(57)【要約】【課題】魚類卵を含む魚類細胞の保存、培養等の各種操作に適した試薬を提供する。【解決手段】体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分を含有する魚類用試薬とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分を含有する、魚類用試薬。
【請求項２】
魚類細胞の保存用である、請求項１に記載の魚類用試薬。
【請求項３】
魚類細胞の処理用である、請求項１に記載の魚類用試薬。
【請求項４】
魚類細胞の培養用である、請求項１に記載の魚類用試薬。
【請求項５】
体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で魚類細胞を保存する工程、
を備える、魚類細胞の保存方法。
【請求項６】
前記魚類細胞は未受精卵である、請求項５に記載の保存方法。
【請求項７】
体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で魚類細胞を処理する工程、
を備える、魚類細胞の処理方法。
【請求項８】
前記処理工程は前記魚類細胞に対する顕微操作を含む、請求項７に記載の処理方法。
【請求項９】
前記処理工程は前記魚類細胞に対する外来遺伝子導入操作を含む、請求項７又は８に記載の処理方法。
【請求項１０】
体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で魚類胚の前駆細胞を保存又は処理する胚作製工程、
を備える、魚類胚を作製する方法。
【請求項１１】
前記胚作製工程は、前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で魚類の未受精卵を保存することを含む、請求項１０に記載の作製方法。
【請求項１２】
前記胚作製工程は、前記水疱の内液又は前記水疱に由来する成分の存在下で顕微操作を施すことを含む、請求項１０又は１１に記載の作製方法。
【請求項１３】
体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で魚類胚を処理する工程、
を備える、魚類胚の処理方法。
【請求項１４】
前記処理工程は、前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で前記魚類胚に顕微操作を施すことを含む工程である、請求項１３に記載の作製方法。
【請求項１５】
体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で魚類細胞を培養する工程、
を備える、魚類細胞の培養方法。
【請求項１６】
前記培養工程は、魚類の体細胞由来の培養細胞を増殖させる工程である、請求項１５に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類用試薬及びその利用に関し、詳しくは、体表に水疱を有する魚類の水疱内液又はその内液由来成分を含有する魚類用試薬及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚類の研究や品種改良にあっては、魚類の体外で未受精卵を操作したり細胞を培養したりするが、そのためには、これらの細胞の活性を魚体外でも十分に維持する必要がある。例えば、魚類の体細胞核移植実験を行うには、魚類の未受精卵や精子の採取後の活力維持時間を予め知っておくのが有利である。例えば、キンギョの雌性発生実験を効率的に行うために、キンギョの未受精卵や精子の保存期間や保存方法が報告されている（非特許文献１）。この報告では、採取した未受精卵や精子を乾燥しないようにそのままラップやバイアル瓶で密封する保存操作が行われている。
【０００３】
一般に、細胞を培養するには、哺乳類なら哺乳類由来の細胞増殖因子を用いることが高い増殖促進効果が得られることが知られている。したがって、哺乳類細胞の培養には、牛胎児血清等各種の血清由来の試薬が開発され使用されている。魚類細胞の培養においても、哺乳類と同様に、本来、魚類由来の増殖因子を添加する方がより高い増殖促進効果が期待できるとの考えから、魚類血清、魚類胚抽出物について良好な増殖促進効果が得られたとの報告がある（非特許文献２〜６）。
【０００４】
【非特許文献１】東京都水産試験場調査研究報告212， 113， 2000
【非特許文献２】Molecular Marine Biology and Technology, (1994) 3, 185-191
【非特許文献３】Journal of Fish Biology (1997) 50, 201-207
【非特許文献４】Molecular Marine Biology and Technology, (1995) 4, 193-199
