(57)【要約】【課題】本発明は、ヒトへの感染力の高いＡ型インフルエンザウイルス株を簡便かつ迅速に同定する方法や、Ａ型インフルエンザウイルスのヒトへの感染力を低下させることによる、Ａ型インフルエンザウイルスに対するヒト感染防除剤を提供することを目的とする。【解決手段】Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位のグリコシル化の有無を分析する工程と、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失の有無を分析する工程と、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位でグリコシル化されておらず、かつ、ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失がない場合、シアリルα２，６ガラクトース結合を末端に持つ糖鎖への結合活性の高いＡ型インフルエンザウイルス株と判定する工程とを実施し、ヒトへの感染力の高いＡ型インフルエンザウイルス株を同定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ１），（ａ２）及び（ｂ）を有することを特徴とする、シアリルα２，６ガラクトース結合を末端に持つ糖鎖への結合活性の高いＡ型インフルエンザウイルス株の同定方法。
工程（ａ１）；Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位のグリコシル化の有無を分析する工程
工程（ａ２）；Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失の有無を分析する工程
工程（ｂ）；Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位でグリコシル化されておらず、かつ、ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失がない場合、シアリルα２，６ガラクトース結合を末端に持つ糖鎖への結合活性の高いＡ型インフルエンザウイルス株と判定する工程
【請求項２】
ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失が、ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における２０アミノ酸の欠失であることを特徴とする請求項１記載の同定方法。
【請求項３】
Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の２２７位がアスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）であるかを分析する工程（ａ３）をさらに有することを特徴とする請求項１又は２記載の同定方法。
【請求項４】
Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザウイルスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の同定方法。
【請求項５】
以下の工程（ａ１），（ａ２）及び（ｂ）を有することを特徴とする、ヒトへの感染力の強いＡ型インフルエンザウイルス株の同定方法。
工程（ａ１）；Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位のグリコシル化の有無を分析する工程
工程（ａ２）；Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失の有無を分析する工程
工程（ｂ）；Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位でグリコシル化されておらず、かつ、ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失がない場合、ヒトへの感染力の強いＡ型インフルエンザウイルス株と判定する工程
【請求項６】
ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失が、ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における２０アミノ酸の欠失であることを特徴とする請求項５記載の同定方法。
【請求項７】
Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の２２７位がアスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）であるかを分析する工程（ａ３）をさらに有することを特徴とする請求項５又は６記載の同定方法。
【請求項８】
Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザウイルスであることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の同定方法。
【請求項９】
Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位のグリコシル化活性組成物を含有することを特徴とする、Ａ型インフルエンザウイルスに対するヒト感染防除剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α２，６シアリルパラグロボシドへの結合活性の高いＡ型インフルエンザウイルス株の同定方法や、ヒトへの感染力の強いＡ型インフルエンザウイルス株の同定方法や、Ａ型インフルエンザウイルスに対するヒト感染防除剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルス感染症は、毎年冬季に流行する感染症であり、特に老人や乳幼児において発症すると、命にかかわる重篤な症状を引き起こす場合がある。また、近年では、高病原性Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスのヒトへの感染が確認されつつあり、世界的な問題となっている。Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスがヒトに感染すると、有効な治療を感染初期に施さない限り、老人や乳幼児以外の成人の場合であっても高い致死率を示す。ＷＨＯのウェブサイトによれば、２００４年以降、Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスのヒトへの感染は、１２カ国で計３１７件確認され、１９１人が死亡したとされる（２００７年６月２９日現在）。Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスは、既にアジア、ヨーロッパ、アフリカ及び中東の家禽に定着し、ヒトでの世界的な流行へつながる危険性をはらんでいる。
