(57)【要約】【課題】気泡の抑制と除去を容易にし、細胞電気生理センサの測定に関する信頼性を向上させることを目的とする。【解決手段】少なくとも一つの貫通孔１を有したダイアフラム２と、このダイアフラム２を支持するとともにキャビティ６を有したフレーム５とからなる細胞電気生理センサであって、前記ダイアフラム２はシリコン層３と二酸化シリコン層４の積層構造とし、前記二酸化シリコン層４の表面を凹凸形状とした構成とすることによって、気泡の発生を抑制できるとともに残留した気泡の除去を容易にできることから、細胞電気生理センサの測定に対する信頼性を向上させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの貫通孔を有したダイアフラムと、このダイアフラムを支持するとともにキャビティを有したフレームとからなる細胞電気生理センサであって、前記ダイアフラムはシリコン層と二酸化シリコン層の積層構造とし、前記二酸化シリコン層の表面を凹凸形状とした細胞電気生理センサ。
【請求項２】
二酸化シリコン層の凹凸形状の表面粗さを中心線平均粗さ（Ｒａ）で５ｎｍ以上とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項３】
貫通孔の周縁部の二酸化シリコン層の表面を平滑にした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項４】
平滑な表面を有する貫通孔の周縁部の二酸化シリコン層の領域を細胞の大きさよりも大きくした請求項３に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項５】
少なくともキャビティおよび貫通孔の内壁面を二酸化シリコン膜で被覆した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の細胞外電位あるいは細胞の活動に発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞電気生理センサに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来の、細胞の電気的活動を指標にして細胞膜に存在するイオンチャネルの機能を解明したり、薬品をスクリーニング（検査）したりする方法として、パッチクランプ法が挙げられる。
【０００３】
このパッチクランプ法は、マイクロピペットの先端部分で細胞膜の微小部分（パッチという）を軽く吸引し、マイクロピペットに設けた微小電極プローブを用いて、パッチを横切る電流を、固定（クランプ）した膜電位のもとで測定するものである。そして、これにより、パッチに存在する１個または少数個のイオンチャネルの開閉の様子を電気的に記録することができるものである。そして、これは細胞の生理機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである。
【０００４】
しかしながら、パッチクランプ法はマイクロピペットの作成および操作に特殊な技術・技能を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要することから、大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする用途には適していない。
【０００５】
これに対して、近年、微細加工技術を利用した平板型の微小電極プローブの開発がなされており、この方法は個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。
【０００６】
例えば、細胞保持基板に複数の貫通孔を設け、この貫通孔の開口部に被検体細胞を接着させ、貫通孔の下方に配置した測定電極で、被検体細胞の電位依存性のイオンチャネル活性を測定する技術を開示している（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
また、シリコン酸化物製の細胞保持基板（ｍｅｍｂｒａｎｅ）の内部に２．５μｍの貫通孔（ｈｏｌｅ）を形成し、この貫通孔にヒト培養細胞株の一種であるＨＥＫ２９３細胞を保持させて高い密着性を確保して高精度に細胞外電位を測定する技術を開示している（例えば、非特許文献１参照）。
【０００８】
さらに、図９に示したように、従来の細胞電気生理センサ３１は細胞保持基板３２と、この細胞保持基板３２の上面に形成された凹部３３と、この凹部３３の下部から細胞保持基板３２の下面まで連結する貫通孔３４と、細胞保持基板３２の上方に配置された参照電極３５と、前記貫通孔３４の内部に配置された測定電極３６とを備えている。そして、この測定電極３６は配線３７を経て信号検出部に連結されている。また、前記細胞保持基板３２はウエル３８の内部に配置されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００９】
