(57)【要約】【課題】多環芳香族炭化水素又はその誘導体で汚染された土壌の浄化に用いる微生物の成長促進剤を提供すること。【解決手段】多環芳香族炭化水素又はその誘導体で汚染された土壌の浄化に用いる微生物の成長促進剤であって、アラニン及びアルギン酸塩を必須成分とし、さらに酸素源又は栄養剤の少なくとも一方を含有してなり、上記酸素源は硝酸根（ＮＯ3-）を含む化合物であり、上記栄養剤はリン酸根（ＰＯ43-）及びアンモニウム根（ＮＨ4+）を含むことを特徴とする微生物の成長促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多環芳香族炭化水素又はその誘導体で汚染された土壌の浄化に用いる微生物の成長促進剤であって、アラニン及びアルギン酸塩を必須成分とし、さらに酸素源又は栄養剤の少なくとも一方を含有してなり、上記酸素源は硝酸根（ＮＯ3-）を含む化合物であり、上記栄養剤はリン酸根（ＰＯ43-）及びアンモニウム根（ＮＨ4+）を含むことを特徴とする微生物の成長促進剤。
【請求項２】
アラニンの含有量をＡ、アルギン酸塩の含有量をＢとした場合に両者の比が、Ａ：Ｂ＝１００質量部：５〜５００質量部である請求項１に記載の微生物の成長促進剤。
【請求項３】
アラニンの含有量をＡ、アルギン酸塩の含有量をＢ、硝酸根の含有量をＣ、リン酸根の含有量をＤ及びアンモニウム根の含有量をＥとした場合に、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの比が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ：Ｅ＝１００質量部：５〜５００質量部：０〜２，０００質量部：０〜１００質量部：０〜２００質量部である請求項１に記載の微生物の成長促進剤。
【請求項４】
多環芳香族炭化水素又はその誘導体が、ナフタレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、ピレン及びトビアス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の微生物の成長促進剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物の成長促進剤を用いることを特徴とする土壌浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の成長促進剤に関し、より詳しくは、多環芳香族炭化水素又はその誘導体で汚染された土壌の浄化に用いる微生物の成長促進剤及びそれを用いる土壌浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
土壌汚染は、大気汚染や騒音等の他の公害と比べると汚染源の特定や有害性の把握が難しいため、長く法規制の対象外であった。このため、土壌汚染により、地下水や農用地が汚染され、地域住民が気付きにくい形で健康被害を与える場合があった。
【０００３】
これに対して、近年の環境問題に対する社会的関心の高まりもあって、土壌汚染の問題も重要視されるようになり、土壌汚染に対する環境基準は年々厳しさを増している。
【０００４】
例えば、２００２年に成立した土壌汚染対策法の規定によると、所定の土地の所有者が土壌を汚染した場合、汚染した土壌の入れ換え、浄化又は覆土による封じ込め等により、土壌の浄化をしなければならない。しかし、土壌の入れ換えや浄化のための費用は莫大であり、土壌浄化費用を負担できず、かつ、土地の転売もできないために、工場跡地の中には土壌が汚染されたまま空き地として放置される場合があり、社会問題となっている。
【０００５】
土壌汚染物質としては、種々の化合物が知られているが、特に多環芳香族炭化水素は健康被害の原因物質となるおそれがあるうえ、水に対する溶解度が低く、揮発性も低いために土壌に蓄積する傾向があり、その処理が急務となっている。
【０００６】
上述した理由により、多環芳香族炭化水素等で汚染された土壌を安価に浄化するための技術を確立することが望まれている。このような技術の中でも、環境への配慮から、微生物を用いる技術が注目されている。
【０００７】
例えば、特許文献１は、トリクロロエチレンを分解する微生物を安定的に保持し、トリクロロエチレンで汚染された土壌を効率的に修復するための土壌修復剤を開示する。また、特許文献２は、石油系成分又は鉱油等で汚染された土壌を微生物により浄化する方法を開示し、特許文献３は、芳香族化合物等の環境汚染物質を微生物により継続的に分解するための方法を開示する。
【０００８】
しかしこれらの技術は、土壌汚染物質を分解する微生物を保持するために担体を使用したり、土壌汚染物質を分解する特定の微生物のみを使用する等、汎用性に欠けるという問題点があった。また、外来の微生物を導入することにより、固有の微生物を駆逐し、生態系を破壊するという問題点もある。
【０００９】
【特許文献１】特開平１１−１７９３３８号公報
【特許文献２】特開２００４−９７９３４号公報
