(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子破壊又は遺伝子変異により低下した増殖能を回復した微生物の製造方法を提供する。【解決手段】遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物に，糖新生を促進する機能を有する遺伝子を導入する工程を含み，前記糖新生を促進する機能を有する遺伝子は，｛ＣＡＴ８，ＳＦＣ１，ＰＵＴ４，ＭＬＳ１，ＣＩＴ２，ＦＢＰ１，ＳＴＬ１，ＩＣＬ１，ＡＣＨ１，及びＡＤＨ２｝からなる群から選ばれる１又は２以上の遺伝子である，遺伝子破壊又は遺伝子変異により低下した増殖能を回復した微生物の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物に，糖新生を促進する機能を有する遺伝子を導入する工程を含み，前記糖新生を促進する機能を有する遺伝子は，
｛ＣＡＴ８，ＳＦＣ１，ＰＵＴ４，ＭＬＳ１，ＣＩＴ２，ＦＢＰ１，ＳＴＬ１，ＩＣＬ１，ＡＣＨ１，及びＡＤＨ２｝からなる群から選ばれる１又は２以上の遺伝子である，遺伝子破壊又は遺伝子変異により低下した増殖能を回復した微生物の製造方法。
【請求項２】
前記遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物は，遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した酵母である，請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物は，遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した出芽酵母，分裂酵母，又はメタノール資化性酵母である，請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物は，遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した出芽酵母である，請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物は，出芽酵母の遺伝子破壊株である，請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物は，
｛ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，ｍｎｎ４破壊，及びａｌｇ３破壊｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の破壊を有する出芽酵母の遺伝子破壊株である，請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
前記遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物は，
ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊を有する出芽酵母の遺伝子破壊株である，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
前記糖新生を促進する機能を有する遺伝子は，ＣＡＴ８であり，前記遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物は，ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊を有する出芽酵母の遺伝子破壊株である，請求項１に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項２に記載の製造方法により，増殖能を回復した酵母を得る工程を含む，糖タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項６から請求項８のいずれかに記載された製造方法により，増殖能を回復した出芽酵母を得る工程を含む，糖タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の製造方法により，増殖能を回復した酵母を得る工程を含む，β−グルカンの製造方法。
【請求項１２】
請求項６から請求項８のいずれかに記載された製造方法により，増殖能を回復した出芽酵母を得る工程を含む，β−グルカンの製造方法。
【請求項１３】
糖新生を促進する機能を有する遺伝子が導入された，
ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊を有する酵母の遺伝子破壊株であって，前記糖新生を促進する機能を有する遺伝子は，
｛ＣＡＴ８，ＳＦＣ１，ＰＵＴ４，ＭＬＳ１，ＣＩＴ２，ＦＢＰ１，ＳＴＬ１，ＩＣＬ１，ＡＣＨ１，及びＡＤＨ２｝からなる群から選ばれる１又は２以上の遺伝子である酵母の遺伝子破壊株。
【請求項１４】
前記糖新生を促進する機能を有する遺伝子として，ＣＡＴ８遺伝子が導入された，請求項１３に記載の酵母の遺伝子破壊株。
【請求項１５】
前記酵母は，出芽酵母である，請求項１３又は請求項１４に記載の酵母の遺伝子破壊株。
【請求項１６】
糖鎖合成遺伝子破壊酵母株又は糖鎖合成遺伝子変異酵母株の，高温感受性を回避するため，又は薬剤感受性を低下させるために用いられる，ＣＡＴ８遺伝子を含有するプラスミド。
【請求項１７】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号「ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１４４５」として寄託されている酵母。
【請求項１８】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号「ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７５７」として寄託されている酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，特定の遺伝子を強制発現させることで，遺伝子破壊又は遺伝子変異により損なわれた増殖能を回復した微生物の製造方法などに関する。より詳しく説明すると，本発明は，ＣＡＴ８などの糖新生を亢進する遺伝子を強制発現させることにより，糖鎖合成遺伝子破壊酵母株又は糖鎖合成遺伝子変異酵母株などの増殖能を回復した微生物の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質へ糖鎖を付加する技術は，医薬原料となる糖タンパク質の開発・生産において極めて重要な課題である。抗体医薬などの糖タンパク質性医薬は，多くの疾患治療薬として需要が拡大している。しかしながら，従来の動物培養細胞を利用した糖タンパク質医薬の製造では，高いコストと，血清成分に対する安全性確保が必要とされること，ヒト生体内と同等あるいは均一な糖鎖を付加することが困難であるなどの問題がある。そこで動物細胞にかわり，医薬品原料として高品質な糖タンパク質を，安全かつ安価に供給するシステムを備えた代替宿主の開発が望まれる。その社会的ニーズに応えるために，糖タンパク質を効率よく生産することができる宿主の開発が世界中の多くのグループによって試みられている。
【０００３】
酵母は，有用糖タンパク質を生産するための優れた宿主である。たとえば，ＧｌｙｃｏＦｉ社（Ｓ．  Ｒ．  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００６）は，メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒiｓ）において，ヒト型糖鎖生産株を開発している。また，産総研グループ（Ｙ．  Ｃｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢＣ，  １９９８）は，出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において，ヒト型糖鎖生産株を開発している。酵母は，遺伝子操作などの分子生物学的手法を駆使できるばかりでなく，増殖速度が速いことから大量培養系へ容易にスケールアップでき，動物培養細胞系のタンパク質生産系に比べ，低コストにタンパク質を生産できる。
【０００４】
特に，国際公開ＷＯ０１／０１４５２２号パンフレット（下記特許文献１を参照）には，ｏｃｈ１破壊（Δｏｃｈ１），ｍｎｎ１破壊（Δｍｎｎ１）及びｍｎｎ４破壊（Δｍｎｎ４）を有する三重破壊株が開示されている。すなわち，国際公開ＷＯ０１／０１４５２２号パンフレットには，酵母に特異的な外糖鎖の生合成に関与する遺伝子のうち，初発の延長付加反応を行うα−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＯＣＨ１），糖鎖の非還元末端にマンノースを付加するα−１，３マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＭＮＮ１），及びマンノース−１−リン酸の付加を制御する遺伝子（ＭＮＮ４）の機能を破壊するか，又はそれらの遺伝子に何らかの変異を導入した酵母変異株が開示されている。これらの酵母株は，哺乳類型の糖鎖を含有する糖タンパク質の産生に優れるので，医薬品の開発などに有用であると考えられる。
【０００５】
この技術によって開発されたヒト型糖タンパク質生産酵母株は，酵母型糖鎖の付加を避けるために，酵母の糖鎖合成関連遺伝子群の破壊の影響を受けて，高温度感受性（ｔｓ性）と増殖能の低下を示す（Ｂ．  Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ２００３）。この酵母は，野生型酵母に比べ増殖能やタンパク質生産能が著しく低いばかりでなく，多様性に富んだ糖鎖を合成するためのさらなる遺伝子改変を加えることができず，糖鎖の多様性に対応することができない。
【０００６】
ところで，多糖類の一種であるβ−グルカンは，体内の感染細胞やガン細胞を攻撃するマクロファージや，ＮＫ細胞，Ｔ細胞，キラーＴ細胞を活性化させ，免疫力・抵抗力を増強させる作用を有することが知られている。この免疫増強作用により，身体の中に侵入した細菌や異物の排除能が高まり，仮に感染したとしても発病を抑制する抵抗力が得られる。また，このように免疫力が高まることにより，アレルギー反応を鎮め，ガンなどの腫瘍を抑える効果も期待でき，実際にさまざまな臨床試験によって抗腫瘍性などが明らかにされている。さらには，血糖値の低下，利尿作用，血圧調整，血中コレステロールと中性脂肪値の低下といった効果も得られる。
【０００７】
酵母（特にパン酵母）は，古くから発酵食品などに用いられており，食品として極めて安全である。パン酵母は，細胞壁中に通常約４５％程度のβ−グルカンを含むため，免疫増強効果にターゲットを絞った健康補助食品として商品化されている。パン酵母のβ−グルカンは，主に細胞壁から抽出することによって利用されている。パン酵母由来のβ−グルカンは，既にザイモサンとして米国で医薬品として販売されている。
【０００８】
酵母の細胞壁からより多くのβ−グルカンを取得するためには，酵母を大量に培養することが必要となる。また培養後は，β−グルカンの高効率な抽出作業が必要となるが，この操作は特別な技術を要するため容易ではない。よって，このような行程をできるだけ省略化し，より一層簡便かつ安価に酵母由来β−グルカンを生産し得る方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０１／０１４５２２号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は，遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能などが低下した微生物の増殖能を回復させる，微生物の製造方法を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明は，糖鎖合成遺伝子破壊又は糖鎖合成遺伝子変異により増殖能が低下した出芽酵母などの増殖能を回復させる，酵母の製造方法を提供することを目的とする。また，本発明は，そのようにして増殖能を回復させる遺伝子を含有するプラスミド，増殖能が回復した酵母，増殖能が回復した酵母を用いたβ−グルカンの製造方法を提供することを目的とする。
