(57)【要約】【課題】キャピラリー管内に注入する前後で再結合ＤＮＡが発生しないようにして正確な  遺伝子分析を行う遺伝子解析方法を提供することを目的とする。【解決手段】標識剤を修飾させた標的ＤＮＡと前記標的ＤＮＡと相補なＤＮＡとが２本鎖を形成して担体に結合した複合体を形成させる第１のステップと、選択性分離フィルタで仕切られた密閉流路内にプローブＤＮＡを高分子化合物に結合させたコンジュゲート体を充填させる第２のステップと、前記複合体を前記密閉流路内に注入する第３のステップと、前記複合体を前記密閉流路内で電気泳動させて前記選択性分離フィルタに前記複合体を捕捉させる第４のステップと、前記捕捉させた複合体から前記標的ＤＮＡを乖離させるための熱を与える第５のステップと、前記乖離した標的ＤＮＡの標識剤を検出する第６のステップからなる遺伝子解析方法。【選択図】図５
2009125009.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識剤を修飾させた標的ＤＮＡと前記標的ＤＮＡと相補なＤＮＡとが２本鎖を形成して担体に結合した複合体を形成させる第１のステップと、
選択性分離フィルタで仕切られた密閉流路内にプローブＤＮＡを高分子化合物に結合させたコンジュゲート体を充填させる第２のステップと、
前記複合体を前記密閉流路内に注入する第３のステップと、
前記複合体を前記密閉流路内で電気泳動させて前記選択性分離フィルタに前記複合体を捕捉させる第４のステップと、
前記捕捉させた複合体から前記標的ＤＮＡを乖離させるための熱を与える第５のステップと、
前記乖離した標的ＤＮＡの標識剤を検出する第６のステップからなる遺伝子解析方法。
【請求項２】
前記第１のステップにおける前記複合体が、前記相補なＤＮＡの末端が前記担体に結合している請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項３】
前記担体のサイズが前記密閉流路の内径よりも小さい請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項４】
前記第５のステップにおける複合体から前記標的ＤＮＡを乖離させるための熱が、前記２本鎖の融解温度以上である請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項５】
前記プローブＤＮＡが前記標的ＤＮＡのＳＮＰ部位を含む塩基配列と相補な塩基配列を持つ請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項６】
前記標識剤が蛍光物質あるいは発光物質である請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項７】
前記選択性分離フィルタの孔径が前記担体の直径よりも小さい請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項８】
前記選択性分離フィルタの孔径は前記標的ＤＮＡが透過できるサイズである請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項９】
前記担体を構成している分子が直鎖状でない請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡにおける一部の塩基配列の違いを検出する遺伝子解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ;一塩基多型と呼ばれる。）が注目されている。このＳＮＰは、ヒトや動物に普遍に見られるが、同じ種でも個体によりＳＮＰが異なる。すなわちＳＮＰの違いを調べることにより、各個人の疾患に対する罹患率や薬剤に対する効果や感受性を予測し、個人に合わせた医療を行うことが出来る。さらには、ヒトや動物の親子関係の特定ができると考えられる。
【０００３】
ＳＮＰを調べる方法として、アフィニティキャピラリー電気泳動法を利用した遺伝子診断装置と遺伝子診断方法がある。この方法は、まず、電荷を持たない高分子化合物と目的の１本鎖ＤＮＡ（以下“標的ＤＮＡ”と称する）に相補的な１本鎖ＤＮＡ（以下“プローブＤＮＡ”と称する）とを結合させることで、キャピラリー管内で移動しない化合物（以下“コンジュゲート体”と称する）を作製する。
