(57)【要約】【課題】  凍結乾燥時に有用物質を変性させることなく、かつ保存期間中に生理活性が低下しない凍結乾燥方法を提供する。【解決手段】  有用物質の水溶液を凍結乾燥して有用物質を精製する過程において、アルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）を存在させて、凍結乾燥させることを特徴とする凍結乾燥方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖、抗生物質およびビタミン類からなる群より選ばれる１種以上の有用物質の水溶液を凍結乾燥して該有用物質を精製する過程において、アルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）を存在させて凍結乾燥させることを特徴とする凍結乾燥方法。
【請求項２】
該アルギニンの有機酸塩（Ａ）の有機酸（ａ）がオキシカルボン酸である請求項１記載の凍結乾燥方法。
【請求項３】
該有機酸（ａ）が乳酸である請求項１または２記載の凍結乾燥方法。
【請求項４】
凍結乾燥後の活性が、凍結乾燥前に比べて５０％以上保持される請求項１〜３いずれか
記載の凍結乾燥方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載の方法で精製されたことを特徴とする、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖、抗生物質、またはビタミン類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品、医薬品および生化学の分野において用いられる凍結乾燥方法の改良、ならびに本発明の凍結乾燥方法を用いる凍結乾燥物の製造方法に関する。さらに詳しくは、凍結乾燥後に有用物質の力価が低下しにくい凍結乾燥方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素やペプチドなどのタンパク質は、診断・検査薬、医薬品として広く利用されており、これらの製品においては、製造工程および保存期間中に生理活性（力価）が損なわれないことが重要である。
安定してタンパク質を取り出し精製するための一つの方法として凍結乾燥が一般的に行われているが、何も添加せずに凍結乾燥すると、タンパク質が変性、失活し、例えば酵素の場合、力価が著しく低下し、場合によっては５〜１５％しか保持できないという問題点があった。
これに対し、糖類などを添加すると、力価の低下は少し抑制され、２０〜３５％まで向上するが、依然として保存期間中に生理活性が損なわれ、力価が１０％程度しか保持されないという問題点がある（たとえば、特許文献１）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２７０００６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、凍結乾燥時に有用物質を変性することなく、かつ保存期間中に生理活性が低下しない凍結乾燥方法を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖、抗生物質およびビタミン類からなる群より選ばれる有用物質の水溶液を凍結乾燥して有用物質を精製する過程において、アルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）を存在させて、凍結乾燥させることを特徴とする凍結乾燥方法；その凍結乾燥方法によって精製されて得られた有用物質である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の凍結乾燥方法は、凍結乾燥時に有用物質を変性することなく、かつ保存期間中に生理活性が低下しないので食品、医薬品、および生化学の分野において有効に使用することができる。また、各種有用物質の製造コストを大幅に改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明はタンパク質（酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチドなど）、アミノ酸、核酸、糖、抗生物質、ビタミン類などの有用物質の水溶液を凍結乾燥して有用物質を精製する過程において、アルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）を存在させて、凍結乾燥させることを特徴とする凍結乾燥方法である。
【０００８】
すなわち、酵素、ペプチドなどのタンパク質や抗生物質などを取り出し精製するための凍結乾燥において、そのまま凍結乾燥すると、これらがが変性、失活し易く、力価が著しく低下するという問題点があるが、本発明では、特定の化学構造を有する上記の化合物（Ａ）を凍結乾燥時の保護剤として添加することにより解決することを見出した。
【０００９】
本発明の凍結乾燥方法において、上記の目的で使用する保護剤として作用させるために存在させるアルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）は、 アルギニンを有機酸（ａ）で中和したものである。
【００１０】
本発明における有機酸（ａ）としてはオキシカルボン酸（乳酸、クエン酸など）、カルボン酸（酢酸、プロピオン酸など）、有機リン酸（メチルリン酸など）、有機スルホン酸（メタンスルホン酸など）などが挙げられるが、得られた酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチドなどが医薬品、食品分野で使用されることを考慮した場合の安全性の観点から、オキシカルボン酸が好ましい。
【００１１】
