(57)【要約】【課題】本発明は、検体組織を含む最初のパラフィンブロックを有効に活用でき、対象の組織配列（組合せ）を任意に選択可能とする、組織マイクロアレイの作製方法を提供することを課題とする。【解決手段】検体組織を含む最初のパラフィンブロックをまず薄切し、薄切した試料から薄片切片試料を得、プレパラート上の所望の位置に薄片切片試料を配置することによる。効果的に薄片切片試料を得るために、弾力を有する合成樹脂製のプレート上に薄切試料をとり、該プレート上の薄切試料を水溶液に浮かべて広げ、広げた薄切試料を再度プレートにすくいとり、裁断用具にて薄片切片試料を得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む組織マイクロアレイの作製方法：
１）摘出検体組織を固定する工程； 
２）固定した検体組織を脱水し、パラフィン包埋する工程；
３）包埋試料を薄切して薄切試料を得る工程；
４）上記３）で得た薄切試料を、弾力を有する合成樹脂製のプレート上にとり、該プレート上の薄切試料を水溶液に浮かべて広げる工程；
５）上記４）を水溶液に浮かべた薄切試料を、弾力を有する合成樹脂製のプレート上にすくいとる工程；
６）上記５）のプレート上の薄切試料を裁断用具にて裁断して、薄片切片試料を得る工程。
７）上記６）の薄片切片試料をプレパラート上に配置する工程。
【請求項２】
６）の工程の後、７）の工程の前に、さらに、薄片切片試料を水溶液に浮かべる工程を含む、請求項１に記載の組織マイクロアレイの作製方法。
【請求項３】
７）の工程の前に、前記再度水溶液に浮かべた薄片切片試料を、弾力を有する合成樹脂製のプレート上にすくいとり、該すくいとった薄片切片試料を７）の工程のプレパラート上にのせる、請求項２に記載の組織マイクロアレイの作製方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載の組織マイクロアレイの作製方法において使用する合成樹脂製プレートからなる薄片試料受け用具。
【請求項５】
請求項４に記載の薄片試料受け用具、および薄切試料裁断用具を含む組織マイクロアレイの作製キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織マイクロアレイ（以下、単に「ＴＭＡ」という。）の作製方法に関し、ＴＭＡによる解析のための、薄片切片試料の新規作製方法に関する。より詳しくは、組織検体を含む最初のパラフィンブロックを有効に活用でき、対象の組織配列（組合せ）を任意に選択可能とする、薄片切片試料の新規作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの解析が進み、塩基配列解析から、機能解析へと焦点が移ってきており、生体関連物質を解析するための多く手法が開発されている。生体関連物質を解析するための手法として、マイクロアレイの手法が良く用いられる。例えば、ｃＤＮＡマイクロアレイは、正常組織由来のｃＤＮＡを用いて、多変数の遺伝子発現を解析する方法である。多数の症例で確認するには、それぞれの症例ごとに検索する必要があり、また遺伝子抽出の為に保存された検体のみで実施が可能である。
【０００３】
免疫組織化学（Immunohistochemistry;ＩＨＣ）は、発現したタンパク質を認識する抗体を用いて、特定の遺伝子発現タンパク質を個々の症例において解析する方法であり、パラフィンブロックで解析が可能である。また in situ hybridization（ＩＳＨ）は、目的遺伝子の塩基配列に相補なプライマーを用いて、組織上で遺伝子発現を解析する手法である。ＩＨＣ同様、パラフィンブロックを用いて解析が可能である。例えば、トラスツズマブ（Trastuzumab）はヒト癌遺伝子HER2/neu（c-erbB-2）の遺伝子産物であるHER2タンパク質に特異的に結合することで、抗腫瘍効果を発揮するヒト化モノクロナール抗体を含む抗がん剤であるが、このようなヒト化モノクロナール抗体療法においても、ＩＨＣやＩＳＨの手法を用いて適応の判定が行われている。
【０００４】
免疫組織化学は組織構築を確認しつつ、目的タンパク質の発現を判断できる点が最大の利点であるが、各組織の発現が弱かったりむらが生じたりして、クリアカットに判別できないこともあり、正確でない解析結果（false negativeやfalse positive）を避ける為にはある程度の大きさが必要である。
【０００５】
ＴＭＡは、ひとつのプレパラート上に多症例の組織をのせたもので、これまでＩＨＣやＩＳＨを個々別々に行っていたものが、同一プレパラート上で同一条件のもと、同時に解析することができる手法である。今後、オーダーメイド医療の発展に伴うタンパク質発現の包括的解析において、重要な役割を果たす。
【０００６】
