(57)【要約】【課題】簡便かつ効率的な精子細胞の保存方法の提供。【解決手段】精子細胞を含む、動物の精巣の切片を作製する工程；および作製された切片を冷凍保存する工程を包含する、精子細胞の保存方法であって、冷凍保存した切片を解凍することによって、顕微授精による卵子への注入において機能的な精子細胞が得られる、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）精子細胞を含む、動物の精巣の切片を作製する工程；および
（ｉｉ）作製された切片を冷凍保存する工程、
を包含する、精子細胞の保存方法であって、冷凍保存した切片を解凍することによって、顕微授精による卵子への注入において機能的な精子細胞が得られる、方法。
【請求項２】
切片がクライオスタットを使用して作製される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
切片の厚さが１０〜２５μｍである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
冷凍保存が１日〜１ヶ月の期間行われる、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
冷凍保存が−３０℃で行われる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
作製された切片が支持体に付着される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
精子細胞を含む、動物の精巣の切片を作製する工程を包含する、精子細胞保存用切片の製造方法であって、作製された切片を冷凍保存後解凍することによって、顕微授精による卵子への注入において機能的な精子細胞が得られる、方法。
【請求項８】
切片がクライオスタットを使用して作製される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
切片の厚さが１０〜２５μｍである、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
冷凍保存が１日〜１ヶ月の期間行われる、請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
冷凍保存が−３０℃で行われる、請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
作製された切片が支持体に付着される、請求項７〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
精子細胞を含む、動物の精巣の切片を含む、精子細胞保存用組成物であって、切片を冷凍保存後解凍することによって、顕微授精による卵子への注入において機能的な精子細胞が得られる、組成物。
【請求項１４】
切片がクライオスタットを使用して作製される、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
切片の厚さが１０〜２５μｍである、請求項１３または１４記載の組成物。
【請求項１６】
冷凍保存が１日〜１ヶ月の期間行われる、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１７】
冷凍保存が−３０℃で行われる、請求項１３〜１６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１８】
切片が支持体に付着されている、請求項１３〜１７のいずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精子細胞の簡便かつ効率的な保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子改変動物（例えば、マウス）の作製による遺伝子機能の解析は、基礎生物学および医学分野の発展に大きな貢献を果たしてきた。今後も数多くの動物が作製されると予想される。このためには、効率的な系統保存法の開発が必要である。
【０００３】
精子細胞の保存方法として現在最も広く用いられている方法は、精子をストロー状の容器に凍結保護剤と共に充填し、液体窒素中に保存する方法である（非特許文献１）。この方法では、解凍後の精子は運動能を保持しているため、精子を未授精卵と共培養することにより授精を行わせるＩＶＦ（in-vitro fertilization）による顕微授精によって子孫を作出することができる。上記方法によれば、例えば１匹の雄マウスから１０個程度のサンプルを作製できる。
【０００４】
類似の方法として、精子を、凍結保護剤を用いず、ストロー状の容器に充填し液体窒素中に保存する技術が報告されている（非特許文献２）。この方法では、解凍後の精子は運動能を有さないため、精子を直接マイクロマニピュレーターで未授精卵へ注入するＩＣＳＩ（intracytoplasmic sperm injection）と呼ばれる顕微授精法により子孫を作出する必要がある。上記方法によれば、例えば１匹の雄マウスから１００個程度の精子サンプルが作製可能と報告されている。
【０００５】
上記２つの方法は、いずれもストロー状の容器に精子を充填するため、凍結操作が繁雑である。また、保存状態を維持するためには液体窒素が必要である。
【０００６】
近年開発された方法として、精巣を凍結チューブに入れて−３０℃または−８０℃の冷凍庫中で保存する方法が報告されている（非特許文献３）。凍結に際してフリージングコンテナと称する特定の容器を使用することによって温度の低下を穏やかにすることが推奨されるものの、精巣を凍結するだけでそこに含まれる精子細胞を保存できるため操作は容易である。また、凍結保護剤や液体窒素の使用も不要である。しかし、精巣そのものを凍結するため、１匹の動物から作製できるサンプル数は非常に限られている。
【０００７】
上記のいずれの方法によっても、顕微授精などにより授精可能な精子を保存することは可能であるが、十分量の凍結サンプルを作製するのに多数の雄マウスが必要である、操作が繁雑である、多数の系統保存にはかなりの保存スペースが必要となるなどの問題点があった。
【０００８】
【非特許文献１】Nakagata N. Cryopreservation of mouse spermatozoa. Mammalian genome, 11: 572-576 (2000).
