(57)【要約】【課題】安定性、生体適合性、滅菌耐性に優れたキトサン微粒子を製造にする技術を提供することを目的とする。【解決手段】本発明によれば、キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子の製造方法であって、カルボキシメチルデキストラン溶液にキトサン溶液を混入しキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子を形成させる工程を含む方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子の製造方法であって、
カルボキシメチルデキストラン溶液にキトサン溶液を混入しキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子を形成させる工程を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造方法において、前記キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子を形成させる工程は、
前記カルボキシメチルデキストラン溶液の攪拌下に前記キトサン溶液を少量ずつ混入する工程である方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の製造方法において、
カルボキシメチルデキストランを中性域緩衝液に溶解することによって前記カルボキシメチルデキストラン溶液を作る工程を含む方法。
【請求項４】
請求項１から３の何れか一項に記載の製造方法において、
キトサンを強酸性溶媒に溶解し、ｐＨ調節剤でｐＨ４．０〜５．５に調節することによって前記キトサン溶液を作る工程とをさらに含む方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の製造方法において、前記中性域緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水である方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載の製造方法において、前記ｐＨ調節剤が炭酸重炭酸緩衝液である方法。
【請求項７】
請求項４から６の何れか一項に記載の製造方法において、前記強酸性溶媒が乳酸水溶液である方法。
【請求項８】
請求項１から７の何れか一項に記載の製造方法において、前記キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子を形成させる工程終了時の前記カルボキシメチルデキストラン溶液と前記キトサン溶液の混合物のｐＨ値が６．５〜７．６である方法。
【請求項９】
請求項１から８の何れか一項に記載の製造方法において、
前記キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子を水溶液に懸濁しキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液を作る工程と、
該水溶液または該懸濁液に単糖類または二糖類に含有させる工程とをさらに含む方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の製造方法において、前記単糖類または二糖類がキシロースまたはラクトースである方法。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の製造方法において、
前記キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液を高圧蒸気滅菌処理する工程を含む方法。
【請求項１２】
請求項１から１１の方法により製造されるキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子。
【請求項１３】
水溶液と前記水溶液中に懸濁されている請求項１２に記載のキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子とを含むキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液。
【請求項１４】
単糖類または二糖類をさらに前記水溶液中に含有する請求項１３に記載のキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液。
【請求項１５】
水溶液と前記水溶液中に溶解している単糖類または二糖類とを含むキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子の保存液。
【請求項１６】
β−ラクタム系抗生物質を内包した、請求項１２に記載のキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子。
【請求項１７】
ラクトースを含む水溶液と、前記水溶液中に懸濁されている請求項１６に記載のキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子とを含む、キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を用いたキトサン微粒子の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デキストランは、主に１，６結合したＤ−グルコース残基から成る親水性多糖類であり、良好な生分解性および生体適合性を有する（非特許文献１）ため、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）やデキストラン誘導体が薬物運搬体として研究されてきた。例えば、ＳＧＰ（シアリル糖鎖ポリペプチド）−ＣＭＤコンジュゲートは、抗サルモネラ症作用（非特許文献２）を延長する；ＣＭＤ−グラフト−ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）の遺伝子トランスファーのベクターは、高い形質移入効率（非特許文献３）を有する；腫瘍診断の為のＣＭＤ皮膜磁気微粒子は良好な細胞適合性を示す（非特許文献４）；ＣＭＤ誘導体であるＣＭＤＢＳ（カルボキシメチルデキストランベンジルアミンスルホン酸エステル）は、抗ＨＩＶ−Ｉ感染作用、抗血液凝固作用および抗癌効果を有する（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）ことが報告されている。
【０００３】
キトサンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとグルコサミンがβ（１−４）グリコシド結合している生物分解可能な直鎖ポリマーであって、天然に大量に存在するカチオン多糖類である。キトサンは、医学、バイオ、農業、工業の分野に、広範囲に適用されている。例えば、保存料（非特許文献８）、農業殺虫剤（非特許文献９）、重金属吸着吸収剤（非特許文献１０）、プラスミド回収のための陰イオン交換吸着剤（非特許文献１１）およびＤＮＡデリバリーシステム（非特許文献１２）などに利用されている。さらに、キトサンはコレステロール濃度の抑制（非特許文献１３）、補体活性化（非特許文献１４；非特許文献１５）、止血剤（非特許文献１６）として、製薬分野においても広く研究されてきた。最近では、キトサンは、生理活性物質（薬物またはタンパク質）の担体、特に徐放性を有する担体としても注目されており、微粒子化の方法が様々に研究されている（非特許文献１７）。
【０００４】
特許文献１は、キトサンとカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）とが結合してゲル状となった高分子電解質複合体とその製造方法を開示する。
【０００５】
非特許文献１８は、ポリカチオン性を有するキトサンとポリアニオン性を有するトリポリリン酸（ＴＰＰ）間のイオン架橋結合を利用したキトサン−ＴＰＰ微粒子の製造方法を開示する。非特許文献１９は、キトサン−ＣＭＣ微粒子およびキトサン−ＴＰＰ微粒子の生物応用性を開示する。非特許文献２０は、キトサン−ＴＰＰ微粒子の粒子サイズについて開示する。非特許文献２１は、水酸化ナトリウムを使用して製造したキトサン微粒子を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２４７９６７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cai Q., Wan Y, Bei J. and Wang S. 2003. Synthesis and characterization of biodegradable polylactide-grafted dextran and its application as compatilizer. Biomaterials. 24(20):3555-62.
【非特許文献２】Sugita-Konishi Y., Kobayashi K., Sakanaka S., Juneja LR and Amano F. 2004. Preventive effect of sialylglycopeptide-nondigestive polysaccharide conjugates on Salmonella infection. J. Agric. Food Chem. 52: 5443-5448.
【非特許文献３】Sun YX, Zhang XZ, Cheng H, Cheng SX and Zhuo RX. 2008. A low-toxic and efficient gene vector: carboxymethyl dextran-graft-polyethylenimine. J Biomed Mater Res A. 84(4):1102-10.
【非特許文献４】Wagner K., Kautz A., Roder M., Schwalbe M., Pachmann K., Clement JH and Schnabelrauch M. 2004. Synthesis of oligonucleotide-functionalized magnetic nanoparticles and study on their in vitro cell uptake. 18: 514-519.
【非特許文献５】Seddiki N., Mbemba E., Letourneur D., Ylisastigui L., Benjouad A., Saffar L., Gluckman JC, Jozefonviez J. and Gattegno L. 1997. Antiviral activity of derivatized dextrans on HIV-1 infection of primary macrophages and blood lymphocytes. Biochimica et Biophysica Acta 1362: 47-55.
