(57)【要約】【課題】熱安定性が高く、しかもより高い温度域で反応することができるＲＮＡポリメラーゼを提供する。【解決手段】ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸を付加、欠失、挿入もしくは置換により変異させたタンパク質であって、改変前の該タンパク質に比して熱安定性もしくは高温域での比活性が向上したことを特徴とする改変型ＲＮＡポリメラーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質からなる、Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼ。
（ａ）８４９番目のアミノ酸残基フェニルアラニン及び８８０番目のアミノ酸残基フェニルアラニンが、それぞれイソロイシン及びチロシンに置換された、配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、挿入若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ改変前の該タンパク質に比して熱安定性若しくは高温域での比活性が向上したタンパク質
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である請求項４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の組換え宿主細胞を培養しＲＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする改変型ＲＮＡポリメラーゼの製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼを用いて恒温核酸増幅反応によりＲＮＡを増幅せしめることを特徴とするＲＮＡを合成する方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼを含む核酸増幅用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質を遺伝子工学的手法により改変することにより得られる、熱安定性あるいは高温度域での比活性が改変前の野生型ＲＮＡポリメラーゼに比して向上した改変型ＲＮＡポリメラーゼ、該ＲＮＡポリメラーゼをコ−ドする遺伝子および該遺伝子を使用する該ＲＮＡポリメラーゼの製造方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ＲＮＡポリメラーゼは遺伝子の転写発現に関するキー酵素として多くの研究がなされ、様々な機能、性質が知られてきている。なかでもＴ７、Ｔ３、Ｋ１１及びＳＰ６といったバクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼについては、大腸菌や高等生物のＲＮＡポリメラーゼとは異なり、単一のポリペプチド鎖のみで活性を発現することから、転写メカニズムを解析するための格好の材料とされている。また、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを鋳型に、ＮＴＰを基質として、プロモーター下流の鋳型ＤＮＡに相補的な一本鎖ＲＮＡを合成するという性質及びその際のプロモーター配列に対する認識が非常に厳密であるという性質から、これらファージ由来のＲＮＡポリメラーゼは、イン・ヴィトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でＲＮＡを合成するための酵素としても汎用されている。これにより合成されたＲＮＡは、多くの分子生物学的手法、例えばノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション時に用いるＲＮＡプローブ(リボプローブ）として、あるいは細胞もしくは無細胞タンパク合成（翻訳）系に加えて、翻訳される鋳型ＲＮＡとして利用されている。
【０００３】
さらに近年になって、ＲＮＡポリメラーゼの持つ、一定温度下にて鋳型ＤＮＡから多くのＲＮＡコピーを作り出す特性すなわち転写活性を利用して、例えば、ＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｅ‐ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、ＴＭＡ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）と呼ばれる転写に基づく核酸増幅方法や転写に基づいたシークエンス方法といった、より複雑な系の方法が開発されている。
【０００４】
ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法などの転写に基づく核酸増幅方法は、ＲＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素さらに必要によりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ部分のみを分解するＲＮａｓｅＨを共存させ、これらの反応をカップリングさせることにより、微量のＲＮＡを増幅、あるいは特定のＲＮＡの有無を検出する方法である。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼを利用した核酸増幅反応、いわゆるＰＣＲ法とは異なり、温度サイクルをかけることなく一定温度にて、従って特別な機器を用いることなく、短時間に目的核酸を増幅することが可能であり、これらの特徴から臨床診断用として広く用いられることが期待されている。
【０００５】
一方、転写に基づくシークエンス方法（特許文献１）は、従来のいわゆるサンガー法あるいはダイデオキシ法と呼ばれるシークエンス方法において、ＤＮＡポリメラーゼ、２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−トリフォスフェイト（２’−ｄＮＴＰｓ）及び２’、３’−ジデオキシリボヌクレオシド−５’−トリフォスフェイト（２’、３’−ｄｄＮＴＰｓ）の代わりにＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオシド５’−トリフォスフェイト（ｒＮＴＰｓ）及び３’−デオキシリボヌクレオシド−５’−トリフォスフェイト（３’−ｄＮＴＰｓ）を用いてシークエンスを行う方法である。従来のＤＮＡポリメラーゼを用いるシークエンス方法では、ＰＣＲ反応で得られた生成物（ＤＮＡ断片）をシークエンス反応に供する場合は、その反応溶液中に存在する、取り込まれなかったプライマー及び２’−ｄＮＴＰｓを除去することが必要であった。しかしながら、このＲＮＡポリメラーゼを用いた転写に基づくシークエンス反応では、上述のプライマー及び２’−ｄＮＴＰｓは反応の基質とはなり得ないため、ＰＣＲ生成物を直接シークエンス反応の鋳型として用いることができる。こうした理由から、この転写に基づくシークエンス法は、ＰＣＲ反応からシークエンス反応までの工程を自動化できる可能性を持つ画期的な方法として期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開  ＷＯ１９９６／１４４３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、このようにＲＮＡポリメラーゼが使用される反応系が複雑化し、かつ用途が広がるなかで、ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性が低いこと及び／又は高温度域で反応することができないことが問題となっていた。