【０００４】
このコンジュゲート体を電気浸透流が起きないようにコーティングされたキャピラリー管に充填した後、陰極側から標的ＤＮＡを注入して電圧を印加する。このとき標的ＤＮＡにＳＮＰを有するＤＮＡはコンジュゲート体との結合強度が強く、ＳＮＰを有さないＤＮＡはコンジュゲート体との結合強度が弱い。この両者の親和性の違いから標的ＤＮＡに含まれるＳＮＰの有無を判別する（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００５】
前記手法においては、標的ＤＮＡが１本鎖状態である必要があるが、標的ＤＮＡを得るために用いるＰＣＲ反応よって得られるＰＣＲ産物は２本鎖ＤＮＡの状態であるため、測定の前処理において２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡにする必要がある。そのため、ＰＣＲ産物に変性剤を混合し熱変性処理を行った後キャピラリー管に注入していた。
【０００６】
しかし、キャピラリー管内では変性剤の濃度が薄まるため標的ＤＮＡと相補な１本鎖ＤＮＡ（以下“相補ＤＮＡ”と称する）が再び結合し、２本鎖に戻ったＤＮＡ（以下“再結合ＤＮＡ”と称する）が生じる。そのため、この再結合ＤＮＡがピークとして検出され、検出すべき標的ＤＮＡのピークと分離することができず、正確なピーク面積が得られないので定量測定が出来ないという課題を有していた。そこで、キャピラリー管内において遅延用ＤＮＡコンジュゲート体を用いて相補ＤＮＡの電気泳動速度を遅延させることで、再結合ＤＮＡを抑制する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００２−３４０８５７号公報
【非特許文献１】Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｂａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＤＮＡ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｃｏｎｊｙｕｇａｔｅ：Ｋａｅ  Ｓａｔｏ，Ａｋｉｒａ  Ｉｎｏｕｅ，Ｋａｚｕｏ  Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｍｉｚｕｏ  Ｍａｅｄａ：Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２００５，（２６）３０７６−３０８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記従来の構成では、キャピラリー管内のみに遅延用ＤＮＡコンジュゲート体が充填されているため、キャピラリー管に注入する前のＰＣＲ産物には、再結合ＤＮＡが生じてしまうものがある。そのため、標的ＤＮＡと再結合ＤＮＡとが混在した試料がキャピラリー管に注入されるので、再結合ＤＮＡのピークと検出すべき標的ＤＮＡとのピークとを分離することができず、正確な遺伝子分析が出来ない課題を有していた。
【０００８】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、キャピラリー管内に注入する前後で再結合ＤＮＡが発生しないようにして正確な遺伝子分析を行う遺伝子解析方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の遺伝子解析方法によれば、再結合ＤＮＡの発生を完全に防止できるので、高精度な定量分析を行うことが出来る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために本発明の遺伝子解析方法は、標識剤を修飾させた標的ＤＮＡと前記標的ＤＮＡと相補なＤＮＡとが２本鎖を形成して担体に結合した複合体を形成させる第１のステップと、選択性分離フィルタで仕切られた密閉流路内にプローブＤＮＡを高分子化合物に結合させたコンジュゲート体を充填させる第２のステップと、前記複合体を前記密閉流路内に注入する第３のステップと、前記複合体を前記密閉流路内で電気泳動させて前記選択性分離フィルタに前記複合体を捕捉させる第４のステップと、前記捕捉させた複合体から前記標的ＤＮＡを乖離させるための熱を与える第５のステップと、前記乖離した標的ＤＮＡの標識剤を検出する第６のステップからなることを特徴とするものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の遺伝子解析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１２】
