(57)【要約】【課題】細胞またはウイルスを、その生物活性を維持しつつ、簡易かつ収率よく回収することができる細胞またはウイルスの回収方法を提供すること。【解決手段】本発明の細胞またはウイルスの回収方法は、少なくとも表面付近が主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体１の表面に付着した細胞・ウイルス（細胞またはウイルス）２を、担体１から遊離させて回収するものであり、細胞・ウイルス２が付着した担体１に、担体１に対する親和性が細胞・ウイルス２よりも大きいタンパク質を含む回収液４００を接触させることにより、細胞・ウイルス２を、回収液４００中に遊離させて回収するものである。回収液４００に含まれるタンパク質としては、特に、カゼインが好適である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表面付近が主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に付着した細胞またはウイルスを、前記担体から離脱させて回収する細胞またはウイルスの回収方法であって、
前記細胞またはウイルスが付着した前記担体に、前記担体に対する親和性が前記細胞またはウイルスよりも大きいタンパク質を含む回収液を接触させることにより、前記細胞またはウイルスを前記担体から離脱させて回収することを特徴とする細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項２】
少なくとも表面付近が主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に付着した細胞またはウイルスを、前記担体から離脱させて回収する細胞またはウイルスの回収方法であって、
前記細胞またはウイルスと、前記担体に対する親和性が前記細胞またはウイルスよりも大きいタンパク質とが付着した前記担体に、さらに、前記タンパク質を含む回収液を接触させることにより、前記細胞またはウイルスを前記担体から離脱させて回収することを特徴とする細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項３】
前記タンパク質は、金属タンパク質である請求項１または２に記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項４】
前記金属タンパク質は、カゼインである請求項３に記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項５】
前記回収液の前記タンパク質の濃度は０．１〜１００ｍｇ／ｍＬである請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項６】
前記回収液を前記担体に接触させる時間は、１〜１５分である請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項７】
前記回収液を前記担体に接触させる際の前記回収液の温度は、２〜４０℃である請求項１ないし６のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項８】
前記担体に前記回収液を接触させる際に、当該担体に対して振動または衝撃を付与する請求項１ないし７のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項９】
前記担体に前記回収液を接触させる処理を、複数回行う請求項１ないし８のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項１０】
前記回収液は、分解酵素およびキレート剤を実質的に含まないものである請求項１ないし９のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項１１】
前記担体に前記回収液を接触させる処理に先立って、前記細胞またはウイルスが付着した前記担体を少なくとも１回洗浄する請求項１ないし１０のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項１２】
前記洗浄に用いる洗浄液は、等張液である請求項１１に記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項１３】
前記担体は、粒状のものである請求項１ないし１２のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項１４】
粒状の前記担体の平均粒径は、１〜１０００μｍである請求項１３に記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【請求項１５】
前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものである請求項１ないし１４のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞またはウイルスの回収方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば、培養培地や、血液等の体液中等の試料中から細胞やウイルスを回収・単離して、その生理機構を調べたり、細胞やウイルスを用いて、これらに対する特異抗体等の生体物質の検出キットを構成したりすることが行われている。これらの場合には、回収対象となる細胞やウイルスが、回収を行うための各種処理によって破壊されたり、その生物活性が損なわれたりせず、効率よく（高濃度で）回収されることが必要となる。
【０００３】
試料中から細胞やウイルスを回収（単離）する方法としては、例えば、１．まず、試料を固体支持体に接触させることにより、固体支持体の表面に細胞やウイルスを付着させ、２．次に、固体支持体と試料とを分離した後、固体支持体を溶離液に接触させさせることにより、固体支持体に付着した細胞やウイルスを溶離液中に溶離して回収する方法がある（例えば、特許文献１、２参照。）。
【０００４】
ここで、固体支持体としては、ガラス、シリカ、ラテックス、ポリマー物質よりなる基板や、これら材料よりなる基材に正電荷コーティングや負電荷コーティングを施した基板が用いられている。
【０００５】
ところが、このような固体支持体を用いた従来の細胞回収方法では、用いる試薬や固体支持体により、細胞やウイルスが破壊されたり、その生物活性が阻害されたりするという問題があった。
【０００６】
また、固体支持体と細胞やウイルスとの組み合わせによっては、固体支持体の細胞やウイルスに対する親和性が不十分であること、または、これとは逆に固体支持体に細胞やウイルスが一旦付着すると強固に結合してしまうことに起因して、細胞やウイルスを、高濃度で、かつ、その生物活性を維持した状態で回収するのが難しいという問題があった。
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５０７１１６号公報
【特許文献２】特表２００５−５３１３０４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、細胞またはウイルスを、その生物活性を維持しつつ、簡易かつ収率よく回収することができる細胞またはウイルスの回収方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような目的は、下記（１）〜（１５）の本発明により達成される。
