(57)【要約】【課題】少ない検体液で感度の高い検出が可能で、一度に複数の検体の処理を行うことができる核酸検出装置を得る。【解決手段】検体の流れる方向に間隔をおいて形成された複数のプローブ領域を備えて形成された流路１０３と、流路１０３の両端に接続されたリザーバ１０４，１０５と、リザーバ１０４，１０５の開口部を覆うように設けられた気液分離膜１０６，１０７とを備え、気液分離膜１０６を介してリザーバ１０４がポンプ１４と接続され、ポンプ１４によって加圧、減圧を繰り返すことにより、リザーバ１０４とリザーバ１０５の間で、流路１０３内の検体液を往復移動させる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体の流れる方向に間隔をおいて形成された複数の反応領域を備えて形成された流路と、
前記流路の一端に接続され、開口部を有する第１のリザーバと、
前記流路の他方の端部に接続され、開口部を有する第２のリザーバと、
前記第１のリザーバの開口部を覆うように設けられた第１の気液分離膜と、
前記第２のリザーバの開口部を覆うように設けられた第２の気液分離膜と、を備え、
各々の前記反応領域は、前記検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブを固定する領域を有することを特徴とする生体物質検出チップ。
【請求項２】
前記流路を複数備え、
各々の前記流路は、それぞれ別の前記第１のリザーバ及び前記第２のリザーバに接続されていることを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出チップ。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の生体物質検出チップを用いて生体物質検出処理を行うための生体物質検出装置であって、
前記第１の分離膜を介して前記第１のリザーバと接続され、前記第１のリザーバ内の加圧または減圧を行う圧力制御手段を備えていることを特徴とする生体物質検出装置。
【請求項４】
複数の前記流路と接続する各々の前記第１のリザーバが、１つの前記圧力制御手段に接続されていることを特徴とする請求項３に記載の生体物質検出装置。
【請求項５】
前記圧力制御手段は、ポンプと、圧力がｐ１以上になると開く第１の圧力弁と、圧力がｐ２以下になると開く第２の圧力弁を備え、ｐ２＜大気圧＜ｐ１であることを特徴とする請求項３または請求項４に記載の生体物質検出装置。
【請求項６】
前記生体物質検出チップの温度調節機構を備えていることを特徴とする請求項３から請求項５のいずれかに記載の生体物質検出装置。
【請求項７】
請求項３から請求項６のいずれかに記載の生体物質検出装置を用いた生体物質検出方法であって、
前記リザーバに検体液を供給する工程と、
前記圧力制御手段によって前記流路内の検体液を往復移動させる工程を備えていることを特徴とする生体物質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の塩基配列を有する核酸分子などの生体物質を検出するための、生体物質検出チップ、生体物質検出装置、および生体物質検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液や組織細胞などの検体中に、疾患に由来する特定の遺伝子が存在するか否かを検査する手法の一つにＤＮＡマイクロアレイがある。ＤＮＡマイクロアレイは、基板上に固定化されたプローブ遺伝子と検体中の遺伝子とを反応（ハイブリダイゼーション）させることにより、目標の遺伝子の有無を検出する。従来、検体中に含まれる特定の遺伝子の検出精度をあげるため、検体中の特定の遺伝子とプローブ遺伝子との反応効率を高くする工夫がなされている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、反応中に検体液の攪拌を行って検体液の分布を改善させることにより、使用する検体液の量を少なくし、反応時間を短縮する方法が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−５７２３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献１に開示された装置では、スライド上に検体液を分布させているため、プローブの配置位置から離れた位置に分布する検体液は反応に用いられないので、より検体液の利用効率の向上が望まれる。