(57)【要約】【課題】  ＩＬ−１タイプＩＩレセプターがＩＬ−１リガンドのシグナル伝達に果たす役割を解明するために、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子が全く発現しない遺伝子欠損変異体動物を作出すること。【解決手段】  本発明は、マウス染色体上のＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子座に欠失及び／又は挿入変異を有する、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の欠損変異体マウスを提供する。本発明は、本発明のマウスにマウスＩＬ−１タイプＩＩレセプタータンパク質を免疫感作して、該レセプタータンパク質に対するモノクローナル抗体を作成するステップ等を含む、アレルギー及び／又は炎症を治療する抗体製剤の作成方法を提供する。本発明は、試験物質存在下又は非存在下、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターか、該レセプターを発現している細胞かにＩＬ−１を作用させるステップ等を含む、抗アレルギー薬又は抗炎症薬候補のスクリーニング方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス染色体上のＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子座に欠失及び／又は挿入変異を有することを特徴とする、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の欠損変異体マウス。
【請求項２】
前記変異は、完全長ＩＬ−１タイプＩＩレセプタータンパク質の代わりに緑蛍光タンパク質が発現することを特徴とする、請求項１に記載のＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の欠損変異体マウス。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のマウスにマウスＩＬ−１タイプＩＩレセプタータンパク質を免疫感作して、該レセプタータンパク質に対するモノクローナル抗体を作成するステップと、前記モノクローナル抗体を野生型マウスか野生型マウス由来の免疫細胞かに投与して、ＩＬ−１による免疫系への刺激を抑制させるモノクローナル抗体をスクリーニングするステップとを含むことを特徴とする、アレルギー及び／又は炎症を治療する抗体製剤の作成方法。
【請求項４】
試験物質存在下又は非存在下、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターか、該レセプターを発現している細胞かにＩＬ−１を作用させるステップと、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターとＩＬ−１との結合を測定するステップとを含むことを特徴とする、抗アレルギー薬又は抗炎症薬候補のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の欠損変異体マウスと、該変異体マウスを用いるアレルギー及び／又は炎症を治療する抗体製剤の作成方法と、抗アレルギー薬又は抗炎症薬候補のスクリーニング方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−１は向炎症性のサイトカインで、その産生及び／又は活性を下向き調節する因子は臨床的に重要な創薬ターゲットである。以下の非特許文献１の総説に説明されるとおり、ＩＬ−１リガンドのファミリーには、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ及びＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）という３つのメンバーがあり、ＩＬ−１アルファ及びＩＬ−１ベータがアゴニストとして機能し、ＩＬ−１Ｒａは特異的なアンタゴニストであることが知られている。一方、ＩＬ−１レセプターのファミリーには、ＩＬ−１タイプＩレセプター（ＩＬ−１Ｒ  Ｉ）と、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター（ＩＬ−１Ｒ  ＩＩ）と、ＩＬ−１レセプターアクセソリープロテイン（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）という３つのメンバーがあり、ＩＬ−１タイプＩレセプターはＩＬ−１リガンドのシグナル伝達に関与するが、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターは細胞内ドメインがほとんどなく、ＩＬ−１リガンドと結合してもシグナル伝達を行わないと考えられている。ＩＬ−１タイプＩＩレセプターは、タイプＩレセプターと複合体を形成することはないが、ＩＬ−１レセプターアクセソリープロテインは、ＩＬ−１タイプＩレセプターともＩＬ−１タイプＩＩレセプターとも複合体を形成することができる。
【非特許文献１】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，  Ｃ．Ｈ．，  Ｂｌｏｏｄ，  ８７：  ２０９５  -  ２１４７  （１９９６）
【０００３】
