(57)【要約】 【課題】高分子材料モノマーとして有用な、新規な２級水酸基を有する（メタ）アクリレートと、酵素反応を用いた２級水酸基を有する脂肪酸とヒドロキシアクリレートとのエステル化反応による該２級水酸基を有する（メタ）アクリレートの製造方法の提供。【解決手段】新規な２級水酸基を有する（メタ）アクリレート、及びそれを提供するための特定の微生物から得られるリパーゼ又はリパーゼを細胞表層に提示したアーミング酵母を用いて、温和な条件下で、２級水酸基を有する脂肪酸とヒドロキシアクリレートとのエステル化反応により、新規な２級水酸基を有する（メタ）アクリレートの製造方法の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2009256288.tif 000022
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｘは酸素原子又は窒素原子、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表されるアクリレート化合物。
【請求項２】
下記式（２）
【化２】
2009256288.tif 000023
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｘは酸素原子又は窒素原子、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表されるアクリレート化合物。
【請求項３】
リパーゼ（Ａ）又はリパーゼを細胞表層に提示したアーミング酵母（Ｂ）の存在下に、一般式（３）
【化３】
2009256288.tif 000024
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｘは酸素原子又は窒素原子、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表される（メタ）アクリル酸誘導体と、リシノール酸とを反応させる請求項１に記載のアクリレート化合物の製造方法。
【請求項４】
リパーゼ（Ａ）又はリパーゼを細胞表層に提示したアーミング酵母（Ｂ）の存在下に、一般式（３）
【化４】
2009256288.tif 000025
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｘは酸素原子又は窒素原子、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表される（メタ）アクリル酸誘導体と、１２−ヒドロキシステアリン酸とを反応させる請求項２に記載のアクリレート化合物の製造方法。
【請求項５】
前記リパーゼ（Ａ）が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クロモバクター（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ハイフォザイマ（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、リゾムーコル（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、又はテルモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属の微生物から得られるものである請求項３又は４に記載のアクリレート化合物の製造方法。
【請求項６】
前記リパーゼを細胞表層に提示したアーミング酵母（Ｂ）が二倍体アーミング酵母であって、一倍体ａ細胞アーミング酵母と一倍体α細胞アーミング酵母を細胞融合することを特徴とするものである請求項３又は４に記載のアクリレート化合物の製造方法。
【請求項７】
前記リパーゼを細胞表層に提示したアーミング酵母（Ｂ）が、前記一倍体ａ細胞アーミング酵母及び一倍体α細胞アーミング酵母のいずれか一方あるいは両方の細胞表層へ提示されるタンパク質が、分泌シグナル配列、前記タンパク質の構造遺伝子配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡによって細胞表層に発現されるものである請求項６に記載のアクリレート化合物の製造方法。
【請求項８】
前記リパーゼを細胞表層に提示したアーミング酵母（Ｂ）が、前記一倍体ａ細胞アーミング酵母及び一倍体α細胞アーミング酵母のいずれか一方あるいは両方の細胞表層へ提示されるタンパク質が、分泌シグナル配列、前記タンパク質の構造遺伝子配列、ＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡによって細胞表層に発現されるものである請求項６に記載のアクリレート化合物の製造方法。
【請求項９】
前記リパーゼを細胞表層に提示したアーミング酵母（Ｂ）が、前記一倍体ａ細胞アーミング酵母及び一倍体α細胞アーミング酵母のいずれか一方あるいは両方の細胞表層へ提示されるタンパク質が、分泌シグナル配列、前記タンパク質の構造遺伝子配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡ、あるいは分泌シグナル配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列、前記細胞表層へ提示されるタンパク質の構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡによって細胞表層に発現されるものである請求項６に記載のアクリレート化合物の製造方法。
【請求項１０】
前記一倍体ａ細胞アーミング酵母及び一倍体α細胞アーミング酵母が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母である請求項６〜９のいずれか一項に記載のアクリレート化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子材料モノマーとして有用な、新規な２級水酸基を有する（メタ）アクリレートと、酵素反応を用いた２級水酸基を有する脂肪酸とヒドロキシアクリレートとのエステル化反応による該２級水酸基を有する（メタ）アクリレートの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２‐ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート（ＨＥ（Ｍ）Ａ）に代表されるヒドロキシル基を有する（メタ）アクリレートは種々のアクリル樹脂の原料に用いられている。アクリル樹脂中にヒドロキシル基を導入することで、樹脂の水溶性付与やポリイソシアネート化合物との反応による架橋反応などが可能になり、塗料や粘／接着剤などの分野で広く用いられている。しかしながら、ＨＥＭＡのようなアクリレートをアクリル樹脂に共重合した場合、アクリル樹脂の主鎖近傍にヒドロキシル基が存在するためポリイソシアネート化合物との硬化物物性が脆くなるといった問題があった。このような問題解決のためＰＥＧなどの片末端に（メタ）アクリル基を導入したモノマーが用いられているが、吸水率の上昇などの問題があった。
【０００３】
一方、再生可能資源として植物由来原料を用いた材料の開発が近年盛んに行われている。脂肪酸を原料に用いた疎水性の高い（メタ）アクリレート化合物およびその製造方法としては、以下の特許文献１、特許文献２、及び特許文献３の開示がある。
しかしながら、本発明で用いる植物由来原料のヒドロキシ脂肪酸であるリシノール酸や１２−ヒドロキシステアリン酸はヒマシ油由来の工業原料として潤滑油やウレタン樹脂用途に用いられているが、当該疎水性の高いヒドロキシ脂肪酸を有する（メタ）アクリレートの製造報告はない。
また、ヒドロキシ脂肪酸とアクリル酸アルカノールを原料に用いたエステル化反応では、アクリル酸アルカノールおよびヒドロキシ脂肪酸のカルボキシル基間の交差反応に加え、それぞれのヒドロキシル基間の交差反応のため上記特許文献における手法では、更にヒドロキシル基の官能基保護／脱保護等の工程が必要となるなどの課題があった。更には、熱、酸、酸素等に不安定な原料を用いた場合には著しい着色や分解、ゲル化などの副反応により製造できないこともある等の問題点を有していた。
