(57)【要約】【課題】本発明は、ヒトサーバイビンタンパク、及び、それと相互作用するパートナータンパク（Ｓｍａｃタンパク、ＩＮＣＥＮＰタンパク、ヒトサーバイビンタンパク）間の相互作用を阻害する物質をハイスループットかつ高感度でスクリーニングする方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明のスクリーニング方法は、以下の工程ａ）〜ｄ）を備えたことを特徴とする。ａ）ビオチン化ヒトサーバイビンタンパク及びタグ融合パートナータンパクを、被検物質の存在下又は非存在下の緩衝液中で反応させる一次反応液調製工程；ｂ）一次反応液に、ストレプトアビジン−ドナービーズと、ニッケルキレート−アクセプタービーズ又は抗ＧＳＴ−アクセプタービーズとを加え、さらに反応させる二次反応液調製工程；ｃ）二次反応液中のストレプトアビジン−ドナービーズ結合ビオチン化ヒトサーバイビンタンパクと、ニッケルキレート−アクセプタービーズ又は抗ＧＳＴ−アクセプタービーズ結合タグ融合パートナータンパクとの間の相互作用を、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ（AlphaScreen）法により測定・比較する測定・比較工程；  ｄ）被検物質を添加した場合が添加しない場合に比べて、AlphaScreen法により測定されるシグナルが減少したとき、前記被検物質をヒトサーバイビン／パートナータンパク間相互作用阻害物質と評価する評価工程；【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程ａ）〜ｄ）を備えたことを特徴とするヒトサーバイビン／Ｓｍａｃタンパク間相互作用阻害物質のハイスループットスクリーニング方法。
ａ）ビオチン化ヒトサーバイビンタンパク及びヒスチジンタグ融合ヒトＳｍａｃタンパクを、被検物質の存在下又は非存在下の緩衝液中で反応させる一次反応液調製工程；
ｂ）一次反応液に、ストレプトアビジン−ドナービーズ及びニッケルキレート−アクセプタービーズを加え、さらに反応させる二次反応液調製工程；
ｃ）二次反応液中のストレプトアビジン−ドナービーズ結合ビオチン化ヒトサーバイビンタンパクと、ニッケルキレート−アクセプタービーズ結合ヒスチジンタグ融合Ｓｍａｃタンパク間の相互作用を、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ（AlphaScreen）法により測定・比較する測定・比較工程；  
ｄ）被検物質を添加した場合が添加しない場合に比べて、AlphaScreen法により測定されるシグナルが減少したとき、前記被検物質をヒトサーバイビン／Ｓｍａｃタンパク間相互作用阻害物質と評価する評価工程；
【請求項２】
以下の工程ａ）〜ｄ）を備えたことを特徴とするヒトサーバイビン／ＩＮＣＥＮＰタンパク間相互作用阻害物質のハイスループットスクリーニング方法。
ａ）ビオチン化ヒトサーバイビンタンパク及びヒスチジンタグ融合ヒトＩＮＣＥＮＰタンパクを、被検物質の存在下又は非存在下の緩衝液中で反応させる一次反応液調製工程；
ｂ）一次反応液に、ストレプトアビジン−ドナービーズ及びニッケルキレート−アクセプタービーズを加え、さらに反応させる二次反応液調製工程；
ｃ）二次反応液中のストレプトアビジン−ドナービーズ結合ビオチン化ヒトサーバイビンタンパクと、ニッケルキレート−アクセプタービーズ結合ヒスチジンタグ融合ＩＮＣＥＮＰタンパク間の相互作用を、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ（AlphaScreen）法により測定・比較する測定・比較工程；
ｄ）被検物質を添加した場合が添加しない場合に比べて、AlphaScreen法により測定されるシグナルが減少したとき、前記被検物質をヒトサーバイビン／ＩＮＣＥＮＰタンパク間相互作用阻害物質と評価する評価工程；
【請求項３】
以下の工程ａ）〜ｄ）を備えたことを特徴とするヒトサーバイビン二量体形成阻害物質のハイスループットスクリーニング方法。
ａ）ビオチン化ヒトサーバイビンタンパク及びグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ融合ヒトサーバイビンタンパクを、被検物質の存在下又は非存在下の緩衝液中で反応させる一次反応液調製工程；
ｂ）一次反応液に、ストレプトアビジン−ドナービーズ及び抗ＧＳＴ−アクセプタービーズを加え、さらに反応させる二次反応液調製工程；
ｃ）二次反応液中のストレプトアビジン−ドナービーズ結合ビオチン化ヒトサーバイビンタンパクと、抗ＧＳＴ−アクセプタービーズ結合ＧＳＴタグ融合ヒトサーバイビンタンパク間の相互作用を、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ（AlphaScreen）法により測定・比較する測定・比較工程；
ｄ）被検物質を添加した場合が添加しない場合に比べて、AlphaScreen法により測定されるシグナルが減少したとき、前記被検物質をヒトサーバイビン二量体形成阻害物質と評価する評価工程；
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法により選択されるヒトサーバイビン／Ｓｍａｃタンパク間相互作用阻害物質、ヒトサーバイビン／ＩＮＣＥＮＰタンパク間相互作用阻害物質、ヒトサーバイビン二量体形成阻害物質を、抗腫瘍物質として評価することを特徴とする、がん治療剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法により選択される、ヒトサーバイビン／Ｓｍａｃタンパク間相互作用阻害物質、ヒトサーバイビン／ＩＮＣＥＮＰタンパク間相互作用阻害物質、ヒトサーバイビン二量体形成阻害物質を、アポトーシス誘導物質として評価することを特徴とする、がん治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトサーバイビンタンパクと、そのパートナータンパクとの間の相互作用を阻害する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Inhibitor of apoptosis protein（ＩＡＰ）ファミリーに含まれるサーバイビン（Survivin）は、分子量１６．５ｋＤａのタンパク質で、一つのbuculovirus IAP repeat（ＢＩＲ）ドメインを持ちreally interesting new geneフィンガーモチーフを欠くという特別な構造を有している（非特許文献１）。また、サーバイビンはがん細胞に特異的に高発現しており、正常成熟細胞には発現が見られなく（非特許文献２）、がん患者の予後不良因子としても特徴付けられている（非特許文献３）。さらに、細胞分裂のＧ２／Ｍ期にのみ発現が見られ、紡錘体やセントロメアに局在して細胞周期進行のコントロールやアポトーシスの抑制に関与しているため（非特許文献４〜６）、サーバイビンは抗がん剤の標的として理想的な分子であるといえるが、その詳細な分子制御機構は十分には解明されていない。
【０００３】
しかし、近年、サーバイビンの分子制御機構についていくつかの知見が得られてきている。例えば、サーバイビンとＳｍａｃ（Second Mitochondria-derived Activator of Caspase）の相互作用がアポトーシス抑制に関与しているとの報告（非特許文献７及び８）や、Ｇ２／Ｍ期に起こるサーバイビンとAurora BやＩＮＣＥＮＰ（Inner CentromereProtein）との結合が染色体整列や染色体分配に関与しているとの報告（非特許文献９）もあり、サーバイビンのタンパク質相互作用の解析が、サーバイビンの機能を解析する上で重要であると考えられてきている。さらに、サーバイビン自身はホモ二量体を形成するが（非特許文献１０）、その機能は未だ解明されていない。現在、製薬企業においてサーバイビンのアンチセンス薬は臨床試験に進んでいるものの、これらタンパク質との相互作用を阻害するような化合物は報告されておらず、サーバイビンのタンパク質相互作用を解析する手法は、分子標的薬の新たなシーズを探す上で重要なツールであると考えられる。
