(57)【要約】【課題】走査型レーザ顕微鏡での多種多様な性能テスト課題および校正課題のうちの少なくとも一つを、時間を節約しながら簡単な手段で処理すること。【解決手段】合焦光学系３と、合焦光学系３の焦点面内に配置されており、落射光および透過光のうちの少なくとも一つにおいて検出可能な構造要素を備えたテスト構造４とを共通のフレーム２内で互いに対し固定的に位置合わせして備える校正装置１が、走査型レーザ顕微鏡内で、合焦光学系の瞳が、走査型レーザ顕微鏡の対物レンズの瞳と重なり合うか、または走査型レーザ顕微鏡の対物レンズの瞳に共役な面内にあるように、顕微鏡の放射線経路内に挿入され得る。【選択図】      図１
2009181122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
走査型レーザ顕微鏡を校正するための校正装置であって、合焦光学系（３）と、該合焦光学系（３）の焦点面（ＦＥ）内に配置されており、落射光および透過光のうちの少なくとも一つにおいて検出可能な構造要素を備えたテスト構造（４）とを共通のフレーム（２）内で互いに対し固定的に位置合わせして備える校正装置。
【請求項２】
前記テスト構造（４）が前記フレーム（２）内で交換可能に止め具で固定される、請求項１に記載の校正装置。
【請求項３】
前記テスト構造（４）が、前記合焦光学系（３）に対置され、かつ前記合焦光学系（３）の方向に前記テスト構造（４）を透過放射するために形成された照明機構（７）に隣接している、請求項１または２に記載の校正装置。
【請求項４】
前記照明機構（７）が、前記共通のフレーム（２）内に止め具で固定される、請求項３に記載の校正装置。
【請求項５】
照明機構（７）として、遠視野照明のために形成されたＬＥＤが設けられる、請求項４に記載の校正装置。
【請求項６】
照明機構（７）として、走査型レーザ顕微鏡のハロゲンランプが設けられる、請求項３に記載の校正装置。
【請求項７】
前記テスト構造（４）が、構造要素として反射性格子要素（５）を備える、請求項１または２に記載の校正装置。
【請求項８】
前記反射性格子要素（５）が、ｘ方向およびｙ方向に周期的に構造化された格子として形成される、請求項７に記載の校正装置。
【請求項９】
前記周期的に構造化された格子が、光学伝達関数の算定のための構造として形成される、請求項８に記載の校正装置。
【請求項１０】
前記周期的に構造化された格子が様々な周期長を有する、請求項８または９に記載の校正装置。
【請求項１１】
前記反射性格子要素（５）の間に蛍光性の格子間領域（１２）が形成される、請求項７に記載の校正装置。
【請求項１２】
前記反射性格子要素（５）が、放射透過性キャリアの上に設けられ、かつ蛍光性材料から成る層によって覆われる、請求項１１に記載の校正装置。
【請求項１３】
蛍光性材料として、単光子励起および多光子励起のうちの少なくとも一つに適した固体または色素溶液が用いられる、請求項１２に記載の校正装置。
【請求項１４】
前記反射性格子要素（５）のためのキャリアとして、蛍光性ガラスまたは蛍光性半導体材料が用いられる、請求項１１に記載の校正装置。
【請求項１５】
前記テスト構造（４）が、スター・テスト用の構造要素を含む、請求項７乃至１０のいずれか１項に記載の校正装置。
【請求項１６】
前記テスト構造（４）が、均質に発光する平面領域と発光性の規則的な格子構造とを備えた発光要素として形成され、その際、該平面領域および該格子構造の発光特性が検出可能に互いに異なる、請求項１または２に記載の校正装置。
【請求項１７】
前記テスト構造（４）が、点光源を生成するため、透過光において放射線を通し得る単孔マスクを備える、請求項３乃至６のいずれか１項に記載の校正装置。
【請求項１８】
前記テスト構造（４）が領域に区分けされており、その際、一方の領域は反射性格子要素（５）および蛍光性の格子間領域（１２）を有し、かつもう一方の領域は透過光において放射線を通し得る単孔マスクとして形成される、請求項３乃至６のいずれか１項に記載の校正装置。
【請求項１９】
請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の校正装置（１）が、顕微鏡の放射線経路内に挿入可能である、走査型レーザ顕微鏡。
【請求項２０】
前記校正装置（１）が更なる対物レンズと共に、複数対物レンズ交換器内に止め具で固定される、請求項１９に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項２１】
前記校正装置（１）の前記合焦光学系が、前記複数対物レンズ交換器内の前記更なる対物レンズより短いアライメント長を有する、請求項２０に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項２２】
