(57)【要約】【課題】真核細胞及び原核細胞、好ましくは植物細胞及び無傷の植物における高効率遺伝子発現システムを提供することを本発明の課題とする。【解決手段】上記課題は、a)発現される所望のコード配列を挿入するためのエンドヌクレアーゼ制限部位の上流のRB47結合部位ヌクレオチド配列；及び、b)RB47結合部位と結合するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；を含むことを特徴とする、所望の分子を発現するための発現カセットを提供することによって解決された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載される発現カセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【化１】
2009183304.tif 000002
【背景技術】
【０００２】
【化２】
2009183304.tif 000003
【０００３】
【化３】
2009183304.tif 000004
【０００４】
【化４】
2009183304.tif 000005
【０００５】
【化５】
2009183304.tif 000006
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第5,234,834号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下を提供する。
【化６】
2009183304.tif 000007
【０００８】
【化７】
2009183304.tif 000008
【０００９】
【化８】
2009183304.tif 000009
【００１０】
【化９】
2009183304.tif 000010
【００１１】
【化１０】
2009183304.tif 000011
【００１２】
【化１１】
2009183304.tif 000012
【００１３】
【化１２】
2009183304.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｂは、残基１−４８８までのＲＢ６０の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２４１３までの対応する核酸配列と共に示され、この塩基１６−１６１４は、ＲＢ６０配列をコードしている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１０に示されている。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは、残基１−４８８までのＲＢ６０の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２４１３までの対応する核酸配列と共に示され、この塩基１６−１６１４は、ＲＢ６０配列をコードしている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１０に示されている。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ  ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ  ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ  ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図４】図４は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含むＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入のための領域、ＲＢ４７コード領域、ＲＢ６０コード領域、並びに転写終結点（ＴＳ）を含み複製起点及び選択マーカーが隣接している３’側フランキング領域を含む、発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、実施例４Ａに更に説明されている。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｂは、ヒスチジンタグをつけたＲＢ４７分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示していて、これは配列番号：１４としても示されている。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｂは、ヒスチジンタグをつけたＲＢ４７分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示していて、これは配列番号：１４としても示されている。
【図６】図６は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、ＲＢ４７コード領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｅに更に説明されている。
【図７】図７は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇに更に説明されている。
【図８】図８は、実施例４Ｇ１）において更に説明されている本発明の構築物によって発現された破傷風菌毒素の１本鎖抗体のウェスタンブロットである。
【図９】図９は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、翻訳終止コドンＴＡＡを含んでいる細菌のルシフェラーゼＡ及びＢタンパク質のコード配列の挿入のための領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇ２）に更に説明されている。
【図１０】図１０は、葉緑体中で発現された細菌性ルシフェラーゼタンパク質の蓄積を示しており、実施例４Ｇ２）に更に説明されている。
【図１１】図１１は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、二量体ＩｇＡ（ｄＩｇＡ）の異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇ３）に更に説明されている。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
【化１３】
2009183304.tif 000014
【化１４】
2009183304.tif 000015
【００１６】
【化１５】
2009183304.tif 000016
【００１７】
【化１６】
2009183304.tif 000017
【００１８】
【化１７】
2009183304.tif 000018
【００１９】
【化１８】
2009183304.tif 000019
【００２０】
【化１９】
2009183304.tif 000020
【００２１】
【化２０】
2009183304.tif 000021
【００２２】
【化２１】
2009183304.tif 000022
【００２３】
【化２２】
2009183304.tif 000023
【００２４】
【化２３】
2009183304.tif 000024
【００２５】
【化２４】
2009183304.tif 000025
【００２６】
【化２５】
2009183304.tif 000026
【００２７】
【化２６】
2009183304.tif 000027
【００２８】
【化２７】
2009183304.tif 000028
【００２９】
【化２８】
2009183304.tif 000029
【００３０】
【化２９】
2009183304.tif 000030
【００３１】
【化３０】
2009183304.tif 000031
【００３２】
【化３１】
2009183304.tif 000032
【００３３】
【化３２】
2009183304.tif 000033
【００３４】
【化３３】
2009183304.tif 000034
【００３５】
【化３４】
2009183304.tif 000035
【００３６】
【化３５】
2009183304.tif 000036
【００３７】
【化３６】
2009183304.tif 000037
【００３８】
【化３７】
2009183304.tif 000038
【００３９】
【化３８】
2009183304.tif 000039
【００４０】
【化３９】
2009183304.tif 000040
【００４１】
【化４０】
2009183304.tif 000041
【００４２】
【化４１】
2009183304.tif 000042
【００４３】
【化４２】
2009183304.tif 000043
【００４４】
【化４３】
2009183304.tif 000044
【００４５】
【化４４】
2009183304.tif 000045
【００４６】
【化４５】
2009183304.tif 000046
【００４７】
【化４６】
2009183304.tif 000047
【００４８】
【化４７】
2009183304.tif 000048
【００４９】
【化４８】
2009183304.tif 000049
【００５０】
【化４９】
2009183304.tif 000050
【００５１】
【化５０】
2009183304.tif 000051
【実施例】
【００５２】
【化５１】
2009183304.tif 000052
【００５３】
【化５２】
2009183304.tif 000053
【００５４】
【化５３】
2009183304.tif 000054
【００５５】
【化５４】
2009183304.tif 000055
【００５６】
【化５５】
2009183304.tif 000056
【００５７】
【化５６】
2009183304.tif 000057
【００５８】
【化５７】
2009183304.tif 000058
【００５９】
【化５８】
2009183304.tif 000059
【００６０】
【化５９】
2009183304.tif 000060
【００６１】
【化６０】
2009183304.tif 000061
【００６２】
【化６１】
2009183304.tif 000062
【００６３】
【化６２】
2009183304.tif 000063
【００６４】
【化６３】
2009183304.tif 000064
【００６５】
【化６４】
2009183304.tif 000065
【００６６】
【化６５】
2009183304.tif 000066
【００６７】
【化６６】
2009183304.tif 000067
【００６８】
【化６７】
2009183304.tif 000068
【図１Ａ】
2009183304.tif 000069
【図１Ｂ】
2009183304.tif 000070
【図１Ｃ】
2009183304.tif 000071
【図１Ｄ】
2009183304.tif 000072
【図２Ａ】
2009183304.tif 000073
【図２Ｂ】
2009183304.tif 000074
【図３Ａ】
2009183304.tif 000075
【図３Ｂ】
2009183304.tif 000076
【図３Ｃ】
2009183304.tif 000077
【図４】
2009183304.tif 000078
【図５Ａ】
2009183304.tif 000079
【図５Ｂ】
2009183304.tif 000080
【図６】
2009183304.tif 000081
【図７】
2009183304.tif 000082
【図８】
2009183304.tif 000083
【図９】
2009183304.tif 000084
【図１０】
2009183304.tif 000085
【図１１】
2009183304.tif 000086