(57)【要約】【課題】構造化照明を有する顕微鏡装置において、正確な位相変化量を計算する方法を提供する。【解決手段】撮像手段の実視野範囲内において一様に反射光を生じる標準標本が、標本１３の位置において、光学系中に挿脱可能に配置されている（図示せず）。標準標本上に形成された構造化照明の強度分布を結像系を通して撮像手段で撮像する。その画像をフーリエ変換して、周波数と位相変化量を求める。この作業を構造化照明の位相を変化させるたびに行い、回折格子３のステップ移動量に対する、画像の位相変化量を求める。【選択図】  図１
2009098215.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可干渉光源と、標本共役位置近傍に配置され、前記可干渉光源からの光束を複数の光束に分割する光束分割手段と、瞳共役面近傍に配置され、前記複数の光束を位相変調させる位相変調手段とを有し、前記複数の光束を、標本面近傍で干渉させることにより干渉縞構造に空間変調した照明光を照射する照明光学系と、
前記標本で反射された光又は前記標本から発生する蛍光を結像させる結像光学系と、
前記結像光学系により結像された像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段により前記空間変調の位相を変調する度に撮像された画像を演算処理することにより標本像を生成する画像処理手段とを有する顕微鏡装置であって、
前記標本の位置に、前記撮像手段の実視野範囲内において一様に反射光を生じる、または一様に蛍光を発する標準標本が、標本載置台に配置され、
かつ、前記照明光学系による前記空間変調した照明光を、前記標準標本に照射したときの、前記標準標本からの反射光または蛍光を前記撮像手段によって、前記位相変調手段による位相変調を行うごとに撮像し、それぞれの画像から、それぞれの画像に対応する位相変化量を求める位相変化量算出手段を有することを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
可干渉光源と、標本共役位置近傍に配置され、前記可干渉光源からの光束を複数の光束に分割する光束分割手段と、瞳共役面近傍に配置され、前記複数の光束を位相変調させる位相変調手段とを有し、前記複数の光束を、標本面近傍で干渉させることにより干渉縞構造に空間変調した照明光を照射する照明光学系と、
前記標本で反射された光又は前記標本から発生する蛍光を結像させる結像光学系と、
前記結像光学系により結像された像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段により前記空間変調の位相を変調する度に撮像された画像を演算処理することにより標本像を生成する画像処理手段とを有する顕微鏡装置において、位相変化量を算出する方法であって、
前記標本の位置に、前記撮像手段の実視野範囲内において一様に反射光を生じる、または一様に蛍光を発する標準標本を配置し、
かつ、前記照明光学系による前記空間変調した照明光を、前記標準標本に照射したときの、前記標準標本からの反射光または蛍光を前記撮像手段によって、前記位相変調手段による位相変調を行うごとに撮像し、それぞれの画像から、それぞれの画像に対応する位相変化量を求めることを特徴とする顕微鏡装置における位相変化量の算出方法。
【請求項３】
前記位相変化量を求める方法が、撮像された画像を空間フーリエ変換し、得られる３つの点画像の２次元フーリエ空間上での座標を（−Ｋｘ，−Ｋｙ）、（０，０）、（Ｋｘ，Ｋｙ）とし、（−Ｋｘ，−Ｋｙ）点、又は（Ｋｘ，Ｋｙ）点でのフーリエ変換値をＡexp（ｉφ）とするとき（ただし、Ａは定数、ｉは複素共役記号）とするとき、φの値を位相変化量とすることを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡装置における位相変化量の算出方法。
【請求項４】
前記位相変化量を求める方法が、波数ベクトルの（Ｋｘ，Ｋｙ）と位相変化量φを未知数として使用して、作成した式
