(57)【要約】【課題】全反射照明とプラズモンによる電場増強効果とを用いた蛍光検出において、非特異的吸着による影響を低減することにより、定量性とＳ／Ｎ比の向上を可能とする。【解決手段】プラズモンによる電場増強を利用する蛍光検出方法において、第１の標識５で標識された被検出物質２を含む試料１を、第２の標識４で標識されかつ被検出物質２と特異的に結合する特異的結合物質３が固定された検出部に供給し、被検出物質２と特異的結合物質３とを結合させ、接近した第１の標識５及び第２の標識４のうちドナーとして機能する標識を励起させ、励起エネルギーを蛍光共鳴エネルギー移動Ｅにより他方のアクセプタとして機能する標識を励起させ、これによりアクセプタとして機能する標識から発せられる蛍光Ｌ２を検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体プリズム基板と、該誘電体プリズム基板上に形成された金属薄膜を含む検出部との界面に対し、励起光を全反射条件を満たすように入射して、該界面表面に発生したエバネッセント光と前記金属薄膜との共鳴により表面プラズモンを発生させ、前記検出部に供給された試料中に含まれる物質が、前記表面プラズモンによって電場増強された前記エバネッセント光を吸収して発する蛍光を光検出器によって検出する蛍光検出方法において、
第１の標識で標識された被検出物質を前記試料中に用意する工程（Ａ）と、
第２の標識で標識されかつ前記被検出物質と特異的に結合する特異的結合物質を用意し、該特異的結合物質を前記検出部上に固定する工程（Ｂ）と、
前記工程（Ａ）及び（Ｂ）の後、前記第１の標識と前記第２の標識との距離を蛍光共鳴エネルギー移動が起きる程度にまで接近させるために、前記試料を前記検出部に供給し、該試料中に含まれる前記被検出物質を前記特異的結合物質と結合させる工程（Ｃ）と、
前記工程（Ｃ）の後、前記接近した前記第１の標識及び前記第２の標識に対し前記エバネッセント光を照明することにより、該第１の標識及び該第２の標識のうちドナーとして機能するどちらか一方の標識を励起させ、該励起エネルギーを蛍光共鳴エネルギー移動によりアクセプタとして機能する他方の標識に移動させて該他方の標識を励起させ、これにより該他方の標識から発せられる蛍光を検出することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項２】
前記光検出器が、前記誘電体プリズム基板に対して、前記金属薄膜が形成されている側に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項３】
前記検出部が、前記金属薄膜表面に、疎水性材料からなる膜厚１０〜１００ｎｍの不撓性膜を有することを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光検出方法。
【請求項４】
前記不撓性膜が、ポリマー材料から構成されることを特徴とする請求項３に記載の蛍光検出方法。
【請求項５】
前記ドナーとして機能するどちらか一方の標識が、有機色素、蛍光性量子ドット、及び金属微粒子より選ばれるいずれか１つの標識材料であり、
前記アクセプタとして機能する他方の標識が、有機色素及び蛍光性量子ドットより選ばれるどちらか１つの標識材料であることを特徴とする請求項１から４いずれかに記載の蛍光検出方法。
【請求項６】
前記アクセプタとして機能する前記他方の標識が、有機色素であることを特徴とする請求項５に記載の蛍光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラズモン増強を利用した蛍光検出方法に関するものであり、特に詳細には、さらに蛍光共鳴エネルギー移動を利用した蛍光検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオ測定等において、蛍光法は高感度かつ容易な測定法として広く用いられている。蛍光法とは、特定波長の光に励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に、上記特定波長の励起光を照射し、このとき発せられる蛍光を検出することによって定性的または定量的に被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質自身が蛍光材料ではない場合、この被検出物質を有機蛍光色素等の蛍光標識で標識し、その後同様にして蛍光を検出することにより、その標識の存在をもって被検出物質の存在を確認する方法である。
【０００３】
