(57)【要約】【課題】感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおける免疫応答は誘導しないが、ヒトでない哺乳類における免疫応答を誘導するウイルスタンパク質の中和領域を同定する方法の提供。【解決手段】（ａ）ＨＩＶ株のリゼートからＨＩＶタンパク質を抽出すること；（ｂ）該抽出物でヒトでない動物を免疫すること；（ｃ）該免疫した哺乳類から抗血清を得ること；（ｄ）ヒトＨＩＶ抗血清との競合イムノアッセイにおいて該抗血清を使用し、該抗血清によって認識されるが該ヒト抗血清中の抗体によっては認識されないＨＩＶタンパク質の領域を同定すること；および（ｅ）該領域が中和または不活化領域である領域を決定することを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導するＨＩＶタンパク質の中和または不活化領域を同定する方法であって、
（ａ）ＨＩＶ株のリゼートからＨＩＶタンパク質を抽出すること；
（ｂ）該抽出物でヒトでない動物を免疫すること；
（ｃ）該免疫した哺乳類から抗血清を得ること；
（ｄ）ヒトＨＩＶ抗血清との競合イムノアッセイにおいて該抗血清を使用し、該抗血清によって認識されるが該ヒト抗血清中の抗体によっては認識されないＨＩＶタンパク質の領域を同定すること；および
（ｅ）該領域が中和または不活化領域である領域を決定すること
を含む、ヒトにおける免疫応答は誘導しないが、ヒトでない哺乳類における免疫応答を誘導するウイルスタンパク質の中和領域を同定する方法。
【請求項２】
該中和または不活化領域が、ＨＩＶ単離物ＨＩＶ１SF2のタンパク質の以下の領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）逆転写酵素ｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜アミノ酸残基２９５の領域；
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域
の１つを含むまたはそれに対してホモローガスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導するＨＩＶタンパク質の中和または不活化領域上のエピトープと反応する抗体を得るための方法であって、
（ａ）ＨＩＶ単離物のリゼートからタンパク質を単離すること；
（ｂ）感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導する中和または不活化領域のアミノ酸配列に対応するまたは模擬するアミノ酸配列を有する該タンパク質の少なくとも1つのエピトープを同定すること；
（ｃ）該タンパク質を生理学的に許容し得る担体と合わせること；
（ｄ）該タンパク質および担体によりヒトでない哺乳類を免疫すること；および
（ｅ）該免疫した宿主から該エピトープに対する抗体を得ること
を含む方法。
【請求項４】
該リゼートが処理によりＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ抗原が除去されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該生理学担体と合わせる前に該タンパク質が脱グリコシル化されている、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
該エピトープのアミノ酸配列が、ヒトタンパク質アミノ酸配列の一部に対応するかまたは模擬している、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
生理学的に許容し得る担体と合わせる前に該タンパク質がアジュバントと結合している、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
該アジュバントが巨大分子担体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該巨大分子担体がムラミルジペプチドの多重反復を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該ムラミルジペプチドの多重反復がＬ−アラニン−Ｄ−イソグルタミンの末端ジペプチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該タンパク質が、１を超える中和または不活化領域に対応するかまたは模擬するエピトープを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
該中和または不活化領域がエンベロープ糖タンパクまたは膜貫通タンパク質の一部を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
該中和または不活化領域の少なくとも１つがエンベロープ糖タンパクまたは膜貫通タンパク質の一部を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
プロテアーゼｐ１０の領域を中和または不活化する領域をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該エピトープが以下の領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）逆転写酵素ｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜アミノ酸残基２９５の領域；
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域
を含むＨＩＶ１SF2のエピトープ領域に対応するかまたは模擬する、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
該タンパク質が1を超える中和または不活化領域に対応するまたは模擬するエピトープを含み、該エピトープが、ＨＩＶ１SF2の該エピトープ領域の２またはそれ以上に対応するまたは模擬する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該タンパク質が該エピトープに富む、請求項３または１１に記載の方法。
【請求項１８】
該エピトープが、いずれかの２つのエピトープ間で約１：１〜最大１０：１の量の比率で存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
ＨＩＶタンパク質の中和または不活化領域上のエピトープと反応する抗体を得る方法であって、
（ａ）、ＨＩＶタンパク質の中和または不活化領域であって、感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導する領域上のエピトープに対応するかまたは模擬するアミノ酸配列を有するペプチドを合成すること；
（ｂ）該ペプチドを生理学的に許容し得る担体と合わせること；
（ｃ）ヒトでない哺乳類を該ペプチドおよび担体で免疫すること；および
（ｄ）該エピトープに対する抗体を該免疫した宿主から得ること
を含む方法。
【請求項２０】
該ペプチドがヒトタンパク質アミノ酸配列の一部を模擬するアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生理学的に許容し得る担体と合わせる前に該ペプチドがアジュバントと結合している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
該アジュバントが巨大分子担体を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
該巨大分子担体がムラミルジペプチドの多重反復を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該ムラミルジペプチドの多重反復がＬ−アラニン−Ｄ−イソグルタミンの末端ジペプチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ペプチドの混合物を含み、そのペプチドがそれぞれ、ＨＩＶタンパク質の中和または不活化領域であって、感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導する領域上のエピトープに対応するまたは模擬するアミノ酸配列を有している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
該ペプチドが、エンベロープ糖タンパク質または膜貫通タンパク質の一部を含む中和または不活化領域に対応するまたは模擬するアミノ酸配列を有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも1つのペプチドが、エンベロープ糖タンパク質または膜貫通タンパク質の一部を含む中和または不活化領域に対応するかまたは模擬するアミノ酸配列を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
プロテアーゼｐ１０の中和または不活化領域に対応するまたは模擬するアミノ酸配列を有するペプチドをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該ペプチドのアミノ酸配列が、以下の領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）逆転写酵素ｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜アミノ酸残基２９５の領域；
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域
を含む、ＨＩＶ１SF2のタンパク質の中和または不活化領域上のエピトープのアミノ酸配列に、対応するまたは模擬する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
該ペプチドが、ＨＩＶ１SF2タンパク質の中和または不活化領域であって、以下の領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）逆転写酵素ｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜アミノ酸残基２９５の領域；
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域
を含む領域上の、少なくとも２つのエピトープのアミノ酸配列に対応または模擬する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
いずれかの２つのペプチドの量が、約１：１〜最大１０：１の比率で該ペプチドが存在している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
ＨＩＶタンパク質の中和または不活化エピトープ領域であって、感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しない領域上のエピトープに対応するまたは認識するエピトープを認識しそれと反応する抗体。
【請求項３３】
該エピトープが、ヒトタンパク質アミノ酸配列の一部またはニューロトキシンタンパク質アミノ酸配列に対応し、または免疫学的に模擬するアミノ酸配列を有する、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３４】
該タンパク質が炭水化物を減少させたエンベロープ前駆体ｇｐ１６０、ｇｐ１２０糖タンパク質またはｇｐ４１膜貫通糖タンパク質を含む、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３５】
該タンパク質が、炭水化物を減少させたｇａｇ前駆体ｐ５５または開裂したｇａｇ産物ｐ１７、ｐ２４またはｐ７を含む、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３６】
該タンパク質が炭水化物を減少させたプロテアーゼｐ１０または逆転写酵素ヘテロダイマーｐ６６／５５を含む、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３７】
該ヒトタンパク質がアルファフェトプロテイン、アスパルチルプロテアーゼ、デオキシウリシン５'−三リン酸ヌクレオチドヒドロラーゼ、好酸球陽イオン性タンパク質、好酸球由来ニューロトキシンを含む、請求項３３に記載の抗体。
【請求項３８】
該抗体がＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）逆転写酵素ｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜アミノ酸残基２９５の領域；
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域
の１つにおけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識する、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３９】
少なくとも2つの抗体であって、そのそれぞれが、ＨＩＶタンパク質の中和または不活化エピトープ領域であって、その領域が感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しない領域上のエピトープに対応するまたは認識するエピトープを認識しそれと反応する抗体の組み合わせ。
【請求項４０】
該抗体のそれぞれが、ヒトタンパク質アミノ酸配列の一部またはニューロトキシンタンパク質アミノ酸配列に対応しまたは免疫学的に模擬するアミノ酸配列を有するエピトープを認識しそれと反応する、請求項３９に記載の抗体の組み合わせ。
【請求項４１】
該抗体の少なくとも１つが、炭水化物を減少させたエンベロープ前駆体ｇｐ１６０、ｇｐ１２０糖タンパク質またはｇｐ４１膜貫通糖タンパク質の中和または不活化領域上のエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識しそれと反応する、請求項３９に記載の抗体の組み合わせ。
【請求項４２】
該抗体の少なくとも１つが炭水化物を減少させたｇａｇ前駆体ｐ５５または開裂したｇａｇ産物ｐ１７、ｐ２４またはｐ７の中和または不活化領域上のエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識しそれと反応する、請求項３９に記載の抗体の組み合わせ。
【請求項４３】
該抗体の少なくとも１つが炭水化物を減少させたプロテアーゼｐ１０または逆転写酵素へテロダイマーｐ６６／５５の中和または不活化領域上のエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識しそれと反応する、請求項３９に記載の抗体の組み合わせ。
【請求項４４】
該ヒトタンパク質が、アルファフェトプロテイン、アスパルチルプロテアーゼ、デオキシウリシン５'−三リン酸ヌクレオチドヒドロラーゼ、好酸球陽イオン性タンパク質または好酸球由来ニューロトキシンを含む、請求項４０に記載の抗体の組み合わせ。
【請求項４５】
該この少なくとも１つがＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）逆転写酵素ｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜アミノ酸残基２９５の領域；
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域
の１つにおけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識する、請求項３９に記載の抗体の組み合わせ。
【請求項４６】
ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
のそれぞれにおけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識する抗体を含む、請求項４５に記載の抗体の組み合わせ。
【請求項４７】
ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域
のそれぞれにおけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識する抗体を含む、請求項４５に記載の抗体の組み合わせ。
【請求項４８】
ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
およびＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域
のうちの少なくとも1つのそれぞれにおけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識する抗体を含む、請求項４５に記載の抗体の組み合わせ。
【請求項４９】
ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）逆転写酵素ｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜アミノ酸残基２９５の領域；
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域
におけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識する、請求項３９に記載の抗体の組み合わせ。
【請求項５０】
請求項４５に記載の抗体の組み合わせを薬学的に許容し得る担体中に含む組成物。
【請求項５１】
請求項４６に記載の抗体の組み合わせを薬学的に許容し得る担体中に含む組成物。
【請求項５２】
請求項４７に記載の抗体の組み合わせを薬学的に許容し得る担体中に含む組成物。
【請求項５３】
請求項４８に記載の抗体の組み合わせを薬学的に許容し得る担体中に含む組成物。
【請求項５４】
請求項４９に記載の抗体の組み合わせを薬学的に許容し得る担体中に含む組成物。
【請求項５５】
トキシンまたは放射性物質に結合している、請求項３２に記載の抗体。
【請求項５６】
ヒトＴ細胞活性化因子によって凝集する、請求項３２に記載の抗体。
【請求項５７】
３'−アジド−３'−デオキシチミジン、２'，３'−ジデオキシシチジン、２'，３'−ジデオキシ−２'，３'−ジデヒドロシチジンと組み合わせて請求項３２に記載の抗体を含む組成物。
【請求項５８】
薬学的に許容し得る担体と組み合わせて請求項１に記載のタンパク質を含む組成物。
【請求項５９】
該タンパク質が巨大分子担体にカップリングしている、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
該担体がムラミルジペプチドの微粒子である、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６１】
薬担体とともに１またはそれ以上の請求項１９の合成ペプチドを含む組成物。
【請求項６２】
該ペプチドが巨大分子担体とカップリングしている、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
該担体がムラミルジペプチドの巨大分子である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
ウイルスに感染したヒトにおいてＨＩＶの感染を阻止する方法であって、タンパク質の中和または不活化領域であってその領域かヒトにおける免疫応答を誘導しない領域におけるエピトープに、対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する１またはそれ以上の抗体を含む組成物の、治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。
【請求項６５】
該エピトープが、感染または周囲への曝露に遭遇したときに、ヒトのアミノ酸配列の一部に対応するかまたは免疫学的に模擬するアミノ鎖配列を有している、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
該タンパク質が、炭水化物を減少させたエンベロープゼ前駆体ｇｐ１６０、ｇｐ１２０糖タンパク質またはｇｐ４１膜貫通を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
該タンパク質が炭水化物を減少させたｇａｇ前駆体ｐ５５または開裂ｇａｇ産物ｐ１７、ｐ２４またはｐ７を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
該タンパク質が炭水化物を減少させたプロテアーゼｐ１０または逆転写酵素ヘテロダイマーｐ６６／５５を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
該抗体を約０．１〜約２００ｍg／ｋｇ患者体重の日用量で投与する、請求項６４に記載の組成物。
【請求項７０】
抗体の組み合わせを投与し、該抗体それぞれのもう１つの他の抗体の用量に対する比率が１０倍を超えない、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
該抗体それぞれの、もう１つ他の抗体の用量に対する比率が約１：１である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
該抗体が巨大分子担体に結合している、請求項６４に記載の組成物。
【請求項７３】
該担体がムラミルジペプチドである、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）逆転写酵素ｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜アミノ酸残基２９５の領域；
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域
の１つにおけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識する、請求項６４に記載の方法。
【請求項７５】
少なくとも２つの抗体を投与し、該抗体のそれぞれが、ＨＩＶタンパク質の中和または不活化領域であって感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないその領域におけるエピトープに、対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する、請求項６４に記載の方法。
【請求項７６】
該抗体の少なくとも１つが、炭水化物を減少させたエンベロープ前駆体ｇｐ１６０、ｇｐ１２０糖タンパク質またはｇｐ４１膜貫通の中和または不活化領域におけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する、請求項６４に記載の方法。
【請求項７７】
該抗体の少なくとも１つが、炭水化物を減少させたｇａｇ前駆体ｐ５５または開裂ｇａｇ産物ｐ１７、ｐ２４またはｐ７の中和または不活化領域におけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
該抗体の少なくとも１つが、炭水化物を減少させたプロテアーゼｐ１０または逆転写酵素ヘテロダイマーｐ６６／５５の中和または不活化領域におけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）逆転写酵素ｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜アミノ酸残基２９５の領域；
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域
のそれぞれに由来するエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する抗体を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
ウイルスに感染した患者においてＨＩＶのライフサイクルにおける必須の段階を中和または不活化するための方法であって、そのそれぞれが、ヒトにおける免疫応答を誘導しないＨＩＶタンパク質の中和または不活化領域におけるエピトープに、対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する１またはそれ以上の抗体を含む組成物の、治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。
【請求項８１】
該エピトープ領域がヒトタンパク質アミノ酸配列の一部に対応するまたは免疫学的に模擬するアミノ酸配列を有する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
該抗体が、ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）逆転写酵素ｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜アミノ酸残基２９５の領域；
