(57)【要約】【課題】細胞の特定の部分に蛍光蛋白質を導入し、生きたまま分裂などの活動状態を可視化する技術が提案されている。蛍光蛋白質は発光をするに際して、励起に必要な波長と発光する波長それぞれにブロードな特性を有するため、別々の色の蛍光蛋白を独立に発光させるためには、それらの特性が重ならないようにしなければならなかった。しかし、４色以上の蛍光蛋白を使用すると、それぞれの特性のピーク値の波長が他の色の蛍光蛋白の特性と重なり合い、各色を独立に見ることが出来なかった。【解決手段】すくなくとも、１色の蛍光蛋白は、その励起または吸収特性のピークからずれた波長の光を利用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起特性が近接する２種類の蛍光物質が導入された細胞を観察する方法であって、
前記蛍光物質のうち少なくとも１つの蛍光物質は、励起または吸収特性のピーク波長を含まない波長の光を用いる細胞観察方法。
【請求項２】
前記２種類の蛍光物質のうち前記励起特性のピーク波長の短い方を第１励起ピーク波長とし、長い方を第２励起ピーク波長とした際に、
前記第１励起ピーク波長を有する蛍光物質を観察する場合には、前記第１励起ピーク波長より短い波長の光を当て、
前記第２励起ピーク波長を有する蛍光物質を観察する場合には、前記第２励起ピーク波長より長い波長の光を当てる請求項１に記載された細胞観察方法。
【請求項３】
前記細胞には前記２種類の蛍光物質以外の蛍光物質が導入されている細胞である請求項１または２の何れかの請求項に記載された細胞観察方法。
【請求項４】
前記蛍光物質は蛍光タンパク質である請求項１乃至３の何れか１の請求項に記載された細胞観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光タンパク質を導入した細胞の観察方法に関するものである。より詳細には、３種の４色蛍光を用いて、細胞が生きている状態でその染色体分配過程全体をモニターできる細胞株を作成し、その細胞を観察する観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞の有糸分裂サイクルの模式図を図１４に示した。それは、間期と５つの有糸分裂の段階（時期）からなる。中心体はＧ１/Ｓ期に複製し、動原体前駆体の複製はＧ２期におこる。複製した中心体は前期に両極へ分離し、成熟して星状体となる。この時までに、クロマチンの凝縮と（動原体前駆体の）動原体への分化は始まっている。
【０００３】
前中期では、核膜が消失したのち、星状体は動原体をとらえ、有糸分裂紡錘体が形成される。中期では、染色体が（赤道面へ）集合し、動原体は紡錘体の赤道面に並ぶ。後期では、姉妹染色分体の分離がおこり、２つの娘染色体はそれぞれ対極に分かれていく。終期で核膜が再形成され、続くＧ１初期で紡錘体が崩れ染色体は脱凝縮する。
【０００４】
しかし、有糸分裂の各段階（時期）を正確に示すためには、通常は細胞をある種の色素や抗体で染めて有糸分裂細胞の細胞内構造の形態を顕微鏡で観察する。もしできるものなら、生きたままで目的とする細胞の正確な（分裂の）段階（時期）を知ることができたら大変に便利である。
【０００５】
くらげ由来の緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）の発見で、われわれは生きた細胞や生物のダイナミックな変化を可視化することができるようになった。ＧＦＰのシアン色や黄色（ＣＦＰ、ＹＦＰ）変異体、イソギンチャク様サンゴ赤色蛍光たんぱく質（ＤｓＲｅｄ）を使う事で我々は細胞を３色に可視化できた（特許文献１参照）。
【０００６】
近年、単量体のクサビライシ（サンゴ）のオレンジ色蛍光蛋白質（ｍＫＯ）やＤｓＲｅｄの黄色から赤色までの変異体も開発されている。そしてこれらの蛍光タンパク質は、有糸分裂の様子を調べるため、有糸分裂紡錘体、クロマチン、核膜、そして動原体のたんぱく質構成成分を発光させることに用いられ細胞内可視化に利用されている。
【０００７】
これらの蛍光タンパク質を導入した細胞を観察するには、蛍光顕微鏡を用いる。図１５に蛍光顕微鏡の構成を示す。蛍光顕微鏡３００は、対物レンズ３０４と接眼レンズ３３４の間に、第１の吸収フィルタ３１２とダイクロイックミラー３０６および第２の吸収フィルタ３０８を有する光学系を挿入した構成を有する。そして、第１のフィルタ３１２の後方には光源３１４が配置される。
【０００８】
光源３１４からでた光は、蛍光タンパク質を励起する波長だけを通過させる第１の吸収フィルタ３１２を通過し（３３１）、ダイクロイックミラー３０６で反射され（３３２）、対物レンズ３０４で合焦され、蛍光たんぱく質が導入された細胞３２０に向かう。蛍光タンパク質によって発光された光３３３は、台黒イックミラー３０６を通過し、その中の特定の波長だけを通過させる第２の吸収フィルタ３０８を通過する。そして、接眼レンズを通して観察される。
