(57)【要約】      （修正有）【課題】魚類由来抗体の製造方法、及び魚類由来抗体の力価を測定する方法の提供。【解決手段】抗原を発現した大腸菌または酵母を魚類に経口投与する魚類由来抗体の製造方法。魚類がゼブラフィッシュである、魚類由来抗体の製造方法。抗原がＧＦＰまたは３８０Ｒである、魚類由来抗体の製造方法。該製造方法により得られる魚類由来抗体。ＩｇＭである、魚類由来抗体。指標となる抗体の力価との比較によって、魚類由来抗体の力価を測定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原を発現した大腸菌または酵母を魚類に投与する魚類由来抗体の製造方法。
【請求項２】
抗原を発現した大腸菌または酵母を魚類に投与して免疫を誘導することによる魚類由来抗体の製造方法。
【請求項３】
投与方法が経口投与である請求項１または２に記載の魚類由来抗体の製造方法。
【請求項４】
魚類がゼブラフィッシュである請求項１〜３のいずれかに記載の魚類由来抗体の製造方法。
【請求項５】
抗原がＧＦＰまたは３８０Ｒである請求項１〜４のいずれかに記載の魚類由来抗体の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法により得られる魚類由来抗体。
【請求項７】
ＩｇＭである請求項６に記載の魚類由来抗体。
【請求項８】
請求項６または７に記載の魚類由来抗体を検出する方法。
【請求項９】
Ｉｇ重鎖抗体を用いる請求項８に記載の魚類由来抗体を検出する方法。
【請求項１０】
次の１）及び２）の工程を含む請求項９に記載の魚類由来抗体を検出する方法。
１）抗原を結合した不溶性担体と請求項６または７に記載の魚類由来抗体（１次抗体）とを反応させる工程
２）請求項６または７に記載の魚類由来抗体（１次抗体）とＩｇ重鎖抗体（２次抗体）とを反応させる工程
【請求項１１】
さらに、Ｉｇ重鎖抗体に特異的な標識抗体（３次抗体）を反応させる工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項６または７に記載の魚類由来抗体の力価を測定する方法。
【請求項１３】
指標となる抗体の力価との比較により、請求項６または７に記載の魚類由来抗体の力価を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は魚類由来抗体の製造方法を提供することに関する。また、当該方法によって製造された魚類由来抗体及びその力価を測定する方法を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗体はマウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはウマなどの哺乳動物に抗原を投与して免疫を誘導したり、哺乳動物由来のハイブリドーマを用いたりすることによって製造されることが主であった。しかし、これらの哺乳動物を用いる抗体の製造方法においても、目的とする抗体が得られない場合や、十分な感度を有する抗体が得られない場合があり、より有効な抗体の製造方法の提供が望まれてきた。
【０００３】
近年、タンパク質解析の新たなツールとして魚類が注目されている。魚類由来のタンパク質は、大腸菌やショウジョウバエ、線虫などの無脊椎動物由来のタンパク質と違い、糖鎖の付加などの修飾が同じ脊椎動物である哺乳動物と同様に行われるためである。
魚類は飼育が比較的容易であり、水温や給餌、日照時間、水質等によって産卵および採卵を制御できる。また、一度の産卵で多数の受精卵を得ることができるため、実験動物として多くの研究で用いられている。特にメダカやゼブラフィッシュのような小型魚類は、飼育スペースもコンパクトに収まることなどの物理的特性があり、飼育コストも低い等の利点もある。
【０００４】
これまでに、魚類を用いて様々な研究がなされている。例えば、イリドウイルス感染症の診断を目的とする、イリドウイルス抗原液を診断用抗原とする受身凝集反応用試薬を調製し、イリドウイルス感染症の魚における血清の抗体価を調べる方法が開発されている（例えば、特許文献１参照）。また、魚類血清に脳細胞壊死ウイルスまたは当該ウイルスの外被蛋白質および標識２次抗体を反応させ、魚類血清中の抗脳細胞壊死ウイルス抗体に結合した標識量または非結合標識量を測定することによる、魚類の脳細胞壊死ウイルス感染診断法が開発されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、抗体の製造を目的として、魚類を用いるという例は知られていなかった。そこで本発明者らは、魚類を用いた新たな抗体の製造方法の提供に試みた。
【特許文献１】特許第３９５０５００号公報
