(57)【要約】【課題】  骨吸収抑制作用及び骨形成促進作用を有する新規の骨代謝改善剤を提供すること。【解決手段】  一般式（１）で表される化合物又はその配糖体を有効成分として含有する骨代謝改善剤を提供する。2009209091.tif 000009［式中、Ｒは、水素原子、又は置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基を表す。］【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される化合物又はその配糖体を有効成分として含有する骨代謝改善剤。
【化１】
2009209091.tif 000006
［式中、Ｒは、水素原子、又は置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基を表す。］
【請求項２】
一般式（１）中のＲが、水素原子、又は置換基を有していてもよい炭素数１〜５のアルキル基である、請求項１に記載の骨代謝改善剤。
【請求項３】
一般式（１）中のＲが、置換基を有しない炭素数１〜４のアルキル基である、請求項１に記載の骨代謝改善剤。
【請求項４】
一般式（１）で表される化合物が、下記式（Ａ）で表される化合物又は下記式（Ｂ）で表される化合物である、請求項１に記載の骨代謝改善剤。
【化２】
2009209091.tif 000007
【化３】
2009209091.tif 000008
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨代謝改善剤を含有する医薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨代謝改善剤を含有する飲食品添加物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨代謝改善剤を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨代謝改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨代謝においては、破骨細胞が骨吸収を担い、骨芽細胞が骨形成を担っている。正常な骨組織では、骨吸収と骨形成とが絶えずバランスよく繰り返されることで、骨代謝が進み、骨密度が一定に維持されている。このバランスが破綻して、骨吸収が骨形成を上回ると、骨密度が低下し、やがて骨粗鬆症が発症する。骨吸収及び骨形成のバランスを是正して、骨粗鬆症を治療又は予防するには、骨吸収を抑制するか、骨形成を促進することが有効である。
【０００３】
骨代謝改善剤に関しては、例えば、ホップの苦味成分であるアルファ酸及びイソアルファ酸が骨吸収抑制作用を有することが報告されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平７−３３０５９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、骨吸収及び骨形成のバランスの破綻は、骨吸収亢進及び骨形成低下の一方のみではなく、双方が関与して生じる場合が多く、骨代謝改善剤としては、骨吸収抑制作用及び骨形成促進作用の双方を有するものが強く求められていると考えられる。しかしながら、そのような骨代謝改善剤に関しては、未だその種類が少なく、消費者の需要が十分に満たされていないのが実情である。
【０００５】
そこで、本発明は、骨吸収抑制作用及び骨形成促進作用を有する新規の骨代謝改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、下記一般式（１）で表される化合物又はその配糖体を有効成分として含有する骨代謝改善剤を提供する。ここで、「骨代謝改善剤」とは、骨吸収及び骨形成のバランスの破綻を是正、抑制又は予防する剤を意味する。
【０００７】
【化１】
2009209091.tif 000002
［式中、Ｒは、水素原子、又は置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基を表す。］
【０００８】
骨吸収を担う破骨細胞は、骨表面に酸（塩酸等）やプロテアーゼ（カテプシンＫ、ＭＭＰ−９等）を分泌して、骨の無機成分（ハイドロキシアパタイト）及びタンパク質成分（コラーゲン等）を分解することを通じて、骨吸収を行う。本発明の骨代謝改善剤は、まず、破骨細胞による骨の無機成分の分解を抑制することができ、そのような作用を介して骨吸収を抑制することができる。また、本発明の骨代謝改善剤は、破骨細胞分化抑制因子であるオステオプロテグリンの産生を促進することができ、そのような作用を介して骨吸収を抑制することができる。更に、本発明の骨代謝改善剤は、骨形成を担う骨芽細胞の前駆細胞を増殖させることができ、そのような作用を介して骨形成を促進することができる。
【０００９】
このように、本発明の骨代謝改善剤は、骨吸収抑制作用及び骨形成促進作用の双方を有し、骨吸収及び骨形成のバランスの破綻を効果的に是正、抑制又は予防することができる。また、骨形成促進作用を有することから、骨形成低下に起因する骨密度の低下を改善又は予防するのにも有用である。また、成長期ないし若年期は最大骨密度及び最大骨量を増大させるべき時期であるが、本発明の骨代謝改善剤は、成長期ないし若年期における最大骨密度及び最大骨量の増大を促進するためにも使用することができる。
【００１０】
一般式（１）中のＲとしては、より高い骨吸収抑制効果及び骨形成促進効果が得られる点で、水素原子、又は炭素数１〜１０のアルキル基が好ましく、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基がより好ましく、炭素数１〜４のアルキル基が更に好ましい。
