(57)【要約】      （修正有）【課題】短時間で反応が完結でき、且つ多量のニトリルヒドラターゼを必要としない、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法の提供。【解決手段】以下の工程を含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。工程I：エピハロヒドリン及び／又は１，３−ジハロ−２−プロパノール、及びシアニドドナーを酵素反応に供し、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを合成する工程。工程II：前記ニトリルの濃度（質量％）と塩濃度（アルカリ金属塩と緩衝剤の塩とニッケル、亜鉛、コバルトからなる金属の塩の合計）（質量％）の積が１６０以下となるように、ニトリルヒドラターゼと接触させる工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。
工程I：エピハロヒドリン及び／又は１，３−ジハロ−２−プロパノール、及びシアニドドナーを酵素反応に供し、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを合成する工程、
工程II：前記ニトリルの濃度（質量％）と塩濃度（アルカリ金属塩と緩衝剤の塩とニッケル、亜鉛、コバルトからなる金属の塩の合計）（質量％）の積が１６０以下となるように、ニトリルヒドラターゼと接触させる工程。
【請求項２】
工程IIにおいて、ニトリルが、工程Iにより製造された後、溶媒を全部または一部留去したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程IIにおいて、ニトリルをニトリルヒドラターゼと接触させる前に、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液を加熱処理及び／又はニッケル、亜鉛、コバルトからなる金属の塩を１種類以上添加する工程（工程I’）を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
下記工程Ｉ’及び IIを含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。
工程I’：４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液を加熱処理及び／又はニッケル、亜鉛、コバルトからなる金属の塩を１種類以上添加する工程、
工程II：上記工程I’で得られる溶液を、その４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度（質量％）と塩濃度（アルカリ金属塩と緩衝剤の塩とニッケル、亜鉛、コバルトからなる金属の塩の合計）（質量％）の積が１６０以下となる条件において、ニトリルヒドラターゼと接触させ、酵素反応により４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを得る工程。
【請求項５】
工程IIにおいて、反応液のｐＨを６〜８．５に維持する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程IIにおいて、反応液の温度を０〜３０℃に維持する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程IIにおいて、ニトリルヒドラターゼが、ロドコッカス（Rhodococcus）属微生物由来のニトリルヒドラターゼである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程I’において、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液中のシアンイオン濃度が、１００ｐｐｍ以下である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程I’において添加された、ニッケル、亜鉛、コバルトからなる群から選ばれる金属の塩の濃度の合計が、工程IIの反応液中において０．１〜１０，０００ｐｐｍである、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程I’において、ニッケル、亜鉛、コバルトからなる金属の塩を１種類以上添加した後の液をｐＨ６〜８．５で５分以上接触させた後、工程IIの酵素反応に供する、請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程IIにおいて、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル及び塩化ナトリウムを含む溶液において、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度（質量％）と塩濃度（アルカリ金属塩と緩衝剤の塩とニッケル、亜鉛、コバルトからなる金属の塩の合計）（質量％）の積が１２０以下となる条件下で、ニトリルヒドラターゼと接触させ、酵素反応により４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドを得る、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程I’において添加された、ニッケル、亜鉛、コバルトからなる群から選ばれる金属の塩の濃度の合計が、工程IIの反応液中において０．１〜１，０００ｐｐｍである、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法で得られる４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを含む水溶液を、トリメチルアミンを接触させる、カルニチンアミドの製造方法。
【請求項１４】
トリメチルアミンと接触させる際の温度が０〜５０℃である、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法に関する。光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドは、種々の医薬品や生理活性物質の合成原料として有用な物質であり、（Ｒ）−体は特にＬ−カルニチンの合成原料として有用である。
【背景技術】
【０００２】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを製造する方法としては、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを水和させる方法が挙げられる。一般に、ニトリルの水和によるアミドの製造方法としては塩酸などの鉱酸やアルカリを使用する方法、アルカリと過酸化水素を併用する方法などが知られているが、これらの方法では工程が煩雑となり、対応する酸が副生し収率が低下してしまうなどの問題がある（特許文献１）。また、生物学的反応としては、ニトリルヒドラターゼの作用によりニトリル化合物を水和してアミド化合物を製造する方法が知られており、本出願人らは先に、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造法として、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルにニトリルヒドラターゼを作用させる方法（特許文献２）を提案している。
【０００３】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法としては、エピハロヒドリンと青酸のアルカリ金属塩を反応させる方法（特許文献３）、エピハロヒドリンと青酸を反応させる方法（特許文献４）、１，３−ジハロ−２−プロパノールと青酸または青酸のアルカリ金属塩とから、酵素反応により製造する方法（特許文献５）が挙げられる。酵素反応で使用される酵素として、ハロヒドリンエポキシダーゼが例示でき、酵素反応により製造する方法は、生成する４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが光学活性体であり、特に有用である。
【０００４】
上述の製造方法によって生成した４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む反応液中には、未反応の青酸及び原料が残存する。また、１，３−ジハロ−２−プロパノールと青酸または青酸のアルカリ金属塩を原料とした場合、およびエピハロヒドリンと青酸のアルカリ金属塩を原料とした場合には、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの生成とともに理論上等モル以上の無機塩が生成し、反応液中に残存する。次いでニトリルヒドラターゼによりアミド化反応を実施する場合、残存している青酸によりニトリルヒドラターゼが失活するため、上述の製造方法によって生成した４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、通常、反応液から有機溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を青酸とともに除去し、必要によりさらに蒸留し精製された留分を得るという公知の方法により回収され、ニトリルヒドラターゼによる４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミド製造工程に供される。
【０００５】
しかし、上述の方法では有機溶媒の使用や抽出および蒸留精製にかかるコスト面・環境面の負担が大きく、必ずしも工業的に好適であるとはいえなかった。また、ニトリルヒドラターゼによりアミド化反応を実施する場合、蒸留などの方法により青酸を例えば１ｐｐｍ以下に除去しても、アミド化反応の反応速度が非常に遅く、反応速度を上昇させるためには大量のニトリルヒドラターゼを必要とする場合があった。
【０００６】
本出願人らは先に、金属添加などの化学的手法によりニトリル化合物中に極微量に含まれる青酸を低減させる方法（特許文献６）を提案しているが、金属添加量が不十分な場合や、過剰な場合では一部のニトリルヒドラターゼ失活が起こり、アミド化反応の反応速度を十分に上昇させることが難しかった。
【特許文献１】特許第２５８８９３０号公報
【特許文献２】特許第３０１４１７１号公報
【特許文献３】特公平５−６９８１８号公報
【特許文献４】特開２００２−２４１３５７号公報
【特許文献５】特許第３０７３０３７号公報
【特許文献６】特許第３４２８４０４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、生産性が高く、コスト面・環境面ともに好適な４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、エピハロヒドリンとシアニドドナーとから得られる、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む反応液、又は１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとからハロヒドリンエポキシダーゼの作用により得られる、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む反応液を、有機溶媒による抽出および蒸留により精製された４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル留分の回収工程を経ることなく、ニトリルヒドラターゼを作用させることによる４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法について検討を行った。
【０００９】
その過程において、高濃度の４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルとともに高濃度の無機塩が存在する条件下ではニトリルヒドラターゼが失活してしまうことがわかった。この問題を解決するために鋭意検討を行った結果、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度（質量％）と無機塩の濃度（質量％）の積を１６０以下とし、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルにニトリルヒドラターゼを作用させることで、煩雑な精製操作や、多量のニトリルヒドラターゼを必要とせず、短時間で４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを製造できることを見出し本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の工程を含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法である。
