(57)【要約】【目的】空間分解能とイオン化効率を高める。【構成】第１および第２の２つのレーザ・ビームＬ１，Ｌ２を異なる方向から試料ＳＡに向けて，これら２つのレーザ・ビームのスポットＳ１，Ｓ２がその一部において試料表面上で重なるように，集光して，照射し，これら２つのレーザ・ビームの重なった試料部分から微粒子を脱離させ，脱離した微粒子が存在する空間に向けて第３のレーザ・ビームＬ３を照射して気化させる。気化された試料イオンをキャピラリー41を通して質量分析装置42に導く。【選択図】図２
2009168673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２の２つのレーザ・ビームを異なる方向から試料に向けて，これら２つのレーザ・ビームがその一部において試料表面上で重なるように，少なくとも一方のレーザ・ビームを集光して，照射し，これら２つのレーザ・ビームの重なった試料部分から微粒子を脱離させ，
脱離した微粒子が存在する空間に向けて第３のレーザ・ビームを照射して微粒子を気化させる，
イオン化方法。
【請求項２】
気化された試料イオンを質量分析装置に導く，
請求項１に記載のイオン化方法。
【請求項３】
第１，第２および第３のレーザ・ビームを生成するとともにこれらの３つのレーザ・ビームを別個に集光，投射するレーザ光学系を備え，
第１および第２のレーザ・ビームは，異なる方向から試料に向けて，少なくとも一方のレーザ・ビームが集光されて，投射され，これら２つのレーザ・ビームがその一部において試料表面上で重なるように調整され，
第３のレーザ・ビームは上記２つのレーザ・ビームの重なった試料部分から脱離した微粒子が存在する空間に向けて集光，投射されるように調整されている，
イオン化装置。
【請求項４】
第１および第２のレーザ・ビームの照射により試料から脱離し，第３のレーザ・ビーム照射により気化された試料イオンを質量分析装置に導く手段をさらに備えている，請求項３に記載のイオン化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明はイオン化方法および装置に関し，特に試料（生体組織，細胞，有機材料等）を質量分析するためにイオン化する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の代表的イオン化法である MALDI（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization ）は，紫外レーザ光を固体マトリックスに吸収させアブレーション（ビームエネルギを吸収した物質が大きなエネルギをもつフラグメントとして爆発的に飛散する現象）を発生させて，生体高分子を脱離，イオン化する方法である。近年はこの技術を２次元イメージングに応用しようという試みがなされている。
【非特許文献１】Koichi Tanaka, Hiroaki Waki, Yutaka Ido, Satoshi Akita, Yoshikazu Yoshida, Tamio Yoshida, T.Matsuo“Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry”Rapid Communications in Mass Spectrometry, Volume 2, Issue 8, August 1988, pp151-153
【非特許文献２】Richard M. Caprioli, Terry B. Farmer, and Jocelyn Gile“Molecular Imaging of Biological Samples:Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS”Analytical Chemistry, Vol.69, No.23, December 1, 1997, pp4751-4760
【０００３】
しかしながら，MALDI の空間分解能は用いる光の回折限界によって決定されるので，波長オーダ程度が限度である。さらに，MALDI では試料を完全に気化できず，そのためイオン化効率が低いという問題がある。
【発明の開示】
【０００４】
この発明は，波長オーダよりも微細な範囲について試料の微粒子を発生させ，これを高い効率でイオン化できる方法および装置を提供するものである。
【０００５】
この発明によるイオン化方法は，第１および第２の２つのレーザ・ビームを異なる方向から試料に向けて，これら２つのレーザ・ビームがその一部において試料表面上で重なるように，少なくとも一方のレーザ・ビームを集光して，照射し，これら２つのレーザ・ビームの重なった試料部分から微粒子を脱離させ，脱離した微粒子が存在する空間に向けて第３のレーザ・ビームを照射して微粒子を気化させるものである。