【非特許文献５】Cell biology and toxicology (1992) 8, 42-62
【非特許文献６】Mechanisms of Development (1996) 60, 33-44
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１によれば、水と接触させることなく密封して乾燥を防ぐことにより、６時間程度は保存が可能であるとしている。しかしながら、実際のところ、魚類の未受精卵の卵質は、採取後、時間経過に伴って低下する。発生工学的手法により、胚を発生させる場合など、採卵してすぐ授精を行えない場合、この卵質の低下により発眼率、ふ化率などが低下してしまう問題があった。また、卵を顕微鏡下で操作する間にも卵質が低下するおそれがあった。さらに、核移植を行う際には、ドナー胚とレシピエント卵を用意しなければならないが、その場合には、発生開始時刻を数時間ずらさねばならならず、その間、卵の活力を維持して保存しておく必要があった。特に、キンギョなど産卵数が多いが排卵頻度が限られる魚類にあっては、一尾から取れた未受精卵を一度の核移植実験で効率よく利用する必要があり、この種の魚類においては、卵質を維持して保存する要請は大きい。
【０００６】
したがって、非特許文献１に記載のような手法でなく、もっと簡易で効率的な卵質維持・保存操作が望まれる。また、キンギョの卵など、水中に放出されると付着力を獲得してしまう付着卵の保存のためには、付着を抑制して卵質維持・保存できる媒体が望まれる。
【０００７】
また、非特許文献２〜５によれば、魚類細胞の培養にあたり、魚類血清等が良好な増殖効果を発揮しているものの、これらの血清等の入手は相当な労力を要し、十分量を入手したり、日常的に利用したりするのは極めて困難である。したがって、これらの利用は現実的ではなく、実際のところ、魚類細胞の培養液に牛胎児血清を添加するのが一般的であった。
【０００８】
以上のように、魚類卵の卵質維持・保存や魚類細胞の培養などに適しておりしかも利用しやすい媒体などの試薬が提供されていないのが現状である。また、魚類卵を含む魚類細胞を取り扱うのに適した操作技術が提供されてないのが現状である。
【０００９】
そこで、本発明は、魚類卵を含む魚類細胞の保存、培養等の各種操作に適した試薬及びその試薬を用いた魚類細胞の操作技術を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記した課題を解決するべく、各種の媒体について、魚類卵の卵質維持及び魚類細胞の増殖特性について検討したところ、水泡眼と呼称される遺伝的に眼の周辺部に水疱を有するキンギョの水疱の内液が、魚類細胞の操作に適しているという知見を得た。本発明者らはこれらの知見に基づき以下の発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。
【００１１】
本発明によれば、体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分を含有する、魚類用試薬が提供される。この魚類用試薬は、魚類細胞の保存用であってもよいし、魚類細胞の処理用であってもよいし、魚類細胞の培養用であってもよい。培養用としては、特に、体細胞由来培養細胞の増殖用であってもよい。
【００１２】
本発明によれば、体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で前記魚類細胞を保存する工程、を備える、魚類細胞の保存方法が提供される。この保存方法において、前記魚類細胞は未受精卵であってもよい。
【００１３】
本発明によれば、体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で魚類細胞を処理する工程、を備える、魚類細胞の処理方法が提供される。前記処理工程は、前記魚類細胞に対する顕微操作を含んでいてもよいし、前記魚類細胞に対する外来遺伝子導入操作を含んでいてもよい。
【００１４】
本発明によれば、体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で魚類胚の前駆細胞を保存又は処理する胚作製工程、を備える、魚類胚を作製する方法が提供される。前記胚作製工程は、前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で魚類の未受精卵を保存することを含んでいてもよい。前記胚作製工程は、前記水疱の内液又は前記水疱に由来する成分の存在下で顕微操作を施すことを含むことができる。
【００１５】
