(57)【要約】【課題】上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼインヒビターを利用した新規なイメージング剤を提供すること。【解決手段】本発明の腫瘍イメージング剤は、下記化合物［（３−エチニル−フェニル）−キナゾリン−４−イル−アミン］に代表される特定のキナゾリン誘導体を放射性標識した標識化合物から成る。該特定のキナゾリン誘導体は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼを阻害する作用を示し、これを用いた本発明の腫瘍イメージング剤は、腫瘍組織への集積比が１よりも高い。2009161477.tif 000010【選択図】図１
2009161477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（I）
【化１】
2009161477.tif 000008
[式中
R1、R2、R3はそれぞれ独立して
（１）R基、
（２）ハロゲン、
（３）−NHR基、−RNHR'NR''基、−RNHR'OR''基、若しくは−RNHR'SR''基、
（４）−OR基、−OROR'基、−ROR'NR''基、−ROR'OR''基、若しくは−ROR'SR''基、又は
（５）−SR基、−RSR'NR''基、−RSR'OR''基、若しくは−RSR'SR''基
（ここでR、R'及びR''はそれぞれ独立して水素又は炭素数１〜１０のアルキル基又はアルキレン基を表し、該アルキル基又はアルキレン基中の炭素原子は=O又は=Sで置換されていてもよい）
を表し、
R4、R5、R6、R7、R8はそれぞれ独立して
（１）ハロゲン、
（２）−OH、−NH2、若しくは−NO2又は
（３）炭素数１〜１０のアルキル基、アルケニル基、若しくはアルキニル基（ここでアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基中の炭素原子はハロゲンで置換されていてもよい）
を表す]
で示されるキナゾリン誘導体を放射性標識した標識化合物から成る腫瘍イメージング剤。
【請求項２】
一般式(I)において、前記全てのアルキル基、アルキレン基、アルケニル基及びアルキニル基の炭素数が１〜４である請求項１記載の腫瘍イメージング剤。
【請求項３】
一般式(I)において、R4、R5、R6、R8が水素であり、R7がエチニル基である請求項１又は２記載の腫瘍イメージング剤。
【請求項４】
一般式(I)において、R1、R2がそれぞれ独立して水素又は−OROR'基であり、R3が水素である請求項３記載の腫瘍イメージング剤。
【請求項５】
一般式(I)において、R1、R2が共に水素である請求項４記載の腫瘍イメージング剤。
【請求項６】
前記放射性標識は放射性ハロゲン、放射性ガリウム又は放射性テクネチウムである請求項１ないし５のいずれか１項に記載の腫瘍イメージング剤。
【請求項７】
前記標識化合物は、下記一般式(II)
【化２】
2009161477.tif 000009
[式中、R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8は前記定義に同じであり、Xはキレート剤構造を表す]
で示される化合物のキレート剤構造部分に放射性金属が結合したものである請求項１ないし６のいずれか１項に記載の腫瘍イメージング剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キナゾリン骨格を有する化合物を利用した腫瘍イメージング剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR）は、細胞内チロシンキナーゼドメインと、膜貫通ドメインと、細胞外リガンド結合ドメインとから成る膜貫通型レセプターであり、様々な悪性腫瘍で過剰発現していることが知られている。近年、EGFRを標的とした分子標的治療薬が頭頚部癌、大腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌に臨床応用されている。そのようなEGFR標的治療薬としては、ゲフィチニブやエルロチニブなどが挙げられるが、これらはEGFRチロシンキナーゼのＡＴＰ結合部位にＡＴＰと競合的に結合することにより、EGFRの自己リン酸化を阻害し、シグナル伝達を遮断する作用を示す。
【０００３】