【特許文献２】特開平５−２３２１１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は魚類由来抗体の製造方法を提供することを課題とする。また、当該方法によって製造された魚類由来抗体及びその力価を測定する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、抗原を発現した大腸菌または酵母を魚類に投与することで、魚類の免疫を誘導し、これによって魚類由来抗体が得られることを見出した。本発明の製造方法によって得られる抗体は抗原認識において十分な感度を有しており、実験試薬等として用いることができる。また、哺乳類を用いた製造方法では抗体が得られなかった場合でも、本発明の製造方法を抗体の製造方法において有用な方法の一つとして用いることができる。さらに本発明者らは、指標となる抗体の力価との比較によって、本発明の製造方法によって得られた魚類由来抗体の力価を測定する方法を見出した。この方法を用いることによって得られた魚類由来抗体を評価することができる。
【０００７】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１３）に記載の魚類由来抗体の製造方法等に関する。
（１）  抗原を発現した大腸菌または酵母を魚類に投与する魚類由来抗体の製造方法。
（２）  抗原を発現した大腸菌または酵母を魚類に投与して免疫を誘導することによる魚類由来抗体の製造方法。
（３）  投与方法が経口投与である上記（１）または（２）に記載の魚類由来抗体の製造方法。
（４）  魚類がゼブラフィッシュである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の魚類由来抗体の製造方法。
（５）  抗原がＧＦＰまたは３８０Ｒである上記（１）〜（４）のいずれかに記載の魚類由来抗体の製造方法。
（６）  上記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法により得られる魚類由来抗体。
（７）  ＩｇＭである上記（６）に記載の魚類由来抗体。
（８）  上記（６）または（７）に記載の魚類由来抗体を検出する方法。
（９）  Ｉｇ重鎖抗体を用いる上記（８）に記載の魚類由来抗体を検出する方法。
（１０）  次の１）及び２）の工程を含む上記（９）に記載の魚類由来抗体を検出する方法。
１）抗原を結合した不溶性担体と上記（６）または（７）に記載の魚類由来抗体（１次抗体）とを反応させる工程
２）上記（６）または（７）に記載の魚類由来抗体（１次抗体）とＩｇ重鎖抗体（２次抗体）とを反応させる工程（１１）  さらに、Ｉｇ重鎖抗体に特異的な標識抗体（３次抗体）を反応させる工程を含む、上記（１０）に記載の方法。
（１２）  上記（６）または（７）に記載の魚類由来抗体の力価を測定する方法。
（１３）  指標となる抗体の力価との比較により、上記（６）または（７）に記載の魚類由来抗体の力価を測定する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって、魚類由来抗体の製造が可能となった。本発明の製造方法によって得られる抗体は抗原の認識において十分な感度を有しており有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の「魚類由来抗体の製造方法」とは、魚類に抗原を発現した大腸菌または酵母を投与することで免疫を誘導し、当該魚類の体内に抗体を製造させることをいう。さらに、製造された抗体を精製することも含む。
抗原を発現した大腸菌または酵母の投与は、魚類に抗体を製造させることができる方法であればいずれの方法も用いる事ができ、例えば、魚類が存在する水中に投与する方法、魚類に直接投与する方法等を用いることができる。特に魚類が存在する水中に投与する方法によって、魚類に経口投与することが特に好ましい。
【００１０】
本発明の「魚類由来抗体の製造方法」に用いる魚類としては、魚類由来抗体を製造できる魚類であればいずれの魚類も用いることができ、硬骨魚類の全ても用いることができる。例えば、メダカ、ゼブラフィッシュ等が挙げられる。また血液量が多く、抗体生産量が多い魚種であるコイ、テラピア、ナマズ、サケ、マス、マダイ、ヘダイ、サバ、アジ、マグロ、ブリ、フグ等も挙げられる。
【００１１】
本発明の「魚類由来抗体」とは、抗原を発現した大腸菌または酵母を魚類に投与することで得られる、魚類を由来とする抗体のことをいい、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む。抗原を投与した魚類の組織や血液から回収されたものをそのまま抗体とすることもできるし、これを精製したものを抗体とすることもできる。本発明の抗体には、魚類が産生し得る全ての免疫グロブリンが含まれるが、特にＩｇＭであることが好ましい。
