(57)【要約】      （修正有）【課題】２０を超える構造的に関連するサイトカインおよび成長因子を含む、成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリーにシステイン残基を付加する、またはシステイン置換を導入するための好ましい部位ならびにそれによって産生されるタンパク質およびタンパク質誘導体を提供する。【解決手段】βインターフェロン等の成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリータンパク質の、部位特異的な生物学的に活性な結合体を作製するための一般的な方法。この方法は、このタンパク質の必須でない領域にシステイン残基を付加する工程、または部位特異的変異誘発を用いてこのタンパク質における必須でないアミノ酸をシステイン残基で置換する工程、次いでこの付加されたシステイン残基を介してこのタンパク質にシステイン反応性ポリマーまたは他の型のシステイン反応性部分を共有結合させる工程を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５のβインターフェロンのシステイン改変体であって、
Ｑ２３、Ｎ２５、Ｇ２６、Ｎ８０、Ｅ１０９、Ｄ１１０、Ｆ１１１、Ｔ１１２、Ｒ１１３、Ｇ１１４、Ｋ１１５およびＮ１６６から選択された少なくとも１つのアミノ酸がシステイン残基に置換され、
前記システイン改変体はβインターフェロンに応答して増殖が阻害される細胞系統の増殖の阻害により測定されるインビトロ生物活性を有するシステイン改変体。
【請求項２】
Ｑ２３がシステイン残基に置換されている請求項１に記載のシステイン改変体。
【請求項３】
Ｎ２５がシステイン残基に置換されている請求項１に記載のシステイン改変体。
【請求項４】
Ｇ２６がシステイン残基に置換されている請求項１に記載のシステイン改変体。
【請求項５】
Ｎ８０がシステイン残基に置換されている請求項１に記載のシステイン改変体。
【請求項６】
Ｅ１０９がシステイン残基に置換されている請求項１に記載のシステイン改変体。
【請求項７】
Ｄ１１０がシステイン残基に置換されている請求項１に記載のシステイン改変体。
【請求項８】
Ｆ１１１がシステイン残基に置換されている請求項１に記載のシステイン改変体。
【請求項９】
Ｔ１１２がシステイン残基に置換されている請求項１に記載のシステイン改変体。
【請求項１０】
Ｒ１１３がシステイン残基に置換されている請求項１に記載のシステイン改変体。
【請求項１１】
Ｇ１１４がシステイン残基に置換されている請求項１に記載のシステイン改変体。
【請求項１２】
Ｋ１１５がシステイン残基に置換されている請求項１に記載のシステイン改変体。
【請求項１３】
Ｎ１６６がシステイン残基に置換されている請求項１に記載のシステイン改変体。
【請求項１４】
配列番号５のβインターフェロンのシステイン改変体であって、
βインターフェロンの最後のアミノ酸の後にシステイン残基が挿入されており、
前記システイン改変体はβインターフェロンに応答して増殖が阻害される細胞系統の増殖の阻害により測定されるインビトロ生物活性を有するシステイン改変体。
【請求項１５】
非システインアミノ酸がβインターフェロンのＣ１７に置換されている請求項１〜１４のいずれかに記載のシステイン残基。
【請求項１６】
βインターフェロンのＣ１７に置換される前記非システインアミノ酸がセリンおよびアラニンから選択される請求項１５に記載のシステイン改変体。
【請求項１７】
前記置換または挿入されたシステイン残基がシステイン反応性部分により修飾される請求項１〜１６のいずれかに記載のシステイン改変体。
【請求項１８】
前記置換または挿入されたシステイン残基がポリエチレングリコールにより修飾される請求項１〜１７のいずれかに記載のシステイン改変体。
【請求項１９】
ポリエチレングリコールで修飾されている請求項１〜１８のいずれかに記載のシステイン改変体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子操作された治療タンパク質に関する。より詳細には、この操作されたタンパク質は、成長ホルモンおよび関連タンパク質を含む。
【背景技術】
【０００２】
以下のタンパク質は、成長ホルモン（ＧＨ）スーパー遺伝子ファミリーの遺伝子によってコードされる（Ｂａｚａｎ（１９９０）；ＭｏｔｔおよびＧａｍｐｂｅｌｌ（１９９５）；ＳｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎおよびＩｈｌｅ（１９９６））：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、白血病阻害因子、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）およびカルジオトロフィン１（ＣＴ−１）（「ＧＨスーパー遺伝子ファミリー」）。この遺伝子ファミリーのさらなるメンバーが将来、遺伝子クローニングおよび配列決定によって同定されることが予期される。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、それらが一般に限定されたアミノ酸配列またはＤＮＡ配列の同一性を有するという事実にも拘らず、類似する二次構造および三次構造を有する。共有された構造的特徴によって、この遺伝子ファミリーの新たなメンバーを容易に同定することが可能になる。
【０００３】
長期に作用する、「ユーザーフレンドリ」なタンパク質療法の開発において患者および保健医療提供者の側においてかなりの関心が存在する。タンパク質は、製造するには高価で、そして従来の低分子薬物とは異なり、身体によっては容易に吸収されない。さらに、それらは、経口投与される場合に消化される。従って、天然のタンパク質は、注射によって投与されねばならない。注射後、ほとんどのタンパク質は、身体から迅速に除去される。このことは、頻繁な（しばしば、毎日の）注射を必要とさせる。患者は注射を嫌がるので、コンプライアンスの低下および薬物効力の減少がもたらされる。いくつかのタンパク質（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ））は、それほど頻繁に投与されない（ＥＰＯについては１週間に３回）場合でも、有効である。なぜなら、それらはグリコシル化されているからである。しかし、グリコシル化タンパク質は、高価な哺乳動物細胞発現系を用いて産生される。
【０００４】
注射されたタンパク質が体内に残留する時間の長さは有限であり、そして例えば、そのタンパク質の大きさ、およびそのタンパク質が共有結合性の改変（例えば、グリコシル化）を含むか否かによって決定される。注射されたタンパク質の循環濃度は、定常的に、２４時間の期間にわたって、しばしば、数桁変化する。タンパク質アゴニストが迅速に濃度を変えることは、劇的な下流の結果を有し得、あるときは標的細胞を刺激するに満たずそして別のときには過剰刺激する。類似の問題がタンパク質アンタゴニストを悩ませる。これらの変動は、タンパク質治療について、効力の減少および有害な副作用の頻度の増加を導き得る。組換えタンパク質の身体からの迅速な除去は、１患者あたりに必要とされるタンパク質の量を有意に増加させ、そして治療費を劇的に増加させる。ヒトタンパク質医薬品の費用は、向こう数年間劇的に増加することが予測される。なぜなら、新たなおよび既存の薬物がより多くの疾患適応について承認されるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、患者および保健医療提供者にとってタンパク質治療の費用を低下させるタンパク質送達技術の開発の必要性が存在する。本発明は、体内のタンパク質治療剤の循環半減期を延長する方法を提供し、その結果そのタンパク質が頻繁に注射される必要をなくならせることによって、この問題に対する解決策を提供する。この解決策はまた、「ユーザーフレンドリー」であるタンパク質治療、すなわち、頻繁な注射を必要としないタンパク質治療についての、患者の必要性および要求を満足する。本発明は、成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーの、生物学的に活性なシステイン付加改変体を提供することによって、これらおよび他の問題を解決する。本発明はまた、システイン反応性ポリマーまたは他の型のシステイン反応性部分を用いるこれらの改変体の化学的改変を提供して、その誘導体およびそのように産生される分子を産生する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーのシステイン改変体を提供する。この改変体は、そのタンパク質の必須でないアミノ酸について置換されたシステイン残基を含む。好ましくは、この改変体は、ループ領域のアミノ酸、αヘリックスの末端付近のアミノ酸、第一の両親媒性ヘリックスの近位のアミノ酸、および最後の両親媒性ヘリックスの遠位のアミノ酸からなる群より選択されるアミノ酸について置換されたシステイン残基を含むか、または、このシステイン残基がそのタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加されている。置換について好ましい部位は、Ｎ結合型およびＯ結合型のグリコシル化部位である。
【０００７】
置換されるアミノ酸が、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのインターフェロン／インターフェロン１０様メンバーのＡ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループ、またはＤ−Ｅループに存在するシステイン改変体もまた提供される。
【０００８】
このシステイン残基が天然タンパク質における２つのアミノ酸間に導入されているＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーのシステイン改変体もまた提供される。詳細には、このシステイン残基は、ループ領域、αヘリックスの末端、第一の両親媒性ヘリックスの近位、または最後の両親媒性ヘリックスの遠位に導入される。さらにより詳細には、このシステイン改変は、Ｎ−Ｏ結合型グリコシル化部位における２つのアミノ酸の間、あるいはＮ結合型またはＯ結合型のグリコシル化部位におけるアミノ酸の近位に導入される。
【０００９】
より詳細には、このシステインが導入されるループ領域がＧＨスーパー遺伝子ファミリーのインターフェロン／インターフェロン１０様メンバーのＡ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−ＤループまたはＤ−Ｅループである、システイン改変体が提供される。
【００１０】
このようなシステイン置換または挿入変異はまた、このシステイン置換または挿入に対してアミノ末端またはカルボキシ末端での１以上のさらなるアミノ酸の挿入を含み得る。
このシステイン改変体をＰＥＧ化することおよびそれにより産生された誘導体化されたタンパク質を含むことによってさらに誘導体化されているシステイン改変体もまた提供される。
【００１１】
実施例に示されるように、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーの特定のシステイン改変体（例えば、ＧＨの改変体を含む）もまた提供される。ＧＨシステイン改変体は、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−ＤループのＮ末端に位置する置換されるアミノ酸または挿入されたシステイン、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤヘリックスにおける最初の３つまたは最後の３つのアミノ酸、ならびにヘリックスＡの近位およびヘリックスＤの遠位のアミノ酸を有し得る。
【００１２】
より詳細には、このシステインは、以下のアミノ酸から置換され得る：Ｆ１、Ｔ３、Ｐ５、Ｅ３３、Ａ３４、Ｋ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、Ｓ４３、Ｑ４６、Ｎ４７、Ｐ４８、Ｑ４９、Ｔ５０、Ｓ５１、Ｓ５５、Ｔ６０、Ａ９８、Ｎ９９、Ｓ１００、Ｇ１０４、Ａ１０５、Ｓ１０６、Ｅ１２９、Ｄ１３０、Ｇ１３１、Ｓ１３２、Ｐ１３３、Ｔ１３５、Ｇ１３６、Ｑ１３７、Ｋ１４０、Ｑ１４１、Ｔ１４２、Ｓ１４４、Ｋ１４５、Ｄ１４７、Ｔ１４８、Ｎ１４９、Ｓ１５０、Ｈ１５１、Ｎ１５２、Ｄ１５３、Ｓ１８４、Ｅ１８６、Ｇ１８７、Ｓ１８８、およびＧ１９０。
【００１３】
本発明に従うシステイン改変体の他の例は、エリスロポエチン改変体を含む。エリスロポエチン改変体は、置換されるアミノ酸が、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループに位置する改変体、ならびにヘリックスＡの近位およびヘリックスＤの遠位であり、かつＮ末端またはＣ末端のアミノ酸である、改変体を含む。さらにより具体的には、このＥＰＯシステイン改変体は、以下に示すのアミノ酸がシステインで置換されている分子を含む：セリン１２６、Ｎ２４、Ｉ２５、Ｔ２６、Ｎ３８、Ｉ３９、Ｔ４０、Ｎ８３、Ｓ８４、Ａ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｒ４、Ｄ８、Ｓ９、Ｔ２７、Ｇ２８、Ａ３０、Ｅ３１、Ｈ３２、Ｓ３４、Ｎ３６、Ｄ４３、Ｔ４４、Ｋ４５、Ｎ４７、Ａ５０、Ｋ５２、Ｅ５５、Ｇ５７、Ｑ５８、Ｇ７７、Ｑ７８、Ａ７９、Ｑ８６、Ｗ８８、Ｅ８９、Ｔ１０７、Ｒ１１０、Ａ１１１、Ｇ１１３、Ａ１１４、Ｑ１１５、Ｋ１１６、Ｅ１１７、Ａ１１８、Ｓ１２０、Ｐ１２１、Ｐ１２２、Ｄ１２３、Ａ１２４、Ａ１２５、Ａ１２７、Ａ１２８、Ｔ１３２、Ｋ１５４、Ｔ１５７、Ｇ１５８、Ｅ１５９、Ａ１６０、Ｔ１６３、Ｇ１６４、Ｄ１６５、Ｒ１６６およびＳ８５。
【００１４】
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２（ｐ３５サブユニット）、インターロイキン１３、インターロイキン１５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、白血病阻害因子、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、カルジオトロフィン１、およびこのファミリーのメンバーとして同定されそして分類された他のタンパク質を含む。これらのタンパク質は、ヒト、コンパニオン動物および家畜を含む任意の動物種に由来し得る。
【００１５】
本発明についての他の改変および変更は、本明細書および本明細書に示される「規則」に基づけば、当業者に明らかである。これらのすべては、本発明の一部であるとみなされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、システイン改変体、およびとりわけ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他のこのような部分でのこのようなタンパク質の部位特異的な結合に関する。ＰＥＧは、非抗原性の不活性ポリマーであり、体内を循環するタンパク質の時間の長さを有意に延長する。このことにより、このタンパク質がより長い時間にわたって有効であることを可能にする。ＰＥＧでのタンパク質の共有結合的改変は、体内でのタンパク質の循環半減期を延長するに有用な方法であることが証明されている（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、１９８４；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ、１９８７；Ｍｅｙｅｒｓら、１９９１）。ＰＥＧのタンパク質への共有結合は、そのタンパク質の有効な大きさを増大させ、そして体内からの除去速度のその速度を減少させる。ＰＥＧは、いくつかのサイズで市販されており、このことは、異なる大きさのＰＥＧの使用を通じて、ＰＥＧ改変タンパク質の循環半減期が個々の適応について変更されることを可能にする。ＰＥＧ改変の他の利点は、タンパク質溶解性
の増加、インビボでのタンパク質安定性の増加、およびタンパク質免疫原性の減少を含む（Ｋａｔｒｅら、１９８７；Ｋａｔｒｅ、１９９０）。
【００１７】
タンパク質をＰＥＧ化するための好ましい方法は、システイン反応性ＰＥＧを用いてシステイン残基にＰＥＧを共有結合させることである。異なる反応基（例えば、マレイミド、ビニルスルホン）および異なる大きさのＰＥＧ（２〜２０ｋＤａ）を有する高度に特異性なシステイン反応性ＰＥＧが多く市販されている（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ、Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）。中性のｐＨでは、これらのＰＥＧ試薬は、「遊離の」システイン残基（すなわち、ジスルフィド結合に関与しないシステイン残基）に選択的に結合する。この結合体は、加水分解に対して安定である。システイン反応性ＰＥＧの使用により、規定された構造の均質なＰＥＧタンパク質結合体の開発が可能である。
【００１８】
商業的に重要なタンパク質治療剤の構造の決定およびそれらがそれらのタンパク質標的（例えば、細胞表面レセプター、プロテアーゼなど）とどのように相互作用するかについての理解が、ここ数年かなり伸展してきた。この構造の情報を使用して、システイン反応性ＰＥＧを用いたＰＥＧタンパク質結合体を設計し得る。ほとんどのタンパク質のシステイン残基は、ジスルフィド結合に関与しており、そしてシステイン反応性ＰＥＧを用いたＰＥＧ化には利用可能でない。組換えＤＮＡ技術を用いたインビトロ変異誘発を通じて、さらなるシステイン残基を、タンパク質の任意の場所に導入し得る。付加されたシステインは、そのタンパク質の始まり、そのタンパク質の終末、そのタンパク質配列の２つのアミノ酸の間に導入され得るか、または好ましくは、そのタンパク質配列において存在するアミノ酸と置換され得る。新たに付加された「遊離の」システインは、システイン反応性ＰＥＧを用いたＰＥＧ分子の特異的な付加についての部位として作用し得る。付加されたシステインは、この方法が成功であるためには、ＰＥＧ化のためにタンパク質の表面に曝露され、そして接近可能でなければならない。付加されるシステイン部位を導入するのに使用される部位が生物学的活性に必須でない場合、ＰＥＧ化タンパク質は、本質的に、野生型（正常な）インビトロ生物活性を示す。システイン反応性ＰＥＧでタンパク質をＰＥＧ化する際の主な技術的障害は、システイン残基が、生物活性の損失を伴うことなく、付加され得るか、または存在するアミノ酸と置換され得る場合に、標的タンパク質において、表面に曝露され、必須でない領域を同定することである。
【００１９】
いくつかのヒトタンパク質のシステイン付加改変体およびこれらのタンパク質のＰＥＧポリマー結合体が記載されている。米国特許第５，２０６，３４４号は、ＩＬ−２のシステイン付加改変体を記載する。このシステイン付加改変は、成熟ＩＬ−２ポリペプチド鎖のアミノ末端から最初の２０アミノ酸以内に位置する。好ましいシステイン改変は、この成熟ポリペプチド鎖の３位に存在し、これは、天然に存在するタンパク質においてＯ−グリコシル化されるスレオニン残基に対応する。３位でのスレオニンのシステインでの置換は、システイン反応性ＰＥＧでＰＥＧ化され得、そしてインビトロ生物活性を充分保持し得るＩＬ−２改変体を生じる（ＧｏｏｄｓｏｎおよびＫａｔｒｅ、１９９０）。対照的に、リジン反応性ＰＥＧでの天然のＩＬ−２  ＰＥＧ化は、インビトロ生物活性の減少を示す（ＧｏｏｄｓｏｎおよびＫａｔｒｅ，１９９０）。ＩＬ−２での他の位置でのシステイン置換の効果は、報告されなかった。
【００２０】
米国特許第５，１６６，３２２号は、ＩＬ−３のシステイン付加改変体を教示する。この改変は、成熟タンパク質配列のＮ末端から最初の１４アミノ酸内に存在する。この特許は、細菌でのこのタンパク質の発現およびシステイン反応性ＰＥＧでのタンパク質の共有結合性改変を教示する。ＩＬ−３のこのシステイン付加改変体およびＰＥＧ結合体が生物学的に活性であるか否かに関してはなんら情報は提供されていない。このポリペプチド鎖における他の位置でのシステイン付加改変は、報告されなかった。
【００２１】
国際特許出願ＷＯ９４１２２１９およびＰＣＴ出願ＵＳ９５／０６５４０は、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のシステイン付加改変体を教示する。ＩＧＦ−Ｉは、ＧＨとは非常に異なる構造を有し、そしてＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではない（ＭｏｔｔおよびＣａｍｐｂｅｌｌ、１９９５）。ＩＧＦ−Ｉタンパク質における多くの位置でのシステイン置換が記載される。このシステイン付加改変体の特定のものだけが生物学的に活性である。このシステイン付加改変体について好ましい部位は、成熟タンパク質鎖におけるアミノ酸６９位である。タンパク質のＮ末端付近（残基１〜３）でのシステイン置換は、生物学的活性の減少および不適切なジスルフィド結合を伴うＩＧＦ−Ｉ改変体を生じた。
【００２２】
国際特許出願ＷＯ９４２２４６６は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質１の２つのシステイン付加改変体を教示する。このタンパク質は、ＧＨとは非常に異なる構造を有し、そしてＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではない。開示されている、この２つのシステイン付加ＩＧＦ結合タンパク質１の改変は、成熟タンパク質鎖において９８位および１０１位に位置し、そして天然に存在するタンパク質においてリン酸化されているセリン残基に対応する。
【００２３】
米国特許出願０７／８２２２９６は、腫瘍壊死因子結合タンパク質のシステイン付加改変体を教示する。このタンパク質は、腫瘍壊死因子細胞レセプターの可溶性の短縮型形態である。腫瘍壊死因子結合タンパク質は、ＧＨとは非常に異なる構造を有し、そしてＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではない。
【００２４】
ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ結合タンパク質１および腫瘍壊死因子結合タンパク質は、ＧＨとは非常に異なる二次構造および三次構造を有し、そしてこれらのタンパク質は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではない。このため、ＩＧＦＩ、ＩＧＦ結合タンパク質１および腫瘍壊死因子結合タンパク質の研究から得られた情報を使用して、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーのシステイン付加改変体を作製することは、困難である。ＩＬ−２およびＩＬ−３を用いた研究は、ＩＬ−２およびＩＬ−３の構造が公知となる（ＭｃＫａｙ、１９９２；Ｂａｚａｎ、１９９２）前、およびこれらのタンパク質がＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであることが公知となる前に行われた。ＩＬ−２およびＩＬ−３へのシステイン残基の付加について好ましい部位を同定することを目的とした以前の実験は、主として経験的であり、そしてＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーが類似の二次構造および三次構造を有することを示す実験の前に行われた。
【００２５】
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーについて現在利用可能となった構造情報に基づいて、本発明は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーにおけるどの領域およびアミノ酸残基を使用して生物学的活性の有意な損失を伴うことなくシステイン残基を導入または置換し得るかについて演繹的に決定するための「規則」を提供する。天然に存在するタンパク質とは対照的に、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーのこれらのシステイン付加改変体は、そのポリペプチド鎖内での規定された部位でのシステイン反応性ポリマーまたは他の型のシステイン反応性部分での共有結合的に改変される能力のような新規の特性を有する。これらの共有結合的に改変されたタンパク質は生物学的に活性である。
【００２６】
ＧＨは、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーにおいて最も充分に研究されたメンバーである。ＧＨは、脳下垂体によって分泌される２２ｋＤａタンパク質である。ＧＨは、骨、軟骨および筋肉の代謝を刺激し、そして小児期の間の身体の成長を刺激するための身体の主要なホルモンである。組換えヒトＧＨ（ｒｈＧＨ）は、小児におけるＧＨの不足および腎不全から生じる低身長を処置するのに使用される。ＧＨは、グリコシル化されておらず、そして細菌において完全に活性な形態で産生され得る。このタンパク質は、短いインビボで