本発明によれば、体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で魚類胚を処理する工程、を備える、魚類胚の処理方法が提供される。この処理方法においては、前記処理工程は、前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で前記魚類胚に顕微操作を施すことを含む工程であってもよい。
【００１６】
本発明によれば、体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液又は前記水疱の内液に由来する成分の存在下で魚類細胞を培養する工程、を備える、魚類細胞の培養方法が提供される。前記培養工程は、魚類の体細胞由来の培養細胞を増殖させる工程とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、魚類用試薬、魚類の未受精卵等の魚類細胞の処理方法及び保存方法、魚類胚の作製方法並びに魚類細胞の培養方法に関する。本発明のこれらの各種実施形態は、体表に水疱を有する魚類の前記水疱の内液（以下、水疱内液という。）又は水疱の内液に由来する成分（以下、水疱内液由来成分という。）の魚類細胞に対する作用に基づいている。水疱内液は、未受精卵の卵質を維持するように作用し、また、魚類培養細胞の増殖に促進するように作用する。すなわち、水疱内液又は水疱内液由来成分は魚類細胞の種類にかかわらずその活性を維持するよう作用することができる。
【００１８】
水疱内液の成分は明らかではないが、水疱内液又は水疱内液由来成分は、魚類細胞に細胞保護的又は細胞増殖促進的に作用するため、魚類細胞の試薬の有効成分として用いることができる。また、水疱内液又は水疱内液由来成分の存在下で、未受精卵等の魚類細胞の処理操作、保存操作及び胚作製を行うことで、未受精卵の卵質を維持して効率的な操作が可能となる。また、水疱内液又は水疱内液由来成分の存在下で、魚類細胞を培養することで、その増殖を促進することができる。
【００１９】
以下、本発明の各種実施形態を、適宜図面を参照しながら詳細に説明する
【００２０】
（魚類用試薬）
本発明の魚類用試薬は、体表に水疱を有する魚類の水疱内液又は水疱内液由来成分を有効成分として含有することができる。本明細書において、「体表に水疱を有する魚類」（以下、単に水疱魚類ともいう。）は、体表に体液が含まれる水疱を有する魚類を意味している。こうした魚類としては、水泡眼というキンギョの品種又はその近縁種が挙げられる。例えば、水泡眼は、両目の周囲に水疱が生じてその内部に体液が蓄積する遺伝的性質を有している。水泡眼の水疱内液の組成は明らかではないが、２歳以上の水泡眼からは、大量（１尾１回あたり５ｍｌ以上２０ｍｌ以下程度）の水疱内液を注射器で容易に採取できる。水泡眼の水疱は一時的に収縮するが、数ヶ月内には再び採取前と同様に体液が蓄積して復帰することがわかっている。なお、水疱魚類は、水泡眼又はその近縁種を利用して交配して得られた新品種又は水泡眼又はその近縁種に対して遺伝子工学的な操作により改変した改変体であってもよい。
【００２１】
本発明の魚類用試薬は、水疱内液又は水疱内液由来成分を含有している。「水疱内液由来成分」とは、水疱内液と同一の活性を有する１種又は２種以上の成分を意味している。成分は、水疱内液中で溶解している成分であってもよいし、分散又は懸濁している成分であってもよい。なお、同一の活性とは、水疱内液が魚類細胞に対する少なくとも一つの活性と同種の活性を示すことを意味しており、活性の程度は特に限定するものではない。水疱内液又は水疱内液由来成分の含有量は、これらにより魚類細胞等において活性維持や増殖促進など細胞活動の維持及び促進に対してプラスの作用を呈する程度となるように設定される。
【００２２】
本発明の魚類用試薬は、水疱内液をそのまま含有する形態を採ることができる。例えば、以下の３つの態様が挙げられる。これらの形態では、水疱内液に含まれる全成分が実質的に含まれている。
（１）水疱内液（固液分離後の液体であってもよい）、その希釈液又はその濃縮液
（２）（１）の各液の凍結体
（３）（１）の各液の凍結乾燥体
なお、凍結体は融解により、凍結乾燥体は、所定量の水に再溶解することにより実質的に水疱内液に復帰させることができる。 
【００２３】
また、本発明の魚類用試薬は、水疱内液由来成分を含有する形態を採ることができる。例えば、魚類用試薬は、上記（１）の各液から分離された水疱内液に含まれる成分の少なくとも一部を水疱内液と同一の活性を有する程度に含んでいる。より具体的には、魚類用試薬は、水疱内液を溶媒抽出、各種クロマトグラフィー等にて分離分画し、水疱内液と同一の活性を有する画分を含む態様が挙げられる。また、魚類用試薬は、上記（１）の各液を成分分析して成分の少なくとも一部を特定するとともに、これら成分を別途取得して水疱内液と同一の活性を有する程度に配合した組成物の態様を採ることもできる。
【００２４】
