(57)【要約】      （修正有）【課題】ＡＰＣやＣＴＮＮＢ１変異のある結腸直腸癌細胞で、ＦＺＤ７がＷｎｔ経路に機能する受容体のひとつであることを証明し、ＦＺＤ７が高発現している癌に対して、ＦＺＤ７の発現を抑制する医薬組成物を提供する。【解決手段】グアニンとシトシンの含有率が４０〜６０％である塩基配列、グアニンとシトシンが３塩基以上連続しない塩基配列、チミジンが４塩基以上連続しない塩基配列、および特定の塩基配列における１９−２９塩基を有する塩基配列、以上の全ての条件を満たすＤＮＡ配列から転写された相補的な配列を有するｓｉＲＮＡで、かつＦＺＤ７遺伝子の発現抑制活性を有するｓｉＲＮＡ、およびその修飾物、ならびに該ｓｉＲＮＡを含有する医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）の条件の全てを満たすＤＮＡ配列から転写された相補的な配列を有するｓｉＲＮＡであって、かつＦＺＤ７遺伝子の発現抑制活性を有するｓｉＲＮＡ、およびその修飾物。
（ａ）グアニンとシトシンの含有率が４０〜６０％である塩基配列、
（ｂ）グアニンとシトシンが３塩基以上連続しない塩基配列、
（ｃ）チミジンが４塩基以上連続しない塩基配列、および
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列における１９−２９塩基を有する塩基配列。
【請求項２】
配列番号２または３のいずれかである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ、およびその修飾物。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｄ）の条件の全てを満たすＤＮＡ配列であって、ＦＺＤ７遺伝子の発現抑制活性を有するｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ａ）グアニンとシトシンの含有率が４０〜６０％である塩基配列、
（ｂ）グアニンとシトシンが３塩基以上連続しない塩基配列、
（ｃ）チミジンが４塩基以上連続しない塩基配列、および
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列における１９−２９塩基を有する塩基配列。
【請求項４】
請求項２に記載のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
ＦＺＤ７を高発現する癌に対する医薬組成物であって、請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ、その修飾物、および請求項３または４に記載のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ、該ｓｉＲＮＡを発現するベクターの中から選ばれる少なくとも1つを含有する医薬組成物。
【請求項６】
ＦＺＤ７を高発現する癌が結腸直腸癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、悪性黒色腫、リンパ芽球性白血病である、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達系に存在するＦｒｉｚｚｌｅｄ−７（ＦＺＤ７）遺伝子を標的とするｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。詳しくは、ｓｉＲＮＡ、および該ｓｉＲＮＡによるＦＺＤ７発現抑制を利用した癌の治療剤、特に結腸直腸癌の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＺＤ遺伝子群のタンパク質は、Ｗｉｎｇｌｅｓｓ型（Ｗｎｔ）シグナル伝達タンパク質の受容体であり、発達過程のための伝達分子として機能している。Ｗｎｔは発生初期における体軸形成や器官形成に必須であることが明らかになっている。細胞の発生と増殖をコントロールする大腸のＷｎｔシグナル伝達経路は、膜受容体、ＦＺＤｓ、低比重リポタンパク受容体にＷｎｔリガンドが結合すると、ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ（ＡＰＣ）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β、カゼインキナーゼ１、アキシンなどの多種タンパク複合体やその分解物によるβ−カテニンの分解が妨げられる。Ｗｎｔ／β‐カテニン経路には多くの癌遺伝子や癌抑制遺伝子が含まれており、Ｗｎｔ／β‐カテニン経路の異常な活性化が癌を引き起こすものと考えられている。β−カテニンは、生育、増殖、浸潤に絡む標的遺伝子を活性化するためにＴ細胞因子（ＴＣＦ）やリンパ球のエンハンサーの転写因子と結合する（非特許文献１、２）。このシグナル伝達経路は、８０％以上の散発的な結腸直腸癌で活性化されている。それは、おもにＡＰＣの変異で起こっており、βカテニン遺伝子（ＣＴＮＮＢ1）の変異は１０％以下で少ない（非特許文献３、４）。最近まで、結腸直腸癌においては、ＷｎｔリガンドやＡＰＣの機能的上流部位の受容体の働きにはあまり注目されていなかったが、結腸直腸癌において、高メチル化プロモーターによって９０％以上低く抑えられたＷｎｔ拮抗物質のｓｅｃｒｅｔｅｄ  ＦＺＤ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＦＲＰｓ）が、ＣＴＮＮＢ１やＡＰＣの変異のある結腸癌細胞ＨＣＴ１１６やＳＷ４８０で、コロニー形成を減少させ、アポトーシスを増加させたことから、ＣＲＣ細胞の増殖や生存に影響を与えることが示された（非特許文献５）。他のＷｎｔ拮抗物質であるＷｎｔ阻害因子１（ＷＩＦ−１）は、結腸直腸癌で非活性化し、ＳＷ４８０細胞における過剰発現はアポトーシスをもたらすことを明らかにし、さらに、アポトーシスはまた、ＳＷ４８０，ＨＣＴ１１６の細胞系や培養結腸癌細胞において、ｓｉＲＮＡやモノクローナル抗体によるＷｎｔ１の抑制によっても増進されることが知られている（非特許文献６）。
【０００３】
ＦＺＤ７はＦＺＤ遺伝子群の１０個のなかの1つである。その発現は正常な組織に限定される。ｍＲＮＡは胎児の腎臓、肺、大人の骨格筋、心臓、脳、胎盤で確認されている（非特許文献７）。それに比べ、ＦＺＤ７ｍＲＮＡは、メラノーマ、肺癌、食道癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、リンパ芽球性白血病などの広く多種の癌細胞中に見出されている（非特許文献８〜１３）。最近の研究でｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを使って、ＦＺＤ７ｍＲＮＡの発現は、未熟結腸での発現から、結腸陰窩上皮に限られたことを示した（非特許文献１４）。癌細胞中のＦＺＤ７について、正規のＷｎｔ経路での活動は、食道癌細胞ＫＹＳＥ１５０（非特許文献８）、肝細胞癌の細胞（非特許文献１２）、結腸癌細胞ＬＩＭ１８６３（非特許文献１１）を用いた先の研究で提案している。しかしながら、ＡＰＣやＣＴＮＮＢ１変異を起こした結腸癌細胞のＦＺＤ７についての情報はなにもない。
【０００４】
特定遺伝子の発現を抑制することにより、疾患の治療に結びつけようとする技術の一つとしてｓｉＲＮＡが用いられている。インターロイキン‐１３（ＩＬ−１３）によるシグナリングを阻害することを作用機序とする消化管粘膜傷害治療剤（特許文献１）、ミッドカインに対するｓｉＲＮＡを有効成分として含有する炎症性疾患治療剤（特許文献２）、ディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）の発現又は活性を抑制する手段を有効成分として含むことを特徴とする間接性肺疾患治療剤（特許文献３）などの報告がある。しかしながら、特定の遺伝子の発現を抑制することができるｓｉＲＮＡ分子の設計は、その個々の遺伝子の構造及び性質によって異なり、遺伝子の全長を元に約２０塩基程度の配列を選び出す組み合わせは膨大な数あり、特定のｓｉＲＮＡを求めるのは非常に困難なものとなっている。
【非特許文献１】Ｍｏｏｎ  ＲＴ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５：６９１−７０１，２００４
【非特許文献２】Ｃｌｅｖｅｒｓ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  １２７：４６９−４８０，２００６
【非特許文献３】Ｓｅｇｄｉｔｓａｓ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５：７５３１−７５３７，２００６
