(57)【要約】【課題】子宮内膜症を、高い特異性でもって早期に発見したりあるいは決定するといった診断のための手法を開発することが必要である。腹腔鏡を用いる手術といった侵襲的な手法でなく、血清などの血液検体を使用しても、子宮内膜症を的確に診断できる方法が求められている。また、子宮癌などの癌疾患と子宮内膜症とを十分に区別して診断できる技術の開発は急務である。【解決手段】子宮内膜症を同定することが可能であるバイオマーカーを発見することに成功した。単一のバイオマーカー又はバイオマーカーの組合せを利用し、子宮内膜症の診断および手術後の微小転移性病態のモニタリング技術、それに用いる試薬などを開発できる。血清サンプルや腹水サンプル用子宮内膜症を示す少なくとも一つのバイオマーカーの存在を検出するための診断アッセイおよびキットも提供できる。【選択図】図２
2009168646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデルであり、該モデルは、対象の血清サンプルをSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が約5830のピークと分子量(m/z値)が約8865のピークとの二つのピークからなるもので、該モデルでもっての、対象の血清サンプルについての非子宮内膜症と子宮内膜症との識別診断において、少なくとも80％以上の感度および少なくとも80％以上の特異性を与えることを特徴とする子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデル。
【請求項２】
対象の血清サンプルをSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が約5830のピークと分子量(m/z値)が約8865のピークとの二つのピークからなる非子宮内膜症と子宮内膜症との識別モデルを使用して診断し、子宮内膜症診断において少なくとも85％以上の感度および少なくとも85％以上の特異性を与えることを特徴とする子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデル。
【請求項３】
対象の腹水サンプルをSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が約6516のピークと分子量(m/z値)が約9022のピークとの二つのピークからなる非子宮内膜症と子宮内膜症との識別モデルを使用して診断し、子宮内膜症診断において少なくとも80％以上の感度および少なくとも80％以上の特異性を与えることを特徴とする子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデル。
【請求項４】
非子宮内膜症と子宮内膜症との間及び／又は子宮内膜症手術の前後において有意に値が異なるバイオマーカーであり、SELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、子宮内膜症診断において単一で少なくとも80％以上の感度および少なくとも80％以上の特異性を与え且つ非子宮内膜症と子宮内膜症との識別及び／又は子宮内膜症手術の治療効果の判断に有用なバイオマーカー。
【請求項５】
子宮内膜症診断において単一で少なくとも85％以上の感度および少なくとも85％以上の特異性を与える請求項４に記載のバイオマーカー。
【請求項６】
SELDI-TOF-MS測定時の分子量(m/z値)が、約5830である請求項４又は５に記載のバイオマ
ーカー。
【請求項７】
SELDI-TOF-MS測定時の分子量(m/z値)が、約8865である請求項４又は５に記載のバイオマ
ーカー。
【請求項８】
(a)対象からサンプルを得る工程、(b)質量分析によりサンプル中のタンパク質を分析する工程、(c) サンプルの質量スペクトルプロファイルを測定する工程を含んでおり、請求項１〜３のいずれか一に記載のバイオマーカーモデルを使用するか、あるいは、請求項４〜７のいずれか一記載のバイオマーカーを子宮内膜症診断の指標とすることを特徴とする対象における子宮内膜症を検出又はモニターする方法。
【請求項９】
(a)子宮内膜症を患っている対象から第１のサンプルを得る工程、(b)質量分析により第１のサンプル中のタンパク質を分析する工程、(c)第１のサンプルの質量スペクトルプロフ
ァイルを測定する工程、(d)対象に薬物を投与するか、あるいは、対象の患部を除去する
などの治療処置を行う工程、(e)工程(d)の完了後、対象から第２のサンプルを得る工程、(f)質量分析により第２のサンプル中のタンパク質を分析する工程、(g)第２のサンプルの質量スペクトルプロファイルを測定する工程、及び(h)第１のサンプルの質量スペクトル
プロファイルを第２のサンプルの質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含んでおり、請求項１〜３のいずれか一に記載のバイオマーカーモデルを使用するか、あるいは、
請求項４〜７のいずれか一記載のバイオマーカーを子宮内膜症診断の指標とすることを特徴とする子宮内膜症の治療における薬物又は治療処置の有効性を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮内膜症に特異的なバイオマーカー及びその利用技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮内膜症は、出産年齢にある女性のおよそ15%に影響を及ぼしている婦人科疾患であ
る〔Sangi-Haghpeykar H, Poindexter A.N. Epidemiology of endometriosis among parous women., Obstet Gynecol 1995; 85: 983-92(非特許文献１)〕。子宮内膜症は、不妊である女性の30%〜40%で観察される。子宮内膜症は、子宮の外側に子宮内膜腺および基質が存在すること及びそれらが増殖することによって定義されるものである。そして、共通する症状としては、月経困難症、性交疼痛症、慢性骨盤痛および不妊である。子宮内膜症の病因は未知であるが、最も一般的な子宮内膜症の開始についての説は、逆行性月経の存在で、それが生存可能な月経の残骸が骨盤臓器および腹膜へ付着し且つ移植されることを可能にしているというものである〔Sampson JA., Peritoneal endometriosis due to the menstrual dissemination of endometrial tissue into the peritoneal cavity., Am J Obstet Gynecol, 1927; 14: 422-5(非特許文献２)〕。
【０００３】
しかしながら、逆行性月経は卵管を持ったすべての女性に生じることが示されており、また、生存可能な子宮内膜細胞は、子宮内膜症を持った女性や子宮内膜症のない女性の両方の腹水において証明されてきている。確かに、逆行性月経は、疾病形成の開始ステップだけであって、細胞のレベルの他の要因と共に疾病進行に導いているもののようである〔Koninckx P.R., Kennedy S, Implantation versus Infiltration: The Samposon versus the Endometriosis Theory., Gynecol. Obstet. Ivest., 1999, 47, 3-10(非特許文献３)〕。また、疾病に対して遺伝学的な感受性があることを示す証拠がある。そして、オーストラリアでの双子の研究で、進行性子宮内膜症の変動の51%が遺伝学的な影響によること
が示唆されている〔Kennedy S.H, Mardon H, Barlow D.H, Familial endometriosis., J Assist. Repord. Gen. 1995, 12, 32-34(非特許文献４); Treloar S.A, O,Connor D.T, O, Connor V. M, Martin N.G., Heritability and molecular genetic studies of endometriosis., Fertil. Steril. 1999,71,701-710(非特許文献５)〕。
【０００４】
ダイオキシンのような環境要因に曝されると、子宮内膜症になる傾向がある。また、子宮内膜症は自己免疫疾患であるという幾つかの裏付けがある〔Rier S., Foster W.G., Toxicol. Sci., 2002,70,161-170(非特許文献６); Nothnick w.b., High Fecundity rates following in vitro., Fertil. Steril., 2001, 76, 223-231(非特許文献７); Matarese G., De Placido G., Nikas Y., Alviggi C., Trends Mol. Med., 2003,9,223-228(非特許文献８)〕。患者は、しばしば、子宮内膜症であるとの診断がなされる前には多くの年数
の間、疼痛あるいは不妊の症状をかかえるものである〔Dmowski W.P., Lesniewicz R., Rana N., Pepping P., Noursalehi M., Fertil. Steril. 1997, 67, 238-243(非特許文献
９); Hadfield R., Mardon H., Barlow D., Kennedy S., Hum. Reprod. 1996, 11, 878-880(非特許文献１０)〕。
【０００５】
したがって、高い特異性でもっての、子宮内膜症を全面的に早期に発見したりあるいは決定することが必要である。現在のところ、子宮内膜症の診断には手術が必要である。腹腔鏡を用いる手術は、子宮内膜症を評価したり、モニターするためには最も特異的で且つ最も敏感な技術を提供している。しかしながら、微細な子宮内膜症とか目に見えない子宮内膜症では、障害部を視覚化することが出来ないことから、誤診されるかもしれない。加えて、診断のための非侵襲的なテストを開発することによって診断用手術の健康への危険性および社会における金銭的影響力を回避することができるかもしれない。
【０００６】
最近、分析前のサンプル分離および質量分析法(MS)との組合せを劇的に単純化することにより、プロテオミック分析（ゲノムの各遺伝子に対応するすべてのタンパク質についての分析）を促進する新しい戦略が、バイオマーカー発見研究のために導入された〔Fung ET, Wright Jr GL, Dalmasso EA. Proteomic strategies for biomarker identification:
progress and challenges., Curr Opin Mol Ther, 2000; 2: 643-50(非特許文献１１)〕。そのような戦略の一つは、表面増強レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(SELDI-TOF-MS)というものであり、そのSELDI-TOF-MSは、生化学的に別個の蛋白チップアレイ(ProteinChip arrays)に結合させることにより生物検体中の蛋白質を互いに分けるために使
うことができる。
【０００７】
SELDIのプロファイリングは、卵巣癌、乳癌、前立癌腺および肝臓癌をコントロール（
対照検体）から識別する為に使用されて成功している〔Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer., Lancet, 2002; 359: 572-7(非特許文献１２); Rai AJ, Zhang Z, Rosenzweig J, Shih Ie M, Pham T, Fung ET, et al. Proteomic approaches to tumor marker discovery., Arch Pathol Lab Med, 2002; 126: 1518-26(非特許文献１３); Li J, Zhang Z, Rosenzweig J, Wang YY, Chan DW. Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer., Clin Chem, 2002; 48: 1296-304(非特許文献１４); Adam BL, Qu Y, Davis JW, Ward MD,
Clements MA, Cazares LH, et al. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men., Cancer Res, 2002; 62: 3609-14(非特許文献１５); Petricoin III EF, Ornstein DK, Paweletz CP, Ardekani A, Hackett PS, Hitt BA, et al. Serum proteomic patterns for detection of prostate cancer., J Natl Cancer Inst, 2002;94:1576-8(非特許文献１６); Poon TC, Yip TT, Chan AT, Yip C, Yip V, Mok TS, et al. Comprehensive proteomic profiling identifies serum proteomic signatures for detection of hepatocellular carcinoma and its subtypes., Clin Chem, 2003; 49: 752-60(非特許文献１７)〕。
【０００８】
また、尿の膀胱癌のマーカーを発見すること使用されて成功する〔Vlahou A, Schellhammer PF, Mendrinos S, Patel K, Kondylis FI, Gong L, et al. Development of a novel proteomic approach for the detection of transitional cell carcinoma of the bladder in urine., Am J Pathol, 2001; 158: 1491-502(非特許文献１８)〕のと同様に、また膵液の膵臓癌のマーカーを確認することに使用されて成功している〔Rosty C, Christa
L, Kuzdzal S, Baldwin WM, Zahurak ML, Carnot F, et al. Identification of hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatitis associated protein I as a biomarker for pancreatic ductal adenocarcinoma by protein biochip technology., Cancer Res, 2002; 62: 1868-75(非特許文献１９)〕。加えて、非小細胞肺癌組織サンプルで見られたプロテオミクスパターンにより、肺癌患者の生存率を予測することが可能であることが示されている〔Yanagisawa K, Shyr Y, Xu BJ, Massion PP, Larsen PH, White BC, et al. Proteomic patterns of tumour subsets in non-small-cell lung cancer., Lancet, 2003;362: 433-9(非特許文献２０)〕。
【０００９】
現在まで、子宮内膜症に対する非侵襲的な診断的検査法を開発する探究は、ほとんどサイトカインと生長因子の値に集中していた。こうしたことにも拘わらず、子宮内膜症に対する非侵襲的な診断検査の開発にまでには至っていない。
現在、プロテオミック技術（ゲノムの各遺伝子に対応するすべてのタンパク質の構造・機能についての研究）を利用して、その疾病に対する潜在的に可能性を有するバイオマーカーである蛋白質を同定確認しようとする試みが行われている。プロテオミクス技術にお
ける最近の進歩により、複雑な生物の検体から新規バイオマーカーを同定確認することが可能になった。例えば、チヤンHら(Zhang H, et al.)は、二次元電気泳動(2-DE)、ウェスタンブロット法および質量分析法を含めたプロテオミック技術を使用して、子宮内膜症の患者と正常コントロール群との間で発現の異なっている蛋白質をスクリーニングし、同定確認することを行っている〔Zhang H, Niu Y.D, Feng J, et al. "Use of proteomic analysis of endometriosis to identify different protein expression in patients with
endometriosis versus normal controls. " Fertil. Steril. 2006; 86: 274-282(非特
許文献２１)〕。また、リュウら(H Liu, et al.)は、SELDI-TOF-MSを用いた血漿タンパクプロファイリングによる子宮内膜症の検出について検討を行い、子宮内膜症群の血漿に20種の異なる蛋白のピークを認めること、そしてその中で質量電荷比m/z値が、3956.83、11710.70、及び、6,986.45の３つの蛋白ピークを選択し、当該３つの蛋白ピーク（m/z値: 3956.83、11710.70、及び、6,986.45）を使用しての子宮内膜症の検出をし、高い感度（36例中32例; 88.9％）及び高い特異性（32例中28例; 87.5％）が示されること、そして、未知群とされているセットについてこの診断モデルを適用した場合に、同様の感度及び特異性、すなわち、感度87.5％と特異性85.7％が示されたとしている〔Haiyuan Liu et al., "Detection of endometriosis with the use of plasma protein profiling by surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry." Fertil. Steril. 2007; 87: 988-990(非特許文献２２)〕。