水疱内液は、水疱魚類の水疱から注射器等で容易に採取できる。既に説明したように、２歳以上の水泡眼からは、大量（１尾１回あたり５ｍｌ以上２０ｍｌ以下程度）の水疱内液を注射器で容易に採取できる。
【００２５】
水疱内液は、適宜熱処理することができる。一般的には殺菌等の観点から熱処理することが好ましい。また、魚類細胞の培養や増殖の観点からは、熱処理することで良好な細胞形態を維持できることがわかっており、熱処理によって、よりその魚類細胞に対してより有効性の高い試薬として利用可能となる。熱処理の条件は、例えば、５０℃以上７０℃以下で、１５分以上４５分以下程度とすることができる。典型的には、５６℃程度で３０分程度とすることができる。
【００２６】
本魚類用試薬は、水疱内液又は水疱内液由来成分のほかに、適宜他の成分を含有することができる。こうした他の成分は特に限定されないが、アミノ酸、各種塩等が挙げられる。また、本魚類用試薬は単独で用いることもできるが、例えば、他の試薬と組み合わせて用いることもできる。例えば、哺乳類用として又は魚類用として公知の試薬と組み合わせて用いることができる。こうした試薬は特に限定されないが、例えば、牛胎児血清や、リンゲル液、コイ血清、コイ人工精漿、各種の緩衝液等が挙げられる。
【００２７】
本発明の魚類用試薬が適用される魚類は特に限定しない。海水魚類であってもよいし、淡水魚類であってもよい。魚類としては特に限定しないが、例えば、研究又は実験用途として、ゼブラフィッシュ、メダカ、キンギョ、ドジョウが挙げられる。また、観賞用途としては、コイ、フナ、メダカ、キンギョ等が挙げられる。さらに、食用としては、サケ、マス、ニジマス、ヤマメ、アマゴ、ウナギ、ブリ、コイ、トラフグ、ヒラメ、マダイ、ティラピア等が挙げられる。なかでも、特開２００１−３４６４８０号公報に開示される透明メダカなどを含むメダカ属又はその近縁に属する魚類は各種のモデル魚など研究用途の他観賞用途にも適している。さらに、本発明を適用する魚類は、天然変異又は既に人工的に遺伝子が修飾された魚類も包含しており、これらの改変魚類の遺伝的性質を維持しあるいはさらに改変する場合にも有用である。
【００２８】
なお、本発明の魚類用試薬は、水疱内液の採取源となった魚類に有効であるほか、当該魚類以外の魚類にも有効である。
【００２９】
本発明の魚類用試薬は、魚類細胞、魚類の組織や器官等に適用できる。魚類細胞は特に限定されない。体細胞であってもよいし、生殖細胞系列であってもよい。生殖細胞系列の細胞としては、始原生殖細胞、卵原細胞、卵母細胞、未受精卵、精原細胞、精母細胞、精子が挙げられる。また、これらの培養細胞であってもよい。
【００３０】
体細胞としては、繊維芽細胞、外皮細胞、内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、心臓、肝臓等の各種内臓の構成細胞、赤血球等の血液細胞等が挙げられる。
【００３１】
また、魚類細胞は、胚性細胞であってもよい。本明細書において、胚性細胞は、受精卵からふ化に到達するまでの全ての発生段階にある細胞を包含している。また、胚性細胞には、胚性幹細胞、始原生殖細胞から誘導した胚性細胞も包含される。
【００３２】
魚類細胞は、融合細胞に由来する細胞であってもよい。魚類細胞は、培養細胞であってもよい。さらに好ましくは初代培養細胞である。このような魚類細胞は、魚類胚、魚類個体の一部又は全体から採取することにより、また採取した細胞を培養することにより得ることができる。
【００３３】
魚類細胞は、その染色体上に天然の又は人工的に導入された変異を備えていてもよい。人工的変異は化学的又は物理的な処理のほか、外来ＤＮＡが相同組換えにより導入されていてもよい。外来ＤＮＡはノックアウトあるいはノックインのいずれの形態であってもよい。魚類細胞は、細胞内あるいは核内に存在する染色体外ＤＮＡやＲＮＡなどの染色体外核酸を有していてもよい。染色体外核酸としては、染色体上に備え得る変異や外来性ＤＮＡのほか、ウイルスのほか、プラスミドあるいは人工染色体などを用いることができる。また、魚類細胞には、モルフォリノアンチセンスオリゴの手法に基づくＲＮＡやCaged技術に基づくＲＮＡやＤＮＡを保持していてもよい。
【００３４】
変異や外来核酸を染色体上あるいは染色体外に有する魚類細胞は、天然変異を備える魚類や遺伝子工学的に作製した魚類から採取し、必要に応じ培養することによって得ることができる。また、変異は、魚類細胞を化学的及び／又は物理的に処理して染色体上に導入することもできる。さらには、培養魚類細胞に対して、注入、細胞融合、各種のトランスフェクション法を用いて外来核酸を導入して染色体上あるいは染色体外に外来核酸を備える魚類細胞を得ることもできる。
【００３５】
