(57)【要約】【課題】生理活性蛋白質或いはペプチドの所定量を投与したときに、投与部位での異常反応が無く、且つ含有する生理活性蛋白質或いはペプチドの持続的な活性を維持する徐放性組成物を提供すること。【解決手段】生理活性蛋白質或いはペプチド、水溶性炭酸塩、水溶性リン酸塩、及び水溶性亜鉛塩のそれぞれの水溶液を添加混合することによってナノ粒子の沈殿物を形成させることからなる生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物であって、水溶性亜鉛塩を、その組成比が重量比で、生理活性蛋白質：水溶性亜鉛塩＝１：０．２〜１：３．５となる範囲内で添加することを特徴とする生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物であり、生理活性蛋白質或いはペプチドが、Ｇ−ＣＳＦ、ｈＧＨ、インターフェロン、エリスロポエチン又はミッドカインである生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性蛋白質或いはペプチド、水溶性炭酸塩、水溶性リン酸塩、及び水溶性亜鉛塩のそれぞれの水溶液を添加混合することによってナノ粒子の沈殿物を形成させることからなる生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物であって、水溶性亜鉛塩を、その組成比が重量比で、生理活性蛋白質：水溶性亜鉛塩＝１：０．２〜１：３．５となる範囲内で添加することを特徴とする生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物。
【請求項２】
生理活性蛋白質或いはペプチドが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インターフェロン、エリスロポエチン又はミッドカインである請求項１に記載の生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物。
【請求項３】
水溶性炭酸塩が、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムであることを特徴とする請求項１又は２に記載の生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物。
【請求項４】
水溶性リン酸塩が、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウムからなり、その混合比が水溶液としたときにｐＨ６．０〜８．０であることを特徴とする請求項１に記載の生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物。
【請求項５】
水溶性亜鉛塩が、塩化亜鉛又は酢酸亜鉛である請求項１に記載の生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物。
【請求項６】
水溶性亜鉛塩が塩化亜鉛で、かつ、生理活性タンパクがＧ−ＣＳＦであり、その組成比が、Ｇ−ＣＳＦ：塩化亜鉛が重量比で１：２〜１：３である請求項１に記載の生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物。
【請求項７】
生理活性蛋白質或いはペプチド、水溶性炭酸塩、水溶性リン酸塩、および水溶性亜鉛塩の水溶液を加え、混合・攪拌して、ナノ粒子の沈殿物を得、上清部を廃棄し、得られた沈殿物に糖水溶液を加え、再分散後、凍結乾燥に付すことからなる生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物の製造方法。
【請求項８】
糖水溶液がトレハロース水溶液である請求項７に記載の生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物の製造方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の製造方法によって製造された生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性蛋白質或いはペプチドを含有するナノ粒子組成物に係わり、詳細には、含有される生理活性蛋白質或いはペプチドの薬理活性の持続性に優れたナノ粒子組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性蛋白質或いはペプチドは、種々の特異的な生理活性作用を有することから、各種疾患の治療に用いられてきている。例えば、好中球の減少を伴う疾患や病態に対して顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）製剤が用いられている。この場合のＧ−ＣＳＦによる治療は、具体的には、１日１回または２回の皮下注射或いは点滴静脈内投与であって、連日７日から１４日間投与する方法で実施されている。