【特許文献３】特開２０００−６９９５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の目的は、上述した従来技術の問題点を解決し、土壌に広く存在する微生物を利用して、生態系を破壊せずに汚染された土壌を安価に浄化する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的は以下の本発明により達成される。すなわち、本発明は、多環芳香族炭化水素又はその誘導体で汚染された土壌の浄化に用いる微生物の成長促進剤であって、アラニン及びアルギン酸塩を必須成分とし、さらに酸素源又は栄養剤の少なくとも一方を含有してなり、上記酸素源は硝酸根（ＮＯ3-）を含む化合物であり、上記栄養剤はリン酸根（ＰＯ43-）及びアンモニウム根（ＮＨ4+）を含むことを特徴とする微生物の成長促進剤を提供する。
【００１２】
上記微生物の成長促進剤においては、アラニンの含有量をＡ、アルギン酸塩の含有量をＢとした場合に両者の比が、Ａ：Ｂ＝１００質量部：５〜５００質量部であることが好ましく、硝酸根の含有量をＣ、リン酸根の含有量をＤ及びアンモニウム根の含有量をＥとした場合に、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの比が、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ：Ｅ＝１００質量部：５〜５００質量部：０〜２０００質量部：０〜１００質量部：０〜２００質量部であることがより好ましい。
【００１３】
また、多環芳香族炭化水素又はその誘導体が、ナフタレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、ピレン及びトビアス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００１４】
また、本発明は上記微生物の成長促進剤を用いる土壌浄化方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、多環芳香族炭化水素又はその誘導体（本明細書中において、多環芳香族炭化水素類と略すことがある）で汚染された土壌を安価に、かつ容易に浄化できる微生物の成長促進剤が提供される。また、この微生物の成長促進剤を用いることにより、多環芳香族炭化水素類で汚染された土壌を安価に、かつ容易に浄化できる土壌浄化方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
まず、本発明の微生物の成長促進剤の完成に至るまでの経緯を説明する。
土壌中には多種多様な微生物が存在し、その中には人間にとって有害な物質を分解することができる微生物も存在する。このような特有の能力を持つ微生物を選択的に成長させることにより、土壌全体の汚染物質の浄化能力を向上させることが本発明の目的である。
【００１７】
そこで本発明者らは、はじめに、土壌汚染物質として多環芳香族炭化水素のナフタレンを添加した土壌に、種々の化合物を添加し、それらの化合物が土壌中に残存するナフタレンの量に与える影響を測定した。具体的には、土壌にナフタレンを２００ｐｐｍとなるように添加し、その土壌に所定量のアルギン酸ナトリウム、アラニン、リン酸二水素カリウム又は硫酸アンモニウムを添加して、３０℃で４日間保った後、土壌中に残存するナフタレンの濃度を測定した。
【００１８】
結果を図１〜図４に示す。これらの結果から、それぞれの化合物を添加することによって、土壌中のナフタレンの分解が促進され、またその添加量（添加時の土壌中の濃度）によって、土壌中のナフタレンの分解の程度が異なることを見出した。さらに、これらの化合物の組み合わせ方によってもその効果が異なり、著しい相乗効果が得られる組み合わせが存在するとの知見を得た。
これらの事実は、上記の化合物によって土壌中の微生物によるナフタレン分解能力が向上したことを示しており、さらに化合物の組み合わせ方によっては、その効果をより顕著なものとし、土壌浄化に利用できる技術となりうることを示している。
【００１９】
そこで、本発明者らは、これらの化合物の組み合わせによる汚染土壌の浄化効果についてさらなる検討を行った。上述したように、多環芳香族炭化水素類は土壌汚染物質の中でも特に問題となっている。そこで、本発明者らは、土壌中に存在する微生物の多環芳香族炭化水素（以下、ＰＡＨと省略する場合がある）の分解に関わる酵素、ＰＡＨジオキシゲナーゼを定量することにより、上記化合物を組み合わせてなる薬剤が多環芳香族炭化水素類で汚染された土壌中で微生物の成長を促進させる効果を測定した。なお、土壌を汚染する多環芳香族炭化水素類としては後述する多種類のものを用いた。
【００２０】
その結果、実施例で詳述するように、アラニン及びアルギン酸塩を必須成分とし、さらに酸素源又は栄養剤の少なくとも一方を含有してなり、上記酸素源は硝酸根（ＮＯ3-）を含む化合物であり、上記栄養剤はリン酸根（ＰＯ43-）及びアンモニウム根（ＮＨ4+）を含む薬剤が、多環芳香族炭化水素類で汚染された土壌の浄化に用いる微生物の成長促進剤として優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
次に好ましい実施の形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
なお、本発明中において「部」又は「％」とあるのは、特に断りのない限り質量基準である。
【００２２】
本発明の多環芳香族炭化水素類で汚染された土壌の浄化に用いる微生物の成長促進剤は、アラニン及びアルギン酸塩を必須成分とする。アラニンとアルギン酸は微生物の成長促進物質であると考えられる。
【００２３】