とりわけここ数年、蛍光法は、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化と相まって、バイオ研究には欠かせない道具となっている。また、蛍光標識に用いる材料においても、特に可視領域では蛍光量子収率の高い蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（蛍光  ５２５ｎｍ、蛍光量子収率  ０．６）やＣｙ５（蛍光  ６８０ｎｍ、蛍光量子収率  ０．３）のような実用の目安となる０．２を超える蛍光色素が開発され広く用いられている。
【０００４】
さらに、非特許文献１において、プラズモンによる電場増強効果を用いて、蛍光信号を増大することにより、１ｐＭを切るような高感度検出が可能であると報告されている。
【０００５】
その概要は例えば以下の通りであり、図５ａを用いて簡単に説明する。金属薄膜２０上には、試料１中に含まれる被検出物質２と特異的に結合する特異的結合物質３が固定されている。試料保持部７の中に試料１が供給され、蛍光標識５に標識された被検出物質２と特異的結合物質３が特異的に結合する。その後、光源８から発せられる励起光９を、誘電体プリズム基板６と金属薄膜２０の界面２０ａに対して、この界面２０ａで全反射条件を満たすように誘電体プリズム基板６を通し入射する。このとき、この界面２０ａ表面に発生したエバネッセント光２２と金属薄膜２０との共鳴により、金属薄膜２０中に表面プラズモンが発生する。そして、この表面プラズモンによる電場増強効果を受けて電場増強されたエバネッセント光２２を吸収することにより、蛍光標識５が励起されることとなる。励起された蛍光標識５は所定波長の蛍光を発し、この蛍光検出によって被検出物質２の検出が行われる。
【０００６】
上記の方法では、表面プラズモンによる電場増強効果により、エバネッセント光２２の電場強度がおよそ数十倍から数百倍にも増強される。さらに、エバネッセント光２２は、界面２０ａから数百ｎｍ程度の領域にしか到達しない。この特性を利用し、上記特異的結合物質３を用いて被検出物質２つまりは蛍光標識５を検出部に集約させることにより、エバネッセント光２２により励起される蛍光標識５の量を効率的に増やすと共に、意図せず試料中に残留した不純物９０からの散乱や浮遊蛍光標識９１からの発光等の影響を大幅に低減することができる。上記のような効果により、総蛍光量を稼ぎかつノイズを抑えて高いＳ／Ｎ比を実現し、高感度検出を可能としている。
【特許文献１】特表平８−５０３９９４号公報
【非特許文献１】Margarida M. L. M. Vareiro, et al., Analytical Chemistry, Vol. 77, No. 8, p.2426-2431 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら実際には、物質−基板表面間に生じる静電効果や疎水効果等に起因する非特異的吸着が大きな問題となっている。非特異的吸着とは、例えば上記のような場合において、標識した被検出物質２が特異的結合物質３と結合せず、金属薄膜２０表面に非特異的に吸着する等の図５ｂのような状態を指す。このとき、非特異的吸着に起因する蛍光標識５’からの蛍光信号は、検出対象とする特異的結合に起因する蛍光標識５からの蛍光信号に対してノイズとなり、測定の定量性を低下させる要因となってしまう。これは、単にｏｎ／ｏｆｆで蛍光検出を行う場合には影響が少ないが、定量的な測定が必要とされる場合に大きな問題となる。特に試料中の被検出物質濃度が１ｐＭ程度の場合は、蛍光信号自体が微弱となるためこの影響は大きい。
【０００８】
このような非特異的吸着が存在していると、蛍光検出の定量性を高めるために蛍光変換部や蛍光増幅部を高性能化（それぞれ、標識の量子収率向上、プラズモンによる電場増強などが含まれる）したとしても、ノイズも同時に増加し結果として感度は期待するほど向上しない。これにより、定量的な蛍光検出を行うためには、非特異的吸着による影響の低減が必須となる。
【０００９】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、非特異的吸着による影響を低減しＳ／Ｎ比を向上させ、高い定量性を有する蛍光検出方法の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明による蛍光検出方法は、
誘電体プリズム基板と、この誘電体プリズム基板上に形成された金属薄膜を含む検出部との界面に対し、励起光を全反射条件を満たすように入射して、この界面表面に発生したエバネッセント光と金属薄膜との共鳴により表面プラズモンを発生させ、検出部に供給された試料中に含まれる物質が、表面プラズモンによって電場増強されたエバネッセント光を吸収して発する蛍光を光検出器によって検出する蛍光検出方法において、
第１の標識で標識された被検出物質を試料中に用意する工程（Ａ）と、