【特許文献１】特開２００４−１８７５３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、これらの細胞内構造の前期から終期を通した形態学的変化は、正確に一つの同じ細胞で比較されてはいなかった。というのも観察に適した細胞株が存在しなかったからである。
【００１０】
また、蛍光蛋白には吸収特性と励起特性があり、それらの特性は光学的にブロードな特性を示す。例えば、細胞に導入される蛍光蛋白による蛍光は、可視光帯域である波長が４００ｎｍから７００ｎｍの範囲では、この帯域の１／３から１／２の帯域（７０ｎｍから１５０ｎｍ）までの広がりを持つ。つまり複数の蛍光蛋白を細胞に導入して、発光させ観察する場合、特にそれらの蛍光特性が近接している場合、ある蛍光蛋白だけを発光させようとしても別の蛍光蛋白が発光してしまうという課題があった。特に細胞に導入する蛍光タンパク質が４色以上になると、各蛍光蛋白の励起・吸収特性が重なり合い、特定の蛍光蛋白からの蛍光だけを観察できないという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は上記の課題を解決するために想到されたものであり、導入した蛍光物質の励起特性又は、吸収特性の少なくとも１種類については、何れかの特性のピーク波長以外の波長を利用する細胞の観察方法を提供する。
【００１２】
すなわち、励起特性が近接する２種類の蛍光物質が導入された細胞を観察する方法であって、
前記蛍光物質のうち少なくとも１つの蛍光物質は、励起または吸収特性のピーク波長以外の波長の光を利用する細胞観察方法を提供するものである。
【００１３】
より具体的には、蛍光物質として４色の蛍光タンパク質をＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ｍＫＯ、ＤｓＲｅｄとし、それぞれの蛍光タンパク質を観察する際の、励起・吸収フィルタの波長特性を以下のように設定する。
【００１４】
励起、吸収フィルタの波長特性は、それぞれ、ＥＣＦＰで４３６nmをピークに２０ｎｍ幅と４７２nmピークに３０ｎｍ幅、ＥＧＦＰで４８４nmをピークに１５ｎｍ幅と５２０nmをピークに３５ｎｍ幅、ｍＫＯで５３２nmをピークに１０ｎｍ幅と５５６nmをピークに２０ｎｍ幅、ＤｓＲｅｄで５８０をピークに１３ｎｍ幅と６３０をピークに６０ｎｍ幅で、一緒にダイクロイックミラー（８６００６ｂｓ  ＣＦＰ／ＹＦＰ／ＤｓＲｅｄ用  Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いる。
【００１５】
また、観察する細胞として、我々は３種の４色蛍光ＭＤＡ４３５細胞株を構築（作成）した。その細胞ではクロマチン、動原体、核膜に加えて、内部セントロメア、微小管か中心体／紡錘体のいずれかのうち４つを同時に可視化される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の細胞観察方法では、細胞に導入された蛍光タンパク質の少なくとも１種類は、励起特性や吸収特性についてピーク波長以外の波長を利用することとしたので、得られる輝度は低くなるものの、他の蛍光タンパク質からの蛍光に対して十分大きなＳＮ比を得ることができ、実質的に単色の蛍光を観察することができる。すなわち、生きた細胞の生態サイクルを４色以上の蛍光タンパク質それぞれからの光によって観察することができるという効果を得ることができる。
【００１７】
また、この観察方法を利用することによって、これらの４色蛍光細胞株は、将来、１つの細胞での前期から終期までの有糸分裂の様子を正確に解析することに利用できる。
【００１８】
より具体的には、
我々は、個々の細胞の有糸分裂の時期を、ただその生きた細胞の画像を取得するだけで同定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
＜細胞＞
本発明に利用できる細胞は特に限定はない。例えば、動物由来の細胞でも植物由来の細胞でもよい。例えば、哺乳動物由来の細胞では、具体的に、ヒトＭＤＡ４３５細胞、マウスＡ９細胞、ウシＭＤＢＫ細胞、ブタＰＫ１５、マウスＣ３Ｈ細胞、インドホエジカ細胞等が挙げられる。
【００２０】
＜蛍光物質＞
本発明に利用できる蛍光物質は、蛍光タンパク質だけでなく、蛍光色素であってもよい。蛍光色素も励起・吸収特性を有しており、細胞の可視化に利用できるからである。蛍光物質を細胞に導入するとは、蛍光タンパク質を発現するＤＮＡを細胞に組み込むといった方法の他、公知の方法を利用することができる。
【００２１】
また、本発明に利用できる蛍光たんぱく質は、被験遺伝子の産物と融合した形で発現し、蛍光を発する性質をそなえたたんぱく質である限り、その種類に限定はない。例えば、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、シアン色蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲｅｄ，ＨｃＲｅｄ）、(オレンジ色蛍光蛋白質（ｍＫＯ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）などが挙げられる。
