(57)【要約】【課題】簡易に合成することができ、かつ標識の多様性に優れたＰＣＲ用プライマー、並びに、該プライマーを用いて標的核酸及び標的生体分子を検出する方法の提供。【解決手段】ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に用いられるプライマーであって、プライマー領域と、前記プライマー領域の５’側にＰＣＲ阻害領域と、前記ＰＣＲ阻害領域の５’側にアプタマー領域とを有し、前記ＰＣＲ阻害領域が、ヘアピンループ構造又はシュードノット構造を有することを特徴とする、ＰＣＲ用プライマー、該プライマーを用いて標的塩基配列を有する標的核酸を検出する方法、及び該プライマーを用いて試料溶液中の標的生体分子を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に用いられるプライマーであって、
プライマー領域と、前記プライマー領域の５’側にＰＣＲ阻害領域と、前記ＰＣＲ阻害領域の５’側にアプタマー領域とを有し、前記ＰＣＲ阻害領域が、ヘアピンループ構造又はシュードノット構造を有することを特徴とする、ＰＣＲ用プライマー。
【請求項２】
前記ＰＣＲ阻害領域が、下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表わされるポリヌクレオチド領域を有することを特徴とする請求項１記載のＰＣＲ用プライマー。
【化１】
2009296948.tif 000005
［式中、Ａ１〜Ａａ、Ｂ１〜Ｂｂ、Ｃ１〜Ｃｃ、Ｐ１〜Ｐｍ、Ｑ１〜Ｑｍ、Ｒ１〜Ｒｎ、Ｓ１〜Ｓｎ、Ｔ１〜Ｔｏ、及びＵ１〜Ｕｏは、同一又は異なって、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、チミンヌクレオチド、又はシトシンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｐ１〜ＰｎはＱ１〜Ｑｎに相補的なヌクレオチドを表し、Ｒ１〜ＲｎはＳ１〜Ｓｎに相補的なヌクレオチドを表し、Ｔ１〜ＴｎはＵ１〜Ｕｎに相補的なヌクレオチドを表し、ａ、ｂ、ｃ、ｍ、ｎ、ｏは、同一又は異なって、１〜２５の整数を表す。］
【請求項３】
前記一般式（Ｉ）において、Ｐ１〜Ｐｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値が、前記プライマー領域のＴｍ値よりも高いことを特徴とする請求項２記載のＰＣＲ用プライマー。
【請求項４】
前記一般式（Ｉ）において、Ｐ１〜Ｐｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値が、前記プライマー領域のＴｍ値よりも１〜２０℃高いことを特徴とする請求項２記載のＰＣＲ用プライマー。
【請求項５】
前記一般式（ＩＩ）において、Ｒ１〜Ｒｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値及びＴ１〜Ｔｏからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値の和が、前記プライマー領域のＴｍ値よりも高いことを特徴とする請求項２記載のＰＣＲ用プライマー。
【請求項６】
前記一般式（ＩＩ）において、Ｒ１〜Ｒｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値及びＴ１〜Ｔｏからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値の和が、前記プライマー領域のＴｍ値よりも１〜２０℃高いことを特徴とする請求項２記載のＰＣＲ用プライマー。
【請求項７】
標識分子を結合させていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のＰＣＲ用プライマー。
【請求項８】
前記標識分子が、分散性微粒子、酵素、及び磁気物質からなる群より選択される１以上であることを特徴とする請求項７記載のＰＣＲ用プライマー。
【請求項９】
標的塩基配列を有する標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）ＰＣＲ用プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得る工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において得られたＰＣＲ産物を、前記ＰＣＲ用プライマーのアプタマー領域と特異的に結合し得るリガンドと結合させることにより、ＰＣＲ産物−リガンド複合体を形成する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において得られたＰＣＲ産物−リガンド複合体を検出する工程と、
を有し、前記ＰＣＲ用プライマーが請求項１〜８のいずれか記載のＰＣＲ用プライマーであることを特徴とする、標的核酸の検出方法。
【請求項１０】
前記ＰＣＲ用プライマーが請求項２〜８のいずれか記載のＰＣＲ用プライマーであり、
前記一般式（Ｉ）におけるＰ１〜Ｐｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値、又は、前記一般式（ＩＩ）におけるＲ１〜Ｒｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値及びＴ１〜Ｔｏからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値の和が、前記工程（ａ）におけるＰＣＲの伸長反応温度よりも高いことを特徴とする請求項９記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１１】
前記工程（ａ）におけるＰＣＲが、修飾分子により修飾されたヌクレオチドを用いて行うものであり、前記工程（ｃ）におけるＰＣＲ産物−リガンド複合体検出が、前記修飾分子を検出することにより行うものであることを特徴とする請求項９又は１０記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１２】
前記修飾分子が、蛍光物質又は放射性同位体であることを特徴とする請求項１１記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１３】
前記リガンドが標識分子と結合したものであることを特徴とする請求項９又は１０記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１４】
前記標識分子が、分散性微粒子、酵素、蛍光物質、及び放射性同位体からなる群より選択される１以上であることを特徴とする請求項１３記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１５】
試料溶液中の標的生体分子を検出する方法であって、
（ａ’）標的生体分子と特異的に結合し得るアプタマー領域を有するＰＣＲ用プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得る工程と、
（ｂ’）前記工程（ａ’）において得られたＰＣＲ産物を、試料溶液に添加し、ＰＣＲ産物−標的生体分子複合体を形成する工程と、
（ｃ’）前記工程（ｂ’）において得られたＰＣＲ産物−標的生体分子複合体を検出する工程と、
を有し、前記ＰＣＲ用プライマーが請求項１〜８のいずれか記載のＰＣＲ用プライマーであることを特徴とする、標的生体分子の検出方法。
【請求項１６】
前記ＰＣＲ用プライマーが請求項２〜８のいずれか記載のＰＣＲ用プライマーであり、
前記一般式（Ｉ）におけるＰ１〜Ｐｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値、又は、前記一般式（ＩＩ）におけるＲ１〜Ｒｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値及びＴ１〜Ｔｏからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値の和が、前記工程（ａ’）におけるＰＣＲの伸長反応温度よりも高いことを特徴とする請求項１５記載の標的生体分子の検出方法。
【請求項１７】
