(57)【要約】【課題】  本発明は、上記のような問題点が解消され、複雑な操作を必要とせずに、簡便、迅速かつ安価に、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを製造するための手段を提供することを目的とする。【解決手段】アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成することを特徴とするペプチドの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成することを特徴とするペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記酵素または酵素含有物が、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記微生物が、ストレプトマイセス属またはフィロバクテリウム属に属する微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のペプチドの製造方法。
【請求項４】
前記微生物が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のペプチドの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
【請求項５】
前記微生物が、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが導入された、形質転換微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のペプチドの製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１１９７〜２１９８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１１９７〜２１９８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち塩基番号４１０〜１７０５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち塩基番号４１０〜１７０５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項６】
前記酵素が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載のペプチドの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
【請求項７】
ストレプトマイセス属またはフィロバクテリウム属に属する微生物に由来し、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質。
【請求項８】
下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
【請求項９】
請求項８に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１１９７〜２１９８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１１９７〜２１９８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち塩基番号４１０〜１７０５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち塩基番号４１０〜１７０５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項１１】
前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項９から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｎ末端を保護したアミノ酸とＣ末端を保護したプロリン（Ｐｒｏ）を化学的に縮合する方法が、特開昭６１−１３４３２１号公報（特許文献１）、及び特開昭６２−００００９８号公報（特許文献２）に記載されている。
【０００２】
また、アラニルプロリン（Ａｌａ−Ｐｒｏ）やリジルプロリン（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）の繰り返しをコードするＤＮＡを、細胞系を用いて転写、翻訳した後、酵素的に加水分解する方法が、国際公開第９６／３２４６８号パンフレット（特許文献３）、米国特許第６２０４００８Ｂ１号明細書（特許文献４）に記載されている。
【０００３】
天然物より抽出する方法は、特開２００３−０２４０１２号公報（特許文献５）に記載されている。
【０００４】
２，２−ジクロロプロピオニルクロライドとＬ−プロリンを縮合し、Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリンを誘導する方法は、米国特許公報第５４２４４５４Ａ号（特許文献６）、米国特許公報第５３１９０９８Ａ号（特許文献７）に記載されている。
【０００５】
【特許文献１】特開昭６１−１３４３２１号公報
【特許文献２】特開昭６２−００００９８号公報
【特許文献３】国際公開第９６／３２４６８号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６２０４００８Ｂ１号明細書
【特許文献５】特開２００３−０２４０１２号公報
【０００６】
アミノ酸エステル、もしくはアミノ酸アミドとプロリンの酵素的縮合法も知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上述の方法はいずれも、保護基の導入脱離が必要であるか、多段階のステップが必要であるか、或いは、収率が極めて低いなどの問題点を有していた。
本発明は、上記のような問題点が解消され、複雑な操作を必要とせずに、簡便、迅速かつ安価に、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを製造するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は下記の〔１〕〜〔１３〕を提供する。
〔１〕  アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成することを特徴とするペプチドの製造方法。
〔２〕  前記酵素または酵素含有物が、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、〔１〕に記載のペプチドの製造方法。
〔３〕  前記微生物が、ストレプトマイセス属またはフィロバクテリウム属に属する微生物であることを特徴とする、〔２〕に記載のペプチドの製造方法。
〔４〕  前記微生物が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、〔２〕に記載のペプチドの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
〔５〕  前記微生物が、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが導入された、形質転換微生物であることを特徴とする、〔２〕に記載のペプチドの製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１１９７〜２１９８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１１９７〜２１９８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち塩基番号４１０〜１７０５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち塩基番号４１０〜１７０５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドをコードするポリヌクレオチド
〔６〕  前記酵素が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、〔１〕に記載のペプチドの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
〔７〕  ストレプトマイセス属またはフィロバクテリウム属に属する微生物に由来し、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質。
〔８〕  下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
〔９〕  〔８〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１０〕  下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１１９７〜２１９８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１１９７〜２１９８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち塩基番号４１０〜１７０５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち塩基番号４１０〜１７０５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔１１〕  前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である、〔１０〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１２〕  〔９〕から〔１１〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチド。