（実施の形態１）
＜複合体の作製＞
図１を用いて、本発明の実施の形態１における複合体の詳細を説明する。本発明の実施の形態１で解析する標的ＤＮＡは、植物、動物、また人の細胞や血液等から入手したＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲ反応を利用して目的の部分を増幅したものである。
【００１３】
ＰＣＲ増幅は図１（ａ）のように標的ＤＮＡ１１１の一端の塩基配列を含むプライマー１００（以後、“フォワード側プライマー”と称する。）には蛍光検出を行うための標識剤１０３（本実施例ではＣｙ５を用いた。）を、相補ＤＮＡ１１２の一端の塩基配列を含むプライマー１０１（以後、“リバース側プライマー”と称する。）には担体１０５と相補ＤＮＡ１１２をアビジン−ビオチン結合させるため、ｂｉｏｔｉｎ１０４を修飾させたものを用いる。こうしてＰＣＲ増幅して得た図１（ｂ）に対し、アビジンが表面にコーティングされた担体１０５を結合させ、図１（ｃ）に示す複合体１１０を作製する。
【００１４】
ここで、ＰＣＲ産物に含まれる標的ＤＮＡは、目的の部分以外で同じ塩基配列が存在しない長さ以上で、１本鎖になったときに自己で高次構造を形成しない長さ以下である４０塩基以上、２００塩基以下が望ましい。
【００１５】
標識剤は、検出部で標的ＤＮＡを検出する際に標識となる物質であればよく、例えばＣｙ５、ＦＩＴＣ等の蛍光物質、ルテニウム等の発光物質が挙げられる。また、標識剤を用いず、吸光度で標的ＤＮＡを検出する手法を用いても良い。
【００１６】
担体１０５は、直径が後述する密閉流路３０１の内径以下であり、複合体となったときに電気泳動可能な物質が良い。具体的には、コロイド粒子、シリカビーズ、ポリマービーズ、磁気ビーズなどが挙げられる。なお、担体１０５は複合体として電気泳動しなくてはいけないから、担体１０５の持つ電荷量、サイズ、そして、電気泳動時の電場の強さ、緩衝液の粘性などに留意して陽極側の電極に複合体として電気泳動するような物質を選ぶ必要がある。
【００１７】
さらに、担体１０５とＰＣＲ産物との結合手法は、アビジンービオチン結合に限らず、アミノ結合、エステル結合、カルボニル結合、イミノ結合などを用いても良い。
【００１８】
＜コンジュゲート体の作製＞
次にコンジュゲート体の詳細について説明する。図２に示すようにコンジュゲート体１１０は電荷を持たない高分子化合物１２１と１本鎖ＤＮＡ１２２（以下“プローブＤＮＡ”と称する）とが結合した構造をしている。ここで、プローブＤＮＡ１２２は標的ＤＮＡをプローブＤＮＡ１２２との結合力が強い結合型ＤＮＡと、プローブＤＮＡとの結合力が弱い非結合型ＤＮＡに分離するよう設計される。このためプローブＤＮＡ１２２の配列は、標的ＤＮＡ中のＳＮＰ部位を含む領域に相補な配列を有するように設計される。
【００１９】
また、プローブＤＮＡ１２２の長さは５塩基以下の場合は、標的ＤＮＡとの結合能力が十分でなく、１９塩基以上の場合は標的ＤＮＡとの結合力が強すぎて、結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡの両方と特異的に結合してしまうため好ましくない。よって、プローブＤＮＡ１２２は６塩基以上１８塩基以下の長さが好ましい。
【００２０】
また、プローブＤＮＡ１２２の濃度は標的ＤＮＡの濃度に対して１０〜６００倍とするのが好ましい。これは１０倍以下だと標的ＤＮＡがコンジュゲート体と十分に結合出来なくなり、６００倍以上だと高濃度のプローブが必要となるので高価なコンジュゲートの作製が必要となるからである。
【００２１】
また、プローブＤＮＡと結合させる高分子化合物は標的ＤＮＡの電気泳動速度に対して十分遅い速度で電気泳動する物質で構成されるものであり、例えば一般的に使用されるリニアポリマーであるアクリルアミドやポリエチレングリコールが挙げられる。また、高分子化合物の代わりにガラスビーズや磁気ビーズなどを使用しても良い。