上記微生物の成長促進剤の必須成分のアラニンは、アミノ酸の一種であり、市販のものを好適に使用することができる。
【００２４】
もう１つの必須成分のアルギン酸塩は、多糖の一種アルギン酸の塩である。アルギン酸は、褐藻の細胞壁から得られる天然物であり、β−Ｄ−マンヌロン酸とα−Ｌ−グルロン酸とからなるブロックコポリマーである。種々の重合度のアルギン酸塩が市販されているが、重合度が高いほど水に溶けにくく、また、水に溶かした際の粘性が増加して扱いにくくなるため、本発明の微生物の成長促進剤に使用する場合、重合度は５〜１，０００であることが好ましい。
【００２５】
アルギン酸塩の種類としては、アルギン酸ナトリウム及びアルギン酸カリウム等のアルカリ金属塩、アルギン酸マグネシウム及びアルギン酸カルシウム等のアルカリ土類金属塩、並びにアルギン酸アンモニウム等を挙げることができるがこれらに限定されない。水溶性の高さから、アルギン酸のアルカリ金属塩が本発明に好適に使用される。
【００２６】
本発明の微生物の成長促進剤が酸素源を含有する場合、当該酸素源は硝酸根（ＮＯ3-）を含む化合物に由来するものを使用することができる。このような化合物の例として硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウム、硝酸鉄及び硝酸アンモニウム等を挙げることができる。中でも、試薬コストが安価であるという理由から、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム又は硝酸アンモニウムを使用することが好ましい。
【００２７】
本発明の微生物の成長促進剤が栄養剤を含有する場合、当該栄養源はリン酸根（ＰＯ43-）及びアンモニウム根（ＮＨ4+）を含むものを使用する。リン酸根を含む化合物の例としては、リン酸三ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸三カルシウム、リン酸一水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸三アンモニウム及びリン酸二水素アンモニウム等を挙げることができる。中でも、試薬コストが安価であるという理由から、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸二水素カリウム又はリン酸二水素ナトリウムを使用することが好ましい。
【００２８】
一方アンモニウム根を含む化合物の例としては、硫酸アンモニウム、リン酸三アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及び塩化アンモニウム等を挙げることができる。中でも、試薬コストが安価であるという理由から、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム又はリン酸水素二アンモニウムを使用することが好ましい。
【００２９】
本発明の微生物の成長促進剤においては、アラニンの含有量をＡ、アルギン酸塩の含有量をＢとした場合に両者の比が、Ａ：Ｂ＝１００質量部：５〜５００質量部であることが好ましい。Ａ１００質量部に対し、Ｂが５質量部より少ない場合、アラニンとアルギン酸塩との相乗効果が弱くなる。同様に、Ａ１００質量部に対し、Ｂが５００質量部より多い場合も、アラニンとアルギン酸塩との相乗効果が弱くなり、好ましくない。
【００３０】
本発明の微生物の成長促進剤が、さらに酸素源として硝酸根を含む化合物を含有する場合、当該硝酸根（ＮＯ3-）の含有量Ｃは、Ａ１００質量部に対し、２，０００質量部以下であることが好ましく、５〜３００質量部であることがより好ましい。Ａ１００質量部に対し、Ｃを２，０００質量部より多くしても、更なる効果が認められず、経済性の点でも好ましくない。
【００３１】
本発明の微生物の成長促進剤が、さらに栄養剤としてリン酸根（ＰＯ43-）及びアンモニウム根（ＮＨ4+）を含有する場合、当該リン酸根の含有量Ｄは、Ａ１００質量部に対し、Ｄは３００質量部以下であることが好ましく、１０〜１００質量部であることがより好ましい。Ａ１００質量部に対し、Ｄを３００質量部より多くしても、更なる効果が認められず、経済性の点でも好ましくない。
【００３２】
一方、アンモニウム根の含有量Ｅは、Ａ１００質量部に対し、Ｅが６００質量部以下であることが好ましく、２０〜２００質量部であることがより好ましい。Ａ１００質量部に対し、Ｅを６００質量部より多くしても、更なる効果が認められず、経済性の点でも好ましくない。
本発明の微生物の成長促進剤は、アラニン、アルギン酸、硝酸根、リン酸根及びアンモニウム根の全てを含有する場合、これらの化合物の相乗効果により、特に顕著な微生物の成長促進効果を発揮することができる。
【００３３】
土壌汚染物質である多環芳香族炭化水素の例としては、ナフタレン、ビフェニレン、フルオレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン及びピレン等を挙げることができる。また、多環芳香族炭化水素の誘導体の例としては、トビアス酸及びβ−オキシナフトエ酸等を挙げることができる。
後述するように、本発明の微生物の成長促進剤は、少なくとも、ナフタレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、ピレン及びトビアス酸で汚染された土壌の浄化に好適に使用できることが確認された。
