(57)【要約】      （修正有）【課題】試料液のチオレドキシンを高感度で迅速に、簡易に定量でき、さらに安価であるチオレドキシン類測定用電極を提供する。【解決手段】導電性基体上に、チオレドキシンレダクターゼ及びチオレドキシン再生酵素を少なくとも有する反応層を配置したことを特徴とし、測定試料中に含まれるチオレドキシンの量が微量であっても、再生基質が存在する限り、電気的信号強度が時間経過とともに減衰することなく、チオレドキシンの濃度に依存した強度の電気的信号を継続して検出・測定することが出来るチオレドキシン類測定用電極を提供する。【選択図】図７
2009002689.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性基体上に、チオレドキシンレダクターゼ及びチオレドキシン再生酵素を少なくとも有する反応層を配置したことを特徴とするチオレドキシン類測定用電極。
【請求項２】
試料中のチオレドキシン類の濃度を測定する方法であって、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、請求項１に記載の反応層に含まれる前記チオレドキシン再生酵素の基質、並びに電子伝達物質を含む水溶液を、試料と混合して試料溶液を調製する工程、
該試料溶液を、少なくとも、請求項１に記載のチオレドキシン類測定用電極が有する作用電極、対極に接触させて、前記試料溶液を介して電気回路を形成する工程、
前記チオレドキシン類測定用電極が有する作用電極と対極の間に電圧を印加して、前記作用電極の表面で前記電子伝達物質の酸化反応または還元反応を行いながら、前記作用電極における電流または積算電荷量を測定する工程、および
前記測定された値からチオレドキシンの濃度を算出する工程、
を含むチオレドキシン類の濃度の測定方法。
【請求項３】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、請求項１に記載のチオレドキシン類測定用電極の該反応層に含まれる該チオレドキシン再生酵素の基質、並びに電子伝達物質を用いて、試料中のチオレドキシン類の濃度を測定するための装置であって、
前記チオレドキシン類測定用電極が有する作用電極と対極の間に、前記電子伝達物質が該作用電極の表面において酸化反応もしくは還元反応を起こすのに十分な電圧を印加する手段と、および前記作用電極における電流若しくは積算電荷量を測定する手段と、を有するチオレドキシン類の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオレドキシン類の濃度を測定するために用いることのできる電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
個体や細胞が受けるストレスには、数多くの種類が存在する。それらストレスに対する応答の機構には、互いに共通の要素があり、多くのシグナル経路が同時に活性化し、密接に関係しながら調節を行っている。様々なストレスの中で、酸化ストレスは重要な位置を占める。酸化ストレスの原因としては、活性酸素種、紫外線、放射線、化学物質や、細胞内で活性酸素種を産生する刺激などが挙げられる。酸化ストレスは、生体中の脂質、タンパク質、ＤＮＡなどに修飾や障害を与える事が知られている。その程度が強い場合には、細胞の機能障害や、細胞死を引き起こし、時には、発ガン、老化、動脈硬化、認知症、神経疾患の原因となる。一方で、この障害を修復する機構が存在し、抗酸化物質が誘導されることなどにより、障害を受けた物質の分子レベルでの修復が行われ、生体が防御される。この抗酸化物質の中の一つとして、細胞内の抗酸化機構を担う代表的なタンパク質であるチオレドキシンが挙げられる。
【０００３】
チオレドキシンは、１９６４年リボヌクレオチドレダクターゼの補酵素として発見された、分子量が約１２ｋＤａのタンパク質であり、活性部位に異種間でよく保存された−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−（Ｃｙｓ：システイン、Ｘ：任意のアミノ酸）配列を有する。チオレドキシンには、この２つのシステイン残基間で、ジスルフィド結合を作る酸化型と、ジチオールとなる還元型が存在する。このうち還元型は、抗酸化物質として機能し、単独で活性酸素種を消去するほか、ペルオキシレドキシンとの作用により、細胞内の活性酸素種を消去し、酸化体となることが知られている。一方で、酸化型は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）との共存下、チオレドキシン還元酵素の触媒作用により還元体へと変換される。このチオレドキシンは、酸化ストレスを引き起こす原因等によって誘導されるため、チオレドキシン濃度が生体内の酸化ストレスによる炎症の程度を反映する。このためチオレドキシンは、生体のストレスマーカーとして知られている。一方で酸化ストレス応答を惹起する多くの疾患が報告されている。肺疾患、循環器疾患、肝疾患、消化器疾患、糖尿病などの疾患はその例で、チオレドキシンをこれらの疾患のマーカー、あるいは治療薬として利用する検討がされている。
【０００４】
このチオレドキシンの測定法として、たとえば抗原抗体反応を利用した酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）がある。非特許文献１は、ＥＬＩＳＡ法を用い、血清中のチオレドキシン濃度がＣ型肝炎ウィルス感染患者の酸化ストレスの指標として有用であることを示している。
【非特許文献１】Yoshio Sumida, Toshiaki Nakamura, Takaharu Yoh, Yoshiki Nakajima, Hiroki Ishikawa, Hironori Mitsuyoshi, Yoshikuni Sakamoto, Takeshi Okanoue, Kei Kashima, Hajime Nakamura, Junji Yodoi Journal of Hepatology 2000, 33, 616-622.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１に開示されるように、従来のチオレドキシン濃度の測定法は、ＥＬＩＳＡ法を使用している。ＥＬＩＳＡ法は、抗チオレドキシン抗体を吸着固定化させたプラスチックの表面などの固相に、検出対象であるチオレドキシンを含む試料を加え、抗原−抗体反応を利用して試料中のチオレドキシンを捕捉させる。その後液相を除いて固相に捕捉されたチオレドキシンだけを残し、ここに酵素や、蛍光物質などにより修飾された抗チオレドキシン二次抗体の液を加える。最初に加えるチオレドキシンの量と後から加えた二次抗体の量が適切な範囲にあれば、固相に捕捉されているチオレドキシンの量に応じて抗原抗体反応で結合する二次抗体の量が変化する。二次抗体に標識されている酵素あるいは蛍光物質の量も変化することになり、標識酵素の活性あるいは蛍光物質の蛍光量を測定することにより結合した二次抗体の量がわかり、ひいては元々存在したチオレドキシンの量もわかる。
【０００６】