また、一度に多数の検体の処理を行うことが困難であった。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、より少ない検体液で感度の高い検出が可能で、一度に多くの検体の処理を行うことが可能な生体物質検出チップ、生体物質検出装置、および生体物質検出方法を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る生体物質検出チップは、検体の流れる方向に間隔をおいて形成された複数の反応領域を備えて形成された流路と、
前記流路の一端に接続され、開口部を有する第１のリザーバと、前記流路の他方の端部に接続され、開口部を有する第２のリザーバと、前記第１のリザーバの開口部を覆うように設けられた第１の気液分離膜と、前記第２のリザーバの開口部を覆うように設けられた第２の気液分離膜とを備え、各々の前記反応領域は、前記検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブを固定する領域を有するものである。
本発明によれば、第１のリザーバと第２のリザーバの開口部がそれぞれ第１の気液分離膜と第２の気液分離膜で覆われているため、検体液は第１の気液分離膜と第２の気液分離膜から外へ漏れることがなく、圧力制御手段を用いて加圧、減圧することにより流路内で検体液を往復移動させるのに適している。流路内の検体液を往復移動させることにより、少ない検体液を効率よく反応領域上のプローブと反応させることができる。
【０００８】
また、前記流路を複数備え、各々の前記流路は、それぞれ別の前記第１のリザーバ及び前記第２のリザーバに接続されていることが望ましい。
これにより、一度に多くの検体の処理を行うことができる。
【０００９】
本発明に係る生体物質検出装置は、上記の生体物質検出チップを用いて生体物質検出処理を行うための生体物質検出装置であって、前記第１の分離膜を介して前記第１のリザーバと接続され、前記第１のリザーバ内の加圧または減圧を行う圧力制御手段を備えているものである。
本発明によれば、第１のリザーバ内の加圧または減圧を行うことにより、流路内の検体液を往復移動させることができるので、検体液が流路内で攪拌され、少ない検体液でプローブとの反応効率を高めることができる。また、第１のリザーバと第２のリザーバの開口部がそれぞれ第１の気液分離膜と第２の気液分離膜で覆われているため、第１のリザーバ内の加圧、減圧を行っても検体液は第１の気液分離膜と第２の気液分離膜から外へ漏れることがなく、制御がしやすいという利点がある。
【００１０】
また、複数の前記流路と接続する各々の前記第１のリザーバが、１つの前記圧力制御手段に接続されるようにすることができる。
これにより、複数の流路を１つの圧力制御手段で制御することができるため、装置の小型化やコストの削減が図れる。また、第１のリザーバと第２のリザーバの開口部がそれぞれ第１の気液分離膜と第２の気液分離膜で覆われているため、流路間で検体の移動時間に差があっても、リザーバ内に検体液を留めておくことで、移動時間の差を吸収することができ、全ての流路で攪拌の回数を一定にすることができる。よって、流路によってばらつきのない信頼性の高い検査結果を得ることができる。
【００１１】
また、前記圧力制御手段は、ポンプと、圧力がｐ１以上になると開く第１の圧力弁と、圧力がｐ２以下になると開く第２の圧力弁を備え、ｐ２＜大気圧＜ｐ１とすることができる。これにより、第１及び第２の圧力弁の開閉を検知してポンプによる加圧、減圧を切り替えるようにすることができ、簡易な処理で、検体液の往復移動を制御することができる。
【００１２】
また、前記生体物質検出チップの温度調節機構を備えるようにすれば、温度設定が必要な反応処理に利用することができる。
【００１３】
本発明に係る生体物質検出方法は、前記リザーバに検体液を供給する工程と、前記圧力制御手段によって前記流路内の検体液を往復移動させる工程を備えている。
