(57)【要約】【課題】有用な形質を有する植物を簡便な手法にて取得すること。【解決手段】転写因子と機能性ペプチドとの融合タンパク質である転写抑制因子をコードする遺伝子が導入されている種子から構成されていることを特徴とする種子ライブラリーを提供する。また、上記種子ライブラリーを用いる、有用形質を有する植物のスクリーニング方法およびキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写因子と任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとの融合タンパク質である転写抑制因子をコードする遺伝子が導入されている種子から構成されていることを特徴とする種子ライブラリー。
【請求項２】
前記機能性ペプチドが、以下：
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３；
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３；
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３；または
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを表し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表し、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを表し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表し、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを表し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを表し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを表す。）
で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の種子ライブラリー。
【請求項３】
前記機能性ペプチドが、配列番号１〜１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の種子ライブラリー。
【請求項４】
前記機能性ペプチドが、以下：
（ａ）配列番号１８または１９に示されるいずれかのアミノ酸配列；あるいは
（ｂ）配列番号１８または１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されているアミノ酸配列
からなることを特徴とする請求項１に記載の種子ライブラリー。
【請求項５】
前記機能性ペプチドが、以下：
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の種子ライブラリー。
【請求項６】
前記機能性ペプチドが、以下：
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ；
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ；または
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ２はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の種子ライブラリー。
【請求項７】
前記機能性ペプチドが、配列番号１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１７１、１７４または１７７に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の種子ライブラリー。
【請求項８】
前記機能性ペプチドが、配列番号１６５または１６８に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の種子ライブラリー。
【請求項９】
前記種子が、前記遺伝子が導入された形質転換植物から得られた種子であることを特徴とする請求項１に記載の種子ライブラリー。
【請求項１０】
前記転写因子が、表１に示される転写因子であることを特徴とする請求項１に記載の種子ライブラリー。
【請求項１１】
請求項１に記載の種子ライブラリーを作製する方法であって、
前記遺伝子を用いて植物を形質転換する工程；
形質転換された該植物において前記融合タンパク質を発現する植物を選抜する工程；および
該融合タンパク質を発現する植物から種子を得る工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の種子ライブラリーを作製するためのキットであって、前記遺伝子および植物形質転換用ベクターを備えていることを特徴とするキット。
【請求項１３】
請求項１に記載の種子ライブラリーを所定の環境下で発育させる工程を包含することを特徴とする有用形質を有する植物をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の種子ライブラリーを所定のストレス環境下で発育させる工程を包含することを特徴とするストレス耐性植物をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の種子ライブラリーを備えていることを特徴とする有用形質を有する植物をスクリーニングするためのキット。
【請求項１６】
ストレス耐性植物をスクリーニングするためのキットであって、
請求項１に記載の種子ライブラリー；および
ストレス環境を形成するための試薬
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項１７】
植物の有用形質の発現を調節する転写因子を同定する方法であって、
請求項１に記載の種子ライブラリーを所定の環境下で発育させる工程；および
発育した植物に導入されている前記遺伝子を同定する工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項１８】
所定のストレス環境下での植物の生育を調節する転写因子を同定する方法であって、
請求項１に記載の種子ライブラリーを所定のストレス環境下で発育させる工程；および
発育した植物に導入されている前記遺伝子を同定する工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項１９】
植物の有用形質の発現を調節する転写因子を同定するためのキットであって、
請求項１に記載の種子ライブラリー；および
該種子ライブラリーに導入されている遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項２０】
所定のストレス環境下での植物の生育を調節する転写因子を同定するためのキットであって、
請求項１に記載の種子ライブラリー； 
該種子ライブラリーに導入されている遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド；および
ストレス環境を形成するための試薬
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項２１】
植物の有用形質の発現を調節する遺伝子を同定する方法であって、
請求項１に記載の種子ライブラリーを所定の環境下で発育させる工程； 
発育した植物から第１のｍＲＮＡを得る工程；
該植物と同系統でありかつ形質転換されていない植物から第２のｍＲＮＡを得る工程；および
第１のｍＲＮＡと第２のｍＲＮＡとを比較する工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項２２】
所定のストレス環境下での植物の発育を調節する遺伝子を同定する方法であって、
請求項１に記載の種子ライブラリーを所定のストレス環境下で発育させる工程； 
発育した植物から第１のｍＲＮＡを得る工程；
該植物と同系統でありかつ形質転換されていない植物から第２のｍＲＮＡを得る工程；および
第１のｍＲＮＡと第２のｍＲＮＡとを比較する工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項２３】
植物の有用形質の発現を調節する遺伝子を同定するためのキットであって、
請求項１に記載の種子ライブラリー；
該種子ライブラリーに導入されている遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド；および
植物からｍＲＮＡを調製するための試薬
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項２４】
所定のストレス環境下での植物の発育を調節する遺伝子を同定するためのキットであって、
請求項１に記載の種子ライブラリー；
該種子ライブラリーに導入されている遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド；
植物からｍＲＮＡを調製するための試薬；および
ストレス環境を形成するための試薬
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項２５】
植物体内において、配列番号７４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を阻害する工程を包含することを特徴とするタンニン含有量の少ない植物体の生産方法。
【請求項２６】
前記タンパク質の機能を阻害する工程が、配列番号７４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとの融合タンパク質を植物体において産生させることによって行われることを特徴とする請求項２５に記載の植物体の生産方法。
【請求項２７】
前記タンパク質の機能を阻害する工程が、前記植物体内での該タンパク質の発現阻害によることを特徴とする請求項２５に記載の植物体の生産方法。
【請求項２８】
植物体内において、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を阻害する工程を包含することを特徴とする大きな種子を結種する植物体の生産方法。
【請求項２９】
前記タンパク質の機能を阻害する工程が、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとの融合タンパク質を植物体において産生させることによって行われることを特徴とする請求項２６に記載の植物体の生産方法。
【請求項３０】
前記タンパク質の機能を阻害する工程が、前記植物体内での該タンパク質の発現阻害によることを特徴とする請求項２８に記載の植物体の生産方法。
【請求項３１】
請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の生産方法により生産された、植物体。
【請求項３２】
成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかであることを特徴とする請求項３１に記載の植物体。
【請求項３３】
植物体のタンニン含有量を低減するためのキットであって、
（ａ’）任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｂ’）配列番号７５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項３４】
（ｃ’）目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクター
をさらに備えていることを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
（ｄ’）前記発現ベクター（ｃ’）を植物細胞に導入するための試薬群
をさらに備えていることを特徴とする請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
大きな種子を結種する植物体を生産するためのキットであって、
（ａ’’）任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｂ’’）配列番号７７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項３７】
（ｃ’’）目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクター
をさらに備えていることを特徴とする請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
（ｄ’’）前記発現ベクター（ｃ’’）を植物細胞に導入するための試薬群
をさらに備えていることを特徴とする請求項３７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用形質を有する植物をスクリーニングするためのツールおよびその利用に関するものであり、より詳細には、有用形質を有する植物をスクリーニングするための種子ライブラリーおよび当該種子ライブラリーの作製方法、ならびに当該種子ライブラリーを用いて有用形質を有する植物をスクリーニングするための方法およびキット、当該有用形質を調節する遺伝子および転写因子の同定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
古来より、植物は人間の社会生活全般にわたって利用されている。その例としては、衣料品、食料、材木、医薬品、紙の原料、染料、香料および樹脂製品などが挙げられる。さらに、植物は、多くの種類および特性を有しているため、遺伝子工学を用いることにより、さらなる用途を見出し得る対象である。現在、様々な分野において、有用形質を有する植物（例えば、環境ストレスに対して耐性である植物）の利用についての研究が進められている。
【０００３】
植物に対する環境ストレスとしては、その生育を阻害するもの（例えば、アルミニウムイオン（Ａｌ３＋）、鉄の欠乏、乾燥状態および高温状態など）が挙げられる。また、植物体へ吸収および集積されることが望まれる物質として、植物が受ける環境ストレスを軽減する効果を有するケイ素、ならびに、汚染土壌の浄化につながるカドミウムおよび亜鉛などの重金属が挙げられる。
【０００４】
現在、遺伝子導入によって環境ストレス耐性植物を開発するための研究が行われている。この研究は、所定の環境ストレスに対し耐性を有する植物から該環境ストレス耐性に関与する遺伝子をスクリーニングし、この遺伝子を当該環境ストレスに対する耐性を有さない植物へ導入する方法が用いられている。現在のところ、有用遺伝子導入による環境ストレス耐性植物の開発は基礎研究の段階であり、さまざまなストレス耐性関連遺伝子の機能について分子生物学的に試験されている段階である。
【０００５】