【００１０】
【非特許文献１】Sangi-Haghpeykar H, Poindexter A.N. Epidemiology of endometriosis among parous women., Obstet Gynecol 1995; 85: 983-92
【非特許文献２】Sampson JA., Peritoneal endometriosis due to the menstrual dissemination of endometrial tissue into the peritoneal cavity., Am J Obstet Gynecol, 1927; 14: 422-5
【非特許文献３】Koninckx P.R., Kennedy S, Implantation versus Infiltration: The Samposon versus the Endometriosis Theory. Gynecol., Obstet. Ivest., 1999, 47, 3-10
【非特許文献４】Kennedy S.H, Mardon H, Barlow D.H, Familial endometriosis., J Assist. Repord. Gen. 1995, 12, 32-34
【非特許文献５】Treloar S.A, O,Connor D.T, O, Connor V. M, Martin N.G., Heritability and molecular genetic studies of endometriosis., Fertil. Steril. 1999,71,701-710
【非特許文献６】Rier S., Foster W.G., Toxicol. Sci., 2002,70,161-170
【非特許文献７】Nothnick w.b., High Fecundity rates following in vitro., Fertil. Steril., 2001, 76, 223-231
【非特許文献８】Matarese G., De Placido G., Nikas Y., Alviggi C., Trends Mol. Med., 2003,9,223-228
【非特許文献９】Dmowski W.P., Lesniewicz R., Rana N., Pepping P., Noursalehi M., Fertil. Steril. 1997, 67, 238-243
【非特許文献１０】Hadfield R., Mardon H., Barlow D., Kennedy S., Hum. Reprod. 1996, 11, 878-880
【非特許文献１１】Fung ET, Wright Jr GL, Dalmasso EA. Proteomic strategies for biomarker identification: progress and challenges., Curr Opin Mol Ther, 2000; 2: 643-50
【非特許文献１２】Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer., Lancet, 2002; 359: 572-7
【非特許文献１３】Rai AJ, Zhang Z, Rosenzweig J, Shih Ie M, Pham T, Fung ET, et al. Proteomic approaches to tumor marker discovery., Arch Pathol Lab Med, 2002; 126: 1518-26
【非特許文献１４】Li J, Zhang Z, Rosenzweig J, Wang YY, Chan DW. Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer., Clin Chem, 2002; 48: 1296-304
【非特許文献１５】Adam BL, Qu Y, Davis JW, Ward MD, Clements MA, Cazares LH, et al. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men., Cancer Res, 2002; 62: 3609-14
【非特許文献１６】Petricoin III EF, Ornstein DK, Paweletz CP, Ardekani A, Hackett PS, Hitt BA, et al. Serum proteomic patterns for detection of prostate cancer., J Natl Cancer Inst, 2002;94:1576-8
【非特許文献１７】Poon TC, Yip TT, Chan AT, Yip C, Yip V, Mok TS, et al. Comprehensive proteomic profiling identifies serum proteomic signatures for detection of hepatocellular carcinoma and its subtypes., Clin Chem, 2003; 49: 752-60
【非特許文献１８】Vlahou A, Schellhammer PF, Mendrinos S, Patel K, Kondylis FI, Gong L, et al. Development of a novel proteomic approach for the detection of transitional cell carcinoma of the bladder in urine., Am J Pathol, 2001; 158: 1491-502
【非特許文献１９】Rosty C, Christa L, Kuzdzal S, Baldwin WM, Zahurak ML, Carnot F, et al. Identification of hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatitis associated protein I as a biomarker for pancreatic ductal adenocarcinoma by protein biochip technology., Cancer Res, 2002; 62: 1868-75
【非特許文献２０】Yanagisawa K, Shyr Y, Xu BJ, Massion PP, Larsen PH, White BC, et al. Proteomic patterns of tumour subsets in non-small-cell lung cancer., Lancet, 2003;362: 433-9
【非特許文献２１】Zhang H, Niu Y.D, Feng J, et al. "Use of proteomic analysis of endometriosis to identify different protein expression in patients with endometriosis versus normal controls. " Fertil. Steril. 2006; 86: 274-282
【非特許文献２２】Haiyuan Liu et al., "Detection of endometriosis with the use of plasma protein profiling by surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry." Fertil. Steril. 2007; 87: 988-990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
子宮内膜症は、頻度の高い婦人科疾患であり、不妊症や骨盤痛を引き起こす。よって、子宮内膜症を、早期に発見したり、さらには、高い特異性でもって発見したり、あるいは、決定するといった診断のための手法を開発することが必要である。子宮内膜症は、腹腔鏡を用いる手術といった侵襲的な手技により内膜腺組織や間質組織を組織学的に同定することで診断されるが、子宮内膜症を非侵襲的な手法で、かつ、簡単で、例えば、血清などの血液検体を使用しても、子宮内膜症を的確に診断できる方法が求められている。また、子宮癌などの癌疾患と子宮内膜症とを十分に区別して診断できる技術の開発は急務である。現在に至るまで、信頼が置けて、非侵襲的な手法で、簡単であり、免疫学的な検査手法開発への道筋を提供するような子宮内膜症の検出並びにモニタリング手法は開発できていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、子宮内膜症の診断に有効で且つより簡単な測定系の構築を目指して、子宮内膜症に特異的なバイオマーカーにつき鋭意研究を行った。その中で、子宮内膜症用として可能な診断用バイオマーカーを発見し確認するために、表面増強レーザー脱離イオン化/電離飛行時間型質量分析(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry: SELDI-TOF-MS)を使用して、子宮内膜症患者からの血清サンプ
ルおよび子宮内膜症でない者のコントロールを解析した。その結果、子宮内膜症の検知およびモニター用潜在的可能性を有するバイオマーカーを発見することに成功した。
【００１３】
本発明は、対象における子宮内膜症(endometriosis)を診断するための子宮内膜症に特
異的なバイオマーカーを提供する。当該バイオマーカーは、子宮内膜症診断において新規であり、タンパク質と考えられる。該バイオマーカーは、子宮内膜症手術の前後において有意に値が異なる、SELDI-TOF-MSで測定するとき、単一で80％以上の感度、好ましくは単一で85％以上の感度、および80％以上の特異性、好ましくは85％以上の特異性を有する子宮内膜症に特異的なバイオマーカー、例えば、子宮内膜症の患者から得られる子宮内膜症に特異的で、SELDI-TOF-MSで測定する時、質量電荷比(m/z値)、すなわち、分子量が、そ
れぞれ、約5830、約6516、約8865、又は、約9022にピークを有するバイオマーカー、特には、子宮内膜症の患者血清中から得られる子宮内膜症に特異的で、SELDI-TOF-MSで測定する時、質量電荷比(m/z値)、すなわち、分子量が、それぞれ、約5830、又は、約8865にピ
ークを有するバイオマーカー、さらには、子宮内膜症の患者腹水中から得られる子宮内膜症に特異的で、SELDI-TOF-MSで測定する時、質量電荷比(m/z値)、すなわち、分子量が、
それぞれ、約6516、又は、約9022にピークを有する単数又は複数のバイオマーカーである。当該バイオマーカーは、単一のもので子宮内膜症の診断を行い、高い感度及び高い特異性を与えるものであり、さらに僅か二つのバイオマーカーからなる子宮内膜症診断モデルを構築可能であり、当該モデルは非常に高い感度及び高い特異性を与えるものである。
【００１４】
本発明は、対象における子宮内膜症を診断するための方法を提供する。該方法は、(a)
対象からサンプル（試料）を得る工程、(b)質量分析によりサンプル中のタンパク質を分
析する工程、(c) サンプルの質量スペクトルプロファイルを測定する工程を含んでいる。さらに、該方法は、測定サンプルの質量スペクトルプロファイルを陽性標準試料または陰性標準試料の質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含んでいてよい。
本発明はまた、子宮内膜症の治療における薬物又は治療処置の有効性を評価するための方法を提供する。該方法は、(a)子宮内膜症を患っている対象から第１のサンプルを得る
工程、(b)質量分析により第１のサンプル中のタンパク質を分析する工程、(c)第１のサンプルの質量スペクトルプロファイルを測定する工程、(d)対象に薬物を投与するか、ある
いは、対象の患部を除去するなどの治療処置を行う工程、(e)工程(d)の完了後、対象から第２のサンプルを得る工程、(f)質量分析により第２のサンプル中のタンパク質を分析す
る工程、(g)第２のサンプルの質量スペクトルプロファイルを測定する工程、及び(h)第１のサンプルの質量スペクトルプロファイルを第２のサンプルの質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含んでいる。
【００１５】
本発明は、次なる態様を提供している。
〔１〕子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデルであり、該モデルは、対象の血清サンプルをSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が約5830のピーク
と分子量(m/z値)が約8865のピークとの二つのピークからなるもので、該モデルでもって
の、対象の血清サンプルについての非子宮内膜症と子宮内膜症との識別診断において、少なくとも80％以上の感度および少なくとも80％以上の特異性を与えることを特徴とする子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデル。
〔２〕対象の血清サンプルをSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が約5830のピークと分子量(m/z値)が約8865のピークとの二つのピークからなる非子宮内膜症と子宮内膜症との識別モデルを使用して診断し、子宮内膜症診断において少なくとも85％以上の感度および少なくとも85％以上の特異性を与えることを特徴とする子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデル。
〔３〕対象の腹水サンプルをSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が約6516のピークと分子量(m/z値)が約9022のピークとの二つのピークからなる非子宮内膜症と子宮内膜症との識別モデルを使用して診断し、子宮内膜症診断において少なくと
も80％以上の感度および少なくとも80％以上の特異性を与えることを特徴とする子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデル。
〔４〕非子宮内膜症と子宮内膜症との間及び／又は子宮内膜症手術の前後において有意に値が異なるバイオマーカーであり、SELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、子宮内膜症診断において単一で少なくとも80％以上の感度および少なくとも80％以上の特異性を与え且つ非子宮内膜症と子宮内膜症との識別及び／又は子宮内膜症手術の治療効果の判断に有用なバイオマーカー。
〔５〕子宮内膜症診断において単一で少なくとも85％以上の感度および少なくとも85％以上の特異性を与える上記〔４〕に記載のバイオマーカー。
〔６〕SELDI-TOF-MS測定時の分子量(m/z値)が、約5830である上記〔４〕又は〔５〕に
記載のバイオマーカー。
〔７〕SELDI-TOF-MS測定時の分子量(m/z値)が、約8865である上記〔４〕又は〔５〕に
記載のバイオマーカー。
〔８〕(a)対象からサンプルを得る工程、(b)質量分析によりサンプル中のタンパク質を分析する工程、(c) サンプルの質量スペクトルプロファイルを測定する工程を含んでおり、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のバイオマーカーモデルを使用するか、あるいは、上記〔４〕〜〔７〕のいずれか一記載のバイオマーカーを子宮内膜症診断の指標とすることを特徴とする対象における子宮内膜症を検出又はモニターする方法。
〔９〕(a)子宮内膜症を患っている対象から第１のサンプルを得る工程、(b)質量分析により第１のサンプル中のタンパク質を分析する工程、(c)第１のサンプルの質量スペクト
ルプロファイルを測定する工程、(d)対象に薬物を投与するか、あるいは、対象の患部を
除去するなどの治療処置を行う工程、(e)工程(d)の完了後、対象から第２のサンプルを得る工程、(f)質量分析により第２のサンプル中のタンパク質を分析する工程、(g)第２のサンプルの質量スペクトルプロファイルを測定する工程、及び(h)第１のサンプルの質量ス
ペクトルプロファイルを第２のサンプルの質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含んでおり、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のバイオマーカーモデルを使用するか、あるいは、上記〔４〕〜〔７〕のいずれか一記載のバイオマーカーを子宮内膜症診断の指標とすることを特徴とする子宮内膜症の治療における薬物又は治療処置の有効性を評価する方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明で子宮内膜症を検知したり、手術後のモニタリングのための潜在的に可能性を有するバイオマーカーが提供される。特には、子宮内膜症血清および腹水用バイオマーカーとして有用性が高く、高い精度、高い感度、そして高い特異性で子宮内膜症と非子宮内膜症とを識別するものであり、子宮内膜症の診断および手術後の微小転移性病態のモニタリングを容易にする。子宮内膜症を非侵襲的な手法で、かつ、簡単で、例えば、血清などの血液検体を使用しても、子宮内膜症を的確に診断できる方法や技術を提供する。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、プロテオミック解析の手法を利用し、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; SELDI-TOF-MS)により、子宮内膜症の患者から得られた血清中に発見され