【非特許文献４】Ｓｃｈｎｅｉｋｅｒｔ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｕｔ．５６：４１７−４２５，２００７
【非特許文献５】Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６：４１７−４２２，２００４
【非特許文献６】Ｈｅ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４：３０５４−３０５８，２００５
【非特許文献７】Ｓａｇａｒａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５２：１１７−１２２，１９９８
【非特許文献８】Ｔａｎａｋａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０１６４−１０１６９，１９９８
【非特許文献９】Ｋｉｒｉｋｏｓｈｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１９：７６７−７７１，２００１
【非特許文献１０】Ｖｉｎｃａｎ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７３：１４２−１５３，２００５
【非特許文献１１】Ｖｉｎｃａｎ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６：２３４０−２３５２，２００７
【非特許文献１２】Ｍｅｒｌｅ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２７：１１１０−１１２２，２００４
【非特許文献１３】Ｋｈａｎ  ＮＩ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１３８：３３８−３４８，２００７
【非特許文献１４】Ｇｒｅｇｏｒｉｅｆｆ  Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２９：６２６−６３８，２００５
【特許文献１】特開２００７−３１４１４公報
【特許文献２】特開２００７−１３７７７１公報
【特許文献３】特開２００７−３１９００９公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＡＰＣやＣＴＮＮＢ１変異のある結腸直腸癌細胞で、ＦＺＤ７がＷｎｔ経路に機能する受容体のひとつであることを証明することにより、ＦＺＤ７が高発現している癌に対して、ＦＺＤ７の発現を抑制する医薬組成物を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、結腸直腸癌細胞中でＷｎｔシグナル経路に機能するＦＺＤ７が、Ｗｎｔ受容体のひとつであることを証明し、さらに、ＦＺＤ７の発現を抑制するｓｉＲＮＡを見出した。数種のｓｉＲＮＡが、ＦＺＤ７の発現による癌の治療用目的物となることを明らかにして、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。
【０００８】
（１）下記（ａ）〜（ｄ）の条件の全てを満たすＤＮＡ配列から転写された相補的な配列を有するｓｉＲＮＡであって、かつＦＺＤ７遺伝子の発現抑制活性を有するｓｉＲＮＡ、およびその修飾物。
（ａ）グアニンとシトシンの含有率が４０〜６０％である塩基配列、
（ｂ）グアニンとシトシンが３塩基以上連続しない塩基配列、
（ｃ）チミジンが４塩基以上連続しない塩基配列、および
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列における１９−２９塩基を有する塩基配列。
【０００９】
（２）配列番号２または３のいずれかである、上記（１）に記載のｓｉＲＮＡ、およびその修飾物。
【００１０】
（３）下記（ａ）〜（ｄ）の条件の全てを満たすＤＮＡ配列であって、ＦＺＤ７遺伝子の発現抑制活性を有するｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ａ）グアニンとシトシンの含有率が４０〜６０％である塩基配列、
（ｂ）グアニンとシトシンが３塩基以上連続しない塩基配列、
（ｃ）チミジンが４塩基以上連続しない塩基配列、および
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列における１９−２９塩基を有する塩基配列。
【００１１】
（４）上記（２）に記載のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【００１２】
（５）ＦＺＤ７を高発現する癌に対する医薬組成物であって、上記（１）または（２）に記載のｓｉＲＮＡ、その修飾物、および上記（３）または（４）に記載のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ、該ｓｉＲＮＡを発現するベクターの中から選ばれる少なくとも1つを含有する医薬組成物。
【００１３】
（６）ＦＺＤ７を高発現する癌が結腸直腸癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、悪性黒色腫、リンパ芽球性白血病である、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、結腸直腸癌などのＦＺＤ７を高発現する癌に対して、ＦＺＤ７に対するｓｉＲＮＡ（以下「ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ」と標記する）を含有する治療用の医薬組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のｓｉＲＮＡは、ＦＺＤ７発現抑制作用を有するものである。標的となるヒト由来のＦＺＤ７遺伝子の特定の核酸部分配列は、２本鎖としてベクターに導入しプラスミドを作成し細胞に導入した場合、プロモーターによりＲＮＡに転写される。転写物はループ構造を作り、このループ構造をＤｉｃｅｒというタンパクがループ部分をカットしてｓｉＲＮＡができる。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）に組み込まれてｍＲＮＡを分解するというメカニズムで標的遺伝子の発現を抑制する。本発明のｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣに組み込まれることが可能なｓｉＲＮＡであり、さらに、本発明のｓｉＲＮＡは、相補的なＦＺＤ７遺伝子の核酸部分配列にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制するものではない。
【００１６】
ＦＺＤ７遺伝子の発現抑制活性を有する本発明のｓｉＲＮＡは、以下の条件の全てを満たすＤＮＡ配列を選択して、転写した相補的な配列を有するｓｉＲＮＡである。選択の条件としては、スタートコドンからストップコドンの配列塩基数が１００塩基以内のものは除外し、偏った塩基を選択しないことが望ましい。さらに、以下の（ａ）〜（ｄ）の条件を満たすＤＮＡ配列に対して、相補的な配列を有するものである。（ａ）グアニンとシトシンの含有率が４０〜６０％である塩基配列、（ｂ）グアニンとシトシンが３塩基以上連続しない塩基配列、（ｃ）チミジンが４塩基以上連続しない塩基配列（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列における１９−２９塩基を有する塩基配列である。
【００１７】
本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列と相補的な１９−２９塩基を有する塩基配列であり、より好ましくは、配列番号１における塩基配列と相補的な２１−２５塩基を有する塩基配列である。選択されたｓｉＲＮＡ配列としては、次のものをあげることができる。５‘−ｕｃａｃｃｕａｃｃｕｇｇｕｇｇａｃａｕｇｃ−３’（配列番号２：「ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ」という）、５‘−ｇｕｃａｕｕｃｕｇｕｃｕｃｕｃａｃｕｕｇｇｕｕｃｃ−３’（配列番号３：「ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８」という）。これらの塩基配列は、両側を、例えば水酸基、リン酸基などで修飾したものであっても良い。また、本発明には、ＦＺＤ７遺伝子の発現抑制活性を有するものであれば、塩基の変異が１〜３個あったものも含まれる。
【００１８】
本発明の、ＦＺＤ７遺伝子の特定の核酸部分配列は、配列番号１に示されるＦＺＤ７遺伝子由来のＤＮＡ配列であって、ＦＺＤ７遺伝子の発現抑制活性を有するｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡである。該ＤＮＡがコードするｓｉＲＮＡが、ＦＺＤ７遺伝子の発現抑制活性を有するものであれば、該ＤＮＡの塩基変異が１〜３個あったものも含まれる。
