(57)【要約】【課題】自己免疫疾患部位に発現するＣＣＬ２０機能を抑制し、自己免疫疾患に有効な医薬の提供。【解決手段】ＣＣＬ２０に反応性を有するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを有効成分として含んでなる、自己免疫疾患治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＣＬ２０に反応性を有するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを有効成分として含んでなる、自己免疫疾患治療剤。
【請求項２】
自己免疫疾患が関節リウマチである請求項１に記載の自己免疫疾患治療剤。
【請求項３】
ＣＣＬ２０に反応性を有するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを有効成分として含んでなる、骨破壊抑制剤。
【請求項４】
ＣＣＬ２０に反応性を有するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを有効成分として含んでなる、抗炎症剤。
【請求項５】
ＣＣＬ２０に反応性を有するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを有効成分として含んでなる、細胞遊走抑制剤。
【請求項６】
抗体がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体である請求項１乃至５のいずれか１項に記載の自己免疫疾患治療剤。
【請求項７】
ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマ。
【請求項８】
被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件において、被検物質の非存在下よりも被検物質の存在下の方がＣＣＬ２０のＣＣＲ６への作用を抑制する場合に、当該被検物質を自己免疫疾患に有用な物質であると判定する工程を備える自己免疫疾患に有用な物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
自己免疫疾患治療に有用な物質が関節リウマチ治療に有用な物質である請求項８に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ケモカインＣＣＬ２０とＣＣＲ６との相互作用を阻害することによる自己免疫疾患の治療に関する。本発明はまた、ＣＣＬ２０に対する抗体およびその用途に関する。具体的には、本発明は、ＣＣＬ２０に反応性を有する抗体及びそのフラグメント、ＣＣＬ２０に反応性を有するモノクローナル抗体及びそのフラグメント、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、自己免疫疾患（特に関節リウマチ）の診断、予防または治療に用いられるキット、自己免疫疾患（特に関節リウマチ）を診断、予防または治療する方法、該抗体または該抗体フラグメントを含んでなる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは生体内での主たる細胞遊走因子であり、細胞運動の亢進や細胞接着分子の活性化を介して、免疫細胞の組織浸潤を制御している。ケモカインは、その最初の２つのシステイン残基の配列により、ＣＣ、ＣＸＣ、Ｃ、ＣＸＸＸＣの４つのサブファミリーに分類される。ＣＣ、ＣＸＣ、Ｃケモカインのメンバーは、約７０アミノ酸からなる分泌タンパク質であり、それ自身には接着分子としての活性はないが、細胞接着を誘導することができる。分泌されたケモカインは、標的細胞表面上の7回膜貫通型受容体に結合して、三量体Gタンパク質を介してインテグリンを活性化し、細胞の接着や遊走を誘導する。近年、ケモカインとその受容体が免疫細胞の浸潤を制御する中心的なサイトカインであることが報告されたことをはじめ、自己免疫疾患におけるケモカインシステムの働きがその病態形成に密接に関係していることが明らかになってきている。
【０００３】
ＣＣＲ６−ＣＣＬ２０（ＬＡＲＣ／  ＭＩＰ−３ａｒｕｆｗａ／ｅｘｏｄｕｓ）系は、獲得免疫に関与する樹状細胞、メモリーＴ細胞、成熟Ｂ細胞を外来抗原に暴露された部位に集結させ、免疫応答を迅速に開始するために重要な役割を担っていると考えられている（Cytokine & Growth Factor Reviews, 14; 409-426, 2003）（非特許文献１）。腸管免疫ではミエロイド系樹状細胞、腸管指向性メモリーＴ細胞、ナイーブおよびメモリーＢ細胞の移動と局在を制御している（Immunity, 12; 495-503, 2000., J Immunol, 162; 186-194, 1999., Blood, 96; 2338-2345, 2000）（非特許文献２−４）。皮膚免疫ではランゲルハンス細胞と皮膚指向性メモリーＴ細胞の移動を制御している（J Exp Med, 190; 1755-1768, 1999., J Immunol, 164, 6621-6632, 2000）（非特許文献５−６）。また、上皮系組織では炎症の開始や再燃時にＣＣＬ２０の発現が誘導されることが知られている（Cytokine & Growth Factor Reviews, 14; 409-426, 2003）（非特許文献７）。腸管上皮細胞やパイエル板の濾胞関連上皮細胞等では、ＣＣＬ２０の構成的な発現が認められ、ＬＰＳやＴＮＦα、ＩＬ−１βにより発現が増強する（Gut, 51; 818-826, 2002, Eur J Immunol, 29, 633-642, 1999., J Exp Med, 191; 1381-1394., Int Immunol, 13; 1255-63, 2001）（非特許文献８−１１）。ケラチノサイト、気管支上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、滑膜線維芽細胞等でも、炎症性刺激によりＣＣＬ２０の発現が誘導される（Cytokine & Growth Factor Reviews, 14; 409-426, 2003, J Exp Med, 194; 797-808, 2001., J Exp Med, 190; 1755-1768, 1999）（非特許文献１２−１４）。
【０００４】
ＣＣＬ２０の受容体ＣＣＲ６は、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等で発現している。Ｔ細胞での発現は、メモリーＴ細胞に限定され、α４β７陽性腸管指向性Ｔ細胞、ＣＬＡ＋皮膚指向性Ｔ細胞のいずれにも発現が認められる（J Immunol, 162; 186-194, 1999., J Immunol, 164, 6621-6632, 2000）（非特許文献１５−１６）。最近では、ＣＣＲ６が抑制性Ｔ細胞でもエフェクターメモリータイプに発現していることが明らかとなった（Blood, 105; 2877-2886, 2005）（非特許文献１７）。Ｂ細胞においては、末梢血中のナイーブＢ細胞、抗原刺激を経験したメモリーＢ細胞に選択的に発現しており、抗原を認識して迅速に抗体産生を行う為に、ＣＣＬ２０の発現が多いパイエル板や炎症上皮組織に移行すると考えられている（Blood, 96; 2338-2345, 2000., J Exp Med, 191; 1303-1318, 2000）（非特許文献１８−１９）。樹状細胞では、ＣＤ３４陽性前駆細胞をＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα存在下に分化させた未熟樹状細胞、末梢血単球をＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＧＦβ存在下に分化させた未熟樹状細胞、表皮ランゲルハンス細胞等、いわゆる未熟な樹状細胞に発現している（J Exp Med, 186; 825-835, 1997., J Immunol, 163, 1737-1741, 1999, J Exp Med, 192; 705-718, 2000）（非特許文献２０−２２）。粘膜上皮や皮膚上皮からの構成的および炎症刺激により産生されるＣＣＬ２０により、未熟樹状細胞が体腔表層に配置されることで抗原の効率よい取り込みが可能となり、獲得免疫が始動されると考えられている（Cytokine & Growth Factor Reviews, 14; 409-426, 2003, J Exp Med, 190; 1755-1768, 1999）（非特許文献２３−２４）。ＴＮＦαで刺激されたヒト好中球でＣＣＲ６が発現しているとの報告もある(Blood, 96; 3958-3963, 2000) （非特許文献２５）。さらに最近では、ＣＣＲ６陽性未熟樹状細胞が、ガン新生血管に取り込まれて血管内皮細胞に分化することが報告されている（Nat Med, 10; 950-958, 2004）（非特許文献２６）。一方で、ＣＤ１ａ陽性未熟樹状細胞が関節リウマチ患者由来の滑膜液によって破骨細胞に分化することが記載されているが（Blood, 104; 4029-4037, 2004）（非特許文献２７）、破骨前駆細胞としてのＣＤ１ａ陽性未熟樹状細胞におけるＣＣＲ６−ＣＣＬ２０系の機能や関節リウマチへの関与、およびこの経路を遮断した際の効果については全く言及されていない。
【０００５】
ところで、関節リウマチでは、患者の滑膜液中にＣＣＬ２０が認められている(Clin Exp Immunol, 125; 155-161, 2001)（非特許文献２８） 。変形性関節炎患者の滑膜液中でＣＣＬ２０の発現は低い。関節リウマチ患者の滑膜組織では、最表層および血管周囲にＣＣＬ２０の発現が見られ、最表層にはＣＣＬ２０発現部位の近傍にCD1a陽性未熟樹状細胞が存在している（J Immunol, 168; 5333-5341, 2002）（非特許文献２９）。また、関節リウマチ患者由来の滑膜細胞をＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−１７等で刺激するとＣＣＬ２０の産生が誘導される(J Immunol, 167; 6015-6020, 2001) （非特許文献３０）。しかしながら、関節内洗浄液中には種々のケモカインの発現が認められるため、ＣＣＬ２０の病態形成への寄与度は明らかではない。
【０００６】
一方、特開２００２−１８７８５６号公報（特許文献１）にはＬＡＲＣ阻害物質を慢性関節リウマチの治療剤等に用いるとの記載は存在するが、当該文献は単にＬＡＲＣが慢性関節リウマチ患者において高発現をしているからＬＡＲＣを抑制すればよいと記載されているだけであり、治療効果の実証は何らなされていない。ケモカインは、各種疾患において発現しているものを抑制すれば治療効果がある場合もあるが、逆に発現を促進すれば治療効果がある場合もあり、単に高発現しているＬＡＲＣを抑制したからといって慢性関節リウマチに効果があるということはいえない。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１８７８５６号公報
【非特許文献１】Cytokine & Growth Factor Reviews, 14; 409-426, 2003
【非特許文献２】Immunity, 12; 495-503, 2000
【非特許文献３】J Immunol, 162; 186-194, 1999
【非特許文献４】Blood, 96; 2338-2345, 2000
【非特許文献５】J Exp Med, 190; 1755-1768, 1999
【非特許文献６】J Immunol, 164, 6621-6632, 2000
【非特許文献７】Cytokine & Growth Factor Reviews, 14; 409-426, 2003
【非特許文献８】Gut, 51; 818-826, 2002
【非特許文献９】Eur J Immunol, 29, 633-642, 1999
【非特許文献１０】J Exp Med, 191; 1381-1394
【非特許文献１１】Int Immunol, 13; 1255-63, 2001
【非特許文献１２】Cytokine & Growth Factor Reviews, 14; 409-426, 2003
【非特許文献１３】J Exp Med, 194; 797-808, 2001
【非特許文献１４】J Exp Med, 190; 1755-1768, 1999
【非特許文献１５】J Immunol, 162; 186-194, 1999
【非特許文献１６】J Immunol, 164, 6621-6632, 2000
【非特許文献１７】Blood, 105; 2877-2886, 2005
【非特許文献１８】Blood, 96; 2338-2345, 2000
【非特許文献１９】J Exp Med, 191; 1303-1318, 2000
【非特許文献２０】J Exp Med, 186; 825-835, 1997
【非特許文献２１】J Immunol, 163, 1737-1741, 1999
【非特許文献２２】J Exp Med, 192; 705-718, 2000
【非特許文献２３】Cytokine & Growth Factor Reviews, 14; 409-426, 2003
【非特許文献２４】J Exp Med, 190; 1755-1768, 1999
【非特許文献２５】Blood, 96; 3958-3963, 2000
【非特許文献２６】Nat Med, 10; 950-958, 2004
【非特許文献２７】Blood, 104; 4029-4037, 2004
【非特許文献２８】Clin Exp Immunol, 125; 155-161, 2001
【非特許文献２９】J Immunol, 168; 5333-5341, 2002
【非特許文献３０】J Immunol, 167; 6015-6020, 2001
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、今般、、ＣＣＲ６発現細胞のＣＣＬ２０に対する遊走を抑制する抗体が関節リウマチの疾患モデルであるコラーゲン誘導関節炎モデルに対して治療効果（特に炎症抑制、骨破壊抑制）を有することを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００９】
本発明の第一の態様は、ＣＣＬ２０に反応性を有する抗体、ＣＣＬ２０に反応性を有するモノクローナル抗体である。本発明の第二の態様は、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。本発明の第三の態様は、該モノクローナル抗体を組換えてなる組換キメラモノクローナル抗体である。本発明の第四の態様は、該モノクローナル抗体を組換えてなる組換ヒト型モノクローナル抗体である。本発明の第五の態様は、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造されるヒトモノクローナル抗体である。本発明の第六の態様は、前記モノクローナル抗体に由来する抗体フラグメントである。本発明の第七の態様は、前記モノクローナル抗体、それに由来するキメラモノクローナル抗体、前記モノクローナル抗体に由来するヒト型モノクローナル抗体またはヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造されるヒトモノクローナル抗体を不溶性担体に固定化してなる固定化モノクローナル抗体である。本発明の第八の態様は、前記モノクローナル抗体、それに由来するキメラモノクローナル抗体、前記モノクローナル抗体に由来するヒト型モノクローナル抗体またはヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造されるヒトモノクローナル抗体を単独または他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識モノクローナル抗体及び前記抗体フラグメントを単独または他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識抗体フラグメントである。本発明の第九の態様は、自己免疫疾患（特に関節リウマチ）の検出、定量に用いられるキットである。本発明の第十の態様は、自己免疫疾患（特に関節リウマチ）を検出、定量する方法である。本発明の第十一の態様は、該抗体または該抗体フラグメントを含んでなる自己免疫疾患（特に関節リウマチ）の予防、治療または診断に用いる医薬組成物を提供することである。本発明の第十二の態様は、関節リウマチにおける骨（軟骨を含む）破壊および炎症の予防、診断または治療に用いる医薬組成物を提供することである。本発明の第十三の態様は、ＣＣＲ６を発現する細胞遊走の阻害に用いる医薬組成物を提供することである。本発明の第十四の態様は、ＣＣＲ６とＣＣＬ２０の結合を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【発明の具体的な説明】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の記述は、本発明を説明するための例示であり、本発明を記述された実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本明細書中で使用される全ての技術的用語、科学的用語および専門用語は、本発明が属する技術分野の通常の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有し、単に特定の態様を説明することを目的として用いられ、限定することを意図したものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。本明細書において引用された全ての先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられ、本発明の実施のために用いることができる。
【００１１】
抗原
本発明で使用する抗体を製造する場合、抗原であるＣＣＬ２０は公知の方法に従って精製したものであってもよいが、遺伝子工学的に調製することも可能である。
【００１２】
ＣＣＬ２０タンパク質は、そのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡが報告されている。例えば、マウスの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NM ０５８６５６、ヒトの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NM ００４５８２およびマウスの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NM ０１６９６０、ヒトの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NM ００４５９１等が報告されている。本発明において用いるＣＣＬ２０タンパク質は、このような公知の情報に基づいてそのアミノ酸配列またはそれをコードするＤＮＡを具体的に特定することができる。