欧米でのEGFRチロシンキナーゼインヒビターを利用した分子標的製剤の臨床治験では、著名な効果を示す症例がいる一方で、死亡などの重篤な副作用が報告されている。また、欧米での臨床治験では、対象が免疫組織染色にてEGFR陽性であることが条件とされていた。しかしEGFRの遺伝子変異をみる標準的な測定・評価方法が確立されておらず、方法・手技により検出率が異なる可能性があること、また切除不能肺癌においては正常細胞の混入の少ない検体を得ることが困難なことがしばしばあることが問題とされてきた。また、EGFRチロシンキナーゼインヒビターを標的とした分子標的薬剤として市販されたゲフィチニブ（商品名イレッサ）は、米国で遺伝子変異がゲフィチニブの感受性予測因子であると報告されたが、その後遺伝子変異と感受性とが完全には一致しないことが研究で示され、遺伝子変異は本剤投与の適応を決定するほどの確実性・現実性はないと判断されている。
【０００４】
EGFRチロシンキナーゼインヒビターを利用した分子標的放射線イメージング製剤の開発により、ガンマ線あるいはポジトロン機能画像を評価することで、すでに市販されている分子標的治療薬が持つ致命的な副作用発現の予見や、治療対象となるEGFR発現症例のよりよい選択が可能になることが期待される。
【０００５】
EGFRチロシンキナーゼインヒビターを利用したイメージング製剤としては、イスラエルのグループが報告した非特許文献１〜２及び特許文献１に記載のイメージング剤や、特許文献２に記載のイメージング剤がある。これらはいずれもキナゾリン骨格を有する化合物の誘導体を利用したものであるが、臨床応用上有用なイメージング剤の開発がさらに望まれている。
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５０５１０１号公報
【特許文献２】特開２００７−１９１４３０号公報
【非特許文献１】J. Med. Chem. (2005) vol.48, p.5337-5348
【非特許文献２】Int. J. Cancer: (2002) vol.101, p.360-370
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、EGFRチロシンキナーゼインヒビターを利用した新規なイメージング剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、キナゾリン骨格を有する４−アニリノキナゾリン誘導体がEGFRチロシンキナーゼを阻害する能力を有し、該誘導体を放射性標識した化合物が生体内において正常筋肉組織よりも腫瘍に有意に多く蓄積することを見出し、本願発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記一般式（I）
【００１０】
【化１】
2009161477.tif 000003
【００１１】
[式中
R1、R2、R3はそれぞれ独立して
（１）R基、
（２）ハロゲン、
（３）−NHR基、−RNHR'NR''基、−RNHR'OR''基、若しくは−RNHR'SR''基、
（４）−OR基、−OROR'基、−ROR'NR''基、−ROR'OR''基、若しくは−ROR'SR''基、又は
（５）−SR基、−RSR'NR''基、−RSR'OR''基、若しくは−RSR'SR''基
（ここでR、R'及びR''はそれぞれ独立して水素又は炭素数１〜１０のアルキル基又はアルキレン基を表し、該アルキル基又はアルキレン基中の炭素原子は=O又は=Sで置換されていてもよい）
を表し、
R4、R5、R6、R7、R8はそれぞれ独立して
（１）ハロゲン、
（２）−OH、−NH2、若しくは−NO2又は
（３）炭素数１〜１０のアルキル基、アルケニル基、若しくはアルキニル基（ここでアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基中の炭素原子はハロゲンで置換されていてもよい）
を表す]
で示されるキナゾリン誘導体を放射性標識した標識化合物から成る腫瘍イメージング剤を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、EGFRチロシンキナーゼ阻害活性を有するキナゾリン誘導体を利用した新規な腫瘍イメージング剤が提供された。本発明の腫瘍イメージング剤を生体に投与し、該イメージング剤からの放射線を体外で測定し解析することにより、腫瘍を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で用いられるキナゾリン誘導体は、上記一般式(I)で示されるものである。上記した置換基R1ないしR3が表し得るアルキル基及びアルキレン基、並びにR4ないしR8が表し得るアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基は、直鎖及び分枝鎖の両者を包含するものとする。