(57)【要約】【課題】神経芽腫の悪性度を含めて検出する手段を提供すること。【解決手段】神経芽腫におけるヒト１４番染色体ｑ２２領域の核酸のメチル化を指標として神経芽腫の悪性度を判定することを見出した。また、本発明は、神経芽腫においてメチル化による遺伝子転写の不活性化を回復することにより、神経芽腫の増殖を抑制することも見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体において、１４番染色体ｑ２２領域の遺伝子の不活性化を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する、癌の検出方法。
【請求項２】
遺伝子が、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子である、請求項１に記載の癌の検出方法。
【請求項３】
検体において、さらにＭＹＣＮ遺伝子の増幅を検出する、請求項１又は２に記載の癌の検出方法。
【請求項４】
遺伝子の不活性化が、ＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化である、請求項１から３の何れか記載の癌の検出方法。
【請求項５】
遺伝子の不活性化が、ヒストンＨ４蛋白質又はヒストン３Ｈ蛋白質のアセチル化、ヒストンＨ３Ｋ９のメチル化の度合いによる不活性化である、請求項１から３の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項６】
検体が、神経提由来の細胞である、請求項１から５の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項７】
癌が神経芽腫である、請求項１から６の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項８】
遺伝子の不活性化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、または、アレイＣＧＨ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、ＣＯＢＲＡ法を用いて検出する、請求項１から７の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項９】
ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子または、該遺伝子の発現産物である蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項１０】
ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質を含む、細胞増殖抑制剤。
【請求項１１】
ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法。
【請求項１２】
ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む、細胞増殖活性化剤。
【請求項１３】
検体にインビトロでｃＡＭＰを蓄積させることを含む、細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項１４】
ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化に起因してＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現が抑制されている神経芽腫に対して、被験物質を接触させて、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現を検出し、遺伝子発現が被験物質を接触させない系よりも増加していた場合に、被験物質を、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドの脱メチル化によりＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子を活性化させることができる抗腫瘍物質として選別する、物質のスクリーニング法。
【請求項１５】
ヒストンＨ３またはＨ４蛋白質のアセチル化の抑制またはヒストンＨ３蛋白質の６番目のリジン残基（Ｋ９）メチル化に起因してＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現が抑制されている神経芽腫に対して、被験物質を接触させて、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現を検出し、遺伝子発現が被験物質を接触させない系よりも増加していた場合に、被験物質を、ヒストンＨ４蛋白質のアセチル化の促進によりＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子を活性化させることができる抗腫瘍物質として選別する、物質のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経芽腫をその遺伝子型を観察することで初期に診断することを目的として、特定の染色体領域に存在する遺伝子の変化を検出することによって癌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経芽腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）は副腎や交感神経節に発生する腫瘍である。多くは５歳以下の子供に発症するが、稀に５歳を過ぎて発症し、新生児に発見される。副腎と交感神経節は胎児期の神経提と呼ばれる共通の組織から発生するので、神経提由来の細胞が神経芽腫の発生細胞と考えられる（Ｂｒｏｄｅｕｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００３，３，２０３−２１６；Ｗｅｓｔｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，２００２，１８４，１２７−１４７）。
【０００３】
１歳以降に発症する神経芽腫では一般に進行していることが多く、手術や化学療法、放射線療法を組み合わせた強力な治療が必要であり、特に病期（Ｓｔａｇｅ）４の場合や癌遺伝子ＭＹＣＮが増えている場合には、造血幹細胞移植（骨髄移植や末梢血幹細胞移植など）を用いた積極的な治療がおこなわれている。しかし、病期４の神経芽腫の場合、造血幹細胞移植を併用した積極的な治療をおこなっても５年後の生存率は３０％程度であることから、神経芽腫発症の原因遺伝子を見つけ出し、その機能を解明することで、その知見に基づいた新たな有効な治療法の開発が望まれている。
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｒｏｄｅｕｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００３，３，２０３−２１６；Ｗｅｓｔｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，２００２，１８４，１２７−１４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
神経提由来細胞の癌化についての遺伝子レベルでのメカニズムが解明されれば、遺伝子レベルにおける神経提由来細胞の癌化の発見や、神経芽腫の悪性度の診断、進行の抑制をおこなうことが可能となり、さらに、メカニズムに基づく薬剤の選別、開発や治療法の確立が可能となるはずである。具体的には、神経芽腫に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して、遺伝子を中心とした技術的検討をおこなうことにより、この課題を解決することができると考えられる。即ち、本発明は、神経芽腫などの癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して癌の検出方法及び細胞増殖抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＣＧＨ）、または、それに伴う、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｇｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＢＡＭＣＡ）はゲノム上で多数の遺伝子増幅並びに欠失、あるいは遺伝子の不活性化に伴う遺伝子異常を解析するためには、簡便で迅速であり、最良の方法である。