（１）  少なくとも表面付近が主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に付着した細胞またはウイルスを、前記担体から離脱させて回収する細胞またはウイルスの回収方法であって、
前記細胞またはウイルスが付着した前記担体に、前記担体に対する親和性が前記細胞またはウイルスよりも大きいタンパク質を含む回収液を接触させることにより、前記細胞またはウイルスを前記担体から離脱させて回収することを特徴とする細胞またはウイルスの回収方法。
【００１０】
これにより、細胞またはウイルスを、その生物活性を維持しつつ、前記担体に回収液を接触させるという簡易な操作で、収率よく回収することができる。
【００１１】
（２）  少なくとも表面付近が主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に付着した細胞またはウイルスを、前記担体から離脱させて回収する細胞またはウイルスの回収方法であって、
前記細胞またはウイルスと、前記担体に対する親和性が前記細胞またはウイルスよりも大きいタンパク質とが付着した前記担体に、さらに、前記タンパク質を含む回収液を接触させることにより、前記細胞またはウイルスを前記担体から離脱させて回収することを特徴とする細胞またはウイルスの回収方法。
【００１２】
これにより、細胞またはウイルスを、その生物活性を維持しつつ、前記担体に回収液を接触させるという簡易な操作で、収率よく回収することができる。
【００１３】
また、かかる構成の細胞またはウイルスの回収方法は、予め、担体の表面の一部に、前記担体に対する親和性が前記細胞またはウイルスより大きいタンパク質が付着しているので、比較的少量の前記細胞またはウイルスを回収する際に好適に適用される。
【００１４】
（３）  前記タンパク質は、金属タンパク質である上記（１）または（２）に記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【００１５】
金属タンパク質は、リン酸カルシウム系化合物に対する親和性が高いため、これを含む回収液を用いることにより、担体から細胞またはウイルスを、効率よく取り外すことができる。
【００１６】
（４）  前記金属タンパク質は、カゼインである上記（３）に記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【００１７】
カゼインは、そのリン酸基において、担体（リン酸カルシウム系化合物）の表面のカルシウムイオンと強く結合すると考えられる。このため、カゼインは、前記担体に対して優れた吸着能（高い親和性）を発揮する。さらに、カゼインは、哺乳類の乳に含まれるタンパク質であり、細胞やウイルスに与えるダメージが極めて小さいという点で優れている。
【００１８】
（５）  前記回収液の前記タンパク質の濃度は０．１〜１００ｍｇ／ｍＬである上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【００１９】
これにより、担体から細胞またはウイルスを効率よく取り外すことができる。
【００２０】
（６）  前記回収液を前記担体に接触させる時間は、１〜１５分である上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
これにより、１回の処理で、多くの細胞またはウイルスを回収することができる。
【００２１】
（７）  前記回収液を前記担体に接触させる際の前記回収液の温度は、２〜４０℃である上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
これにより、担体から細胞またはウイルスを効率よく取り外すことができる。
【００２２】
（８）  前記担体に前記回収液を接触させる際に、当該担体に対して振動または衝撃を付与する上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【００２３】
これにより、担体の表面により強固に付着する細胞またはウイルスも取り外すことができる。
【００２４】
（９）  前記担体に前記回収液を接触させる処理を、複数回行う上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【００２５】
回収液による処理を複数回行うことにより、十分な数の細胞またはウイルスを回収することができる。
【００２６】
（１０）  前記回収液は、分解酵素およびキレート剤を実質的に含まないものである上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【００２７】
分解酵素を実質的に含まない回収液を用いることにより、細胞の生存数が低減するのをより確実に防止することができ、キレート剤を実質的に含まない回収液を用いることにより、リン酸カルシウム系化合物が分解され、前記担体の表面が潰れてしまうのを確実に防止することができる。
【００２８】
（１１）  前記担体に前記回収液を接触させる処理に先立って、前記細胞またはウイルスが付着した前記担体を少なくとも１回洗浄する上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
これにより、タンパク質による処理効果をより向上させることができる。
【００２９】
（１２）  前記洗浄に用いる洗浄液は、等張液である上記（１１）に記載の細胞またはウイルスの回収方法。
これにより、浸透圧の違いによる細胞またはウイルスの破壊を防止することができる。
【００３０】
（１３）  前記担体は、粒状のものである上記（１）ないし（１２）のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【００３１】
これにより、担体の表面積を増大させることができ、担体の表面に、細胞またはウイルスを効率よく付着させることができる。
【００３２】
（１４）  粒状の前記担体の平均粒径は、１〜１０００μｍである上記（１３）に記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【００３３】
これにより、担体の表面積を十分に確保することができるとともに、担体の表面に、細胞またはウイルスをより効率よく付着させることができる。
【００３４】
（１５）  前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものである上記（１）ないし（１４）のいずれかに記載の細胞またはウイルスの回収方法。
【００３５】
ハイドロキシアパタイトは、生体材料として用いられるものであり、細胞またはウイルスが極めて効率よく付着することができ、かつ、細胞またはウイルスに対するダメージを与える可能性が特に低い。このため、担体の少なくとも表面付近がハイドロキシアパタイトを主成分として構成されていることにより、細胞またはウイルスを、その生物活性を確実に維持して、この担体の表面により効率よく付着させることができる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、細胞またはウイルスを、その生物活性を維持しつつ、簡易かつ収率よく回収することができる。
【００３７】
