(57)【要約】【課題】血管拡張作用及び抗酸化作用のいずれの性質も備え、かつ長期服用が可能な、血管病の予防及び／又は治療薬を提供する。【解決手段】本発明の医薬組成物は、式（１）で表される化合物、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を有効成分として含有する、血管病の予防及び／又は治療用医薬組成物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
2009209081.tif 000010
〔式中、Ｒは−ＣＯＲ'（ここで、Ｒ'はＯＨ、ＮＨ2若しくはＣＨ3）、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＨ3又は−ＳＨである。〕
で表される化合物、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を有効成分として含有する、血管病の予防及び／又は治療用医薬組成物。
【請求項２】
血管病が動脈硬化性血管病である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記式（１）で表される化合物が、下記式（３）：
【化２】
2009209081.tif 000011
で表される化合物である、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
下記式（１）：
【化３】
2009209081.tif 000012
〔式中、Ｒは−ＣＯＲ'（ここで、Ｒ'はＯＨ、ＮＨ2若しくはＣＨ3）、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＨ3又は−ＳＨである。〕
で表される化合物、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含有することを特徴とする、血管拡張剤。
【請求項５】
下記式（１）：
【化４】
2009209081.tif 000013
〔式中、Ｒは−ＣＯＲ'（ここで、Ｒ'はＯＨ、ＮＨ2若しくはＣＨ3）、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＨ3又は−ＳＨである。〕
で表される化合物、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含有することを特徴とする、抗酸化剤。
【請求項６】
血管内酸化ストレスを解消及び／又は抑制するものである、請求項５記載の抗酸化剤。
【請求項７】
下記式（１）：
【化５】
2009209081.tif 000014
〔式中、Ｒは−ＣＯＲ'（ここで、Ｒ'はＯＨ、ＮＨ2若しくはＣＨ3）、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＨ3又は−ＳＨである。〕
で表される化合物、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含有する、血管病の予防及び／又は治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管病、特に動脈硬化性血管病を予防及び／又は治療するための医薬組成物に関する。詳しくは、還元型のアスパラガス酸又はその誘導体を有効成分として含有する、血管病の予防及び／又は治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化、高血圧、糖尿病等の血管病においては一酸化窒素ガス（NO）の生理活性が低下して、内皮依存性血管拡張の減弱が引き起こされる。この内皮依存性血管拡張の低下は、動脈硬化の進展、血圧の上昇、糖尿病における血管内皮障害に繋がり、血管病の予後に直結する。従って、NOによる血管拡張作用の低下は、動脈硬化の進展の重大な規定因子である。血管病におけるNOの生理活性低下には、血管内酸化ストレスの増加が密接に関わっていることが多くの知見により知られるようになった。
従って、還元作用を有する抗酸化剤は、種々の血管病に対して抗動脈硬化に作用することが期待されている（非特許文献１〜３）。抗酸化剤の中では、チオール（SH）基を有する、N-アセチルシステイン（NAC）や、アルファー・リポ酸が、血管内皮機能保護に働くことが示され、医薬品やサプリメントとして広く用いられる。従って、SH含有抗酸化剤は、抗動脈硬化作用を有する抗酸化剤として最も実用化が見込まれる薬剤の一つである（非特許文献４）。
【０００３】
近年、内皮依存性血管拡張物質としてNO以外にも多くのメディエーターが同定され、臨床応用が検討されてきた。アデノシンは虚血時の血管拡張に関わることが判明した。内皮依存性過分極因子（EDHF）は血管拡張作用と共に、抗炎症作用も有することが知られるようになった。また、プロスタサイクリンはその血管拡張作用から下肢閉塞性動脈硬化症や肺高血圧症に広く用いられている。内因性一酸化炭素（CO）も血管トーヌスを調節して局所血流調節に働く（非特許文献５）。カルシウム拮抗剤、ACE阻害剤、アルファー受容体拮抗薬、アンジオテンシンII受容体拮抗薬、亜硝酸薬等の降圧剤、抗狭心症薬、抗心不全薬の多くは血管拡張作用に依存する。
