(57)【要約】【課題】  糖鎖プライマー法により伸長した糖鎖化合物の効率的な精製方法、固定化方法を提供する。【解決手段】  培養細胞に糖鎖プライマーを投与し、培養することにより、伸長された糖鎖伸長化合物にＦＬＡＧタグを導入し、ＦＬＡＧタグに対する抗体を結合した担体を用いて精製・固定化できる、利用し易い有用な糖鎖化合物に変換して用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖プライマー法により合成された糖鎖化合物の精製方法であって、糖鎖プライマー法によって合成された糖鎖化合物を回収する際に、ＦＬＡＧタグを付加することを特徴とする精製方法。
【請求項２】
糖鎖化合物が、ＦＬＡＧタグに対する抗体を結合した担体と親和性を示すことを特徴とする精製方法。
【請求項３】
糖鎖化合物において、糖鎖プライマー部分のアルキル鎖中にＦＬＡＧタグを付加する工程を含む、請求項１または２記載の糖鎖化合物を精製する方法。
【請求項４】
動物細胞にアジド基を有したアルキル鎖をオリゴ糖鎖に結合させた化合物を加えて培養し、得られた糖鎖化合物にＦＬＡＧタグを付加する工程を含む、請求項１及び２のいずれかに記載の糖鎖化合物を精製する方法。
【請求項５】
糖鎖プライマー法により合成された糖鎖化合物の固定化方法であって、生成した糖鎖伸長化合物に、ＦＬＡＧタグを付加する工程を含む固定化方法。
【請求項６】
糖鎖プライマー法により合成された糖鎖化合物の固定化方法であって、生成した糖鎖伸長化合物に、ＦＬＡＧタグに対する抗体を結合した担体と親和性を付与することを特徴とする固定化方法。
【請求項７】
動物細胞にアジド基を有したアルキル鎖をオリゴ糖鎖に結合させた化合物を加えて培養し、得られた糖鎖化合物に、ＦＬＡＧタグに対する抗体を結合した担体と親和性を付与することを特徴とする固定化方法。
【請求項８】
糖鎖プライマー法により合成された糖鎖化合物の固定化方法であって、糖鎖化合物において、糖鎖プライマー部分のアルキル鎖中にＦＬＡＧタグを付加する工程を含む、請求項５〜７のいずれかに記載の固定化方法。
【請求項９】
培養細胞に糖鎖プライマーを投与して生成した糖鎖伸長化合物に、ＦＬＡＧタグが付加された糖鎖化合物。
【請求項１０】
培養細胞に糖鎖プライマーを投与して生成した糖鎖伸長化合物を、請求項１から４までのいずれかに記載の方法で精製された糖鎖化合物。
【請求項１１】
培養細胞に糖鎖プライマーを投与して生成した糖鎖伸長化合物を、請求項５から８までのいずれかに記載の方法で固定化された糖鎖固定化担体。
【請求項１２】
培養細胞に糖鎖プライマーを投与して生成した糖鎖伸長化合物を、請求項５から８までのいずれかに記載の方法で固定化された糖鎖アレイ。
【請求項１３】
前記担体が、高分子化合物を含む担体、金属を含む担体、および紙からなる担体からなる群より選択される1種であることを特徴とする請求項１１に記載の糖鎖固定化担体を作成する方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の糖鎖固定化担体を、該糖鎖固定化担体中の糖鎖部分と結合あるいは相互作用する物質と接触させる方法。
【請求項１５】
前記物質が、ウィルス、微生物、原虫、植物細胞、および動物細胞からなる群より選択される1種である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項７から８までのいずれかに記載の固定化糖鎖体を含む診断薬。
【請求項１７】
請求項１１に記載の糖鎖固定化担体を含むウィルス又は細菌毒素の検出基盤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖の調製方法およびその固定化方法、ならびにそれを用いた糖鎖アレイに関する。より詳しくは、糖鎖プライマーに予め導入可能なアジド基との反応により、特定の担体への親和性を持つタグを付加することによる精製方法、ならびにその担体に結合してなる固定化糖鎖体、さらには、それを用いた糖鎖アレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は構造が複雑であり、同じ生体分子であるＤＮＡやタンパク質よりも産業上の利用の為の開発が遅れている。しかし、近年、糖鎖の研究が急速に進展し、産業上の利用への模索も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等への糖鎖の関わりについて新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や脂質と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることも明らかになってきている。
【０００３】
