(57)【要約】      （修正有）【課題】フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有する酵素、当該酵素、遺伝子、およびそれらの製造方法の提供。【解決手段】フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有し、特定のアミノ酸配列を有する、アラビノース転移酵素。該アミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えベクター。該組換えベクターを有する形質転換体。該形質転換体を培養する、アラビノース転移酵素の製造方法。アラビノース転移酵素の存在下でアラビノースとフラボノイドを反応させることを含む、アラビノースをフラボノイドに結合させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有する、アラビノース転移酵素。
【請求項２】
前記活性が、フラボノイドの３位にアラビノースを転移する活性である、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の酵素。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して３５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項４】
以下の（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの遺伝子によりコードされる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵素。
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子
（ｅ）配列番号２に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有する遺伝子
（ｆ）配列番号２に示す塩基配列に対して３５％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子
（ｇ）配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子
【請求項５】
以下の（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子
（ｅ）配列番号２に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｆ）配列番号２に示す塩基配列に対して３５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｇ）配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項６】
以下の（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの遺伝子または請求項５に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子
（ｅ）配列番号２に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｆ）配列番号２に示す塩基配列に対して３５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｇ）配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアラビノース転移酵素の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のアラビノース転移酵素の存在下でアラビノースとフラボノイドを反応させることを含む、アラビノースをフラボノイドに結合させる方法。
【請求項９】
前記フラボノイドがフラボノールである、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有する酵素、それをコードする遺伝子、およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラボノイドは、活性酸素の除去、抗がん作用、高血圧の改善、コレステロール値の低下、抗アレルギー作用、抗菌作用などの健康増進機能をもつポリフェノールの一種である。植物中でフラボノイドが安定に蓄積するためには、配糖化酵素によってフラボノイドの骨格に糖を付加することが必要である。
【０００３】
植物において配糖化は様々な代謝産物の安定化、不活性化に関与している反応である。このため配糖化酵素の対象となる代謝物は、植物ホルモンやフラボノイド、アルカロイドといった二次代謝産物から一次代謝産物まで非常に幅広いことが知られている。配糖化酵素遺伝子は、その構造より７０以上のファミリーに分類されるが、比較的ゲノムサイズの小さいモデル植物シロイヌナズナのfamily 1 配糖化酵素遺伝子でさえ、１０７遺伝子存在する多重遺伝子族であることが知られている。
【０００４】