【０００４】
Ｓｍａｃはミトコンドリア内在タンパク質であるが、紫外線照射やエトポシドもしくはグルココルチコイドなどのアポトーシスを誘導する刺激により細胞質に放出される（非特許文献７、８、及び１１）。これらの刺激がミトコンドリア内に伝わった後、ミトコンドリア内の前駆ＳｍａｃのＮ末端が切断されて成熟Ｓｍａｃに変換される（非特許文献７及び１２）。ＳｍａｃはX-linked IAP （XIAP） を含むIAPファミリーに結合しその作用を中和させることによりカスパーゼの活性化を促すことが報告されている（非特許文献７、８、及び１１）。実際、ＳｍａｃはXIAPのBIR2とBIR3に結合し、その結合には成熟ＳｍａｃのＮ末端が必要であると報告されている（非特許文献１２〜１６）。またサーバイビンとＳｍａｃの結合にもＳｍａｃのＮ末端４残基が必要であることも報告されている（非特許文献１７）。これらの報告を受けてSongらは、サーバイビンは直接的にカスパーゼに結合して抑制させるわけではなく、Ｓｍａｃに結合することでＳｍａｃがXIAPなどの抗アポトーシス効果を中和させる作用を阻害し、XIAPなどの抗アポトーシス作用を亢進させると報告している（非特許文献１８）。
【０００５】
ＩＮＣＥＮＰは染色体の中心の領域にあって染色体の分配に際して紡錘微小管と相互作用をする動原体と結びついているタンパクであり、細胞質の分裂に関与することが知られている。また、サーバイビンとの関連については、ＩＮＣＥＮＰのドミナントネガティブによりサーバイビンの局在が変わるという報告がなされている（非特許文献１９、２０）。
【０００６】
生体分子の相互作用を簡便かつ高感度で検出する方法として、AlphaScreen法（パーキンエルマー社）が知られている。AlphaScreen法は、ビーズ間の接近を利用した化学増幅型ルミネッセンス解析系であり、具体的にはAlphaScreenドナービーズとAlphaScreenアクセプタービーズにそれぞれ相互作用を解析したい基質を結合させ、６８０ｎｍの光を照射するとドナービーズが活性化されて周囲の酸素が一重項酸素に変換される。それらビーズ複合体が基質である生体高分子間の結合により物理的に接近した時、アクセプタービーズはこの一重項酸素を受け取り５２０−６２０ｎｍの光を発生する。
【０００７】
【非特許文献１】Bergmann, A., Yang, A. Y., and Srivastava, M.（2003） Curr. Opin. Cell Biol, 15 （6） : 717-724
【非特許文献２】Kren L, Brazdil J, Hermanova M, Goncharuk VN, Kallakury BV, Kaur P, Ross JS （2004）Appl ImmunohistochemMol Morphol. 12 （1） : 44-49
【非特許文献３】Ambrosini, G., Adida, C., and Altreri,  D.C. （1997）Nat. Med., 3 : 917-921
【非特許文献４】Li, F., Ambrosini, G., Chu, E.Y., Plescia, J., Tognin, S., Marchisio, P.C., and Altieri,D.C. （1998） Nature 396, 580-584
【非特許文献５】Tamm, I., Wang, Y., Sausville, E., Scudiero, D. A., Vigna, N., Oltersdorf, T., and Reed, J. C. （1998） Cancer Res. 58, 5315-5320
【非特許文献６】Fraser, A.G., James, C., Evan, G. I., and Hengartner, M. O. （1999） Nat. Cell Biol. 9, 293-301
【非特許文献７】Du, C., Fang, M., Li, Y., Li, L., and Wang, X. （2000） Cell 102, 33-42
【非特許文献８】Verhagen, A. M., Ekert, P. G., Pakusch, M., Silke, J., Connolly, L. M., Reid, G. E., Moritz, R. L., Simpson, R. J., and Vaux, D. L. （2000） Cell 102, 43-53
【非特許文献９】Uren, A. G., Wong, L., Pakusch, M., Fowler, K. J., Burrows, F. J., Vaux, D. L., and Choo, K. H.（2000）Curr. Biol, 2 ; 10（21）, 1319-1328
【非特許文献１０】Muchmore SW, Chen J, JakobC, Zakula D, Matayoshi ED, Wu W, Zhang H, Li F, Ng SC, Altieri DC. （2000） Mol. Cell 6 （1） :173-182
【非特許文献１１】Ekert, P. G., Silke, J., Hawkins, C. J., Verhagen, A. M., and Vaux, D. L. （2001） J. Cell Biol. 152, 483-490
【非特許文献１２】Srinivasula, S. M., Datta, P., Fan, X. J., Fernandes-Alnemri, T., Huang, Z., and Alnemri, E. S. （2000） J. Biol. Chem. 275, 36152-36157
【非特許文献１３】Chai, J., Du, C., Wu, J. W., Kyin, S., Wang, X., and Shi, Y. （2000）Nature 406, 855-862
【非特許文献１４】Wu, G., Chai, J., Suber, T. L., Wu, J. W., Du, C., Wang, X., and Shi, Y. （2000） Nature 408, 1008-1012
【非特許文献１５】Srinivasula, S. M., Hegde, R., Saleh, A., Datta, P., Shiozaki, E., Chai, J., Lee, R. A., Robbins, P. D., Fernandes-Alnemri, T., Shi, Y., and Alnemri, E. S. （2001） Nature 410, 112-116
【非特許文献１６】Chai, J., Shiozaki, E., Srinvasula, S. M., Wu, Q., Datta, P., Alnemri, E. S., Shi, Y., and Dataa, P. （2001） Cell 104, 769-780
【非特許文献１７】Sun, C., Nettesheim, D., Liu, Z., and Edward T. Olejniczak（2005）Biochemistry 44, 11-17
【非特許文献１８】Song, Z. Y., Yao, X. B., and Wu, M.（2003）J. Biol. Chem. 278, 23130-23140
【非特許文献１９】Wheatley SP, CarvalhoA et. al. (2001） Curr Biol. 11, 886-890
【非特許文献２０】Honda R, KornerR, and Nigg EA. (2003) Mol BiolCell. 14, 3325-3341