そして、癌化並びに癌の悪性化などに関与するゲノム上の遺伝子異常を解析するためにＣＧＨアレイに搭載する４５００種類のＢＡＣ/ＰＡＣ  ＤＮＡを選別する（ＭＣＧ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ‐４５００；Ｉｎａｚａｗａ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，２００４，９５，５５９−５６３）ことにより、神経提細胞の癌化を促進する癌関連遺伝子、すなわち、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２（ＰＴＧＥＲ２）遺伝子の同定に成功した。そして、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の不活性化、すなわち、ＰＴＧＥＲ２蛋白質の減少が神経芽腫の増殖を顕著に促進すること、また、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の転写産物または蛋白質を増加させると神経芽腫の増殖を著しく低下することを見出すことに成功し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明によれば、検体において、１４番染色体ｑ２２領域の遺伝子の不活性化を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出する、癌の検出方法が提供される。
好ましくは、遺伝子は、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子である。
好ましくは、検体において、さらにＭＹＣＮ遺伝子の増幅を検出する。
好ましくは、遺伝子の不活性化は、ＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化である。
【０００８】
好ましくは、遺伝子の不活性化は、ヒストンＨ４蛋白質又はヒストン３Ｈ蛋白質のアセチル化、ヒストンＨ３Ｋ９のメチル化の度合いによる不活性化である。
好ましくは、検体は、神経提由来の細胞である。
好ましくは、癌は神経芽腫である。
好ましくは、遺伝子の不活性化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、または、アレイＣＧＨ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、ＣＯＢＲＡ法を用いて検出する。
【０００９】
本発明によればさらに、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子または、該遺伝子の発現産物である蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法が提供される。
本発明によればさらに、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質を含む、細胞増殖抑制剤が提供される。
本発明によればさらに、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法が提供される。
本発明によればさらに、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む、細胞増殖活性化剤が提供される。
【００１０】
本発明によればさらに、検体にインビトロでｃＡＭＰを蓄積させることを含む、細胞の増殖を抑制する方法が提供される。
本発明によればさらに、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化に起因してＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現が抑制されている神経芽腫に対して、被験物質を接触させて、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現を検出し、遺伝子発現が被験物質を接触させない系よりも増加していた場合に、被験物質を、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドの脱メチル化によりＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子を活性化させることができる抗腫瘍物質として選別する、物質のスクリーニング法が提供される。
【００１１】
本発明によればさらに、ヒストンＨ３またはＨ４蛋白質のアセチル化の抑制またはヒストンＨ３蛋白質の６番目のリジン残基（Ｋ９）メチル化に起因してＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現が抑制されている神経芽腫に対して、被験物質を接触させて、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現を検出し、遺伝子発現が被験物質を接触させない系よりも増加していた場合に、被験物質を、ヒストンＨ４蛋白質のアセチル化の促進によりＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子を活性化させることができる抗腫瘍物質として選別する、物質のスクリーニング法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、神経提由来の細胞検体における癌化、悪性度を的確に把握することが可能となった。また、神経芽腫において、遺伝子発現を不活性化するＰＴＧＥＲ２遺伝子の転写産物を導入することにより、神経芽腫の増殖を抑制することができる。また、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現が不活性化することにより発生する神経芽腫の治療剤のスクリーニングをおこなうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
（１）癌の検出方法
本発明による癌の検出方法は、検体において、１４番染色体ｑ２２領域の遺伝子の不活性化を検出することにより、検体の悪性度を含めた癌化を検出することを特徴とする。好ましくは、検出される遺伝子は、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子である。
【００１４】
ヒトゲノムプロジェクトの成果により、ヒトＰＴＧＥＲ２遺伝子の転写産物は既に知られており、１４ｑ２２．１染色体に存在する遺伝子である（Ｄｕｎｃａｎ  ＡＭ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９５，２５，７４０−７４２）。ヒトＰＴＧＥＲ２遺伝子がコードする蛋白質は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の受容体であり、そのシグナリングを仲介する役割を持つ（Ｎａｒｕｍｉｙａ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ，１９９９，７９，１１９３−１２２６）。しかしながら、このヒトＰＴＧＥＲ２遺伝子が、ヒト神経芽腫の発症、または悪性化に関わる重要な癌関連遺伝子であることは未だ知られていない。
【００１５】
上述したように、本検出方法は、神経提細胞や神経芽腫におけるＰＴＧＥＲ２遺伝子の不活性化を検出することを特徴とする方法である。
ＰＴＧＥＲ２遺伝子の不活性化を検出する対象となる神経提細胞または神経芽腫は、検体提供者の生検組織細胞が好適である。
この検体組織細胞は、健常人の神経提細胞か、神経芽腫患者の癌組織であるかを問わないが、現実的には、検査等の結果、副腎や交感神経節に癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織、または、神経芽腫であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある神経芽腫の組織、等が主な対象となり得る。
【００１６】
本検出方法により、「検査等の結果、副腎や交感神経節に癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織」におけるＰＴＧＥＲ２遺伝子の不活性化が認められた場合には、病変組織は癌化に向かって進行しているか或るいは既に癌化の状態であり、かつ、悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。また、「神経芽腫であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある神経芽腫の組織」におけるＰＴＧＥＲ２遺伝子の不活性化が認められた場合にも、癌組織の悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。検体として採取された神経芽腫組織は、必要な処理、例えば、採取された組織からのＤＮＡあるいはＲＮＡの調製をおこない、本検出方法をおこなう対象とすることができる。
