(57)【要約】【課題】長距離にわたり神経に損傷を受けた場合に、神経を的確に誘導して接続して正しい神経回路を作り、損傷部位の神経機能の回復を促進する手段及び方法を提供すること。【解決手段】神経細胞の移動又は細胞軸策の伸長を一方向に誘引する構造を有する構造体、及び、断裂損傷した神経の部分に、本発明の構造体を移植することにより、神経細胞の移動又は細胞軸策の伸長を一方向に誘引し、新たに神経線維を伸長させ、該断裂損傷した神経を接続して正常な神経回路を回復させ、更に、該損傷部位の神経機能の回復を促進させる方法。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞の移動又は細胞軸策の伸長を一方向に誘引する構造を有する構造体。
【請求項２】
爪車におけるのこぎり歯状の構造を細胞レベルで有する、請求項１記載の構造体。
【請求項３】
のこぎり歯の単位が、高さ0.01 〜 1000μｍ、かつ、幅0.01 〜 1000μｍである、請求項２記載の構造体。
【請求項４】
のこぎり歯状の構造が直線状に伸長する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の構造体。
【請求項５】
構造体の表面に、神経細胞の移動は細胞軸策の伸長を誘引する物質が、細胞レベルでの濃度勾配で繰り返し塗布されて成る、請求項１記載の構造体。
【請求項６】
濃度勾配の繰り返しが0.01 〜 1000μｍの範囲で行なわれる、請求項５記載の構造体。
【請求項７】
神経細胞の移動又は細胞軸策の伸長を誘引する物質が神経成長因子である、請求項６記載の構造体。
【請求項８】
神経成長因子がヒト由来である、請求項７記載の構造体。
【請求項９】
生体適合性の素材からなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の構造体。
【請求項１０】
生体適合性の素材が細胞外基質又は合成高分子から選択される、請求項９記載の構造体。
【請求項１１】
断裂した神経の部分に、請求項１〜１０のいずれかに記載の構造体を移植することにより、神経細胞の移動又は細胞軸策の伸長を一方向に誘引する方法。
【請求項１２】
断裂損傷した神経の部分に、請求項１〜１０のいずれかに記載の構造体を移植することにより、新たに神経線維を伸長させ、該断裂損傷した神経を接続して正常な神経回路を回復させる方法。
【請求項１３】
断裂損傷した神経の部分に、請求項１〜１０のいずれかに記載の構造体を移植することにより、該損傷部位の神経機能の回復を促進する方法。
【請求項１４】
神経系の細胞も移植する、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、爪車様構造を利用した、神経回路の形成用の構造体、及び該構造体を移植することにより、断裂損傷した神経を接続して正常な神経回路を回復させる方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
外傷や疾患により神経繊維に損傷を受けた場合、的確に神経を繋ぐ必要があるが、損傷の程度が大きくなると難しくなる。例えば、腕の一部に怪我をし、その部分に通っていた指を動かす神経繊維が断絶されたとき、たとえ怪我が治ったように見えても、神経が正しく接続されない限り指は動かない。神経繊維が一箇所できれいに切断された場合は外科手術により繋げることも可能である。しかし、長距離にわたり損傷を受けた場合は、神経形繊維を伸ばさない限り繋げない。通常は神経はグリア細胞のような足場となる細胞の上に接着するが、このグリア細胞ごと損傷を受けている場合が多い。いずれにせよ、神経線維を正しく繋げるためには、単に神経系の細胞（グリア細胞も含む）を活性化したり、移植するだけではなく、正しい方向に誘導する必要がある。
【０００３】
神経成長因子のように神経繊維の伸長を促す薬剤を投与する方法もあるが、これで制御することは難しい。特定の方向に誘導するためには、その薬剤の濃度勾配を作る必要がある。しかし、薬剤は時間とともにが拡散するので、単に注入するだけでは効果がない。細胞の伸長などに併せて少しずつ位置を変えながら注入するという手法は、あまりに手間がかかり、現実的とはいえない。何かの表面を化学的に修飾することにより拡散しないようする技術もあるが、距離を伸ばそうとすると濃度勾配が緩やかになり、細胞が濃度勾配に反応しなくなる。