しかしながらＥＬＩＳＡ法は、上述の通り複雑な実験手順を踏まなくてはならず、高度の専門性が要求され、吸光度の測定に適した検査対象濃度を得るために濃縮を行う必要があり、検出には長時間をかけなければならないという欠点がある。
【０００７】
そこで、本発明は、試料液のチオレドキシンを高感度で迅速に、簡易に定量、また安価であるチオレドキシン類測定用電極を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は、試料液のチオレドキシンを高感度で迅速に、簡易に定量できるチオレドキシン測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための、本発明のチオレドキシン類測定用電極は、導電性基体上に、チオレドキシンレダクターゼ及びチオレドキシン再生酵素を少なくとも有する反応層を配置したことを特徴とする。
【００１０】
本発明のチオレドキシン類測定用電極における第１の態様は、導電性基体上にチオレドキシンレダクターゼ、還元型メディエータ：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ、および還元型チオレドキシン：再生基質の酸化還元酵素を固定化したことを特徴とする。
【００１１】
また本発明のチオレドキシン類測定用電極における第２の態様は、導電性基体上にチオレドキシンレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ：酸化型メディエータオキシドレダクターゼ、および再生基質：酸化型チオレドキシンの酸化還元酵素を固定化したことを特徴とする。
【００１２】
また本発明のチオレドキシン類測定用電極は、上記チオレドキシン再生酵素がチオレドキシンペルオキシダーゼ、Ｌ−メチオニンＳ−オキシドレダクターゼ、ホスホアデニリル−スルフェートレダクターゼ、リボヌクレオシド−ジホスフェートレダクターゼ、リボヌクレオシド−トリホスフェートレダクターゼ、Ｏ−アセチルホモセリンアミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼから選択された酵素であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
試料液のチオレドキシン類を、高感度かつ迅速に定量することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のチオレドキシン類測定用電極の第１の態様によれば、以下に述べる作用機序に基づき測定試料中に含まれるチオレドキシンの濃度に相関する電気的信号を取得することが可能となる。図７は第１の態様の作用機序を説明するもので、参照符号を用いて説明する。すなわち、
（１−１）導電性基体１４上の反応層１５に含まれるチオレドキシンレダクターゼ１６の触媒作用により、測定試料中に含まれる検出対象であるチオレドキシンのうち、酸化型チオレドキシン１７は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）１８との共存下、還元型チオレドキシン１９に変換されると同時に酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）２０を生成する。
【００１５】
(１−２)生成したＮＡＤＰ+２０は、還元型メディエータ２１との共存下、反応層１５に含まれる還元型メディエータ：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ２２の触媒作用により、ＮＡＤＰＨ１８に変換されると同時に酸化型メディエータ２３を生成する。
【００１６】
(１−３)生成した酸化型メディエータ２３は、導電性基体１４に印加される適当な範囲の電圧のもとで、導電性基体１４から電子を受取り還元型メディエータ２１に変換されると同時に、導電性基体に接続された外部回路に対して電気的信号を与える。
【００１７】
導電性基体に接続された外部回路に対して与えられる電気的信号は、（１−１）でチオレドキシンレダクターゼ１６の触媒作用により単位時間に変換される酸化型チオレドキシンの量１７に比例する。この量は測定試料中に含まれるチオレドキシンの濃度に相関するため、電気的信号の量を基に、測定試料中に含まれるチオレドキシンの濃度を推定することができる。
【００１８】
(１−４)チオレドキシンレダクターゼ１６の触媒作用により生成した還元型チオレドキシン１９は、酸化型再生基質２４との共存下、導電性基体１４上の反応層１５に含まれる、チオレドキシン再生酵素（還元型チオレドキシン：再生基質の酸化還元酵素）２５の触媒作用により、酸化型チオレドキシン１７に変換されると同時に、還元型再生基質２６を生成する。
【００１９】
生成した酸化型チオレドキシン１７は、前記（１−１）の作用に始まる、チオレドキシンレダクターゼ１６の触媒作用を経由した電気的信号への変換経路へ利用されることが可能である。よって、測定試料中に含まれるチオレドキシンの量が微量であっても、酸化型再生基質２４が存在する限り、電気的信号強度が時間経過とともに減衰することなく、チオレドキシンの濃度に依存した強度の電気的信号を継続して検出・測定することが出来る。
【００２０】
一連の作用機序は、測定試料に対して、本発明のチオレドキシン類測定用電極を浸漬し、適当な範囲の電圧を印加するだけで、自発的に進行するため、ＥＬＩＳＡ法のような複雑な実験手順を踏む必用はなく、高度の専門性も要求されない。このため測定試料液のチオレドキシンを高感度で迅速に、簡易に定量することが可能となる。
【００２１】
本発明のチオレドキシン類測定用電極の第２の態様によれば、以下に述べる作用機序に基づき測定試料中に含まれるチオレドキシンの濃度に相関する電気的信号を取得することが可能となる。図８は第２の態様の作用機序を説明するもので、参照符号を用いて説明する。すなわち、
（２−１）導電性基体１４上の反応層１５に含まれるチオレドキシンレダクターゼ１６の触媒作用により、測定試料中に含まれる検出対象であるチオレドキシンのうち、還元型チオレドキシン１９は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）２０との共存下、酸化型チオレドキシン１７に変換されると同時に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(ＮＡＤＰＨ)１８を生成する。
【００２２】
（２−２）生成したＮＡＤＰＨ１８は、酸化型メディエータ２３との共存下、導電性基体１４上の反応層１５に含まれるＮＡＤＰＨ：酸化型メディエータオキシドレダクターゼ２７の触媒作用により、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）２０に変換されると同時に還元型メディエータ２１を生成する。
【００２３】
（２−３）生成した還元型メディエータ２１は、導電性基体１４に印加される適当な範囲の電圧のもとで、導電性基体１４に電子を与え酸化型メディエータ２３に変換されると同時に、導電性基体に接続された外部回路に対して電気的信号を与える。
