(57)【要約】【課題】マイクロインジェクション時に針から吐出される物質の吐出量を計測・較正することで、精度良く物質の吐出較正を行なうことができるマイクロインジェクション用のシャーレを提供することを目的とする。【解決手段】シャーレ２０を構成するシャーレ本体２１は、シャーレ底面の培養液内に細胞を付着させる凹部形状の細胞培養領域部２２と、細胞が含まれていない液体が満たされる凹部形状の吐出較正領域部２３とに領域が区分され、このうち予め吐出較正領域部２３によりインジェクションを行う場合に、針の針先から吐出される物質の吐出量を計測および較正する。【選択図】        図１
2009183193.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の細胞に突き刺した針を通して該細胞に目的物を注入するマイクロインジェクション用のシャーレであって、
前記シャーレは、
前記細胞を培養する培養液を満たす細胞培養領域部と、
前記細胞培養領域部と隔壁により仕切られるとともに、前記針から吐出される目的物を対象とし、当該目的物の吐出量の較正を行なう吐出較正領域部とから構成されることを特徴とするマイクロインジェクション用のシャーレ。
【請求項２】
所定の細胞に突き刺した針を通して該細胞に目的物を注入するマイクロインジェクション用のシャーレであって、
前記シャーレは、
前記細胞を培養液内に保持する略矩形型に形成されるシャーレ本体と、当該シャーレ本体の外周形状と嵌合する内周形状を有する外枠体とで構成され、
前記シャーレ本体は、前記細胞を培養する培養液を満たす細胞培養領域部と、
前記細胞培養領域部と隔壁により仕切られるとともに、前記針から吐出される目的物を対象とし、当該目的物の吐出量の較正を行なう吐出較正領域部とから構成されることを特徴とするマイクロインジェクション用のシャーレ。
【請求項３】
前記吐出較正領域部は、細胞を含まない液体を満たすことを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロインジェクション用のシャーレ。
【請求項４】
前記吐出較正領域部が占有する領域面積は、当該吐出較正領域部の液体内で対流が発生しないように小面積の凹部形状となるように形成されることを特徴とする請求項１、２または３に記載のマイクロインジェクション用のシャーレ。
【請求項５】
前記細胞培養領域部の所定位置には、前記細胞を対象とする焦点の位置合わせとともに、シャーレの底面高さ位置を検出する複数個の焦点合わせ用マークが設けられていることを特徴とする請求項１〜４の何れか一つに記載のマイクロインジェクション用のシャーレ。
【請求項６】
前記シャーレに形成された前記吐出較正領域部と隣接した位置には、前記マイクロインジェクション時に使用する前記針の針先を洗浄する針先洗浄領域部が形成されていることを特徴とする請求項１〜５の何れか一つに記載のマイクロインジェクション用のシャーレ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の細胞に突き刺した針を通して該細胞に目的物（薬液などの物質）を注入するマイクロインジェクション用のシャーレに関し、特に、マイクロインジェクション時に針から吐出される物質の吐出量を計測・較正することで、精度の高い吐出較正を行なうことができるように構成されたマイクロインジェクション用のシャーレに関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡を使用して対象とする細胞内に微細な針を通して遺伝子を注入することにより細胞の遺伝情報を改変させる研究は、遺伝子の役目を明らかにするとともに、個人の遺伝的特性に合わせた遺伝子治療を行うテーラメード医療を可能にする。かかる研究により、従来は治療ができなかった遺伝的な原因による病気の治療も可能となってきている。 
【０００３】
遺伝子を細胞に注入する方式には、電気的な方式（エレクトロポレーション）、化学的な方式（リポフェクション）、生物的な方式（ベクター法）、光学的な方法（レーザインジェクション）、機械的な方式（マイクロインジェクション）などがある。 
【０００４】
上記５つの方式のうち、電気的な方式は、大電流を流し細胞膜を破るため、細胞に与えるダメージが大きい。また、化学的な方式は、導入できる遺伝子に制限があり、導入効率が悪い。また、生物的な方式は、導入できる材料の種類が限られ、安全性が確認できない等の欠点がある。 
【０００５】
そこで、現在では、マイクロインジェクションによる機械的な方式が最も安全で効率が高い方法として採用されることが多い。以下、図１６を参照して、マイクロインジェクションを行なうときに使用されるマイクロインジェクション装置１０の概要について説明する。ここで図１６は、マイクロインジェクション装置１０の全体構成である斜視図を示している。また、図１７は、従来のシャーレによるインジェクションを説明するための説明図を示している。
【０００６】
図１６に示すようにマイクロインジェクション装置１０は、シャーレ１１を載置するためのシャーレステージ１２と、このシャーレステージ１２上にセットされたシャーレ１１に上方から光を照射する照明光源１３と、対物レンズ１４と、反射鏡１５と、結像レンズ１６と、ＣＣＤカメラ（Charge  Coupled  Devices）１７とを備えている。対物レンズ１４は、インジェクション対象の細胞の拡大画像をシャーレ１１の下方から取得し観察したり、反射鏡１５を介して結像レンズ１６により画像をＣＣＤカメラ１７の映像素子上に結像させることができる。
