(57)【要約】【課題】ヒト・Ｓｈｈを指標として発毛又は育毛薬剤を評価するためには、Ｓｈｈが検出可能なレベルで発現しなければならない。従って、Ｓｈｈを有意に発現することが可能な培養系及び発現したＳｈｈを効率良く増幅することが可能なＰＣＲ用プライマーを確立する必要がある。さらには、発ガン性を示す可能性があるＳｈｈのアゴニストやＳｈｈ発現を直接促進する物質を回避することが極めて重要な問題となる。【解決手段】ヒト毛乳頭細胞と外毛根鞘細胞から成る細胞塊を用いること、ヒトＳｈｈ発現を効率良く検出できるＰＣＲプライマーを見出したことにより、平面培養系でほとんど検出されないＳｈｈを指標とする発毛薬剤の評価が可能となる。さらに被験物質の添加から２４時間経過後に初めてＳｈｈ発現を亢進させる作用をモニタリングすることにより発癌性物質を選択するおそれを回避し、被験物質の発毛又は育毛促進活性を安全に評価することが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される配列中の少なくとも１５個の連続した塩基配列を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列を含んで成る、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２に示される配列中の少なくとも１５個の連続した塩基配列を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２に示される塩基配列を含んで成る、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ヒト・ソニック・ヘッジホッグ遺伝子の発現の亢進を指標とする被験物質の発毛又は育毛促進活性を評価するための方法であって、ヒト毛乳頭細胞とヒト外毛根鞘細胞の混合培養液から製造した細胞塊に被験物質を適用させる工程、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチドを順方向プライマーとして使用し、かつ請求項３又は４に記載のオリゴヌクレオチドを逆方向プライマーとして使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により該遺伝子を増幅させる工程、そして該増幅させた発現遺伝子をモニタリングする工程を含んで成り、ここで該モニタリングが、該被験物質を該細胞塊に適用させてから少なくとも２４時間経過後に行われることを特徴とする方法。
【請求項６】
前記モニタリングが、被験物質を細胞塊に適用させてから少なくとも３日目以降に行われることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞塊がハンギングドロップ法により製造されることを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト毛乳頭細胞及びヒト外毛根鞘細胞からなる細胞塊においてヒト・ソニック・ヘッジホッグ遺伝子（Ｓｈｈ）の発現を効率良く検出することができるＰＣＲ用プライマー、及び該プライマーを使用して増幅させたヒト・ソニック・ヘッジホッグ遺伝子の発現の亢進を指標とする被験物質の発毛又は育毛促進活性を評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会、ストレス社会といわれる現代社会では、頭部毛髪が様々な原因により、脱毛の危機にさらされる機会がますます多くなってきている。これに対応して、発毛又は育毛剤を開発するためにより優れた評価方法が望まれる。従来、発毛又は育毛剤の評価方法としては、マウスやウサギの体毛に覆われている部分を毛刈りして、その部分に被験物質を塗布し、発毛を観察するインビボ法が知られている。しかしながら、近年の動物愛護の風潮から、実験動物を可能な限り用いずに、高精度で簡便な発毛剤又は育毛剤の評価方法の確立が望まれている。このようなインビトロ法の１つとしては、毛成長を促進する遺伝子の発現の亢進を指標とした評価法、又は毛成長を抑制する遺伝子の発現の抑制を指標とした評価法が考えられる。
【０００３】
発毛に関与する遺伝子としてはＳｈｈが疑われる。Rudolph D et al., Journal of Investigative Dermatology (2005) 125, 638-646 には、Ｓｈｈのアゴニストが発毛を誘導することが示唆され、そしてヒト胎児頭皮の器官培養にＳｈｈのアゴニストを作用させることによりＳｈｈの下流の遺伝子発現が変動することが記載されており、Ｓｈｈ又はその下流に存在する因子が発毛剤又は育毛剤の評価方法における指標となりうることが示唆されている。
【０００４】
