(57)【要約】【課題】より少量の被測定検体量で、より短時間において、測定対象物質を定量測定することが可能な光導波路型センサを提供することにある。【解決手段】測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路；  前記光導波路表面に配置され、測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された複数の微粒子の分散層；および  前記微粒子の分散層に対向して配置され、微粒子の径より小さい孔を有する細孔膜；を備えることを特徴とする光導波路型センサ。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路；
前記光導波路表面に配置され、測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された複数の微粒子の分散層；および
前記微粒子の分散層に対向して配置され、微粒子の径より小さい孔を有する細孔膜；
を備えることを特徴とする光導波路型センサ。
【請求項２】
前記光導波路が有機系樹脂膜であることを特徴とする請求項１記載の光導波路型センサ。
【請求項３】
前記光導波路がガラス板であることを特徴とする請求項１記載の光導波路型センサ。
【請求項４】
前記微粒子が有機樹脂ビーズであることを特徴とする請求項１記載の光導波路型センサ。
【請求項５】
前記微粒子が貴金属コロイドであることを特徴とする請求項１記載の光導波路型センサ。
【請求項６】
前記細孔膜が、メッシュまたは多孔質膜であることを特徴とする請求項１記載の光導波路型センサ。
【請求項７】
前記測定対象物質が抗原で、前記光導波路表面に固定化された第１物質および前記微粒子に固定化された第２物質が前記抗原に対する抗体であることを特徴とする請求項１記載の光導波路型センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光導波路型センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の抗原抗体反応を利用した免疫測定システムにおいては、通常、被測定検体中のタンパク質等に対応する一次抗体をウエル状の基材表面に固定化し、そのウエル内に各々所定量の被測定検体溶液、二次抗体液、発色試薬、それぞれに対する所定の洗浄液を、測定者が秤量しつつ加え、かつ排出するという複雑な手順で行われている。この免疫測定システムにおいて、被測定検体の容量は５μＬ〜２５μＬ程度必要である。
【０００３】
一方、特許文献１には必要最小の被測定検体の量が１μＬである上、被測定検体の容量が不正確でも被測定検体の測定対象物質の濃度測定が可能な濃度測定方法、センサチップが開示されている。
【特許文献１】ＷＯ２００５／０２２１５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、前述した特許文献１の発明をさらに改良し、より少量の被測定検体量で、より短時間において、測定対象物質を定量測定することが可能な光導波路型センサを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によると、測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路；
前記光導波路表面に配置され、測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された複数の微粒子の層；および
前記微粒子の層に対向して配置され、微粒子の径より小さい孔を有する細孔膜；
を備えることを特徴とする光導波路型センサが提供される。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、より少量の被測定検体量で、より短時間において、被測定検体の測定対象物質を定量測定することが可能な光導波路型センサを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の実施形態に係る光導波路型センサを説明する。
【０００８】
実施形態に係る光導波路型センサは、一例として、被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された平面光導波路を備える。被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された複数の微粒子の層（微粒子分散層）は、第１物質を含む平面光導波路表面に配置されている。微粒子の径より小さい孔を有する細孔膜は、微粒子分散層に対向して配置されている。
【０００９】