従って、抗動脈硬化薬を考慮するに当たり、血管拡張作用及び抗酸化作用の両方の作用を有する物質について、今後の広範な臨床応用が期待されている。また、動脈硬化症は数十年の単位で進行して、心血管イベントや脳卒中を引き起こすため、長期の服用が必要であり、その安全性は非常に重要と考えられている。
【０００４】
【非特許文献１】R.A. Cohen et al., Nitric oxide-induced vasodilatation: Regulation by physiological S-glutathiolation and pathologic oxidation of the sarcoplasmic endoplasmic reticulum calcium ATPase., Trends in Cardiovascular Medicine, 16(4): 109-14, 2006
【非特許文献２】T. Adachi et al., Antioxidant improves smooth muscle sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase function and lowers tyrosine nitration in hypercholesterolemia and improves nitric oxide-induced relaxation., Circ. Res., 90 (10): 1114-1121, 2002
【非特許文献３】T. Adachi et al., S-Glutathiolation by peroxynitrite activates SERCA during arterial relaxation by nitric oxide., Nat. Med.,.10(11): 1200-1207, 2004
【非特許文献４】T. Adachi et al., Decreased aortic glutathione levels may contribute to impaired nitric oxide-induced relaxation in hypercholesterolemia. Br J. Pharmacol., 129: 1014-1020, 2000
【非特許文献５】M. Ishikawa et al., Carbon monoxide from heme oxygenase-2 is a tonic regulator against nitric oxide-dependent vasodilatation in the adult rat cerebral microcirculation, Circ. Res., 97(12): e104-e114, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、血管拡張作用及び抗酸化作用のいずれの性質も備え、かつ長期服用が可能な、血管病の予防及び／又は治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、血管拡張作用及び抗酸化作用のいずれの性質も有する物質として、ホワイト・アスパラガスの先端部に多く含まれる含硫低分子であるアスパラガス酸（特に還元型のアスパラガス酸）及びその誘導体が、上記作用について優れた効果を発揮することを見出した。しかも、この還元型アスパラガス酸は、食用植物であるアスパラガスから抽出され得るものであるため、長期服用に対する安全性への危惧についても大幅に軽減されると考えた。本発明者はこのようにして本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００７】
（ｉ） 下記式（１）：
【化６】
2009209081.tif 000002
〔式中、Ｒは−ＣＯＲ'（ここで、Ｒ'はＯＨ、ＮＨ2若しくはＣＨ3）、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＨ3又は−ＳＨである。〕
で表される化合物、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を有効成分として含有する、血管病の予防及び／又は治療用医薬組成物。
上記（ｉ）の組成物において、血管病としては、例えば動脈硬化性血管病等が挙げられる。
上記（ｉ）の組成物において、式（１）で表される化合物としては、例えば下記式（３）：
【化７】
2009209081.tif 000003
等が挙げられる。
【０００８】
（ｉｉ） 下記式（１）：
【化８】
2009209081.tif 000004
〔式中、Ｒは−ＣＯＲ'（ここで、Ｒ'はＯＨ、ＮＨ2若しくはＣＨ3）、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＨ3又は−ＳＨである。〕
で表される化合物、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含有することを特徴とする、血管拡張剤。
