(57)【要約】【課題】酵素が安定的に長期間使用可能であって、特に糖化反応において生産効率が向上する固定化酵素複合体、およびそれを利用し生産した糖液を製造する。【解決手段】活性基として水酸基とアミノ基を両方有する多孔質両性イオン交換樹脂の中から選ばれる担体であり、その樹脂の細孔系が２〜１０００ｎｍであり、各種酵素、好ましくは糖質分解酵素とを水溶液中で接触させて固定化酵素複合体を作製し、液化や糖化反応の触媒として用いることを特徴とする固定化酵素複合体、および利用し生産した糖液。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性基として水酸基とアミノ基を両方有する多孔質両性イオン交換樹脂からなる担体に、酵素を固定化した固定化酵素複合体。
【請求項２】
上記記載の多孔質両性イオン交換樹脂が、レゾルシン・メタフェニレンジアミン・ホルムアルデヒド共付加縮合体、あるいはフェノール・ホルムアルデヒド付加縮合体であることを特徴とする請求項1記載の固定化酵素複合体。
【請求項３】
上記記載の多孔性両性イオン交換樹脂の細孔径が２ｎｍ〜１０００ｎｍであることを特徴とする請求項１乃至２記載の固定化酵素複合体。
【請求項４】
担持する酵素が糖質分解酵素であり、その固定化率が７〜４０％であることを特徴とする請求項１乃至３記載の固定化酵素複合体。
【請求項５】
請求項１乃至４記載の固定化酵素複合体を反応に用いて得られる糖液
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定化酵素複合体に関し、詳しくは、活性基として水酸基とアミノ基を両方有する多孔質両性イオン交換樹脂の担体に、酵素を接触させて固定化した固定化酵素複合体、及び、それを利用して製造した糖液に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素はタンパク質からなる生体触媒で、２０種類のアミノ酸が連結してできた高分子化合物である。特有の立体構造（２ｎｍ〜５０ｎｍ）をしているが、この立体構造が高温などのために破壊されると酵素活性はなくなる(失活)。この酵素は水溶液の状態で用いられ、目的とする反応が終了すると、さらに反応が進行するのを止めるため、加熱や酸、アルカリ処理などで酵素を失活させているが、この場合高価な酵素も使い捨てとなってしまう。
【０００３】
固定化酵素複合体は、不溶性の担体に酵素を保持するため、反応終了後の反応液から酵素失活させることなく分離回収が容易であり、連続操作が可能となる。そこで酵素活性が高くて安定化した固定化酵素複合体の実現が望まれている（例えば、非特許文献１参照。）
【０００４】
酵素を固定化する方法には、担体結合法、架橋法、包括法があり、担体結合法は、さらに共有結合法、イオン結合法、物理吸着法に区分される。これらは単独だけでなく併用して用いられることが多い。例えば、多孔性粒状珪藻土を担体に用いる方法では（例えば、特許文献１参照。）、ポリエチレンイミンを作用させた多孔性粒状珪藻土を調製して、別に、酵素にグルタルアルデヒドを作用させた処理酵素を調製してから該担体と該処理酵素とを反応させて固定化糖化酵素複合体を作製している。更に詳しくは、澱粉の糖化技術に関する固定化には多様な方法があり、グルコースの製造法において多孔質キトサンビーズと膜モジュールを担体とする方法（例えば、特許文献２参照。）、グルコースの製造方法においてグルタルアルデヒド処理した限外濾過膜を担体とする方法（例えば、特許文献３参照。）、オリゴ糖の製造方法においてアルギン酸カルシウムゲルによる包括法（例えば、特許文献４参照。）、澱粉の糖化方法においてグルタルアルデヒド処理した豚骨粉砕物を担体とする方法（例えば、特許文献５参照。）、粒状固定化リパーゼ調製品においてマクロポーラスシリカもしくはケイ酸塩を担体とする方法（例えば、特許文献６参照。）、固定化酵素においてグルタルアルデヒド処理したゼラチンと活性炭を担体とする方法（例えば、特許文献７参照。）