(57)【要約】【課題】神経再生が問題である神経系創傷を有する患者を処置するために、ミエリンにおいて軸索再生の強力なインヒビターである分子を同定し、神経系におけるＭＡＧ活性のレベルをブロックまたは操作するための組成物および方法を提供すること。【解決手段】薬学的に受容可能なキャリアーおよび治療有効量の少なくとも１つのＭＡＧのインヒビターを含有する組成物であって、１つの好ましい実施態様では、ＭＡＧインヒビターは、小さなシアル酸を有するオリゴサッカライド（糖）を含み、これは、必要に応じてシアリダーゼの競合的なインヒビターである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載されるような、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、神経再生の強力なインヒビターとしてのミエリン会合糖タンパク質（「ＭＡＧ」）の新規同定に関する。より詳細には、本発明は、中枢神経系および末梢神経系における神経再生の阻害を逆転させるのに有用である組成物および方法に関する。神経再生におけるＭＡＧの効果をモニターするため、および神経成長におけるＭＡＧの阻害効果をブロックするかまたは促進する因子を同定するためのアッセイが提供される。このような因子を同定するためのスクリーニング方法がまた提供される。本発明はまた、神経再生におけるＭＡＧの阻害効果を逆転し得る因子を用いた組成物および方法に関する。本発明の組成物の少なくとも１つを投与する工程を含む、神経系における神経成長または再生を調節および促進するための方法、神経組織またはニューロンに対する創傷または損傷を処置する方法、および障害または疾患に関連した神経の傷害を処置する方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
軸索（神経）の成長を促進（ｅｎｃｏｕｒａｇｅ）／促進（ｐｒｏｍｏｔｅ）する多くの分子が存在するという事実にも関わらず、哺乳動物の神経系は創傷の後に再生しない。再生の欠失は、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）における、活性に再生を防止／阻害する分子の存在によって引き起こされると考えられている。従って、成体哺乳動物ＣＮＳが創傷後に再生できないという十分に考証された不能は、阻害分子の優性から生じると考えられている。
【０００３】
ニューロンがＣＮＳの組織切片に伸びる場合、それらは白質である、ミエリンの領域に突起を伸長できないことが実証されている。ミエリン特異的阻害分子がＣＮＳ再生の欠失をほとんど説明し得、そしてそれらの同定が創傷後の再成長を促進する治療法の設計に役立つと考えられている。この阻害の原因となる正確な分子は、これまで分からないままであった。これらの阻害分子を同定および阻害することができれば、神経の再生は促進され得る。
【０００４】
Ｓｃｈｗａｂおよび共同研究者は、約３５ｋＤおよび２５０ｋＤの範囲の分子量の、ＣＮＳミエリン中の２つの成分を同定した。これらは、軸索の成長を阻止する。これらの２つのタンパク質画分の阻害作用を支持する最も説得力のある観察は、ＣＮＳミエリンタンパク質の分離後のポリアクリルアミドゲルのこれらの領域から溶出されたタンパク質に対して惹起された抗体が、インビトロでミエリンの阻害効果を特異的に逆転し、そして切除された神経にインビボで適用された場合、限定された脊髄の再生を許容するということである（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。これらの２つのタンパク質の性質およびそれらがどのように作用するかはまだ記載されていないが、それらがこの組織の阻害効果の重要な一因であることは一般に認められている。しかし、筆者らに認識されているように、これらの２つのタンパク質に対して指向される抗体の存在下でさえも、他の因子がＣＮＳミエリンによる阻害に貢献しているようであり、インビボで大多数の軸索は再生し得ない（非特許文献４；非特許文献５）。
【０００５】
ミエリン中の阻害分子に加えて、別のファミリーのタンパク質が最近同定されている。そのメンバーは軸索再生を阻害する。これらの分子はコラプシンと呼ばれる（非特許文献６）。しかし、コラプシンは、神経系を通して遍在して見い出されており、そして軸索が成長する神経系の領域（すなわち、灰白質）で見出されるので、創傷後の神経再生の欠失に有意に寄与しているようではない。そのかわり、コラプシンは発生の間に成長する軸索をガイドすることにおいて役割を演じるようである。
【０００６】
Ｉｇスーパーファミリーの分子の多くのメンバーと同様に、ＭＡＧは、この場合、２日齢のラット由来の後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンからの神経突起成長を促進し得る（１３）。本発明者らはまた、出生後３日までのラット由来のＤＲＧニューロンに対する同様の効果を観察したが、この年齢以降のＭＡＧは反対の効果を有していた（すなわち、神経突起成長を阻害した）（非特許文献７）。さらに、本発明者らは、ＭＡＧが、成体までの全ての年齢のラット由来の小脳ニューロンからの神経突起成長を劇的に阻害することを見出した。ＭＡＧに対して指向されるポリクローナル抗体は、神経突起成長におけるＭＡＧの刺激効果および阻害効果の両方を特異的にブロックし得る。ＭＡＧは、それ故、ニューロンの年齢およびタイプに依存して、神経突起成長を促進し得るかまたは阻害し得るかのいずれかである。ＭＡＧの阻害効果における本発明者の報告の後に、別のグループが、異なる相補的アプローチを用いて、ＭＡＧが軸索成長のインヒビターであることを実証した（非特許文献８；特許文献１（１９９５年８月２４日））；これらは参考として本明細書中に援用される）。
【０００７】
神経再生が問題である神経系創傷を有する患者を処置するために軸索再生のインヒビターをブロックすることは有用である。ミエリンにおいて軸索再生の強力なインヒビターである分子は同定されていない。Ｓｃｈｗａｂおよび共同研究者らは、阻害性であるミエリン中の成分を同定したが、これらの成分の正確な性質は同定されていない（すなわち、それらはクローン化もされていないし、それらのタンパク質も精製されていない）。さらに、推定上の阻害分子が再成長を防止するように相互作用するニューロンにおけるこの成分に利用できる情報はなかった。阻害分子も相互作用する分子も正確に同定されていなかったので、不可能ではなくとも、これらの分子が神経の再生を阻害することをブロックおよび防止し得るストラテジーを論理的に設計することは困難であった。
【特許文献１】国際公開第９５／２２３４４号パンフレット
【非特許文献１】Ｃａｒｏｎｉ，Ｐ．およびＳｃｈｗａｂ，Ｍ．Ｅ．，Ｎｅｕｒｏｎ，（１９８８ａ）１，ｐｐ．８５−９６
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，（１９８８ｂ）１０６，ｐｐ．１２８１−８８
【非特許文献３】Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｌ．およびＳｃｈｗａｂ，Ｍ．Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ，（１９９０）３４３，ｐｐ．２６９−７２
【非特許文献４】Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｌ．およびＳｃｈｗａｂ，Ｍ．Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ，（１９９０）３４３，ｐｐ．２６９−７２
【非特許文献５】Ｓｃｈｎｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，（１９９３）３６７，ｐｐ．１７０−７３
【非特許文献６】Ｌｕｏら、Ｃｅｌｌ，（１９９３）７５，ｐｐ．２１７−２７
【非特許文献７】Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、Ｎｅｕｒｏｎ，（１９９４）１３，ｐｐ．７５７−６７
【非特許文献８】ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ，（１９９４）１３  ｐｐ．８０５−８１１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）における軸索再生の強力なインヒビターとしてＭＡＧを同定することにより、上記で言及する問題を解決する。本発明は、神経系におけるＭＡＧ活性のレベルをブロックまたは操作するための組成物および方法を提供する。
【０００９】
１つの実施態様では、それらの組成物は、薬学的に受容可能なキャリアーおよび治療有効量の少なくとも１つのＭＡＧのインヒビターを含有する。ＭＡＧのインヒビターとしては、抗ＭＡＧ抗体、変化した生物学的活性によって特徴付けられる、変化および／または変異した形態のＭＡＧ、遊離したシアル酸を有する糖、糖に付着したシアル酸の修飾された誘導体、タンパク質または脂質キャリアー分子に付着されたシアル酸を有する糖、タンパク質または脂質キャリアー分子に付着された修飾されたシアル酸を有する糖、およびシアル酸糖ペプチドが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１０】
１つの好ましい実施態様では、ＭＡＧインヒビターは、小さなシアル酸を有するオリゴサッカライド（糖）を含み、これは、必要に応じてシアリダーゼの競合的なインヒビターである。より好ましくは、シアル酸アナログは、シアロ２，３−αラクトース（２，３−ＳＬ）または２，３−ジデオキシシアル酸（ＤＤ−ＮＡＮＡ）である。
【００１１】
別の好ましい実施態様では、ＭＡＧインヒビターは、変化および／または変異した形態のＭＡＧを含み、これはＣＮＳまたはＰＮＳにおいてニューロンへの内因性ＭＡＧの結合を阻害し得る。変化した形態のＭＡＧは、好ましくは、そのキメラタンパク質に可溶性を付与する別の分子に融合されたＭＡＧの細胞外ドメインの全てまたは一部分を含む。１つのこのような好ましい可溶性ＭＡＧキメラタンパク質は、ヒト免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ）のＦｃドメインに融合されたＭＡＧの５つのＩｇ様ドメイン（「ＭＡＧ−Ｆｃ」））を含む。
【００１２】
好ましい変化／変異形態のＭＡＧは、ＭＡＧ分子中に１つ以上の変異を保有する可溶性分子である。この変異は、内因性ＭＡＧまたはＭＡＧ−Ｆｃと比較して、神経突起の成長を阻害または促進する能力を減少または除去するが、ニューロン表面への変化または変異した形態のＭＡＧの結合を有意に減少させない。最も好ましい変化／変異形態のＭＡＧは、免疫グロブリンＦｃドメインに融合したＭＡＧの５つの細胞外Ｉｇ様ドメインの内の最初の３つからなる短縮形態のＭＡＧ−Ｆｃ（「ＭＡＧ（ｄｌ−３）−Ｆｃ」）を含む。
【００１３】
