(57)【要約】【課題】非共鳴背景信号現象の影響を受けることなく、弱い信号においても雑音に強く、優れた感度および分解能を有するコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置および方法を提供する。【解決手段】アンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させるためにポンプ光およびストークス光を試料に照射するためのポンプ光源およびストークス光源と；参照光を発生させるための参照光源；および前記アンチストークス周波数付近における前記試料の屈折率の変化による前記参照光の位相変化を利用して前記試料の映像を獲得する映像獲得手段を含む。【選択図】図４
2009204613.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置であって、
アンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させるためにポンプ光およびストークス光を試料に照射するためのポンプ光源およびストークス光源と；
参照光を発生させるための参照光源；および
前記アンチストークス周波数付近における前記試料の屈折率の変化による前記参照光の位相変化を利用して前記試料の映像を獲得する映像獲得手段を備えることを特徴とする映像獲得装置。
【請求項２】
前記参照光は、前記アンチストークス周波数より所定の大きさだけ高いまたは低い周波数を有することを特徴とする、請求項１に記載の映像獲得装置。
【請求項３】
前記映像獲得手段は、前記参照光を前記試料を通過する第１経路と前記試料を通過しない第２経路に分割して進行させるための手段を含み、前記第１経路を経た参照光と前記第２経路を経た参照光の位相差による干渉現象を利用して前記試料の映像を獲得することを特徴とする、請求項１に記載の映像獲得装置。
【請求項４】
前記参照光源は、前記アンチストークス周波数より所定の大きさだけ高い第１参照光および所定の大きさだけ低い第２参照光を各々発生させる第１参照光源および第２参照光源を含み、
前記映像獲得手段は、前記第１参照光および前記第２参照光を各々前記試料を通過する第１経路と前記試料を通過しない第２経路に分割して進行させるための手段を含み、前記第１経路を経た第１参照光と前記第２経路を経た第１参照光の位相差および前記第１経路を経た第２参照光と前記第２経路を経た第２参照光の位相差を共に利用して前記試料の映像を獲得することを特徴とする、請求項１に記載の映像獲得装置。
【請求項５】
前記ストークス光源は広い周波数帯域のストークス光を発生させることによって複数のアンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させ、
前記参照光源は広い周波数帯域の参照光を発生させ、
前記映像獲得手段は前記複数のアンチストークス周波数それぞれの付近における前記試料の屈折率の変化による前記参照光の位相変化を利用して前記試料の映像を獲得することを特徴とする、請求項１に記載の映像獲得装置。
【請求項６】
コヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置であって、
アンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させるためにポンプ光およびストークス光を試料に照射するためのポンプ光源およびストークス光源と；
参照光を発生させるための参照光源；および
前記アンチストークス周波数付近における前記試料の複屈折率の変化を利用して前記試料の映像を獲得する映像獲得手段を備えることを特徴とする映像獲得装置。
【請求項７】
前記映像獲得手段は、前記試料の複屈折率の変化を測定するために前記参照光が進行する経路上に前記参照光が前記試料を通過する前の位置に設けられる第１偏光板と、前記参照光が前記試料を通過した後の位置に設けられ、前記第１偏光板と異なる方向の光軸を有する第２偏光板とを含むことを特徴とする、請求項６に記載の映像獲得装置。
【請求項８】
前記映像獲得手段は、前記試料に電場または磁場を印加する電磁場発生部をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の映像獲得装置。
【請求項９】
コヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得方法であって、
（ａ）アンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させるためにポンプ光およびストークス光を試料に照射するステップと；
（ｂ）参照光を発生させるステップ；および
（ｃ）前記アンチストークス周波数付近における前記試料の屈折率の変化による前記参照光の位相変化を利用して前記試料の映像を獲得するステップを含むことを特徴とする映像獲得方法。
【請求項１０】
前記参照光は、前記アンチストークス周波数より所定の大きさだけ高いまたは低い周波数を有することを特徴とする、請求項９に記載の映像獲得方法。
【請求項１１】
前記（ｃ）ステップは、
（ｃ１）前記参照光を前記試料を通過する第１経路と前記試料を通過しない第２経路に分割して進行させるステップ；および