【００１９】
本発明のｓｉＲＮＡ、およびその修飾物は、化学的な方法や、遺伝子組換えの方法など周知の方法で合成することができるが、塩基の数が少ないことから、慣用のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を使用して化学的に合成するのが望ましい。化学合成は、専門的な業者に委託して合成することも可能である。
【００２０】
本発明のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、プラスミドベクターや、ウイルスベクターなどのｓｉＲＮＡ発現ベクターに導入して、治療用に用いることができる。プラスミドベクターは、定法により調製しても良いが、ｓｉＲＮＡ発現用に市販されているベクター、例えばｐｉＧＥＮＥ（登録商標）ｈＵ６ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｉＧＥＮＥ（登録商標）ｈＨ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＢＡｓｉベクター（タカラバイオ）、およびｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）などを利用することもできる。
【００２１】
プラスミドベクターは、本発明のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の他に、プロモーター（例えばヒトもしくはマウスＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、及びサイトメガロウイルスプロモーター等）、薬剤耐性遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等）、転写停止配列、特定制限部位、複製開始点などを含む。
【００２２】
また、ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、レンチウイルスベクターなどを使用することができる。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどの病原性の低いウイルスベクターを使ってもよいが、ウイルス本体の機能、例えば自己複製能を欠損させたものであれば、いかなるウイルスベクターであってもよい。
【００２３】
上記ｓｉＲＮＡ発現ベクターの他に、ｓｉＲＮＡを生体内に有効に導入する手段として、リポソームや高分子ナノ微粒子のベクターを利用することもできる。リポソームは、細胞膜に構造が良く似た脂質二重膜からなる人工のミクロ球体であり、主にリン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等の脂質からなる。ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリンなどのリン脂質、
グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質などの糖脂質、コレステロール、ラノステロール、フィトステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロールなどのステロールのいずれか、または２種以上組み合わせて作成したリポソームを用いることができる。
【００２４】
高分子ナノ微粒子のベクターは、ポリエチレングリコールとポリリジンとの共重合体を、プラスミドＤＮＡと会合させて作製したものや、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質に由来するセンサータンパク質と脂質二重膜から構成される中空状粒子であるバイオナノカプセルを用いることもできる。これらの高分子ナノ微粒子は、ウイルスと同じくらいの直径が７０〜１５０ｎｍ前後の非常に小さな粒子であり、高機能で安全なベクターといえる。
【００２５】
本発明のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、上記ベクターを使用して細胞に導入し、形質変換した細胞を得ることにより、Ｗｎｔシグナル伝達経路の１つであるＷｎｔ／β−カテニン経路（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ経路）の活性化の有無について知ることができる。すなわち、形質変換した細胞のＴｃｆ転写活性を、例えば、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼリポーターアッセイを測定することにより、Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ経路の活性レベルを知ることができる。
【００２６】
ＦＺＤ７遺伝子の発現抑制活性は、ＦＺＤ７遺伝子のＴｏｔａｌ  ＲＮＡ発現量を定量する方法や、発現タンパク質を免疫化学的手法で測定することができる。
【００２７】
通常Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量の測定は定量ＰＣＲ法で行うが、本発明においても、癌細胞や形質転換したｓｉＲＮＡ発現細胞中のＦＺＤ７遺伝子のＴｏｔａｌ  ＲＮＡレベルは、定量ＰＣＲ法により求めることができる。定量ＰＣＲは、増幅産物がある量に達するのに行ったＰＣＲのサイクル数を基にした測定法であるが、対照となる遺伝子のｍＲＮＡの定量値を用いてサンプル間の鋳型量の標準化を行い、試験する遺伝子の発現量を求める。定量値は、検量線法を用いることも、比較Ｃｔ法を用いることもできる。比較Ｃｔ法は基準となる対照遺伝子サンプルと比較して閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅ）に到達するサイクル数を比較して相対的に定量する方法であり、毎回検量線を作成する必要が無く簡便である。
【００２８】
免疫化学的手法として、ウエスタンブロット分析法を用いることができる。免疫化学的手法は、抗原−抗体反応という特異的な結合反応を利用して、目的とするタンパク質の細胞内外および組織内の局在を検出する手法であり、抗原に対する特異的抗体である一次抗体に酵素や蛍光物質を直接結合させて検出する方法や、一次抗体に対する抗体である二次抗体を用いて可視化する方法等がある。本発明は、上記のどちらの手法を用いることもできる。また、ここで用いる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良い。抗体には、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ）等の蛍光物質や、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ビオチン等の酵素標識を施すことにより、精度良く効率的な検出を行うことができる。これらの標識された抗体は、市販のキットを用いることもできる。例えば、ＨＲＰ標識の抗体を使用した場合は、ＬｕｍｉＧＬＯ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅｔ試薬（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）で可視化して、ウエスタンブロット分析を行なうことができる。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、ＦＺＤ７遺伝子の発現抑制活性を有する、ｓｉＲＮＡ、およびその修飾物、該ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡを導入した発現ベクターを有効成分とし、保存剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等などの製剤上許容される材料を有することができる。
【００３０】
本発明の医薬組成物は、経口あるいは非経口で用いられる形態を有する。カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤などの経口投与剤や、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、貼付剤などの非経口投与剤として使用することができる。
【００３１】