本発明の魚類用試薬は、魚類細胞の活性を維持するように作用する。このため、本魚類用試薬は、生殖細胞系列、体細胞及び胚性細胞など各種魚類細胞の保存用として用いることができる。例えば、未受精卵に適用したとき、卵質を維持するように作用する。すなわち、受精後にふ化や発眼可能な状態を維持することができる。このため、未受精卵の卵質維持用又は保存用として用いることができる。このほか、生殖細胞系列や胚性細胞など活性が低下しやすい細胞に好ましく用いることができる。
【００３６】
本魚類用試薬は、その魚類細胞の活性維持作用に基づいて、胚性細胞や生殖細胞系列等の凍結保存用としても用いることができる。凍結保存用として用いる場合には、保護剤として糖類などを添加して用いることが好ましい。
【００３７】
魚類細胞の活性維持作用に基づいて、生殖細胞系列、体細胞及び胚性細胞など各種魚類細胞の処理用として用いることができる。ここで処理とは、例えば、温度、紫外線、ガンマ線、Ｘ線等の照射、磁気、電気刺激、圧力及び化学薬品等による処理が挙げられる。例えば、未受精卵や受精卵に対する各種の染色体操作（２倍体魚、３倍体魚及びクローン魚の作製のための染色体操作）における各種処理が挙げられる。また、核移植における未受精卵や体細胞への各種物理的又は化学的処理が挙げられる。また、生殖細胞系列、胚性細胞及び体細胞への外来遺伝子導入操作における各種処理が挙げられる。特に、生殖細胞系列や胚性細胞など活性が低下しやすい細胞に好ましく用いることができる。
【００３８】
特に、同様の理由から、始原生殖細胞系列、胚性細胞、体細胞などの各種魚類細胞に対する顕微操作用として用いることができる。顕微操作とは、顕微鏡等で視野を拡大した状況での微小器具による操作である。顕微操作は、時間を要する場合もあり、顕微鏡下、本魚類用試薬の存在下で魚類細胞を操作することで確実に顕微操作を実施することができる。特に、生殖細胞系列や胚性細胞など活性が低下しやすい細胞に好ましく用いることができる。顕微操作としては、例えば、マイクロインジェクション等による核移植操作、遺伝子導入操作等が挙げられる。
【００３９】
本魚類用試薬は、未受精卵や受精卵などの卵細胞であって卵細胞が付着卵であるときにメリットが大きい。付着卵は、水に接触すると容器内壁に接着する傾向を呈するが、本魚類用試薬の場合、かかる接着性を抑制して、水などの水性媒体中でも容易に卵細胞を取り扱うことができる。したがって、付着卵を産卵する魚類に本発明の魚類用試薬を好ましく用いることができる。
【００４０】
本魚類用試薬は、魚類細胞の増殖促進作用に基づいて、生殖細胞系列、体細胞及び胚性細胞など各種魚類細胞の培養用又は各種魚類培養細胞の増殖用として用いることができる。魚類細胞を培養し又は効率的に増殖させるのは、例えば、トランスジェニック魚類など魚類個体を得る効率を向上させるのに極めて有用である。特に、魚類体細胞、より好ましくは、魚類培養細胞の増殖用に好ましい。さらに、外来遺伝子が導入された魚類細胞の培養及び増殖に好ましく用いることができる。増殖促進用の魚類用試薬は、培地への添加剤、あるいは培地そのものの形態等を採ることができる。
【００４１】
以上のことから、本魚類用試薬は、魚類細胞についての発生工学技術における各種操作や処理に好ましく用いることができる。発生工学技術とは、例えば、魚類クローン技術、遺伝子ターゲティング技術を含むトランスジェニック技術、染色体操作技術及び核移植技術が挙げられる。本魚類用試薬は、人為的に魚体外で生殖細胞系列、胚性細胞及び体細胞を操作する場合の適切な媒体又は媒体成分となりうる。本魚類用試薬は魚類胚作製用あるいは魚類個体作製用として好ましく用いることができる。なお、本発明において魚類胚とは、魚類個体を構築しうる遺伝物質を保持し、かつ魚類個体のふ化に至るまでの全ての段階にあるものをいう。また、ここで魚類個体とは、成魚のほか、一旦ふ化したものは幼魚であっても個体というものとする。
【００４２】
なお、魚類用試薬は、魚類細胞のみならず、その細胞活性維持作用等に基づいて、魚類の組織、魚類の器官の保存用、処理用等に好ましく用いることができる。
【００４３】
（魚類細胞の保存方法）
本発明の魚類細胞の保存方法は、水疱内液又は水疱内液由来成分の存在下、魚類細胞を保存する工程、を備えることができる。水疱内液は魚類細胞活性維持作用を有しているため、魚類細胞をその活性を維持して保存することができる。対象となる魚類細胞は、処理の種類や処理の目的に応じ適宜選択される。細胞活性の維持が相対的に体細胞よりも困難な未受精卵などの生殖細胞系列及び胚性細胞の処理に好ましく用いられる。保存工程の実施にあたり、水疱内液又は水疱内液由来成分を含む魚類用試薬を、魚類細胞を保存するためのあるいは保存している媒体に添加してもよいし、予め水疱内液又は水疱内液由来成分を含む媒体を魚類用試薬として準備し、この魚類用試薬を魚類細胞に供給するようにしてもよい。保存工程における、温度、時間等は、特に限定されない。魚類細胞の種類や目的とする保存状態に応じて適宜設定される。保存工程は、凍結保存工程としても実施できる。  
