(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト胃がんの分化型と未分化型について共通して用いることができ、当該２つの型を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セット、該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイ、及び該ＤＮＡマイクロアレイを用いたヒト胃がん用分子診断システムを提供する。【解決手段】特定のＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイを用いることによって、ヒト胃がんの分化型と未分化型を識別してこれを特定する。該ＤＮＡプローブ・セットは、従来以上に小型化されたＤＮＡマイクロアレイの作製を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜７７で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡプローブ・セット。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３】
前記ＤＮＡプローブ・セットが２×２ｍｍ〜４×４ｍｍのエリアに搭載された、請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４】
請求項２または３に記載のＤＮＡマイクロアレイを含み、蛍光強度の直線的測定レンジが３桁であることを特徴とする、ヒト胃がん用分子診断システム。
【請求項５】
請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト胃がんを特定する方法であって、
配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞がヒト分化型胃がんであるか否かを判断する方法。
【請求項６】
請求項２に記載のＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト胃がんを特定する方法であって、
配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞がヒト未分化型胃がんであるか否かを判断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイに搭載するＤＮＡプローブ・セットに関し、より詳細には、ヒト胃がん細胞の分化型と未分化型とを識別するためのＤＮＡプローブ・セットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、胃がんは、病理形態学的診断基準から、分化型と未分化型の２つの型に分類される。従来、胃がんの型を特定する診断においては、手術で摘出した臓器や組織を固定液などで固定して包埋し、適宜の大きさに切り出して作製した顕微鏡標本を病理医が細胞病理組織診断することによって行われていた。
【０００３】
しかしながら、このような細胞病理組織診断には一般に時間がかかり、またそれを正確に行うには経験を要することに加え、その判断に診断を行う病理医の主観が入るという問題があった。そこで、診断者を選ばず、且つ、精度の高い客観的な診断を実現すべく、ヒト胃がんの型の特定診断においてゲノム研究の成果を取り入れた分子診断法の適用が求められていた。ここで、がんの分子診断法とは、がん細胞で特異的に変化する遺伝子発現をマーカーとして、その分子マーカーの変化を定量的に計測することでがん細胞の存在を特定する方法をいう。がんの分子診断法を実現するシステムとして、たとえば、Affymetrix社から１６００遺伝子を搭載したがん関連のカスタム・ＤＮＡマイクロアレイと自動測定システムが提供されているが、この製品は、大集積のＤＮＡマイクロアレイであって非常に高価であり、また、胃がんに特化されたものではなかった。
【０００４】
加えて、従来の市販のＤＮＡマイクロアレイは、すくなくとも1000オーダーのプローブを搭載しており、これに伴ってそれらを測定する装置には、低蛍光強度から高蛍光強度に至る広範囲について定量性をもって測定すべく６桁以上の直線的測定レンジが要求されており、ＤＮＡマイクロアレイを用いる検査システムは、その低コスト化が困難であった。なお、非特許文献１〜７は、ヒト胃がん培養細胞における遺伝子発現解析に関する知見を開示する。
【非特許文献１】Yu CD et al World J Gastroenterol. [2005]11(16):2390-7.
【非特許文献２】Norsett KG et al Cancer Lett. [2004] 210(2):227-37.
【非特許文献３】Inoue H et al Clin Cancer Res. [2002] (11):3475-9.
【非特許文献４】Sakakura C et al Br J Cancer. [2002];87(10):1153-61.
【非特許文献５】Lee S et al Cancer Lett. [2002] 184(2):197-206.
【非特許文献６】Hippo Y et al Cancer Res. [2002] 62(1):233-40.
