(57)【要約】      （修正有）【課題】シクロデキストリンが導入されたポリ−γ−グルタミン酸誘導体を提供すること。【解決手段】シクロデキストリンが導入されたポリ−γ−グルタミン酸（ＰＧＡ）誘導体が提供される。好ましくは、ＰＧＡの側鎖カルボシキシル基のうちの１％〜３０％程度にシクロデキストリンを結合させる。これにより、シクロデキストリン特有の作用効果（不安定物質の安定化、不快な臭い・不快な味等のマスキングなど）を、ＰＧＡに付与することができる。このため、ＰＧＡ誘導体は、バイオテクノロジーの様々な用途において、広く用いることが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロデキストリン類が結合したポリ−γ−グルタミン酸誘導体。
【請求項２】
前記シクロデキストリン類がαシクロデキストリン、βシクロデキストリン、またはγシクロデキストリンである、請求項１の誘導体。
【請求項３】
前記ポリ−γ−グルタミン酸の重量平均分子量が、１万以上である、請求項１に記載の誘導体。
【請求項４】
前記ポリ−γ−グルタミン酸の側鎖カルボシキシル基のうち、０．１％〜３０％にシクロデキストリン類が結合している、請求項１に記載の誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロデキストリン類を含むポリ−γ−グルタミン酸誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生分解性、生体適合性に優れ、かつ保湿性を有するポリ−γ−グルタミン酸は、化粧品、食品等の材料として注目されている。以下、本明細書中において、ポリ−γ−グルタミン酸を「ＰＧＡ」とも記載する。ＰＧＡは、納豆の粘りに含まれる主成分であることから、生体適合性が高いだけでなく、長い食経験により安全性が保証されている。また、同等の分子量を有する高分子同士を比較しても、ＰＧＡ水溶液は粘度が低く、工業的にも扱いやすい特徴を有する。
【０００３】
特開２００２−２３３３９１号公報（特許文献１）は、高分子量のポリ−γ−グルタミン酸を生産するバチルス属菌株を開示する。
【０００４】
国際公開ＷＯ２００４−７５９３号公報（特許文献２）は、平均分子量が５，０００ｋＤａ以上のポリ−γ−グルタミン酸を開示する。
【０００５】
しかしながら、上述した生分解性、生体適合性および保湿性に留まらず、さらにＰＧＡが高機能化されればさらにＰＧＡの用途が拡大することは明らかである。
【特許文献１】特開２００２−２３３３９１号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００４−７５９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記従来の技術を考慮して、さらなるＰＧＡの高機能化を意図するものであり、ＰＧＡに特殊な構造を導入することにより、高性能を有するＰＧＡ誘導体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、シクロデキストリン類をＰＧＡに導入することにより高性能のＰＧＡ誘導体が提供されることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【０００８】
具体的には、本発明によれば、以下のＰＧＡ誘導体などが提供される。
【０００９】
（１）  シクロデキストリン類が結合したポリ−γ−グルタミン酸誘導体。
【００１０】
（２）  前記シクロデキストリン類がαシクロデキストリン、βシクロデキストリン、またはγシクロデキストリンである、上記項１の誘導体。
【００１１】
（３）  前記ポリ−γ−グルタミン酸の重量平均分子量が、１万以上である、上記項１に記載の誘導体。
【００１２】
（４）  前記ポリ−γ−グルタミン酸の側鎖カルボシキシル基のうち、０．１％〜３０％にシクロデキストリン類が結合している、上記項１に記載の誘導体。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、シクロデキストリン類が導入されたＰＧＡ誘導体が得られる。
【００１４】
本発明によれば、包接能を有するシクロデキストリン類の分子がＰＧＡの主鎖により運動を束縛されるため、包接能が改良されることも期待できる。
【００１５】
また、シクロデキストリン類は、底の抜けたバケツのような立体構造を有することが知られている。この立体構造において、バケツの内側にあたる部分には炭化水素が多数存在して疎水性となっており、バケツの外側にあたる部分には水酸基が多数存在して親水性となっている。本発明によれば、このような特殊な疎水性部分構造および親水性部分構造を有するシクロデキストリン類が、非常に親水性の高いＰＧＡに導入されるために、ＰＧＡの親水性の高さによる欠点が解消される。具体的には、例えば、本来、ＰＧＡと混和しにくい疎水性物質を、ＰＧＡ誘導体と共に用いることが可能になる。
