(57)【要約】【課題】納豆のアンモニアの発生そのものを抑制し、かつ通常発酵は勿論、過発酵、再発酵時、或いは長期保存時においても、アンモニア臭の発生が極めて抑制される納豆をつくるアンモニア生産が抑制された納豆菌、及びそれを用いた納豆を提供する。【解決手段】本発明は、上記課題を解決するため、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属するＴＴＣＣ９９９菌株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１４９８）又はＴＴＣＣ１０００菌株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１４９９）を新たに作成した。さらに、前記何れかに記載のアンモニア生産が抑制された納豆菌を用いて、豆類を発酵させたことを特徴とする納豆の構成とすることで実現した。これにより、アンモニア臭が親株から作られた納豆、即ち従来の納豆に比べ、極めて低く抑制することができた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニン資化能が、低下又は欠損したことを特徴とするアンモニア生産が抑制された納豆菌。
【請求項２】
アルギニンを唯一炭素源、窒素源として、生育することができないことを特徴とするアンモニア生産が抑制された納豆菌。
【請求項３】
生育培地のアルギニン濃度が０．７％以上であることを特徴とする請求項２に記載の
アンモニア生産が抑制された納豆菌。
【請求項４】
前記納豆菌が、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属するＴＴＣＣ９９９菌株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１４９８）であることを特徴とする請求項１〜請求項３の何れかに記載のアンモニア生産が抑制された納豆菌。
【請求項５】
前記納豆菌が、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属するＴＴＣＣ１０００菌株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１４９９）であることを特徴とする請求項１〜請求項３の何れかに記載のアンモニア生産が抑制された納豆菌。
【請求項６】
大豆を３８℃〜４２℃で２４時間発酵（過発酵）し、納豆５０ｇを密閉容器（２．７Ｌ）に入れ、２５℃で３０分放置したときの密閉容器中のアンモニア濃度が５０ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求項１〜請求項５の何れかに記載のアンモニア生産が抑制された納豆菌。
【請求項７】
大豆を３８℃〜４２℃で１８時間発酵（通常発酵）し、続いて５℃で３日、１０℃で１２時間、２５℃で２４時間放置（再発酵）したときの納豆５０ｇを密閉容器（２．７Ｌ）に入れ、２５℃で３０分放置したときの密閉容器中のアンモニア濃度が５０ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求項１〜請求項６の何れかに記載のアンモニア生産が抑制された納豆菌。
【請求項８】
前記請求項１〜請求項７の何れかに記載のアンモニア生産が抑制された納豆菌を用いて、豆類を発酵させたことを特徴とする納豆。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、納豆から発生するアンモニア臭を従来のものより抑制された納豆菌、該菌を用いてアンモニア生産が抑制された納豆に関する。更に詳しくは、アルギニンを資化しないことにより、アルギニンを出発原料として生産されるアンモニアを低減させる納豆菌と、該菌を用いてアンモニア臭が軽減された納豆に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本古来より食されてきた納豆は、植物性蛋白質、食物繊維、カルシウム、鉄、ビタミン類等を豊富に含む栄養価の高い伝統的な健康食品として広く食されている。その一方で、臭いの強い発酵食品としても認知されている。
【０００３】
また、納豆製品は、流通過程において室温に放置された際、再び発酵が開始し、製品の劣化が著しく進むことがある。納豆業界においてこの現象は一般に、再発酵あるいは二次発酵と呼ばれる。そしてこの再発酵によってもアンモニア臭が強く感じられ、不快の原因の一つになっている。
