(57)【要約】【課題】浄化対象物質分解細菌を系内において優占化できる浄化対象物質分解細菌の調製方法、この調製方法を利用した地下水及び／又は土壌の浄化剤及び浄化方法を提供すること。【解決手段】浄化対象物質分解細菌の調製方法は、浄化対象物質分解細菌（デハロコッコイデス属細菌）を含む細菌群をメンブレンフィルタで濾過し、細菌群における浄化対象物質分解細菌（デハロコッコイデス属細菌）の占有度を増加する優占化手順を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
浄化対象物質分解細菌の調製方法であって、
浄化対象物質分解細菌を含む細菌群をメンブレンフィルタで濾過し、細菌群における前記浄化対象物質分解細菌の占有度を増加する優占化手順を有する調製方法。
【請求項２】
前記浄化対象物質は塩素化エチレンを含み、前記浄化対象物質分解細菌はデハロコッコイデス属細菌を含む請求項１記載の調製方法。
【請求項３】
前記メンブレンフィルタは、０．４５μｍ以上１．２μｍ以下の孔径を有する請求項２記載の調製方法。
【請求項４】
前記メンブレンフィルタは、ポリフッ化ビニリデンを含む請求項２又は３記載の調製方法。
【請求項５】
前記ポリフッ化ビニリデンは、親水性ポリフッ化ビニリデンである請求項４記載の調製方法。
【請求項６】
前記浄化対象物質により汚染された地下水及び／又は土壌を含有する植種源を培養することで前記細菌群を調製する調製手順を、前記優占化手順の前に更に有する請求項１から５いずれか記載の調製方法。
【請求項７】
浄化対象物質により汚染された地下水及び／又は土壌の浄化剤であって、請求項１から６いずれか記載の調製方法により得られる浄化対象物質分解細菌を含有する浄化剤。
【請求項８】
浄化対象物質により汚染された地下水及び／又は土壌の浄化方法であって、請求項７記載の浄化剤を前記地下水及び／又は土壌に投入する手順を有する浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、浄化対象物質分解細菌、とりわけ塩素化エチレン分解細菌の調製方法に関する。また、本発明は、浄化対象物質により汚染された地下水及び／又は土壌の浄化剤及び浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の科学技術の発展により、有害且つ難分解性の化学物質を含む種々の物質が使用されるに伴って、地下水や土壌の汚染が問題となっている。特に、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、シスジクロロエチレン、塩化ビニルといった塩素化エチレンによる汚染は、深刻である。即ち、塩素化エチレンは、水溶性が低く化学的に安定なことから、一旦環境中に放出されると、長期間に亘って土壌や地下水中に残留し蓄積される。
【０００３】
このような背景のもと、塩素化エチレンにより汚染された地下水や土壌の浄化が急務であるが、とりわけ、嫌気性細菌を利用したバイオレメディエーションが、安価な浄化方法として注目されている。欧米では既に実用化された例も報告されており、日本でも実用化に向けた取り組みが活発化している（非特許文献１参照）。
【０００４】
バイオオーグメンテーションに利用する微生物を取得するためには、通常、目的とする機能を有する微生物を環境中からスクリーニングする必要がある。例えば塩素化エチレン分解能を有する微生物の取得においては、炭素源としての有機物と、呼吸基質（電子受容体）としての塩素化エチレンとを含む培地を用いて集積培養を行い、更に継代培養を継続的に行う。ここで一般的に使用できる有機物としては、乳酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸等の有機酸、メタノール等のアルコール、糖類およびタンパク質等が報告されている。
【非特許文献１】「微生物によるバイオレメディエーション利用指針」経済産業省及び環境省、２００５年３月３０日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、このような有機物を資化できる微生物は、環境中に多く存在する。このため、集積培養後の継代培養等の過程で、成長が早く雑多な微生物が、系内において、塩素化エチレン分解能を有する細菌に代わって優占化する事態が懸念される。このような場合、微生物群の構成種を正確に把握し、各種が占める割合を維持すること、ひいてはバイオオーグメンテーションに利用する集積培養体の品質管理が困難になる。
【０００６】