【０００９】
（ｉｉｉ） 下記式（１）：
【化９】
2009209081.tif 000005
〔式中、Ｒは−ＣＯＲ'（ここで、Ｒ'はＯＨ、ＮＨ2若しくはＣＨ3）、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＨ3又は−ＳＨである。〕
で表される化合物、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含有することを特徴とする、抗酸化剤。
上記（ｉｉｉ）の抗酸化としては、例えば、血管内酸化ストレスを解消及び／又は抑制するもの等が挙げられる。
【００１０】
（ｉｖ） 下記式（１）：
【化１０】
2009209081.tif 000006
〔式中、Ｒは−ＣＯＲ'（ここで、Ｒ'はＯＨ、ＮＨ2若しくはＣＨ3）、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＨ3又は−ＳＨである。〕
で表される化合物、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含有する、血管病の予防及び／又は治療用キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、血管拡張作用及び抗酸化作用のいずれの性質も備え、かつ長期服用が可能な、血管病の予防及び／又は治療用医薬組成物を提供することができる。
本発明の医薬組成物は、血管拡張作用及び抗酸化作用の点で優れた効果を発揮する化合物を有効成分とすることで、血管病、特に動脈硬化性の血管病を予防及び／又は治療することができるため、例えば、今後高齢化人口の増加を迎える社会において極めて有用な医薬組成物（医薬）であると言える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１３】
１．本発明の概要
脳血管障害・虚血性心疾患などを含む動脈硬化性血管病による死亡は、現代の成人病死の約３０％を占める。我国が更なる高齢化社会を迎えるに当たり、新規血管病治療薬の開発は必須の問題である。慢性の動脈硬化症による血管病は、高血圧、糖尿病、喫煙、高脂血症、メタボリック・シンドロームにより引き起こされる。これらは数十年の単位で動脈硬化進展に関わるため、長期の服薬を考慮して安全性の高い抗動脈硬化薬の開発が重要である。近年、動脈硬化研究領域において、いくつかの目覚しい発展が認められた。一つは、一酸化窒素（NO）による血管拡張作用の低下が動脈硬化の進展に直接繋がることが示されたことである。NOの生理活性の低下には、血管内酸化ストレスの増強が深く関与している。従って、ビタミンやフェノールに代表される抗酸化作用をもつ薬物が、血管の保護に働くと考えられる。もう一つは、内皮依存性血管過分極因子（EDHF）や一酸化炭素（CO）といった種々の血管拡張因子が発見され、これらの多くが抗動脈硬化作用をもつことが示されたことであり、その臨床応用が期待されている。
【００１４】
ところで、アスパラガスは、水溶性ビタミンに富み、健康食品として広く摂取されているが、その抗動脈硬化作用については明らかではない。柳川らによって抽出されたアスパラガス酸は、ホワイト・アスパラガス先端部に多く含まれる含硫低分子の化合物であり、分子内に硫黄を有し、酸化型及び還元型が存在する（柳川 弘志ら, アスパラガスの成分―アスパラガス酸の化学構造と生理作用, The Japanese Society for Chemical Regulation of Plants, 8(1): 31-39, 1973）。アスパラガス酸は、植物の成長抑制作用を有することが知られていたが、本発明者は、その作用が動脈硬化進展に関わる血管平滑筋の増殖・遊走抑制に働くのではないかと考えた。また、還元型のアスパラガス酸については、２つのSH基を介した優れた抗酸化作用を有するのではないかと考えた。しかし、これらの物質の血管作用を直接検証した報告はこれまでに無く、特にアスパラガス酸が血管にどのように働くかは全く不明であった。
そこで本発明者は、鋭意実験を行うことにより、還元型のアスパラガス酸が、血管拡張作用を有すること、及びその作用機序がATP感受性カリウムチャンネルの活性化と強力な抗酸化作用とによることを発見した。これにより、本発明者は、還元型アスパラガス酸が、抗酸化作用により動脈硬化、高血圧、糖尿病等の血管障害に有効であると共に、血管拡張作用を介して降圧・抗虚血作用を有するものであり、さらに自然食品より抽出された新規抗血管病薬として臨床応用が可能なものであることを見出した。
【００１５】
２．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、下記式（１）で表される化合物（以下「化合物（１）」）を有効成分として含有することを特徴とするものである。化合物（１）は、−ＳＨ基を２つ有するジヒドロ体であり、前述したように、血管拡張作用及び抗酸化作用（特に血管内酸化ストレスに対する抗酸化作用）のいずれについても優れた効果を発揮し得るものであるため、血管病の予防及び／又は治療用医薬組成物の有効成分として極めて有用なものである。
【化１１】
