(57)【要約】【課題】  疾患に伴う糖鎖修飾及び変異に関する病態を低侵襲的かつ早期に識別または推定する方法を提供する。【解決手段】  特定糖鎖を認識する物質、例えばレクチン、を用いて低侵襲的に採取可能な血液を分画及び濃縮する事で、血液中の大部分を占めるアルブミンを除外し、特定の糖鎖を持つタンパク質のみを網羅的に分画し濃縮する事で微量な疾患マーカーを検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料をレクチンと接触させ、前記レクチンに結合する分画を分離することにより、試料中の糖鎖を持つ物質を精製する方法であって、前記レクチンがイヌエンジュレクチンであるときはシアル酸を含む糖鎖を持つ物質を、前記レクチンがレンチルレクチン、又はヒイロチャワンタケレクチンであるときはフコースを含む糖鎖を持つ物質を、精製することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記レクチンが、支持体に固定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記支持体が、セファロース、アガロース、及びデキストランからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
試料をレクチンと接触させ、レクチンに結合した分画を分離する工程を、アフィニティークロマトグラフィーにより行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記糖鎖を持つ物質が、糖タンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
試料が、血液、血清、血漿、細胞抽出液、尿、リンパ液、組織液、腹水、髄液、及び体液からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
試料が、健常者、及び／又は疾患の患者由来のものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により精製した糖鎖を持つ物質を、二次元電気泳動により分離する工程、及び
前記工程で得られた結果を、複数の試料の間で比較する工程、
を含む、試料間で発現量に差がある、シアル酸又はフコースを含む糖鎖を持つ物質を検出する方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により検出した物質を、質量分析装置により同定する工程、
を含む、試料間で発現量に差がある、シアル酸又はフコースを含む糖鎖を持つ物質を同定する方法。
【請求項１０】
質量分析装置が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＳＥＬＤＩ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳ、及びメンブレンＭＳからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
疾患マーカーを探索する方法であって、
請求項９〜１０のいずれか１項に記載の方法により得られた結果を用いて、探索する方法。
【請求項１２】
病態を推測する方法であって、
請求項９〜１０のいずれか１項に記載の方法により得られた結果を用いて、推測する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ  α  ２−３Ｇａｌ  β  １−４ＧｌｃＮＡｃ）またはフコースなどの糖またはそれらの糖鎖を持つ糖タンパク質を分画する方法であり、かつ、特定糖鎖にて試料状態または病態を識別する方法に関する。より具体的には、健常（非病態）試料と比較し有意に特定糖鎖が存在する場合、特定糖鎖に関連する病態にある可能性があると言う推測を行なう方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  病態や試料状態を識別する方法には侵襲的に患部を切除・摘出した組織をＤＮＡアレイやタイリングアレイにて解析する方法があるが、ゲノム解析だけではリン酸化状態や糖鎖修飾などの翻訳後修飾を解析する事は非常に困難である。
一般に悪性腫瘍などの病態をバイオプシーなどにより解析する場合、悪性腫瘍組織に侵された患部の外科的切除・摘出が必要である。この方法は侵襲的であり、しかも腫瘍の病期が進行している時点で発見される可能性が非常に高い。
腫瘍は転移する前に発見できれば局部的な外科的手術や抗癌剤などの化学療法により完治する可能性が高くなる事実を考慮すると、特に低侵襲的に採血した血液などの試料を用いる事が腫瘍などの病態の早期発見ひいては完治に反映できるものと思われる。【０００３】  癌化に伴い糖鎖修飾の変異が生じる事が知られている。実際にＣＡ１９−９などの著名な癌抗原は糖鎖抗原であり、これらの有無が健常者と癌患者の病態を識別する際に実際に臨床で用いられている。特にシアル酸付加が起こっている事が知られているが、癌化に伴うシアル酸に着目した血液分画法の報告は少ない。