【０００３】
インフルエンザウイルスはヒトのみならず、ブタ、ウマ、家禽、そして野生の鳥類など様々な動物から分離される。疫学的及び分子遺伝学的研究から、哺乳動物から分離されるインフルエンザウイルスは、もともとは野生の鳥類（特にカモなどの水禽類）に由来することがこれまでに判明している。しかし、一般的なトリインフルエンザは、通常そのままではヒトでは増殖せず、一般的なヒトインフルエンザも、通常そのままでは鳥類では増殖しない。すなわち、これらのインフルエンザウイルスの宿主域には基本的には制限がある。したがって、家禽からヒトへの感染は依然として非効率的であり、家禽からヒトへ感染したウイルスがそのままさらにヒトへと感染することは基本的には稀といえる。このことは、Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスについてもあてはまる（非特許文献１）。
【０００４】
前述したようなインフルエンザウイルスの種間の感染障壁、すなわち、インフルエンザウイルスの宿主細胞に対する結合特異性の重要な要素として、例えば、一次及び二次受容体結合部位（ＲＢＳ）（非特許文献２）を含むヘマグルチニン（ＨＡ）におけるＲＢＳの活性や特異性（非特許文献３、４）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）のシアリダーゼ活性や特異性（非特許文献５〜７）、宿主細胞表面上のシアル酸の分子種や複合糖質の末端シアル酸−Ｇａｌ結合（非特許文献８〜１０）が挙げられる。ＨＡ１及びＨＡ２でペプチドを結合する複数の塩基性アミノ酸は、高病原性Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスのＨＡのトリプシン様酵素による切断に対する脆弱性を高める（非特許文献１１）一方で、ＲＢＳを構成するアミノ酸残基にそれほどの違いはない。
【０００５】
トリとヒトの間の感染障壁に関してより具体的にいえば、トリインフルエンザウイルスのほとんどは、通常、ガラクト−スとα２，３結合したシアル酸（SAα2,3Gal）を糖鎖末端にもつ受容体（トリ型受容体）に選択的に結合するのに対し、ヒトインフルエンザウイルスのほとんどは、通常、ガラクト−スとα２，６結合したシアル酸（SAα2,6Gal）を糖鎖末端にもつ受容体（ヒト型受容体）に選択的に結合することが知られる（非特許文献８）。そのため、α２，３結合したシアル酸（α２，３シアル酸）からα２，６結合したシアル酸（α２，６シアル酸）への受容体特異性の転換は、トリウイルスのヒト宿主への適応にとって、決定的なステップの一つである（非特許文献９等）。
【０００６】
シアル酸 (sialic acid) とは、９炭糖であるノイラミン酸 (neuraminic acid) のアミノ基やヒドロキシ基が置換された物質の総称であり、５位がアセチル化されたＮ−アセチルノイラミン酸 (Neu5Ac) や、グリコール酸で修飾されたＮ−グライコリルノイラミン酸 (Neu5Gc)がよく知られている。シアル酸は、糖タンパク質、糖脂質、糖ペプチド等の複合糖質の構成成分として生体内に広く分布しており、特に細胞膜表面に存在して、細胞の特異的認識機構に大きな役割を果たしているといわれている。置換基としてのシアル酸残基の種類は、代謝酵素、特にシアリダーゼの活性に対して強く影響し、複合糖質の転換率に影響する。複合糖質は、多種多様な細胞機能に関わっており、例えば、生体器官の表面に存在する複合糖質における酸性分子によって、生体器官の表面は酵素による攻撃や免疫学的な攻撃から保護される。しかし一方では、生体器官の表面の複合糖質は、様々な生理学的な受容体となって、ウイルスを含む微生物や毒素の認識部位ともなり、その感染を許すことにもつながる。多くのウイルス、特にインフルエンザウイルスは、細胞に感染する際にシアル酸残基に結合することが知られている。
【０００７】
一方、インフルエンザウイルス感染においては、インフルエンザウイルスのウイルス膜抗原であるヘマグルチニン（ＨＡ）と、レセプター破壊酵素であるノイラミニダーゼ（ＮＡ）活性とバランスが重要であることが知られている（非特許文献１２〜１５）。インフルエンザウイルスの流行の型の変異は、ＨＡやＮＡの変異に起因し、ＨＡ亜型（Ｈ１−Ｈ１５）やＮＡ亜型（Ｎ１−Ｎ９）のすべては野生水鳥の世界に貯留されている。
【０００８】
本発明者らは、これまでに、インフルエンザウイルスのＨＡを認識する宿主細胞受容体の化学構造を明らかにしてきた。その結果、ヒト、ブタ、トリ、ウマから分離されるインフルエンザＡ型ウイルス及びヒトインフルエンザＢ型ウイルスは、いずれも共通してシアル酸（Ｓｉａ）を含む糖鎖を特異的に認識結合すること、特に、シアリルラクト系Ｉ型糖鎖（SAα2-6(2-3)Galβ1-3GlcNAcβ1-）又はシアリルラクト系II型糖鎖（SAα2-6(2-3)Galβ1-４GlcNAcβ1-）と強く結合することを明らかにし、Ａ、Ｂ型ウイルスＨＡの分子進化は、受容体シアロ糖鎖末端のシアル酸結合様式(SA2-3Gal, SA2-6Gal)とシアル酸分子種(Neu5Ac, Neu5Gc)の認識の変化として現れることを見出した。さらに、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子の１塩基置換（すなわち、Ｌｅｕ２２６→Ｇｌｎ又はＳｅｒ２２８→Ｇｌｙの１アミノ酸置換）により、宿主域が変わり得ること、トリウイルスがヒトへ伝播する際にブタが中間宿主となること、自然宿主であるカモのインフルエンザウイルスが家禽類に伝播し、それが家禽宿主動物の間で循環している間に、宿主動物の受容体糖鎖による進化上の選択を受け、ＨＡ分子内のアミノ酸置換が起こり、その置換がヒト型受容体認識特異性を持った場合、ブタを介さないで直接ヒトへ伝播する可能性などを明らかにした（非特許文献９、１６）。
【０００９】
