４】
近年、塩基の伸長反応を利用し、反応が進むと同時に配列データを取得する方法としてＤＮＡの伸長反応に伴ってピロリン酸が放出されることを利用したパイロシークエンス法が実用化されている（非特許文献１）。この方法はビーズ上もしくは基板上に試料ＤＮＡを固定化し、試料ＤＮＡに４種のｄＮＴＰのうち特定の塩基を供給し伸長反応の有無をピロリン酸の放出の有無で検出し、試料ＤＮＡの配列を決定していく。具体的には放出されたピロリン酸とアデノシン5'-ホスホ硫酸からＡＴＰスルフリラーゼの触媒反応でＡＴＰを生成させる。このＡＴＰがルシフェリン、ルシフェラーゼの存在下で発光反応を引き起こすため、発光の有無によりピロリン酸の放出の有無を確認する。さらに、基板表面にランダムに分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定する方法も提案されている。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼの基質として、鋳型ＤＮＡに取り込まれると保護基の存在によりＤＮＡ鎖伸長反応を停止させることができ、かつ検出可能な標識を持つ４種のｄＮＴＰ誘導体（ＭｄＮＴＰ）を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる工程、次いで取り込まれたＭｄＮＴＰを蛍光等で検出する工程、及びＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、それを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。本技術では、ＤＮＡ断片を１分子ずつ配列決定することができるため、同時に数多くの断片を解析することができ、解析スループットを大きくすることができる。
【０００５】
以上の方法はいずれも特異的なプライマーを試料ＤＮＡにアニールさせ、そのプライマーの３’末端から伸長反応を起こさせる。すなわちプライマーがハイブリダイズした位置から配列解析が開始される。
【０００６】
塩基配列解析を行う目的のひとつに細胞内で発現しているメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（ポリ（Ａ)＋ＲＮＡ）の配列を解析し、細胞内で発現している遺伝子を解析することがある。配列解析結果から遺伝子の同定を配列データベースを利用したホモロジー検索で行う場合、ポリアデニン部分ではない３’下流側非コード領域の配列でも同定は可能ではあるが、アミノ酸配列コード領域の全部又はその一部の配列が得られていることが最も望ましい。しかしポリ(Ａ)+ＲＮＡの３’末端側にあるポリアデニン部分及び非コード領域の長さはポリ(Ａ)+ＲＮＡ分子によってまちまちであるため、短い長さの塩基配列決定では解析したポリ(Ａ)+ＲＮＡ分子が同定できない場合もある。長塩基長の配列読み取りが望ましいが、装置、反応など、原理的に困難な場合がある。
【０００７】
したがって、短い塩基配列長でアミノ酸コード領域あるいはポリ(Ａ)部分以外の３’非翻訳領域などの情報を得る方法が望まれている。
【０００８】
【非特許文献１】Analytical Biochemistry, vol. 242(1), pp84, 1996
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 100(7), pp3960, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
単分子のポリヌクレオチド鎖を鋳型とした配列解析法やパイロシークエンス法などの塩基伸長反応を利用する配列解析方式において、ポリ(Ａ)+ＲＮＡの配列解析をオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて行なう場合には以下のような困難な点がある。短い長さのオリゴｄＴはポリ（Ａ）配列のどの部分にハイブリするか一意的に決定せず、ランダムにハイブリする。そのため単分子のポリヌクレオチド鎖を鋳型とした配列解析法では、プライマーと本来必要な配列情報の間にポリアデニン部分が介在し、読み取る塩基長が短い場合、実質的に必要な配列を得ることが困難な場合が多く出る。一方、パイロシークエンス法など固相にサンプル（又はプライマー）を固定する場合、通常同じ位置には、複数の同じターゲット核酸が固定され、それらにオリゴ（ｄＴ）をハイブリさせると、前述の理由により、同じターゲット核酸に対して異なる位置にハイブリしてしまう。全てのハイブリをポリ（Ａ）の同じ位置にすることは困難である。そのため１塩基ずつ伸長させても、配列位置が異なるため混合した信号となってしまい配列決定が困難である。そのため同期させるための方式が望まれる。