また、R1ないしR3が表し得るアルキル基及びアルキレン基においては、１以上の炭素原子が=O又は=Sで置換されていてもよい。すなわち、該アルキル基及びアルキレン基の炭素鎖を構成する炭素原子は、カルボニル基又はチオカルボニル基を形成していてもよい。上記「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。キナゾリン骨格４位に結合するアニリノ基の環構造上の置換基R4ないしR8が表し得るアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基においては、炭素鎖を構成する１以上の炭素原子がハロゲンで置換されていてもよい（すなわち、炭素原子がハロゲンと結合していてもよい）。
【００１４】
上記した一般式(I)のキナゾリン誘導体のうち、好ましい置換基の例としては以下のものが挙げられる。
【００１５】
R1、R2、R3が表し得るアルキル基及びアルキレン基としては、炭素数１〜４であるものが好ましい。また、R4、R5、R6、R7、R8が表し得るアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基としては、炭素数１〜４であるものが好ましい。
【００１６】
キナゾリン骨格の６位及び７位にそれぞれ結合する置換基R1及びR2としては、それぞれ独立してR基又は−OROR'基が好ましく、中でも両者が水素であることが好ましい。
【００１７】
キナゾリン骨格の４位を置換するアニリノ基の窒素原子に結合する置換基R3としては、上記したR基が好ましく、中でも水素が好ましい。
【００１８】
４位のアニリノ基の環構造上の置換基としては、R4、R5、R6、R8が水素又はハロゲン（F,Cl,Br,I）であり、R7が炭素数１〜４のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であることが好ましい。中でも、R4、R5、R6、R8が水素であることが好ましく、R7が炭素数１〜４のアルキニル基、特にエチニル基であることが好ましい。
【００１９】
上記した一般式(I)で示されるキナゾリン誘導体は、この分野で公知の常法により、市販の化合物から容易に調製することができる。例えば、下記スキーム１に記載されるように、4−クロロ−6,7−置換−キナゾリンと、１〜３当量程度の置換アニリンとを、アルコール溶媒（出発物質のキナゾリン化合物1molに対し5〜15L程度）中で１〜５時間程度加熱還流することにより、両者を反応させ、R3が水素である一般式(I)のキナゾリン誘導体(I')を得ることができる。アルコール溶媒としては、イソプロパノール等を好ましく用いることができる。
【００２０】
【化２】
2009161477.tif 000004
【００２１】
（置換基R1〜R8は上記定義に同じ）
【００２２】
置換基R3が上記（１）〜（５）に示される水素以外の基である一般式(I)のキナゾリン誘導体は、上記一般式(I')の化合物から公知の常法により得ることができる。また、R1及びR2は、出発物質上の置換基のままでもよいし、(I')を合成した後に公知の常法により他のR1及びR2に変換してもよい。
【００２３】
本発明の腫瘍イメージング剤は、上記した一般式(I)で示されるキナゾリン誘導体を放射性標識した化合物から成る。標識に用いる放射性物質としては、PET（陽電子断層撮影法）やSPECT（単一光子放射型コンピュータ断層撮影法）等において使用されるイメージング剤の標識に通常用いられる放射性物質であれば特に限定されず、例えば放射性ハロゲン（123I、18F等）、放射性金属（68Ga等の放射性ガリウム、99mTc等の放射性テクネチウム等）11C、13N、15O等を用いることができる。
【００２４】
放射性ハロゲンによる標識は、上記した一般式(I)のキナゾリン誘導体中のハロゲンを放射性ハロゲンとすることにより、容易に行うことができる。また、11C、13N、15O等による標識は、上記キナゾリン誘導体の骨格構造（キナゾリン骨格及びアニリン環）中又は上記置換基中にこれらの放射性原子を適用することにより、容易に行うことができる。このような放射性原子の導入は、この分野で周知の常法により行なうことができる。
【００２５】
