(57)【要約】【課題】短時間でより簡便、且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出可能な核酸プライマーセット、アッセイキットおよびB型肝炎ウィルスの薬剤耐性株の検出方法を提供する。【解決手段】プライマーセットを用いて試料溶液中のＢ型肝炎ウイルス核酸をＬＡＭＰ増幅し増幅産物を得る工程と、  前記増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせ、Ｂ型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程とを具備するＢ型肝炎ウィルスの薬剤耐株の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーを具備し、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の181位および204位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための、
FIPプライマーが配列番号３、BIPプライマーが配列番号４、F3プライマーが配列番号２７、B3プライマーが配列番号２８で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１、および
FIPプライマーが配列番号５、BIPプライマーが配列番号６、F3プライマーが配列番号２９、B3プライマーが配列番号３０で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット２、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の204位および236位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための、
FIPプライマーが配列番号７、BIPプライマーが配列番号８、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号３２で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット３、および
FIPプライマーが配列番号９、BIPプライマーが配列番号１０、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号３２で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット４、
FIPプライマーが配列番号７、BIPプライマーが配列番号１２１、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号１２３で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１１、および
FIPプライマーが配列番号９、BIPプライマーが配列番号１２２、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号１２４で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１２、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の236位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための
FIPプライマーが配列番号１５、BIPプライマーが配列番号１６、F3プライマーが配列番号３３、B3プライマーが配列番号３４で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット５、
FIPプライマーが配列番号１７、BIPプライマーが配列番号１８、F3プライマーが配列番号３５、B3プライマーが配列番号３６で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット６、
FIPプライマーが配列番号１９、BIPプライマーが配列番号２０、F3プライマーが配列番号３７、B3プライマーが配列番号３８で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット７、および
FIPプライマーが配列番号２１、BIPプライマーが配列番号２２、F3プライマーが配列番号３９、B3プライマーが配列番号４０で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット８、並びに、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の181位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための
FIPプライマーが配列番号２３、BIPプライマーが配列番号２４、F3プライマーが配列番号４１、B3プライマーが配列番号４２で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット９、および
FIPプライマーが配列番号２５、BIPプライマーが配列番号２６、F3プライマーが配列番号４３、B3プライマーが配列番号４４で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１０：
からなる群より少なくとも１セットが選択されることを特徴とするB型肝炎ウィルスの薬剤耐性株および非薬剤耐性株を検出するためのLAMP増幅用核酸プライマーセット。
【請求項２】
更に、ループプライマーとして、前記プライマーセット１または２に対して、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７のうち、少なくとも１の配列で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーを具備し、前記プライマーセット３または４に対して、配列番号４８および配列番号４９のうち少なくとも１の配列で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーを更に具備し、前記プライマーセット１１または１２に対して、配列番号１２５および配列番号１２６のうち少なくとも１の配列で示されるプライマーを更に具備することを特徴とする請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
プライマーセットを用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物と、B型肝炎ウイルスの薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび／または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせ、B型肝炎ウィルスの薬剤耐性株または非薬剤耐性株を検出する工程とを具備するB型肝炎ウィルスの薬剤耐株または非薬剤耐性株の検出方法であって、
前記プライマーセットは、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーを具備し、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の181位および204位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための、
FIPプライマーが配列番号３、BIPプライマーが配列番号４、F3プライマーが配列番号２７、B3プライマーが配列番号２８で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１、および
FIPプライマーが配列番号５、BIPプライマーが配列番号６、F3プライマーが配列番号２９、B3プライマーが配列番号３０で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット２、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の204位および236位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための、
FIPプライマーが配列番号７、BIPプライマーが配列番号８、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号３２で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット３、および
FIPプライマーが配列番号９、BIPプライマーが配列番号１０、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号３２で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット４、
FIPプライマーが配列番号７、BIPプライマーが配列番号１２１、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号１２３で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１１、および
FIPプライマーが配列番号９、BIPプライマーが配列番号１２２、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号１２４で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１２、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の236位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための
FIPプライマーが配列番号１５、BIPプライマーが配列番号１６、F3プライマーが配列番号３３、B3プライマーが配列番号３４で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット５、
FIPプライマーが配列番号１７、BIPプライマーが配列番号１８、F3プライマーが配列番号３５、B3プライマーが配列番号３６で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット６、
FIPプライマーが配列番号１９、BIPプライマーが配列番号２０、F3プライマーが配列番号３７、B3プライマーが配列番号３８で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット７、および
FIPプライマーが配列番号２１、BIPプライマーが配列番号２２、F3プライマーが配列番号３９、B3プライマーが配列番号４０で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット８、並びに、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の181位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための
FIPプライマーが配列番号２３、BIPプライマーが配列番号２４、F3プライマーが配列番号４１、B3プライマーが配列番号４２で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット９、および
FIPプライマーが配列番号２５、BIPプライマーが配列番号２６、F3プライマーが配列番号４３、B3プライマーが配列番号４４で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１０；
からなる群より少なくとも１セットが選択されることを特徴とするB型肝炎ウィルス薬剤耐性株または非薬剤耐株の検出方法。
【請求項４】
前記薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび／または前記非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブが、
配列番号５０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号５７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブからなる群より少なくとも１種選択されたプローブを具備するプローブ群１、
配列番号５８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号７５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブからなる群より少なくとも１種選択されたプローブを具備するプローブ群２、並びに
配列番号７６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号９０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号９１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号１３２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号１３３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号１３４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号１３５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号１３６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブからなる群より少なくとも１種選択されたプローブを具備するプローブ群３、
からなる群より、用いるプライマーセットに応じて、少なくとも１選択されるプローブ群であり、前記各々のプローブが全長１５塩基以上４５塩基以下であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーセットが、
FIPプライマーが配列番号３、BIPプライマーが配列番号４、F3プライマーが配列番号２７、B3プライマーが配列番号２８で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１、
FIPプライマーが配列番号５、BIPプライマーが配列番号６、F3プライマーが配列番号２９、B3プライマーが配列番号３０で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット２、
FIPプライマーが配列番号７、BIPプライマーが配列番号１２１、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号１２３で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１１、および
FIPプライマーが配列番号９、BIPプライマーが配列番号１２２、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号１２４で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１２
からなる群より少なくとも１選択されたプライマーセットであり、
前記薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび／または前記非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブが、
配列番号９３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号９６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号９９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１０５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１０８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１１３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１１７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１１９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１４７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１４９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１５２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１５５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１５７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１５８示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１６１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１６４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１６７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１６９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７９示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８４示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１９０示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１９２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１９３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、および配列番号１９５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブからなる群より少なくとも１種選択されたプローブを具備するプローブ群であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記増幅産物を得る工程は、前記プライマーセット１およびプライマーセット２を同時に用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し第1の増幅産物を得る工程と、
前記プライマーセット３およびプライマーセット４を同時に用いて試料溶液中のHBV核酸をLAMP増幅し、第2の増幅産物を得る工程を備え、
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程は、前記第1および第2の増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを有するプローブおよび／または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを有するプローブとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記増幅産物を得る工程は、前記プライマーセット１およびプライマーセット２を同時に用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し第1の増幅産物を得る工程と、
前記プライマーセット５およびプライマーセット６を同時に用いて試料溶液中のHBV核酸をLAMP増幅し、第2の増幅産物を得る工程を備え、
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程は、前記第1および第2の増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび／または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項８】