次に、前記細胞電気生理センサ３１の動作方法について、以下に説明する。
【００１０】
まず、ウエル３８の内部に細胞および電解液４０が注入され、細胞が凹部３３によってトラップ（捕捉）されて保持される。この凹部３３に保持された細胞を以下被検体細胞３９という。
【００１１】
そして、測定の際には被検体細胞３９は貫通孔３４の下方から吸引ポンプなどで吸引され、貫通孔３４の開口部に密着した状態で保持される。すなわち、この貫通孔３４がガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たしている。そして、被検体細胞３９のイオンチャネルの機能性や薬理反応などは、参照電極３５と測定電極３６との間における反応前後の電圧、あるいは電流を測定し、細胞内外の電位差を求めることによって分析している。
【特許文献１】特表２００２−５１８６７８号公報
【特許文献２】国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット
【非特許文献１】T.Sordel et al, Micro Total Analysis Systems  ２００４，Ｐ５２１〜５２２（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、従来の細胞電気生理センサは、参照電極と測定電極との間における電位差の測定値に誤差が生じ、細胞電気生理センサの測定に対する信頼性が低下するという問題があった。
【００１３】
それは、流路の内壁面の親水性が低い部分、あるいは細胞保持基板には気泡が残りやすく、この気泡の抵抗値は非常に大きいため、この気泡の有無によって測定値が変動するからであった。
【００１４】
特に、貫通孔周辺部に発生した気泡は、測定電極で検知する電流、あるいは電圧の測定値を大きく変動させる要因となっていた。
【００１５】
そこで、本発明は、貫通孔の周辺における気泡の発生を抑制するとともに効率良く気泡を除去することによって、測定に対する信頼性に優れた細胞電気生理センサを実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記従来の課題を解決するために、本発明は、貫通孔を有した二層構造のダイアフラムと、このダイアフラムを支持するとともにキャビティを有したフレームとからなり、前記ダイアフラムはシリコン層と二酸化シリコン層の積層構造とし、前記二酸化シリコン層の表面を凹凸形状としたものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の細胞電気生理センサは、ダイアフラムの表面を親水性に優れた二酸化シリコンとし、かつその表面を凹凸形状とすることによって、貫通孔の周辺における気泡の発生を抑制するとともに、残留した気泡を効率良く除去することができるセンサ構造とするものである。その結果、ダイアフラムの表面に付着した気泡を除去し、細胞電気生理センサの測定に対する信頼性を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの構成について、図面を参照しながら説明する。
【００１９】
図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図であり、図２は図１の平面図である。また、図３は本実施の形態１の細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理現象を測定する方法を説明するための断面図である。
【００２０】
図１及び図２において、本実施の形態１における細胞電気生理センサは、シリコン基板などの入手性、加工性に優れたウエハーを準備し、フォトリソ技術を用いたエッチング加工などによって、一括して作製することができるとともに、高寸法精度で微小な形状を有する細胞電気生理センサを効率よく作製することができる。
【００２１】
特に、シリコンと二酸化シリコンの積層構造を有したＳＯＩ基板を用いることが好ましい。このＳＯＩ基板は半導体デバイスを作製する際に良く用いられ、入手は容易であり、二酸化シリコンの厚みは所定の厚みに指定することによって容易に作製することができるものである。
【００２２】