【０００７】
ここで、図１７に示すように、シャーレステージ１２に載置されるシャーレ１１には、培養液（培地）が満たされており、この培養液内に配置された細胞を対象として針１８を使用してマイクロインジェクションを行なう。具体的には、シャーレ１１の培養液中に細胞を投入すると、一定時間後に細胞はシャーレ１１の上面に付着するため、この付着した細胞に中空の針１８（マイクロピペット、シリンジ、或いは、キャピラリ等）を突き刺し、この針１８の針先１９を通して細胞に目的物を注入するマイクロインジェクションを行なうこととなる。
【０００８】
以上のように構成されるマイクロインジェクション装置１０では、シャーレ１１の下方に配した対物レンズ１４によって取得される細胞の拡大画像に基づいて針１８が制御部（図示せず）の制御により細胞へ誘導され、インジェクションが実行される。
【０００９】
ところで、このような細胞に針１８の針先１９を突き刺して遺伝子等を注入するインジェクションを行なう場合には、ある程度熟練した操作技術が必要となる。すなわち、付着細胞は、シャーレ１１の底面上では、シャーレ底面に沿って伸展した形状となり、水直径が１５μm程度、厚さが５μｍ程度しかないため、体積が小さく、インジェクションにおいては、針先から細胞内への物質の注入量（以降、吐出量と呼ぶ）の微細なコントロールが必要となる。
【００１０】
このように、針１８のコントロールの作業を難しくしているのは、細胞が透明であることと、底面に細胞を付着させるシャーレが透明な材質からなることによって、細胞とシャーレとの境界が明確でないことと、基本的に１つの対物レンズ１４のみを使用して観測を行うために、遠近感や立体感が掴みづらいことによる。このため、針１８の針先１９から吐出される物質の吐出量を把握するために何らかの方法により計測する必要がある。
【００１１】
このような、インジェクション時における物質の吐出量を計測する方法としては、蛍光試薬を利用した方法がある。これは針の針先に蛍光を発する試薬を塗布し、針から針に充填した目的物を培養液中に吐出して蛍光強度（光量）を検出し、予め計測した吐出量と蛍光強度との相関より吐出量を求めるようにしている。そして、算出した吐出量から、針の吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求め、この求めた吐出量と圧力及び加圧時間との相関に基づいて圧力及び加圧時間を制御することで針から吐出される吐出量を調整する方法である。この方法によれば、導入溶液として蛍光物質を含んだ溶液を用いて吐出量と蛍光強度との相関関係から微少な吐出量を精度良く測定して圧力／加圧時間を制御するので、吐出量の定量化を図ることができる。
【００１２】
また、この種のマイクロインジェクションに関する蛍光強度に関連する従来技術としては、例えば、特許文献１に開示されているように、蛍光強度の変化を計測することにより細胞の核酸成分の定量解析を行なうなどの方法がある。
【００１３】
【特許文献１】特開２００４−８１０８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ところが、上述した蛍光試薬を利用したマイクロインジェクションによる物質の吐出量を計測・制御する方法の場合、以下のような問題がある。すなわち、蛍光試薬を利用した方法の場合、シャーレ底面に付着した細胞の影響により、計測精度が低下するという問題がある。また、シャーレ底面に細胞のない場所を探すにしても、細胞の培養密度によっては、付着細胞のない観察位置を探すのが困難であったり、細胞が密集しすぎてシャーレ上に観察可能位置がなかったりする問題がある。また、シャーレの形状は、基本的に円形型であるため、シャーレの回転により培養液内に配置された細胞の位置再現性が低いという問題がある。
【００１５】
本発明は、上記問題点（課題）を解消するためになされたものであって、マイクロインジェクション時に針から吐出される薬液などの物質の吐出量を正確に計測・較正できるとともに、精度の高い較正を行なうことができるように構成されたマイクロインジェクション用のシャーレに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上述した問題を解決し、目的を達成するため、請求項１に係る発明は、所定の細胞に突き刺した針を通して該細胞に目的物を注入するマイクロインジェクション用のシャーレであって、前記シャーレは、前記細胞を培養する培養液を満たす細胞培養領域部と、前記細胞培養領域部と隔壁により仕切られるとともに、前記針から吐出される目的物を対象とし、当該目的物の吐出量の較正を行なう吐出較正領域部とから構成されることを特徴とする。
【００１７】
また、請求項２に係る発明は、所定の細胞に突き刺した針を通して該細胞に目的物を注入するマイクロインジェクション用のシャーレであって、前記シャーレは、前記細胞を培養液内に保持する略矩形型に形成されるシャーレ本体と、当該シャーレ本体の外周形状と嵌合する内周形状を有する外枠体とで構成され、前記シャーレ本体は、前記細胞を培養する培養液を満たす細胞培養領域部と、前記細胞培養領域部と隔壁により仕切られるとともに、前記針から吐出される目的物を対象とし、当該目的物の吐出量の較正を行なう吐出較正領域部とから構成されることを特徴とする。