【００１３】
具体的には、本発明におけるＣＣＬ２０タンパク質は下記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるポリペプチドからなる：
（Ａ）  前述のアクセッション番号：NM ００４５９１によりコードされるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（Ｂ）  前記(Ａ)のアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個、より好ましくは１、２、または３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ、ＣＣＬ２０タンパク質と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド；
（Ｃ）  前記(Ａ)のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（Ｄ）  前記(Ａ)のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＣＣＬ２０タンパク質と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド；および、
（Ｅ）  前記(Ａ)のアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされてなるポリペプチドであって、ＣＣＬ２０タンパク質と実質的に同じ活性を有する、ポリペプチド。
【００１４】
本発明に使用するＣＣＬ２０タンパク質としては、「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド」が好ましい。
【００１５】
ここで、「前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列」とは前記に列記したアクセッション番号により所定の公知のデータベースより特定されるアミノ酸配列のことである。
【００１６】
ここで、ポリペプチドが「ＣＣＬ２０タンパク質と実質的に同じ活性を有する」とは、そのポリペプチドが、自己免疫疾患作用を有するものであればいかなるものも含まれる。具体的には、ＣＣＲ６に直接的または間接的に遊走化作用を有することを意味する。また実質的に同じとは、活性が性質的に同質であることを意味する。すなわち、「ＣＣＬ２０タンパク質と実質的に同じ活性を有する」ためには、前記活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは０．０５〜２０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましい。これらの活性については、慣用の方法にしたがって測定することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって測定することができる。
【００１７】
本発明の好ましい態様によれば、前記（Ｂ）のポリペプチド（以下において「改変ポリペプチド」と言うことがある）は、そのアミノ酸配列が、前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、ヒトの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００４５８２）を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個、より好ましくは１、２、または３個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であって、しかもＣＣＬ２０タンパク質と実質的に同じ活性を有するポリペプチドであることができる。
【００１８】
本願明細書において「保存的置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１または複数個（好ましくは数個、より好ましくは１、２、または３個）のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合等が挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００１９】
ここで、欠失、置換および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。なお、前記改変ポリペプチドには、改変ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。したがって、これらの条件を満たす限り、前記改変ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。
【００２０】
アミノ酸の欠失、置換および／または付加による変異体は、例えばそれをコードするＤＮＡに例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982参照）を施すことにより作成できる。本明細書において「１または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換および／または付加できる程度の数のアミノ酸を意味する。
【００２１】
あるタンパク質において、元のタンパク質の抗原性を維持した状態で、１若しくは複数個のアミノ酸を欠失、挿入、置換または付加させる方法は公知である。例えば、部位特異的変異誘発法により変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製し、適宜発現させて得ることができる(Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Press(1989);Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,(1987-1997),Section8.1-8.5;Hashimoto-Goto et a1.(1995)Gene 152:271-5;Kinkel(1985)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 82:488-92;Kramer and Fritz(1987)Method.Enzymol 154:350-67;Kunke1(1988)Method.Enzymo1.85:2763-6)。部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養しＤＮＡを回収する。
尚、ＣＣＬ２０タンパク質の生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を喪失せしめない１または複数のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを欠失、置換および／または付加し、次いで連結する方法もある。
【００２２】
本明細書において、「欠失」には、アミノ酸配列の端からアミノ酸残基を欠失したものおよびアミノ酸配列の途中のアミノ酸残基が欠失したものも含まれる。
【００２３】
「付加」には、アミノ酸配列の端にアミノ酸残基を付加したものおよびアミノ酸配列の途中にアミノ酸残基を付加したものも含まれる。
【００２４】
１つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在する。従って、前述のアクセッション番号により特定されるいずれかのアミノ酸配列（好ましくは、マウスの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０５８６５６、ヒトの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００４５８２）またはその酵素活性部分をコードするいずれのＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。
【００２５】
本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するＣＣＬ２０タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前述のアクセッション番号により特定されるいずれかの塩基配列（好ましくは、ヒトの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NM ００４５９１）からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のＣＣＬ２０タンパク質と実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードしてなるものである。具体的には、前記アクセッション番号により特定される塩基配列以外の配列からなるポリヌクレオチドであって、マウスの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NM ０１６９６０（マウス由来）からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２６】
この改変ポリペプチドには、さらにそのＮ末端（アミノ末端）およびＣ末端（カルボキシル末端）が改変または修飾されているものも包含されてよい。例えば、Ｃ末端のカルボキシルが、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）とされていてもよい。なおここで前記Ｒは、例えば直鎖、分岐鎖もしくは環状のＣ１−６アルキル基、Ｃ６−１２アリール基等が挙げられる。またＮ末端のアミノ基が慣用の保護基により保護されたもの等も改変ポリペプチドに包含され得る。
【００２７】
前記（Ｂ）のポリペプチドの例としては、ヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌ等）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類等］由来のＣＣＬ２０タンパク質もしくはその変異体が挙げられる。具体的には例えば、マウスの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NP_058656（マウス由来）からなるポリペプチドが挙げられる。
【００２８】
前記（Ｃ）のポリペプチド（以下において「相同ポリペプチド」と言うことがある）は、ＣＣＬ２０タンパク質のアミノ酸配列に関して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではないが、好ましくは、ＣＣＬ２０タンパク質に関して、同一性が８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもＣＣＬ２０タンパク質と実質的に同じ活性を有するポリペプチドである。
【００２９】
本願明細書において、「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。なお、前記相同ポリペプチドには、相同ポリペプチドの塩が含まれ、ジスルフィド結合をしたものとジスルフィド結合をしていないもの、リン酸化されたものとリン酸化されていないもの、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。したがって、これらの条件を満たす限り、前記相同ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。例えばヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌ等）］由来のＣＣＬ２０タンパク質もしくはその変異体が含まれる。
【００３０】
具体的には、前記（Ｃ）の相同ポリペプチドとしては、例えば、マウスの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NP_０５８６５６（マウス由来）からなるポリペプチドが挙げられる。
【００３１】
なお、本明細書において、変異体とは、「ｖａｒｉａｔｉｏｎ」、すなわち、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
【００３２】
さらに、本発明に使用するＣＣＬ２０タンパク質（すなわち、ＣＣＬ２０タンパク質、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）の部分ポリペプチドも、ＣＣＬ２０タンパク質と実質的に同じ活性を有する限り使用することができる。この場合、部分ポリヌクレオチドを構成するアミノ酸数は、ＣＣＬ２０タンパク質のアミノ酸数の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％である。
【００３３】
前記(D)のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにおける「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Meth. Enzym., 164, 765 (1988)〕等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、例えばヒトの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NM ００４５９１と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer(Amersham Life Science)を用いた方法として、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して１時間以上６８℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、最後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行うことも考えられる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、３７〜５５℃で１時間以上インキュベートし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや２度目の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる
。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を６０℃、さらにストリンジェントな条件としては６８℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ＣＣＬ２０タンパク質のアイソフォーム、アレリック変異体、及び対応する他種生物由来の遺伝子を得るための条件を設定することができる。
【００３４】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press (1989);特にSection9.47-9.58) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997);特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995);条件については特にSection2.10)等を参照することができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NM ００４５９１の塩基を含む塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より一層好ましくは９０％（例えば、９５％以上、さらには９９％）の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このような同一性は、上述の相同性の決定と同様にBLASTアルゴリズム(Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。上述の塩基配列についてのプログラムBLASTNの他に、このアルゴリズムに基づいたアミノ酸配列についての同一性を決定するプログラムとしてBLASTX(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)等が開発されており、利用可能である。具体的な解析方法については先に挙げたように、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.等を参照することができる。
【００３５】
その他、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 6.1-6.4)により、ＣＣＬ２０タンパク質のアイソフォームやアレリック変異体等を、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから、ヒトの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NM ００４５９１、マウスの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NM ０１６９６０等を基に設計したプライマーを利用して得ることができる。
【００３６】
ポリヌクレオチドの塩基配列は、慣用の方法により配列決定して確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463）等による確認が可能である。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００３７】
本発明に使用するＣＣＬ２０タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明に使用するＣＣＬ２０タンパク質をコードするポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分ポリヌクレオチド配列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行なう方法等を挙げることができる。
【００３８】