ここで測定対象物質としては、例えば血液、血清、血漿、生体試料、食品等の中に含まれる蛋白質、ペプチド、遺伝子等が挙げられる。具体的には、例えば、インスリン、カゼイン、β―ラクトグロブリン、オボアルブミン、カルシトニン、Ｃ−ペプチド、レプチン、β−２−ミクログロブリン、レチノール結合タンパク、α−１−ミクログロブリン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、トロポニン−Ｉ、クルカゴン様ペプチド、インスリン様ペプチド、腫瘍増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板成長因子、上皮増殖因子、コルチゾール、トリヨードサイロニン、サイロキシン等のハプテンホルモン、ジゴキシン、テオフィリン等の薬物、細菌、ウイルス等の感染性物質、肝炎抗体、ＩｇＥの他、そばの主要タンパク質複合体、落花生のＡｒａｈ２を含む可溶性タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
平面光導波路は、例えばフェノール樹脂、エポキシ樹脂のような熱硬化性樹脂または無アルカリガラスから形成することができる。詳細には、ここで用いる材料とは、所定の光の透過性を有する材料であって、特に、ポリスチレンを主たる構造とするエポキシ樹脂等であることが好ましい。平面光導波路への第１物質の固定化は、例えばシランカップリング剤等により疎水化処理した表面上に前記物質の疎水性相互作用により固定化する。第１物質は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体を用いることができる。
【００１１】
微粒子は、例えばラテックスビーズのような有機系樹脂ビーズもしくは金コロイドのような貴金属コロイド、または酸化チタン粒子のような無機酸化物粒子等を用いることができる。特に、ラテックスビーズ、貴金属コロイドが好ましい。ラテックスビーズ中で、後述する光導波路を伝播させる光が赤色レーザの場合、青色ラテックスビーズが好ましい。
【００１２】
微粒子は、５０ｎｍ〜１０μｍの径を有することが好ましい。
【００１３】
微粒子への第２物質の固定化は、例えば、物理吸着、あるいはカルボキシル基やアミノ基等を介した化学結合により行うことができる。第２物質は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体を用いることができる。
【００１４】
平面光導波路表面への微粒子分散層の配置は、例えばポリビニルアルコールのような水溶性樹脂に微粒子を添加したスラリを平面光導波路表面に塗布し、凍結乾燥する方法を採用することができる。
【００１５】
なお、ここでは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やポリエチレングリコール、リン脂質ポリマー、ゼラチン等のような水溶性高分子材の少なくとも何れかに微粒子を添加したスラリを塗布して、凍結乾燥することにより行うことが、さらに好ましい。
【００１６】
細孔膜は、例えば目開きが微粒子の径より小さいメッシュまたは連続気孔が微粒子の径より小さい多孔質膜を用いることができる。メッシュは、例えば金、チタンのような金属もしくはポリエチレン、ナイロンのような有機系樹脂から作ることができる。多孔質膜は、例えば金属、有機系樹脂またはシリカ、アルミナのようなセラミックから作ることができる。
【００１７】
微粒子分散層と細孔膜の距離（ギャップ）は、微粒子の大きさにもよるが、微粒子が前記径（５０ｎｍ〜１μｍの径）を有する場合、５〜１００μｍであることが好ましい。
【００１８】
実施形態に係る光導波路型センサを図１を参照して具体的に説明する。図１（ａ）は実施形態に係る光導波路型センサを示す上面図、同図（ｂ）は同図（ａ）の断面図である。
【００１９】
ガラス基板１の主面の両端部には、入射側グレーティング２ａおよび出射側グレーティング２ｂが設けられている。これらのグレーティング２ａ，２ｂは、例えば酸化チタン（ＴｉＯ2）、酸化錫（ＳｎＯ2）、酸化亜鉛、ニオブ酸リチウム、ガリウム砒素（ＧａＡｓ）、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）、ポリイミド等から形成される。例えばエポキシ樹脂のような熱硬化性樹脂からなる平面光導波路３は、グレーティング２ａ，２ｂを含む基板１主面に形成されている。低屈折率樹脂膜４は、平面光導波路３上に被覆されている。低屈折率樹脂は、例えば市販されている旭硝子株式会社製のサイトップ（登録商標）のポリ（パーフルオロブテニルビニルエーテル）等を用いることができる。低屈折率樹脂膜４には、グレーティング２ａ，２ｂ間に位置する平面光導波路３の一部が露出するよう開口して例えば矩形状の反応ホール（測定域）５を形成している。
【００２０】