また、回収液に含有させるタンパク質として金属タンパク質、特にカゼインや、塩基性タンパクを用いることにより、担体から細胞またはウイルスをより効率よく離脱させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下、本発明の細胞またはウイルスの回収方法を添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００３９】
本発明の細胞またはウイルスの回収方法は、少なくとも表面付近が主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に付着した細胞またはウイルスを、前記担体から離脱させて回収するものであり、前記細胞またはウイルスが付着した前記担体に、前記担体に対する親和性が前記細胞またはウイルスよりも大きいタンパク質を含む回収液を接触させることにより、前記細胞またはウイルスを前記担体から離脱させて回収するものである。
【００４０】
まず、本発明の細胞またはウイルスの回収方法を説明するのに先立って、本発明で用いられる担体について説明する。
【００４１】
図１は、本発明で用いられる担体の一例を示す断面図である。
図１に示す担体１は、粒状（好ましくは、ほぼ球状）をなしている。担体１には、ブロック状（塊状）、ペレット状、シート状等の各種形状のものを使用することもできるが、粒状のものを用いることにより、その表面積を増大させることができ、より効率よく細胞またはウイルスを付着させることができる。
【００４２】
図１に示すように、担体１は、主として樹脂材料で構成された基材１１と、基材１１の表面を覆うように設けられ、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されたリン酸カルシウム系化合物層１２とを有している。これにより、担体１の形状、大きさ（平均粒径等）、物性（密度等）等の調整が容易となる。なお、担体１は、その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成されるものであってもよい。全体が、リン酸カルシウム系化合物で構成される担体１は、細胞またはウイルスをより効率よく捕捉し得る。
【００４３】
また、担体１の比表面積は、５〜１００ｍ２／ｇであるのが好ましく、１５〜８０ｍ２／ｇであるのがより好ましい。下限値を下回った場合、効率よく細胞またはウイルスを付着させることができないおそれがある。また、上限値を上回った場合、担体１の機械的強度が低下することにより担体１が破砕するおそれがある。
【００４４】
基材１１を樹脂材料で構成する場合、この樹脂材料としては、各種熱硬化性樹脂、各種熱可塑性樹脂を用いることができ、具体的には、熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリイミド、アクリル樹脂、熱可塑性ポリウレタン等、熱硬化性樹脂としては、例えば、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル、アルキド樹脂、熱硬化性ポリウレタン、エボナイド等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４５】
リン酸カルシウム系化合物層１２を構成するリン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０の各種化合物を用いることができ、例えば、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、ＣａＨＰＯ４等のうちの１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００４６】
これらの中でも、リン酸カルシウム系化合物としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）を主成分とするものが最適である。ハイドロキシアパタイトは、生体材料として用いられるものであり、細胞またはウイルスが極めて効率よく付着することができ、かつ、細胞またはウイルスに対するダメージを与える可能性が特に低い。
【００４７】
なお、これらのリン酸カルシウム系化合物は、公知の湿式合成法、乾式合成法などによって合成することができる。この場合、リン酸カルシウム系化合物中には、その合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。
【００４８】
また、リン酸カルシウム系化合物層１２は、図１に示すように、基材１１の表面付近に、リン酸カルシウム系化合物で構成された粒子１３（以下、単に「粒子１３」と言う。）の一部が貫入することにより形成されたものであるのが好ましい。これにより、リン酸カルシウム系化合物層１２と基材１１との密着性を優れたものとすることができる。このため、リン酸カルシウム系化合物層１２の基材１１の表面からの剥離を好適に防止すること、すなわち、担体１の強度を優れたものとすることができる。
【００４９】
この場合、リン酸カルシウム系化合物層１２は、例えば、基材１１の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子（以下、単に「多孔質粒子」と言う。）を衝突させることにより形成することができる。かかる方法によれば、容易かつ確実に、リン酸カルシウム系化合物層１２を形成することができる。
【００５０】
この基材１１と多孔質粒子との衝突は、例えば、市販のハイブリダイゼーション装置を用いて、乾式で行うことができる。このときの条件は、例えば、基材１１と多孔質粒子との混合比が、重量比で１００：５〜１００：３０程度、装置内の温度が、基材１１の主材料として用いた樹脂材料の軟化温度以下（通常、８０℃以下）とされる。
【００５１】
このような担体１は、その密度（比重）が水の密度に近いのものであるのが好ましい。具体的には、担体１の密度は、０．８〜１．４ｇ／ｃｍ３程度であるのが好ましく、０．９〜１．２ｇ／ｃｍ３程度であるのがより好ましい。これにより、担体１を、後述する被処理液や回収液中でより均一に懸濁させることができる。その結果、これらの液体と担体１とをより確実かつ均一に接触させることができ、担体１へ細胞またはウイルスが付着する効率や、回収液中への細胞またはウイルスの収率をより向上させることができる。
【００５２】
また、担体１の平均粒径は、１〜１０００μｍ程度であるのが好ましく、２〜１００μｍ程度であるのがより好ましく、４〜１０μｍ程度であるのがさらに好ましい。これにより、担体１の表面積を十分に確保することができるので、担体１への細胞またはウイルスの付着率をより向上させることができる。また、粒径が小さ過ぎると、担体１同士の間を液体が流れにくくなるおそれがある。
【００５３】
次に、図１に示す担体を用いて、細胞またはウイルスを回収する回収方法（本発明の細胞またはウイルスの回収方法）の一例について説明する。
【００５４】
なお、本実施形態では、［１］細胞またはウイルスを担体に付着させ、［２］この細胞またはウイルスが付着した担体を洗浄した後に、［３］担体から細胞またはウイルスを脱離させて回収する処理を行い、その後さらに、［４］細胞またはウイルスが回収された担体を洗浄する場合を代表に説明する。
【００５５】
図２、３は、本実施形態の細胞またはウイルスの回収方法を模式的に示す工程図である。
【００５６】
図２、３に示すように、これらの一連の工程（操作）は、例えば、ビーカー、試験管等の容器内で行われる。以下、各工程について順次説明する。
【００５７】
［１］細胞またはウイルスを担体に付着させる工程