【非特許文献６】Raucourt E., Mauray S., Chaubet F., Maiga-Revel O., Jozefowicz M. and Fischer AM. 1998. Anticoagulant activity of dextran derivatives. J Biomed Mater Res. 41: 49-57.
【非特許文献７】Hamma-Kourbali Y., Starzec A., Vassy R., Martin A., Kraemer M., Perret G.. and Crepin M. 2003. Carboxymethyl benzylamide dextran inhibits angiogenesis and growth of VEGF-overexpressing human epidermoid carcinoma xenograft in nude mice. British Journal of Cancer. 89: 215 - 221.
【非特許文献８】Tsai GJ, and Huang SP. 2002. Effects of chitosan on the growth and intestinal surface integrity of hamster. Food Sci. Agri. Chem. 4: 57-61.
【非特許文献９】Rabea EI., El Badawy M., Rogge TM., Stevens CV., Steurbaut W., Hofte M. and Smagghe G. 2006. Enhancement of fungicidal and insecticidal activity by reductive alkylation of chitosan. Pest Manag Sci. 62(9):890-7.
【非特許文献１０】Septhum C., Rattanaphani S., Bremner JB. and Rattanaphani V. 2007. An adsorption study of Al(III) ions onto chitosan. J Hazard Mater. 2007 Sep 5;148(1-2):185-91.
【非特許文献１１】Tiainen P., Galaev I. and Larsson PO.2007. Plasmid adsorption to anion-exchange matrices: comments on plasmid recovery. Biotechnol J. 2(6):726-35.
【非特許文献１２】Nafee N., Taetz S., Schneider M., Schaefer UF. and Lehr CM. 2007. Chitosan-coated PLGA nanoparticles for DNA/RNA delivery: effect of the formulation parameters on complexation and transfection of antisense oligonucleotides. Nanomedicine. 3(3):173-83.
【非特許文献１３】van Bennekum AM., Nguyen DV, Schulthess G., Hauser H. and Phillips MC. 2005 Mechanisms of cholesterol-lowering effects of dietary insoluble fibres: relationships with intestinal and hepatic cholesterol parameters.Br J Nutr. Sep;94(3):331-7.
【非特許文献１４】Minami, S., Suzuki, H., Okamoto, Y., Fujinaga, T. and Shigemamsa, Y. 1998. Chitin and chitosan activate complement via the alternative pathway. Carbohydr. polym., 36: 151-155.
【非特許文献１５】Suzuki K, Miyatake K, Okamoto Y, Muraki E, and Minami S. 2003. Influence of the chain length of chitosan on complement activation. Carbohydrate polymers. 54:465-469.
【非特許文献１６】Yang J., Tian F., Wang Z., Wang Q., Zeng YJ. and Chen SQ. 2008. Effect of chitosan molecular weight and deacetylation degree on hemostasis. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 84(1):131-7.
【非特許文献１７】Agnihotri SA., Mallikarjuna NN. and Aminabhavi TM. 2004. Recent advances on chitosan-based micro- and nanoparticles in drug delivery. Journal of Controlled Release 100 : 5 -28.
【非特許文献１８】Blanco MD., Gomez C., Olmo R., Muniz E. and Teijion JM. 2000. Chitosan microspheres in PLG films as devices for cytarabine release. International Journal of Pharmaceutics, 202: 29-39.
【非特許文献１９】Athanasiou KA., Niederauer G.G..and Agrawal CM., 1996. Sterilization, toxicity, biocompatibility and clinical applications of polylactic acid/polyglycolic acid copolymers. Biomaterials 17: 93-102.
【非特許文献２０】Gan Q., Wang T., Cochrane C. and McCarron P. 2005. Modulation of surface charge, particle size and morphological properties of chitosan-TPP nanoparticles intended for gene delivery. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 44:65-73.
【非特許文献２１】Shi Z., Neoh KG.., Kang ET. and Wang W. 2006. Antibacterial and mechanical properties of bone cement impregnated with chitosan nanoparticles. Biomaterials 27:2440-2449.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
【０００９】
非特許文献１９に記載されているキトサン−ＣＭＣ微粒子およびキトサン−ＴＰＰ微粒子は感熱性であり、滅菌処理が困難であるので、滅菌耐性に改善の余地を有していた。
【００１０】
非特許文献２０に記載されているキトサン−ＴＰＰ微粒子の粒子サイズは、ｐＨ５．０の溶液中では製造後１日で増加し、キトサン−ＴＰＰ微粒子懸濁液のｐＨ値を７．０に調整した場合では、粒子サイズが１８０ｎｍから５５０ｎｍまで増加したので、安定性に改善の余地を有していた。
【００１１】
非特許文献２１に記載されている水酸化ナトリウムを使用して製造したキトサン微粒子は、遠心分離による回収後に水で十分にリンスしても、望ましくない影響を誘導する可能性がある残余の水酸化ナトリウムを完全に取り除くことは出来なかったので、生体適合性に改善の余地を有していた。    
【００１２】
このように従来のキトサン微粒子は、トリポリリン酸（ＴＰＰ）あるいはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）との混合で作製されているが、安定性、生体適合性、滅菌耐性に乏しく、生物応用に耐えるものは示されていない。
【００１３】