特定糖鎖を持つタンパク質に選択的に結合する物質としては抗体があり、実際に臨床診断にも多く用いられている。しかしながら、特定糖鎖に対する抗体を作製する事は極めて困難であるだけでなく、有効な疾患マーカーに対する抗体が少ないため擬陽性を呈する事が多い。【０００４】  特定糖鎖を持つタンパク質に選択的に結合する物質としては他にレクチンがあり、天然物からの抽出または人工タンパク質として合成が可能である。結合能力は一般的に抗体に劣るものの特定糖鎖に選択的に結合できるため、網羅的かつ選択的な解析に適する。
しかも、低侵襲的に採血したタンパク質のほとんどは糖タンパク質であり、その５０％以上を占める単純タンパク質であるアルブミンとは結合しないため、効率的に特定糖鎖を持つタンパク質のみを分画できる。
特に、多くのサイトカイン、ホルモン、疾患マーカーなどは数ｎｇ／ｍｌ以下の微量のものが多いため、有効な分画法や濃縮法が求められていたが、特定糖鎖を持つタンパク質を分画する事でこれらの問題が解決可能である。【０００５】  タンパク質の比較解析はゲル、キャピラリー、カラムなどで分画し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）などの質量分析装置にて同定するのが一般的であり、プロテオミクスの気運と共に精度・感度ともにａ（アット）ｍｏｌレベルのタンパク質の同定が可能である。【０００６】  タンパク質を網羅的に分画し比較解析できる技術はスクリーニング、臨床診断、薬品への応用において期待でき、ゲノミクスではスクリーニングできなかったより重要な疾患マーカーを発見できる事と期待される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  質量分析装置（ＭＳ）の精度・感度が飛躍的に改良されタンパク質同定技術は一般化されたが、血液などにおけるタンパク質のダイナミックレンジは非常に広く、しかも翻訳後修飾を考慮するとさらに解析における複雑性を増す。
特に血液中の単純タンパク質であるアルブミンが優先的に存在し比較解析を困難にしているため、糖鎖を持たないアルブミンを除外し、特定の糖鎖を持つタンパク質のみを分画し濃縮する事ができれば、微量な疾患マーカーを同定できる可能性は飛躍的に増加する。【０００８】  前立腺癌特異的抗原ＰＳＡの有無を識別する方法（特開２００２−５５１０８）は存在するが、例えばイヌエンジュレクチンを用いてのシアル酸に関する網羅的な分画及び濃縮を行った報告はない。
特定糖鎖に結合する物質（レクチンなど）を用いて、例えば血液を用いた網羅的な特定糖鎖を持つタンパク質の分画による疾患マーカー探索法は未熟であるため、より疾患に関わる特定糖鎖の網羅的探索法が望まれている。【０００９】  加えて、特定糖鎖に対する抗体が存在しない時であっても、特定糖鎖を持つタンパク質を健常試料と比較する事で病態を識別または推定する事を可能とする。
すなわち、疾患に伴う糖鎖修飾に関する病態を低侵襲的かつ早期に識別または推定する方法を提供する事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者は従来技術の問題点に対し鋭意検討した結果、特定糖鎖に結合するタンパク質を用いる事で、特定糖鎖を持つタンパク質を低侵襲的かつ網羅的に分画かつ比較しうる方法を見出した。【００１１】  より具体的には、特定の糖鎖を持つタンパク質のみをレクチンを用いる事で分画し、単純タンパク質であり血液の大部分を占めるアルブミンを未結合分画として分離する事で、特定糖鎖を持つ微量なタンパク質のみを濃縮する事を可能にする。
レクチンは糖鎖を認識するタンパク質の総称であり、動植物や微生物などに広く存在する。本発明では例えばイヌエンジュレクチンなどのシアル酸に親和性を有するレクチンをアフィニティカラムの支持物として利用し、高濃度のシアル酸を持ったタンパク質を得る事を特徴とする。【００１２】  このようなイヌエンジュレクチンを支持物とするレクチンアフィニティカラムに、シアル酸を含む試料を通液すると、レクチンに対しシアル酸を持ったタンパク質のみが選択的に結合される（結合ステップ）。次に洗浄液を通液すると、夾雑物などはレクチンから流出しシアル酸を持つタンパク質のみがレクチン結合分画として保持される（洗浄ステップ）。さらに溶出液をレクチンカラムに通液する事でレクチン結合分画のシアル酸を持ったタンパク質が溶出され選択的かつ高濃度のシアル酸を持ったタンパク質を得る事が可能となる（溶出ステップ）。【００１３】  レクチンアフィニティカラムによる分画及び濃縮を行なった試料、例えば健常試料及び病態試料、を２次元電気泳動などによって差異のあるタンパク質を比較する事で、病態に関与するマーカーとして病態の識別または推測が可能になる。
この方法はマーカーに対する抗体が存在しない場合でも病態を識別または推測しうる事を意味する。【００１４】即ち、本発明は、
（１）試料をレクチンと接触させ、前記レクチンに結合する分画を分離することにより、試料中の糖鎖を持つ物質を精製する方法であって、前記レクチンがイヌエンジュレクチンであるときはシアル酸を含む糖鎖を持つ物質を、前記レクチンがレンチルレクチン、又はヒイロチャワンタケレクチンであるときはフコースを含む糖鎖を持つ物質を、精製することを特徴とする、方法；
（２）前記レクチンが、支持体に固定されている、（１）に記載の方法；