【０００３】
これは、Ｇ−ＣＳＦの血中における安定性が悪く、且つ半減期が短いため、所望の薬効を維持するためにはある一定の濃度以上のＧ−ＣＳＦが血中に存在する必要があるからである。このために患者は、連日の静脈内点滴注射投与という負担を強いられ、かつ、全体の投与量も多いものになっている。
これは何もＧ−ＣＳＦに限られるものではなく、広く生理活性蛋白質或いはペプチドについてもいえることであり、したがって、Ｇ−ＣＳＦを始めとする生理活性蛋白質の血中濃度を持続的に維持する徐放性製剤が検討され、その幾つかが提案されている（特許文献１、２及び３）。
【０００４】
これまで提案されている徐放性製剤は、Ｇ−ＣＳＦ、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）等が金属イオン、たとえばカルシウムイオンや亜鉛イオン等の多価金属イオンにより沈澱を形成することに注目し、その水不溶性沈澱物による徐放製剤の開発を試みたものである。
しかしながら、生理活性蛋白質と多価金属イオンのみにより得られた沈殿物は、生体内、たとえば皮下あるいは筋肉などの投与部位においては溶解し易いものであり、そのままでは期待する徐放性効果は得られていない。そのため、特許文献１が提案する徐放性製剤では、Ｇ−ＣＳＦと多価金属イオンとからなる沈澱組成物中にさらに別の沈澱性の物質を加える改良がなされている。
【０００５】
この特許文献１に記載の方法は、生理活性蛋白質を含有する水不溶性沈澱物を得る点で優れたものであるが、その調製にあたってスケールアップを行うと、徐放性製剤が効率よく作製できない問題点がある。また、添加される別の沈澱性の物質としては、金属イオンと結合するがそれ自体で薬効がほとんど無い蛋白質、例えばヒト血清アルブミンなどを用いており、その点での安全性に懸念がある。
【０００６】
特許文献２では、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の固形化を目的とし、ｈＧＨと炭酸水素ナトリウム及び酢酸亜鉛を組み合わせてｈＧＨの固形化を図る技術が記載されている。しかしながら、生成した固形化ｈＧＨについての徐放性効果に関する言及は、一切なされていない。
さらに特許文献３に開示される方法は、担体として多孔性ヒドロキシアパタイトを用い、そこに生理活性蛋白質或いはペプチドを吸着させるシステムであり、本発明が意図するものとは異なるシステムである。
【０００７】
一方、本出願人の一人により、上記した特許文献１〜３に記載の技術とは異なり、簡便な方法で、しかもＧ−ＣＳＦ等の生理活性蛋白質あるいはペプチドを高収率で沈澱化させることによる、生理活性蛋白質あるいはペプチドを含有するナノ粒子からなる徐放性製剤が提案されている（特許文献４）。
このナノ粒子は極めて安定なものであり、徐放効果に優れ、生体内で数日間に亘り生理活性蛋白質あるいはペプチドの薬効を保持し得るものである。
【０００８】
ところで、生理活性蛋白質或いはペプチドの活性を持続させる徐放性製剤を作製するにあたって要求されるファクターは、
（１）１回の投与で活性が少なくとも１週間は持続すること、
（２）投与部位での局所刺激がないこと、
（３）生理活性蛋白質であることから、注射投与がメインであり、したがって、可能なかぎり細い注射針を通過する製剤であること、
（４）製剤のスケールアップ製造が容易であること、
等であり、これらの条件を満たす徐放性製剤であることが望ましい。
【０００９】
先に本出願人の一人により提案された特許文献４に記載の徐放性製剤は、いくつかの無機物を添加することで生理活性蛋白質或いはペプチドの活性の持続化が得られている。
しかしながら、生理活性蛋白質としてＧ−ＣＳＦを用い、得られた製剤について持続的な薬効を示す量をラット皮下に投与したところ、投与１日または３日後の投与皮下部位に、強い発赤および浮腫とみられる局所反応が生じ、安全性の面で実用に供せられない恐れがあることが明らかとなった。
【００１０】
かかる原因について本発明者は鋭意検討を行った結果、生理活性蛋白質を不溶化するために添加する水溶性無機金属塩のなかで、遊離の無機金属塩量が大きく影響していることを見出した。
したがって、本発明者は、添加した水溶性亜鉛塩のうち、多大な遊離の亜鉛量を軽減することを検討し、その結果、得られた徐放性製剤の投与局所部位での反応をなくすことに成功し、本発明を完成させるに至った。