本発明者らはさらに、トリインフルエンザウイルスＮＡとヒトインフルエンザウイルスのＮＡはわずか２つのアミノ酸置換により、酸性ｐＨでの安定性が異なることを見出し、ＮＡがウイルスの病原性、宿主域、世界流行（パンデミック）に深く関係することを明らかにしている (非特許文献１６、１７)。
【００１０】
【非特許文献１】N. Engl. J. Med. 352, 333-340 (2005)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 324-328 (1992)
【非特許文献３】Nature 289, 366-373 (1981)
【非特許文献４】Nature 333, 426-431 (1988)
【非特許文献５】J. Virol. 79, 11705-11715 (2005)
【非特許文献６】J. Virol. 73, 6743-6751 (1999)
【非特許文献７】J. Virol. 78, 12665-12667 (2004)
【非特許文献８】Biol. Pharm. Bull. 28, 399-408 (2005)
【非特許文献９】J. Virol. 74, 11825-11831 (2000)
【非特許文献１０】J. Virol. 71, 3357-3362(1997)
【非特許文献１１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 324-328 (1988)
【非特許文献１２】J. Virol. 74, 6015-6020 (2000)
【非特許文献１３】Virus Res. 79, 177-85 (2001)
【非特許文献１４】Rev. Med. Virol. 12, 159-166 (2002)
【非特許文献１５】Virology 339, 12-20 (2005)
【非特許文献１６】生化学  76, 227-233 (2004)
【非特許文献１７】FEBS LETT. 557, 228-232 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来技術でも述べたように、例えばＡ型インフルエンザの１種であるＨ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスなどのトリ由来のインフルエンザウイルスが、変異によりヒトへの高い感染力を獲得した場合、対策の若干の遅れにより感染が少しでも拡大してしまえば、二次感染の広がりを止めるのはきわめて困難な状況となり、ヒトでの大流行（パンデミック）が発生する危険性が高い。ヒトでの大流行を阻止するには、ヒトの感染者がきわめて少ない段階で、そのインフルエンザウイルス株がヒトへの感染力の強い株かどうかを簡便かつ迅速に同定し、ヒトへの感染力の強い株であると同定された場合は、感染者の移動制限や隔離を厳格に行い、二次感染の防止に最大限の注意を払うことがきわめて重要となる。本発明の課題は、ヒトへの感染力の強いＡ型インフルエンザウイルス株を簡便かつ迅速に同定する方法や、Ａ型インフルエンザウイルスのヒトへの感染力を低下させることによる、Ａ型インフルエンザウイルスに対するヒト感染防除剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
これまで、α２，６シアル酸やα２，３シアル酸などの受容体に対するインフルエンザウイルスの結合活性を測定するアッセイは、ノイラミニダーゼタンパク質の活性が低下する４℃条件下などの条件下で行われていた。というのも、ノイラミニダーゼは、宿主細胞からウイルス粒子が出芽又は遊離する際に、自らのシアル酸残基又は宿主細胞受容体のシアル酸残基を切断する酵素として知られているため、α２，６シアル酸やα２，３シアル酸などの受容体に対するインフルエンザウイルスの結合活性を調べる際にはむしろ実験結果のノイズとなると考えられていたからである。本発明者らは、このような当業者の常識を覆し、ノイラミニダーゼタンパク質の活性に適した温度条件下（例えば３７℃）で、α２，６シアル酸やα２，３シアル酸などの受容体に対するインフルエンザウイルスの結合アッセイを試み、その結果、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位がグリコシル化されておらず、かつ、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼタンパク質の幹部が欠失を有していないと、かかるＡ型インフルエンザウイルス株は、α２，６シアル酸に対する結合活性が高く、ヒトへの感染力の強いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、（１）以下の工程（ａ１），（ａ２）及び（ｂ）を有することを特徴とする、シアリルα２，６ガラクトース結合を末端に持つ糖鎖への結合活性の高いＡ型インフルエンザウイルス株の同定方法；Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位のグリコシル化の有無を分析する工程（ａ１）、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失の有無を分析する工程（ａ２）、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位でグリコシル化されておらず、かつ、ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失がない場合、シアリルα２，６ガラクトース結合を末端に持つ糖鎖への結合活性の高いＡ型インフルエンザウイルス株と判定する工程（ｂ）や、（２）ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失が、ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における２０アミノ酸の欠失であることを特徴とする上記（１）記載の同定方法や、（３）Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の２２７位がアスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）であるかを分析する工程（ａ３）をさらに有することを特徴とする上記（１）又は（２）記載の同定方法や、（４）Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザウイルスであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の同定方法に関する。