【００１２】
本発明は，上記のような増殖能が回復した酵母を用いた哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は，基本的には，遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能などが低下した微生物に対して，ＣＡＴ８遺伝子などを導入することで糖新生系を亢進させ，遺伝子破壊又は遺伝子変異により低下した機能を回復させることができるという，実施例に基づくものである。
【００１４】
具体的に説明すると，本発明者らは，以下の参考例に示される出芽酵母遺伝子破壊株ＴＩＹ２０及び，そのＴＩＹ２０に不均衡変異導入法により変異を導入したＹＡＢ１００及びＹＡＢ１０１を得た。ＴＩＹ２０は，ヒト様高マンノース型糖鎖を作るように改変された出芽酵母遺伝子破壊株である。そして，ＴＩＹ２０は，遺伝子破壊により，温度感受性が見られ，薬剤感受性となり，さらに増殖能が低下していた。一方，ＹＡＢ１００及びＹＡＢ１０１は，遺伝子破壊により損なわれた機能を回復した。この機能の回復には何らかの遺伝子に変異が入ったために引き起こされたと考えられる。そこで，ＴＩＹ２０と，ＹＡＢ１００およびＹＡＢ１０１のマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行うことで，ＴＩＹ２０よりもＹＡＢ１００，又はＹＡＢ１０１において発現が上昇する遺伝子を網羅的に調べた。その結果，２４遺伝子が，ＴＩＹ２０と比べ３倍以上の発現が誘導されていた。
【００１５】
Ｖ．  Ｈａｕｒｉｅらの文献（Ｖ．  Ｈａｕｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  ＪＢＣ，  ２７６，  ７６‐８５）に示されるとおり，この２４遺伝子のうち９遺伝子が糖新生に関する遺伝子であり，それら９遺伝子はＣＡＴ８転写因子の下流で発現誘導されるものである。そこで，ＣＡＴ８遺伝子をＴＩＹ２０内で強制発現させ，ＣＡＴ８下流の遺伝子群の発現を誘導させた。その結果，ＴＩＹ２０の増殖能の低下および薬剤感受性を回復させることに成功した。よって，糖新生に関与する遺伝子を導入して，糖新生系を亢進させることにより，遺伝子破壊などにより損なわれた機能を回復させることができると考えられる。
【００１６】
なお，実施例において，β−グルカンを多量に生産でき，哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質を産生できる出芽酵母の遺伝子破壊株の増殖能などを回復できることが実証されたので，本発明はそのような方法により製造された酵母や，その酵母を用いた糖タンパク質の製造方法や，その酵母を用いたβ−グルカンの製造方法なども提供できる。
【００１７】
具体的には，上記課題は，以下の発明により解決できる。
本発明の第１の側面は，遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物に，糖新生を促進する機能を有する遺伝子を導入する工程を含み，前記糖新生を促進する機能を有する遺伝子は，｛ＣＡＴ８，ＳＦＣ１，ＰＵＴ４，ＭＬＳ１，ＣＩＴ２，ＦＢＰ１，ＳＴＬ１，ＩＣＬ１，ＡＣＨ１，及びＡＤＨ２｝からなる群から選ばれる１又は２以上の遺伝子である，遺伝子破壊又は遺伝子変異により低下した増殖能を回復した微生物の製造方法に関する。
【００１８】
このように遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物に対して，糖新生を促進する機能を有する遺伝子を導入することで，遺伝子破壊又は遺伝子変異により低下した機能を回復した微生物を製造することができるようになる。
【００１９】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物は，遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した酵母である，上記に記載の製造方法である。この利用態様における酵母として出芽酵母，分裂酵母，又はメタノール資化性酵母があげられる。酵母は遺伝子操作などが容易であるため，微生物として，酵母を用いることで，遺伝子破壊又は遺伝子変異により低下した増殖能を回復した酵母を容易に製造することができるようになる。
【００２０】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物は，遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した出芽酵母である，上記に記載の製造方法である。この利用態様における微生物として，出芽酵母の遺伝子破壊株があげられる。
【００２１】
具体的には，前記遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物は，｛ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，ｍｎｎ４破壊，及びａｌｇ３破壊｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の破壊を有するか，又はｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊を有する出芽酵母の遺伝子破壊株である，上記に記載の製造方法である。これにより，哺乳類型糖タンパク質を効率よく産生する出芽酵母を製造することができる。
【００２２】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記糖新生を促進する機能を有する遺伝子は，ＣＡＴ８であり，前記遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物は，ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊を有する出芽酵母の遺伝子破壊株である，上記に記載の製造方法である。後述する実施例により実証されたとおり，増殖能が低下したｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊を有する出芽酵母の遺伝子破壊株に，ＣＡＴ８遺伝子を導入することにより，増殖能を回復することができる。
【００２３】
本発明の第２の側面は，上記の酵母の製造方法により，増殖能を回復した酵母を得る工程を含む，糖タンパク質の製造方法に関する。本発明の好ましい態様は，上記のいずれかに記載の製造方法により，増殖能を回復した出芽酵母を得る工程を含む，糖タンパク質の製造方法である。
【００２４】
酵母は，有用糖タンパク質を生産するための優れた宿主であるので，遺伝子破壊又は遺伝子変異により低下した増殖能を回復した酵母を用いることで，大量培養系へのスケールアップが容易になり，有用糖タンパク質を効率よく生産することができるようになる。
【００２５】
｛ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，ｍｎｎ４破壊，及びａｌｇ３破壊｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の破壊を有する出芽酵母の遺伝子破壊株，特にｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊を有する出芽酵母の遺伝子破壊株は，哺乳類型の糖鎖を含有する糖タンパク質の生産に優れるので，遺伝子破壊により低下した増殖能を回復させることで，高品質な糖タンパク質を効率よく生産することができるようになる。
【００２６】
さらに後述する実施例により実証されたとおり，糖新生を促進する機能を有する遺伝子として，ＣＡＴ８を導入した出芽酵母の遺伝子破壊株は，増殖能を回復することができる。実施例に記載の出芽酵母の遺伝子破壊株は，哺乳類型糖タンパク質を作るように改変された株である。よって，その増殖能を回復させることで，容易に効率よく糖タンパク質を生産することができるようになる。
【００２７】
本発明の第３の側面は，上記の酵母の製造方法により，増殖能を回復した酵母を得る工程を含む，β−グルカンの製造方法に関する。本発明の好ましい態様は，上記のいずれかに記載の製造方法により，増殖能を回復した出芽酵母を得る工程を含む，β−グルカンの製造方法である。β−グルカンは，主に酵母の細胞壁から抽出される。糖鎖合成遺伝子を破壊あるいは変異により機能しないようにすることにより，酵母細胞壁中のβ−グルカンの含有量が増加する。さらに，糖鎖遺伝子破壊株の増殖能を回復させることで，その効率が増す。よって，増殖能を回復した酵母を用いることで，効率よくβ−グルカンを製造することができるようになる。
【００２８】
本発明の第４の側面は，糖新生を促進する機能を有する遺伝子が導入された，ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊を有する酵母の遺伝子破壊株であって，前記糖新生を促進する機能を有する遺伝子は，｛ＣＡＴ８，ＳＦＣ１，ＰＵＴ４，ＭＬＳ１，ＣＩＴ２，ＦＢＰ１，ＳＴＬ１，ＩＣＬ１，ＡＣＨ１，及びＡＤＨ２｝からなる群から選ばれる１又は２以上の遺伝子である酵母の遺伝子破壊株に関する。具体的には，前記糖新生を促進する機能を有する遺伝子として，ＣＡＴ８遺伝子が導入された，上記に記載の酵母の遺伝子破壊株である。この利用態様の酵母として，出芽酵母があげられる。
【００２９】
本発明の第５の側面は，糖鎖合成遺伝子破壊酵母株又は糖鎖合成遺伝子変異酵母株の，高温感受性を回避するため，又は薬剤感受性を低下させるために用いられる，ＣＡＴ８遺伝子を含有するプラスミドに関する。後述する実施例に実証されたとおり，このプラスミドを用いることで，遺伝子破壊酵母株または遺伝子変異酵母株の高温感受性を回避することができ，また薬剤感受性を低下させることができるようになる。
【００３０】
具体的な酵母として，独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号「ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１４４５」として寄託されている酵母があげられる。この酵母は，出芽酵母遺伝子破壊株にＣＡＴ８遺伝子を含有するプラスミドを導入し，増殖能が回復したものである。この増殖能が回復した酵母を用いることで，効率的に糖タンパク質又はβ−グルカンを製造することができるようになる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば，遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能などが低下した微生物の増殖能を回復させる，微生物の製造方法を提供することができる。
【００３２】
本発明によれば，糖鎖合成遺伝子破壊又は糖鎖合成遺伝子変異により増殖能が低下した出芽酵母などの酵母の増殖能を回復させる，酵母の製造方法を提供することができる。また，本発明によれば，そのようにして増殖能を回復させた遺伝子を含有するプラスミド，増殖能が回復した酵母，増殖能が回復した酵母を用いたβ−グルカンの製造方法を提供することができる。
【００３３】
本発明によれば，上記のような増殖性を回復した酵母の製造方法を用いた哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は，図面に替わるアガロースゲル電気泳動写真である。
【図２】図２は，図面に替わるアガロースゲル電気泳動写真である。
【図３】図３は，図面に替わる合成培地（ウラシル欠損）および同培地にハイグロマイシンを添加したプレートの写真である。
【図４】図４は，図面に替わる合成培地および合成培地にハイグロマイシンを添加したプレートの写真である。
【図５】図５は，Ｎ−結合型糖鎖長を調べるための図面に替わるＳＤＳゲル電気泳動写真である。
【図６】図６は，ＫＩＤ３−２２株（−）とＫＩＤ０８−０８−１株（＋）細胞内でのＯ．ｍｉｎｕｔａＣＡＴ８遺伝子の強制発現の結果を示す図面に替わるアガロース電気泳動の写真である。
