(57)【要約】      （修正有）【課題】微小反応槽への迅速な試薬物質の供給と隣接反応解析等を可能とする化学発光計測装置。【解決手段】複数の反応槽が設けられたプレートと、前記プレートと対面し当該プレートとの間に流路を形成する透明基板と、前記流路に反応基質及び洗浄液を選択的に注入する注入部と、前記プレートに設けられた複数の反応槽内に保持された反応物質と前記流路を通して供給された前記反応基質との化学反応に起因する発光を、前記透明基板を通して撮像する撮像系と、前記流路のコンダクタンスあるいは流路断面形状を変化させる流路制御手段とを有することを特徴とする化学発光計測装置。微小反応槽１０３が設けられたプレート２０１を含むフローセル１０１の流路の形状を、物質供給時と発光反応時で変形させることにより、遺伝子配列解析において、段階反応を用いた精度の高いＤＮＡ解析を実現できる。【選択図】図２
2009002806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の反応槽が設けられたプレートと、
前記プレートと対面し当該プレートとの間に流路を形成する透明基板と、
前記流路に反応基質及び洗浄液を選択的に注入する注入部と、
前記プレートに設けられた複数の反応槽内に保持された反応物質と前記流路を通して供給された前記反応基質との化学反応に起因する発光を、前記透明基板を通して撮像する撮像系と、
前記流路のコンダクタンスあるいは流路断面形状を変化させる流路制御手段と
を有することを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項２】
請求項１記載の化学発光計測装置において、前記流路制御手段は前記プレートと前記透明基板の間の間隔を変化させる手段であり、前記流路に反応基質あるいは洗浄液を注入するときは前記間隔を広げ、前記撮像系による撮像時には前記間隔を狭めることを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項３】
請求項２記載の化学発光計測装置において、前記流路制御手段は、前記撮像系による撮像時には前記間隔を実質的にゼロにすることを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項４】
請求項２記載の化学発光計測装置において、前記複数の反応槽は前記プレートと前記透明基板の間に配置された弾力性を有するスペーサによって囲まれており、前記流路制御手段は前記透明基板を押圧して前記スペーサを圧縮することにより前記間隔を狭めることを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項５】
請求項１記載の化学発光計測装置において、前記透明基板は変形可能であり、前記流路制御手段は前記透明基板にかける応力を制御して、前記流路に反応基質あるいは洗浄液を注入するときは、前記プレートの前記複数の反応槽が設けられた領域に対応する部分と前記プレートとの間の間隔を広げ、前記撮像系による撮像時には前記間隔を狭めることを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項６】
請求項１記載の化学発光計測装置において、前記透明基板は中空室と前記流路に接する透明膜とを有し、前記流路制御手段は前記中空室に流体を出し入れすることにより、前記流路に反応基質あるいは洗浄液を注入するときは前記透明膜を前記プレートの表面から離し、前記撮像系による撮像時には前記透明膜を前記プレートの表面に近づけることを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項７】
請求項１記載の化学発光計測装置において、前記透明基板は体積変化が可能なゲルを含み、前記流路制御手段は前記ゲルの体積を制御して、前記流路に反応基質あるいは洗浄液を注入するときは前記プレートと前記透明基板の間の間隔を広げ、前記撮像系による撮像時には当該間隔を狭めることを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項８】
請求項１記載の化学発光計測装置において、前記反応槽は前記プレートの表面に加工された凹みであることを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項９】
請求項８記載の化学発光計測装置において、前記透明基板は、前記プレートに設けられた前記複数の反応槽に対向する位置にそれぞれ凹みが設けられていることを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項１０】
請求項１記載の化学発光計測装置において、前記反応物質はビーズの表面に固定されて前記反応槽に収容されることを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の化学発光計測装置において、前記反応槽は底部から突出する突起を有することを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項１２】
請求項１記載の化学発光計測装置において、前記プレートは前記反応基質及び前記洗浄液を透過する基板の上に設置され、前記反応槽は前記プレートに設けられた貫通孔であり、前記基板は前記プレートに接する側と反対側の面が第２の流路に接していることを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項１３】
複数の反応槽が設けられたプレートと、
前記プレートと対面し当該プレートとの間に流路を形成する透明基板と、
前記流路に反応基質及び洗浄液を選択的に注入する注入部と、
前記プレートに設けられた複数の反応槽内に保持された反応物質と前記流路を通して供給された前記反応基質との化学反応に起因する発光を、前記透明基板を通して撮像する撮像系と、
前記流路内に配置された流路内基板と、
前記流路内基板を駆動する駆動部とを有し、
前記駆動部は、前記流路に反応基質あるいは洗浄液を注入するときは前記複数の反応槽の上部開口を開放する位置に前記流路内基板を移動し、前記撮像系による撮像時には前記複数の反応槽の上部開口を遮蔽する位置に前記流路内基板を移動することを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項１４】
請求項１３記載の化学発光計測装置において、前記流路内基板は透明板であり、前記駆動部は前記流路内基板を前記プレートの表面に垂直な方向に駆動することを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項１５】