【非特許文献２】Ward MA et al. Long-term preservation of mouse spermatozoa after freeze-drying and freezing without cryoprotectoin. Biology of Reproduction, 69: 2100-2108 (2003).
【非特許文献３】Ogonuki N et al. Spermatozoa and spermatids retrieved from frozen reproductive organs or frozen whole bodies of male mice can produce normal offspring. Proc Natl Acad Sci USA, 103: 13098-13103. (2006).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、簡便かつ効率的な精子細胞の保存方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記のような問題を改善するために、本発明者らは鋭意検討し、冷凍保存した精巣凍結切片から顕微授精により子孫を作出することができることを見出した。この方法により、例えば１匹の雄マウスから理論上数百以上の精子サンプルを調製することが可能である。また、精巣組織１枚当たりの厚さは数十μｍであるため、大量のサンプルを省スペースで保存することができる。
【００１１】
本発明は、
［１］（ｉ）精子細胞を含む、動物の精巣の切片を作製する工程；および
（ｉｉ）作製された切片を冷凍保存する工程、
を包含する、精子細胞の保存方法であって、冷凍保存した切片を解凍することによって、顕微授精による卵子への注入において機能的な精子細胞が得られる、方法；
［２］切片がクライオスタットを使用して作製される、［１］の方法；
［３］切片の厚さが１０〜２５μｍである、［１］または［２］の方法；
［４］冷凍保存が１日〜１ヶ月の期間行われる、［１］〜［３］のいずれかの方法；
［５］冷凍保存が−３０℃で行われる、［１］〜［４］のいずれかの方法；
［６］作製された切片が支持体に付着される、［１］〜［５］のいずれかの方法；
［７］精子細胞を含む、動物の精巣の切片を作製する工程を包含する、精子細胞保存用切片の製造方法であって、作製された切片を冷凍保存後解凍することによって、顕微授精による卵子への注入において機能的な精子細胞が得られる、方法；
［８］切片がクライオスタットを使用して作製される、［７］の方法；
［９］切片の厚さが１０〜２５μｍである、［７］または［８］の方法；
［１０］冷凍保存が１日〜１ヶ月の期間行われる、［７］〜［９］のいずれかの方法；
［１１］冷凍保存が−３０℃で行われる、［７］〜［１０］のいずれかの方法；
［１２］作製された切片が支持体に付着される、［７］〜［１１］のいずれかの方法；
［１３］精子細胞を含む、動物の精巣の切片を含む、精子細胞保存用組成物であって、切片を冷凍保存後解凍することによって、顕微授精による卵子への注入において機能的な精子細胞が得られる、組成物；
［１４］切片がクライオスタットを使用して作製される、［１３］の組成物；
［１５］切片の厚さが１０〜２５μｍである、［１３］または［１４］の組成物；
［１６］冷凍保存が１日〜１ヶ月の期間行われる、［１３］〜［１５］のいずれかの組成物；
［１７］冷凍保存が−３０℃で行われる、［１３］〜［１６］のいずれかの組成物；
［１８］切片が支持体に付着されている、［１３］〜［１７］のいずれかの組成物
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、簡便かつ効率的な精子細胞の保存方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の精子細胞の保存方法は、（ｉ）精子細胞を含む、動物の精巣の切片を作製する工程；および（ｉｉ）作製された切片を冷凍保存する工程を包含し、冷凍保存した切片を解凍することによって、顕微授精による卵子への注入において機能的な精子細胞が得られる。また、本発明の精子細胞保存用切片の製造方法は、精子細胞を含む、動物の精巣の切片を作製する工程を包含し、作製された切片を冷凍保存後解凍することによって、顕微授精による卵子への注入において機能的な精子細胞が得られる。さらに、本発明の精子細胞保存用組成物は、精子細胞を含む、動物の精巣の切片を含み、切片を冷凍保存後解凍することによって、顕微授精による卵子への注入において機能的な精子細胞が得られる。
【００１４】
本明細書における用語「顕微授精による卵子への注入において機能的な精子細胞」とは、顕微授精技術を使用して卵子中に注入した際に、授精・発生を生じさせる能力を有する精子細胞をいう。授精・発生を生じさせる能力は、例えば、得られた授精卵における前核の形成、２細胞期胚への発生、２細胞胚の動物への移植後の子孫の作出などによって確認される。
【００１５】