ＩＬ−１タイプＩＩレセプターは、従来、おとり（ｄｅｃｏｙ）レセプターであって、ＩＬ−１タイプＩレセプターとＩＬ−ｌリガンドとの結合を競合的に阻害することによって、ＩＬ−１シグナル伝達を調節すると考えられてきた。また、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターは、ＩＬ−１リガンドと結合すると、ＩＬ−１レセプターアクセソリープロテインとも結合して複合体を形成することから、ＩＬ−１リガンドだけでなく、ＩＬ−１レセプターアクセソリープロテインについても、ＩＬ−１タイプＩレセプターとの結合を競合的に阻害するものと考えられてきた（非特許文献２）。さらにタイプＩＩレセプターの細胞外ドメインは、タンパク質分解酵素によって切断されて、可溶性断片として血液循環中に存在する。このタイプＩＩレセプターの可溶性断片は、レセプターアクセソリープロテインの可溶性断片と会合すると、ＩＬ−１アルファ及びベータへの親和性が１００倍高くなり、安定な可溶性複合体を形成することも知られている（非特許文献３）。
【非特許文献２】Ｌａｎｇ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１：  ６８７１  -  ６８７７  （１９９８）
【非特許文献３】Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  １８：  ８７  -  ９６  （２００３）
【０００４】
表１に示すとおり、マウスＩＬ−１リガンド及びレセプターファミリー遺伝子については１９８４年にＩＬ−１アルファ遺伝子がクローニングされて以来、次々に遺伝子がクローニングされている。そして、クローニングされた遺伝子は、順次、ＥＳ細胞への相同遺伝子組換え法により遺伝子欠損マウスが作出されてきた。
【０００５】
【表１】
2009183176.tif 000002
【０００６】
表１のうち、本発明の発明者らのグループ（Ｈｏｒａｉら、１９９８年）は、ＩＬ−１リガンドファミリー遺伝子の全てについて遺伝子欠損マウスを作出した。すなわち、ＩＬ−１アルファ及びＩＬ−１ベータ遺伝子のそれぞれの欠損マウスと、二重欠損マウスとを作出し、さらに、ＩＬ−１Ｒａ遺伝子の欠損マウスも作出した（非特許文献４）。
【非特許文献４】Ｈｏｒａｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８７：  １４６３−  ７５  （１９９８）
【０００７】
ＩＬ−１レセプターファミリー遺伝子の欠損マウスは他のグループによって作出されている。すなわち、ＩＬ−１タイプＩレセプター（ＩＬ−１Ｒ  Ｉ）及びＩＬ−１レセプターアクセソリープロテイン（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）の遺伝子欠損マウスについては、それぞれ、１９９７年及び１９９８年に作出されている。しかし、１９９１年にＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子がクローニングされているのに、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター（ＩＬ−１Ｒ  ＩＩ）遺伝子の欠損マウスは、世界中のいずれの研究室からも現在に至るまで作出されたという報告がない。
【０００８】
ＩＬ−１関連遺伝子の欠損マウスのうち、発明者のグループで作出されたＩＬ−１Ｒａ遺伝子の欠損マウスは、関節炎を始めとする種々の自己免疫性疾患を自然発症することから、極めて有用な疾患モデル動物として利用されている（非特許文献５）。ＩＬ−１ＲａはＩＬ−１リガンドのアンタゴニストで、アゴニストであるＩＬ−１アルファやＩＬ−１ベータの刺激を阻害する。ＩＬ−１タイプＩＩレセプターもＩＬ−１リガンドやＩＬ−１ＲＡｃＰのおとりレセプターであり、ＩＬ−１アルファやＩＬ−１ベータの刺激を阻害すると考えられるので、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子（Ｉｌ１ｒ２遺伝子座）の欠損マウスも有用な疾患モデル動物となることが期待される。
【非特許文献５】Ｈｏｒａｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９１：  ３１３−３２０  （２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＩＬ−１タイプＩＩレセプターがＩＬ−１リガンドのシグナル伝達に果たす役割を解明するためには、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子が全く発現しない遺伝子欠損変異体動物を作出する必要がある。また、かかる動物個体におけるＩＬ−１リガンド及びレセプターの動態、複合体形成及びシグナル伝達を解析する方法を開発する必要がある。さらに、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターを相補することができる物質の候補からＩＬ−１シグナル伝達調節活性を有する物質のスクリーニング方法を開発する必要もある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、マウス染色体上のＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子座に欠失及び／又は挿入変異を有する、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の欠損変異体マウスを提供する。