そして、本実施の形態１における細胞電気生理センサの基本的な構成は、少なくとも一つの貫通孔１を有する薄板状のダイアフラム２を形成しており、このダイアフラム２はシリコン３と二酸化シリコン４からなる積層構造としている。そして、前記二酸化シリコン４の表面は凹凸部４ｂを有しており、この凹凸部４ｂを設けることによってダイアフラム２の表面は親水性をより高めることができ、気泡の移動および除去を容易に行うことができる。
【００２３】
また、貫通孔１には測定のための被検体細胞９ａが吸引固定されることから、この貫通孔１の近傍の表面は平滑な表面をしている平滑部４ａを設けることが好ましい。そして、平滑性は中心線平均粗さ（Ｒａ）で１ｎｍ以下が好ましい。これによって、被検体細胞９ａの保持性と気密性を高く保持することができるとともに、被検体細胞９ａの皮膜表面を損傷することを防止することができる。従って、二酸化シリコン４に平滑部４ａを設ける領域は被検体細胞９ａの大きさよりも若干大きくなるように貫通孔１の周縁部に設けることが好ましい。
【００２４】
そして、本実施の形態１における細胞電気生理センサは前記ダイアフラム２を固定支持するとともに測定装置などへの固定配置を容易にするためのフレーム５を設けており、このフレーム５をシリコンとすることによって、中間に二酸化シリコン４を配した市販のＳＯＩ基板を加工することによって、寸法精度に優れた細胞電気生理センサを効率よく実現することができる。
【００２５】
なお、前記貫通孔１は少なくとも一つあれば良く、複数の細胞９を同時に測定したいときには、複数の貫通孔１を形成することも可能である。これによって、複数の細胞９を複数の被検体細胞９ａとして同時に測定することによってＳ／Ｎ比を高めることができる。
【００２６】
また、前記フレーム５の内部には液体などを貯留することができるキャビティ６を形成している。このキャビティ６は細胞９などを含んだ液体などを貯留しておくためのものである。そして、このような構成の細胞電気生理センサは液体の中で浮遊している複数の細胞９の中から、吸引などの手段によって貫通孔１を塞ぐように細胞９を固定して被検体細胞９ａとすることができる。その後、この被検体細胞９ａの薬液などに対する反応を接続された電極にて測定するものである。
【００２７】
特に、本実施の形態１における細胞電気生理センサの構成の特徴は、ダイアフラム２をシリコン３と二酸化シリコン４の積層構造とし、この二酸化シリコン４の表出面を凹凸形状とした構成としていることである。このような構造とすることによって、親水性に優れた二酸化シリコン４を表出面とし、その表出面を凹凸形状とすることによって、その親水性を更に高めてダイアフラム２の表面における気泡の発生の抑制と気泡の除去を容易に行うことができることから高精度な測定を可能とする細胞電気生理センサを実現することができるものである。
【００２８】
ここで、この凹凸形状を有した二酸化シリコン４の表面に、分注器などを用いて液滴状の細胞９を分散させた液体をキャビティ６の内部へ注入したとき、液体は表面張力によって球面状の外観形状を形成しており、そのまま自動分注機などを介してキャビティ６の中へ所定量の液体を分注する必要がある。そして、安定に精度良く被検体細胞９ａの電気化学的変化を測定するためには、貫通孔１の周辺に気泡の残留していない状態で液体を充填しておくことが重要である（図３参照）。これを実現するために、ダイアフラム２の表面を図１に示したような親水性に優れた表面構造にしておくことによって、滴下した液滴は凹凸部４ｂの先端部から速やかに濡れ広がりを示すようになり、気泡の発生の抑制と気泡の除去を効率よく行うことができるダイアフラム２を実現することができる。
【００２９】
ここで、二酸化シリコン４の表出面である凹凸部４ｂの表面粗さはＲａ≧５ｎｍが好ましく、より好ましくはＲａ：５〜２００ｎｍである。Ｒａが５ｎｍを下回ると親水性が低下し、２００ｎｍを上回ると加工性が低下するからである。この凹凸部４ｂは生産性の観点からエッチング技術を用いることが好ましい。
【００３０】
このような構成の細胞電気生理センサを用いて、気泡が残留しない状態で液体を充填し、例えばキャビティ６の内部に細胞９を分散させた細胞外液１０を貯留し、その内の一個の細胞９を貫通孔１の上に吸引手段などによってトラップさせることによって高精度に測定することができる被検体細胞９ａとすることができる。
【００３１】
一方、気泡の発生の抑制と除去という観点からはダイアフラム２の表出面を全て凹凸部４ｂからなる二酸化シリコン４で構成することが好ましいが、貫通孔１に吸引された被検体細胞９ａは薄い皮膜にて保護された形態をしており、この二酸化シリコン４の突起部によって被検体細胞９ａの薄い皮膜が損傷する可能性がある。
【００３２】
これを防止するため、貫通孔１の周縁部の表面は平滑な形状を有していることが好ましい。