第２の標識で標識されかつ被検出物質と特異的に結合する特異的結合物質を用意し、この特異的結合物質を検出部上に固定する工程（Ｂ）と、
工程（Ａ）及び（Ｂ）の後、第１の標識と第２の標識との距離を蛍光共鳴エネルギー移動が起きる程度にまで接近させるために、試料を検出部に供給し、この試料中に含まれる被検出物質を特異的結合物質と結合させる工程（Ｃ）と、
工程（Ｃ）の後、上記接近した第１の標識及び第２の標識に対しエバネッセント光を照明することにより、これら第１の標識及び第２の標識のうちドナーとして機能するどちらか一方の標識を励起させ、この励起エネルギーを蛍光共鳴エネルギー移動によりアクセプタとして機能する他方の標識に移動させてこの他方の標識を励起させ、これによりこの他方の標識から発せられる蛍光を検出することを特徴とするものである。
【００１１】
本発明において、上記「検出部」とは、試料等を接するように供給する場所であって、標識を検出部に固定し、この固定された標識を上記エバネッセント光によって励起発光させて、被検出物質の検出を行うように配されたものである。
【００１２】
また、上記「光検出器」とは、試料中の標識から発せられる蛍光を検出するものである。測定に応じて分光手段と組み合わせて、蛍光スペクトルの測定も可能とするものである。
【００１３】
なお、「蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）」とは、ドナー、すなわちエネルギー供与体と特定の条件を満たすアクセプタ、すなわちエネルギー受容体が近傍にある場合、ドナーを励起すると一重項状態のエネルギーがアクセプタに移動し、アクセプタが励起される現象である。このとき、アクセプタが蛍光材料であれば、アクセプタ側から蛍光が観測される。
【００１４】
そして、光検出器は、誘電体プリズム基板に対して、金属薄膜が形成されている側に配置されていることが望ましい。
【００１５】
また、検出部は、金属薄膜表面に、疎水性材料からなる膜厚１０〜１００ｎｍの不撓性膜を有することが望ましい。このとき、不撓性膜は、ポリマー材料から構成されることがより望ましい。
【００１６】
さらに、ドナーとして機能するどちらか一方の標識は、有機色素、蛍光性量子ドット、及び金属微粒子より選ばれるいずれか１つの標識材料であり、
アクセプタとして機能する他方の標識は、有機色素及び蛍光性量子ドットより選ばれるどちらか１つの標識材料であることが望ましい。この場合、アクセプタとして機能する他方の標識は、有機色素であることがより望ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明による蛍光検出方法によれば、全反射照明を用いた蛍光検出方法において、被検出物質を特異的結合物質に結合させて、第１の標識と第２の標識との間に起こるＦＲＥＴを経て発せられる蛍光を検出することにより、非特異的吸着による影響を低減し、定量性を向上することが可能となる。
【００１８】
また、ＦＲＥＴを経て発せられる検出対象とする蛍光は、励起光の波長に対して大きくストークスシフトしているため、入射光や散乱光との分離が容易になり、さらなるＳ／Ｎ比の向上が可能となる。
【００１９】
さらに、金属薄膜中に生じる表面プラズモンによる電場増強効果を利用しているため、得られる微弱な蛍光信号量を増幅することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明における最良の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００２１】
「蛍光検出方法」
＜第１の実施形態＞
図１ａは、本実施形態による蛍光検出方法を用いて、被検出物質としての抗原２を含む試料１から、抗原２を検出する場合に用いる蛍光検出装置の概略部分断面図である。
【００２２】
図示の通り、この蛍光検出装置は、第２の標識４を励起しうる所定波長の励起光９を発する光源８と、この励起光９を一面から透過させるように配された、励起光９を透過させる材料からなる誘電体プリズム基板６と、この誘電体プリズム基板６の励起光９入射面とは異なる一面に成膜された金属薄膜２０と、金属薄膜２０上に形成された不撓性膜２１と、不撓性膜２１上に固定された一次抗体３と、一次抗体３を標識している第２の標識４と、不撓性膜２１に試料１が接するように試料１を保持する試料保持部７と、誘電体プリズム基板６に対して金属薄膜２０が形成されている側に配置された光検出器１０とを備えてなるものである。そして、図中には、試料１中に含まれる抗原２と、抗原２を標識している第１の標識５も同時に示している。
【００２３】
励起光９は、例えばレーザ光源等から得られる単波長光でも白色光源等から得られるブロード光でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。