（ｃ２）前記第１経路を経た参照光と前記第２経路を経た参照光の位相差による干渉現象を利用して前記試料の映像を獲得するステップを含むことを特徴とする、請求項９に記載の映像獲得方法。
【請求項１２】
前記（ｂ）ステップは、前記アンチストークス周波数より所定の大きさだけ高い第１参照光と前記アンチストークス周波数より所定の大きさだけ低い第２参照光を発生させ、
前記（ｃ）ステップは、
（ｃ１）前記第１参照光および前記第２参照光を各々前記試料を通過する第１経路と前記試料を通過しない第２経路に分割して進行させるステップ；および
（ｃ２）前記第１経路を経た第１参照光と前記第２経路を経た第１参照光の位相差および前記第１経路を経た第２参照光と前記第２経路を経た第２参照光の位相差を共に利用して前記試料の映像を獲得するステップを含むことを特徴とする、請求項９に記載の映像獲得方法。
【請求項１３】
前記（ａ）ステップは、広い周波数帯域のストークス光を前記試料に照射することによって複数のアンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させ、
前記（ｂ）ステップは、広い周波数帯域の参照光を発生させ、
前記（ｃ）ステップは、前記複数のアンチストークス周波数それぞれの付近における前記試料の屈折率の変化による前記参照光の位相変化を利用して前記試料の映像を獲得することを特徴とする、請求項９に記載の映像獲得方法。
【請求項１４】
コヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得方法であって、
（ａ）アンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させるために試料にポンプ光およびストークス光を照射するステップと；
（ｂ）参照光を発生させるステップ；および
（ｃ）前記アンチストークス周波数付近における前記試料の複屈折率の変化を利用して前記試料の映像を獲得するステップを含むことを特徴とする映像獲得方法。
【請求項１５】
前記（ｃ）ステップは、
（ｃ１）前記参照光の前記試料を通過する前の偏光特性と前記試料を通過した後の偏光特性を分析して前記試料の複屈折率を測定するステップ；および
（ｃ２）前記測定された結果を映像化するステップを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の映像獲得方法。
【請求項１６】
前記試料に電場または磁場を印加するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１４に記載の映像獲得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質の構造と特性を明らかにするための映像を獲得する装置および方法に関し、特に、コヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラマン分光法（Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）は単色光の光を照射した試料から入射された単色光と相異なる波長の光が散乱する現象であり、現在は、赤外線分光法（Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）と共に振動モードの変化を追跡することによって分子の構造と特性を明らかにする学問における独自の領域を構築している。
【０００３】
このようなラマン分光法は、弱い強さのラマン散乱光を用いる特性により、赤外線分光法より先に研究が始まったにもかかわらず、発展速度が遅くてその間多く活用されなかったが、出力の強さが向上したレーザの出現と共に急速に発展し、現在は様々な分野で脚光を浴びている。
【０００４】
一方、蛍光顕微鏡は、様々な蛍光プローブ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｂｅ）の開発と共焦点の検出、多光子励起を通した３次元的イメージングにより、細胞生物学において画期的な技術として位置づけられた。蛍光顕微鏡は、自然的に試料に存在するか、人工的に注入された蛍光プローブとして知られている蛍光分子を励起できる波長の光源を試料に照射する。この時、試料は励起光源を吸収して蛍光を出し、蛍光を選択的に透過するフィルタを用いて試料を観察する。このような蛍光顕微鏡は、一般的な光学顕微鏡より高分解能を有する長所があるものの、蛍光プローブを使うために測定しようとする試料に変化を与えるようになり、光漂白（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）現象が起こる短所がある。
【０００５】
そこで、ラマン活性媒質に固定／可変の２つのレーザ光を入射し、これらの結合によって得られるアンチストークス光のスペクトルを測定するコヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ；Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を用いた顕微鏡が、高感度でありながらも蛍光を発生する媒質からの影響を受けないということで広く用いられている。
【０００６】