【０００４】
このアンモニア臭は、納豆を好まない消費者が挙げる納豆を好まない理由で多い。そこでアンモニア臭を抑えた納豆の開発が期待されている。
【０００５】
このことからアンモニア臭を低減させる幾つかの試みがされてきた。例えは、特許文献１には、アンモニア臭及びムレ臭が少なく、かつ、糸引きのよい納豆が記載されている。特許文献１の納豆は、納豆製造時の大豆又は製造後の納豆にフルクトースポリマーを添加するものである。
【特許文献１】特開２００５−３３３８５６号公報
【０００６】
また、特許文献２には、納豆の発酵は充分に行えて品質の良好な納豆を製造でき、かつ、アンモニアの生産性が低下してアンモニア臭が少ない納豆を製造できる納豆菌を育種開発し、その納豆菌を用いて納豆を生産することにより、アンモニア臭が低下した品質の良好な納豆を生産する納豆菌、それを用いた納豆が記載されている。
【０００７】
特許文献２の納豆菌は、納豆菌のグルタミン合成酵素遺伝子を分離同定し、該遺伝子の発現を増強してグルタミン合成酵素の活性を増大させた納豆菌を取得し、好ましくは０.０１ユニット／ｍｇ蛋白質以上にまで該酵素活性が増大した納豆菌である。具体的にはＦＥＲＭ ＢＰ−１０４４６が挙げられている。
【特許文献２】特開２００７−１４３４６７号公報
【０００８】
さらに、特許文献３には、アンモニア含有量が少なく、かつガンマーポリグルタミン酸含有量が従来の納豆と変化ないか、それよりも多い品質改良納豆、その製造法、その製造に用いる納豆菌株が記載されている。
【０００９】
特許文献３の納豆菌株は、自然からからスクリーニング（段落００１１）、または変異処理し、アンモニア含量が低下した納豆菌を選択（段落００１１、００１３〜００１８）して得られる。具体的には、宮城野納豆菌株から得た受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４３９２（実施例１）の納豆菌株が挙げられている。
【特許文献３】特開平８−１５４６１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、特許文献１の納豆は、添加物（フルクトースポリマー）の添加により、アンモニア臭を選択的にフルクトースポリマーに吸着させて、アンモニア臭を低減（段落００３４）しているもので、根本的にアンモニア臭の発生を抑制しているとは言えない。従って、納豆の製造工程、コストは高くなってしまう。
【００１１】
また、特許文献２の納豆は、グルタミン合成酵素を活性化し、一旦生成されたアンモニアを再び消費することにより納豆中のアンモニア含量を低下させるものであり（段落００１０）、根本的にアンモニア発生の初期の段階に着目して、アンモニア臭の発生を抑制するものではない。また、組み換え遺伝子を導入した納豆菌であるため、納豆の製造に使用し、販売することはできない。
【００１２】
さらに、特許文献３のアンモニア量は、納豆、培養物を水に懸濁し、固形分を除き、遠心分離して得た上清中のアンモニア濃度（段落０００７）であり、菌体外に放出されるアンモニア量ではい。また、アンモニア臭の低下は、培養が終了した時点での含量であり、長期保存したときの値ではないとされる（段落００１０）。さらに、アンモニア含量が６５ｍｇ％（ｗ／ｗ）を超える場合は、保存中にアンモニアが増加して２００ｍｇ％（ｗ／ｗ）を超え、アンモニア臭が感じられるようになるとされる（段落００１２）。従って、過発酵、再発酵時においてはアンモニアの発生は抑制できないといえる。
【００１３】
そこで、本発明は、納豆のアンモニアの発生そのものを抑制し、かつ通常発酵は勿論、過発酵、再発酵時においても、アンモニア臭の発生が極めて抑制される納豆をつくるアンモニア生産が抑制された納豆菌、及びそれを用いた納豆を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するため、アルギニンを出発原料として生産されるアンモニアに注目し、鋭意研究を積み重ねた結果、アルギニン資化できない納豆菌を用いて納豆を製造することにより、納豆から発生するアンモニア臭を劇的に低下させることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１５】