投与方法としては、局所投与あるいは非局所投与で行うことができる。局所投与の場合は、外科手術による患部へ直接投与することもでき、内視鏡を用いた患部投与も可能である。この場合、注射剤でも、貼付剤であってもよい。あるいは、リポソームと複合体を形成しカプセル化された状態で患部に直接投与してもよい。また、非局所投与の場合は、注射剤を静脈内、または腹腔内投与をすることが可能である。
【００３２】
本発明の癌治療剤における有効成分量は、癌の種類、使用目的等に応じて、ＦＺＤ７の発現抑制作用を発揮する範囲で適宜設定されうる。本発明の癌治療剤における有効成分の投与量は、投与対象の重症度、患部の大きさ、患者の体重、年齢により適宜設定することができるが、例えば、有効成分を０．１μｇ〜１ｇ、好ましくは１μｇ〜１００ｍｇとすることが望ましい。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、ＦＺＤ７を高発現する癌、例えば結腸直腸癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、悪性黒色腫、リンパ芽球性白血病の治療のために使用することができるが、好ましくは結腸直腸癌の治療のために使用することができる。
【００３４】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００３５】
＜ヒト結腸癌細胞系におけるＦＺＤ遺伝子群のｍＲＮＡ発現レベル＞
【００３６】
１．細胞培養
ヒト結腸癌細胞ＳＷ−４８０、ＨＣＴ−１１６、ＤＬＤ−１、ＬｏＶｏ、ＨＴ−２９をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手した。ヒト結腸癌細胞Ｃａｃｏ−２と、ヒト胚腎臓細胞２９３Ｔは理研ＢＲＣ（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）から入手した。２９３Ｔ細胞は、ＤＭＥＭ培地（Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に、１０％熱処理した子牛血清（ＡＴＣＣ）、１００Ｉｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を加え培養した。ＳＷ−４８０細胞は、Ｌｅｉｂｏｖｉｚ‘ｓＬ−１５倍地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）に、１０％熱処理した子牛血清（ＡＴＣＣ）、１００Ｉｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を加え培養した。ＨＣＴ−１１６とＨＴ−２９細胞は、ＭｃＣｏｙ‘ｓ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）に、１０％熱処理した子牛血清（ＡＴＣＣ）、１００Ｉｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を加え培養した。ＤＬＤ−１細胞は、ＲＰＭＩ  １６４０倍地（Ｇｉｂｃｏ）に、１０％熱処理した子牛血清（ＡＴＣＣ）、１００Ｉｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を加え培養した。Ｃａｃｏ−２細胞は、エッセンシャル培地（Ｅａｇｌｅ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎ  Ｋ．Ｋ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に、２０％熱処理した子牛血清（ＡＴＣＣ）、１００Ｉｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を加え培養した。ＬｏＶｏ細胞は、Ｈａｍ‘ｓＦ１２Ｋ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に、１０％熱処理した子牛血清（ＡＴＣＣ）、１００Ｉｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を加え培養した。
【００３７】
２．定量ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ＫＩｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを結腸癌細胞から単離した。抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡはＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を使って、１本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。定量ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。内因性コントロール（ＧＡＰＤＨ遺伝子）とターゲット遺伝子のアッセイ番号は表１のとおりである。
【００３８】
【表１】
2009213470.tif 000002
【００３９】
定量ＰＣＲは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７９００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。定量ＰＣＲのサイクル条件は次のように設定した。５０℃で２分間、９５℃で１０分間後、９５℃で１５秒の熱変性と６０℃で１分間の伸長反応を４０サイクル行った。全ての反応は、１サンプル２０μｌで３重測定を行った。ｍＲＮＡの発現レベルは、比較Ｃｔ法により、ＦＺＤ１を１として相対値を求めた。
【００４０】
３．ＦＺＤ遺伝子群のｍＲＮＡ発現レベル
ＡＰＣ遺伝子やＣＴＮＮＢ１遺伝子に変異が起こっている結腸癌細胞における１０個のＦＺＤ遺伝子のｍＲＮＡレベルを定量ＰＣＲで試験し、対照のＦＺＤ１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを１として、平均値とＳ．Ｄ．で表した（図１）。その結果、ＡＰＣ変異を有するＳＷ−４８０、Ｃａｃｏ−２、ＤＬＤ−１、ＬｏＶｏ、ＨＴ−２９の全ての細胞、およびＣＴＮＮＢ１変異を有するＨＣＴ−１１６において、ＦＺＤ６とＦＺＤ７が顕著に発現していた。
【実施例２】
【００４１】
＜ターゲット遺伝子に対するＦＺＤ７の影響＞
【００４２】
１．プラスミドの構築
実施例１で発現レベルが高かったＦＺＤ６は、ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ経路に関ることがＧｏｌａｎらにより知られていることから（Ｇｏｌａｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１４８７９−１４８８８，２００４）対象外とし、結腸癌細胞にＦＺＤ７と、結腸経路で活性化していることがＧａｚｉｔらにより知られているＦＺＤ１を、ポジティブコントロールとして使用した（Ｇａｚｉｔ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：５９５９−５９６６，１９９９）。ＦＺＤ１とＦＺＤ７は、ヒトＴｏｔａｌ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅した。プライマーは、次のものを使用した。ＦＺＤ１のフォワード  プライマーとして、５‘−ｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｇｇｃｔｇｃｇｇ−３’（配列番号４）、リバース  プライマーとして、５’−ａｇｃｃｔｇｃｇａａａｇａｇａｇｔｔｇｔｃ−３’(配列番号５)、ＦＺＤ７のフォワード  プライマーとして、５‘−ｇｃｃｔｃｇｔｃｇｃａｃｔｃｃｔｃａｇ−３’ (配列番号６)、リバース  プライマーとして、５’−ｇｇｇｇｃｔｃａｔａｃｃｇｃａｇｔｃｔｃ−３’ (配列番号７)を使用した。ＰＣＲ産物はｐＴａｒｇｅＴ（登録商標）−Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍｅｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）へクローニングした。ｐＴａｒｇｅＴ−ＦＺＤ１とｐＴａｒｇｅＴ−ＦＺＤ７からのＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩサイトへサブクローニングして、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＺＤ１とｐｃＤＮＡ３．１−ＦＺＤ７を得た。
【００４３】
２．遺伝子導入
