(57)【要約】【課題】導入物質の使用量を極力低減すること。【解決手段】細胞を培養するガラスベースディッシュ２０内の細胞接着面２２ａに、観察部を形成するための開口部１１が少なくとも１個設けられた被覆部１２を備えるシート部材１０を貼り付けた後に、上記ガラスベースディッシュ２０内に細胞を撒き、培養液を入れて細胞を培養する。その後、上記ガラスベースディッシュ２０中の培養液を抜き取り、細胞接着面２２ａから上記シート部材１０を剥がして、そのシート部材１０の開口部１１のあった場所に導入物質の分散された溶液を滴下した後、上記ガラスベースディッシュ２０を細胞操作装置にセットし、上記溶液が滴下されて溶液の液滴で覆われた細胞に対して所望の細胞操作を行う。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養する培養容器の細胞接着面上に貼り付けられた際に観察部を形成するための開口部が少なくとも１個設けられた被覆部を備え、細胞培養後に剥離可能であることを特徴とするシート部材。
【請求項２】
該シート部材は、上記培養容器の細胞接着面への密着性が良く且つ上記細胞接着面から剥離し易いと共に、上記培養容器から剥離した際に上記細胞接着面に粘着剤が残らない素材で構成されることを特徴とする請求項１に記載のシート部材。
【請求項３】
細胞を培養するための培養液を収容する本体と、
上記本体の細胞接着面上に貼り付けられ、細胞培養後に剥離される、開口部が少なくとも１個設けられた被覆部を備えるシート部材と、
を具備することを特徴とする培養容器。
【請求項４】
上記本体の細胞接着面上の細胞培養後に疎水性を維持したい部位に設けた疎水性パターンを更に具備し、
上記シート部材の被覆部は、上記疎水性パターンにほぼ合致するパターンを有することを特徴とする請求項３に記載の培養容器。
【請求項５】
細胞を培養する培養容器内の細胞接着面に、観察部を形成するための開口部が少なくとも１個設けられた被覆部を備えるシート部材を貼り付ける工程と、
上記培養容器内に細胞を撒き、培養液を入れて細胞を培養する工程と、
上記培養容器中の培養液を抜き取る工程と、
上記培養容器内の細胞接着面から上記シート部材を剥がす工程と、
上記シート部材の開口部のあった場所に導入物質の分散された溶液を滴下する工程と、
上記培養容器を細胞操作装置にセットし、上記溶液が滴下された場所の細胞に対して所望の細胞操作を行う工程と、
を具備することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項６】
上記細胞操作の終了後、上記培養容器を上記細胞操作装置から取り外し、培養液を追加して更に培養を行う工程を更に具備することを特徴とする請求項５に記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養する培養容器に貼り付けるシート部材、培養容器、及び細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、細胞の細胞膜に孔を形成し溶液中に含まれる生理活性物質を細胞内に導入する装置が示されている。この装置によれば、細胞を浸しておく培養液中に細胞内に導入したい物質を予め混濁させておき、細胞に孔を形成する操作を行うことで、細胞内に導入することができる。
【０００３】
通常、細胞は培養容器内にて扱われる。一般に市販されている培養容器としては、カルチャーディッシュ、スライドガラスチャンバ、ウェルプレート、フラスコなどのタイプがあり、培養中は、およそ１００μＬ以上の液量の培養液中に浸されている。
【特許文献１】特開２００７−３１９０３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来、培養液中に所定の濃度で導入物質を混濁しなければならないため、何れの培養容器にて細胞操作を行ったとしても、多量の導入物質が必要である。
【０００５】
本発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、導入物質の使用量を極力低減することが可能なシート部材、培養容器、及び細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のシート部材の一態様は、