【００１１】
工程I：エピハロヒドリン及び／又は１，３−ジハロ−２−プロパノール、及びシアニドドナーを酵素反応に供し、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを合成する工程、
工程II：前記ニトリルの濃度（質量％）と塩濃度（アルカリ金属塩と緩衝剤の塩とニッケル、亜鉛、コバルトからなる金属の塩の合計）（質量％）の積が１６０以下となるように、ニトリルヒドラターゼと接触させる工程。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、煩雑な４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの抽出・蒸留精製工程を経ることなく、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを得られるため、生産性が高く、コスト面・環境面ともに好適な４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明に関して詳細に説明する。
【００１４】
工程I：４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの合成
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法については特に限定されないが、以下に述べる、エピハロヒドリン及び／又は１，３−ジハロ−２−プロパノール、及びシアニドドナーを酵素反応（以後、シアノ化酵素反応と称することがある）に供する方法が光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが得られる点で好ましい。
【００１５】
シアノ化酵素反応とは、ハロヒドリンエポキシダーゼと称される酵素を利用した、エピハロヒドリン及び／又は１，３−ジハロ−２−プロパノール、及びシアニドドナーを基質とする酵素変換反応を意味する。
【００１６】
（工程I−１）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルとは、下記一般式（１）で表される化合物のことをいう。
【化１】
2009000097.tif 000002
【００１７】
（式中、Ｘ１はハロゲン原子を示す。具体的にはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、塩素原子、臭素原子が好ましく、塩素原子が最も好ましい。＊は不斉炭素を示し、その立体配置は（Ｒ）体、（Ｓ）体、のいずれでも構わないが、（Ｒ）体が好ましい。）
また、光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルとは、一方の鏡像異性体（例えばＲ体）が他方の鏡像異性体（例えばＳ体）より多く含まれている４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのこと、または、いずれか一方の鏡像異性体のみからなる４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのことをいう。
【００１８】
具体的には（Ｒ）−４−フルオロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｓ）−４−フルオロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｒ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｒ）−４−ヨード−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｓ）−４−ヨード−３−ヒドロキシブチロニトリルが挙げられ、好ましくは（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｒ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリルであり、特に（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが好ましい。
【００１９】
（工程I−２）ハロヒドリンエポキシダーゼ
ハロヒドリンエポキシダーゼとは、下記一般式（２）で表される１，３−ジハロ−２−プロパノールを脱ハロゲン化水素し、下記一般式（３）で表されるエピハロヒドリンを合成する活性、及びその逆反応を触媒する活性を有する酵素（EC number: 4.5.1.-）を意味する。
【化２】
2009000097.tif 000003
【００２０】
（式中、Ｘ１、Ｘ２はハロゲン原子を示す。フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には１，３−ジフルオロ−２−プロパノール、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノール、１，３−ジヨード−２−プロパノール等が挙げられ、好ましくは、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノールである。）
【化３】
2009000097.tif 000004
【００２１】
（式中、Ｘ１はハロゲン原子を示し、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的にはエピフルオロヒドリン、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、エピヨードヒドリン等が挙げられ、特に好ましくはエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンである。）
この酵素を産生する微生物としては、アグロバクテリウム属（Agrobacterium sp.）、アースロバクター属（Arthrobacter sp.）、オウレオバクテリウム属（Aureobacterium sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、レイフソニア属（Leifsonia sp.）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium sp.）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、リゾビウム属（Rhizobium sp.）等に属する微生物が挙げられる。好ましくはオウレオバクテリウム属（Aureobacterium sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、レイフソニア属（Leifsonia sp.）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium sp.）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）であり、オウレオバクテリウム属（Aureobacterium sp.）DH095（FERM P-12360）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074（FERM BP-2643）、レイフソニア属（Leifsonia sp.）MRC03（FERM AP-20453）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium sp.）N-4701（FERM BP-2644）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）GP1が（Ｒ）−体の４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが得られる点でより好ましく、特にコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074（FERM BP-2643）が好ましい。
【００２２】
ハロヒドリンエポキシダーゼのうち、アミノ酸配列が明らかにされているものについては、米国生物工学情報センター （NCBI; National Center for Biotechnology Information） により提供されるGenBankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=protein）において、以下のAccession No.により登録されている。
【００２３】
・Accession No. BAA14361（コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheAのアミノ酸配列）
・Accession No. AAK92100（アースロバクター属（Arthrobacter sp.）AD2株由来のHheAAD2のアミノ酸配列）
・Accession No. BAA14362（コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheBのアミノ酸配列）
・Accession No. AAK73175（マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）GP1株由来のHheBGP1のアミノ酸配列）
・Accession No. AAK92099（アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter） AD1株由来のHheCのアミノ酸配列）
Accession No. AAD34609（アグロバクテリウム  チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens） 由来のHalBのアミノ酸配列）
コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheB、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）GP1株由来のHheBGP1が（Ｒ）−体の４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが得られる点で好ましく、特に好ましくはコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheBである。
【００２４】
ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記微生物を培養することにより生産することができる。また、ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を組み込んで作製した遺伝子組換え微生物によっても生産することができる。ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を組み込んで作成した遺伝子組換え微生物を培養して得られるハロヒドリンエポキシダーゼが、目的のハロヒドリンエポキシダーゼを大量に得ることができることから好ましく使用される。
【００２５】
また、形質転換に用いる宿主微生物としては大腸菌（Escherichia coli）あるいはロドコッカス（Rhodococcus）属細菌に属する微生物が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではなく、他の宿主微生物を用いることも出来る。
【００２６】
さらに天然型のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を改変し、酵素機能を改変したハロヒドリンエポキシダーゼについても、本発明に用いることができる。
【００２７】