図１は一般的なＣＡＲＳ信号の発生原理を説明するためのエネルギーバンドダイヤグラムである。ＣＡＲＳはポンプ光、ストークス光、そしてプローブ光が試料と相互作用してアンチストークス光を発生させる四波混合（ｆｏｕｒ  ｗａｖｅ  ｍｉｘｉｎｇ）過程であって、周波数が相異なる２つのレーザービームを用いる。第１レーザービームはストークス光ωｓとして用いられ、第２レーザビームはポンプ光ωｐとプローブ光ωｐｒｏの役割をする。すなわち、ωｐｒｏの周波数がωｐと同一である。また、光の電場はＥＰ（ωｐ）、ＥＳ（ωｓ）、Ｅｐｒｏ（ωｐｒｏ）（＝ＥＰ（ωｐ））である。レーザービームが照射されれば、先ず、基底状態υ０＝０にある電子はポンプ光ωｐによって仮想状態（ｖｉｒｔｕａｌ  ｓｔａｔｅ）に励起され、ストークス光ωｓによって共鳴ラマン散乱で固有振動周波数がΩであるυ１＝１準位に殆ど遷移する。このように、υ０＝０準位からυ１＝１準位に転移した電子は、再びプローブ光ωｐｒｏによってωｐ＋Ωのような仮想状態に励起した後、エネルギー保存を満足させる周波数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓを有するアンチストークス光、すなわちＣＡＲＳ信号を放出してυ０＝０準位に遷移する。ＣＡＲＳ顕微鏡はこのようなＣＡＲＳ信号の強さを測定して物質を分析する。
【０００７】
前述したようなＣＡＲＳ顕微鏡は、共焦点顕微鏡と同じ分解能を有しながらも色素の発光を使わないために試料そのものに変化を与えず、化学種の振動準位のラマンだけを使うので化学種の選択性を持つという長所がある。また、自発ラマン散乱（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）に比べて非常に大きい信号を得ることができ、用いた２つのレーザ光の周波数とは異なるアンチストークス周波数を有するためにフィルタなどを用いて信号を分離し易い。
【０００８】
しかし、コヒーレントアンチストークスラマン散乱の代表的な短所は、２光子電子共鳴現象（ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によって引き起こされる非共鳴背景信号（ｎｏｎｒｅｓｏｎａｎｔ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｉｇｎａｌ）現象である。［Ｍ．Ｄ．Ｄｕｎｃａｎ，Ｊ．Ｒｅｉｎｔｊｅｓ，ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｍａｎｕｃｃｉａ，“Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ  Ｒａｍａｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，”Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．７，３５０-３５２，１９８２．］の研究では、可視光の使用により共鳴振動信号を凌駕するある２光子誘発（ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ）背景信号が表れた。［Ａ．Ｚｕｍｂｕｓｃｈ，Ｇ．Ｒ．Ｈｏｌｔｏｍ，ａｎｄ  Ｘ．Ｓ．Ｘｉｅ，“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｖｉｂｒａｔｉｏｎａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｂｙ  ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，”Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．８２，４１４２-４１４５，１９９９．］の研究では、近赤外線光の使用が２光子電子共鳴を避けるようにし、増加した感度を示した。その後、コヒーレントアンチストークスラマン散乱分光器の発展と共にいくつかの方法が非共鳴背景信号を減らすのに用いられた。
【０００９】
しかし、従来のＣＡＲＳに関する技術には多くの問題点があるにもかかわらず、全てＣＡＲＳ信号の強さを検出して直接分析した。その内、ＣＡＲＳ信号と非共鳴背景信号との間の対比に目的をおくようになり、よって、多くの問題点が現れるようになった。特に、非共鳴背景信号を減らすことに焦点をおく方法を探ることによって検出する光の強さが弱くなり、それにより、弱い強さの信号を雑音なしで検出するために高い仕様の光検出器に依存するしかない短所が生じるようになった。その上、直接的な信号の強さとして検出される信号を分析するために信号の感度、分解能、正確性などに限界があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が達成しようとする技術的課題は、非共鳴背景信号現象の影響を受けることなく、弱い信号においても雑音に強く、優れた感度および分解能を有するコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置を提供することである。
【００１１】
