(57)【要約】      （修正有）【課題】増幅反応を行うことにより特定の目的物質の存在を検出するとともに、増幅阻害の影響を精度良く検出可能なマイクロチップを提供する。【解決手段】検体液と、ポジティブコントロールと、試薬分岐部で分岐させた試薬（１）と、酵素分岐部で分岐させた酵素（１）とを合流させて第１混合液を形成し、検体液と、ネガティブコントロールと、前記試薬分岐部で分岐させた試薬（２）と、前記酵素分岐部で分岐させた酵素（２）とを合流させて第２混合液を形成し、ネガティブコントロールと、試薬分岐部で分岐させた試薬（３）と、酵素分岐部で分岐させた酵素（３）とを合流させて第３混合液を形成し、第１混合液乃至第３混合液のそれぞれを核酸増幅反応により増幅させ、増幅の有無に基づいて増幅反応を前記検出部で検出するよう構成するマイクロチップ。【選択図】図４
2009183179.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体もしくは検体から抽出したＤＮＡを含む検体液が注入される検体収容部と、
核酸増幅反応に用いる少なくともプローブ、プライマー、ｄＮＴＰを含む試薬が収容される試薬収容部と、
核酸の増幅反応に用いる酵素が収容される酵素収容部と、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
これらの各収容部に連通する微細流路と、
増幅反応を検出する検出部と、
を有するマイクロチップであって、
前記試薬収容部の試薬を三つの微細流路に分岐させる試薬分岐部と、
前記酵素収容部の酵素を三つの微細流路に分岐させる酵素分岐部と、
前記検体収容部から前記微細流路内を送液された検体液を二つの微細流路に分岐させる第１分岐部と、
前記ネガティブコントロール収容部から前記微細流路内を送液されたネガティブコントロールを二つの微細流路に分岐させる第２分岐部と、
を有し、
前記微細流路は、
前記第１分岐部で分岐させた一方の検体液と、前記ポジティブコントロール収容部からのポジティブコントロールと、前記試薬分岐部で分岐させた試薬（１）と、前記酵素分岐部で分岐させた酵素（１）とを合流させて第１混合液を形成し、
前記第１分岐部で分岐させた他方の検体液と、前記第２分岐部で分岐させた一方のネガティブコントロールと、前記試薬分岐部で分岐させた試薬（２）と、前記酵素分岐部で分岐させた酵素（２）とを合流させて第２混合液を形成し、
前記第２分岐部で分岐させた他方のネガティブコントロールと、前記試薬分岐部で分岐させた試薬（３）と、前記酵素分岐部で分岐させた酵素（３）とを合流させて第３混合液を形成し、
前記第１混合液乃至第３混合液のそれぞれを核酸増幅反応により増幅させ、増幅の有無に基づいて増幅反応を前記検出部で検出するよう構成されていることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項２】
前記ポジティブコントロール収容部から前記微細流路内を送液されたポジティブコントロールを二つの微細流路に分岐させる第３分岐部を有し、
前記微細流路は、
前記試薬分岐部では、更に四つ目の微細流路に試薬を分岐させ、
前記酵素分岐部では、更に四つ目の微細流路に酵素を分岐させ、
前記第３分岐部で分岐させたポジティブコントロールと、前記試薬分岐部で分岐させた試薬（４）と、前記酵素分岐部で分岐させた酵素（４）とを合流させて第４混合液を形成し、
第４混合液を核酸増幅反応により増幅させ、増幅の有無に基づいて増幅反応を前記検出部で検出するよう構成されていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項３】
前記増幅の有無を増幅させた検出対象の核酸と、前記試薬収容部からのプローブとのハイブリダイゼーションにより検出するよう構成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロチップ。
【請求項４】
前記増幅の有無を増幅させた検出対象の核酸と、前記試薬収容部からのプローブとのハイブリダイゼーション反応時の乖離温度により検出するよう構成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、遺伝子検査用のマイクロチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロマシン技術及び超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段（例えばポンプ、バルブ、流路、センサーなど）を微細化して１チップ上に集積化したシステムが注目されている。これは、μ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）とも呼ばれ、マイクロチップといわれる部材に、試薬と検体（例えば、検査を受ける被験者の尿、唾液、血液を処理して抽出したＤＮＡ処理した抽出溶液など）を合流させ、その反応を検出することにより検体の特性を調べる方法である。
【０００３】
マイクロチップは、樹脂材料やガラス材料からなる基体に、フォトリソプロセス（パターン像を薬品によってエッチングして溝を作成する方法）や、レーザ光を利用して溝加工を行い、試薬や検体を流すことができる微細な流路と試薬を蓄える液溜部を設けており、さまざまなパターンが提案されている。