〔１３〕  〔１２〕に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを、保護基の導入などの煩雑な操作を行わずに、簡便且つ迅速に、且つ安価に製造することができる。
【００１０】
１．ペプチドの製造方法
本発明のペプチドを製造する方法（以下、「本発明のペプチド製造方法」ともいう）は、所定のペプチド生成活性を有する酵素の存在下で、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端（カルボキシル末端）に有するペプチドを生成する。すなわち、本発明のペプチド製造方法は、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとからプロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成せしめるものである。アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとからプロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する能力を有する酵素または酵素含有物とは、実質的に、下記の化学式で表されるアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとのアシル転移反応による縮合を触媒する能力または活性を有する酵素または酵素含有物のことをいう。
【化１】
2009183255.tif 000002
上記反応式中、Ｒ１はアミノ酸の側鎖、またはペプチドのＣ末端のアミノ酸残基の側鎖を示し、Ｒ２は置換または無置換の炭化水素基を表す。
【００１１】
酵素または酵素含有物を、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンに作用せしめる方法としては、当該酵素または酵素含有物と、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとを混合する方法が挙げられる。より具体的には、酵素または酵素含有物をアミノ酸エステルまたはペプチドとプロリンを含む溶液中に添加して反応せしめる方法を用いることができる。また、当該酵素含有物として当該酵素を生産する微生物を用いる場合には、当該酵素を生産する微生物を上記のように溶液中に添加して反応させる方法の他、当該酵素を生産する微生物を培養し、微生物中または微生物の培養液中に当該酵素を生成・蓄積せしめ、培養液中にアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンを添加する方法などを用いてもよい。生成されたプロリン残基をＣ末端に有するペプチドは、常法により回収し、必要に応じて精製することができる。
【００１２】
「酵素含有物」とは、当該酵素を含む混合物である。酵素含有物は、さらに１種類以上のその他の物質を含みうる。具体的には、微生物の培養など、酵素を生産する工程をその中において行った酵素含有混合物、又はそれをさらに必要に応じて後処理に供したものを、酵素含有物として用いることができる。当該その他の物質には、培地を構成する物質に加え、微生物の細胞、及び微生物の細胞の破片を含みうる。当該後処理としては、培養終了後の培養液からの培地の回収又は菌体の回収；菌体の破砕、溶菌及び凍結乾燥；粗精製等によるその他の物質の一部の除去；共有結合法、吸着法、包括法等による酵素又は酵素を含む構造体（例えば細胞）の固定化；及びこれらの組み合わせが挙げられる。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
【００１３】
また、当該酵素を含む微生物としては野生株を用いても良いし、本酵素を発現した遺伝子組換え株を用いてもよい。当該微生物としては、酵素微生物菌体に限らず、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体処理物を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化菌体、固定化菌体処理物を使用してもよい。
【００１４】
プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性のある酵素を生産できる野生株を用いる場合には、遺伝子組み換え株などを作製する手間なしに、より簡便にペプチド生産を行える点などで好適である。他方、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性のある酵素をより大量生成するように改変された変異株（例えば、前記酵素遺伝子を大量発現可能なように形質転換された遺伝子組み換え株）を用いれば、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドの合成も大量により速く行うことが可能となり得る。すなわち、本発明の方法においては、微生物として、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性のある酵素、例えば、後述する本発明のタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物や、前記酵素遺伝子、例えば、後述する本発明のポリヌクレオチドを発現可能なように形質転換された微生物も、用いることができる。野生株または変異株の微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、当該酵素を蓄積させて、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンに混合して、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成することができる。
【００１５】
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を用いる場合には、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存在することが多い。従って、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤を添加することが可能である。添加量は、例えば０．１ｍＭから３００ｍＭの範囲、好ましくは１ｍＭから１００ｍＭの範囲で適宜定めることができる。
【００１６】
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよい。この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば酵素を用いる場合には、０．０１〜１００ユニット（Ｕ）程度、洗浄菌体を用いる場合は０．１〜５００ｇ／Ｌ程度である。なお、１Ｕは、５０ｍＭのアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとを含む１００ｍＭ  ホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、２５℃の温度条件下で反応させた場合に、１分間により１μｍｏｌｅのプロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成せしめる酵素量とする。
【００１７】
本発明の製造方法において第１の反応原料は、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルである。
【００１８】
アミノ酸エステルを構成するアミノ酸としては、例えば、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸のいずれでもよく、また、天然型のアミノ酸に対応するアミノ酸エステルでも非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するアミノ酸などであってもよい。さらに、アミノ酸としては、α−アミノ酸の他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸なども例示される。好ましいものとして、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジンのそれぞれのエステルが挙げられる。
またエステルとしては、上記アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｉｓｏ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル等が例示され、これらのうちメチルエステル、エチルエステルが好ましい。
本発明において好ましいアミノ酸エステルとしては、Ｌ−アラニンメチルエステル、Ｌ−バリンメチルエステル、Ｌ−ロイシンメチルエステル、Ｌ−イソロイシンメチルエステル、Ｌ−メチオニンメチルエステル、Ｌ−プロリンメチルエステル、Ｌ−セリンメチルエステル、Ｌ−スレオニンメチルエステル、Ｌ−リジンメチルエステル、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、Ｌ−トリプトファンメチルエステル、Ｌ−ヒスチジンメチルエステルが挙げられる。
【００１９】
ペプチドエステルとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合してなるペプチドにおいて、Ｃ末端のアミノ酸残基のカルボキシル基がエステル化されているものを意味する。ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ体、Ｄ体のいずれでもよく、また、天然型でも非天然型でもよく、また置換基を有するなどアミノ酸誘導体であってもよい。ペプチドを構成するアミノ酸の数は、２以上であればよい。またエステルとしては、ペプチドのメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｉｓｏ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル等が例示され、このうちメチルエステル、エチルエステルが好ましい。本発明において好ましいペプチドエステルとしては、アラニルアラニンメチルエステルが挙げられる。