前記合焦光学系（３）の瞳が、前記走査型レーザ顕微鏡の前記対物レンズの瞳と重なり合うか、または前記走査型レーザ顕微鏡の前記対物レンズの瞳に共役な面内にあることを特徴とする請求項１９乃至２１のいずれか１項に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項２３】
励起用放射線を生成するための少なくとも１つのレーザと、該励起用放射線の変動する偏向のために形成された偏向機構と、少なくとも１つの検出チャネルとを含む走査型レーザ顕微鏡の励起用放射線経路と検出用放射線経路との間のアライメント状態を決定および補正するための方法であって、
該走査型レーザ顕微鏡の該放射線経路内に請求項１乃至７のいずれか１項に記載の校正装置が配置され、その際、該走査型レーザ顕微鏡の前記対物レンズの前記瞳と該校正装置の前記合焦光学系の前記瞳とが重なり合うか、または互いに共役な面内で配置される工程と、
該励起用放射線により前記テスト構造を走査し、かつ前記テスト構造の反射画像または蛍光画像を記録する工程と、
前記テスト構造を透過放射し、かつ前記テスト構造の透過光画像を記録する工程と、
該反射画像および該透過光画像内の構造ポジションを算定し、かつ相互のポジションのズレを決定する工程と、
を備える方法。
【請求項２４】
前記反射または蛍光画像および前記透過光画像の記録が、互いに分離された検出チャネル内で同時に行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
相互のポジションのズレの決定および補正が、相互相関によって自動的に行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
励起の蛍光画像および検出の透過光画像が反転される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
走査型レーザ顕微鏡内の信号対雑音比を測定するための請求項１１に記載の校正装置の使用方法。
【請求項２８】
走査型レーザ顕微鏡内の信号対雑音比を測定するための請求項１７または１８のいずれか１項に記載の校正装置の使用方法。
【請求項２９】
蛍光相関分光法またはＣＡＲＳ顕微鏡検査を実施するために走査型レーザ顕微鏡の試料領域内にテスト信号を入射するための請求項１７または１８のいずれか１項に記載の校正装置の使用方法。
【請求項３０】
走査型レーザ顕微鏡内の解像度を測定するための請求項７、１７または１８のいずれか１項に記載の校正装置の使用方法。
【請求項３１】
走査型レーザ顕微鏡内のスキャナを校正するための請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の校正装置の使用方法。
【請求項３２】
走査型レーザ顕微鏡内の励起抑制および検出用放射線経路の透過を測定するための請求項１１に記載の校正装置の使用方法。
【請求項３３】
走査型レーザ顕微鏡内の照らし出しの均質性を決定するための請求項１１または１６のいずれか１項に記載の校正装置の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、校正装置およびそのような校正装置を備えた走査型レーザ顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
共焦点の走査型レーザ顕微鏡（ＬＳＭ）の場合、少なくとも１つのレーザによって励起用放射線として生成されたレーザ放射が、偏向機構（スキャナ）と、スキャン光学系と、鏡筒レンズとを介して案内され、かつ対物レンズにより、検査すべき標本内に、回折限界で合焦される。励起用放射線が標本と相互作用することにより放出された蛍光放射は、スキャナを介して２色性ビーム・スプリッタ上に到達し、このビーム・スプリッタは、蛍光放射を励起用放射から分離して検出用放射線経路内に導く。続いて蛍光放射は、共焦点絞りであるピンホール上に合焦され、このピンホールは、検出用放射線経路内で焦点面に共役な面内に配置されている。蛍光放射は、再度の励起用放射抑制のためブロック・フィルタを通過した後、光電子増倍管（ＰＭＴ）によって測定される。
【０００３】
走査型レーザ顕微鏡の場合、多数のコンポーネントに基づき多種多様な性能テスト課題および校正課題があり、これらの課題は、製造の際およびユーザのために非常に重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このため、多種多様な性能テスト課題および校正課題のうちの少なくとも一つを、時間を節約しながら簡単な手段で処理するという課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この課題は本発明により、合焦光学系と、合焦光学系の焦点面内に配置されており、落射光および透過光のうちの少なくとも一つにおいて検出可能な構造要素を備えたテスト構造とを共通のフレーム内で互いに対し固定的に位置合わせして備える校正装置によって解決される。
