(57)【要約】      （修正有）【課題】S-アデノシルメチオニンを大量生産し得る製造方法を提供する。【解決手段】コリン系化合物を添加した培地で酵母を培養し、系内に蓄積したＳ−アデノシルメチオニンを回収することからなるＳ−アデノシルメチオニンを生産する方法。前記酵母が、ホスファチジルコリン合成系酵素をコードする遺伝子において、１個またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加した配列を有する変異体である、Ｓ−アデノシルメチオニンを生産する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリン系化合物を添加した培地で酵母を培養し、系内に蓄積したＳ−アデノシルメチオニンを回収することを特徴とするＳ−アデノシルメチオニンを生産する方法。
【請求項２】
前記コリン系化合物がコリン、ホスファチジルコリン、ホスホコリン、シチジン-５’-ジリン酸コリン、又はアセチルコリンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵母がサッカロミセス（Saccharomyces）属である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵母がサッカロミセス  セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵母が、ホスファチジルコリン合成系酵素をコードする遺伝子において、１個またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加した配列を有する変異体である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記酵母がcho2変異体である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記コリン系化合物を添加した培地が、１０μＭ以上のコリン系化合物を含む培地である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記コリン系化合物を添加した培地が、０．１〜１００ｍＭのコリン系化合物を含む培地である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記コリン系化合物を添加した培地が、メチオニンを含む培地である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記コリン系化合物を添加した培地が、０．０１w/v％以上のメチオニンを含む培地である請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｓ−adenosylmethionine：以下、ＳＡＭという）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＡＭは、生体組織全体に存在し、ホルモン、神経伝達物質、リン脂質及びタンパク質の合成および代謝における様々なメチル化反応のメチル基供与体として機能する生理活性物質である。臨床的には、肝臓機能を高め、有害物質を体内から排出するのを助ける作用があり、従来から肝炎、高脂血症、動脈硬化症などに対する治療効果があることが知られている。また、神経伝達物質の生成にも関与し、近年ではうつ病、老人性痴呆症、関節炎の治療薬やサプリメントとしても使われている。このようにＳＡＭの有用性が明らかになるに従って近年需要が拡大し、さらに生産性の高いＳＡＭの製造方法が希求されている。
【０００３】
現在、ＳＡＭの工業的生産は微生物培養によって行われており、主に酵母が使用されている。生産に使用される酵母は、過去の経験や研究からＳＡＭを高蓄積することが知られている既存の菌株が使用されており、ビタミン類、アミノ酸、各種塩などの基本的な栄養成分や培養条件を検討することによりその生産性の向上が図られてきた。しかし、効率的にＳＡＭ蓄積株を選抜する方法がなく、又、培養条件で飛躍的にＳＡＭの生産性を向上させることには限界があった。
【０００４】
一方、近年のバイオテクノロジーの進歩により、微生物の代謝経路や遺伝子の情報などが整備され、ＳＡＭの代謝、蓄積に関与する遺伝子を推定し、直接特定遺伝子を加工する事が可能となり、新たなアプローチで変異株を作製したり、製造方法を改良することが可能となった。
上記アプローチによりＳＡＭの高蓄積変異株の作製を行った例として、特許文献１にはＳＡＭを消費する酵素の一つであるホスファチジルコリン生合成系酵素の機能を分子生物学的手法を用いて抑制した変異株が開示されており、該変異株を培養することにより細胞内外にＳＡＭが高蓄積することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０２０５９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＳＡＭを大量生産し得る製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＳＡＭに関連する酵素の一つとしてホスファチジルコリン生合成系酵素がある。本酵素は、ホスファチジルエタノールアミンからホスファチジルコリンを合成する一連の反応を触媒する酵素で、具体的にはホスファチジルエタノールアミンのアミノ基をメチル化するホスファチジルエタノールアミンメチル基転移酵素、およびＮ-メチルホスファチジルエタノールアミンをホスファチジルコリンとなるように更にＮ-メチル化するN-メチルホスファチジルエタノールアミンメチル基転移酵素を指す。これらメチル化反応においてＳＡＭはメチル基供与体として関与する事が知られている（図１）。