【００２４】
光源８は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また必要に応じて、光源８は、励起光９を誘電体プリズム基板６と金属薄膜２０の界面２０ａに対して、この界面で全反射条件を満たすように誘電体プリズム基板６を通して入射させるために、励起光９を導光するためのミラーやレンズ等の導光系等を適宜組み合わせることができる。
【００２５】
誘電体プリズム基板６は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。誘電体プリズム基板６は樹脂から形成されたものが望ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより望ましい。
【００２６】
金属薄膜２０は、その薄膜材料として、特に制限はなく検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点から、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ等を用いることが望ましい。また、金属薄膜２０の堆積方法は、例えば、スパッタリング法、蒸着法、めっき法、金属コロイドを用いた塗布法やスプレー法などの各種の薄膜作製方法によって形成することができ、これらの方法は使用する材料に応じて適宜選択することができる。一方その膜厚も、特に制限はなく検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点から、２０ｎｍ〜６０ｎｍ の範囲にあることが望ましい。
【００２７】
不撓性膜２１は、その薄膜材料として、例えばシリコン酸化膜やポリマー材料等を用いることができる。この場合、特に成膜条件や表面処理条件等の観点からポリマー材料が望ましい。例えばこの場合、スピンコート等の簡便な方法により作成することができる。また、本発明のように不撓性膜２１が疎水性材料から形成されている場合には、試料液中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる因子が不撓性膜の内部にまで入り込むことが無く、これらの消光因子によって蛍光標識の励起エネルギーが奪われることが防止される。
【００２８】
不撓性膜２１の具体的な材料は、誘電体プリズム基板６に用いられている材料と比して線（熱）膨張係数の差が３５×１０−６以内にあるものを選択することが望ましく、例えば下記表１に挙げたものの中から適宜選択することができる。  
【表１】
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【００２９】
ここで、上記のように線（熱）膨張係数の差を３５×１０−６以内と規定したのは以下の理由による。
【００３０】
環境、特に温度の変動に対する安定性を高める上では、不撓性膜２１と誘電体プリズム基板６は互いに熱膨張係数が近い方が望ましい。つまり、それら両者の熱膨張係数が大きくかけ離れていると、温度変動が生じた際に両者の剥離や密着度の低下等の問題を招きやすい。具体的には、それら両者の線（熱）膨張係数の差が３５×１０−６以内の範囲にあることが望ましい。なお、不撓性膜２１と誘電体プリズム基板６との間には金属薄膜２０が存在しているが、この金属薄膜２０は温度変動が有ったとき、上下の不撓性膜２１と誘電体プリズム基板６に追随して伸縮するので、結局、不撓性膜２１と誘電体プリズム基板６の熱膨張係数が近い方が望ましいことに変わりは無い。以上の点を考慮すると、不撓性膜２１をポリマー材料から形成する場合、誘電体プリズム基板６の材料としても一般にはガラスより樹脂を選択する方がより望ましいと言える。
【００３１】
一方、不撓性膜２１の膜厚は１０ｎｍ〜１００ｎｍとする。ここで、上記膜厚の下限値および上限値をそれぞれ１０ｎｍ、１００ｎｍと規定したのは以下の理由による。
【００３２】
金属の近傍に存在する蛍光体は、金属へのエネルギー移動により消光を起こす。エネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。そして、金属薄膜の場合は、金属と蛍光体との間の距離は少なくとも 数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。これにより、本発明では不撓性膜の膜厚の下限値を１０ｎｍとする。一方、蛍光体は、エバネッセント光によって励起される。このエバネッセント光は、金属薄膜表面から高々励起光の波長程度であり、その電界強度は金属薄膜表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰することが知られている。実際に、波長６３５ｎｍの可視光について両者の関係を計算によって求めると、エバネッセント光が到達するのは波長（６３５ｎｍ）程度である。しかしながら、１００ｎｍを超えるとその電界強度が急激に減衰する。蛍光体を励起する電界強度は大きいほど望ましいので、効果的な励起を行なうためには、金属薄膜表面と蛍光体との距離を１００ｎｍより小さくすることが望ましい。それにより、本発明では不撓性膜の膜厚の上限値を１００ｎｍとする。