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域
の１つにおけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
少なくとも２つの抗体を投与し、該抗体のそれぞれが、感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないＨＩＶタンパク質の中和または不活化領域におけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域
のそれぞれに由来するエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する抗体を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域
のそれぞれに由来するエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する抗体を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）逆転写酵素ｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜アミノ酸残基２９５の領域；
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域のそれぞれに由来するエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する抗体を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８７】
該抗体が巨大分子担体に結合している、請求項８０に記載の方法。
【請求項８８】
該担体がムラミルジペプチド微粒子である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
ＨＩＶに曝露した患者においてＨＩＶ感染を阻止する方法であって、感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおける免疫応答を誘導しないＨＩＶタンパク質の中和または不活化領域におけるエピトープに、対応するまたは模擬するエピトープをそのそれぞれが認識し反応する１またはそれ以上の抗体を含む組成物の、治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。
【請求項９０】
該エピトープが、ヒトタンパク質のアミノ酸配列の一部に対応するかまたは免疫学的に模擬するアミノ鎖配列を有している、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
該抗体が、ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）逆転写酵素ｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜アミノ酸残基２９５の領域；
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域
の１つにおけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
少なくとも２つの抗体を投与し、該抗体のそれぞれが、ヒトにおいて免疫応答を誘導しないＨＩＶタンパク質の中和または不活化領域におけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域
のそれぞれに由来するエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する抗体を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域
のそれぞれに由来するエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する抗体を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
ＨＩＶ単離物ＨＩＶＳＦ２の以下の中和または不活化領域：
（ａ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基４〜アミノ酸残基２７の領域；
（ｂ）ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸残基５４〜アミノ酸残基７６の領域；
（ｃ）ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜アミノ酸残基５４１の領域；
（ｄ）逆転写酵素ｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜アミノ酸残基２９５の領域；
（ｅ）プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜アミノ酸残基９４の領域；
（ｆ）ｇａｇタンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜アミノ酸残基１８１の領域；
（ｇ）ｇａｇタンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜アミノ酸残基４１０およびアミノ酸残基４３８〜４４３の領域；
（ｈ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２３の領域；または
（ｉ）ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基８９〜アミノ酸残基１２２の領域のそれぞれに由来するエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する抗体を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
ＨＩＶに感染したかもしれない人に由来する生物学的流体試料におけるＨＩＶの存在を検出する方法であって、該抗体を抗体複合体形成を誘導する条件下でその人に由来する体液試料と合わせ、該抗体がＨＩＶ抗原に結合するかどうかについて測定する抗体抗原アッセイにおいて、請求項３２に記載の抗体を使用することを含む方法。
【請求項９７】
ＨＩＶに感染したかもしれない人におけるＨＩＶの存在を検出する方法であって、抗体を酵素に結合し、抗体複合体形成を誘導する条件下でその人に由来する体液試料と接触させ、該抗体がＨＩＶ抗原に結合するかどうかについて測定するエンザイムイムノアッセイにおいて、請求項３２に記載の抗体を使用することを含む方法。
【請求項９８】
タンパク質溶液に由来するＨＩＶタンパク質の中和または不活化領域のエピトープに対応するまたは模擬する少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質を精製する方法であって、請求項３２に記載の抗体を基質または固体の支持体に固定化し、該固定化した抗体と該タンパク質を含む溶液とを、該抗体と該タンパク質との間の免疫複合体の形成に適当な条件下で接触させ、結合しなかったタンパク質を該抗体に結合したタンパク質から分離し、該結合したタンパク質を該抗体から溶出し、該タンパク質を回収することを含む方法。
【請求項９９】
処理によりウイルスリゼートに存在するヒトＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ抗原を除去した該ウイルスリゼートから単離されたウイルスタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が脱グリコシル化され、該タンパク質が感染環境の曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類の種の少なくとも１つにおいて免疫応答を誘導する少なくとも１つのエピトープ領域を含む組成物。
【請求項１００】
該エピトープ領域が、該ウイルスタンパク質の中和または不活化領域を含む、請求項９９に記載の組成物。
【請求項１０１】
該エピトープ領域がヒトタンパク質アミノ酸配列の一部に対応するまたは免疫学的に模擬するアミノ酸配列を有する、請求項９９に記載の組成物。
【請求項１０２】
該タンパク質が巨大分子担体にカップリングしている、請求項９９に記載の組成物。
【請求項１０３】
該担体がムラミルジペプチド微粒子である、請求項１０２に記載の組成物。
【請求項１０４】
該ムラミルジペプチドがＬ−アラニン−Ｄ−イソグルタミンの末端ジペプチドを含む、請求項１０２に記載の組成物。
【請求項１０５】
ウイルスタンパク質の中和または不活化領域に対応するまたは模擬するエピトープ領域を含む合成ペプチドを含む組成物であって、該ペプチドが、感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類の種の少なくとも１つにおいて免疫応答を誘導する組成物。
【請求項１０６】
該エピトープ領域がヒトタンパク質アミノ酸配列の一部に対応するまたは免疫学的に模擬するアミノ酸配列を有する、請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１０７】
該タンパク質が巨大分子担体にカップリングしている、請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１０８】
該担体がムラミルジペプチド微粒子である、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１０９】
該ムラミルジペプチドがＬ−アラニン−Ｄ−イソグルタミンの末端ジペプチドを含む、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１１０】
感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導するウイルスタンパク質の中和または不活化領域を同定する方法であって、
（ａ）ウイルスリゼートからウイルスタンパク質を抽出すること；
（ｂ）該抽出物でヒトでない動物を免疫すること；
（ｃ）該免疫した哺乳類から抗血清を得ること；
（ｄ）ヒトウイルス抗血清との競合イムノアッセイにおいて該抗血清を使用し、該抗血清中の抗体によって認識されるが該ヒト血清中の抗体によっては認識されないウイルスタンパク質の領域を同定すること；および
（ｅ）該領域が中和または不活化領域である領域を決定すること
を含む方法。
【請求項１１１】
感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導するタンパク質の中和または不活化領域上のエピトープと反応する抗体を得るための方法であって、
（ａ）ウイルスリゼートからタンパク質を単離すること；
（ｂ）ヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導する中和または不活化領域のアミノ酸配列に対応するまたは模擬するアミノ酸配列を有する該タンパク質の少なくとも１つのエピトープを同定すること；
（ｃ）該タンパク質を生理学的に許容し得る担体と合わせること；
（ｄ）該タンパク質および担体によりヒトでない哺乳類を免疫すること；および
（ｅ）該免疫した宿主から該エピトープに対する抗体を得ること
を含む方法。
【請求項１１２】
該生理学担体と合わせる前に、該タンパク質に処理を施してＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ抗原を除去し、炭水化物を除去する、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
該生理学担体と合わせる前に、該タンパク質をムラミルジペプチドを含む巨大分子担体に結合させる、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導するウイルスタンパク質の中和または不活化領域上のエピトープと反応する抗体を得る方法であって、
（ａ）ヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導するウイルスタンパク質の中和または不活化領域におけるエピトープに対応するかまたは模擬するアミノ酸配列を有するペプチドを合成すること；
（ｂ）該ペプチドを生理学的に許容し得る担体と合わせること；
（ｃ）ヒトでない哺乳類宿主を該ペプチドおよび担体で免疫すること；および
（ｄ）該エピトープに対する抗体を該免疫した宿主から得ること
を含む方法。
【請求項１１５】
該生理学担体と合わせる前に、該タンパク質に処理を施してＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ抗原を除去し、炭水化物を除去する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
該生理学担体と合わせる前に、該タンパク質をムラミルジペプチドを含む巨大分子担体に結合させる、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
ウイルスタンパク質の中和または不活化エピトープ領域であって、感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導する領域におけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する抗体。
【請求項１１８】
少なくとも２つの抗体の組み合わせであって、そのそれぞれが、ウイルスタンパク質の中和または不活化エピトープ領域であって感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導する領域におけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する組み合わせ。
【請求項１１９】
ウイルスに感染した人においてウイルス感染を阻害する方法であって、１またはそれ以上の抗体を含む組成物であってそれぞれの抗体が感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないがヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導するウイルスタンパク質の中和または不活化エピトープ領域におけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する組成物の治療上有効な量を、該患者に投与することを含む方法。
【請求項１２０】
該抗体がムラミルジペプチド微粒子に結合している、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
ウイルスに曝露した患者においてウイルス感染を防止する方法であって、１またはそれ以上の抗体を含む組成物であって、それぞれの抗体が感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないＨＩＶタンパク質の中和または不活化エピトープ領域におけるエピトープに対応するまたは模擬するエピトープを認識し反応する組成物の治療上有効な量を、該患者に投与することを含む方法。
【請求項１２２】
ウイルスに感染したかもしれない人に由来する生物学的流体試料におけるウイルスの存在を検出する方法であって、該抗体を抗体複合体形成を誘導する条件下でその人に由来する体液試料と合わせ、該抗体がウイルスの抗原に結合するかどうかについて測定する抗体抗原アッセイにおいて、請求項１１７に記載の抗体を使用することを含む方法。
【請求項１２３】
ウイルスに感染したかもしれない人におけるウイルスの存在を検出する方法であって、該抗体を酵素に結合し、抗体複合体形成を誘導する条件下でその人に由来する体液試料と接触させ、該抗体がウイルスの抗原に結合するかどうかについて測定するエンザイムイムノアッセイにおいて、請求項１１７に記載の抗体を使用することを含む方法。
【請求項１２４】
タンパク質溶液に由来するウイルスタンパク質の中和または不活化領域のエピトープに対応するまたは模擬する少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質を精製する方法であって、請求項１１７に記載の抗体を基質または固体の支持体に固定化し、該固定化した抗体と該タンパク質を含む溶液とを、該抗体と該タンパク質との間の免疫複合体の形成に適当な条件下で接触させ、結合しなかったタンパク質を該抗体に結合したタンパク質から分離し、該結合したタンパク質を該抗体から解離させ、該タンパク質を回収することを含む方法。
【請求項１２５】
架橋によりムラミルジペプチド微粒子を形成するムラミルジペプチドの多重反復を含んでなるアジュバント組成物であって、該ムラミルジペプチド微粒子が、哺乳類に送達したときに免疫応答を刺激するための免疫原性ペプチドまたはタンパク質の担体である、アジュバント組成物。
【請求項１２６】
さらに、製薬的に許容し得る担体を含んでなる請求項１２５記載のアジュバント組成物。
【請求項１２７】
ムラミルジペプチド微粒子の直径が０．０１〜０．２ミクロンである、請求項１２５または１２６記載のアジュバント組成物。
【請求項１２８】
ムラミルジペプチド微粒子の直径が０．０５〜０．１ミクロンである、請求項１２７記載のアジュバント組成物。
【請求項１２９】
ムラミルジペプチドが、合成されたまたはPropionibacterium aciniもしくは関連微生物から単離されたムラミルジペプチドを含んでなる、請求項１２５〜１２８のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【請求項１３０】
ムラミルジペプチド微粒子が、アミノ架橋したＬ−アラニン−Ｄ−イソグルタミンジペプチド及びその誘導体の多重重複から構成される、請求項１２５〜１２９のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【請求項１３１】
少なくとも１つの免疫原性ペプチドまたはタンパク質がムラミルジペプチド微粒子の表面にコンジュゲートされている、請求項１２５〜１３０のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【請求項１３２】
前記ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つが、感染または周囲への曝露に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を活性化しないがヒトでない哺乳類の少なくとも１つにおいて免疫応答を活性化する少なくとも１つのエピトープ領域を含んでなる、請求項１３１記載のアジュバント組成物。
【請求項１３３】
少なくとも１つの免疫原性ペプチドまたはタンパク質がペプチドまたはタンパク質である、請求項１２５〜１３２のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【請求項１３４】
免疫原性ペプチドまたはタンパク質がウイルスペプチドまたはタンパク質である、請求項１３３記載のアジュバント組成物。
【請求項１３５】
製薬的に許容し得る担体が水性担体である、請求項１２６〜１３２のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【請求項１３６】
製薬的に許容し得る担体が、油のまたは油性の担体である、請求項１３５記載のアジュバント組成物。
【請求項１３７】
水中油型または油中水型エマルジョンである、請求項１２６〜１３６のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【請求項１３８】
請求項１３１〜１３７のいずれかに記載のムラミルジペプチド微粒子の有効量を、免疫応答の刺激を必要とする哺乳類に投与する工程を含んでなる、免疫応答を刺激する方法。
【請求項１３９】
以下の工程を含んでなる、アジュバントとしてムラミルジペプチド微粒子を製造する方法：
（ａ）天然由来または合成由来のムラミルジペプチドモノマーを得；
（ｂ）該ムラミルジペプチドモノマーの少なくとも２つまたはそれ以上を架橋して非毒性のムラミルジペプチド微粒子を形成し、架橋ムラミルジペプチド微粒子は免疫原性ペプチドまたはタンパク質を担持することが可能であり；
（ｃ）該ムラミルジペプチド微粒子を適当な担体中に希釈し、濃縮されたムラミルジペプチド微粒子が少なくとも１つの免疫原性ペプチドまたはタンパク質にコンジュゲートされる状態にある。
【請求項１４０】
前記微粒子が、０．０５〜０．１ミクロンのサイズを有する請求項１３９に記載の製造方法。
【請求項１４１】
ムラミルジペプチド微粒子の末端カルボキシ基を介して少なくとも１つの免疫原性ペプチドまたはタンパク質との、またはムラミルジペプチド微粒子の末端アミノ基を介して少なくとも１つの免疫原性ペプチドまたはタンパク質との共有結合のために異種二官能性架橋剤を適用する工程を含んでなる免疫原性組成物の製造方法。
【請求項１４２】
架橋剤が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等である、請求項１４１に記載の製造方法。
【請求項１４３】
温和な酸化を用いて反応性のアルデヒド基を形成した後、所望のタンパク質とシッフ塩基を形成させ、シッフ塩基を還元して微粒子と免疫原性ペプチドまたはタンパク質との間の安定な共有結合を形成する工程をさらに含んでなる、請求項１４１または１４２に記載の製造方法。
【請求項１４４】
哺乳類において免疫応答を刺激するため製薬的に許容し得る担体中に共有結合したムラミルジペプチド微粒子および免疫原性ペプチドまたはタンパク質を投与する工程をさらに含んでなる、請求項１４１〜１４３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４５】
免疫応答がサイトカイン応答である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４６】
免疫原がペプチドまたはタンパク質である、請求項１４１〜１４４のいずれかに記載の方法。
【請求項１４７】
免疫原がウイルスペプチドまたはタンパク質である、請求項１４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にウイルス感染の処置および防止に関する。特に、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の処置および診断に有用な抗体およびペプチドの製造のための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染の診断、処置および防止は、多くの医学研究者の主たる興味の中心である。数多くのウイルス感染に対する診断、処置およびワクチン接種のための組成物および方法が知られているけれども、人間において検出することが困難で、それに対する処置またはワクチン接種の方法が有効でないことが知られている数多くのウイルスが依然として存在している。勿論、最も重要なウイルスのひとつがＨＩＶである。
【０００３】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およびその前駆段階、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）およびリンパ節腫脹症候群（ＬＡＳ）に関与し得る感染因子は、ＬＡＶ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＡＲＶ、および最近ではウイルス分類学の国際委員会（文献２９９）によって推奨されているＨＩＶと呼ばれる向リンパ性レトロウイルスである。本明細書における命名法には、ＡＩＤＳに関連する指定されたウイルスおよびその株に対するこれらの推奨を用いる。ＬＡＶおよびＡＲＶ−２を含む株についての歴史的な言及は、現在では、それぞれＨＩＶ１ ＬＡＩおよびＨＩＶ１SF2と命名されている。
【０００４】
ＨＩＶの広がりは、世界的流行の程度に達しているので、感染した人の処置、およびさらされる危険のある感染していない人への伝染の防止は、主要な関心事である。様々な治療上の戦略は、ウイルスのライフサイクルの種々の段階を標的としており、Mitsuya および Broder, 1987, Nature 325: 773に概説されている。ひとつの方法は、ウイルスに結合して、ウイルスの宿主への侵入を妨害することによるかまたは他の機構によってウイルスの複製を阻害する抗体を使用するものである。抗体の介入を受けやすいウイルスの成分が同定されると、ウイルスの感染性を中和するに十分な抗体反応性を生じさせて、ＨＩＶ感染患者に免疫グロブリンまたは精製された抗体の形態で投与することができ、この受動免疫法がＨＩＶ感染の進行を変化または逆行させるであろうと期待された。さらに、改変してＭＨＣ相互作用を増強させた選択されたエピトープによる感染していない人のワクチン接種は、ＨＩＶへの曝露の結果としての感染からの保護をもたらすであろうと期待された。
【０００５】