の半減期を有しており、そして最大限の効果のために毎日皮下注射によって投与されねばならない（ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙら、１９９６）。組換えヒトＧＨ（ｒｈＧＨ）は、ＡＩＤＳ患者における悪液質を処置するために最近承認され、そして他の疾患に関連する悪液質を処置することについて研究中である。
【００２７】
ヒトＧＨの配列は周知である（例えば、Ｍａｒｔｉａｌら、１９７９；Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９を参照のこと、これは、本明細書において参考として援用される；配列番号１）。ＧＨは、プロラクチンおよび胎盤ラクトゲンと配列が密接に関連しており、そしてこれらの３つのタンパク質は、もともと、小さな遺伝子ファミリーを含むと考えられていた。ＧＨの一次配列は、動物種間で非常に保存されている（Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕｉｄら、１９８７）。このことは、このタンパク質の広範な種の交叉反応性と一致する。ブタＧＨの三次元折り畳みパターンは、Ｘ線結晶学によって解析された（Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕｉｄら、１９８７）。このタンパク質は、コンパクトな球状の構造を有し、ループによって結合される両親媒性のαヘリックスルの４つの束を含む。ヒトＧＨは、類似の構造を有する（ｄｅ  Ｖｏｓら、１９９２）。この４つのαヘリックス領域は、タンパク質のＮ末端から始まって、Ａ〜Ｄと称される。このループ領域は、それらが結合する（例えば、Ａ−ＢループはＡおよびＢのヘリックスの束を結合する）ヘリックス領域によって言及される。Ａ−ＢループおよびＣ−Ｄループは長いが、ＢＣループは短い。ＧＨは、４つのシステイン残基を含み、それらの全てがジスルフィド結合に関与する。ジスルフィドの割り当ては、システイン５３のシステイン１６５への結合、およびシステイン１８２のシステイン１８９への結合である。
【００２８】
そのレセプターに結合したＧＨの結晶構造は、ＧＨが２つのレセプター結合部位を有し、そして２つのレセプター分子を結合することを示す(Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、１９９
１；ｄｅ  Ｖｏｓら、１９９２)。この２つのレセプター結合部位は、部位Ｉおよび部位
ＩＩと呼ばれる。部位Ｉは、ヘリックスＤのカルボキシ(Ｃ)末端ならびにヘリックスＡおよびＡ−Ｂループの一部を包含し、その一方、部位ＩＩは、ヘリックスＡのアミノ(Ｎ)末端領域およびヘリックスＣの部分を包含する。ＧＨのそのレセプターへの結合は、部位Ｉが常に最初に結合して続いて起こる。次いで部位ＩＩが、第２のＧＨレセプターに係合し、ＧＨに対する細胞内応答に至る、レセプターの二量体化および細胞内シグナル伝達経路の活性化を生じる。部位ＩＩが変異したＧＨムテイン(アミノ酸１２０におけるグリシン
からアルギニンへの変異)は、単一のＧＨレセプターに結合し得るが、ＧＨレセプターを
二量体化し得ない；このムテインは、おそらく、細胞内シグナル伝達経路を活性化することなくＧＨレセプター部位を占有することにより、インビトロでＧＨアンタゴニストとして作用する(Ｆｕｈら、１９９２)。
【００２９】
ＧＨレセプター結合および細胞内シグナル伝達における特定領域およびアミノ酸の役割はまた、変異誘発、モノクローナル抗体およびタンパク質分解消化のような技術を用いて研究されている。最初の変異誘発実験は、ＧＨの全領域を、近縁のタンパク質であるプロラクチンの類似の領域で置き換えることを伴った(Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、１９８９)。１つの知見は、ＧＨのＢ−Ｃループのプロラクチンのそれとの置換が、ハイブリッドＧＨタンパク質のヒトＧＨレセプターの可溶性形態への結合に影響しなかったことであり、これは、Ｂ−Ｃループがレセプター結合に必須ではなかったことを示す。アラニンスキャニング突然変異誘発(個々のアミノ酸のアラニンでの置換)は、ＧＨ生体活性に重要である１４のアミノ酸を同定した(ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，１９８９)。これらのアミノ酸は、ヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤならびにＡ−Ｂループ中に位置し、そして構造研究から同定された部位ＩおよびＩＩに対応する。アミノ酸位置４１および１７２の２つのリジン残基であるＫ４１およびＫ１７２は、部位Ｉのレセプター結合部位の重要な成分であると決定され、これは、Ｋ１７２がアセチル化された時に観察された生体活性の減少を説明する(ＴｅｈおよびＣｈａｐｍａｎ、１９８８)。Ｋ１６８の修飾もまた、ＧＨ
レセプター結合および生体活性を顕著に低減させた(ｄｅ  ｌａ  Ｌｌｏｓａら、１９８
５；Ｍａｒｔａｌら、１９８５；ＴｅｈおよびＣｈａｐｍａｎ、１９８８)。ＧＨレセプ
ターを結合することに関係するＧＨの領域はまた、モノクローナル抗体を用いて研究された(Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、１９８９)。一連の８つのモノクローナル抗体がヒトＧＨに対して生成され、そしてＧＨ活性を中和し、そしてＧＨのその組換え可溶性レセプターへの結合を防げる能力について分析された。後者の研究は、各モノクローナル抗体に対する推定の結合部位を、ＧＨ三次元構造内に局在化することにした。興味深いのは、モノクローナル抗体１および８は、ＧＨをそのレセプターを結合することから置換し得なかったことであった。これらのモノクローナル抗体に対する結合部位は、Ｂ−Ｃループ(モノクロ
ーナル番号１)およびＡ−ＢループのＮ末端(モノクローナル番号８)に局在化した。Ｃ−
Ｄループに特異的に結合したモノクローナル抗体は研究されなかった。このモノクローナル抗体研究は、Ｂ−ＣループおよびＡ−ＢループのＮ末端がレセプター結合に必須ではないことを示唆する。最後に、トリプシンを用いたＧＨの限定切断は、完全活性を保持した２つの鎖誘導体を生成することが見出された(Ｍｉｌｌｓら、１９８０；Ｌｉ、１９８２)。マッピング研究は、トリプシンがＣ−Ｄループに対応する位置１３４と位置１４９との間を切断および/またはその間のアミノ酸を欠失したことを示した。これらの研究は、Ｃ
−Ｄループがレセプター結合またはＧＨ生体活性に関与しないことを示唆する。
【００３０】
Ｇ−ＣＳＦ(Ｈｉｌｌら、１９９３)、ＧＭ−ＣＳＦ(Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓら、１９９
１；Ｗａｌｔｅｒら、１９９２)、ＩＬ−２(Ｂａｚａｎ、１９９２；Ｍｃｋａｙ、１９９２)、ＩＬ−４(Ｒｅｄｆｉｅｌｄら、１９９１；Ｐｏｗｅｒｓら、１９９２)、およびＩ
Ｌ−５(Ｍｉｌｂｕｒｎら、１９９３)を含む多くのサイトカインの構造が、Ｘ線回折研究およびＮＭＲ研究により決定され、そして顕著な一次配列相同性の欠如にも拘わらず、ＧＨ構造をともなう顕著な保存を示す。モデリングおよび変異誘発研究に基づいて、ＥＰＯは、このファミリーのメンバーであると考えられている(Ｂｏｉｓｓｅｌら、１９９３；
Ｗｅｎら、１９９４)。毛様体神経栄養因子(ＣＮＴＦ)、白血病阻害因子(ＬＩＦ)、トロ
ンボポイエチン(ＴＰＯ)、オンコスタチンＭ、マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−Ｃ
ＳＦ)、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１
５、およびα−、β−、ω−、τ−およびγ−インターフェロンを含む多くの数のさらなるサイトカインおよび成長因子がこのファミリーに属する(ＭｏｔｔおよびＣａｍｐｂｅ
ｌｌ、１９９５：ＳｉｌｖｃｎｎｏｉｎｅｎおよびＩｈｌｅ１９９６に総説がある)。上
記のサイトカインおよび成長因子のすべては、ＧＨがプロトタイプである、１つの大きな遺伝子ファミリーを構成すると現在考えられている。
【００３１】
類似の二次構造および三次構造を共有することに加えて、このファミリーのメンバーは、それらが細胞表面レセプターをオリゴマー形成し、細胞内シグナル伝達経路を活性化させるに違いないという性質を共有する。いくつかのＧＨファミリーのメンバー、例えば、ＧＨおよびＥＰＯは、単一のタイプのレセプターに結合し、そしてそれをホモダイマーを形成するようにする。他のファミリーメンバー、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−６は、１つより多いタイプのレセプターに結合し、そしてこれらレセプターをヘテロダイマーまたはより上位の凝集体を形成するようにする(Ｄａｖｉｓら、１９９３；Ｐａ
ｏｎｅｓｓａら、１９９５；ＭｏｔｔおよびＣａｍｐｂｅｌｌ、１９９５)。変異誘発研
究は、ＧＨのように、これら他のサイトカインおよび成長因子が、複数の、代表的には２つのレセプター結合部位を含み、そしてそれらの同族のレセプターを逐次的に結合することを示した(ＭｏｔｔおよびＣａｍｐｂｅｌｌ、１９９５；Ｍａｒｔｈｅｗｓら、１９９
６)。ＧＨのように、これらの他のファミリーのメンバーに対する主要なレセプター結合
部位は、主に４つのαヘリックスおよびＡ−Ｂループに生じる(ＭｏｔｔおよびＣａｍｐ
ｂｅｌｌ、１９９５に総説がある)。レセプター結合に関与するヘリックス状の束にある
特定アミノ酸は、ファミリーのメンバー間で異なる(ＭｏｔｔおよびＣａｍｐｂｅｌｌ、
１９９５)。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーと相互作用する細胞表面レセプタ
ーの大部分は構造的に関連し、そして第２の大きな複数遺伝子ファミリーを構成する(Ｂ
ａｚａｎ、１９９０；ＭｏｔｔおよびＣａｍｐｂｅｌｌ、１９９５；ＳｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎおよびＩｈｌｅ、１９９６)。
【００３２】
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの種々のメンバーの変異的研究から到達した一般的な結論は、αヘリックスを結合型するループは、一般にレセプター結合に関与しない傾向にあることである。特に、短いＢ−Ｃループは、全てではないにしても大部分のファミリーメンバーにおいてレセプター結合に必須ではないようである。この理由のため、Ｂ−Ｃループは、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーにシステイン置換を導入するための好適な領域である。Ａ−Ｂループ、ＢＣループ、Ｃ−Ｄループ(およびＧＨスーパー遺伝子フ
ァミリーのインターフェロン/ＩＬ−１０様メンバーのＤ−Ｅループ)はまた、システイン変異を導入するための好適な部位である。ヘリックスＡの近位方向にあってかつ最終ヘリックスの遠位方向にあるアミノ酸はまた、レセプター結合に関与しない傾向にあり、そしてまたシステイン置換を導入するための好適な部位でもある。ＧＨファミリーの特定のメンバー、例えば、ＥＰＯ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５およびβ-
インターフェロンは、Ｎ結合型糖およびＯ結合型糖を含む。タンパク質中のグリコシル化部位は、ほとんど独占的にループ領域中にあり、そしてα−ヘリックス束中にはない。ループ領域は、一般に、レセプター結合に関与しないため、そしてそれらは糖基の共有結合のための部位であるので、それらはタンパク質中にシステイン置換を導入するための好適な部位である。タンパク質中にＮ結合型グリコシル化部位およびＯ結合型グリコシル化部位を含むアミノ酸は、システイン置換の好適な部位である。なぜなら、これらのアミノ酸は表面にむき出しであり、天然のタンパク質は、これらの部位でタンパク質に付着するかさばる糖基に耐え得て、そしてグリコシル化部位は、レセプター結合部位から離れて位置する傾向にあるからである。
【００３３】
多くのさらなる、ＧＨ遺伝子ファミリーのメンバーが将来発見されるようである。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの新たなメンバーは、推定されたタンパク質配列のコンピューター支援二次および三次構造分析により同定され得る。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、非ヘリックスアミノ酸により結合型された４つまたは５つの両親媒性ヘリックス(ループ領域)を所有する。これらタンパク質は、それらのＮ末端に疎水性のシグナル配列を含み、細胞からの分泌を促進し得る。このような後に発見されたＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーもまた、本発明に含まれる。
【００３４】
本発明は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーの生物学的に活性なシステインが付加された改変体を作成するための「規則」を提供する。これらの「規則」は、現存するかまたは将来のＧＨスーパー遺伝子ファミリーの任意のメンバーに適用され得る。このシステインが付加された改変体は、天然に存在するタンパク質によって共有されない新たな性質を所有する。最も重要なことは、このシステインが付加された改変体は、それらがシステイン反応性ポリマーまたはその他のタイプのシステイン反応性成分で共有結合により修飾され、増加したインビボ半減期、増加した溶解度および改善されたインビボ効力のような改善された性質をもつ生物学的に活性なタンパク質を生成し得るという性質を所有することである。
【００３５】
より詳細には、本発明は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーの生物学的に活性なシステイン改変体を、タンパク質中の非必須アミノ酸をシステイン残基で置換することにより提供する。好ましくは、このシステイン残基は、ループ領域を構成するアミノ酸、α−ヘリックスの末端近くのアミノ酸およびこれらタンパク質の第１の両親媒性ヘリックスの近位方向にあるかまたは最後の両親媒性ヘリックスの遠位方向にあるアミノ酸に置き換わる。システイン残基を付加するための他の好適な部位は、これらタンパク質のＮ末端
またはＣ末端である。システイン残基はまた、このポリペプチド鎖の開示された領域中の２つのアミノ酸の間に導入され得る。本発明は、これらタンパク質中のＮ結合型およびＯ結合型グルコシル化部位が、この部位を構成するアミノ酸の置換によるか、またはＮ結合型部位の場合、その中へのシステインの導入によるかのいずれかで、システイン置換を導入するための好適な部位であることを教示する。このグリコシル化部位は、Ｏグリコシル化されるセリンもしくはスレオニン残基、またはＮグリコシル化されるアスパラギン残基であり得る。Ｎ結合型グリコシル化部位は、一般構造であるアスパラギン−Ｘ−セリンまたはスレオニン(Ｎ−Ｘ−Ｓ/Ｔ)を有し、ここでＸは任意のアミノ酸であり得る。Ｘ位置
にあるアミノ酸であるアスパラギン残基およびＮ結合型グリコシル化部位のセリン/スレ
オニン残基は、これらのタンパク質の生物学的に活性なシステインが付加された改変体を作成するための好適な部位である。Ｏ結合型およびＮ結合型グリコシル化部位のすぐ周辺または隣接するアミノ酸(グリコシル化部位のいずれかの側の約１０残基以内)は、システイン置換を導入するための好適な部位である。
【００３６】
より一般的には、生物学的に活性なシステインが付加されたタンパク質改変体を作成するために好適な部位を同定するための特定の「規則」は、まさにＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであることのない任意のタンパク質に適用され得る。より詳細には、これらタンパク質(ＩＬ−２以外)の生物学的に活性なシステイン改変体を作成するための好適な部位は、Ｏ結合型グリコシル化部位である。Ｏ結合型グリコシル化部位のすぐ周辺のアミノ酸(グリコシル化部位のいずれかの側の約１０残基以内)もまた好適な部位である。Ｎ結合型グリコシル化部位、およびグリコシル化部位のいずれかの側にすぐ隣接するアミノ酸残基(ＮＸ−Ｓ/Ｔ部位の約１０残基以内)もまたシステインが付加されたタンパク質
改変体を作成するための好適な部位である。生物学的活性の顕著な損失なくしてシステインで置換され得るアミノ酸はまた、システインが付加されたタンパク質改変体を作成するための好適な部位である。このような非必須アミノ酸は、標的タンパク質に対してシステインスキャニング変異誘発を行い、そして生物学的活性に対する影響を測定することにより同定され得る。システインスキャニング変異誘発は、ポリペプチド鎖中の個々のアミノ酸にシステイン残基を付加することまたは置換すること、および生物学的活性に対するシステイン置換の影響を測定することをともなう。システインスキャニング変異誘発は、標的アミノ酸が個々にアラニン残基よりもむしろシステイン残基で置換されることを除いては、アラニンスキャニング変異誘発(Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、１９９２)と同様である。
【００３７】
システインが付加された改変体およびタンパク質アンタゴニストの同族体を作成するための「規則」の適用がまた意図される。サイトカインおよび成長因子の過剰産生は、慢性関節リウマチ、喘息、アレルギーおよび創傷はん痕のような多くの炎症性症状の病理に関連している。ＧＨの過剰産生は、先端巨大症の原因として関係している。特定の成長因子およびサイトカイン、例えば、ＧＨおよびＩＬ−６は、特定の癌の増殖に関係している。炎症および癌に関係する多くの成長因子およびサイトカインは、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーである。これらの疾患を処置するためにこれら分子のタンパク質アンタゴニストを開発することにおいて重要な興味がある。１つの戦略は、サイトカインおよび成長因子を、それらがレセプターに結合し得るがオリゴマー化しないように操作することを含む。これは、分子上の第２のレセプター結合部位(部位ＩＩ)を変異誘発することにより達成される。得られるムテインは、レセプター部位に結合しかつ占有し得るが、細胞内シグナリング経路を活性化し得ない。この戦略は、ＧＨに首尾良く適用され、ＧＨアンタゴニストを作成してきた(Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、１９９２)。ＩＬ−２(Ｚｕｒａｗｓ
ｋｉら、１９９０；ＺｕｒａｗｓｋｉおよびＺｕｒａｗｓｋｉ、１９９２)、ＩＬ−４(Ｋｒｕｓｅら、１９９２)、ＩＬ−５(Ｔａｖｅｒｎｉｅｒら、１９９５)、ＧＭ−ＣＳＦ(Ｈｅｒｃｕｓら、１９９４)およびＥＰＯ(Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９９６)のようなＧＨス
ーパー遺伝子ファミリーのその他のメンバーのアンタゴニストを開発するために類似の戦略が追求されている。本明細書に記載のＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーにシス
テイン残基を付加する好適な部位は、これらのタンパク質中のレセプター結合部位の外側に存在し、そしてそれ故、タンパク質アンタゴニストを作成するために用いられる任意の部位から除去されるので、本明細書に記載のシステインが付加された改変体は、長期間作用するタイプのタンパク質アンタゴニストを生成するために用いられ得る。例として、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら(１９９２)は、グリシン残基(アミノ酸１２０)をアルギニンに変異させることによりインビトロのＧＨアンタゴニストを開発した。このグリシン残基は、それがアルギニンで置換される場合；ＧＨにおいて第２のレセプター結合部位の重要な成分である。ＧＨはレセプターを二量体化し得ない。位置１２０におけるグリシンからアルギニンへの変異は、本明細書で意図されるＧＨのシステイン付加改変体をコードするＤＮＡ配列中に導入され得、システイン反応性のＰＥＧまたはその他のタイプのシステイン反応性成分と結合し得るシステインが付加されたＧＨアンタゴニストを作成する。同様に、その他のタンパク質における、これらタンパク質をアゴニストからアンタゴニストに変えるアミノ酸の変化が、本明細書に記載のシステインが付加されたタンパク質改変体をコードするＤＮＡ配列中に取り込まれ得る。タンパク質アゴニストをアンタゴニストに変換するアミノ酸変化を同定するために相当な努力が費やされている。Ｈｅｒｃｕｓら(１９９４)は、成熟ＧＭ−ＣＳＦタンパク質中の位置２１におけるグルタミン酸をアルギニンまたはリジンで置換すると、ＧＭ−ＣＳＦがアゴニストからアンタゴニストに転換することを報告した。Ｔａｖｅｒｎｉｅｒら(１９９５)は、成熟ＩＬ−５の位置１３におけるグルタミン酸をグルタミンに置換することはＩＬ−５アンタゴニストを作成することを報告した。
【００３８】
上記に記載の戦略と類似の実験的戦略を用いて、種々の動物由来のＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーのシステインが付加された改変体(アゴニストおよびアンタゴスト
の両者)を作成し得る。これは、サイトカインおよび成長因子の一次アミノ酸配列および
構造がヒトおよび動物種の間で大部分が保存されているので可能である。この理由により、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーの生物学的に活性なシステインが付加された改変体を作成するための本明細書に開示された「規則」は、身近な動物種(例えば、イヌ
、ネコ、ウマ)および商業用動物種(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ)のＧＨスーパー遺伝子
ファミリーのメンバーの生物学的に活性なシステインが付加された改変体を作成するために有用である。これらのシステインが付加された改変体の、システイン反応性ＰＥＧとの結合は、身近な動物および商業的な家畜の市場に利益を与えるこれらタンパク質の長く作用する型を作成する。
【００３９】
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであるタンパク質(造血サイトカイン)は、ＳｉｌｖｅｎｎｏｉｍｅｍおよびＩｈｌｅ(１９９６)で提供される。ＳｉｌｖｅｎｎｏｉｍｅｍおよびＩｈｌｅ(１９９６)はまた、これらタンパク質の構造および発現に関する情報を提供する。本明細書に記載のタンパク質のためのＤＮＡ配列、コードされるアミノ酸ならびにインビトロおよびインビボバイオアッセイは、ＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ(１９９２；１９９６)、Ａｇｇａｒｗａｌ(１９９８)、およびＳｉｌｖｅｎｎｏｉｍｅｍおよびＩｈｌｅ(１９９６)に記載される。これらタンパク質に対するバイオアッセイもまた、これらタンパク質の種々の市販の供給者(例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ
，Ｉｎｃ．、Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．)のカタログ中に提供されている。
【００４０】
以下の実施例は、ＧＨ、エリスロポイエチン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＨスーパー遺伝子ファミリーのその他のメンバーのシステインが付加された改変体を作成するためにこれらの「規則」がどのように用いられ得るかを示すために提供される。これらの実施例は、制限されるべきであることは意図されず、本発明の特定の実施態様の例示を示すに過ぎない。
【００４１】
(実施例１)
ＧＨのシステイン付加改変体この実施例は、ＧＨにおいて、生物学的活性には必須では
なく、そしてそれがシステイン残基に変異する場合に分子のジスルフィド結合パターンおよび全体のコンホメーションを変えない特定のアミノ酸を開示する。これらのアミノ酸は、Ａ−ＢループのＮ末端(成熟タンパク質配列のアミノ酸３４−５２；配列番号１；Ｍａ
ｒｔｉａｌら  １９７９；Ｇｏｅｄｄｅｌら  １９７９)、Ｂ−Ｃループ(成熟タンパク質配列中のアミノ酸９７−１０５)、およびＣ−Ｄループ(成熟タンパク質配列中のアミノ酸１３０−１５３)に位置する。システイン残基を導入するために好適な部位としてもまた
同定されるのは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤヘリックス中の最初の３つまたは最後の３つのアミノ酸、およびヘリックスＡの近位方向およびヘリックスＤの遠位方向にあるアミノ酸である。
【００４２】