請求項１４記載の化学発光計測装置において、前記流路内基板に強磁性体が固定されており、前記駆動部は磁力によって前記流路内基板を駆動することを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項１６】
請求項１３記載の化学発光計測装置において、前記流路内基板は前記複数の反応槽の位置に対応した貫通孔を有する透明板であり、前記駆動部は前記流路内基板を前記プレートの表面に平行な方向に駆動することを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項１７】
請求項１６記載の化学発光計測装置において、前記流路内基板に強磁性体が固定されており、前記駆動部は磁力によって前記流路内基板を駆動することを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項１８】
複数の反応槽が設けられたプレートと、
前記プレートと対面し当該プレートとの間に流路を形成する透明基板と、
前記流路に反応基質及び洗浄液を選択的に注入する注入部と、
前記プレートに設けられた複数の反応槽内に保持された反応物質と前記流路を通して供給された前記反応基質との化学反応に起因する発光を、前記透明基板を通して撮像する撮像系と、
前記複数の反応槽の上部開口を開閉する可動弁と、
前記可動弁を駆動する駆動部とを有し、
前記駆動部は、前記流路に反応基質あるいは洗浄液を注入するときは前記可動弁が前記複数の反応槽の上部開口を開放するように前記可動弁を駆動し、前記撮像系による撮像時には前記可動弁が前記反応槽の上部開口を遮蔽するように前記可動弁を駆動することを特徴とする化学発光計測装置。
【請求項１９】
請求項１８記載の化学発光計測装置において、前記可動弁に透明強磁性体が固定されており、前記駆動部は磁力によって前記可動弁を駆動することを特徴とする化学発光計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化学発光計測装置に関し、より詳しくは、遺伝子配列解析、遺伝子多型解析、遺伝子変異解析、遺伝子発現解析等を可能とする化学発光計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ塩基配列決定には、ゲル電気泳動と蛍光検出を用いた方法が広く用いられている。この方法ではまず、配列解析を行おうとするＤＮＡ断片のコピーを多数作製する。ＤＮＡの５’末端を始点として種々の長さの蛍光標識断片を作製する。また、これらＤＮＡ断片の３’末端の塩基種に応じて、蛍光波長の異なる蛍光標識を付加しておく。ゲル電気泳動により長さの違いを１塩基の差で識別し、それぞれの断片群が発する発光を検出する。発光波長色から、測定中のＤＮＡ断片群のＤＮＡ末端塩基種を知る。ＤＮＡは短い断片群から順次蛍光検出部を通過するので、蛍光色を計測することで、短いＤＮＡから順に末端塩基種を知ることができる。これにより、配列を決定する。このような蛍光式ＤＮＡシーケンサーは幅広く普及しており、また、ヒトゲノム解析にも大いに活躍した。この方法では、内径５０μｍ程度のガラス細管を多数本用い、さらに末端検出等の方法を利用し、一台あたりの解析処理数を増加する技術が非特許文献１に開示されている。
【０００３】
一方、パイロシーケンシングに代表される段階的化学反応による配列決定法（例えば特許文献１及び特許文献２）は、取り扱いの簡便性から注目されている。この方法の概略は以下の通りである。ターゲットとするＤＮＡ鎖にプライマーをハイブリダイズさせ、４種の相補鎖合成核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を１種類ずつ順番に反応液中に加えて相補鎖合成反応を行う。相補鎖合成反応が起きるとＤＮＡ相補鎖が伸長し、副産物としてピロリン酸（ＰＰｉ）が生成する。ピロリン酸は共存する酵素の働きでＡＴＰに変換され、ルシフェリンとルシフェラーゼの共存下で反応して発光を生じる。この光を検出することで加えた相補鎖合成基質がＤＮＡ鎖に取り込まれたことがわかり、相補鎖の配列情報、従ってターゲットとなったＤＮＡ鎖の配列情報がわかる。
【０００４】
この方法はフロースルー型解析への適用が可能であり、上記手法を応用して解析処理数を格段に増加させる技術が非特許文献２に報告されている。そこでは、複数の微小反応槽を一面に有するフロースルーセルを用いる。ターゲットＤＮＡ鎖にプライマーをハイブリダイズさせた同一種類の分子複数を、直径約３５μｍのセファロース製ビーズ１個の表面に固定し、そのビーズと生物発光用酵素（ルシフェラーゼ）等を固定したビーズを、フローセル内の同じ微小反応槽に充填する。また、それらのビーズが流出しない様に、直径０．８μｍのマイクロ粒子（microparticle）を充填している。これらのビーズの充填は、ビーズ含有溶液をフローセルに導入して、遠心器により沈降させることにより実施している。また解析は、フローセル上流より、伸長反応用の４種の相補鎖合成核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を逐次導入し、その際に生じる生物発光を観測して行っている。
【０００５】
これらの技術は、上記光ファイバープレートを利用し、ピコタイタープレートを製作し、フローセルの一部に利用している（例えば非特許文献３）。ピコタイタープレート（以下プレートと略記する）上に多数の微小反応槽を設け、解析対象であるＤＮＡをビーズ上に固定し、そのビーズを微小反応槽に挿入して、微小反応槽において個別にＤＮＡの伸長反応及びそれにともなう化学発光反応を進める。この方法によれば、微小反応槽の数を増やしていけば、同時計測できるＤＮＡの種類を増やすことができるため、大幅にスループットを向上することができる。しかし、微小反応槽を高密度に配置して多数のＤＮＡを解析しようとすると、プレート内の個々の微小反応槽内で生成する物質、具体的にはピロリン酸の横方向への拡散によるコンタミネーションが問題となり、測定精度の低下を招く。この隣接する微小反応槽の間のコンタミネーションを抑制するためにメンブレン等を付加したプレートを用いることが特許文献４に開示されている。また、非特許文献２には、解析対象となるＤＮＡを固定したビーズと化学発光に必要な酵素を固定したビーズを最初微小反応槽に挿入し、次にパッキンビーズというメンブレンと同様の役目をするビーズを詰める方法が開示されている。
【０００６】
また、パイロシーケンシング反応へ応用が可能な試薬として、先に述べた技術と異なる反応系が特許文献５に開示されている。この技術では、酵素ピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）の逆反応を用いて、ＡＭＰとＰＰｉをＡＴＰに合成し、ＡＴＰ濃度を測定している。
【０００７】