【０００４】
そして、これらマイクロチップを用いて検体の特性を調べる際は、マイクロポンプなどでマイクロチップ内に収容されているプライマーや酵素等を含有する試薬や検体を送液することにより、試薬と検体とを核酸増幅反応により増幅させて検出部に導き、検出を行う。検出部では、例えば光学的な検出方法などによって目的物質の検出が行われる。
【０００５】
核酸増幅反応としては、遺伝子の検出ではＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によるものがあり、その有用性は広く認められている（例えば特許文献１）。
【０００６】
特許文献１等に記載のＰＣＲ法では、プライマー試薬、基質試薬、酵素試薬及びその他の試薬を、ＤＮＡの試料と合流させて混合液を作成し、混合液をＰＣＲ法に基づく温度サイクルを実施すること鋳型ＤＮＡを増幅させるものである。
【０００７】
しかしながら、ＰＣＲ法は検体中に存在する微量の遺伝子を数十万〜数百万倍以上にも増幅できることから、コンタミネーションあるいは、反応阻害物質の混入あるいは、試薬の不活性化、不適切な反応条件、等による増幅不調の障害、等の影響による検査エラーが生じる場合がある。検査エラーへの対応として検査エラーが発生したことを検知するためにコントロールを平行して分析することが通例である。
【０００８】
特許文献２では、コントロールとしてポジティブコントロールとネガティブコントロールを用い、検体と試薬の混合液（１）、ポジティブコントロールと試薬の混合液（２）、ネガティブコントロールと試薬との混合液（３）、を得る。そして次に、
（ａ）混合液（１）と混合液（２）の混合物、
（ｂ）混合液（１）のみ、
（ｃ）混合液（２）のみ、
（ｄ）混合液（３）のみ、
の各流体を増幅部で核酸増幅反応させ、当該増産物質を検出するマイクロリアクタが開示されている。
【特許文献１】特開２００７−４３９９８号公報
【特許文献２】国際公開第０７／０５８０７７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、特許文献２に開示されているマイクロリアクタでは流体（ａ）、流体（ｂ）とでは検体から持ち込まれる阻害物質の割合が異なるために、増幅阻害の影響を精度良く検出できないという問題があった。
【００１０】
また酵素を用いた核酸増幅反応において、酵素は熱により失活しやすく、その影響により増幅効率が低下してしまうという問題がある。
【００１１】
本願発明は上記問題に鑑み、増幅反応を行うことにより特定の目的物質の存在を検出するとともに、増幅阻害の影響を精度良く検出可能なマイクロチップを得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的は、下記に記載する発明により達成される。
【００１３】
１．検体もしくは検体から抽出したＤＮＡを含む検体液が注入される検体収容部と、
核酸増幅反応に用いる少なくともプローブ、プライマー、ｄＮＴＰを含む試薬が収容される試薬収容部と、
核酸の増幅反応に用いる酵素が収容される酵素収容部と、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
これらの各収容部に連通する微細流路と、
増幅反応を検出する検出部と、
を有するマイクロチップであって、
前記試薬収容部の試薬を三つの微細流路に分岐させる試薬分岐部と、
前記酵素収容部の酵素を三つの微細流路に分岐させる酵素分岐部と、
前記検体収容部から前記微細流路内を送液された検体液を二つの微細流路に分岐させる第１分岐部と、
前記ネガティブコントロール収容部から前記微細流路内を送液されたネガティブコントロールを二つの微細流路に分岐させる第２分岐部と、
を有し、
前記微細流路は、
前記第１分岐部で分岐させた一方の検体液と、前記ポジティブコントロール収容部からのポジティブコントロールと、前記試薬分岐部で分岐させた試薬（１）と、前記酵素分岐部で分岐させた酵素（１）とを合流させて第１混合液を形成し、
前記第１分岐部で分岐させた他方の検体液と、前記第２分岐部で分岐させた一方のネガティブコントロールと、前記試薬分岐部で分岐させた試薬（２）と、前記酵素分岐部で分岐させた酵素（２）とを合流させて第２混合液を形成し、
前記第２分岐部で分岐させた他方のネガティブコントロールと、前記試薬分岐部で分岐させた試薬（３）と、前記酵素分岐部で分岐させた酵素（３）とを合流させて第３混合液を形成し、
前記第１混合液乃至第３混合液のそれぞれを核酸増幅反応により増幅させ、増幅の有無に基づいて増幅反応を前記検出部で検出するよう構成されていることを特徴とするマイクロチップ。
【００１４】
２．前記ポジティブコントロール収容部から前記微細流路内を送液されたポジティブコントロールを二つの微細流路に分岐させる第３分岐部を有し、
前記微細流路は、
前記試薬分岐部では、更に四つ目の微細流路に試薬を分岐させ、
前記酵素分岐部では、更に四つ目の微細流路に酵素を分岐させ、
前記第３分岐部で分岐させたポジティブコントロールと、前記試薬分岐部で分岐させた試薬（４）と、前記酵素分岐部で分岐させた酵素（４）とを合流させて第４混合液を形成し、
第４混合液を核酸増幅反応により増幅させ、増幅の有無に基づいて増幅反応を前記検出部で検出するよう構成されていることを特徴とする１．に記載のマイクロチップ。
【００１５】