【００２０】
本発明の製造方法において第２の反応原料は、プロリンである。プロリンとしては、Ｌ体とＤ体のいずれでもよいが、Ｌ−プロリンが好ましい。また、本発明の目的に鑑みて、プロリンは保護基を有していないことが望ましい。
【００２１】
出発原料であるアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンの濃度は１ｍＭ〜２Ｍ、好ましくは２０〜６００ｍＭである。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができる。
【００２２】
反応温度は５〜６０℃で、ペプチド生成が可能であり、好ましくは１０〜４０℃である。また反応ｐＨはｐＨ５〜１２で、ペプチド生成が可能であり、好ましくはｐＨ６〜１１である。
【００２３】
２．本発明で用いられる微生物
本発明に使用される微生物としては、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する能力を有する微生物を特に限定なく使用することができる。アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する能力を有する微生物としては、例えば、ストレプトマイセス属、フィロバクテリウム属のそれぞれに属する微生物を挙げることができ、例えばフィロバクテリウム  エスピーおよびストレプトマイセス  エスピーを挙げることができる。そして具体的にはフィロバクテリウム  エスピー  Ｓ１２０１（ＡＪ１１０３１７）、ストレプトマイセス  エスピー  ＡＪ９５８７を挙げることができる。
フィロバクテリウム  エスピー  Ｓ１２０１（ＡＪ１１０３１７）、ストレプトマイセス  エスピー  ＡＪ９５８７は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（日本国茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に平成１９年（２００７年）１１月６日付けで寄託されており、Ｓ１２０１（ＡＪ１１０３１７）の受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−２１４３１、ＡＪ９５８７の受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−２１４３０である。よって、これらはＩＰＯＤより分譲を受けることができる。
【００２４】
これらの微生物としては、野生株または変異株のいずれを用いてもよいし、また、細胞融合もしくは遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導される組み換え株等も用いることができる。
【００２５】
このような微生物の菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
【００２６】
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭化水素類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
【００２７】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、リン酸一カリウム、リン酸二カリウムなどのリン酸塩、硫酸マグネシウムなどの硫酸塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００２８】
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
【００２９】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
【００３０】
３．本発明で用いられる酵素
本発明では、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する能力を有する酵素が用いられる。本発明では、このような活性を有する酵素であれば、その由来、取得方法などの限定なく用いることができる。以下に、本発明の酵素タンパク質、その精製、遺伝子工学的な手法の利用などについて説明する。
【００３１】
（３−１）本発明のタンパク質
本発明のアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとからプロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質は、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンからプロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する能力を有する微生物から入手することができる。例えば上述の本発明に使用される微生物の例として挙げた属の微生物、すなわちストレプトマイセス属またはフィロバクテリウム属に属する細菌などを利用できる。より具体的には上述したフィロバクテリウム  エスピー  Ｓ１２０１（ＡＪ１１０３１７）およびストレプトマイセス  エスピー  ＡＪ９５８７を挙げることができる。
【００３２】
本発明のタンパク質を、上述の微生物から単離・精製する方法を説明する。
【００３３】
まず、微生物の菌体から、超音波破砕等の物理的方法、あるいは細胞壁溶解酵素等を用いた酵素法等により菌体を破壊し、遠心分離等により不溶性画分を除いて菌体抽出液を調製する。このようにして得られる菌体抽出液を、通常のタンパク質の精製法、例えば硫安分画、透析、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて分画することによって、ペプチド生成酵素を精製することができる。
【００３４】
陰イオン交換クロマトグラフィー用の担体としては、ＨｉＬｏａｄ−１６／１０−Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｍｏｎｏ−Ｑ５／５（アマシャムバイオサイエンス社（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）製）が挙げられる。
【００３５】
疎水性クロマトグラフィー用担体としては、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、ＨｉＬｏａｄ−１６／１０−ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＥＴＨ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＩＳＯ（いずれもアマシャムバイオサイエンス社（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させて本酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。
【００３６】
陽イオンクロマトグラフィー用担体としては、ＭｏｎｏＳ  ＨＲ（ファルマシア社（ＧＥヘルスケアサイエンス）製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させて本酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。
【００３７】
ゲル濾過クロマトグラフィー用担体としては、ＨｉＬｏａｄ−１６／６０−Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００ｐｇ（アマシャムバイオサイエンス社（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）製）が挙げられる。
【００３８】
上記精製操作において、本酵素を含む画分は、後述する実施例に示される方法等により、各画分のペプチド生成活性を測定することにより、確認することができる。フィロバクテリウム  エスピー  Ｓ１２０１（ＡＪ１１０３１７）から上記のようにして精製された本酵素の部分アミノ酸配列を、配列表の配列番号５に示す。また、ストレプトマイセス  エスピー  ＡＪ９５８７から上記のようにして精製された本酵素の部分アミノ酸配列を、配列表の配列番号１０に示す。
【００３９】
本発明の、アミノ酸エステルまたはペプチドのエステルとプロリンとからプロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質として、配列番号５または１０に記載のアミノ酸配列をその一部に有するタンパク質を挙げることができる。より具体的には、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質が挙げられる。
【００４０】
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質
【００４１】
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、フィロバクテリウム  エスピー  Ｓ１２０１（ＡＪ１１０３１７）から、本発明者らが新規に単離し、上記のペプチド生成酵素のタンパク質のアミノ酸配列として特定したものである。かかる（Ａ）のタンパク質は、アミノ酸エステルやペプチドエステルと、アミノ酸、ペプチド或いはこれらのアミドなどの誘導体との間でアシル転移活性を発揮する。また、アミノ酸エステル、ペプチドエステルに対しエステラーゼとしての活性を発揮する。特に、（Ａ）のタンパク質は、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性に優れており、この点は後述の実施例において証明されている。
【００４２】