【図７】ＣＡＴ８強制発現によるＫＩＤ３−２２が示す高温感受性の回復を示す図面に替わる写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下，本発明の実施の形態を説明する。本発明の第１の側面は，遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物に，糖新生を促進する機能を有する遺伝子を導入する工程を含み，前記糖新生を促進する機能を有する遺伝子は，ＣＡＴ８，ＳＦＣ１，ＰＵＴ４，ＭＬＳ１，ＣＩＴ２，ＦＢＰ１，ＳＴＬ１，ＩＣＬ１，ＡＣＨ１，及びＡＤＨ２からなる群から選ばれる１又は２以上の遺伝子である，遺伝子変異により低下した増殖能を回復した微生物の製造方法に関する。
【００３６】
「遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物」としては，酵母があげられ，出芽酵母，分裂酵母，又はメタノール資化性酵母があげられ，酵母の遺伝子変異株又は遺伝子破壊株があげられる。具体的な，「遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物」として，出芽酵母の遺伝子破壊株が好ましい。出芽酵母の遺伝子破壊株として，｛ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，ｍｎｎ４破壊，及びａｌｇ３破壊｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の破壊を有する株があげられる。また，出芽酵母の遺伝子破壊株として，ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊を有する出芽酵母の遺伝子破壊株があげられる。具体的には，後述するＴＩＹ１９株，又はＴＩＹ２０株などの遺伝子破壊株があげられる。「遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物」として，上記の遺伝子破壊株であって，哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質又はβグルカンを高収率に産生する酵母が好ましい。
【００３７】
先に説明したとおり，以下の参考例において，ＴＩＹ２０とＹＡＢ１００およびＹＡＢ１０１のマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行うことで，ＴＩＹ２０よりもＹＡＢ１００，又はＹＡＢ１０１にて発現が上昇する遺伝子を網羅的にリストアップした。その結果，２４遺伝子が，ＴＩＹ２０と比べ３倍以上の発現誘導を示した。Ｖ．  Ｈａｕｒｉｅらの文献（Ｖ．  Ｈａｕｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  ＪＢＣ，  ２７６，  ７６‐８５）に示されるとおり，この２４遺伝子のうち９遺伝子が糖新生に関する遺伝子であり，それら９遺伝子はＣＡＴ８転写因子の下流で発現誘導されるものである。そこで，ＣＡＴ８遺伝子をＴＩＹ２０内で強制発現させ，ＣＡＴ８下流の遺伝子群の発現を誘導させた。その結果，ＴＩＹ２０の増殖能の低下および薬剤感受性を回復させることに成功した。よって，糖新生に関与する遺伝子を導入して，糖新生系を亢進させることにより，遺伝子破壊などにより損なわれた機能を回復させることができると考えられる。
【００３８】
具体的な「糖新生を促進する機能を有する遺伝子」として，ＣＡＴ８，ＳＦＣ１，ＰＵＴ４，ＭＬＳ１，ＣＩＴ２，ＦＢＰ１，ＳＴＬ１，ＩＣＬ１，ＡＣＨ１，及びＡＤＨ２のうちいずれか１つ又は２つ以上があげられる。「糖新生を促進する機能を有する遺伝子を導入する方法」は，たとえば，それらの遺伝子を公知の方法により遺伝子導入する方法があげられる。「糖新生を促進する機能を有する遺伝子を導入する方法」として，具体的には，ＣＡＴ８を含むプラスミドを用いて形質転換する方法があげられる。
【００３９】
このように糖新生を促進する機能を有する遺伝子を導入することにより，糖新生系を亢進させることができる。すなわち，本発明においては，遺伝子破壊又は遺伝子変異により増殖能が低下した微生物に対し，糖新生系を亢進させることにより，遺伝子破壊又は遺伝子変異により低下した増殖能を回復させることができる。
【００４０】
また，「糖新生を促進する機能を有する遺伝子」を含有するプラスミド（好ましくは，ＣＡＴ８遺伝子を含有するプラスミド）は，糖鎖合成遺伝子破壊酵母株又は糖鎖合成遺伝子変異酵母株の，高温感受性を回避するため，又は薬剤感受性を回復させるため有効に用いることができる。このようなプラスミドは，公知の方法に従って容易に製造することができる。そして，このプラスミドを用いて，「糖新生を促進する機能を有する遺伝子」を増幅し，形質転換することによって，温度感受性が緩和し，又は薬剤感受性が回復し，増殖能が回復した酵母株を得ることができる。
【００４１】
本発明に用いる酵母は，一般的に酵母とよばれるものであれば特に限定されず，出芽酵母，分裂酵母などを適宜用いることができる。代表的な酵母として，サッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ），又はシゾサッカロミセス科（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ），に属するものがあげられる。より具体的な酵母として，真核生物のモデル生物として汎用されており，出芽酵母の一種であるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ），及び分裂酵母の一種であるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）があげられる。本発明に用い得る他の酵母としては，例えば，黒酵母（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）があげられる。
【００４２】
なお，本発明における酵母として，メタノール資化性酵母を用いても良い。具体的なメタノール資化性酵母として，ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ），オガタエ・ミニュータＯｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ），カンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｎｉ），ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ），またはハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）があげられる。これらの中では，Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，又はＯｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａが，好ましいメタノール資化性酵母である。また，Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓについては，例えば，Ｗｏｕｔｅｒ  Ｖｅｒｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ７０，  Ｎｏ．５，２００４，ｐｐ２６３９−２６４６に記載されている。
【００４３】
メタノール資化性酵母Ｏ．ｍｉｎｕｔａでは，ｏｃｈ１破壊およびａｌｇ３破壊を有する二重破壊株（Δｏｃｈ１Δａｌｇ３）が報告されている。Ｏ．ｍｉｎｕｔａのΔｏｃｈ１Δａｌｇ３二重破壊株は生育が悪く，浸透圧調整下のみで生育し，凝集性が高いなど出芽酵母糖鎖遺伝子破壊株と同様な表現型を示す。Ｏ．ｍｉｎｕｔａには出芽酵母同様にＣＡＴ８遺伝子が存在する。後述する実施例で示されたとおり，Ｏ．ｍｉｎｕｔａ糖鎖遺伝子破壊株などメタノール資化性酵母においてもＣＡＴ８遺伝子などの糖新生を促進する機能を有する遺伝子を強制発現させることによって，遺伝子破壊又は遺伝子変異により惹起される表現型を回復させることができる。
【００４４】
本発明で用いられる酵母として，実施例で実証された出芽酵母が好ましいが，本発明は特に出芽酵母に限定されず，分裂酵母やメタノール資化性酵母など，酵母全般に広く適用できる。特に，分裂酵母については，参考例に示したとおり，出芽酵母と同様に不均衡変異導入法により，糖鎖欠損株について増殖能及び高温感受性（ｔｓ性）を回復させることに成功している。分裂酵母については，出芽酵母と同様，所定の遺伝子を破壊することで，糖鎖へのマンノースの付加を効果的に防止し，哺乳類型の糖鎖を有する糖タンパク質を産生できることが知られている（Ｔａｋｅｈｉｋｏ  Ｙｏｋｏ−ｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４８９（２００１）７５−８０；Ｃｌｉｎｔｏｎ  Ｅ．  Ｂａｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９１．ｐｐ９３２７−９３３１，１９９４；Ｎａｏｔａｋａ  Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３３０（２００５）８１３−８２０；Ｓａｎｄｒａ  Ｆａｎｃｈｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １４３，  Ｎｏ．３，  １９８８，ｐｐ６２５−６３６，特開２００１−１６１３７６号公報）。
【００４５】
本発明に用いる酵母の遺伝子破壊株は，野生型酵母における何らかの遺伝子を破壊した株であれば特に限定されない。何らかの遺伝子を破壊した株は，一般的に野生型酵母に比べて，高温耐性や増殖性などが低下する。以下，具体的な遺伝子破壊株を説明する。
【００４６】
特許第３０９１８５１号公報には，ＯＣＨ１遺伝子破壊株（Δｏｃｈ１）であって，さらにｍｎｎ１破壊を有する二重破壊株（Δｏｃｈ１  Δｍｎｎ１）が開示されている（例えば，同公報の実施例１を参照）。すなわち，本発明に用いる酵母の遺伝子破壊株が二重破壊株（Δｏｃｈ１  Δｍｎｎ１）である場合，そのような二重破壊株は，同公報に記載の方法に従って得ればよい。そして，同公報によれば，そのような二重破壊株を用いれば，ヒトなど哺乳類細胞の生産する高マンノースと同一のコア型糖鎖，あるいはこの糖鎖構造をもつ高マンノース型糖タンパク質を多量かつ純度よく生産することができるとされている。本発明の酵母の製造方法において，この二重破壊株を用いれば，高温感受性を回避し，増殖性などが回復されるので，効果的に哺乳類細胞の生産する高マンノースと同一のコア型糖鎖などを産生できると考えられる。
【００４７】
特許第３０９１８５１号公報には，ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ６破壊を持つ三重破壊株（Δｏｃｈ１  Δｍｎｎ１  Δｍｎｎ６）が開示されている（例えば，同公報の実施例１を参照）。すなわち，本発明に用いる酵母の遺伝子破壊株が三重破壊株（Δｏｃｈ１  Δｍｎｎ１  Δｍｎｎ６）などである場合，それらの株は，同公報に記載の方法に従って得ればよい。そして，同公報によれば，そのような三重破壊株などを用いることで，ヒトなど哺乳類細胞の生産する高マンノースと同一のコア型糖鎖，あるいはこの糖鎖構造をもつ高マンノース型糖タンパク質を多量かつ純度よく生産することができるとされている。本発明の酵母の製造方法において，これらの株を用いれば，高温感受性を回避し，増殖性などが回復されるので，効果的に哺乳類細胞の生産する高マンノースと同一のコア型糖鎖などを産生できると考えられる。さらに，同公報に開示された技術に従って，ＯＣＨ１遺伝子及びＭＮＮ１遺伝子を破壊した二重破壊株を得ることができる。
【００４８】
また，特開平９−２６６７９２号公報には，Δｏｃｈ１  Δｍｎｎ１破壊の他に，ＭＮＮ４遺伝子及びＫＲＥ２遺伝子の機能を破壊した四重破壊株が開示されている。同公報に開示されるように，たとえば，接合型の異なる変異株や遺伝子破壊株を接合させて，生成する２倍体細胞を窒素源を欠乏させた胞子形成培地[例えば，Ｆ．Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１９４，ｐ．１７（１９９１）参照]に移すことにより，減数分裂させ，これによって生成する４つの胞子を顕微鏡下で個別に分離し，その表現型を調べることにより，様々な変異株又は破壊株を作成することができる。