【０００６】
本発明の特に有用で有利な形態および変形形態は従属請求項から明らかである。
このため校正装置は、合焦光学系および校正構造から成る固定的な組合せにより、温度に起因する焦点位置の変化に対し特に抵抗力のある構成ユニットを形づくっており、この構成ユニットを用いて、検査すべき機器システム内で、その機器システムの性能の測定および判断に適したテスト画像を生成することができる。その際、テスト画像が所望の特性を備えていれば、テスト画像がどのように生成されるかは重要でなく、例えば、合焦光学系としての高倍率の対物レンズと共に非常に小さなテスト構造を使用し得ることによって生成される。同じテスト画像は、より大きなテスト構造およびより小さな倍率を備えた対物レンズによっても生成可能である。別の包括的な調整を実施することができる。例えば、合焦光学系の焦点面の望ましくない湾曲は、この画像エリアの湾曲に適合させたテスト構造を使用することによって補償し得る。結果として、画像側に望ましい平面的なテスト画像が生じる。
【０００７】
全体的に、この校正装置に関しては以下の調整を行い得る：
・使用した材料の熱膨張よりかなり大きな、校正装置の対象物側の焦点深度の調整が、簡単なやり方で、温度安定性の校正装置の実現を可能にする、
・テスト構造による、合焦光学系の幾何学的な歪みの補整、および
・湾曲した構造を使用することによる、湾曲した焦点面の補整。
【０００８】
校正装置の残っている結像欠陥も、必ずしも校正装置としての適性の制限を意味しない。
補償され得ない結像特性が、例えば合焦光学系の横色収差を形成し、この横色収差は、テスト構造を様々な波長で検出する際に異なる大きさで出現させる。それにもかかわらず、測定されたテスト構造の評価の際に合焦光学系の横色収差を考慮し、かつ差し引くことによって、走査型レーザ顕微鏡の倍率などを厳密に測定することが可能である。
【０００９】
特に、テスト構造の交換にアライメントの必要がないことが利点であり、そのためにフレームは、交換時に校正装置内のテスト構造の側方および軸方向の位置が常に同じままであるように形成されている。
【００１０】
本発明の有利な変形形態では、テスト構造が、合焦光学系に対置され、合焦光学系の方向にテスト構造を透過放射するために形成された照明機構に隣接している。
有利にはＬＥＤとして形成された照明源を共通のフレーム内に止め具で固定することができ、もしくは走査型レーザ顕微鏡のハロゲンランプを透過光源として使用する。
【００１１】
テスト構造が、構造要素として反射性格子要素を備え得ることが有利である。例えばクロムから成るこのような構造要素は、スキャン・エリアの大きさの校正、スキャナの移動の直線性の校正、または光学システムの結像特性における非直線性の補正を可能にするので、特に適切であると実証されている。特に、ｘ方向およびｙ方向に周期的に構造化された格子としての格子要素が形成され得、この格子は、様々な走査周波数を実現するために様々な周期長を有することも可能である。
【００１２】
さらにテスト構造は、スター・テスト用構造要素も含み得る。
昨今の蛍光を検出する顕微鏡のアライメントおよび校正のため、励起光による照射の応答として蛍光を放出し得る校正装置が必要である。このため反射性格子要素の間に、蛍光性の格子間領域が形成される場合が有利である。
【００１３】
本発明の１実施形態では、反射性格子要素が、放射透過性キャリアの上に設けられており、かつ蛍光性材料から成る層によって覆われている。蛍光性材料としては、単光子励起および多光子励起のうちの少なくとも一つに適した固体または色素溶液が企図され得る。特に、蛍光性材料によって放出された蛍光が、定義されたスペクトル特性および偏光特性を有している場合も有利であり、これにより、そのような特性が顕微鏡の検出システムによって捕捉され得る。軸方向の焦点長さ（例えば＜１００ｎｍ）より明らかに小さい蛍光性材料の層厚は、特に励起ＰＳＦおよび検出ＰＳＦ（ＰＳＦ＝点広がり関数）の測定に適している。
【００１４】
別の実施形態では、蛍光性ガラスまたは蛍光性半導体材料も、反射性格子要素のキャリアとして用いられ得る。
走査型レーザ顕微鏡内での照らし出しの均質性を決定するため、テスト構造は、均質に発光する平面領域と発光性の規則的な格子構造とを備えた発光要素として形成可能であり、その際、平面領域および格子構造の発光特性は検出可能に互いに異なっている。
【００１５】
本発明の更なる実施形態は、点光源を生成するためのテスト構造が、透過光において放射線を通し得る単孔マスクを含むことを企図する。
特に、テスト構造が領域に区分けされることも可能であり、その際、一方の領域は反射性格子要素および蛍光性領域を有しており、かつもう一方の領域は単孔マスクとして形成される。