【００１６】
具体的には、例えば、シクロデキストリン類は、様々な不安定な生理活性物質（プロスタグランジンなど）を安定化させることができることが知られている。すなわち、光、紫外線、熱に不安定な物質や、酸化、加水分解されやすい物質をシクロデキストリン類で包接することによって安定化することができる。
【００１７】
シクロデキストリン類は、不快な臭い・不快な味等を包接によってマスキングすることができる。このため、種々の香料や食品等に用いることができる。
【００１８】
シクロデキストリン類は、溶媒（例えば、水）に溶けにくい物質を包接して可溶化することができる。
【００１９】
本発明によれば、シクロデキストリン類に特有のこれらの効果を併せ持つＰＧＡ誘導体が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
（ＰＧＡ）
ポリ−γ−グルタミン酸（ＰＧＡ）は、Ｄ，Ｌ−グルタミン酸のアミノ基およびγ位のカルボシキシル基が重合反応して得られる化合物をいう。ＰＧＡは、また、その塩として本発明に用いることもできる。例えば、ＰＧＡのナトリウム塩が好適に使用可能である。
【００２２】
ＰＧＡの分子量は、特に限定されない。ただし、物性などの点から、重量平均分子量１万以上であることが好ましく、１０万以上であることがより好ましい。さらに好ましくは、５０万以上であり、いっそう好ましくは１００万以上であり、ひときわ好ましくは１５０万以上であり、特に好ましくは２００万以上である。また、合成の困難性などの点で、重量平均分子量１３００万以下であることが好ましく、１０００万以下であることがより好ましい。
【００２３】
例えば、上記特許文献１（特開２００２−２３３３９１号公報）には、重量平均分子量約１３００万のＰＧＡが記載されており、このＰＧＡを好適に本発明に使用することができる。
【００２４】
また、上記特許文献１の従来の技術欄に記載されているように、従来から、分子量１０万〜２００万のＰＧＡが汎用されており、この分子量範囲のＰＧＡを本発明に用いることも可能である。
【００２５】
本発明に用いるＰＧＡは、任意の公知の製造方法で製造され得る。例えば、上記特許文献１に記載された方法などが使用可能である。
【００２６】
なお、上記ＰＧＡは、αポリグルタミン酸とはまったく異なる化合物である。αポリグルタミン酸はα位のカルボキシル基がアミノ基と重縮合してポリマーの主鎖を構成する。αポリグルタミン酸は天然に存在しておらず、化学合成により得られる。グルタミン酸はカルボキシル基を２個有するため、化学合成的に重合しようとすると分岐が生じる可能性が非常に高く、分岐を含まない高分子を合成することが極めて困難であり、合成できたとしてもそのコストが高く、工業的に使用することが極めて困難である。従って、αポリグルタミン酸は試薬として市販され、各種研究に使用されているが、現状、工業的な利用はほとんどされていない。
【００２７】
他方、ＰＧＡ（γポリグルタミン酸）はγ位のカルボキシル基がアミノ基と重縮合してポリマーの主鎖を構成する。ＰＧＡは納豆の糸引き成分に含まれる天然高分子であり、基質特異性の高い酵素により合成されるため、分子構造は直鎖状である。ＰＧＡは長い食経験（納豆）に基づいて高い安全性が確認されている。また、このγタイプのポリグルタミン酸は同じポリグルタミン酸でもαタイプのものと全く別の物質であり、反応性や性質・機能は全く異なる。
【００２８】
（シクロデキストリン類）
本発明においてシクロデキストリン類とは、複数のグルコースが結合して大きい環状構造を結合している化合物をいう。例えば、６、７または８個のグルコースが環状構造を形成したもの（α、β、γ−シクロデキストリン）などが挙げられる。シクロデキストリンの水酸基のうちの１つまたは複数が置換基（例えば、低級アシル基）によって置換されていてもよい。低級アシル基の好ましい例としては、直鎖または分岐鎖のアルキルカルボニル基などである。低級アシル基の炭素数は好ましくは６以下であり、より好ましくは４以下である。また、低級アシル基の炭素数は１以上であり、１つの実施態様では２以上である。具体的には、例えば、アセチル基、プロピオニル基などが挙げられる。
【００２９】
（合成方法)
本発明の化合物の合成方法は、特に限定されないが、好ましい実施態様においては、エステル化触媒の存在下で、ＰＧＡとシクロデキストリン類とを反応させることにより、シクロデキストリン類が導入されたＰＧＡが得られる。
【００３０】
