(57)【要約】【課題】  時々刻々と変化するような病態に対して適切なステロイド治療を行なうことができるように、ステロイドの投与効果を短時間で知ることができるステロイド感受性の判定方法、ＳＩＲＳの発症予測方法、及びこれらの結果を出力できる装置を提供する。【解決手段】  ステロイド投与後の患者から採取された生体試料に含まれる、炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子量を測定する工程；及び測定結果に基づいて前記患者のステロイド感受性を判定する工程を含む。蛍光相関分光法等を利用して、分離精製操作を経ずに生体試料中の活性型転写因子量を測定する。【選択図】  図７
2009011245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロイド投与後の患者から採取された生体試料に含まれる、炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子量を測定する工程；及び
測定結果に基づいて、前記患者のステロイド感受性を判定する工程
を含む、ステロイド感受性の判定方法。
【請求項２】
前記生体試料が血球の核抽出物である請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
前記活性型転写因子は、ＮＦ−κＢである請求項１又は２に記載の判定方法。
【請求項４】
前記測定工程は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光偏光解消法（ＦＰ）、及び蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）よりなる群から選ばれる１種の測定方法を用いて、前記活性型転写因子量を測定することにより実行される請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
【請求項５】
前記活性型転写因子量は、下記反応系Ａにおける蛍光物質の測定結果Ａ及び下記反応系Ｂにおける蛍光物質の測定結果Ｂに基づいて求められる請求項１〜４のいずれかに記載の判定方法；
反応系Ａ：前記生体試料、前記活性型転写因子が特異的に結合する塩基配列（Ｗｓｅｑ）を有する蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）、及び前記配列（Ｗｓｅｑ）を含む非標識核酸プローブ（Ｐｗ）を含み、ＰｗはＰｆｗよりも多く含む系、
反応系Ｂ：生体試料、蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）、及び前記活性型転写因子が特異的に結合しない非標識核酸プローブ（Ｐｎ）を含み、Ｐｎは試薬Ａ中のＰｗと同等量を含む系。
【請求項６】
前記測定工程は、
前記反応系Ａ及び反応系Ｂの蛍光物質の並進拡散時間を蛍光相関分光法により測定し、
前記反応系Ａで測定された並進拡散時間Ｔａと前記反応系Ｂで測定された並進拡散時間Ｔｂとの差（｜Ｔａ−Ｔｂ｜）に基づいて、前記活性型転写因子量を算出することにより実行される請求項５に記載の判定方法。
【請求項７】
ステロイド投与前の患者から採取された生体試料に含まれる、前記活性型転写因子量を測定する工程を、更に含み、
前記判定工程は、ステロイド投与前の活性型転写因子量とステロイド投与後の活性型転写因子量とを比較した結果に基づいて行なわれる請求項１〜６のいずれかに記載の判定方法。
【請求項８】
ステロイド投与後の患者から経時的に採取された生体試料に含まれる活性型転写因子量を測定する第２測定工程を、更に含み、
前記判定工程は、それぞれの測定結果を比較した結果に基づいて行なわれる請求項１〜７のいずれかに記載の判定方法。
【請求項９】
刺激付与前の患者から採取された生体試料に含まれる、炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子量（Ｍ１）を測定する工程；
刺激付与３０〜１２０分後の前記患者から採取された生体試料に含まれる、前記活性型転写因子量（Ｍ２）を測定する工程；
刺激付与前の活性型転写因子量（Ｍ１）と刺激付与後の活性型転写因子量（Ｍ２）とを比較した結果に基づいて、患者の全身性炎症反応症候群の発症を予測する工程
を含む全身性炎症反応症候群の発症予測方法。
【請求項１０】
ステロイド投与後の患者から採取された生体試料について測定された、炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子量に関する情報を取得する取得手段；
前記取得手段により取得された情報に基づいて、患者のステロイド感受性を判定する判定手段；及び
前記判定手段による判定結果を出力する出力手段；
を備えたステロイド感受性の判定装置。
【請求項１１】
前記取得手段は、ステロイド投与後の患者から経時的に採取された生体試料に含まれる、前記活性型転写因子量に関する経時的データを取得し、
前記判定手段は、前記経時的データの変化に基づいて、患者のステロイド感受性を判定する請求項１０に記載の判定装置。
【請求項１２】
前記取得手段は、さらに、ステロイド投与前の患者から採取された生体試料に含まれる、前記活性型転写因子量に関する情報（以下「投与前活性型転写因子量情報」という）を取得し、
前記判定手段は、前記取得手段により取得された前記投与前活性型転写因子量情報と、前記ステロイド投与後の患者から取得された活性型転写因子量情報とに基づいて、ステロイド感受性を判定する請求項１０又は１１に記載の判定装置。
【請求項１３】
刺激付与される患者の刺激付与前及び刺激付与後に採取された生体試料について測定された、炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子に関する情報を取得する取得手段；
前記取得手段により取得された情報に基づいて、前記患者の全身性炎症反応症候群の発症を予測する予測手段；及び
前記予測手段による予測結果を出力する出力手段；
を備えた全身性炎症反応症候群の発症予測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋梗塞や心不全患者の動脈弁置換手術、癌患者の腫瘍切除手術などの侵襲性の大きい外科手術に伴って起る全身性炎症性症候群（ＳＩＲＳ）等の炎症反応を抑制するために投与されたステロイド投与の効果を迅速に判定するステロイド感受性の判定方法及び判定装置、並びにＳＩＲＳの発症予測方法及び予測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、全身性又は局所性の炎症を起こしている患者に対しては、一般に抗炎症剤であるステロイドが投与されているが、その臨床的効果は十分ではないといった報告もある。また、抗炎症治療としてのステロイド投与に関しては、病態に対するステロイド投与の明確なプロトコルが確立されていないことから、過剰投与となって感染症を引き起すことになったり、連続投与が必要な場合に投与不十分なために、炎症抑制効果が不十分になったりする。
【０００３】
このため、臨床現場においては、ステロイド投与による効果を確認しながら、ステロイド投与スケジュール、適正な投与量を決めていきたいといった要望があり、ステロイド投与による効果を判定、測定する方法が望まれている。
【０００４】
ステロイド投与の効果を知る方法としては、炎症に関連するサイトカインの量を測定する方法がある。しかし、ステロイド投与により実際に炎症性サイトカインの産生が抑制され、あるいはそれらが代謝、分解されてサイトカイン量が減少するまでの応答には時間がかかる。しかもサイトカイン量の主な測定方法であるＥＬＩＳＡでは、患者の試料採取から測定結果が得られるまでにも時間がかかる。このような理由から、ステロイド投与の効果が現われはじめ、炎症性サイトカインの産生抑制、代謝、分解がはじまっているにもかかわらず、患者から採取された試料においては、炎症性サイトカインがまだ多量に組織液中に存在しているといったような測定結果しか得られない場合がある。
【０００５】
このため、サイトカイン量に基づいて炎症反応を判断する場合、ステロイド投与効果が現われはじめているにもかかわらず、ステロイド投与が不十分であるといった判断をしてしまうおそれがある。また、人工心肺の使用や人工弁置換を伴うような侵襲性の高い外科手術中の患者の状態や、炎症状態から抗炎症状態へと症状が時々刻々と変わるＳＩＲＳのような病態に対しては、測定試料の採取時と、患者に症状の進行状態とが合致しているとは限らない。このため、炎症性サイトカインの含有量の測定結果から判定されたステロイド投与効果に基づいて、次の治療方法を選択することは必ずしも適切でない。