まず、担体１に付着させる細胞またはウイルス（以下、細胞またはウイルスを「細胞・ウイルス２」として表す。）を用意し、これを含む被処理液２００を得る。
【００５８】
細胞・ウイルス２としては、例えば、バクテリア細胞、植物細胞、動物細胞等の各種細胞、インフルエンザ、日本脳炎、デング熱、風疹、麻疹、ムンプスのような感染症等の原因となるウイルス等が挙げられる。
【００５９】
細胞・ウイルス２は、凍結乾燥されたものであってもよく、血液、唾液のような体液や培養液中で培養されたもの、生活環境に存在する各種水（浴槽水、河川水、井戸水、プールの水等）等の液体に懸濁されたものであってもよい。
なお、細胞・ウイルス２が凍結乾燥されたものである場合には、これを分散液に懸濁させることによって被処理液２００を得る。また、細胞・ウイルス２が液体に懸濁されたものである場合には、この懸濁液をそのまま被処理液２００として用いてもよく、これを希釈液によって希釈したものを被処理液２００として用いてもよい。
【００６０】
ここで、分散液および希釈液としては、等張液（細胞内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体）が好適である。これにより、分散液および希釈液が細胞・ウイルス２に接触した際における浸透圧の違いによる細胞・ウイルス２の破壊を防止することができる。
【００６１】
この等張液には、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ液（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）、Ｌｏｃｋｅ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｔｙｒｏｄｅ液、Ｅａｒｌｅ液、Ｋｒｅｂｓ液、生理食塩水等を用いることができる。
【００６２】
次に、被処理液２００を、担体１に接触させることにより、担体１に細胞・ウイルス２が付着した細胞・ウイルス付着担体３を得る。
【００６３】
具体的には、担体１を容器１００内に収納するとともに被処理液２００を供給する（図２中（ａ）参照）。そして、被処理液２００を振盪（揺動）、攪拌、超音波の付与等することにより、被処理液２００中に担体１を分散（懸濁）させる（図２中（ｂ）参照）。これにより、担体１の表面に細胞・ウイルス２が接触し付着する。
【００６４】
次に、担体１を含有する被処理液２００を静置することにより、担体１を容器１００内に沈降させ、上清の被処理液２００を除去して廃棄する（図２（ｃ）参照）。
【００６５】
ここで、担体１は、少なくとも表面付近が主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されている。リン酸カルシウム系化合物は、細胞・ウイルス２に対して高い親和性を有しているので、細胞・ウイルス２が効率よく付着している。
【００６６】
なお、後述するように、担体１に対する親和性が細胞・ウイルス２よりも大きいタンパク質は、リン酸カルシウム系化合物の構成元素の一つであるカルシウム（サイト）や、リン酸（サイト）を、静電的な結合等を介して、付着するものと考えられるため、本発明を適応して回収する細胞・ウイルス２としては、回収を目的とするウイルスや細胞と比べ、リン酸カルシウムへの親和性がより高いたんぱく質を選択すれば、より効率よく細胞・ウイルス２を回収することができる。
【００６７】
このように各サイトに付着する細胞・ウイルス２としては、上述したような、各種細胞、さらには、デングウイルスおよび日本脳炎ウイルスが属するフラビウイルス科、インフルエンザウイルスが属するオルトミクソウイルス科、風疹ウイルスが属するトガウイルス科、麻疹ウイルスおよびムンプスウイルスが属するパラミクソウイルス科のウイルスのようなエンベロープを有するウイルスが考えられる。
【００６８】
すなわち、本発明の回収方法は、各種細胞やエンベロープを有するウイルスの回収に好適に適用し得ると考えられる。
【００６９】
この被処理液２００を担体１に接触させる時間は、１〜２４０分程度であるのが好ましく、１０〜１８０分程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、担体１に付着する細胞数またはウイルス数が少なくなり、十分に細胞・ウイルス２を回収できないおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、細胞・ウイルス２が崩壊してしまうおそれがあり、細胞・ウイルス２を目的とする用途に使用することが困難となる。
【００７０】
また、この際（処理時）の被処理液２００の温度は、７０℃以下であるのが好ましく、５０℃以下であるのがより好ましく、５〜４０℃程度であるのがさらに好ましい。処理時の被処理液２００の温度が低く過ぎると、細胞・ウイルス２の種類等によっては、担体１に細胞・ウイルス２を効率よく付着させることができないおそれがあり、一方、処理時の被処理液２００の温度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、細胞・ウイルス２が崩壊して（破壊されて）しまうおそれがあり、細胞・ウイルス２を目的とする用途に使用することが困難となる。
【００７１】
［２］  細胞またはウイルスが付着した担体を洗浄する第１の洗浄工程
次に、細胞・ウイルス２が担体１に付着した細胞・ウイルス付着担体３を洗浄液３００により洗浄する。
【００７２】
具体的には、容器１００内に洗浄液３００を供給する（図２中（ｄ）参照）。そして、洗浄液３００を穏やかに攪拌等することにより、洗浄液３００中に細胞・ウイルス付着担体３を分散（懸濁）させる（図２中（ｅ）参照）。次いで、静置することにより、細胞・ウイルス付着担体３を容器１００内に沈降させ、上清の洗浄液３００を除去して廃棄する（図２中（ｆ）参照）。
これにより、細胞・ウイルス付着担体３の表面に残存する被処理液２００を除去する。
【００７３】
被処理液２００中には、例えば、後述する高親和性タンパク質の担体１に対する付着を阻害する阻害物質が含まれている場合があるが、本工程［２］において、細胞・ウイルス付着担体３の表面に残存する被処理液２００を極力除去しておくことにより、次工程［３］における高親和性タンパク質による処理効果をより向上させることができる。
【００７４】
本工程［２］で用いる洗浄液３００としては、各種のものが使用可能であるが、本実施形態のように細胞・ウイルス２の回収を目的とする場合には、等張液（細胞内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体）が好適である。これにより、浸透圧の違いによる細胞・ウイルス２の破壊を防止することができる。
この等張液には、前記工程［１］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【００７５】
また、本工程［２］は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、細胞・ウイルス付着担体３の表面に残存する被処理液２００をより確実に除去することができる。
【００７６】
この場合、用いる洗浄液３００は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。
【００７７】
また、本工程［２］における洗浄の方法には、上述した方法の他、例えば、フィルター上に細胞・ウイルス付着担体３を載置して、細胞・ウイルス付着担体３に洗浄液３００を供給する（例えば。ピペット等を用いて吹き掛ける）方法等を用いることもできる。
