(57)【要約】【課題】本発明は、十分に安全であることから恒常的な服用が可能であり、肝線維化の抑制効果に優れる飲用水、およびその製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の肝線維化抑制飲用水は、セラミックに接触させたセラミック処理水を含むことを特徴とする。また、本発明に係る肝線維化抑制飲用水の製造方法は、セラミックを水に接触させてセラミック処理水を得る工程；および、セラミックとセラミック処理水とを分離する工程；を含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラミックに接触させたセラミック処理水を含むことを特徴とする肝線維化抑制飲用水。
【請求項２】
セラミックが、微粉砕した堆積岩を水で混練した上で焼成したものである請求項１に記載の肝線維化抑制飲用水。
【請求項３】
セラミックを水に接触させてセラミック処理水を得る工程；および、セラミックとセラミック処理水とを分離する工程；を含むことを特徴とする肝線維化抑制飲用水の製造方法。
【請求項４】
堆積岩を微粉砕し、水を加えて混練したものを焼成することによりセラミックを得る工程を含む請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
セラミック処理水を得る工程において、水に対するセラミックの割合を４ｇ／Ｌ以上とする請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項６】
セラミック処理水を得る工程において、セラミックと水との接触時間を１分間以上とする請求項３〜５のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝線維化を抑制するための飲用水、および肝線維化抑制飲用水を製造するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
持続的な肝炎ウィルス感染やアルコールの多飲などにより肝細胞死が起こると、その後に残る隙間にコラーゲンなどの線維成分が沈着し、肝線維化といわれる状態に至る。かかる肝線維化が進行すると最終的に肝硬変となるが、肝硬変患者は高い確率で肝がんを併発する。よって、肝硬変や肝がんの危険を回避するためには、できるだけ早い段階から肝線維化の進行を抑制することが重要である。
【０００３】
現在、日本においては、肝硬変の原因のうち約７０％がＣ型肝炎ウィルス感染、約１５％がＢ型肝炎ウィルス感染、約１０％がアルコールの多飲である。中でも、日本におけるＣ型肝炎患者は約１４０万人に及ぶといわれていることから、Ｃ型肝炎の予防や治療は重要である。Ｃ型肝炎ウィルスの駆除方法としては、唯一インターフェロンとリバビリンの併用療法が認められているが、約４０％には効果がない。また、高齢であることや副作用によって、当該併用療法を適用できない患者も多い。その他、アルコール多飲の既往のないヒトであっても、肥満等に起因する脂肪肝から脂肪性肝炎を経て肝硬変や肝がんを発症する例が増加傾向にある。
【０００４】
ウィルス性肝炎などの慢性肝障害に対しては、その要因を根本から解消することが重要であるが、上記のとおり要因除去治療が困難である場合がある。但し、たとえ肝硬変になっても、それ以上の肝線維化の進行を抑制し続けることにより、肝硬変状態から脱することも可能であり、さらに肝がんの危険を軽減することにもなる。さらに、軽症な段階で肝線維化の進行を早期に抑制できれば、これら深刻な肝障害のリスクを格段に軽減することができる。
【０００５】
従来、肝線維化を抑制するための薬剤としては、特許文献１〜３のように、主に合成薬剤が検討されている。臨床的に肝庇護剤として汎用されている合成薬剤も多い。しかし、実際には肝線維化を優位に抑制可能なものであり、且つ有効で安全な合成薬剤は少なく、軽症な肝線維化段階では、こうした肝障害治療薬は長期にわたっては投与されていない。
【０００６】
ところで、本願出願人の研究者らはセラミックにつき研究を継続しており、特許出願している。その成果として、例えば特許文献４のとおり、植物の生長を促進するために用いる、有用放線菌を定着させたセラミックを開発した。また、特許文献５に示すように、セラミックスボールで処理した液体を用いてワイヤ放電加工する技術を完成させている。
【特許文献１】国際公開第２００５／００５３７２号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−９６６６４号公報
【特許文献３】特表２００３−５３０３５３号公報
【特許文献４】特開２００７−２１０９８１号公報