【非特許文献１】Anal. Chem. 2000, 72, 3423-3430
【非特許文献２】Margulies M, et al., “Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.”, Nature, Vol.437, Sep.15; 2005, pp376-80及びSupplementary Information s1-s3
【非特許文献３】Electrophoresis 2003, 24, 3769-3777
【特許文献１】国際公開パンフレット第９８／１３５２３号
【特許文献２】国際公開パンフレット第９８／２８４４０号
【特許文献３】国際公開パンフレット第０１／０２００３９号
【特許文献４】国際公開パンフレット第０３／００４６９０号
【特許文献５】特開平９−２３４０９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
微小反応槽を複数並置したフロースルー型反応プレートを用いたパイロシーケンシング解析技術は、従来のゲル電気泳動と比較して、スループットを格段に増大することができる。この場合、プレート上の微小反応槽中で起こる反応により生じた化学発光を検出してＤＮＡの解析を行う。特に解析対象であるＤＮＡ（反応物質）をビーズに固定し、このビーズを微小反応槽に挿入するか、微小反応槽の内部に直接固定するかした状態で、少なくとも反応基質を含む試薬を多くの微小反応槽内部に導入することによって起きる反応で生じる反応産物であるピロリン酸（ＰＰｉ）を連続する反応によってＡＴＰに変換し、更にこれに引き続いてＡＴＰによって、ルシフェラーゼを酵素としてルシフェリンを発光反応させて検出する。この場合、各微小反応槽内で生成した反応産物であるＰＰｉあるいはＡＴＰが隣の反応槽に混入する（クロストークが生じる）と配列決定或いはＤＮＡ検出の精度が低下するという問題があった。具体的には、ＤＮＡ伸長時に発生するＰＰｉが隣接する微小反応槽に拡散し、あたかも、隣接する微小反応槽で伸長反応が起きているような発光が生じて、発光強度が変化するという問題があった。
【０００９】
一方、伸長反応によって生成された生成産物の拡散を抑圧するためにメンブレンやパッキングビーズを用いる事もできるが、この場合にはＤＮＡの伸長や化学発光に必要な物質を微小反応槽の内部にまで迅速に供給し、かつ、余剰となった反応基質を排除することができない、すなわち、ＤＮＡ解析の精度を高める上で重要なＤＮＡ相補鎖合成反応を均一に進行させる事ができないという問題があった。
【００１０】
本発明の課題は、微小反応槽への反応基質を含む試薬の迅速な供給及び排出と、隣接反応槽間でのクロストークの排除を両立させることである。迅速な反応基質の供給及び余剰基質の排出あるいは反応産物の排出が十分にできないと、微小反応槽内で伸長反応が均一に進まず、一部反応が進まないＤＮＡ鎖が残ったり、ＤＮＡ相補鎖伸長反応で余剰となった核酸基質ｄＮＴＰが反応槽内に残存し、続く相補鎖合成反応に悪影響を与えたりして、ＤＮＡ塩基配列決定を不正確なものにしてしまう難点があった。また、対象ＤＮＡの分子数が少なくても解析できるようにするためにも、伸長時に生じる反応産物が微小反応槽の外に拡散していかないようにすることが重要である。なぜなら、この拡散によって、発光のために必要な化学物質の濃度が実効的に低下し、発光強度密度が低下するからである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明ではこれらの相反する要求を同時に満たすために、微小反応槽が設けられたプレートを含むフローセルの流路のコンダクタンス又は流路の断面形状を、物質供給又は排出時と発光反応時とで変化させる手段を設ける。
【００１２】
具体的には、微小反応槽が設けられたプレートとこれに対向して配置した透明基板（上板）の間に流路を形成し、この流路を通して反応基質を含む溶液（試薬）を微小反応槽に供給する構造のフローセルにおいて、透明基板とプレートの間隔を変化させる手段を設ける。微小反応槽はプレート上の凹みとして形成する。流路を規定するプレートと透明基板が十分離れているときには、試薬はフローセル中を自由に流れることができ、必要な試薬を微小反応槽に供給し、不要な化学物質を微小反応槽から排出することができる。一方、プレートと透明基板の間隔を十分狭くするか、両者を完全に密着することによって、伸長反応によって生じたＰＰｉやＡＴＰは微小反応槽の外に拡散しにくくなるか、全く拡散しなくなる。すなわち、フローセルの流路厚みを規定するプレートと透明基板の間隔を変化させることによって、迅速な反応液供給及び不要な化学物質の排出と、伸長反応時に生成した物質の微小反応槽の外への拡散抑制を実現する。ここで、発光反応にはルシフェラーゼやＰＰＤＫなどの酵素が必要であるが、この酵素は反応槽中に固定しても試薬中に混入させて、試薬投入の度に供給してもよい。
【００１３】
別の方法として、プレートと透明基板の間に別の基板を設け、それを微小反応槽に近づけたり、膨張させたりする手段を設けることによって、微小反応槽からの伸張反応に伴う物質の拡散を抑制することができる。上記別の基板に開口部を設け、開口部の位置と微小反応槽の位置を合わせることによって、微小反応槽への物質の供給を実現し、開口部の位置を微小反応槽の位置から外すことによって、伸長反応に伴う化学物質の拡散を抑制するようにしてもよい。また、微小反応槽と流路の境界付近に開閉弁を設けることによって拡散を抑制するようにしてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、核酸分析、特に遺伝子配列解析において、段階反応を用いた精度の高いＤＮＡ解析を実現できる。また、これにより解析スループットの向上と、計測感度の向上が達成される。特に、計測感度の向上は、たとえば１分子を測定対象とした場合、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）などの増幅によっても十分な分子量が得られない場合にも十分な感度を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下本発明を、実施例により説明する。ここでは、測定対象の遺伝子の配列を、パイロシーケンシング法の原理を用いて決定する場合を例にとって説明する。
【００１６】
［実施例１］
図１は、本発明による化学発光計測装置の構成例を示す図である。本実施例の化学発光計測装置では、多数の微小反応槽が設けられたプレート２０１と透明基板１０５によって形成されるフローセル１０１に各種の試薬を流し、プレート２０１上に設置した多数の微小反応槽１０３からの化学発光を計測することによって塩基配列を決定する。本発明では、試薬の流れる流路の厚さを、化学発光を計測しているときと、試薬を流し微小反応槽に試薬を供給するときとで変化させることによって、流路のコンダクタンスと断面形状、断面積を変化させる。それによって、化学発光計測時には、隣接する微小反応槽とのクロストークを抑制するとともに発光密度を向上し、発光の計測感度を向上させる。また、微小反応槽への試薬供給時、あるいは反応生成物の洗浄除去時には、その供給効率あるいは洗浄効率を向上させる。