ＴＭＡの質は１）組織の大きさと数のバランス、２）よくデザインされた組合せ、３）各組織の情報量の多さ、などが要因となり決定される。ＴＭＡの質の向上のために、単に多くの種類の組織を集めればよいという問題ではない。また、直径０．６ｍｍという小さな切片では、質的判断を誤る可能性がある。
【０００７】
従来のＴＭＡは、パラフィンブロックから被検組織を直径０．６〜２ｍｍ大にくりぬき、円筒状のくりぬいた組織切片（切片試料）を多数集めて、新たなパラフィンブロックに埋め込み、その後薄切し、切片が配置されたシート状の薄片切片試料をスライドグラス上にのせて解析用試料を作製していた（特許文献１）。しかし、最初のパラフィンブロックに穴をあけて円筒状にくりぬいて切片試料を得ることで、一度切片試料をくりぬくと最初のパラフィンブロックは利用不能となる。また、新たなパラフィンブロックに円筒状のくりぬいた切片試料を多数集めて埋め込み、薄片切片試料を作製することは、同一の切片試料の組合せで一度に多くの薄片切片試料を作製するには便利な手法であるが、一度切片試料の組合せが決定されると、同じ組合せの複製しか作製できず、一度シリーズを作製すると作り変えが難しい。しかも薄切を進めていくうちに腫瘍組織が無くなってしまう可能性もある。
【０００８】
ところで、腫瘍細胞は、組織型により単一なものではなく、個々の症例により組織型が同じでも性質は各々異なり、また、薬剤の感受性も各々異なる。一塩基多型の解析が精力的になされているところである。また腫瘍の性質を知る上で、予後因子は重要なファクターであるにも関わらず、長期間の経過観察を必要とするため解析には大変な労力を必要とする。したがって、プレパラート上の被検試料の組合せも、必要に応じて自由に組合せができれば、より緻密な解析が可能となる。
【特許文献１】特表２００５−５３０５０４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＴＭＡの作製に関し、組織検体を含む最初のパラフィンブロックを有効に活用でき、対象の組織配列（組合せ）を任意に選択可能とする、薄片切片試料の新規作製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、最初のパラフィンブロックをまず薄切して薄切試料を得、該薄切試料から薄片切片試料を得ることで、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成した。薄切試料を効果的に裁断するために、薄切試料を、弾力を有する合成樹脂製のプレート上にとり、該プレート上の薄切試料を水溶液に浮かべて広げ、該広げた薄切試料から薄片切片試料を得ることができることを確認し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．以下の工程を含むＴＭＡの作製方法：
１）摘出検体組織を固定する工程； 
２）固定した検体組織を脱水し、パラフィン包埋する工程；
３）包埋試料を薄切して薄切試料を得る工程；
４）上記３）で得た薄切試料を、弾力を有する合成樹脂製のプレート上にとり、該プレート上の薄切試料を水溶液に浮かべて広げる工程；
５）上記４）を水溶液に浮かべた薄切試料を、弾力を有する合成樹脂製のプレート上にすくいとる工程；
６）上記５）のプレート上の薄切試料を裁断用具にて裁断して、薄片切片試料を得る工程。
７）上記６）の薄片切片試料をプレパラート上に配置する工程。
２．６）の工程の後、７）の工程の前に、さらに、薄片切片試料を水溶液に浮かべる工程を含む、前項１に記載のＴＭＡの作製方法。
３．７）の工程の前に、前記再度水溶液に浮かべた薄片切片試料を、弾力を有する合成樹脂製のプレート上にすくいとり、該すくいとった薄片切片試料を７）の工程のプレパラート上にのせる、前項２に記載のＴＭＡの作製方法。
４．前項１〜３の何れかに記載のＴＭＡの作製方法において使用する合成樹脂製プレートからなる薄片試料受け用具。
５．前項４に記載の薄片試料受け用具、および薄片試料裁断用具を含むＴＭＡの作製キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＴＭＡの作製方法によると、最初のパラフィンブロック試料から被検試料を円筒状にくりぬく必要がないため、くりぬきによるパラフィンブロックの欠損が生じない。また、従来の方法であれば、円筒状にくりぬいた切片試料を集めて、新たなパラフィンブロックを作製したものから薄片切片試料を作製し、プレパラートを作製するため、新たなパラフィンブロックから複数の薄片切片試料を作製する場合において、組織片の組合せを変更することができない。また、従来法であれば、円筒状にくりぬいた組織片を薄切して切片試料を得ているため、切片試料の大きさ（直径）は変更させることができないのに対し、本発明の方法では、適宜所望の大きさの、例えば２〜８ｍｍの大きさの切片試料を作製することが可能であり、組織構築を確認しやすい。