即ち、本発明は、アルギニン資化能が、低下又は欠損したことを特徴とするアンモニア生産が抑制された納豆菌とし、アルギニンを唯一炭素源、窒素源として、生育することができないことを特徴とするアンモニア生産が抑制された納豆菌とし、生育培地のアルギニン濃度が０．７％以上であることを特徴とする前記記載のアンモニア生産が抑制された納豆菌とした。
【００１６】
さらに、前記納豆菌が、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属するＴＴＣＣ９９９菌株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１４９８）であることを特徴とするアンモニア生産が抑制された納豆菌とし、また前記納豆菌が、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属するＴＴＣＣ１０００菌株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１４９９）であることを特徴とするアンモニア生産が抑制された納豆菌とした。
【００１７】
より、具体的には、大豆を３８℃〜４２℃で２４時間発酵（過発酵）し、納豆５０ｇを密閉容器（２．７Ｌ）に入れ、２５℃で３０分放置したときの密閉容器中のアンモニア濃度が５０ｐｐｍ以下であることを特徴とする前記何れかに記載のアンモニア生産が抑制された納豆菌とし、また、大豆を３８℃〜４２℃で１８時間発酵（通常発酵）し、続いて５℃で３日、１０℃で１２時間、２５℃で２４時間放置（再発酵）したときの納豆５０ｇを密閉容器（２．７Ｌ）に入れ、２５℃で３０分放置したときの密閉容器中のアンモニア濃度が５０ｐｐｍ以下であることを特徴とする前記何れかに記載のアンモニア生産が抑制された納豆菌とした。
【００１８】
加えて、前記何れかに記載のアンモニア生産が抑制された納豆菌を用いて、豆類を発酵させたことを特徴とする納豆の構成とした。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、以上の構成であるから以下の効果が得られる。即ち、通常発酵は勿論、納豆の過発酵、再発酵、長期保存においても、人がアンモニア臭をはっきりと感じるといわれる５０ｐｐｍより低い４０ｐｐｍ以下のアンモニア臭の発生に留めた、従来と糸引き、旨みなど変わらない納豆を製造する納豆菌及びそれを用いて製造した納豆を提供することができる。さらに、アンモニア臭の発生が、極めて抑制されるため、発酵制御、流通温度などの制限が緩和され、容易に納豆の製造、販売が可能になる。
【００２０】
また、親株（市販の納豆から分離した納豆菌をＵＶ処理し、本発明の納豆菌を得ているため、本発明の納豆菌を用いて納豆の製造、販売を行うことができ、安全なアンモニア臭が抑制された納豆を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
納豆のアンモニアの発生そのものを抑制し、かつ通常発酵は勿論、過発酵、再発酵時、或いは長期保存時においても、アンモニア臭の発生が極めて抑制される納豆をつくるアンモニア生産が抑制された納豆菌、及びそれを用いた納豆を提供する目的を、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属するＴＴＣＣ９９９菌株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１４９８）であることを特徴とするアンモニア生産が抑制された納豆菌とし、又はバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属するＴＴＣＣ１０００菌株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１４９９）であることを特徴とするアンモニア生産が抑制された納豆菌の構成とすることで実現した。
【００２２】
具体的には、大豆を３８℃〜４２℃で２４時間発酵（過発酵）し、納豆５０ｇを密閉容器（２．７Ｌ）に入れ、２５℃で３０分放置したときの密閉容器中のアンモニア濃度が５０ｐｐｍ以下であることを特徴とする前記何れかに記載のアンモニア生産が抑制された納豆菌とし、また、大豆を３８℃〜４２℃で１８時間発酵（通常発酵）し、続いて５℃で３日、１０℃で１２時間、２５℃で２４時間放置（再発酵）したときの納豆５０ｇを密閉容器（２．７Ｌ）に入れ、２５℃で３０分放置したときの密閉容器中のアンモニア濃度が５０ｐｐｍ以下であることを特徴とする前記何れかに記載のアンモニア生産が抑制された納豆菌とした。