野生型ＧＨをコードするＤＮＡ配列は、ヒト下垂体から調製された市販の一本鎖ｃＤＮＡ(ＣｌｏｎＴｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ)からポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて増幅し得るか、または重複するオリゴヌクレオチドを用いて構策され得る。特定の変異は、ファージ技術(Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７)、ＰＣＲ変異誘発技術(Ｉｎｎｉｓら  １
９９０；Ｗｈｉｔｅ  １９９３)、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ(「Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」キット、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ)またはＰｒｏｍｅｇａ(Ｇｅｎｅ  Ｅｄｉｔｏｒ  Ｋｉｔ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ)により販売されるような変異誘
発キットのような種々の手順を用いてＧＨ配列中に導入され得る。
【００４３】
システイン置換は、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−ＤループおよびＡ−ＢループのＮ末端を構成する任意のアミノ酸中に、またはこれらの領域に隣接するα−ヘリックス領域の最初の３つのアミノ酸中に、あるいはヘリックスＡの近位方向にあるかまたはヘリックスＤの遠位方向にある領域中に導入され得る。システイン残基の導入に好適な部位は：Ｆ１、Ｔ３、Ｐ５、Ｅ３３、Ａ３４、Ｋ３８、Ｅ３９、Ｑ４０、Ｓ４３、Ｑ４６、Ｎ４７、Ｐ４８、Ｑ４９、Ｔ５０、Ｓ５１、Ｓ５５、Ｔ６０、Ａ９８、Ｎ９９、Ｓ１００、Ｇ１０４、Ａ１０５、Ｓ１０６、Ｅ１２９、Ｄ１３０、Ｇ１３１、Ｓ１３２、Ｐ１３３、Ｔ１３５、Ｇ１３６、Ｑ１３７、Ｋ１４０、Ｑ１４１、Ｔ１４２、Ｓ１４４、Ｋ１４５、Ｄ１４７、Ｔ１４８、Ｎ１４９、Ｓ１５０、Ｈ１５１、Ｎ１５２、Ｄ１５３、Ｓ１８４、Ｅ１８６、Ｇ１８７、Ｓ１８８、およびＧ１９０である。システイン残基はまた、成熟タンパク質の始めに、すなわちＦ１アミノ酸の近位方向に、または成熟タンパク質の最後のアミノ酸の後に、すなわちＦ１９１の後に導入され得る。所望であれば、２つ以上のこのような変異は、クローン化された変異体遺伝子のインビトロＤＮＡ組換えおよび/または個々の所望の変異の
逐次的構築のいずれかにより同一タンパク質中に容易に組み合わせられ得る。
【００４４】
１．ヒト成長ホルモン(ＧＨ)遺伝子のクローニング
ヒトＧＨ遺伝子を、ヒト下垂体一本鎖ｃＤＮＡ(ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌ
ｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡから入手可能)から、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)技術およびプラ
イマーＢＢ１およびＢＢ２を用いて増幅した。ＢＢ１の配列は、５’-ＧＧＧＧＧＴＣＧ
ＡＣＣＡＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧ−３’(配列番号２
４)である。ＢＢ２の配列は、５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣ
ＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣ−３’(配列番号２５)である。プライマーＢＢ１は、成熟ＧＨの最初のアミノ酸であるフェニルアラニンに先行する開始メチオニン、およびクローニング目的のためのＳａｌＩおよびＮｄｅＩ部位をコードするように設計された。逆プライマーＢＢ２は、クローニング目的にＢａｍＨＩ部位を含む。ＰＣＲの１００マイクロリットル反応は、２０ピコモルの各オリゴヌクレオチドプライマー、１ＸＰＣＲ緩衝液(ＭｇＣｌ２
を含むＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒの緩衝液)、２００マイクロモル濃度の各４つのヌクレ
オチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴ、２ｎｇの一本鎖ｃＤＮＡ、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ(Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ)ならびに２．５単位のＰｆｕポリメラーゼ(Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ)を含んだ。ＰＣＲ反応条件は、９６℃３分間、３５サイクル(９５℃、１分間；６３℃、３０秒間；７２℃、１分間)、次いで７２℃で１０分間であった
。用いたサーモサイクラーは、ＡｍｐｌｉｔｒｏｎＩＩ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ(Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ)であった。約６００ｂｐのＰＣＲ産物を、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、そして同様に消化したプラスミドｐＵＣ１９(Ｎｅｗ  Ｅｎ
ｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから入手可能)中にクローン化した
。結合型混合物をＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α中に形質転換し、そして形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ平板上で選択した。いくつかのコロニーをＬＢ培地中で一晩増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ(Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ)から購入したミニプラスミドＤＮＡ単離キットを用いて単離した。クローンＬＢ６が正確なＤＮＡ配列を有することを決定した。
【００４５】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現には、クローンＬＢ６をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、約６００ｂｐのフラグメントをゲル精製し、そして同じ酵素で消化し、そしてホスファターゼ処理したプラスミドｐＣＹＢ１(Ｎｅｗ  ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，ＭＡ)中にクローン化した。結合型混合物をＥ．ｃｏｌｉＤＨα中に形質転換
し、そしてＬＢアンピシリンプレート上で形質転換体を選択した。プラスミドＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離し、そしてＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いた消化によりスクリーニングした。正確なクローンを同定し、そしてｐＣＹＢ１：ｗｔＧＨ(ｐＢＢＴ１
２０)と命名した。このプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９またはＷ３１１０(Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能)中に形質転換した。
【００４６】
２．ＳＴＩＩ−ＧＨの構築
野生型ＧＨクローンＬＢ６(ｐＵＣ１９：野生型ＧＨ)をテンプレートとして用いＥ．ｃｏｌｉ  ＳＴＩＩシグナル配列(Ｐｉｃｋｅｎら、１９８３)を含むＧＨクローンを構築した。その長さのために、ＳＴＩＩ配列を２つの逐次的ＰＣＲ反応に添加した。最初の反応は、前方向プライマーＢＢ１２と逆方向プライマーＢＢ１０を用いた。ＢＢ１０は、配列：５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＧＡＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＣＣＴＣ３’(配列
番号２８)を有する。ＢＢ１２は、配列：５’ＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴ
ＡＴＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＣＴＴＡＣＧＣＡＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧ−３’(配列番号３０）を有する。
【００４７】
ＰＣＲ反応は、一本鎖ｃＤＮＡよりもむしろ約４ｎｇのプラスミドＬＢ６をテンプレートとして用い、そしてＰＣＲ条件が、９６℃３分間、３０サイクル(９５℃１分間；６３
℃３０秒間；７２℃１分間)、次いで７２℃１０分間であったことを除いては、野生型Ｇ
Ｈを増幅するために記載と同じあった。約６３０ｂｐのＰＣＲ産物を、ＱｉａｅｘＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ)を用いてゲル精製し、水で５０倍に希釈し、そして２マイクロリットルを第２のＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。第２のＰＣＲ反応は、逆方向プライマーＢＢ１０および前方向プライマーＢＢ１１を用いた。ＢＢ１１は配列：５’ＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧ-３’(配列番号２９)を有する。
【００４８】
プライマーＢＢ１１は、クローニング目的にＸｂａＩおよびＮｄｅＩ部位を含む。ＰＣＲ条件は、第１の反応について記載と同じであった。約６６０ｂｐのＰＣＲ産物を、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、そして同様に切断したプラスミドであるｐＣＤＮＡ３．１(＋)(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ)中にクローン化した。クローンｐＣＤＮＡ３．１(＋)：：ｓｔＩＩ-ＧＨ(５Ｃ)または「５Ｃ」は
正確なＤＮＡ配列を有すると決定した。
【００４９】
クローン「５Ｃ」を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、そして同様に切断したｐＢ
ＢＴ１０８(ＰｓｔＩ部位を欠くｐＵＣ１９の誘導体、このプラスミドは以下に記載され
る)中にクローン化した。正確な挿入片を持つクローンを、これらの酵素で消化した後に
同定した。ｐＢＢＴ１１１と称したこのクローンを、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化し、ｓｔＩＩ-ＧＨ融合遺伝子を含む６６０ｂｐのフラグメントをゲル精製し、そして同じ酵
素で消化しそしてホスファターゼ処理したプラスミド発現ベクターｐＣＹＢ１(Ｎｅｗ  
Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ)中にクローン化した。ｓｔＩＩ-ＧＨ挿入片を含む組換えプラスミドを制限エンドヌクレアーゼ消化により同定した。１つのこのような単離体をさらなる研究のために選択し、そしてｐＢＢＴ１１４と称した。このプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９またはＷ３１１０(Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓおよ
びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能)中
に形質転換した。
【００５０】
３．ｏｍｐＡ-ＧＨの構築
野生型ＧＨクローンであるＬＢ６(ｐＵＣ１９：野生型ＧＨ)をテンプレートとして用い、Ｅ．ｃｏｌｉのｏｍｐＡシグナル配列(Ｍｏｖｖａら  １９８０)を含むＧＨクローンを構築した。その長さのため、ｏｍｐＡ配列を２つの逐次的ＰＣＲ反応物中に添加した。最初の反応は、前方向プライマーであるＢＢ７：５’ＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧ３’(配列番号３１)、および逆方向プライマーであるＢＢ１０：５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＧＡＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＣＣＴＣ３’(配列番号２８)を用いた。
【００５１】
ＰＣＲ反応は、一本鎖ｃＤＮＡよりもむしろ約４ｎｇのプラスミドＬＢ６をテンプレートとして用い、そしてＰＣＲ条件が、９６℃３分間、３０サイクル(９５℃１分間；６３
℃３０秒間；７２℃１分間)次いで７２℃１０分間であったことを除いては、野生型ＧＨ
を増幅するために記載と同じであった。約６３０ｂｐのＰＣＲ産物を、ＱｉａｅｘＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘａｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ)を用いてゲル精製し、水で５０倍希釈し、そして２マイクロリットルを第２のＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。第２のＰＣＲ反応は、逆方向プライマーＢＢ１０および前方向プライマーＢＢ６：５’ＣＣＣＣＧＴＣＧＡＣＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣ３’(配列番号３２)を用いた。
【００５２】
ＰＣＲ条件は、第１の反応についての記載と同じであった。約６６０ｂｐのＰＣＲ産物をゲル精製し、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１９(Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ)またはＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＣＤＮＡ３．１(＋)(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)(ＳａｌＩおよびＸｈ
ｏＩ産物は、一致する一本鎖突出部分を生成する)中にクローン化した。いくつかのクロ
ーンを配列決定したとき、すべてのｐＵＣ１９クローン(８／８)がｏｍｐＡ配列の領域中に誤りを含んでいたことが発見された。唯一のｐＣＮＡ３．１(＋)クローンを配列決定し、そしてそれは、ｏｍｐＡ領域中に配列アンビギュイティーを含んでいた。正確なｏｍｐＡ-ＧＨ融合遺伝子を生成するために、都合の良い制限部位により分離された異なる誤り
を含んでいた２つの配列決定したクローンのセグメントを組換え、そしてＰｓｔＩ部位を欠くｐＵＣ１９誘導体(以下に記載のｐＢＢＴ１０８を参照のこと)中にクローン化した。ｐＢＢＴ１１２と呼ぶ得られたプラスミドは、ｐＢＢＴ１０８中のこれらと同一の部位中にＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてクローン化されたｏｍｐＡ−ＧＨ融合遺伝子を保持する。このプラスミドを、ｐＢＢＴ１１２と称し、そして以下に記載のように、ＰＣＲを基礎にした部位特異的変異誘発に用いた。
【００５３】
４．Ｐｓｔ−ｐＵＣ１９の構築
選択されたシステイン置換および挿入変異の構築のための、クローニングされたＧＨ遺
伝子の変異誘発を促進するために、ＰｓｔＩ部位を欠くプラスミドｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）の誘導体を以下の通りに構築した。ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡを、ＰｓｔＩを用いて消化し、続いて７５℃で、販売者が供給し、２００μＭ
ｄＮＴＰを補充した反応緩衝液を用いてＰＦＵ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理した。これらの条件下で、このポリメラーゼは、ＰｓｔＩ消化により生じた３’単鎖突出部を消化するが、二本鎖領域へは消化しない。正味の結果は、ＰｓｔＩ認識部位の真中の４つの塩基を含む４つの一本鎖塩基の欠失である。得られる分子は、二本鎖末端、すなわち「平滑」末端を有する。これらの酵素反応に続いて、直鎖状モノマーを、Ｑｉａｅｘ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いてゲル精製した。この精製したＤＮＡを、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、販売者のプロトコルに従って処理し、ＰｓｔＩで消化し、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換するために用いた。形質転換体を拾い、そしてＰｓｔＩおよびＢａｍＨ１を用いる制限消化により分析した。ＰｓｔＩによって切断されないが付近のＢａｍＨ１部位で切断される形質転換体の１つを拾い、そしてｐＢＢＴ１０８と称した。
【００５４】
５．ＧＨムテインの構築
ＧＨムテインを、一般に、部位特異的ＰＣＲベース変異誘発を、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ編，１９９３  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪおよびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ら編，１９９０  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載される通りに用いて構築した。代表的には、ＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを、タンパク質内の特異的位置のアミノ酸についてのシステイン残基での置換となるヌクレオチドの変化をＧＨのコード配列に取りこませるように設計する。このような変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーをまた、さらなるシステイン残基を、ＧＨのコード配列のカルボキシ末端またはアミノ末端に取込むように設計し得る。この後者の場合には、所望の場合には、１以上のさらなるアミノ酸残基をまた、この付加されたシステイン残基のアミノ末端側および／またはカルボキシ末端側で取込ませ得る。さらに、所望の場合には、オリゴヌクレオチドを、システイン残基を挿入変異としてＧＨコード配列内の特定の位置に取込むように設計し得る。さらに、１以上のさらなるアミノ酸を、システイン残基とともに挿入し得、そしてこれらのアミノ酸をシステイン残基に対してアミノ末端側および／またはカルボキシ末端側に配置し得る。
【００５５】
システイン置換変異Ｔ１３５Ｃを、以下の通りに構築した。変異誘発性の逆方向オリゴヌクレオチドＢＢ２８：
５’ＣＴＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＴＣ３’（配列番号３３）
を、アミノ酸残基１３５のトレオニンについてのコドンＡＣＴを、システインをコードするＴＧＴコドンに変化させ、付近のＢｇｌＩＩ部位までまたがるように設計した。このオリゴヌクレオチドを正方向オリゴヌクレオチドＢＢ３４（ｏｍｐＡ−ＧＨ融合遺伝子の連結領域にアニーリングし、そして変異誘発性でない、５’ＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴ３’（配列番号３４））とともにＰＣＲにおいて用いた。ＰＣＲを、１×ＰＣＲ緩衝液（１．５ｍＭＭｇＣｌ2  を含有するＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ緩衝
液）、各２００マイクロモル濃度の４つのヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ、０．５μＭで存在する各々のオリゴヌクレオチドプライマー、テンプレートとしての５ｐｇのｐＢＢＴ１１２（上記）、ならびに１．２５単位のＡｍｐｌｉｔａｃ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）および０．１２５単位のＰＦＵＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中の５０μｌ反応物において行なった。反応を、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ９６サーマルサイクラー（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）において行なった。用いたプログラムは、以下を必要とした：９５℃にて３分間、続いて９５℃にて６０秒間、４５℃または５０℃または５５℃にて７５秒間、７２℃にて６０秒間の２５サイクル、続いて６℃での保持。このＰＣＲ反応物を、アガロースゲル電気泳動により分析して、予測されたサイズである約４３０ｂｐの顕著な産物を与えるアニーリング温度を同定した。４５℃の反応物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて「浄化」し、ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩを用いて消化した。得られる２７８ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩフラグメント（推定のＴ１３５Ｃ変異を含む）をゲル精製し、そしてＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩで消化され、ゲル精製されたｐＢＢＴ１１１（ｓｔＩＩ−ＧＨ融合遺伝子（上記）を保有するｐＵＣ１９誘導体）に連結した。この連結物からの形質転換体を最初に、ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩでの消化によりスクリーニングし、続いて１つのクローンを配列決定して、Ｔ１３５Ｃ変異が存在すること、およびＰＣＲ反応または合成オリゴヌクレオチドによって潜在的に導入され得る任意のさらなる変異が存在しないことを確認した。配列決定したクローンは、正確な配列を有することが見出された。
【００５６】
置換変異Ｓ１３２Ｃを、Ｔ１３５Ｃについて上記に記載されたものと以下が異なるプロトコルを用いて構築した：変異誘発性逆方向オリゴヌクレオチドＢＢ２９（５’ＣＴＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＴＴＣ３’（配列番号３５））をＢＢ２８の代わりに用い、そして５０℃のアニーリング温度でのＰＣＲ反応をクローニングのために用いた。配列決定した２つのクローンのうちの１つが、適切な配列を有することが見出された。
【００５７】
置換変異Ｔ１４８Ｃを、類似するが異なるクローニングストラテジーを用いるプロトコルを用いて構築した。変異誘発性正方向オリゴヌクレオチドＢＢ３０（５’ＧＧＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＡＣ３’（配列番号３６））を、ＧＨコード配列の最も３’末端にアニーリングし、そしてすぐ下流のＢａｍＨ１部位にまたがる非変異誘発性逆方向プライマーＢＢ３３（５’ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＧＡＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴ３’（配列番号３７））とともにＰＣＲにおいて用いた。ＰＣＲを、上記の通りに行なった。ただし、用いたアニーリング温度は４６、５１、および５６℃であった。上記の通りのＰＣＲおよびゲル分析の後、４６および５１℃の反応物をクローニングのためにプールした。これらを、ＢａｍＨ１およびＢｇｌＩＩで消化し、ゲル精製し、そしてｐＢＢＴ１１１（これは、ＢａｍＨ１およびＢｇｌＩＩで消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で販売者のプロトコルに従って処理し、そしてゲル精製した）中にクローニングした。この連結物からの形質転換体を、ＢａｍＨ１およびＢｇｌＩＩを用いる消化により分析し、１８８ｂｐのＢａｍＨ１−ＢｇｌＩＩ変異誘発性ＰＣＲフラグメントが適切な方向でクローニングされたクローンを同定した。ＢａｍＨ１およびＢｇｌＩＩは、適合性の末端を生じるので、このクローニング工程は、方向特異的ではない。試験した６つのうち５つのクローンが正確に方向付けされたことが示された。これらのうちの１つを配列決定し、そして所望のＴ１４８Ｃ変異を含むことが示された。このクローンにおける１８８ｂｐのＢａｍＨ１−ＢｇｌＩＩ変異誘発性ＰＣＲフラグメントの残りの配列は、正確であることが確認された。