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ヒトサーバイビンタンパク、及び、それと相互作用するパートナータンパク（Ｓｍａｃタンパク、ＩＮＣＥＮＰタンパク、ヒトサーバイビンタンパク）間の相互作用を阻害する物質をハイスループットかつ高感度でスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、AlphaScreen法を利用して、ヒトサーバイビンタンパク、及び、それと相互作用するパートナータンパク（Ｓｍａｃタンパク、ＩＮＣＥＮＰタンパク、ヒトサーバイビンタンパク）間の相互作用を阻害する物質をスクリーニングすることにより、前述の阻害物質のスクリーニングをハイスループットかつ高感度で行い得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、（１）以下の工程ａ）〜ｄ）を備えたことを特徴とするヒトサーバイビン／Ｓｍａｃタンパク間相互作用阻害物質のハイスループットスクリーニング方法；ａ）ビオチン化ヒトサーバイビンタンパク及びヒスチジンタグ融合ヒトＳｍａｃタンパクを、被検物質の存在下又は非存在下の緩衝液中で反応させる一次反応液調製工程；ｂ）一次反応液に、ストレプトアビジン−ドナービーズ及びニッケルキレート−アクセプタービーズを加え、さらに反応させる二次反応液調製工程；ｃ）二次反応液中のストレプトアビジン−ドナービーズ結合ビオチン化ヒトサーバイビンタンパクと、ニッケルキレート−アクセプタービーズ結合ヒスチジンタグ融合Ｓｍａｃタンパク間の相互作用を、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ（AlphaScreen）法により測定・比較する測定・比較工程；ｄ）被検物質を添加した場合が添加しない場合に比べて、AlphaScreen法により測定されるシグナルが減少したとき、前記被検物質をヒトサーバイビン／Ｓｍａｃタンパク間相互作用阻害物質と評価する評価工程；に関する。
【００１１】
また本発明は、（２）以下の工程ａ）〜ｄ）を備えたことを特徴とするヒトサーバイビン／ＩＮＣＥＮＰタンパク間相互作用阻害物質のハイスループットスクリーニング方法；ａ）ビオチン化ヒトサーバイビンタンパク及びヒスチジンタグ融合ヒトＩＮＣＥＮＰタンパクを、被検物質の存在下又は非存在下の緩衝液中で反応させる一次反応液調製工程；ｂ）一次反応液に、ストレプトアビジン−ドナービーズ及びニッケルキレート−アクセプタービーズを加え、さらに反応させる二次反応液調製工程；ｃ）二次反応液中のストレプトアビジン−ドナービーズ結合ビオチン化ヒトサーバイビンタンパクと、ニッケルキレート−アクセプタービーズ結合ヒスチジンタグ融合ＩＮＣＥＮＰタンパク間の相互作用を、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ（AlphaScreen）法により測定・比較する測定・比較工程；ｄ）被検物質を添加した場合が添加しない場合に比べて、AlphaScreen法により測定されるシグナルが減少したとき、前記被検物質をヒトサーバイビン／ＩＮＣＥＮＰタンパク間相互作用阻害物質と評価する評価工程；に関する。
【００１２】
さらに本発明は、（３）以下の工程ａ）〜ｄ）を備えたことを特徴とするヒトサーバイビン二量体形成阻害物質のハイスループットスクリーニング方法；ａ）ビオチン化ヒトサーバイビンタンパク及びグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ融合ヒトサーバイビンタンパクを、被検物質の存在下又は非存在下の緩衝液中で反応させる一次反応液調製工程；ｂ）一次反応液に、ストレプトアビジン−ドナービーズ及び抗ＧＳＴ−アクセプタービーズを加え、さらに反応させる二次反応液調製工程；ｃ）二次反応液中のストレプトアビジン−ドナービーズ結合ビオチン化ヒトサーバイビンタンパクと、抗ＧＳＴ−アクセプタービーズ結合ＧＳＴタグ融合ヒトサーバイビンタンパク間の相互作用を、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ（AlphaScreen）法により測定・比較する測定・比較工程；ｄ）被検物質を添加した場合が添加しない場合に比べて、AlphaScreen法により測定されるシグナルが減少したとき、前記被検物質をヒトサーバイビン二量体形成阻害物質と評価する評価工程；に関する。
【００１３】
さらにまた本発明は、（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法により選択されるヒトサーバイビン／Ｓｍａｃタンパク間相互作用阻害物質、ヒトサーバイビン／ＩＮＣＥＮＰタンパク間相互作用阻害物質、ヒトサーバイビン二量体形成阻害物質を、抗腫瘍物質として評価することを特徴とする、がん治療剤のスクリーニング方法や、（５）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法により選択される、ヒトサーバイビン／Ｓｍａｃタンパク間相互作用阻害物質、ヒトサーバイビン／ＩＮＣＥＮＰタンパク間相互作用阻害物質、ヒトサーバイビン二量体形成阻害物質を、アポトーシス誘導物質として評価することを特徴とする、がん治療剤のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のスクリーニング方法によれば、ヒトサーバイビンタンパク、及び、それと相互作用するパートナータンパク（Ｓｍａｃタンパク、ＩＮＣＥＮＰタンパク、ヒトサーバイビンタンパク）間の相互作用を阻害する物質を、ハイスループットかつ高感度でスクリーニングすることができる。また、上記物質は抗腫瘍物質やアポトーシス誘導物質として機能する可能性が高いため、本発明のスクリーニング方法は、がん治療剤のスクリーニング方法として応用し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のスクリーニング方法は、ＳｍａｃタンパクやＩＮＣＥＮＰタンパクやヒトサーバイビンタンパク（以下、「パートナータンパク」ともいう）と、ヒトサーバイビンタンパクとの間の相互作用を阻害する物質（以下、「本発明における阻害物質」ともいう。）をハイスループットでスクリーニングする方法であり、以下の工程ａ）〜ｄ）を備えたことを特徴とする。
ａ）ビオチン化ヒトサーバイビンタンパク及びタグ融合パートナータンパクを、被検物質の存在下又は非存在下の緩衝液中で反応させる一次反応液調製工程；
ｂ）一次反応液に、ストレプトアビジン−ドナービーズと、ニッケルキレート−アクセプタービーズ又は抗ＧＳＴ−アクセプタービーズとを加え、さらに反応させる二次反応液調製工程；
ｃ）二次反応液中のストレプトアビジン−ドナービーズ結合ビオチン化ヒトサーバイビンタンパクと、ニッケルキレート−アクセプタービーズ又は抗ＧＳＴ−アクセプタービーズ結合タグ融合パートナータンパクとの間の相互作用を、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ（AlphaScreen）法により測定・比較する測定・比較工程；  
ｄ）被検物質を添加した場合が添加しない場合に比べて、AlphaScreen法により測定されるシグナルが減少したとき、前記被検物質をヒトサーバイビン／パートナータンパク間相互作用阻害物質と評価する評価工程；
【００１６】
上記工程ａ）〜ｄ）を備えている本発明のスクリーニング方法が利用するAlphaScreen法とは、６８０ｎｍの光を照射すると、ドナービーズが活性化されて周囲の酸素が一重項酸素に変換され、ドナービーズに近接したアクセプタービーズがこの一重項酸素を受け取ると５２０−６２０ｎｍの光を発生する性質を利用したものである。本発明のスクリーニング方法は、ヒトサーバイビンとパートナータンパクが相互作用しているかどうかを、それらのタンパクにそれぞれ結合したドナービーズとアクセプタービーズとの近接の有無により検出する方法である。本発明の方法は上記の工程を有することによって、本発明における阻害物質をハイスループットかつ高感度でスクリーニングすることができる。
【００１７】