【００３３】
なお、ポリマーからなる不撓性膜２１を用いた場合、被検出物質２がタンパク等であれば容易に非特異的吸着しやすくなっている。これは、ポリマーとタンパク等が疎水性を有することに起因する疎水性効果による。この場合、非特異的吸着したタンパク等が蛍光検出を行う上で定量性を損なう要因となってしまうため、不撓性膜２１の表面に親水性表面修飾を施すことが望ましい。さらに、この表面修飾は上記のような機能の他に、特異的結合物質を固定するリンカーとしての機能も持たせることができる。
【００３４】
一次抗体３は、抗原２に対する特異的結合物質であり、第２の標識４で標識されている。使用する抗体は、特に制限なく、検出条件（特に被検出物質２）に応じて適宜選択することができる。例えば、抗原２がｈＣＧ抗原（分子量３８０００ Ｄａ）の場合、この抗原２と特異的に結合するモノクロナール抗体等を用いることができ、例えば末端をカルボキシル基化したＰＥＧを介して、アミンカップリング法により、ポリマーからなる場合の不撓性膜２１に固定することができる。上記アミンカップリング法は一例として下記（１）〜（３）のステップからなるものである。なおこれは、３０ｕｌ（マイクロ・リットル）のキュベット／セルを用いた場合の例である。
【００３５】
（１）リンカー部先端（末端）の−ＣＯＯＨ基を活性化
０．１ＭのＮＨＳと０．４ＭのＥＤＣとを等体積混合した溶液を３０ｕｌ加え、３０分間室温静置する。
【００３６】
NHS:N-hydrooxysuccinimide
EDC：1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
（２）一次抗体の固定化
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、一次抗体溶液（５００ｕｇ／ｍｌ）を３０ｕｌ加え、３０〜６０分間室温静置する。
【００３７】
（３）未反応の−ＣＯＯＨ基をブロッキング
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を３０ｕｌ加え、２０分間室温静置する。さらにＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄する。
【００３８】
試料保持部７は、試料１を検出部上（本実施形態において、より正確には不撓性膜２１上）に接するように保持でき、試料１中に含まれる標識から発せられる蛍光の検出を妨げないような形状や材料であれば特に制限されるものではない。蛍光を上方から検出する場合には、例えば図１ａ中に示すような、光を透過させない側面と光をよく透過させる上端面からなる試料保持部７等を用いることができる。ここで、光を透過させない側面を用いているのは、意図しない外部からの光を遮断するためである。
【００３９】
光検出器１０は、試料１中に含まれる標識が発する微弱な蛍光を定量的に検出するもので、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができる。しかしながら、これに限らず検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。また、光検出器１０は、検出条件に応じてフィルタや分光器等の分光手段と組み合わせて用いることができる。
【００４０】
そして、本実施形態による蛍光検出方法は、誘電体プリズム基板６と、この誘電体プリズム基板６上に形成された金属薄膜２０を含む検出部との界面２０ａに対し、励起光９を全反射条件を満たすように入射して、この界面２０ａ表面に発生したエバネッセント光２２と金属薄膜２０との共鳴により表面プラズモンを発生させ、検出部に供給された試料１中に含まれる物質が、表面プラズモンによって電場増強されたエバネッセント光２２を吸収して発する蛍光を光検出器１０によって検出する蛍光検出方法において、第１の標識５で標識された抗原２を試料１中に用意する工程（Ａ）と、第２の標識４で標識され、かつ抗原２と特異的に結合する一次抗体３を用意し、この一次抗体３を検出部上に固定する工程（Ｂ）と、工程（Ａ）及び（Ｂ）の後、第１の標識５と第２の標識４との距離を蛍光共鳴エネルギー移動Ｅが起きる程度にまで接近させるために、試料１を検出部に供給し、この試料１中に含まれる抗原２を一次抗体３と結合させる工程（Ｃ）と、工程（Ｃ）の後、上記接近した第１の標識５及び第２の標識４に対しエバネッセント光２２を照明することにより、第２の標識４を励起させ、この励起エネルギーを蛍光共鳴エネルギー移動Ｅにより第１の標識５に移動させて第１の標識５を励起させ、これによりこの第１の標識５から発せられる蛍光を検出することを特徴とするものである。なお、本実施形態では、第１の標識５がアクセプタとして機能し、第２の標識４がドナーとして機能している。