【００３３】
また、被検体細胞９ａは貫通孔１を塞ぐように吸引固定し、貫通孔１によって分離された二つの領域の電気的な変化を測定することから、被検体細胞９ａの貫通孔１における気密性は重要なファクターである。この気密性を高く均質に保持することからも貫通孔１の周縁部の二酸化シリコン４は平滑部４ａで構成することが好ましい。これによって、気密性を安定して保持しながら被検体細胞９ａの電気的変化を測定することができる。ここで、細胞９の大きさは数μｍ〜５０μｍであるので、細胞９の大きさより若干大きな面積の平滑な二酸化シリコン４の表出面とすることが好ましい。
【００３４】
これに対して、凹凸部４ｂを有した二酸化シリコン４を設けていないセンサ構造では、マイクロピペットを用いて液体を分注するときなど、マイクロピペットの先端にできる液滴がそのままの状態で滴下され、キャビティ６の内部に存在していた空気などの気泡をうまく除去できなくなり、ダイアフラム２の表面に気泡となって残存することが問題であった。
【００３５】
そして、この気泡が貫通孔１の近傍に残存していると、吸引手段を用いて貫通孔１の上方に固定させた被検体細胞９ａの電気化学的変化である電流あるいは電圧の微小変化を高精度に測定することが困難であった。
【００３６】
また、細胞の電気生理現象の測定を安定して行うためには、前記貫通孔１の大きさは被検体細胞９ａの大きさよりも少し小さな形状とし、この貫通孔１を塞ぐように被検体細胞９ａを吸引などの手段によって被検体細胞９ａを固定しておける形状とすることが好ましく、前記貫通孔１の開口部の直径は３μｍとした。
【００３７】
このように、細胞９の大きさが５〜５０μｍ程度である場合、細胞９と貫通孔１とを高い密着性を持って保持するには、貫通孔１の開口部の直径を３μｍ以下とすることが望ましいからである。
【００３８】
なお、この貫通孔１の開口部の最適な大きさは、測定する被検体細胞９ａの形状、性質によって決定することができる。
【００３９】
そして、ダイアフラム２の厚みは１０〜３００μｍとすることが加工性、機械的強度等の観点から好ましい。
【００４０】
また、キャビティ６の内径は１００μｍ〜２．０ｍｍとすることが生産性の観点から好ましい。１００μｍより小さくなると液体の分注などが困難となるとともに、気泡の残留が多く発生するようになる。また、２ｍｍを越えるとセンサの生産性が低下するとともに、少量の細胞９を含んだ液体等の測定に不向きとなる。
【００４１】
また、このダイアフラム２を支持するとともに液体を貯留しておくためのキャビティ６を有したフレーム５から構成することが機械的強度と取り扱いの観点から好ましい。
【００４２】
次に、前記のような構成を有する細胞電気生理センサを用いて、細胞９が活動する際に発する電気生理活動を測定する方法について、図面を用いてさらに詳細に説明する。図３は前記細胞電気生理センサを測定装置にセットした際の測定装置の模式断面図である。
【００４３】
図３に示したように、細胞電気生理センサはプラスチックなどの絶縁体からなる容器１７の内部に設けた仕切り板１４の内部にセットされている。そして、この仕切り板１４の上層部には液体を貯留するためのウエル１５を配置している。
【００４４】
また、前記仕切り板１４とウエル１５は樹脂などで構成することが生産性、加工性及び寸法精度などの観点から好ましい。
【００４５】
さらに、この仕切り板１４の内部には開口部を設けており、細胞電気生理センサは開口部の内部にダイアフラム２が下面側とし、開口部に液漏れが発生しないように隙間無く接合することによって、容器１７の内部の空間はダイアフラム２を境に２つの領域に仕切られることとなり、仕切り板１４によって仕切られた上下の領域内には細胞外液１０または培養液などの液体と細胞内液１１または薬液などの液体がそれぞれ貯留されることとなる。そして、これらの被検体細胞９ａの上下の液体の移動は貫通孔１を介してのみ行われることとなる。また、容器１７の一部を用いて仕切り板１４の下面側には流路１６を形成しておき、この流路１６の内部にマイクロポンプなどの送液手段を用いて細胞内液１１あるいは薬液などの液体を充填、除去することができるようにしている。
【００４６】
さらに、仕切り板１４の上側には細胞外液１０中に銀・塩化銀電極などで構成した参照電極１２を配置し、仕切り板１４の下側には細胞内液１１中に銀・塩化銀電極などで構成した測定電極１３を配置している。
【００４７】
なお、これらの参照電極１２と測定電極１３が入れ替わっていても良い。また、参照電極１２及び測定電極１３は、クロム、チタン、銅、金、白金、銀および塩化銀からなる材料から選択することも可能である。さらに、参照電極１２及び測定電極１３は針状の微小電極プローブを用いてもよい。