細胞を培養する培養容器の細胞接着面上に貼り付けられた際に観察部を形成するための開口部が少なくとも１個設けられた被覆部を備え、細胞培養後に剥離可能であることを特徴とする。
【０００７】
また、本発明の培養容器の一態様は、
細胞を培養するための培養液を収容する本体と、
上記本体の細胞接着面上に貼り付けられ、細胞培養後に剥離される、開口部が少なくとも１個設けられた被覆部を備えるシート部材と、
を具備することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明の細胞培養方法の一態様は、
細胞を培養する培養容器内の細胞接着面に、観察部を形成するための開口部が少なくとも１個設けられた被覆部を備えるシート部材を貼り付ける工程と、
上記培養容器内に細胞を撒き、培養液を入れて細胞を培養する工程と、
上記培養容器中の培養液を抜き取る工程と、
上記培養容器内の細胞接着面から上記シート部材を剥がす工程と、
上記シート部材の開口部のあった場所に導入物質の分散された溶液を滴下する工程と、
上記培養容器を細胞操作装置にセットし、上記溶液が滴下された場所の細胞に対して所望の細胞操作を行う工程と、
を具備することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞操作時の培養液量を極力少なくすることにより、導入物質の使用量を極力低減することが可能なシート部材、培養容器、及び細胞培養方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための最良の形態を図面を参照して説明する。
【００１１】
［第１実施形態］
図１（Ａ）は、本発明の第１実施形態に係るシート部材１０を示す図であり、図１（Ｂ）及び（Ｃ）は、本発明の第１実施形態に係る培養容器としてのガラスベースディッシュ２０の上面図及び断面図である。
【００１２】
図１（Ａ）に示すように、シート部材１０は、培養容器の細胞接着面上に貼り付けられた際に観察部を形成するための開口部１１が少なくとも１個設けられた被覆部１２を備えている。このシート部材１０は、培養容器の細胞接着面への密着性が良く且つ上記細胞接着面から剥離し易いと共に、培養容器から剥離した際に上記細胞接着面に粘着剤が残らない素材で構成されることが好ましい。例えば、シリコンゲルシートやウレタンゲルシート等のゲルシート１３を型抜きして形成される。
【００１３】
このようなシート部材１０は、図１（Ｂ）及び（Ｃ）に示すように、ガラスベースディッシュ２０の底板部２１に配された、細胞（図示せず）を付着させて培養するための細胞接着面２２ａとなる透明な板状ガラス部２２の上面に貼り付けて使用される。
【００１４】
ここで、上記ガラスベースディッシュ２０は、ポリスチレンなどの合成樹脂材からなる底板部２１と周側部２３とで円筒状に形成されており、その底板部２１の中心部位には、円形を呈する透孔２４が１個穿設されている。そして、底板部２１には、下面２１ａ側から透孔２４の開口面２４ａを完全に覆うに足る板状ガラス部２２がシリコン系接着剤やアクリレート系接着剤などからなる接着剤Ｓを介して接合されており、該板状ガラス部２２により透孔２４の開口面２４ａの全体が遮蔽されている。こうして、底板部２１と板状ガラス部２２とによって、ガラスベースディッシュ２０の底部が構成され、該底部と上記周側部２３とで、該ガラスベースディッシュ２０の本体が構成される。
【００１５】
また、上記板状ガラス部２２の細胞接着面２２ａには、細胞培養後に疎水性を維持したい部位に、疎水部２５が設けられている。そして、上記シート部材１０の被覆部１２は、この疎水部２５のパターンにほぼ合致するパターンを有している。
【００１６】
なお、上記シート部材１０の観察部を形成する開口部１１のサイズとしては、直径１乃至５ｍｍ程度であることが好ましい。その理由については後述する。
【００１７】
ここで、本第１実施形態に係るシート部材１０が貼り付けられたガラスベースディッシュ２０で培養した細胞に対し操作・観察を行うための細胞操作装置及び顕微鏡について、図２を参照して説明する。
【００１８】