本発明によって得られる「魚類由来抗体」は、目的に応じて利用することができ、例えば、試験・研究用の試薬や、抗体治療用の医薬品の有効成分等として用いることもできる。また、魚類とヒトの種が大きく離れていることから、本発明の「魚類由来抗体」は、ヒトの疾病に対する治療薬として有効である可能性が高く、ガンなどの分子標的医薬品となる抗体医薬として用いることができる。
【００１２】
本発明の「抗原」には、魚類由来抗体を製造することを目的とする全ての抗原を用いる事ができ、任意のペプチド、タンパク質等の物質が含まれる。
魚類由来抗体を製造することを目的とする抗原としては、例えば、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰやイリドウイルス感染防御抗原タンパク質である３８０Ｒ（以下、３８０Ｒとする）等が挙げられる。
【００１３】
本発明の「抗原を発現した大腸菌」または「抗原を発現した酵母」には、魚類由来抗体を製造することを目的とする抗原を発現している大腸菌または酵母が該当し、遺伝子工学的手法によって作製される形質転換体も含まれる。
これらの「抗原を発現した大腸菌」または「抗原を発現した酵母」は、目的に応じて利用することができ、例えば魚類の病気に対するワクチンとして用いることもできる。
【００１４】
本発明の「魚類由来抗体を検出する方法」は、魚類由来抗体を検出する方法であればいずれの方法も用いることができる。例えば、魚類に製造させた魚類由来抗体を回収し、抗原を結合させたメンブレンや不溶性担体に１次抗体として反応させる、いわゆるウェスタンブロッティング法、Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ法やＥＬＩＳＡ法等を用いることができる。この場合、この１次抗体に反応し得る「Ｉｇ重鎖抗体」を２次抗体として用いることが好ましい。また、さらにこの２次抗体に反応し得る「Ｉｇ重鎖抗体に特異的な標識抗体」を３次抗体として用いることが好ましい。
【００１５】
本発明の「Ｉｇ重鎖抗体」（２次抗体）とは、免疫グロブリンのＩｇ重鎖に結合し得る抗体のことをいう。免疫グロブリンのＩｇ重鎖に結合できることから、任意の抗原に対して魚類体内で産生された「魚類由来抗体」のいずれにも結合し得る。
例えば、「魚類由来抗体」がＩｇＭである場合には、ＩｇＭのＩｇ重鎖またはその一部に特異的に結合し得る抗体であることが好ましく、特にＩｇ重鎖の定常領域に結合する抗体であることが好ましい。さらにＩｇ重鎖のうち、特に保存された領域に特異的に結合し得る抗体であることが好ましい。例えば本実施例において得たゼブラフィッシュｓＩｇ重鎖中のＤｏｍａｉｎＩＶに特異的に結合し得る抗体は、ゼブラフィッシュのみならず、少なくとも同じコイ科の魚のＩｇＭが検出できる可能性がある。また、マダイなどの他の魚種においても、上記と同様の原理で特異的抗体を検出できる。
なお、このＩｇ重鎖抗体は、蛍光物質等で標識したものも用いることができ、この標識により、「対象とする抗原に特異的な抗体」の産生の有無や、産生量を定量的に検出することができる。
【００１６】
本発明の「Ｉｇ重鎖抗体に特異的な標識抗体」（３次抗体）とは、蛍光物質、放射性物質、酵素等の物質で標識された、Ｉｇ重鎖抗体に結合し得る抗体のことをいう。標識されていない「Ｉｇ重鎖抗体」（２次抗体）を用いる場合には、「魚類由来抗体」の産生の有無や、産生量を定量的に検出するために、この抗体を用いることが好ましい。Ｉｇ重鎖抗体に結合し得る抗体であればいずれの抗体も用いることができ、市販の抗体を用いることもできる。
本実施例では、標識物質として発色基質ＤＡＢ（３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を結合した抗ウサギーヤギ抗体（Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇ’ｓ，ＨＲＰ；ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）を用いたが、その他の標識物質を結合した抗体を用いることができる。また、「Ｉｇ重鎖抗体」（２次抗体）の作成においてウサギ以外の動物を用いた場合には、その動物に対して抗原性を有する抗体を用いることもできる。
【００１７】
本発明の「魚類由来抗体の力価を測定する方法」とは、指標となる抗体の力価との比較によって、本発明の製造方法によって得られた魚類由来抗体の力価を測定することをいう。指標となる抗体としては、同一の抗原を対象とする、力価が知られている全ての抗体を用いる事ができる。例えば、哺乳類由来の抗体を用いる事ができる。