【０００４】
【特許文献１】特開平２−１１０１１５号
【特許文献２】特開平５−２２９９９１号
【特許文献３】特許第３８２９１０１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、高分子材料モノマーとして有用な、新規な２級水酸基を有する（メタ）アクリレートと、酵素反応を用いた２級水酸基を有する脂肪酸とヒドロキシアクリレートとのエステル化反応による該２級水酸基を有する（メタ）アクリレートの製造方法の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クロモバクター（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ハイフォザイマ（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、リゾムーコル（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、又はテルモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属の微生物から得られるリパーゼ（Ａ）又はリパーゼを細胞表層に提示したアーミング酵母（Ｂ）（以下リパーゼ・アーミング酵母（Ｂ）と記す。）を用いて、温和な条件下で、２級水酸基を有する脂肪酸とヒドロキシアクリレートとのエステル化反応により、新規な２級水酸基を有する（メタ）アクリレートの製造方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、
１．下記式（１）
【０００８】
【化１】
2009256288.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｘは酸素原子又は窒素原子、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表されるアクリレート化合物、
２．下記式（２）
【００１０】
【化２】
2009256288.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｘは酸素原子又は窒素原子、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表されるアクリレート化合物、
３、リパーゼ（Ａ）又はリパーゼ・アーミング酵母（Ｂ）の存在下に、一般式（３）
【００１２】
【化３】
2009256288.tif 000004
【００１３】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｘは酸素原子又は窒素原子、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表される（メタ）アクリル酸誘導体と、リシノール酸とを反応させる１．に記載のアクリレート化合物の製造方法、及び
【００１４】
４．リパーゼ（Ａ）又はリパーゼ・アーミング酵母（Ｂ）の存在下に、一般式（３）
【００１５】
【化４】
2009256288.tif 000005
【００１６】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｘは酸素原子又は窒素原子、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表される（メタ）アクリル酸誘導体と、１２−ヒドロキシステアリン酸とを反応させる２．に記載のアクリレート化合物の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、高分子材料モノマーとして有用な、新規な２級水酸基を有する（メタ）アクリレートと、酵素反応を用いた２級水酸基を有する脂肪酸とヒドロキシアクリレートとのエステル化反応による該２級水酸基を有する（メタ）アクリレートの製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明を詳細に説明する。
下記式（１）
【００１９】
【化５】
2009256288.tif 000006
【００２０】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｘは酸素原子又は窒素原子、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表されるアクリレート化合物は、本発明により得られる新規な（メタ）アクリレートである。
式中、Ｒ１は水素原子であってもメチル基であってもよい。また、Ｘが酸素原子を表すときは、一般式（１）で表される化合物はエステル誘導体であり、Ｘが窒素原子を表すときは、一般式（１）で表される化合物はアミド誘導体であるが、本発明ではどちらであってもよい。ｎは２〜４の整数であれば特に制限なく用いることが可能であるが、特に好ましくは、ｎが２である場合である。
【００２１】
次に、下記式（２）
【００２２】
【化６】
2009256288.tif 000007
【００２３】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｘは酸素原子又は窒素原子、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表されるアクリレート化合物も、本発明により得られる新規な（メタ）アクリレートである。
式中、Ｒ１は水素原子であってもメチル基であってもよい。また、Ｘが酸素原子を表すときは、一般式（２）で表される化合物はエステル誘導体であり、Ｘが窒素原子を表すときは、一般式（２）で表される化合物はアミド誘導体であるが、本発明ではどちらであってもよい。ｎは２〜４の整数であれば特に制限なく用いることが可能であるが、特に好ましくは、ｎが２である場合である。
【００２４】
上記一般式（１）で表される（メタ）アクリレート化合物は、リパーゼ（Ａ）又はリパーゼ・アーミング酵母（Ｂ）の存在下に、一般式（３）
【００２５】
【化７】
2009256288.tif 000008
【００２６】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｘは酸素原子又は窒素原子、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表される（メタ）アクリル酸誘導体と、リシノール酸（シス体）とを反応させることにより得ることができる。
【００２７】
一般式（３）で表される化合物は、（メタ）アクリル酸と２価アルコールまたはヒドロキシアミンとの脱水縮合反応によって、通常公知の方法により得ることができる。
【００２８】
また、上記一般式（２）で表される（メタ）アクリレート化合物は、リパーゼ（Ａ）又はリパーゼ・アーミング酵母（Ｂ）の存在下に、一般式（３）
【００２９】
【化８】
2009256288.tif 000009
【００３０】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｘは酸素原子又は窒素原子、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表される（メタ）アクリル酸誘導体と、１２−ヒドロキシステアリン酸とを反応させることにより得ることができる。
【００３１】
本発明で使用される酵素は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クロモバクター（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ハイフォザイマ（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、リゾムーコル（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、又はテルモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属の微生物から得られるものが好ましい。