生理活性蛋白質と亜鉛塩の配合比率は、生理活性蛋白質の種類によって異なり、その最適比は一概に規定できない。一般的に、確実に不溶性塩を形成させようとすれば、水溶性亜鉛塩を過剰に加えることになる。その結果として、上記のように、局所反応が発生する。この局所反応を生成させない配合比率は、生理活性蛋白質１０ｍｇに対して、亜鉛塩１０〜３００μモルの範囲が好ましいといえる。
【００１１】
【特許文献１】特開２００３−８１８６５号公報
【特許文献２】国際公開公報  ＷＯ２００３／０００２８２
【特許文献３】国際公開公報  ＷＯ２００４／１１２７５１
【特許文献４】特表２００６−５２５３１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明は、生理活性蛋白質或いはペプチドの所定量を投与したときに、投与部位での異常反応が無く、且つ含有する生理活性蛋白質或いはペプチドの持続的な活性を維持する徐放性組成物を提供することを課題とする。
具体的には、特許文献４に記載の組成を基本的な骨格として、その改良を行い、得られた生理活性蛋白質或いはペプチドを含有する組成物の所定量を投与したときに、皮下投与部位に異常反応がなく、かつ、含有された生理活性蛋白質の持続的な活性を維持する組成物あるいは製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
而して、本発明はその基本的態様として、生理活性蛋白質或いはペプチド、水溶性炭酸塩、水溶性リン酸塩、及び水溶性亜鉛塩のそれぞれの水溶液を添加混合することによってナノ粒子の沈殿物を形成させることからなる生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物であって、水溶性亜鉛塩を、その組成比が重量比で、生理活性蛋白質：水溶性亜鉛塩＝１：０．２〜１：３．５となる範囲内で添加することを特徴とする生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物である。
【００１４】
より好ましくは、本発明は、生理活性蛋白質或いはペプチドが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インターフェロン、エリスロポエチン又はミッドカインである生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物である。
【００１５】
より具体的には、本発明は、水溶性炭酸塩が、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムであり、水溶性リン酸塩が、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウムからなり、その混合比が水溶液としたときにｐＨ６．０〜８．０であり、また、水溶性亜鉛塩が、塩化亜鉛又は酢酸亜鉛である生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物である。
【００１６】
最も具体的に好ましくは、本発明は水溶性亜鉛塩が塩化亜鉛で、かつ、生理活性タンパクがＧ−ＣＳＦであり、その組成比が、Ｇ−ＣＳＦ：塩化亜鉛が重量比で１：２〜１：３．５であるＧ−ＣＳＦ含有ナノ粒子組成物である。さらに好ましくは、１：２〜１：３であるＧ−ＣＳＦ含有ナノ粒子組成物である。
【００１７】
また本発明は別の態様として、当該生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物の製造方法を提供するものであり、具体的には、生理活性蛋白質或いはペプチド、水溶性炭酸塩、水溶性リン酸塩、および水溶性亜鉛塩の水溶液を加え、混合・攪拌して、ナノ粒子の沈殿物を得、上清部を廃棄し、得られた沈殿物に糖水溶液を加え、再分散後、凍結乾燥に付すことからなる生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物の製造方法である。
【００１８】
そのなかでも、好ましくは、糖水溶液がトレハロース水溶液である上記の生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物の製造方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、生理活性蛋白質或いはペプチドの所定量を投与したときに、投与部位での異常反応が無く、且つ含有する生理活性蛋白質或いはペプチドの持続的な活性を維持する徐放性組成物が提供される。
本発明が提供する生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物は、生体内で数日間に亘り生理活性蛋白質あるいはペプチドの薬効を保持し得るものである。