本発明が達成しようとする他の技術的課題は、非共鳴背景信号現象の影響を受けることなく、弱い信号においても雑音に強く、優れた感度および分解能を有するコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記技術的課題を解決するために、本発明に係るコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置は、アンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させるためにポンプ光およびストークス光を試料に照射するためのポンプ光源およびストークス光源と；参照光を発生させるための参照光源；および前記アンチストークス周波数付近における前記試料の屈折率の変化による前記参照光の位相変化を利用して前記試料の映像を獲得する映像獲得手段を含むことを特徴とする。
【００１３】
ここで、前記参照光は前記アンチストークス周波数より所定大きさだけ高いか低い周波数を有することが好ましい。
また、前記映像獲得手段は、前記参照光を前記試料を通過する第１経路と前記試料を通過しない第２経路に分割して進行させるための手段を含み、前記第１経路を経た参照光と前記第２経路を経た参照光の位相差による干渉現象を利用して前記試料の映像を獲得することができる。
【００１４】
また、前記参照光源は、前記アンチストークス周波数より所定大きさだけ高い第１参照光および所定大きさだけ低い第２参照光を各々発生させる第１参照光源および第２参照光源を含み、前記映像獲得手段は、前記第１参照光および前記第２参照光を各々前記試料を通過する第１経路と前記試料を通過しない第２経路に分割して進行させるための手段を含み、前記第１経路を経た第１参照光と前記第２経路を経た第１参照光の位相差および前記第１経路を経た第２参照光と前記第２経路を経た第２参照光の位相差を共に利用して前記試料の映像を獲得することができる。
【００１５】
また、前記ストークス光源は広い周波数帯域のストークス光を発生させることによって複数のアンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させ、前記参照光源は広い周波数帯域の参照光を発生させ、前記映像獲得手段は前記複数のアンチストークス周波数それぞれの付近における前記試料の屈折率の変化による前記参照光の位相変化を利用して前記試料の映像を獲得することができる。
【００１６】
前記技術的課題を解決するために、本発明に係るコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置は、アンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させるためにポンプ光およびストークス光を試料に照射するためのポンプ光源およびストークス光源と；参照光を発生させるための参照光源；および前記アンチストークス周波数付近における前記試料の複屈折率の変化を利用して前記試料の映像を獲得する映像獲得手段を含むことを特徴とする。
【００１７】
ここで、前記映像獲得手段は、前記試料の複屈折率の変化を測定するために前記参照光が進行する経路上に前記参照光が前記試料を通過する前の位置に設けられる第１偏光板と、前記参照光が前記試料を通過した後の位置に設けられ、前記第１偏光板と異なる方向の光軸を有する第２偏光板とを含むことができる。
また、前記映像獲得手段は前記試料に電場または磁場を印加する電磁場発生部をさらに含むことができる。
【００１８】
前記他の技術的課題を解決するために、本発明に係るコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得方法は、（ａ）アンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させるためにポンプ光およびストークス光を試料に照射するステップと；（ｂ）参照光を発生させるステップ；および（ｃ）前記アンチストークス周波数付近における前記試料の屈折率の変化による前記参照光の位相変化を利用して前記試料の映像を獲得するステップを含むことを特徴とする。
【００１９】
ここで、前記（ｃ）ステップは、（ｃ１）前記参照光を前記試料を通過する第１経路と前記試料を通過しない第２経路に分割して進行させるステップ；および（ｃ２）前記第１経路を経た参照光と前記第２経路を経た参照光の位相差による干渉現象を利用して前記試料の映像を獲得するステップを含むことができる。
【００２０】
また、前記（ｂ）ステップは、前記アンチストークス周波数より所定大きさだけ高い第１参照光と前記アンチストークス周波数より所定大きさだけ低い第２参照光を発生させ、前記（ｃ）ステップは、（ｃ１）前記第１参照光および前記第２参照光を各々前記試料を通過する第１経路と前記試料を通過しない第２経路に分割して進行させるステップ；および（ｃ２）前記第１経路を経た第１参照光と前記第２経路を経た第１参照光の位相差および前記第１経路を経た第２参照光と前記第２経路を経た第２参照光の位相差を共に利用して前記試料の映像を獲得するステップを含むことができる。
【００２１】
また、前記（ａ）ステップは広い周波数帯域のストークス光を前記試料に照射することによって複数のアンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させ、前記（ｂ）ステップは広い周波数帯域の参照光を発生させ、前記（ｃ）ステップは前記複数のアンチストークス周波数それぞれの付近における前記試料の屈折率の変化による前記参照光の位相変化を利用して前記試料の映像を獲得することができる。