例えば、重金属汚染土壌の浄化には工業的な手段が用いられているが、工業的な浄化手段はコストが高いという欠点を有する。そのため、重金属汚染土壌の浄化策の１つとして、植物による浄化（ファイトレメディエーション）が注目されている。重金属汚染に対するファイトレメディエーションは、重金属集積能を有する植物を汚染土壌に植えることで、植物に重金属を集積し、土壌を浄化することを目的とした、低コストおよび環境負荷の少ない、土壌の浄化策である。しかし、現在知られている重金属集積能を有する植物は、生育が遅いため、浄化に長い期間が必要であるという問題を有しており、実用段階には至っていない。
【０００６】
一方、本発明者らは、Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＥＲＦ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）遺伝子群によってコードされるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、ＡｔＥＲＦ４タンパク質、ＡｔＥＲＦ７タンパク質、ＡｔＥＲＦ８タンパク質、タバコＥＲＦ３タンパク質およびイネＯｓＥＲＦ３タンパク質の各々をコードする遺伝子、ならびにＺｎフィンガータンパク質（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の１つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０タンパク質およびＺＡＴ１１タンパク質の各々をコードする遺伝子と、転写因子をコードする遺伝子とを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することを見出している（例えば、特許文献１〜６を参照のこと）。そして、これらの遺伝子がコードするタンパク質またはペプチドには（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）Ｐという共通のモチーフ（但し、Ｘは、任意のアミノ酸残基を示す。）が存在することを明らかにしている（例えば、非特許文献１を参照のこと）。
【０００７】
本発明者らはまた、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質は、上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有すること、また当該ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質をコードする遺伝子を転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは転写因子をコードする遺伝子に結合させたキメラ遺伝子は、強力な転写抑制機能を有するタンパク質を産生することも見出している（例えば、非特許文献２を参照のこと）。
【０００８】
このような植物の転写抑制に係る技術は、いろいろな植物遺伝子について、生体内でその機能を解析するに有用である。本技術は、任意の遺伝子を標的（ターゲット遺伝子）とし、例えば、上記エフェクタープラスミドを植物細胞に導入することによりターゲット遺伝子の転写を抑制し、その結果、エフェクタープラスミドが導入された植物では、ターゲット遺伝子の機能が抑制される。そのため、形質転換された植物に現れる表現型を観察することで、ターゲット遺伝子の機能を解析することができる。
【０００９】
本発明者らはまた、本技術を効率よく植物に導入するためのベクターを開示するとともにし、同様の性質を有するさらなるペプチドを見出している（特許文献７および８を参照のこと）。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７号公報（平成１３（２００１）年１０月２日公開）
【特許文献２】特開２００１−２６９１７８号公報（平成１３（２００１）年１０月２日公開）
【特許文献３】特開２００１−２９２７７６号公報（平成１３（２００１）年１０月２日公開）
【特許文献４】特開２００１−２９２７７７号公報（平成１３（２００１）年１０月２３日公開）
【特許文献５】特開２００１−２６９１７６号公報（平成１３（２００１）年１０月２日公開）
【特許文献６】特開２００１−２６９１７９号公報（平成１３（２００１）年１０月２日公開）
【特許文献７】特開２００５−１３２１４号公報（平成１７（２００５）年１月２０日公開）
【特許文献８】特開２００５−２７６５４号公報（平成１７（２００５）年２月３日公開）
【非特許文献１】Ｏｈｔａ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．，Ｈｉｒａｔｓｕ，Ｋ．，Ｓｈｉｎｓｈｉ，Ｈ．  ａｎｄ  Ｏｈｍｅ−Ｔａｋａｇｉ，Ｍ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．１３，１９５９−１９６８，Ａｕｇｕｓｔ，２００１
【非特許文献２】Ｈｉｒａｔｓｕ，Ｋ．，Ｏｈｔａ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．，Ｏｈｍｅ−Ｔａｋａｇｉ，Ｍ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５１４（２００２）３５１−３５４。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
有用形質を有する植物を得るために、植物遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびタンパク質の発現を抑制することによって植物を改良する研究が進められている。これまでに確立されている方法としては、植物が有する遺伝子に変異を導入することで、有用な形質に関与する遺伝子をスクリーニングする方法が挙げられる。
【００１１】
このようなスクリーニング法は以下のような操作（１）〜（３）を必要とし煩雑である：（１）異なる遺伝子に対して変異を導入した多くの個体を作製する；（２）変異を導入した個体の中から有用な形質を有する個体を探索する；（３）さらに、変異が導入された遺伝子を同定する。また、このようなスクリーニング方法は以下の欠点［１］〜［３］を有している：［１］非常に多くの個体に対して変異を導入する必要があるため、スクリーニングを行う準備に時間およびコストが必要とされる；［２］どのような形質が得られるのかを予め判断することができない；［３］変異体の有する形質の多くは劣性にしか発現しないため、対立遺伝子の両方に同じ変異を導入した個体の集団を用いなければ、変異体が有する優性の形質しかスクリーニングすることができない。
【００１２】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、有用な形質を有する植物を簡便な手法にて取得する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上述したように、本発明者らによる植物の転写抑制に係る技術は、簡便な手法でありかつ標的遺伝子の解析に非常に有効である。そこで本発明者らは、有用形質を有する植物をスクリーニングするために本技術の利用を鋭意検討し、その結果、本技術を導入した植物が首尾よく結実し、その形質を維持したＴ２世代の種子を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明に係る種子ライブラリーは、上記課題を解決するために、転写因子と機能性ペプチドとの融合タンパク質である転写抑制因子をコードする遺伝子が導入されている種子から構成されていることを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る種子ライブラリーにおいて、上記機能性ペプチドは、以下：
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３；
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３；
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３；または
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを表し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表し、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを表し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表し、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを表し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを表し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを表す。）
で表されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１５】
本発明に係る種子ライブラリーにおいて、上記機能性ペプチドは、配列番号１〜１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなってもよい。
【００１６】
本発明に係る種子ライブラリーにおいて、上記機能性ペプチドは、以下：
（ａ）配列番号１８または１９に示されるいずれかのアミノ酸配列；あるいは
（ｂ）配列番号１８または１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されているアミノ酸配列
からなってもよい。
【００１７】
本発明に係る種子ライブラリーにおいて、上記機能性ペプチドは、以下：
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００１８】
本発明に係る種子ライブラリーにおいて、上記機能性ペプチドは、以下：
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ；
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ；または
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ２はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有してもよい。
【００１９】
本発明に係る種子ライブラリーにおいて、上記機能性ペプチドは、配列番号１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１７１、１７４または１７７に示されるアミノ酸配列を有してもよい。
【００２０】
本発明に係る種子ライブラリーにおいて、上記機能性ペプチドは、配列番号１６５または１６８に示されるアミノ酸配列を有してもよい。
【００２１】
本発明に係る種子ライブラリーにおいて、上記種子は、上記遺伝子が導入された形質転換植物から得られた種子であることが好ましい。
【００２２】
本発明に係る種子ライブラリーにおいて、上記転写因子は、表１に示される転写因子であることが好ましい。
【００２３】
本発明に係る種子ライブラリーを作製する方法は、上記遺伝子を用いて植物を形質転換する工程；形質転換された該植物において上記融合タンパク質を発現する植物を選抜する工程；および該融合タンパク質を発現する植物から種子を得る工程、を包含することを特徴としている。
【００２４】
本発明に係る種子ライブラリーを作製するためのキットは、上記遺伝子および植物形質転換用ベクターを備えていることを特徴としている。
【００２５】
本発明に係るスクリーニング方法は、有用形質を有する植物をスクリーニングするために、上記種子ライブラリーを所定の環境下で発育させる工程を包含することを特徴としている。
【００２６】
本発明に係るスクリーニング方法は、ストレス耐性植物をスクリーニングするために、上記種子ライブラリーを所定のストレス環境下で発育させる工程を包含することを特徴としている。
【００２７】
本発明に係るスクリーニングキットは、有用形質を有する植物をスクリーニングするために、上記種子ライブラリーを備えていることを特徴としている。
【００２８】
本発明に係るスクリーニングキットは、ストレス耐性植物をスクリーニングするために、上記種子ライブラリーとストレス環境を形成するための試薬とを備えていることを特徴としている。
【００２９】
本発明に係る転写因子同定方法は、植物の有用形質の発現を調節する転写因子を同定するために、上記種子ライブラリーを所定の環境下で発育させる工程；および発育した植物に導入されている上記遺伝子を同定する工程、を包含することを特徴としている。
【００３０】
本発明に係る転写因子同定方法は、所定のストレス環境下での植物の生育を調節する転写因子を同定するために、上記種子ライブラリーを所定のストレス環境下で発育させる工程；および発育した植物に導入されている上記遺伝子を同定する工程、を包含することを特徴としている。
【００３１】
本発明に係る転写因子同定キットは、植物の有用形質の発現を調節する転写因子を同定するために、上記種子ライブラリー；および該種子ライブラリーに導入されている遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド、を備えていることを特徴としている。
【００３２】
本発明に係る転写因子同定キットは、所定のストレス環境下での植物の生育を調節する転写因子を同定するために、上記種子ライブラリー；該種子ライブラリーに導入されている遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド；および、ストレス環境を形成するための試薬、を備えていることを特徴としている。
【００３３】
本発明に係る遺伝子同定方法は、植物の有用形質の発現を調節する遺伝子を同定するために、上記種子ライブラリーを所定の環境下で発育させる工程；発育した植物から第１のｍＲＮＡを得る工程；該植物と同系統でありかつ形質転換されていない植物から第２のｍＲＮＡを得る工程；および第１のｍＲＮＡと第２のｍＲＮＡとを比較する工程、を包含することを特徴としている。
【００３４】
本発明に係る遺伝子同定方法は、所定のストレス環境下での植物の発育を調節する遺伝子を同定するために、上記種子ライブラリーを所定のストレス環境下で発育させる工程；発育した植物から第１のｍＲＮＡを得る工程；該植物と同系統でありかつ形質転換されていない植物から第２のｍＲＮＡを得る工程；および第１のｍＲＮＡと第２のｍＲＮＡとを比較する工程、を包含することを特徴としている。
【００３５】
本発明に係る遺伝子同定キットは、植物の有用形質の発現を調節する遺伝子を同定するために、上記種子ライブラリー；該種子ライブラリーに導入されている遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド；および植物からｍＲＮＡを調製するための試薬、を備えていることを特徴としている。
【００３６】