上記工程ａ）としては、ビオチン化ヒトサーバイビンタンパク及びタグ融合パートナータンパクを、被検物質の存在下又は非存在下の緩衝液中で反応させる一次反応液調製工程である限り特に制限はされず、反応プロトコルについては、AlphaScreen検出キット（パーキンエルマー社製）に添付の説明書に記載されたプロトコルを好適に例示することができる。上記ビオチン化ヒトサーバイビンタンパクに用いるヒトサーバイビンタンパクは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク、若しくはそのタンパクと実質的に同一なタンパクである。配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパクと実質的に同一なタンパクとしては、配列番号４に示されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、上記パートナータンパクのいずれかと相互作用する領域を保持するタンパクを例示することができる。
【００１８】
上記ヒトサーバイビンタンパクは、後述の実施例に記載したように、ヒトｃＤＮＡライブラリーと、配列番号１及び２に示された配列からなるプライマーとを用いたＰＣＲによりヒトサーバイビング遺伝子をクローニングし、その遺伝子を適当なベクターに導入して得られた組換えベクターを適当な宿主に形質転換し、得られた形質転換細胞を培養し、得られた培養物を精製するなどして作製することができる。また、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパクと実質的に同一なタンパクについても、配列番号３に示されるＤＮＡ配列（配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列）に部位特異的変異を導入するなどして適宜作製することができる。
【００１９】
上記ビオチン化ヒトサーバイビンタンパクは、前述のヒトサーバイビンタンパクを公知の手法によりビオチン化することにより作製することができる。
【００２０】
上記タグ融合パートナータンパクとしては、ヒスチジンタグ融合ヒトＳｍａｃタンパク、ヒスチジンタグ融合ヒトＩＮＣＥＮＰタンパク、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ融合ヒトサーバイビンタンパクのいずれかであれば特に制限されない。
【００２１】
上記ヒスチジンタグ融合ヒトＳｍａｃタンパクに用いるヒトＳｍａｃタンパクは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク、若しくはそのタンパクと実質的に同一なタンパクである。配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するタンパクと実質的に同一なタンパクとしては、配列番号８に示されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、上記ヒトサーバイビンタンパクと相互作用する領域を保持するタンパクを例示することができる。
【００２２】
上記ヒトＳｍａｃタンパクは、後述の実施例に記載したように、ヒトｃＤＮＡライブラリーと、配列番号５及び６に示された配列からなるプライマーとを用いたＰＣＲによりヒトサーバイビン遺伝子をクローニングし、その遺伝子を適当なベクターに導入して得られた組換えベクターを適当な宿主に形質転換し、得られた形質転換細胞を培養し、得られた培養物を精製するなどして作製することができる。また、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するタンパクと実質的に同一なタンパクについても、配列番号７に示されるＤＮＡ配列（配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列）に部位特異的変異を導入するなどして適宜作製することができる。
【００２３】
上記ヒスチジンタグ融合ヒトＩＮＣＥＮＰタンパクに用いるヒトＩＮＣＥＮＰタンパクは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク、若しくはそのタンパクと実質的に同一なタンパクである。配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するタンパクと実質的に同一なタンパクとしては、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、上記ヒトサーバイビングタンパクと相互作用する領域を保持するタンパクを例示することができる。
【００２４】
上記ヒトＩＮＣＥＮＰタンパクは、後述の実施例に記載したように、ヒトｃＤＮＡライブラリーと、配列番号９及び１０に示された配列からなるプライマーとを用いたＰＣＲによりヒトサーバイビン遺伝子をクローニングし、その遺伝子を適当なベクターに導入して得られた組換えベクターを適当な宿主に形質転換し、得られた形質転換細胞を培養し、得られた培養物を精製するなどして作製することができる。また、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するタンパクと実質的に同一なタンパクについても、配列番号１１に示されるＤＮＡ配列（配列番号１２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列）に部位特異的変異を導入するなどして適宜作製することができる。
【００２５】
上記ＧＳＴタグ融合ヒトサーバイビンタンパクに用いるヒトサーバイビンタンパクは、前述のビオチン化ヒトサーバイビンタンパクに用いるヒトサーバイビンタンパクと同様である。
【００２６】
上記ヒスチジンタグ融合ヒトＳｍａｃタンパクは、前述のヒトＳｍａｃタンパクに公知の手法によりヒスチジンタグを付加することにより作製することができ、上記ヒスチジンタグ融合ヒトＩＮＣＥＮＰタンパクは、前述のヒトＩＮＣＥＮＰタンパクに公知の手法によりヒスチジンタグを付加することにより作製することができ、上記ＧＳＴタグ融合ヒトサーバイビンタンパクは、前述のヒトサーバイビンタンパクに公知の手法によりＧＳＴタグを付加することにより作製することができる。
【００２７】
上記工程ａ）で用いる緩衝液としては、ビオチン化ヒトサーバイビンタンパクと、そのパートナータンパクとの相互作用を妨げない限り特に制限されないが、AlphaScreen用緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌと０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ；ｐＨ７．４）を好適に例示することができる。
【００２８】
上記工程ｂ）としては、工程ａ）で得られた一次反応液に、ストレプトアビジン−ドナービーズと、ニッケルキレート−アクセプタービーズ又は抗ＧＳＴ−アクセプタービーズとを加え、さらに反応させる二次反応液調製工程である限り特に制限されず、反応プロトコルについては、AlphaScreen検出キット（パーキンエルマー社製）に添付の説明書に記載されたプロトコルを好適に例示することができる。上記のドナービーズやアクセプタービーズとしては、AlphaScreen His6 検出キット又はAlphaScreen GST 検出キット（それぞれパーキンエルマー社製）に含まれるドナービーズやアクセプタービーズを好適に例示することができる。
なお、アクセプタービーズの種類は、スクリーニング方法に用いるパートナータンパクのタグの種類に応じて選択することができる。例えば、パートナータンパクのタグがヒスチジンタグの場合は、アクセプタービーズとしてAlphaScreen His6 検出キットに含まれるアクセプタービーズを、パートナータンパクのタグがＧＳＴの場合はアクセプタービーズとしてAlphaScreen GST検出キットに含まれるアクセプタービーズをそれぞれ用いることができる。
【００２９】
上記工程ｃ）としては、工程ｂ）で得られた二次反応液中のストレプトアビジン−ドナービーズ結合ビオチン化ヒトサーバイビンタンパクと、ニッケルキレート−アクセプタービーズ又は抗ＧＳＴ−アクセプタービーズ結合タグ融合パートナータンパクとの間の相互作用を、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ（AlphaScreen）法により測定・比較する測定・比較工程である限り特に制限されない。ヒトサーバイビンタンパクとそのパートナータンパクとの相互作用は、蛍光シグナル（AlphaScreenシグナル）として検出することができる。蛍光シグナルの検出に用いる装置としては、EnVision（パーキンエルマー社製）を好適に例示することができる。