【非特許文献７】El-Rifai W et al nt J Cancer. [2001] ;92(6):832-8.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記従来技術における課題に鑑みてなされたものであり、本発明は、ヒト胃がんの分化型と未分化型の２つの型に共通して用いることができ、当該分化型と未分化型を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セット、該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイ、及び該ＤＮＡマイクロアレイを用いたヒト胃がん用分子診断システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ヒト胃がんの型の特定診断に対し分子診断法の適用を試みるうえで、ＤＮＡマイクロアレイに搭載するＤＮＡプローブ・セットであって、ヒト胃がんを特定することができるＤＮＡプローブ・セットにつき鋭意検討した。その結果、精選された７７のマーカー遺伝子由来のＤＮＡプローブからなるセットであって、特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド群を用いることによって、ヒト胃がんを特定することはもちろんのこと、その胃がん細胞の型（分化型あるいは未分化型）を識別してこれを特定することができることを発見し、本発明に至ったのである。
【０００７】
すなわち、本発明によれば、配列番号１〜７７で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡプローブ・セットが提供され、該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイが提供される。本発明によれば、前記ＤＮＡプローブ・セットが２×２ｍｍ〜４×４ｍｍのエリアに搭載された、ＤＮＡマイクロアレイが提供される。さらに、本発明によれば、前記ＤＮＡマイクロアレイを含み、蛍光強度の直線的測定レンジが３桁であることを特徴とする、ヒト胃がん用分子診断システムが提供される。
【０００８】
さらに本発明の別の構成によれば、前記ＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト胃がんを特定する方法であって、配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞がヒト分化型胃がんであるか否かを判断する方法が提供される。また、本発明によれば、前記ＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト胃がんを特定する方法であって、配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞がヒト未分化型胃がんであるか否かを判断する方法が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
上述したように、本発明によれば、ヒト胃がんの分化型と未分化型について共通して用いることができ、この２つの型を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セットおよび当該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を実施の形態をもって説明するが、本発明は、以下に示す実施の形態に限定されるものではない。本発明者らは、本発明のヒト胃がんの分化型と未分化型を識別して特定するためのＤＮＡプローブ・セットの設計に際し、ヒト胃がん培養細胞における遺伝子発現解析に関する先に挙げた論文７報（非特許文献１〜７）に掲載されたマーカー遺伝子について、ヒト胃がんの分化型および未分化型に対する発現の特異性とその発現量などに鑑みて精査した結果、胃がん関連遺伝子として合計２６０のマーカー遺伝子を抽出した。
【００１１】
次に、National Center for Biotechnology Information（NCBI）とEnsembl に登録されているＤＮＡデータベースを参照して、上述した２６０のマーカー遺伝子のそれぞれについて、45
±2 merのオリゴヌクレオチド・シーケンスを抽出した。オリゴヌクレオチド・シーケンスの抽出は、（１）5′末端および3′末端が、ＧまたはＣであること、（２）ＧＣ含有率が４５〜６０％であること、（３）融解温度（Ｔｍ）が６３〜７４°であること、（４）Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）の各塩基が偏在しないこと、（５）NCBIの検索ソフトウェアであるBLASTを用いた検索で、他の遺伝子において部分配列として含まれていないこと、の５つの条件を満たすものについてこれを選択して行った。
【００１２】