大部分のレトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質は、感受性である細胞の表面上のレセプター分子と反応し、それによってある特定の宿主に対するウイルスの感染性が決定されると考えられている。これらのエンベロープ糖タンパク質に結合する抗体は、ウイルスと細胞レセプターとの相互作用をブロックすることができ、ウイルスの感染性を中和する。一般的に、The Molecular Biology of Tumor Viruses, 534 (J. Tooze編, 1973); および RNA Tumor Viruses, 226, 236 (R. Weiss ら編, 1982); Gonzalez-Scarano ら, 1982, Virology 120: 42 (La Crosse Virus); Matsuno および Inouye, 1983, Infect. Immun. 39: 155 (Neonatal Calf Diarrhea Virus); および Mathewsら, 1982, J. Immunol., 129 : 2763 (Encephalomyelitis Virus)。今日まで、ＨＩＶタンパク質／ペプチドでワクチン接種することによる、人間における保護的な免疫応答の誘導を目的とした治療方法は失敗に終わってきた。さらに、ＨＩＶ感染した患者から回収された高い力価の中和抗体も、マウスにおいて産生したモノクローナル抗体も、ＡＩＤＳおよび死につながるＨＩＶ感染の進行を変えることに成功しなかった。ＨＩＶ感染の過程を変え得る免疫応答を誘導し得る、ＨＩＶにおける既存のものに代わる免疫学的標的を同定することが当分野において必要とされている。
【０００６】
ＨＩＶの一般的構造は、感染した宿主細胞の膜からの出芽の過程の間にウイルスが獲得する脂質含有エンベロープで囲まれたリボヌクレオタンパク質コアの構造である。ウイルスがコードした糖タンパク質は、エンベロープ内に包まれ、外へ突き出ている。ＨＩＶのエンベロープタンパク質は、感染した細胞において、１５０，０００〜１６０，０００ダルトンの前駆分子（ｇｐ１６０）として最初に合成された後、細胞内で、外部糖タンパク質を生じる１１０，０００〜１２０，０００ダルトンのＮ末端断片（ｇｐ１２０）と、膜貫通エンベロープ糖タンパク質になる４１，０００〜４６，０００ダルトンのＣ末端断片（ｇｐ４１）にプロセシングされる。
【０００７】
上記の理由のために、ＨＩＶのｇｐ１２０糖タンパク質は、ウイルスのライフサイクルを遮断する可能性を秘めた標的として多くの研究の対象とされてきた。ＨＩＶ感染した人に由来する血清は in vitroでＨＩＶを中和し、精製されたｇｐ１２０に結合する抗体がこれら血清中に存在していることが示された(Robert-Guroffら, 1985, Nature 316: 72; Weiss ら, 1985, Nature 316:69; および Mathewsら, 1 986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83: 9709)。精製されたおよび組換えｇｐ１２０を使用して、動物 (Robeyら, 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 83: 7023; Lasky ら, l986,Science, 233 : 209) およびヒト(zagury ら,1986,Nature 326 : 249)を免疫したとき、中和血清抗体の産生を刺激した。ＣＤ４レセプターへのｇｐ１２０分子の結合もさらに示され、ＣＤ４レセプターのある特定のエピトープを認識するモノクローナル抗体がＨＩＶ結合、シンシチウム形成および感染性をブロックすることが示された。McDougalら,(1986,Science 231: 382)および Putneyら(1986, Science, 234: 1392)は、ｇｐ１２０分子のカルボキシ末端側の半分を含む組換え融合タンパク質による免疫後、動物において血清抗体の中和を誘導し、さらにエンベロープタンパク質のグリコシレーションが抗体応答の中和に必須ではないことを示した。
【０００８】
ＨＩＶ感染後間もなくして、ヒトの免疫系は、抗体産生および細胞が介在する免疫応答によりウイルスに応答する。レトロウイルスに対する免疫応答の概説は公開されている(Norley, S., および Kurth R., 1994: The Retroviridae, Vol E, J. A. Levy編, pp. 363-464, Plenum Press)。ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｐ６６、ｐ５５、ｇｐ４１、ｐ３２、ｐ２４およびｐ１７を含む数多くのＨＩＶタンパク質に特異的なヒト抗体が報告されている (Carlson,1988, J. Am. Med. Assoc. 206: 674)。ヒトにおけるＨＩＶに対する最初の抗体応答は、ｐ１７およびｐ２４に対するものであり、その後ｇｐ１２０／１６０、次いでｇｐ４１、ｐ６６／５５、そして最後にｐ３２に対するものになる（Lange 35ら 1986, Br. Med. J. 292: 228)。ＨＩＶ感染がＡＩＤＳへ進行するにつれて、ｐ１７およびｐ２４に対する抗体レベルは検出不可能な限界にまで著しく減少し、ｐ１７およびｐ２４抗原血症にとってかわられる。しかしｐ３２およびｐ５５に対する抗体力価もまたより低い程度まで減少する(McDouga1ら 1987 J. Clin. Invest. 80:316)。しかし、ｇｐ１６０／１２０に対する抗体の実質的な量は、ＨＩＶ感染の全過程を通じて持続する。ＨＩＶ感染の初期の段階の間は、総免疫グロブリン量の上昇が観察され、抗体のこの量の増加はＨＩＶに対して特異的であり、おもにｇｐ１２０に対するものである(Amadoriら, 1988, C1in. Immunol. Immunopathol. 46: 342; Amadori ら, 1989, J. Immunol 143: 2146)。このＨＩＶ特異的高ガンマグロブリン血症に対する可能性ある機構は、Barker E.ら 1995: The Retroviridae Vol 4, J. A. Levy 編 pp 1-96 Plenum Press によって概説されている。ＨＩＶ感染中に産生したこれらの抗体が標的とする機能的特性およびエピトープが記載されており、抗体が介在する中和を受けやすいエピトープが記載されている。これらの主要な標的エピトープは、おもにエンベロープタンパク質ｇｐ１６０（ｇｐ１２０／ｇｐ４１）およびｇａｇタンパク質ｐ１７に位置している。概説については、Levy, 1994 Am. Soc. Micro; Nixon ら, 1992 Immunol 76: 515を参照。ＨＩＶエンベロープタンパク質に対する中和抗体は同定されており、ｇｐ１２０の保存およびダイバージェント領域に結合する。これらには、ＣＤ４結合領域(Linsley ら 1988および Thali ら 1992)；第２および第３可変ループ領域(Fung ら, 1992および Haigwood ら 1990)；炭水化物部分(Benjouad ら, 1992および Feizi および Larkin, 1990)が位置する領域が含まれる。その他の中和部位は、ｇｐ４１の外側部分およびｐ１７の結合部位で同定されている(Changh ら, 1986)。初期の研究は、より好ましい臨床結果を導く中和抗体の存在を示唆した(Robert-Guroff ら, 1985)。しかしながら、これらの研究は、自己のＨＩＶ単離物に対してではなくＨＩＶの実験室的な株に対して、高い中和許容範囲を有する選択された血清を用いていた(Homsy ら, 1990; Tremblay および Wainberg, 1990)。その後の研究により、自己抗体が、自己のＨＩＶ単離物に対して中和活性をほとんどかまたは全く有しないことが示された(Homsy ら, 1990)。中和抗体存在下での抗体介在の中和に対する感受性の欠失は、新たな抗体特異性が生じるので、セロコンバーション後(Arendrup ら, 1992)および感染の間中に出現するエスケープ突然変異体の発生に起因すると考えられている。ＨＩＶ感染の結果として産生した中和抗体の臨床的関連性は明らかでない。しかし、ＨＩＶに感染��た人におけるＨＩＶに対する強力な免疫応答にもかかわらず、免疫機能不全の結果としてのＡＩＤＳへの進行および遂には死が勝ることは明らかである。したがって、処置のための新たな方法が求められる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ヒトにおける免疫応答は誘導しないが、ヒトでない哺乳類における免疫応答を誘導するウイルスタンパク質の中和領域を同定し、これら領域と反応する抗体を製造することである。本発明の更なる目的は、タンパク質のこれら同定された中和領域およびそれと反応する抗体を、そのウイルスによって引き起こされた疾患の診断、処置および防止において使用することである。本発明の更なる目的は、以下に詳述する発明の記載から明らかとなろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、ウイルスタンパク質の領域と反応して、ウイルスのライフサイクルにおける機能上必須の事象を中和および不活化する抗体を使用することによって、ウイルス感染を処置、診断および防止するための方法および組成物を提供する。抗体は、感染または環境曝露に遭遇したときに、ヒトにおける免疫応答は誘導せず、ヒトでない哺乳類において免疫応答を誘導するウイルスエピトープを認識する。
【００１１】
非ヒト抗ウイルス抗体と反応し、ヒトの抗ウイルス抗体には反応しない選択されたエピトープを同定する。これらエピトープは、ヒトのタンパク質に対する分子的模擬によってヒトの免疫系の監視を逃れ、いくつかの場合では、抗原プロセシング細胞における酵素的開裂を受けやすいアミノ酸から構成されている。望ましいエピトープは、ヒトの酵素によって酵素的に開裂され、したがって免疫提示のためのプロセシングを受けない。
【００１２】
これらエピトープを示すペプチドは合成することができ、場合により修飾、およびマクロ担体アジュバントにコンジュゲートして非ヒトにおける抗体応答を誘導することができる。好ましいアジュバントは、Propionibacterium aciniから抽出されたムラミルジペプチドの多重反復（multiple repeat）を含む微粒子である。
【００１３】
本発明の抗体およびペプチドは、イムノアッセイ配置（configuration）において使用して種特異的なエピトープを同定し、ヒトの組織および体液中のウイルス抗原を定量する。好ましい態様においては、本発明は、ウイルスに感染した人の処置および診断に有用な、抗体およびペプチド組成物および方法を提供する。
好ましい態様では、目的とするウイルスはＨＩＶである。
【００１４】
本発明は、ウイルス感染を診断および中和するための新規組成物および方法を提供する。本発明を、目的とするウイルスがＨＩＶである好ましい態様に焦点をあてて詳細に記載する。しかし、本発明の原理が、他のウイルスのタンパク質の中和領域を同定するために使用でき、そして他のウイルスによって引き起こされた感染も同様に診断、処置および防止するために使用できるそのようなタンパク質と反応する抗体を製造するために使用できることは理解される。
【００１５】
ここでＨＩＶに焦点を当てれば、本発明はＨＩＶ感染を中和し、ＨＩＶ感染性、細胞から細胞への伝染、および感染した宿主におけるウイルス産生を阻止または実質的に阻害するための新規の組成物および方法を提供する。より具体的には、感染または環境に自然に遭遇したときにヒトにおいて免疫応答を誘導することができないエピトープを含むＨＩＶタンパク質配列を、以下に詳細に記載するように使用して、ＨＩＶ感染性を中和し、感染したＣＤ４リンパ球の殺傷を促進し、およびＨＩＶのライフサイクルにおける必須の段階を不活化するために投与することができる抗体をヒトでない哺乳類において産生させる。「中和領域」なる語は、単独でまたは本発明の他の抗体と組み合わせてＨＩＶ感染を中和することができる抗体と反応する１またはそれ以上のエピトープを決めるアミノ酸断片を含むＨＩＶ、特にＨＩＶタンパク質の部分を示す。中和を評価するための適当なアッセイはよく知られており、Ｔ細胞系におけるＨＩＶ感染の減少、ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質を有するＶＳＶ（ＨＩＶ）偽性型（pseudo type）のプラーク形成単位の減少を測定するアッセイ、細胞融合阻害（syncytial inhibition）試験、およびビリオン−レセプター結合試験が含まれる。「不活化領域」なる語は、単独でまたは組み合わせて本発明の抗体と反応させたときにＨＩＶのライフサイクルの機能的に重要な事象を不活化する１またはそれ以上のエピトープを含むＨＩＶタンパク質の断片を表す。ＨＩＶ感染したリンパ球の、抗体が介在する破壊を評価するための適当なアッセイはよく知られており、抗体依存性細胞細胞性傷害、補体介在性溶解、およびナチュラルキラー（ＮＫ）アッセイが含まれる。ＨＩＶのライフサイクルの必須の段階の抗体介在性不活化を測定するための適当なアッセイには、逆転写酵素の不活化を測定する、またはポリメラーゼおよびプロテアーゼ活性を測定する、またはウイルスＲＮＡをリボヌクレアーゼ破壊にさらすヌクレオキャプシド透過性における抗体介在補体依存性の変化を評価するアッセイが含まれる。記載するように、中和活性は、免疫蛍光、免疫ブロット、酵素結合イムノアッセイ、およびラジオイムノアッセイなどの免疫化学分析において、抗体反応性と比較することができる。
【００１６】
本発明は、ＨＩＶのライフサイクルにおいて機能的に重要でありヒトにおいて免疫原性でないエピトープを、ヒト以外の選択された哺乳類の種で産生させた抗体を用いて同定し、特徴づけることができるという発見に基づく。さらに、これら領域に対してヒトにおける免疫学的な非応答性は、分子の模倣性の機能、必須のＭＨＣ ＨＬＡクラス１およびＨＬＡクラス２関連事象による抗原提示を含むＭＨＣ関連事象の欠失であるということを発見した。分子の模倣性に関しては、正常な環境でエピトープは自己として認識され、応答されない。抗原提示におけるＭＨＣ関連事象の欠失に関しては、いくつかの段階が関与しており、いずれか１つの段階の機能不全が、抗原に対する免疫学的応答の欠失を引き起こし得る。
【００１７】
多重複エピトープ（multiple overlapping epitope）を含むペプチド領域およびこれらのエピトープに対する抗体が製造され、ＨＩＶのライフサイクルにおける必須の段階をin vitroで中和および不活化することが示されている。さらに、ＨＩＶ感染したＡＩＤＳ患者がこれらペプチド領域に対する抗体で処置されており、全組織培養感染価（ＴＣＩＤ）によって測定される血液由来（born）感染性の迅速な減少をもたらしている。これら抗体による慢性のＡＩＤＳ患者の処置は、体重の増加、日和見感染の解決、発生率および感染の重篤度および医師の往診の減少およびＨＩＶに関連する神経障害の解決を含む、顕著な臨床上の改善をもたらした。患者はさらに、ＨＩＶ−ＲＮＡの減少、ＣＤ４数の増加、ＣＤ８数の増加およびＣＤ４およびＣＤ８数と機能の改善に関連したサイトカイン系の回復によって明らかであるように、免疫学的な回復を示した。
【００１８】
エピトープの同定および抗体の製造
大多数の免疫反応は免疫優位エピトープを標的とする。ＨＩＶエピトープは、最も頻繁に同定されており、ＨＩＶに対する抗血清、ＨＩＶエピトープ標的に対する細胞毒性Ｔリンパ球反応性およびＨＩＶエピトープのヘルパーリンパ球抗原提示を用いる様々な免疫学的方法によってマッピングされている。ＨＩＶ配列を模倣した既知の配列の合成ペプチドを、これら観察結果を確認するために、よく知られたアッセイを用い競合的にまたは非競合的に使用することができる。免疫系の刺激は、免疫応答の増強または抑制のいずれかにつながり得ると理解されている。これを支配する因子には、
Ａ．免疫原によって刺激されるリンパ球の副次集団（サプレッサー対ヘルパー）
Ｂ．最初に免疫源と接触するそこに存在している細胞集団を含む微視的環境
Ｃ．エフェクター細胞が免疫原と接触する時点で微視的環境に存在しているサイトカインのタイプ
Ｄ．エフェクター細胞が免疫原と接触した後に誘導されるサイトカインのタイプ
Ｅ．免疫原の構造的および生化学的構成
Ｆ．免疫原のアミノ酸配列と微視的環境におけるプロテアーゼによるプロテアーゼ分解に対するその感受性
【００１９】
予備実験から、ヒトにおける疾患過程、特にＡＩＤＳを含む全ての段階におけるＨＩＶによる感染の処置または軽減において受動免疫治療の適用を意図する抗体の製造に使用するための、あるタンパク質およびペプチドの潜在的価値の決定において、以下の特性が根本的に重要であると決定した：
Ａ．以下の場合を除き、免疫原は、受動免疫治療において使用するための抗体を製造するために使用するときに、ヒトの細胞および組織において発現するエピトープ決定基を欠いていなければならない。
１．抗原の分布が抗体にとって隔離されたおよび／または利用できない位置に制限されている。
２．発生サイクルの間の特定の時点において抗体の使用が可能な発生段階の間に抗原が発現する、このとき抗原は利用できない。
３．宿主内のエピトープの位置が致命的な構造に隣接していない。
４．宿主細胞における抗原の分布が、傷害を生じるに必要な密度よりも低い密度であるが、選択的な標的化をもたらす所望の標的においては好都合である。
５．正常な割合に対する標的が十分に異なっており、所望の標的への抗体送達に好都合でなければならない。
Ｂ．抗原提示細胞に送達されるペプチド反復の数が、免疫応答の規模に直接影響を及ぼす。
Ｃ．エピトープが抗体を中和し標的化を阻止する濃度で体液中に存在していてはならない。
【００２０】
今日まで、ワクチン開発は、ヒトの免疫系がそれに対して応答する標的に対する応答を増幅するためのよりよい技術を設計することに焦点が当てられてきたが、受動免疫治療は要領を得ない結果に終わってきた。従来達成できなかった、免疫反応をもたらす抗原をＨＩＶへ送達する新たな形態とともに、人間において免疫事象を誘導しない、既存のものに代わるＨＩＶの標的を本明細書に開示する。本明細書に開示する方法は、ＨＩＶおよびＡＩＤＳの処置に焦点を当てているが、本発明の製剤が広い応用範囲を有するということは理解されよう。ヤギにおける抗体応答は、ＨＩＶの鍵となる標的に対する抗体産生により、そしてＡＩＤＳの臨床的改善をもたらす処置により本発明の有用性を実証している。この技術は、ワクチン開発において広い応用範囲を有する。
【００２１】
抗原投与に対する好結果の免疫誘導は、ＭＨＣ事象における抗原提示細胞（ＡＰＣ）による多重エピトープ反復の提示を必要とする。最も免疫原性であるエピトープは、一方の末端における疎水性アミノ酸、他方の末端における親水性アミノ酸を有する両親媒性の形態をとっており、両親媒性らせんの形成に矛盾しないアミノ酸を含んでいる。すなわち、それらは、プロリンのようならせんを破壊するアミノ酸を欠いており、炭水化物を欠いている。微視的環境におけるプロテアーゼによるプロテアーゼ分解に感受性であるアミノ酸を欠く配列は、特に望ましい。
【００２２】
機能上重要性を有するＨＩＶの免疫学的標的を同定するために、人間以外の動物種におけるＨＩＶ関連タンパク質の免疫原性領域を決定した。ヤギを、炭水化物基を除去したまたは除去していない精製したＨＩＶリゼートで免疫した。ＨＩＶタンパク質からの炭水化物基の除去は、そのタンパク質に対する免疫学的応答にはほとんど影響しないが、隠れたエピトープを曝露させることができる。商業的に得られたＨＩＶリゼートをさらに精製して、ヒトＨＬＡクラスＩ抗原、ＨＬＡクラスＩＩ抗原、およびβ−２−ミクログロブリンを含む組織培養由来のタンパク質を除去した。免疫後、ヤギ由来の抗血清を競合イムノアッセイ法を用いて試験して、ＨＩＶ感染した患者からプールした抗体によって認識されないＨＩＶペプチドを同定した。ヒトＨＩＶ抗血清のプールを高い中和活性とウエスタンブロット活性を有する選択された患者の抗血清から調製し、標準的な競合イムノアッセイ法を用いる競合抗体として用いた。ヤギ抗体の広範なスペクトルが同定され、ヒト抗ＨＩＶ抗血清プールによって認識されるものと免疫学的に別個のＨＩＶ決定基と反応した。
【００２３】
当業者は、他の動物種を使用してこれらエピトープに対する抗体を産生させること、そしてこのような抗体がＡＤＣＣおよび補体が介在する反応において機能し得ることを認識する。抗体産生のための他の適当な動物種には、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシおよびマウスが含まれるがこれらに限られない。
【００２４】
抗ＨＩＶ抗体のエピトープ反応性は、ＨＩＶ１SF2の直鎖状アミノ酸配列に存在する１２マーペプチドを使用して特徴付けた。このサイズのペプチドは抗体とよく反応し、容易に合成でき、高度に精製された形態で調製することができる。ペプチドは、Purification Systems, Inc.によって合成され、そこから購入した。その合成ペプチドを、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ＨＩＶ抗体と混合し、ＨＩＶで被覆したマイクロタイタ−ウェル２組のそれぞれに加えた。１組はヒトＩｇＧ抗ＨＩＶでブロックし、もう１組はブロックしなかった。ヒト抗ＨＩＶでブロックしたＨＩＶタンパク質部位に対する、ヤギ抗ＨＩＶ結合のペプチド阻害の百分率を測定した。
【００２５】
特定の合成ペプチドによって結合の阻害が観察された場合、もとの阻害ペプチドのアミノ酸配列と重複するアミノ酸配列を有する更なるペプチドを合成してエピトープ配列をさらに明確に決定した。
【００２６】
ヤギ抗ＨＩＶ ＩｇＧによって認識されヒト抗ＨＩＶ ＩｇＧによって認識されないＨＩＶタンパク質のエピトープの位置をさらに調べ、同定マーカーとしてＨＩＶペプチドＨＲＰコンジュゲートを用いて確認した。このアッセイでは、ＨＩＶタンパク質をマイクロタイタ−プレートウェルまたは精密なポリスチレンビーズなどの支持体に吸着させた。ＨＩＶ１SF2の直鎖状アミノ酸配列に位置する１２マーペプチドを、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合させた。ヒトおよびヤギ抗ＨＩＶ反応性を、支持体およびペルオキシダーゼに共有結合したペプチドエピトープに吸着させた天然のエピトープを架橋するヒトおよびヤギ由来の抗ＨＩＶ反応性について独立に測定した。この方法により、実施例８に詳述するように合成ペプチドに含まれる正確なエピトープのみが認識された。
【００２７】
ヒトのタンパク質を有意に模擬しているペプチドが同定されたら、ＨＩＶのライフサイクルにおいて機能的な重要性を有するそのペプチドの配列を決定する。これは、以下に記載し実施例８で説明するように、ぺプチド候補に対する抗体を生じさせた後、その抗体のＨＩＶ感染性とウイルス中和に対する効果について試験することによって行う。
【００２８】
上に記載したように、数多くの特異的なエピトープ領域が同定されており、特記しない限り、９つの領域をＨＩＶ１SF2配列に関して以下に詳細に記載する。ＨＩＶ１SF2に関して、以下および本願を通して記載するアミノ酸残基の命名法は、ロス・アラモス・データ・バンク（エイズウイルス配列データベース、Los Alamos National Laboratories, Theoretical Division, Los Alamos, N.M. 87545）から得られるものである。ＨＩＶ２NZに関して、以下および本願を通して記載するアミノ酸残基の命名法は、ジュネーブ大学病院およびジュネーブ大学の Ex Pasy World Wide Web Molecular Biology Server、および Weizman Instutute, IsraelのCompugen Ltd．および Akira Ohyama, BioScience Systems Department, Mitsuey Knowledge Industry Co., Ltd.,Tokyo, Japan を通して入手できる BioAcceleratorから得られる。当業者は、様々な単離物に由来する関連したタンパク質内のそれらの位置に基づいて、他のＨＩＶ単離物に由来する更なる同族領域（「ホモローグ」）を同定することができることを認識するであろう。実際問題として、そのようなホモローグは、以下のように、ＨＩＶ１SF2配列データを参照することにより同定することができる。
（ａ）ＨＩＶ単離物のアミノ酸配列とＨＩＶ１SF2を並べて、２つの配列間の最大の相同性を得ることができ、一般に配列間で少なくとも７５％が同一である；
（ｂ）アミノ酸配列を、ＨＩＶ１SF2タンパク質内の対応する位置に並べたら、模擬されたまたはホモローガスな配列に対する抗体反応性の保持によって定義される、ＨＩＶ１SF2に対する免疫学的な模擬、類似性または同一性が示される。
【００２９】
同定された他のＨＩＶ単離物に由来するペプチドおよびそのアミノ酸配列は、ＨＩＶ１SF2の領域に対応して典型的に免疫学的に模擬的であろう。
【００３０】
鍵となるペプチドを同定するこの方法は、未だ発見されていないＨＩＶ株に適用することができる。例えば、ＨＩＶの新たな株が同定されたとき、それらのエンベロープおよびコアアミノ酸配列をＨＩＶ１SF2のアミノ酸配列と並べて、その株に関する最大の配列相同性を得ることができる。配列を並べる方法は、当業者に知られている。配列を並べることにおいて、できるだけ大きなシステイン残基間の相同性が維持されることが望ましい。本明細書に特に開示したペプチドの位置に対応する新たなＨＩＶ株または種のアミノ酸配列を合成して、本発明にしたがって使用することができる。