【００１１】
一般式（１）で表される化合物のうち、Ｒが、置換基を有しない炭素数１〜４のアルキル基である化合物としては、例えば、フロロイソブチロフェノン（以下、場合により、「ＰＩＢＰ」という。）及びフロロイソバレロフェノン（以下、場合により、「ＰＩＶＰ」という。）が好ましい。フロロイソブチロフェノン及びフロロイソバレロフェノンは、それぞれ下記式（Ａ）及び（Ｂ）で表される化合物である。
【００１２】
【化２】
2009209091.tif 000003
【００１３】
【化３】
2009209091.tif 000004
【００１４】
本発明の骨代謝改善剤は、上述のような効果を奏することから、特に、骨吸収抑制及び骨形成促進剤として、また、骨粗鬆症の治療又は予防剤として使用することができる。
【００１５】
また、本発明の骨代謝改善剤は、医薬、飲食品添加物、飲食品、飼料添加物、飼料等の成分として使用することができる。すなわち、本発明はまた、本発明の骨代謝改善剤を含有する医薬、飲食品添加物、飲食品、飼料添加物、飼料等を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、骨吸収抑制作用及び骨形成促進作用を有する新規の骨代謝改善剤が提供される。また、そのような骨代謝改善剤を含有する医薬、飲食品添加物、飲食品、飼料添加物、飼料等が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
【００１８】
本発明の骨代謝改善剤は、一般式（１）で表される化合物又はその配糖体を有効成分として含有する。
【００１９】
一般式（１）において、Ｒは、水素原子、又は置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基を表す。「アルキル基」は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキル基が置換基を有する場合、当該置換基の炭素数はアルキル基の「炭素数」に含まれないものとする。
【００２０】
炭素数１〜２０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、３−メチルブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、２−エチルヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が挙げられる。より高い骨吸収抑制効果及び骨形成促進効果が得られる点で、アルキル基の炭素数としては、１〜１０が好ましく、１〜５がより好ましく、１〜４が更に好ましい。
【００２１】
一般式（１）で表される化合物のうち、Ｒが、置換基を有しない炭素数１〜４のアルキル基である化合物としては、例えば、フロロイソブチロフェノン（式（Ａ）で表される化合物）及びフロロイソバレロフェノン（式（Ｂ）で表される化合物）が好ましい。
【００２２】
一般式（１）において、Ｒで表されるアルキル基は、置換基を有していてもよい。本明細書において、「置換基を有していてもよい」とは、置換基の数又は種類に関して特に断らない限り、置換可能な部位に１個又は複数の置換基を有していてもよいことを意味する。アルキル基が複数の置換基を有する場合、複数の置換基は１種の置換基のみから構成されていても、２種以上の置換基から構成されていてもよい。置換基としては、例えば、フェニル基、カルボキシル基又はヒドロキシル基が好適である。
【００２３】
一般式（１）で表される化合物の配糖体は、例えば、一般式（１）で表される化合物中のフロログルシノール環のいずれかのＯＨ基と、β−Ｄ−グルコピラノシド基と、が縮合して生成したものである。そのような配糖体としては、例えば、下記式（Ａ−１）で表される配糖体が挙げられる。
【００２４】
【化４】
2009209091.tif 000005
【００２５】
一般式（１）で表される化合物のうち、フロロイソブチロフェノン及びフロロイソバレロフェノンは、例えば、次のようにして得ることができる。フロログルシノール０．０５ｍｏｌ及び無水三塩化アルミニウム０．１ｍｏｌをメチレンクロライド５０ｍｌ中に懸濁させる。ここに、ニトロメタン０．１ｍｏｌを攪拌しながら添加し、３５℃に加温して、フロログルシノール及び三塩化アルミニウムを溶解させる（塩化水素を発生させる）。混合物を４０℃で５分間加熱し、次いで、塩化イソブチリル０．０５ｍｏｌ（フロロイソブチロフェノンの場合）又は塩化イソバレリル０．０５ｍｏｌ（フロロイソバレロフェノンの場合）を添加し、１０分間沸騰させる。その後、氷及び塩酸で分解し、メチレンクロライド及びニトロメタンを蒸発させ、生成物（フロロイソブチロフェノン又はフロロイソバレロフェノン）をエーテルで抽出する。
【００２６】
また、フロロイソブチロフェノンの配糖体は、例えば、ホップ球果中のルプリン腺毛において、バレロフェノンシンターゼの作用によって、マロニル−ＣｏＡ及びイソブチリル−ＣｏＡからそのアグリコンが生合成され、当該アグリコンに糖が付加することによって生合成される。フロロイソバレロフェノンの配糖体は、例えば、ホップ球果中のルプリン腺毛において、バレロフェノンシンターゼの作用によって、マロニル−ＣｏＡ及びイソバレリル−ＣｏＡからそのアグリコンが生合成され、当該アグリコンに糖が付加することによって生合成される。
【００２７】