さらに、従来法では２回のパラフィンブロックを作製する必要があるが、本発明の方法であれば、再度のパラフィンブロックを作製する必要がない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のＴＭＡの作製方法について、以下詳述する。本明細書において、パラフィンブロックからミクロトームなどによりシート状の試料を得ることを「薄切する」といい、薄切して得た試料を「薄切試料」といい、薄切試料から裁断用具などで、所望の大きさに切り出した試料を、「薄片切片試料」ということとする。「薄片切片試料」を、単に「組織試料」という場合もある。また、パラフィンブロックから円筒状に切り出した組織試料を、「切片試料」といい、切片試料を含む薄切試料を、「薄片切片試料」ともいう。
【００１４】
本発明のＴＭＡの作製は、以下の１）〜７）の工程を含む。
１）摘出検体組織を固定する工程； 
２）固定した検体組織を脱水し、パラフィン包埋する工程；
３）包埋試料を薄切して薄切試料を得る工程；
４）上記３）で得た薄切試料を、弾力を有する合成樹脂製のプレート上にとり、該プレート上の薄切試料を水溶液に浮かべて広げる工程；
５）上記４）を水溶液に浮かべた薄切試料を、弾力を有する合成樹脂製のプレート上にすくいとる工程；
６）上記５）のプレート上の薄切試料を裁断用具にて裁断して、薄片切片試料を得る工程。
７）上記６）の薄片切片試料をプレパラート上に配置する工程。
【００１５】
ここにおいて、工程１）の摘出検体組織については、ＴＭＡの手法に適用しうるあらゆる検体組織を適用することができる。さらに、工程１）および工程２）は、通常のＴＭＡの作製において、自体公知の方法を適用することができる。
【００１６】
従来では、３）の工程で、包埋試料から円筒状の試料を切り出して、まず切片試料を得ていたのに対し、本発明では包埋試料をまず薄切して薄切試料を得ることが、本発明の最大の特徴点である。薄切の手段は自体公知の方法、例えばミクロトームなどの薄切用機器を用いることができる。
【００１７】
本発明は、３）で得た薄切試料を、弾力を有する合成樹脂製のプレート上にとり、該プレート上の薄切試料を水溶液に浮かべて薄切試料を広げる工程４）を含む。ここにおいて、弾力を有する合成樹脂製のプレートとは、ガラス状のような硬質素材ではない合成樹脂を素材とするプレートをいい、例えばカッティングマットなどに使用されている材質のプレートを挙げることができる。具体的には、発泡性フッ素樹脂、アクリル樹脂、軟質塩化ビニルや塩化ビニルの他、ポリプロピレン（ＰＰ）などの軟質オレフィン系樹脂や硬質オレフィン系樹脂などの素材からなるプレートを挙げることができる。
【００１８】
上記において、薄切試料を水溶液に浮かべて薄切試料を広げる工程を設けることは、本発明の方法を達成するために、必須である。従来、薄切試料を先に得て試料を加工することは、薄切試料の取扱い上非常に困難であることが問題であった。しかし、上記の弾力を有する合成樹脂製のプレートを用いて、薄切試料をすくい、水溶液表面で広げることで、薄切試料の取扱いが可能になり、続けて行う裁断処理も可能になった。水溶液は、試料を損傷させない溶液であればよく、特に限定されないが、水、生理食塩水、生物試料の取扱い分野で使用される一般的な緩衝液などを使用することができる。
【００１９】
本発明の５）の工程で、水溶液に浮かべた薄切試料を、弾力を有する合成樹脂製のプレート上にすくいとり、６）の工程で、上記プレート上の薄切試料を裁断用具にて裁断し、薄片切片試料を得る。弾力を有する合成樹脂製のプレート上で薄切試料を裁断することで、薄切試料に損傷を与えず裁断することができる。ここで裁断用具は、薄切試料を裁断しうる用具であればよく、特に限定されないが、例えば皮膚検体採取用の円筒形のカッターや、通常の切り出しナイフなどを挙げることができる。
【００２０】
本発明の７）の工程で、上記６）の工程で得た薄片切片試料をプレパラート上に配置し、所望の組合せのＴＭＡを作製する。薄片切片試料をプレパラートに配置するために、薄片切片試料を水溶液に浮かべる工程を含んでいてもよい。また、前記再度水溶液に浮かべた薄片切片試料を、弾力を有する合成樹脂製のプレート上にすくいとり、該すくい取った薄片切片試料をプレパラート上にのせることで、プレパラート上の所望の位置に、所望の組織試料を配置させることができる。プレパラート上に配置させた薄片切片試料は、通常の方法により、伸展させることができる。
【００２１】
本発明のＴＭＡの作製方法で、解析を所望する組織（被検組織）について、上述の１）〜６）の工程を各々繰り返して各薄片切片試料を作製し、上述の方法により、プレパラート上の所望の位置に、所望の薄片切片試料を配置させ、並べることにより所望のＴＭＡを得ることができる。