本実施形態に係る細胞操作装置３０は、細胞を観察するための倒立型顕微鏡４０に備えられる。
【００１９】
倒立型顕微鏡４０は、上記細胞を収容したガラスベースディッシュ２０等を載置する培養容器ホルダ４１と、該培養容器ホルダ４１上の細胞を照明する照明装置４２と、細胞において反射あるいは透過した光、あるいは細胞から発生した蛍光を観察する観察装置４３と、上記培養容器ホルダ４１をＸ方向及びＹ方向に移動する顕微鏡ＸＹステージ４４と、該顕微鏡ＸＹステージ４４を駆動制御する顕微鏡ＸＹステージコントローラ４５と、上記照明装置４２及び観察装置４３を制御する顕微鏡コントローラ４６と、上記観察装置４３により得られた画像を処理する画像処理装置４７と、該画像処理装置４７により処理された画像を表示するモニタ４８を有し、上記細胞操作装置３０及び該倒立型顕微鏡４０の全体を制御する制御コンピュータ４９と、を備えている。
【００２０】
また、上記照明装置４２には、細胞に対して、上記観察装置４３とは反対側から照明光を照射する透過照明光源４２Ａと、該透過照明光源４２Ａから発せられた照明光を細胞に集光するコンデンサレンズ４２Ｂと、細胞に対して上記観察装置４３と同一方向から照明光を照射する落射照明光源４２Ｃとが備えられている。
【００２１】
一方、上記観察装置４３には、図示しない対物レンズを含む観察光学系と、該観察光学系を介した細胞からの光を撮像して画像を取得するＣＣＤカメラ４３Ａと、細胞からの光を直接観察する接眼レンズ４３Ｂとが備えられている。
【００２２】
そして、細胞操作装置３０は、上記倒立型顕微鏡４０の培養容器ホルダ４１近傍に配置され、細胞に対して挿入される導入針３１と、該導入針３１を保持する導入針保持具３２と、該導入針保持具３２を移動させることで上記導入針３１を移動させる駆動ユニット３３と、該細胞操作装置３０を制御するコントロールボックス３４と、を備えている。ここで、駆動ユニット３３は、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向に導入針３１を移動させる、例えば、３軸の直線移動機構を備えている。
【００２３】
上記導入針３１は、図３（Ａ）に示すように、カンチレバー３５の自由端側に、該カンチレバー３５の長手方向に対して交差する方向に延びるように設けられている。カンチレバー３５は取付部材３６に固定され、該取付部材３６は、Ｚ軸アクチュエータ３７を介して導入針保持具３２のアーム３２Ａに固定されている。これにより、カンチレバー３５は斜め下向きに保持され、導入針３１はカンチレバー３５の自由端において、先端を鉛直下方に向けて保持されている。
【００２４】
カンチレバー３５は、図３（Ｂ）に示すように、可撓性を持つシリコンベース部３５Ａと、先端に微細な導入針３１が形成されたレバー部３５Ｂとから構成されており、上記取付部材３６に対して交換可能に固定される。従って、このカンチレバー３５を交換することで、コンタミネーションのおそれなく、該細胞操作装置３０を繰り返し使用することができる。
【００２５】
上記取付部材３６と導入針保持具３２との間に配置されたＺ軸アクチュエータ３７は、例えば、積層された圧電素子により構成され、その印加電圧に応じて伸縮する。図３（Ａ）に示すようにＺ軸アクチュエータ３７は取付部材３６と導入針保持具３２との間に垂直方向に配置されているので、印加電圧を調整することにより導入針保持具３２に対して取付部材３６を垂直方向に微小変位させ、該取付部材３６に鉛直下向きに取り付けられている導入針３１の先端を垂直方向に微小距離、移動させることができるようになっている。
【００２６】
上記コントロールボックス３４は、駆動ユニット３３を制御する駆動ユニット制御回路３４Ａと、Ｚ軸アクチュエータ３７を制御するアクチュエータ制御回路３４Ｂとを備えている。
【００２７】
細胞操作装置３０による細胞操作、例えば細胞への遺伝子導入の操作は以下のようにして行われる。
【００２８】