【００３１】
そのような配列内に含まれるエピトープがＨＩＶのすべての株または種に対する抗体と交差反応することは、本発明にとって必要ではない。１つの種または血清群を他のものと区別する免疫学的エピトープを含むペプチドは、特定の種または血清群を同定することにおいて有用であり、ＨＩＶの１またはそれ以上の種または血清群によって感染した人を同定することを助けるであろう。それらを、治療レジメにおいてホモローガスな領域か別の中和領域に由来する他のペプチドと組み合わせても有用であろう。
【００３２】
本発明のアミノ酸配列は、約５〜約５０のアミノ酸を典型的に含み、感染または周囲との接触に遭遇したときに、ヒトにおける保護的な免疫応答は誘導しないが、ヒトでない動物においては応答を誘導する、ＨＩＶタンパク質上に位置するあるエピトープ領域または複数のエピトープ領域を含んでいる。好ましくは、配列は、約５〜３５個のアミノ酸を含む。所望のアミノ酸配列を含む合成ペプチドまたは天然ＨＩＶの処理されたリゼートを使用して、それに対して免疫学的に応答する動物を免疫し、ＨＩＶ感染の処置において治療的価値を有する抗体を製造する。
【００３３】
目的のアミノ酸配列またはペプチドは、ヒトおよび他のタンパク質におけるエピトープの模擬により、ヒトにおける免疫応答を誘導しない。特に興味があるのは、ＨＩＶタンパク質およびヒトアルファフェトプロテイン、アスパルチルプロテアーゼ、デオキシウリシン５'−三リン酸ヌクレオチドヒドロラーゼ、好酸球陽イオン性タンパク質、好酸球由来ニューロトキシンおよびリボヌクレアーゼ４前駆体および Bangaris Naja、Dendoaspis、Psudechis、または Androctonus Centruoides由来のニューロトキシンによって模擬されたペプチドエピトープ領域の間で共有されるペプチドエピトープである。
【００３４】
以下の考察において、そのタンパク質に関する標準的な識別用略号を用いて数多くのヒトのタンパク質およびニューロトキシンについて言及する。以下の記載は、そのタンパク質が対応するそのタンパク質の略号およびフルネームを記載した表である。
【表１−１】
2009080118.tif 000002
【表１−２】
2009080118.tif 000003
【表１−３】
2009080118.tif 000004
【００３５】
上で述べた高度に保存されたエピトープ領域の９つのアミノ酸配列を以下に記載する。これら領域のうち３つがエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０（２つの標的）およびｇｐ４１（１つの標的）に存在し、１つは逆転写酵素ヘテロダイマーｐ６６／５５に存在し、１つはプロテアーゼｐ１０に存在している。更なる標的は、ｐ１７（２つの標的）、ｐ２４およびｐ７の部位でＧａｇ前駆体（ｐ５５／Ｇａｇ）に存在している。
【００３６】
ＨＩＶ１SF2ｇｒ１２０の１つのエピトープ領域は、ＨＩＶ１のアミノ酸残基４〜２７に存在し、もうひとつの領域はアミノ酸残基５４〜７６に存在している。ｇｐ１２０に位置するエピトープ領域に対する抗体は、相乗的に機能してｇｐ４１からのｇｐ１２０の遊離を引き起こす。ｇｐ４１からのｇｐ１２０の遊離は、抗体用量依存的であり、ＨＩＶ感染性を測定するＴＣＩＤなどの中和アッセイによって実証することができる。
【００３７】
ＨＩＶ２NZのｇｐ１２０の領域を中和または不活化するエピトープ領域もまた決定されている。ＨＩＶ２NZエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０の配列は、マッピングされており、アミノ酸残基約７〜４３がＨＩＶ１SF2ｇｐ１２０およびある種のヒトタンパク質の配列を模擬する領域である。その領域を標的とする抗体は、ｇｐ４１からのＨＩＶ２ｇｐ１２０の解離をもたらし、それは感染性の減少と相関している。
【００３８】
ＨＩＶ１SF2に関する第３のＨＩＶエンベロープ糖タンパク質標的は、ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のアミノ酸残基５０２〜５４１に位置していた。補体の存在下でこの領域を標的とする抗体は、ＨＩＶエンベロープタンパク質の抗体依存補体介在性の溶解とＨＩＶ感染性の顕著な減少をもたらす。
【００３９】
エンベロープ糖タンパク質エピトープ領域に加えて、目的とするもうひとつのＨＩＶ１エピトープ領域には、逆転写酵素ヘテロダイマーのｐ６６／５５アミノ酸残基２５４〜２９５が含まれる。この領域を標的とする抗体は、逆転写酵素活性の抗体用量依存性の減少をもたらす。さらに目的とするものは、プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜９４を包含するエピトープ領域である。この領域を標的とする抗体は、プロテアーゼ活性の抗体用量依存性の減少をもたらす。
【００４０】
逆転写酵素およびプロテアーゼにおける標的は、酵素活性部位に隣接する保存領域に存在し、その突然変異とその結果としての競合阻害剤に対する耐性についてよく知られている。抗体介在性の不活化は、二次的な活性の損失を伴う酵素の立体的または立体配置的変化に起因する。不活化のこの方法は独立に機能し、酵素活性部位の突然変異に影響を受けず、不可逆的である。
【００４１】
Ｇａｇ遺伝子内の３つのエピトープ領域もまた目的とする。具体的には、Ｇａｇ遺伝子タンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜１８１、Ｇａｇ遺伝子タンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜２３の第１の標的およびアミノ酸残基８９〜１２２の第２の標的、およびＧａｇ遺伝子タンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜４１０および４３８〜４４３が本発明において有用である。これら領域を標的とする抗体は、上記した抗体によるＨＩＶエンベロープの溶解後のヌクレオキャプシドの破壊をもたらす。この標的化はついには、ＨＩＶ ＲＮＡを血漿ＲＮＡse破壊にさらすことになる。さらに、ｐ１７上の標的は、出芽後、感染したリンパ球の表面に曝露される。これは、感染したリンパ球のＡＤＣＣ溶解のための更なる標的を提供する。
【００４２】
ＨＩＶ感染した患者由来の抗体によって認識されないが、ヤギ抗ＨＩＶ抗体によって認識される少なくとも１つのエピトープを含む、上記した具体的なペプチドの１つは、以下の配列を有するＨＩＶ１SF2エンベロープｇｐ１２０タンパク質のアミノ酸残基４〜２７を含むペプチドおよびその直鎖状のエピトープを含有する部分配列である。
【数１】
2009080118.tif 000005
このペプチドは、ヒトタンパク質、FOL1、NTCR、PIP5、PSS1、KLTK、MC5R、ECP、INIU、INI9、VPRT、CD69、MYSE、RNKD、ACHE、TCO2、LCAT、MAG1、MAG2、MAG3 および LYOXを模擬する。
【００４３】
ＨＩＶ１SF2ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質由来の第２のエピトープ領域はアミノ酸残基５４〜７６に存在し、以下の配列を有する。
【数２】
2009080118.tif 000006
このペプチドは、タンパク質 CYRB および SYV を模擬する。
【００４４】
ＨＩＶ１SF2エンベロープにおける目的の第３のエピトープ領域は、糖タンパク質ｇｐ４１のアミノ酸残基５０２番〜５４１番に存在している。このペプチドは、以下のアミノ酸配列を有している。
【数３】
2009080118.tif 000007
このペプチドは、ヒトタンパク質 CYPC、TYK2、ACHE、NTCF、NTCR、CD81、41BL、NIDO、GSHR、CO02 および TCO2 を模擬する。
【００４５】
別の具体的な態様では、目的のエピトープ領域は、ＨＩＶ１SF2Ｇａｇタンパク質ｐ１７のアミノ酸残基２〜２３の領域である。このペプチドは以下の配列を有する。
【数４】
2009080118.tif 000008
このペプチドは、ヒトタンパク質 TFPI、PA2M、BLSA、ECP および FETA、およびNXS1および NAJAT等のある特定のニューロトキシンを模擬する。このペプチドは、宿主細胞膜に結合し、細胞の翻訳タンパク質Ｓｒｃを模擬する機能を標的とする疎水性配列を有する。
【００４６】
ＨＩＶ１SF2ｐ１７の第２の標的は、アミノ酸残基８９〜１２２に存在している。このペプチドは、以下の配列を有している。
【数５】
2009080118.tif 000009
このペプチドは、FETA および TRICを模擬する。
【００４７】
別の目的とするペプチドは、Ｇａｇ遺伝子タンパク質ｐ２４のアミノ酸残基１６６〜１８１のペプチドおよびそのなかのエピトープを含有する部分配列である。このペプチドは以下の配列を有する。
【数６】
2009080118.tif 000010
このペプチドは、ヒトタンパク質 FETA および TRFL を模擬する。
【００４８】
第３の目的とするＧａｇ遺伝子タンパク質エピトープ領域は、Ｇａｇ遺伝子タンパク質ｐ７のアミノ酸残基３９０〜４１０および４３８〜４４３を有するペプチドおよびそのエピトープ含有部分配列である。このペプチドは以下の配列を有する。
【数７】
2009080118.tif 000011
このペプチドは、ヒト FETA および ＲＮＡ結合タンパク質を模擬する。このペプチドは、ウイルスＲＮＡに相互作用し結合する亜鉛結合領域を含んでいる。この領域に対する抗体は、感染したＣＤ４＋リンパ球の溶解後のエンベロープをもたない未成熟ＨＩＶの除去を促進する。
【００４９】
さらにエピトープ領域として目的とするものは、プロテアーゼｐ１０のアミノ酸残基６９〜９４のペプチドおよびそのエピトープ含有部分配列である。このペプチドは以下の配列を有する。
【数８】
2009080118.tif 000012
このペプチドは、ヒトタンパク質RENI、BLSA、VPRT および CATD 模擬する。この配列に対する抗体は、ＨＩＶのプロテアーゼ活性を阻害する。
【００５０】
本発明において有用な更なる具体的な配列は、ＨＩＶ１逆転写酵素ヘテロダイマーｐ６６／５５のアミノ酸残基２５４〜２９５を含む配列である。このペプチドは以下の配列を有する。
【数９】
2009080118.tif 000013
このペプチドは、ヒトタンパク質 POL1 および ECP を模擬する。
【００５１】
上記のように、ＨＩＶのその他の株もまた本発明に従ってペプチドおよび抗体を得るために使用することができる。他の株に由来する有用なペプチドは、別の株の配列をＨＩＶ１SF2またはＨＩＶ２NZの配列に対して比較し並べ、ＨＩＶ１SF2またはＨＩＶ２NZについて同定された目的のエピトープに対してホモローガスな配列の部分を見つけることによって決定することができる。
【００５２】
本発明の方法によって同定されたＨＩＶ２NZにおける目的とする配列は、ｅｎｖ ｇｐ１２０オープンリシングフレームに存在し、アミノ酸残基７番〜４３番に存在する。このペプチドは、以下の配列を有する。
【数１０】
2009080118.tif 000014
このペプチドは、ヒトタンパク質 IL9、SRE1、NRM1、LBP、NOL1、S5A2、LMA1、LECH、LFA3、KPLC、FETA、3BH2、3BH1、INR2 および EV2B を模擬する。
【００５３】
例えば、所望のアミノ酸配列が同定されたら、これら配列を認識する抗体が得られる。このような抗体は、ＨＩＶリゼート、合成ペプチド、細菌の融合タンパク質および所望のエピトープを含む系統進化的に関連しない供給源に由来するタンパク質／ペプチドから単離したペプチドを含むタンパク質を用いて得ることができる。
【００５４】
ウイルスのリゼートを使用する場合は、ＨＩＶの単一の株のタンパク質リゼートを使用することができるか、または２またはそれ以上の異なる株のリゼートの混合物を使用することができる。リゼートの混合物を使用する場合は、混合物は、異なるＨＩＶ１株または少なくとも1つのＨＩＶ１株と少なくとも１つのＨＩＶ２株の組み合わせのリゼートを含むことができる。好ましい混合物は、ＨＩＶ１BAL、ＨＩＶ１MN、およびＨＩＶ２NZ由来のリゼートの組み合わせである。
【００５５】
ウイルスのリゼートは、最初に処理してＨＩＶタンパク質由来の脂質および他の不純物を除去する。次いでＨＩＶタンパク質混合物を処理してヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩおよびＩＩ抗原を含む培養細胞由来の汚染物質を除去する。これら抗原を除去する方法は、当分野において知られており、モノクローナル抗ＨＬＡクラスＩおよび抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体を使用することおよび免疫アフィニティー法が含まれる。１つの方法を以下の実施例３に詳細に記載する。
【００５６】
さらに、ＨＩＶの炭水化物を除去しなければならないことが分かっている。さもなければ、系統進化的に保存された炭水化物決定基が、ＨＩＶタンパク質を動物に投与したときに免疫応答を刺激し、ヒトの組織に対して細胞毒性であろう抗体の産生をもたらす。タンパク質を当業者に知られた酵素で処理してＰＧＮase、ノイロミニダーゼ、およびグリコシダーゼを含む炭水化物を除去する。そのような方法の１つを実施例３に詳細に記載する。
【００５７】
次いで、処理したＨＩＶタンパク質の混合物を使用して動物を免疫し、目的のペプチドに対する抗体を産生させることができる。望ましくは、混合物は、大体等量の目的のペプチドまたはエピトープ領域を含むタンパク質を含む。すなわち、好ましくは、それらは、約１：１の割合で提供され、いずれかの２つのペプチド間のモル比における差は、約１０：１、好ましくは３：１よりは大きくない。
【００５８】
別法として、合成ペプチドを免疫原として使用することができる。合成ペプチドを使用する場合、いずれかの所望のペプチドのアミノ酸配列は、例えば、置換されたまたは先端が切り取られた形態のアミノ酸配列を用いることによって改変し得る。
【００５９】
アミノ酸置換を行って、特定のアミノ酸部分での抗原プロセシングの間に起こり得る予想される酵素的開裂を回避し、両親媒性のコンフォメーションを、必要なＭＨＣ関連抗原提示に適うようにし、エピトープ境界でまたはその近くで開裂を起こすＨＬＡ提示に十分な長さを与えるようにすることができる。先端が切り取られた配列は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗原提示モチーフによって予想される、エピトープの長さの要求に対する適合性を維持するよう選択する。望ましいアミノ酸置換についてのより詳細な指針を、合成ペプチドに関する節の一部として以下に記載する。置換されたおよび先端が切り取られた配列に加えて、固相の支持体および巨大分子担体への結合を助長する目的で、更なるアミノ酸を選択したエピトープ領域の一端に付加した延長された配列を調製することができる。
【００６０】
例として、上記のＨＩＶ１SF2ｇｐ４１のアミノ酸残基５０２〜５４１に存在する有用な先端が切り取られたペプチドの配列には、以下のアミノ酸残基５１２〜５３１の配列：
【数１１】
2009080118.tif 000015
およびさらにアミノ酸残基５１８〜アミノ酸残基５２７のアミノ酸配列：
【数１２】
2009080118.tif 000016
を有するペプチドが含まれる。
【００６１】
別の特に有用な先端が切り取られたペプチドは、ＨＩＶ２NZのｇｐ１２０のアミノ酸７〜４３のペプチドの先端が切り取られた配列であり、以下の配列を有する。
【数１３】
2009080118.tif 000017
【００６２】
ペプチドは、広く様々な方法で調製することができる。ペプチドは、その比較的小さなサイズのために、慣用の技術にしたがって溶液中でまたは固体の支持体において合成することができる。様々な自動化された合成装置が今日商業的に入手可能であり既知のプロトコルにしたがって使用することができる。例えば、Stewart および Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 第２版, Pierce Chemical Co., 1984; および Tam ら, J, Am Chem. Soc. （1983）105：6442参照。
【００６３】
別法として、ハイブリッドＤＮＡ技術を使用することができる。その方法では、ポリペプチドまたはその実質的に相補的な鎖をコードする一本鎖を用いることによって合成遺伝子を調製し、その一本鎖が重複しアニーリング培地中でハイブリダイズするよう一緒にし得る。次いで、ハイブリダイズした鎖を連結して完全な遺伝子を形成させることができ、そして、適当な末端の選択によって、遺伝子を、その多くが今日容易に入手可能である発現ベクターに挿入することができる。例えば、Maniatis ら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982参照。または、ペプチドをコードしているウイルスゲノムの領域を慣用の組換えＤＮＡ技術によってクローニングし、原核または真核発現系において発現させて所望のペプチドを製造することができる。
【００６４】
好ましくは、ＨＩＶ感染のライフサイクルにおける必須の段階を中和および不活化するであろう抗体の産生によって、抗体産生Ｂリンパ球がそれに対して応答し得る所望のエピトープに免疫原は富んでいるであろう。本明細書で使用する「富んでいる」なる語は、所望のエピトープがＨＩＶタンパク質の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、および最も好ましくは約９５％を構成していることを意味する。より具体的には、破壊されたウイルスリゼートまたは抽出物を含有する溶液、または模擬エピトープを含む生物学的に発現した組換えタンパク質、または破壊された発現ベクターまたはタンパク質の上清を、所望に応じ、たとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動などの精製法を使用して、そのようなタンパク質に富ませることができる。イムノアフィニティー精製、例えばモノスペシフィックなアフィニティー精製されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用するアフィニティー精製は、所望のＨＩＶエピトープを含むタンパク質およびペプチドの精製にとって好ましい便利な方法である。免疫原として使用するためにペプチドが溶液から精製される程度は、幅広く変化し得る。すなわち、約５０％、典型的には少なくとも７５％〜９５％、望ましくは９５％〜９９％および、最も望ましくは完全に均一である。
【００６５】
所望のエピトープに対する抗体を得るために、上述のように処理して炭水化物およびＨＬＡ抗原を除去した、目的のペプチドまたはそれを含むＨＩＶタンパク質で動物を免疫する。免疫プロトコルはよく知られており、効果を維持したままでかなり変更することができる。Colco, Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc. 1995参照。タンパク質および／またはペプチドは、免疫のための適当な生理学的担体中で懸濁または希釈することができる。適当な担体は、滅菌水および０．９％生理食塩水を含む、ペプチドの免疫原性を送達および／または増強するための、いずれかの生物学的に適合し得る非毒性の物質である。
【００６６】
別法として、免疫原として使用する前にペプチドを担体分子に結合することができる。例えば、以下に１つの好ましい方法をより詳細に議論するが、この方法はタンパク質およびその断片を、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）などの糖タンパク質の多重反復に結合して、典型的には直径１ミクロン未満、好ましくは０．２ミクロン未満の微粒子を形成することができる。次いで、その微粒子を、注射用の医薬用担体中に分散させることができる。この方法により、所望の免疫応答を誘導するために使用することができる高密度のペプチドが達成される。担体の選択は、投与経路および応答に依存して幅広く変化するであろう。慣用の、よく知られた滅菌技術によって、組成物を滅菌することができる。ペプチドは、経口または非経口の経路で投与することができる。好ましいのは後者である。
【００６７】
所望のエピトープに富んでいる免疫原性的な量の抗原調製物を、通常１μｇ〜２０ｍg／ｋg（宿主の体重）の範囲の濃度で注射する。例えば筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内などの注射によって投与することができる。一回または複数回、通常１週間に１〜４回投与することができる。
【００６８】
免疫された動物を、所望のエピトープに対する抗体の産生について監視する。高アフィニティー補体結合性ＩgＧ抗体は、受動免疫治療に好ましく、完全なＩgＧ抗体またはＦｖ、Ｆab、Ｆ(ab')２などの断片として使用することができる。より大きな組織透過性が望ましい場合には、抗体断片が好ましいであろう。抗体および断片は、単独でまたは毒性物質もしくは放射性同位体とのコンジュゲートとして得ることができる。所望の抗体応答が達成されたら、血液を、例えば静脈穿刺、心臓穿刺、または血漿浄化によって集める。例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、サイズクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを含む慣用の方法にしたがって、抗体を複合血清または血漿混合物から精製する。組み合わせた方法がしばしば使用される。イムノアフィニティークロマトグラフィーが好ましい方法である。
【００６９】
ヒトでない動物に由来する抗体を投与されたヒトにおける可能性のある抗原性を回避するために組換え抗体を構築することができる。組換え抗体の１つのタイプはキメラ抗体であり、これは免疫グロブリン分子の抗原結合断片（可変領域）が、ペプチド結合によって、ヒトによって外来として認識されない別のタンパク質の少なくとも一部、例えばヒト免疫グロブリン分子の定常部分などに連結している。これは、動物の可変領域エキソンを、ヒトのカッパまたはガンマ定常領域エキソンと融合することによって達成することができる。例えば、参考のためその開示をここに引用するＰＣＴ ８６／０１５３３、ＥＰ１７１４９６、およびＥＰ１７３４９４に記載されている技術のような、様々な技術が当業者に知られている。組換え抗体の好ましい種類は、ＣＤＲ−グラフト抗体である。
【００７０】
医薬製剤とその使用
感染性を中和し、感染したＣＤ4リンパ球を殺傷し、およびＨＩＶのライフサイクルの機能的に重要な事象を不活化する本発明の抗体を、医薬組成物の成分として組み込む。組成物は、治療的または予防的用量の本発明の抗体の少なくとも１つ、望ましくは抗体カクテルを薬学的に許容し得る担体とともに含む。薬学的に許容し得る担体は、いずれかの適合する、抗体の患者への送達に適当な非毒性物質である。即ち、本発明は、許容し得る担体、好ましくは水性担体中に溶解した抗体の溶液を含む非経口投与のための組成物を提供する。例えば、水、緩衝化された水、０．４％生理食塩水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシンなど、様々な水性担体を使用することができる。これらの溶液は滅菌されており、一般に粒状物を含まない。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要に応じ薬学的に許容し得る補助物質、例えば pＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤などを含むことができる。例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等が使用できる。これら製剤中の抗体の濃度は、典型的には約０．１ｍg／ｍL未満〜１５０または２００ｍg／ｍL、好ましくは約１ｍg／ｍL〜約２０ｍg／ｍLの間で変えることができ、好ましくは選択された特定の投与形式に関して主として流体の体積、粘度などに基づいて選択する。特定の抗体または抗体カクテルの濃度の決定は、当業者の能力の範囲内である。例えば、静脈注入のための典型的な医薬組成物を、滅菌リンゲル液２５０ｍLおよび抗体１００〜２００ｍgを含むよう製造することができる。筋肉内注射のための組成物は、１ｍLの滅菌緩衝水と約２０〜約５０ｍgの抗体を含むよう製造することができる。非経口的に投与可能な組成物の実際の製造方法は、当業者に知られているかまたは明らかであろう。また、例えば、本明細書の一部を構成する Remington's Pharmaceutical Science, １５版, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980) により詳細に記載されている。このような組成物は、例えば、ＨＩＶのある株に特異的である、またはＨＩＶ株の大部分およびより好ましくはすべてによって発現する単一のタンパク質または糖タンパク質に特異的である、単一の抗体を含有することができる。別法として、医薬組成物に１以上の抗体を含有させて「カクテル」を形成することができる。例えば、ＨＩＶの様々なタンパク質および株に対する抗体を含有するカクテルは、ＨＩＶの大多数の臨床的単離物に対する治療的または予防的活性を有する万能的な製品であろう。そのカクテルは、例えば、ＨＩＶエンベロープのタンパク質または糖タンパク質上のエピトープに結合する抗体を含むことができ、または、ＨＩＶ１SF2Ｅｎｖタンパク質ｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１；Ｇａｇタンパク質ｐ７、ｐ１７およびｐ２４；逆転写酵素ヘテロダイマーｐ６６／５５およびプロテアーゼｐ１０、またはそれらのサブグループ上にある、上で定義したエピトープ部位に対する抗体の組み合わせを含むことができ、よってＨＩＶのライフサイクルおいてきわめて重要である一連のエピトープを中和することができる。勿論、ＨＩＶタンパク質の他の中和または不活化領域におけるエピトープ部位に対する抗体もまた使用することができる。