【００１０】
本発明は、上記の場合において、新たなプライマーを作製することなく、必要な領域の配列解析を行なう方法とその方法を用いた配列解析装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題に対し、発明者らは、配列決定反応のまえにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの4種のヌクレオチドのうち少なくとも１種を欠いた状態でＤＮＡ伸長反応を行い、その反応系から欠損している塩基の手前までプライマーを伸長する工程を欠損塩基の種類を変えながら繰り返すことにより、プライマーのハイブリダイズした位置より大幅に前進した部分から配列解析を開始できることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の工程を含む塩基配列解析方法を提供する：
１）プライマーを解析対象核酸にハイブリダイズさせる；
２）前記解析対象核酸を、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうち少なくとも１種の塩基を欠いた反応系で、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応を行なう；
３）前記伸長反応後、ＤＮＡポリメラーゼと塩基を反応系から除去し、核酸伸長反応を利用した配列解析反応を行なうことにより、前記解析対象核酸上のプライマー結合部位から離れた所望の領域の配列決定を行なう。なお、「プライマー結合部位から離れた所望の領域」はプライマー結合部位よりも５’上流側にある配列情報を必要とする領域」で、たとえば、繰り返し配列がプライマー結合部位の近傍にあるような場合、その部分を飛ばして配列情報を必要とする領域から配列決定することが可能となる。対象核酸の配列に依存するが、数塩基〜数十塩基解析位置をずらすことが可能となる。
【００１３】
ある実施態様において、前記２）及び３）の工程を欠損塩基の種類を変えて複数回行う。
【００１４】
またある実施態様においては、前記解析対象核酸がポリ(Ａ)領域を有するｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡであり、プライマーがオリゴ(ｄＴ)プライマーである。
【００１５】
またある実施態様においては、前記解析対象がポリ（Ａ）領域を有するｍＲＮＡであり、プライマーがオリゴ（ｄＴ）プライマーであって、ｄＴＴＰ以外の少なくとも１種の塩基を欠いた反応系で伸長反応を行う。
【００１６】
またある実施態様においては、前記解析対象が、ｍＲＮＡ由来の、ポリ（Ｔ）領域を有するｃＤＮＡであり、プライマーがオリゴ（ｄＡ）プライマーであって、ｄＡＴＰ以外の少なくとも１種の塩基を欠いた反応系で伸長反応を行う。
【００１７】
上記実施態様において、伸長反応は欠損塩基の種類を変えて複数回行う。
【００１８】
本発明の塩基配列決定方法は、解析対象核酸の増幅を行うことなく所望の領域の配列決定を行なうことができるため、微量核酸の解析を必要とするゲノム解析等において有用である。
【００１９】
本発明の塩基配列決定方法の１つの実施態様として、以下の工程を含む塩基配列解析方法を挙げることができる：
１）オリゴ(ｄＡ)プライマーを、ｍＲＮＡ由来の、ポリ(Ｔ)領域を有するｃＤＮＡにハイブリダイズさせる；
２）前記ｃＤＮＡにＤＮＡポリメラーゼとｄＡＴＰを加えて、伸長反応を行なう；
３）前記伸長反応後、ＤＮＡポリメラーゼとｄＡＴＰを反応系から除去する；
４）核酸伸長反応を利用した配列解析反応を行なうことにより、配列決定を行なう。
【００２０】
本発明の塩基配列決定方法のもう１つの実施態様として、以下の工程を含む塩基配列解析方法を挙げることができる：
以下の工程を含む塩基配列解析方法：
１）オリゴ(ｄＴ)プライマーをポリ(Ａ)領域を有するｍＲＮＡにハイブリダイズさせる；
２）前記ｍＲＮＡにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとｄＴＴＰを加えて、伸長反応を行なう；
３）前記伸長反応後、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとｄＴＴＰを反応系から除去する；
４）核酸伸長反応を利用した配列解析反応を行なうことにより、配列決定を行なう。
【００２１】
本発明はまた、上述の塩基配列解析方法を実施するための装置も提供する。この装置は：
前記解析対象核酸のプライマーからの伸長反応及び配列解析反応を行なうためのチャンバーと；