３．前記増幅の有無を増幅させた検出対象の核酸と、前記試薬収容部からのプローブとのハイブリダイゼーションにより検出するよう構成されていることを特徴とする１．又は２．に記載のマイクロチップ。
【００１６】
４．前記増幅の有無を増幅させた検出対象の核酸と、前記試薬収容部からのプローブとのハイブリダイゼーション反応時の乖離温度により検出するよう構成されていることを特徴とする１．又は２．に記載のマイクロチップ。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、一箇所に収容した酵素を分割し、分割した酵素を用いて増幅反応を行うことにより、特定の目的物質の存在を検出するとともに、増幅阻害の影響を精度よく検出することが可能なマイクロチップを得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明を実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限られない。
【００１９】
［分析システムの装置構成］
図１は、本実施形態に係るマイクロチップを用いるマイクロチップ分析システム８の外観図である。マイクロチップ分析システム８は、マイクロチップ１に予め注入された検体と試薬とを自動的に反応させ、反応結果を自動的に出力する装置である。
【００２０】
マイクロチップ分析システム８の筐体８２には、マイクロチップ１を装置内部に挿入するための挿入口８３、表示部８４、メモリカードスロット８５、プリント出力口８６、操作パネル８７、外部入出力端子８８が設けられている。
【００２１】
検査担当者は、図１の矢印方向にマイクロチップ１を挿入し、操作パネル８７を操作して検査を開始させる。マイクロチップ分析システム８の内部では、マイクロチップ１内の反応の検査が自動的に行われ、検査が終了すると表示部８４に結果が表示される。検査結果は操作パネル８７の操作により、プリント出力口８６よりプリントを出力したり、メモリカードスロット８５に挿入されたメモリカードに記憶したりすることができる。また、外部入出力端子８８から例えばＬＡＮケーブルを使って、パソコンなどにデータを保存することができる。検査終了後、検査担当者はマイクロチップ１を挿入口８３から取り出す。
【００２２】
図２は、本実施形態に係るマイクロチップを用いるマイクロチップ分析システム８の概略斜視図であり、図３は構成図である。図２及び図３においては、マイクロチップが図１に示す挿入口８３から挿入され、セットが完了している状態を示している。
【００２３】
マイクロチップ分析システム８は、マイクロチップ１に予め注入された検体及び試薬を送液するための駆動液Ｌ０を貯留する駆動液タンク７０、マイクロチップ１に駆動液Ｌ０を供給するためのマイクロポンプ５、マイクロポンプ５とマイクロチップ１とを駆動液Ｌ０が漏れないように接続するポンプ接続部６、マイクロチップ１の必要部分を温調する温度調節ユニット３、マイクロチップ１をずれないように温度調節ユニット３及びポンプ接続部６に密着させるためのチップ押圧板２、チップ押圧板２を昇降させるための押圧板駆動部２１、マイクロチップ１をマイクロポンプ５に対して精度良く位置決めする規制部材２２、マイクロチップ１内の検体と試薬との反応状態等を検出する光検出部４（４ａ及び４ｂ）、等を備えている。
【００２４】
チップ押圧板２は、初期状態においては、図３に示す位置より上方に退避している。これにより、マイクロチップ１は矢印Ｘ方向に挿抜可能であり、検査担当者は挿入口８３（図１参照）から規制部材２２に当接するまでマイクロチップ１を挿入する。その後、チップ押圧板２は、押圧板駆動部２１により下降してマイクロチップ１に当接し、マイクロチップ１の下面が温度調節ユニット３及びポンプ接続部６に密着される。
【００２５】
温度調節ユニット３は、マイクロチップ１と対向する面にペルチェ素子３１及びヒータ３２を備え、マイクロチップ１がマイクロチップ分析システム８にセットされたときに、ペルチェ素子３１及びヒータ３２がマイクロチップ１に密着するようになっている。試薬が収容されている部分をペルチェ素子３１で冷却して試薬が変性させないようにする。また検体と試薬とが反応する反応部１３９をヒータ３２で加熱したり、ペルチェ素子３１で冷却したりしてＰＣＲ法による増幅反応を行わせたりする。
【００２６】
また、温度領域の異なるヒータを反応にあわせて回転させたり、チップ自身を回転させたりすることにより、加熱及び冷却の温度サイクルをかけるようにしてもよい。
【００２７】
更に反応部１３９での加熱時の制御温度は適宜変更することが可能であり、制御温度を切り換えることにより、検出対象の核酸が含まれているか否かをハイブリダイゼーション反応による増幅の有無により検出するようにしても良い。
【００２８】
ＰＣＲ法による増幅反応においては、温度条件を厳密にしないと反応の成否に影響したり、反応の制御に支障が生じたりする。そのためＰＣＲ法では、温度条件のみならずその加熱時間を厳密に管理することが求められる。微細流路内に中間温度領域が存在すると、副反応として非特異的な増幅が生じ、これにより標的物質の増幅が阻害されてしまう。このため目的の増幅反応が充分に起こらない可能性もある。したがって核酸増幅などが行われる微細流路とその両端との温度差は、画然としていることが望ましい。
【００２９】