前記工程（ａ’）におけるＰＣＲが、修飾分子により修飾されたヌクレオチドを用いて行うものであり、前記工程（ｃ’）におけるＰＣＲ産物−標的生体分子複合体検出が、前記修飾分子を検出することにより行うものであることを特徴とする、請求項１５又は１６記載の標的生体分子の検出方法。
【請求項１８】
前記修飾分子が、蛍光物質又は放射性同位体であることを特徴とする請求項１７記載の標的生体分子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アプタマーで標識されたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）用プライマー、並びに、該プライマーを用いて標的核酸及び標的生体分子を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子解析等の核酸解析分野では、解析対象である標的塩基配列を有する標的核酸を増幅することにより解析が行われることが多く、標的核酸の増幅には、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）法が最も一般的に用いられている。ＰＣＲ法は、標的塩基配列を挟んだ２種類のＰＣＲ用プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡポリメラーゼ反応を繰り返すことにより、標的核酸を数十万倍に増幅する方法である。該方法は基本的に、（１）変性工程、（２）アニーリング工程、及び（３）伸張工程の３つの工程を１サイクルとし、該サイクルを２５〜３０回繰り返すことにより特定の標的核酸を増幅していく。
【０００３】
このようにＰＣＲにより増幅された核酸を検出するために、予め５’末端を標識されたプライマーを用いてＰＣＲを行うことが広く行われている。標識されたプライマーを用いることにより、末端が標識された増幅核酸（ＰＣＲ産物）が得られ、この標識を検出することによりＰＣＲ産物を検出することができる。プライマーの標識に用いられる標識分子としては、例えば、ハプテン等の、特定の抗体や受容体と結合し得る物質が用いられており、標識されたＰＣＲ産物を、標識分子と特異的に結合し得る受容体等を用いて、免疫比濁法等の凝集法、沈降法、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト法等の様々な方法により検出している。
【０００４】
該ハプテンとして、例えば、ビオチンやジゴキシゲニン等が挙げられる。このようなハプテンにより標識されたプライマーとしては、例えば、ビオチン誘導体で末端リン酸基を標識した核酸が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。ビオチンはストレプトアビジンと強固に結合するため、アルカリホスファターゼを結合したアビジンをビオチン誘導体で標識したプライマーに結合させ、アルカリホスファターゼの発光等を測定することにより、該プライマーを用いて増幅された核酸を検出することが可能となる。その他にも、例えば、アミノ基やチオール基等の特定の官能基を導入したヌクレオチド、各種蛍光物質、発光酵素等のタンパク質等がプライマーの標識に用いることができる。また、多様な標識を行うことができるため、核酸に対する標識として抗体を用いる試みも行われている。
【特許文献１】特開平５−３３１１７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
プライマー等のポリヌクレオチドの化学合成には、通常、自動核酸合成機が用いられており、オートメーション化されている。このため、一般的に、ビオチンや蛍光物質等の標識分子で標識されたプライマーを得るためには、合成されたオリゴヌクレオチドの末端に、標識分子を結合させることが行われている。つまり、オリゴヌクレオチドの合成とは別の化学的な修飾反応が必要になり、操作の煩雑化及び自動合成装置の複雑化を招くという問題があった。特に、抗体による標識は、多様な標識を可能とする一方、オリゴヌクレオチドに対する抗体の標識には非常に煩雑な作業を必要とする。  
【０００６】
一方で、特定のリガンドと特異的に結合し得るアプタマーを標識分子として用いることにより、抗体と同様に多様な標識が可能になることに加えて、簡易に標識されたプライマーを合成することができる。アプタマーは機能性一本鎖核酸であるため、プライマー領域の末端にアプタマーとして機能する機能性配列を付加したポリヌクレオチドを、自動核酸合成機等を用いて合成することにより、アプタマー標識されたプライマーを得ることができる。
【０００７】
しかしながら、単にアプタマーとプライマーとを結合させたプライマーを用いてＰＣＲを行った場合には、アプタマー領域まで伸長され二本鎖化されてしまうため、リガンドに対する結合能が失われてしまうという問題がある。アプタマーは、一本鎖状態で特定の三次構造を形成するために特定のリガンドに対する結合能を有するものであり、二本鎖の状態では一次構造のような三次構造を取ることができず、該リガンドに結合することが出来ないためである。このため、アプタマー標識されたプライマーを用いてＰＣＲを行った後に得られたＰＣＲ産物を、アプタマーを利用して検出することは困難であった。
【０００８】
本発明は、簡易に合成することができ、かつ標識の多様性に優れたＰＣＲ用プライマー、並びに、該プライマーを用いて標的核酸及び標的生体分子を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＰＣＲに用いられるプライマーにおいて、アプタマーとして機能するアプタマー領域と、プライマーとして機能するプライマー領域との間に、ＤＮＡポリメラーゼの進行を阻害するＰＣＲ阻害領域を設けることにより、アプタマー領域を二本鎖化することなくＰＣＲを行うことが可能になるため、このようなプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物は、アプタマーを利用して検出し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）ＰＣＲに用いられるプライマーであって、プライマー領域と、前記プライマー領域の５’側にＰＣＲ阻害領域と、前記ＰＣＲ阻害領域の５’側にアプタマー領域とを有し、前記ＰＣＲ阻害領域が、ヘアピンループ構造又はシュードノット構造を有することを特徴とする、ＰＣＲ用プライマー、
（２）前記ＰＣＲ阻害領域が、下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表わされるポリヌクレオチド領域を有することを特徴とする前記（１）記載のＰＣＲ用プライマー、
【００１１】
【化１】
2009296948.tif 000002
［式中、Ａ１〜Ａａ、Ｂ１〜Ｂｂ、Ｃ１〜Ｃｃ、Ｐ１〜Ｐｍ、Ｑ１〜Ｑｍ、Ｒ１〜Ｒｎ、Ｓ１〜Ｓｎ、Ｔ１〜Ｔｏ、及びＵ１〜Ｕｏは、同一又は異なって、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、チミンヌクレオチド、又はシトシンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｐ１〜ＰｎはＱ１〜Ｑｎに相補的なヌクレオチドを表し、Ｒ１〜ＲｎはＳ１〜Ｓｎに相補的なヌクレオチドを表し、Ｔ１〜ＴｎはＵ１〜Ｕｎに相補的なヌクレオチドを表し、ａ、ｂ、ｃ、ｍ、ｎ、ｏは、同一又は異なって、１〜２５の整数を表す。］
【００１２】
（３）前記一般式（Ｉ）において、Ｐ１〜Ｐｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値が、前記プライマー領域のＴｍ値よりも高いことを特徴とする前記（２）記載のＰＣＲ用プライマー、
（４）前記一般式（Ｉ）において、Ｐ１〜Ｐｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値が、前記プライマー領域のＴｍ値よりも１〜２０℃高いことを特徴とする前記（２）記載のＰＣＲ用プライマー、
（５）前記一般式（ＩＩ）において、Ｒ１〜Ｒｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値及びＴ１〜Ｔｏからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値の和が、前記プライマー領域のＴｍ値よりも高いことを特徴とする前記（２）記載のＰＣＲ用プライマー、