例えば、ホップ球果で生合成されたフロロイソブチロフェノン配糖体は、次のようにしてホップ球果から単離することができる。すなわち、まず、ホップ球果を５％エタノールで一晩抽出する。次いで、抽出液を酢酸エチルで２層分配し、水層を採取し、更に、この水層をブタノールで２層分配し、ブタノール層を採取する。そして、ブタノール層を、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）  ＸＡＤ４（ローム・アンド・ハース社）等の吸着剤に通液し、吸着剤を２０％ＭｅＯＨで洗浄し、更に、吸着成分を５０％ＭｅＯＨで溶出させる。最後に、得られた溶出成分をメタノールに溶解させ、これをＯＤＳカラムに通液して分取すると、精製されたフロロイソブチロフェノン配糖体の溶液が得られる。
【００２８】
本発明の骨代謝改善剤は、固体、液体（水溶性又は脂溶性の溶液又は懸濁液）、ペースト等のいずれの形状でもよく、また、散剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、注射剤等のいずれの剤形を取ってもよい。また、放出制御製剤の形態を取ることもできる。また、本発明の骨代謝改善剤は、一般式（１）で表される化合物又はその配糖体からなるものであってもよく、そのような骨代謝改善剤としては、高い骨吸収抑制効果及び骨形成促進効果が得られる点で、例えば、フロロイソブチロフェノン、フロロイソバレロフェノン、及びそれらの配糖体、のうちの少なくとも１種からなるものが好ましい。
【００２９】
上述の各種製剤は、一般式（１）で表される化合物又はその配糖体と、薬学的に許容される添加剤（賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等）と、を混和することによって調製することができる。
【００３０】
例えば、賦形剤としては、ラクトース、スクロース、デンプン、デキストリン等が挙げられる。結合剤としては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。基剤としては、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール、米糠油、魚油（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ８０等が挙げられる。懸濁化剤としては、上述の界面活性剤の他、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００３１】
本発明の骨代謝改善剤は、医薬、飲食品添加物、飲食品、飼料添加物、飼料等の成分として使用することができる。
【００３２】
例えば、本発明の骨代謝改善剤は、水、清涼飲料水、果汁飲料、乳飲料、アルコール飲料、パン類、麺類、米類、豆腐、乳製品、醤油、味噌、菓子類等の飲食品への添加物として使用することができる。これらの飲食品は、当分野で通常使用される他の添加物を更に含有していてもよく、そのような添加物としては、例えば、苦味料、香料、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂；グルコース等の単糖類；スクロース、フルクトース、マンニトール等の二糖類；デキストロース、デンプン等の多糖類；エリスリトール、キシリトール、ソルビトール等の糖アルコール類；ビタミンＣ等のビタミン類、が挙げられる。本発明の骨代謝改善剤はまた、特定保健用食品、特殊栄養食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、病者用食品等の成分として使用することもできる。
【００３３】
本発明の骨代謝改善剤は、ヒトに投与されても、非ヒト哺乳動物に投与されてもよい。適切な投与量は、投与される個体の状態、年齢等に応じて適宜決定することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
〔実施例１：フロロイソブチロフェノンによる骨無機成分分解抑制〕
（試験サンプルの調製）
フロログルシノール０．０５ｍｏｌ及び無水三塩化アルミニウム０．１ｍｏｌをメチレンクロライド５０ｍｌ中に懸濁させた。ここに、ニトロメタン０．１ｍｏｌを攪拌しながら添加し、３５℃に加温して、フロログルシノール及び三塩化アルミニウムを溶解させた。混合物を４０℃で５分間加熱し、次いで、塩化イソブチリル０．０５ｍｏｌを添加し、１０分間沸騰させた。その後、氷及び塩酸で分解し、メチレンクロライド及びニトロメタンを蒸発させ、生成物（ＰＩＢＰ）をエーテルで抽出した。得られたＰＩＢＰを２０％ＤＭＳＯ溶液に溶解させて、試験サンプルを得た。なお、ＰＩＢＰを含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。
【００３６】
（ピットフォーメーションアッセイ）
ラット破骨細胞前駆細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ）を、ラット破骨細胞培養キット（セルガレージ社）に含まれる分化誘導用培地（５ｍＬ）（培地組成：α−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍＬ  ＲＡＮＫＬ＆Ｍ−ＣＳＦ）に懸濁し、これを、ハイドロキシアパタイトで被膜されたＯＡＡＳプレート（オスコテック社）の各ウェルに１００μＬ（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）ずつ分注し、細胞がプレートに完全に接着するまで３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
【００３７】
その後、各ウェルに試験サンプルを加えて、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で７〜１０日間培養し、コントロールのウェル（２０％ＤＭＳＯ溶液のみを添加したウェル）において骨吸収痕跡の形成が一面に確認された時点で、各ウェルの表面の様子をデジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−１００Ｆ、キーエンス社）で観察し、骨吸収面積及び骨吸収痕跡数を計測した。