【００４１】
「蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）」とは、ドナーの蛍光スペクトルとアクセプタの吸収スペクトルに重なりがあり、かつそれらが近傍にある場合、ドナーを励起するとこの励起エネルギーがアクセプタに移動して、ドナーは基底状態に戻りアクセプタが励起される現象である（図６）。例えば、蛍光観察でよく用いられるＦＩＴＣの励起は４９０ｎｍ付近にピークがあり、蛍光は５２０ｎｍ付近にある（図６ａ）。このとき、励起波長が５２０ｎｍ近傍にある蛍光プローブ（蛍光  ５６０ｎｍ、図６ｂ）がＦＩＴＣに隣接して存在すれば，ドナーであるＦＩＴＣがエネルギーを吸収し励起しても、このエネルギーはアクセプタのプローブを励起するために吸い取られてしまう（図６ｃ）。これにより、ＦＩＴＣの蛍光である５２０ｎｍの光強度が減少する。一方、これとは逆にドナーのエネルギーを受け取り励起したアクセプタは、所定波長（５６０ｎｍ）の蛍光を放出して基底状態に戻るため、蛍光プローブの蛍光である５６０ｎｍの光強度が増加する。ドナーからアクセプタへのエネルギー移動の速度定数はドナー−アクセプタ間の距離の６乗に反比例するため、実際にＦＲＥＴが生じるのはドナー−アクセプタ間距離が１〜１０ｎｍ程度の距離になるときである。このようにＦＲＥＴは、（１）特定の条件を満たした場合に生じる、（２）励起波長に対して最終的に発せられる蛍光波長が大きくシフトするといった特徴がある。
【００４２】
第１の標識５及び第２の標識４は、前述の理由のためその組み合わせの選択は非常に重要である。ＦＲＥＴを生じさせる色素の組み合わせは、古くから研究されており、例えば特表平８−５０３９９４号公報の表１及び表２に数多く示されている。ただし、標識の組み合わせは、ＦＲＥＴを生じさせることが可能なものであれば、これらに限定されるものではない。また、第１の標識５を抗原２に標識する際は、抗体を介して標識するのではなく、化学的結合によりに直接標識することが望ましい。これにより、抗原２を一次抗体３に結合させる場合、余計な仲介物質を除いて第１の標識５及び第２の標識４の距離を近づけることができ、効率的にＦＲＥＴを生じさせることができる。なお、第１の標識５及び第２の標識４はどちらも、ドナー・アクセプタになり得る。この場合、ドナーとして機能するどちらか一方の標識は、有機色素、蛍光性量子ドット、及び金属微粒子より選ばれるいずれか１つの標識材料であり、アクセプタとして機能する他方の標識が、有機色素及び蛍光性量子ドットより選ばれるどちらか１つの標識材料であることが望ましい。
【００４３】
以下、図１ｂを用いながら本実施形態における作用を示す。図１ｂは、図１ａにおける検出部付近の拡大図である。
【００４４】
不撓性膜２１上には、抗原２と特異的に結合する一次抗体３が固定化されている。試料保持部７の中に第１の標識５に標識された試料１が供給され、試料１中の抗原２は一次抗体３に結合し固定される。その後、光源８から発せられる励起光９を、誘電体プリズム基板６と金属薄膜２０の界面２０ａに対して、この界面２０ａでの全反射条件を満たすように誘電体プリズム基板６を通し入射する。このとき、この界面２０ａ表面にエバネッセント光２２が発生し、このエバネッセント光２２と金属薄膜２０との共鳴により金属薄膜２０中に表面プラズモンが発生する。そして、抗原２と一次抗体３の結合によって接近した第１の標識５及び第２の標識４に対し、この表面プラズモンによる電場増強効果を受けて電場増強されたエバネッセント光２２を照明する。このとき、ドナーとして機能する第２の標識４がまず励起され、この励起エネルギーがＦＲＥＴにより、アクセプタとして機能する第１の標識５に移動（図１ｂ中のＥ）することによって、次に第１の標識５が励起する。結果的に、この励起した第１の標識５から所定波長の蛍光Ｌ２が発せられ、この蛍光Ｌ２を検出することによって抗原２の検出を行うことができる。
【００４５】
ここで、以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは第１の標識５であるが、基本的に前処理によって、この第１の標識５には抗原２が結合しているものと考えて、この第１の標識５の存在を確認することにより、間接的に抗原２の存在を確認している。
