(57)【要約】【課題】より効率の良い攪拌が行え、より高感度、高効率な増幅が可能となる温度サイクルシステムを提供する。【解決手段】この温度サイクルシステムは、内部に液体を含むループ形状の流路をもつマイクロ流体デバイス１と、流路９に複数の異なる温度の温度領域を作り出す加熱部６ａ，６ｂと、液体の送液のための超音波ステータ２とを有する。さらに、超音波ステータ２を発振させるための信号を出力する信号発生器３と、流路９の少なくとも一部が超音波ステータ２と対向するようにマイクロ流体デバイス１を保持する保持部５とを有する。【選択図】図１
2009005609.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を注入可能なループ形状の流路が内部に形成されたマイクロ流体デバイスと、
前記流路に温度の異なる複数の温度領域を作り出す手段と、
前記マイクロ流体デバイスを振動させて前記液体の送液を行う振動子と、
前記振動子を発振させるための信号を出力する信号発生手段と、
前記流路の少なくとも一部が前記振動子と対向するように前記マイクロ流体デバイスを保持する保持手段と、を有する温度サイクルシステム。
【請求項２】
前記振動子は第一の圧電素子と第二の圧電素子を具備する構造であり、
前記信号発生手段は、前記第一と第二の圧電素子とをそれぞれ駆動する互いに位相が異なる第一相の信号と第二相の信号とを、前記保持手段で保持された状態の前記マイクロ流体デバイスが共振する周波数で発生し、当該信号の位相のずれにより前記振動子に生じる進行波によって前記送液が行われることを特徴とする請求項１に記載の温度サイクルシステム。
【請求項３】
前記液体がＰＣＲ増幅を行うのに必要なＰＣＲ反応液であることを特徴とする請求項１または2に記載の温度サイクルシステム。
【請求項４】
前記温度領域の位置が変更可能であることを特徴とする請求項１から3のいずれかに記載の温度サイクルシステム。
【請求項５】
前記ループ形状の流路が複数の互いに交差しない流路であることを特徴とする請求項１から4のいずれかに記載の温度サイクルシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）に代表される核酸増幅などを行う温度サイクルシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸を増幅する代表的な方法であるＰＣＲで必要な温度サイクルを行う方法として、温度の上げ下げを行わずに複数の温度領域を設けてＰＣＲ反応溶液をそれらの温度領域に通過させる方法がある。その中で、さらに温度サイクルの回数を自由に設定できる方法として、サンプル液をループ状の流路にて循環させる方法が提案されている。
【０００３】
特許文献１では、ループ状の流路に高温、低温の２つの温度領域部分を設け、自然熱対流によるサンプル液の繰り返し循環流れを作り、温度サイクルを繰り返す装置が開示されている。
【０００４】
また、特許文献２には、ループ状の流路に３つの温度領域を設け、流路内にサンプル液を注入して圧力でサンプル流体を移動させて繰り返し循環流れを作り、温度サイクルを繰り返す流体循環装置の開示がある。さらに、サンプル液と磁性流体を注入し、外部の磁石を動かして磁性流体を動かすことによりサンプル流体を移動して、同様の繰り返し循環流れを作る開示もある。
【０００５】
また、特許文献３では、ループ状の流路上部にあるエラストマー膜に、バルブの機能をもつ複数の空気チャネルを形成するデバイスの開示がある。そして、増幅ではないが、これらの空気チャネルを順次作動してサンプルDNAの循環流れを作り、流路に固定したDNAプローブとのハイブリダイゼーションを繰り返し行うことが開示されている。
【特許文献１】米国特許第6586233号明細書
【特許文献２】特表2005-509424号公報