【００１８】
また、請求項３に係る発明は、上記発明において、前記吐出較正領域部は、細胞を含まない液体を満たすことを特徴とする。
【００１９】
また、請求項４に係る発明は、上記発明において、前記吐出較正領域部が占有する領域面積は、当該吐出較正領域部の液体内で対流が発生しないように小面積の凹部形状となるように形成されることを特徴とする。
【００２０】
また、請求項５に係る発明は、上記発明において、前記細胞培養領域部の所定位置には、前記細胞を対象とする焦点の位置合わせとともに、シャーレの底面高さ位置を検出する複数個の焦点合わせ用マークが設けられていることを特徴とする。
【００２１】
また、請求項６に係る発明は、上記発明において、前記シャーレに形成された前記吐出較正領域部と隣接した位置には、前記マイクロインジェクション時に使用する前記針の針先を洗浄する針先洗浄領域部が形成されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
請求項１の発明によれば、シャーレは、シャーレに培養液および細胞を投入し、シャーレ底面に細胞を付着させる細胞培養領域部と、細胞が含まれていない液体が満たされた吐出較正領域部とに区分し、このうち予め吐出較正領域部によってインジェクション時に針から吐出される物質の吐出量を計測及び較正を行う構成としているので、針の針先から吐出される物質の吐出量の計測及び吐出される物質の吐出量の較正を精度良く行なうことができるという効果がある。
【００２３】
また、請求項２の発明によれば、シャーレは、細胞を培養液内に保持する略矩形型に形成されるシャーレ本体と、シャーレ本体の外周形状と嵌合する内周形状を有する外枠体とで構成され、シャーレ本体は、細胞を培養する培養液を満たす細胞培養領域部と、細胞培養領域部と隔壁により仕切られるとともに、針から吐出される目的物を対象とし、当該目的物の吐出量の較正を行なう吐出較正領域部とから構成されるので、シャーレ本体は、外枠体の内周部に嵌合された状態で固定されるので、シャーレ本体は回転などにより位置が変位することがなく、外枠体の内側に固定されるので、これによって、シャーレの培養液内に保持された細胞位置の再現性を向上させることができる。
【００２４】
また、請求項３の発明によれば、吐出較正領域部は、細胞を含まない液体を満たすので、細胞の影響を受けずに正確に物質の吐出量の計測および吐出較正を行なうことができる。
【００２５】
また、請求項４の発明によれば、吐出較正領域部が占有する領域面積は、液体内で対流が発生しないように小面積の凹部形状となるように形成されるので、温度対流や振動対流などの影響を低減することができ、これによって、効率良く正確に吐出較正を行なうことができる。
【００２６】
また、請求項５の発明によれば、細胞培養領域部には、位置合わせ及びシャーレの底面高さ検出のための複数個の焦点合わせ用マークが設けられているので、焦点合わせ用マークに焦点を合わせるだけでインジェクション時の細胞の状態を観察することができるとともに、シャーレの底面に付着する細胞の焦点位置を自動的に効率よく正確に計測し、これにより、細胞に対する効率的な遺伝子注入作業を可能とすることができる。また、焦点合わせ用マークによりシャーレ底面の傾斜を正確に算出することが可能になり、これにより、より効率的に細胞の正確な焦点位置を検出することができる。 
【００２７】
また、請求項６の発明によれば、シャーレに形成された吐出較正領域部と隣接した位置には、マイクロインジェクションを行なう時に細胞に物質を吐出させる針の先端を洗浄するための針先洗浄領域部が設けられているので、針先洗浄領域部により針の先端を効率的に洗浄することができ、これによって、針の針先に付着した付着物を簡単に除去することができため、針先を常に清潔な状態で維持するとともに、マイクロインジェクション時に細胞に対して物質の吐出を良好に行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下に添付図面を参照し、本発明のマイクロインジェクション用のシャーレに係る実施例１について詳細に説明する。実施例１は、照明光源とシャーレの底面に配置した付着細胞を顕微鏡の対物レンズを通して観察或いは、撮影することができるマイクロインジェクション装置に適用されるシャーレの構成に係る実施例である。なお、以下に示す実施例１によりこの発明が限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
［シャーレの構成の特徴］
ここで、本実施例１に係るシャーレは、シャーレ２０を構成する領域（シャーレ本体２１）に培養液および細胞を投入し、シャーレ底面に細胞を付着させる領域部（細胞培養領域部２２）と、細胞が含まれていない液体が満たされた領域（吐出較正領域部２３）とに区分し、予め吐出較正領域部２３によってインジェクション時に針から吐出される物質の吐出量の計測及び較正を行なうことに特徴がある。
【００３０】
［シャーレの全体構成］
先ず、図１を参照して、本実施例１に係るシャーレ２０の全体構成を説明する。図１は、本実施例１に係るシャーレ２０の全体構成を示す平面図及び縦断面図である。また、図２は、シャーレ２０内の培養液中に複数個の細胞を配置させた状態を示す説明図である。
【００３１】