即ち、上記ガラスベースディッシュ２０内の培養液中に遺伝子導入物質を分散させた後、該ガラスベースディッシュ２０を倒立型顕微鏡４０の培養容器ホルダ４１上に載置して、細胞操作を行うための細胞を選定し、駆動ユニット制御回路３４Ａの作動により駆動ユニット３３を作動させて、カンチレバー３５の導入針３１を上記選定した細胞の上方から当該細胞に近接移動させる。ガラスベースディッシュ２０の板状ガラス部２２上に播種された細胞は、２μｍ〜１０μｍ程度の厚みしかないため、この近接した位置からの微細な下降は、アクチュエータ制御回路３４Ｂの作動によりＺ軸アクチュエータ３７を作動させることにより行う。
【００２９】
Ｚ軸アクチュエータ３７を作動させることにより、図４（Ａ）に示すように、導入針３１を下降させ板状ガラス部２２へ近づけていく。これにより、導入針３１の先端が下降していく途中において、ガラスベースディッシュ２０内の遺伝子が分散された溶液（以下、ＤＮＡ分散溶液５０）内に進入し、ガラスベースディッシュ２０の板状ガラス部２２上に播種された細胞６０に接触する。ここで、更に導入針３１を下降させていき、細胞膜６１及び核６２に穿孔する。
【００３０】
そして、図５（Ｂ）に示すように、導入針３１の先端が板状ガラス部２２面と接触する位置まで導入針３１を下降させたならば、板状ガラス部２２面との接触位置よりも更に導入針３１を降下させる。これにより、図５（Ｃ）に示すように、導入針３１の先端は板状ガラス部２２面に対して摺動し、この摺動により、底面側も破断し、細胞膜６１の上面側及び底面側の２箇所の破断箇所７０間を貫通する孔が空けられる。
【００３１】
こうして形成された貫通する孔をＤＮＡ分散溶液５０が流通することにより、ＤＮＡ分散溶液５０中に分散した遺伝子が細胞６０内に流入する。
【００３２】
なお、導入針３１を上昇させて導入針３１を細胞６０から引き抜いた後は、ある一定時間が経過すると、細胞膜６１は自己修復により回復し、細胞６０内に遺伝子が取り込まれた状態となる。
【００３３】
このようにして、従来と同様に低侵襲で生存率は高いまま、更に、遺伝子を細胞６０内に確実且つ高い導入効率で導入することができる。
【００３４】
なお、導入針３１の摺動方法は、上記のように板状ガラス部２２面との接触位置よりも更に導入針３１を降下させることにより行う手法に限定されるものではなく、例えば、導入針保持具３２のアーム３２Ａも上記Ｚ軸アクチュエータ３７と同様に積層された圧電素子により構成し、該アーム３２Ａを伸縮させることで、導入針３１の先端が板状ガラス部２２と接触した状態で導入針３１を水平移動させることにより行うこともできる。
【００３５】
あるいは、上記特許文献１に開示されているように、導入針３１を下降させてその先端がガラスベースディッシュ２０内のＤＮＡ分散溶液５０内に進入したとき、上記アーム３２Ａを作動させることにより、導入針３１の先端を水平方向に振動させながら導入針３１を下降させていくようにしても良い。これにより、導入針３１の先端が下降していく途中において、細胞６０に接触すると、導入針３１の振動によって細胞膜６１に切り込みが形成される。即ち、細胞膜６１は流動性を有し、導入針３１を単に長さ方向に移動させて刺す場合には、細胞膜６１が導入針３１に倣って変形するため細胞膜６１を貫通することができないが、導入針３１をその長手方向に交差する方向に振動させながら長さ方向に移動させることで、細胞膜６１に切り込みを形成し、容易に細胞膜６１を貫通することが可能となる。
【００３６】
その結果、導入針３１を細胞膜６１内の核６２に確実に刺し入れることが可能となる。そして、導入針３１を細胞６０から引き抜き、所定時間にわたって培養することにより、核６２内まで形成された孔にＤＮＡ分散溶液５０中に分散した遺伝子がより確実に導入されることになる。
【００３７】
勿論、駆動ユニット３３で微細なＸＹＺ方向の調整が可能な場合には、Ｚ軸アクチュエータ３７やアーム３２Ａを圧電素子で構成することは不要となる。
【００３８】
以下、上記シート部材１０、上記ガラスベースディッシュ２０、上記細胞操作装置３０及び上記倒立型顕微鏡４０を用いた本発明の第１実施形態に係る細胞培養方法を、図５のフローチャートを参照して説明する。
【００３９】
まず、上記シート部材１０を、ガラスベースディッシュ２０の板状ガラス部２２の細胞接着面２２ａに、上記被覆部１２が上記疎水部２５と重なるように貼り付ける（ステップＳ１）。
【００４０】