発光部４ａ及び受光部４ｂから構成される光検出部４では、発光部４ａからの光をマイクロチップ１に照射し、マイクロチップ１を透過した光を受光部４ｂにより検出する。受光部４ｂはチップ押圧板２の内部に一体的に設けられている。発光部４ａ及び受光部４ｂは、図３に示すマイクロチップ１の検出部１４８に対向するように設けられている。
【００３０】
蛍光を検出する際には、検出部１４８の斜め４５℃の方向から、蛍光検出波長に関連する波長をフィルターによりカットした励起光をあて、励起光入射と９０度方向に設けた受光部に、励起光をカットするフィルターを介して受光させるようにしても良い。
【００３１】
マイクロポンプ５は、ポンプ室５２、ポンプ室５２の容積を変化させる圧電素子５１、ポンプ室５２のマイクロチップ１側に位置する第１絞り流路５３、ポンプ室の駆動液タンク７０側に位置する第２絞り流路５４、等から構成されている。第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４は絞られた狭い流路となっており、また、第１絞り流路５３は第２絞り流路５４よりも長い流路となっている。
【００３２】
駆動液Ｌ０を順方向（マイクロチップ１に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を急激に減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液Ｌ０は、第１絞り流路５３の方に支配的に押し出され送液される。次に、ポンプ室５２の容積を緩やかに増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液Ｌ０が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなり、ポンプ室５２内には第２絞り流路５４の方から支配的に駆動液Ｌ０が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液Ｌ０が順方向に送液されることになる。また圧電素子５１への駆動電圧を変更することにより駆動液Ｌ０の送液圧力を変更することが可能である。
【００３３】
一方、駆動液Ｌ０を逆方向（駆動液タンク７０に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を緩やかに減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液Ｌ０は、第２絞り流路５４の方に支配的に押し出され送液される。次に、ポンプ室５２の容積を急激に増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液Ｌ０が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内には第１絞り流路５３の方から支配的に駆動液Ｌ０が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液Ｌ０が逆方向に送液されることになる。
【００３４】
ポンプとしては、このようなマイクロポンプに限らず、必要に応じてシリンジポンプやダイヤフラム型のマイクロポンプ、電気浸透流ポンプなどを使用してもかまわない。
【００３５】
ポンプ接続部６は、必要なシール性を確保して駆動液の漏出を防止するために、ポリテトラフルオロエチレン、シリコン樹脂などの柔軟性（弾性、形状追随性）をもつ樹脂によって密着面が形成されることが好ましい。このような柔軟性を有する密着面は、例えばマイクロチップの構成基材自体によるものであっても良く、また、ポンプ接続部６における流路開口の周囲に貼着された柔軟性を有する別途の部材によるものであっても良い。
【００３６】
［マイクロチップ１の構成］
次に図４乃至図６に基づいて、マイクロチップ１の構成について説明する。図４はマイクロチップ１の主要部における各流路エレメントの関係を表す構成概略図であり、図５及び図６は、２層構造のマイクロチップ１の流路構成の一例を示す模式図であり、図５は第１層（上層）の流路構成を示すものであり、図６は第２層（下層）の流路構成を示すものである。
【００３７】
図４に示すマイクロチップ１においては、検体液は、検体収容部ｓｔＥからの微細流路を送液され第１分岐部ＳＰ１で２分割され、下流側の微細流路に送液される。ネガティブコントロールは、ネガティブコントロール収容部ｓｔＮから微細流路を送液され第２分岐部ＳＰ２で２分割され、下流側の微細流路に送液される。試薬は試薬収容部ｓｔから三つの微細流路を試薬（１）〜試薬（３）に３分割されて送液される。酵素は酵素収容部ｓｔＰｙから三つの微細流路を酵素（１）〜酵素（３）に３分割されて送液される。なお本実施形態においてはマイクロチップ１内で用いる酵素は全て一箇所の酵素収容部ｓｔＰｙから微細流路を送液され、各反応部１３９に供給される。
【００３８】
そして「第１混合液Ｌ１」は、ポジティブコントロール収容部ｓｔＰからのポジティブコントロールと、第１分岐部ＳＰ１で分岐した一方の検体液と、試薬収容部ｓｔから試薬分岐部ＳＰ９により分岐されて送液された試薬（１）と、酵素収容部ｓｔＰｙから酵素分岐部ＳＰ４により分割された酵素（１）と、を合流させることにより形成される。
【００３９】