【００１７】
本実施例では駆動部１０２を設け、透明基板１０５がプレート２０１に近づくように圧縮力を加える。これによって、流路の厚み１０４は狭まり、微小反応槽１０３で生成された化学物質は微小反応槽の外には出ず、クロストークが低減され、計測感度が向上する。また、化学発光の計測前にルシフェラーゼ等の化学発光を触媒する酵素を含む試薬を微小反応槽に供給するときには、駆動部１０２の圧縮力を解放し、流路の厚み１０４を十分厚くする。これによって必要な試薬が微小反応槽１０３の中に迅速に供給される。流路の厚みが変化するフローセル１０１の詳細構造については後に記載する。
【００１８】
本実施例の化学発光計測装置は他に、塩基の伸長反応に基づく発光画像を検出する冷却型ＣＣＤカメラなどの２次元撮像デバイス１０６、２次元撮像素子上に発光像を結像させるレンズ系１０７、フローセル１０１に順次分注される反応基質である４種の核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰなど）を各々収める試薬槽１０８〜１１１、伸長反応測定後にフローセル内を洗浄するための洗浄試薬を収める洗浄試薬槽１１２、洗浄後にセル内の洗浄試薬成分の残留を洗い流すためのコンディショニング試薬を収めるコンディショニング試薬槽１１３、それらを選択的にフローセル側に注入するための注入部（選択バルブ１１４、試薬をハンドリングするためのポンプ１１５）、廃液ボトル１１６、などを備えている。
【００１９】
流路の厚み１０４は、４種類の核酸基質を分注するときには厚くなっており、核酸基質が微小反応槽内に迅速に拡散し、微小反応槽内で核酸基質がほぼ均一になったとき（核酸基質を投入し始めてから数秒後、例えば２秒後）に駆動部１０２で透明基板１０５を押圧し、流路厚さ１０４を狭める。その状態で化学発光を撮像素子で計測し、例えば１５秒後に光の蓄積を終了し、同時に透明基板１０５の押圧力を開放し、流路厚さ１０４を厚くする。これによって追加的にｄＮＴＰが供給され、未伸長のＤＮＡが完全に解消される。また、次の塩基を伸長させる前に微小反応槽１０３中の過剰なｄＮＴＰを排除するために、ｄＮＴＰの分解酵素であるアピラーゼを微小反応槽に導入するが、このときにも流路を厚くした状態で、アピラーゼの入った洗浄試薬を流路に流す。このとき、過剰なｄＮＴＰは、流路厚みが厚いため拡散や流動によっても迅速に排出される。さらに、アピラーゼが微小反応槽の中に残った状態で次の拡散基質を微小反応槽に導入すると、伸長反応が完了する前にアピラーゼによってｄＮＴＰが分解されるため、伸長反応が完全に終了せずに次のステップに進んでしまい、解析精度が低下する。このようなことが起きないようにコンディショニング試薬を流路に流し、アピラーゼを排出する。この場合にも流路厚さは厚くしておき、拡散や流動によって速やかにアピラーゼが排出されるようにする。
【００２０】
次に、上記のフローセルの構造例を説明する。図２は、フローセル１０１の断面模式図である。フローセル１０１は微小反応槽１０３を多数形成したプレート２０１と化学発光を計測するための透明基板１０５をほぼ平行に対向させ、プレート２０１と透明基板１０５の間の流路を試薬が漏れずに流れるようにするための、弾力性を有するスペーサ２０２から構成されている。プレート２０１と透明基板１０５の間の領域は試薬流路２１０であり、この流路２１０の厚み１０４は、駆動部１０２に取り付けられた加圧のためのロッド２０３によって透明基板１０５をプレート２０１に押し付けることによって小さくすることができる。駆動部１０２は、ステップモータあるいは圧電素子とすることができる。
【００２１】
図２（ａ）にロッド２０３による加圧をせずに、流路を厚くした状態のフローセルの断面模式図を示し、図２（ｂ）に加圧して流路厚みを薄くした状態の断面模式図を示す。図２（ａ）の状態では、迅速かつ均一に微小反応槽１０３に試薬を供給するために厚み１０４は０．３ｍｍ程度とし、図２（ｂ）の状態では、化学発光基質（本実施例ではＰＰｉやＡＴＰ）の微小反応槽１０３の外への拡散を抑制するために、厚み１０４は数μｍ以下になるようにした。また、スペーサ２０２は、十分な弾力性があるゴム材料で化学的に不活性な材料を用いる必要があり、本実施例ではシリコーンゴムを用いた。また、厚みを薄くしたときに数μｍ以下の薄層となり、より望ましくは完全に流路を閉じることができるように、プレート２０１上にザグリ２０４を設けた。これによって、ゴムの圧縮変形率が低くても十分な流路厚さ変化を得ることができる。具体的には、０．１ＭＰａで２０％圧縮される厚さ３ｍｍ、幅３ｍｍ、周囲長４０ｃｍのシリコーンゴムをスペーサ２０２として用い、ザグリ２０４の深さを２．４ｍｍとした。このとき駆動部１０２から４本のロッド２０３にそれぞれ３ｋｇの荷重を加えることによって、流路厚さ１０４を数μｍ以下にすることができる。
【００２２】
また、フローセル１０１の内部は塩基の伸長及び化学発光に必要な物質が供給され、所望の化学反応以外の反応を十分に抑制する必要があるため、プレート２０１や透明基板１０５の材料は、反応性の低い樹脂材料、例えばポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメタクリル酸メチルなどの材料を用いた。
【００２３】
図３に、フローセルの分解組み立て図を示す。図２は、図３のＣＣ’断面図に相当する。試薬は、試薬流入口３０１から投入され、図中でひし形の形状をした流路を通過し、微小反応槽１０３に試薬を供給した後、試薬排出口３０２から排出される。
【００２４】
微小反応槽１０３の形状は、例えば円柱状でよい。この形状は、基板の素材や製作方法により選択される。プレート２０１は、ステンレス材に切削加工により微小反応槽を形成する方法、シリコンウエハーにマスクとウエットエッチングにより微小反応層を形成する方法、スライドガラス等のガラスに粒子を用いたブラスタ加工により微小反応槽を形成する方法、金型の射出成型によりポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン等に微小反応槽を形成する方法などで製作することができるが、これらの材料や製作法に限定されるものではない。
【００２５】
また、弾力性のあるスペーサ２０２にはシリコーンゴムを用いたが、フッ素ゴム、アルゴゲル、ブチルゴム、二トリルゴム、グロロブレンゴム、エチレンプロピレンゴムなどでもよい。