別の実施態様では、これらの組成物は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ（３−Ｏ）構造（ＰＮＳまたはＣＮＳにおいてニューロン表面へのＭＡＧの酵素を媒介する）を有するシアル酸残基を変化または除去し得る治療有効量の酵素を含む可溶性分子である。この実施態様の好ましい組成物は、シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）およびシアリルトランスフェラーゼを含み、これらはＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ（「３−Ｏ」）シアリル化グリカンの構造を変化させるか、そして／またはその有効濃度を低下させる。
【００１４】
本発明はまた、神経系における神経の成長または再生を調節および促進する方法、神経組織またはニューロンに対する創傷または損傷を処置する方法、および障害または疾患に関する神経の変性を処置する方法を提供し、これらは本発明の薬学的組成物の少なくとも１つを投与する工程を含む。
【００１５】
本発明は、特定の年齢の特定のタイプのニューロンからの神経突起の成長がＭＡＧ（またはＭＡＧ誘導体）の存在下で刺激または阻害されるかどうかを決定するためのアッセイを提供する。１つの実施態様では、この方法は以下の工程を含む：
ａ）ＭＡＧの非存在下にて成長許容基材上で選択されたニューロン細胞タイプの第１のサンプルを培養する工程；
ｂ）結合したＭＡＧを含む成長許容基材上で選択されたニューロン細胞タイプの第２のサンプルを培養する工程；
ｃ）ａ）およびｂ）の培養細胞における神経突起成長の相対量を比較する工程；ここで、ａ）の培養細胞における神経突起の相対的な成長がｂ）よりも大きい場合、ニューロン細胞はＭＡＧの存在によって阻害されており、そしてａ）の培養細胞における神経突起の相対的な成長がｂ）よりも小さい場合、ニューロン細胞はＭＡＧの存在によって刺激されている。
【００１６】
好ましい実施態様では、ＭＡＧの非存在下での成長許容基材は、細胞表面ＭＡＧを発現しない哺乳動物細胞の単層を含み、そして結合したＭＡＧを含む成長許容基材は、細胞表面ＭＡＧを発現するように操作された等価な哺乳動物細胞の単層を含有する。好ましくは、哺乳動物細胞は、細胞表面ＭＡＧを発現するように操作されたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ−ＭＡＧ２細胞）である。
【００１７】
本発明はまた、ＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子（すなわち、ＭＡＧの非存在下と比較してＭＡＧの存在下で、選択されたニューロン細胞タイプまたは混合した細胞タイプの集団からの神経突起の成長を変化させる因子）を同定するための方法を提供する。
【００１８】
１つの実施態様では、この方法は以下の工程を含む：
ａ）ＭＡＧの非存在下にて成長許容基材上で選択されたニューロン細胞タイプの第１のサンプルを培養する工程；
ｂ）成長許容基材上で選択されたニューロン細胞タイプの第２のサンプルを培養する工程であって、その基材はＭＡＧの非存在下で培養された細胞の第１のサンプルと比較してその細胞からの神経突起の成長を変化させるのに十分な量の結合したＭＡＧを含む、工程；
ｃ）神経突起成長を可能にするのに十分な時間、既知の相対濃度の試験因子とともにａ）およびｂ）の細胞培養物をインキュベートする工程；および
ｄ）ａ）およびｂ）の培養細胞における神経突起成長の相対量を比較する工程；ここでａ）およびｂ）の培養細胞における神経突起の相対成長を変化する因子は、ＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子として同定される。
【００１９】
好ましい実施態様では、ＭＡＧの非存在下での成長許容基材は、細胞表面ＭＡＧを発現しない哺乳動物細胞の単層を含み、そして結合したＭＡＧを含む成長許容基材は、細胞表面ＭＡＧを発現するように操作された等価な哺乳動物細胞の単層を含有する。好ましくは、哺乳動物細胞は、細胞表面ＭＡＧを発現するように操作されたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ−ＭＡＧ２細胞）である。
【００２０】
本発明の別の実施態様では、ＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子を同定するための方法は、以下の工程を含む：
ａ）ＭＡＧを欠失する成長許容基材上で選択されたニューロン細胞タイプの個々のサンプルを培養する工程；
ｂ）既知の濃度の追跡可能な可溶性形態のＭＡＧとともにａ）の第１のサンプルを培養する工程；
ｃ）既知の濃度のＭＡＧ活性を欠失した、追跡可能な可溶性形態のコントロールタンパク質とともにａ）の第２のサンプルを培養する工程；
ｄ）神経突起成長を可能にするのに十分な時間の間、既知の相対濃度の試験因子とともにｂ）およびｃ）の細胞培養物をインキュベートする工程；および
ｅ）ｃ）およびｄ）の培養細胞における神経突起成長の相対量を比較する工程；ここでｃ）およびｄ）の培養細胞における神経突起の相対成長を変化させる因子は、ＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子として同定される。
【００２１】
１つの好ましい実施態様では、ＭＡＧを欠失した成長許容基材は、細胞表面ＭＡＧを発現しない哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳまたはＮＩＨ  ３Ｔ３細胞）の単層を含む。別の好ましい実施態様では、ＭＡＧを欠失した成長許容基材は、精製された、成長促進因子の固定化された単層を含む。単層に固定化され得る１つの最も好ましいニューロン成長促進因子はＬ１糖タンパク質である。
【００２２】
好ましい実施態様では、可溶性形態のＭＡＧは、ＭＡＧ−Ｆｃ融合タンパク質であり、そしてＭＡＧ活性を欠失した可溶性コントロールタンパク質はＭＵＣ  １８−Ｆｃ融合タンパク質である。好ましい追跡可能な融合タンパク質は、放射標識または蛍光標識されている。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）  薬学的に受容可能なキャリアーと、治療有効量の少なくとも１つのＭＡＧのインヒビターとを含有する、薬学的組成物。
【００２３】
・（項目２）  上記ＭＡＧインヒビターは、変化した生物学的活性により特徴付けられる変化形態または変異形態のＭＡＧ、遊離のシアル酸保有糖、糖に付着したシアル酸の改変された誘導体、タンパク質または脂質キャリア分子に付着したシアル酸保有糖、タンパク質または脂質キャリア分子に付着した改変されたシアル酸保有糖、およびシアル酸糖ペプチドからなる群より選択される、上記の薬学的組成物。
【００２４】
・（項目３）  上記ＭＡＧインヒビターは、シアル酸保有糖である、上記の薬学的組成物。
【００２５】
・（項目４）  上記シアル酸がシアロ２，３−αラクトースまたは２，３−ジデオキシシアル酸である、上記の薬学的組成物。
【００２６】
・（項目５）  上記ＭＡＧインヒビターが、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）においてニューロンへの内因性ＭＡＧの結合を阻害し得る変化形態のＭＡＧを含む、上記の薬学的組成物。
【００２７】
・（項目６）  上記変化形態のＭＡＧは、内因性ＭＡＧまたは可溶性ＭＡＧと比較して神経突起（ｎｅｕｒｉｔｅ）成長をそのＭＡＧが阻害または促進する能力を減少または除去するが、ニューロン表面への当該変化形態のＭＡＧの結合を有意には減少させない、１つ以上の変異をＭＡＧ分子内に保有する可溶性キメラタンパク質である、上記の薬学的組成物。
【００２８】
・（項目７）  上記変化形態のＭＡＧが、ＭＡＧの細胞外Ｉｇ様ドメイン１〜細胞外Ｉｇ様ドメイン３を含有する可溶性キメラタンパク質である、上記の薬学的組成物。
【００２９】
・（項目８）  上記変化形態のＭＡＧが、ＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃである、上記の薬学的組成物。
【００３０】
・（項目９）  上記変化形態のＭＡＧが、ＭＡＧの細胞外Ｉｇ様ドメイン１〜細胞外Ｉｇ様ドメイン５を含有する可溶性キメラタンパク質である、上記の薬学的組成物。
【００３１】
・（項目１０）  上記変化形態のＭＡＧが、ＭＡＧ（ｄ１−５）−Ｆｃである、上記の薬学的組成物。
【００３２】
・（項目１１）  上記ＭＡＧインヒビターは、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ（３−Ｏ）構造を有するシアル酸残基を含むニューロン表面上のシアリル化（ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）グリカンを変化または除去し得る酵素である、上記の薬学的組成物。
【００３３】
・（項目１２）  上記酵素はシアリダーゼである、上記の薬学的組成物。
【００３４】
・（項目１３）  神経系における神経の成長または再生を調節するための方法であって、当該方法は、
上記の薬学的組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【００３５】
・（項目１４）  神経系における神経の成長または再生を調節するための方法であって、当該方法は、
上記の薬学的組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【００３６】
・（項目１５）  神経の成長または再生が促進される、上記の方法。
【００３７】
・（項目１６）  神経組織またはニューロンに対する傷害（ｉｎｊｕｒｙ）または損傷（ｄａｍａｇｅ）を処置するための方法であって、当該方法は、
上記の薬学的組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【００３８】
・（項目１７）  障害または疾患に関する神経変性を処置するための方法であって、当該方法は、
上記の薬学的組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【００３９】
・（項目１８）  特定の年齢における特定のタイプのニューロンからの神経突起（ｎｅｕｒｉｔｅ）の成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）が、ＭＡＧまたはＭＡＧ誘導体の存在下で刺激されるか阻害されるかを決定するための方法であって、当該方法は、
ａ）ＭＡＧの非存在下での成長許容基材上で、選択されたニューロン細胞タイプの第一のサンプルを培養する工程；
ｂ）結合したＭＡＧを含む成長許容基材上で、当該選択されたニューロン細胞タイプの第二のサンプルを培養する工程；ならびに
ｃ）ａ）およびｂ）の培養細胞における神経突起の成長の相対量を比較する工程、
を包含し、
ａ）の培養細胞における神経突起の相対的成長が、ｂ）の培養細胞における神経突起の相対的成長よりも大きい場合、当該ニューロン細胞は、ＭＡＧの存在によって阻害されており、
ａ）の培養細胞における神経突起の相対的成長が、ｂ）の培養細胞における神経突起の相対的成長よりも小さい場合、当該ニューロン細胞は、ＭＡＧの存在によって刺激されている、方法。
【００４０】
・（項目１９）  上記ＭＡＧの非存在下での成長許容基材が、細胞表面ＭＡＧを発現しない哺乳動物細胞の単層を含み、上記結合したＭＡＧを含む成長許容基材が、細胞表面ＭＡＧを発現するように操作された等価な哺乳動物細胞の単層を含む、上記の方法。