より具体的に、本発明に用いられる、好ましい市販の酵素を列挙すると、ノボザイムズ社製リポザイムＲＭ−ＩＭ、リポザイムＴＬ−ＩＭや名糖産業株式会社のリパーゼＱＬ、同社リパーゼＰＬ、これらの固定化酵素であるリパーゼＱＬＣ、リパーゼＱＬＧ、リパーゼＰＬＣ、リパーゼＰＬＧがあり、他にも、天野製薬社製リパーゼＡ、リパーゼＡＫ、リパーゼＡＰ、リパーゼＡＹＳ、リパーゼＦ−ＡＰ１５、リパーゼＧ等が挙げられる。これらの酵素を混合して使用しても良く、また反応過程に伴い酵素を変えたり、又は異なった酵素を足し込んでも良い。
【００３２】
反応槽中に添加する酵素量は反応後に酵素を取り除く工程上の手間と経済性の点から少ない方が好ましく、この観点から高活性の酵素が好ましい。具体的には１０００Ｕ／ｇ（脂肪酸エステルの加水分解による活性測定法）以上が好ましく、粉体で分散しにくい酵素の場合は５０００Ｕ／ｇ以上が好ましい。
酵素の形態は溶液状態、固体粉末、担体に固定化された形態を問わないが、生成物の精製時に不要な成分を含まない固体粉末もしくは担体に固定化されたものが好ましい。また、酵素の再利用を考慮すると担体に固定化されたものが、より好ましい。
酵素の回収は、未反応原料の回収と共に行うことが可能で、反応後の反応液を静置又は冷却後に沈降した酵素と未反応原料と共にデカンテーション、遠心分離又は濾別によって容易に分離できる。冷却は反応時の組成にも依存するが室温以下が好ましい。濾別された酵素及び未反応原料はこのまま、もしくは一度、加温及び減圧下に乾燥し再利用できる。
【００３３】
また、本発明では、エステル反応に適したエステル合成活性の高いリパーゼを細胞表層に発現させた高活性アーミング酵母も好ましく用いることができる。
【００３４】
本発明で用いられるリパーゼ・アーミング酵母（Ｂ）は、以下の特徴を有する。
１．リパーゼ・アーミング酵母（Ｂ）が、一倍体ａ細胞アーミング酵母と一倍体α細胞アーミング酵母を細胞融合したものであること、
２．リパーゼ・アーミング酵母（Ｂ）が、前記一倍体ａ細胞アーミング酵母及び一倍体α細胞アーミング酵母のいずれか一方あるいは両方の細胞表層へ提示されるタンパク質が、分泌シグナル配列、前記タンパク質の構造遺伝子配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡによって細胞表層に発現されるものであること、
３．リパーゼ・アーミング酵母（Ｂ）が、前記一倍体ａ細胞アーミング酵母及び一倍体α細胞アーミング酵母のいずれか一方あるいは両方の細胞表層へ提示されるタンパク質が、分泌シグナル配列、前記タンパク質の構造遺伝子配列、ＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡによって細胞表層に発現されるものであること、
４．リパーゼ・アーミング酵母（Ｂ）が、前記一倍体ａ細胞アーミング酵母及び一倍体α細胞アーミング酵母のいずれか一方あるいは両方の細胞表層へ提示されるタンパク質が、分泌シグナル配列、前記タンパク質の構造遺伝子配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡ、あるいは分泌シグナル配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列、前記細胞表層へ提示されるタンパク質の構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡによって細胞表層に発現されるものであること。
【００３５】
次に、本発明で用いられるリパーゼ・アーミング酵母（Ｂ）について説明する。
【００３６】
（アーミング酵母）
本発明において、アーミング酵母とは細胞表層局在タンパク質と種々の機能性タンパク質（酵素・抗原・抗体・レポータータンパク質など）やペプチドを融合させ、細胞表層にディスプレイさせることにより、通常の酵母では有していない新しい機能を有する、あるいは元来有している機能を増強した酵母細胞のことをいう。また、細胞表層とは細胞膜・細胞壁ならびにその間の空間であるペリプラズムのことであり、これらの層を利用し上記の様な要件を満たす酵母細胞をアーミング酵母という。
【００３７】
本発明におけるアーミング酵母の創製は、特許文献；特開平１１−２９００７８号公報、及び国際公開第２００２／０８５９３５号パンフレットを基に行われた。
【００３８】
次に、本発明におけるリパーゼ（Ａ）について説明する。
（分泌型酵素）
リパーゼとは、油脂から脂肪酸を遊離させ得る活性を有する酵素であり、その起源については特に限定されないが、通常、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｉｚａｅ、以下、リゾプス・オリザエと略記する）などのカビ由来のリパーゼや、キャンディダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、以下、キャンディダ・アンタルクチカと略記する）などの酵母由来のリパーゼが好適に用いられている。
【００３９】
（細胞表層局在タンパク質）
本発明において、細胞表層局在タンパク質とは、酵母の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。例えば、凝集性タンパク質であるα―またはａ−アグルチニン、ＦＬＯタンパク質、大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＡなどが挙げられる。一般に細胞表層局在タンパク質は、Ｎ末端側に分泌シグナル配列及びＣ末端側にＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列を有している。分泌シグナル配列を有する点では分泌性タンパク質と共通しているが、細胞表層局在タンパク質は、ＧＰＩアンカーを介して細胞膜に固定されて輸送される点が分泌性タンパク質と異なる。細胞表層局在タンパク質は細胞膜通過の際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が選択的に切断され、新たに突出したＣ末端部分でＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣ（以下、ＰＩ−ＰＬＣと略記する）によりＧＰＩアンカーの根元部分が切断される。次いで、細胞膜から切り離されたタンパク質は、細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に局在する。
【００４０】
（分泌シグナル配列）
本発明において、分泌シグナル配列とは、一般に細胞外に分泌されるタンパク質のＮ−末端に結合している、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むアミノ酸配列であり、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通して細胞外（ペリプラズムも含む）へ分泌される際に除去される。分泌シグナル配列であれば、どのような分泌シグナル配列でも用いることができ、その起源は限定されない。例えば、グルコアミラーゼの分泌シグナル配列、酵母のα―またはａ―アグルチニンの分泌シグナル配列、リパーゼの分泌シグナル配列などが好適に用いられている。また、リパーゼの活性に影響を与えないのであれば、分泌シグナル配列の一部または全部が酵素のＮ−末端側に残っても良い（特開平１１−２９００７８号公報、国際公開第２００２／０８５９３５号パンフレット参照）。
【００４１】
（ＧＰＩアンカー及びＧＰＩアンカリングドメイン）
ＧＰＩアンカーとは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれる、エタノールアミンリン酸―６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいう。
【００４２】
ＧＰＩアンカリングドメインは、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。例えば、α―アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列がこれに相当し、この配列には、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であるＧＰＩアンカー認識付着シグナル配列の他に、４カ所の糖鎖結合部位がある。ＧＰＩアンカーの根元部分がＰＩ−ＰＬＣにより切断された後、これらの糖鎖結合部位に結合した糖鎖と細胞壁を構成する多糖類とが共有結合することで、α―アグルチニンのＣ末端配列部分が細胞壁と結合し、α―アグルチニンは細胞表層に保持される。