（６）前記一般式（ＩＩ）において、Ｒ１〜Ｒｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値及びＴ１〜Ｔｏからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値の和が、前記プライマー領域のＴｍ値よりも１〜２０℃高いことを特徴とする前記（２）記載のＰＣＲ用プライマー、
（７）標識分子を結合させていることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載のＰＣＲ用プライマー、
（８）前記標識分子が、分散性微粒子、酵素、及び磁気物質からなる群より選択される１以上であることを特徴とする前記（７）記載のＰＣＲ用プライマー、
（９）標的塩基配列を有する標的核酸を検出する方法であって、（ａ）ＰＣＲ用プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得る工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において得られたＰＣＲ産物を、前記ＰＣＲ用プライマーのアプタマー領域と特異的に結合し得るリガンドと結合させることにより、ＰＣＲ産物−リガンド複合体を形成する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）において得られたＰＣＲ産物−リガンド複合体を検出する工程と、を有し、前記ＰＣＲ用プライマーが前記（１）〜（８）のいずれか記載のＰＣＲ用プライマーであることを特徴とする、標的核酸の検出方法、
（１０）前記ＰＣＲ用プライマーが前記（２）〜（８）のいずれか記載のＰＣＲ用プライマーであり、前記一般式（Ｉ）におけるＰ１〜Ｐｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値、又は、前記一般式（ＩＩ）におけるＲ１〜Ｒｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値及びＴ１〜Ｔｏからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値の和が、前記工程（ａ）におけるＰＣＲの伸長反応温度よりも高いことを特徴とする前記（９）記載の標的核酸の検出方法、
（１１）前記工程（ａ）におけるＰＣＲが、修飾分子により修飾されたヌクレオチドを用いて行うものであり、前記工程（ｃ）におけるＰＣＲ産物−リガンド複合体検出が、前記修飾分子を検出することにより行うものであることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載の標的核酸の検出方法、
（１２）前記修飾分子が、蛍光物質又は放射性同位体であることを特徴とする前記（１１）記載の標的核酸の検出方法、
（１３）前記リガンドが標識分子と結合したものであることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載の標的核酸の検出方法、
（１４）前記標識分子が、分散性微粒子、酵素、蛍光物質、及び放射性同位体からなる群より選択される１以上であることを特徴とする前記（１３）記載の標的核酸の検出方法、
（１５）試料溶液中の標的生体分子を検出する方法であって、（ａ’）標的生体分子と特異的に結合し得るアプタマー領域を有するＰＣＲ用プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得る工程と、（ｂ’）前記工程（ａ’）において得られたＰＣＲ産物を、試料溶液に添加し、ＰＣＲ産物−標的生体分子複合体を形成する工程と、（ｃ’）前記工程（ｂ’）において得られたＰＣＲ産物−標的生体分子複合体を検出する工程と、を有し、前記ＰＣＲ用プライマーが前記（１）〜（８）のいずれか記載のＰＣＲ用プライマーであることを特徴とする、標的生体分子の検出方法、
（１６）前記ＰＣＲ用プライマーが前記（２）〜（８）のいずれか記載のＰＣＲ用プライマーであり、前記一般式（Ｉ）におけるＰ１〜Ｐｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値、又は、前記一般式（ＩＩ）におけるＲ１〜Ｒｎからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値及びＴ１〜Ｔｏからなるポリヌクレオチド領域のＴｍ値の和が、前記工程（ａ’）におけるＰＣＲの伸長反応温度よりも高いことを特徴とする前記（１５）記載の標的生体分子の検出方法、
（１７）前記工程（ａ’）におけるＰＣＲが、修飾分子により修飾されたヌクレオチドを用いて行うものであり、前記工程（ｃ’）におけるＰＣＲ産物−標的生体分子複合体検出が、前記修飾分子を検出することにより行うものであることを特徴とする前記（１５）又は（１６）記載の標的生体分子の検出方法、
（１８）前記修飾分子が、蛍光物質又は放射性同位体であることを特徴とする前記（１７）記載の標的生体分子の検出方法、
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＰＣＲ用プライマーは、標識として一本鎖核酸であるアプタマーを用いているため、標識分子の修飾のためにポリヌクレオチド合成とは異なる別種の修飾反応を要することなく、自動核酸合成機等を用いて簡便に合成することができる。また、アプタマーは、ヌクレオチドの配列を任意に設計することにより、様々な三次構造を形成させることができるため、抗体標識の場合と同様に、標識の多様性に優れている。さらに、本発明のＰＣＲ用プライマーを用いることにより、アプタマーを利用して簡便に核酸等の生体分子を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明における標的塩基配列とは、ＰＣＲによる増幅の対象となる塩基配列であって、ＰＣＲにより増幅が可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列であってもよく、ｍＲＮＡ等の生物のＲＮＡに存在する塩基配列であってもよい。
【００１５】
本発明における標的核酸は、標的塩基配列を有する核酸であり、ＰＣＲにおける鋳型となり得る核酸であれば、特に限定されるものではない。例えば、血液や体液等の生体試料（検体）や培養細胞溶液等から調製した試料中に含有される核酸であってもよく、これらの試料等から抽出された核酸であってもよく、これらの核酸を鋳型として増幅された核酸であってもよい。また、生体試料等に含有されているＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡであってもよい。
【００１６】
本発明のＰＣＲ用プライマーは、プライマー領域と、前記プライマー領域の５’側にＰＣＲ阻害領域と、前記ＰＣＲ阻害領域の５’側にアプタマー領域とを有することを特徴とする。アプタマー領域とプライマー領域との間にＰＣＲ阻害領域を有することにより、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応がアプタマー領域へ進行せず、このため、本発明のＰＣＲ用プライマー由来の５’末端側に、リガンドに対する結合能を有する一本鎖のアプタマーを有するＰＣＲ産物を得ることができる。
【００１７】
図１は本発明のＰＣＲ用プライマーを用いてＰＣＲを行った場合と、単にアプタマー標識した対照プライマーを用いてＰＣＲを行った場合とを、模式的に示した図である。プライマー領域１ａとＰＣＲ阻害領域１ｂとアプタマー領域１ｃとを有する本発明のＰＣＲ用プライマー２と、プライマー領域１ａとアプタマー領域１ｃのみを有する対照プライマー３は、いずれも、アプタマー領域１ｃはリガンド８と特異的に結合し得る立体構造を有している。これらのプライマーをフォワードプライマーとし、標的核酸４を鋳型とし、対となるリバースプライマー５を用いて、それぞれＰＣＲを行うと、本発明のＰＣＲ用プライマー２を用いた場合には、得られたＰＣＲ産物６において、アプタマー領域１ｃは一本鎖のままであり、リガンド８と特異的に結合し得る。一方で、対照プライマー３を用いた場合には、得られたＰＣＲ産物７において、アプタマー領域１ｃ二本鎖となるため、リガンド８と結合することができない。
