(57)【要約】      （修正有）【課題】簡易な遺伝子増幅定量装置および方法を提供する。【解決手段】石英素材の反応容器１と、その反応容器内において螺旋状である毛細管流路２と、試料導入口３で反応容器が構成され、反応容器１は、加温設定できるように、ホルダーに挿入設置されている。反応容器の各側面は、ＤＮＡの変性温度、プライマーがアニールする温度、及び伸長反応する温度に設定するための各ヒーターを有している。更に、増幅した試料を紫外線励起するための光源ＬＥＤを配置し、試料から発する蛍光を測定する為の受光ダイオードを配置できる構造により、簡易に、安価に遺伝子増幅操作と遺伝子増幅度合いの検知ができる。【選択図】図１
2009183244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子増幅法を用いて、簡易にＤＮＡまたはＲＮＡの定量を行なう方法であって、毛細管流路を保持した反応容器の毛細管流路内を移動しつつ、増幅反応を行いながら、同時に、増幅度をモニタリングすることを特徴とする装置および方法
【請求項２】
反応容器の毛細管流路に導入する試料が、連続的または断続的に、増幅反応の開始反応成分を含む溶液と希釈混合されながら、反応容器の毛細管流路内に導入されることを特徴とする請求項１記載の装置および方法
【請求項３】
反応容器が棒状または円柱状または立方体状の形状であって、反応容器の毛細管流路が螺旋状であることを特徴とした請求項１および請求項２記載の装置および方法
【請求項４】
エチジウムブロマイドやアクリジオンオレンジやサイバーグリーンなどの、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合して蛍光信号を出す試薬を利用して、遺伝子増幅反応の増幅度をモニタリングすることを特徴とする請求項１および請求項２および請求項３の装置および方法
【請求項５】
石英粉末を原料とした金型を用いて毛細管流路を形成しガラス化して製造された、素材が石英の反応容器を用いることを特徴とする請求項１および請求項２および請求項３および請求項４の装置および方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡易に遺伝子増幅し、定量検出する装置および方法に関する。より詳しくは、反応容器の毛細管流路に導入した試料を、遺伝子増幅法により増幅反応を行いつつ、増幅度を蛍光色素を利用して定量検出を行なう装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
耐熱性ポリメラーゼを利用した遺伝子増幅法であるＰＣＲ法は、研究用の技術として開発され、遺伝子工学の技術発展に寄与するばかりではなく、生物のゲノム解析や創薬開発や、ウィルス感染検査などの臨床検査や、アレルギー物質の食品混入や、成分チェックの検査などにも適用されている。
【０００３】
また、ＬＡＭＰ法などＰＣＲ法以外の増幅原理に基づく遺伝子増幅法も開発されており、遺伝子増幅法が多様な目的に利用できるようになってきている。
【０００４】
また、検出対象の遺伝子の有無を検出する方法だけでなく、遺伝子増幅反応の増幅状態を解析しながら、対象とする遺伝子の存在数や濃度などのより多くの情報を得るリアルタイムＰＣＲ法なども開発されてきている。
【０００５】
通例は、検査などで用いるＰＣＲ法などの遺伝子増幅の実際の操作は、対象試料をプラスチック容器に入れて、その容器をヒートブロックなどの温度制御できる部分を持つ装置に設置して、温度を制御して、遺伝子の増幅反応を行い、反応後に、反応溶液を取り出して、アガロースゲルなどを用いたゲル電気泳動を行なって、エチジウムブロマイドなどのＤＮＡに結合する蛍光試薬を用いて、検出を行なう。
【０００６】
遺伝子増幅の操作における対象試料をプラスチック容器に入れる作業や、反応終了後に、取り出して電気泳動を行なうための作業は、操作に熟練した作業者が、注意深く、少量の試料を取り扱って操作を行う必要があり、時間と手間、ひいては、費用を要する、簡易とはいえない、検査方法となっている。
【０００７】
また、遺伝子増幅の操作後においては、反応に用いたプラスチック容器や、電気泳動に用いたアガロースゲルや、緩衝液などの廃棄物が多く出て、産業廃棄物として適正に処理を行う必要がある。
【０００８】
半導体体加工における微細加工の手法を用いて、シリコンなどの板状の部材の片側表面に溝を構成させ、あるいは、片側表面からの貫通穴を構成し、板状部材を貼りあわせることにより液体試料の流路を形成して作成した反応容器を使った増幅分析方法（特許文献１）や反応装置（特許文献２）が開示されており、特殊な技術を持ち合わせていなくとも、遺伝子増幅反応操作が可能となってきているが、反応容器の作製操作が複雑であり、それゆえ、反応容器が特殊で高価であり、かつ、装置も高価である。
【０００９】
遺伝子増幅により、より多くの情報を得るためのリアルタイムＰＣＲは、上記の人手での操作は難しいので、機械化されているが、そのための装置が高価であり、また、検出のための試薬は、高価な蛍光色素を用いる必要がある。
【００１０】