糖鎖は、天然に存在する他、合成することも可能である。糖鎖の合成方法としては、化学的に合成する方法、分解酵素による方法、糖転移酵素を用いる方法、動物細胞の機能を利用した糖鎖合成方法（例えば特許文献１）などがある。
【０００４】
これまで動物細胞の機能を利用した糖鎖合成において、生成した糖鎖化合物は、通常C18系固相カートリッジで生成されており、内在性の糖脂質を始め、疎水性の高い化合物が混在し、伸長物を特異的に回収する方法がなく、分離するためには、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や液液分配クロマトグラフィー（ＣＰＣ）による精製（例えば非特許文献１）が必要である。
【０００５】
また、糖鎖はタンパク質や脂質と相互作用することにより、生体内における様々な重要なプロセスに関与しているため、そのメカニズムを分子レベルで解析しようと、糖鎖アレイが利用されている。例えば、24種類の糖脂質をブチルシランでコーティングしたスライドガラス上にスポットし、糖脂質の脂質部分とガラス表面の疎水的相互作用を利用して固定化した糖脂質アレイがタカラバイオ株式会社より販売されている。
【０００６】
このような技術において、糖鎖を固定化する方法としては、糖鎖を非共有結合によって固相担体に固定化する方法が知られているが、安定して固定することができず、洗浄工程により糖鎖が洗い流されてしまう可能性がある。また、共有結合によって糖鎖を固相担体に固定化する手法として、ディールス・アルダー反応によって固定化する手法やマイケル付加反応によって固定化する方法も知られている。しかしながら、タンパク質との非特異的吸着が大きいことや、基板上のチオールの酸化による反応点が減少するといった問題点を有している。
【０００７】
また、特許文献２には、糖鎖がスペーサー基を介してチオアルキル化によって固相担体に結合している糖鎖アレイを作製する方法が開示されている。しかし、糖鎖を、スペーサー基を介してチオアルキル化する必要があることや、多種の糖鎖を固定化するためには原材料となる多種の糖鎖を入手し、更にチオアルキル化する必要がある。
【特許文献１】特開２００３−２７４９９３
【特許文献２】特開２００６−７８４１８
【非特許文献１】Ｋａｔｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ，  １１７８，  １５４−１５９（２００８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在用いられている、糖鎖化合物の濃縮および／または精製に用いられているC18系固相カートリッジあるいは更にＨＰＬＣやＣＰＣを用いて精製する方法では、大量の合成物が必要であるのに加え、時間や労力がかかる。また、固定化するためには、アジド基を還元してアミノ基に変換したりする必要があり、化学合成の技術が必要となる。このように、糖鎖プライマー法で合成される糖鎖化合物を天然の構造を保持したままで効率的に精製、固定化して利用する方法は未だなく、このような方法の開発が強く望まれている。
【０００９】
そこで、本発明の目的は、細胞による糖鎖プライマー法等で得られた糖鎖化合物を効率的に糖鎖本来の構造、活性を保持したままで精製および／または固定化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、細胞による糖鎖プライマー法等で得られた糖鎖化合物を天然型構造を保持したままで、効率的に精製および／または固定化する方法を見出し、本発明を完成するに到った。
【００１１】
即ち、本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであり、以下発明を包含する。
[１]糖鎖プライマー法により合成された糖鎖化合物の精製方法であって、糖鎖プライマー法によって合成された糖鎖化合物を回収する際に、ＦＬＡＧタグを付加することを特徴とする精製方法。
[２]糖鎖化合物が、ＦＬＡＧタグに対する抗体を結合した担体と親和性を示すことを特徴とする精製方法。
[３]糖鎖化合物において、糖鎖プライマー部分のアルキル鎖中にＦＬＡＧタグを付加する工程を含む、[１]または[２]記載の糖鎖化合物を精製する方法。
[４]動物細胞にアジド基を有したアルキル鎖をオリゴ糖鎖に結合させた化合物を加えて培養し、得られた糖鎖化合物にＦＬＡＧタグを付加する工程を含む、[１]〜[３]のいずれかに記載の糖鎖化合物を精製する方法。
[５]糖鎖プライマー法により合成された糖鎖化合物の固定化方法であって、生成した糖鎖伸長化合物に、ＦＬＡＧタグを付加する工程を含む固定化方法。
[６]糖鎖プライマー法により合成された糖鎖化合物の固定化方法であって、生成した糖鎖伸長化合物に、ＦＬＡＧタグに対する抗体を結合した担体と親和性を付与することを特徴とする固定化方法。