2009209081.tif 000007
化合物（１）中、Ｒとしては、例えば、−ＣＯＲ'（Ｒ'としては、例えば、ＯＨ、ＮＨ2若しくはＣＨ3が挙げられる。）、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＨ3又は−ＳＨが挙げられる。中でも、Ｒとしては、下記式（３）で表される化合物（還元型アスパラガス酸）となるように、Ｒが−ＣＯＯＨであることが好ましい。
【化１２】
2009209081.tif 000008
【００１６】
なお、比較として、酸化型アスパラガス酸の構造を下記式（２）に表す。
【化１３】
2009209081.tif 000009
【００１７】
ここで、上記式（３）で表される還元型アスパラガス酸の取得方法は、特に限定はされず、市販されているものから取得してもよいし、公知の方法によりホワイト・アスパラガスから抽出、単離及び精製をしてもよいし（柳川 弘志ら, The Japanese Society for Chemical Regulation of Plants, 8(1): 31-39, 1973）、公知の化学合成技術を用いて取得してもよい。また、還元型アスパラガス酸の誘導体に相当する化合物（１）は、式（１）中のＲが所望の基となるように、還元型アスパラガス酸を出発物質として、公知の技術により合成することができる。
【００１８】
本発明の医薬組成物による治療又は予防対象となる血管病としては、例えば、動脈及び静脈のいずれの血管に関するものでもよく、限定はされないが、特に動脈硬化性の血管病が好ましく挙げられる。動脈硬化性血管病は、動脈硬化を基盤として生じる血管病であればよく、限定はされないが、例えば、脳卒中、大動脈瘤、閉塞性動脈硬化症、心筋梗塞、狭心症、虚血性腸炎、大動脈弁硬化狭窄症、腎動脈硬化症、一過性脳虚血、及び高血圧症等が挙げられる。
【００１９】
本発明の医薬組成物の有効成分である化合物（１）は、必要に応じ、薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物の状態で用いることができる。また、化合物（１）は、治療剤としての保存安定性を考慮して適当な化学的修飾がなされた状態で用いられてもよく、限定はされない。
薬理学的に許容し得る塩としては、限定はされないが、例えば、ハロゲン化水素酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、及びヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、及び重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、及びクエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えば、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、及びカンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えば、アスパラギン酸塩、及びグルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、及びカリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩、及びカルシウム塩など）、有機アミン塩（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、アルギニン及びリジンなどの有機塩基との塩）、アンモニウム塩などが好ましく挙げられ、なかでも塩酸塩が特に好ましい。
【００２０】
本発明の医薬組成物において、有効成分である化合物（１）、若しくはその塩、又はそれらの水和物の含有割合は、限定はされず、適宜設定することができるが、例えば、組成物全体に対し、90.0重量％以上であることが好ましく、より好ましくは99.0重量％以上、さらに好ましくは99.9重量％以上である。また、有効成分である化合物（１）、若しくはその塩、又はそれらの水和物は、より高純度に精製されたものであることが好ましく、限定はされないが、例えば、90.0％以上の純度が好ましく、より好ましくは99.0％以上、さらに好ましくは99.9％以上である。
【００２１】
本発明の医薬組成物は、化合物（１）、若しくはその塩、又はそれらの水和物以外に他の成分を含むことができる。他の成分としては、当該組成物の用法（使用形態）に応じて必要とされる製薬上の各種成分（薬学的に許容し得る各種担体等）が挙げられる。他の成分は、化合物（１）、若しくはその塩、又はそれらの水和物により発揮される効果が損なわれない範囲で適宜含有することができる。
本発明の医薬組成物は、ヒト又は非ヒト哺乳動物に対し、種々の投与経路で投与することができるが、通常、非経口（例えば静脈注射など）で投与することができる。有効成分として用いる化合物（１）、若しくはその塩、又はそれらの水和物は、単独で用いることも可能であるが、投与経路に応じて慣用される方法により薬学的に許容し得る担体を用いて適当な剤形に製剤化することができる。