【００３８】
〔実施例２：フロロイソバレロフェノンによる骨無機成分分解抑制〕
（試験サンプルの調製）
フロログルシノール０．０５ｍｏｌ及び無水三塩化アルミニウム０．１ｍｏｌをメチレンクロライド５０ｍｌ中に懸濁させた。ここに、ニトロメタン０．１ｍｏｌを攪拌しながら添加し、３５℃に加温して、フロログルシノール及び三塩化アルミニウムを溶解させた。混合物を４０℃で５分間加熱し、次いで、塩化イソバレリル０．０５ｍｏｌを添加し、１０分間沸騰させた。その後、氷及び塩酸で分解し、メチレンクロライド及びニトロメタンを蒸発させ、生成物（ＰＩＶＰ）をエーテルで抽出した。得られたＰＩＶＰを２０％ＤＭＳＯ溶液に溶解させて、試験サンプルを得た。なお、ＰＩＶＰを含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。
【００３９】
（ピットフォーメーションアッセイ）
得られた試験サンプルについて、実施例１と同様にしてピットフォーメーションアッセイを行った。
【００４０】
実施例１及び２の結果を図１に示す。図１は、各種濃度のＰＩＢＰ又はＰＩＶＰの存在下で行われたピットフォーメーションアッセイにおける骨吸収活性を示すグラフである。図１中の「骨吸収面積」及び「骨吸収痕跡数」は、それぞれ、コントロールを１００％として骨吸収面積及び骨吸収痕跡数の測定値から換算した相対的な骨吸収活性（％）を表す。横軸の濃度は、培地中のＰＩＢＰ又はＰＩＶＰの濃度である。
【００４１】
図１から明らかなように、ＰＩＢＰ及びＰＩＶＰのいずれも、顕著な骨無機成分（ハイドロキシアパタイト）分解抑制効果を示した。
【００４２】
〔実施例３：フロロイソブチロフェノンによるオステオプロテグリン産生促進〕
（試験サンプルの調製）
実施例１と同様にして試験サンプルを調製した。なお、ＰＩＢＰを含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。
【００４３】
（オステオプロテグリン産生量の測定）
マウス骨髄由来ストローマ細胞ＳＴ−２（理研セルバンク、ＲＣＢ０２２４）をＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、１０％ＦＢＳ添加）に懸濁し、２４ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種した後、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。
【００４４】
次いで、５０ｎＭ  デキサメタゾン（和光純薬工業）及び１０ｎＭ  １，２５（ＯＨ）２Ｄ３（活性型ビタミンＤ３）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に培地交換し、培地に試験サンプル１％（ｖ／ｖ培地）を添加して、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。培養後、培養上清中のオステオプロテグリン量をマウスＯＰＧ−ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。
【００４５】
〔実施例４：フロロイソバレロフェノンによるオステオプロテグリン産生促進〕
（試験サンプルの調製）
実施例２と同様にして試験サンプルを調製した。なお、ＰＩＶＰを含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。
【００４６】
（オステオプロテグリン産生量の測定）
得られた試験サンプルについて、実施例３と同様にしてオステオプロテグリン産生量の測定を行った。
【００４７】
実施例３及び４の結果を図２に示す。図２は、ＰＩＢＰ又はＰＩＶＰの存在下でマウス骨髄由来ストローマ細胞を培養した後の培養上清中のオステオプロテグリン量を示すグラフである。図２において、（ａ）は、ｎｇ／ｍＬで表されるオステオプロテグリン量を示すグラフであり、（ｂ）は、コントロールを１００％とする相対的なオステオプロテグリン量（％）を示すグラフである。横軸の濃度は、培地中のＰＩＢＰ又はＰＩＶＰの濃度である。
【００４８】
図２から明らかなように、ＰＩＢＰ及びＰＩＶＰのいずれも、顕著なオステオプロテグリン産生促進効果を示した。
【００４９】
〔実施例５：フロロイソブチロフェノンによるマウス由来骨芽細胞前駆細胞増殖〕
（試験サンプルの調製）
実施例１と同様にして試験サンプルを調製した。なお、ＰＩＢＰを含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。
【００５０】
（骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定）
マウス由来骨芽細胞前駆細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（理研セルバンク、ＲＣＢ１１２６）２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬをα−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１０％ＦＢＳ添加）に懸濁し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌ播種した後、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。
【００５１】