フラボノイドの配糖化酵素については、family 1 配糖化酵素遺伝子であり、既にその基本骨格のＣ−３位、Ｃ−５位、Ｃ−７位、Ｃ−３’位等を配糖化する酵素遺伝子について報告がある（非特許文献１）。付加する糖の種類に関してもグルコース（特許文献１〜３）、ラムノース、ガラクトース、グルクロン酸を転移する酵素遺伝子の報告が存在するが、その他の糖に関する酵素遺伝子についての報告はない。また糖供与体に対する特異性は高い。配糖化酵素の一次構造は保存性が低く、一次構造のみからの基質の識別は困難である。フラボノイド配糖化酵素間でも、糖の付加する基本骨格の位置によってその構造は大きく異なる。糖付加の位置が異なれば、アミノ酸レベルで２０〜３０％程度の同一性しか認められず、基本骨格の同じ位置に同じ糖を配糖化する酵素でも、アミノ酸レベルで３０〜５０％の同一性を示すにすぎない。また付加する糖の種類についても、その一次構造からの推定は困難である。吉川らはガラクトース転移酵素、グルコース転移酵素にそれぞれ特徴的なヒスチジン残基、グルタミン残基の役割を提唱している（非特許文献２）。しかし、吉川らの研究によれば、ガラクトース転移酵素のヒスチジン残基をグルタミン残基に変換することでガラクトース転移酵素がグルコース転移酵素活性を示したものの、逆は成立しなかった。またヒスチジン残基は、ガラクトース転移酵素の他にラムノース転移酵素および本発明のアラビノース転移酵素にも保存されている場合もある。
【０００５】
以上、フラボノイド・アラビノース転移酵素遺伝子は既知のフラボノイド配糖化酵素の一次構造からの同定は困難であり、ＵＤＰ糖に対する高い基質特異性により、他のフラボノイド配糖化酵素での代用も不可能である。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２８９８８４号公報
【特許文献２】特開平１０−１１３１８４号公報
【特許文献３】特開平０９−０５６３８５号公報
【非特許文献１】Glycosyltransferases of lipophilic small molecules, 2006年3月3日発行, Dianna Bowles, Eng-Kiat Lim, Brigitte Poppenberger, Fabian E. Vaistij, Annu. Rev. Plant Biol. (2006) 57, 567-597
【非特許文献２】Alternation of sugar donor specificities of plant glycosyltransferases by a single point mutation, 2004年6月20日発行,  Akiko Kubo, Yuka Arai, Shigeyuki Nagashima, Takafumi Yoshikawa, Archives of Biochemistry and Biophysics (2004) 429, 198-203
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有する酵素、およびそれをコードする遺伝子を同定し、当該酵素、遺伝子およびそれらの利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、シロイヌナズナに存在する１０７のfamily  1 配糖化酵素遺伝子群から選択され、ＵＧＴ５と名づけられた遺伝子が、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有する酵素をコードすることを見出し、本発明を完成した。なお、これまでフラボノイドの配糖化酵素の報告は多々あるが、アラビノースを転移する配糖化酵素遺伝子が同定されたのは初めてである。
【０００９】
本発明は、要約すると以下のとおりである。
〔１〕フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有する、アラビノース転移酵素。
〔２〕前記活性が、フラボノイドの３位にアラビノースを転移する活性である、〔１〕に記載の酵素。
〔３〕以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれかのアミノ酸配列を有する、〔１〕または〔２〕に記載の酵素。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して３５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
〔４〕以下の（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの遺伝子によりコードされる、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の酵素。
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子
（ｅ）配列番号２に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有する遺伝子
（ｆ）配列番号２に示す塩基配列に対して３５％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子
（ｇ）配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子
〔５〕以下の（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子
（ｅ）配列番号２に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｆ）配列番号２に示す塩基配列に対して３５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｇ）配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
〔６〕以下の（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの遺伝子または〔５〕に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子