本発明は前記事情に鑑みてなされたものであり、安定性、生体適合性、滅菌耐性に優れたキトサン微粒子を製造する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明によれば、キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子の製造方法であって、カルボキシメチルデキストラン溶液にキトサン溶液を混入しキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子を形成させる工程を含む方法を提供する。この方法は、生体適合性の高いカルボキシメチルデキストランを用いて製造する。従って、この方法で製造されたキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は生体適合性に優れている。
【００１５】
本発明によれば、カルボキシメチルデキストラン溶液にキトサン溶液を混入することによって製造したキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子を提供する。本発明のキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は、生体適合性の高いカルボキシメチルデキストランを用い、生体応用可能なｐＨ範囲で製造されている。従って、本発明の製造方法によるキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は生体適合性に優れている。
【００１６】
本発明によれば、水溶液と前記水溶液中に溶解している単糖類または二糖類とを含むキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子の保存液を提供する。本発明のキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子の保存液は、単糖類または二糖類を含有し、そのため保存性に優れている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法によれば、生体適合性が高いカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を使用してキトサン微粒子を製造するため、生物応用性が高く、加えて安定性と滅菌耐性に優れているという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は高圧蒸気殺菌処理前（Ａ）と処理後（Ｂ）のキトサン−ＣＭＤ微粒子のＳＥＭ画像を示した図である。
【図２】図２は高圧蒸気殺菌処理前（Ａ）と処理後（Ｂ）のキトサン−ＣＭＤ微粒子の粒度分布データを示した図である。
【図３】図３はキシロース含有、ラクトース含有または無含有のキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液の吸光度の経日変化を示した図である。
【図４】図４はさまざまな単糖類または二糖類含有、または無含有のキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液の吸光度の経日変化を示した図である。
【図５】図５はキトサン乳酸溶液のｐＨ調節を４Ｎの水酸化ナトリウムまたは炭酸重炭酸緩衝液（ｐＨ１０．４）を使用して行ったキトサン−ＣＭＤ微粒子のＳＥＭ画像を示した図である。
【図６】図６（参考例１）は高圧蒸気殺菌処理前（Ａ）と処理前（Ｂ）のキトサン−ＴＰＰ微粒子のＳＥＭ画像を示した図である。
【図７】図７はｈｕｍａｎ  ＨｅＬａ細胞をキトサン−ＣＭＤ微粒子と混合し、インキュベート後の細胞の生存割合と、キトサン−ＣＭＤ微粒子の濃度の関係を示したグラフである。
【図８】図８は３Ｔ６マウス線維芽細胞をキトサン−ＣＭＤ微粒子と混合し、インキュベート後の細胞の生存割合と、キトサン−ＣＭＤ微粒子の濃度の関係を示したグラフである。
【図９】図９は緩衝液中へのセフメタゾールの放出の割合と、セフメタゾールを内包したキトサン−ＣＭＤ微粒子の懸濁液をインキュベートした時間の関係を示したグラフである。
【図１０】図１０はセフメタゾールの吸光波長である２７５  ｎｍのピークの高さの減少の割合と、セフメタゾールを内包したキトサン−ＣＭＤ微粒子の懸濁液をインキュベートした時間の関係を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
＜用語の説明＞
本願明細書では、「微粒子」なる用語は平均粒子径（例えば体積平均値）１ｎｍ〜１μｍの粒子を指し、ナノ粒子およびサブミクロン粒子を含んでもよい。一般に、ナノ粒子は、微粒子の中でも粒子の直径が１〜１００ｎｍ程度の超微粒子である。サブミクロン粒子は、粒子の直径が１００〜１０００ｎｍ程度の微粒子である。粒子径の測定方法は、遠心沈降光透過法、Ｘ線透過法、レーザー回析散乱法、遮光法、電気的検知法、光子相関法、クロマトグラフィー法、気相法、遠心沈降重量法および画像解析法を含んでもよい。
【００２０】
本願明細書で使用する「カルボキシメチルデキストラン」または「ＣＭＤ」は、以下の化学式を有する。
【化１】
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【００２１】
本願明細書で使用する「キトサン」は、以下の化学式を有する。
【化２】
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【００２２】
以下、本発明の実施の形態について説明する。本発明の方法は、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を用い、キトサンの正に帯電したアミノ基とＣＭＤの負に帯電したカルボキシル基間の向イオン性反応によって、微粒子を製造する。向イオン性の結合反応を利用する微粒子の製造方法は、従来法に比較して製造工程が簡略であり、毒性化学物質架橋剤を使用しないという利点がある。
【００２３】
カルボキシメチルデキストランの分子量は微粒子の所望の強度と所望の大きさに応じたものであって、水溶性のものが選択される。従って、カルボキシメチルデキストランの分子量は１０００００〜１００００００が好ましく、１２０００〜２００００がより好ましい。カルボキシメチルデキストランの置換度は、０．１〜２．５が好ましく、０．２６〜０．６５がより好ましい。この範囲の置換度を有するカルボキシメチルデキストランは向イオン性反応のために十分な官能基を有する。
【００２４】
キトサンの分子量は、微粒子の所望の強度と所望の大きさに応じたものであって、少なくとも酸性溶媒に可溶である。キトサンはどの分子量でも酸に溶解する為、どの分子量でも良いが、特に３００００〜９００００ものが好ましい。キトサンの脱アセチル化の程度は７０〜１００％が好ましく、９５〜１００％がより好ましい。この範囲の脱アセチル化の程度を有するキトサンは、向イオン性反応のために十分な官能基を有する。
【００２５】
キトサンは酸性溶媒に溶解する。酸性溶媒に用いる酸は、生体に対し毒性の低いものであることが望ましい。従って、乳酸、酢酸が好ましい。本願明細書における酸性溶媒はｐＨ７未満の溶媒を指す。酸性溶媒は、例えば酸の水溶液であって、キトサンを十分に溶解する目的から、強酸性であることが望ましい。本願明細書における強酸性はｐＨ２．０〜３．０を意味する。酸性溶媒のｐＨ値は、１．０〜４．０が好ましく、２．０〜３．０がさらに好ましい。酸性溶媒中の酸の濃度は、使用する酸の種類、溶解するキトサンの量などに依存して変化するが、酸性溶媒が十分なキトサン溶解性を有するために必要な濃度である。従って、酸性溶媒の濃度は０．５〜１０．０ｍｇ／ｍｌが好ましく、１．０〜５．０ｍｇ／ｍｌがさらに好ましい。
【００２６】
キトサンを強酸性溶媒に溶解した液は、ｐＨ調節されてもよい。製造する微粒子の生体応用性を高めるためにｐＨ値は７．４に近づけることが好ましいが、キトサンを強酸性溶媒に溶解した液中のキトサンはｐＨ値６．５以上では析出する。これらを考慮し、キトサンを強酸性溶媒に溶解した液は、ｐＨ調節剤を用いて調製する。調製されたキトサン溶液のｐＨ値は４．０〜５．５が好ましく、４．０〜５．０がさらに好ましい。
【００２７】
キトサンを強酸性溶媒に溶解した液のｐＨ調節に用いるｐＨ調節剤は、生体に対し毒性の低いものが望ましい。ｐＨ調節剤はアルカリ性のものであって、キトサンを強酸性溶媒に溶解した水溶液のｐＨ値を４．０〜５．５に調節できるものが望ましい。ｐＨ調節剤は、炭酸ナトリウム、炭酸重炭酸緩衝液、水酸化ナトリウム、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液が好ましい。
【００２８】
強酸性溶媒に溶解するキトサンの濃度は、カルボキシメチルデキストラン溶液と混合した際に必要十分な結合反応が生じる目的により選択されるので、キトサンの濃度は、０．５〜１０．０ｍｇ／ｍｌが好ましく、１．０〜５．０ｍｇ／ｍｌがさらに好ましい。
【００２９】