４種の基質塩基及び反応に必要な試薬を格納するための容器及び保管ユニットと；
前記基質塩基及び解析に必要な試薬を、少なくとも１種の塩基を欠いた状態で任意に組み合わせて前記チャンバーへ供給するための試薬供給システムと；
前記チャンバー内の温度を制御するための加温冷却システムと；
前記配列解析反応を検出するための検出システムと；
前記検出結果を解析するための解析システムとを含む。
【００２２】
前記装置は、用いる塩基配列解析反応に応じて、さらに４種の標識ｄＮＴＰを格納するための容器を備えていてもよい。なお、前記ｄＮＴＰ誘導体又は標識体は特に限定されず、公知の保護基や蛍光標識、放射標識、酵素標識を有するｄＮＴＰやｄｄＮＴＰ等を挙げることができる。
【００２３】
本発明の装置は、少なくとも１種の塩基を欠いた状態の基質塩基混合試薬を用いるものであってもよい。その場合、装置は：
前記解析対象核酸のプライマーからの伸長反応及び配列解析反応を行なうためのチャンバーと；
少なくとも１種の塩基を欠いた状態の基質塩基混合試薬１種以上、反応に必要な試薬、及び、４種のｄＮＴＰ又は４種の標識ｄＮＴＰをそれぞれ格納するための容器及び保管ユニットと；
前記保管ユニット内の試薬を前記チャンバーに供給するための試薬供給システムと；
前記チャンバー内の温度を制御するための加温冷却システムと；
前記配列解析反応を検出するための検出システムと；
前記検出結果を解析するための解析システムとを含む。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、単分子のポリヌクレオチド鎖を鋳型とした配列解析法やパイロシークエンス法などの塩基伸長反応を利用した配列解析において、特別なプライマーを作製することなく、鋳型核酸上のプライマー結合部位から離れた所望の領域の解析を行なうことができる。これにより、配列情報を必要とする領域とプライマー結合部位との間にポリ(Ａ)領域が介在するｍＲＮＡやｃＤＮＡの解析を効率的に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の方法ではその第一ステップにおいて核酸分子と該核酸分子の配列の一部分と相補的な配列を有するプライマーを通常のＤＮＡポリメラーゼ反応が行われるバッファー中でハイブリダイズさせる。
【００２６】
核酸分子及びプライマーのうち一方はあらかじめ担体表面に固定化されていても良い。また、ハイブリダイズ後に固定化するものであれば両者とも固定化されていても良い。
第二のステップではＤＮＡポリメラーゼと、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうち少なくとも１種類を欠いた塩基を含む溶液を核酸分子とプライマーのハイブリダイズしたものに提供し、プライマーの３’末端に塩基を反応させる。
【００２７】
第三のステップでは反応後、核酸分子から少なくとも塩基を含む反応溶液を分離する。核酸分子が担体表面に固定化されている場合には少なくとも塩基を含まない緩衝液で洗い流す。担体に固定化されていない場合にはエタノール沈殿により核酸分子を回収する。
【００２８】
以降必要と認められる回数にわたって第二のステップと第三のステップを繰り返す。その際反応に加えないヌクレオチドの種類は毎回変更する。例えば最初のサイクルではｄＡＴＰ, ｄＣＴＰ, ｄＴＴＰを反応に加え、次のサイクルではｄＡＴＰ, ｄＧＴＰ, ｄＴＴＰを反応に加える。繰り返しの回数は特に限定されず、解析対象核酸あるいは塩基配列情報が必要な領域に応じて適宜決定される。解析対象がｍＲＮＡやｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの場合、配列にもよるが通常１〜３回行えばよい。
【００２９】
第四のステップでは処理の終了した解析対象核酸分子を、核酸伸長反応を利用した配列解析反応に供する。核酸伸長反応を利用した配列解析反応は公知のいずれの方法であってもよく、たとえばシークエンスバイシンセンス法、サンガー法、パイロシークエンス法等に適用できる。
【００３０】
以下、本発明の方法を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
なお、以下の実施例においては、対象核酸（ＲＮＡかＤＮＡか）に応じて、適宜塩基Ｔに相当する試薬をＵに変更することも可能である。
【実施例１】
【００３２】
鋳型ＤＮＡは人工的にデザインしたものを用いた。鋳型ＤＮＡ（配列番号１）とプライマー（配列番号２）に用いたオリゴＤＮＡの配列は配列表に記載したとおりである。プライマーの５’末端はビオチンでラベルされている。
【００３３】