【００７１】
例えば、結合、細胞侵入、転写、翻訳、アッセンブリー、形質膜に対する成熟ビリオンの標的化およびビリオンの放出を改変する抗体は、ＨＩＶライフサイクルの事象を妨害し得る。複数の必須のＨＩＶタンパク質を不活化するために、抗体カクテルがより頻繁に用いられるであろう。このことは、ビリオンが外側のエンベロープを欠いているが、飲作用または感染などの他の機構によって細胞侵入を獲得するなら感染性である恐れのある場合において特に治療上の利点となるであろう。種々の抗体成分のモル比は、一般に１０倍以上、より一般的には５倍以上は違わないであろう。通常は、他の抗体成分のそれぞれに対し約１：１〜３のモル比であろう。
【００７２】
上記９つの具体的なペプチドに対する抗体に関して、望ましい抗体カクテルは、２つのエンベロープｇｐ１２０ペプチドとｇｐ４１ペプチドに対する抗体を含む。より望ましくは、カクテルは、これら３つのエピトープ領域に対する抗体に加え、プロテアーゼＰ１０エピトープ領域に対する抗体に対する抗体を含む。さらにより望ましくは、カクテルはこれら４つのエピトープ領域に対する抗体に加え、他の５つの列挙されたエピトープ領域のうちの少なくとも１つに対する抗体を含む。最も好ましい態様では、カクテルは、9つすべてのエピトープ領域に対する抗体を含む。
【００７３】
本発明の抗体および抗体カクテルは、独立にまたは他の抗レトロウイルス剤と組み合わせて投与することができる。他の抗レトロウイルス剤、および特に抗ＨＩＶ剤の現在の開発段階は、Mitsuya ら, Nature 325：773-778, 1987に概説されている。
【００７４】
本発明の抗体およびペプチドは、抗体活性を保つために知られている様々な温度、例えば−７０℃、−４０℃、−２０℃、および０〜４℃の液体の形態で保存するか、または保存のために凍結乾燥し、使用する前に適当な担体中で再構成することができる。この技術は、慣用の免疫グロブリン、精製された抗体、およびタンパク質からなる免疫原、糖タンパク質およびペプチドには効果的であることが証明されている。当分野で知られている凍結乾燥および再構成技術を使用することができ、当業者は、凍結乾燥および再構成が種々の程度の抗体活性の損失（例えば、慣用の免疫グロブリンに関して、ＩgＭ抗体はＩgＧ抗体よりも活性の損失が大きいという傾向にある）につながり得ること、および投与量を調節して損失を補なわねばならないであろうということを認識するであろう。
【００７５】
本抗体またはそのカクテルを含有する組成物は、ＨＩＶ感染の治療的および／または予防的処置のために投与することができる。治療的適用において、組成物を既にＨＩＶに感染した患者へ、感染およびその合併症を処置または少なくとも阻止するに十分な量で投与する。これを達成するに十分な量を「治療上効果な用量」として定義する。この使用に効果的な量は、感染の重さと患者自身の免疫系の一般状態に依存するが、通常、体重１ｋgあたり約０．１〜２００ｍgの抗体の範囲であり、１ｋgあたり０．５〜２５ｍgの用量が好ましい。本発明の組成物は、生命を脅かすまたは生命を脅かす恐れのある重篤な病状において使用することができる。そのような場合、実質的に過剰量のこれら抗体を投与することが可能であり、処置を行う医師が望ましいと感じるかもしれない。
【００７６】
予防的適用では、本抗体またはそのカクテルを含有する組成物を、ＨＩＶにはまだ感染していないが、最近ウイルスに最近さらされたかもしれないまたはさらされたと考えられる、またはさらされる危険性のある（例えば、ＨＩＶ感染した人の新生児）、またはＨＩＶにさらされたもしくはされされたと推定された直後の患者に投与する。組成物をＨＩＶ感染した妊娠した女性に投与する場合には、分娩前に１回または複数回投与して、母体の血液中のＨＩＶ感染性を減少させ、これによりＨＩＶ新生児へのＨＩＶ伝染の危険性を減らすことができる。危険性のある新生児を処置してＨＩＶを含む危険性をさらに減らすこともできる。「予防上効果的な用量」であると定義される量は、通常、体重１kgあたり０．１ｍg〜２５ｍgの範囲であり、患者の健康状態と一般的な免疫レベルに依存する。
【００７７】
さらに、本発明の抗体は標的特異的な担体分子として使用することができる。抗体をトキシンに結合してイムノトキシンを形成するか、放射性物質または薬剤と結合させて放射性医薬品または医薬品を形成することができる。イムノトキシンおよび放射性医薬品を製造するための方法はよく知られている（例えば、Cancer Treatment Reports 68：317 (1984)参照）。本発明の抗体のヘテロ凝集体およびヒトＴ細胞活性化因子、例えばＴ細胞上のＣＤ３抗原またはＦｃガンマレセプターに対するモノクローナル抗体は、Ｔ細胞またはＦｃガンマを有する細胞（Ｋ細胞または好中球のような）が抗体依存性の細胞介在性細胞溶解（ＡＤＣＣ）によってＨＩＶ感染細胞を殺傷することを可能にし得る。そのようなヘテロ凝集体は、例えば 本明細書の一部を構成する Karpowsky ら, J. Exp. Med. 160： 1686（1984）に記載のように、異種二官能性試薬Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネートを用いて、抗ＨＩＶ抗体を抗ＣＤ３抗体に共有結合的に架橋するこにより構築し得る。
【００７８】
他の抗ＨＩＶ剤、例えば３'−アジド−３'−デオキシチミジン、２'，３'−ジデオキシシチジン、２'，３'−ジデオキシ−２'，３'−ジデヒドロシチジンなども製剤中に含有させることができる。
【００７９】
抗体組成物に加えて、本発明のペプチドを含有する組成物をＨＩＶ感染した人の治療的および予防的ワクチン投与のために投与することができる。治療的な適用については、場合により上記のように修飾された単離されたペプチドとして、または上記のように処理したＨＩＶタンパク質中に含まれ、望ましくはさらに免疫原性を刺激するためＭＤＰ微粒子に結合させたペプチドを含む組成物を、ＨＩＶに感染した患者に投与する。投与するペプチドの量は、患者の免疫系によって以前は認識されなかった機能的なＨＩＶエピトープに対する抗体産生を刺激し、その結果刺激された抗体が感染を阻止するように選択する。予防的的な適用では、微粒子ＭＤＰに結合させたペプチドの組成物をＨＩＶに感染していない人に投与して、それを投与しなければ認識されないようなエピトープに対する抗体の産生を刺激し、将来の感染に対して保護的な機能を与える。
【００８０】
抗体および抗原の予防および診断的使用
抗体および、それによって認識され本発明において開示されるエピトープは、ＨＩＶ感染の診断および管理にも有用である。典型的には、抗体および／またはその各抗原を使用する診断的アッセイは、抗原−抗体複合体の検出を必要とする。数多くのイムノアッセイ形態が記載され、この目的のために標識されているかまたは標識されていない免疫化学物質が使用されている。標識されていない場合、抗体は、例えば凝集アッセイ、抗体依存補体介在性細胞溶解アッセイ、および中和アッセイにおいて使用される。標識されていない抗体は、他の、標識された一次抗体と反応する抗体（二次抗体）、例えば免疫グロブリンに特異的な抗体と組み合わせて使用することができる。標識されていない抗体は、サンドウィッチタイプイムノアッセイなどにおいて、同じ抗原上の非競合的エピトープと反応する標識された抗体と組み合わせて使用するか、または標識された抗原と組み合わせて使用することができる。別法として、抗原を直接標識して競合的および非競合的イムノアッセイの両方において使用することができる。これらのアッセイのタイプおよび形態は、当分野でよく知られている。様々な標識が使用できる。例えば、放射性同位体、蛍光タグ、酵素，酵素基質，酵素コファクター，酵素阻害剤，リガンド（特にハプテン）など。数多くのタイプのイムノアッセイが可能であり、例として、米国特許第３,８１７,８２７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号に記載されているものが含まれる。
【００８１】
通常、本発明の抗体およびペプチドを酵素イムノアッセイにおいて利用する。ここで、例えば、目的の抗体またはその各々の抗原を酵素に結合させて、生物学的試料、例えばヒトの血清、唾液、精液、膣分泌物、ウイルス感染した培養細胞懸濁液などにおけるＨＩＶ抗原の検出において最大の感受性と選択性が得られるようにイムノアッセイを構成する。
【００８２】
ＨＩＶ感染またはＨＩＶ抗原の存在の検出に使用するための目的の抗体とともに使用するためのキットも設計することができる。そのキットは、場合によりＨＩＶの他のエピトープに特異的な更なる抗体と結合させた本発明の抗体を含んでいる。標識に結合させることができ、固体の支持体例えばマイクロタイタープレートウェルまたはポリスチレンビーズの表面などに結合しないかまたは結合することができる抗体は、Tris、リン酸塩、炭酸塩などの緩衝液、安定化剤、殺生物剤、ウシ血清アルブミンなどの不活性タンパク質と共にキットに含まれている。一般に、これらの物質は、活性な抗体の量に対して約５重量％未満で存在し、通常は抗体濃度に対して総量で少なくとも０．００１重量％存在する。しばしば、不活性な増量剤または添加剤を含有させて活性成分を希釈することが望ましい。ここで添加剤は、組成物全体の約１〜９９重量％で存在し得る。抗体に結合可能な第２抗体を使用する場合、第２抗体を通常別のバイアルに入れる。第２抗体は典型的に標識に結合し、上記の抗体製剤と同様の方法で製剤化する。抗体によって認識される目的のエピトープは、標識されていても標識されていなくてもよく、支持体へペプチドを結合し、支持体の表面からペプチドを延長するために使用することができるスペーサーアーム、アミノ基またはシステイン残基の付加などの修飾がなされているかまたはなされていない大きなタンパク質（合成，組換えまたは天然の）の一部として提供し得る。そのような修飾を用いて、抗体との免疫反応性を最適化するように配置されたエピトープを得る。そのようなペプチドを、上記のエピトープ含有タンパク質と同様の方法で製剤化する。
【００８３】
様々な生物学的試料における、ＨＩＶ抗原またはウイルス全体の検出は、ＨＩＶによる現在の感染の診断、治療に対する応答の評価、感染細胞の計数、ＨＩＶ株（クレード）の血清タイピング、一次感染、進行および合併症例えば末梢神経障害、多源性白質脳症，およびカポジ肉腫などに関連する毒性因子の同定と定量において有用である。生物学的試料には、血液、血清、唾液、精液、組織生検試料（脳、皮膚、リンパ節、唾液など）、培養細胞上清、破壊された真核および細菌発現系などを含むがこれに限られない。ウイルス、ウイルス抗原、毒性因子、および血清タイピング決定因子の存在は、抗体と生物学的試料を、免疫複合体形成を誘導する条件下でインキュベーションした後、複合体形成を検出することにより試験する。ひとつの態様では、一次抗体、典型的には標識に結合させた一次抗体に結合することが可能な第２抗体の使用によって複合体形成を検出する。第２抗体は、上記の一次抗体製剤について記載した方法と同様の方法で製剤化することができる。別の態様では、抗体を固相支持体に結合させた後、生物学的試料と接触させる。インキュベーション工程の後、標識した抗体を加えて結合した抗原を検出する。別の態様では、抗体を検出標識に結合した後、細胞または組織断片などの生物学的試料とのインキュベーション工程の後、試料をフローサイトメトリーまたは顕微鏡検査法により抗原について調べる。
【００８４】
合成ペプチドの調製および使用
本発明のペプチドは、ペプチドにアミノ酸置換を導入することによって修飾することができる。置換は、１またはそれ以上のアミノ酸を変更して異なるレトロウイルス株のエピトープをより効果的に模擬するため、または免疫またはワクチン投与に使用した場合に免疫学的応答またはエピトープとのＭＨＣ相互作用を増強し模擬されたエピトープのより大きな免疫原性をもたらすために望ましいであろう。さらに、ある種のアミノ酸置換を行ってペプチドの化学的安定性を増強することが望ましいであろう。
【００８５】
より具体的には、本発明で使用されるポリペプチドは、ＨＩＶの少なくとも１つの株のタンパク質と免疫学的競合をもたらすことが可能である限り、いずれかの特定のＨＩＶポリペプチド配列と同一である必要はない。したがって、目的のポリペプチドは、そのような変化がペプチドの望ましい活性を増強し得る、保存または非保存的な、挿入、欠失および置換などの様々な変化に付することができる。保存的置換は、中性、酸性、塩基性、および疎水性アミノ酸などのグループ内の類似のアミノ酸による置換である。そのようなグループ内の置換の例には、gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；phe、tyrが含まれ、 metは含まれない。分子モデリングソフトウエアをＨＬＡアロタイピングデータベース分類（ＤＮＡおよび血清学的）に適用することによって得られた更なるアミノ酸置換を示す：
【表２】
2009080118.tif 000018
本発明の好ましい態様では、目的のペプチドのより親水性である末端の親水性残基およびそのペプチドのより疎水性である末端の疎水性残基を置換するようにアミノ酸修飾を行う。そのような置換は両親媒性らせんの形成をもたらす。Ｄ異性体における置換されたアミノ酸をブラケットエピトープに使用してエピトープを保護および安定化し、エピトープの免疫原性を増強することができる。Ｄ−アミノ酸は細胞内酵素によっては開裂しないので、このような部分は、適当な部位に挿入されたときにＭＨＣ分子と相互作用するための望ましい長さのペプチドエピトープを与える。これについては、以下の実施例８．５に詳細に記載する。
【００８６】
通常、修飾された配列は、ヒト免疫不全レトロウイルスの少なくとも１つの株の配列と約２０％を超えて異なることはない。しかし、本発明のペプチドを便利に固相の支持体に固定化し、巨大分子に結合し、または修飾されてＭＨＣ結合および提示を変化または増強することにより免疫原性を増大させることができるような「アーム」を与えるために、更なるアミノ酸が一方または両方の末端に付加される場合は除く。アームは、１個のアミノ酸または５０またはそれ以上のアミノ酸を含むことができ、典型的には１〜１０個のアミノ酸の長さである。
【００８７】
チロシン、システイン、リシン、グルタンミン酸またはアスパラギン酸等のアミノ酸を、ペプチドまたはオリゴペプチドのＣ−またはＮ−末端に導入して、結合のための有用な機能を与えることができる。システインは他のペプチドへの共有結合カップリングを容易にするため、または酸化によるポリマーの形成に特に好ましい。
【００８８】
さらに、ペプチドまたはオリゴペプチド配列は、安定性、支持体または他の分子への連結または結合のための増加した疎水性、重合化をもたらす、末端のＮＨ２アシル化（例えばアセチル化）、チオグリコール酸アミド化、または末端カルボキシアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンによる）によって修飾されている配列によって、天然の配列と異なっていてもよい。
【００８９】
このように、例えば、本明細書に開示したペプチドの好ましい態様では、１またはそれ以上のシステイン残基、または１またはそれ以上のシステイン残基をスペーサーアミノ酸との組み合わせを、ペプチドの末端に付加することができる。個々のペプチドが望ましい場合は、グリシンは特に好ましいスペーサーである。ペプチドの多重ペプチド反復が望ましい場合は、リシンコアのペプチドを合成して４価のペプチド反復を形成することができる。その形態を例として示す。酸化的重合に使用するための好ましいペプチドは、そこで少なくとも２つのシステイン残基が望ましいペプチドの末端に付加されているペプチドである。2つのシステイン残基がペプチドの同じ末端に存在している場合、好ましい態様は、システイン残基が１〜３のスペーサーアミノ酸残基、好ましくはグリシンによって隔てられている場合に存在する。システイン残基の存在は、ペプチドのダイマーの形成を可能にし得、そして／または生成したペプチドの疎水性を増加し得て、固相または固定化されたアッセイシステムにおいてペプチドの固定化を容易にする。末端アミノ基をアシル化するため、または数多くのエピトープを含むポリマーを形成するために２つのペプチドまたはオリゴペプチドまたはその組み合わせをジスルフィド結合またはより長い連結によって連結するための、多重反復ペプチド反復などを構築するための最初のアミノ酸として使用されるシステインまたはチオグリコール酸のメルカプト基の使用は特に興味がある。そのようなポリマーは増加した免疫学的反応という利点を有する。種々のペプチドが免疫に望ましい場合、それらを個別に構築してカクテルとして組み合わせ、種々のＨＩＶ単離物のいくつかの抗原決定基と免疫反応する抗体を誘導する更なる能力を得る。抗原性ポリマー（合成マルチマー）の形成を達成するために、ビス−ハロアセチル基、ニトロアリールハライドなどを有する化合物を用いることができ、ここで試薬はこれらの基に特異的なものである。ペプチドまたはオリゴペプチドの１または２のメルカプト基の間の連結は、単結合または少なくとも２またはそれ以上の炭素原子の連結基であり得る。
【００９０】
巨大分子担体への連結ペプチド
目的のペプチドを用いて、可溶性の巨大分子（例えば、５kDal未満でない）担体に連結することができる。便利には、担体は、ヒトの血清において抗体が出会いそうにない天然のまたは合成のポリ（アミノ酸）であり得る。そのような担体の例は、ポリ−Ｌ−リシン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、チログロブリン、ウシ血清アルブミンのようなアルブミン、破傷風トキソイドなどである。担体の選択は、おもに抗原について意図される究極的な使用および便宜性および入手可能性の１つに依存する。好ましい態様では、担体は、合成するかまたはProprionibacterium acini などのある種の細菌から単離することができるグリコペプチドの多重反復を含む微粒子である。この微粒子は、マルチマー形態を生じる広く架橋したムラミルジペプチドから構成される。
【００９１】
ムラミルジペプチドが Proprionibacterium acini または関連する生物から単離される場合、株の選択は有用であり、選択は細菌細胞壁の化学分析に基づく。好ましい態様は、Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミンからなるジペプチドと広く架橋したムラミルジペプチドである。
【００９２】
予備実験から種の間の相違が同定されており、ジペプチド組成およびペプチド長が変化している。高濃度の脂質ＡおよびＯ−アシル化βミリステートの単離物は、細胞壁の成分である。予備実験は、これらの違いが毒性の増加とアジュバント効果の減少に関与することを示した。好ましい態様の種の選択とその精製を、以下の実施例４に記載する。
【００９３】
ＭＤＰ微粒子は、当分野で知られている手法を用いることにより合成することができる。ＭＤＰが強力な免疫刺激剤であり、かなりの毒性を有することはよく定着している。ＭＤＰ毒性を減少させる多くの試みは、リポソームまたは他の関連する化合物内へのＭＤＰ取りこみまたは末端基の修飾などの、放出を遅延させる手法を用いていた。化学的修飾は望ましいアジュバント効果の著しい減少をもたらし、送達速度を変化させる設計は制御が困難であった。例として、ＭＤＰ微粒子の形態、サイズパラメーター、および抗原送達結合法を以下に記載する。微粒子形態からの脂質の除去は、ＭＤＰの抗原提示細胞（ＡＤＰ）による迅速なインターナリゼーションを容易にする。抗原提示細胞は主に単球系統のものであり、単球、マクロファージ、組織球、Kuffer細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞等が含まれ、ＭＨＣ関連事象による抗原プロセシングと抗原提示にあずかっている。外来のタンパク質に対する免疫応答の展開に寄与する因子は、アミノ酸配列および微小的環境でプロテアーゼ開裂を受けやすい配列によって部分的に決定することができる。成功する免疫応答は、好ましくはアミノ末端に疎水性末端と、カルボキシ末端に最もよくみられる親水性アミノ酸を有する、両親媒性のらせんを形成するペプチドに最も頻繁に観察される。プロテアーゼ分解に耐性であり、両親媒性のらせん配列を形成する配列形態は、強力な免疫原であることが多い。配列中にプロリンを含む残基は、らせん形成を阻止することによって一般に免疫原性が低く、グリコシレーション部位はあまり望ましくなく、ペプチドエピトープを標的とする応答が阻害されることが多い。宿主動物において成功する免疫学的応答をもたらす抗原投与は、ＭＨＣ関連事象を経由する抗原のプロセシングと提示を必要とする。外来の抗原は、エンドソームへのインターナリゼーションの後に、おもに抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってプロセシングされる。この酸性環境下で存在し反応するカテプシンＤなどの酵素によるタンパク質加水分解の後、上記の基準を満足するペプチド断片が、ＭＨＣクラスＩＩと会合し細胞表面に提示される。ペプチドが十分な密度で提示されたら、免疫事象が起こる。免疫応答のタイプは、ＡＰＣあたりのペプチドの密度、微小的環境、サイトカイン環境、および抗原提示細胞によって最初に刺激されたリンパ球のタイプによって決定される。インターナリゼーションの後、微小的環境を改変し免疫事象を誘導する条件を確立するサイトカイン応答のカスケードが誘導される。
【００９４】
例として、以下の実施例5に示すように、独特のＭＤＰ微粒子（０．０１〜０．２ミクロン）を、免疫原性が乏しいが慣用の方法を用いて観察されないエピトープに対する免疫応答をもたらす抗原提示細胞に免疫原を送達するために使用する。
これら免疫応答の定量は、他のアジュバントと比較して１０〜１００倍の抗体濃度の増加を示す。
【００９５】
免疫原として使用する目的のペプチドを、目的のペプチドのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかを使用して、ムラミルジペプチドのカルボキシ末端アミノ酸部分に、または実施例に開示するように炭水化物部分のアルデヒド酸化生成物に連結する。ＭＤＰ微粒子につき、少なくとも１分子の目的のペプチド、好ましくはＭＤＰ微粒子につき１０〜１００分子の目的のペプチド、および最も好ましくはＭＤＰ微粒子につき１００〜１０００の目的のペプチドが存在するであろう。したがって、担体のサイズおよび可能な連結基は、担体あたりの目的のペプチドの数に影響するであろう。
【００９６】
マクロ担体組成物は、選択的な細胞取りこみ、ペプチド半減期、およびＭＨＣ免疫学的事象を経由する抗原提示に影響を及ぼすことによって免疫原性に影響を及ぼす。１またはそれ以上の異なる目的のペプチドを同じマクロ担体に連結することができるが、好ましくは単一の目的のペプチドを１価または４価の形態でマクロ担体に結合することができる。１以上の目的のペプチドによる免疫が望ましい場合、目的のペプチドマクロ担体コンジュゲートのカクテルは、カクテルに入れた各目的ペプチドの免疫原性を最適化する割合で個々のコンジュゲートを混合することにより調製することができる。この形態では、十分なペプチドが、マクロ担体コンジュゲートにおいて利用でき（１００〜１０００ペプチド）、単一の抗原提示細胞による抗原提示を増強する。目的のペプチドの免疫原性は、開示したように巨大分子担体あたりの目的ペプチドの数、例えばアミノ対カルボキシ結合、末端アミノ酸修飾、およびスペースアーム長および組成などの提示の形態の両方を調節することによって最適化する。この形態では、抗原提示細胞による抗原プロセシングによって、高い密度、通常１００以上および最も多くの場合には５００以上のペプチドが生じ、ＭＨＣ相互作用を介して抗原提示細胞の細胞表面に提示される。この形態により、以下の実施例に示すように、有意に高い濃度の抗体が免疫後に産生する。
【００９７】
連結の形態は、ｐ−マレイミド安息香酸、ｐ−メチルジチオ安息香酸、マレイン酸無水物、コハク酸無水物、グルタルアルデヒドなどの試薬を用いる、慣用なものである。Ｎ末端、Ｃ末端またはその分子の両端の間の部位で連結することができる。ムラミルジペプチドの多重反復に関して、目的ペプチドのアルデヒド基への結合は、例えば過ヨウ素酸ナトリウムにより糖残基を穏やかに酸化した後、ホウ水素化ナトリウムなどにより穏やかに還元し、シッフ塩基中間体を安定な共有結合に変換する。微粒子あたりのペプチドの数は、酸化条件を変えることによって制御し、放射性トレーサーを用いることにより定量することができる。これらの方法は、当分野でよく知られている。結合方法および結合形態は、所望の応答を達成するために必要に応じペプチドごとに変わり得る。
