(57)【要約】【課題】１個のヒトＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）遺伝子を効率よく解析・同定する技術や、１個のＴ細胞に由来するヒトＴＣＲを発現する形質転換ヒトＴ細胞等を提供すること。【解決手段】樹状細胞ワクチンの投与を受けたメラノーマ患者において増幅されているｇｐ１００２０９−２１７ペプチドに対するＴＣＲを産生すると考えられるＣＴＬ細胞を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体及びＰＥ標識ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマーにより二重染色し、マイクロメッシュデバイス等を用いて、二重染色されたＣＴＬ細胞を１細胞ずつ分取して、分離された１個のヒトＣＴＬ細胞から全ＲＮＡを抽出した後、１個のヒトＴ細胞の抗原レセプター遺伝子を解析・同定する。同定されたＴＣＲ遺伝子を発現ベクターに組み込み、ナイーブＴ細胞を形質転換する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のヒトＴ細胞の抗原レセプター遺伝子の解析・同定方法。
（Ａ）細胞障害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞が認識する特異抗原若しくは抗原エピトープに対する免疫応答が確認されているヒトから得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）標識物質により標識された前記特異抗原若しくは抗原エピトープと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒトＴ細胞を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＴ細胞を二重標識する工程； 
（Ｃ）標識物質により二重標識されたＴ細胞を１細胞ずつ分取する工程；
（Ｄ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｅ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒトＴ細胞抗原レセプターに特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応を行い、ヒトＴ細胞抗原レセプター遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｆ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程； 
【請求項２】
末梢血単核球を採取する工程において、がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取することを特徴とする請求項１に記載の解析・同定方法。
【請求項３】
末梢血単核球中のＴ細胞を二重標識する工程において、標識物質により標識された前記特異抗原若しくは抗原エピトープとして、がん特異的抗原ペプチド、ヒト組織適合性抗原（ＨＬＡ）タンパク、及び標識物質からなる複合体を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の解析・同定方法。
【請求項４】
末梢血単核球中のＴ細胞を二重標識する工程において、ヒトＴ細胞を認識しうる抗体として、抗ＣＤ８抗体又は抗ＣＤ４抗体を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の解析・同定方法。
【請求項５】
Ｔ細胞を１細胞ずつ分取する工程において、１細胞を捕捉することが可能な微細孔を複数有する基板を備えたマイクロ流路デバイスを用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の解析・同定方法。
【請求項６】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｇ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のヒトＴ細胞に由来する抗原レセプターを発現しうる組換えベクターの調製方法。
（Ａ）細胞障害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞が認識する特異抗原若しくは抗原エピトープに対する免疫応答が確認されているヒトから得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）標識物質により標識された前記特異抗原若しくは抗原エピトープと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒトＴ細胞を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＴ細胞を二重標識する工程； 
（Ｃ）標識物質により二重標識されたＴ細胞を１細胞ずつ分取する工程；
（Ｄ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｅ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒトＴ細胞抗原レセプターに特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応を行い、ヒトＴ細胞抗原レセプター遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｇ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターに組み込む工程；
【請求項７】
末梢血単核球を採取する工程において、がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取することを特徴とする請求項６記載の調製方法。
【請求項８】
末梢血単核球中のＴ細胞を二重標識する工程において、標識物質により標識された前記特異抗原若しくは抗原エピトープとして、がん特異的抗原ペプチド、ヒト組織適合性抗原（ＨＬＡ）タンパク、及び標識物質からなる複合体を用いることを特徴とする請求項６又は７に記載の調製方法。
【請求項９】
末梢血単核球中のＴ細胞を二重標識する工程において、ヒトＴ細胞を認識しうる抗体として、抗ＣＤ８抗体又は抗ＣＤ４抗体を用いることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載の調製方法。
【請求項１０】
Ｔ細胞を１細胞ずつ分取する工程において、１細胞を捕捉することが可能な微細孔を複数有する基板を備えたマイクロ流路デバイスを用いることを特徴とする請求項６〜９のいずれか記載の調製方法。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか記載の調製方法により得られる組換えベクター。
【請求項１２】
請求項６〜１０のいずれか記載の調製方法により得られる組換えベクターがナイーブＴ細胞に導入され、１個のヒトＴ細胞に由来する抗原レセプターを発現する形質転換ヒトＴ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１個のヒトＴ細胞の抗原レセプター遺伝子の解析・同定方法や、１個のヒトＴ細胞に由来する抗原レセプターを発現しうる組換えベクターの調製方法や、１個のヒトＴ細胞に由来する抗原レセプターを発現しうる組換えベクターがナイーブＴ細胞に導入され、１個のヒトＴ細胞に由来する抗原レセプターを発現する形質転換ヒトＴ細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性黒色腫は、インターロイキン２などを用いた免疫療法が比較的有効な癌であるが（例えば、非特許文献１参照）、生体内における抗腫瘍効果には、腫瘍細胞に反応する細胞傷害性Ｔ細胞（Cytotoxic T lymphocyte：ＣＴＬ）が重要であることが示されている（例えば、非特許文献２参照）。免疫療法後、腫瘍反応性Ｔ細胞が活性化され、Ｔ細胞上のＴ細胞レセプター（T cell receptor：ＴＣＲ）が、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）分子によって腫瘍細胞表面に提示される腫瘍細胞タンパク質が分解されてできたペプチド（腫瘍抗原）を認識し、腫瘍細胞を傷害する。更に各種サイトカインを分泌し、マクロファージ等の他の免疫細胞をも誘導活性化し、生体内で腫瘍拒絶を起こすと考えられている。腫瘍反応性Ｔ細胞には自己腫瘍細胞のみならず、ＨＬＡを共有する他の患者からの腫瘍細胞にも反応するような共通腫瘍抗原を認識する場合と、自己腫瘍細胞しか反応しない固有抗原を認識する場合がある。
【０００３】