【００２６】
本実施例では、装置の測定対象である試料ＤＮＡをビーズに固定し、１つの微小反応槽に２つ以上のビーズが入らないようにして測定する。ビーズ材料はジルコニア、シリカ、セファロース、各種半導体材料、各種ゲル材料などでも良い。
【００２７】
図４は、試料ＤＮＡが固定されたビーズの模式図である。ビーズ４０１の表面には、測定対象の単鎖化ＤＮＡ４０２と配列解析開始位置であるプライマー４０３が相補的に結合したものが、複数分子固定されている。なお、図４には、簡単のため１組だけを描いた。ここで、１ビーズの表面に固定される分子は、１種類、つまり同じ種類のものである必要がある。１ビーズ表面に単一種類の分子を複数増幅するには、公知の「エマルジョンＰＣＲ」等を用いることができる（例えば非特許文献２）。ＤＮＡの固定方法としては、図４（ａ）及び（ｂ）に示すように、測定対象ＤＮＡをビーズ表面に固定し、あるいは増幅した後に固定し、プライマーを相補的に結合させる方法と、図４（ｃ）に示すように、プライマーをビーズ表面に固定し、測定対象ＤＮＡを相補的に結合する方法などが利用できる。
【００２８】
ビーズ４０１の径としては、約２０〜１００μｍについて実験を行い、効果を確認した。ビーズ４０１の径の違いは、表面積の違いとなり、１ビーズ表面に固定される分子数、つまり、後述の測定感度の違いにつながるが、カメラとして冷却ＣＣＤを用いた場合、上記すべての場合について測定が可能である。ただし、フローセルの微小反応槽の径や深さは、用いるビーズの大きさにより選択する必要がある。一般的には、微小反応層の径や深さは、用いるビーズの１．２〜１．５倍程度とすることが好適である。すなわち、約５０μｍのビーズを用いる場合には、微小反応槽の径及び深さとして、６０〜７５μｍ程度とすることが好適である。これは、１つの微小反応層に入るビーズが高々１個である条件を満たすことのできる好適な条件である。
【００２９】
図５は、ＤＮＡの塩基配列決定の手順を示すフローチャートである。まず、フローセルのイニシャライズにおいて、フローセルの位置をＣＣＤに対して位置あわせする、画素とフローセル中の微小反応槽の位置及びフォーカス調整を行うとともに、フローセルの洗浄を行うなどをして、ＤＮＡの伸長反応及びそれに伴う発光計測の準備を行う。次に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＴＴＰのいずれか１種類の核酸基質を含む反応試薬を２秒程度フローセルに流し、微小反応槽にこれらの物質を供給したあと、駆動部１０２を駆動してスペーサ２０２を圧縮し、流路の厚みを薄く、あるいは完全に流路がなくなるようにする。この状態を、ＣＣＤで発光画像を取り込んでいる１５秒の間保持する。
【００３０】
このようにして得られた発光画像の模式図を図６（ａ）に示す。図示したように、それぞれの微小反応槽からの発光を分離して計測することが可能である。一方、図６（ｂ）に、流路を狭めずに計測した場合の発光画像の模式図を示す。拡散によって微小反応槽から外に出た後に発光するＰＰｉやＡＴＰの成分があるため、各微小反応槽からの発光を分離して計測することができず、ほぼ一様な発光画像となってしまう。すなわち、クロストークによって隣接する微小反応槽の分離が困難となる。
【００３１】
図５に戻って、次に伸長反応を完全に終了させるために、フローセルの流路の厚みをもとの厚い状態、すなわち、０．３ｍｍに戻して、１５秒保持し、ｄＮＴＰ分解酵素であるアピラーゼを含む洗浄バッファをフローセル中に３０秒流し続けたあと、アピラーゼを取り除いて、次の塩基の伸長及び化学発光が効率よく起きるようにコンディショニングバッファを流し、次のｄＮＴＰを含む発光試薬を流すという操作を、シーケンスが終了するまで繰り返す。このような試薬供給動作に対応して画像データを蓄積して行き、どの種類のｄＮＴＰをフローセルに流したときにどの微小反応槽から発光があったか、またどの程度の発光であったかを計測することによって、解析対象である塩基配列を決定する。
【００３２】
図７に、フローセルの他の例の断面模式図を示す。上記実施例ではプレート２０１に切削加工又は射出成型によって凹み部を形成して微小反応槽１０３としていたが、ここでは、同様の加工方法でプレート２０１に凸部７１１を形成し、凸部に設けられた有底穴７１２を微小反応槽として利用した。また、微小反応槽の深さが深いと、反応基質であるｄＮＴＰの反応基質の拡散や反応産物の排出に時間がかかる。そのため、透明基板１０５にも凸部７１３を設け、凸部７１１，７１３の対向する２つの穴でビーズの移動を拘束するようにした。この構造によると、有底穴７１２の深さを図２に示した微小反応槽１０３の深さより浅くすることができ、反応基質の供給に必要な拡散距離を短くすると同時に微小反応槽の体積を大きくすることによって、伸長反応に必要な反応基質が不足して反応が完了せず、配列解析精度が低下するのを防ぐこともできる。
【００３３】
また、解析対象となるＤＮＡをビーズに固定し、ビーズを微小反応槽に挿入することによって解析対象ＤＮＡを微小反応槽に固定したが、必ずしもビーズを用いる必要はない。解析対象となる反応物の固定方法としては、微小反応槽の内壁に化学結合によって固定する方法、ビーズに磁気ビーズを用いて、磁力によって固定する方法などを用いてもよい。
【００３４】
［実施例２］
実施例１ではスペーサを弾性変形させることによって流路の厚さを変え、これによって微小反応槽からの生成物の拡散を抑制したが、本実施例ではフローセルの上板である透明基板を変形させて微小反応槽の直上の流路の厚さを変化させることによって実施例１と同様の効果を得るものである。
【００３５】
図８に、フローセルの他の例の断面模式図を示す。本例のフローセルは、透明基板７０１に応力をかけてそらせ、微小反応槽１０３の直上で流路の厚みを狭めることができるようにしたフローセルである。図８（ａ）は応力がかけられていない状態を示す図、図８（ｂ）は応力かがかけられて流路の厚みが薄くなった状態を示す図である。この実施例では、上板となる透明基板７０１の一部を薄膜化することによって、ロッド２０３で応力をかけたときに変形しやすい形にしている。また透明基板７０１の材料はポリカーボネートとしたが、他の透明樹脂材料を用いてもよい。特に微小反応槽１０３がある領域に対応して透明基板７０１を薄膜化し、微小反応槽がある領域での流路厚さが応力をかけた状態で均一になるようにしている。一例として、透明基板７０１の厚さを、厚い部分では３ｍｍ、薄膜化した部分では１ｍｍ程度とした。また、微小反応槽１０３の直径は１０μｍ、深さは１０μｍとし、この中に実施例１と同様に測定対象となるＤＮＡを固定化した直径８μｍのジルコニアビーズを挿入して計測を行った。微小反応槽の配置は１５μｍの正方格子の交点に微小反応槽の中心が一致するように４０９６×４０９６個配列させ、プレート上の６．１４４×６．１４４ｃｍの領域に配置した。