以下、本発明の詳細を実施例等で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
＜抗原を発現した大腸菌を投与する魚類由来抗体の製造＞
１．抗原を発現した大腸菌の作製
１）ＥＧＦＰ塩基配列のサブクローニング
プラスミドｐＺｅｘ−ＥＧＦＰ（図１、特開２００７−１４３４９７参照）４６．５μｌとＢａｍＨＩ０．５μｌ、ＳａｃＩ０．５μｌ、１０×Ｋ  ｂｕｆｆｅｒ２．５μｌとを混合し、３７℃で一晩インキュベートすることで制限酵素処理した。
制限酵素処理後、１．０％アガロースＴＡＥゲルで１３５Ｖ、２５分間電気泳動し、ＤＮＡ断片をゲルから切り出した後、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。
精製した上記ＤＮＡ断片をｔｅｍｐｌａｔｅとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＴＭ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲを行い、得られた増幅断片を１．０％アガロースゲル中で１３５Ｖ、２５分間電気泳動を行った。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ反応液（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＴＭ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．０５μｌ、５×ＰＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌ、ｄＮＴＰ  １μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ（配列表配列番号１）  ０．５μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ（配列表配列番号２）  ０．５μＬ、ｄＨ２Ｏ  ４．９５μｌ）を混合し、８６℃  ５分を１サイクル、９４℃  １０秒、５０℃  ５秒  ７２℃  １分を３０サイクルの条件で行った。
【００１９】
２）ＥＧＦＰ発現用プラスミドベクターの構築
上記１．１）で精製したＤＮＡ増幅断片４４μｌとＮｄｅＩ０．５μｌ、ＸｈｏＩ０．５μｌ、１０×Ｈ  ｂｕｆｆｅｒ５μｌとを混合し、３７℃で１晩インキュベートすることで制限酵素処理をした。
ｐＣｏｌｄ  ＴＦ  ＤＮＡベクター（ＴａＫａＲａ）を同様に制限酵素処理した後、１．０％アガロースＴＡＥゲルで１３５Ｖ、２５分間電気泳動を行い、ＤＮＡ断片をゲルから切り出した後、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。更にＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）により脱リン酸化処理を行った後、再度精製した。
精製した上記断片を用いて、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）によるライゲーション反応を行い、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＸＬＩ−Ｂｌｕｅに対して形質転換を行った。
【００２０】
形質転換した大腸菌をＬＢ／アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含む寒天平板培地に塗抹後、３７℃で１晩インキュベートした。得られた形質転換体を用いて、Ｂｌｅｎｄ  ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてダイレクトＰＣＲ法によりコロニーＰＣＲを行った。
ダイレクトＰＣＲ反応は、ＰＣＲ反応液（Ｂｌｅｎｄ  ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．０５μｌ、１０×Ｂｌｅｎｄ  ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  １μｌ、ｄＮＴＰ  １μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ（配列表配列番号３）  ０．５μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ（配列表配列番号４）  ０．５μＬ、ｄＨ２Ｏ  ６．９５μｌ）を混合し、大腸菌のシングルコロニーを懸濁した後、８６℃  ５分を１サイクル、９４℃  １０秒、５３℃  ３０秒  ７２℃  １分を３０サイクルの条件で行った。