【００２２】
好ましい剤形としては、例えば、注射剤（点滴剤を含む）等が好ましく挙げられる。これら製剤の製剤化に用い得る担体としては、通常用いられる賦形剤、その塩又はそれらの水和物のほか、必要に応じ、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、糖類（糖衣錠用）及び無痛化剤等が挙げられ、医薬品製剤の原料として用いることができる公知の成分を配合して常法により製剤化することが可能である。
上記公知の成分として使用可能な無毒性のものとしては、例えば、大豆油及び牛脂等の動植物油；流動パラフィン等の炭化水素；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の界面活性剤；ポリエチレングリコール等の水溶性高分子；エタノール及びグリセリン等の低級又は多価アルコール；グルコース等の糖；塩化ナトリウム等の無機塩；精製水等が挙げられ、いずれもその塩またはその水和物であってもよい。
【００２３】
本発明の医薬組成物を非経口投与（例えば注射投与）する場合、その有効な投与量は、例えば、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態、塩の種類、及び疾患の具体的な種類等に応じて異なり、限定はされないが、例えば、成人の場合は体重60kgの人で１日あたり、10μg〜5g、好ましくは100μg〜1gを、それぞれ１回で又は複数回に分けて投与することができる。なお、投与経路の違いにより治療等の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動し得ることが予測される。そのため、実際に用いられる投与法は、本明細書に記載の好ましい投与法から逸脱することがあってもよい。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的かつ経験的な最適化手順を用いて適宜調整することができる。
【００２４】
なお、本発明は、血管病（特に動脈硬化性血管病）の予防及び／又は治療用医薬組成物の製造のための、化合物（１）、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物の使用をも含むものである。
また、本発明は、血管病（特に動脈硬化性血管病）の予防及び／又は治療用の、化合物（１）、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含むものであり、本発明は、化合物（１）、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物の有効量を患者に投与することを特徴とする、血管病（特に動脈硬化性血管病）の予防及び／又は治療方法を含むものでもある。
さらに、前述したように、化合物（１）は血管拡張性及び抗酸化性に優れた効果を発揮するものであるため、本発明は、化合物（１）、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含有することを特徴とする、血管拡張剤又は抗酸化剤を提供することもできる。ここで、抗酸化剤としては、例えば、血管内酸化ストレスを解消及び／又は抑制するものであることが好ましい。
上記の本発明に含まれる又は本発明が提供し得る発明について、用法及び用量等の詳細は、前述した本発明の医薬組成物に関する説明を同様に適用することができる。
【００２５】
３．キット
本発明のキットは、前記化合物（１）、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物を含有することを特徴とするものである。当該キットは、血管病の予防及び／又は治療に好ましく用いることができる。なお、当該化合物（１）、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物の詳細については、本発明の医薬組成物についての説明が同様に適用できる。
本発明のキットにおいて、化合物（１）、若しくはその薬理学的に許容し得る塩、又はそれらの水和物の保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
本発明のキットは、前記化合物（１）等以外に他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、特に限定はされず、各種疾患の予防又は治療用キットの構成要素として含まれ得る公知のもの、例えば、溶解用又は希釈用等の各種バッファ、滅菌水、保存液、防腐剤、各種容器及び使用説明書（使用マニュアル）等を挙げることができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
＜方法＞
（１）Rat、Organ Chamberによる胸部大動脈血管張力の測定