従って、バイオオーグメンテーションに利用する微生物としては、浄化対象物質分解能を有する細菌が純化又は高度に優占化した集積培養体であることが望ましい。実際、非特許文献１においても、バイオオーグメンテーションに利用する微生物は、「高度に限定された微生物で構成され、その構成が継続的に安定していること」という条件を満たすことが望ましいと記されている。
【０００７】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、浄化対象物質分解細菌を系内において優占化できる浄化対象物質分解細菌の調製方法、この調製方法を利用した地下水及び／又は土壌の浄化剤及び浄化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、細菌群を適宜のメンブレンフィルタで濾過することで、浄化対象物質分解細菌の占有度が増加することを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【０００９】
（１）  浄化対象物質分解細菌の調製方法であって、
浄化対象物質分解細菌を含む細菌群をメンブレンフィルタで濾過し、細菌群における前記浄化対象物質分解細菌の占有度を増加する優占化手順を有する調製方法。
【００１０】
（２）  前記浄化対象物質は塩素化エチレンを含み、前記浄化対象物質分解細菌はデハロコッコイデス属細菌を含む（１）記載の調製方法。
【００１１】
（３）  前記メンブレンフィルタは、０．４５μｍ以上１．２μｍ以下の孔径を有する（２）記載の調製方法。
【００１２】
（４）  前記メンブレンフィルタは、ポリフッ化ビニリデンを含む（２）又は（３）記載の調製方法。
【００１３】
（５）  前記ポリフッ化ビニリデンは、親水性ポリフッ化ビニリデンである（４）記載の調製方法。
【００１４】
（６）  前記浄化対象物質により汚染された地下水及び／又は土壌を含有する植種源を培養することで前記細菌群を調製する調製手順を、前記優占化手順の前に更に有する（１）から（５）いずれか記載の調製方法。
【００１５】
（７）  浄化対象物質により汚染された地下水及び／又は土壌の浄化剤であって、（１）から（６）いずれか記載の調製方法により得られる浄化対象物質分解細菌を含有する浄化剤。
【００１６】
（８）  浄化対象物質により汚染された地下水及び／又は土壌の浄化方法であって、（７）記載の浄化剤を前記地下水及び／又は土壌に投入する手順を有する浄化方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、細菌群をメンブレンフィルタで濾過したので、浄化対象物質分解細菌の占有度が増加し、浄化対象物質分解細菌を系内において優占化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに特に限定されるものではない。
【００１９】
＜調製方法＞
本発明の調製方法は、浄化対象物質分解細菌を含む細菌群をメンブレンフィルタで濾過し、細菌群における浄化対象物質分解細菌の占有度を増加する優占化手順を有することを特徴とする。
【００２０】
細菌群としては、既に調製されたものを使用してもよく、浄化対象物質により汚染された地下水及び／又は土壌を含む植種源から新たに調製してもよい。後者の場合、本発明の調製方法は、細菌群を調製する調製手順を優占化手順の前に有する。
【００２１】
以下、本発明の培養方法の手順を、時系列に沿って説明する。
【００２２】
［調製手順］
調製手順は、浄化対象物質により汚染された地下水及び／又は土壌を含有する植種源を培養することで、細菌群を調製する手順である。
【００２３】
具体的には、まず、浄化対象物質により汚染された地下水及び／又は土壌を、培養容器に投入する。植種源として地下水を用いる場合、そのまま培養容器に投入してもよいが、水等で希釈した後に投入してもよい。また、植種源として土壌を用いる場合、そのまま培養容器に投入し液体培地中に懸濁してもよいが、適当な溶媒（例えば、水）に懸濁した後に培養容器に投入してもよい。
【００２４】
使用する地下水や土壌は、バイオスティミュレーションによる汚染の浄化が進行し且つ浄化の過程において浄化対象物質分解細菌が顕著に増殖している汚染現場から採取されたものが好ましい。
【００２５】
培養容器は、培地に対して安定であることが好ましい。培地に後述の塩素化エチレンが含有されている場合、培養容器はガラス製であることが好ましい。植種源が投入されると、更に、有機栄養源としてクエン酸、酵母エキス等が添加される。デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、クエン酸の濃度は１００〜１０００ｍｇ／Ｌ、酵母エキスの濃度は１０〜１００ｍｇ／Ｌであることが好ましい。
【００２６】