ヒト腫瘍細胞に対する免疫応答機構を解明して、新しい免疫療法を開発するためには、これらの腫瘍反応性Ｔ細胞が認識する腫瘍抗原を同定することが重要である。腫瘍反応性Ｔ細胞が樹立されている場合には、その反応性を利用した機能的ｃＤＮＡ発現クローニング法を用い、悪性黒色腫抗原の単離が可能である。例えば、転移メラノーマ患者からの腫瘍反応性ＣＴＬと、ＨＬＡ−Ａ２を発現する腫瘍細胞株とを用いて、メラノーマの予防、診断及び治療に用いることができる悪性黒色腫抗原を単離することが可能であり（例えば、特許文献１参照）、その一つＭＡＲＴ１は同様な方法によって単離、同定されたものである。現在までに代表的なものとして、上記ＭＡＲＴ１やｇｐ１００のような色素細胞（メラノサイト）組織特異的タンパク質、各種腫瘍と正常組織では精巣に発現が認められるＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ等のＣＴ抗原（Cancer-Testis抗原）、腫瘍細胞の遺伝子異常により産生されるβカテニン、ＣＤＫ４（cyclin dependent kinase 4）、ｐ１５、ＧｎＴ−Ｖ等の変異ペプチド抗原が単離されている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
また、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus；ＣＭＶ）感染症は、通常の免疫状態である健常人ではあまり問題にはならないが、特に臓器移植後など免疫低下状態では、重篤な間質性肺炎などの合併症を起こしうる深刻な疾患である。現在、抗ウイルス剤の投与によりＣＭＶ感染症の臨床症状は緩和されるが、根治対策となり得る抗ウイルス剤は現在のところまだ知られていない。これまでに主にＣＭＶｐｐ６５タンパク由来のＨＬＡ−Ａ２拘束性のエピトープに関する研究が行われており、ＣＭＶｐｐ６５４９５−５０３ペプチドを用いた特異的ＣＴＬ細胞の誘導やテトラマ―試薬を用いたＣＴＬクローンの評価が行われている。しかし、進行がん患者でのＣＭＶに対するＣＴＬ細胞の誘導反応に関して、それほど多くの知見は得られておらず、ＣＭＶ感染症に特異的なＣＴＬ細胞のＴＣＬβ鎖遺伝子については何ら知られていない。
【０００５】
Ｔ細胞はＴＣＲによりＭＨＣ分子／抗原ペプチド複合体を認識して、抗原提示細胞（antigen presenting cell；ＡＰＣ）などの標的細胞に結合するが、ＣＴＬはＭＨＣクラスＩ分子／抗原ペプチドの複合体のみに結合し(ＭＨＣクラスＩ拘束性)、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞はＭＨＣクラスII分子／抗原ペプチドの複合体のみしか結合できない（ＭＨＣクラスII拘束性）とされている。また、ＭＨＣクラスＩ分子はほとんどの有核細胞に発現しているが、ＭＨＣクラスII分子はＢ細胞，マクロファージ，クッパー細胞，活性化Ｔ４リンパ球など異物の排除や感染防御に関係する特別な機能をもった細胞でしか発現していない。このためＴｈ細胞はＭＨＣクラスII分子を発現した樹状細胞やＢ細胞、活性化Ｔ細胞などとは結合できるが、これら以外の腫瘍細胞やウイルス感染細胞などには直接結合することができない。しかし遺伝子操作によってＭＨＣクラスＩ拘束性とされるＣＴＬ由来のＴＣＲ遺伝子を導入したＭＨＣクラスII拘束性とされるＣＤ４陽性ＣＤ８陰性Ｔ細胞が、対応抗原をパルスしたＡＰＣとＣＤ８非依存的に反応して活性化されることができ、対応抗原に結合できるＴＣＲを発現していることが示された。また、非特異的な抗腫瘍活性をもつ末梢血リンパ球に腫瘍抗原特異的ＣＴＬ由来のＴＣＲ遺伝子を導入することにより、特異的に腫瘍を傷害することができることが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００６】
他方、Ｔ細胞表面に存在する膜表面タンパク質であり、抗原認識を担うＴＣＲには、α鎖・β鎖から成るヘテロ二量体とγ鎖・δ鎖から成るヘテロ二量体の二種類が同定されている。ＴＣＲ遺伝子は、免疫グロブリン遺伝子と同様に、可変領域（Ｖ：variable）、多様性領域（Ｄ：diversity）、結合領域（Ｊ：joining）からなり分子の多様性を生じるＶドメインと、細胞外定常領域、膜貫通領域、細胞内領域を含む定常領域（Ｃ：constant）からなるＣドメインにより構成されている。これらのアミノ酸配列はＴ細胞ごとに異なっていることから、ＴＣＲは抗原認識分子であると同時に個々のＴ細胞の目印にもなっている。このＴＣＲの多様性は後天的なＴＣＲ遺伝子の再構成によって生みだされており、ＴＣＲβ，δ鎖はＶ−Ｄ−Ｊを、ＴＣＲα，γ鎖はＶ−Ｊを再構成することが知られている。
【０００７】
Ｔ細胞の初期分化は、Ｂ細胞と同様にＴＣＲのα鎖及びβ鎖遺伝子の再構成と密接に関わっている。ＴＣＲβ鎖遺伝子の再構成はＤＮ−Ｔ細胞（double negative：ＣＤ４−８−）の段階で開始され、β鎖遺伝子の再構成に成功した細胞はβ鎖タンパク質と代替α鎖（ｐｒｅＴα）の複合体、つまりプレＴ細胞レセプターを細胞表面に発現する。そして、ＣＤ４及びＣＤ８分子の発現が誘導され、ＤＰ−Ｔ細胞（double positive：ＣＤ４+８+）へと移行し、ＤＰとなったＴ細胞は、次にＴＣＲのα鎖遺伝子の再構成に成功した細胞のみが、ＴＣＲを表面に発現できることが知られている。
【０００８】
ＴＣＲβ鎖の遺伝子構成に関しては、ヒトゲノム遺伝子配列情報データベースによれば、ＴＣＲβ鎖の遺伝子は約３０種類の亜族（遺伝子自体は約７０種）からなるＶ遺伝子、２種類のＤ遺伝子、１４種類のＪ遺伝子、２種類のＣ遺伝子によって構成され、Ｖβ中に２つの可変領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２）が存在することも知られている。これらの中からＶβ、Ｄβ、Ｊβが各１つずつ選ばれて結合し、ＴＣＲβ鎖をコードするＤＮＡが構成されている。この際、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβの結合部にはランダムな塩基の挿入や欠失が起こり、無限に近い多様性が生みだされている。このＶβ−Ｄβ−Ｊβの結合部位は、ＣＤＲ３（相補性決定領域３：third complementarity determining region）、結合部（junctional）領域と呼ばれ、ＴＣＲの中で最も多型性に富む部分であり、塩基の挿入・欠失が起こるため、各遺伝子構成が同じであっても連結部分も含めて同一配列になることは極めて稀である。
【０００９】
【特許文献１】特表平１０−５０５４８１号公報
【非特許文献１】JAMA 271, 907, 1994
【非特許文献２】Microbiol.Immunol. 42, 803, 1998
【非特許文献３】Immunol Res 16, 313, 1997
【非特許文献４】J.Immunol.,171:3287-3295, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
近年、がんや自己免疫疾患という病態での免疫細胞の異常クローンが注目されているが、免疫のダイナミックな順応メカニズムを考えれば、個々の細胞の機能的性格が異なることは容易に想像できる。免疫応答の観点からしてもＴＣＲや抗体遺伝子の変異も最初は１個の細胞から始まる現象であり、免疫細胞の機能研究においては、１細胞レベルでの研究はもはや避けては通れない時代である。特に、がんという病態下での個々の免疫細胞の動態については、未だ詳細な検討はなされておらず、新しい治療を考える上で重要な研究課題となりうる。本発明の課題は、１個のＴ細胞由来のｍＲＮＡの遺伝子解析を将来的な研究開発の目的と位置づけ、１個のヒトＴ細胞の抗原レセプター遺伝子を効率よく解析・同定する技術や、１個のＴ細胞に由来するヒトＴ細胞抗原レセプターを発現する形質転換ヒトＴ細胞等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ＴＣＲ分子が、Ｔ細胞を介する免疫応答および免疫機構に重要な役割を果たしていることから、これら免疫応答および免疫機構の解析には、個々のＴＣＲ分子を得ることが必要である。しかし、膜表面タンパク質を細胞から精製すると、１０１０個の細胞からせいぜい１０μｇ程度しか得られない。しかも、ＴＣＲの多様性により、一種類のＴＣＲを分取するためには、それぞれのＴＣＲを持つＴ細胞株を樹立し、その各々からＴＣＲを単離することが必須となる。しかし、Ｔ細胞のＴＣＲレパートリーは１０１０種類にも及んでおり、１０１０種のＴ細胞株を樹立することは、実質的に極めて困難である。
【００１２】