＜標的ＤＮＡの解析方法＞
続いて、図３（ａ）から（ｂ）を用いて標的ＤＮＡの解析方法について説明する。
【００２２】
（ａ）コンジュゲート体の充填
図３（ａ）に密閉流路にコンジュゲート体を充填する方法を示す。３０１〜３０４は密閉流路で、流路結合ユニット３０５によって結合される。流路結合ユニット３０５は密閉流路３０１〜３０４を結合させ、密閉流路３０１と密閉流路３０２の間に選択性分離フィルタ３０６を配置する役割を果たす。また、流路結合ユニット３０５付近には高温部３０７が配置されている。ここで、選択性分離フィルタ３０６には、孔径が担体１０５の直径よりも小さく、且つ標的ＤＮＡ１１１を透過できるサイズのものを使用する。本実施例では、  本実施例では、孔径が５ｎｍであるセルロース系の半透膜を使用した。流路結合ユニットを作製するためには、選択性分離フィルタ３０６は、薄い半透膜が適している。上記の他に、セルロース系膜か、合成高分子系膜の半透膜を使用することが出来る。孔径は、標的ＤＮＡ１１１と担体１０５のサイズに応じて、適宜、変更すれば良い。
【００２３】
ここで、流路結合ユニット３０５について説明を加える。図４に、流路結合ユニット３０５の構成を示す。流路結合ユニット３０５は、密閉流路結合用の流路が形成された２個のブロックと選択性分離フィルタ３０６とから構成される。選択性分離フィルタ３０６はこの２つのブロックの間に配置されており、２つのブロックは選択性分離フィルタ３０６を挟んで互いに接合している。このブロックに用いる材料は、微細流路加工ができる材料であれば良い。例えば、アクリル、ＰＰ、ＰＣ、ガラスなどが挙げられる。なお、流路結合ユニットの挿入口３１０、３１１、３１５、３１６は密閉流路３０１から密閉流路３０４を挿入したときに隙間のないよう、パッキンを設けた構造が望ましい。
【００２４】
さて、図３（ａ）に戻り、説明を続ける。密閉流路３０１と密閉流路３０２の一端は緩衝液３１２の入った容器３１３、コンジュゲート体１２０の入った容器３０９のそれぞれ挿入されており、他の一端は流路結合ユニット３０５の挿入口３１０、挿入口３１１にそれぞれ接続されている。
【００２５】
密閉流路３０３と密閉流路３０４の一端は流路結合ユニット３０５の挿入口３１５、挿入口３１６にそれぞれ接続され、他の一端は密閉された液だめ容器３１７に挿入されている。密閉された液溜め容器３１７には外部からの指示で作動するポンプ３１８が接続されている。ポンプ３１８によって密閉された液溜め容器３１７の空気を吸引することで、密閉流路３０１〜３０４にコンジュゲート体１２０を充填できる。本実施例では、ポンプによる吸引によりコンジュゲート体１２０を密閉流路３０１〜密閉流路３０４に充填する方法を示すが、これに限定されるものでは無く、ポンプによる加圧、又は遠心力を用いた方法などを適宜用いればよい。
【００２６】
（ｂ）複合体の注入
次に、図３（ｂ）のように緩衝液３１２の入った容器３１３を複合体１１０の入った容器３２０に交換する。その後、ポンプ３１８によって密閉された液溜め容器３１７の空気を吸引することで密閉流路３０１内に複合体１１０を注入する。
【００２７】
以上のようにして、密閉流路３０１〜密閉流路３０４をコンジュゲート体１２０で満たし、密閉流路３０１の一端に複合体１１０を注入する。
（ｃ）標的ＤＮＡの検出
次に、標的ＤＮＡの検出構成を図５に示す。これは、図３（ｂ）から次のような変更を行うことで実現できる。まず、コンジュゲート体１２０の入った容器３０９と複合体１１０の入った容器３２０を、各々緩衝液３１２の入った容器３１３と容器３１４に交換する。この容器３１４には陽極側の電極３２１が、容器３１３には陰極側の電極３２２が設けられており、電源部３２３により電極３２１と電極３２２に電圧を印加するように構成されている。これらの電極に電圧が印加されれば、密閉流路３０１と密閉流路３０２とを利用して電気泳動を行うことができる。
【００２８】
緩衝液３１２には、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐH７．２〜ｐH８程度）緩衝液等を利用するのが適当である。また、緩衝液３１９には必要に応じてＤＮＡ結合制御剤が混入される。ＤＮＡ結合制御剤としては、コンジュゲート体に対する標的ＤＮＡの結合を促進する塩化マグネシウム等の結合促進剤が挙げられる。結合促進剤としての他の電解質を選ぶことで、ＤＮＡに対する多様な泳動速度の制御が可能になるものである。