【００４１】
・（項目２０）  上記哺乳動物細胞が、細胞表面ＭＡＧを発現するように操作されたＣＨＯ細胞である、上記の方法。
【００４２】
・（項目２１）  上記哺乳動物細胞がＣＨＯ−ＭＡＧ２細胞である、上記の方法。
【００４３】
・（項目２２）  選択されたニューロン細胞タイプについてＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子を同定するための方法であって、当該方法は、
ａ）ＭＡＧの非存在下にて成長許容基材上で、選択されたニューロン細胞タイプの第１のサンプルを培養する工程；
ｂ）成長許容基材上で、当該選択されたニューロン細胞タイプの第２のサンプルを培養する工程であって、当該基材は、当該細胞からの神経突起の成長を、ＭＡＧの非存在下で培養された細胞の当該第１のサンプルと比較して変化させるのに十分な量の結合したＭＡＧを含む、工程；
ｃ）神経突起成長を可能にするのに十分な時間、既知の相対濃度の試験因子とともにａ）およびｂ）の細胞培養物をインキュベートする工程；ならびに
ｄ）ａ）およびｂ）の培養細胞における神経突起成長の相対量を比較する工程；
を包含し、
ａ）およびｂ）の培養細胞における神経突起の相対成長を変化させる因子は、ＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子として同定される、方法。
【００４４】
・（項目２３）  上記ＭＡＧの非存在下での成長許容基材は、細胞表面ＭＡＧを発現しない哺乳動物細胞の単層を含み、上記結合したＭＡＧを含む成長許容基材は、細胞表面ＭＡＧを発現するように操作された等価な哺乳動物細胞の単層を含有する、上記の方法。
【００４５】
・（項目２４）  上記哺乳動物細胞が、細胞表面ＭＡＧを発現するように操作されたＣＨＯ細胞である、上記の方法。
【００４６】
・（項目２５）  上記哺乳動物細胞がＣＨＯ−ＭＡＧ２細胞である、上記の方法。
【００４７】
・（項目２６）  選択されたニューロン細胞タイプについてＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子を同定するための方法であって、当該方法は、
ａ）ＭＡＧを欠く成長許容基材上で、選択されたニューロン細胞タイプの個々のサンプルを培養する工程；
ｂ）既知の濃度の追跡可能な可溶性形態のＭＡＧとともにａ）の第１のサンプルを培養する工程；
ｃ）既知の濃度の追跡可能な可溶性形態のＭＡＧ活性を欠くコントロールタンパク質とともにａ）の第２のサンプルを培養する工程；
ｄ）神経突起成長を可能にするのに十分な時間の間、既知の相対濃度の試験因子とともにｂ）およびｃ）の培養物をインキュベートする工程；および
ｅ）ｃ）およびｄ）の培養細胞における神経突起成長の相対量を比較する工程；
を包含し、
ｃ）およびｄ）の培養細胞における神経突起の相対成長を変化させる因子は、ＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子として同定される、方法。
【００４８】
・（項目２７）  上記ＭＡＧを欠く成長許容基材は、細胞表面ＭＡＧを発現しない哺乳動物細胞の単層を含む、上記の方法。
【００４９】
・（項目２８）  上記ＭＡＧを欠く成長許容基材は、精製された成長促進因子の、固定化された単層を含む、上記の方法。
【００５０】
・（項目２９）  上記成長促進因子はＬ１糖タンパク質を含む、上記の方法。
【００５１】
・（項目３０）  上記可溶性形態のＭＡＧは、ＭＡＧ−Ｆｃキメラタンパク質であり、上記ＭＡＧ活性を欠く可溶性コントロールタンパク質はＭＵＣ１８−Ｆｃキメラタンパク質である、上記の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載される本発明が完全に理解され得るために、以下の詳細な説明を示す。
【００５３】
用語「ＭＡＧ誘導体」は、少なくとも１つのＭＡＧ細胞外ドメインを含有する分子をいう。ここで、ＭＡＧ分子は、（例えば、ＭＡＧ分子に融合された他の分子の部分とキメラを形成させるための組換えＤＮＡ技術、または化学的または酵素的改変によって）変化されているか、または変異（例えば、内部欠失、挿入、転移および点変異）されている。ＭＡＧ誘導体は、他に注記されない限り、ＭＡＧ活性を保持する。
【００５４】
用語「ＭＡＧ生物活性」および「ＭＡＧ生物学的活性」は、本明細書に記載される神経突起成長アッセイのような神経突起成長アッセイにおいて検出されるような、定性的に細胞表面ＭＡＧまたは可溶性ＭＡＧと同じ方向に、特定の齢の選択されたニューロン細胞タイプの神経突起成長を阻害または促進する分子の能力、特に変化形態または変異形態のＭＡＧの能力をいう。
【００５５】
用語「ＭＡＧ結合活性」は、本明細書に記載されるアッセイのようなアッセイにおいてシアル酸依存性ニューロン結合に関して細胞表面ＭＡＧまたは可溶性ＭＡＧと競合する分子の能力、特に変化形態または変異形態のＭＡＧの能力をいう。例えば、好ましいＭＡＧのインヒビターは、ＭＡＧ結合活性を保持するが、ＭＡＧ生物活性を減少または欠失している。
【００５６】
用語「ＭＡＧ活性」は、一般に、上記のＭＡＧ生物活性および結合活性をいう。
【００５７】
用語「シアル酸の改変された誘導体」は、特に、その分子の反応位置上に化学基または側鎖を添加または変換するように化学的または酵素的に改変されているシアル酸残基をいう。シアル酸は、ノイラミン酸の誘導体であり、そしてしばしば細胞表面炭水化物の終端である９個のカルボン酸糖のファミリーである。「ＮｅｕＡｃ」はＮ−アセチルノイラミン酸を表す；「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチルガラクトサミンを表す。
【００５８】
（ＭＡＧは神経突起成長の強力なインヒビターである）
上記のように、ＭＡＧは特定のタイプのニューロンから神経突起伸長を促進することが以前に示されている。さらに、ＭＡＧは、ミエリン形成の開始に関与すると考えられている。本発明は、軸索成長、それ故、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）における神経再生のインヒビターとしてのＭＡＧの新規の役割を実証する。
【００５９】
選択されたニューロン細胞タイプは、実施例１に記載される手順に従って、出生後日数（ＰＮＤ）において漸増時間で動物から単離され得る。単一細胞タイプを表すニューロンが単離されそして単独で試験され得るか、または所望であれば、非ニューロン細胞の存在下または非存在下で１つ以上のニューロン細胞タイプを含む細胞の混合された集団もまた試験され得る。
【００６０】
本発明は、特定の齢の特定のタイプのニューロンからの神経突起成長がＭＡＧの存在下で刺激または阻害されるかどうかを決定するためのインビトロアッセイを提供する。選択した単離されたニューロンは、結合したＭＡＧの存在下または非存在下で、成長許容基剤を含有する単層上で培養され得、そして相対的な神経突起成長が測定され得る。好ましくは、成長許容基剤は、それらの細胞表面上にＭＡＧを発現するように操作された哺乳動物の線維芽細胞を含有する。ＭＡＧ発現細胞は、実施例２に記載の手順を用いて操作され得る。次いで、ＭＡＧ発現細胞における神経突起成長は、細胞表面ＭＡＧを発現しないコントロール細胞における神経突起成長と比較され得る。
【００６１】
図１に示されるように、ＭＡＧは、新生児から成体にわたる、試験した全ての齢のラット由来の小脳ニューロン由来の軸索成長の強力なインヒビターである。このことは、ＭＡＧを発現するトランスフェクトチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）上でニューロンを共培養し、そして伸長した神経突起の長さを、ＭＡＧを発現しないコントロールのトランスフェクトされたＣＨＯ細胞上で伸長した神経突起の長さと比較することにより決定された（実施例２を参照のこと）。４つの異なるＭＡＧ発現細胞株を用い、そして各々は同じ効果を有し、そして試験した全ての年齢でコントロール細胞と比較して少なくとも７０％まで神経突起成長を阻害した（図１；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、Ｎｅｕｒｏｎ，１３，７５７−６７頁（１９９４）もまた参照のこと）。抗ＭＡＧ抗体による神経突起成長阻害の逆転、および神経突起成長における別のミエリンタンパク質である、Ｐｏを発現するＣＨＯ細胞の効果の欠失は、この阻害がＭＡＧに対して特異的であることを実証している（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、前出）。しかし、上記で考察したように、ＭＡＧは新生児ＤＲＧニューロンからの神経突起成長を促進することが以前に報告されていた（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｎ，３，３７７−３８５頁（１９８９））。
【００６２】
この明白な矛盾を明らかにするために、１日〜２０日齢のラット由来の後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを、実施例２に記載のようにＣＨＯ細胞における神経突起成長アッセイにおいて試験した。図２に示されるように、ＭＡＧは２日齢のラット由来のＤＲＧニューロンの神経突起成長を増強した；神経突起は、ＭＡＧ発現細胞においてコントロール細胞と比較してほぼ２倍の長さであった。他方で、成体ラット由来のＤＲＧニューロンを試験した場合、ＭＡＧは約４０％まで神経突起成長を阻害した。異なる齢のＤＲＧニューロンからの神経突起成長におけるＭＡＧの効果のより詳細な時間経過は、促進から阻害への遷移が出生後約４日目に起こることを明らかにした（図２）。従って、ニューロンの齢およびタイプに依存して、ＭＡＧは神経突起成長を促進または阻害し得る。
【００６３】
（ＭＡＧは多くのタイプのニューロンからの軸索成長を阻害する）
種々のニューロン集団におけるＭＡＧの効果の特徴付けは、神経系の種々の領域における創傷の後の増強された再生に対する必要条件を規定することを援助する。他のニューロンの集団がＭＡＧに応答してどのように挙動するかを確立するために、種々の異なるニューロン細胞タイプを、実施例１に記載のように１日齢のラット（ＰＮＤ１）から単離した。単離された網膜神経節（ＲＧ）、海馬（ＨＮ）、運動ニューロン（ＭＮ）および上頸神経節（ＳＣＧ）を、実施例２に記載したようにＣＨＯ細胞神経突起成長アッセイにおいて試験した。図３に示したように、ＭＡＧは、試験した全ての細胞タイプにおいて神経突起成長の強力なインヒビターである。従って、ＭＡＧは、今日まで試験した神経系の全ての領域における神経再生の欠失において重要な役割を演じるようである。
【００６４】
これらの結果は、実施例２に記載したトランスフェクト哺乳動物細胞アッセイが有効なアッセイであり、それによってＭＡＧによる神経突起成長の阻害および促進の両方がモニターおよび特徴付けされ得ることを示す。このアッセイをまた用いて、ＭＡＧ生物活性をブロック（または増強）し得る因子をスクリーニングおよび同定し得、それによって神経系における軸索成長の阻害または刺激を変化させる（実施例３）。このような因子は、本明細書中では「ＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子」と呼ばれる。