本明細書における用語「顕微授精」とは、顕微鏡下で人為的に授精を行わせる技術をいう。顕微授精の技術としては、ＩＶＦ（in-vitro fertilization、体外受精ともいう）、ＩＣＳＩ（intracytoplasmic sperm injection、卵細胞内精子注入法ともいう）などが知られている。前者のＩＶＦにおいては、精子を未授精卵と共培養することにより授精を行わせる。この技術には、操作が容易で一度に大量の授精卵を作製することが可能であるという利点があるが、精子が運動能を保持している必要があるという制約がある。後者のＩＣＳＩにおいては、精子を直接マイクロマニピュレーターで未授精卵へ注入する。この技術には、習熟に一定期間のトレーニングが必要であり、一度に作製できる授精卵の数はＩＶＦよりも少ない。しかし、ＩＣＳＩには、精子が運動能を有していなくても授精卵を得ることができるという利点がある。本発明によって得られる精子細胞は、ＩＣＳＩによる顕微授精のために好適に使用される。
【００１６】
本発明において使用する動物には限定はなく、精巣を有する任意の動物が使用される。１つの実施態様において、動物は哺乳動物である。哺乳動物の例としては、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスが挙げられる。精巣は精子形成を行う器官である。従って、精巣中には精子細胞が含まれる。
【００１７】
本明細書において「精子細胞」とは精巣中に含まれる細胞であって、顕微授精による卵子への注入において機能を有する限り限定はない。すなわち、精子細胞は、成熟精子およびより未熟な雄性生殖細胞（例えば、精母細胞）を含む。使用する精子細胞が卵子活性化能を有しない場合は人為的に卵子を活性化する。上記性質を有している限り精子細胞は運動性を示す必要はなく、また生存している必要もない。精子細胞の生存は、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって確認することができる。成熟精子を使用する場合一般に頭部のみを卵子に注入するので、尾部が切断されていても使用可能であり得る。
【００１８】
本発明において動物の精巣の切片を作製する手段には、顕微授精による卵子への注入において機能的な精子細胞が得られる限り限定はない。１つの実施態様において、切片はクライオスタット（クリオスタットともいう）を使用して作製される。クライオスタットは、病理診断において組織の病変や、細胞内部のタンパク質・糖鎖の局在、ＤＮＡ・ＲＮＡの存在などを知るために、細胞・組織の形態をそのままの状態で保持した像を顕微鏡下で観察する目的で（例えば、手術中に行われる組織診断、すなわち術中迅速診断などに）使用される装置である。具体的には、切片を作製しようとする生体試料（器官など）を凍結組織包埋剤（例えば、ＯＣＴコンパウンド）で包んで凍結し、クライオスタットを使用して低温（一般に−１０〜−４０℃、例えば−２０〜−２５℃）でミクロトームにより切片を作製し、次いで作製された切片をスライドガラスに付着させる。得られた切片は一般的には染色やインサイチュハイブリダイゼーションに供され観察される（例えば、廣安  誠、Ｂｉｏ  Ｖｉｅｗ、３９号、３８−４１頁（２００２年）、廣川  満良ら、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１巻１０号１０６４〜１０６８頁（２００３年）参照）。従って、この技術は、機能的な細胞を保存する目的では使用されていない。ここで、上記のＯＣＴコンパウンドは代表的な凍結組織包埋剤であり、ポリニルアルコール、ポリエチレングリコール、否活性物質からなる混合物である。人体などへの有害性は確認されていないが、冷凍保存した切片中の精子細胞に対する影響は未知である。
【００１９】
切片の厚さは精子細胞の損傷などを回避するためには厚い方が好ましいが、より多数の切片を得るためには薄い方が好ましい。当業者は本願の開示に基づいて適切な切片の厚さを決定することができる。本発明において、切片の厚さは、例えば２〜１００μｍ、好ましくは５〜５０μｍ、より好ましくは１０〜２５μｍである。
【００２０】
保存期間中精子細胞の機能が維持される限り、作製された切片を冷凍保存する際の温度に限定はない。温度は、例えば−８０℃〜−５℃、好ましくは−６０℃〜−１０℃、より好ましくは−４０℃〜−２０℃、さらに好ましくは−３０℃である。温度の低下方法にも限定はなく、冷凍保存しようとする試料を直接冷凍庫に入れても良く、あるいはフリージングコンテナやプログラムされた冷却装置を使用して穏やかに温度を低下させてもよい。また、本発明においては一般に精子の保存に使用されているような凍結保護剤を使用する必要はない。保存期間にも限定はなく期間は、例えば１時間以上、好ましくは５時間以上、より好ましくは１日以上であり、例えば１０年以下、好ましくは１年以下、より好ましくは１ヶ月以下である。
【００２１】
１つの実施態様において、切片は支持体に付着される。支持体としては任意の材料（ガラス、プラスティックなど）および形態（チューブ、プレートなど）のものを使用することができる。好ましくは、支持体はスライドガラスである。スライドガラスを支持体として用いることにより、切片を解凍して得られた精子細胞を、直ちに顕微授精に使用することができる。