前記ハロヒドリンエポキシダーゼを生産する微生物を培養するための培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、マルトースやフルクトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸あるいはその塩、またはエタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、硫酸、塩酸、燐酸やホウ酸などの無機酸あるいはその塩、用いられる微生物が利用可能なナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウムなどを含む無機塩、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル微量金属塩、微生物育成促進剤としてビタミンＢ１、Ｂ２、Ｃ、Ｋ等のビタミン等が必要に応じて適宜添加される。本発明の微生物の培養は、通常は液体培養で行われるが、固体培養によっても行うことができる。
【００２８】
培養は１０〜５０℃の温度で、ｐＨ２〜１１の範囲で行われる。微生物の生育を促進させるために通気攪拌を行ってもよい。培養により得られた微生物は、培養液そのまま若しくは該培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる微生物菌体、若しくは菌体処理物（例えば、菌体破砕液、粗酵素、精製酵素）あるいは常法により固定化した菌体または菌体処理物の形で、ハロヒドリンエポキシダーゼとして利用することができる。
【００２９】
（工程I−３）シアニドドナー
シアニドドナーとは、反応液中に添加した際にシアンイオン（ＣＮ−）又はシアン化水素を生じる化合物を意味し、特に制限されないが、シアン化水素（以下、青酸またはＨＣＮと称することがある）、シアン化カリウム（以下、ＫＣＮと称することがある）、シアン化ナトリウム（以下、ＮａＣＮと称することがある）、アセトンシアンヒドリン（以下、ＡＣＨと称することがある）が例示される。シアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウムが好ましく使用される。特に、シアン化水素が酵素反応時のｐＨに調整する際、副生する塩が少ないことから好ましい。
【００３０】
（工程I−４）シアノ化酵素反応
シアノ化酵素反応は、水または緩衝液へ、シアニドドナー、エピハロヒドリン又は１，３−ジハロ−２−プロパノール、及びハロヒドリンエポキシダーゼを反応系に添加することにより開始する。緩衝液としては、例えば、青酸、リン酸、ホウ酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成される緩衝液、トリス緩衝液あるいはグッド緩衝液等が例示され使用できる。その内、青酸とその塩によって構成される緩衝液、トリス緩衝液が好ましい。緩衝剤由来の不純物が混入しない点で、青酸とその塩によってのみ構成される緩衝液が特に好ましい。
【００３１】
上記ハロヒドリンエポキシダーゼを利用した酵素反応において、反応液中のエピハロヒドリン又は１，３−ジハロ−２−プロパノールの濃度は、０．１〜１０ｗｔ％が好ましい。また、シアニドドナーの使用量は、エピハロヒドリン又は１，３−ジハロ−２−プロパノールに対して、通常１〜３倍モルである。エピハロヒドリン又は１，３−ジハロ−２−プロパノール及びシアニドドナーは反応液に一括して加えるかあるいは分割添加することができる。
【００３２】
反応温度は０〜４０℃、ｐＨは４〜１０の範囲で行うことが好ましい。また、１，３−ジハロ−２−プロパノールを原料とした場合、反応が進行するに従い、反応液中にハロゲン化水素が生成するためｐＨが低下していくため、反応系内にアルカリを追添加することにより、系内のｐＨを酵素の活性が発揮される領域に調整、維持することが好ましい。
【００３３】
使用するアルカリとしては、ハロゲン化水素と塩を形成し、その塩の水溶液が酵素の活性が発揮されるｐＨ領域にあるものであれば特に制限されず、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属またはアンモニアの、水酸化物あるいは弱酸との塩が例示される。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン化カリウムが好ましい。アルカリの使用形態としては、特に制限されないが、取り扱いの容易さから水溶液が好ましい。
【００３４】
反応時間は基質等の濃度、ハロヒドリンエポキシダーゼの量や反応条件によって変わるが、通常１〜１２０時間で終了するように条件を設定することが好ましい。
【００３５】
（工程I−５）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルと未反応のシアニドドナーの分離
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの合成に際しては、ハロヒドリンエポキシダーゼを利用した酵素反応で製造するしないに係らず、１，３−ジハロ−２−プロパノールと青酸または青酸のアルカリ金属塩を原料とした場合、およびエピハロヒドリンと青酸のアルカリ金属塩を原料とした場合には、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの生成とともに理論上、等モル以上の塩が生成する。また、エピハロヒドリンと青酸を原料とした場合においても、反応液のｐＨ調整等により塩が生成する。また、反応液中に未反応のシアニドドナー及び１，３−ジハロ−２−プロパノールまたはエピハロヒドリンが残存する。
【００３６】
上記のような理由から、反応液中に生成、蓄積した４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、例えば、酢酸エチルなどの溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのシロップを得ることができ、また、これらのシロップを減圧下に蒸留することにより、さらに精製した留分として回収してニトリルヒドラターゼによる水和反応（以後、アミド化酵素反応を称することがある）に供することもできるが、有機溶媒の使用や抽出および蒸留精製にかかるコスト面・環境面の観点から、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル合成反応終了後の反応液を蒸留することにより濃縮し、未反応のシアニドドナー及び、エピハロヒドリンまたは１，３−ジハロ−２−プロパノールを含む留分を分離してから、アミド化酵素反応に供することが好ましい。
【００３７】
濃縮の際、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル合成反応液から、未反応のシアニドドナーの反応液からの分離効率を上げ、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの分解を防ぐために、蒸留ボトムを中性または酸性に維持することが好ましい。蒸留ボトムのｐＨについては、７以下が好ましく、５以下がより好ましい。ｐＨの下限については特に制限されないが、濃縮中に生成する青酸やハロゲン化水素等の蒸気による装置の腐食を防いだり、後の工程I’および工程IIにおいて、ｐＨを中性付近に調整する際生じる塩の生成量を少なくする観点から、ｐＨは０以上とすることが好ましく、２以上とすることがより好ましい。
【００３８】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル合成反応液のｐＨが７を超えている場合、反応液に青酸より強い酸を添加することや、反応液を３０℃以上沸点以下に加熱することでｐＨを７以下に下げることができる。また、アルカリの投入によりシアノ化酵素反応液のｐＨを制御している場合にはアルカリの投入を遮断して反応を継続することによってもｐＨを７以下に下げることができる。
【００３９】
反応液を３０℃以上沸点以下に加熱する場合は、反応液に青酸より強い酸を添加したり、アルカリの投入によりシアノ化酵素反応液のｐＨを制御している場合にはアルカリの投入を遮断して反応を継続することによりｐＨを７以下に下げた後に加熱を行い所望のｐＨとすることが好ましい。
【００４０】
酸としては、青酸より強い酸、すなわち、青酸と強塩基からなる塩の水溶液と混合することにより青酸ガスが発生するものであれば、特に制限されないが、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸といった有機酸や、塩酸、硫酸、硝酸、りん酸といった無機酸が例示される。
【００４１】
ｐＨ調整の際、所望のｐＨより低い値に下げすぎた際にはアルカリを添加することにより所望のｐＨに調整することができる。使用するアルカリとしては、ハロゲン化水素と塩を形成し、その塩の水溶液が酵素の活性が発揮されるｐＨ領域にあるものであれば特に制限されず、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属またはアンモニアの、水酸化物あるいは弱酸との塩が例示される。水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。シアン化ナトリウム、シアン化カリウム等の金属シアン化物塩は、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル合成反応液のシアンイオン濃度が上昇するため好ましくない。アルカリの使用形態としては、特に制限されないが、取り扱いの容易さから水溶液が好ましい。反応液の温度を３０℃以上とした場合、アルカリを添加することによるｐＨ調整は光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの分解を誘発するため好ましくない。
【００４２】
また、酵素反応に使用したハロヒドリンエポキシダーゼ由来の固形物がある場合には、濃縮前に取り除いても取り除かなくても構わない。上記固形物を除去する場合には、常法によって行えば良く、例えばろ過や遠心分離といった方法が例示される。
【００４３】
圧力及び温度は、用いる装置の種類および蒸留の目的に応じて適宜決定することができる。通常、蒸留温度を０〜１１０℃、好ましくは４０〜１１０℃にし、圧力は１〜７６０Ｔｏｒｒ、好ましくは５０〜７６０Ｔｏｒｒとする。濃縮速度を高めたい場合には、蒸留温度を４０〜８０℃、より好ましくは４０〜６０℃とし、圧力を１〜３００Ｔｏｒｒ、より好ましくは５０〜１５０Ｔｏｒｒとすることで、濃縮速度を高めることができる。
【００４４】
蒸留ボトム中に残留するシアニドドナーは、後の工程IIにおいて、ニトリルヒドラターゼの活性を著しく阻害するため、極力低減することが好ましい。その濃度は１００ｐｐｍ以下とすることが好ましく、より好ましくは１０ｐｐｍ以下であり、１ｐｐｍ以下とすることが特に好ましい。
【００４５】
蒸留は、未反応のシアニドドナー及び、エピハロヒドリン又は１，３−ジハロ−２−プロパノールの反応液からの分離効率を上げるために、空気または不活性気体を吹き込みながら実施することもできる。シアニドドナーの濃度を１００ｐｐｍ以下に低減させる際には、空気または不活性気体を吹き込みながら蒸留することが好ましい。
【００４６】
不活性気体としては、蒸留の際に生成物である４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルや、未反応のシアニドドナー及び、エピハロヒドリン又は１，３−ジハロ−２−プロパノールと実質的に反応しない気体であれば特に制限されず、水蒸気、窒素、二酸化炭素、ヘリウム、アルゴンが例示される。これらの気体は単独で用いても２種類以上混合されていても、蒸留の間において組成が一定であっても変化しても良い。空気としては、特に制限されないが、蒸留を行う系内に過剰の酸素が導入されないよう、上記の不活性気体により希釈して使用することが好ましい。上記気体の流量については、特に制限されないが、１~１２０時間で反応容器内の気相部が置換されるように設定することが好ましい。
【００４７】
留出したシアニドドナー及び、エピハロヒドリン又は１，３−ジハロ−２−プロパノールを含む留分は、必要に応じ、これらを捕集するのに十分な温度、例えば、−１０℃〜１０℃に冷却された冷却管を使い捕集することができる。
【００４８】
濃縮の時間については特に制限されないが、１〜１２０時間で蒸留ボトムの４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが所望の濃度となるように実施することが好ましい。蒸留ボトムの４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度については、特に制限されないが３０重量％を超えると、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル合成反応条件によっては、ハロゲン化水素の塩などが析出して取り扱いが困難となる場合があるため、３０重量％を超えないことが好ましい。  