本発明に係る遺伝子同定キットは、所定のストレス環境下での植物の発育を調節する遺伝子を同定するために、上記種子ライブラリー；該種子ライブラリーに導入されている遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド；植物からｍＲＮＡを調製するための試薬；およびストレス環境を形成するための試薬、を備えていることを特徴としている。
【００３７】
本発明に係るタンニン含有量の少ない植物体の生産方法は、植物体内において、配列番号７４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を阻害する工程を包含することを特徴としている。
【００３８】
本発明に係るタンニン含有量の少ない植物体の生産方法において、上記タンパク質の機能を阻害する工程は、配列番号７４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとの融合タンパク質を植物体において産生させることによって行われることが好ましい。
【００３９】
本発明に係るタンニン含有量の少ない植物体の生産方法において、上記タンパク質の機能を阻害する工程は、上記植物体内での該タンパク質の発現阻害によってもよく、この場合、上記発現阻害は、ノックアウト法またはＲＮＡｉ法によって行われることが好ましい。
【００４０】
本発明に係る大きな種子を結種する植物体の生産方法は、植物体内において、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を阻害する工程を包含することを特徴としている。
【００４１】
本発明に係る大きな種子を結種する植物体の生産方法において、上記タンパク質の機能を阻害する工程は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとの融合タンパク質を植物体において産生させることによって行われることが好ましい。
【００４２】
本発明に係る大きな種子を結種する植物体の生産方法において、上記タンパク質の機能を阻害する工程は、上記植物体内での該タンパク質の発現阻害によってもよく、この場合、上記発現阻害は、ノックアウト法またはＲＮＡｉ法によって行われることが好ましい。
【００４３】
本発明に係る植物体は、上記生産方法によって生産されたことを特徴としている。
【００４４】
本発明に係る植物体は、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかであることが好ましい。
【００４５】
本発明に係るキットは、植物体のタンニン含有量を低減するために、（ａ’）任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ’）配列番号７５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、を備えていることを特徴としている。
【００４６】
本発明に係るキットは、（ｃ’）目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクター、をさらに備えていてもよい。
【００４７】
本発明に係るキットは、（ｄ’）上記発現ベクター（ｃ’）を植物細胞に導入するための試薬群、をさらに備えていてもよい。
【００４８】
本発明に係るキットは、大きな種子を結種する植物体を生産するために、（ａ’’）任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ’’）配列番号７７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、を備えていることを特徴としている。
【００４９】
本発明に係るキットは、（ｃ’’）目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクター、をさらに備えていてもよい。
【００５０】
本発明に係るキットは、（ｄ’’）上記発現ベクター（ｃ’’）を植物細胞に導入するための試薬群、をさらに備えていてもよい。
【発明の効果】
【００５１】
本発明を用いれば、有用な形質を有する植物（特に、所定の環境下にて発育可能な植物）を容易にスクリーニングすることができる。また、本発明を用いれば、所定の環境下での植物の発育を調節する転写因子を容易に同定することができる。さらに、本発明を用いれば、有用な形質を有する植物（特に、所定の環境下にて発育する植物）において発現が抑制されている遺伝子を容易に同定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
上述したように、本発明者らによる上記技術は、簡便な手法であるにもかかわらず標的遺伝子の解析に非常に有効である。そこで本発明者らは、有用形質を有する植物をスクリーニングするために上記独自の技術を利用する手段を鋭意検討し、その結果、本発明者らの遺伝子転写抑制技術を導入した植物が首尾よく結実し、その形質を維持したＴ２世代の種子を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００５３】
〔１〕種子ライブラリー、ならびに種子ライブラリー作製方法および作製用キット
本発明は、転写因子と機能性ペプチドとの融合タンパク質である転写抑制因子をコードする遺伝子が導入されている種子から構成されている種子ライブラリーを提供する。本明細書中で使用される場合、「転写抑制因子」は転写因子および機能性ペプチドからなる融合タンパク質であり、「キメラリプレッサー」と交換可能に使用され得る。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「転写因子（転写因子等）」は転写因子または転写因子のＤＮＡ結合ドメインが意図される。本発明に係る種子ライブラリーにおいて、上記転写因子としては特に限定されないが、好ましくは植物の転写因子であり得る。「転写因子」は、転写あるいはその開始反応を正あるいは負に調節するポリペプチド（転写調節因子）が意図され、好ましくは、正に調節するポリペプチドが意図される。すなわち、「転写因子の機能を阻害する」とは、転写調節因子としての機能を失わせることが意図される。転写調節因子としての機能喪失としては、例えば、タンパク質−タンパク質間の相互作用能の消失、ＤＮＡ結合能の消失、ならびに転写調節機能の消失および／または逆転などが挙げられ、これらのような機能が失われている状態の転写因子は、機能が阻害されているということを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。転写因子の機能を阻害するための方法は、標的遺伝子の発現を抑制することであっても、ＲＮＡの合成阻害であってもタンパク質の合成阻害であってもよい。なお、本明細書において表１に示すシロイヌナズナの転写因子を用いて本発明を説明しているが、本明細書を読んだ当業者は、上記転写因子がシロイヌナズナの転写因子に限定されないことを容易に理解する。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【００６７】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００６８】
「ポリペプチド」は、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、「ポリペプチド」は、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、「ポリペプチド」はまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００６９】
「ポリペプチド」は、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されず、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、「機能性ペプチド」は、転写因子を転写抑制因子に変換することができるペプチドが意図され、「転写抑制転換ペプチド」または「リプレッサードメイン」と交換可能に使用され得る。
【００７１】
一実施形態において、上記機能性ペプチドは、以下：
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３；
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３；
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３；または
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを表し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表し、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを表し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表し、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを表し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを表し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを表す。）
で表されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００７２】
式（１）の機能性ペプチドにおいて、Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（１）の機能性ペプチドにおいて、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていても、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００７３】
Ｘ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の機能性ペプチドを合成する際の簡便さの観点から、できるだけ短いほうがよい。具体的には、Ｘ１で表されるアミノ酸残基は、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００７４】
同様に、式（１）の機能性ペプチドにおいて、Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個あればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（１）の機能性ペプチドにおいて、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００７５】
式（１）の機能性ペプチドにおいて、Ｘ１およびＸ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５ｍｅｒ）の具体的な配列を、配列番号２０、２１に示す。なお、Ｘ２がＡｓｎの場合のアミノ酸配列が配列番号２０に示すアミノ酸配列であり、Ｘ２がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号２１に示すアミノ酸配列である。
【００７６】
式（２）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドのＸ１と同様、Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（２）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていても、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００７７】
Ｙ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の機能性ペプチドを合成する際の簡便さの観点から、できるだけ短いほうがよい。具体的には、Ｙ１で表されるアミノ酸残基は、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００７８】
同様に、式（２）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドのＸ３と同様、Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個あればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（２）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００７９】
式（２）の機能性ペプチドにおいて、Ｙ１およびＹ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５ｍｅｒ）の具体的な配列を、配列番号２２、２３に示す。なお、Ｙ２がＰｈｅの場合のアミノ酸配列が配列番号２２に示すアミノ酸配列であり、Ｙ２がＩｌｅの場合のアミノ酸配列が配列番号２３に示すアミノ酸配列である。また、Ｙ２を除いた４個のアミノ酸残基からなるテトラマー（４ｍｅｒ）の具体的な配列を、配列番号８２に示す。
【００８０】
式（３）の機能性ペプチドにおいて、Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものである。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕであり、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕである。
【００８１】
一方、式（３）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドのＸ１等と同様、Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（３）の機能性ペプチドにおいて、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていても、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００８２】
Ｚ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の機能性ペプチドを合成する際の簡便さの観点から、できるだけ短いほうがよい。具体的には、Ｚ３で表されるアミノ酸残基は、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
また、式（３）で表される機能性ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されないが、合成する際の簡便さの観点から、２０アミノ酸以下であることが好ましい。
【００８４】