前記増幅産物を得る工程は、前記プライマーセット１およびプライマーセット２を同時に用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し第1の増幅産物を得る工程と、
前記プライマーセット７およびプライマーセット８を同時に用いて試料溶液中のHBV核酸をLAMP増幅し、第2の増幅産物を得る工程を備え、
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程は、前記第1および第2の増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび／または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項９】
前記増幅産物を得る工程は、前記プライマーセット３およびプライマーセット４を同時に用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し第1の増幅産物を得る工程と、
前記プライマーセット９およびプライマーセット１０を同時に用いて試料溶液中のHBV核酸をLAMP増幅し、第2の増幅産物を得る工程を備え、
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程は、前記第1および第2の増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび／または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅産物を得る工程は、前記プライマーセット１およびプライマーセット２を同時に用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し第1の増幅産物を得る工程と、
前記プライマーセット１１およびプライマーセット１２を同時に用いて試料溶液中のHBV核酸をLAMP増幅し、第2の増幅産物を得る工程を備え、
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程は、前記第1および第2の増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび／または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅産物を得る工程は、前記プライマーセット９およびプライマーセット１０を同時に用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し第1の増幅産物を得る工程と、
前記プライマーセット１１およびプライマーセット１２を同時に用いて試料溶液中のHBV核酸をLAMP増幅し、第2の増幅産物を得る工程を備え、
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程は、前記第1および第2の増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび／または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項１２】
請求項１または２のいずれかに記載のプライマーセットと、
B型肝炎ウィルスの薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび／または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとを具備することを特徴とするB型肝炎ウィルスの薬剤耐性株または非薬剤耐性株を検出するためのアッセイキット。
【請求項１３】
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび／または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブが、
配列番号５０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号５７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブからなる群より少なくとも１種選択されたプローブを具備するプローブ群１、
配列番号５８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号５９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号６３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号６９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号７５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブからなる群より少なくとも１種選択されたプローブを具備するプローブ群２、および
配列番号７６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号７９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号８９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号９０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号９１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号１３２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号１３３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号１３４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号１３５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号１３６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブからなる群より少なくとも１種選択されたプローブを具備するプローブ群３、
からなる群より、前記で選択されたプライマーセットに応じて、少なくとも１選択されるプローブ群を具備し、前記各々のプローブが全長１５塩基以上４５塩基以下であることを特徴とする請求項１０記載のアッセイキット。
【請求項１４】
前記プライマーセットが、
FIPプライマーが配列番号３、BIPプライマーが配列番号４、F3プライマーが配列番号２７、B3プライマーが配列番号２８で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１、および
FIPプライマーが配列番号５、BIPプライマーが配列番号６、F3プライマーが配列番号２９、B3プライマーが配列番号３０で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット２、
FIPプライマーが配列番号７、BIPプライマーが配列番号８、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号３２で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット３、および
FIPプライマーが配列番号９、BIPプライマーが配列番号１０、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号３２で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット４
FIPプライマーが配列番号７、BIPプライマーが配列番号１２１、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号１２３で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１１、および
FIPプライマーが配列番号９、BIPプライマーが配列番号１２２、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号１２４で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１２
からなる群より少なくとも１選択されたプライマーセットであり
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび／または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブが、
配列番号９３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号９６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号９９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１０５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１０８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１１３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１１７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１１９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１４７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１４９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１５２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１５５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１５７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１５８示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１６１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１６４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１６７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１６９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７９示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８４示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１９０示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１９２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１９３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、および配列番号１９５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブで示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブからなる群であることを特徴とする請求項１１記載のアッセイキット。
【請求項１５】
前記プライマーセットは、前記プライマーセット１、３、５、７、９、１１のうち少なくとも１セットであり、ジェノタイプがB型であるB型肝炎ウィルスの薬剤耐性を検出するためのものであることを特徴とするための請求項１記載のプライマーセット。
【請求項１６】
前記プライマーセットは、前記プライマーセット２、４、６、８、１０，１２のうち少なくとも１セットであり、ジェノタイプがC型であるB型肝炎ウィルスの薬剤耐性を検出するためのものであることを特徴とするための請求項１記載のプライマーセット。
【請求項１７】
ジェノタイプがB型であるB型肝炎ウィルスの薬剤耐性を検出するためのアッセイキットであり、
請求項１０に記載のプライマーセットと、
配列番号５０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号５１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号５２で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号５３で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号５４で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号５５で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号５６で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号５７で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号５８で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号５９で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号６０で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号６１で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号６２で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号６３で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号７６で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号７７で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号７８で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号７９で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号８０で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号８１で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号８２で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号８３で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号１３２で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号１３３で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号１３４で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号１３５で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、および配列番号１３６で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖を、それぞれに含み、全長１５塩基以上４５塩基以下であるプローブ群と
を具備することを特徴とするアッセイキット。
【請求項１８】
ジェノタイプがC型であるB型肝炎ウィルスの薬剤耐性を検出するためのアッセイキットであり、
請求項１１に記載のプライマーセットと、
配列番号５０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号５１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号５２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号５３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号５４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号５５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号５６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号５７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号６４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号６５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号６６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号６７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号６８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号６９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号７０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号７１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号７２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号７３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号７４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号７５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号８４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号８５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号８６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号８７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号８８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号８９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号９０で示されるポリヌクレオチドおよび配列番号９１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号１３２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号１３３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号１３４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号１３５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、および配列番号１３６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖をそれぞれ含み、全長１５塩基以上４５塩基以下であるプローブ群と
を具備することを特徴とするアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