上記の生合成経路において、ホスファチジルコリン生合成系酵素をコードする遺伝子を変異させてその酵素機能を消失させることにより、ホスファチジルエタノールアミンからホスファチジルコリンの生合成経路におけるＳＡＭの消費が抑えられ、結果として菌体内外にＳＡＭが蓄積することが判明した（特許文献１）。
一方、ホスファチジルコリンを生合成する経路は上記ホスファチジルコリン生合成系酵素による新規生合成系経路（de novo pathway）以外に、再生系経路(salvage pathway)が存在し、ホスファチジルコリンの生合成ではこの２つの生合成経路が互いに競合していると考えられる（図２）。即ち、一方の生合成系を活性化すれば他方は抑制される。
そこで、再生系経路を活性化させることで新規生合成系経路を抑制し、結果としてＳＡＭの消費を抑えることができるのではないかとの仮説をたて、培地中に再生系の基質たるコリン系化合物を添加してＳＡＭ生産株を培養した。その結果、細胞内外にＳＡＭが高蓄積する事を見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の要旨を有する。
（１）コリン系化合物を添加した培地で酵母を培養し、系内に蓄積したＳ−アデノシルメチオニンを回収することを特徴とするＳ−アデノシルメチオニンを生産する方法。
（２）前記コリン系化合物がコリン、ホスファチジルコリン、ホスホコリン、シチジン-５’-ジリン酸コリン、又はアセチルコリンである上記（１）に記載の方法。
（３）前記酵母がサッカロミセス（Saccharomyces）属である上記（１）に記載の方法。
（４）前記酵母がサッカロミセス  セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である上記（３）に記載の方法。
（５）前記酵母が、ホスファチジルコリン合成系酵素をコードする遺伝子において、１個またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加した配列を有する変異体である上記（１）に記載の方法。
（６）前記酵母がcho2変異体である上記（５）に記載の方法。
（７）前記コリン系化合物を添加した培地が、１０μＭ以上のコリン系化合物を含む培地である上記（１）に記載の方法。
（８）前記コリン系化合物を添加した培地が、０．１〜１００ｍＭのコリン系化合物を含む培地である上記（７）に記載の方法に関する。
（９）前記コリン系化合物を添加した培地が、メチオニンを含む培地である上記（１）に記載の方法。
（１０）前記コリン系化合物を添加した培地が、０．０１w/v％以上のメチオニンを含む培地である上記（９）に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の生産方法では、細胞内外にＳＡＭを高濃度で蓄積するので、従来よりも効率的かつ大量にＳＡＭを生産する事が可能となる。また、酵母としてcho2変異体等の高生産株を用いることにより、更にＳＡＭの生産性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】酵母（Saccharomyces cerevisiae）におけるSAM関連代謝系と遺伝子の相関図
【図２】酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるホスファチジルコリンのde novoとsalvage生合成系の概略図
【図３】コリン添加培地で清酒酵母(Kyokal 7）、実験室酵母の野生型(Wt)およびそのcho2変異体(cho2)を培養したときの、コリン濃度とSAMの収量を示す表。ただし、() 内の数値は、コリン添加なしの場合に対する増加率。
【図４】コリン添加培地で清酒酵母、実験室酵母の野生型およびそのcho2変異体を培養したときのSAMの収率向上を示すグラフ。(図３のコリン濃度とSAMの収量増加率を図示したもの。)
【図５】コリンを添加した培地における実験室酵母の野生型及びそのcho2変異体の生育曲線
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の一形態について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明はＳＡＭ生産菌に好適な培地に対して、コリン系化合物を添加することによりＳＡＭの生産性を向上させる方法である。
【００１２】
コリン系化合物とは、コリン又は生体内で分解し容易にコリンに転換される化合物の一群をいう。コリンに転換される化合物として、コリンの水酸基にホスファチジル基、リン酸基、CDP基、酢酸基などがエステル結合したものなどが挙げられ、これら化合物は生物体内で容易に分解しコリンへ変換される事が知られている。コリン系化合物の内、好ましい化合物としては、コリン、ホスファチジルコリン、ホスホコリン、シチジン−５’−ジリン酸コリンやアセチルコリンが挙げられる。コリン系化合物の添加量は１０μＭ(＝0.01ｍＭ)以上であり、好ましくは0.1ｍＭ以上である。また上限は、500ｍＭ以下であり、好ましくは100ｍＭ以下である。更に好ましくは１ｍＭである。１０μＭ未満であれば十分なＳＡＭの蓄積効果が得られず、500ｍＭ超であれば培養や精製に悪影響を与えるため、好ましくない。
【００１３】