[７]動物細胞にアジド基を有したアルキル鎖をオリゴ糖鎖に結合させた化合物を加えて培養し、得られた糖鎖化合物に、ＦＬＡＧタグに対する抗体を結合した担体と親和性を付与することを特徴とする固定化方法。
[８]糖鎖プライマー法により合成された糖鎖化合物の固定化方法であって、糖鎖化合物において、糖鎖プライマー部分のアルキル鎖中にＦＬＡＧタグを付加する工程を含む、[５]〜[７]のいずれかに記載の固定化方法。
[９]培養細胞に糖鎖プライマーを投与して生成した糖鎖伸長化合物に、ＦＬＡＧタグが付加された糖鎖化合物。
[１０]培養細胞に糖鎖プライマーを投与して生成した糖鎖伸長化合物を、[１]から[４]までのいずれかに記載の方法で精製された糖鎖化合物。
[１１]培養細胞に糖鎖プライマーを投与して生成した糖鎖伸長化合物を、[５]から[８]までのいずれかに記載の方法で固定化された糖鎖固定化担体。
[１２]培養細胞に糖鎖プライマーを投与して生成した糖鎖伸長化合物を、[５]から[８]までのいずれかに記載の方法で固定化された糖鎖アレイ。
[１３]前記担体が、高分子化合物を含む担体、金属を含む担体、および紙からなる担体からなる群より選択される1種であることを特徴とする[１１]に記載の糖鎖固定化担体を作成する方法。
[１４][１１]に記載の糖鎖固定化担体を、該糖鎖固定化担体中の糖鎖部分と結合あるいは相互作用する物質と接触させる方法。
[１５]前記物質が、ウィルス、微生物、原虫、植物細胞、および動物細胞からなる群より選択される1種である、[１４]記載の方法。
[１６][７]から[８]までのいずれかに記載の固定化糖鎖体を含む診断薬。
[１７][１１]に記載の糖鎖固定化担体を含むウィルス又は細菌毒素の検出基盤。
【００１２】
すなわち、本発明は、細胞による糖鎖プライマー法等で得られた糖鎖化合物を効率的に精製および／または固定化する方法であって、得られた糖鎖化合物に、特定の担体に特異的に結合するタグを導入し、その特異的な結合力を利用して、糖鎖伸長化合物を精製および固定化する工程を含む検出方法を提供する。
【００１３】
上記検出方法において、生成した糖鎖伸長化合物を精製する工程に供した後に分析することもできる。この精製工程は、Sep-Pak C-18カラムによる精製、強イオン交換カートリッジカラムによる精製、スチレン系合成吸着体またはメタクリル系合成吸着体による固体吸着剤を利用した精製、HPLCによる精製、および液液分配クロマトグラフィによる精製からなる群より選択される少なくとも1種または２種以上の組合せであり得る。
【発明の効果】
【００１４】
以上のように、本発明を適用することによって、迅速で簡便でかつ特異的に動物細胞により生産される糖鎖化合物を精製することができ、更には、糖鎖固定化体及び該固定化体の作製方法が得られる。本発明に係る新規な固定化糖鎖体は、動物細胞により生産される糖鎖化合物に対し、その構造を損なうことなくＦＬＡＧタグ等を導入した後に、簡便な方法で精製したものを、抗ＦＬＡＧ抗体等のタグに対し親和性を有する担体へ固定化することによって得られる。従って、容易に糖鎖構造内部にＦＬＡＧが導入されていない天然型の糖鎖の精製および固定化ができ、様々な固定化糖鎖体を提供できる。この為、本発明の固定化糖鎖体は、様々な用途に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１６】
本発明の方法では、対象物質が、生体内での細胞、あるいはウイルスや微生物の糖鎖合成に与える影響を、インビトロで検出することができ、培養細胞に糖鎖プライマーおよび対象物質を投与して、生成した糖鎖伸長化合物を分析する工程を含む。
【００１７】
ここで、生体内での細胞とは、主に、植物細胞または動物細胞を指す。また、培養細胞とは、酵母、植物細胞または動物細胞であり、好ましくは、影響を調べたい細胞と同一または類似の細胞である。例えば、対象物質の影響を調べたい生体内の細胞がヒト脳組織を構成する細胞である場合には、ヒト脳組織由来の細胞あるいはその他の動物の脳組織由来の細胞を培養細胞として用いることが好ましいがこれに限定されない。ウイルスには、インフルエンザウイルスなどの病原性ウイルスが主に含まれる。微生物には、グラム陽性細菌やグラム陰性細菌などを含む細菌の他、真菌、放線菌なども含まれる。
【００１８】
このような培養細胞を糖鎖化合物が得られるような条件下にて培養することで行うことができる。動物細胞は特に限定されず、所望の対象の生体内の細胞の種類に応じて様々な動物細胞が用いられ得る。動物細胞の例としては、ヒト由来、マウス由来、サル由来、ラット由来などの哺乳動物細胞が挙げられ、これらの細胞は正常細胞でもよいし、なんらかの疾患に関連する細胞でもよい。Ｂ１６マウスメラノーマ細胞、ラットＰＣ１２細胞、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＭＯＬＴ−４細胞、ヒトＨＬ−６０細胞、サル腎臓由来ベロ細胞、アフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ７細胞、ヒトフィブロブラスト細胞、ヒトＨｅｐＧ２、ウシＢＭＥＣ、ヒトＨｅＬａ細胞などが好適に用いられ得るが、これらに限定はされない。