本発明者らは、転移性メラノーマの症例を対象にＨＬＡ−Ａ２又はＡ２４ペプチドカクテルにて処理をした樹状細胞ワクチンの臨床試験を実施している。今回、ＨＬＡ−Ａ２拘束性をもつｇｐ１００２０９−２１７ペプチド（以下、ｇｐ１００ペプチドということがある）にて処理した樹状細胞ワクチン投与を受けたメラノーマ患者由来のＴ細胞を用いて１細胞レベルでのメラノーマｇｐ１００ペプチド特異的なＴＣＲについて解析・同定を行った。すなわち、樹状細胞ワクチンの投与を受けたメラノーマ患者において増幅されているｇｐ１００ペプチドに対するＴＣＲを産生すると考えられるＣＴＬ細胞を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体及びＰＥ標識ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマー（ｇｐ１００ペプチドとＨＬＡ-Ａ２の複合体を４個連結し、さらにＰＥ標識したもの）により二重染色し、複数の微細孔を有する基板を備えたマイクロ流路デバイスを用いて、二重染色されたＣＴＬ細胞を１細胞ずつ分取して、分離された１個のヒトＣＴＬ細胞から全ＲＮＡを抽出した後、１個のヒトＴ細胞の抗原レセプター遺伝子を解析・同定することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、［１］以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のヒトＴ細胞の抗原レセプター遺伝子の解析・同定方法
（Ａ）細胞障害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞が認識する特異抗原若しくは抗原エピトープに対する免疫応答が確認されているヒトから得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）標識物質により標識された前記特異抗原若しくは抗原エピトープと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒトＴ細胞を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＴ細胞を二重標識する工程； 
（Ｃ）標識物質により二重標識されたＴ細胞を１細胞ずつ分取する工程；
（Ｄ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｅ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒトＴ細胞抗原レセプターに特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応を行い、ヒトＴ細胞抗原レセプター遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｆ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程； 
や、［２］末梢血単核球を採取する工程において、がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取することを特徴とする上記［１］に記載の解析・同定方法に関する。
【００１４】
また本発明は、［３］末梢血単核球中のＴ細胞を二重標識する工程において、標識物質により標識された前記特異抗原若しくは抗原エピトープとして、がん特異的抗原ペプチド、ヒト組織適合性抗原（ＨＬＡ）タンパク、及び標識物質からなる複合体を用いることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載の解析・同定方法や、［４］末梢血単核球中のＴ細胞を二重標識する工程において、ヒトＴ細胞を認識しうる抗体として、抗ＣＤ８抗体又は抗ＣＤ４抗体を用いることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載の解析・同定方法や、［５］Ｔ細胞を１細胞ずつ分取する工程において、１細胞を捕捉することが可能な微細孔を複数有する基板を備えたマイクロ流路デバイスを用いることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載の解析・同定方法や、［６］以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｇ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のヒトＴ細胞に由来する抗原レセプターを発現しうる組換えベクターの調製方法
（Ａ）細胞障害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞が認識する特異抗原若しくは抗原エピトープに対する免疫応答が確認されているヒトから得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）標識物質により標識された前記特異抗原若しくは抗原エピトープと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒトＴ細胞を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＴ細胞を二重標識する工程； 
（Ｃ）標識物質により二重標識されたＴ細胞を１細胞ずつ分取する工程；
（Ｄ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｅ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒトＴ細胞抗原レセプターに特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応を行い、ヒトＴ細胞抗原レセプター遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｇ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターに組み込む工程；
に関する。
【００１５】
さらに本発明は、［７］末梢血単核球を採取する工程において、がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取することを特徴とする上記［６］記載の調製方法や、［８］末梢血単核球中のＴ細胞を二重標識する工程において、標識物質により標識された前記特異抗原若しくは抗原エピトープとして、がん特異的抗原ペプチド、ヒト組織適合性抗原（ＨＬＡ）タンパク、及び標識物質からなる複合体を用いることを特徴とする上記［６］又は［７］に記載の調製方法や、［９］末梢血単核球中のＴ細胞を二重標識する工程において、ヒトＴ細胞を認識しうる抗体として、抗ＣＤ８抗体又は抗ＣＤ４抗体を用いることを特徴とする上記［６］〜［８］のいずれか記載の調製方法や、［１０］Ｔ細胞を１細胞ずつ分取する工程において、１細胞を捕捉することが可能な微細孔を複数有する基板を備えたマイクロ流路デバイスを用いることを特徴とする上記［６］〜［９］のいずれか記載の調製方法や、［１１］上記［６］〜［１０］のいずれか記載の調製方法により得られる組換えベクターや、［１２］上記［６］〜［１０］のいずれか記載の調製方法により得られる組換えベクターがナイーブＴ細胞に導入され、１個のヒトＴ細胞に由来する抗原レセプターを発現する形質転換ヒトＴ細胞に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、腫瘍免疫学的観点から見ると従来不可能とされてきた１個のＴ細胞レベルでの機能的なＴＣＲを解析・同定することができ、免疫応答のモニタリングが可能となるため、画期的な基盤技術の開発につながる可能性が高い。その上、特異的な免疫エピトープや腫瘍抗原に対するＴＣＲを網羅的に解析・同定することが可能となるため、今後のがんのテーラーメイド医療や診断も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の１個のヒトＴ細胞の抗原レセプター遺伝子の解析・同定方法としては、以下に示す工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）を順次備えた方法であれば特に制限されるものではなく、また、本発明の１個のヒトＴ細胞に由来する抗原レセプターを発現しうる組換えベクターの調製方法としては、以下に示す工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｇ）を順次備えた方法であれば特に制限されるものではないが、組換えベクターの調製方法においても、工程（Ｅ）と（Ｇ）の間に工程（Ｆ）を設けることが好ましい。
（Ａ）ＣＴＬ又はＴｈ細胞が認識する特異抗原若しくは抗原エピトープに対する免疫応答が確認されているヒトから得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）標識物質により標識された前記特異抗原若しくは抗原エピトープと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒトＴ細胞を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＴ細胞を二重標識する工程； 