放射性ガリウムや放射性テクネチウム等の放射性金属による標識は、例えば、上記したキナゾリン誘導体に二官能性キレート剤構造を導入し、該キレート剤を介して放射性金属を結合させることにより、容易に行うことができる。このような手法はこの分野において公知の常法であり、導入する二官能性キレート剤は種々のものが公知であり、市販品も存在する。例えば、二官能性キレート剤としては、ジアミノジチオール（DADT）類、ヒドラジノニコチンアミド（HYNIC）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）や、European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging (2007) vol.34, No.3, p.354-362,及びAcad Radiol. (2007) Sep, 14(9), p.1050-1057に記載のポリグルタミン酸ペプチド（GAP）が挙げられるが、これらに限定されない。このような二官能性キレート剤は、上記キナゾリン誘導体中のアミノ基を利用して容易に該誘導体中に導入できる。従って、このような手法により放射性金属標識を行う場合、上記キナゾリン誘導体は、末端にアミノ基を有する置換基を有することが好ましい。例えば、一般式(I)のキナゾリン誘導体が、R3が水素である上記一般式(I')の化合物である場合、キナゾリン骨格の４位に結合するアミノ基を利用してキレート剤構造を導入することができる。
【００２６】
例えば、本発明で用いられる標識化合物としては、一般式(I')のキナゾリン骨格４位のアミノ基にキレート剤構造を導入した下記一般式(II) 
【００２７】
【化３】
2009161477.tif 000005
【００２８】
[式中、R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8は前記定義に同じであり、Xはキレート剤構造を表す]
で示される化合物のキレート剤構造部分に放射性金属を結合させた標識化合物を挙げることができるが、これに限定されない。
【００２９】
本発明の腫瘍イメージング剤は、PETやSPECTのような非侵襲の検出技術におけるイメージング剤として用いることができる。下記実施例に記載される通り、本発明の腫瘍イメージング剤を生体内に投与すると、正常筋肉組織よりも腫瘍組織に有意に多く蓄積するので、放射性標識からの放射線を検出・解析することで生体内の腫瘍を検出することができる。
【００３０】
本発明の腫瘍イメージング剤は、通常、投与に適した緩衝液に溶解し、血管内投与により生体内に投与される。投与量は、特に限定されないが、通常、対象動物の体重1kg当たり1MBq〜15MBq程度、特に1.5MBq〜5MBq程度である。対象動物は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３２】
市販の4-クロロ-キナゾリンと3-エチニル-アニリンから、(3-エチニル-フェニル)-キナゾリン-4-イル-アミン（YCU05）を合成した。
【００３３】
【化４】
2009161477.tif 000006
【００３４】
具体的には、50 mLのナス型フラスコに4-クロロキナゾリン(164.6 mg, 1.00 mmol), 3-エチニルアニリン (0.22 mL, 2当量), イソプロピルアルコール(10 mL)を順次加え、３時間加熱還流した。TLCで原料の消失を確認した後、室温まで冷却し、飽和NaHCO3水溶液(5 mL)を加えた。AcOEt(10mL x 3)で抽出し、有機層を飽和食塩水(5 mL)で洗浄した後、Na2SO4で乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィーで精製しYCU05(207mg, 収率76%)を黄色固体として得た。
【００３５】
European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging (2007) vol.34, No.3, p.354-362,及びAcad Radiol. (2007) Sep, 14(9), p.1050-1057記載の方法に準じて、上記で得られたYCU05のキナゾリン骨格４位のアミノ基に公知のキレート剤（ポリグルタミン酸ペプチド、GAP）を結合させ、これを介して68Gaを結合させることにより、YCU05への標識を行い、分子標的ポジトロンイメージング製剤（68Ga-GAP-YCU05)を調製した。
【００３６】
【化５】
2009161477.tif 000007
【００３７】