【００１７】
ＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現量が減少する原因としては、ａ）ＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化、ｂ）ヒストンＨ４蛋白質のアセチル化の度合いの低下による不活性化、の２通りの要因に大別される。以下に、これら２通りの要因について簡単に説明する。
【００１８】
（ａ）ＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化による不活性化
ＣｐＧリッチプロモーター並びにエキソン領域を密にメチル化すると転写不活性化が起こることが報告されている（Ｂｉｒｄ，ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９９，９９，４５１−４５４）．癌細胞では、ＣｐＧアイランドはそれ以外の領域と比較すると高い頻度で密にメチル化されており、プロモーター領域のＨｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎは、癌での癌抑制遺伝子の不活性化に深く関与している（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２，２１，６６９４−６７０２）。
【００１９】
後述するように、実際、ＰＴＧＥＲ２遺伝子のエキソンに存在するＣｐＧアイランドはプロモーター活性を有しているが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこの領域をメチル化するとプロモーター活性が消失することが判明した。また、このＣｐＧアイランドのメチル化の度合いは、一部の神経芽腫細胞でのＰＴＧＥＲ２遺伝子発現の抑制と強く相関していた。そして、神経芽腫細胞を、脱メチル化試薬である５−アザデオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣ）存在下で培養することにより、ＣｐＧアイランドを脱メチル化することができ、その結果、ＰＴＧＥＲ２遺伝子発現を回復させることができた。これらの結果により、ＣｐＧアイランドの高頻度メチル化（Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）が神経芽腫における癌抑制遺伝子の発現抑制を高頻度で起こす原因の一つであることが判明した。
【００２０】
（ｂ）ヒストンＨ４蛋白質のアセチル化の度合いの低下による不活性化
ヒストン蛋白質の修飾がＤＮＡのメチル化によって誘起される遺伝子発現の抑制に関与していることが知られている（Ｃａｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００１，２９，４５９８−４６０６）。
トリコスタチンＡ（Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ：ＴＳＡ）は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり、アセチル化と遺伝子発現との関係を解析するための重要なツールであるが、ＴＳＡ存在下で、一部の神経芽腫細胞を培養するとＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現が上昇した（後述する）。従って、ＴＳＡ存在下で、細胞内でＤＮＡと結合しているヒストンＨ３あるいはＨ４蛋白質のアセチル化の度合いが上昇するものと結論付けられる。さらに、ヒストンＨ３あるいはＨ４蛋白質のアセチル化によって誘導されるＰＴＧＥＲ２遺伝子発現の活性化は、神経芽腫におけるＣｐＧアイランドのメチル化に依存しないことも判明した。
【００２１】
（ｃ）上述した手段により、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現量が減少している検体細胞について、さらに、上記（ａ）、（ｂ）の２通りの不活性化の要因にタイプわけすることは、検体提供者に対して最適の治療（投与すべき抗がん剤の選別をおこなう）をおこなう上で非常に有用である。具体的には、上述した検出手段により、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現量が減少していることが判明した検体細胞（癌組織に由来するプライマリー癌細胞）に対して、脱メチル化剤（５−アザデオキシシチジンなど）、または、アセチル化促進剤（トリコスタチンＡなど）を作用させて、遺伝子発現量の回復を検討することにより、上記の要因のタイプわけをすることができる。
【００２２】
すなわち、検体細胞に脱メチル化剤を作用させて、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現量が回復する場合には、検体細胞における遺伝子の抑制要因は、ＣｐＧアイランドのメチル化であり、検体提供者に、脱メチル化作用を有する薬剤を投与することにより、相応の抗腫瘍効果が期待される。また、検体細胞にアセチル化促進剤を作用させて、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現量が回復する場合には、検体細胞における遺伝子の抑制要因は、ヒストンＨ３あるいはＨ４蛋白質におけるアセチル化の抑制であり、検体提供者に、アセチル化促進作用を有する薬剤を投与することにより、相応の抗腫瘍効果が期待される。また、これらの両者の反応が認められる場合には、検体細胞におけるＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現量の抑制原因は、上記のメチル化と、アセチル化の抑制にあると結論づけられ、脱メチル化剤とアセチル化促進剤の両者を投与することにより、相応の抗腫瘍効果が期待される。
【００２３】
（２）細胞増殖の抑制方法、及び細胞増殖抑制剤
本発明によればさらに、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法、並びに上記遺伝子又は蛋白質を含む細胞増殖抑制剤が提供される。
【００２４】
ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子を取り扱う場合、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲ法などにより酵素学的に合成したものでもよい。ＰＣＲ法によりＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、目的とする塩基配列を増幅できるように設計したプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００２５】
ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の検出ブローブ又はプライマーの調製、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、２nd  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。
【００２６】
ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子は、ベクターに組み込んだ組換えベクターの形態で用いることができる。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。
【００２７】
動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００，１９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００２８】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００２９】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００３０】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００３１】
本発明の細胞増殖抑制剤は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００３２】
有効成分である上記遺伝子又は蛋白質を配合するために使用する基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００３３】