下記表１〜３に、上述した手順で抽出した、本発明のＤＮＡプローブ・セットとして用いられる、７７のオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。表１には、未分化型胃がんのマーカー遺伝子（配列番号１）、分化型胃がんのマーカー遺伝子由来の一群（配列番号２〜４）、および、胃がんのマーカー遺伝子由来の一群（配列番号５〜３０）を、表２には、胃がん前がんのマーカー遺伝子由来の一群（配列番号３１〜４１）、Helicobacter pylori関連のマーカー遺伝子由来の一群（配列番号４２〜４６）、および、chemotherapy関連のマーカー遺伝子（配列番号４７）を、表３には、肺がんマーカー遺伝子とも共通のがんのマーカー遺伝子由来の一群（配列番号４８〜７７）をそれぞれ示す。なお、表１〜３には、ＤＮＡプローブの塩基配列とともに、由来マーカー遺伝子のAccession
No.（GenBank）およびSymbol、ならびに、その塩基数、ＧＣ含有率（％）、および融解温度（Ｔｍ）を併せて示す。
【００１３】
【表１】
2009213391.tif 000002
【００１４】
【表２】
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【００１５】
【表３】
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【００１６】
本発明のＤＮＡプローブ・セットによれば、上記表１〜３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが搭載されたわずか７７のスポットによって、ヒト胃がんを特定することはもちろんのこと、その分化型または未分化型を識別してこれを正確に特定することができるＤＮＡマイクロアレイが実現される。すなわち、本発明のＤＮＡプローブ・セットは、わずか７７のプローブから構成されているにもかかわらず、ヒト胃がんの上記２つの型を絞り込むための解析に必要十分な情報を提供することができることを特徴とするものであり、このような機能を奏する特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド群の構成は、本発明者らによって初めて開示されるものである。さらに、本発明のＤＮＡプローブ・セットは、そのプローブ数が７７に精選されているため、その他コントロールを含めても、たとえば、２×２ｍｍ〜４×４ｍｍのスポットエリアに搭載可能であり、さらに、その解析時間も大幅に短縮される。
【００１７】
さらに好都合なことに、本発明のＤＮＡプローブ・セットによれば、ＤＮＡマイクロアレイ解析において、有意な測定値として採用するスポットの蛍光強度を100〜100,000(３桁）の範囲に収めることができる。これはすなわち、本発明のＤＮＡプローブ・セットを用いたヒト胃がんの分子診断においては、ＤＮＡマイクロアレイ解析装置におけるスキャナーの直線的測定レンジが３桁あれば必要十分であることを意味する。従来の市販のＤＮＡマイクロアレイは、すくなくとも1000オーダーのプローブを搭載しており、これに伴ってそれらを測定する装置には、低蛍光強度から高蛍光強度に至る広範囲について定量性をもって測定すべく６桁以上の直線的測定レンジが要求されており、その結果、システム全体が高額なものとなっていたのに対し、本発明のＤＮＡプローブ・セットによれば、上述したように測定装置に要求される直線的測定レンジは３桁の範囲である。したがって、本発明によれば、蛍光強度100〜100,000の範囲が直線的測定レンジであるヒト胃がん用分子診断システムが提供され、これに対応してシステムに関するコストの低減が期待される。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明のＤＮＡプローブ・セットについて、実施例を用いてより具体的に説明を行なうが、本発明は、後述する実施例に限定されるものではない。
【００１９】
（ＤＮＡマイクロアレイの作製）
上述した手順に従って決定した塩基配列を有する45 ±2 mer のオリゴヌクレオチドを、Invitrogen社（Invitrogen Japan KK.,Tokyo,Japan)から入手した。上記表１〜３に示す末端未修飾の７７のオリゴヌクレオチドを、３×３ｍｍ基板に対してスポッティングすることによって独自のＤＮＡマイクロアレイを作製した。なお、本実施例におけるＤＮＡマイクロアレイには、上記表１〜３に示す７７のオリゴヌクレオチドの他に、正常細胞のマーカーとして標準化遺伝子由来のＤＮＡプローブである２３種のオリゴヌクレオチドと、陰性対照として植物遺伝子由来のＤＮＡプローブである３種のオリゴヌクレオチドを加え、合計１０３のスポットを搭載した。下記表４に、標準化遺伝子由来の２３種のオリゴヌクレオチドの塩基配列を、下記表５に、植物遺伝子由来の３種のオリゴヌクレオチドの塩基配列をそれぞれ示す。
【００２０】
【表４】
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【００２１】
【表５】
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【００２２】
（ヒト胃がん培養細胞系への適用）
上述した手順で作製したＤＮＡマイクロアレイをヒト胃がん培養細胞系へ適用し遺伝子発現量の測定を行った。本実施例においては、ヒト分化型胃がんについて２種類のヒト胃がん由来培養細胞、ヒト未分化型胃がんについて３種類のヒト胃がん由来培養細胞をそれぞれ用いた。下記表６に、各病態と用いた培養細胞株の対応関係をまとめて示す。
【００２３】
【表６】