キレート剤のポリグルタミン酸ペプチド（GAP）としては、上記式中に示される分子量1,500〜3,000（n=10-20）のものを用いた。まず、GAPのナトリウム塩500mgを2mlの2N塩酸に溶解して酸性型に変換し、該溶液を分子量カットオフ値1,000のSpectra/POR molecular porous membrane（Spectrum Medical Industries Inc.）を用いて４８時間透析した。凍結乾燥後、酸性型GAP（357.7 mg, 0.1589 mmol）を10mlのDMFに溶解した。該溶液にYCU05（38.97mg, 0.1589 mmol）、4-N,N-ジメチルアミノピリジン（23.30mg,0.1907mmol）を加えた。この混合物を室温で２日間撹拌した。減圧下でDMFを蒸発させた後、１N炭酸水素ナトリウムを添加してクロロホルムで抽出した。水層を４８時間透析（分子量カットオフ値1,000）し、生成物を凍結乾燥することにより、キナゾリン骨格４位のアミノ基にGAPを結合させた化合物（GAP-YCU05、105mg）を得た。
【００３８】
標識に用いる68Gaは、市販の68Ge/68Ga generator（Eckert & Ziegler Isotope Products Inc., USA）から抽出して得た。具体的には、68Ge/68Ga generatorから0.5NのHClで68Gaを抽出し、酸性溶液をアニオン樹脂カートリッジに通液して68Gaを捕捉した。カートリッジを4N塩酸で洗浄し乾燥させた後、68GaCl3として水を用いて68Gaを溶出させ、水酸化ナトリウムと酢酸ナトリウムを用いてpHを4-5に調整した。GAP-YCU05のアセテートバッファー溶液を68GaCl3溶液に添加し、３７℃で２０分間反応させることで、YCU05の68Ga標識化合物（68Ga-GAP-YCU05）を得た。
【００３９】
In vitro実験
YCU05(10μM)のEGFRチロシンキナーゼ阻害作用を、A431腫瘍細胞を用いてELISA定量法により測定した。具体的には、以下のとおりに行なった。A431腫瘍細胞にYCU05を10μMの濃度で添加し、バッファー（50mM HEPES, PH7.4, 20mM MgCl2, 0.2mM Na3VO4）中で２５℃、６０分間インキュベートした。次いで、Journal of Biological Chemistry (1996) vol.271, p.311-318 及びANALYTICAL BIOCHEMISTRY (1992) vol. 203, No.1, p.151-157の論文報告に従いEGFR Receptor チロシンキナーゼの活性の抑制効果を測定した。
【００４０】
動物実験１
ヒト類表皮癌A431を6週令のBALB/cヌードマウスに移植した腫瘍モデルに対し、0.5MBq/0.5mg/0.5ml（PH6.4）の68Ga標識YCU05を尾静脈から注射し、30分後に屠殺し、OCT(optimal cutting temperature)コンパウンドおよび液体窒素を用いてLeica CM3600（ライカマイクロシステムズ）により凍結薄層組織切片を作製した。該切片は、マウスをほぼ体軸に沿う方向で、腫瘍部を縦断するように切断して作製した。該切片を、Instant Imager (Perkin-Elmer)にて撮像し、筋肉組織に対する腫瘍組織の集積比を算出した（図１）。
【００４１】
動物実験２
ヒト類表皮癌A431を6週令のBALB/cヌードマウスに移植した腫瘍モデルに対し、4MBq/2mg/0.5ml（PH6.4）の68Ga-GAP-YCU05を尾静脈から注射し、30分後に屠殺し解剖して腫瘍と筋肉を取り出し、Cobra gamma counter(Packard)でカウントし、筋肉組織に対する腫瘍組織の集積比を算出した。
【００４２】
結果
In Vitro 実験
A431腫瘍細胞を用いたEGFRチロシンキナーゼ阻害作用試験において、YCU05は23%の阻害作用を示した。すなわち、10μMのYCU05を添加したA431腫瘍細胞では、EGFRチロシンキナーゼの活性が、YCU05非添加のA431腫瘍細胞の活性の23%まで低下していた。
【００４３】
動物実験１
Autoradiographic image上の筋肉組織に対する腫瘍組織の集積比は1.27と1より高い集積を示した（図１）。
【００４４】
動物実験２
A431腫瘍移植したBALB/cヌードマウスの生体内分布の実験ではT/M比が1.1±0.2と１よりも高値を示した。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】動物実験１において作製した腫瘍モデルマウスの凍結切片像（上段）と、該切片からの放射線を撮像した図（下段）である。枠内が腫瘍組織であり、図の左側が頭部、右側が尾部方向である。
【図１】
2009161477.tif 000011