【０００８】
ＮＡＳＢＡ反応の場合では、反応温度を上げることによりターゲットに対する特異性ひいては検出感度の向上に繋がることが期待されるが、ＲＮＡポリメラーゼが失活してしまうために不可能であった。また診断に用いるキットの一構成物としての酵素の熱安定性の向上は、輸送を容易にし、結果の再現性を向上させる意味からも重要である。
【０００９】
一方、転写に基づくシークエンス反応においてもＲＮＡポリメラーゼの熱安定性が低いために、ＰＣＲ生成物をシークエンス決定する際には、ＰＣＲ反応後にＲＮＡポリメラーゼを追加することが必要となり、自動機器を用いる場合における試薬の長期保存の観点から、自動化する際の大きな障壁となりうることが考えられる。
【００１０】
以上のようなことから、従来のものよりも熱安定性が高く、しかもより高い温度域で反応できるＲＮＡポリメラーゼが待ち望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成するためにＴ７ＲＮＡポリメラーゼにおいて熱安定性の向上した改変型ＲＮＡポリメラーゼを構築することを目的として鋭意検討した結果、野生型ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を遺伝子工学的手法により改変することで熱安定性を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、以下のような構成からなる。
（１）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸を付加、欠失、挿入もしくは置換により変異させたタンパク質であって、改変前の該タンパク質に比して熱安定性もしくは高温域での比活性が向上したことを特徴とする改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（２）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質が、Ｔ７ファージ、Ｔ３ファージおよびＫ１１ファージよりなる群から選択されるファージ由来のタンパク質である（１）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（３）配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸を付加、欠失、挿入もしくは置換により変異させてなる（１）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（４）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、４３０番目のアミノ酸残基セリン、８４９番目のアミノ酸残基フェニルアラニンおよび８８０番目のアミノ酸残基フェニルアラニンよりなる群から選ばれた少なくとも１箇所のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する（１）〜（３）のいずれかの改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（５）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、少なくとも４３０番目のアミノ酸残基セリンがプロリンに置換されたアミノ酸配列を有する（４）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（６）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、少なくとも８４９番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を有する（４）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（７）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、少なくとも８８０番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有する（４）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（８）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、少なくとも４３０番目のアミノ酸残基セリン、８４９番目のアミノ酸残基フェニルアラニン、８８０番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがそれぞれプロリン、イソロイシン、チロシンに置換されたアミノ酸配列を有する（４）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（９）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、４３０番目のアミノ酸残基セリン、８４９番目のアミノ酸残基フェニルアラニン、８８０番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがそれぞれプロリン、イソロイシン、チロシンに置換されたアミノ酸配列を有する（４）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（１０）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、８５０番目のアミノ酸残基フェニルアラニンもしくは８８１番目のアミノ酸残基フェニルアラニンのうちの少なくとも１箇所のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