本発明の細胞増殖抑制剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、細胞増殖抑制剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００３４】
本発明の細胞増殖抑制剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００３５】
（３）細胞増殖の活性化方法、及び細胞増殖活性化剤
本発明によれば、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで腫瘍細胞に導入することを含む細胞の増殖を活性化する方法、並びに上記のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む細胞増殖活性化剤が提供される。
【００３６】
ｓｉＲＮＡは、約２０塩基（例えば、約２１〜２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、このようなｓｉＲＮＡ は、細胞に発現させることにより、そのｓｉＲＮＡ の標的となる遺伝子（本発明においては、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子）の発現を抑制することができる。
【００３７】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡ は、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよい。ここで、「ｓｉＲＮＡ 」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡ に特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡ と同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡ の中央部でｍＲＮＡを切断する。
【００３８】
ｓｉＲＮＡ の配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡ の中央から外れた位置の塩基が一致していない場合については、ＲＮＡｉによる切断活性は部分的には残存することが多いので、必ずしも１００％一致していなくてもよい。
【００３９】
ｓｉＲＮＡの塩基配列と、発現を抑制すべきＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、当該遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。翻訳開始領域には種々の転写因子や翻訳因子が結合することが予想されるため、ｓｉＲＮＡ が効果的にｍＲＮＡに結合することができず、効果が低減することが予測されるからである。従って、相同性を有する配列は、当該遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、より好ましくは当該遺伝子の翻訳開始領域から７０塩基離れている。相同性を有する配列としては、例えば、当該遺伝子の３'末端付近の配列でもよい。
【００４０】
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡｉにより標的遺伝子の発現を抑制することができる因子として、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を使用することができる。ｓｈＲＮＡとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことを言う。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。上記の通りｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明において有効に用いることができる。
【００４１】
ｓｈＲＮＡは好ましくは、３'突出末端を有している。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約２０ヌクレオチド以上である。ここで、３'突出末端は、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のＤＮＡであり、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチドのＤＮＡである。
【００４２】
上記の通り、本発明では、ＲＮＡｉによりＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現を抑制することができる因子として、ｓｉＲＮＡ またはｓｈＲＮＡを使用することができる。ｓｉＲＮＡの長所としては、（１）細胞内に導入してもＲＮＡ自体は正常細胞の染色体内に組み込まれないので、子孫に伝わる変異を起こすような治療ではなく、安全性が高いこと、及び（２）短鎖二本鎖ＲＮＡは化学合成が比較的容易であり二本鎖にするとより安定であること、などが挙げられる。また、ｓｈＲＮＡの長所としては、遺伝子発現を長期間抑制することによって治療を行う場合、細胞内でｓｈＲＮＡを転写するようなベクターを作製して細胞内に導入することができることなどが挙げられる。
【００４３】
本発明で用いるＲＮＡｉによりＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現を抑制することができるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成してもよいし、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロでＲＮＡを合成することによって作製することもできる。インビトロで合成する場合は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、ＲＮＡｉが引き起こされ、標的遺伝子の発現が抑制される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、oligofectamine、Lipofectamineおよびlipofectionなど）を用いてそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【００４４】
上記したｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、細胞増殖活性化剤として有用である。本発明の細胞増殖活性化剤の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。本発明の薬剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。  薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されないが、例えば、液剤、注射剤、徐放剤などが挙げられる。本発明の薬剤を上記製剤として処方するために使用される溶媒としては、水性または非水性のいずれでもよい。
【００４６】
さらに、本発明の細胞増殖活性化剤の有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
【００４７】
本発明の細胞増殖活性化剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの種類などを考慮して、当業者が決定することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの投与量は特に限定されないが、例えば、約０．１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１ｎｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。ＲＮＡｉは、一般に投与後１〜３日間効果が見られる。したがって、毎日〜３日に１回の頻度で投与することが好ましい。発現ベクターを用いる場合、１週間に１回程度投与することも可能である。
【００４８】
本発明では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖活性化剤として使用することもできる。本発明で用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであって、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであっても良く、また機能に支障がない限りにおいて修飾されたものであってもよい。本明細書で言う「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドがすべて相補的であるもののみならず、ＤＮＡ又はｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが安定にハイブリダイズできる限り、多少のミスマッチが存在してもよい。