次いで、培地交換し、培地に試験サンプル１％（ｖ／ｖ培地）を添加して、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で４８時間培養した。４８時間の培養後、細胞数をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学）で測定した。ここで、吸光度から細胞数への変換は、同様の方法で別途作成していた検量線を用いて行った。
【００５２】
〔実施例６：フロロイソバレロフェノンによるマウス由来骨芽細胞前駆細胞増殖〕
（試験サンプルの調製）
実施例２と同様にして試験サンプルを調製した。なお、ＰＩＶＰを含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。
【００５３】
（骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定）
得られた試験サンプルについて、実施例５と同様にして骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定を行った。
【００５４】
実施例５及び６の結果を図３に示す。図３は、各種濃度のＰＩＢＰ又はＰＩＶＰの存在下でマウス由来骨芽細胞前駆細胞を培養した後の細胞数を示すグラフである。図３において、細胞数は、コントロールを１００％とする相対細胞数（％）で示されている。横軸の濃度は、培地中のＰＩＢＰ又はＰＩＶＰの濃度である。
【００５５】
図３から明らかなように、ＰＩＢＰ及びＰＩＶＰのいずれも、顕著なマウス由来骨芽細胞前駆細胞増殖活性を示した。
【００５６】
〔実施例７：フロロイソブチロフェノンによるヒト由来骨芽細胞前駆細胞増殖〕
（試験サンプルの調製）
実施例１と同様にして試験サンプルを調製した。なお、ＰＩＢＰを含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。
【００５７】
（骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定）
ヒト由来骨芽細胞前駆細胞ＭＧ−６３（理研セルバンク、ＲＣＢ１８９０）２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬをα−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１０％ＦＢＳ添加）に懸濁し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌ播種した後、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。
【００５８】
次いで、培地交換し、培地に試験サンプル１％（ｖ／ｖ培地）を添加して、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で４８時間培養した。４８時間の培養後、細胞数をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学）で測定した。ここで、吸光度から細胞数への変換は、同様の方法で別途作成していた検量線を用いて行った。
【００５９】
〔実施例８：フロロイソバレロフェノンによるヒト由来骨芽細胞前駆細胞増殖〕
（試験サンプルの調製）
実施例２と同様にして試験サンプルを調製した。なお、ＰＩＶＰを含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。
【００６０】
（骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定）
得られた試験サンプルについて、実施例７と同様にして骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定を行った。
【００６１】
実施例７及び８の結果を図４に示す。図４は、各種濃度のＰＩＢＰ又はＰＩＶＰの存在下でヒト由来骨芽細胞前駆細胞を培養した後の細胞数を示すグラフである。図４において、細胞数は、コントロールを１００％とする相対細胞数（％）で示されている。横軸の濃度は、培地中のＰＩＢＰ又はＰＩＶＰの濃度である。
【００６２】
図４から明らかなように、ＰＩＢＰ及びＰＩＶＰのいずれも、顕著なヒト由来骨芽細胞前駆細胞増殖活性を示した。
【００６３】
以上の実施例により、本発明の骨代謝改善剤を使用すれば、顕著な骨吸収抑制及び骨形成促進が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の骨代謝改善剤は、例えば、骨粗鬆症の治療及び予防に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＰＩＢＰ又はＰＩＶＰの存在下で行われたピットフォーメーションアッセイにおける骨吸収活性を示すグラフである。
【図２】ＰＩＢＰ又はＰＩＶＰの存在下でマウス骨髄由来ストローマ細胞を培養した後の培養上清中のオステオプロテグリン量を示すグラフである。
【図３】ＰＩＢＰ又はＰＩＶＰの存在下でマウス由来骨芽細胞前駆細胞を培養した後の細胞数を示すグラフである。
【図４】ＰＩＢＰ又はＰＩＶＰの存在下でヒト由来骨芽細胞前駆細胞を培養した後の細胞数を示すグラフである。
【図１】
2009209091.tif 000010
【図２】
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【図３】
2009209091.tif 000012
【図４】
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