【００３０】
上記工程ｄ）としては、被検物質を添加した場合が添加しない場合に比べて、AlphaScreen法により測定されるシグナル（AlphaScreenシグナル）が減少したとき、前記被検物質をヒトサーバイビン／パートナータンパク間相互作用阻害物質と評価する評価工程である限り特に制限されない。被検物質を添加した場合が添加しない場合に比べてAlphaScreenシグナルが減少した場合は、ヒトサーバイビン／パートナータンパク間の相互作用が低下したことを意味するため、その被検物質はヒトサーバイビン／パートナータンパク間の相互作用阻害物質と評価することができる。
【００３１】
上記の本発明のスクリーニング方法によって得られる本発明における阻害物質は、アポトーシス誘導物質や抗腫瘍物質である可能性が高い。以下に各パートナータンパクの種類ごとにその理由を述べる。
【００３２】
（１）ヒトサーバイビン／Ｓｍａｃタンパク間相互作用阻害物質
背景技術で引用された非特許文献１８には、サーバイビンは直接的にカスパーゼに結合して抑制させるわけではなく、Ｓｍａｃに結合することでＳｍａｃがXIAPなどの抗アポトーシス効果を中和させる作用を阻害し、XIAPなどの抗アポトーシス作用を亢進させる旨が記載されている。このことから、ヒトサーバイビン／Ｓｍａｃタンパク間の相互作用を阻害する物質は、アポトーシス誘導物質である可能性が高く、したがって、抗腫瘍物質である可能性も高い。
【００３３】
（２）ヒトサーバイビン／ＩＮＣＥＮＰタンパク間相互作用阻害物質
一般的に、大部分のサーバイビンはインナーセントロメアに存在し、メタフェーズからアナフェーズへの進行に関与していると考えられている。さらに、サーバイビンは細胞周期に依存して局在が変化することからも、サーバイビンの機能を果たす上でその局在が重要であることが示唆されている。さらに、ＩＮＣＥＮＰのドミナントネガティブによりサーバイビンの局在が変わるという報告（非特許文献１９、２０）を考慮すると、ヒトサーバイビン／ＩＮＣＥＮＰタンパク間相互作用阻害物質は、サーバイビンの局在変化によるサーバイビンの機能低下を誘導し、その結果アポトーシスを誘導し、抗腫瘍活性を発揮する物質である可能性が高い。
【００３４】
（３）ヒトサーバイビン二量体形成阻害物質
サーバイビンのダイマーがＳｍａｃとの結合に重要であるという報告（Sun C., Nettesheim D., et. al. (2005) Biochemistry 44(1), 11-17）を考慮すると、サーバイビンの二量体形成を阻害する物質は、アポトーシス誘導物質である可能性が高く、したがって、抗腫瘍物質である可能性も高い。
【００３５】
以上のように、本発明における阻害物質は、アポトーシス誘導物質や抗腫瘍物質である可能性が高いため、本発明のスクリーニング方法はがん治療剤のスクリーニング方法としても用いうる。本発明のがん治療剤のスクリーニング方法は、上記のヒトサーバイビン／パートナータンパク間相互作用阻害物質のスクリーニング方法により選択されるヒトサーバイビン／Ｓｍａｃタンパク間相互作用阻害物質、ヒトサーバイビン／ＩＮＣＥＮＰタンパク間相互作用阻害物質、ヒトサーバイビン二量体形成阻害物質を、抗腫瘍物質又はアポトーシス誘導物質として評価することを特徴とする。
【００３６】
上記の抗腫瘍物質又はアポトーシス誘導物質として評価する方法としては、特に制限されず、本発明における阻害物質を腫瘍細胞やがん患者に投与し、その腫瘍細胞のバイアビリティの低下や細胞死が生じるかどうかを調べたり、がん患者の腫瘍の増殖が抑制されるかどうかを調べるなどして、抗腫瘍物質やアポトーシス誘導物質として評価することができる。
【００３７】
なお、本発明における阻害物質のスクリーニング方法やがん治療剤のスクリーニング方法に用いる被検物質としては、本発明における阻害物質であるかどうかや、がん治療効果を有する物質であるかどうかが不明である物質だけでなく、本発明における阻害物質であることや、がん治療効果を有する物質であることが判明している物質を用いることもできる。それらの判明している物質を被検物質として用いる場合、本発明のスクリーニング方法は、被検物質の阻害活性の程度やがん治療効果の程度を調べるアッセイ方法として利用することができる。
【００３８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
［組み換えＧＳＴ-ヒトサーバイビンタンパク質の作製］
サーバイビンは、Inhibitor of apoptosis protein（ＩＡＰ）ファミリーに含まれる分子量１６．５ｋＤａのタンパク質で、１つのbuculovirus IAP repeat （ＢＩＲ）ドメインを持ち、really interesting new geneフィンガーモチーフを欠くという特別な構造を有している（図１）。本発明では、Human Universal Quick-Clone cDNAII(Clone-Tech社製）を鋳型に、BamHI認識配列を含む上流プライマー（配列番号１）とSalI認識配列を含む下流プライマー（配列番号２）を用いてPolymerase Chain Reaction（ＰＣＲ法）を行い、ヒトサーバイビン遺伝子をクローニングした。得られたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を配列番号３に、またそのＤＮＡ配列のコードするアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００４０】
上記のＰＣＲ産物をpBluescriptIIKS (+)ベクターへライゲートし、ＤＮＡ配列解析により変異が入っていないことを確認した後、ベクターをBamHI及びSalIにより消化することにより、ヒトサーバイビン遺伝子フラグメントを切り出した。pGEX6P-1発現ベクター（アマシャム社製）にヒトサーバイビン遺伝子フラグメントをサブクローニングし、組換えタンパク質発現用大腸菌であるBL21 Star（DE3）pLysSに導入した。形質転換体を６００ｎｍの吸光度が０．５に達するまで振盪培養し、終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加することでＧＳＴ結合タンパク質の発現を誘導し、さらに２３℃で一晩振盪培養した。培養後の菌体は、冷却したリン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ） で洗浄した後、溶解用緩衝液 （５０ｍＭトリス緩衝液 ; ｐＨ７．４、５００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．５％ＮＰ−４０、１ｍＭＥＤＴＡ、５％スクロース）に懸濁した。懸濁液を超音波処理することにより菌体を破砕し、遠心後の上清を採取した。
【００４１】
得られた上清に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質精製用担体であるGlutathion Sepharose High Performance（以下グルタチオンビーズと略す；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を加え、４℃で２時間反応させた。その後、溶解用緩衝液で２回、洗浄溶液 （５０ｍＭトリス緩衝液；ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  β-メルカプトエタノール、０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％スクロース）で３回洗浄し、ゲル担体に結合したＧＳＴ-ヒトサーバイビンタンパク質を精製した。
【実施例２】
【００４２】
実施例１により、目的のＧＳＴ-サーバイビンタンパク質が得られたどうかを、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びＣＢＢ（クーマシーブリリアントブルー）染色により確認した（図２）。図２の各レーンには、以下のサンプルを１０μｌずつアプライした；