【００１９】
糖鎖化合物が得られるような条件とは、例えば、上記の動物細胞を、室温から４５℃までの温度の間で１時間から７０時間までの間の時間で、糖鎖プライマー及び1×10５から1×1010cells/mlまでの濃度の細胞を添加した反応液を静置あるいは撹拌しながら反応を行い、糖鎖伸長反応を行うことなどである。
【００２０】
ここで、糖鎖プライマーは、用いられる細胞種、所望の糖鎖構造により任意に選択することができる。好ましい糖鎖プライマーの例としては、式（Ｉ）：
（Ｇ1）x（Ｇ2）y（Ｇ3）z−Ｌ−Ｘ
で表される化合物が挙げられる。
【００２１】
ここで、式中、Ｇ1、Ｇ2及びＧ3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2）m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2）m−から選択される連結基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜５、さらに好ましくは０から３であり、ｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。また、mは、８〜２０の整数であり、好ましくは８〜１６、特に好ましくは１２である。Ｘは、−Ｎ3、−Ｈ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−Ｃ1-Ｃ4アルキルから選択される基である。単糖としては、限定はされないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。
【００２２】
このような糖鎖プライマーを各種細胞の培地に添加して細胞を培養すると、細胞は、糖鎖プライマーを取り込み、その糖鎖部分に更に糖を付加してグリコシル化し、その糖付加生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に分泌する。この糖鎖プライマーからの糖鎖伸長化合物を、回収した培地中に存在する状態、あるいは精製を行ったものに対し、のＦＬＡＧタグを導入することができる。
ＦＬＡＧタグは、Asp-Tyr-Lye-Asp-Asp-Asp-Asp-Lyeの8個のアミノ酸からなり、タンパク質に融合させて発現させることにより、Anti−FLAG抗体により検出・精製を容易に行うのに利用されている。
【００２３】
精製方法は、特に限定はされないが、有機溶媒、各種水溶液、および水などから選択される少なくとも2種以上の溶媒を混和した二相溶媒系の上層または下層の一方を固定相とし、他方を移動相に用いて試料を分離する、液液分配クロマトグラフィなどを用いておこなうことができる。液液分配クロマトグラフィには、さらに、遠心液液分配クロマトグラフィ(ＣＰＣ)、高速向流クロマトグラフィ（ＨＳＣＣＣ）などが含まれる。
【００２４】
液液分配クロマトグラフィに用いる二相溶媒系は、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、アルコール類、エーテル類、水、酸または酸性水溶液、およびアルカリ性水溶液からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和して調製する。このうち、アルコール類として好ましいのは、メタノール、エタノール、ブタノールであるが、これに限定されない。酸性水溶液としては、酢酸水溶液が挙げられるが、これに限定されない。
【００２５】
糖脂質類似化合物を含有する試料から中性の化合物を分離する場合には、二相溶媒系が、クロロホルム、アルコール類、および水を混和してなるものであることが好ましい。
【００２６】
糖脂質類似化合物を含有する試料から酸性の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離する場合、二相溶媒系が、アルコール類、酸、および水を混和して調製されることが好ましい。より好ましくは、アルコール類がｎ−ブタノールであり、前記酸または酸性水溶液が酢酸である。あるいは、二相溶媒系を、二種の異なるアルコール類および酸性水溶液を混和することで調製することも好ましい。この場合、より好ましくは、二相溶媒系が、n−ブタノール、エタノール、および１％酢酸水溶液を混和して調製されるものである。
【００２７】