「第２混合液Ｌ２」は、第１分岐部ＳＰ１で分岐したうちの他方の検体液と、第２の分岐部ＳＰ２で分岐した一方のネガティブコントロールと、試薬分岐部ＳＰ９で分岐させた試薬（２）と、酵素分岐部ＳＰ４により分岐させた酵素（２）とを合流させることにより形成する。
【００４０】
「第３混合液Ｌ３」は、第２分岐部ＳＰ２で分岐したうちの他方のネガティブコントロールと、試薬分岐部ＳＰ９で分岐させた試薬（３）と、酵素分岐部ＳＰ４により分岐させた酵素（３）と、を合流させることにより形成する。
【００４１】
そして第１混合液Ｌ１、第２混合液Ｌ２及び第３混合液Ｌ３はそれぞれに対応する反応部１３９で増幅反応させてから、検出部１４８でプローブＤＮＡ（あるいは単にプローブとも称す）とハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基づいて増幅反応を前記検出部で検出する。以上が全体の概略である。
【００４２】
なお、あらかじめ試薬中に、増幅反応に伴って蛍光を発するいわゆるインターカレータや、蛍光のＦＬＥＴ現象を利用した、ｔａｑｍａｎプローブ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、モレキュラービーコンプローブ、サイクリングプローブなどの蛍光プローブを用いて反応の進行をリアルタイムの測定したり、増幅反応物にインターカレータを挿入して、検出部１４８でゆっくりと加熱して、その乖離温度を計測したりすることにより検出するようにしてもよい。
【００４３】
ここで「プローブＤＮＡ」とは、ＤＮＡの相補性を利用して、検出対象の遺伝子と相補関係となるＤＮＡ断片のことである。ハイブリダイゼーションにより検出対象の遺伝子と結合させる。
【００４４】
「ポジティブコントロール」は、単独でも、検出対象の遺伝子と同様の核酸増幅反応とプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応及び、後述の蛍光物質との生成反応を起こす。その配列は、検体を検出する特異的な配列で、プライマーがハイブリダイズする部分とその間の配列が検体と同じものである。コントロールに使用する核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）は、公知技術文献に記載されているものを使用すれば良い。
【００４５】
「ネガティブコントロール」は、単独では蛍光物質との生成反応を起こさない。核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）以外の試薬などをすべて含み、コンタミネーションの有無のチェック、バックグラウンド補正用に用いる。
【００４６】
「ｄＮＴＰ」とは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの４種類ヌクレオチド三リン酸の混合物であり、伸張反応の基質として用いられる。
【００４７】
そして「試薬」には、プローブＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰが含まれる。
【００４８】
「酵素」として、本実施形態においては、例えばＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する。天然型のＤＮＡポリメラーゼの他、活性を有する変異体酵素も包含される。またＤＮＡポリメラーゼとしては、鎖置換（Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性やエンドヌクレアーゼ活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ、反応温度まで加熱されないと活性が生じないようにブロックされたＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。なお「試薬」の中には、当該酵素を活性化するために、マグネシウム塩なども含まれる。
【００４９】
また「乖離温度」とは、２本鎖構造の核酸が壊れてそれぞれ一本鎖に乖離（変性ともいう）する温度のことであり、変性温度とも称される。乖離温度は、相同性の高い２本鎖においては高く、相同性の低い２本鎖では低い傾向を示す。
【００５０】
図５は、本実施形態に係るマイクロチップ１の一例を示すものである。同図においては被覆基板が取り外された状態での微細流路及び流路エレメントの配置を模式的に示している。
【００５１】
マイクロチップ１には、疎水性の基材を用いて、液状の試薬と同じく液状の検体（試料）をマイクロチップ１上で混合・反応させるための微細流路及び流路エレメントが配設されている。微細流路はマイクロメーターオーダーで形成されており、例えば幅ｗは数十〜数百μｍ、好ましくは５０〜３００μｍで、高さｈは２５〜１０００μｍ程度、好ましくは５０〜３００μｍである。
【００５２】
以下、マイクロチップにおける反応及び検出の工程について説明する。図５及び図６に示すマイクロチップ１は、第１層と第２層の二つの層からなる流路が形成されたマイクロチップであり。ｃ１乃至ｃ７は接続孔であり両図において同一部位を示しており、二つの層を連通させるものである。そして当該接続孔ｃ１乃至ｃ７により図５に示す第１層と図６に示す第２層の間を流体が往来する。
【００５３】