【特許文献３】特表2003-536058号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のように、サンプル液をループ状の流路にて循環させて核酸の増幅あるいは増幅以外の反応を行う種々のシステムが提案されている。しかしながら、増幅に適用した場合、何れも、攪拌が充分にできず、高感度、高効率な増幅ができなかった。
【０００７】
本発明の目的は、上述の問題点を解消し、より効率の良い攪拌が行え、より高感度、高効率な増幅が可能となる温度サイクルシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明に係る温度サイクルシステムは、液体を注入可能なループ形状の流路が内部に形成されたマイクロ流体デバイスと、該デバイスにおける当該流路に温度の異なる複数の温度領域を作り出す手段と、前記マイクロ流体デバイスを振動させて前記液体の送液を行う振動子と、前記振動子を発振させるための信号を出力する信号発生手段と、前記流路の少なくとも一部が前記振動子と対向するように前記マイクロ流体デバイスを保持する保持手段と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
以上説明したように本発明に係る温度サイクルシステムは、より効率の良い攪拌が行え、より高感度、高効率な増幅を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を図示の実施例に基づいて詳細に説明する。
【００１１】
「実施例１」
図１は本発明による温度サイクルシステムの実施例１の構成を示す図である。
【００１２】
図１に示される温度サイクルシステムは、液体を注入可能な流路を有するマイクロ流体デバイス（μ-TAS（Micro Total Analysis System）とも言う）１における流路内の液体の送液を行う振動子である超音波ステータ２を有する。ここではリング型超音波モータのステータ（固定子）を用いている。
【００１３】
超音波ステータ２には、マイクロ流体デバイス１の流路の少なくとも一部が超音波ステータ２と対向するようにマイクロ流体デバイス１を保持する保持手段としての保持部５が備わっている。保持部５には例えば、磁力やバキューム、静電による吸着方法が適用できる。
【００１４】
超音波ステータ２には信号発生器３が信号増幅器４ａ，４ｂを介して電気的に接続されている。信号発生器３で発生した信号を信号増幅器４で増幅して超音波ステータ２に電圧信号を与えることにより、超音波ステータ２を発振させる。
【００１５】
さらに、本温度サイクルシステムは、マイクロ流体デバイス１の流路に温度の異なる複数の温度領域を作り出す手段としての加熱部６ａ，６ｂを備える。加熱部６ａ，６ｂは制御部７に電気的に接続されている。この制御部７には上記の信号発生器３も電気的に接続されている。
【００１６】
制御部７は、信号発生器３で発生する信号のオン／オフ、電圧、周波数、位相などの制御と、２つの独立した加熱部６ａ、６ｂのオン／オフ、温度などの制御を行う。
【００１７】
制御部７にはさらに入力部８が電気的に接続されている。この入力部８は、温度サイクルシステムのユーザーが加熱温度、加熱時間、温度サイクル数などの増幅の条件を入力したり、温度サイクルシステムの開始を入力したりするためのものである。
【００１８】
また、超音波ステータ２の底面には圧電素子である複数の圧電セラミックスが接着され（不図示）、圧電セラミックスの表面には二組の電極群が配列される。ここで、一組目の電極群が配列した圧電セラミックスを第一相の圧電セラミックスとし、二組目の電極群が配列した圧電セラミックスを第二相の圧電セラミックスとする。すなわち、超音波振動子としての超音波ステータ２は、第一相の圧電素子（第一の圧電素子）と第二相の圧電素子（第二の圧電素子）を具備する構造である。
【００１９】