６個の結腸癌細胞に、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてＴＯＰｆｌａｓｈ  Ｐｌａｓｍｉｄ（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）０．１μｇ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＺＤ１、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＺＤ７を各々０．１μｇ、さらにｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．００５μｇを導入した。
【００４４】
３．ルシフェラーゼリポーターアッセイ
上記導入細胞を４８時間培養した後、ルシフェラーゼ量をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。データは、３つの独立した実験で、Ｍｏｃｋ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性レベルを１として、ＦＺＤ１遺伝子およびＦＺＤ７遺伝子の導入によるルシフェラーゼ活性レベルを平均値とＳ．Ｄ．で表した（図２Ａ）。Ｔｃｆ転写活性は、ＦＺＤ７を導入した時、１．５−２４．３倍増加し、ＦＺＤ７は結腸癌細胞においてＣａｎｏｎｉｃａ  Ｗｎｔ経路（Ｗｎｔ／β−カテニン経路）を活性化することが明らかになった。
【００４５】
４．ＦＺＤ７導入細胞におけるＷｎｔターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル
上記導入細胞のうちＨＣＴ−１１６細胞を、４８時間培養した後、ターゲット遺伝子のＴｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞から単離した。抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡをＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１本鎖ｃＤＮＡへ逆転写した。定量ＰＣＲはＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って行った。使用したプライマーは、内部コントロールのＧＡＰＤＨ遺伝子のプライマーと合わせて表２に示した。定量ＰＣＲは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７９００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。定量ＰＣＲのサイクル条件は次のように設定した。９５℃で１０分間後、９５℃で１５秒の熱変性と６０℃で１分間の伸長反応の４０サイクルとした。全ての反応は、１サンプル２０μｌで３重測定を行った。
【００４６】
【表２】
2009213470.tif 000003
【００４７】
７つの知られているターゲット遺伝子Ｍｙｃ，ＣｙｃｌｉｎＤ１，ＣＤ４４，ＶＥＧＦ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，Ｉｄ−２、ＪｕｎのｍＲＮＡ発現レベルは、Ｍｏｃｋ遺伝子導入によるターゲット遺伝子の発現量を１として、ＦＺＤ１遺伝子およびＦＺＤ７遺伝子の導入による発現量を、平均値とＳ．Ｄ．で表した結果、ＦＺＤ７導入の場合において、Ｍｏｃｋ導入に比べ、１．５−３．４倍の増加を示した（図２Ｂ）。
【００４８】
５．ウエスタンブロット分析
上記導入細胞のうちＨＣＴ−１１６細胞を氷冷のリン酸バッファー食塩水で洗い、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９，１０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５ｍＭ  フェニルメチルスルフニルフルオライドを含む冷緩衝液に溶解した。溶解した細胞を０．５％  ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０の中で１５分間溶解し、次いで４℃で１０００ｒｐｍ５分間の遠心分離を行ない、その上清を細胞質分画タンパクとした。細胞質分画の１０μｇで、ウエスタンブロット分析を行なった。すなわち、１次抗体としてマウスモノクローナル抗体またはウサギポリクローナル抗体を用い、２次抗体としてＨＲＰが結合した抗マウスと抗ウサギ  ＩｇＧ  （Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用し、ＬｕｍｉＧＬＯ試薬とＰｅｒｏｘｉｄｅｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）で可視化した。使用した第１抗体は、マウス抗β−カテニン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）、抗Ｍｙｃ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）、抗Ｊｕｎ（ＢＤ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）、抗β−アクチン（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）のモノクローナル抗体と、ウサギ抗ｓｕｒｖｉｖｉｎポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）である。
【００４９】
ウエスタンブロット分析法により、β−アクチンを内部コントロールとして、対照のＭｏｃｋ遺伝子、ＦＺＤ１遺伝子およびＦＺＤ７遺伝子導入による、細胞質のβカテニン、Ｍｙｃ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｊｕｎの影響を、電気泳動後のバンドの強さで表した（図２Ｃ）。この結果は、定量ＰＣＲの結果とも一致し、ＦＺＤ７は、Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ経路のターゲット遺伝子の発現増加を引き起こすことが明らかになった。
【実施例３】
【００５０】
＜癌組織におけるｍＲＮＡ発現レベル＞
【００５１】
外科手術により除去した患者１３５症例の癌組織と３８症例の非癌部組織からＲＮＡを抽出し、ＦＺＤ７  ｍＲＮＡの発現レベルをＴａｑＭａｎ（登録商標）法によりリアルタイムＰＣＲで定量測定した。１３５症例の中で予後調査可能であった１２１症例のデータから再発・死亡について統計解析を行った。Ａｌｌ  ｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ)を使用してトータルＲＮＡを単離した。単離したトータルＲＮＡはＨｉｇｈ
Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。内因性のコントロールとしたβ―アクチンとターゲット遺伝子のアッセイ番号は４３２６３１５Ｅ（β―アクチン）、Ｈｓ００２７５８３３＿ｓ１（ＦＺＤ−７）である。定量ＰＣＲはＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ
７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。定量ＰＣＲのサイクル条件は次のように設定した。５０℃で２分間、９５℃で１０分間後、９５℃で１５秒の熱変性と６０℃で１分間の伸長反応を４０サイクル行った。全ての反応は、１サンプル２０μｌで３重測定を行った。
【００５２】
直腸結腸腫瘍組織図３（ａ）は癌の各ステージ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ，ＩＶ：Ｎは非癌部）におけるＦＺＤ７のｍＲＮＡの発現を調べたものである。縦軸はＦＺＤ７のｍＲＮＡの値をβ―アクチンの値で補正した時の相対値であり、ｎは解析を行った患者数、Ｐは統計解析値を示す。ステージがＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶと高くなるについてＦＺＤ７のｍＲＮＡの発現量も高くなっていることが明らかとなった。図３（ｂ）は直腸結腸癌を手術した後の再発を調べたものである。左側が再発若しくは死亡をしなかった患者数、右側が再発若しくは死亡した患者数であり、縦軸はＦＺＤ７のｍＲＮＡの値をβ―アクチンの値で補正した時の相対値であり、Ｐは統計解析値を示す。再発若しくは死亡した患者のＦＺＤ７  ｍＲＮＡの値は再発若しくは死亡しなかった患者のＦＺＤ７  ｍＲＮＡの値と比べて有意に高値を示した。図３（ｃ）は直腸結腸癌を手術した患者のその後の生存を調べたものである。横軸は手術後の経過時間（月）を、縦軸は患者全体を１００％とした時の生存数を示す。図中、予後調査可能であった１２１症例の患者のＦＺＤ７