する（１）または（２）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（１１）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、少なくとも８５０番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を有する（１０）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（１２）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、少なくとも８８１番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有する（１０）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（１３）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、少なくとも８５０番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがイソロイシンに置換され、かつ８８１番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有する（１０）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（１４）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、８５０番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがイソロイシンに置換され、かつ８８１番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有する（１０）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（１５）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、４５３番目のアミノ酸残基セリン、８７２番目のアミノ酸残基フェニルアラニンおよび９０３番目のアミノ酸残基フェニルアラニンよりなる群から選ばれた少なくとも１箇所のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する（１）または（２）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（１６）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、少なくとも４５３番目のアミノ酸残基セリンがプロリンに置換されたアミノ酸配列を有する（１５）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（１７）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、少なくとも８７２番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を有する（１５）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（１８）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、少なくとも９０３番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがチロシンに置換されたアミノ酸配列を有する（１５）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（１９）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、少なくとも４５３番目のアミノ酸残基セリン、８７２番目のアミノ酸残基フェニルアラニン、９０３番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがそれぞれプロリン、イソロイシン、チロシンに置換されたアミノ酸配列を有する（１５）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（２０）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、４５３番目のアミノ酸残基セリン、８７２番目のアミノ酸残基フェニルアラニン、９０３番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがそれぞれプロリン、イソロイシン、チロシンに置換されたアミノ酸配列を有する（１５）の改変型ＲＮＡポリメラーゼ。
（２１）（１）〜（２０）のいずれかの改変型ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも一部をコードする塩基配列を含有することを特徴とするＤＮＡフラグメント。
（２２）（２１）のＤＮＡをベクタ−に挿入したことを特徴とするＤＮＡ組換えベクタ−。
（２３）（２２）のＤＮＡ組換え発現ベクタ−を用いて形質転換されたことを特徴とする組換え宿主細胞。
（２４）宿主細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である（２３）の組換え宿主細胞。
（２５）（２３）または（２４）の組換え宿主細胞を培養しＲＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする改変型ＲＮＡポリメラーゼの製造方法。
（２６）（１）〜（２０）のいずれかの改変型ＲＮＡポリメラーゼを用いて恒温核酸増幅反応によりＲＮＡを増幅せしめることを特徴とするＲＮＡを合成する方法。
（２７）（１）〜（１８）のいずれかの改変型ＲＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用試薬キット。
【００１３】
尚、アミノ酸残基については、以下、慣例により使用されている一文字表記法を用いて説明する。本発明において改変されるアミノ酸のみを記述すると、セリン(Ｓ)、プロリン(Ｐ、フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、イソロイシン(Ｉ)である。また、例えば、Ｓ４３０Ｐの表記は、４３０番目のアミノ酸残基ＳをＰに置換させたことあるいは置換させた変異体（変異型酵素）を意味し、さらにＳ４３０Ｐ＋Ｆ８４９Ｉ＋Ｆ８８０Ｙは、Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８４９ＩおよびＦ８８０Ｙの３種類の置換を含む三重変異体（三重変異型酵素）を意味する。