本発明に使用するＣＣＬ２０タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、「前述のアクセッション番号により特定される塩基配列（例えば、ヒトの場合ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NM ００４５９１）からなるポリヌクレオチド」が好ましい。
【００３９】
また、本発明の抗体を得るためのＣＣＬ２０タンパク質には、ＣＣＬ２０タンパク質の全長アミノ酸配列を有するポリペプチドに加えて、ＣＣＬ２０タンパク質の少なくとも６アミノ酸残基以上（例えば、６、８、１０、１２または１５アミノ酸残基以上）と同一の配列を有するポリペプチド断片（「フラグメント」ということもある。）も含まれる。本明細書におけるＣＣＬ２０タンパク質のフラグメントは、ＣＣＬ２０タンパク質の抗原性さえ有すればどのようなフラグメントであってもよい。
【００４０】
好ましいフラグメントとしては、ＣＣＬ２０タンパク質のアミノ末端、カルボキシル末端等のフラグメントを挙げることができる。ポリペプチドの抗原決定部位は、タンパク質のアミノ酸配列上の疎水性／親水性を解析する方法(Kyte-Doolittle(1982)J.Mol.Biol. 157:105-22)、二次構造を解析する方法(Chou-Fasman(1978)Ann.Rev.Biochem. 47:251-76)により推定し、さらにコンピュータープログラム(Anal.Biochem. 151:540-6(1985))または短いペプチドを合成しその抗原性を確認するＰＥＰＳＣＡＮ法（特表昭６０−５００６８４号公報）等の手法により確認することができる。
【００４１】
抗体
本発明による抗体には、ＣＣＬ２０タンパク質を抗原として、該抗原をマウス等の哺乳動物に免疫して得られるモノクローナル抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造されるキメラモノクローナル抗体およびヒト型モノクローナル抗体、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造されるヒトモノクローナル抗体が含まれる。本発明による抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用の観点から、ヒトモノクローナル抗体が望ましい。
【００４２】
本発明における「抗体」とは、ポリクローナル抗体 （抗血清）あるいはモノクローナル抗体 を意味し、好ましくはモノクローナル抗体 である。また、本発明の「抗体」は、抗原（例えば、天然型抗原、遺伝子組換抗原、抗原を発現している細胞等）を後述に挙げるような哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体 、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラモノクローナル抗体 及びヒト型モノクローナル抗体 、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等も用いて製造され得るヒトモノクローナル抗体を包含する。
【００４３】
免疫抗原としては、ＣＣＬ２０タンパク質のフラグメントを用いることができる。あるいは、上記抗原のアミノ酸配列に基づき合成したものを用いることができる。抗原はキャリアタンパク質との複合体として用いてもよい。抗原とキャリアタンパク質の複合体の調製には種々の縮合剤を用いることができる、例えばグルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用できる。キャリアタンパク質は牛血清アルブミン、サイログロブリン、ヘモシアニン等の常用されているものでよく、通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる方法が用いられる。
【００４４】
免疫される哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギ等が挙げられ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内の投与が挙げられる。投与に際しては完全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよく、投与は通常２〜５週毎に１回ずつ行われる。免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させ、ハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としては哺乳動物由来、例えばマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましいが、異種間においても可能な場合もある。
【００４５】
本発明による抗体は、ＣＣＬ２０タンパク質を特異的に認識することができる。従って、本発明による抗体を得るためのＣＣＬ２０タンパク質は、ＣＣＬ２０の抗原性を有していればよく、ＣＣＬ２０タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が包含される。このような変異タンパク質が元のタンパク質と同じ生物学的活性が維持されることは公知である(Mark et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5662-6;Zoller and Smith(1982)Nucleic Acids Res. 10:6487-500;Wang et al.(1984)Science 224:1431-3;Dalbadie-McFarland et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6409-13)。また、本発明による抗体には、ＣＣＬ２０タンパク質の一部に対して特異的な抗体も含まれる。
【００４６】
本発明による抗体は、好ましくはＣＣＬ２０タンパク質の機能に影響を与える抗体である。ＣＣＬ２０タンパク質の機能に影響を与えるとは、例えば、該抗体がＣＣＬ２０タンパク質と結合することにより、ＣＣＬ２０タンパク質とＣＣＲ６との結合を阻害すること、または該抗体がＣＣＬ２０タンパク質と結合することにより、ＣＣＲ６の活性化を介した細胞遊走を阻害することである。
【００４７】
ポリクローナル抗体
本発明における「ポリクローナル抗体」は、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。即ち、例えば、前述のような抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギに免疫することで該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。
【００４８】
モノクローナル抗体
また、本発明における「モノクローナル抗体」は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、前述のような抗原を免疫原とし、該免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギ（後述するヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１〜数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜４回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。免疫を施す回数及び時間的インターバルは、使用する免疫原の性質等により、適宜変更することができる。
【００４９】
本発明によるモノクローナル抗体は、当業者に周知方法を用いて得ることができる（例えば、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987))、Antibodies:A Laboratory Manual, Ed.Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)）。
【００５０】
さらに、本発明におけるモノクローナル抗体を分泌する「ハイブリドーマ」の調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（ネイチャー(Nature) , 256,495, 1975）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシから取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞を細胞融合させることにより調製される。
【００５１】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（６５３）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ、Ｓｐ２）、ＰＡＩ、Ｆ０あるいはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ．２．３．、ヒト由来ミエローマＵ−２６６ＡＲ１、ＧＭ１５００−６ＴＧ−Ａ１−２、ＵＣ７２９−６、ＣＥＭ−ＡＧＲ、Ｄ１Ｒ１１あるいはＣＥＭ−Ｔ１５等を使用することができる。
【００５２】
融合促進剤としてはポリエチレングリコールやセンダイウイルス等が挙げられ、通常には、２０〜５０％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜４０００）を用いて２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃の温度下、抗体 産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常１：１〜１０：１程度、約１〜１０分間程度反応させることにより細胞融合を実施することができる。
【００５３】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の免疫化学的方法によって測定することにより行うことができる。具体的には、例えば、ＣＣＬ２０タンパク質をコートしたマイクロプレートを用いるＥＬＩＳＡ法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマイクロプレートを用いるＥＩＡ法、ＣＣＬ２０タンパク質を含むサンプルを電気泳動後、ニトロセルロース転写膜を用いるイムノブロット法等が挙げられる。
【００５４】
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには、また、上記免疫化学的方法に代えて、該抗体がＣＣＬ２０タンパク質の機能に影響を与えるか否かによりスクリーニングすることができる。例えば、該抗体がＣＣＬ２０タンパク質と結合することにより、ＣＣＬ２０タンパク質とＣＣＲ６との結合が阻害されるか否か、および該抗体がＣＣＬ２０タンパク質と結合することにより、ＣＣＲ６の活性化を介した細胞遊走を阻害するか否かにより、抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることができる。このスクリーニング方法により、本発明の抗体の好ましい様態であるＣＣＬ２０タンパク質の機能に影響を与える抗体を選択することができる。またこのスクリーニングは、ＣＣＬ２０タンパク質と結合する抗体を産生するか否かにより選択する上記免疫化学的方法スクリーニングに次いで行う、２次スクリーニングとして行っても良い。
【００５５】
このようなウェルから更に、例えば限界希釈法によってクローニングを行い、クローンを得ることができる。ハイブリドーマの選別、育種は、通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。このようにして得られたクローンはあらかじめプリスタンを投与したＳＣＩＤマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製の原料とすることもできる。
【００５６】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、または哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ等、好ましくはマウス、ラット、ハムスターまたはモルモット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
【００５７】
インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知の栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
【００５８】
基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。
【００５９】
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。具体的には、モノクローナル抗体の精製は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、たとえば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、さらにＣＣＬ２０タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー等の手段により容易に達成することができる。
【００６０】
本発明によるモノクローナル抗体の具体例としては、２００５年１１月８日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５のもと受託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が挙げられる。
【００６１】
従って、本発明のハイブリドーマの具体例としては、２００５年１１月８日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５のもと寄託されたハイブリドーマ（＠ｍＬＡＲＣ ＃２Ｆ５−５）が挙げられる。
【００６２】
遺伝子組換え技術を用いて製造されるモノクローナル抗体
また、本発明における「キメラモノクローナル抗体」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その可変領域が、非ヒト哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター等）のイムノグロブリン由来の可変領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体等のキメラモノクローナル抗体を意味する。また、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（Ｖ領域）を切り出し、ヒト骨髄由来の抗体定常部（Ｃ領域）遺伝子と結合して作製することができる。例えば、特公平３−７３２８０号公報に記載の方法を参照して作製することができる。
【００６３】
ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明における組換キメラモノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。
【００６４】
本発明におけるキメラモノクローナル抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。しかしながら、そのような製造方法に限定されるものでないことは言うまでもない。
【００６５】
例えば、マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体は、実験医学（臨時増刊号）、第１．６巻、第１０号、１９８８年及び特公平３−７３２８０号公報等を参照しながら作製することができる。即ち、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから単離した該マウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶH遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＤＪ遺伝子）の下流に、ヒトイムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣH遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、また該ハイブリドーマから単離したマウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶL遺伝子 （Ｌ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）の下流にヒトイムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣL遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、各々発現可能なように配列して１つ又は別々の発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養することにより作製することができる。
【００６６】
具体的には、まず、マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから常法によりＤＮＡを抽出後、該ＤＮＡを適切な制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII等）を用いて消化し、電気泳動に付して（例えば０．７％アガロースゲル使 用）サザンブロット法を行う。泳動したゲルを例えばエチジウムブロマイド等で染色し、写真撮影後、マーカーの位置を付し、ゲルを２回水洗し、０．２５Ｍ ＨＣｌ溶液に１５分間浸す。次いで、０．４ＮのＮａＯＨ溶液に１０分間浸し、その間緩やかに振盪する。常法により、フィルターに移し、４時間後フィルターを回収して２×ＳＳＣで２回洗浄する。フィルターを十分乾燥した後、ベイキング（７５℃、３時間）を行う。ベイキング終了後に、該フィルターを０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に入れ、６５℃で３０分間処理する。次いで、３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に浸す。得られたフィルターをプレハイブリダイゼーション液と共にビニール袋に入れ、６５℃で３〜４時間処理する。
【００６７】