【００７８】
なお、上述した阻害物質が被処理液２００に含まれていない場合や、含まれていても微量である場合には、本工程を省略することもできる。
【００７９】
［３］  担体に付着した細胞またはウイルスを回収する処理工程
次に、洗浄後の細胞・ウイルス付着担体３に、担体１に対する親和性が細胞・ウイルス２よりも大きいタンパク質（以下、「高親和性タンパク質」と言う。）を含む回収液４００を接触させる処理を行う。
【００８０】
具体的には、容器１００内に高親和性タンパク質を含む回収液４００を供給する（図３中（ａ）参照）。そして、回収液４００を攪拌等することにより、図３中（ｂ）に示すように、回収液４００中に細胞・ウイルス付着担体３を分散（懸濁）させて、高親和性タンパク質を細胞・ウイルス付着担体３に接触させる。これにより、細胞・ウイルス付着担体３から細胞・ウイルス２が回収液４００中に脱離（遊離）する。次いで、細胞・ウイルス付着担体３を含有する回収液４００を静置することにより、細胞・ウイルス付着担体３を容器１００内に沈降させ、上清の回収液４００を回収する（図３中（ｆ）参照）。
【００８１】
これにより、細胞・ウイルス付着担体３に回収液４００を接触させるという簡易な操作で、細胞・ウイルス２を、その生物活性を維持しつつ、細胞・ウイルス付着担体３から脱離させて、回収液４００中に浮遊した状態で、収率よく回収することができる。
【００８２】
ここで、細胞・ウイルス付着担体３に、高親和性タンパク質を含む回収液４００を接触させることにより、担体１に付着している細胞・ウイルス２が脱離（遊離）するのは、次のようなメカニズムによるものと推察される。
【００８３】
すなわち、細胞・ウイルス付着担体３では、細胞・ウイルス２は、リン酸カルシウム系化合物層１２を足場として付着しているものと考えられる。一方、このような細胞・ウイルス付着担体３に付着する高親和性タンパク質は、リン酸カルシウム系化合物の構成元素であるカルシウム（サイト）やリン酸（サイト）を、静電的な結合等を介して付着するものと考えられる。
【００８４】
そして、細胞・ウイルス付着担体３に、高親和性タンパク質が接触すると、高親和性タンパク質は、担体１に対する親和性が細胞・ウイルス２よりも大きいことに基づいて、担体１に付着している細胞・ウイルス２を、いわば押し退けるようにして、担体１に付着する。一方、細胞・ウイルス２は、高親和性タンパク質に押し退けられるように足場を失い、さらに、高親和性タンパク質の立体障害の影響を受けることによって、担体１から脱離（剥離）し、回収液４００中に遊離するものと推測される。
【００８５】
なお、細胞・ウイルス付着担体３から細胞・ウイルス２を遊離させるために用いる回収液としては、高親和性タンパク質を含む回収液４００の他に、トリプシンのような分解酵素や、エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤を含むものも考えられる。
【００８６】
しかしながら、トリプシンのような分解酵素は、細胞・ウイルス２に含まれるタンパク質を分解することにより、細胞・ウイルス付着担体３から細胞・ウイルス２を遊離させるが、このような分解酵素を用いた方法では、細胞・ウイルス２自体に破壊（溶解）が生じ、細胞・ウイルスの特性に悪影響をおよぼすという問題がある。一方、キレート剤は、リン酸カルシウム系化合物層１２から、その構成元素の１つであるカルシウムをイオンとして捕捉して引き抜く作用を有しており、この作用を利用して細胞・ウイルス付着担体３から細胞・ウイルス２を遊離させることができる。しかしながら、このようなキレート剤を用いた方法では、リン酸カルシウム系化合物層１２からカルシウムイオンが引き抜かれることによって、リン酸カルシウム系化合物が分解されリン酸カルシウム系化合物層１２が潰れてしまうという問題がある。
【００８７】
これに対して、高親和性タンパク質には、以下に例示するようなものがあるが、これらはいずれも細胞・ウイルス２に与えるダメージが小さく、その生理活性を維持した状態で、細胞・ウイルス付着担体３から細胞・ウイルス２を脱離させることができる。また、高親和性タンパク質は、カルシウムを取り込んだ状態でリン酸カルシウム系化合物層１２の表面に付着するため、タンパク質に取り込まれたカルシウムはリン酸カルシウム系化合物層１２中に保持され、リン酸カルシウム系化合物層１２の分解の問題を生じないという利点がある。
【００８８】
以上のことから、回収液４００は、例えば、トリプシン、ペプシン、パパインのような分解酵素（消化酵素）、および、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）のようなキレート剤を実質的に含まないものであるのが好ましい。このように分解酵素およびキレート剤を実質的に含まない回収液４００とすることにより、上記問題点を確実に解消することができる。
【００８９】
高親和性タンパク質としては、担体１に対する親和性が、前記工程［１］で担体１に付着させた細胞・ウイルス２よりも大きいものであれば、特に限定されないが、例えば、カゼイン、ビテリン、ホスビチン、シトクロムｃ、トランスフェリンのような金属タンパク質やアルブミンおよびミオグロビン等が挙げられる。
【００９０】
このようなタンパク質の中でも、金属タンパク質が好ましく用いられる。金属タンパク質は、その分子内に金属イオンを有しているため、金属イオンとの親和性が高い。そして、リン酸カルシウム系化合物は、金属イオンであるカルシウムイオンおよびリン酸イオンを有するため、金属タンパク質は、表面付近にリン酸カルシウム系化合物層１２が設けられた担体１に対して優れた吸着能（高い親和性）が得られる。
【００９１】
また、金属タンパクとしては、例えば、カゼイン、ビテリン、ホスビチンのように、タンパク質の一部がリン酸化されているリン酸化タンパク質であることが好ましい。ここで、カゼイン、ビテリン、ホスビチンのようなリン酸化タンパク質は、リン酸基に結合する金属イオンとしてカルシウムを含んでいる。そして、この金属（カルシウム）イオンが金属タンパク質から離脱すると、リン酸化タンパク質は、そのリン酸基において、担体（リン酸カルシウム系化合物）の表面のカルシウムイオンと強く結合すると考えられる。このため、リン酸化タンパク質は、表面付近にリン酸カルシウム系化合物層１２が設けられた担体１に対して優れた吸着能（高い親和性）を発揮する。さらに、金属（カルシウム）イオンを有するリン酸化タンパク質の中でも、カゼインは、哺乳類の乳に含まれるタンパク質であり、細胞やウイルスに与えるダメージが極めて小さいという点で優れている。
【００９２】
なお、高親和性タンパク質として、金属タンパク質のような金属イオンを保有するタンパク質を用いる場合には、かかる高親和性タンパク質には、その保有する金属イオンを除去する（減少させる）処理を施しておくのが好ましい。これにより、高親和性タンパク質の担体１に対する親和性を、より高いものとすることができ、細胞・ウイルス付着担体３から細胞・ウイルス２を効率よく遊離させることができる。
【００９３】
この金属イオンの除去方法としては、例えば、かかる高親和性タンパク質を含有する溶液（回収液４００）を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤で処理する方法等が挙げられる。この場合、高親和性タンパク質を含有する溶液をキレート剤で処理する方法としては、例えば、高親和性タンパク質を含有する溶液にキレート剤を添加した後、例えばゲルろ過、限外ろ過、透析等により、高親和性タンパク質を含有する溶液からキレート剤を除去する方法が挙げられる。