薬剤耐性を示すHBVウィルスに特異的なアミノ酸配列をコードする塩基配列を検出するために用いられる核酸プライマーセット、アッセイキットおよびB型肝炎ウイルスの薬剤耐性株の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
HBV患者への治療方法のひとつとして、逆転写酵素阻害剤等、ＨＢＶ増殖を阻害する薬剤を投与する方法がある。このような薬剤は、DNA複製時に本来ならdCTPが結合する位置に対して結合し、逆転写酵素がdCTPを取り込もうとする作業を拮抗的に阻害する作用と、複製中の(−)鎖DNAに取り込まれる作用によりDNA鎖が伸長するのを阻害する作用によって、HBVの増殖を阻害する。
【０００３】
しかしながら、例えば、ラミブジンの長期投与を行った場合、あるアミノ酸領域（例えばYMDD領域）に変異を持つ、変異ウイルスが出現することがあり、この変異ウイルスはラミブジンに対して耐性があるため、ウイルス量の再上昇を引き起こすことが知られている（非特許文献１）。従って、薬剤耐性株の出現をモニタリングし、出現した場合は、薬剤の変更等、早急な対処が必要となる。薬剤耐性株の検出は、B型肝炎ウイルス(以下、HBVと記す）のDNAをPCRにより増幅し、シークエンス解析により、上記アミノ酸変異をコードする塩基配列を読む方法で行われている(非特許文献２)。しかしながら、より簡便な方法で薬剤耐性株を検出する方法が望まれている。
【非特許文献１】肝臓、47巻11号、499-502(2006)
【非特許文献２】Int.J.Med.Sci.2005 2(1)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記問題に鑑み、本発明は、短時間でより簡便、且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出可能な核酸プライマーセット、アッセイキットおよびB型肝炎ウィルスの薬剤耐性株の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するため、
本発明は、
プライマーセットを用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物と、B型肝炎ウイルスの薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび／または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせ、B型肝炎ウィルスの薬剤耐性株または非薬剤耐耐性株を検出する工程とを具備するB型肝炎ウィルスの薬剤耐株または非薬剤耐性株の検出方法であって、
前記プライマーセットは、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーを具備し、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の181位および204位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための、
FIPプライマーが配列番号３、BIPプライマーが配列番号４、F3プライマーが配列番号２７、B3プライマーが配列番号２８で示されるプライマーセット１、および
FIPプライマーが配列番号５、BIPプライマーが配列番号６、F3プライマーが配列番号２９、B3プライマーが配列番号３０で示されるプライマーセット２、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の204位および236位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための、
FIPプライマーが配列番号７、BIPプライマーが配列番号８、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号３２で示されるプライマーセット３、および
FIPプライマーが配列番号９、BIPプライマーが配列番号１０、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号３２で示されるプライマーセット４、
FIPプライマーが配列番号７、BIPプライマーが配列番号１２１、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号１２３で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１１、
FIPプライマーが配列番号９、BIPプライマーが配列番号１２２、F3プライマーが配列番号３１、B3プライマーが配列番号１２４で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１２
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の236位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための
FIPプライマーが配列番号１５、BIPプライマーが配列番号１６、F3プライマーが配列番号３３、B3プライマーが配列番号３４で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット５、
FIPプライマーが配列番号１７、BIPプライマーが配列番号１８、F3プライマーが配列番号３５、B3プライマーが配列番号３６で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット６、
FIPプライマーが配列番号１９、BIPプライマーが配列番号２０、F3プライマーが配列番号３７、B3プライマーが配列番号３８で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット７、および
FIPプライマーが配列番号２１、BIPプライマーが配列番号２２、F3プライマーが配列番号３９、B3プライマーが配列番号４０で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット８
並びに、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の181位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための
FIPプライマーが配列番号２３、BIPプライマーが配列番号２４、F3プライマーが配列番号４１、B3プライマーが配列番号４２で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット９、
FIPプライマーが配列番号２５、BIPプライマーが配列番号２６、F3プライマーが配列番号４３、B3プライマーが配列番号４４で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット１０；
からなる群より少なくとも１が選択されることを特徴とするB型肝炎ウィルス薬剤耐性株または非薬剤耐株の検出方法である。
【０００６】
を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、短時間でより簡便、且つ安価に且つ高感度にHBVの薬剤耐性株または非薬剤耐性株を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
HBVの薬剤耐性株は、一種の変異株である。当該薬剤耐性株は、HBVのポリメラーゼ領域のアミノ酸配列の181位、204位、または236位のアミノ酸が非薬剤耐性株（即ち、野生型株）とは異なる。このような変異は、HBVの遺伝子の変異に由来するものであり、また、当該変異部位は当該アミノ酸配列をコードする塩基配列の変異の存在による。従って、当該領域の塩基変異に基づく塩基多型を特定することによりHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、延いてはHBV感染患者などの対象からのHBVが薬剤耐性であるか、否かを判定することが可能である。
【０００９】
このような塩基変異に基づく塩基多型（以下「塩基多型」と表記する）の検出は、従来では主にPCR（Polymerase chain reaction）法より行われている。しかしながら、PCR法は核酸抽出などの前処理が煩雑である。また、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御が必須であり、さらに反応時間に2時間以上を要するなどの不都合がある。また、PCR法による増幅産物は2本鎖であるため、相補鎖が、検出の際にプローブに対するコンペティターとなり、検出感度を低下させるという問題があった。そこで、増幅産物を1本鎖にするため、酵素や磁気ビーズを用いて、相補鎖を分解または分離する方法がとられているが、いずれも操作が煩雑であり、また費用がかかるという問題がある。
【００１０】
よって、本発明では、PCR法に替わってLAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法を利用し、且つ増幅産物を核酸プローブとハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションを検知することにより塩基多型を検出する。
【００１１】
LAMP法とは、核酸を等温条件下60〜65℃で増幅する技術である。LAMP法はPCR法と比較して、短時間で多量の増幅産物が得られるという利点を有する。また、サンプル中の不純物の影響を受けにくいとも報告されている。LAMP法を用いることによって、簡便に標的核酸を増幅することが可能である。
【００１２】
増幅産物の検出は、これに限定されるものではないが、例えば核酸プローブを用いて測定することができる。核酸プローブは、本発明に従うLAMP増幅用プライマーにより増幅される領域を特異的に検出するプローブであればよい。核酸プローブは、野生型（即ち、非耐性株）の増幅産物、変異型（即ち、耐性株）の増幅産物にそれぞれ相補的であり、且つ相互の交差反応性がより低い核酸プローブを用い、増幅産物とそれぞれの核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせ、それぞれの核酸プローブに結合した増幅産物を検出する。野生型の核酸プローブに結合した増幅産物と、変異型の核酸プローブに結合した増幅産物をそれぞれ検出することにより、検体中のHBVウイルスが薬剤耐性型か否かを判定することができる。
【００１３】
＜LAMP法の概要＞
以下にLAMP法の概要を説明する。なお、本明細書では、塩基多型の検出に供される核酸を検体核酸と称する。また、本発明に従うLAMP増幅プライマーにより増幅されるHBVのポリメラーゼ領域の181位、204位、または236位のアミノ酸をコードする領域を含む核酸を標的核酸と称する。また、LAMP法によって得られた産物を増幅産物と称する。また、増幅の対象となるHBVを含む溶液を試料溶液と称する。
【００１４】
LAMP法では、標的核酸に対してその5’末端側から順にF3領域、F2領域、F1領域を設定し、3’末端側から順にB3c領域、B2c領域、およびB1c領域を設定する。そして、図１に示すような4種のプライマーを用いて標的核酸を増幅する。なお、F1c、F2c、F3c、B1、B2、およびB3領域はそれぞれ、F1、F2、F3、B1c、B2c、およびB3c領域の相補鎖における領域を示す。
【００１５】
LAMP法において核酸を増幅するために使用される4種のプライマーとは、（１）3’末端側に前記F2領域と同じ配列を有し、且つ5’末端側に前記F1領域と相補的な配列を有するFIPプライマー；（２）前記F3領域と同じ配列から成るF3プライマー；（３）3’末端側に前記B2c領域と相補的な配列を有し、且つ5’末端側に前記B1c領域と同じ配列を有するBIPプライマー；および、（４）前記B3c領域と相補的な配列から成るB3プライマーである。一般に、FIPプライマーおよびBIPプライマーはインナープライマーと呼ばれ、F3プライマーおよびB3プライマーはアウタープライマーと呼ばれる。
【００１６】
上記4種のプライマーを用いてLAMP増幅を行うと、図２に示すようなダンベル構造を有する中間産物が生成される。一本鎖ループ内のF2cおよびB2c領域にFIPおよびBIPプライマーが結合し、該プライマーの3’末端および中間産物自体の3’末端から伸長反応が進行する。詳細には、特許第3313358号を参照されたい。
【００１７】
LAMP法ではさらに、ループプライマー；（５）と呼ばれるさらなるプライマーを任意に用いることによって、増幅時間を短縮させることができる。この場合、図３に示すように、前記F2領域からF1領域にかけての部分においてLF領域を設定し、前記B2c領域からB1c領域にかけての部分においてLBc領域を設定する。これらはループプライマー領域と称する。そして、上記の４種のプライマーに加えて、LF領域と相補的な配列から成るループプライマーLFｃ、および上記LBｃ領域と同じ配列から成るループプライマーLBｃを用いる。詳細には、WO2002/0249028号を参照されたい。これらのループプライマーLFｃおよびLBｃは、同時に用いてもよいが、何れか一方のみを用いてもよい。ループプライマーは、図４に示すように、FIPおよびBIPプライマーがアニールするループとは別のループにアニールし、さらなる合成起点を与えることによって増幅を促進させる。
【００１８】
塩基多型を検出する場合は、検出される多型部位を図５に示すFP領域（F-Loop）またはBPc領域（B-Loop）に位置させる。或いは、FP領域およびBPc領域のそれぞれに異なる多型を位置させてもよい。図５に記載したように、F2領域からF1領域にかけての部分は、増幅産物中で一本鎖となる部分である。同様に、B2c領域からB1c領域にかけての部分も増幅産物中で一本鎖となる部分である。一本鎖である部分に検出すべき多型部位を位置させることによって核酸プローブとの反応効率が良く、核酸プローブによる検出を簡便にすることができる。
【００１９】
これらのプライマーの選択の詳細については後述する。
【００２０】
＜LAMP増幅産物の検出；核酸プローブ＞
核酸プローブは、多型部位を含むFP領域またはBPc領域と結合するように設計する。即ち、核酸プローブは、FP領域またはBPc領域のうち、多型部位を含む領域の配列と相補的な配列を有する。
【００２１】
なお、増幅産物中には、FP領域およびBPc領域とそれぞれ相補的なFPc領域およびBP領域も存在する。よって、これらのFPc領域およびBP領域を検出に利用することも可能である。
【００２２】
本明細書においては、野生型の増幅産物と相補的な配列を含む核酸プローブを野性型核酸プローブまたは非薬剤耐性プローブと称し、変異型の増幅産物と相補的な配列を含む核酸プローブを変異型核酸プローブまたは薬剤耐性プローブと称する。
【００２３】
核酸プローブは、特に限定されないが、DNA、RNA、PNA、LNA、メチルホスホネート骨格の核酸、その他の人工核酸鎖から構成されて良い。基体に固定化するために、末端をアミノ基、カルボキシル基、ヒドロシル基、チオール基、スルホン基などの反応性官能基で修飾してもよい。該官能基とポリヌクレオチドの間にスペーサーを導入することも可能である。スペーサーには、例えばアルカン骨格、エチレングリコール骨格などを用いることができる。
【００２４】
核酸プローブの長さは下限が１５塩基以上、上限が４５塩基以下である。より好ましくは１５塩基以上４０塩基以下、さらに好ましくは１８塩基以上３５塩基以下である。
【００２５】
＜核酸プローブ固定化基体＞
核酸プローブは、これに限定されないが、基体上に固定化して用いることができる。核酸プローブ固定化基体は、DNAチップ、DNAマイクロアレイと称されるそれ自身公知の装置を利用しても良い。
【００２６】
プローブ固定化基体の一実施態様の模式図を図６に示した。プローブは、基体１上の固定化領域２に固定化される。基体１は例えばシリコン基板などから製造することができるが、これに限定されない。プローブの固定化は、公知の手段によって行えばよい。1つの基体１に固定化されるプローブは１種でも複数種類であってもよく、その配置や数は当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。後述するように、プローブを蛍光検出する場合には、本実施態様のようなプローブ固定化基体を用いることができる。
【００２７】
プローブ固定化基体の他の実施態様の模式図を図７に示した。本実施態様においては、基体１１に電極１２が備えられる。プローブは電極１２に固定化される。電極１２は、電気的情報を取り出すためのパット１３に接続される。基体１１は例えばシリコン基板などから製造することができるが、これに限定されない。電極の製造およびプローブの固定化は、公知の手段によって行えばよい。電極は、特に限定されるものではないが、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウムおよびタングステン等の金属単体およびそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボンのような炭素、およびこれらの酸化物または化合物で製造することができる。
【００２８】
図７の固定化基体は１０個の電極を備えるが、これに限定されず、1つの基体に配置される電極の数は任意に変更できる。また電極の配置パターンも図に示したものに限定されず、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。基体１には、必要に応じて、参照電極および対極を設けても良い。後述するように、プローブを電気化学的に検出する場合には、本実施態様のようなプローブ固定化基体を用いることができる。
【００２９】
＜核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーション＞
核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションは適切な条件下で行う。適切な条件は、増幅産物の種類や構造、検出配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブの種類によって異なる。例えば、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。反応溶液中には、ハイブリダーゼション促進剤である硫酸デキストラン、並びにサケ精子DNA、牛胸腺DNAやEDTAおよび界面活性剤などを添加しても良い。反応温度は、例えば10℃〜90℃の範囲で行い、攪拌や振盪などで反応効率を高めても良い。反応後の洗浄には、例えばイオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００３０】
＜検出方法＞
前記基体に固定化されたプローブと増幅産物とがハイブリダイズすると2本鎖核酸が生じる。この2本鎖核酸は、電気化学的にまたは蛍光により検出することができる。
【００３１】
(a)電流検出方式
電気化学的に2本鎖核酸を検出する方法を説明する。この方法では、2本鎖核酸を特異的に認識する2本鎖認識体を用いる。2本鎖認識体の例には、例えば、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーターなどが含まれるが、これらに限定されない。更に、これらの物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾することも可能である。
【００３２】
2本鎖認識体の濃度はその種類によって異なるが、一般的には１ng/mL〜1mg/mLの範囲で使用する。この際には、イオン強度0.001〜5の範囲でpH5〜10の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００３３】
ハイブリダイゼーション反応中または反応後、反応溶液中に2本鎖認識体を添加する。ハイブリダイズによって2本鎖核酸が生じている場合は、2本鎖認識体がこれに結合する。そこで、例えば2本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加して、2本鎖認識体に由来する反応電流値を測定することができる。この際、電位は定速で印加するか、あるいは、パルスで印加するかあるいな定電位を印加してもよい。測定の際に、例えばポテンショスタット、デジタルマルチメーター、およびファンクションジェネレーターなどの装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。例えば特開平10-146183号公報に記載された公知の電気化学的検出手段が好適に用いられる。
【００３４】
(ｂ)蛍光検出法
蛍光によって２本鎖核酸を検出する方法を説明する。予め、プライマーを蛍光学的に活性な物質で標識しておく。または、蛍光学的に活性な物質で標識した2次プローブを用いて検出する。或いは、複数の標識を使用してもよい。蛍光学的に活性な物質は、これらに限定されないが、FITC、Cy3、Cy5、もしくはローダミンなどの蛍光色素を含む。蛍光物質は、例えば蛍光検出器を用いて検出される。標識の種類に応じた適宜の検出装置を用い、標識された検出配列または2次プローブを検出する。