式（３）の機能性ペプチドにおいて、Ｚ３を除いた７〜１０個のアミノ酸残基からなるオリゴマーの具体的な配列を、配列番号２４〜３２に示す。なお、Ｚ１がＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２４、２５または２６に示すアミノ酸配列であり、Ｚ１がＡｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２７、２８または２９に示すアミノ酸配列であり、Ｚ１がＬｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３０、３１または３２に示すアミノ酸配列である。
【００８５】
式（４）の機能性ペプチドは、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６ｍｅｒ）であり、その具体的な配列を、配列番号５、１４、３３に示す。なお、Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号５に示すアミノ酸配列であり、Ｚ４がＡｓｐの場合のアミノ酸配列が配列番号１４に示すアミノ酸配列であり、Ｚ４がＧｌｎの場合のアミノ酸配列が配列番号３３に示すアミノ酸配列である。
【００８６】
特に、本発明において用いられる機能性ペプチドは、式（４）で表されるヘキサマーのような最小配列を有するペプチドであってもよい。例えば、配列番号５に示すアミノ酸配列は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質（ＳＵＰタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当し、上述したように、本発明者によって新たに上記機能性ペプチドとして見出されたものである。
【００８７】
本実施形態において、より好ましくは、上記機能性ペプチドは、配列番号１〜１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなってもよい。
【００８８】
なお、配列番号１〜１７に示されるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドが上記機能性ペプチドであることは、合成したこれらのペプチドを、前述した特許文献３〜８、非特許文献２および３に記載されている方法によって確認されている。
【００８９】
さらに、配列番号１、４に示されるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドが上記機能性ペプチドであることは、植物における転写因子であるＥＩＮ３遺伝子に結合し、シロイヌナズナ植物体を形質転換させることにより、確認されている。
【００９０】
同様に、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドが上記機能性ペプチドであることは、植物における転写因子であるＣＵＣ１遺伝子に結合し、シロイヌナズナ植物体を形質転換させさせることにより、確認されている。
【００９１】
同様に、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する上記オリゴペプチドが上記機能性ペプチドであることは、植物における転写因子であるＰＡＰ１遺伝子やＡｔＭＹＢ２３に結合し、シロイヌナズナ植物体を形質転換させることにより、確認されている。
【００９２】
また、本実施形態において、より好ましくは、上記機能性ペプチドは、以下：
（ａ）配列番号１８または１９に示されるいずれかのアミノ酸配列；あるいは
（ｂ）配列番号１８または１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されているアミノ酸配列
からなってもよい。
【００９３】
上記の「配列番号１８または１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」における「１個または数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１個〜５個、特に好ましくは１個〜３個を意味する。
【００９４】
アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記ペプチドをコードする塩基配列を当該分野において公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法またはＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法またはこれに準ずる方法により行い得、例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−ＫやＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ））等を用いて、あるいはＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて変異が導入され得る。
【００９５】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列の全長配列を有するペプチドに限られず、その部分配列を有するペプチドであってもよい。
【００９６】
その部分配列を有するペプチドとしては、例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列（ＳＵＰタンパク質の１７５〜２０４番目のアミノ酸配列）を有するペプチドが挙げられ、その部分配列を有するペプチドとしては、式（３）で表されるペプチドが挙げられる。
【００９７】
他の実施形態において、上記機能性ペプチドは、以下：
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有することが好ましい。なお、式（５）で表したアミノ酸配列を以下の（６）〜（９）にさらに分類することができる：
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ；
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ；または
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β３−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、上記各式中、α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示す。また、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β３は、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＧｌｎを示す。さらに、γ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）。
【００９８】
本実施形態において、より好ましくは、上記機能性ペプチドは、配列番号１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１７１、１７４または１７７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。このうち、配列番号１３８、１４１、１４７、１５３、１７１、１７４または１７７のペプチドは、一般式（６）に示されるペプチドに相当し、配列番号１１７、１２６、１５６、１５９または１６２のペプチドは、一般式（７）に示されるペプチドに相当し、配列番号１２９、１３２、１３５、１４４、または１５０のペプチドは、一般式（８）に示されるペプチドに相当し、配列番号１２０または１２３のペプチドは、一般式（９）に示されるペプチドに相当する。
【００９９】
また、本実施形態において、より好ましくは、上記機能性ペプチドは、配列番号１６５または１６８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。
【０１００】
配列番号１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１７１、１７４または１７７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドについては、以下に示すようにして機能性ペプチドであることが確認されている。まず、上記各ペプチドをコードするポリヌクレオチド（該ポリヌクレオチドの塩基配列については後述する）を合成し、該ポリヌクレオチドと酵母のＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインのコード領域とを連結し、さらに植物細胞で機能するカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流につないで、エフェクタープラスミドを構築する。またカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターのエンハンサー領域と、ＧＡＬ４タンパク質結合ＤＮＡ配列と、さらにカリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターのＴＡＴＡ領域をプロモーター領域に結合した、ルシフェラーゼ遺伝子からなるレポーター遺伝子を構築する。これらのエフェクタープラスミドとレポーター遺伝子とを同時に遺伝子銃（パーティクルガン）を用いてシロイヌナズナ葉に導入し、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子の活性を測定することによって、機能性ペプチドであるか否かを調べることができる。
【０１０１】
上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド（転写抑制転換ポリヌクレオチド）は、遺伝暗号に基づき、上記機能性ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいれば特に限定されるものではない。
【０１０２】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９，１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１８、１１９、１２１、１２２、１２４、１２５、１２７、１２８、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４５、１４６、１４８、１４９、１５１、１５２、１５４、１５５、１５７、１５８、１６０、１６１、１６３、１６４、１６６、１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５、１７６、１７８または１７９で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１０３】
なお、配列番号１のペプチドは、配列番号８３または８４の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号２のペプチドは、配列番号８５または８６の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号３のペプチドは、配列番号８７または８８の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号４のペプチドは、配列番号８９または９０の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号５のペプチドは、配列番号９１または９２の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号６のペプチドは、配列番号９３または９４の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号７のペプチドは、配列番号９５または９６の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号８のペプチドは、配列番号９７または９８の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号９のペプチドは、配列番号９９または１００の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１０のペプチドは、配列番号１０１または１０２の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１１のペプチドは、配列番号１０３または１０４の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１２のペプチドは、配列番号１０５または１０６の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１３のペプチドは、配列番号１０７または１０８の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１４のペプチドは、配列番号１０９または１１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１５のペプチドは、配列番号１１１または１１２の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１６のペプチドは、配列番号１１３または１１４の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１７のペプチドは、配列番号１１５または１１６の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１１７のペプチドは、配列番号１１８または１１９の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１２０のペプチドは、配列番号１２１または１２２の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１２３のペプチドは、配列番号１２４または１２５の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１２６のペプチドは、配列番号１２７または１２８の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１２９のペプチドは、配列番号１３０または１３１の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１３２のペプチドは、配列番号１３３または１３４の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１３５のペプチドは、配列番号１３６または１３７の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１３８のペプチドは、配列番号１３９または１４