(57)【要約】【課題】多数の微量な試料溶液中の酵素活性を、水素イオン濃度を測定することにより、直接かつ迅速に計測することが可能な酵素活性測定装置を提供する。【解決手段】複数のウェルを有するマイクロプレートを測定容器として、水素イオン濃度変化を介して試料溶液の酵素活性を測定する装置であって、前記マイクロプレートを収容するマイクロプレート収容室と、前記マイクロプレート収容室を加湿する加湿器と、前記マイクロプレート収容室の温度を調節する温度調節機構と、前記マイクロプレートの各ウェルに１対に挿入可能である複数の水素イオン検出センサ及び参照電極対と、を備えるようにした。【選択図】図１
2009162519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のウェルを有するマイクロプレートを測定容器として、水素イオン濃度変化を介して試料溶液の酵素活性を測定する装置であって、
前記マイクロプレートを収容するマイクロプレート収容室と、
前記マイクロプレート収容室を加湿する加湿器と、
前記マイクロプレート収容室の温度を調節する温度調節機構と、
前記マイクロプレートの各ウェルに１対に挿入可能である複数の水素イオン検出センサ及び参照電極対と、を備えている酵素活性測定装置。
【請求項２】
前記ウェルに収容された液体を攪拌する攪拌機構と、
前記ウェルに液体を注入する注入機構と、を備えている請求項１記載の酵素活性測定装置。
【請求項３】
前記水素イオン検出センサ及び前記参照電極を自動校正する自動校正機構と、
前記水素イオン検出センサ及び前記参照電極を洗浄する洗浄機構と、
前記水素イオン検出センサ及び前記参照電極を乾燥する乾燥機構と、を備えている請求項１又は２記載の酵素活性測定装置。
【請求項４】
前記水素イオン検出センサは、ガラス電極、ＩＳＦＥＴ、又は、ケミカルＣＣＤである請求項１、２又は３記載の酵素活性測定装置。
【請求項５】
前記ＩＳＦＥＴ又はケミカルＣＣＤは、前記ウェルに挿入されたときに、前記ウェルの底面と対向するように設けられている請求項４記載の酵素活性測定装置。
【請求項６】
前記水素イオン検出センサ及び前記参照電極は、一体となっている請求項１、２、３、４又は５記載の酵素活性測定装置。
【請求項７】
前記加湿器は、超音波方式による加湿器、又は、加熱方式による加湿器である請求項１、２、３、４、５又は６記載の酵素活性測定装置。
【請求項８】
前記水素イオン検出センサ又は前記参照電極が運動することにより、前記ウェルに収容された液体を攪拌する請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の酵素活性測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、多数の微量な試料溶液の水素イオン濃度を一度に測定することが可能な酵素活性測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、検体中の微量物質を測定する方法としては、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）を用いて吸光度を介して酵素活性を測定する方法（特許文献１）や、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて放射能を測定する方法等が用いられている。
【０００３】
測定対象物質が酵素や酵素基質である場合も、微量の検体中の酵素活性を直接測定することは困難であったので、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡや、ＲＩＡを用いて増幅された反応が測定されていた。
【０００４】
しかしながら、これらの分析方法は工程が多段階にわたるため、作業が煩雑であり分析に時間がかかり、また、多数の試薬が必要となる。更に、ＲＩＡではラジオアイソトープを使用するので、安全性を確保するために、操作・取り扱いに細心の注意が必要となる。
【０００５】
また、酵素活性の測定においては温度調節が必要な場合が多いため、検体が微量であると、温度調節する際に乾燥により体積が減少し、正確な測定が妨げられていた。