しかしながら、発毛剤又は育毛剤の評価方法において、特定の遺伝子発現を指標とする場合には、その発現レベルが発毛又は育毛作用に特異的であり、かつ検出可能である必要があるが、該Ｓｈｈは一般的な平面培養系ではほとんど検出することができない。また逆転写ポリメラーゼ連鎖反応等により、極微量のＳｈｈを特異的に検出可能なレベルにまで増幅させるために有効なプライマーの存在も知られていない。
【０００５】
さらに、Ｓｈｈの下流の遺伝子であるＧＬＩ転写因子を指標にＳｈｈアゴニストをスクリーニングする場合には、Ｓｈｈタンパク質の受容体であるＰＴＣＨを介してアゴニストによる影響をモニターすることになる。しかしながら、皮膚などの基底細胞ガン（ＢＣＣ）は、ＰＴＣＨタンパク質の変異が原因であることが知られており（Athar M et al., Exp Dermatol. 2006 Sep;15(9):667-77）、このようなスクリーニング方法で選定されたＳｈｈのアゴニストやＳｈｈ発現を直接促進する物質は発癌性を示す可能性がある。
【０００６】
また、特表2001-520202号公報には、上皮細胞の増殖速度を変化させるため、ヘッジホッグ治療薬を上皮細胞に異所的に接触させる方法が記載されている。しかしながら、この文献にはShhのアゴニストをスクリーニングする方法については何ら記載されていない。
【０００７】
【特許文献１】特表２００１−５２０２０２号公報
【非特許文献１】Journal of Investigative Dermatology (2005) 125, 638-646
【非特許文献２】Exp Dermatol. 2006 Sep;15(9):667-77
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ヒト・ソニック・ヘッジホッグ遺伝子（Ｓｈｈ）を指標として発毛又は育毛薬剤を評価するためには、Ｓｈｈが発毛又は育毛促進作用を有する物質に対して特異的かつ検出可能なレベルで発現しなければならない。しかしながら、Ｓｈｈは一般的な平面培養系ではほとんど発現しないため、Ｓｈｈを有意に発現することが可能な培養系を確立しなければならない。さらに、発現したＳｈｈを効率良く増幅することが可能なＰＣＲ用プライマーを構築する必要がある。また、さらには、ＰＴＣＨに対する作用を介して選定されたＳｈｈのアゴニストやＳｈｈ発現を直接促進する物質は発ガン性を示す可能性があるため、これらの物質の選別を回避することが極めて重要な問題となる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願は以下の発明を包含する。
（１）  配列番号１に示される配列中の少なくとも１５個の連続した塩基配列を含んで成るオリゴヌクレオチド。
（２）  配列番号１に示される塩基配列を含んで成る、（１）に記載のオリゴヌクレオチド。
（３）  配列番号２に示される配列中の少なくとも１５個の連続した塩基配列を含んで成るオリゴヌクレオチド。
（４）  配列番号２に示される塩基配列を含んで成る、（３）に記載のオリゴヌクレオチド。
（５）  ヒト・ソニック・ヘッジホッグ遺伝子の発現の亢進を指標とする被験物質の発毛又は育毛促進活性を評価するための方法であって、ヒト毛乳頭細胞とヒト外毛根鞘細胞の混合培養液から製造した細胞塊に被験物質を適用させる工程、（１）又は（２）に記載のオリゴヌクレオチドを順方向プライマーとして使用し、かつ（３）又は（４）に記載のオリゴヌクレオチドを逆方向プライマーとして使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により該遺伝子を増幅させる工程、そして該増幅させた発現遺伝子をモニタリングする工程を含んで成り、ここで該モニタリングが、該被験物質を該細胞塊に適用させてから少なくとも２４時間経過後に行われることを特徴とする方法。
（６）  前記モニタリングが、被験物質を細胞塊に適用させてから少なくとも３日目以降に行われることを特徴とする、（５）に記載の方法。
（７）  前記細胞塊がハンギングドロップ法により製造されることを特徴とする（５）又は（６）に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、ヒト毛乳頭細胞と外毛根鞘細胞から成る細胞塊を用いること、ヒトＳｈｈ発現を効率良く検出できるＰＣＲプライマーを見出したことにより、平面培養系でほとんど検出されないＳｈｈを指標とする発毛薬剤の評価が可能となる。さらに、ＳｈｈのアゴニストやＳｈｈ発現を直接促進する物質は発癌性を示す可能性が考えられることから、本方法では、被験物質の添加から２４時間まではヒトＳｈｈ発現を変化させず、２４時間経過後に初めてヒトＳｈｈ発現を亢進させる作用をモニタリングすることにより発癌性物質を選択するおそれを回避し、被験物質の発毛又は育毛促進活性を安全に評価することが可能となる。
【００１１】