（Ｃ）標識物質により二重標識されたＴ細胞を１細胞ずつ分取する工程；
（Ｄ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｅ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒトＴ細胞抗原レセプターに特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応を行い、ヒトＴ細胞抗原レセプター遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｆ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程； 
（Ｇ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターに組み込む工程；
【００１８】
上記工程（Ａ）におけるＣＴＬが認識する特異抗原若しくは抗原エピトープとしては、ＭＨＣクラスＩ分子に捕捉されて細胞表面に、がん特異的抗原ペプチドやウイルス感染をうけた細胞で増殖したウイルス粒子の断片化されたウイルス特異的抗原ペプチド等を表出しうるものであれば特に制限されず、また、Ｔｈ細胞が認識する特異抗原若しくは抗原エピトープとしては、ＭＨＣクラスII分子に捕捉され、マクロファージやクッパー細胞などの細胞表面に、体内に侵入した細菌、体内に取り込まれた食物アレルゲン等の異物抗原が細胞内のプロテアーゼなどの酵素で小さなペプチド断片へと切断処理された抗原ペプチドを表出しうるものであれば特に制限されない。
【００１９】
また、上記工程（Ａ）においては、これらＣＴＬ又はＴｈ細胞が認識する特異抗原若しくは抗原エピトープを特異的に認識するＴ細胞を増やしておくことが特に重要である。例えば、ＭＨＣクラスＩ分子に捕捉されるがん特異的抗原ペプチド、好ましくはＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２拘束性のがん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血を用いることにより、がん特異的抗原ペプチドを特異的に認識するＴＣＲ産生ＣＴＬを増やしておくことができる。かかるＨＬＡ−Ａ２拘束性のがん特異的抗原ペプチドとして、メラノーマ細胞特異的抗原ｇｐ１００由来のｇｐ１００２０９−２１７ペプチドを挙げることができる。通常がん患者より樹状細胞ワクチンを製造する場合には、末梢血より成分採血装置にて採取した単球細胞をサイトカインとともに７日間培養し、その後ｇｐ１００を含むペプチドカクテル（各ペプチドあたり２５μｇ／ｍＬ）とＫＬＨ（２５μｇ／ｍＬ）にて処理を行い、最終的に樹状細胞ワクチンが得られる。現在進行中の第II相試験では、１〜５×１０７個の樹状細胞をまず４回投与し、明らかな有害事象がなければ最大１０回まで樹状細胞ワクチンの投与を行うものである。樹状細胞ワクチンを投与したがん患者から得られる末梢血単核球に、ｇｐ１００ペプチドにて処理した樹状細胞及びＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ＊0201遺伝子を発現している）を用いて複数回刺激を行うことが、ｇｐ１００ペプチドを特異的に認識するＴＣＲをもつＣＴＬ細胞をあらかじめ増やしておく上で好ましい。この工程（Ａ）において、目的とするＴＣＲ産生ＣＴＬを、全Ｔ細胞中の１０％以上、好ましくは２０％、より好ましくは４０％以上とすることがきわめて重要である。すなわち、この工程（Ａ）を、がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られ、目的とするＴＣＲ産生ＣＴＬを、全Ｔ細胞中の１０％以上、好ましくは２０％、より好ましくは４０％以上含む末梢血単核球を採取する工程とすることがきわめて重要である。
【００２０】
上記工程（Ｂ）における標識物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などの蛍光物質、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム誘導体などの化学発光物質、ビオチン、マグネットビーズを挙げることができる。標識物質による標識化は常法で行うことができ、例えばMolecular Cloning, Third Edition,ColdSpring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる。また、工程（Ｂ）におけるヒトＴ細胞を認識しうる抗体としては、ＣＴＬを認識しうる抗ヒトＣＤ８抗体を、Ｔｈ細胞を認識しうる抗ヒトＣＤ４抗体や抗ヒトＣＤ２８抗体をそれぞれ好適に例示することができる。例えば、工程（Ｂ）において、標識物質により標識されたがん特異的抗原ペプチドとして、ＰＥ標識がん特異的抗原ペプチド−ＨＬＡ-Ａ２テトラマーを用い、異なる標識物質により標識されたヒトＴ細胞を認識しうる抗体として、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８抗体を用いる場合など、がん抗原特異的ＴＣＲ産生ＣＴＬの細胞膜結合型ＴＣＲが脱落しない条件で標識化を行うことが好ましい。
【００２１】
これまでの検討でヒト末梢血に含まれるＴ細胞は、全細胞の約２０〜３０％、ＣＤ８が陽性である細胞障害性Ｔ（ＣＴＬ）細胞は、その内の約２０％と考えられ、全細胞の５％しか存在しない。この中でさらにｇｐ１００を認識するＴＣＲをもつＣＴＬ細胞はさらに少数であり（全細胞の０．０１−０．０５％）、通常の方法では検出することが困難と考えられる。しかし、本発明では、前記工程（Ａ）において、がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンにより免疫され、すでに抗体価の増加したがん患者のＴ細胞を用いるため、微少の細胞の検出が可能となる。このように、本発明においては、あらかじめがん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンが投与された患者から得られる末梢血単核球を採取する工程（Ａ）が、きわめて重要である。
【００２２】
上記工程（Ｃ）において、標識物質により二重標識された、がん特異的抗原ペプチドを認識するＴＣＲを細胞膜上に発現するＴ細胞を、１細胞ずつ分取する。Ｔ細胞を１細胞ずつ分取するには、使用した標識物質の種類に応じて適切な手法が用いられる。例えば、標識物質として蛍光物質を使用した場合に、その形状的特徴により１細胞を捕捉することが可能な微細孔を複数有する基板を備えたマイクロ流路デバイスを用いることができる（実施例参照）。このマイクロ流路デバイスにより、Ｔ細胞を簡便且つ多数同時に分取することができる。また、該マイクロ流路デバイスを用いることにより、細胞以外の粒子物質などの夾雑物による影響を回避することができ、より高感度な解析・同定法を提供することができる。このマイクロ流路デバイスにおいては、上記基板に設けられた各微細孔にＴ細胞がそれぞれ捕捉される。
【００２３】
上記基板としては、例えば、本発明者が既に開発した微生物分離装置（特開２００７−８９５６６号公報参照）の構成要素として用いたマイクロチップを、本発明における細胞分離用として利用することが可能である。
ここで、上記微細孔の孔径は、分取すべき細胞の大きさに応じて適宜選定されればよく、効率良く捕捉するために、開口部の直径は１〜３μが好ましい。
該微細孔に目的の細胞を捕捉させるための手段としては、例えば上記特開２００７−８９５６６号公報に開示される試料水吸引手段等を、本発明における細胞捕捉用として利用することが可能である。
また、上記基板の材質は、ｂＰＥＴ(black polyethylene terephthalate)で、上記微細孔の加工方法としては、微生物分離装置用マイクロチップにおいて使用した方法がいずれも適用可能である。ｂＰＥＴは自家蛍光が少ないことから、細胞の蛍光観察時におけるバックグラウンドが少なく、細胞を鮮明に観察することができる点で他の材料より優れている。また、上記加工方法によってｂＰＥＴ基板に形成された微細孔の孔径、形状は、例えばステンレス基板を含む金属基板材料よりも均一であり、その結果、効率的な細胞の補足が行える。
【００２４】
更に、該基板は、細胞の損傷を少なくする目的で（細胞ローディングを容易にするために）、例えば10％Pluronic F-127（Invitrogen社）等の界面活性剤等により表面処理を施すこともできる。
また、標識物質として蛍光物質を使用した場合に、蛍光を指標としたフローサイトメトリー（シングルセルソーター）によって、１細胞ずつ分取することもできる。フローサイトメトリーによれば効率的かつ高精度の細胞分離が可能となる。また、標識物質としてビオチンを採用した場合においてもアビジンとの結合反応を利用して１細胞ずつ分取することができる。マグネットビーズを採用した場合にも同様に、磁石を用いた良好な分離が可能である。さらに、マイクロマニピュレーターを用いて１細胞ずつ分取することもできる。