【００２４】
導電性基体に接続された外部回路に対して与えられる電気的信号は、（２−１）でチオレドキシンレダクターゼ１６の触媒作用により単位時間に変換される還元型チオレドキシンの量に比例する。この量は測定試料中に含まれるチオレドキシンの濃度に相関するため、電気的信号の量を基に、測定試料中に含まれるチオレドキシンの濃度を推定することができる。
【００２５】
（２−４）チオレドキシンレダクターゼ１６の触媒作用により生成した酸化型チオレドキシン１７は、還元型再生基質２６との共存下、導電性基体１４上の反応層１５に含まれる、チオレドキシン再生酵素（再生基質：酸化型チオレドキシンの酸化還元酵素）２５の触媒作用により、還元型チオレドキシン１９に変換されると同時に、酸化型再生基質２４を生成する。
【００２６】
ここで生成した還元型チオレドキシン１９は、（２−１）の作用に始まる、チオレドキシンレダクターゼ１６の触媒作用を経由した電気的信号への変換経路へ利用されることが可能である。よって、測定試料中に含まれるチオレドキシンの量が微量であっても、還元型再生基質２６が存在する限り、電気的信号強度が時間経過とともに減衰することなく、チオレドキシンの濃度に依存した強度の電気的信号を継続して検出・測定することが出来る。
【００２７】
一連の作用機序は、測定試料に対して、本発明のチオレドキシン類測定用電極を浸漬し、適当な範囲の電圧を印加するだけで自発的に進行するため、ＥＬＩＳＡ法のような複雑な実験手順を踏む必用はなく、高度の専門性も要求されない。このため測定試料液のチオレドキシンを高感度で迅速に、簡易に定量することが可能となる。
【００２８】
本発明のチオレドキシン類測定用電極を用いた測定装置による測定対象であるチオレドキシン類とは、チオレドキシン(ＴＲＸ)に加えて、チオレドキシンスーパーファミリーと呼ばれるチオレドキシン用のドメインを持つ一連のたんぱく質群を含む。このチオレドキシンスーパーファミリー分子は、−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−からなる活性部位を持ち、活性部位のジスルフィド／ジチオール基によりその酸化還元能を担う分子である。また、チオレドキシンスーパーファミリーの中には、複数のチオレドキシンモチーフを持つものも含む。これらチオレドキシンスーパーファミリーの例としては、ＴＲＸ、Ｓｐｔｒｘ、ＰＤＩ、ＥＲｐ７２、ＥＲｄｊ５ ＡｈｐＦ、ｔｒｙｐａｒｅｄｏｘｉｎ、ＡｈｐＤが挙げられる。
【００２９】
チオレドキシン類を含む試料は、特に限定されるものではないが、生体の体液、組織が好ましく用いられる。なかでも、動物の体液がさらに好ましく用いられ、ヒトの体液が最も好ましく用いられる。体液は、特に限定されるものではないが、血液、血液を構成する成分(血清、血漿を含む)、尿、唾液が好ましく用いられる。
【００３０】
上記測定の際、本発明の装置においては、チオレドキシン類の測定を行う前後に、別途処理が好ましく行われる。この処理の例としては、分離、分画、ろ過、洗浄、抽出、精製、温度変化、分散、混合、沈殿、透析、蒸留、修飾(化学反応を含む）、脱酸素、脱泡、超音波処理、マイクロ波処理、磁場の印加を伴う処理、電解、電気泳動、クロマトグラムが挙げられる。また、これらは複数を組み合わせて用いてもよく、さらに順序だてて用いてもよい。これらの前後処理を自動化して装置の一部として組み込む手法も好ましく用いられる。また、マイクロ流路等の微小な空間をこの前後処理および／または測定に利用することも好ましく用いられる。
【００３１】
本発明のチオレドキシン類測定用電極は、導電性基体上に、チオレドキシンレダクターゼおよびチオレドキシン再生酵素を少なくとも有する反応層を配置することを特徴とする。反応層は、チオレドキシンレダクターゼおよびチオレドキシン再生酵素が分子レベルで共存している部分であり、チオレドキシンレダクターゼおよびチオレドキシン再生酵素を後述の方法で、導電性基体の物理的近傍に捕捉している部分である。
【００３２】
本発明のチオレドキシン類測定用電極を構成するチオレドキシンレダクターゼ(thioredoxin reductase）は、酵素番号ＥＣ１.８.１.９に分類され、以下の反応を触媒する酵素であれば、その由来については限定されない
還元型チオレドキシン＋ＮＡＤＰ+＝酸化型チオレドキシン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+。
【００３３】
本発明のチオレドキシン類測定用電極を構成するチオレドキシン再生酵素（再生基質：酸化型チオレドキシン酸化還元酵素）は、後述する再生基質との組み合わせに応じて選択される酵素であり、チオレドキシンペルオキシダーゼ、Ｌ−メチオニンＳ−オキシドレダクターゼ、ホスホアデニリル−スルフェートレダクターゼ、リボヌクレオシド−ジホスフェートレダクターゼ、リボヌクレオシド−トリホスフェートレダクターゼ、Ｏ−アセチルホモセリンアミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼ等から選択される。
【００３４】
チオレドキシンペルオキシダーゼ(thioredoxin peroxidase)は、酵素番号ＥＣ１.１１.１.１５に分類され、以下の反応を触媒する酵素であれば、その由来については限定されない
還元型チオレドキシン＋Ｈ2Ｏ2＝酸化型チオレドキシン＋２Ｈ2Ｏ。
【００３５】
Ｌ−メチオニンＳ−オキシドレダクターゼ(L-methionine-S-oxide reductase)は、酵素番号ＥＣ１.８.４.５に分類され、以下の反応を触媒する酵素であれば、その由来については限定されない
Ｌ−メチオニン＋酸化型チオレドキシン＋Ｈ2Ｏ＝Ｌ−メチオニンＳ−オキシド＋還元型チオレドキシン。
【００３６】
ホスホアデニリル−スルフェートレダクターゼ(phosphoadenylyl-sulfate reductase)（thioredoxin）は、酵素番号ＥＣ １.８.４.８に分類され、以下の反応を触媒する酵素であれば、その由来については限定されない
アデノシン３',５'−ビスホスフェート＋スルフィト＋酸化型チオレドキシン＝３'−ホスホアデニリル−スルフェート＋還元型チオレドキシン。
【００３７】
リボヌクレオシド−ジホスフェートレダクターゼ(ribonucleoside-diphosphate reductase)は、酵素番号ＥＣ １.１７.４.１に分類され、以下の反応を触媒する酵素であれば、その由来については限定されない
２'−デオキシリボヌクレオシド−ジホスフェート＋酸化型チオレドキシン＋Ｈ2Ｏ＝リボヌクレオシド−ジホスフェート＋還元型チオレドキシン。
【００３８】
リボヌクレオシド−トリホスフェートレダクターゼ(ribonucleoside-triphosphate reductase)は、酵素番号ＥＣ １.１７.４.２に分類され、以下の反応を触媒する酵素であれば、その由来については限定されない
２'−デオキシリボヌクレオシド−トリホスフェート＋酸化型チオレドキシン＋Ｈ2Ｏ＝リボヌクレオシド−トリホスフェート＋還元型チオレドキシン。
【００３９】