【００２２】
＜顕微鏡＞
本発明に利用できる顕微鏡は、複数の蛍光たんぱく質で修飾された細胞を生きたまま観察するために利用される。本発明に利用できる顕微鏡は、複数波長で励起された試料から発せられる複数波長の蛍光画像を、ほぼ同時に、波長ごとの蛍光独立画像として、あるいは複数蛍光波長の重畳画像として検出できる。
【００２３】
複数波長で励起するための光源として、例えば、ハロゲンランプあるいは波長可変レーザーなどが利用できる。光源にハロゲンランプを利用する場合、ランプ前方に複数種のフィルタを配置した波長選択機構として回転フィルタ(励起フィルタ)を設け、このフィルタを駆動することで特定の複数波長の光を同時的に出射する光源として利用することができる。また、波長可変レーザー光源を利用する場合、発信装置の制御(波長選択)で複数波長の光を同時的に出射することができる。
【００２４】
本発明に利用できる顕微鏡は、これら複数波長の励起光と試料から生起する複数波長の蛍光とを分離するダイクロイックミラーと、このミラーを透過した複数波長の蛍光を特定の波長域幅の蛍光へと順次波長分割してゆく複数段のダイクロイックミラー機構と特定の波長域幅の蛍光が得られる最終段の各ダイクロイックミラー出力を検出する電子的検出器と、各電子的検出器出力を画像信号として処理する信号処理部と、この処理部出力を単独画像あるいは重畳画像として表示する表示部とから構成されている。
【００２５】
さらに、顕微鏡の信号処理部に、蛍光波長に対応した適当な色(例えば虹色)を割り当てることも可能である。これによって、特に蛍光波長が可視域以外(赤外域、紫外域)の場合、強制的に色を割り当てることで可視域外で目に見えない蛍光像も目に見える画像として検出できる。これによって、幅広い波長域が励起光として利用できる。
【００２６】
さらに、本発明で利用できる顕微鏡は、細胞が生きたままの状態で観察できるよう工夫がされている。対物レンズが備えられたステージ上は、３５ｍｍシャーレ（カバーガラスが底に張り付けてある）がセッティングできる。この部分は、サーモスタットおよび炭酸ガス導入制御タイマーにより温度および炭酸ガス濃度をコントロールした湿潤器である。これによりシャーレで培養した細胞を生きたまま観察できる。サーモスタットにより対物レンズをふくめた試料周辺を同じ温度に調整することで、試料と対物レンズの温度差によるレンズの収縮を防ぐ効果もある。そのため、レンズの収縮によるピントのずれを防止している。
【００２７】
また、励起または吸収特性のピーク波長を含まない波長の光を用いるとは、ある蛍光物質の励起特性若しくは吸収特性の少なくとも一方において、その特性中ピークとなる波長以外の波長の光を用いて細胞を励起させ又は吸収を観察することをいう。例えば、ある蛍光物質の励起特性のピーク波長から１０ｎｍ離れた波長から幅２０ｎｍの波長幅の光を当てて励起させる場合がこれにあたる。もちろん、吸収特性を観察する際に吸収特性のピーク波長以外の波長で観察することも上記の意味に含まれる。また、励起特性も吸収特性もどちらもそれぞれの特性のピーク波長以外の波長の光を用いても良い。なお、ここでいうピーク波長を含まない波長の光とは、所定の幅を持った波長帯域の光であってよい。
【実施例】
【００２８】
３色蛍光細胞株であるＭＤＡ−Ｈ３／ｉｍｐ／ｔｕｂは、ｐＥＧＦＰ−アルファ−チューブリンとｐＴＫ−Ｈｙｇプラスミド（クロンテック社製、パロアルト、カリフォルニア、アメリカ）をＭＤＡ−Ｈ３／ｉｍｐ細胞へ導入し、そこからハイグロマイシン耐性コロニーを選択することで構築した。
【００２９】
クサビラ（サンゴ）−オレンジ−ＣＥＮＰ−Ａ発現プラスミド（ｐｍＫＯ−ＡＦ８）は、ｐＥＧＦＰ−ＡＦ８の０．４５ｋｂ  ＢｇｌＩＩ（「ＩＩ」はローマ数字の２）−ＫｐｎＩ断片をｐｍＫＯ１−ＭＣ１（ＭＢＬ社製，名古屋、愛知、日本）のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩサイトへ導入して構築された。
【００３０】
同様に、３種の４色蛍光細胞株である、ＭＤＡ−Ａｕｒｏ／ｉｍｐ／Ｈ３／ＡＦとＭＤＡ−Ｈ３／ｉｍｐ／ｓｕｒ／ＡＦとＭＤＡ−Ｈ３／ｉｍｐ／ｔｕｂ／ＡＦは、ｐｍＫＯ−ＡＦ８とｐＣＡＧＧＳ−ｂｓｒプラスミド(京都大学  真貝洋一博士より寄贈)をＭＤＡ−Ａｕｒｏ／ｉｍｐ／Ｈ３とＭＤＡ−Ｈ３／ｉｍｐ／ｓｕｒとＭＤＡ−Ｈ３／ｉｍｐ／ｔｕｂ細胞株へ導入し、そこからブラスサイジン耐性コロニーを選択することで構築した。
【００３１】
ＭＤＡ−ＡＦ８も含めたヒト胸ガン細胞ＭＤＡ４３５由来のすべての細胞株は１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した。
【００３２】
＜生細胞視覚化＞
細胞を３５ｍｍガラスボトムデイッシュ（イワキ社製、船橋、千葉、日本）へ接種し、ＩＮＵ−ＮＩ−ＦＩ顕微鏡保温装置（ステージトップインキュベーター）（東海ヒット社製、富士宮、静岡、日本）で培養した。
【００３３】