【００２５】
上記工程（Ｄ）においては、１細胞ずつ分取した１個のがん抗原特異的ＴＣＲ産生ＣＴＬから、全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法（例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.参照）に従って実施することができる。
【００２６】
上記工程（Ｅ）においては、合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒトＴ細胞抗原レセプター遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒトＴ細胞抗原レセプター遺伝子断片を増幅する。ヒトＴ細胞抗原レセプター遺伝子に特異的なプライマー対としては、ヒトＴ細胞抗原レセプターのα鎖遺伝子、β鎖遺伝子、γ鎖遺伝子又はδ鎖遺伝子の各配列に特異的なプライマー対であれば特に制限されないが、例えば、ヒトＴ細胞抗原レセプターβ鎖遺伝子に特異的なプライマー対としては、配列番号２に示されるＶ領域の配列と、配列番号３に示されるＣ領域の配列とからなるプライマー対を挙げることができる（図５参照）。増幅された遺伝子断片の塩基配列が、上記工程（Ｆ）において常法により解析・決定される。
【００２７】
上記工程（Ｅ）で増幅された遺伝子断片を用いて、１個のＴ細胞由来の抗原レセプター遺伝子を調製することができる。例えば、ヒトＴＣＲα鎖遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒトＴＣＲα鎖遺伝子を調製することができ、ヒトＴＣＲβ鎖遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒトＴＣＲβ鎖遺伝子を調製することができる。また、ヒトＴＣＲγ鎖遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒトＴＣＲγ鎖遺伝子を調製することができ、ヒトＴＣＲδ鎖遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒトＴＣＲδ鎖遺伝子を調製することができる。これら調製されたヒトＴＣＲ遺伝子をサブクローニングして増幅させることもできる。なお、ゲノムＤＮＡを鋳型にする場合、エクソンが離れているため効果的な増幅が期待できない。
【００２８】
上記工程（Ｇ）において、工程（Ｅ）において増幅された遺伝子断片である、ヒトＴＣＲα鎖遺伝子，ヒトＴＣＲβ鎖遺伝子，ヒトＴＣＲγ鎖遺伝子又はヒトＴＣＲδ鎖遺伝子を、発現ベクターを用いて発現させ、１個のヒトＴ細胞に由来する抗原レセプターを発現する形質転換ヒトＴ細胞を製造することができる。発現ベクターとしては、ＴＣＲ遺伝子の発現に適したものであれば特に制限されないが、動物細胞において発現しうるものが好ましい。本発明の組換えベクターは、ＴＣＲ遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、ＴＣＲ遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列の他、選択マーカー遺伝子を導入しておくこともできる。発現ベクターへのＴＣＲ抗体遺伝子の導入は、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照できる)により行うことができる。
【００２９】
上記動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ｐＣＲ２．１−ＴＡ（Invitrogen社製）、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307, 1987）、ｐＡＧＥ２１０等のプラスミドベクターや、非分列細胞を含む全ての細胞（血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）の他、ＳＶ４０ウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター等のウイルスベクターを例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。
【００３０】
上記ヒトＴＣＲα鎖遺伝子とヒトＴＣＲβ鎖遺伝子、又はヒトＴＣＲγ鎖遺伝子とヒトＴＣＲδ鎖遺伝子は、通常、それぞれ別の発現ベクターに挿入され、これら２つの組換えベクターで宿主となるナイーブＴ細胞を共形質転換し、同一細胞内でＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖、又はＴＣＲγ鎖とＴＣＲδ鎖を発現させることが好ましい。組換えベクターによりナイーブＴ細胞を形質転換する方法としては、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等を例示することができる。このようにして、１個のヒトＴ細胞に由来する抗原レセプターを発現する形質転換ヒトＴ細胞を製造することができる。
【００３１】
上記本発明の組換えベクターがインビトロで導入されたナイーブＴ細胞は、養子免疫療法等を適用しうる疾患（組換えベクターに組み込まれたＴＣＲβ鎖遺伝子にコードされるＴＣＲβ鎖タンパク質が特異性を示す抗原ペプチドを特異的に発現する疾患）に対する治療用組成物として有用である。特に、前記組換えベクターに組み込まれた本発明のＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列が、配列番号４で表される塩基配列（ｇｐ１００ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号５及び６で表される塩基配列（ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号７で表される塩基配列（ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号８で表される塩基配列（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）からなる場合は、ナイーブＴ細胞は、養子免疫療法等に好適に用いることができるメラノーマ治療用組成物として有用であり、該組換えベクターに組み込まれた本発明のＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列が、配列番号９〜１１（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号１２で表される塩基配列（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）からなる場合は、ナイーブＴ細胞は、養子免疫療法等に好適に用いることができるＣＭＶ感染症治療用組成物として有用である。
【００３２】
養子免疫療法等免疫治療剤に用いる場合は、形質転換ヒトＴ細胞クローンを精製することが好ましく、その手法としては、リン酸緩衝液等に混合して遠心する方法、分離剤を用いた比重遠心法などを用いることができる。メラノーマやＣＭＶ感染症等の疾患治療用組成物の投与量は、１回あたり形質転換ヒトＴ細胞として１０６〜１０１２個の細胞が好ましい。投与形態としては、注射剤、点滴剤等の液体が好ましく、形質転換ヒトＴ細胞をヒト血清アルブミンが０．０１〜５％となるように添加した生理食塩液に分散した注射剤又は点滴剤がより好ましい。投与方法としては、静脈への点滴又は静脈、動脈、局所等への注射が好ましい。投与する液量は、投与方法、投与する場所等に異なるが、５０〜５００ｃｃとするのが好ましく、この液量に前記の形質転換リンパ球が含まれるようにするのが好ましい。投与頻度は１回／日〜１回／月とするのが好ましく、投与回数は少なくとも１回、好ましくは５回以上とすることができる。
【００３３】
本発明の１個のヒトＴ細胞由来のＴＣＲ遺伝子の解析・同定方法によって、がん患者のがん特異的ＴＣＲの遺伝子を解析・同定することにより、患者個人の体内で産生されているがん抗原特異的ＴＣＲの種類の全体像に関する情報を得ることができる。また、本発明の１個のヒトＴ細胞に由来する抗原レセプターを発現しうる組換えベクターの調製方法を利用して、上記のようにがん抗原特異的ＴＣＲを膜表面に発現する形質転換ヒトＴ細胞を大量に得ることができ、テイラーメイド的な患者個人の診断や治療が可能となる。
【００３４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
［末梢血単核球の採取］
