(57)【要約】【課題】骨髄間質細胞から高率に神経様細胞へ分化させることができる細胞培養方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る細胞培養方法は、表面に複数のマイクロ容器１１を有し、隣接する前記マイクロ容器１１同士が開口部１３により連通した細胞培養容器において細胞を培養する細胞培養方法であって、前記細胞が単離された骨髄間質細胞であり、当該骨髄間質細胞の分化率が４０％以上であることを特徴とするものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に複数のマイクロ容器を有し、隣接する前記マイクロ容器同士が開口部により連通した細胞培養容器において細胞を培養する細胞培養方法であって、
前記細胞が単離された骨髄間質細胞であり、当該骨髄間質細胞の分化率が４０％以上であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
前記骨髄間質細胞培養用の培地にレチノイン酸及び／又は塩基性繊維芽細胞増殖因子を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
前記マイクロ容器を構成する凸部の高さが０．１μｍ〜５００μｍであることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記開口部の幅が１μｍ〜１００μｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
前記細胞培養容器が透明性を有する樹脂からなることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索及び薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。そのため、バイオテクノロジー分野で使用される細胞類は、極めて多様化してきている。
【０００３】
単離した細胞は、直ちに浮遊状態にて試験に用いられる場合もあるが、多くの場合、培養皿に接着させた状態で培養し、種々の試験、検査に用いられる。細胞培養に用いられる初代細胞、株化細胞には、生体内での試験いわゆるin vivo試験と同様の薬剤感受性、毒性反応などを示すことが要求される。すなわち、細胞培養容器上で生体内類似の細胞機能が必要とされる。
【０００４】
ところで、骨髄間質細胞は間葉系細胞を含み、神経細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞など様々な細胞に分化できる細胞である（非特許文献１、２）。このような分化能を有するため、胚性幹細胞や胎児幹細胞において懸念されている倫理問題や免疫抑制剤の副作用、増殖コントロール等の課題を考慮せずに、自家組織として採取することができる。また、ドナーの犠牲が少ない状況で臨床に使用できる。以上のような理由から、骨髄間質細胞の分化・増殖の研究が活発に進められている。
【０００５】
骨髄間質細胞から神経細胞に分化させるためには、例えば、以下の手段がある。まず脊髄や大腿骨から骨髄細胞を採取する。このとき、骨髄細胞には骨髄間質細胞以外に浮遊性の造血系細胞が含まれている。この造血系細胞は非接着性であることから、樹脂製の培養ディッシュ、培養ボトルで培養することで浮遊する。そのため、接着性である骨髄間質細胞と容易に分離することができる。
【０００６】
次に、分離された骨髄間質細胞を樹脂製の培養面が平面である培養ディッシュや培養ボトルに再度播種し、数時間から数日間培養する。その後、神経細胞に分化させるため、分化誘導剤を添加する。一般的に知られている分化誘導剤としては、レチノイン酸、塩基性繊維芽細胞増殖因子等を挙げることができる。このようにして神経細胞に分化させた場合、神経細胞への分化比率は約２０％である。
【０００７】
そのため、培養前に培養ディッシュや培養ボトルの表面をラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン等のタンパク性細胞外マトリクスやポリ−Ｌ−リシンやポリオルニチンのような合成高分子でコーティングし、培養に供することで分化率を高めることができる。（非特許文献３）
【非特許文献１】梅澤明弘、２００１年、分子細胞治療、第２巻、ｐ．１７−２４
【非特許文献２】伊澤良兼、外１名、２００３年、Molecular Medicine、Ｖｏｌ．４０臨時増刊号「再生医学」、ｐ．１４４−１５１
【非特許文献３】Kim BJ、外３名、NeuroReport、２００２年  Ｖｏｌ．１３、ｐ．１１８５−１１８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、骨髄間質細胞の分化方向の制御は容易でない。また、臨床応用や研究用途では、より高効率に目的とする細胞へ分化させることが望まれている。なぜなら、上記各種試験において神経細胞を使用する場合、目的とする細胞以外の細胞へ分化すると、その分離に極めて多大な時間を要するからである。