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ストレプトマイセス  エスピー  ＡＪ９５８７から、本発明者らが新規に単離し、上記のペプチド生成酵素のタンパク質のアミノ酸配列として特定したものである。かかる（Ｃ）のタンパク質は、アミノ酸エステルやペプチドエステルと、アミノ酸またはペプチド或いはこれらのアミドなどの誘導体との間で、アシル転移活性を発揮する。また、種々のアミノ酸からなるペプチドに対しエンドペプチダーゼ活性を発揮する。特に、（Ｃ）のタンパク質は、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性に優れており、この点は後述の実施例において証明されている。
【００４３】
本発明のタンパク質には、配列表の配列番号２、および配列番号４のいずれかに記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質も含まれる。具体的には、上記（Ｂ）、（Ｄ）を挙げることができる。
【００４４】
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。また、１若しくは数個のアミノ酸の変異を有する配列は、変異を有さない配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上のホモロジーを有するものとすることができる。ただし、（Ｂ）、（Ｄ）のタンパク質のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、変異を含まない状態でのタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質の場合について説明すると、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。尚、ここでいうホモロジーは、全長のアミノ酸残基数を分母として、比較する二つの配列のうち対応するアミノ酸残基が同一のものの数を分子として算出し、これに１００を乗じて得られる。また、ホモロジーの解析は、Ｇｅｎｅｔｙｘ（株式会社ゼネティックス）を用い、パラメーターを初期設定値として算出しても得られる。
【００４５】
上記（Ｂ）などに示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、上記（Ａ）などに示すアミノ酸配列中の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されるように改変されたアミノ酸配列をあらかじめ設計し、このアミノ酸配列に対応する塩基配列を発現させることによって得られる。
【００４６】
また、上記のような塩基の置換、欠失、および／または挿入等には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、配列表の配列番号２もしくは４に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質が得られる。
【００４７】
タンパク質（Ｂ）及び（Ｄ）は、５０℃、ｐＨ８の条件下で、それぞれの元となるアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、タンパク質（Ｂ）の場合について説明すると、５０℃、ｐＨ８の条件下で、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００４８】
本酵素は、アミノ酸エステルのエステルとアミノ酸との転移反応によりジペプチドを合成する活性を持つ転移酵素であるが、一般に転移酵素と呼ばれるものでも、転移反応、エステル分解反応を共に行うものが多く、アミノ酸エステルのエステルが切れる際にアミノ酸が結合する割合が高ければ転移酵素（transferase）と呼ばれ、水が入る割合が高ければエステラーゼと呼ばれる。
転移酵素活性を保持していることの確認は、対象となるタンパク質をアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとに作用させてプロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成するかどうかを実験して確認することができる。しかし、基質の種類などに応じて個別に解析条件を設定する必要があるため、Ｎ末端の基質特異性を確認するには、便宜的に上記の実験に代えて、対象タンパク質をアミノ酸エステルまたはペプチドに作用させて加水分解反応をみる確認試験を行ってもよい。
【００４９】
（３−２）本発明のポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、形質転換体の作製およびペプチド生成酵素の精製
（３−２−１）ペプチド生成酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明は、上述したペプチド生成酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドは、上述したペプチド生成酵素タンパク質を構成するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであるが、コドンの縮重により、１つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。具体的には、上述の（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドの好ましい具体例としては、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５１】
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１１９７〜２１９８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１１９７〜２１９８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち塩基番号４１０〜１７０５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち塩基番号４１０〜１７０５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとから、プロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００５２】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、フィロバクテリウム  エスピー  Ｓ１２０１（ＡＪ１１０３１７）より単離されたものである。配列番号１の塩基番号１１９７〜２１９８の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＯＲＦである。このＯＲＦによりコードされるタンパク質は、高いペプチド生成活性を示すことが実施例で証明されている。
配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス  エスピー  ＡＪ９５８７より単離されたものである。配列番号３の塩基番号４１０〜１７０５の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＯＲＦである。このＯＲＦによりコードされるタンパク質は、高いペプチド生成活性を示すことが実施例で証明されている。
【００５３】
なお、以下に挙げる種々の遺伝子組換え技法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）などの記載に準じて行うことができる。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドは、フィロバクテリウム  エスピー、ストレプトマイセス  エスピーなどのｃＤＮＡ、もしくはｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｉｏｎ、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９）参照）又はハイブリダイゼーションによって取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは、上記（３）の欄で説明したようにして精製されたペプチド生成酵素に基づいて決定され部分アミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、本発明によりペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列（配列番号１、配列番号３）が明らかになったので、これらの塩基配列に基づいてプライマーやハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、プローブを使って単離することもできる。ＰＣＲ用のプライマーとして、５'非翻訳領域及び３'非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーを用いると、本酵素のコード領域全長を増幅することができる。具体的には、配列番号１の塩基配列を例に挙げると、５'側プライマーとしては配列番号１において塩基番号１１９７よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマーが、３'側プライマーとしては塩基番号２１９８よりも下流の領域の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーが挙げられる。
【００５５】
プライマーの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機  ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）常法に従って合成できる。ＰＣＲ反応は、例えばＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）及びＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【００５６】