【００９８】
当業者によく知られている様々なアッセイプロトコルを、レトロウイルスタンパク質エピトープに対する各々の抗体の存在を検出するため、または複合タンパク質混合物におけるレトロウイルスタンパク質を検出するために使用することができる。特に興味があるのは、本明細書に開示した新規アッセイであり、該アッセイでは目的のペプチドを西洋ワサビペルオキシダーゼなどの検出標識に共有結合し、１つまたは複数のエピトープを発現する天然のＨＩＶタンパク質を直接または間接的に固相の支持体に結合する。この形態では、ペプチドエピトープを認識する抗体は固相上のエピトープと標識上のエピトープを架橋する。この方法により、ＨＩＶに対する抗体のエピトープ反応性を測定することができ、標識に結合したペプチドを変えることにより定量することができる。ＨＩＶ血清型、毒性因子または他のＨＩＶ特性に関連するペプチドエピトープは、本明細書に開示し、例として記載した１段階の競合イムノアッセイによって、これらのエピトープを発現しているいずれかの試料において同定および測定することができる。
【００９９】
イムノアフィニティー精製法における抗体およびその各エピトープの使用
ＨＩＶタンパク質およびこれらエピトープを含む精製されたタンパク質に含まれるエピトープに特異的な抗体は、これらのエピトープを含むタンパク質およびペプチドおよびそれらと反応する抗体のイムノアフィニティー精製における使用に特に有用である。一般に、抗体は１０８〜１０１２Ｍのオーダーのアフィニティー会合定数をを有する。そのような抗体を使用して、目的のエピトープを含むタンパク質およびペプチドを精製することができる。しばしば、遺伝的に修飾された細菌を使用してＨＩＶタンパク質を製造することができ、発現したタンパク質が分泌される場合は目的の組換え融合タンパク質を組換え発現系の培地から、または発現したタンパク質が分泌されない場合は破壊した生物学的発現系の成分から、またはその混合物のいくつかまたは１つの成分がＨＩＶ上のエピトープを模擬しているエピトープを含んでいる、タンパク質の複合的な生物学的混合物から精製することができる。一般に、ＨＩＶエピトープと反応することができる抗体を、基質または支持体上に結合させるかまたは固定化する。次いで、エピトープを含有する溶液を、抗体とエピトープを含むタンパク質との間の免疫複合体の形成に適当な条件下で、固定化した抗体と接触させることができる。結合しなかった物質を結合した免疫複合体から分離し、結合したタンパク質を固定化した抗体から遊離させて溶出液中に回収する。
【０１００】
同様に、ＨＩＶのエピトープを含むタンパク質またはペプチドまたはＨＩＶのも模擬エピトープを、基質または支持体に結合または固定化し、目的の抗体を溶液から単離するために使用することができる。抗体を含有する溶液、例えばアルブミンが除去された血漿などを、所望のエピトープを含む固定化したペプチドまたはタンパク質のカラムに通し、免疫複合体を形成させた後、結合した免疫複合体から反応しなかった抗体を分離し、抗体を溶出緩衝液により遊離させ、溶出液中で回収する。これは、ＨＩＶのエピトープを模擬しているがＨＩＶに系統進化的に関連性のない供給源に由来するエピトープを含むタンパク質の精製において特に価値がある。
【０１０１】
典型的には、抗体を高度免疫血清から粗精製する。腹水または培養細胞上清およびＨＩＶエピトープを模擬するエピトープを含むタンパク質またはペプチドを、支持体に結合させる前に、成人および胚の両方に由来する体液、血液、血液成分、細胞抽出物、組織抽出物、および培地上清、培養細胞の抽出物、毒素、および組換え融合産物などであるがこれらに限られない生物学的な供給源から粗精製する。そのような方法は、当業者によく知られており、高濃度での中性塩による分画を含むことができる。イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、調製用ゲル電気泳動、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの他の精製方法もまた、免疫吸着剤としてそれを使用する前に使用して調製物の純度を上げることができる。粗精製された抗体調製物を、反応性エピトープまたはそのエピトープを含むタンパク質が結合した支持マトリックスと反応させることにより、所望なら、アフィニティー精製された抗体を調製し得る。
【０１０２】
特に興味があるのは、天然に系統進化的に模擬されたＨＩＶエピトープに対する抗体である。そのような抗体は治療剤として有用であり、ＨＩＶタンパク質の精製、および配列の位置および機能に関するＨＩＶタンパク質のマッピングが可能になり、ＨＩＶを研究する為に有用である。そのような抗体は、ＨＩＶに由来するタンパク質／ペプチドによる免疫、および生じた高度免疫ポリクローナル多価抗血清と上記のように支持体に固定化した胚タンパク質、毒素、および非ＨＩＶ微生物／ウイルス成分などの非ＨＩＶ供給源に由来するタンパク質／ペプチドとを反応させることにより精製したイムノアフィニティー精製によって製造することができる。得られたイムノアフィニティー精製された抗体は、ＨＩＶおよびその免疫精製のために使用された系統進化的に関連のないタンパク質により共有される１または複数のエピトープに対してエピトープ特異的である。これらのエピトープ特異的抗体は、ＨＩＶおよび非ＨＩＶ由来両方のタンパク質およびペプチドのイムノアフィニティー精製において特に有用である。そのような抗体を使用して、ＨＩＶにおけるエピトープの位置をマッピングし、その配列を決定し、ＨＩＶのライフサイクルにおける機能的な重要性、ＨＩＶのクレードおよび他のレトロウイルスにおけるその分布、ＨＩＶ毒性との関連について調べることができ、ヒトに対して非毒性であるがＨＩＶのライフサイクルにおける重要な機能を中和する場合、そのような抗体をＨＩＶ感染を処置するために使用することができる。
【０１０３】
抗体またはエピトープがそれに望ましく固定化されるような支持体は、以下の一般的特性を有する：（ａ）一般に非特異的結合を最小化するタンパク質との弱い相互作用、（ｂ）高分子量物質の流動を可能にする良好な流動特性、（ｃ）抗体またはエピトープの化学的連結を可能にするために活性化または修飾し得る化学的基を有すること、（ｄ）抗体を連結するために使用する条件における物理的および化学的安定性、および（ｅ）抗原の吸着および溶出に必要な緩衝液の条件および濃度に対する安定性。一般に使用される支持体は、アガロース、誘導体化ポリスチレン、ポリサッカライド、ポリアクリルアミドビーズ、活性化されたセルロース、ガラスなどである。抗体および抗原の支持基材への結合のための様々な化学的方法が存在する。一般に、Cuatrecasas P.,Advances in Enzymology 36：29 (1972)参照。本発明の抗体および抗原は、支持体に直接か、あるいはリンカーまたはスペーサーアームを介して結合することができる。抗体および抗原のクロマトグラフィー支持体への固定化に必要な一般的条件は当分野においてよく知られている。例えば、本明細書の一部を構成するTijssen, P.,1985，Practice and Theory of Enzyme Immunoassay を参照。実際のカップリング法は、カップリングする抗体または抗原の特性およびタイプに少しばかり依存する。結合は典型的に共有結合によって起こる。
【０１０４】
免疫血清、抗体に富む腹水または培養上清、ＨＩＶウイルスの抽出物またはリゼート、培養した生物学的発現系に由来する上清または抽出物、破壊した細胞組織または血液成分（成人または胚）の懸濁液に由来する上清または抽出物または他の複合タンパク質混合物、例えば唾液、体液またはエピトープを含む培養産物などを、次に適当な分離マトリックスに加える。混合物を、抗原抗体結合が起こるに十分な条件下と時間で、通常少なくとも３０分間、より一般的には２〜２４時間インキュベーションする。次いで、特異的に結合した抗体またはエピトープを含む固定化された免疫複合体を、複合混合物から分離し、吸着緩衝液でよく洗浄して結合しなかった汚染物質を除く。次いで、免疫複合体を、特定の支持体、結合したタンパク質、および溶出タンパク質に適合する溶出緩衝液で解離させる。溶出タンパク質、抗原、または抗体を溶出液中で回収する。溶出緩衝液および方法は当業者によく知られている。抗体によって認識されるエピトープを含むペプチドを溶出緩衝液において使用して抗体結合部位について競合させることができ、溶出を温和な溶出条件下で行うことができる。選択的に吸着したタンパク質は、緩衝液の pＨおよび／またはイオン強度を変化させることによってまたはカオトロピック剤によってアフィニティー吸着剤から溶出することができる。溶出緩衝液の選択、その濃度およびその他の溶出条件は、抗体−抗原相互作用の特性に依存し、一度決定したらあまり変えてはならない。
【０１０５】
低いまたは高い pＨまたはイオン強度の緩衝液またはカオトロピック剤を免疫複合体の解離に使用する場合、溶出したタンパク質を生理学的 pＨおよびイオン強度に調節する必要があるかもしれない。そのような調節は、透析またはゲル濾過クロマトグラフィーにより行うことができる。これらの方法はまた、溶出したタンパク質がその天然のコンフォメーションを回復することを可能にする。
【０１０６】
上記の方法により、例えば、ＨＩＶのエピトープまたは模擬エピトープを含む実質的に精製されたタンパク質およびそのエピトープと反応する抗体が得られる。精製されたタンパク質は典型的に５０％以上純粋、より一般的には少なくとも７５％純粋、および多くの場合９５％〜９９％以上純粋である。
【０１０７】
例として本発明を記載する以下の実験の記載から、本発明のその他の特徴および利点が明らかとなろう。実施例によってさらに本発明の方法が説明されるが、本発明の限定をなんら意味するものではない。
【実施例】
【０１０８】
実施例１
ヒトおよびヤギの免疫反応の間のＨＩＶエピトープの相違のマッピングに使用するためのヒト抗ＨＩＶ抗体（ＩgＧ画分）プールの調製
ＨＩＶ感染した患者由来のヒト血清は、患者の承諾、患者が署名したインフォームドコンセント、医師の承認および地域のＩＲＢの承認を得、地域診療所から得た。すべての血清は、始めにAbbott Laboratoriesから商業的に入手可能な試験キットを用いて１：１０の希釈率でＨＩＶ感染についてスクリーニングした。高い反応性を有する血清（１よりも大きい吸光度の試験結果によって任意に定義した）をさらにウェスタン・ブロット分析により調べ、大部分のＨＩＶタンパク質（ｅｎｖ、ｇａｇおよびｐｏｌ）に対する抗体反応性を有する血清を同定した。所定の大部分のＨＩＶタンパク質に対し良好な反応性を示した患者の血清をさらにミクロカルチャー中和分析によってさらに調べ、ミクロカルチャー分析においてＨＩＶ感染性を中和するであろう血清含有抗体の特異性を同定した（全組織培養感染価（ＴＣＩＤ）中和）。ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｐ６６／５５、ｇｐ４１、ｐ２４、およびｐ１７およびｐ１０に対する高い抗体力価反応性、およびマイクロカルチャーにおける中和されたＨＩＶ感染性を有する２９人の患者の血清を同定しプールした（各２０〜４０ｍL）。プールした抗ヒトＨＩＶをさらに調べ、ＨＩＶの複数の株に対する広範な中和活性および上で詳細に記載した９つのエピトープ領域に対する高い力価の抗体が示された（ウェスタン・ブロット１：１００またはそれ以上で陽性）。慣用の方法を用いて、ヒトＩgＧをこの血清プールから精製した。精製の後、ＩgＧ全濃度を１０ｍg／ｍLに調整し、その組成および純度を標準的なイムノアッセイ法により調べた。結果は、９８％以上の純度とヒトＩgＧの組成を示した。精製された抗ＨＩＶをアリコートに分け、実験および以下に開示する方法において後に使用するために凍結した。当業者は、比較を目的とした未知の抗体または抗原に対する後の測定において使用し得る特異性を定義するために抗原および抗体プールの両方を特徴付ける方法についてよく知っているであろう。
【０１０９】
以下の実施例に記載するように、このヒト抗ＨＩＶを使用して粗製のウイルスリゼートからのＨＩＶタンパク質の精製をさらに行い、ヒトの免疫系によっておよび競合ＥＩＡにおいて認識されるＨＩＶエピトープをマッピングし、ヤギにおいて産生するがヒトにおいては産生しない抗体によって標的化されるＨＩＶエピトープを同定した。ウェスタン・ブロット分析を用いて、目的のペプチドを含有する精製されたＨＩＶタンパク質またはそのペプチドの合成形態のいずれかによって免疫されたヤギにおける抗体応答を特徴付け、弱い免疫原性ペプチドに対する免疫応答を増幅するために設計した微粒子担体複合体の効果を調べた。ＨＩＶ感染性を中和する抗体は、モノクローナル抗体をコンジュゲートした磁性粒子を使用して不要な細胞を除去する標準的な技術を用いて末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）から単離した、精製されたヒトＣＤ４リンパ球を使用するミクロカルチャー法によって調べた。ＣＤ４リンパ球をミトゲンで刺激してＨＩＶ感染に対するその感受性を高め、特記しない限り、一貫してＨＩＶ感染の宿主標的として使用した。ＨＩＶ１SF2は、特記しない限り一貫して参照ＨＩＶ株として用いた。ＨＩＶ感染性に対する抗体の効果を、当業者によく知られた技術を用いるミクロカルチャーによって測定した。感染性を感染単位（ＩＵ）として示す。抗体が介在するＩＵの減少はウイルス感染性の中和に関連し、感染単位の変化として示される。ヒト抗ＨＩＶプールは、ヒト抗ＨＩＶ抗体を必要とする本明細書に記載したすべての実験を通して使用した。このヒトＩgＧ抗ＨＩＶプールを、いくつかの商業的に入手可能なヒト抗ＨＩＶ調製物と比較し、ＨＩＶ中和活性は同等かまたはより高かった。ウェスタン・ブロット解析によって比較した場合、反応性は有意により高いものであった。
【０１１０】
実施例２
本明細書中で使用する商業的に入手可能なＨＩＶウイルスリゼートのキャラクタリゼーション
ＨＩＶ１MN，ＨＩＶＢＡＬ，ＨＩＶ２NZを、Advanced Bio-Technology,Inc.Columbia,MDから、精製されたウイルスリゼートの形態で購入した。これら精製されたウイルスリゼートの分析によって、全タンパク量が０．８ｍg／ｍL〜１．２ｍg／ｍLの範囲でロットごとに相違していることが示された。各ＨＩＶリゼートのタンパク組成を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヒトＩgＧ抗ＨＩＶによるウェスタン・ブロット解析によって調べた。ＨＩＶリゼートをプロテアーゼ阻害剤および Nonidet P-40またはIgepal CA630などの非イオン性界面活性剤（１．０％ｖ／ｖ）で処理し、ＨＩＶタンパク質および糖タンパク質をモノマー形態に完全に解離し、０．２２ミクロンのフィルターによる濾過により透明化した。脂質を、標準的な方法を用いてSeroClearにより除去した。ＨＩＶは、発芽過程の一部として、ヒトのタンパク質をそのエンベロープ内に取りこむことが当業者によく知られている。一度同定されたそのような汚染物質をイムノアフィニティークロマトグラフィーによって除去した。最初の精製段階において、細胞増殖を促進するために加えた増殖培地に存在する血清の汚染物質およびＨＩＶリゼート中の汚染物質を、抗正常ヒト血清セファロースＣＬ６Ｂ（２〜３ｍg抗体／ｇセファロース）を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーにより除去した。ＨＩＶリゼートのクロマトグラフィーは、１：１体積／体積のマトリックス対リゼート比で、１０ｍL／時間の流速にて行った。クロマトグラフィーおよび溶出を、分光光度計により２８０ｎｍの波長で監視した。ＨＩＶ関連タンパク質を含むタンパク質に富む結合しなかった画分を１ｍgタンパク質／ｍLに濃縮し、将来必要なときの使用のために−７０℃で保存した。アフィニティーマトリックスに結合したタンパク質を、０．９％ＮaＣl中の pＨ２．２のグリシン−ＨＣl緩衝液で溶出した。溶出液を中和し、０．１％ Igepal CA630を含む pＨ７．８のＰＢＳ中で透析し、濃縮して、将来の分析のために−７０℃で保存した。精製されたＨＩＶ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにウェスタン・ブロットは、ヒト抗ＨＩＶＩgＧを用いて、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｐ６６／５５、ｇｐ４１、ｐ１０、ｐ２４、ｐ１７およびｐ７の存在を一貫して示した。ＨＩＶタンパク質は、ウェスタン・ブロットを用いるとグリシンＨＣl溶出液中には検出されなかったが、タンパク質の視覚化のためにクーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル染色は、２、３本の弱く染色されたバンドを示した。
【０１１１】
部分的に精製されたＨＩＶリゼートに対して産生した抗ＨＩＶ抗体のキャラクタリゼーション
ヤギ（ｎ＝２）は、上で得られた精製したＨＩＶタンパク質で免疫し、ＨＩＶ上の免疫優性エピトープと反応する抗体により免疫学的に応答した。この抗血清をさらに調べると、ＨＩＶ感染したおよび感染していないＣＤ４＋リンパ球の両方と反応する細胞毒性抗体の存在が示され、赤血球細胞（ＲＢＣ）凝集素が検出された。これらの凝集素をすべてのヒトＲＢＣ血液型およびウサギおよびモルモット由来のＲＢＣ血液型と反応させた。これらの不用な抗体特異性について２つの可能性が考慮された。１つの可能性は、培養細胞由来のタンパク質を含むＨＩＶリゼートからの汚染であり、第２の可能性は、ＨＩＶタンパク質／糖タンパク質とヒトおよび他の動物種においてみられる糖タンパク質との間の模倣性である。宿主の膜タンパク質が、ＨＩＶのエンベロープにおいてしばしば同定されていることはよく知られている。ＨＩＶのエンベロープ内への宿主膜成分の取りこみは、非特異的であり、成熟ビリオンの発芽に関連していると考えられている。成熟ビリオンエンベロープにおいて以前に同定された２つのこのようなタンパク質は、ヒトＨＬＡクラスＩとクラスＩＩ抗原である。ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ抗原の両方を、酵素結合イムノアッセイを用いて定量し、結果は、これらＨＩＶ調製物において、感染していない培養細胞に由来する細胞膜調製物において測定される濃度に対し不均衡な濃度でのＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ両方の存在が示された。更なる実験により、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ抗原の存在が、ＨＩＶウイルスリゼートの種々の調製物（ｎ＝１７）において確認された。これら調製物において測定された濃度は、変化し得るが、感染していない対照の細胞に由来する膜抽出物において測定される濃度よりも一貫して１０〜１００倍高かった。ヤギ抗ＨＩＶ抗体を、既知のＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ単離物に対するウェスタン・ブロット解析により試験し、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩ（αおよびβ鎖）およびβ２ミクログロブリンに対する抗体特異性を含んでいることを確認した。この抗体を、ＨＬＡアロタイプ特異性について調べた。既知のアロタイプのリンパ球を含む市販のトレイを標的として用いた。分析条件下で、この抗体は、すべてのリンパ球に対して細胞毒性であり、この細胞毒性は、特に、可溶性のＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩによって用量依存的に阻害された（表２．１）。
【表３−１】
2009080118.tif 000019
可溶性クラスＩおよびＩＩを、抗ＨＩＶ抗体を含むマイクロタイターウェルに加え、４℃で一晩インキュベーションした。可溶性ＩおよびＩＩは免疫細胞傷害性を減少させたが、５０μｇ以上の濃度でそれ以上の効果はなかった。
【０１１２】
更なる実験によって、ｇｐ１２０、ヒト赤血球および白血球細胞、およびウサギ、ラット、およびモルモットを含む異なる動物種に由来する赤血球細胞上に存在する系統進化的に保存された炭水化物抗原と反応する抗体が示された。ヒトおよびウサギ赤血球細胞による吸収試験は、Ｓ−ＨＬＡ−ＩおよびＩＩによる吸収の後に残存する、ＲＢＣ（表２．２）およびリンパ球（表２．１）の両方に対する抗体活性を完全に除去した。
【表３−２】
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*精製されたＨＩＶリゼートに対して産生した抗血清は、免疫後、ヤギにおいて産生したＲＢＣ凝集素を生じた。ヤギ（それぞれｎ＝２）は、それぞれＨＩＶ１MNおよびＨＩＶ１BALおよび／またはＨＩＶ２NZで免疫した。
【表３−３】
2009080118.tif 000021
*２０週目の血液採取日でグリコシダーゼ処理なしでＨＩＶに対して抗血清を産生させ、０〜５倍の赤血球細胞で吸収させ、リンパ球細胞毒性についてリンパ球を試験した。
【０１１３】
ＨＬＡおよび赤血球凝集素に対する抗体特異性の吸収および除去の後、ヤギ抗ＨＩＶ抗体が、文献に既に記載されたのと同様の特異性を含むことが同定された。この情報は、ＨＩＶタンパク質を修飾して炭水化物およびＨＬＡ抗原を除去してヒト抗原を標的とする細胞毒性抗体の生成を回避する必要性を示した。
【０１１４】
実施例３
ＨＩＶリゼートから単離されたＨＩＶタンパク質の精製、クラスＩおよびクラスＩＩ抗原除去および炭水化物除去
ＨＩＶ１MN、ＨＩＶ１BALおよびＨＩＶ２ＭＺのＨＩＶリゼートを Advanced Biotechnologies，Columbia，MDから購入した。それらは、タンパク質を０．８〜１．２ｍgタンパク質／ｍLの範囲で含有していた。プロテアーゼ阻害剤を加えてタンパク質を分解から保護し、非イオン性洗浄剤（Igepal Ca-630、またはNonidet P-40）を加えて、ＨＩＶタンパク質を解離させた。混合物を栓をした脱脂剤を有する抽出チューブ中に入れ、脂質を除去し、混合物を透明化した。遠心後、脂質を有機層中で特異的に溶解し、水相を除去した。
【０１１５】
ＨＬＡを含む培養細胞由来の汚染物質を、以下のものの共有結合により調製された５つの分離アフィニティーマトリックスを用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーにより除去した：ヒト血清タンパク質に対するイムノアフィニティー精製されたポリクローナルＩgＧ抗体、ＨＬＡ−１に対するモノクローナルＩgＧ抗体、ＨＬＡ−２に対するモノクローナルＩgＧ抗体、β２−ミクログロブリンに対するモノクローナル抗体、リンパ球および赤血球細胞膜抗原に対するイムノアフィニティー精製されたポリクローナルＩgＧ抗体。各マトリックスは、セファロースＣL６Ｂ１ｇあたり２〜３ｍgの抗体を含んでいた。カラムをタンデム配列に配置し、マトリックスを注入し、 ０．１％の Igepal Ca-630を含む pＨ７．８のＰＢＳで平衡化した。カラムベッド体積と等体積のリゼート溶液を、各カラム中を１０ｍL／ｈの流速で順次クロマトグラフした。クロマトグラフィーおよび溶出は、分光光度計により２８０nmの波長で監視した。ＨＩＶ関連タンパク質を含むタンパク質に富む結合しなかった画分を、１ｍgタンパク質／ｍLに濃縮した。
【０１１６】
ＳＤＳを、目的のＨＩＶタンパク質を含むイムノアフィニティー精製した混合物に加え、混合物を７０℃に１０分間加熱した。タンパク質を、ＰＧＮａｓｅを用いて酵素的に脱グリコシル化した。タンパク質混合物を、０．１％非イオン性洗浄剤を含む生理食塩水であらかじめ平衡化したセファロースＧ５０を用いるサイズクロマトグラフィーにより分画した。タンパク質画分を集め、所望のＨＩＶタンパク質を含む画分を個々にプールした。ｇｐ１６０およびｇｐ１２０、ｐ５５／６５およびｇｐ４１、およびｐ２４，ｐ１７、およびｐ１０に富む３つのタンパク質プールを確保した。画分は、更なる処理を行うまで、−７０℃で保存した。
【０１１７】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の定量および除去の詳細な方法は、本明細書の一部を構成する“Identification， Characterization, and Quantitation of Soluble HLA Antigens in Circulation and Peritoneal Dialysate of Renal Patients”, F. Gelder, Annals of Surgery Vol. 213,(1991)に開示されている。
表３．１は、精製により得られたデータを示す。
【表４】
2009080118.tif 000022