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【００２４】
表６に示した細胞株を培養してtotal RNAを抽出し、当該total RNAから逆転写酵素によってcDNAを調製した。本実験においては、ヒト正常胃由来培養細胞は入手困難であったため、ブランクとして、ヒト正常胃由来培養細胞の代りにMKN7（ヒト分化型胃がん由来培養細胞）を用いた。なお、MKN7については、事前に、ヒト正常胃粘膜由来のtotal
RNA を入手し、MKN7の遺伝子発現がヒト正常胃粘膜細胞に近いことを確認した。
【００２５】
表６に示した細胞株由来のcDNAのうち、MKN7由来のcDNAはAlexa647で、その他の株由来のcDNAはAlexa555でそれぞれ蛍光標識した。ほぼ等量の蛍光標識DNAを本実施例のＤＮＡマイクロアレイへ競合ハイブリダイズさせて、スキャナーで測定して蛍光強度を解析した。なお、測定した蛍光強度は、GAPD(配列番号８７)の蛍光強度で補正して蛍光値データを得た。本実施例においては、上述した測定を各々の培養細胞について最低２回以上行い、その平均値を蛍光値データとした。
【００２６】
上記手順で得られた各スポットの蛍光値データについて、ブランク（本実施例においてはMKN7で代替）の蛍光値に対する比（以下、Ratioとして参照する）を求め、（１）Ratioが２以上、（２）Ratioが１／２以下、（３）Ratioが１／２以上２以下、（４）蛍光値が低い（胃がん細胞およびブランクの蛍光値のいずれもが１００以下）、という４段階で評価した。なお、評価（１）〜（３）においては、胃がん細胞およびブランク（MKN7）のいずれにおいても有意な蛍光値が得られたことを前提とした。本実施例においては、蛍光光度計で出力１０００Ｖのフォトマルを９８％出力で使用した時の蛍光値１００を閾値とし、これを超える値を有意な蛍光値とした。
【００２７】
次に、上記評価結果に基づいて、ヒト分化型胃がん培養細胞２株（MKN7、AZ521）に対して共通した評価を得たスポット群を抽出するとともに、ヒト未分化型胃がん培養細胞３株（KATO
III、NUGC3、NUGC4）に対して共通した評価を得たスポット群を抽出したうえで、上記両スポット群の共通項を抽出した。さらに、この共通項のスポット群について、ヒト分化型胃がん培養細胞２株における評価と、ヒト未分化型胃がん培養細胞３株のおける評価とが異なるスポット群を抽出した。
【００２８】
図1は、ヒト分化型胃がん培養細胞２株において同じ評価を得、且つ、ヒト未分化型胃がん培養細胞３株においても同じ評価を得たスポットの由来遺伝子のうち、ヒト分化型胃がん培養細胞２株における評価とヒト未分化型胃がん培養細胞３株における評価とが異なるものであった１１マーカー遺伝子のオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子（Symbol）とともにまとめて示す。
【００２９】
図１に示されるように、本実施例のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイにおいて、配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された１１のスポットのそれぞれが、ヒト分化型胃がんの培養細胞２株（MKN7,
AZ521）について同じ評価を示した。具体的には、ヒト分化型胃がんの培養細胞２株（MKN7,
AZ521）は、配列番号２、配列番号５３、配列番号６６、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、および配列番号４６で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された７のスポットにおいては、いずれも、「Ratioが１／２以上２以下」という評価を示し、配列番号４８、配列番号６０、配列番号３７、および配列番号６８で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された４のスポットにおいては、「蛍光値が低い」という評価を示した。
【００３０】
同じく、配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された１１のスポットのそれぞれが、ヒト未分化型胃がんの培養細胞３株（KATO
III, NUGC3, NUGC4）について同じ評価を示した。具体的には、ヒト未分化型胃がんの培養細胞３株（KATO
III, NUGC3, NUGC4 ）は、配列番号４８、配列番号６０、配列番号３７、配列番号６８、配列番号４６で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された５のスポットにおいては、「Ratioが２以上」という評価を示し、配列番号２、配列番号５３、および配列番号７７で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された３のスポットにおいては、「蛍光値が低い」という評価を示し、配列番号６６、配列番号７３、および配列番号４７で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された３のスポットにおいては、「Ratioが１／２以下」という評価を示した。