【００３５】
＜核酸プライマーおよび核酸プローブの選択指針＞
図５に示すように、問題の塩基多型部位をB1cとB2cの間、すなわちBPc領域に位置させる場合、BIPプライマーは、B2c領域と相補的な配列、および、B1c領域と同じ配列を有するプライマーである。したがって、このB2c領域とB1c領域とが、問題の塩基多型部位を挟んで位置する限り、様々な種類のプライマーを設計し、目的の増幅産物を得ることが可能である。
【００３６】
同様に、問題の塩基多型部位をF2とF1の間、すなわちFP領域に位置させる場合、FIPプライマーは、F1領域と相補的な配列、および、F2領域と同じ配列を有するプライマーである。したがって、このF1領域とF2領域とが、問題の塩基多型部位を挟んで位置する限り、様々な種類のプライマーを設計し、目的の増幅産物を得ることが可能である。
【００３７】
しかしながら、プライマーの種類によってLAMP法の増幅効率が異なることが、本発明者らの研究によって明らかとなった。例えば、後述する表１、表２および表３に4種のプライマーを例示する。それらのプライマー（FIP、BIP、F3、およびB3プライマー）を使用して増幅する。その結果、何れもスムーズに且つ短時間で増幅が終了する。従って、これらのプライマーは増幅のための良好なプライマーである。
【００３８】
さらに、増幅産物を、核酸プローブを用いて検出する場合には、増幅産物と核酸プローブとのハイブリダイゼーションが、高効率で生じることが必要である。よって、ハイブリダイゼーションの効率が優れた増幅産物であるかどうかも、上記プライマーを評価する際に考慮される。
【００３９】
塩基多型を間に挟まないもう一方のインナープライマーについては、F2からB2までの長さが450bp以下、より好ましくは350bp以下となる領域に設計することが好ましい。また、1本鎖ループの長さは、100bp以下、より好ましくは70bp以下となるように両インナープライマーを設計することが好ましい。
【００４０】
プライマー同士の非特異的な増幅はLAMP反応でしばしば見られる現象である。FIPプライマーはF1c領域とF2領域を含むため、長鎖の核酸となる。同じくBIPプライマーもB1c領域とB2領域を含むため、長鎖の核酸となる。よって、FIPプライマー同士、BIPプライマー同士、またはFIPプライマーとBIPプライマーが互いに絡み合い、プライマーを鋳型として増幅してしまう確率が高くなる。また、LAMP反応は、F3プライマー、B3プライマー、さらに場合によってはLFcプライマー、LBcプライマーも反応液中に存在するため、PCR反応と比較して非特異反応の確率はさらに高くなる。このような非特異反応が発生すると、検体核酸を鋳型とする所望のLAMP産物の量が低下する。
【００４１】
＜核酸プライマーおよび核酸プローブの設計＞
以上を踏まえて、本発明に従うLAMP増幅用核酸プライマーおよびその増幅産物を検出するための核酸プローブの塩基配列の設定は、以下のように行った。まず、基準配列をデータベースを基に設定した。まず、遺伝子配列情報データベースであるGenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov./Genbank/index.html)から、B型およびC型のHBVの配列情報を入手した。図８および図９に、当該設定に使用した配列の受諾番号(Accession No.)を示す（図８および図９）。
【００４２】
次に、HBVのB型およびC型のそれぞれについて、アラインメント解析を行い、各塩基配列位置について最も高い頻度で存在ずる塩基を基準配列とした。基準配列を、B型については図１０に、C型については図１１に示した。この基準配列を基に、本発明に従うプライマーセット１〜１２の１２種のプライマーセットおよび核酸プローブの塩基配列を決定した。
【００４３】
＜プライマーの設計＞
[FIPプライマー（１）とBIPプライマー（３）]
まず、FIPプライマーとBIPプライマーを決定した。表１に、HBV薬剤耐性株検出用の１２種の核酸プライマーセットのFIPプライマーおよびBIPプライマーを示す。
【表１】
2009213465.tif 000002
【００４４】
表中、「SET No.」は、プライマーセット番号を示し、「FIP or BIP」は、FIPプライマーであるかBIPプライマーであるかを示し、「SEQ.ID.NO.」は各プローブに割り当てた配列番号を示し、「対象Type」はそのプライマーがHBVのB型またはC型の何れを検出対象とするかを示し、「検出対象」は、対象となる塩基変異部位を含む核酸が何位のアミノ酸に該当するかを示した。このようなFIPプライマーおよびBIPプライマーを使用することにより、検出対象アミノ酸をコードする塩基多型部位をループ内部にもつ、LAMPの増幅産物(一般的には、ターゲット核酸、ターゲットDNAとも称する)を得ることができる。
【００４５】
プライマーセット１〜４、１１、１２は表１に示したように検出対象となる塩基多型が２箇所である。すなわち、試料核酸の増幅により２箇所の塩基多型を含む増幅産物が得られる。例えば、プライマーセット１ではF-Loopに181位の多型、B-Loopに204位の多型を含む増幅産物が得られる。一方、プライマーセット５〜１０はいずれも表１に示したように検出対象となる塩基多型が１箇所である。
【００４６】
図１２に、例えばプライマーセット１〜４に対応する配列領域、検出対象アミノ酸の相対的な位置関係を示した。
【００４７】
四角で囲んだ３塩基がそれぞれ検出対象アミノ酸をコードするコドン領域である。プライマーセット１では四角に「GCT」と記した領域が181位のアミノ酸をコードする領域である。同様に四角に「ATG」と記した領域が204位のアミノ酸をコードする領域である。プライマーセット２では、四角に「GCT」と記した領域が181位のアミノ酸をコードする領域であり、四角に「ATG」と記した領域が204位のアミノ酸をコードする領域である。プライマーセット３では、四角に「AAC」と記した領域が236位のアミノ酸をコードする領域である。プライマーセット４では、四角に「AAC」と記した領域が236位のアミノ酸をコードする領域である。
【００４８】
また、一重下線は、インナープライマー（FIPとBIP）設計時に使用したF2、B2領域を示し、二重下線は、インナープライマー（FIPとBIP）設計時に使用したF1、B1領域の配列を示している。
【００４９】
ここで、表１に示したプライマーは、そこに記載されたプライマーのプライマーとしての機能を維持できる限りにおいて、当該多型塩基の位置の以外の位置にある塩基が一部置換されてもよく、当該多型塩基の位置以外の部位に更なる塩基が付加されてもよく、また、当該多型塩基の位置以外の部位の塩基が一部欠失してもよい。
【００５０】
[F3プライマー（２）および B3プライマー（４）]
F3およびB3プライマーは、F2領域の5’末端より上流の領域、B2c領域の3’末端より下流の領域に結合する配列を有するものであればよい。表１に示す各プライマーセットに対して表２に記載する配列を、F3 および B3プライマーセットとして使用する。
【表２】
2009213465.tif 000003
【００５１】
表中、「Primer No.」はプライマー番号を示し、「F or B」は、当該プローブがF3プライマーであるか、B3プライマーであるかの識別を示し、「プライマー配列」は各プライマーの塩基配列を示し、「SEQ.ID.NO.」は各プライマーに割り当てた配列番号を示し、「対象プライマーセット」はそれぞれが組み合わせるのに適切な表１のプライマーセット番号を示した。
【００５２】
ここで、表２に示したプライマーは、そこに記載されたプライマーのプライマーとしての機能を維持できる限りにおいて、当該多型塩基の位置の以外の位置にある塩基が一部置換されてもよく、当該多型塩基の位置以外の部位に更なる塩基が付加されてもよく、また、当該SNPの位置以外の部位の塩基が一部欠失してもよい。
【００５３】
[ループプライマー（５）]
増幅効率の向上を目的として、各プライマーセットにループループプライマーを添加してもよく、本発明に従うと、例えば、表３に記載する配列をループプライマーとして使用してよい。
【表３】
2009213465.tif 000004
【００５４】
表中、「Primer No.」はプライマー番号を示し、「F or B」は、当該プローブがFのループプライマーであるか、Bのループプライマーであるかの識別を示し、「プライマー配列」は各プライマーの塩基配列を示し、「SEQ.ID.NO.」は各プローブに割り当てた配列番号を示し、「対象プライマーセット」はそれぞれが組み合わせるのに適切な表１のプライマーセット番号を示した。
【００５５】
ここで、表３に示したプライマーは、そこに記載されたプライマーのプライマーとしての機能を維持できる限りにおいて、当該多型塩基の位置の以外の位置にある塩基が一部置換されてもよく、当該多型塩基の位置以外の部位に更なる塩基が付加されてもよく、また、当該多型塩基の位置以外の部位の塩基が一部欠失してもよい。
【００５６】
＜プローブの設計＞
図１０および図１１に示した各々の基準配列を元にプローブの設計を行なった。四角で囲んだ３塩基がそれぞれ変異部位である181位、204位、または236位のアミノ酸をコードするコドン領域の位置である。塩基変異に基づいて四角で囲んだ３塩基の配列は当然異なったものとなる。本発明で使用される核酸プローブは、B型、C型の181位、204位、または236位の対象アミノ酸に対応するプローブをその希望する検出対象に応じて選択して用いる。
【００５７】
本発明に使用するプローブ配列に必須の配列領域の例を表４に示す。
【表４−１】
2009213465.tif 000005
【００５８】
【表４−２】
2009213465.tif 000006
【００５９】
【表４−３】
2009213465.tif 000007
【００６０】
【表５−１】
2009213465.tif 000008
【００６１】
【表５−２】
2009213465.tif 000009
【００６２】
【表５−３】
2009213465.tif 000010
表中、「Probe No.」はプローブ番号を示し、「対象アミノ酸No.」は、検出の対象となる変異部位である181位、204位、または236位の識別を示し、「対象Type」はHBVのB型、C型の識別を示し、「アミノ酸」は、当該検出対象アミノ酸の種類を示し、「薬剤耐性」は非耐性プローブ（即ち、非薬剤耐性プローブ）であるか、耐性プローブ（即ち、薬剤耐性プローブ）であるかを示し、「塩基配列」は各プローブに必須の塩基配列を示し、「SEQ.ID.NO.」は各プローブに割り当てた配列番号を示した。なお、表４において、＊のついた配列は、図１０または図１１に記載された基準配列と同様の塩基配列である。
【００６３】
さらに、本発明の核酸プローブは、上記表４に示される塩基配列またはその相補鎖を含む全長１５塩基以上４５塩基の核酸鎖である。上記「表４に示される塩基配列またはその相補鎖を含む全長１５塩基以上４５塩基の核酸鎖」について、さら詳細に説明すると、B型検出用プローブの場合は、図１０に示した基準配列、C型検出用プローブの場合は図１１に示した基準配列のうち連続する１５塩基以上４５塩基以下の塩基配列であって、かつ波線部の部分が表４に示した各配列に置換した塩基配列またはその相補鎖からなるものであることが望ましい。
【００６４】
また、表４に示される配列またはその相補鎖を含む核酸鎖のうち、より好ましい配列を表５に示す。
【００６５】
表５に示される配列のうち配列番号９２〜１２０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブは、検出条件を限定した際に、検体のウィルスDNAのポリメラーゼ204位のアミノ酸をコードする塩基配列が、薬剤耐性を示すものであるか、薬剤非耐性を示すものであるかを、より効率的に識別することができるプローブ配列である。特に各プローブDNAを固層に固定し、このプローブに標的核酸（ウィルスDNAからプライマーセット１〜４、１１、１２のいずれかを用いて増幅されたLAMP産物）を反応させ、0.2×SSC溶液中で、37℃で洗浄工程を行うことを仮定した場合、配列番号９３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号９６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号９９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１０５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１０８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１１３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１１７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１１９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブを用いた場合に、ポリメラーゼ204位のアミノ酸をコードする塩基配列を明確に識別することが可能であり、好ましい。
【００６６】
表５に示される配列のうち配列番号１４７〜１６７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブは、検出条件を限定した際に、検体のウィルスDNAのポリメラーゼ236位のアミノ酸をコードする塩基配列が、薬剤耐性を示すものであるか、薬剤非耐性を示すものであるかを、より効率的に識別することができるプローブ配列である。特に各プローブDNAを固層に固定し、このプローブに標的核酸（ウィルスDNAからプライマーセット３、４、５、６、７，８、１１、１２のいずれかを用いて増幅されたLAMP産物）を反応させ、0.2×SSC溶液中で、37℃で洗浄工程を行うことを仮定した場合、配列番号１４７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１４９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１５１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１５５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１５７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１５８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１６１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１６４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、および配列番号１６７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブを用いた場合に、ポリメラーゼ236位のアミノ酸をコードする塩基配列を明確に識別することが可能であり、好ましい。
【００６７】
表５に示される配列のうち配列番号１６８〜１９６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブは、検出条件を限定した際に、検体のウィルスDNAのポリメラーゼ181位のアミノ酸をコードする塩基配列が、薬剤耐性を示すものであるか、薬剤非耐性を示すものであるかを、より効率的に識別することができるプローブ配列である。特に各プローブDNAを固層に固定し、このプローブに標的核酸（ウィルスDNAからプライマーセット１，２、９、１０のいずれかを用いて増幅されたLAMP産物）を反応させ、0.2×SSC溶液中で、37℃で洗浄工程を行うことを仮定した場合、配列番号１６９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１７９で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８４で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１８８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１９０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１９２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号１９３で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、および配列番号１９５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブを用いた場合に、ポリメラーゼ181位のアミノ酸をコードする塩基配列を明確に識別することが可能であり、好ましい。
【００６８】
なお、表４または表５に示した配列は、そこに本発明で使用されるプローブとしての機能を維持できる限りにおいて、当該多型塩基の位置の以外の位置にある塩基が一部置換されてもよく、当該多型塩基の位置以外の部位に更なる塩基が付加されてもよく、また、当該多型塩基の位置以外の部位の塩基が一部欠失してもよい。
【００６９】
各プローブは、３箇所、即ち、181位、204位、または236位の対象アミノ酸に対応するプローブをその希望する検出対象に応じて選択して用いてよく、当該多型塩基の箇所に異なる塩基を具備する複数のプローブを同時に使用することが好ましい。例えば、204位の対象アミノ酸をコードする塩基多型を検出する場合、配列番号５０〜５７、配列番号９２〜１２０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ（プローブ群１）を使用する。また、B型とC型の236位の対象アミノ酸をコードする塩基多型をそれぞれ検出する場合、配列番号５８〜７５、配列番号１４７〜１６７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ（プローブ群２）を使用する。B型とC型の181位の対象アミノ酸をコードする塩基多型を検出する場合、配列番号７６〜９１、配列番号１３２〜１３６、配列番号１６８〜１９６で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ（プローブ群３）を使用する。B型およびC型の181位、204位、または236位の対象アミノ酸をコードする塩基多型を検出する場合、プローブ群１〜３を同時に使用する。
【００７０】
上記データベースの配列情報は、追加登録される可能性があること、また、ある特定集団の均一な塩基頻度を示している保証は無いため、経時的に、または、対象集団により、基準配列の変更が想定される。従って、上記基準配列は、暫定的な配列であり、配列情報の変更に伴い、表１から表５に記載の配列も変更することが望ましい。これを考慮し、上記配列に対して、80%程度以上の相同性を有するか、または、HBVに対して増幅反応が生じる程度の相同性があれば良い。核酸プライマー、核酸プローブに使用する塩基配列の範囲については、表１から表４の配列を含むものであれば、その一部を削除した塩基数の少ない配列、または、基準範囲を参照して得られる周辺の配列を加えた、塩基数の多い配列でもよい。また、高頻度の変異が存在する場合、タイプ特異的な変異が存在する場合などは、核酸プライマー配列、核酸プローブ配列にミックス塩基（即ち、複数種塩基の混合）、修飾塩基を入れることも可能である。
【００７１】
＜各プライマーセットの使用について＞
当該プライマーセット１〜１２を用いて検体核酸をLAMP増幅する際には、検出を行なうジェノタイプや多型塩基の種類に応じて、プライマーセット１〜１２を単独で、または、プライマーセット１〜１２から選択される複数のプライマーセットを組み合わせて混合して、増幅を実施しても良い。
【００７２】
すなわち、当該プライマーセット１〜１２は、181位、204位および236位を全て検出するように複数のプライマーセットを組み合わせて使用しても、また、181位、204位または236位の少なくとも１箇所を検出するように単独で、若しくは複数のプライマーセットを組み合わせて使用しても良い。また、当該プライマーセット１〜１２は、ジェノタイプB型およびC型の両方を検出するように複数のプライマーセットを組み合わせて使用しても、また、B型またはC型の何れか一方を検出するように単独で若しくは複数のプライマーセットを組み合わせて使用してもよい。
【００７３】