た子宮内膜症に特異的なバイオマーカー及び／又は腹水中に発見された子宮内膜症に特異的なバイオマーカーに関する。当該子宮内膜症特異的バイオマーカーは、分子量は、質量電荷比m/z値が約5830である。子宮内膜症の診断には、腹腔鏡手術前グループの血清蛋白
に含まれるm/z比5830のタンパク質は術後グループのそれと比較して有意に高いというこ
とである。術前サンプルの正味のピーク強度は、10,593±5,458であるのに対し、術後サ
ンプルのピーク強度は、1,891±1,019であった（約5.6倍，p<0.001）。この血清蛋白（m/z比:5830）の感度及び特異性は、それぞれ89.65%（26/29）、100%（29/29）であった。またこのピークは健康女性ボランティアでは検出されなかった。当該子宮内膜症特異的バイオマーカーの別のものは、分子量は、質量電荷比m/z値が約8865である。子宮内膜症の診
断には、腹腔鏡手術前グループの血清蛋白に含まれるm/z比8865のタンパク質は術後グル
ープのそれと比較して有意に高いということである。また、当該子宮内膜症特異的バイオマーカーの別のものは、分子量は、質量電荷比m/z値が約6516である。子宮内膜症の診断
には、腹腔鏡手術前グループの腹水蛋白に含まれるm/z比6516のタンパク質は術後グルー
プのそれと比較して有意に高いということである。さらにまた、当該子宮内膜症特異的バイオマーカーの別のものは、分子量は、質量電荷比m/z値が約9022である。子宮内膜症の
診断には、腹腔鏡手術前グループの腹水蛋白に含まれるm/z比9022のタンパク質は術後グ
ループのそれと比較して有意に低いということである。
【００１８】
当技術分野で「プロテオーム」(proteome)とは、ある生物学的な系において存在するタンパク質の総体をいっており、したがって、生体サンプル中に存在する全てのタンパク質およびペプチド配列を一時に採取することを、当技術分野でプロテオームと呼ばれることが多い。生物学的な系とは組織や生物種、細胞の状態などを指す。このように、本発明の方法は、特定のサンプルのプロテオームを分析する手段を提供する。プロテオームを扱う解析をプロテオミクス(proteomics)と言う。
当業者であれば、生体サンプルに存在するタンパク質のプロテオミクス解析とは、サンプル中の全てのペプチド配列の系統的な分離、同定、および特徴付けを含むことを理解するであろう。サンプル中のタンパク質は、当技術分野で公知の任意の適切な方法により分離されることができる。適切な方法としては、例えば、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などが挙げられる。好ましくは、サンプル中のタンパク質は、ゲル電気泳動（例えば、一次元または二次元ゲル電気泳動）を用いて分離される。最も好ましくは、サンプル中のタンパク質は、サンプルを二次元ゲル電気泳動(2DGE)に付すことによって分離されることができる。2DGEは、典型的には、等電点分離法(IEF)を用いた電荷による一次元でのタンパク質の分離を含むものであ
ってよい。電荷で分離して集められたタンパク質は、その後、SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いてサイズにより二次元で分離されることができる（例えば、Lin, D., et al., Large-scale protein identification using mass spectrometry, Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics, 1646, 1-10 (2003)、およびOng, S. E. et al., An
evaluation of the use of two-dimensional gel electrophoresis in proteomics, Biomol. Eng., 18, 195-205 (2001)参照）。
【００１９】
サンプル中のタンパク質の分離に続いて、各々のタンパク質は分離媒体から単離されることができる。タンパク質は、ゲルからタンパク質「スポット」を抽出するなどの、任意の適切な手法を用いて単離されることができる。ゲルからのタンパク質スポットの抽出は、典型的には、ゲルからのスポットの物理的に切除することが挙げられる。
サンプル中のタンパク質は分離せしめられ、その一旦分離せしめられたタンパク質は、本発明の方法で、質量分析により分析される。質量分析において、物質は、分子をフラグメント化するのに充分なエネルギーを有する電子ビームで照射処理される。生じた陽性フラグメント（陽イオンおよびラジカル陽イオン）は、磁場を介して真空で加速され、質量電荷比(m/z)に基づいて選別される。質量分析計において生じるイオンの多くは単位正電
荷を保有するので、値m/zは典型的には、フラグメントの分子量に等しい。任意の適切な
質量分析法が、本発明の方法と一緒に用いられ得る。適切な質量分析法の例には、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析(MALDI)、マトリクス支援レーザー脱離／イオ
ン化飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析、プラズマ脱離／イオン化質量分析(PDI)、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI)、および表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型(SELDI-TOF)質量分析などが挙げられる。質量分析の飛行時間型(TOF)法において、荷電分
子（イオン化された分子）が真空で生じ、イオン光学アセンブリーによって生じた電場により自由飛行チューブにより、又は、ドリフト時間により加速される。分子が加速されるであろう速度は、加速電位の平方根、分子の電荷の平方根に比例し、分子の質量の平方根に反比例する。荷電分子は、TOFチューブの下方に移動し、検出器に至る。さらに、質量
分析法は、例えば、国際特許出願公開第WO 93/24834号パンフレット、米国特許第5,792,664号明細書、米国特許第6,558,902号明細書、米国特許出願公開第2004/0033530Al、及びHillenkamp et al., Matrix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization: A New Approach
to Mass Spectroscopy of Large Biomolecules, Biological Mass Spectroscopy, A.L. Burlingame and J.A. McCloskey, eds., Elsevier Science Publ. (1990)、例えば、同書のpp. 49-60に記載されている。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様においては、サンプル中のタンパク質は、質量分析技術、例えば、SELDI-TOF質量分析により分析される。本発明において使用するための好ましい質
量分析技術は、SELDIに基づく手法で、例えば、米国特許第5,719,060号明細書、米国特許第6,225,047号明細書などに記載されている。サンプル、特には分析対象物（ここでは、
一以上のバイオマーカー）をエネルギー源に提示するという働きをする基板の表面（一般的には、プローブの表面）は、脱離／イオン化過程において能動的な役割を果たしており、そうした過程を表面増強脱離／イオン化過程と呼んでいる。本明細書中、「プローブ」とは、イオン化およびガス相をイオン分光計（例えば、質量分光計）へ導入するためのデバイスであって、プローブ界面と結合するように適合されたデバイス、そして、分析対象物をイオン化のためのエネルギーに提示するために適合されたデバイスをいう。プローブとしては、代表的に、可撓性または剛性の固体基板などが挙げられ、そのものは、分析対象物がイオン化エネルギーに提示されるところのサンプル提示表面を有する。この点で、基板（例えば、プローブ）は、サンプル提示のための単なる受け皿となる台ではない。幾つかのタイプの表面増強基板が、表面増強脱離／イオン化過程で使用されることができる。一実施態様において、当該表面は、所定のクラスの分子に優先的に結合する親和性材料、例えば、陰イオン交換基または親水基（例えば、酸化ケイ素）のような親和性材料を含む。つまり、化学選択性又は化学親和性を有する表面を持ったプローブが使用される。
【００２１】
このような親和性材料としては、吸着性物質（吸着剤）を挙げルことができ、クロマトグラフィーで代表的に使用される物質である「クロマトグラフィー吸着剤」などが包含されてよく、例えば、イオン交換物質、金属キレート剤、固定化金属キレート、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、色素、混合様式吸着剤（例えば、疎水性の誘引／静電反発性吸着剤）など、抗原と抗体間の相互作用、リガンドとレセプｔ−間の相互作用などの生体分子間で見出される親和性相互作用を利用できる物質などが挙げられる。該親和性材料の例としては、られる。例えば、親水性、疎水性、固定化金属キレート（配位共有結合性）、陰イオン性、陽イオン性、あるいは抗体などの生体特異性などを利用する物質などが挙げられる。より具体的には、該親和性材料の例としては、例えば、シラノール(
親水性)、C8またはC16アルキル（疎水性）、固定化金属キレート（配位共有）、陰イオンまたは陽イオン交換体（イオン性）あるいは抗体（生体特異性）などが挙げられる。サンプルは、特定の誘引力の原則に従ってアナライト分子（分析対象分子）に結合するように、担体に結合せしめられた吸着体に接触せしめられる。
【００２２】
分析対象物が生体分子（例えば、タンパク質）の場合、通常、プローブ表面に化学結合されるエネルギー吸収性物質（又は、エネルギー吸収分子）を含んでいるプローブを使用
することが包含される。エネルギー吸収性物質は、レーザー脱離イオン化源からエネルギーを吸収し、その後、この物質（又は、この分子）と接触した分析対象物分子の脱離およびイオン化に寄与することが可能であるものであり、MALDIに使用される場合、しばしば
「マトリックス」と呼ばれる。当該マトリックスとしては、例えば、ケイ皮酸誘導体、シナピン酸(SPA)、シアノ-ヒドロキシ-ケイ皮酸(CHCA)、ジヒドロキシ安息香酸、フェルラ
酸、ヒドロキシアセト-フェノン誘導体などが挙げられる。該エネルギー吸収性物質は、
典型的には、結合せしめられたサンプルと一緒になる。その後、分析対象物を脱離およびイオン化するのにレーザーが用いられ、脱離およびイオン化された生成物を検出器で検出する。SELDI-TOF質量分析について、各タンパク質ピークに対する質量精度は、+/-0.2%あるいはそれ以下にすることができる。SELDI-TOF質量分析システムは、例えば、Ciphergen
Biosystems, Inc.(Fremont, CA)から市販されている。表面増強脱離／イオン化法は、例えば、米国特許第5,719,060号明細書、米国特許第6,294,790号明細書、米国特許第6,406,921号明細書、米国特許第6,675,104号明細書、国際特許出願公開第WO 98/59360号パンフ
レットなどに記載されている。
【００２３】
典型的な態様では、サンプルは、「バイオチップ」を使用して分析される。本用語「バイオチップ」は、吸着性物質（吸着剤、又は、捕捉用試薬）が結合され且つ一般に平面を有する固体基板を指している。しばしば、バイオチップの表面は、複数のアドレス可能な位置を含むものであり、各位置は、そこに結合された捕捉用試薬を有している。バイオチップは、プローブ表面に結合可能なようにされることができ、それにより、質量分光計へ挿入されることができるプローブとして機能することができる。
本発明で使用可能な、バイオマーカーの捕捉のための種々のバイオチップは、Ciphergen Biosystems (Fremont, CA, USA), Packard BioScience Company (Meriden CT, USA), Zyomyx (Hayward, CA, USA)、Phylos (Lexington, MA, USA)などの販売業者から購入可能
である。これらバイオチップの例は、米国特許第6,225,047号明細書、米国特許第6,329,209号明細書、国際特許出願公開第WO 99/51773号パンフレット、国際特許出願公開第WO 00/56934号パンフレットなどに記載されている。
【００２４】
吸着剤などの親和性材料を有する基板は、バイオマーカーが、この吸着剤などの捕捉用試薬の位置する部位に結合するように提示されるに十分な期間、血清、腹水などのサンプルと接触せしめられる。インキュベーション期間後、この基板を、洗浄し、未結合物質を除去する。任意の適切な洗浄溶液が使用され得、好ましくは、水溶液が使用される。
次いでエネルギー吸収性物質が、結合バイオマーカーを伴う基板へ適用される。上記したように、エネルギー吸収性物質は、レーザー脱離イオン化のためのエネルギー源からエネルギーを吸収するものであり、それによって基板からバイオマーカーの脱離を補助する。
基板に結合するバイオマーカーは、質量分光計中で検出される。このバイオマーカーは、レーザーのようなイオン化源によってイオン化され、生じたイオンは、イオン光学アセンブリによって回収され、次いで質量分析器が、通過するイオンを分散せしめて、分析する。次いで検出器は、質量対電荷の割合へと、検出したイオンの情報を翻訳する。バイオマーカーの検出は、代表的に、シグナル強度の検出を含む。従って、バイオマーカーの量(quantity)と質量(mass)の両方が、測定することができる。
【００２５】
質量分析により得られたデータは、プログラム可能なコンピューターの使用により解析されることができる。このコンピュータープログラムは、データを解析し、検出されたマーカーの種別及び／又は数を示し、必要に応じて検出された各バイオマーカーについてのシグナル強度および決定された分子量を示すことができる。データ解析は、バイオマーカーのシグナル強度を決定する工程および予め決定された統計学的分布からはずれるデータを取り除く工程を包含していてよい。例えば、観察されたピークは、ある基準に対する各ピークの高さを計算することによって標準化されることもできる。この基準は、機器およ
び一定尺度に応じてゼロとして設定されたエネルギー吸収性物質のような化学薬品によって生じたバックグラウンドノイズを包含していてよい。
生じたデータを表示のため、種々のフォーマットへ変換するには、コンピューターを使用することができる。有用なフォーマットの一つでは、標準的なスペクトルを表示することが可能である一方で、スペクトル図にあるピークの高さおよび質量の情報のみを、そのままに保持しながら、よりきれいな画像を生成し、より容易に見られるようにして、ほぼ同一の分子量を有するバイオマーカーを使用することを可能にするものであってよい。別の有用なフォーマットでは、二つ以上のスペクトルが比較され、独特のバイオマーカーを都合よく強調し、このバイオマーカーを、サンプル間でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるものであってよい。これらのフォーマットのいずれかを使用して、当業者はサンプル中に特有のバイオマーカーが存在するか否かを容易に決定することができる。
【００２６】
データを解析するために使用されたソフトウェアは、シグナルの解析にアルゴリズムを適用するコードを含み、シグナル中に本発明によるバイオマーカーに対応するピークを示すか否かを決定する。このソフトウェアはまた、観察されたバイオマーカーピークに関するデータを分類樹、又は、ファジィ推論やニューラルネットワークといった計算知能と呼ばれる手法に供し、子宮内膜症の診断を示すバイオマーカーのピークまたはバイオマーカーのピークの組み合わせが存在するか否かを決定することができる。
【００２７】
質量分析解析の出力結果は、サンプル中のタンパク質の質量電荷比(m/z)の関数として
の相対強度のプロットであり、それは「質量スペクトルプロファイル」または「質量スペクトル」と称される。典型的には、タンパク質「ピーク」を示すヒストグラムとして表される質量スペクトルプロファイルは、分子量の確定に役立つもので、そして化合物の構造の解析に利用される。このように、本発明の方法は、サンプルの質量スペクトルプロファイルを測定することを含む。スペクトルにおける最も強いピークは、基準ピークといわれ、そして全ての他のピークは、基準ピークの強度と比較して記録される。ピーク自体は、典型的には、非常に鋭く、そして単に垂直線として表されることが多い。
【００２８】
質量分析の間にサンプル中のタンパク質のフラグメント化により形成されるイオンは、タンパク質分子により形成される最も安定な陽イオンおよびラジカル陽イオンである。スペクトルにおいて観察される最も高い分子量ピークは、典型的には、電子を差し引いた親分子を表し、そして分子イオン(M+)と呼ばれる。また、一般的に、13C、2Hなどの天然同