【００４８】
次に、上記のような細胞電位測定装置を準備した状態で、測定対象である細胞外液１０などの液体中に分散させた細胞９を容器１７の上部側より分注器を用いて分注し、その後吸引ポンプなどを用いて仕切り板１４の下側が低圧になるように吸引力を制御することによって、仕切り板１４の上下間に所定の圧力差を発生させる。このとき、一個の細胞９が貫通孔１の開口部に引き寄せられて吸引保持され、被検体細胞９ａとしている。
【００４９】
そして、この圧力差が維持されていると十分な密着性が確保されることとなり、内部にある細胞外液１０と細胞内液１１との間で電気的抵抗値を持つようになる。
【００５０】
この被検体細胞９ａの吸引圧力を制御することによって前記被検体細胞９ａの皮膜の一部を破るとともに、さらに被検体細胞９ａの貫通孔１の下面側より、細胞内液１１を注入することによって、被検体細胞９ａの一部に細胞内液１１と接触させることができる。これによって、被検体細胞９ａの電気化学的変化を測定できる状態となる。
【００５１】
次に、この電気的変化を測定するために、細胞外液１０に接続するように参照電極１２を配置するとともに、細胞内液１１に接続する測定電極１３を配置し、この参照電極１２と測定電極１３との間で電流あるいは電圧変化を測定することによって被検体細胞９ａの電気化学的変化を測定検出することができる。
【００５２】
例えば、被検体細胞９ａに薬品などの化学化合物などの刺激が加わると、被検体細胞９ａは電気生理的応答を示すこととなり、その結果、参照電極１２と測定電極１３との間において、例えば電圧、電流などの電気的応答として観測することができる。
【００５３】
ここで、細胞外液１０とは、例えば、哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ+イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ+イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液であり、細胞内液１１とは、例えば、哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ+イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ+イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液である。
【００５４】
なお、細胞外液１０と細胞内液１１とは、本実施の形態１のように異なる組成のものを用いてもよく、同じものを用いてもよい。
【００５５】
そして、ウエル１５に細胞外液１０を充填すると、ウエル１５の内部に設置された参照電極１２と流路１６の内部に設置された測定電極１３との間で、１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の抵抗値を観察することができる。これは細胞電気生理センサに設けられた貫通孔１に電解液が浸透し、それぞれの電極１２，１３との間で電気回路が形成されるからである。
【００５６】
次に、例えば流路１６の一方を封止し、他方から減圧することで、細胞９は貫通孔１へ引き付けられ、ついにはこの貫通孔１を塞ぐことによって被検体細胞９ａとなり、細胞外液１０を充填したキャビティ６と細胞内液１１などの液体を充填した流路１６との電気抵抗は十分に高くなる。
【００５７】
そして、さらに減圧を続ける、もしくはナイスタチンのように被検体細胞９ａの外壁を溶解する作用のある薬液を流路１６の内部に導入することで、被検体細胞９ａに微細小孔を形成する。
【００５８】
その後、この被検体細胞９ａに化学的刺激、あるいは物理的刺激を付与する。この化学的刺激としては、化学薬品、毒物、物理的刺激としては機械的変異、光、熱、電気、電磁波などが挙げられる。
【００５９】
そして、被検体細胞９ａがこれらの刺激に対して活発に反応する場合、被検体細胞９ａはその細胞膜にあるイオンチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。そうすると、被検体細胞９ａを通るイオン電流が発生し、この被検体細胞９ａの内外の電位勾配が変化するため、この変化を反応前後の参照電極１２と測定電極１３との間の電圧、あるいは電流を測定することによって検出することができる。
【００６０】
そして、このとき貫通孔１の近傍に気泡が存在すれば、抵抗値の増大により測定電極１３で検知する電流・電圧の測定値が変動するが、図１に示したような構成の細胞電気生理センサを用いることによって残留する気泡の発生を抑制することができるとともに、残留した気泡を速やかに除去することができるセンサ構造を実現していることから、測定の信頼性を高めた細胞電気生理センサを実現することができる。