（ｅ）配列番号２に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｆ）配列番号２に示す塩基配列に対して３５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｇ）配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、フラボノイドにアラビノースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
〔７〕〔６〕に記載の形質転換体を培養することを含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のアラビノース転移酵素の製造方法。
〔８〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のアラビノース転移酵素の存在下でアラビノースとフラボノイドを反応させることを含む、アラビノースをフラボノイドに結合させる方法。
〔９〕前記フラボノイドがフラボノールである、〔８〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、フラボノイドにアラビノースを転移する酵素、それをコードする遺伝子を提供でき、フラボノイドにアラビノースを付加した配糖体の人為的生産が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に述べる。
（１）本発明のアラビノース転移酵素
本発明のアラビノース転移酵素は、フラボノイドにアラビノースを転移する糖転移酵素活性を有し、好ましくは、フラボノイドの３位にアラビノースを転移する活性を有する。フラボノイドは、例えばフラボノールなどが挙げられる。
【００１２】
また、本発明のアラビノース転移酵素は、好ましくは  以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれかのアミノ酸配列を有する。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して３５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００１３】
本発明において「配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号１に示すアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいことを意味する。
【００１４】
また、本発明において「配列番号１に示すアミノ酸配列に対して３５％以上の同一性を有するアミノ酸配列」の「同一性」は、３５％以上、好ましくは４０％以上、４５％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
【００１５】
糖転移酵素のアミノ酸配列は、程度は異なるが、相同性があり、スーパーファミリーを形成している。同じ機能を持つ糖転移酵素のアミノ酸配列は植物種が異なっていても相同性が高くスーパーファミリーの中でファミリーを形成しており、１つのファミリーの中で異なる植物種由来の糖転移酵素のアミノ酸配列の同一性は３０〜５０％以上である。
【００１６】
例えば、フラボノイドの３位にグルコースを転移する酵素の場合、植物間でアミノ酸レベルで約３５〜６０％程度の同一性がある（シロイヌナズナ−ブドウ５９％、シロイヌナズナ−ペチュニア４９％、シロイヌナズナ−トウモロコシ４１％、シロイヌナズナ−大麦４０％、ペチュニア−ブドウ４９％、ペチュニア−トウモロコシ３６％、ペチュニア−大麦３６％）。
【００１７】
従って、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して３５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、フラボノイドの３位にアラビノースを転移する活性を有する酵素であり得る。
【００１８】
本発明のアラビノース転移酵素は、例えばシロイヌナズナ、アボガド、オウソウカ、スピノーサスモモなどから公知の方法を用いて得ることができるが、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列の酵素を公知の化学合成法により合成してもよいし、後述の当該酵素をコードする遺伝子を取得して、公知の遺伝子組換え技術により作製してもよい。
【００１９】
また、上記配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、または配列番号１に示すアミノ酸配列に対して３５％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、例えば、後述の遺伝子を当該技術分野で公知の手法で改変することによって得ることができる。遺伝子に変異を導入するには、例えばＫｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法などの公知手法またはこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））、あるいはＬＡ ＰＣＲ in vitro Mutagenesisシリーズキット（ＴＡＫＡＲＡ社製）などを用いて変異を導入できる。また、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法なども用いることができる。
【００２０】
本発明のアラビノース転移酵素は、その存在下でアラビノースとフラボノイドを反応させることにより、アラビノースをフラボノイドに結合させることができる。例えばフラボノールなどの３位にアラビノースを結合させることができる。
【００２１】