【００１６】
テスト構造のうちの幾何学的な構造も、材料特性によって決定される領域も、異なる校正工程を互いに妨げないよう空間的に分離されるべきである。
さらに課題は、合焦光学系と、合焦光学系の焦点面内に配置されており、落射光および透過光のうちの少なくとも一つにおいて検出可能な構造要素を備えたテスト構造とを共通のフレーム内で互いに対し固定的に位置合わせして備える校正装置を顕微鏡の放射線経路内に挿入可能な走査型レーザ顕微鏡によって解決される。
【００１７】
特に、合焦光学系の瞳が、走査型レーザ顕微鏡の対物レンズの瞳と重なり合うポジションで、または走査型レーザ顕微鏡の対物レンズの瞳に共役な面内にあるポジションで、顕微鏡の放射線経路内に挿入されることが企図される。
【００１８】
顕微鏡の放射線経路内に挿入可能な校正装置の更なる特徴は、校正装置に関する従属請求項から明らかである。
好ましい実施形態では、校正装置が更なる対物レンズと共に、複数対物レンズ交換器内に止め具で固定される。
【００１９】
特に、校正装置の合焦光学系が、複数対物レンズ交換器内の更なる対物レンズより短いアライメント長（標本内の対象面と、複数対物レンズ交換器での対物レンズの設置平面との間隔）を有する場合が有利である。これにより、適用可能な標本が顕微鏡の対象物ステージ上にあるときに、本発明による校正装置を顕微鏡の放射線経路内に挿入することで校正測定を実施することも可能である。こうして標本との衝突を排除し得る。
【００２０】
さらに本発明の主題は、請求項２３の特徴に基づく、走査型レーザ顕微鏡の励起用放射線経路と検出用放射線経路との間のアライメント状態を決定および補正するための方法である。
【００２１】
この方法の場合の最適な信号調整には、互いに分離された検出チャネル内で反射画像および透過光画像を同時に記録することが有益であり、これにより、偏向機構での変化（例えばスキャン・エリアの中心点のドリフト／ジッター）が悪影響を及ぼすことがない。相互のポジションのズレの決定および補正が、相互相関によって自動的に行われ得ることが有利である。
【００２２】
さらに本発明の主題は、請求項２７〜３３に基づく、本発明による校正装置の数多くの使用可能性である。
以下に、概略的な図面に基づき本発明をさらに詳しく説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
図１に示した校正装置１は、共通のフレーム２内に、合焦光学系３と、合焦光学系３の焦点面ＦＥ内で交換可能に、かつ合焦光学系３に対してアライメントされて配置されたテスト構造４と、を含んでいる。合焦光学系３およびテスト構造４の互いに対する固定的なポジショニングが、持続的にチェック測定を実施し得ることを保証する。テスト構造４は、幾何学的な構造要素および材料特性のうちの少なくとも一つによって決定される構造要素を備えており、これら要素は落射光および透過光のうちの少なくとも一つにおいて検出可能である。
【００２４】
図３に基づく実施形態では、構造要素が、反射性格子要素５を備えたテスト格子として例えばスキャナ移動の直線化または校正のために形成され、もしくはスター・テストのためにジーメンス・スター６として形成される。構造の幅は、合焦光学系３の点広がり関数（ＰＳＦ）の大きさ内にあるべきである。構造の幅がＰＳＦの大きさ以下の場合、透過光において明暗コントラストが低下する。校正装置１の第１の実施形態は、フレーム２と接続された例えばＬＥＤのような照明機構７を遠視野照明のために含んでおり、この照明機構７は、合焦光学系３に対置されたテスト構造４に隣接しており、それにより、合焦光学系３の方向にテスト構造４を透過放射するために形成されている。
【００２５】
校正装置１の図２に示した実施形態は、落射光におけるアライメント課題および校正課題のために企図されることが好ましく、かつ図１に基づく実施形態とは異なり、装置内に組み込まれた照明機構がない。フレームと交換可能に接続されたテスト構造の構造要素は、その要素の目的を、要素の幾何学的な形状および互いに対する配置によって果たす以外に、固体または液体の材料の蛍光特性によって果たす。
【００２６】
図１および図２に基づく両方の実施形態のために、プラン・アポクロマート５×／０．１６が図１４に基づき合焦光学系として使用されることが好ましい。
本発明による校正装置によって、多数の自動化可能な校正課題およびテスト課題が実施され得る。
【００２７】
励起用放射線経路と検出用放射線経路との間のアライメント状態の品質
走査型レーザ顕微鏡の性能を決定する主要な状態パラメータは、励起用放射線経路と検出用放射線経路との間のアライメント状態の品質であり、この品質は、ピンホールの画像と標本内の励起用放射線の画像との位置が同じであることによって、またはピンホール面内の励起用放射線の画像とピンホールの画像との位置が同じであることによって、特徴付けられる。