溶出した移動相はそのままあるいは溶出時間毎に分画し、固相抽出カートリッジ、逆相ＴＬＣ、順相ＴＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、アフィニティークロマトグラフィ、ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＴＯＦ−ＭＳなどの分析に供することにより、さらに詳細な分離、分析を行うことができる。
【００２８】
精製工程には、その他、Sep-Pak C-18カラムを使用した精製、強イオン交換カートリッジカラム、固体吸着剤として、スチレン系合成吸着体、メタクリル系合成吸着体、およびフェノール系合成吸着体からなる群より選択される少なくとも1種である吸着剤を使用する方法が含まれる。培養物中または培養上清中の糖鎖化合物を吸着させるスチレン系合成吸着剤としては、例えばスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を樹脂母体とするものが挙げられる。スチレン系合成吸着体として、具体的には、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ２０、ＨＰ２１、セパビーズ（登録商標、以下同じ）ＳＰ２０７、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ８７５、ロームアンドハース社製アンバーライト（登録商標、以下同じ）ＸＡＤ４、ＸＡＤ１６、ＸＡＤ１１８０、ＸＡＤ２０００、Ｂａｙｅｒ社製ＶＰＯＣ１０６２、ＶＰＯＣ１０６４等が挙げられる。また、メタクリル系合成吸着体として、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ等を用いることができる。
【００２９】
強イオン交換カートリッジカラムを使用する場合には、四級アンモニウム基などの官能基を有する充填剤など、当業者に公知のいずれの強イオン交換樹脂も使用することができる。溶出に用いる溶媒系は、クロロホルム、酢酸アンモニウム、アルコール類、エーテル類、および水からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和して調製する。このうち、アルコール類として好ましいのは、メタノール、エタノール、ブタノールであるが、これに限定されない。酸性糖脂質の抽出には、クロロホルム、メタノール、酢酸アンモニウム水溶液の混和液が特に好ましい。
【００３０】
タグの導入については、その方法は限定されないが、例えば、アジド基を有する糖鎖プライマーから糖鎖伸長された糖鎖化合物の場合、ＧｌｙｃｏＰｒｏｆｉｌｅ  ＦＬＡＧ  Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（シグマアルドリッチジャパン）を用いることにより、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応により、容易に糖鎖化合物にＦＬＡＧタグを導入できる。
【００３１】
ＦＬＡＧを導入した糖鎖化合物は、ＦＬＡＧアフィニティーゲルに特異的に吸着させた後、高濃度のＦＬＡＧペプチド溶液や、或いは酸性の緩衝液により溶出することができる。
糖鎖固定化担体を作製する方法としては、例えば、抗ＦＬＡＧ抗体コートアガロースビース（Sigma社製）を混合し結合させることにより、糖鎖化合物をビーズ表面にコートすることができる。
【００３２】
精製したＦＬＡＧが導入された糖鎖化合物は、抗ＦＬＡＧ抗体で予めコーティングされたプレート等に結合させることにより固定化することができる。
【００３３】
また、精製したＦＬＡＧが導入された糖鎖化合物は、ＦＬＡＧタグの末端に存在するカルボキシル基を用いて、固相担体に固定化することもできる。例えば、アミノ基を有する担体に対し、直接このカルボキシル基とアミノ基の間で脱水縮合してアミド結合を形成させればよい。（糖鎖固定化担体）
糖鎖アレイを作成する場合には、抗FLAG抗体をコーティングしたマイクロタイタープレートや検出基盤を利用することができる。例えば、マイクロタイタープレートの各ウェルを抗FLAG抗体で予めコーティングしておき、そこに各種FLAGタグを導入した糖鎖化合物を加えることにより結合させることができる。
ＦＬＡＧタグの末端に存在するカルボキシル基を用いて、固相担体に固定化することも可能であり、表面にアミノ基を有する担体［マイクロタイタープレートや、SPR(表面プラズモン共鳴)やQCM(水晶振動子マイクロバランス)などの検出装置の基盤］に対し、縮合反応により固定化することができる。