【００４９】
国際公開ＷＯ０１／０１４５２２号パンフレット（特許文献１）には，ｏｃｈ１破壊（Δｏｃｈ１），ｍｎｎ１破壊（Δｍｎｎ１）及びｍｎｎ４破壊（Δｍｎｎ４）を有する三重破壊株が開示されている。すなわち，酵母に特異的な外糖鎖の生合成に関与する遺伝子のうち，初発の延長付加反応を行うα−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＯＣＨ１），糖鎖の非還元末端にマンノースを付加するα−１，３マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＭＮＮ１），及びマンノース−１−リン酸の付加を制御する遺伝子（ＭＮＮ４）の機能を破壊した遺伝子破壊酵母株が開示されている。本発明の実施例で用いたＴＩＹ２０は，同文献に開示されるＴＩＹ１９とｍａｔが異なるものであって，同じクローンから四分子分析によって得られるものである。四分子分析については，例えば，Ｄａｎ  Ｂｕｒｋｅら（大矢禎一ら訳，酵母遺伝子実験マニュアル，丸善株式会社平成１４年１２月１０日発行）などに記載される方法に従って行うことができる。
【００５０】
国際公開ＷＯ０１／０１４５２２号パンフレット（特許文献１）には，ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，ｍｎｎ４破壊及びａｌｇ３破壊を含む破壊を導入した出芽酵母破壊株が開示される他，ＯＣＨ１遺伝子，ＭＮＮ１遺伝子，ＭＮＮ４遺伝子及びＡＬＧ３遺伝子を破壊した出芽酵母の遺伝子破壊株が開示されている。また，同公報においては，それらの遺伝子破壊による変異形質の他に，ｕｒａ３変異，ｈｉｓ３変異，ｌｅｕ３変異，ｌｅｕ２変異，ａｄｅ２変異，ｔｒｐ１変異，及びｃａｎ１変異からなる群から選ばれる栄養要求性変異形質を有する酵母変異株が開示されている。同公報によれば，これらの変異株は栄養要求性選択マーカーを用いた外来遺伝子の導入が容易に可能であり，これらの変異株を用いることで，哺乳類型の糖鎖あるいは哺乳類型の糖鎖を有する糖タンパク質を多量かつ純度よく製造できることが開示されている。よって，本発明の酵母の製造方法において，同公報に開示される変異株を用いれば，増殖性などが回復されるので，効果的に哺乳類型の糖タンパク質などを製造できると考えられる。さらに，このようにして増殖性などが回復された変異株は，β−グルカンを高効率に産生すると考えられる。
【００５１】
よって，例えば，酵母の遺伝子破壊株又は遺伝子変異株などの遺伝子機能欠損株として，｛ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，ｍｎｎ４破壊，及びａｌｇ３破壊｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の破壊を有する株であるか，又は｛ｏｃｈ１変異，ｍｎｎ１変異，ｍｎｎ４変異，及びａｌｇ３変異｝からなる群から選ばれるひとつ又は２つ以上の変異を有する株であるものがあげられる。特定の遺伝子機能の欠損が遺伝子の破壊による遺伝子破壊株のみならず，遺伝子の変異による遺伝子変異株においても，上記と同様の問題がある。よって，本発明の方法により，実施例で実証された遺伝子破壊株のみならず，遺伝子変異株にも効果的に用いることができる。より具体的な株として，ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊を有する酵母株があげられる。「ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊を有する」とは，ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊を有するほかに，他の遺伝子破壊を有していてもよく，さらに他の変異が導入されていてもよい。ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊を有する酵母の遺伝子破壊株として，ｏｃｈ１破壊，ｍｎｎ１破壊，及びｍｎｎ４破壊のみの遺伝子破壊を有する三重破壊株であってもよい。本発明によれば，高温感受性を回避又は増殖性を回復した酵母を得ることができ，それによりβ−グルカンや糖タンパク質を高効率に産生させることができる。遺伝子破壊株又は遺伝子変異株などの遺伝子機能欠損株の中では，ｏｃｈ１破壊のみ又はｏｃｈ１破壊とその他の遺伝子破壊を有する酵母の遺伝子破壊株を好ましく用いることができる。なお，特開２００１−１６１３７６号公報には，分裂酵母の糖転移酵素遺伝子ｏｃｈ１＋の機能を失わせた分裂酵母のｏｃｈ１破壊株（Δｏｃｈ１）が開示されている。本発明は，酵母の遺伝子破壊株として，分裂酵母のｏｃｈ１破壊株（Δｏｃｈ１）を用いてもよい。よって，例えば酵母として分裂酵母を用いた場合であっても，ｏｃｈ１破壊のみ又はｏｃｈ１破壊とその他の遺伝子破壊を有する遺伝子破壊株を好ましく用いることができる。
【００５２】
本発明は，基本的には，上記した特定の遺伝子を酵母などの微生物内で強制発現させる。特定の遺伝子を酵母内で発現させるために，上流にプロモーターを，下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し，これを発現ベクターに導入すればよい。また，その遺伝子を導入する発現ベクターにプロモーターとターミネーターが既に存在する場合は，発現カセットを構築することなく，そのプロモーターとターミネーターを利用してその間に当該融合遺伝子のみを導入すればよい。
【００５３】
発現カセット中のプロモーターは，酵母発現系で一般に使用され，形質転換酵母菌内で導入した融合遺伝子を発現させることができるプロモーターであれば特に限定はないが，例えば，ＰＧＫ，ＧＡＰ，ＴＰＩ，ＧＡＬ１，ＧＡＬ１０，ＡＤＨ２，ＰＨＯ５，及びＣＵＰ１などがあげられ，これらの中ではＧＡＰプロモーターが好ましい。
【００５４】
一方，ターミネーターは，酵母発現系で一般に使用され，導入した融合遺伝子の下流に存在させて転写終結が可能とするものであればよく，例えば，ＡＤＨ１，ＴＤＨ１，ＴＦＦ，及びＴＲＰ５などがあげられる。
【００５５】
発現カセットを導入する発現ベクターとして，酵母発現系で一般に使用されるものであれば特に限定はない。具体的な発現ベクターとして，大腸菌由来のプラスミド（例，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，及びｐＵＣ１３），枯草菌由来のプラスミド（例，ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，及びｐＣ１９４），酵母由来のプラスミド（例，ｐＳＨ１９，及びｐＳＨ１５），λファージなどのバクテリオファージ，レトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス，並びにバキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができるが，酵母由来のプラスミドが好適に使用されうる。
【００５６】
酵母の形質転換に利用されるプラスミドは，酵母の形質転換に用いることができるプラスミドであれば特に限定されないが，例えば，ＹＥｐと略される酵母エピソーム型プラスミド（ｙｅａｓｔ  ｅｐｉｓｏｍｅ  ｐｌａｓｍｉｄ），ＹＲpと略される酵母自己複製型プラスミド（ｙｅａｓｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ）などがあげられる。酵母エピソーム型プラスミドベクターは，酵母の本来もつ２μプラスミドの配列を含んでおり，その複製起点を利用して宿主酵母細胞内で複製できるようにしたベクターである。本発明で使用する酵母エピソーム型発現ベクターは，酵母の２μプラスミド配列の少なくともＡＲＳ配列を含んでおり，かつ宿主酵母菌体内において染色体外で増殖することができるものが好ましい。具体的なプラスミドとして，ＹＥｐ５１，ｐＹＥＳ２，ＹＥｐ３５１，ＹＥｐ３５２及びｐＲＥＰなどがあげられる。
【００５７】
上記の酵母エピソーム型発現ベクターは，組換え大腸菌でのサブクローニングを行えるように，大腸菌体内部で増殖できるシャトルベクターである方が好ましく，またアンピシリン耐性遺伝子等選択マーカー遺伝子を含むものがさらに好ましい。また，該発現ベクターは，組換え酵母を作成した際に，栄養要求性や薬剤耐性によって酵母クローンを選抜できる，マーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子としては，例えば，ＨＩＳ３，ＴＲＰ１，ＬＥＵ２，ＵＲＡ３，ＡＤＥ２，ＣＡＮ１，ＳＵＣ２，ＬＹＳ２，及びＣＵＰ１などがあげられる（大島泰治編著，生物化学実験法３９，酵母分子遺伝学実験法，１１９−１４４  （１９９６））。これらはあくまで例示であり，遺伝子導入の宿主とする酵母菌株の遺伝子型に応じて適宜選択すればよい。上述した融合遺伝子発現プラスミドの構築に関する一連の手法は，後記実施例の記載を参照して，あるいは慣用の技術により当業者が適宜実施することができる。
【００５８】
発現ベクターには，プロモーター，エンハンサー，スプライシングシグナル，ポリＡ付加シグナル，選択マーカー，ＳＶ４０複製オリジン，タグをコードするＤＮＡなどを付加してもよい。また，発現ベクターは，融合タンパク質発現ベクターであってもよい。市販されている融合タンパク質発現ベクターとして，ｐＧＥＸシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社），ｐＥＴ  ＣＢＤ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３４ｂ−３８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社），ｐＥＴ  Ｄｓｂ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ３９ｂ  ａｎｄ  ４０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社），及びｐＥＴ  ＧＳＴ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ４１  ａｎｄ  ４２（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などがあげられる。
【００５９】
本発明において，遺伝子発現ベクターにて形質転換させる宿主酵母としては，サッカロミセス属，カンジダ属に属する酵母を用いるものがあげられるが，特に限定はされない。サッカロミセス属の酵母としては，例えば，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＫ４株，Ｙ３３４株，Ｉｎｖ−Ｓｃ１株，及びＷ３０３株があげられる。
【００６０】
融合遺伝子発現ベクターにて酵母を形質転換するには，公知の方法を適宜用いればよい。融合遺伝子発現ベクターにて酵母を形質転換する方法として，例えば，以下の方法があげられる。リン酸リチウムで処理し，ＤＮＡとＰＥＧを加えてインキュベートする方法や，エレクトロポレーション法などの公知の方法を利用できる（Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９４，  １８２−１８７（１９９１））。また，細胞壁を酵素で消化したスフェロプラスト細胞をＰＥＧとＤＮＡとを，二塩化カルシウムなどに由来するカルシウムイオンの存在下でインキュベートするスフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：１９２９（１９７８））や，ＤＮＡを表面に付着させた粒子を細胞に照射することにより形質転換を行う方法（Ｆｏｘ  Ｔ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，１９８８．Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｃａｎ  ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｙｅａｓｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｍｔＤＮＡ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：７２８８−７２９２）を用いてもよい。