リアルタイムＰＣＲにおいて、高価な蛍光色素が必要となる理由としては、安価なプラスチックやガラスを素材とする反応容器は、紫外線を通過させることができず、よって、アガロースゲル電気泳動で用いる、エチジウムブロマイドのような安価な試薬を用いることができないことがあげられる。
【００１１】
紫外線を通過できる素材としては、石英があげられるが、石英の容器は、高価であり、かつ、使用目的にあうような形状に加工した容器を、大量に製造することは難しいとされていたが、近年、通信用の端末器の作製方法として、石英粉末を原料とし、金型で形状を付与で、内部貫通穴を容易に成型できる石英器の作製法が開示（特許文献３）されている。
【特許文献１】特許第３５５８２９４号公報
【特許文献２】特許第３５５１９１７号公報
【特許文献３】特開２００３−２７０４８６公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
簡易に遺伝子増幅操作ができ、かつ、その増幅遺伝子を簡易に、定量的に検出できる装置および方法を提供する。また、遺伝子増幅操作に伴う廃棄物処理の軽減に貢献する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、蛍光検出ができる素材・構造を付与した反応容器の毛細管流路に、試料を流通させながら遺伝子増幅反応を行わせ、遺伝子増幅反応過程での遺伝子増幅の度合いを蛍光により検出して、遺伝子増幅程度を定量する装置であり、その装置を用いた方法である。
【００１４】
本発明は、増幅試料を、遺伝子増幅の反応溶液により、連続的または断続的に希釈して、反応容器の毛細管流路内に導入し増幅操作を行い、増幅度合いを検出する装置であり、その装置を用いた方法である。
【００１５】
本発明は、石英などの紫外線を利用できる素材を用いて反応容器を作製して、安価な蛍光試薬を利用して検出できる装置および方法である。
【００１６】
本発明は、使用した反応容器は、高温で処理して容器内に残留した有機物を分解処理して、再利用することができ、遺伝子増幅操作にともなう廃棄物の処理負荷を軽減できる方法である。
【００１７】
本発明は、反応容器の部分を異なる複数の温度にすることにより、反応容器内に形成させた毛細管流路に、異なる温度領域を作ることができ、その流路を、試料が通過することにより、ＰＣＲ反応の変性、アニーリング、伸長の反応ステップを、繰り返し行えることができ、反応容器の毛細管流路内での試料の移動に伴い、遺伝子増幅反応ができる方法である。
【００１８】
本発明は、反応容器内の毛細管流路のいずれの部分でも、遺伝子の増幅に伴う蛍光強度の増加を検出できる装置および方法であり、安価な可視光の複数の受光素子を反応容器の側面に配置することにより、同時に、複数点で、遺伝子の増幅度合いを検知できる装置および方法である。
【００１９】
本発明の光源としては、紫外線灯や可視光または紫外光を発する発光ダイオードや半導体レーザーやレーザー装置を用いることができる。
【００２０】
本発明で用いる蛍光試薬は、アガロースゲル電気泳動やアクリルアミドゲル電気泳動などで用いられているエチジウムブロマイドやサイバーグリーンなどを用いることもでき、アクリジンオレンジなどの微生物染色などに用いられる蛍光試薬を用いることができる。
【００２１】
本発明では、試料を反応容器の毛細管流路に導入して遺伝子増幅反応を行ってもよく、遺伝子増幅反応の組成を用いて、連続的に、あるいは、断続的に希釈して、毛細管流路に導入してもよく、断続的に希釈する場合は、希釈試料間にミネラルオイルなどを導入して、希釈試料間の区分けをしてもよい。
【００２２】
本発明での試料を反応容器の毛細管流路を移動させるためには、シリンジ型ポンプを用いてもよく、ぺリスター型のポンプでもよく、ダイヤフラム式ポンプでもよく、圧電素子を用いたバイモルフ型のポンプでもよく、ＨＰＬＣのポンプでもよく、あるいは、電気浸透流による押し出しでもよく、表面弾性波による送液方法でもよい。
【００２３】
本発明での、遺伝子増幅法は、ＰＣＲ法でもよく、ＬＡＭＰ法でもよい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、簡易な装置構成にて遺伝子増幅操作を行い、かつ、遺伝子増幅の度合いを検知できる。
【００２５】
本発明によれば、既存の安価な蛍光色素を利用できるので、安価な遺伝子増幅操作ができる。
【００２６】
本発明によれば、光源として安価な紫外灯やＬＥＤなどを利用し、検出には安価な受光素子が利用することができ、簡易で安価な遺伝子増幅装置が構築できる。
【００２７】
本発明によれば、反応容器を高温処理することにより、流路内に付着・残留した有機物を除去でき、反応容器が再利用でき廃棄物の排出負荷を軽減できるとともに、高温処理によりウィルスや細菌などの病原微生物を死滅させることができるので、遺伝子増幅操作を衛生的に実施できる。
【００２８】