また、極めて簡便な方法で生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物を提供することができ、その医療上の価値は多大なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、上記したように、特許文献４に記載の組成を基本的な骨格として、その改良に係わるものであり、生理活性蛋白質或いはペプチド、水溶性炭酸塩、水溶性リン酸塩、及び水溶性亜鉛塩のそれぞれの水溶液を添加混合することによってナノ粒子の沈殿物を形成させることからなる生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物であって、水溶性亜鉛塩を、その組成比が重量比で、生理活性蛋白質：水溶性亜鉛塩＝１：０．２〜１：３．５となる範囲内で添加することを特徴とする生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物である。
すなわち、その基本は、生理活性蛋白質或いはペプチドに水溶性無機塩の水溶液を添加混合することによってナノ粒子の沈殿物を形成させることからなる生理活性蛋白質含有ナノ粒子組成物である。
【００２１】
具体的には、使用する水溶性無機塩としては、炭酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、亜鉛塩が挙げられ、これらと生理活性蛋白質を組み合わせることにより、活性の維持、皮下部位での局所反応の抑制、薬物の安定化等の点で満足することができる組成物を提供することにある。
さらに、生理活性蛋白質或いはペプチドとしては、種々の生理活性蛋白質或いはペプチドが挙げられるが、本発明にあってはＧ−ＣＳＦが最も好ましく用いられる。Ｇ−ＣＳＦの薬効は、ラットなどの動物に皮下投与し、その血中の白血球数の増加を未投与の群と比較して評価できる。
【００２２】
以下に本発明の適用が最も好ましい生理活性蛋白質としてＧ−ＣＳＦを例に挙げ、詳細に説明していく。
徐放製剤化にあたって、Ｇ−ＣＳＦを不溶化する水溶性無機塩としては、亜鉛塩がもっとも有効であった。
Ｇ−ＣＳＦのヒトへの投与量は、最大で、１０μｇ／ｋｇ／日を７日間連続投与するものである。したがって、日本人の平均的な体重を６０ｋｇとすると、１週間タイプの徐放剤であれば４．２ｍｇのＧ−ＣＳＦの投与となる。
そこで、亜鉛塩として酢酸亜鉛と塩化亜鉛を用いて、Ｇ−ＣＳＦを４．２ｍｇ含有するものに相当の製剤を、特許文献４の実施例９に従って作製し、亜鉛塩の添加効果を確認した。
【００２３】
簡単にその製造工程を以下に示す。Ｇ−ＣＳＦ  １０ｍｇ相当を含有すると仮定して、それぞれの添加物を以下のように秤量した。炭酸水素ナトリウム１６．８ｍｇの０．２ｍＬ水溶液に、リン酸二水素ナトリウム２．２８ｍｇとリン酸水素二ナトリウム１１．５ｍｇからなるｐＨ７．２の緩衝液０．２ｍＬを加え、さらに、塩化亜鉛２７．３ｍｇを含む水溶液１ｍＬ、または酢酸亜鉛３６．７ｍｇ含む水溶液１ｍＬを攪拌下で加えると微細な沈殿が生じる。
【００２４】
この懸濁液を遠沈して上清を廃棄する。得られた沈殿物にトレハロース１２５ｍｇを含む水溶液５ｍＬを加える。この懸濁液を凍結乾燥してＧ−ＣＳＦおよび２種の亜鉛塩を含有する２種類のナノ粒子を得た。
【００２５】
また、特許文献４の方法に従って、遠沈操作なしで２種類の沈殿物を作製した。すなわち全部で４種類のナノ粒子を得た。
【００２６】
これらをラットの皮下にＧ−ＣＳＦとして４．２ｍｇ含有に相当する量として投与し、３日後の皮下における反応性を比較した。その結果、遠沈操作をしない場合（特許文献４の方法）には、酢酸亜鉛含有ナノ粒子では強い紅斑と浮腫が認められ、塩化亜鉛含有ナノ粒子では弱いものの紅斑が認められた。しかし、遠沈操作をして得たナノ粒子では、酢酸亜鉛含有ナノ粒子並びに塩化亜鉛含有ナノ粒子にあっては、いずれも何の異常反応も認められなかった。
以上の遠心操作をしない場合に得られたナノ粒子の局所投与における反応の結果から、亜鉛塩としては、塩化亜鉛がより好ましいと考えられた。
【００２７】
次に、添加物である無機金属塩類の添加順序を検討したが、その順序を変えても薬効の持続性には差を認めなかった。また、皮下投与部位での反応性は変わらなかった。
【００２８】
無機金属塩類と生理活性蛋白質との配合比率は、用いる生理活性蛋白質の特性によって異なる。なかでも最も重要なのは亜鉛塩の配合比率であった。
亜鉛塩の添加量は、Ｇ−ＣＳＦにおいては、有効な沈殿を生じさせるために重量比で亜鉛に換算して表記すると、Ｇ−ＣＳＦ：亜鉛＝１：１以上の亜鉛が必要であった。これはＧ−ＣＳＦ１０ｍｇに対して亜鉛が１５０μモル必要ということになる。これを１００μモルとすると沈殿の形成効率が低下するものであった。