【００１４】
また本発明は、（５）以下の工程（ａ１），（ａ２）及び（ｂ）を有することを特徴とする、ヒトへの感染力の強いＡ型インフルエンザウイルス株の同定方法；Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位のグリコシル化の有無を分析する工程（ａ１）、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失の有無を分析する工程（ａ２）、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位でグリコシル化されておらず、かつ、ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失がない場合、ヒトへの感染力の強いＡ型インフルエンザウイルス株と判定する工程（ｂ）や、（６）ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失が、ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における２０アミノ酸の欠失であることを特徴とする上記（５）記載の同定方法や、（７）Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の２２７位がアスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）であるかを分析する工程（ａ３）をさらに有することを特徴とする上記（５）又は（６）記載の同定方法や、（８）Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザウイルスであることを特徴とする上記（５）〜（７）のいずれかに記載の同定方法に関する。
【００１５】
さらに本発明は、（９）Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位のグリコシル化活性組成物を含有することを特徴とする、Ａ型インフルエンザウイルスに対するヒト感染防除剤やに関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のヒトへの感染力の強いＡ型インフルエンザウイルス株の同定方法によれば、単離・検出されたＡ型インフルエンザウイルス（トリインフルエンザウイルス）株がヒトへの感染力の強い株であるかどうかを簡便かつ迅速に同定し得るため、単離・検出されたトリインフルエンザウイルス株がヒトで実際に流行する前の段階で、ヒトで流行し得るのかどうかや、ヒトで流行するとした場合、どの程度流行し得るのかをあらかじめ予測することができ、インフルエンザ・パンデミックの予知に応用することができる。また、前述の同定結果に基づいて、感染者の移動制限や隔離の程度等を適切に設定することができるため、感染者を必要以上に拘束することなどの人権侵害や、トリインフルエンザのヒトでの大流行を回避することが可能となる。  
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のシアリルα２，６ガラクトース結合を末端に持つ糖鎖（例えば、α２，６シアリルパラグロボシド）への結合活性の高いＡ型インフルエンザウイルス株の同定方法や、本発明のヒトへの感染力の強いＡ型インフルエンザウイルス株の同定方法（以下、併せて「本発明の同定方法」ともいう。）としては、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位のグリコシル化の有無を分析する工程（ａ１）、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失の有無を分析する工程（ａ２）、及びＡ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位でグリコシル化されておらず、かつ、ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失がない場合、α２，６シアリルパラグロボシドへの結合活性の高いＡ型インフルエンザウイルス株と判定する工程（ｂ）を有する同定方法であれば特に制限されず、上記Ａ型インフルエンザウイルスとして具体的には、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザウイルスを好適に例示することができる。なお、本願明細書におけるヘマグルチニンタンパク質やノイラミニダーゼタンパク質のアミノ酸番号は、慣行にしたがい、Ｈ３型インフルエンザウイルスにおけるヘマグルチニンタンパク質やノイラミニダーゼタンパク質のアミノ酸番号に換算した数値である。それらのタンパク質のアミノ酸番号の換算は、後述のインフルエンザウイルスのデータベースを利用して配列を比較することにより容易に行うことができる。
【００１８】
本発明の同定方法の工程（ａ１）におけるＡ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位のグリコシル化の有無は、具体的には、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質の１５８〜１６０位のアミノ酸配列がグリコシル化モチーフ（Ａｓｎ‐Ｘ‐Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；１５９位のＸは任意のアミノ酸残基を表す）であるかを分析することにより行うことができる。ＨＡタンパク質の１５８〜１６０位のアミノ酸配列がグリコシル化モチーフ（Ａｓｎ‐Ｘ‐Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）に該当しなければ、そのＨＡタンパク質の１５８位はグリコシル化されていないと判断することができ、ＨＡタンパク質の１５８〜１６０位のアミノ酸配列がグリコシル化モチーフ（Ａｓｎ‐Ｘ‐Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）に該当すれば、そのＨＡタンパク質の１５８位はグリコシル化されていると判断することができる。
【００１９】