「ソニック・ヘッジホッグ」は脊椎動物において発見された３つのホモログの１つである。該ホモログファミリーは、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）、デザート・ヘッジホッグ（ＤＨＨ）、及びインディアン・ヘッジホッグ（ＩＨＨ）から構成される。ソニック・ヘッジホッグはこれらの中で最も一般的なホモログであり、この発現遺伝子は生体において多くの重要な機能を有し、ソニック・ヘッジホッグのアゴニストが発毛を誘導することが知られているが、そのメカニズムについては不明である。
【００１２】
本発明における特徴の１つは、被験物質の発毛又は育毛促進活性を評価する方法において、ヒトＳｈｈを有意に発現することができる細胞塊を用いることである。該細胞塊は、毛包の原子的な器官様をなし得、ヒト毛乳頭細胞とヒト外毛根鞘細胞の混合培養液から、例えばハンギングドロップ方法などにより人工的に製造することが可能である。
【００１３】
「外毛根鞘細胞」とは、外毛根鞘は毛幹を包む毛包細胞の上皮系細胞の一つであり、毛幹と内毛根鞘を支える役割を担っている。該細胞の調製は、採取した頭皮から毛包組織を得て、該毛包組織を、加水分解酵素溶液で処理した後に、コラーゲンコーティングした培養皿に静置させ、低カルシウム無血清培地中で培養することにより調製することができる。
【００１４】
「毛乳頭細胞」とは、間葉系細胞として毛包最底部に位置し、毛包の自己再生のために毛包上皮幹細胞に活性化シグナルを送る、いわば司令塔の役割を担っている細胞をいう。該細胞は、頭皮から実体顕微鏡下で毛乳頭を得て、該毛乳頭を、常用の動物細胞培養培地で培養することにより調製することができる。
【００１５】
本発明に係る毛包構成細胞、すなわち外毛根鞘細胞及び毛乳頭細胞の培養に有効な培養液は特に限定されるものではなく、細胞培養において慣用されているものが使用できる。例えば、毛乳頭細胞については、好ましくはＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、Ｃｈａｎｇメディウム等の血清含有型培地が使用可能である。この場合、血清濃度は０〜３０％、好ましくは１０％とし、必要不可欠な因子として、ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）及びＥＧＦ（上皮増殖因子）、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加する。
【００１６】
外毛根鞘細胞の場合、Ｅｐｉｌｉｆｅ（登録商標）、ＨｕＭｅｄｉａ（登録商標）（共にクラボウ社）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）など、無血清型のケラチノサイトに対し最適化された培地が好ましい。ケラチノサイトは場合によってはＧｒｅｅｎ法（Cell 1975 NOV;6(3):331-43, Serial cultivation of strain of human epidermal keratinocytes:the formation of keratinizing colonies from single cells. Rheinwalf J.G., Green H.）にて調製することが出来るが、この場合はその培養に上記間葉系で使用した血清含有型培地を使用できる。なお、外毛根鞘細胞及び毛乳頭細胞の培養に共通して使える抗生物質としてはペニシリンＧ、カナマイシン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢが挙げられる。
【００１７】
ハンギングドロップ方法とは、非平面接触性培養方法の１つであり、Keller G. M. et al., Curr. Opin. Cell Biol., 7, 862-869 (1995)に記載されるとおり、培養細胞を含む培養液の液滴（一般に２５〜３５μＬ程度）を培養皿の蓋の天井側に点着し、培養液が落下又は流れ落ちないように注意深く蓋を閉じ、表面張力により培養液内の細胞を逆さの液滴の状態で培養する方法である。このように培養することで、細胞は平面培養など場合における平面との接触により受ける影響を最小限にすることができる。非平面接触性培養方法のその他の例としては、あらかじめ細胞接着ができないよう表面加工された半球状の細胞培養皿（例えば住友ベークライトから販売されている「スフェロイド」）を利用した形成方法（スフェロイド形成方法）、ニトロセルロース培地内での培養により浮遊状態で細胞凝集させる浮遊方法などがある。
【００１８】
ハンギングドロップ培養のための温度・時間は取り扱う細胞の種類や継代回数に依存して変わりうるが、例えば３７℃で１〜１０日間、好ましくは３〜７日間行い、必要であれば適宜培地を同様のもので交換する。
【００１９】
上述のとおり、ヒト毛乳頭細胞とヒト外毛根鞘細胞の混合培養液を使用したハンギングドロップ方法により、実際の人の毛包構成に類似し、そしてヒトＳｈｈを有意なレベルで発現することができる細胞塊を効率良く人工的に作成することが可能となる。