【００２９】
同様にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の場合は、ｈＧＨ  １０ｍｇに対して塩化亜鉛および酢酸亜鉛ともに亜鉛換算値で２０μモル（塩化亜鉛とすると１．３５ｍｇ）の添加で沈殿が生じた。
すなわち、生理活性蛋白質と亜鉛塩の配合比率は、生理活性蛋白質の種類によって異なるが、生理活性蛋白質１０ｍｇに対して、亜鉛塩１０〜３００μモルの範囲が好ましい。より好ましくは、２０〜２５０μモルである。
【００３０】
本発明者の検討によれば、炭酸水素塩を過剰に加えると生理活性蛋白質によっては、生成した生理活性蛋白質と無機金属塩類との沈殿ナノ粒子を逆に溶出するものであった。
好ましい炭酸水素塩の添加量としては、生理活性蛋白質１０ｍｇに対して５０〜５００μモルがよく、より好ましくは、５０〜２５０μモルである。
【００３１】
また、水溶性リン酸塩としてのリン酸緩衝液も多量に用いると形成された沈殿から生理活性蛋白質が溶出するものであった。生理活性蛋白質１０ｍｇに対して１〜２００μモルが好ましく用いられる。より好ましくは、２０〜１５０μモルである。
【００３２】
先の記載では沈殿物を形成したのち、遠沈操作を行い、その上清を廃棄し、得られた沈殿物に糖などを加えた水溶液を添加し、さらに、凍結乾燥に付しナノ粒子組成物を得ている。沈殿物を形成した後の懸濁液の上清中には過剰の亜鉛塩が含まれており、この過剰の亜鉛塩を除去することで、得られたナノ粒子組成物の局所反応性が弱まったものと考えられる。
その考え方を推し進めると、上清を廃棄した後に、さらに、精製水を加え、攪拌・遠沈すると、より過剰の亜鉛塩が除去されるので好ましいと考えられる。
しかしながら、理由は不明であるが、更なる遠沈操作を行っても、亜鉛塩はそれ以上ほとんど除去されずに、逆に、沈殿した生理活性蛋白質が溶出された。また、この生理活性蛋白質の溶出は、塩化亜鉛を使用した場合よりも、酢酸亜鉛を使用した場合の方が大きかった。
【００３３】
このことは単純に、沈殿物を洗浄すればよいということにならず、初めの上清のみの除去が製造工程としては好ましいことになる。すなわち沈殿物の洗浄回数は、初めの懸濁液の除去または最大１回の精製水による洗浄が好ましく、それ以上の洗浄は、逆効果であった。さらに、初めの懸濁液のみの除去がより好ましい製造方法ということになる。
なお、これらの無機金属塩類からなるナノ粒子は、生体に皮下投与したときに徐々に消失し、３週間後にはほとんど投与部位から消失することが確認されている。
【００３４】
本発明方法により製造される徐放性のナノ粒子組成物含有製剤にあっては、ナノ粒子に含有させる生理活性蛋白質あるいはペプチドとして、Ｇ−ＣＳＦのみならず、亜鉛イオンと沈澱を形成することができる生理活性蛋白質あるいはペプチドをあげることできる。そのような生理活性蛋白質あるいはペプチドとしては、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ヒト成長ホルモン、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＦＧＦ、ミッドカインなどを挙げることができる。
そのなかでも、特に微量で薬効を示す生体由来因子は望ましいものである。
例えば、インターフェロンやヒト成長ホルモンを、本発明の方法により沈澱化したものは、Ｇ−ＣＳＦと同様の高率で沈澱物中に含有されたことから、同様の徐放効果を期待できる。
【００３５】
また、本発明方法により製造される徐放性のナノ粒子組成物含有製剤にあっては、さらに、マンニトールやトレハロースなどの糖類を加え凍結乾燥したものを、注射用蒸留水で再懸濁し、用いることができる。
【００３６】
本発明が提供する徐放性製剤は、その特性を生かした非経口投与用製剤として製剤化することができる。
非経口用製剤としては、注射剤（皮下注射、筋肉内注射、静脈注射等）、点滴靜注等の液剤、水性懸濁剤、噴霧剤等の経鼻剤、粘膜経由投与剤等を挙げることができる。これらの製剤は、いずれも日本薬局方の「製剤総則」に記載の方法に順じ、調製することができ、製剤化に用いられる担体、等張化剤、安定化剤等としては、製剤学的に汎用されている各種のものを適宜選択して、使用することができる。
【００３７】
本発明が提供する徐放性剤における有効成分である沈澱組成物の含有量は、一概に限定できない。一般には、投与されるべき患者の年齢、性別、体重、その症状等により異なるが、沈澱組成物中に含有される生理活性蛋白質またはペプチドの薬理活性を発揮し、その効果が発現できる用量を含有させればよい。