【００１８】
本発明においてプライマー領域とは、ＰＣＲ用プライマーのうち、ＰＣＲにおけるプライマーとして機能し得る塩基配列を有するポリヌクレオチド領域を意味する。具体的には、標的核酸の標的塩基配列における５’末端側又は３’末端側と対合（ハイブリダイズ）し得る塩基配列を有するポリヌクレオチド領域である。一般的には、標的塩基配列の５’末端側又は３’末端側の部分塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列であるが、ミスマッチ部位を有していてもよい。
【００１９】
このようなプライマー領域の塩基配列は、標的塩基配列の種類やＰＣＲにおいて用いられるＤＮＡポリメラーゼの種類、ＰＣＲの反応条件等に応じて、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても設計することができる。例えば、公知のゲノム配列データ等から得られる塩基配列情報と、汎用されているプライマー設計ツールを用いて、簡便に設計することができる。このようなプライマー設計ツールとして、例えば、Ｗｅｂ上で利用可能なＰｒｉｍｅｒ３（Ｒｏｚｅｎ, Ｓ., Ｈ.Ｊ. Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ、１９９６年、ｈｔｔｐ: ／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ.ｗｉ.ｍｉｔ.ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｏｔｈｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３.ｈｔｍｌ）や、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（ＤＮＡ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）等がある。また、公知のゲノム配列データは、通常、国際的な塩基配列データベースである、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）や、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）等において入手することができる。
【００２０】
本発明においてＰＣＲ阻害領域とは、ＰＣＲにおいて用いられるＤＮＡポリメラーゼの進行が阻害される立体構造を有するポリヌクレオチド領域を意味する。このような立体構造としては、ヘアピンループ（Ｈａｉｒｐｉｎ  ｌｏｏｐ）構造やシュードノット（Ｐｓｅｕｄｏ  ｋｎｏｔ）構造等の、同一分子内のほかの一本鎖領域と対合することで形成される安定なループ構造等が挙げられる。具体的には、下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表わされるポリヌクレオチド領域を有する。
【００２１】
【化２】
2009296948.tif 000003
［式中、Ａ１〜Ａａ、Ｂ１〜Ｂｂ、Ｃ１〜Ｃｃ、Ｐ１〜Ｐｍ、Ｑ１〜Ｑｍ、Ｒ１〜Ｒｎ、Ｓ１〜Ｓｎ、Ｔ１〜Ｔｏ、及びＵ１〜Ｕｏは、同一又は異なって、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、チミンヌクレオチド、又はシトシンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｐ１〜ＰｎはＱ１〜Ｑｎに相補的なヌクレオチドを表し、Ｒ１〜ＲｎはＳ１〜Ｓｎに相補的なヌクレオチドを表し、Ｔ１〜ＴｎはＵ１〜Ｕｎに相補的なヌクレオチドを表し、ａ、ｂ、ｃ、ｍ、ｎ、ｏは、同一又は異なって、１〜２５の整数を表す。］
【００２２】
前記一般式（Ｉ）中、Ａ１〜Ａａは、同一又は異なって、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、チミンヌクレオチド、又はシトシンヌクレオチドのいずれかを表す。Ａ１〜Ａａからなるポリヌクレオチド領域（Ａ１〜Ａａ領域、以下同様。）の塩基配列は、ＰＣＲ用プライマー中のプライマー領域及びアプタマー領域の機能を阻害しない限り、特に限定されるものではなく、任意に設定することができる。
前記一般式（Ｉ）において、ａは１〜２５の整数を表す。本発明のＰＣＲ用プライマーにおいては、ａは１〜１２であることが好ましく、１〜１０であることがより好ましく、３〜７であることがさらに好ましい。
【００２３】
前記一般式（Ｉ）において、Ｐ１〜Ｐｍ及びＱ１〜Ｑｍは、同一又は異なって、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、チミンヌクレオチド、又はシトシンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｐ１〜ＰｎはＱ１〜Ｑｎに相補的なヌクレオチドを表す。すなわち、Ｐ１〜Ｐｎ領域の塩基配列は、Ｑ１〜Ｑｎ領域の塩基配列と相補的な塩基配列であり、Ｐ１〜Ｐｎ領域とＱ１〜Ｑｎ領域とが対合することにより、ヘアピンループが形成される。
前記一般式（Ｉ）において、ｍは１〜２５の整数を表す。本発明のＰＣＲ用プライマーにおいては、ｍは３〜２５であることが好ましく、５〜２５であることがより好ましく、１０〜２５であることがさらに好ましい。
【００２４】
ＰＣＲ阻害領域がＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の進行を阻止し得るためには、ＰＣＲにおけるＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応時に、このヘアピンループ構造が安定的に形成されていることが必要である。ヘアピンループ構造の安定性は、Ｐ１〜Ｐｎ領域とＱ１〜Ｑｎ領域との対合の安定性に依存しており、該対合の安定性は、Ｔｍ値を指標として判断することができる。
【００２５】
このため、本発明のＰＣＲ用プライマーにおいては、Ｐ１〜Ｐｎ領域のＴｍ値が、プライマー領域のＴｍ値よりも高いことが好ましい。ＰＣＲにおけるプライマーと鋳型である標的核酸との対合の安定性よりも、ヘアピンループ構造の安定性が高いことにより、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応時においても、このヘアピンループ構造がより安定的に形成される結果、アプタマー領域の二本鎖化を効果的に阻害することができる。本発明においては、Ｐ１〜Ｐｎ領域のＴｍ値が、プライマー領域のＴｍ値よりも１〜２０℃高いことがより好ましく、５〜１０℃高いことがさらに好ましい。
【００２６】
一方、前記一般式（ＩＩ）中、Ｂ１〜Ｂｂ及びＣ１〜Ｃｃは、同一又は異なって、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、チミンヌクレオチド、又はシトシンヌクレオチドのいずれかを表す。Ｂ１〜Ｂｂ領域及びＣ１〜Ｃｃ領域の各塩基配列は、ＰＣＲ用プライマー中のプライマー領域及びアプタマー領域の機能を阻害しない限り、特に限定されるものではなく、任意に設定することができる。
前記一般式（Ｉ）において、ｂ及びｃは、同一又は異なって、１〜２５の整数を表す。本発明のＰＣＲ用プライマーにおいては、ｂ及びｃは、同一又は異なって、１〜１２であることが好ましく、１〜１０であることがより好ましく、３〜７であることがさらに好ましい。
【００２７】
前記一般式（ＩＩ）において、Ｒ１〜Ｒｎ、Ｓ１〜Ｓｎ、Ｔ１〜Ｔｏ、及びＵ１〜Ｕｏは、同一又は異なって、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、チミンヌクレオチド、又はシトシンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ１〜ＲｎはＳ１〜Ｓｎに相補的なヌクレオチドを表し、Ｔ１〜ＴｎはＵ１〜Ｕｎに相補的なヌクレオチドを表す。すなわち、Ｒ１〜Ｒｎ領域の塩基配列はＳ１〜Ｓｎ領域の塩基配列と相補的な塩基配列であり、Ｔ１〜Ｔｎ領域の塩基配列はＵ１〜Ｕｎ領域の塩基配列と相補的な塩基配列であり、Ｒ１〜Ｒｎ領域とＳ１〜Ｓｎ領域、及びＴ１〜Ｔｎ領域とＵ１〜Ｕｎ領域が、それぞれ対合することにより、シュードノットが形成される。