【００５８】
置換変異Ｓ１４４Ｃの構築は、以下を除いてＴ１４８Ｃの構築と同一であった。変異誘発性正方向オリゴヌクレオチドＢＢ３１（５’ＧＧＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＴＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＣ３’（配列番号３８））をＢＢ３０の代わりに用いた。試験した６つのうち２つのクローンが適切に方向付けられたことが示された。これらのうちの１つを配列決定し、そして所望のＳ１４４Ｃ変異を含むことが示された。このクローンにおける１８８ｂｐのＢａｍＨ１−ＢｇｌＩＩ変異誘発性ＰＣＲフラグメントの残りの配列は、正確であることが確認された。
【００５９】
ＧＨの天然のカルボキシ末端にシステイン残基を付加する変異をまた構築した。この変異（ｓｔｐ１９２Ｃと称する）の構築は、Ｔ１４８Ｃの構築と類似するが、異なるオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。ＧＨのカルボキシ末端ｐｈｅ残基についてのコドンとＴＡＡ翻訳停止コドンとの間にシステインについてのＴＧＣコドンを挿入し、そして付近のＢａｍＨ１部位にまたがる逆方向変異誘発性オリゴヌクレオチドＢＢ３２（５’ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣ３’（配列番号３９））を、上記のＢＢ３４（５’ＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴ３’（配列番号４０））とともに用いた。上記の通りのＰＣＲおよびゲル分析の後、４６℃での反応物をクローニングのために用いた。試験した６つのうち３つのクローンが正確に方向付けられたことが示された。これらのうちの１つを配列決定し、そして所望のｓｔｐ１９２Ｃ変異を含むことが示された。このクローンにおける１８８ｂｐのＢａｍＨ１−ＢｇｌＩＩ変異誘発性ＰＣＲフラグメントの残りの配列は、正確であることが確認された。
【００６０】
類似のＰＣＲ変異誘発手順を用いて、他のシステイン変異を生成し得る。変異誘発性オリゴヌクレオチドについての配列の選択は、所望のシステイン残基を配置する位置、および有用な制限エンドヌクレアーゼ部位の近さによって指図される。一般的には、変異、すなわち、ミスマッチなセグメントをオリゴヌクレオチドの真中の近くに配置してテンプレートへのオリゴヌクレオチドのアニーリングを増強することが所望される。任意のオリゴヌクレオチドについての適切なアニーリング温度は、経験的に決定され得る。変異誘発性オリゴヌクレオチドが、独特な制限部位にまたがり、その結果、ＰＣＲ産物を切断して、適切なベクター（例えば、ムテインを発現するために用いられ得るベクター）に容易にクローニングされ得るか、または変異遺伝子を切り出し、そしてこれをこのような発現ベクターに容易にクローニングするのに便利な制限部位を提供する、フラグメントを生成し得ることもまた、望ましい。時々、変異部位および制限部位は、合成オリゴヌクレオチドの合成に望ましい距離よりも大きな距離により隔てられている：一般に、このようなオリゴヌクレオチドを８０塩基未満の長さに保つことが望ましく、そして３０〜４０塩基の長さがより好ましい。
【００６１】
これが可能ではない場合には、変異誘発が標的化される遺伝子は、再操作または再合成されて制限部位を適切な位置に取込み得る。あるいは、上記で用いたＰＣＲ変異誘発プロトコルのバリエーション（例えば、いわゆる「Ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄ」（Ｂａｒｉｋ，Ｓ．，２７７〜２８６頁，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１５巻：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ編，１９９３．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）または「Ｇｅｎｅ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ」（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，２５１〜２６１頁，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１５巻：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ編，１９９３，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ））もまた、このような変異を構築するために用いられ得る。
【００６２】
６．ｐＣＹＢ１におけるＧＨの発現
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＧＨの発現のために、ｐＢＢＴ１２０（ｔａｃ発現ベクターｐＣＹＢ１にクローニングした、リーダー配列を有さないＧＨ遺伝子）およびｐＢＢＴ１１４（ｔａｃ発現ベクターｐＣＹＢ１にクローニングされた、ｓｔＩＩリーダー配列を有するＧＨ遺伝子）を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９およびＷ３１１０に形質転換した。親のベクターｐＣＹＢ１もまた、ＪＭ１０９およびＷ３１１０に形質転換した。これらの株に、以下の名称をつけた：
ＢＯＢ１１９：  ＪＭ１０９（ｐＣＹＢ１）
ＢＯＢ１３０：  Ｗ３１１０（ｐＣＹＢ１）
ＢＯＢ１２９：  ＪＭ１０９（ｐＢＢＴ１２０）
ＢＯＢ１３３：  Ｗ３１１０（ｐＢＢＴ１２０）
ＢＯＢ１２１：  ＪＭ１０９（ｐＢＢＴ１１４）
ＢＯＢ１３２：  Ｗ３１１０（ｐＢＢＴ１１４）。
【００６３】
発現のために、株を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）（Ｓｍｂｒｏｏｋら，１９８９）中で３７℃にて一晩増殖させた。これらの飽和した一晩培養物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ中でＡ6 00  にて約０．０３  ＯＤまで希釈し、そして旋回シェーカーにおいて、代表的には２５０〜３００ｒｐｍで振盪フラスコ中で３７℃にてインキュベートした。ＯＤをモニターし、そして培養物のＯＤが約０．２５〜０．５、代表的には０．３と０．４との間に到達したときにＩＰＴＧを０．５ｍＭの最終濃度になるように添加した。培養物を、代表的には誘導後１、３、５、および約１６時間にサンプリングした。「約１６時間」の時点は、培養物の一晩のインキュベーションを表し、そして正確な時間は、約１５〜２０時間で変化する。誘導した培養物および誘導していない培養物のサンプルを、遠心分離によりペレット化し、１×サンプル緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ラウリル硫酸ナトリウム、１０％グリセロール、０．１％ブロモフェノールブルー）中に所望の場合にはさらに１％のβ−メルカプトエタノールを添加して再懸濁した。サンプルを約１０分間煮沸するかまたは９０℃まで約１０分間加熱した。サンプルを室温まで冷却した後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードしたかまたはすぐに泳動しない場合は−２０℃で保存した。サンプルを、成形済みの１５％ポリアクリルアミド「Ｒｅａｄｙ  Ｇｅｌｓ」（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）に、Ｒｅａｄｙ  Ｇｅｌ  Ｃｅｌｌ電気泳動装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて販売者のプロトコルに従って泳動した。代表的には、ゲルを、２００ボルトで約３５〜４５分間泳動した。ゲルを、クーマシーブルーで染色するか、または電気ブロッティング後のウェスタンブロットにより分析した。株ＢＯＢ１２９、ＢＯＢ１３３、ＢＯＢ１２１、およびＢＯＢ１３２からの全細胞溶解産物のクーマシー染色は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ（Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）から購入した精製組換えヒトＧＨ標準と同時に移動する約２２ｋＤのバンドを示した。このバンドは、一晩の誘導後に誘導した培養物において最も顕著であった。しかし、これらの同じ株の誘導していない培養物においてこの分子量のバンドもまた観察され、そしてＧＨ遺伝子を欠く発現ベクターｐＣＹＢ１を保有するＢＯＢ１１９およびＢＯＢ１３０コントロール株において誘導ありおよび誘導なしでも観察され得た。この観察を明確にするために、ウェスタンブロット分析を、株ＢＯＢ１１９、ＢＯＢ１３０、ＢＯＢ１２９、ＢＯＢ１３３、ＢＯＢ１２１、およびＢＯＢ１３２の誘導した培養物の全細胞溶解産物について行なった。ウェスタンブロットを、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）から購入したポリクローナルウサギ抗ヒトＧＨ抗血清（カタログ番号Ｇ９０００−１１）を用いて行なった。この一次抗体を、１：５０００希釈で用い、そしてその結合を、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入したアルカリホスファターゼに結合体化したヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ（製品番号３１３４１）を用いて検出した。この二次抗体を、１：１０，００００希釈で用いた。アルカリホスファターゼ活性を、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  ＴＲ／ＡＳ−ＭＸ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）を販売者のプロトコルに従って用いて検出した。ウェスタンブロットは、誘導後３時間および１６時間の両方で、ＢＯＢ１２９、ＢＯＢ１３３、ＢＯＢ１２１、およびＢＯＢ１３２の誘導された培養物の溶解産物におけるＧＨの存在を明らかに示した。コントロールの株であるＢＯＢ１１９およびＢＯＢ１３０の誘導した培養物においては、誘導後３時間の時点でも１６時間の時点でもウェスタンブロットによりＧＨは検出されなかった。
【００６４】
これらの予備的な実験では、最大の収量のＧＨは、ＧＨ遺伝子が、ｓｔＩＩ分泌シグナル配列の下流に融合されたＢＯＢ１３２  Ｗ３１１０（ｐＢＢＴ１１４）から得られた。この株をさらに試験して、ＧＨタンパク質が予測されるようにペリプラズムに分泌されるか否かを決定した。ＢＯＢ１３２の誘導した培養物を、上記の通りに調製し、そしてＫｏｓｈｌａｎｄおよびＢｏｔｓｔｅｉｎ（Ｃｅｌｌ  ２０  （１９８０）７４９〜７６０頁）の手順に従って浸透圧性ショックに供した。この手順により、外膜が破壊され、そしてペリプラズムの内容物が周辺の培地中へ放出される。続いての遠心分離により、上清中に存在するペリプラズム内容物が、残りの細胞関連成分から分離される。この実験では、ＢＯＢ１３２により合成されたＧＨの大部分がペリプラズム中に局在することが見出された。この結果は、総ＧＨの大部分がまた、精製されたＧＨ標準とサイズが区別できないという知見と一致し、このことは、ｓｔＩＩシグナル配列が除去されていることを示す。これは、分泌を示す。ＢＯＢ１３２のより大規模な（５００ｍｌ）培養物もまた、Ｈｓｉｕｎｇら，１９８６（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４，９９１〜９９５頁）により記載される手順に従って誘導し、一晩培養し、そして浸透圧性ショックに供した。ゲル分析はさらに、生成されたＧＨの大部分が、可溶性で、ペリプラズム性で、そしてＧＨ標準とサイズが区別できないことを示した。この物質をまた、ＢｅｃｋｅｒおよびＨｓｉｕｎｇ，１９８６（ＦＥＢＳＬｅｔｔ  ２０４  １４５〜１５０頁）により組換えヒトＧＨについて記載された条件と非常に類似した条件を用いてＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに定量的に結合させ、そしてこのカラムから溶出させ得た。
【００６５】
７．ヒトＧＨレセプターのクローニング
ヒトＧＨレセプターを、正方向プライマーＢＢ３および逆方向プライマーＢＢ４を用いてＰＣＲによりクローニングした。ＢＢ３は、配列：
５’−ＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＴＴ−３’（配列番号２６）
を有する。ＢＢ４は、配列：
５’ＣＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＴＴＡＡＡＴＡＣＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＧＧ−３’（配列番号２７）
を有する。テンプレートは、ヒト肝臓から調製した一本鎖ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販される）であった。プライマーＢＢ３およびＢＢ４は、それぞれ、クローニングの目的でＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限部位を含む。１００μｌのＰＣＲ反応物は、２．５ｎｇの一本鎖ｃＤＮＡおよび２０ピコモルの各プライマーを１×ＰＣＲ緩衝液（ＭｇＣｌ2  を含有するＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ緩衝液）、各２０
０マイクロモル濃度の４つのヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ならびに２．５単位のＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ）中に含んでいた。ＰＣＲ反応条件は、以下の通りであった：９６℃にて３分間、（９５℃にて１分間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて２分間）の３５サイクル、続いて７２℃にて１０分間。用いたサーモサイクラーは、Ａｍｐｌｉｔｒｏｎ  ＩＩ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）であった。約１．９ｋｂのＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、そして同様に切断したプラスミドｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と連結した。しかし、この連結反応物から得られた形質転換体はいずれも、１．９ｋｂのＰＣＲフラグメントを含んでいなかった。Ｌｅｕｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ  １９８７  ３３０  ５３７〜５４３頁）もまた、ｐＵＣ１９においてヒトＧＨレセプターの全長ｃＤＮＡクローンを得ることができなかった。続いて、ＰＣＲフラグメントを、低コピー数ベクターであるｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）にこのベクターのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位にてクローニングした。このようなクローンを、妥当な頻度で得たが、クローニングされたＰＣＲフラグメントを保有するＥ．ｃｏｌｉ株は、ｐＡＣＹＣ１８４の維持のための選択に用いたクロラムフェニコールの存在下では不十分にしか増殖せず、小さくかつ不均質な外観のコロニーしか形成しなかった。
【００６６】
ＰＣＲフラグメントを、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に同時にクローニングした。約１．９ｋｂのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、そしてｐＣＤＮＡ３．１（＋）のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩクローニング部位に連結した。この連結からの稀な形質転換体のみが、クローニングされたＧＨレセプターｃＤＮＡを含んでおり、そしてこれらはいずれもレセプターコード配列のセグメントの欠失を含んでいることが見出された。これらのうちの１つのクローンを配列決定し、そして１３５ｂｐの欠失をＧＨレセプターコード配列内に含むことが見出された：この遺伝子の残りの配列は、Ｌｅｕｎｇら（１９８７）により報告された配列と一致した。
【００６７】
８．ウサギＧＨレセプターのクローニング
ウサギＧＨレセプターを、正方向プライマーＢＢ３（上記）および逆方向プライマーＢＢ３６を用いてＰＣＲによりクローニングした。ＢＢ３６は、配列：
５’ＣＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＴＴＡＧＡＴＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＴＧＧＧ３’（配列番号４１）
を有し、そしてクローニングの目的でＸｂａＩおよびＳａｌＩ制限部位を含む。ウサギ肝臓ポリ（Ａ）+ｍＲＮＡを、ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．から購入し、そして一本鎖ｃＤ
ＮＡの第１鎖合成において基質として用いてＰＣＲ増幅のためのテンプレートを生成した。一本鎖ｃＤＮＡの第１鎖合成を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）からの１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＡＭＶ）キットを販売者のプロトコルに従って用いて達成した。平行な第１鎖ｃＤＮＡ合成を、ランダムヘキサマーまたはＢＢ３６をプライマーとして用いて行なった。第１鎖合成の産物をテンプレートとして用いる、続いてのＰＣＲ反応を、プライマーＢＢ３およびＢＢ３６を１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＡＭＶ）キットのプロトコルに従って、２．５単位のＡｍｐｌｉｔａｃ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）および０．６２５単位のＰｆｕ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施した。ＰＣＲ反応条件は、９６℃にて３分間、（９５℃にて１分間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて２分間）の３５サイクル、続いて７２℃にて１０分間であった。用いたサーモサイクラーは、Ａｍｐｌｉｔｒｏｎ  ＩＩ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）であった。予測された約１．９ｋｂのＰＣＲ産物は、ランダムヘキサマープライムｃＤＮＡまたはＢＢ３６プライムｃＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲ反応物中に観察された。ランダムヘキサマープライムｃＤＮＡを、次のクローニング実験に用いた。これを、ＢａｍＨ１およびＸｂａＩで消化し、そして１．２％アガロースゲルで泳動した。この消化により、２つのフラグメント（約３６５ｂｐおよび約１６００ｂｐ）を生じる。なぜなら、ウサギＧＨレセプター遺伝子は、内部にＢａｍＨ１部位を含むからである。両方のフラグメントをゲル精製した。最初に、約１６００ｂｐのＢａｍＨ１−ＸｂａＩフラグメントを、これらの同じ２つの酵素で消化したｐＣＤＮＡ３．１（＋）中にクローニングした。これらのクローンは、妥当な頻度で容易に得られ、そして制限消化および続いての配列決定により決定した場合、欠失の証拠を示さなかった。全長クローンを生じるために、１６００ｂｐのＢａｍＨ１−ＸｂａＩフラグメントを含有するプラスミドの１つ（ｐＣＤＮＡ３．１（＋）：：ｒａｂ−ｇｈｒ−２Ａ）をＢａｍＨ１で消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で販売者のプロトコルに従って処理し、ゲル精製し、そしてゲル精製した約３６５ｂｐのＢａｍＨ１フラグメント（ウサギＧＨレセプター遺伝子の５’部分を含む）に連結した。この連結物からの形質転換体を拾い、そして制限消化およびＰＣＲにより分析して、約３６５ｂｐのフラグメントの存在を確認し、そしてこのウサギＧＨレセプター遺伝子の遠位セグメントに対する方向を決定した。分析した４つのうちの３つのクローンが、ウサギＧＨレセプター遺伝子の再構築について正確な方向にクローニングされた約３６５ｂｐのフラグメントを含むことが見出された。ヒト遺伝子とは対照的に、このウサギ遺伝子のＥ．ｃｏ
ｌｉにおけるクローニングにおいて複雑化の要因がないことは、Ｌｅｕｎｇら（１９８７）の結果と一致する。Ｌｅｕｎｇら（１９８７）はまた、ウサギＧＨレセプター遺伝子についての全長ｃＤＮＡクローンを容易に入手したが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてヒトの遺伝子の全長ｃＤＮＡをクローニングすることができなかった。ウサギＧＨレセプターを、ヒトＧＨを用いるアッセイにおいてリガンドとして用い得る。これは、ヒトＧＨがウサギレセプターと高親和性で結合することが示されている（Ｌｅｕｎｇら，１９８７）からである。クローニングされたウサギＧＨレセプターを含むプラスミドを配列決定して、使用の前に、正確な配列を有するウサギＧＨレセプターｃＤＮＡを同定するべきである。
【００６８】
９．ヒト／ウサギキメラＧＨレセプター遺伝子の構築
ウサギレセプターの代替物として、ヒトレセプターの細胞外ドメインをウサギレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと合わせるキメラレセプターを構築し得る。このようなキメラレセプターを、ヒトの遺伝子とウサギの遺伝子とを、各々において存在する独特なＮｃｏＩ部位（Ｌｅｕｎｇら，１９８７）にて組換えることにより構築し得る。ＮｃｏＩ部位の５’側、すなわち上流に位置するヒトの遺伝子セグメント、およびＮｃｏＩ部位の３’側，すなわち下流にウサギ遺伝子セグメントを含むこのような組換え体は、ヒトレセプターの細胞外ドメインを、ウサギレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとともに有する、正確に所望のタイプのキメラレセプターをコードする。これは、ＧＨ、ＧＨムテイン、およびＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ＧＨムテインと、天然のレセプター結合部位との相互作用の分析を可能にするが、Ｅ．ｃｏｌｉ中に全長ヒトＧＨレセプターをクローニングする必要性を回避し得る。
【００６９】