【００４３】
（糖鎖結合タンパク質ドメイン）
本発明において、糖鎖結合タンパク質ドメインとは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が、細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることのできるドメインをいう。例えば、レクチンなどの糖鎖結合部位や、α―アグルチニン、ａ―アグルチニン、ＦＬＯタンパク質などの凝集タンパク質の凝集機能ドメインなどが挙げられる。
（凝集機能ドメイン）
細胞表層局在タンパク質の凝集機能ドメインとはＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
【００４４】
本発明において、リパーゼを細胞表層に発現させるＤＮＡは、以下の配列を有するＤＮＡであることが好ましい。
（１）分泌シグナル配列、リパーゼの構造遺伝子配列、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡ
（２）分泌シグナル配列、リパーゼの構造遺伝子配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡ
（３）分泌シグナル配列、糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列、リパーゼの構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡ
（４）分泌シグナル配列、リパーゼの構造遺伝子配列、ＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列をこの順で有するＤＮＡ
上記（２）、（３）の場合は、糖鎖結合タンパク質ドメインが、少なくとも細胞表層局在タンパク質の凝集機能ドメインを含む部分であることが好ましい。
【００４５】
また、上記（１）〜（４）の場合、リパーゼの構造遺伝子配列と、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列もしくは糖鎖結合タンパク質ドメインをコードする配列またはＧＰＩアンカリングドメインをコードする配列との間には、適当な長さのリンカー配列が挟みこまれてもよく、アミノ酸の種類は限定されないが、アミノ酸８個〜２１個をコードするＤＮＡ配列が好ましい。
【００４６】
前記（１）〜（４）のＤＮＡは、従来公知の手法を用いて合成することができる。例えば、（１）のＤＮＡの場合、分泌シグナル配列とリパーゼの構造遺伝子配列との結合は、部位特異的突然変異法を用いて行うことができ、正確な分泌シグナル配列の切断と高活性なリパーゼＢの発現が可能である。さらに、このようにして得られた配列と、細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列とを結合すればよい。結合は、適切な制限酵素、リンカー等を用いて行うことができる。
【００４７】
また、係るＤＮＡは、プラスミドの形態でも、宿主となるサッカロミセス属酵母の遺伝子に組み込まれた形態でも、いずれでもよい。
【００４８】
アーミング酵母は、係るＤＮＡをサッカロミセス属酵母に導入することにより得ることができる。
【００４９】
このようにして得られるアーミング酵母は、従来のアーミング酵母に比べ、エステル反応を触媒する活性が高く、エステル反応により適したアーミング酵母である。更に、従来のアーミング酵母よりも耐熱性が高く、高温でエステル反応を触媒できるため、エステル合成反応のような吸熱反応を効率よく触媒することが可能である。
一般式（３）で表される（メタ）アクリレートと２級水酸基を有する脂肪酸の使用比率は、好ましくは等モル、又は一般式（３）で表される（メタ）アクリレートと２級水酸基を有する脂肪酸に対して１．１〜１．５倍モルの比率で使用してもよい。
反応に使用する酵素量は、一般式（３）で表される（メタ）アクリレートと２級水酸基を有する脂肪酸の合計質量に対して、０．５〜１０質量％、好ましくは、１〜５質量％、より好ましくは、２〜４質量％である。
本発明の反応は、一般式（３）で表される（メタ）アクリレートを基質とすると共に反応溶媒として用いて、酵素反応を行なうことができるが、酵素活性に影響しない有機溶媒を添加して行うこともできる。このような反応溶媒は、用いないことが好ましいが、反応系の撹拌効率の向上や基質の溶解促進を目的として、必要に応じて反応系に添加しても良い。
【００５０】
用いられる溶媒としては、例えば、水、緩衝水溶液、塩水溶液、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ターシャリーブタノール、アミルアルコール、イソアミルアルコール、エチレングリコール、グリセリン、モノグリム、ジグリム、アセトニトリル、硝酸メチル、ジエチルエーテル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ＴＨＦ、ジオキサン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、トリクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、ピリジン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタン、シクロヘキサン等が好ましく、これら２種以上の混合物でもかまわない。
反応で副生する水は、反応系内を減圧にし、窒素等の不活性ガスを吹き込むことにより、減圧留去することが好ましい。
【００５１】
酵素活性を考慮すると反応系の水分を制御することが好ましく、水分量は１０ｐｐｍから１０％（１０００００ｐｐｍ）、酵素の活性のためには１０ｐｐｍから１％（１００００ｐｐｍ）添加することが好ましく、反応の平衡を考慮すると１０ｐｐｍから１０００ｐｐｍとすることが好ましい。これらの水分は、添加する酵素に含ませても、反応系に別途に添加しても良く、反応途中で順次、少量の水分を添加しても良い。
反応温度は、基質の溶解性と反応速度を考慮すると高温が好ましいが、一方、酵素の熱による失活を考慮すると低温が好ましく、相反する条件を満たす必要があり、極めて重要である。本発明に使用するリパーゼ（Ａ）では、好ましい反応温度として、３０〜６０℃の温度を挙げることができ、更に好ましくは、３５〜４５℃の温度を挙げることができる。
反応圧力は沸点による温度制御等を目的とし可変であり、減圧、加圧、０．１３から１０１３ｋｈＰａ（１ｍｍＨｇから７６００ｍｍＨｇ）の範囲で反応可能であり、通常１．３から２０２．６ＫＰａ（１０ｍｍＨｇから１５２０ｍｍＨｇ）の範囲で可能である。反応時間は、反応系により異なり、一概に規定されないが、反応効率と収量を考慮すると、一般に３時間から４８時間が好ましく、更に好ましくは５時間から３０時間であって、この程度の反応時間で留めて、未反応の原料を全て回収し、再反応に用いることが好ましい。
【００５２】
本発明に用いる反応装置は特に限定されるものではないが、基質と酵素の分散衝突性を向上させる為に、攪拌装置を有する反応槽での反応が好ましい。即ち、反応槽から留出する水を凝縮器に通し、次いで凝集したこれらをモレキュラーシーブス等の充填剤を充填した副生成物除去槽に通して、水をモレキュラーシーブスで吸着除去する。
副生成物除去槽に充填する充填材としては、（メタ）アクリレートと溶媒を吸着しないものを選択することが好ましく、モレキュラーシーブス、シリカゲル、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、酸化マグネシウム、硫化マグネシウム、炭酸カリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられる。モレキュラーシーブスは、副生物の種類により適宜変える必要があるが、副生生物が水、メタノールならば３Ａタイプ、これらもしくはエタノール等では４Ａタイプが好ましい。副生成物除去槽は反応槽の１％から１００％の体積があれば十分である。