酵母とは、単細胞の真菌を示し、有胞子酵母、担子菌酵母、不完全酵母などが挙げられる。この中でもＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属など有胞子酵母が望ましく、より望ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属である。中でもＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが更に望ましい。具体的には、実験室酵母、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母などが含まれる。又、より好ましい酵母としては、ホスファチジルコリン合成系酵素をコードする遺伝子において、１個またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加した配列を有する酵母の変異体が挙げられる。なかでも、ホスファチジルエタノールアミンメチル基転移酵素遺伝子（CHO2遺伝子）の変異体（以下、「cho2変異体」ともいう）が代表的な例として挙げられる。
【００１４】
ＳＡＭ生産は、酵母を適切な培地で培養し、ＳＡＭを菌体内外に生産蓄積せしめ、適切な精製工程を経ることによって、高収率で生産することができる。
【００１５】
酵母の培養については特に限定されることはなく、培養条件としては通常、酵母に対して好適な条件を用いることができる。例えば、培養温度を２０〜４５℃（好ましくは２５〜４０℃）、培養中のｐＨを３〜８（好ましくは５〜８）に制御した好気的条件下で１２〜１５０時間（好ましくは１６〜１２０時間）培養することができる。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００１６】
培地についても同様に、酵母に対して好適な培地を用いる事ができる。例えば、炭素源、窒素源などの基本成分と、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分とを含有する通常の培地である。その成分選択は過去の知見から酵母が利用可能な物質とされていれば、特に限定されるものではない。例えば、炭素源としてはグルコースやフルクトースの様な単糖に限らず、ショ糖や乳糖などの二糖、セルロースやスターチなどの多糖、エタノールや乳酸などの有機化合物、さらには廃糖蜜など粗精製原料なども利用可能である。窒素源に関しても、アンモニウム塩や硝酸塩などの無機塩類だけでなく、アミノ酸やグルコサミンなどの含窒素有機化合物、酵母抽出物やペプトンなどの有機原料なども利用可能である。これらの基本成分に加え、過去の培養工学の知見から好適な無機イオン塩、ビタミン、ミネラル、有機化合物、緩衝成分、消泡剤などを添加することができる。さらにSAM生産にとって望ましくは、メチオニン添加培地を使用することによって、更なるＳＡＭの大量取得が可能となる。メチオニンの添加量としては０．０１w/v％以上であり、好ましくは０．０５w/v％以上、更に好ましくは０．１w/v％以上である。また、上限については、０．４w/v％以下、好ましくは０．３５w/v％以下、更に好ましくは０．３w/v％以下である。０．１〜０．３w/v％の範囲内が最も好ましい。０．０１w/v％未満では、十分なＳＡＭの蓄積効果が得られず、０．４w/v％超では、酵母の生育に悪影響を与えるため、好ましくない。
【００１７】
培養後の培地からのＳＡＭの抽出及び精製については、特に限定されることは無い。例えば、培養物からの菌体の回収については、遠心、沈殿、ろ過といった方法で実施することができる。例えば酵母では遠心やろ過により容易に回収が可能である。又、得られた菌体からのＳＡＭの回収は、物理的破壊法（ホモジナイザー、ガラスビーズ破砕、凍結融解など）や化学的破壊法（溶剤処理、酸、塩基処理、浸透圧処理、酵素処理など）によって行なうことができる。例えば酵母では酸処理により容易にSAMは溶出する。さらに、抽出したＳＡＭの精製については、既存の精製方法（溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、塩沈降など）によって実施することができる。具体的にはSAMは酸性のイオン交換クロマトグラフィーを用いる事で精製は可能であり、冷アセトンを添加することで塩沈降によって固体として回収することが可能である。これらの方法は、必要に応じて適宜組み合わせて実施することが可能である。
【００１８】
以下、本発明の具体的な実施例について述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】
実施例
実験室酵母（Saccharomyces cerevisiae BY20592）およびそのcho2変異体、清酒酵母（協会7号酵母）をそれぞれ親株として培養を行い、菌体内に蓄積されたSAM含量を測定した。なお、本試験で用いた実験室酵母株は全て酵母遺伝資源センターより入手した。
【００２０】
（１）cho2変異体の作製
標的遺伝子破壊用のベクターはタカラバイオ社製 pAUR135ベクターを利用して作製した。具体的には、pAUR135ベクターのEcoR I−Sma I制限酵素切断処理物と、CHO2の一部のPCR増幅物（実験室酵母BY2041のゲノムDNAを鋳型に、プライマーＡ、Ｂ（表１、配列番号１及び２）を用いたPCR反応によって増幅された配列）のEcoR I制限酵素切断処理物を混合し、T4DNAリガーゼでライゲーションして、CHO2破壊用ベクターを作製した。さらに、このベクターをクローニングするために大腸菌DH5αへ導入し、この大腸菌培養物から常法に従いプラスミド精製を行うことで、必要量の遺伝子破壊用ベクターを調製した。
【００２１】
前項で作製したCHO2破壊用ベクターに挿入されているCHO2遺伝子の部分配列に対して、CDSに相当する配列でストップコドンが発生するように点突然変異を設計したプライマーC、D（表１、配列番号３及び４）を用いてCHO2破壊用ベクターの全長を増幅した。このPCR反応物をそのまま大腸菌DH5αへ形質転換し、目的の点突然変異が導入されたCHO2破壊用ベクターを保持した大腸菌を得た。この大腸菌培養物から常法に従いプラスミド精製を行い、必要量の点突然変異が導入されたCHO2破壊用ベクター（以下、「CHO2変異導入ベクター」という）を作製した。