Ｏ−アセチルホモセリンアミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼ(O-acetylhomoserine aminocarboxypropyltransferase)は、酵素番号ＥＣ ２.５.１.４９に分類され、以下の反応を触媒する酵素であれば、その由来については限定されない
Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン＋チオスルフェート＋還元型チオレドキシン＋Ｈ＋＝Ｌ−ホモシステイン＋スルフィト＋酸化型チオレドキシン＋アセテート
若しくは
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン＋チオスルフェート＋還元型チオレドキシン＋Ｈ＋＜＝＞Ｌ−システイン＋スルフィト＋酸化型チオレドキシン＋アセテート。
【００４０】
本発明のチオレドキシン類測定用電極を用いてチオレドキシン類を測定する方法において使用する再生基質は、前述のチオレドキシン再生酵素（再生基質：酸化型チオレドキシン酸化還元酵素）との組み合わせに応じて選択される。
【００４１】
チオレドキシン再生酵素としてチオレドキシンペルオキシダーゼを選択する場合には、再生基質としては過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を選択して使用する。
【００４２】
チオレドキシン再生酵素としてＬ−メチオニンＳ−オキシドレダクターゼを選択する場合には、再生基質としてはＬ−メチオニン(L−methionine)若しくはＬ−メチオニンＳ−オキシド(L−methionine S−oxide)を選択して使用する。
【００４３】
チオレドキシン再生酵素としてホスホアデニリル−スルフェートレダクターゼを選択する場合には、再生基質としてはアデノシン３',５'−ビスホスファイト＋スルフィト若しくは３'−ホスホアデニリル−スルフェートを選択して使用する。
【００４４】
チオレドキシン再生酵素としてリボヌクレオシド−ジホスフェートレダクターゼを選択する場合には、再生基質としては２'−デオキシリボヌクレオシド−ジホスフェート若しくはホスホアデニリル−スルフェートを選択して使用する。
【００４５】
チオレドキシン再生酵素としてリボヌクレオシド−トリホスフェートレダクターゼを選択する場合には、再生基質としては２'−デオキシリボヌクレオシド−トリホスフェート若しくはリボヌクレオシド−トリホスフェートを選択して使用する。
【００４６】
チオレドキシン再生酵素としてＯ−アセチルホモセリンアミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼを選択する場合には、再生基質としてはＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリン＋チオスルフェート、Ｌ−ホモシステイン＋スルフィト＋アセテート、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン＋チオスルフェート、若しくはＬ−システイン＋スルフィト＋アセテートを選択して使用する。
【００４７】
本発明のチオレドキシン類測定用電極を構成する還元型メディエータ：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、前述の再生基質として、過酸化水素、Ｌ−メチオニンＳ−オキシド、３'−ホスホアデニリル−スルフェート、リボヌクレオシド−ジホスフェート、リボヌクレオシドートリホスフェート、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン＋チオスルフェート、若しくはＯ−アセチル−Ｌ−セリン＋チオスルフェートを使用する場合に選択される酵素であり、次の反応を触媒する酵素であれば、その由来については限定されない
還元型メディエータ＋ＮＡＤＰ+＝酸化型メディエータ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+。
【００４８】
本発明のチオレドキシン類測定用電極を構成するＮＡＤＰＨ：酸化型メディエータオキシドレダクターゼは、前述の再生基質として、Ｌ−メチオニン、アデノシン３',５'−ビスホスフェート＋スルフィト、２'−デオキシリボヌクレオシド−ジホスフェート、２'−デオキシリボヌクレオシド−トリホスフェート、Ｌ−ホモシステイン＋スルフィト＋アセテート、若しくはＬ−システイン＋スルフィト＋アセテートを使用する場合に選択される酵素であり、次の反応を触媒する酵素であれば、その由来については限定されない
ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+＋酸化型メディエータ＝ＮＡＤＰ+＋還元型メディエータ。
【００４９】
本発明のチオレドキシン類測定用電極を構成するメディエータは、酵素と導電性基体間の電子授受反応を促進し、測定感度・電流密度を高めるために電極系に含有される物質である。本発明の酵素電極に使用される電子伝達メディエータとしては、上記のような物質である限り特に限定されないが、例えば、中心金属としてＯｓ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｖ、Ｍｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｔｉ、Ｉｒ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｗのなかから選ばれる少なくとも１種の元素を含み、この中心金属への配位子としてピロール、ピラゾール、イミダゾール、１,２,３−または１,２,４−トリアゾール、テトラゾール、２,２'−ビイミダゾール、ピリジン、２,２'−ビチオフェン、２,２'−ビピリジン、２,２'：６',２'−ターピリジン、エチレンジアミン、ポルフィリン、フタロシアニン、アセチルアセトン、キノリノール、アンモニア、シアンイオン、トリフェニルホスフィンオキサイド、シクロペンタジエニル環およびそれらの誘導体をもつ金属錯体、メタロセン類(例えばフェロセン、１,１'−ジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸、フェロセンカルボキシアルデヒド等のフェロセン誘導体）、オスミウム、ルテニウム、コバルト、ニッケル等の金属とビピリジンとから形成されるビピリジン錯体、フェリシアンイオン、オクタシアノタングステン酸イオン、オクタシアノモリブデン酸イオン等の金属錯体イオン、フェナジンメトサルフェート、１−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、キノン類(例えばキノン、ベンゾキノン、ナフトキノン、アントラキノン、ピロロキノリンキノン、１,２−ナフトキノン−４−スルホン酸、２−ヒドロキシ−１,４−ナフトキノン、ジメチルベンゾキノン、ハイドロキノン、テトラシアノキノジメタンなど)およびそれらの誘導体、フェナジン、フェノチアジン、ビオローゲン、ベンジルビオローゲン、２,６−ジクロロフェノールインドフェノール(ＤＣＩＰ)、メチレンブルー、メルドーラブルー、トルイジンブルー、ガロシアニン、チオニン、ジメチルジスルホン化チオニン、ニューメチレンブルー、ブリリアントクレジルブルー、レソルフィン、アリザリンブリリアントブルー、サフラニン、およびこれらの誘導体などを挙げることができる。