【００３１】
上述した本実施例のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイに対して、蛍光標識したサンプルを競合ハイブリダイズさせ、その蛍光データを解析する際、図１に示した配列番号で表されるＤＮＡプローブ群についての評価に着目することによってヒト胃がんの２つの型を識別しうることは容易に理解されよう。
【００３２】
すなわち、図１に示した配列番号で表されるＤＮＡプローブが搭載されたスポットについて得られた評価結果（「Ratioが２以上」、「Ratioが１／２以下」、「Ratioが１／２以上２以下」、「蛍光値が低い」）と、図１に表示した評価を内容とするテーブルとを照合し、その合致率を割り出すことによってヒト胃がんの２つの型（分化型・未分化型）を絞り込むことが可能となる。
【００３３】
例えば、図１に示した配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６の１１のオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの結果に着目し、その内の７つ以上のスポットで、図１に表示されたヒト分化型胃がん培養細胞についての評価と同じ評価結果を得た場合に（７／１１の合致率）に、当該サンプルを「ヒト分化型胃がん」と判定すること、あるいは、図１に表示されたヒト未分化型胃がん培養細胞についての評価と同じ評価結果を得た場合に（７／１１の合致率）、当該サンプルを「ヒト未分化型胃がん」と判定することは、いずれも十分な妥当性をもつ。
【００３４】
なお、判定基準となる上述した合致率は、その診断に求められる精度に鑑みて適宜設定しうることはいうまでもない。以上、説明してきた本実施例によって、本発明のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイによって、ヒト胃がん培養細胞の２つの型を正確に識別してこれを特定することができることが示された。
【００３５】
（ＤＮＡマイクロアレイの妥当性の検証）
図２は、本実施例のＤＮＡプローブ・セットを搭載して独自に作製したＤＮＡマイクロアレイの、ヒト分化型胃がん培養細胞（MKN7)とヒト未分化型胃がん培養細胞（NUGC4）によるscattering pattern を示す。図２において「×」はプローブが搭載された各スポットを示し、線分ａはRatio（分化型胃がん細胞/未分化型胃がん細胞)が「１」を示している。また、線分ｂと線分ｃの２本の線によって画定される範囲は、Ratio（分化型胃がん細胞/未分化型胃がん細胞)が「0.5< <2.0」であり、両細胞において有意な差異が認められない範囲を示している。一方、線分ｂの上側にある「×」はヒト分化型胃がん細胞で2.0倍以上に発現が増加している遺伝子を示しており、線分ｃの下側にある「×」はヒト分化型胃がん細胞で0.5倍以下に発現が減少している遺伝子を示している。
【００３６】
図２に示されるように、「×」で示される各スポットは、蛍光強度101〜105の範囲にほぼ納まっている。一方、蛍光強度101〜102の範囲は、すでに説明したように、本発明の解析方法においては「蛍光値が低い」と評価される範囲であって、その定量化を必要としない。すなわち、本発明の解析方法においては、蛍光強度101〜102の範囲に定量性は要求されず、蛍光強度102〜105の範囲についてのみ定量性をもって測定できれば必要十分なのであり、図２は、蛍光強度102〜105の３桁の範囲についてのみ直線的測定レンジを備える測定装置であっても妥当性をもった診断結果が得られることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
以上、説明したように、本発明によれば、ヒト胃がんの分化型と未分化型について共通して用いることができ、この２つの型を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セットおよび当該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイが提供される。本発明のＤＮＡプローブ・セットは、従来以上に小型化されたＤＮＡマイクロアレイの作製を可能にすることによって、安価で高性能なヒト胃がんの分子診断システムの構築に資することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ヒト分化型胃がん培養細胞２株の間およびヒト未分化型胃がん培養細胞３株の間で同程度のレベルの発現を示した遺伝子のうち、ヒト分化型胃がん培養細胞２株とヒト未分化型胃がん培養細胞３株で異なるレベルの発現を示した１１マーカー遺伝子のオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子（Symbol）とともにまとめて示した図。
【図２】本実施例のＤＮＡプローブ・セットを搭載して作製したＤＮＡマイクロアレイの、ヒト分化型胃がん培養細胞とヒト未分化型胃がん培養細胞によるscattering patternを示す図。
【図１】
2009213391.tif 000008
【図２】
2009213391.tif 000009
【配列表】
2009213391000001.app