ＥＣＬＩＰＳＥ  ＴＥ３００またはＴＥ２０００−Ｕ蛍光顕微鏡（ニコン社製、東京、日本）へ、ＰｌａｎＡｐｏ  ＶＣ  ６０Ｘ対物レンズ（ニコン社製）とＯＲＣＡ−ＥＲ  ＣＣＤカメラ（浜松フォトニクス社製、浜松、静岡、日本）とさらに、励起、吸収フィルタホイールとＺ軸モニター（Ｌｕｄｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、ホーソン、ニューヨーク、アメリカ）を備えたＭＡＣ５０００コントローラーを取り付けた。
【００３４】
適切な波長の光を得るために１００Ｗのハロゲンランプを光源にした。励起、吸収フィルタ（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ロッキンガム、バーモント、アメリカまたはＳｅｍｒｏｋ社製、ロチェスター、ニューヨーク、アメリカ）の波長特性は、それぞれ、ＥＣＦＰで４３６ｎｍをピークに２０ｎｍ幅と４７２ｎｍピークに３０ｎｍ幅、ＥＧＦＰで４８４ｎｍをピークに１５ｎｍ幅と５２０ｎｍをピークに３５ｎｍ幅、ｍＫＯで５３２ｎｍをピークに１０ｎｍ幅と５５６ｎｍをピークに２０ｎｍ幅、ＤｓＲｅｄで５８０をピークに１３ｎｍ幅と６３０をピークに６０ｎｍ幅で、一緒にダイクロイックミラー（８６００６ｂｓ  ＣＦＰ／ＹＦＰ／ＤｓＲｅｄ用  Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。
【００３５】
生細胞のタイムラプス画像は、ＭａｃＯＳ  Ｘ（三谷コーポレーション社製、福井、日本）用ルミナビジョンソフトウエアのプレリリース版を用いて、励起、吸収フィルタホイールを回転させ、焦点面を1μmずつ移動させつつ、取得した。
【００３６】
得られたＺ軸画像スタックは、ルミナビジョンソフトウエアを用いて最大値投影法（ＭＩＰ）へ変換し、画像解析した。
【００３７】
レーザー共焦点画像は、上記顕微鏡システムにさらにＣＳＵ１０共焦点スキャナユニット（横河電機株式会社製  東京  日本）を装備し、４４０ｎｍ，４８８ｎｍ、５６１ｎｍのレーザーを交互に照射しながら得た。
【００３８】
次に各蛍光タンパク質の励起・吸収特性について詳細に説明する。図１（ａ）は上記の４つの蛍光タンパク質の励起特性を表し、図１（ｂ）は吸収特性を示す。縦軸は最大値で規格化した特性の比率（無単位）であり、横軸は波長（ｎｍ）である。図１（ａ）、（ｂ）ともに、横軸は波長（ｎｍ）であり、縦軸は特性の相対値を表す。ＥＣＦＰの励起特性１のピーク値は４３３ｎｍであり、吸収特性２のピーク値は４７５ｎｍである。同様に、ＥＧＦＰの励起特性３のピーク値は４８８ｎｍであり、吸収特性４のピーク値は５０７ｎｍである。また、ｍＫＯの励起特性５のピーク値は５４８ｎｍであり、吸収特性６のピーク値は５５９ｎｍであり、ＤｓＲｅｄの励起特性７のピーク値は５６３ｎｍであり、吸収特性８のピーク値は５８２ｎｍである。
【００３９】
この励起特性と吸収特性についてさらに詳細に説明する。図２はＤｓＲｅｄの励起特性７と吸収特性８だけを取り出して示した。励起特性とは蛍光タンパク質が当てられた光の波長によって励起される割合を示す特性である。例えば、ピーク値を示す波長１０で励起される割合を１とすると、他の波長１１で励起した場合は０．６だけが励起されることを示す。
【００４０】
一方、吸収特性とは、蛍光タンパク質が発光する光の波長分布を示す。これは約５００ｎｍから７００ｎｍまでのブロードな特性を示す。そして吸収特性の縦軸は発光強度の相対値を示す。すなわち、励起特性において波長１０の光でＤｓＲｅｄを励起させると、符号１０ａの特性の波長分布を有する光を発光する。そして、もし波長１１で励起した場合は、吸収特性のピーク値が０．６に減少した特性の光１１ａを発光する。
【００４１】
次に本発明の細胞観察方法における励起光と吸収光との関係について説明する。
図３は、ＥＣＦＰの蛍光を観察する場合の励起・吸収特性を示す。ＥＣＦＰは、波長４３６ｎｍ（Ｐ１）を中心に幅２０ｎｍ（Ｗ１）の波長の光を励起光として利用する（図３（ａ）参照）。この時、ＥＧＦＰ、ｍＫＯ、ＤｓＲｅｄのそれぞれは、図３（ａ）中で、符号３１、５１、７１だけ励起される。そしてＥＧＦＰ、ｍＫＯ、ＤｓＲｅｄのそれぞれは、この励起光によって４１、６１、８１の吸収光を放出する（図３（ｂ）参照。）。ＥＣＦＰにとって波長４３６ｎｍ付近の光は励起特性のピークに近い波長なので、ＥＣＦＰの吸収光２１は、ほぼ１の光を放出する。そして、吸収特性では、波長４７２ｎｍ（Ｐ２）を中心に幅３０ｎｍ（Ｗ２）の光を観測する。
【００４２】
すると、この観察波長帯域では、ＥＣＦＰの蛍光が十分に大きく、シアン色に光る箇所だけを観察することができる。なお、図では、励起光の最大値を矢印で示し、吸収光はこの値が放出されるように説明したが、実際は、励起光の帯域幅による光の総和が発光される。しかし、本発明は、上記の励起光の最大値まで吸収光が放出されると説明しても、矛盾は起きない。
【００４３】