【発明の効果】
【００１４】
上述したように、本発明により提供される改変型ＲＮＡポリメラーゼは、野生型に比べて熱安定性及び特に高温度域での比活性が向上しており、従来の野生型ＲＮＡポリメラーゼでは使用できなかった高温度下における反応に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｋ１１ファージ、Ｔ３ファージ及びＴ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を比較した図である（前半部）。各段の最下行のアスタリスク（＊）は、３種類のファージ由来のＲＮＡポリメラーゼに共通しているアミノ酸であることを示している。
【図２】Ｋ１１ファージ、Ｔ３ファージ及びＴ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を比較した図である（後半部）。各段の最下行のアスタリスク（＊）は、３種類のファージ由来のＲＮＡポリメラーゼに共通しているアミノ酸であることを示している。
【図３】野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素及び各変異型酵素の熱安定性を比較した図である。野生型及び各変異型酵素を４８℃にてインキュベートし、経時的にサンプリングして残存活性を測定したものである。
【図４】野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素及び各変異型酵素のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写活性を反応温度がそれぞれ３７、４５、４８及び５１℃の条件で測定したものである。Ｔ７プロモーターを含むプラスミドに野生型及び各変異型酵素を加え、各温度にて1時間反応させた後、合成（転写）されたＲＮＡを０．７％アガロースゲル電気泳動により調べたものである。
【図５】野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素と変異型酵素（Ｓ４３０Ｐ＋Ｆ８４９Ｉ＋Ｆ８８０Ｙ）の３７〜６５℃での比活性を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、「野生型ＲＮＡポリメラーゼ」とは、天然に存在する全てのＲＮＡポリメラーゼを意味する。さらに、「野生型ＲＮＡポリメラーゼ」は、対応する野生型ＲＮＡポリメラーゼの能力と比較して、熱安定性を向上させることを目的とする改変以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失を、さらに有するものであることもできる。即ち、野生型ＲＮＡポリメラーゼを人為的に上記以外の目的で改変したＲＮＡポリメラーゼも、上記「野生型ＲＮＡポリメラーゼ」に含まれる。但し、そのようなアミノ酸の置換、挿入または欠失は、ＲＮＡポリメラーゼとしての活性を維持する範囲で、行われたものであることが適当である。さらに「野生型ＲＮＡポリメラーゼ」としては、例えば、Ｔ７ファージ、Ｔ３ファージ、Ｋ１１ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼを挙げることができる。但し、これらのＲＮＡポリメラーゼに限定されるものではない。
【００１７】
本発明のＲＮＡポリメラーゼは、対応する野生型ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つのアミノ酸が改変された熱安定性もしくは高温域での比活性の向上したＲＮＡポリメラーゼである。ここで、「熱安定性」とは、例えば、０℃から１００℃の温度下で、ある特定の時間インキュベーションした場合に、インキュベーション後の酵素が熱により失活せずに活性が残存していること、あるいは残存している酵素活性のインキュベーション前に対する割合をいうものである。また、「高温域での比活性」とは、例えば、３７℃から１００℃の温度下で酵素活性を測定した場合における単位タンパク質重量当たりの酵素活性をいうものである。
【００１８】
本発明において、アミノ酸残基の変異は公知の方法により実施することができる。具体的には、例えば、付加によるタンパク質の機能を改変する方法としては、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１７巻、第５８〜６１頁（１９９９年）に記載されている。また、欠失による方法としては、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第２４８巻、第２号、第３７２〜３７７頁、挿入による方法としては、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．第４４２巻、第２４１〜２４５頁（１９９９年）、置換による方法としては、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅｒｃｈ 第２６巻、第２号、第６８１〜６８３頁（１９９８年）にそれぞれ記載されている。
【００１９】
本発明者らは、まず、野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を挿入した発現プラスミドｐＫＫＴ７ＲＮＡＰを構築し、次に、この発現プラスミドｐＫＫＴ７ＲＮＡＰを基にＴ７ＲＮＡポリメラーゼの変異体を作製した。即ち、４３０番目のアミノ酸残基ＳをＰに置換させた変異体Ｓ４３０Ｐを、また、同様に８４９番目のアミノ酸残基ＦをＩに置換させた変異体Ｆ８４９Ｉを、さらに同様に８８０番目のアミノ酸残基ＦをＹに置換させた変異体Ｆ８８０Ｙを作製した。次にこれらの変異型酵素を精製し、その熱安定性について調べた。
【００２０】
本明細書における、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、遺伝子配列データベースであるＧｅｎｅＢａｎｋより、ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ． Ｍ３８３０８で登録されているＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子配列を若干訂正した配列表・配列番号１及び配列番号２を基礎としている。配列番号１及び配列番号２において右端の数字は、アミノ酸の場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの最初のＭ(メチオニン)を１として全長８８３アミノ酸残基からなっていることを示し、また塩基配列の場合、開始コドンＡＴＧのＡを１として全長２６５２塩基よりなることを示す。従って、本発明における野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列及び各アミノ酸に付された番号は、この配列番号１及び配列番号２に示される配列及び番号のことである。