【００５３】
モレキュラーシーブは、その重量の３０％程度の重量の水等を吸着することが可能であるが、反応効率等の観点から過剰量を充填することが好ましい。反応中又は反応後に充填材は再生する必要があり、再生方法としては洗浄、加熱、減圧の方法がある。一般には水、アルコールでの洗浄後に加熱乾燥及び減圧乾燥を行う。温度は１００℃以上が好ましく、１８０℃以上が速い再生を望める。
副生成物除去槽の規模を小さくするには、反応中に充填剤の再生を行うことが効率的であり、例えば２つ以上の除去槽を並列に使用し、使用槽を切換えて連続運転することが好ましい。また副生成物除去槽はソクスレー抽出機のような構造を有していることも好ましい。また副生成物除去槽を持たずに反応槽に直接、これらの充填物を反応槽内部に入れて反応させ、反応後に反応物から除去することも可能である。
撹拌装置はスクリュー翼、ヘリカル翼、ファードラー翼、タービン翼、パドル翼等を使用でき、均質な撹拌が可能な用いることが好ましい。撹拌回転数は撹拌効率、撹拌動力に依存するもののため、撹拌翼、反応槽のスケール等に依存するが、基質が不均質な場合、沈殿が生じない範囲で低速度が好ましい。
【００５４】
本発明により提供される２級水酸基を有する（メタ）アクリレートは、抗菌活性を有することに特徴がある。
本発明により提供される２級水酸基を有する（メタ）アクリレートは、それ自体を重合させるか、これらの数種の２級水酸基を有する（メタ）アクリレートを共重合させるか、他のアクリル酸系のモノマー、及び／又は他のビニル系モノマーとともに共重合させることもできる。又は、イソシアネート、及び／又はエポキシドのような反応性の他の化合物と反応させて使用することもできる。
本発明で提供される２級水酸基を有する（メタ）アクリレートは、各種のポリマー材料や、反応性のポリマー材料として、塗料、接着剤、インク、紙・布のサイジング剤に広く使用でき、また廃棄物処理を目的に他のポリマーに分解性を付与する目的で、他のポリマーの改質に使用することもできる。
【実施例】
【００５５】
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。
【００５６】
（実施例１）リシノール酸とＨＥＭＡとの反応
三方コック（一方は、冷却トラップを介して減圧ポンプと、他方は減圧ゲージと結合している）および気体導入管（ガス流量制御コントローラーに結合している）を取り付けた三ツ口フラスコに、
リシノール酸４４．８ｇ、０．１５０ｍｏｌ
２−ヒドロキシエチルメタクリレート    ２１．５ｇ、０．１６５ｍｏｌ
メトキシハイドロキノン          １２．７ｍｇ
リポザイムＲＭ−ＩＭ            ３．３ｇ（モノマー全量に対し５重量％）
を入れ、油浴にて４０℃に加温した。反応は攪拌羽根を取り付けた機械式攪拌器を用い攪拌を行った。３０分後、反応系内を減圧（２．５ｋＰａ）し、かつ乾燥空気を供給した。反応開始より２時間後、反応系内の減圧度を１．０ｋＰａにまで高め反応を継続した。反応開始より２３時間後の反応転化率は＞９８％であった．反応系内の減圧および空気の吹き込みを停止し、濾過（アドバンテック製生産用濾紙Ｎｏ．２８−３を使用）により固定化酵素を濾別した。室温にて淡黄色液体（収量５２．４ｇ、収率８３％）を得た。
本発明において反応追跡および純度の決定はガスクロマトグラムにより行った。
以下の実施例、比較例により得られた生成物の分析は本実施例における方法と同様にして行った。
＜ガスクロマトグラム条件＞
測定機器：  島津製  ＧＣ−２０１０
カラム：    キャピラリーカラムＴＣ−５（０．３２ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍ、ｄｆ＝０．２５μｍ、ＧＬサイエンス製）
インジェクション方法：          スプリット法（３０：１）
インジェクション温度：          ３００℃
検出方法：  ＦＩＤ
検出器温度：３２０℃
カラム温度：１００℃（２分間保持）→２０℃／分→３００℃（１３分間保持）
化合物の同定は、１Ｈ-ＮＭＲ、質量分析（ＧＣ−ＭＳ）およびＩＲ測定により行った。また、酵素反応によってリシノール酸の重縮合反応が進行していないことの確認はＧＰＣ測定によって確認した。
＜１Ｈ−ＮＭＲ条件＞
測定機器：  日本電子製  ＬＡ−３００（３００ＭＨｚ）
溶媒：    ＣＤＣｌ３
内部標準：  ＴＭＳ
＜ＧＣ−ＭＳ条件＞
測定機器：  日本電子製  ＪＭＳ−Ｋ９（四重極型）
カラム：    キャピラリーカラムＤＢ−５ｍｓ（０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍ、ｄｆ＝０．２５μｍ、アジレントテクノロジー製）
インジェクション方法：          スプリット法（３０：１）
インジェクション温度：          ３００℃
カラム温度：５０℃（２分間保持）→１５℃／分→３００℃
イオン化方法：ＥＩ  または  ＣＩ（イソブタン）
＜ＩＲ測定条件＞
測定機器：  ＳｅｎｓＩＲ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ製  ＴｒａｖｅｌＩＲ
＜ＧＰＣ測定条件＞
使用機器：  島津製  ＧＰＣシステム（ポンプ  ＬＣ−１０ＡＴｖｐ、コントローラー  ＳＣＬ−１０Ａｖｐ、カラムオーブン  ＣＴＯ−１０Ａｖｐ、デガッサー  ＤＧＵ−１４Ａ、検出器  ＲＩＤ−１０ＡおよびＳＰＤ−１０Ａｖｐ）
カラム：    ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００ＨＸＬ
ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＨＸＬ
ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２０００ＨＸＬ
ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ１０００ＨＸＬ
（以上、４本を連結）
カラム温度：４０℃
移動層：    ＴＨＦ
流速：    １  ｍｌ／分
また、分子量の較正は以下の東ソー製ＴＳＫｓｔａｎｄａｒｄ１２種を用いた。
標準ポリスチレン分子量（  ）内はＴｙｐｅ  Ｎｏ．：
１０９００００（Ｆ−１２８）、７０６０００（Ｆ−８０）
４２７０００（Ｆ−４０）、１９００００（Ｆ−２０）
９６４００（Ｆ−１０）、３７９００（Ｆ−４）
１８１００（Ｆ−２）、１０２００（Ｆ−１）
５９７０（Ａ−５０００）、２６３０（Ａ−２５００）
１０１０（Ａ−１０００）、５００（Ａ−５００）
＜化合物同定＞
1Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：
【００５７】
【化９】
2009256288.tif 000010
【００５８】
【表１】
2009256288.tif 000011
【００５９】
ＭＳ：ｍ／ｚ  ４１０（および  ＴＭＳ（トリメチルシリル）化処理によりｍ／ｚ  ４８２）
ＩＲ：３４００（ｂｒ、ＯＨ）、１７２３（Ｃ＝Ｏ）  ｃｍ-1
＜その他＞
ＧＰＣ（ポリスチレン換算）：  Ｍｎ  ７９０、Ｍｗ／Ｍｎ  １．１
※参考  リシノール酸（原料）Ｍｎ  ６７０、Ｍｗ／Ｍｎ  １．１
カラー：  ガードナー色数  １（ハーゼン色数  １６０）
※参考  リシノール酸(原料)    ガードナー色数  ２（ハーゼン色数  ３９０）
【００６０】
（比較例１）化学合成法によるリシノール酸とＨＥＭＡとの反応
デカンターおよび気体導入管を取り付けた四ツ口フラスコに、
リシノール酸４４．８ｇ、０．１５０ｍｏｌ
２−ヒドロキシエチルメタクリレート    ２３．４ｇ、０．１８０ｍｏｌ
メトキシハイドロキノン          １００ｍｇ
トルエン    ２７０．０ｇ
ｐ−トルエンスルホン酸一水和物      ２．０ｇ（モノマー全量に対し３重量％）