【００４４】
（魚類細胞の処理方法）
本発明の魚類細胞の処理方法は、水疱内液又は水疱内液由来成分の存在下、魚類細胞を処理する工程、を備えることができる。水疱内液は魚類細胞活性維持作用を有しているため、魚類細胞をその活性を維持して処理することができる。
【００４５】
魚類細胞の処理の内容については特に限定しない。典型的には、本魚類用試薬について説明した各種処理が挙げられる。好ましくは、発生工学技術における各種処理、より具体的には魚類胚や魚類個体の作製における各種処理が挙げられる。例えば、処理工程は、魚類細胞を遺伝子工学的に改変する操作を含んでいてもよいし、顕微操作を含んでいてもよい。染色体操作を含んでいてもよい。対象となる魚類細胞は、処理の種類や処理の目的に応じ適宜選択される。細胞活性の維持が相対的に体細胞よりも困難な未受精卵などの生殖細胞系列及び胚性細胞の処理に好ましく用いられる。処理工程への水疱内液又は水疱内液由来成分の供給形態は、特に限定されない。例えば、魚類細胞の保存方法と同様にして魚類細胞に供給することができる。
【００４６】
（魚類胚の作製方法及び魚類個体の作製方法）
本発明の魚類胚を作製する方法は、体表に水疱を有する魚類の水疱内液又は水疱内液由来成分の存在下で魚類胚の前駆細胞を保存又は処理する胚作製工程、を備えることができる。本発明は、魚類胚の作製方法としても実施できる。本作製方法は、それぞれ、上記した本発明の魚類細胞の保存方法や処理方法における保存工程や処理工程のいずれかあるいは双方を含むことができる。保存対象又は処理対象たる魚類細胞は、魚類胚の前駆細胞であればよく、体細胞でも、始原生殖細胞系列であっても未受精卵であってもよい。典型的には、水疱内液又は水疱内液由来成分の存在下で未受精卵を保存し、その後、あるいは保存した未受精卵に対して顕微操作を実施することで、魚類胚を作製することができる。
【００４７】
本発明によれば、これらの魚類胚の作製方法における魚類胚作製工程を備え、さらに魚類個体を得る工程を備える、魚類個体の作製方法も提供される。魚類個体の作製にあたり、体表に水疱を有する魚類の水疱内液又は水疱内液由来成分の存在下で魚類胚を処理する工程を備えることができる。保存対象又は処理対象たる魚類胚であればよく、どのような段階であってもよい。処理工程は、魚類胚に顕微操作を施すものであってもよいし、外来遺伝子の導入操作であってもよい。また、保存的工程であってもよい。
【００４８】
また、これらの作製方法において、魚類胚はクローン胚、トランスジェニック胚のいずれであってもよい。魚類個体についても同様である。また、これらの作製方法は、それぞれ、核移植工程、生殖細胞系列や胚性細胞に対する染色体操作工程、生殖細胞系列、胚性細胞及び体細胞への外来遺伝子導入工程のいずれかあるいは２種以上を含むことができる。これらの工程は、本発明の魚類細胞の処理方法の処理工程の一部として行われるものであってもよい。
【００４９】
本発明によれば、本発明の魚類胚又は魚類個体の作製方法によって得られた魚類胚又は魚類個体も提供される。
【００５０】
（魚類細胞の培養方法）
本発明の魚類細胞の培養方法は、水疱内液又は水疱内液由来成分の存在下、魚類細胞を培養する工程を備えることができる。水疱内液の魚類細胞の増殖促進効果に基づいている。魚類細胞は、特に限定しないが、好ましくは、体細胞、外来遺伝子が導入された体細胞及び体細胞由来の培養細胞である。トランスジェニック魚類を得る場合など、所望の遺伝子が導入された体細胞クローンを得るのに好ましく用いることができる。培養工程への水疱内液又は水疱内液由来成分の供給形態は、特に限定されない。例えば、水疱内液又は水疱内液由来成分を培地に別途加えてもよいし、予めこれらを含有する培地を魚類用試薬として用いてもよい。
【００５１】
（その他の実施形態）
以上のことから、本発明によれば、水疱内液又は水疱内液由来成分と、魚類細胞とを含む魚類培養組成物も提供される。この組成物は、水疱内液又は水疱内液由来成分による細胞活性維持作用によってその活性が維持又は向上され、あるいは良好な状態で増殖された魚類細胞を含んでいる。したがって、魚類細胞を維持、増殖させるのに好ましい組成物となっている。
【００５２】
なお、以上説明した、魚類細胞の保存方法、魚類細胞の処理方法、魚類胚及び魚類個体の作製方法、魚類細胞の培養方法においては、水疱内液又は水疱内液由来成分を用いるが、水疱内液又は水疱内液由来成分として、本発明の魚類用試薬を用いることができる。すなわち、水疱内液又は水疱内液由来成分以外の成分もよく、また、水疱内液又は水疱内液由来成分は熱処理されていてもよい。
【００５３】
また、魚類細胞の保存方法、魚類細胞の処理方法、魚類細胞の培養方法において、水疱内液又は水疱内液由来成分の作用に基づき、いずれも魚類細胞のみならず、魚類細胞から構成される魚類の組織、魚類の器官の保存方法や処理方法にも好ましく用いることができる。  