【００２２】
前記他の技術的課題を解決するために、本発明に係るコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得方法は、（ａ）アンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させるために試料にポンプ光およびストークス光を照射するステップと；（ｂ）参照光を発生させるステップ；および（ｃ）前記アンチストークス周波数付近における前記試料の複屈折率の変化を利用して前記試料の映像を獲得するステップを含むことを特徴とする。
【００２３】
ここで、前記（ｃ）ステップは、（ｃ１）前記参照光の前記試料を通過する前の偏光特性と前記試料を通過した後の偏光特性を分析して前記試料の複屈折率を測定するステップ；および（ｃ２）前記測定された結果を映像化するステップを含むことを特徴とする。
また、前記試料に電場または磁場を印加するステップをさらに含むことができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、非共鳴背景信号現象の影響を受けることなく、弱い信号においても雑音に強く、優れた感度および分解能を有するコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置および方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】一般的なＣＡＲＳ信号の発生原理を説明するためのエネルギーバンドダイヤグラムである。
【図２】コヒーレントアンチストークスラマン散乱によりアンチストークス周波数付近で屈折率が変化する様子を説明するためのグラフである。
【図３】吸収率と屈折率の変化をより詳細に示すグラフである。
【図４】本発明の一実施形態によるコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置の構成図である。
【図５】ストークス光の周波数帯域が広い場合にアンチストークス光が発生する様子と吸収率および屈折率を示すグラフである。
【図６】本発明の他の実施形態において２つの参照光を共に用いる実施形態を説明するためのグラフである。
【図７】本発明の他の実施形態によるコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置の構成図である。
【図８】本発明のまた他の実施形態によるコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置の構成図である。
【図９】本発明のまた他の実施形態によるコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置の構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下では図面に基づいて本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。以下にて説明および添付図面における実質的に同一な構成要素は各々同一符号を付することによって重複説明は省略する。また、本発明を説明するにおいて、関連する公知機能または構成に関する具体的な説明が本発明の要旨を濁す恐れがあると判断される場合にはその詳細な説明は省略する。
【００２７】
本発明によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱により発生するアンチストークス光の信号の強さを直接測定することなく、それを間接的に利用することにより、非共鳴背景信号現象の影響を受けず、弱い信号においても雑音に強い映像獲得装置および方法を実現する。そのために、本発明に係る映像獲得装置および方法は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱により発生するアンチストークス光が有するアンチストークス周波数付近で試料の屈折率が変化する原理を利用する。
【００２８】
図２はコヒーレントアンチストークスラマン散乱によりアンチストークス周波数付近で屈折率が変化する様子を説明するためのグラフである。図２を参照すれば、ωｐはポンプ光の周波数を示し、ωｓはストークス光の周波数を示す。このようなポンプ光とストークス光が試料に照射されれば、アンチストークス周波数ωａｓ（＝２ωｐ−ωｓ）を有するアンチストークス光が試料から放出される。この時、試料においてはアンチストークス周波数付近で光の吸収または放出が起こることによって吸収率α（あるいは放出率）が変化する。ωｓ付近で周波数に応じた光の吸収率ｎ（α）が図２に示されている。このような吸収率の変化は屈折率の変化を伴い、吸収率の変化と屈折率の変化はＫｒａｍｅｒ−Ｋｒｏｎｉｇ関係と呼ばれる次に数学式による。
【００２９】
【数１】
2009204613.tif 000003
（数学式１）
【００３０】
ここで、ｃは任意の定数であり、Ｐはコーシーの主値（Ｃａｕｃｈｙ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｖａｌｕｅ）を意味する。