なお、本発明のアラビノース転移酵素は、後述するようにシロイヌナズナ由来であり、アントシアニジンを基質としない結果が得られている。しかし、同じくシロイヌナズナ由来のフラボノイド３位グルコース転移酵素は、フラボノールに加え、アントシアニジンも基質とすることから、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するアラビノース転移酵素はアントシアニジンを基質としなかったけれども、アントシアニジン３−Ｏ−アラビノシドの存在が報告されているヒマワリ、ブラックカラントでは、フラボノールに加えアントシアニジンも基質にできることが考えられる。
【００２２】
また、シロイヌナズナ由来フラボノイド３位グルコース転移酵素は、フェニルプロパノイド化合物であるesculetinの７位にもグルコースを転移することから、本発明のアラビノース転移酵素もフェニルプロパノイド化合物へのアラビノース転移活性を有することが十分に期待できる。
【００２３】
また、本発明のアラビノース転移酵素は、以下の（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの遺伝子によりコードされる。
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子
（ｅ）配列番号２に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有する遺伝子
（ｆ）配列番号２に示す塩基配列に対して３５％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子
（ｇ）配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子
【００２４】
本発明において「配列番号２に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」とは、例えば、配列番号２に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が欠失してもよく、配列番号２に示す塩基配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が付加してもよく、あるいは配列番号２に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が他の塩基酸に置換してもよいことを意味する。
【００２５】
本発明において「配列番号２に示す塩基配列に対して３５％以上の同一性を有する塩基配列」の「同一性」は、３５％以上、好ましくは４０％以上、４５％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
【００２６】
本発明において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが実質的に形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い核酸、すなわち配列番号２で表される塩基配列と３５％以上の同一性を有する塩基配列」の「同一性」は、３５％以上、好ましくは４０％以上、４５％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基性配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより同一性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
【００２７】
配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子は、以下のようにして同定された。
【００２８】
シロイヌナズナにおけるフラボノイド配糖化酵素の網羅的機能同定を目的とし、シロイヌナズナに存在する１０７のfamily 1 配糖化酵素遺伝子群から、フラボノイド生合成系酵素遺伝子群およびそれらの転写因子をコードする遺伝子群と発現パターンに相関の見られる遺伝子について遺伝子共発現解析を行った。候補遺伝子のうち、ＵＧＴ５と名づけられた遺伝子の破壊されたＴ−ＤＮＡ挿入変異体のフラボノールパターンを分析し野生型と比較したところ、３種のフラボノール化合物が消失していた。このうちの２種類はケンフェロールあるいはケルセチンの３位と７位の配糖体であり、７位にラムノースが付加していることは予想できたが、３位に付加した糖については決定できなかった。そこで、大腸菌を用いてＵＧＴ５組換えタンパク質を発現、精製して、酵素活性を測定したところ、ＵＧＴ５組換えタンパク質はフラボノール３位アラビノース転移酵素活性を示した。ＵＧＴ５は、ＵＤＰ糖としてはＵＤＰ−アラビノースのみを利用でき、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−キシロースは利用できなかった。フラボノイドとしては、フラボノールアグリコンであるケンフェロール、ケルセチン、イソラムネチン、ミリセチンおよびケンフェロール７−Ｏ−ラムノシドは基質として認識できたが、フラボノール３−Ｏ−グリコシドおよびアントシアニジン、アントシアニンは認識できなかった。ケンフェロール７−Ｏ−ラムノシドを基質とした時の反応産物は、ＵＧＴ５ Ｔ−ＤＮＡ挿入変異体において消失したフラボノールのピークのうちの一つと一致したことから、そのピークはケンフェロール３−Ｏ−アラビノシド７−Ｏ−ラムノシドに対応することが明らかとなった。これにより、初めてフラボノールの３位にアラビノースを転移する酵素遺伝子を同定した。ＵＧＴ５のＤＮＡ配列は、配列番号２で示される。
【００２９】
上記遺伝子は、例えばシロイヌナズナ、アボガド、オウソウカ、スピノーサスモモなどから公知の方法を用いて単離できる。配列番号２の配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、該遺伝子を、上記ライブラリー等由来の核酸を鋳型とし、該遺伝子の一部である断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは該遺伝子を、化学合成法などの公知の核酸配列合成法によって合成してもよい。