ＧＨムテインは、種々の発現系（例えば、細菌、酵母、または昆虫細胞）において発現され得る。これらの系においてＧＨムテインを発現するためのベクターは、多数の供給業者（例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのｐＥＴ１５ｂ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのｐＣ４Ｂ１）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（バキュロウイルスベクターを用いる昆虫細胞における発現のためのｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＭＥＬＢＡＣ、酵母細胞における発現のためのＰｉｃｈｉａベクター、ならびに哺乳動物細胞における発現のためのｐＣＤＮＡ３））から市販されている。ＧＨは、細胞周辺腔へのこのタンパク質の分泌を促進するためにＥ．ｃｏｌｉ  ＯｍｐＡまたはＳＴＩＩシグナル配列を用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて細胞質タンパク質として、および分泌型、ペリプラズム性タンパク質として首尾良く生成された（Ｃｈａｎｇら，１９８７；Ｈｓｉｕｎｇら，１９８６）。ＧＨムテインが、分泌タンパク質として発現され、その結果、これらが、天然のヒトタンパク質に存在しないＮ末端メチオニン残基を含まないことが好ましい。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために、ＧＨまたはＧＨムテインをコードするＤＮＡ配列を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター（例えば、強力なＴ７プロモーターを用いるｐＥ１５ｂ、またはＴＡＣプロモーターを用いるｐＣＹＢ１）中にクローニングし得る。増殖培地にＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能なイソプロピルチオガラクトピラノシド）を添加することにより、タンパク質の発現を誘導し得る。組換えＧＨは、細胞周辺腔に分泌され、その後の浸透圧性ショック（ＢｅｃｋｅｒおよびＨｓｉｕｎｇ，１９８６）により、細胞周辺腔から放出、続いて精製され得る。このタンパク質は、他のクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換、疎水性相互作用、サイズ排除、および逆相クロマトグラフィー（これらはすべて当業者に周知である（例えば、ＢｅｃｋｅｒおよびＨｓｉｕｎｇ，１９８６を参照のこと）））を用いてさらに精製され得る。タンパク質濃度を、市販のタンパク質アッセイキット（例えば、ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）により販売されるもの）を用いて決定し得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現したときにＧＨタンパク質が不溶性である場合、これらは、当業者に周知の手順を用いて再折り畳みされ得る（Ｃｏｘら，１９９４、ならびに国際特許出願ＷＯ９４２２４６６およびＷＯ９４１２２１９を参照のこと）。
【００７０】
あるいは、このタンパク質は、分泌タンパク質として昆虫細胞中で発現され得る。発現プラスミドは、培地中へのこのタンパク質の分泌を促進するためにＧＨシグナル配列を含むように改変され得る。ｃＤＮＡは、市販のベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．からのｐＶＬ１３９２）にクローニングされ、そして昆虫細胞を感染させるために用いられ得る。ＧＨおよびＧＨムテインは、従来のクロマトグラフィー手順を用いて馴化培地から精製され得る。ｒｈＧＨに対する抗体をウェスタンブロットに関連して用いてクロマトグラフィーの間にＧＨタンパク質を含有する画分を位置決めし得る。あるいは、ＧＨを含有する画分を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて同定し得る。
【００７１】
システイン付加ＧＨ改変体もまた、真核生物細胞（例えば、酵母、昆虫細胞、または哺乳動物細胞）において細胞内タンパク質または分泌タンパク質として発現され得る。タンパク質を発現するためのベクターおよびこのような実験を行うための方法は、種々の市販会社（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．およびＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．）からのカタログにおいて記載されている。ＧＨおよびＧＨムテインは、従来のクロマトグラフィー手順を用いて精製され得る。
【００７２】
ＧＨムテインの生物学的活性は、ＧＨに応答して増殖する細胞株を用いて測定され得る。Ｆｕｈら（１９９２）は、骨髄性白血病細胞株ＦＤＣ−Ｐ１を、マウスＧ−ＣＳＦレセプターに融合されたウサギＧＨレセプターの細胞外ドメインを含むキメラレセプターで安定に形質転換することにより、ＧＨ応答性細胞株を作製した。この細胞株は、ＧＨに応答して増殖し、最大有効濃度の半値（ＥＣ50）は、２０ピコモル濃度である。類似の細胞株は、これらのレセプターの公開された配列および標準的な分子生物学技術を用いて構築され得る（Ｆｕｈら、１９９２）。あるいは、ヒトＧＨレセプターの細胞外ドメインが、マウスＧ−ＣＳＦレセプターに、これらのレセプターの公開された配列および標準的な分子生物学技術を用いて融合され得る。キメラレセプターを発現する形質転換細胞は、標識化ＧＨを用いるフローサイトメトリーによって、放射性標識ＧＨに結合する形質転換細胞の能力によって、または添加されたＧＨに応答して増殖する形質転換細胞の能力によって、同定され得る。精製されたＧＨおよびＧＨムテインは、キメラレセプターを発現する細胞を用いる細胞増殖アッセイにおいて、これらのタンパク質の比活性を測定するために試験され得る。細胞は、種々の濃度のＧＨまたはＧＨムテインを有する９６ウェル皿においてプレートされ得る。１８時間後、細胞を、４時間、3Ｈチミジンで処理し、取り込まれた
放射能の決定のために回収した。ＥＣ50は、各ムテインについて決定され得る。アッセイは、各データ点について３連のウェルを用いて各ムテインについて少なくとも３回実施すべきである。類似の至適刺激レベルおよび野生型ＧＨに匹敵するまたはこれより大きいＥＣ50値を示すＧＨムテインは、好ましい。
【００７３】
インビトロ活性を保持するＧＨムテインは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ，Ｉｎｃ．から市販されているシステイン反応性の８ｋＤａ  ＰＥＧ−マレイミド（またはＰＥＧ−ビニルスルホン）を用いてＰＥＧ化され得る。一般に、これらの試薬でタンパク質をＰＥＧ化するための方法は、わずかに変更があるが、国際特許出願ＷＯ９４１２２１９およびＷＯ９４２２４６６およびＰＣＴ出願ＵＳ９５／０６５４０に記載の方法と類似である。組換えタンパク質は、遊離システインの至適なＰＥＧ化を達成するために、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）で部分的に還元されなければならない。遊離システインはジスルフィド結合に関与しないが、この部分的な還元工程が行われなければ、システイン反応性ＰＥＧに対して相対的に反応性でない。各ムテインを部分的に還元させるのに必要なＤＴＴの量は、ある範囲のＤＴＴ濃度を使用して、経験的に決定され得る。代表的には、３０分間室温での５〜１０倍モル過剰のＤＴＴが、十分である。部分的な還元は、逆相カラムからのタンパク質の溶出プロフィールにおいて、わずかなシフトによって検出され得る。タンパク質を過剰に還元したり、さらなるシステイン残基を露出させないように、注意を払わなければな
らない。過剰還元は、逆相ＨＰＬＣ（タンパク質は、十分に還元され、そして変性されたタンパク質と類似の保持時間を有する）、および２つのＰＥＧを含むＧＨ分子の出現（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の分子量変化によって検出可能）によって検出され得る。野生型ＧＨは、コントロールとして供され得る。なぜなら、これは、類似の条件下でＰＥＧ化しないからである。過剰なＤＴＴは、スピンカラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって除去され得る。部分的に還元されたタンパク質を種々の濃度のＰＥＧ−マレイミドと反応させて（ＰＥＧ：タンパク質モル比は、１：１、５：１、１０：１、および５０：１）、２つの試薬の至適比を決定し得る。タンパク質のＰＥＧ化は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いる分子量シフトによってモニタリングされ得る。二ＰＥＧ化産物を生じることなく有意な量の単ＰＥＧ化産物を生じる最も低い量のＰＥＧを、至適であるとみなす（単ＰＥＧ化産物への８０％変換が良好であるとみなされる）。一般に、単ＰＥＧ化タンパク質は、非ＰＥＧ化タンパク質および未反応ＰＥＧから、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって精製され得る。精製されたＰＥＧ化タンパク質は、上記の細胞増殖アッセイにおいて、その比活性を決定するために試験され得る。
【００７４】
上記実験は、システイン残基に変更され、ＰＥＧ化され、そしてインビトロで生物学的活性を保持し得る、ＧＨ中のＢ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループ、またはＡＢループのＮ末端におけるアミノ酸の同定を可能にする。これらのムテインは、当該分野で周知の動物疾患モデルにおいて試験され得る。
【００７５】
実験は、ＰＥＧ分子が適切な部位でタンパク質に付着され得ることを確認するために行い得る。これは、タンパク質のタンパク質分解性消化、サイズ排除、イオン交換、または逆相クロマトグラフィーによるＰＥＧペプチド（大きな分子量を有する）の精製、次いでアミノ酸配列決定または質量分析を行うことによって達成され得る。ＰＥＧカップリングアミノ酸は、アミノ酸配列決定泳動においてブランクとして出現する。
【００７６】
ＰＥＧ−ＧＨタンパク質の薬物速度論的特性は、以下のように、または国際特許出願ＷＯ９４２２４６６において記載のように、決定され得る。ラットまたはマウスの対は、試験タンパク質の静脈内ボーラス注射を受容し得る。タンパク質の循環レベルを、所望の時点で少量の血液サンプルを動物から採取することによって、２４時間の経過にわたって測定する。試験タンパク質の循環レベルは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて定量され得る。さらなる実験は、タンパク質を投与するために、皮下経路を用いて実施され得る。類似の実験が、コントロールとして供するために、非ＰＥＧ化タンパク質を用いて実施されるべきである。これらの実験は、ＰＥＧ試薬のタンパク質への付着がその薬物速度論的特性を変化させるか否かを明らかにする。タンパク質のＰＥＧとの共有結合修飾が、非ＰＥＧ化タンパク質に対してタンパク質の循環半減期を増大させるはずである。より大きなＰＥＧ分子および／または複数のＰＥＧ分子の付着は、循環半減期を延長し、より小さなＰＥＧ分子より長くするはずである。
【００７７】
ＰＥＧ−ＧＨタンパク質は、成長ホルモン欠損（Ｃｏｘら、１９９４）および悪液質（Ｔｏｍａｓら、１９９２；Ｒｅａｄら、１９９２）のげっ歯類モデルにおいて、至適投与スケジュールを決定し、そして効力を示すために試験され得る。これらの研究は、至適なＰＥＧサイズおよび投与スケジュールを決定するために、異なるサイズのＰＥＧ分子（例えば、８ｋＤａおよび２０ｋＤａ）および投与スケジュールを探索し得る。より大きなＰＥＧ分子は、循環半減期を、より小さなＰＥＧ分子よりも長く増大させ、そしてより少ない頻度の投与を必要とすることが期待される。しかし、大きなタンパク質は、潜在的に、インビボにおいては減少された分布容量を有し得、従って、ＧＨに付着された２０ｋＤａ
ＰＥＧは、バイオアベイラビリティーを制限し、その効力を減少させることが可能である。げっ歯類モデルは、これがその場合であるか否かの決定を可能にする。一旦、至適な
投与スケジュールおよびＰＥＧサイズが決定されると、ＧＨに対するＰＥＧ−ＧＨの効力が、動物モデルにおいて比較され得る。ＧＨ活性を有する全てのＰＥＧ−ＧＨタンパク質が本発明に含まれるが、好ましいＰＥＧ−ＧＨタンパク質は、ＧＨに等しいまたはこれより優れた成長を増強するが、より少ない頻度で与えられ得るタンパク質である。ＰＥＧ−ＧＨは、ＰＥＧ−ＧＨおよびＧＨのいずれもが、より頻度の低い投与スケジュールを用いて投与されたとき、ＧＨよりも有効であるはずである。
【００７８】
使用され得る１つのＧＨ欠損モデルは、下垂体切除ラットである。ＧＨは、このモデルにおいて、体重増加および骨成長および軟骨成長を刺激する（Ｃｏｘら、１９９４）。下垂体切除ラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入され得る。ラットにＧＨ、ＰＥＧ−ＧＨまたはプラシーボを注射し得、そして体重増加を１０〜１４日間にわたって毎日測定し得る。屠殺時点で、脛骨骨端幅を、骨成長の測定値として決定し得る。これらの研究を行うための実験方法は、Ｃｏｘら（１９９４）に記載される。
【００７９】
げっ歯類悪液質モデルにおけるＰＥＧ−ＧＨの効力は、類似の様式で試験され得る。浸透圧ポンプまたは皮下注射によるデキサメタゾンの毎日投与は、体重減少を誘導するために使用され得る（Ｔｏｍａｓら、１９９２；Ｒｅａｄら、１９９２；ＰＣＴ特許出願ＵＳ９５／０６５４０）。
【００８０】
（実施例２）
（エリスロポエチンのシステイン付加改変体）
本実施例は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のシステイン付加改変体に関する。ＥＰＯは、赤血球生成または赤血球形成の刺激の主に原因となるホルモンである。ＥＰＯは、未熟赤血球前駆体上で作用し、それらのさらなる増殖および成熟赤血球への分化を刺激する。市販の薬学的等級物は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．から入手可能である。ヒトＥＰＯは、成人腎臓によって分泌される３５〜３９ｋＤａ糖タンパク質である。成熟ヒトタンパク質は、１６６アミノ酸を含み、そして高度にグリコシル化されている。ヒトＥＰＯの配列（配列番号２）は、Ｌｉｎら、１９８５およびＪａｃｏｂｓら１９８５に示されている（これらは共に、本明細書中に参考として援用される）。ＥＰＯの一次配列は、種間で高度に保存されている（８０％同一性より高い；Ｗｅｎら、１９９４）。糖基は、タンパク質の質量の４０％を超えて占める。ヒトＥＰＯは、３つのＮ結合型グリコシル化部位および１つのＯ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、異なる種において保存されているが、Ｏ結合型グリコシル化部位は保存されていない。ＥＰＯの多数のグリコシル化がタンパク質の結晶化を妨害し、従って、このタンパク質のＸ線構造は知られていない。ヒトＥＰＯは、４つのシステイン残基を含む。ジスルフィドの配置は、Ｃｙｓ７−Ｃｙｓ１６１およびＣｙｓ２９−Ｃｙｓ３３である。Ｃｙｓ３３は、マウスＥＰＯにおいて保存されておらず、このことは、Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ３３ジスルフィド結合がマウスＥＰＯの構造または機能に必須ではないことを示唆する。この結論はまた、ヒトＥＰＯについても支持されているようである（Ｂｏｉｓｓｅｌら、１９９３）。
【００８１】
ＥＰＯのアミノ酸配列は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであるタンパク質と一致し、そして変異研究は、ＥＰＯ構造についてのこの見解を支持する（Ｂｏｉｓｓｅｌら、１９９３；Ｗｅｎら、１９９４）。ＥＰＯの三次元構造のモデルは、ＧＨ構造が提唱された（Ｂｏｉｓｓｅｌら、１９９３；Ｗｅｎら、１９９４）後に、モデリングされた。レセプター結合について重要なＥＰＯ中のアミノ酸は、変異誘発実験によって同定され、そして主に推定へリックスＡのＮ末端側半分および推定へリックスＤのＣ末端側半分に存在する（Ｂｏｉｓｓｅｌら、１９９３；Ｗｅｎら、１９９４；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９９６）。ＥＰＯについて単一の細胞表面レセプターのみが同定されている（Ｄ’Ａｎｄｒｃａら、１９８９）。ＥＰＯは、ＧＨがそのレセプターを二量体化するのとほぼ同様に、そのレセプターを二量体化すると考えられる（Ｍａｔｔｈｅｗ’ｓら、１９９６）。
【００８２】
ヒトＥＰＯは、Ｎ結合型グリコシル化の３つの部位（アスパラギン−２４、−３８、および−８３）およびＯ結合型グリコシル化の１つの部位（セリン−１２６）を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、Ａ−ＢループおよびＢ−Ｃループに位置し、そしてＯグリコシル化部位は、Ｃ−Ｄループに位置する。Ｎ結合型グリコシル化部位は種間で保存されるが、Ｏ結合型グリコシル化部位はげっ歯類ＥＰＯには存在しない（Ｗｅｎら、１９９３）。１２６位にメチオニンを含有する非Ｏ結合型グリコシル化ヒト改変体が、記載されている（米国特許第４，７０３，００８号）。Ｎ結合型糖基は、密に分枝化されており、そして末端シアル酸残基を含む（Ｓａｓａｋｉら、１９８７；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、１９８８）。Ｎ−３８およびＮ−８３は、最も高度に分枝化されたオリゴ糖を含む（Ｓａｓａｋｉら、１９８８）。
【００８３】
ＥＰＯにおける末端シアル酸残基は、タンパク質のインビボでの機能に重要である。なぜなら、消化によるこれらの残基の除去が、インビボでの活性を除去するからである（Ｆｕｋａｄａら、１９８９；ＳｐｉｖａｋおよびＨｏｇａｎｓ、１９８９）。活性の損失は、身体からのシアル酸除去（ａｓｉａｌａｔｅｄ）タンパク質のより早いクリアランスと相関する。ラットにおけるシアル酸除去タンパク質の循環半減期は、１０分未満である。これに対して、シアル化（ｓｉａｌａｔｅｄ）タンパク質の循環半減期は、約２時間である（Ｆｕｋａｄａら、１９８９；ＳｐｉｖａｋおよびＨｏｇａｎｓ、１９８９）。従って、ＥＰＯのインビボ活性は、直接的にその循環半減期と相関する。
【００８４】
ＥＰＯ生物学的活性におけるＮ結合型糖の役割は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含む３つのアスパラギン残基を個々におよび組み合わせて変異させることにより、より良好に定義されている。たった１つのＮ結合型グリコシル化部位が変異されているＥＰＯムテイン（すなわち、Ｎ２４Ｑ、Ｎ３８Ｑ、およびＮ８３Ｑ）は、野生型ＥＰＯと同じぐらい効率的に、哺乳動物から分泌された。このことは、３つの部位全てにおけるＮ結合型グリコシル化が、タンパク質分泌に必要とされるわけではないことを示している（Ｎ２４Ｑは、２４位のアスパラギンがグルタミンに変異されることを示している）。逆に、２つ以上のＮ結合型グリコシル化部位が変異されているＥＰＯムテインは、哺乳動物細胞から、野生型ＥＰＯほど効率的には分泌されなかった（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、１９９１；Ｄｅｌｏｒｍｅら、１９９２）。変異誘発研究は、単一のＮ結合型グリコシル化部位ムテインのそれぞれが、野生型ＥＰＯと等しいまたはそれより大きいインビトロでの生物学的活性を有したことを見出した。従って、Ｎ結合型グリコシル化部位のいずれもが、ＥＰＯの分泌またはインビトロでの生物学的活性に必須でないと結論された。実際、グリコシル化部位の１つの除去は、生物学的活性を改善するようであった（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、１９９１）。
【００８５】
Ｎ結合型グリコシル化ムテインのインビボでの生物学的活性は、２つのグループによって研究された。Ｙａｍａｇｕｃｈｉら（１９９１）は、Ｎ２４ＱおよびＮ８３Ｑムテインが、野生型ＥＰＯよりも大きなインビボ活性を有したと結論した。インビボ活性は、それらの増大されたインビトロでの活性と相関した。これらの著者らは、Ｎ３８Ｑムテインが、インビボでの活性を、野生型ＥＰＯの約６０％に減少させたことを見出した。Ｎ３８は、３つのＮ結合型グリコシル化部位のうち最も密に分枝化されている（Ｓａｓａｋｉら、１９８８）。Ｄｅｌｏｒｍｅら（１９９２）は、Ｎ結合型グリコシル化部位のいずれかを変異させることが、インビボでの生物学的活性を約５０％減少させたことを報告した。両研究において、２つ以上のグリコシル化部位を変異させたムテインは、減少したインビボでの活性を有した。
【００８６】
上記研究は、いくつかのＮ結合型グリコシル化が、ＥＰＯのインビトロおよびインビボでの活性に必要であることを示している。しかし、個々に、３つのグリコシル化部位のい
ずれもが、活性について絶対的に必須ではない。Ｎ結合型糖は、ＥＰＯの見かけの分子量を増大させ、そして循環半減期を延長する。循環半減期は生物活性と相関する。天然ＥＰＯおよび哺乳動物細胞で製造されたＥＰＯは、ガラクトースおよび末端シアル酸残基を含む複合型Ｎ結合型糖を有する。ガラクトース残基は、肝細胞上の特異的レセプターによって認識され、そしてガラクトース残基が末端シアル酸残基によってマスキングされなければ、身体からのＥＰＯの迅速なクリアランスを促進する。
【００８７】
変異誘発研究は、Ｏ結合型グリコシル化は、ＥＰＯのインビトロまたはインビボでの機能に必要とはされないと結論した（Ｄｅｌｏｒｍｅら、１９９２）。これは、げっ歯類ＥＰＯがＯグリコシル化されていないという所見、およびセリン−１２６がメチオニンによって置換されている、天然に存在しているヒトＥＰＯ改変体（これは、対応するＯ結合型グリコシル化を有さない）の存在と一致する。セリン−１２６の変異誘発は、この部位での特定のアミノ酸変化（バリン、ヒスチジン、またはグルタミン酸への）が、野生型ＥＰＯと類似の生物学的活性を有するＥＰＯムテインを生じ、一方、他のアミノ酸変化（アラニンまたはグリシンへの）は、重度に減少した活性を有するＥＰＯ分子を生じた（Ｄｅｌｏｒｍｅら、１９９２）ことを明らかにした。セリン−１２６をシステインに変更する影響は研究されていなかった。Ｓ１２６Ｖ  ＥＰＯのインビボでの生物活性は、野生型ＥＰＯに対して類似であることが見出された（Ｄｅｌｏｒｍｅら、１９９２）。
【００８８】
ＥＰＯがインビボで活性であるために、末端シアル酸残基を含む複合型Ｎ結合型炭水化物を必要とすることは、哺乳動物細胞に対するこのタンパク質の商業的製造を制限してきた。シアル化Ｎ結合型糖の重要な機能は、タンパク質の凝集を防止し、タンパク質安定性を増大し、そしてタンパク質の循環半減期を延長することである。末端シアル酸残基は、基本的なガラクトース残基をマスキングすることによって、ＥＰＯの循環半減期を延長する。ガラクトース残基は、肝細胞上の特異的レセプターによって認識され、そしてシアル酸除去タンパク質のクリアランスを促進する。ＥＰＯは、昆虫細胞で産生され得、そしてＮ−グリコシル化され、インビトロで十分に活性である；そのインビボでの活性は、報告されていない（Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉら、１９８７）。
【００８９】
本実施例は、システイン付加ＥＰＯ改変体の設計、ならびにシステイン反応性ＰＥＧおよび他のシステイン反応性部分を使用する結合体の調製におけるそれらの使用を提供する。ＥＰＯにおける特定のアミノ酸が生物学的活性に必須であるわけではなく、これは、分子の通常のジスルフィド結合パターンおよび全体的なコンフォメーションを変化させることなく、システイン残基に変異され得る。これらのアミノ酸はＡ−Ｂループ（成熟タンパク質配列のアミノ酸２３−５８）、Ｂ−Ｃループ（成熟タンパク質配列のアミノ酸７７−８９）、Ｃ−Ｄループ（成熟タンパク質配列のアミノ酸１０８−１３１）に、ヘリックスＡ（アミノ酸１−８）の近位、およびヘリックスＤ（成熟タンパク質配列のアミノ酸１５３−１６６）の遠位に位置する。タンパク質配列のＮ末端またはＣ末端もまた、システイン残基を付加するための好ましい部位として意図される。システイン置換のための好ましい部位は、Ｏ結合型グリコシル化部位（セリン−１２６）、および３つのＮ結合型グリコシル化部位を含むアミノ酸（Ｎ２４、Ｉ２５、Ｔ２６、Ｎ３８、Ｉ３９、Ｔ４０、Ｎ８３、Ｓ８４、Ｓ８５）である。グリコシル化部位は、システイン置換を導入し、そしてＰＥＧ分子をＥＰＯに付着させるのに魅力的な部位である。なぜなら、（１）これらの部位は、表面曝露されている；（２）天然タンパク質は、これらの位置で嵩高い糖基に寛容であり得る；（３）グリコシル化部位は推定ループ領域に位置し、レセプター結合部位から離れている（Ｗｅｎら、１９９４）；および（４）変異誘発研究は、これらの部位が、（少なくとも個々に）インビトロまたはインビボでの活性に必須ではないことを示している（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、１９９１；Ｄｅｌｏｒｍｅら、１９９２）。上記で議論したように、Ｏグリコシル化部位領域を包含する領域の局所的なコンフォメーションが生物学的活性に重要であるようである。１２６位でのシステイン置換が生物学的活性に影響するか否
かは、研究されていない。システイン−２９からシステイン−３３へのジスルフィド結合は、ＥＰＯの生物学的活性に必要ではない。なぜなら、両残基のチロシンへの変更が、同時に、生物学的に活性なＥＰＯタンパク質を生じたからである（Ｂｏｉｓｓｅｌら、１９９３；Ｗｅｎら、１９９４）。「遊離」システインは、システイン−２９またはシステイン−３３のいずれかを別のアミノ酸へ変更することによって作製され得る。好ましいアミノ酸変更は、セリンまたはアラニンへのものである。残存する「遊離」システイン（システイン−２９またはシステイン−３３）は、システイン反応性部分でタンパク質を共有結合修飾することについて、好ましい部位である。
【００９０】