複数のプライマーセットの組み合わせ方としては、その目的に応じてジェノタイプ同じのもの、あるいは、検出対象の塩基多型が同じもの、さらには検出対象の塩基多型とその位置（F-Loop or B-Loop）が同じものの組み合わせ等があるが、増幅効率や検出効率の向上などを考慮すると、検出対象の塩基多型とその位置（F-Loop or B-Loop）が同じもの同士を組み合わせることが望ましい。例えば、プライマーセット１と２、プライマーセット３と４、プライマーセット５と６、プライマーセット７と８、プライマーセット９と１０、プライマーセット１１と１２などの組み合わせは、検出対象の塩基多型とその位置（F-Loop or B-Loop）が同じであるプライマーセット同士の組み合わせである。
【００７４】
なお、複数のジェノタイプ若しくは異なる塩基多型を検出するために、上記のプライマーセット１〜１２を単独若しくは複数用いて別個にLAMP増幅を行なった後、さらに別個に行なった増幅で得られた増幅産物を混合し、核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応に供しても良い。
【００７５】
検出対象がB型、C型の181位、204位、および236位であり増幅効率および検出効率が良好な望ましい形態例としては、
（A）プライマーセット１と２（検出対象：B型、C型、181位、204位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得（第１の増幅産物）、また別個にプライマーセット３と４（検出対象：B型、C型、204位、236位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得（第２の増幅産物）、さらに第１および第２の増幅産物を混合し、この混合物を、B型、C型の181位、204位、および236位検出用プローブとのハイブリダイゼーションに供する。
【００７６】
（B）プライマーセット１と２（検出対象：B型、C型、181位、204位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得（第１の増幅産物）、また別個にプライマーセット５と６（検出対象：B型、C型、236位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得（第２の増幅産物）、さらに第１および第２の増幅産物を混合し、この混合物を、B型、C型の181位、204位、および236位検出用プローブとのハイブリダイゼーションに供する。
【００７７】
（C）プライマーセット１と２（検出対象：B型、C型、181位、204位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得（第１の増幅産物）、また別個にプライマーセット７と８（検出対象：B型、C型、236位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得（第２の増幅産物）、さらに第１および第２の増幅産物を混合し、この混合物を、B型、C型の181位、204位、および236位検出用プローブとのハイブリダイゼーションに供する。
【００７８】
（D）プライマーセット１と２（検出対象：B型、C型、181位、204位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得（第１の増幅産物）、また別個にプライマーセット１１と１２（検出対象：B型、C型、204位、236位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得（第２の増幅産物）、さらに第１および第２の増幅産物を混合し、この混合物を、B型、C型の181位、204位、および236位検出用プローブとのハイブリダイゼーションに供する。
【００７９】
（E）プライマーセット３と４（検出対象：B型、C型、204位、236位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得（第１の増幅産物）、また別個にプライマーセット９と１０（検出対象：B型、C型、181位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得（第２の増幅産物）、さらに第１および第２の増幅産物を混合し、この混合物を、B型、C型の181位、204位、および236位検出用プローブとのハイブリダイゼーションに供する。
【００８０】
（F）プライマーセット９と１０（検出対象：B型、C型、181位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得（第１の増幅産物）、また別個にプライマーセット１１と１２（検出対象：B型、C型、204位、236位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得（第２の増幅産物）、さらに第１および第２の増幅産物を混合し、この混合物を、B型、C型の181位、204位、および236位検出用プローブとのハイブリダイゼーションに供する。
【００８１】
＜例＞
本発明に従うLAMP増幅用核酸プライマーセットの例およびプローブセットの例を以下に示す。
【００８２】
＜例１＞（プライマーセット１、２、３、４の使用）
当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーからなり、二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号３で示されるプライマー、配列番号５で示されるプライマー、配列番号７で示されるプライマーおよび配列番号９で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号４で示されるプライマー、配列番号６で示されるプライマー、配列番号８で示されるプライマーおよび配列場号１０で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号２７で示されるプライマー、配列番号２９で示されるプライマーおよび配列番号３１で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号２８で示されるプライマー、配列番号３０で示されるプライマーおよび配列番号３２で示されるプライマーを含む
プライマーセットであってよい。
【００８３】
更に、ループプライマーセットを同時に使用してもよく、上記の場合、ループプライマーとして使用するのに好ましい組み合わせは、配列番号４５で示されるプライマーおよび／または配列番号４６で示されるプライマー、および配列番号４７で示されるプライマー、並びに配列番号４８で示されるプライマーおよび配列番号４９で示されるプライマーである。
【００８４】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、配列番号６４で示されるプローブ、配列番号６５で示されるプローブ、配列番号６６で示されるプローブ、配列番号６７で示されるプローブ、配列番号６８で示されるプローブ、配列番号６９で示されるプローブ、配列番号７０で示されるプローブ、配列番号７１で示されるプローブ、配列番号７２で示されるプローブ、配列番号７３で示されるプローブ、配列番号７４で示されるプローブ、配列番号７５で示されるプローブ、配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブ、配列番号８３で示されるプローブ、配列番号８４で示されるプローブ、配列番号８５で示されるプローブ、配列番号８６で示されるプローブ、配列番号８７で示されるプローブ、配列番号８８で示されるプローブ、配列番号８９で示されるプローブ、配列番号９０で示されるプローブおよび配列番号９１で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であっても良い。
【００８５】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該ループプライマーセットおよび当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【００８６】
＜例２＞（プライマーセット１、２、５、６の使用）
当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーからなり、二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号３で示されるプライマー、配列番号５で示されるプライマー、配列番号１５で示されるプライマーおよび配列番号１７で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号４で示されるプライマー、配列番号６で示されるプライマー、配列番号１６で示されるプライマーおよび配列場号１８で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号２７で示されるプライマー、配列番号２９で示されるプライマー、配列番号３３で示されるプライマーおよび配列番号３５で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号２８で示されるプライマー、配列番号３０で示されるプライマー、配列番号３４で示されるプライマーおよび配列番号３６で示されるプライマーを含む
プライマーセットであってよい。
【００８７】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、配列番号６４で示されるプローブ、配列番号６５で示されるプローブ、配列番号６６で示されるプローブ、配列番号６７で示されるプローブ、配列番号６８で示されるプローブ、配列番号６９で示されるプローブ、配列番号７０で示されるプローブ、配列番号７１で示されるプローブ、配列番号７２で示されるプローブ、配列番号７３で示されるプローブ、配列番号７４で示されるプローブ、配列番号７５で示されるプローブ、配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブ、配列番号８３で示されるプローブ、配列番号８４で示されるプローブ、配列番号８５で示されるプローブ、配列番号８６で示されるプローブ、配列番号８７で示されるプローブ、配列番号８８で示されるプローブ、配列番号８９で示されるプローブ、配列番号９０で示されるプローブおよび配列番号９１、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブで示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であっても良い。
【００８８】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【００８９】
＜例３＞（プライマーセット１、２、７、８の使用）
当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーからなり、二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号３で示されるプライマー、配列番号５で示されるプライマー、配列番号１９で示されるプライマーおよび配列番号２１で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号４で示されるプライマー、配列番号６で示されるプライマー、配列番号２０で示されるプライマーおよび配列場号２２で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号２７で示されるプライマー、配列番号２９で示されるプライマー、配列番号３７で示されるプライマーおよび配列番号３９で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号２８で示されるプライマー、配列番号３０で示されるプライマー、配列番号３８で示されるプライマーおよび配列番号４０で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
【００９０】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、配列番号６４で示されるプローブ、配列番号６５で示されるプローブ、配列番号６６で示されるプローブ、配列番号６７で示されるプローブ、配列番号６８で示されるプローブ、配列番号６９で示されるプローブ、配列番号７０で示されるプローブ、配列番号７１で示されるプローブ、配列番号７２で示されるプローブ、配列番号７３で示されるプローブ、配列番号７４で示されるプローブ、配列番号７５で示されるプローブ、配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブ、配列番号８３で示されるプローブ、配列番号８４で示されるプローブ、配列番号８５で示されるプローブ、配列番号８６で示されるプローブ、配列番号８７で示されるプローブ、配列番号８８で示されるプローブ、配列番号８９で示されるプローブ、配列番号９０で示されるプローブおよび配列番号９１で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であっても良い。
【００９１】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【００９２】
＜例４＞（プライマーセット１、２、１１、１２の使用）
当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーからなり、二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号３で示されるプライマー、配列番号５で示されるプライマー、配列番号７で示されるプライマーおよび配列番号９で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号４で示されるプライマー、配列番号６で示されるプライマー、配列番号１２１で示されるプライマーおよび配列場号１２２で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号２７で示されるプライマー、配列番号２９で示されるプライマー、および配列番号３１示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号２８で示されるプライマー、配列番号３０で示されるプライマー、配列番号１２３で示されるプライマーおよび配列番号１２４で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
【００９３】
更に、ループプライマーセットを同時に使用してもよく、上記の場合、ループプライマーとして使用するのに好ましい組み合わせは、配列番号４５で示されるプライマーおよび／または配列番号４６で示されるプライマー、および配列番号４７で示されるプライマー、並びに配列番号１２５で示されるプライマーおよび配列番号１２６で示されるプライマーである。
【００９４】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、配列番号６４で示されるプローブ、配列番号６５で示されるプローブ、配列番号６６で示されるプローブ、配列番号６７で示されるプローブ、配列番号６８で示されるプローブ、配列番号６９で示されるプローブ、配列番号７０で示されるプローブ、配列番号７１で示されるプローブ、配列番号７２で示されるプローブ、配列番号７３で示されるプローブ、配列番号７４で示されるプローブ、配列番号７５で示されるプローブ、配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブ、配列番号８３で示されるプローブ、配列番号８４で示されるプローブ、配列番号８５で示されるプローブ、配列番号８６で示されるプローブ、配列番号８７で示されるプローブ、配列番号８８で示されるプローブ、配列番号８９で示されるプローブ、配列番号９０で示されるプローブおよび配列番号９１で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であっても良い。
【００９５】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【００９６】
＜例５＞（プライマーセット３、４、９、１０の使用）
当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーからなり、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号７で示されるプライマー、配列番号９で示されるプライマー、配列番号２３で示されるプライマーおよび配列番号２５で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号８で示されるプライマー、配列番号１０で示されるプライマー、配列番号２４で示されるプライマーおよび配列場号２６で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号３１で示されるプライマー、配列番号４１で示されるプライマーおよび配列番号４３で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号３２で示されるプライマー、配列番号４２で示されるプライマーおよび配列番号４４で示されるプライマーを含み
プライマーセットである。
【００９７】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、配列番号６４で示されるプローブ、配列番号６５で示されるプローブ、配列番号６６で示されるプローブ、配列番号６７で示されるプローブ、配列番号６８で示されるプローブ、配列番号６９で示されるプローブ、配列番号７０で示されるプローブ、配列番号７１で示されるプローブ、配列番号７２で示されるプローブ、配列番号７３で示されるプローブ、配列番号７４で示されるプローブ、配列番号７５で示されるプローブ、配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブ、配列番号８３で示されるプローブ、配列番号８４で示されるプローブ、配列番号８５で示されるプローブ、配列番号８６で示されるプローブ、配列番号８７で示されるプローブ、配列番号８８で示されるプローブ、配列番号８９で示されるプローブ、配列番号９０で示されるプローブおよび配列番号９１、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブで示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であってもよい。
【００９８】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【００９９】
＜例６＞（プライマーセット９．１０、１１、１２の使用）
当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーからなり、二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号２３で示されるプライマー、配列番号２５で示されるプライマー、配列番号７で示されるプライマーおよび配列番号９で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号２４で示されるプライマー、配列番号２６で示されるプライマー、配列番号１２１で示されるプライマーおよび配列場号１２２で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号４１で示されるプライマー、配列番号４３で示されるプライマー、および配列番号３１示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号４２で示されるプライマー、配列番号４４で示されるプライマー、配列番号１２３で示されるプライマーおよび配列番号１２４で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
【０１００】
更に、ループプライマーセットを同時に使用してもよく、上記の場合、ループプライマーとして使用するのに好ましい組み合わせは、配列番号１２５で示されるプライマーおよび配列番号１２６で示されるプライマーである。
【０１０１】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、配列番号６４で示されるプローブ、配列番号６５で示されるプローブ、配列番号６６で示されるプローブ、配列番号６７で示されるプローブ、配列番号６８で示されるプローブ、配列番号６９で示されるプローブ、配列番号７０で示されるプローブ、配列番号７１で示されるプローブ、配列番号７２で示されるプローブ、配列番号７３で示されるプローブ、配列番号７４で示されるプローブ、配列番号７５で示されるプローブ、配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブ、配列番号８３で示されるプローブ、配列番号８４で示されるプローブ、配列番号８５で示されるプローブ、配列番号８６で示されるプローブ、配列番号８７で示されるプローブ、配列番号８８で示されるプローブ、配列番号８９で示されるプローブ、配列番号９０で示されるプローブおよび配列番号９１で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であっても良い。