Wister Rat (8〜12週齢、雄)をSodium Phentobarbital（50 mg/kg、腹腔内注射）にて麻酔後開胸して、胸部大動脈を取り出した。氷冷下クレブス液内（118.3mmol/L NaCl, 4.7mmol/L KCl, 2.5mmol/L CaCl2, 1.2mmol/L KH2PO4, 1.2mmol/L MgSO4, 25mmol/L NaHCO3, 5.5mmol/L dextrose; pH 7.4）で脂肪組織を取り除き、長さ5 mmの大動脈リングを作製した。血管リングをOrgan Chamber（Physiotech/Iwashiya、京都、日本）内の37℃、95% O2、5% CO2に平衡化したクレブス液内に装着し、5gの前負荷を段階的に90分かけて与えた。L-Phenyrephrin（PE: 0.1μM）を投与し、血管リングを収縮させた（1.5〜3g）。一部のリングでは、血管収縮30分前にNO合成酵素阻害剤L-wnitro-arginine methyl ester（L-NAME: 100μM）、及びATP依存性カリウムチャンネル（IKATP）阻害剤Glybenclamide（GLB: 10μM）の投与を行った。血管リング収縮後、酸化型アスパラガス酸（ASP-SS）又は還元型アスパラガス酸（ASP-SH）を0.3〜3mM投与して、血管が拡張するか否かを観察した。最大拡張のPEによる初期収縮の割合を「％Relaxation」として計算した（持続的に血管拡張する場合も考慮し、最大拡張はアスパラガス酸投与後15分以内での最大拡張時のデータとした。）（前記非特許文献２〜４：T. Adachi et al., Circ. Res., 90 (10): 1114-1121, 2002；T. Adachi et al., Nat. Med., 10(11): 1200-1207, 2004；T. Adachi et al., Br J. Pharmacol., 129: 1014-1020, 2000）。
血管拡張のスピードを検討する際には、同様の血管収縮後ASP-SH 3mMを一回投与して、血管の最大拡張の50%拡張する時間を「Relaxation Half Time」として記録した。
【００２７】
（２）血管内酸化型、還元型グルタチオン（GSSG、GSH）の測定
上記（１）と同様の実験下、ASP-SH投与前、投与後（15分）に血管リングをすばやくOrgan Chamberから取り出し、液体窒素を用いて迅速に凍結、代謝を固定した。血管片に5μl/mg tissueの10% Trichloro Acetic Acid + 100μM DTPA溶液を加えて、グラス−グラス ホモジェナイザーで，GSH、GSSGを溶出した。GSH、GSSGは高速液体クロマトグラフィー、クールアレー法で測定した（era Coulochem Model 520）。分析用カラムはMCM C18 column（250 mm × 4.6 mm i.d.; MC Medical, Tokyo, Japan）を用いた。バッファとして、A液: 100 mM NaH2PO4, pH2.1及び150μM Octansulfonic acid、並びにB液: 100 mM NaH2PO4 in 30% Acetnitril pH2.1及び150μM Octansulfonic acidを用いた。カラムをA液で平衡化し、10〜40分に、B液で濃度0〜70％のグラディエントを作製した。GSH及びGSSGピークは、クールメトリー分析機にて750 mV 波長の9分と18分とを測定し、スタンダードのGSH及びGSSG溶液で濃度を算出した。
【００２８】
＜結果＞
（１）Rat、Organ Chamberによる胸部大動脈血管張力の測定
図１に、Organ Chamberによる張力測定の典型的トレースを示す。ASP-SHは1mMよりPE収縮血管リングを拡張させた。ASP-SH 3mM投与後は持続的な血管拡張を認めた（59±10%）。(A) この血管拡張作用はGSH、NAC、システイン等の他のSH含有薬より強力であった（予備的データ）。ASP-SSは低濃度では全く拡張を認めなかった。(B) 3mMでは一部拡張するリングもあったが、一定の血管作用は示さず、有意な血管拡張は認めなかった（0±4%）。
一般にSHドナーはNOと結合してニトロソチオール（RSNO）を生成することが血管拡張機序として知られている（前記非特許文献４：T. Adachi et al., Br J. Pharmacol., 129: 1014-1020, 2000）。従って、NOの生理活性の低下する病的血管ではSH含有薬の効果が減少する可能性がある。従って、ASP-SHの血管拡張作用がNOとの相互作用であるか否かを検討するために、血管リングをNO合成阻害剤L-NAMEで30分間インキュベートした後、PE、ASP-SH投与を行った。非常に興味深いことに、L-NAME前投与は、むしろASP-SHの血管拡張作用を増強させた。
【００２９】