次に、この中に３２Ｐ標識したプローブＤＮＡ及びハイブリダイゼーション液を入れ、６５℃で１２時間程度反応させる。ハイブリダイゼーション終了後、適切な塩濃度、反応温度および時間（例えば、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液、室温、１０分間）のもとで、フィルターを洗う。該フィルターをビニール袋に入れ、２×ＳＳＣを少量加え、密封し、オートラジオグラフィーを行う。
【００６８】
上記サザンブロット法により、マウスモノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖を各々コードする再配列されたＶＤＪ遺伝子及びＶＪ遺伝子を同定する。同定したＤＮＡ断片を含む領域をショ糖密度勾配遠心にて分画し、ファージベクター（例えば、Charon 4A、Charon 28、 λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４等）に組み込み、該ファージベクターで大腸菌（例えば、LE392、 NM539等） を形質転換し、ゲノムライブラリーを作製する。そのゲノムライブラリーを適当なプローブ（Ｈ鎖Ｊ遺伝子、Ｌ鎖（κ）Ｊ遺伝子等）を用いて、例えばベントンデイビス法（サイエンス(Science)、第１９６巻、第１８０〜第１８２頁、１９７７年）に従って、プラークハイブリダイゼーションを行い、再配列されたＶＤＪ遺伝子あるいはＶＪ遺伝子を各々含むポジティブクローンを得る。得られたクローンの制限酵素地図を作製し、塩基配列を決定し、目的とする再配列されたＶＨ（ＶＤＪ）遺伝子あるいはＶＬ（ＶＪ）遺伝子を含む遺伝子が得られていることを確認する。
【００６９】
一方、キメラ化に用いるヒトＣＨ遺伝子及びヒトＣＬ遺伝子を別に単離する。例えば、ヒトＩｇＧ１  とのキメラ抗体を作製する場合には、ＣＨ遺伝子であるＣγ１遺伝子とＣＬ遺伝子であるＣκ遺伝子を単離する。これらの遺伝子はマウス免疫  グロブリン遺伝子とヒト免疫グロブリン遺伝子の塩基配列の高い相同性を利用してヒトＣγ１遺伝子及びヒトＣκ遺伝子に相当するマウスＣγ１遺伝子及びマウスＣκ遺伝子をプローブとして用い、ヒトゲノムライブラリーから単離することによって得ることができる。
具体的には、例えば、クローンＩｇ１４６（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第７５巻、第４７０９〜第４７１３頁、１９７８年）からの３ｋｂのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片と クローンＭＥＰ１０（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第７８巻、第４７４〜第４７８頁、１９８１年）からの６．８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をプローブとして用い、ヒトのラムダCharon 4A のＨａｅIII−ＡｌｕＩゲノムライブラリー（ (Cell、第１５巻、第 １１５７〜第１１７４頁、１９７８年）中から、ヒトＣκ遺伝子を含み、エンハンサー領域を保持しているＤＮＡ断片を単離する。また、ヒトＣγ1遺伝子は、 例えばヒト胎児肝細胞ＤＮＡをＨｉｎｄIIIで切断し、アガロースゲル電気泳動で分画した後、５．９ｋｂのバンドをλ７８８に挿入し、前記のプローブを用いて単離する。
【００７０】
このようにして単離されたマウスＶH遺伝子とマウスＶL遺伝子、及びヒトＣH 遺伝子とヒトＣL遺伝子を用いて、プロモーター領域及びエンハンサー領域等を考慮しながらマウスＶH遺伝子の下流にヒトＣH遺伝子を、またマウスＶL遺伝子の下流にヒトＣL遺伝子を、適切な制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、例えばｐＳＶ２ｇｐｔあるいはｐＳＶ２ｎｅｏ等の発現ベクターに常法に従って組み込む。この際、マウスＶH遺伝子／ヒトＣH遺伝子とマウスＶL遺伝子／ヒトＣL遺伝子のキメラ遺伝子は、一つの発現ベクターに同時に配置されてもよいし、各々別個の発現ベクターに配置することもできる。
【００７１】
このようにして作製したキメラ遺伝子挿入発現ベクターを、例えばP3X63・Ag8・653細胞あるいは SP210細胞といった、自らは抗体を産生していない骨髄腫細胞にプロトプラスト融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法あるいは電気穿孔法等により導入する。形質転換細胞は、発現ベクターに導入された薬物耐性遺伝子に対応する薬物含有培地中での培養により選別し、目的とするキメラモノクローナル抗体産生細胞を取得する。
【００７２】
このようにして選別された抗体産生細胞の培養上清中から目的のキメラモノクローナル抗体を取得する。
【００７３】
本発明における「ヒト型モノクローナル抗体」は、マウス抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ；相補性決定領域）の遺伝子配列だけをヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体である。例えば、特表平４−５０６４５８号公報および特開昭６２−２９６８９０号公報等に記載の方法を参照して作製することができる。具体的には、その超可変領域の相補性決定領域の一部または全部が非ヒト哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター等）のモノクローナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であり、その可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒト型モノクローナル抗体を意味する。
【００７４】
ここで、超可変領域の相補性決定領域とは、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相補的に直接結合する部位である３つの領域（Complementarity-determining residue；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を指し、また可変領域の枠組領域とは、該３つ相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された４つの領域（Framework；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を指す。
【００７５】
換言すれば、非ヒト哺乳動物由来のモノクローナル抗体の超可変領域の相補性決定領域の一部または全部以外の全ての領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域と置き代わったモノクローナル抗体を意味する。
【００７６】
ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ（IgG1, IgG2, IgG3, IgG4）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明におけるヒト型モノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。また、ヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域についても限定されるものではない。
【００７７】
本発明におけるヒト型モノクローナル抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。しかしながら、そのような製造方法に限定されるものでないことは言うまでもない。
【００７８】
例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する組換ヒト型モノクローナル抗体は、特表平４−５０６４５８号公報及び特開昭６２−２９６８９０号公報等を参照して、遺伝子工学的に作製することができる。即ち、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、少なくとも１つのマウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子に対応する少なくとも１つのマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を単離し、またヒトイムノグロブリン遺伝子から前記マウスＨ鎖ＣＤＲに対応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ鎖遺伝子と、前マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子を単離する。
【００７９】
単離した該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＨ鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに導入し、同様に該マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＬ鎖遺伝子を発現可能なように適当なもう１つの発現ベクターに導入する。または、該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＨ鎖遺伝子とマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＬ鎖遺伝子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入することもできる。このようにして作製された発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりヒト型モノクローナル抗体産生形質転換細胞を得、該形質転換細胞を培養することにより培養上清中から目的のヒト型モノクローナル抗体を得る。
【００８０】
本発明における「ヒトモノクローナル抗体」とは、イムノグロブリンを構成するＨ鎖の可変領域及びＨ鎖の定常領域並びにＬ鎖の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含むすべての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンとなっている抗体であって、ヒト抗体遺伝子をマウスに導入して作製することができる。例えば、Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994；Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997；特表平４−５０４３６５号公報；特表平７−５０９１３７号公報； ＷＯ９４／２５５８５号公報；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994；および特表平６−５００２３３号公報に記載の方法を参照して作製することができる。具体的には、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。
【００８１】
例えば、ヒトモノクローナル抗体を産生するトランスジェニックマウスは、Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994；Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997；特 表平4-504365号公報；特表平7-509137号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994；及び特表平６−５００２３３号公報等に記載の方法に従って作製することができる。
【００８２】
また、昨今開発された技術であるトランスジェニックなウシやブタのミルク中からヒト由来タンパク質を製造する方法を適用することも可能である（日経サイエンス、1997年４月号、第７８頁乃至８４頁）。
【００８３】
以下に単にモノクローナル抗体と記載した場合、上述のキメラモノクローナル抗体、ヒト型モノクローナル抗体およびヒトモノクローナル抗体を含む場合もある。
【００８４】
本発明における「抗体のフラグメント」とは、前述のようなモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはF(ab')2 、Fab'、Fab 、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、およびこれらの重合体等が挙げられる。ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（disulphide stabilised Fv）あるいはｄＡｂ（single domain antibody）等を意味する（Exp. Opin. Ther. Patents，第６巻，第５号，第441〜456頁，1996年）。
【００８５】
ここで、「Ｆ(ａｂ’)２」及び「Ｆａｂ'」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）を、蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてＶL（Ｌ鎖可変領域）とＣL（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶH（Ｈ鎖可変領域）とＣHγ1（Ｈ鎖定常領域中のγ1領域）とからなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Ｆａｂ'という。またＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのＦａｂ'がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをＦ(ａｂ’)２という。
【００８６】
［抗体の用途および医薬組成物］
自己免疫疾患
前述のように、生体は、生体（自己）にとって異物である抗原に対しては獲得免疫応答システムを作動させるが、自己の生体成分（自己抗原）に対しては免疫応答を示さない免疫寛容を有している。しかしながら、何らかの原因で免疫寛容の破綻が起こると、自己抗原に対する免疫応答が起こり前述と同様のメカニズムにより自己抗原反応性Ｔ細胞が誘導され免疫異常状態に陥り、種々の自己免疫疾患が惹起される。
【００８７】
また、後記実施例では、コラーゲン誘導関節炎モデルにおいて、本発明による抗体が実際に治療効果を有することが確認された。コラーゲン誘導関節炎モデルは、自己免疫疾患の一つである関節リウマチのモデルである。
【００８８】
従って、本発明による抗体は、自己免疫疾患の治療に有用である。自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチが挙げられる。
【００８９】
自己免疫疾患を検出・定量する方法
「固定化モノクローナル抗体」及び「固定化抗体フラグメント」とは、不溶性担体に物理的吸着あるいは化学的結合等によって坦持された状態にあるモノクローナル抗体及び抗体フラグメントを各々意味する。これらの固定化モノクローナル抗体及び固定化抗体フラグメントは、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるＣＣＬ２０を検出、定量、分離または精製するために用いることができる。該検出または定量の目的においては、該不溶性担体に固定化された固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを用いることができ、とりわけ定量に用いる不溶性担体としては、操作の簡便性及び多数検体の同時処理の観点を考慮すると、例えば９６穴マイクロタイタープレート等の多数のウェルを有するプラスチックプレートを用いるのが好ましい。また、該分離または精製の目的においては、前記（１）に挙げたフィルター若しくはメンブレンまたは前記（２）に挙げた不溶性担体に固定化された固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを用いることができる。
【００９０】
本発明における「単独または他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質」とは、前記モノクローナル抗体または抗体フラグメントに物理化学的結合等により結合させることによりそれらの存在を検出可能にするために用いられる物質を意味し、具体的には、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジンあるいは放射性同位体等であり、さらに具体的には、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク質、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉ若しくは131Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、または化学発光物質が挙げられる。
【００９１】
ここで、放射性同位体及び蛍光物質は単独で検出可能なシグナルをもたらすことができる。一方、酵素、化学発光物質、ビオチン及びアビジンは、単独では検出可能なシグナルをもたらすことができないため、さらに１種以上の他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらす。例えば、酵素の場合には少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測定する方法（比色法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光法等）に依存して種々の基質が用いられる。また、ビオチンの場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的であるが、この限りではない。必要に応じてさらに該基質に依存する種々の発色物質が用いられる。
【００９２】
「標識モノクローナル抗体」および「標識抗体フラグメント」とは、各々該標識物質で標識されたモノクローナル抗体および抗体フラグメントを意味する。これらの標識モノクローナル抗体および標識抗体フラグメントは、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるＣＣＬ２０を検出または定量するために用いることができる。本発明においては、上記のいずれの標識物質をも使用可能であるが、検出感度あるいは定量感度の高さ及び操作の利便性の点を考慮すると、ビオチンで標識するのが好ましい。