【００６１】
対数増殖期の酵母細胞を，該酵母細胞に導入する遺伝子およびポリエチレングリコールを含有する溶液中で維持する工程を含む酵母の形質転換方法（特許３６８２５３０号）であってもよい。
【００６２】
形質転換酵母のスクリーニングのために，適当な選択マーカーを用いてもよい。一例として，宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の代謝に関与する遺伝子を用いるものがあげられる。すなわち，染色体ＤＮＡ上の上記遺伝子を突然変異等の適当な手段により機能しないような宿主細胞を用い，相当する正常な遺伝子を含む発現ベクターを形質転換することにより，正常な代謝遺伝子を含む形質転換細胞のみを増殖させてスクリーニングできる物が好ましい。具体的には上記したようなＵＲＡ３，ＬＥＵ２等広く用いられている選択マーカー遺伝子を発現ベクターに接続する。染色体組み込み型タイプ（ＹＩｐタイプ）の場合にもこれらの遺伝子はスクリーニングのマーカーとなる。
【００６３】
形質転換された形質転換酵母は公知の方法にしたがって培養すればよい。具体的には，培地５ｍｌで一晩培養し，２０ｍｌ，５０ｍｌ，１００ｍｌとスケールアップを繰り返し，約一週間程度の期間，酵母が分裂できる状態で培養を繰り返す。形質転換酵母の培養方法は，酵母の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。培地として，酵母が資化し得る炭素源，窒素源，無機塩類等を含有し，形質転換体の培養を効率的に行える培地を用いればよく，具体的には，ＹＰＤ培地，ＹＰＧ培地，ＹＰＤＧ培地，ＹＰＡＤ培地，グルコース合成最小培地（ＳＤ），ヨウ素添加最小培地（ＳＭＭ），Ｈａｒｔｗｅｌｌの完全培地（ＨＣ），ＧＡＬ発酵試験培地，又は胞子形成培地などを適宜用いることができる。また，例えば，Ｄｉｆｃｏ社から供給される各種の培地成分を添加し，かつプラスミドの複製・保持に必要なマーカーによって供給可能となるアミノ酸を除いた合成培地（炭素源，窒素源，無機塩類，アミノ酸，ビタミン等を含む）等を利用できる（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，３−５７（１９９１））。
【００６４】
培地のｐＨは，６〜８に調節することが適当である。ｐＨの調整は，無機又は有機の酸，アルカリ溶液，尿素，炭酸カルシウム，アンモニアなどの添加量を制御することにより行えばよい。培養は，２８〜３２℃，好ましくは３０℃で，１日から１ヶ月，たとえば，１日以上３日以下，又は約一週間（たとえば，５日〜１０日），常法に従い，通気や攪拌を適宜加えつつ行えばよい。特に，ＴＩＹ２０株を効率よく培養するためにＫＣｌ及びソルビトールを加え３０℃で培養することが望ましいが，穏やかな選択圧を加えるために，ＫＣｌ及びソルビトールを加えない培地にて培養を行ってもよい。また，穏やかな選択圧を得るために，３１℃〜３５℃（又は３２℃〜３３℃）など３０℃に比べ少し高い温度で培養してもよい。
【００６５】
増殖性を回復した酵母
増殖性を回復した酵母は，上記した製造方法により製造された酵母を意味する。そして，具体的には，哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質を産生する出芽酵母，分裂酵母，又はメタノール資化性酵母などがあげられる。より具体的には，公知の遺伝子破壊株，又は公知の遺伝子破壊株から公知の方法に従って製造しうる遺伝子破壊株において，特定の遺伝子を導入することにより得られる酵母などがあげられる。
【００６６】
哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質
本明細書における糖タンパク質として，哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質があげられる。哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質は，上記した公知の遺伝子破壊株などによって産生されるものであればよく，遺伝子破壊株から糖タンパク質を単離・精製する方法も，本明細書に記載したいずれかの文献に開示される方法又は公知の方法を適宜用いればよい。例えば，培養が終了した後に，細胞を遠心分離により回収し，水系緩衝液に懸濁する。その後，超音波破砕機，フレンチプレス，ホモジナイザー，ダイノミルなどを適宜用いて細胞を破砕し，無細胞抽出液を得る。そのようにして得られた無細胞抽出液を遠心分離して上清を得て，その上清から糖タンパク質を抽出すればよい。タンパク質を抽出する方法として，溶媒抽出法，硫安などによる塩析法，有機溶媒による沈殿法，ジエチルアミノエチル−セファロースなどのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法，アフィニティークロマトグラフィー法などがあげられる。
【００６７】
本明細書において，Ｍａｎはマンノース，ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを示す。またアスタリスク（＊）は，リン酸化可能部位を示す。具体的な哺乳類型糖鎖を有する糖タンパク質として，下記式（Ｉ），又は（ＩＩ）で示されるオリゴ糖鎖をアスパラギン結合型糖鎖として有する糖タンパク質があげられる。
【００６８】
【化１】
2009183283.tif 000003
【００６９】
β−グルカンを高効率に産生する酵母
β−グルカンを高効率に産生する酵母は，増殖性を回復した酵母と同様に，上記した製造方法により製造された酵母があげられる。β−グルカンを高効率に産生する酵母の例として，β−グルカンを高効率に産生する出芽酵母，分裂酵母，又はメタノール資化性酵母などがあげられる。より具体的には，公知の遺伝子破壊株，又は公知の遺伝子破壊株から公知の方法に従って製造しうる遺伝子破壊株において，所定の遺伝子を強制発現することにより得られる酵母などがあげられる。
【００７０】
β−グルカン
β−グルカンは，上記した公知の遺伝子破壊株によって産生されるものであればよい。例えば，具体的なβ−グルカンの種類として，β−１，３−Ｄ−グルカン及びβ−１，６／１，３−Ｄグルカンがあげられる。遺伝子破壊株から（特に酵母細胞壁から）β−グルカンを単離・精製する方法として，公知の方法を適宜用いることができる。例えば，培養が終了した後に，得られた培養物（細胞）を遠心分離により回収し，水系緩衝液に懸濁する。次いで，超音波破砕機，ボルテックスミキサー，フレンチプレス，ホモジナイザー，ダイノミルなどを適宜用いて細胞を破砕し，細胞破砕液を得る。得られた細胞破砕液を遠心分離してペレット（細胞壁含む）を回収する（再懸濁，遠心分離，ペレット回収は適当回数繰り返す。抽出は，たとえば，Ｍａｇｎｅｌｌｉ  Ｐ.  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０１．  １３６‐１５０  （２００２）に記載の方法を用いて行うことができる。
【００７１】
寄託株の説明
後述する参考例で得られたＹＡＢ１００株は，平成１８年７月１１日から独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに，受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５５として寄託されている。
後述する参考例で得られたＹＡＢ１０１株は，平成１８年７月１１日から独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに，受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５６として寄託されている。
後述する参考例で得られたＣ２−１１株は，平成１８年１２月２７日から独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに，受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１４５として寄託されている。
後述する実施例で得られたＴＩＹ＜ＣＡＴ８株は，平成１８年１２月２７日から独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに，受託番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１４４５として寄託されている。
後述する実施例で得られたＫＩＤ０８−０８−１株は，平成２１年１月８日から独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに，受託番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７５７として寄託されている。
【００７２】
参考例１．変異型ｐｏｌ３ＤＮＡ断片を導入したプラスミドｐＡＢ１００の産生
以下のようにして変異型ｐｏｌ３ＤＮＡ断片を出芽酵母強制発現用マルチコピーベクターＹＥＰ３５２ＧＡＰ２のＳａｃＩ−ＳａｌＩサイトにクローニングし，プラスミドｐＡＢ１００を構築した。Ｐｏｌ３のアミノ酸配列は配列番号１５に示され，Ｐｏｌ３をコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号１６に示されるが，本実施例で得られたｐｏｌ３−０１変異遺伝子は配列番号１６における９６２番目の塩基がＡからＣに置換され，９６８番目の塩基がＡからＣに置換されたものである。すなわち，配列番号１６で示される塩基配列の９６１番目から９６９番目までの塩基配列によってコードされるアミノ酸残基が，ＤＩＥからＡＩＡに置換されるような変異を導入した。このようにして得られたｐｏｌ３−０１のアミノ酸配列を配列番号１７に示し，ｐｏｌ３−０１変異遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１８に示す。
【００７３】
具体的に説明すると，天然のミューテーターとして知られているＡＭＹ１２８−１株（ＭＡＴαｐｏｌ３−０１，ｕｒａ３−５２，ｌｅｕ２−１，ｌｙｓ１−１，ａｄｅ２−１，ｈｉｓ１−７，ｈｏｍ３−１０，ｔｒｐ１−２８９）のゲノムをテンプレートに用いて，ＰＣＲ反応（フォワードプライマー：５’−ＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣ（ＳａｃＩ）ＡＴＧＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＴＧ−３’（配列番号１），リバースプライマー：５’−ＧＣＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣ（ＮｏｔＩ）ＴＴＡＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号２））にてｐｏｌ３−０１変異遺伝子を増幅し，その増幅断片をｐＹＥＳ２ベクターのＳａｃＩ−ＮｏｔＩサイトにクローニングした（得られたプラスミドをｐＹＥＳ２−ｐｏｌ３−０１と命名した。）。さらに，ＧＡＰＤＨプロモーターの支配下でｐｏｌ３−０１変異遺伝子が発現できるように，ｐＹＥＳ２−Ｐｏｌ３−０１からｐｏｌ３−０１変異遺伝子を制限酵素ＳａｃＩとＸｈｏＩにて消化し，ＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩベクターのＳａｃＩ−ＳａｌＩ  ｓｉｔｅにクローニングした（このようにして得られたプラスミドをｐＡＢ１００と命名した。）。
【００７４】
糖鎖改変株の高温耐性株の取得
