(57)【要約】【課題】透過型電子顕微鏡用薄片試料の作製時間を効率よく短縮し、また、作製した試料が包埋樹脂と剥離を起こし難く、観察可能個所を増やすこと。【解決手段】高分子薄膜試料の断面を透過型電子顕微鏡で観察するための断面薄片試料の作成方法であって、  前記高分子薄膜試料を複数枚重ねる工程と、複数枚重ねた状態で前記試料を切断する工程と、前記高分子薄膜試料をモールドに入れ、樹脂に包埋する工程と、前記包埋された樹脂を硬化させる工程と、前記試料が包埋された硬化後の樹脂ブロックをウルトラミクロトームで薄片化する工程とを含むことを特徴とする断面薄片試料の作成方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子薄膜試料の断面を透過型電子顕微鏡で観察するための断面薄片試料の作成方法であって、
前記高分子薄膜試料を複数枚重ねる工程と、複数枚重ねた状態で前記試料を切断する工程と、前記高分子薄膜試料をモールドに入れ、樹脂に包埋する工程と、前記包埋された樹脂を硬化させる工程と、前記試料が包埋された硬化後の樹脂ブロックをウルトラミクロトームで薄片化する工程とを含むことを特徴とする断面薄片試料の作成方法。
【請求項２】
前記高分子薄膜試料の厚みが５〜５０μｍであることを特徴とする請求項１記載の断面薄片試料の作成方法。
【請求項３】
前記試料を複数枚重ねる工程にて、多層構造からなる高分子薄膜試料の表裏を揃えることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の断面薄片試料の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、光学顕微鏡、電子顕微鏡での分析に用いるサンプル包埋体の作製技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、透過型電子顕微鏡は、試料から透過した電子線をもとに結像するため、電子線の通過に可能な厚みになるまで薄片化する前処理が必要になる。
【０００３】
ウルトラミクロトームは、光学顕微鏡や電子顕微鏡等で観察するための試料の前処理作業である樹脂包埋された試料ブロックの断面出しや薄片作成装置として用いられてきた（例えば非特許文献１参照）。樹脂包埋は、試料が柔らかい、または非常に薄膜である場合などに、切削の衝撃により破損、変形するのを防ぐために、試料を固定する操作である。包埋された樹脂は、内部に埋め込まれた試料面が露出するまで削られ、最終的には、削り跡が目立たなくなるまで、平滑になるように、ガラスナイフやダイヤモンドナイフで仕上げられる。
【０００４】
ウルトラミクロトームは、上下に動くアーム、微量移動が可能なナイフ用台座、実体顕微鏡を有する。削る際には、試料ブロックを試料ホルダーに固定し、アームに試料ホルダーを挿入固定し、試料近傍までナイフ用台座を近づけ、アームが上下することにより、切削される。ナイフ用台座を微量動かすことにより、超薄切片を作製する。
【０００５】
薄片採取の方法としては、不溶性で常温切削可能である場合、水を用いたウェット切削法が用いられることが多い。ウェット切削法では、ダイヤモンドナイフのナイフボート内に水が張られ、薄片が切削により作られるたびに薄片は連なり、ナイフボート上の水面上に浮かぶ。その薄片群をメッシュで採取することにより、電子顕微鏡用試料として用いる。
【非特許文献１】朝倉健太郎、広畑泰久共編，「電子顕微鏡研究者のためのウルトラミクロトーム技法Ｑ＆Ａ」，第１版，アグネ承風社，１９９９年９月３０日，ｐ．３−８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来一般でおこなわれてきた前記記載の包埋樹脂をウルトラミクロトームにて切削する方法は、手間と時間がかかる。巻き取り式の原反など大型製品の形態検査をおこなう場合などに、より確実なデータを求めるために、検体数を上げることがあるが、検体数が増加すると更に時間が倍増するという問題があった。また、試料を樹脂で包埋したのち、薄片化する過程では、試料や切削時の強さや刃のふりおろしスピード、水位などの切削条件により、包埋で固定した試料と樹脂の間に剥離が生じ、樹脂との剥離の衝撃で試料が変形することもある。
【０００７】
そこで、本発明は、透過型電子顕微鏡用薄片試料の作製時間を効率よく短縮し、また、作製した試料が包埋樹脂と剥離を起こし難く、観察可能個所を増やすことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための請求項１に係る発明は、
高分子薄膜試料の断面を透過型電子顕微鏡で観察するための断面薄片試料の作成方法であって、
前記高分子薄膜試料を複数枚重ねる工程と、複数枚重ねた状態で前記試料を切断する工程と、前記高分子薄膜試料をモールドに入れ、樹脂に包埋する工程と、前記包埋された樹脂を硬化させる工程と、前記試料が包埋された硬化後の樹脂ブロックをウルトラミクロトームで薄片化する工程とを含むことを特徴とする断面薄片試料の作成方法である。