0.1pmoleのオリゴ(ｄＴ)プライマーを10μLのストレプトアビジン結合ビーズと混合しビーズ上にオリゴ(ｄＴ)プライマーを固定化する。洗浄バッファー（10mM TrisHCl pH 7.5, 7mM MgCl2, 50ｍＭ NaCl）で100μLずつ３回洗浄したのちテンプレートＤＮＡをオリゴ(ｄＴ)プライマーと等量加え、良く攪拌し、７５ ℃で１０分加熱した後、冷却する。洗浄バッファーで100μLずつ３回洗浄した後、5 pmole のｄＴＴＰと0.5ユニットの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントを含む反応バッファーを加え、３７℃、１０分間反応させる。さらに洗浄バッファーで100μLずつ３回洗浄した後、5 pmole のＣｙ３−ｄＣＴＰと0.5ユニットの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントを含む反応バッファー（10mM TrisHCl pH 7.5, 7mM MgCl2, 0.1ｍＭ DTT）を加え、３７℃、１０分間反応させる。次いで、Ｃｙ３の蛍光強度を測定し、配列を決定する。
【００３４】
上記の手順により、蛍光色素標識塩基を利用した配列解析においてポリ(Ａ)配列の5'上流側配列を解析することができる。
【００３５】
以上の工程を図１を参照しながら説明する。オリゴ(ｄＴ)プライマーはポリ(Ａ)領域の任意の位置にハイブリダイズする。１ａ−ｃはポリ(Ａ)領域の中央部に、２ａ−ｃはポリ(Ａ)領域の５’末端にハイブリダイズした例である。ハイブリ位置は確率的に決定され、上記反応によってビーズ上に固定されたプライマーとテンプレートのハイブリ状態は１ａと２ａその他の混在となる。これらにｄＴＴＰとＤＮＡポリメラーゼを加えると１ａでは伸長反応が起こりプライマーの３’末端がポリ(Ａ)領域の５’末端まで到達するがそこで反応が止まる（１ｂ）。一方、２ａでは伸長反応は起こらない（２ｂ）。この後にＣｙ３−ｄＣＴＰとＤＮＡポリメラーゼを加えると１ｂ，２ｂで同様に伸長反応が起こりポリ(Ａ)領域終了地点の次の塩基としてＧ（グアニン）が決定できる。
【００３６】
図３及び図４は本実施例方式に基づいて得られる伸長状態を示す蛍光強度とその説明模式図である。条件(a)は、ｄＴＴＰでの伸長反応の後、Ｃｙ３-ｄＣＴＰを反応させる、条件(ｂ) は、ｄＴＴＰ反応をせずにＣｙ３-ｄＣＴＰを反応させる、条件(ｃ) (ｄ)は、比較試料で、条件(ｃ)は、ｄＴＴＰ反応をせずにＣｙ３-ｄＧＴＰを反応させる、 条件(ｄ)は、何もしないビーズのみ、の場合で、そのときに得られる蛍光強度を図３に示す。なお、試料液は上記反応後、洗浄して浮遊する蛍光体等を除去した後、溶液に再分散させて行う。蛍光測定は、再分散させた試料溶液を蛍光測定用マイクロ石英セルに入れ、通常の蛍光分光測定装置で励起波長を約530nm（Ｃｙ３を励起できる波長であればよい）、蛍光検出波長約580nm（励起波長をカットし、蛍光を検出できる波長であればよい）に設定して行う。条件(a)では大きな蛍光強度が得られるが、条件(ｂ)では蛍光強度は小さく、条件(ｃ) (ｄ)では背景光程度の強度が得られる。プライマーとテンプレートのポリ(Ａ)領域は任意の位置でハイブリするが、条件(a)では図１の１ｂ、２ｂと同様に、ハイブリしたほとんど全てのプライマーがポリ(Ａ)領域終了地点まで伸長し、Ｃｙ３-ｄＣＴＰが結合した状態と考えられ（図４-条件(a)）、大きな蛍光強度を示すと考えられる。一方、条件(ｂ)では、ハイブリしたプライマーのうち図１の2aと同じ状態のものにしかＣｙ３-ｄＣＴＰが結合しないため（図４-条件(b)）、弱い蛍光しか得られない(図１の２ａと同じ状態のものは確率的にわずかしか存在しない)。条件(c) (d)では、図４-条件(c) (d)のようにＣｙ３-ｄＣＴＰが伸長していないため、背景光程度の強度になる。なお、図４で固相とプライマーとの長さが個々に異なるように表示しているが、実際は同じ状態で固定化しているものとする。
【００３７】
本実施例により、本例のようなポリ(Ａ)領域終了地点の次の塩基がＧであるテンプレート核酸の場合、オリゴ(dT)プライマーのハイブリの後、Ｃｙ３-ｄＣＴＰによる伸長反応前に、ｄＴＴＰとポリメラーゼ酵素を使って制限された伸長反応を行うことにより、制限伸長反応をしない通常の状態に比べ、正確に、精度よくｄＣＴＰを検出することができる。
【００３８】
本例はポリ(Ａ)領域終了地点の次の塩基がGに限らず、Ｃ、Ｔでも同様にＣｙ３-ｄＧＴＰ、Ｃｙ３-ｄＡＴＰを使って塩基配列を正確に決定することができる。また、蛍光体としてＣｙ３に限るものではなく、Ｃｙ５、ローダミンなど周知の任意の蛍光体でも同様に反応、実施可能である。
【００３９】