【００１１】
本発明のＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の欠損変異体マウスにおいて、該変異は、完全長ＩＬ−１タイプＩＩレセプタータンパク質の代わりに緑蛍光タンパク質が発現する場合がある。
【００１２】
本発明は、本発明のマウスにマウスＩＬ−１タイプＩＩレセプタータンパク質を免疫感作して、該レセプタータンパク質に対するモノクローナル抗体を作成するステップと、前記モノクローナル抗体を野生型マウスか野生型マウス由来の免疫細胞かに投与して、ＩＬ−１による免疫系への刺激を抑制させるモノクローナル抗体をスクリーニングするステップとを含む、アレルギー及び／又は炎症を治療する抗体製剤の作成方法を提供する。
【００１３】
本発明は、試験物質存在下又は非存在下、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターか、該レセプターを発現している細胞かにＩＬ−１を作用させるステップと、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターとＩＬ−１との結合を測定するステップとを含む、抗アレルギー薬又は抗炎症薬候補のスクリーニング方法を提供する。
【００１４】
本明細書において、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の欠損変異体マウスとは、野生型ＩＬ−１タイプＩＩレセプターを正常に産生することができないような変異体のマウスをいう。ＩＬ−１タイプＩＩレセプターの遺伝子座はマウスの第１番染色体に位置し、約４０．５ｋｂにわたる転写産物から９個のエクソンが連結したｍＲＮＡが産生され、４１０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが翻訳される。
【００１５】
本発明の欠損変異体は、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターのポリペプチドが全く産生されない変異体の他、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターの野生型遺伝子の少なくとも１つエクソンの少なくとも一部にコード化されるポリペプチドが産生される場合であって、ＩＬ−１リガンドの結合、ＩＬ−１レセプターアクセソリープロテインとの会合、その他の機能のいずれか又は全てを欠いている変異体を含む。本発明の変異体は、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子座のうち、いずれのエクソン及び／又はイントロンのいかなる部分について欠失及び／又は挿入が生じていてもかまわない。本発明の変異体マウスには、２本の第１染色体の両方が前記変異を含むホモ接合個体だけでなく、２本の第１染色体のうち一方だけが前記変異を含み、他方は野生型である、ヘテロ接合個体も含む。
【００１６】
本発明の変異体は化学物質、放射線その他のいかなる方法で作出してもかまわない。好ましい本発明の変異体の作出方法は、例えばＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｎａｇｙ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎ．Ｙ．，  ２００３）に詳しく説明される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）への相同遺伝子組換え法による標的遺伝子への変異導入である。
【００１７】
本発明の１つの実施態様では、緑蛍光タンパク質が産生されるような変異をＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子に導入した。しかし、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターのポリペプチドが全く産生されない変異体か、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターの野生型遺伝子の少なくとも１つエクソンの少なくとも一部にコード化されるポリペプチドが産生される場合であって、ＩＬ−１リガンドの結合、ＩＬ−１レセプターアクセソリープロテインとの会合、その他の機能のいずれか又は全てを欠いている変異体かであることを条件として、例えばＣｒｅのような配列特異的組換え酵素が認識するｌｏｘＰのような特異的組換え配列が挿入されたり、ＲＮＡｉその他遺伝子発現制御に関与するＲＮＡやｔＲＮＡの遺伝子が挿入されたり、緑蛍光タンパク質その他の蛍光タンパク質と、ウミシイタケ、ホタル等由来のルシフェラーゼその他の発光タンパク質と、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼその他の酵素反応産物により酵素活性の定量又は局在が可能な酵素と、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、ピューロマイシン、ブラストシジンＳその他の薬剤に対する耐性を付与する遺伝子産物と、栄養要求性による選択を可能にする遺伝子産物と、ＩＬ−１リガンドによるシグナル伝達機構とは明確に区別できる別のシグナル伝達機構に関与するタンパク質とを含むが、これらに限定されないいずれかのタンパク質が産生されたりしてもかまわない。