【特許文献１】特開平８−９４６３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、多数の微量な試料溶液中の酵素活性を、水素イオン濃度を測定することにより、直接かつ迅速に測定することが可能な酵素活性測定装置を提供すべく図ったものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明に係る酵素活性測定装置は、複数のウェルを有するマイクロプレートを測定容器として、水素イオン濃度変化を介して試料溶液の酵素活性を測定する装置であって、前記マイクロプレートを収容するマイクロプレート収容室と、前記マイクロプレート収容室を加湿する加湿器と、前記マイクロプレート収容室の温度を調節する温度調節機構と、前記マイクロプレートの各ウェルに１対に挿入可能である複数の水素イオン検出センサ及び参照電極対と、を備えていることを特徴とする。
【０００８】
このようなものであれば、微量な多種類の試料溶液の水素イオン濃度を水素イオン検出センサにより直接かつ迅速に測定することができる。このため、本発明に係る酵素活性測定装置を酵素活性の測定に使用すれば、免疫反応を利用する場合に必要とされる前処理を省略することができ、簡便な操作により短時間で測定を行うことができる。また、免疫反応を利用する場合に必要とされる前処理を省略することができるので、使用する試薬の量・種類ともに減らすこともできる。更に、本発明に係る酵素活性測定装置は、加湿器を備えているので、試料溶液からの水分の蒸発を防ぎ、試料溶液の体積の変動を抑えることができるので、試料溶液が微量であっても、測定誤差を抑制して、精度の高い測定を可能とする。
【０００９】
本発明に係る酵素活性測定装置は、更に、前記ウェルに収容された液体を攪拌する攪拌機構と、前記マイクロプレート収容室の温度を調節する温度調節機構と、前記ウェルに液体を注入する注入機構と、を備えていることが好ましい。
【００１０】
本発明に係る酵素活性測定装置は、更に、前記水素イオン検出センサ及び前記参照電極を自動校正する自動校正機構と、前記水素イオン検出センサ及び前記参照電極を洗浄する洗浄機構と、前記水素イオン検出センサ及び前記参照電極を乾燥する乾燥機構と、を備えていることが好ましい。
【００１１】
前記水素イオン検出センサとしては、例えば、ガラス電極、ＩＳＦＥＴ、ケミカルＣＣＤ等が挙げられる。
【００１２】
前記ＩＳＦＥＴ又はケミカルＣＣＤは、前記ウェルに挿入されたときに、前記ウェルの底面と対向するように設けられていることが好ましい。
【００１３】
前記水素イオン検出センサ及び前記参照電極は、一体となっていることが好ましい。
【００１４】
前記加湿器としては、超音波方式による加湿器や、加熱方式による加湿器等が使用される。
【００１５】
前記ウェルに収容された液体を攪拌する態様としては、前記水素イオン検出センサ又は前記参照電極が運動することにより、前記ウェルに収容された液体を攪拌するものであってもよい。
【発明の効果】
【００１６】
このように本発明によれば、微量な多種類の試料溶液の水素イオン濃度を水素イオン検出センサにより直接かつ迅速に測定することができる。また、本発明は、試料溶液からの水分の蒸発を防ぎ、試料溶液の体積の変動を抑えることができるので、試料溶液が微量であっても、測定誤差を抑制して、精度の高い測定を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の一実施形態を図面を参照して説明する。
【００１８】
本実施形態に係る酵素活性測定装置１は、マイクロプレートＭに設けられたウェルＷに収容された試料溶液中の酵素活性を、水素イオン濃度を測定することにより計測することができるものであり、図１に示すように、マイクロプレートＭを収容するマイクロプレート収容室２と、マイクロプレート収容室２を加湿する加湿器３と、マイクロプレートＭに設けられた複数のウェルＷに１本ずつ挿入可能である複数の水素イオン検出複合電極４と、を備えている。
【００１９】