【００２１】
さらに、上述のように、上記野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、本発明で目的とする改変以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失をさらに有するものであってもよい。従って、本発明の目的に基づいて変異を導入すべき野生型ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに別の変異を導入したものである場合、特にそのような変異が、アミノ酸の挿入または欠失である場合、それに応じて上記アミノ酸番号は変動し、図１及び図２に示す番号とは異なったとしても、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ活性を維持している限り、そのような挿入または欠失を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼも本発明の目的とする変異を導入する野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの範疇に含まれる。
【００２２】
また、本明細書におけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ以外のＲＮＡポリメラーゼについてのアミノ酸配列及び各アミノ酸に付された番号は、図１及び図２に示されている配列及び番号である。さらに、本発明で目的とする改変以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失を、さらに有するものであることもできる。従って、これらのアミノ酸配列及びその番号に付いても、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの場合と同様であり、アミノ酸の挿入または欠失による変異がある場合、それに応じて上記アミノ酸番号は変動するが、そのような一部に変異を有する野生型のＲＮＡポリメラーゼも本発明において本発明の目的とする変異を導入する野生型ＲＮＡポリメラーゼの範疇に含まれる。
【００２３】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む発現ベクターは、Ｔ７ファージゲノミックＤＮＡ（シグマ製）を鋳型にして、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の開始コドン領域に特異的なプライマーと終始コドン領域に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施し、この増幅産物を制限酵素にて消化した後、発現ベクターｐＫＫ２２３‐３（ファルマシア製）に導入することにより構築した。この発現ベクターを用いて、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することにより、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質を大量に発現させることができる。
【００２４】
発現ベクターｐＫＫＴ７ＲＮＡＰを持つ大腸菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から精製したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ７プロモーターを含んだＤＮＡ存在下で充分なＲＮＡ合成活性を有していた。この発現プラスミドｐＫＫＴ７ＲＮＡＰをベースにして変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとして、上述のＳ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、Ｆ８８０Ｙ及びそれらの置換を複数含んだ多重変異体を構築した。これらの変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを大腸菌組換え宿主より精製し、各変異型酵素の熱安定性を野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較した。結果を表１に示す。表１に示すように、これらの変異型酵素では、熱安定性の一つの指標である活性半減期が野生型酵素に比べて大幅に向上していた。
【００２５】
ここで上記３種のファージ、即ち、Ｔ７、Ｔ３及びＫ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼにおいては、それらのアミノ酸配列は互いに極めて高いホモロジーを有していることが知られている。図１及び図２に、これら３種類のファージ由来ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を比較して示す。このように、Ｔ７、Ｔ３、Ｋ１１由来のＲＮＡポリメラーゼは互いに極めて類似しており、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにおいて得られた結果を、アミノ酸配列の類似する他のＲＮＡポリメラーゼに適用することは比較的容易にできると考えられる。即ち、図１及び図２から、Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼの４３０、８４９及び８８０番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基は、Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼではそれぞれ４３１、８５０及び８８１番目のアミノ酸残基であり、またＫ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼではそれぞれ４５３、８７２及び９０３番目のアミノ酸残基であり、従って、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼにおけるＦ８５０Ｉ及びＦ８８１Ｙ変異体、さらにＫ１１ ＲＮＡポリメラーゼにおけるＳ４５３Ｐ、Ｆ８７２Ｉ及びＦ９０３Ｙ変異体も、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにおける変異体と同様に野生型に比べてより高い熱安定性を有していることは容易に類推できる。