位体の存在度により、計算された分子量を超えるといった小さなピークも観察される。特に不安定なプロトンを有する多くの分子は、分子イオンを提示しない。例えば、アルコールの質量スペクトル中の最も高い分子量ピークは、分子イオンより１つ少ないm/z(m-1)で生じる。フラグメントは、それらの質量電荷比により同定されることができるが、失った質量によりそれらを同定することがより有益である場合がある。例えば、メチル基の消失はm-15にピークを発生させるであろうし、一方、エチルの消失はm-29にピークを発生させるであろう。
【００２９】
本発明の方法はさらに、サンプルの質量スペクトルプロファイルを陽性標準試料または陰性標準試料の質量スペクトルプロファイルと比較することを含むものであってよい。「標準試料」とは、ある分子（例えば、タンパク質）の同定、定量、および／または特徴付けを可能にするサンプル（試料）を意味するものである。病気を診断する方法に関して、標準試料は、特定の病気または病気の進行の指標である分子を含んでいる場合、それは「陽性」である。また、このような指標分子も「バイオマーカー」といわれ、そして典型的には、タンパク質またはタンパク質フラグメントである。標準試料は、特定の病気または病気の進行の指標である分子を欠損しているか、または対象が特定の病気にはなっていない指標となる分子を含んでいる場合、それは「陰性」である。本発明の方法において、標
準試料は子宮内膜症の陽性または陰性診断を容易にする。標準試料は、本発明の方法に従って、子宮内膜症に対する特定の診断に到達するように、検査対象サンプルと標準試料が有効に比較されることができる限り、任意の陽性標準試料または陰性標準試料であってよい。本発明の好ましい態様において、陽性標準試料は、子宮内膜症を患っている対象（例えば、ヒト）から得られたサンプルを含むものである。一方、陰性標準試料は、好ましくは、子宮内膜症を患っていない対象（例えば、ヒト）から得られたサンプルを含むものであってよい。
【００３０】
標準試料が子宮内膜症を患っている対象、例えば、子宮内膜症患者から得られた陽性標準試料の場合、標準試料の質量スペクトルプロファイルは、臨床医が信頼できる診断をするのを可能とするであろうバイオマーカーを任意の適切な数だけ含んでいることができる。陽性標準試料の質量スペクトルプロファイルは、好ましくは、m/z比: 5,830のタンパク質ピーク、m/z比: 8,865のタンパク質ピーク、m/z比: 6,516のタンパク質ピーク、m/z比:
9,022のタンパク質ピークなどからなる群から選択される１以上のバイオマーカーを含むものが挙げられる。言い換えれば、陽性標準試料の質量スペクトルプロファイルは、好ましくは、5,830ダルトン(Da)タンパク質ピーク、8,865Daタンパク質ピーク、6,516Daタン
パク質ピーク、9,022Daタンパク質ピークなどからなる群から選択される１以上のバイオ
マーカーを含むものである。こうしたバイオマーカーの存在（又は、減少あるいは欠失）は、タンパク質発現レベルにおける異常性（例えば、タンパク質過剰発現の結果としての異常）、タンパク質の異常な分解過程、及び／又は、タンパク質の異常な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、あるいは、酸化など）と関連したものであると考えることもできる。
【００３１】
本発明の方法に従って、目的の対象(例えば、ヒト)から得られたサンプルの質量スペクトルプロファイルが、上記したような陽性標準試料の質量スペクトルプロファイルにおいて観察されるバイオマーカーの１つまたは任意の組合せを含んでいるような場合（あるいはバイオマーカーの１つまたは任意の組合せの減少あるいは欠失がある場合）、子宮内膜症について陽性であるとの診断となる。この点で、子宮内膜症がポジティブであるとの診断は、対象から得られたサンプルの質量スペクトルプロファイルが、１以上、又は、２以上の上記の陰性標準試料と異なるタンパク質ピークを含む場合、あるいは、他のバイオマーカー（例えば、CA125など）についての結果を加えて、上記の陰性標準試料と異なるタ
ンパク質ピークを含む場合（及び／又は、ピークが減少又は欠失している場合）になされることができる。実際、上記タンパク質ピークの任意の一つ又は特定のサブセットは、子宮内膜症に関して診断的意義を有することができる。このようなバイオマーカーの任意の一つ又はサブセットは、好ましくは、m/z比: 5,830のタンパク質ピーク単独、5,830Daタ
ンパク質ピーク単独、m/z比: 8,865のタンパク質ピーク単独、8,865Daタンパク質ピーク
単独、m/z比: 6,516のタンパク質ピーク単独、6,516Daタンパク質ピーク単独、m/z比: 9,022のタンパク質ピーク単独、9,022Daタンパク質ピーク単独、m/z比: 5,830のタンパク質ピークとm/z比: 8,865のタンパク質ピークとの組合せ、5,830Daタンパク質ピークと8,865Daタンパク質ピークの組合せ、m/z比: 6,516のタンパク質ピークとm/z比: 9,022のタンパク質ピークとの組合せ、6,516Daタンパク質ピークと9,022Daタンパク質ピークの組合せ、m/z比: 5,830のタンパク質ピークとCA125の組合せ、m/z比: 8,865のタンパク質ピークとCA125の組合せ、m/z比: 5,830のタンパク質ピークとm/z比: 8,865のタンパク質ピークとCA125との組合を含むものであってよく、そうしたバイオマーカーの任意の一つ又はサブセ
ットは子宮内膜症を診断するばあいに、望ましくは、100%の精度を提供するものであるが、例えば、少なくとも85%の精度を提供するもの、さらには、少なくとも88%（ある場合には、89%）あるいは91%の精度を提供するもの、あるいは、少なくとも93%又は94%の精度を提供するもの、好適には、少なくとも95%の精度を提供するものであってもよい。しかし
ながら、これらのサブセットは、単なる例示にすぎないものであり、ここで同定したバイオマーカーの一つ又は任意の適切なサブセットを子宮内膜症を診断するのに用いることが
できよう。本発明の典型的な態様では、子宮内膜症の患者血清をSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が、それぞれ、約5830のピークと約8865のピークと
の二つのピークからなる非子宮内膜症と子宮内膜症との識別モデルにより検査して、少なくとも80％以上の感度及び少なくとも80％以上の特異性を有する子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデルが提供される。より好ましい態様では、子宮内膜症の患者血清をSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が、それぞれ、約5830のピーク
と約8865のピークとの二つのピークからなるモデルにより検査して、少なくとも85％以上の感度及び少なくとも85％以上の特異性を有する子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデルである。本発明の別の典型的な態様では、子宮内膜症の患者腹水をSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が、それぞれ、約6516のピークと約9022のピ
ークとの二つのピークからなる非子宮内膜症と子宮内膜症との識別モデルにより検査して、少なくとも80％以上の感度及び少なくとも80％以上の特異性を有する子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデルが提供される。さらに、本発明の一つの態様では、子宮内膜症手術の前後において有意に値が異なる、SELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、単一で少なくとも80％以上の感度及び少なくとも80％以上の特異性を有する子宮内膜症手術の終了の判断に有用なバイオマーカーである。本発明のより好ましい一つの態様では、子宮内膜症手術の前後において有意に値が異なる、SELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が約5830であり、単一で少なくとも80％以上の感度及び少なくとも80％以上の特異性を有する子宮内膜症手術の終了の判断に有用なバイオマーカーが提供さ
れる。さらには、本発明の一つの別の態様では、子宮内膜症手術の前後において有意に値が異なる、SELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、単一で少なくとも85％以上の感度及び少なくとも85％以上の特異性を有する子宮内膜症手術の終了の判断に有用なバイオマーカーである。本発明のより好ましい別の一つの態様では、子宮内膜症手術の前後において有意に値が異なる、SELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が
約5830であり、単一で少なくとも85％以上の感度及び少なくとも85％以上の特異性を有する子宮内膜症手術の終了の判断に有用なバイオマーカーが提供される。加えて、子宮内膜症が陽性であるとの診断は、サンプルの質量スペクトルプロファイルを陽性標準試料の質量スペクトルプロファイルと比較することにより確認されることができる。この点に関し、子宮内膜症がポジティブであるとの診断は、陽性標準試料の質量スペクトルプロファイルで見出されるバイオマーカーのうちのいずれかが、対象(例えば、ヒト)のサンプルの質量スペクトルプロファイル中に観察される場合に確認される。
【００３２】
同様にして、子宮内膜症に関して陰性であるとの診断（すなわち、対象は子宮内膜症を有しないとの診断）は、目的の対象（例えば、ヒト）から得られたサンプルの質量スペクトルプロファイルが上述の陰性標準試料の質量スペクトルプロファイルと実質的に同じ場合にそれをなすことができる。子宮内膜症がネガティブであるとの診断は、サンプルの質量スペクトルプロファイルを陽性標準試料の質量スペクトルプロファイルと比較することによっても確認されることができる。この点に関し、子宮内膜症がネガティブであるとの診断は、目的の対象のサンプルの質量スペクトルプロファイルが上述のような陽性標準試料の質量スペクトルプロファイル中に観察された如何なるバイオマーカーも含まない場合（あるいは特定のものが減少又は欠失している場合）に確認される。あるいは、子宮内膜症がネガティブであるとの診断は、陽性標準試料と異なるバイオマーカーの特定のサブセットを用いて確認されることもできる。
【００３３】
また、目的の対象から得られたサンプルで同定されたバイオマーカーとして機能するタンパク質ピークの任意の１つ又は組合せ（すなわち、サブセット）が、陽性または陰性標準試料を規定しているものであることは、当業者であれば、理解するところのものであろう。さらに、サンプル中のタンパク質ピークの強度値は、陽性標準試料及び／又は陰性標準試料と比較した場合に診断情報を提供することができる。すなわち、タンパク質ピークの平均強度値は、子宮内膜症を有する患者と子宮内膜症を有しない者とを識別するのに有
用であることもできる。
対象における子宮内膜症の診断は、目的の患者から得られたサンプル中に陽性標準試料のバイオマーカーの全てが存在することを必要としない。実際、子宮内膜症の診断は、患者から得られたサンプルが、任意の１つのバイオマーカー、陽性標準試料のバイオマーカーの組合せ、または陰性標準試料と異なるバイオマーカーの任意の１つ又は特定のサブセットを含むのであれば、それを行うことができる。加えて、子宮内膜症の診断は、対象から得られたサンプルが、陽性標準試料のバイオマーカーの１以上のフラグメントまたは全長アミノ酸配列を含むのであれば、それを行うことができる。さらに、タンパク質の翻訳後修飾の結果として、子宮内膜症の診断は、対象から得られたサンプルが陽性標準試料のバイオマーカーの１以上の修飾型(例えば、グリコシル化型など)を含む場合、その診断を行うこともできる。
【００３４】
本発明のタンパク質質量分析で同定されたバイオマーカーについては、それをさらにタンパク質の同定に付すことができる。このように、本発明は、特定の試料由来のタンパク質バイオマーカーの同定技術も包含するものである。この点に関し、タンパク質は当技術分野で公知の任意の適切なタンパク質同定法を用いて同定確認並びに特性の決定を行うことができよう。適切なタンパク質同定法としては、例えば、タンパク質エレクトロブロッティング（protein electroblotting）、エドマン配列決定法（例えば、Gevaert et al.,
Electrophoresis, 21, 1145-1154 (2000)など参照）、質量分析による配列決定（例えば、Michael Kinter and Nicholas E. Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectroscopy, Wiley-Interscience (2000)、米国特許第6,379,971号明細書、米国特許第6,632,339号明細書、米国特許第6,706,529号明細書など参照）などが挙げられる。
【００３５】
質量分析に基づくタンパク質同定法としては、例えば、MALDI-MSペプチドマスフィンガープリント法(MALDI-MS-PMF)およびMALDI-MSポストソース分解分析法(MALDI-MS-PSD)などが挙げられる。MALDI-MS-PMFでは、典型的には二次元ゲル電気泳動により精製した目的のタンパク質は、酵素的または化学的のいずれかで切断され、そして得られたペプチド混合物の一部分を使用して、それを質量分析手法により分析して、それによってタンパク質のマス「フィンガープリント」を取得する。続いて、マスフィンガープリントは、データーベース（例えば、MOWSE、ProFound、PeptIdent、PeptideSearch、SEQUESTなど)に蓄積さ
れたタンパク質配列の理論上の切断により得られた「仮想」フィンガープリントと比較され、そしてトップスコアのタンパク質が可能性のある候補タンパク質として選択される。MALDI質量分析で一次構造情報を得るためには、そのままのペプチドとそのフラグメント
イオンからなるイオン束を分析しなければならない。イオン源でのイオン化後に生じる過程は、ポストソース分解(postsource decay: PSD）と呼ばれている。ペプチドがPSDを受
けた場合、おおむねポリペプチド骨格が開裂されるので、原理的にペプチドのアミノ酸配列情報を含む一連の断片化したペプチドイオン（フラグメントイオン）が生成される。このPSDフラグメントイオンは、プレカーサーイオン（前駆イオン）とはその運動エネルギ
ーに違いをもっているので、この運動エネルギー差を利用して分離することができる。PSDフラグメントは、イオンミラー（リフレクトロン）やイオンゲートを備えた装置を使用
して解析され、かくして配列特異的なフラグメントイオン情報を、分離されていない数多くのペプチド混合物から引き出すことができる。
本発明の好ましい実施態様では、試料中のタンパク質はMALDI-MS-PMFにより同定される。試料中のタンパク質の予備的な同定の際、タンパク質の同定は、例えば、酵素免疫測定法(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)、ウエスタンブロット分析、免疫沈降法、等電点分離法、それに続く二次元ゲル電気泳動法などの当技術分野で公知の様々なタンパク質検出法により確認することができる。
【００３６】
本発明はさらに、対象における子宮内膜症の治療での、薬物又は治療処置の有効性を評
価するための方法を提供する。該方法は、(a)子宮内膜症を患っている対象から第１の試
料を得る工程、(b)質量分析により第１の試料中のタンパク質を分析する工程、(c)第１の試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程、(d)対象に薬物を投与するか、ある
いは、対象の患部を除去するなどの試料処置を行う工程、(e)対象に薬物を投与するか、
あるいは、対象の患部を除去するなどの試料処置を施した後、該対象から第２の試料を得る工程、(f)質量分析により第２の試料中のタンパク質を分析する工程、(g)第２の試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程、および(h)第１の試料の質量スペクトルプ
ロファイルを第２の試料の質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含んでいるものである。ここで薬物又は治療処置の有効性が評価される工程が含まれる。
【００３７】
本発明は、子宮内膜症の診断を補助するための試薬及び／又はキットを提供する。この試薬及び／又はキットは、本発明によるバイオマーカーを検出するために使用される。この試薬及び／又はキットは、子宮内膜症患者に由来するサンプル中に差異を有して存在するバイオマーカーまたはバイオマーカーの組合せの存在についてスクリーニングすることを可能ならしめる。
本発明の一つの実施形態においては、このキットは、本発明によるバイオマーカーを結合するのに適している吸着性試薬、又は、当該吸着性試薬をその上に有する基板などの固相、および洗浄溶液または洗浄溶液を作製するための指示書を含んでいるものであってよい。本発明のキットは、質量分析によりバイオマーカーの検出を可能にするものが含まれる。好ましい実施形態において、このキットは、固定化された金属アフィニティー捕捉チップを含むものである。該キットは、その上に吸着性試薬を備える第一の基板、およびこの第一の基板がプローブを形成するように位置決めされる第二の基板（質量分析計へ挿入されることができる）を含んでいてよい。別の実施形態において、発明のキットは、質量分析器などの分光計へ挿入されることのできる単一の基板を含むものであってよい。
【００３８】
また、本発明によるバイオマーカーは、サンプル中のバイオマーカーの存在を検出するための他の形態の診断アッセイ用製品、例えば、診断試薬にも有用であるし、さらには、当該診断アッセイ用製品、例えば、診断試薬の開発に有用であり、したがって、本発明は、こうして開発された診断アッセイ用製品、例えば、診断試薬も包含するものである。