1+cos(KxX+KyY+φ)と撮像された画像との輝度の相互相関係数を求め、この相互相関係数が最大となるときのφの値を位相変化量とすることを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡装置における位相変化量の算出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造化照明を有する顕微鏡装置、及びこの顕微鏡装置における位相変化量の算出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
試料の微小構造の観察や計測の分野において、より高い空間分解能での観測が求められている。しかし、一般的な顕微鏡装置においては、対物レンズの開口数をＮＡ、使用する光の波長をλとすると、観察される物体のカットオフ周波数は、２ＮＡ／λ以上にはならないことが知られており、限界がある。
【０００３】
ところが、観察物体と結像光学系の間に空間周波数を変調する手段を挿入することにより、結像光学系では伝達できない空間周波数領域の観察物体の空間周波数成分を結像に反映させることができる。ただし、その場合、結像光学系により結像された観察物体の像は変調を受けているので、その変調の回復（復調）手段を合わせて用いることにより、正しい観察物体像が形成できる。これを光学顕微鏡に適用した場合、従来のカットオフ周波数より高い空間周波数を持つ観察物体の微細構造を解像できるようになる。これを超解像と呼ぶ。
【０００４】
このような手法は、特開平１１−２４２１８９号公報（特許文献１）、ＵＳ  Re３８３０７（特許文献２）に詳しく説明されている。
【０００５】
特開平１１−２４２１８９公報に開示されている第６の実施形態は、蛍光観察装置に適用した例であり、その光学系は、可干渉光源から発した照明光を回折格子等の光束分割手段によって分割された後、照明光束を対物レンズの瞳位置に集光させ、対物レンズから角度の異なる平行光束として射出させ、観察物体近傍で重なり合い干渉縞を形成する。
【０００６】
縞状に変調された照明光により、本来結像光学系のみでは伝達できなかった観察物体の形状情報の空間周波数成分を含む回折光を結像に関与させることができる。そして分割した照明光束の位相を相対的に変調して、干渉縞を観察物体上で移動させて複数の画像を取得し、画像演算処理による像形成を可能にしている。具体的には、回折格子を光軸と垂直に移動させることによって、あるいは別の例では、照明光の一方の光路に楔形プリズムを挿入し、それを光軸と垂直な方向に移動することによって位相変調を行っている。
【０００７】
ＵＳ  Re３８３０７公報に開示されている方法は、可干渉光源からの照明光を光ファイバーを用いて導入後、回折格子等の光束分割手段によって分割し、その後照明光束を対物レンズの瞳位置に集光させ、観察物体近傍で干渉縞を形成する。縞状に変調された照明光により、本来結像光学系のみでは伝達できなかった観察物体の形状情報の高周波成分を結像に関与させることができる。そして同様に複数の画像を取得し、画像演算処理による像形成をおこなっている。この方法では、１枚の画像を形成するために、照明光束に位相変調を与えた複数の画像を取得するだけでなく、照明光の干渉縞の向きも変えて画像取得している。その理由は、高周波成分が結像に関与できるのは、照明光の干渉縞の方向と同じ方向を持った構造のみであるため、２次元に広がる標本の形状を再現するには、干渉縞の方向を変換して複数の画像を取得して合成する必要があるからである。
【特許文献１】特開平１１−２４２１８９号公報
【特許文献２】ＵＳ  Re３８３０７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これら、特許文献１、特許文献２に記載のいずれの方法においても、位相変調量の評価方法について一切開示されていないが、空間変調の位相φは、それを操作する光学素子の構造と位置によって、一義的に決まるとして、計算を行っている。
【０００９】
従来の方法には、位相変調量の評価方法について一切開示されていないが、実際には、回折格子の駆動に用いるピエゾアクチュエータの誤差や、照明光束が分割された状態で通過する範囲に配置されている光学部材の厚み誤差や蒸着ムラ等により相互に位相差が生じることがあり、位相変調量が意図した通りの値になっているとは限らない。
【００１０】
例えば瞳面近傍に配置する位相板を用いて一方の光束だけ位相を遅らせる働きをさせる場合、位相板の厚みや屈折率誤差によって、実際に光束に与えられる位相差は変化するが、位相板の物理的な厚みや屈折率を測定するには精度に限界がある。