Ｂｉｌｌら（１９９５）は、Ｎ２４、Ｎ３８、およびＮ８３をシステインに個々に置換し、そしてこのムテインがインビトロでの生物学的活性を大きく減少させたことを報告した（野生型活性の２０％未満）。Ｂｉｌｌら（１９９５）は、細菌において（グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ）−Ｓ−トランスフェラーゼに融合された）融合タンパク質として、ＥＰＯ改変体を発現させた。本発明の１つの局面は、Ｎ２４Ｃ、Ｎ３８Ｃ、およびＮ８３Ｃ  ＥＰＯ改変体が、野生型ＥＰＯにより類似した、インビトロでの生物学的活性を有する発現系を提供することである。
【００９１】
米国特許第４，７０３，００８号は、ＥＰＯの天然に存在する改変体、ならびに哺乳動物のＥＰＯタンパク質に存在するアミノ酸置換を意図する。ヒツジＥＰＯは、ポリペプチド鎖の８８位にシステイン残基を含む。その発明者らは、システイン残基が、システイン付加ＥＰＯ改変体の生成のために有用であるとして本明細書中に開示されたポリペプチド領域に存在する、ＥＰＯのいかなる他の天然に存在するヒトまたは動物システイン改変体にも気づいていない。特許第４，７０３，００８号は特に、ＥＰＯの発現が、システイン残基を欠失させることによるか、または天然に存在するシステイン残基をセリンまたはヒスチジン残基と置換することによって改善され得ることを示唆することにより、システイン付加ＥＰＯ改変体を教示していない。
【００９２】
ＥＰＯの成熟タンパク質形態は、Ｃ末端アルギニンの翻訳後除去のために、１６５または１６６アミノ酸を含み得る。Ａｓｐ−１６５は、１６５アミノ酸形態のＣ末端であり、Ａｇｒ−１６６は、１６６アミノ酸形態のＣ末端アミノ酸である。本明細書中に記載のシステイン置換および挿入変異は、成熟ＥＰＯの１６５アミノ酸形態または１６６アミノ酸形態のいずれかを含み得る。
【００９３】
ＥＰＯをコードするｃＤＮＡは、ヒトＨｅｐＧ２またはＨｅｐ３Ｂ細胞株から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用してクローン化され得る。これら細胞株はともに、低酸素または塩化コバルトで処理したとき、ＥＰＯを発現するとして知られ（Ｗｅｎら、１９９３）、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能である。システイン変異は、ＧＨについて記載されたような、標準的なファージ、プラスミド、またはＰＣＲ変異誘発手順によって、ｃＤＮＡに導入され得る。上記のように、システイン置換変異の導入のための好ましい部位は、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループ、およびヘリックスＡの近位かつヘリックスＤの遠位の領域にある。これらの領域における最も好ましい部位は、ＮおよびＯ結合型グリコシル化部位である：Ｓ１２６Ｃ；Ｎ２４Ｃ；Ｉ２５Ｃ、Ｔ２６Ｃ；Ｎ３８Ｃ；Ｉ３９Ｃ、Ｔ４０Ｃ；Ｎ８３Ｃ；Ｓ８４ＣおよびＮ８５Ｃ。システイン置換変異誘発のための他の好ましい部位は、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、およびＣ−Ｄループ、グリコシル化部位周囲のアミノ酸、およびヘリックスＡの近位かつヘリックスＤの遠位のタンパク質の領域にある（Ｂｏｉｓｓｅｌら、１９９３；Ｗｅｎら、１９９４）。これらの領域におけるシステイン置換のための他の好ましい部位は、以下のとおりである：Ａ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｒ４、Ｄ８、Ｓ９、Ｔ２７、Ｇ２８、Ａ３０、Ｅ３１、Ｈ３２、Ｓ３４、Ｎ３６、Ｄ４３、Ｔ４４、Ｋ４５、Ｎ４７、Ａ５０、Ｋ５２、Ｅ５５、Ｇ５７、Ｑ５８、Ｇ７７、Ｑ７８、Ａ７９、Ｑ８６、Ｗ８８、Ｅ８９、
Ｔ１０７、Ｒ１１０、Ａ１１１、Ｇ１１３、Ａ１１４、Ｑ１１５、Ｋ１１６、Ｅ１１７、Ａ１１８、Ｓ１２０、Ｐ１２１、Ｐ１２２、Ｄ１２３、Ａ１２４、Ａ１２５、Ａ１２７、Ａ１２８、Ｔ１３２、Ｋ１５４、Ｔ１５７、Ｇ１５８、Ｅ１５９、Ａ１６０、Ｔ１６３、Ｇ１６４、Ｄ１６５、およびＲ１６６。システイン残基はまた、成熟タンパク質の最初のアミノ酸に近位（すなわち、Ａ１の近位）または成熟タンパク質の最後のアミノ酸の遠位（すなわち、Ｄ１６５またはＲ１６６の遠位）に導入され得る。ｃｙｓ−２９またはｃｙｓ−３３が他のアミノ酸（好ましくは、セリンまたはアラニン）に置換されている他の改変体もまた、提供される。
【００９４】
野生型ＥＰＯおよびＥＰＯムテインは、システイン付加ムテインが生物学的に活性か否かを決定するために、昆虫細胞を使用して発現され得る。ＥＰＯ／ＥＰＯムテインをコードするＤＮＡは、バキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．およびＳｉｇｍａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である）にクローン化され得、そして昆虫細胞を感染させるために使用され得る。組換えバキュロウイルス産生ＥＰＯは、ポリクローナル抗ヒトＥＰＯ抗血清（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である）を使用して、感染昆虫細胞馴化培地のウェスタンブロットによって同定され得る。分泌ＥＰＯムテインタンパク質は、当業者に周知の従来のクロマトグラフィー手順によって精製され得る。タンパク質濃度は、市販のタンパク質アッセイキットまたはＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓおよびＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能である）を使用して決定され得る。
【００９５】
精製ＥＰＯおよびＥＰＯムテインは、ＥＰＯ応答性細胞株（例えば、ＵＴ７−ｅｐｏ（Ｗｅｎら、１９９４）またはＴＦ１（ＡＴＣＣから入手可能である））を使用する細胞増殖アッセイにおいて、このタンパク質の比活性を測定するために試験され得る。細胞は、種々の濃度のＥＰＯを有する９６ウェルマイクロタイタープレートにおいてプレートされ得る。アッセイは３連で実施すべきである。培養１〜３日後、細胞増殖を、ＧＨについて上述されるように、3Ｈチミジン取り込みによって測定し得る。最大刺激の半値（ＥＣ50
）を生じるタンパク質の濃度を、各ムテインについて決定し得る。アッセイは、各データ点について３つ組のウェルを用いて各ムテインについて少なくとも３回実施すべきである。ＥＣ50値は、ムテインの相対的な効力を比較するために使用され得る。あるいは、添加されたＥＰＯムテインに応答した細胞増殖を、ＭＴＴ色素排除アッセイ（Ｋｏｍａｔｓｕら、１９９１）を使用して分析し得る。類似の至適刺激レベルおよび野生型ＥＰＯに匹敵するまたはこれより大きいＥＣ50値を示すタンパク質は、好ましい。
【００９６】
上記の研究は、システイン残基に変更され、そして生物学的活性を保持し得る、ＥＰＯにおけるアミノ酸残基の同定を確認する。活性を保持するムテインは、ＧＨムテインについて上述したように、システイン反応性の８ｋＤａ  ＰＥＧ−マレイミドを用いてＰＥＧ化され得る。野生型ＥＰＯは、コントロールとして供されるべきである。なぜなら、これは、同一の部分的還元条件下でシステイン反応性ＰＥＧと反応しないはずであるからである。二ＰＥＧ化産物を生じることなく有意な量の単ＰＥＧ化産物を生じる最も低い量のＰＥＧが、至適であるとみなされるべきである。単ＰＥＧ化タンパク質は、非ＰＥＧ化タンパク質および未反応ＰＥＧから、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって精製され得る。精製されたＰＥＧ化タンパク質は、上記の細胞増殖アッセイにおいて、その生物活性を決定するために試験されるべきである。
【００９７】
インビトロ生物活性を保持するＰＥＧ化ＥＰＯムテインの１つ以上が、動物疾患モデルにおいて試験するための候補である。適切なアミノ酸でのタンパク質のＰＥＧ化は、ＧＨについて記載のように決定され得る。
【００９８】
昆虫細胞を使用して発現されたＰＥＧ化ＥＰＯムテインのインビボ試験は、それらが、
適切なグリコシル化を確実にするために、哺乳動物細胞における発現のために再操作されることを必要とし得る。昆虫細胞を用いて産生されたＰＥＧＥＰＯ候補は、以下に記載の動物モデルにおいて、それらがインビボで活性であるかどうか、およびそれらが哺乳動物細胞発現系を使用して産生されたＰＥＧＥＰＯと同程度に活性であるか否かを決定するために試験され得る。哺乳動物細胞における発現のために、ＥＰＯムテインは、市販の真核生物発現ベクターにサブクローン化され得、そしてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣから入手可能である）を安定に形質転換するために使用され得る。亜株は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＥＰＯ発現についてスクリーニングされ得る。充分量の昆虫細胞産生ＥＰＯムテインおよび哺乳動物細胞産生ＥＰＯムテインが、動物貧血モデルにおいて生物学的活性を比較するために調製され得る。
【００９９】
ＥＰＯムテインのインビボ生物活性は、人工赤血球増加モデルまたは飢餓げっ歯類モデルを使用して試験され得る（ＣｏｔｅｓおよびＢａｎｇｈａｍ、１９６１；ＧｏｌｄｗａｓｓｅｒおよびＧｒｏｓｓ、１９７５）。飢餓げっ歯類モデルでは、１日目に、ラットに食餌を与えず、２日目および３日目に、ラットを試験サンプルで処置する。４日目に、ラットは、放射性鉄−５９の注射を受容する。約１８時間後、ラットを麻酔し、血液サンプルを採取する。次いで、標識化鉄の赤血球への変換パーセントを決定する。人工赤血球増加モデルでは、マウスを密閉タンク中に維持し、数日間、低圧空気に曝す。次いで、動物を通常気圧に戻す。赤血球形成は、数日間抑制される。通常気圧に戻した後４または６日目に、マウスに、エリスロポエチンまたは生理食塩水を注射する。マウスは、１〜２日間、１日あたり１回の注射を受容する。１日後、動物は、標識化鉄−５９の静脈内注射を受容する。２０時間後にマウスを麻酔し（ｃｕｔｈａｎｉｚｅｄ）、そして赤血球に取り込まれた標識化鉄の量を決定する。ＥＰＯは、赤血球に取り込まれた標識化鉄における用量依存性増加によって測定されるように、両モデルにおいて、赤血球形成を刺激する。両モデルにおいて、異なる投与レジメおよび異なる注射時間は、ＰＥＧ−ＥＰＯが生物学的に活性であるか、かつ／または天然ＥＰＯよりも強力であるか、そして天然ＥＰＯよりも長い作用効果を生じるかを決定するために研究され得る。
【０１００】
（実施例３）
（αインターフェロン）
αインターフェロンは、白血球で産生され、そして、抗ウイルス、抗腫瘍および免疫調節効果を有する。７０％以上のアミノ酸同一性を共有するタンパク質をコードする、少なくとも２０の異なるαインターフェロン遺伝子が存在する。公知のαインターフェロン種のアミノ酸配列は、Ｂｌａｔｔら（１９９６）において提供される。最も共通のアミノ酸を単一のポリペプチド鎖に取り込む「コンセンサス」インターフェロンが、記載されている（Ｂｌａｔｔら、１９９６）。ハイブリッドαインターフェロンタンパク質は、αインターフェロンタンパク質の種々の部分を単一のタンパク質にスプライシングすることにより、産生され得る（ＨｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒおよびＤｉ  Ｍａｒｃｏ、１９９５）。いくつかのαインターフェロンは、Ｎ結合型グリコシル化部位をＡへリックスの近位であり、そしてＢ−Ｃループに近い領域において含む（Ｂｌａｔｔら、１９９６）。α２インターフェロンタンパク質（配列番号３）は、２つのジスルフィド結合を形成する４つのシステイン残基を含有する。ｃｙｓ１−ｃｙｓ９８ジスルフィド結合（α１（配列番号４）のようないくつかのαインターフェロン種においてはｃｙｓ１−ｃｙｓ９９）は、活性に必須ではない。α２インターフェロンタンパク質は、Ｎ結合型グリコシル化部位を、全く含有しない。αインターフェロンの結晶構造は、決定されている（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら、１９９６）。
【０１０１】
この実施例は、Ａへリックスの近位、Ｅへリックスの遠位、Ａ−Ｂループ内、Ｂ−Ｃループ内、Ｃ−Ｄループ内およびＤ−Ｅループ内の領域におけるシステイン付加改変体を提供する。αインターフェロン−２種のこれらの領域においてシステイン残基の導入に好ま
しい部位は：Ｄ２、Ｌ３、Ｐ４、Ｑ５、Ｔ６、Ｓ８、Ｑ２０、Ｒ２２、Ｋ２３、Ｓ２５、Ｆ２７、Ｓ２８、Ｋ３１、Ｄ３２、Ｒ３３、Ｄ３５、Ｇ３７、Ｆ３８、Ｑ４０、Ｅ４１、Ｅ４２、Ｆ４３、Ｇ４４、Ｎ４５、Ｑ４６、Ｆ４７、Ｑ４８、Ｋ４９、Ａ５０、Ｎ６５、Ｓ６８、Ｔ６９、Ｋ７０、Ｄ７１、Ｓ７２、Ｓ７３、Ａ７４、Ａ７５、Ｄ７７、Ｅ７８、Ｔ７９、Ｙ８９、Ｑ９０、Ｑ９１、Ｎ９３、Ｄ９４、Ｅ９６、Ａ９７、Ｑ１０１、Ｇ１０２、Ｇ１０４、Ｔ１０６、Ｅ１０７、Ｔ１０８、Ｐ１０９、Ｋ１１２、Ｅ１１３、Ｄ１１４、Ｓ１１５、Ｋ１３１、Ｅ１３２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｙ１３５、Ｓ１３６、Ａ１３９、Ｓ１５２、Ｓ１５４、Ｔ１５５、Ｎ１５６、Ｌ１５７、Ｑ１５８、Ｅ１５９、Ｓ１６０、Ｌ１６１、Ｒ１６２、Ｓ１６３、Ｋ１６４、Ｅ１６５である。システイン残基が成熟タンパク質の最初のアミノ酸の近位（すなわち、Ｃ１の近位）、または、成熟タンパク質中の最後のアミノ酸の遠位（すなわち、Ｅ１６５の遠位）に導入された改変体が、提供される。ｃｙｓ−１またはｃｙｓ−９８（いくつかのαインターフェロン種においてはｃｙｓ−９９）が他のアミノ酸（好ましくは、セリンまたはアラニン）に置換された他の改変体もまた、提供される。Ｃｙｓ−１が欠失した他の改変体（ｄｅｓ  Ｃｙｓ−１）もまた、提供される。システイン改変体は、任意の天然に存在するか、または非天然のαインターフェロン配列（例えば、コンセンサスインターフェロンまたはインターフェロンタンパク質ハイブリッド）の状況において存在し得る。いくつかの天然に存在するαインターフェロン種（例えば、αインターフェロン−１）は、天然に生じる「遊離」のシステインを含有する。そのようなインターフェロン種において、天然に生じる遊離のシステインは、別のアミノ酸（好ましくは、セリンまたはアラニン）に、変更され得る。
【０１０２】
この実施例はまた、他のαインターフェロン種（コンセンサスインターフェロンを含む）のこれらのタンパク質の等価な部位におけるシステイン改変体を提供する。αインターフェロン−２種と、他の公知のαインターフェロン種およびコンセンサスインターフェロンとのアラインメントは、Ｂｌａｔｔら（１９９６）において提供される。αインターフェロン−２の結晶構造は、Ｒｈａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら（１９９６）によって決定されている。Ｌｙｄｏｎら（１９８５）は、αインターフェロンのＮ末端からの最初の４アミノ酸の欠失が生物学的活性に影響を与えなかったことを見出した。Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９８５）は、αインターフェロン−２におけるＰｈｅ−４７の、Ｃｙｓ、ＴｙｒまたはＳｅｒへの置換がタンパク質の生物学的活性を変化させないことを、見出した。Ｃｙｓ−１およびＣｙｓ−９８は、タンパク質の生物学的活性を変化させることなく、それぞれ、グリシンおよびセリンに、個別に変更されている（ＤｅＣｈｉａｒａら、１９８６）。
【０１０３】
αインターフェロン−２をコードするＤＮＡ配列は、ヒトゲノムＤＮＡから増幅され得る。なぜなら、αインターフェロン遺伝子は、イントロンを含まないからである（Ｐｅｓｔｋａら、１９８７）。αインターフェロン−２のＤＮＡ配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）において提供される。あるいは、αインターフェロン−２のｃＤＮＡは、自発的にまたはウイルスへの暴露後にαインターフェロンを発現することが知られているヒトリンパ芽球腫細胞株から単離され得る（Ｇｏｅｄｄｅｌｌら、１９８０；Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇら、１９８０）。これらの細胞株の多くは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手可能である。特定の変異は、プラスミドに基づく部位特異的変異誘発キット（例えば、Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）を使用してか、ファージ変異誘発ストラテジーによってか、またはＧＨについて記載されるようにＰＣＲ変異誘発を使用してαインターフェロン配列に、導入され得る。
【０１０４】
αインターフェロンは、細胞内タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉにおいて首尾よく産生されている（Ｔａｒｎｏｗｓｋｉら、１９８６；ＴｈａｔｃｈｅｒおよびＰａｎａｙｏｔａｔｏｓ、１９８６）。同様の手順は、αインターフェロンムテインを発現するために使用
され得る。αインターフェロンまたはαインターフェロンムテインをコードするプラスミドは、強力なＴ７プロモーターを使用するｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）、またはＴＡＣプロモーターを使用するｐＣＹＢ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、(ＭＡ）のようなＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター中にクローン化さ
れ得る。そのタンパク質の発現は、培養培地にＩＰＴＧを添加することにより、誘導され得る。
【０１０５】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される組換えαインターフェロンは、時として可溶性であり、そして時として不溶性である（Ｔａｒｎｏｗｓｋｉら、１９８６；ＴｈａｔｃｈｅｒおよびＰａｎａｙｏｔａｔｏｓ、１９８６）。不溶性は、タンパク質の過剰発現の程度に関連するようである。不溶性αインターフェロンタンパク質は、封入体として回収され得、そして標準的な酸化的再折り畳みプロトコールに従い十分に活性なコンフォメーションに再生され得る（ＴｈａｔｃｈｅｒおよびＰａｎａｙｏｔａｔｏｓ、１９８６；Ｃｏｘら、１９９４）。αインターフェロンタンパク質は、イオン交換、疎水的相互作用、サイズ排除および逆相樹脂のような他のクロマトグラフィー方法を使用してさらに精製され得る（ＴｈａｔｃｈｅｒおよびＰａｎａｙｏｔａｔｏｓ、１９８６）。タンパク質濃度は、市販のタンパク質アッセイキットを使用して測定され得る（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【０１０６】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される組換えαインターフェロンは、時として可溶性であり、そして時として不溶性である（Ｔａｒｎｏｗｓｋｉら、１９８６；ＴｈａｔｃｈｅｒおよびＰａｎａｙｏｔａｔｏｓ、１９８６）。不溶性は、タンパク質の過剰発現の程度に関連するようである。不溶性αインターフェロンタンパク質は、封入体として回収され得、そして標準的な酸化的再折り畳みプロトコールに従い十分に活性なコンフォメーションに再生され得る（ＴｈａｔｃｈｅｒおよびＰａｎａｙｏｔａｔｏｓ、１９８６；Ｃｏｘら、１９９４）。αインターフェロンタンパク質は、イオン交換、疎水的相互作用、サイズ排除および逆相樹脂のような他のクロマトグラフィー方法を使用してさらに精製され得る（ＴｈａｔｃｈｅｒおよびＰａｎａｙｏｔａｔｏｓ、１９８６）。タンパク質濃度は、市販のタンパク質アッセイキットを使用して測定され得る（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【０１０７】
αインターフェロンムテインのＥ．ｃｏｌｉ発現が、成功しない場合、ＧＨについて記載されるように分泌タンパク質として昆虫細胞においてタンパク質を発現し得る。そのタンパク質は、天然のαインターフェロンシグナル配列（Ｇｏｅｄｄｅｌｌら、１９８０）またはミツバチメリチンシグナル配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．）を含むように改変され得、そのタンパク質の分泌を促進し得る。αインターフェロンおよびαインターフェロンムテインは、従来のクロマトグラフィー手順を使用して馴化培地から精製され得る。αインターフェロンに対する抗体は、ウエスタンブロットと共に使用され得、クロマトグラフィーの間にαインターフェロンタンパク質を含む画分を位置付けし得る。あるいは、αインターフェロンタンパク質を含む画分は、ＥＬＩＳＡを使用して同定され得る。
【０１０８】
αインターフェロンおよびαインターフェロンムテインの生物学的活性は、インビトロウイルスプラーク減少アッセイを使用して測定され得る（Ｏｚｅｓら、１９９２；Ｌｅｗｉｓ，１９９５）。ヒトＨｅＬａ細胞は、９６ウェルプレートにプレートされ得、そして３７℃で、ほとんどコンフルエントまで増殖され得る。次に細胞は、洗浄され、そして種々の濃度の各αインターフェロン調製物を用いて２４時間処理される。コントロールは、αインターフェロンを全く含まないべきであり、そしてコントロールは、野生型αインターフェロン（Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡより市販される）を含むべきである。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のまたは脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のようなウイルスは、プレートに添加され、そしてプレートを３７℃で、さらに２４〜４８時間
、インキュベートする。さらなるコントロールは、ウイルスを含まないサンプルを含むべきである。ウイルス処理された、αインターフェロンを含まないコントロールウェルにおいて９０％以上の細胞が死滅している場合（ウェルの視覚的な検査により決定される）、細胞の単層をクリスタルバイオレットを用いて染色し、そしてウェルの吸光度をマイクロプレートリーダーを使用して読み取る。あるいは、細胞単層は、ＭＴＴ染料を用いて染色され得る（Ｌｅｗｉｓ、１９９５）。サンプルは、２連または３連で、分析されるべきである。ＥＣ50の値（ウイルスの細胞障害性効果を５０％まで阻害するために必要なタンパク質の量）は、そのタンパク質の相対的な効力を比較するために、使用され得る。野生型αインターフェロン−２は、細胞をＶＳＶおよびＥＭＣＶの細胞障害性効果から保護し、8そしてこのアッセイにおいて約２×１０8単位／ｍｇの比活性を有する（Ｏｚｅｓら、１９９２）。野生型αインターフェロンに匹敵するＥＣ50値を示すαインターフェロンムテインが、好ましい。  
【０１０９】
活性を保持するαインターフェロンムテインは、ＧＨについて記載された手順と同様の手順を使用して、ＰＥＧ化され得る。野生型αインターフェロン−２は、同様の条件下でＰＥＧ化されないはずであるから、コントロールとして使用され得る。ジ−ＰＥＧ化産物を生じることなく、モノ−ＰＥＧ化産物の顕著な量を生じるＰＥＧの最低量が、最適であると考慮されるはずである。モノ−ＰＥＧ化タンパク質は、非ＰＥＧ化タンパク質および未反応のＰＥＧから、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって、精製され得る。精製されたＰＥＧ化タンパク質は、それらの生物学的活性を測定するために、上記のウイルスプラーク減少バイオアッセイにおいて、試験され得る。野生型αインターフェロンに匹敵する生物学的活性を有するＰＥＧ化αインターフェロンタンパク質が、好ましい。ＰＥＧ化タンパク質についてのＰＥＧ結合部位のマッピング、および薬物動態学的データの測定は、ＧＨについて記載されるように行われ得る。
【０１１０】
ＰＥＧ−αインターフェロンムテインのインビボ生物学的活性は、ヌードマウスにおける腫瘍異種移植モデル、およびウイルス感染モデルを用いて、試験され得る（Ｂａｌｋｗｉｌｌ、１９８６；Ｆｉｓｈら、１９８６）。ＰＥＧ−αインターフェロンの生物学的活性は、種特異的であり得るので、上記のアッセイと同様の、インビトロウイルスプラーク減少アッセイにおいて適切な動物細胞株を使用してＰＥＧ化タンパク質の活性を確認すべきである。次に、種々の用量レジメおよび種々の注射時間の効果を調べて、ＰＥＧ−αインターフェロンが、非ＰＥＧ化αインターフェロンに比べて、より強力か否か、およびより長時間持続する効果を生成するか否かを決定するであろう。
【０１１１】
本実施例のαインターフェロンから誘導された新規の分子は、本質的に実施例１および２において示されるように（しかし、この実施例の特定のタンパク質に関連する適切なアッセイ、および当該分野で公知の他の考察に代えて）処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１１２】