【００３６】
また、透明基板が変形する他の構成としては、図９（ａ）に示したように微小反応槽１０３に対応する領域の周辺部分８０２を薄膜化していても良いし、図９（ｂ）に示したように微小反応槽１０３に対応する領域の周辺部分８０２を弾力性の高いシリコーンゴム等の材料としても良い。一例として、図９（ａ）に示したように、周辺部分を薄膜化する場合には、微小反応槽のある領域８０１での透明基板の厚さは３ｍｍとし、その周辺部分８０２では厚さを０．５ｍｍとした。また、図９（ｂ）に示したように、周辺部分８０２を弾力性の高い材料に変更する場合には、幅１０ｍｍ、厚さ３ｍｍのシリコーンゴムを熱融着によって接着した。また、融着の代わりに接着剤による接着を行っても良い。
【００３７】
このような構成にすることによって、微小反応槽のある領域は剛性が高く、プレートとの密着性を確保しつつ、高い変形率を確保できるので、プレート上の微小反応槽が配置された領域が数ｃｍ四方と広い場合でも均一に流路厚さを狭めることが可能となる。また、流路厚さの機械的均一性が高くない状態、即ち、上板がゆがんでいたり、凹凸があったり、斜めに配置された状態であっても、微小反応槽からの反応生成物の拡散をより効果的に抑制するために、透明基板８０１の微小反応槽に対応する側に弾力性の高い材料であるシリコーンゴムを接着して、密着層８０３を形成してもよい。この場合、スペーサ２０２の厚さを０．５ｍｍとし、密着層８０３の厚さを力が加わっていない状態で０．２ｍｍとすることによって、流路厚みは０．３ｍｍと０．１μｍ以下の状態を繰り返しとるようにすることができる。
【００３８】
上記例では変形の駆動力は駆動部１０２による機械的圧力であったが、変形の駆動力に気体又は液体の圧力を用いてもよい。図１０に、このような例を示す。図１０（ａ）は圧力をかけておらず、流路厚さ１０４が厚い状態を示し、図１０（ｂ）は圧力をかけて、流路厚さを狭めている状態を示す。本例では、透明基板を中空にするために３層構造とした。即ち、上層９０１とスペーサ層９０２と変形層９０３を重ねて接着して、上層９０１と変形層９０３の間の領域９０４が中空となった透明基板を形成した。
【００３９】
加圧ポート９０５から空気を導入することによって変形層９０３が変形し、微小反応槽１０３がある領域で流路の厚みを薄くすることができる。また、減圧ポート９０６から空気を抜くことによって、流路の厚さを大きくすることもできる。この操作を繰り返すことによって微小反応槽１０３からの拡散の抑制と、発光試薬の効率的供給を順次行う。一例として、透明基板の上層９０１には厚さ３ｍｍのアクリル板を使用し、スペーサ層９０２にも厚さ３ｍｍのアクリル板を利用した。また変形層９０３には厚さ０．５ｍｍの透明ポリプロピレン膜を用いた。
【００４０】
変形層９０３にはシリコーンゴムなどのより柔らかい材料を用いてもよいが、その場合には流路厚みの均一性に問題が生じることがある。流路厚みの均一性を高めるために、変形層を微小反応槽に対応する領域だけ厚い材料を用い、周辺部分が変形しやすいように薄い材料にすることや、微小反応槽に対応する部分には透明で硬い材料を用い、周辺部分にはシリコーンゴムなどの弾性変形しやすい柔らかい材料を組み合わせて用いてもよいことは上記実施例と同様である。また、変形層９０３とプレート２０１との密着性を高めるために密着層を張り合わせもよいことも上述と同様である。また、ここでは変形層９０３を変形させるために空気を加圧ポート９０５から加えたが、空気ではなく他の透明で不活性な液体、例えば水やオイルなどを用いてもよい。この場合もスペーサ２０２の厚さを０．５ｍｍとし、流路厚さは０．４ｍｍと０．１μｍ以下の２つの状態を繰り返し取るようにすることができる。
【００４１】
［実施例３］
本実施例では、透明基板及びプレートの移動、変形ではなく、フローセルの流路内に別の透明基板を設けることによって、微小反応槽からの生成物の拡散を抑制する。図１１に、化学発光計測装置のシステム構成例を示す。図１のロッド２０３の代わりに電磁石１００１を設け、駆動部１０２の代わりに電磁石を支持、駆動する駆動部１００２を設けている。
【００４２】
図１２（ａ）に本実施例のフローセルの流路厚みを厚くした状態での断面模式図を、図１２（ｂ）に流路厚みを薄くした状態での断面模式図を示す。流路内にポリプロピレン性の透明基板１１０１を設け、ネオジウム磁石（主成分：ネオジウム、鉄、ボロン）１１０２の表面を厚さ０．２ｍｍ程度のポリプロピレンで覆った上で透明基板１１０１に固定し、電磁石１００１の極性を変化させることによって、図１２（ａ）の状態と図１２（ｂ）の状態のどちらかをとるようにする。また、透明基板１１０１が流路の厚み方向のみに移動できるように、ガイドピン１１０３が透明基板１１０１上に設けた孔を貫通して設けられている。直径１ｍｍのガイドピン１１０３もポリプロピレン製で、プレート２０１又は上部透明基板１０５のどちらかに固定されている。永久磁石１１０２には、サマリウムコバルト磁石（主成分：サマリウム、コバルト、銅、鉄）、アルニコ磁石（主成分：アルミニウム、コバルト、ニッケル）、フェライト磁石（酸化鉄、バリウム、ストロンチウム）などを用いてもよい。駆動部１００２では磁石の極性を電磁石に流す電流の極性を変えることによって変化させたが、電磁石を回転させて、永久磁石に働く磁力の向きを変化させてもよい。
【００４３】
透明基板１１０１を上下に移動させ、透明基板１１０１を上部透明基板１０５に近づくように移動させたときには微小反応槽１０３に試薬を供給し、プレート２０１に近づくように移動させたときには、微小反応槽１０３からの生成物の拡散を抑制しクロストークのない状態で計測を行う。このようにして、微小反応槽１０３が配置された領域での実効的な流路厚さを、０．３ｍｍと１μｍ以下の２状態とすることが可能である。
【００４４】
また、流路内に設けた透明基板を用いて流路厚さを変化させる別の方法としては、透明基板の中央部分を中空にしてこの部分に空気圧又は水等の溶液による圧力印加によって基板厚みを変化させる方法もある。
【００４５】
［実施例４］
上記実施例では流路内に設けた透明基板を流路の厚み方向（上下方向）に移動させることによって微小反応槽からの拡散の抑制と迅速な試薬の供給を両立させていたが、本実施例では微小反応槽の入り口を開閉することによってこれを実現する。
【００４６】