上記のように精製したＨＩＶ調製物は、ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩを含む汚染物質を概して含んでいなかった。プールしたヒトＩgＧ抗ＨＩＶを用いる、精製したＨＩＶ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・ブロット解析は、一貫してｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｐ６６／５５、ｇｐ４１、ｐ１０、ｐ２４、ｐ１７およびｐ７の存在を示した。
【０１１８】
実施例４
精製されたＨＩＶによる誘導アジュバント効果のための、ＭＤＰ微粒子の生化学的およびコンフォーメション的な必要物質の調製およびキャラクタリゼーション
Proopionibacteriumu acini から単離したムラミルジペプチド（ＭＤＰ）の多重反復は、この実施例のＭＤＰミクロ担体複合体のコア構造を形成した。モノマーサブユニットの化学的要素は、
【化１】
2009080118.tif 000023
である。
【０１１９】
ＭＤＰはよく知られた免疫刺激特性を有し、それは免疫機能の増加に対する効果を測定するために設計された試験において詳細に調べられてきた。当業者は、この効果についてよく知っている。
【０１２０】
今日まで、天然の供給源から単離されたＭＤＰおよび合成ＭＤＰは両方とも、哺乳類に投与した場合に有意の毒性に関連していた。この毒性は、担体としてのＭＤＰの効果を制限してきた。
【０１２１】
毒性成分を含まないＭＤＰの単離の方法を本明細書において提供する。Proopionibacterium acini を定常中期まで培養し、洗浄して培養細菌細胞由来の汚染物質を当業者によく知られた技術を用いて除去した。細胞壁および細胞質に含まれている疎水性成分は、上昇させた温度で、逐次的に上昇させる濃度のエタノール／メタノール／水の中で順次洗浄することによって、順次抽出した。得られるＭＤＰ微粒子を１０％エタノールに懸濁し、その濃度は５４０ｎｍにおけるその吸光度を濁度標準の吸光度に対して関連づけることによって測定した。ＭＤＰ微粒子の濃度は、保存および後の使用のため、１ｍg／ｍLに調整した。
【０１２２】
この調製物の解析によって、ムラミルジペプチドが０．１〜０．２ミクロンのサイズの微粒子と広範に架橋していることが示された。末端のジペプチドアミノ結合したＬ−アラニン−Ｄ−イソグルタミンは、上に示したモノマー構造と同一であった。細菌の株の間での違いが有り得るということ、そしてこれらの違いがペプチド組成の違い、例えば５またはそれ以上のアミノ酸を有する末端ペプチド、ジペプチドアミノ酸組成の変化、特にＬ−アラニン−Ｌ−イソグルタミン、およびＯ−アシル化βミリスチン酸基が挿入されている部位を生じ得ることはよく知られている。これらは望ましくなく、天然の供給源から単離されたＭＤＰの毒性および低いアジュバント特性の原因となっている。好ましい態様では、ＭＤＰ微粒子（０．０１〜０．２ミクロン；好ましくは０．０５〜０．１ミクロン）は、アミノ結合したＬ−アラニン−Ｄ−イソグルタミンジペプチドを有している。そのような微粒子は、天然の供給源から上記のように単離するか、またはよく知られた合成方法を用いて合成することができる。
【０１２３】
実施例５
ＭＤＰ免疫原コンジュゲートの調製および予備評価
上記実施例のＭＤＰ微粒子（０．２μ）の抗体産生に対するアジュバント効果を、スルフヒドリル架橋の約２２アミノ酸を欠いている免疫原性の弱いモノクローナルヒトラムダ軽鎖断片（Ｍｒ約180,000）を免疫原（Ｉ）として用いて評価した。２つのコンジュゲートを作成した。１つが免疫原がカルボキシル末端基を介してＭＤＰに共有結合しており、もう１つがアミノ末端基を介して結合しているものであった。ＭＤＰ免疫原コンジュゲートを段階的に構築した。試薬交換は、遠心、上清の除去および必要な試薬による置換による各段階の後に行い、ＭＤＰ：免疫原構築を介して結合を連続的に続けた。各反応について示したモル比および各段階の後に行った試薬交換は、予備実験によれば、免疫抗体応答を有意に減少させる免疫原の複数点結合を阻止した。
【０１２４】
ＭＤＰ：ＮＨ２：免疫原：ＣＯ２Ｈの合成
ＥＤＣを用いるＨＩＶタンパク質とムラミルジペプチドの有効な２段階カップリングのためのプロトコル
Grabarek, Z.および Gergely, J., Anal, Biochem. 185:1331(1990)に記載されている方法から適合させた以下の方法は、ＨＩＶタンパク質を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）にさらしてＨＩＶのカルボキシルに影響を与えることなく、ＨＩＶタンパク質およびペプチドのＭＤＰへの逐次的カップリングを可能にする。この方法は、チオール化合物で最初の反応をクエンチすることを要する。反応は、２−[Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（pＨ４．５〜５．０）中で行う。
【０１２５】
ＭＥＳ（０．５ｍL）（pＨ４．５〜５．０）中で再懸濁した、水から凍結乾燥したＭＤＰ（１０ｍg）と、ＭＥＳ（pＨ４．５〜５．０）に溶解した０．５ｍLのＥＤＣ（０．５ｍg〜２ｍＭ）とを混合して、１５分間室温で反応させる。２−メルカプトエタノール（終濃度２０ｍＭ）を加えてＥＤＣをクエンチし、遠心より分離した。反応混合物をＭＥＳで１回洗浄し、０．５ｍLのＭＥＳ（pＨ４．５〜５．０）中で再懸濁した。ＭＥＳ中に溶解したヒトλ軽鎖断片を活性化したＭＤＰに約２：１のモル比で加えた。ＭＥＳ（０．５Ｍ、pＨ８．５）を加えることにより、反応物の pＨを１５分間かけて８．５にゆっくりと再生し、室温で２時間反応させた。ＭＤＰに加えたλ軽鎖断片の濃度をＭＤＰ末端ＣＯ２Ｈ基の定量解析から算出し、ＭＤＰ１ｍgあたりのＣＯ２Ｈのモル数で表した。ヒドロキシルアミンを終濃度１０ｍＭになるまで添加することにより、反応をクエンチした。このクエンチの方法は、いずれの未反応ＭＤＰ活性化部位をも加水分解し、もとのカルボキシルの再生をもたらした。クエンチの他の方法には、２０〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、リシン、グリシンまたはエタノールアミンの添加が含まれるが、これらの１級アミン含有化合物は、修飾されたカルボキシルＭＤＰを生じるであろう。ＭＤＰをＨＩＶ合成ペプチドと共に使用し、そのペプチドの疎水性を変化させるまたは生物活性化合物を結合させるなどの修飾が望ましい場合は、最終のクエンチ工程の前に、所望の化合物を加えることにより、修飾を行うことができる。これは、ＨＩＶペプチドとの最初のカップリングの後に所望の化合物を連続的に付加することを可能にする。ペプチド免疫一般性（immunogenerity）のより高い制御が望ましい場合は、生物学的に活性なペプチドを、ＨＩＶペプチドに対して所望の割合で単一の工程として加えることができる。ＩＬ２などの生物学的応答修飾剤が当業者によく知られており、この目的のために使用することができる。
遠心、洗浄工程、および選択した緩衝液中での再懸濁により、分離した。
【０１２６】
ＭＤＰ−ＣＯ２Ｈ−免疫原―ＮＨ２の調製
ＭＤＰ：ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２：ＣＯ２Ｈ：免疫原：ＮＨ２の合成
ＥＤＣを用いるタンパク質とムラミルジペプチドの有効な３段階カップリングのためのプロトコル
この方法は、タンパク質をＥＤＣにさらしてタンパク質のアミノ基に影響を及ぼすことなく、タンパク質またはペプチドをＭＤＰに連続的にカップリングさせることを可能にする。この方法は、連続的に行う２つの中間工程を用いる。最初の反応は、ＭＥＳ（pＨ４．５〜５．０）中で行う。pＨ４．５のＭＥＳ０．５ｍL中で再懸濁した水から凍結乾燥したＭＤＰ（１０ｍg）と、ＭＥＳに溶解した０．５ｍLのＥＤＣ（０．５ｍg〜２ｍＭ）を混合して、室温で１５分間反応させた。２−メルカプトエタノール（終濃度２０ｍＭ）の添加により過剰のＥＤＣをクエンチし、活性化したＭＤＰを遠心より分離し、ＭＥＳで２回洗浄し、０．５ｍLＭＥＳ（pＨ４．５）中に再懸濁した。ＭＥＳ（pＨ４．５）に溶解したジアミノエタン（ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）を、活性化したＭＤＰに約１０：１のモル比で加えた。ＭＥＳ（０．５Ｍ、pＨ８．５）を加えることにより、pＨを１５分間かけてゆっくりと上げ、室温で１時間反応させた。ＭＤＰ：ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２を遠心によって分離し、ＭＥＳで２回洗浄し、pＨ４．５のＭＥＳ０．５ｍLに再懸濁した。 pＨ４．５のＭＥＳ０．５ｍL中に懸濁したλ軽鎖断片およびＭＥＳに溶解した０．５ｍLのＥＤＣ（０．５ｍg〜２ｍＭ）を加え、室温で１５分間反応させた。過剰のＥＤＣを２−メルカプトエタノール（終濃度２０ｍＭ）を加えることにより過剰のＥＤＣをクエンチし、活性化したタンパク質を適当なサイズゲル濾過カラムを用いるサイズクロマトグラフィーにより過剰な還元剤および不活化した架橋剤から分離した。活性化されたタンパク質を、約５：１のモル比で活性化されたＭＤＰ：ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２に加え、室温で約２時間反応させた。ＭＤＰに加えたタンパク質の濃度をＭＤＰ末端ＣＯ２Ｈ基の定量分析から計算し、ＭＤＰ１ｍgあたりのＣＯ２Ｈのモル数で表した。ヒドロキシルアミンを終濃度１０ｍＭになるまで添加することにより、反応をクエンチした。このクエンチの方法は、いずれの未反応ＭＤＰ活性化部位をも加水分解し、もとのカルボキシルの再生をもたらした。ＨＩＶ合成ペプチドを免疫原として使用し、そのペプチドの疎水性を変化させるまたは生物活性化合物を結合させるなどの修飾が望ましい場合は、修飾を上記のように行うことができる。遠心、洗浄工程、および選択した緩衝液中での再懸濁により、分離した。
生物活性化合物は、ＣＯ２Ｈ基を介する結合が望ましい場合、上記の中間の工程を必要し得ることに注意する。
【０１２７】
実施例６
フロイント完全アジュバント、ＲＩＢＩ（商標登録）、Ｔｉｔｅｒ Ｍａｘ（商標登録）およびミョウバンを含む市販のアジュバントに対するＭＤＰ免疫原コンジュゲートの比較試験
このＭＤＰ微粒子（０．１μ）の抗体産生に対するアジュバント効果を、上記実施例に記載された弱免疫原性モノクローナルヒトラムダ軽鎖断片（Ｍｒ−１８，０００）を免疫原（Ｉ）として用いて調べた。２つのコンジュゲートを作成した。１つは免疫原がカルボキシル末端基を介してＭＤＰに共有結合しているものであり、もう１つはアミノ末端基を介して結合している。
ウサギ（各群ｎ＝５）を、５００μｇのＭＤＰに結合させスクアレン中に乳化させたラムダ軽鎖約１００μｇで皮下免疫した。動物は、１ヶ月ごとに免疫し、期間中免疫前および２週間ごとに試験血液を得た。ＭＤＰ：ＮＨ２−Ｉ−ＣＯ２ＨおよびＭＤＰ：ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２：ＨＯ２Ｃ−Ｉ−ＮＨ２に対する抗体応答は、活性において比較可能であった。しかし、ＭＤＰ：ＮＨ２−Ｉ−ＣＯ２Ｈ刺激されたウサギは、競合ＥＩＡによって測定される少なくとも１つの更なる抗体特異性を産生した。得られた抗体応答を、フロイント完全アジュバント、Ｒｉｂｉ（商標登録）、Ｔｉｔｅｒ Ｍａｘ（商標登録）およびミョウバン（水酸化アルミニウム）を含む慣用のアジュバントを抗体応答に使用した場合に得られた応答と比較した。ＭＤＰ：ＨＯ２Ｃ−Ｉ−ＮＨ２およびＭＤＰ：ＮＨ２−Ｉ−ＣＯ２Ｈは、抗体の誘導において、免疫原を用いる慣用のアジュバントによりも有意に優れていた。免疫原濃度（１００μｇ／免疫）および免疫計画は、すべてに群において同一にした。表６．１は、２週間おきに測定した抗体力価を示し、力価は、上記の陽性反応を生じる希釈率の逆数で示した。ＭＤＰコンジュゲートは両方とも慣用のよく知られたアジュバントよりも優れていた。
【表５】
2009080118.tif 000024
Ｔ−０＝最初の免疫および免疫前の血液採取
ＭＤＰ：Ｉ  ムラミルジペプチド：免疫原微粒子（＜０．２ｍ）
＊  ペプチドを、カルボキシ末端が曝露しているイソグルタミンと、アミノ末端基において結合させた。（ＭＤＰ：Ｉ：ＣＯ２Ｈ）
＋  ペプチドを、ジアミノエチレンを用いてＭＤＰのカルボキシ末端を修飾する中間の工程を経て、カルボキシ末端において結合させた。（ＭＤＰ：Ｉ：ＮＨ２）
【０１２８】
実施例７
ＭＤＰ：ＮＨ２：Ｉ：ＣＯ２ＨおよびＭＤＰ：ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２：Ｏ２ＨＣ−Ｉ−ＮＨ２免疫原によって誘導された末梢血単核球細胞のサイトカイン応答
ＭＤＰ微粒子免疫原複合体に対する抗体応答の増加に関連する機構をさらに調べるために、サイトカイン産生たは末梢血単核球細胞を測定する in vitro 法を使用し、既知のサイトカイン誘導物質と比較した。リポ多糖（ＬＰＳ）およびＬＰＳおよびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を、既知のサイトカイン誘導物質として使用した。サイトカインをよく確立されたアッセイを用いて定量し、単位／ｍLとして表した。末梢血単核球細胞をＦｉｃｏｌ Ｈｙｐａｇｕｅグラジェント遠心によって単離し、組織培地中２×１０６／ｍLの濃度に調整した。細胞（１００μL）をマイクロカルチャーウェルに入れた。ＭＤＰ：Ｉ：ＣＯ２Ｈ、ＭＤＰ：Ｉ：ＮＨ２、ＰＨＡ＋ＬＰＳ、ＬＰＳおよび培地単独を、希釈することなくまたは１：１０および１：２５（１０μL）に希釈して加えた。培地を、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で４８時間インキュベーションし、上清を除き、標準のバイオアッセイおよび／またはＥＩＡ法により分析した。
【表６】
2009080118.tif 000025
ＭＤＰ：Ｉ：ＣＯ２ＨおよびＭＤＰ：Ｉ：ＮＨ２は両方とも、ＬＰＳ＋ＰＨＡまたはＬＰＳ単独よりも高いＩ型サイトカイン応答を刺激した。１型サイトカイン応答は免疫事象を増強し、２型サイトカイン応答はＩＦＮガンマおよびＩＬ２の上昇とＴＮＦおよびＩＬ６の低いレベルによって示される。
【０１２９】
実施例８
未処理および処理により炭水化物部分を除去したＨＩＶタンパク質に対するヤギにおける抗体応答のキャラクタリゼーションおよびＭＤＰ微粒子のアジュバント特性と慣用のアジュバントの比較
実施例８．１
ＨＩＶ１MN、ＨＩＶ１BALおよびＨＩＶ２NZウイルスリゼートを、Advanced Biotechnologies Inc., Columbia, MD.より購入し、各調製物の１／２を酵素的に処理して炭水化物を除去し、すべての調製物（炭水化物有りおよび無し）を上記のように精製した。それぞれのアリコートを、実施例５に記載した方法にしたがってアミノ末端残基を介してＭＤＰに結合し、個々にスクアレン中に懸濁した。比較のため、これらのＨＩＶタンパク質をさらに、ＭＤＰに結合させることなくフロイント完全アジュバント中で乳化した。
群１−ＨＩＶ１MN、ＨＩＶ１BAL１：１、炭水化物除去なし；
群２−ＨＩＶ１MN、ＨＩＶ１BAL１：１、炭水化物除去あり；
群３−ＨＩＶ２NZ、炭水化物除去なし；
群４−ＨＩＶ２NZ、炭水化物除去あり；
群５−ＨＩＶ１MN：ＨＩＶ１BAL：ＨＩＶ２NZ、１：１：１、炭水化物除去なし；
群６−ＨＩＶ１MN：ＨＩＶ１BAL：ＨＩＶ２NZ、１：１：１、炭水化物除去あり；
群７−ＨＩＶ１MN：ＨＩＶ１BAL：ＨＩＶ２NZ、１：１：１、炭水化物除去なし、およびＭＤＰに結合せずにフロイント完全アジュバント中で乳化した；
群８−ＨＩＶ１MN：ＨＩＶ１BAL：ＨＩＶ２NZ、１：１：１、炭水化物除去あり、ＭＤＰに結合させてフロイント完全アジュバント中で乳化させた。
【０１３０】
ヤギを免疫群１〜８（各ｎ＝３）に階層化し、表８．１に示した間隔で１００μｇＨＩＶ／免疫によりそれぞれ免疫した。血液試料を、免疫前および２週間ごとに得た。抗体反応性を、Abbott LaboratoriesよりＦＤＡ承認の商業的に入手可能な試験キットを用いてＥＩＡにより定量した。結果は、吸光度＞１．０を生じる抗血清希釈率の逆数で示した。
【表７−１】
2009080118.tif 000026
抗体応答は、免疫の期間中２週間間隔で測定した。ＥＩＡにより測定すると、ＭＤＰを使用した個々の動物群の間（群１および２、群３および４、群５および６）で抗体反応性における有意の違いはなかった。炭水化物の除去は、所望の抗ＨＩＶタンパク質に対する抗体の産生には効果がなかった。
【０１３１】
実施例８．２
実施例８．１に記載したように得られた抗血清を赤血球凝集抗体について調べた。表８．２から分かるように、ＨＩＶタンパク質からの炭水化物除去は赤血球凝集応答を喪失させた。
処理により炭水化物基を除去したＨＩＶ調製物は、赤血球細胞を凝集することができる抗体反応性を生じなかった（表８．２Ａ）。炭水化物減少なしのＭＤＰ−ＨＩＶコンジュゲートで免疫したヤギ、およびフロイント完全アジュバント中で乳化させた炭水化物減少なしの精製ＨＩＶで免疫したヤギは、赤血球凝集素を産生した。ＭＤＰ−ＨＩＶコンジュゲートまたはフロイント完全アジュバント中で乳化させたＨＩＶで免疫したヤギ由来の抗血清中の赤血球凝集素の、力価における検出可能な違いはなかった。ここに記載の赤血球凝集素は、実施例２の予備実験において記載したものと本質的に同一である。これらの凝集素は、細胞毒性である（表８．２Ａ）。しかし、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩに対する検出可能な抗体反応性はなく、赤血球細胞による吸収は赤血球凝集および細胞毒性抗体反応性の両方を完全に除去した。
【表７−２】
2009080118.tif 000027
【表７−３】
2009080118.tif 000028
ＨＩＶとＲＢＣの炭水化物基の間の模倣性の可能性について調べるために、更なる抗血清を、ヒトの赤血球細胞から単離した、精製しプールした細胞膜からなる免疫原によってヤギを免疫することにより製造した。この抗血清を用いるウェスタン・ブロット解析は、赤血球細胞糖タンパク質（〜Ｍｒ３５，０００）に対する反応性を示し、ＨＩＶｇｐ４１およびｇｐ１２０と反応した。しかし、処理により炭水化物基を除去したＨＩＶｇｐ４１およびｇｐ１２０は反応しなかった。これらのデータは、ＨＩＶの炭水化物エピトープと赤血球細胞糖タンパク質との間の系統進化的な模倣性に一致する。
ウエスタン・ブロット解析は、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ６６／５５、ｐ１０、ｐ２４、ｐ１７およびｐ７を含むＨＩＶタンパク質の大部分に対して強力な反応性を示した。本明細書に開示されたＨＩＶエピトープに対するこれら抗体の反応性または特異性において明らかな違いはなかった。これらの抗体は、逆転写酵素およびプロテアーゼの阻害剤に対する耐性を有することが示されているものを含めて、試験したすべてのＨＩＶ単離物と反応した。
【０１３２】
実施例８．３
炭水化物を減少させたＨＩＶに対して産生した抗体によるＨＩＶ感染性の中和
この実施例は、上で開示した炭水化物を減少させたＨＩＶに対して産生した抗体を使用するＨＩＶ感染性の中和を記載し、特徴付ける。結果は、これらの抗体が高いレベルの中和活性を含み、ＣＥＭ細胞を感染から用量依存的に保護することを示している。
中和アッセイ：
高感度の中和アッセイを用いて、ＨＩＶ感染性に対するヤギ抗ＨＩＶの効果を定量した。ＨＩＶ感染に対して感受性の高いＣＥＭ ＣＤ４＋細胞系を標的細胞として選択し、ＨＩＶ感染性に対するこの抗体の効果を測定した。抗体および希釈は、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ培地中で必要なように行った。ＨＩＶ１SF2の懸濁液を、対数増殖期のＣＥＭの約４日間カルチャーから回収し、０．２または０．４５ミクロンのフィルターで濾過し、アリコートに分け、−７０℃で保存した。１つのアリコートを解凍し、滴定してＴＣＩＤ５０を測定し、後のアッセイは、新たに解凍し、培地中１：５００に希釈して濃度をＣＥＭ細胞の５０％の感染に必要な量の約１０倍（１０ＴＣＩＤ５０）にすることにより行った。ウイルスの懸濁液を、１：５〜１：９,７６５,６２５の抗体の５倍希釈系列の同体積（２５０μL）と混合した。ウイルス／抗体混合物を３７℃で６０分間インキュベーションし、２００μLの試料２つ一組を使用して、ウェルあたり約２×１０５個のＣＥＭ細胞１．０ｍLを含むウェルに接種した。カルチャーを、３７℃の加湿５％ＣＯ２雰囲気下で１４日間インキュベーションした。細胞を回収し、ペレット化し、ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で約１０分間溶解した。溶解した細胞中に存在するウイルス（ウイルス抗原）の量を、商業的に入手可能なｐ２４アッセイを用いて定量した。中和活性の力価は、抗体なしまたは同様の方法で調製したヤギ免疫前ＩgＧとインキュベーションした、ウイルス対照カルチャーのｐ２４抗原産生を５０％以上阻害する抗体の希釈率の逆数として決定した。溶解した細胞懸濁液２００μLを分析した。
【表８−１】
2009080118.tif 000029
最も高い中和活性を有する抗ＨＩＶ調製物は、炭水化物決定因子を除去する処理を行わなかったＨＩＶ−ＭＤＰコンジュゲートに対して産生した（表８．３Ａ）。炭水化物を減少させたＨＩＶコンジュゲートに対する抗体の赤血球細胞吸収は効果がなかった。しかし、炭水化物が自然のままのＨＩＶコンジュゲートに対する抗体のＲＢＣ吸収は、中和反応性における有意の減少をもたらし、ＨＩＶとヒトとの間で共有される系統進化的に存在する炭水化物部分の存在が確認された（表８．３Ａの最終行）。ＨＩＶ−ＭＤＰコンジュゲートに対して産生したすべての抗ＨＩＶ抗体調製物は、フロイント完全アジュバントを使用して産生した抗ＨＩＶよりも統計学的に高かった。ＨＩＶの特徴的な予想される遺伝子の変異性のため、２０週目の調製物に由来する抗ＨＩＶを、ＨＩＶＭＮ、および上記と同一の条件下で多剤耐性型株として特徴付けられた１つを含む４つのＨＩＶ野生型単離物を用いて中和活性について試験した。炭水化物を欠くＨＩＶコンジュゲートに対して産生した２０週目の抗体調製物由来の抗ＨＩＶは、すべての株を中和した（表８．３Ｂ）。
当業者は、ＨＬＡを減少させた、炭水化物を減少させたＨＩＶタンパク質に対して産生した中和活性は、ヒト抗ＨＩＶ血清において概して観察される中和活性よりもかなり高いことを認識するであろう。
【表８−２】
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【０１３３】
実施例８．４
抗体依存補体介在細胞毒性におけるＨＩＶ感染したＣＤ４リンパ球に対する抗ＨＩＶの効果
炭水化物を減少させたおよび炭水化物が自然のままのＨＩＶコンジュゲートに対する抗体を、ＨＩＶに感染したおよび感染していないＣＤ４リンパ球に富む正常な末梢血単核球細胞に対する補体介在細胞毒反応性について調べた。正常な末梢血単核球細胞を単離し、Ｆｉｃｏｌ Ｈｙｐａｇｕｅグラジェント遠心に付し、ＣＤ４＋リンパ球を濃縮した。ＣＤ４＋リンパ球をＰＨＡで刺激し、ＨＩＶＭＮによりミクロカルチャー中７日間感染させた。上清を除き、糖基を除去した、正常な細胞に対する細胞毒性を持たないことが分かっているＨＩＶ調製物に対して産生した抗ＨＩＶで置換した。表８．４に示されるように、抗ＨＩＶは、感染したＣＤ４リンパ球を用量依存的に溶解した。
【表９】
2009080118.tif 000031
【０１３４】
実施例８．５
ＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列に対応するペプチドの合成
合成ペプチドを、ＨＩＶ１SF2のアミノ酸配列を模擬する１２マーのペプチドとして構築した。ｇｐ１２０、ｇ４１、Ｖｉｆ、ｇａｇ ｐ１７、ｇａｇ ｐ２４、ｎｅｆ、Ｒｅｖ、インテグラーゼ、プロテアーゼ、Ｔａｔ：ＨｘＢ２および逆転写酵素および６つのアミノ酸残基が重複している逆転写酵素のアミノ酸配列は、Purification Systems, Inc.によって固相技術を用いて合成され、そこから購入した。