【００３４】
本発明の微生物の成長促進剤を用いて多環芳香族炭化水素類で汚染された土壌を浄化する場合、固体の粉末として土壌に散布してもよいが、水溶液としそれを土壌に適用するとより効果的である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
＜実験用土壌の調製＞
工場跡地から土壌を採取し、これを網目２ｍｍの篩にかけたものを実験用土壌とした。なお、実験用土壌の含水率は約２４％であった。
【００３７】
［実施例１］
＜微生物の成長促進剤の調製＞
酸素源、栄養剤及び微生物の成長促進物質を含む以下の組成の微生物の成長促進剤水溶液を調製した。
酸素源：硝酸ナトリウム１．０ｇ／Ｌ
栄養剤：リン酸三ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム０．５ｇ／Ｌ
成長促進物質：アラニン０．５ｇ／Ｌ、アルギン酸ナトリウム０．５ｇ／Ｌ
なお、アルギン酸ナトリウムは、ナカライテスク株式会社製（商品コード：31130-95、重合度約４５０）を使用した。
【００３８】
＜土壌試料の調製＞
１００ｍｌ容のガラス製バイアル瓶に実験用土壌１０ｇを入れ、それに上記成長促進剤水溶液を１００ｍｌ添加した。次いで、土壌汚染物質としてナフタレン１００μｌを添加し、その後、ゴム栓とアルミシールにて蓋をし、土壌を十分に撹拌して、土壌試料を調製した。
【００３９】
＜ＤＮＡ試料の抽出＞
土壌試料を２９℃に保ったインキュベーターに入れ、１ヵ月静置した後、１ｇの土壌試料からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ試料を得た。なお、ＤＮＡの抽出には、土壌ＤＮＡ抽出キット  ＩＳＯＩＬ（株式会社ニッポンジーン）を用いた。
上記ＤＮＡ試料の吸光度から、試料中のＤＮＡ量を求めたところ、０．７２μｇであった。
【００４０】
＜ＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子の定量＞
次に、上記ＤＮＡ試料に含まれるＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子の数をリアルタイムＰＣＲ法により求めた。すなわち、既知量のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子についてＰＣＲを行いながら、増幅過程の蛍光強度値を測定し、補正蛍光強度値を得（図５）、そのデータに基づいて検量線を作成した（図６）。次いで、上記ＤＮＡ試料についても同様にＰＣＲを行いながら蛍光強度値を測定し、検量線からＤＮＡ試料に含まれるＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子の数を求めた。
【００４１】
上記リアルタイムＰＣＲ法では、ＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子に特異的な配列に対するプライマーを用いた。フォワードプライマーとしては以下の配列
配列番号１：５’−ＴＧＹＣＧＢＣＡＹＣＧＢＧＧＳＡＷＧ−３’
を持つものを使用し、リバースプライマーとしては、
配列番号２：５’−ＣＣＡＧＣＣＧＴＲＲＴＡＲＳＴＧＣＡ−３’
を持つものを使用した。プライマーＤＮＡ鎖の合成は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。
なお、上記配列中、ＹはＣ又はＴを意味し、ＢはＧ、Ｃ又はＴを意味し、ＳはＧ又はＣを意味し、ＷはＡ又はＴを意味し、ＲはＧ又はＡを意味する。
【００４２】
リアルタイムＰＣＲ法に用いた反応溶液は、以下の組成の試薬を蒸留水で５０μｌにメスアップして調製した。
・SYBR(R) Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(2×)(TaKaRa Ex Taq HS、dNTP混合物、Mg2+及びSYBR Green Iを含む；タカラバイオ社)：２５μｌ
・既知量のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子
・フォワードプライマー（配列番号１）：２０ｐｍｏｌ
・リバースプライマー（配列番号２）：２０ｐｍｏｌ
【００４３】
なお、上記反応溶液として、ＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子を含まないもの、並びに、ＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子を１０コピー、１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピー及び１０6コピー含む反応溶液をそれぞれ２つずつ調製し、検量線作成のためのリアルタイムＰＣＲに使用した。
【００４４】
ＰＣＲは、以下の（１）熱変性工程の後、工程（２）〜（４）を６０サイクル行い、最後に（５）の伸長工程を行った。蛍光強度は、（３）のアニーリング工程において励起波長４９４ｎｍ、検出波長５２１ｎｍを用いて測定した。
（１）熱変性工程：９５℃、１２０秒間
（２）熱変性工程：９５℃、４５秒間
（３）アニーリング工程：５５℃、６０秒間
（４）伸長工程：７２℃、４５秒間
（５）伸長工程：７２℃、４５秒間