前記一般式（ＩＩ）において、ｎ及びｏは、同一又は異なって、１〜２５の整数を表す。本発明のＰＣＲ用プライマーにおいては、ｎ及びｏは、同一又は異なって、３〜２５であることが好ましく、５〜２５であることがより好ましく、１０〜２５であることがさらに好ましい。
【００２８】
前記一般式（Ｉ）で表される場合と同様に、前記一般式（ＩＩ）で表される場合においても、ＰＣＲにおけるＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応時に、このシュードノット構造が安定的に形成されていることが必要である。シュードノット構造の安定性は、Ｒ１〜Ｒｎ領域とＳ１〜Ｓｎ領域との対合の安定性と、Ｔ１〜Ｔｎ領域とＵ１〜Ｕｎ領域との対合の安定性との双方に依存しており、該対合の安定性は、Ｔｍ値を指標として判断することができる。
【００２９】
このため、本発明のＰＣＲ用プライマーにおいては、Ｒ１〜Ｒｎ領域のＴｍ値及びＴ１〜Ｔｏ領域のＴｍ値の和が、プライマー領域のＴｍ値よりも高いことが好ましい。本発明においては、Ｒ１〜Ｒｎ領域のＴｍ値及びＴ１〜Ｔｏ領域のＴｍ値の和が、プライマー領域のＴｍ値よりも１〜２０℃高いことがより好ましく、５〜１０℃高いことがさらに好ましい。
【００３０】
また、本発明のＰＣＲ用プライマーにおいては、前記一般式（Ｉ）におけるＰ１〜Ｐｎ領域のＴｍ値や、前記一般式（ＩＩ）におけるＲ１〜Ｒｎ領域のＴｍ値及びＴ１〜Ｔｏ領域のＴｍ値の和を、ＰＣＲの伸長反応温度よりも高くすることも好ましい。ＰＣＲの伸長反応時において、ＰＣＲ阻害領域のヘアピンループ構造やシュードノット構造をより安定的に形成し得るためである。
【００３１】
本発明においてアプタマー領域とは、ＰＣＲ用プライマーのうち、機能性核酸であるアプタマーとして機能し得る塩基配列を有するポリヌクレオチド領域を意味する。アプタマーは、特定のリガンドと特異的に結合し得る立体構造を有する一本鎖核酸を意味する。但し、本発明において、特異的に結合するとは、該リガンドの検出や精製等に通常用いることができる程度に特異的に結合し得ることを意味し、他の物質等と交差するものであってもよい。
【００３２】
アプタマー領域の塩基配列は、公知のアプタマーと同じ塩基配列を有していてもよく、所望のリガンドとの結合能を有するように任意に設計したものであってもよい。なお、特定のリガンドと結合し得る特定の三次構造を有する一本鎖核酸の塩基配列は、常法により設計することができる。本発明においては、アプタマーのリガンドの種類は特に限定されるものではなく、例えば、蛍光物質、ビオチン、グルタチオン、ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ジゴキシゲニン、ジゴキシン、２以上の糖からなる糖鎖、６以上のアミノ酸からなるポリペプチド、オーキシン、ジベレリン、ステロイド、タンパク質、及び、それらの類縁体等がある。
【００３３】
本発明におけるアプタマー領域は、ＤＮＡからなるポリヌクレオチドであってもよく、ＲＮＡからなるポリヌクレオチドであってもよく、ＤＮＡ及びＲＮＡからなるキメラポリヌクレオチドであってもよい。その他、人工核酸や、アミノ基等で修飾された修飾核酸を含むポリヌクレオチドであってもよい。より安価かつ簡便に合成することが可能であるため、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなるポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００３４】
このようにして設計した本発明のＰＣＲ用プライマーは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても合成することができる。例えば、オリゴ合成メーカーに依頼して合成してもよく、市販の自動核酸合成機を用いて独自に合成してもよい。
【００３５】
また、本発明のＰＣＲ用プライマーの塩基配列は、任意に設計することができ、プライマー領域、ＰＣＲ阻害領域、及びアプタマー領域以外にも、各領域の機能を阻害しない程度において、付加的な配列設けて様々な機能を付することもできる。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列や、リンカーとして機能し得る配列等がある。
【００３６】
さらに、本発明のＰＣＲ用プライマーは、該プライマーを用いて得られるＰＣＲ産物の検出や解析等を容易にするために、様々な標的分子により標識されたものであってもよい。該標識分子としては、通常ポリヌクレオチドの標識に用いられるものであれば、特に限定されるものではなく、ＰＣＲ産物の検出方法等を考慮して適宜選択して用いることができる。このような標識分子として、例えば、分散性微粒子、酵素、磁気物質、蛍光物質、放射性同位体、化学発光物質等がある。その他、電気化学的に検出することが可能であるルテニウム錯体等であってもよい。該化学発光物質としては、ルミノール等のように無機反応により発光する物質であってもよく、ルシフェリン、セランテラジン等の酵素によって触媒される発光物質であってもよい。本発明のＰＣＲ用プライマーの標識分子としては、分散性微粒子、酵素、磁気物質等であることが好ましく、磁性粒子（磁気を帯びた分散性微粒子）又は酵素であることがより好ましい。
【００３７】
本発明において、分散性微粒子とは、溶液中で分散する微粒子を意味する。このような分散性微粒子としては、例えば、シリカ、ガラス、セラミックス、プラスチック、ラテックス等からなる粒子、磁性粒子、金、アルミニウム、ニッケル、アルミナ、チタニア、ジルコニア等からなる金属粒子、アガロースレジン等が挙げられる。ＰＣＲ産物の回収や精製等が簡便になし得るため、本発明のＰＣＲ用プライマーの標識に用いられる分散性微粒子としては、磁性粒子であることが好ましい。
【００３８】
本発明において、磁性粒子は、磁性を帯びている粒子であれば、特に限定されるものではない。該磁性粒子として、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3 Ｏ4 ）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ2 Ｏ3 ）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロム等の金属からなる粒子や、コバルト、ニッケル、マンガン等を含む合金からなる粒子等がある。また、該磁性粒子は、磁性体のみからなる粒子であってもよく、ラテックス粒子等の非磁性体粒子の内部に磁性体の微粒子を含有させた粒子であってもよい。
【００３９】
本発明において、標識分子として用いられる分散性微粒子の平均粒子径は、特に限定されるものではなく、例えば０．１〜１００μｍ程度の、分子生物学や生化学の分野において通常用いられている大きさのものを用いることができる。なお、分散性微粒子の検出として、全自動免疫比濁法装置等を用いて比濁を測定するには、分散性微粒子の粒径は０．３μｍ以下であることが好ましい。
【００４０】
本発明のＰＣＲ用プライマーの標識に用いられる酵素としては、ＰＣＲや、本発明のＰＣＲ用プライマー中のアプタマー領域とリガンドとの結合等を阻害しないものであれば、特に限定されるものではなく、酵素反応を利用した標的物質の検出等において通常用いられている酵素から適宜選択して用いることができる。このような酵素として、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等がある。
【００４１】
本発明のＰＣＲ用プライマーの標識に用いられる蛍光物質としては、特に限定されるものでなく、核酸等の標識において通常用いられている蛍光物質から適宜選択して用いることができる。このような蛍光物質としては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ＮＢＤ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）、Ａｌｅｘａ  ｄｙｅシリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）、Ｃｙ  ｄｙｅシリーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等がある。