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度を３０重量％以上に濃縮しても、シアニドドナーおよび１，３−ジハロ−２−プロパノールの回収率や蒸留ボトム内の濃度が所望の値とならない場合には、蒸留ボトムに水を加えてさらに濃縮することもできる。
【００４９】
本工程における、反応系内のエピハロヒドリンまたは１，３−ジハロ−２−プロパノールの濃度、及び光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度ならびに光学純度は、例えばガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定・定量することができる。また、反応系内のシアニドドナーの濃度は、例えば滴定によって定量することができる。
【００５０】
上記のようにして得られた４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液は、下記に述べる工程I’に供される。
【００５１】
工程I’：アミド化酵素反応前処理
工程I’とは、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液を加熱処理及び／又はニッケル、亜鉛、コバルトからなる群から選ばれる金属の塩を１種類以上添加する工程である。本工程を実施することにより、後の工程IIにおける４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルからニトリルヒドラターゼの作用により４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを得る工程を円滑に進行させることができる。
【００５２】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液の調製方法については特に制限されないが、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル合成工程でのコスト面、環境面の負荷が低い観点から、上記工程Iで得られる、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液が好ましい。
【００５３】
（工程I’−１）４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミド
４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドとは、下記一般式（４）で表される化合物のことをいう。
【化４】
2009000097.tif 000005
【００５４】
（式中、Ｘ１はハロゲン原子を示す。具体的にはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、塩素原子、臭素原子が好ましく、塩素原子が最も好ましい。＊は不斉炭素を示し、その立体配置は（Ｒ）体、（Ｓ）体、のいずれでも構わないが、（Ｒ）体が好ましい。）
また、光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドとは、一方の鏡像異性体（例えばＲ体）が他方の鏡像異性体（例えばＳ体）より多く含まれている４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドのこと、または、いずれか一方の鏡像異性体のみからなる４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドのことをいう。
【００５５】
具体的には（Ｒ）−４−フルオロ−３−ヒドロキシブチブチルアミド、（Ｓ）−４−フルオロ−３−ヒドロキシブチルアミド、（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド、（Ｒ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチルアミド、（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチルアミド、（Ｒ）−４−ヨード−３−ヒドロキシブチルアミド、（Ｓ）−４−ヨード−３−ヒドロキシブチルアミドが挙げられ、好ましくは（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド、（Ｒ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチルアミド、（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチルアミドであり、特に（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミドが好ましい。
【００５６】
（工程I’−２）加熱処理
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの加熱処理とは、光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液を加熱することをいう。加熱方法は、本発明の目的が達成されれば特に制限はなく、加圧、減圧、常圧条件下のいずれも選択できる。また上記工程Iで得られる４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液を、その沸点以上に加熱し、還流又は留去する方法などが挙げられる。
【００５７】
加熱時における４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液の濃度は特に制限されないが、シアンイオンはニトリルヒドラターゼの活性を著しく阻害するため、極力低減することが好ましい。その濃度は１００ｐｐｍ以下とすることが好ましく、より好ましくは１０ｐｐｍ以下であり、１ｐｐｍ以下とすることが特に好ましい。
【００５８】
加熱時間は、０．１〜１００時間程度で、０．５〜５０時間が好ましく、さらに好ましくは１〜１０時間である。加熱温度は、４０℃程度から４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが分解しない温度までの範囲で処理することが可能であり、６０〜１５０℃が好ましく、８０〜１００℃がより好ましい。
【００５９】
また、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの分解を防ぐため、ｐＨは７以下とすることが好ましく、ｐＨ５以下がより好ましい。ｐＨの下限については特に制限されないが、加熱時におけるハロゲン化水素等の蒸気による装置の腐食を防いだり、後の金属塩添加の工程および工程IIにおいて、ｐＨを中性付近に調整する際生じる塩の生成量を少なくする観点から、ｐＨは０以上とすることが好ましく、２以上とすることがより好ましい。
【００６０】
また加熱処理後にはニトリルヒドラターゼが高活性を示す至適ｐＨに再度調節してから、工程IIのアミド化酵素反応に移ることが好ましい。
【００６１】
ｐＨの調整方法については青酸及び／又は金属シアン化物を使用しない限り特に制限されないが、アルカリを添加することによるｐＨ調整は４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの分解を防ぐ観点から０〜３０℃で実施することが好ましい。
【００６２】
（工程I’−３）金属塩の添加
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液に、微量の金属塩を添加することで、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル中に極微量含まれるシアンイオンを金属錯体とすることで低減させることができる。これにより、工程IIのアミド化酵素反応を円滑に進行させることができる。
【００６３】
金属としては、コバルト、ニッケル、亜鉛が好ましく、塩の形態としては、特に制限されないが、硝酸塩、ハロゲン化物塩、硫酸塩、カルボン酸塩が例示できる。
【００６４】
上記金属塩を添加する量は特に制限されないが、シアンイオンの影響を十分に低減し、工程IIにおけるニトリルヒドラターゼの失活を防ぐ観点から、通常、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液に含まれるシアンイオン濃度に応じた量を添加することができる。
【００６５】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む水溶液に金属塩を添加する前の、シアンイオン濃度は、１００ｐｐｍ以下とすることが好ましく、より好ましくは１０ｐｐｍ以下であり、１ｐｐｍ以下とすることが特に好ましい。また、添加する金属塩の濃度は、ニトリルヒドラターゼの安定性の面から、工程IIにおける反応液中において１０，０００ｐｐｍ以下とすることが好ましい。１,０００ｐｐｍ以下とすることがより好ましく、１０ｐｐｍ以下とすることが特に好ましい。上記金属塩濃度の下限については、シアンイオンの影響を低減可能な濃度であるという観点から、工程IIにおける反応液中において０．１ｐｐｍ以上とすることが好ましい。
【００６６】
添加する金属塩の濃度が反応液中において１０，０００ｐｐｍより高くなると、ニトリルヒドラターゼの一部失活が起こる場合がある。工程IIにおいて、ニトリルヒドラターゼと４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルおよび上記金属塩を含む溶液を接触させる前に、この溶液を希釈するか、金属塩および金属シアノ錯体を例えば吸着剤等により除去するなどの方法により、金属塩の濃度を１０，０００ｐｐｍ以下とすることが好ましい。吸着剤としては、例えば、活性炭、活性アルミナ、ゼオライト、シリカゲルやイオン交換樹脂等を使用することができる。
【００６７】
金属塩を添加した後のｐＨは、金属シアノ錯体の形成を円滑に行う観点から、６以上とすることが好ましく、７以上がより好ましい。また、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの分解を防ぐ観点から、ｐＨ９以下とすることが好ましく、ｐＨ８．５以下とすることがより好ましい。ｐＨ調整の時期は、上記金属塩の添加の前後で特に制限されない。
【００６８】
ｐＨの調整方法については青酸及び／又は金属シアン化物を使用しない限り特に制限されないが、アルカリを添加することによるｐＨ調整は４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの分解を防ぐ観点から０〜３０℃で実施することが好ましい。
【００６９】
金属塩を添加する際、および添加した後の温度は特に限定されないが、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの安定性の観点から０〜４０℃とすることが好ましい。
【００７０】
また、金属塩を添加した後、工程IIのアミド化酵素反応に供するまでの処理時間については、金属シアノ錯体を十分に形成させ、ニトリルヒドラターゼの失活を防ぐ観点から、金属塩を添加してから５分以上が好ましく、さらに好ましくは１０分以上経過してから工程IIのアミド化酵素反応に供することが好ましい。また、金属塩を添加した後、ｐＨを６〜８．５に調整した後、ｐＨをこの範囲に維持したまま工程IIのアミド化酵素反応に供することが好ましい。金属塩を添加した後、ｐＨが６以下に低下した場合はアルカリを添加することによりｐＨを６〜８．５に調整し、１秒以上、さらに好ましくは５分以上この範囲に維持したまま工程IIのアミド化酵素反応に供することが好ましい。ｐＨが６未満の状態でニトリルヒドラターゼを添加し工程IIのアミド化酵素反応を開始することも可能であるが、その場合は、反応開始後１時間以内にｐＨを６〜８．５に調整することが好ましく、３０分以内に調整することがより好ましく、特に好ましくは１５分以内にｐＨを６〜８．５に調整する。処理時間の上限は特に限定されないが、１時間〜１年間とすることができる。また、処理中に攪拌することも可能であるが、特に制限されない。
【００７１】