【非特許文献１】Zheng JQ, Wan JJ, Poo MM. Essential role of filopodia in chemotropic turning of nerve growth cone induced by a glutamate gradient.J Neurosci. 1996 ;16:1140-9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明の目的は、このように長距離にわたり神経に損傷を受けた場合に、神経を的確に誘導して接続して正しい神経回路を作り、損傷部位の神経機能の回復を促進する手段及び方法を提供し、再生医療の実現に貢献することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決すべく研究の結果、微細加工技術を使いて細胞レベルの大きさで爪車様の構造を構築し、これを移植することにより細胞体の移動や神経線維の伸長方向を制御することが可能であることを見出した。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の各態様に係る。
［態様１］神経細胞の移動又は細胞軸策の伸長を一方向に誘引する構造を有する構造体。
［態様２］爪車におけるのこぎり歯状の構造を細胞レベルで有する、態様１記載の構造体。
［態様３］のこぎり歯の単位が、高さ0.01 〜 1000μｍ、かつ、幅0.01 〜 1000μｍである、態様２記載の構造体。
［態様４］のこぎり歯状の構造が直線状に伸長する、態様１〜３のいずれか一項に記載の構造体。
［態様５］構造体の表面に、神経細胞の移動は細胞軸策の伸長を誘引する物質が、細胞レベルでの濃度勾配で繰り返し塗布されて成る、態様１記載の構造体。
［態様６］濃度勾配の繰り返しが0.01 〜 1000μｍの範囲で行なわれる、態様５記載の構造体。
［態様７］神経細胞の移動又は細胞軸策の伸長を誘引する物質が神経成長因子である、請求項６記載の構造体。
［態様８］神経成長因子がヒト由来である、態様７記載の構造体。
［態様９］生体適合性の素材からなる、態様１〜８いずれか一項に記載の構造体。
［態様１０］生体適合性の素材が細胞外基質又は合成高分子から選択される、態様９載の構造体。
［態様１１］断裂損傷した神経の部分に、神経系の細胞と態様１〜１０のいずれかに記載の構造体を移植することにより、神経細胞の移動又は細胞軸策の伸長を一方向に誘引する方法。
［態様１２］断裂損傷した神経の部分に、神経系の細胞と請求項１〜１０のいずれかに記載の構造体を移植することにより、新たに神経線維を伸長させ、該断裂損傷した神経を接続して正常な神経回路を回復させる方法。
［態様１３］断裂損傷した神経の部分に、神経系の細胞と態様１〜１０のいずれかに記載の構造体を移植することにより、該損傷部位の神経機能の回復を促進する方法。
［態様１４］神経系の細胞も移植する、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の構造体では、神経細胞の移動又は細胞軸策（突起）の伸長を一方向に誘引する構造、例えば、以下の実施例に示されるように、爪車におけるのこぎり状の歯車の構造が細胞レベルの大きさで作られているので、細胞が一方向のみに動きやすくなる。この構造体の主な利点は以下の通りである。即ち、１）同じ形が繰り返されるので、いくらでも長くできる。２）時間とともに拡散するなどの変化が無いために、制御性が高い。３）従来法では必要な、突起の伸張や細胞の移動に合わせて処理を施す必要が無い。即ち、制御装置などが必要なく、簡単に作成、使用できる。その結果、本発明により簡便かつ確実に細胞体の運動や突起の伸張の制御が可能となる。
【０００８】