【００２０】
このようにして得られた細胞塊に被験物質を加えることによりヒトＳｈｈを細胞塊内で発現させることが可能となる。しかしながら、発毛剤又は育毛剤の評価方法において、ヒトＳｈｈの発現を指標とする場合には、発癌性を示すヒトＳｈｈのアゴニストやＳｈｈ発現を直接的に促進する物質までも選別してしまうおそれがある。
【００２１】
そこで、毛周期における発毛機構に目を向けると、毛包は皮膚の付属器官の一つで一定の周期をもって常に生え変わり、自己再生を繰り返す能力をもつ器官として特徴付けられ、毛包は皮膚外部に露出したいわゆる毛髪と、皮膚真皮に埋没した毛幹を生み出す元になる毛根鞘や毛母細胞、毛乳頭細胞などから形成されている。発生学的には皮膚−真皮の相互作用により毛包原基が形成され、下部方向に皮膚が伸長することで毛包は形成される（成長期）。発生の最終段階として毛幹の伸長は一定期間継続するが、やがて停止し、アポトーシスによって毛根鞘、毛母細胞の部分が退縮に向かう（退行期）。この一連の過程で、真皮奥深くまで伸長していた毛包は皮膚近くまで短くなり、毛乳頭のサイズも小さくなる。やがて休止期を経て、再び毛母細胞は活性化され新しい周期の成長期へと向かう。この周期がほぼ一生を通じて繰り返される（毛周期）。このような毛周期の発毛機構などには多数の因子が複雑に関与、機能しているものと考えられる。
【００２２】
かかる知見に基づき、シクロスポリンＡが、副作用として多毛症(Lutz et al, Skin Pharmacol 7, 101, 1994)が知られている薬剤であり、発毛作用(Paus et al, Lab Invest 60, 365, 1989)や毛成長促進作用(Taylor et al, J Invest Dermatol 100, 237, 1993)を示すことから、該薬剤をポジティブコントロールとしてハンギングドロップ法培養で作製した細胞塊に適用し、Ｓｈｈの発現変化を調べたところ、Ｓｈｈの発現がシクロスポリンＡの添加後２４時間までは変化がなく、その後はじめてその発現が亢進されることが判明した。発癌機構によりヒトＳｈｈの発現が亢進される場合、発癌性を有する物質はヒトＳｈｈに直接的に働きかけるため、数時間でヒトＳｈｈの発現が亢進されるものと考えられるが、発毛又は育毛活性作用でヒトＳｈｈの発現が亢進される場合には複雑な相互作用を介して間接的に発毛又は育毛を促進することにより、ヒトＳｈｈ発現の亢進にタイムラグが生じるものと考えられる。従って、本発明において、薬剤の発毛効果の有無を確認する上で、候補薬剤の添加から２４時間経過後、好ましくは少なくとも３日目以降のヒトＳｈｈの発現の亢進を指標とすることにより、安全かつ正確に発毛剤又は育毛剤を評価することが可能となる。
【００２３】
したがって、本発明においては、候補薬剤の添加から２４時間経過後、好ましくは少なくとも３日目以降に発現したヒトＳｈｈを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）解析に供し、ヒトＳｈｈの発現を定量的に分析することを特徴とする。
【００２４】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＲＮＡを逆転写することによってＤＮＡとし、これをＰＣＲ法によって高度に増幅することにより、極めて微量なＲＮＡを検出・定量する方法である。これにより、細胞塊中の微量なヒトＳｈｈ遺伝子発現を解析することができる。具体的には、まず、候補薬剤をハンギングドロップ培養した細胞塊に添加してから、少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも３日間経過後、該細胞塊試料からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び好適なプライマーを用いてｃＤＮＡを逆転写する。該方法において、ヒトＳｈｈに対する特異性はプライマーの配列により決定するため、最適なプラマーを選択しなければならない。これに関連して、ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター）のデータベースにおいては、ヒトＳｈｈのＰＣＲプライマーがいくつか公開されているが、これらのＰＣＲプライマーは、定量ＰＣＲに試用したところ不適当であることが確認された。しかしながら、このたび、本発明に従う方法においてヒトＳｈｈに最適なＰＣＲ用プライマーペアを構築することに成功した。該プライマーペアは、順方向プライマーとして、ＡＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＴＴＡＧＣＣＴＡＣ（配列番号１）中の少なくとも１５個の連続した塩基配列を含んで成るオリゴヌクレオチド、好ましくは配列番号１の塩基配列を含んで成るオリゴヌクレオチド、及び逆方向プライマーとして、ＴＣＴＧＡＧＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣ（配列番号２）中の少なくとも１５個の連続した塩基配列を含んで成るオリゴヌクレオチド、好ましくは配列番号２中の塩基配列を含んで成るオリゴヌクレオチド、である。