コロニーＰＣＲによりインサート配列の存在が確認されたクローンのみを５ｍｌＬＢ／アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む液体培地に接種して３７℃で１６時間振とう培養し、その培養液からＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐを用いてプラスミド抽出を行った。
【００２１】
３）ＤＮＡシーケンスによる遺伝子配列の確認
上記１．２）で抽出したプラスミドを用いて、ＰＣＲ増幅されたインサート断片の塩基配列を決定した。ＤＮＡシーケンス反応はＤＴＳＱ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いてジデオキシ法で行った。また、ＤＮＡシーケンス反応には配列表配列番号３および４のプライマー（ｐＣｏｌｄ  ＴＦ  Ｆ１プライマー、ｐＣｏｌｄ  ＴＦ  Ｒプライマー）を用いて行った。
【００２２】
４）大腸菌によるＥＧＦＰの発現確認
上記１．２）で構築し、上記１．３）で遺伝子配列の確認を行ったＥＧＦＰの遺伝子配列を含むプラスミドベクター１μｌを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、ＬＢ／アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む平板培地にコンラージ棒を用いて塗抹し、３７℃で１晩インキュベートした。大腸菌コロニーをピックアップし、５ｍｌ  ＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）液体培地に接種して３７℃で１２時間振とう培養してこれを前培養とし、この一部をフリーズストックにした。
前培養液４００μｌを４００ｍｌのＬＢ／アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む液体培地に加え、Ｏ．Ｄ．６００＝０．５前後になるまで３７℃で振とう培養した。その後４℃で３０分間インキュベートし、それぞれの４００ｍｌ液体培地に対して１Ｍ  ＩＰＴＧを最終濃度０．４ｍＭとなるように加えて１５℃で２４時間振とう培養した。
培養した大腸菌液を５μｌ採取し、正立型蛍光顕微鏡（ＮＩＫＯＮ）を用いて観察した。また、残りの大腸菌培養液を６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して集菌し、集菌したペレットの重量を測定し、抗原を発現した大腸菌として用いた。
【００２３】
２．魚類由来抗体の製造
１）成魚ゼブラフィッシュの選定
魚類由来抗体を免疫する魚類として、ゼブラフィッシュ（株式会社名東水圏）を用いた。ゼブラフィッシュを水温２８℃、明期１４時間／暗期１０時間で６ヶ月〜１年間飼育した後、雌雄の区分をつけて１０匹ずつ、計２０匹を任意に選んだ。
【００２４】
２）抗原を発現した大腸菌の経口投与
上記１．で作製した抗原を発現した大腸菌をゼブラフィッシュに曝露することで、経口投与した。即ち、上記１．の抗原を発現した大腸菌のペレットを最終濃度が５００μｇ／ｍｌとなるように溶かした飼育水に、ゼブラフィッシュ２０匹を移して３０分間放置することで曝露を行った。その後、曝露後のゼブラフィッシュは清浄な飼育水に移して飼育した。１４日後、同様に曝露を行った。
【００２５】
３）血清および心臓、脾臓の採取
上記２．２）により曝露を行った５日後若しくは１０日後のゼブラフィッシュから血液と心臓、脾臓を採取した。
採取した血液は２３００ｒｐｍで５分間遠心分離し、血ぺいを除き、血清のみを採取した。心臓と脾臓は、それぞれ１．５ｍｌエッペンチューブに入れ、５０％グリセロール−リン酸バッファー（終濃度１０ｍＭ）を１００μｌ添加してホモジェナイズした。その後１０００×ｇで５分間遠心分離し、その上澄液を両臓器のＩｇＭ抽出溶液とした。このＩｇＭ抽出液をそれぞれＣａｎＧｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（ＴＯＹＯＢＯ）のｓｏｌｕｔｉｏｎ１で希釈した。希釈後の血清におけるタンパク濃度は５０．４μｇ／ｍｌで心臓のそれは１４７．０μｇ／ｍｌ、脾臓のそれは８０．０μｇ／ｍｌであった。
【００２６】
４）ＥＧＦＰ濃度の測定
上記１．で作製した抗原（ＥＧＦＰ）を大腸菌から精製し、ＥＧＦＰの蛋白質濃度を測定した。
【実施例２】
【００２７】
＜魚類由来抗体を検出する方法＞
Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ法により、ゼブラフィッシュ抗ＧＦＰ抗体を検出した。