【０００６】
炎症性サイトカイン量が変化する前に、炎症性サイトカインの発現を予測することで、ＳＩＲＳのような時々刻々と病態が変化する疾患に対して、炎症症状が現われる前に発症を予測する診断支援方法が、ＷＯ２００６−６２１２７（特許文献１）に提案されている。ここで提案している方法は、炎症性サイトカインの産生に関与する転写因子の活性を測定することで、炎症性サイトカインが発現するか否かを予測するというものである。そして、実施例においては、刺激を付与した細胞の核抽出物から、炎症性サイトカインの発現に関与する活性型転写因子をゲルシフトアッセイで検出している。
【０００７】
しかし、特許文献１には、ステロイドの感受性の判定やステロイドの投与効果の判定について、全く記載がない。
【特許文献１】ＷＯ２００６−６２１２７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、時々刻々と変化するような病態に対して、適切なステロイド治療を行なうことができるように、炎症性サイトカインの活性型転写因子量を迅速に測定することで、ステロイドの投与効果を、短時間で知ることができるステロイド感受性の判定方法、ＳＩＲＳの発症予測方法、及びこれらの結果を出力できる装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、患者から採取した生体試料から、サイトカインの発現を調節する活性型転写因子量を、迅速に且つ高精度に定量できる方法を種々検討し、定量方法を確立することで、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明のステロイド感受性の判定方法は、ステロイド投与後の患者から採取された生体試料に含まれる、炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子量を測定する工程；及び測定結果に基づいて前記患者のステロイド感受性を判定する工程を含む。
【００１１】
前記生体試料が血球の核抽出物であることが好ましく、前記活性型転写因子は、ＮＦ−κＢであることが好ましい。
【００１２】
前記測定工程は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光偏光解消法（ＦＰ）、及び蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）よりなる群から選ばれる１種の測定方法を用いて、前記活性型転写因子量を測定することにより実行されることが好ましい。
【００１３】
前記活性型転写因子量は、下記反応系Ａにおける蛍光物質の測定結果Ａ及び下記反応系Ｂにおける蛍光物質の測定結果Ｂに基づいて求められることが好ましい。
反応系Ａ：前記生体試料、前記活性型転写因子が特異的に結合する塩基配列（Ｗｓｅｑ）を有する蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）、及び前記配列（Ｗｓｅｑ）を含む非標識核酸プローブ（Ｐｗ）を含み、ＰｗはＰｆｗよりも多く含む系、
反応系Ｂ：生体試料、蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）、及び前記活性型転写因子が特異的に結合しない非標識核酸プローブ（Ｐｎ）を含み、Ｐｎは試薬Ａ中のＰｗと同等量を含む系。
【００１４】
また、前記測定工程は、前記反応系Ａ及び反応系Ｂの蛍光物質の並進拡散時間を蛍光相関分光法により測定し、前記反応系Ａ測定された並進拡散時間Ｔａと前記反応系Ｂで測定された並進拡散時間Ｔｂとの差（｜Ｔａ−Ｔｂ｜）に基づいて、前記活性型転写因子量を算出することにより実行されることが好ましい。
【００１５】
また、本発明のステロイド感受性の判定方法は、ステロイド投与前の患者から採取された生体試料に含まれる、前記活性型転写因子量を測定する工程を更に含み、前記判定工程は、ステロイド投与前の活性型転写因子量とステロイド投与後の活性型転写因子量とを比較した結果に基づいて行なわれてもよい。あるいは、ステロイド投与後の患者から経時的に採取された生体試料に含まれる活性型転写因子量を測定する第２測定工程を、更に含み、前記判定工程は、それぞれの測定結果を比較した結果に基づいて行なわれてもよい。
【００１６】
本発明の全身性炎症反応症候群の発症予測方法は、刺激付与前の患者から採取された生体試料に含まれる、炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子量（Ｍ１）を測定する工程；刺激付与３０〜１２０分後の前記患者から採取された生体試料に含まれる、前記活性型転写因子量（Ｍ２）を測定する工程；及び刺激付与前の活性型転写因子量（Ｍ１）と刺激付与後の活性型転写因子量（Ｍ２）とを比較した結果に基づいて患者の全身性炎症反応症候群の発症を予測する工程を含む。
【００１７】
本発明のステロイド感受性の判定装置は、ステロイド投与後の患者から採取された生体試料について測定された、炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子量に関する情報を取得する取得手段；前記取得手段により取得された情報に基づいて、患者のステロイド感受性を判定する判定手段；及び前記判定手段による判定結果を出力する出力手段；を備えている。
【００１８】
前記取得手段は、ステロイド投与後の患者から経時的に採取された生体試料に含まれる、前記活性型転写因子量に関する経時的データを取得し、前記判定手段は、前記経時的データの変化に基づいて、患者のステロイド感受性を判定することが好ましい。
【００１９】
また、前記取得手段は、ステロイド投与前の患者から採取された生体試料に含まれる、前記活性型転写因子量に関する情報（以下「投与前活性型転写因子量情報」という）を、さらに取得し、前記判定手段は、前記取得手段により取得された前記投与前活性型転写因子量情報と、前記ステロイド投与後の患者から取得された活性型転写因子量情報とに基づいて、ステロイド感受性を判定することが好ましい。
【００２０】
本発明の全身性炎症反応症候群の発症予測装置は、刺激付与される患者の刺激付与前及び刺激付与後に採取された生体試料について測定された、炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子に関する情報を取得する取得手段；前記取得手段により取得された情報に基づいて、前記患者の全身性炎症反応症候群の発症を予測する予測手段；及び前記予測手段による予測結果を出力する出力手段；を備えている。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のステロイド感受性の判定方法は、炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子量に基づいて判定するので、炎症症状に変化が現われる前に、患者のステロイド感受性を知ることができる。
また、本発明の全身性炎症反応症候群の発症予測方法は、炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子に着目し、刺激付与される患者の刺激付与前後での量変化に基づいて行なうので、全身性炎症反応症候群の発症を症状が現われる前に予測することが可能であり、これによりＳＩＲＳの重症化を防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
〔活性型転写因子量の測定〕
はじめに、本実施形態の発明のステロイド感受性の判定方法、全身性炎症反応症候群発症の予測方法で採用する、活性型転写因子量の測定方法について説明する。
活性型転写因子量の測定方法は、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｍｅｎｔｈｏｄ：ＦＣＳ）、蛍光偏光解消法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ：ＦＰ）、及び蛍光共鳴エネルギー移動法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ：ＦＲＥＴ）よりなる群から選ばれる１種であることが好ましい。