【００３０】
さらに、配列番号２に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、または配列番号２に示す塩基配列に対して３５％以上の同一性を有する塩基配列は、上述の方法で変異を導入するなどして作製することができる。
【００３１】
（２）本発明の組換えベクター
本発明の組換えベクターは、上記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ベクターの種類は特に限定されず、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＥＴ系、ｐＫＳ１、ｐＴｒｉＥＸＴＭ系（ＴＡＫＡＲＡ社）などのベクターを用いることができる。また、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等のウイルスベクターも用いることができる。また、例えばｐＢＩ系などのバイナリーベクターを用いてもよい。
【００３２】
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３３】
また目的遺伝子のほかに、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。さらにフラボノイド合成酵素遺伝子を含めてもよい。
【００３４】
植物細胞で作動可能なプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーターなどが挙げられる。また、細菌細胞で作動可能なプロモーターとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、またはファージ・ラムダのＰＲもしくはＰＬプロモーター、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母宿主細胞で作動可能なプロモーターとしては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーターなどが挙げられる。真菌で作動可能なプロモーターとしては、ＡＤＨ３プロモーター、ｔｐｉＡプロモーターなどが挙げられる。昆虫細胞で作動可能なプロモーターとしては、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモーター、バキュロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、バキュロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーターなどが挙げられる。哺乳動物で作動可能なプロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター、ＭＴ−１プロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはアデノウイルス２主後期プロモーターなどが挙げられる。
【００３５】
エンハンサーとしては、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域、ＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶエンハンサーなどが挙げられる。
【００３６】
ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、大腸菌リポポリプロテインｌｐｐの３’ターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター、ａｍｙＢターミネーター、ＡＤＨ１遺伝子のターミネーター、などが挙げられる。
【００３７】
選抜マーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）、蛍光または発光レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニターゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）など）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ ＩＩ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの酵素遺伝子が挙げられる。
【００３８】
（３）本発明の形質転換体
本発明の形質転換体は、上記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子または上記組換えベクターを適当な宿主に導入することによって作製することができる。
【００３９】
宿主は、導入された遺伝子が発現可能であれば限定されず、大腸菌や枯草菌などの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ポンベ、ピヒア・パストリスなどの酵母、アスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、トリコデルマなどの真菌、または単子葉または双子葉植物、例えばアブラナ科、クスノキ科、バンレイシ科、バラ科などに属する植物細胞、ｓｆ９、ｓｆ２１などの昆虫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳動物細胞でもよい。
【００４０】
遺伝子または組換えベクターの導入は、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。導入された遺伝子は、宿主のゲノムＤＮＡ中に組み込まれてもよいし、外来ベクターに含有されたままで存在していてもよい。