【実施例】
【００３８】
以下に本発明を、実施例によって詳細に記載するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１：Ｇ−ＣＳＦ徐放性製剤調製時のＧ−ＣＳＦおよび亜鉛の沈殿率の検討
［方法］
ガラスバイアルに、脱塩精製したＧ−ＣＳＦ溶液４ｍｇ／ｍＬを２．５ｍＬ（Ｇ−ＣＳＦとして１０ｍｇ）、炭酸水素ナトリウム溶液８４ｍｇ／ｍＬを０．２ｍＬ（１６．８ｍｇ）、リン酸二水素ナトリウム（２．２８ｍｇ）とリン酸水素二ナトリウム（１１．５ｍｇ）からなるｐＨ７．２の緩衝液０．２ｍＬを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液３６．７ｍｇ／ｍＬを１ｍＬ（３６．７ｍｇ）あるいは、塩化亜鉛溶液２７．３ｍｇ／ｍＬを１ｍＬ（２７．３ｍｇ）を加えた。さらに注射用蒸留水１．１ｍＬを加え、総体積５ｍＬとした。これら懸濁液を遠心操作により沈降部、上清部に分離し、上清部のＧ−ＣＳＦおよび亜鉛を定量した。沈降部に精製水を添加、攪拌して、沈降部を洗浄し、遠心操作により分離した上清部のＧ−ＣＳＦおよび亜鉛を洗浄部１として定量した。
再び、沈降部に精製水を添加、攪拌して、遠心操作により分離した上清部のＧ−ＣＳＦおよび亜鉛を洗浄部２として定量した。
【００４０】
上清部、洗浄部１、洗浄部２中のＧ−ＣＳＦ量はＨＰＬＣ法にて、亜鉛量は和光純薬工業（株）のＺｎテストワコーにて定量した。
また、沈降部中のＧ−ＣＳＦ量および亜鉛量は、添加したＧ−ＣＳＦ量および亜鉛量から、上清部、洗浄部１、洗浄部２中の各Ｇ−ＣＳＦ量および亜鉛量の合計を差し引くことで求めた。
その結果を表１及び表２に示す。
【００４１】
【表１】
2009256241.tif 000002
【００４２】
【表２】
2009256241.tif 000003
【００４３】
［考察］
本発明の徐放性製剤は、亜鉛塩含有水溶液との共存下において、Ｇ−ＣＳＦが、効率良く沈殿することを特徴としており、得られた製剤組成中の亜鉛は、製剤の徐放性効果を得る上で極めて重要な組成である。しかし、特許文献４記載の方法で得た徐放性製剤は、亜鉛に起因すると推察される投与局所における刺激性が観察された。このため、刺激性を軽減させた、或いは刺激性が観察されない製剤を作製することを検討した。そこで、投与局所における刺激性は、製剤組成中の亜鉛塩の種類、さらに遊離亜鉛に起因すると推察し、遊離亜鉛がどの程度製剤中に存在するかを確認した。
【００４４】
その結果、従来用いていた酢酸亜鉛に比べ、塩化亜鉛を用いて作製した場合、上清部中の遊離亜鉛が少なくなることが確認された。さらに、洗浄操作を繰り返しても洗浄部１、洗浄部２中には、亜鉛がほとんど確認されず、一度沈殿した亜鉛は、容易に溶出しないことが示された。一方、Ｇ−ＣＳＦは、上清部中、洗浄部１中にはわずかしか確認されなかったが、洗浄部２中には酢酸亜鉛を用いた場合には約２５％、塩化亜鉛を用いた場合には約１０％検出され、遠沈操作による洗浄操作の繰り返しは、沈殿したＧ−ＣＳＦを溶出させることが示された。
【００４５】
以上のことから、（１）添加する亜鉛塩は、酢酸亜鉛より塩化亜鉛が好ましいものであり、（２）亜鉛塩を添加、攪拌後、遠心分離により、上清に存在する遊離亜鉛を除去することにより、沈殿したＧ−ＣＳＦの溶出を避けつつ、遊離亜鉛の残留を抑えた製剤の調製が可能となった。
【００４６】
実施例２：プラセボ徐放性製剤調製法が刺激性に与える影響
［方法］
実施例１の方法に従い、以下の生理活性タンパクを含有しない（注射用蒸留水で総体積５ｍＬに補正）、各プラセボ徐放性製剤Ａ〜Ｄを調製した。
（Ａ）：ガラスバイアルに炭酸水素ナトリウム溶液（１６．８ｍｇ）、リン酸緩衝液（１３．８ｍｇ）を最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（３６．７ｍｇ）を加え、懸濁液とした後、トレハロース溶液（１２５ｍｇ）を添加し、総体積５ｍＬとし、凍結乾燥した。
（Ｂ）ガラスバイアルに炭酸水素ナトリウム溶液（１６．８ｍｇ）、リン酸緩衝液（１３．８ｍｇ）を最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら塩化亜鉛溶液（２７．３ｍｇ）を加え、懸濁液とした後、トレハロース溶液（１２５ｍｇ）を添加し、凍結乾燥した。
（Ｃ）ガラスバイアルに炭酸水素ナトリウム溶液（１６．８ｍｇ）、リン酸緩衝液（１３．８ｍｇ）を最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（３６．７ｍｇ）を加えた。これら懸濁液を遠心操作により沈降部、上清部に分離し、上清部を除去した後、トレハロース溶液（１２５ｍｇ）を添加し、凍結乾燥した。