図１に示すように、シャーレ２０は、培養液を入れた状態で、この培養液内に細胞を配置する円形型のシャーレ本体２１により構成されている。また、シャーレ本体２１の大部分は、細胞を培養液内に配置した状態で、この細胞に対するインジェクションを行なう凹部形状に形成された細胞培養領域部２２として構成されており、このうちの一部は、小円筒型の凹部形状に形成された吐出較正領域部２３として構成されている。
【００３２】
図２に示すように、細胞培養領域部２２には、細胞培養液或いは、生体内と浸透圧が同じになるよう塩濃度を調整しているＰＢＳ（phosphate-buffered saline：リン酸緩衝生理食塩水）のような緩衝液が入れられる。すなわち、この細胞培養領域部２２は、従来と同様に培養液および細胞が投入されるため、シャーレ本体２１の底面に細胞を付着させる領域部として使用される。
【００３３】
一方、吐出較正領域部２３には細胞を含んでいない培養液やＰＢＳ（phosphate-buffered saline）のような緩衝液或いは、通常の水が入れられることとなる。すなわち、この吐出較正領域部２３により、細胞培養領域部２２とは異なり細胞の付着していない領域を確保することができるため、本実施例１では、この吐出較正領域部２３を使用して、針１８の針先１９から吐出される物質の計測および較正を予め行なうことで、精度の高い較正を可能としている。
【００３４】
以下、図３−１及び図３−２を参照して、マイクロインジェクション時に行なう吐出較正の詳細について説明する。図３−１は、インジェクション時に行なう吐出較正領域部２３を使用した吐出較正処理を説明するための説明図である。また、図３−２は、細胞培養領域部２２による細胞に対するインジェクションを説明する説明図である。
【００３５】
すなわち、図３−１に示すように、吐出較正を行なう場合には、吐出較正領域部２３の液体中に針１８の針先１９を入れて物質を吐出し、この吐出した物質の吐出量を計測し、計測した吐出量に応じて較正を行なう。これによって、針から吐出される物質の吐出量の計測及び吐出される物質の吐出量の較正を精度良く行なうことができる。ここで、物質の吐出量の計測は、前述した蛍光試薬を利用した方法により行なう。次いで、このように吐出較正を行なったならば、従来と同様に細胞培養領域部２２の培養液中に針１８を入れ、細胞に対して針先１９から所定量の物質を吐出するマイクロインジェクションを行なう。
【００３６】
以上説明したように、本実施例１のシャーレ２０は、シャーレ２０を構成するシャーレ本体２１に培養液および細胞を投入し、シャーレ底面に細胞を付着させる細胞培養領域部２２と、細胞が含まれていない液体が満たされた吐出較正領域部２３とに区分し、このうち予め吐出較正領域部２３によってインジェクション時に針から吐出される物質の吐出量の計測及び較正を行うので、針１８の針先１９から吐出される物質の吐出量の計測及び吐出される物質の吐出量の較正を精度良く行なうことができる。
【実施例２】
【００３７】
［シャーレの特徴及び構成］
次に、本実施例２に係るシャーレの構成について詳細に説明する。先ず、図４を参照して、本実施例１に係るシャーレ３０の特徴及び全体構成を説明する。図４は、本実施例２に係るシャーレ３０の全体構成を示す平面図である。また、図５は、シャーレ３０内に培養液を入れ複数個の細胞を配置した状態を示す説明図である。なお、本実施例２において、前述した実施例１と同様の箇所および作用についての詳細な説明は省略する。
【００３８】
図４に示すように、本実施例２のシャーレ３０は、細胞を培養液内に配置する略矩形型に形成されるシャーレ本体４０と、このシャーレ本体４０を内部に嵌合させた状態で固定する外枠体５０とで構成したことに特徴がある。また、前述した実施例１と同様に、シャーレ３０を構成するシャーレ本体４０は、培養液および細胞を投入し、シャーレ底面に細胞を付着させる細胞培養領域部４２と、細胞が含まれていない液体が満たされた吐出較正領域部４３とに区分され、このうち予め吐出較正領域部４３によってインジェクション時に針１８から吐出される物質の吐出量を計測及び較正を行うように構成している。
【００３９】
すなわち、同図に示すように、シャーレ３０を構成するシャーレ本体４０は、従来のように円形型ではなく、全体が略矩形型に形成されるとともに、このシャーレ本体４０の外周縁部４１と嵌合する内周縁部５１を有する同じく全体が略矩形型に形成された外枠体５０とを組み合わせる一体成型として構成されている。
【００４０】
このように、シャーレ本体４０は、外枠体５０の内側に嵌合された状態で固定されるので、シャーレ本体４０は回転などにより位置が変位することがなく、これによって、シャーレ３０の培養液内に配置されている細胞位置の再現性を向上させることができる。なお、本実施例２では、シャーレ３０を構成する外枠体５０は、略矩形型（角型）としているが、回転対象とならない形状であれば、角型以外の形状であってもよい。
【００４１】
また、細胞培養領域部４２には、細胞培養液或いは、生体内と浸透圧が同じになるよう塩濃度を調整しているＰＢＳ（phosphate-buffered saline：リン酸緩衝生理食塩水）のような緩衝液が入れられる。すなわち、この細胞培養領域部４２は、従来と同様に培養液および細胞を投入し、シャーレ本体４０の底面に細胞を付着させる領域部（図５参照）として機能する。
【００４２】