【０００９】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、骨髄間質細胞から高率に神経様細胞へ分化させることができる細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る細胞培養方法は、表面に複数のマイクロ容器を有し、隣接する前記マイクロ容器同士が開口部により連通した細胞培養容器において細胞を培養する細胞培養方法であって、前記細胞が単離された骨髄間質細胞であり、当該骨髄間質細胞の分化率が４０％以上であることを特徴とするものである。前記骨髄間質細胞培養用の培地にレチノイン酸及び／又は塩基性繊維芽細胞増殖因子を含むのが好ましい。
【００１１】
前記マイクロ容器を構成する凸部の高さが０．１μｍ〜５００μｍであるのが好ましい。また、前記開口部の幅が１μｍ〜１００μｍであるのが好ましい。さらに、前記細胞培養容器が透明性を有する樹脂からなるのが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、骨髄間質細胞から高率に神経様細胞へ分化させることができる細胞培養方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究した結果、培養面に凹凸パターンすなわち複数のマイクロ容器が形成され、かつ、隣接するマイクロ容器同士が連通した細胞培養容器において、単離された骨髄間質細胞を培養することにより、高率に神経様細胞に分化させることができることを見出した。分化率は４０％以上であることが好ましい。以下、本発明の実施の形態について説明する。ただし、本発明が以下の実施の形態に限定されるわけではない。また、説明を明確にするため、以下の記載及び図面は、適宜、簡略化されている。
【００１４】
実施の形態
実施の形態にかかる細胞培養容器の構成について図１（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を用いて説明する。図１（ａ）は、実施の形態にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）のＩＢ−ＩＢ断面図である。図１（ｃ）は、図１（ａ）の凹凸パターンの形状、大きさならびに配列を示す平面図である。
【００１５】
細胞培養容器の培養面には、図１（ａ）に示すように凹凸パターンからなる細胞培養領域１０が形成されている。細胞培養領域１０は図１（ａ）に示した１０ｍｍ×１０ｍｍに限定されることはなく、領域の大きさは細胞培養に関する実験条件や実験方法で任意に設定してよい。細胞培養容器のプレート形状ならびに大きさは、図１（ａ）の直径２５ｍｍの円形に限定されることはなく、大きさも限定されることはない。
【００１６】
細胞培養容器の断面の厚みは５０μｍ〜１０００μｍが好ましく、１００μｍ〜５００μｍがより好ましい。５０μｍよりも薄いと強度が低過ぎ、細胞培養容器の取扱いが困難となり、また１０００μｍより厚いと倒立型光学顕微鏡による観察に支障をきたす。
【００１７】
図１（ｃ）に示すように、細胞培養領域１０はマイクロ容器１１、凸部１２、開口部１３を備える。細胞培養領域１０には、凸部１２が網目状に形成されており、この凸部１２に四方を囲われた空間がマイクロ容器１１となる。また、各マイクロ容器１１の四辺に形成された凸部１２の各辺の中央部に、開口部１３が形成されている。
【００１８】
細胞培養容器の凸部１１の高さは、０．１μｍ〜５００μｍが好ましく、１０〜１００μｍがより好ましい。０．１μｍよりも低いと細胞が凹凸パターンを認識せず、また５００μｍよりも高いと製造技術上の難易度が増し、高コストとなる。
【００１９】
細胞培養容器の開口部１３の幅は１μｍ〜１００μｍが好ましく、１０μｍ〜５０μｍがより好ましい。１μｍより狭いと製造技術上の難易度が増し、高コストとなり、１００μｍよりも広いと細胞が凹凸パターンを認識しなくなる。
【００２０】
本発明にかかる細胞培養容器を適用できる細胞は骨髄間質細胞であるが、その種は限定されるものでなく、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、ウサギ、ニワトリ、ヒト等が挙げられる。
【００２１】
細胞培養容器は光学顕微鏡観察を可能にするため、ガラスと同等もしくはこれに近い光透過率が必要であり、３００ｎｍ〜８００ｎｍの紫外線を含む光の透過率が８０％以上になる材料が好ましい。そのため、アクリレート系ポリマー、カーボネート系ポリマー、スチレン系ポリマー、環状オレフィン系ポリマー等の非晶性樹脂が好ましい。
【００２２】
樹脂製の細胞培養容器に培養液を注入すると、凹凸パターンにより形成される空間構造や間隙に気泡が付着し易くなり、細胞培養ならびに観察が困難となる。そのため、細胞培養容器表面を親水化処理することが好ましい。細胞培養容器表面を親水化する方法は種々の方法が適用できる。具体的には、真空蒸着、スパッタリングにより、細胞培養容器表面に金属、金属酸化物を成膜する方法、親水性高分子を細胞培養容器表面にコートする方法、低温プラズマ処理、コロナ放電処理等により細胞培養容器表面に官能基を導入し直接親水化する方法、等が挙げられる。