本発明のペプチド製造方法で用いることができる酵素をコードするポリヌクレオチドとしては、配列表の配列番号１に記載のポリヌクレオチドのうちのＯＲＦと実質的に同一のポリヌクレオチドも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするポリヌクレオチドまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号１に記載のＯＲＦと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離することによっても、本発明のポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドが得られる。
また、本発明のペプチド製造方法で用いることができる酵素をコードするポリヌクレオチドとしては、配列表の配列番号３に記載のポリヌクレオチドのうちのＯＲＦと実質的に同一のポリヌクレオチドも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするポリヌクレオチドまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号３に記載のＯＲＦと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離することによっても、本発明のポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドが得られる。
【００５７】
プローブは、例えば配列番号１に記載の塩基配列に基づいて常法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするポリヌクレオチドをつり上げ、目的とするポリヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブはプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするポリヌクレオチドに応じて調節することができる。
【００５８】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いポリヌクレオチド同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、中でも好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００５９】
ただし、上記のようにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチドの場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、元となる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、上記（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１１９７〜２１９８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合について説明すると、５０℃、ｐＨ８の条件下で、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００６０】
上記酵素活性を保持していることの確認は、対象となるタンパク質をアミノ酸エステルまたはペプチドエステルとプロリンとに作用させてプロリン残基をＣ末端に有するペプチドを生成するかどうかを実験して確認することができる。しかし、基質の種類などに応じて個別に解析条件を設定する必要がある。そのため、便宜的に上記の実験に代えて、対象タンパク質をアミノ酸エステルまたはペプチドに作用させて加水分解反応をみる確認試験を行ってもよい。
【００６１】
このような改変されたポリヌクレオチドは、従来知られている突然変異処理によって取得され得る。突然変異処理としては、本酵素をコードするポリヌクレオチド、例えば（ａ）および（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを、ヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および本酵素をコードするポリヌクレオチドを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００６２】
尚、配列表の配列番号１中のＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示される。また、配列番号３中のＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号４に示される。
【００６３】
（３−２−２）組換えポリヌクレオチドおよび形質転換体の作製、ならびにペプチド生成酵素の生成
上記（３−２−１）で説明したポリヌクレオチドを適当な宿主に導入し組換えポリヌクレオチドとし、得られる形質転換細胞（形質転換体）に該ポリヌクレオチドにより特定されるタンパク質を発現させることによっても、本発明で用いることができるペプチド生成酵素を生成することができる。
【００６４】
ポリヌクレオチドにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、宿主としては、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、及びバチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア  スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。
【００６５】
ポリヌクレオチドを宿主に導入するのに用いる組換えポリヌクレオチドは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、導入しようとするポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモータとしては、フィロバクテリウム  エスピー  、ストレプトマイセス  エスピーなどのペプチド生成酵素遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には該プロモータを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを本発明のポリヌクレオチドに連結し、該プロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。
【００６６】
組換えポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６８，３２６（１９７９））あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してポリヌクレオチドの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））等が挙げられる。
【００６７】
タンパク質を組換えポリヌクレオチド技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換細胞内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
【００６８】
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
【００６９】
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
【００７０】
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
【００７１】
以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いてペプチド生成酵素を製造する方法を例として、より具体的に説明する。
【００７２】
ペプチド生成酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等を用いることができる。他にもファージポリヌクレオチドのベクターも利用できる。さらに、プロモータを含み、挿入ポリヌクレオチド配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもできる。
【００７３】
ペプチド生成酵素を融合タンパク質封入体として生産させるためには、ペプチド生成酵素遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ  １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、γインターフェロン遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００７４】
これらの遺伝子とペプチド生成酵素をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ポリヌクレオチドを利用すればよい。
【００７５】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、ｒｒｎＢターミネータ、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
【００７６】
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、ｐＱＥ系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、および／または挿入などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００７７】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
【００７８】
プロモータ、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結したポリヌクレオチド断片と、ベクターポリヌクレオチドとを連結して組換えポリヌクレオチドを得る。