ここで、「浄化対象物質」とは、バイオオーグメンテーションによって浄化する対象となる任意の物質であり、具体的には塩素化エチレン等が挙げられる。「塩素化エチレン」とは、エチレンの水素原子のうち少なくとも１個が塩素原子に置換されている化合物を意味し、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、及び塩化ビニルを含む。
【００２７】
浄化対象物質が塩素化エチレンを含む場合、浄化対象物質分解細菌は、分解能に優れる点でデハロコッコイデス属細菌を含むことが好ましい。かかるデハロコッコイデス属細菌は、偏性嫌気性微生物であるため、酸素の存在下では速やかに死滅する。従って、地下水や土壌の採取、移送、培養容器への添加等の一連の操作において、嫌気性条件を保持することが好ましい。
【００２８】
培地の環境を嫌気性とするためには、硫化ナトリウム及び塩化第一鉄が添加されることが好ましい。デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、培地中の硫化ナトリウム及び塩化第一鉄の濃度は、それぞれ、好ましくは５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌである。なお、培養容器の内部環境の嫌気化は、脱気することによってもよく、窒素ガス、又は窒素ガス及び二酸化炭素の混合ガスで培養容器の内部を充填することによってもよい。
【００２９】
培養容器を蓋で密閉した後、培養を開始する。この蓋としては、ポリテトラフルオロエチレンで被覆されたブチルゴム栓が好ましい。
【００３０】
デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、培養は静置して行われ、その温度は１５〜３０℃であることが好ましく、２５〜３０℃であることがより好ましい。培養は、培地内に含まれるすべての浄化対象物質が分解されるまで行われる。デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、シス−１，２−ジクロロエチレンがエチレンに分解されるまで、即ち、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルのいずれもが検出されなくなるまで培養が行われる。浄化対象物質及び分解中間物質（例えばシス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニル）の検出は、例えば、培養容器中の気相を少量採取し、ガスクロマトグラフィー分析により行われる。
【００３１】
培養終了後、培養液を、継代培養用の培地が収容された別の培養容器に移植する。この培地は、先程の添加成分と同様に、クエン酸、酵母エキス、硫化ナトリウム、及び塩化第一鉄を含有するとともに、所定の無機塩類を含有する。
【００３２】
代替的に、培地は、乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸等の有機酸、その塩、メタノール等のアルコール、ショ糖等の糖類等を含んでいてもよい。デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、有機酸はギ酸を除くことが好ましい。また、培養容器には浄化対象物質が添加される。デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、シス−１，２−ジクロロエチレンが添加され、その濃度は、好ましくは１〜１００ｍｇ／Ｌ（１０μＭ〜１ｍＭ）、より好ましくは１〜１０ｍｇ／Ｌ（１０〜１００μＭ）である。
【００３３】
培地には、嫌気度を調べるための指示薬であるレサズリンが添加されてもよい。培地のｐＨは、６．０〜８．５程度の中性域であることが好ましい。
【００３４】
なお、上述した培地成分の濃度は、培養時における濃度である。このため、植種源による希釈で濃度が低下することを考慮し、地下水を加える前の培地は、より高濃度であることが好ましい。
【００３５】
継代培養は、浄化対象物質及び分解中間物質（例えばシス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニル）のいずれもが検出されなくなるまで、先程の培養と同様の条件で行われる。浄化対象物質及び分解中間物質（例えばシス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニル）の検出は、例えば、培養容器中の気相を少量採取し、ガスクロマトグラフィー分析により行われる。このような継代培養を、継続的に行うことで、浄化対象物質（例えば塩化ビニル）分解細菌を含む細菌群が調製される。
【００３６】
［優占化手順］
優占化手順は、浄化対象物質分解細菌を含む細菌群をメンブレンフィルタで濾過し、細菌群における浄化対象物質分解細菌の占有度を増加する手順である。