本発明によれば、流路内の検体液を往復移動させることにより、検体液が流路内で攪拌され、少ない検体液でプローブとの反応効率を高めることができる。また、第１のリザーバと第２のリザーバの開口部がそれぞれ第１の気液分離膜と第２の気液分離膜で覆われているため、第１のリザーバ内の加圧、減圧を行っても検体液は第１の気液分離膜と第２の気液分離膜から外へ漏れることがなく、制御がしやすいという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１は、本発明の実施の形態１による核酸検出装置（生体物質検出装置）１０の構成を示す模式図である。図に示すように、核酸検出装置１０は、ＤＮＡチップ（検出用チップ）１１、ステージ１２、コントローラ１３、ポンプ（圧力制御手段）１４、圧力弁（圧力制御手段）１５，１６、管１７を備えている。
【００１５】
図に示すように、ＤＮＡチップ１１はステージ１２上に固定されている。ステージ１２にはヒータ（図示せず）が設置されており、コントローラ１３によって所定の温度に設定することができる。また、ポンプ１４によって加圧、減圧を繰り返すことにより、ＤＮＡチップ１１の流路内の検体液を往復移動させることができるように構成されている。ポンプ１４は例えばシリンジポンプやマイクロポンプを用いることができる。また、管１７は、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）樹脂、シリコーン樹脂等からなるキャピラリーチューブを用いることができる。
【００１６】
図２は、ＤＮＡチップ１１の上面図、図３は、図２に示すＢ−Ｂ断面図である。図に示すように、ＤＮＡチップ１１は、透明基板１０１，１０２、流路１０３、リザーバ（第１のリザーバ、第２のリザーバ）１０４，１０５、気液分離膜（第１の気液分離膜、第２の気液分離膜）１０６，１０７、Ｏリング１０８〜１１２、蓋１１３，１１４、カバー１１５、ポンプとの接続部１１６を備えている。
【００１７】
流路１０３は透明基板１０２に形成されており、リザーバ１０４，１０５は透明基板１０１に形成されている。透明基板１０１，１０２は例えばガラス基板とすることができ、この場合には、流路１０３、リザーバ１０４，１０５は、サンドブラスト法等を用いて形成することができる。透明基板１０１と透明基板１０２は、リザーバ１０４，１０５が流路１０３の両端に接続されるように貼り合わされている。
【００１８】
リザーバ１０４，１０５は、流路１０３との接続部の反対側に開口部を有し、それぞれ気液分離膜１０６，１０７によって覆われている。気液分離膜１０６，１０７は、４フッ化エチレン樹脂等で形成された膜であり、気体は透過させるが、液体の透過は遮断する性質を持つ。気液分離膜１０６，１０７は、それぞれ蓋１１３，１１４によって押さえられており、さらに蓋１１３，１１４はカバー１１５で覆われている。蓋１１３，１１４と透明基板１０１，１０２の間にはＯリング１０８，１０９、蓋１１３，１１４とカバー１１５の間にはＯリング１１０，１１１が設けられており、これにより気液分離膜１０６，１０７を透明基板１０１に密着させている。
【００１９】
リザーバ１０４は、気液分離膜１０６、蓋１１３、カバー１１５、Ｏリング１１２、およびポンプとの接続部１１６を介してポンプ１４に接続されている。ポンプ１４と接続部１１６とを繋ぐ管１７には、図１に示すように圧力弁１５，１６が設置されている。圧力弁１５は、管内の圧力が一定値（ｐ１）以上になると開いて管内の空気を外部へ放出し、圧力弁１６は、管内の圧力が一定値（ｐ２）以下になると開いて外気を管内に取り込む動作をする。ポンプ１４の動作は、制御部（図示せず）が検知した圧力弁１５，１６の開閉に基づいて制御される。なお、ｐ２＜大気圧＜ｐ１である。リザーバ１０５は、気液分離膜１０７、蓋１１４、カバー１１５、を介して外部に通じている。
【００２０】
図２に示すように、実施の形態１では複数の流路１０３が平行に透明基板１０２に形成されており、各々のリザーバ１０４は、ポンプとの接続部１１６を介して１つのポンプ１４に接続されている。
【００２１】
図４は、流路１０３を上から見た図である。流路１０３の形状は、例えば検体が流れる方向（図２に示すＡ方向）に垂直な断面が直径１００μｍの半円とすることができる。図に示すように、流路１０３の内壁には、検体が流れる方向に間隔をおいてプローブが塗布された領域（反応領域）が形成されている。
【００２２】