【００２３】
いずれの方法においても、活性型転写因子が特異的に結合できる蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）を使用し、溶液中で前記蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）と活性型転写因子との複合体を形成させ、形成された複合体（Ｐｆｗ−転写因子複合体）と未反応の蛍光標識核酸プローブとを区別できる物理量を測定する。この物理量は、後述するように、ＦＣＳの場合は並進拡散時間、ＦＰの場合は偏光度、ＦＲＥＴの場合は蛍光強度などの測定値であり、それぞれの測定値が活性型転写因子の量を反映する情報である。
【００２４】
このような測定方法によれば、生体試料のように、２種以上のタンパク、その他の夾雑物が混合して含まれている混合系試料から、目的の活性型転写因子を分離精製する操作を行なわなくても、Ｐｆｗ−活性型転写因子複合体を検出測定することで、活性型転写因子量を知ることができる。
分離精製操作を要さず、生体試料から直接、目的の活性型転写因子量を測定することができるので、短時間で検出結果を得ることができる。また、溶液中でプローブとの結合を生成させ、溶液系で測定する方法であることから、混合系試料中の目的の転写因子に特異的に結合するプローブとの複合体を検出するアッセイ系のうち、固相にプローブを固定化して複合体を形成させる方法、例えば、表面プラズモン共鳴法や水晶発振子マイクロバランス法、ＥＬＩＳＡ、イムノアッセイと比べて、固相の非特異吸着による誤差が少なくて済む。
【００２５】
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）とは、測定用試料の溶液が共焦点領域を通過するときに発する蛍光を測定する方法である。溶液中の分子はブラウン運動により自由に移動することができるので、小さい分子は動きが速く、共焦点領域を速く通過するため蛍光の信号強度の変化が速くなるが、大きな分子は動きが遅いため蛍光信号強度の変化がおそくなる。この蛍光の信号強度の揺らぎの速さから分子の運動速度（並進拡散時間）を自己相関法により求める方法であり、蛍光標識ＤＮＡプローブとの複合体形成により共焦点領域を通過するのにかかる時間（並進拡散時間）が、蛍光標識ＤＮＡプローブ単体の並進拡散時間よりも長くなることから、並進拡散時間により、活性型転写因子との複合体の量を知ることができる。
【００２６】
蛍光偏光解消法（ＦＰ）とは、溶液中の蛍光分子が平面偏光により励起されると、蛍光分子中のフルオロフォアが励起状態で且つ定常状態を維持しているとき、同一平面に偏光蛍光を発し、フルオロフォアが励起状態中に、ブラウン運動により回転すると励起表面と異なる平面へ蛍光を発して蛍光偏光が解消されることを利用したもので、蛍光標識ＤＮＡプローブ単体のように分子容積の小さな分子では溶液中のブラウン運動により激しく回転するため低い偏光度を示し、活性型転写因子量と複合体を形成すると、溶液中におけるブラウン運動は減少し、偏光度は上昇する。よって、偏光度の変化から、複合体形成の割合を知ることができる。
【００２７】
蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）とは、ある波長で励起された蛍光分子のそばに別の分子があって発光スペクトルと吸収スペクトルに重なりがあると、蛍光分子の励起エネルギーが別の蛍光分子へ移動する蛍光共鳴エネルギー移動現象が起るので、複合体を形成することで、蛍光標識ＤＮＡプローブ単体の光強度が減衰し、新たな蛍光強度が大きくなる。従って、複合体、プローブ単体それぞれの蛍光強度を測定することで、複合体量を知ることができる。
【００２８】
以上のように、ＦＣＳでは蛍光標識された物質の並進拡散時間を測定し、ＦＰでは蛍光標識された物質の偏光度を測定し、ＦＲＥＴでは蛍光強度を測定することになるので、これらの物理量から活性型転写因子量を算出する。具体的には、タンパクとして目的の活性型転写因子（好ましくは組換え転写因子）のみを含む純系試料の溶液を調製し、これについて活性型転写因子量と、測定される物理量との関係を示す検量線を作成しておき、生体試料で測定される物理量から、検量線に基づいて活性型転写因子量を算出すればよい。
【００２９】
蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）は、後述する蛍光物質により標識され、目的とする活性型転写因子が結合する塩基配列である、コンセンサス配列（Ｗｓｅｑ）を含むものであれば、特に制限されるものではない。また、核酸を構成する塩基は、ＤＮＡ構成塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、チミンの他、ＲＮＡ構成塩基であるウラシル、さらにＰＮＡなど、又はこれらの修飾塩基を使用することができる。また、Ｐｆｗは、ステムループ構造を形成しているものが好ましく用いられる。ステムループ構造を有するプローブは、コンセンサス配列（Ｗｓｅｑ）を含んだセンス鎖又はアンチセンス鎖を鋳型として相補鎖を作製し、これらをハイブリダイズさせた後、アデニン又はチミンによって架橋することでステムループ構造を形成させることにより作製することができる。また、蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）の総塩基数は特に制限されるものではないが、４６〜７４個程度の核酸プローブが好ましい。
【００３０】
標識に使用される蛍光物質としては、核酸プローブを標識できるものであれば特に制限されるものではない。例えば、ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ５４６、ＴＭＲ、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７などが挙げられ、特にＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎが好ましく用いられる。これらの蛍光物質は既に公知であり、一般に入手可能である。
【００３１】
生体試料に含まれる活性型転写因子量の測定は、溶液中の分子のブラウン運動が関係していることから、溶液の粘度や他のタンパク等の夾雑物が共存する場合、測定される物理量はこれらの影響を受けることになる。このため、夾雑物の影響がない系で作成した検量線から算出される量と、実際の生体試料に含まれる量とは違った値になってしまう場合が少なくない。また、試料によって夾雑物の含有量や溶液の粘度が異なることから、測定対象の含有量が等しい場合であっても、検量線から算出される量は異なってしまうといった場合がある。この点、反応系Ａ及び反応系Ｂそれぞれの測定結果を用いて活性型転写因子量を求めることで、夾雑物の共存による影響を相殺できるので、検量線から算出される含有量の正確度が高くなる。
【００３２】
反応系Ａとは、目的の活性型転写因子と結合する配列を有する蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）を含有し、且つＰｆｗと同じ塩基配列を有する非標識核酸プローブ（Ｐｗ）をＰｆｗの含有量より多く含有する試薬Ａと、生体試料との混合系である。ここで、試薬Ａ中の蛍光標識プローブ（Ｐｆｗ）の含有量は、測定試料中に含まれる標的の転写因子を捕捉するのに充分な量である。試薬Ａ中の非標識核酸プローブ（Ｐｗ）の含有量は、Ｐｆｗの含有量よりも多い量で、具体的には１０倍以上の量、好ましくは５０倍以上の量が含有されていることが好ましい。
【００３３】
反応系Ｂとは、試薬Ａにおける非標識核酸プローブ（Ｐｗ）に代えて、目的とする活性化転写因子が結合しない非標識核酸プローブ（Ｐｎ）を含有させた試薬Ｂと、生体試料との混合系である。すなわち、試薬Ｂには、コンセンサス配列（Ｗｓｅｑ）を有する蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）、及び目的の転写因子が結合しない非標識核酸プローブ（Ｐｎ）を、非標識核酸プローブＰｗと同等量含有する。
【００３４】