なお、本工程における、金属塩の添加による処理と、上記の加熱処理は必要に応じて組み合わせて使用することもできる。組み合わせる場合には、上記の加熱処理を行った後、金属塩の添加処理を行い、下記工程IIのアミド化酵素反応に供することが好ましい。
【００７２】
工程II：アミド化酵素反応
工程IIとは、上記工程Iで得られる処理液と、ニトリルヒドラターゼを接触させ、酵素反応により４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを得る工程である。
【００７３】
（工程II−１）ニトリルヒドラターゼ
本工程において使用される酵素としては、ニトリルヒドラターゼが挙げられる。ニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物の水和反応によりアミド化合物の生成を触媒する酵素をいい、国際的な酵素分類によればリアーゼに属する酵素である。本発明において使用するニトリルヒドラターゼは４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのニトリルをアミドへ変換する反応を触媒する酵素であれば良い。
【００７４】
例えば、アクロモバクター（Achromobacter）属、アシドボラックス（Acidovorax）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、キャンディダ（Candida）属、カセオバクター（Caseobacter） 属、コマモナス（Comamonas）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ディーツィア（Dietzia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、エルビニア（Erwinia）属、ジオバチルス（Geobacillus）属、ゴルドナ（Gordona）属、クレブシエラ（Klebsiela）属、ミクロアスカス（Microascus）モルガネラ（Morganella）属、パントエア（Pantoea）属、プロテウス（Proteus）属、シュードモナス（Pseudomonas） 属、シュードノカルディナ（Pseudonocardia）属、ロドコッカス（Rhodococcus） 属、リゾビウム（Rhizobium）属、セラチア（Serratia）属、シクタリジウム（Syctalidium）属、ツカムレラ（Tukamurella）属、に属する微生物が産生するニトリルヒドラターゼである。
【００７５】
具体的には、アースロバクター  グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）IFO 12138、ブレビバクテリウム  ヘルボラム（Brevibacterium helvolum）ATCC11822 、コリネバクテリウム  フラベシエンス（Corynebacterium flavescens）IAM 1642 、ロドコッカス  エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）IFO 12540 およびIFO 12539 、ストレプトマイセスアルボグリセルス（Streptomyces aＬＢogriseolus）HUT 6045、ストレプトマイセス クリゾマルス（Streptomyces chrysomallus）HUT 6141、ストレプトマイセス シネレオルバー（Streptomyces cinereouruber）HUT6142、ストレプトマイセス ヂアスタチカス（Streptomyces diastaticus）HUT 6116、ストレプトマイセス オリバセウス（Streptomyces olivaceus）HUT 6061、ストレプトマイセス ルブロシアノヂアスタチカス（Streptomyces rubrocyanodiastaticus）HUT 6117、クレブシエラ ニュウモニアエ（Klebsiella pneumoniae）IFO 12019、IFO 3319、IFO12059、IAM 1063、クレブシエラ ニュウモニアエ サブスピーシズ ニュウモニアエ（Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae） NH-36T2株、セラチア ピリムシカ（Serratia plymuthica）IFO 3055、セラチア マルセッセンス（Serratia marcescens）IAM 1105、エルビニア キャロトボラ（Erwinia carotovora）IFO 3057、ツカムレラ ポーロメタボラム（Tukamurella paurometabolum）JCM 3226、ゴルドナ ルブロペルチンクタス（Gordona rubropertinctus）JCM 3227、モルガネラ モルガニ（Morganella morganii）IFO 3848、プロテウス ブルガリス（Proteus vulgaris）IFO 3167、エンテロバクター エアロジェネス（Enterobacter aerogenes）IFO 12010、ミクロアスカス デスモスポラス（Microascus desmosporus）IFO6761、キャンディダ グイリエモンディー（Candida guilliermondii）NH-2株（FERM P-11350 号）、パントエア アグロメランス（Pantoea agglomerans）NH-3株（FERM P-11349 号）などが産生するニトリルヒドラターゼである。
【００７６】
なお、ＡＴＣＣ番号が付与された微生物菌株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から容易に入手することができる。ＩＦＯ番号の付された微生物は、（財）醗酵研究所（ＩＦＯ）発行の「List of Cultures、第８版、第１巻（１９８８）」に記載されており、現在は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門遺伝資源保存課から入手できる。ＩＡＭ番号の付された微生物は東京大学応用微生物学研究所から入手できる。ＪＣＭ番号の付された微生物は、理化学研究所 系統微生物保存機関発行の「Catalogue of strains 第４版（１９８９）」に記載されており、理化学研究所 系統微生物保存機関より入手できる。ＨＵＴ番号の付された微生物は、日本微生物保存連盟（ＪＦＣＣ）発行の「Catalogue of Cultures、第４版（１９８７）」に記載されており、広島大学工学部から入手できる。FERM番号の付された微生物は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターから入手できる。
【００７７】
さらに山田らが土壌より分離したロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous） J-1〔FERM BP-1478号〕、及び本出願人らの一部が土壌より分離したアースロバクター（Arthrobacter）sp. SK103〔FERM P-11300号〕、カセオバクター（Caseobacter）sp. BC23〔FERM P-11261号〕、シュードモナス（Pseudomonas）sp. BC15-2 〔FERM BP-3320号〕、シュードモナス（Pseudomonas）sp. SK31〔FERM P-11310号〕、シュードモナス（Pseudomonas）sp. SK87〔FERM P-11311号〕、シュードモナス（Pseudomonas）sp. SK13 〔FERM BP-3325号〕、ロドコッカス（Rhodococcus）sp. SK70 〔FERM P-11304号〕、ロドコッカス（Rhodococcus）sp. HR11〔FERM P-11306号〕およびロドコッカス（Rhodococcus） sp. SK49〔FERM P-11303号〕などが産生するニトリルヒドラターゼも挙げられる。これらの微生物は、それぞれ上記寄託番号にて独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００７８】
また、上記微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子をクローニングし、形質転換（導入）した微生物も、上記のニトリルヒドラターゼを産生する微生物として含まれる。例えば、米国特許第５８０７７３０号に記載のシュードノカルディア（Pseudonocardia）属のニトリルヒドラターゼ遺伝子で形質転換した大腸菌 MT-10822株（FERM BP-5785）、特許３５３１９９７号公報記載のアクロモバクター（Achromobacter）属のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌  MT-10770株（FERM P-14756）、特許３１６２０９１号公報記載のロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）種のニトリルヒドラターゼで形質転換した微生物などが挙げられる。
【００７９】
中でも、ロドコッカス（Rhodococcus） 属に属する微生物に由来するニトリルヒドラターゼが好ましく、より好ましくはロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）種由来のものであり、特に好ましくはロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J-1株由来のものである。
【００８０】
ニトリルヒドラターゼを産生する微生物を培養するための培地組成としては、微生物が生育でき、所望の酵素を産生するのであれば特に限定はない。例えば、炭素源としてグルコース、フラクトース、シュークロース、マルトースなどの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸類、エタノール、グリセロールなどのアルコール類など、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物、アミノ酸類などの天然窒素源の他に各種無機、有機酸アンモニウム塩などが使用でき、このほか、無機塩、微量金属、ビタミンなどが必要に応じて適宜使用される。また場合により、酵素活性を誘導させるために、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、プロピオニトリル、イソブチロニトリル、ベンジルシアニドなどの各種ニトリル化合物、４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド、プロピオンアミド、イソブチルアミドなどの各種アミド化合物などを培地に添加しても良い。上記微生物の培養は常法によればよく、例えば ｐＨ４〜１０、温度１０〜４５℃の範囲にて好気的に１０〜１８０時間培養する。培養は液体培養、固体培養のいずれでも行うことができる。
【００８１】
上記のようにして得た微生物菌体は、培養液そのまま、遠心分離などにより得た菌体の懸濁液、菌体処理物（例えば菌体破砕物、菌体抽出物など）、常法により固定化した菌体または菌体処理物、粗精製した酵素、精製酵素として、ニトリルヒドラターゼとしてアミド化酵素反応に使用することができる。
【００８２】
（工程II−２）アミド化酵素反応
上記工程I’で得られる処理液には、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの他、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する工程によっては、ハロゲン化水素の塩等の無機塩が含まれている。この塩は、本工程におけるアミド化反応液中の４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度に応じてニトリルヒドラターゼの活性を一部阻害するため、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度（質量％）と塩濃度（質量％）の積が１６０以下、好ましくは１２０以下となるように濃度を調整し、ニトリルヒドラターゼと接触させることが好ましい。また、上記工程I’で添加する金属塩の濃度も上記の塩濃度に加えて濃度を調整すればよい。
【００８３】