プローブには、例えば血液、尿、唾液、髄液のような検体試料に含まれる標的物質（ターゲット）を捕捉し得る物質を用いることができる。例えば、ターゲットがＤＮＡやＲＮＡのような核酸である場合には、プローブとしては、これらの核酸とハイブリダイゼーション（相補的に結合）する核酸やヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）等を用いることができる。このような核酸としては、例えばｃＤＮＡやＰＣＲ産物等が用いられる。なお、ターゲットは核酸に限られず、例えば特定のタンパク質であってもよい。この場合には、プローブとしては、このタンパク質を特異的に捕捉（例えば、吸着、結合等）するもの等が用いられる。具体的には、抗原、抗体、レセプター、酵素等のタンパク質、ペプチド（オリゴペプチド）等である。
【００２３】
プローブの塗布は、非接触あるいは接触式スポッター等を用いて行うことができる。なお、各々の反応領域には、それぞれ異なる１種類のプローブが固定されている。これにより、１度に複数種類のターゲットの検出が可能である。
【００２４】
次に、本実施形態による核酸検出装置１０を用いた、ターゲット（核酸）とプローブとのハイブリダイゼーション処理について説明する。
【００２５】
まず、リザーバ１０４又は１０５にピペット等を用いて検体液を供給する。上述したように、流路１０３の形状を検体が流れる方向に垂直な断面が直径１００μｍの半円とすると、流路１０３の体積は０．１μｌ以下となるため、リザーバ１０４，１０５に供給する検体液の量は１μｌ以下でよい。従来の標準的なハイブリダイゼーション処理において用いられる検体液の量は１００μｌ程度であり、本実施形態では、１／１００以下に減らすことが可能となる。
【００２６】
検体液は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルを含む。なお、必要に応じて、ＰＣＲ法を用いて、ターゲットとなる核酸の増幅処理を行っておいてもよいが、上述したように、本実施形態では検体液の量が従来と比較して非常に少量でありハイブリダイゼーションの効率が高いため、増幅を行わなくても検査が可能となり、増幅処理工程を省くことで検査時間を短縮することができる。
【００２７】
リザーバ１０４又は１０５に検体液を供給した後、リザーバ１０４，１０５に気液分離膜１０６，１０７を被せ、Ｏリング１０８，１０９、蓋１１３，１１４、Ｏリング１１０，１１１、カバー１１５を取り付けて、気液分離膜１０６，１０７を密着させる。また、ポンプとの接続部１１６をＯリング１１２を介して取り付け、ポンプ１４を接続する。
【００２８】
次に、ＤＮＡチップ１１をステージ１２に取り付け、ヒーターの温度を３７℃に設定する。ステージ１２の温度が３７℃に達したら、ポンプ１４を作動させて加圧と減圧を繰り返し、検体液を流路１０３内で往復させる。これにより、流路１０３内で検体液が攪拌され、ターゲットとプローブとの反応効率を上げることができる。
【００２９】
初めにリザーバ１０４に検体液を導入した場合には、ポンプ１４で管１７内を加圧していく。すると気液分離膜１０６を通してリザーバ１０４に空気が入り、検体液は流路１０３を通ってリザーバ１０５へ移動する。リザーバ１０５が検体液で満たされた状態になると、検体液は気液分離膜１０７を通ることができないため、検体液の移動が停止する。その後さらに加圧を行うと、管１７内の圧力がｐ１に達し、圧力弁１５が開いて管内の空気が外部へ放出される。圧力弁１５が開いたことが検知されると、今度は逆にポンプ１４で管１７内を減圧していく。すると、今度はリザーバ１０４内から空気が出ていくため、検体液は流路１０３を通ってリザーバ１０４へ移動する。リザーバ１０４が検体液で満たされた状態になると、検体液は気液分離膜１０６を通ることができないため、検体液の移動が停止する。その後さらに減圧を行うと、管１７内の圧力がｐ２に達し、圧力弁１６が開いて外部の空気が管１７内へ流入する。圧力弁１６が開いたことが検知されると、再びポンプ１４で管１７内が加圧される。以上の動作を繰り返すことにより、流路１０３内の検体液を往復移動させることができる。
【００３０】