（実施例４）
（βインターフェロン）
βインターフェロンは、線維芽細胞によって産生され、そして抗ウイルス、抗腫瘍および免疫調節効果を示す。単一コピーのβインターフェロン遺伝子は、切断されて１６６アミノ酸の成熟タンパク質を生じるプレタンパク質をコードする（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、１９８０；配列番号５）。そのタンパク質は、３つのシステインを含み、これらの１つのシステイン−１７は、「遊離」のものであり、すなわちジスルフィド結合に関与しない。そのタンパク質は、１つのＮ結合型グリコシル化部位を、含有する。そのタンパク質の結晶構造は、決定されている（Ｋａｒｐｕｓａｓら、１９９７）。
【０１１３】
この実施例は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含む３つのアミノ酸のいずれかにおけるシ
ステイン付加改変体（すなわち、Ｎ８０Ｃ、Ｅ８１ＣまたはＴ８２Ｃ）を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスの近位、Ｅへリックスの遠位、Ａ−Ｂループ内、Ｂ−Ｃループ内、Ｃ−Ｄループ内およびＤ−Ｅループ内の領域におけるシステイン付加改変体を提供する。これらの領域においてシステイン残基の導入に好ましい部位は：Ｍ１、Ｓ２、Ｙ３、Ｎ４、Ｌ５、Ｑ２３、Ｎ２５、Ｇ２６、Ｒ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｋ３３、Ｄ３４、Ｒ３５、Ｎ３７、Ｄ３９、Ｅ４２、Ｅ４３、Ｋ４５、Ｑ４６、Ｌ４７、Ｑ４８、Ｑ４９、Ｑ５１、Ｋ５２、Ｅ５３、Ａ６８、Ｆ７０、Ｒ７１、Ｑ７２、Ｄ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｓ７６、Ｔ７７、Ｇ７８、Ｅ１０７、Ｋ１０８、Ｅ１０９、Ｄ１１０、Ｆ１１１、Ｔ１１２、Ｒ１１３、Ｇ１１４、Ｋ１１５、Ｌ１１６、Ａ１３５、Ｋ１３６、Ｅ１３７、Ｋ１３８、Ｓ１３９、Ｉ１５７、Ｎ１５８、Ｒ１５９、Ｌ１６０、Ｔ１６１、Ｇ１６２、Ｙ１６３、Ｌ１６４、Ｒ１６５およびＮ１６６である。システイン残基が成熟タンパク質の最初のアミノ酸の近位（すなわち、Ｍ１の近位）、または、成熟タンパク質中の最後のアミノ酸の遠位（すなわち、Ｎ１６６の遠位）に導入された改変体がまた、提供される。
【０１１４】
これらの改変体は、天然に生じる「遊離」のシステイン残基（システイン−１７）が別のアミノ酸（好ましくはセリンまたはアラニン）に変更されている、天然のタンパク質配列または改変体タンパク質の状況において、生成される。
【０１１５】
本実施例のβインターフェロンから誘導された新規の分子は、本質的に実施例１および２において示されるように（しかし、この実施例の特定のタンパク質に関連する適切なアッセイ、および当該分野で公知の他の考察に代えて）処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１１６】
（実施例５）
（顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ））
Ｇ−ＣＳＦは、顆粒球の増殖、分化および機能を刺激する多機能性サイトカインである。そのタンパク質は、活性化単球およびマクロファージによって産生される。Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列（配列番号６）は、Ｓｏｕｚａら（１９８６）、Ｎａｇａｔａら（１９８６ａ、ｂ）および米国特許４，８１０，６４３号において提供され、これら全ては、本明細書において参考として援用される。そのヒトタンパク質は、２０４または２０７アミノ酸のプレタンパク質として合成され、このプレタンパク質は、切断されて、１７４または１７７アミノ酸の成熟タンパク質を生じる。より大きな形態は、より小さな形態よりも、低い比活性を有する。そのタンパク質は、５つのシステインを含有し、その４つは、ジスルフィド結合に関与する。システイン−１７は、ジスルフィド結合に関与しない。システイン−１７のセリンへの置換は、十分に活性な変異型Ｇ−ＣＳＦタンパク質を生じる（米国特許第４，８１０，６４３号）。そのタンパク質は、その成熟タンパク質のスレオニン−１３３において、Ｏグリコシル化されている。
【０１１７】
この実施例は、スレオニン−１３３におけるシステイン付加改変体を提供する。この実施例は、Ａへリックスの近位、Ｄへリックスの遠位、Ａ−Ｂループ内、Ｂ−Ｃループ内およびＣ−Ｄループ内の領域における他のシステイン付加改変体を提供する。これらの領域においてシステイン置換の導入に好ましい部位は：Ｔ１、Ｐ２、Ｌ３、Ｇ４、Ｐ５、Ａ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｐ１０、Ｑ１１、Ｓ１２、Ｔ３８、Ｋ４０、Ｓ５３、Ｇ５５、Ｗ５８、Ａ５９、Ｐ６０、Ｓ６２、Ｓ６３、Ｐ６５、Ｓ６６、Ｑ６７、Ａ６８、Ｑ７０、Ａ７２、Ｑ９０、Ａ９１、Ｅ９３、Ｇ９４、Ｓ９６、Ｅ９８、Ｇ１００、Ｇ１２５、Ｍ１２６、Ａ１２７、Ａ１２９、Ｑ１３１、Ｔ１３３、Ｑ１３４、Ｇ１３５、Ａ１３６、Ａ１３９、Ａ１４１、Ｓ１４２、Ａ１４３、Ｑ１４５、Ｑ１７３およびＰ１７４である。システイン残基が成熟タンパク質の最初のアミノ酸の近位（すなわち、Ｔ１の近位）、または、成熟タンパク質中の最後のアミノ酸の遠位（すなわち、Ｐ１７４の遠位）に導入された改変体が、提供される。これらの改変体は、天然のタンパク質配列または、天然に生じる「遊
離」のシステイン残基（システイン−１７）が別のアミノ酸（好ましくはセリンまたはアラニン）に変更されている、改変体タンパク質の状況において、提供される。
【０１１８】
ヒトＧ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡは、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入され得るか、またはＧ−ＣＳＦを構成的に発現することが既知である５６３７およびＵ８７−ＭＧのようなヒトのガン細胞株から単離されたｍＲＮＡよりＰＣＲを使用して増幅され得る（Ｐａｒｋら、１９８９；Ｎａｇａｔａ、１９９４）。これらの細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手可能である。特定の変異は、プラスミドに基づく部位特異的変異誘発キット（例えば、Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｋｉｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）を使用してか、ファージ変異誘発方法によってか、またはＧＨについて記載されるようにＰＣＲ変異誘発を使用してＧ−ＣＳＦ配列に、導入され得る。
【０１１９】
Ｇ−ＣＳＦは、細胞内タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉにおいて首尾よく産生されている（Ｓｏｕｚａら、１９８６）。同様の手順は、Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦムテインを発現するために使用され得る。Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦムテインをコードするプラスミドは、強力なＴ７プロモーターを使用するｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）、または強力なＴＡＣプロモーターを使用するｐＣＹＢ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡから入手可能）のようなＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター中にクローン化され得る。そのタンパク質の発現は、培養培地にＩＰＴＧを添加することにより、誘導され得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される組換えＧ−ＣＳＦは、不溶性であり、そして封入体として回収され得る。そのタンパク質は、標準的な酸化的再折り畳みプロトコールに従い十分に活性なコンフォメーションに再生され得る（Ｓｏｕｚａら、１９８６；Ｌｕら、１９９２；Ｃｏｘら、１９９４）。同様の手順は、システインムテインを再折り畳みするために使用され得る。そのタンパク質は、イオン交換、疎水的相互作用、サイズ排除および逆相樹脂のような他のクロマトグラフィー方法をさらに使用して精製され得る（Ｓｏｕｚａら、１９８６；Ｋｕｇａら、１９８９；Ｌｕら、１９９２）。タンパク質濃度は、市販のタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して測定され得る。
【０１２０】
Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦムテインのＥ．ｃｏｌｉ発現が、成功しない場合、ＧＨについて記載されるように分泌タンパク質として昆虫細胞においてＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦムテインを発現し得る。そのタンパク質は、天然のＧ−ＣＳＦシグナル配列（Ｓｏｕｚａら、１９８６；Ｎａｇａｔａら、１９８６ａ；Ｎａｇａｔａら、１９８６ｂ）またはミツバチメリチンシグナル配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むように改変され得、そのタンパク質の分泌を促進し得る。Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦムテインは、従来のクロマトグラフィー手順を使用して馴化培地から精製され得る。Ｇ−ＣＳＦに対する抗体は、ウエスタンブロットと共に使用され得、クロマトグラフィーの間にＧ−ＣＳＦタンパク質を含む画分を位置付けし得る。あるいは、Ｇ−ＣＳＦタンパク質を含む画分は、ＥＬＩＳＡを使用して同定され得る。
【０１２１】
Ｇ−ＣＳＦムテインはまた、実施例２においてエリスロポエチンについて記載されるように、哺乳動物細胞において発現され得る。
Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦムテインの生物学的活性は、インビトロ細胞増殖アッセイを使用して測定され得る。マウスＮＦＳ−６０細胞株およびヒトＡＭＬ−１９３細胞株は、Ｇ−ＣＳＦの生物学的活性を測定するために使用され得る（Ｔｓｕｃｈｉｙａら、１９８６；Ｌａｎｇｅら、１９８７；Ｓｈｉｒａｆｕｊｉら、１９８９）。両方の細胞株は、ヒトＧ−ＣＳＦに応答して増殖する。ＡＭＬ−１９３細胞株は、ヒト起源であるので（このことは、種の相違より生じる誤った結論の可能性を除外する）好ましい。ＮＦＳ−６０
細胞株は、１０〜２０ピコモル濃度の最大半値有効濃度（ＥＣ50）で、Ｇ−ＣＳＦに応答して増殖する。精製Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦムテインは、これらの細胞株を使用して細胞増殖アッセイにおいて試験され得、公開された方法を用いてそのタンパク質の比活性を決定し得る（Ｔｓｕｃｈｉｙａら、１９８６；Ｌａｎｇｅら、１９８７；Ｓｈｉｒａｆｕｊｉら、１９８９）。細胞は、Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦムテインの種々の濃度を用いて、９６ウェル組織培養ディッシュにプレートされ得る。加湿した組織培養インキュベータ中で、３７℃で１〜３日間後、増殖は、ＧＨについて記載されるように、3Ｈ−チミ
ジン取り込みにより測定され得る。アッセイは、各データ点について３連のウェルを用いて、各ムテインについて少なくとも３回行われるべきである。ＥＣ50値は、ムテインの相対的な効力を比較するために使用され得る。野生型Ｇ−ＣＳＦに匹敵する刺激の同様の最適なレベルおよびＥＣ5 0値を示すＧ−ＣＳＦムテインが、好ましい。
【０１２２】
活性を保持するＧ−ＣＳＦムテインは、ＧＨについて記載された手順と同様の手順を使用して、ＰＥＧ化され得る。野生型Ｇ−ＣＳＦおよびｓｅｒ−１７  Ｇ−ＣＳＦは、同様の条件下でＰＥＧ化されないはずであるから、コントロールとして使用され得る。ジＰＥＧ化産物を生じることなく、モノＰＥＧ化産物の顕著な量を生じるＰＥＧの最低量が、最適であると考慮されるはずである。モノ−ＰＥＧ化タンパク質は、非ＰＥＧ化タンパク質および未反応のＰＥＧから、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって、精製され得る。その精製されたＰＥＧ化タンパク質は、その生物学的活性を測定するために、上記の細胞増殖アッセイにおいて、試験され得る。
【０１２３】
そのタンパク質におけるＰＥＧ部位は、ＧＨについて記載される手順と同様の手順を使用してマッピングされ得る。そのＰＥＧ化タンパク質についての薬物動態学的データは、ＧＨについて記載される手順と同様の手順を使用して、得られ得る。
【０１２４】
ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのインビボでの有効性を実証するための最初の研究は、通常のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒより購入され得る）において行われ得る。ラットの群は、種々の用量のＧ−ＣＳＦ、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦまたはプラシーボの、単回の皮下または静脈注射を受けるべきである。動物を、末梢血における好中球および全白血球計数の決定のために、１週間まで、毎日の周期で、屠殺するべきである。他の血球細胞型（血小板および赤血球）は、測定され得、そして細胞特異性を実証し得る。
【０１２５】
ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの効力は、ラットの好中球減少モデルにおいて、試験され得る。好中球減少は、シクロホスファミド（骨髄抑制性である一般に使用される化学治療剤）を用いた処理によって誘導され得る。Ｇ−ＣＳＦは、シクロホスファミド処理された動物において、正常な好中球レベルの回復を促進する（Ｋｕｂｏｔａら、１９９０）。ラットに、０日目にシクロホスファミド注射を与え、好中球減少を誘導する。次に動物を、異なる群に分け、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＥＧ−ＧＣＳＦまたはプラシーボの皮下注射を与える。末梢血の好中球および全白血球の計数は、それらが正常レベルに戻るまで、毎日測定されるべきである。最初に、毎日の注射の場合に、Ｇ−ＣＳＦが好中球減少からの回復を促進することを確認するべきである。次に、種々の用量のレジメおよび種々の回数の注射の効果を調べて、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦが、非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦよりも、より強力であるか否か、およびより長時間持続する効果を生成するか否かを決定するべきである。
【０１２６】
本実施例のＧ−ＣＳＦから誘導された新規の分子は、本質的に実施例１および２において示されるように（しかし、この実施例の特定のタンパク質に関連する適切なアッセイ、および当該分野で公知の他の考察に代えて）処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１２７】
（実施例６）
（トロンボポエチン（ＴＰＯ））
トロンボポエチンは、血小板の巨核球前駆体の発生を刺激する。ＴＰＯのアミノ酸配列（配列番号７）は、Ｂａｒｔｌｅｙら（１９９４）、Ｆｏｓｔｅｒら（１９９４）、ｄｅ
Ｓａｕｖａｇｅら（１９９４）において提供され、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１２８】
このタンパク質は、３５３アミノ酸前駆体タンパク質として合成され、これは切断されて、３３２アミノ酸の成熟タンパク質を生じる。Ｎ末端の１５４アミノ酸は、ＥＰＯおよびＧＨスーパー遺伝子ファミリーの他のメンバーとの相同性を有する。Ｃ末端の１９９アミノ酸は、他の公知のタンパク質のいずれとも相同性を共有しない。Ｃ末端領域は、６つのＮ結合型グリコシル化部位および複数のＯ結合型グリコシル化部位を含む（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９６）。Ｏ結合型グリコシル化部位はまた、Ａへリックスの近位、Ａ−Ｂループ内、およびへリックスＣのＣ末端において見出される（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９６）。成熟タンパク質の１〜１９５残基のみを含有する短縮型ＴＰＯタンパク質は、インビトロにおいて十分に活性である（Ｂａｒｔｌｅｙ、１９９４）。
【０１２９】
この実施例は、Ｎ結合型グリコシル化部位およびＯ結合型グリコシル化部位を含有する任意のアミノ酸での、システイン付加改変体を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスの近位、Ｄへリックスの遠位、Ａ−Ｂループ内、Ｂ−Ｃループ内およびＣ−Ｄループ内の領域における他のシステイン付加改変体を提供する。
【０１３０】
システイン残基の導入に好ましい部位は：Ｓ１、Ｐ２、Ａ３、Ｐ４、Ｐ５、Ａ６、Ｔ３７、Ａ４３、Ｄ４５、Ｓ４７、Ｇ４９、Ｅ５０、Ｋ５２、Ｔ５３、Ｑ５４、Ｅ５６、Ｅ５７、Ｔ５８、Ａ７６、Ａ７７、Ｒ７８、Ｇ７９、Ｑ８０、Ｇ８２、Ｔ８４、Ｓ８７、Ｓ８８、Ｇ１０９、Ｔ１１０、Ｑ１１１、Ｐ１１３、Ｐ１１４、Ｑ１１５、Ｇ１１６、Ｒ１１７、Ｔ１１８、Ｔ１１９、Ａ１２０、Ｈ１２１、Ｋ１２２、Ｇ１４６、Ｇ１４７、Ｓ１４８、Ｔ１４９、Ａ１５５、Ｔ１５８、Ｔ１５９、Ａ１６０、Ｓ１６３、Ｔ１６５、Ｓ１６６、Ｔ１７０、Ｎ１７６、Ｒ１７７、Ｔ１７８、Ｓ１７９、Ｇ１８０、Ｅ１８３、Ｔ１８４、Ｎ１８５、Ｆ１８６、Ｔ１８７、Ａ１８８、Ｓ１８９、Ａ１９０、Ｔ１９２、Ｔ１９３、Ｇ１９４、Ｓ１９５、Ｎ２１３、Ｑ２１４、Ｔ２１５、Ｓ２１６、Ｓ２１８、Ｎ２３４、Ｇ２３５、Ｔ２３６、Ｓ２４４、Ｔ２４７、Ｓ２５４、Ｓ２５５、Ｔ２５７、Ｓ２５８、Ｔ２６０、Ｓ２６２、Ｓ２７２、Ｓ２７４、Ｔ２７６、Ｔ２８０、Ｔ２９１、Ｔ２９４、Ｓ３０７、Ｔ３１０、Ｔ３１２、Ｔ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１９、Ｔ３２０、Ｓ３２１、Ｔ３２３、Ｓ３２５、Ｑ３２６、Ｎ３２７、Ｌ３２８、Ｓ３２９、Ｑ３３０、Ｅ３３１およびＧ３３２である。システイン残基が成熟タンパク質の最初のアミノ酸の近位（すなわち、Ｓ１の近位）、または、成熟タンパク質中の最後のアミノ酸の遠位（すなわち、Ｇ３３２の遠位）に導入された改変体が、提供される。システイン付加改変体は、天然のヒトタンパク質または、アミノ酸１４７と天然タンパク質のＣ末端（Ｇ３３２）との間が短縮された改変体タンパク質の状況において提供される。アミノ酸１４７と３３２との間が短縮されたＴＰＯタンパク質の最後のアミノ酸から遠位にシステイン残基が付加された改変体がまた、提供される。
【０１３１】
本実施例のＴＰＯから誘導された新規の分子は、本質的に実施例１および２において示されるように（しかし、この実施例の特定のタンパク質に関連する適切なアッセイ、および当該分野で公知の他の考察に代えて）処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１３２】
（実施例７）
（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））
ＧＭ−ＣＳＦは、種々の造血性細胞（好中球、単球、好酸球、赤血球、および巨核球細胞
系統を含む）の増殖および分化を刺激する。ヒトＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列（配列番号８）は、Ｃａｎｔｒｅｌｌら（１９８５）およびＬｅｅら（１９８５）において提供され、これらの両方は、本明細書において参考として援用される。
【０１３３】
ＧＭ−ＣＳＦは、１４４アミノ酸のプレタンパク質として生成され、このプレタンパク質は、切断されて、１２７アミノ酸の成熟タンパク質を生じる。その成熟タンパク質は、２つのＮ結合型グリコシル化部位を有する。１つの部位は、へリックスＡのＣ末端に位置し；第２の部位は、Ａ−Ｂループ内に存在する。
【０１３４】
この実施例は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含有する任意のアミノ酸におけるシステイン付加改変体（すなわち、Ｎ２７Ｃ、Ｌ２８Ｃ、Ｓ２９Ｃ、Ｎ３７Ｃ、Ｅ３８ＣおよびＴ３９Ｃ）を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスの近位、Ｄへリックスの遠位、Ａ−Ｂループ内、Ｂ−Ｃループ内およびＣ−Ｄループ内の領域におけるシステイン付加改変体を提供する。これらの領域においてシステイン置換の導入に好ましい部位は：Ａ１、Ｐ２、Ａ３、Ｒ４、Ｓ５、Ｐ６、Ｓ７、Ｐ８、Ｓ９、Ｔ１０、Ｑ１１、Ｒ３０、Ｄ３１、Ｔ３２、Ａ３３、Ａ３４、Ｅ３５、Ｅ４１、Ｓ４４、Ｅ４５、Ｄ４８、Ｑ５０、Ｅ５１、Ｔ５３、Ｑ６４、Ｇ６５、Ｒ６７、Ｇ６８、Ｓ６９、Ｌ７０、Ｔ７１、Ｋ７２、Ｋ７４、Ｇ７５、Ｔ９１、Ｅ９３、Ｔ９４、Ｓ９５、Ａ９７、Ｔ９８、Ｔ１０２、Ｉ１１７、Ｄ１２０、Ｅ１２３、Ｖ１２５、Ｑ１２６およびＥ１２７である。システイン残基が成熟タンパク質の最初のアミノ酸の近位（すなわち、Ａ１の近位）、または、成熟タンパク質中の最後のアミノ酸の遠位（すなわち、Ｅ１２７の遠位）に導入された改変体が、提供される。
【０１３５】
本実施例のＧＭ−ＣＳＦから誘導された新規の分子は、本質的に実施例１および２において示されるように（しかし、この実施例の特定のタンパク質に関連する適切なアッセイ、および当該分野で公知の他の考察に代えて）処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１３６】
（実施例８）
（ＩＬ−２）
ＩＬ−２は、活性化Ｔ細胞により合成されるＴ細胞増殖因子である。このタンパク質は、活性化Ｔ細胞のクローン増殖を刺激する。ヒトＩＬ−２は、切断されて１３３アミノ酸の成熟タンパク質を産生する１５３アミノ酸の前駆体として合成される（Ｔａｄａｔｓｕｇｕら、１９８３；Ｄｅｖｏｓら、１９８３；配列番号９）。
【０１３７】
ＩＬ−２のアミノ酸配列は、（Ｔａｄａｔｓｕｇｕら、１９８３；Ｄｅｖｏｓら、１９８３）に示される。成熟タンパク質は３つのシステイン残基を含み、そのうち２つがジスルフィド結合を形成する。成熟タンパク質のシステイン１２５は、ジスルフィド結合には関与しない。システイン１２５のセリンへの置換は、完全な生物学的活性を有するＩＬ−２ムテインを産生する（Ｗａｎｇら、１９８４）。このタンパク質は、成熟タンパク質鎖のスレオニン３においてＯ−グリコシル化される。
【０１３８】
この実施例は、Ｄへリックスの最後の４つの位置、Ｄへリックスに対して遠位の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、およびＣ−Ｄループにおいて、システインが付加された改変体を提供する。これらの改変体は、天然のタンパク質配列、あるいは天然に生じる「遊離の」システイン残基（システイン１２５）が別のアミノ酸、好ましくはセリンまたはアラニンに変化している改変体タンパク質の状況において、提供される。システイン残基が、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基（すなわちＡ１）に対して近位に、または最後のアミノ酸残基（すなわちＴ１３３）に対して遠位に導入される改変体もまた、提供される。
【０１３９】
本実施例のＩＬ−２に由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１４０】
（実施例９）
（ＩＬ−３）
ＩＬ−３は、活性化Ｔ細胞により産生され、そして多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）造血幹細胞の増殖および分化を刺激する。ヒトＩＬ−３のアミノ酸配列（配列番号１０）は、Ｙａｎｇら、（１９８６）；Ｄｏｒｓｓｅｒｓら（１９８７）およびＯｔｓｕｋａら、（１９８８）に示され、これらの文献は、すべて本明細書中に参考として援用される。このタンパク質は、２つのシステイン残基および２つのＮ結合型グリコシル化部位を含む。８位のアミノ酸にセリンもしくはプロリンを有するアイソフォーム、または成熟タンパク質を生じる２つの対立遺伝子が記載されている。
【０１４１】