加湿器３は、マイクロプレート収容室２内の水蒸気圧が飽和水蒸気圧となるようにマイクロプレート収容室２内を加湿するものである。マイクロプレート収容室２内をこのように加湿することにより、マイクロプレートＭのウェルＷに収容された試料溶液からの水分の蒸発が防止されるので、ウェルＷ中の試料溶液の酵素濃度の変動が抑制されて、より精度の高い分析を行うことが可能となる。加湿器３としては、超音波方式による加湿器や、加熱方式による加湿器等が挙げられる。
【００２０】
水素イオン検出複合電極４は、水素イオン検出センサと参照電極とが一体となったものであり、その先端に設けられた液絡部と水素イオン感応部をマイクロプレートＭのウェルＷに挿入して試料溶液に浸漬することが可能な大きさを有するものである。前記水素イオン検出センサとしては、例えば、ガラス電極、ＩＳＦＥＴ（Ｉｏｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｔｒａｓｉｓｔｅｒ）、いわゆるケミカルＣＣＤ（特開平１０−３３２４２３及び特開平１１−２０１７７５参照）等が挙げられる。前記ＩＳＦＥＴとしては、例えば、ゲート上にＳｉＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、Ｔａ２Ｏ５等からなる薄膜が形成されているものが挙げられる。
【００２１】
前記ＩＳＦＥＴ又はケミカルＣＣＤは、ウェルＷに挿入されたときに、ウェルＷの底面と対向するように設けられていることが好ましい。このようなものであれば、ウェルＷ中に収容された試料溶液が５０μＬ以下の微量であってもＩＳＦＥＴ又はケミカルＣＣＤによる測定が可能となる。
【００２２】
一方、前記参照電極としては、例えば、内部液が含浸している中空糸と、前記中空糸の中空に挿入された内部電極と、を備えている中空糸電極や、支持管と、前記支持管に充填された内部液と、前記内部液に浸漬された内部電極と、前記支持管の開口部に設けられた多孔質セラミックスからなる液絡部と、を備えている汎用電極等が挙げられる。
【００２３】
前記中空糸電極は、例えば、フッ素樹脂等からなる支持管の内部空間に、ＫＣｌ溶液等の内部液が含浸している中空糸が挿入されており、中空糸の中空には更にＡｇ／ＡｇＣｌからなる内部電極が挿入されているものである。
【００２４】
このような水素イオン検出センサと参照電極とが一体となった水素イオン検出複合電極４の１例としてＩＳＦＥＴが使用されたものとしては、例えば、図２及び図３に示すように、内部が２つに仕切られた支持管４１が設けてあり、支持管４１の仕切られた一方の側はｐＨ電極支持管４１ａ、他方の側は参照電極支持管４１ｂとなっているものである。
【００２５】
ｐＨ電極部４２は、ｐＨ電極支持管４１ａと、その下端部に設けられたＩＳＦＥＴからなるプロトン感応部４３と、を備えており、参照電極部４４は、参照電極支持管４１ｂと、その内部空間に充填された内部液４５と、内部液４５に浸漬された例えば銀／塩化銀からなる内部電極４６と、プロトン感応部４３に近傍に設けられた液絡部４７と、参照電極支持管３ａの基端部に設けられた通気部４８と、を備えているように構成されている。
【００２６】
水素イオン検出複合電極４には図示しない駆動機構が備わっていて、測定対象であるウェルＷの上方まで水平移動して、測定対象であるウェルＷの上方まで来ると、次いで、下降して液絡部及び水素イオン感応部をウェルＷ中の試料溶液に浸漬することができる。また、水素イオン検出複合電極４にピエゾ素子等からなる振動子が備わっていて、水素イオン検出複合電極４が細かく振動することにより、攪拌機構として機能して、ウェルＷに注入された検体と試薬とを攪拌・混合して、酵素反応を均一に起こすことができる。
【００２７】
また、水素イオン検出複合電極４には図示しない洗浄機構、乾燥機構、及び、自動校正機構が備わっており、１つのウェルＷから次のウェルＷに移動する際にこれらの機構が作動して、水素イオン検出複合電極４を常に洗浄に保ち検体への夾雑物の混入を防いで精度の高い測定を維持する。
【００２８】