同様に、ＥＧＦＰは、波長４８４ｎｍ（Ｐ３）を中心に幅１５ｎｍ（Ｗ３）の波長の光を励起光として利用する（図４（ａ））。この時、ＥＣＦＰ、ｍＫＯ、ＤｓＲｅｄのそれぞれは、図４（ａ）中で、符号１３、５３、７３だけ励起される。そしてＥＣＦＰ、ｍＫＯ、ＤｓＲｅｄのそれぞれは、この励起光によって２３、６３、８３の吸収光を放出する（図４（ｂ）参照。）。ＥＧＦＰにとって波長４８４ｎｍ付近の光は励起特性のピークに近い波長なので、ＥＧＦＰの吸収光４３は、ほぼ１の光を放出する。そして、吸収特性では、波長５２０ｎｍ（Ｐ４）を中心に幅３５ｎｍ（Ｗ４）の光を観測する。
【００４４】
すると、この観察波長帯域では、ＥＣＦＰの蛍光が十分に大きく、緑色に光る箇所だけを観察することができる。
【００４５】
次にｍＫＯの場合について説明する。ｍＫＯとＤｅＲｅｄは励起特性と吸収特性が極めて近い。そしてこれらの蛍光特性もブロードであるため、どちらか一方だけの光を発光させ観測するのが困難である。
【００４６】
図５には、ｍＫＯの励起特性のピークである５４８ｎｍ（Ｐ５）を中心とし、３０ｎｍ（Ｗ５）の波長幅を有する光で励起した場合を示す。ＤｓＲｅｄの励起特性はｍＫＯの励起特性と極めて近いため、ｍＫＯの励起特性のピークに近い光で励起させた場合はＤｓＲｅｄも高い割合（７５ｐ）で励起される。図５（ｂ）を参照して、ｍＫＯの吸収特性のピーク５５９ｎｍ（Ｐ６）を中心とする幅３０ｎｍ（Ｗ６）の波長帯で、蛍光を観測すると、ｍＫＯの光にＤｓＲｅｄの光８５ｐ（図中の斜線部分）がかぶって発光する。このｍＫＯの光とＤｓＲｅｄの光量の関係は、図２乃至４で示した光量の関係とは異なる。つまり、これらの光は同じ程度の光量であり、視認観察においては、判別は困難である。特に細胞中の近接する部分で、細胞活動中の同じ活動段階でこれらの蛍光タンパク質が生成された場合には、どちらの蛍光蛋白が生成されたのか判別できない。
【００４７】
図６には、本発明の観察方法を実施した場合について説明する。本発明の観察方法では、このように近接した蛍光特性を有する蛍光タンパク質同士を観察する場合には、少なくとも一方の蛍光タンパク質の蛍光特性のピーク値の波長を使用しない。つまり、ピーク値以外の波長を用いる。図６（ａ）には、励起特性の中心波長をずらした場合を示す。ｍＫＯの励起特性のピーク波長が５５９ｎｍであるが、ここでは、５３２ｎｍ（Ｓ５）を中心した１０ｎｍ（Ｗ５ｓ）の波長幅の光を当てて励起する。これによってＤｓＲｅｄの励起特性においては、ピーク値の６割の光（７５ｓ）で励起される。一方、ｍＫＯは、ピーク値の０．８５倍程度の強さ（５５ｓ）で励起される。
【００４８】
図６（ｂ）を参照して、吸収特性ではｍＫＯのピーク値５５９ｎｍ（Ｐ６ｓ）を中心に２０ｎｍ（Ｗ６ｓ）の波長幅で観測を行う。すると、ＤｓＲｅｄの励起光はピーク値の０．６倍程度であったために吸収特性は、この観測波長帯域で抑圧され（８５ｓ）、ほとんど視認できない程度になる。
【００４９】
図７にはＤｓＲｅｄを観察する場合の励起・吸収の波長帯を示す。ＤｓＲｅｄを励起する場合もそのピーク値である５６３ｎｍからずれた５８０ｎｍ（Ｓ７）を中心とした１３ｎｍ（Ｗ７ｓ）の光をあてる。ｍＫＯの励起を抑制するためである。幸い、ｍＫＯの励起特性はピーク値より大きい波長帯域では急速に低下するため、上記の波長帯域の光でｍＫＯはほとんど励起を抑えられる。
【００５０】
一方図７（ｂ）にはＤｓＲｅｄを観察する場合に利用する波長帯域を示す。ここでは６３０ｎｍ（Ｓ８）を中心として６０ｎｍ幅（Ｗ８ｓ）の波長帯を利用する。他の観測波長帯より広いのは、発光量が少なくなるため広い波長帯域で観測を行い、できるだけ多くの光量を得るためである。
【００５１】
図６および図７を参照して、このように励起・吸収特性が近接した蛍光タンパク質を用いて細胞を発光させ観察する場合には、それぞれの特性のピーク値を使うのではなく、ピーク値から外れた波長の光を使う。特に、波長特性が短い方の蛍光タンパク質を観察する場合は、ピーク値より短い波長の光を利用し、波長が長い方の蛍光タンパク質を観察する場合は、ピーク値より長い波長の光を用いれば、吸収特性の波長の重なりを少なくすることができ、観察時に良好な単一色の画像を得ることができる。
【００５２】
本発明はこのように蛍光特性が近接した蛍光タンパク質を細胞中に導入した場合であっても、それぞれの蛍光タンパク質からの蛍光を分離して観察することができる。
【００５３】
次に結果について説明する。
＜細胞が生きている状態での動原体の可視化＞
動原体は有糸分裂期染色体上の微小管接合部位である。染色体の分配過程を解析するために、われわれは動原体の動きに注目した。動原体の可視化のために、動原体特異的ヒストンＨ３（ＣＥＮＰ−Ａ）をＥＧＦＰとの融合蛋白質にしてヒト乳ガン細胞株であるＭＤＡ４３５中で安定発現させた。
【００５４】
図８Ａに細胞周期を同調せず培養したその細胞のタイムラプス画像を示す。有糸分裂期細胞の動原体だけでなく、間期細胞の「動原体前駆体」も可視化できた。観察を始めた時点では、我々は図８Ａの左側の細胞が有糸分裂期にあると知らなかった。
【００５５】
しかし、画像解析してみると、核内のＥＧＦＰ−ＣＥＮＰ−Ａの一部が、３４分後に急激に細胞質へ拡散したことに気がついた。加えて、いくつかの動原体の点が速やかにそれぞれの位置を変えた。これらの動きは核膜の崩壊を示すものであった。