（３）前記支持体が、セファロース、アガロース、及びデキストランからなる群より選択される少なくとも１種である、（２）に記載の方法；
（４）試料をレクチンと接触させ、レクチンに結合した分画を分離する工程を、アフィニティークロマトグラフィーにより行う、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法；
（５）前記糖鎖を持つ物質が、糖タンパク質である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法；
（６）試料が、血液、血清、血漿、細胞抽出液、尿、リンパ液、組織液、腹水、髄液、及び体液からなる群より選択される少なくとも１種である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法；
（７）試料が、健常者、及び／又は疾患の患者由来のものである、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法；
（８）（１）〜（７）のいずれか１項に記載の方法により精製した糖鎖を持つ物質を、二次元電気泳動により分離する工程、及び
前記工程で得られた結果を、複数の試料の間で比較する工程、
を含む、試料間で発現量に差がある、シアル酸又はフコースを含む糖鎖を持つ物質を検出する方法；
（９）（８）に記載の方法により検出した物質を、質量分析装置により同定する工程、
を含む、試料間で発現量に差がある、シアル酸又はフコースを含む糖鎖を持つ物質を同定する方法；
（１０）質量分析装置が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＳＥＬＤＩ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳ、及びメンブレンＭＳからなる群より選択される少なくとも１種である、（９）に記載の方法；
（１１）疾患マーカーを探索する方法であって、
（９）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法により得られた結果を用いて、探索する方法；
（１２）病態を推測する方法であって、
（９）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法により得られた結果を用いて、推測する方法；
に関する。
【発明の効果】
【００１５】  本発明において、例えば血液における特定糖鎖（シアル酸など）の分画法によれば、特定糖鎖に対する抗体の有無に関わらず、特定糖鎖の修飾が関連した病態を低侵襲的かつ早期に識別または推定する事ができる。【００１６】  より詳細には、血液における比較解析を困難にさせる大量のアルブミンを除外でき、特定の糖鎖を持つタンパク質のみを分画し濃縮する事が可能になるため、より微量で検出できなかった疾患マーカーの探索および比較解析には絶大な効果を発揮するものと期待される。【００１７】  よって本発明は従来技術の問題点を大幅に解消した分画法及び病態の識別法として臨床診断に大きく貢献するだけでなく、疾患に関与する特定糖鎖を対象とした抗体医薬、糖鎖医薬などの医薬分野への発展に寄与する期待が大きいものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】  以下、本発明について、その好ましい態様を具体的に説明する。【００１９】  本発明に使用する特定糖鎖に結合しうる物質は、シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ  α  ２−３Ｇａｌ  β  １−４ＧｌｃＮＡｃ）やフコースなどの有無を識別する事が可能であるものであれば限定されないが、特にイヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）、レンチル（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ）由来のレクチンが特に適している。【００２０】  本発明に使用するシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ  α  ２−３Ｇａｌ  β  １−４ＧｌｃＮＡｃ）やフコースなどを含む試料としては、血液、血清、血漿、尿、体液、細胞抽出液、リンパ液、組織液、腹水、髄液などを挙げる事が出来る。【００２１】  試料の分画はアフィニティークロマトグラフィーにて行なう。基本的には特定糖鎖に結合する物質を架橋させた支持物を固定相とする。これらの物質を用いる順序または混合する割合などは特に規定するものではない。
支持物としての充填担体はセファロースやアガロース、デキストランなどが望ましく、担体の形状はビーズ状、シート状、網目状などあらゆる形状を含んで良い。
架橋条件は適量のレクチンとＮＨＳ担体（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：ＧＥヘルスケア社）をＨＥＰＥＳ溶液中にて混合し回旋させる。架橋後、未反応基をＴｒｉｓ溶液にてブロッキングし、再度ＨＥＰＥＳ溶液で平衡化しレクチンカラムとする。