一方、吐出較正領域部４３は、シャーレ本体４０の隔壁４４と隔壁４５とにより区分された凹部領域であり、細尺状の凹部形状となるように形成されるとともに、この吐出較正領域部４３が占有する領域面積（縦寸法ｈ×横寸法ｔ＝面積ｓ）は、液体内で対流が発生しないように小面積となるように形成されている。具体的には、本実施例２では、吐出較正領域部４３の縦寸法ｈは、４mmに、横寸法ｔは、１６mm（面積ｓ＝６４mm２）となるように設定されている（図５参照）。すなわち、吐出較正領域部４３は、小面積となるように形成されていることから温度対流や振動対流を低減することができ、これによって、精度良く吐出較正を行なうことができる。
【００４３】
このように、本実施例２では、細胞が存在しない液体が満たされている吐出較正領域部４３により、針１８から吐出される物質の吐出量の計測・較正を行うことで、精度の高い較正を可能とするとともに、吐出較正領域部４３の底面積を対流が発生しないように小面積とすることによって、さらに吐出量の計測・較正の精度を向上できる構成としている。
【００４４】
以下、図６−１及び図６−２を参照して、マイクロインジェクション時に行なう吐出較正の詳細について説明する。図６−１は、インジェクション時に行なう（吐出較正領域部４３による）吐出較正処理を説明するための説明図である。また、図６−２は、細胞培養領域部４２による細胞に対するインジェクションを説明する説明図である。
【００４５】
すなわち、吐出較正を行なう場合、先ず、図６−１に示すように、吐出較正領域部４３の液体中に針１８の針先１９を入れて物質を吐出し、この吐出した物質の吐出量を計測し、計測した吐出量に応じて較正を行なう。次いで、このように吐出較正を行なったならば、従来と同様に細胞培養領域部４２の培養液中に針１８を入れ、細胞に対して針先１９から所定量の物質を吐出するマイクロインジェクションを行なう。ここで、前述したように、本実施例２では、外枠体５０の内周部に嵌合された状態で固定されるので、シャーレ本体４０は回転などにより位置が変位することがなく、外枠体５０の内側に固定されるので、これによって、シャーレ３０の培養液内に配置されている細胞位置の再現性を向上させることができる。
【００４６】
ここで、図７−１及び図７−２を参照して、通常のシャーレによる蛍光試薬吐出画像と吐出較正領域部４３を使用した蛍光試薬吐出画像について説明する。図７−１は、直径３５mmの市販のシャーレ内で蛍光試薬を吐出したときの蛍光試薬吐出画像を示している。また、図７−２は、本実施例２で説明した吐出較正領域部４３の底面が小領域（縦寸法ｈ×横寸法ｔ＝４mm×１６mm）に区切られたシャーレ２０の吐出較正領域部４３内の液体中に蛍光試薬を吐出した時の蛍光試薬吐出画像を示している。
【００４７】
すなわち、図７−１に示すように、直径３５mmの市販のシャーレの場合には、対流の影響により蛍光試薬の拡散が大となり蛍光量の計測精度が低下しているのに対し、図７−２に示すように、小領域（縦寸法ｈ×横寸法ｔ＝４mm×１６mm）となるように形成された吐出較正領域部４３の場合には、対流の影響がなく蛍光試薬の拡散が少ないことがわかる。
【００４８】
すなわち、このように、本実施例２では、吐出較正領域部４３の大きさは、小領域（縦ｈ×横ｔ＝４mm×１６mm）となるように形成しているため、蛍光試薬吐出画像の拡散が大きくなることはなく、温度や振動などによる液体の対流を防止し、これにより、針１８から吐出される物質の吐出量の計測及び較正を正確に行なうことができる。
【００４９】
［蛍光強度の計測結果］
次に、本実施例２における蛍光強度の計測結果について説明する。図８は、直径３５mmの市販のシャーレ、底面が１２mm×２２mmの領域に区切られた容器、底面が４mm×１６mmの領域に区切られた容器の３種類の容器で蛍光試薬の吐出較正を行った時の「吐出圧力×時間」と吐出した試薬の「蛍光強度」との計測結果である。ここで、横軸は、吐出圧力×時間（Ｐａ×ms）を、縦軸は、正規化した蛍光強度である正規化蛍光強度（０〜１．０）をそれぞれ示している。
【００５０】
図８に示すように、それぞれの計測結果の近似直線、および、相関値Ｒを算出すると、直径３５mmの市販のシャーレは、「Ｒ=０.９７１」、底面が１２mm×２２mmの領域に区切られた容器は、「Ｒ＝０.９８９」、底面が４mm×１６mmの領域に区切られた容器は、「Ｒ=０.９９７」となることがわかる。以上のことから４mm×１６mmの領域に区切られた容器が最も相関値が高く直線性が高いことがわかり、これにより、本実施例２に示した吐出較正領域部４３で小領域（縦寸法ｈ×横寸法ｔ＝４mm×１６mm）の領域に区切られた容器（吐出較正領域部４３）を使用した場合の計測精度が高いことわかる。
【００５１】
以上説明したように、本実施例２のシャーレ３０を構成するシャーレ本体４０は、略四角型状に形成されるとともに、外枠体５０の内周縁部５１に嵌合された状態で、外枠体５０の内側に固定されるので、このシャーレ本体４０が回転し位置が変位することはなく、これによって、シャーレ本体４０内の培養液中に配置された細胞位置の再現性を向上させることができる。また、実施例１と同様に、シャーレ本体２１は、培養液内に細胞を付着させる細胞培養領域部２２と、細胞が含まれない液体が満たされた吐出較正領域部２３とに区分され、吐出較正領域部２３によりインジェクション時に針１８から吐出される物質の吐出量を計測及び較正を行うので、物質の吐出量の較正を精度良く行なうことができる。