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）糖鎖改変株ＴＩＹ２０（ｍａｔα  ｏｃｈ１：：ｈｉｓＧ  ｍｎｎ１：：ｈｉｓＧ  ｍｎｎ４：：ｈｉｓＧ）に，上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢ１００を形質転換した。ＴＩＹ２０は，国際公開ＷＯ０１／０１４５２２号パンフレット（特許文献１）に開示されるＴＩＹ１９と同じクローンから四分子分析によって得た。得られた形質転換体（ＴＩＹ２０／ｐＡＢ１００）を，より多くの変異を入れるために出芽酵母用合成培地ＳＤ−Ｕ（６．７ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  （Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），２０ｇ  グルコース，０．７７ｇ  ＣＭＳ−ＵＲＡ（Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（液体）に，できるだけ多く分裂できるように条件を制御して培養した。これらの菌の中から高温耐性株を得るために，ＳＤ−Ｕ固形培地に蒔いてから３７℃で３日培養し，生えてきたコロニーを釣菌した。得られた株からｐＡＢ１００を脱落させるために完全培地ＹＰＡＤ（１０ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），２０ｇ  ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ），０．２ｇ硫酸アデニン（Ｓｉｇｍａ），２０ｇＧｌｕｃｏｓｅ／１Ｌ）にストリークした後，培養し，シングルコロニーを２０個ずつ回収した。これらのコロニーのうちＳＤ−Ｕ培地で生えることができないコロニーを取得した。
【００７５】
参考例２．酵母内タンパク質インベルターゼに付加される糖鎖長の解析
参考例１で得られた９株（Ｃ１５，Ｃ２７，Ｃ２８，Ｃ３０，Ｃ３−２０，Ｃ４−１，Ｃ３−３−１，Ｃ３−７−２，及びＣ３−３−９）のＮ−結合型糖鎖長を調べるために酵母内で作られるインベルターゼに付加されるＮ−結合型糖鎖長を以下の方法にて調べた。それぞれの株を５ｍｌのＹＰＡＤで培養後，５ｍｌのＹＰＳｕｃ（１０ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），２０ｇのｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ），１０ｇのｓｕｃｒｏｓｅ／１Ｌ）で３時間以上培養し，菌を回収した。回収した菌は５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），２ｍＭ  ＰＭＳＦ，３％ＳＤＳ，０．１％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，１％２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）とグラスビーズを加えてボルテックスにて破砕した。１５，０００回転で５分間遠心分離した後，上清５μｌずつを５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動（１００Ｖ，３時間）した。ゲルを反応液（３．４ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ，３ｍｌ  ３Ｍ  Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ／１００ｍｌ）に移し，３０分３７℃でインキュベーションした後，脱イオン水にて２回洗浄した。染色液（２ｇ  ＮａＯＨ，５０ｍｇ  ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ／５０ｍｌ）に移し，発色するまで煮込んだ。その結果，得られた９株のインベルターゼに付加されるＮ−結合型糖鎖は親株であるＴＩＹ２０と同じ糖鎖長をもつことが分かった。
【００７６】
生育の回復効率の解析
次に，参考例１で得られた株の成長回復効率を解析した。５ｍｌのＹＰＡＤで３０℃にて培養を行った後，ＯＤ６００が０．１となるように１０ｍｌのＹＰＡＤに移し，３０℃あるいは３７℃にて培養した。タイムポイントごとに菌を回収しＯＤ６００を調べた。その結果，解析を行った９株のうち，Ｃ４−１とＣ３−２０は３０℃での成長割合がＴＩＹ２０よりも上回ったことがわかる。また，３７℃ではＴＩＹ２０はほとんど増殖できないにもかかわらず，Ｃ４−１（ＹＡＢ１００），Ｃ３−２０（ＹＡＢ１０１）では増殖能が回復したことがわかる。
【００７７】
参考例３．糖鎖構造解析
参考例１で得られた株におけるマンノタンパク質の糖鎖構造を解析した。５０ｍｌで培養した菌を回収し，水で洗浄後，１００ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ７．０）８ｍｌに懸濁し，１２１℃にて２時間オートクレーブした。遠心にて上清を回収し，２４ｍｌの冷エタノールを添加し，−２０℃にて３０分静置後，遠心して沈殿を回収した。水に懸濁後，３ｍｇ／ｍｌになるようにタンパク溶液を調整し，そのうち５μｌ  ＧｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＦ（タカラバイオ社製４４５０）にて処理した。３７℃１７時間インキュベーション後１００μｌとなるように水を加え，フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５・２４・１）を加えて良く攪拌し，遠心にて上清を回収した（フェノールクロロホルム抽出）。回収した液にクロロホルムを加えて攪拌後，遠心して上清を回収し（クロロホルム抽出），ドライアップした。ドライアップしたサンプルにＰｙｒｉｄｙｌａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍａｎｕａｌ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製４４８０）にてピリジルアミノ化した後，７回のフェノールクロロホルム抽出に供し余分な試薬を除去した。クロロホルム抽出を行った後，上清をドライアップし，水に溶解後，ＨＰＬＣ（島津社製Ｃｌａｓｓ−ＶＰ，カラム，ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＡＭＩＤＥ−８０（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ），流速，１ｍｌ／ｍｉｎ，検出，３２０ｎｍ（励起），４００ｎｍ（蛍光），バッファーＡ，アセトニトリル，バッファーＢ，２００ｍＭ  ＴＥＡＡ（バッファーの濃度を上げて各糖を溶出），バッファーＢのグラジエント条件，０−４０分，３０→６０％，４０−５０分，３０％）にて糖鎖構造を解析した。その結果，野生株Ｗ３０３−１Ｂでは，様々な数のマンノースが付加していることが分かった。一方，得られた株の全てにおいて，親株であるＴＩＹ２０と同じマンノース８個からなる糖鎖構造を示すピークがメインピークとして観察された。このことは，実施例における変異株が，いわゆる哺乳類型の糖鎖を有していることを示す。
【００７８】
参考例４．キチナーゼ解析
参考例１で得られた株から分泌されるタンパク質の分泌効率を解析した。４０ｍｌで培養した菌の上清に４０ｍｇのｗｅｔ  ｃｈｉｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を加え，４℃で一晩攪拌した。遠心してキチン回収後，ＰＢＳで３回洗浄した。１００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに懸濁し，１００℃にて１０分処理した後，１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥしＣｏｎＡ−ｂｉｏｔｉｎ（生化学工業）にてレクチンブロットした。検出はＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（生化学工業）にて検出した。検出用試薬として，Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い，検出装置として富士フィルムＬＡＳ１０００を用いた。その結果，ＴＩＹ２０では分泌効率が野生型株の約５０％にも拘らず，得られた株において分泌効率が回復することがわかる。とりわけ，Ｃ４−１及びＣ３−２０では分泌効率が野生型株と同等までに回復した。そこで，得られた株Ｃ４−１をＹＡＢ１００，Ｃ３−２０をＹＡＢ１０１とし特許微生物寄託した。
【００７９】
参考例５．α−ガラクトシダーゼＡ活性測定（外来遺伝子の発現能検証）
ヒトα−ガラクトシダーゼＡ遺伝子をＧＡＰＤＨプロモーターの下流に連結した発現カセットを有するベクター（ｐＲＳ４−ＧＡＰ−αＧａｌＡ）（Ｃｈｉｂａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１２，８２１−８２８，２００２）をＣ４−１（ＹＡＢ１００），Ｃ３−２０，Ｃ３−７−２，及びＣ２７にそれぞれ形質転換した。得られた形質転換体を培養した後，その培養液（菌も含む）を酵素源とした。基質として５ｍＭの４−ＭＵ−α−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを用いて，３７℃において３０分反応後，２００μｌの反応停止液（０．２Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ１０．７））を入れることによって停止させた。蛍光用マイクロプレートリーダー（コロナ社製ＭＴＰ−３２，Ｅｘ：３６５ｎｍ，Ｅｍ：４５０ｎｍ）で測定を行った。その結果，ＴＩＹ２０株は，α−ガラクトシダーゼが失活するのに対し，Ｃ３−２０，Ｃ３−７−２及びＣ４−１（ＹＡＢ１００）は，良好なα−ガラクトシダーゼＡ活性を示し，特にＣ３−２０及びＣ３−７−２は，野生型Ｗ３０３−１Ｂよりも高いα−ガラクトシダーゼＡ活性を示すことがわかる。
【００８０】
参考例６．酵母細胞壁の単糖分析
参考例１で得られた酵母Ｃ４−１（ＹＡＢ１００）およびＣ３−７−２を，５ｍｌのＹＰＤ，３０℃で１５時間，振盪培養した後，菌を遠心分離（４０００回転  ５分）することにより回収し，１ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー  （ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁し遠心分離（４０００回転５分）することにより菌体を回収した。この操作を，３回行うことにより菌体を洗浄した。上記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー０．１ｍｌに再懸濁しガラスビーズを液面まで加え−２０℃で1時間保存した。ボルテックスミキサーにより細胞を破砕した後，細胞破砕液のみを回収し，遠心分離（１０００g，１０分）によってペレットを回収した。ペレット（細胞壁）は１ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌに懸濁し，遠心分離した。この操作を３回繰り返すことにより，ペレットを洗浄した。次に，１ｍｌの１ｍＭ  ＰＭＳＦで３回洗浄した。０．２ｍｌの１ｍＭ  ＰＭＳＦに再懸濁した。
【００８１】
５０μｌの細胞壁懸濁液に５０μｌの滅菌超純水を加え，１００μｌの４Ｍ  ＴＦＡを加え１００℃で４時間インキュベーションした。減圧乾燥器にて溶媒を完全に蒸発させた後，１００μlの０．２Ｍ酢酸アンモニウムと１０μlの酢酸を加えて，室温にて３０分インキュベーションした。減圧乾燥器にて乾燥した後，１００μlの０．２Ｍ酢酸アンモニウムと１０μｌの酢酸を加えて，室温にて３０分インキュベーションした。ＰＡチューブに懸濁液を移し乾燥した。ＰＡラベルはＰＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  （ＰＡＬＳＴＡＴＩＯＮ  Ｐｙｒｉｄｙｌａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  単糖分析用  （ＴａＫａＲａ））を用いて行った。ＨＰＬＣはカラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＳＵＧＡＲ  ＡＸ  タイプ（ＴＯＳＨＯ），溶媒：０．７Ｍ  ホウ酸カリウム（ｐＨ９．０）：アセトニトリル＝９：１，６５℃，流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎで行った。単糖の組成比はピークの面積比から算出した。ＷＴにおけるグルコースの割合（約４５％）に比べ，ＴＩＹ２０株におけるグルコースの割合は約８０％と高いものであったが，Ｃ４−１（ＹＡＢ１００）株およびＣ３−７−２株はさらに高いグルコースの割合（９０％以上）を示した。グルコースの割合が約８０％を超えるようなβ−グルカン含有割合の高い酵母を作製することは，技術的にも非常に困難であると考えられていたが，さらに約１０％以上もグルコースの割合が向上したものであった。