【００７９】
該組換えポリヌクレオチドを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、エシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
【００８０】
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ペプチド生成酵素内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてペプチド生成酵素を切り出せるようにしてもよい。
【００８１】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【００８２】
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。ペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、ペプチド生成酵素あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００８３】
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
【００８４】
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【００８５】
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したペプチド生成酵素が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【実施例】
【００８６】
実施例１  エステラーゼの精製
〔無細胞抽出液の調製〕
Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｓ１２０１（ＡＪ１１０３１７）（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４３１）を５００ｍｌ容の坂口フラスコに張り込んだ５０ｍｌの培地（０．５％酵母エキス、０．５％トリプトン、０．３％ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（ｐＨ７．２））に接種し、培養温度３０℃、２４時間振とう培養した。遠心分離（８，０００ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）により、集菌した後、５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄後、同緩衝液に懸濁し、超音波破砕処理（２００Ｗ、２０ｍｉｎ、４℃）により細胞を破砕した。次いで遠心分離（１８，０００ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）により、未破砕細胞を除去し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
【００８７】
〔工程Ｉ〕
上記の方法に従って、培養液３リットル相当から調製した２１１０ｍｇのタンパク質を含む無細胞抽出液を予め５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャムバイオサイエンス）にアプライし、０−１ＭのＮａＣｌ濃度勾配によりタンパク質を溶出させた。
【００８８】
〔工程ＩＩ〕
工程Ｉで得られた活性画分を集め、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、同緩衝液で予め平衡化されたＰｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（アマシャムバイオサイエンス）にアプライし、１−０Ｍの硫酸アンモニウム勾配によりタンパク質を溶出させた。
【００８９】
〔工程ＩＩＩ〕
工程ＩＩで得られた活性画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎＹＭ１００（ミリポア）で濃縮し、５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（アマシャムバイオサイエンス）にアプライし１ｍｌ／ｍｉｎにて溶出させた。
【００９０】
〔工程ＩＶ〕
工程ＩＩＩで得られた活性画分を５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＭｏｎｏＱ５／５（アマシャムバイオサイエンス）にアプライし、０−１ＭのＮａＣｌ濃度勾配によりタンパク質を溶出させた。
【００９１】
〔工程Ｖ〕
工程ＩＶで得られた活性画分を集め、１Ｍ  硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、同緩衝液で予め平衡化されたＲｅｓｏｕｒｃｅＩＳＯ（アマシャムバイオサイエンス）にアプライし、１−０Ｍの硫酸アンモニウム勾配によりタンパク質を溶出させた。
【００９２】
〔工程ＶＩ〕
工程Ｖで得られた活性画分を集め、１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化されたＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（アマシャムバイオサイエンス）にアプライし、５０ｍＭ燐酸二水素一カリウム−５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）をステップワイズ法にて２０％毎にタンパク質を溶出させた。
【００９３】
全工程において、１００ｍＭ  Ｌ−アラニンメチルエステル、１００ｍＭ  Ｌ−プロリン、１００ｍＭホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、２５℃において、Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリンの生成活性を測定した。１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＬ−アラニル−Ｌ−プロリンを生成せしめる酵素量とし、精製により４９１倍に精製された（表１）。
【００９４】
【表１】
2009183255.tif 000003
【００９５】
得られた酵素画分を５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。その後、クーマシーブリリアントブルー染色によって、電気泳動的に単一であり、分子サイズが約３７ｋＤａであることが確認された（図１）。
【００９６】
調製した酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、プロテインシーケンサー  Ｍｏｄｅｌ４９１  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ｃＬＣ（アプライドバイオシステム社製）によって、３０残基のアミノ酸配列を得た（配列番号５）。
【００９７】
実施例２  塩基配列の決定
Ｓ１２０１（ＡＪ１１０３１７）染色体ＤＮＡ５μｇをＢｇｌＩＩ（５０Ｕ）にて切断した後、ＴａＫａＲａＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔのマニュアル記載の方法に従って、Ｓａｕ３ＡＩカセットとライゲートした。ライゲートミックスを鋳型として、上記Kitに付属のカセットプライマーＣ１とプライマーＳ１（１）（配列番号６）の組み合わせによってＰＣＲ（９４℃：３０秒、４２℃：２分、７２℃：１分、３０サイクル）を行った。次いでこのＰＣＲ反応液を鋳型として２回目のＰＣＲ（９４℃：３０秒、４７℃：２分、７２℃：１分、３０サイクル）を上記Ｋｉｔに付属のカセットプライマーＣ２とプライマーＳ２（１）（配列番号７）をもちいて行った。
【００９８】
増幅が確認された約１．１ｋｂ長の断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（プロメガ）にライゲートし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。目的断片を有するプラスミドをＤＮＡシーケンサー（ＣＥＱ２０００、ベックマンコールター製）により塩基配列を確認した。このプラスミドをＳｐｈＩ／ＰｓｔＩ処理して得られる約１．１ｋｂ長の遺伝子断片をＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（ロシュ）によってジゴキシゲニンラベルプローブを調製した。
【００９９】
Ｓ１２０１（ＡＪ１１０３１７）染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ処理後、アガロース電気泳動し、マニュアル記載の方法に従い、上記プローブをもちいてサザン解析したところ、ＥｃｏＲＩ処理の場合約２．５ｋｂおよび約１．２ｋｂ、ＢｇｌＩＩの場合約１．７ｋｂ、ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩの場合約１．２ｋｂ、約０．８ｋｂにポジティブシグナルを確認した。
【０１００】
次いで、Ｓ１２０１（ＡＪ１１０３１７）染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ処理、アガロース電気泳動し、約２．５ｋｂ断片を精製し、ｐＵＣ１１８にライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。同様の手法により、ＢｇｌＩＩ処理して得られる約１．７ｋｂ断片をもちいてライブラリーを作製した。
【０１０１】
上記プローブをもちいてマニュアル記載の方法に従いコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、ＥｃｏＲＩ断片を有するプラスミドをｐＵＣ１２０１Ｅ、ＢｇｌＩＩ断片を有するプラスミドをｐＵＣ１２０１Ｂｇとした。それぞれのプラスミドの有する断片の塩基配列を決定したところ、ｐＵＣ１２０１Ｅ内に３３４アミノ酸からなるＯＲＦが存在し、Ｎ末端解析結果から得られたアミノ酸配列と同一の配列を有していたことから目的の遺伝子の取得を確認した。また、ｐＵＣ１２０１Ｂｇ内にはＯＲＦ上流１．２ｋｂ及びＯＲＦの一部が含まれていた。以上の解析から、ＯＲＦを含む３０１６ｂｐの塩基配列を決定した（配列番号１）。