【００２９】
この状態で電源部３２３によって準備電圧を印加し、密閉流路３０１の一端に注入されている複合体１１０を陽極側の電極３２１の方向へ電気泳動させる。複合体１１０は選択性分離フィルタ３０６を透過することが出来ないため、選択性分離フィルタ３０６に捕捉される。この捕捉された複合体１１０に高温部３０７の温度を標的ＤＮＡが相補ＤＮＡから乖離する温度まで上昇させ、標的ＤＮＡ１１１を担体１０５から乖離させる。このときの様子を図６に示す。
【００３０】
図６（ａ）は、高温部３０７の温度を標的ＤＮＡと相補ＤＮＡが乖離する温度まで上昇させる前の模式図である。この状態では、標的ＤＮＡ１１１は担体１０５に結合された相補ＤＮＡ１１２と2本鎖を形成しており、選択性分離フィルタ３０６に捕捉されている。
【００３１】
図６（ｂ）は、高温部３０７の温度を標的ＤＮＡと相補ＤＮＡが乖離する温度まで上昇させた時の模式図である。標識剤と結合した標的ＤＮＡ１１１は、乖離温度より高い熱を加えられたため、相補ＤＮＡ１１２から分離する。この分離された標的ＤＮＡ１１１は、サイズが小さくなるので、選択性分離フィルタ３０６を透過することが出来る。
【００３２】
高温部３０７で与える乖離温度は、次のようにして決める。２本鎖を乖離させる時の温度は９４℃以上にすれば良いが、９４℃より低い温度でも標的ＤＮＡ１１１と相補ＤＮＡ１１２の間で形成される２本鎖の融解温度以上であれば良い。高温部３０７はヒーターをサーミスタなどの温度測定素子でモニタリングしながら駆動させる構成が好ましいが、温度を標的ＤＮＡ１１１と相補ＤＮＡ１１２が乖離する温度まで上昇させることが出来る構成であれば別の構成に置き換えることも可能である。
【００３３】
次に、図５に戻り説明を続ける。高温部３０７により、相補ＤＮＡ１１２から分離した標的ＤＮＡ１１１は、選択分離フィルタ３０６を透過し、分離部３２４の方向へ電気泳動する。分離部３２４は、相補ＤＮＡ１１２から乖離した標的ＤＮＡ１１１を結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡに分離する部分で、分離に最適な所定の温度に調整される。この時の温度はコンジュゲート体と標的ＤＮＡ１１１の結合力の差に基づいて標的ＤＮＡ１１１を結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡとに分離できるように高温部３０７より低温且つ、１５℃〜６０℃の範囲で所定の温度プラスマイナス１℃以下に制御できるのが好ましい。また、分離部３２４はペルチェ素子を、サーミスタなどの温度測定素子でモニタリングしながら駆動して温度制御する構成が好ましいが、１５℃〜６０℃の範囲をプラスマイナス１℃以下の精度で温度制御できる構成であれば別の構成に置き換えることも可能である。
【００３４】
次に、標的ＤＮＡ１１１の検出方法について説明する。標的ＤＮＡ１１１の検出はフォワード側の５´末端に標識された蛍光色素Ｃｙ５に、検出部４００内部のレーザー４０１（６３５ｎｍ）を照射して発せられる６６０ｎｍの蛍光を、フォトダイオード４０２で検出することによって行われる。
【００３５】
レーザー４０１から照射される光（６３５ｎｍ）は、ＤＮＡを標識する蛍光物質Ｃｙ５の吸収波長域であり、蛍光物質Ｃｙ５を励起できる励起パワーが必要である。ダイクロイックミラー４０３は、波長６３５ｎｍ付近の光を反射し、波長６７０ｎｍ付近の光を透過する特性を持ち、励起光はダイクロイックミラー４０３で反射される。さらに、励起光は、対物レンズ４０４により集光され、密閉流路３０２中を電気泳動する標的ＤＮＡ１１１へ照射される。
【００３６】
標的ＤＮＡ１１１に修飾させた蛍光物質１０３は、励起光を照射され、蛍光を発する。蛍光は、対物レンズ４０４、ダイクロイックミラー４０３、集光レンズ４０５を通り、フォトダイオード４０２で受光され電気信号に変換される。電気信号はアンプ４０６によって増幅され、その後Ａ／Ｄコンバータ４０７でディジタル変換して制御演算部３２５に取り込む。なお、制御演算部３２５はタイマ（図示なし）を内蔵しており、泳動開始時間からの経過時間を測定することが出来る。