図２を参照すれば、このような吸収率と屈折率の関係に応じた屈折率ｎ（ω）が示されている。図面に示すように、屈折率はωａｓ付近で最も大きい変化を示す。
【００３１】
図３はこのような吸収率と屈折率の変化をより詳細に示すグラフである。図３を参照すれば、吸収率グラフα１に対応する屈折率グラフｎ１、そして吸収率グラフα２に対応する屈折率グラフｎ２が示されている。図面に示すように、ωａｓ付近で所定周波数だけ低い周波数と高い周波数においてその変化が最も大きく、また、ωａｓを中心に吸収率の変化が大きいほどωａｓ付近で屈折率の変化がより大きいことが分かる。
【００３２】
図４は本発明の一実施形態によるコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置の構成図である。図４を参照すれば、本実施形態による映像獲得装置は、アンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させるために試料に照射されるポンプ光およびストークス光を発生させるためのポンプ光源４０１およびストークス光源４０２と、参照光を発生させるための参照光源４１０、および図示したような、アンチストークス周波数付近における試料の屈折率の変化による参照光の位相変化を利用して試料の映像を獲得する映像獲得手段を含む。ポンプ光源４０１とストークス光源４０２としてはパルス型レーザ光源を用いる。
【００３３】
本実施形態によれば、参照光の周波数ωｒｅｆはアンチストークス周波数ωａｓより所定大きさだけ高いか低い周波数を有するようにする。この時、屈折率の変化が最も大きい地点の周波数を有することが好ましい。例えば、図１および図２に示すように、屈折率の変化が最も大きい地点に該当する周波数、すなわち、ωａｓより所定大きさだけ低い周波数を参照光の周波数ωｒｅｆとして用いる。勿論、ωａｓより所定大きさだけ高い周波数を参照光の周波数として用いることもできる。
【００３４】
以下では、図４に示された実施形態による映像獲得装置の動作を説明する。ポンプ光源４０１とストークス光源４０２は各々周波数ωｐのポンプ光と周波数ωｓのストークス光を発生させ、ポンプ光とストークス光は第１ダイクロイック反射鏡４１３で反射され、試料Ｓに照射される。試料においてはコヒーレントアンチストークスラマン散乱によりアンチストークス光が発生する。また、ポンプ光とストークス光は第２ダイクロイック反射鏡４１５で反射され、外部に放出される。第１ダイクロイック反射鏡４１３と第２ダイクロイック反射鏡４１５は、周波数ωｐのポンプ光と周波数ωｓのストークス光は反射させ、周波数ωｒｅｆの参照光は通過させることにより、ポンプ光とストークス光を濾過する役割をする。
【００３５】
参照光源４１０は周波数ωｒｅｆを有する参照光を発生させる。参照光は第１光分配器４１１を介し、試料Ｓを通過する第１経路と試料Ｓを通過しない第２経路の２つの経路に分割される。
第１経路に分割された参照光は第１反射鏡４１２で反射され、第１ダイクロイック反射鏡４１３を通って試料Ｓを通過する。この時、顕微鏡の対物レンズ４１４によって拡大され得る。試料Ｓにおいては、上述したように、コヒーレントアンチストークス散乱によりアンチストークス周波数付近で屈折率の変化が起こるため、試料を通過した参照光は位相変化を経る。この参照光は第２光分配器４１８に入射される。
【００３６】
第２経路に分割された参照光は第２反射鏡４１６で反射され、第２光分配器４１８に入射される。この時、干渉縞を最大にするために可変波長板４１７を前記参照光の経路に置くことができる。
試料を通過する第１経路に進行した参照光と試料を通過しない第２経路に進行した参照光は互いの間に位相差が存在し、よって、第２光分配器４１８を通過した後に干渉現象を起こす。検出部４１９はこのような干渉現象による信号を検出し、検出された信号は映像化部４３０に伝達される。検出部４１９としては、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）を用いることができる。映像化部４３０は、前記検出された信号を分析し、それを映像化してディスプレイ（図示せず）などを介して出力する。
【００３７】
上述した実施形態において、前記第１経路に進行する参照光と前記第２経路に進行する参照光間の経路の相対的な長さを変化させるために各構成要素、例えば、第１光分配器４１１、第１反射鏡４１２、第２反射鏡４１６などを移送する移送装置を設けることができる。
また、上述した実施形態の変形実施形態として、ポンプ光源４０１としてはパルス型レーザ光源を用い、ストークス光源４０２としては単一周波数のパルス型レーザ光源の代わりに周波数帯域の広い広帯域光源（ｂｒｏａｄｂａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｓｏｕｒｃｅ）、例えば、ＬＥＤ光源を用いる。
【００３８】