レーン１及び３：タンパク質分子量マーカーであるＳＤＳ-ＰＡＧＥ Standards Broad Range（Bio-Rad社製）
レーン２：実施例１により取得した試料（ＧＳＴ-ヒトサーバイビンタンパク質）
レーン４：実施例１により取得した試料をPreScission Protease処理（４℃で１６時間）することでＧＳＴとサーバイビンタンパク質と分解した試料
【００４３】
ExPASy Proteomics Serverにて算出したＧＳＴ-サーバイビンタンパクの理論分子量は４３．２ｋＤａであった。図２のレーン３に示すように、実施例１で得られたタンパクの分子量はこの理論分子量とほぼ同じあった。また、PreScissionProtease処理した試料（図２、レーン４）では、分子量の異なる３つのバンドが認められたが、これらはそれぞれ、約４５ｋＤａのバンド：ＧＳＴ-サーバイビン、約３０ｋＤａのバンド：ＧＳＴ、約２０ｋＤａのバンド：サーバイビンであると推測される。実施例１によりＧＳＴ-ヒトサーバイビンタンパク質を得られたと考えられる。また、本操作より得られるＧＳＴ-サーバイビンのタンパク量は、１ｍｌの大腸菌培養液から約６μｇであった。
【００４４】
さらに、ウエスタンブロット法により、実施例１で得られた試料がサーバイビンタンパクであるかどうかを検討した（図３）。１次抗体として抗−サーバイビンウサギ抗体（Chemicon社製；＃ＡＢ３６１０）を用いたウエスタンブロット法による解析の結果、分子量約４５ｋＤａのバンドが検出された（図３、レーン２）。上記のＣＢＢ染色及びウエスタンブロット法の結果から、実施例１によりＧＳＴ−ヒトサーバイビンタンパク質が得られたことが確認された。
【実施例３】
【００４５】
［組み換えヒトＳｍａｃ−Ｈｉｓ６タンパク質の作製］
本発明ではタンパク質間相互作用の解析に用いる組み換えヒトＳｍａｃとして、アポトーシス刺激によりミトコンドリアから放出される成熟型Ｓｍａｃ（５６−２３９番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列）を用いた。本実験では、Human Universal Quick-Clone cDNAII(Clone-Tech社製）を鋳型に、NcoI認識配列を含む上流プライマー（配列番号５）とHindIII認識配列を含む下流プライマー（配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、ヒトＳｍａｃ遺伝子をクローニングした。得られたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を配列番号７に、またそのＤＮＡ配列のコードするアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００４６】
上記のＰＣＲ産物をpBluescriptIIKS (+)ベクターへライゲートし、ＤＮＡ配列解析により変異が入っていないことを確認した後、ベクターをNcoI及びHindIIIにより消化することにより、ヒトＳｍａｃ遺伝子フラグメントを切り出した。６個のヒスチジン残基のペプチド残基（Ｈｉｓ６）をタグとして組み込むことが可能なpET28a発現ベクターにヒトＳｍａｃ遺伝子フラグメントをサブクローニングし、組換えタンパク質発現用大腸菌であるBL21 Star（DE3）pLysSに導入した。形質転換体を６００ｎｍの吸光度が０．５に達するまで振盪培養し、終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加することでＧＳＴ結合タンパク質の発現を誘導し、さらに２３℃で一晩振盪培養した。培養後の菌体は、冷却したリン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）で洗浄した後、溶解用緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  トリス緩衝液；ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  β-メルカプトエタノール、 ０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％スクロース）に懸濁した。懸濁液を超音波処理することにより菌体を破砕し、遠心後の上清を採取した。
【００４７】
得られた上清に、Ｈｉｓ６融合タンパク質精製用クロマトグラフィー担体であるNi Sepharose High Performance （以下Ｎｉビーズと略す；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を加え、４℃で２時間反応させた。溶解用緩衝液で２回、洗浄溶液Ｂ（５０ｍＭトリス緩衝液；ｐＨ７．４、３００ｍＭＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、５ｍＭβ-メルカプトエタノール、０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％スクロース） で３回洗浄した。その後、ポリエンプティーカラム （Bio-Rad社製）を用いたカラムクロマトグラフィーを行い、溶出緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  トリス緩衝液；ｐＨ７．４、３００ｍＭ    ＮａＣｌ、４０−２５０ｍＭ  イミダゾール、１０ｍＭ  β-メルカプトエタノール、０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）により溶出することでヒトＳｍａｃ−Ｈｉｓ６を精製した。
【実施例４】
【００４８】
実施例３により、目的のヒトＳｍａｃ−Ｈｉｓ６タンパク質が得られたどうかを、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びＣＢＢ（クーマシーブリリアントブルー）染色により確認した（図４）。ExPASy Proteomics Serverにより得られるヒトＳｍａｃ−Ｈｉｓ６の理論分子量は２２．４ｋＤａあった。図４に示すように、実施例３で得られた溶出試料の分子量はこの理論分子量とほぼ同じであった。また、本操作より得られるヒトＳｍａｃ-Ｈｉｓ６のタンパク量は、１ｍｌの大腸菌培養液から２．５μｇであった。
【００４９】
さらに、ウエスタンブロット法により、実施例３で得られた試料がヒトＳｍａｃタンパクであるかどうかを検討した（図５）。１次抗体として抗−Ｓｍａｃウサギ抗体（Chemicon社製）を用いたウエスタンブロット法による解析の結果、分子量約２２ｋＤａのバンドが検出された（図５、レーン１）。上記のＣＢＢ染色及びウエスタンブロット法の結果から、実施例３によりヒトＳｍａｃ−Ｈｉｓ６タンパク質が得られたことが確認された。
【実施例５】
【００５０】
［組み換えヒトＩＮＣＥＮＰ-Ｈｉｓ６タンパク質の作製］
ヒトＩＮＣＥＮＰの遺伝子の全長は２７６０ｂｐであるが、本発明ではその１−９３３番目の塩基の部分をクローニングした。本発明では、Human Universal Quick-Clone cDNAII(Clone-Tech社製）を鋳型に、NedI認識配列を含む上流プライマー（配列番号９）とHindIII認識配列を含む下流プライマー（配列番号１０）を用いてＰＣＲを行い、ヒトＩＮＣＥＮＰ遺伝子をクローニングした。得られたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を配列番号１１に、またそのＤＮＡ配列のコードするアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【００５１】