【０１０２】
実施例３  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによる異種発現、精製
Ｓ１２０１（ＡＪ１１０３１７）染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー１（１）、２（２）（配列番号８、９）によりＣ末端にヒスチジンタグ配列をコードする塩基配列を付加した断片を増幅し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理後、ｐＫＫ２２３−３（アマシャムバイオサイエンス）に挿入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。目的のプラスミドを有する形質転換体を選別し、ＪＭ１０９／ｐＫＫ＿ｅｓｔ＿ｈｉｓとした。
【０１０３】
本菌株をＬＢ培地（１００ｍｇ／ｌ  アンピシリンナトリウム、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ添加）にて、３０℃、１６ｈｒ培養し、得られた培養菌体を出発材料として、Ｍａｇ−Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｈｉｓ−ｔａｇ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、アフィニティー精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって約３７ｋＤａに均一な酵素が調製されたことを確認した。
【０１０４】
この酵素標品を５０ｍＭ  燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した後、Ａｌａ−Ｐｒｏ合成活性を測定したところ２３Ｕ／ｍｇであった。
【０１０５】
実施例４  反応ｐＨのエステラーゼ活性に及ぼす影響
実施例３で調製した酵素をもちいて、１００ｍＭ  Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩、２５℃の条件下で２００ｍＭの各緩衝液（燐酸カリウム、トリス塩酸、ホウ酸−塩化カリウム）をもちいて開始ｐＨ６．０−９．２の範囲でエステラーゼ活性を測定した。なお、活性値はアラニンメチルエステルの各ｐＨにおける水溶液中のＬ−アラニン生成は酵素添加条件と酵素無添加条件の差から算出した。本検討におけるエステラーゼ活性は燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた場合に最大を示し、１２４０Ｕ／ｍｇであった（図２）。
【０１０６】
実施例５  エステラーゼ活性の基質特異性
実施例３で調製した酵素をもちいて、基質濃度５０ｍＭ、２００ｍＭ  燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、２５℃において、反応１５分まで経時的に測定した。なお、基質の水溶液中における分解がある場合には酵素無添加条件を設定し、酵素添加区との差から活性を算出した。尚、Ｌ−アラニンメチルエステルに対する活性１１９０Ｕ／ｍｇを１００％として表２に示した。
【０１０７】
【表２】
2009183255.tif 000004
【０１０８】
実施例６  アシル転移活性の測定
実施例３で調製した酵素をもちいて、Ｌ−アラニンメチルエステルへのアシル転移活性を基質濃度１００ｍＭ、２００ｍＭ  ホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、２５℃において測定し、表３に示した。
【０１０９】
【表３】
2009183255.tif 000005
【０１１０】
実施例７  Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリンの酵素合成
実施例１で調製した酵素をもちいて、１００ｍＭ  Ｌ−アラニンメチルエステル、１００−３００ｍＭ  Ｌ−プロリン、１００ｍＭ  ホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、１６μｇ調製酵素を１ｍｌの反応液にて、２５℃、７．５時間反応した。その結果、表４に示すようにＬ−アラニル−Ｌ−プロリンの生成が確認された。
【０１１１】
【表４】
2009183255.tif 000006
【０１１２】
実施例８  酵素の調製
〔無細胞抽出液の調製〕
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．Ｓｐ  ＡＪ９５８７（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４３０）を５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ内の１００ｍｌの液体培地（０．５％アスパラギン酸ナトリウム１水和物、０．５％酵母エキス、０．５％ペプトン、０．５％マルツエキス、０．３％燐酸二水素カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム七水和物  （ｐＨ７．２））、３２℃にて４８時間攪拌培養した。菌体を遠心分離により集めた後、５０ｍＭ  燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄し、同緩衝液に懸濁し、超音波破砕処理（２００Ｗ、２０ｍｉｎ、４℃）により細胞を破砕した。次いで遠心分離（１８，０００ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）により、未破砕細胞を除去し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
【０１１３】
〔工程Ｉ〕
上記の方法に従って、培養液２リットル相当から調製した１４７０ｍｇのタンパク質を含む無細胞抽出液に固体の硫酸アンモニウムを４０％飽和となるようにゆるやかに攪拌しながら１時間かけて加え、溶解させた後、４℃にて一晩放置した。遠心分離(１８，０００ｇ、２０ｍｉｎ、４℃）により、沈殿を回収し、少量の５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて溶解させ、同緩衝液に対して透析した。
【０１１４】
〔工程ＩＩ〕
工程Ｉで得られた試料を集め、５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、同緩衝液で予め平衡化されたＨｉＬｏａｄ−１６／１０−Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（アマシャムバイオサイエンス）にアプライし、０−１Ｍの塩化ナトリウム勾配によりタンパク質を溶出させた。１−０Ｍの硫酸アンモニウム勾配によりタンパク質を溶出させた。
【０１１５】
〔工程ＩＩＩ〕
工程ＩＩで得られた活性画分を１Ｍ  硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、同緩衝液で予め平衡化されたＨｉＬｏａｄ−１６／１０−Ｐｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（アマシャムバイオサイエンス）にアプライし、０−１Ｍの塩化ナトリウム勾配によりタンパク質を溶出させた。１−０Ｍの硫酸アンモニウム勾配によりタンパク質を溶出させた。
【０１１６】
〔工程ＩＶ〕
工程ＩＩＩで得られた活性画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎＹＭ１００（ミリポア）で濃縮し、５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＬｏａｄ−１６／６０−Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（アマシャムバイオサイエンス）にアプライし１ｍｌ／ｍｉｎにて溶出させた。
【０１１７】
〔工程Ｖ〕
工程ＩＶで得られた活性画分を１Ｍ  硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、同緩衝液で予め平衡化されたＲｅｓｏｕｒｃｅ−ＥＴＨ（アマシャムバイオサイエンス）にアプライし、１−０Ｍの硫酸アンモニウム勾配によりタンパク質を溶出させた。
【０１１８】
全工程において、１００ｍＭ  Ｌ−アラニンメチルエステル、１００ｍＭ  Ｌ−プロリン、１００ｍＭ  ホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、２５℃において、Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリンの生成活性を測定した。１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＬ−アラニル−Ｌ−プロリンを生成せしめる酵素量とし、精製により５０９倍に精製された（表５）。
【０１１９】
【表５】
2009183255.tif 000007
【０１２０】
得られた酵素画分を５０ｍＭ  燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した後、クーマシーブリリアントブルー染色によって、電気泳動的に単一であり、分子サイズが約４４ｋＤａであることが確認された（図３）。
【０１２１】
調製した酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、プロテインシーケンサー  Ｍｏｄｅｌ４９１  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ｃＬＣ（アプライドバイオシステム社製）によって、３０残基のアミノ酸配列を得た（配列７）。
【０１２２】
実施例９  塩基配列の決定