図に示すマイクロチップ１においては、混合液Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３の各混合液Ｌに対応した複数の反応検出流路が配置されている。図４で示した概略図と同様に、最も左側の（混合流路１３８ａ、反応部１３９ａを含む）反応検出流路は、検体、ポジティブコントロール、試薬及び酵素から形成された第１混合液Ｌ１の反応検出に用いられ、それに隣接する（混合流路１３８ｂ、反応部１３９ｂを含む）反応検出流路は、検体、ネガティブコントロール、試薬及び酵素とから構成された第２混合液体Ｌ２の反応検出に用いられる。
【００５４】
更に、その隣には不図示の第３混合液Ｌ３の反応検出に用いる反応検出流路が配置されている。
【００５５】
これら複数の反応検出を比較することにより増幅阻害の影響を精度良く検知することができる。またこれらの反応検出流路は同様の形状で配置され基本的に同様の流路構成であるので、以下では、これらを代表して最も左側の反応検出流路について説明する。
【００５６】
ｇ（ｇ１乃至ｇ３、ｇ６乃至ｇ８）は、マイクロチップ１の一方の面から外部へ解放された上流開口部である。これらの上流開口部ｇは、ポンプ接続部６を介してマイクロチップ１をマイクロポンプ５に重ね合わせて接続した際に、マイクロポンプ５の接続面に設けられた流路開口と位置合わせされてマイクロポンプ５に連通される。そして当該上流開口部から送液を行うための駆動液Ｌ０が注入される。
【００５７】
ｉは試薬或いは検体等の液体（以下、単に試薬液ともいう）を注入する注入孔であり、マイクロチップ１の外部へ解放された開口となっている。各注入孔ｉそれぞれの近傍の上流開口部ｇを開口した状態で試薬液を注入する。注入された液体は、近傍の上流開口部ｇに向かって微細流路を送られることになる。本実施形態においては当該液体を蓄えておく微細流路の一部を試薬収容部ｓｔ（ｓｔ１乃至ｓｔ８）として用いている。
【００５８】
図６に示す酵素収容部ｓｔＰｙには酵素が収容されており、一箇所の当該酵素収容部ｓｔＰｙからマイクロチップ内の微細流路を経由して各反応部１３９に送液される。なお同図に示すマイクロチップ１では一箇所の酵素分岐部ＳＰ４により酵素を３つに分岐させる例を示しているがこれに限られず、二つに分岐させる酵素分岐部ＳＰ４を多段階に複数設けることにより、三つあるいはそれ以上の微細流路に分岐させる構成としてもよい。
【００５９】
図５に示すポジティブコントロール収容部ｓｔＰにはポジティブコントロールが収容されており、検体収容部ｓｔＥには検体もしくは検体から抽出したＤＮＡを含む検体液が収容されている。また後述するが、試薬収容部ｓｔ６にはプローブＤＮＡが収容されている。
【００６０】
試薬液注入時には、上流開口部ｇ及び注入孔ｉのみが開いており、試薬注入後に注入孔ｉのみを封止する。そして試薬収容部ｓｔ、上流開口部ｇに連通するマイクロポンプ５から送り込まれる駆動液Ｌ０により、空気を間に介して試薬或いは検体等の液体は送液される。
【００６１】
１３０は混合液収容部であり、上流側で合流した試薬収容部ｓｔ１〜ｓｔ３からの試薬液が混合される。例えば、試薬収容部ｓｔ１にはｄＮＴＰ等の基質が、試薬収容部ｓｔ２にはプライマーが収容される。
【００６２】
ｊ（ｊ１乃至ｊ６）は合流部であり、ＳＰ１は第１分岐部である。合流部ｊでは上流側の微細流路から送液された試薬液を合流させる。第１分岐部ＳＰ１では、上流側の検体収容部ｓｔＥから送液された検体液を２分割に分岐させる。分岐された一方は、第１流路１３１を送液されて合流部ｊ４で、ポジティブコントロール収容部ｓｔＰから送液されたポジティブコントロールと試薬収容部ｓｔ４１、ｓｔ４２等からの試薬と、接続孔ｃ２を経由して酵素収容部ｓｔＰｙから送液された酵素と、が合流して「第１混合液」が作成される。
【００６３】
同様に、第１分岐部ＳＰ１で分岐された他方の検体は、第２流路１３２を送液されて合流部ｊ５で、不図示のネガティブコントロール収容部ｓｔＮから送液されたネガティブコントロールと試薬収容部ｓｔ４２、ｓｔ４３等からの試薬と、接続孔ｃ３を経由して酵素収容部ｓｔＰｙから送液された酵素と、が合流して「第２混合液」が作成される。
【００６４】
合流部ｊ４、ｊ５の接続孔ｃ４、ｃ５の下流側には、図６に示すように第１混合液と第２混合液とを十分に分子拡散させて混合するための混合流路１３８ａ、１３８ｂが設けられている。混合流路１３８ａの下流には反応部１３９ａが、混合流路１３８ｂの下流には反応部１３９ｂがそれぞれ設けられている。
【００６５】
反応部１３９ａ（あるいは１３９ｂ）は、混合流路１３８ａ（あるいは１３８ｂ）で十分混合された検体と試薬との混合液を加熱反応させる部位で、マイクロチップ１をマイクロチップ分析システム８にセットした際に、反応部１３９ａにマイクロチップ分析システム８のヒータ３２及びペルチェ素子３１が対向するようになっている。反応部１３９ａをヒータ３２により加熱することにより核酸の変性が行われ、放熱或いはペルチェ素子３１で冷却することによりアニーリングが行われる。加熱及び冷却を繰り返すことにより核酸増幅反応が行われる。当該核酸増幅反応により反応部１３９ａで増幅された増幅産物は、検出部１４８ａへ送液され、光検出部４により検出が行われる。
【００６６】