例えば、本アッセイとしては、本発明で同定された一以上のバイオマーカーに対する抗体を含むものであることができる。抗体は、バイオマーカーを含有すると推測されるサンプルと混合され、そしてバイオマーカー−抗体結合を利用してモニターされる。本バイオマーカー抗体は、放射活性標識および酵素標識などの標識を用いて標識されることができる。好ましい実施形態において、このバイオマーカーの抗体は、固体マトリックス上に固定され、その結果、このバイオマーカー抗体は、サンプル中のバイオマーカーに対して接近可能になっているものであってよい。次いで、このサンプルを、このマトリックスの表面に接触させ、そしてこの表面を、バイオマーカー−抗体結合についてモニターする。
【００３９】
例えば、本発明のバイオマーカーは、放射免疫測定法(RIA)、酵素免疫測定法(EIA)、特にはELISA、蛍光免疫測定法(FIA)、発光免疫測定法(LIA)などで検出されることができる
。ELISAでは、典型的な場合、バイオマーカー抗体は、固相に結合され、そして酵素−抗
体結合体（コンジュゲート）は、サンプル中に存在するバイオマーカーを検出及び／又は定量するために使用される。別の態様では、可溶化され且つ分離されたバイオマーカーがニトロセルロール紙などの担体（例えば、膜など）に結合したウエスタンブロットアッセイを使用することができる。高度に特異的で、安定な抗体コンジュゲートと感受性色素基質との組み合わせは、迅速かつ正確なサンプルの同定を可能にする。膜のブロッキングおよび洗浄ならびに抗体の希釈のために必要とされる全ての溶液が提供される。バイオマーカーは、沈殿性基質または検出可能な基質の存在下においてフィルター紙をインキュベートすることによって、酵素または標識結合抗免疫グロブリン(Ig)（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)-Igコンジュゲート）によって検出される。ウエスタンブロットアッ
セイは、所望のバイオマーカーについて50%を越える純度などの高純度を必要としない利
点を有する。ELISA技術およびウェエスタンブロット技術の記述は、例えば、Fred M. Ausubel et al. (eds), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, 1988, Last Updated January 2004), "10 Analysis of Proteins" and "11 Immunology"を
参照できる。
【００４０】
本明細書中、「抗体」との用語は、広義の意味で使用されるものであってよく、所望の本発明のバイオマーカータンパク質、その構成ポリペプチド及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型(intact)分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、F(ab')2, Fab' 及びFab といったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原又はエピトープ (epitope)結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又は、例えば、IgMなどの複数のサブユニットから構成されるもの、二重特異性組
換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合又はハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用したり、DNA 組換え技術を用いて調製される抗体、本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体又は結合特性を有する抗体を包含していてよい。特に好ましい本発明の抗体は、本発明のバイオマーカータンパク質を特異的に識別できるものが挙げられる。
【００４１】
抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる任意の方法を用いて産生される。修飾語「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られているというその抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なった抗原決定基（エピトープ)に対して向けら
れた種々の抗体を典型的には含んでいる通常の（ポリクローナル）抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリン類の夾雑がないあるいは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来やイムノグロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ることができる（例えば、米国特許第4,816,567 号; Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987など)。
【００４２】
モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、ハイブリドーマ法 (G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp.495-497 (1975)); ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 (Kozbor et al., Immunology Today, 4, pp.72-79 (1983); Kozbor, J. Immunol., 133, pp.3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987);トリオーマ法; EBV-ハイブリドーマ法 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96 (1985))(ヒトモノクローナル抗体を産生するための方法);米国特許第4,946,778 号 (単鎖抗体の産生のための技術)が挙げられる他、抗体に関して以下の文献が挙
げられる: S. Biocca et al., EMBO J, 9, pp.101-108 (1990); R.E. Bird et al., Science, 242, pp.423-426 (1988); M.A. Boss et al., Nucl. Acids Res., 12, pp.3791-3806 (1984); J. Bukovsky et al., Hybridoma, 6, pp.219-228 (1987); M. DAINO et al., Anal. Biochem., 166, pp.223-229 (1987); J.S. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp.5879-5883 (1988); P.T. Jones et al., Nature, 321, pp.522-525 (1986); J.J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical
Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986); S. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp.6851-6855 (1984); V.T. Oi et al., BioTechniques, 4, pp.214-221 (1986); L. Riechmann et al., Nature, 332, pp.323-327 (1988); A. Tramontano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp.6736-6740 (1986); C. Wood et al., Nature, 314, pp.446-449 (1985); Nature, 314, pp.452-454 (1985)あるいはそこで引用された文献（それらの中にあ
る記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる) 。本発明の抗体は、本発明のバイオマーカーの解析、検知などに利用できる他、様々な利用が可能である。
【００４３】
以下、モノクローナル抗体を例に挙げて、抗体の作製につき詳しく説明する。 本発明
のモノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術（例えば、G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp.495-497 (1975))など) を利用して得られたモノクローナル抗体であってよく、例えば次のような工程で作製できる。
１．免疫原性抗原の調製
２．免疫原性抗原による動物の免疫
３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製
４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合
５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化
６．モノクローナル抗体の製造
【００４４】
１．免疫原性抗原の調製
抗原としては、上記で記載してあるように、本発明のバイオマーカータンパク質、それを構成するポリペプチド又はそれから誘導された断片を単離したものを用いることもできるが、決定された当該バイオマーカータンパク質のアミノ酸配列情報を基に、適当なオリゴペプチドを化学合成しそれを抗原として利用することができる。代表的には当該バイオマーカータンパク質に存在するアミノ酸残基のうちの連続した少なくとも５個のアミノ酸を有するペプチドが挙げられる。抗原は、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できるが、免疫原性コンジュゲートなどにしてもよい。例えば、免疫原として用いる抗原は、当該タンパク質を断片化したもの、あるいはそのアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び、ポリペプチドをデザインして化学合成して得られた合成ポリペプチド断片であってもよい。また、その断片を適当な縮合剤を介して種々の担体タンパク質類と結合させてハプテン−タンパク質の如き免疫原性コンジュゲートとし、これを用いて特定の配列のみと反応できる（あるいは特定の配列のみを認識できる）モノクローナル抗体をデザインするのに用いることもできる。デザインされるポリペプチドには予めシステイン残基などを付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易にできるようにしておくことができる。担体タンパク質類と結合させるにあたっては、担体タンパク質類はまず活性化されることができる。こうした活性化にあたり活性化結合基を導入することが挙げられる。活性化結合基としては、(1) 活性化エステルあるいは活性化カルボキシル基、例えばニトロフェニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、1-ベンゾトリアゾールエステル基、N-スクシンイミドエステル基など、(2) 活性化ジチオ基、例えば2-ピリジルジチオ基などが挙げられる。担体タンパク質類としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン (KLH)、牛血清アルブミン (BSA)、卵白アルブミン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイド、細菌菌体成分、例えばBCG などが挙げられる。
【００４５】
２．免疫原性抗原による動物の免疫
免疫は、当業者に知られた方法により行うことができ、例えば村松繁、他編、実験生物学講座 14 、免疫生物学、丸善株式会社、昭和60年、日本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、東京化学同人、1986年、日本生化学会編、新生化学実験講座 12 、分子免疫学 III、抗原・抗体・補体、東京化学同人、1992年などに記載の方法に準じて行うことができる。免疫化剤を（必要に応じアジュバントと共に）一回又はそれ以上の回数哺乳動物に注射することにより免疫化される。代表的には、該免疫化剤及び／又はアジュバントを哺乳動物に複数回皮下注射あるいは腹腔内注射することによりなされる。免疫化剤は、上記抗原ペプチドあるいはその関連ペプチド断片を含むものが挙げられる。免疫化剤は、免疫処理される哺乳動物において免疫原性であることの知られているタンパク質（例えば上記担体タンパク質類など）とコンジュゲートを形成せしめて使用してもよい。アジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ(Ribi)アジュバント、百日咳ワクチン、BCG 、リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。免疫は、例えばBALB/cなどのマウス、ハムスター、その他の適当な動物を使用して行われる。抗原の投与量は、例えばマウスに対して約１〜約400 μg/動物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜10回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはBALB/c系マウスの他、BALB/c系マウスと他系マウスとのF1マウスなどを用いることもできる。必要に応じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫の程度を確認できる。本発明の抗体は、こうして得られ免疫された動物から得られたものであってよく、例えば、抗血清、ポリクローナル抗体等を包含する。
【００４６】
３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製
細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）としては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶことができ、例えば P3-NS-1-Ag4-1 (NS-1, Eur. J. Immunol., 6: 511-519, 1976)、SP-2/0-Ag14 (SP-2, Nature, 276: 269 〜270,1978 )、マウスミエロー
マ MOPC-21セルライン由来のP3-X63-Ag8-U1 (P3U1, Curr. topics Microbiol. Immunol.,
81: 1-7, 1978 )、P3-X63-Ag8 (X63, Nature, 256: 495-497, 1975 ) 、P3-X63-Ag8-653
(653, J. Immunol., 123: 1548-1550, 1979)などを用いることができる。8-アザグアニ
ン耐性のマウスミエローマ細胞株はダルベッコMEM 培地 (DMEM培地)、RPMI-1640 培地な
どの細胞培地に、例えばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清(FCS) などを加え、さらに８−アザグアニン（例えば５〜45μg/ml) を加えた培地で継代されるが、細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結保存株を約37℃で完全に解凍したのち RPMI-1640培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよい。
【００４７】
４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合
上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、それから脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうして得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に従い得られたミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地(MEM培地) 、DMEM培地、RPMI-1640 培地などの細胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリコールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当該分野で知られたものを用いることができ、この様なものとしては不活性化したセンダイウイルス(HVJ: Hemagglutinating Virus
of Japan)なども挙げられる。好ましくは、例えば30〜60％のポリエチレングリコールを
0.5〜２ml加えることができ、分子量が 1,000〜8,000 のポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分子量が 1,000〜4,000 のポリエチレングリコールがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチレングリコールの濃度は、例えば30〜60％となるようにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチルスルホキシドなどを少量加え、融