（Ｄ）ガラスバイアルに炭酸水素ナトリウム溶液（１６．８ｍｇ）、リン酸緩衝液（１３．８ｍｇ）を最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら塩化亜鉛溶液（２７．３ｍｇ）を加えた。これら懸濁液を遠心操作により沈降部、上清部に分離し、上清部を除去した後、トレハロース溶液（１２５ｍｇ）を添加し、凍結乾燥した。
【００４７】
各プラセボ徐放性製剤Ａ〜Ｄの実際を表にまとめると、以下のとおりである。
【００４８】
【表３】
2009256241.tif 000004
【００４９】
得られた各凍結乾燥した徐放性製剤Ａ〜Ｄに蒸留水を加え再懸濁し、７週齢のＳＤ系雄性（日本チャールスリバー；ＣＲＪ）ラット（各群２匹）にそれぞれ、Ｇ−ＣＳＦとして４．２ｍｇ（臨床における最大投与量）／投与部位／ｍＬに相当するプラセボ徐放性製剤を背部中央皮下に投与した。
投与部位の刺激性は、投与後３日目の投与部位の皮下状況（浮腫、紅斑の有無）を肉眼観察することによって評価した。
評価は以下のとおりである。
＋＋：浮腫、紅斑著しい。
＋  ：浮腫、紅斑を認める。
−  ：浮腫、紅斑を認めない。
その結果を表４に示す。
【００５０】
【表４】
2009256241.tif 000005
【００５１】
［考察］
酢酸亜鉛を用いて作製した従来の製剤（Ａ）に比較し、塩化亜鉛を用いて作製した製剤（Ｂ）は、紅斑、浮腫ともに軽減していた。さらに、遊離亜鉛を除去（上清部分を除去）した製剤（Ｃ及びＤ）においては、紅斑、浮腫ともに観察されなかった。
このことから、添加する亜鉛塩を酢酸亜鉛から塩化亜鉛へ変更し、さらに亜鉛塩を添加、攪拌後、上清に存在する遊離の亜鉛を遠心分離により除去する方法が、刺激性の軽減を可能にすることが確認された。
【００５２】
実施例３：Ｇ−ＣＳＦ徐放性製剤調製法が刺激性に与える影響
［方法］
実施例２と同様に、以下の生理活性蛋白質としてＧ−ＣＳＦを含有する、本発明の徐放性ナノ粒子含有製剤（製剤Ｅ及びＦ）を調製した。
（Ｅ）ガラスバイアルに脱塩精製したＧ−ＣＳＦ溶液（１０ｍｇ）、炭酸水素ナトリウム溶液（１６．８ｍｇ）、リン酸緩衝液（１３．８ｍｇ）を最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（３６．７ｍｇ）を加え、懸濁液とした後、トレハロース溶液（１２５ｍｇ）を添加し、凍結乾燥した。
（Ｆ）ガラスバイアルに脱塩精製したＧ−ＣＳＦ溶液（１０ｍｇ）、炭酸水素ナトリウム溶液（１６．８ｍｇ）、リン酸緩衝液（１３．８ｍｇ）を最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら塩化亜鉛溶液（２７．３ｍｇ）を加えた。これら懸濁液を遠心操作により沈降部、上清部に分離し、上清部を除去した後、トレハロース溶液（１２５ｍｇ）を添加し、凍結乾燥した。
【００５３】
徐放性製剤Ｅ及びＦの実際を表にまとめると、以下のとおりである。
【００５４】
【表５】
2009256241.tif 000006
【００５５】
得られた各凍結乾燥製剤Ｅ及びＦに蒸留水を加え再懸濁し、７週齢のＳＤ系雄性ラット（各群２匹）にそれぞれ、Ｇ−ＣＳＦとして４．２ｍｇ（臨床における最大投与量）／投与部位／ｍＬの各徐放性製剤を背部中央皮下に投与した。
刺激性は、実施例２と同様に基準により、投与後１日目の皮下状況の肉眼観察によって評価した。
製剤中のＧ−ＣＳＦ量の測定は、Ｇ−ＣＳＦ  ０．１ｍｇ相当の製剤に２００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．５ｍＬを加えて製剤を溶解し、ＨＰＬＣ法を用いて測定した。
その結果を表６に示す。
【００５６】
【表６】
2009256241.tif 000007
【００５７】
［考察］
製剤（Ｅ）は、投与部位周辺に紅斑および浮腫が観察されたが、製剤（Ｆ）は異常な所見は確認されなかった。このことから、沈殿したＧ−ＣＳＦの溶出を避けつつ、かつ刺激性が観察されない製剤の作製が可能となった。
【００５８】
実施例４：刺激性を軽減させたＧ−ＣＳＦ徐放性製剤の白血球数上昇率を指標とした薬効評価
［方法］
上記実施例３で得られた凍結乾燥製剤（Ｆ）は、塩化亜鉛との沈殿物について、遠沈操作により上清部を除去した製剤であり、皮膚刺激性が軽減された製剤である。この凍結乾燥製剤（Ｆ）に蒸留水を加え再懸濁し、７週齢のＳＤ系雄性ラット（各群４匹）背部中央皮下に投与し、対照群のＧ−ＣＳＦ水溶液の連日皮下投与群と、白血球数上昇率を比較した。
投与量は、Ｇ−ＣＳＦ  ０．１ｍｇ／ｋｇ／日×５日間でおこなった。