上記のＰＣＲ産物をpBluescriptIIKS (+)ベクターへライゲートし、ＤＮＡ配列解析により変異が入っていないことを確認した後、ベクターをNedI及びHindIIIにより消化することにより、ヒトＩＮＣＥＮＰ遺伝子フラグメントを切り出した。６個のヒスチジン残基のペプチド残基（Ｈｉｓ６）をタグとして組み込むことが可能なpET28a発現ベクターにヒトＳｍａｃ遺伝子フラグメントをサブクローニングし、組換えタンパク質発現用大腸菌であるBL21 Star（DE3）pLysSに導入した。形質転換体を６００ｎｍの吸光度が０．５に達するまで振盪培養し、終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加することでＧＳＴ結合タンパク質の発現を誘導し、さらに２３℃で一晩振盪培養した。培養後の菌体は、冷却したリン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ） で洗浄した後、溶解用緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  トリス緩衝液；ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  β-メルカプトエタノール、 ０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％スクロース）に懸濁した。懸濁液を超音波処理することにより菌体を破砕し、遠心後の上清を採取した。
【００５２】
得られた上清に、Ｈｉｓ６融合タンパク質精製用クロマトグラフィー担体であるNi Sepharose High Performance（以下Ｎｉビーズと略す；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を加え、４℃で２時間反応させた。溶解用緩衝液で２回、洗浄溶液Ｂ（５０ｍＭトリス緩衝液；ｐＨ７．４、３００ｍＭＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、５ｍＭβ-メルカプトエタノール、０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％スクロース） で３回洗浄した。その後、ポリエンプティーカラム （Bio-Rad社製）を用いたカラムクロマトグラフィーを行い、溶出緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリス緩衝液；ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０−２５０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭβ-メルカプトエタノール、０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭＥＤＴＡ）により溶出することでヒトＩＮＣＥＮＰ−Ｈｉｓ６を精製した。
【００５３】
念のため、精製したタンパク質が、目的のヒトＩＮＣＥＮＰ−Ｈｉｓ６タンパク質であるかどうかを、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びＣＢＢ（クーマシーブリリアントブルー）染色により確認した（図６）。ExPASy Proteomics Serverにより得られるヒトＩＮＣＥＮＰ−Ｈｉｓ６の理論分子量は３５．７ｋＤａあるが、図６のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、この理論分子量にほぼ一致していたことから、目的のヒトＩＮＣＥＮＰ−Ｈｉｓ６タンパク質が得られたと考えられる。なお、本操作より得られるヒトＩＮＣＥＮＰ-Ｈｉｓ６のタンパク量は、６ｍｌの大腸菌培養液から３μｇであった。
【実施例６】
【００５４】
［ビオチン化タンパク質発現用ベクターの作製］
組換えビオチン化ヒトサーバイビンタンパク質の作製のため、Ｎ末端へＨｉｓ６タグとHRV3C protease認識領域を、Ｃ末端にアビジンタグをそれぞれ導入したpColdベクター（ビオチン化タンパク質発現用ベクター）を作製した。以下にそれぞれの領域の導入方法を具体的に示す。配列番号１３及び１４に示すpCold-His6-HRV3C proteas認識領域オリゴヌクレオチドをＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭトリス緩衝液 ;ｐＨ７．４、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌ）中でアニールさせ、T4 polynucleotide Kinase （TOYOBO社製） で５’末端をリン酸化し、Ligation highよりpColdIIベクターに挿入した。このベクターをヒートショック法により大腸菌（DH5α）へ導入し、４μｌの８００ｍＭ  ＩＰＴＧ及び４０μｌの２０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌとともに、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にプレートした。３７℃で一晩培養した後、カラーセレクションを行った。白色コロニーから得た大腸菌から、ミニプレップ法よりプラスミドを抽出し、遺伝子配列解析にてＤＮＡ配列を確認した。また、配列番号１５及び１６に示す、ビオチン結合領域アビジンタグのオリゴヌクレオチドをＴＥＮ緩衝液中でアニールさせた後、５’末端をリン酸化し、Ligation highを用いてpColdベクター中のHRV3C protease認識配列部分に連結させ、pCold-His6-HRV3C protease認識配列-アビジンタグを取得した。
【実施例７】
【００５５】
［組換えビオチン化ヒトサーバイビンタンパク質の作製］
組換えビオチン化ヒトサーバイビンタンパク質作製のために、新たにヒトサーバイビン遺伝子をクローニングした。クローニングは、実施例１で作製したヒトサーバイビン遺伝子導入pBluescriptIIベクターを鋳型とし、NdeI認識配列を含む上流プライマー（配列番号１７）及びSalI認識配列を含む下流プライマー（配列番号１８）を用いたＰＣＲ法により行った。
【００５６】
上記のＰＣＲ産物をpBluescriptIIKS (+)ベクターへライゲートし、ＤＮＡ配列解析により変異が入っていないことを確認した。ベクターをNdeI及びSalIにより消化することにより、ヒトサーバイビン遺伝子フラグメントを切り出し、前述のビオチン化タンパク質発現用ベクターにサブクローニングした。この組換えベクターを、予めビオチンリガーゼを発現するpBirAベクターを導入したBL21 Star（DE3）pLysSに形質導入した。この形質転換体を、５０μＭビオチンと１ｍＭＩＰＴＧ存在下、１５℃で２４時間振盪培養することにより、Ｈｉｓ６-ビオチン化サーバイビンタンバク質の発現を誘導した。培養後に遠心分離により菌体を回収し、ＰＢＳで洗浄した後、溶解用緩衝液Ｃ（５０ｍＭトリス緩衝液；ｐＨ７．４、５００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、５ｍＭβ-メルカプトエタノール、０．１％ＮＰ−４０、１０％グリセロール）に懸濁した。懸濁液を超音波処理することにより菌体を破砕し、遠心後の上清を採取した。この上清とＮｉビーズを４℃で２時間反応させた後、Ｎｉビーズは溶解用緩衝液Ｃで２回、洗浄溶液Ｂで３回それぞれ洗浄し、さらに、ＨＲＶ３Ｃprotease存在下、４℃で１６時間転倒混和することにより、ビオチン化ヒトサーバイビンを精製した。
【００５７】
念のため、精製したタンパク質が、目的のビオチン化ヒトサーバイビンタンパク質であるかどうかを、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びＣＢＢ（クーマシーブリリアントブルー）染色により確認した（図７）。