合を促進することもできる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）: ミエローマ細胞株の割合は、例えば 1:1〜20:1とすることが挙げられるが、より好ましくは 4:1〜7:1 とすることができる。融合反応を１〜10分間行い、次にRPMI-1640 培地などの細胞培地を加える。融合反応処理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心などにより細胞を分離した後選択用培地に移す。
【００４８】
５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化
選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む、FCS 含有MEM 培地、RPMI-1640 培地などの培地、所謂 HAT培地が挙げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレートに分注した容量と等容量を翌日加え、その後１〜３日ごとに HAT培地で半量ずつ交換するというように処理することができるが、適宜これに変更を加えて行うこともできる。また融合後８〜16日目には、アミノプテリンを除いた、所謂HT培地で１〜４日ごとに培地交換をすることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺細胞を使用することもでき、それが好ましい場合がある。
ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養上清を、例えば放射免疫分析(RIA) 、酵素免疫分析(ELISA) 、蛍光免疫分析(FIA) などの測定系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置(FACS)などで、所定の断片ペプチドを抗原として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目的抗体を測定するなどして、スクリーニングしたりする。
目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニングする。クローニングは、寒天培地中でコロニーをピック・アップするか、あるいは限界希釈法によりなされうる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。クローニングは複数回行うことが好ましい。
【００４９】
６．モノクローナル抗体の製造
得られたハイブリドーマ株は、FCS 含有MEM 培地、RPMI-1640 培地などの適当な増殖用培地中で培養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエローマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、あるいは例えばヌード・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖させ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を回収して得ることが出来る。動物はハイブリドーマの移植に先立ち、プリスタン（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与しておくことができ、その処理後、ハイブリドーマを増殖させ、腹水を採取することもできる。腹水液はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製してモノクローナル抗体として用いることができる。好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫安分画した後、DEAE−セファロースの如き、陰イオン交換ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィニティ・カラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好ましくは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する部位など）を固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００５０】
また、トランスジェニックマウス又はその他の生物、例えば、その他の哺乳動物は、本発明の免疫原ポリペプチド産物に対するヒト化抗体等の抗体を発現するのに用いることができる。またこうして大量に得られた抗体の配列を決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコードする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗体を作製することも可能である。当該モノクローナル抗体をコードする核酸は、例えばマウス抗体の重鎖や軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用するなどの慣用の手法で単離し配列決定することができる。一旦単離されたDNA は、上記
したようにして発現ベクターに入れ、CHO, COSなどの宿主細胞に入れることができる。該DNA は、例えばホモジーニアスなマウスの配列に代えて、ヒトの重鎖や軽鎖の定常領域ドメインをコードする配列に置換するなどして修飾することが可能である (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6581, 1984)。かくして所望の結合特異性を有するキメラ抗体やハイブリッド抗体も調製することが可能である。また、抗体は、縮合剤を用いることを含めた化学的なタンパク質合成技術を適用して、キメラ抗体やハイブリッド抗体を調製するなどの修飾をすることも可能である。ヒト化抗体は、当該分野で知られた技術により行うことが可能である（例えば、Jones et al., Nature, 321: pp.522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: pp.323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science,
239: pp.1534-1536 (1988))。ヒトモノクローナル抗体も、当該分野で知られた技術により行うことが可能で、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのヒトミエローマ細胞やヒト・マウスヘテロミエローマ細胞は当該分野で知られている (Kozbor, J. Immunol., 133, pp.3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)) 。バイスペシフィックな抗体を製造する方法も当該分野で知られている (Millstein et al., Nature, 305: pp.537-539 (1983); WO93/08829; Traunecker et al., EMBO J., 10: pp.3655-3659 (1991); Suresh et al., "Methods in Enzymology", Vol. 121, pp.210 (1986))。
【００５１】
さらに、これら抗体をトリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるFab 、Fab'、F(ab')2 といった抗体フラグメントにして使用してもよい。抗体は、既知の任意の検定法、例えば競合的結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定、及び免疫沈降検定に使用することができる（Zola, Monoclonal Antibodies: A
Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)。抗体を検出可能な原子
団にそれぞれコンジュゲートするには、当分野で知られる任意の方法を使用することができ、例えば、David et al., Biochemistry, 13巻, 1014-1021 頁（1974); Pain et al, J. Immunol. Meth., 40: pp.219-231 (1981);及び "Methods in Enzymology", Vol. 184, pp.138-163 (1990) により記載の方法が挙げられる。標識物を付与する抗体としては、IgG 画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Fab'を用いることができる。これらの場合の標識物の例としては、下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼあるいはβ-D-ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質あるいは
放射性同位元素などがある。
【００５２】
本発明での検知・測定は、イムノ染色、例えば組織あるいは細胞染色、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、ラジオイムノアッセイ、ELISA などを用いることができ、B-F分離を行ってもよいし、あるいは
行わないでその測定を行うことができる。好ましくは放射免疫測定法や酵素免疫測定法であり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられる。例えばサンドイッチ型アッセイでは、一方を本発明の当該タンパク質及びその関連ペプチド断片に対する抗体とし、他方を当該タンパク質のN-末端側残基に対する抗体とし、そして一方を検出可能に標識化する。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、ここで非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗原、すなわち当該ポリペプチド断片抗原の量と比例する。このアッセイでは、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（forward)サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどと呼ばれる。例えば洗浄、撹拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特定の状況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用される。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはインキュベーション処理時間などのその他の測定条件は、検体中の抗原の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変えることができる。当業者は通常の実験法を用いながら各測定に対して有効な最適の条件を適宜選定して測定を行うことが出来る。
【００５３】
抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに使用されるものが種々知られており、本発明においても勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、例えば試験管、タイタープレート、タイターウェル、ガラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質（物体）の表面などが挙げられる。
【００５４】
これら担体へは、抗体を結合させることができ、好ましくは本発明で得られる抗原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を結合させることができる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するものとの結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出来る。
標識としては、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利用することもできる。
【００５５】
本発明の測定法によれば、測定すべき物質を酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させることができるし、同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後該感作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより測定を行うことができる。
本発明の定量法においては、免疫学的測定法が用いられるが、その際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、微粒子あるいは試験管などの種々の材料および形態を任意に選択し、使用することができる。
測定にあたっては至適pH、例えばpH約４〜約９に保つように適当な緩衝液系中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、Tris-HCl緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いることができる。抗原抗体反応は約０〜約60℃の間の温度で行うことが好ましい。
【００５６】
酵素などで標識されたモノクローナル抗体などの抗体試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達するまで行うことができるが、抗原抗体反応の平衡が達成されるよりもずっと早い時点で固相と液相とを分離して限定されたインキュベーション処理の後に反応を止めることができ、液相又は固相のいずれかにおける酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。測定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。抗原抗体反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定
すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗原抗体反応自体を安定化するように適切な手段を講ずることができる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性化剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加えることもできる。
当該分野で普通に採用されていたり、あるいは、当業者に知られた非特異的結合反応を防ぐためのブロッキング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正常血清タンパク質、アルブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができる。非特異的結合反応を防ぐ目的である限り、それらの方法は特に限定されず用いることが出来る。
本発明の測定方法で測定される試料としては、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非流体試料などが使用しうるが、好ましくは生物由来の試料、例えば血液、血清、血漿、唾液、羊水、尿、その他の体液、細胞培養液、組織培養液、組織ホモジュネート、生検試料、組織、細胞などが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を含めた各種の分析・定量法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明の当該対象物質あるいはそれと実質的に同等な活性を有する物質に関連した測定系を構築すればよい。
【００５７】
これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、H. V. Vunakis et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 70 (Immunochemical Techniques, Part A), Academic Press, New York (1980); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 73 (Immunochemical Techniques, Part B), Academic Press, New York (1981); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 74 (Immunochemical Techniques, Part C), Academic Press, New York (1981);
J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 84 (Immunochemical Techniques, Part D: Selected Immunoassays), Academic Press, New York (1982); J. J.
Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 92 (Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), Academic Press, New York (1983); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in
Enzymology", Vol. 178 (Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry), Academic Press, New York (1989); M. Wilchek et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 184 (Avidin-Biotin Technology), Academic Press, New York (1990); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 203 (Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B: Anibodies and Antigens, Nucleic Acids, Polysaccharides, and Drugs), Academic Press, New York (1991) などあるいはそこで引用された文献 (それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる) 〕。
【００５８】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
【実施例１】
【００５９】
〔材料と方法〕
〔患者とグループ〕
独立行政法人国立病院機構京都医療センター産婦人科部門での潜在的な可能性を持っている診断用バイオマーカーを発見するためにの研究で、2006年11月から2007年3月まで、59人の手術前の子宮内膜症患者、良性の婦人科疾病を持った31人の患者、30人の健康な女
性ボランティアおよび29人の手術後の子宮内膜症患者を対象とした。
募集されたすべての女性は、身体的検査および生化学のテストの結果、何らその他の疾病も持っていなかった。本研究の前の6か月間は、いずれの者も、どんなホルモン治療も
受けていなかった。子宮内膜症は、生検を実施された組織を病理学的に検査することによって確認された。また、疾病の程度は、アメリカ不妊学会の改訂された分類(r-AFS)によ
って行った。募集された女性は全員この研究手順に参加する前に同意書類に署名した。本研究は病院の倫理委員会による承認の後に行われた。
【００６０】
本研究では血清サンプルは3つのグループに分けられた:
手術前の子宮内膜症のグループで、59人の子宮内膜症患者から成り、異なる臨床病期:
段階I(n=9)、段階II(n=20)、段階III(n=14)および段階IV(n=16)
を有していた。
年齢を一致させた子宮内膜症でない31人の患者(13人は良性の卵巣腫瘍、18人は筋腫)、および、年齢を一致させた30人の健康な女性(国立病院機構京都医療センター付属看護学
校の中年夫人クラスの学生)を、対照群（コントロール群）として組み入れた。
手術前の子宮内膜症患者および対照群は、予備研究のグループとテストのグループに無作為的に選択されて分けられた(表１)。さらに29人の手術後の子宮内膜症患者が手術と関係する潜在的に可能性を有するバイオマーカーを同定確認するために募集された。腹水サンプルは2つのグループ:
(1)異なる臨床病期の30人の子宮内膜症患者から成っている被検群、段階I(n=5)、段階II(n=10)、段階III(n=7)および段階IV(n=8) 、そして、
(2) 年齢を一致させた子宮内膜症でない31人の患者(13人は良性の卵巣腫瘍、18人は筋
腫)から成っている対照群（コントロール群）
を包含している。
【００６１】
【表１】
2009168646.tif 000003
【００６２】
〔血清サンプルと腹水サンプル〕
募集されたすべての女性から5mLの末梢血を集めた。手術前の子宮内膜症グループおよ
び対照群については、血液サンプルは、腹腔鏡手術の前日に集められた。健康な女性ボランティアの血液サンプルは2007年1月29日に集められた。また、手術後の被検群について
は、血液サンプルを腹腔鏡手術後4〜5週に集められた。血液は、すべて静脈穿刺により、3.2％クエン酸ナトリウムの入った真空管に採取された。
5〜10 mLの腹水試料は、腹腔鏡手術を受ける被検群と腹腔鏡手術を受ける対照群から得られた。各試料は1時間4℃に置かれて血液凝固させ、4℃で20分間3000rpmで遠心分離し、細胞成分を除いた。血清サンプルを集め、分注され、使用まで-80℃で凍結保管せしめら
れた。
【００６３】
〔試料調製法〕
凍結血清を解凍した。各検体からの血清(10μl)を、1.5 mL マイクロチューブにおいて、U9緩衝液(9mmol/L尿素、2%CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate)、50mmol/Lトリス塩酸緩衝液、pH 9.0)の20μlと共にボルテックスし、4℃
で30分間200rpmの速度で振盪して、蛋白質を変性させた。変性処理された試料(10μl)と120μlの吸収/脱離バッファー(100mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、pH 7.0)を混合し、10秒間振盪した。
【００６４】
〔チップの選択、および、調製〕
４種類のタイプのチップ(Ciphergen Biosystems社、フリーモント(CA)、米国)、即ち、表面化学特性が、疎水性、イオン性、カチオン性、金属結合性のチップをテストして、どれが最良の血清プロフィールを提供することができるかを決定した。評価の後に、本研究のため、IMAC30-Cu ProteinChip (Ciphergen Biosystems社、フリーモント(CA)、米国)を選択した。IMAC30-Cuチップ・アレイを50μlの100mM CuSO4で各アレイ上を被覆し、4℃で5分間200rpmで振盪した。
アレイを洗浄し、蒸留水で5回素早くすすいだ。そして、50μlの100mM酢酸ナトリウム(pH 4.0)溶液を各アレイに加え、4℃で5分間200rpmで振盪した。アレイを洗浄し、蒸留水
で5回素早くすすいだ。そして、150μlの吸収/脱離バッファーを各チップ・アレイに適用し、そのチップを4℃で5分間 200rpmで振盪した。その吸収/脱離バッファーを廃棄し、もう１度繰り返した。希釈された血清50μlを各チップ・アレイに加えた。そして、そのチ
ップを4℃で60分間200rpmで振盪した。血清/緩衝液混合物を廃棄し、150μlの吸収/脱離
バッファーを各チップ・アレイに加え、そのチップを4℃で5分間200rpmで振盪し、そしてもう１度繰り返した。バッファーを棄て、そのチップをシェーカーから外し、空気乾燥した。15μlのシアン化メチルおよび15μlの1%のTFAをエネルギー吸収する分子(EAM): 0.001mgSPAに加え、5分間振盪し、1分間遠心分離した。SELDI分析の前に、0.5μlのSPAを各チップ・アレイ上に2度適用し、各SPA適用の間にアレイ表面が風乾するようにした。
【００６５】
〔SELDI分析〕
チップをプロテイン・バイオロジカル・システム質量分析計リーダー上に置いた。NP20チップ(それは分子質量標準物であるオール・イン・ワン・ペプチドを含有している)を使って、測定のその日に質量の精度を調整した。装置パラメーターをセットして、データを読むための手順を当該Ciphergen Proteinchipにおいてプログラムした。コンピューター
は、1 x 109 Hzの速度でプライマリーデータを受け取り、蛋白質のマススペクトルグラフを迅速且つ正確にプロットする。Y軸は、各蛋白質の蛋白質相対含量を表わし、また、X軸は、蛋白質の電荷に対する質量の比率を表わす。
【００６６】
〔統計分析〕
データ分析は、3つの段階：
(a)ピーク検知および整列;
(b)最も高い識別力を持つピークの選択;
(c)決定木アルゴリズムを使うデータ分析
を包含するものである(Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cance
r., Lancet, 2002;359:572-7; Adam BL, Qu Y, Davis JW, Ward MD, Clements MA, Cazares LH, et al. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men., Cancer Res, 2002;62:3609-14)。
29人の手術前子宮内膜症患者、子宮内膜症のない15人の患者および15人の健康な女性で、予備研究群を構成した。一方、試験群は、30人の手術前の子宮内膜症患者、子宮内膜症のない16人の患者および15人の健康な女性から成るものであった。ピーク検出は、Ciphergen ProteinChipソフトウェア・バージョン4.0 (Ciphergen Biosystems社、フリーモント(CA)、米国)を使って行なわれた。1,000から20,000ダルトンまでの質量範囲が選択された。低い質量(m/z<1,000)および低い強度のピーク(m/z>20,000)を除去するために、この範
囲に注目した。
ピーク検出法は、(a)ベースライン減算法、(b)質量精度較正法および(c)自動ピーク検
出法を包含するものである。バイオマーカー・ウィザード(Ciphergen Biosystems社、フ
リーモント(CA)、米国)を使って、多数のスペクトルにわたって一貫した蛋白質ピークの
セットを表わすバイオマーカーを生成した。決定木分類アルゴリズムの構築は予備研究のデータセットを使うことにより行なわれた。同じM/Zを持っている蛋白質の質量を各グル
ープに関して比較するために分散分析(ANOVA)を行った。データのグループ化および相関
分析は、BioMarker Pattern 4.0 (対象は決定木方法により分類された)を使って解析された。
〔CA125測定〕
IMMULITE (DPC、米国)を使って、化学発光免疫測定(chemiluminescence immunoassay, CLIA)を使用して、同じ予備研究とテストのセットに対する血清CA125値を測定した。カットオフ値を16.3U/mlにセットした。
【００６７】
〔結果〕
〔再現性〕
精度管理(QC)用試料を使って、SELDIスペクトルの再現性を証明することに成功した。
それぞれ、ピーク位置に対する分析内および分析間変動係数は、両方とも0.05%であった
。また、標準化された強度(ピーク高さあるいは相対的な濃度)に対する分析内及び分析間変動係数は、11%および16%であった。日々のサンプリングや使用機械での変動あるいはチップ変動はほとんどなかった。正確で且つ再現可能な特徴の選択が、SELDI法によるデー
タ解析法開発成功の為の、最も重要な、かつ、最初の一歩であると思われた。血清試料において使われる本システムの許容される変化を分析内および分析間で調べた結果、本研究において信頼性を持ってそれを使用できるものであることがわかっている。
【００６８】
〔予備研究群に関してのデータ分析〕
〔マススペクトルグラフ分析〕
予備研究群セットのSELDIスペクトルから、1,000〜20,000のm/zの範囲に合計98個の補
正を加えてないピークを確認した。手術前子宮内膜症グループと対照グループとの比較は、BioMarker Wizardソフトウェアにより行った。結果は、異なる43個の蛋白質ピークがあることを示しており（図１）、その蛋白質ピークの中では、手術前子宮内膜症グループと対照群との間で蛋白質質量の34個の違いが見つかった(P<0.05)。
【００６９】
〔子宮内膜症特異血清蛋白質マーカーの発見〕
Biomarker Patterns Softwareを使って、対照群から生成されたスペクトルを、手術前
子宮内膜症グループのそれと比べた。この比較により、非子宮内膜症と子宮内膜症を識別する2つのピークから成るモデルが生まれた。これらの２個のピークは、5830のm/z比および8865のm/z比に相当しました(図２)。両方のピークは子宮内膜症グループにおいてアッ
プレギュレーションされていた。本モデルの精度は、93.22%(55/59)であり、その感度お
よび特異性は、それぞれ89.66%(26/29)および96.67%(29/30)であった(表２)。
【００７０】
【表２】
2009168646.tif 000004
【００７１】
〔テスト群に対する盲検検知法〕
盲検法群は子宮内膜症症30例と対照31例が、非子宮内膜症と子宮内膜症を識別する目的で、このモデルの評価のために使われた。本研究では、30の子宮内膜症症例のうちの27人、および、子宮内膜症でない16人の患者のうちの15人および15人の健康な女性のうちの15人の女性患者症例が、91.80%(56/61)の正確さで、正しく分類された。感度と特異性は、
それぞれ、86.67%(26/30)および96.77%(30/31)であった(表２)。
〔CA125検知法の結果〕
CA125値は、予備研究群とテスト群のすべての被験者において利用可能であった。上記
されたと同様の方法を使って、非子宮内膜症と子宮内膜症を識別することに関し、CA125
が44.8%の感度および83.9%の特異性を持っていることを見出した(表２)。本研究から同定確認された２つのマーカーは、対照から子宮内膜症患者を識別することに関しては、CA125より著しく良かった(P<0.05)。
【００７２】
〔手術前と手術後の子宮内膜症グループについてのデータ分析〕
〔マススペクトルグラフ分析〕
子宮内膜症グループの手術前症例29例、および、手術後症例の29症例の比較を、バイオマーカー・ウィザード・ソフトウェア(BioMarker Wizard software)により行った。
結果は、差異を有している47箇所の蛋白質ピークがあり(図３)、その中で、手術前及び手術後の子宮内膜症グループ間で蛋白質質量で30箇所の差異が見つかった(P<0.05)。
〔バイオマーカー分析〕
バイオマーカー・ウィザード・ソフトウェア(BioMarker Wizard software)を使って、
子宮内膜症グループの手術前症例29例、および、手術後症例の29症例に関し、血清蛋白質の成分を解析した。
m/z比5830に相当する一つの蛋白質質量が、手術前後の子宮内膜症グループを正確に分
けることができることを見出した。5830のm/z比のところの手術前子宮内膜症グループの
血清蛋白質含量は、手術後の子宮内膜症グループのそれより著しく高かった(図４)。本マススペクトルプロフィールは、手術前の試料ではm/z 5830のピークがアップレギュレーションされていることを明らかにしている。
手術前の試料の平均ピーク強度は、10.593±5.458で、それに対し、手術後の試料では1.891±1.019のピーク強度であった(P<0.001)。バイオマーカー・パターン・ソフトウェア(BioMarker Pattern software)による解析の結果は、子宮内膜症手術前症例26例と子宮内膜症手術後症例29例を、94.83%(55/58)までの精度比でもって、正確に分類できることを
示すものであった。その感度と特異性は、それぞれ89.65%(26/29)および100%(29/29)であった。また、本ピークは健康なボランティアのスペクトルにおいては存在しなかった。
また、m/z比8865に相当する一つの蛋白質質量についても、上記m/z比5830と同様のこと
が期待できると考えられる。
【００７３】
〔手術前の子宮内膜症グループ、コントロールグループ、手術後の子宮内膜症グループにおけるm/z比 5,830の血清蛋白質含量〕
手術前の子宮内膜症のm/z 5,830の血清蛋白質含量は、コントロール及び手術後の子宮
内膜症のそれらより著しく高かった(P<0.01)。一方、コントロールグループと手術後の子宮内膜症グループでは、何らの相違もなかった(p>0.05)(表３)。同様に、手術前の子宮内膜症のm/z 8,865の血清蛋白質含量も、コントロール及び手術後の子宮内膜症のそれらよ
り著しく高い一方、コントロールグループと手術後の子宮内膜症グループでは、何らの相違もなかった(表４)。また、手術前の子宮内膜症グループの臨床病期毎のm/z 5,830及びm/z 8,865の血清蛋白質含量についての結果を、それぞれ、図５及び６に示す。
【００７４】
【表３】
2009168646.tif 000005
【００７５】
【表４】
2009168646.tif 000006
【００７６】
【表５】
2009168646.tif 000007
【００７７】
【表６】
2009168646.tif 000008
【００７８】
〔子宮内膜症患者からの腹水試料および非子宮内膜症患者からの腹水試料についてのデータ解析〕
子宮内膜症患者からの30の腹水試料と非子宮内膜症患者からの30の腹水試料の比較をバイオマーカー・ウィザード・ソフトウェア(BioMarker Wizard software)を使って実施し