を入れ、油浴にて１２５〜１３０℃に加温した。攪拌はマグネチックスターラーを用い、また、乾燥空気をバブリングにより供給した。トルエンの還流とともに縮合水の生成が確認されたが、反応溶液は褐色に変化した。反応開始より６．５時間後、縮合水の生成が停止し、また、反応追跡結果より反応の進行が認められないため反応を停止した。このときの反応転化率は８５％であった。反応混合物のアルカリ洗浄を試みたが乳化がひどく、水洗は困難であった。また、アルカリおよび水洗による反応混合物からの脱色（ガードナー色数１６、ハーゼン色数測定不能）はできなかった。
【００６１】
（実施例２）リシノール酸メチルとＨＥＭＡとの反応
三方コック（一方は、冷却トラップを介して減圧ポンプと、他方は減圧ゲージと結合している）および気体導入管（ガス流量制御コントローラーに結合している）を取り付けた三ツ口フラスコに、
リシノール酸メチル            ６２．５ｇ、０．２００ｍｏｌ
２−ヒドロキシエチルメタクリレート    ２７．３ｇ、０．２１０ｍｏｌ
メトキシハイドロキノン          ８ｍｇ
リポザイムＲＭ−ＩＭ            ４．５ｇ（モノマー全量に対し５重量％）
を入れ、油浴にて４０℃に加温した。反応は攪拌羽根を取り付けた機械式攪拌器を用い攪拌を行った。反応系内を減圧（５．０ｋＰａ）し、かつ乾燥空気を供給した。反応開始より９時間後、反応系内の減圧度を１．０ｋＰａ、ついで２４時間後に０．５ｋＰａにまで高め反応を継続した。反応開始より２２５時間後、反応系内の減圧および空気の吹き込みを停止し、濾過（アドバンテック製生産用濾紙Ｎｏ．２８−３を使用）により固定化酵素を濾別した。室温にて淡黄色透明液体の目的物を得た。
【００６２】
（実施例３）リシノール酸とＨＥＡとの反応
三方コック（一方は、冷却トラップを介して減圧ポンプと、他方は減圧ゲージと結合している）および気体導入管（ガス流量制御コントローラーに結合している）を取り付けた三ツ口フラスコに、
リシノール酸２０８．９ｇ、０．７００ｍｏｌ
２−ヒドロキシエチルアクリレート    １８．３ｇ、０．７７０ｍｏｌ
メトキシハイドロキノン          ６３ｍｇ
リポザイムＲＭ−ＩＭ            ６．０ｇ（モノマー全量に対し２重量％）
を入れ、油浴にて４０℃に加温した。反応は攪拌羽根を取り付けた機械式攪拌器を用い攪拌を行った。３０分後、反応系内を減圧（２．５ｋＰａ）し、かつ乾燥空気を供給した。反応開始より２４時間後（反応転化率９６％）、反応系内の減圧および空気の吹き込みを停止し、濾過（アドバンテック製生産用濾紙Ｎｏ．２８−３を使用）により固定化酵素を濾別した。室温にて淡黄色透明液体（収量２６２．６ｇ、収率９２％）を得た。
＜化合物同定＞
1Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：
【００６３】
【化１０】
2009256288.tif 000012
【００６４】
【表２】
2009256288.tif 000013
【００６５】
ＭＳ：  ｍ／ｚ  ３９６  （および  ＴＭＳ化処理によりｍ／ｚ  ４６８）
ＩＲ： ３４００（ｂｒ、ＯＨ）、１７２３（Ｃ＝Ｏ）  ｃｍ-1
【００６６】
（実施例４）リシノール酸とＨＢＡとの反応
三方コック（一方は、冷却トラップを介して減圧ポンプと、他方は減圧ゲージと結合している）および気体導入管（ガス流量制御コントローラーに結合している）を取り付けた三ツ口フラスコに、
リシノール酸４４．８ｇ、０．１５０ｍｏｌ
２−ヒドロキシブチルアクリレート    ２３．８ｇ、０．１５８ｍｏｌ
メトキシハイドロキノン          ９ｍｇ
リポザイムＲＭ−ＩＭ            ２．１ｇ（モノマー全量に対し３重量％）
を入れ、油浴にて４０℃に加温した。反応は攪拌羽根を取り付けた機械式攪拌器を用い攪拌を行った。１５分後、反応系内を減圧（３．５ｋＰａ）し、かつ乾燥空気を供給した。反応開始より４．５時間後、反応系内の減圧度を１．５ｋＰａにまで高め反応を継続した。反応開始より２４時間後（反応転化率＞９９％）、反応系内の減圧および空気の吹き込みを停止し、濾過（アドバンテック製生産用濾紙Ｎｏ．２８−３を使用）により固定化酵素を濾別した。室温にて淡黄色透明液体（収量６０．１ｇ、収率９１％）を得た。
＜化合物同定＞
1Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：
【００６７】
【化１１】
2009256288.tif 000014
【００６８】
【表３】
2009256288.tif 000015
【００６９】
ＭＳ：  ｍ／ｚ  ４２４  （および  ＴＭＳ化処理によりｍ／ｚ  ４９６）
ＩＲ：３４００（ｂｒ、ＯＨ）、１７２３（Ｃ＝Ｏ）  ｃｍ-1
【００７０】
（実施例５）１２−ヒドロキシステアリン酸とＨＥＭＡとの反応
三方コック（一方は、冷却トラップを介して減圧ポンプと、他方は減圧ゲージと結合している）および気体導入管（ガス流量制御コントローラーに結合している）を取り付けた三ツ口フラスコに、
１２−ヒドロキシステアリン酸        １５０．２ｇ、０．５００ｍｏｌ
メトキシハイドロキノン          ４５ｍｇ
を入れ、油浴（９０℃）にて１２−ヒドロキシステアリン酸を融解した後、８０℃まで放冷した。
２−ヒドロキシエチルメタクリレート    ７１．６ｇ、０．５５０ｍｏｌ
リポザイムＲＭ−ＩＭ            ６．７ｇ（モノマー全量に対し３重量％）
を加えて反応開始した。反応温度７０℃まで徐々に放冷し、２時間後、反応系内を減圧（５．０ｋＰａ）かつ乾燥空気を供給した。反応開始より２０時間後に減圧を３．５ｋＰａ、３０時間後に２．０ｋＰａにまで高め反応を継続した（反応転化率９６％）。反応系内の減圧および空気の吹き込みを停止し、濾過（アドバンテック製生産用濾紙Ｎｏ．２８−３を使用）により固定化酵素を濾別した。室温にて白色ワックス状固体（収量１８７．３ｇ、収率８８％、純度９２％（ＧＣピーク比））を得た。
＜化合物同定＞
1Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：
【００７１】
【化１１】
2009256288.tif 000016
【００７２】
【表４】
2009256288.tif 000017
【００７３】
ＭＳ： m/z ４１２（および  ＴＭＳ化処理によりｍ／ｚ  ４８４）
ＩＲ： ３４００（ｂｒ、ＯＨ）、１７２３（Ｃ＝Ｏ）  ｃｍ-1
【００７４】
（実施例６）  リシノール酸とN-ヒドロキシエチルアクリルアミドとの反応
三方コック（一方は、冷却トラップを介して減圧ポンプと、他方は減圧ゲージと結合している）および気体導入管（ガス流量制御コントローラーに結合している）を取り付けた三ツ口フラスコに、
リシノール酸１１９．５ｇ、０．４００ｍｏｌ
N-ヒドロキシエチルアクリルアミド    ４８．４ｇ、０．４２０ｍｏｌ
メトキシハイドロキノン          ３０ｍｇ
リポザイムRM-IM            ８．４ｇ（モノマー全量に対し５重量％）
を入れ、油浴にて４０℃に加温した。反応は攪拌羽根を取り付けた機械式攪拌器を用い攪拌を行った。３時間後、反応系内を減圧（８ｋPa）し、かつ乾燥空気を供給した。反応開始より２１時間後、反応系内の減圧度を１．５ｋＰａにまで高め反応を継続した。反応開始より４６時間後（反応転化率＞９９％）、反応系内の減圧および空気の吹き込みを停止し、濾過（アドバンテック製生産用濾紙No.２８−３を使用）により固定化酵素を濾別した。室温にて淡黄色透明液体（収量１５１．１ｇ、収率９０％）を得た。
＜化合物同定＞
1Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：
【００７５】
【化１２】
2009256288.tif 000018
2009256288.tif 000019
【００７６】
【表５】
2009256288.tif 000020
【００７７】
ＭＳ：  ｍ／ｚ  ３９５ （および  ＴＭＳ化処理によりｍ／ｚ  ４６７）
ＩＲ： ３４００（ｂｒ、ＯＨ）、１７２６（Ｃ＝Ｏ、エステル）、１６５４（Ｃ＝Ｏ、アミド）  ｃｍ-1
（実施例７）  リシノール酸とＨＥＭＡとの反応
【００７８】
三方コック（一方は、冷却トラップを介して減圧ポンプと、他方は減圧ゲージと結合している）および気体導入管（ガス流量制御コントローラーに結合している）を取り付けた三ツ口フラスコに、
リシノール酸５９．７ｇ、０．２００ｍｏｌ