本発明に使用する非標識核酸プローブ（Ｐｗ）は、蛍光物質により標識されておらず、測定対象となる活性型転写因子が結合するコンセンサス配列（Ｗｓｅｑ）を含むものであれば、特に制限されるものではない。非標識核酸プローブ（Ｐｗ）の核酸配列全体が蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）の核酸配列全体と等しいことが望ましいが、目的とするＤＮＡ結合タンパクの配列部分以外の配列で、当該結合配列に影響与えない部分であれば、数個程度異なっていてもよい。また、非標識核酸プローブ（Ｐｗ）は、上述の蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）と同様に、コンセンサス配列（Ｗｓｅｑ）を含み、且つステムループ構造を形成していることが好ましい。
【００３５】
活性型転写因子が結合しない核酸配列からなる非標識核酸プローブ（Ｐｎ）は、蛍光物質により標識されておらず、プローブ全体において上記コンセンサス配列（Ｗｓｅｑ）を含まないものであれば特に限定されないが、当該プローブに含まれる総塩基数が、前記蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）及び非標識核酸プローブ（Ｐｗ）と同じ塩基数であることが好ましい。また、蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）及び非標識核酸プローブ（Ｐｗ）と同様に、ステムループ構造を形成していることが好ましい。
【００３６】
尚、試薬Ａ、試薬Ｂには、上記核酸プローブの他、核酸プローブに対する非特異結合を抑制するために、ｐｏｌｙ（ｄＩｄＣ）が含有されていることが好ましい。また、試薬Ａの溶媒としては、核酸プローブの２本鎖が安定して存在でき、且つ標的とする活性型転写因子が安定して存在することにより、核酸プローブと転写因子が結合できるｐＨ、塩濃度を保持できるものが用いられる。具体的には、Ｔｒｉｓバッファー、Ｈｅｐｅｓバッファー、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅバッファーなどに、塩化ナトリウム、２価金属イオン捕捉剤としてＥＤＴＡ、ＤＴＴなどを適宜添加した溶液を用いることができ、転写因子の種類に応じて、適宜選択される。
【００３７】
ＦＣＳの測定方法で、上記のような反応系Ａ及び反応系Ｂを利用した場合、以下のようにして活性型転写因子量を求める。
すなわち、反応系Ａ及び反応系Ｂそれぞれに、共焦点レーザ光を照射し、蛍光相関分光法により、反応系Ａにおける並進拡散時間（Ｔａ）を、反応系Ｂにおける並進拡散時間（Ｔｂ）を求めて、両者の並進拡散時間の差（｜Ｔａ−Ｔｂ｜）を算出する。予め作成された転写因子量と並進拡散時間との関係を示す検量線に基づいて、前記並進拡散時間の差（｜Ｔａ−Ｔｂ｜）から、試料中の活性型転写因子量を算出する。
【００３８】
反応系Ａでは、蛍光標識核酸プローブ（Ｐｆｗ）に比べて、非標識核酸プローブ（Ｐｗ）が過剰に含まれていることから、活性型転写因子は、優先的にＰｗと結合することになる。よって、反応系Ａ中の蛍光標識物質は、Ｐｆｗと考えられるから、反応系Ａの並進拡散時間（Ｔａ）はＰｆｗの並進拡散時間となる。
一方、反応系Ｂでは、過剰に含まれている非標識核酸プローブ（Ｐｎ）は、標的の転写因子とは実質的に結合しないので、試料中の活性型転写因子は蛍光標識核酸ブローブ（Ｐｆｗ）に結合する。よって、反応系Ｂの並進拡散時間（Ｔｂ）は、反応系Ｂに含まれる蛍光標識物質、すなわちＰｆｗと活性型転写因子の複合体（Ｐｆｗ−転写因子複合体）、及び未反応のＰｆｗの並進拡散時間となる。
【００３９】
従って、反応系Ｂの並進拡散時間（Ｔｂ）と反応系Ａの並進拡散時間（Ｔａ）の差は、Ｐｆｗ−転写因子複合体の有無に基づく拡散時間の差に相当すると考えられる。このような反応系では、複合体のブラウン運動に対する他のタンパクの影響は、反応系Ａ、Ｂともに同じである。従って、他のタンパクの影響を相殺できるので、純系試料を用いて作製した検量線から算出される含有量の正確度が高くなる。
【００４０】
〔ステロイド感受性の判定方法〕
本発明のステロイド感受性の診断方法は、ステロイド投与後の患者から採取された生体試料に含まれる、炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子量を測定し、測定結果に基づいて、前記患者のステロイド感受性を判定する方法である。
【００４１】
生体試料としては、患者から採取された細胞を含む液体試料で、患者の血液、尿、髄液、唾液、痰などが挙げられるが、炎症反応、ステロイドの応答が現われやすく、採取容易という点から、血液、好ましくは、血球の核抽出物が用いられる。これは、炎症性サイトカインの発現量に関与する活性型転写因子が、核抽出物に多く存在するためである。
【００４２】
患者からの測定試料の採取は、ステロイド投与後、１０分〜５時間後に行なうことが好ましく、転写因子の種類、患者の状態、ステロイド薬の代謝速度等によって適宜選択される。例えば、ＮＦ−κＢであれば、３０分〜４時間後に行なうことが好ましい。
【００４３】
ステロイド投与後の測定試料の採取は、１回に限らず、経時的に行なうことが好ましい。これにより、ステロイド投与による活性型転写因子量の経時的変化を知ることができる。活性型転写因子量の経時的変化を知ることで、患者の感受性の個人差、ステロイド薬の種類の違いによる代謝、分解速度の違い等の種々の要因を考慮して試料採取時間を決定しなくても、精度の高いステロイド感受性の判定結果を得ることが可能となる。
【００４４】
また、ステロイド投与前にも測定試料を採取することが好ましい。活性型転写因子量は個人差があり、患者の病態にも依存するので、ステロイド投与前後の変化を見ることで、信頼性の高い判定結果を得ることができる。
【００４５】
患者から採取した試料から核内抽出物を含む試料の調製方法は特に限定しないが、例えば、細胞を低張液で処理して膨張させ、ホモジナイザー又はシリンジを用いて、細胞膜を破壊し、遠心により核ペレットを単離し、これを高張液又は界面活性剤で処理することにより、核蛋白質を抽出し、遠心の後、上清を回収するといった方法が挙げられる。この上清には、核から抽出されたタンパク質が含有されている。核抽出物の調製は、公知の方法を用いて行なえばよく、また市販のキットを試用することもできる。例えば、市販のキットとしては、Ｎｏｖａｇｅｎ社のタンパク抽出キットであるＮｕｃＢｕｓｔｅｒ（登録商標）等が挙げられる。患者からの試料採取から測定に供する試料調製までの時間は、出来る限り短くすることがステロイド感受性の効果を迅速に判定する観点から好ましい。
【００４６】
炎症性サイトカインとしては、炎症症状を引き起すサイトカインであり、ステロイド投与によりその発現が変化するものであれば、特に制限されるものではないが、Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｏｒｏｓｉｓ因子（ＴＮＦα）、インターロイキン１、インターロイキン６、インターロイキン８、インターロイキン１８が挙げられる。
【００４７】
測定対象とする活性型転写因子としては、これらの炎症性サイトカインの発現を調節する転写因子であれば、特に制限されるものではない。例えば、ＡＰ−１、ＮＦ−κＢ、ＥＧＲ１、ＣＲＥＢファミリー、ＳＰ１、ＡＰ−２、Ｃ／ＥＢＰファミリーなどが挙げられ、これらのうち、ＮＦ−κＢが好ましい。
【００４８】
以上のようにして調製した生体試料を、上述の定量方法に従って、該当する物理量を測定し、予め作成された検量線に基づいて、測定された物理量から活性型転写因子量を算出する。いずれも試料調製から、プローブとの反応時間、測定にかかる時間の合計、すなわち試料調製から定量結果を得るまでの時間は３０分以内とすることが可能である。
【００４９】
定量結果、すなわち患者から採取された試料に含まれる活性型転写因子量により、ステロイド感受性を判定する。判定は、具体的には、下記により行なうことが好ましい。
（１）測定結果と、ステロイド投与前の患者から採取された試料に含まれていた活性型転写因子量と比較する。測定結果が、ステロイド投与前の活性型因子量よりも減少していれば、患者はステロイド感受性が高く、逆に増加又はほとんど変化しない場合には、患者のステロイド感受性は低いと判定することができる。
【００５０】