【００６１】
次に、本実施の形態１における細胞電気生理センサの製造方法について図面を用いて説明する。図４〜図８は製造方法を説明するための工程の断面図である。
【００６２】
まず、図４に示すように、厚みが約２０μｍのシリコン層２０、厚みが約２μｍの二酸化シリコン層２１、厚みが４００〜５００μｍのシリコン層２２からなるＳＯＩ基板を準備し、貫通孔１を形成するシリコン層２０の一面にレジストマスク（図示せず）を形成する。このとき、レジストマスクのマスクホールの形状は所望の貫通孔１の形状とほぼ同じになるように設計している。本実施の形態１では貫通孔１の最小開口径を３μｍとしたため、マスクホールの開口径も３μｍとした。
【００６３】
その後、ドライエッチング技術を用いてシリコン層２０の表面からエッチングを行い、貫通孔１の一部となる凹部２３を形成する。このとき、凹部２３を高精度に形成する際には、エッチングを促進するＳＦ6などのエッチングガスと、エッチングを抑制するガスを交互に用いたドライエッチング加工を行うことが好ましい。このエッチングを抑制するガスとしてはＣＨＦ3、Ｃ4Ｆ8などがあり、このエッチングを抑制するガスをエッチングされた壁面に吹き付けると、その表面にＣＦ2のポリマーである保護膜を形成するため、貫通孔１を形成する凹部２３の最深部からシリコン層２０の表出面に向けてほぼ垂直に凹部２３を形成させることができる。そして、ドライエッチングガスとしてシリコンのエッチングを促進するＳＦ6などを用いると、エッチンググレードの差により二酸化シリコン層２１がエッチングストップ層となる。このようなエッチング技術を用いることによって、貫通孔１の深さを所定形状に高精度に形成することができ、微少形状であっても容易に作製することができる製造方法とすることができる。
【００６４】
次に、図５に示すように、凹部２３から二酸化シリコン層２１の下面までドライエッチングを行い、これによって貫通孔１となるビアホールを形成することができる。このとき、二酸化シリコン層２１を、ＳＯＩ基板の上面から例えばＣＦ4などのガスを用いてエッチングすることによって貫通孔１を形成することができる。その後、レジストマスクを除去する。
【００６５】
次に、シリコン層２２の表出面にレジストマスク（図示せず）を形成した後、シリコン層２２から二酸化シリコン層２１までをエッチングを促進するＳＦ6などのエッチングガスを用いて前記と同様のエッチング法を用いてエッチングすることによって、図６に示したようにフレーム５とキャビティ６を形成することができる。このときも、二酸化シリコン層２１がエッチングストップ層となるので、高精度にフレーム５およびキャビティ６を作製可能となる。
【００６６】
なお、前記製造方法において、ＳＯＩ基板を用いて一括して前記センサを作製することが可能であり、各製造工程のレジストマスクを工夫しながら作製すると、一括して多数の細胞電気生理センサを作製することができる。
【００６７】
次に、図７に示したように二酸化シリコン層２１のキャビティ６側の貫通孔１の周縁部に所定寸法となるようにレジストマスク（図示せず）を形成する。ここでは、２０μｍφの円形状を有したレジストマスクを形成した。そして、このレジストマスクの形成方法はディスペンサあるいはインクジェット工法を用いて形成することができる。レジストマスクを形成した後、二酸化シリコン層２１の表出面に凹凸を形成するためのエッチング処理を行う。これに用いるエッチングガスとしてはＣＨＦ3とＡｒガスとの混合ガスを用いてプラズマエッチングを行うことによって表出した二酸化シリコン層２１の表面に凹凸加工を施して凹凸部４ｂを形成することができる。このとき、プラズマの発生条件を変化させることによって凹凸部４ｂの表面粗さを制御することができ、これを制御することによって凹凸部４ｂの表面粗さをＲａ≧５〜１００ｎｍの範囲で形成し、それぞれのサンプルについて、その親水性の評価と気泡の状況をそれぞれの表面粗さについて確認し、前記範囲において気泡の発生の抑制と除去を効率よく行うことができる表面性を有していることを確認できた。
【００６８】
また、凹凸加工の後、レジストマスクを除去することによって、貫通孔１の周縁部に平滑部４ａを形成することができる。このとき、平滑部４ａの大きさは測定する細胞の大きさによって変更することが好ましく、細胞の大きさよりも若干大きく設計しておくことが好ましい。これによって、この平滑部４ａの一部は被検体細胞９ａの一部が接触することになり、表面が１ｎｍ（Ｒａ）以下の平滑性を有しておれば、被検体細胞９ａの皮膜に傷が入らないことと、貫通孔１より吸引したときに密着性が高めることによる高いシール性（Ｇシール性）を発揮することができ、高精度に測定することができる細胞電気生理センサを作製することができる。