そこで、第一相、第二相の圧電セラミックスをそれぞれ駆動する第一相、第二相の電圧信号（正弦波波形信号）を、保持部５で保持された状態のマイクロ流体デバイス１が共振する周波数で、信号発生器３から出力する。すると、それぞれの電圧信号が信号増幅器４ａ、４ｂで増幅されて二組の圧電セラミックスそれぞれの電極群に与えられ、第一相、第二相の圧電セラミックスがそれぞれ伸縮する。それにより、超音波ステータ２が発振し、２つの定在波が発生して合成されるが、上記第一相の信号と第二相の信号（正弦波波形信号）の位相のずれにより進行波になる。このとき、位相差を変えることで進行波の速度を調整することができる。この進行波により、マイクロ流体デバイス１の流路内にある液体を進行波の方向に送液することができる。
【００２０】
図２は上記の送液における流速の時間履歴を示す図で、時間経過とともに進行波方向の流れと逆方向の流れとが交互に表れ、すなわち振動的であるが、平均化すると進行波方向にゆっくり流れる。この振動的な流れによって、積極的な攪拌が行われる。また、超音波ステータ２に与える上記の２つの電圧信号（正弦波波形信号）の位相差を０度からおよそ９０度までの間で変えると、流速を最小から最大まで変化させることができる。
【００２１】
図１に戻り、加熱部６は、加熱されたエアが吐出するようになっており、加熱時には超音波ステータ２の発振を妨げないようにマイクロ流体デバイス１に対してギャップが設けられるように配置される。また、加熱部６には、吐出された加熱エアを逃がす出口が構成されている。さらに、２つの加熱部６ａ、６ｂそれぞれが加熱するマイクロ流体デバイス１の流路の長さの比率が変更できるように、２つの加熱部６ａ、６ｂはそれぞれ、図１に示す矢印の方向に移動可能になっている。
【００２２】
図３はマイクロ流体デバイス１の構成を表す図である。マイクロ流体デバイス１は、合成石英、ガラス、シリコン、または、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）などの合成樹脂で形成される。マイクロ流体デバイス１の内部には、保持部５でマイクロ流体デバイス１が保持されたときに超音波ステータ２に重なる大きさのリング形状の流路９が形成されている。流路９の対向する２箇所の上部には、マイクロ流体デバイス１の外部に連通する穴があって、流路９に流体を入れるあるいは流路９から出すための流体の出入り口となる２箇所の流体出入り口１０を構成している。流体出入り口１０には、取り外しが可能な、流体出入り口１０を密閉するためのシール１１が貼付されている。
【００２３】
温度サイクルシステムのユーザーは、ＰＣＲ増幅を行うのに必要なテンプレートDNA、プライマ、ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ、ｄNTP、を混合したＰＣＲ反応液を流体出入り口１０からピペットなどで注入する。そして、シール１１を流体出入り口１０を含む領域に貼付して流体出入り口１０を密閉する。ユーザーはマイクロ流体デバイス１を保持部５にセットし、ＰＣＲ増幅の変性時間と伸長時間の比率になるように加熱部６ａ、６ｂを移動する。次に、入力部８から、加熱部６ａ，６ｂによる加熱の温度をそれぞれ変性温度と伸長温度に設定し、変性時間と伸長時間、温度サイクルの回数、温度サイクルシステムの開始を入力する。
【００２４】
すると、制御部７は、流路９内のＰＣＲ反応液が設定温度になるように加熱部６ａ，６ｂを制御し、さらに設定した変性時間と伸長時間になる流速を算出し、その流速で図３に示す矢印方向に流れるような進行波の振幅と位相差を選択して信号発生器３を制御する。流路９、液体の種類、流速と、振幅、位相差との関係は事前に実験、解析などで求めておく。制御部７が信号発生器３の制御を始めるとＰＣＲ反応液は流路９内を流れ、１周すると変性から伸長、または伸長から変性が行われ、設定した温度サイクルになるまで流路９内の移動を続ける。設定サイクル数が終了したら、加熱部６ａ，６ｂの制御をオフにし、信号発生器３からの信号出力をオフにしてＰＣＲ増幅を終了する。ユーザーはマイクロ流体デバイス１を取り出し、シール１１を剥がして流体出入り口１０からピペットなどでＰＣＲ反応液を吸い出す。
【００２５】