これによって、長距離にわたり断裂した神経の部分に、外から神経系の細胞と本発明構造体を移植することにより、神経を的確につなげ、正しい神経回路を作ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の構造体は、細胞、特に神経細胞の移動、又は細胞軸策の伸長を一方向に誘引する構造を有することを特徴とする。その様な構造の代表的な例として、例えば、爪車におけるのこぎり歯状の構造を挙げることが出来る。「爪車」とは、図１に示されるように、非対称な形をしたのこぎり状の歯からなる繰り返し空間パターンをもつ歯車と、この歯に引っかかるバネ付の爪の２つから構成されており、一方向にしか動かない。本発明の構造体では、爪の代わりに細胞自身が爪のように働き、歯車ではなく細胞自身が動くことによって、結果として、細胞の移動又は細胞軸策の伸長を一方向に誘引される。
【００１０】
神経細胞の移動、又は細胞軸策の伸長を一方向に誘引するには、このような爪車におけるのこぎり歯状の構造は細胞レベルであることが好ましい。ここで、「細胞レベル」とは、のこぎり歯状の構造が、細胞の移動又は細胞軸策の伸長が一方向に誘引されるような適当な大きさを有していることを意味する。好適な効果を得るために、例えば、爪車におけるのこぎり歯の単位が、高さ0.01 〜 1000μｍ、かつ、幅  0.01 〜 1000μｍであることを意味する。又、歯の傾斜の角度等、のこぎり歯状の形状におけるその他の特徴は、断裂損傷した神経の部分の構造・形態などに応じて、当業者が適宜設計することが出来る。
【００１１】
更に、本発明の構造体における、細胞、特に神経細胞の移動、又は細胞軸策の伸長を一方向に誘引する構造は、上記のような「物理的」加工に限らず、その他の要因、例えば、構造体に化学的な修飾を施すことによっても作製することが可能である。このような「化学的」加工の例として、構造体の表面に、神経細胞の移動は細胞軸策の伸長を誘引する物質が、細胞レベルでの濃度（塗布密度）勾配で繰り返し塗布されて成る構造体を挙げることが出来る。ここで、「細胞レベル」とは、濃度勾配の単位が細胞の移動又は細胞軸策の伸長が一方向に誘引されるような適当な幅（距離）を有していることを意味する。又、濃度及びその勾配の程度は塗布する物質の種類などに応じて適宜決めることが出来る。好適な効果を得るために、例えば、濃度勾配の繰り返し単位を0.01 〜 1000μｍの範囲とすることが出来る。
【００１２】
神経細胞の移動は細胞軸策の伸長を誘引する物質の好適例として、当業者に公知のヒト等の神経成長因子及びその他の神経栄養因子を挙げることが出来る。
【００１３】
本発明の所望の効果が得られる限り、構造体全体の形態・大きさ等にも特に制限はない。例えば、図２に示すような直線状、又は曲線状とすることが出来る。本発明の構造体は、当業者に公知の任意の微細加工技術を使いて、容易に作製することが可能である。更弐、構造体の素材に特に制限はないが、生体適合性であり、微細加工が可能なものが好適である。このような素材の例として、細胞外基質又は合成高分子、例えば、シリコーンなどの無機材料、及び、コラーゲンのような有機材料を挙げることが出来る。
【００１４】
本発明は更に、このような構造体を使用して、長距離にわたり断裂した神経を的確につなげ、正しい神経回路を作ることを可能ならしめる方法に関する。即ち、本発明は、断裂損傷した神経の部分に、本発明の構造体を移植することにより、神経細胞の移動又は細胞軸策の伸長を一方向に誘引する方法に係る。その結果、新たに神経線維を伸長させ、該断裂損傷した神経を接続して正常な神経回路を回復させることが出来、更に、該損傷部位の神経機能の回復を促進することが可能となる。
【００１５】
尚、図３に例示するように、上記の各方法において、本発明の構造体を、神経細胞を移動させたい方向、又は、細胞軸策を伸長させたい方向に沿うように移植することが重要である。更に、本発明の構造体を移植するときに、神経系の細胞を併せて同時に移植することにより、より早く確実に所望の効果をえることが出来る。
【００１６】