上記ＨＡタンパク質の１５８〜１６０位のアミノ酸配列は、ＨＡタンパク質の塩基配列を決定することにより分析することができ、また、ＨＡタンパク質の塩基配列の決定は、サザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等の公知の手段を利用して行うことができる。サザンハイブリダイゼーション法に用いるＨＡ用プローブやＰＣＲ法に用いるＨＡ用プライマーの配列の設計は、ＮＣＢＩのホームページ上の「Influenza Virus Resource」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/select.cgi?go=1）等のデータベースを利用して入手した、公知のインフルエンザウイルスのＨＡの配列に基づいて、容易に行うことができる。上記ＨＡタンパク質の全長の塩基配列を決定するためのＨＡ用のプライマーとしては、５ＢｍＨＡフォワードプライマー（配列番号１：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG）及び３ＢｍＨＡリバースプライマー（配列番号２：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT）を好適に例示することができ、また、ＨＡタンパク質の１５８〜１６０位のアミノ酸配列の塩基配列を決定するためのＨＡ用プライマーとしては、ＭｔＨ５Ｔ１５８ＡＦフォワードプライマー（配列番号３：GAACAATGCATACCCAAC）ＭｔＨ５Ｔ１５８ＡＲリバースプライマー（配列番号４：TTGGGTATGCATTGTTC）を好適に例示することができる。
【００２０】
上記グリコシル化モチーフとしてより具体的には、Ａｓｎ‐Ｓｅｒ−Ｔｈｒ（ＮＳＴ）、Ａｓｎ‐Ａｓｎ−Ｔｈｒ（ＮＮＴ）及びＡｓｎ‐Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（ＮＳＳ）を例示することができ、グリコシル化モチーフでない配列としてより具体的にはＡｓｎ‐Ｓｅｒ−Ａｌａ（ＮＳＡ）、Ａｓｎ‐Ａｓｎ−Ａｌａ（ＮＮＡ）、Ａｓｐ‐Ａｓｎ−Ａｌａ（ＤＮＡ）及びＡｓｎ‐Ａｓｐ−Ａｌａ（ＮＤＡ）を例示することができる。
【００２１】
本発明の同定方法の工程（ａ２）におけるＡ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失の有無は、例えば、サザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等を利用して、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子の塩基配列を決定したり、ＰＣＲ法を利用してＮＡタンパク質の幹部を含む領域に対応する塩基配列を増幅し、増幅して得られたＰＣＲ産物の配列長を、全長の幹部を有するＮＡタンパク質に対応する塩基配列の長さと比較するなどして、そのＮＡタンパク質の幹部に欠失があるかどうかを分析することにより行うことができる。
【００２２】
前述のサザンハイブリダイゼーション法に用いるＮＡ用プローブやＰＣＲ法に用いるＮＡ用プライマーの配列の設計は、ＮＣＢＩのホームページ上の「Influenza Virus Resource」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/select.cgi?go=1）等のデータベースを利用して入手した、公知のインフルエンザウイルスのＮＡの配列に基づいて、容易に行うことができる。ＮＡタンパク質の幹部の欠失の有無を調べるためのＮＡ用プライマーとしては、５ＢｍＮＡフォワードプライマー（配列番号５：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT）及び３ＢｍＮＡリバースプライマー（配列番号６：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT）を好適に例示することができる。
【００２３】
本発明において、幹部に欠失を有するＮＡタンパク質としては、そのＮＡタンパク質をコードするＮＡ遺伝子を、後述の実施例中のウイルスプラスミドのＮＡ遺伝子として用いたウイルスプラスミドを、α２，３シアリルパラグロボシド（α2,3 sialylparagloboside：α２，３ＳＰＧ）（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１’Ｃｅｒ）に接触させたときに、そのウイルスプラスミドのＨＡの一次ＲＢＳに接触している受容体のα２，３シアル酸結合を切断することができない程度の幹部の長さを有するＮＡタンパク質をいい、例えば、ＮＡタンパク質のアミノ酸配列の４９〜６８位の２０アミノ酸を欠失したＮＡタンパク質を好ましく例示することができる。
【００２４】
本発明の同定方法の工程（ｂ）においては、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位でグリコシル化されておらず、かつ、ノイラミニダーゼタンパク質の幹部における欠失がない場合、かかるＡ型インフルエンザウイルス株は、シアリルα２，６ガラクトース結合を末端に持つ糖鎖（例えば、α２，６シアリルパラグロボシド）への結合活性の高いＡ型インフルエンザウイルス株、又はヒトへの感染力の強いＡ型インフルエンザウイルス株と判定される。例えば、工程（ａ１）や工程（ａ２）の分析結果を以下の表１の判断基準にあてはめることによって、まず、以下のＤｅｇｒｅｅIII、II、Ｉ、０の４段階に分類し、Ｄｅｇｒｅｅ０からIIIへと、Ｄｅｇｒｅｅが高くなるにつれて、そのＡ型インフルエンザウイルスは、シアリルα２，６ガラクトース結合を末端に持つ糖鎖（例えば、α２，６シアリルパラグロボシド）への結合活性が高く、ヒトへの感染力が強くなる。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
また、α２，６シアリルパラグロボシド（α２，６ＳＰＧ）は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１’Ｃｅｒからなる糖鎖であり、ヒト細胞表面に存在してウイルスの受容体として機能を発揮する。そのため、α２，６ＳＰＧへの結合活性が高いウイルス株は、ヒトへの感染力が高いウイルス株ということができる。ここで、本発明におけるヒトへの感染力には、トリやブタなどのヒト以外の動物（特にトリ）からヒトへの感染力や、ヒトからヒトへの感染力を含む。なお、α２，６ＳＰＧは、例えば、ヒト胎便（FEBS Lett. 133, 197-200 (1981)）から常法にしたがって調製することができる。