以上のように、ＰＣＲ増幅中のＰＣＲ反応液の送液に超音波振動を用いることで流路９の内部まで振動が伝わり、送液と共に攪拌を行うことができる。特に超音波振動の進行波を用いることにより、振動的な流れが発生してより積極的な攪拌を行うことができる。したがって、マイクロ流体デバイス１の流路がＰＣＲ増幅の反応場になる場合でも、流路内液が層流にならずに充分に攪拌されながらＰＣＲ増幅を行えるので、より高感度、高効率なＰＣＲ増幅ができる。特に、テンプレートDNAの濃度が低い場合に攪拌が充分に行われないと、周囲のプライマ、ｄNTPが消費され切ってＰＣＲ増幅が充分に進まないことがあり、本発明の効果が大きい。
【００２６】
また、ＰＣＲ反応液の送液と攪拌を同時に共通の超音波ステータで行えるので、安価で小型な温度サイクルシステムの提供が可能になる。
【００２７】
なお、前述した、進行波の速度を規定する位相差は一定に限らず、符号が逆になるような位相差にときどき変えると、一部、進行波の方向が逆、すなわち流れの方向が逆になり、平均流速と比較した攪拌の効果が大きくなる。
【００２８】
また、テンプレートDNAの長さによって必要な伸長時間が異なる。そのため、２つの加熱部６ａ，６ｂが加熱するマイクロ流体デバイス１の流路の長さの比率が変更できるように２つの加熱部６ａ，６ｂの位置が変更可能になっている。これにより、最適な時間でのＰＣＲ増幅を行うことができ、より高効率なＰＣＲ増幅を行うことが可能になる。
【００２９】
さらに、本実施例では、ＰＣＲ増幅の変性時間と伸長時間の比率になるように加熱部６ａ，６ｂをユーザーが移動しているが、入力部８等からユーザーがその比率を設定すると、加熱部６ａ、６ｂがその位置に自動的に移動するようにしても良い。
【００３０】
また、本実施例では加熱されたエアの吐出で流路９の一部の加熱を行っているが、赤外線の照射あるいはレーザ光照射によって加熱しても良い。さらに本実施例では、加熱部６ａ，６ｂをマイクロ流体デバイス１に対してギャップが設けられるように配置している。これは、前述したとおり超音波ステータ２の発振を妨げないようにするためである。しかしながら、共振周波数を大きく変えず、かつ安定させられるのであれば、本実施例のような加熱部６や固体のヒータなどを、ギャップを設けずにマイクロ流体デバイス１に接触させても良く、加熱の効率を上げることができる。
【００３１】
「実施例２」
図４は本発明による温度サイクルシステムの実施例２に用いられたマイクロ流体デバイス１の構成を示す図である。マイクロ流体デバイス１を除いた構成は実施例１と同様である。なお、実施例１の図３と同一の符号は、同一又は同様の部材を表す。
【００３２】
図４で、マイクロ流体デバイス１内部の流路９は２本あって交差せずに同心状に配置されており、それぞれの流路に２箇所ずつ流体出入り口１０がある。ユーザーは、異なる２種類のＰＣＲ反応液をそれぞれの流路9の流体出入り口１０からピペットなどで注入して、シール１１を流体出入り口１０を含む領域に貼付して流体出入り口１０を密閉する。その後のユーザーの作業、温度サイクルシステムの動作は実施例１と同様である。２種類のＰＣＲ反応液で、変性温度と伸長温度は同一のものに限られるが、変性時間と伸長時間は長い方、温度サイクルの回数は多い方に合わせれば良い。
【００３３】
本実施例では、同時に２種類のＰＣＲ反応液についてのＰＣＲ増幅を行うことが可能となった。
【００３４】
もちろん、超音波ステータ２の振動が伝わり液体の移動ができる範囲内であれば、３本以上の流路を設け、３種類以上のＰＣＲ増幅を行うことも可能である。
【００３５】
「実施例３」
図５は本発明による温度サイクルシステムの実施例３に用いられたマイクロ流体デバイス１の構成を示す図である。マイクロ流体デバイス１を除いた構成は実施例１と同様である。なお、実施例１の図３と同一の符号は、同一又は同様の部材を表す。
【００３６】