【０００６】
この発明によるイオン化装置は，第１，第２および第３のレーザ・ビームを生成するとともにこれらの３つのレーザ・ビームを別個に集光，投射するレーザ光学系を備え，第１および第２のレーザ・ビームは，異なる方向から試料に向けて，少なくとも一方のレーザ・ビームが集光されて，投射され，これら２つのレーザ・ビームがその一部において試料表面上で重なるように，そして重なった領域において試料から微粒子が脱離するように，方向，強度，ビーム径等が調整され，第３のレーザ・ビームは上記２のレーザ・ビームの重なった試料部分から脱離した微粒子が存在する空間に向けて集光，投射されるように（方向，強度，ビーム径等が）調整されているものである。
【０００７】
この発明によると，第１および第２のレーザ・ビームを集光し（必要ならば光の回折限界近くまで），試料表面上でこれら２つのレーザ・ビームによる照射範囲が一部重なるようにする。２つのレーザ・ビームの重なった照射範囲（領域）では試料の微粒子が脱離する程度のレーザ強度となるように各レーザ強度が調整される。レーザ・ビームが重なった領域においてのみ試料から微粒子が脱離する。レーザ・ビームのスポットは回折限界により規定される範囲以下には小さくすることはできないが，２つのレーザ・ビームが重なった領域については回折限界により規定される範囲よりも小さくすることが可能である。２つのレーザ・スポットが重なった領域でのみ試料からの脱離が行なわれるから，光の回折限界を超えた空間分解能が得られる。
【０００８】
このようにして微細な領域から脱離した試料の微粒子は次に第３のレーザ・ビームによって照射され，ほぼ完全に気化，イオン化される。
【０００９】
イオン化された試料分子は質量分析装置に導かれ，質量分析される。
【００１０】
このように，空間分解能が高まるので，２つのレーザ光のスポットが重なる場所を走査すれば，２次元分子イメージ像を得ることも可能となる。
【００１１】
なお，２つまたは３つのレーザ・ビームは１つまたは２つのレーザ装置から出射するレーザ・ビームをビーム・スプリットすることにより生成することも可能である。
【００１２】
この発明によるイオン化方法は大気圧下でも，真空内でも行うことが可能である。
【実施例】
【００１３】
図１はこの発明の実施例による分子イメージング像の形成が可能なイオン化装置の概略構成を示すものである。
【００１４】
このイオン化装置は大気圧下で動作可能である。このイオン化装置によって試料から脱離，イオン化された試料イオンは，キャピラリ41を通してたとえば質量分析装置42に導かれる。質量分析装置の例としては直交型飛行時間質量分析計を挙げることができるが，この発明は（リニア）イオントラップ装置等の質量分析装置にも適用可能である。
【００１５】
イオン化装置内の適所にサンプル・ステージ10が設けられる。このサンプル・ステージ10上には試料が塗布された基板12が載置されかつ適当な固定具（図示略）により固定される。便宜的にサンプル・ステージ10の上面をＸＹ平面とし，これに垂直な方向をＺ方向とする。
【００１６】
イオン化装置にはＸＹＺマニュピレータ11が設けられ，このＸＹＺマニュピレータ11はサンプル・ステージ10をＸ，Ｙ，Ｚの各方向に独立に移動可能に保持する。Ｘ方向，Ｙ方向およびＺ方向への変位の駆動源はたとえばピエゾ素子またはステッピングモータを用いた駆動装置など機械的な振動を与え得るものであり，nmオーダの分解能でＸ，Ｙ，Ｚ方向への変位を別個に制御できることが望ましい。Ｘ，Ｙ方向のうちの少なくとも一方向に変位可能であればよく，またＺ方向への移動は必ずしもできなくてもよい。
【００１７】
サンプル・ステージ10の斜め上方には，第１および第２のレーザ装置21，22とそれらの集光光学系（レンズなど）31，32（レーザ装置と集光光学系を含めてレーザ光学系という）が設けられている。これらのレーザ光学系は，集点位置，レーザの投射方向等が調整可能であり，さらにレーザ・ビーム径およびレーザ強度も制御できるものである。さらに，サンプル・ステージ10の側方には第３のレーザ装置23およびその集光光学系（レンズなど）33（レーザ装置と集光光学系を含めてレーザ光学系という）が配置されている。このレーザ光学系もまた，集点位置，レーザの投射方向，ビーム径，レーザ強度が調整可能である。レーザ装置21，22，23から出射するレーザ・ビームをそれぞれＬ１，Ｌ２，Ｌ３とする。１つのレーザ装置の出射光を２つに分け（又は３つに分け），これらをレーザ・ビームＬ１，Ｌ２（およびＬ３）とすることも可能である。
【００１８】