2-ヒドロキシエチルメタクリレート    ２８．７ｇ、０．２２０ｍｏｌ
メトキシハイドロキノン          ２１ｍｇ
CALB-アーミング酵母        ８．６ｇ（モノマー全量に対し１０重量％）
を入れ、油浴にて４０℃に加温した。反応は攪拌羽根を取り付けた機械式攪拌器を用い攪拌を行った。３時間後、反応系内を減圧（１０ｋPa）し、かつ乾燥空気を供給した。反応開始より６時間後、反応系内の減圧度を５ｋＰａにまで高め、更に９時間後に２．５ｋＰａ、２３時間後に１．０ｋＰａにまで高め、反応を継続した。反応開始より６７時間後の反応転化率は＞９２％であった。反応系内の減圧および空気の吹き込みを停止し、濾過（アドバンテック製生産用濾紙No.２８−３を使用）により固定化酵素を濾別した。室温にて淡黄色液体（収量７７．８ｇ、収率８８％）を得た。
【００７９】
以下に、上記実施例で用いたアーミング酵母の調整法を記す。
（製造例１）＜ＣＡＬＢ表層発現プラスミドの作成＞
（１−Ａ．キャンディダ・アンタルクチカ由来リパーゼＢ遺伝子の取得）
次のようにしてキャンディダ・アンタルクチカ由来リパーゼＢ（ＣＡＬＢ）遺伝子を取得した。
【００８０】
すなわち、キャンディダ・アンタルクチカＣＢＳ６６７８株ゲノムをテンプレートとし、従来公知の方法でＤＮＡ合成装置にて合成した、配列番号１及び２に示す塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで切断して、約１０００ｂｐの長さのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片（ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＰｒｏＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８断片）を得た。このＣＡＬＢは、Ｕｐｐｅｎｂｅｒｇらの文献（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：２９３（１９９４））に記載され、もっとも広く知られているキャンディダ・アンタルクチカ ＬＦ０５８株由来リパーゼＢのアミノ酸配列（ＣＡＬＢ  ＷＴ）と比較して７アミノ酸が変異している。すなわち２５番目のアラニンがトレオニンに、２８番目のセリンがトレオニンに、３１番目のセリンがトレオニンに、４６番目のグルタミンがグリシンに、８９番目のアラニンがトレオニンに、９７番目のアスパラギンがアルギニンに、２８６番目のバリンがイソロイシンにそれぞれ変異している、特徴的なＣＡＬＢであった。
（１−Ｂ．ＣＡＬＢ遺伝子導入プラスミドの取得）
ＣＡＬＢ遺伝子中への変異の導入を効率よく行うため、上記１−Ａで得られたＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８遺伝子を、一度サイズの小さいプラスミドに導入した。
【００８１】
すなわち、プラスミドｐＵＣ１９（ＴａＫａＲａ  ＢＩＯ社製）をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し、上記Ａで得られたＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＰｒｏＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８断片を挿入して、プラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８を得た。作成の模式図を図1に示す。
【００８２】
（１−Ｃ．ＣＡＬＢ１遺伝子ならびにＣＡＬＢ１導入プラスミドの取得）
上記１−Ｂで得られたプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８をテンプレートとし、従来公知の方法でＤＮＡ合成装置にて合成した、配列番号３及び４に示す塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、ＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８中にポイントミューテーションを導入し、ＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８中のアミノ末端から２５番目のトレオニンをアラニンに、２８番目のトレオニンをセリンに、３１番目のトレオニンをセリンにそれぞれ置換したＣＡＬＢ１遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ１を得た。
【００８３】
（１−Ｄ．ＣＡＬＢ２遺伝子ならびにＣＡＬＢ２導入プラスミドの取得）
上記１−Ｃで得られたプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ１をテンプレートとし、従来公知の方法でＤＮＡ合成装置にて合成した、配列番号５及び６に示す塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、ＣＡＬＢ１中にポイントミューテーションを導入し、ＣＡＬＢ１中のアミノ末端から４６番目のグリシンをグルタミンに置換したＣＡＬＢ２遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ２を得た。
【００８４】
（１−Ｅ．リンカー導入型ＣＡＬＢ遺伝子の取得）
上記１−Ｄで得られた各ＣＡＬＢ２導入プラスミドをテンプレートとし、従来公知の方法でＤＮＡ合成装置にて合成した、配列番号７及び８に示す塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、次いでＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで切断して、約１０００ｂｐの長さのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２断片を得た。ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２断片は、ＦＬＡＧ  ｔａｇ、リパーゼのプロ配列、及びＣＡＬＢ２の成熟タンパク質配列を有している。ここで、プロ配列とは、リパーゼの立体構造を形成するために必要とされる配列のことであり、ＦＬＡＧ  ｔａｇとは、リンカー配列のことであり、成熟タンパク質配列とは、実際にリパーゼの触媒反応機能を有する配列のことである。
【００８５】
（１−Ｆ．ＣＡＬＢ表層発現カセットの作成）
ＣＡＬＢ表層発現カセットは、発現プロモーターの配列とターミネーターの配列、並びにこれらの間にＦＬＯ１誘導体であるＳｈｏｒｔ型ＦＬＯ１アンカー遺伝子と上記１−Ｅで得られたリンカー導入型ＣＡＬＢ遺伝子を接続したものをそれぞれ有するＤＮＡ配列である。該ＣＡＬＢ表層発現カセットを作成するために、以下の操作を行った、作成の模式図を図２に示す。
【００８６】
すなわち、プラスミドｐＷＩＦＳ（Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６８：４５１７（２００２））をＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断し、上記１−Ｅで得られたＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２断片を挿入して、ｐＷＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２を得た。そしてこれをＢｓｓＨＩＩで切断し、約６３００ｂｐのＣＡＬＢ表層発現カセットを得た。
【００８７】
（１−Ｇ．ＣＡＬＢ表層発現プラスミドの作成）
目的のＤＮＡを有するプラスミドは、上記１−Ｆで得られたＣＡＬＢ表層発現カセットを、各種選択マーカーを有するプラスミドに導入することで得られる。作成の模式図を図３に示す。
【００８８】