【００６５】
（ＭＡＧは、ニューロン上のシアル酸を有する糖タンパク質に結合することにより軸索成長を阻害する）
ＭＡＧは、シアル酸依存性様式で試験した全てのタイプのニューロンに結合する（Ｋｅｌｍら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，４，９６５−７２頁（１９９４））。図４は、水性ＭＡＧ−Ｆｃニューロン結合アッセイの結果を示す。これは本質的にはＫｅｌｍらに記載されるように行われた。この実験は、単離されたＰＤＮ１小脳ニューロン（その成長がＭＡＧにより阻害される）へのＭＡＧの結合が、抗ＭＡＧモノクローナル抗体５１３の含有または結合反応前のニューロンのシアリダーゼ処理のいずれかによって無効にされることを確認する。シアリダーゼは、複合糖質からシアル酸を除去する酵素である。同様に、単離されたＰＤＮ１  ＤＲＧニューロン（その成長がＭＡＧにより促進される）へのＭＡＧの結合は、抗ＭＡＧモノクローナル抗体５１３の含有、およびより少ない程度までシアリダーゼ処理によって阻害される。
【００６６】
ニューロンへのＭＡＧのシアル酸依存性結合が、軸索の成長および再生の阻害または促進を合図する事象であるかを決定するために、単離されたニューロンをシアリダーゼで処理した後に実施例２に記載のアッセイのような神経突起成長アッセイを行った（実施例７）。ＰＮＤ２小脳ニューロンを脱シアル化した場合、軸索再生の阻害は約５０％まで逆転された（図５）。同様に、新生児（ＰＮＤ１）ＤＲＧニューロンを脱シアル化した場合、ＭＡＧによる軸索成長の促進は完全に無効になった（図６）。
【００６７】
実施例２に記載のアッセイのような軸索成長アッセイをまた、小さな遊離シアル酸を有する糖の存在下で行った。これらの糖は、ＭＡＧ結合に関してニューロン表面のシアル酸成分と競合し得、それによってＭＡＧによる神経突起成長の阻害をブロック（表１）または促進（表２）する。増加する濃度の小さなシアル酸を有する糖２，３−ジデオキシシアル酸（ＤＤ−ＮＡＮＡ）またはシアロ２，３−αラクトース（ＳＬ）のいずれかを含有することにより、ＭＡＧによる軸索成長の阻害が４０〜５６％の間で逆転し（表１）、そしてＭＡＧによる神経突起成長の促進が完全に無効となった（表２）。
【００６８】
【表１】
2009073845.tif 000002
神経突起成長を、実施例３に記載するようなＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞およびコントロールＣＨＯ細胞上で成長したＰＮＤ２動物由来の小脳ニューロンについて比較した。
【００６９】
【表２】
2009073845.tif 000003
神経突起成長を、実施例３に記載するようなＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞およびコントロールＣＨＯ細胞上で成長したＰＮＤ２動物由来のＤＲＧニューロンについて比較した。
【００７０】
上記の実験は、通常、ＭＡＧ生物学的活性が、ニューロンの表面上のシアル酸を有する成分に結合するＭＡＧの能力に依存することを実証している。従って、このシアル酸を有する成分に結合するＭＡＧの能力を中断させ得る種々の因子がＭＡＧインヒビターとしてインビボで機能し、従ってＣＮＳおよびＰＮＳにおけるニューロン成長を制御（特に促進）するのに有用であることが予想される。
【００７１】
ＭＡＧ結合活性のインヒビターとしては、抗ＭＡＧ抗体、遊離シアル酸を有する糖、糖に付着したシアル酸の改変誘導体、タンパク質または脂質キャリア分子に付着したシアル酸を有する糖、タンパク質または脂質キャリア分子に付着した改変シアル酸を有する糖およびシアル酸糖ペプチドまたは糖タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
上記で示したように、ＭＡＧ結合活性のインヒビターとしてはまた、シアル酸残基（特に、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ（３−Ｏ）構造（これはＰＮＳまたはＣＮＳにおけるニューロン表面へのＭＡＧ結合を媒介する））を変化または除去し得る酵素が挙げられる。本実施態様の好ましい組成物は、その構造を変化および／またはＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ（”  ３−Ｏ”）シアリル化グリカンの有効濃度を低下するシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）およびシアリルトランスフェラーゼを含む。
【００７３】
（ＭＡＧ依存性成長調節因子の同定）
推定上の新規ＭＡＧ依存性神経突起成長調節因子を、実施例３に記載の手順を用いて試験し得る。試験因子は、それがＭＡＧによって阻害される細胞タイプからの神経突起成長を促進するか、またはＭＡＧによって刺激される細胞タイプからの神経突起成長を阻害する場合、ＭＡＧインヒビターとして同定される。同様に、それがＭＡＧによって刺激される細胞タイプからの神経突起成長を促進するか、またはＭＡＧによって阻害される細胞タイプからの神経突起成長を阻害する場合、因子はＭＡＧアゴニストである。
【００７４】
（可溶性ＭＡＧは軸索再生の強力なインヒビターである）
本発明は、軸索成長におけるＭＡＧの効果をアッセイし、そしてＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子を同定する第２の方法を提供する。本方法は、選択されたニューロン細胞タイプのサンプルを、既知濃度の追跡可能な、可溶形態のＭＡＧまたはＭＡＧ活性を欠失したコントロールタンパク質のいずれかの存在下で、ＭＡＧを欠失した成長許容基剤上で培養する工程を含む。次いで、ニューロン培養物を、神経突起成長を許容するに十分な時間、既知の相対濃度の試験因子とともにインキュベートし、そして可溶性ＭＡＧの存在下または非存在下で培養した細胞における神経突起成長の量が比較される（実施例５）。可溶性ＭＡＧの存在下および非存在下で培養された細胞からの神経突起の相対的な成長を変化させる因子は、ＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子として同定される。
【００７５】
好ましい実施態様では、ＭＡＧを欠失した成長許容基剤は、細胞表面ＭＡＧ（例えば、ＣＯＳ細胞またはＮＩＨ  ３Ｔ３細胞）を発現しない哺乳動物細胞の単層を含む。広範な種々の哺乳動物細胞株（例えば、線維芽細胞および上皮細胞）が用いられ得、そして当業者に周知である。本発明は、結合したＭＡＧを含有しないこのような成長許容単層を作製するために用いられ得る細胞タイプにより限定されない。
【００７６】
別の好ましい実施態様では、ＭＡＧを欠失した成長許容基剤は、精製された成長促進因子の固定化された単層を含有する。ニューロン細胞が、コラーゲンまたはフィブロネクチンを含有する成長促進単層上で培養され得る。単層上に固定化され得る本発明の好ましいニューロン成長促進因子は、Ｌ１糖タンパク質である。
【００７７】
本方法の好ましい実施態様では、可溶性形態のＭＡＧはＭＡＧ−Ｆｃ融合タンパク質であり、ＭＡＧ活性を欠失した可溶性コントロールタンパク質はＭＵＣ１８−Ｆｃ融合タンパク質である（実施例４）。好ましい追跡可能な融合タンパク質は、市販の試薬および当該分野で周知の方法を用いて放射標識または蛍光標識される。
【００７８】
図７ａは、実施例４に記載の手順に従って行われたアッセイの結果を示す。このアッセイでは、ニューロンは、「Ｌ１」と称される精製された成長促進分子を含有する基剤上で成長させられた。ＩｇＧのＦｃ領域に融合したＭＡＧの細胞外ドメインからなる可溶形態のＭＡＧ（ＭＡＧ−Ｆｃ）を、成長するニューロンに添加した（ＭＡＧ−Ｆｃ；実施例４）。ＭＡＧ−Ｆｃの濃度が増大するにつれ、神経突起成長の阻害は増大したが、一方、コントロールキメラである、ＭＵＣ１８−Ｆｃは、同じ濃度で効果を有さなかった（図７ａ）。さらに、ＭＡＧ−Ｆｃによる軸索再生の阻害は、ＭＡＧに指向するモノクローナル抗体を添加すること、またはアッセイの前に単離されたニューロンを脱シアル化することのいずれかによって逆転され得た。可溶性ＭＡＧ−Ｆｃはまた、線維芽細胞の単層上で成長した小脳ニューロンからの軸索再生を阻害し得る（図７ｃ）。
【００７９】
重要なことに、このアッセイを用いて、軸索再生を阻害することなくニューロンに結合し得そして野生型ＭＡＧの阻害効果を逆転し得るＭＡＧ活性のインヒビター：小脳ニューロンに特異的に結合した（図８ａ）ＩｇＧ  Ｆｃドメインに融合したＭＡＧの正常な５つのＩｇ様細胞外ドメインよりも最初の３つのＩｇ様細胞外ドメインからなる短縮型のＭＡＧ−Ｆｃ（「ＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃ」；実施例４）を同定した。図８ａは、ＭＡＧの５つ全て（「ＭＡＧ（ｄ１−５）」）または最初の３つ（「ＭＡＧ（ｄ１−３）」）のＩｇ様ドメインからなる可溶性Ｆｃキメラが、抗ＭＡＧモノクローナル抗体の存在によって完全に阻害された反応において、ＰＮＤ２ラット由来の小脳ニューロンに結合し得たことを示す。コントロールＦｃキメラタンパク質（ＭＵＣ１８）は、抗ＭＡＧ抗体の存在下または非存在下のいずれでもニューロンに結合しなかった。
【００８０】
しかし、Ｌ１の単層基剤上で成長したニューロンに添加した場合、正常なＭＡＧ−Ｆｃキメラとは異なり、ＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃキメラは軸索再生において効果を有さなかった（図８ｂ）。従って、ＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃは、ニューロンへの結合に関して全長ＭＡＧと競合し得るようである。なぜなら、５０μｇ／ｍｌの濃度のＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃは、ＣＨＯ細胞によって発現される全長ＭＡＧによる軸索再生の阻害を約４０％まで逆転し得るからである（図８ｃ）。
【００８１】
上記の実験は、ＭＡＧ分子中に１つ以上の変異（神経突起成長を阻害または促進する能力を減少または除去するが、ニューロン表面への変化または変異形態のＭＡＧの結合を有意に減少させない）を有する変化および／または変異形態の可溶性ＭＡＧが、インビボで投与された場合ＭＡＧ活性の有用なインヒビターであり得ることを実証する（実施例８）。本発明の最も好ましい変化／変異形態のＭＡＧは、免疫グロブリンＦｃドメインに融合したＭＡＧの５つの細胞外Ｉｇ様ドメインの最初の３つからなるＭＡＧ−Ｆｃの短縮型を含有する可溶性分子（「ＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃ」）である。
【００８２】