図２に、ASP-SHによる血管拡張（%Relaxation）の結果をまとめた。(A)に示すように、L-NAME前投与は0.3〜3 mMにわたり、全ての濃度で血管拡張作用を増強させた。特に、ASP-SH, 0.3 mMの低濃度では13±7%〜54±11%とL-NAME存在下のみ著明な血管拡張作用を認めた。これは、血管病においてNO合成が低下していることを考えると、血管病の強い部分に特異的に効果が高いことを示す所見であった。L-NAMEに加えて、NOシグナルの下流にあるグアニレート・サイクレースを阻害してもASP-SHによる血管拡張は減弱しなかった。このことからも、ASP-SHによる血管拡張機序はNO経路を介さないと考えられた。3mM 一回投与による比較でも49±10%〜92±6%と、L-NAME投与でASP-SHによる血管拡張作用の増強が認められた。ASP-SHが内皮障害のある血管でも拡張するか否かを検討するために、内皮を剥離した血管で拡張作用を比較した。ASP-SH 3 mMで50±4%〜77±6%と内皮を剥離した血管で著明に血管拡張作用が増強することがわかった。この後の実験は、病態血管への応用を考えて、全てL-NAME投与化で実験を行った。その結果を図３に示した。
【００３０】
内皮依存性の血管拡張には、EDHFで知られているように、しばしば外向きカリウムチャンネル活性化がその血管拡張作用に関与する。高カリウム刺激で外向きカリウムチャンネルを阻害したところ、ASP-SHによる血管拡張が73±4 %〜44±5%と減弱したことからASP-SHによる外向きカリウムチャンネル活性化の関与が示された。
ATP依存性カリウムチャンネル（IKATP）は細胞内のATP濃度が低下した際に開口するカリウムチャンネルで、虚血や低酸素時の組織血流保持や、臓器保護に強く関与する（M. Nakagawa et al., ATP-sensitive Potassium Channels Prevent Extension of Myocardial Ischemia to Subepicardium During Hemorrhagic Shock, Shock, in press, 2007）。ASP-SHによる血管拡張作用がIKATPを介するか否かを調べるために、その阻害剤GLB投与化でASP-SHによる血管拡張作用を検討した。GLB前投与は、ASP-SHによる最大拡張（％Relaxation：70±6%〜59±9%）は低下させる傾向にあったが有意差には至らなかった。しかし、GLBはASP-SHによる血管拡張早期のスピード（Relaxation Half Time）を著明に低下させた。（図３；Relaxation Half Time：262±70 msec〜392±90 msec）このことから、ASP-SHによる初期の血管拡張作用にIKATPの活性化が関与することが示された。
【００３１】
抗酸化作用は酸化ストレスが増大する動脈硬化、高血圧、糖尿病に伴う血管病治療薬を考えるに当たり重要な要因である。SH含有抗酸化剤は、細胞内のGSH-redox（GSSG/GSHで示される）を変化させることにより、細胞内の還元状態を保ち抗酸化ストレス作用に働く（前記非特許文献３及び４：T. Adachi et al., Nat. Med., 10(11): 1200-1207, 2004；T. Adachi et al., Br J. Pharmacol., 129: 1014-1020, 2000）。ASP-SHの抗酸化作用を調べるに当たり、血管リングにASP-SH投与15分後の血管内GSH及びGSSGをHPLCクールアレー法にて測定した。その結果を図４に示した。
ASP-SH投与15分後、GSSG濃度が31±2 nmol/g tissueから3±1 nmol/g tissueと約1/10に低下が認められた。その結果、GSSG/GSHは14±2%〜1.3±0.3%へと著明に低下した。このことは、ASP-SHが細胞内のSH基を強力に還元して、抗酸化ストレスに働くことが示された。この急性の強力な還元作用は既存のSH製剤（NAC）では認められなかった。
【００３２】
＜考察＞
本実施例では、ホワイト・アスパラガス先端部に存在するアスパラガス酸について、その血管拡張作用を検討して、抗動脈硬化薬、降圧剤、抗狭心剤、抗酸化剤としての薬効を検討することを目的に行ったところ、以下の結果を得た。
１）還元型アスパラガス酸（ASP-SH）は強力な血管拡張作用を有した。
２）その血管拡張作用は、NO合成阻害や内皮を剥離した血管で増強されることから、動脈硬化症など内皮障害のある血管で増強される可能性が示された。
３）その血管拡張作用の一部に外向きカリウムチャンネル、特にIKATP活性化を介するものであった。
４）ASP-SHは血管内GSSG/GSHを著明に低下したことから、強力な抗酸化作用を有することが分かった。
【００３３】
ASP-SHは植物抽出成分であり、強力な血管拡張作用を有することが判明した。その作用は内皮障害のある血管で増強し、抗酸化作用も有することから、様々な血管病に対する薬効が期待される新規血管作動薬となり得ることが示された。
アスパラガス酸は、前述したように、酸化型と還元型が存在する。本実施例で示したように、還元型（ASP-SH）が強い血管拡張作用を有する。しかし、in vivoにおいては血中や肝臓で酸化型アスパラガス酸（ASP-SS）は還元される可能性があるため、ASP-SSの血管作用についてはin vivoの系での更なる検討が必要であると考えられた。ASP-SHの血管拡張作用には、そのSH基による強力な細胞内還元作用が関与していると推測された。従って、ASP-SH内のカルボキシル基を他の置換基に変えることにより、SH基のpKaを低下させて、更なる還元力の強い低分子を開発し得ると考えられた。