【００１８】
本発明の１つの実施態様で導入する変異では、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の発現制御機構を用いて緑蛍光タンパク質を発現させることができる。かかる変異体マウスを用いると、緑蛍光タンパク質による蛍光発光を指標としてＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の発現をモニターすることができる。前記変異体マウスを用いると、さまざまな創薬候補物質からＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子を上向き調節又は下向き調節する物質をハイスループットなやり方でスクリーニングすることができる。本発明のＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の欠損変異体マウス個体又はその細胞に創薬候補物質を投与及び／又は発現させるステップを含む、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の発現に影響を与える物質のスクリーニング方法によって選ばれる物質は、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の発現に影響を与えることを通じて、ＩＬ−１リガンドの刺激によるシグナル伝達機構を調節することができるので、新規な免疫調節医薬の開発につながる。
【００１９】
また、本発明のＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の欠損変異体マウス又はその細胞に創薬候補物質を投与及び／又は発現させることによって、本発明の変異が原因となるＩＬ−１タイプＩＩレセプターの機能不全を補償するような活性のある物質をスクリーニングすることができる。ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の欠損変異体マウス個体又はその細胞に創薬候補物質を投与及び／又は発現させるステップを含む、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の発現に影響を与える物質のスクリーニング方法によって選ばれる物質は、ＩＬ−１リガンドの複合体形成に影響を与えることを通じて、ＩＬ−１リガンドの刺激によるシグナル伝達機構を調節することができるので、新規な免疫調節医薬の開発につながる。
【００２０】
ＩＬ−１リガンドの刺激によるシグナル伝達の下流には、例えば、ＩＬ−６、プロコラーゲン、ＭＣＰ（Monocyte Chemotactic Protein）−１、ＭＩＰ（Macrophage Inflammatory Protein）−２、ＰＧＥＳ（Prostaglandin E synthase）等を含むが、これらに限定されない遺伝子があり、ＩＬ−１リガンドによる刺激はこれらの遺伝子の発現の誘導又は亢進につながる。したがって上記の免疫調節医薬の開発において、ＩＬ−１リガンドの刺激によるシグナル伝達は、ＩＬ−６、プロコラーゲン、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−２、ＰＧＥＳ等を含むが、これらに限定されない遺伝子の発現量の変化に基づいて定量的に解析することができる。
【００２１】
本明細書において、創薬候補物質とは、新規医薬又はその開発のリード化合物となりうる物質であって、天然物質及び合成物質のいずれでもよく、なんらかの単位構造の化学物質の重合体又は多量体であっても、単量体であってもよく、いかなる化学構造の物質でもかまわない。前記創薬候補物質は、該物質の溶解特性等に応じた薬物伝達システムを用いてマウス個体又はその細胞に投与される場合がある。前記創薬候補物質がウイルス粒子又は核酸であって、マウス細胞内でなんらかの遺伝子の発現の誘導又は阻害を起こす機能を有するものであるときには、ウイルス感染、電気穿孔法、リポソーム法その他の方法で発現させる場合がある。
【００２２】
ＩＬ−１リガンドは、膜結合型のＩＬ−１タイプＩＩレセプター又はその可溶性断片と結合することにより、ＩＬ−１タイプレセプターを介したシグナル伝達が阻害されると考えられてきた。しかし、本発明のＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の欠損変異体マウスでは、ＩＬ−１による刺激が抑制されるという結果が得られた。このことは、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターは正常な個体ではＩＬ−１刺激を促進するという、これまで知られていなかった機能を果たしていることを示唆する。したがって、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターのＩＬ−１刺激促進機能を抑制する物質を探索することにより、新規なアレルギー及び／又は炎症の治療薬を開発することができる。
【００２３】