【００５６】
図８Ｂは、娘動原体の一対のドットが細胞の赤道面にならんでいる分裂中期の細胞を示す。タイムラプス画像は０．５分間隔で取得した。５分後、娘動原体は対極へと分かれ始め、分裂後期が始まったことが示された。
【００５７】
しかし、われわれはいつ２つの娘細胞が分裂終期に入ったのかわからなかった。なぜなら、動原体の可視化だけでは細胞が生きたままの状態で、正確な有糸分裂の段階（時期）を特定するには不十分だから。
【００５８】
＜染色体分配過程を可視化するための生細胞マーカー＞
有糸分裂の事象を正確に追跡するために、我々は３色蛍光細胞株ＭＤＡ−Ｈ３／ｉｍｐ／ｔｕｂを作成した。それにはＥＣＦＰ−ヒストンＨ３とＥＧＦＰ−アルファ−チューブリンとＤｓＲｅｄ−インポーチン−アルファが安定発現している。
【００５９】
細胞周期を同調しないで培養した細胞が生きたままの画像は回転円盤式（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｄｉｓｋ）レーザー共焦点顕微鏡システムによって取得した。
【００６０】
図９に示すように、クロマチンと微小管と核膜は常に３色の蛍光を発する（蛍光染色してある）。我々は細胞が生きたままの状態でどの有糸分裂の時期にあるのかを容易に同定することができた。
【００６１】
凝集したクロマチンが核膜に囲まれている左の二つの細胞は、分裂前期の細胞である(図９Ａ，９Ｂ)。微小管形成中心（ＭＴＯＣ）の形態から、それらの細胞は各々分裂前期の初期と後期であった。同様に、我々は、有糸分裂期染色体に囲まれている２つの星状体を持つ分裂前中期の細胞(図９Ｃ)、染色体が紡錘体の赤道面に並んでいる分裂中期の細胞（図９Ｄ）、娘染色体が分離している分裂後期の細胞（図９Ｅ）と、娘染色体が新たに形成された核膜に覆われている分裂終期の細胞（図９Ｆ）を同定した。
【００６２】
このように、クロマチンと微小管と核膜を同時に可視化することで、分裂前期の初期にある細胞を見つけることが可能となり、以後の染色体の分配過程を細胞が生きたままの状態で解析することが可能となった。
【００６３】
図１０は凝集したクロマチンと２つの微小管形成中心をもつ別の分裂前期にある細胞のタイムラプス画像を示している。
【００６４】
観察を始めて２分後、微小管形成中心の直下の核膜が陥入しはじめ、それらはそのくぼみに配置された。すでに報告があるように。
【００６５】
６分後、核膜は崩壊しつつ、クロマチンはさらに凝集し染色体となった。微小管形成中心から放射状に伸びた細胞質微小管はさらに短くなり、２つの星状体の形成に至った。
【００６６】
１０分後、その星状体は互いに連結され、次第に典型的な２極紡錘体へと変化した（１８分後）。
興味深いことに、この紡錘体はこの段階で２極を通る軸のまわりを回転しているように見えた。染色体は紡錘体の赤道面に集合したが、一つの染色体は３０分後に偶発的に上の方の極に捕らえられた。
【００６７】
我々はこの染色体の動きを追うことができた。つまり、その染色体はそこに１時間（観察後７６−８４分）とどまり、最終的に紡錘体表面上を滑るように赤道面へ移動した。これらの観察結果はＥＣＦＰ−ヒストンＨ３とＥＧＦＰ−アルファ−チューブリンとＤｓＲｅｄ−インポーチン−アルファが有糸分裂時の生細胞可視化のための優れたマーカーであることをはっきりと示した。
【００６８】
＜前期から終期までを通しての有糸分裂の事象をモニターするための４色蛍光ＭＤＡ４３５細胞株の構築（作成）＞
クロマチンと核膜と微小管を同時に可視化することは、細胞が生きたままの状態での動原体の動きを解析するのに大変有効な方法であると思われた。
しかし、２００４年になるまで、これらの三つに加えて、さらに動原体を可視化するための四つめの適切な蛍光蛋白質がなかった。
【００６９】
ＥＢＦＰ（緑色蛍光蛋白質ＧＦＰの青色変異体）は利用できたけれども、３８０ｎｍというような短波長の光で励起することは細胞に対してきわめて強い毒性があった。こういった状況で単量体クサビライシ（サンゴ）オレンジ蛍光蛋白質（ｍＫＯ）が開発された。そこで我々は、オレンジ色動原体蛋白質（ｍＫＯ−ＣＥＮＰ−Ａ）を上記３色蛍光細胞株ＭＤＡ−Ｈ３／ｉｍｐ／ｔｕｂに加えて発現させた４色蛍光細胞株ＭＤＡ−Ｈ３／ｉｍｐ／ｔｕｂ／ＡＦを構築（作成）した。
【００７０】
図１１Ｃと図１１Ｄで示すように、我々は有糸分裂期染色体と紡錘体と動原体を異なった色で同時に可視化できた。我々はまた、有糸分裂期染色体の内部セントロメア領域を可視化するためにＥＧＦＰ−アルファ−チューブリンではなくＥＧＦＰ−サービビンを発現させた、別の４色蛍光細胞株ＭＤＡ−Ｈ３／ｉｍｐ／ｓｕｒ／ＡＦも構築した。
【００７１】
サービビンはＧ２期から中期までセントロメアへテロクロマチンに局在する染色体パッセンジャータンパク質である。図１１Ａに示すように、ＥＧＦＰ−サービビンは、ちょうど動原体の一対のドットの間である内部セントロメア領域に局在した。後期が始まっても（ＥＧＦＰ−サービビンは）紡錘体の赤道面にのこり（図１１Ｂ）それからＧ１期の初期で中央体に局在した。このように、ＥＧＦＰ−サービビンは細胞質分裂用の生細胞マーカーとして利用できた。