【００５４】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定するものではない。
【実施例１】
【００５５】
本実施例では、比較的大量に入手できる魚類由来の体液として、水泡眼という品種のキンギョの水疱内液について、キンギョ卵及びアユ卵の保存効果を評価した。
【００５６】
メダカにおいては、従来、ＢＳＳ（Balanced salt solution：平衡塩類溶液）を用いて卵を一時的に保存し、また、ＢＳＳ中で一連の核移植操作を行っている。ＢＳＳを始め、淡水魚用リンゲル液、コイ人工精漿、ＰＢＳ（−）、Ｌ−１５、ＭＥＭなど、淡水魚でよく用いられる既知の緩衝液などについて、キンギョ卵の保存効果を調査したが、どの溶液も１時間後の観察で卵膜の上昇が肉眼で観察された。卵膜が上昇した未受精卵は、すでに受精能を失っており、いずれの溶液も保存液としては不適当だと考えられた。Ｌ−１５やＭＥＭはキンギョの体細胞培養にも用いられている培地であり、無機的な組成としては卵を保存するのにも問題ないと考えられる。しかし、これらの培地でも卵膜の上昇が起きるということは、何らかの有機的な成分が卵膜の上昇、卵の賦活化を抑える働きをしているのではないか、と考えられた。
【００５７】
本実施例に用いる水疱内液は、水泡眼と呼ばれる遺伝的に眼の周辺部に水疱を形成する性質を持つ品種から、水疱内液をシリンジで採取し、それを遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分）を行って上清を回収して用いた。また、淡水魚用リンゲル液は蒸留水１Ｌ中にＮａＣｌ７．５ｇ、ＫＣｌ０．２ｇ、ＣａＣｌ２０．４ｇを添加し、ｐＨを７．０に調整したものを使用した。
【００５８】
実験１で使用したキンギョ卵は、温度刺激によって人工的に放卵されたキンギョの未受精卵を搾り出して使用した。また、実験２で使用したアユ卵は、産卵のため川を下ってきたアユを捕獲し、生きたまま実験室に運び、実験室内で卵を搾って使用した。
【００５９】
実験１，２とも、５つの試験区を設け、保存液を以下のように調製した。
（Ａ）水疱内液100%区（水疱内液そのまま）、
（Ｂ）水疱内液30%区（水疱内液を３０％になるよう淡水魚用リンゲル液で希釈したもの）
（Ｃ）水疱内液10%区（水疱内液を１０％になるよう淡水魚用リンゲル液で希釈したもの）
（Ｄ）リンゲル区（淡水魚用リンゲル液そのまま）
（Ｅ）対照区（搾った卵をそのまま何の保存液も添加せずに保存したもの）
【００６０】
（実験１）
キンギョ未受精卵をそれぞれの条件で調製した保存液で満たしたシャーレ（対照区は何も入れていないシャーレ）に入れ、２０℃で放置し、１時間後と５時間後に卵を取り出して人工授精させた。受精後は２０℃で飼育して発眼率、ふ化率を計測した。対照区は実験開始直後（０時間保存）の卵についても人工授精させ、同様に発眼率、ふ化率を計測した。結果を図１及び図２に示す。
【００６１】
（実験２）
アユ未受精卵をそれぞれの条件で調製した保存液で満たしたシャーレ（対照区は何も入れていないシャーレ）に入れ、２０℃で放置し、２時間後と６時間後、３０時間後に卵を取り出して人工授精させた。受精後は２０℃で飼育して発眼率、ふ化率を計測した。対照区は実験開始直後（０時間保存）の卵についても人工授精させ、同様に発眼率、ふ化率を計測した。結果を図３及び図４に示す。
【００６２】
（実験１）
図１及び図２示すように、何も保存液を加えなかった対照区は、実験開始時に８９％であった発眼率が、１時間および５時間経過後に６４％、３２％に減少したのに対し、水疱内液１００％区では１時間および５時間経過後の卵での発眼率はそれぞれ９１％、７８％を示し、顕著な保存効果が見られた。しかし、リンゲル液が悪影響を及ぼすのか、リンゲル液で希釈した水疱内液３０％区は対照区と同程度、水疱内液１０％区は保存１時間後の卵でも発眼率は０％で、リンゲル区とほぼ同じ値だった。ふ化率についても同様の傾向が得られ、水疱内液が高い卵の保存効果を有することが示されたが、リンゲル液を用いた試験区は全て、５時間後のふ化率がほぼ０％であった。
【００６３】
（実験２）
図３及び図４に示すように、対照区が６時間後までは高い発眼率、ふ化率を示したが、そこから３０時間後の間に急激に卵質が低下し、３０時間後の卵の発眼率、ふ化率はともに０％だった。対して、水疱内液３０％区は３０時間後も発眼率７９％、ふ化率７２％の高い値を示した。また、水疱内液１００％区も、６時間後の発眼率５８％、ふ化率３２％と対照区よりかなり低い値だったが、３０時間後は発眼率５６％、ふ化率２４％と対照区より高い値を示した。水疱内液１０％区とリンゲル区はともに２時間後には受精能を失っており、保存液としては不適当だった。水疱内液３０％区が保存液としては最適だと考えられた。