【００１１】
また、変調する位相差は、均等であることが望ましい。それは、励起光の平均が一様でないと、標本が縞状に退色するからである。縞状に退色すると、同じところを再度観察したときに、縞状に構造があるように見えてしまい、画像演算をするとアーティファクトになってしまうからである。したがって、実際に標本上での位相の変化量を定量的に評価することが必要となる。
【００１２】
位相変化量が意図したとおりのものとなっていないと、画像を復調するときの計算に誤差が生じ、正確な標本画像が得られないという問題がある。
【００１３】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、構造化照明を有する顕微鏡装置において、正確な位相変化量を計算する方法、及びこれを用いて正確な標本画像を得ることができる顕微鏡装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題を解決するための第１の手段は、
可干渉光源と、標本共役位置近傍に配置され、前記可干渉光源からの光束を複数の光束に分割する光束分割手段と、瞳共役面近傍に配置され、前記複数の光束を位相変調させる位相変調手段とを有し、前記複数の光束を、標本面近傍で干渉させることにより干渉縞構造に空間変調した照明光を照射する照明光学系と、
前記標本で反射された光又は前記標本から発生する蛍光を結像させる結像光学系と、
前記結像光学系により結像された像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段により前記空間変調の位相を変調する度に撮像された画像を演算処理することにより標本像を生成する画像処理手段とを有する顕微鏡装置であって、
前記標本の位置に、前記撮像手段の実視野範囲内において一様に反射光を生じる、または一様に蛍光を発する標準標本が、標本載置台に配置され、
かつ、前記照明光学系による前記空間変調した照明光を、前記標準標本に照射したときの、前記標準標本からの反射光または蛍光を前記撮像手段によって、前記位相変調手段による位相変調を行うごとに撮像し、それぞれの画像から、それぞれの画像に対応する位相変化量を求める位相変化量算出手段を有することを特徴とする顕微鏡装置である。
【００１５】
前記課題を解決するための第２の手段は、
可干渉光源と、標本共役位置近傍に配置され、前記可干渉光源からの光束を複数の光束に分割する光束分割手段と、瞳共役面近傍に配置され、前記複数の光束を位相変調させる位相変調手段とを有し、前記複数の光束を、標本面近傍で干渉させることにより干渉縞構造に空間変調した照明光を照射する照明光学系と、
前記標本で反射された光又は前記標本から発生する蛍光を結像させる結像光学系と、
前記結像光学系により結像された像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段により前記空間変調の位相を変調する度に撮像された画像を演算処理することにより標本像を生成する画像処理手段とを有する顕微鏡装置において、位相変化量を算出する方法であって、
前記標本の位置に、前記撮像手段の実視野範囲内において一様に反射光を生じる、または一様に蛍光を発する標準標本を配置し、
かつ、前記照明光学系による前記空間変調した照明光を、前記標準標本に照射したときの、前記標準標本からの反射光または蛍光を前記撮像手段によって、前記位相変調手段による位相変調を行うごとに撮像し、それぞれの画像から、それぞれの画像に対応する位相変化量を求めることを特徴とする顕微鏡装置における位相変化量の算出方法である。
【００１６】
前記課題を解決するための第３の手段は、前記第２の手段であって、
前記位相変化量を求める方法が、撮像された画像を空間フーリエ変換し、得られる３つの点画像の２次元フーリエ空間上での座標を（−Ｋｘ，−Ｋｙ）、（０，０）、（Ｋｘ，Ｋｙ）とし、（−Ｋｘ，−Ｋｙ）点、又は（Ｋｘ，Ｋｙ）点でのフーリエ変換値をＡexp（ｉφ）とするとき（ただし、Ａは定数、ｉは複素共役記号）とするとき、φの値を位相変化量とすることを特徴とするものである。
【００１７】
前記課題を解決するための第４の手段は、前記第２の手段であって、
前記位相変化量を求める方法が、波数ベクトルの（Ｋｘ，Ｋｙ）と位相変化量φを未知数として使用して、作成した式