【００４９】
なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよい。適当な修飾を施すことにより、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは生体内で分解されにくくなり、より安定してITIIαを阻害できるようになる。このような修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、Ｓ−オリゴ型（ホスフォロチオエート型）、Ｃ−５チアゾール型、Ｄ−オリゴ型（フォスフォジエステル型）、Ｍ−オリゴ型（メチルフォスフォネイト型）、ペプチド核酸型、リン酸ジエステル結合型、Ｃ−５プロピニルピリミジン型、２−Ｏ−プロピルリボース、２'−メトキシエトキシリボース型等の修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されているものでもよい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性、水溶性、ＲＮＡへの親和性に特に優れている。リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、Ｓ−オリゴ型等のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は、５０以下であることが好ましく、２５以下であることがより好ましい。塩基数があまりに多くなると、オリゴヌクレオチドの合成の手間とコストが増大し、また、収率も低下する。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は５以上であり、９以上であることが好ましい。塩基数が４以下の場合には、標的遺伝子に対する特異性が低下して好ましくないためである。
【００５１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（又はその誘導体）は常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製など）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで得ることができる。
【００５２】
本発明においてアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖活性化剤として使用する場合には、一般的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドと製剤用添加物（担体、賦形剤など）とを含む医薬組成物の形態で提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトを含む哺乳動物に医薬として投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）の何れでもよい。
【００５３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの製剤形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択可能である。
【００５４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００５５】
さらに本発明では、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の機能欠失型遺伝子を細胞増殖活性化剤として使用することもできる。機能欠失型遺伝子とは、該当する遺伝子においてその機能を欠失するように変異が導入されている遺伝子のことを言う。具体的には当該遺伝子から作製されるアミノ酸配列の少なくとも１個の構成アミノ酸を欠くもの、少なくとも１個の構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの、少なくとも１個のアミノ酸が付加されたもの等の本来の機能を欠失した一般にムテインと呼ばれるタンパク質を翻訳する当該遺伝子がこれに相当する。
【００５６】
機能欠失型遺伝子を細胞増殖活性化剤として使用する場合は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００５７】
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００５８】
機能欠失型遺伝子の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００５９】
機能欠失型遺伝子の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００６０】
また、上記した本発明の各種の遺伝子治療剤は、常法により調製されたリポソームの懸濁液に遺伝子を添加し凍結した後融解することにより製造することもできる。リポソームを調製する方法は、薄膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法などがある。リポソームの懸濁液は超音波処理した後、遺伝子を添加するのが遺伝子の封入効率を向上させる上で好ましい。遺伝子を封入したリポソームはそのまま、又は水、生理食塩水などに懸濁して静脈投与することができる。
【００６１】
（４）抗腫瘍物質のスクリーニング方法
上述したように、神経芽腫に関しては、ＰＴＧＤＲ遺伝子又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の不活性化が大きな要因となっており、遺伝子の働きを正常化する薬剤は、神経芽腫に対する抗腫瘍剤として用いることが可能であると考えられる。特に、この不活性化の要因が、ＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドによるメチル化、及び／または、ヒストンＨ３あるいはＨ４蛋白質のアセチル化の抑制である場合には、これらの要因を解消・緩和することができる薬剤は、抗腫瘍剤として有用である。
【００６２】
そこで、本発明は、上述したように、脱メチル化作用を有する薬剤のスクリーニング方法である本スクリーニング方法１と、アセチル化促進作用を有する薬剤のスクリーニング方法である本スクリーニング方法２、を提供する発明である。
【００６３】
これらの本スクリーニング方法をおこなう前提として、検体細胞においてＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現量が抑制されている神経芽腫細胞を確保する必要がある。すなわち、本スクリーニング方法１においては、「ＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化に起因してＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現が抑制されている神経芽腫細胞株」が、本スクリーニング方法２においては、「ヒストンＨ４蛋白質のアセチル化の抑制に起因してＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現が抑制されている神経芽腫細胞株」が必要となる。これらの細胞株の確立法は、上述した知見に基づいた上で、常法に従いおこなうことができる。例えば、少なくとも、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の不活性化が確認された細胞の中から、既存の脱メチル化試薬（例えば５−アザデオキシシチジン）を作用させることにより、ＰＴＧＥＲ２遺伝子のレベルが回復する細胞を選択して、これを継代して、所望する「ＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化に起因してＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現が抑制されている神経芽腫細胞株」（以下、メチル化癌細胞株ともいう）として確立することができる。また、少なくとも、ＰＴＧＥＲ２遺伝子のメチル化が確認された神経芽腫細胞の中から、既存のアセチル化促進剤（例えば、トリコスタチンＡ等）を作用させることにより、ＰＴＧＥＲ２遺伝子のレベルが回復する細胞を選択して、これを継代して、所望する「ヒストンＨ３あるいはＨ４蛋白質のアセチル化の抑制に起因してＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現が抑制されている神経芽腫細胞株」（以下、脱アセチル化癌細胞株ともいう）として確立することができる。