更に、マイクロプレート収容室２には、検体や試薬等の溶液をウェルＷに注入する機構としてタンク５１、配管５２及び複数のノズル５３からなる注入機構５と、マイクロプレート収容室２の温度を調節する温度調節機構として温度調節装置６と、水素イオン検出複合電極４により測定された電位差から得られた水素イオン濃度に所定の演算処理を施して酵素活性を算出する情報処理装置７と、が備わっている。
【００２９】
注入機構５は、例えば、タンク５１に収容しておいた試薬を、図示しないポンプを有する配管５２を流通させて、ノズル５３から所定量ずつ各ウェルＷに分注するものである。ノズル５３には図示しない駆動機構が備わっていて、注入対象であるウェルＷの上方まで水平移動することができる。また、タンク５１は温度調節機能を有している恒温タンクであってもよい。
【００３０】
このような注入機構５としては、例えば、シリンジポンプを用いた機構、インクジェット方式を用いた機構等が挙げられる。
【００３１】
温度調節装置６は、マイクロプレート収容室２内の温度を所定の温度に調節するものである。このようなものが備わっていると、マイクロプレート収容室２内の温度を酵素が触媒機能を発現するのに最適な温度である至適温度に調節して、酵素反応を安定的に進行させることができる。なお、一般的な酵素の至適温度は通常約３７℃である。
【００３２】
また、マイクロプレート収容室２内に有する水素イオン検出複合電極４の温度も併せて、試料温度に合わせることができ、温度影響を受けやすいｐＨ（水素イオン）による測定において、温度差による誤差を小さくすることができる。
【００３３】
このような温度調節装置６としては、例えば、シートヒータ、ブロックヒータ、恒温水を循環させる装置、ペルチェ素子を用いた装置等が挙げられる。
【００３４】
情報処理装置７は、水素イオン検出複合電極４により測定された電位差から得られた水素イオン濃度に所定の演算処理を施して酵素活性を算出するものである。このような情報処理装置７は、ＣＰＵ、内部メモリ、ＨＤＤ等の外部記憶装置、モデム等の通信インタフェース、ディスプレイ、マウスやキーボードといった入力手段等を有し、前記内部メモリや外部記憶装置等の所定領域に設定したプログラムにしたがってＣＰＵやその周辺機器を作動させることにより、データ解析が行なわれるように構成してある。かかる情報処理装置７は、汎用のコンピュータであってもよく、専用のものであってもよい。また、この情報処理装置７は、物理的に一体である必要はなく、有線又は無線により複数の機器に分割されていても構わない。
【００３５】
情報処理装置７が、酵素活性を算出する方法としては、水素イオン濃度の変化を連続的に測定する方法、水素イオン濃度が定常状態に達したエンドポイントを測定する方法、水素イオン濃度増加の初速度を測定する方法のいずれであってもよく、適宜選択可能に構成してある。
【００３６】
本実施形態に係る酵素活性測定装置１に適用可能なマイクロプレートＭとしては特に限定されず、水素イオン検出複合電極４の太さを変えることにより、例えば、ウェルＷの直径が７ｍｍの９６穴プレートからウェルＷの直径が２ｍｍの３８６穴プレート程度までを使用することができる。
【００３７】
次に、本実施形態に係る酵素活性測定装置１を用いて酵素活性を測定する方法として、検体としてウレアーゼを含有するものを用い、試薬としてウレアーゼの基質である尿素を含有するものを用いる場合を、図４に示すプロトコルを参照して説明する。
【００３８】
ここで、ウレアーゼ（Ｕｒｅａｓｅ）は、下記式に示すような加水分解反応により、尿素を二酸化炭素とアンモニアに分解する酵素（ＥＣ  ３．５．１．５）である。
【００３９】
（ＮＨ２）２ＣＯ＋Ｈ２Ｏ→ＣＯ２＋２ＮＨ３
【００４０】
このような酵素反応によりアンモニアが発生するとｐＨがアルカリ側に変化する。そして、この酵素反応により生じたｐＨ変化を測定することにより、酵素活性を測定することが可能となる。
【００４１】
前記酵素反応により生じたｐＨ変化を測定するには、まず、酵素活性測定装置１の電源を入れて（工程Ｎｏ．１）、ｐＨ４，７，９の標準緩衝液をマイクロプレートに１列ずつ加える（工程Ｎｏ．２）。検体（ウレアーゼ含有）及び試薬（尿素含有）を約３７℃に設定された恒温タンク５１にそれぞれ収容し（工程Ｎｏ．３）温度調節を行なう。その間に、ｐＨ７、ｐＨ４、ｐＨ９の順にそれぞれのｐＨの緩衝液に水素イオン検出複合電極４を浸漬してｐＨ設定を行い（工程Ｎｏ．４〜８）、校正を実施する（工程Ｎｏ．９）。