ここで、使用されるシクロデキストリン類のモル数は、ＰＧＡに対して導入しようとする所望の量に応じて適宜選択される。おおよそ、反応前のＰＧＡの側鎖カルボシキシル基のモル数に対して、０．１％以上が好ましく、１％以上がより好ましく、３％以上がさらに好ましく、５％以上がいっそう好ましく、１０％以上が特に好ましい。また、１５０％以下とすることが好ましく、１００％以下がより好ましく、７０％以下がさらに好ましい。５０％以下がいっそう好ましい。１つの実施態様では、４０％以下とすることも可能であり、別の実施態様では、３０％以下としてもよい。導入される量が少なすぎる場合には、得られるＰＧＡ誘導体においてシクロデキストリン類の導入効果が得られにくい。導入される量が多すぎる場合には、得られるＰＧＡ誘導体におけるＰＧＡとしての性能が失われやすい。
【００３１】
なお、後述する実施例に記載する方法においては、用いるシクロデキストリン類の量に比べて、得られるＰＧＡ誘導体中のＣＤ量は少なくなるので、このような場合には、その合成反応の際のＣＤ量の減少を考慮して、反応に用いるシクロデキストリン類の量を決めることが好ましい。
【００３２】
シクロデキストリン類とＰＧＡとの反応の際の溶媒としては、例えば、水などが使用可能である。
【００３３】
シクロデキストリン類とＰＧＡとの反応には、カルボン酸とアルコールとの反応に使用できることが知られている縮合剤を用いて行うことができる。縮合剤を用いずに反応を行うことも可能であるが、反応効率等の点で、縮合剤を用いることが極めて好ましい。本発明の製造方法における反応は水性溶媒で行われることが好ましいので、縮合剤は水溶性の縮合剤であることが好ましい。水溶性の縮合剤の例には、水溶性カルボジイミド、トリアジン型の脱水縮合剤などが含まれるが、好ましくは水溶性カルボジイミドである。これらの点から、本発明の製造方法に用いられる縮合剤の特に好ましい例には、水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が含まれる。
【００３４】
縮合剤（例えばＥＤＣ）の使用量としては、シクロデキストリン類１モルに対して、１モル以上とすることが好ましく、２モル以上とすることが好ましく、２．５モル以上とすることがより好ましい。また、シクロデキストリン類１モルに対して、１０モル以下とすることが好ましく、８モル以下とすることがより好ましく、６モル以下とすることがさらに好ましい。
【００３５】
前記反応は、縮合剤とあわせてその活性助剤を用いて行うこともできる。活性助剤とは、縮合剤の活性を上げるものである。水溶性カルボジイミドの活性助剤の例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などが含まれる。また、活性助剤の使用量としては、縮合剤１モルに対して、０．０１モル以上とすることが好ましく、０．１モル以上とすることが好ましく、０．５モル以上とすることがより好ましい。また、縮合剤１モルに対して、１０モル以下とすることが好ましく、５モル以下とすることがより好ましく、３モル以下とすることがさらに好ましい。活性助剤としてＮＨＳを用いる場合は、水溶性カルボジイミド１モルに対して、０．１〜３モル程度用いることが好ましい。
【００３６】
また、シクロデキストリン類とＰＧＡとの反応の際の触媒としては、必要に応じて、カルボン酸とアルコールとの反応に使用できることが知られている触媒を用いることが可能である。触媒の使用量については、それぞれの触媒の種類および性能に応じて、適宜定めることができる。
【００３７】
反応時の温度は特に限定されない。室温でもよく、加温してもよい。ただし、温度が低すぎる場合には、反応に極めて長時間を有するので、室温または室温以上で行うことが好ましい。具体的には、好ましくは、１０℃以上であり、より好ましくは、１５℃以上であり、さらに好ましくは、２０℃以上である。また、好ましくは、１００℃以下であり、より好ましくは、５０℃以下である。高すぎる場合には、ＰＧＡが分解しやすい。従って室温付近で行うことが好ましい。
【００３８】
反応時間は、好ましくは、３０分間以上であり、より好ましくは、１時間以上であり、さらに好ましくは、２時間以上であり、いっそう好ましくは、６時間以上であり、特に好ましくは、１２時間以上である。ただし、プロセス全体の長さを短縮するためには、好ましくは、７日以下であり、より好ましくは、４日以下であり、さらに好ましくは、２日以下である。
【００３９】
ＥＤＣは弱酸性〜塩基性ｐＨ域の条件下でカルボキシル基を活性化し、その活性中間体がアミノ基または水酸基と反応し、アミド結合またはエステル結合を形成することが知られている。ＥＤＣの使用例は、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １７  ７６５−７７３  （１９９６）、またはＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９０  ７４７−７５３  （２００３）に記載されている。これらの文献に記載された反応条件等を応用することにより、反応を効率良く行うことができる。従って、反応の際のｐＨは、好ましくは６以上であり、より好ましくは７以上である。また、好ましくは１１以下であり、より好ましくは１０以下である。