ニューロン表面への変異形態のＭＡＧの結合を有意に減少させることなく神経突起成長を阻害または促進する能力をまた減少または除去する他のより特異的な変異（特に、点変異または小さな内部欠損）が、ＭＡＧ  Ｉｇ様ドメインに作製され得ることが想像される。変異的分析は、神経突起成長調節を媒介することに関与する下流の細胞シグナルを活性化するのに必要とされる局在化した「ＭＡＧ神経突起成長シグナル伝達部位」の同定を導くようである。ＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃキメラタンパク質中で欠損される第４および第５のドメイン、および／またはＭＡＧ中のＩｇ様ドメイン３と４との間の接合部に特異的に標的化された所定の変異は、この点に関して有用であることが想像される。
【００８３】
（ＭＡＧ誘導体およびインヒビターを用いた薬学的組成物および処置）
本発明のＭＡＧ依存性神経突起成長調節因子は、薬学的組成物中に処方され得、そして所定の特定の臨床状態を処置するのに有効な用量でインビボにて投与され得る。本発明の１つ以上の薬学的組成物の投与は、神経系において神経の成長または再生を調節および促進するのに、神経組織またはニューロンへの創傷または損傷を処置するのに、そして神経系への外傷、障害または疾患に関与する神経の変性を処置するのに有用である。このような外傷、疾患または障害としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：動脈瘤、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、クールー、ハンチントン舞踊病、多系統変性症、筋萎縮性側索硬化症（ルー−ゲーリッヒ病）、および進行性核上性麻痺。
【００８４】
一定の適用に対する好ましい薬学処方物および治療的に有効な用量レジメの決定は、例えば、患者の状態および体重、所望の処置の程度および処置に対する患者の耐性を考慮に入れて、当該分野の技術内にある。
【００８５】
本発明のＭＡＧ誘導体およびインヒビター（単離および精製形態、それらの塩またはそれらの薬学的に受容可能な誘導体を含む）の投与は、神経の創傷または障害を処置するのに用いられる因子の投与の慣習的に受容されている任意の様式を用いて達成され得る。
【００８６】
本明細書に記載されるような可溶性の変化および変異形態のＭＡＧは、これらの形態のＭＡＧのｃＤＮＡをコードする発現プラスミドでトランスフェクトされた、トランスフェクト細胞（例えば、ＣＯＳ細胞（線維芽細胞））の培養培地から調製される（実施例４）。ＭＡＧ−Ｆｃのような可溶性ＭＡＧ分子は、これらの細胞によって分泌される。抗体を分泌するハイブリドーマ細胞に対して実施されたように（Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｌ．およびＳｃｈｗａｂ，Ｍ．Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４３，ｐｐ．２６９−７２  （１９９０）；Ｓｃｈｎｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３６７，ｐｐ．１７０−７３  （１９９３））、可溶性ＭＡＧ−Ｆｃキメラを分泌するＣＯＳ細胞または他のトランスフェクト物は、損傷した脊髄中に移植され得ることが予想される。この細胞は、変化または変異したＭＡＧ−ＦｃのＭＡＧ阻害形態を分泌し、これは内因性ＭＡＧがニューロン表面と相互作用することを防止し、それ故、内因性ＭＡＧによる軸索の成長および再生の阻害を防止する。
【００８７】
約２×１０６個のトランスフェクトＣＯＳ細胞は、５日間にわたって約１ｍｇのＭＡＧ−Ｆｃを分泌する。５０μｇ／ｍｌの濃度の変異したＭＡＧ−Ｆｃは、野生型ＭＡＧの阻害効果を効率的に逆転する。最後に、成体ラット脊髄の神経周膜内は、約０．５ｍｌの容積である。それ故、２×１０６個の変異または変化したＭＡＧ−Ｆｃ分泌ＣＯＳ細胞が創傷した脊髄中に移植され、次いでＭＡＧ−Ｆｃの濃度は約４００μｇ／ｍｌ（すなわち、培養細胞において有効であると本明細書中で示された濃度よりも８倍以上濃縮されている）に維持されるはずである。最後に、処置されるべき被験体と比較した成体ラット脊髄の神経周膜の容積間の差異を補正する計算は、当業者によって行われ得る。他の「逆転させる」変異形態のＭＡＧまたはＭＡＧ「ブロック」ペプチドを分泌するトランスフェクト細胞は、同様の様式でニューロンの創傷または変性の部位に投与され得る、
同様に、本発明の他のＭＡＧインヒビターおよびレギュレーター（例えば、シアリダーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ、遊離タンパク質または脂質付着シアル酸を有する糖、糖ペプチドまたは糖タンパク質）はまた、本発明のＭＡＧ調節因子を分泌するように遺伝子操作された細胞の脊髄移植（例えば、髄液へ）によって送達され得る。この因子の細胞分泌速度は、細胞培養において測定され、次いで推定される。
【００８８】
必要に応じて、ＭＡＧ調節因子を分泌するトランスフェクト細胞は、当業者に公知である利用可能な方法を用いて、免疫絶縁カプセルまたはチャンバーにカプセル化され得、そして脳または脊髄領域に移植され得る。例えば、ＷＯ  ８９／０４６５５；ＷＯ  ９２／１９１９５；ＷＯ  ９３／００１２７；ＥＰ  １２７，９８９；米国特許第４，２９８，００２号；米国特許第４，６７０，０１４号；米国特許第５，４８７，７３９号およびそれらに引用される参考文献を参照のこと。それらの全てが本明細書中に参考として援用される。
【００８９】
トランスフェクト細胞によって分泌され得ないＭＡＧ調節因子のために、ポンプおよびカテーテル様デバイスが創傷の部位に移植されて、適時にそして所望の濃度で因子が投与される。これは当業者によって選択され、そして経験的に改変される。このような薬学的送達システムは当業者に公知である。例えば、米国特許第４，５７８，０５７号およびそれに引用される参考文献を参照のこと。これらは本明細書中に参考として援用される。
【００９０】
本発明の薬学的組成物は種々の形態であり得る。これらは投与の好ましい形態に従って選択され得る。これらは、例えば、固体、半流動体および液体投与形態（例えば、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液または懸濁物、坐剤ならびに注射可能および注入可能な溶液）を含む。好ましい形態は、投与および治療適用の意図される様式に依存する。投与の様式は、経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、病巣内投与、または局所投与を含み得る。
【００９１】
本発明のＭＡＧ誘導体およびインヒビターは、例えば、取り込みまたは安定性を刺激するコファクターを有するかまたは有しない無菌の等張性処方物中に配置される。この処方物は、好ましくは液体であり、あるいは凍結乾燥散剤であり得る。例えば、ＭＡＧ誘導体およびインヒビターは、５．０ｍｇ／ｍｌクエン酸一水和物、２．７ｍｇ／ｍｌクエン酸三ナトリウム、４１ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌグリシンおよび１ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０を含有する処方緩衝液で希釈され得る。この溶液は、凍結乾燥され得、冷蔵下で保存され得、そして注射用の滅菌水（ＵＳＰ）で投与の前に再構築され得る。
【００９２】
組成物はまた、好ましくは、当該分野で周知の従来の薬学的に受容可能なキャリアを含有する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６版、１９８０、Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。このような薬学的に受容可能なキャリアは、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物のような、他の薬用因子、キャリア、遺伝的キャリア、アジュバント、賦形剤などを含み得る。これらの組成物は、好ましくは単位用量の形態であり、そして通常１日に１回以上投与される。
【００９３】
本発明の薬学的組成物はまた、罹患した組織あるいは血流内、その近傍、またはそれと連絡するように配置されたミクロスフェア、リポソーム、他の微小粒子送達系または持続性放出処方物を用いて投与され得る。持続性放出キャリアの適切な例としては、坐薬またはマイクロカプセルのような形成商品の形態の半透性のポリマーマトリックスが挙げられる。移植可能なまたはマイクロカプセルの持続性放出マトリックスとしては、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，３１９；ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，ｐｐ．５４７−５６  （１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸塩）またはエチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５，ｐｐ．１６７−２７７  （１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２，ｐｐ．９８−１０５  （１９８２））が挙げられる。
【００９４】
ＭＡＧ誘導体およびインヒビターを含有するリポソームは、周知の方法により調製され得る（例えば、ＤＥ  ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，８２，ｐｐ．３６８８−９２  （１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，７７，ｐｐ．４０３０−３４  （１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号を参照のこと）。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層タイプであり、ここで脂質含量は約３０ｍｏｌ．％コレステロールよりも大きい。コレステロールの比率は、ＭＡＧ誘導体およびインヒビター放出の至適速度を制御するように選択される。
【００９５】
本発明のＭＡＧ誘導体およびインヒビターはまたリポソームに付着され得る。これは、必要に応じて、所望の処置部位への組成物の標的化または投与を援助する他の因子を含有し得る。ＭＡＧ誘導体およびインヒビターのリポソームへの付着は、任意の公知の架橋因子（例えば、標的化送達のために毒素または化学療法因子を抗体に結合させるのに広範に用いられているヘテロ二官能性架橋因子）によって達成され得る。リポソームへの結合はまた、炭水化物指向架橋試薬４−（４−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）を用いて達成され得る（Ｄｕｚｇｕｎｅｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．１６Ｅ  ７７  （１９９２））。
【００９６】
（ＭＡＧ誘導体およびインヒビターの有用性）