【００４２】
次に、温度調節された試薬を注入機構５を介して各ウェルＷに分注してから、各ウェルＷに水素イオン検出複合電極４を挿入して、試薬のｐＨ測定を行なう（工程Ｎｏ．１０）。ｐＨ測定値が安定した後で、各ウェルＷ中の試薬に注入機構５を介して適量の検体を加え、試薬と検体とを攪拌した後で、酵素反応によるｐＨ変化を測定する（工程Ｎｏ．１１）。測定終了後に電極を洗浄し（工程Ｎｏ．１２）、純水に浸漬して保管する。
【００４３】
このように構成した本実施形態に係る酵素活性測定装置１によれば、多種類の微量な検体の酵素活性を水素イオン検出センサにより直接かつ迅速に測定することができるので、簡便な操作により短時間で測定を行うことができる。また、免疫反応を利用する場合に必要とされる前処理を省略することができるので、使用する試薬の量・種類ともに減らすこともできる。更に、本実施形態に係る酵素活性測定装置１は、加湿器３を備えているので、検体からの水分の蒸発を防ぎ、検体の体積の変動を抑えることができるので、検体が微量であっても、測定誤差を抑制して、精度の高い測定を可能とする。
【００４４】
更に、温度調節機構を有することにより、水素イオン検出複合電極４本体の温度と試料温度の差を小さくすることができ、測定誤差をより小さくすることができる。
【００４５】
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
【００４６】
攪拌機構としては前記実施形態におけるものに限られず、振盪器、超音波を利用するもの、小型のマグネチックスターラ等であってもよい。
【００４７】
各ウェルＷに検体や試薬を注入するためには機械的な注入機構５を備えていなくとも良く、ピペットを用いて手動により各ウェルＷに検体や試薬を分注してもよい。
【００４８】
水素イオン検出センサと参照電極とは一体化して複合電極を構成していなくともよく、互いに分離していてもよい。
【００４９】
本実施形態に係る酵素活性測定装置１においては、複数の水素イオン検出複合電極４が１列に配置されており、マイクロプレートＭのウェルＷを１列ずつ測定するように構成してあるが、より多数の水素イオン検出複合電極４が複数列に配置されていて、１枚のマイクロプレートＭ上の全ウェルＷを同時に測定できるように構成してあってもよい。
【００５０】
本実施形態に係る酵素活性測定装置１は酵素反応により生じた水素イオン濃度だけでなく、多種類の緩衝液等のｐＨを同時に測定することもできる。
【００５１】
本発明に係る酵素活性測定装置は、ＥＬＩＳＡ等のエンザイムイムノアッセイにおいて標識として水素イオンを発生する反応を触媒する酵素を使用した場合にも使用することができる。その場合、本発明に係る酵素活性測定装置は、マイクロプレートＭを洗浄したり乾燥したりする機構を備えていることが好ましい。
【００５２】
その他、前述した実施形態や変形実施形態の一部又は全部を適宜組み合わせてもよく、その趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能であるのは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の一実施形態に係る酵素活性測定装置の模式的機器構成図。
【図２】同実施形態における水素イオン検出複合電極の全体構成を示す図。
【図３】同実施形態における水素イオン検出複合電極の構成を示す断面図（図２のＡ−Ａ線断面図）。
【図４】同実施形態において酵素活性を測定する方法を示すプロトコル。
【符号の説明】
【００５４】
１・・・酵素活性測定装置
２・・・マイクロプレート収容室
３・・・加湿器
４・・・水素イオン検出複合電極
Ｍ・・・マイクロプレート
Ｗ・・・ウェル
【図１】
2009162519.tif 000003
【図２】
2009162519.tif 000004
【図３】
2009162519.tif 000005
【図４】
2009162519.tif 000006