【００２３】
細胞培養容器を樹脂により成形する場合は金属構造体を金型として作製することが好ましい。金属構造体の作製は精密切削・研磨による方法、フォトリソグラフ法によりパターンを形成しこの上に金属を形成させる方法が挙げられる。
【００２４】
樹脂の成形は特に限定されないが、例えば射出成形、プレス成形、キャスト成形、等を挙げることができる。
【実施例】
【００２５】
次に本発明の実施様態を具体的な実施例で説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２６】
骨髄間質細胞の調製は雌のウィスターラットの大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を採取した。これを１０％のウシ胎児血清を含むαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）を入れたポリスチレン製の８０ｃｍ２セルカルチャーフラスコ（Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄ社）に播種し、３７℃、５％炭酸ガスを含む雰囲気下で１２時間培養した。培養後、培養液中の浮遊細胞及び培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。
【００２７】
さらに、セルカルチャーフラスコの底面に付着した細胞を、１０％のウシ胎児血清を含むαＭＥＭ培地中、３７℃、５％炭酸ガスを含む雰囲気下でさらに３〜５日間培養した。コンフルエントに達した細胞を、０．２５％トリプシンを含む１ｍＭＥＤＴＡ溶液にて回収した。これを３〜５倍に希釈して１０％のウシ胎児血清を含むαＭＥＭ培地中、３７℃、５％炭酸ガスを含む雰囲気下でさらに３〜５日間培養した。これら細胞の増殖の操作をさらに１回又は２回繰り返した後、神経様細胞分化用の骨髄間質細胞を得た。
【００２８】
細胞培養容器は熱をかけた金属構造体をメタアクリル樹脂フィルムに押し当て、図１（ａ）に示すように１０ｍｍ四方の領域に凹凸パターンを成形し、２５ｍｍの円形状に切り出した。図１（ｂ）に示すようにプレート厚みは凹凸パターンの高さも含め１５０μｍとなるように調整した。図１（ｃ）は凹凸パターンの詳細形状を示した。円形状に切り出したプレートの凹凸パターン成形側の表面に、ＳｉＯ２をエレクトロンビーム蒸着装置で膜厚が約１００ｎｍになるように蒸着した。その後、ガンマ線で滅菌し、分化評価用プレートを得た。分化評価用プレートは３５ｍｍφのポリスチレン製ディッシュの底面に凹凸パターン成形表面が上になるように設置し、骨髄間質細胞の神経様細胞への分化評価用ディッシュとした。
【００２９】
神経様細胞への分化評価は分化評価用ディッシュに、１０％のウシ胎児血清を含み、レチノイン酸と塩基性繊維芽細胞増殖因子の濃度がそれぞれ１０μＭ、２０ｎｇ／ｍｌであるＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｇｉｂｃｏ社）を入れた。これに神経様細胞分化用の骨髄間質細胞を１０５個／ディッシュで播種し、３７℃、５％炭酸ガスを含む雰囲気下で４日間培養した。
【００３０】
培養後、神経幹細胞の分子マーカーで中間径フィラメントであるネスチン又は神経細胞の分子マーカーである中間径フィラメント（以下、ＮＦ−Ｍと称す）の免疫染色をする。そのため、分化評価用ディッシュをＰＢＳで穏やかに洗浄した。そして、細胞を固定化するため４％のフォルムアルデヒドを含むＰＢＳを入れ、室温で２０分間静置した。
【００３１】
その後、分化評価用ディッシュをＰＢＳで洗浄し、１０％のヒツジ血清と０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳのブロッキング溶液を入れ、１２時間室温下でブロッキングした。
【００３２】
その後、ネスチンに対するマウス抗ネスチン抗体（ケミコンインターナショナル社）とＮＦ−Ｍに対するウサギ抗ＮＦ−Ｍ抗体（ケミコンインターナショナル社）をそれぞれ２００倍に希釈した１０％のヒツジ血清を含むＰＢＳの一次抗体溶液を入れ、１２時間室温で静置した。
【００３３】
一次抗体と反応後、二次抗体であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５５５で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８で標識されたニワトリ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を１０００倍希釈した１０％のヒツジ血清を含むＰＢＳの二次抗体溶液を入れ、１時間室温で静置した。
【００３４】
二次抗体と反応後、分化評価用ディッシュをＰＢＳで洗浄し、細胞の核を染色する４'，６−Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（以下ＤＡＰＩと称す）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）の０．３μＭのＰＢＳ溶液を入れ、５分間室温にて静置した。その後、分化評価用ディッシュをＰＢＳで洗浄し、神経様細胞観察用ディッシュを得た。