被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質１１は、反応ホール５から露出する平面光導波路３表面に例えばシランカップリング剤により疎水化処理により固定化されている。被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質１２が固定化された微粒子１３の分散層は、前記物質１１が固定化された平面光導波路３表面に形成されている。この微粒子の分散層は、例えば微粒子を含む水溶性樹脂の水スラリを前記平面光導波路３に塗布、凍結乾燥することによりを形成される。
【００２１】
細孔膜であるメッシュ６は、低屈折率樹脂膜４上に反応ホール５を覆うように、かつ微粒子の分散層に所望のギャップをあけて対向するように配置されている。反応ホール５に対応する部分が開口され、接着剤層を持つ押え板７は、その接着層側をメッシュ６が重ねられた低屈折率樹脂膜４上に接着することによってメッシュ６を低屈折率樹脂膜４上に固定している。
【００２２】
次に、前述した光導波路型センサを用いて被測定検体の測定対象物質の測定方法を図２の（Ａ）〜（Ｃ）を参照して説明する。なお、反応ホール５に露出する平面光導波路３でのエバネッセント光の変化を測定するために入射側グレーティング２ａに光を入射させるレーザ発振器（例えば赤色レーザダイオード）２１を設置し、出射側グレーティング２ｂから出射される光を受光する光電変換素子（フォトダイオード）２２を設置する。
【００２３】
まず、図１および図２の（Ａ）に示すように反応ホール５から露出する平面光導波路３表面に被測定検体の測定対象物質（例えば抗原）と特異的に反応する第１物質（例えば第１抗体）１１を固定化し、さらに平面光導波路３表面に被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質（例えば第２抗体）１２が固定化された複数の微粒子１３を分散させた分散層を有し、さらに分散層に対向してメッシュ６を配置した光導波路型センサを用意する。
【００２４】
次いで、反応ホール５内の前記微粒子１３の分散層を含む平面光導波路３表面に被測定検体溶液をメッシュ６を通して滴下する。このとき、被測定検体溶液はメッシュ６に伝って測定域である反応ホール５の全域に速やかに濡れ広がる。滴下した被測定検体溶液中に平面光導波路３表面の第１抗体１１と微粒子１３の第２抗体１２と特異的に反応する抗原が存在しないと、図２の（Ｂ）に示すように微粒子１３の第２抗体１２は平面光導波路３表面の第１抗体１１と結合することなくメッシュ６側の被測定検体溶液１４に浮遊する。この状態で、赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させても、反応ホール５内の被測定検体溶液１４の微粒子１３が浮遊しているため、微粒子１３がエバネッセント光領域に存在しなくなる。すなわち、微粒子１３がエバネッセント光の吸収や散乱に関与しないため、エバネッセント光の強度の減衰が殆ど起きない。その結果、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が殆ど変化しない。
【００２５】
一方、メッシュ６に滴下した被測定検体溶液１４中に抗原が存在すると、図２の（Ｃ）に示すように抗原１５は平面光導波路３表面の第１抗体１１と抗原抗体反応を生じて結合し、さらに微粒子１３の第２抗体１２は抗原１５と抗原抗体反応を生じて結合する。つまり、平面光導波路３表面の第１抗体１１と微粒子１３の第２抗体１２の間で抗原１５を介して抗原抗体反応を生じるために、微粒子１３が平面光導波路３表面に対して固定化される。このとき、被測定検体溶液は前述したようにメッシュ６に伝って測定域である反応ホール５の全域に速やかに濡れ広がるため、前記抗原抗体反応が短時間でなされる。
【００２６】
前記被測定検体溶液の滴下直後に赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させると、微粒子１３が平面光導波路３表面に対して固定化されているため、微粒子１３がエバネッセント光領域に存在することになる。すなわち、微粒子１３がエバネッセント光の吸収や散乱に関与するため、エバネッセント光の強度の減衰が起きる。その結果、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が固定化された微粒子１３の影響によって時間の経過に伴って低下する。
【００２７】
フォトダイオード２２で受光したレーザ光強度の低下率は、平面光導波路３表面に対して固定化される微粒子１３の量、つまり抗原抗体反応に関与する被測定検体溶液１４中の抗原濃度に比例する。したがって、抗原濃度が既知の被測定検体溶液において時間の経過に伴うレーザ光強度の低下曲線を作成し、この曲線の所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、抗原濃度とレーザ光強度の低下率との関係を示す検量線を予め作成する。前記方法で測定した時間とレーザ光強度の低下曲線から所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、このレーザ光強度の低下率を前記検量線と照合させることにより、被測定検体溶液中の抗原濃度を測定できる。