この際の縮合方法としては、活性エステル法や縮合剤を用いる方法などがある。カルボキシル基の活性化は、従来公知の方法にて行うことができ、用いられる試薬なども公知のものから適宜選択しえる。例えば、カルボキル基の活性化は、該カルボキシル基と種々の試薬とを反応させ、対応する酸クロライド、酸無水物または混合酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロフェノール、p-ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等とのエステル）などを形成させることにより行う。一方、縮合反応は、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボキシイミド（DCC)、カルボジイミダゾールなどのカルボジイミド試薬やテトラエチルピロホスフェイト、ベンゾトリアゾール−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（Bop試薬）などの存在下で行うこともできる。
【実施例】
【００３４】
（実施例１）
触媒としてルイス酸であるboron trifluoride etherate (BF3・OEt2)と、アジド基を導入したアルコールを用いてグリコシル化を行った後、脱アセチル化反応を行うことにより、糖鎖プライマー（１２−ａｚｉｄｏｄｏｄｅｃｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を得た（Murozuka, Y., Kasuya, M. C., Kobayashi, M., Watanabe, Y., Sato, T. and Hatanaka, K. 2005, Chemistry and Biodiversity, 2, 1063,  Kasuya, M. C., Wang, L., Lee, Y. C., Mitsuki, M., Nakajima, N., Sato, T., Hatanaka, K., Yamagata, S. and Yamagata, T. 2000, Carbohydr. Res., 329, 755.）
Ｂ１６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞を用い、下記の方法で、糖鎖伸長物を得た。１００ｍｍのディッシュに、細胞数２×１０６ｃｅｌｌｓの細胞をそれぞれ７ｍｌの１０％  ＦＢＳと、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）に懸濁して播き、ＣＯ２インキュベターの中で３７℃にて１５時間、前培養をいった。その後、培地を除いた後、２ｍｌのＰＢＳ（−）で２回洗浄を行った後、７ｍｌの終濃度５０μＭのドデシル−βラクトシド、１％のＩＴＳ−Ｘサプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて４８時間培養し、糖鎖伸長反応を行った。
【００３５】
糖鎖伸長反応後、培地と細胞を分けて回収した。培地を回収し、更にディッシュ表面やバイアル瓶内壁を１．５ｍｌのＰＢＳで洗浄することにより、培地上清を回収した。回収した培地上清中に含まれる糖脂質化合物を、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８カラム（充填剤量840ｍｇ）（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて精製し、培地画分の総脂質抽出物を得た。その際、10ｍｌのメタノール、水を通液した後、サンプルを通した。その後、10ｍｌの水で洗浄した後、10ｍｌのメタノールで溶出した。
【００３６】
得られたメタノール溶出液に、１．４ｍｌの２５０μＭのＦＬＡＧ  Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ溶液（シグマアルドリッチジャパン）を加え、４℃にて一晩放置した。
【００３７】
１００μｌのＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  アフィニティーゲル（シグマアルドリッチジャパン）を、１．２５ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で２回洗浄した後、上記反応液に加え、３時間室温にて振盪した。その後、５，０００ｇで３０秒遠心し、上清を除いた。１．２５ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で３回洗浄した後、２５０μｌの０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ，ｐＨ３．５で溶出した。溶出液は、速やかに２５μｌの０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４の入った新しい容器へ移し、各々、２７５μｌのＦＬＡＧ標識糖鎖溶液を得た。