【００２２】
冷凍保存した切片を解凍し、顕微授精に使用する精子細胞を得る。詳細には、解凍した切片を適当な培地中で懸濁し、分離した精子細胞を回収する。
【００２３】
本発明によって機能的な精子細胞が分離した状態で得られたことは予想外であった。これは、凍結保護剤を使用して精子を凍結する従来の方法や、精巣全体を凍結して器官自体が保護剤の代替物として作用し得る場合に比較して、切片を使用する方法には下記のような悪条件が予測されていたからである。例えば、クライオスタットを使用した場合、精巣は一旦凍結され、作製された凍結切片はスライドガラスに付着させる際に解凍され、スライドガラスに付着した切片は冷凍保存され、顕微授精に供する際に冷凍保存された切片が解凍される。すなわち、この場合、精子細胞は２回の凍結融解を経た後に顕微授精に供される。ここで凍結融解が精子細胞の損傷をもたらすことは一般的に知られている（Wakayama, T. et al., Journal of Reproduction and Fertility, 112: 11-17 (1998)）。また、切片を作製する際に精子細胞自体が切断される可能性もある。これらの物理的な影響に加えて、切片を作製する際に使用するＯＣＴコンパウンドや、切片化して精子細胞を外気に曝露することによる酸化ストレス（Twigg, J.P. et al., Human Reproduction, 13: 1864-1871 (1998)）などが悪影響を及ぼす可能性があった。それにもかかわらず、本発明によって保存された精巣の切片から得られた精子細胞を使用して正常な子孫を効率よく得ることができた。
【００２４】
本発明は、例えば、実験動物または家畜として有用な動物の系統保存に有用である。また、本発明は、射出精液中には精子が認められないが精巣組織には精子が存在する場合の男性不妊（すなわち、精子形成障害に起因する男性不妊）の治療に使用され得る。さらに、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は免疫系の細胞に感染するが、精巣の精細管の内腔部は精巣−血管関門によって免疫系から隔離されているので、本発明によれば、ＨＩＶ感染男性の精細管の内腔部からＨＩＶが存在しない精子細胞を得ることができる。
【００２５】
精子を組織切片として保存できることのさらなる利点は、多大な保存スペースを要しない点である。組織切片は非常に薄いため、シート状（もしくは「本」のような形態）での保存が可能になると思われる。また例えば１匹のマウスから理論上数百サンプルを作製可能である。さらに、凍結サンプルの送付も手紙のような状態で送付可能になると思われ、従来法（発泡スチロールの容器に梱包）より簡便になると予想される。
【００２６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
精巣切片の作成とその凍結保存
マウスはＢ６Ｄ２Ｆ１（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２；以下、ＢＤＦ１）の成熟雄個体（１０週齢）を使用し、凍結切片の作製は通常の組織切片作成方法に従った。具体的には、ＢＤＦ１の雄マウスより精巣を採取し、ＯＣＴコンパウンド（Sakura Finetechnical Co., Ltd.）に包埋した。冷凍庫（−３０℃）で凍結後、クライオスタット（MICROM社）を用いて厚さ１０μｍまたは２５μｍの凍結切片を作製した。作製した切片はスライドガラスに付着させ、−３０℃で保存した。
【００２８】
精巣凍結切片からの精子細胞の回収と顕微授精による子孫の作出
保存後２４時間（１日）または１ヶ月の凍結切片から精子の回収を試みた。まず、スライドガラスに付着させた精巣切片から精子を回収するため、スライドガラスをＮＩＭ溶液（Kuretake S. et al. Fertilization and development of mouse oocytes injected with isolated sperm heads. Biology of Reproduction, 55:789-795. (1996)）に浸した（４℃、２分）。その後マイクロピペットを用いて精巣切片をスライドガラスから剥離し、１．５ｍｌのマイクロチューブに移した。マイクロピペットを用いてよく懸濁し、２３００ｇで２分間遠心した。上清を捨てた後、ＮＩＭ溶液に再懸濁し、顕微授精まで４℃で保存した。
【００２９】