図５はストークス光の周波数帯域が広い場合にアンチストークス光が発生する様子と吸収率および屈折率を示すグラフである。図面に示すように、アンチストークス光が十分広い周波数帯域を有する場合、複数の周波数においてコヒーレントアンチストークスラマン散乱が起こり、複数のアンチストークス周波数（ωａｓ１，ωａｓ２）を有するアンチストークス光が発生する。したがって、これら周波数の各々において、試料の屈折率の変化による参照光の位相変化を利用して試料の映像を獲得することができる。このために、本実施形態においては、参照光としても広い周波数帯域を有する参照光を用い、検出部４１９として、干渉現象による信号を色々な周波数帯域から検出できる素子を用いる。例えば、アレイ検出器（ａｒｒａｙｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）またはＣＣＤアレイなどを用いることができる。
【００３９】
図６は、本発明の他の実施形態として、２つの参照光、すなわち、アンチストークス周波数ωａｓより所定大きさだけ低い周波数ωｒｅｆ１と、所定大きさだけ高い周波数ωｒｅｆ２を各々有する２つの参照光を共に用いる実施形態を説明するためのグラフである。図面に示すように、ωｒｅｆ１における屈折率とωｒｅｆ２における屈折率はアンチストークス周波数ωａｓにおける屈折率を基準にその符号が逆になる。したがって、これら２つの周波数の各々における屈折率の差を利用すれば、光源の強さの変化などのような測定時の雑音を減少させることができる。
【００４０】
図７は本発明の他の実施形態によるコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置の構成図であって、ωｒｅｆ１とωｒｅｆ２の２つの周波数を各々有する２つの参照光を共に用いる実施形態を示す構成図である。
【００４１】
図７を参照すれば、本実施形態による映像獲得装置は、アンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させるために試料に照射されるポンプ光およびストークス光を発生させるためのポンプ光源７０１およびストークス光源７０２と、周波数ωｒｅｆ１の第１参照光および周波数ωｒｅｆ２の第２参照光を発生させるための第１参照光源７０３および第２参照光源７０４と、前記第１参照光および前記第２参照光を各々前記試料Ｓを通過する第１経路と前記試料Ｓを通過しない第２経路に分割して進行させるための手段、および前記第１経路を経た第１参照光と前記第２経路を経た第１参照光の位相差および前記第１経路を経た第２参照光と前記第２経路を経た第２参照光の位相差を共に利用して前記試料の映像を獲得する映像獲得手段を含む。
【００４２】
以下では図７に示された実施形態による映像獲得装置の動作を説明する。ポンプ光源７０１とストークス光源７０２は各々周波数ωｐのポンプ光と周波数ωｓのストークス光を発生させ、ポンプ光とストークス光は第２ダイクロイック反射鏡７１３で反射され、試料Ｓに照射される。試料Ｓにおいてはコヒーレントアンチストークスラマン散乱によりアンチストークス光が発生する。また、ポンプ光とストークス光は第３ダイクロイック反射鏡７１５で反射され、外部に放出される。第２ダイクロイック反射鏡７１３と第３ダイクロイック反射鏡７１５は、周波数ωｐのポンプ光と周波数ωｓのストークス光は反射させ、周波数ωｒｅｆ１の第１参照光と周波数ωｒｅｆ２の第２参照光は通過させることにより、ポンプ光とストークス光を濾過する役割をする。
【００４３】
第１参照光源７０３は周波数ωｒｅｆ１を有する第１参照光を発生させる。第１参照光は、第１反射鏡７０５と第１ダイクロイック反射鏡７０６で反射され、第１光分配器７１１に入射された後、試料Ｓを通過する第１経路と試料Ｓを通過しない第２経路の２つの経路に分割される。
第２参照光源７０４は周波数ωｒｅｆ２を有する第２参照光を発生させる。第２参照光は、第１ダイクロイック反射鏡７０６を通過して第１光分配器７１１に入射された後、第１参照光と同じように、試料Ｓを通過する第１経路と試料Ｓを通過しない第２経路の２つの経路に分割される。
【００４４】
第１経路に分割された第１参照光と第２参照光は第２反射鏡７１２で反射され、第２ダイクロイック反射鏡７１３を通って試料Ｓを通過する。この時、顕微鏡の対物レンズ７１４によって拡大され得る。試料Ｓにおいては、上述したように、コヒーレントアンチストークス散乱によりアンチストークス周波数付近で屈折率の変化が起こるため、試料を通過した参照光は位相変化を経る。試料を通過した第１参照光および第２参照光は第２光分配器７１８に入射される。
【００４５】
第２経路に分割された第１参照光と第２参照光は第３反射鏡７１６で反射され、第２光分配器７１８に入射される。この時、干渉縞を最大にするために可変波長板７１７を経路に置くことができる。
試料Ｓを通過する第１経路に進行した第１参照光と試料Ｓを通過しない第２経路に進行した第１参照光は互いの間に位相差が存在し、よって、第２光分配器７１８を通過した後に干渉現象を起こす。この干渉は周波数ωｒｅｆ１における干渉になる。
【００４６】
同じように、試料Ｓを通過する第１経路に進行した第２参照光と試料Ｓを通過しない第２経路に進行した第２参照光は互いの間に位相差が存在し、よって、第２光分配器７１８を通過した後に干渉現象を起こす。この干渉は周波数ωｒｅｆ２における干渉になる。
【００４７】