【００５０】
電子メディエータは、本発明の酵素電極に全構成成分の０．５〜１０重量％、好適には１〜５重量％含有される。
【００５１】
これらの電子メディエータは本発明の効果を損なわない範囲でその２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００５２】
本発明のチオレドキシン類測定用電極を構成する導電性基体は、導電性が高く、電極が使用される条件において充分な電気化学安定性を有する材料が好適に使用できる。このような導電性部材の構成材料の例としては、金属、導電性高分子、金属酸化物、及び炭素材料などを挙げることができる。
【００５３】
本発明のチオレドキシン類測定用電極における酵素の固定化は、酵素電極作製について酵素を導電性基体の物理的近傍に捕捉するために用いられる、当業者にとって公知の方法で作製しうるものである。具体的方法としては、例えば以下に述べる（１）から（３）の方法を挙げることができる。
【００５４】
（１）共有結合法
導電性基体表面に直接官能基を導入し、この官能基と酵素とを共有結合させて酵素を固定化する。あるいは、導電性基体に接触して配置した担体に官能基を導入し、この官能基と酵素とを共有結合させて酵素を固定化する。
【００５５】
このような共有結合に利用できる官能基として例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、ヒドラジノ基、チオシアネート基、エポキシ基、ビニル基、ハロゲン基、酸エステル基、リン酸基、チオール基、ジスルフィド基、ジチオカルバメート基、ジチオホスフェート基、ジチオホスホネート基、チオエーテル基、チオ硫酸基、チオ尿素基を挙げることができる。
【００５６】
また、アルキルチオールのチオール基が金などの金属に作用して結合し容易に単分子膜(自己組織化単分子膜)を形成できることを利用し、アルキルチオールのアルキル基に予め導入した官能基を介して共有結合により酵素を金属に結合させて酵素を固定化する。
【００５７】
アルキルチオールのアルキル基に予め導入した官能基と酵素との共有結合は、例えば二官能性試薬を用いて形成することができる。代表的な二官能性試薬としては、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ,Ｎ'−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−スクシニミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−(４−マレイミドブチリロキシ)スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−(６−マレイミドカプロイロキシ)スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−(８−マレイミドカプリロキシ)スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−(１１−マレイミドウンデカノイロキシ)スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ[２−(１−ピペラジニル)エチル]マレイミド・二塩酸、ジスルホン化合物(例えば、ジビニルスルホン化合物など)等が挙げられる。
【００５８】
また導電性基体に接触して配置する担体としてはアガロース、アガロース分解物、κ−カラギーナン、寒天、アルギン酸、ポリアクリルアミド、ポリイソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール、およびこれらの共重合体等が挙げられる。
【００５９】
（２）吸着法（その１）
導電性基体と酵素との疎水性相互作用を利用した物理吸着法により酵素を固定化する。導電性基体への酵素の物理的吸着が不可能あるいは不十分である場合には、酵素が物理的吸着を起す担体を介して酵素を固定化できる。このような担体としては、ポリアリルアミン、ポリリジン、ポリビニルピリジン、アミノ基で変性したデキストラン(たとえばＤＥＡＥ−デキストラン）、キトサン、ポリグルタメート、ポリスチレンスルホン酸、硫酸デキストラン等のポリアニオンやポリカチオンからなる担体を用いることができる。担体と酵素との静電相互作用を利用したイオン結合法により酵素を担体に固定し、この酵素固定化担体を導電性基体に接触させ配置する。
【００６０】
（３）吸着法（その２）
遺伝子組換えタンパク質の精製を容易にするために用いられる各種のアフィニティータグを利用して固定化する。例えば、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジンタグを利用して酵素を固定化する。
【００６１】
本発明の酵素固定化電極における酵素の固定量は、特に限定されず、広い範囲で変えることができる。例えば、導電性基体表面１平方ミリメートルあたり０．０１ユニットから１００ユニットである。
【００６２】
本発明のチオレドキシン類測定方法は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(ＮＡＤＰＨ)、上記反応層に含まれる前記チオレドキシン再生酵素の基質、並びに電子伝達物質を含む水溶液を、試料と混合して試料溶液を調製する工程、上記工程で得られた試料溶液を、少なくとも、本発明のチオレドキシン類測定用電極が有する作用電極、対極に接触させて、試料溶液を介して電気回路を形成する工程、チオレドキシン類測定用電極が有する作用電極と対極の間に電圧を印加して、作用電極の表面で該電子伝達物質の酸化反応または還元反応を行いながら、作用電極における電流または積算電荷量を測定する工程、およびその測定された値からチオレドキシンの濃度を算出する工程を含む。
【００６３】
上記電気回路を形成する工程は、作用電極、対極および場合により参照電極をポテンショスタット等の電圧印加および電流検出装置に接続することをいう。
【００６４】
上記試料溶液を調製する工程は、本発明のチオレドキシン類測定用電極が有する作用電極上で、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、上記反応層に含まれる前記チオレドキシン再生酵素の基質、並びに電子伝達物質を含む水溶液と、試料とを混合することとしてもよい。
【００６５】
本発明のチオレドキシン類測定用電極において、導電性基体に印加される適当な範囲の電圧は、使用するメディエータの酸化還元電位により規定される。
【００６６】