【特許文献５】特開２００７−４４８２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述した様に、ウィルス性肝炎などの慢性肝障害では十分な治療が早期から行われていないケースがある一方で、持続的な肝障害による肝線維化の進行を放置すると最終的には肝硬変となり、さらに肝がんを併発するおそれがある。よって、特に肝線維化の早期段階での恒常的な対策が非常に重要である。また、肝線維化を予防できれば、非常に好ましいといえる。
【０００８】
そこで本発明の目的は、十分に安全であることから恒常的な服用が可能であり、肝線維化の抑制効果に優れる飲用水、およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた。その結果、セラミックと接触させた水が優れた肝線維化抑制効果を有することを見出して、本発明を完成した。
【００１０】
本発明の肝線維化抑制飲用水は、セラミックに接触させたセラミック処理水を含むことを特徴とする。なお、本発明において「抑制」には、肝線維化を軽減するあらゆる態様が含まれる。例えば、「抑制」とは、肝線維化の進行の停止や遅延、肝線維化の治療のみならず、肝線維化の予防を含む概念である。
【００１１】
上記セラミックとしては、微粉砕した堆積岩を水で混練した上で焼成したものが好適である。
【００１２】
本発明に係る肝線維化抑制飲用水の製造方法は、セラミックを水に接触させてセラミック処理水を得る工程；および、セラミックとセラミック処理水とを分離する工程；を含むことを特徴とする。
【００１３】
上記製造方法においては、さらに、堆積岩を微粉砕し、水を加えて混練したものを焼成することによりセラミックを得る工程を含むことが好ましい。
【００１４】
また、上記製造方法のセラミック処理水を得る工程においては、水に対するセラミックの割合を４ｇ／Ｌ以上とすることや、セラミックと水との接触時間を１分間以上とすることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る肝線維化抑制飲用水は、優れた肝線維化抑制作用を有する上に、安全性にも優れる。よって、肝線維化を治療するための薬剤として使用することも可能であるし、また、肝線維化を予防的に抑制する健康食品として毎日飲用することもできる。従って本発明は、慢性肝障害の重篤化を防ぎ得るものとして、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
はじめに、本発明に係る製造方法につき説明する。本発明に係る肝線維化抑制飲用水の製造方法は、セラミックを水に接触させてセラミック処理水を得る工程；および、セラミックとセラミック処理水とを分離する工程；を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明で用いるセラミックは、堆積岩を粉砕して得られる微粒子に水を加えて混練したものを焼成して得られる多孔質なものである。堆積岩は、砂や泥に加えて生物の遺骸などの有機物が海底や湖底、或いは地表に堆積したものが続成作用を受けてできた岩石である。かかる堆積岩は、焼成により空孔が生じて多孔質となることから水との接触面積が大きく、水を効率的に処理することができる。
【００１８】
堆積岩の粉砕の程度は、水と混練することができるものであれば特に制限されないが、例えば平均粒子径で２μｍ以上、６００μｍ以下程度とすることができる。平均粒子径が約６００μｍ以下であれば、水を加えることにより十分に混練物とすることができる。一方、平均粒子径が２μｍ未満になるまで粉砕するには過剰なエネルギーが必要となるので、２μｍ以上とすることが好ましい。粉砕手段は特に制限されず、ハンマーミルやボールミルなど常法を用いることができる。なお、平均粒子径は、常法により体積基準の粒度分布を求めた上で算出した５０％累積径とすることができる。
【００１９】
次に、得られた堆積岩微粒子に水を加えて混練し、混練物とする。得られた混練物は、所望の形状に成形すればよい。形状は特に制限されないが、水との接触面積を高めるために球形とすることが好ましい。より具体的には、直径０．５ｍｍ以上、１５ｍｍ以下程度の球形とすることが好ましい。
【００２０】
次いで、混練物を焼成することにより多孔質のセラミックとする。焼成に用いる機器としては、ロータリーキルン、シャフトキルン、サーキュラグレート式焼成炉など公知の焼成炉を特に制限無く用いることができる。
【００２１】
本発明では、以上の方法と同様の方法で得られるセラミックであれば、市販のものを用いてもよい。そのようなセラミックとしては、エフエフシー・ジャパン社製のＦＦＣセラミックボールを挙げることができる。
【００２２】
本発明では、水をセラミックと接触させることによりセラミック処理水を得る。より具体的には、水にセラミックを加えて浸漬したり、或いはセラミックを容器に詰めた上で水を通液してもよい。
【００２３】