【００２３】
さらに、前記何れかに記載のアンモニア生産が抑制された納豆菌を用いて、豆類を発酵させたことを特徴とする納豆の構成とすることで実現した。これにより、アンモニア臭が親株に比べ、極めて低く抑制することができた。
【００２４】
ここで、納豆菌において、アルギニンを出発材料とするアンモニアが生成される機構の一部として、図１に示す経路があると考えられている。
【００２５】
そこで、発明者らは、納豆からのアンモニア臭の発生を抑制するため、アルギニン資化能が低下、又は欠損した納豆菌株を得ることを試みた。
【００２６】
アルギニン資化能が低下、又は欠損したとは、アルギニンを唯一の窒素源として、生育できないことを意味する。自然界からのスクリーニング、遺伝子組換え技術などにより得ることができる。
【００２７】
変異体とは、自然界に存在する納豆菌、市販の納豆菌を変異処理して得られた納豆菌であることを意味し、変異処理としては特に制限されるものではなく、従来の技術が使用できる。例えば、紫外線、ガンマ線照射など、ニトロソグアニジンなどの変異剤と接触させる方法が挙げられる。
【００２８】
このように、本発明では、アルギニン非資化性納豆菌株等であれば、その入手ないし育種又は作製の過程の如何にかかわらず使用することが可能である。
【実施例１】
【００２９】
以下、本発明であるアンモニア生産が抑制された納豆菌及びそれを用いて製造した納豆について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。先ず、アルギニン資化能が、低下又は欠損した納豆菌の作成について説明する。
【００３０】
［変異処理］
市販納豆（タカノフーズ(株)、商品名極小粒ミニ３）から分離した納豆菌を親株とした。
【００３１】
親株を肉汁培地で、３７℃、４時間培養し、集菌し、約１．０×１０６〜７個／ｍｌの菌体懸濁液にし、紫外線ランプ下（距離３０ｃｍ）に置き、紫外線を３．５分間照射した。その時の生存率は、約０．１％程度であった。
【００３２】
［一次スクリーニング］                                   
上記、変異処理を行った菌体懸濁液を、アルギニン培地（図２に示す選択培地から寒天を水に置き換えた培地）に投入し、３７℃で、３０分間培養（アンプリファイ）した。その後、アンピシリンを終濃度１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃において、一晩培養した（アンピシリン濃縮法）。
【００３３】
アンピシリンは菌の増殖時に作用する抗生物質で、アルギニンを資化できる菌のみを最初に増殖させて、アンピシリンによりアルギニンを資化できる菌を優先的に致死させる。また、アルギニンを資化できない菌（目的の菌）はこの工程中では増殖できず、増殖しないためにアンピシリンが作用せず、最後まで生き残り易い性質を利用して、本発明である納豆菌の濃縮を行った。
【００３４】
なお、図２に示すBact
Yeast Nitrogen Base W/O Amino Asids and 
Ammonium Sulfate (Difco、商品番号２３３５２０)は、酵母の窒素源、炭素源要求に基づく分類に用いられる培地であって、酵母の培養に必要な必須栄養素、ビタミン類が含まれている。しかし、アミノ酸、硫酸アンモニウム、炭素源は除かれている。
【００３５】
［二次スクリーニング］
続いて、一晩培養した菌体を集菌し、生理食塩水で菌体を洗浄し、アンピシリンの除去をおこなった。そして、少量の生理食塩水に培養菌体を懸濁し、図３に示す肉汁培地に塗布し、３７℃で、１６時間培養し、コロニーを形成させた。なお、このときコロニーは総量で２５５３８形成された。
【００３６】
続いて、形成されたコローを、図２のアルギニン培地、図３の肉汁培地にそれぞれ植菌し、肉汁培地のみで生育する菌株を選択した。このとき、８４株がアルギニン培地では生育しなかった。本発明の目的の菌株は、この８４株に含まれることとなる。
【００３７】
［三次スクリーニング］
このようにして得られた８４株について、以下に示す常法に従って納豆を、通常発酵（３８〜４２℃、１８時間）、過発酵（３８℃〜４２℃、２４時間）で作成した。その後以下の方法によってアンモニア臭を測定した。さらに、通常発酵の納豆を続いて５℃で３日、１０℃で１２時間、２５℃で２４時間放置（再発酵）し、同様にアンモニア臭を測定した。その結果、親株で作成した納豆に比べ、１０株にアンモニア臭の抑制が確認できた。その中でも大幅にアンモニア臭が抑制された納豆菌株２株が得られた。