０の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１４１のペプチドは、配列番号１４２または１４３の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１４４のペプチドは、配列番号１４５または１４６の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１４７のペプチドは、配列番号１４８または１４９の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１５０のペプチドは、配列番号１５１または１５２の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１５３のペプチドは、配列番号１５４または１５５の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１５６のペプチドは、配列番号１５７または１５８の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１５９のペプチドは、配列番号１６０または１６１の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１６２のペプチドは、配列番号１６３または１６４の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１６５のペプチドは、配列番号１６６または１６７の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１６８のペプチドは、配列番号１６９または１７０の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１７１のペプチドは、配列番号１７２または１７３の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１７４のペプチドは、配列番号１７５または１７６の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号１７７のペプチドは、配列番号１７８または１７９の塩基配列にコードされている。
【０１０４】
必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドには、転写因子遺伝子と連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。また、上記機能性ペプチドの読み枠と転写因子遺伝子の読み枠とが一致しないような場合には、これら読み枠を一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【０１０５】
上記付加的な塩基配列を含んだ転写抑制転換ポリヌクレオチドの塩基配列の具体例としては、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７に示される塩基配列を挙げることができる。
【０１０６】
また、配列番号１８、１９に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の具体例としては、例えば、それぞれ配列番号６８、６９に示される塩基配列を挙げることができる。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子が導入された」または「遺伝子が導入されている」は、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されていること（すなわち、形質転換体）が意図される。従って、本明細書において、形質転換体は、キメラリプレッサー遺伝子を含む組換え発現ベクターを各種生物に導入したものであり得る。「形質転換体」は、細胞だけでなく、各種生物の組織、器官、植物もしくは動物の個体をも包含される。対象となる生物としては、特に限定されな。実験用に用いられる生物としては、植物であればシロイヌナズナ等を、動物であれば、マウス、ラット、ショウジョウバエ、線虫等を挙げることができる。
【０１０８】
あるいは、植物を用いた産業分野に本発明を適用する場合は、生物としては、各種作物（農林水産業で生産される植物、農作物）が挙げられる。具体的には、例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀物；各種野菜・花卉類；マツ、スギ、ヒノキ等の材木類；等が挙げられる。さらに、医薬産業分野および／または医療産業分野では、ヒトまたはヒト由来の培養細胞等が対象とされ得る。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、植物への遺伝子導入法は特に限定されないが、目的の遺伝子が発現ベクターに組み込まれていることが好ましい。発現ベクターとしては、公知の植物形質転換用ベクター（例えば、バイナリーベクター（ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩＧなど））が用いられ得るが、特許文献７に記載されるように、公知の植物形質転換用ベクターを用いた場合は、その用途によっては、十分な効率を得ることができない場合があるので、特許文献７に記載の発現ベクター構築用ベクターを用いることが好ましい。なお、好ましい発現ベクターは、植物用のプロモーターおよびターミネーターと、その間に配置される目的遺伝子とを有しており、植物を宿主として上記目的遺伝子にコードされているタンパク質を発現するものであり得る。
【０１１０】
このような発現ベクターを用いた植物の形質転換方法については特に限定されるものではなく、宿主の種類に応じた適切な形質転換方法を用いて、組換え発現ベクターを宿主に導入されればよい。本発明では、宿主として特に植物を好ましく用いることができるが、この場合の形質転換方法も特に限定されるものではなく、パーティクルガンによる方法、プロトプラスト／スフェロプラスト法、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。本発明を実施するためには、アグロバクテリウムを用いた減圧浸潤法が好ましい。
【０１１１】
目的の遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと目的の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から目的の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、目的のタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、目的のタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。さらに、組換え発現ベクターには、形質転換植物における発現部位を可視化してモニターするための遺伝子を導入することもできる。このような遺伝子の一例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を挙げることができる。
【０１１２】
本明細書中で使用される場合、「転写因子と機能性ペプチドとの融合タンパク質である転写抑制因子をコードする遺伝子」は、「転写因子とコードする遺伝子」と「転写抑制転換ポリヌクレオチド」とがインフレームで連結されていればよい。よって、用いられる発現ベクターに「転写因子とコードする遺伝子」と「転写抑制転換ポリヌクレオチド」とを別々に挿入しても、「転写因子とコードする遺伝子」と「転写抑制転換ポリヌクレオチド」とを予め連結させて同時に挿入してもよい。また、転写抑制転換ポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターに「転写因子とコードする遺伝子を挿入する部位」を設けておき、当該部位に所望の遺伝子を挿入してもよい。
【０１１３】
機能性ペプチドは、任意の転写因子等と融合させることにより、当該転写因子を転写抑制因子に変換することができる。そのため、特定の標的遺伝子の発現調節領域に結合し得る転写因子等をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いて、植物遺伝子の生体内における機能解析を効率化させることが可能となる。
【０１１４】
なお、本明細書中で使用される場合、「標的遺伝子」は、機能性ペプチドと融合させる転写因子等のターゲットとなる任意の遺伝子が意図される。本発明に従って、機能性ペプチドと転写因子等とのキメラ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを植物に導入すれば、キメラ遺伝子より生じたキメラタンパク質が、転写抑制因子として生体中の標的遺伝子の転写を抑制し、その結果、標的遺伝子にコードされるタンパク質の発現が生じない。
【０１１５】
このように、機能性ペプチドは、任意の転写因子を転写抑制因子に変換することができる。そのため、特定の標的遺伝子の転写を支配している転写因子等を組み込むことによって、その標的遺伝子の転写抑制を行うことができる。その結果、植物体に変化が見られれば、それから標的遺伝子の機能を解析することができる。
【０１１６】
上記機能性ペプチドは、さらに機能的に重複（リダンダント）する他の転写因子の活性に優先して標的遺伝子の発現を抑制する能力を有している。それゆえ、本発明にかかる構築用ベクターに転写抑制転換ポリヌクレオチドが組み込まれていれば、重複する転写因子活性の機能の解析にも利用することができる。
【０１１７】
例えば、芽生えの頂芽の形成を制御する転写因子として、ＣＵＣ１タンパク質およびＣＵＣ２タンパク質が知られている。これらタンパク質をコードするＣＵＣ１遺伝子およびＣＵＣ２遺伝子は、両方が変異を有する場合にのみ、その植物体の子葉がカップ状の形態を示し、かつ頂芽の分裂組織の形成が行われないことが知られている。
【０１１８】
これら重複した機能を有する遺伝子の一方のみ（例えば、ＣＵＣ１遺伝子）に、上記機能性ペプチドを結合させたキメラ遺伝子を植物体内で発現させた場合であっても、発現したキメラタンパク質は、ＣＵＣ１タンパク質だけでなく、ＣＵＣ２タンパク質の転写活性をも抑制する。
【０１１９】
植物は、機能的に重複した複数の転写因子を有する場合が多い。ここで、上記機能性ペプチドを用いて機能変換した転写抑制因子は、優性形質（ドミナント）で作用する。そのため、本発明を利用することで、これまで一遺伝子のノックアウトでは明らかにされなかった転写因子の機能解析が可能となる。また、小麦等のように複２倍体ゲノムを有する植物にも適応することもできる。
【０１２０】
一実施形態において、本発明に係る種子ライブラリーの種子は、転写因子と機能性ペプチドとの融合タンパク質である転写抑制因子をコードする遺伝子が導入された形質転換植物から得られた種子であることが好ましい。
【０１２１】
本発明はまた、種子ライブラリーを作製する方法を提供する。本発明に係る種子ライブラリーを作製する方法は、転写因子と機能性ペプチドとの融合タンパク質である転写抑制因子をコードする遺伝子を用いて植物を形質転換する工程；形質転換された該植物において上記融合タンパク質を発現する植物を選抜する工程；および該融合タンパク質を発現する植物から種子を得る工程、を包含することを特徴としている。
【０１２２】
具体的には、本発明に係る種子ライブラリーの作製手順は以下に従えばよい：（１）植物由来の転写因子をコードするポリヌクレオチドおよび転写抑制ペプチドをコードするポリヌクレオチドがインフレームで連結されたキメラＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を、１つの転写因子に対して１つずつ作製する；（２）（１）において作製したＤＮＡ構築物から切り出したキメラＤＮＡを挿入した植物発現ベクターを、各々アグロバクテリウムに導入する；（３）（２）で得られた各アグロバクテリウムを用いて、シロイヌナズナを感染させる；（４）（３）で得られたアグロバクロテリウムに感染したシロイヌナズナの各個体より、Ｔ１種子を回収する；（５）（４）において回収した各Ｔ１種子を生育させた個体より単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、キメラＤＮＡを含む配列を増幅するように設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲにより増幅が得られたゲノムＤＮＡを有する植物を形質転換植物として選抜する；（６）（５）において選抜した各形質転換体を生育し、Ｔ２種子を回収して種子ライブラリーを構築する。
【０１２３】
本発明はさらに、種子ライブラリーを作製するためのキットを提供する。本発明に係る種子ライブラリーを作製するためのキットは、上述した種子ライブラリーを作製する方法を実施するために必要な物品を備えていればよく、少なくとも転写因子と機能性ペプチドとの融合タンパク質である転写抑制因子をコードする遺伝子と、植物形質転換用ベクターとを備えている。なお、本明細書中で使用される場合、「キット」は複数の物質を別々に併せて包含している形態であることが意図され、例えば、別の容器中に保持されている「転写因子と機能性ペプチドとの融合タンパク質である転写抑制因子をコードする遺伝子」と「植物形質転換用ベクター」とを併せて内包している形態が意図される。
【０１２４】
本発明は、本技術を導入した植物がその一世代においてのみ所望の形質を有するのではなく、首尾よく結実し、その形質を維持したＴ２世代の種子を提供することができることを見出したことにより完成されたものである。本発明に係る種子ライブラリーを用いることによって提供される以下の発明もまた、本発明に包含される。
【０１２５】
〔２：種子ライブラリーの用途〕
〔２−１：有用形質を有する植物体をスクリーニングするための方法およびキット〕
１つの局面において、本発明は、有用形質を有する植物体をスクリーニングするための方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方法は、所定の環境下にて発育可能な植物をスクリーニングするために、上述した種子ライブラリーを所定の環境下で発育させる工程を包含している。一実施形態において、上記有用形質を有する植物体は、所定のストレス環境下にて発育可能な植物であり得る。
【０１２６】
本実施形態に係るスクリーニング方法は、所定のストレス環境下にて発育可能な植物をスクリーニングするために、上述した種子ライブラリーを所定のストレス環境下で発育させる工程を包含している。
【０１２７】
上記種子ライブラリーを環境ストレス下で発育させることにより、環境ストレスに耐性である植物を得ることができる。植物に負荷する環境ストレスとしては、高グルコース、重金属などが挙げられるが、これらに限定されない。ストレス耐性以外の有用形質としては、オーキシン非感受性、エチレン非感受性の他に、タンニン、アントシアニン、アミノ酸の含有量が少ないといった形質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