ＰＣＲ反応のサーマルサイクラーは、iCycler（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社）を使用した。
【００４５】
ＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子を含む６種の反応溶液について得られた蛍光強度値からＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子を含まない反応溶液の蛍光強度値を引いて、補正蛍光強度値を求めた。すなわち、補正蛍光強度値は、以下の式１から求められる。
［式１］
補正蛍光強度値＝ＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子を含む反応溶液の蛍光強度値−ＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子を含まない反応溶液の蛍光強度値
【００４６】
ＰＣＲのサイクル数を横軸としたグラフに、補正蛍光強度値をプロットした図を図５に示す。
ここで、補正蛍光強度値が０．５となるＰＣＲのサイクル数を各反応溶液のＣｔ値(Threshold Cycle)とし、上記６種の反応溶液についてＣｔ値の平均値を求めた。各溶液中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を縦軸とした片対数グラフに当該Ｃｔ値の平均値をプロットし、最小二乗法により検量線を作成した。この結果、Ｒ2＝０．９９９１の非常に相関のよい検量線が得られた。この図を図６に示す。
【００４７】
次に、前記ＰＣＲ反応溶液中、既知量のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子に代えて前記土壌試料から得たＤＮＡ試料を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を求めた。このＣｔ値を上記検量線に当てはめ、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に実施例及び比較例の結果を評価したものを表２に示す。表２より、本発明の微生物の成長促進剤を使用することにより、多環芳香族炭化水素類で汚染された土壌中の微生物のＰＡＨジオキシゲナーゼの遺伝子数が増加し、土壌中の多環芳香族炭化水素類の分解が促進されることが理解される。
また、表１より、本発明の微生物の成長促進剤は、アラニン、アルギン酸、硝酸根、リン酸根及びアンモニウム根を含有する場合、これらの化合物の相乗効果により、特に顕著な微生物の成長促進効果を発揮することが明らかとなった。
【００４８】
［実施例２］
微生物の成長促進剤として、酸素源及び成長促進物質のみを用いたこと以外は、実施例１と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を求めた。算出したコピー数を表１に示し、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。
【００４９】
［実施例３］
微生物の成長促進剤として、栄養剤及び成長促進物質のみを用いたこと以外は、実施例１と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を求めた。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。
【００５０】
［比較例１］
微生物の成長促進剤を使用しなかったこと以外は、実施例１と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。
【００５１】
［比較例２］
微生物の成長促進剤として、酸素源のみを用いたこと以外は、実施例１と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。
【００５２】
［比較例３］
微生物の成長促進剤として、栄養剤のみを用いたこと以外は、実施例１と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を求めた。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。
【００５３】
［比較例４］
微生物の成長促進剤として、成長促進物質のみを用いたこと以外は、実施例１と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を求めた。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。
【００５４】
［比較例５］
微生物の成長促進剤として、酸素源及び栄養剤のみを用いたこと以外は、実施例１と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を求めた。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。
【００５５】
［実施例４〜６］
土壌汚染物質としてナフタレンの代わりにフェナントレンを使用したこと以外は、それぞれ実施例１〜３と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。表２より、本発明の微生物の成長促進剤を使用することにより、土壌中の微生物のＰＡＨジオキシゲナーゼの遺伝子数が増加し、土壌中の多環芳香族炭化水素類の分解が促進されることが理解される。