ＭＡＧが軸索再生の強力なインヒビターであるという発見は、神経系創傷−−末梢および中枢神経系−−の状況および特にＣＮＳ創傷に対して潜在的な臨床使用を有する。哺乳動物の中枢神経系の両方は、神経を成長するように促進および促進する多くの分子が存在するにも関わらず、創傷の後には再生しない。この結果は麻痺または脳損傷である。神経が再生することを活性に妨げる分子が成体ＣＮＳに存在することが示されている。これらの阻害分子がまず同定され、続いてブロックされ得れば、次いで再生を許容する環境が操作され得ることが予測される。
第１の工程は、阻害分子がどのようなものであるかを同定することである。ＭＡＧは、ミエリン中で同定されるべき第１のこのような分子である。ＭＡＧの阻害効果をモニターするための本明細書中で確立されたアッセイ系を用いて、ストラテジーが、ここで、その阻害機能がブロックされるように標的としてＭＡＧで設計され得る。次いで、このような因子は損傷した神経に投与され得、インビボでＭＡＧの阻害効果を逆転し、そして神経再生を進行させる。
本発明のアッセイは、ＭＡＧによる神経再生の阻害を逆転させるような因子を同定するのに有用である。本明細書中に記載のアッセイ系を用いて、ＭＡＧの阻害効果が示されて、シアリダーゼまたは小さなシアル酸を有する糖のような因子による、および可溶性の、変異形態のＭＡＧによる機能からブロック／防止される。これらの因子、またはこれらの因子の改変形態（ＭＡＧまたはそのレセプターに対するそれらの親和性を増大させ得るか、または減少させ得るかのいずれか）は、損傷した神経に投与されて、インビボでのＭＡＧの阻害効果を逆転し、そして再生を進行させ得る。
【００９７】
さらに、ネガティブなガイダンス合図としてのＭＡＧの特性が、再生する軸索をそれらの正しい標的にガイドし、そしてそれらを正しい経路上に維持するのに用いられ得る。この目的のために、ＭＡＧ、またはＭＡＧの異なるドメインは、再生する神経組織の正確な領域に投与され得て正確な経路に沿った成長を含む。
【００９８】
本明細書中に示されるように、ＭＡＧはニューロン上のシアル酸を有する糖タンパク質に結合し、広範な種々のニューロン細胞タイプにおいて神経の成長および再生の阻害をもたらす。また本明細書中に示されるように、ニューロンのシアル酸残基がシアリダーゼと称される酵素で除去される場合、ＭＡＧのこれらの阻害効果は逆転される。同様に、小さなシアル酸を有する糖およびその誘導体はＭＡＧに結合し、それがニューロン上のシアル酸糖タンパク質と相互作用することを防止し、そして軸索再生の阻害を防止し得る。インビボで、創傷後、ＭＡＧインヒビター（例えば、シアリダーゼ、遊離した小さなシアル酸を有する糖または他の糖に付着したシアル酸の改変体、タンパク質キャリア分子または脂質に共有結合した小さなシアル酸を有する糖、あるいは小さなシアル酸糖タンパク質または糖ペプチド、個々のまたは種々の組み合わせのいずれか）は、ＭＡＧおよび／またはシアル酸を有するレセプターを介して作用する他の阻害分子の阻害効果をブロックし、そして軸索再生が起きるように促進することが予期される。同様に、ＭＡＧの小さなペプチドまたはペプチドフラグメント、変異および変化形態のＭＡＧ、ならびにＭＡＧに対する抗体は、ニューロンとの内因性ＭＡＧの相互作用をブロックし、そして神経再生を可能にし得る。
【００９９】
本明細書中に示すように、変異した、可溶性形態のＭＡＧはニューロンに結合し得るが、それ自身は軸索成長を阻害しない。重要なことに、この変異形態のＭＡＧは野生型ＭＡＧの阻害効果を逆転し得る。最後に、ＭＡＧ、ＭＡＧ誘導体、およびＭＡＧインヒビターが、再生する神経系の正確な領域でガイダンス合図として用いられ得、正しい経路上で軸索を成長させ、そして正しい標的に向かって移動させ続けることが想像される。
【０１００】
本明細書中に引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される。
【０１０１】
以下は、ＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子を同定するために用いられる本発明の方法、そのような因子を含む本発明の組成物、およびそれらの組成物の投与を含む方法を説明する実施例である。これらの実施例は、限定するものとして解釈されるべきではない：これらの実施例は例示の目的のみのために含まれ、そして本発明は請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１０２】
（実施例１）
異なるニューロン細胞タイプの同定
ニューロンを、本質的には、Ｄｏｈｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３４３，ｐｐ．４６４−６６  （１９９０）；Ｎｅｕｒｏｎ，５，ｐｐ．２０９−１９  （１９９０）；およびＫｌｅｉｔｍａｎら、Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｎｅｒｖｅ  Ｃｅｌｌｓ，ｐｐ．３３７−７８，ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ／Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ  （Ｇ．ＢａｎｋｅｒおよびＫ．Ｇｏｓｌｉｎ，編）（１９９１）に記載のように単離した。簡単には、９日齢までの動物に関して、小脳、網膜、海馬、および脊髄を２体の動物から取り出した。同様の組織を、組み合わせて、５ｍｌの０．０２５％トリプシンを含有するＰＢＳ中に置き、摩砕し、そしてさらに３７℃にてさらに１０分間インキュベートした。トリプシン処理を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する５ｍｌ  ＤＭＥＭの添加によって停止し、そして細胞を８００ｒｐｍで６分間遠心分離した。この細胞を、２％  ＦＣＳを含有する２ｍｌのＳＡＴＯで単一細胞懸濁物に再懸濁した。ＤＲＧおよびＳＣＧニューロンについては、神経節を２体の動物から取り出し、０．０２５％トリプシンおよび０．３％  Ｉ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を含有する５ｍｌのＬ１５培地中で３７℃にて３０分間インキュベートした。この神経節を、先端熱加工したパスツールピペットで摩砕した。トリプシン処理を、１０％ＦＣＳを含有する５ｍｌ  ＤＭＥＭの添加によって停止し、８００ｒｐｍで６分間遠心分離し、そして２％  ＦＣＳを含有する２ｍｌのＳＡＴＯ中に再懸濁した。細胞をＣｏｕｌｔｅｒカウンターで計数した。
【０１０３】
（実施例２）
（トランスフェクトＣＨＯ細胞における神経突起成長アッセイ）
（トランスフェクトＣＨＯ細胞によるＭＡＧの発現）
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，ｐｐ．４２１６−２０  （１９８０））を、ｄｈｆｒ遺伝子および５’−３’方向またはコントロールとして３’−５’方向のいずれかでＬ−ＭＡＧ  ｃＤＮＡを有するＭＡＧ−ｃＤＮＡ発現プラスミドでトランスフェクトし、複数コピーのｄｈｆｒを有する細胞を、漸増濃度のメトトレキセート中で増殖させることにより選択し、そして個々のトランスフェクトＣＨＯ細胞株によるＭＡＧの発現を、Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、Ｎｅｕｒｏｎ，１３，ｐｐ．７５７−６７  （１９９４）（これは本明細書中に参考として援用される）に記載されるように特徴付けた。トランスフェクト細胞を、１０％の透析したＦＣＳ、プロリン（４０ｍｇ／リットル）、チミジン（０．７３ｍｇ／リットル）、およびグリシン（７．５ｍｇ／リットル）を補充したＤＭＥＭ中で３７℃にて５％  ＣＯ２下で維持した。
【０１０４】
その出版物中にＭＡＧ２として記載されるＭＡＧ発現トランスフェクトＣＨＯ細胞株（「ＣＨＯ−ＭＡＧ２」）を、ブダペスト条約の規定に従って１９９６年６月２７日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に寄託した。これは、［ＣＲＬ−１２１４５］と命名されたＡＴＣＣ受託番号を割り当てられた。上記ＡＴＣＣ寄託の公衆への利用における全ての制限は、本出願における特許の付与において取り消し不能に除去される。
【０１０５】
（神経突起成長アッセイ）
コントロールＣＨＯ細胞およびＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞のコンフルエントな単層を、８ウェル組織培養スライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）の個々のチャンバーで２４時間（ｈ）にわたって確立した。約５０００個の小脳の、後根神経節（ＤＲＧ）および上頸神経節（ＳＣＧ）ニューロンならびに１０，０００個の網膜、海馬および脊髄細胞をＣＨＯ単層に添加することにより、共培養を以前に記載されたように確立した（Ｄｏｈｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３４３，ｐｐ．４６４−６６  （１９９０）；Ｎｅｕｒｏｎ，５，ｐｐ．２０９−１９  （１９９０）；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、Ｎｅｕｒｏｎ，１３，ｐｐ．７５７−６７  （１９９４））。培養培地は２％ＦＣＳを含有するＳＡＴＯであった。指示された場合には、２０ｍＵのＶＣＳを培養の期間を通して含ませるか（実施例４を参照のこと）、またはニューロン細胞懸濁物を添加する前の１時間の間、単層を小さなオリゴサッカライドとともにインキュベートし、そして共培養の期間を通して含ませた。指示された時間の期間の後、共培養物を、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、そして氷冷メタノールで２分間透化処理した。次いで、この細胞を、１０％  ＦＣＳを含有するＤＭＥＭで３０分間ブロックし、ニューロンマーカーＧＡＰ４３（１：４０００）に対するウサギポリクローナル抗体とともに２時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ−ＢＳＡ（２％）で３回洗浄し、次いでビオチン標識ロバ抗ウサギＩｇ（１：３００，Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに室温で３０分間インキュベートし、３回洗浄し、そしてストレプトアビジン結合テキサスレッド（１：３００，Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに３０分間インキュベートした。３回以上の洗浄の後、これらのスライドをＰｅｒｍｆｌｕｏｒ（Ｂａｘｔｅｒ）にマウントし、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡で観察した。各々のＧＡＰ４３ポジティブニューロンに関する最も長い神経突起の長さを、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ画像分析プログラム（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）を用いて決定した。
【０１０６】