（２）ステロイド投与後、経時的に患者から試料を採取し、当該試料における活性型転写因子量の測定結果を得る。測定結果が経時的に低下していれば、患者はステロイド感受性が高いと判定することができ、経時的に増加又は変化しない場合には、ステロイド感受性が低いと判定することができる。
【００５１】
得られた判定結果から、臨床現場の医師は、当該患者のステロイド投与効果を判定することができる。例えば、代謝速度なども含めたステロイド投与効果、患者特有のステロイド感受性を判定することができ、当該判定結果に基づいて、その後のステロイド投与量、投与タイミングなどを含めた投与スケジュールを含めたステロイド治療スケジュールを決めることができる。さらに、活性型転写因子量の経時的変化に基づいて、例えば、ステロイド投与により炎症性サイトカイン発現は抑制される方向にあるか、その抑制が不十分であるか、単に効き方が遅いだけで、数時間後には炎症はおさまるかといったことも予測できる。
【００５２】
〔全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の発症予測方法〕
本実施形態のＳＩＲＳの発症予測方法は、刺激付与前の患者から採取された生体試料に含まれる、炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子量（Ｍ１）を測定する工程；
刺激付与から３０〜１２０分後の前記患者から採取された生体試料に含まれる、前記活性型転写因子量（Ｍ２）を測定する工程；
刺激付与前の活性型転写因子量（Ｍ１）と刺激付与後の活性型転写因子量（Ｍ２）とを比較した結果に基づいて、患者の全身性炎症反応症候群の発症を予測する工程
を含む。
【００５３】
ここでいう刺激とは、炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの発現に影響を及ぼす刺激であれば、特に制限されるものではないが、例えば、ステロイド等の薬剤投与、心筋梗塞の弁置換や腫瘍部の切除等の侵襲性の大きい外科的手術、手術における切開、切除、人工心肺の使用などの手術操作、さらにはけが、火傷、感染などが挙げられる。
【００５４】
患者からの生体試料の採取は、上記のような刺激付与前と刺激付与後である。刺激付与前の試料採取は、患者の平常時であってもよいし、刺激付与直前、例えば、手術前であってもよい。刺激付与後の試料採取は、少なくとも１回は、刺激付与から１０分〜５時間後に行なうことが好ましく、転写因子の種類、患者の状態等によって適宜選択される。特に刺激付与から３０〜１２０分後に、試料採取を行なうことが好ましい。これは、刺激付与から３０〜１２０分後に炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの発現に関与する転写因子が核内に移行して、活性型転写因子として、生体試料の核抽出物に含まれるようになっていると考えられるからである。
【００５５】
測定に供する生体試料は、上記ステロイド投与効果の判定方法と同様、血球の核抽出物であることが好ましい。また、測定対象となる転写因子は、炎症性サイトカインの他、抗炎症性サイトカインの発現に関与する転写因子である。いずれも炎症反応の亢進、減退により発現量が変化するサイトカインだからである。炎症性サイトカインの転写因子としては、上記ステロイド投与効果の判定方法で測定対象とした転写因子が挙げられる。
【００５６】
抗炎症性サイトカインとしては、インターロイキン１０、インターロイキン４、インターロイキン２、インターロイキン１レセプターアンタゴニストなどが挙げられ、抗炎症性サイトカインの発現に関与する転写因子としては、ＳＴＡＴファミリー、ＡＰ１、ＮＦＡＴ、Ｏｃｔ−１、ＳＰ１などが挙げられる。
【００５７】
刺激付与前に採取した試料に含まれる活性型転写因子量（Ｍ１）と刺激付与後に採取した試料に含まれる活性型転写因子量（Ｍ２）とを比較する。比較結果により炎症反応が全身性炎症性反応へと移行し重症化するかを予測できる。
【００５８】
例えば、測定対象が炎症性サイトカインの発現に関与する転写因子の場合には、Ｍ１よりもＭ２が大きくなっていると、活性型転写因子量が増大していることを意味し、炎症性サイトカインの発現量が増大してくると予測される。ひいては炎症反応が発症すると予測される。一方、Ｍ２がＭ１とあまり変わらない場合や、逆に減少している場合には、活性型転写因子量が増大していないことを意味する。このことは、炎症性サイトカイン量がそれほど変化しないと予測できるので、ひいては、重症な炎症反応は起らないであろうと予測される。
【００５９】
ここで、炎症反応とは、侵襲に対する生体の防御反応であり、炎症反応が強すぎると全身性の炎症反応へと移行する。特に白血球数（１２０００／μｌ以上又は４０００／μｌ以下あるいは未熟顆粒球１０％以上）、発熱（３８℃以上又は３６℃以下）、頻脈（２０／分以上又はＰａＣＯ２、３２Ｔｏｒｒ以下）、心拍数（９０／分以上）の４項目中、２項目以上が該当する場合、ＳＩＲＳと診断される。
【００６０】
〔ステロイド感受性の判定装置〕
本実施形態のステロイド感受性の判定装置は、ステロイド投与後の患者から採取された生体試料について測定された、炎症性サイトカインの活性型転写因子の量に関する情報を取得する取得手段；前記取得手段により取得された情報に基づいて、患者のステロイド感受性を判定する判定手段；及び前記判定手段による判定結果を出力する出力手段を備えている。
【００６１】
本発明の判定装置の一実施形態について、図１のハードウェア構成例に基づいて説明する。
本実施形態に係る判定装置１００は、本体１１０と、ディスプレイ１２０と、入力デバイス１３０とから主として構成されたコンピュータ１００ａによって構成されている。本体１１０は、ＣＰＵ１１０ａと、ＲＯＭ１１０ｂと、ＲＡＭ１１０ｃと、ハードディスク１１０ｄと、読出装置１１０ｅと、入出力インタフェース１１０ｆと、通信インタフェース１１０ｇと、画像出力インタフェース１１０ｈとから主として構成されており、ＣＰＵ１１０ａ、ＲＯＭ１１０ｂ、ＲＡＭ１１０ｃ、ハードディスク１１０ｄ、読出装置１１０ｅ、入出力インタフェース１１０ｆ、および画像出力インタフェース１１０ｈは、バス１１０ｉによってデータ通信可能に接続されている。
【００６２】
図１に示すステロイド感受性の判定装置１００の構成において、入出力インタフェース１１０ｆが情報取得手段に該当し、ディスプレイ１２０が判定結果を出力する出力手段に該当する。また、判定手段はＣＰＵ１１０ａが該当し、ＲＯＭ１１０ｂ、ＲＡＭ１１０ｃ、ハードディスク１１０ｄは記憶手段である。
【００６３】
入出力インタフェース１１０ｆは、例えばUSB，IEEE1394，RS-232C等のシリアルインタフェース、SCSI，IDE，IEEE1284等のパラレルインタフェース、およびＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器等からなるアナログインタフェース等から構成されている。入出力インタフェース１１０ｆには、キーボードおよびマウスからなる入力デバイス１３０が接続されており、ユーザが当該入力デバイス１３０を使用することにより、コンピュータ１００ａにデータを入力することが可能である。
【００６４】
入力デバイス１３０を介して、ＦＣＳ測定装置などで測定された物理量（測定データ）をユーザーが入力してもよいし、活性型転写因子を測定する測定装置、例えば、ＦＣＳ測定装置の出力部と入出力インタフェース１３０とを接続して、測定により得られた並進拡散時間に該当するデジタル信号を、活性型転写因子の量に関する情報として直接入力されるようにしてもよい。
【００６５】
入力される測定データは、ステロイド投与後の患者から採取された試料における活性型転写因子の量に関する情報の他、ステロイド投与前の患者から採取された試料における活性型転写因子の量に関する情報、さらには経時的に採取した試料における活性型転写因子の量に関する情報を含んでいてもよい。
【００６６】
判定手段であるＣＰＵ１１０ａは、記憶手段としてのハードディスク１１０ｄやＲＯＭ１１０ｂに記憶されているコンピュータプログラムをＲＡＭ１１０ｃにロードし、実行することが可能である。そして、後述するようなアプリケーションプログラム１４０ａを当該ＣＰＵ１１０ａが実行することにより、コンピュータ１００ａが判定システム１００として機能する。具体的には、情報取得手段から入力された測定データに基づいて、予め記憶された検量線データに基づき、試料に含まれる活性型転写因子量を算出する。算出された活性型転写因子量に基づいて、ステロイド感受性を判定する。具体的には、ステロイド投与前の活性型転写因子量との比較結果、記憶手段に記憶されている健常人データ（閾値）との比較結果、経時的に取得された測定データから算出される活性型転写因子量の変化などに基づいて、判定結果を出力する。