【００４２】
本発明のＰＣＲ用プライマーを用いて、標的核酸を検出することができる。本発明のＰＣＲ用プライマーは、アプタマー標識されたものであるため、抗体標識等のように、標識の多様性に優れている。例えば、蛍光標識の場合には、標識に用いられる蛍光物質の種類が限られており、また、検出される蛍光の波長が重なる場合や蛍光の漏れこみがある場合には検出精度が落ちてしまう。このため、一の試料から検出できる標的核酸の種類が１〜３種類程度と限定される傾向がある。これに対して、本発明のＰＣＲ用プライマーの場合には、標的核酸の種類ごとに異なるリガンドに対するアプタマー領域を有するように設計すればよく、多様な標識が可能である。また、リガンドとアプタマーの結合は、抗原抗体反応と同様に特異性が高い。したがって、本発明のＰＣＲ用プライマーを用いることにより、マルチプレックスＰＣＲ産物のような複数種類のＰＣＲ産物が含まれている試料からも、標的核酸を簡便かつ高精度に検出することができる。
【００４３】
具体的には、本発明の標的核酸の検出方法は、（ａ）本発明のＰＣＲ用プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得る工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において得られたＰＣＲ産物を、前記ＰＣＲ用プライマーのアプタマー領域と特異的に結合し得るリガンドと結合させることにより、ＰＣＲ産物−リガンド複合体を形成する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）において得られたＰＣＲ産物−リガンド複合体を検出する工程と、を有することを特徴とする。
以下、工程ごとに説明する。
【００４４】
まず、工程（ａ）において、本発明のＰＣＲ用プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得る。ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、反応バッファー等のＰＣＲに用いられる試薬は、特に限定されるものではなく、通常ＰＣＲを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性ポリメラーゼであることが好ましい。さらに、校正機能を有するポリメラーゼであってもよい。
【００４５】
ＰＣＲの反応条件は、用いるＤＮＡポリメラーゼの種類、標的塩基配列の長さ、ＰＣＲ阻害領域が有するループ構造の安定性等を考慮して、適宜決定することができる。ＰＣＲ阻害領域が前記一般式（Ｉ）で表わされるポリヌクレオチドを有している場合には、前記一般式（Ｉ）におけるＰ１〜Ｐｎ領域のＴｍ値が、ＰＣＲの伸長反応温度よりも高いことが好ましい。また、ＰＣＲ阻害領域が前記一般式（ＩＩ）で表わされるポリヌクレオチドを有している場合には、前記一般式（ＩＩ）におけるＲ１〜Ｒｎ領域のＴｍ値及びＴ１〜Ｔｏ領域のＴｍ値の和が、ＰＣＲの伸長反応温度よりも高いことが好ましい。
【００４６】
次に、工程（ｂ）として、工程（ａ）において得られたＰＣＲ産物を、ＰＣＲ用プライマーのアプタマー領域と特異的に結合し得るリガンドと結合させることにより、ＰＣＲ産物−リガンド複合体を形成する。具体的には、ＰＣＲ産物が含まれているＰＣＲ溶液に、リガンドを添加し、適宜混合することにより、ＰＣＲ産物とリガンドを接触させて、ＰＣＲ産物−リガンド複合体を形成する。
【００４７】
なお、ＰＣＲ産物に接触させるリガンドは、ＰＣＲ産物−リガンド複合体の形成を阻害しない限りにおいて、標識分子を用いて標識したものであってもよい。リガンドを予め標識しておくことにより、ＰＣＲ産物−リガンド複合体の検出をより簡便に行うことができる。リガンドの標識に用いられる標識分子としては、前述のＰＣＲ用プライマーの標識に用いることができる標識分子として挙げたものと同様のものを用いることができる。本発明の標的核酸の検出方法において用いられるリガンドの標識分子としては、分散性微粒子、酵素、蛍光物質、放射性同位体等であることが好ましく、磁性粒子（磁気を帯びた分散性微粒子）、ラテックス粒子、金粒子、酵素であることがより好ましい。
【００４８】
その後、工程（ｃ）として、得られたＰＣＲ産物−リガンド複合体を検出することにより、ＰＣＲにより増幅された標的核酸を検出することができる。ＰＣＲ産物−リガンド複合体の検出方法は、特に限定されるものではなく、核酸やタンパク質等の検出において通常用いられる方法を利用して検出することができる。
【００４９】
例えば、工程（ｂ）において標識分子により標識されたリガンドを用いた場合には、該標識分子を利用して、ＰＣＲ産物−リガンド複合体を簡便に検出することができる。より具体的には、例えば、標識分子として蛍光物質や放射性同位体を用いた場合には、該標識分子により発される蛍光や放射線を検出することにより、ＰＣＲ産物−リガンド複合体を検出することができる。また、標識分子として酵素を用いた場合には、該酵素の基質を添加して酵素活性を測定することにより、ＰＣＲ産物−リガンド複合体を検出することができる。さらに、標識分子として分散性微粒子を用いた場合には、遠心分離法等により分散性微粒子を回収することにより、ＰＣＲ産物−リガンド複合体を回収・精製して検出することができる。標識分子として磁性粒子を用いた場合には、磁場を利用することにより、ＰＣＲ産物−リガンド複合体を回収・精製して検出することができる。その他、免疫比濁法を利用して、分散性微粒子により標識されたリガンドを添加した後の溶液の濁度（光散乱度）を測定することによっても、ＰＣＲ産物−リガンド複合体を検出することができる。
【００５０】
本発明の標的核酸の検出方法において、工程（ａ）におけるＰＣＲにおいて、蛍光物質や放射性同位体等の修飾分子により修飾されたヌクレオチドを用いた場合には、該修飾分子から発される蛍光や放射線を検出することにより、ＰＣＲ産物−リガンド複合体を検出することもできる。例えば、蛍光物質等で修飾されたヌクレオチドを用いて、工程（ｂ）において分散性微粒子により標識されたリガンドを用いた場合には、遠心分離や磁場等を利用して回収された分散性微粒子の蛍光等を測定することにより、ＰＣＲ産物−リガンド複合体を検出することができる。
【００５１】
本発明の標的核酸の検出方法においては、工程（ａ）におけるＰＣＲにおいて用いられる標的塩基配列を挟んだ２種類のプライマーのうち、一方を本発明のＰＣＲ用プライマーとし、他方を本発明のＰＣＲ用プライマー以外のプライマーとしてもよく、２種類とも本発明のＰＣＲ用プライマーとしてもよい。本発明のＰＣＲ用プライマー以外のプライマーとしては、通常ＰＣＲにおいて用いられるプライマーであれば特に限定されるものではなく、標識されたものであってもよく、標識されていないものであってもよい。
【００５２】
本発明の標的核酸の検出方法において、工程（ａ）におけるＰＣＲにおいて用いるフォワードプライマーとリバースプライマーを、共に本発明のＰＣＲ用プライマーとした場合には、例えば、両プライマーのアプタマー領域を同一のリガンド（例えば、リガンドａ）に対するアプタマー（例えば、アプタマーＡ）とした場合には、両端が同一のアプタマーＡで標識されたＰＣＲ産物を得ることができる。一方、フォワードプライマーのアプタマー領域はリガンドａに対するアプタマーＡとし、リバースプライマーのアプタマー領域はリガンドｂに対するアプタマーＢとした場合には、一方の端にはアプタマーＡ、他方の端にはアプタマーＢで標識されたＰＣＲ産物を得ることができる。
【００５３】
図２は、両端をそれぞれ異なるアプタマーで標識されたＰＣＲ産物の検出方法を模式的に示した図である。図中、「Ａ」はアプタマーＡを、「ａ」はリガンドａを、「Ｂ」はアプタマーＢを、「ｂ」はリガンドｂを、それぞれ示している。ＰＣＲ産物９に、リガンドｂを結合させた分散性粒子１０を接触させると、リガンドｂとアプタマーＢの結合により、ＰＣＲ産物−リガンドｂ−分散性粒子複合体が形成される。そこで、分散性微粒子を回収することにより、簡便にＰＣＲ産物を回収・精製することができる。回収されたＰＣＲ産物をリガンドａと接触させると、リガンドａとアプタマーＡの結合を利用して、より高精度にＰＣＲ産物を検出することができる。