カルボキシメチルデキストランは緩衝液に溶解される。緩衝液は中性域（ｐＨ６．０〜８．０）で十分な緩衝能を有するものが選択される。本願明細書の中性域用緩衝液は、ｐＨ値が４．０〜５．５のキトサン溶液を加えても、中性域で十分な緩衝作用が働くものである。カルボキシメチルデキストランを溶解する中性域緩衝液は、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液、トリス緩衝生理食塩水、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液が好ましい。
【００３０】
適当な緩衝液に溶解したカルボキシメチルデキストランの濃度は、キトサン溶液と混合した際に必要十分なゲル化反応が生じる濃度が望ましい。カルボキシメチルデキストランの濃度は、０．２〜２．０ｍｇ／ｍｌが好ましく、０．３〜１．０ｍｇ／ｍｌがさらに好ましい。カルボキシメチルデキストラン水溶液のｐＨ値は使用する緩衝液に依存し、７．０〜９．０が好ましく、７．２〜７．６がさらに好ましい。
【００３１】
キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子の製造方法は、キトサン溶液とカルボキシメチルデキストラン溶液を混合することを含む。混合方法は、キトサン溶液中のキトサンとカルボキシメチルデキストラン溶液中カルボキシメチルデキストランの結合反応が十分に起こり、効率よくキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子が形成される方法であればよい。例えば、混合方法は、キトサン溶液がカルボキシメチルデキストラン溶液中に少量ずつ混じることに応じて微粒子が形成される方法であってもよい。少量とは製造方法や製造スケールに応じて変わるが、例えば３０ｍｌのカルボキシメチルデキストラン溶液に３０ｍｌのキトサン溶液を混入する場合は、１分間に１００μｌ〜１０ｍｌの量が好ましく、１分間に２ｍｌ〜５ｍｌの量がさらに好ましい。少量ずつ混入する方法は、スポイトを用いて滴下する方法や棒を伝わせて流下する方法であってもよい。少量ずつ混入することによって、キトサン溶液とカルボキシメチルデキストラン溶液の混合液のｐＨ値の大きな変動を抑制する。これは、キトサンの析出を防止し、またキトサンの正に帯電した官能基とカルボキシメチルデキストランの負に帯電した官能基のイオン性架橋結合反応を安定的に進めるためである。
【００３２】
カルボキシメチルデキストラン溶液またはカルボキシメチルデキストラン溶液とキトサン溶液の混合液の攪拌は、カルボキシメチルデキストラン溶液とキトサン溶液の混合開始直前から混合中および混合終了時後も続ける。例えば、カルボキシメチルデキストラン溶液の攪拌下にキトサン溶液を滴下する。混合開始直前から混合中の攪拌は、キトサンとカルボキシメチルデキストランの反応を促進する目的で行う。混合終了時後の攪拌は、キトサンの正に帯電した官能基とカルボキシメチルデキストランの負に帯電した官能基の反応が終了し、形成された微粒子が安定するまで行う。例えば、キトサン溶液の滴下終了後から少なくとも１０分間続けることが好ましく、２０分間以上続けることがより好ましい。
【００３３】
生物適用範囲を広げるためには、混合終了時の混合物のｐＨ値が６．０〜８．０程度であることが好ましく、６．３〜７．６がより好ましい。本発明の実施形態において、カルボキシメチルデキストランを緩衝液に溶解した溶液は十分な緩衝能を有するものであり、酸性のキトサン溶液を混合しても混合液が持続的にｐＨ値６．０〜８．０の範囲外になることはない。
【００３４】
キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は適切な方法によって、キトサン溶液とカルボキシメチルデキストラン溶液の混合物から分離回収される。分離は、遠心分離またはろ過で行われることが好ましい。分離したキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は、水溶液に懸濁され、好ましくは脱イオン水、蒸留水、滅菌水、生理食塩水に懸濁される。
【００３５】
キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子の製造方法は、安定化剤を用いて貯蔵安定性または粒子分散安定性を高める工程を含んでもよい。本発明で用いる安定化剤は、単糖類または二糖類であって、好ましくはグルコース、ラクトース、キシロース、フルクトース、スクロース、ガラクトースまたはこれらの組み合わせであり、最も好ましくはキシロース、ラクトースである。単糖類または二糖類は、キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液の粘度が粒子分散性に影響を与えない濃度範囲で含有される。従って、単糖類または二糖類の濃度は、１〜５０ｍｇ／ｍｌが好ましく、１０ｍｇ／ｍｌがより好ましい。
【００３６】
キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子の製造方法は、滅菌処理工程を含んでもよい。滅菌することにより、生体応用範囲が広がることが期待できる。キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液は、オートクレーブ処理により高圧蒸気滅菌可能である。オートクレーブ処理の条件は、１１５〜１３２℃、１０〜６０分が好ましく、１２１〜１３２℃、２０〜３０分がより好ましい。
【００３７】
また、培養液中において、キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子が細胞の増殖抑制に影響を及ぼす程度、または活性化に影響を及ぼす程度を、該微粒子を含む培地と含まない培地それぞれを用いて細胞を培養し、培養後の生存細胞数を比較することで評価しておくことが好ましい。なぜなら、該微粒子を生体内の標的細胞への薬物運搬体として用いた場合に、生体への安全性を担保できるからである。細胞増殖を抑制しなければ安全であり、薬物運搬体として好適に利用できる。
【００３８】
標的細胞としては、線維芽細胞が選ばれることが好ましい。なぜなら、後述する実施例において、線維芽細胞の増殖を抑制しないことが、実験データより実証されているためである。なお、一般に、線維芽細胞は皮膚の機能を保つ上で最も重要な細胞であり、結合組織を構成する細胞の１つである。
【００３９】
また、標的細胞は線維芽細胞である必要はなく、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞、間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞や幹細胞もしくは癌細胞などでも良い。ＨｅＬａ細胞の場合は、後述する実施例において、高濃度の該微粒子を培地に含むとわずかにではあるが増殖が抑制されている。そのため、ＨｅＬａ細胞のように増殖抑制効果が見られる細胞においては、キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は、より低濃度で、薬物運搬体として好適に利用可能な濃度で使用することが好ましい。
【００４０】
さらに、標的細胞の生物由来に特に制限はない。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）由来の細胞であっても良く、特にマウスであることが好ましい。なぜなら、後述する実施例において、培養液中のキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子がマウス由来の線維芽細胞の増殖を抑制しないことが、実験データより実証されているためである。
【００４１】
キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子に含まれるキトサンは、脱アセチル化の割合が８０％のキトサン（キトサンＤＡＣ８０）が好ましく、１００％のキトサン（キトサンＤＡＣ１００）であることがより好ましい。なぜなら、後述する実施例において、上記両方のキトサンを使用しても線維芽細胞の増殖をほとんど抑制しないことと、キトサンＤＡＣ１００を添加した場合においては増殖効率が上昇することが、実験データより実証されているためである。また、ＨｅＬａ細胞を用いた後述の実施例においては、キトサンＤＡＣ８０を使用した場合よりも、キトサンＤＡＣ１００を使用した場合の方が増殖効率が良いことが実証されていることから、やはりキトサンＤＡＣ１００であることが好ましい。
【００４２】
セフメタゾールを内包したキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子が懸濁している緩衝液には単糖類または二糖類を含んでいてもよく、例えば単糖類と二糖類はそれぞれキシロースとラクトースでも良く、ラクトースであることがより好ましい。なぜなら、後述する実施例において、ラクトースを含んでいることにより、セフメタゾールの安定性が向上していることが、実験データより実証されているためである。特に、４８〜２１６時間の期間において安定性が向上しており、好ましい。安定性が向上していることは、例えば、抗菌剤として使用する場合に所望の抗菌効果が期待できるという利点である。