【００９３】
本発明における「イムノアッセイ」とは、抗原抗体反応の原理に基づき、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる抗原の検出あるいは定量を行う方法を意味し、本発明においては、該抗原抗体反応における抗体が、ＣＣＬ２０に反応性を有する前記モノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント、前記固定化モノクローナル抗体若しくは固定化抗体フラグメント、または前記標識モノクローナル抗体若しくは標識抗体フラグメントから選ばれる一つ以上の該モノクローナル抗体または抗体フラグメントであること、及び抗原がＣＣＬ２０であること以外は、これまでに知られているイムノアッセイをも適用することができる。
【００９４】
具体的には、酵素免疫測定法（第３版、石川榮治ら編集、医学書院発行、１９８７年）に記載されているような、例えば、一抗体固相法、二抗体液相法、二抗体固相法、サンドイッチ法、ＥＭＩＴ法（Enzyme multiplied immunoassay technique）、エンザイムチャネリングアッセイ（Enzyme channeling immunoassay）、酵素活性修飾物質標識イムノアッセイ（Enzyme modulator mediated enzyme immunoassay、ＥＭＭＩＡ）、酵素阻害物質標識イムノアッセイ（Enzyme inhibitor immunoassay）、イムノエンザイムメトリックアッセイ（Immunoenzymometricassay）、酵素活性増強イムノアッセイ（Enzyme enhanced immunoassay）あるいはプロキシマールリンケージイムノアッセイ（Proximal linkage immunoassay）、ワンポット法（特公平２−３９７４７号公報）等を挙げることができる。
【００９５】
本発明においては、このようなイムノアッセイを、目的に応じて適宜選択して用いることができるが、操作上の簡便性及び／または経済的な利便性、とりわけ臨床上での汎用性の点を考慮すると、サンドイッチ法、ワンポット法、一抗体固相法または二抗体液相法を用いるのが好ましく、より好ましくは、ワンポット法であり、ビーズまたはボールに固定化された固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントと、酵素あるいはビオチンにより標識された標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントとを用いるワンポット法である。
【００９６】
この特に好ましい態様において具体的な一例を挙げるならば、本発明のハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５）産生モノクローナル抗体またはそれらのＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’をマイクロプレートに固定化した固定化モノクローナル抗体、固定化Ｆ（ａｂ’）２若しくは固定化Ｆａｂ’と本発明のハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５）産生モノクローナル抗体またはそのＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’を酵素またはビオチンで標識した標識モノクローナル抗体また標識Ｆ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’との組合わせによるワンポット法である。
【００９７】
以下に、ワンポット法、サンドイッチ法、一抗体固相法及び二抗体液相法について詳述する。
ワンポット法は、第１は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程。
（ｂ）該固定化モノクローナル抗体または該固定化抗体フラグメントと試料中に含まれるＣＣＬ２０との結合により形成される抗原抗体複合体に本発明の標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントを反応せしめる工程。
第２は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程。
（ｂ）該標識モノクローナル抗体または該標識抗体フラグメントと試料中に含まれるＣＣＬ２０との結合により形成される抗原抗体複合体に本発明の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを反応せしめる工程。
第３は、少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメント、本発明の標識モノクローナル抗体もしくは標識抗体フラグメント、及び試料を含む混合物を反応せしめる工程。
上記第１〜第３の方法を、本発明に即して、特に一般的である酵素あるいはビオチンを標識物質として用いる方法について具体的に説明すると、例えば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみに限定されるものではない。なお、以下で使用する「固定化モノクローナル抗体」と「モノクローナル抗体固定化ビーズ」は、同一物を意味する。
【００９８】
第１の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）ＣＣＬ２０に反応性を有する本発明のハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５）産生モノクローナル抗体をビーズに固定化し、固定化モノクローナル抗体（モノクローナル抗体固定化ビーズ）を作製する工程；
（工程２）試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器に緩衝液とともにモノクローナル抗体固定化ビーズとヒト血漿等の試料を加え、固定化モノクローナル抗体と試料を反応させる工程；
（工程３）容器中の内溶液の除去及びモノクローナル抗体固定化ビーズを洗浄する工程；
（工程４）ＣＣＬ２０に反応性を有する本発明のハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５）産生モノクローナル抗体をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識モノクローナル抗体を作製する工程；
（工程５）工程３で洗浄されたモノクローナル抗体固定化ビーズを含有する容器に、標識モノクローナル抗体を加え、固定化モノクローナル抗体と試料中に含まれるＣＣＬ２０が反応して形成される抗原抗体複合体に標識モノクローナル抗体を反応させる工程；
（工程６）容器中の内溶液の除去及びモノクローナル抗体固定化ビーズを洗浄し、未反応の標識モノクローナル抗体を抗原抗体複合体から取り除く工程；
（工程７）工程６で洗浄されたモノクローナル抗体固定化ビーズを含む容器に、工程４でビオチン標識モノクローナル抗体を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程４でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識モノクローナル抗体を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識モノクローナル抗体上の標識物質と反応させる工程；
（工程８）工程７で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程９）工程７または工程８の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び（工程１０）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【００９９】
第２の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）ＣＣＬ２０に反応性を有する本発明のハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５）産生モノクローナル抗体をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識モノクローナル抗体を作製する工程；
（工程２）試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器に緩衝液とともに標識モノクローナル抗体とヒト血漿等の試料を加え、標識モノクローナル抗体と試料を反応させる工程；
（工程３）ＣＣＬ２０に反応性を有する本発明のハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５）産生モノクローナル抗体をビーズに固定化し、固定化モノクローナル抗体（モノクローナル抗体固定化ビーズ）を作製する工程；
（工程４）工程２の反応系に、モノクローナル抗体固定化ビーズを加え、標識モノクローナル抗体と試料中に含まれるＣＣＬ２０が反応して形成される抗原抗体複合体に固定化モノクローナル抗体を反応させる工程；
（工程５）容器中の内溶液の除去及びモノクローナル抗体固定化ビーズを洗浄し、未反応の標識モノクローナル抗体を取り除く工程；
（工程６）工程５で洗浄されたモノクローナル抗体固定化ビーズを含む容器に、工程１でビオチン標識モノクローナル抗体を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程１でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識モノクローナル抗体を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識モノクローナル抗体上の標識物質と反応させる工程；
（工程７）工程６で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程８）工程６または工程７の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び（工程９）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【０１００】
第３の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）ＣＣＬ２０に反応性を有する本発明のハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５）産生モノクローナル抗体をビーズに固定化し、固定化モノクローナル抗体（モノクローナル抗体固定化ビーズ）を作製する工程；
（工程２）ＣＣＬ２０に反応性を有する本発明のハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５）産生モノクローナル抗体をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識モノクローナル抗体を作製する工程；
（工程３）試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器に緩衝液とともに、工程１で作製されたモノクローナル抗体固定化ビーズ、工程２で作製された標識モノクローナル抗体、及びヒト血漿等の試料を加え、固定化モノクローナル抗体、標識モノクローナル抗体、及び試料を同時に反応させる工程；
（工程４）容器中の内溶液の除去及びモノクローナル抗体固定化ビーズを洗浄し、未反応の標識モノクローナル抗体を取り除く工程；
（工程５）工程４で洗浄されたモノクローナル抗体固定化ビーズを含む容器に、工程２でビオチン標識モノクローナル抗体を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程２でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識モノクローナル抗体を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識モノクローナル抗体上の標識物質と反応させる工程；
（工程６）工程５で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程７）工程５または工程６の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び（工程８）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【０１０１】
サンドイッチ法によるイムノアッセイ法を使用するには、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５）産生モノクローナル抗体と別のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて本発明の検出・定量方法に使用することができる。サンドイッチ法では、９６穴マイクロプレートに代表されるような多数のウェルを有するマイクロプレートに固定化された固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントと、酵素あるいはビオチンにより標識された標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントとを用いることができる。
【０１０２】
一抗体固相法や二抗体液相法等によるイムノアッセイ法も本発明の検出・定量方法には有効である。
本発明における「アフィニティークロマトグラフィー」とは、抗原抗体反応を利用することにより試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるＣＣＬ２０を分離または精製する方法を意味する。具体的には、（１）不溶性担体であるフィルターあるいはメンブレン等にＣＣＬ２０に反応性を有する本発明のハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５）産生モノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントを固定化した後、該フィルターあるいはメンブレンと試料を接触させることにより該試料中に含まれるＣＣＬ２０を分離する方法、及び（２）前述のようなセルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体等のような不溶性担体上にＣＣＬ２０に反応性を有する本発明のハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５）産生モノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントを常法により固定化（物理的吸着、架橋による高分子化、マトリックス中への封印あるいは非共有結合等による固定化）し、該不溶性担体をガラス製、プラスチック製あるいはステンレス製等のカラムに充填し、該カラム（例えば、円柱状カラム）に、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）を通じて溶出させることにより、該試料中に含まれるＣＣＬ２０を分離あるいは精製する方法である。後者（２）の方法を特にアフィニティーカラムクロマトグラフィーという。
【０１０３】
該アフィニティーカラムクロマトグラフィーに用いられる前記不溶性担体としては、本発明のモノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントを固定化でき得るものであればどのような不溶性担体でも使用できるが、例えば、市販品である、ファルマシア(Pharmacia)社（製）のSepharose 2B、Sepharose 4B、Sepharose 6B、CNBr-activated Sepharose 4B、AH-Sepharose 4B、CH-Sepharose 4B、Activated CH-Sepharose 4B、Epoxy-activated Sepharose 6B、Activated thiol-Sepharose 4B、Sephadex、CM-Sephadex、ECH-Sepharose 4B、EAH-Sepharose 4B、NHS-activated SepharoseあるいはThiopropyl Sepharose 6B等、バイオラッド(Bio-Rad)社（製）のBio-Gel A、Cellex、Cellex AE、Cellex-CM、Cellex PAB、Bio-Gel P、Hydrazide Bio-Gel P、Aminoethyl Bio-Gel P、Bio-Gel CM、Affi-Gel 10、Affi-Gel 15、Affi-Prep 10、Affi-Gel Hz、Affi-Prep Hz、Affi-Gel 102、CMBio-Gel A、Affi-Gel heparin、Affi-Gel 501あるいはAffi-Gel 601等、和光純薬工業社（製）のクロマゲルＡ、クロマゲルＰ、エンザフィックス P-HZ、エンザフィックス P-SHあるいはエンザフィックス P-AB等、セルバ(Serva)社（製）のAE-Cellurose、CM-CelluroseあるいはPAB Cellurose等を挙げることができる。
【０１０４】
細胞遊走阻害剤
後記実施例において示されるように、ＣＣＬ２０タンパク質に対する抗体により、ＣＣＲ６発現細胞のＣＣＬ２０に対する細胞遊走が顕著に抑制された。従って、本発明による抗体は、細胞遊走阻害剤として用いることができる。
【０１０５】
ここで「細胞遊走」とは、ＣＣＬ２０タンパク質に対するＣＣＲ６発現細胞の細胞遊走を意味する。本発明の細胞遊走阻害剤を用いて、ＣＣＲ６陽性の免疫細胞のＣＣＬ２０タンパク質に対する細胞遊走を阻害することにより、免疫細胞の集積によって生じる免疫応答、例えば、樹状細胞およびＴ細胞の活性化、増殖、分化、サイトカイン・ケモカイン産生を抑制することができる。
【０１０６】
自己免疫疾患の予防、診断または治療薬
本発明のＣＣＬ２０に反応性を有する抗体は、ＣＣＬ２０が発現している体内部位に特異的に反応するが、ＣＣＬ２０は自己免疫疾患（特に関節リウマチ）に多く発現することから、上記のモノクローナル抗体や検出方法等を用いれば自己免疫疾患（特に関節リウマチ）の予防、診断または治療薬として使用することができる。
関節リウマチは、関節の腫れや痛み等の炎症と関節の骨破壊の二つの症状を伴うものである。本願発明のモノクローナル抗体は、後述の実施例において示されるように上記症状のうち炎症も骨破壊も共に抑制するものである。従って、本願発明は関節リウマチのうち炎症または骨破壊の予防、診断または治療に用いることができる。即ち、本願発明のモノクローナル抗体は、抗炎症剤または骨破壊抑制剤として使用することができる。