【００３７】
浄化対象物質分解細菌に応じて、適切な特性（例えば、孔径、素材、親水性度）を有するメンブレンフィルタを採用することで、浄化対象物質分解細菌が選択的に分離される。浄化対象物質分解細菌は、メンブレンフィルタを透過して濾液に濃縮してもよいし、メンブレンフィルタに選択的に捕捉してもよい。分離後の浄化に容易に使用できる点では、濾液に濃縮することが好ましい。また、浄化対象物質分解細菌をより優占化できる点では、双方を組み合わせて行うことが好ましい。
【００３８】
一般に、浄化対象物質分解細菌を濾液に濃縮する場合、孔径が浄化対象物質分解細菌の平均径と同等値以上であり且つ細菌群に含まれる多くの他の細菌の平均径よりも小さいメンブレンフィルタを用いる。また、浄化対象物質分解細菌をメンブレンフィルタに選択的に捕捉する場合、孔径が浄化対象物質分解細菌の平均径と同等値未満であり且つ細菌群に含まれる多くの他の細菌の平均径よりも大きいメンブレンフィルタを用いる。ただし「同等値」は、メンブレンフィルタが有する他の特性（例えば、素材、親水性度）に応じて変化する場合がある。
【００３９】
浄化対象物質分解細菌がデハロコッコイデス属細菌を含む場合、孔径は０．４５μｍ以上１．２μｍ以下であることが好ましい。デハロコッコイデス属細菌は、他の細菌に比べて小型（約０．５μｍ径）であるため、かかる孔径のメンブレンフィルタを選択的に透過し、濾液に濃縮される。
【００４０】
メンブレンフィルタの素材としては、特に限定されず、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、セルロース混合エステル、ポリカーボネート、酢酸セルロース、再生セルロース、ナイロン、ポリプロピレン等の公知の素材が挙げられ、親水性又は疎水性であってよく、浄化対象物質分解細菌に応じて適宜選択されてよい。浄化対象物質分解細菌がデハロコッコイデス属細菌を含む場合、高度な占有度及び収率の双方を達成できる点で、メンブレンフィルタはポリフッ化ビニリデンで構成されることが好ましく、親水性ポリフッ化ビニリデンで構成されることがより好ましい。
【００４１】
また、これらの素材からなるメンブレンフィルタは、使用前に親水化処理又は疎水化処理されていてもよい。親水化処理又は疎水化処理は、常法に従って行えばよい（例えば、特開平１１−９０１６０号公報参照）。
【００４２】
浄化対象物質分解細菌の占有度の増加は、浄化対象物質分解細菌の収率と相反する傾向にある。このため、以上のメンブレンフィルタの特性は、占有度及び収率を考慮して適宜設定されることが好ましい。また、濾過は適宜繰り返して行ってもよく、使用するメンブレンフィルタは、すべて同一であっても、異なってもよい。濾過の回数は、多ければ占有度は増加するが収率が低下することを考慮し、適宜設定されることが好ましい。
【００４３】
［その他］
このようにして浄化対象物質分解細菌が優占化された細菌群は、その後、更に培養して増幅させてもよい。ただし、培養の過程で浄化対象物質分解細菌の占有度が低下するおそれがあることに留意すべきである。
【００４４】
浄化対象物質分解細菌がデハロコッコイデス属細菌を含む場合、培養過程でのデハロコッコイデス属細菌の占有度の低下を抑制するべく、ギ酸及び／又はその塩を主な炭素源とする集積培地で培養することが好ましい。
【００４５】
ここで、「主な炭素源」とは、ギ酸及び／又はその塩以外の炭素源が、微生物の生育に影響を及ぼす程度には含有されていないことを意味する。即ち、微生物の生育に影響を及ぼさない限りにおいて、他の炭素成分が含有されていてもよい。ただし、炭素源としてギ酸及び／又はその塩のみからなることが、塩化ビニル分解能に劣るデハロコッコイデス属細菌をより効果的に除去できる点で、好ましい。
【００４６】
ギ酸、ギ酸の塩は、一方又は双方が添加されていてもよいが、集積培地のｐＨを中性域に保持するためには、ギ酸の塩が好ましい。ギ酸の塩は、デハロコッコイデス属細菌の生育を阻害するものでない限りにおいて特に限定されないが、例えば、ギ酸ナトリウムであってよい。
【００４７】
ギ酸及び／又はその塩の濃度は、通常、塩化ビニル分解能に劣るデハロコッコイデス属細菌の除去効果とコスト面とを考慮して、１ｍＭ以上５ｍＭ以下であることが好ましい。ただし、電子供与体としての水素ガスを培地の気相に添加すれば、ギ酸及び／又はその塩の濃度は、０．１ｍＭ程度であってもよい。
【００４８】
炭素源以外の成分については、前述した継代培養用の培地と同様であってよい。また、同様の条件で培養を行い、植え継ぎを所定回数行う。植え継ぎの回数は、特に限定されないが、少なすぎると、塩化ビニル分解能に劣るデハロコッコイデス属細菌が充分には除去できない場合があり、多すぎても、除去効果は飽和しており経済的でない。そこで、通常３〜１０回程度であることが好ましい。