【００３７】
ここで、相補ＤＮＡ１１２は担体１０５の影響により電気泳動しても選択性分離フィルタ３０６を透過できないので、標的ＤＮＡ１１１が電気泳動途中に相補ＤＮＡ１１２と再結合ＤＮＡを形成することがなくなり、検出部４００では標的ＤＮＡのみを検出することが出来るため、高精度な定量分析が可能になる。
【００３８】
以下、本発明の実施の形態をより詳細に理解するために、本発明の具体的な実施例および従来技術による比較例との差異とその効果を詳細に説明する。
【００３９】
(実施例)
［ＰＣＲ産物の調整]
ＰＣＲの増幅はＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて増幅した。鋳型はｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。フォワード側のプライマーＤＮＡは蛍光色素、ここではＣｙ５で標識した、５´−（Ｃｙ５）−ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ−３´（フォワードプライマー、配列表１）を、リバース側のプライマーは５´−（ｂｉｏｔｉｎ）−ＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣ−３´（リバースプライマー、配列表２）を、それぞれ終濃度５００ｎＭになるよう加えた。反応サイクルは以下の通りである。９５℃−１０分、（９５℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−３０秒）３０サイクル、７２℃−５分。これにより、６０ｂｐのＰＣＲ産物を作製した。
【００４０】
［ＰＣＲ産物の精製］
前記ＰＣＲ産物を  Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて精製した。（収率３０％、終濃度１５０ｎＭ）
［複合体の作製］
複合体の担体にはストレプトアビジンがコーティングされた平均粒径３５０ｎｍの金コロイドを用いた。まず、１ｍＬの金コロイドを、ＴＴＬバッファー（終濃度：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、 １Ｍ ＬｉＣｌ）で洗浄後、２０μＬのＴＴＬバッファーに置換した。その後、（１００ｎＭの）ＰＣＲ産物を５μＬ添加し、室温で１５分穏やかに振とうした。
【００４１】
次に反応物を、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで金コロイドを沈殿させ、上澄み液を除去した。その後、金コロイドを０．１５M 水酸化ナトリウムで懸濁させ、洗浄した。その後再び、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを除去してＴＴＥバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、 ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、 ２０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解することで、目的物（複合体）を得た。
【００４２】
［緩衝液の調整］
Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．４）終濃度５０ｍＭで使用した。
【００４３】
［コンジュゲート体の作製］
第１の標的ＤＮＡに相補的な塩基配列を持つアミノ化ＤＮＡ（プローブ）を１ｍＭになるように水またはＴＥ（ｐＨ７．４）を加えて調整した。アミノ化ＤＮＡ（プローブ）の配列は５´−ＡＣＣＡＧＣ−３´（配列表３）である。分子量２０，０００のＮＨＳ−ＰＥＧにＤＭＳＯを４４５μｌ加え、２０℃で３時間振とう後、分子量１０，０００を分画する透析膜を用いて、一晩透析した後、乾燥した。コンジュゲート体１２０は１００μＭになるよう緩衝液で溶かした。
【００４４】
［ＳＮＰ遺伝子の解析］