検出部１４８ａにおいて、増幅産物を検出する手段について説明する。検出部１４８ａでは増幅産物をそのまま光検出することはできず、一般には、増幅産物を検出部１４８ａの流路壁に担持されている反応物質と反応させることにより増幅産物を検出部１４８ａにトラップさせ、更に増幅産物に蛍光標識したプローブＤＮＡを結合させて光学的に検出できるようにしている。検出部１４８ａの少なくともその検出部分は、光学的測定を可能とするために透明な材質、好ましくは透明なプラスチックとなっている。
【００６７】
ここで具体的に遺伝子検査を例にして説明する。
【００６８】
（１）試薬はビオチン修飾したプライマーであり、反応部１３９ａにおいて検体の遺伝子増幅を行い、増幅された遺伝子を変性処理により一本鎖にした反応後の検体を検出部１４８ａに送る。検出部１４８ａの流路壁には予めストレプトアビジン等のビオチン親和性タンパク質（アビジン、ストレプトアビジン、エクストラアビジン、好ましくはストレプトアビジン）が反応物質として担持されて固定化されている。反応部１３９ａで反応後の検体が検出部１４８ａに流入すると、ビオチン親和性タンパク質と、プローブＤＮＡに標識されたビオチンと、の結合反応によって検体の遺伝子が検出部１４８ａの流路壁に固定化（トラップ）される。前述したビオチン親和性タンパク質とビオチンとの結合反応は、公知のアビチン−ビオチン反応である。
【００６９】
更に、増幅産物（この例では増幅遺伝子）をトラップする工程を経て、増幅遺伝子をトラップした検出部１４８ａに、末端にＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で蛍光標識したプローブＤＮＡを流し、これを検出部１４８ａの流路壁に固定化した遺伝子にハイブリダイズさせる。（予め増幅遺伝子と蛍光標識したプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせたものを検出部でトラップしも良い。）
（２）微細流路内にＦＩＴＣに特異的に結合する抗ＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイド液を流し、これにより遺伝子にハイブリダイズしたＦＩＴＣ修飾プローブに、その金コロイドを吸着させる。
【００７０】
（３）上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する。
【００７１】
なお蛍光色素ＦＩＴＣの蛍光を測定することも可能である。しかしながら、蛍光色素の光褪色、バックグラウンドノイズなどを考慮する必要がある。このため本実施形態においては、前述のとおり最終的に可視光により、高感度で測定できる方式を採用している。
【００７２】
以上のように、検出部１４８ａでは、微細流路に収容される各試薬が順に送液され検出部１４８ａに固定化されている反応物質と反応を行うが、この順序は予め決まっている。
【００７３】
反応部１３９ａから検出部１４８ａに送液された増幅産物は、当該検出部１４８ａにて反応物質と反応を開始する（例えばアビチン−ビオチン反応）。
【００７４】
次に、上流開口部ｇ６から駆動液Ｌ０の送り込みを開始し、試薬収容部ｓｔ６に収容されているプローブＤＮＡを下流側の検出部１４８ａに送液することにより検出部１４８ａの反応物質とハイブリダイゼーション反応が行われる。
【００７５】
その後、上流開口部ｇ７から駆動液Ｌ０の送り込みを開始し、試薬収容部ｓｔ７の色素液（例えばＰＥＧ化金コロイド）を検出部１４８ａに送液することにより検出部１４８ａにて抗原抗体反応が開始される。金コロイドが増幅産物と反応した後、検出部１４８ａにて検出する際、余分な金コロイドが存在する。この余剰な金コロイドを洗い流すため、上流開口部ｇ８から駆動液Ｌ０の送液を開始することにより試薬収容部ｓｔ８の洗浄液が、検出部１４８ａに送液される。
【００７６】
検出部１４８ａに送液され検出のための反応が行われた増幅産物は、光検出部４により検出が行われる。検出後の増幅産物は、廃液部１６０に送液される。
【００７７】
（１）第１混合液から生成された増幅生産物を検出する検出部１４８ａと（２）第２混合液から生成された増幅生産物を検出する検出部１４８ｂからの検出結果を比較することにより、検査は正常に行われたか否かを判断することができる。また更に、（３）第３混合液から生成された増幅生産物を検出する検出部１４８ｃ（不図示）での検出結果をベースラインレベルとして用いることにより、上記（１）、（２）の検出結果を補正することが可能となり、精度良く検査を行うことが可能となる。
【００７８】
つまり、陽性すなわち検体に標的遺伝子が含まれる場合、検体とポジティブコントロールとの「第１混合液」、及び検体とネガティブコントロールとの「第２混合液」のいずれ混合液による反応生成物からも蛍光発光が生じる。陰性すなわち検体に標的遺伝子が含まれない場合、「第１混合液」は、ポジティブコントロールの反応による蛍光発光が生じるが、「第２混合液」は、反応が生じず蛍光発光は生じない。これら２つのケースは、正常な反応が行われた検査結果として扱うことができる。
【００７９】
その一方で、例えば、検体に増幅阻害物質が混入した場合は、「第１混合液」及び「第２混合液」のいずれ混合液による反応生成物からも蛍光発光は生じない、偽陰性となる。また、「第１混合液」による反応生成物では蛍光発光無し、「第２混合液」による反応生成物では蛍光発光有りの場合は、マイクロチップ１に収容した試薬の失活などの異常が考えられる。これら２つのケースは、異常な反応を行った検査結果として、再検査を促すことが可能となる。
【００８０】