【００９４】
回収液４００における高親和性タンパク質の濃度は、特に限定されないが、０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ程度であるのが好ましく、０．２〜１０ｍｇ／ｍＬ程度であるのがより好ましい。高親和性タンパク質の濃度が低く過ぎると、高親和性タンパク質の種類等によっては、担体１から細胞・ウイルス２を効率よく取り外すことができない場合があり、一方、高親和性タンパク質の濃度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、高親和性タンパク質の種類によっては、細胞・ウイルス２にダメージ（悪影響）が生じるおそれがある。
【００９５】
また、高親和性タンパク質を溶解する溶媒としては、例えば、前記工程［１］で説明した分散液または希釈液と同様の等張液が好適である。これにより、浸透圧の違いによる細胞・ウイルス２の破壊を確実に防止することができる。
【００９６】
回収液４００による処理時間は、１〜１５分程度であるのが好ましく、３〜５分程度であるのがより好ましい。処理時間が短過ぎると、回収液４００中に遊離する細胞数またはウイルス数が少なくなり、目的とする細胞数またはウイルス数を得るには処理回数を増加させざるを得ず、その結果、回収される回収液４００の液量が不要に増大し好ましくない。一方、処理時間を、前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、細胞・ウイルス２にダメージを与えてしまうおそれがある。
【００９７】
回収液４００による処理時の回収液の温度は、２〜４０℃程度であるのが好ましく、４〜３７℃程度であるのがより好ましい。処理時の回収液４００の温度が低く過ぎると、高親和性タンパク質の種類等によっては、細胞・ウイルス付着担体３から細胞・ウイルス２を効率よく取り外すことができなくなるおそれがあり、一方、処理時の回収液４００の温度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、細胞・ウイルス２にダメージ（悪影響）を与えるおそれがある。
【００９８】
また、本工程［３］では、細胞・ウイルス付着担体３に回収液４００を接触させる際にこの細胞・ウイルス付着担体３に対して振動または衝撃を付与するのが好ましい。これにより、担体１の表面により強固に付着する細胞・ウイルス２も取り外すことができる。
【００９９】
この操作としては、例えば、回収液４００とともに細胞・ウイルス付着担体３をピペット６００で吸引し、排出する操作を繰り返すピペッティング操作（図３中（ｃ）〜（ｅ）参照）や、ピペットを用いて上清の回収液４００を吸引し、担体１に吹き掛ける操作、振盪器により担体１に振動を与える方法、回収液４００に超音波を付与する方法等により行うことができる。特に、図示のようなピペッティング操作によれば、細胞・ウイルス２へダメージを与えることを防止しつつ、短時間で操作を行うことができるという利点がある。
【０１００】
このような本工程［３］における回収液４００による細胞・ウイルス付着担体３の処理は、１回行うものであってもよいが、複数回行うのが好ましく、特に、２〜３回程度行うのがより好ましい。このように回収液４００による処理を複数回行うことにより、十分な数の細胞・ウイルス２を回収することができる。なお、回収液４００による処理回数を前記上限値を超えて多くしても、それ以上の細胞・ウイルス２の回収率の増大は見込めず、回収する液量が増大する場合があり、好ましくない。
【０１０１】
［４］  細胞またはウイルスが回収された担体を洗浄する第２の洗浄工程
次に、前記工程［３］を経て、細胞・ウイルス付着担体３から細胞・ウイルス２が取り外された担体１を、洗浄液（第２の回収液）５００により洗浄（処理）する。
【０１０２】
具体的には、容器１００内に洗浄液５００を供給する（図３中（ｇ）参照）。そして、洗浄液５００を攪拌等することにより、洗浄液５００中に担体１を分散（懸濁）させる（図３中（ｈ）参照）。次いで、静置することにより、担体１を容器１００内に沈降させ、上清の洗浄液５００を回収する（図３中（ｉ）参照）。
【０１０３】
これにより、前記工程［３］を経た後に、細胞・ウイルス付着担体３から取り外されたが、担体１の表面や容器１００の内面に吸着して、前記回収液４００中には回収されなかった細胞・ウイルス２を回収することができ、その結果、細胞・ウイルス２の回収率をより向上させることができる。
【０１０４】
本工程［４］で用いる洗浄液５００としては、例えば、前記工程［１］で説明した分散液または希釈液と同様の等張液が好適である。これにより、浸透圧の違いによる細胞・ウイルス２の破壊を確実に防止することができる。
【０１０５】
また、洗浄液５００（第２の回収液）は、このようなものに限定されず、例えば、前記回収液４００と異なる条件のもの、具体的には、回収液４００に対して高親和性タンパク質の濃度、種類、組成等の条件が異なるものを使用することもできる。
【０１０６】
なお、本工程［４］は、前記工程［３］で十分な量の細胞・ウイルス２が回収されている場合には、省略することもできるが、より細胞・ウイルス２の回収率を向上させるために必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、担体１の表面や容器１００の内面に吸着して残存する細胞・ウイルス２をより確実に回収することができる。
【０１０７】
また、この場合、用いる洗浄液５００は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。
【０１０８】
また、本実施形態では、高親和性タンパク質が付着していない担体１に、細胞・ウイルス２を付着させた細胞・ウイルス付着担体３を得、この細胞・ウイルス付着担体３に高親和性タンパク質を含む回収液４００を接触させることにより、細胞・ウイルス２を、細胞・ウイルス付着担体３から脱離させて、回収液４００中に回収する場合について説明したが、この場合に限定されず、例えば、以下のようにして細胞・ウイルス２を回収してもよい。
【０１０９】
すなわち、細胞・ウイルス２と、高親和性タンパク質２とが付着した担体に、さらに、高親和性タンパク質を含む回収液４００を接触させることにより、細胞・ウイルス２を前記担体から離脱させて、回収液４００中に回収するようにしてもよい。
【０１１０】
より具体的には、細胞・ウイルス２を担体１に付着させる前記工程［１］に先立って、担体１に、高親和性タンパク質を含有する溶液を供給することにより、担体１の表面の少なくとも一部に高親和性タンパク質を付着させた後に、前記工程［１］〜前記工程［４］の工程を施して、細胞・ウイルス２を回収液４００中に回収するようにしてもよい。
【０１１１】
かかる工程を経て、細胞・ウイルス２を回収する構成とした場合、担体に細胞・ウイルス２を付着させる際には、予め、担体の表面の一部には高親和性タンパク質が付着しているので、比較的少量の細胞・ウイルス２を回収する際に、かかる構成の回収方法が好適に適用される。さらに、担体に付着した細胞・ウイルス２を回収する前記工程［３］で用いられる回収液４００中の高親和性タンパク質の濃度を低くしたり、回収液４００による処理時間を短く設定できるという利点も得られる。
【０１１２】