【００３８】
０．１  M   ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）で希釈した１０μｇ／ｍｌの濃度のＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ(R)  Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙを１５０μｌずつ。９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに加え、４℃にて一晩放置した。その後、液を捨て、各ウェルを１５０μｌのＰＢＳ（−）で４回洗浄した。その後、各ＦＬＡＧ標識糖鎖溶液を５５μｌ、１１μｌ、2．２μｌ、０．２７５μｌずつ取り出し、ＰＢＳ（−）で１５０μｌに容量を合わせ、各ウェルに加えた後、３７℃にて３時間インキュベートした。その後、液を捨て、５０μｌのブロッキング溶液［１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（−）］を各ウェルに加え、３７℃にて３時間インキュベートした。その後、液を捨て、ブロッキング溶液で希釈した０．２μｇ／ｍｌのＶｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｉ， β−ｓｕｂｕｎｉｔ及び、Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎを５０μｌずつ各ウェルに加え、４℃にて一晩放置した。その後、上清を除去し、３００μｌのＰＢＳ−Ｔ［０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）］で４回洗浄した。それぞれの毒素に対するペルオキシダーゼで標識された二次抗体と室温で２時間反応させた。Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎに対しては、ＨＲＰ標識Ａｎｔｉ  β−ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ（コスモバイオ）をＰＢＳ（−）で５０００倍希釈したもの、Ｖｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｉ， β−ｓｕｂｕｎｉｔに対しては抗ベロトキシン−１大腸菌O１５７由来（ナカライ）をＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学）を用いてキットに添付のマニュアルに従って標識したものを１０００倍希釈した溶液を用いた。反応後、上清を除去し、３００μｌのＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。洗浄後、各ウェルに１００μｌのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（フナコシ）を加え５〜１０分反応させ、着色が確認されたら、１００μｌのＴＭＢ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３９】
コントロールとして、未反応の糖鎖プライマー（１２−ａｚｉｄｏｄｏｄｅｃｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ）も上記と同様の操作により各毒素との作用を調べた。
【００４０】
その結果、Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎに対しては、ＭＤＣＫ細胞由来の糖鎖伸長物、また、Ｖｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｉ， β−ｓｕｂｕｎｉｔに対しては、Ｖｅｒｏ細胞由来の糖鎖伸長物への特異的な吸着が認められた。
【００４１】
Ｖｅｒｏ細胞では、ＧＭ3型糖鎖化合物、Ｇｂ３型糖鎖化合物、Ｇｂ４型糖鎖化合物が、Ｂ１６細胞では、ＧＭ3型糖鎖化合物がよく産生されることから、ベロ毒素がＧｂ３と特異的な結合を示す知見と一致する。
【００４２】
なお、本実験の結果から明らかなように、糖鎖プライマー法により合成した糖鎖を容易に精製でき、デバイス化もし易くなる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】糖鎖プライマー法により各種細胞を用いて合成した糖鎖化合物の固定化物と各種毒素との相互作用を調べた結果を示す。
【図１】
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