ｍＲＮＡの平均値より低かった患者をＬｏｗ、平均値より高かった患者をＨｉｇｈとした。ＦＺＤ７ｍＲＮＡ発現量の高い患者は、全生存でみると、有意に予後不良であった。
【実施例４】
【００５３】
＜ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡのＦＺＤ７に対する抑制効果＞
【００５４】
１．ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ発現ベクターの作成
ＦＺＤ７に対する核酸ターゲット配列は、５‘−ｔｃａｃｃｔａｃｃｔｇｇｔｇｇａｃａｔｇｃ−３’、の２１塩基（配列番号２４：「ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ
ｃｏｄｉｎｇ  ＤＮＡ」という）を用いた。ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ
ｃｏｄｉｎｇ  ＤＮＡ含有プラスミドは、ｐｉＧＥＮＥ（登録商標）ｈＵ６ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に構築した。ｐｉＧＥＮＥと構築したＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ ｃｏｄｉｎｇ  ＤＮＡ含有プラスミドをＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトで切り出した配列をｐｃＤＮＡ３．１のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトへサブクローニングしてｃＤＮＡ３．１−Ｕ６とｐｃＤＮＡ３．１−Ｕ６ＦＺＤ７をそれぞれ得た。図４にｐｃＤＮＡ３．１−Ｕ６ＦＺＤ７含有プラスミドを示した。
【００５５】
２．ｐＥＦ４−ＦＺＤ７−Ｖ５ベクターの作製
ｐＴａｒｇｅＴ−ＦＺＤ７のＥｃｏＲＩサイト切り出したＦＺＤ７を含む配列をｐＥＦ４−Ｖ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩサイトへサブクローンしてｐＥＦ４−ＦＺＤ７を作製した。さらに、次のプライマーを使った。ＦＺＤ７のフォワード  プライマーとして、５‘−ｇｃｃａｔｇｇｇｃｃａｇｇｔａｇａｃ−３’（配列番号２５）、リバース  プライマーとして、５’−ｔｔｃｇａａｔａｃｃｇｃａｇｔｃｔｃｃｃｃｃｔｔｇｃ−３’（配列番号２６）を使用した。そのＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）へクローニングした。ｐＧＥＭ−Ｔ−ＦＺＤ７からのＢ１ｐＩ−ＢｓｔＢ１断片を、ｐＥＦ４−ＦＺＤ７のＢ１ｐＩ−ＢｓｔＢ１サイトへサブクローニングして、ｐＥＦ４−ＦＺＤ７−Ｖ５を得た。
【００５６】
３．ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡによるＦＺＤ７の発現抑制
ｐｉＧＥＮＥまたはＦＺＤ７ｓｉＲＮＡ発現ベクターを、ｐＥＦ４またはｐＥＦ４−ＦＺＤ７−Ｖ５と共にＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて２９３Ｔ細胞へ導入し、Ｔｏｔａｌタンパクは抗Ｖ５抗体で免疫検出を行った。すなわち、ｐＥＦ４−ＦＺＤ７−Ｖ５またはその対照としてｐＥＦ４を導入し、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡまたはその対照としてｐｉＧＥＮＥを導入して、ｓｉＲＮＡのＦＺＤ７に対する抑制効果を、抗β−アクチン抗体を内部コントロールとして、抗Ｖ５抗体で観察した。図５Ａで示す通り、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡはＦＺＤ７−Ｖ５タンパクの発現を抑制することを確認した。
【００５７】
４．ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡのＴｃｆ転写活性
６個の結腸癌細胞に、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＴＯＰｆｌａｓｈ  Ｐｌａｓｍｉｄ（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）０．１μｇ、ｐｉＧＥＮＥ、あるいはＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ
ｃｏｄｉｎｇ  ＤＮＡを各々０．１μｇ、さらにｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．００５μｇを導入した。実施例２と同様にしてＴｃｆ転写活性を測定した。結腸直腸癌細胞に導入したｐｉＧＥＮＥ導入によるルシフェラーゼ活性レベルを１として、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡの抑制効果によるルシフェラーゼ活性レベルを平均値とＳ．Ｄ．で表した。Ｔｃｆ転写活性は、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡにより２０−８０％に減少していた（図５Ｂ）。
【００５８】
５．ウエスタンブロット分析
ＨＣＴ−１１６細胞にＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてｐｉＧＥＮＥ、あるいはＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡを導入し、ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ経路のターゲット遺伝子のタンパク発現レベルの変化をウエスタンブロット分析法に解析した。β−アクチンを内部コントロールとして、対照のｐｉＧＥＮＥと、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ ｃｏｄｉｎｇ  ＤＮＡを導入した細胞でのＷｎｔターゲット遺伝子の発現量を、電気泳動後のバンドの強さで表した。図５Ｃで見られるように、βカテニン、Ｍｙｃ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｊｕｎのタンパク発現が、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡにより減少したことが明らかになった。
【実施例５】
【００５９】
＜ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡの結腸癌細胞に対する効果＞
【００６０】
１．細胞生存アッセイ
ＨＣＴ−１１６細胞に、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてｐｃＤＮＡ３．１−Ｕ６、あるいはｐｃＤＮＡ３．１−Ｕ６ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡを導入し、２４時間後に培地に最終濃度が５００μｇ／ｍｌになるようにＧ４１８を加えて細胞を選別した。Ｇ４１８選別は非導入細胞を除去するために使った。導入後２−７日に、ＭＴＳアッセイ法で細胞の生育状況を測定した。ＭＴＳアッセイには、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、３重測定の平均結果を示した。
【００６１】
ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡの細胞生存への影響結果を図６Ａに示した。ｐｃＤＮＡ３．１−Ｕ６ＦＺＤ７導入後の細胞の生存量は、対照のｐｃＤＮＡ３．１−Ｕ６導入後の生存量に対する割合で表した。生存細胞数は、ベクターだけの対照に比べ、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡでは８０％減少した。
【００６２】
２．細胞浸潤アッセイ