【０００９】
また請求項２に係る発明は、
前記高分子薄膜試料の厚みが５〜５０μｍであることを特徴とする請求項１記載の断面薄片試料の作成方法である。
【００１０】
また請求項３に係る発明は、
前記試料を複数枚重ねる工程にて、多層構造からなる高分子薄膜試料の表裏を揃えることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の断面薄片試料の作成方法である。
【発明の効果】
【００１１】
請求項１に記載の発明は、複数の試料をひとつのモールドに埋め込み、試料と試料の間に樹脂が入り込むので、透過型電子顕微鏡用薄片試料の作製時間を効率よく短縮し、また、作製した試料が包埋樹脂と剥離を起こし難く、観察可能個所を増やせるという効果がある。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、観察用試料を４〜４０枚程度重ね合わせることが可能なので、上記効果が、より一層高くなるという効果がある。
【００１３】
請求項３に記載の発明は、多層構造からなる高分子薄膜試料が反る場合でも、反る方向と角度が同様になるため、複数の試料を重ね合わせることが可能となり、上記効果が得られるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
まず、本発明方法により断面薄片試料にされる高分子薄膜試料について説明する。
【００１５】
高分子薄膜試料としては、公知の高分子フィルムを用いることができる。高分子フィルムとしては、ポリエチレン（ＰＥ）フィルム、ポリプロピレン（ＰＰ）フィルム、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）フィルム、三酢酸セルロース（ＴＡＣ）フィルム、ポリカーボネート（ＰＣ）フィルム、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）フィルム、ナイロン（Ｎｙ）フィルム、ポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）フィルム、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）フィルム等が例示される。なお、高分子フィルムは単層構造であっても、積層構造であってもかまわない。
【００１６】
また、高分子薄膜試料は、プラスチックフィルム上の少なくとも一方の面若しくは両面に単層若しくは複数の機能層を備えていても良い。また、機能層はパターン上に形成されていても良い。例えば、導電性フィルムにあっては、プラスチックフィルム上に導電性物質からなる導電層が機能層として形成されており、これを高分子薄膜試料とすることができる。また、バリア性フィルムにあっては、プラスチックフィルム上に金属酸化物等からなるバリア層が機能層として形成されており、これを高分子薄膜試料とすることができる。なお、高分子薄膜試料は、これらに限定されるものではない。
【００１７】
また、高分子薄膜試料は、厚さが５〜５０μｍのものを用いることができる。
【００１８】
また、複数枚重ねあわされた高分子薄膜試料は、静電気力により付着し合い、１枚の高分子薄膜試料のように扱うことができる。
【００１９】
以下に、本発明に係る断面薄片試料の作成方法について、その最良の一実施形態を説明する。
【００２０】
まず、前記高分子薄膜試料を、望ましくは１０〜２０μｍ厚みの高分子試料を、２〜５枚重ね合わせる。このとき、多層構造からなる高分子薄膜試料の場合、それらの表裏を揃えることが好ましい。
【００２１】
次に、複数枚重ねた状態で前記試料を切断する。前記試料端が動かぬように片面や両面のセロハンテープで固定した状態でくさび形に切断することが望ましい。固定したテープごと切断し、観察断面のさまたげになる場合は、後工程でのトリミング時にテープをトリミング除去してもよい。
【００２２】
次に、前記高分子薄膜試料を包埋用モールドに入れ、樹脂に包埋する。前記高分子薄膜試料の包埋樹脂ブロックを作製する包埋用モールドは、図１に示すように複数の凹みがあり、シリコン材でつくられており、柔らかいため、硬化後に容易に包埋樹脂ブロックを取り出すことができる。
【００２３】
望ましくは、前記薄膜試料が静電気などで１枚ずつの分離が困難な程度に付着している状態、またはテープで固定された状態で、熱硬化樹脂、または光硬化樹脂が流し込まれたモールドに、くさび形試料の細い側をモールドの末端に近くなるような位置に針やピンセットなどの突起物で沈め、底に押し付けるようにする。高分子薄膜試料同士が静電気により付着している場合においても、わずかな隙間まで樹脂が入り込むため、試料周囲は少なくとも３方向は樹脂で囲まれる。
【００２４】
次に、前記包埋された樹脂を硬化させる。熱硬化樹脂の場合は、加熱、光硬化樹脂の場合は光照射をおこない、樹脂硬化させる。
【００２５】
次に、前記試料が包埋された硬化後の樹脂ブロックをウルトラミクロトームで薄片化する。