１．タンパク質溶液の滴下とブロッキング
実施例１、２．４）で濃度を測定したＥＧＦＰ溶液の原液（４７３．０μｇ／ｍｌ）を用い、その希釈液（２３６．５μｇ／ｍｌ、４７．３μｇ／ｍｌ、９．５μｇ／ｍｌ、４．７μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ）およびネガティブコントロールとして原液と同濃度のＢＳＡ溶液の７サンプルを調製した。それぞれのサンプルを１μｌ取り出し、ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）上に滴下し、室温で十分乾燥させた後、０．５％スキムミルク／ＰＢＳに浸し、１時間室温でゆっくり振とうした。
【００２８】
２．抗原抗体反応
上記１．でブロッキングしたＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳに浸し、５分間ゆっくり振とうしながら洗浄を行った。洗浄を５回繰り返し、１次抗体に実施例１、２．３）で調製した血清や心臓、脾臓のＩｇＭ抽出溶液を用いて抗原抗体反応を行った。次に、２次抗体として、本発明者らがＩｇＭ重鎖タンパク質溶液をウサギに免疫して作成したＡｎｔｉ  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｉｇμ−Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（特願２００６−７３１２５）を、３次抗体にＡｎｔｉ  Ｒａｂｂｉｔ−Ｇｏａｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）を用いて抗原抗体反応を行った。各抗体の洗浄には同膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳに浸し、５分間ゆっくり振とうすることで行い、各５回洗浄を繰り返した。
【００２９】
３．発色反応
３次抗体が結合したＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳに浸し、５分間ゆっくり振とうして洗浄した。洗浄を５回繰り返した後、ＤＡＢ（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を０．３％Ｈ２Ｏ２／ＰＢＳに溶かし、それを３次抗体の結合したＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）に添加して発色を観察することで、シグナルを検出した。
【００３０】
４．結果
Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ法の結果、血清、心臓および脾臓のいずれの抽出液においても抗原抗体反応が確認された。従って、抗原を発現した大腸菌を魚類に投与することで、魚類由来抗体が得られることが確認された（図２）。
【実施例３】
【００３１】
＜魚類由来抗体の力価の測定＞
魚類由来抗体の力価をＤｏｔ  ｂｌｏｔ法によって測定した。
１．検量線の作図
１次抗体にＡｎｔｉ  ＧＦＰ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（最終濃度：０．５μｇ／ｍｌ、フナコシ）、２次抗体にＡｎｔｉ  Ｒａｂｂｉｔ−Ｇｏａｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）を用いて、実施例１、３．と同様の方法でＤｏｔ  ｂｌｏｔ法を行った。
検出したそれぞれのシグナル（図３）をＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  ソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて数値化した（表１）。ｙ軸に数値化した色の濃淡をｘ軸にＧＦＰ濃度をとり、グラフ化して近似曲線を得た（図４）。次に両軸の逆数をとり、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔにより抗原量を変化させた場合のそれに対する市販の抗ＧＦＰ抗体の反応度を解析した。その結果、Ｋｍ値およびＶｍａｘはそれぞれ８．０１μｇ／ｍｌ、１４４．９３であり、これを与える数式はｙ＝０．０５５３ｘ＋０．００６９であった（図５）。
【００３２】
【表１】
2009073783.tif 000002
【００３３】
２．抗体力価の評価