前記ＩＬ−１タイプＩＩレセプターのＩＬ−１刺激促進機能を抑制する物質の１つの例は、ＩＬ−１タイプＩＩレセプターに対する抗体である。本発明のＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子欠損変異体マウスでは、マウスＩＬ−１タイプＩＩレセプターに対する免疫反応は抑制されないので、マウスＩＬ−１タイプＩＩレセプタータンパク質に対する抗体を作成することができる。かかる抗体には、本発明で用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６の技術と、その改良技術を用いて調製される場合がある。これらの方法は、所望の特異性を有する抗体を産生できる不死性細胞株の調製を伴う。かかる細胞株は上記のとおり免疫された本発明のＩＬ−１タイプＩＩレセプター欠損マウス由来の脾臓細胞から作成される場合がある。前記脾臓細胞は、さまざまな方法で不死化され、抗体産生能を有する不死化細胞株が調製される。前記脾臓細胞は、例えば、前記免疫された本発明のＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子欠損変異体マウスと同種又は異種の動物由来のミエローマ細胞との融合によって不死化される。当業者に周知のさまざまな融合技術を用いる場合がある。例えば、前記脾臓細胞とミエローマ細胞とは非イオン性界面活性剤と数分間混合され、それからハイブリッド細胞の増殖は支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地に低濃度でプレートされる。好ましい選択技術はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。通常約１ないし２週間の十分な時間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。シングルコロニーが選択され、その培養上清が前記ポリペプチドに対する結合活性についてテストされる。反応性及び特異性が高いハイブリドーマが好ましい。限界希釈法によるクローニングを繰り返すことにより、反応性及び特異的が高い抗体を安定的に大量に産生するハイブリドーマのクローンが選択される。モノクローナル抗体は増殖中の選択されたハイブリドーマクローン由来の細胞株のコロニーの上清から単離される場合がある。さらに、マウスのような適当な脊椎動物宿主の腹腔内に前記ハイブリドーマ細胞株を注射するような、収率を向上させるためのさまざまな技術が用いられる場合がある。モノクローナル抗体は前記ハイブリドーマ細胞腹水又は血液から回収される場合がある。汚染物は、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿及び抽出のような従来技術によって前記抗体から除去される場合がある。
【００２４】
本発明で用いられる抗体の抗原結合断片は、インタクトなポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体をそれぞれタンパク質分解酵素パパイン又はペプシンで分解して得られるＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片の他、天然抗体分子の抗原認識能及び結合能の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合的なＶＨ及びＶＬ領域のヘテロ２量体を含むＦｖ断片を含む。
【００２５】
本発明で用いられる組換え抗体は、適当な細菌宿主への形質転換か、適当なほ乳類細胞宿主へのトランスフェクションかを含む抗体遺伝子の発現クローニングによって調製される場合がある。本発明で用いられるキメラ抗体は、前記本発明の組換え抗体の抗原結合部位がＩＬ−１タイプＩＩレセプターと特異的に結合できるように同種又は異種の抗体の定常ドメインによって支持された融合タンパク質である。本発明で用いられるキメラ抗体には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に操作可能に連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）と、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマを含む）の動物が産生する軽鎖がないＩｇＧのクラスであるラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）又はその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）とを含む。本発明の組換え抗体は原核生物及び真核生物由来の遺伝子発現システムを用いて大量に調製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に実施例を示すが、これらは実施態様の例示を意図しており本発明の範囲を限定することは意図しない。
【実施例１】
【００２７】
ターゲティングベクター１の構造
図１は、ターゲティングベクター１の構造と、これに対応する野生型染色体ＤＮＡ及び相同組換え体ＤＮＡの構造とを示す模式図である。Ｅ２ないしＥ８はそれぞれ第２ないし第８エクソンの位置を表す。したがって、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子は図の左から右の向きに転写される。ターゲティングベクター１には、ターゲティングベクター１を取り込んだＥＳ細胞を選別するためのマーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を用い、その左側の相同領域は１．８ｋｂ、その右側の相同領域は１１．２ｋｂであった。ハイグロマイシン耐性遺伝子の矢印は、該遺伝子が左から右の向きに転写されることを示す。また、相同組換え体を選別するためのマーカーとして、前記左側の相同領域に隣接してジフテリア毒素遺伝子が連結されている。ターゲティングベクター１では第２エクソンから第５エクソンまでが欠失する。