上記濃度の調整（４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度（質量％）と塩濃度（質量％）の積が１６０以下となるように濃度を調整）の方法については特に制限されず、上記工程I’で得られる処理液の希釈や、脱塩操作等により実施することができる。脱塩操作としては、例えば、濃縮を行うことで析出した塩をろ過等により除去する方法、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む水溶液や、上記工程I’で得られる処理液を電気透析処理やイオン交換樹脂等による処理により塩を除去する方法等によって行われる。
【００８４】
上記の方法により濃度を調整した、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの溶液は、上述のごとく調製したニトリルヒドラターゼと接触させる前にｐＨをニトリルヒドラターゼの活性が十分に発揮できる範囲に調整しておくことが酵素の安定性の面から好ましい。
【００８５】
本工程においては、ｐＨの調整を容易にするために緩衝液を使用することもできる。緩衝液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成される緩衝液、トリス緩衝液あるいはグッド緩衝液等が例示され使用できる。ただし、青酸とその塩によってのみ構成される緩衝液は、ニトリルヒドラターゼの活性を著しく阻害するため、本工程においては使用してはならない。４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する工程で緩衝液を使用した場合及び本工程において緩衝液を使用する場合、その濃度についても上記の塩濃度に加えて、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度（質量％）との積を算出し濃度を調整することが好ましい。
【００８６】
該ニトリルの水溶液とニトリルヒドラターゼとの接触の方法については特に制限されず、例えば、該ニトリルの水溶液にニトリルヒドラターゼを一括添加する方法や、該ニトリルの水溶液にニトリルヒドラターゼを分割添加する方法、ニトリルヒドラターゼを含む水溶液に該ニトリルの水溶液を分割添加する方法が挙げられる。アミド化反応が発熱反応であることから、ニトリルヒドラターゼを該ニトリルの水溶液に分割添加する方法、およびニトリルヒドラターゼを含む水溶液に該ニトリルの水溶液を分割添加する方法が好ましい。
【００８７】
反応温度は、使用するニトリルヒドラターゼにより適宜選択されるが、酵素の安定性と反応の円滑な進行、および副反応の抑制の面から０〜３０℃程度に維持することが好ましく、より好ましくは０〜２０℃である。
【００８８】
反応液のｐＨも使用する微生物により適宜選択され、ｐＨ４〜１０の範囲で行うことができるが、酵素の安定性と反応の円滑な進行、および副反応の抑制の面からｐＨ６〜８．５が好ましく、ｐＨ７〜８．５が特に好ましい。
【００８９】
反応時間は該ニトリル濃度、酵素量又はその他の反応条件によって変わるが、通常０．５〜１２０ 時間で終了するように条件を設定することが好ましく、副反応の進行を抑制するためにも、０．５〜２４時間程度で終了するように設定することがより好ましい。
【００９０】
なお、反応系内の光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルおよび光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの濃度ならびに光学純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定・定量することができる。また、反応系内の塩の濃度は、例えば滴定や、イオンクロマトグラフィー、ＩＣＰ発光分光分析法や原子吸光分析法によって測定・定量することができる。
【００９１】
工程III：４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの利用
以上のようにして合成した４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドは、ろ過や遠心分離による菌体等に由来する固形分の除去、抽出、カラム分離、再結晶等の定法に従い、単離精製することができる。
【００９２】
また、本工程で得られた４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを含む水溶液と、トリメチルアミンと接触することにより、カルニチンアミドとすることができる。この接触は常法にしたがって行えばよく、本工程で得られた４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを含む水溶液にトリメチルアミンの水溶液を滴下する方法や、気体のトリメチルアミンを吹き込む方法、トリメチルアミンの水溶液に本工程で得られた４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを含む水溶液を滴下する方法などが挙げられる。
【００９３】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドと、トリメチルアミンとの反応は、０〜１００℃で行うことができるが、反応の円滑な進行と副反応の抑制の面から、０〜５０℃で行うことが好ましく、０〜４０℃が特に好ましい。トリメチルアミンの使用量は、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドに対して１〜３当量が好ましく、１．１〜１．５当量が特に好ましい。
【００９４】
反応時間は温度やトリメチルアミンの使用量またはその他の反応条件によって変わるが、通常０．５〜１２０ 時間で終了するように条件を設定することが好ましい。
【００９５】
以上のようにして合成したカルニチンアミドはろ過や遠心分離による菌体等に由来する固形分の除去や、イオン交換樹脂による脱塩、再結晶などの常法に従い、単離精製することができる。また、塩基性条件下で加水分解することにより、カルニチンとすることもできる。
【実施例】
【００９６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００９７】
［分析方法］
ＨＰＬＣ分析：化学純度分析
本発明の工程Iのシアノ化反応における、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（以下ＤＣＰと称することがある）、及び４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（以下ＣＨＢＮと称することがある）の定量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて表１に示す分析条件で行った。  
【表１】
2009000097.tif 000006
【００９８】
また、本発明の工程IIのアミド化反応における、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、エピクロロヒドリン、及び４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド（以下ＣＨＢＡと称することがある）の定量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて表２に示す分析条件で行った。  
【表２】
2009000097.tif 000007
【００９９】
上記のＨＰＬＣ定量分析においては、予め、濃度既知のＤＣＰ、ＥＣＨ、ＣＨＢＮおよびＣＨＢＡの溶液を用いて検量線を作成し、該検量線を用いて反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨ、ＣＨＢＮおよびＣＨＢＡ濃度を求めた。なお、ＤＣＰ、ＥＣＨの標品については和光純薬工業（株）等から購入して入手することができる。ＣＨＢＮの標品については、（Ｒ）−ＣＨＢＮはアヅマックス（株）等から購入して入手することができる。ラセミ体のＣＨＢＮについては、特公平５−６９８１８号公報の記載にしたがって製造することなどにより入手できる。ＣＨＢＡの標品については、上記ＣＨＢＮを原料として特公昭５３−１３６１１号公報の記載にしたがって製造することなどにより入手できる。
【０１００】
なお、上述の工程IIIにおける、カルニチンアミド、およびカルニチンの定量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて表３に示す分析条件で行った。
【表３】
2009000097.tif 000008
【０１０１】
上記のＨＰＬＣ定量分析においては、予め、濃度既知のカルニチンアミドおよびカルニチンの溶液を用いて検量線を作成し、該検量線を用いて反応液中のカルニチンアミドおよびカルニチン濃度を求めた。なお、カルニチンアミドの標品については和光純薬工業（株）等から購入して入手することができる４−クロロアセト酢酸エチル等を原料として、特開昭５７−１４０７４９号公報に記載の方法に従って製造することなどにより入手できる。カルニチンの標品については、和光純薬工業（株）等から購入して入手することができる。
【０１０２】
ＨＰＬＣ分析：光学純度分析
（Ｒ）−ＣＨＢＮおよび（Ｒ）−ＣＨＢＡの光学純度は、以下のようにして測定した。（Ｒ）−ＣＨＢＮおよび／又は（Ｒ）−ＣＨＢＡを含む水溶液を約３ｍＬ採取し、等量の酢酸エチル加えて抽出を行った。酢酸エチル層を分取し、少量の無水硫酸ナトリウムを加えて撹拌した後、上清をエバポレーター（バス温度４０℃、３０Ｔｏｒｒ）にて濃縮し酢酸エチルを留去し、（Ｒ）−ＣＨＢＮおよび／又は（Ｒ）−ＣＨＢＡを主成分とするオイルを回収した。１．５ｍＬのマイクロチューブに上記のオイルを２μＬ採取し、ジクロロメタン２０μＬ、ピリジン２０μＬを加えた後、（Ｒ）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロライド（以下、（Ｒ）−ＭＴＰＡと称することがある）２μＬを添加し、約１０秒程度振り混ぜた後そのまま室温で５時間〜２４時間静置しエステル化反応を行った。反応終了液にジイソプロピルエーテル（以下、ＩＰＥと称することがある）約３００μＬを添加し、続いて１Ｎ塩酸水溶液約３００μＬを用いて洗浄、ＩＰＥ層を回収した。さらにＩＰＥ層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液約３００μＬで洗浄し、回収したＩＰＥ層をアスピレーターにより減圧濃縮、残渣をｎ−ヘキサン：２−プロパノール＝４：１の混合液に溶解させ、これをＨＰＬＣを用いて表４に示す分析条件で分析を行った。
【表４】
2009000097.tif 000009
【０１０３】
（Ｒ）−ＣＨＢＮ（またはＣＨＢＡ）−（Ｒ）−ＭＴＰＡエステルおよび（Ｓ）−ＣＨＢＮ（またはＣＨＢＡ）−（Ｒ）−ＭＴＰＡエステルのエリア面積比から、（Ｒ）−ＣＨＢＮ（またはＣＨＢＡ）の光学純度を下記のごとく算出した。なお、上記エリア面積については、事前にラセミ体のＣＨＢＮ（またはＣＨＢＡ）の（Ｒ）−ＭＴＰＡエステルについて上記表２の分析条件にて分析してしておき、得た（Ｒ）−ＣＨＢＮ（またはＣＨＢＡ）−（Ｒ）−ＭＴＰＡエステルおよび（Ｓ）−ＣＨＢＮ（またはＣＨＢＡ）−（Ｒ）−ＭＴＰＡエステルのエリア面積の比により補正を行った。
【０１０４】
＜式１＞
2009000097.tif 000010
ここで [R]は被測定試料における（Ｒ）−ＣＨＢＮ（またはＣＨＢＡ）−（Ｒ）−ＭＴＰＡエステルの、[S]は被測定試料における（Ｓ）−ＣＨＢＮ（またはＣＨＢＡ）−（Ｒ）−ＭＴＰＡエステルのエリア面積を示す。
【０１０５】
ｒはr=[R]rac/[S]racで定義し、算出される補正係数であり、[R]racはラセミ体のＣＨＢＮ（またはＣＨＢＡ）における（Ｒ）−ＣＨＢＮ（またはＣＨＢＡ）−（Ｒ）−ＭＴＰＡエステルのエリア面積を、[S]racはラセミ体のＣＨＢＮ（またはＣＨＢＡ）における（Ｓ）−ＣＨＢＮ（またはＣＨＢＡ）−（Ｒ）−ＭＴＰＡエステルのエリア面積を示す。
【０１０６】
滴定による分析：シアンイオン分析
反応液中におけるシアンイオン濃度については、「毒物又は劇物を含有する物の定量方法を定める省令」（昭和四十一年一月八日厚生省令第一号）の「別表第一  シアンイオン標準溶液に係る吸光度の測定」の項に記載の、ｐ−ジメチルアミノベンジリデンロダニンを指示薬とした硝酸銀試液による滴定の方法を参考に、下記のように滴定によって測定した。
【０１０７】