このように移植する神経系の細胞の種類及び量等は、断裂損傷した神経の部分の特性などに応じて当業者が適宜選択することが出来る。組織適合性の観点からは自己由来の細胞、例えば、神経細胞、神経幹神経、神経前駆細胞、神経芽細胞等が好ましい。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
【００１８】
以下に、微細加工技術を用いて本発明の構造体（爪車の歯車構造）を作ることにより、細胞の運動方向の制御を実際に行った実験例を示す。定点観測カメラで観察しやすいように、直線状ではなく、環状に細胞の接着領域が設定されている。このようにすることにより、細胞が移動してもカメラの視野から外れずに長期間観測が可能である。また、図４に示すような互いに対称な形を作った。ここで便宜上、左側を時計回り（CW）型、右側を反時計回り（CCW）型と呼ぶ。
【００１９】
微細加工技術を使い、培養皿上に爪車の歯車構造状に細胞接着する領域を作成する手法の概要は以下のとおりである。まず初めに、鋳型を作製した後それを元に微細なスタンプを作成した。光感受性の樹脂に光のパターンを照射した後に薬品処理することにより樹脂のパターンを作り鋳型とした。この鋳型にシリコーン樹脂（PDMS: Polydimethylsiloxane）を流し込み60度で一晩熱して硬化させてスタンプを作った。鋳型からスタンプを外した後、スタンプの表面をより平滑にするために、スタンプの表面に薄くPDMSを塗布し、180度で2時間熱して硬化させた。以上のようにして微細なスタンプを作成した。次に、この微細なスタンプにPDMS（細胞非接着）の薄膜を塗布し、コラーゲン（細胞接着）でコートした培養皿の上に押し、60℃で一晩熱硬化した。このようにして、コラーゲンコート上にPDMSの薄膜が部分的にコートされた培養皿が出来上がった。以上の工程を図４に示す。又、出来上がった爪車の歯車構造は図５のとおりである。
【００２０】
両方の型を互い違いに並べ、そこに細胞（神経系の株価細胞  PC12）を撒き、撒いた1日後より80時間タイムラプス計測し、細胞の移動を集計した。CW型、CCW型内において細胞がそれぞれCW、CCW方向のどちらに運動したかの分布を示した図６から明らかなように、CW型とCCW型内での分布は互いに対象であり、それぞれ順方向（CW型内でCW方向、またはCCW型内でCCW方向）へと移動した細胞の比率は、逆方向（CW型内でCCW方向、またはCCW型内でCW方向）へと移動した細胞の比率よりも高かった。尚、多くの細胞は動かなかったが、一部の細胞が有意な方向に動くだけで、本発明の目的は達成することできる。
【００２１】
尚、タイムラプス計測は以下のように行った。オリンパスの倒立型顕微鏡の上にアクリルの保温箱をかぶせて温風を吹き込み37度に保った。培養皿は密閉された箱の中に入れ、そこに加湿した5％CO2を含む空気を入れた。以上のようにして顕微鏡とCO2インキュベータを組み合わせた装置を作成し、培養しながら細胞の位相差顕微鏡像を撮影した。画像は、CCDカメラシステム（浜松ホトニクスのオルカシステム）でコンピュータに取り込んだ。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
再生医療は、幹細胞から目的とする細胞を特異的に誘導するだけでなく、得られた細胞を大型組織化するtissue engineering（組織工学）の面からも、企業も含めて、精力的に進められている。本発明は、組織工学への貢献が大きいので、企業化の可能性があるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】爪車の構造を示す模式図である。
【図２】直線状を有する本発明の構造体の一例を示す。
【図３】本発明の構造体の移植の様子を示す模式図である。
【図４】微細加工技術を使い、培養皿上に本発明の構造体である爪車の歯車構造状を作製する工程を示す。
【図５】爪車の歯車構造を有する本発明の構造体を示す。
【図６】爪車の歯車構造を有する本発明の構造体を用いた実験結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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