製剤中のＧ−ＣＳＦ量の測定は、Ｇ−ＣＳＦ  ０．１ｍｇ相当の製剤に２００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．５ｍＬを加えて製剤を溶解し、ＨＰＬＣ法を用いて測定した。
［結果］
その結果を、下記表７に示す。
【００５９】
【表７】
2009256241.tif 000008
＊  ：ｐ＜０．０５
＊＊：ｐ＜０．０１
【００６０】
［考察］
製剤（Ｆ）は、投与後１日目から４日目まで、対照群の水溶液の連日皮下投与群と比較して白血球数上昇率が同等かそれ以上であり、さらに７〜９日目においても非投与群、連日皮下投与群に比較し高く維持されていた。
このことから、製剤（Ｆ）は、７日間以上の持続的な薬効を示すことが確認された。
【００６１】
実施例５：Ｇ−ＣＳＦ徐放性製剤の物性評価
上記実施例３で得られた凍結乾燥製剤（Ｆ）に蒸留水を加え再懸濁し、Ｍａｌｖｅｒｎ（株）の粒子径測定器を用いて、製剤の平均粒子径および粒度分布を測定した。その結果、強度平均粒子径４１３．３ｎｍ、数平均粒子径４１４．９ｎｍ、体積平均粒子径４０８．７ｎｍと算出され、ナノオーダーの粒子であることが確認された。
また、粒子の分布幅は比較的狭く、単分散に近い製剤であることが示された。さらに、本製剤は、２７Ｇの針を容易に通過し、通針性も良好であり、ラット皮下残存試験から生体吸収性であることが確認された。
【００６２】
実施例６：ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）徐放性製剤の血中ｈＧＨベル
（Ｇ）ガラスバイアルに、脱塩精製したｈＧＨ溶液４ｍｇ／ｍＬを２．５ｍＬ（ｈＧＨとして１０ｍｇ）、炭酸水素ナトリウム溶液８４ｍｇ／ｍＬを０．２ｍＬ（１６．８ｍｇ）、リン酸二水素ナトリウム（２．２８ｍｇ）とリン酸水素二ナトリウム（１１．５ｍｇ）からなるｐＨ７．２の緩衝液０．２ｍＬを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら、塩化亜鉛溶液２７．３ｍｇ／ｍＬを１ｍＬ（２７．３ｍｇ）を加えた。さらに注射用蒸留水１．１ｍＬを加え、総体積５ｍＬとした。これら懸濁液を遠心操作により沈降部、上清部に分離し、上清部を除去した後、トレハロース溶液４００ｍｇ／ｍＬを０．３１３ｍＬ（１２５ｍｇ）を添加し、注射用蒸留水４．６９ｍＬを加え総体積５ｍＬとして凍結乾燥した。
得られた凍結乾燥製剤（Ｇ）に蒸留水を加えて再懸濁し、７週齢のＳＤ雄性ラット（各群３匹）背部中央皮下に投与し、ｈＧＨ溶液単回皮下投与群と血中ｈＧＨレベルを比較した。
投与量は、ｈＧＨ  １０．５ｍｇ／ｋｇでおこなった。製剤中のｈＧＨ量は、ｈＧＨ  ０．１ｍｇ相当の製剤に１００ｍＭ−塩酸を加えて製剤を溶解し、ＨＰＬＣ法を用いて測定した。その結果を表８に示す。
【００６３】
【表８】
2009256241.tif 000009
ＮＤ：未検出
【００６４】
表中に示した結果から判明するように、本発明のナノ粒子含有製剤（Ｇ）は、水溶液の単回皮下投与群と比較して、初期の血中ｈＧＨレベルが抑制され、かつ数日間に亘り、血中ｈＧＨレベルが高く維持されていた。
このことから、本発明のナノ粒子含有製剤（Ｇ）にあっては、徐放性を有することが確認された。
【００６５】
実施例７：ミッドカイン（ＭＫ）徐放性製剤の作製
（Ｈ）ガラスバイアルに、脱塩精製したミッドカイン（ＭＫ）溶液４ｍｇ／ｍＬを２．５ｍＬ（ＭＫとして１０ｍｇ）、炭酸水素ナトリウム溶液８４ｍｇ／ｍＬを０．２ｍＬ（１６．８ｍｇ）、リン酸二水素ナトリウム（２．２８ｍｇ）とリン酸水素二ナトリウム（１１．５ｍｇ）からなるｐＨ７．２の緩衝液０．２ｍＬを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら、塩化亜鉛溶液２７．３ｍｇ／ｍＬを１ｍＬ（２７．３ｍｇ）を加えた。さらに注射用蒸留水１．１ｍＬを加え、総体積５ｍＬとした。これら懸濁液を遠心操作により沈降部、上清部に分離し、上清部を除去した後、トレハロース溶液４００ｍｇ／ｍＬを０．３１３ｍＬ（１２５ｍｇ）を添加し、注射用蒸留水４．６９ｍＬを加え総体積５ｍＬとして凍結乾燥した。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
以上記載のように、本発明により、生理活性蛋白質或いはペプチドの所定量を投与したときに、投与部位での異常反応が無く、且つ含有する生理活性蛋白質或いはペプチドの持続的な活性を維持する徐放性ナノ粒子含有製剤を提供することができる。
本発明が提供するナノ粒子含有製剤は、ナノ粒子中に含有される生理活性蛋白質或いはペプチドの活性の持続性に優れたものであり、これまでみられた投与部位での異常反応を軽減したものであり、臨床上極めて有効なものである。