実施例１、３．３）で検出したシグナルをＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  ソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて数値化したＥＧＦＰ濃度を４７．３μｇ／ｍｌに調製した時に得られるシグナルが検出できる限界だったので、この濃度のシグナルを用いたところ、血清、脾臓、心臓の各臓器のシグナルはそれぞれ３８．２２、６２．９５、４０．６２であった。
これらの値を上記１）で作図した検量線に代入し、各臓器における抗ＧＦＰ抗体の力価を算出した。それぞれのタンパク質濃度を０．５μｇ／ｍｌに換算して、市販の抗ＧＦＰ抗体（Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ＧＦＰ  ＩｇＧ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＡＢＲ）がメーカー推奨濃度の０．５μｇ／ｍｌである時の抗体力価を１とすると、それぞれの抗体力価は血清が２．８５×１０−２、脾臓が３．８５×１０−２、心臓は１．０６×１０−２であった。
【実施例４】
【００３４】
＜抗原を発現した酵母を投与する魚類由来抗体の製造＞
１．抗原を発現した酵母の作製
京都大学農学研究科応用生命科学専攻生体高分子化学研究室の植田充美教授に作製いただいた３８０Ｒ表層発現酵母と３８０Ｒ内部発現酵母（参考文献参照）を、抗原を発現した酵母として用いた。またコントロールとして、未発現酵母を使用した。
これらの酵母は前培養として５ｍｌＳＤ＋Ｗ０．５％カザミノ酸培地にシングルコロニーの酵母を植菌し、２４時間３０℃で振倒培養した。次に本培養として５００ｍｌ容の坂口フラスコに１５０ｍｌのＳＤ＋Ｗ０．５％カザミノ酸培地を調製し、その中に前培養液１ｍｌを加えて３０℃で３０時間振倒培養を行った後、６，０００ｒｐｍ２０分間遠心して得られた酵母のペレット重量を測定した。
参考文献：Ａ．Ｋｏｎｄｏ．Ｍ．Ｕｅｄａ．Ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）  ６４：２８−４０．
【００３５】
２．魚類由来抗体の製造
１）成魚ゼブラフィッシュの選定
魚類由来抗体を免疫する魚類として、ゼブラフィッシュ（株式会社名東水圏）を用いた。ゼブラフィッシュを水温２７．５℃、明期１４時間／暗期１０時間で飼育した後、幅６０ｃｍ、奥行き３０ｃｍ、高さ３０ｃｍの水槽に２０Ｌの環境水をはり、１試験区に５０尾で６試験区となるように６個の水槽で飼育した。
【００３６】
２）抗原を発現した酵母の経口投与
上記１．で作成した抗原を発現した酵母（３８０Ｒ表層発現酵母、３８０Ｒ内部発現酵母）およびコントロールの酵母（３８０Ｒ未発現酵母）を抗原として、それぞれ５００μｇ／ｍｌとなるように溶かした飼育水１０Ｌを作製し、ゼブラフィッシュを移して３０分間放置することで曝露を行った。曝露は１００匹ごとに行い、曝露後５０匹ごとを２つに無作為に振り分けて清浄な飼育水に移して飼育した。１５日後、同様に曝露を行った。
【００３７】
３）血液の採取
上記２．２）により曝露を行った５日後若しくは１０日後のゼブラフィッシュから、３８０Ｒ表層発現酵母、３８０Ｒ内部発現酵母および３８０Ｒ未発現酵母の３種類の抗原における３試験区で、それぞれ５０尾ごとに血液を採取した。
採取した血液はそれぞれ１．５ｍｌチューブに入れておいた５００μｌの結合バッファー（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４と２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を混合してｐＨ７．０に調整）内に流入した。１つのチューブに５尾ずつ血液を回収し、これを試験区ごとに統一することにより、１試験区５ｍｌのゼブラフィッシュ血液溶出バッファーを得た。
【００３８】
４）ゼブラフィッシュ血液中からの魚類由来抗体の精製
Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、回収したゼブラフィッシュ血液溶液から３８０Ｒに特異的な魚類由来抗体の精製をおこなった。その後、精製液を５ｋＤａ限外ろ過フィルターＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて１ｍｌ〜１．５ｍｌにまで濃縮し、１５ｍｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で懸濁した。再び５ｋＤａ限外ろ過フィルターＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａを用いて１ｍｌ〜１．５ｍｌにまで濃縮し、その後、タンパク質量をＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓｅｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＢｒａｄ  ｆｏｒｄ法にて測定した。