その後、ガラスベースディッシュ２０内に細胞を撒き、図６（Ａ）に示すように、培養液５１を入れて細胞を培養する（ステップＳ２）。
【００４１】
そして所定期間経過後、培養液交換時と同様の周知の方法で、ガラスベースディッシュ２０中の培養液５１を抜き取る（ステップＳ３）。例えば、図６（Ｂ）に示すように、ピペット８０を使って、まずガラスベースディッシュ２０の底板部２１の培養液５１を抜き取り、その後に、上記底板部２１より１段低くなっている開口面２４ａの細胞接着面２２ａ上の培養液５１を抜き取る。
【００４２】
培養液５１の抜き取りが終わったならば、図６（Ｃ）に示すように、例えばピンセット８１を用いてガラスベースディッシュ２０内の細胞接着面２２ａから上記シート部材１０を剥がす（ステップＳ４）。このとき、シート部材１０の開口部１１のあった場所には微量の培養液５１が残り、細胞６０が死滅することを防止できる。
【００４３】
その後、図６（Ｄ）に示すように、上記シート部材１０の開口部１１のあった場所に、導入物質を含む溶液、つまりＤＮＡ分散溶液５０を滴下する（ステップＳ５）。
【００４４】
その後、上記ＤＮＡ分散溶液５０が滴下されたガラスベースディッシュ２０を、倒立型顕微鏡４０の培養容器ホルダ４１上に載置して、上述したように、上記溶液が滴下された場所の細胞に対して、所望の細胞操作、例えば遺伝子導入操作を行う（ステップＳ６）。  そして、遺伝子の導入操作が行われたならば、ガラスベースディッシュ２０を倒立型顕微鏡４０の培養容器ホルダ４１上から取り外し、培養液５１を追加して、更に培養を行うこととなる（ステップＳ７）。
【００４５】
以上のように、細胞操作時に、従来は図７（Ａ）に示すように、開口面２４ａ全体にＤＮＡ分散溶液５０を入れなければならなかったのに対し、本第１実施形態によれば、図７（Ｂ）に示すように、ＤＮＡ分散溶液５０を液滴とすることができるので、導入物質の使用量を極力低減することが可能なシート部材、培養容器、及び細胞培養方法を提供することができる。
【００４６】
例えば、図７（Ａ）において、ＤＮＡ分散溶液５０の深さを１ｍｍとすると、開口面２４ａの直径Ａが１４ｍｍの場合は１６０μＬ、１０ｍｍの場合は８０μＬ、５ｍｍの場合でも２０μＬのＤＮＡ分散溶液５０が必要であった。これに対して、本第１実施形態によれば、液滴の直径Ｂが５ｍｍあっても８μＬしかＤＮＡ分散溶液５０を必要としない。ＤＮＡ分散溶液５０の濃度は、およそ０．１μｇ／μＬで導入が確認されており、０．８μｇのＤＮＡしか必要としない。そして、更に小さな液滴を形成することが可能であり、液滴の直径Ｂが３ｍｍであれば４μＬのＤＮＡ分散溶液５０（この場合は０．４μｇのＤＮＡ）、２ｍｍであれば２μＬのＤＮＡ分散溶液５０（この場合は０．２μｇのＤＮＡ）しか必要とせず、直径Ｂを１ｍｍとすれば１μ以下のＤＮＡ分散溶液５０しか使用せずに、細胞操作を行うことができる。
【００４７】
また、本実施形態では、観察部となる開口部１１に対応する位置以外には疎水部２５を設けており、該疎水部２５がシート部材１０の被覆部１２の密着により保護されるため、培養後でも撥水性が維持され、より濡れ角の大きい液滴形成ができ、細胞操作が安定して行える。
【００４８】
なお、シート部材１０における観察部つまり開口部１１の個数は、図１（Ａ）及び（Ｂ）に示すような４個に限定されるものではなく、更に多数であって良いし、また逆に、４個よりも少なくても良い。即ち、シート部材１０には、開口部１１が少なくとも１個設けられていれば良い。
【００４９】
［第２実施形態］
上記第１実施形態は、培養容器としてガラスベースディッシュを例に説明したが、本発明は、そのようなガラスベースディッシュに限定されるものではなく、カバーガラスチャンバ，スライドガラスチャンバ，ウェルプレートなど、各種、培養容器に適用可能である。
【００５０】
例えば、図８は、スライドガラスチャンバ９０に上記シート部材１０を適用した例を示す断面図である。
【００５１】
このスライドガラスチャンバ９０は、１枚の透明なガラス板９１からなる底部９２上にポリスチレンなどの合成樹脂材からなる囲繞隔壁９３を立設して仕切られた複数個の隔室９４を有して形成されている。これにより、各隔室９４の別に底部９２に、細胞を付着させるための透明な板状ガラス部９５が細胞接着面として構成されることとなる。