有用形質を有する植物体をスクリーニングするための方法において、上記工程以外の工程は、当該分野において公知の種々の工程が採用されればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【０１２９】
他の局面において、本発明は、有用な形質を有する植物をスクリーニングするためのキットを提供する。本発明に係るスクリーニングキットは、所定の環境下にて発育可能な植物をスクリーニングするために、上述した種子ライブラリーを備えている。一実施形態において、上記有用な形質を有する植物は、所定のストレス環境下にて発育可能な植物であり得る。
【０１３０】
本実施形態に係るスクリーニングキットは、所定のストレス環境下にて発育可能な植物をスクリーニングするために、上述した種子ライブラリーを備えている。本キットを用いれば、上述したように環境ストレスに耐性である植物をスクリーニングすることができる。
【０１３１】
有用形質を有する植物体をスクリーニングするためのキットにおいて、上記種子ライブラリー以外に用いる試薬などは、当該分野において公知の種々の試薬を採用すればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【０１３２】
〔２−２：有用形質の発現を調節する転写因子を同定するための方法およびキット〕
１つの局面において、本発明は、植物の有用形質の発現を調節する転写因子を同定するための方法を提供する。本発明に係る転写因子同定方法は、所定の環境下での植物の発育を調節する転写因子を同定するために、上記種子ライブラリーを所定の環境下で発育させる工程；および発育した植物に導入されている上記遺伝子を同定する工程、を包含している。本方法を用いれば、上述したように所定の環境下での植物の発育を調節する転写因子を同定することができる。そして、同定された転写因子の機能を植物体において阻害すれば、目的の性質が付与された植物体が得られる。
【０１３３】
一実施形態において、上記有用形質を有する植物は、所定のストレス環境下にて発育可能な植物であり得る。本実施形態に係る転写因子同定方法は、所定のストレス環境下での植物の発育を調節する転写因子を同定するために、上記種子ライブラリーを所定の環境下で発育させる工程；および発育した植物に導入されている上記遺伝子を同定する工程、を包含している。本方法を用いれば、上述したように所定のストレス環境下での植物の発育を調節する転写因子を同定することができる。そして、同定された転写因子の機能を植物体において阻害すれば、目的の性質が付与された植物体が得られる。
【０１３４】
有用形質の発現を調節する転写因子を同定するための方法において、上記工程以外の工程は、当該分野において公知の種々の工程が採用されればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【０１３５】
他の局面において、本発明は、植物の有用形質の発現を調節する転写因子を同定するためのキットを提供する。本発明に係る転写因子同定用キットは、所定の環境下での植物の発育を調節する転写因子を同定するために、上記種子ライブラリー；および該種子ライブラリーに導入されている遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド、を備えている。好ましくは。本実施形態に係る転写因子同定用キットは、ストレス環境を形成するための試薬をさらに備えている。本キットを用いれば、上述したように所定の環境下での植物の発育を調節する転写因子を同定することができる。そして、同定された転写因子の機能を植物体において阻害すれば、目的の性質が付与された植物体が得られる。
【０１３６】
一実施形態において、上記有用形質を有する植物は、所定の環境下にて発育可能な植物であり得る。本実施形態に係る転写因子同定用キットは、所定の環境下での植物の発育を調節する転写因子を同定するために、上記種子ライブラリー；および該種子ライブラリーに導入されている遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド、を備えている。好ましくは。本実施形態に係る転写因子同定用キットは、ストレス環境を形成するための試薬をさらに備えている。本キットを用いれば、上述したように所定の環境下での植物の発育を調節する転写因子を同定することができる。そして、同定された転写因子の機能を植物体において阻害すれば、目的の性質が付与された植物体が得られる。
【０１３７】
有用形質の発現を調節する転写因子を同定するためのキットにおいて、上記種子ライブラリーおよび上記オリゴヌクレオチド以外に用いる試薬などは、当該分野において公知の種々の試薬を採用すればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【０１３８】
〔２−３：植物の有用形質の発現を調節する遺伝子を同定するための方法およびキット〕
１つの局面において、本発明は、植物の有用形質の発現を調節する遺伝子を同定するための遺伝子同定方法を提供する。本発明に係る遺伝子同定方法は、植物の有用形質の発現を調節する遺伝子を同定するために、上記種子ライブラリーを所定の環境下で発育させる工程；発育した植物から第１のｍＲＮＡを得る工程；該植物と同系統でありかつ形質転換されていない植物から第２のｍＲＮＡを得る工程；および第１のｍＲＮＡと第２のｍＲＮＡとを比較する工程、を包含している。
【０１３９】
一実施形態において、上記有用な形質を有する植物は、所定のストレス環境下にて発育可能な植物であり得る。本実施形態に係る遺伝子同定方法は、所定のストレス環境下での植物の発育を調節する遺伝子を同定するために、上記種子ライブラリーを所定のストレス環境下で発育させる工程；発育した植物から第１のｍＲＮＡを得る工程；該植物と同系統でありかつ形質転換されていない植物から第２のｍＲＮＡを得る工程；および第１のｍＲＮＡと第２のｍＲＮＡとを比較する工程、を包含している。
【０１４０】
植物の有用形質の発現を調節する遺伝子を同定するための方法において、上記工程以外の工程は、当該分野において公知の種々の工程が採用されればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【０１４１】
他の局面において、本発明は、植物の有用形質の発現を調節する遺伝子を同定するための遺伝子同定用キットを提供する。本発明に係る遺伝子同定用キットは、植物の有用形質の発現を調節する遺伝子を同定するために、上記種子ライブラリー；該種子ライブラリーに導入されている遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド；および植物からｍＲＮＡを調製するための試薬、を備えている。好ましくは、上記遺伝子は、所定の環境下にて発現が抑制されている。
【０１４２】
一実施形態において、上記有用形質を有する植物は、所定のストレス環境下にて発育可能な植物であり得る。本実施形態に係る遺伝子同定用キットは、所定のストレス環境下で発育する植物において発現が抑制されている遺伝子を同定するために、上記種子ライブラリー；該種子ライブラリーに導入されている遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド；植物からｍＲＮＡを調製するための試薬；およびストレス環境を形成するための試薬、を備えている。好ましくは、上記遺伝子は、所定のストレス環境下にて発現が抑制されている。
【０１４３】
植物の有用形質の発現を調節する遺伝子を同定するためのキットにおいて、上記種子ライブラリーおよび上記オリゴヌクレオチド以外に用いる試薬などは、当該分野において公知の種々の試薬を採用すればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【０１４４】
〔３：有用形質を有する植物体を生産する方法およびキット〕
上記〔２−２〕において述べたように、本発明に係る、有用形質の発現を調節する転写因子を同定するための方法およびキットを用いれば、当該転写因子の機能を阻害することによって有用形質を有する植物体を生産することができる。
【０１４５】
すなわち、本発明は、有用形質を有する植物体を生産する方法を提供する。本方法は、上記有用形質の発現を調節する転写因子の機能を阻害する工程を包含することを特徴としている。上記転写因子の機能を阻害するためには、上記植物体内で上記転写因子の発現を阻害しても、上記転写因子と任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとの融合タンパク質（キメラリプレッサー）を植物体内で発現させてもよい。なお、タンパク質の発現を阻害する方法は、当該分野において周知の技術が用いられればよく、ノックアウト法またはＲＮＡｉ法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
なお、「機能性ペプチド」は、〔１〕において詳述したような、転写因子を転写抑制因子に変換することができるペプチドが意図され、「転写抑制転換ペプチド」または「リプレッサードメイン」と交換可能に使用され得る。
【０１４７】
例えば、実施例において示すように、転写因子Ａｔ１ｇ７１０３０は、植物のタンニン含有量に関与する転写因子であることがわかった。すなわち、転写因子Ａｔ１ｇ７１０３０の機能を抑制することにより、タンニン含有量の少ない植物体を作製することができる。さらに、転写因子Ａｔ５ｇ３５５５０は、植物の種子の大きさに関与する転写因子であることがわかった。すなわち、転写因子Ａｔ５ｇ３５５５０の機能を抑制することにより、通常より大きな種子を結種する植物体を作製することができる。
【０１４８】
一実施形態において、本発明は、タンニン含有量の少ない植物体の生産方法を提供し、本方法は、植物体内において、配列番号７４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を阻害する工程を包含することを特徴としている。本実施形態に係る方法において、上記タンパク質の機能を阻害する工程は、配列番号７４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとの融合タンパク質を植物体において産生させることによって行われても、上記植物体内での該タンパク質の発現阻害によってもよい。
【０１４９】
別の実施形態において、本発明は、大きな種子を結種する植物体の生産方法を提供し、本方法は、植物体内において、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を阻害する工程を包含することを特徴としている。本実施形態に係る方法において、上記タンパク質の機能を阻害する工程は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとの融合タンパク質を植物体において産生させることによって行われても、上記植物体内での該タンパク質の発現阻害によってもよい。
【０１５０】
有用形質を有する植物体を生産するための方法において、上記工程以外の工程は、当該分野において公知の種々の工程が採用されればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。また、上述した有用形質を有する植物体を生産する方法を、植物体に有用形質を付与する方法として用いることができることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【０１５１】
本発明はまた、有用形質を有する植物体を生産するためのキットを提供する。本キットは、上記有用形質の発現を調節する転写因子の機能を阻害する手段を備えていることを特徴としている。上記転写因子の機能を阻害するためには、上記転写因子と任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとの融合タンパク質（キメラリプレッサー）を植物体内で発現させればよい。
【０１５２】
一実施形態において、本発明は、植物体のタンニン含有量を低減するためのキットを提供する。本実施形態に係るキットは、植物体のタンニン含有量を低減するために、（ａ’）任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ’）配列番号７５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、を備えていることを特徴としている。本実施形態に係るキットは、（ｃ’）目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクター、をさらに備えていてもよく、この場合は、（ｄ’）該発現ベクター（ｃ’）を植物細胞に導入するための試薬群、をさらに備えていることが好ましい。
【０１５３】
別の実施形態において、本発明は、大きな種子を結種する植物体を生産するためのキットを提供する。本実施形態に係るキットは、大きな種子を結種する植物体を生産するために、（ａ’’）任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ’’）配列番号７７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、を備えていることを特徴としている。本実施形態に係るキットは、（ｃ’’）目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクター、をさらに備えていてもよく、この場合は、（ｄ’’）該発現ベクター（ｃ’’）を植物細胞に導入するための試薬群、をさらに備えていることが好ましい。
【０１５４】
有用形質を有する植物体を生産するためのキットにおいて、上述したポリヌクレオチド以外に用いる試薬などは、当該分野において公知の種々の試薬を採用すればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。また、上述した有用形質を有する植物体を生産するためのキットを、植物体に有用形質を付与するためのキットとして用いることができることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【０１５５】
さらに、本明細書を読んだ当業者は、上述した有用形質を有する植物体を生産するための方法およびキットを用いて生産した植物体、ならびに植物体に有用形質を付与するための方法およびキットを用いて得られた植物体もまた、本発明の範囲内に包含されることを、容易に理解する。
【０１５６】
なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。それゆえ、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１５７】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【０１５８】
本発明に係る種子ライブラリーの作製手順、および有用形質を有する植物のスクリーニング手順の概略について、図１（ａ）〜（ｄ）を用いて説明する。