【００２８】
相同組換え体ＥＳ細胞の単離
ターゲティングベクター１のトランスフェクションは以下のとおり行った。ＥＳ細胞Ｅ１４．１株１ｘ１０７個あたり２０μｇの直鎖化したターゲティングベクター１を５００μＦ、２５０Ｖの条件で電気穿孔法でトランスフェクションし、１４０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを添加したＥＳ細胞用培地で１週間培養して、ターゲティングベクター１を取り込んだＥＳ細胞を選択した。なお、ハイグロマイシン耐性遺伝子とジフテリア毒素遺伝子との間の相同領域で染色体ＤＮＡとターゲティングベクター１のＤＮＡとの間で相同組換えが起こっていない細胞では、ジフテリア毒素遺伝子が発現して細胞が死滅する場合が多く、結果的にハイグロマイシン耐性のＥＳ細胞のコロニーでは相同組換え体の頻度が上昇する。実際、発明者のグループの経験では、選択されたＥＳ細胞の１−４％の頻度で相同組換え体クローンが得られる。
【００２９】
ターゲティングベクター１を導入したハイグロマイシン耐性のＥＳ細胞のクローンを１０９９個単離して、相同組換えを起こしているかどうかサザンブロット法で確認したが、相同組換えを起こしていたクローンは１個もなかった。
【実施例２】
【００３０】
ターゲティングベクター２の構造
図２は、ターゲティングベクター２の構造と、これに対応する野生型染色体ＤＮＡ及び相同組換え体ＤＮＡの構造とを示す模式図である。ターゲティングベクター１には、ターゲティングベクター２を取り込んだＥＳ細胞を選別するためのマーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を用い、その左側の相同領域は３．２ｋｂ、その右側の相同領域は４．８ｋｂであった。また、相同組換え体を選別するためのマーカーとして、前記左側の相同領域に隣接してジフテリア毒素遺伝子が連結されている。ターゲティングベクター２では第２エクソンと第３エクソンの一部が欠失する。
【００３１】
相同組換え体ＥＳ細胞の単離
ターゲティングベクター２のトランスフェクションはターゲティングベクター１と同様に行った。ターゲティングベクター２を導入したハイグロマイシン耐性のＥＳ細胞のクローンを７４９個単離して、相同組換えを起こしているかどうかサザンブロット法で確認したが、相同組換えを起こしていたクローンは１個もなかった。
【実施例３】
【００３２】
ターゲティングベクター３の構造
図３は、ターゲティングベクター３の構造と、これに対応する野生型染色体ＤＮＡ及び相同組換え体ＤＮＡの構造とを示す模式図である。ターゲティングベクター３には、ターゲティングベクター３を取り込んだＥＳ細胞を選別するためのマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を用い、その左側の相同領域は５．５ｋｂ、その右側の相同領域は２．７ｋｂであった。また、相同組換え体を選別するためのマーカーとして、前記右側の相同領域に隣接してジフテリア毒素遺伝子が連結されている。ターゲティングベクター３では第２エクソンの一部と、第３エクソン及び第４エクソンが欠失し、ＩＬ−１タイプＩＩレセプタータンパク質の代わりに緑蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）が発現するようにコード化される。
【００３３】
相同組換え体ＥＳ細胞の単離
ターゲティングベクター２のトランスフェクションは、ハイグロマイシンの代わりに３００μｇ／ｍＬのＧ４１８をＥＳ細胞用培地に添加することを除いて、ターゲティングベクター１及び２と同様に行った。ターゲティングベクター３を導入したＧ４１８耐性のＥＳ細胞のクローンを１１５０個単離して、相同組換えを起こしているかどうかサザンブロット法で確認した。ここで、ＢａｍＨＩで消化したゲノムＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離して固相に写し取り、第５エクソンの３’下流に存在するＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片（約３６０ｂｐ）をプローブとして用いることにより、野生型約１０．５ｋｂに対して変異型は約７．０  ｋｂにシグナルを得ることができる（図４）。前記１１５０個のうち７Ａ１クローン１個だけが相同組換え体であった。
【００３４】
ＥＳ細胞キメラマウスの作出
ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子座に変異を持つ７Ａ１クローンは定法に従いアグリーゲションキメラ法を用いてキメラマウスの作製を行った。すなわち、ＢＤＦ１オスマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウスとの交配により得られた８細胞期胚と５−１５個のＥＳ細胞とをＭ１６培地（Ｓｉｇｍａ）内で一晩接触共培養することによりキメラ胚盤胞を形成させた後、偽妊娠処理３日目のＩＣＲメスマウスの子宮内に移植することによりキメラマウスを出生させた。毛色による判定で７０％以上のＥＳ細胞の寄与率を示すオスキメラマウスは、メスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの交配を行い、生殖系列伝達試験を行った。ＥＳ細胞由来を示す野生色の仔マウスについては尻尾よりＤＮＡを抽出し、ターゲット遺伝子座（ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子に相同組換えにより欠失及び挿入を有する遺伝子座）を持つかどうかＰＣＲ法及びサザンブロット法により確認を行った。ターゲット遺伝子座を持つマウスは、戻し交配（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系及びＢＡＬＢ／ｃＡ系に８世代）行い、解析に用いた。
【００３５】
ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子欠損マウスの表現型
ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子欠損マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＡいずれの遺伝的背景においてもメンデルの法則に則って出生し、外見上も特に異常は見当たらなかった。また、ＩＬ−１Ｒａ遺伝子欠損マウスと異なり、加齢と共にリウマチ様関節炎や乾癬様皮膚炎などの自己免疫疾患の発症は認められなかった。さらに、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子欠損マウスでは、ＩＬ−１リガンドに対するおとりレセプターが消失したことを示す表現型は、現在のところ認められていない。
【００３６】
ハプテン塗布による接触型過敏症モデル
ＩＬ−１のシグナルが増悪化に関与することが知られているハプテン塗布による接触型過敏症（ＣＨＳ）モデルをＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子欠損マウスに行なった。免疫感作するためのハプテンとしては２，４−ジニトロフルオロベンセン（ＤＮＦＢ）又は２，４，６−トリニトロクロロベンゼン（ＴＮＣＢ）を用いた。剃毛して２日後のマウスの腹部に０．５％に溶解したＤＮＦＢ又は３．０％に溶解したＴＮＣＢを５０μＬ塗布した。この時、溶媒としてオリーブオイル（和光）：アセトン（ナカライ）＝１：４の混合液を用いた。免疫感作５日後のマウスの片方の耳介に０．２％ＤＮＦＢ又は１．０％ＴＮＣＢを２５μＬ塗布し、もう一方の耳介には溶媒のみを塗布して炎症を誘導した。二度目のハプテン塗布から２４時間後にマウスの左右の耳介を直径６ｍｍのパンチで切り取りその重量差を測定した。
【００３７】
［耳介の腫れ（ｍｇ）］＝［ハプテンを塗布した耳介片重量（ｍｇ）］
−［溶媒を塗布した耳介片重量（ｍｇ）］。
【００３８】
ＤＮＦＢ塗布によるＣＨＳモデルアレルギー反応の結果を図５Ａ、ＴＮＣＢ塗布によるＣＨＳモデルアレルギー反応の結果を図５Ｂに示す。図５Ａ及び図５Ｂに示すとおり、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子欠損マウスでは、ハプテン塗布による接触型過敏症の発症が抑制された。
【００３９】
ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子発現の確認
前記ＣＨＳモデルアレルギー反応においてＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子が野生型マウスでは発現していることを確認した。ＣＨＳを誘導したマウス耳介をセパゾールＲＮＡＩスーパー（ナカライ）中でホモジナイズし、クロロホルムを加えて混和した後、ＲＮＡが抽出された水相を回収した。ここから１００％イソプロパノール、７５％エタノールを用いてＲＮＡを精製した。このＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを得た。これをテンプレートとしＲＴ−ＰＣＲ法を用いてＩＬ−１Ｒ２ｍＲＮＡ発現量を調べた。ＰＣＲに用いたプライマー配列は、ＩＬ−１Ｒ２（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ；  ５’  −ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴ−３’（配列番号１）：  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ；  ５’  −ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＣＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＴＧ−３’（配列番号２））、Ｇａｐｄｈ（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ；  ５’  −ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  Ａ−３’（配列番号３）：  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ；  ５’  −ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＴＡＧ  ＣＣＧ  Ｔ−３’（配列番号４））である。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いた。ＰＣＲ反応の条件は、９４°Ｃで２分間インキュベーションした後、（９４°Ｃで１５秒間、５８°Ｃで３０秒間、７２°Ｃで３０秒間）×３５サイクル反応させ、その後７２°Ｃで１０分間インキュベーションする条件で行った。