【実施例３】
【００５２】
［シャーレの特徴及び構成］
次に、本実施例３に係るシャーレの構成について詳細に説明する。先ず、図９を参照して、本実施例３に係るシャーレ３０Ａの特徴及び全体構成を説明する。図９は、本実施例３に係るシャーレ３０Ａの全体構成を示す平面図である。また、図１０は、シャーレ３０Ａに培養液を入れ複数個の細胞を配置した状態を示す説明図である。なお、本実施例３において、前述した実施例２と同様の箇所および作用についての詳細な説明は省略する。
【００５３】
ここで、前述した実施例２のシャーレ３０と本実施例３のシャーレ３０Ａとの相違は、シャーレ本体４０の底面部（細胞培養領域部４２）に細胞に対する焦点合わせおよびシャーレ本体４０の底面部の傾斜を計測するための焦点合わせ用マーク６０を設けたことにある。また、このシャーレ３０Ａは、前述した実施例１、２と同様に、培養液内に細胞を付着させる細胞培養領域部４２と、細胞が含まれない液体が満たされた吐出較正領域部４３とに区分され、吐出較正領域部４３によりインジェクション時に針１８から吐出される物質の吐出量を計測及び較正を行う構成としている。
【００５４】
図９に示すように、焦点合わせ用マーク６０は、黒丸印とされた点画像が縦に３個、横に３個（合計９個）配列されたマークであり、シャーレ本体４０の底面部の表面位置に５箇所に配置されている。この焦点合わせ用マーク６０の平面位置、高さをマイクロインジェクション装置１０の対物レンズ１４を使用して観察することで、細胞に対する焦点合わせおよびシャーレ本体４０の底面部（表面側）の傾き（シャーレ３０Ａの傾斜、高さ）をを高精度に計測することができる。なお、本実施例３では、焦点合わせ用マーク６０の形状は、黒丸形状としているが、この焦点合わせ用マーク６０の形状は、黒丸マークに限らず長方形、十字形のように、円形以外の形状であっても良い。ここで、焦点合わせ用マーク６０の大きさは、観察視野（４０倍の対物レンズと２／３インチのＣＣＤを使用する場合）内に入る直径１００ｕｍ以下が望ましいが、その限りではない。
【００５５】
また、この焦点合わせ用マーク６０は、スライドグラス、カーボン板、カーボン支持膜などの疎水性基板の表面を水に濡れやすくする親水化処理が施されている。すなわち、焦点合わせ用マーク６０を親水化処理することで、細胞の付着を防ぐことができ、シャーレに設けられている焦点合わせ用マーク６０に対する細胞の付着を確実に防止することができ、これによって、マイクロインジェクション時に物質の吐出量を正確に計測することができる。実際には、プラズマ処理などを利用してイオンスパッタ装置のターゲットを外した状態で放電させ、放電領域のそばにシャーレ３０Ａを置くことで焦点合わせ用マーク６０を親水性にすることができる。その他、界面活性剤で焦点合わせ用マーク６０を親水化することも可能である。
【００５６】
［シャーレの傾斜の計算方法］
ここで、以下、図１１と、式（１）〜（３）と数１および数２の式（１）〜（２）とにより、上述した焦点合わせ用マーク６０を使用した場合に求められるシャーレの傾斜の計算例を説明する。図１１は、焦点合わせ用マーク６０の任意の三点のＸ、Ｙ、Ｚ座標により表せられる法線ベクトルの線図を示している。
【００５７】
すなわち、図１１に示すように、焦点合わせ用マークの任意の三点のＸ、Ｙ、Ｚ座標をそれぞれＰ1(ｘ１，y１，z１)、Ｐ２(ｘ２，y２，ｚ２)、Ｐ３(ｘ３，ｙ３，ｚ３)とし、また、Ｐ１→Ｐ２のベクトルをＶ１=Ｐ２−Ｐ１とし、Ｐ１→Ｐ３のベクトルをＶ２=Ｐ３−Ｐ１とすると、二つのベクトルの法線ベクトルＮ（Nｘ，Nｙ，Nz）は、Ｖ１とＶ２の外積となり、以下の式で表される。
Ｎｘ＝Ｖ１ｙ×Ｖ２ｚ−Ｖ１ｚ×Ｖ２ｙ
＝（ｙ２−ｙ１）（ｙ３−ｙ１）−（ｙ２−ｚ１）（ｙ３−ｙ１）  ・・・・・（１）
Ｎｙ＝Ｖ１ｚ×Ｖ２ｘ−Ｖ１ｘ×Ｖ２ｚ
＝（ｚ２−ｚ１）（ｘ３−ｘ１）−（ｘ２−ｘ１）（ｚ３−ｚ１）  ・・・・・（２）
Ｎｚ＝Ｖ１ｘ×Ｖ２ｙ−Ｖ１ｙ×Ｖ２ｘ
＝（ｘ２−ｘ１）（ｙ３−ｙ１）−（ｙ２−ｙ１）（ｘ３−ｘ１）  ・・・・・（３）
【００５８】
そして、Ｘ軸周りの回転角をθxとし、Ｙ軸周りの回転角をθyとすると、θxとθyは、上記で算出したした式（１）と、式（２）と、式（３）とより、以下で示す数１と数２の式となる。
【００５９】
【数１】
2009183193.tif 000003
【００６０】
【数２】
2009183193.tif 000004
【００６１】
このようにシャーレ３０Ａ内の任意の３点の焦点合わせ用マーク６０の位置を計測することで、シャーレ３０Ａの傾斜を計算することが可能である。また、４点以上の焦点合わせ用マーク６０を使用して、上記３点の計測を複数回行い、結果を平均化することで、傾斜の計測精度はさらに高めることがができる。
【００６２】
以上説明したように、本実施例３のシャーレ３０Ａは、シャーレ本体４０の構成する細胞培養領域部４２には、細胞の焦点位置合わせ及びシャーレの底面高さ検出のための複数個の焦点合わせ用マーク６０が設けられているので、焦点合わせ用マーク６０を検出し、焦点を合わせるだけでシャーレ底面の傾斜を正確に算出することが可能になり、これにより、より効率的に細胞の正確な焦点位置を検出することができる。
【実施例４】
【００６３】
［シャーレの特徴及び構成］