作製したレクチンカラムに血液試料や細胞抽出液を適量添加し一晩結合させ、非結合分画は結合溶液で流出し、結合分画をグリシンで溶出する。【００２２】  溶出した結合分画をさらに濃縮した後、タンパク質の量を定量し、そのうち数百μｇを２次元電気泳動により比較解析し、健常試料との差異のあるタンパク質を検出する。【００２３】  差異のあったタンパク質を質量分析装置（ＭＳ）にて同定する事が望ましく、同定されたタンパク質は病態に関与する可能性が非常に高いと判断しうる。【００２４】  本発明において糖鎖を持つ物質とは、糖タンパク質をはじめ、糖脂質、遊離の糖鎖など、糖鎖を有する物質であれば何でもよい。【００２５】  本発明において試料は、健常者由来、及び疾患の患者由来の双方を用いることもできるが、いずれか一方のみを用いることもできる。疾患の患者由来の試料とは、疾患であることが明らかな者に限らず、疾患の可能性がある者由来の試料も含まれる。また、試料は、複数の者から採取したものを混合してもよい。【００２６】  本発明において疾患とは、例えば、癌、糖尿病などの生活習慣病、メタボリックシンドロームが挙げられる。【００２７】  本発明において疾患マーカーとは、その量的又は質的差異により、特定の疾患の進行又は病態を推測しうるものを言う。
本発明において、疾患マーカーを探索する方法は、健常者由来の試料及び特定の疾患をもつ患者由来の試料を使用して、レクチンカラムクロマトグラフィーでタンパク質を精製し、二次元電気泳動にて分離した結果を比較する。そこで、患者の試料においてのみ検出されたスポット、又は健常者の試料におけるスポットよりも濃いスポットを選択し、このような、発現量に差があるタンパク質を質量分析装置で同定する。こうして同定した結果から、特定の疾患に関連のある、新規の疾患マーカーの候補を抽出する。比較する対象としては、健常者と特定の疾患をもつ患者の間で行う他、進行度の異なる特定の疾患をもつ患者の間で行うこともできる。
本発明を利用して得られた疾患マーカーは、診断や創薬に活用する他、特定の病態を推測するための指標に活用することができる。【００２８】  本発明において、病態を推測する方法は、ある患者がどのような病態にあるかを詳しく調べたいときに、その患者由来の試料を使用して、健常者由来の試料又は異なる病態の患者と比較して発現量に差があるタンパク質を検出し、同定する。このように同定したタンパク質が、前述のマーカーをはじめとする、特定の病態との関連性が明らかなものであれば、その情報から、特定の病態を推測することができる。
【実施例】
【００２９】  以下に、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
１．未分画とのイヌエンジュ処理分画との比較
健常人の血清を、イヌエンジュレクチンをＮＨＳ担体に架橋して作製したレクチンカラムに抵触させ、その結合分画のみをグリシンで溶出して濃縮した。
その後、何の処理もしない健常人の血清と、イヌエンジュレクチンカラムでシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ  α  ２−３Ｇａｌ  β  １−４ＧｌｃＮＡｃ）を持つタンパク質を含む血清試料を同量にして２次元電気泳動を行なった。
その結果、比較解析を困難にする最大の障害であるアルブミンの除外に成功しただけでなく、未処理の血清では検出できなかったタンパク質群が明確にスポットとして検出された（図１）。
これらの結果は、血液処理にはイヌエンジュレクチンによる分画及び濃縮が非常に有用である事を示している。【００３０】２．未分画とのレンチル処理分画との比較
健常人の血清を、レンチルレクチンをＮＨＳ担体に架橋して作製したレクチンカラムに抵触させ、その結合分画のみをグリシンで溶出して濃縮した。
その後、何の処理もしない健常人の血清と、レンチルレクチンカラムでフコースを持つタンパク質を含む血清試料を同量にして２次元電気泳動を行なった。
その結果、比較解析を困難にする最大の障害であるアルブミンの除外に成功しただけでなく、未処理の血清では検出できなかったタンパク質群が明確にスポットとして検出された（図２）。
これらの結果は、血液処理にはレンチルレクチンによる分画及び濃縮が非常に有用である事を示している。
【産業上の利用可能性】
【００３１】  本発明によれば、特定の糖鎖を持つタンパク質を網羅的に精製することが可能である。本発明の精製方法を利用すれば、癌、及び糖鎖変異若しくは修飾に基づいて起こる疾患の臨床診断、特定の糖鎖を持つタンパク質を標的とした抗体医薬品の開発に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  未処理の健常血清試料（Ａ）とイヌエンジュレクチンにて分画した健常血清試料（Ｂ）におけるタンパク質の２次元電気泳動の結果を示す写真である。
【図２】  未処理の健常血清試料（Ａ）とレンチルレクチンにて分画した健常血清試料（Ｂ）におけるタンパク質の２次元電気泳動の結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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