【００７２】
同様に、我々は、３番目の４色蛍光細胞系ＭＤＡ−Ａｕｒｏ／ｉｍｐ／Ｈ３／ＡＦ−そこにはＥＧＦＰ−オーロラＡが中心体と星状体と有糸分裂紡錘体を可視化するため発現してある−を構築した（図１１Ｃ，１１Ｄ）。
【００７３】
オーロラＡは中心体のセリン／トレオニンキナーゼで、Ｇ２期の後半から前期にかけておこる中心体の分配や成熟の様子や、それに続く紡錘体の動きを解析するのに有効だと知られている。
【００７４】
図９Ｂと図１１Ｃに示したように、分裂中期の有糸分裂紡錘体はＥＧＦＰ−アルファ−チューブリンまたはＥＧＦＰ−オーロラＡで可視化できた。しかしながら、後期ではＥＧＦＰ−オーロラＡの有糸分裂紡錘体は２つに割けた（図１１Ｄ）。従って、重なり合った微小管はＥＧＦＰ−アルファ−チューブリンでのみ可視化された（図１１Ｅと図１１Ｄを比較の事）。
【００７５】
＜ＭＤＡ−Ａｕｒｏ／ｉｍｐ／Ｈ３／ＡＦ細胞のタイムラプス画像＞
ＭＤＡ−Ａｕｒｏ／ｉｍｐ／Ｈ３／ＡＦ細胞の前期から中期にかけてのタイムラプス画像は従来型の広視野（共焦点でない）蛍光顕微鏡システムを用いて取得された（図１２Ａ）。図１２では、ＥＣＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ｍＫＯ、ＥＧＦＰの発光色を独立に得た状態を示している。図１２Ａはこれらを合成して得た図である。
【００７６】
すなわち、本発明の観察方法によって、それぞれの蛍光タンパク質は、単独に識別することができ、それぞれの蛍光タンパク質と融合されたタンパク質が生成されると、所定の色によって区別することができた。より具体的に言うと、ｍＫＯと融合されたＣＥＮＰ−Ａタンパク質とＤｓＲｅｄと融合されたインポーチン−アルファタンパク質は、同じ色として見えるのではなく、別々の色として観察することができた。
【００７７】
観察を開始した時、ＥＧＦＰ−オーロラＡによって可視化された２つの中心体が対極に位置していており、この細胞は前期の初めであると分かった（０ｍｉｎ）。１１分後、この２つの中心体はお互いに近づく一方、核は少し縮み（核）クロマチンはさらに凝集した。動原体のお互いの位置関係はあまり変化がなかった。
【００７８】
しかし、矢頭で示した動原体のドットはより小さな一対のドットへと分かれた。これは互いに堅く連結している複製した娘動原体が、核膜消失の直前に分離したことを示していた。これは、ＥＧＦＰ−ＣＥＮＰ−Ａのいくらか（すべてではなく）がこの時期に細胞質へ拡散する観察結果と密接に関連している（図８Ａで矢頭で示している左の細胞を参照の事）。
【００７９】
核膜崩壊のはじまりは核が急につぶれるのと時期を同じくする（１５分）。中心体は成長し（大きくなり）、成熟して星状体となった。ゆがんでばらばらになった核膜のなかで、凝集したクロマチン、つまり染色体、が核の内部へ動き、娘動原体のドットが急速にその位置を変えた。
【００８０】
２１分後、２つの星状体が２極紡錘体へと変化した。動原体は有糸分裂紡錘体にとらえられ、その表面に移動した。染色体は、動原体を内側に向けるようにして、輪のような構造へと配置された。２６分後、染色体と動原体は紡錘体赤道面へと集まった。これにより中期に入ったことが示された。動原体は紡錘体上に列になって並んだ。おそらく、（動原体同士は）サービビンタンパク質複合体によって結合されている（図１１Ａ）。
【００８１】
ＭＤＡ−Ａｕｒｏ／ｉｍｐ／Ｈ３／ＡＦ細胞の分裂後期の初期から分裂終期までを通じたタイムラプス画像を２分間隔でとらえた（図１３）。図１３でも４つの蛍光タンパク質からの光を別々に観察できた。後期のはじまりは娘動原体と染色分体の分離で認識された。動原体と染色体は、両極の間の距離をほぼ一定に保ちつつ、極へむかって移動した（０−６分）。核膜が娘染色体の周りに再形成され、終期に入ったことが示された（８分）。細胞質分裂の始まりは、核膜が再形成されるまえに、分裂溝が現れたことで認識された（６分）。これらの結果により、クロマチンと核膜と星状体／紡錘体を同時に可視化することで細胞が生きたままの状態での有糸分裂における動原体の動きを解析するために不可欠であることが示された。
【００８２】
＜考察＞
本研究で、我々は、細胞が生きたままの状態で前期から終期を通じてクロマチンと核膜と動原体と星状体／紡錘体の形態学的変化をモニターするための２種の４色蛍光細胞株を構築した。我々は以前ＥＣＦＰ−ヒストンＨ３とＤｓＲｅｄ−インポーチン−アルファが生細胞中でクロマチンと核膜を２つとも可視化するために利用できることを報告した。
【００８３】
ＥＧＦＰ−アルファ−チューブリンまたはＥＧＦＰ−オーロラＡは星状体と有糸分裂紡錘体を可視化するのに利用された（図９、図１１）。さらにｍＫＯ−ＣＥＮＰ−Ａが動原体の可視化に利用された。これら４色の細胞内構造のマーカーは細胞が生きたままの状態で染色体分配過程全体を解析するのに大変有効であった。
【００８４】