【００４１】
（４）本発明のアラビノース転移酵素の製造方法
本発明のアラビノース転移酵素は、宿主に応じて、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な培地中で培養されることによって、産生することができる。
【００４２】
培地は、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地、ＹＰＤ培地、ＹＰＧ培地、ＹＰＭ培地、ＹＰＤＭ培地、ＳＭＭ培地などが挙げられ、炭素源（例えばグルコース、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクトースなど）、窒素源（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機窒素、カゼイン分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物などの有機窒素源）、無機塩（例えば二リン酸ナトリウム、二リン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなど）、ビタミン（ビタミンＢ１など）、薬剤（アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンなどの抗生物質）などを適宜含有する。
【００４３】
培養条件は、遺伝子の発現に適切であれば特に限定されないが、通常１０〜４５℃で、必要に応じて通気、攪拌しながら、数時間〜数百時間、培養する。
【００４４】
培養物（培養上清または培養された形質転換体を含む）から本発明の酵素を採取するには、培養物に蓄積されたタンパク質を公知の方法で抽出し、必要に応じて精製すればよい。例えば溶媒抽出法、塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で、あるいは適宜組み合わせて、本発明の酵素を得ることができる。
【００４５】
なお、本発明のアラビノース転移酵素の基質となるフラボノイド、好ましくはフラボノールなどを培地に添加し、形質転換体を培養すれば、フラボノイドの３位にアラビノースが転移された配糖体を製造することができる。
【００４６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４７】
分子生物学的手法は特に断らない限り、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに拠った。また実験の参照文献としてThe Journal of Biological Chemistry (2007) vol.282, pp14932-14941 が挙げられる。
【００４８】
〔実施例１〕植物体の育成
シロイヌナズナの種子（エコタイプColumbia−０）（Lehel Seeds, Round Rock, TX, アメリカ）を野生型植物として用いた。シロイヌナズナは植物育成室にて２２℃で１６時間明所／８時間暗所のサイクルで生育させた。葉と花を採取し、直ちに液体窒素で冷凍し、使用するまで−３０℃で保存した。
【００４９】
〔実施例２〕共発現解析による候補遺伝子の絞り込み
フラボノイドの修飾に関係する候補遺伝子の数を絞り込むため、ＲＩＫＥＮ−ＰＲＩＭｅウェブサイト(http://prime.psc.riken.jp/)の共発現遺伝子検索プログラムを用いて、共発現解析を行った。共発現遺伝子検索プログラムは、幾つかの遺伝子発現のデータから相関する遺伝子を検索するためのウェブベースアプリケーションである。相関データは、ＡＴＴＥＤ−ＩＩ (Arabidopsis thaliana trans-factor and cis-element prediction database, http://www.atted.bio.titech.ac.jp/)に公開されている。ＡＴＴＥＤ−ＩＩは、公開され入手可能なAtGenExpressの１，３８８個のマイクロアレイデータに基づいている。フラボノイドの生産に関与すると実験的に特徴づけられた２０個の遺伝子(At5g13930, TT4; At3g55120, TT5; At3g51240, TT6; At5g07990, TT7; At5g17050, UGT78D2; At5g08640, FLS1; At1g30530, UGT78D1; At1g06000, UGT89C1; At5g42800, TT3; At4g22880, TT18; At4g14090, UGT75C1; At5g54060, UGT79B1; At3g29590, A5G6’’’MaT; At1g03495, A3G6”p-CouT; At5g17220, TT19; At5g54160, AtOMT1; At2g47460, AtMYB12; At5g49330, AtMYB111; At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2)を、共発現解析のcore query遺伝子として使用した。AtGenExpressデータセットにある全データセットver.3（１，３８８個のアレイデータ）を用いて、フラボノイド経路の遺伝子２０個に対して正の相関（ｒ＞０．５で上位２０個の遺伝子）を示した遺伝子を抽出した。これら候補遺伝子のうちの１つがＵＧＴ５遺伝子であった。
【００５０】
〔実施例３〕シロイヌナズナＵＧＴ５変異体の解析