、固定化酵素及びトレハロースの製造方法においてフェノール系陰イオン交換樹脂を担体とする方法（例えば、特許文献８参照。）、固定化酵素においてアルミニウムとマグネシウムとの複合酸化物を担体とする方法（例えば、特許文献９参照。）、オリゴ糖シロップの製造方法において酵素反応の再循環にナノ濾過膜装置を用いる方法（例えば、特許文献１０参照。）、固定化酵素の製造方法において塩水溶液中で固定化担体に酵素を吸着させる方法（例えば、特許文献１１参照。）、酒類及び甘味食品の製造方法においる固定化酵素の利用例（例えば、特許文献１２参照。）など、様々な創意工夫が試みられているが、詳述した如く、酵素や担体を活性化試薬や架橋剤のような薬剤処理する方法が多く、これらを使用することなく、酵素を担体に安定に吸着させる方法が強く要望されていた。
【特許文献１】特開平７−１４７９８１号公報
【特許文献２】特開昭６３−１９２３９７号公報
【特許文献３】特開平１−１４４９９０号公報
【特許文献４】特開平４−６６０９４号公報
【特許文献５】特開平４−１７３０９５号公報
【特許文献６】特開平４−５０１６６４号公報
【特許文献７】特開平６−２２７６１号公報
【特許文献８】特開平１０−２４８５６０号公報
【特許文献９】特開平１１−６９９７４号公報
【特許文献１０】特表２００１−５２５１７７号公報
【特許文献１１】特開２００４−６５１５３号公報
【特許文献１２】特開２０００−１８４８７８号公報
【非特許文献１】豊田中央研究所 Ｒ＆Ｄレビュー  Ｐ５７〜６２  Ｖｏｌ．３６ Ｎｏ．２ （２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、酵素の担体結合法においても特定の細孔分布を有し、かつ特定の合成樹脂材料から構築された活性基をもつ吸着剤の担体を選定することにより、物理吸着に基づく処理操作のみで酵素の固定化が堅固に維持されており、例えば、担体ならびに酵素に対して固定化のための複雑な処理を施さなくとも担体からの酵素の脱離がなく、酵素活性の安定性に優れた固定化酵素複合体を提供すること、および、それを利用して効率的に糖液を製造することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、担体として多孔質両性イオン交換樹脂と酵素とを接触させて固定化酵素複合体を作製し、該固定化酵素複合体を反応の触媒として効果的に使用できることを見出し、本発明をなした。
【０００７】
すなわち本発明は、活性基として水酸基とアミノ基を両方有する多孔質両性イオン交換樹脂からなる担体に酵素を接触させて固定化した固定化酵素複合体や、活性基として水酸基とアミノ基を両方有する多孔質両性イオン交換樹脂がレゾルシン・メタフェニレンジアミン・ホルムアルデヒド共付加縮合体、あるいはフェノール・ホルムアルデヒド付加縮合体である固定化酵素複合体や、活性基として水酸基とアミノ基を両方有する多孔質両性イオン交換樹脂のポアサイズが２ｎｍ〜１０００ｎｍである固定化酵素複合体からなる。
【０００８】
また本発明は、酵素の固定化率が７〜４０％である固定化酵素複合体や、糖質分解酵素である固定化酵素複合体であり、さらにそれを利用して製造して糖液を得る事である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来の活性炭、珪藻土を担体に用いた担体結合法による固定化酵素に比べて、活性基として水酸基とアミノ基両方を有する多孔質両性イオン交換樹脂を担体に用いることにより酵素固定化率の高い固定化酵素複合体を製造でき、反応をより効率的に実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
多孔質両性イオン交換樹脂は、モノマーは溶かすがポリマーは溶かさない溶媒の存在下で合成を行い、析出したポリマー中からこの溶媒を除去することによって樹脂母体中にミクロポア(０．１ｎｍ〜２ｎｍ)、メソポア(２ｎｍ〜５０ｎｍ)、マクロポア(５０ｎｍ〜１０００ｎｍ)の細孔を多数形成させて作られ、数十から数百ｍ２／ｇの比表面積を有するため吸着作用に優れる。