1+cos(KxX+KyY+φ)と撮像された画像との輝度の相互相関係数を求め、この相互相関係数が最大となるときのφの値を位相変化量とすることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、構造化照明を有する顕微鏡装置において、正確な位相変化量を計算する方法、及びこれを用いて正確な標本画像を得ることができる顕微鏡装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態の例を、図を用いて説明する。図１は本発明の実施形態である顕微鏡装置の概略図である。図示しない光源からの光は光ファイバー１にて導かれ、コレクタレンズ２によって平行光に変換される。回折格子３によって回折光を生じさせ、偏光板３１を通過させた後、レンズ４により瞳共役面を形成する。回折格子３は図の紙面の垂直方向に１次元の周期構造をもっており、濃度（透過率）で構造をつけても、段差（位相差）で構造を持たせても良いが、位相型の方が±１次光の回折効率が高いので好ましい。
【００２０】
５は、瞳共役面近傍に配置された位相板である。光束の一方あるいは両方に適当な位相の遅れが生じるような透明基板の厚みとなっているか、または膜厚を制御した薄膜を蒸着してある。
【００２１】
６は回折格子によって生じた回折光のうち不要な次数をカットする遮光板である。±１次回折光を利用して光束干渉する場合は、０次と２次以上の高次回折光をカットする働きを持つ。レンズ７によって視野絞りを形成し、フィールドレンズ９により、平行光に変換されて、励起フィルタ１０、ダイクロイックミラー１１を経て、対物レンズ１２の瞳面Ｐ上に各次数ごとに集光する。各光束が対物レンズ１２から射出する際には、平行光束となって標本１３面を照射する。このとき各光束は可干渉であるため等間隔の干渉縞の構造をもって標本１３面を照射するのである。この、縞構造を持った照明光を構造化照明と呼ぶ。
【００２２】
この構造化照明光で標本を照明すると、照明光の周期構造と標本の周期構造が干渉してモアレ干渉縞を生成するが、そのモアレ干渉縞は標本の高周波の形状情報を含んでいながらもとの周波数より低周波であるため対物レンズ１２に入射することができる。そして結像した画像を取得し、既知の照明光の周期構造を演算、復元処理することにより、未知である標本１３の形状を求め可視化する技術が構造化照明超解像顕微鏡の原理である。
【００２３】
標本１３からの光は、対物レンズ１２を通って平行光に変換されたのち、ダイクロイックミラー１１を透過して、バリアフィルタ１４を介し、第２対物レンズ１５によってＣＣＤカメラなどの撮像手段２１の撮像面１６上に標本像を形成する。
【００２４】
ただしこの取得画像は、先にも述べたように変調された照明光で照明された結果の画像であるから、画像記憶・演算装置２２によって公知の画像演算手段により画像処理され逆の変調をかけて復元することで標本像を得て、画像表示装置２３に標本の超解像画像を表示することができる。
【００２５】
画像処理で元画像を復元する際には、同じ標本に対して、照明の干渉縞の位相を３回以上変調させて撮影するとよい。それは、変調画像には標本の周波数成分が構造化照明によって回折された情報のうち０次成分、＋１次成分、−１次成分の３つの未知のパラメータがあるからで、演算処理で未知数を求めるためには、未知数の数以上の情報が必要になるからである。本実施の形態の場合は、位相板５を回転することにより、位相変調を行う。
【００２６】
なお、以上の測定原理については、特許文献１に詳しく説明されており、公知のものとなっているので、重複した説明を避け、特許文献１の記載を援用する。
【００２７】
本実施の形態においては、撮像手段の実視野範囲内において一様に反射光を生じる標準標本が、標本１３の位置において、光学系中に挿脱可能に配置されている（図示せず）。すなわち、標本１３を光学系から抜き出し、代わりに標準標本を光学系に挿入する。本実施の形態においては、この標準標本を使用して位相常数の算出を行う。なお、標準標本が一様な反射物体である場合には、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、バリアフィルタのセットの代わりに、ハーフミラーを用い、標準標本上に形成された構造化照明の強度分布を結像系を通して撮像手段で撮像する。この作業を構造化照明の位相を変化させるたびに行い、位相板５の段差あるいは屈折率差に対する、画像の位相変化量を求める。