【００４０】
反応が完了した後、必要に応じて中和、残存する反応材料（縮合剤、活性助剤など）の除去、溶媒の除去および精製などを行うことにより、本発明の誘導体が得られる。なお、反応後の水溶液の中和に際しては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、重炭酸水素ナトリウム、アルギニンなどのアルカリを用いることができる。
【００４１】
（リンカー）
なお、本発明において、シクロデキストリン類は、好ましくは、直接、ＰＧＡの側鎖カルボシキシル基と結合するが、必要に応じて、シクロデキストリン類を、リンカーを介してＰＧＡのカルボシキシル基に結合させてもよい。リンカーとしては、シクロデキストリンの水酸基と結合し得る官能基と、ＰＧＡのカルボシキシル基と結合し得る官能基とを有する任意の低分子化合物が使用可能である。このような低分子化合物の分子量としては、５００以下であることが好ましく、３００以下であることがより好ましい。また、５０以上であることが好ましい。リンカーの主鎖は、好ましくは、アルキレン基である。すなわち、リンカーとしては、例えば、低級アルキレン（例えば、炭素数１〜５のアルキレン）にシクロデキストリンの水酸基と結合し得る官能基と、ＰＧＡのカルボシキシル基と結合し得る官能基とを有する任意の化合物が好ましく使用可能である。
【００４２】
（生成物）
リンカーを用いない場合、上述した方法により得られた誘導体は、ＰＧＡの側鎖カルボシキル基のうちの一部にシクロデキストリン類がエステル結合により共有結合した構造を有する。
【００４３】
ＰＧＡのカルボシキル基のすべてにシクロデキストリン類を結合させることも可能であるが、一部のみに結合させることが、ＰＧＡの性能を損なわないという点で有効である。導入するシクロデキストリン類のモル数は、シクロデキストリン類とＰＧＡとを反応させる際の配合量および反応時間などを調整することにより、制御することができる。導入するシクロデキストリン類のモル数は、その用途に応じて適宜設計され得る。反応前のＰＧＡの側鎖カルボシキシル基のモル数に対して、０．００１％以上が好ましく、０．１％以上がより好ましく、１％以上がさらに好ましく、３％以上が特に好ましい。また、８０％以下とすることが好ましく、６０％以下がより好ましく、４０％以下がさらに好ましい。１つの実施態様では、２０％以下とすることも可能であり、別の実施態様では、１０％以下としてもよい。導入される量が少なすぎる場合には、シクロデキストリン類を導入する効果が得られにくい。導入される量が多すぎる場合には、得られるＰＧＡ誘導体におけるＰＧＡとしての性能が失われやすい。
【００４４】
シクロデキストリンを構成するグルコースユニットには、２位および３位に２級の水酸基が存在し、６位に１級の水酸基が存在するが、本発明の方法によれば、通常、６位の１級水酸基がＰＧＡの側鎖カルボキシル基と反応する。
【００４５】
なお、シクロデキストリンには多数のグルコースユニットが存在し、それぞれのグルコースユニットに１つずつ６位の１級水酸基が存在するので、理論上は、１つのシクロデキストリン分子の複数の水酸基がＰＧＡと反応して、その結果、シクロデキストリンがＰＧＡ分子間を架橋してＰＧＡがゲル化することも考えられる。しかし、後述する実施例１〜３においては、そのようなゲル化は生じておらず、これらの実施例のような条件下では、１つのシクロデキストリンの１つの水酸基のみがＰＧＡと結合する反応が優先的に生じることがわかった。
【００４６】
他方、リンカーを用いた場合、ＰＧＡ誘導体は、ＰＧＡの側鎖カルボシキル基のうちの一部にリンカーの１端が結合し、そしてリンカーの他方の端がシクロデキストリン類の水酸基に結合した構造を有する。ＰＧＡの側鎖カルボシキル基とリンカーとの結合はエステル結合であってもよく、他の結合（例えば、アミド結合など）であってもよい。また、リンカーとシクロデキストリン類の水酸基との結合も任意の結合が採用され得る。
【００４７】
（用途）
本発明の誘導体は、幅広い分野における応用が期待される。すなわち、ＰＧＡの生体適合性が維持されたまま親水性が制御され、そしてシクロデキストリン特有の作用効果が付加されるので、医薬品、化粧品、食品などの様々な分野において様々な材料として使用することが可能となる。
【実施例】
【００４８】
以下に、シクロデキストリン類をＰＧＡに導入する実施例を説明する。
【００４９】
（ＰＧＡの調製）
国際公開ＷＯ２００４−７５９３号公報に記載の方法に従い、分子量約２００万のＰＧＡのナトリウム塩（ＰＧＡＮａ）を得た。これを以下の実験に用いた。
【００５０】
（実施例１）