【００１１】
多孔質両性イオン交換樹脂は水酸基とアミノ基が共存した構造を持つので、酸性、中性域においては物理吸着だけでなく化学吸着も起こる。アルカリ域では吸着した物質の脱着(溶離)作用が起きる。この作用を利用した再生法により多孔質両性イオン交換樹脂の反復使用が可能となるので廃棄物を減少させ環境にも良い。市販品には、代表として、ホクエツＫＳ、ホクエツＨＳ、ホクエツＤＳがあり、その他Ａｐｏｌｌｉｔｅ
３７、Ｉｏｎａｃ Ｂ−１００、Ａｓｍｉｔｅ １７３、Ｄｕｏｌｉｔｅ ＥＳ−３３などがある。
【００１２】
物理吸着における酵素の固定化には、酵素分子の大きさに対して多孔質両性イオン交換樹脂の細孔の大きさが影響する。本発明には、ミクロポアが発達した形状よりも、メソポアやマクロポアが発達した形状である多孔質両性イオン交換樹脂の方が適している。酵素の大きさは２ｎｍ〜５０ｎｍであり、ミクロポア（０．１ｎｍ〜２ｎｍ）では細孔が小さすぎて固定化には適していない。メソポア（２ｎｍ〜５０ｎｍ）の細孔の大きさは、酵素の大きさと合致し固定化に適しているが、酵素の大きさが上限側で細孔の大きさが下限側の場合は吸着が一部制約される。マクロポア（５０ｎｍ〜１０００ｎｍ）の細孔の大きさは、酵素より大きいので制約は少なく、吸着にはより適している。
【００１３】
本発明で使用する糖質分解酵素は、α−アミラーゼ、耐熱α−アミラーゼ、バクテリアα−アミラーゼ、カビα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、アミログルコシダーゼ、α−グルコシダーゼ、マルトトリオヒドロラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、シクロデキストリントランスフェラ−ゼ、イヌリナーゼ、トランスグルコシダーゼ、インベルターゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、デキストラナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースイソメラーゼおよびその混合物やそのＧＭＭ酵素（遺伝子組換え添加物）を包含する。これらの酵素の内で特に好ましいのは、グルコアミラーゼおよびそのＧＭＭ酵素である。
【００１４】
本発明に係る酵素の固定化の条件は、以下に代表例を記すが、特にこれに限定されるものではない。
まず、酢酸塩緩衝溶液を調整して、この溶液中に酵素を加えて酵素緩衝溶液とする。これに多孔質両性イオン交換樹脂を加えて、溶液温度：２５〜３５℃、溶液ｐＨ:４．０〜５．０、溶液攪拌又は振とう速度：３０〜１００ｒｐｍ、吸着時間：２〜５時間かけて、酵素たんぱく質を多孔性両性イオン交換へ固定化させる。酵素１質量部に対して、多孔性両性イオン交換樹脂を1容量部、酢酸緩衝溶液を１０質量部部程度の比率で使用することが望ましい。酵素を固定化した多孔質両性イオン交換樹脂は酵素緩衝溶液から取出してから、約１０倍量の水の中で洗浄を行って、本発明の固定化酵素複合体とする。
【００１５】
本発明の固定化酵素複合体は、バッチ（回分）方式でも反応は可能であるが、カラム等の容器に該固定化酵素複合体を充填して、所定の反応条件で原液を連続的に接触させる事により、反応時間は従来の酵素の１／１０〜１／１００程度に大幅に短縮できる。カラム方式の反応条件としては、バッチ方式の反応条件と比較すると、液化液ＤＥは粘性を下げるため、やや高目のＤＥ２０〜３５とする。液化液濃度はバッチと同等の２５〜３５質量％とする。作用温度は反応中の雑菌汚染防止の維持と、酵素（グルコアミラーゼ）の熱安定を図るため、やや低目の５０〜５８℃とする。空間速度（ＳＶ）は反応時間３０分〜２時間内での反応完了を目標にＳＶ０．５〜２．０で行う。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００１７】