実施例７で得られた前述の菌体溶解液にStreptavidin SepharoseHigh Performance （ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；以下ＳＡビーズと略す）を反応させると、pCold-サーバイビン-アビジンタグを導入した大腸菌の溶解液を用いたものから２６ｋＤａほどの位置にバンドが確認できた（図７、レーン１）。同様に、溶解液を反応させたＮｉビーズからも２６ｋＤａ付近にバンドが確認でき（図７、レーン３）、ＨＲＶ３ＣProtease 処理でこのビーズに結合したタンパク質からＨｉｓタグを除去した場合、２３ｋＤａほどの位置にタンパク質が確認できた（図７、レーン５）。これに対して、コントロールとして空ベクターを導入した大腸菌溶解液からは、ＳＡビーズ（図７、レーン２）、Ｎｉビーズ（図７、レーン４）、ＨＲＶ３ＣProtease で処理したＮｉビーズ（図７、レーン６）のいずれにおいても該当するバンドは確認できなかった。以上の結果と、ビオチン化ヒトサーバイビンタンパク質の理論上分子量は２６ｋＤａであることとを考慮した結果、精製したタンパク質は、目的のビオチン化ヒトサーバイビンタンパク質であると考えられた。
なお、本操作より得られるビオチン化サーバイビンのタンパク量は１ｍｌの大腸菌培養液から１５μｇであった。
【実施例８】
【００５８】
［ＧＳＴプルダウン法によるタンパク質間相互作用の解析］
上記の方法で得られた各組換えタンパク質間の相互作用に関して検討する目的で、ＧＳＴプルダウンアッセイを行った。グルタチオンビーズに結合したＧＳＴ-サーバイビンを、Ｓｍａｃ-Ｈｉｓ６、ＩＮＣＥＮＰ-Ｈｉｓ６と、それぞれモル濃度比１対１、又は１対２となるように混和し、４℃で１２０分間転倒させながら反応させた。反応後、遠心分離によりビーズとの複合体を沈殿させ溶解用緩衝液Ａで３回洗浄した。この試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥを用い１２．５％アクリルアミドゲルに展開し、その分子量の大きさによって各タンパク質を検出した。
【００５９】
その結果、ＧＳＴ-ヒトサーバイビンにＳｍａｃ-Ｈｉｓ６を混合した試料では２５ｋＤａ付近にＳｍａｃ-Ｈｉｓ６に相当するバンドが、ＩＮＣＥＮＰ-Ｈｉｓ６を混和した試料からは３５ｋＤａ付近にＩＮＣＥＮＰ-Ｈｉｓ６に相当するバンドが検出された。一方、グルタチオンビーズとＧＳＴとの複合体のみを反応させた場合では検出されなかった（図８）。これらの結果から、作製した組換えヒトサーバイビンタンパクはヒトＳｍａｃやヒトＩＮＣＥＮＰに対する結合能を有していることが示された。
【実施例９】
【００６０】
［AlphaScreen法を用いた試験管内相互作用の解析］
実施例７で作製したビオチン化サーバイビンと、各組換えタンパク質と相互作用をAlphaScreen法により検出した。AlphaScreen用緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌと０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ；ｐＨ７．４）に、各組換えタンパク質を以下のように加えた；
（１）５０ｎＭビオチン化サーバイビン、５０ｎＭＳｍａｃ-Ｈｉｓ６、及び３００μｇ／ｍｌＢＳＡ：
（２）１．２μＭビオチン化サーバイビン、１．０μＭＩＮＣＥＮＰ-Ｈｉｓ６、及び３０μｇ／ｍｌＢＳＡ：
（３）５００ｎＭビオチン化サーバイビン、５００ｎＭＧＳＴ-サーバイビン、及び３００μｇ／ｍｌＢＳＡ：
【００６１】
（１）及び（２）は２５℃で１時間、（３）は３７℃で２時間反応させた。次に、各反応液にAlphaScreen His6 検出キット又はAlphaScreen GST 検出キット（それぞれパーキンエルマー社製）に含まれるドナービーズとアクセプタービーズをそれぞれ２０μｇ／ｍｌに加え、遮光下で２５℃、１時間させて反応させた。その後、EnVision（パーキンエルマー社製）を用いて各タンパク質相互作用により得られるAlphaScreenシグナルを測定した（図９）。また、（１）〜（３）の各サンプルについて、コントロールとなるサンプルを作製し、同様にAlphaScreenシグナルを測定した（図９）。
図９に示すように、ビオチン化サーバイビンと、Ｓｍａｃ-Ｈｉｓ６、ＩＮＣＥＮＰ-Ｈｉｓ６、又はＧＳＴ−サーバイビンとのタンパク間相互作用を示す、AlphaScreenシグナルが検出され、それらのシグナルはそれぞれのコントロールに対して有意であった。この結果は、実施例８のＧＳＴプルダウン法の結果と一致するものであった。
【実施例１０】
【００６２】
［非ビオチン化サーバイビンを用いたAlphaScreen反応系の競合実験］
実施例９で検出された、ビオチン化サーバイビンと、Ｓｍａｃ-Ｈｉｓ６、ＩＮＣＥＮＰ-Ｈｉｓ６、又はＧＳＴ−サーバイビンとのそれぞれのタンパク間相互作用に対して、非ビオチン化サーバイビンが競合作用を示すかどうかを検討した。AlphaScreen用緩衝液に、各組換えタンパク質を以下のように加え、２５℃で1時間反応させた；
１）０又は３０００ｎＭの非ビオチン化サーバイビン、５００ｎＭビオチン化サーバイビン、５００ｎＭのＳｍａｃ-Ｈｉｓ６、及び３００μｇ／ｍｌのＢＳＡ：
２）０又は１００００ｎＭの非ビオチン化サーバイビン、３００ｎＭビオチン化サーバイビン、１．０μＭのＩＮＣＥＮＰ-Ｈｉｓ６、及び３０μｇ／ｍｌのＢＳＡ：
３）０又は１００００ｎＭの非ビオチン化サーバイビン、３００ｎＭビオチン化サーバイビン、６０ｎＭのＧＳＴ-サーバイビン、及び３００μｇ／ｍｌのＢＳＡ：
【００６３】
次に、各反応液にAlphaScreen His6 検出キット又はAlphaScreen GST 検出キット（それぞれパーキンエルマー社製）に含まれるドナービーズとアクセプタービーズをそれぞれ２０μｇ／ｍｌに加え、遮光下で２５℃、１時間させて反応させた。その後、EnVisionによりAlphaScreenシグナルを測定した。その結果、非ビオチン化サーバイビン存在下で、サーバイビンとＳｍａｃとの結合は８０％、サーバイビンとＩＮＣＥＮＰとの結合は６０％、サーバイビン同士の結合は７０％それぞれ減弱した（図１０）。また、図１１に示すように、非ビオチン化サーバイビンの競合作用は濃度依存的であった。これらの結果から、ビオチン化サーバイビンと、Ｓｍａｃ-Ｈｉｓ６、ＩＮＣＥＮＰ-Ｈｉｓ６、又はＧＳＴ−サーバイビンとのそれぞれのタンパク間相互作用を、AlphaScreen法を用いて特異的に検出することが可能なアッセイ系を構築できたと考えられる。このアッセイ系は、９６穴プレートに溶液を混合させることにより検出でき、短時間で多数の検体を処理できるため、ホモジェニアスなハイスループットスクリーニング系として有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＩＡＰファミリーのタンパク質の構造を示す図である。
【図２】精製したＧＳＴ-サーバイビンタンパク質の発現をＣＢＢ染色により確認した図である。
【図３】精製したＧＳＴ-サーバイビンタンパク質の発現をウエスタンブロット法により確認した図である。
【図４】精製したヒトＳｍａｃ−Ｈｉｓ６タンパク質の発現をＣＢＢ染色により確認した図である。
【図５】精製したヒトＳｍａｃ−Ｈｉｓ６タンパク質の発現をウエスタンブロット法により確認した図である。
【図６】精製したヒトＩＮＣＥＮＰ−Ｈｉｓ６タンパク質の発現をＣＢＢ染色により確認した図である。
【図７】精製したビオチン化ヒトサーバイビンタンパク質の発現をＣＢＢ染色により確認した図である。
【図８】ＧＳＴプルダウンアッセイにより、組換えヒトサーバイビンタンパクと、ヒトＳｍａｃ又はヒトＩＮＣＥＮＰとの結合を検討した結果を示す図である。
【図９】ビオチン化サーバイビンと、Ｓｍａｃ-Ｈｉｓ６、ＩＮＣＥＮＰ-Ｈｉｓ６、又はＧＳＴ−サーバイビンとの、それぞれのタンパク間相互作用をAlphaScreen法により検討した結果を示す図である。
【図１０】ビオチン化サーバイビンと、Ｓｍａｃ-Ｈｉｓ６、ＩＮＣＥＮＰ-Ｈｉｓ６、又はＧＳＴ−サーバイビンとの、それぞれのタンパク間相互作用に対して、非ビオチン化サーバイビンが競合作用を示すかどうかをAlphaScreen法により検討した結果を示す図である。
【図１１】非ビオチン化サーバイビンの競合作用が濃度依存的であることを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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