顕微授精による子孫の作出はKimura and Yanagimachiの方法（Kimura Y and Yanagimachi R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction, 52: 709-720. (1995)）に従って行った。具体的には、まず、ＢＤＦ１の雌マウスに過排卵処理（ウマ絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）（５ＩＵ）を投与し、４８時間後にヒト胎盤性性刺激ホルモン（ｈＣＧ）（５ＩＵ）を投与）を施し、卵管より卵子を採取した。卵子の周りの卵丘細胞はヒアルロニダーゼを用いて乖離し、得られた卵子はＣＺＢ培地（Chatot CL et al. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. Journal of Reproduction and Fertility, 86: 679-688. (1989)）を用いて３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【００３０】
先に調製しておいた精子懸濁液を１２％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）溶液に懸濁し、ピエゾパルスにより精子頭部のみを回収した。これらの精子頭部を未授精卵に注入することにより顕微授精を行った。授精後の卵子はＣＺＢ培地で２４時間培養し、２細胞期に発生した胚を偽妊娠マウスへ移植した。これらのマウスは移植後１８．５日で帝王切開し、子孫の有無を確認した。
【００３１】
結果
精巣切片をスライドガラスとして保存し（図１ａ）、精子の回収を試みた。精子回収前の切片を顕微鏡により観察したところ、図１ｂ，ｃのように精子形成を確認することができた。マイクロピペットにより切片を剥離後、細胞懸濁液を作製したところ（図１ｄ）、尾部が切断された精子だが顕微授精可能な細胞懸濁液を調製することに成功した（図１ｅ−ｇ）。また、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により精子を染色したところ、これらの精子は細胞としては死んでいることが明らかとなった（図１ｈ）。
【００３２】
次にこれらの精子細胞の授精・発生能を顕微授精ＩＣＳＩにより確認した。１０μｍおよび２５μｍの精巣切片を−３０℃で２４時間（１日）保存しＩＣＳＩを行ったところ、９０％以上の胚で前核が形成され、そのうち６０〜７０％程度の胚が２細胞期胚へと発生した（表１）。これらの２細胞期胚を偽妊娠マウスへ移植したところ、移植した胚の１０〜２０％が正常な子孫へと発生した（表１、図１ｉ）。以上の結果から、精巣切片から調製した精子は正常な授精・発生能を有していることが明らかとなった。
【００３３】
さらに、１ヶ月保存した精巣切片から精子を調製し、ＩＣＳＩを行ったところ、２４時間保存の精子と同等の成績で子孫を作出することに成功した（表１）。また、この方法により得られたマウスを観察したところ、成長や生殖能力に異常は認められず、正常なマウスが得られていると考えられる。これらの結果から、機能的な精子細胞を精巣凍結切片として保存可能なことが明らかとなった。
【００３４】
また、全ての実験区において２５μｍの切片から調製した精子の方が１０μｍの切片から調製した精子より成功率が高かった（表１）。このことは切片化することにより精子がある程度のダメージを受けていることが示唆される。
【００３５】
【表１】
2009005651.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明により、簡便かつ効率的な精子細胞の保存方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１ａ】凍結切片からの精子の回収とその子孫の作出を示す図である：スライドガラスで凍結保存した精巣切片。
【図１ｂ】凍結切片からの精子の回収とその子孫の作出を示す図である：保存した精巣切片（精子形成が確認できる）。
【図１ｃ】凍結切片からの精子の回収とその子孫の作出を示す図である：保存した精巣切片（精子形成が確認できる）。
【図１ｄ】凍結切片からの精子の回収とその子孫の作出を示す図である：精巣切片から調製した精子細胞。
【図１ｅ】凍結切片からの精子の回収とその子孫の作出を示す図である：精子（正常に近い精子細胞）
【図１ｆ】凍結切片からの精子の回収とその子孫の作出を示す図である：精子（尾部が切断された精子細胞）
【図１ｇ】凍結切片からの精子の回収とその子孫の作出を示す図である：精子（尾部が切断された精子細胞）
【図１ｈ】凍結切片からの精子の回収とその子孫の作出を示す図である：ＰＩ染色した精子細胞。
【図１ｉ】凍結切片からの精子の回収とその子孫の作出を示す図である：顕微授精により作出したマウス。
【図１ａ】
2009005651.tif 000003
【図１ｂ】
2009005651.tif 000004
【図１ｃ】
2009005651.tif 000005
【図１ｄ】
2009005651.tif 000006
【図１ｅ】
2009005651.tif 000007
【図１ｆ】
2009005651.tif 000008
【図１ｇ】
2009005651.tif 000009
【図１ｈ】
2009005651.tif 000010
【図１ｉ】
2009005651.tif 000011