【００３５】
神経様細胞観察用ディッシュは神経幹細胞由来のネスチン、神経細胞由来のＮＦ−Ｍ、及び細胞の核を観察するため、共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス社製ＬＳＭ５１０）を使用し、レーザー波長３６４ｎｍ、４８８ｎｍ、及び５４３ｎｍにてそれぞれＤＡＰＩ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５５５を励起し、蛍光観察を行った。観察結果の評価は任意の一視野内における総細胞数（青色に光る陽性細胞数）に対する神経幹細胞数（赤色に光る陽性細胞数）、神経細胞数（薄緑色に光る陽性細胞数）のそれぞれの比率を比較した。各実施例及び比較例におけるＮＦ−Ｍ陽性細胞の比率を表１に示す。
【００３６】
［実施例１］
実施例１に係る細胞培養容器はアクリル樹脂からなる。図１に示すように、実施例１に係る細胞培養容器では、凸型パターンは縦１００μｍ、横１００μｍの十字の形で、高さ５０μｍの凸部１２が縦方向及び横方向に間隔２０μｍで配列されている。これにより、正方形状のマイクロ容器１１が形成される。また、当該正方形の各辺の中央部が幅２０μｍの開口部１３となり、各開口部１３において隣接する２つのマイクロ容器１１同士が連通している。骨髄間質細胞を培養した結果、薄緑色に蛍光を発する神経細胞が観察された。表１に示すように、実施例１のＮＦ−Ｍ陽性細胞の比率は７０％と高率であった。
【００３７】
［実施例２］
実施例２に係る細胞培養容器もアクリル樹脂からなる。図２に示すように、実施例２に係る細胞培養容器では、縦８０μｍ、横２０μｍ、高さ５０μｍの凸部１２が正方形状のマイクロ容器１１の各辺を構成するように配置されている。そして、当該正方形の各頂点に、２０μｍの開口部１３が形成され、各開口部１３において隣接する４つのマイクロ容器１１同士が連通している。表１に示すように、実施例２のＮＦ−Ｍ陽性細胞の比率は５０％と高率であった。
【００３８】
［実施例３］
実施例３に係る細胞培養容器もアクリル樹脂からなる。図３に示すように、実施例３に係る細胞培養容器では、縦６０μｍ、横２０μｍ、高さ５０μｍの第１の凸部１２ａと対角線が６０μｍの正方形で高さ５０μｍの第２の凸部１２ｂとが組み合わされてパターン配列させている。凸部の開口部１３の最小値は２２μｍである。各開口部１３において、隣接する４つのマイクロ容器１１同士が連通している。表１に示すように、実施例３のＮＦ−Ｍ陽性細胞の比率は４０％と高率であった。
【００３９】
［比較例１］
凹凸パターンが形成されていない分化評価用プレートをアクリル樹脂にて作製した。比較例１のＮＦ−Ｍ陽性細胞の比率は２５％と低率であった。
【００４０】
［比較例２］
分化評価用マルチプレートとして使用している６ウェルマルチウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）のウェル内にて直接調製した神経様細胞分化用の骨髄間質細胞を播種し、培養した。比較例２のＮＦ−Ｍ陽性細胞の比率は３０％と低率であった。
【００４１】
［比較例３］
比較例３に係る細胞培養容器もアクリル樹脂からなる。図４（ａ）に示すように、１０ｍｍ四方の領域に凹凸パターンからなる細胞培養領域１０を成形し、２５ｍｍの円形状に切り出した。図４（ｂ）に示すようにプレート厚みは凹凸パターンも含め１５０μｍとなるように調整した。図４（ｃ）には細胞培養領域１０の詳細形状を示した。凹凸パターンから構成されるマイクロ容器１１は、縦１００μｍ、横１００μｍ、深さ５０μｍであって、幅２０μｍの壁で仕切られている。比較例３のＮＦ−Ｍ陽性細胞の比率は２５％と低率であった。
【００４２】
実施例１〜３に示す通り、培養面に凹凸パターンすなわち複数のマイクロ容器１１が形成され、かつ、隣接するマイクロ容器１１同士が連通した細胞培養容器において、単離された骨髄間質細胞を培養することにより、高率に神経様細胞に分化させることができる。なお、いずれの実施例においてもネスチン陽性細胞はほとんど観察できなかった。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施例１にかかる分化評価用プレートの模式的平面図及び断面図である。
【図２】実施例２にかかる分化評価用プレートの模式的平面図である。
【図３】実施例３にかかる分化評価用プレートの模式的平面図である。
【図４】比較例３にかかる分化評価用プレートの模式的平面図及び断面図である。
【符号の説明】
【００４４】
１０  細胞培養領域
１１  マイクロ容器
１２  凸部
１２ａ  第１の凸部
１２ｂ  第２の凸部
１３  開口部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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