【００６９】
なお、凹凸部４ｂを形成する方法としては、サンドブラスト法、ＨＦなどの化学エッチング法などを適宜用いることができる。
【００７０】
次に、図８を用いて別の例の細胞電気生理センサの構成について説明する。
【００７１】
図８に示した細胞電気生理センサが、図１で示した細胞電気生理センサの構成と大きく異なっているところは、貫通孔１の内壁面およびフレーム５の内壁面に二酸化シリコン膜２５を形成していることである。これによって、さらに気泡の発生の抑制と除去を効率よく行うことができる細胞電気生理センサを実現することができる。これは、液体と接触するシリコンの表面を二酸化シリコン膜２５で被覆することによって親水性を高めることによってそれぞれの壁面から気泡の発生を抑制するとともに、気泡の残留を大幅に低減しながら薬液などの液体を充填することができるものである。特に、少なくとも貫通孔１の内壁面およびフレーム５の内壁面を二酸化シリコン膜２５で被覆することが好ましい。その理由は、被検体細胞９ａの測定を行うときに気泡の影響を受けやすい箇所であるからである。
【００７２】
このような細胞電気生理センサを作製するためには、表出したシリコンの表面を温度；７００℃以上、および酸素の存在下で熱酸化することによって、シリコンの表面を熱酸化し、二酸化シリコン膜２５として形成することができる。なお、水蒸気を加えて熱処理することも有効である。
【００７３】
そして、この熱酸化による二酸化シリコン膜２５の皮膜は５ｎｍ以上が好ましい。５ｎｍを下回ると均一な欠陥の少ない熱酸化膜を得ることが困難となる。
【００７４】
そして、この細胞電気生理センサの表面の親水性を維持しておくためには、表面に付着した炭素分子を除去した清浄な表面としておくことが好ましい。清浄化した後、速やかに純水を充填した容器の内部に前記センサを保管しておくことによって、表面の清浄度を保持することができる。また、このときの親水性は接触角で１０°以下であることが好ましい。この接触角は測定対象の表面にイオン除去された純水の水滴を塗布して測定することができる。
【００７５】
このように、キャビティ６の内壁面、ダイアフラム２の表出面および貫通孔１の内壁面などの液体が接触する全ての表面を親水性としておくことがより好ましい。これによって、各種測定のための液体との濡れ性を高めることによって、気泡の発生をさらに抑制することができる。これによって、細胞電気生理センサの壁面と薬液などの液体との濡れ性を高め、速やかに液体をキャビティ６から貫通孔１の内部へ充填することができるとともに、貫通孔１の周辺に気泡の無い状態で充填することができる細胞電気生理センサを実現できる。
【００７６】
これによって気泡の発生の抑制と残留した気泡を効率よく除去することができる細胞電気生理センサを実現している。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の細胞電気生理センサは、気泡の発生の抑制と残留した気泡の除去を容易に行うことができることから、細胞電気生理センサの測定に対する信頼性を向上させることができる。従って、高精度な測定が要求される医療分野等における細胞電気生理センサとして、大いに利用可能性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図
【図２】同平面図
【図３】同細胞の電気生理現象を測定する方法を説明するための断面図
【図４】同細胞電気生理センサの製造方法を説明するための工程断面図
【図５】同断面図
【図６】同断面図
【図７】同断面図
【図８】同別の例の細胞電気生理センサの断面図
【図９】従来の細胞外電位測定センサの断面図
【符号の説明】
【００７９】
１  貫通孔
２  ダイアフラム
３  シリコン
４  二酸化シリコン
４ａ  平滑部
４ｂ  凹凸部
５  フレーム
６  キャビティ
９  細胞
９ａ  被検体細胞
１０  細胞外液
１１  細胞内液
１２  参照電極
１３  測定電極
１４  仕切り板
１５  ウエル
１６  流路
１７  容器
２０  シリコン層
２１  二酸化シリコン層
２２  シリコン層
２３  凹部
２５  二酸化シリコン膜
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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