以上、本発明の細胞またはウイルスの回収方法について説明したが、本発明は、これらに限定されるものではなく、必要に応じて任意の工程が追加されてもよい。
【実施例】
【０１１３】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．担体の用意
まず、平均粒径７μｍ、密度１．０２ｇ／ｃｍ３のナイロン粒子（基材）５０ｇと、Ｃａ／Ｐ比１．６７、平均粒径１０μｍのハイドロキシアパタイト粒子（一次粒子が凝集結合した多孔質粒子）１０ｇとを用意した。
【０１１４】
なお、ハイドロキシアパタイト粒子は、その比表面積が４５ｍ２／ｇ、かつ、その細孔径が６００Åであった。
【０１１５】
次に、これらナイロン粒子およびハイドロキシアパタイト粒子をＮＡＲＡハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（（株）奈良機械製作所製、定格動力５．５ｋＷ、定格電流２３Ａ）に投入し、この装置を８０００回転／分、３２〜５０℃で７分間稼動させた。これにより、表面がハイドロキシアパタイトで被覆された担体（図１参照）を得た。
【０１１６】
なお、得られた担体は、平均粒径９μｍ（ハイドロキシアパタイト被覆層の平均厚さ１μｍ）、密度１．０３ｇ／ｃｍ３であった。
【０１１７】
２．インフルエンザウイルスを用いた検討
（２−１）ウイルス懸濁液（被処理液）の用意
１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後に上清を除去したインフルエンザウイルス溶液（B/大阪/72/CCAstandard）を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて５倍希釈したものをウイルス懸濁液とした。
【０１１８】
（２−２）担体分散液の調製
＜１Ａ＞  まず、０．１ｇ担体を用意し、この担体をチューブ（ファルコンチューブ）内に収納した。そして、このチューブ内に、１０％エタノール含有ＰＢＳ溶液を、全量が１０ｍＬとなるように供給した。
【０１１９】
＜２Ａ＞  次に、チューブ内の担体を、ボルテックスを用いてほぐした後、３７℃で１時間ローテートした。
【０１２０】
＜３Ａ＞  次に、ローテートした後の分散液を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後、上清を、アスピレータを用いて廃棄した。
【０１２１】
＜４Ａ＞  次に、チューブ内に、全量が１０ｍＬとなるようにＰＢＳを供給することにより、１％の担体を含む担体分散液（１％担体分散液）を得た。
【０１２２】
（２−３）担体へのウイルス付着性能の検討
＜１Ｂ＞  まず、２ｍＬエッペンドルフチューブを５本（第１のチューブ〜第５のチューブ）×８組用意し、そのうち第２のチューブ〜第５のチューブにＰＢＳを２００μＬずつ供給し、第１のチューブには１％担体分散液を２００μＬ供給した。
【０１２３】
＜２Ｂ＞  次に、第２のチューブに、１％担体分散液２００μＬを供給して攪拌し、この第２のチューブ内から担体分散液２００μＬを分注し、このものを、第３のチューブに供給して攪拌した。
【０１２４】
この操作を、第３のチューブから第４のチューブへ、第４のチューブから第５のチューブへと同様に行うことにより、担体分散液を倍々希釈した。その結果、第１のチューブ〜第５のチューブ内に、それぞれ、担体濃度が１ｗｔ％、０．５ｗｔ％、０．２５ｗｔ％、０．１２５ｗｔ％、０．０６３ｗｔ％の担体分散液（２００μＬ）を得た後、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を取り除く。
【０１２５】
＜３Ｂ＞  次に、第１〜第５のチューブ内に、それぞれ、ウイルス懸濁液を２００μＬずつ分注し、その後、３７℃で１時間ローテートを行うことにより、担体にインフルエンザウイルスを付着させた。
【０１２６】
また、これとは別に、コントロール用の２ｍＬエッペンドルフチューブ（チューブＣ１）を用意し、このチューブＣ１内に、ウイルス懸濁液を２００μＬ分注し、３７℃で１時間ローテートを行った。
【０１２７】
＜４Ｂ＞  次に、各チューブ内の分散液を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、各チューブ内の上清の一部を採取した。そして、各上清について、赤血球凝集反応を用いてインフルエンザウイルスの検出試験を行った。
【０１２８】
赤血球凝集反応とは、ウイルスが赤血球の表面に存在する糖鎖と結合する反応を利用したウイルスの検出方法である。
【０１２９】
より詳しくは、ウイルスの存在する溶液の入ったＵ底のマイクロプレートのウェルに赤血球を加えると、赤血球同士がウイルスを介してシート状に広がった状態でウェルの底全体に沈降する反応のことである。ウイルスの存在しないウェルでは、赤血球はウェルの底の中心部に凝集する。
【０１３０】
そのため、ウェルの底部に赤血球が凝集した場合には「陰性」、赤血球の凝集が認められないか、認められたとしてもごく僅かな凝集であった場合には「陽性」と判定することができる。また、ウイルスの存在する溶液の濃度を段階的に希釈し赤血球凝集反応の有無を観察することでウイルスの濃度を推測することが可能となる。
【０１３１】
本実施例では、第１のチューブ〜第５のチューブおよびチューブＣ１に対応させて６列のウェルを用い、各列を構成する各ウェルに、それぞれのチューブ内の原液の上清、および、この上清を倍々希釈した希釈上清を注入し、「陰性」および「陽性」の判定を行った。
【０１３２】
各チューブについて、「陽性」と判定された上清の最大希釈倍率を表１に、担体の含有量と、「陽性」と判定された上清の最大希釈倍率の関係を図４に示す。なお、この最大希釈倍率が大きいもの程、上清に含まれるインフルエンザウイルスの量が多いことを意味する。
【０１３３】
【表１】
2009296934.tif 000003
【０１３４】
表１および図４に示すように、担体の含有量が多いチューブ程、「陽性」と判定される最大希釈倍率が小さくなった。すなわち、上清に含まれるインフルエンザウイルスの含有量が少なくなった。このことは、担体が、インフルエンザウイルスを付着する機能を有しており、担体の含有量が多くなる程、担体に付着するインフルエンザウイルスの量が多くなるため、その分、上清に含まれるインフルエンザウイルスの量が少なくなっていると考えられる。
【０１３５】
（２−４）回収液のウイルス遊離性能の検討
＜１Ｃ＞  まず、前記（２−３）の工程＜４Ｂ＞で上清の一部を採取した各チューブ（第１のチューブ〜第５のチューブ）内の残りの担体分散液を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清をアスピレータを用いて廃棄した。
【０１３６】
＜２Ｃ＞  次に、各チューブ内に、カゼイン溶液（濃度３００μｇ/ｍＬ）を２００μＬずつ分注し、その後、３７℃で１時間ローテートを行うことにより、インフルエンザウイルスが付着した担体にカゼインを接触させた。
【０１３７】
＜３Ｃ＞  次に、各チューブ内の担体分散液を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、各チューブ内の上清の一部を採取し、前記工程＜４Ｂ＞で説明したのと同様にしてインフルエンザウイルスの検出試験を行った。
【０１３８】
各チューブについて、「陽性」と判定された上清の最大希釈倍率を表２に、担体の含有量と、「陽性」と判定された上清の最大希釈倍率の関係を図５に示す。
【０１３９】
【表２】