２００ｍＬ三角フラスコに、測定に係る液を正確に秤取し、必要に応じてイオン交換水または蒸留水を加え約１００ｍＬとした後（測定に係る液が１００ｍＬあれば加える必要はない）、苛性アンモニア水（４％水酸化ナトリウムを含む５％アンモニア水）を１０ｍＬ加えて（測定に係る液が強酸性の場合、ｐＨ＞９となるまで増量する）、ｐ−ジメチルアミノベンジリデンロダニン０．０２ｇにアセトンを加えて溶かし１００ｍＬとした溶液０．５ｍＬを加え、硝酸銀水溶液（０．１Ｎ、または必要に応じ０．０１Ｎ）で、液が赤色に変わるまで滴定し、滴定に要した硝酸銀水溶液の量（ｍＬ）から次の式により算出する。
【０１０８】
＜式２＞
2009000097.tif 000011
滴定による分析：塩化物イオン分析
反応液中における塩化ナトリウム濃度については、ホルハルト法における滴定結果から、上記により測定したシアンイオンの濃度を差し引いて塩化物イオンの濃度を算出し、塩化ナトリウム濃度に換算することにより求めた。具体的には下記のようにして行った。
【０１０９】
２００ｍＬ三角フラスコに、０．１Ｎ硝酸銀水溶液を正確に２０ｍＬ取り、測定に係る液を正確に秤取し加える。イオン交換水または蒸留水５０ｍＬ、１５％硝酸水溶液１０ｍＬを加えて、硫酸鉄（III）アンモニウム溶液（硫酸鉄（III）アンモニウム・１２水和物１０ｇに２０％硝酸水溶液１０ｍＬとイオン交換水または蒸留水８０ｍＬを加えて溶解したもの）５ｍＬと、ニトロベンゼン５ｍＬを加え、０．１Ｎチオシアン酸アンモニウム水溶液で、液が赤褐色を呈するまで滴定し、滴定に要したチオシアン酸アンモニウム水溶液の量（ｍＬ）から、（シアンイオン＋塩化物イオン）の重量モル濃度（ｍｍｏｌ／ｍｇ）を次の式により算出する。
【０１１０】
＜式３＞
2009000097.tif 000012
ここで、ブランクとは、０．１Ｎ硝酸銀水溶液２０ｍＬを上記方法にて滴定（つまり、測定に係る液を加えないで滴定）した際の、滴定に要したチオシアン酸アンモニウム水溶液の量（ｍＬ）である。
【０１１１】
塩化ナトリウムの濃度は、上記式３で算出した（シアンイオン＋塩化物イオン）の重量モル濃度（ｍｍｏｌ／ｍｇ）から、上記の「滴定による分析」で求めたシアンイオン濃度を重量モル濃度（ｍｍｏｌ／ｍｇ）に換算した値を差し引き、塩化物イオンの重量モル濃度（ｍｍｏｌ／ｍｇ）を求め、これに塩化ナトリウムの分子量（５８．４４）を掛けることにより求められる。具体的には、次の式により示される。
【０１１２】
＜式４＞
2009000097.tif 000013
［調製例１］
ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物JM109/pST111の培養
ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ大腸菌形質転換体JM109/pST111（FERM BP-10922）の培養を以下のように行った。なお、pST111は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）sp.N-1074のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ＨｈｅＢ）を含むBam H I - Pst I １．１ｋｂｐ断片をｐＵＣ１１８に結合させたプラスミドであり、ｐＳＴ１１１は、特許第３０２６３６７号公報に記載されている。
【０１１３】
JM109/pST111のコロニーを、５００ｍＬ三角フラスコ中に調製した１００ｍＬ のＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ、１ｍＭ ＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍＬアンピシリンナトリウム） ２０本に植菌し、３７℃で２０時間振盪培養した。ＬＢ培地は、アンピシリンナトリウムおよびＩＰＴＧ以外の各成分必要量を水に溶解して１００ｍＬにメスアップした後に加熱滅菌（１２１℃、２０分間）を行い、室温に冷却後、予め０．４５μｍのフィルターでろ過除菌しておいたアンピシリンナトリウム水溶液（１００ｇ／Ｌ）を５０μＬ、および予め０．４５μｍのフィルターでろ過除菌しておいたＩＰＴＧ水溶液（２４０ｇ／Ｌ）を１００μＬをそれぞれ無菌条件下にて添加して調製した。
【０１１４】
培養菌体を５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８）で洗浄し、５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８）を２０ｇになるように加え、懸濁した。この菌体懸濁液の活性は１ｇあたり４４０Ｕであった。この菌体懸濁液を５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８）で菌体懸濁液１ｇあたり４００Ｕになるように希釈した。
【０１１５】
上記で得られた菌体懸濁液の活性は、下記のようにＤＣＰからの塩化物イオン脱離量を測定することにより算出した。
【０１１６】
１００ｍＬの活性測定用反応液（５０ｍＭ ＤＣＰ、５０ｍＭ トリス−硫酸（ｐＨ８））を調製し、温度を２０℃に調整した。該反応液に、希釈した菌体懸濁液を添加し、反応を開始した。ハロヒドリンエポキシダーゼ活性による塩化物イオンの遊離に伴うｐＨの低下を、ｐＨ自動コントローラーを用い、０．０１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を用いて、ｐＨを８に保つよう連続的に調整した。１０分間の反応の間に、ｐＨを８に保つために投入された０．０１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の量から、塩化物イオン生成量を算出し、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性（脱クロル活性）（Ｕ）を算出した。１Ｕは上記条件下でＤＣＰから１分間あたり１μｍｏｌの塩化物イオンが脱離する酵素量に相当するものと定義した。
【０１１７】
［調製例２］
ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物JM109/pST111の培養
JM109/pST111のコロニーを、５００ｍＬフラスコ中に調製した１００ｍＬの前培養培地（ポリペプトンＮ ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム １．５ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム０．１ｇ／Ｌ；ｐＨ７．２）に植菌し、温度３７℃、回転数２１０ｒｐｍにて、６時間振盪培養を行った。
【０１１８】
前培養培地は、アンピシリンナトリウム以外の各成分必要量を水に溶解して１００ｍＬにメスアップした後に加熱滅菌（１２１℃、２０分間）を行い、室温に冷却後、予め０．４５μｍのフィルターでろ過除菌しておいたアンピシリンナトリウム水溶液（１００ｇ／Ｌ）を無菌条件下にて１００μＬ添加して調製した。
【０１１９】
得られた前培養液２０ｍＬを、３Ｌジャーファーメンター中に調製した１．８Lの本培養培地（フルクトース ４０ｇ／Ｌ、ポリペプトンＮ ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム １．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物 ２．３７５ｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物 ０．２ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水和物 ０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物 ０．０２ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム ０．１ｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ ０．２４ｇ／Ｌ、プルロニックＬ−６１（株式会社ＡＤＥＫＡ、日本） ０．５ｇ／Ｌ） ２本に植菌し、温度３７℃、回転数７５０ｒｐｍ、通気量２Ｌ／ｍｉｎ、常圧、ｐＨ６．８−７．２制御（水酸化ナトリウム２５％水溶液および硫酸２４％水溶液を使用）で２４時間培養を行った。
【０１２０】
本培養培地は、必要量のフルクトースを水に溶解して５００ｍＬにメスアップした後に加熱滅菌（１２１℃、２０分間）したものと、フルクトースおよびアンピシリンナトリウム以外の各成分必要量を水に溶解して１．３Ｌにメスアップした後に加熱滅菌（１２１℃、２０分間）したものとを無菌条件下で混合し、室温に冷却後、予め０．４５μｍのフィルターでろ過除菌しておいたアンピシリンナトリウム水溶液（１００ｇ／Ｌ）を１．８ｍＬ、および予め０．４５μｍのフィルターでろ過除菌しておいたＩＰＴＧ水溶液（２４０ｇ／Ｌ）を１．８ｍＬ添加して調製した。
【０１２１】
培養終了後、菌体の集菌、洗浄を行った。２本のジャーファーメンター培養液を混合したものから３５６５ｇ（ＯＤ６３０＝３５）を採り、１２，０００ｒｐｍ（１４，１００Ｇ）で１０分間遠心分離を行い、湿菌体１４２ｇを得た。該湿菌体に水２７８ｇを加え、均一になるよう再懸濁して菌体懸濁液４２０ｇ（ＯＤ６３０＝３００）を得た。菌体懸濁液の活性は１ｇあたり２０００Ｕであった。
【０１２２】
得られた菌体懸濁液のうち２２０ｇを約１０℃に冷却した後、高圧ホモジナイザーＰＡ２Ｋ（ＮｉｒｏＳｏａｖｉ社、イタリア）を用いて約１００ＭＰａで破砕処理を行った。再び約１０℃まで冷却した後、再度約１００ＭＰａで破砕処理を行い、菌体破砕液１７０ｇを得た。これに１０％塩酸アルキルジアミノエチルグリシン水溶液を１７ｍＬ添加し（終濃度０．９１％となる）、約１０分間撹拌した後、１７．０ｇのセライトＨｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｌ（ワールドミネラルズ社、米国）を加え、さらに約５分間撹拌した。予め９ｇのセライトＨｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｌをプリコートしておいたろ過面積約１６３ｃｍ２のＮｏ．５Ａろ紙（アドバンテック（株）、日本）および加圧ろ過器（アドバンテック（株）、日本）を用い、圧力０．２ＭＰａで加圧ろ過を行い、粗酵素液を得た。粗酵素液の活性は１ｇあたり１７５０Ｕであった。
【０１２３】
［調製例３］
ニトリルヒドラターゼ発現微生物Rhodococcus rhodochrous J-1株の培養
ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J-1株（FERM BP-1478）を、３０Ｌ容ジャーファーメンターにて、グルコース２％、尿素１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、塩化コバルト０．０５％を含む培地（ｐＨ７．０）により温度３０℃で好気的に６０時間培養し、これを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）にて洗浄し、菌体懸濁液５００ｇ（乾燥菌体換算２０％）を得た。
【０１２４】
＜実施例１〜６、比較例１〜４＞
工程I-A：シアノ化酵素反応
ｐＨ電極及びｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した３００ｍＬ４つ口フラスコに、水１２７．５５ｇ、ＨＣＮ４．４１ｇ（０．１６３２ｍｏｌ）を入れ、３０％ＮａＯＨ ０．６５ｇ（０．００４９ｍｏｌ）で、ｐＨ７．５に調整した。１，３-ジクロロ-２-プロパノール１０．００ｇ（０．０７７５ｍｏｌ）を入れ、均一に溶解するまで攪拌した。
【０１２５】
調製例１のJM109/pST111菌体懸濁液２０．００ｇを加え、２０℃で反応を開始した。系内のｐＨを７．５〜７．６に維持するよう、３０％ＮａＯＨを投入するようにｐＨコントローラーを設定し、投入されたＮａＯＨとほぼ等モルの割合で１，３-ジクロロ-２-プロパノール， ＨＣＮを追加していくことで、系内の１，３-ジクロロ-２-プロパノールの濃度を０．５ｍｏｌ/ｋｇを超えないよう、また、系内のシアンイオン濃度を１．１ｍｏｌ/ｋｇを超えないようにした。このときの反応プロファイルを表５に示す。
【表５】
2009000097.tif 000014
【０１２６】
２３時間後、４-クロロ-３-ヒドロキシブチロニトリルを０．７５３ｍｏｌ/ｋｇ（９．０％）蓄積することができ、その光学純度は９４．８％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−体過剰であった。反応により消費された１，３-ジクロロ-２-プロパノールからの収率は９６．３％であった。