また、表１より、本発明の微生物の成長促進剤は、アラニン、アルギン酸、硝酸根、リン酸根及びアンモニウム根を含有する場合、これらの化合物の相乗効果により、特に顕著な微生物の成長促進効果を発揮することが明らかとなった。
【００５６】
［比較例６〜１０］
土壌汚染物質としてナフタレンの代わりにフェナントレンを使用したこと以外は、それぞれ比較例１〜５と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。
【００５７】
［実施例７〜９］
土壌汚染物質としてナフタレンの代わりにアントラセンを使用したこと以外は、それぞれ実施例１〜３と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。表２より、本発明の微生物の成長促進剤を使用することにより、土壌中の微生物のＰＡＨジオキシゲナーゼの遺伝子数が増加し、土壌中の多環芳香族炭化水素類の分解が促進されることが理解される。
また、表１より、本発明の微生物の成長促進剤は、アラニン、アルギン酸、硝酸根、リン酸根及びアンモニウム根を含有する場合、これらの化合物の相乗効果により、特に顕著な微生物の成長促進効果を発揮することが明らかとなった。
【００５８】
［比較例１１〜１５］
土壌汚染物質としてナフタレンの代わりにアントラセンを使用したこと以外は、それぞれ比較例１〜５と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。
【００５９】
［実施例１０〜１２］
土壌汚染物質としてナフタレンの代わりにフルオランテンを使用したこと以外は、それぞれ実施例１〜３と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。表２より、本発明の微生物の成長促進剤を使用することにより、土壌中の微生物のＰＡＨジオキシゲナーゼの遺伝子数が増加し、土壌中の多環芳香族炭化水素類の分解が促進されることが理解される。
また、表１より、本発明の微生物の成長促進剤は、アラニン、アルギン酸、硝酸根、リン酸根及びアンモニウム根を含有する場合、これらの化合物の相乗効果により、特に顕著な微生物の成長促進効果を発揮することが明らかとなった。
【００６０】
［比較例１６〜２０］
土壌汚染物質としてナフタレンの代わりにフルオランテンを使用したこと以外は、それぞれ比較例１〜５と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。
【００６１】
［実施例１３］
土壌汚染物質としてナフタレンの代わりにピレンを使用したこと以外は、それぞれ実施例１と同様にして、それぞれ土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。表２より、本発明の微生物の成長促進剤を使用することにより、土壌中の微生物のＰＡＨジオキシゲナーゼの遺伝子数が増加し、土壌中の多環芳香族炭化水素類の分解が促進されることが理解される。
また、表１より、本発明の微生物の成長促進剤は、アラニン、アルギン酸、硝酸根、リン酸根及びアンモニウム根を含有する場合、これらの化合物の相乗効果により、特に顕著な微生物の成長促進効果を発揮することが明らかとなった。
【００６２】
＜Ｔ−ＲＦＬＰ解析＞
次に、本発明の微生物の成長促進剤を使用した後の土壌中の優先菌種を同定するため、実施例１３のＤＮＡ試料についてＴ−ＲＦＬＰ法（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism；制限酵素末端断片長解析）による解析を行った。まず、以下の手順でＤＮＡ試料をＰＣＲ増幅し、それを制限酵素処理した。
【００６３】
１６ＳｒＲＮＡのＰＣＲ増幅に用いるフォワードプライマーは、以下の配列
配列番号３：５’−ＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
を持ち、５’末端をＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬでラベルしたプライマー（プライマー３）を使用し、リバースプライマーとしては以下の配列
配列番号４：５’−ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧ−３’
を持つ非標識のプライマー（プライマー４）を使用した。なお、プライマーＤＮＡ鎖の合成は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。
【００６４】
ＰＣＲ増幅に用いた反応溶液は、以下の組成の試薬を蒸留水で５０μｌにメスアップして調製した。
・SYBR(R) Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(2×)(TaKaRa Ex Taq HS、dNTP混合物、Mg2+及びSYBR Green Iを含む；タカラバイオ社)：２５μｌ
・ＤＮＡ試料：２μｌ
・フォワードプライマー（プライマー３）：２０ｐｍｏｌ
・リバースプライマー（プライマー４）：２０ｐｍｏｌ
【００６５】
ＰＣＲは、以下の（１）熱変性工程の後、工程（２）〜（４）を６０サイクル行い、最後に（５）の伸長工程を行った。