この実施例は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含むアミノ酸のいずれかにシステインを付加された改変体を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスに対して近位の領域、Ｄへリックスに対して遠位の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、およびＣ−Ｄループにおいてシステインを付加された改変体を提供する。システイン残基が、成熟タンパク質における最初のアミノ酸残基に対して近位に、または最後のアミノ酸残基に対して遠位に導入される改変体もまた、提供される。
【０１４２】
本実施例のＩＬ−３に由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１４３】
（実施例１０）
（ＩＬ−４）
ＩＬ−４は、単球およびＴ細胞およびＢ細胞の増殖および分化を刺激する、多面的なサイトカインである。ＩＬ−４は、喘息およびアトピーにおいて役割を演ずると考えられているＩｇＥをＢ細胞が分泌するように導くプロセスに関係する。ＩＬ−４の生物活性は種特異的である。ＩＬ−４は、切断されて１２９アミノ酸の成熟タンパク質を産生する、１５３アミノ酸の前駆体タンパク質として合成される。ヒトＩＬ−４のアミノ酸配列（配列番号１１）は、Ｙｏｋｏｔａら（１９８６）において示され、これは本明細書中に参考として援用される。このタンパク質は、６つのシステイン残基および２つのＮ結合型グリコシル化部位を含む。グリコシル化部位はＡ−ＢおよびＣ−Ｄループに位置する。
この実施例は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含むアミノ酸のいずれかにシステインを付加された改変体を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスに対して近位の領域、Ｄへリックスに対して遠位の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、およびＣ−Ｄループにおいてシステインを付加された改変体を提供する。システイン残基が、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基（Ｈ１）に対して近位に、または最後のアミノ酸残基（Ｓ１２９）に対して遠位に導入されている改変体が提供される。
【０１４４】
本実施例のＩＬ−４に由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１４５】
（実施例１１）
（ＩＬ−５）
ＩＬ−５は、好酸球の分化および活性化の因子である。ヒトＩＬ−５のアミノ酸配列（
配列番号１２）は、Ｙｏｋｏｔａら（１９８７）において示され、この文献は、本明細書中に参考として援用される。この成熟タンパク質は、１１５アミノ酸を含み、そしてジスルフィド連結されたモノダイマーとして溶液中に存在する。このタンパク質は、Ｏ結合型およびＮ結合型グリコシル化部位を含む。
【０１４６】
この実施例は、Ａへリックスに対して近位の領域、Ｄへリックスに対して遠位の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、およびＣ−Ｄループにおいて、システインが付加された改変体を提供する。システイン残基が、成熟タンパク質における最初のアミノ酸残基に対して近位に、または最後のアミノ酸残基に対して遠位に付加されている改変体もまた、提供される。
【０１４７】
本実施例のＩＬ−５に由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１４８】
（実施例１２）
（ＩＬ−６）  ＩＬ−６は、多くの細胞型の増殖および分化を刺激する。ヒトＩＬ−６のアミノ酸配列（配列番号１３）は、Ｈｉｒａｎｏら（１９８６）において示され、この文献は、本明細書中に参考として援用される。ヒトＩＬ−６は、切断されて１８４アミノ酸の成熟タンパク質を生成する２１２アミノ酸のプレタンパク質として合成される。この成熟タンパク質は、Ｔ１３７、Ｔ１３８、Ｔ１４２、またはＴ１４３において２つのＮ結合型グリコシル化部位および１つのＯ結合型グリコシル化部位を含む。
【０１４９】
この実施例は、Ｎ結合型グリコシル化部位およびＯ結合型グリコシル化部位を含むアミノ酸のいずれかにシステインを付加された改変体を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスに対して近位の領域、Ｄへリックスに対して遠位の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、およびＣ−Ｄループにおいてシステインを付加された改変体を提供する。システイン残基が、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基に対して近位に、または最後のアミノ酸残基に対して遠位に付加されている改変体もまた、提供される。
【０１５０】
本実施例のＩＬ−６に由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１５１】
（実施例１３）
（ＩＬ−７）
ＩＬ−７は、未熟Ｂ細胞の増殖を刺激し、そして成熟Ｔ細胞に作用する。ヒトＩＬ−７のアミノ酸配列（配列番号１４）は、Ｇｏｏｄｗｉｎら（１９８９）において示され、この文献は、本明細書中に参考として援用される。このタンパク質は、切断されて１５２アミノ酸の成熟タンパク質（３つのＮ結合型グリコシル化部位を含む）を産生する１７７アミノ酸のプレタンパク質として合成される。
【０１５２】
この実施例は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含むアミノ酸のいずれかにシステインを付加された改変体を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスに対して近位の領域、Ｄへリックスに対して遠位の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、およびＣ−Ｄループにおいてシステインを付加された改変体を提供する。
【０１５３】
本実施例の新規なＩＬ−７に由来する分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。システ
イン残基が、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基に対して近位に、または最後のアミノ酸残基に対して遠位に付加される改変体もまた、提供される。
【０１５４】
（実施例１４）
（ＩＬ−９）
ＩＬ−９は、リンパ球、骨髄細胞、およびマスト細胞の系統における多くの細胞型に作用する多面的なサイトカインである。ＩＬ−９は、活性化Ｔ細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖を刺激し、マスト細胞前駆体の増殖を刺激し、そして未熟な赤血球前駆体を刺激するにおいてエリスロポエチンと共働作用する。ヒトＩＬ−９のアミノ酸配列（配列番号１５）は、Ｙａｎｇら（１９８９）において示され、この文献は、本明細書中に参考として援用される。ＩＬ−９は、切断されて１２６アミノ酸の成熟タンパク質を産生する１４４アミノ酸の前駆体タンパク質として合成される。このタンパク質は、４つの潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を含む。
【０１５５】
この実施例は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含む３つのアミノ酸のいずれかにシステインを付加された改変体を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスに対して近位の領域、Ｄへリックスに対して遠位の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、およびＣ−Ｄループにおいてシステインを付加された改変体を提供する。システイン残基が、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基に対して近位に、または最後のアミノ酸残基に対して遠位に付加されている改変体もまた、提供される。
【０１５６】
本実施例のＩＬ−９に由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１５７】
（実施例１５）
（ＩＬ−１０）
ヒトＩＬ−１０のアミノ酸配列（配列番号１６）は、Ｖｉｅｉｒａら（１９９１）において示され、この文献は、本明細書中に参考として援用される。ＩＬ１０は、切断されて１６０アミノ酸の成熟タンパク質を産生する１７８アミノ酸の前駆体タンパク質として合成される。ＩＬ−１０は、免疫系を活性化または抑制するように機能し得る。このタンパク質は、インターフェロンと構造的な相同性を共有する（すなわち、５つの両親媒性ヘリックスを含む）。このタンパク質は、１つのＮ結合型グリコシル化部位を含む。
【０１５８】
この実施例は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含む３つのアミノ酸のいずれかにシステインを付加された改変体を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスに対して近位の領域、Ｅへリックスに対して遠位の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−ＤループおよびＤ−Ｅループにおいてシステインを付加された改変体を提供する。システイン残基が、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基に対して近位に、または最後のアミノ酸残基に対して遠位に導入される改変体もまた、提供される。
【０１５９】
本実施例のＩＬ−１０に由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１６０】
（実施例１６）
（ＩＬ−１１）
ＩＬ−１１は、造血、リンパ球産生、および急性期応答を刺激する多面的なサイトカインである。ＩＬ−１１は、多くの生物学的効果をＩＬ−６と共有している。ヒトＩＬ−１１のアミノ酸配列（配列番号１７）は、Ｋａｗａｓｈｉｍａら（１９９１）およびＰａｕ
ｌら（１９９０）において示され、その両方が本明細書中に参考として援用される。ＩＬ−１１は、切断されて１７８アミノ酸の成熟タンパク質を産生する１９９アミノ酸の前駆体タンパク質として合成される。このタンパク質には、Ｎ結合型グリコシル化部位は存在しない。
【０１６１】
この実施例は、Ａへリックスに対して近位の領域、Ｄへリックスに対して遠位の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、およびＣ−Ｄループにおいてシステインを付加された改変体を提供する。システイン残基が、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基に対して近位に、または最後のアミノ酸残基に対して遠位に付加されている改変体もまた、提供される。
【０１６２】
本実施例のＩＬ−１１に由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１６３】
（実施例１７）
（ＩＬ−１２ｐ３５）
ＩＬ−１２は、ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖および分化を刺激する。ＩＬ−１２は、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットのヘテロダイマーとして存在する。ｐ３５は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーである。ｐ３５サブユニットのアミノ酸配列（配列番号１８）は、Ｇｕｂｌｅｒら（１９９１）およびＷｏｌｆら（１９９１）において示され、両方が本明細書中に参考として援用される。ｐ３５は、切断されて１７５アミノ酸の成熟タンパク質を産生する１９７アミノ酸の前駆体タンパク質として合成される。このタンパク質は、７つのシステイン残基および３つの潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を含む。
【０１６４】
この実施例は、３つのＮ結合型グリコシル化部位を含む３つのアミノ酸のいずれかにシステインを付加された改変体を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスに対して近位の領域、Ｄへリックスに対して遠位の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、およびＣ−Ｄループにおいてシステインを付加された改変体を提供する。これらの改変体は、天然のタンパク質配列、あるいは天然に生じる「遊離の」システイン残基が別のアミノ酸、好ましくはセリンまたはアラニンに変化している改変体タンパク質の状況において、提供される。システイン残基が、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基に対して近位に、または最後のアミノ酸残基に対して遠位に導入されている改変体もまた、提供される。
【０１６５】
本実施例のＩＬ−１２ｐ３５に由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１６６】
（実施例１８）  （ＩＬ−１３）  ＩＬ−１３は多くの生物学的特性をＩＬ−４と共有する。ＩＬ−１３のアミノ酸配列（配列番号１９）は、Ｍｃｋｅｎｚｉｅら（１９９３）およびＭｉｎｔｙら（１９９３）において示され、両方が本明細書中に参考として援用される。このタンパク質は、切断されて１１２アミノ酸の成熟タンパク質を産生する１３２アミノ酸の前駆体タンパク質として合成される。この成熟タンパク質は、５つのシステイン残基および複数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。７８位のグルタミンがｍＲＮＡの選択的スプライシングによって欠失している改変体が記載されている（Ｍｃｋｅｎｚｉｅら、１９９３）。
【０１６７】
この実施例は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含む３つのアミノ酸のいずれかにシステインを付加された改変体を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスに対して近位の領域
、Ｄへリックスに対して遠位の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、およびＣ−Ｄループにおいてシステインを付加された改変体を提供する。これらの改変体は、天然のタンパク質配列、あるいはすでに存在する「遊離の」システインが別のアミノ酸、好ましくはアラニンまたはセリンに変化している改変体配列の状況において、提供される。システイン残基が、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基に対して近位に、または最後のアミノ酸残基に対して遠位に導入される改変体もまた、提供される。
【０１６８】
本実施例のＩＬ−１３に由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１６９】
（実施例１９）（ＩＬ−１５）  ＩＬ−１５は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球の増殖および分化を刺激する。ＩＬ−１５は、ガンおよびウイルス感染を処置するにおいて有用であり得る。ＩＬ−１５のアミノ酸配列（配列番号２０）は、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９５）において示され、この文献は、本明細書中に参考として援用される。ＩＬ−１５は、２つのＮ結合型グリコシル化部位を含み、これらはＣ−Ｄループ内およびＤヘリックスのＣ末端に位置する。ＩＬ−１５は、切断されて１１４アミノ酸の成熟タンパク質を生成する１６２アミノ酸のプレタンパク質をコードする。
【０１７０】
この実施例は、Ｎ結合型グリコシル化部位（Ｃ−ＤループまたはＤヘリックスのＣ末端中）を含む３つのアミノ酸のいずれかにシステインを付加された改変体を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスに対して近位の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループ、またはＤへリックスに対して遠位の領域においてシステインを付加された改変体を提供する。システイン残基が、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基に対して近位に、または最後のアミノ酸残基に対して遠位に導入されている改変体もまた、提供される。
【０１７１】
本実施例のＩＬ−１５に由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１７２】
（実施例２０）（マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ））Ｍ−ＣＳＦは、単球の増殖、分化および機能を調節する。このタンパク質は、ジスルフィド連結したホモダイマーである。異なるｍＲＮＡスプライシングより生じるＭ−ＣＳＦの複数の分子量種が記載されている。ヒトＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列およびその種々のプロセッシング型は、Ｋａｗａｓａｋｉら（１９８５）、Ｗｏｎｇら（１９８５）、およびＣｅｒｒｅｔｔｉら（１９８８）において示され、これらは本明細書中に参考として援用される。システイン付加改変体は、本願の一般的教示に従って、および本明細書に示される実施例に従って産生され得る。
【０１７３】
本実施例のＭＣＳＦに由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１７４】
（実施例２１）
（オンコスタチンＭ）
オンコスタチンＭは、多くの細胞型の増殖および分化に影響を与える多機能なサイトカインである。オンコスタチンＭのアミノ酸配列（配列番号２１）は、Ｍａｌｉｋら（１９８９）において示され、この文献は、本明細書中に参考として援用される。オンコスタチンＭは、活性化単球およびＴリンパ球によって産生される。オンコスタチンＭは、順番に切断されて、２２７アミノ酸タンパク質、次いで１９６アミノ酸タンパク質を産生する２
５２アミノ酸のプレタンパク質として合成される（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９０）。成熟タンパク質は、Ｏ結合型グリコシル化部位および２つのＮ結合型グリコシル化部位を含む。このタンパク質は、Ｔ１６０、Ｔ１６２、およびＳ１６５でＯ−グリコシル化される。成熟タンパク質は５つのシステイン残基を含む。
【０１７５】
この実施例は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含む３つのアミノ酸のいずれかにまたはＯ結合型グリコシル化部位を含むアミノ酸にシステインを付加された改変体を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスに対して近位の領域、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループ、またはＤへリックスに対して遠位の領域においてシステインを付加された改変体を提供する。これらの改変体は、天然のタンパク質配列、あるいはすでに存在する「遊離の」システインが別のアミノ酸、好ましくはアラニンまたはセリンに変化している改変体配列の状況において、提供される。システイン残基が、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基に対して近位に、または最後のアミノ酸残基に対して遠位に導入されている改変体もまた、提供される。
【０１７６】
本実施例のオンコスタチンＭに由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１７７】
（実施例２２）
（毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ））
ヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列（配列番号２２）は、Ｌａｍら（１９９１）において示され、この文献は、本明細書中に参考として援用される。ＣＮＴＦは、グリコシル化部位または分泌のためのシグナル配列を含まない、２００アミノ酸のタンパク質である。このタンパク質は、１つのシステイン残基を含む。ＣＮＴＦは、神経細胞の生存因子として機能する。
【０１７８】
この実施例は、Ａへリックスに対して近位において、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループにおいて、またはＤへリックスに対して遠位においてシステインを付加された改変体を提供する。これらの改変体は、天然のタンパク質配列、あるいはすでに存在する「遊離の」システインが別のアミノ酸、好ましくはアラニンまたはセリンに変化している改変体配列の状況において、提供される。システイン残基が、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基に対して近位に、または最後のアミノ酸残基に対して遠位に導入されている改変体もまた、提供される。
【０１７９】
本実施例のＣＮＴＦに由来する新規な分子は、実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、処方され得、そして活性について試験され得る。
【０１８０】
（実施例２３）
（白血病阻害因子（ＬＩＦ））
ＬＩＦのアミノ酸配列（配列番号２３）は、Ｍｏｒｅａｕら（１９８８）およびＧｏｕｇｈら（１９８８）において示され、両方は、本明細書中に参考として援用される。そのヒト遺伝子は、切断されて１８０アミノ酸の成熟タンパク質を産生する２０２アミノ酸前駆体をコードする。このタンパク質は６つのシステイン残基を含み、それらのすべてがジスルフィド結合に関与する。このタンパク質は、多数のＯ結合型グリコシル化部位およびＮ結合型グリコシル化部位を含む。このタンパク質の結晶構造は、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（１９９４）によって決定された。このタンパク質は、多くの細胞型の増殖および分化に影響を与える。
【０１８１】
この実施例は、Ｎ結合型グリコシル化部位またはＯ結合型グリコシル化部位を含む３つのアミノ酸のいずれかにシステインを付加された改変体を提供する。この実施例はまた、Ａへリックスに対して近位において、Ａ−Ｂループ、Ｂ−Ｃループ、Ｃ−Ｄループにおいて、またはＤへリックスに対して遠位においてシステインを付加された改変体を提供する。システイン残基が、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基に対して近位に、または最後のアミノ酸残基に対して遠位に付加されている改変体もまた、提供される。
【０１８２】
本実施例のＬＩＦに由来する新規な分子は、処方され得、そして実施例１および２に本質的に示されるが、しかし、本実施例の特定のタンパク質に関連する当該分野で公知の適切なアッセイおよび他の考慮に置換されるように、活性について試験され得る。
【０１８３】
本明細書中で引用されたすべての文書は、本明細書中で参考として援用される。
本明細書中で開示されたタンパク質アナログは、すべて当該分野で周知の本質的に同じ形態および用量で、ネイティブタンパク質の公知の治療的使用のために使用され得る。
【０１８４】
本発明の例示的な好ましい実施態様が本明細書中で詳細に記載されるが、当業者は、特に本明細書中で記載された以外の変更、改変、付加、および適用を認識し、そして本発明の精神から逸脱することなく、好ましい実施態様および方法を応用し得る。
【０１８５】
（参考文献）
【０１８６】
【表１】
2009096810.tif 000002
【０１８７】
【表２】
2009096810.tif 000003
【０１８８】
【表３】
2009096810.tif 000004
【０１８９】
【表４】
2009096810.tif 000005
【０１９０】
【表５】
2009096810.tif 000006
【０１９１】
【表６】
2009096810.tif 000007
【０１９２】
【表７】
2009096810.tif 000008
【０１９３】
【表８】
2009096810.tif 000009
【０１９４】
【表９】
2009096810.tif 000010
【配列表】
2009096810000001.app