（１）キメラリプレッサー（転写因子と転写抑制ペプチドからなるキメラ融合タンパク質：図１（ａ））を発現させるために、植物由来の転写因子をコードするポリヌクレオチドおよび転写抑制ペプチドをコードするポリヌクレオチドがインフレームで連結されたキメラＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を、１つの転写因子に対して１つずつ作製した（図１（ｂ）の工程Ｉ）。
（２）（１）において作製したＤＮＡ構築物から切り出したキメラＤＮＡを挿入した植物発現ベクターを、各々アグロバクテリウムに導入した（図１（ｂ）の工程ＩＩ）。
（３）（２）で得られた各アグロバクテリウムを用いて、シロイヌナズナを感染させた（図１（ｂ）の工程ＩＩＩ）。
（４）（３）で得られたアグロバクロテリウムに感染したシロイヌナズナの各個体より、Ｔ１種子を回収した。
（５）（４）において回収した各Ｔ１種子を生育させた個体より、ゲノムＤＮＡを単離した。キメラＤＮＡを含む配列を増幅するように設計したプライマーを用い、各ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲにより増幅が得られたゲノムＤＮＡを有する植物を形質転換植物として選抜した（図１（ｃ）の工程ＩＶ）。
（６）（５）において選抜した各形質転換体を生育し（図１（ｃ）の工程Ｖ）、Ｔ２種子を回収した。なお、本発明に係る種子ライブラリーは、これらのＴ２種子からなる。
（７）上記種子ライブラリーを、所定の環境条件（例えば、環境負荷（例えば、乾燥、低温など）および／または生育を促進する要素の付加（例えば、肥料の添加、光照射時間の延長など））下において生育する（図１（ｄ））。
（８）所定の環境条件下において生育した植物において、環境負荷を与えた群については、生育可能であった個体または同一群において生育が良好であった個体を選抜した。また、生育を促進する要素を付加した群については、生育がより良好であった個体または有用な形質（例えば、種子が大きい、有用な成分を多く含むなど）を有する個体を選抜した（図１（ｄ））。
（９）（８）で選抜した個体より、ゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡを単離した（図１（ｄ））。
（１０）（９）において選抜した個体より単離したゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ配列を決定することより、キメラＤＮＡを形成している転写因子を同定した（図１（ｄ））。また、（９）において、有用形質を有する植物および野生体からｍＲＮＡを単離し、マイクロアレイ解析を行うことより、有用形質を有する植物において、キメラリプレッサーによって転写が抑制されている遺伝子を同定した（図１（ｄ））。
【０１５９】
上記工程についての具体例を以下の実施例に示す。
【０１６０】
〔実施例１：種子ライブラリーの作製〕
＜１．ＤＮＡ構築物の作製＞
転写因子をコードする遺伝子を挿入することにより、転写抑制因子として機能するキメラリプレッサー（転写因子と転写抑制ペプチドからなるキメラ融合タンパク質）を発現し得るベクターとして、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧを用いた（特許文献７を参照のこと）。ｐ３５ＳＳＲＤＸＧは、公知のλファージ由来の組換え部位（以下、ａｔｔ部位と称する）を２つ有し、この２つのａｔｔ部位に挟まれた領域にカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと称する）、シロイヌナズナ由来の転写抑制ペプチドＳＲＤＸ（ＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ：配列番号１７）およびノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下、ＮＯＳ−ｔｅｒと称する）を有するベクターである。
【０１６１】
キメラリプレッサーを発現する種々のＤＮＡ構築物を、以下の工程（１）〜（３）に従って作製した：
（１）シロイヌナズナについてのＴｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＴＡＩＲ）のゲノム情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）に基づいて、シロイヌナズナの転写因子をコードする遺伝子（１５１２個）に関する情報および該遺伝子におけるタンパク質コード領域に関する情報からなるデータベースを作成した（示さず）；
（２）このデータベースに基づいて、転写因子をコードする遺伝子各々のタンパク質コード領域を増幅するためのプライマーを合成した（配列番号１８０〜３２０３）。９４℃で１分間の変性、４７℃で２分間のアニーリング、および７４℃で１分間の伸張を２５サイクルからなるＰＣＲを行った；
（３）このＰＣＲ反応によって増幅したＤＮＡ断片の各々を、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位に挿入した。得られた構築物を用いて大腸菌を形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させた後、上記構築物を大腸菌から調製し、その塩基配列を決定した。転写因子をコードする遺伝子が順方向に挿入されたクローンを単離し、転写因子をコードする遺伝子とＳＲＤＸとのキメラ遺伝子を有するＤＮＡ構築物を得た。
【０１６２】
＜２．形質転換用ベクターのアグロバクテリウムへの導入＞
上述したＤＮＡ構築物の２つのａｔｔ部位、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、キメラ遺伝子、およびＮＯＳ−ｔｅｒを含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨ（特許文献７を参照のこと）に挿入した。また、この組換え反応には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＧａｔｅ  ｗａｙ（登録商標）およびＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）を用いた。
【０１６３】
形質転換用ベクターのアグロバクテリウムへの導入を、以下の工程（１）〜（４）に従って行った。
（１）ＤＮＡ構築物１．５μｌ（約３００ｎｇ）およびｐＢＩＧＣＫＨ４．０μｌ（約６００ｎｇ）の混合物に対して、５倍希釈したＬＲ  ｂｕｆｆｅｒ４．０μｌとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７.０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）５．５μｌを加えた。
（２）（１）で得られた溶液に、ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ４．０μｌを加えて、２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｋ  ２.０μｌを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。
（３）（２）で得られた溶液１〜２μｌを導入した大腸菌（ＤＨ５α等）を、カナマイシンを含む培養液において培養することにより、マーカー遺伝子が導入された大腸菌を選択した。この大腸菌より、上記２つのａｔｔおよびこの２つのａｔｔに挟まれた領域を含む上記ＤＮＡ構築物のＤＮＡ断片がｐＢＩＧＣＫＨに首尾よく挿入された植物形質転換用ベクターを調製した。
（４）（３）で得られた植物形質転換用ベクターを、エレクトロポレーション法を用いて、土壌細菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｅｍｆａｃｉｅｎｓ  Ｓｔｒａｉｎ  ＧＶ３１０１（Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆｒ）ｐＭＰ９０（Ｇｍｒ）（ｋｏｎｃｚ  ａｎｄＳａｈｅｌｌ  １９８６））株に導入した。
【０１６４】
＜３．植物の形質転換およびＴ１種子の回収＞
上記植物形質転換用ベクターを導入したアグロバクテリウムを用いて、以下の工程（１）〜（２）に従って、シロイヌナズナの形質転換を行った。
（１）１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌおよびリファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ培地またはＬＢ培地を用いて、上記形質転換用ベクターを導入したアグロバクテリウムを培養した。培養液のＯＤ６００が１になるまで培養した後、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ：特許文献７を参照のこと）に懸濁した。
（２）(１)で得た菌体懸濁液に、１４日間以上生育させたシロイヌナズナを２分間浸漬することにより、上記形質転換用ベクターを導入したアグロバクテリウムに菌体を感染させた。形質転換されたシロイヌナズナを生育し、Ｔ１種子を得た。
【０１６５】
＜４．形質転換体の選抜およびＴ２種子の回収＞
形質転換体の選抜およびＴ２種子の回収を、以下の工程（１）〜（３）に従った。
（１）上述のＴ１種子を、２５％ブリーチ、０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を用いて７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（特許文献７を参照のこと）に播種した。
（２）播種したＴ１種子を生育させたシロイヌナズナロゼット葉より、Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。具体的には、凍らせた植物組織を、ドライアイスまたは液体窒素とともに粉末状になるまで破砕した（細胞壁の破壊）。破壊した組織をチューブに移した後、Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｉを添加し、これを懸濁した後、Ｒｅａｇｅｎｔ  ＩＩを添加して転倒混和した（細胞の溶解）。チューブを、ウォーターバス中にて６５℃で１０分間振盪し、次いで、氷上にて２０分間静置した。チューブを氷上から取り出し、クロロホルム、ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ樹脂を添加した後、室温で１０分間振盪した。チューブを１，３００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清を回収した（ＤＮＡ抽出）。回収した上清に同量の冷イソプロパノールを添加して転倒混和し、４，０００×ｇで５分間遠心分離した後、上精を除去した。沈殿を冷７０％エタノールで洗浄した後、４，０００×ｇで５分間遠心分離した後、上精を除去した。１０分間風乾した沈殿に適量のＴＥ緩衝液または水を添加してＤＮＡ溶液を得た。ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターのＤＮＡ配列に対するプライマー（ＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧ：配列番号７２）およびＮＯＳ−ｔｅｒに対するプライマー（ＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＣＡＧＧＡＴＴＣＡＡＴＣ：配列番号７３）を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより増幅が得られたゲノムＤＮＡを有する植物を、目的の形質転換植物として選抜した。
（３）選抜した上記形質転換植物よりＴ２種子を取得し、各Ｔ２種子から構成される種子ライブラリーを作製した。
【０１６６】
〔実施例２：有用形質を有する植物のスクリーニング〕
＜１．高濃度グルコースに対する耐性を有する植物のスクリーニング＞
高濃度のグルコースの存在により、植物は生育阻害を受けることが知られている。このため、高濃度グルコースにより生育阻害を受けない植物を用いれば、植物の生育地域を拡大することができ、収穫物の生産量増大が期待され得る。高濃度グルコースに対する耐性を有する植物を、以下の手順に従ってスクリーニングした。
（１）実施例１にて作製した種子ライブラリーまたは野生体（Ｃｏｌ−０株）由来の種子を塩素滅菌し、６％グルコースを含有するＭＳプレートに播種した。なお、直径１５０ｍｍのプレート一枚に対して、各種子を含む溶液を５０μＬずつ播種した。
（２）野生型の種子は、６％のグルコース存在条件下において発芽しなかったが、種子ライブラリーを播種したプレートにおいて、発芽した種子が得られた（図２（ａ））。なお、以下に示す有用形質を有する植物のスクリーニングは、上述のスクリーニングと同様の手順に従って行った。
【０１６７】
＜２．オーキシンに対して非感受性である植物のスクリーニング＞
オーキシンの類縁体である２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）・２，４，５−Ｔは、除草剤として用いられていることから、オーキシン非感受性株は、除草剤に耐性を持つことになる。すなわち、２，４−Ｄを撒いても、不要な雑草となる植物のみが枯れ、非感受性植物は生き残る。このように、オーキシン非感受性株は、農業上、産業上有用な形質を持つ植物である。また、オーキシンは、茎や根の伸長成長、茎や根の伸長成長、頂芽の成長、果実の肥大、発根や組織分化などの促進、側芽の成長、果実や葉の脱離などを阻害することから、オーキシン非感受性株は、個体の矮性化、生長抑制、側芽の抑制、果実や葉の脱離などが生じにくい植物体であることが期待される。そこで、オーキシンに対して非感受性である植物のスクリーニングを、以下のように行った。
【０１６８】
個々の転写因子キメラリプレッサー発現体から単離したＴ２種子を混合し、キメラリプレッサー種子ライブラリーを調製した。オーキシンの類似物である濃度が２００ｎＭとなる２，４−Ｄを含むＭＳ寒天培地を作製した。これらの寒天培地に、消毒処理した野生型の種子および上記の種子ライブラリーをそれぞれ個別のプレートに播種した。シロイヌナズナ野生型植物では、２００ｎＭの２，４−Ｄ存在下では根の伸長が抑制され、根毛が多く生じるので、これを指標とし、根の伸長抑制が見られない非感受性植物の単離を行った。
【０１６９】
＜３．エチレンに対して非感受性である植物のスクリーニング＞
植物ホルモンの１つであるエチレンは、一般的には植物の生長を阻害、果実の成熟促進、農産物の成熟、老化の促進などの作用を有している。エチレンガスは、成熟作用を有する物質であることから、輸送時または保存時においてわずかでも存在することにより新鮮な農産物を早く腐らせてしまう。例えば、縮み（新鮮な作物や花の球根）、褐色の点（葉物野菜やナス）、黄色化（きゅうり、ブロッコリー、芽キャベツ）、いやな臭い（にんにく、たまねぎ）、しぼむ（野菜、切花）、日焼け、ブヨブヨになる（りんご）、表皮の傷み（かんきつ類）、などを誘導する。