メラノーマ細胞特異的抗原ペプチドｇｐ１００を用いたワクチン治療を受けた転移性メラノーマ患者から末梢血単核球を採取した。転移性メラノーマ患者に、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ｇｐ１００２０９−２１７ペプチドにより処理された樹状細胞ワクチンを４回投与し、免疫応答反応を確認した。ｇｐ１００２０９−２１７ペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に示す。この患者由来の末梢血から、末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell; ＰＢＭＣ）を採取し、以下の実験に用いた。
【実施例２】
【００３６】
［ｇｐ１００−Ａ２テトラマー染色結果］
樹状細胞ワクチン投与を受けたＨＬＡ−Ａ２陽性の患者由来の末梢血単核球を、ｇｐ１００２０９−２１７ペプチドにて処理した樹状細胞及びＴ２−Ａ２細胞（Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子を導入し発現させたもの）を用いて４回刺激を行った。Ｔ２−Ａ２細胞は、ＡＴＣＣ（cat.CRL-1992）から入手した。その後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８＋抗体及びＰＥ標識ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマーにより染色を行った。ＰＥ標識ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマー（ベックマンコールター社製）は医学生物研究所（ＭＢＬ）から入手した。結果を図１に示す。その結果、ＣＤ８＋／ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマー＋の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）細胞は、全体の４４．３％まで増幅を認めた。これに対して、対照のＣＤ８＋／Ｆｌｕ−ＭＰ−Ａ２テトラマー陽性細胞は、０．０４％であった。
【実施例３】
【００３７】
［ＴＣＲ抗体レパトワスクリーニング結果］
Ex vivoにて増幅されたｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマー陽性ＣＴＬ細胞のＴＣＲレパトワの使用頻度をＴＣＲに対するモノクローナル抗体パネルを用いて解析した。結果を表１に示す。この結果ＴＣＲＶβ１２（IMGTによる新しい TRBV の名称）（Wei* らによる旧名称；ＴＣＲＶβ８）に対する抗体で染色される細胞の有意な増加（３６．６％）が認められた。（*参考文献：Immunogenetics 40:27-36, 1994）
【００３８】
【表１】
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【実施例４】
【００３９】
［マイクロ流路デバイスの構築］
マイクロ流路（深さ；１ｍｍ，幅；１ｍｍ）作製のための鋳型を、ＣＡＤ−ＣＡＭＭ(computer-aided design-computer aided modeling machineシステム；ＰＮＣ−３００，ローランド株式会社製)を用いて、厚さ３ｍｍのＰＭＭＡ(polymethylmethacrylate) の基板を切削することにより作製した。この鋳型を超音波洗浄した後に乾燥させ、ＰＤＭＳ(poly-dimethylsiloxisane、シルガード１８４；ダウコーニング社製) を主剤と硬化剤を１０：１で混合し、鋳型に注入後、減圧下において脱気した。また、基板と接着するＰＤＭＳ部位は主剤と硬化剤を５０：１で配合したものを使用した。このＰＤＭＳを８５℃で２０分間以上加熱することにより硬化させた。これらの表面に２０秒間プラズマ処理を行い、プラズマ処理後すぐに張り合わせることでＰＤＭＳを接着した。また、流路の入口と出口にはシリコンチューブ（内径１ｍｍ×外径３ｍｍ）を接続した。基板を加工するための基板として厚さ３８μｍの黒色のｂＰＥＴ(black polyethylene terephthalate) 基板を使用した。各微細孔は反すり鉢状をしており、孔径が小さい側の直径が２μｍになるように設計した。さらにこれらの中心間距離を６０μｍとして、２５×５０の合計１２５０孔をアレイ状に配した。この設計を基にクロムを蒸着したガラス基板によりフォトマスクを作製した。このマスクを用いて、エキシマレーザー微細加工機 (Optec Micro-Master System，Optec社) により波長２４８ｎｍ、周波数１５０Ｈｚのレーザーを用いて、ｂＰＥＴ基板に貫通孔を加工した。このｂＰＥＴ基板を直径１０ｍｍの貫通孔をあけたスライドガラスにエポキシ接着剤を用いて接着した。最終的に、ＰＤＭＳによりｂＰＥＴ基板を挟み込み、マイクロ流路デバイスの構築を行った。
【実施例５】
【００４０】
［ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体＋／ＰＥ標識ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマー＋ＣＴＬ細胞の染色およびソーティング結果］
ＰＥ標識ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマーを用いたＭＡＣＳソーティング後のＣＴＬ細胞（純度９９．８％）は、ほとんどがＴＣＲＶβ１２レパトワを認識するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）により陽性に染色された。結果を図２に示す。このためＰＣＲ増幅用のプライマーとして、ＴＣＲＶβ１２を特異的に認識する配列を使用した。また、図３に示すように、ＣＤ８＋／ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマー陽性のＣＴＬ細胞を、セルソーターにより選別し、２５個のマイクロウェルを持った基板上に１個の細胞ごとに採取した。
【実施例６】
【００４１】
［ｂＰＥＴ基板上での二重染色ＣＴＬ細胞の蛍光顕微鏡による確認］
マイクロ流路デバイスを用いた二重染色ＣＴＬ細胞の個別分離は下記の要領で行った。はじめに、上述のデバイス流路表面にプラズマ処理を２０秒間施し、流路内に１０％pluronic Ｆ−１２７を導入して２時間インキュベーションすることで、流路への非特異吸着を抑制するための表面処理をした。次に、ＣＴＬマーカーであるＣＤ８と、ｇｐ１００ペプチドへの抗原レセプターとをともに発現している細胞のみを単離する目的で、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体＋／ＰＥ標識ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２−テトラマーで二重染色したＣＴＬ細胞懸濁液を流路に導入し、２．０ｋＰａで減圧吸引を行うことで、細胞をｂＰＥＴ基板上へトラップした。蛍光顕微鏡（ＢＸ−５１；Olympus社製) を用いて、ｂＰＥＴ基板上の細胞を観察した。得られた画像をマージさせることで、ＦＩＴＣおよびＰＥの両方に染色されたＣＴＬを確認した。結果を図４に示す。
【実施例７】
【００４２】
［１個のＣＴＬ細胞からのｍＲＮＡ抽出］
ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体／ＰＥ標識ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマーにより二重染色された（マージ画像にて黄色に見える細胞）細胞を採取した。ｂＰＥＴ基板上にトラップした細胞をセルトラムｖａｒｉｏ（eppendorf 社）の先端にトランスファーチップ（内径；２０μｍ）を接続したマイクロマイピュレーターを用いて１細胞ごとに分取し、細胞はミニトレイ (Nalge NuncInternational社製)に回収し、顕微鏡観察により、細胞が１個存在することを確認した。各ウェル中にLysis bufferを加え、ピペッティングすることで細胞を溶解した。その後、μＭＡＣＳｍＲＮＡ Isolation Kit (Miltenyi Biotec社製) を用いてｍＲＮＡの抽出を行った。抽出操作は、標準プロトコールに従って行った。また、この他に希釈により調整した１０細胞，１０００細胞からも同様にｍＲＮＡの抽出を行った。
【実施例８】
【００４３】
［がん抗原特異的ＴＣＲをターゲットとしたＲＴ−ＰＣＲ反応］
１細胞，１０細胞，１０００細胞からそれぞれ抽出したｍＲＮＡを用いて、ガン抗原特異的レセプター遺伝子（約９５０ｂｐ）をターゲットとしたＲＴ−ＰＣＲを行った。使用したＰＣＲプライマーは、配列番号２に示されるＴＣＲβ鎖Ｖ領域に特異的な配列ＴＲＢＶ１２ｂ（ＴＣＲＶ・８に対するＭｏＡｂにより認識される）及び配列番号３に示されるＴＣＲβ鎖Ｃ領域に特異的な配列ＴＲＢＣ２を使用した（図５）。５０℃で３０分、９９℃で５分、５℃で５分でのＲＴ反応の後、９４℃で２分と９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分を５５サイクルのＰＣＲ反応により増幅を行った。また、同様に、ヒトＧＡＰＤＨ（２２６ｂｐ）を９４℃で２分と９４℃で３０秒，６０℃で３０秒，７２℃で３０秒を４０サイクルのＰＣＲ反応により増幅した。その後、アガロースゲル電気泳動を行うことで１個のＴ細胞からのｍＲＮＡ抽出及びＰＣＲ増幅の評価を行った。