ＡＪ９５８７染色体ＤＮＡ５μｇをＰｓｔＩ（５０Ｕ）にて切断した後、ＴａＫａＲａＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔのマニュアル記載の方法に従って、ＰｓｔＩカセットとライゲートした。ライゲートミックスを鋳型として、上記Ｋｉｔ付属のカセットプライマーＣ１とプライマーＳ１（２）（配列番号１０）の組み合わせによってＰＣＲ（９４℃：３０秒、４２℃：２分、７２℃：１分、３０サイクル）を行った。次いでこのＰＣＲ反応液を鋳型として２回目のＰＣＲ（９４℃：３０秒、４７℃：２分、７２℃：１分、３０サイクル）を上記Ｋｉｔに付属のカセットプライマーＣ２とプライマーＳ２（２）（配列番号１１）をもちいて行った。
【０１２３】
増幅が確認された約０．５ｋｂ長の断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（プロメガ）にライゲートし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。目的断片を有するプラスミドをＤＮＡシーケンサー（ＣＥＱ２０００、ベックマンコールター製）により塩基配列を確認した。このプラスミドをＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ処理して得られる約１．１ｋｂ長の遺伝子断片をＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（ロシュ）によってジゴキシゲニンラベルプローブを調製した。
【０１２４】
Ｓ１２０１（ＡＪ１１０３１７）染色体ＤＮＡをＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ処理後、アガロース電気泳動し、マニュアル記載の方法に従い、上記プローブをもちいてサザン解析したところ、５ｋｂにポジティブシグナルを確認した。
【０１２５】
次いで、ＡＪ９５８７染色体ＤＮＡをＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ処理、アガロース電気泳動し、約５ｋｂ断片を精製し、ｐＵＣ１９にライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。
【０１２６】
上記プローブをもちいてマニュアル記載の方法に従いコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐ９５８７−１として、１９５９ｂｐについて塩基配列を決定したところ、４４１アミノ酸からなるＯＲＦが存在し、Ｎ末端解析結果から得られたアミノ酸配列と同一の配列を有していたことから目的の遺伝子の取得を確認した（配列番号３）。
【０１２７】
実施例１０  精製酵素によるアミノ酸パラニトロアニリド加水分解活性の測定
実施例８の精製酵素をもちいて、各種アミノ酸パラニトロアニリド加水分解活性を反応液組成（５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  アミノ酸ｐＮＡ）、２５℃にて４０５ｎｍの吸収を追跡することによって測定した（表６）。
【０１２８】
【表６】
2009183255.tif 000008
【０１２９】
表６から明らかなとおり、精製酵素はＰｒｏ−ｐＮＡを分解することができることが明らかとなった。
【０１３０】
実施例１１  精製酵素によるアミノ酸エステル、アミノ酸アミド加水分解活性の測定
実施例８の酵素をもちいて、１００ｍＭホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、基質濃度１００ｍＭにて加水分解活性を生成物をＨＰＬＣによる定量により測定した。なお、基質の自発的分解が観察される場合には、酵素無添加区を設定して、その差異から活性を算出した（表７）。
【０１３１】
【表７】
2009183255.tif 000009
【０１３２】
実施例１２  精製酵素によるアシル転移活性の測定
実施例８で調製した酵素をもちいて、１００ｍＭホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、基質濃度各１００ｍＭにてアシル転移活性を、生成物のＨＰＬＣによる定量により測定した（表８）。
【０１３３】
【表８】
2009183255.tif 000010
【０１３４】
実施例１３  Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリンの酵素合成
実施例８で調製した酵素をもちいて、１００ｍＭ  Ｌ−アラニンメチルエステル、１００−３００ｍＭ  Ｌ−プロリン、１００ｍＭ  ホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、１６μｇの調製酵素を１ｍｌの反応液にて、２５℃、７．５時間反応したところ、表９に示すようにＬ−アラニル−Ｌ−プロリンの生成が確認された。
【０１３５】
【表９】
2009183255.tif 000011
【０１３６】
実施例１４  Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏの酵素合成
１００ｍＭホウ酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩、１００ｍＭ  Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリンの組成溶液に、実施例８で調製した精製酵素を２０μｇ添加し、全量１ｍｌとした。２５℃で反応させ、２．５時間後にＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏを定量したところ、５６．３ｍＭの蓄積が確認された。
【０１３７】
実施例１５  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによる異種発現、精製
プラスミドｐ９５８７−１を保持するＥ．ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー１（配列１１）、プライマー２（配列１２）の組み合わせ、もしくはプライマー１、プライマー３（配列１３）の組み合わせにより遺伝子断片を増幅し、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理後、ｐＱＥ３０（キアゲン）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。目的のプラスミドを有する形質転換体を選別し、各々のプラスミドをｐＱＥ−ＰＩＰ１、ｐＱＥ−ＰＩＰ２とした。
【０１３８】
形質転換体をＬＢ培地（１００ｍｇ／ｌ  アンピシリンナトリウム、０．０２ｍＭ  ＩＰＴＧ添加）にて、３０℃、１６ｈｒ培養し、得られた培養菌体を出発材料として、Ｍａｇ−Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｈｉｓ−ｔａｇ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、アフィニティー精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって約４４ｋＤａに均一な酵素が調製されたことを確認した。
【０１３９】
この酵素標品を５０ｍＭ  燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した後、Ｐｒｏ−ｐＮＡの加水分解活性を反応液組成（５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  Ｐｒｏ−ｐＮＡ）、２５℃にて４０５ｎｍの吸収を追跡することによって測定したところ、それぞれ３７．５Ｕ／ｍｇ、７９．１Ｕ／ｍｇであった。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．から抽出精製された酵素の分子量を示す図である。
【図２】図２は、反応ｐＨとＰｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．由来の酵素のエステラーゼ活性との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．から抽出精製された酵素の分子量を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４１】
配列番号１：Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．由来酵素の塩基配列
配列番号２：Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．由来酵素のアミノ酸配列
配列番号３：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．由来酵素の塩基配列
配列番号４：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．由来酵素のアミノ酸配列
配列番号５：Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．由来酵素の部分アミノ酸配列
配列番号６：プライマーＳ１（１）の塩基配列
配列番号７：プライマーＳ２（１）の塩基配列
配列番号８：プライマー１（１）の塩基配列
配列番号９：プライマー２（１）の塩基配列
配列番号１０：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．由来酵素の部分アミノ酸配列
配列番号１１：プライマーＳ１（２）の塩基配列
配列番号１２：プライマーＳ２（２）の塩基配列
配列番号１３：プライマー１（２）の塩基配列
配列番号１４：プライマー２（２）の塩基配列
配列番号１５：プライマー３の塩基配列
【図１】
2009183255.tif 000012
【図２】
2009183255.tif 000013
【図３】
2009183255.tif 000014
【配列表】
2009183255000001.app