シロイヌナズナＵＧＴ５のＴ−ＤＮＡ挿入変異体（SALK_114099）をSalk Institute（アメリカ）から入手し、ＵＧＴ５変異体とした。該ＵＧＴ５変異体について、Ｔ−ＤＮＡに特異的なプライマーとして、ＬＢａ１プライマー(5’-GTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATC-3’、配列番号３)およびＲＢ−３００プライマー(5’-AATGGTTTCTGACGTATGTGCTTAG-3’、配列番号４）を、ＵＧＴ５に特異的なプライマーとして、ＵＧＴ５ｆプライマー (5’-CATATCTAAACAAATTGTATGTCGGTAG-3’、配列番号５)およびＵＧＴ５ｒプライマー  (5’-GCGTTGGCTGCGAGGGTTTGGCCAT-3’、配列番号６)を用い、ＰＣＲでスクリーニングを行った。正確な挿入部位を決定するためＰＣＲ産物の配列を決定した。ＵＧＴ５変異体は、開始メチオニンコドンから１００ｂｐ上流にＴ−ＤＮＡが挿入されていた。5g17030cDNA-RT183fプライマー(5’-CTCCTCCGATATCCCCACAAA-3’、配列番号７）および5g17030cDNA-RT253Rプライマー(5’-TCAACACGAATCCCTCAGGAA-3’、配列番号８）を用いてリアルタイムＰＣＲ法によりＵＧＴ５遺伝子の発現を調べたところ、野生型に比べ、ＵＧＴ５変異体ではＵＧＴ５ ｍＲＮＡの蓄積量が減少していた（図１）。
【００５１】
〔実施例４〕ＵＰＬＣ／ＰＤＡ／ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ／ＭＳによるＵＧＴ５変異体のフラボノイド分析
実施例３で得られたＵＧＴ５変異体のフラボノイド分析を行った。
【００５２】
冷凍した花を、生体重１ｍｇの組織に対し５μｌの抽出用溶媒（メタノール：ＣＨ３ＣＯＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９：１：１０）で、ミキサーミル（ＭＭ３００: Retsch GmbH ＆ Co. KG, Haan, ドイツ)を用いて３０Ｈｚで５分間ホモジナイズした。１２，０００×ｇで遠心分離した後、上澄みを直ちにフラボノイド分析に使用した。
【００５３】
フラボノイドのプロファイリングに、Q-Tof Premier質量分析計(Micromass MS Technologies, Manchester, イギリス)を備えた Waters Acquity UPLCTMシステム(Waters Co., Massachusetts, アメリカ)を使用した。UPLCTM phenyl C18カラム (φ２．１ｍｍ×１００ｍｍ, Waters)で、流速０．５ｍｌ／分、３５℃でＵＰＬＣを行った。溶媒Ａ（０．１％ギ酸水溶液）と溶媒Ｂ（０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）を用いて、０分，１００％ Ａ；１０分，４０％ Ｂの直線的グラジエント勾配により溶出を行った。２１０〜５００ｎｍの紫外可視吸収の検出にＰＤＡ(Photo Diode Array)を用いた。フラボノイド配糖体［Ｍ＋Ｈ］＋の検出、および以下のようにセットした陽イオンスキャニングモードでのフラグメントイオンのピークについて、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計を用いた：desolvation temperature, 400℃, nitrogen gas flow, 600l/h；capillary spray, 3.0kV；source temperature, 150℃；cone voltage, 10V。 
【００５４】
タンデム質量分析による保持時間、紫外可視吸収分光およびマスフラグメンテーションに基づく植物抽出物のピークの同定に、標準フラボノール配糖体を用いた。フラボノール３−Ｏ−α−Ｌ−アラビノシドの標品はEXTRASYNTHESE (Genay, フランス)およびAnalyticon Discovery (Potsdam, ドイツ)から購入し、ケンフェロール３，７−Ｏ−ジラムノシドとケルセチンは千葉大学（高山廣光教授）から入手した。報告データと、紫外可視吸収分光、溶出時間、ｍ／ｚ値およびＭＳ２フラグメンテーションパターンを比較することにより他のフラボノイドピークをアノテートした。
【００５５】
分析の結果、ＵＧＴ５変異体では、野生型に比べフラボノール３−Ｏ−グリコシド−７−Ｏ−ラムノシドと推定される３つの化合物のピークが検出できなかった（図２のＰ１、Ｐ２、Ｐ３）。ピークＰ１はｍ／ｚ値およびＭＳ２フラグメンテーションパターンよりケルセチン３−Ｏ−グリコシド−７−Ｏ−ラムノシドであることが推定できた。未同定の３位の糖は、その分子量より、キシロースあるいはアラビノースあるいはアピオースであると考えられた。
【００５６】
〔実施例５〕組換えＵＧＴ５タンパク質を用いた酵素機能の同定
ＵＧＴ５の機能同定のために大腸菌を用いてＵＧＴ５組換えタンパク質の発現および精製を行った。
【００５７】
シロイヌナズナの花のｃＤＮＡを鋳型として用い、プライマーＵＧＴ５−Ｆ (5’-AGCATTGCCTGCATCATGGCCAAACCCTCG-3’、配列番号９)とプライマーＵＧＴ５−Ｒ (5’-ACGTCAATAATTTATTATTCCCGCCCACAA-3’、配列番号１０)で、全長ＵＧＴ５ ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅した。増幅した断片をｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター(Invitrogen社)にクローニングした。タンパク質発現ベクターを構築するため、得られたプラスミドを、プライマー5g17030pET41bF (5’- AAGGCCTTGATGGCCAAACCCTCG-3’、配列番号１１)とプライマー5g17030pET41Bf (5’-CCGCTCGAGTTATCCAAAGTTCAC-3’、配列番号１２)を用いてＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物をＳｔｕＩとＸｈｏＩで消化し、ＳｔｕＩ−ＸｈｏＩ消化したｐＥＴ−４１ｂ（＋）ベクター（Novagen, San Diego, CA, アメリカ）に連結した。得られたプラスミドｐＫＹＳ３４２の配列を確認した。大腸菌株ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）を発現宿主として用いた。形質転換した細胞をＡ６００が０．５になるまで３７℃で培養した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度１ｍＭになるよう添加後、細胞を２５℃で４時間培養した。細胞を回収し、タンパク質を従来法に従ってグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合物として精製した。