【０１０７】
ここで、「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および/または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒という点では治療的である。本明細書において「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば以下の（a）および（b）の治療を含む： 
（a）疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；
（b）疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。
【０１０８】
また、上記効果については、疾病および／または症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり（疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防することも含む）、この意味においては、「治療」に「予防」が含まれる場合もある。
【０１０９】
医薬組成物
本発明の抗体は、自己免疫疾患（特にリウマチ）の予防、診断または治療薬として使用することができることから、本発明の抗体を含むものは、医薬組成物として使用することができる。
【０１１０】
本発明による抗体の投与形態は、特に制限されず、経口投与、非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができるが、非経口投与、特に静脈注射、が好ましい。
【０１１１】
経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、本発明による抗体を、薬学的に許容される坦体等と混合等することにより、常法に従って製造することができる。
非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等が挙げられる。
【０１１２】
例えば、注射用製剤は、通常、本発明による抗体を注射用蒸留水に溶解して調製するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤等を添加することができる。また、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
【０１１３】
経口投与のための剤型は、固体または液体の剤型、具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、トローチ剤等が挙げられる。
【０１１４】
本発明による医薬組成物は、治療上有効な他の薬剤を更に含有していてもよく、また、必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。このときの有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。
【０１１５】
これらの製剤の製剤化に用いる担体には、例えば通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化することが可能である。使用可能な無毒性のこれらの成分としては、例えば大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油；例えば流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィン等の炭化水素；例えばミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；例えばセトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース等の水溶性高分子；例えばエタノール、イソプロパノール等の低級アルコール；例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール（ポリオール）；例えばグルコース、ショ糖等の糖；例えば無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウム等の無機粉体；塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム等の無機塩；精製水等が挙げられる。
【０１１６】
賦形剤としては、例えば乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素等が、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミン等が、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が、ぞれぞれ用いられる。上記の成分は、その塩またはその水和物であってもよい。
例えば経口製剤は、有効成分に、賦形剤、さらに必要に応じて例えば結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤等を加えた後、常法により例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。錠剤・顆粒剤の場合には、例えば糖衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差支えない。シロップ剤や注射用製剤等の場合は、例えばpH調整剤、溶解剤、等張化剤等と、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤等とを加えて、常法により製剤化する。また、外用剤の場合は、特に製法が限定されず、常法により製造することができる。使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能であり、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水等の原料が挙げられ、必要に応じ、pH調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料等を添加することができる。さらに、必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、1〜90重量％の間で変動され得る。本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類を前記治療に使用する場合は、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【０１１７】
本発明による抗体の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴等の薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、臨床医師により決定することができるが、通常、成人（体重６０ｋｇ）あたり、経口投与では１〜５０００μｇ／日、好ましくは１０〜２０００μｇ／日、さらに好ましくは５０〜２０００μｇ／日を、注射投与では１〜５０００μｇ／日、好ましくは５〜２０００μｇ／日、さらに好ましくは５０〜２０００μｇ／日を、１回または数回に分けて投与することができる。小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よりも少ない可能性がある。実際に用いられる投与法は、臨床医師の判断により大幅に変動することもあり、上記の投与範囲から逸脱することがある。
【０１１８】
キット
前記モノクローナル抗体、それらに由来する前記組換キメラモノクローナル抗体若しくは組換ヒト型モノクローナル抗体、前記抗体フラグメントＦ（ａｂ’）2若しくはＦａｂ’、前記固定化モノクローナル抗体若しくは固定化抗体フラグメント、または前記標識モノクローナル抗体若しくは標識抗体フラグメントを少なくとも含んでなるＣＣＬ２０の検出または定量に用いられるキットである。具体的には、前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントと前記標識モノクローナル抗体若しくは標識抗体フラグメントを含んでなるＣＣＬ２０の検出または定量に用いられるキットである。
【０１１９】
スクリーニング方法
前記したように、本発明によれば、ＣＣＲ６を含む細胞膜またはそれを含む細胞と、ＣＣＬ２０とを用いることを特徴とする、ＣＣＲ６とＣＣＬ２０との相互作用を変化させる物質のスクリーニング方法が提供される。好ましくは、この方法は、被検物質存在下および被検物質非存在下のそれぞれにおいて、ＣＣＲ６を含む細胞膜またはそれを含む細胞と、ＣＣＬ２０とを接触させ、次いで、細胞刺激活性を測定して、被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合とにおける測定結果を比較することを含んでなる。
【０１２０】
本発明のより好ましい態様によれば、前記方法は、被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合との間で、結果に相違が出た場合に、その物質をＣＣＲ６を介した細胞刺激活性を変化させる物質であると決定する工程をさらに含んでなる。
【０１２１】
このスクリーニング方法によれば、ＣＣＲ６の機能（遊走）を促進もしくは阻害する能力を区別して被検物質（または被検化合物）をスクリーニングすることができる。すなわち、このスクリーニング方法では、ＣＣＬ２０とＣＣＲ６との相互作用（結合能）を変化させる物質をスクリーニングすることができ、具体的には、ＣＣＲ６の活性化に影響を与える化合物を、より具体的には、ＣＣＲ６を介した細胞刺激活性を変化させる物質、さらに具体的には、ＣＣＲ６の機能を促進する物質（アゴニスト）あるいはＣＣＲ６の機能（遊走）を阻害する物質（アンタゴニスト）を、スクリーニングすることができる。
【０１２２】
本発明において、アゴニストはＣＣＲ６の機能（遊走）を促進するため、関節リウマチの疾患モデルを誘発することとなるので、当該疾患モデルを調製したりするのに使用できる可能性がある。
【０１２３】
本発明は、ＣＣＲ６発現細胞のＣＣＬ２０に対する遊走を抑制する抗体を作製し、該タンパク質に対する抗体が関節リウマチの疾患モデルであるコラーゲン誘導関節炎モデルに対して治療効果（特に炎症抑制、骨破壊抑制）を有することを見出したことから、ＣＣＲ６の機能（遊走）を阻害する物質（アンタゴニスト）を、スクリーニングすることが好ましい。
【０１２４】
したがって、被検物質非存在下における細胞刺激活性に対して、被検物質存在下における細胞刺激活性が上昇する場合またはＣＣＬ２０の非存在下においてＣＣＬ２０の代わりに細胞刺激活性が上昇する場合には、その被検物質は、ＣＣＲ６の機能を促進する物質（ＣＣＲ６アゴニスト）と決定することができる。被検物質非存在下における細胞刺激活性に対して、被検物質存在下における細胞刺激活性が低下する場合には、その被検物質は、ＣＣＲ６の機能を阻害する物質（ＣＣＲ６アンタゴニスト）と決定することができる。
【０１２５】
本発明においては、例えばＣＣR６の活性化によって、アデニル酸シクラーゼの活性抑制により減少する細胞内ｃＡＭＰの濃度、あるいは上昇する細胞内カルシウム濃度を公知の手法で測定すればよく、ＣＣＲ６の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、ＣＣＲ６にＣＣＬ２０が作用することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、ＣＣＲ６の細胞刺激活性の一つであるアデニル酸シクラーゼの活性抑制および細胞内カルシウム濃度の上昇作用を利用するものである。
【０１２６】
例えばＣＣＲ６を細胞膜上に発現（好ましくは、ＣＣＲ６を含む発現ベクターを導入し過剰に発現）した哺乳動物由来細胞（例えばＨＥＫ−２９３細胞もしくはＣＨＯ細胞）にＣＣＬ２０を作用させると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が減少、および細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する。
【０１２７】
ＣＣＲ６の機能を促進する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＣＣＲ６を介して細胞刺激活性を惹起しうる物質（例えばＣＣＬ２０）に代わり、被検物質を単独で接触させて細胞内のｃＡＭＰの濃度が減少する、あるいは細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する化合物を選択するか、またはＣＣＲ６の機能を促進する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＣＣＲ６を介して細胞刺激活性を惹起しうる物質（例えばＣＣＬ２０）に加えて、被検物質を接触させて細胞内のｃＡＭＰの濃度がさらに減少する、あるいは細胞内Ｃａ２＋濃度がさらに上昇する化合物を選択すると良い。
【０１２８】
ＣＣＲ６の機能を阻害する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＣＣＬ２０、および被検物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、ＣＣＬ２０の作用でｃＡＭＰの生成量が減少するが、被検物質がＣＣＬ２０の作用に拮抗する場合には、ｃＡＭＰ生成量の減少を抑制する。または、ＣＣＲ６の機能を抑制する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＣＣＲ６を介して細胞刺激活性を惹起しうる物質（例えばＣＣＬ２０）に加えて、被検物質を接触させて細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇を抑制する化合物を選択する。このときには、前記被検物質はＣＣＲ６の機能を阻害する化合物として選択できる。
【０１２９】
細胞内ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、例えばイムノアッセイ等が挙げられるが、市販のｃＡＭＰ定量キットを使用することもできる。
【０１３０】
本発明の好ましい態様によれば、細胞刺激活性の測定は、シグナル伝達物質生成によるレポーター遺伝子の翻訳・転写量の変化を検出するレポーターアッセイ系により測定するか、または、細胞内カルシウムイオン遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化もしくは活性化、ｐＨの低下変動活性、ＭＡＰキナーゼのリン酸化もしくは活性化、ｃ−ｆｏｓの活性化、グリセロール生成活性、脂肪分解活性、および、副腎皮質ホルモン分泌活性からなる群より選択されるパラメーターを測定することによって行うことができる。
【０１３１】
本発明においては、また、ＣＣＲ６を細胞膜上に発現（好ましくは、ＣＣＲ６を含む発現ベクターを導入し過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子等、またはＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）等の蛍光タンパク質遺伝子等）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、ＣＣＲ６の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この場合は、前述のｃＡＭＰの生成が増加するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が促進されることを利用している。
【０１３２】
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥは、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群（ｃＡＭＰ誘導性遺伝子）の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。したがって、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばＦＳＫ）をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇し、その結果、ＣＲＥの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。さらにこのレポーター遺伝子は、細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇によるシグナル伝達系によっても発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することにより、もしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することにより、容易に測定することが可能である。
【０１３３】
被検物質による作用が、ＣＣＲ６を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞（すなわち、ＣＣＲ６を細胞膜上に発現し、しかも、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用いた前記試験と並行して、コントロール用細胞（例えばＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＣＣＲ６を細胞膜上に発現していない細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被検物質による作用が、ＣＣＲ６に対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被検物質による作用が、ＣＣＲ６に対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。
【０１３４】