【００６７】
出力される判定結果は、具体的には、数時間前にステロイドを投与した患者の活性型転写因子量が健常人の平均レベルと比べて多いか少ないか、ステロイド投与後に経時的に取得した活性型転写因子量であれば、活性型転写因子量が増加傾向にあるか、減少傾向にあるかといった結果が出力される。ステロイド投与前の活性型転写因子量が測定された場合には、投与前の活性型転写因子量と投与後の活性型転写因子量とを比較して減少しているかどうかの判定結果が出力される。
【００６８】
記憶手段には、測定データ（測定された物理量）に基づいて、活性型転写因子を算出するのに必要なデータ、さらには、判定手法に応じて、ステロイド投与効果を判定するための健常人データなどが記憶されていてもよい。さらに、今後必要な投与量、比較結果が閾値と同程度以下の場合にはステロイド投与中止といったメッセージ出力などの情報を記憶させてもよく、これらの情報は、ハードディスク１１０ｄに記憶される。
【００６９】
ＲＯＭ１１０ｂは、ＣＰＵ１１０ａにより実行されるコンピュータプログラムおよびこれに用いるデータ等が記録されている。
【００７０】
ＲＡＭ１１０ｃは、ＳＲＡＭまたはＤＲＡＭ等によって構成されている。ＲＡＭ１１０ｃは、ハードディスク１１０ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ１１０ａの作業領域として利用される。入出力インタフェース１１０ｆから入力された、測定される物理量等の情報を、一時的に記憶してもよい。
【００７１】
ハードディスク１１０ｄには、測定データから活性型転写因子量を計算するためのプログラム、感受性判定のためのプログラム、閾値と比較して判定結果を出力するためのプログラムの他、オペレーティングシステム（例えば米マイクロソフト社が製造販売するWindows（登録商標）等のグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーティングシステム）およびアプリケーションプログラム等、ＣＰＵ１１０ａに実行させるための種々のコンピュータプログラムがインストールされている。後述するアプリケーションプログラム１４０ａも、このハードディスク１１０ｄにインストールされている。
【００７２】
読出装置１１０ｅは、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、またはＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によって構成されており、可搬型記録媒体１４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。また、可搬型記録媒体１４０には、コンピュータを本実施形態に係る判定装置として機能させるためのアプリケーションプログラム１４０ａが格納されており、コンピュータ１００ａが当該可搬型記録媒体１４０から本発明に係るアプリケーションプログラム１４０ａを読み出し、当該アプリケーションプログラム１４０ａをハードディスク１１０ｄにインストールすることが可能である。
【００７３】
なお、前記アプリケーションプログラム１４０ａは、可搬型記録媒体１４０によって提供されるのみならず、電気通信回線（有線、無線を問わない）によってコンピュータ１００ａと通信可能に接続された外部の機器から前記電気通信回線を通じて提供することも可能である。例えば、前記アプリケーションプログラム１４０ａがインターネット上のサーバコンピュータのハードディスク内に格納されており、このサーバコンピュータにコンピュータ１００ａがアクセスして、当該コンピュータプログラムをダウンロードし、これをハードディスク１１０ｄにインストールすることも可能である。
【００７４】
画像出力インタフェース１１０ｈは、ＬＣＤまたはＣＲＴ等で構成されたディスプレイ１２０に接続されており、ＣＰＵ１１０ａから与えられた画像データに応じた映像信号をディスプレイ１２０に出力するようになっている。ディスプレイ１２０は、入力された映像信号にしたがって、判定手段が行なった判定結果を表示する。
【００７５】
臨床現場の医師は、出力されたステロイド感受性の判定結果、即ち、数時間前に患者に投与したステロイドによる活性型転写因子量についての判定結果を知ることができ、これにより判定対象となった活性型転写因子が関与する炎症性サイトカインの発現が増大、減少するといったこと、ひいては患者の炎症症状がステロイド投与により収まる傾向にあるのか、さらなるステロイド投与が必要なのかといった診断、さらには今後のステロイド投与量、ステロイド投与スケジュールなどのステロイド治療プログラムを決める有用な判断材料として活用できる。
特に癌患者の腫瘍切除手術後のＩＣＵで、適切なステロイド治療、ステロイド投与タイミングを決めることで、術後のＳＩＲＳ発症や重症化およびステロイドの過剰投与による副作用を予防することが可能となる。
【００７６】
なお、上記実施形態においては、測定データ（活性型転写因子量に関する情報）と検量線データに基づいて活性型転写因子量を算出し、算出された活性型転写因子量に基づいてステロイド感受性の判定を行なうようにしているが、これに限定されるものではなく、例えば、ステロイド投与前後の測定データの比較、健常人データと測定データとの比較、あるいは経済的に取得された測定データの変化などに基づいてステロイド感受性の判定を行なうようにしてもよい。
【００７７】
〔全身性炎症反応発症予測装置〕
本実施形態の全身性炎症反応発症予測装置は、刺激付与される患者の刺激付与前及び刺激付与後に採取された生体試料について測定された、炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子の量に関する情報を取得する取得手段；前記取得手段により取得された情報に基づいて、前記患者のＳＩＲＳの発症を予測する予測手段；及び前記予測手段による予測結果を出力する出力手段；を備えている。
【００７８】
上記発症予測装置は、ステロイド感受性判定装置１００と同様の構成のものを採用できる。
情報取得手段は、システムにおける入出力インタフェース１１０ｆが該当する。情報取得手段が取得する情報が、ステロイド感受性の判定装置ではステロイド投与後の患者から採取された活性型転写因子の量に関する情報であったのに対し、ＳＩＲＳの発症予測装置では、刺激付与される患者の刺激付与前及び刺激付与後に採取された生体試料について測定された、炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの発現を調節する活性型転写因子の量に関する情報である。
【００７９】
前記予測手段は、ＣＰＵ１１０ａが該当する。予測手段であるＣＰＵ１１０ａは、記憶手段（ＲＯＭ１１０ｂ、ハードディスク１１０ｄ）にインストールされたコンピュータプログラムを実行することで、情報取得手段から入力された測定データと、予め記憶された検量線データに基づき、試料に含まれる活性型転写因子量を算出する。算出された刺激付与前の活性型転写因子量（Ｍ１）と刺激付与後の活性型転写因子量（Ｍ２）の値を比較し、さらに経時的に活性型転写因子の量が算出されている場合には、刺激付与前からの活性化転写因子量の変化を求め、これらの比較結果、変化の様子などに基づいて、ＳＩＲＳの発症を予測する。
【００８０】
例えば、活性型転写因子として、炎症性サイトカインの発現を調節する転写因子を測定対象としていた場合、Ｍ２の値がＭ１より大きい、活性型転写因子量が増加傾向にあるといった場合には、ＳＩＲＳ重症化のおそれありといった予測をし、Ｍ２の値がＭ１より小さく、活性型転写因子量が減少傾向にあるといった場合には、ＳＩＲＳ重症化の危険は小さいといった予測をする。
【００８１】
出力手段は、ステロイド感受性判定装置の出力手段と同様に、ディスプレイ１２０が、判定結果を出力する出力手段に該当する。ステロイド感受性の判定装置ではステロイド感受性についての判定結果を出力するのに対し、ＳＩＲＳの発症予測装置では、予測手段により予測された結果、すなわちＳＩＲＳ重症化のおそれあり、ＳＩＲＳ発症の危険は少ないといったような予測結果を出力する。
【００８２】