【００４３】
また、本実施形態において、キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子に内包する化学物質は特に限定しないが、抗生物質でも良く、その中でもβ−ラクタム系抗生物質が好ましい。β−ラクタム系抗生物質は構造式の中にβラクタム環を持つ抗生物質であり、例えば、ペニシリン系抗生物質（アンピシリン、シクラシリン、アモキシシリン、アスポキシシリン、バカンピシリン、レナンピシリン、ピブメシリナム、スルタミシリン、タランピシリン、カリンダシリン、ピペラシリン、スルベニシリン、チカルシリン、クロキサシリン、フルクロキサシリン、ベンジルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン、フェネチシリンなど）、セフェム（セファロスポリン）系抗生物質（セフタジジム、セフォジジム、セフジトレンピボキシル、セフェタメトピボキシル、セフチブテン、セフジニル、セフィキシム、セフェピム、セフカペンピボキシル、セフスロジン、セフテラムピボキシル、セフメノキシム、セフポドキシムプロキセチル、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム、セフォペラゾン、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフォゾプラン、セフチゾキシムなど）、ペネム系抗生物質（ファロペネムなど）、セファマイシン系抗生物質（セフブぺラゾン、セフォキシチン、セフミノクス、セフメタゾール、セフォテタンなど）などで、特にセフメタゾールであることが好ましい。なぜなら、後述する実施例において、該微粒子がセフメタゾールを長時間多量に、安定性を保ったまま内包できることが、実験データより実証されているためである。このことは、例えばキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子を薬物運搬体として利用し、セフメタゾールを内包した該微粒子を抗菌剤として生体に投与した場合に、患部において長時間安定した抗菌効果が期待できることを表す。
【００４４】
キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は、高圧蒸気滅菌済みであることが好ましい。なぜなら、細菌やウイルス、芽胞を死滅させることができるので、製造品質の向上や、薬物運搬体として利用する場合の生体への安全性向上などの利点があるためである。なお、高圧蒸気滅菌をすると薬剤内包の安定性が落ちることがあるので、長時間薬物を内包する必要がある場合には注意が必要である。ただし、後述する実施例において、４８時間以内であれば放出する薬剤は８％以下とわずかであるので、高圧蒸気滅菌済みである場合は、そのような時間で使用できる製剤設計や使用形態にすることが好ましい。
【００４５】
以下、本実施形態の作用効果について説明する。
【００４６】
本実施形態の方法は、キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子の製造方法であって、カルボキシメチルデキストラン溶液にキトサン溶液を混入しキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子を形成させる工程を含む方法である。カルボキシメチルデキストランは、生体適応が高い。したがって、上記方法によって製造されたキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は生体適応が高いという効果を有する。
【００４７】
本実施形態の方法において、上記キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子を形成させる工程は、上記カルボキシメチルデキストラン溶液の攪拌下に上記キトサン溶液を少量ずつ混入する工程である方法であってもよい。また、本実施形態の方法において、カルボキシメチルデキストランを中性域緩衝液に溶解することによって上記カルボキシメチルデキストラン溶液を作る工程を含む方法であってもよい。さらに、本実施形態の方法において、キトサンを強酸性溶媒に溶解し、ｐＨ調節剤でｐＨ４．０〜５．５に調節することによって上記キトサン溶液を作る工程とをさらに含む方法であってもよい。上記方法は、キトサン微粒子を生理活性物質の生物学的活性を損なわない範囲のｐＨ値で製造される方法である。したがって、上記方法によって製造されたキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は生物応用性が高いという効果を有する。
【００４８】
本実施形態の方法において、上記中性域緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水であってもよい。本実施形態の方法において、上記ｐＨ調節剤が炭酸重炭酸緩衝液であってもよい。本実施形態の方法において、上記強酸性溶媒が乳酸水溶液であってもよい。リン酸緩衝生理食塩水、炭酸重炭酸緩衝液および乳酸は、生体に対し毒性がないかあるいは毒性が非常に低い。したがって、上記方法によって製造されたキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は生物応用性が高いという効果を有する。
【００４９】
本実施形態の方法において、上記キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子を形成させる工程終了時の上記カルボキシメチルデキストラン溶液と上記キトサン溶液の混合物のｐＨ値が６．５〜７．６である方法であってもよい。キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は中性で安定である。したがって、本実施形態の方法によって製造されたキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は生物応用性が高いという効果を有する。
【００５０】
本実施形態の方法において、上記キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子を水溶液に懸濁しキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液を作る工程と、該水溶液または該懸濁液に単糖類または二糖類に含有させる工程とをさらに含む方法であってもよい。単糖類または二糖類は、粒子分散安定性が維持する時間を延長する。したがって、本実施形態の方法によって製造されたキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液は粒子分散安定性に優れ、貯蔵安定性が高いという効果を有する。
【００５１】
本実施形態の方法において、上記単糖類または二糖類がキシロースまたはラクトースである方法であってもよい。キシロースまたはラクトースは、特に粒子分散安定性が維持する時間を延長する。したがって、本実施形態の方法によって製造されたキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液は粒子分散安定性に優れ、貯蔵安定性が高いという効果を有する。
【００５２】
本実施形態の方法において、上記キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液を高圧蒸気滅菌処理する工程を含む方法であってもよい。キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は滅菌耐性を有する。したがって、本実施形態の方法によって製造された高圧蒸気滅菌処理済のキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液は、生体適用性が高いという効果を有する。
【００５３】
本発明の他の実施形態は、上記のキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子である。本実施形態の微粒子は、生体適応性の高い材料を使用し、生体適応性の高いｐＨ範囲で反応を実施するため、生物応用性が高いという特徴を有する。
【００５４】
本発明のさらに他の実施態様は、水溶液とその水溶液中に懸濁されているキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子とを含むキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液である。本実施形態の微粒子の懸濁液は、生体適応性の高い材料を使用するため、生物応用性が高いという特徴を有する。
【００５５】