本発明の別の態様のＣＣＬ２０とＣＣＲ６との相互作用（結合能）を変化させる物質をスクリーニング方法は、被検物質存在下および被検物質非存在下のそれぞれにおいて、ＣＣＲ６を含む細胞膜またはそれを含む細胞と、ＣＣＬ２０とを接触させ、次いで、ＣＣＲ６を含む細胞膜またはそれを含む細胞へのＣＣＬ２０の結合量を測定して、被検物質存在下の場合と被検物質非存在下の場合とを比較することを含んでなる。このスクリーニング方法によれば、ＣＣＲ６の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずに被検化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、この態様の方法が適用可能な場合、この方法により、ＣＣＬ２０とＣＣＲ６との相互作用を変化させる物質をスクリーニングすることができ、具体的には、ＣＣＬ２０のＣＣＲ６への結合性を変化させる化合物を、より具体的には、ＣＣＲ６の機能を促進もしくは阻害する能力を有する化合物を、スクリーニングすることができる。
【０１３５】
具体的には、被検物質非存在下および被検物質存在下の各条件下において、ＣＣＲ６と、標識したＣＣＬ２０とを接触させ、前記条件下におけるＣＣＲ６へのＣＣＬ２０の特異的結合量を比較することにより、ＣＣＲ６の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、被検物質非存在下におけるＣＣＲ６へのＣＣＬ２０の特異的結合量に対して、被検物質存在下における前記特異的結合量が低下する場合には、その被検物質は、ＣＣＬ２０とＣＣＲ６との相互作用を変化させる物質であると、具体的には、ＣＣＬ２０のＣＣＲ６への結合性を変化させる化合物であると、より具体的には、ＣＣＲ６アゴニストあるいはＣＣＲ６アンタゴニストであると、決定することができる。
【０１３６】
結合量を測定する場合、ＣＣＬ２０は、標識することができる。前記標識としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等が用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［３Ｈ］、［１４Ｃ］、［１２５Ｉ］、［３５Ｓ］等を用いることができる。前記酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ等を用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルオレセイソチオシアネート、ＢＯＤＩＰＹ等を用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニン等を用いることができる。
【０１３７】
本発明に使用する被検物質は、どのような化合物であってもよいが、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、核酸（オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ）、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）抽出液、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを挙げることができる。
【０１３８】
さらに具体的には、本発明は、ＣＣＬ２０、もしくは細菌、酵母、哺乳類由来の細胞、昆虫由来の細胞において強制的に発現させたＣＣＬ２０により誘導されたＣＣＲ６含有細胞遊走に対する阻害能を評価することにより関節リウマチの治療剤のスクリーニングを行うことができる。用いるＣＣＬ２０はＣＣＬ２０の生物学的活性を保持する物質であれば、その種類および由来を問わず、哺乳類の体内から精製されたＣＣＬ２０、培養細胞内およびその培養上清中のＣＣＬ２０であってもよい。なかでも、関節リウマチ患者由来の滑膜細胞の培養上清中のＣＣＬ２０が好ましい。さらに好ましくは、抗ＣＣＬ２０抗体のＣＣＬ２０阻害作用、もしくは、抗ＣＣＲ６抗体のＣＣＲ６阻害作用と比較し評価することによって、関節リウマチの治療剤のスクリーニングをする方法が挙げられる。
【実施例】
【０１３９】
［実施例１］  マウスＣＣＬ２０に対する抗体の作製と発現解析
（１）マウスＣＣＬ２０に対するモノクローナル抗体の作製
抗マウスＣＣＬ２０抗体は、以下のようにして作製した。マウスＣＣＬ２０（R&D社製）とTiterMaxTMGoldアジュバンドを混合した後、アルメニアハムスター（オリエンタルバイオ社より入手）に複数回免疫し、さらに最終免疫をマウスＣＣＬ２０のみで行った。血清中の抗体価を固相化したマウスＣＣＬ２０を用いたELISAで測定し、抗体価が上昇したアルメニアハムスターからリンパ球を分離し、リンパ球：P3ミエローマ細胞の比率が5:1になるように混合し、ＰＥＧ１５００溶液（ベーリンガー社製）を用いて細胞融合を行った。ハイブリドーマは、RPMI-1640/10% FCS/HAT/10% Origen HCF (ISGN社製)を用いて、プレートで1週間培養した。ＨＡＴ培地（Invitrogen社製）でハイブリドーマを選択し、得られたハイブリドーマの培養上清は、マウスＣＣＬ２０−ＡＰキメラタンパク質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行った。その結果、４２個の陽性ウェルが得られた。つぎにマウスＣＣＬ２０−ＡＰのマウスＣＣＲ６発現細胞に対する結合を抑制することを指標にして、強い結合阻害活性を示すウェル２Ｆ５を得た。抗マウスＣＣＬ２０抗体を産生するハイブリドーマは、２回の限界希釈によりクローニングを行った。モノクロ−ナル抗体は、プリスタンを投与したＳＣＩＤおよびヌードマウスにハイブリドーマを接種して作製した腹水から、Protein Aカラムを用いて精製した。得られた抗体の中和活性は、マウスＣＣＲ６発現細胞のマウスＣＣＬ２０に対する遊走を抑制することを指標にして測定して、中和活性を有する2F5-5抗体を得た。
【０１４０】
（２）マウスＣＣＬ２０に対するモノクローナル抗体の中和活性の同定
抗マウスＣＣＬ２０のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清を加えた場合のマウスＣＣＲ６発現Ｂ３００．１９細胞へのマウスＣＣＬ２０−ＳＥＡＰの結合量の変化を調べた。ハイブリドーマの培養上清１００μｌに結合溶液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４），１％  ＢＳＡ，０．０２％  アジ化ナトリウムを含むＲＰＭＩ−１６４０）で６ｎＭとなるように希釈したマウスＣＣＬ２０−ＳＥＡＰ溶液２５μｌを加え室温で１０分間反応させた後に、結合溶液で２ｘ１０５個／２５μｌに調整したマウスＣＣＲ６発現Ｂ３００．１９細胞２５μｌを混合して１６℃で１時間反応させた。結合溶液１５０μｌで５回洗浄した後、細胞を５０μｌの１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶解した。次に細胞に由来するフォスファターゼを６５℃１０分間の処理で不活化した後、細胞溶解液中のＡＰ活性を測定することで、マウスＣＣＲ６に結合したマウスＣＣＬ２０−ＳＥＡＰの量を検出した。結合活性は、抗マウスＣＣＬ２０抗体非存在下での結合量を１００％として計算した。４２サンプルのうち、２ウェルが強い結合阻害活性を示した。強い結合阻害活性を示す２つのウェルからクローニングを行い、１種類のクローン（２Ｆ５−５）を得た。得られた抗マウスＣＣＬ２０モノクローナル抗体２Ｆ５−５を産生するハイブリドーマをヌードマウスの腹腔に接種し腹水を得て、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを用いて抗体を精製した。精製した抗体を用いて、マウスＣＣＲ６発現細胞のマウスＣＣＬ２０に対する遊走の抑制活性を測定したところ、１μｇ／ｍｌでほぼ１００％の中和活性を示すことが明らかとなった（図１）。抗マウスＣＣＬ２０モノクローナル抗体（ＣＣＬ２０  ｍＡｂ）２Ｆ５−５を産生するハイブリドーマは、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４４５のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。
【０１４１】
（３）マウスＣＣＲ６遺伝子発現細胞の作製
マウスＣＣＲ６遺伝子発現ベクターの作製は、以下のように行った。
プライマーは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００９８３５の配列をもとに設計した。
ｍＣＣＲ６−ＳａｌＩ−Ｆ：CGCGTCGACGCCACCATGAATTCCACAGAGTCCTA（配列番号１）
ｍＣＣＲ６−ＮｏｔＩ−Ｒ：GCGGGCGGCCGCCATGGTAAAGGACGATGCAT（配列番号２）
【０１４２】
マウス脾臓 quick-clone ｃＤＮＡ (Clontech社製)を鋳型に用いた。ＰＣＲは、以下の反応液組成（１０×バッファー  ５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（TAKARA社製）  ０．５μｌ、１００μＭプライマー  各０．５μｌ、ｃＤＮＡ  １μｌ、蒸留水  ３８．５μｌ）で行った。ＰＣＲは、９４℃で３分間処理した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で３分の反応を４０サイクル行い、最後に７２℃で３分間反応した。増幅したｃＤＮＡをｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ社製）にクローニングして、ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を確認した。得られたｃＤＮＡ断片を発現ベクターｐＭＸＩＩ  ＥＧＦＰＮ （Oncogene (2000) 19 (27): 3050-3058）に挿入して、ｍＣＣＲ６遺伝子発現ベクターを作製した。
【０１４３】
組換えレトロウイルスの作製は以下のように行った。
２９３／ＥＢＮＡ−１細胞株（Invitrogen社製）３×１０６個を培地（Ｄ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）に懸濁して１０ｃｍディッシュに播き、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。翌日、培地を交換し、以下のように調製したトランスフェクション溶液を加えてトランスフェクションを行った。トランスフェクション溶液は、５ｍｌチューブにＯＰＴＩ−ＭＥＭ（GIBCO BRL社製）を６００μｌとＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ１（TaKaRa社製）２４μｌを加えて混合して室温５分静置した後、発現ベクター  ９μｇとパッケージングベクターであるｐＣＬ−Ｅｃｏ（Imgenex社製）  ９μｇを加えて室温５分静置して調製した。４８時間後に、培養上清を回収して０．４５μｍのフィルターろ過を行い、組換えウイルス液を得た。
【０１４４】
この組換えウイルスを以下のようにＢ３００．１９細胞株（EMBO J. (1984)3: 1209-1219）に感染させ、ｍＣＣＲ６遺伝子発現細胞を作製した。Ｂ３００．１９細胞  ２×１０５個を１．５ｍｌチューブに加え、３０００ｒｐｍ、室温で２分間遠心後、培養上清を吸引除去した。細胞に、組換えウイルス液  １ｍｌにｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）  １μｌと５５μＭ  ２−メルカプトエタノール  １μｌを加えて混合した溶液を加え、２４ウェルプレートに移し、ＣＯ２インキュベーターで８時間培養して感染を行った。さらに、１ｍｌの培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／５５ｕＭ  ２−メルカプトエタノール）を加え一晩培養した後に組換えウイルス液を除去し、培地を加えて培養を行った。マウスＣＣＬ２０に対して遊走する細胞を分離することでマウスＣＣＲ６発現細胞を得た。
【０１４５】
（４）マウスＣＣＬ２０の細胞外領域とＳＥＡＰキメラタンパク質の作製
まず、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＳＥＡＰ（Ｈｉｓ）１０−Ｎｅｏベクターを、以下のように作製した。
ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｏベクター（Invitrogen社製）の内在性のＳａｌＩサイトは、ＳａｌＩで消化した後、平滑化を行うことにより欠損させた。ＳＥＡＰ（Ｈｉｓ）１０のｃＤＮＡ断片は、ｐＤＲＥＦ−ＳＥＡＰ  Ｈｉｓ６−Ｈｙｇ（J. Biol. Chem., 1996, 271, 21514-21521）を鋳型として、ＨｉｎｄＩＩＩを付加した５’プライマーとＸｈｏＩを付加した３’プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。得られたｃＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化した後、ＳａｌＩサイトを欠損させたｐＣＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｏベクターに挿入した。
【０１４６】
プライマーは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１６９６０の配列をもとに設計した。
ｍＭＩＰ−３α−ＳａｌＩ−Ｆ：CGCGTCGACGCCACCATGGCCTGCGGTGGCAAGCG（配列番号３）
ｍＭＩＰ−３α−ＮｏｔＩ−Ｒ：GCGGGCGGCCGCCATCTTCTTGACTCTTAGGC（配列番号４）
【０１４７】
マウスＣＣＬ２０の細胞外領域は、BALB/cマウス小腸よりの全ＲＮＡからＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（TAKARA社製）を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成して鋳型として、ＳａｌＩを付加した５’プライマー（ｍＭＩＰ−３α−ＳａｌＩ−Ｆ）とＮｏｔＩを付加した３’プライマー（ｍＭＩＰ−３α−ＮｏｔＩ−Ｒ）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、以下の反応液組成（１０×バッファー  ５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（TAKARA社製）  ０．５μｌ、１００μＭプライマー  各０．５μｌ、ｃＤＮＡ  １μｌ、蒸留水  ３８．５μｌ）で行った。ＰＣＲは、９４℃で３分間処理した後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３分の反応を４０サイクル行い、最後に７２℃で３分間反応した。増幅したｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Stratagene社製）にクローニングして、ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を確認した。得られたｃＤＮＡ断片をＳａｌＩとＮｏｔＩで消化した後、上記ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＳＥＡＰ（Ｈｉｓ）１０−Ｎｅｏベクターに挿入して、マウスＣＣＬ２０−ＡＰ発現ベクターを作製した。
【０１４８】
これにより、マウスＣＣＬ２０の細胞外領域と分泌型ヒト胎盤性アルカリフォスファターゼが３個のアミノ酸リンカー（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ）で結合され、さらにＣ末端に１０個のヒスチジンタグ（Ｈｉｓ）１０のついた分泌キメラタンパク質（以下ＡＰキメラタンパク質）の発現が可能となる。得られたＡＰキメラタンパク質発現ベクターは、ＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ１（TAKARA社製）を用いて２９３／ＥＢＮＡ−１細胞株へ導入し、４から５日間培養を行った。培養上清中に分泌されたＡＰキメラタンパク質は、遠心分離により培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルターでろ過した後、Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．４）とアジ化ナトリウムをそれぞれ最終濃度が２０ｍＭ、０．０２％となるように加えて４℃で保存した。ＡＰキメラタンパク質の濃度は、アルカリフォスファターゼ活性をＡｕｒｏｒａ  ＡＰ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ（ICN社製）を用いて測定して算出した。
【０１４９】
［実施例２］  コラーゲン誘導関節炎モデルにおける抗ＣＣＬ２０抗体の治療効果
コラーゲン誘導関節炎（Collagen-Induced Arthritis:CIA）モデルは自己免疫性の関節リウマチの疾患モデルであり、ＩＩ型コラーゲンに反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞および抗体が検出されることから、両者が協同して関節炎を惹起すると考えられている。また、ＣＩＡモデルでは、ＭＨＣクラスＩＩに拘束があると言われている。ＣＣＬ２０は、活性化上皮細胞等に発現する細胞遊走分子であり、またＣＣＲ６を介して樹状細胞、Ｔ細胞、B細胞等の免疫細胞の細胞遊走を誘導する。したがって、抗ＣＣＬ２０抗体によりＣＣＲ６との相互作用を阻害することで、樹状細胞、Ｔ細胞、B細胞の関与する免疫応答を抑制する可能性が考えられた。一方で、ＣＣＲ６は抑制性Ｔ細胞にも発現しているため、抗ＣＣＬ２０抗体により抑制性Ｔ細胞の関与する免疫抑制効果が解除されることで免疫応答が増強する可能性も考えられた。そこで、コラーゲン誘導関節炎モデルにおける抗マウスＣＣＬ２０抗体の治療効果を検討した。
【０１５０】
コラーゲン誘導関節炎モデルは、ウシ関節由来のＩＩ型コラーゲン３％溶液（コラーゲン技術研修会社製）と完全フロイントアジュバント（Difco社製）を等量混合してエマルジョンを作製し、５週齢のＤＢＡ／１Ｊマウス（チャールズリバー社より入手）に一匹あたり１００μｌ（１５０μｇ／匹）を、−２１日目（初回免疫）と０日目（追加免疫）に臀部皮内に免疫した。追加免疫から３日目より体重測定と外見的評価を経時的に行った。外見的所見は、以下の様にスコア化して評価した。０：非発症、１：紅斑と足根もしくは足首の関節に軽い腫脹、２：紅斑と足首から足根にかけて軽い腫脹、３：紅斑と足首から中足の関節にかけての中程度の腫脹、４：紅斑と足首、足、指全体に重度の腫脹。
【０１５１】
（１）コラーゲン誘導関節炎マウスの足蹄でのＣＣＬ２０ｍＲＮＡの発現誘導