【００５４】
その他、ＰＣＲ産物に、リガンドｂを結合させた分散性粒子とリガンドａを結合させた分散性粒子とを接触させることにより、分散性粒子−リガンドａ−ＰＣＲ産物−リガンドｂ−分散性粒子複合体が形成される。このように大きな粒子が形成されることにより、溶液の濁度（光散乱度）の変化をより大きくすることができるため、免疫比濁法を利用したＰＣＲ産物の検出により好適である。
【００５５】
本発明のＰＣＲ用プライマーを用いて得られたＰＣＲ産物は、リガンドに対する検出用プローブとして使用することもできる。すなわち、標的生体分子をリガンドとし、該リガンドに対するアプタマーとして機能し得るアプタマー領域を有するＰＣＲ用プライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を検出用プローブとして用いることにより、標的生体分子を検出することができる。
【００５６】
なお、本発明における標的生体分子は、検出等の対象である生体分子を意味する。また、生体分子とは、タンパク質、脂質、糖類、核酸、ビタミン類等の低分子化合物等の生体を構成する分子を意味する。
【００５７】
具体的には、本発明の標的生体分子の検出方法は、試料溶液中の標的生体分子を検出する方法であって、（ａ’）標的生体分子と特異的に結合し得るアプタマー領域を有する本発明のＰＣＲ用プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得る工程と、（ｂ’）前記工程（ａ’）において得られたＰＣＲ産物を、試料溶液に添加し、ＰＣＲ産物−標的生体分子複合体を形成する工程と、（ｃ’）前記工程（ｂ’）において得られたＰＣＲ産物−標的生体分子複合体を検出する工程と、を有することを特徴とする。
【００５８】
例えば、工程（ａ’）におけるＰＣＲにおいて、本発明の標的核酸の検出方法における工程（ａ）と同様に、蛍光物質や放射性同位体等の修飾分子により修飾されたヌクレオチドを用いた場合には、得られたＰＣＲ産物は、蛍光等により修飾されたアプタマーとして機能し得る。このため、工程（ｃ’）において、修飾されたヌクレオチドから発される蛍光等を測定することにより、試料溶液中の標的生体分子を検出することができる。
【００５９】
図３は、修飾されたヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った場合の標的生体分子の検出方法を模式的に示した図である。図中、「Ａ」と「ａ」は図２と同様である。蛍光物質１１で修飾されたヌクレオチドｄＧＴＰを用いてＰＣＲを行うと、蛍光物質１１で標識されたＰＣＲ産物１２が得られる。このＰＣＲ産物１２は、標的生体分子であるリガンドａと結合するため、蛍光物質１１から発される蛍光を測定することにより、標的生体分子を検出することができる。
【００６０】
なお、本発明の標的核酸の検出方法と同様に、工程（ａ’）におけるＰＣＲにおいて用いるフォワードプライマーとリバースプライマーを、共に本発明のＰＣＲ用プライマーとすることにより、両端に標的生体分子と特異的に結合し得るアプタマー領域を有するＰＣＲ産物や、一方に標的生体分子と特異的に結合し得るアプタマー領域を有し、他方に標的生体分子以外のリガンドと特異的に結合し得るアプタマー領域を有するＰＣＲ産物を得ることができる。
【００６１】
例えば、一方に標的生体分子と特異的に結合し得るアプタマー領域を有し、他方に標的生体分子以外のリガンド（例えば、リガンドｂ）と特異的に結合し得るアプタマー領域を有するＰＣＲ産物を得た場合に、工程（ｂ’）において、本発明の標的核酸の検出方法における工程（ｂ）と同様に、標識分子により標識されたリガンドｂを用いた場合には、標的生体分子−ＰＣＲ産物−リガンドｂ−標識分子複合体が形成されるため、該標識分子を利用して、試料溶液中の標的生体分子を簡便に検出することができる。なお、リガンドｂの標識に用いられる標識分子としては、前述のＰＣＲ用プライマーの標識に用いることができる標識分子として挙げたものと同様のものを用いることができる。
【００６２】
また、分散性微粒子により標識されたリガンドｂを用いた場合には遠心分離法等により、特に磁性粒子により標識されたリガンドｂを用いた場合には磁場を利用することにより、分散性微粒子と複合体を形成している標的生体分子を、回収・精製して検出することができる。その他、金粒子により標識されたリガンドｂを用いた場合には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ)によって標的生体分子を定量化することも可能である。
【実施例】
【００６３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６４】
［実施例１］
ストレプトアビジンに特異的に結合し得るアプタマー領域を有する本発明のＰＣＲ用プライマーを用いて、標的核酸を検出した。なお、標的塩基配列は、プラスミド（ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋）中の塩基配列（配列番号７）とした。
＜プライマーの設計＞
標的核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーとして、ストレプトアビジンに特異的に結合し得るアプタマー領域（Ａｎｔｉ−ＳｔＡｖアプタマー領域）と、ヘアピンループ構造を有するＰＣＲ阻害領域と、プライマー領域を有するフォワードプライマー（ＰＳＡ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｆ、配列番号１）とリバースプライマー（ＰＳＡ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｒ、配列番号２）、プライマー領域のみを有するフォワードプライマー（Ｐ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｆ、配列番号３）とリバースプライマー（Ｐ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｒ、配列番号４）、Ａｎｔｉ−ＳｔＡｖアプタマー領域とプライマー領域とを有するフォワードプライマー（ＰＡ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｆ、配列番号５）とリバースプライマー（ＰＡ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｒ、配列番号６）を、それぞれ設計した。
各プライマーの塩基配列を表１に示す。表１の各塩基配列中、大文字がプライマー領域であり、白黒反転の大文字がＰＣＲ阻害領域であり、下線付大文字がＡｎｔｉ−ＳｔＡｖアプタマー領域である。また、図４に、シミュレーションにより求めたＰＣＲ阻害領域のヘアピンループ構造を示す。図４中、「Ａ」（ＣＡＴＧ）が、前記一般式（Ｉ）におけるＡ１〜Ａａ領域（ａ＝４）に相当し、「Ｐ」がＰ１〜Ｐｍ領域（ｍ＝１９）に相当し、「Ｑ」がＱ１〜Ｑｍ領域（ｍ＝１９）に相当する。
これらのプライマーのうち、プライマー領域のＴｍ値は５５℃であり、ＰＣＲ阻害領域のＴｍ値（Ｐ１〜Ｐ１９領域のＴｍ値）は６９℃であった。
また、これらの設計に基づき、化学合成をすることにより、各プライマーを得た。
【００６５】
【表１】
2009296948.tif 000004
【００６６】
＜ＰＣＲ＞
プラスミド（ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋）を鋳型とし、ＰＳＡ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｆ及びＰＳＡ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｒからなるプライマーセット、Ｐ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｆ及びＰ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｒからなるプライマーセット、ＰＡ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｆ及びＰＡ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｒからなるプライマーセットを、それぞれ用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。各プライマーセットのフォワードプライマーとリバースプライマーを、それぞれ１０μＭとなるように混合して、プライマーミックス溶液を調製した。