図１３（ａ）と図１３（ｂ）にフローセルの断面模式図を示す。図１３（ａ）は微小反応槽の入り口が開いた状態を示し、図１３（ｂ）は閉じた状態を示す。流路内に設けたポリプロピレン製の透明基板１２０１には、微小反応槽１０３の大きさと配列にあわせて複数の貫通孔１２０２が形成されている。微小反応槽１０３の開閉は、透明基板１２０１をプレート２０１の表面に沿って移動することによって行われる。透明基板１２０１の貫通孔１２０２が微小反応槽１０３の位置に一致するように透明基板を移動させたとき、微小反応槽１０３の上部が開放され、微小反応槽１０３の内部に挿入されたビーズ上のＤＮＡに塩基等の試薬が充分に供給される。逆に、微小反応槽１０３の上に貫通孔１２０２が来ないように透明基板１２０１を移動させると、微小反応槽１０３がふたをされた状態となり、反応によって生成した化学物質の微小反応槽１０３の外への拡散が抑制される。
【００４７】
この透明基板１２０１の移動は、透明基板１２０１の端部領域に永久磁石１２０３を固定し、この永久磁石１２０３に電磁石１２０４，１２０５から磁力を作用させることで行った。例えば、微小反応槽の入り口を開放するときは永久磁石１２０３がある領域での磁界の向きを矢印１２０７のようにして、透明基板１２０１を右側のストッパ１２０６に押し付けて微小反応槽１０３の上に貫通孔１２０２を位置づけ、微小反応槽１０３の入り口を閉じるときは、磁界を矢印１２０８のように反対の向きにし、透明基板１２０１が反対側のストッパ１２０６に押し付けられるように移動して、微小反応槽１０３の上から貫通孔１２０２が外れるようにする。矢印１２０７から矢印１２０８への磁場の向きの切り替えは、電磁石１２０４のＮ極が図中上の方向、電磁石１２０５のＮ極が図中下の方向にある状態から２つの電磁石１２０４，１２０５の極性を反転することによって実現することができる。また、透明基板１２０１がプレート２０１から離れたり、貫通孔１２０２が微小反応槽１０３に対して位置ずれを起こしたりするのを防止する目的で、図１３（ｃ）に示すように、透明基板１２０１の側部に沿ってガイドレール１２０９を設けた。この結果、プレート２０１と透明基板１２０１の間の距離１μｍ以下を保って、透明基板１２０１を左右に１５μｍ移動し、微小反応槽１０３の開閉を実現することができる。
【００４８】
図１４に、微小反応槽の開閉を実現する他の手段を有するフローセルの模式図を示す。シリコーンゴム等の柔らかい材料からなり、微小反応槽１０３に対応する位置に弁１４０２を有する基板１４０１を用意し、それをプレート２０１の表面に固定する。弁１４０２を磁力によって開閉することによって、微小反応槽１０３で生成した化学物質の拡散抑制と、微小反応槽１０３への迅速な試薬供給とを両立することができる。基板１４０１の作製に当たっては、シリコーンゴムを微小反応槽の開口部にあわせ、型押しによって、円形に切り込みを入れる。ただし、弁１４０２のちょうつがいに対応する位置には切り込みを入れずに残す。また、ＺｎＯにＭｎをドープした材料を数μｍ以下の直径のビーズ状に粉砕して作製した透明磁性体を、シリコーンゴムと混ぜあわせたあと成型することによって弁１４０２に磁性を持たせる。電磁石１４０３に一定方向に電流を流すと弁１４０２が上方に引き寄せられて弁が開き、電流を逆方向に流すと弁が閉じる。このようにして、迅速な試薬の供給と反応生成物の拡散の抑制を両立した。
【００４９】
［実施例５］
本実施例は、フローセルの流路厚さ１０４を変化させるために体積変化が可能なゲルを用いた例である。図１５に、フローセルの断面模式図を示す。図１５（ａ）は流路厚さが厚い状態を示し、図１５（ｂ）は流路厚さを小さくした状態を示している。
【００５０】
本実施例では、微小反応槽１０３を設けたプレート２０１に対向する透明基板１５０１を、体積膨張可能なゲルによって構成する。ゲルとしては、アクリルアミドゲルを用いることができる。このゲルは、温度を低下させるか、ゲルの溶媒としてアセトン水溶液を用いて、アセトン濃度を上げると、ある温度又はあるアセトン濃度でゲルの体積が急激に膨張する体積相転移を起こす。本実施例では、このゲルの体積膨張を利用して流路厚さ１０４を変化させる。本実施例では、透明基板１５０１の大部分はアセトン水溶液中のアクリルアミドゲルである。アセトン水溶液溶媒が流路を流れる試薬と混ざらないように、ゲルは、ポリプロピレン等からなる厚さ０．５ｍｍ程度の薄い透明な膜１５０３で覆われている。膜１５０３は、ポリ塩化ビニル等の他の柔軟性のある樹脂材料で形成しても良い。また、ゲルの体積はほぼ等方的に膨張するので、ゲルの膨張によって効果的に流路厚さを変化させるために、流路と反対側の透明基板１５０１の上面及び側面を透明のポリカーボネート製のガイド層１５０４で形成し、流路側以外の面の変形を防いだ。これによって、微小反応槽１０３がある領域でのゲルの平面形状がたもたれ、繰り返し体積変化を起こしたときに、レンズ効果によって、微小反応槽１０３からの発光像がゆがんだり、フォーカスがずれることが防がれる。
【００５１】
アセトン濃度を透明基板１５０１中のゲル全体で均一かつ迅速に変化させるためにアセトン水溶液を流す流路１５０２を設けた。アセトン等の低分子はゲル中を透過するので、透明基板１５０１の大きさがあまり大きくないときには、この流路は必ずしも必要ない。微小反応槽１０３に試薬を供給する場合の流路厚さを決定するスペーサ２０２の厚さは１ｍｍとし、ゲルの体積膨張によって流路厚さをほぼ０にすることができる。アセトン水溶液中のアセトン濃度は流路厚さを厚くする場合には２０％以下になるようにし、流路厚さを薄くし、完全に閉じる場合には６０％以上になるように、流路１５０２からアセトン水溶液を供給する。
【００５２】
ゲル材料としては、アクリルアミドゲル以外にイソプロピルアクリルアミドゲルを用いてもよい。また、メタクリロイルアミノプロピル  トリメチルアンモニウムクロライド（ＭＡＰＴＡＣ）とアクリル酸を７：１２で共重合させたゲルを図１５中の透明基板１５０１に用いた場合には、ｐＨを７から９に変化させることによって体積膨張させることができる。ｐＨを変化させるためにｐＨの異なる２種類のバッファを流路１５０２から交互に流し、流路厚さ１０４を交互に変化させた。また、ｐＨではなくイオン強度を変化させても体積変化させることができる。
【００５３】
ゲルの温度を変化させてゲルの体積変化を引き起こし、流路厚さ１０４を変えるフローセルの例を図１６の断面模式図に示す。図１６（ａ）は流路厚さが厚い状態を示し、図１６（ｂ）は流路厚さを小さくした状態を示している。
【００５４】
ゲル材料はアクリルアミドゲルであり、アセトン水溶液濃度を６０％程度より上に設定した状態で、ゲル１５０１の温度を臨界温度である３０℃をまたぐように４０℃から２０℃に変化させる。この温度変化を引き起こすためにペルチェ素子（電子冷却素子）１６０１を配置した。ペルチェ素子は発光計測に干渉しないようにゲル１５０１の縁部に配置した。また、ゲル温度と流路を流れる試薬の温度とを独立して制御できるように、ゲルとポリプロピレン製の膜１５０３の間に断熱領域として空気層１６０２を設けた。
【００５５】