コラーゲン誘導関節炎マウスの足蹄からRNAを回収して、ＣＣＬ２０ｍＲＮＡの発現を解析した。解析は後述のリアルタイムＰＣＲ法に従って実施した。その結果、コラーゲン誘導関節炎を発症したマウスの足蹄でＣＣＬ２０ｍＲＮＡの発現が認められた（図２）。したがって、ＣＣＬ２０ ｍＲＮＡは、イン・ビボにおける正常時の足蹄ではほとんど発現していないが、発症時には足蹄に発現していることが明らかとなり、ＣＣＬ２０はコラーゲン誘導関節炎の発症に関与していることが示唆された。
【０１５２】
（２）抗マウスＣＣＬ２０抗体によるコラーゲン誘導関節炎の抑制効果
ウシ関節由来のＩＩ型コラーゲン３％溶液（コラーゲン技術研修会社製）と完全フロイントアジュバント（Difco社製）を等量混合してエマルジョンを作製し、５週齢のＤＢＡ／１Ｊマウス（チャールズリバー社より入手）に一匹あたり１００μｌ（１５０μｇ／匹）を、−２１日目（初回免疫）と０日目（追加免疫）に臀部皮内に免疫した。抗マウスＣＣＬ２０抗体２Ｆ５−５は、追加免疫時から５００μｇ／１回で週２回、尾静脈に投与した。追加免疫から３日目より体重測定と外見的（「肉眼的」ということもある。）評価を行った。１３日目に屠殺した。外見的所見は、以下の様にスコア化して評価した。０：非発症、１：紅斑と足根もしくは足首の関節に軽い腫脹、２：紅斑と足首から足根にかけて軽い腫脹、３：紅斑と足首から中足の関節にかけての中程度の腫脹、４：紅斑と足首、足、指全体に重度の腫脹。その結果、抗マウスＣＣＬ２０抗体投与により、外見的所見において明らかな症状の軽減（図３(a)）と、体重減少の抑制が認められた（図３(b)）。
【０１５３】
（３）抗マウスＣＣＬ２０抗体による不完全フロイントアジュバントを用いた追加免疫によるコラーゲン誘導関節炎の抑制効果
０日目（追加免疫）をウシ関節由来のＩＩ型コラーゲン３％溶液（コラーゲン技術研修会社製）と完全フロイントアジュバントあるいは不完全フロイントアジュバント（Difco社製）を等量混合してエマルジョンを作製し、臀部皮内に免疫した。抗マウスＣＣＬ２０抗体２Ｆ５−５は、追加免疫時から５００μｇ／１回で週３回、尾静脈に投与した。追加免疫から３日目より体重測定と外見的評価を行い、１３日目に屠殺した。外見的所見は、以下の様にスコア化して評価した。０：非発症、１：指に限定された浮腫、２：四肢の軽度の浮腫、３：四肢の重度の浮腫。その結果、抗マウスＣＣＬ２０抗体投与により、不完全フロイントアジュバント（図４(a)、(b)）および完全フロイントアジュバント（図４(c)、(d)）を追加免疫に用いたいずれのコラーゲン誘導関節炎においても、肉眼的所見において明らかな症状の軽減（図４(a)、(c)）と、体重減少の抑制が認められた（図４(b)、(d)）。コラーゲン誘導関節炎発症抑制効果は、不完全フロイントアジュバント追加免疫群のほうが強かった（図４(a)）。
【０１５４】
また、屠殺したマウスの腹部大静脈よりヘパリン採血をおこない、血漿中の血清アミロイドＡ（Ｓｅｒｕｍ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ：ＳＡＡ）濃度、コラーゲンに対する抗体価、COMP (Cartilage Oligomeric Matrix Protein)濃度を測定した。ＳＡＡは炎症刺激により産生されたサイトカインの作用により、肝細胞で産生される血漿タンパク質であり、血漿中のＳＡＡ濃度は炎症の指標となる。コラーゲンに対する抗体価は抗原特異的液性免疫応答の指標となる。ＣＯＭＰ(Cartilage Oligomeric Matrix Protein)は、関節軟骨中に存在するタンパク質であり、軟骨マトリクスの主要成分であるType IIコラーゲンと結合し、コラーゲンネットワークの安定化機能を有している。炎症性疾患において軟骨が損傷すると、マトリクス構成蛋白の一部が関節液中に流出してくることが知られている。COMPは、関節軟骨の破壊によってType IIコラーゲンより先に関節液中に流出し、ついで血中に移行し、その量は、軟骨破壊の指標となる。
【０１５５】
血漿中のＳＡＡの濃度は、血漿を２０００から１６０００倍希釈し、ＥＬＩＳＡキット（バイオソース社製）を用いて測定した。血漿中のコラーゲンに対する抗体価の測定は、以下のように行った。まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Nunc社製）に５μｇ／ｍｌのウシ関節由来のＩＩ型コラーゲン溶液を５０μｌずつ加え、４℃で一晩静置して固相化した。Ｔ−ＰＢＳ（０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で洗浄後、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳで非特異的結合部位をブロックした。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄後、Ｔ−ＰＢＳで１０および５０万倍希釈した血漿を５０μｌずつ各穴に加え、室温で２時間静置した。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄後、ビオチン化抗マウスＩｇＧ１（BD社製）、ビオチン化抗マウスＩｇＧ２ａ（BD社製）をＴ−ＰＢＳで１０００倍希釈して５０μｌずつ各穴に加え、室温で２時間静置した。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Pierce社製）をＴ−ＰＢＳで５０００倍希釈して５０μｌずつ各穴に加え、室温で３０分間静置した。その後、発色基質を用いて発色させた。血漿中のCOMPの濃度は、血漿を２０倍希釈し、ＥＬＩＳＡキット（AnaMar社製）を用いて測定した。
【０１５６】
その結果、血漿中のＳＡＡの濃度は、不完全フロイントアジュバントを追加免疫に用いたコラーゲン誘導関節炎において抗マウスＣＣＬ２０抗体の投与により減少する傾向が見られた（図５(a)）。したがって、不完全フロイントアジュバントを追加免疫に用いた場合、抗マウスＣＣＬ２０抗体の投与は、炎症反応を抑制する傾向にあることが明らかとなった。
一方、血漿中の抗コラーゲン抗体価は、抗マウスＣＣＬ２０抗体の投与により変化が認められなかった（図６(a)、(b)）。したがって、抗マウスＣＣＬ２０抗体の投与は、コラーゲン特異的液性免疫応答に影響を及ぼさないことが示唆された。
興味深いことに、血漿中のCOMPの濃度は、不完全フロイントアジュバントおよび完全フロイントアジュバントを追加免疫に用いたいずれのコラーゲン誘導関節炎においても、抗マウスＣＣＬ２０抗体の投与により顕著な減少が認められた（図７）。したがって、ＣＣＲ６−ＣＣＬ２０系を遮断することにより、関節軟骨の破壊を抑制できることが明らかとなった。
さらに、不完全フロイントアジュバントを追加免疫に用いたコラーゲン誘導関節炎の足蹄における、炎症、細胞浸潤、骨破壊に関与するｍＲＮＡ発現解析を行った。足蹄よりTorizol（Invitrigen社製）とRNeasy mini kit (キアゲン社製)を用いて精製したtotal RNA (500 ng)をAMV Reverse transcriptase (TAKARA社製)とrandam hexamer (TAKARA社製)を用いて逆転写して得たcDNAをテンプレートとして、リアルタイムPCRに解析した。リアルタイムPCRは、各種プライマーとQuantiTect SYBR Green PCR kit (Qiagen社製)、Uracil-DNA-glycosylase (Invitrogen社製)を混合した反応液を調製し、ABI PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems社製)を用いて行った。PCRは、50℃ 2分、95℃ 15分の反応を行った後、95℃ 15秒および60℃  1分の反応を35サイクル実施した。使用したプライマーのセットは以下のとおりである。
【０１５７】
プライマー名
COX-2 sense          5’- CTCCCTGAAGCCGTACACAT-3’ （配列番号５）
COX-2 anti-sense      5’- CCCCAAAGATAGCATCTGGA-3’ （配列番号６）
MMP9 sense            5’- AGACGACATAGACGGCATCC-3’ （配列番号７）
MMP9 anti-sense       5’- GTGGTTCAGTTGTGGTGGTG-3’ （配列番号８）
IL-1β sense          5’- GCTGAAAGCTCTCCACCTCA -3’ （配列番号９）
IL-1β anti-sense     5’- AGGCCACAGGTATTTTGTCG -3’ （配列番号１０）
IL-6 sense            5’- CAAAGCCAGAGTCCTTCAGAG-3’ （配列番号１１）
IL-6 anti-sense       5’- GCCACTCCTTCTGTGACTCC-3’ （配列番号１２）
KC sense              5’- CTTGAAGGTGTTGCCCTCAG-3’ （配列番号１３）
KC anti-sense        5’- TGGGGACACCTTTTAGCATC-3’ （配列番号１４）
MIP-2 sense          5’- TCCAGAGCTTGAGTGTGACG-3’ （配列番号１５）
MIP-2 anti-sense      5’- GCCTTGCCTTTGTTCAGTATC-3’ （配列番号１６）
MIP-1α sense        5’- ACCATGACACTCTGCAACCA-3’ （配列番号１７）
MIP-1α anti-sense    5’- GATGAATTGGCGTGGAATCT-3’ （配列番号１８）
MIP-1β sense        5’- CCCACTTCCTGCTGTTTCTC-3’ （配列番号１９）
MIP-1β anti-sense    5’- CTCACTGGGGTTAGCACAGA-3’ （配列番号２０）
ＣＣＬ２０ sense      5’ - CTTGCTTTGGCATGGGTACT-3’ （配列番号２１）
ＣＣＬ２０ anti-sense 5’ - CTTCATCGGCCATCTGTCTT-3’ （配列番号２２）
CCR5 sense            5’- GCCAGAGGAGGTGAGACATC-3’ （配列番号２３）
CCR5 anti-sense       5’- GCCAGAGGAGGTGAGACATC-3’ （配列番号２４）
ＣＣＲ６ sense               5’- CCTGCCTGGGGAATGAATTC-3’ （配列番号２５）
ＣＣＲ６ anti-sense   5’- TGGCACAAATACCTTGGTGA-3’ （配列番号２６）
CD45 sense            5’- TGACTCATGTGCTCCAGCTA -3’ （配列番号２７）
CD45 anti-sense       5’- AGCCTTTTCTTTTGGTGTGC -3’ （配列番号２８）
CD4 sense            5’- GGGCTGTGGCAGTGTCTACT -3’ （配列番号２９）
CD4 anti-sense               5’- CTGGTTCACCCCTCTGGATA -3’ （配列番号３０）
M-CSFR sense          5’- CGACTTCTTCAAGTGACTCCTTC -3’ （配列番号３１）
M-CSFR anti-sense     5’- CTACGTCCCGGTGGATGC -3’ （配列番号３２）
F4/80 sense          5’- TGCCTCCCTGACTTTCAAAT -3’ （配列番号３３）
F4/80 anti-sense      5’- TGGCATTGCTGTATCTGCTC -3’ （配列番号３４）
Ly6G sense            5’- GATGGATTTTGCGTTGCTCT -3’ （配列番号３５）
Ly6G anti-sense       5’- GTCCAGAGTAGTGGGGCAGA -3’ （配列番号３６）
RANKL sense          5’- CATTTGCACACCTCACCATC -3’ （配列番号３７）
RANKL anti-sense      5’- TCCGTTGCTTAACGTCATGT -3’ （配列番号３８）
RANK sense            5’- CGGCGTTTACTACAGGAAGG-3’ （配列番号３９）
RANK anti-sense       5’- TTCTTGCTGACTGGAGGTTG-3’ （配列番号４０）
TRAP sense            5’- GCTGGAAACCATGATCACCT -3’ （配列番号４１）
TRAP anti-sense       5’- GGTAGTAAGGGCTGGGGAAG -3’ （配列番号４２）
Cathepsin K sense     5’- CAGTGTTGGTGGTGGGCTAT -3’ （配列番号４３）
Cathepsin K anti-sense       5’- CCGAGCCAAGAGAGCATATC -3’ （配列番号４４）
【０１５８】
抗ＣＣＬ２０抗体で発症抑制効果が認められたマウスでは、炎症（ＣＯＸ−２(図８(a))、ＩＬ−１β(図８(b))、ＭＭＰ９(図８(c))、ＩＬ−６(図８(d))）、細胞浸潤を主に制御するケモカイン・ケモカイン受容体（ＫＣ(図９(a))、ＭＩＰ−１α(図９(b))、ＣＣＲ５(図９(c))、ＭＩＰ−２(図９(d))、ＭＩＰ−１β(図９(e)), ＣＣＲ６(図９(f)) , ＣＣＬ２０(図９(g))）、免疫細胞マーカー（ＣＤ４５(図１０(a))、Ｍ−ＣＳＦＲ(図１０(b))、ＣＤ４(図１０(c))、Ｆ４／８０(図１０(d))、Ｌｙ６Ｇ(図１０(e))）の足蹄におけるｍＲＮＡの発現がコントロール抗体投与群では上昇し、抗ＣＣＬ２０抗体によりその発現が抑制される傾向が認められた。さらに、骨破壊に関係する遺伝子（ＲＡＮＫＬ(図１１(a))、ＴＲＡＰ(図１１(b))、ＲＡＮＫ(図１１(c))、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ(図１１(d))）の発現が顕著に抑制されていることが明らかとなった。
【０１５９】
以上の結果から、ＣＣＲ６-ＣＣＬ２０経路がコラーゲン誘導関節炎モデルにおいて重要な役割を果たすことが明らかとなった。その作用は細胞浸潤を抑制することにより炎症反応を軽減することに加え、骨（軟骨）破壊に関与する細胞の足蹄への浸潤や分化を顕著に抑制することにより、組織障害を軽減しているものと推察された。つまりＣＣＲ６-ＣＣＬ２０の相互作用阻害に基づく抗炎症および骨・軟骨破壊抑制は、関節リウマチ疾患に有用な治療体系であることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】抗ＣＣＬ２０抗体２Ｆ５−５によるＣＣＲ６発現細胞のマウスＣＣＬ２０タンパク質への細胞遊走の阻害を示した図である。
【図２】コラーゲン誘導関節炎モデルにおける足蹄でのＣＣＬ２０ ｍＲＮＡの発現を示した図である。
【図３】抗ＣＣＬ２０抗体を投与されたコラーゲン誘導関節炎モデルにおける外見的所見（ａ）および体重の経時的変化（ｂ）を示した図である。三角形：抗ＣＣＬ２０モノクローナル抗体；四角形：ＩｇＧ（コントロール）。
【図４】抗ＣＣＬ２０抗体を投与された不完全フロイントアジュバントおよび完全フロイントアジュバントによるコラーゲン誘導関節炎モデルにおける外見的所見および体重の経時的変化を示した図である。（ａ）不完全フロイントアジュバントを使用した場合の外見的所見；（ｂ）不完全フロイントアジュバントを使用した場合の体重変化；（ｃ）完全フロイントアジュバントを使用した場合の外見的所見；（ｄ）完全フロイントアジュバントを使用した場合の体重変化。三角形：抗ＣＣＬ２０モノクローナル抗体；四角形：ＩｇＧ（コントロール）。
【図５】コラーゲン誘導関節炎モデルの血漿中の血清アミロイドＡ濃度に対する抗ＣＣＬ２０抗体投与の効果を示した図である。（ａ）不完全フロイントアジュバントを使用した場合；（ｂ）：完全フロイントアジュバントを使用した場合。
【図６】コラーゲン誘導関節炎モデルの血漿中の抗コラーゲン抗体価に対する抗ＣＣＬ２０抗体（ＣＣＬ２０  ｍＡｂ）投与の効果を示した図である。（ａ）：ＩｇＧ１クラス抗コラーゲン抗体価；（ｂ）：ＩｇＧ２ａクラス抗コラーゲン抗体価。
【図７】コラーゲン誘導関節炎モデルの血漿中のCOMP濃度に対する抗ＣＣＬ２０抗体投与の効果を示した図である。
【図８】コラーゲン誘導関節炎モデルにおける足蹄での炎症関連分子のｍＲＮＡの発現に対する抗ＣＣＬ２０抗体投与の効果をリアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示した図である。白抜きバー：正常、黒塗りバー：ＩｇＧ（コントロール）、斜線バー：抗ＣＣＬ２０モノクローナル抗体。
【図９】コラーゲン誘導関節炎モデルにおける足蹄でのケモカイン・ケモカイン受容体のｍＲＮＡの発現に対する抗ＣＣＬ２０抗体投与の効果をリアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示した図である。白抜きバー：正常、黒塗りバー：ＩｇＧ（コントロール）、斜線バー：抗ＣＣＬ２０モノクローナル抗体。
【図１０】コラーゲン誘導関節炎モデルにおける足蹄での細胞マーカーのｍＲＮＡの発現に対する抗ＣＣＬ２０抗体投与の効果をリアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示した図である。白抜きバー：正常、黒塗りバー：ＩｇＧ（コントロール）、斜線バー：抗ＣＣＬ２０モノクローナル抗体。
【図１１】コラーゲン誘導関節炎モデルにおける足蹄での破骨細胞関連分子のｍＲＮＡの発現に対する抗ＣＣＬ２０抗体投与の効果をリアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示した図である。白抜きバー：正常、黒塗りバー：ＩｇＧ（コントロール）、斜線バー：抗ＣＣＬ２０モノクローナル抗体。
【図１】
2009096716.tif 000002
【図２】
2009096716.tif 000003
【図３】
2009096716.tif 000004
【図４】
2009096716.tif 000005
【図５】
2009096716.tif 000006
【図６】
2009096716.tif 000007
【図７】
2009096716.tif 000008
【図８】
2009096716.tif 000009
【図９】
2009096716.tif 000010
【図１０】
2009096716.tif 000011
【図１１】
2009096716.tif 000012
【配列表】
2009096716000001.app