０．８μｍポアサイズのトランスウェルろ過膜（Ｃｏｓｔｅｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）へＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を血清無添加培地と１：５の割合で希釈して作製した培養液を１００μｌ添加し、５％炭酸ガス中、３７℃で５時間培養した。ＨＣＴ−１１６細胞へはｐｉＧＥＮＥ、あるいはｐｉＧＥＮＥ−ＦＺＤ７を導入した。プラスミドを導入して２４時間後、細胞を集め血清無添加培地へ溶解した。細胞１０００００個を上のチャンバーに入れ、そして５μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む６００μｌの培地で満たした下のチャンバーで、５％炭酸ガスを含む組織培養の培養器中３７℃で４８時間培養した。浸潤細胞はＤＩｆｆ−Ｑｕｉｃｋ溶液（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）に入れた。細胞は顕微鏡で１ウェル当たり５個所を数え、ｐｉＧＥＮＥとｐｉＧＥＮＥ−ＦＺＤ７をそれぞれ３ウェルで測定し、３重測定の平均結果を示した。
【００６３】
ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡの細胞浸潤への影響結果を図６Ｂに示した。ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ ｃｏｄｉｎｇ  ＤＮＡを導入した細胞が、上部から下部の培地への移行した量を、対照のｐｉＧＥＮＥ導入後の細胞の移行量に対する割合で表した。ＨＣＴ−１１６細胞において、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞浸潤を４０％抑制した。
【実施例６】
【００６４】
＜ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８のＦＺＤ７に対する抑制効果＞
【００６５】
１．ｓｉＲＮＡ発現ベクターの作成
ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８のＦＺＤ７に対する核酸ターゲット配列は５‘−ｇｔｃａｔｔｃｔｇｔｃｔｃｔｃａｃｔｔｇｇｔｔｃｃ−３’の２５塩基（配列番号２７：「ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８ ｃｏｄｉｎｇ  ＤＮＡ」という）を用いた。ＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡのＥＧＦＰに対する核酸ターゲット配列は５‘−ｇｇｃｔａｃｇｔｃｃａｇｇａｇｃｇｃａｃｃ−３’（配列番号２８:「ＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ
ｃｏｄｉｎｇ  ＤＮＡ」という）の２１塩基を用いた。ｓｉＲＮＡ含有プラスミドは、ｐｉＧＥＮＥ（登録商標）ｈＵ６ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に構築した。構築したＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８含有プラスミドとＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ含有プラスミドをＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトで切り出した配列をｐｃＤＮＡ３．１のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトへサブクローニングしてｐｃＤＮＡ３．１−Ｕ６ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８とｐｃＤＮＡ３．１−Ｕ６ＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡをそれぞれ得た。
【００６６】
２．ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８によるＦＺＤ７のｍＲＮＡ発現レベルの抑制
ＨＣＴ−１１６細胞に、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてｐｉＧＥＮＥ、ＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ
ｃｏｄｉｎｇ  ＤＮＡ、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８ ｃｏｄｉｎｇ  ＤＮＡを導入し、４８時間培養した後、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＨＣＴ−１１６から単離した。抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡをＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１本鎖ｃＤＮＡへ逆転写した。定量ＰＣＲはＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って行った。使用したプライマーは、内部コントロールのＧＡＰＤＨ遺伝子のプライマーと合わせて表３に示した。定量ＰＣＲは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７９００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。定量ＰＣＲのサイクルは実施例２と同じ条件で行った。その結果、図７Ａで示す通り、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８はＦＺＤ７をｍＲＮＡレベルで抑制することが確認された。
【００６７】
【表３】
2009213470.tif 000004
【００６８】
３．ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８によるＦＺＤ７の発現抑制
ＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ発現ベクター、またはＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８発現ベクターを、ｐＥＦ４またはｐＥＦ４−ＦＺＤ７−Ｖ５と共にＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて２９３Ｔ細胞へ導入し、Ｔｏｔａｌタンパクは抗Ｖ５抗体で免疫検出を行った。すなわち、β−アクチンを内部コントロールとして、２９３Ｔ細胞にｐＥＦ４−ＦＺＤ７−Ｖ５またはその対照としてｐＥＦ４を導入し、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８  ｃｏｄｉｎｇ  ＤＮＡ、またはその対照としてＥＧＦＰｓｉＲＮＡ  ｃｏｄｉｎｇ  ＤＮＡを導入して、ｓｉＲＮＡのＦＺＤ７に対する抑制効果を抗Ｖ５抗体で観察した。図７Ｂで見られるように、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８はＦＺＤ７−Ｖ５タンパクの発現を抑制することを確認した。
【実施例７】
【００６９】
＜ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株＞
【００７０】
１．ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株の作製
実施例５で得たベクターのｐｃＤＮＡ３．１−Ｕ６ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８とｐｃＤＮＡ３．１−Ｕ６ＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＨＣＴ−１１６とＤＬＤ−１にそれぞれ導入して４８時間後に、培地に最終濃度が５００μｇ／ｍｌになるようにＧ４１８を加えてコロニーが形成されるまで培養した。形成されたコロニーを、クローニングリングを用いて細胞のクローニングを行ないＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株とＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ安定発現細胞株を作製した。
【００７１】
２．ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株でのＦＺＤ７のｍＲＮＡ発現レベルの抑制
ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株（２クローン）とＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ安定発現細胞株のＴｏｔａｌ  ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡをＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１本鎖ｃＤＮＡへ逆転写した。定量ＰＣＲはＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って行った。使用したプライマーは表３のとおりである。定量ＰＣＲは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７９００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。定量ＰＣＲのサイクルは実施例２と同じ条件で行った。
【００７２】
図８Ａで示す通りＨＣＴ−１１６ではＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株はＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ安定発現細胞株よりＦＺＤ７のｍＲＮＡが約８０％抑制され、ＤＬＤ−１では、図８Ｂで示す通り、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株はＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ安定発現細胞株よりＦＺＤ７のｍＲＮＡが約４０−７０％抑制された。
【００７３】
３．ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株でのＴｃｆ転写活性
ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株とＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ安定発現細胞株に、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてＴＯＰｆｌａｓｈ  Ｐｌａｓｍｉｄ（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）０．４７５μｇと、ｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．０７５μｇを導入した。実施例２と同様にしてＴｃｆ転写活性を測定した。データは、３つの独立した実験で、ＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ安定発現細胞株におけるＭｏｃｋ遺伝子のルシフェラーゼ活性レベルを１として平均値とＳ．Ｄ．で表した。
【００７４】
その結果、図８Ｃで示す通り、ＨＣＴ−１１６ではＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株はＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ安定発現細胞株よりＣａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ経路の活性化が約７０−８０％抑制され、ＤＬＤ−１では、図８Ｄで示す通り、ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株はＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ安定発現細胞株よりＣａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ経路の活性化が約２０−４０％抑制された。
【００７５】
４．ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株での癌転移能力の抑制
ＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ安定発現細胞株であるＵ６ＥＧＦＰｓｉＲＮＡｃｌｏｎｅ１とＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株であるＵ６ＦＺＤ７ｓｉＲＮＡ８ｃｌｏｎｅ１とＵ６ＦＺＤ７ｓｉＲＮＡ８ｃｌｏｎｅ２をＭｙＣｏｙ‘ｓ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）１００μｌ当たり２．５ｘ１０６個に調整した。７週齢のメスのＳｃｉｄマウスにネンブタール（大日本住友ファーマ）を生理食塩水（大塚製薬）で１０倍に希釈した溶液２００μｌを注射し麻酔を行なった。Ｓｃｉｄマウスの脾臓に細胞懸濁液１００μｌを注射した。細胞を移植して３週間後にマウスから肝臓を取り出し、肝臓に転移して出来た結節を数えた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を使用して統計解析を行なった。
【００７６】
結果を図９に示す。縦軸は結節数、Ｐは統計解析値を示す。ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株であるＵ６ＦＺＤ７ｓｉＲＮＡ８ｃｌｏｎｅ１とＵ６ＦＺＤ７ｓｉＲＮＡ８ｃｌｏｎｅ２はＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ安定発現細胞株であるＵ６ＥＧＦＰｓｉＲＮＡｃｌｏｎｅ１と比較して、有意に肝臓への転移能が減少した。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明により、ＦＺＤ７を高発現する癌、例えば結腸直腸癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、悪性黒色腫、リンパ芽球性白血病、特に結腸直腸癌の治療のために有効な治療薬が提供されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】結腸直腸癌細胞におけるＦＺＤ遺伝子群のｍＲＮＡ発現レベルを示した図である。
【図２】結腸直腸Ｗｎｔシグナル経路におけるＦＺＤ７遺伝子の過剰発現の効果を示す。  Ａ：結腸直腸癌細胞におけるＴｃｆ転写活性を示した図である。  Ｂ：ＨＣＴ−１１６細胞におけるＷｎｔターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示した図である。  Ｃ：ＨＣＴ−１１６細胞におけるＷｎｔターゲット遺伝子の発現量をウエスタンブロット分析法で示した図である。
【図３】人の癌患者におけるＦＺＤ７ｍＲＮＡの発現量を示す。
【図４】ｐｃＤＮＡ３．１−Ｕ６ＦＺＤ７ベクターを示す。
【図５】結腸直腸Ｗｎｔシグナル経路におけるＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡの効果を示す。  Ａ：２９３Ｔ細胞を用いた、ＦＺＤ７発現の抑制作用をウエスタンブロット分析法で示した図である。  Ｂ：結腸直腸癌細胞におけるＴｃｆ転写活性を示した図である。  Ｃ：ＨＣＴ−１１６細胞におけるＷｎｔターゲット遺伝子の発現量をウエスタンブロット分析法で示した図である。
【図６】ＨＣＴ−１１６細胞におけるＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡの機能的効果を示す。  Ａ．細胞生育における効果を示した図である。  Ｂ．細胞浸潤おける効果を示した図である。
【図７】結腸直腸Ｗｎｔシグナル経路におけるＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８の効果を示す。  Ａ．ＨＣＴ−１１６におけるＦＺＤ７のｍＲＮＡ発現量を示した図である。  Ｂ．２９３Ｔ細胞を用いた、ＦＺＤ７発現の抑制作用をウエスタンブロット分析法で示した図である。
【図８】ＦＺＤ７−ｓｉＲＮＡ８安定発現細胞株のＣａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ経路に対する効果を示す。  Ａ．ＨＣＴ−１１６から作製した細胞株におけるＦＺＤ７のｍＲＮＡ発現量を示した図である。  Ｂ．ＤＬＤ−１から作製した細胞株におけるＦＺＤ７のｍＲＮＡ発現量を示した図である。  Ｃ．ＨＣＴ−１１６から作製した細胞株におけるＴｃｆ転写活性を示した図である。  Ｄ．ＤＬＤ−１から作製した細胞株におけるＴｃｆ転写活性を示した図である。
【図９】マウスにおけるＦＺＤ７のｍＲＮＡ発現レベルの抑制によるがん細胞の転移抑制効果を示した図である。縦軸は肝臓に移転して出来た結節の数を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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