【００５８】
ＵＧＴ５タンパク質の活性測定は以下の条件で行った。
【００５９】
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５、１５０μＭ フラボノイド基質および５００μＭ ＵＤＰ糖からなる標準エンザイムアッセイ反応混合物（最終量５０μｌ）を、３０℃で２分間プレインキュベーションし、酵素を添加することにより反応を開始した。３０℃で０，４，８，１２または３０分間インキュベーションしたのち、フラボノールには氷冷０．５％  （ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸／ＭｅＯＨを５０μｌ、アントシアニジンとアントシアニンには氷冷１．０％（ｖ／ｖ）ＨＣｌ／ＭｅＯＨを５０μｌ添加することによって反応を停止した。１２，０００×ｇで３分間遠心分離し、上澄みを回収した。上澄み液のフラボノイドを実施例４と同様にして分析した。
【００６０】
ケンフェロールおよびＵＤＰ−アラビノースを基質とした時の反応産物の分析結果を図３に示した。ＵＧＴ５組換え蛋白質を用いたときにのみ検出されるピーク（図３、矢印）は、ケルセチン３−Ｏ−アラビノシドと溶出時間、ｍ／ｚ値およびＭＳ２フラグメンテーションパターンが一致した。ＵＧＴ５は、糖受容体としては、フラボノールアグリコン（ケンフェロール、ケルセチン、ミリセチン、イソラムネチン）およびケンフェロール７−Ｏ−ラムノシドを基質として認識できたが、フラボノール配糖体（ケンフェロール３−Ｏ−グルコシド、ケンフェロール３−Ｏ−ラムノシド、ケルセチン３−Ｏ−グルコシド、ケルセチン３−Ｏ−ラムノシド）やシアニジン、シアニジン配糖体（シアニジン３−Ｏ−グルコシド、シアニジン５−Ｏ−グルコシド、）には反応しなかった。糖供与体としては、ＵＤＰ−アラビノースのみを利用でき、他のＵＤＰ糖（ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−キシロース）は利用できなかった。以上の結果からＵＧＴ５はフラボノール３位アラビノース転移酵素をコードしていることが明らかにできた。ケンフェロール７−Ｏ−ラムノシドを基質とした時の反応産物は、ＵＧＴ５ Ｔ−ＤＮＡ挿入変異体において消失したフラボノールのピークのうちの一つ（図２、Ｐ２）と一致し、ケンフェロール３−Ｏ−アラビノシド７−Ｏ−ラムノシドに対応することが明らかとなった。
【００６１】
また、ＵＤＰ−アラビノースを用いて、フラボノールアグリコン（ケンフェロール、ケルセチン、ミリセチン、イソラムネチン）およびケンフェロール７−Ｏ−ラムノシドに対する基質特異性を調べた（表１、表中のＮＤはNot Detectedの略）。アグリコン換算で、ケンフェロールに対する反応性を１００％とするとケルセチン、ミリセチン、イソラムネチン、ケンフェロール７−Ｏ−ラムノシドに対する反応性は、それぞれ２８２、１４８、１６５、１４０％であり、他のアグリコンに比べケルセチンを好むことを明らかにした。
【００６２】
【表１】
2009034068.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、フラボノイド３−Ｏ−アラビノシドの人為的合成を可能にし、植物フラボノイドによる健康増進機能向上の可能性が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】シロイヌナズナ野生型とＵＧＴ５変異体のＵＧＴ５ ｍＲＮＡ蓄積量を示す。シロイヌナズナ野生型およびＵＧＴ５変異体におけるＵＧＴ５遺伝子転写産物の蓄積パターン。野生型での蓄積量を１００％として表した。
【図２】ＵＰＬＣ／ＰＤＡ／ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ／ＭＳによるシロイヌナズナ野生型とＵＧＴ５変異体のフラボノイド分析結果を示す（横軸：分、縦軸：任意単位）。シロイヌナズナ野生型およびＵＧＴ５変異体の花を用いたＵＰＬＣ／ＰＤＡ／ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ／ＭＳによるフラボノール分析。ピークＰ１，Ｐ２，Ｐ３はＵＧＴ５変異体において検出できなかったピークを示している。ピークＰ１についてはマススペクトルもあわせて示した。
【図３】組換えＵＧＴ５タンパク質を用いた酵素機能の分析結果を示す（横軸：分、縦軸：任意単位）。ＵＧＴ５組換え蛋白質を用いた酵素反応産物の分析とＵＧＴ５の基質特異性。ケルセチンおよびＵＤＰ−アラビノースを基質としてＧＳＴとＵＧＴ５の融合蛋白質（ＧＳＴ−ＵＧＴ５）とＧＳＴ蛋白質のみ（ＧＳＴ）を用いて酵素反応を行った。矢印で示したピークはケルセチン３−Ｏ−アラビノシドと一致した。
【図１】
2009034068.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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