【０１０２】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【０１０３】
＜例７＞（プライマーセット１、３の利用）
当該プライマーセットは、B型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号３で示されるプライマーおよび配列番号７で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号４で示されるプライマーおよび配列番号８で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号２７で示されるプライマーおよび配列番号３１で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号２８で示されるプライマーおよび配列番号３２で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
【０１０４】
更に、ループプライマーセットを同時に使用してもよく、上記の場合、ループプライマーとして使用するのに好ましい組み合わせは、配列番号４５で示されるプライマーおよび／または配列番号４６で示されるプライマー、および配列番号４７で示されるプライマー、並びに配列番号４８で示されるプライマーおよび配列番号４９で示されるプライマーである。
【０１０５】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、
配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブおよび配列番号８３で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブであってよい。またはこれらのプローブの相補鎖であってもよい。
【０１０６】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該ループプライマーセットおよび当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【０１０７】
＜例８＞（プライマーセット２、４の使用）
当該プライマーセットは、C型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号５で示されるプライマーおよび配列番号９で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号６で示されるプライマーおよび配列場号１０で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号２９で示されるプライマーおよび配列番号３１で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号３０で示されるプライマーおよび配列番号３２で示されるプライマー含むプライマーセットであってよい。
【０１０８】
更に、ループプライマーセットを同時に使用してもよく、上記の場合、ループプライマーとして使用するのに好ましい組み合わせは、配列番号４５で示されるプライマーおよび／または配列番号４６で示されるプライマー、および配列番号４７で示されるプライマー、並びに配列番号４８で示されるプライマーおよび配列番号４９で示されるプライマーである。
【０１０９】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号６４で示されるプローブ、配列番号６５で示されるプローブ、配列番号６６で示されるプローブ、配列番号６７で示されるプローブ、配列番号６８で示されるプローブ、配列番号６９で示されるプローブ、配列番号７０で示されるプローブ、配列番号７１で示されるプローブ、配列番号７２で示されるプローブ、配列番号７３で示されるプローブ、配列番号７４で示されるプローブ、配列番号７５で示されるプローブ、
配列番号８４で示されるプローブ、配列番号８５で示されるプローブ、配列番号８６で示されるプローブ、配列番号８７で示されるプローブ、配列番号８８で示されるプローブ、配列番号８９で示されるプローブ、配列番号９０で示されるプローブおよび配列番号９１で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であっても良い。
【０１１０】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該ループプライマーセットおよび当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【０１１１】
＜例９＞（プライマーセット１、５の使用）
当該プライマーセットは、B型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号３で示されるプライマー、配列番号１５で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号４で示されるプライマー、配列番号１６で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号２７で示されるプライマー、配列番号３３で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号２８で示されるプライマー、配列番号３４で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
【０１１２】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブおよび配列番号８３で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であってもよい。
【０１１３】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【０１１４】
＜例１０＞（プライマーセット２、６の使用）
当該プライマーセットは、C型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号５で示されるプライマー、配列番号１７で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号６で示されるプライマー、配列番号１８で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号２９で示されるプライマー、配列番号３５で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号３０で示されるプライマー、配列番号３６で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
【０１１５】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブおよび配列番号８３、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブで示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であってもよい。
【０１１６】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【０１１７】
＜例１１＞（プライマーセット１、７の使用）
当該プライマーセットは、B型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号３で示されるプライマー、配列番号１９で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号４で示されるプライマー、配列番号２０で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号２７で示されるプライマー、配列番号３７で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号２８で示されるプライマー、配列番号３８で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
【０１１８】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブおよび配列番号８３で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であってもよい。
【０１１９】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【０１２０】
＜例１２＞（プライマーセット２、８の使用）
当該プライマーセットは、C型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号５で示されるプライマー、配列番号２１で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号６で示されるプライマー、配列番号２２で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号２９で示されるプライマー、配列番号３９で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号３０で示されるプライマー、配列番号４０で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
【０１２１】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブおよび配列番号８３で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であってもよい。
【０１２２】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【０１２３】
＜例１３＞（プライマーセット１、１１の利用）
当該プライマーセットは、B型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号３で示されるプライマーおよび配列番号７で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号４で示されるプライマーおよび配列番号１２１で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号２７で示されるプライマーおよび配列番号３１で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号２８で示されるプライマーおよび配列番号１２３で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
【０１２４】
更に、ループプライマーセットを同時に使用してもよく、上記の場合、ループプライマーとして使用するのに好ましい組み合わせは、配列番号４５で示されるプライマーおよび／または配列番号４６で示されるプライマー、および配列番号４７で示されるプライマー、並びに配列番号１２５で示されるプライマーである。
【０１２５】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、
配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、
配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブおよび配列番号８３で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブであってよい。またはこれらのプローブの相補鎖であってもよい。
【０１２６】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該ループプライマーセットおよび当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【０１２７】
＜例１４＞（プライマーセット２、１２の使用）
当該プライマーセットは、C型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号５で示されるプライマーおよび配列番号９で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号６で示されるプライマーおよび配列場号１２２で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号２９で示されるプライマーおよび配列番号３１で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号３０で示されるプライマーおよび配列番号１２４で示されるプライマー含むプライマーセットであってよい。
【０１２８】
更に、ループプライマーセットを同時に使用してもよく、上記の場合、ループプライマーとして使用するのに好ましい組み合わせは、配列番号４５で示されるプライマーおよび／または配列番号４６で示されるプライマー、および配列番号４７で示されるプライマー、並びに配列番号１２６で示されるプライマーおよび配列番号４９で示されるプライマーである。
【０１２９】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号１２７で示されるプローブ、配列番号１２８で示されるプローブ、配列番号１２９で示されるプローブ、配列番号１３０で示されるプローブ、配列番号１３１で示されるプローブ、
配列番号６４で示されるプローブ、配列番号６５で示されるプローブ、配列番号６６で示されるプローブ、配列番号６７で示されるプローブ、配列番号６８で示されるプローブ、配列番号６９で示されるプローブ、配列番号７０で示されるプローブ、配列番号７１で示されるプローブ、配列番号７２で示されるプローブ、配列番号７３で示されるプローブ、配列番号７４で示されるプローブ、配列番号７５で示されるプローブ、
配列番号８４で示されるプローブ、配列番号８５で示されるプローブ、配列番号８６で示されるプローブ、配列番号８７で示されるプローブ、配列番号８８で示されるプローブ、配列番号８９で示されるプローブ、配列番号９０で示されるプローブおよび配列番号９１で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であっても良い。
【０１３０】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該ループプライマーセットおよび当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【０１３１】
＜例１５＞（プライマーセット３、９の使用）
当該プライマーセットは、B型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号７で示されるプライマー、配列番号２３で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号８で示されるプライマー、配列番号２４で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号３１で示されるプライマー、配列番号４１で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号３２で示されるプライマー、配列番号４２で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
【０１３２】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブおよび配列番号８３で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であってもよい。
【０１３３】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【０１３４】
＜例１６＞（プライマーセット４、１０の使用）
当該プライマーセットは、C型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号９で示されるプライマー、配列番号２５で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号１０で示されるプライマー、配列番号２６で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号３１で示されるプライマー、配列番号３３で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号３２で示されるプライマー、配列番号４４で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
【０１３５】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブおよび配列番号８３、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブで示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であってもよい。
【０１３６】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【０１３７】
＜例１７＞（プライマーセット９、１１の利用）
当該プライマーセットは、B型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号２３で示されるプライマーおよび配列番号７で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号２４で示されるプライマーおよび配列番号１２１で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号４１で示されるプライマーおよび配列番号３１で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号４２で示されるプライマーおよび配列番号１２３で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
【０１３８】
更に、ループプライマーを同時に使用してもよく、上記の場合、ループプライマーとして使用するのに好ましい配列は、配列番号１２５で示されるプライマーである。
【０１３９】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、
配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、配列番号６２で示されるプローブ、配列番号６３で示されるプローブ、
配列番号７６で示されるプローブ、配列番号７７で示されるプローブ、配列番号７８で示されるプローブ、配列番号７９で示されるプローブ、配列番号８０で示されるプローブ、配列番号８１で示されるプローブ、配列番号８２で示されるプローブおよび配列番号８３で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブであってよい。またはこれらのプローブの相補鎖であってもよい。
【０１４０】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該ループプライマーセットおよび当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【０１４１】
＜例１８＞（プライマーセット１０、１２の使用）
当該プライマーセットは、C型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号２５で示されるプライマーおよび配列番号９で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号２６で示されるプライマーおよび配列場号１２２で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号４３で示されるプライマーおよび配列番号３１で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号４４で示されるプライマーおよび配列番号１２４で示されるプライマー含むプライマーセットであってよい。