本発明のチオレドキシン類測定用電極を用いたチオレドキシン類測定装置は、本発明のチオレドキシン類測定用電極を物質の検知部位として用いることを特徴とする。代表的な構成としては、チオレドキシン類測定用電極を作用電極として、参照電極及び対極とセットで使用して、チオレドキシン類測定用電極で電極に固定した酵素の機能により検知可能な電流または電荷量の積算値を検知して、これらの電極が接している液体中のチオレドキシンの検出に利用する構成を挙げることができる。図９に本発明のチオレドキシン類測定用電極を用いたチオレドキシン類測定装置の一例を示す。
【００６７】
本発明のチオレドキシン類測定用電極を用いたチオレドキシン類測定装置における電気的信号は、前記電流または電荷量の積算値の他、電位やインピーダンスを測定してもよい。
【００６８】
本発明のチオレドキシン類測定用電極表面を粗化して表面積を増大すること、電極の表面にバックグラウンド電流を低減する処理を施すことが好ましく行われる。この処理の例としては、化学的に電極を修飾する方法や物理的に修飾することが挙げられる。具体例として、前者としてはチオール化合物やシラン化合物の吸着が挙げられ、後者としては電極表面をフッ素樹脂膜や透析膜で覆うことが挙げられる。またこれらの手法は、単独で用いてもよいし、組み合わせて使用してもよい。
【００６９】
本発明の装置の好ましい一つの形態は、疾患の診断、疾患の経過観察を行うことができることである。疾患の例としては、肺疾患、循環器疾患、肝疾患、消化器疾患、腎疾患、糖尿病、後天性免疫不全症候群、腫瘍、皮膚疾患を挙げることができる。また、チオレドキシンを医薬として使用する場合には、チオレドキシンの投与前および後に、それぞれその効果を評価することができる。
【実施例】
【００７０】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明の方法はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００７１】
（実施例１）酵素の調製
[チオレドキシンレダクターゼ]
ヒト胎盤由来のｃＤＮＡライブラリを鋳型にして、合成オリゴＤＮＡ：
5'-GCTACTAAAAATGAACGGCCCTGAAG-3'［配列番号１］および
5'-TCCACACTGGGGCTTAACCTCAGCA-3'［配列番号２］
をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、約１,５００ｂｐのＤＮＡ増幅産物を得る。
【００７２】
このＤＮＡ増幅産物を鋳型にして順次プライマー伸長反応を行い、配列番号３で表されるＤＮＡ増幅産物を得る。
【００７３】
このＤＮＡ増幅産物を制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化切断し、ｐＥＴ−４５ｂ(＋)(Ｎｏｖａｇｅｎ社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、Ｈｉｓ−ＴＸＮＲＤ１発現ベクターｐＥＴ４５−ＴＸＮＲＤ１を作製する。
【００７４】
[還元型メディエータ：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ（フェレドキシンＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ）]
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２から常法に従いゲノムＤＮＡを調製する。このゲノムＤＮＡを鋳型にして、合成オリゴＤＮＡ：
5'-aataatCATatggctgattgggtaacaggcaaagtcact-3' (NdeI)［配列番号４］および
5'-aataatCTCGAGccagtaatgctccgctgtcatatggcccgg-3' (XhoI)［配列番号５］
をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、約７５０ｂｐのＤＮＡ増幅産物［配列番号６］を得る。
【００７５】
このＤＮＡ増幅産物を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化切断し、ｐＥＴ−２１ｂ(＋)(Ｎｏｖａｇｅｎ社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ＦＰＲ−Ｈｉｓ発現ベクターｐＥＴ２１−ＦＰＲを作製する。
【００７６】
[ＮＡＤＰＨ：酸化型メディエータオキシドレダクターゼ（ジアフォラーゼ）]
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０から常法に従いゲノムＤＮＡを調製する。このゲノムＤＮＡを鋳型にして、合成オリゴＤＮＡ：
5'-aataatCATATGcttgtgaatgtactgatcgtccacgctcac-3' (NdeI)［配列番号７］、および
5'-aataatCTCGAGcgtcagcgggtacaacgcttcatcgaa-3' (XhoI)［配列番号８］
をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、約７３０ｂｐのＤＮＡ増幅産物［配列番号９］を得る。
【００７７】
このＤＮＡ増幅産物を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化切断し、ｐＥＴ−２１ｂ(＋)(Ｎｏｖａｇｅｎ社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ｐｐｕＤｐ−Ｈｉｓ発現ベクターｐＥＴ２１−ｐｐｕＤｐを作製する。
【００７８】
[Ｌ−メチオニンＳ−オキシドレダクターゼ]
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＵＴＩ８９から常法に従いゲノムＤＮＡを調製する。このゲノムＤＮＡを鋳型にして、合成オリゴＤＮＡ：
5'-aataatCATatgagcacgattaaagtgagatgtgagcaaatg-3' (NdeI)［配列番号１０］および
5'-aataatCTCGAGaccgttgatttcttcgccgttttcgccatc-3' (XhoI)［配列番号１１］
をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、約４５０ｂｐのＤＮＡ増幅産物［配列番号１２］を得る。
【００７９】
このＤＮＡ増幅産物を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化切断し、ｐＥＴ−２１ｂ(＋)(Ｎｏｖａｇｅｎ社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ｍｓｒＢ−Ｈｉｓ発現ベクターｐＥＴ２１−ｍｓｒＢを作製する。
【００８０】
発現ベクターｐＥＴ４５−ＴＸＮＲＤ１、ｐＥＴ２１−ＦＰＲ、ｐＥＴ２１−ｐｐｕＤｐおよびｐＥＴ２１−ｍｓｒＢをそれぞれ個別に、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１(ＤＥ３)に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【００８１】