［実施例１］（固定化酵素複合体の調製）
多孔質両性イオン交換樹脂であるホクエツＨＳ（味の素ファインテクノ社製細孔径：２ｎｍ〜５０ｎｍ）を担体として用いた。２５０ｍｌ容共栓三角フラスコに多孔質両性イオン交換樹脂（水に浸漬してある多孔質両性イオン交換樹脂をブフナーロートの濾紙上で濾別して、水滴がなくなるまで吸引した湿重量状態のもの）各１０ｇを量り取り、０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）１００ｇに、グルコアミラーゼ（ノボ社：ＡＭＧ３００）１０ｇを加えた酵素緩衝溶液に担体を加え、温度３０℃、振とう（６０回/分）しながら５時間固定化した。上澄酵素（非吸着酵素）液の力価の測定により、固定化率を求めた後、固定化酵素複合担体を、純水１リットルで洗浄（デカンテーション）して固定化酵素複合体Ａを得た。
【００１８】
［実施例２］
多孔質両性イオン交換樹脂ホクエツＨＳ（味の素ファインテクノ社製  細孔径：２ｎｍ〜５０ｎｍ）の替わりに、多孔質両性イオン交換樹脂ホクエツＤＳ（味の素ファインテクノ社製  細孔径：５０ｎｍ〜１０００ｎｍ）を使用した以外は、実施例１と同様の作業をおこない、固定化酵素複合体Ｂを得た。
【００１９】
［実施例３］
グルコアミラーゼ（ノボ社：ＡＭＧ３００）の替わりに、デキストロザイムＤＸ（ノボ社製）を使用した以外は、実施例１と同様の作業をおこない、固定化酵素複合体Ｃを得た。
【００２０】
［比較例１］
多孔質両性イオン交換樹脂ホクエツＨＳ（味の素ファインテクノ社製  細孔径：２ｎｍ〜５０ｎｍ）の替わりに、多孔質両性イオン交換樹脂ホクエツＫＳ（味の素ファインテクノ社製  細孔径：０．１ｎｍ〜２ｎｍ）を使用した以外は、実施例１と同様の作業をおこない、固定化酵素複合体Ｄを得た。
【００２１】
［比較例２］
多孔質両性イオン交換樹脂ホクエツＨＳ（味の素ファインテクノ社製  細孔径：２ｎｍ〜５０ｎｍ）の替わりに、粒状活性炭ホクエツＧＳ（味の素ファインテクノ社製  細孔径：２ｎｍ〜５０ｎｍ）を使用した以外は、実施例１と同様の作業をおこない、固定化酵素複合体Ｅを得た。
【００２２】
［比較例３］
多孔質両性イオン交換樹脂ホクエツＨＳ（味の素ファインテクノ社製  細孔径：２ｎｍ〜５０ｎｍ）の替わりに、粒状珪藻土ラヂオライト３０００（昭和化学工業社製  細孔径：２ｎｍ〜５０ｎｍ）を使用した以外は、実施例１と同様の作業をおこない、固定化酵素複合体Ｆを得た。
【００２３】
［比較例４］
多孔質両性イオン交換樹脂ホクエツＨＳ（味の素ファインテクノ社製  細孔径：２ｎｍ〜５０ｎｍ）の替わりに粒状活性炭ホクエツＧＳ（味の素ファインテクノ社製  細孔径：２ｎｍ〜５０ｎｍ）を使用し、グルコアミラーゼ（ノボ社：ＡＭＧ３００）の替わりにデキストロザイムＤＸ（ノボ社製）を使用した以外は、実施例１と同様の作業をおこない、固定化酵素複合体を得た後、さらに、１％グルタルアルデヒド溶液（ｐＨ４．５）１００ｇに浸漬させ、温度２０℃で、振とう（１００回／分）しながら２時間架橋反応した。架橋後、純水1リットルで洗浄して、固定化酵素復合体Ｇを得た。
【００２４】
［比較例５］
酵素グルコアミラーゼ（ノボ社：ＡＭＧ３００）を担体に固定化せず、そのまま使用した。
【００２５】
上記実施例１〜３、及び比較例１〜４にて調製した固定化酵素複合体Ａ〜Ｇの固定化率は、酢酸塩緩衝溶液に酵素を加えた酵素緩衝溶液の初期酵素活性（Ａ）を測定し、これに多孔質両性イオン交換樹脂を加えて酵素固定化処理を行い、多孔質両性イオン交換樹脂を取出した後の酵素緩衝溶液の残存酵素活性（Ｂ）を測定して、（Ａ−Ｂ／Ａ）×１００で求めた。同時に固定化酵素（多孔質両性イオン交換樹脂担体）ｇあたりの酵素活性を、（Ａ−Ｂ）／担体ｇで求めた。結果を表１に示す。
【００２６】