本発明で使用する「水」の種類は特に制限されず、例えば純水、超純水、蒸留水、水道水などを用いることができる。
【００２４】
使用するセラミックの割合は、水の容量に対して４ｇ／Ｌ以上とすることが好ましい。水に対して十分量のセラミックを用いれば、有効成分を効率的に溶出させることができると考えられる。より好適には、かかる割合は６ｇ／Ｌ以上、特に１０ｇ／Ｌ以上とすることが好ましい。
【００２５】
セラミックと水との接触時間は、用いるセラミックの表面積、即ち水との接触面積などにも依存するが、通常は１分間以上とすることが好ましい。１分間以上浸漬すれば、有効成分をより確実に水中へ溶出せしめることが可能になる。一方、上限は特に制限されないが、通常は７２時間以下とする。但し、セラミックと水の接触時間が長いほどより確実に水を処理できると考えられるため、セラミックと水との接触時間としては、より好適には１時間以上とする。なお、セラミックを詰めた容器に水を通液する場合には、水とセラミックが十分に接触できるように通液速度を調整する必要がある。
【００２６】
セラミックと水との接触時における温度は特に制限されず、常温とすることができる。接触処理後は、セラミックとセラミック処理水とを分離する。分離手段は常法を用いればよく、単に浸漬水からセラミックを除去するのみでもよい。その他、例えば濾過処理や遠心分離処理を行なっても差し支えない。
【００２７】
本発明の肝線維化抑制飲用水は、上記で得たセラミック処理水を含む。即ち、上記セラミック処理水を含むものであれば、一般的な添加成分をさらに含むものであってもかまわない。添加成分としては、例えば、グルコースやキシリトースなどの甘味料；矯味料；アスコルビン酸などの酸化防止剤；防腐剤；着色料などを挙げることができる。
【００２８】
本発明の肝線維化抑制飲用水の摂取量は特に制限されないが、摂取者の症状、年齢、性別などに応じて適宜調整すればよい。但し、本発明の肝線維化抑制飲用水は非常に安全であることから、毎日飲用してもよい。例えば、１回当たり１００ｍＬ以上を１日何回でも飲用することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３０】
実施例１  本発明に係るセラミック処理水の調製と分析
パイレックス（登録商標）蓋付きガラス瓶へ、電気伝導率が１０×１０-4Ｓ／ｍ以下の脱イオン水（１Ｌ）を入れ、さらに２０ｇの直径約１．５ｍｍのセラミックボール（エフエフシー・ジャパン社製，製品名「ＦＦＣセラミックス」）を入れた。当該ガラス瓶をプラスチックラップで密封し、２５℃の恒温室に入れ、遮光下で２４時間静置した。
【００３１】
得られたセラミック処理水を、孔径０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターで濾過した後、高周波誘導プラズマ発光分光分析装置（パーキンエルマー社製，Ｏｐｔｉｍａ５３００ＤＶ）とイオンクロマトグラフィシステム（ダイオネクス社製，ＩＣＳ３０００）により分析し、含まれる陽イオンと陰イオンの種類と濃度を特定した。陽イオンに関する結果を表１に、陰イオンに関する結果を表２に示す。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
【表２】
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【００３４】
実施例２  本発明に係るセラミック処理水の調製
１個４ｇのセラミックボール（エフエフシー・ジャパン社製，製品名「ＦＦＣセラミックス」）５個を蓋付きガラス瓶に入れ、さらに超純水、または滅菌培養液であるＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（以下、「ＤＭＥＭ」という）もしくはウィリアムＥ培地（以下、「ＷＥ」という）を入れて全量を１０００ｍＬにした。各ガラス瓶を２５℃の恒温室に入れ、遮光下で２４時間静置した。また、比較のために、セラミックボールを入れないで同様の処理をした水と滅菌培養液を調製した。
【００３５】
試験例１  本発明に係るセラミック処理水の肝線維化抑制作用の確認実験
ラット肝より単離した肝星細胞は、プラスチック培養皿に播種するだけで培養６日以降に強く活性化され、Ｉ型コラーゲン等の線維成分を産生し、α−平滑筋アクチンを発現する筋線維芽様細胞に形質転換する。よって、α−平滑筋アクチンを肝星細胞の活性化マーカーとすることができる。また、活性化した肝星細胞は、強力な線維化促進サイトカインであるＴＧＦ−β、マロンジアルデヒドなどの脂質過酸化物質、および活性酸素を自己産生して自らを一層活性化する。よって、これらＴＧＦ−β等も肝星細胞の活性化マーカーとすることができる。そこで、これら活性化マーカーを基準として、本発明に係るセラミック処理水の肝線維化抑制作用の確認実験を行なった。