【００２５】
ｃＤＮＡを逆転写した後、通常のＰＣＲの反応手順と同様に、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを変性させて一本鎖にほどき、そしてまた上記ＰＣＲ用プライマーと対合させて、ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ鎖の伸長を行う。かかる段階を繰り返すことにより、ヒトＳｈｈが増幅される。ＰＣＲ条件は、例えば、変性条件として９５℃で５秒から３０秒；アニーリング条件として５０℃〜６５℃で５秒から３０秒；伸長条件として７２℃で５秒から３０秒を３５サイクルから４５サイクルとして行うことができる。好ましいＰＣＲ条件は、変性条件として９５℃で１０秒間；アニーリング条件として５８℃で１０秒間；伸長条件として７２℃で１５秒間を４０サイクルとして行う。
【００２６】
増幅したヒトＳｈｈは、当業界において慣習的な方法により検出・定量することができる。これらの方法には、例えば、アガロースゲル電気泳動法、ＳＹＢＲグリーン法、蛍光プローブ法等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
候補薬物によるヒトＳｈｈの発現の亢進を、コントロール、例えば、溶媒又はあらかじめヒトＳｈｈ遺伝子の発現量がわかっている標準物質と比較することにより、候補薬物の発毛又は育毛効果について評価することができる。
【００２８】
本発明の方法により発毛又は育毛活性を有する物質として選定されるには、例えば、被験物質の作用によるヒトＳｈｈ遺伝子の発現が、コントロール、すなわち、発現を作用させていない物質に比べ、有意に亢進しているか否かで判断される。例えば、ヒトＳｈｈの発現が、コントロールに比べ、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％、更に好ましくは５０％、最も好ましくは１００％以上亢進している場合、発毛又は育毛促進物質として選定される。
【００２９】
このように、本発明は、被験物質の発毛又は育毛促進活性を極めて正確かつ安全に評価する方法を提供することができ、発毛又は育毛剤の開発に著しく貢献するものである。
【実施例】
【００３０】
毛包細胞の調製
ヒト外毛根鞘細胞
ヒト外毛根鞘細胞は、ヒトの頭皮を美容整形外科手術又は外科手術の副産物として得て、これをこの頭皮から実体顕微鏡下で毛包組織を得た。次にこの毛包組織をコラゲナーゼ溶液で３７℃で３０分間処理した後に、さらにトリプシン溶液で３７℃で５分間処理してから、コラーゲンコーティングした培養皿に静置させ、Ｋ−ＧＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）又はＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）中で培養し、２日間ごとに培地を交換した。細胞が増殖したことを確認した後、培養器に付着している細胞を遊離させ遠心分離により細胞を回収し、無血清培地により継代培養を行った。
【００３１】
ヒト毛乳頭細胞
ヒト毛乳頭細胞も外毛根鞘細胞と同様、美容整形外科手術又は外科手術の副産物としてヒト頭皮から実体顕微鏡下で毛乳頭を得た。次に該毛乳頭を、ウシ胎児血清を含むダルベコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium; D-MEM ）中で培養し、この間２日間ごとに培地を交換した。細胞が増殖したことを確認した後、培養器に付着している細胞を遊離させ遠心分離により細胞を回収し、無血清培地により継代培養を行った。
【００３２】
ヒト正常ヒト表皮メラニン細胞（メラノサイト）はクラボウ社より購入して、通常の継代培養を行った。
【００３３】
毛乳頭細胞と外毛根鞘細胞からの細胞塊の調製（ハンギングドロップ法）
培地構成
Ａｄｖａｎｃｅｄ−ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン・ストレプトマイシン混合液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（１００倍希釈）、及び３．５μｌ／５００ｍｌβ−メルカプトエタノールを加えた培地に、ＨｕｍｅｄｉａＫＧ−２（クラボウ社）を１：１にて混合した培地を用いた。
【００３４】
調製方法