【０１４２】
更に、ループプライマーを同時に使用してもよく、上記の場合、ループプライマーとして使用するのに好ましい配列は、配列番号１２６で示されるプライマーである。
【０１４３】
また、このようなプライマーセットを使用した場合に、同時に使用することが好ましいプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号６４で示されるプローブ、配列番号６５で示されるプローブ、配列番号６６で示されるプローブ、配列番号６７で示されるプローブ、配列番号６８で示されるプローブ、配列番号６９で示されるプローブ、配列番号７０で示されるプローブ、配列番号７１で示されるプローブ、配列番号７２で示されるプローブ、配列番号７３で示されるプローブ、配列番号７４で示されるプローブ、配列番号７５で示されるプローブ、
配列番号８４で示されるプローブ、配列番号８５で示されるプローブ、配列番号８６で示されるプローブ、配列番号８７で示されるプローブ、配列番号８８で示されるプローブ、配列番号８９で示されるプローブ、配列番号９０で示されるプローブおよび配列番号９１で示されるプローブ、配列番号１３２で示されるプローブ、配列番号１３３で示されるプローブ、配列番号１３４で示されるプローブ、配列番号１３５で示されるプローブ、配列番号１３６で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であっても良い。
【０１４４】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行うことにより、短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能であり、当該ループプライマーセットおよび当該プローブを併用することにより、更にその効果は増大する。
【０１４５】
＜例１９＞
本発明のアッセイキットは、本発明に従うプライマーセット、任意にループプライマー、本発明に従うプローブを具備する。また、任意に、LAMP法に必要な試薬を具備してもよく、当該プローブを基体に固定化した状態で具備してもよい。
【０１４６】
＜例２０＞
対象からの血液、血清および臓器を試料として、上述の何れかのLAMP増幅用核酸プライマーセットとプローブを用いて、HBVからの標的核酸が薬剤耐性であるか、非薬剤耐性であるかを調べる。
【０１４７】
まず、試料から核酸を抽出する。得られた試料溶液について、例１〜例８で示されるプライマーを用いて、適切な増幅をえら得る条件化で、即ち、等温条件下60〜65℃で適切なバッファーを用いてLAMP増幅を行う。
【０１４８】
得られた増幅産物を各々例１〜例８で示される核酸プローブ固定化基体を用いて検出する。当該核酸固定化基体に対して、増幅産物を添加し、ハイブリダイゼーションを行い、電気化学的にハイブリダイゼーションの有無を検出し、試料からのHBVが薬剤耐性株であるか、非薬剤耐性株であるかを判定する。
【０１４９】
このようなプライマーセットを用いて、それ自体知られたLAMP増幅法を利用してHBVからの核酸の増幅を行い、当該プローブにより検出を行うことにより短時間で簡便に且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出することが可能である。
【０１５０】
＜例２１＞
以下、プライマーセット1〜１２を用いた増幅試験について記載する。
【０１５１】
標的核酸としてLAMP産物を用いる場合、まず、検出対象塩基の配置を決定する必要がある。LAMP産物にはそれぞれ２種類のLoop配列(F-LoopとB-Loop、例えば、図２（ａ）ではF2cの部分がF-loopに、B2の部分がB-Loopに該当する)が存在し、そのループ配列中に検出対象塩基を配置するとプローブとの反応効率が良い。本例では、アミノ酸181位、204位、236位の３箇所をコードする塩基配列を検出するために、それぞれをループ配列に配置するには、2つのLAMP産物（計４つのループ配列）が必要となり、プライマーセット１〜１２は、４つのループ配列に対する３箇所の検出対象配列の配置の組み合わせを示している。また、プライマーセット１と２、プライマーセット３と４、プライマーセット５と６、プライマーセット７と８、プライマーセット９と１０、プライマーセット１１と１２は、それぞれ検出対象の配置は同じであるが、対象Genotype(BまたはC)が異なるプライマーセットである。以下、各プライマーセットを用いた増幅試験について記載する。
【０１５２】
（１）鋳型配列
鋳型配列として、以下の配列をそれぞれ含むプラスミドDNAを2種類準備した。
【化１】
2009213465.tif 000011
【０１５３】
上記のジェノタイプBおよびジェノタイプCの配列において、四角で囲んだ部分の３塩基のコドンは、それぞれ上流からアミノ酸181位、204位、236位の３つのアミノ酸をコードする塩基を示す。
【０１５４】
（２）LAMP法による標的核酸の増幅
LAMP反応に必要な酵素、dNTP、緩衝溶液を含むLAMP反応溶液に、表１に記載のプライマーセット１〜１２をそれぞれ含む１２本のLAMP反応溶液を調製した。６３℃にてLAMP増幅を行い、LAMP増幅の立ち上がり時間を濁度計によって検出し、比較した。ここで、「立ち上がり時間」とは、増幅反応に伴い増加する濁度が濁度計で最初に検出される時間である。
【０１５５】
（３）結果
１２種類のプライマーセットから得られるLAMP増幅の立ち上がり時間を表６に示した。
【０１５６】
ジェノタイプ B型およびC型ともに増幅時間が60分未満であったのは、プライマーセット１と２、およびプライマーセット１１と１２である。プライマーセット１と２は、F-Loop、B-Loopそれぞれに、aa181, aa204をコードする塩基配列が配置されている（表１参照）。一方、プライマーセット１１と１２は、F-Loop、B-Loopそれぞれに、aa204, aa236をコードする塩基配列が配置されている（表１参照）。次に、ジェノタイプB型およびC型ともに増幅時間が60分以上70分未満であったのは、プライマーセット３と４、およびプライマーセット７と８の組み合わせである。プライマーセット３と４は、F-LoopとB-Loopのそれぞれに、aa204, aa236をコードする塩基配列が配置されている（表１参照）。一方、プライマーセット７と８は、B-Loopそれぞれにaa236をコードする塩基配列が配置されている（表１参照）。その他のプライマーセットの場合では70分を超えていたが、実用上十分使用可能である。
【０１５７】
ウィルスDNAの配列を検出する場合、そのプロトコルは、大きく、（１）DNA抽出、（２）標的核酸の増幅、（３）配列の検出、の3段階の工程に分けられる。検査全体の時間をより短くするために、各工程の所要時間はより短いほうが好ましく、目安は６０分程度となる。
【０１５８】
さらに、プライマーセット３と４の組み合わせ、プライマーセット７と８の組み合わせ、およびプライマーセット１１と１２の組み合わせを比較した場合、プライマーセット３と４およびプライマーセット１１と１２には、F-loopにaa204が配置されており、プライマーセット１と２の組み合わせと合わせると、両プライマーセットから増幅されたLAMP産物のLoopにaa.204が含まれることになる。
【０１５９】
ウィルスDNAに対する増幅を行う場合、検出対象以外の変異が含まれることによって、増幅反応が阻害されることが考えられる。検出対象の塩基配列が、異なるプライマー領域によって増幅される2種類以上のLAMP産物に含まれていることは、上記阻害の確立を低減させる上でより好ましい。したがって、プライマーセット１と２で、aa181(F-Loop)およびaa204(B-Loop)を増幅し、プライマーセット３と４またはプライマーセット１１と１２でaa204(F-Loop)およびaa236(B-Loop)を含むLAMP産物を増幅し、標的核酸とすることがより好ましいと考えられる。
【表６】
2009213465.tif 000012
【０１６０】
＜例２２＞
例１１で決定されたより好ましいプライマーセットそれぞれについて、各アミノ酸を検出するためのプローブ配列を決定した。
【０１６１】
以下、プライマーセット１を用いてLAMP増幅を行い、B型肝炎ウィルスのポリメラーゼ領域の204位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出する例を記載する。
【０１６２】
（１）鋳型配列
鋳型配列として、以下の８種類の配列を合成した。
【０１６３】
テンプレート１は以下の配列である。
【化２】
2009213465.tif 000013
【０１６４】
テンプレート２は、上述のテンプレート１の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「ATG」が「ATC」である塩基配列である；
テンプレート３は、上述のテンプレート１の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「ATG」が「ATT」である塩基配列である；
テンプレート４は、上述のテンプレート１の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「ATG」が「ATA」である塩基配列である；
テンプレート５は、上述のテンプレート１の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「ATG」が「GTG」である塩基配列である；
テンプレート６は、上述のテンプレート１の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「ATG」が「GTC」である塩基配列である；
テンプレート７は、上述のテンプレート１の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「ATG」が「GTT」である塩基配列である；
テンプレート８は、上述のテンプレート１の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「ATG」が「GTA」である塩基配列である。
【０１６５】
（２）LAMP法による標的核酸の増幅
表１、表２に記載のプライマーセット１（FIP, BIPを40pmol, F3, B3を5pmol）、および表３に記載のループプライマー１９（20pmol）、およびLAMP反応に必要な酵素（Bst-DNPポリメラーゼ[NEB社製]1μL）、dNTP、LAMP反応用緩衝溶液を含むLAMP反応溶液を８本調製した。調製した８本それぞれに対し、テンプレート１からテンプレート８をそれぞれ終濃度1E+03copies/reactionとなるように添加し、６３℃で１時間反応させた。それぞれに得られた反応液の一部分について電気泳動を行い、LAMP産物が得られたことを確認した。
【０１６６】
残りの反応液をLAMP産物溶液とし、これに20×SSC溶液を終濃度2×SSCとなるように添加し、標的核酸溶液とした。即ち、テンプレート１〜テンプレート８より得られた標的核酸溶液をそれぞれ核酸溶液１〜核酸溶液８とした。その中に含まれる標的核酸を標的核酸１〜標的核酸８とした。別に、標的核酸を含まないこと以外は組成が同じ溶液を作成し、これをネガティブコントロールとしての核酸溶液９とした。
【０１６７】
（３）核酸プローブ固定化電極の作製
本実施例ではDNAプローブの支持体として金電極を使用した。核酸プローブを固定する作用極、電気化学測定に必要な対極と参照極、さらにこれらの電極と配線されている電極パッドが一枚のガラス基板上に複数配置されているDNAチップ用基板を作製した。
【０１６８】
配列番号９２から配列番号１２０の配列それぞれの末端にSH基が修飾されている核酸プローブをそれぞれ含む核酸プローブ溶液を作用極に滴下し、１時間放置した。その後、超純水で洗浄し乾燥させることで、核酸プローブ固定化電極(DNAチップ)を作製した。
【０１６９】
（４）標的核酸の検出
上記で調製した標的核酸溶液１〜８、を上記核酸プローブ固定化電極上に添加後、４５℃で１０分間反応することで、標的核酸を核酸プローブにハイブリダイズさせた。その後、非特異的に吸着または結合している標的核酸を除去するために、０．２×SSC溶液を添加し、各温度（３５、３７、３９℃）で20分間反応させることで洗浄を行った。洗浄用緩衝液を除去したあと、核酸に結合する挿入剤としてヘキスト33258を添加した。その後、リニアスイープボルタンメトリーを行い、得られたボルタモグラムからヘキスト33258の酸化に由来するピーク電流値を算出した。
【０１７０】
標的核酸溶液添加以降の、設定温度でのハイブリダイズ反応、洗浄用緩衝液の添加、設定温度での洗浄、挿入剤の添加、電流検出、各電極から得られる電流値の比較は、これらに必要な送液制御系、温度制御系、ポテンシオスタットを含む自動検出装置、および各部の制御ソフトウェアを使用して行った。
【０１７１】
（５）結果
本例は、プローブと標的核酸の一部が完全に相補的である組み合わせ、およびプローブと標的核酸の一部が１塩基だけ異なる組み合わせを選択し、各核酸プローブ固定化電極から得られる電流値をバックグラウンド電流値に対する割合（S/B比）として表７〜１４に示した。
【０１７２】
表７にはプローブ４３から４５に対して、標的核酸溶液１、２、３、４、５および９を反応させた際に得られたS/B比を、表８にはプローブ４６〜４８に対して核酸溶液１、２、６および９を反応させたときのS/B比を、表９にはプローブ４９〜５３に対して核酸溶液１、３、７および９を反応させたときのS/B比を、表１０にはプローブ５４〜５７に対して核酸溶液１、４、８および９を反応させたときのS/B比を、表１１にはプローブ５８〜６２に対して核酸溶液１、５および９を反応させたときのS/B比を、表１２にはプローブ６３〜６５に対して核酸溶液２、６および９を反応させたときのS/B比を、表１３にはプローブ６６〜６８に対して核酸溶液３、７および９を反応させたときのS/B比を、表１４にはプローブ６９〜７１に対して核酸溶液４、８および９を反応させたときのS/B比を示した。また、それぞれS/B比は、３５、３７または３９℃の温度でそれぞれに洗浄した際に得られたものである。
【０１７３】
例えば、表７では、プローブ４３〜４５に対して核酸溶液１、２、３、４、５または９を反応させた際に得られたS/B比が示されているが、プローブ４３から４５は、それぞれ異なる塩基数であり、標的核酸１の一部と相補的な配列をもち、標的核酸２、３、４、５の相補鎖と1塩基異なる配列を有する。各表の網掛けをしたカラムは、使用したプローブと標的核酸が完全相補であるため、値が高くなるべき部分である。一方、その他の部分は、プローブと標的核酸が１塩基異なるために値が低くなるべき部分である。
【０１７４】
表７では、洗浄温度を３７℃とした場合には、プローブ４４を使用することにより、核酸溶液１を反応させた際により高い値を示し、核酸溶液２、３、４、５を反応させた際により低い値を示すことが明らかとなった。従って、洗浄温度を３７℃とした場合には、プローブ４４を使用することが好ましい。
【０１７５】
同様に、表８から表１４に示すように、プローブ４６〜７１についても数値を取得し、各プローブ配列の複数の塩基数から最も好ましい塩基数を決定した。
【０１７６】
表８に示した結果から、プローブ４６〜４８の中ではプローブ４７が好ましく、表９に示した結果から、プローブ４９〜５３の中ではプローブ５０が好ましく、表１０に示した結果から、プローブ５４〜５７の中ではプローブ５６が好ましく、表１１に示した結果から、プローブ５８〜６２の中ではプローブ５９が好ましく、表１２に示した結果から、プローブ６３〜６５の中ではプローブ６４が好ましく、表１３に示した結果からプローブ６６〜６８の中ではプローブ６８が好ましく、表１４に示した結果からプローブ６９〜７１の中ではプローブ７０が好ましかった。
【０１７７】
これらの結果から、配列番号９３で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号９６で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号９９で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１０５で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１０８で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１１３で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１１７で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、および配列番号１１９で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブにおいて、洗浄温度37℃で、目的の標的核酸鎖を明確に識別できることが示された。
【０１７８】
さらに、表５に記載したその他のプローブでも、洗浄温度を変更した場合、目的の標的核酸鎖を明確に識別できることが示された。
【表７】
2009213465.tif 000014
【０１７９】
【表８】
2009213465.tif 000015
【０１８０】
【表９】
2009213465.tif 000016
【０１８１】
【表１０】
2009213465.tif 000017
【０１８２】
【表１１】
2009213465.tif 000018
【０１８３】
【表１２】
2009213465.tif 000019
【０１８４】
【表１３】
2009213465.tif 000020
【０１８５】
【表１４】
2009213465.tif 000021
【０１８６】
＜例２３＞
以下、プライマーセット１１、１２を用いてLAMP増幅を行い、B型およびC型肝炎ウィルスのポリメラーゼ領域の236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出する例を記載する。
【０１８７】
（１）鋳型配列
鋳型配列として、以下の９種類の配列を合成した。
【０１８８】
テンプレート15は以下の配列である。
【化３】
2009213465.tif 000022
【０１８９】
テンプレート１６は、上述のテンプレート１５の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「AAC」が「AAT」である塩基配列である；
テンプレート１７は、上述のテンプレート１５の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「AAC」が「ACC」である塩基配列である。
【０１９０】
テンプレート18は以下の配列である。
【化４】
2009213465.tif 000023
【０１９１】
テンプレート１９は、上述のテンプレート１８の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GAAC」が「GAAT」である塩基配列である；
テンプレート２０は、上述のテンプレート１８の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GAAC」が「GACC」である塩基配列である；
テンプレート２１は、上述のテンプレート１８の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GAAC」が「AAAC」である塩基配列である；
テンプレート２２は、上述のテンプレート１８の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GAAC」が「AAAT」である塩基配列である；
テンプレート２３は、上述のテンプレート１８の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GAAC」が「AACC」である塩基配列である。
【０１９２】
（２）LAMP法による標的核酸の増幅
表１、表２に記載のプライマーセット１１、１２（FIP, BIPを各40pmol, F3, B3を各5pmol）、および表３に記載のループプライマー１２５、１２６（各20pmol）、およびLAMP反応に必要な酵素（Bst-DNPポリメラーゼ[NEB社製]2μL）、dNTP、LAMP反応用緩衝溶液を含むLAMP反応溶液を９本調製した。調製した９本それぞれに対し、テンプレート１５からテンプレート２３をそれぞれ終濃度1E+03copies/reactionとなるように添加し、６３℃で１時間反応させた。それぞれに得られた反応液の一部分について電気泳動を行い、LAMP産物が得られたことを確認した。
【０１９３】
残りの反応液をLAMP産物溶液とし、これに20×SSC溶液を終濃度2×SSCとなるように添加し、標的核酸溶液とした。即ち、テンプレート１５〜テンプレート２３より得られた標的核酸溶液をそれぞれ核酸溶液１５〜核酸溶液２３とした。その中に含まれる標的核酸を標的核酸１５〜標的核酸２３とした。別に、標的核酸を含まないこと以外は組成が同じ溶液を作成し、これをネガティブコントロールとしての核酸溶液９とした。