【００５２】
そして、その各板状ガラス部９５つまり細胞接着面に、上記シート部材１０がそれぞれ貼り付けられる。
【００５３】
このように、どのような培養容器であっても、上記第１実施形態と同様の効果を奏することができる。
【００５４】
以上実施形態に基づいて本発明を説明したが、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々の変形や応用が可能なことは勿論である。
【００５５】
（付記）
前記の具体的実施形態から、以下のような構成の発明を抽出することができる。
【００５６】
（１）  細胞を培養する培養容器の細胞接着面上に貼り付けられた際に観察部を形成するための開口部が少なくとも１個設けられた被覆部を備え、細胞培養後に剥離可能であることを特徴とするシート部材。
【００５７】
（対応する実施形態）
この（１）に記載のシート部材に関する実施形態は、第１及び第２実施形態が対応する。それらの実施形態において、例えば、ガラスベースディッシュ２０、スライドガラスチャンバ９０が上記培養容器に、細胞接着面２２ａ、板状ガラス部９５が上記細胞接着面に、開口部１１が上記開口部に、被覆部１２が上記被覆部に、シート部材１０が上記シート部材に、それぞれ対応する。
【００５８】
（作用効果）
この（１）に記載のシート部材によれば、開口部により形成される観察部にのみ培養した細胞及び培養液を残すことができ、導入物質が分散された溶液として液滴しか必要としなくなるので、導入物質の使用量を極力低減することが可能となる。
【００５９】
（２）  該シート部材は、上記培養容器の細胞接着面への密着性が良く且つ上記細胞接着面から剥離し易いと共に、上記培養容器から剥離した際に上記細胞接着面に粘着剤が残らない素材で構成されることを特徴とする（１）に記載のシート部材。
【００６０】
（対応する実施形態）
この（２）に記載のシート部材に関する実施形態は、第１及び第２実施形態が対応する。
【００６１】
（作用効果）
この（２）に記載のシート部材によれば、培養容器の細胞接着面への密着性が良く且つ細胞接着面から剥離し易いと共に、培養容器から剥離した際に細胞接着面に粘着剤が残らない。
【００６２】
（３）  細胞を培養するための培養液を収容する本体と、
上記本体の細胞接着面上に貼り付けられ、細胞培養後に剥離される、開口部が少なくとも１個設けられた被覆部を備えるシート部材と、
を具備することを特徴とする培養容器。
【００６３】
（対応する実施形態）
この（３）に記載の培養容器に関する実施形態は、第１及び第２実施形態が対応する。それらの実施形態において、例えば、底板部２１，板状ガラス部２２及び周側部２３、囲繞隔壁９３及び板状ガラス部９５が上記本体に、細胞接着面２２ａ、板状ガラス部９５が上記細胞接着面に、開口部１１が上記開口部に、被覆部１２が上記被覆部に、シート部材１０が上記シート部材に、ガラスベースディッシュ２０、スライドガラスチャンバ９０が上記培養容器に、それぞれ対応する。
【００６４】
（作用効果）
この（３）に記載の培養容器によれば、シート部材の開口部にのみ培養した細胞及び培養液を残すことができ、導入物質が分散された溶液として液滴しか必要としなくなるので、導入物質の使用量を極力低減することが可能となる。
【００６５】
（４）  上記本体の細胞接着面上の細胞培養後に疎水性を維持したい部位に設けた疎水性パターンを更に具備し、
上記シート部材の被覆部は、上記疎水性パターンにほぼ合致するパターンを有することを特徴とする（３）に記載の培養容器。
【００６６】
（対応する実施形態）
この（４）に記載の培養容器に関する実施形態は、第１及び第２実施形態が対応する。それらの実施形態において、例えば疎水部２５が上記疎水性パターンに対応する。
【００６７】
（作用効果）
この（４）に記載の培養容器によれば、疎水性パターンがシート部材の被覆部の密着により保護されるため、培養後でも撥水性が維持され、より濡れ角の大きい液滴形成ができ、細胞操作が安定して行える。
【００６８】
（５）  細胞を培養する培養容器内の細胞接着面に、観察部を形成するための開口部が少なくとも１個設けられた被覆部を備えるシート部材を貼り付ける工程と、