図５に示す方法により遺伝子解析を行った。密閉流路３０１〜３０４はコーティングされた内径１００μｍのキャピラリー管（大塚電子製）を使用した。また、選択性分離フィルタ３０６は公称孔径５ｎｍのものを用いた。そして、ポンプ３１８によってコンジュゲート体を密閉流路３０２、密閉流路３０４内に、緩衝液を密閉流路３０１、密閉流路３０３内に充填し、続いて同じくポンプ３１８によって１ｃｍ／秒の速度で複合体を密閉流路３０１内に２秒間注入した。その後、電源部３２３によって電極３２１、電極３２２間へ２０ｋＶの電圧を印加して複合体を１５分間電気泳動させ電源部の出力電圧を６ｋＶに切替えた後、高温部３０７を９５℃になるよう制御して１分間加熱した。
【００４５】
次に密閉流路３０１内の標的ＤＮＡを３０℃に温度制御した分離部３１６中で電気泳動させ、前記標的ＤＮＡを前記コンジュゲート体に対する親和性の差によって、結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡに分離した。検出部４００では検出フィルタでレーザー４０１から照射される６３５ｎｍの励起光をカットして標的ＤＮＡに標識しているＣｙ５の６６０ｎｍの蛍光をフォトダイオード４０２で検出してアンプ４０６で増幅し、Ａ／Ｄコンバータ４０７でアナログ信号をディジタル化して制御演算部３２５に取り込んだ。
【００４６】
（比較例）
比較例として、従来の方法を用いて上記実施例と同じ標的ＤＮＡの解析を行った。
【００４７】
［ＰＣＲ産物の調整］
ＰＣＲの増幅はＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて増幅した。鋳型はｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。フォワード側のプライマーＤＮＡは蛍光色素、ここではＣｙ５で標識した、５´−（Ｃｙ５）−ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ−３´（フォワード側プライマー、配列表２）（配列表の番号は１から）を、リバース側のプライマーは５´−ＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣ−３´（リバース側プライマー、配列表３）を、それぞれ終濃度５００ｎＭになるよう加えた。反応サイクルは以下の通りである。９５℃−１０分、（９５℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−３０秒）３０サイクル、７２℃−５分。これにより、６０ｂｐのＰＣＲ産物を作製した。
【００４８】
なお、従来技術に対する本発明の新規な点は、標的ＤＮＡと相補ＤＮＡとが２本鎖を形成して担体に結合した複合体を形成させ、この複合体を密閉流路内の選択性分離フィルタで捕捉して加熱することにより、担体から標的ＤＮＡを分離させた後に電気泳動することにある。従来は、担体を相補ＤＮＡに結合させていないので、比較例においてもリバース側のプライマーに相補ＤＮＡと担体をアビジン結合させるためのビオチンは修飾させていない。
【００４９】
［ＰＣＲ産物の変性］
比較例では前項の［ＰＣＲ産物の調整］で出来たＰＣＲ産物を２本鎖から１本鎖にする変性処理が必要になる。ＰＣＲ産物２μＬに変性剤としてホルムアミドを４０μＬを加え、９５℃で５分間熱した後、氷冷した。
【００５０】
［緩衝液の調整］
本発明の実施例と同じ緩衝液を使用した。
【００５１】
［コンジュゲート体の作製］
本発明の実施例と同じコンジュゲート体を使用した。
【００５２】
［ＳＮＰ遺伝子の解析］
実施例と同様に、図５に示す方法により遺伝子解析を行った。まず、ポンプ３１８によってコンジュゲート体を密閉流路３０１内に充填する。その後、ＰＣＲ産物をポンプ３１８によって１ｃｍ／秒の速度で密閉流路３０１内に２秒間注入してから、電極３２１、電極３２２間へ６ｋＶの電圧を印加して密閉流路３０２内の標的ＤＮＡを３０℃に温度制御した分離部３２４中で電気泳動させ、前記標的ＤＮＡを前記コンジュゲート体に対する親和性の差によって、結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡに分離した。
【００５３】
その他は、上記実施例と同じ方法を用いた。
（実施例１と比較例の比較）
実施例１と比較例で得た検出波形から実施例１と比較例を比較する。
【００５４】