【００２７】
前述のＤｅｇｒｅｅIIIに分類されるＡ型インフルエンザ株は、Ｄｅｇｒｅｅ０、ＩやIIに分類されるＡ型インフルエンザ株に比べて、α２，６ＳＰＧへの結合活性が特に高いため、α２，６ＳＰＧへの結合活性の高いＡ型インフルエンザウイルス株やヒトへの感染力の強いＡ型インフルエンザウイルスと判定することができる。なお、後述の実施例中の図１Ａ〜Ｃにおけるウイルスプラスミドの実験結果では、α２，６ＳＰＧに対する結合活性に対して、ＨＡタンパク質の１６９位のグリコシル化の有無が、ＨＡタンパク質の１５８位のグリコシル化の有無と同様の影響を与えることが示唆されている。Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質において、１６９位がグリコシル化されていないものは現在確認されておらず、１６９位におけるグリコシル化は、ウイルスが生態系で存続するために必須である可能性もあるが、将来的に、ＨＡタンパク質の１６９位がグリコシル化されていないウイルスが変異等により発生する可能性がある。したがって、本発明の同定方法には、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位のグリコシル化の有無を分析する工程（ａ）に代えて、又は、工程（ａ１）と共に、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１６９位のグリコシル化の有無を分析する工程（ａ１’）を有する同定方法も含まれる。
【００２８】
本発明の同定方法には、本発明の同定方法を損なわない限り、前述の工程（ａ１）や（ａ２）の他に、さらにＡ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の２２７位アスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）であるかを分析する工程（ａ３）を含んでいてもよい。Ａ型ヘマグルチニンタンパク質の２２７位がＡｓｎ又はＡｒｇである場合は、該部位がＡｓｎ又はＡｒｇ以外のアミノ酸残基である場合に比べて、α２，６シアリルパラグロボシドへの結合活性がより高いＡ型インフルエンザウイルス株であると同定することができる。工程（ａ３）は、前述の工程（ａ１）と同様の方法、すなわち、サザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等を利用してＡ型インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子の配列を決定するなどして、遂行することができる。
【００２９】
本発明のＡ型インフルエンザウイルスに対するヒト感染防除剤（以下、「本発明のヒト感染防除剤」ともいう。）としては、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の１５８位のグリコシル化活性組成物を含有するヒト感染防除剤である限り特に制限されず、これらグリコシル化活性組成物は、ヒトの他、トリ、ブタ等に投与することができる。
【００３０】
上記グリコシル化活性組成物としては、Ａ型インフルエンザウイルス（好ましくはＨ５Ｎ１型インフルエンザウイルス）のヘマグルチニンタンパク質の１５８位をグリコシル化する活性を有する化合物を含有する組成物、例えば、糖転移酵素を含有する組成物、グリコシル化促進剤などを例示することができ、中でも、シアル酸転移酵素等を好ましく例示することができる。
【００３１】
その他、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の２２７位のアミノ酸残基をＡｓｎ又はＡｒｇ以外のアミノ酸残基に置換しうる物質もヒト感染防除剤として用いることができる。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子に相補的な配列を有し、かつ、ＨＡタンパク質の２２７位のアミノ酸残基に対応するコドンがＡＡＴ及びＡＡＣのいずれでもない核酸配列などの、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質をコードする遺伝子を組み換える活性の有する物質を挙げることができる。
【００３２】
本発明のヒト感染防除剤として、そのヒト感染防除効果を損なわない限り、グリコシル化活性組成物の１種又は２種以上の組成物を用いてもよく、これら組成物には、それぞれ薬学的に許容される通常の担体、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、生理的食塩水等の水溶性溶剤、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、メチルパラベン等の保存剤、ベンジルアルコール等の局麻剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。また、本発明のヒト感染防除剤以外にも、Ａ型インフルエンザウイルスの感染を防除する効果を有する成分をさらに含有させて用いることもできる。
【００３３】
本発明のヒト感染防除剤の投与量や投与方法は、用いる化合物Ａや化合物Ｂや化合物Ｃの性質や、投与対象に応じて適宜選択することができる。本発明のヒト感染防除剤の投与対象としては、トリやブタなどのヒト以外の動物（好ましくはトリ）であってもよいし、ヒトであってもよい。すなわち、ヒト以外の動物に本発明のヒト感染防除剤を投与することによって、Ａ型インフルエンザウイルスのヒトへの感染を防除してもよいし、本発明のヒト感染防除剤をヒトに投与することによって、ヒトへの感染を防除してもよい。
【００３４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
［受容体基質の調製］
二種類のシアリルパラグロボシド（ＳＰＧ）、すなわち、トリ型受容体α２，３ＳＰＧ及びヒト型受容体α２，６ＳＰＧを受容体基質として用いた。α２，３ＳＰＧ及びα２，６ＳＰＧはそれぞれ、ヒト胎盤（Lipids 23, 192-198 (1988)）及びヒト胎盤（FEBS Lett. 133, 197-200 (1981)）から常法にしたがって調製した。
【実施例２】
【００３６】
［受容体特異性アッセイ］