また、本例では鋳型核酸として合成核酸を使用したが、構造の同じポリ(Ａ)領域を有するｍＲＮＡにも適用でき、塩基を正確に決定することができるようになる。この場合、周知のようにＲＮＡ活性の有するポリメラーゼを使用する。
【００４０】
さらに、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの場合でも同様に測定ができる。この場合のｃＤＮＡにはポリ（Ｔ）領域があるため、上記実施例のオリゴ(ｄＴ)プライマーに変えてオリゴ(ｄＡ)プライマーを使用し、ｄＡＴＰとポリメラーゼ酵素を使って制限された伸長反応を行うことにより、制限伸長反応をしない通常の状態に比べ、正確に、精度よくｄＣＴＰを検出することができる。
【００４１】
また、蛍光測定は上記例のほか、蛍光顕微鏡など、種々の蛍光強度を測定することのできる装置が使用できる。
【００４２】
また、ビーズ（固相）にプライマーを固定化している系で説明したが、測定対象である核酸を固相に固定化し、プライマーを添加して反応させることでも同様にできる。
【００４３】
また、固相としてビーズのほかスライドガラスなどの基板を使っても同様に実現可能である。
【００４４】
また、予め制限された伸長反応を行うことにより、同じビーズ上の配列解析位置をそろえることができる。例えば、ポリＡ領域の端部にそろえることができ、複数の同じ核酸がビーズ固相に捕捉されている場合、ほとんど全ての核酸分子の同じ位置で伸長反応が起き、精度が高い測定が可能になる。予め制限された伸長反応を行わない場合、核酸分子ごとに配列解析する位置が異なってしまうため、正確な配列を決定することができなくなる。
【実施例２】
【００４５】
固相としてガラス平板を使用する系について説明する。
【００４６】
鋳型ＤＮＡ、プライマーＤＮＡ、洗浄バッファーは実施例１と同様のものを使用する。図５に反応工程での模式図を示す。
【００４７】
十分に洗浄したスライドガラス上に5×20mm程度に切断した両面テープ２枚を15mm程度の間隔をあけて平行に貼り付ける。この両面テープの上に18ｘ18mmのカバーガラスを貼り合わせ反応チャンバーとする。Poly-L-Lysine水溶液（10％ Poly-L-Lysineを含む）を30μL反応チャンバーに添加し１分間放置する。ろ紙でPoly-L-Lysine水溶液を吸引して除き、30μLずつ の水で３回同様に吸引してチャンバーを洗浄する。その後ビオチン化BSAを1％含む水溶液を30μL反応チャンバーに添加し５分間放置する。上記の操作と同じく、ろ紙で水溶液を除き、30μLずつの水で３回チャンバーを洗浄する。次いでストレプトアビジンを１％含む水溶液を30μL反応チャンバーに添加し５分間放置する。ろ紙で水溶液を除き、30μLずつの水で３回チャンバーを洗浄する。0.1pmoleのオリゴ(ｄＴ)プライマーと同量のテンプレートＤＮＡをあらかじめハイブリダイズしたＤＮＡを含む水溶液を30μL反応チャンバーに添加し５分間放置する（図５（ａ））。洗浄バッファー（10mM Tris-HCl pH 7.5, 7mM MgCl2, 50ｍＭ NaCl）で30μLずつ３回洗浄したのち、0.5pmole のｄＴＴＰと0.5ユニットの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントを含む反応バッファー（10mM Tris-HCl pH 7.5, 7mM MgCl2, 0.1ｍＭ DTT）をチャンバーに加え、室温で１５分間反応させる（図５（ｂ））。さらに30μLずつの洗浄バッファーで３回洗浄した後、0.5 pmole のＣｙ３−ｄＣＴＰと0.5ユニットの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントを含む反応バッファー（10mM TrisHCl pH 7.5, 7mM MgCl2, 0.1ｍＭ DTT）を加え、室温で１５分間反応させる（図５（ｃ））。次いで、全反射光を利用した顕微鏡下で蛍光を観察し、配列決定を行なう。図６にその測定装置の構成図と図７に照射時の模式図を示す。
【００４８】
図８は、本実施例にて得られる、図６の高感度二次元CCDカメラの取り込み画像の1例である。図中の番号及び矢印は生じる蛍光輝点の一部を示したものであるが、図のようにこのような輝点が複数検出できる。なお、測定は、ガラス上側の面で全反射条件となるように、ガラス基板面に波長５３２nmのレーザ光を適当な角度で照射する。これにより、ガラス基板面上部にエバネッセント場が生じ、これがＣｙ３−ｄＣＴＰを励起し、蛍光を発する。オリゴ（ｄＴ）プライマーは基板上にランダムに固定されているため、Ｃｙ３からの蛍光輝点も図のようにランダムに観察される。この輝点はＣｙ３−ｄＣＴＰ１分子からの蛍光であり、つまりは、測定対象核酸の一分子ごとの伸長を示し、塩基配列が決定できる。