第３ダイクロイック反射鏡７１９は、周波数ωｒｅｆ１の光は通過させ、周波数ωｒｅｆ２の光は反射させる。したがって、第１検出部７２１は周波数ωｒｅｆ１領域における干渉現象による信号を検出し、第２検出部７２２は第４反射鏡７２０で反射された周波数ωｒｅｆ２領域における干渉現象による信号を検出する。第１検出部７２１および第２検出部７２２から各々検出された信号は映像化部７３０に入力される。映像化部７３０は、第１検出部７２１から検出された信号と第２検出部７２２から検出された信号との間の差を映像化し、ディスプレイ（図示せず）などを介して出力する。
【００４８】
図８は本発明のまた他の実施形態によるコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置の構成図である。図２に関して説明したように、コヒーレントアンチストークスラマン散乱が起こる場合、アンチストークス周波数付近で屈折率が変われば、屈折率が方向性に応じて異に表れる複屈折率の変化が起こる。本実施形態によれば、このような複屈折率の変化を利用して試料の映像を獲得する。
【００４９】
図８を参照すれば、本実施形態による映像獲得装置は、アンチストークス周波数を有するアンチストークス光を発生させるために試料Ｓに照射されるポンプ光およびストークス光を発生させるためのポンプ光源８０１およびストークス光源８０２と、アンチストークス周波数より所定大きさだけ高いか低い周波数を有する参照光を発生させるための参照光源８１０、および図示したような、試料Ｓの複屈折率の変化による参照光の偏光状態の変化を利用して試料Ｓの映像を獲得するための映像獲得手段を含む。ポンプ光源８０１とストークス光源８０２としてはパルス型レーザ光源を用いる。
【００５０】
ポンプ光源８０１とストークス光源８０２は各々周波数ωｐのポンプ光と周波数ωｓのストークス光を発生させ、ポンプ光とストークス光は第１ダイクロイック反射鏡８１４で反射され、試料Ｓに照射される。試料においてはコヒーレントアンチストークスラマン散乱によりアンチストークス光が発生する。また、ポンプ光とストークス光は第２ダイクロイック反射鏡８１６で反射され、外部に放出される。第１ダイクロイック反射鏡８１４と第２ダイクロイック反射鏡８１６は、周波数ωｐのポンプ光と周波数ωｓのストークス光は反射させ、周波数ωｒｅｆの参照光は通過させることにより、ポンプ光とストークス光を濾過する役割をする。
【００５１】
参照光源８１０は周波数ωｒｅｆを有する参照光を発生させる。参照光は第１偏光板８１１を通過した後に第１偏光板８１１が有する光軸方向に偏光した光になる。偏光した参照光は可変波長板８１２を通過した後に第１反射鏡８１３で反射され、試料Ｓに照射される。この時、参照光は顕微鏡の対物レンズ８１５によって拡大され得る。参照光は試料Ｓを通過した後に第２反射鏡８１７で反射される。また、第１偏光板８１１と異なる方向の光軸、例えば、９０度差の光軸を有する第２偏光板８１８に入射される。検出部８１９は第２偏光板８１８を通過した参照光を検出し、映像化部８３０は試料Ｓを通過する前の参照光の偏光特性と試料Ｓを通過した後の参照光の偏光特性を分析して試料Ｓの複屈折率を測定し、それを映像化してディスプレイ（図示せず）などを介して出力する。
【００５２】
図９は本発明のまた他の実施形態によるコヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた映像獲得装置の構成図であって、図８に示された映像獲得装置に、試料Ｓに電場または磁場を印加する電磁場発生部８４０を追加した実施形態を示す。図面に示すように、試料Ｓに電場または磁場を印加すれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱効果を増加させたり減少させたりすることができる。したがって、コヒーレントアンチストークスラマン散乱による複屈折率の変化を調節することができる。
【００５３】
上述した本発明によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱により発生するアンチストークス光の信号の強さを直接測定することなく、アンチストークス光が有するアンチストークス周波数付近で試料の屈折率の変化または複屈折率の変化を利用して試料の映像を獲得する。したがって、非共鳴背景信号現象の影響は受けず、屈折率の変化は信号の強さとは関係ないため、弱い信号においても雑音に強く、優れた感度および分解能を有する映像獲得装置および方法を実現することができる。
【００５４】
今までに本発明について好ましい実施形態を中心に説明した。本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者であれば、本発明の本質的な特性から逸脱しない範囲内で変形した形態で実現できることを理解するはずである。したがって、開示された実施形態は限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮しなければならない。本発明の範囲は前述した説明ではなく特許請求の範囲に示されており、それと同等な範囲内にある全ての差異点は本発明に含まれると解釈しなければならない。
【符号の説明】
【００５５】
４１０  参照光源
４０１  ポンプ光源
４０２  ストークス光源
４１９  検出部
４３０  映像化部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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