2009296934.tif 000004
【０１４０】
表２および図５に示すように、担体の含有量が多いチューブ程、「陽性」と判定される最大希釈倍率が大きくなった。すなわち、上清に含まれるインフルエンザウイルスの含有量が多くなった。このことは、カゼインが、担体に付着するインフルエンザウイルスを遊離する機能を有しており、担体の含有量が多くなる程、上清中に遊離するインフルエンザウイルスの量が多くなったものと考えられる。
【０１４１】
３．デングウイルスを用いた検討
（３−１）ウイルス懸濁液（被処理液）の用意
不活化した４種類の血清型のデングウイルス（デング１型、デング２型、デング３型、デング4型）を混合したウイルス溶液（１８６μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ用いて希釈することにより、２５μｇ／ｍＬのデングウイルス懸濁液を用意した。
【０１４２】
（３−２）担体分散液の調製
担体分散液に含まれる担体の濃度が５％となるように調整したこと以外は、前記工程（２−２）と同様にして、担体分散液（５％担体分散液）を得た。
【０１４３】
（３−３）担体のウイルス付着性能の検討
＜１Ｄ＞  まず、前記（２−３）で説明したのと同様の方法を用いて、５％担体分散液を倍々希釈することにより、各チューブ（第６のチューブ〜第１４のチューブ）内に、それぞれ、担体濃度が５ｗｔ％、２．５ｗｔ％、１．２５ｗｔ％、０．６３ｗｔ％、０．３２ｗｔ％、０．１５ｗｔ％、０．０８ｗｔ％、０．０４ｗｔ％、０．０２ｗｔ％の担体分散液（２００μＬ）を得た後、１５００ｒｐｍで５分遠心し、上清を除去した。
【０１４４】
＜２Ｄ＞  次に、第６〜第１４のチューブ内に、それぞれ、ウイルス懸濁液を２００μＬずつ分注し、その後、４℃で１時間ローテートを行うことにより、担体にデングウイルスを付着させた。
【０１４５】
また、これとは別に、コントロール用の２ｍＬエッペンドルフチューブ（チューブＣ２およびチューブＣ３）を用意し、これらチューブ内にデングウイルス懸濁液を２００μＬずつ分注した。そして、チューブＣ２は３７℃で１時間静置し、チューブＣ３は、３７℃で１時間ローテートを行った。
【０１４６】
＜３Ｄ＞  次に、各チューブ内の分散液を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、各チューブ内の上清の一部を採取した。そして、各上清について、赤血球凝集法を用いてデングウイルスの検出試験を行った。
【０１４７】
各チューブ（第６〜第１４のチューブ、チューブＣ２、Ｃ３）について、「陽性」と判定された上清の最大希釈倍率を表３に、担体の含有量と、「陽性」と判定された上清の最大希釈倍率の関係を図６に示す。なお、この最大希釈倍率が大きいもの程、上清に含まれるデングウイルスの量が多いことを意味する。
【０１４８】
【表３】
2009296934.tif 000005
【０１４９】
表３および図６に示すように、担体の含有量が多いチューブ程、「陽性」と判定される最大希釈倍率が小さくなった。すなわち、上清に含まれるデングウイルスの含有量が少なくなった。このことは、担体が、デングウイルスを付着する機能を有しており、担体の含有量が多くなる程、担体に付着するデングウイルスの量が多くなるため、その分、上清に含まれるデングウイルスの量が少なくなっていると考えられる。
【０１５０】
（３−４）回収液のウイルス遊離性能の検討
＜１Ｅ＞  まず、前記（３−３）の工程＜３Ｄ＞で上清の一部を採取した各チューブ（第６のチューブ〜第１４のチューブ）内の残りの担体分散液を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清をアスピレータを用いて廃棄した。
【０１５１】
＜２Ｅ＞  次に、各チューブ内に、カゼイン溶液（濃度３００μｇ／ｍＬ）を２００μＬずつ分注し、その後、３７℃で１時間ローテートを行うことにより、デングウイルスが付着した担体にカゼインを接触させた。
【０１５２】
＜３Ｅ＞  次に、各チューブ内の担体分散液を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、各チューブ内の上清の一部を採取し、前記工程＜４Ｂ＞で説明したのと同様にしてデングウイルスの検出試験を行った。
【０１５３】
各チューブについて、「陽性」と判定された上清の最大希釈倍率を表４に、担体の含有量と、「陽性」と判定された上清の最大希釈倍率の関係を図７に示す。
【０１５４】
【表４】
2009296934.tif 000006
【０１５５】
表４および図７に示すように、担体濃度１．２５ｗｔ％を超えるチューブにおいて、担体に吸着していたウイルスが溶液中に放出されたことが確認された。なお、０．６３ｗｔ％以下の担体濃度のチューブにおいてもウイルスの放出は行われたと考えられるが担体の数量が少ないために放出されたウイルスを検出できなかったものと考えられる。
【０１５６】
また、ウイルスの放出量が担体濃度１．２５ｗｔ％を最大にして、担体濃度が上がるにつれて放出されるウイルス量が低下している。このことは、担体量が多いためタンパク質の結合するサイトが増え、カゼインがウイルスを押しのけることなく担体表層の結合サイトに結合できるサイトが出現した為と考えられる。
【０１５７】
以上の結果から、表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体は、各種ウイルスを付着する機能を有しており、担体に付着したウイルスは、カゼインのような担体に対して高い親和性を有するタンパク質によって遊離させて回収できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】本発明で用いられる担体の一例を示す断面図である。
【図２】本実施形態の細胞またはウイルス回収方法を模式的に示す工程図である。
【図３】本実施形態の細胞またはウイルス回収方法を模式的に示す工程図である。
【図４】担体にインフルエンザウイルスを接触させた後において、担体の含有量と、インフルエンザウイルスが「陽性」と判定された上清の最大希釈倍率の関係を示す図である。
【図５】担体にカゼインを接触させた後において、担体の含有量と、インフルエンザウイルスが「陽性」と判定された上清の最大希釈倍率の関係を示す図である。
【図６】担体にデングウイルスを接触させた後において、担体の含有量と、デングウイルスが「陽性」と判定された上清の最大希釈倍率の関係を示す図である。
【図７】担体にカゼインを接触させた後において、担体の含有量と、デングウイルスが「陽性」と判定された上清の最大希釈倍率の関係を示す図である。
【符号の説明】
【０１５９】
１            担体
１１          基材
１２          リン酸カルシウム系化合物層
１３          粒子
２            細胞・ウイルス
３            細胞・ウイルス付着担体
１００        容器
２００        被処理液
３００        洗浄液
４００        回収液
５００        洗浄液
６００        ピペット
【図１】
2009296934.tif 000007
【図２】
2009296934.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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