【００４９】
なお、オリゴ(dT)プライマーのハイブリの後、Ｃｙ３-ｄＣＴＰによる伸長反応前に、ｄＴＴＰとポリメラーゼ酵素を使って制限された伸長反応を行わない場合は、実施例１の場合と同じように、Ｃｙ３-ｄＣＴＰを加えて反応させても、対象の核酸にＣｙ３-ｄＣＴＰが結合せず、蛍光発光輝点が少なくなる。確率的に、図１の２ａの状態にハイブリした核酸分子の場合のみ蛍光を発することになるが、ほとんどの核酸分子の蛍光は得られず、配列が決定できなくなる。つまり、ｄＴＴＰとポリメラーゼ酵素を使って制限された伸長反応を行うことにより、多くの対象核酸の塩基配列を決定することができる。
【００５０】
本例はポリ(Ａ)領域終了地点の次の塩基がＧに限らず、Ｃ、Ｔでも同様にＣｙ３-ｄＧＴＰ、Ｃｙ３-ｄＡＴＰを使って塩基配列を正確に決定することができる。また、蛍光体としてＣｙ３に限るものではなく、Ｃｙ５、ローダミンなど周知の任意の蛍光体でも同様に反応、実施可能である。
【００５１】
また、本例では鋳型核酸として合成核酸を使用したが、構造の同じポリ(Ａ)領域を有するｍＲＮＡにも適用でき、塩基を正確に決定することができるようになる。この場合、周知のようにＲＮＡ活性の有するポリメラーゼを使用する。
【００５２】
さらに、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの場合でも同様に測定ができる。この場合のｃＤＮＡにはポリ（Ｔ）領域があるため、上記実施例のオリゴ(ｄＴ)プライマーに変えてオリゴ(ｄＡ)プライマーを使用し、ｄＡＴＰとポリメラーゼ酵素を使って制限された伸長反応を行うことにより、制限伸長反応をしない通常の状態に比べ、数多くの核酸分子の塩基を決定できる。
【００５３】
上記例では、１塩基分の配列を決定する場合について説明したが、ｄＴＴＰとポリメラーゼ酵素を使って制限された伸長反応を行ったあと、順番にCy3-dATP, Cy3-dCTP, Cy3-dGTP, Cy3-dTTP, Cy3-dATP, Cy3-dCTP, Cy3-dGTP, Cy3-dTTP,・・・・・と反応させ、検出することで連続して塩基配列を決定させることが可能である。この場合、塩基の種類を変えるたびに、基板の洗浄、蛍光体の退色反応または蛍光体分子部の脱離反応などが必要である。また、塩基種ごとに異なる蛍光体で標識したものを使用し、４種の蛍光体標識塩基を混合して反応させ、蛍光測定を４色分離して検出してもよい。この場合、１反応で、対象となる核酸の１塩基分がどの塩基種かどうかを判定でき、迅速な配列解析が可能になる。
【００５４】
４種の塩基を順番に反応させる場合、ｄＴＴＰとポリメラーゼ酵素を使って制限された伸長反応を行えば、検出１塩基目から「GCGCGGGTGA・・・」と決定できる。一方、予め制限伸長反応を行わない場合、ハイブリ状態で種々のパターンが存在するが、例えば、「AAAAAAAAAG・・・」となり、意味の無いポリＡ部分を主に検出してしまう。特に配列決定塩基長が短い場合、例えば１０塩基であれば、予め制限伸長反応を行わない場合、有効な塩基長が短くなり、または全く読めない場合も発生する。予め制限伸長反応を行えば、ポリＡ部分の検出を自動的に飛ばすことができ、効果的に塩基配列を決定することが可能になる。
【００５５】
上記の手順により、蛍光色素標識塩基を利用した単分子DNAの塩基配列解析においてポリ(Ａ)配列の5' 上流側配列を解析することができる。
【実施例３】
【００５６】
鋳型ＤＮＡ、プライマーＤＮＡ、洗浄バッファーは実施例１と同様のものを使用する。
【００５７】
0.1pmoleのオリゴ(ｄＴ)プライマーを10μLのストレプトアビジン結合ビーズと混合しビーズ上にオリゴ(ｄＴ)プライマーを固定化する。洗浄バッファーで100μLずつ3回洗浄した後プライマーと等量のテンプレートＤＮＡを加え、良く攪拌し、７５℃で１０分加熱した後、冷却する。洗浄バッファーで３回洗浄した後、ビーズに5pmole のｄＴＴＰと0.5ユニットの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントを含む反応バッファーを加え、３７℃、１０分間反応させる。洗浄バッファーで100μLずつ3回洗浄した後、ｄＣＴＰ（6.5μM）） と大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメント（1.0ユニット/mL）、ＡＴＰスルフリラーゼ(0.3 ユニット/mL))、アデノシン５’−ホスホ硫酸（2.5μM）、ルシフェラーゼ（20μｇ/mL）、ルシフェリン（300μM））を含む反応バッファー（10mM Tris-HCl pH 7.5, 7mM MgCl2, 1ｍＭ DTT, 0.1% Tween20）を加える。３７℃、１０分間反応させながらプレートリーダーで発光を測定し、配列を決定する。