【００２２】
上記のCHO2変異導入ベクターを用いて酵母ゲノムのCHO2遺伝子への変異導入を行った。具体的には、親株として実験室酵母（Saccharomyces cerevisiae BY20592）を用い、酢酸リチウム法によって上記ベクターを導入し、形質転換を行った。この形質転換酵母をYPD液体培地で一晩培養した後、0.5 μg/mlのオーレオバシジンＡ含有YPD固体培地に塗布し、生育してきたコロニーについて、導入ベクターがCHO2遺伝子部位に挿入されている事を確認できた。
【００２３】
次に、そのコロニーをYP-Galactose固体培地（2w/v％ペプトン、1w/v％イーストエキス、2w/v％ガラクトース、2w/v%精製寒天）に塗布し、28℃で3日間培養した。ここで、pAUR135ベクターにはガラクトース誘導致死性があるため、生育してくるコロニーはベクター配列が脱落した復帰変異体であり、その中にはcho2変異導入ベクターに導入したストップコドンがゲノムに導入された株が含まれる。そこで、CHO2遺伝子にストップコドンが導入されたコロニー（以後、この株を「cho2変異体」という）のゲノムをシークエンスする事により選抜した。
【００２４】
（２）コリン添加培地によるSAM生産量の測定
前項で得られた実験室酵母のcho2変異体と野生型親株（BY20592）および清酒酵母（Saccharomyces cerevisiae BY2696 、協会7号）を下記の条件で培養し、培養物を得た。すなわち、50mlの遠沈管に5mlのSAM発酵用培地（5w/v％グルコース、1w/v％ペプトン、0.5w/v％イーストエキス、0.4w/v％KH2PO4、0.2w/v％K2HPO4、0.05w/v％Mg2SO4・H2O、0.15w/v％L-メチオニン、pH6.0）を分注した後、最終濃度が10μＭ〜100ｍＭの範囲となるように10倍濃度毎にコリンを添加した。これらの培地に酵母株をそれぞれ接種し、28℃、72時間浸とう培養を行い、十分量の培養物を得た。
【００２５】
上述の72時間培養物に蓄積されるSAMを以下のような方法で抽出し、定量した。すなわち、菌体を遠心にて沈降させ、上清を除いた後、10％過塩素酸を添加してSAMを抽出（室温、1時間）し、その上清をペーパークロマトグラフィー（展開溶媒  EtOH：n-BuOH：水：AcOH：1w/v％NaP2O7＝３０：３５：４０：１：２）にて精製し、SAMスポットを切り出して抽出したものを分析用サンプルとした。
【００２６】
定量はHPLCを用いて260ｎmのUV吸収を指標に標準品との比較で行った。分析条件としては、使用装置：Waters  2690 Separation Module Waters 2487 Dual Absorbance Detectorシステム、使用カラム：cosmosil packed column 5C18-MS(4.6i.d.×250mm)、溶出溶媒：5v/v％メタノール-95v/v％0.2M  KH2PO4溶液、流速：1 ml/min、カラム温度：25℃であった。
【００２７】
その結果、全ての株でコリン添加によるSAMの蓄積量の向上が確認された。さらにその効果は１mＭまで濃度依存的に向上する事が観察され、それ以上の濃度では効果は飽和する事が分かった（図３及び４）。
【００２８】
さらに、コリン添加の効果をcho2変異体とその親株の培養物において比較した。その結果、SAM収量増加効果はcho2変異体を培養した方が効果的であった。これはCHO2遺伝子がホスファチジルコリンの生合成に関与する遺伝子である事からも明らかであり、ホスファチジルコリンのde novoの生合成系の抑制だけではなく、不足していたホスファチジルコリンがコリンの添加によって補給される事による生育改善などが相乗的に効果を及ぼしていると推測される。実際に図５に示すように、コリン添加濃度に応じて生育は改善され、野生型に比べて大きな生育促進効果を示している。この事から、コリン添加は特にcho2変異体によるSAM生産性向上に対して有効であると言える。
実施例で使用したプライマーの配列を第１表に示す。
【００２９】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、ＳＡＭの大量生産を可能とするため、治療薬やサプリメント等を始め、医療分野その他において広く使用されるＳＡＭの大量供給に寄与する。
なお、２００８年２月１２日に出願された日本特許出願２００８−０３０６７２号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
【配列表フリーテキスト】
【００３１】
SEQ ID NO: 1, Primer for amplification of CHO2 gene
SEQ ID NO: 2, Primer for amplification of CHO2 gene
SEQ ID NO: 3, Mutagenic primer containing mutations for amplification of CHO2 gene
SEQ ID NO: 4, Mutagenic primer containing mutations for amplification of CHO2 gene
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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