培養した毛乳頭細胞と外毛根鞘細胞をトリプシン処理後に、各細胞が２×１０3個／μｌになるよう上記の混合培地に懸濁した。この細胞懸濁液を、１０ｃｍ角の四角い培養皿の天井側（フタ）に３０μｌずつ分注して、適当な大きさのドーム上の水滴を形成させた。注意深くフタを閉じ、培養液が落下しないようにして、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気にて培養した。毛乳頭細胞及び外毛根鞘細胞は、Ｐ３（継代数１をＰ1と表記）以内の細胞を使用した。
【００３５】
細胞塊に発毛薬剤シクロスポリンＡを添加した場合のＳｈｈ発現の変化
免疫抑制剤であるシクロスポリンＡは、副作用として多毛症(Lutz et al, Skin Pharmacol 7, 101, 1994)が知られている薬剤であり、発毛作用(Paus et al, Lab Invest 60, 365, 1989)や毛成長促進作用(Taylor et al, J Invest Dermatol 100, 237, 1993)を示すことが明らかになっている。そこで、ハンギングドロップ法培養で作製した細胞塊に、シクロスポリンＡを加えた際のＳｈｈの発現変化を調べた。ハンギングドロップ法培養開始の３日後に、シクロスポリンＡあるいは溶媒コントロールのエタノールを含む上記培地にて培地交換を行った。シクロスポリンＡ（Novartis社）は、エタノールにて１０ｍＭ溶解して、５μＭとなるように添加した。シクロスポリンＡの添加から経時的に細胞塊サンプルを回収し、下記のＲＴ−ＰＣＲ解析に供した。
【００３６】
ＲＴ−ＰＣＲ解析
平面培養した細胞及びハンギングドロップ法培養した細胞塊サンプルから、ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＲＮＡを抽出した。各ＲＮＡ５００ｎｇ相当をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０μｌの反応系にてｃＤＮＡへ逆転写した。得られたサンプル１μｌを表１に示したプライマーペアを用い、２０μｌの系で定量ＰＣＲ（LightCycler system、Roche）にかけた。LightCycler  FastStart DNA Master SYBR Green Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）の反応プロトコール［９５℃、１０秒；５８℃、１０秒；７２℃、１５秒を４０サイクル］を用いた。
【００３７】
結果
ハンギングドロップ法培養を３日間行って形成させた細胞塊のｃＤＮＡを鋳型に用いた場合に、表１に示した１０種類のプライマーペアのうち、ＳＨＨ−Ｆ１０とＳＨＨ−Ｒ１０のプライマーペアのみで目的のＳｈｈの遺伝子断片が増幅され、定量が可能であった（表１）。
【表１】
2009213442.tif 000002
【００３８】
ＳＨＨ−Ｆ１０とＳＨＨ−Ｒ１０のプライマーペアを用いてＳｈｈの発現量を測定した結果を図１に示す。まず、単層で培養した外毛根鞘細胞において、わずかにＳｈｈの発現は検出されるが、ハンギングドロップ法培養を３日間行って形成させた細胞塊において、Ｓｈｈの発現は約６０倍まで亢進した。一方、毛乳頭細胞とメラノサイトにおいて、Ｓｈｈの発現は確認されなかった（図１）。
【００３９】
次に図２に示すとおり、細胞塊にシクロスポリンＡを添加した場合、シクロスポリンＡ添加から３日後において、Ｓｈｈの発現が約１．５倍まで有意に亢進した。一方、血管拡張作用が主な発毛の機序と考えられるミノキシジルを３０μＭの濃度で添加した場合には、Ｓｈｈの有意な発現亢進は確認されなかった。
【００４０】
Ｓｈｈは発毛への関与が知られているが、Ｗｎｔなどの下流に位置して二次的に働く因子であることを考えると、薬剤のＳｈｈ発現に対する効果は間接的であるべきであると考えられる。図３に示すとおり、Ｓｈｈの発現はシクロスポリンＡの添加後２４時間までは変化がなく、３日目以降においてはじめて、その発現が亢進されて来ることが分かった。このように、薬剤の発毛効果の有無を確認する上で、薬剤の添加から３日目以降にＳｈｈの発現が亢進されるかを評価することが肝要と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】培養細胞におけるＳｈｈ遺伝子の発現を示すグラフである。
【図２】シクロスポリンＡによるＳｈｈ遺伝子発現の亢進を示すグラフである（溶媒によるＳｈｈ遺伝子発現を１００％とした場合のミノキシジルとシクロスポリンＡによるＳｈｈ発現量を比較する）。
【図３】シクロスポリンＡによるＳｈｈ遺伝子発現の経時的変化を示すグラフである。
【図１】
2009213442.tif 000003
【図２】
2009213442.tif 000004
【図３】
2009213442.tif 000005
【配列表】
2009213442000001.app