【００２８】
アライメント状態を算定するため、図４に基づく光学的装置が用いられ、この装置の場合、放射線経路の一部が鏡筒レンズ８、スキャン光学系９、スキャナ１０、およびピンホール１１と共に図示されている共焦点走査型レーザ顕微鏡の放射線経路内に、図１に基づき形成された校正装置１が持ち込まれている。検出用放射線経路内のピンホール１１の後ろに、２つの受信チャネルＣＨ１およびＣＨ２が、同時の画像記録のために配列されており、その際、チャネルＣＨ１内ではテスト構造４の反射画像が記録され、かつもう１つのチャネルＣＨ２内ではテスト構造４の透過光画像が記録される。反射における検出が、大きすぎるレーザ抑制のために不可能な場合、励起用放射線によって生成された蛍光を、ピンホール１１を開いて、落射光画像として検出することも可能である。このやり方でも励起用放射線経路のポジションを決定可能であり、その際、反射画像の明領域だけが、画像内に暗く現れる。
【００２９】
校正装置１は特に、合焦光学系３の瞳が、走査型レーザ顕微鏡の対物レンズの瞳と重なり合うか、または走査型レーザ顕微鏡の対物レンズの瞳に共役な面内にあるように、放射線経路内に持ち込まれる。実体的には、図４に示されていない複数対物レンズ交換器または対物レンズ・レボルバ内に校正装置１を収容することが好ましく、そうすることで、温度に依存した膨張作用の影響が最小限にされ、かつテスト構造４が焦点内にあり続ける。
【００３０】
図５および図６は、２つの受信チャネルＣＨ１、ＣＨ２内で同時に記録されたテスト画像を示しており、その際、図５での反射画像は、アルゴン・レーザの４８８ｎｍのレーザ放射線で照明された格子周期２０μｍのテスト格子に由来しており、かつ図６での透過光画像は、同じテスト格子から、ＬＥＤ照明７によって生成される。
【００３１】
両方のテスト画像内の構造ポジションの評価によって、励起用放射線経路と検出用放射線経路のアライメント状態の品質を突き止めることが可能であり、その際、図５はレーザ・スポットによる励起を表しており、かつ図６は検出、つまりピンホールのポジションを表している。
【００３２】
図７に基づき、例えば、好ましくは自動的な相互相関によって励起と検出の間のオフセットを突き止めることが可能であり、ただし、その際、透過光画像を評価の前に反転させるべきである。座標原点を重ね合わせることにより、励起および検出のオーバーラップ補正が行われ、これも自動的に行われ得る。
【００３３】
本発明により、図８および図９が示すように両方のテスト画像を重畳させることで、ピンホールのポジショニングを視覚的に判断することも可能である。
図４に基づく装置はさらに、ほぼ均質に放射されるＬＥＤ光によってボリューム試料の蛍光をシミュレーションすることにより、信号対雑音比（ＳＮＲ）を測定することを可能にし、これに関し、ＳＮＲは、ピンホールの大きさの校正によって決定的に影響を受ける。白色光ＬＥＤを使用する場合、様々なスペクトル領域内でのＳＮＲ測定が実施され得る。検出効率の推移を比較的長い期間にわたって比較可能に捕捉し得るように、同じフィルタ調整および同じＬＥＤ電流が選択されなければならない。
【００３４】
蛍光性の固体または液体の校正試料による信号対雑音比（ＳＮＲテスト）の測定
校正装置１の均質に蛍光を発する領域を、定義された励起光出力で照明し、続いて蛍光を検出して評価する。顕微鏡の検出効率を決定するため、通常は標準偏差および平均値の決定に基づき信号対雑音比（ＳＮＲ）を計算し、これに従いＳＮＲ＝平均値／標準偏差が適用される。
【００３５】
校正された点光源（例えば１エアリーＬＥＤ）による信号対雑音比（ＳＮＲ）の測定
共焦点顕微鏡検査における信号対雑音比の測定の結果は、主に共焦点絞り（ピンホール）の校正によって決定される。例えば、顕微鏡の試料空間内での共焦点絞りの画像の直径が１エアリーより大きい場合、多すぎる蛍光が検出され、かつ大きすぎるＳＮＲが決定される。
【００３６】
改善策は、等方性に半空間内に放射する校正された点光源を、校正装置１内に作ることであり、その際、点光源の開口部は、試料空間内の共焦点絞りの画像の最大直径より小さくなければならない。共焦点絞りの大きさを最大に調整すれば、共焦点絞りの校正に関係なくＳＮＲの決定がなされる。
【００３７】
実践的には、校正装置１のテスト構造４が、点光源を生成するため、透過光において放射線を通し得る単孔マスクとして形成され、その際、定義された幾何学的寸法での開口部は、例えばマイクロ構造化方法によって非常に正確に作製可能である。光源としては、図１に基づき校正装置内に組み込まれた発光ダイオード（ＬＥＤ）が企図され得る。校正された点光源の開口部が、校正装置１内の合焦光学系３の回折限界より大きい場合、合焦光学系３の開口数を活用し得るように、ランベルト放射光源（ＬＥＤ）を使用することが有意義であり得る。回折限界より小さな開口部に関しては、小さな開口部での回折が、開口数の充満を引き起こす。