【００２２】
また、従来と同様に、所望のＴＭＡを得るために、予め薄切試料を染色することで、ＴＭＡに使用する試料として適切な部位の組織試料を選択することができる。薄切試料の染色の方法は、本技術分野で用いられる通常の染色方法を適用することができる。
【００２３】
本発明は、ＴＭＡの作製方法において使用する弾力を有する合成樹脂製のプレートからなる薄切試料受け用具も発明の範囲に含まれる。薄切試料受け用具は、薄片切片試料を受ける用具としても利用することができる。さらには、該薄片試料受け用具、および薄片試料裁断用具を含むＴＭＡの作製キットにも及ぶ。
【実施例】
【００２４】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【００２５】
（実施例１）
本実施例では、大腸癌のうち、高分化腺癌：５例、中分化腺癌：５例、低分化腺癌：５例、粘液癌：４、印環細胞癌：２例および正常大腸粘膜：２例について、本発明の方法によりＴＭＡを作製し、解析を行った。一枚のスライドグラス上に４ｍｍと３ｍｍの大腸癌２１症例の組織片(4mm-19片と3mm-2片)および正常大腸粘膜組織片２症例(4mm)が収載されている。
【００２６】
ＲＦＰ染色の結果、大腸癌症例２１例中１２例は陽性であり、ネガティブコントロールの正常大腸粘膜組織切片２片は陰性という良好な結果を得た（図１参照）。
【００２７】
ＲＦＰ染色は、Beckman Coulter社製UltraTech HRP Streptavidin-Biotin Detection Systemを用い、添付文書の方法に従って染色した。ＲＦＰはRET finger proteinの略で、転写因子をつかさどる核タンパク質の一種であり、本実施例では該ＲＦＰのアミノ酸配列の一部を認識する抗体（rabbit polyclonal anti-RFP antibody）を用いて染色した。該染色した組織について、DAB発色（発現が見られる場合、濃茶色に発色がみられる）の有無を解析した。
【００２８】
さらに、大腸癌の上記ＴＭＡ解析の２０倍拡大像を図２に示し、２００倍拡大像を図３に示した。濃く染まっているのが陽性の大腸癌の細胞核である。
【００２９】
（実施例２）
本実施例では、胃癌のうち、高分化腺癌：４例、中分化腺癌：４例、低分化腺癌：４例、印環細胞癌：３例および正常大腸粘膜：２例について、本発明の方法によりＴＭＡを作製し、解析を行った。一枚のスライド上に胃癌症例１５例および正常胃粘膜組織片２例が収載されている。
【００３０】
ＲＦＰ染色の結果、胃癌症例１５例中９例は陽性であり、ネガティブコントロールの正常胃粘膜組織切片２片は陰性という良好な結果を得た（図４参照）。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
以上詳述したように、本発明のＴＭＡの作製方法によると、最初のパラフィンブロック試料から被検組織を円筒状にくりぬく必要がないため、くりぬきによるパラフィンブロックの欠損が生じない。また、従来の方法であれば、円筒状にくりぬいた切片試料を集めて、新たなパラフィンブロックを作製し、さらに薄片切片試料を作製してプレパラート上の組織試料を作製するため、新たなパラフィンブロックから複数の組織試料を作製する場合に、組織片の組合せを変更することができない。また、従来法であれば、円筒状にくりぬいた切片試料を薄切して薄片切片試料を得ているため、薄片切片試料の大きさ（直径）は変更させることができないのに対し、本発明の方法では適宜所望の大きさの、例えば２〜８ｍｍの大きさの薄片切片試料を作製することができ、組織構築を確認しやすい。
【００３２】
本発明のＴＭＡの作製方法によると、ドナーブロック（最初のパラフィンブロック試料）を傷めない為、グレード別や臓器別、予後別など任意に組織配列の選択が可能である。また組織サイズとして適切な大きさが確保されているため組織構築の確認ができ、病理診断時のマスタースライドや教材としても利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】大腸癌症例１９例および正常大腸粘膜組織２例についてのＲＦＰ染色結果を示す図である。（実施例１）
【図２】大腸癌のＴＭＡ解析結果の２０倍拡大像を示す図である。（実施例１）
【図３】大腸癌のＴＭＡ解析結果の２００倍拡大像を示す図である。（実施例１）
【図４】胃癌症例１５例および正常胃粘膜組織片２例についてのＲＦＰ染色結果を示す図である。（実施例１）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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