【実施例１】
【００８２】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが，本発明はこれらに限定されるものではない。
１．ＹＡＢ１００株で発現が誘導される遺伝子の探索
遺伝子破壊株である出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＩＹ２０株は，温度感受性を示し，増殖性に乏しい。一方，上記の参考例のとおり，このＴＩＹ２０株のＤＮＡポリメラーゼ変異を利用した不均衡変異導入法を利用して変異を導入することによって得られたＹＡＢ１００株は，増殖性などを回復した。そこで，ＹＡＢ１００株における増殖遅延などの表現型を回復する原因遺伝子を探索するために，ＹＡＢ１００，ＴＩＹ２０および野生型株であるＷ３０３−１Ｂ株との遺伝子の発現比較解析をマイクロアレイにて解析した。
【００８３】
ＹＡＢ１００，ＴＩＹ２０，Ｗ３０３−１Ｂ株を，５ｍｌ  ＹＰＡＤ液体培地にて３０℃，１５時間振盪前培養した。これらの培養液からＹＡＢ１００はＯＤ６００＝２．４Ｕ，ＴＩＹ２０はＯＤ６００＝５Ｕ，Ｗ３０３−１Ｂ＝０．３Ｕ分をＹＰＡＤ液体培地１０ｍｌに加え，３４℃にて１５時間振盪培養した。これらの菌体をすべて回収し，滅菌水にて菌体を洗浄後，２００μｌのセパゾール（ナカライテスク株式会社）とガラスビーズを加え，激しくボルテックスすることにより菌体を破砕した。菌体破砕液を新しいチューブに移した後，８００μｌのセパゾールを加え，撹拌後，室温にて５分静置した。２００μｌのクロロホルムを加えて転倒混和し，室温で３分間静置後，４℃，１２，０００ｇで１５分間遠心分離した。水相を別のチューブへ移し，５００μｌのイソプロパノールを加え，混和し１０分室温にて静置した。４℃，１２，０００×ｇで５分間遠心し，上清を除いた。ペレットに７５％エタノールを加え，洗浄後，エタノールを捨て，１０分乾燥させた後，２００μｌのＤＥＰＥＣ処理水に溶かした。さらに，同量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝５０：４８：２を加え，混和後，１５，０００ｇで５分間，室温にて遠心分離した。水相を新しいチューブに移し，２．５倍量の１００％エタノールと１／１０量の３Ｍ  ＬｉＣｌを加え，−８０℃にて３０分静置した後，４℃，１５，０００ｇで１５分間遠心した。上清を捨て，ペレットを７０％エタノールにて洗浄し，よく乾燥させた後，１００μｌの滅菌ミリＱ水に溶かした。ゲノムＤＮＡの混入を防ぐために，上記で得たＲＮＡサンプルの３０μｌに５μｌのＤＮａｓｅＩ反応バッファー（インビトロジェンＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ，  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ）および，２μｌのＤＮＡａｓｅ  Ｉ，  Ａｍｐ  ｇｒａｄｅ（インビトロジェン），１３μｌのミリＱ水を加え，２３℃にて１５分間静置した。４μｌの２５ｍＭ  ＥＤＴＡを加え，６５℃にて１０分加熱後，同量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝５０：４８：２を加え，混和後，１５，０００×ｇで５分間，室温にて遠心分離した。水相を新しいチューブに移し，２．５倍量の１００％エタノールと１／１０量の３Ｍ  ＬｉＣｌを加え，−８０℃にて３０分静置した後，４℃，１５，０００×ｇで１５分間遠心した。上清を捨て，ペレットを７０％エタノールにて洗浄し，よく乾燥させた後，３０μｌの滅菌ミリＱ水に溶かした。これらのＲＮＡサンプルをアジレント社製マイクロアレイ受託解析サービス（北海道システムサイエンス株式会社）にてマイクロアレイ解析を行った。Ｗ３０３−１ＢのＲＮＡはＣｙ５，ＴＩＹ２０およびＹＡＢ１００のＲＮＡはＣｙ３にて蛍光ラベルし，ＹｅａｓｔオリゴＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズし，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いて１０μｍの解像度でスキャンした。
【００８４】
ＹＡＢ１００とＴＩＹ２０のｍＲＮＡの発現比較において，表１に列挙された遺伝子の発現がＹＡＢ１００株およびＹＡＢ１０１株において転写誘導されていることが分かった。これらの遺伝子群が実際にＹＡＢ１００株において発現誘導されているかどうか確かめるために，上記と同様の手法にて得たｍＲＮＡを鋳型として，上記遺伝子の発現を逆転写ＰＣＲ反応にて確認した。逆転写ＰＣＲ反応にはＭＬＳ１フォワードプライマー：５’−ＣＣＴＧＴＣＡＴＣＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＴＣＡＴＧＣ−３’（配列番号３），リバースプライマー：  ５’−ＧＧＧＣＡＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＣ−３’（配列番号４），ＩＣＬ２フォワードプライマー：５’−ＣＡＣＣＡＡＴＴＧＴＣＧＣＴＧＡＴＧＣＡＧＡＣＧＣ−３’（配列番号５），リバースプライマー：５’−ＣＴＴＧＣＴＴＡＴＴＴＧＡＣＡＧＧＧＣＴＧＡＴＣ−３’（配列番号６），ＰＣＬ１フォワードプライマー：５’−ＣＧＣＣＡＧＴＡＡＣＧＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号７），リバースプライマー：５’−ＧＴＡＣＣＴＡＧＣＣＣＡＧＴＧＣ−３’（配列番号８），ＹＯＸ１フォワードプライマー：５’−ＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＧ−３’（配列番号９），リバースプライマー：５’−ＧＧＴＧＴＧＧＡＴＧＡＧＣＧＣＣ−３’（配列番号１０）を用いた。
【００８５】
逆転写ＰＣＲ反応の反応液を，以下の通りに調製した。
２×反応バッファー：６．２５μｌ
鋳型ｍＲＮＡ  ５００ｎｇ
１０μＭフォワードプライマー：０．２５μｌ
１０μＭリバースプライマー：０．２５μｌ
ＲＴ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｍｉｘ：０．２５μｌ
滅菌ミリＱ水：ｘμｌ
トータル５０μｌ
【００８６】
反応条件はｃＤＮＡ合成１サイクル（５０℃  ３０分，９４℃  ２分），ＰＣＲ合成１８サイクル（９４℃  １５秒，５５℃  ３０秒，７２℃  １分），１サイクル（７２℃  １０分）とした。これら増幅産物の６μｌを２．０％アガロースゲルにアプライし，１００Ｖ  ２０分で電気泳動（電気泳動バッファー：Ｔｒｉｓｂａｓｅ  ２４．２ｇ，酢酸  ５．７１ｍｌ，ＥＤＴＡ・２Ｎａ（２Ｈ２Ｏ）１．８６ｇ／５００ｍｌ）を行った。図１に示したようにＩＣＬ２，ＭＬＳ１，ＰＣＬ１およびＹＯＸ１のメッセージはＴＩＹ２０に比べＹＡＢ１００において誘導されていることが分かった。図示していないが，ＴＩＹ２０と比べＹＡＢ１００で発現が上昇した２４遺伝子のうち，糖新生に機能する遺伝子の発現を誘導するＣａｔ８転写因子によって発現誘導される遺伝子のうち９遺伝子（ＳＦＣ１，ＰＵＴ４，ＭＬＳ１，ＣＩＴ２，ＦＢＰ１，ＳＴＬ１，ＩＣＬ１，ＡＣＨ１，及びＡＤＨ２）がＹＡＢ１００にて約５〜１１倍の発現量で誘導されていることが分かった。さらに，Ｇ１サイクリンをコードするＰＣＬ１も発現することがわかった。
【００８７】
【表１】
2009183283.tif 000004
【実施例２】
【００８８】
２．ＣＡＴ８遺伝子を導入したプラスミドＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ＣＡＴ８の構築
Ｃａｔ８依存的に発現誘導される遺伝子の多くがＹＡＢ１００内で発現誘導されていることから，ＴＩＹ２０内でＣａｔ８を強制発現させることによってＴＩＹ２０の増殖能の低下，および薬剤感受性などのタンパク生産には不適切な表現型を回復する可能性が考えられた。そこで，ＣＡＴ８強制発現プラスミドを構築し，ＴＩＹ２０に形質転換した。
以下のようにしてＣＡＴ８のＤＮＡ断片を出芽酵母強制発現用マルチコピーベクターＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩのＳａｃＩ−ＳｍａＩサイトにクローニングし，プラスミドＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ＣＡＴ８を構築した。
【００８９】
出芽酵母Ｗ３０３−１Ｂ株のゲノムＤＮＡを鋳型として，ＰＣＲ反応にてＣＡＴ８断片を増幅した。ＰＣＲ反応にはフォワードプライマー：５’−ＧＴＴＴＧＡＧＣＴＣ（ＳａｃＩ）ＡＴＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＧＡＣＡＡＧＧ−３’（配列番号１１），リバースプライマー：５’−ＧＴＴＴＣＣＣＧＧＧ（ＳｍａＩ）ＴＴＡＴＴＴＧＧＣＧＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＧＡＡＴＡＡＡＴＣ−３’（配列番号１２）を用いた。得られた増幅断片をＴＡクローニング用ベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社Ｋ４５００−０１）のＴＡクローニングサイトにクローニングした。本ベクターを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｍａＩにより消化し，得られたＣＡＴ８断片をＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩベクターのＳａｃＩ−ＳｍａＩサイトにクローニングした（このようにして得られたプラスミドをＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ＣＡＴ８と命名した）。このプラスミドはＧＡＰＤＨプロモーターの支配下でＣＡＴ８遺伝子を発現させることができる。
【実施例３】
【００９０】
３．ＣＡＴ８強制発現ＴＩＹ２０株の増殖能および薬剤感受性の回復
上記のようにして得られたプラスミドＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩ−ＣＡＴ８（ウラシルマーカー遺伝子を含む）を，出芽酵母Ｗ３０３−１Ｂ株またはＴＩＹ２０株に形質転換し，各々の形質転換体（ＷＴ＜ＣＡＴ８およびＴＩＹ＜ＣＡＴ８株）を得た。先に説明したとおり，ＴＩＹ＜ＣＡＴ８株は，寄託された株である。また，それぞれのコントロール株として，Ｗ３０３−１Ｂ株あるいはＴＩＹ２０株に空のＹＥｐ３５２ＧＡＰ−ＩＩベクターを導入した株も得た（ＷＴ＜ＶｅｃおよびＴＩＹ＜Ｖｅｃ株）。ＷＴ＜Ｖｅｃ，ＷＴ＜ＣＡＴ８，ＴＩＹ＜Ｖｅｃ，ＴＩＹ＜ＣＡＴ８株１クローンを５ｍｌのＳＤ−ｕｒａ＋ＫＣｌ液体培地（６．７ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  （Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），  ２０ｇグルコース，０．７７ｇ  ＣＭＳ−ＵＲＡ（Ｓｕｎ  ｒｉｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，０．２２ｇＡｄｅｎｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ／１Ｌに終濃度が０．３ＭとなるようにＫＣｌを添加）で３０℃にて培養し，上記実施例１と同様にしてｍＲＮＡを取得した後，逆転写ＰＣＲにてＣＡＴ８のｍＲＮＡの発現を確認した。逆転写ＰＣＲ反応にはＣＡＴ８フォワードプライマー：５’−ＣＡＣＡＧＴＣＧＣＧＡＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号１３），リバースプライマー：５’−ＧＡＡＧＣＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号１４），を用いて上記と同様の条件で行った。図２に示したように，ＣＡＴ８は野生型株，ＴＩＹ２０株において強制発現されていることが分かる。