【００３８】
単位時間ごと、単位面積ごと、および立体角ごとに、放出される光子の数が既知であるという意味において点光源が校正される場合、測定は、システムの絶対的な検出効率の決定をも可能にする。
【００３９】
検出ユニットを、例えば蛍光相関分光法（ＦＣＳ）もしくはヘテロダインＣＡＲＳまたはＦＭ−ＣＡＲＳのような、ハードウェアおよびソフトウェアの機能に基づきテストし得るための、例えばＬＥＤ（ファイバ・ベースでも）のような変調可能な光源を介した試料領域内へのテスト信号の入射
例えば、マイクロ構造化された開口部および透過光源としてのＬＥＤを備えた、透過光において放射線を通し得る単孔マスクのような、校正装置１内の校正された等方性の点光源は、共焦点顕微鏡の検出効率の決定にのみ適しているのではなく、共焦点原理に基づく更なる方法にも広範囲に利用可能である。
【００４０】
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）は、細胞内の、または単純に溶液中の、蛍光性分子の動きに関する動的な情報の取得を可能にする（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｔｗｏ−Ｐｈｏｔｏｎ  Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ；ケー  エム  バーランド（Ｋ．Ｍ．Ｂｅｒｌａｎｄ）、ピー  ティー  シー  ソー（Ｐ．Ｔ．Ｃ．Ｓｏ）、ワイ  チェン（Ｙ．Ｃｈｅｎ）、ダブリュ  ダブリュ  マンツリン（Ｗ．Ｗ．Ｍａｎｔｕｌｉｎ）、およびイー  グラットン（Ｅ．Ｇｒａｔｔｏｎ）、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｎａｌ、第７１巻、１９９６年７月、４１０−４２０参照）。共焦点ボリューム内の非常に小さな色素濃度（ｎＭ）に対して一連の蛍光光子インパルスが発生し、つまり正確には、可動の色素分子が焦点を通過する場合に発生する。蛍光インパルス列の長さは、分子が共焦点ボリュームを横断するために必要な時間（拡散時間）によって決定され、これに対し強度は、分子の「ブライトネス」、吸光係数と量子収率の積によって決定される。２つのインパルス現象の間の平均時間は、焦点ボリューム内の粒子の平均数に反比例する。
【００４１】
誤りのない相関分析は、完璧に働くハードウェア（光学系、検出器、および電子機器など）およびソフトウェア（相関アルゴリズム、数学的モデル、およびＦＩＴルーチン）を前提条件とする。校正装置１内の等方性の校正された点光源によって定義的にシミュレーションされた光学的なテスト信号、例えば定義された分子の「ブライトネス」を備えた色素分子の拡散応答をシミュレーションする光インパルスが、顕微鏡システム内に入射され、かつ評価され得、これにより適用に関する機器のパフォーマンス（ハードウェアおよびソフトウェア）が算定され得る。
【００４２】
別の実施形態では、光学的なテスト信号を、透過光において放射線を通し得る単孔マスクによる代わりに、光ファイバを介して校正装置内に入射させることも可能である。
ＦＣＳの他に、ハードウェアおよびソフトウェアのテスト目的のため、「コヒーレント反ストークス・ラマン散乱顕微鏡検査」（ＣＡＲＳ顕微鏡検査）用の、位相または周波数および振幅のうちの少なくとも一つを変調させた光学的なテスト信号の供給も（校正装置１内のテスト構造４を介して）提供される。信号源が３次の非線形電気感受率を有するＣＡＲＳ信号は、共鳴部分および非共鳴部分を有している。
・（Ｈｅｔｅｒｏｄｙｎｅ  ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＣＡＲＳ）ｉｍａｇｉｎｇ；エリック  オー  ポトマ（Ｅｒｉｃ  Ｏ．Ｐｏｔｍａ）、＊コナー  エル  エバンス（Ｃｏｎｏｒ  Ｌ．Ｅｖａｎｓ）、およびエックス  サニー  シエ（Ｘ．Ｓｕｎｎｅｙ  Ｘｉｅ）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３１巻、第２号、２００６年１月、２４１−２４３参照）
・（Ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｖｉｂｒａｔｉｏｎａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＦＭ  ＣＡＲＳ）ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；フェルズ  ガニカノフ（Ｆｅｒｕｚ  Ｇａｎｉｋｈａｎｏｖ）、コナー  エル  エバンス（Ｃｏｎｏｒ  Ｌ．Ｅｖａｎｓ）、ブライアン  ジー  ザール（Ｂｒｉａｎ  Ｇ．Ｓａａｒ）、およびエックス  サニー  シエ（Ｘ．Ｓｕｎｎｅｙ  Ｘｉｅ）、第３１巻、第１２号、２００６年６月、１８７２−１８７４参照）