具体的には、５μＬの１０×ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−用ＰＣＲバッファー（東洋紡社製）に対して、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓを５μＬ、２５ｍＭ硫酸マグネシウムを２μＬ、プライマーミックス溶液を１．５μＬ、プラスミド溶液を１μＬ、１０ｐｇ／μＬのＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を１μＬそれぞれ添加し、滅菌した超純水を適当量添加して、５０μＬのＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液を、９４℃で２分間処理した後、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間の熱サイクルを３０サイクル行うことにより、ＰＣＲを行った。
【００６７】
＜ＰＣＲ産物の検出＞
ストレプトアビジンを用いてゲルシフトアッセイをすることにより、得られたＰＣＲ産物を検出した。
まず、５μＬのＰＣＲ後のＰＣＲ溶液を、５００ｎｇのストレプトアビジンと混合した。その後、この混合物をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにより分離し、ＣＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ及びＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙにより染色し、ＰＣＲ産物を検出した。
この結果、ストレプトアビジンのみの溶液を分離した場合と比較すると、ＰＳＡ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｆ及びＰＳＡ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｒからなるプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物においてのみ、ゲルシフトが観察され、ストレプトアビジンとの結合が確認された。
この結果から、ＰＣＲ阻害領域を有する本発明のＰＣＲ用プライマーを用いた場合には、アプタマー領域のリガンド結合能を維持したＰＣＲ産物を得ることができるため、リガンドを用いてＰＣＲ産物を検出し得ることが明らかである。
【００６８】
［実施例２］
本発明のＰＣＲ用プライマーを用いて、標的生体分子を検出した。標的生体分子をストレプトアビジンとし、フォワードプライマーとして実施例１で合成したＰＳＡ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｆを、リバースプライマーとしてＰ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｒを、それぞれ用いた。なお、予め、ＰＳＡ−Ｐｒｉｍｅｒ−ＦとＰ−Ｐｒｉｍｅｒ−Ｒを、それぞれ１０μＭとなるように混合して、プライマーミックス溶液を調製した。
【００６９】
＜ＰＣＲ＞
プラスミド（ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋）を鋳型とし、蛍光物質であるＣｙ３（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で修飾されたヌクレオチド（Ｃｙ３  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｄＧＴＰ）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。
具体的には、５μＬの１０×ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−用ＰＣＲバッファー（東洋紡社製）に対して、５ｍＭ  ｄＡＴＰを２μＬ、５ｍＭ  ｄＴＴＰを２μＬ、５ｍＭ  ｄＣＴＰを２μＬ、５ｍＭ  Ｃｙ３  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｄＧＴＰを２μＬ、２５ｍＭ硫酸マグネシウムを２μＬ、プライマーミックス溶液を１．５μＬ、プラスミド溶液を１μＬ、１０ｐｇ／μＬのＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を１μＬそれぞれ添加し、滅菌した超純水を適当量添加して、５０μＬのＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液を、９４℃で２分間処理した後、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間の熱サイクルを３０サイクル行うことにより、ＰＣＲを行った。
【００７０】
＜ストレプトアビジンの検出＞
ストレプトアビジンを転写した転写膜に対してウェスタンブロッティングを行うことにより、ストレプトアビジンを検出した。
まず、ストレプトアビジンを転写した転写膜を２枚作製した。具体的には、１、５、１０、５０、１００、５００、及び１０００μｇのストレプトアビジンをＰＡＧＥで展開した後、ニトロセルロース膜に転写し、スキムミルクを用いてブロッキング処理を行った。
この２枚の転写膜のうち、１枚にはＰＣＲ産物を添加し、他の１枚にはＣｙ３標識抗ストレプトアビジン抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を添加し、それぞれ室温で３０分間反応させた。その後、蛍光イメージャーを用いて、転写膜中のストレプトアビジンに結合したＣｙ３標識物の検出を行った。
この結果、ＰＣＲ産物を用いることにより、Ｃｙ３標識抗ストレプトアビジン抗体を用いた場合よりも高い感度でストレプトアビジンを検出することができた。すなわち、本発明のＰＣＲ用プライマーを用いて得られたＰＣＲ産物を検出用プローブとして用いることにより、生体分子を検出し得ることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明のＰＣＲ用プライマーは、簡易に合成することができ、かつ標識の多様性に優れているため、核酸等の生体分子を検出するような生化学、分子生物学、臨床検査等の分野で利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明のＰＣＲ用プライマーを用いてＰＣＲを行った場合と、単にアプタマー標識した対照プライマーを用いてＰＣＲを行った場合とを、模式的に示した図である。
【図２】本発明の標的核酸の検出方法において、両端をそれぞれ異なるアプタマーで標識されたＰＣＲ産物の検出方法を模式的に示した図である。
【図３】本発明の標的生体分子の検出方法において、修飾されたヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った場合の標的生体分子の検出方法を模式的に示した図である。
【図４】実施例において使用したプライマーのＰＣＲ阻害領域の、シミュレーションにより求めたヘアピンループ構造を示した図である。
【符号の説明】
【００７３】
１ａ…プライマー領域、１ｂ…ＰＣＲ阻害領域、１ｃ…アプタマー領域、２…本発明のＰＣＲ用プライマー、３…対照プライマー、４…標的核酸、５…リバースプライマー、６…ＰＣＲ産物、７…ＰＣＲ産物、８…リガンド、９…ＰＣＲ産物、１０…分散性粒子、１１…蛍光物質、１２…ＰＣＲ産物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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