【００３６】
具体的には、ラットの肝星細胞を単離し、１０％胎児ブタ血清含有培養液で１日前培養した。次いで、培養開始から２日目から９日目まで、培養液を、上記実施例２で得たセラミック処理ＤＭＥＭまたは当該セラミック処理ＤＭＥＭの未処理ＤＭＥＭによる２倍希釈液に１０％胎児ブタ血清を加えた培養液と２日毎交換しつつ、３７℃で培養した。また、比較のためのコントロール群は、胎児ブタ血清を１０％含有する未処理ＤＭＥＭを用い、同様に培地交換しつつ培養を行った。培養開始から９日目に培養皿をＰＢＳで３回洗浄した後に細胞をラバーポリスマンでかき集め、全ＲＮＡ、全タンパク質および脂質過酸化物質であるマロンジアルデヒド（以下、「ＭＤＡ」という）を抽出した。抽出した全ＲＮＡを用い、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲによりＩ型コラーゲンとＴＧＦ−βの遺伝子発現量を測定した。また、抽出した全タンパク質を用い、ウエスタンブロット法によりα−平滑筋アクチン発現を同定し、β−アクチンに対する発現比をｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒで測定して半定量化した。ＭＤＡ量は、ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅ法で測定した。Ｉ型コラーゲンとＴＧＦ−βの遺伝子発現量をそれぞれ図１と図２に、α−平滑筋アクチンの相対的発現量を図３に、ＭＤＡ量を図４に示す。なお、図中のデータは、実験を４〜５回繰り返して得られた値の平均値±ＳＤである。
【００３７】
図１〜４のとおり、本発明に係るセラミック処理水は、脂質過酸化反応を阻害してＭＤＡ産生を抑制し、肝星細胞の特異的活性化マーカーであるα−平滑筋アクチン、強力な線維化促進サイトカインであるＴＧＦ−β、さらに主要な細胞外マトリックスの線維成分であるＩ型コラーゲンのそれぞれの発現を濃度依存性に有意に抑制することが実証された。
【００３８】
試験例２  本発明に係るセラミック処理水の肝細胞障害抑制作用の確認実験
ラット肝から単離した肝細胞をコラーゲンコートした培養皿に播種し、５％胎児ブタ血清含有培養液で４時間培養した。別途、上記実施例２で得たセラミック処理ＷＥ、および当該セラミック処理ＷＥの未処理ＷＥによる２倍希釈液へ、１００μＭの割合で鉄ニトリロ三酢酸を溶解することにより、酸化ストレスを与えるための二価鉄イオンを加えた。次いで、培養皿をＰＢＳで１回洗浄した後に、上記セラミック処理ＷＥまたはセラミック処理ＷＥの２倍希釈液を加え、さらに１２時間培養した。比較のためのコントロール群の培地は、未処理ＷＥで同様に交換した。培養後、培養液のみを取り出し、障害肝細胞からの逸脱酵素であるＬＤＨの濃度を日立自動解析装置で測定した。また、培養皿の細胞をＰＢＳで３回洗浄後にラバーポリスマンでかき集め、全ＲＮＡと脂質過酸化物であるＭＤＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡからは、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにより主要な炎症性サイトカインであり肝細胞障害性を有するＴＮＦ−αの遺伝子発現量を測定した。ＭＤＡ量は、ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅ法で測定した。細胞外に放出されたＬＤＨの量を図５に、ＭＤＡ量を図６に、ＴＮＦ−αの遺伝子発現量を図７に示す。なお、図中のデータは、実験を４〜５回繰り返して得られた値の平均値±ＳＤである。
【００３９】
図５〜７のとおり、本発明に係るセラミック処理液は、肝細胞内脂質過酸化反応を阻害してＭＤＡ産生を抑制し、障害肝細胞からのＬＤＨ放出やＴＮＦ−α産生を阻害した。さらに、２価鉄溶液の添加にて誘導された酸化ストレス由来の脂質過酸化反応（ＭＤＡ産生）、肝細胞障害（ＬＤＨ放出）、ＴＮＦ−α産生を抑制した。本発明に係るセラミック処理液のこの抑制作用は、用量依存性に発揮された。
【００４０】
試験例３  本発明に係るセラミック処理水の肝線維化抑制作用の確認実験
ウイスター系雄ラット（７週齢）に肝毒素であるジメチルニトロサミン４０ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内単回投与することにより、肝細胞障害を与えて肝臓の線維化を促進した。給水瓶に、上記実施例２で得たセラミック処理超純水、その２倍希釈液、または未処理水を入れ、肝線維化ラットに自由摂取させた。また、飼料（オリエンタル酵母標準飼料：３６０ｋｃａｌ／１００ｇ）も自由摂取させた。ジメチルニトロサミンを投与しない無処置ラット群に対しては、生理食塩水を腹腔内投与し、セラミック処理水または未処理水と飼料を同様に自由摂取させた。