【００５８】
上記の手順により、パイロシークエンス法を利用してポリ(Ａ)配列の5'上流側配列を解析することができる。
【実施例４】
【００５９】
図２は本発明の方法を実施するための装置である。８の反応用基板に解析対象を固定化したのち９のフローチャンバーに取り付け、反応を行なう。反応の温度コントロールは７の加温冷却装置で行なう。試薬、バッファーは３の試薬保管ユニットに保管し、４の分注ユニット中で混合され、５の送液チューブ、６の試薬導入口を通じて反応槽に送られる。反応後の試薬は１０の廃液チューブを通じて１１の廃液容器に溜まる。配列解析反応のデータは反応槽上方に取り付けられた１２の２次元センサカメラを通じて１４の制御PCに取り込まれ、１５のモニターで観察できる。試薬の送液、反応槽の温度は制御PCを通じてコントロールする。図ではパイロシークエンス法を用いる装置を示しているが３の試薬保管ユニットにさらに4種のｄＮＴＰ蛍光誘導体を保管する容器を増設した構成とすれば蛍光誘導体を利用した配列解析装置となる。さらに加えて、シグナルの検出を顕微鏡を通じて２次元センサカメラで行なう構成とすれば単分子のポリヌクレオチド鎖を鋳型とした配列解析のための装置となる。
【００６０】
以下の配列解析反応に用いる鋳型ＤＮＡ、プライマーＤＮＡ、洗浄バッファーは実施例１と同様のものを使用する。
【００６１】
オリゴ(ｄＴ)プライマーをストレプトアビジン結合ビーズと混合しビーズ上にオリゴ(ｄＴ)プライマーを固定化する。洗浄バッファーで３回洗浄したのちプライマーと等量のテンプレートＤＮＡを加え、良く攪拌し、７５℃で１０分加熱した後、冷却する。プライマーとテンプレートＤＮＡの複合体が固定化されているビーズを表面をビオチン化した反応用基板８上に分散、固定化する。配列解析装置のフローチャンバー９内に反応用基板を取り付ける。容器３ｇに保持されている洗浄バッファーで洗浄する。容器３ｄに保持されているｄＴＴＰと容器３ｅに保持されているＤＮＡポリメラーゼ反応溶液とを混合しながらフローチャンバー９に送り37℃に加温しながら１０分間反応させる。反応後、容器３ｇに保持されている洗浄バッファーで洗浄する。ついで容器３ａに保持されているｄＡＴＰと容器３ｆに保持されているＤＮＡポリメラーゼ及び発光反応溶液とを混合しながらフローチャンバー９に送り３７℃に加温しながら２次元センサカメラ１２で発光シグナルを検出する。ついで再び洗浄バッファーで洗浄する。さらに同様な反応、検出と洗浄をｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰについて行なう。これを１サイクルの反応とし、サイクルを繰り返すことで塩基配列を決定する。このようにしてパイロシークエンス法を用いてポリ(Ａ)配列の5'上流側配列を解析することができる。
【００６２】
なお、あらかじめ少なくとも１種の塩基を欠いた状態の混合基質溶液を準備し、装置内に配置しておくこともできる。この場合、基質塩基を混合することが不要になる。
【実施例５】
【００６３】
本実施例では、１種の塩基を欠いた制限伸長反応を２回続けて行う方式について説明する。
【００６４】
固相としてガラス基板を使い、測定対象の鋳型核酸、プライマーＤＮＡ（オリゴ（ｄT）プライマー）、洗浄バッファー等は実施例２と同様のものとする。また、スライドガラス基板へのオリゴ（ｄT）プライマーの固定化、プライマーと鋳型核酸とのハイブリダイズ、洗浄条件、制限伸長反応条件も実施例２と同じように行う（図５(a)）。塩基配列測定前の、制限伸長反応として、第１段階目としてdTTP,dCTP,dGTPの組合せ（制限伸長反応試薬セット１）での伸長反応、第２段階目として、dATP,dTTP,dCTP,の組合せ（制限伸長反応試薬セット２）での伸長反応 を行う。図９には各段階での伸長状態を図示する。図９(a) はハブリダイズ後、 図９(b)は第１段階目の制限伸長反応後、図９(c)は 第２段階目の制限伸長反応後の状態である。第１段階目で、残っているポリ（A）領域を伸長し、さらに、その地点から７塩基分伸長する。第２段階目の反応によりさらに５塩基分伸長させ、合わせて、ポリ(Ａ)領域終了地点から１２塩基離れたところから塩基配列解析することになる。配列解析手段として、順番にCy3-dATP, Cy3-dCTP, Cy3-dGTP, Cy3-dTTP, Cy3-dATP, Cy3-dCTP, Cy3-dGTP, Cy3-dTTP,・・・・・と反応させ、検出することで連続して塩基配列を決定させることが可能である。この場合、塩基の種類を変えるたびに、基板の洗浄、蛍光体の退色反応または蛍光体分子部の脱離反応などが必要である。また、塩基種ごとに異なる蛍光体で標識したものを使用し、４種の蛍光体標識塩基を混合して反応させ、蛍光測定を４色分離して検出してもよい。この場合、１反応で、対象となる核酸の１塩基分がどの塩基種かどうかを判定でき、迅速な配列解析が可能になる。