次に、本実施例４に係るシャーレの構成について詳細に説明する。先ず、図１２を参照して、本実施例４に係るシャーレ３０Ｂの特徴及び全体構成を説明する。図１２は、本実施例４に係るシャーレ３０Ｂの全体構成を示す平面図である。また、図１３は、シャーレ３０Ｂ内に培養液を入れ複数個の細胞を配置した状態を示す説明図である。なお、本実施例４において、前述した実施例２と同様の箇所および作用についての詳細な説明は省略する。
【００６４】
ここで、前述した実施例２のシャーレ３０と本実施例４のシャーレ３０Ｂとの相違は、シャーレ本体４０に形成された培養液内で細胞を付着させる細胞培養領域部４２と物質の吐出量の計測及び較正を行う吐出較正領域部４３以外に、マイクロインジェクションを行なう時に使用される針１８の針先１９を洗浄するための針洗浄領域部７０を設けたことに特徴がある。
【００６５】
すなわち、図１２に示すように、シャーレ本体４０の所定位置には、培養液内に細胞を付着させるための凹部形状の細胞培養領域部４２と、細胞が含まれない液体を満たすための凹部形状の吐出較正領域部４３とがそれぞれ隔壁４４、４５により区分された状態で形成されている。そして、この吐出較正領域部４３と隣接した位置（図１２の右側）には、マイクロインジェクションを行なう時に使用される針１８の針先１９を洗浄するための針洗浄領域部７０が形成されている。具体的には、図１３に示すように、吐出較正領域部４３によりインジェクション時に針１８から吐出される物質の吐出量を計測及び較正を行う構成としている。
【００６６】
以上説明したように、本実施例４のシャーレ３０Ｂは、シャーレ本体４０に形成された細胞培養領域部４２および吐出較正領域部４３以外に、マイクロインジェクションを行なう時に使用される針１８の針先１９を洗浄するための針洗浄領域部７０を設けたので、この針洗浄領域部７０を使用してマイクロインジェクションを行なう時に使用される針１８を洗浄できるとともに、針１８の針先１９に付着した付着物を簡単に除去することができため、針１８を常に清潔な状態とすることができる。
【実施例５】
【００６７】
［シャーレの特徴及び構成］
次に、本実施例５に係るシャーレの構成について詳細に説明する。先ず、図１４を参照して、本実施例５に係るシャーレ３０Ｃの特徴及び全体構成を説明する。図１４は、本実施例５に係るシャーレ３０Ｃの全体構成を示す平面図である。また、図１５は、シャーレ３０Ｃ内の培養液中に細胞を配置した状態を示す説明図である。なお、本実施例５において、前述した実施例４と同様の箇所および作用についての詳細な説明は省略する。
【００６８】
ここで、前述した実施例４のシャーレ３０Ｂと本実施例３のシャーレ３０Ｃとの相違は、シャーレ３０Ｃの細胞培養領域部４２に、実施例３と同様の焦点合わせ用マーク６０を設けたことに特徴がある。
【００６９】
すなわち、図１４に示すように、シャーレ本体４０は、培養液内に細胞を付着させるための細胞培養領域部４２と、細胞が含まれない液体を満たすための吐出較正領域部４３と、この吐出較正領域部４３と隣接した位置（図１４の左側）に、針１８の針先１９を洗浄するための針洗浄領域部７０が形成されており、さらに、シャーレ本体４０の底面部（細胞培養領域部４２）に細胞に対する焦点合わせおよびシャーレ本体４０の底面部の傾斜を計測するための焦点合わせ用マーク６０を設けている。
【００７０】
以上説明したように、本実施例５のシャーレ３０Ｃは、シャーレ本体４０に形成された細胞培養領域部４２および吐出較正領域部４３以外に、マイクロインジェクションを行なう時に使用される針１８の針先１９を洗浄するための針洗浄領域部７０を設けるとともに、細胞培養領域部４２には、細胞の焦点位置合わせ及びシャーレの底面高さ検出のための複数個の焦点合わせ用マーク６０が設けられているので、針洗浄領域部７０を使用してマイクロインジェクションを行なう時に使用される針１８を洗浄できるとともに、焦点合わせ用マーク６０によりシャーレ底面の傾斜を正確に算出することが可能となる。
【００７１】
以上の実施例１〜５を含む実施形態に関し、更に以下の付記を開示する。
【００７２】
（付記１）所定の細胞に突き刺した針を通して該細胞に目的物を注入するマイクロインジェクション用のシャーレであって、
前記シャーレは、
前記細胞を培養する培養液を満たす細胞培養領域部と、
前記細胞培養領域部と隔壁により仕切られるとともに、前記針から吐出される目的物を対象とし、当該目的物の吐出量の較正を行なう吐出較正領域部とから構成されることを特徴とするマイクロインジェクション用のシャーレ。
【００７３】
（付記２）所定の細胞に突き刺した針を通して該細胞に目的物を注入するマイクロインジェクション用のシャーレであって、
前記シャーレは、
前記細胞を培養液内に保持する略矩形型に形成されるシャーレ本体と、当該シャーレ本体の外周形状と嵌合する内周形状を有する外枠体とで構成され、
前記シャーレ本体は、前記細胞を培養する培養液を満たす細胞培養領域部と、
前記細胞培養領域部と隔壁により仕切られるとともに、前記針から吐出される目的物を対象とし、当該目的物の吐出量の較正を行なう吐出較正領域部とから構成されることを特徴とするマイクロインジェクション用のシャーレ。
【００７４】
（付記３）前記吐出較正領域部は、細胞を含まない液体を満たすことを特徴とする付記１または２に記載のマイクロインジェクション用のシャーレ。
【００７５】