【００２６】
本発明は、上記改変型ＲＮＡポリメラーゼを製造する方法であって、ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸分子を用意し、次いでその塩基配列内の1つまたはそれ以上の部位における塩基を変異させるように該核酸分子を改変し、次いで変異させた核酸分子により発現される改変されたＲＮＡポリメラーゼを回収することを含む方法を包含する。ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸分子の調製、核酸分子への突然変異の導入、改変されたＲＮＡポリメラーゼの精製はいずれも、公知の手法を用いて行うことが出来る。
【００２７】
即ち、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をベースとして適当な塩基を改変して変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製し、続いてこの遺伝子をベクターに導入し、発現ベクターを構築する。次に、この発現ベクターを用いて、宿主細胞を形質転換することにより変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質を大量に発現させることができる。
【００２８】
本発明における核酸分子への変異の導入は、当業者がなし得る方法であればいかなる方法でもよいが、例えばサイトディレクテッドミュータジェネシス法がある。
【００２９】
本発明において使用するベクターは、ＲＮＡポリメラーゼのクローニング及び発現を可能とするものであればいかなるものでもよく、例えばファージ及びプラスミドが挙げられる。プラスミドとしては、ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＬＥＤ−Ｍ１、ｐ７３、ｐＧＷ７などが挙げられる。ファージとしては、例えばλｇｔ１１、λＺＡＰIIなどが挙げられる。
【００３０】
本発明において使用する宿主細胞としては、大腸菌、酵母、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌などが挙げられる。大腸菌としては、例えばエシェリヒア・コリＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＰＲ１、ＢＬ２１などが挙げられる。本発明においては、上記の熱安定性の向上した改変型ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を上記ベクターに挿入して組換え発現ベクターとし、さらにこの組換え発現ベクターにて宿主細胞を形質転換する。
【００３１】
本発明の製造方法においては、上記組換え宿主細胞を培養して、熱安定性の向上した改変型ＲＮＡポリメラーゼを発現させる。組換え宿主細胞の培養に使用する培地ならびに条件は常法に従う。具体例としては、熱安定性の向上した改変型ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を、例えばＴＢ培地にて培養する。
【００３２】
上記培養により得られた改変型ＲＮＡポリメラーゼの精製法としては、（ａ）組換え宿主を集めた後、破砕して細胞抽出物を調製し、（ｂ）宿主細胞由来の不純タンパク質を除去する工程を含む。組換え宿主細胞より産出された熱安定性の向上した改変型ＲＮＡポリメラーゼは、宿主菌体を培地で培養後、培養液から遠心分離等にて分離、回収する。該菌体を緩衝液に再懸濁した後、超音波処理、ダイノミル・フレンチプレンス等により菌体を破砕する。次いでカラムクロマトグラフィーを実施し、熱安定性の向上した改変型ＲＮＡポリメラーゼを回収する。カラムクロマトグラフィーは、陽イオン交換体、例えば、フォスフォセルロース、あるいは陰イオン交換体、例えば、ＤＥＡＥセファロース、あるいはアフィニティー吸着体ヘパリンセファロースなどが好ましい。
【００３３】
本発明における改変型ＲＮＡポリメラーゼは、例えば恒温核酸増幅反応により特定のＲＮＡを増幅せしめるのに特に有用である。ここで、恒温核酸増幅反応とは、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法（Ｓｅｌｆ‐ｓｕｓｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、ＴＡＳ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｍｅｔｈｏｄ）などが挙げられる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、以下の実施例において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ活性の測定は以下のように行なった。すなわち、活性測定用緩衝液（４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)、２０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール、０．５ｍＭ ｒＮＴＰ、Ｔ７ゲノムＤＮＡ（シグマＤ４９３１）、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、［３Ｈ］ｒＵＴＰ（３７０ｋＢｑ／μｌ））中で、酵素を３７℃，１０分間反応させたのち、合成されたＲＮＡを酸不溶性沈殿として回収し、シンチレーションカウンターにて取り込まれた３Ｈ量を測定した。酵素活性の１単位(Ｕ)は、この条件下で６０分間に１ナノモルのｒＮＴＰを酸不溶性沈殿画分に取り込ませる酵素量とした。
【００３５】
実施例１  野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニングと発現プラスミドの構築