【００６５】
本例は、構造の同じポリ(Ａ)領域を有するｍＲＮＡにも適用でき、ポリ(Ａ)領域終了地点から１２塩基程度離れたところからの塩基配列を効率よく得られる。ポリ(Ａ)領域終了地点直後からの配列では、ｍＲＮＡの同定が困難な系であっても、その読取位置を変えれば、同定できるようになる場合がある。本例は、このような場合に有効である。ポリ(Ａ)領域終了地点からの距離は上記のような制限伸長反応の種類と回数と順番、対象とする核酸の配列によって変わるが、任意に選択可能である。これらの方式は、たとえば、オリゴ（ｄT）プライマーを固定化し、細胞内のｍＲＮＡを網羅的にハイブリし、そのポリ（A）領域を除いた配列を効果的に検出する方法として有効である。また、検出された配列からホモロジー検索などを使ってどのｍＲＮＡなのかを同定し、それらの頻度分布、つまりmRNA発現分布を得るのに有効である。
【００６６】
また、上記のような制限伸長反応方式は、一般的な核酸の配列解析にも適用できる。たとえば、設計したプライマーとのハイブリ位置の後に配列解析が不要な２塩基の繰り返し配列がある場合、この２塩基の相補な塩基を組み合わせた制限伸長反応方式を配列解析前に行うことで、有効な配列を効果的に得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、ゲノム解析におけるｍＲＮＡやｃＤＮＡの単分子シークエンス等に有用である。したがって、生物、化学、医療等を含むライフサイエンス全般において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例１の説明図である。
【図２】実施例４における塩基配列解析装置を示す図である。
【図３】実施例１における伸長状態ごとの蛍光強度を示す説明図である。
【図４】実施例１における伸長状態の説明図である。
【図５】実施例２における反応工程ごとの状態の説明図である。
【図６】実施例２における蛍光検出装置の構成図である。
【図７】実施例２における蛍光検出状態の照射字の模式説明図である。
【図８】実施例２にて得られる、高感度二次元CCDカメラの取り込み画像の1例である。
【図９】実施例５における反応各段階での伸長状態図である。
【符号の説明】
【００６９】
１ａ  ポリ(Ａ)領域の中間にオリゴ(ｄＴ)プライマーがハイブリダイズした状態
１ｂ  １ａにｄＴＴＰとＤＮＡポリメラーゼが反応しオリゴ(ｄＴ)プライマーの末端がポリ(Ａ)領域の５’末端に達した状態
１ｃ  １ｂを用いて伸長反応を利用した配列解析を行なっている状態
２ａ  ポリ(Ａ)領域の５’末端にオリゴ(ｄＴ)プライマーがハイブリダイズした状態
２ｂ  ２ａにｄＴＴＰとＤＮＡポリメラーゼを加えてもオリゴ(ｄＴ)プライマーからの伸長が起こっていない状態
２ｃ  ２ｂを用いて伸長反応を利用した配列解析を行なっている状態
３    試薬保管ユニット
３ａ  ｄＡＴＰ溶液容器
３ｂ  ｄＣＴＰ溶液容器
３ｃ  ｄＧＴＰ溶液容器
３ｄ  ｄＴＴＰ溶液容器
３ｅ  ＤＮＡポリメラーゼ反応溶液容器
３ｆ  ＤＮＡポリメラーゼ及び発光反応溶液容器
３ｇ  洗浄バッファー容器
４    分注ユニット
５    送液チューブ
６    試薬導入口
７    加温冷却装置
８    反応用基板
９    フローチャンバー
１０    廃液チューブ
１１    廃液容器
１２    ２次元センサカメラ（高感度冷却ＣＣＤカメラ）
１３    ２次元センサカメラコントローラ
１４    制御ＰＣ
１５    モニター
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号１−人工配列の説明：鋳型核酸
配列番号２−人工配列の説明：オリゴｄＴプライマー
【図１】
2009011230.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009011230.tif 000009
【図８】
2009011230.tif 000010
【図９】
2009011230.tif 000011
【配列表】
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