【０１７０】
植物にエチレン非感受性を付与することができれば、収穫から消費までの間の貯蔵、輸送、販売のいずれの段階においても商品の寿命を格段に伸ばす事が可能となり、驚くほど長期間の保存が可能となる。また、このような非感受性植物では、果実や切り花等の貯蔵中の品質低下が抑えられるとともに貯蔵性が向上されることが可能となる。また、エチレンは、花や葉、実が落ちるのを促進する作用を有していることから、エチレン非感受性植物では、長持ちする花や、枝から安易に落下しない果実を形成させることが可能となる。そこで、エチレンに対して非感受性である植物のスクリーニングを、以下のように行った。
【０１７１】
個々の転写因子キメラリプレッサー発現体から単離したＴ２種子を混合し、キメラリプレッサー種子ライブラリーを調製した。これらの種子を消毒した後、ＭＳ寒天培地に播種した。これらを１００ｐｐｍのエチレンガスの存在する暗所で３日間育成した後、トリプルレスポンスを指標として、エチレン非感受性植物の単離を行った。
【０１７２】
＜４．タンニン含有量の少ない植物のスクリーニング＞
タンニンはポリフェノール化合物の一種であり、一般に植物に含まれる。特に種子に多く含まれており、種子の表皮の褐色は、縮合型タンニンによるものであり、強い渋味を感じさせる。タンニンを過剰に摂取すると、収斂作用が生じ、便秘になる。これは、タンニンがタンパク質と結合して変性させることによると考えられている。タンニンが多く含まれる飼料は、消化を阻害することから、飼料としてタンニン含量が低い種子の作出が望まれている。
【０１７３】
一方、緑茶タンニンには強い抗酸化作用があり、また発癌予防効果があるとして期待されている。そのため、タンニンの含量が抑制された植物体を解析することにより、タンニン生合成の詳細な経路が明らかにすることができ、これらを人為的に操作することが可能になり、より効率的なタンニンの生産が可能となる。そこで、タンニン含有量の少ない植物のスクリーニングを、以下のように行った。
【０１７４】
個々の転写因子キメラリプレッサーを発現する植物体を結実させ、個々に種子を採取した。種子の色を比較して、野生型種子（図３（ａ））より黄色であるもの（図３（ｂ））を選択した。これらの種子のプロアントシアニジン含有量を定量し、タンニンの含量が抑制された植物体を選抜した。
【０１７５】
＜５．アントシアニン含有量の少ない植物のスクリーニング＞
アントシアニン（Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ）は抗酸化物質として知られるポリフェノールの一種であり、アントシアニジン（Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）をアグリコンとする配糖体のことである。
【０１７６】
植物界において広く存在するアントシアン（ａｎｔｈｏｃｙａｎ；果実や花の赤、青、紫を示す水溶性色素の総称）の一種で、高等植物では普遍的な物質であり、主にワインの原料であるブドウや、ブルーベリー、紫芋、あずきなどに含まれ、花や果実の色の表現に関与することが知られている。
【０１７７】
一方、アントシアニンは、種々のストレスによって生合成が誘導されることが知られており、芝などでは、低温でアントシアニンが蓄積し赤紫に変化することが問題となっている。そのため、アントシアニンの蓄積を抑制し得る芝の開発が望まれている。
【０１７８】
一方、他のポリフェノール同様、強い抗酸化作用により、老化防止や、血をサラサラにしてくれる働きがあるとされていることから、アントシアニンの生合成が抑制された植物体を解析することにより、アントシアニン生合成の詳細な経路が明らかにすることができ、これらを人為的に操作することが可能になり、より効率的なアントシアニンの生産が可能となる。そこで、アントシアニン含有量の少ない植物のスクリーニングを、以下のように行った。
【０１７９】
個々の転写因子キメラリプレッサー発現体から単離したＴ２種子を混合し、キメラリプレッサー種子ライブラリーを調製した。これらの種子を消毒した後、３〜６％のショ糖を含むＭＳ寒天培地に播種した。野生型では、高濃度のショ糖存在下では、発芽時に赤紫色のアントシアニンが蓄積されるが、これらを蓄積しないものを非感受性植物として単離した。
【０１８０】
＜６．通常より大きな種子を結種する植物のスクリーニング＞
通常より大きな種子を結種する植物を開発することにより、種子が産業的価値を有する植物（例えば、ゴマ、エンドウなど）において、糖、脂質、アミノ酸など種々の有用物質の含有量が多い種子を供給することができる。そこで、通常より大きな種子を結種する植物のスクリーニングを、以下のように行った。
【０１８１】
個々の転写因子キメラリプレッサーを発現する植物体を結実させ、個々に種子を採取した。これらの種子の大きさを比較し、野生型種子より大きいものを選択した（図４（ａ））。これらの種子の生育させて次世代の種子を採取し、大きさを測定し、統計処理を行うことで、遺伝子的に安定な物を選択することができる（図４（ｂ））。
【０１８２】
＜７．タンパク質含有量の多い植物のスクリーニング＞
タンパク質含有量の多い植物は、食品としての栄養価が高いといった有用性を有する。そこで、タンパク質含有量の多い植物のスクリーニングを行った。具体的には、個々の転写因子キメラリプレッサーを発現する植物体を結実させ、個々に種子を採取し、一定量の種子毎にタンパク質を抽出して比色定量し総タンパク質量が多いものを選択した。
【０１８３】
＜８．タンパク質含有量の少ない植物のスクリーニング＞
タンパク質含有量の少ない植物は、他の有用成分が増加している可能性が高いといった有用性を有する。そこで、アミノ酸含有量の少ない植物のスクリーニングを行った。具体的には、個々の転写因子キメラリプレッサーを発現する植物体を結実させ、個々に種子を採取した。一定量の種子毎にタンパク質を抽出して比色定量し総タンパク質量が少ないものを選択した。
【０１８４】
〔実施例３：有用形質に関与する転写因子の同定〕
実施例２にて示した有用形質を有する植物において、キメラリプレッサーによって転写機能が抑制されている転写因子の同定した。具体的には、有用形質を有する各植物の種子を生育させた植物体より、Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１８５】
キメラリプレッサーをコードするＤＮＡ配列は、形質転換植物のゲノムＤＮＡ上において、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＮＯＳ−ｔｅｒとの間の領域に存在しているので、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに対するプライマー（配列番号７２）およびＮＯＳ−ｔｅｒに対するプライマー（配列番号７３）を用いてキメラリプレッサーのコード領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。
【０１８６】
ＤＮＡシーケンサーを用いて、増幅フラグメントの塩基配列を決定した。このフラグメントが有する塩基配列と、シロイヌナズナの転写因子をコードする遺伝子のデータベースを比較した。
【０１８７】
その結果、タンニン含有量の少ない植物（図３（ｂ））については、増幅フラグメントは転写因子Ａｔ１ｇ７１０３０（配列番号７４（タンパク質））をコードする領域（配列番号７５）を含んでいた。このことより、転写因子Ａｔ１ｇ７１０３０は、植物のタンニン含有量に関与する転写因子であることがわかった。さらに、通常より大きな種子を結種する植物（図４（ｂ））については、増幅フラグメントは転写因子Ａｔ５ｇ３５５５０（配列番号７６（タンパク質））をコードする領域（配列番号７７）を含んでいた。このことより、転写因子Ａｔ５ｇ３５５５０は、植物の種子の大きさに関与する転写因子であることがわかった。なお、Ａｔ１ｇ７１０３０の増幅に用いたプライマーは、配列番号５１７および配列番号２０２９であり、Ａｔ５ｇ３５５５０の増幅に用いたプライマーは、配列番号１４９０および配列番号３００２である。
【０１８８】
〔実施例４：有用形質に関与する遺伝子の同定〕
マイクロアレイを利用すれば多数の遺伝子の発現状況を調べることができる。マイクロアレイは、大きく分けて１色法アレイと２色法アレイに分けることができる。１色法アレイでは、１枚のマイクロアレイに１種類のＲＮＡをハイブリダイズさせ、絶対的な発現値を得ることができる。２色法アレイでは、１枚のマイクロアレイに異なる２条件（例えば、野生株および変異体）から抽出したＲＮＡを、異なる蛍光にて標識して同時にハイブリダイズさせる。得られる発現値は、原則的に２条件間の比となる。
【０１８９】
１色法アレイとしてはアフィメトリクス社のＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐが挙げられ、２色法アレイとしてはアジレント社のものが挙げられるが、これらに限定されない。いずれを利用しても実験方法は大きく異なるものではないが、アジレント社の２色法マイクロアレイを利用した場合の実験方法を以下に示す。
【０１９０】
先ず、各条件から総ＲＮＡを抽出する。この時点でＲＮＡ量が少ない場合はＴ７増幅法を利用し、ＲＮＡ量が十分である場合はダイカップリング法を利用して、ハイブリダイズに用いる標識化ｃＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）を合成する。ダイカップリング法では通常の逆転写酵素を用いて、ｐｏｌｙＴプライマーを起点としてアミノアリル化ｄＵＴＰを含む核酸基質中で逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡのアミノアリル基にＣｙａｎｉｎｅ３もしくはＣｙａｎｉｎｅ５を結合させ、標識化ｃＤＮＡをハイブリダイズに用いる。Ｔ７増幅法では、Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＭＭＬＶ−ＲＴ）を用いて、Ｔ７プロモーターを付加したｐｏｌｙＴプライマーを起点として二本鎖ｃＤＮＡを合成する。これにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを添加し、Ｃｙａｎｉｎｅ３もしくはＣｙａｎｉｎｅ５が結合したｄＣＴＰを含む核酸基質中で標識化ｃＲＮＡを合成して、これをハイブリダイズに用いる。通常、ハイブリダイズする前に標識化ｃＤＮＡ（またはｃＲＮＡ）を熱化学処理によって３５〜２００塩基程度に断片化する。ハイブリダイゼーションは通常、６５℃で１７時間行う。その後、マイクロアレイ供給元から供給される洗浄用緩衝液で数回洗浄し、共焦点レーザースキャナーで各スポットのシグナル値をスキャンする。
【０１９１】
スキャン後のシグナル値を、ＬＯＷＥＳＳ法などの計算処理によって色素補正し、さらにシグナルがスポット内において均一性を満たしているかどうか、バックグラウンド値を有意に上回っているかどうかなどの観点からフィルタリングを行い、その後の解析に利用できるスポットを絞り込む。
【０１９２】
高濃度グルコースに対する耐性を有する植物において、転写が抑制されている遺伝子を以下の手順により同定する。
【０１９３】
６％のグルコースを含むＭＳプレート上に種子ライブラリーを播種し、発芽した種子を生育させた（図２（ａ））。この種子を生育させた植物体から、以下の手順に従ってｍＲＮＡを抽出した。シロイヌナズナロゼット葉から、ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて、総ＲＮＡを単離した。具体的には、液体窒素で凍結したシロイヌナズナロゼット葉２〜３枚を、融解させないように注意して液体窒素中でペレットミキサーを用いて軽く組織を破砕した。破砕した組織に１．５ｍＬ  ＴＲＩｚｏｌ試薬（総容量１Ｌ当たり、３８０ｍＬのＴＥ飽和フェノール、１１８．１６ｇのグアニジンチオシアネート、７６．１２ｇのアンモニウムチオシアネート（チオシアン酸アンモニウム）、３３．４ｍＬの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液、および５０ｍＬグリセロール（グリセリン）を含む。）を添加した後、ホモジナイザーで１〜２分間細胞を破壊した。破壊した細胞サンプルを、１５秒間ボルテックスした後、６０℃で５分間加熱し、次いで、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を新たなチューブに移し、クロロホルム４００μＬ加えた。再度、ボルテックスおよび遠心分離を行った後、上清（約１ｍＬ）を回収した。回収した上清に、０．８Ｍクエン酸／１．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液（約５００μＬ）を穏やかに加え、次いで、イソプロパノール（約５００μＬ）を加えた。サンプルを軽く撹拌した後、室温で１０分間静置した。１４０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した後、上清を除去した。沈殿に７５％エタノールを１ｍＬ加え、１４０００ｒｐｍにて５分間遠心した。上清を除去し、沈殿を乾燥させた（総ｍＲＮＡ）。単離した総ＲＮＡから、ｍＲＮＡ精製ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ（Ｒ）  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてｍＲＮＡを抽出精製した。
【０１９４】
また、ＭＳプレート上に野生体の種子を播種しかつ生育させ、生育させた植物体から同様にｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡを上記マイクロアレイにて解析する。
【産業上の利用可能性】
【０１９５】
本発明を用いれば、環境ストレスに対して耐性である植物を容易にスクリーニングすることができるとともに、環境ストレス耐性の発現に関与する転写因子を容易に同定することができるので、環境ストレス存在下で生育することができる所望の植物を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】（ａ）は、本発明に係る種子ライブラリーを作製するために植物に導入する転写抑制因子（キメラリプレッサー）の構造を示す図である。（ｂ）および（ｃ）は、本発明に係る種子ライブラリーを得るための手順を示す図である。（ｄ）は、本発明に係る種子ライブラリーの応用例を示す図である。
【図２】（ａ）は、高濃度グルコース環境下で生育する植物体を示す図である。（ｂ）は、高濃度グルコース環境下で生育する植物体に導入されていたキメラリプレッサーの構造を示す図である。
【図３】（ａ）は野生型種子を示す図である。（ｂ）は、タンニンの含量が抑制された種子を示す図である。
【図４】（ａ）は、野生型種子と通常より大きな種子との比較を示す図である。（ｂ）は、得られた種子の重量を比較した結果を示す図である。
【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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