オキシカルボン酸としては、乳酸、クエン酸、酒石酸、グリコール酸、リンゴ酸などが挙げられ、凍結乾燥時の活性保持の観点から、乳酸、クエン酸が好ましい。
【００１２】
なお、アルギニン以外の塩基性アミノ酸であるヒスチジン、リシンでも、凍結乾燥時の活性保持効果は認められるが、活性保持期間の観点から、アルギニンに比べて劣る。
【００１３】
本発明における化合物（Ａ）の添加量は、目的とする酵素等の有用物質１００部に対して１部〜１，０００部が好ましく、活性の保持の観点から１０部〜５００部がさらに好ましい。  添加量が１部未満の場合、十分に活性を保持することができなくなり、１，０００部より多い場合、実使用上効率的でないので適さない。
【００１４】
本発明の凍結乾燥方法によれば、有用物質の凍結乾燥後の活性が、凍結乾燥前に比べて、通常４０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上保持できる。
ここでいう活性とは、酵素および抗体の場合は力価を表し、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖、抗生物質およびビタミン類の場合は純度を表す。
従来の方法では、特に酵素の場合、一般に１０％前後しか力価が保持できなかったのに対して、本発明の方法によれば、力価を高い保持率で製造できるので、製造コストを大幅に改善することができる。
【００１５】
本発明の凍結乾燥方法で得られた有用物質は、さらに凍結乾燥後２５℃、１ヶ月間密閉した状態で保存した後においても、凍結乾燥前に比べて活性を３０％以上保持される。
従来の方法で得られた有用物質として、特に酵素の場合に、保存期間中にさらに活性が低下してしまうのに対して、本方法は、活性を長期間高い保持率で保持することができるので、食品、医薬品および生化学の分野において有効に使用することができる。
【００１６】
本発明の凍結乾燥方法の一例を以下に説明するが、化合物（Ａ）を凍結乾燥する直前に加えてもよいし、それより前の工程で加えていてもよい。
＜酵素の凍結乾燥による精製の場合＞
１．酵素水溶液に化合物（Ａ）を加え、かきまぜる。
２．これを液体窒素に浸漬し凍結する。
３．凍結乾燥機で減圧条件下、−４０℃で２晩乾燥させる。
【００１７】
本発明の凍結乾燥方法が適用できる有用物質としては特に限定されないが、酵素（Ｐ１）、組み換えタンパク質（Ｐ２）、抗体（Ｐ３）、ペプチド（Ｐ４）、アミノ酸（Ｐ５）、核酸（Ｐ６）、糖（Ｐ７）、抗生物質（Ｐ８）およびビタミン類（Ｐ９）などが挙げられる。
【００１８】
本発明が適用できる酵素（Ｐ１）としては、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素および脱離酵素などが挙げられる。
加水分解酵素としては、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼなどが挙げられる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼが挙げられる。
酸化還元酵素としては、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼなどが挙げられる。
合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ、クエン酸シンターゼなどが挙げられる。
脱離酵素としては、ペクチンリアーゼなどが挙げられる。
【００１９】
本発明が適用できる組み換えタンパク質（Ｐ２）としては、タンパク製剤、ワクチン等が挙げられる。
タンパク製剤としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン、カルシトニン等が挙げられる。
ワクチンとしては、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン等が挙げられる。
【００２０】
本発明が適用できる抗体（Ｐ３）としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル
抗体が挙げられる。
【００２１】
本発明が適用できるペプチド（Ｐ４）としては、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド、トリペプチドなどが挙げられる。
【００２２】
本発明が適用できるアミノ酸（Ｐ５）としては、例えばグルタミン酸、トリプトファン、アラニンなどが挙げられる。
【００２３】
本発明が適用できる核酸（Ｐ６）としてはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。
【００２４】
本発明が適用できる抗生物質（Ｐ７）としてはストレプトマイシンおよびバンコマイシンなどが挙げられる。
【００２５】
本発明が適用できる糖類（Ｐ８）としては、ヒアルロン酸、アルブミン、セラミド、エリスリトール、トレハロース、リポ多糖およびシクロデキストリンなどが挙げられる。
【００２６】
本発明が適用できるビタミン類（Ｐ９）としては、ビタミンＡ類およびそれらの誘導体並びにその塩、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２等のビタミンＢ類およびそれらの誘導体並びにその塩、ビタミンＣ類およびそれらの誘導体並びにその塩が挙げられる。
これらのうち、本発明の方法は、（Ｐ１）および（Ｐ２）に好適に適用され、特に（Ｐ１）の生産に適している。
【００２７】
本発明のもう１つの実施態様は、上記の凍結乾燥方法で得られた有用物質であり、具体的には、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド、アミノ酸、核酸、抗生物質、糖類またはビタミン類で、かつ高い力価などのの保持率を有するこれらの有用物質である。