あるいは、抗神経フィラメントモノクローナル抗体のような他のニューロン特異的抗体（これらは市販されている（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））が、製造業者によって推奨される希釈度で開始して用いられ得る。次いで、適切な種特異的ビオチン標識抗Ｉｇ二次抗体が、一次抗神経抗体が産生された種に従って選択される。さらに、神経突起を染色する種々の生体染料（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ）が、蛍光神経特異的抗体のかわりにこのアッセイで用いられ得る。
【０１０７】
（実施例３）
（推定上のＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子を試験するためのＣＨＯ細胞を用いた神経突起成長アッセイ）
実施例２に記載のトランスフェクトＣＨＯ細胞アッセイはまた、ＭＡＧ依存性様式で特定のニューロン細胞タイプおよび年齢の神経突起成長特性を変化する因子をスクリーニングおよび同定するのに用いられ得る。神経突起成長を、実施例２に記載のようなＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞およびコントロールＣＨＯ細胞上で成長させたＰＮＤ  ２動物由来の小脳ニューロン（表１）およびＤＲＧニューロン（表２）について比較した。指示される場合、小さなシアル酸を有する糖を漸増濃度で共培養物に含ませた。１００％阻害を、コントロールＣＨＯ細胞およびＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞上の神経突起の長さの差異として取った。結果は、少なくとも２つの実験の平均値であり、各々の実験に対して少なくとも１５０個のニューロンを測定した。ＤＤ−ＮＡＮＡ＝２，３−ジデオキシシアル酸；ＳＬ＝シアロ２，３−αラクトース。
【０１０８】
このアッセイは、共培養物中に他の推定上のＭＡＧ依存性神経突起成長調節因子を含ませることにより、そして小さなシアル酸を有する糖に関して上述のような細胞表面ＭＡＧの存在下および非存在下におけるそれらの効果を測定することにより、他の推定上のＭＡＧ依存性神経突起成長調節因子を試験するために用いられ得る。
【０１０９】
（実施例４）
（ニューロンへの可溶性ＭＡＧ−Ｆｃキメラの結合）
（免疫グロブリンＦｃキメラタンパク質の産生）
種々の形態のＭＡＧ−Ｆｃ（例えば、本明細書中でＭＡＧ［ｄ１−５］−Ｆｃ、ＭＡＧ［ｄ１−３］−ＦｃおよびコントロールＦｃキメラタンパク質ＭＵＣ  １８−Ｆｃと称されるようなＭＡＧ−Ｆｃ）をコードする発現プラスミドを、Ｋｅｌｍら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．，４，ｐｐ．９６５−７２  （１９９４）およびそこに記載される参考文献に記載されるように調製した。考察および可溶性組換え接着分子を作製するための一般的なプロトコルについては、Ｄ．Ｌ．Ｓｉｍｍｏｎｓ，「Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，」、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  −  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．１１８−１２５，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  （編  Ｄ．Ａ．Ｈａｒｔｌｅｙ）（１９９３）；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （補充），ｐｐ．１９３−２０３  （１９９３）；およびＰ．Ｒ．ＣｒｏｃｋｅｒおよびＳ．Ｋｅｌｍ，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１−３０  （１９９５）を参照のこと。これらは本明細書中に参考として援用される。
【０１１０】
Ｋｅｌｍら（前出）に記載されるＭＡＧ［ｄ１−５］−Ｆｃ、ＭＡＧ［ｄ１−３］−ＦｃおよびＭＵＣ１８−Ｆｃキメラタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトしたＥ．ｃｏｌｉ細胞サンプルを、ブダペスト条約の規定に従って１９９６年６月２７日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に寄託した。これは、以下に示されるように称されるＡＴＣＣ受託番号を割り当てられた：
細胞株                        ＡＴＣＣ受託番号
ａ）ＭＡＧ［１−３］−Ｆｃ    ９８０８９
ｂ）ＭＡＧ［１−５］−Ｆｃ    ９８０９０
ａ）ＭＵＣ１８−Ｆｃ          ９８０８８
上記ＡＴＣＣ寄託の公衆への利用における全ての制限は、本出願における特許の付与において取り消し不能に除去される。
【０１１１】
（ニューロンへのＦｃキメラの結合）
ＭＡＧ−Ｆｃ、ＭＡＧ［ｄ１−３］−ＦｃおよびＭＵＣ  １８−Ｆｃをコードするプラスミドを、ＣＯＳ細胞中にトランスフェクトし、Ｆｃ−キメラタンパク質をＫｅｌｍら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．，４，ｐｐ．９６５−７２  （１９９４）およびＰ．Ｒ．ＣｒｏｃｋｅｒおよびＳ．Ｋｅｌｍ，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１−３０  （１９９５）に記載されるような培地から精製した。ニューロン結合アッセイを、本質的に、Ｄｅｂｅｌｌａｒｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７，ｐｐ．８９−１０１  （１９９６）（これは本明細書中に参考として援用される）に記載のように行った。Ｆｃキメラタンパク質を、０．１Ｍ炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ  ９．６中で１５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧで３７℃にて２時間コートしたマイクロタイタープレートのウェルに３７℃にて３時間吸収させた。結合アッセイの前に、ニューロンを、５ｍｌのＰＢＳ中の１０μＭのｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ中で２×１０６個のニューロンを、３７℃で１５分間インキュベートすることにより、蛍光染料ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で生きた組織を標識し、その後ＰＢＳで洗浄および再懸濁した。指示される場合、ＭＡＧに指向するモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、１０μｇ／ｍｌの濃度でアッセイに含ませ、そして指示される場合、ニューロンを使用する前に脱シアル化した。１〜２×１０５個の細胞を含有する１００μｌの生きた組織を標識したニューロンの懸濁物を、各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートさせた。これらのプレートを、重力下で各ウェルに適用したＰＢＳで３回洗浄し、そして蛍光をＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で測定した。
【０１１２】
（実施例５）
（ＭＡＧ−Ｆｃキメラの存在下および非存在下での成長許容基剤における
神経突起成長アッセイ）
（Ｌ１−Ｆｃキメラを含有する成長許容基剤）
Ｌ１糖タンパク質は、広範な種々の哺乳動物のニューロン細胞タイプの表面に発現される細胞接着分子（ＣＡＭ）であり、これは神経突起成長を刺激する。可溶性Ｌ１−Ｆｃキメラは、当業者に公知の手順（実施例３に引用されるような手順；Ｄｏｈｅｒｔｙら、Ｎｅｕｒｏｎ，ｐｐ．５７−６６  （１９９５）、これは参考として本明細書中で援用される）を用いて構築され得る。可溶性Ｌ１−Ｆｃキメラは、ニューロンに向けられた場合、正常細胞表面会合Ｌ１と同様に神経突起成長を促進することにおいて効果的である（Ｄｏｈｅｒｔｙら、前出、およびそこに記載される参考文献、これらは本明細書中に参考として援用される）。Ｄｏｈｅｒｔｙらに記載されるように、Ｌ１−Ｆｃキメラは、線維芽細胞３Ｔ３細胞、あるいはポリリジン／コラーゲンまたはポリリジン／フィブロネクチンコート基剤の表面と安定に会合し得る。
【０１１３】
８つのチャンバー組織培養プラスチックスライド（Ｌａｂ−Ｔａｋ，Ｎｕｃ．Ｉｎｃ．）の個々のウェルを、無菌条件下で少なくとも１時間０．３ｍｌの滅菌水中の１６．６μｇ／ｍｌのポリ−１−リジンとともにインキュベートした。個々のウェルを、４００μｌの０．１Ｍ重炭酸水素ナトリウム溶液、ｐＨ  ９．６で２回洗浄し、次いで１５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を含有する０．３ｍｌの０．１Ｍ重炭酸水素ナトリウム溶液，ｐＨ  ９．６を加えた。これらのウェルを３７℃にて２時間インキュベートし、そして０．４ｍｌの氷冷ＤＭＥＭで３回洗浄した。次いで、各ウェルに４０μｇ／ｍｌのＬ１−Ｆｃを含有する０．３ｍｌのＤＭＥＭを加え、３７℃で２〜４時間インキュベートした。これらのウェルをＤＭＥＭで２回洗浄した。
【０１１４】
（Ｌ１−Ｆｃ基剤上での神経突起成長：）
（可溶性ＭＡＧ−Ｆｃ結合アッセイ）
解離したニューロンを２％の透析したＦＢＳを含有する５ｍｌのＳＡＴＯ培地に再懸濁した以外は実施例１に記載するようなトリプシン処理により、小脳ニューロン（出生後２〜７日）を解離させた。上記のようなＬ１−Ｆｃの単層でコートした個々のウェルに、５．０×１０４個の小脳ニューロンを添加し、続いて実験に応じて、単一の濃度（約５０μｇ／ｍｌ）または漸増濃度（例えば、０〜３０μｇ／ｍｌ）のＭＡＧ−ＦｃまたはＭＵＣ１８−Ｆｃキメラ可溶性タンパク質を加えた。ニューロンを３７℃で一晩（約１６時間）培養し、次いで本質的に実施例２に記載のように固定化し、そして染色した。
【０１１５】
（実施例６）
（ＭＡＧ依存性神経突起成長変化因子を同定するための
可溶性ＭＡＧを用いた神経突起成長アッセイ）
実施例５に記載の可溶性ＭＡＧ−Ｆｃを用いた神経突起成長結合アッセイはまた、ＭＡＧ依存性様式で特定のニューロン細胞タイプおよび年齢の神経突起成長特性を変化させる新規の因子をスクリーニングおよび同定するための競合ニューロン結合／成長実験を行うために用いられ得る。１つ以上の濃度の試験因子を、実施例５の共培養物中に含ませ、そして可溶性ＭＡＧの存在下および非存在下でその試験因子の効果を評価した。
【０１１６】
（実施例７）
（脱シアル化したニューロンを用いた神経突起成長アッセイ）