特に非共鳴部分は、ＣＡＲＳ信号が、バックグラウンド無しではなく、かつ相応にＣＡＲＳ顕微鏡検査においてコントラストが減少する原因である。光源の位相および周波数を適切に変調することにより、振幅が変調された検出すべきＣＡＲＳ信号を生成可能であり、その結果、ハードウェアおよびソフトウェアの分析／フィルタリングにより、高コントラストでバックグラウンドの無い信号（共鳴ＣＡＲＳ画像）が算定され得る。
【００４３】
解像度の測定／点広がり関数（ＰＳＦ）
共焦点走査型レーザ顕微鏡の性能は、蛍光に関する検出効率だけによって決定されるのではない。使用した対物レンズに相応の最大解像度を達成し得るためにも、１エアリーまで閉じたピンホールの場合に、つまり最適な「ｚセクショニング」の場合に最大量の蛍光を検出し得るためにも、励起焦点が回折限界であることが不可欠である。校正装置内の合焦光学系が回折限界で合焦するという前提条件の下では、合焦性における狂いは照明光学系および検出光学系のうちの少なくとも一つにおける欠陥を示唆している。
【００４４】
欠陥は、例えばミラーの変形、カラー・スプリッタの不適切なポジショニングによる陰影効果、鏡筒レンズまたはスキャン対物レンズなどの誤ったアライメントによって、引き起こされ得る。結像システムの品質は、コントラスト伝達関数（ＭＴＦ）により、または位相ズレが発生する場合は複素係数の光学伝達関数（ＯＴＦ）により、特徴付け得る。
【００４５】
伝達関数の測定は、格子構造の画像、点状の開口部の画像（点広がり関数‐ＰＳＦ）の分析によって、もしくは縁または間隙の画像の分析によって実施し得る。それに応じて、テスト構造は、顕微鏡の光学的パフォーマンスに関する判定の取得に適切なソフトウェアによって構造要素の画像を評価し得るように、伝達関数の決定のための構造要素を含み得る。
【００４６】
スキャナの直線性／スキャナの校正の測定
スキャナ制御のための信号の校正は、例えば（独国特許出願公開第１０２００５０４７２００号明細書）に記載されている。テスト構造の構造要素は、簡単なやり方で、スキャナの校正に対する光学的な評価が可能であるように形成され得る。同様に例えば、スキャナのポジションまたはスキャン画像内のその時々の測定ポジションを測定するために利用されるポジション・センサのポジション信号も校正され得る。校正は、ポジション信号または制御信号の伝達関数の正確な測定を含み得る（独国特許出願公開第１０２００５０４７２００号明細書）。
【００４７】
スキャナの制御信号を校正するための適切で単純な構造要素は、例えば周期的な格子である。テスト構造４は、Ｘ方向に周期的な格子もＹ方向に周期的な格子も含むことが有利である。その際、テスト構造４の格子領域は、同時にＸ方向およびＹ方向に周期的に構造化されることも可能である。非常に様々なスキャン振幅の場合に校正を行い得るように、様々な周期長を備えた格子が存在することが有利である。
【００４８】
励起抑制および検出用放射線経路の透過
蛍光顕微鏡検査では蛍光性対象物が記録され、その際、蛍光顕微鏡は、蛍光のために必要な励起光を供給する。励起光および対象物から放出された蛍光の波長は色素に依存する。蛍光および励起光の波長領域が異なることに基づき、スペクトル分離が実施可能である。この特性は、励起光を蛍光顕微鏡の検出器から遠ざけておくために利用される。
【００４９】
一般的に励起光より明らかに小さい蛍光強度に基づき、「優れた」蛍光顕微鏡は、放出された蛍光をできるだけ高い効率で検出し、その際、同時に励起光は非常に強く抑えられる。
【００５０】
蛍光顕微鏡の品質について判定する場合、励起抑制および検出効率の決定が不可欠である。校正装置１の図１０に基づくテスト構造４が適用され、このテスト構造の場合、構造要素として、反射性格子要素５および反射性格子要素５の間で既知の蛍光効率で蛍光を発する格子間領域１２が企図される。テスト構造４によって記録されたテスト画像内では、反射性格子要素５に属するピクセルおよび蛍光性の格子間領域１２に属するピクセルの強度が別々に評価され、その際、強度値の平均が求められ得る。既知の蛍光効率に基づき、蛍光強度信号から励起光の強度が推論され得る。推論された励起光の強度を、反射性格子要素５で測定された反射強度と比較すれば、励起抑制の程度が明らかになる。
【００５１】