得られたそれぞれの形質転換体を、抗生物質アンピシリンを添加したＬＢ培地１０ｍＬで一晩プレカルチャーした後、その０．２ｍＬを、１００ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３０℃、１７０ｒｐｍで４時間振とう培養する。その後ＩＰＴＧを添加(終濃度１ｍＭ)し、３７℃で４〜１２時間培養を続ける。ＩＰＴＧ誘導した形質転換体を集菌(８０００×ｇ、２分、４℃)し、１／１０量の４℃ＰＢＳに再懸濁する。凍結融解および超音波処理により菌体を破砕し、遠心(８０００×ｇ、１０分、４℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、それぞれの誘導発現されたＨｉｓタグ融合タンパク質を、ニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【００８２】
（実施例２）
本発明のチオレドキシン類測定用電極を用いて試料中のチオレドキシン類を測定するための装置における感応部の基本構造を、図１に示す。
【００８３】
この感応部は、大まかには、反応槽カバー、反応槽壁、基板、絶縁層からなる。反応槽カバーは、例えば粘着剤付のＰＥＴ樹脂であり、これには試料の導入口とエアの排出口が設けられ、それぞれ反応槽の対角に位置している。反応槽壁は、例えばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）からなり、基板の電極上に一定量の試料(一例をあげると５００μＬ)が保持できるように設計されている。基板には、例えばポリイミドを用い、基板上には作用極、対極、参照極を有し、それぞれの電極は、スルーホールを通して基板の背面に接続され、リードを通じて集電パッドに接続されている。スルーホールとリードは、あらかじめ銅張りポリイミド基板のめっき、フォトリソグラフィーによって形成しておく。作用極は、ポリアミノアニリン処理したグラッシーカーボン電極を使用する。グラッシーカーボン棒から円筒形の薄片を切り出し、仮の基板に導電性ペーストで接着する。背面からリードを取り、ポリアミノアニリン処理用の参照極、対極を使用して、電極を０．０１Ｍの２−ニトロアニリンを含む１．０Ｍの硫酸水溶液中で、カーボン電極に対し、ポテンショスタットを用いて電位を印加する。１．５Ｖを１０秒、−０．５Ｖを５０秒のサイクルを１時間繰り返した後、−０．５Ｖを１０分間印加、その後水洗する。水洗後、仮の基板から取り外し、センサ基板へ導電性ペーストで接着する。対極は、基板上にＴｉ／Ｐｔをスパッタ製膜することによって調製する。膜厚は、一例としてＴｉ:１００ｎｍ、Ｐｔ:２００ｎｍを挙げる。参照極は、対極と同様にＴｉ／Ｐｔを形成した後に、さらにスパッタでＡｇ層を形成し、その後、塩化処理を行うことで調製する。Ａｇ層の膜厚は、一例として５００ｎｍを挙げる。Ａｇ層の厚さは、使用環境、時間により膜厚を最適化する必要がある。Ａｇ層の塩化処理としては、ＦｅＣｌ3の５０ｍＭ水溶液に１０分間浸漬することで行う。電極上には、一定組成、一定量の試薬層が塗布される。
【００８４】
試薬層の組成として、アルギン酸に固定化されたビオローゲン誘導体５０ｎｍｏｌ(ビオローゲン分子相当)、ＮＡＤＰＨ １μｍｏｌ、フェレドキシンＮＡＤＰ+レダクターゼ ０．１ユニット、チオレドキシンレダクターゼ １ユニット、Ｌ−メチオニンＳ−オキシドレダクターゼ １ユニットとする。
【００８５】
比較のために上記試薬層の組成のうち、Ｌ−メチオニンＳ−オキシドレダクターゼを除いた組成の試薬層を塗布した電極を作製する。
【００８６】
前記アルギン酸に固定化されたビオローゲン誘導体の合成法について説明する。４,４’−ビピリジンに等モルのヨウ化メチル、１,４−ジブロモブタンを加え、オートクレーブ中１１０℃で６時間反応させる。得られた生成物から原料を減圧溜去で除き、水溶性成分をシリカゲルのカラムにかけ、目的とする１−メチル−ｌ−１'−ブロモブチル−４,４'−ビピリジン臭化物、ヨウ化物塩(ＢｒＢｕＶ)を得る。市販のアルギン酸ナトリウム(分子量２００００)２８．７ｍｇと０．１５ｍｍｏｌの１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸(ＥＤＣ)を２０ｍＬの水に溶かす。４０分攪拌した後、市販のポリエチレンオキサイドジアミン０．７５ｍｍｏｌを加え、さらに１時間攪拌する。この溶液を水に対して２４時間透析し、ＢｒＢｕＶ ０．３ｍｍｏｌを加え５℃で水に対し１２時間透析することで、アルギン酸に固定化されたビオローゲン誘導体を得る。
【００８７】
測定部をポテンショスタットに接続し、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０中にチオレドキシンを含む溶液を調製する。そこに再生基質としてＬ−メチオニン−Ｓ−オキシドを１０ｍＭの濃度になるように加え３７℃に調温、窒素バブリングした後、測定部の注入口より添加し、参照極に対し−０．９Ｖの電位を作用極に印加する。
【００８８】
電位を印加し始めてからの経過時間を横軸に、その時点までの積算電荷量を縦軸に、プロットすると、図２のような傾向を示すことがわかる。すなわちチオレドキシンの濃度の増大と共に、積算電荷量が増大し、積算電荷量は時間経過とともに増加し続けることがわかる。
【００８９】
比較のためにチオレドキシン再生酵素を除いた電極を用いた場合には、図４に示すように観測される電流値は時間経過とともに減少してしまい、積算電荷量については図５に示すように、チオレドキシン濃度に応じた上限以上には増加しないことがわかる。
【００９０】
図３は、本発明の酵素電極を用いた場合と、比較として再生酵素を除いた電極を用いた場合の、６００秒間の積算電荷量を指標としたチオレドキシンの検量線の一例を示す。再生酵素を有しない酵素電極に比べて、本発明の酵素電極では約５００から１０００倍の検出感度をもつことがわかる。
【００９１】
（実施例３）
実施例２の電極上に塗布される試薬層の組成として、アルギン酸に固定化されたビオローゲン誘導体５０ｎｍｏｌ(ビオローゲン分子相当)、ＮＡＤＰＨ １μｍｏｌ、フェレドキシンＮＡＤＰ+レダクターゼ ０．１ユニット、チオレドキシンレダクターゼ １ユニット、チオレドキシンペルオキシダーゼ １ユニットとする。
【００９２】
比較のために前記試薬層の組成のうち、チオレドキシンペルオキシダーゼを除いた組成の試薬層を塗布した電極を作成する。
【００９３】
再生基質として過酸化水素１０ｍＭを加えたチオレドキシン溶液を調製し実施例２と同様にして積算電荷量を測定した。チオレドキシンの検量線を作成すると再生酵素を有しない酵素電極に比べて、本発明の酵素電極では約５００から１０００倍の検出感度をもつことがわかる。
【００９４】
（実施例４）
試薬層の組成として、アルギン酸に固定化されたフェロセン誘導体５０ｎｍｏｌ(フェロセン分子相当)、ＮＡＤＰＨ １μｍｏｌ、ジアフォラーゼ ０．１ユニット、チオレドキシンレダクターゼ １ユニット、Ｌ−メチオニンＳ−オキシドレダクターゼ １ユニットとする。
【００９５】