上記培養容器内に細胞を撒き、培養液を入れて細胞を培養する工程と、
上記培養容器中の培養液を抜き取る工程と、
上記培養容器内の細胞接着面から上記シート部材を剥がす工程と、
上記シート部材の開口部のあった場所に導入物質の分散された溶液を滴下する工程と、
上記培養容器を細胞操作装置にセットし、上記溶液が滴下された場所の細胞に対して所望の細胞操作を行う工程と、
を具備することを特徴とする細胞培養方法。
【００６９】
（対応する実施形態）
この（５）に記載の細胞培養方法に関する実施形態は、第１及び第２実施形態が対応する。それらの実施形態において、例えば、ステップＳ１が上記シート部材を貼り付ける工程に、ステップＳ２が上記細胞を培養する工程に、ステップＳ３が上記培養液を抜き取る工程に、ステップＳ４が上記シート部材を剥がす工程に、ステップＳ５が上記溶液を滴下する工程に、ステップＳ６が上記細胞操作を行う工程に、それぞれ対応する。
【００７０】
（作用効果）
この（５）に記載の細胞操作方法によれば、シート部材の開口部により形成される観察部にのみ培養した細胞及び培養液を残すことができ、導入物質が分散された溶液として液滴しか必要としなくなるので、導入物質の使用量を極力低減することが可能となる。
【００７１】
（６）  上記細胞操作の終了後、上記培養容器を上記細胞操作装置から取り外し、培養液を追加して更に培養を行う工程を更に具備することを特徴とする（５）に記載の細胞培養方法。
【００７２】
（対応する実施形態）
この（６）に記載の細胞培養方法に関する実施形態は、第１及び第２実施形態が対応する。それらの実施形態において、例えば、ステップＳ７が上記更に培養を行う工程に対応する。
【００７３】
（作用効果）
この（６）に記載の細胞操作方法によれば、更に培養を続けることができ、細胞操作による経時変化を後で観察できる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１（Ａ）は、本発明の第１実施形態に係るシール部材を示す図であり、図１（Ｂ）及び（Ｃ）は、本発明の第１実施形態に係る培養容器としてのガラスベースディッシュ２０の上面図及び断面図である。
【図２】図２は、ガラスベースディッシュで培養した細胞に対し操作・観察を行うための細胞操作装置及び倒立型顕微鏡の構成を示す図である。
【図３】図３（Ａ）は、カンチレバー近傍の構造を示す拡大図であり、図３（Ｂ）は、カンチレバーの構造を示す拡大図である。
【図４】図４は、細胞操作としての遺伝子導入の方法を説明するための、カンチレバーに設けた導入針の一連の状態を示す図である。
【図５】図５は、本発明の第１実施形態に係る細胞培養方法を説明するためのフローチャートを示す図である。
【図６】図６は、細胞培養方法を説明するための、ガラスベースディッシュの一連の状態を示す図である。
【図７】図７（Ａ）は、細胞操作時における従来のＤＮＡ分散溶液の必要量を説明するための図であり、図７（Ｂ）は、細胞操作時における第１実施形態でのＤＮＡ分散溶液の必要量を説明するための図である。
【図８】図８は、本発明の第２実施形態に係る培養容器としてのスライドガラスチャンバの断面図である。
【符号の説明】
【００７５】
１０…シート部材、  １１…開口部、  １２…被覆部、  １３…ゲルシート、  ２０…ガラスベースディッシュ、  ２１…底板部、  ２２…板状ガラス部、  ２２ａ…細胞接着面、  ２３…周側部、  ２４…透孔、  ２４ａ…開口面、  ２５…疎水部、  ３０…細胞操作装置、  ３１…導入針、  ４０…倒立型顕微鏡、  ４１…培養容器ホルダ、  ４２…照明装置、  ４３…観察装置、  ５０…ＤＮＡ分散溶液、  ５１…培養液、  ６０…細胞、  ８０…ピペット、  ８１…ピンセット、  ９０…スライドガラスチャンバ、  ９１…ガラス板、  ９２…底部、  ９３…囲繞隔壁、  ９４…隔室、  ９５…板状ガラス部、  Ｓ…接着剤。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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