【００６４】
本スクリーニング方法においては、上記のメチル化癌細胞株または脱アセチル化細胞株に対して被験物質を接触させることが必要である。この接触の態様は、特に限定されないが、メチル化細胞株の培養物に対して、被験物質を好適には適切な希釈倍率で希釈して添加して、引き続き培養をおこなうことによりおこなわれる。そして、被験物質を添加する前のメチル化癌細胞株または脱アセチル化細胞株におけるＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現量と、添加後の遺伝子の発現量を、好適には経時的に定量し、定量前後の遺伝子の発現量の差を、被験物質を添加せずに同条件で培養された対照培養物と比較して、対照培養物よりも、被験物質を添加した培養物における遺伝子の発現量が増加している場合には、被験物質は１）メチル化癌細胞株を用いた試薬においては「ＰＴＧＥＲ遺伝子のＣｐＧアイランドの脱メチル化によりＰＴＧＥＲ２遺伝子を活性化させることができる抗腫瘍物質」（本スクリーニング方法１）として選別され、２）脱アセチル化癌細胞株を用いた試験においては「ヒストンＨ３あるいはＨ４蛋白質のアセチル化の促進によりＰＴＧＥＲ２遺伝子を活性化させることができる抗腫瘍物質」（本スクリーニング方法２）、として選別される。
さらに、本スクリーニング方法をおこなって、所望の神経芽腫に対する抗腫瘍成分としてスクリーニングされた物質を、さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニング、例えば、上記のメチル化癌細胞株、または、脱アセチル化細胞株を植えつけたヌードマウスでの神経芽腫細胞の増殖抑制効果とヌードマウスの生存率の向上を指標とするスクリーニング方法にかけて、最終的な絞込みをおこなうことが好適である。
【００６５】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００６６】
実施例１：神経芽腫におけるＰＴＧＥＲ２遺伝子の不活性化
神経芽腫での新規な遺伝子変化を検出するために、２種の神経芽腫細胞株（ＩＭＲ３２細胞とＧＯＴＯ細胞）から調製したゲノムＤＮＡを用いて、ＭＧＣ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｒｒａｙ−４５００を用いてＢＡＭＣＡ法による解析をおこなった（Ｉｎａｚａｗａ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，２００４，９５，５５９−５６３）。なお、対象として、５種類のＳｔａｇｅＩの神経芽腫から調製したゲノムＤＮＡを混ぜて使用しＣｙ５で標識した。被検ＤＮＡとして、ＩＭＲ３２細胞とＧＯＴＯ細胞から調製したゲノムＤＮＡを使用しＣｙ３で標識した。具体的には、ＳｍａＩ（１００Ｕｎｉｔｓ）とＸｍａＩ（２０Ｕｎｉｔｓ）で消化した各ゲノムＤＮＡ（５μｇ）にアダプターオリゴを結合し、そのアダプターに相補的なプライマー、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケア）を用いてＰＣＲ反応をおこなうことで標識した。ＢＡＭＣＡ法によるハイブリダイゼーションの後、ＣＧＨアレイをＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＣｙ３及びＣｙ５に由来する蛍光をモニタリングした。得られた結果をＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ４．１イメージングソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｙ３に由来する蛍光強度の平均とＣｙ５に由来する蛍光強度の平均を同じ値に調整し、Ｃｙ３/Ｃｙ５のＲａｔｉｏを求めた。ゲノムに異常がない場合にはＲａｔｉｏ値は１である。Ｒａｔｉｏ値が１．５以上の時にゲノムの変化が認められると判定した。その結果、１４ｑ２２．１染色体領域に存在する１クローン（ＲＰ１１−２６２Ｍ８）にゲノムの変化が認められると判定した。その染色体領域には２つの遺伝子［ＰＴＧＤＲ遺伝子（ＮＭ０００９５３）、ＰＴＧＥＲ２遺伝子（ＮＭ０００９５６）］が存在していることがヒトゲノムデータベース（ｈｔｔｐ://ｇｅｎｏｍｅ.ｕｃｓｃ.ｅｄｕ/）から確認した。そのゲノム構造の模式図を図１Ａに示す。
【００６７】
２つの遺伝子の発現を２０種類の神経芽腫細胞株を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図１Ｂ）。この結果、ＰＴＧＥＲ２遺伝子が発現していない神経芽腫細胞株は、全てＭＹＣＮ遺伝子の増幅が起きていることがわかった。
【００６８】
また、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現の抑制が、ＤＮＡのメチル化による原因かどうかを調べるため、ＰＴＧＥＲ２遺伝子が発現していない神経芽腫細胞株を用い、脱メチル化試薬５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄを１μＭ、５μＭで５日間、そして／また、脱アセチル化阻害剤ＴＳＡを１００ｎｇ／ｍｌで１２時間処理をおこなった。それらの細胞由来からＲＮＡを抽出し、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた（図１Ｃ）。その結果、ＰＴＧＥＲ２遺伝子は、ＴＳＡ処理、５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄ、その両者の処理により、遺伝子発現を回復することがわかった。この結果は、明らかに、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現抑制には、ＤＮＡのメチル化とヒストンのアセチル化が関与していることが推定される。
【００６９】
実施例２：ＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化についての検討
ＣｐＧアイランドのメチル化は遺伝子発現を抑制するメカニズムの１つである。ＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドをＣｐＧＰＬＯＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ｃｐｇｐｌｏｔ／）を用いて解析した結果、ＰＴＧＥＲ２遺伝子のエキソン１周辺にＣｐＧアイランドが存在することを確認した（図２Ａ）。
【００７０】
そのエキソン１を３つの領域にわけ、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンス法（Ｔｏｙｏｔａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，２３０７，１９９９）により、メチル化の度合いを確認した（図２Ｂ）。メチル化の検討には、ＥＺ  ＤＮＡメチレーションキット（Ｚｙｍｏ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、神経芽腫細胞に由来するゲノムＤＮＡ（２μｇ）をＳｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ中５０℃で１晩処理をおこない、目的とするメチル化ＤＮＡを増幅するようにデザインしたプライマーを用いてＰＣＲをおこなった。得られたＰＣＲ産物をＴａｑＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。ＴａｑＩはメチル化されないシトシンがＳｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅで修飾された配列は消化しないが、メチル化されたシトシンがＳｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅで修飾されない配列を消化する性質を利用して、メチル化の度合いをモニタリングした。ＰＣＲ断片を電気泳動後、メチル化された断片のバンドとメチル化されない断片のバンドの濃度比をＭｕｌｔｉＧａｕｇｅ２．０（富士フイルム株式会社）を用いたデンシトメトリーにより測定し、メチル化された領域のメチル化度を％で表示した。また、これらの配列をＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、ＰＴＧＥＲ２遺伝子を発現していない３つの神経芽腫細胞株（ＩＭＲ３２、ＧＯＴＯ、ＳＪ‐Ｎ‐ＣＧ）は、エキソン１の領域（Ｒｅｇｉｏｎ  ２と３）が高頻度にメチル化されていることがわかった。