従って、このような予測結果を得た臨床現場では、ＳＩＲＳ重症化のおそれがある場合には、抗炎症剤の投与を決定したり、ＳＩＲＳ発症の危険が少ないといった予測結果であれば、現時点における発熱症状などがあっても、即座にステロイド治療などを選択せず、症状を観察するといった決定をすることができる。
【００８３】
なお、上記実施形態においては、測定データ（活性型転写因子量に関する情報）と検量線データに基づいて活性型転写因子量を算出し、算出された活性型転写因子量に基づいてＳＩＲＳの発症予測を行なうようにしているが、これに限定されるものではなく、例えば、刺激付与前後の測定データの比較、あるいは閾値データと測定データとの比較などに基づいてＳＩＲＳの発症予測を行なうようにしてもよい。
【実施例】
【００８４】
〔測定に使用する試薬、核酸プローブ〕
（１）ＦＣＳバッファー
ＦＣＳ測定溶液調製のために使用した溶媒で、下記組成を有している。
【表１】
2009011245.tif 000003
（２）核酸プローブ
（２−１）蛍光標識されたコンセンサス配列（Ｗｓｅｑ）を有する核酸プローブ（Ｐｆｗ）
４塩基のアデニンをループ部分とするステムルーム構造を形成する下記塩基配列の核酸の５’末端に、蛍光色素としてＴＡＭＲＡ（シグマジェノシス社）を結合したものである。下記配列のうち、Ｗｓｅｑは、５’末端から８番目〜１７番目の領域である。
【００８５】
【化１】
2009011245.tif 000004
【００８６】
なお、Ｐｆｗは、シグマジェノシス社で合成されたＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｒｉｄｅ（凍結乾燥品）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液で溶解し、Ｐｆｗ濃度１００μＭとした後、９５℃で１０分間、６５℃で３０分間保持して１本鎖にした後、再び常温に戻してステムループ構造を形成させて、使用に供した。
【００８７】
（２−２）非標識の結合配列（Ｗｓｅｑ）を有する核酸プローブ（Ｐｗ）
蛍光色素が結合されていない以外は、Ｐｆｗと同様の塩基配列（下記配列）を有する核酸プローブである。
【００８８】
【化２】
2009011245.tif 000005
【００８９】
なお、Ｐｗは、Ｐｆｗと同様に、一旦、熱変性により１本鎖にした後、再び常温に戻してステムループ構造を形成させて、使用に供した。
【００９０】
（２−３）非標識で結合しない非特異タイプの核酸プローブ（Ｐｎ）
下記塩基配列の核酸プローブであり、４塩基のアデニンをループ部分とするステムループ構造を形成している。
【００９１】
【化３】
2009011245.tif 000006
【００９２】
なお、Ｐｎも、Ｐｆｗと同様に、一旦、熱変性により１本鎖にした後、再び常温に戻してステムループ構造を形成させて、使用に供した。
【００９３】
〔採取血液の活性型転写因子量の測定方法〕
（１）採取血液からの末梢血単核球の活性型転写因子測定用溶液の調製
患者から真空採血管により採取した血液に等量の生理食塩水を加え、２倍に希釈した後、リンパ球単離用比重液としてＦｉｃｏｌｌ（アマシャムバイオサイエンス社）の上に重層し、遠心により赤血球、末梢血単核球及び血漿成分に分離した。末梢血単球分画を回収し、生理食塩水で洗浄後、遠心操作を行ない、上清を除去して細胞のペレットを得た。
Ｎｏｖａｇｅｎ社のタンパク抽出キットであるＮｕｃＢｕｓｔｅｒ（登録商標）を使用して、上記細胞ペレットから核抽出物を調製した。すなわち、細胞のペレットを、７５μｌのＲｅａｇｅｎｔ１で分散させ、Ｖｏｒｔｅｘで１５秒間ホモジナイズし、５分間、氷上で静置した。その後、再びボルテックスで１５秒間ホモジナイズし、１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、細胞質フラクションとなる上清を回収した。得られた核ペレットに、ＤＴＴ、プロテアーゼインヒビター、及びＲｅａｇｅｎｔ２の混合液（混合比１：１：７５）４０μｌ加え、ボルテックスで１５秒間ホモジナイズし、５分間氷上で静置した。再びボルテックスで１５秒間ホモジナイズし、１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間、遠心した。得られた上清が核抽出物であり、これを活性型転写因子測定用溶液として用いた。
【００９４】
（２）転写因子量算出用検量線の作成
リコビナントＮＦ−κＢ（プロメガ社）１μｌと希釈液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、０．１％  ＮＰ−４０、１０％グリコール）３９μｌを混合し、リコビナントＮＦ−κＢ濃度３ｎｇ／μｌのキャリブレータ原液を調製した。
ＦＣＳバッファー４μｌ、１００ｎＭの蛍光標識核酸プローブＰｆｗ０．２μｌ（最終濃度１ｎＭ）、水８．８μｌ、Ｒｅａｇｅｎｔ２を５μｌ混合して、検量用反応液を調製した。
【００９５】
検量用反応液にキャリブレータ原液の希釈液を混合して、リコビナントＮＦ−κＢ濃度１．５ｎｇ／μｌ、０．８ｎｇ／μｌ、０．２ｎｇ／μｌのキャリブレータを調製した。室温で１０分間反応させた後、ＭＦ２０（オリンパス社）により、各キャリブレータの並進拡散時間を測定した。リコビナントＮＦ−κＢ濃度０ｎｇ／μｌに該当する希釈液のみと検量用反応液の混合液についても、上記キャリブレータと同様にして、並進拡散時間を測定した。
リコビナントＮＦ−κＢの濃度をＸ軸、と並進拡散時間をＹ軸にプロットし、直線性が得られる濃度範囲で最小二乗法により検量線を作成した。得られた検量線のグラフを図２に示す。
【００９６】
（３）活性型転写因子量のＦＣＳによる測定
患者から採取した血液を用いて調製した活性型転写因子測定用溶液（核抽出物）、ＦＣＳバッファー、核酸プローブ、水、Ｐｏｌｙ（ｄＩｄＣ）を、表２に示す割合で混合することにより反応系Ａ及び反応系Ｂを調製し、室温で１５分反応させた。反応終了後、ＭＦ２０（オリンパス社）により、並進拡散時間を測定し、図２に示す検量線に基づいてＮＦ−κＢの含有量を算出した。
【００９７】
【表２】
2009011245.tif 000007
【００９８】
〔採取血液中のＩＬ−６の測定方法〕
（１）採取血液からのＩＬ−６測定用溶液の調製
真空採血管により採取した血液に等量の生理食塩水を加え、２倍に希釈した後、Ｆｉｃｏｌｌ（リンパ球単離用比重液）の上に重層し、遠心して赤血球球、末梢血単核球及び血漿成分に分離した。遠心後、血漿成分を回収し、インターロイキン６（ＩＬ−６）測定用溶液として用いた。
【００９９】
（２）ＩＬ−６定量用検量線の作成
Ｅｎｄｏｇｅｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキット（ＰＩＥＲＣＥ社のＥＨ２ＩＬ６）を用いて測定した。
キットに付属のキャリブレータを、希釈溶液で段階的に希釈して、濃度が異なるキャリブレータを調製し、各濃度のキャリブレータ５０μｌをいれた各ｗｅｌｌに、希釈溶液１００μｌを添加し、室温で２時間インキュベートした。反応終了後、Ｗａｓｈバッファーにより３回洗浄し、各ウェルにビオチン化抗ＩＬ−６抗体５０μｌとＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）標識ストレプトアビジン１００μｌを添加し、室温で３０分間インキュベートした。反応終了後、Ｗａｓｈバッファーで３回洗浄し、基質を１００μｌ添加し、２０分間室温でインキュベートする。２０分後、反応停止溶液を５０μｌ加え、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度（リファレンス：５５０ｎｍ）を測定した。
キャリブレータの濃度をＸ軸、吸光度をＹ軸にプロットし、最小二乗法により検量線を作成した。なお、吸光度としては、測定された４５０ｎｍの吸光度から５５０ｎｍの吸光度を引いた値をプロットした。
【０１００】
（３）ＩＬ−６のＥＬＩＳＡによる測定
調製したサイトカイン用試料５０μｌをいれた各ｗｅｌｌに、希釈溶液１００μｌを添加し、室温で２時間インキュベートした。反応終了後、Ｗａｓｈバッファーにより３回洗浄し、各ウェルにビオチン化抗ＩＬ−６抗体５０μｌとＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）標識ストレプトアビジン１００μｌを添加し、室温で３０分間インキュベートした。反応終了後、Ｗａｓｈバッファーにより３回洗浄し、基質を１００μｌ添加し、２０分間室温でインキュベートする。２０分後、反応停止溶液を５０μｌ加え、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度（リファレンス：５５０ｎｍ）を測定した。