野生型ＲＮＡポリメラーゼの発現プラスミドは以下のようにして構築した。すなわち、Ｔ７ファージゲノミックＤＮＡ（シグマ製）を鋳型にして、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の開始コドン領域に特異的なプライマー(Ｔ７ＥｃｏＡＴＧ  ：  ５’−ＣＧＣ ＧＡＡ ＴＴＣＡＴＧ ＡＡＣ ＡＣＧＡＴＴ ＡＡＣ ＡＴＣＧＣＴ ‐３’)、及び終始コドン領域に特異的なプライマー（Ｔ７ＴｅｒＰｓｔＩ： ５’−ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＴＡＣ  ＧＣＧ ＡＡＣ ＧＣＧ ＡＡＧ−３’)を用いてＰＣＲを実施し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を増幅した。次に、この増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩにて消化した後、発現プラスミドｐＫＫ２２３‐３（ファルマシア製）の同制限酵素サイトに導入しＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現プラスミドを作製した。これをｐＫＫＴ７ＲＮＡＰと名付けた。なお、得られたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列に関しては、発現プラスミド中の得られた遺伝子をシークエンス決定することにより、ＰＣＲにより増幅した際の意図しない塩基置換が入っていないことを確認した。
【００３６】
実施例２  改変型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の作製
改変型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、上記実施例１で得られた野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に点変異を導入することにより行った。点変異の導入はクイックチェインジミュータジェネシスキット（ストラタジーン社製）および点変異導入用オリゴヌクレオチドを用いて、説明書の指示に従い行った。Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ及びＦ８８０Ｙのための点変異の導入は、変異導入用のプライマーを変えること以外は基本的に同じ条件にて実施できる。以下に一例として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の１２８８番目の塩基であるＴをＣに置換した（その結果、４３０番目のアミノ酸残基ＳがＰに置換される）変異型遺伝子Ｓ４３０Ｐを作製した際の条件を示す。
【００３７】
ｐＫＫＴ７ＲＮＡＰ５ｎｇ、変異導入用プライマー（５’‐ＧＴＴ ＴＡＣ ＧＣＴ ＧＴＧ ＣＣＡＡＴＧ ＴＴＣＡＡＣ ＣＣＧＣＡＡ‐３’及び ５’‐ＴＴＧ ＣＧＧ ＧＴＴ ＧＡＡＣＡＴ ＴＧＧ ＣＡＣＡＧＣ ＧＴＡ ＡＡＣ‐３’）各１２５ｎｇ、上記キット添付の反応用緩衝液５μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ １μｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕを含む５０μｌの溶液を、９５℃で３０秒間インキュベートした後、９５℃、３０秒／５５℃、１分／６８℃、１２分の温度サイクルを１２サイクル実施した。温度サイクル終了後、反応液に制限酵素ＤｐｎＩ１０Ｕを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次にこの反応液１μｌをエシェリヒア・コリＪＭ１０９株コンピテントセル１００μｌに加え、３０分間氷冷した後、４２℃で３０秒間インキュベートし、９００μｌのＳＯＣ培地を加え３７℃で１時間インキュベートした。これに５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にスプレッドし、３７℃で一晩インキュベートした。得られたコロニーをＬＢ培地２．５ｍｌにて一晩培養した後、定法に従いプラスミドを抽出した。最後に、これらのプラスミドの当該領域のシークエンスを行い、１２８８番目のＴがＣに置換されているクローンを取得し、ｐＫＫＴ７Ｓ４３０Ｐと名付けた。
【００３８】
また、同様の方法で、変異導入用プライマーとして５’‐ＴＴＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＣＡＧ ＡＴＣＧＣＴ ＧＡＣ ＣＡＧＴＴＧ ＣＡＣ‐３’及び ５’‐ＧＴＧ ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＴＣＡＧＣ ＧＡＴ ＣＴＧＧＴＣ ＧＴＡ ＧＡＡ‐３’を用いることにより２５４５番目のＴをＡに置換した（結果として、８４９番目のＦがＩに置換される）遺伝子を含む発現プラスミド（ｐＫＫＴ７Ｆ８４９Ｉ）、５’‐ＴＣＴ ＴＡＧ ＡＧＴ ＣＧＧＡＣＴ ＡＣＧ ＣＧＴＴＣＧ ＣＧＴ ＡＡＣ‐３’及び ５’‐ＧＴＴ ＡＣＧ ＣＧＡＡＣＧ ＣＧＴ ＡＧＴ  ＣＣＧ  ＡＣＴ  ＣＴＡ  ＡＧＡ‐３’を用いることにより２６３９番目のＴをＡに置換した（結果として、８８０番目のＦがＹに置換される）遺伝子を含む発現プラスミド（ｐＫＫＴ７Ｆ８８０Ｙ）を作製した。さらに、これらの３種類の変異を複数含む変異型遺伝子に関しては、変異を含む領域を制限酵素にて切り出し、他の変異を含む発現プラスミドの同領域と入れ替えることにより作製した。
【００３９】
実施例３  形質転換体の作製
実施例１及び実施例２で得られたプラスミド１ｎｇをＪＭ１０９コンピテントセル１００μｌに加え、３０分間氷冷した後、４２℃で３０秒間インキュベートし、９００μｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間インキュベートした。これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にて３７℃で一晩インキュベートし、形質転換体を得た。
【００４０】
実施例４  野生型及び各種改変型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの精製
野生型及び各種改変型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは基本的に同じ方法にて精製、調製することができる。実施例３で得られた各形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で一晩インキュベートした。得られた菌体を１２，０００回転／分で５分間遠心することにより回収した。菌体約１０ｇをバッファー１（２０ｍＭトリス−塩酸(ｐＨ８．０),１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール, ５％グリセロール）２０ｍｌに懸濁し、これを超音波破砕機で破砕した後、１２０００回転／分で２０分間遠心することにより沈殿を分離した。得られた上清に０．６％ポリエチレンイミン溶液を０．４ｍｌ添加し、３０分間攪拌した。これを１２０００回転／分で１０分間遠心することにより沈殿を分離し、上清を回収した。この液に硫酸アンモニウムを４．５６ｇ加え、３０分間攪拌した後、これを１２０００回転／分で１０分間遠心することにより沈殿を分離し回収した。