（付記４）前記吐出較正領域部が占有する領域面積は、当該吐出較正領域部の液体内で対流が発生しないように小面積の凹部形状となるように形成されることを特徴とする付記１、２または３に記載のマイクロインジェクション用のシャーレ。
【００７６】
（付記５）前記吐出較正領域部の寸法形状は、横幅が１６mmに、縦寸法が４mmとなるように設定されていることを特徴とする付記４に記載のマイクロインジェクション用のシャーレ。
【００７７】
（付記６）前記細胞培養領域部の所定位置には、前記細胞を対象とする焦点の位置合わせとともに、シャーレの底面高さ位置を検出する複数個の焦点合わせ用マークが設けられていることを特徴とする付記１〜５の何れか一つに記載のマイクロインジェクション用のシャーレ。
【００７８】
（付記７）前記焦点合わせ用マークには、前記細胞の付着を防止する親水化処理が施されることを特徴とする付記６に記載のマイクロインジェクション用のシャーレ。
【００７９】
（付記８）前記焦点合わせ用マークは、前記シャーレの底面部の５箇所の位置に等間隔で配置されていることを特徴とする付記６または７に記載のマイクロインジェクション用のシャーレ。
【００８０】
（付記９）前記シャーレに形成された前記吐出較正領域部と隣接した位置には、前記マイクロインジェクション時に使用する前記針の針先を洗浄する針先洗浄領域部が形成されていることを特徴とする付記１〜８の何れか一つに記載のマイクロインジェクション用のシャーレ。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は、マイクロインジェクションを行なう場合に有用であり、以って針から吐出される物質の吐出量の計測及び吐出される物質の吐出量の較正を精度良く行ないたい場合に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】実施例１に係るシャーレの構成を示す平面図及び縦断面図である。
【図２】同シャーレ内の培養液中に細胞を配置した状態を示す説明図である。
【図３−１】吐出較正領域部による吐出較正処理を説明する説明図である。
【図３−２】細胞へのマイクロインジェクションを説明するための説明図である。
【図４】実施例２に係るシャーレの構成を示す平面図である。
【図５】同シャーレ内の培養液中に細胞を配置した状態を示す説明図である。
【図６−１】吐出較正領域部による吐出較正処理を説明するための説明図である。
【図６−２】細胞培養領域部によるインジェクションを説明する説明図である。
【図７−１】従来のシャーレによる蛍光試薬吐出画像を示す説明図である。
【図７−２】実施例２で示したシャーレによる蛍光試薬吐出画像を示す説明図である。
【図８】吐出較正の計測結果を説明するグラフを示す図である。
【図９】実施例３に係るシャーレの構成を示す平面図である。
【図１０】同シャーレ内の培養液中に細胞を配置した状態を示す説明図である。
【図１１】焦点合わせ用マークによるＸ、Ｙ、Ｚ座標に基づく法線ベクトルを示す線図である。
【図１２】実施例４に係るシャーレの構成を示す平面図である。
【図１３】同シャーレ内の培養液中に細胞を配置した状態を示す説明図である。
【図１４】実施例５に係るシャーレの構成を示す平面図である。
【図１５】同シャーレ内の培養液中に細胞を配置した状態を示す説明図である。
【図１６】マイクロインジェクション装置の全体構成を示す斜視図である。
【図１７】従来のシャーレによるマイクロインジェクションを説明するための説明図である。
【符号の説明】
【００８３】
１０  マイクロインジェクション装置
１１、２０、３０、３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ  シャーレ
２１、４０  シャーレ本体
１２  シャーレステージ
１３  照明光源
１４  対物レンズ
１５  反射鏡
１６  結像レンズ
１７  ＣＣＤカメラ（Charge  Coupled  Devices）
１８  針
１９  針先
２２、４２  細胞培養領域部
２３、４３  吐出較正領域部
４１  外周縁部
４４、４５  隔壁
５０  外枠体
５１  内周縁部
６０  焦点合わせ用マーク
７０  針洗浄領域部
【図１】
2009183193.tif 000005
【図２】
2009183193.tif 000006
【図３−１】
2009183193.tif 000007
【図３−２】
2009183193.tif 000008
【図４】
2009183193.tif 000009
【図５】
2009183193.tif 000010
【図６−１】
2009183193.tif 000011
【図６−２】
2009183193.tif 000012
【図７−２】
2009183193.tif 000013
【図８】
2009183193.tif 000014
【図９】
2009183193.tif 000015
【図１０】
2009183193.tif 000016
【図１１】
2009183193.tif 000017
【図１２】
2009183193.tif 000018
【図１３】
2009183193.tif 000019
【図１４】
2009183193.tif 000020
【図１５】
2009183193.tif 000021
【図１６】
2009183193.tif 000022
【図１７】
2009183193.tif 000023
【図７−１】
2009183193.tif 000024