ここで、図２に示すように、本実施形態では、複数の流路１０３が１つのポンプ１４に接続されており、ポンプ１４を用いて全ての流路１０３内の検体液の移動を制御している。一般に、各々の流路１０３は、加工によるばらつきなどの理由から、検体液の流れやすさに違いがあり、一方のリザーバから他方のリザーバへの移動時間は流路１０３によって異なる。しかし、本実施形態によれば、リザーバの開口部を気液分離膜で覆うようにしたため、一方のリザーバに検体液が完全に移動すると、それ以上加圧あるいは減圧を行ってもリザーバ内に検体液が留まるため、検体液の移動の速い流路１０３の移動完了後も、遅い流路１０３の移動が完了するまで、加圧あるいは減圧を続けることができる。そして、全ての流路１０３の移動が完了したところで、ポンプ１４の動作を加圧から減圧へ、あるいは減圧から加圧へ移行することができる。この結果、検体液の往復移動の回数が全ての流路１０３で等しくなる。このように、流路１０３毎に別のポンプ１４及び圧力弁１５，１６を用いなくても、攪拌の回数を一定にすることができる。よって、流路１０３の複数の流路間でばらつきのない信頼性の高い検査結果を得ることができる。
【００３１】
なお、本実施形態によれば、検体液の往復を繰り返しながらの反応時間は３時間以下でよい。従来の標準的なハイブリダイゼーション処理では、１０時間以上の反応時間が必要であり、本実施形態では大幅に時間短縮を図ることができる。また、１つのポンプ１４及び圧力弁１５，１６による制御で複数の流路１０３の制御が行えるため、従来のハイブリダイゼーション処理と比較し、一度に多くの検体の処理を行うことができる。
ハイブリダイゼーション反応が終了したら、ＣＣＤカメラ等を用いて予めターゲット核酸に結合してある蛍光標識剤を検出するなどの方法により、光学測定を行う。
【００３２】
以上のように、本実施形態によれば、リザーバ１０４内の加圧または減圧を行うことにより、流路１０３内の検体液を往復移動させることができるので、検体液が流路１０３内で攪拌され、少ない検体液でプローブとの反応効率を高めることができる。また、リザーバ１０４，１０５の開口部がそれぞれ気液分離膜１０６，１０７で覆われているため、リザーバ１０４内の加圧、減圧を行っても検体液は気液分離膜１０６，１０７から外へ漏れることがなく、制御がしやすいという利点がある。
【００３３】
また、複数の流路１０３と接続する各々のリザーバ１０４が、１つのポンプ１４及び圧力弁１５，１６に接続されるようにしたので、複数の流路１０３を１つのポンプ１４で制御することができるため、装置の小型化やコストの削減が図れる。また、リザーバ１０４，１０５の開口部がそれぞれ気液分離膜１０６，１０７で覆われているため、流路１０３間で検体の移動時間に差があっても、リザーバ内に検体液を留めておくことで、移動時間の差を吸収することができ、全ての流路１０３で攪拌の回数を一定にすることができる。よって、流路１０３によって検体間の感度ばらつきのない信頼性の高い検査結果を得ることができる。
【００３４】
また、圧力弁１５，１６の開閉を検知してポンプ１４による加圧、減圧を切り替えるようにしたので、簡易な処理で、検体液の往復移動を制御することができる。
なお、圧力弁１５，１６の代わりに、圧力センサと制御回路を設置し、管１７内の圧力がｐ１以上になったらポンプ１４による減圧に切り替え、管１７内の圧力がｐ２以下になったらポンプ１４による加圧に切り替えるように制御してもよい。
【００３５】
なお、本実施形態では、流路１０３を複数設け、全ての流路１０３内の検体液を１つのポンプ１４を用いて往復移動させるようにしたが、流路１０３が１つの場合でも同様に反応処理を行うことができる。
また、本実施形態では、リザーバ１０４のみがポンプ１４に接続されているが、リザーバ１０４，１０５をそれぞれ別のポンプに接続し、両方のポンプを用いて流路１０３内の検体液を往復移動させるようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の実施の形態１による核酸検出装置の構成を示す模式図である。
【図２】本発明の実施の形態１によるＤＮＡチップの上面図である。
【図３】図２のＢ−Ｂ断面図である。
【図４】本発明の実施の形態１による流路を上から見た図である。
【符号の説明】
【００３７】
１０  核酸検出装置、１１  ＤＮＡチップ、１２  ステージ、１３  コントローラ
１４  ポンプ、１５，１６  圧力弁、１７  管、１０１，１０２  透明基板、１０３  流路、１０４，１０５  リザーバ、１０６，１０７  気液分離膜、１０８〜１１２  Ｏリング、１１３，１１４  蓋、１１５  カバー、１１６  ポンプとの接続部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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