【００３９】
３．魚類由来抗体の検出
プルダウンアッセイにより、ゼブラフィッシュ抗３８０Ｒ抗体を検出した。
１）特異的抗体の吸着
試験区ごとに、３８０Ｒタンパク質３μｌ（７８０ｍｇ／ｍｌ）とリン酸バッファー（ｐＨ７．４）５００μｌ、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）１５μｌを加え、４℃で２時間振倒混合をおこなった。その後、試験区ごとに精製液を１００μｌずつ加えて４℃で１２時間振倒混合した。
【００４０】
２）結合タンパク質の精製
上記３．１）で吸着させたサンプルを４℃で３，０００ｒｐｍ１０分間遠心分離し、ペレット状になったビーズ（以下、ビーズペレットとする）を吸わずに上澄みを除去し、そこにリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を１０００μｌ加えてビーズペレットを懸濁し、４℃、４，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。次に再びできたビーズペレットを２０ｍＭイミダゾール・リン酸バッファー（ｐＨ７．４）３００μｌを加えて懸濁し、４℃、４０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心分離し、ビーズペレットを吸わずに上澄みを除去した。最後にでき上がったビーズペレットを５００ｍＭイミダゾール・リン酸バッファー（ｐＨ７．４）３０μｌで懸濁し、４℃、４０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心分離して上澄みを回収し、これを３８０Ｒ−ゼブラフィッシュＩｇ結合プルダウン精製液とした。
【００４１】
３）３８０Ｒ合成タンパク質、ゼブラフィッシュＩｇの検出
３８０Ｒ−ゼブラフィッシュＩｇ結合プルダウン精製液をＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥにスポットし、抗Ｈｉｓ  ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および本発明者らがＩｇＭ重鎖タンパク質溶液をウサギに免疫して作成したＡｎｔｉ  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｉｇμ−Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（特願２００６−７３１２５）を用いてのウェスタンブロッティングをおこなった。
【００４２】
４）結果
プルダウンアッセイの結果、血液中に抗原抗体反応が確認された。図６に示すように、３試験区ともＨｉｓ  ｔａｇ融合３８０Ｒタンパク質を検出することができたが、ゼブラフィッシュ抗３８０Ｒ抗体は３８０Ｒ表層発現酵母曝露区、３８０Ｒ内部発現酵母曝露区では検出できたものの、３８０Ｒ未発現酵母曝露区では検出されなかった。従って、抗原を発現した酵母を魚類に投与することで、魚類由来抗体が得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の製造方法および抗体の力価を測定する方法によって、力価が確認された魚類由来抗体を得ることが可能となった。本発明で得られる抗体は抗原認識において十分な感度を有していることから、実験試薬等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】プラスミドｐＺｅｘ−ＥＧＦＰを示した図である（実施例１）。
【図２】ゼブラフィッシュ抗ＧＦＰ抗体の製造を確認した図である（実施例２）。
【図３】Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ法によって検出されたＧＦＰのシグナルを示した図である（実施例３）。
【図４】数値化したシグナルを近似曲線で示した図である（実施例３）。
【図５】数値化したシグナルからＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔ解析を行った図である（実施例３）。
【図６】ゼブラフィッシュ抗３８０Ｒ抗体の製造を確認した図である（実施例４）。
【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【配列表】
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