図５で、マイクロ流体デバイス１内部の流路９はリング形状ではなく、一部分が超音波ステータ２に沿った円弧になっているが、その他は超音波ステータ２から外れた位置にてジグザグ形状で配置されている。流路９には、マイクロ流体デバイス１の端より入り口流路１２と出口流路１３が連通している。とりわけ、入り口流路１２は、流路９のうちの、超音波ステータ２に沿った円弧部分であって加熱部６ｂの加熱部６ａ側近傍に対応する位置に連通している。一方、出口流路１３は、流路９のうちの、超音波ステータ２に沿った円弧部分であって加熱部６ａ近傍に対応する位置に連通している。
【００３７】
このような形状および配置をとる流路９、入り口流路１２、出口流路１３には、当初ＰＣＲ反応液と混合しないオイルが充填されている。そして、ユーザーが温度サイクルシステムの開始を入力すると、制御部７により、図示しないポンプでＰＣＲ反応液が流路９のうち加熱部６ｂに対応する部分に注入される。
【００３８】
次に、入り口流路１２と出口流路１３に設けられた図示しないバルブが閉じられ、信号発生器３を制御してＰＣＲ反応液を流路９内の加熱部６ａに対応する位置まで図５に矢印で示す方向に移動した後、移動を止めて、変性時間分だけ加熱部６ａ位置に留まらせる。その後、流路９内の加熱部６ｂに対応する位置まで同じ方向に移動して伸長時間分、加熱部６ｂ位置に留まらせ、以上を繰り返して変性と伸長を繰り返す。ＰＣＲ増幅が終了したら、入り口流路１２と出口流路１３に設けられた図示しないバルブを開き、図示しないポンプでＰＣＲ反応液を回収する。
【００３９】
本実施例では、ＰＣＲ反応液が超音波ステータ２の上にある流路にあるときにのみ攪拌が行われるという限定があるが、上述した送液動作のため、ＰＣＲ増幅の変性時間と伸長時間の比率になるように加熱部６ａ，６ｂを移動する必要がない。すなわち、大きさが１対１の比率になるような加熱部６ａ，６ｂを固定しておけば良い。また、マイクロ流体デバイス１の中でＰＣＲ増幅に必要な流路９を超音波ステータ２の形状に合わせる必要がないので、マイクロ流体デバイス１をコンパクトにすることが可能になる。
【００４０】
また、本実施例のように流路９の一部分にあるＰＣＲ反応液を温度領域に滞在させる方式の場合は、ループ形状にせずに往復移動させることも可能であるが、ループ形状にして一方向に移動することによってＰＣＲ反応液全体の滞在時間を均等にすることができる。
【００４１】
なお、以上の実施例では、温度サイクルシステムが２つの加熱部をもち、変性温度と伸長温度を設定しているが、３つの加熱部をもつ構成にして、変性温度、アニーリング温度、伸長温度を設定しても良い。
【００４２】
さらに、以上の実施例では何れもＰＣＲ増幅反応を行っているが、複数の温度でのサイクルが必要な反応であれば、ＰＣＲ増幅に限らず、本発明の温度サイクルシステムを適用することが可能である。
【００４３】
また、以上の実施例では、送液のための超音波振動子としてリング型超音波モータのステータを用いているが、流路の一部のみが超音波ステータの上にある形態を取る場合は、リニア型の超音波モータのステータを用いても良い。
【００４４】
また、送液の駆動源として振動子を利用する目的が達成される限り、超音波振動子に限らず、いわゆる音波振動を発生する振動子であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の温度サイクルシステムの実施例１を示す構成図である。
【図２】実施例１のシステムを用いた送液における流速の時間履歴を示す図である。
【図３】本発明の温度サイクルシステムの実施例１に用いられるマイクロ流体デバイス１の構成図である。
【図４】本発明の温度サイクルシステムの実施例２に用いられるマイクロ流体デバイス１の構成図である。
【図５】本発明の温度サイクルシステムの実施例３に用いられるマイクロ流体デバイス１の構成図である。
【符号の説明】
【００４６】
１  マイクロ流体デバイス
２  超音波ステータ
３  信号発生器
５  保持部
６ａ，６ｂ  加熱部
９  流路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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