【００２８】
撮像される像は縞模様となっており、その明るさＩは、２次元平面（ｘ，ｙ）上で、以下の式で表される。
【００２９】
Ｉ＝Ａcos(Ｋｘ・ｘ＋Ｋｙ・ｙ＋φ)＋Ｂ    …（１）
ここで、Ａ、Ｋｘ、Ｋｙ、φ、Ｂは定数であり、φが位相変化量である。
【００３０】
特許文献１においては、（１）式を簡略化して書いてあるが、その第００２５段落における
cos（２πｆ０ｘ＋φ）    …（２）
という変調成分を（１）式は含んでおり、（１）式を使用することで、特許文献１に記載の手法を順次行えば、超解像による観察という目的を達成することができる。
【００３１】
ここで、従来は実測されていなかった位相常数φを求め、これを用いて、特許文献１に記載の方法により超解像による観察を行うのが本発明の目的である。
【００３２】
φを求める方法について以下に説明する。
【００３３】
標準標本からの光の像は、（１）式で表されるような強さを有し、縞模様として観察される。これを空間フーリエ変換すると、３つの点が、２次元フーリエ空間上で観察される。これらの２次元フーリエ空間上での座標を（−Ｋｘ，−Ｋｙ）、（０，０）、（Ｋｘ，Ｋｙ）とし、（−Ｋｘ，−Ｋｙ）点、又は（Ｋｘ，Ｋｙ）点でのフーリエ変換値をＡexp（ｉφ）（ただし、Ａは定数、ｉは複素共役記号）とするとき、φの値が位相変化量となる。
【００３４】
φを求める別の方法について以下に説明する。前提条件として、構造化照明の波数ベクトルの概略値はわかっているとする。その上で以下の手順で計算を行う。
【００３５】
（１）撮像された画像を、Ｉｍ（Ｘ，Ｙ）とする。
（２）波数ベクトルの概略値（Ｋｘ，Ｋｙ）と位相φの仮定値を使って、
【数１】
2009098215.tif 000003
の強度分布を持ったＩｍ（Ｘ，Ｙ）と同じ大きさの画像を作る。ただし、Ｄは適当な定数であり、Ｄ＝１でもよい。
【００３６】
（３）上記の画像Ｉｍ（Ｘ，Ｙ）と、Ｉ０（Ｘ，Ｙ，Ｋｘ，Ｋｙ，φ）との相互相関係数Ｃ（Ｋｘ，Ｋｙ，φ）を計算する。すなわち、
【数２】
2009098215.tif 000004
ただし、Ｎｘ、Ｎｙはそれぞれ、画像の縦横のピクセル数を示し、その積は全ピクセル数を表す。又、
【数３】
2009098215.tif 000005
は、それぞれ各画像のピクセル値の平均を表し、
【数４】
2009098215.tif 000006
は各画像のピクセル値の標準偏差を表す。
【００３７】
（４）相互相関係数Ｃ（Ｋｘ，Ｋｙ，φ）が最大となるときの（Ｋｘ，Ｋｙ），φが構造化照明の波数ベクトルと位相なので、（Ｋｘ，Ｋｙ），φを変化させながら相互相関係数Ｃ（Ｋｘ，Ｋｙ，φ）を計算し、構造化照明の波数ベクトルと位相変化量を求める。
【００３８】
これらを求める際には、（Ｋｘ，Ｋｙ），φ、それぞれについて必要な精度単位で変化させて全探索を行ってもよいが、良く知られた最適化計算技法(山登り法、最急降下法など) を用いてもよい。また、同一の波数ベクトルを持ち、位相のみ変化させた複数の画像について計算する際には波数ベクトルの探索は一度行うだけでよい。
【００３９】
なお、以上の実施の形態では、標準標本として一様な反射物体を用いたが、一様な蛍光物体を標本として用いることができる。具体的には、蛍光硝子を薄く研磨したものである。蛍光標本であるので、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、バリアフィルタはそのまま使用可能であり、装置の状態をなるべく実測時と同じ状態にすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の実施形態である顕微鏡装置の概略図である。
【符号の説明】
【００４１】
１…光ファイバー、２…コレクタレンズ、３…回折格子、４…レンズ、５…位相板、６…遮光板、７…レンズ、８…視野絞り、９…フィールドレンズ、１０…励起フィルタ、１１…ダイクロイックミラー、１２…対物レンズ、１４…バリアフィルタ、１５…第２対物レンズ、１６…撮像面、２１…撮像手段、２２…演算装置、２３…画像表示装置、３１…偏光板、４１…回折格子移動装置、４２…位相板移動装置
【図１】
2009098215.tif 000007