そして本実施形態においては、一箇所の酵素収容部ｓｔＰｙから酵素をマイクロチップ１の全域に供給しているので、ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素は、複数の反応部１３９間においてほぼ同等の増幅効率を得ることができる。このことにより上記検査を精度よく行うことが可能となる。更に「第２混合液」は検体をネガティブコントロールで希釈していることにより、「第１混合液」との比較において、増幅阻害の影響による検査異常を精度良く検知することが可能となる。更に「第３混合液」をベースラインとして用いることにより、更に検査精度を向上させることが可能なマイクロチップを得ることが可能となる。
【００８１】
［第２の実施形態に係るマイクロチップ１の構成］
次に図７に基づいて、第２の実施形態に係るマイクロチップ１の構成について説明する。図７は第２の実施形態に係るマイクロチップ１の主要部における各流路エレメントの関係を表す構成概略図である。
【００８２】
同図に示すマイクロチップ１においては、図４に示したマイクロチップ１に対して第３分岐部ＳＰ３を追加して、第４の混合液を形成する。図４に示したマイクロチップ１と同一の構成に関しては同一符号を付すことにより説明に代える。
【００８３】
図７に示すマイクロチップ１においては、ポジティブコントロールは、ポジティブコントロール収容部ｓｔＰから微細流路内を送液され第３分岐部ＳＰ３で２分割され、下流側の微細流路に送液される。試薬は試薬収容部ｓｔから三つの微細流路を試薬（１）〜試薬（４）に４分割されて送液される。酵素は酵素収容部ｓｔＰｙから三つの微細流路を酵素（１）〜酵素（４）に４分割されて送液される。なお本実施形態においてはマイクロチップ１内で用いる酵素は全て一箇所の酵素収容部ｓｔＰｙから微細流路を送液され、各反応部１３９に供給される。
【００８４】
そして「第４混合液Ｌ４」は、ポジティブコントロール収容部ｓｔＰからの第３分岐部で分岐された他方のポジティブコントロールと、試薬収容部ｓｔから試薬分岐部ＳＰ９により分岐されて送液された試薬（４）と、酵素収容部ｓｔＰｙから酵素分岐部ＳＰ４により分割された酵素（４）と、を合流させることにより形成される。
【００８５】
「第１混合液Ｌ１」、「第２の混合液Ｌ２」、及び「第３の混合液Ｌ３」は、図４で示した実施形態と同様の流路構成としているので説明は省略する。
【００８６】
そして第１混合液Ｌ１、第２混合液Ｌ２、第３混合液Ｌ３及び第４混合液はそれぞれの対応する反応部１３９で増幅反応させてから、検出部１４８でプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基づいて増幅反応を検出部１４８で検出する。
【００８７】
第４混合液に対して増幅検出するのは、当該ポジティブコントロール由来の流路で増幅が確認できた場合でも、検体由来の阻害物質があった場合にはポジティブコントロール及び検体由来の第１混合液では増幅しないことになる。つまり第４混合液と第１混合液による増幅検出を比較することにより、検体由来の増幅阻害物質による偽陰性と判定されることを防止することができる。
【００８８】
本実施形態によれば、一箇所の酵素収容部ｓｔＰｙから酵素をマイクロチップ１の全域に供給しているので、ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素は、複数の反応部１３９間においてほぼ同等の増幅効率を得ることができる。このことにより上記検査を精度よく行うことが可能となる。更に第１乃至第４混合液の増幅反応を検出すことにより特定の目的物質の存在を検出するとともに、増幅阻害の影響を精度良く検出可能であり、更に増幅反応のレベルにより変化するベースラインレベルを修正することが可能なマイクロチップを得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本実施形態に係るマイクロチップを用いるマイクロチップ分析システム８の外観図である。
【図２】マイクロチップ分析システム８の概略斜視図である。
【図３】マイクロチップ分析システム８の構成図である。
【図４】本実施形態に係るマイクロチップ１の主要部における各流路エレメントの関係を表す構成概略図である。
【図５】２層構造のマイクロチップ１の流路構成の第１層の流路構成を示すものである。
【図６】２層構造のマイクロチップ１の流路構成の第２層の流路構成を示すものである。
【図７】第２の実施形態に係るマイクロチップ１の主要部における各流路エレメントの関係を表す構成概略図である。
【符号の説明】
【００９０】
１  マイクロチップ
３  温度調節ユニット
ｓｔ１乃至ｓｔ８  試薬収容部
ｓｔＥ  検体収容部
ｓｔＰｙ  酵素収容部
ｓｔＰ  ポジティブコントロール収容部
ｓｔＮ  ネガティブコントロール収容部
１３９  反応部
１４８  検出部
１６０  廃液部
７０  駆動液タンク
ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３  分岐部
ＳＰ４  酵素分岐部
ＳＰ９  試薬分岐部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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