【００４６】
抗原２が不撓性膜２１上に非特異的に吸着している場合を考える。このとき、この非特異的に吸着している抗原２’の近傍には、一次抗体３は存在しない、すなわちこの抗原２’を標識している第１の標識５’（アクセプタ）の近傍１０ｎｍ以下に第２の標識４（ドナー）が存在していないことになる。これにより、励起エネルギーを供与されることがない第１の標識５’（アクセプタ）は励起されることがないため、特異的に結合し検出対象としている抗原２に対する蛍光信号のノイズを低減することができる。また、抗原２と結合していない一次抗体３’を標識している第２の標識４’（ドナー）は、励起光によってエネルギーを供与されるため励起され蛍光Ｌ１を発することになる。しかしながら、この蛍光Ｌ１を受け取る第１の標識５（アクセプタ）が近くに存在しないためにＦＲＥＴは起こらない。したがって、ドナー・アクセプタそれぞれの蛍光を分光することにより、これによる影響も同様に低減することができる。
【００４７】
そして図２に示すように、アクセプタが発する蛍光Ｌ２の波長は、励起波長及びドナーが発する蛍光Ｌ１の波長と異なるため、アクセプタが発する蛍光Ｌ２を分光して検出することが容易となり、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。さらに、アクセプタが発する蛍光量は抗原２の量によって変化するため、このアクセプタが発する蛍光量を解析することにより定量性の高い蛍光検出が可能となる。
【００４８】
また、一般的にＦＲＥＴは発生条件が厳しく効率が著しく低いため、高感度検出には不向きであるが、本発明による蛍光検出方法では、プラズモンによる電場増強効果を利用しているため、得られる蛍光信号量を増幅することができる。
【００４９】
さらに本実施形態においては、不撓性膜２１が形成されていることにより、第１の標識５から金属薄膜２０へエネルギー移動が起こり金属内でエネルギーが消失される、いわゆる金属消光を防止することができる。これにより、励起した第１の標識５から効率よく蛍光を得ることができる。
【００５０】
また、光検出器１０を、誘電体プリズム基板６に対して金属薄膜２０が形成されている側に配置することにより、検出する蛍光が金属薄膜２０中を通過する必要がなく、効率的に蛍光を検出することが可能となる。
【００５１】
以上により、ＦＲＥＴを利用して特異的な結合が起こった場合にのみ発せられる、波長がシフトした蛍光を検出することにより、非特異的吸着による影響を低減しＳ／Ｎ比を向上させ、高い定量性を有する蛍光検出が可能となる。
【００５２】
＜第２の実施形態＞
本実施形態で使用する蛍光検出装置は、図１ａに示す第１の実施形態で使用した装置と同じものである。ただし、本実施形態において、第１の標識５がドナーとして機能し、第２の標識４がアクセプタとして機能している。つまり、第１の実施形態における第１の標識５の機能と第２の標識４の機能とを交換したものに対応している。その他の構成は、第１の実施形態の場合と同様であり、図１ａに示す第１の実施形態と同等の要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。なお、励起光９はドナーに合わせ適宜選択するものとする。
【００５３】
本実施形態による蛍光検出方法は、工程（Ｃ）までは第１の実施形態と同様であり、その後、上記接近した第１の標識５及び第２の標識４に対しエバネッセント光２２を照明することにより、第１の標識５を励起させ、この励起エネルギーを蛍光共鳴エネルギー移動Ｅにより第２の標識４に移動させて第２の標識４を励起させ、これによりこの第２の標識４から発せられる蛍光Ｌ２を検出することを特徴とするものである（図３）。
【００５４】
本実施形態においては、図３に示すように、抗原２と一次抗体３の結合によって接近した第１の標識５及び第２の標識４に対し、表面プラズモンによる電場増強効果を受けて電場増強されたエバネッセント光２２を照明するとき、ドナーとして機能する第１の標識５がまず励起され、この励起エネルギーがＦＲＥＴ（図３中のＥ）により、アクセプタとして機能する第２の標識４に移動することによって、次に第２の標識４が励起する。結果的に、この励起した第２の標識４から所定波長の蛍光Ｌ２が発せられ、この蛍光Ｌ２を分光検出することによって抗原２の検出を行うことができる。
【００５５】