図７に比較例における遺伝子の検出波形を示し、図８に実施例における遺伝子の検出波形を示す。図７に示すように、プライマーのピーク２０２、非結合型ＤＮＡのピーク２００、結合型ＤＮＡのピーク２０１の順に検出されているが、非結合型ＤＮＡと結合型ＤＮＡのピークの間に再結合ＤＮＡによるピーク２０３が検出されている。
【００５５】
ところが、実施例では、図８に見られるように、非結合型ＤＮＡのピーク２００と結合型ＤＮＡのピーク２０１が検出されており、しかも両者は明確に分離されている。これは、本発明による選択性分離フィルタに捕捉し加熱することで、再結合ＤＮＡ２０３の発生を防止できるため、再結合ＤＮＡ２０３のピークが発生しないからである。
【００５６】
この結果から明らかなように、本発明による複合体を密閉流路内の選択性分離フィルタに捕捉し加熱する。その後、担体に結合した相補ＤＮＡから乖離した標的ＤＮＡを電気泳動させて分離することで、従来遺伝子解析の際課題となっていた再結合ＤＮＡピークを除去することが出来る。
【００５７】
さらに本実施例の新たな効果として、図８に見られるように、プライマーのピーク２０２も除去することができることにある。これは、本発明の実施例において、複合体を１５分間電気泳動させて選択性分離フィルタに補足させる間に、プライマーが選択性分離フィルタを透過し、いち早く陽極側の電極３２１まで電気泳動されたためである。そのため、検出する前に検出領域を通過しているプライマーは検出波形に現れることが無い。本来、プライマーのピーク２０２は分析には関係の無いピークであるので、検出波形に現れないことが好ましい。この点でも、本発明は従来技術よりも優れた効果を有している。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明にかかる遺伝子解析方法は、簡便、迅速、正確に生体物質の状態を解析する方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】（ａ）本発明の実施の形態１における鋳型ＤＮＡとプライマーの構成図（ｂ）本発明の実施の形態１におけるＰＣＲ産物の構成図（ｃ）本発明の実施の形態１における複合体の構成図
【図２】本発明の実施の形態１におけるコンジュゲート体の構成図
【図３】（ａ）本発明の実施の形態１におけるコンジュゲート体の充填を示す図（ｂ）本発明の実施の形態１における複合体の注入示す図
【図４】本発明の実施の形態１における流路結合ユニットの構成を示す図
【図５】本発明の実施の形態１における標的ＤＮＡ検出の構成を示す図
【図６】（ａ）高温部による温度を上昇させる前の標的ＤＮＡの模式図（ｂ）高温部による温度を上昇させた後の標的ＤＮＡの模式図
【図７】比較例における検出波形を示す図
【図８】実施例における検出波形を示す図
【符号の説明】
【００６０】
１００  フォワード側プライマー
１０１  リバース側プライマー
１０２  鋳型ＤＮＡ
１０３  標識剤
１０４  ｂｉｏｔｉｎ
１０５  担体
１１０  複合体
１１１  標的ＤＮＡ
１１２  相補ＤＮＡ
１２０  コンジュゲート体
１２１  高分子化合物
１２２  プローブＤＮＡ
２００  非結合型ＤＮＡ
２０１  結合型ＤＮＡ
２０２  プライマー
２０３  再結合ＤＮＡ
３０１  密閉流路
３０２  密閉流路
３０３  密閉流路
３０４  密閉流路
３０５  流路結合ユニット
３０６  選択性分離フィルタ
３０７  高温部
３０９  コンジュゲート体を入れる容器
３１０  流路結合ユニットの挿入口
３１１  流路結合ユニットの挿入口
３１２  緩衝液
３１３  緩衝液を入れる容器
３１４  緩衝液を入れる容器
３１５  流路結合ユニットの挿入口
３１６  流路結合ユニットの挿入口
３１７  密閉された液だめ容器
３１８  ポンプ
３２０  複合体を入れる容器
３２１  陽極側の電極
３２２  陰極側の電極
３２３  電源部
３２４  分離部
３２５  制御演算部
４０１  レーザー
４０２  フォトダイオード
４０３  ダイクロックミラー
４０４  対物レンズ
４０５  集光レンズ
４０６  アンプ
４０７  Ａ／Ｄコンバータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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