本実施形態の懸濁液において、上記キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液は単糖類または二糖類を含有してもよい。単糖類または二糖類は、キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液の粒子分散性を維持する。したがって、本実施形態のキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子懸濁液は、貯蔵安定性に優れているという効果を有する。
【００５６】
本発明の他の実施態様は、水溶液とその水溶液中に溶解している単糖類または二糖類とを含むキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子の保存液である。単糖類または二糖類は、キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子の粒子分散性を維持する。したがって、本実施形態のキトサン微粒子の保存液は、安定剤である単糖類または二糖類を含むため、保存性に優れているという効果を有する。
【００５７】
本発明の他の実施態様は、β−ラクタム系抗生物質を内包したキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子である。キトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は、細胞の増殖を抑制せず、また、β−ラクタム系抗生物質を長時間安定的に内包することができる。そのため、β−ラクタム系抗生物質を内包したキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子は、抗菌剤として生体に投与した場合に、安全であり、患部において長時間安定した抗菌効果を有する。
【００５８】
本発明の他の実施態様は、β−ラクタム系抗生物質を内包したキトサン−カルボキシメチルデキストラン微粒子と、ラクトースを含む水溶液とを含む懸濁液である。ラクトースを含んでいることによりセフメタゾールの安定性が向上し、懸濁液中に放出したセフメタゾールがより機能している。そのため、ラクトースを含む懸濁液として保存していれば、抗菌剤として使用した場合により強い抗菌効果を発揮できる。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。  
【００６０】
実施例で使用する材料は以下のとおりである。
キトサン（分子量  ５４７００、脱アセチル化の程度：１００％、甲陽ケミカル社）
カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）（分子量  １２０００  、置換度：０．２６、シグマアルドリッチ社）
乳酸（試薬特級、ナカライテスク社）
【００６１】
以下の試薬は、和光純薬工業から購入し、更なる精製をしないで使用した：
無水炭酸ナトリウム塩（Ｎａ２ＣＯ３）
重炭酸ナトリウム塩（ＮａＨＣＯ３）
ＰＢＳ粉（ｐＨ  ７．４）  ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水の略。
キシロース
ラクトース水和物
グルコース
フルクトース
スクロース
ガラクトース
【００６２】
実施例１：キトサン−カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）微粒子の調製
キトサンを１．０％（ｖ／ｖ）の乳酸水溶液に濃度２．０ｍｇ／ｍｌで溶解し、炭酸重炭酸緩衝液（ｐＨ  １０．４）でｐＨを４．３５に合わせた。ＣＭＤは、濃度０．５ｍｇ／ｍｌで、ＰＢＳ緩衝液に溶解した。ＣＭＤ−ＰＢＳ溶液のｐＨ値は７．４であった。
【００６３】
室温において、３０ｍｌのＣＭＤ−ＰＢＳ溶液を２０００ｒｐｍ（ＬＴ４００Ｄスターラー、ヤマト科学社）の速度で攪拌し、この攪拌下のＣＭＤ−ＰＢＳ溶液に３０ｍｌのキトサン乳酸溶液を滴下することで、キトサン−ＣＭＤ微粒子が自発的に形成された。反応終了時のキトサン乳酸溶液とＣＭＤ−ＰＢＳ溶液の混合物のｐＨ値は６．８であった。攪拌は、微粒子を安定させるためキトサン乳酸溶液の滴下終了後から２０分間続けた。
【００６４】
キトサン−ＣＭＤ微粒子は、温度１５℃、回転数５０００ｒｐｍで３０分の遠心分離（大容量高速遠心機７７８０、久保田商事社）によって分離した。分離したキトサン−ＣＭＤ微粒子はｐＨ７．０の脱イオン水に懸濁した。
【００６５】
実施例２：キトサン−ＣＭＤ微粒子の特性
微粒子の形態解析は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＪＯＥＬ−ＪＳＭ  ５８００、日本電子社）を使用して行った。微粒子の粒度は、島津レーザ回折式粒度分布測定装置ＳＡＬＤ２０００Ａ（島津製作所）を使用して計測した。実施例１で得られたキトサン−ＣＭＤ微粒子のＳＥＭ画像を図１Ａに示す。粒子サイズがほぼ均一であることがわかる。図２Ａに示すように、実施例１で得られたキトサン−ＣＭＤ微粒子の平均粒子径（体積平均）６３７ｎｍであった。また、実施例１で得られたキトサン−ＣＭＤ微粒子は、最終ｐＨ値６．８の液中で形成され、ｐＨ値７．０の脱イオン水に懸濁したものであるが、少なくとも反応終了直後においては、ｐＨ値６．８〜７．０の溶液中であっても、大多数の粒子が分散性を維持していることが、ＳＥＭ画像（図１Ａ）および粒度分布測定値（図２Ａ）により推定できる。
【００６６】
実施例３：微粒子の粒子分散安定性評価
単糖類または二糖類の存在下におけるキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液の粒子分散安定性は、分光光度法による吸光度の経日変化によって評価した。これは、微粒子が貯蔵中に凝集した場合、微粒子懸濁液の吸光度は増加することに依る。各単糖類または二糖類はそれぞれ、実施例１で調整したキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液に濃度１０ｍｇ／ｍｌで加えた。懸濁液のｐＨ値は７．０であった。単糖類または二糖類無含有のキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液をコントロールとして使用した。単糖類または二糖類含有または無含有のキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液は、吸光度を計測するまで恒温（２０℃）で貯蔵した。吸光度は、イムノリーダー（ＮＪ−２３００、日本インターメッド社）を用いて波長４１４ｎｍで計測した。吸光度は、貯蔵前と貯蔵後に適当な時間的間隔で繰り返し計測した。また、１回の計測につき最低３つの測定値を評価した。ｔ検定またはペアワイズ多重比較方法による一方向の分散分析は、それぞれ二グループまたは多数のグループを比較するために実行した。全ての分析はＳＰＳＳプログラムを使用して決定し、差はｐ＜０．０５のレベルで有意性を考慮した。図３において、コントロールである無含有キトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液は貯蔵開始後２日目には吸光度は上昇しており、粒子分散安定性は１日であった。コントロールと比較して、キシロースまたはラクトースを含有したキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液（ｐＨ７．０）は、貯蔵開始後１０日の間に吸光度に大きな変動が無かった。これは、キシロース添加またはラクトース添加により粒子分散安定性が改良されたことを意味する。すなわち、キシロースまたはラクトース含有キトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液はｐＨ７．０において１０日間の貯蔵安定性を有することを示す。さらに、図４に示すように、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトースの含有のキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液では、粒子分散安定性はｐＨ７．０において４〜６日持続した。
【００６７】
表１  キトサンーＣＭＤ微粒子懸濁液の粒子分散安定性：
各粒子の分散性が維持できた日数    （ｐ＞０．０５）
コントロール（糖類または二糖類無含有）        １日
ガラクトース含有                                ４日
グルコース含有                                ６日
スクロース含有                                ６日
フルクトース含有                              ６日
キシロース含有                              １０日
ラクトース含有                              １０日
【００６８】
実施例４：キトサン−ＣＭＤ微粒子の滅菌処理耐性