得られた沈殿をバッファー２（２０ｍＭトリス−塩酸(ｐＨ８．０),１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、２０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）５ｍｌに溶解し、１００ｍｌのバッファー２に対して透析した。次に、これをＤＥＡＥセファロースカラム（５ｍｌ)にチャージし、１０ｍｌのバッファー２で洗浄後、ＮａＣｌの０〜５００ｍＭのグラジエントにより溶出した。得られたフラクションのうち、ＲＮＡポリメラーゼ活性を含む画分をプールし、１００ｍｌのバッファー２に対して透析した。次に、これをフォスフォセルロースカラム（５ｍｌ)にチャージし、１５ｍｌのバッファー２で洗浄後、バッファー２をベースとしてＮａＣｌ濃度の１００〜４００ｍＭのグラジェントにより溶出した。得られたフラクションのうち、ＲＮＡポリメラーゼ活性を含む画分を回収した。以上の操作で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりほぼ単一なバンドを示す１０ｍｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼタンパク質を得た。
【００４１】
実施例５  野生型及び各変異体の活性半減期の測定
熱安定性の指標の一つである活性半減期（ある温度でインキュベートした際に活性が半減するまでの時間）の測定は以下のようにして実施した。すなわち４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)、２０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール、７０ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡからなる緩衝液中、酵素を４８℃にてインキュベートし、一定の時間間隔ごとにサンプリングを行い、各サンプリング時点での残存活性を測定した。野生型および各種改変型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを４８℃でインキュベートした際の残存活性を経時的に測定した結果を図３に示す。また、図３から導き出される野生型及び各変異型酵素の活性半減期を表１に示す。
【００４２】
表１の数値は、４８℃で酵素をインキュベートした場合に、酵素活性が半減するまでの時間（ｍｉｎ）を示しており、数値が大きいほどその酵素の熱安定性が高いことを示している。図３及び表１から、各変異型酵素はいずれも野生型酵素に比してより高い熱安定性を有していることがわかる。また今回作製した変異型酵素の中では、Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ及びＦ８８０Ｙの３箇所の変異を全て含む三重変異型酵素（Ｓ４３０Ｐ＋Ｆ８４９Ｉ＋Ｆ８８０Ｙ）が最も熱安定性に優れている。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
実施例６  野生型及び各変異型酵素のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応
野生型及び各変異型酵素のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応は以下のように実施した。即ち、野生型及び各変異型酵素各５０Ｕを、４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)、２０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール、０．４ｍＭｒＮＴＰ、０．１％ＢＳＡ、０．５μｇ ｐＵＣＴ７−１からなる転写反応バッファー５０μｌに加え、３７、４５、４８、５１℃の各温度にて１時間反応させた。ここでｐＵＣＴ７−１は、Ｔ７プロモーターの下流に約１．５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントが連結されたプラスミドＤＮＡであり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより転写されると約１．５ＫｂｐのＲＮＡが合成されるものである。１時間の反応の後、反応液のうちの３μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、合成されたＲＮＡの有無、量を測定した。その０．７％アガロースゲル電気泳動の結果を図４に示す。なお各レーンに付されているナンバーは上記表１における各変異体のナンバーに相当する。図４より、変異型酵素、特にＮｏ．８の三重変異体（Ｓ４３０Ｐ＋Ｆ８４９Ｉ＋Ｆ８８０Ｙ）は、より高い反応温度でも合成された転写産物（ＲＮＡ）のバンドを確認でき、野生型に比してより高い温度下でも活性を有していることが確認できる。
【００４５】
実施例７  野生型及び三重変異型酵素の各温度での比活性測定
各温度での比活性の測定は以下のようにして実施した。すなわち、野生型及び改変型酵素を、予め以下の温度に保った活性測定緩衝液（４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)、２０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール、０．５ｍＭ ｒＮＴＰ、Ｔ７ファージゲノムＤＮＡ（シグマＤ４９３１）、５０ｕｇ／ｍｌＢＳＡ、[３Ｈ]ｒＵＴＰ（３７０ｋＢｑ／ｕｌ）に加え、それぞれ３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃にて１０分間反応させ、各温度における活性を測定した。また、各酵素のタンパク質濃度は、プロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用いて、キット付属のイムノグロブリンガンマ（ＩｇＧ）を標準タンパク質として用いて測定した。比活性（ＳＡ)は、単位タンパク質重量当たりの酵素活性のことであり、活性量を酵素タンパク量で割ることにより算出できる。野生型および三重変異型酵素（Ｓ４３０Ｐ＋Ｆ８４９Ｉ＋Ｆ８８０Ｙ）の各温度での比活性を測定した結果を図５に示す。図５より、改変型酵素は、野生型酵素に比べて各温度全般にわたって高い比活性を有しており、特に高温域での比活性に優れており、とりわけ５０℃での比活性は野生型の約１２倍もの値を有していることが判る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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