【００４９】
このようにして得られる培養液は、優れた塩化ビニル分解能を有するデハロコッコイデス属細菌が高度に優占化した状態にある。
【００５０】
＜浄化剤＞
本発明の浄化剤は、浄化対象物質により汚染された地下水及び／又は土壌の浄化剤であって、上記の調製方法により得られる浄化対象物質分解細菌を含有することを特徴とする。
【００５１】
浄化剤に含有される浄化対象物質分解細菌は、適宜の形態であってよい。優占化手順において濾液に濃縮されていた場合には、濾液の形態であってもよく、適宜加工された形態であってもよい。また、優占化手順後に培養を行った場合には、培養後の培養液の形態であってもよく、適宜加工された形態であってもよい。
【００５２】
ただし、浄化対象物質分解細菌がデハロコッコイデス属細菌のように嫌気性である場合、優占度を維持するため、嫌気的条件のもとで管理、使用されるべきである。
【００５３】
＜浄化方法＞
本発明の浄化方法は、浄化対象物質により汚染された地下水及び／又は土壌の浄化方法であって、前述の浄化剤を地下水及び／又は土壌に投入する手順を有することを特徴とする。地下水及び／又は土壌は、原位置であってもよく、原位置から揚水され又は掘削されたものであってもよい。
【００５４】
地下水及び／又は土壌に投入される浄化剤の量、投入速度等は、汚染された地下水及び／又は土壌の汚染状況に応じて、適宜設定されてよい。
【実施例】
【００５５】
塩素化エチレンにより汚染された土壌及び地下水の浄化が、バイオスティミュレーションにより行われている現場から、地下水を採取した。この地下水１００ｍＬを容積１５５ｍＬのガラス製バイアルに入れ、表１に示される培地成分を添加し、窒素／二酸化炭素混合（体積比８／２）ガスで気相を置換した。更に、液中濃度が約６ｍｇ／Ｌ程度となるようシスジクロロエチレン（ｃＤＣＥ）を添加した後、ポリテトラフルオロエチレンで被覆されたブチルゴム栓によりバイアルを密閉した。
【００５６】
【表１】
2009213427.tif 000003
【００５７】
続いて、このバイアルを３０℃の恒温槽内に静置し、培養を開始した。バイアルの気相２００μＬを定期的に引き抜き、ガスクロマトグラフを用いてシスジクロロエチレン（ｃＤＣＥ）、塩化ビニル（ＶＣ）、エチレンの濃度を各々測定した。シスジクロロエチレン及び塩化ビニルが検出されなくなったことを確認した後、培地の水相を採取した。採取した水相１ｍＬを、表２に示される組成の合成培地を収容する別のバイアルに植え継いだ。同様の手順で、合成培地への植え継ぎを計５回行う継代培養を行った。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
得られた培養液の細菌相を、１６ＳｒＤＮＡを対象とする末端制限酵素切断断片長多型（Ｔｅｒｍｉｎａｌ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：Ｔ−ＲＦＬＰ）解析、デハロコッコイデス属細菌および全細菌の１６ＳｒＤＮＡを対象としたリアルタイムＰＣＲ解析、及び１６ＳｒＤＮＡのクローン解析により評価した。この結果、全細菌に占めるデハロコッコイデス属細菌の割合は、１％程度と非常に少ないことが判明した。
【００６０】
続いて、培養液１ｍＬを表３に示すメンブレンフィルタで濾過し、濾液から常法でＤＮＡを抽出した。このＤＮＡ及び前述の培養液の細菌相から得たＤＮＡを用い、リアルタイムＰＣＲ解析によって、全細菌、デハロコッコイデス属細菌（ＤＨＣ）、トリココッカス属細菌（ＴＣ）の１６ＳｒＤＮＡ濃度を測定した。この結果を表３に示す。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
表３に示されるように、各メンブレンフィルタで濾過を行うことで、デハロコッコイデス属細菌の占有度が０．１％（無処理）から８％以上へと増加することが確認された。孔径０．４５μｍ以上１．２μｍ以下のメンブレンフィルタでは、デハロコッコイデス属細菌の占有度が３０％以上に増加し、とりわけ孔径０．４５μｍのメンブレンフィルタでは、デハロコッコイデス属細菌の占有度が１００％になり、デハロコッコイデス属細菌を略完全に分離できることが確認された。
【００６３】
また、親水性ＰＶＤＦからなるメンブレンフィルタによれば、デハロコッコイデス属細菌の回収率が１２％と比較的高く、高度の占有度及び収率の双方を達成できることが確認された。
【００６４】
（Ｔ−ＲＦＬＰ解析）
次に、表３の「ＤＵＲＡＰＯＲＥ（登録商標）」（孔径０．４５μｍ）を用いて得た濾液、及び濾過前の培養液の細菌相から得たＤＮＡを用い、１６ＳｒＤＮＡを対象とするＴ−ＲＦＬＰ解析を行った。この結果を図１に示す。