【００２６】
ここで、試料を薄片化するウルトラミクロトームについて述べる。ウルトラミクロトームは、図４に示したように、断面切削対象の試料を保持する試料ホルダー９、試料ホルダー９の角度調整をおこなうセグメントアーク１０、上下に振れるアーム１１、ナイフ８を前進させる台座１２、実体顕微鏡１３、などを有する。試料ブロックを試料ホルダー９で固定し、試料ホルダー９をセグメントアーク１０に固定し、ナイフ８をナイフホルダー１４に固定し、ナイフ８の台座１２が前後することで試料の切削をおこなう。
【００２７】
また、ダイヤモンドナイフでウェット切削を行う場合、ナイフボート上に水を注入し、水位調整機にて水位調整をおこなう。切削の様子は、実体顕微鏡で確認をおこない、薄片化するための前処理である鏡面の確認も、実体顕微鏡でおこなう。
【００２８】
試料ブロックは図２の（ａ）に示すように直方体になっており、複数の試料断面が露出するまで樹脂の先端を細く削り、図２（ｂ）に示すようにトリミングする。断面切削を行うにあたり、試料周囲に樹脂が少なくとも３方向に存在することが望ましく、更には、試料に沿って樹脂の残量が少ないほうが望ましく、薄片となる断面が０．２〜０．４ｍｍ四方程度の大きさになることが望ましい。複数の試料面が露出し、鏡面状態になるまでガラスナイフ等でトリミングする。試料面は可能な限り試料が密集している個所が出るように可能な限り小面積にトリミングすることが望ましい。
【００２９】
トリミング後、ガラスナイフをダイヤモンドナイフに置き換える。試料を薄片化するダ
イヤモンドナイフは図３に示すように、水を用いたウェットでの切削が可能なタイプであり、最上部のナイフボート６の端に刃先５がある構造になっている。試料面とナイフの刃先の角度が平行になるように、実体顕微鏡で確認しながらセグメントアークやナイフホルダーで角度調整をおこなう。ウェットでの切削をおこなう場合は、ダイヤモンドナイフ上のナイフボートに水を注入する。水位を調整したのち、試料面とナイフの距離を縮めていき、自動切削モードで薄切する。ウルトラミクロトームで切削を進めると、刃先を起点として順次薄片が連なり、水面上に短冊状に連なっていく状態（図３に示す薄片化された連続切片試料７参照）になるが、この短冊状の状態において金属メッシュでのサンプル採取を行うことが望ましい。
【実施例】
【００３０】
以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。
【００３１】
１０μｍ厚み程度の高分子基材上に金属酸化膜が蒸着されたフィルムが４枚重なった試料の端をセロハンテープで固定し、くさび形に切断した。フィルムが４枚付着している状態において、アクリル系光硬化樹脂が流しこまれたモールド内に試料を入れ、モールド底に針で軽く押し込んだのち、６０秒間光照射し、硬化した樹脂ブロックを取り出した。
【００３２】
前記試料を包埋した試料ブロックにおいて、４枚の試料面が露出するように断面出しをおこない、面が約０．２ｍｍ四方になるようにトリミングをし、試料面とその側面近傍が平滑になるようにガラスナイフで鏡面化させた。鏡面化の後、ダイヤモンドナイフにて膜厚設定０．１０μｍに薄片化をおこなった。ウェット式で薄片をすくい上げ、支持膜付き銅メッシュ上に採取した。
【００３３】
採取後、観察したところ、試料と試料の間の厚み約１５μｍに入り込んだ包埋樹脂と、金属蒸着膜が成膜されている１、２、３枚目の試料界面は剥離することなく、良好に検体の観察をおこなうことが出来た。試料と試料の隙間に入り込んだ樹脂は試料に擬似的に挟まれている状態であり、剥離しにくくなると考えられる。４枚目は端にあるためか、剥離した。また、試料を1枚ずつ包埋していく場合の４検体分の薄膜化をおこなう時間の約４分の１の時間で試料作製をおこなうことができた。また、電子顕微鏡内の出し入れが一度で済むため、真空引き等の出し入れに要する時間も削減することができ、従来の方法より短時間で試料作製、観察をおこなうことが可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】シリコン製包埋用モールドの斜視図。
【図２】（ａ）は試料が包埋樹脂に埋め込まれた試料ブロックの斜視図、（ｂ）は試料が包埋樹脂に埋め込まれた試料の断面が出ている試料ブロックの斜視図。
【図３】ダイヤモンドナイフの斜視図。
【図４】ウルトラミクロトームの側面図。
【符号の説明】
【００３５】
１…包埋用モールド
２…包埋樹脂
３…試料
４…ダイヤモンドナイフ
５…ダイヤモンドの刃先
６…ナイフボート
７…薄片化された連続切片試料
８…ナイフ
９…試料ホルダー
１０…セグメントアーク
１１…アーム
１２…台座
１３…実体顕微鏡
１４…ナイフホルダー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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