ＰＭＴゲイン特性線および校正されたＡＯＴＦ特性線の知識に基づく更なる手法では、まず、例えば、既知の透過曲線を備えた中立的な主カラー・スプリッタ（例えばＨＦＴ８０／２０）の使用による、レーザ光の直接的な検出を可能にするフィルタ調整で、反射におけるレーザのＰＭＴ信号が算定される。その際、たいていはＰＭＴゲインと呼ばれるＰＭＴ高圧は、できるだけ小さいべきである。続いて、測定すべき蛍光フィルタを放射線経路内に装入し、既知のＡＯＴＦ透過の場合に、ＰＭＴ高圧および場合によってはレーザ出力も、レーザ光の直接的な検出の場合とほぼ同じ信号が得られるまで上昇させる。レーザの抑制は、蛍光フィルタの既知の特性線を基に算出し得る。この手法によりＯＤ４〜ＯＤ５での抑制に対する測定が可能であり、この場合、ＯＤは光学密度を表す。
【００５２】
検出用放射線経路の透過の決定は、既知の参照光源での透過を直接的に測定することにより、または特に走査型レーザ顕微鏡の励起出力を、例えばレーザ・パワー・メータで測定することにより、更なる補助手段を必要とする。
【００５３】
照らし出しの均質性の決定
特に量的な顕微鏡検査に関しては、顕微鏡検査される対象物がどのくらい明るく発光したかを知ることが重要である。理想的な顕微鏡は、画像エリア内の全ての点を同等に「扱う」。つまり、これは明るさに関して、同等に明るく発光する対象物は顕微鏡画像内でも同等に明るいことを意味する。実際には、この要求はせいぜい近似的に満たされ得る。画像の明るさは、しばしば、特に顕微鏡画像の周縁に向かって、例えば口径食に基づき減少する。
【００５４】
本発明による校正装置により、テスト構造４の明るさを位置に依存して測定することで、照らし出しを簡単なやり方で決定し得る。
照らし出しの決定には、検査すべき機器に適合させて反射性、散乱性、蛍光性、または自己発光性に実施可能で均質な、平面またはボリュームが適している。
【００５５】
本実施形態では、テスト構造４が均質に発光する平面として形成されており、この平面は、例えば画像エリアの幾何学形状の測定のような更なる校正目的のために、正方形の格子構造１３の形の追加的な構造要素を含んでいる（図１１）。この追加的な構造要素は、より明るいか、またはより暗い、または例えば別の波長領域において発光することによって、均質に発光する平面とは異なっている。
【００５６】
確かに最初は、追加的な構造要素によって生成されたテスト画像内の不均質性が邪魔であるが、それでも以下の前提条件が満たされていれば、記録されたテスト画像から追加的な構造要素を差し引くことにより、画像エリアの均質性を決定し得る。
・  追加的な構造が既知である。
・  顕微鏡の照らし出しプロフィルが、画像エリアの表面に沿って一般的にゆっくりとしか変化せず、急激な落ち込みは予測され得ない。
【００５７】
記録されたテスト画像（図１２）では、格子間領域がもう均質ではないことが分かり、その際、明るさは画像周縁に向かって減少している。格子構造も確認し得る。
後処理されたテスト画像（図１３）では、格子構造が取り除かれており、これにより照らし出し画像が残る。テスト格子によって覆われる領域内の明るさは、内挿法によって算定可能であり、内挿法は、顕微鏡の照らし出しプロフィルが急激な変化を含まない限り、信頼性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明による校正装置の第１の実施形態を示す図。
【図２】本発明による校正装置の第２の実施形態を示す図。
【図３】顕微鏡の幾何学的な大きさのアライメントおよび校正のためのテスト構造を示す図。
【図４】共焦点走査型レーザ顕微鏡の放射線経路内に配置された、励起用放射線経路と検出用放射線経路の間のアライメント状態を決定するための校正装置を示す図。
【図５】反射性格子要素を備えたテスト構造の反射画像を示す図。
【図６】図５と同じテスト格子の透過光画像を示す図。
【図７】反射画像および透過光画像に基づく画像記録によって算定された、励起用放射線経路と検出用放射線経路の間のアライメント状態に関する相関窓を示す図。
【図８】図５および図６からの反射画像および透過光画像の重なりを示す図。
【図９】図８において重ねられた画像構造のｘ方向およびｙ方向における断面を示すグラフ。
【図１０】反射性格子構造および蛍光性の格子間領域を備えたテスト構造を示す図。
【図１１】均質に発光する平面およびその上にある発光性格子構造を備えたテスト構造を示す図。
【図１２】図１１に基づくテスト構造によって記録されたテスト画像を示す図。
【図１３】格子構造を取り除いた図１２に基づくテスト画像を示す図。
【図１４】校正装置内で企図された合焦光学系のレンズ断面を示す図。
【符号の説明】
【００５９】
１…校正装置、２…フレーム、３…合焦光学系、４…テスト構造、５…反射性格子要素、７…照明機構、１２…格子間領域。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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