【００３８】
それぞれ、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属するＴＴＣＣ９９９菌株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１４９８）、ＴＴＣＣ１０００菌株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１４９９）である。なお、これら菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託申請され、平成２０年２月１日付けで受託されている。
【００３９】
以下、納豆の製造方法について説明する。吸水させた原料大豆を高圧で蒸し、それぞれ納豆菌を接種した煮豆を発酵させるという工程で製造した。１５℃〜２０℃で１８〜１４時間浸漬した浸漬大豆を、加圧釜に入れ、２０分前後で蒸煮した。菌の接種は、納豆菌胞子を使用し、１０３〜１０４個 ／ 蒸煮大豆ｇになるように接種した。これを納豆用ＰＳＰ容器に充填した後、表面を有孔ポリエチレンフィルムで覆い、蓋をかぶせ、温度３８℃〜４２℃で上記所定時間発酵させた。
【００４０】
納豆におけるアンモニア濃度の測定は以下の方法で行った。品温を室温（２５℃）にし、よく攪拌した納豆５０ｇを直径９ｃｍのシャーレに取り、下記容器に入れ、一定時間放置した。
【００４１】
具体的には、蓋にチューブ（吸引口及び吸入口）を設置したプラスチック製のタッパー（内容量２．７リットル、長さ約２１ｃｍ、幅約１６ｃｍ、高さ約９ｃｍ）からなる容器に納豆を入れ、密閉し、室温（２５℃）で３０分放置した。
【００４２】
その後、容器を軽く振り容器内のアンモニアを均一にし、前記吸引口のチューブに気体採取器（(株)ガステック製）にセットしたアンモニア用ガステック検知管（（株）ガステック製、アンモニアＮｏ．３Ｌ、３Ｌａ、３Ｍ）をつなげ、気体採取器のハンドルを引き取扱い説明書に従いアンモニア濃度を測定した。なお、蓋に設置してあるチューブは測定時のみ開放し、それ以外のときはピンチコックで閉じておいた。
【００４３】
［変異株によって作られた納豆のアンモニア測定結果］
上記、納豆菌によって得られた納豆のアンモニア臭測定結果を図４に示す。今回得られた本発明であるＴＴＣＣ９９９菌株、ＴＴＣＣ１０００菌株から得られた納豆のアンモニア臭は、親株に比べ何れも、通常発酵後１０％、過発酵後約７％、再発酵後約２５％（４０）に抑制されていた。図４の結果から、本発明で得られた納豆菌は、従来の納豆にくらべ、大幅にアンモニア生産が抑制された納豆菌であることが分かる。なお、これら２株によってえられた納豆は、親株から得られた納豆と、アンモニア臭以外の性質は同等であった。
【００４４】
以上のことから、本発明の納豆菌株を用いて、納豆においてアルギニンを出発原料とするアンモニア臭の生産を抑制させた納豆を製造することができる。
【００４５】
また、本発明のアンモニア生産が抑制された納豆菌を用いて製造する納豆は、納豆菌として、本発明であるアンモニア生産が抑制された納豆菌を用いること以外の納豆の製造方法及び条件は、特に制限されるものではなく、適宜の方法及び条件を任意に使用することができる。本発明により、納豆の発酵過程において、アルギニンの分解を抑制して、アンモニア生産を抑えた納豆を製造し提供することができる。
【００４６】
即ち、本発明は、洗浄した原料大豆を水に浸漬した後、これを蒸煮し、これに本発明であるアンモニア生産が抑制された納豆菌を接種し、所定の容器に充填し、所定温度で発酵をさせる通常の納豆の製造方法で構わない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】アンモニア発生経路の一部を示す図である。
【図２】アルギニン平板培地の組成である。
【図３】肉汁平板培地の組成である。
【図４】アンモニア濃度測定結果である。
【図１】
2009213423.tif 000002
【図２】
2009213423.tif 000003
【図３】
2009213423.tif 000004
【図４】
2009213423.tif 000005