【００７１】
また、図２Ａで同定したＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドのプロモーター活性を調べるために、このＣｐＧアイランドの周辺を含めて３つの断片にわけそれらの断片をルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＧＬ３‐Ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ：Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入し、神経芽腫細胞株（ＳＪ‐Ｎ‐ＣＧ、ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ）へトランスフェクションした。Ｄｕａｌ-Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、マニュアルに従ってルシフェラーゼ活性を測定し、各Ｒｅｇｉｏｎを有するｐＧＬ３ベクターに由来するルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、Ｒｅｇｉｏｎ１のルシフェラーゼ活性が高いことがわかった（図２Ｃ）。高度にメチル化されていたＲｅｇｉｏｎ３は、ルシフェラーゼ活性があまり高くないことから、直接的に遺伝子発現の不活性化に関与していないかもしれない。
【００７２】
この結果から、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現調節には、ＤＮＡのメチル化の他にエピジェネティックなメカニズムが関与している可能性があることが予想される。そこで、ＣｈＩＰアッセイ（Ｓｏｎｏｄａ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６４，３７４１−３７４７，２００４）を用いて、ヒストンのアセチル化またはメチル化を確認することにした。図２ＡにＣｈＩＰアッセイに用いたプライマーの位置、図２Ｄに結果を示す。その結果、アセチル化されたヒストンＨ３とヒストンＨ４に結合したＤＮＡ断片は、ＰＴＧＥＲ２遺伝子が発現していない細胞株（ＳＪ−Ｎ−ＣＧ、ＧＯＴＯ）においては、ＰＴＧＥＲ２遺伝子が発現している細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）と比較して減少していた。しかし、リジン９番目がトリメチル化されたヒストンＨ３に結合したＤＮＡ断片は、ＳＪ−Ｎ−ＣＧ、ＧＯＴＯ細胞株で増加していた。これらの結果は、ＰＴＧＥＲ２遺伝子が発現していない神経芽腫は、ヒストンＨ３とヒストンＨ４が低アセチル化され、その上、ヒストンＨ３の９番目のリジンがメチル化され、さらにＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドＲｅｇｉｏｎ３がメチル化されている。これらの度合いにより、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現調節がおこなわれていることが予想される。
【００７３】
実施例３：プライマリー神経芽腫でのＰＴＧＥＲ２遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化
これまで、神経芽腫細胞でＰＴＧＥＲ２遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化を解析してきたが、実際に神経芽腫組織でも同様な現象が起こっているかどうかを検討した。組織は、Ｓｔａｇｅ１の神経芽腫組織を１つとＳｔａｇｅ４の神経芽腫組織を３つを用いて、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスで解析した（図２Ｂ）。その結果、Ｓｔａｇｅ４の２つの神経芽腫組織において、Ｒｅｇｉｏｎ３の高いメチル化が確認できた。また、Ｓｔａｇｅ１の神経芽腫組織からは高メチル化は確認できなかった。
【００７４】
さらに４９例の神経芽腫組織のＲｅｇｉｏｎ３についてのメチル化を、メチル化特異的ＰＣＲ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ；ＭＳＰ）をおこない、そのＰＣＲ産物を３％アガロースゲル電気泳動で確認し調べた結果、４９例中１２例はＲｅｇｉｏｎ３のメチル化が確認された（２４．５％）。１２例のうち４例は、Ｓｔａｇｅ１、２、３、４Ｓであり、残り８例はＳｔａｇｅ４の神経芽腫組織であった（図３Ａ）。また、ＭＹＣＮ遺伝子が増幅している神経芽腫９例のうち８例は、ＰＴＧＥＲ２遺伝子のＲｅｇｉｏｎ３がメチル化されていることがわかった（８８．９％）（図３Ｂ）。そして、ＭＹＣＮ遺伝子が増幅されていない４０例では、ＰＴＧＥＲ２遺伝子のＲｅｇｉｏｎ３がメチル化されているのは４例のみであった（１０％）。これらの結果、ＰＴＧＥＲ２遺伝子のメチル化とＭＹＣＮ遺伝子の増幅を検出することにより、神経芽腫の悪性度を見極めることが可能であることを示している。
【００７５】
実施例４：ＰＴＧＥＲ２遺伝子の活性化による神経芽腫の増殖抑制
これまでの結果から、ＰＴＧＥＲ２遺伝子発現を活性化することで、神経芽腫の増殖が抑制されるかどうかを検討した。まず、ＰＴＧＥＲ２遺伝子のＭｙｃタグを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ‐ＰＴＧＥＲ２‐Ｍｙｃ）を構築した。これは全長を有するＰＴＧＥＲ２遺伝子の役割をモニタリングするために使用できる。本プラスミドは、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅したＰＴＧＥＲ２  ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにＭｙｃタグと翻訳フレームがあうように挿入して作製した。対照として、ＰＴＧＥＲ２遺伝子を挿入しない空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１‐ｍｏｃｋ）を使用した。これらの発現プラスミドを、トランスフェクション試薬であるＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と混合し、ＳＪ−Ｎ−ＣＧ、ＧＯＴＯ細胞へトランスフェクションした。２または３週間後にネオマイシン系薬剤であるＧ４１８存在下で増殖する細胞を７０％エタノール７０％エタノールで固定し、クリスタルバイオレッドで染色することによりカウントした。その結果、空ベクターでトランスフェクションした細胞と比べてｐｃＤＮＡ‐ＰＴＧＥＲ２‐Ｍｙｃでトランスフェクションした細胞は顕著にコロニー数が減少した（図４）。この結果は明らかにＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現を活性化することで、神経芽腫の増殖を抑制でき癌抑制剤として機能することを示している。
【００７６】
実施例５：ｃＡＭＰの細胞内濃度増加による神経芽腫の増殖抑制
ＰＴＧＥＲ２蛋白質とＧ蛋白質は連結し、細胞内のｃＡＭＰの濃度を増加に関連があることから（Ｎａｒｕｍｉｙａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ，７９，１１９３‐１２２６，１９９９）、ｃＡＭＰの細胞内濃度と神経芽腫の増殖との関係性を探ることにした。まず、ＰＴＧＥＲ２遺伝子を発現していない神経芽腫細胞株（ＧＯＴＯ、ＳＪ−Ｎ−ＣＧ）と発現している細胞株（ＳＪ−Ｎ−ＫＰ、ＫＰ−Ｎ−ＳＩＦＡ）に、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを増殖培地中に、それぞれ０ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ添加し、７２時間培養した。その後、細胞の生存率は、ＷＳＴアッセイを用いて検出した（図５）。その結果、ＰＴＧＥＲ２遺伝子を発現していない細胞株に、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを添加し、細胞内のｃＡＭＰの濃度を増加させた場合、ＰＴＧＥＲ２遺伝子を発現していない神経芽腫の増殖が抑制されていることが明らかとなった。このことから、ＰＴＧＥＲ２遺伝子を発現していない神経芽腫において、細胞内のｃＡＭＰを蓄積させるということは、癌抑制剤として機能することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、ＰＴＧＤＲ遺伝子とＰＴＧＥＲ２遺伝子のゲノム構造と神経芽腫細胞株における遺伝子発現を示す。Ａ：ＰＴＧＤＲ遺伝子とＰＴＧＥＲ２遺伝子のゲノム構造を示す。オープンとフィルボックスは非翻訳領域とコーディングエキソン配列、ハッチボックスは１４７９ｂｐと１４８２ｂｐのＣｐＧアイランドをそれぞれ示す。Ｂ：正常な脳、副腎、ＭＹＣＮ遺伝子の発現のあり（＋）、なし（−）の神経芽腫細胞株におけるＰＴＧＤＲ遺伝子とＰＴＧＥＲ２遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。コントロールとして、ＧＡＰＤＨの発現を示す。Ｃ：５−ａｚａ−ｄＣと／またはＴＳＡの処理あり（＋）なし（−）をおこなった神経芽腫細胞株におけるＰＴＧＤＲ遺伝子とＰＴＧＥＲ２遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。また、コントロールとして、ＧＡＰＤＨの発現を示す。両方の遺伝子の発現は３種類の細胞株で５−ａｚａ−ｄＣで処理すると回復した。また、３種類の細胞株でＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現はＴＳＡのみの処理により回復した。