【００６４】
水疱内液は、体長１０ｃｍ程度の水泡眼の個体からでも、約２０ｍｌの体腔液が回収でき、また、回収後も飼育を継続すると、一旦縮んだ水疱が再び膨らんでくるため、再利用が可能であった。
【実施例２】
【００６５】
本実施例では、水泡眼という品種のキンギョの水疱内液について、メダカ及びゼブラフィッシュの培養増殖効果を評価した。
【００６６】
（水泡眼の水疱内液の採取）
水泡眼キンギョの水疱から内部の体液を採取し、これを５６℃で３０分間処理した後、濾過滅菌したものを水泡眼水疱内液とした。５６℃で３０分間の処理を施さない水疱内液は非熱処理水疱内液とした。水泡眼水疱内液の採取には２０ｍｌ注射器と２１Ｇ注射針を用い、濾過滅菌には０．２μｍのナイロン製フィルター（ナイロンは商標である）を用いた。
【００６７】
（細胞）
メダカおよびゼブラフィッシュの尾鰭から初代培養し、継代を繰り返して（継代数６（メダカ）、１１（ゼブラフィッシュ））、実験に使用した。ここでは便宜的にこれらの細胞を初代培養細胞と呼ぶ。
【００６８】
（基本培養液）
メダカおよびゼブラフィッシュの尾鰭からの初代培養およびその後の継代培養には、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ１５培地に１０−２０％の牛胎児血清を添加したものを用いた。基本培養液には、血清のほかにピルビン酸、メルカプトエタノール、非必須アミノ酸などを添加した。
【００６９】
（増殖促進効果の測定）
基本培養液に水泡眼水疱内液を０，１，２，５％添加した培養液中で、上記の培養細胞を培養して、培養開始から３，６，９日目の培養皿当たりの細胞数を測定した。まず、コンフルエントに達した培養皿をトリプシン処理（０．１％ ｔｒｙｐｓｉｎ，０．０２％ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ、室温２分）により細胞を回収し、基本培養液に懸濁して、６．０×１０４細胞（メダカ）、８．８×１０４細胞（ゼブラフィッシュ）を含む細胞懸濁液２ｍｌを直径３５ｍｍの培養皿に播種した。翌日（０日目）、培養液を０，２，５％水泡眼水疱内液含有の培養液に交換した。その後培養液の交換は３，６日目に行った。０，３，６，９日目の培養皿当たりの細胞数を、血球計数盤を用いて、一実験区につき３培養皿分計数した。培養皿ごとの細胞数は３回の計数値の平均で示した。結果を図５及び図６に示す。
【００７０】
（細胞形態の観察）
倒立位相差顕微鏡にて対物レンズ×１０、接眼レンズ×１０で観察した。結果を図７に示す。
【００７１】
（メダカおよびゼブラフィッシュ尾鰭由来初代培養細胞に対する水泡眼水疱内液の増殖促進効果）
図５に示すように、水泡眼水疱内液の濃度に依存して細胞増殖が亢進した。集団倍加時間は０％実験区で９．７日、２％実験区で５．５日、５％実験区で４．４日であった。図６に示すように、水疱内液はゼブラフィッシュ尾鰭初代培養細胞に対しても同様の増殖促進活性を示した。ゼブラフィッシュ細胞の集団倍加時間は０％実験区で２．１日、２％実験区で１．６９日、５％実験区で１．６３日であった。
【００７２】
（水泡眼水疱内液による上記の初代培養細胞の形態変化）
図７のように、メダカ尾鰭由来初代培養細胞は、基本培養液中で典型的な繊維芽細胞様の形態を呈するが、非熱処理水疱内液を２−５％添加した培養液中では細長い二極性の形態をとり、細胞輪郭が鮮明になる。このような形態変化は、水疱内液に熱処理を施すことによりほぼ失われる。したがって、水疱内液を熱処理することで細胞培養により適した試薬となると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】実験１で得られたキンギョ卵における保存時間と発眼率との関係を示すグラフ図である。
【図２】実験１で得られたキンギョ卵における保存時間とふ化率との関係を示すグラフ図である。
【図３】実験２で得られたアユ卵における保存時間と発眼率との関係を示すグラフ図である。
【図４】実験２で得られたアユ卵における保存時間とふ化率との関係を示すグラフ図である。
【図５】実施例２で得られたメダカ培養細胞の細胞増殖を示す図である。
【図６】実施例２で得られゼブラフィッシュ培養細胞の細胞増殖を示す図である。
【図７】実施例２で得られたメダカ初代培養細胞の形態観察結果を示す写真である。
【図１】
2009183151.tif 000002
【図２】
2009183151.tif 000003
【図３】
2009183151.tif 000004
【図４】
2009183151.tif 000005
【図５】
2009183151.tif 000006
【図６】
2009183151.tif 000007
【図７】
2009183151.tif 000008