（１）熱変性工程：９５℃、１２０秒間
（２）熱変性工程：９５℃、４５秒間
（３）アニーリング工程：５５℃、６０秒間
（４）伸長工程：７２℃、４５秒間
（５）伸長工程：７２℃、４５秒間
ＰＣＲ反応のサーマルサイクラーは、iCycler（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社）を使用した。
【００６６】
ＰＣＲ反応終了後のＰＣＲ産物をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−100を用いて精製した後、制限酵素ＨｈａＩ（Ｔａｋａｒａ社製）を作用させた。制限酵素反応終了後、９７℃で４分間の変性処理を行い、電気泳動に用いるまで４℃にて保存した。
【００６７】
次いで、制限酵素処理産物を、キャピラリーＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製ＰＲＩＳＭ３１００−Ａｖａｎｔ）で電気泳動し、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（登録商標）ソフトウェアを用いてＴ−ＲＦＬＰ解析を行った。解析結果を図７に示す。この解析結果から、本発明の微生物の成長促進剤を使用した後の土壌中の優先菌種は、シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＳＡ１株に近縁な微生物種であり、フラボバクテリウム（Flavobacterium）sp. Rud11株に近縁な微生物種がそれに次ぐことが明らかとなった。なお、図中の「ｓｉｚｅ」は制限酵素処理産物の塩基長を示し、「ａｒｅａ」は当該制限酵素処理産物の存在量を示す。
【００６８】
［実施例１４、１５］
土壌汚染物質としてナフタレンの代わりにピレンを使用したこと以外は、それぞれ実施例２及び３と同様にして、それぞれ土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。表２より、本発明の微生物の成長促進剤を使用することにより、土壌中の微生物のＰＡＨジオキシゲナーゼの遺伝子数が増加し、土壌中の多環芳香族炭化水素類の分解が促進されることが理解される。
【００６９】
［比較例２１〜２５］
土壌汚染物質としてナフタレンの代わりにピレンを使用したこと以外は、それぞれ比較例１〜５と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。
【００７０】
［実施例１６〜１８］
土壌汚染物質としてナフタレンの代わりにトビアス酸を使用したこと以外は、それぞれ実施例１〜３と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。表２より、本発明の微生物の成長促進剤を使用することにより、土壌中の微生物のＰＡＨジオキシゲナーゼの遺伝子数が増加し、土壌中の多環芳香族炭化水素類の分解が促進されることが理解される。
また、表１より、本発明の微生物の成長促進剤は、アラニン、アルギン酸、硝酸根、リン酸根及びアンモニウム根を含有する場合、これらの化合物の相乗効果により、特に顕著な微生物の成長促進効果を発揮することが明らかとなった。
【００７１】
［比較例２６〜３０］
土壌汚染物質としてナフタレンの代わりにトビアス酸を使用したこと以外は、それぞれ比較例１〜５と同様にして土壌試料及びＤＮＡ試料を調製し、試料中のＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子のコピー数を算出した。算出したコピー数を表１に、このコピー数を基に行った評価結果を表２に示す。
【００７２】
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【００７３】
2009197120.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明によれば、多環芳香族炭化水素類で汚染された土壌を安価に、かつ容易に浄化できる微生物の成長促進剤が提供される。また、この微生物の成長促進剤を用いることにより、多環芳香族炭化水素類で汚染された土壌を安価に、かつ容易に浄化できる土壌浄化方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】アルギン酸ナトリウムを添加した土壌でのナフタレンの分解量を示すグラフである。
【図２】アラニンを添加した土壌でのナフタレンの分解量を示すグラフである。
【図３】リン酸二水素カリウムを添加した土壌でのナフタレンの分解量を示すグラフである。
【図４】硫酸アンモニウムを添加した土壌でのナフタレンの分解量を示すグラフである。
【図５】検量線作成のため、既知量のＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、得られた補正蛍光強度値を示す。
【図６】リアルタイムＰＣＲでＰＡＨジオキシゲナーゼ遺伝子を定量するための検量線を示す。
【図７】実施例１３の土壌試料についてのＴ−ＲＦＬＰ解析の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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