実施例及び比較例に係る試験法は、澱粉糖関連工業分析法（食品化学新聞社1991）に準じた。すなわち、酵素活性は、酵素剤（グルコアミラーゼ、β−アミラーゼ）の活性測定における還元糖の定量法として、ＪＩＳ−Ｋ−７００１−１９９０で指定されているフェーリング・レーマン・ショール法で測定した。
【００２７】
【表１】
2009125038.tif 000002
【００２８】
（固定化酵素複合体を用いたバッチ方式による糖化反応）
上記実施例１〜３、及び比較例１〜４にて調製した固定化酵素複合体Ａ〜Ｇをそれぞれ１ｇ（湿重量）、比較例５の場合は０．００５ｇを量り取り、２０％澱粉液化液（ＤＥ１２と２５）５ｇ、０．１Ｍ酢酸塩緩衝液５ｇを加え、温度４０℃、ｐＨ４．５、基質濃度１０％、振とう（６０回／分）の糖化条件で６０分間反応後、糖組成あたりのグルコース量をＨＰＬＣで分析し比較した。結果を表２に示す。
【００２９】
（固定化酵素複合体を用いたバッチ方式による糖化反応の反復使用）
上記実施例１〜３、及び比較例１〜４にて調製した固定化酵素複合体Ａ〜Ｇをそれぞれ１ｇ（湿重量）を量り取り、１バッチあたりの糖化条件として、２０％澱粉液化液（ＤＥ２５）５ｇ、０．１Ｍ酢酸塩緩衝液５ｇを加え、温度４０℃、ｐＨ４．５、基質濃度１０％、振とう（６０回／分）で６０分間反応後、固定化酵素結合体は反応系から取り出して、純水１００ミリリットルで洗浄（デカンテーション）した。各５バッチ反復使用を行い、糖組成あたりのグルコース量をＨＰＬＣで分析し、５バッチの平均で比較した。結果を表２に示す。
【００３０】
（固定化酵素複合体のカラム方式による糖化反応）
温水ジャケット付のガラスカラム(内径３．５ｃｍ×長さ５０ｃｍ)に、上記上記実施例１〜３、及び比較例１〜４にて調製した固定化酵素複合体Ａ〜Ｇをそれぞれ３００ｇ(湿重量)を充填し、水飴(群栄化学工業社製：ＤＥ２５)を濃度３０％、ｐＨ４．５±０．２に調整し、温度５５℃、ＳＶ（空間速度）０．５の条件で連続糖化反応した。各反応液のグルコース量を、２時間後、１００時間後、３００時間後、７００時間後に測定した。結果を表２に示す。
【００３１】
（固定化しない酵素を用いたバッチ方式による糖化反応）
比較例５にて調整した酵素を基質(濃度)あたり０．１質量％加え、水飴(群栄化学工業製：ＤＥ２５)を濃度３０％、ｐＨ４．５±０．２に調整して、温度５５℃、振とう（３０回／分）の条件で、糖化反応した。反応液のグルコース量を、２時間、１００時間、３００時間、７００時間後に測定した。結果を表２に示す。
【００３２】
実施例及び比較例に係る液化液のＤＥは、氷点降下度による方法（米フィスケ社：オズモメーターＯＳ型）で測定した。糖化液のグルコース定量は、ＨＰＬＣ（カラム：島津製作所ＳＣＲ−１０１、カラム温度：８５℃、移動相：純水、検出器：ＲＩ、データ処理：修正面積百分率法）で測定し、糖液のｐＨは、ガラス電極ｐＨメーター（堀場製作所：Ｆ−５２型）で測定した。
【００３３】
【表２】
2009125038.tif 000003
【００３４】
表１、表２から、多孔質両性イオン交換樹脂のうち、ホクエツＫＳはミクロポアを主体とするもので、本発明の固定化酵素複合体の担体としては不適であることが分かる。また、メソポア、ミクロポアを主体とするホクエツＨＳ及びホクエツＤＳを固定化酵素複合体の担体とした場合は、多孔質粒状活性炭及び多孔質粒状珪藻土を担体とした固定化酵素複合体と比較して、さらに該固定化酵素複合体をグルタルアルデヒド処理したものと比較しても、安定した固定化酵素複合体を作製できることが分かる。
また、７００時間後のグルコース生成量は初発（２時間後）に比べて６％減少に抑えられ、糖液製造のための長時間安定な固定化糖化酵素複合体であった。
【００３５】
また、本発明による固定化酵素複合体を澱粉糖化工程における液化液の加水分解反応の触媒に用いると、通常の方法よりも数段効率的に、グルコース含有糖液の生産を行うことができることがわかった。グルコース組成においても何ら問題の無いものが得られ、バイオエタノールなどのアルコール原料の前駆体となるグルコース含有糖液を効率的に得ることができる。