触媒量の４−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノピリシンによりジシクロヘキシルカルボジイミドを用いてポリスチレンにカップリングしたブチルオキシカルボニル−Ｓ−４−メチルベンジル−Ｌ−シスチンを、合成のための固相担体として使用した。tert-ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）でアミノ基を保護し、側鎖を保護基は以下の通りであった：セリンの水酸基に対してはベンジルエーテル、チロシンのフェノール性カルボキシル基に対してジクロロベンジルエーテル、およびグルタミン酸およびアスパラギン酸のそれぞれのカルボキシル基に対してβベンジルエステルを使用した。トリフルオロ酢酸（ＣＨ２Ｃl２中４０％）を使用してｔ−ＢＯＣを脱離し、生成した塩をＮ−ジイソプロピルエチルアミン（ＣＨ２Ｃl２中１０％）で中和した。ジイソプロピルカルボジイミドを使用してｔ−ＢＯＣアミノ酸をカップリングさせた。保護基を除去し、１０％アニソールおよび１％エタンジオールをスカベンジャーとして含む無水フッ化水素により、０℃にてペプチドを樹脂から開裂させた。フッ化水素試薬を真空下で０℃にて除去した後、ペプチドを沈殿させ無水エーテルで洗浄した。トリフルオロ酢酸によりペプチドを樹脂から抽出し、溶媒を１５℃で蒸発させ、ペプチドを再びエーテルで沈殿させた。エーテルを遠心後に傾斜し、ペレットを５％酢酸および６ＭグアンジジンＨＣl中に溶解した。この溶液を５％酢酸中で平衡化した BioGel F2カラムで脱塩し、ペプチドを含む画分をプールし凍結乾燥した。必要に応じシステイン残基をペプチドのカルボキシル末端に付加し、ペプチドと担体タンパク質またはＥＩＡ法のための固相支持体またはＭＤＰとの結合のために機能性ＳＨ基を与えた（実施例５）。ペプチドの多重反復が望まい場合、最初にシステイン残基を樹脂支持体に結合することにより合成を行った。様々な長さの炭素スペーサーを付加した；変化させるスペーサーの長さの選択は適用法、ペプチドの電荷、長さおよび支持体へのペプチドの結合から得られた予備データから予想される立体的影響に依存する。６−アミノヘキサン酸などの６炭そのスペーサーを、ジアミノエタンについて実施例５で上記したように、最初にリシン−（リシン）２−（リシン）４付加物と結合したが、保護基ブロッキングの順序は変更した。アミノ基を保護した後、脱保護し、２つのリシン残基が脱保護した末端に結合するのを可能にした。脱保護した後リシン付加を行い、ペプチド合成のための分岐鎖構造を構築した。特異的な生物学的機能または酵素的分解を受けやすい配列を有するペプチドを、Ｄ−アミノ酸の付加により修飾した。１つの特に有用な付加は、Ｄ−イソグルタミンのＮＨ２末端から合成した目的のペプチドへのＬ−アラニン−Ｄ−イソグルタミンの付加である。別の形態では、ペプチドをＬ−リシン−Ｌ−リシン−ペプチド−Ｄ−イソグルタミンにより合成した。カルボキシ末端のリシン基は、微小環境において多くの酵素による酵素分解を受けやすく、一方Ｄ−イソグルタミンはペプチドの半減期の増加と、レセプター結合およびＭＨＣ関連事象による免疫誘導などの機能を誘導する両親媒特性を必要とするペプチドを構築する疎水性部位の両方を与える。ペプチドから担体タンパク質への結合効率を測定し、精製の間ペプチドを同定するための１２５Ｉヨウ素による放射性標識のために、チロシン残基をアミノ末端に付加した。ペプチド機能がチロシン付加によって影響を受けない場合、１２５Ｉはさらに、生物学的系においてペプチドの半減期を追跡し、レセプター結合を評価するトレーサーも提供した。
【０１３５】
実施例８．６
ウイルスエピトープの同定のための、ＨＩＶおよび他のレトロウイルスのペプチド配列を模擬する合成ペプチドの使用
本発明の範囲内で、ＨＩＶおよび他のレトロウイルスにみられる高度に保存された配列を模擬する合成ペプチド配列を開示し、ウイルス感染の処置における免疫学的標的としてのその機能的な有意性を同定する。これらのペプチドは、免疫反応の非特異的な下方調節、自己免疫の誘導、ＨＩＶ関連末梢神経障害へと導く毒性作用によってＨＩＶの病原の一因となる配列を有するＨＩＶミクロ変異体から生じるＨＩＶ感染の診断および管理において更なる応用性を有する。患者において存在するときにこれら事象のそれぞれはＨＩＶの病原の一因となり、生活の質を低下させる。そのような事象を開始するＨＩＶペプチド領域を同定し定量するために使用される合成ペプチドは、自己免疫および末梢神経障害の危険因子を同定することにおいて有用である。合成ペプチドは、疾患の進行および処置の結果としての進行の変化を監視するための新規の分析方法において更なる有用性を与える。
本発明の１つの工程において、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）を、ヒト抗ＨＩＶによって認識されないＨＩＶに対するヤギ抗体特異性の同定のために構築した。ＨＩＶ１ｇｐ１２０およびｇｐ４１タンパク質の精製された調製物を、３７℃で２０時間インキュベーションすることにより、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ＜ pＨ７．８）中５μｇ／ｍLでポリビニルマイクロタイタ−プレートのウェルに被覆した。ウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、それぞれのウェルの結合しなかった部位を、５％ウシ血清アルブミンで３７℃で１時間インキュベーションすることにより飽和した。プレートは直ちに使用するか、または４℃で保存した。ヒトＩgＧ抗ＨＩＶ（１００μL）（実施例１）をそれぞれのウェルに加え、４℃で２５時間インキュベーションし、ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した。標準的な方法によりあらかじめ製造しＨＲＰで標識されたヤギ抗ＨＩＶを、アッセイの条件（１：１００００力価）において１．０の吸光度が得られるに必要な希釈率でウェルに加え、４℃で２４時間インキュベーションした。ウェルを洗浄し、基質を加えてヤギＩgＧの結合量を測定した。ヒト抗ＨＩＶによるＨＩＶのブロッキングにより誘導される結合の百分率阻害を式を用いて計算した。
【数１４】
2009080118.tif 000032
ヒト抗ＨＩＶによるヤギ抗ＨＩＶ−ＨＲＰコンジュゲートの最小のブロッキングは、ヒト抗ＨＩＶとは異なったヤギ抗ＨＩＶの結合を示した。
【０１３６】
別の工程では、ＥＩＡを構築して、ヤギ抗体に対して免疫原性であるがヒトの抗体に対しては免疫原性でないＨＩＶタンパク質上のエピトープを同定した。ＨＩＶ１ｇｐ１２０およびｇｐ４１タンパク質の精製した調製物を、３７℃で２０時間インキュベーションすることによりポリスチレンビーズに５μｇ／ｍLで被覆した。ビーズを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、それぞれのビーズの結合しなかった部位を、３７℃で１時間インキュベーションすることにより５％ウシ血清アルブミンで飽和した。ビーズは直ちに使用して４℃で保存した。ヒトＩgＧ抗ＨＩＶ（１００μL）（実施例１）をそれぞれのビーズに加え、４℃で２４時間インキュベーションした。ヒトＩgＧ抗ＨＩＶ（１００μL）（実施例１）を各ビーズに加え、４℃で２４時間インキュベーションし、ビーズをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した。合成ペプチドをウシ血清アルブミン（５ｍg／ｍL）および０.１ｍg／ｍLの濃度のＴｗｅｅｎ２０（０．１％）を含有するＰＢＳに溶解した。ペプチド（２５μL）をヤギ抗ＨＩＶ ＩgＧ−ＨＲＰコンジュゲート溶液（１００μL）に加え、４℃で２４時間インキュベーションした。次いで、混合物をＨＩＶで被覆した２組のビーズに加えた。１組は、ＨＩＶで被覆した２組のビーズに加えたヒト抗ＨＩＶでブロックした。１組は、ペプチドをヤギ抗ＨＩＶ−ＨＲＰコンジュゲートに加えたときと同時に加えたヒト抗ＨＩＶでブロックした。反応物質を添加したビーズを４℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、ビーズを洗浄して、ペルオキシダーゼ活性を上記のように測定した。活性をＨＩＶタンパク質内のペプチドの位置に対してプロットした。これらのプロットは、ヒト抗体によって認識されないヤギＨＩＶ免疫ＩgＧにより標的化されるＨＩＶタンパク質の領域を示した。結合の阻害が特定の合成ペプチドについて観察された場合、更なるペプチドを合成して、更なる長さのペプチドによってもとのペプチドに重複させた。合成ペプチドによる阻害の欠失は、ヤギ免疫系による免疫原性標的化の欠失の存在を示すと考えられた。この方法を用いて、直鎖状のペプチドエピトープを試験のために選択した。
【０１３７】
本発明の別の好ましい方法では、ＥＩＡを構築して、以下に開示するように製造したペプチド−ペルオキシダーゼコンジュゲートを使用し、ヤギによって認識されるがヒトの免疫系によって認識されないＨＩＶタンパク質上のエピトープと反応する抗体を同定した。ＨＩＶ配列を模擬するペプチドをＨＲＰに共有結合的に結合して、抗体特異性のマッピングに使用するための酵素標識したペプチドライブラリーを製造した。具体的には、ＨＲＰを、ＨＲＰ １：ペプチド １０の計算されたモル比で試験管に入れた。カップリングするべき各ペプチドをマイクロチューブに、それぞれ所望のコンジュゲートの量およびペプチドの分子量によって変わる０．１〜１μmole／ｍLの濃度、０．１〜１ｍLの体積で個々に入れた。１〜１０μmole／ｍLの濃度のＨＲＰを、４℃の０．１Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液（pＨ９．８）に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウムを加えて最終濃度０．０２Ｍにした。混合物をペプチドを含むマイクロチューブに直ちに入れ、ペプチドを混合し、３０分間反応させた。エチレングリコール（０．０２Ｍ）を加えて、残りの過ヨウ素酸ナトリウムをクエンチした。ペプチドのアミノ末端とＨＲＰ炭水化物部分の酸化によって形成したアルデヒドとの間で形成したシッフ塩基中間体を、水中のホウ水素化ナトリウム（０．２Ｍ）の添加によって還元した。セファデックスＧ２５中での各ペプチド−ペルオキシダーゼコンジュゲートのクロマトグラフィーを用いて、反応物と過剰のペプチドを除去した。
【０１３８】
ＨＩＶエピトープと反応する抗体は、ペルオキシダーゼに結合した合成ペプチドエピトープと反応し得る抗原結合部位を保持するので、この好ましいアッセイにおいて抗体を使用し、ＨＩＶウイルスリゼートから調製したＨＩＶタンパク質上で同定されたエピトープとＨＲＰに共有結合した合成ＨＩＶペプチドとを架橋させた。ビーズを上記のようにＨＩＶタンパク質で被覆した。被覆されたビーズはヤギ抗ＨＩＶＩgＧと２４時間反応させ、ビーズを洗浄し、基質と反応させてペルオキシダーゼ活性したがってペプチド結合を測定した。この方法によって、合成ペプチドに含まれるまさにそのエピトープのみが認識される。このアッセイにおいて、ヤギ反応性の完全なレパートリーを同定した。ヒト抗ＨＩＶおよびヤギ抗ＨＩＶ反応性を比較し、ヤギ抗ＨＩＶとのみ反応するペプチドをエピトープ標的候補として選択した。これらのデータは、反応性の間での相違とＨＩＶタンパク質のアミノ酸ペプチド配列相同性の間での変化が、合成ペプチドの選択にとって二次的なエピトープ反応性の消失をもたらし得るので、ＨＩＶタンパク質に対するヒトとヤギとの間の反応性の相違すべてを包含しているものであるとは考えられなかった。
【０１３９】
実施例９
治療剤としての抗体の効力
免疫化学的に設計した抗体の群について試験を行い、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの処置のための治療剤としての抗体の効力を測定した。具体的には、ＨＩＶ単離物ＨＩＶ１MN、ＨＩＶ１BALおよびＨＩＶ２ＭＺのリゼートの混合物を、実施例３のように処理して低分子量の汚染物質およびＨＬＡクラスＩとクラスＩＩ抗原を除去し、ＨＩＶタンパク質を脱グリコシル化した。タンパク質混合物を分析し、ＨＩＶ１SF2タンパク質の以下の領域を模擬するペプチドを見い出だした：
ｇｐ１２０：アミノ酸残基４〜２７のエピトープ領域およびアミノ酸残基５４〜７６の第２のエピトープ領域；
ｇｐ４１：アミノ酸残基５０２〜５３１のエピトープ領域；
逆転写酵素ヘテロダイマーｐ６６／５５：アミノ酸残基２５４〜２９５のエピトープ領域；
プロテアーゼｐ１０：アミノ酸領域６９〜９４のエピトープ領域；
Ｇａｇ遺伝子タンパク質ｐ２４：アミノ酸領域１６６〜１８１のエピトープ領域；
Ｇａｇ遺伝子タンパク質ｐ１７：アミノ酸領域２〜２３のエピトープ領域およびアミノ酸領域８９〜１２２の第２のエピトープ領域；
Ｇａｇ遺伝子タンパク質ｐ７：アミノ酸領域３９０〜４１および４３８〜４４３のエピトープ領域。
これらのアミノ酸配列は、感染を経由してまたは周囲の環境を自然に経由して接触したときにヒトにおいて免疫応答を誘導しないが、他の哺乳類の種において免疫応答を誘導する。
精製され処理されたタンパク質を濃縮し、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、および所望により、当分野に知られた方法を用いてそれぞれ個々にセファロースＣL４Ｂに結合させたｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐｐ６６／５５、ｐ２４、ｐ１７およびｐ１０に対する商業的に入手可能な（ICN Costa Mesa, CA and Advanced Biotechnologies, Columbia, MD）モノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製した。精製の後、それぞれの精製した目的のＨＩＶタンパク質ペプチドを、実施例４に記載のとおりにＭＤＰ微粒子に個々に結合させた。ＨＩＶ−ＭＤＰ微粒子コンジュゲートを、生理学的生理食塩水中に約１ｍgタンパク質／ｍLの最終濃度で等モル濃度の各ＨＩＶタンパク質／ペプチドを含むカクテルとして製剤化した。ＨＩＶ−ＭＤＰカクテル（０．５ｍL）をスクアレン（０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１．５ｍL）中に乳化し、６０頭のヤギに１頭につき４〜６箇所腹腔内注射した。ブースター免疫を１ヶ月ごとに投与し、所望の抗体応答を達成した。１ヶ月ごとの血清試料を、毎月のブースター前にそれぞれのヤギから得、ウエスタン・ブロット解析、ＨＩＶ中和および実施例８．６に開示した酵素イムノアッセイによって試験した。所望の抗体応答が達成されたら、Baxter A 201-A401 Autophresis 装置を用いて、ヤギを頚静脈からプラズマフェレーシスした。ヤギの赤血球細胞を生理学的生理食塩水中に戻した。それぞれのプラズマフェレーシスで各動物から集めた血漿の体積は、３５０ｍL±５．０ｍLであった。
【０１４０】
ヤギ免疫血漿をオクタン酸により分画した後、塩酸によりpＨを４．８に調整した。混合物を遠心し、活性化したチャコールフィルターで濾過して塊を除去し、オクタン酸のレベルを０．０５％以下まで減少させた。免疫グロブリン（ＩgＧ）を含む画分を一連のカラムに通すことによりさらに精製した：
１．２０ｍＭリン酸緩衝液を用いるセファデックスＧ２５
２．リン酸緩衝液中で平衡化した Whatman ＤＥ５３によるイオン交換
３．０．９％生理食塩水中で平衡化したセファデックスＧ２５。
最終のカラム濾液を滅菌濾過し、次いで濃縮または希釈して、所望の生物学的活性が１０ｍgＩgＧ／ｍLの最終濃度にした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・ブロット解析は、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ５１／６６、ｐ２４、ｐ１７、ｐ７およびｐ１０の７つの別個のウイルスタンパク質について、１：１００希釈でヤギＩgＧ免疫グロブリンの反応性を示した。ＨＩＶ中和に関する解析は、実施例８．３に開示したように、ＨＩＶ１実験室株および野生株の広い中和を示した。実施例８．３に開示した酵素結合イムノアッセイによる解析は、１：１０００またはそれ以上の試料希釈率で所望の９つのエピトープに対して陽性の反応を示した。これらの基準を満たす製品ロットは、商品名ＨＲＧ２１４が与えられているものであった。これは、開示されている通り添加剤なしで０．９％塩化ナトリウムに懸濁された、滅菌されピロゲンを含まない１０ｍg／ｍLの濃度のヤギＩgＧからなるものである。それぞれの製品ロットを本明細書に開示した参照ロットと比較し、ＨＲＧ２１４活性の当量を決定した。効力をｍg当量／ｍLで表す。
【０１４１】
１８歳以上の男性および妊娠していない女性を、ＡＩＤＳ判定基準、臨床的徴候、および試験に入る３０日前以内のＣＤ４Ｔリンパ球数＜３００細胞／μLに関する、彼等が受けたウェスタン・ブロットにより記録されるＨＩＶ感染の血清学的診断に基づいて選択した。臨床的および実験室的パラメーターを効力の評価に使用した。臨床的パラメーターには、日和見感染の変化、体重の変化、便の硬さおよび頻度を含む胃腸機能の変化、エネルギーレベルの変化、食欲の変化、体力および持久力、および生活の質における全体的な変化が含まれる。実験室的なパラメーターには、ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球数における変化、選択された血液学、血液化学および尿検査、および可能ならばＰＣＲによるウイルスＲＮＡの測定によるウイルス負荷の変化が含まれる。
【０１４２】
試験結果は、免疫化学的に設計した抗体タンパク質の使用によって、患者は、日和見感染の減少、体重の増加、ひどい下痢の減少を含む胃腸機能の変化、エネルギーレベルの増加、食欲の増加、体力および持久力の改善、および生活の質に置ける全体的な改善といった臨床的な改善を示した。実験室的パラメーターは、ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球数の増加、血液学、血液化学および尿検査の数における改善、ならびにＰＣＲによるウイルスＲＮＡの測定によるウイルス負荷の減少およびＴＣＩＤにより測定した場合の感染性の減少といった改善を示した。
試験の詳細な実験結果は、添付の表９．１〜９．１３に記載する。
【０１４３】
実施例９．１
ＨＩＶ感染した患者の処置におけるＨＲＧ２１４の毒性および効力の臨床的評価
２５人のＨＩＶ感染した患者をＨＲＧ２１４で処置した。ＨＲＧ２１４は、ＨＩＶウイルス負荷を減少させ、疾患の進行および症状を改善する効力について試験した。患者を、ＣＤ４数／ｍｍ３（＜２００および≧２００）および治療計画によって階層化した：
群１：ＨＲＧ２１４、ＣＤ４＜２００、ｎ＝１１；
群２：ＨＲＧ２１４および１ヶ月ごとの再処置、ＣＤ４＜２００、ｎ＝６；
群３：ＨＲＧ２１４および進行時の再処置、ＣＤ４＜２００、ｎ＝５；
群４：ＨＲＧ２１４、ＣＤ４＞２００、ｎ＝７；
群５：ＨＲＧ２１４および進行時の再処置（患者に悪性腫瘍に対する化学療法を実施）、ＣＤ４＜２００、ｎ＝６；
群６：プラシーボ対照、ＣＤ４＞５００、ｎ＝１９；
群７：プラシーボ対照、ＣＤ４＞２００〜５００、ｎ＝３。
【０１４４】
処置群の患者には、１〜１．５ｍg／ｋｇ体重のＨＲＧ２１４を２１〜２８日間毎日点滴した。ＣＤ４＜２００の患者は、１ヶ月に３日再処置したか（ｎ＝６）またはＨＩＶ進行が明らかなときに再処置した（ｎ＝１１）。副作用は２°Ｆ以下の微熱、悪寒、頭痛、および筋肉痛などに限られた。処置中および処置後の臨床化学および血液学的測定は、すべての患者において、９０日間変化なしのままかまたは改善した。２８人の患者を栄養状態について試験した。２４人が２〜２２lbs、平均で４．４lbs 体重が増加した（ｐ＝０．００１４）。悪性腫瘍に対して全身的な化学療法を受けた６人の患者のうちの４人は、安定を維持したか（ｎ＝２）、または体重が減少した（それぞれ２および６lbs）。体重の増加は、血清総タンパクとアルブミン測定値の増加に直接相関した。ＨＩＶ−ＲＮＡ測定値は、すべての処置群において減少した。
【表１０】
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ＣＤ４／ｍｍ３減少の割合は、時間の経過とともに、対照群６および７と比較するとすべての処置群において減少した（ｐ＜０．０１）。持続的なＣＤ４増加が群２、３および４において観察された。ミクロカルチャーによって測定した感染性の測定値（ＴＣＩＤ）は、ＨＩＶ−ＲＮＡ量の測定値には示されていない７〜１４日目の処置によって２ logの感染性の減少を示した（ｐ＜０．００１）。食欲およびスタミナの増加、並びに慢性疲労症候群、下痢、吸収不良、カンジダ症、ＣＭＶ（網膜炎を除く）、単純ヘルペスおよび帯状ヘルペス、皮膚伝染性軟疣、口腔毛様細胞白血病、消耗症候群、細菌性毛包炎、および肺炎およびＨＩＶ関連末梢神経障害における顕著な改善を含む臨床的変化が観察された。
【０１４５】
ＨＲＧ２１４は、ＨＩＶ感染の管理を助けるための新しい薬剤を提供する。
患者群２〜５についてのデータを以下により詳細に示す：
患者群２
患者 n＝６
主目的：２８日間の１．５ｍg／ｋｇ／日の用量での投与と１か月に３回の再処置により、ＨＩＶ感染のＨＲＧ２１４処置の安全性と効力を評価する。臨床的追跡を３年間継続する。患者は再処置オプションを繰り返し受ける。
終点：日和見感染、感染の発生率、消耗症候群、末梢神経障害における改善および異常な血液化学および血液学、ＣＤ４およびＣＤ８における改善およびＰＣＲにより定量したＨＩＶ−ＲＮＡの減少を含む、臨床的および実験室的パラメーターの正常化。
安全性に関する変数：血液化学および血液学および臨床的パラメーターが含まれる。
効力に関する変数：ＰＣＲによるＨＩＶ−ＲＮＡ測定値、ＣＤ４およびＣＤ８数が含まれる。
追跡期間＝３年
現在までの追跡期間＝＞３４５日
試験のデモグラフィー：患者ｎ＝６；開始日１０／２３／９５；３９０日目、生存＝６；その後の死亡＝０
患者のデモグラフィー：ＨＩＶ陽性、ＣＤ４数＜５０／ｍｍ３のＡＩＤＳ判定基準
処置薬物：ＨＲＧ−２１４ − １．５ｍg／ｋｇ／日並びに毎月の再処置。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【０１４６】
患者群３
患者 ｎ＝５
主目的：２８日間の１．５ｍg／ｋｇ／日の用量での投与で、ＨＩＶ感染のＨＲＧ２１４処置の安全性と効力を評価する。臨床的追跡を３年間継続する。患者は再処置のオプションを繰り返し受ける。
終点：日和見感染、感染の発生率、消耗症候群、末梢神経障害における改善および異常な血液化学および血液学、ＣＤ４およびＣＤ８における改善およびＰＣＲにより定量したＨＩＶ−ＲＮＡの減少を含む、臨床的および実験室的パラメーターの正常化。
安全性に関する変数：血液化学および血液学および臨床的パラメーターが含まれる。
効力に関する変数：ＰＣＲによるＨＩＶ−ＲＮＡ測定値、ＣＤ４およびＣＤ８数が含まれる。
追跡期間＝３年
現在までの追跡期間＝＞４６９日
開始日６／１３／９５；３８０日目、生存＝３；死亡＝２；その後の死亡＝０
患者のデモグラフィー：ＡＩＤＳ判定基準でＨＩＶ陽性の患者。患者５人のうち、５人の患者の血液がＣＤ４＜５０／ｍｍ３。ＰＣＲによるＨＩＶ−ＲＮＡ測定値は統計的に有意な減少を示した；７日目（Ｐ＝０．０１７９）および２１〜２８日目（Ｐ＝０．０４３）。６０〜９０日目および１２０〜１５０日目のＨＩＶ−ＲＮＡ測定値は減ってはいたが、ＨＩＶ−ＲＮＡ値は増加傾向にあった。5人の患者全員を再処置した（１２０〜１５０日目の間で開始する毎月の３回連続の投与）。再処置後、ＨＩＶ ＲＮＡ測定値における統計学的に有意の（Ｐ＝０．０００６）減少が２５０日目以降に観察された。対にして行ったＴ検定、Wilcoxon Signed Rank Test および Mann-Mhitney Rank Sum Testを用いて統計学的解析を行った。
開始日：０６／１３／９５
終点：オープン
【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【０１４７】
患者群４
患者 ｎ＝７
主目的：２８日間の１．５ｍg／ｋｇ／日の用量での投与（１〜７日目および２１〜２３日目はＩＦＮ誘導物質とともに）で、ＨＩＶ感染のＨＲＧ２１４処置の毒性および効力を評価する。臨床的追跡は３年間継続する。患者は再処置オプションを繰り返し受ける。
終点：ＯＩ、感染の発生率、消耗症候群など、異常な血液化学および血液学、ＣＤ４およびＣＤ８における改善、およびＰＣＲにより定量したＨＩＶ−ＲＮＡの減少を含む、臨床的および実験室的パラメーターの正常化。
追跡期間＝３年
現在までの追跡期間＝＞４０５日
試験のデモグラフィー：患者ｎ＝７；開始日８／２５／９５；３９０日目、生存＝７；死亡＝０；その後の死亡＝０
患者のデモグラフィー：ＡＩＤＳ判定基準なしのＣＤ４数＞２００のＨＩＶ陽性患者
処置薬物：１．５ｍg／ｋｇ／日を２８日間。患者は再処置のオプションを繰り返し受ける。
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【０１４８】
患者群５
患者 ｎ＝６
主目的：ＨＲＧ２１４処置の毒性および効力を評価する。臨床的追跡は３年間継続する。患者は再処置オプションを繰り返し受ける。
終点：ＯＩ、感染の発生率、消耗症候群など、異常な血液化学および血液学、ＣＤ４およびＣＤ８における改善、ＰＣＲにより定量したＨＩＶ−ＲＮＡの減少を含む、臨床的および実験室的パラメーターの正常化。
追跡期間＝３年
現在までの追跡期間＝＞４６９日
開始日６／１３／９５；２７０日目、生存＝２；死亡＝４（１８０〜２１０日目の間に２人死亡、２４０〜２７０日目の間に１人死亡；２７０日目以降に１人死亡）；その後の死亡＝０
患者のデモグラフィー：ＣＤ４＜２００／ｍｍ３血液およびカポジ肉腫の転移を含むＡＩＤＳ判定基準を有するＨＩＶ陽性患者。患者に全身的な化学療法を実施した。２人の患者が１８０〜２１０日目の間に死亡し、２人の患者が２４０日目以降に死亡した。ＰＣＲにより定量したＨＩＶ−ＲＮＡは、６０〜９０、１２０〜１５０、１８０〜２１０および２４０〜２７０日目で減少を示した（ｐ＝０．０１８）。
対にして行ったｔ検定 Wilcox，Signed Rank Testおよび Mann-Mhitney Rank Sum Test をを用いて統計学的解析を行った。
【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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