抗原２が不撓性膜２１上に非特異的に吸着している場合も、図３を用いて同様に考えることができる。このとき、この非特異的に吸着している抗原２’の近傍には、一次抗体３は存在しない、すなわちこの抗原２’を標識している第１の標識５’（ドナー）の近傍１０ｎｍ以下に第２の標識４（アクセプタ）が存在していないことになる。これにより、励起光によってエネルギーを供与された第１の標識５’（ドナー）は、励起されて蛍光Ｌ１を発することになるが、この蛍光を受け取る第２の標識４（アクセプタ）が近くに存在しないためにＦＲＥＴは起こらない。したがって、ドナー・アクセプタそれぞれの蛍光を分光することにより、特異的に結合し検出対象としている抗原２に対する蛍光信号のノイズを低減することができる。また、抗原２と結合していない一次抗体３’を標識している第２の標識４’（アクセプタ）は、励起エネルギーを供与されることがない。これにより、励起されて蛍光Ｌ２を発することがないため、これによる影響も同様に低減することができる。
【００５６】
以上により、第１の実施形態と同様な効果を得ることができる。
【００５７】
＜第３の実施形態＞
本実施形態で使用する蛍光検出装置は、図１ａに示す第１の実施形態で使用した装置において、一次抗体３を標識している第２の標識４として金属微粒子を用いたものである。また、本実施形態においても第１の実施形態と同様に、第１の標識５がアクセプタとして機能し、第２の標識４つまり金属微粒子がドナーとして機能しているものとする。その他の構成は、第１の実施形態の場合と同様であり、図１に示す第１の実施形態と同等の要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。なお、励起光９はドナーに合わせ適宜選択するものとする。
【００５８】
以下、図４を用いて説明する。
【００５９】
金属微粒子４は、所定波長の光を吸収するものであり、ＦＲＥＴの発生条件の観点から、Ａｕ及びＡｇのナノ粒子が望ましい。また、ＦＲＥＴを生じさせるアクセプタは、上記所定波長によって適宜選択することができる。
【００６０】
本実施形態による蛍光検出方法は、第１の実施形態と同様であるが、唯一の相違点は、金属微粒子４はエネルギーを吸収するが蛍光を発しない点である。
【００６１】
本実施形態において、図４に示すように、抗原２が不撓性膜２１上に非特異的に吸着している場合を考える。このとき、この非特異的に吸着している抗原２’の近傍には、一次抗体３は存在しない、すなわちこの抗原２’を標識している第１の標識５’（アクセプタ）の近傍１０ｎｍ以下に金属微粒子４（ドナー）が存在していないことになる。これにより、励起エネルギーを供与されることがない第１の標識５’（アクセプタ）は励起されることがないため、特異的に結合し検出対象としている抗原２に対する蛍光信号のノイズを低減することができる。また、抗原２と結合していない一次抗体３’を標識している金属微粒子４’（ドナー）は、励起光によってエネルギーを供与されるため励起されるが、金属微粒子４’自身は発光しない。したがって、蛍光を分光する必要なくこれによる影響も同様に低減することができる。
【００６２】
以上により、第１の実施形態と同様な効果を得ることができると共に、蛍光信号を分光する必要なく蛍光検出を容易にすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】（ａ）本発明による蛍光検出方法を実施するための装置の一例を概略的に示す部分断面図（ｂ）第１の実施形態における蛍光共鳴エネルギー移動過程を示す概略図
【図２】被検出物質の量と蛍光共鳴エネルギー移動によって得られる蛍光量との関係を示す概略図
【図３】第２の実施形態における蛍光共鳴エネルギー移動過程を示す概略図
【図４】第３の実施形態における蛍光共鳴エネルギー移動過程を示す概略図
【図５】一般的なプラズモン増強を利用した蛍光検出装置を概略的に示す部分断面図
【図６】蛍光共鳴エネルギー移動の概念図
【符号の説明】
【００６４】
１            試料
２            抗原
３            特異的結合物質
４            第２の標識
５            第１の標識
６            誘電体プリズム基板
７            試料保持部
８            光源
９            励起光
１０          光検出器
２０          金属薄膜
２０ａ        誘電体プリズム基板と金属薄膜との界面
２１          不撓性膜
２２          エバネッセント光
Ｅ            蛍光共鳴エネルギー移動
Ｌ１          ドナーから発せられる蛍光
Ｌ２          アクセプタから発せられる蛍光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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