すなわち、プラスミドｐＲＳ４０２（ＡＴＣＣ８７４７７）、ｐＲＳ４０３（ＡＴＣＣ８７５１４）、ｐＲＳ４０４（ＡＴＣＣ８７５１５）、ｐＲＳ４０５（ＡＴＣＣ８７５１６）、ｐＲＳ４０２（ＡＴＣＣ８７５１７）をそれぞれＢｓｓＨＩＩで切断し、上記Ｆで得られたＣＡＬＢ表層発現カセットを挿入してｐＲＳＡＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２、ｐＲＳＨＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２、ｐＲＳＷＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２、ｐＲＳＬＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２、ｐＲＳＵＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２を得た。
【００８９】
（製造例２）＜ゲノム組み込み型二倍体ＣＡＬＢ−アーミング酵母の調製＞
（２−Ａ．サッカロミセス属酵母への遺伝子の導入）
上記１−Ｇで得られたＣＡＬＢ表層発現プラスミドを、表１に示す制限酵素を用いて、それぞれ選択マーカー中に存在する制限酵素サイトで切断した。次いで、ＹＥＡＳＴ  ＭＡＫＥＲＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）を用いて、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、以下、サッカロミセス・セレヴィシエと略記する）ＹＰＨ４９９（ＭＡＴａ、ｕｒａ３、ｌｙｓ２、ａｄｅ２、ｈｉｓ４、ｔｒｐ１、ｌｅｕ２）には、ｐＲＳＵＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２、ｐＲＳＬＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２、ｐＲＳＨＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２、ｐＲＳＡＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２をこの順で、サッカロミセス・セレヴィシエＹＰＨ５００（ＭＡＴａｌｐｈａ、ｕｒａ３、ｌｙｓ２、ａｄｅ２、ｈｉｓ４、ｔｒｐ１、ｌｅｕ２）には、ｐＲＳＵＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２、ｐＲＳＬＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２、ｐＲＳＷＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２、ｐＲＳＡＩＦＳ−ＦＬＡＧ−ＰｒｏＣＡＬＢ２をこの順で、それぞれのゲノム中に導入した。各形質転換の選択においては、アミノ酸並びに核酸（０．００２％Ｌ−ヒスチジン、０．０１％Ｌ−ロイシン、０．００２％Ｌ−トリプトファン、０．００２％Ｌ−リシン、０．００２％アデニン、０．００２％ウラシル）のうち、選択に必要なものを含むＳＤ寒天培地（２％グルコース、０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）を用いて培養した。生育した酵母を選択し、ゲノム組み込み型ＣＡＬＢアーミング酵母である、サッカロミセス・セレヴィシエＹＰＨ４９９−Ｕ、ＹＰＨ４９９−ＵＬ、ＹＰＨ４９９−ＵＬＨ、ＹＰＨ４９９−ＵＬＨＡ、並びにＹＰＨ５００−Ｕ、ＹＰＨ５００−ＵＬ、ＹＰＨ５００−ＵＬＷ、ＹＰＨ５００−ＵＬＷＡアーミング酵母を得た。
【００９０】
表６  各プラスミドの選択マーカー中における切断に用いた制限酵素
【００９１】
【表６】
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【００９２】
（２−Ｂ．一倍体サッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母の調製）
上記２−Ａで創製したサッカロミセス・セレヴィシエＹＰＨ４９９−Ｕ、ＹＰＨ４９９−ＵＬ、ＹＰＨ４９９−ＵＬＨ、ＹＰＨ４９９−ＵＬＨＡ、並びにＹＰＨ５００−Ｕ、ＹＰＨ５００−ＵＬ、ＹＰＨ５００−ＵＬＷ、ＹＰＨ５００−ＵＬＷＡアーミング酵母を、ＳＤＣ培地（２％グルコース、０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２％カザミノ酸、ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）に植菌し、３０℃で６日間浸透培養した。次いで、遠心分離により培地と菌体に分離し、得られた菌体を一倍体サッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母とした。得られた一倍体サッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母の、酪酸ｐ−ニトロフェニル（以下、ＰＮＰＢと略記する）を基質とした３０℃におけるリパーゼ活性を確認した。
【００９３】
（２−Ｃ．二倍体サッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母の創製）
一倍体アーミング酵母ＹＰＨ４９９−ＵＬＨＡ、ＹＰＨ５００−ＵＬＷＡをＹＰＤ培地（２％グルコース、２％ｐｅｐｔｏｎｅ、１％ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）に植菌し、３０℃で１時間培養後、遠心分離により培地と菌体に分離し、得られた菌体を混合してＹＰＤ培地に再懸濁し、３０℃で一晩培養した。これを適切な菌体密度に希釈した後、ＳＤ＋Ｋ寒天培地（２％グルコース、０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．００２％Ｌ−リシン）を用いて培養した。生育した酵母を選択し、ゲノム導入型二倍体ＣＡＬＢ−アーミング酵母である、サッカロミセス・セレヴィシエＹＰＨ５０１−Ｕ２Ｌ２ＨＷＡ２アーミング酵母を得た。
【００９４】
（２−Ｄ．二倍体サッカロミセス−ＣＡＬＢアーミング酵母の調製）
上記２−Ｃで得られたサッカロミセス・セレヴィシエＹＰＨ５０１−Ｕ２Ｌ２ＨＷＡ２アーミング酵母を、ＳＤＣ＋Ｋ培地（２％グルコース、０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２％カザミノ酸、０．００２％Ｌ−リシン）に植菌し、３０℃で６日間浸透培養した。次いで、遠心分離により培地と菌体に分離し、ＰＮＰＢを基質とした菌体の３０℃におけるリパーゼ活性（エステル分解活性）を確認した。
【００９５】
エステル分解活性の測定には、ＰＮＰＢ法を用いた。培養液を遠心分離することで菌体を回収し、得られた菌体を蒸留水で２回洗浄した。次いで、菌体を２０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、３０℃で５分間プレインキュベートした。一方、基質にはＰＮＰＢを用いた。ＰＮＰＢは少量のエタノールに溶解させた後、蒸留水で適当に希釈して基質液を調製した。プレインキュベートした菌体懸濁液へ基質液を加え、よく撹拌し、振盪させながら３０℃で１０分間反応させた。次いで、５％トリクロロ酢酸水溶液を添加し、反応を停止したのち、遠心分離し、上清を回収し、２００ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、４００ｎｍの吸光度を測定した。そして、生成したｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）量を求め、エステル分解活性とした。活性を定義するにあたり、ＰＮＰが１分間に1μｍｏｌ生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】製造例におけるプラスミドｐＵＣ１９−ＰｒｏＣＡＬＢ  ＣＢＳ６６７８作成の模式図である。
【図２】製造例におけるＣＡＬＢ表層発現カセット作成の模式図である。
【図３】製造例におけるＣＡＬＢ表層発現プラスミド作成の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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