【実施例９】
【００４４】
［ＰＣＲ産物の抽出・精製］
得られたＰＣＲ反応液を、１．５％のアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチヂウムブロマイド染色によりバンドを確認した。図６に示すように、１細胞の５サンプルのうち２サンプルにおいて、ターゲットとした９５０ｂｐのがん抗原特異的レセプター遺伝子断片の増幅が確認された。ＰＣＲ反応物は、シリカゲル粒子（QIAEX II(R) Gel Extraction Kit；QIAGEN社製）及びＤＮＡ抽出用カラム（MinEluteTM Reaction Cleanup Kit；QIAGE社製）を用いてゲルから抽出・精製した。
【００４５】
まず、増幅バンド部分のゲルを切り出し、１．５ｍＬサンプルチューブに移し、切り出したゲルを秤量した。１ｍｇ＝１μＬと換算し、３倍量のバッファーＱＸ１（QIAEX IITM Gel Extraction Kit；QIAGE社製）及び１７．２μＬのＱＩＡＥＸIIＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（QIAEX IITM Gel Extraction Kit；QIAGEN社製）を加えた。Vortexにてよく混和してから、予め５０℃に設定しておいたヒートブロック上に置き、２分ごとにVortexにかけ、合計１０分間処理した。次いで、室温中１００００×ｇで１分間遠心を行い、上清を取り除いた。再度、沈殿に５００μＬのバッファーＱＸ１を加えた後、vortexにて混和し、室温中１００００×ｇで１分間遠心を行った。上清を取り除き、予めエタノールを加えておいた５００μＬのバッファーＰＥ（QIAEX IITM Gel Extraction Kit；QIAGE社製）を沈殿に加えてからvortexにて混和し、室温中１００００×ｇで１分間遠心後、上清を取り除いた。再度、５００μＬのバッファーＰＥを沈殿に加えてからvortexにて混和し、室温中１００００×ｇで１分間遠心を行い、上清を取り除いた。サンプルチューブをクリーンベンチ内で蓋を開けたまま１５分間置き、沈殿を乾燥させた。沈殿に２０μＬのバッファーＥＢ（MinEluteTM Reaction Cleanup Kit；QIAGEN社製）を加えてvortexにて混和し、室温に５分間置いた。室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、上清を別の１．５ｍＬサンプルチューブに回収し、沈殿に再び２０μＬのバッファーＥＢを加えた。Vortexにて混和した後、室温に５分間置き、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、先に回収した上清に加えた。
【００４６】
計４０μＬの回収液に対して、３００μＬのバッファーＥＲＣ（MinEluteTM Reaction Cleanup Kit；QIAGE社製）を加え、vortexにて混和した。混和溶液が黄色であることを確認し、２ｍＬcollection tube（MinEluteTM Reaction Cleanup Kit；QIAGEN社製） にセットしたMinElute column（MinEluteTM Reaction Cleanup Kit；QIAGEN社製）の中に全量をアプライし、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行った。流出液を廃棄してから、カラムを再びcollection tubeに戻し、予めエタノールを加えておいた７５０μＬのバッファーＰＥ（MinEluteTM Reaction Cleanup Kit；QIAGEN社製）を加え、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行った。流出液を廃棄してから、カラムを再度collection tubeに戻し、室温・２２０００×ｇで１分間遠心を行った。カラムの淵についている液滴をマイクロピペットで取り除き、カラムを新しい１．５ｍＬサンプルチューブにセットした。１０μＬのバッファーＥＢ（MinEluteTM Reaction Cleanup Kit；QIAGEN社製）を加え、室温で１分間静置した後、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、精製されたＤＮＡ断片を回収した。
【実施例１０】
【００４７】
［pCR2.1-TA プラスミドベクターへの挿入］
実施例９で得られたＰＣＲ断片を、pCR2.1-TA プラスミドベクターに挿入することによりプラスミドＤＮＡを作製した。４μＬのＤＮＡ断片、１μＬのSalt Solution（TOPO TA Cloning(R) Kit pCR2.1TOPO Vector；Invitrogen社製）及び１μＬのＴＯＰＯ(R)Ｖｅｃｔｏｒ（TOPO TA Cloning(R) Kit pCR2.1 TOPOVector；Invitrogen社製）を氷上で混和した。室温で５分間反応させた後、再び氷上に戻しTransformationに使用した。
【実施例１１】
【００４８】
［DH5αコンピテントセルへのプラスミドＤＮＡの導入］
DH5αコンピテントセル（Competent high DH5α；TOYOBO社製）を氷上で融解し、２０μＬずつ別のサンプルチューブに分注した。実施例１０で調製した反応液を２μＬずつ加え、チップの先で穏やかに混和した。氷上に３０分間置いた後、ヒートブロックを用いて４２℃で３０秒間処理をした。再び、氷上に２分間置き冷却した後、２５０μＬのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間振盪培養を行った。振盪培養を行っている間に、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ固形培地に０．１Ｍ ＩＰＴＧ（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；SIGMA社製）及び０．１Ｍ Ｘ−Ｇａｌ（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside；SIGMA社製）を５０μＬずつ塗付した。作製した固形培地に培養したサンプル１００μＬを播き、３７℃で一晩培養した。
【実施例１２】
【００４９】
［青白選択及びコロニーＰＣＲ法によるスクリーニング］
実施例１１で作製したプレートにコロニーが出現していることを確認した後、４℃に５時間静置した。白いコロニーをマークしてからチップの先を使って軽くつつき、５０μＬの滅菌水の入った９６ウェルプレートに入れて軽くゆすいだ。サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間処理をした後に、軽く遠心を行い、２μＬを新しいプレートのウェルに入れた。続いて、１μＬの１０ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒII（Ｍｇ＋）、０．８μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、６．１１μＬのｄＨ２Ｏ、０．０５μＬのＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（TaKaRa LA-Taq(R) Hot Start version；タカラバイオ社製）、０．０２μＬの１００μＭ  Ｍ１３  フォワードプライマー、及び０．０２μＬの１００μＭ  Ｍ１３  リバースプライマーを加え、プレートを軽く遠心した。サーマルサイクラーGeneAmp(R) PCR System9700を用いて、９４℃で１分間の熱変性の後、９４℃で１０秒、５０℃で１０秒、及び６８℃で２分間の反応を３５サイクル繰り返す反応条件でのＰＣＲ反応を行った。１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動により、各ＰＣＲ反応液のＰＣＲ産物の大きさを確認し、１．０ｋｂの大きさのバンドが確認されたクローンを選択した。
【実施例１３】
【００５０】
［ポジティブクローンの液体培養とプラスミドＤＮＡの抽出］