サンプル・ステージ10上の試料が置かれる場所付近の上方には，イオン・サンプリング用のキャピラリー41の先端が臨むように配置されている。キャピラリー41はここで生成された試料イオンを質量分析装置42に導くためのものである。キャピラリー41もまた，その角度や位置が調整可能に保持されることが望ましい。
【００１９】
分析対象となる試料（ペプチド，たんぱく質，合成高分子，顔料，ＤＮＡなど）に適した適当なマトリックスを選択して（マトリックスは必ずしも必要ではない。対象試料に依存する。），試料と混合する。マトリックスと混合した試料を適当な溶媒に溶解し，またはすりつぶすなどして，ガラス基板12上に塗布する。対象試料をそのまま基板12上に載置ないしは塗布してもよいし，試料の上に適当なマトリックスを薄く塗布してもよい。いずれにしても，試料ＳＡはマトリックスを含むもの，含まないものの両方を含むものとする。ガラス基板12はサンプル・ステージ10上に固定される。
【００２０】
図２は３つのレーザ光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３の照射方向と照射範囲を拡大して示すものであり，図３は２つのレーザ光Ｌ１とＬ２のレーザ・スポットの重なりを示すものである。レーザＬ１，Ｌ２により試料ＳＡの表面上に形成されるレーザ・スポットをＳ１，Ｓ２で示す。
【００２１】
第１および第２のレーザ光学系による第１，第２のレーザ光Ｌ１，Ｌ２の焦点位置および投射方向（必要ならばレーザ・ビーム径も）を調整して，これらのレーザ光Ｌ１，Ｌ２によるレーザ・スポットＳ１，Ｓ２が試料ＳＡの表面上で一部のみ重なるようにする。また，レーザ光Ｌ１またはレーザ光Ｌ２単独では試料が脱離しない程度のレーザ光強度とし，レーザ・スポットＳ１とＳ２が重なった領域でのみ試料から微粒子が脱離するようにレーザ光Ｌ１，Ｌ２のレーザ強度が調整される。レーザ光Ｌ１とＬ２は連続光でもパルス光でもよいが，パルス光の場合にはこれらのレーザ光Ｌ１，Ｌ２は同期して同時に試料を照射するようにする。
【００２２】
レーザ光Ｌ１，Ｌ２それぞれ単独では光の回折限界により規定されるスポット径以下に集光することはできないが，上記のように２つのレーザ光Ｌ１とＬ２が重なった領域は光の回折限界を超えた狭い範囲にすることが可能であり，きわめて高い空間分解能が得られる。
【００２３】
試料ＳＡがマトリックスを含む場合には２のレーザ光Ｌ１，Ｌ２として紫外光レーザを用いることが好ましいが，水溶液系を脱離，イオン化するためには赤外光レーザを用いるとよい。
【００２４】
図１ないし図３では回折限界近くまで絞った２つのレーザ光の重ね合わせが図示されているが，たとえば第２のレーザ光Ｌ２を光ファイバにより試料ＳＡの近くまで導き，近接場光を発生させ，これと第１のレーザ光Ｌ１（集光されている）とを重ね合わせてもよい。
【００２５】
第３のレーザ・ビームＬ３は試料ＳＡから脱離した（キャピラリー41により吸引される前の）微粒子が存在する空間に向けて集光されて投射される。第３のレーザ・ビームＬ３としては，パルス状または連続発振の赤外光（たとえばＣＯ2 レーザ光）がよい。さまざまなサイズの液滴を含む微粒子が第３のレーザ・ビームＬ３の照射によりほぼ完全に気化されて，キャピラリー41を通して質量分析装置42に導入されることになる（質量分析装置42内は真空なので，試料イオンは吸引される）。
【００２６】
他の実施例として，サンプル・ステージ10とイオン取り込み口（キャピラリー41の先端）との間に放電電極を設けて試料イオンをフラグメント化する。それによってタンパク質分析などが可能となる。サンプル・ステージ10，ＸＹＺマニュピレータ11等を内部に含むハウジングを設け，このハウジング内を真空にしてもよい。レーザ装置21，22，23はハウジングの外に配置し，レーザ光に対して透明な窓を通してレーザ光を照射することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】イオン化装置の概略構成を示す。
【図２】３つのレーザ・ビームの焦点位置と方向を拡大して示す。
【図３】２つのレーザ・ビームのスポットの重なりを示す。
【符号の説明】
【００２８】
10  サンプル・ステージ
12  ガラス基板
21，22，23  レーザ装置
31，32，33  集光光学系
41  キャピラリー
42  質量分析装置
Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３  レーザ・ビーム
ＳＡ  試料
Ｓ１，Ｓ２  レーザ・スポット
【図１】
2009168673.tif 000003
【図２】
2009168673.tif 000004
【図３】
2009168673.tif 000005