【００４０】
図６に示すとおり、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子発現解析の結果、野生型マウスでは、ＤＮＦＢ塗布によるＣＨＳモデルアレルギー反応の際にＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子は発現が亢進したが、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子座の欠損マウスではＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子の発現は全く検出されなかった。
【００４１】
ＩＬ−１タイプＩＩレセプターはおとりレセプターとしてＩＬ−１刺激を抑制すると考えられてきた。そこで、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子欠損マウスではＩＬ−１刺激を抑制することができないからアレルギー反応は増悪すると予測された。しかし、図６に示すとおり、ＣＨＳモデルアレルギー反応ではＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子が全く発現していないにもかかわらず、図５Ａ及び図５Ｂに示すとおり、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子欠損マウスではアレルギー反応は野生型マウスよりも抑制された。これは、従来の予測に反する結果である。
【００４２】
新しいＩＬ−１シグナル解析ツールとしてのＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子欠損マウス
これまでの遺伝子欠損マウスを用いた解析から、ＣＨＳの増悪化にはＩＬ−１アルファのシグナルが重要であることが明らかになっていた（Ｎａｋａｅら、Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：１４７１−１４７８（２００１））。また、最近、強皮症患者由来の繊維芽細胞では核内に存在するｐｒｅ−ＩＬ−１アルファがＩＬ−６などの発現誘導に関与すること、このときｐｒｅ−ＩＬ−１アルファはＩＬ−１Ｒ２と複合体を形成することにより転写因子として機能していることが報告された（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １０３：１４５０１−１４５０６（２００６））。このことから、ＩＬ−１アルファ依存性／ＩＬ−１ベータ非依存性のアレルギー・モデルであるＣＨＳは、新しい概念であるｐｒｅ−ＩＬ−１アルファ／ＩＬ−１タイプＩＩレセプターシグナルが増悪化に関与していると示唆された。
【００４３】
ＩＬ−１は、ＮＣＢＩが公開している医学・生物学の文献データベースであるＰｕｂＭｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ＰｕｂＭｅｄ）で検索した場合、２００８年１月現在で４３，０１４報もの論文がヒットする、極めて注目度の高い分子である。また、ＩＬ−１システムを標的とした生物製剤（例：Ａｎａｋｉｎｒａ）も免疫疾患の治療薬として実用化に至っている。これらのことから、ＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子欠損マウスはＩＬ−１のシグナル解析ツールとして、極めて有用かつ必要度の高い、貴重な遺伝子改変マウスであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ターゲティングベクター１の構造と、これによる相同組換え体染色体ＤＮＡの構造とを示す模式図。
【図２】ターゲティングベクター２の構造と、これによる相同組換え体染色体ＤＮＡの構造とを示す模式図。
【図３】ターゲティングベクター３の構造と、これによる相同組換え体染色体ＤＮＡの構造とを示す模式図。
【図４】ターゲティングベクター３によるＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子座での変異を確認するサザンブロット図。
【図５Ａ】ＤＮＦＢ塗布によるＣＨＳモデルアレルギー反応がＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子欠損マウスの耳介ではみられないことを示す棒グラフ。
【図５Ｂ】ＴＮＣＢ塗布によるＣＨＳモデルアレルギー反応がＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子欠損マウスの耳介ではみられないことを示す棒グラフ。
【図６】ＣＨＳ炎症局所でのＩＬ−１タイプＩＩレセプター遺伝子発現を示すＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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