また、電界の印加によって体積変化を生じさせ、これによって、流路厚さを変化させることもできる。図１７に、この場合のフローセルの断面模式図を示す。図１７（ａ）は流路厚さが厚い状態を示し、図１７（ｂ）は流路厚さを小さくした状態を示している。
【００５６】
ゲルとしてはアクリルアミドゲルを一部加水分解したゲルを使用した。具体的には、アクリルアミドゲルとＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドをラジカル重合によってゲルを調整し、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチレンジアミンの１．２％溶液中で１ヶ月以上加水分解することによって、およそ、２０％のアクリルアミド基がアクリル酸に置換された高分子ゲルを得る。これを透明基板のゲル１７０１として利用した。化学発光を計測する側の電極１７０２には透明電極を用い、反対側の電極１７０３には白金電極を用いた。電源１７０４から電極１７０２，１７０３間に１Ｖ程度の電圧を印加することによって流路高さ１０４の十分な変化を得ることができるように、プレート２０１の厚さは５ｍｍ程度とした。また、この材料は電界をスクリーンしないように樹脂材料（ポリプロピレン等）を用いて、金属材料は使用しなかった。
【００５７】
［実施例６］
反応産物を拡散させないために特に微小反応槽を完全に閉じてしまった場合に、外部から反応に必要な反応基質の供給が止まるため、反応基質であるｄＮＴＰが不足してしまい、ＤＮＡが十分伸長しなくなる場合もある。このようなことが起きないようにするための微小反応槽の構造例を次に示す。
【００５８】
図１８に、本実施例におけるフローセルの断面模式図を示す。表面にＤＮＡが固定されたビーズ１８０２を微小反応槽１０３中で浮かせて保持できるように微小反応槽１０３中に柱１８０１を設けた。この構造によって、微小反応槽１０３中のｄＮＴＰを含む試薬溶液量を柱がない場合に比べて増やすことができる。これによってＤＮＡの伸長が不十分になることがない。さらに、円柱の形状の微小反応槽では、反応槽底面に近い側のビーズ表面でｄＮＴＰ濃度が低下する可能性が高い。しかし、柱１８０１を設けることによってｄＮＴＰの濃度の低い部分はビーズ表面から離れるので、この意味でもＤＮＡの伸長が不十分となる確率を低下させることができる。
【００５９】
また、ＤＮＡの伸長が不十分とならないようにするだけでなく、ｄＮＴＰを順次微小反応槽に投入し、伸長反応させたときに、一つ前のｄＮＴＰが次のｄＮＴＰ反応の時に残ったりしないようにバッファ交換の効率を向上させなければならないが、このことを効率的に行えるフローセルの断面構造を図１９の模式図に示す。
【００６０】
この例では、プレート２０１に微小反応槽１０３に対応する凹み部を設けるだけでなく、透明基板１０５の方にも凹み部を設ける。図１９は流路厚み１０４を薄くした状態を示しているが、この場合でも、微小反応槽１０３は十分な反応基質を蓄える溶液体積を確保できている。一方、流路厚みを大きくして、反応基質を微小反応槽、特にビーズ１８０２上のＤＮＡに供給するときに、微小反応槽１０３の深さが浅いために迅速に基質が供給される。また、逆に迅速に排出されることにもなる。すなわち、バッファ交換効率が高い。ただし、透明基板１０５の凹み部とプレート２０１の凹み部は一致するように上下移動しなければならない。
【００６１】
さらに、ＤＮＡの伸長反応の効率とバッファ交換効率の向上を図る他のフローセル構造の断面模式図を図２０に示す。この例では、微小反応槽２００２は基板２００１上に形成した貫通孔で構成される。この貫通孔の底にはアクリルアミドゲル等の反応基質を透過させるゲル層２００３を配置し、微小反応槽２００２の上部の入り口を閉じたときにも、反応基質を透過させるゲル層２００３を通してｄＮＴＰを供給し、ＤＮＡの伸長不足を防ぐ構造にした。また、ｄＮＴＰを排出するときは、透明基板１０５を上昇させて流路２００６の厚さを厚くした状態で下側流路２００７側から洗浄溶液を流すことによって、迅速に余剰のｄＮＴＰを微小反応槽２００２から排除することができるようにする。なお、下側流路２００７は貫通孔を設けた基板２００１とほぼ平行に配置した基板２００４の間に形成された流路であり、その厚さはスペーサ２００５によって例えば厚さ１ｍｍとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明による化学発光計測装置の構成例を示す図。
【図２】フローセルの構造例を示す断面模式図。
【図３】フローセルの分解組み立て図。
【図４】試料ＤＮＡが固定されたビーズの模式図。
【図５】ＤＮＡの塩基配列決定の手順を示すフローチャート。
【図６】発光画像の模式図。
【図７】フローセルの他の例の断面模式図。
【図８】フローセルの他の例の断面模式図。
【図９】フローセルの他の例の断面模式図。
【図１０】フローセルの他の例の断面模式図。
【図１１】本発明による化学発光計測装置の構成例を示す図。
【図１２】フローセルの他の例の断面模式図。
【図１３】フローセルの他の例の模式図。
【図１４】フローセルの他の例の模式図。
【図１５】フローセルの他の例の断面模式図。
【図１６】フローセルの他の例の断面模式図。
【図１７】フローセルの他の例の断面模式図。
【図１８】フローセルの他の例の断面模式図。
【図１９】フローセルの他の例の断面模式図。
【図２０】フローセルの他の例の断面模式図。
【符号の説明】
【００６３】
１０１：フローセル
１０２：駆動部
１０３：微小反応槽
１０５：透明基板
１０６：２次元撮像デバイス
１０７：レンズ系
２０１：プレート
２０２：スペーサ
２０３：ロッド
２１０：試薬流路
４０１：ビーズ
４０２：単鎖化ＤＮＡ
４０３：プライマー
７０１：透明基板
７１１：凸部
７１２：有底穴
７１３：凸部
８０３：密着層
９０１：上層
９０２：スペーサ層
９０３：変形層
９０５：加圧ポート
９０６：減圧ポート
１００１：電磁石
１００２：駆動部
１１０１：透明基板
１１０２：永久磁石
１１０３：ガイドピン
１２０１：透明基板
１２０２：貫通孔
１２０３：永久磁石
１２０６：ストッパ
１２０９：ガイドレール
１４０１：基板
１４０２：弁
１４０３：電磁石
１５０１：透明基板
１５０２：流路
１５０３：膜
１５０４：ガイド層
１６０１：ペルチェ素子
１６０２：空気層
１７０１：ゲル
１７０２：電極
１７０３：電極
１７０４：電源
１８０１：柱
１８０２：ビーズ
２００１：基板
２００２：微小反応槽
２００３：ゲル層
２００４：基板
２００５：スペーサ
２００６：流路
２００７：下側流路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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