種々の出生後齢の異なるニューロンの単一細胞懸濁物を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、再懸濁した。約２×１０６個の細胞を、０．５ｍｌの最終容量中で５０ｍＵのＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａシアリダーゼ（ＶＣＳ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（ノイラミニダーゼ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。ニューロンをＰＢＳで洗浄し、そして神経突起成長実験のために２％  ＦＣＳを含有するＳＡＴＯ培地中に再懸濁するか、または神経突起結合アッセイのためにＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１１７】
この手順は、炭水化物構造を消化するかそうでなければ改変するシアリダーゼ以外の酵素を用いることによって改変される（例えば、Ｋｅｌｍら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１４９，ｐｐ．５９−６４  （１９８６）を参照のこと。これは本明細書中に参考として援用される）。例えば、シアリルトランスフェラーゼを用いてＭＡＧが結合するＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ（３−Ｏ）構造を有するシアル酸残基を含有するニューロン表面上のシアル化グリカンを変化または除去し得る。
【０１１８】
（実施例８）
（ＭＡＧ依存性神経突起変化因子のインビボ送達）
ＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃをコードする発現プラスミドでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を培養し、そして培養物をＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃ分泌の速度についてアッセイした。約２×１０６個細胞−−約１ｍｇのＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃを５日間にわたって分泌する−−が、修復を必要とする神経損傷の近傍で損傷した被験体の脊髄を取り囲む脳脊髄液中に移植した。必要に応じて、反復投与が行われる。この細胞はＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃを分泌する。これは移植部位のミエリンにおける内因性ＭＡＧ活性を阻害し得、そして神経再生が刺激される。
【０１１９】
【化１】
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【０１２０】
【化２】
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【０１２１】
【化３】
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【０１２２】
【化４】
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【０１２３】
【化５】
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【０１２４】
【化６】
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【０１２５】
【化７】
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【０１２６】
【化８】
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【０１２７】
【化９】
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【０１２８】
【化１０】
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【０１２９】
【化１１】
2009073845.tif 000014
【０１３０】
【化１２】
2009073845.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ＭＡＧによる小脳ニューロン由来の神経突起の成長の阻害。出生後（ＰＮＤ）１、４および７日目由来の小脳ニューロンを、ＭＡＧ発現細胞（白棒）またはコントロールトランスフェクトＣＨＯ細胞（斜線の棒）の単層上で一晩成長させた。ニューロンを、ＧＡＰ−４３抗原について染色し、そして神経突起の長さを測定し、そして平均の長さを、少なくとも１５０個（＋／−  ＳＥＭ）の測定値から計算した。
【図２】異なる齢のＤＲＧニューロン由来の神経突起の成長におけるＭＡＧの効果。ＤＲＧニューロンを、ＰＮＤ  １からＰＮＤ  ２０までの動物から単離し、そしてＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞またはコントロールＣＨＯ細胞上で成長させ、そして神経突起の長さを、図１に記載のように計算した。
【図３】異なるニューロン細胞タイプ由来の神経突起の成長におけるＭＡＧの効果。ＰＮＤ１動物から種々のニューロンを単離し、そしてＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞（斜線）またはコントロールＣＨＯ細胞（明るい斜線平行線）上で一晩成長させた。平均の神経突起の長さを、図１に記載のように計算した。ＲＧ＝網膜神経節；ＨＮ＝海馬；ＭＮ＝運動性；およびＳＣＧ＝上頸神経節ニューロン。
【図４】小脳ニューロンおよびＤＲＧニューロンへのＭＡＧのシアル酸依存性結合。放射標識ＭＡＧ−Ｆｃ（黒棒）を、ＰＮＤ１の小脳ニューロンおよびＤＲＧニューロンに結合させた。インキュベーションをまた、５μｇ／ｍｌのＭＡＧ  ５１３モノクローナル抗体の存在下（暗い斜線の棒）または脱シアル化（ｄｅｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）したニューロン（斑点の棒）とともに行った。各々の実験を４連で行った。結果は３回の実験の平均値である。
【図５】ニューロンの脱シアル化は、ＭＡＧによる神経突起の成長の阻害をブロックする。アッセイの前にニューロンの脱シアル化ありおよび脱シアル化なしで、ＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞ならびにコントロールＣＨＯ細胞についてのＰＮＤ  ２動物由来の小脳ニューロンについて、神経突起成長を図１に記載のように比較した。Ｃ＝コントロールＣＨＯ細胞上で成長したニューロン；ＭＡＧ＝ＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞上で成長したニューロン；＋＝ニューロンをアッセイの前に脱シアル化した；＋＋＝ニューロンをアッセイの前に脱シアル化し、デシアリダーゼを、培養物中に含ませた。結果は、少なくとも１５０個のニューロン＋／−  ＳＥＭからの平均の神経突起の長さ（μｍ）を示す。
【図６】ニューロンの脱シアル化は、ＭＡＧによる神経突起成長の促進をブロックする。アッセイの前にニューロンの脱シアル化あり（ＭＡＧシアリダーゼ）および脱シアル化なしで、ＭＡＧ発現（ＭＡＧ）ＣＨＯ細胞ならびにコントロールＣＨＯ細胞（コントロール）上のＰＮＤ  １動物由来のＤＲＧニューロンについて、神経突起成長を図１に記載のように比較した。結果は、少なくとも１５０個のニューロン＋／−  ＳＥＭからの平均神経突起の長さ（μｍ）を示す。
【図７】図７ａ。可溶性ＭＡＧ−Ｆｃは、濃度依存様式で、Ｌ１上で成長した小脳ニューロンの軸索再生を阻害する。Ｌ１−Ｆｃを固定化し、そして単離されたＰＮＤ２小脳ニューロンを示したような種々の濃度のＭＡＧ−Ｆｃ（菱形）またはＭＵＣ−Ｆｃ（四角）の存在下で一晩成長させた。ニューロンを固定化し、染色し、そして神経突起の長さを図１に記載のように測定した。結果は、平均の神経突起の長さ（μｍ）＋／−  ＳＥＭを示す。図７ｂ。ＭＡＧ−Ｆｃは特異的なシアル酸依存性様式で軸索成長を阻害する。小脳ニューロンを、基材としての固定化されたＬ１上で成長させた。ＭＡＧ−Ｆｃ（カラム１）またはＭＵＣ−Ｆｃ（カラム２）を５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。抗ＭＡＧ  ５１３モノクローナル抗体を、５μｇ／ｍｌ（カラム３）の濃度で含ませるかまたは脱シアル化ニューロンを用いた（カラム４）。神経突起の長さ（μｍ）を図１に記載のように測定した。結果は、平均神経突起の長さ（μｍ）＋／−  ＳＥＭを示す。図７ｃ。  ＭＡＧ−Ｆｃは、線維芽細胞上で成長したニューロンからの軸索成長を阻害する。単離されたＰＮＤ  ２小脳ニューロンを、５０μｇ／ｍｌのＭＡＧ−Ｆｃ（カラム１、ＭＡＧ）、５０μｇ／ｍｌのＭＵＣ１８−Ｆｃ（カラム２、ＭＵＣ  １８）の存在下で、または５μｇ／ｍｌの抗ＭＡＧ  ５１３モノクローナル抗体（カラム３、抗ＭＡＧ）の存在下で線維芽細胞（３Ｔ３細胞）の基材上で成長させた。神経突起の長さ（μｍ）を図１に記載のように測定した。結果は、平均の神経突起の長さ（μｍ）＋／−  ＳＥＭを示す。
【図８】図８ａ。ＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃは、特異的なシアル酸依存性様式でニューロンに結合する。フルオレセインで生きた組織を標識した小脳（ＰＮＤ２）ニューロンを、抗ＭＡＧモノクローナル抗体の存在下（＋抗ＭＡＧ）または非存在下（−Ａｂ）で、固定化されたＭＡＧ（ｄ１−５）−Ｆｃ（黒棒）、ＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃ（斜線の棒）またはＭＵＣ１８−Ｆｃ（斑点の棒）に結合させた。結果は、結合したＦｃ−キメラの量（ｎｇ）を示す。図８ｂ。  ＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃは、軸索再生を阻害しない。小脳ニューロンを、５０μｇ／ｍｌ  ＭＡＧ（ｄ１−５）−Ｆｃ、Ｍｕｃ１８−Ｆｃ、またはＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃの存在下で、固定化したＬ１−Ｆｃ上にて成長させた。神経突起の長さ（μｍ）を図１に記載のように測定した。結果は、平均の神経突起の長さ（μｍ）＋／−  ＳＥＭを示す。図８ｃ。  ＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃは、ＣＨＯ細胞によって発現される野生型ＭＡＧによる軸索再生の阻害を逆転する。小脳ニューロン（ＰＮＤ２）を、ＭＡＧ（ｄ１−３）−Ｆｃの存在下（＋ＭＡＧ１−３）または非存在下で、ＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞（ＭＡＧ細胞）またはコントロール(c)ＣＨＯ細胞上で成長させた。神経突起の長さ（μｍ）を図１に記載のように測定した。結果は平均の神経突起の長さ（μｍ）＋／−  ＳＥＭを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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