【００４１】
実験開始前と、ジメチルニトロサミンまたは生理食塩水の投与から１４日目に各ラットの体重を測定した。
【００４２】
また、体重測定後にラットをジエチルエーテルで麻酔し、開腹した。腹部大動脈から脱血して肝臓を取り出した。採取した肝臓の一部を、ヘマトエオジン染色またはα−平滑筋アクチン抗体を用いたＡＢＣ法により免疫組織化学染色した。さらに別の部分をホモジナイザーで粉砕後、全ＲＮＡと脂質過酸化産物であるＭＤＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡからはｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてＩ型コラーゲンの遺伝子発現量を測定し、ＭＤＡ量はｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅ法で測定した。体重測定の結果を表３に示す。ヘマトエオジン染色の結果を図８に、免疫組織化学染色の結果を図９に示す。また、肝臓内のＭＤＡ量を図１０に、Ｉ型コラーゲンの遺伝子発現量を図１１に示す。なお、図１０〜１１中のデータは、実験を４〜５回繰り返して得られた値の平均値±ＳＤである。
【００４３】
【表３】
2009256266.tif 000004
【００４４】
表３のとおり、ジメチルニトロサミン処置群の体重は、無処置群に比べて有意に低くなっている。しかし本発明のセラミック処理水を投与した群では、生理食塩水を投与したコントロール群に比して体重の増加が見られる。
【００４５】
図８によれば、生理食塩水を投与したコントロールラットの肝臓の一部には、線維性隔壁を有する明らかな線維沈着が認められた。しかし本発明のセラミック処理水を投与したラットの肝臓では、かかる線維性変化はほとんど見られない。また、図９によれば、コントロールラットの肝臓には、α−平滑筋アクチンを発現している活性化肝星細胞が多数存在している。それに対してセラミック処理水を投与したラットの肝臓では、α−平滑筋アクチンを発現する陽性細胞がほとんど認められなかった。
【００４６】
また、図１０〜１１のとおり、線維肝ラットの肝臓内では脂質過酸化物量やＩ型コラーゲンの遺伝子発現量が高まっており、肝星細胞が活性化され、肝細胞障害が進行していることが分かる。しかし、本発明のセラミック処理水を投与した群では、肝星細胞の活性化は有意に抑制されている。
【００４７】
以上の結果から、本発明のセラミック処理水は、肝星細胞の活性化と肝細胞障害を抑制し、ひいては肝線維化を顕著に抑制できることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ラット培養肝星細胞のＩ型コラーゲン発現に及ぼす、本発明に係るセラミック処理水の作用効果を示すグラフである。
【図２】ラット培養肝星細胞のＴＧＦ−βの発現に及ぼす、本発明に係るセラミック処理水の作用効果を示すグラフである。
【図３】ラット培養肝星細胞のα−平滑筋アクチンの発現に及ぼす、本発明に係るセラミック処理水の作用効果を示すグラフである。
【図４】ラット培養肝星細胞の脂質過酸化産物（ＭＤＡ）の産生に及ぼす、本発明に係るセラミック処理水の作用効果を示すグラフである。
【図５】ラット培養肝細胞の肝細胞逸脱酵素（ＬＤＨ）の分泌に及ぼす、本発明に係るセラミック処理水の作用効果を示すグラフである。
【図６】ラット培養肝細胞の脂質過酸化産物（ＭＤＡ）の産生に及ぼす、本発明に係るセラミック処理水の作用効果を示すグラフである。
【図７】ラット培養肝細胞のＴＮＦ−αの発現に及ぼす、本発明に係るセラミック処理水の作用効果を示すグラフである。
【図８】ラット線維肝をヘマトエオジン染色した結果を示す写真である。（１）はコントロールの結果、（２）は本発明に係るセラミック処理水を投与した結果、（３）は希釈した本発明に係るセラミック処理水を投与した結果である。
【図９】ラット線維肝をα−平滑筋アクチン免疫組織化学染色した結果を示す写真である。（１）はコントロールの結果、（２）は本発明に係るセラミック処理水を投与した結果、（３）は希釈した本発明に係るセラミック処理水を投与した結果である。
【図１０】ラット線維肝の脂質過酸化産物（ＭＤＡ）の産生に及ぼす、本発明に係るセラミック処理水の作用効果を示すグラフである。
【図１１】ラット線維肝のＩ型コラーゲン発現に及ぼす、本発明に係るセラミック処理水の作用効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図８】
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【図９】
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