実験例１のとおりに調製したキトサン−ＣＭＤ微粒子を、オートクレーブ処理（１２１℃、３０分）により高圧蒸気滅菌し、滅菌処理後のキトサン−ＣＭＤ微粒子の形態をＳＥＭによって確認した。図１に示す高圧蒸気滅菌前後のＳＥＭ画像の比較では、キトサン−ＣＭＤ微粒子の形状は１２１℃、３０分の高圧蒸気滅菌後に損害を受けていない。これは、キトサン−ＣＭＤ微粒子が感熱性を有しないことを意味する。
【００６９】
実施例５：水酸化ナトリウムを用いて製造したキトサン−ＣＭＤ微粒子
キトサンを１．０％（ｖ／ｖ）の乳酸溶液に濃度２．０ｍｇ／ｍｌで溶解し、４Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを４．３５に合わせた。その他の材料と方法は実施例１と同様である。
図５に示すように、キトサンと乳酸溶液の混合液のｐＨ値を調整するために水酸化ナトリウムを使用した場合と、炭酸重炭酸緩衝液を使用した場合とで、得られたキトサン−ＣＭＤ微粒子の形態に違いはなかった。
【００７０】
参考例１：キトサン−ＴＰＰ微粒子の滅菌処理
非特許文献１８のとおりに調製したキトサン−ＴＰＰ微粒子を、オートクレーブ処理（１２１℃、３０分）により高圧蒸気滅菌し、滅菌処理後のキトサン−ＴＰＰ微粒子の形態をＳＥＭによって確認した。図６に示す高圧蒸気滅菌前後のＳＥＭ画像を比較では、キトサン−ＴＰＰ微粒子の形状は１２１℃、３０分の高圧蒸気滅菌後に崩壊し、粒子同士が接着している。これは、キトサン−ＴＰＰ微粒子が滅菌耐性を有しないことを意味する。すなわち、高圧蒸気滅菌耐性は、ＣＭＤを用いて製造したキトサン微粒子が有する特異的性質であることがわかる。
【００７１】
実施例６：ＨｅＬａ細胞におけるキトサン−ＣＭＤ微粒子の細胞毒性活性の評価
ＨｅＬａ細胞における、高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子と高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子の、細胞毒性への影響を評価した。まず、ｈｕｍａｎ  ＨｅＬａ細胞を、１０％のウシ胎児血清と、１％の抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｏｔｉｃ（ペニシリン：１０００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン：１０００μｇ／ｍｌ、アンホテリシンＢ：２５μｇ／ｍｌ）、ＧＩＢＣＯ）を添加したＭｉｎｉｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｅａｇｌｅ培地で培養した。ＨｅＬａ細胞は、湿度５％のＣＯ２  を含んだ環境下で３７℃に維持した。そのＨｅＬａ細胞を、９６−ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ  ｐｌａｔｅｓ内の２００  μｌの生育培地に、５×１０３  細胞数／ウェルの密度で蒔き、２４時間インキュベートした。次に、生育培地を、ポリマー（２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）を含む、新しいＭＥＭ培地に置換した。そして、それぞれのウェルの培養液１００μｌ  に、高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液と高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液をそれぞれ１００μｌ  ずつ加え、４８時間インキュベート後、生存細胞をＭＴＴアッセイで分析した。
【００７２】
ＭＴＴアッセイとは、一般的に、生存細胞量や増殖能を評価する方法である。以下にＭＴＴとＭＴＴアッセイの原理について説明する。ＭＴＴとはテトラゾリウム塩の一種３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅで、水溶性で黄色の溶液である。細胞内に取り込まれると細胞内のミトコンドリアにある脱水素によってホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）に変化する。ホルマザンは青色の非水溶性の結晶で生成後は沈殿する。これをＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）などの有機溶媒で溶解させると赤紫色の溶液となるので、赤紫色の吸光波長である５７０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定することによって、ホルマザン量がわかる。そして、上記ホルマザン量を細胞の活性、即ち生存細胞量の指標として、生存細胞量や増殖能を評価する方法がＭＴＴアッセイである。
【００７３】
図７に示すように、ＨｅＬａ細胞におけるＭＴＴアッセイの結果、キトサン−ＣＭＤ微粒子の濃度依存的に細胞毒性がみられ、培養後の生存細胞が減少した（図中のＳＮＰは高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子を用いたことを表し、ＮＰは高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子を用いたことを表す）。高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子は、高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子よりも細胞毒性が穏やかであった。また、含有するキトサンの脱アセチル化の割合が８０％の場合のキトサン−ＣＭＤ微粒子より、１００％の場合のキトサン−ＣＭＤ微粒子の方が、細胞毒性が低く、生存細胞が多かった。このことは、含有するキトサンの脱アセチル化の割合が１００％であるキトサン−ＣＭＤ微粒子が、生体適合性が高いことを表し、例えば薬物運搬体として使用する場合に有用であることを示している。
【００７４】
実施例７：３Ｔ６マウス線維芽細胞の細胞分裂における、キトサン−ＣＭＤ微粒子の影響の評価
３Ｔ６マウス線維芽細胞における、高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子と高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子の、細胞毒性への影響を評価した。３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで、３Ｔ６マウス線維芽細胞を増殖に適した完全培養液で培養した。増殖に適した完全培養液は、１０％のウシ胎児血清と１％の抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｏｔｉｃ（ペニシリン：１０００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン：１０００μｇ／ｍｌ、アンホテリシンＢ：２５μｇ／ｍｌ）、ＧＩＢＣＯ）をＤｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に添加することで調整した。細胞をトリプシン処理によって集菌し、１×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように新鮮な培養液に再懸濁下した。そして、９６−ｗｅｌｌ  ｆｌａｔ−ｂｏｔｔｏｍｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅｓに１×１０４  細胞数／ウェルの密度で蒔き、３７  °Ｃ  、５％  （ｖ／ｖ）  のＣＯ２  を含む環境下、抗生物質の存在下で４８時間培養した。次に、高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液と、高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液をそれぞれ２５、５０、７５、１００  μｇ／ｍｌの濃度になるように培養液に希釈した。高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子と、高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子の毒性の効果を、１００  μｌの培養液を含むウェルに、１００  μｌの混合液をそれぞれ加えることで評価した。４８時間インキュベーション後、生存細胞をＭＴＴアッセイで分析した。コントロール実験は、完全培養液のみ（無毒性のコントロールを与えるものとして）と、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  （Ｓｉｇｍａ）  （有毒性のコントロールを与えるものとして）を用いることで行った。
【００７５】