本発明の装置と方法によれば、食品・飲料、乳、乳製品、医薬品、医薬部外品、化粧品、人間または動植物から採取した組織・血液などの試料、環境試料、土壌など遺伝子増幅法を適用して分析、検査されている対象物に対して、簡易に、遺伝子増幅操作と、遺伝子増幅の度合いの検知ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の例示を以下に示すが、光源や容器の素材種類や容器の形状や流路形状は、例示に示す方法に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
図１に示したように、本発明の実施形態である装置に用いる反応容器は、金型で作製した石英素材の反応容器１と、その反応容器内において、螺旋状である毛細管流路２と、試料導入口３で構成される。反応容器の全体形状は、図１では、立方体を支援したが、底面が円状の円柱状であっても、三角柱や六角柱など、底面が多角形の形状のものであってもよい。
【００３１】
図２に示したように、本発明の装置の主要な構造は、反応容器１と、反応容器１の螺旋状の毛細管流路部分を加温設定できるように、反応容器１を収納できる構造を持つホルダー４と、そのホルダーに挿入設置された反応容器の１つの側面をＤＮＡの変性温度で例えば９５℃に温度設定するためのヒーター５、毛細管流路の流れ方向に沿った、反応容器の別の側面をプライマーがアニールする温度で、例えば５５℃に温度設定するためのヒーター６、反応容器のもう一つの側面を伸長反応する温度で、例えば７２℃に設定するためのヒーター７を有し、かつ、増幅した試料を紫外線励起するための光源ＬＥＤ８を配置し、試料から発せされる蛍光を測定する為の受光ダイオード９を配置できる構造である。
【００３２】
試料導入の方法は、試料導入口３に、増幅反応溶液に混合した測定対象試料を載せて、ポンプから増幅反応溶液を任意の速度で送液することで、反応容器の毛細管流路内に導入させ、以降、ポンプの液押し出しにより、試料を、毛細管流路内を移動させて、増幅反応を進行させる。
【実施例２】
【００３３】
試料導入口部分に、試料貯留の空間を設けて、増幅反応溶液を試料貯留の空間に導入して、試料貯留の空間内で、試料と増幅反応溶液を希釈混合させつつ、試料貯留の空間内の液の一部を反応容器内の毛細管流路内に導入を行なうことで、導入試料の連続的な希釈を行うことができる。
【００３４】
試料の希釈導入により、試料中の増幅対象ＤＮＡの濃度が変化するので、反応容器の螺旋状毛細管流路内の増幅試料由来の増幅信号の発生位置・強度が変化する。その変化情報と、希釈倍率・希釈速度、毛細管流路内の反応溶液の送液量などの情報を組み合わせることにより、試料中の増幅対象のＤＮＡの濃度が正確に測定できる。
【００３５】
反応試料と遺伝子増幅反応溶液との混合比率は、反応試料が反応容器内の毛細管流露に流入するに従い、希釈倍率が高くなり、反応容器の毛細管流路の螺旋の回転数が増加しても、増幅された遺伝子が少なくなるため、蛍光色素の信号が低下し、希釈比率が大きくない反応操作初期に反応容器の毛細管流路に導入された試料での蛍光強度と比較しながら、定量的に、試料中に存在する対象とする遺伝子の数が推定される。
【００３６】
遺伝子増幅を行う対象試料は、反応容器とポンプ部分の間に導入され、ポンプの送液の作用により、反応容器内の毛細管流露に導入される。
【００３７】
反応試料を導入する空間に反応試料を導入して、その反応試料を導入する空間に対して、遺伝子増幅反応溶液の成分である耐熱酵素、その反応基質のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰや、プライマーとなるオリゴＤＮＡや、エチジウムブロマイドのような蛍光色素を含む溶液を導入し、反応試料と連続して混合している。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の方法により、簡易な装置構成により、遺伝子増幅操作と遺伝子増幅の増幅度合いの検知する装置が構築できる。
【００３９】
本発明の方法により、特別の操作手法を要せず、簡易に、遺伝子増幅操作と、増幅度合いの検知をができる装置を構築できる。
【００４０】
本発明の方法により、安価な蛍光試薬が適用でき、遺伝子増幅操作と増幅確認操作を安価に実施できる。
【００４１】
本発明の方法により、反応容器を高温で処理して再利用も可能であるので、遺伝子増幅操作と、遺伝子増幅の確認、分析操作に伴う使い捨て廃棄物の発生を抑制できる。
【００４２】
本発明により、食品・飲料、乳、乳製品、医薬品、医薬部外品、化粧品、人間または動植物から採取した組織・血液などの試料、環境試料、土壌など遺伝子増幅法を適用して分析、検査されている対象物に対して、簡易に、安価に、かつ、安全・衛生的に、遺伝子増幅操作と、遺伝子増幅の度合いの検知ができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の反応容器の構造を示した説明図である。
【図２】本発明の主要な装置構成を示した説明図である。
【符号の説明】
【００４４】
１  反応容器
２  毛細管流路
３  試料導入口
４  ホルダー
５  ヒーター
６  ヒーター
７  ヒーター
８  光源ＬＥＤ
９  受光ダイオード
【図１】
2009183244.tif 000003
【図２】
2009183244.tif 000004