【００２８】
以上、実施形態によれば被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された平面光導波路と、この平面光導波路表面に形成され、被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された複数の微粒子の分散層と、微粒子の分散層に対向して配置され、微粒子の径より小さい孔を有する細孔膜を備えることによって、必要最小の被測定検体量が少量（例えば１０μＬ以下）で、被測定検体を測定域に滴下するときの反応性を高め、かつ被測定検体を測定域に滴下する１回の操作で被測定検体の測定対象物質の濃度を迅速に定量することが可能な光導波路型センサを提供することができる。
【００２９】
以下、本発明の実施例を前述した図１を参照して詳細に説明する。
【００３０】
（実施例１）
屈折率１．５２の無アルカリガラス基板１に屈折率が２．２〜２．４の酸化チタンをスパッタリングして厚さ５０ｎｍの酸化チタン膜を成膜した後、リソグラフィーとドライエッチングによりガラス基板１上にグレーティング２ａ，２ｂを形成した。つづいて、グレーティング２ａ，２ｂを含むガラス基板１上にエポキシ樹脂溶液をスピンコートした後、焼成することにより厚さ約３０μｍの平面光導波路３を形成した。焼成後の平面光導波路３の屈折率は１．５６であった。ひきつづき、平面光導波路３上に低屈折率樹脂である市販されている旭硝子株式会社製のサイトップ（登録商標）のポリ（パーフルオロブテニルビニルエーテル）をスクリーン印刷することにより矩形状の反応ホール（測定域）５が開口された低屈折率樹脂４を形成した。
【００３１】
なお、ここでは、エポキシ樹脂溶液に替えて、フェノール樹脂溶液を用いることも可能である。
【００３２】
次いで、反応ホール５から露出する平面光導波路３表面に抗インスリン抗体１１を疎水性相互作用により固定化した。つづいて、抗インスリン抗体１２が固定化され，赤色レーザ光の波長６５５ｎｍの光を吸収する粒径２１０ｎｍの青色ラテックスビーズ１３をポリビニルアルコールと共に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に分散してビーズ分散スラリを調製し、このスラリを平面光導波路３表面に塗布し、凍結乾燥することによりビーズ１３の分散層を形成した。なお、ここでは、ポリビニルアルコールに替えて、ウシ血清アルプミン（ＢＳＡ）等を用いることが、さらに好ましく、それと共に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に分散してビーズ分散スラリを調製し、このスラリを平面光導波路３表面に塗布し、凍結乾燥することによりビーズ１３の分散層を形成することができる。その後、低屈折率樹脂４上に目開き２００ｎｍのメッシュ６を反応ホール５を覆うように配置し、反応ホール５に対応する部分が開口され、接着剤層を持つ押え板７でメッシュ６を低屈折率樹脂膜４上に固定して図１に示す構造の光導波路型センサを製造した。
【００３３】
得られたセンサの反応ホール５に被測定検体溶液であるインスリン溶液４μＬを滴下した。インスリン溶液の滴下直後に赤色レーザダイオード２１から波長６５５ｎｍの赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させ、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光し、そのレーザ光強度を測定した。
【００３４】
その結果、インスリン溶液の滴下から５秒以内でインスリン（抗原）と平面光導波路の抗インスリン抗体および青色ラテックスビーズの抗インスリン抗体の抗原抗体反応に起因するレーザ光の強度低下が認められ、インスリン溶液を反応ホール（測定域）にメッシュを通して滴下する１回の操作でインスリン溶液中のインスリン濃度を短時間で測定することができた。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施形態に係る光導波路型センサを示す図。
【図２】実施形態における物質の測定工程を示す概略図。
【符号の説明】
【００３６】
１…ガラス基板、２ａ，２ｂ…グレーティング、３…平面光導波路、５…反応ホール、６…メッシュ、１１…第１物質、１２…第２物質、１３…微粒子、１５…測定対象物質。
【図１】
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【図２】
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