実施例１２により、ベクターへのＰＣＲ増幅断片の挿入が確認されたコロニーを選び、３．５ｍＬの５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地中で、３７℃で一晩振盪培養を行った。培養したサンプル１．８ｍＬを２ｍＬサンプルチューブに入れ、１０００×ｇで１０分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿に対して２５０μＬのバッファーＡ１（NucleoSpin(R) Multi-8 Plasmid；MACHEREY-NAGEL社製）を加えvortexして混和した。続いて、２５０μＬのバッファー Ａ２を加え転倒混和してから室温で５分間置き、細胞を溶解させた。３５０μＬのバッファー Ａ３を加え転倒混和し、４℃下１４０００×ｇで１０分間遠心をした。上清をNucleoVac vacuum manifoldにセットしたNucleoSipn(R) Plasmid Binding Stripsに移した。４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液をsilica membraneを透過させ、ＤＮＡを結合させた。６００ｍＬのバッファーＡＷを加え４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させた後、９００ｍＬのバッファーＡ４を加えて、４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させ、silica membraneを洗浄した。再度、９００ｍＬのバッファーＡ４を加えて、４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させ、silica membraneを洗浄した。６００ｍｂａｒで１５分間吸引し、silica membraneを乾燥させた。NucleoVac vacuum manifoldに回収用のNucleoSipn(R) MN Tube Stripsを付け替え、membraneに１２０μＬのバッファーＡＥを加え１分間置き、４００ｍｂａｒで１分間吸引してプラスミドＤＮＡを回収した。回収したプラスミドＤＮＡ液３μＬに、１μＬの１０×Ｈ バッファー、５μＬのｄＨ２Ｏ、及び１μＬのＥｃｏＲＩ（TOYOBO社製）加え、３７℃で１時間処理した。１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動により、酵素反応液中のＤＮＡ消化断片を確認し、各プラスミドサンプルについて吸光度を測定してＤＮＡ濃度を算出し、１００μｇ／μＬのプラスミドＤＮＡ希釈液を調製した。
【実施例１４】
【００５１】
［Cycle Sequencing法による塩基配列の決定］
氷上に置いた９６ウェルプレートに実施例１３で調製したＤＮＡ希釈液を１クローンにつき２ウェルずつ、それぞれ６μＬずつ加えた。続いて、各ウェルに、３μＬの５×Sequencing Buffer （BigDye(R)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit；Applied Biosystems社製）、２μＬのCycle Sequencing Mix （BigDye(R)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit；Applied Biosystems社製）、８μＬのｄＨ２Ｏ、１μＬの３．２μＭ プライマーを加え、軽く遠心した。
【００５２】
各クローンは、Ｍ１３ リバースプライマー及びＭ１３ フォワードプライマーの２つのプライマーを用いてそれぞれサイクルシークエンシング反応を行った。サーマルサイクラーGeneAmp(R) PCR System9700を用いて、９４℃で１分間の熱変性の後、９４℃で１０秒、５０℃で５秒、及び６８℃で４分間の反応を２５サイクル繰り返す反応条件でのサイクルシークエンシング反応を行った。反応が終わるまでに、MultiScreenTMHV-plate（MultiScreen(R) HV-plate；MILLIPORE社製）のウェルにSephadex G-50（SephadexTMG-50 Superfine；GE Healthcare社製）、及び滅菌水３００μＬを加え、室温で２時間静置した。十分に水和させた後、室温中１１００×ｇで５分間遠心して、流出液を廃棄した。MultiscreenTMHV-plateに新しい９６ウェルプレート（ASSAY PLATE 96 well round bottom；IWAKI社製）を付け替え、反応液全量を各ウェルにアプライし、室温中１１００×ｇで５分間遠心してサンプルを回収した。
【００５３】
精製されたサンプルを全量シークエンサー用の９６ウェルプレート（MicroAmp(R) Optical 96- well Reaction Plate；Applied Biosystems社製）に移し、さらに元のウェルに滅菌水１７．２μＬを加え、ウェルを洗いながら全量を同一のサンプルに加えた。x3130/Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）を用いて、各サンプルに付いて８クローンずつ配列を読み、得られた配列のMultiple alignment解析を行った。クローン間で差があった塩基については、その塩基を有するクローンが多いほうを正しい配列であるとし、各サンプルの塩基配列を決定した。
【００５４】
泳動ゲルから増幅されたＴＣＲ遺伝子のバンドを切り出し、上記のように最終的なＤＮＡ配列データを得た。今回２種類のバンドからクローニングに成功した４クローン（ＴＲＢ１−１，３−１，５−１，６−１）のＴＣＲβ鎖の遺伝子配列は、すでにｂｕｌｋのＣＤ８＋／ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマー陽性ＣＴＬ細胞から得られている遺伝子配列（Ｍ８−ｇｐ１００）と完全に一致を認めた。２クローン（ＴＲＢ５−１，６−１）のＴＣＲβ鎖の遺伝子配列データ（配列番号４）をＭ８−ｇｐ１００のＴＣＲβ鎖の遺伝子配列データ（配列番号４）と並べて図７に、Ｍ８−ｇｐ１００のＴＣＲβ鎖の遺伝子配列データ（配列番号４）を図８に示す。  
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】樹状細胞ワクチン投与を受けたＨＬＡ−Ａ２陽性の患者由来の末梢血単核球を、ｇｐ１００２０９−２１７ペプチドにて処理した樹状細胞及びＴ２−Ａ２細胞（Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子を導入し発現させたもの）を用いて４回刺激を行った後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８＋抗体及びＰＥ標識ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマーにより染色を行った結果を示す図である。
【図２】ＰＥ標識ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマーを用いたＭＡＣＳソーティング後のＣＴＬ細胞を、ＴＣＲＶβ１２レパトワを認識するモノクローナル抗体で染色した結果を示す図である。
【図３】ＣＤ８＋／ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマー陽性のＣＴＬのソーティングプロフィールを示す図である。
【図４】ｂPET基板上に捕獲されたＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体＋／ＰＥ標識ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２−テトラマーでＣＴＬ細胞を染色した結果を示す図である。
【図５】ＲＴ−ＰＣＲに用いた、ＴＣＲβ鎖Ｖ領域に特異的なプライマー配列ＴＲＢＶ１２ｂ及びＴＣＲβ鎖Ｃ領域に特異的なプライマー配列ＴＲＢＣ２を示す図である。
【図６】ＴＣＲβ鎖Ｖ領域に特異的なＰＣＲプライマーを用いた、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ｇｐ１００２０９−２１７ペプチド特異的ＣＴＬ細胞のＴＣＲβ鎖遺伝子の増幅結果を示す図である。
【図７】１個のＣＴＬから得られたＴＣＲβ鎖の遺伝子配列データ（ＴＲＢ５−１，６−１）と、ｂｕｌｋのＣＤ８＋／ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマー陽性ＣＴＬ細胞から得られている遺伝子配列データ（Ｍ８−ｇｐ１００）が完全に一致することを示す図である。
【図８】ｂｕｌｋのＣＤ８＋／ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２テトラマー陽性ＣＴＬ細胞から得られている遺伝子配列データ（Ｍ８−ｇｐ１００）のＶ領域，Ｄ領域，Ｊ領域及びＣを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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