７０ｍＬの脱イオン水にグルタミン酸モノマーとして３ｍｍｏｌ相当のＰＧＡＮａ塩（０．４５１ｇ）を溶解させ、ＰＧＡＮａ塩水溶液を調製した。当該水溶液にβ−シクロデキストリン（β−ＣＤ）０．３ｍｍｏｌ（０．３４１ｇ）を加えて溶解させた後、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）０．９ｍｍｏｌ（０．１０４ｇ）を加え、次いで１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を０．９ｍｍｏｌ（０．１７２ｇ）加えることで反応を開始させた。反応は全て室温で攪拌することにより行い、反応時間は２４時間とした。反応終了後、反応溶液に膨潤させたイオン交換樹脂（オルガノ社製、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（アンバーライト）ＩＲ−１２０Ｈ）を反応に用いたＥＤＣ１ｇに対して３０ｇ加えて１２時間攪拌することで残存アミンを中和して粗精製を行った。粗精製物水溶液に重炭酸水素ナトリウムを加えて粗精製物を中和し、その水溶液を分子量分画２０００の透析膜を用いて透析による精製を行った（水を４回交換）。その後、内容物を凍結乾燥することで生成物を得た。使用したＰＧＡおよびβ−シクロデキストリンの量（仕込みに用いたβ−シクロデキストリンが全て仕込んだＰＧＡに導入されたと仮定する理論収量）に基づく収率は５５％であった。
【００５１】
核磁気共鳴スペクトルより合成確認を行った。その結果、シクロデキストリン残基の炭素に結合している水素のピーク（例えば、グルコースユニットの１位の炭素に結合している水素のピーク：５．０４ｐｐｍ）が、ＰＧＡに結合する前に比べて顕著にブロード化されていたので、シクロデキストリンがＰＧＡの側鎖に結合したことが確認された。
【００５２】
シクロデキストリン導入率について、得られた誘導体のＮＭＲを調べた結果、ＰＧＡ残基中のβ位炭素に結合している水素のピーク（４．１２ｐｐｍ）の積分値と、βＣＤ残基のそれぞれのグルコースユニットの２位〜６位の炭素に結合している水素のピーク（３．５−４．０ｐｐｍ）の積分値との比から、ＰＧＡの側鎖のカルボシキシル基のうちの約３．６％にシクロデキストリンが導入されたことが確認された。
【００５３】
（実施例２）
上記β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）の使用量を０．６ｍｍｏｌ（０．６８１ｇ）とし、また、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）の使用量を１．８ｍｍｏｌ（０．２０７ｇ）とし、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の使用量を１．８ｍｍｏｌ（０．３４６ｇ）とした以外は、上記実施例１と同様に実験を行った。その結果、使用したＰＧＡおよびβ−シクロデキストリンの量に（仕込みに用いたβ−シクロデキストリンが全て仕込んだＰＧＡに導入されたと仮定する理論収量に）基づく収率は３８％であった。β−ＣＤ導入率は６．４％であった。
【００５４】
（実施例３）
上記β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）の使用量を０．９ｍｍｏｌ（１．０２２ｇ）とし、また、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）の使用量を２．７ｍｍｏｌ（０．３１１ｇ）とし、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の使用量を２．７ｍｍｏｌ（０．５１８ｇ）とした以外は、上記実施例１と同様に実験を行った。その結果、使用したＰＧＡおよびβ−シクロデキストリンの量に（仕込みに用いたβ−シクロデキストリンが全て仕込んだＰＧＡに導入されたと仮定する理論収量に）基づく収率は３８％であった。β−ＣＤ導入率は９．６％であった。
【００５５】
以下の表に、実施例１〜３の条件および結果をまとめて示す。
【００５６】
【表１】
2009073861.tif 000002
なお、上記実施例１〜３においては、ゲル化が起こらなかったので、これらの生成物においては、β−ＣＤの複数の水酸基がＰＧＡのカルボキシル基と反応して架橋する現象は起こらなかったことが理解される。すなわち、β−ＣＤに存在する７つのグルコースユニットのうちの１つのグルコースユニットの６位の水酸基がＰＧＡのカルボキシル基と反応して結合したことがわかる。
【００５７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載および技術常識に基づいて、特許請求の範囲に等価な範囲を理解することができる。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明によれば、シクロデキストリン類が導入されたＰＧＡ誘導体が提供される。このため、バイオテクノロジーの様々な用途において、様々な生物学的材料（例えば、医薬品）を包接して様々な効果を発現することが可能になる。