た。
結果は、相違を有している28箇所の蛋白質ピークが存在している(図５)ということを示すもので、その中で、試験群と対照群の間で蛋白質質量で7箇所の違いが見出された(P<0.05)。この比較で、子宮内膜症の腹水と非子宮内膜症の腹水とを区別する2つのピークから成るモデルが得られた。これらの2つのピークは、6516と9022のm/z比に相当するものであった(図６)。本マススペクトルプロフィールは、子宮内膜症患者ではm/z 6516のピークがアップレギュレーションされており、m/z 9022のピークがダウンレギュレーションされていることを明らかにしている。m/z 6516のピークは、子宮内膜症グループにおいてアップレギュレーションされていた。また、m/z 9022のピークは、子宮内膜症グループにおいてダウンレギュレーションされていた。バイオマーカー・パターン・ソフトウェア(BioMarker Pattern software)による解析の結果は、88.33%(53/60)までの精度でもって、子宮内
膜症の28症例および非子宮内膜症の25症例が正しく分類されることを示している。その感度と特異性は、それぞれ93.33%(28/30)および83.33%(25/30)であった。
【００７９】
〔検討〕
本発明では、SELDI-TOF-MS蛋白質チップ技術が子宮内膜症バイオマーカーの同定確認に応用された。
蛋白質チップ技術は、様々な疾病に対して潜在的可能性を有するバイオマーカーを同定
確認することにハイ・スループットのプロテオミクス技術を応用することを可能にする。本革新的な技術は、多数の長所を持っており、例えば、少量の試料を同時に適用できるとか、比較的短い実験の時間を実現可能とするとか、前もっての精製ステップなしにチップ表面上で発現された蛋白質の強度の差により、同じチップ上でペプチド・サイズの分離および同定確認することができるなどである(Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet 2002; 359: 572-7; Petricoin III EF, Ornstein DK, Paweletz CP, Ardekani A, Hackett PS, Hitt BA, et al. Serum proteomic patterns for detection of prostate cancer. J Natl Cancer Inst 2002; 94: 1576-8; Rogers MA, Clarke P, Noble J, Munro NP, Paul A, Selby PJ, et al. Proteomic profiling of urinary proteins in renal cancer by surface enhanced laser desorption ionization and neural-network analysis: identification of key issues affecting potential clinical utility. Cancer Res 2003; 63: 6971-83; Shiwa M, Nishimura Y, Wakatabe R, Fukawa A, Arikuni H, Ota H, et al. Rapid discovery and identification of a tissue-specific tumor biomarker from 39 human cancer cell lines using the SELDI ProteinChip platform. Biochem Biophys Res Commun 2003; 309: 18-25)。チップ・アレイは、疎水性の蛋白質、陰イオン性の蛋白質、陽イオン性の蛋白質、あるいは、親水性の蛋白質に対して特異性を示すようなものである。さらに、チップ・アレイは、抗体-抗原相互作用、
受容体-リガンド相互作用、あるいは、DNA-蛋白相互作用を利用して、特異的な蛋白質を
釣り上げることを可能にするものであってよい。こうしたことから、診療処置行為あるいは疾病というものが、疎水性の蛋白質又は陰イオン性の蛋白質を発現させることを予想させるか否かを同定し確認するには、あるいは、１つの特異的な標的蛋白質の発現を増加させると予想させるか否かを同定し確認するには、予備的な知識が必要とされよう。
【００８０】
本発明では、疎水性表面化学性状、イオン性表面化学性状、陽イオン性表面化学性状、そして、金属結合の表面化学性状を有しているチップの4つのタイプのチップをテストし
た。評価の結果、金属結合の表面化学性状を有しているチップ、すなわち、銅結合の表面化学性状を有しているチップIMAC30-Cu ProteinChipを選択した。
本蛋白質チップを使用して、手術前の子宮内膜症患者からの蛋白質スペクトルを、非子宮内膜症対照群からの対応するスペクトルと比較した。分析に使われた質量スペクトルデータは、フィルター処理されていないものであり、それゆえ、実際の蛋白質の特徴を示す信号に加えて、電気的なノイズ、化学的ノイズを含んでいた。さらに、疾病カテゴリーと無関係なサンプル間での差異による変動や日々派生する変動は、本来的に、すべてのスペクトルに影響を及ぼすであろう。
したがって、遺伝学的なアルゴリズムの力を使った。該アルゴリズムは、ノイズを含むスペクトルにおいて問題となるピークをうまく除去することができる。本発明の分析で、2つの候補マーカーから成る多変数のモデルが提供されることが見出された。それらのマ
ーカーは両方とも、子宮内膜症患者においてアップレギュレーションされていた。盲検法群を使用して、このモデルが非子宮内膜症と子宮内膜症とを区別することができるか否かを評価した。結果、その感度と特異性は86.67%および96.77%であった。
【００８１】
腫瘍抗原CA125は、卵巣癌の検知およびモニタリングに典型的に使われている [Rai AJ,
Zhang Z, Rosenzweig J, Shih Ie M, Pham T, Fung ET, et al., Proteomic approaches
to tumor marker discovery., Arch Pathol Lab Med, 2002; 126: 1518-26; Li J, Zhang Z, Rosenzweig J, Wang YY, Chan DW., Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer., Clin Chem 2002; 48: 1296-304]。さらに、そのCA125は子宮内膜症の診断においても使わる。しかしながら、CA125はその低い感度・特異性により、このCA125抗原の使用はやや限界のあるものである。卵巣癌は高いCA125値を持っており、さらに、その卵巣癌は非子宮内膜症疾病のうち
の重要な構成員の1つであることである。本試験では、対照群に卵巣癌が含まれないこと
から、子宮内膜症と非子宮内膜症とを区別するという点では、そのCA125の特異性は、疑
いなく、一見、より大きなものとなっている。
【００８２】
本試験を通して、血清のSELDIプロファイリングにより、良性の疾病の患者や健康な女
性から子宮内膜症を持った患者を識別するという点では、本発明の手法はCA125より著し
くよいことが実証された。本試験の結果、SELDIにより分離された多数の蛋白質の組合わ
せを選択すると、潜在的可能性を有する診断のアプローチになるということが示された。
手術前の患者および手術後の子宮内膜症患者の間の血清蛋白質変動を比較したところ、m/z比5830に対応する一つの蛋白質のマスにより、手術前及び手術後の子宮内膜症のグル
ープを正確に分離できることが示された。手術前の子宮内膜症患者のm/z 5,830の血清蛋
白質含量は、対照および手術後の子宮内膜症患者のそれよりも著しく高かった。しかし、対照および手術後の子宮内膜症グループでは、それは何ら著しい差はなっかった。このことは、m/z 5,830の蛋白質が子宮内膜症診断及び／又はモニター治療のための新規血清バ
イオマーカーであることを示している。
【００８３】
Joshi et al. (Joshi, S.G., Zamah, N.M., Raikai, R.S. et al. Serum and peritoneal fluid proteins in women with and without endometriosis., Fertil. Steril., 1986, 46, 1077-1082)は、SDSおよびネイティブPAGEを用い、子宮内膜症を持った女性および正常な女性の腹水を比べた。そこで、18/20の分泌期の腹水サンプルに、増殖期のサンプ
ルにおいては存在していない蛋白質(M, 70,000)を見つけてはいるが、その結果は何ら有
意の違いはないということを示すものであった。本蛋白質の特性を示すような文献報告書はない。Tabibzedeh及びその共同研究者は、2-DEを使用して、不妊症の女性及び子宮内膜症では全くない女性で観察された腹水の蛋白質は、健全な対照群のものと異なるところがなく、症状の軽い子宮内膜症では、対照群と比較して、35〜40 Kda及びpI 5.7〜6.0の範
囲にある蛋白質が僅かに減少することが付随していると報告している。しかしながら、劇症の子宮内膜症の女性では、同じ蛋白質スポットのところに比較的大きな減少が観察され、また、対照と比較して、さらに、多数の他の蛋白質の量が2〜4倍増加することが、劇症の子宮内膜症の女性で見られた(Tabibzadeh,  S., Becker, J.L., Parsons, A.K., Endometriosis is associated with alterations in the relative abundance of proteins and IL-10 in the peritoneal fluid. Front. Biosci. 2003, 8, A70-A78)。しかし、現在
まで、これらの発見は子宮内膜症に対する診断薬の開発にまで歩みを進めるものではなかった。
【００８４】
本発明では、SELDI-TOF-MSを使って比較を行うことにより、子宮内膜症の腹水と非子宮内膜症の腹水とを区別できる２つのピークから成るモデルが提供されている。これらの二つのピークは、6516のm/z比と9022のm/z比に相当するものであった。m/z 6516のピークは、子宮内膜症グループ中でアップレギュレーションされていた。また、m/z 9022のピークは、子宮内膜症グループ中でダウンレギュレーションされていた。その感度と特異性は、それぞれ、93.33%および83.33%であった。
結論として、SELDI-TOF-MS蛋白質チップを使用して、新規な子宮内膜症の血清および腹水のバイオマーカーを同定確認できた。これらの蛋白質マーカーは、新規な子宮内膜症蛋白質である可能性が高いものである。該蛋白質は、手術の後の子宮内膜症診断および微小転移性病態のモニタリングに役立つ可能性が高いものである。
子宮内膜症と非子宮内膜症とを識別した血清の2つのバイオマーカーピークモデルは、89.66%の感度および96.67%の特異性で子宮内膜症診断を可能とする。盲検法で検討した結
果も、CA125では、43.33%の感度および80.64%の特異性であるのと比較して、本発明の樹
立された血清の2つのバイオマーカーピークモデルは、86.67%の感度および96.77%の特異
性という大変優れた結果を与える。すなわち、本発明の血清についての2つのバイオマー
カーを使用するモデルは、現在の標準マーカーCA125(P<0.05)より、著しく良い診断機能
を持っている。特には、本発明の血清についてのバイオマーカーの一つ（蛋白質ピークm/
z、5830)は、手術前の子宮内膜症と手術後の子宮内膜症とを89.65%の感度および100%の特異性でもって識別するものであることが、確認された。バイオマーカーm/z 5,830の子宮
内膜症手術前の血清蛋白質含量は、対照のものおよび子宮内膜症の手術後のものより著しく高かった(P<0.01)。一方、対照および手術後のグループでは、違いは無かった(P>0.05)。
【００８５】
また、腹水の2つのバイオマーカーピークモデルは、子宮内膜症と非子宮内膜症とを93.33%の感度および83.33%の特異性でもって識別するものであることが、確認された。
上記で、新規な子宮内膜症の血清および腹水バイオマーカーが同定された。当該蛋白質マーカーは新規な子宮内膜症蛋白質である可能性がある。そして、当該蛋白質マーカーは、子宮内膜症の診断および手術後の微小転移性病態のモニタリングの指標として有用である。
特に、本発明で、血液サンプル、例えば、血清サンプルで同定されたバイオマーカー、m/z比5830に相当する蛋白質質量をもつもの、及び、m/z比8865に相当する蛋白質質量をもつものは、いずれも、単独で、子宮内膜症診断（子宮内膜症と非子宮内膜症との識別、子宮内膜症の検出及び／又はモニターリング、予後の経過観察）において、高い精度、高い感度、そして高い特異性を与えることのできるもので、優れた子宮内膜症に特異的なバイオマーカーである。当該バイオマーカーからなる子宮内膜症診断モデルは、僅か、二つのバイオマーカーで、非常に優れた精度、高い感度、そして高い特異性を与えることのできるものであり、費用面、操作の簡素化などの面で利点が大きい。さらに、当該バイオマーカーを利用すれば、免疫学的測定系の開発が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明では、新しい子宮内膜症血清および腹水用バイオマーカーが確認され、該マーカーを指標として使用として、高い精度、高い感度、そして高い特異性で、子宮内膜症と非子宮内膜症とを識別する技術を開発できる。すなわち、子宮内膜症の診断および手術後の微小転移性病態のモニタリング技術、それに用いる試薬などを開発できる。本発明のバイオマーカーは、単一のもので、高い精度、高い感度、そして高い特異性でもって、子宮内膜症の診断・検出・モニタリングを可能とし、単純化された子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデル、すなわち、SELDI-TOF-MSシステム測定のピークのうち、僅か、二つのピークからなる子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデルを構築できるし、免疫学的な検査手法の開発の可能性を拓くものである。当該バイオマーカーを利用して、子宮内膜症の診断に有効で且つより簡単な測定系の構築を可能とする。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】バイオマーカー・ウィザード・ソフトウェアによる解析結果  Y軸は、蛋白質の相対的な含量を表わし、X軸は、蛋白質の電荷に対する質量の比率を表わす。図中、ダイヤモンド(s-1)は手術前子宮内膜症患者を表わし、正方形(s-5)は対照群を表わす。
【図２】子宮内膜症のサンプルおよびコントロールのサンプルにおけるプロテオミックパターンについての血清のSELDI分析の結果を、質量スペクトル(左側)およびゲルの写真(右側)で示す。Y軸は、蛋白質の相対的な含量を表わし、X軸は、蛋白質の電荷に対する質量の比率を表わす。
【図３】バイオマーカー・ウィザード・ソフトウェア解析の結果。  Y軸は、蛋白質の相対的な含量を表わし、X軸は、蛋白質の電荷に質量の比率を表わす。図中、ダイヤモンド(s-1)は手術前の子宮内膜症患者を示し、正方形(s-4)は手術後の子宮内膜症患者を示す。
【図４】子宮内膜症の手術前と手術後のサンプルにおけるプロテオミックパターンについての血清のSELDI分析の結果を、質量スペクトル(左側)およびゲルの写真(右側)で示す。Y軸は、蛋白質の相対的な含量を表わし、X軸は、蛋白質の電荷に対する質量の比率を表わす。本マススペクトルプロフィールは、手術前の試料ではm/z 5830のピークがアップレギュレーションされていることを明らかにしている。
【図５】バイオマーカー・ウィザード・ソフトウェア解析の結果。Y軸は、蛋白質の相対的な含量を表わし、X軸は、蛋白質の電荷に対する質量の比率を表わす。図中、ダイヤモンド(腹水-1)は、子宮内膜症患者からの腹水を示し、正方形(腹水-4)は非子宮内膜症患者からの腹水を示す。
【図６】子宮内膜症患者のサンプルと非子宮内膜症患者のサンプルにおけるプロテオミックパターンについての腹水のSELDI分析の結果を、質量スペクトル(左側)および棒グラフ(右側)で示す。Y軸は、蛋白質の相対的な含量を表わし、X軸は、蛋白質の電荷に対する質量の比率を表わす。本マススペクトルプロフィールは、子宮内膜症患者ではm/z 6516のピークがアップレギュレーションされており、m/z 9022のピークがダウンレギュレーションされていることを明らかにしている。
【図３】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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