【００３４】
ASP-SHの血管拡張作用は、NO非依存性であり、更にはNO合成阻害、内皮剥離血管で増強する特性を有する。これは、種々の病態血管でNOによる血管拡張が低下することを考えると、非常に興味深いものであった。アセチルコリン、ブラッディキニン、ATP等多くの血管作動物質は、内因性NO合成に依存する。また、同じSH基含有薬物でもNACの血管拡張作用はNO合成阻害では増強しない。虚血冠動脈、高血圧、糖尿病血管等ではNOによる血管拡張は減弱する。ASP-SHは、このような病態において、NO合成が低下した虚血部や、病態血管でより強く働き得ることが示された。すなわち、正常血管にはあまり影響を与えず、虚血や高血圧などで特異的に血管拡張に働く薬剤として用量設定されることにより、疾患治療に応用し得ることが示された。
【００３５】
EDHFに代表される血管過分局因子は外向きカリウムチャンネル活性化により血管拡張に働くことが知られ、この機序は新しい血管拡張薬へ応用されることが期待されている。ASP-SHによる血管拡張作用も、外向きカリウムチャンネル活性化を介して血管拡張に働く。その一部はIKATPを介していることが、阻害剤GLBを用いた検討で明らかとなった。IKATPは虚血や低酸素で活性化して臓器保護に働くため、ASP-SHが、このような病態で有効である可能性がある。IKATP活性化剤Nicorandilは広く抗狭心症薬として使われており、ASP-SHも心臓、脳及び腎臓等に対する臓器保護剤としての作用を有すると考えられた。
【００３６】
ASP-SHは血管内GSSG濃度を約1/10に減少させた。これは、この薬剤が非常に強い還元作用を有することを意味するものであった。NAC等、他のSH含有還元剤と比較しても、その作用は非常に強力であった。近年、酸化ストレスの増加が動脈硬化の進行に働くことは周知の事実である。また、ASP-SHは脂溶性であるために、ビタミンE等と同様にLipid Peroxidationを抑制する可能性があり、また、NAC等のSH含有抗酸化剤は血管平滑筋の増殖や遊走を阻害し、動脈硬化に伴う血管リモデリングを抑制することが報告されている（前記非特許文献１；T. Adachi et al., Drug Discovery Today, 2(1): 39-46, 2005）。アスパラガス酸は、実際にアスパラガスの成長抑制に働き、またNACより強力なSH抗酸化作用を有するため、血管拡張以外の抗動脈硬化作用も考えられた。また、アスパラガスには、葉酸を含む豊富なビタミンB類が含まれており、これらは容易に酸化変性されることが知られている。アスパラガス酸は、これらの必須ビタミン及びミネラルを安定化させている可能性があり、ビタミン剤の併用薬としての応用も可能と考えられた。
本実施例の結果から、食物より抽出されたアスパラガス酸（還元型のアスパラガス酸）は、血管病の予防及び／又は治療薬として非常に有用な特性を備えていること示された。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】アスパラガス酸の血管拡張作用を示す図である。  ラット大動脈血管リングをフェニレフリンで収縮後安定化し、アスパラガス酸を投与してその血管拡張（血管弛緩）作用を検討した。図１はその典型的なトレース（血管張力の記録）を示すものである。（A）還元型アスパラガス酸（ASP-SH）は著明な血管拡張作用を示した。（B）酸化型アスパラガス酸は極軽度の血管拡張作用を認めたが、個体によっては全く拡張しなかった。（C）NO合成酵素阻害剤L-NAMEを前投与したところ、ASP-SHによる血管拡張は著明に増強した。
【図２】L-NAMEによるNO合成阻害下での還元型アスパラガス酸（ASP-SH）による血管拡張作用増強を示す図である。（A）ASP-SH（0.3-3 mM）による血管拡張はL-NAME(100μM)前投与にて著明に増強した。（B）ASP-SH単回投与（3 mM）時の血管拡張もL-NAME投与にて著明に増強した。
【００３８】
【図３】Glybenclamide（GLB）によるIKATP阻害下での還元型アスパラガス酸（ASP-SH）による血管拡張を示す図である。  GLBはASP-SHによる血管の最大拡張には有意な変化は与えなかったが、血管拡張のスピードは著明に低下させた。これはASP-SHによる血管拡張の初期にIKATPが関与することを示すものであった。
【図４】ASP-SH投与15分後の血管内GSH及びGSSG濃度の変化を示す図である。（A）ASP-SH投与15分後、血管内GSH濃度に著変は認めなかった。血管内GSSG濃度は著明に低下した。（B）その結果、血管内Redoxの指標であるGSSG/GSH比はASP-SH投与後約1/10に低下した。すなわち、ASP-SHは強力な細胞内還元作用を有し、抗酸化作用を有することが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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