図１２と図１３で示すように、我々は前期の初期や後期の細胞を、その生細胞の画像を顕微鏡で取得することで見つけ、それに続く有糸分裂の事象を正確に追った。染色体分配過程に加えて、Ｓ／Ｇ２期での中心体の複製、Ｇ２期での動原体前駆体の複製、Ｇ２後半／前期にかけての中心体の分配も観察できるだろう。
【００８５】
我々はまた、ＥＧＦＰ−サービビンを生細胞マーカーとして発現させることによって、染色体分配や細胞質分裂をモニターするための別の４色蛍光細胞株も構築した（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。サービビンは内部セントロメア蛋白質（ＩＮＣＥＮＰ）とオーロラＢキナーゼを結合している染色体パッセンジャー蛋白質である。サービビンは有糸分裂期染色体の内部セントロメア領域に局在し、後期で紡錘体中央域に位置を変えた（図１１Ａ、図１１Ｂ）。
【００８６】
サービビンはＧ２期でセントロメアへテロクロマチンに局在することが知られているので、この細胞株はＧ２期での動原体前駆体複製やＧ２後半／前期の初めにかけてのクロマチンの凝縮の様子を解析するためにも利用できるであろう。
【００８７】
生細胞で核膜を可視化するために、我々はN末端を切り取られたインポーチンアルファを融合させたＤｓＲｅｄを用いてきた。実際、それは核膜表面の核膜孔へ局在する様に思われた（データは示さない）。ここで再び、我々はそれ（Ｎ末端を切り取られたインポーチンアルファを融合させたＤｓＲｅｄ）が核膜の消失（図１０および図１２）や核膜の再形成（図１３）を見るための生細胞マーカーとして利用できることを示した。
【００８８】
しかし、この人工（先端を切断されたインポーチン）ペプチドの代わりに、ラミンＢのような核ラミナの構成成分やそのレセプターまたは核膜孔複合体構成成分の蛋白質サブユニットを代用してもよい。
【００８９】
我々は短いが、しかし鮮明な、有糸分裂ＭＤＡ−Ａｕｒｏ／ｉｍｐ／Ｈ３／ＡＦ細胞のタイムラプス画像を４色で取得した（図１２および図１３）。ＥＣＦＰとＥＧＦＰとｍＫＯおよびＤｓＲｅｄの蛍光シグナルを従来型の広視野（ｗｉｄｅｆｉｅｌｄ）顕微鏡システムを用いて分離することができた。我々は細胞へのダメージを和らげるためハロゲンランプを光源に使用し、各々の蛍光蛋白質に適当な励起、吸収フィルタを適用した。
【００９０】
なお、上記実施の形態および実施例では励起・吸収光が可視光の場合を説明したが、本発明の細胞観察方法では、可視光に限定される必要はなく、例えば近赤外光や遠赤外光又は紫外光で励起吸収が生じる蛍光タンパク質を利用して細胞観察を行う際に利用してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
我々は最近、細胞が生きたままの状態で紡錘極形成時における微小管安定化剤の効果について試験をしたが、上記生細胞マーカーは大変有用なマーカーであることが示された我々がここで構築した４色蛍光ＭＤＡ４３５細胞株は微小管と相互作用する薬剤やその他の有糸分裂阻害剤に感受性があった（未発表データ）。
我々は細胞が生きたままの状態でどのようにこれらの阻害剤が有糸分裂を阻害するのかさらなる諸見を得るだろう。
【００９２】
さらに、これらの多色（蛍光）細胞株や（その作成に用いた）生細胞マーカーは、観察前の面倒な固定や染色の手間を省けるので、有糸分裂阻害剤や抗がん剤のハイスループットなスクリーニングにもっと有効であるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】４種類の蛍光タンパク質の励起・吸収特性を示す図である。
【図２】ＤｓＲｅｄの励起・吸収特性を使って、励起・吸収の関係を示す図である。
【図３】ＥＣＦＰを観察する場合の励起・吸収の関係を示す図である。
【図４】ＥＧＦＰを観察する場合の励起・吸収の関係を示す図である。
【図５】ｍＫＯを観察する場合にもし励起特性のピークで励起させた場合にｍＫＯとＤｓＲｅｄの吸収特性の関係を示す図である。
【図６】本発明の観察方法でｍＫＯを観察する場合の励起・吸収特性の関係を示す図である。
【図７】ＤｓＲｅｄを観察する場合の励起・吸収の関係を示す図である。
【図８】ＭＤＡ−ＡＦ８細胞の間期の動原体前駆体、および（分裂期の）動原体のタイムラプス画像である。
【図９】有糸分裂期の３色蛍光ＭＤＡ−Ｈ３／ｉｍｐ／ｔｕｂ細胞の生細胞画像である。
【図１０】３色蛍光ＭＤＡ−Ｈ３／ｉｍｐ／ｔｕｂ細胞の前期から中期にかけてのタイムラプス画像である。
【図１１】本研究で構築された３種の４色蛍光ＭＤＡ４３５細胞株の有糸分裂期細胞の画像である。
【図１２】４色蛍光ＭＤＡ−Ａｕｒｏ／ｉｍｐ／Ｈ３／ＡＦ細胞の、クロマチンと中心体／紡錘体と動原体と核膜の前期から中期にかけての画像である。
【図１３】ＭＤＡ−Ａｕｒｏ／ｉｍｐ／Ｈ３／ＡＦ細胞の染色体、紡錘体、動原体、核膜の分裂中期から終期にかけての画像である。
【図１４】哺乳動物細胞の有糸分裂の模式図である。
【図１５】蛍光顕微鏡の構成を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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