【００９１】
ＷＴ＜Ｖｅｃ，ＷＴ＜ＣＡＴ８，ＴＩＹ＜Ｖｅｃ株，それぞれ１クローン，ＴＩＹ＜ＣＡＴ８株３クローンを，５ｍｌのＳＤ−ｕｒａ＋ＫＣｌ液体培地にて培養した。その後，ＯＤ６００が１．０〜１．０ｘ１０−４となるように段階的に希釈した。これらの菌液をＳＤ−ｕｒａ＋ＫＣｌプレート（上記ＳＤ−ｕｒａ＋ＫＣｌに２０ｇ／１Ｌ  Ａｇａｒを添加，以下ＳＤ−ｕｒａプレート）又は５ｍｇ／１Ｌ  ハイグロマイシンＢを含むＹＰＡＤプレート（１０ｇ  Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，２０ｇ  Ｐｅｐｔｏｎｅ，２０ｇ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，０．２ｇ  Ａｄｅｎｉｎｅ，２０ｇ  Ａｇａｒ／１Ｌ，以下「ハイグロマイシンプレート」という）上に６μｌずつスポットし，３０℃で静置培養した。培養２日後のＳＤ−ｕｒａプレート，培養５日後のハイグロマイシンプレートの写真を図３に示す。野生型株Ｗ３０３−１Ｂが宿主の場合には，ＣＡＴ８発現株（Ｗ３０３＜ＣＡＴ８）の生育は空ベクター導入株（Ｗ３０３＜Ｖｅｃ）よりも若干遅延する傾向が観察された。一方ＴＩＹ２０株が宿主の場合には，ＣＡＴ８発現株（ＴＩＹ＜ＣＡＴ８）は，空ベクター導入株（Ｗ３０３＜Ｖｅｃ）よりもよく増殖することがわかった（図３ａ）。さらに，ＴＩＹ２０株へＣＡＴ８遺伝子を導入することで，ＴＩＹ２０株が示すハイグロマイシンＢ感受性が低下することが分かった（図３ｂ）。
【実施例４】
【００９２】
４．ＣＡＴ８発現プラスミドを取り除いたＴＩＹ２０株の表現型
上記のＴＩＹ＜ＣＡＴ８株３クローン（ウラシル非要求性）をＹＰＡＤ培地で２回継代し，プラスミドを失ってウラシル要求性となった株を選抜・取得した。Ｗ３０３−１Ｂ株，ＴＩＹ２０株および上記のベクター除去株を，５ｍｌのＳＤａｌｌ＋ＫＣｌ培地（上記ＳＤ−ｕｒａ＋ＫＣｌ培地に２０ｍｇＵｒａｃｉｌ／１Ｌ）で３０℃にて培養した後，ＯＤ６００が１．０〜１．０ｘ１０−４となるように段階希釈した。これらの菌液をＳＤ  ａｌｌ＋ＫＣｌプレート（上記ＳＤ  ａｌｌ＋ＫＣｌに２０ｇ／１Ｌ  Ａｇａｒを添加，以下ＳＤ  ａｌｌプレート）又はハイグロマイシンプレート上に６μｌずつスポットし，３０℃で静置培養した。培養２日後のＳＤ  ａｌｌプレート，培養５日後のハイグロマイシンプレートの写真を図４に示す。ＴＩＹ＜ＣＡＴ８株のベクター除去株の生育は，ＴＩＹ２０株よりも若干遅延することがわかった（図４ａ）。さらに，これらのベクター除去株はＴＩＹ２０株と同様に強いハイグロマイシンＢ感受性を示すことがわかった（図４ｂ）。これらの結果より，ＴＩＹ＜ＣＡＴ８株にみられる生育改善およびハイグロマシンＢ感受性の低下はＣＡＴ８遺伝子の強制発現に起因するものであると考えられた。
【実施例５】
【００９３】
５．酵母のインベルターゼに付加される糖鎖長の解析
実施例３で得られた３株（Ｃ１，Ｃ３，Ｃ５）のＮ結合型糖鎖長を調べるために，酵母内で作られるインベルターゼに付加されるＮ−結合型糖鎖長を，以下の方法にて調べた。それぞれの株を５ｍｌのＹＰＡＤで培養後，５ｍｌのＹＰＳｕｃ（１０ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），２０ｇのｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ），１０ｇのｓｕｃｒｏｓｅ／１Ｌ）で３時間以上培養し，菌を回収した。回収した菌は５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），２ｍＭ  ＰＭＳＦ，３％ＳＤＳ，０．１％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，１％２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）とグラスビーズを加えてボルテックスにて破砕した。１５，０００×ｇで５分間遠心分離した後，上清５μｌずつを５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動（１００Ｖ，３時間）した。ゲルを反応液（３．４ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ，３ｍｌ  ３Ｍ  Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ／１００ｍｌ）に移し，３０分３７℃でインキュベーションした後，脱イオン水にて２回洗浄した。その後，染色液（２ｇ  ＮａＯＨ，５０ｍｇ  ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ／５０ｍｌ）に移し，発色するまで煮込んだ。その結果を図５に示す。図５は，Ｎ−結合型糖鎖長を調べるための図面に替わるＳＤＳゲル電気泳動写真である。図５のレーンは，左から，Ｗ３０３−１Ｂ，ＴＩＹ２０，Ｃ１，Ｃ３およびＣ５を示す。図５から，得られた３株のインベルターゼに付加されるＮ−結合型糖鎖は親株であるＴＩＹ２０と同じ糖鎖長をもつことが分かった。
【実施例６】
【００９４】
６．ＫＩＤ０８−０８−１株細胞内でのＯ．ｍｉｎｕｔａＣＡＴ８遺伝子の強制発現の確認
Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ由来ＣＡＴ８遺伝子は、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａのゲノム上に存在しており、その配列を配列番号１９に示す。次にこのＣＡＴ８遺伝子をコードする領域について、Ｎ末端側１．５ｋｂをコードする領域をプライマーＡ  ５’−ＣＣＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＡＴ−３’（配列番号２０）とプライマーＢ  ５’−ＴＣＡＧＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＴＡＧＴＧＡ−３’（配列番号２１）を用いて、またＣ末端側１．８ｋｂをコードする領域をプライマーＣ  ５’−ＴＣＡＣＴＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＧＴＣＴＧＡ−３’（配列番号２２）とプライマーＤ  ５’−ＡＧＣＡＴＧＣＡＴＴＣＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＣＴ−３’（配列番号２３）を用いて、サブクローン化したＣＡＴ８を含む領域を鋳型としＰＣＲで増幅した。
【００９５】
プライマーＡとＢにより得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩ部位とＮｃｏＩ部位で切断し、大腸菌のクローニング用プラスミドｐＲＳ３０６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＳａｌＩ／ＮｃｏＩ部位に組み込み、プラスミドｐＲＳ３０６−ＯｍＣＡＴ８Ｎを構築した。またプライマーＣ（配列番号２２）とプライマーＤ（配列番号２３）により得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩ部位とＥｃｏＴ２２Ｉ部位で切断し、大腸菌のクローニング用プラスミドｐＲＳ３０６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＮｃｏＩ／ＥｃｏＴ２２Ｉ部位に組み込み、プラスミドｐＲＳ３０６−ＯｍＣＡＴ８Ｃを構築した。次にｐＲＳ３０６−ＯｍＣＡＴ８ＮをＳａｌＩとＮｃｏＩにて、ｐＲＳ３０６−ＯｍＣＡＴ８ＣをＮｃｏＩとＥｃｏＴ２２Ｉでそれぞれ切断し、Ｏ.ｍｉｎｕｔａ発現用ベクターｐＯＭＥＧＰＵ１のＳａｌＩ／ＥｃｏＴ２２Ｉ部位に組み込み、プラスミドｐＯＭＥＧＰＵ−ＯｍＣＡＴ８を構築した。
【００９６】
このプラスミドｐＯＭＥＧＰＵ−ＯｍＣＡＴ８をＮｏｔＩにて切断後、Ｏ.ｍｉｎｕｔａ  ＫＩＤ３−２２株（Δａｌｇ３Δｏｃｈ１）(２００５年の日本農芸化学会にて発表)を形質転換した。形質転換はエレクトロポレーション法（ＰＣＴ／ＪＰ０３／０５４６４）にて行った。形質転換後、ＳＤ−Ｕｒａ（２％グルコース、０．１７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ/ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製)、ウラシルをのぞく核酸塩基およびアミノ酸混合物（２０−４００ｍｇ／Ｌ）培地にまいて、３０℃にて２日間培養し形質転換体を得た。形質転換体をプレートから掻きとり、ＰＣＲ反応液に懸濁する簡易法PCRにて染色体上への組み込みを確認し、ＫＩＤ０８−０８−１株とした。
【００９７】
ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ
ＫＩＤ３−２２株ならびにＫＩＤ０８−０８−１株から、市販のＳＶ  ＴｏｔａｌＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡ５００ｎｇに対し、プライマーＣ（配列番号２２）とプライマーＥ  ５’−ＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＣＧＧＧＧＣＡＧＡＧＣＣＧ−３’（配列番号２４）を用いて、逆転写ＰＣＲを行なった。
【００９８】
逆転写ＰＣＲはＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用い、プロトコールに従って行なった。反応は５０℃−３０分、次いで９５℃−１５分の反応の後、９４℃−１５秒、６５℃−１５秒、７２℃−１分の反応を２５サイクル繰り返した後、電気泳動にて半定量解析を行なった。その結果、ＫＩＤ３−２２株（図６中，ＣＡＴ８（−））ではシグナルがほとんど見られないのに対し、ＫＩＤ０８−０８−１株（図６中，ＣＡＴ８（＋））ではシグナルが観察されたことから、ＫＩＤ０８−０８−１株ではＣＡＴ８が過剰に発現していることが確認された（図６）。
【実施例７】
【００９９】
７．ＣＡＴ８強制発現によるＫＩＤ３−２２が示す高温度感受性の回復
上記のようにして得られたＯ．ｍｉｎｕｔａ  ＫＩＤ３−２２株とＫＩＤ０８−０８−１株を５ｍＬのＹＰＡＤ液体培地（１０ｇ  Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，２０ｇ  Ｐｅｐｔｏｎｅ，２０ｇ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，０．２ｇ  Ａｄｅｎｉｎｅ）にて培養した。その後，ＯＤ６００が１．０〜１．０×１０−４となるように段階的に希釈した。これらの菌液をＹＰＡＤプレート（上記ＹＰＡＤに２０ｇ／１Ｌ  Ａｇａrを添加，以下ＹＰＡＤプレート）上に５μｌずつスポットし，３０℃，３３℃，３４℃で静置培養した。培養５日後のＹＰＡＤプレートの写真を図７に示す。ＫＩＤ３−２２株へＣＡＴ８遺伝子を導入することで，ＫＩＤ３−２２株が示す高温度感受性が低下することが分かった（図７）。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明の増殖性を回復した酵母及びその製造方法は，増殖性及び糖タンパク質産生能に優れた酵母を得ることができ，出芽酵母，分裂酵母及びメタノール資化性酵母のみならず，酵母全般に広く適用することができる。
【０１０１】
本発明のβ−グルカンを高効率に産生する酵母及びその製造方法は，従来公知の酵母に比べてよりβ−グルカン産生能に優れた酵母を得ることができ，出芽酵母，分裂酵母及びメタノール資化性酵母のみならず，酵母全般に広く適用することができる。
【０１０２】
本発明は，酵母を用いた糖タンパク質及びβ−グルカンの生産などに効果的に用いることができるため医薬産業において利用されうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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