測定された４５０ｎｍの吸光度から５５０ｎｍの吸光度を引いた値を測定値とし、検量線に基づいて、当該吸光度からＩＬ−６量を算出した。
【０１０１】
〔ＳＩＲＳの発症予測〕
下記のような手術を行なう患者の刺激前後のＮＦ−κＢ量、ＩＬ−６量の変化を調べ、術後の様子を見た。
【０１０２】
（１）患者１（胆嚢癌）
胆嚢癌の患者に膵頭十二指腸切除手術を行なった。麻酔導入直後すなわちＡライン挿入時（９時）に患者から７ｍｌ採血した。９時１７分に手術を開始し、集中治療室（ＩＣＵ）に入室する（１９時）までの間、２時間毎に、７ｍｌずつ採血した。各時間（９時、１１時、１３時、１５時、１７時、１９時）に採取した血液から、上記調製方法にて、ＮＦ−κＢ測定用溶液及びＩＬ−６測定用溶液を調製し、上記測定方法にて、ＮＦ−κＢ量、ＩＬ−６量を求めた。各測定結果を図３及び図４に示す。
【０１０３】
この患者は、手術後３日間、白血球数の上昇、発熱、頻脈が認められ、ＳＩＲＳと診断された。手術開始２時間後からＮＦ−κＢ量が増加しており（図３参照）、手術６時間後くらいから、炎症性サイトカインであるＩＬ−６量が急激に増大していた（図４参照）。これらのことから、切除手術という刺激付与前から刺激後付与後にＮＦ−κＢ量が増大している場合には、ＳＩＲＳの発症を予測できると考える。つまり、刺激付与後まもなく変化が現われる転写因子量（活性型ＮＦ−κＢ量）の変化を見ることで、ＳＩＲＳの発症を予測することが可能である。一方、ＩＬ−６量に着目する場合、刺激付与から６時間以上経過しなければ、ＳＩＲＳ発症を予測できない。
【０１０４】
（２）患者２（大動脈弁閉鎖不全症）
大動脈弁閉鎖不全症の患者に、大動脈弁置換手術（ＡＶＲ）を行なった。麻酔導入直後すなわちＡライン挿入時（８時５０分）に患者から７ｍｌ採血した。９時３３分に手術を開始し、人工心肺離脱直後（１１時４５分）、ＩＣＵ移動時（１２時１０分）、及びＩＣＵでの翌朝８時に、７ｍｌずつ採血した。各時間に採取した血液から、上記調製方法にて、ＮＦ−κＢ測定用溶液及びＩＬ−６測定用溶液を調製し、上記測定方法にて、ＮＦ−κＢ量、ＩＬ−６量を求めた。各測定結果を図５及び図６に示す。
【０１０５】
この患者は、白血球数の上昇は見られたものの、心拍数６５−８０／分（正常レベル）であり、発熱もなく、ＳＩＲＳのクライテリアをみたさなかった。図５からわかるように、刺激となる手術前に活性型ＮＦ−κＢが存在したものの、手術開始後、大きな増加もなく、手術終了時には、開始時よりも活性型ＮＦ−κＢ量は減少していた。一方、図６からわかるように、ＩＬ−６量は、手術開始後の数時間は増加したが、翌朝には、手術前と同程度にまで下がっていた。従って、ＩＬ−６量が低いことはＳＩＲＳが発症しなかったことと合致しており、刺激付与から数時間後に採血された試料中の活性型ＮＦ−κＢ量が刺激付与前よりも増大していないことは、ＩＬ−６量のその後の減少とも合致している。よって、刺激付与後、数時間後の活性型ＮＦ−κＢ量を測定し、刺激付与前よりも増大していなければ、手術後のＳＩＲＳ発症の危険が少ないと予測することが可能である。
【０１０６】
〔ステロイド感受性の判定〕
下記のような手術を行なう患者にステロイドを投与し、ＮＦ−κＢ量、ＩＬ−６量の変化を調べた。
【０１０７】
（２）患者３（急性心筋梗塞及び心房中隔破裂）
急性心筋梗塞及び心房中隔破裂で緊急入院してきた患者に、冠動脈バイパス手術を行なった。手術開始は９時０３分であった。手術執刀直前（９時００分）に採血し、９時３９分にステロイド薬（メチルプレドニゾロン５００ｍｇ）を投与した。また、人工心肺離脱直後（１３時００分）、ＩＣＵ移動直前（１３時５０分）にそれぞれ７ｍｌずつ採血した。各時間に採取した血液から、上記調製方法にて、ＮＦ−κＢ測定用溶液及びＩＬ−６測定用溶液を調製し、上記測定方法にて、ＮＦ−κＢ量、ＩＬ−６量を求めた。各測定結果を図７及び図８に示す。
【０１０８】
図７からわかるように、手術開始時には活性型ＮＦ−κＢ量は高かったが、ステロイド投与して約３時間３０分後には、活性型ＮＦ−κＢはほとんど消失していた。一方、図８から、ＩＬ−６量については、手術開始時から４時間後では、ステロイド投与前（手術開始後）よりも増大していた。しかしながら、その後、ＩＣＵ移動直前（手術開始から約５時間後、ステロイド投与から４時間半後）には減少に転じていたものの、ステロイド投与前よりは、まだ多かった。この患者はステロイド投与効果が現われており、ステロイド感受性であると判定できる。また、ステロイド感受性の判定は、ＩＬ−６では投与から４時間半後でも明確には判定できないが、活性型ＮＦ−κＢ量に基づけば、投与後、３時間半以内の採血で判定できることがわかる。
【０１０９】
（３）患者４（大動脈弁閉鎖不全）
大動脈弁閉鎖不全症で緊急入院してきた患者に、大動脈弁置換手術を行なった。手術開始は９時２６分であった。手術執刀直前（９時１２分）に採血し、９時５３分にステロイド薬（メチルプレドニゾロン５００ｍｇ）を投与した。また、人工心肺離脱直後（１１時４８分）、ＩＣＵ移動直前（１２時５１分）にそれぞれ７ｍｌずつ採血した。各時間に採取した血液から、上記調製方法にて、ＮＦ−κＢ測定用溶液及びＩＬ−６測定用溶液を調製し、上記測定方法にて、ＮＦ−κＢ量、ＩＬ−６量を求めた。各測定結果を図９及び図１０に示す。
【０１１０】
この患者は、活性型ＮＦ−κＢ量がステロイド投与前よりもステロイド投与後の方が増大していた。また、手術開始時には、それほど活性型ＮＦ−κＢ量は多くなかったが、人工心肺離脱時（ステロイド投与２時間後）には活性型ＮＦ−κＢ量が増大し、その後、ＩＣＵ移動直前（ステロイド投与３時間後）でも、活性型ＮＦ−κＢ量が減少に転ずることはなかった。また、ＩＬ−６量については、手術開始後、人工心肺離脱時、ＩＣＵ移動直前まで、増加傾向にあった。従って、この患者は、ステロイド投与前後で活性型ＮＦ−κＢ量が増加しているだけでなく、その後も減少に転じていないので、この患者はステロイド投与効果が認められない、すなわちステロイド非感受性の患者であると判定できる。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明のステロイド感受性の判定方法によれば、ステロイド投与後、短時間でステロイド投与効果を知ることができるので、臨床現場で、本発明の判定方法を利用してステロイド感受性の判定結果を知ることで、心筋梗塞の弁置換手術や癌の腫瘍切除手術の術前、術後の炎症反応、時々刻々と症状が変化し得るＳＩＲＳのような病態に対して行なったステロイド治療効果を迅速に知り、さらにその結果に応じて、次に行なうステロイド治療における適切な量のステロイド投与、ステロイド投与スケジュールの調整に役立てることができる。
【０１１２】
また、本発明のＳＩＲＳの発症予測方法では、炎症の直接の原因となるサイトカイン量が変化するよりも速い段階でサイトカイン量と関連づけられる活性型転写因子量に基づいて予測することができるので、臨床現場、特に侵襲性の大きい手術現場で、ＳＩＲＳが重症化する前に適切な対処、治療を選択するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】本発明のステロイド感受性の判定装置の構成を示すブロック図である。
【図２】活性型転写因子量算出に用いた検量線を示すグラフである。
【図３】患者１のＮＦ−κＢ量の測定結果を示すグラフである。
【図４】患者１のＩＬ−６量の測定結果を示すグラフである。
【図５】患者２のＮＦ−κＢ量の測定結果を示すグラフである。
【図６】患者２のＩＬ−６量の測定結果を示すグラフである。
【図７】患者３のＮＦ−κＢ量の測定結果を示すグラフである。
【図８】患者３のＩＬ−６量の測定結果を示すグラフである。
【図９】患者４のＮＦ−κＢ量の測定結果を示すグラフである。
【図１０】患者４のＩＬ−６量の測定結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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