比較のために前記試薬層の組成のうち、Ｌ−メチオニンＳ−オキシドレダクターゼを除いた組成の試薬層を塗布した電極を作製する。
【００９６】
再生基質としてＬ−メチオニン１０ｍＭを加えたチオレドキシン溶液を調製し実施例２と同様にして積算電荷量を測定した。チオレドキシンの検量線を作成すると、再生酵素を有しない酵素電極に比べて、本発明の酵素電極では約５００から１０００倍の検出感度をもつことがわかる。
【００９７】
（実施例５）
ホスホアデニリル−スルフェートレダクターゼの調製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２から常法に従いゲノムＤＮＡを調製する。このゲノムＤＮＡを鋳型にして、合成オリゴＤＮＡ：
5'-aataatCATatgtccaaactcgatctaaacgccctgaacgaa-3' (NdeI)[配列番号１３]および
5'-aataatCTCGAGcccttcgtgtaacccacattccctttttaa-3' (XhoI)［配列番号１４］
をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、約７５０ｂｐのＤＮＡ増幅産物［配列番号１５］を得る。
【００９８】
このＤＮＡ増幅産物を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化切断し、ｐＥＴ−２１ｂ(＋)(Ｎｏｖａｇｅｎ社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ｃｙｓＨ−Ｈｉｓ発現ベクターｐＥＴ２１−ｃｙｓＨを作製する。
【００９９】
発現ベクターｐＥＴ２１−ｃｙｓＨをＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０１００】
得られたそれぞれの形質転換体を、抗生物質アンピシリンを添加したＬＢ培地１０ｍＬで一晩プレカルチャーした後、その０．２ｍＬを、１００ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３０℃、１７０ｒｐｍで４時間振とう培養する。その後ＩＰＴＧを添加(終濃度１ｍＭ)し、３７℃で４〜１２時間培養を続ける。ＩＰＴＧ誘導した形質転換体を集菌(８０００×ｇ、２分、４℃)し、１／１０量の４℃ＰＢＳに再懸濁する。凍結融解および超音波処理により菌体を破砕し、遠心(８０００×ｇ、１０分、４℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、それぞれの誘導発現されたＨｉｓタグ融合タンパク質を、ニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０１０１】
（実施例６）
実施例２の電極上に塗布される試薬層の組成として、アルギン酸に固定化されたビオローゲン誘導体５０ｎｍｏｌ(ビオローゲン分子相当)、ＮＡＤＰＨ １μｍｏｌ、フェレドキシンＮＡＤＰ+レダクターゼ ０．１ユニット、チオレドキシンレダクターゼ １ユニット、ホスホアデニリル−スルフェートレダクターゼ １ユニットとする。
【０１０２】
比較のために前記試薬層の組成の内、ホスホアデニリル−スルフェートレダクターゼを除いた組成の試薬層を塗布した電極を作製する。
【０１０３】
再生基質として３'−ホスホアデニリル−スルフェートレダクターゼ １０ｍＭを加えたチオレドキシン溶液を調製し実施例２と同様にして積算電荷量を測定し、チオレドキシンの検量線を作成すると再生酵素を有しない酵素電極に比べて、本発明の酵素電極では約５００から１０００倍の検出感度をもつことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明によれば、測定試料中に含まれるチオレドキシンの量が微量であっても、再生基質が存在する限り、電気的信号強度が時間経過とともに減衰することなく、チオレドキシンの濃度に依存した強度の電気的信号を継続して検出・測定することが出来る。
【０１０５】
測定操作は、試料に対して本発明のチオレドキシン類測定用電極を浸漬し、適当な範囲の電圧を印加するだけで、自発的に進行するため、ＥＬＩＳＡ法のような複雑な実験手順を踏む必用はなく、高度の専門性も要求されない。このため測定試料液のチオレドキシンを高感度で迅速に、簡易に定量することが可能となるため有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】酵素電極を用いたチオレドキシン濃度センサ感応部の概略図である。
【図２】酵素電極を用いて測定した積算電荷量の時間経過の一例である。
【図３】本発明の酵素電極を用いた場合と、比較として再生酵素を除いた電極を用いた場合の、積算電荷量を指標としたチオレドキシンの検量線の一例である。
【図４】再生酵素を除いた比較の酵素電極を用いて測定した電流値の時間経過の一例である。
【図５】再生酵素を除いた比較の酵素電極を用いて測定した積算電荷量の時間経過の一例である。
【図６】本発明の酵素電極を用いた場合と、比較として再生酵素を除いた電極を用いた場合の、積算電荷量の時間経過の一例である。
【図７】本発明のチオレドキシン類測定用電極の第１の態様の作用機序の一例を示す図である。
【図８】本発明のチオレドキシン類測定用電極の第２の態様の作用機序の一例を示す図である。
【図９】本発明のチオレドキシン類測定用電極を用いたチオレドキシン類測定装置の一例を示す図である。
【符号の説明】
【０１０７】
１  反応槽カバー
２  反応槽壁
３  基板
４  絶縁層
５  試料導入口、エア排出口
６  反応槽
７  参照極
８  作用極
９  対極
１０  試薬層
１１  リード
１２  集電パッド
１３  スルーホール
１４  導電性基体
１５  反応層
１６  チオレドキシンレダクターゼ
１７  酸化型チオレドキシン
１８  還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
１９  還元型チオレドキシン
２０  酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
２１  還元型メディエータ
２２  還元型メディエータ：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ
２３  酸化型メディエータ
２４  酸化型再生基質
２５  チオレドキシン再生酵素
２６  還元型再生基質
２７  ＮＡＤＰＨ：酸化型メディエータオキシドレダクターゼ
【図１】
2009002689.tif 000003
【図２】
2009002689.tif 000004
【図３】
2009002689.tif 000005
【図４】
2009002689.tif 000006
【図５】
2009002689.tif 000007
【図６】
2009002689.tif 000008
【図７】
2009002689.tif 000009
【図８】
2009002689.tif 000010
【図９】
2009002689.tif 000011
【配列表】
2009002689000001.app