【０１２７】
この反応液を塩酸でｐＨ５．０に調節し、６０℃、１４０ｔｏｒｒで４時間減圧してＨＣＮの除去を行い、滴定により、反応系内のＨＣＮが１ｐｐｍ以下であることを確認した。
【０１２８】
工程I-B：アミド化酵素反応前処理
上記シアノ化反応工程で得られた（Ｒ）−ＣＨＢＮ水溶液を１４０ｔｏｒｒで減圧し、６０℃、１１時間加熱処理を行った。この（Ｒ）−ＣＨＢＮ水溶液を２０％まで濃縮し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５の水溶液とした。
【０１２９】
工程I-C：アミド化酵素反応
上記処理を行った、（Ｒ）−ＣＨＢＮ２０％水溶液の、（Ｒ）−ＣＨＢＮ濃度、食塩濃度、ＣＨＢＮ濃度と食塩濃度の積を、表６に記載の所定値に調整後５ｇ採取し、調整例３のRhodococcus rhodochrous J-1株菌体懸濁液を表６に記載の所定量滴下し、２℃で反応を開始した。結果は表６に示す。
【０１３０】
＜実施例７＞
実施例１の工程I-Aで得られた（Ｒ）−ＣＨＢＮ水溶液を、加熱処理を行わずにそのまま濃縮し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５とした後、（Ｒ）−ＣＨＢＮの濃度が１４．０％、食塩濃度が７．７％、つまりＣＨＢＮ濃度と食塩濃度の積が１０８の水溶液を調製した。この水溶液に酢酸コバルトを１２０ｐｐｍとなるように添加し、５分間室温で攪拌した。それ以外は実施例１と同様に反応を行った。結果は表６に示す。
【０１３１】
＜実施例８＞
実施例１の工程I-Aで得られた（Ｒ）−ＣＨＢＮ水溶液を、加熱処理を行わずにそのまま濃縮し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５とした後、（Ｒ）−ＣＨＢＮの濃度が１４．０％、食塩濃度が８．１％、つまりＣＨＢＮ濃度と食塩濃度の積が１１４の水溶液を調製した。この水溶液に硝酸ニッケルを１９０ｐｐｍとなるように添加し、１時間室温で攪拌した。それ以外は実施例１と同様に反応を行った。結果は表６に示す。
【表６】
2009000097.tif 000015
【０１３２】
比較例１〜４では十分な時間が経過しても転化率１００％には未到達であったのに対して、実施例１〜８では反応開始後２時間で転化率１００％であった。
【０１３３】
＜実施例９＞
実施例１の工程I-Aで得られた（Ｒ）−ＣＨＢＮ水溶液を、加熱処理を行わずにそのまま濃縮し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５とした後、（Ｒ）−ＣＨＢＮの濃度が１３．５％、食塩濃度が６．９％、つまりＣＨＢＮ濃度と食塩濃度の積が９３の水溶液を調製した。この水溶液に塩化コバルトを８．１ｐｐｍとなるように添加し、５分間室温で攪拌した。それ以外は実施例１と同様に反応を行った。結果は表７に示す。
【０１３４】
＜実施例１０＞
実施例１の工程I-Aで得られた（Ｒ）−ＣＨＢＮ水溶液を、加熱処理を行わずにそのまま濃縮し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５とした後、（Ｒ）−ＣＨＢＮの濃度が１３．５％、食塩濃度が６．９％、つまりＣＨＢＮ濃度と食塩濃度の積が９３の水溶液を調製した。この水溶液に塩化コバルトを８．１ｐｐｍとなるように添加し、３０分間室温で攪拌した。それ以外は実施例１と同様に反応を行った。結果は表７に示す。
【０１３５】
＜実施例１１＞
実施例１の工程I-Aで得られた（Ｒ）−ＣＨＢＮ水溶液を、加熱処理を行わずにそのまま濃縮し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５とした後、（Ｒ）−ＣＨＢＮの濃度が１３．５％、食塩濃度が６．９％、つまりＣＨＢＮ濃度と食塩濃度の積が９３の水溶液を調製した。この水溶液に塩化コバルトを８．１ｐｐｍとなるように添加し、２時間室温で攪拌した。それ以外は実施例１と同様に反応を行った。結果は表７に示す。
【０１３６】
＜実施例１２＞
実施例１の工程I-Aで得られた（Ｒ）−ＣＨＢＮ水溶液を、加熱処理を行わずにそのまま濃縮し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５とした後、（Ｒ）−ＣＨＢＮの濃度が１３．５％、食塩濃度が６．９％、つまりＣＨＢＮ濃度と食塩濃度の積が９３の水溶液を調製した。この水溶液に塩化コバルトをｐＨ４で８．１ｐｐｍとなるように添加し、５分間室温で攪拌し、ｐＨ４のまま反応を開始した。それ以外は実施例１と同様に反応を行った。結果は表７に示す。
【表７】
2009000097.tif 000016
【０１３７】
＜実施例１３＞
工程II-A：シアノ化酵素反応
ｐＨ電極及びｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した１０Ｌ容セパラブルフラスコに、水５４５２ｇ、ＨＣＮ１６９ｇを投入し攪拌後、３０％ＮａＯＨ２９ｇでｐＨ７．８に調整した。その後、ＤＣＰ４００ｇを加え、均一に溶解するまで攪拌した。次いで、調製例２の粗酵素液１８３ｇ（３２０ｋＵ）を加え、１８℃、ｐＨ７．８〜７．９で反応を開始した。
【０１３８】
反応開始後は、反応系内のｐＨを制御するために、ｐＨコントローラーを設定し、３０％ＮａＯＨにてｐＨ７．８〜７．９の制御を行った。反応開始直後はｐＨが７．０まで低下したが、その後はｐＨ７．８〜７．９の間に維持した。並行して、投入された３０％ＮａＯＨとほぼ等モルの割合でＤＣＰ４００ｇおよびＨＣＮ９９ｇを追添加した。
【０１３９】
反応開始から２３時間後、３０％ＮａＯＨ８２０ｇ追加された時点で、ｐＨ制御を終了し、シアノ化酵素反応終了液７５５２ｇ（ａ）を得た。ＣＨＢＮのＤＣＰからの収率は８６．８％であった。
【０１４０】
上記のシアノ化酵素反応終了液（ａ）のうち、７５００ｇに、３５％塩酸を２４ｇ添加し、ｐＨ２．０に調整した。釜内温８０℃、４００〜５００Ｔｏｒｒで減圧濃縮を行い、−１０℃で冷却した冷却管を用いて、１４４ｇの留出液（ｂ）を得た。続いて、窒素ガスを毎分２０ｍＬ吹き込みながら、釜内温５０〜６０℃、８０〜１００Ｔｏｒｒで減圧濃縮を行い、−２℃で冷却した冷却管を用いて、３２６７ｇの留出液（ｃ）を得た。このとき、釜内の残渣（ｄ）は３９８１ｇであった。留出液（ｂ）および（ｃ）で得られた、シアノ化酵素反応終了液（ａ）中の未反応ＤＣＰおよびＨＣＮ、ＣＨＢＮの回収率はそれぞれ６９．０％、５３．１％、０．３％であった。
【０１４１】
工程II-B：アミド化酵素反応前処理
上記工程II-Aで得られた残渣（ｄ）のうち、２０００ｇを３Ｌ容セパラブルフラスコに仕込み、０．１％塩化コバルト（ＩＩ）水溶液２０ｇを入れ攪拌したのち、３０％ＮａＯＨ２．７ｇにてｐＨ８．２に調整し、水を２５７ｇ添加して反応液を希釈した後２０℃で１時間攪拌した。攪拌中、ｐＨは８．２のままであった。
【０１４２】
工程II-C：アミド化酵素反応
上記工程II-Bで得られた処理液を２℃に冷却し、調製例３のRhodococcus rhodochrous J-1株菌体懸濁液を６ｇ加え、反応開始液の組成（ｅ）にて反応を開始した。反応中、４％ＮａＯＨを随時添加し、ｐＨを７．８〜８．２の間に維持した。反応開始から４時間後、ＨＰＬＣにてＣＨＢＮの消失と、ＣＨＢＡの生成を確認した。このとき、４％ＮａＯＨの添加量は２ｇで、反応液の組成は（ｆ）であり、ＣＨＢＡのＣＨＢＮからの収率は９９．９％であった。
【０１４３】
なお、上記工程II-A〜II-Cにおける、各液の組成を表８に示す。
【表８】
2009000097.tif 000017
【０１４４】
表８により、本工程Ｂにおいて、ＣＨＢＮの濃度（重量％）と塩濃度（重量％）の積は、
１４（％）×（８．０４（％）＋０．０００８（％））＝１１２．５７であった。
【０１４５】
工程II-D：カルニチンアミドの合成
上記工程II-Cで得られた反応液に、３０％トリメチルアミン水溶液６３３ｇを加え、３０℃で攪拌しながら反応を行った。反応開始から５時間後、ＨＰＬＣにて、ＣＨＢＡの消失と、カルニチンアミドの生成を確認した。このとき、カルニチンアミドのＣＨＢＡからの収率は９５％であった。
【０１４６】
＜実施例１４＞
工程III-B：アミド化酵素反応前処理
実施例１３の工程II-Aにおいて得た残渣（ｄ）のうち、１０００ｇを２Ｌ容セパラブルフラスコに仕込み、常圧下、１００℃で１２時間加熱還流させた後、３０％ＮａＯＨ１．３ｇにてｐＨ８．２に調整した。
【０１４７】
工程III-C：アミド化酵素反応
上記工程III-Bで得られた処理液を２℃に冷却し、調製例７のRhodococcus rhodochrous J-1株菌体懸濁液を３ｇ加え、反応を開始した。反応中、４％ＮａＯＨを随時添加し、ｐＨを７．８〜８．２の間に維持した。反応開始から１０時間後、ＨＰＬＣにてＣＨＢＮの消失と、ＣＨＢＡの生成を確認した。このとき、４％ＮａＯＨの添加量は１ｇで、ＣＨＢＡのＣＨＢＮからの収率は９９．５％（光学純度９１．９％ｅｅ）であった。本工程IIにおいて、ＣＨＢＮの濃度（重量％）と塩濃度（重量％）の積は、１５．９３（％）×９．１５（％）＝１４５．７６であった。
【０１４８】
工程III-D：カルニチンアミドの合成
上記工程III-Cで得られた反応液に、３０％トリメチルアミン水溶液３１６．５ｇを加え、３０℃で攪拌しながら反応を行った。反応開始から５時間後、ＨＰＬＣにて、ＣＨＢＡの消失と、カルニチンアミドの生成を確認した。このとき、カルニチンアミドのＣＨＢＡからの収率は９５％であった。
【０１４９】
＜実施例１５＞
工程IV-A：４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの合成
攪拌機、温度計、ジムロート冷却菅を備えた３Ｌセパラブルフラスコに、エピクロロヒドリン２７４．９３ｇ（２．９７ｍｏｌ）、水１２７１．３ｇ、硫酸ナトリウム１９１．７５ｇ（１．３５ｍｏｌ）を仕込み、温水浴中で攪拌しながら内温５０〜６０℃でＨＣＮ７２．３ｇ（２．７０ｍｏｌ）を１時間かけて反応液中に直接供給した。その後、内温５０〜６０℃で熟成を６時間行った。窒素ガスを毎分１０ｍＬ吹き込みながら、釜内温５０〜６０℃、８０〜１００Ｔｏｒｒで減圧濃縮を行い、−２℃で冷却した冷却管を用いて、５５０ｇの留出液を得た。このとき、釜内の残渣は１２６０ｇであり、釜内の残渣における、ＣＨＢＮの濃度は１６％、硫酸ナトリウムの濃度は１５．２１％、ＨＣＮの濃度は１ｐｐｍであった。
【０１５０】
工程IV-B：アミド化酵素反応前処理
上記工程IV-Aで得られた残渣のうち、５００ｇを１Ｌ容セパラブルフラスコに仕込み、０．１％塩化コバルト（ＩＩ）水溶液５ｇを入れ攪拌したのち、３０％ＮａＯＨ０．５ｇにてｐＨ８．２に調整し、水を２９３ｇ添加して反応液を希釈した後２０℃で１時間攪拌した。攪拌中、ｐＨは８．２のままであった。
【０１５１】
工程IV-C：アミド化酵素反応
上記工程IV-Bで得られた処理液を２℃に冷却し、調製例３のRhodococcus rhodochrous J-1株菌体懸濁液を１．５ｇ加え、反応を開始した。反応中、４％ＮａＯＨを随時添加し、ｐＨを７．８〜８．２の間に維持した。反応開始から４時間後、ＨＰＬＣにてＣＨＢＮの消失と、ＣＨＢＡの生成を確認した。このとき、４％ＮａＯＨの添加量は０．５ｇで、ＣＨＢＡのＣＨＢＮからの収率は９９．９％であった。本工程において、反応開始時のＣＨＢＮの濃度（重量％）と塩濃度（重量％）の積は、１０（％）×（９．５（％）＋０．０００６（％））＝９５であった。
【０１５２】
＜実施例１６＞
工程V-B：アミド化酵素反応前処理
実施例１５の工程IV-Aにおいて得た残渣のうち、５００ｇを１Ｌ容セパラブルフラスコに仕込み、常圧下、１００℃で１２時間加熱還流させた後、３０％ＮａＯＨ０．５ｇにてｐＨ８．２に調整し、水を加えてＣＨＢＮの濃度を１０．０５％とした。
【０１５３】
工程V-C：アミド化酵素反応
上記工程V-Bで得られた処理液を２℃に冷却し、調製例３のRhodococcus rhodochrous J-1株菌体懸濁液を４ｇ加え、反応を開始した。反応中、４％ＮａＯＨを随時添加し、ｐＨを７．８〜８．２の間に維持した。反応開始から１０時間後、ＨＰＬＣにてＣＨＢＮの消失と、ＣＨＢＡの生成を確認した。このとき、４％ＮａＯＨの添加量は１ｇで、ＣＨＢＡのＣＨＢＮからの収率は９９．５％であった。本工程において、ＣＨＢＮの濃度（重量％）と塩濃度（重量％）の積は、１０（％）×９．５（％）＝９５であった。