図８に示すように、線維芽細胞におけるＭＴＴアッセイの結果、２５、５０、７５、１００  μｇ／ｍｌの濃度のキトサン−ＣＭＤ微粒子は線維芽細胞に対して毒性がないことがわかった（図中のＳＮＰは高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子を用いたことを表し、ＮＰは高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子を用いたことを表す）。特にキトサン−ＣＭＤ微粒子の濃度が７５μｇ／ｍｌの時に、最も増殖効率が高かった。このことは、キトサン−ＣＭＤ微粒子の創傷治癒効果を示している。また、キトサン−ＣＭＤ微粒子の生体適合性が高いことを表し、例えば薬物運搬体として使用する場合にも細胞への毒性を誘起することがなく、有用であることを示している。
【００７６】
実施例８：セフメタゾールを内包したキトサン−ＣＭＤ微粒子の、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬剤放出実験
すでに説明したようにキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液を調整後、１０ｍｌのキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液に８．２５  ｍｇのセフメタゾールを加え４８時間インキュベートした。追加で７４ｍｇのラクトースを同様に加えた。セフメタゾールを内包したキトサン−ＣＭＤ微粒子懸濁液を、４℃、１００００×ｇで３０分間遠心分離し、キトサン−ＣＭＤ微粒子に内包されたセフメタゾールの量を、セフメタゾールの全体量から、上清中のセフメタゾール量を引くことによって測定した。それから４８時間インキュベートし、セフメタゾールを内包したキトサン−ＣＭＤ微粒子を１０ｍｌのＮＰｓ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ  ６．８）  に再懸濁し、１０個のエッペンドルフバイアルに分けた。上記ＮＰｓ  ｂｕｆｆｅｒは、１．０％（ｖ／ｖ）の乳酸水溶液３０ｍｌのｐＨを、ＮａＨＣＯ３  ／  Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ  １０．４）によって４．３５に調整し、その後、ＰＢＳ緩衝液３０ｍｌを室温、攪拌下で加えることで調整した緩衝液である。そして各時点（０、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０時間）で、一つのバイアルを４℃、１００００×ｇで１０分間遠心分離し、上清に放出されたセフメタゾールを分析した。分析にはＳｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ１６０Ｕ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて、セフメタゾールの吸光波長である２７５ｎｍを測定した。
【００７７】
その結果、キトサン−ＣＭＤ微粒子がセフメタゾールを内包した割合は、高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子が２３％、高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子が１１％、懸濁液にラクトースを加えた場合の高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子が３３％、懸濁液にラクトースを加えた場合のラクトースを加えた高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子が１４％であった。
【００７８】
また、図９に示すように、４８時間インキュベート後のセフメタゾールの放出率は、いずれのキトサン−ＣＭＤ微粒子も低く、高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子は７％以下、高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子は１１％以下、ラクトースを加えた場合の高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子は２９％以下、懸濁液にラクトースを加えた場合の高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子は１６％以下であった（図中のＳＮＰは高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子を用いたことを表し、ＮＰは高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子を用いたことを表す）。このことは、キトサン−ＣＭＤ微粒子が効果的にセフメタゾールを内包できることを示している。また、例えば、薬物運搬体として使用する場合にも、患部へ多量の薬剤を運搬できるため、キトサン−ＣＭＤ微粒子が有用であることを示している。
【００７９】
なお、１６８時間インキュベート後の場合は、高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子は２４％以下、高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子は５３％以下、ラクトースを加えた場合の高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子は３６％以下、懸濁液にラクトースを加えた場合の高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子は４８％以下であった。２４０時間インキュベート後の場合は、高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子は４３％以下、高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子は１００％以下、ラクトースを加えた場合の高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子は５２％以下、懸濁液にラクトースを加えた場合の高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子は１００％以下であった。
【００８０】
実施例９：セフメタゾールを内包したキトサン−ＣＭＤ微粒子の、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬剤安定性の評価
セフメタゾールを内包したキトサン−ＣＭＤ微粒子の懸濁液を、遠心分離せずに直接１０個のエッペンドルフバイアルに分けた。そして各時点（０、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０時間）で、一つのバイアルを４℃、１００００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をさらに０．２２μｍのフィルターに通して、キャピラリー電気泳動に供し、ピークの高さをセフメタゾールの濃度の濃さとみなした。
【００８１】
図１０に示すように、ラクトースを加えたグループは、加えてないグループに比べて、より薬剤安定性を示した（図中のＳＮＰは高圧蒸気滅菌済みのキトサン−ＣＭＤ微粒子を用いたことを表し、ＮＰは高圧蒸気滅菌をしていないキトサン−ＣＭＤ微粒子を用いたことを表す）。特に、４８〜２１６時間においてより安定であった。このことは、コロイド性の安定性がラクトースによって与えられ、セフメタゾールの安定性に良い影響をもたらしたことをあらわす。
【００８２】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
以上のように、本発明にかかるキトサン−ＣＭＤ微粒子の製造方法は生体適合性の低い物質を使用しないので、該キトサン−ＣＭＤ微粒子は生物応用性に優れており、農業、工業、食品、化粧品、医薬品、製薬の分野に広く応用できる。特に製薬の分野では、止血剤、コレステロール濃度の抑制剤、補体活性剤、薬物徐放剤、接着剤  、ＤＮＡ運搬システム、薬物運搬体等として有用である。
【００８４】
発明にかかるキトサン−ＣＭＤ微粒子は、貯蔵安定性に優れた、高圧蒸気滅菌可能な微粒子を製造するので、止血剤、コレステロール濃度の抑制剤、補体活性剤、薬物徐放剤、接着剤  、ＤＮＡ運搬システム、薬物運搬体等として有用である。
【００８５】
本発明のキトサン−ＣＭＤ微粒子の製造は、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５程度の反応液中で実施出来るので、ポリペプチド、例えばイムノグロブリンの生物学的活性を損なわずに、キトサン−ＣＭＤ微粒子に内包させることができる。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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