これらのうち好ましいのは（Ｐ１）および（Ｐ２）、特に（Ｐ１）である。
【実施例】
【００２８】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
製造例１  （アルギニン・乳酸塩の合成）
２００ｍＬコルベンにアルギニン（和光純薬製）８．７ｇ（０．０５モル）を入れ、イオン交換水１００ｇに溶解させた。ここに９０％乳酸（和光純薬製）を５．０ｇ（０．０５モル）を少しずつ加え、６０℃で１時間加熱攪拌して反応させた。エバポレーターで濃縮後、水から再結晶してアルギニン・乳酸塩を得た。乾燥精製した後、用いた。
【００３０】
製造例２  （アルギニン・クエン酸塩の合成）
乳酸をクエン酸１水和物３．５ｇ（０．０１７モル）に変更する以外は製造例１と同様におこない、アルギニン・クエン酸塩を得た。
【００３１】
実施例１
リゾチーム（市販品「リゾチーム」和光純薬製、力価２００００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）５０ｍｇをイオン水１０ｇに溶解させ、アルギニン・乳酸塩３４ｍｇを加え、１分間軽くかき混ぜた。この溶液が入った容積２０ｍＬの密栓付きガラス瓶を液体窒素中に１分浸漬し凍結した。その後、凍結乾燥機（アルバック社製ＤＦ−０１Ｈ）で減圧下（０．１ｔｏｒｒ）、−４０℃で４０時間かけて凍結乾燥した。乾燥後、五酸化リンが入ったデシケーターで３日間保存し、水分の調整をおこない、本発明の凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１）を得た。
この（Ｒ−１）を後述の方法で酵素活性（力価）を測定した。
【００３２】
実施例２
アルギニン・乳酸塩の代わりに、アルギニン・クエン酸塩３１ｍｇを使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−２）を得た。
【００３３】
比較例１
アルギニン・乳酸塩の代わりに、トレハロース（和光純薬製）５０ｍｇを使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ’−１）を得た。
【００３４】
比較例２
アルギニン・乳酸塩の代わりに、グルコース（和光純薬製）２４ｍｇを使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ’−２）を得た。
【００３５】
＜酵素活性（力価）の測定＞
実施例１、２および比較例１、２で得られた凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１）、（Ｒ−２）、と（Ｒ’−１）、（Ｒ’−２）のそれぞれ１９．０、１９．８、１６．０、２１．６ｍｇを、それぞれ５ｇのイオン交換水に溶解させ、この水溶液１０μＬを０．４％枯草菌懸濁液（２０％枯草菌懸濁液１ｍｌにイオン交換水４６．５ｍＬおよび１モル／Ｌリン酸カリウム水溶液２．５ｍＬを加えて前もって調製したもの）３ｍＬに加えた。
加えた直後の４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ0）を分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定し、さらに５分後にもう一度吸光度（Ａ5）を測定し、これらの４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化DＡ＝Ａ0−Ａ5を読み取った。
また、実施例１、２および比較例１、２のリゾチーム濃度と同濃度の市販品「リゾチーム」で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて上記と同様に、４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（DＡb）を読み取った。
【００３６】
各凍結乾燥後のリゾチームの「力価の保持率」は以下の式を用いて算出した。
力価の保持率（％）＝（DＡ／DＡb） ×１００
【００３７】
また、実施例１、２および比較例１、２で得られた凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１）、（Ｒ−３）と（Ｒ’−１）、（Ｒ’−２）を２５℃、密封状態で１ヶ月保存した後、再び上記測定を行い、４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（DＡ’）を測定した。
【００３８】
各凍結乾燥リゾチームの１ヶ月保存後の力価の保持率は以下の式を用いて算出した。
【００３９】
１ヶ月保存後の力価の保持率（％）＝（DＡ’／DＡb） ×１００
【００４０】
上記実施例および比較例の力価の保持率と１ヶ月保存後の力価の保持率を表１に示す。
【００４１】
【表１】
2009023934.tif 000002
【００４２】
表１から、従来の添加剤は、凍結乾燥後の力価の保持率が低く、さらに経時的に力価が減少することがわかる。一方、本発明の添加剤は、凍結乾燥後の力価の保持率が高く、経時的な力価の減少も抑えられている。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の凍結乾燥方法は、タンパク質などの有用物質を凍結乾燥して精製する過程において使用できる。有用物質としては、タンパク質、アミノ酸、核酸、糖、抗生物質およびビタミン類が挙げられる。また、本発明の凍結乾燥方法は、凍結乾燥時に有用物質を変性することなく、かつ保存期間中に生理活性が低下しないので食品、医薬品、および生化学の分野において有効に使用することができる。