【０１９４】
（３）核酸プローブ固定化電極の作製
本実施例ではDNAプローブの支持体として金電極を使用した。核酸プローブを固定する作用極、電気化学測定に必要な対極と参照極、さらにこれらの電極と配線されている電極パッドが一枚のガラス基板上に複数配置されているDNAチップ用基板を作製した。
【０１９５】
配列番号１４７から配列番号１６７の配列それぞれの末端にSH基が修飾されている核酸プローブをそれぞれ含む核酸プローブ溶液を作用極に滴下し、１時間放置した。その後、超純水で洗浄し乾燥させることで、核酸プローブ固定化電極(DNAチップ)を作製した。
【０１９６】
（４）標的核酸の検出
上記で調製した標的核酸溶液１５〜２３を上記核酸プローブ固定化電極上に添加後、４５℃で１０分間反応することで、標的核酸を核酸プローブにハイブリダイズさせた。その後、非特異的に吸着または結合している標的核酸を除去するために、０．２×SSC溶液を添加し、各温度（３５、３７、３９℃）で10分間反応させることで洗浄を行った。洗浄用緩衝液を除去したあと、核酸に結合する挿入剤としてヘキスト33258を添加した。その後、リニアスイープボルタンメトリーを行い、得られたボルタモグラムからヘキスト33258の酸化に由来するピーク電流値を算出した。
【０１９７】
標的核酸溶液添加以降の、設定温度でのハイブリダイズ反応、洗浄用緩衝液の添加、設定温度での洗浄、挿入剤の添加、電流検出、各電極から得られる電流値の比較は、これらに必要な送液制御系、温度制御系、ポテンシオスタットを含む自動検出装置、および各部の制御ソフトウェアを使用して行った。
【０１９８】
（５）結果
本例は、プローブと標的核酸の一部が完全に相補的である組み合わせ、およびプローブと標的核酸の一部が１塩基または２塩基だけ異なる組み合わせを選択し、各核酸プローブ固定化電極から得られる電流値をバックグラウンド電流値に対する割合（S/B比）として表A〜２８に示した。
【０１９９】
表Aにはプローブ９２、９３に対して、標的核酸溶液１５、１７および９を反応させた際に得られたS/B比を、表Bにはプローブ９４、９５に対して核酸溶液１６，１７および９を反応させたときのS/B比を、表Cにはプローブ９６〜９８に対して核酸溶液１５、１７および９を反応させたときのS/B比を、表Dにはプローブ９９〜１０１に対して核酸溶液１８、２０および９を反応させたときのS/B比を、表Eにはプローブ１０２に対して核酸溶液１９、２０および９を反応させたときのS/B比を、表Fにはプローブ１０３、１０４に対して核酸溶液１８、２０および９を反応させたときのS/B比を、表Gにはプローブ１０５〜１０８に対して核酸溶液２１、２３および９を反応させたときのS/B比を、表Hにはプローブ１０９、１１０に対して核酸溶液２２、２３および９を反応させたときのS/B比を、表Iにはプローブ１１１、１１２に対して核酸溶液２１、２３および９を反応させたときのS/B比を示した。また、それぞれS/B比は、３５、３７または３９℃の温度でそれぞれに洗浄した際に得られたものである。
【０２００】
各表の網掛けをしたカラムは、使用したプローブと標的核酸が完全相補であるため、値が高くなるべき部分である。一方、その他の部分は、プローブと標的核酸が１塩基または２塩基異なるために値が低くなるべき部分である。
【０２０１】
表Aでは、洗浄温度を３７℃とした場合には、プローブ９２を使用することにより、核酸溶液１５を反応させた際により高い値を示し、核酸溶液１７を反応させた際により低い値を示すことが明らかとなった。従って、洗浄温度を３７℃とした場合には、プローブ９２を使用することが好ましい。
【０２０２】
同様に、表Bから表Iに示すように、プローブ９４〜１１２についても数値を取得し、各プローブ配列の複数の塩基数から最も好ましい塩基数を決定した。
【０２０３】
表Bに示した結果から、プローブ９４、９５の中ではプローブ９４が好ましく、表Cに示した結果から、プローブ９６〜９８の中ではプローブ９７が好ましく、表Dに示した結果から、プローブ９９〜１０１の中ではプローブ９９が好ましく、表Eに示した結果から、プローブ１０２が好ましく、表Fに示した結果から、プローブ１０３、１０４の中ではプローブ１０３が好ましく、表Gに示した結果からプローブ１０５〜１０８の中ではプローブ１０６が好ましく、表Hに示した結果からプローブ１０９、１１０の中ではプローブ１０９が好ましく、表Iに示した結果から、プローブ１１１、１１２の中ではプローブ１１２が好ましかった。
【０２０４】
これらの結果から、配列番号１４７で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１４９で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１５２で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１５５で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１５７で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１５８示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１６１で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１６４で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、および配列番号１６７で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブにおいて、洗浄温度37℃で、目的の標的核酸鎖を明確に識別できることが示された。
【０２０５】
さらに、表５に記載したその他のプローブでも、洗浄温度を変更した場合、目的の標的核酸鎖を明確に識別できることが示された。
【表Ａ】
2009213465.tif 000024
【０２０６】
【表Ｂ】
2009213465.tif 000025
【０２０７】
【表Ｃ】
2009213465.tif 000026
【０２０８】
【表Ｄ】
2009213465.tif 000027
【０２０９】
【表Ｅ】
2009213465.tif 000028
【０２１０】
【表Ｆ】
2009213465.tif 000029
【０２１１】
【表Ｇ】
2009213465.tif 000030
【０２１２】
【表Ｈ】
2009213465.tif 000031
【０２１３】
【表Ｉ】
2009213465.tif 000032
＜例２４＞
以下、プライマーセット１、２を用いてLAMP増幅を行い、B型およびC型肝炎ウィルスのポリメラーゼ領域の181位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出する例を記載する。
【０２１４】
（１）鋳型配列
鋳型配列として、以下の１５種類の配列を合成した。
【０２１５】
テンプレート24は以下の配列である。
【化５】
2009213465.tif 000033
【０２１６】
テンプレート２５は、上述のテンプレート２４の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCC」である塩基配列である；
テンプレート２６は、上述のテンプレート２４の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCA」である塩基配列である；
テンプレート２７は、上述のテンプレート２４の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCG」である塩基配列である；
テンプレート２８は、上述のテンプレート２４の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GTT」である塩基配列である。
【０２１７】
テンプレート29は以下の配列である。
【化６】
2009213465.tif 000034
【０２１８】
テンプレート３０は、上述のテンプレート２９の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCC」である塩基配列である；
テンプレート３１は、上述のテンプレート２９の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCA」である塩基配列である；
テンプレート３２は、上述のテンプレート２９の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCG」である塩基配列である；
テンプレート３３は、上述のテンプレート２９の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GTT」である塩基配列である。
【０２１９】
テンプレート３４は以下の配列である。
【化７】
2009213465.tif 000035
【０２２０】
テンプレート３５は、上述のテンプレート３４の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCC」である塩基配列である；
テンプレート３６は、上述のテンプレート３４の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCA」である塩基配列である；
テンプレート３７は、上述のテンプレート３４の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCG」である塩基配列である；
テンプレート３８は、上述のテンプレート３４の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GTT」である塩基配列である。
【０２２１】
（２）LAMP法による標的核酸の増幅
表１、表２に記載のプライマーセット１、２（FIP, BIPを各40pmol, F3, B3を各5pmol）、および表３に記載のループプライマー４６（各20pmol）、およびLAMP反応に必要な酵素（Bst-DNPポリメラーゼ[NEB社製]2μL）、dNTP、LAMP反応用緩衝溶液を含むLAMP反応溶液を９本調製した。調製した９本それぞれに対し、テンプレート２４からテンプレート３８をそれぞれ終濃度1E+03copies/reactionとなるように添加し、６３℃で１時間反応させた。それぞれに得られた反応液の一部分について電気泳動を行い、LAMP産物が得られたことを確認した。
【０２２２】
残りの反応液をLAMP産物溶液とし、これに20×SSC溶液を終濃度2×SSCとなるように添加し、標的核酸溶液とした。即ち、テンプレート２４〜テンプレート３８より得られた標的核酸溶液をそれぞれ核酸溶液２４〜核酸溶液３８とした。その中に含まれる標的核酸を標的核酸２４〜標的核酸３８とした。別に、標的核酸を含まないこと以外は組成が同じ溶液を作成し、これをネガティブコントロールとしての核酸溶液９とした。
【０２２３】
（３）核酸プローブ固定化電極の作製
本実施例ではDNAプローブの支持体として金電極を使用した。核酸プローブを固定する作用極、電気化学測定に必要な対極と参照極、さらにこれらの電極と配線されている電極パッドが一枚のガラス基板上に複数配置されているDNAチップ用基板を作製した。
【０２２４】
配列番号１６８から配列番号１９６の配列それぞれの末端にSH基が修飾されている核酸プローブをそれぞれ含む核酸プローブ溶液を作用極に滴下し、１時間放置した。その後、超純水で洗浄し乾燥させることで、核酸プローブ固定化電極(DNAチップ)を作製した。
【０２２５】
（４）標的核酸の検出
上記で調製した標的核酸溶液２４〜３８を上記核酸プローブ固定化電極上に添加後、４５℃で１０分間反応することで、標的核酸を核酸プローブにハイブリダイズさせた。その後、非特異的に吸着または結合している標的核酸を除去するために、０．２×SSC溶液を添加し、各温度（３５、３７、３９℃）で10分間反応させることで洗浄を行った。洗浄用緩衝液を除去したあと、核酸に結合する挿入剤としてヘキスト33258を添加した。その後、リニアスイープボルタンメトリーを行い、得られたボルタモグラムからヘキスト33258の酸化に由来するピーク電流値を算出した。
【０２２６】
標的核酸溶液添加以降の、設定温度でのハイブリダイズ反応、洗浄用緩衝液の添加、設定温度での洗浄、挿入剤の添加、電流検出、各電極から得られる電流値の比較は、これらに必要な送液制御系、温度制御系、ポテンシオスタットを含む自動検出装置、および各部の制御ソフトウェアを使用して行った。
【０２２７】
（５）結果
本例は、プローブと標的核酸の一部が完全に相補的である組み合わせ、およびプローブと標的核酸の一部が１塩基または２塩基だけ異なる組み合わせを選択し、各核酸プローブ固定化電極から得られる電流値をバックグラウンド電流値に対する割合（S/B比）として表J〜４３に示した。
【０２２８】
表Jにはプローブ１１３〜１１５に対して、標的核酸溶液２４、２８および９を反応させた際に得られたS/B比を、表Kにはプローブ１１６、１１７に対して核酸溶液２５、２８および９を反応させたときのS/B比を、表Lにはプローブ１１８に対して核酸溶液２６、２８および９を反応させたときのS/B比を、表Mにはプローブ１１９に対して核酸溶液２７、２８および９を反応させたときのS/B比を、表Nにはプローブ１２０〜１２２に対して核酸溶液２４、２８および９を反応させたときのS/B比を、表Oにはプローブ１２３〜１２５に対して核酸溶液２９、３３および９を反応させたときのS/B比を、表Pにはプローブ１２６、１２７に対して核酸溶液３０、３３および９を反応させたときのS/B比を、表Qにはプローブ１２８に対して核酸溶液３１、３３および９を反応させたときのS/B比を、表Rにはプローブ１２９に対して核酸溶液３２、３３および９を反応させたときのS/B比を、表Sにはプローブ１３０〜１３２に対して、標的核酸溶液２９、３３および９を反応させた際に得られたS/B比を、表Tにはプローブ１３３、１３４に対して核酸溶液３４、３８および９を反応させたときのS/B比を、表Uにはプローブ１３５、１３６に対して核酸溶液３５、３８および９を反応させたときのS/B比を、表Vにはプローブ１３７に対して核酸溶液３６、３８および９を反応させたときのS/B比を、表Wにはプローブ１３８に対して核酸溶液３７、３８および９を反応させたときのS/B比を、表Xにはプローブ１３９〜１４１に対して核酸溶液３４、３８および９を反応させたときのS/B比を示した。また、それぞれS/B比は、３５、３７または３９℃の温度でそれぞれに洗浄した際に得られたものである。
【０２２９】
各表の網掛けをしたカラムは、使用したプローブと標的核酸が完全相補であるため、値が高くなるべき部分である。一方、その他の部分は、プローブと標的核酸が１塩基または２塩基異なるために値が低くなるべき部分である。
【０２３０】
表Jでは、洗浄温度を３７℃とした場合には、プローブ１１４を使用することにより、核酸溶液２４を反応させた際により高い値を示し、核酸溶液２８を反応させた際により低い値を示すことが明らかとなった。従って、洗浄温度を３７℃とした場合には、プローブ１１４を使用することが好ましい。
【０２３１】
同様に、表Kから表Xに示すように、プローブ１１６〜１４１についても数値を取得し、各プローブ配列の複数の塩基数から最も好ましい塩基数を決定した。
【０２３２】
表Kに示した結果から、プローブ１１６、１１７の中ではプローブ１１６が好ましく、表Lに示した結果から、プローブ１１８が好ましく、表Mに示した結果から、プローブ１１９が好ましく、表Nに示した結果から、プローブ１２０〜１２２の中ではプローブ１２１が好ましく、表Oに示した結果から、プローブ１２３〜１２５の中ではプローブ１２４が好ましく、表Pに示した結果からプローブ１２６、１２７の中ではプローブ１２６が好ましく、表Qに示した結果からプローブ１２８が好ましく、表Rに示した結果から、プローブ１２９が好ましく、表Sに示した結果から、プローブ１３０〜１３２の中ではプローブ１３１が好ましく、表Tに示した結果から、プローブ１３３、１３４の中ではプローブ１３３が好ましく、表Uに示した結果から、プローブ１３５、１３６の中ではプローブ１３５が好ましく、表Vに示した結果から、プローブ１３７が好ましく、表Wに示した結果から、プローブ１３８が好ましく、表Xに示した結果から、プローブ１３９〜１４１の中ではプローブ１４０が好ましかった。
【０２３３】
これらの結果から、配列番号１６９で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１７１で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１７３で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１７４で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１７６で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１７９示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１８１で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１８３で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１８４示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１８６で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１８８で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１９０示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１９２で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、配列番号１９３で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブ、および配列番号１９５で示される塩基配列またはその相補鎖であるプローブにおいて、洗浄温度37℃で、目的の標的核酸鎖を明確に識別できることが示された。
【０２３４】
さらに、表５に記載したその他のプローブでも、洗浄温度を変更した場合、目的の標的核酸鎖を明確に識別できることが示された。
【表Ｊ】
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【０２３５】
【表Ｋ】
2009213465.tif 000037
【０２３６】
【表Ｌ】
2009213465.tif 000038
【０２３７】
【表Ｍ】
2009213465.tif 000039
【０２３８】
【表Ｎ】
2009213465.tif 000040
【０２３９】
【表Ｏ】
2009213465.tif 000041
【０２４０】
【表Ｐ】
2009213465.tif 000042
【０２４１】
【表Ｑ】
2009213465.tif 000043
【０２４２】
【表Ｒ】
2009213465.tif 000044
【０２４３】
【表Ｓ】
2009213465.tif 000045
【０２４４】
【表Ｔ】
2009213465.tif 000046
【０２４５】
【表Ｕ】
2009213465.tif 000047
【０２４６】
【表Ｖ】
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【０２４７】
【表Ｗ】
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【０２４８】
【表Ｘ】
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【図面の簡単な説明】
【０２４９】
【図１】LAMP法の概要図。
【図２】LAMP法の中間産物およびインナープライマー（FIP、BIP）のアニール位置を示す模式図。
【図３】ループプライマーの配置を示す概要図。
【図４】LAMP法の中間産物およびループプライマー（LFc、LBc）のアニール位置を示す模式図。
【図５】増幅産物の検出位置を示す模式図。
【図６】プローブ固定化基体の一実施形態の平面模式図。
【図７】プローブ固定化基体の一実施形態の平面模式図。
【図８】データバンクに登録されているHBV配列の受諾番号を示す図。
【図９】データバンクに登録されているHBV配列の受諾番号を示す図。
【図１０】HBVの基準配列を示す図。
【図１１】HBVの基準配列を示す図。
【図１２】核酸プライマー配列、検出対象配列の相対位置を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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