【００６５】
図１に示されるように、濾過前の培養液では、トリココッカス属細菌の存在を示すピークが格段に突出していたが、濾液では、トリココッカス属細菌の存在を示すピークが消失するとともに、デハロコッコイデス属細菌の存在を示すピークが突出していた。エリア面積に基づき、濾液におけるデハロコッコイデス属細菌の占有率は５８％であり、デハロコッコイデス属細菌が最優占種であることが判明した。なお、その他、セジメントバクター属細菌の存在を示すピークも観察された。
【００６６】
（クローン解析）
Ｔ−ＲＦＬＰ解析で用いたものと同じ濾液から抽出したＤＮＡを用い、１６ｓｒＤＮＡのランダムクローニングを行った。即ち、無作為に選んだ４８クローンに対して３種類の制限酵素（ＢｓｔＵＩ、ＭｓｐＩ、Ｓａｕ９６Ｉ）で制限処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、切断パターンを比較した。３種類がすべて同じパターンを示すものを同一のファイロタイプとして分類した後、分類されたすべてのファイロタイプ（１５種類）の各々から１クローンを選び、１６ＳｒＤＮＡの前方５００塩基の配列を決定した。この配列に基づき、ＢＬＡＳＴ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔの各データベースを利用して、近縁種の決定を試みた。この結果を表４に示す。
【００６７】
【表４】
2009213427.tif 000006
【００６８】
表４に示されるように、濾液におけるデハロコッコイデス属細菌は占有率が６０％と過半数を超える最優占種であり、セジメントバクター属細菌の占有率は２７％であった。Ｔ−ＲＦＬＰ解析の結果（図１）では、デハロコッコイデス属細菌及びセジメントバクター属細菌の占有率はそれぞれ５８％、３１％であり、このクローン解析の結果とほぼ一致した。
【００６９】
表４に示される細菌について、「バイオセーフティー指針」（日本細菌学会）、ドイツＤＳＭＺのデータベースを利用して病原性の有無を調査した。セジメントバクター属細菌としてはＳ．  ｓａａｌｅｎｓｉｓ、Ｓ．  ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃｕｓの２種が報告されているが、いずれも病原性を有しない。また、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ属細菌の一種であるＳ．  ｊｏｎｅｓｉｉについても病原性の報告例はない。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属細菌の一種であるＰ．  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓは、ＤＳＭＺでクラス２の病原体に指定されているが、この解析で検出されたクローンのＤＮＡ配列との相同性は９３％に過ぎず、大きく異なる種類と考えられる。このように、４８クローン中には病原性細菌が確認されず、濾過により特定の病原性細菌が集積されるおそれは低く、この調製方法は安全性に優れることが示された。
【００７０】
（塩化ビニル分解）
濾液中のデハロコッコイデス属細菌が、浄化対象物質としての塩化ビニルを分解する機能を保持しているか否かについて確認を行った。具体的には、Ｔ−ＲＦＬＰ解析で用いたものと同じ濾液２ｍＬを、表２に示す合成培地１００ｍＬに添加し、上述の培養条件と同様に、３０℃で２０日間に亘り静置培養した。なお、培養開始１３日後に塩化ビニルを補充した。かかる培養の間、バイアル中の気体を採取し、ガスクロマトグラフを用いて、気体中の塩化ビニル及びエチレン（塩化ビニルの分解生成物質）濃度を測定した。この結果を図２に示す。
【００７１】
図２に示されるように、培養開始後１３日間で、塩化ビニルがエチレンへとほぼ完全に分解され、塩化ビニル補充をしても、その後５日間でほぼすべての塩化ビニルがエチレンへと分解されていた。これにより、濾過を経て調製されるデハロコッコイデス属細菌は、塩化ビニルの分解機能を維持していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の一実施例に係る調製方法を行うことで、細菌群における浄化対象物質分解細菌の占有度が増加したことを示す図である。
【図２】本発明の一実施例に係る調製方法で調製された浄化対象物質分解細菌が、浄化対象物質分解機能を維持したことを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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