【図２】図２は、ＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現状態とＤＮＡメチル化とヒストン修飾の関連性を示す。Ａ：ＰＴＧＤＲとＰＴＧＥＲ２遺伝子のエキソン１周辺領域のＣｐＧアイランド（スティプルバー）の地図。ＣｐＧ部位は垂直線で示す。各遺伝子の断片（Ｒｅｇｉｏｎ１−３）はＣＯＢＲＡとＢｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスによりメチル化を決定した（黒い矢印で示す）。プロモーターアッセイにおけるＰＴＧＥＲ２遺伝子の断片（Ｒｅｇｉｏｎ１−４）は平行線で示す。ＣｈＩＰ−ＰＣＲにより解析した領域はアローヘッドで示す。Ｂ上図：ＰＴＧＤＲ遺伝子またはＰＴＧＥＲ２遺伝子の非発現（ＩＭＲ３２、ＧＯＴＯ、ＳＪ−Ｎ−ＣＧ）と発現（ＫＰ−Ｎ−ＳＩＬＡ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）神経芽腫細胞株、４種類のプライマリー神経芽腫におけるＢｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンスの結果。オープンとフィルのスクエアは非メチル化とメチル化ＣｐＧ部位を示し、各列は１種類のクローン由来である。ＴａｑＩ制限部位は黒いアローヘッドで示す。黒い矢印（ＭＳＰ）と白い矢印（ＵＳＰ）はメチル化と非メチル化アレルを増幅するためにデザインしたプライマー配列の位置を示す。下図：各遺伝子の発現有り（＋）なし（−）の神経芽腫細胞株におけるＰＴＧＤＲとＰＴＧＥＲ２のＣｐＧアイランドのＲｅｇｉｏｎ３に伴うＣＯＢＲＡ実験。ＰＣＲ産物はＴａｑＩにより消化した。矢印は非メチル化アレル、アローヘッドはメチル化アレルを示す。Ｃ：ＰＴＧＥＲ２ＣｐＧアイランドのプロモーター活性。ｐＧＬ３空ベクター（ｍｏｃｋ）とＣｐＧアイランドＲｅｇｉｏｎ１−４の異なった配列を含むレポーターを構築した。それらをＰＴＧＥＲ２遺伝子が発現している細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）と発現していない細胞（ＳＪ−Ｎ−ＣＧ）へトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性はコントロールに対してノーマライズした。データは３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｄ：ＣｈＩＰアッセイは、神経芽腫細胞内でのＰＴＧＥＲ２プロモーター領域のメチル化とヒストンアセチル化の状態を示す。左、アセチル化ヒストンＨ３（Ａｃ−Ｈ３）、アセチル化ヒストンＨ４（Ａｃ−Ｈ４）、トリメチル化ヒストンＨ３−リジン９（３Ｍｅ−Ｈ３Ｋ９）の抗体を用いた、ＤＮＡ−蛋白質複合体の免疫沈降法。実験は、ＰＴＧＥＲ２遺伝子を発現している細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）とＰＴＧＥＲ２遺伝子を発現していない細胞株（ＳＪ−Ｎ−ＣＧ、ＧＯＴＯ）からクロスリンクした抽出物を用いた。ＰＴＧＥＲ２プロモーター領域を含んだ免疫沈降したサンプルはＰＣＲにより増幅させた。免疫沈降前（Ｉｎｐｕｔ）のソニケートしたクロマチンの部分は、ノーマライズのためのポジティブコントロールとして供給した。抗体が非存在の免疫沈降はネガティブコントロールとして供給した。右、ＣｈＩＰ−ＰＣＲ産物の定量解析。ＣｈＩＰ−ＰＣＲ産物より生産したバンドはデンシトメトリー（ＬＡＳ−３０００、富士フイルム）により定量した。ＳＪ−Ｎ−ＣＧとＧＯＴＯ細胞株において、ＰＴＧＥＲ２プロモーター内のアセチル化ヒストンＨ３とＨ４に結合したＤＮＡは減少した。また、ＳＹ５Ｙと比較してトリメチル化ヒストンＨ３Ｋ９は増加した。これは、神経芽腫細胞におけるＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現調節に、Ｃｐ���アイランド内のメチル化パターンとプロモーター領域内のヒストン修飾が関連していることを連想する。
【図３】図３は、プライマリー神経芽腫におけるＰＴＧＥＲ２のメチル化と発現状態を示す。Ａ：神経芽腫のプライマリーサンプルにおけるＭＳＰ実験の結果。メチル化と非メチル化アレルのためのプライマーは図２Ｂに示すＰＴＧＥＲ２のＣｐＧアイランドＲｅｇｉｏｎ３内に設計し、増幅した。アローヘッドは２種類の腫瘍でのメチル化アレルを示す。Ｂ：プライマリー神経芽腫のＰＴＧＥＲ２のメチル化状態、腫瘍病期（左）とＭＹＣＮ増幅状態（右）の比較。メチル化状態はＭＳＰにより決定した。左、ＰＴＧＥＲ２ＣｐＧアイランドは病期１、２、３、または４Ｓの３７症例中４例（１０．８％）がメチル化されていた。病期４では１２症例中８例（６６．７％）がメチル化されていた（ｐ＝０．０００４、Ｆｉｓｈｅｒ‘ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）。右、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅している９症例では８例（８８．９％）がＰＴＧＥＲ２ＣｐＧアイランドのメチル化を伴う。ＭＹＣＮ遺伝子の増幅していない４０症例では４例（１０．０％）のみＰＴＧＥＲ２ＣｐＧアイランドのメチル化を伴う（ｐ＜０．０００１、Ｆｉｓｈｅｒ‘ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）。
【図４】図４は、神経芽腫の増殖に関するＰＴＧＥＲ２遺伝子発現の効果を示す。ＰＴＧＥＲ２遺伝子が発現していない神経芽腫細胞株（ＧＯＴＯとＳＪ−Ｎ−ＣＧ）を用いたコロニーフォーメーションアッセイ。これらの細胞へＰＴＧＥＲ２を含むＭｙｃタグベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ＰＴＧＥＲ２−Ｍｙｃ）または、空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｅｍｐｔｙ）を一過性でトランスフェクションし、Ｇ４１８存在下で２−３週間薬剤選択をおこなった。左、トランスフェクション後２（ＳＪ−Ｎ−ＣＧ）または３（ＧＯＴＯ）週間で薬剤耐性コロニーを形成した結果、ＰＴＧＥＲ２遺伝子をトランスフェクションした細胞のコロニー形成は、空ベクターをトランスフェクションした細胞よりも少ないことがわかった。右、コロニー形成の定量解析。＞２ｍｍコロニーをカウントした、そしてその結果は３回の別々の実験の平均値±ＳＤとして表した。統計解析はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔ（：ａ、ｐ＜０．０５対空ベクターをトランスフェクションした細胞）を用いた。
【図５】図５は、神経芽腫の増殖におけるｃＡＭＰアナログ、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの細胞浸透性の効果を示す。野生型ＧＯＴＯとＳＪ−Ｎ−ＣＧ細胞、ＰＴＧＥＲ２の発現をしていないＳＪ−Ｎ−ＫＰとＫＰ−Ｎ−ＳＩＦＡ細胞に、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを様々な濃度で添加し７２時間培養した。そして、細胞生存率をＷＳＴアッセイにより決定した。統計解析は、分散分析の１つであるＳｃｈｅｆｆｅ‘ｓ  ｔｅｓｔ（：ａ、ｐ＜０．０５対賦形剤を添加した細胞）を用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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