アジアのＷＨＯ協力実験施設（ホンコン大学）から入手した表２記載の５５株の野生型のＡ型ウイルスについて酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を利用したウイルス結合アッセイを行い、前述の受容体基質としてのＳＰＧに対するＨ５Ｎ１亜型ウイルスの結合特異性を決定した。
【００３７】
【表２】
2009034061.tif 000003
【００３８】
ＥＬＩＳＡを利用したウイルス結合アッセイは以下のような方法で行った。まず、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、５０ｐｍ／ｍｌの濃度の基質（α２，３ＳＰＧ及びα２，６ＳＰＧ）をメタノールで２倍段階希釈した。前述のプレートを熱風で乾燥した後、２重量％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ（Invitrogen社製）で室温下１時間ブロッキングした。このプレートをＰＢＳで５回洗浄した後、６４ＨＡ単位の濃度のウイルス懸濁液と共に３７℃で一晩インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳで５回洗浄した後、プレート上に残ったＳＰＧ及びウイルスを、４重量％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで室温下３０分間固定した。次いでＰＢＳで該プレートを５回洗浄したのち、抗Ｈ５Ｎ１ウサギ血清をプレートに添加し、室温で２時間インキュベーションした。プレートから血清を除去して、ＰＢＳでよく洗浄した後、このプレートをＨＲＰ共役タンパク質Ａ（ICN Pharmacueticals,Inc.製）と２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで１０回洗浄した後、０．０１重量％Ｈ２Ｏ２含有ＰＢＳでＯ−フェニレンジアミン（Sigma社製）と室温下１０分間インキュベートした。次いでこのプレートに１Ｎ ＨＣｌを添加して発色反応を停止させた。プレートのウェル中の溶液の吸光度を、ＭＴＰ−３２マイクロプレートリーダー（Corona Electric Co.,Ltd製）を用いて４９０ｎｍの波長で測定した。
【００３９】
トリ型受容体α２，３ＳＰＧ及びヒト型受容体α２，６ＳＰＧに対する各ウイルスの結合活性を相対比（％）で表わした結果を表２に示す。ヒト単離体を含むほとんどの単離体がトリ型受容体を選択的に認識したが、ヒト型受容体に選択的に結合したのは５５株のうち１２．７％（７株）であった（表２）。これらウイルスを結合特異性により３つのグループ（I〜III）に分類することができた。グループＩ（ｎ＝２４）はトリ型受容体に選択的に結合し、グループIII（ｎ＝７）はヒト型受容体に選択的に結合し、グループII（ｎ＝２４）はどちらの型にも結合した。
【実施例３】
【００４０】
［配列解析］
次いで、実施例２で用いた５５株のＡ型ウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）配列及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列の分析を試みた。配列の決定は以下の方法で行った。
メーカーの取扱説明に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen社製）を用い、各ウイルスからウイルスＲＮＡを抽出した。ウイルスから抽出したウイルスＲＮＡからの逆転写反応は、ウイルスＲＮＡの３’末端の相補配列であるＵ１２プライマー及び逆転写酵素（SuperScript III；Invitrogen社製）を用い、メーカーの取扱説明に従って行った。この逆転写反応によって得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、ＨＡ遺伝子及びＮＡ遺伝子の配列を増幅した。ＨＡ遺伝子の増幅には、５ＢｍＨＡフォワードプライマー（配列番号１：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG）及び３ＢｍＨＡリバースプライマー（配列番号２：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT）を用い、ＮＡ遺伝子の増幅には、５ＢｍＮＡフォワードプライマー（配列番号５：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT）及び３ＢｍＮＡリバースプライマー（配列番号６：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT）を用いた。このようにしてクローニングされたＨＡ遺伝子やＮＡ遺伝子の配列を決定した。これらの遺伝子配列の決定は、ホンコン大学医学部微生物学科で常法にしたがって行った。
【００４１】
配列分析の結果、これらＡ型ウイルスグループ間でグリコシル化モチーフ及び受容体結合部位のアミノ酸に明確な違いがあった。１５８〜１６０位のグリコシル化モチーフ（Ａｓｎ‐Ｘ‐Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）はグループＩの全ての株が共有していたが、グループII及びIIIではそうではなかった。受容体結合ポケットから成る２２０ループの配列は、グループI及びIIのＨＡのほとんどで２２５〜２２９位がＧＱＳＧＲであったが、一方で２２７位のＳｅｒはグループIIIでＡｓｎ又はＡｒｇに変わっていた。さらに、グループＩ及びIIのウイルスは、ＮＡ幹部に２０アミノ酸残基の欠失があった（J. Virol. 79, 9926-9932 (2005)、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 101, 8156-8161 (2004)）が、グループIIIのウイルスにはそれがなかった（表２）。
【実施例４】
【００４２】
［再集合体ウイルスプラスミドの作製］
実施例３の実験結果からは、α２，３ＳＰＧやα２，６ＳＰＧへの結合活性の相違が、ＨＡやＮＡの配列以外の要因によるものである可能性も否定できない。そこで、ＨＡやＮＡの配列の違いが、α２，３ＳＰＧやα２，６ＳＰＧへの結合活性の変化に実際に影響を与えているか否かを調べるために、まず再集合体ウイルスプラスミドを作製した。
【００４３】
Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／２１２／０３（Ａ／ＨＫ２１２）、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／２０／０３（Ａ／ＶＮＭ２０）、Ａ／Ｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１３３／０４（Ａ／ＶＮＭ１３３）、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ａ／ＰＲ８）、Ａ／ＧＳ／Ｓｈａｎｔｏｕ／２０８６／０６（Ａ／ＳＴ２０８６）、Ａ／Ｃｋ／Ｙｕｎｎａｎ／１１５／０４（Ａ／ＹＮ１１５）の６株の野生型のＡ型ウイルスを、アジアのＷＨＯ協力実験施設（ホンコン大学）から入手した。動物からの分離株は、孵化鶏卵で培養し、１代継代の後に集菌した尿膜腔液を−８０℃で冷凍保存し、本実験に用いた。ヒトからの分離株は、ＭＤＣＫ細胞において培養した。これらＭＤＣＫ細胞は、５％新生仔ウシ血清（Sigma社製）及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）を添加した最小必須培地に、３４．５℃及び５％ＣＯ２条件下に維持した。これらの実験は全て、ホンコン大学医学部微生物学科のＢＬ３＋の施設で行った。
【００４４】
培養して得られた前述の６株の野生型のＡ型ウイルス（Ａ／ＨＫ２１２、Ａ／ＶＮＭ２０、Ａ／ＶＮＭ１３３、Ａ／ＹＮ１１５、Ａ／ＳＴ２０８６及びＡ／ＰＲ８）を用いて以下のようにプラスミド構築を行った。
ＲＮＡ抽出キット（ＱｉＡａｍｐ；Ｑｉａｇｅｎ社製）をメーカーの取扱説明に従って利用することにより、これらウイルスに由来するＨＡ ｃＤＮＡ及びＮＡ ｃＤＮＡを逆転写ＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ断片をｐＨＷ２０００ベクターの二箇所のＢｓｍＢＩ部位へとサブクローンした（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6108-6113 (2000)）。また、表３に記載されたようなＨＡへの点突然変異の導入は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Stratagene社製）及びＨ５型ウイルスのＨＡに特異的なプライマーセットをメーカーの取扱説明書に従って用いることにより行った。
【００４５】
【表３】
2009034061.tif 000004
【００４６】
なお、表３の遺伝子名の欄における略称の表示方法について説明すると、例えば、「ＨＡ（Ａ１６０Ｔ）」は、ＨＡのアミノ酸配列の１６０位のアラニン（Ａ）残基がトレオニン（Ｔ）残基に変異したＨＡ遺伝子の略称であり、また、「ＨＫ２１２ＨＡ」は、ＨＫ２１２株のＨＡの略称である。
【００４７】
このようにして得られたＨＡ遺伝子を含むプラスミドやＮＡ遺伝子を含むプラスミドなどの８つのプラスミドのreverse genetics system（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6108-6113 (2000)）を用いて、再集合体ウイルスプラスミドを作製した。すなわち、ＨＫ２１２株やＶＮＭ１３３株等の内部遺伝子を中心として用い、そこに適切なＨＡ遺伝子及びＮＡ遺伝子、又はそれらの変異遺伝子を発現させた。本実験のために作製されたウイルスプラスミドを表４に示し、それらのウイルスプラスミドが有するＨＡ遺伝子やＮＡ遺伝子に関する情報を表３に示す。
【００４８】
【表４】
2009034061.tif 000005
【００４９】
ウイルスプラスミドは全て、ＭＤＣＫ細胞において１代のみ継代培養し、その後−８０℃で凍結したものを本実験で用いた。なお、本実験に用いるウイルスプラスミドについては、そのＨＡ遺伝子やＮＡ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲによって増幅して配列を決定し、それらの遺伝子の配列が目的の配列であることを確認した。
【実施例５】
【００５０】
［再集合体ウイルスプラスミドについての受容体結合アッセイ］
実施例４で作製した再集合体ウイルスプラスミドについて、後述の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を利用したウイルス結合アッセイ、及び、実施例２と同様の酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を利用したウイルス結合アッセイを行い、実施例１記載のトリ型受容体α２，３ＳＰＧ及びヒト型受容体α２，６ＳＰＧに対するＨ５Ｎ１型ウイルスプラスミドの結合活性や結合特異性について調べた。
【００５１】
ＴＬＣを利用したウイルス結合アッセイは以下のような方法で行った。
基質（α２，３ＳＰＧ及びα２，６ＳＰＧ、各０．２５ｎｍ）をシリカプラスチックＴＬＣ上にスポットし、次いで、クロロホルム、メタノール及び１２ｍＭのＭｇＣｌ２を含む水からなる混合液（クロロホルム：メタノール：１２ｍＭのＭｇＣｌ２を含む水の体積比＝５：４：１）を展開した。ＴＬＣプレートは、１重量％のポリビニルピロリドン及び１重量％の卵アルブミンを含むＰＢＳを用いて、１時間室温でブロッキングした。ウイルスプラスミド（２５６ＨＡ単位／ｍｌ）の受容体への結合は、３７℃でのインキュベーションにより一晩かけて行い、その後、４重量％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで、プレート上に残ったＳＰＧ及びウイルスを、室温下３０分間固定した。次いでＰＢＳで該プレートを５回洗浄したのち、抗Ｈ５Ｎ１ウサギ血清をプレートに添加し、室温で２時間インキュベーションした。プレートから血清を除去して、ＰＢＳでよく洗浄した後、このプレートをＨＲＰ共役タンパク質Ａ（ICN Pharmacueticals,Inc.製）と２時間インキュベートした。最後に、プレートに基質溶液Ｉ［１００ｍＭクエン酸塩緩衝剤（ｐＨ６．０）、６０ｍＭ Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐ｐ‐フェニレンジアミン二塩酸塩、１００ｍＭ ４‐クロロ‐１‐ナフトール、及び３重量％Ｈ２Ｏ２水溶液（体積比で５：１：１：０．００５）］を添加して室温で１５分間放置し、免疫反応を示したＳＰＧ（ウイルスプラスミドが結合したＳＰＧ）を可視化した。
【００５２】
このＴＬＣを利用したウイルス結合アッセイの結果を図１の各グラフ内の左上のパネルに示した。また、これら各ウイルスプラスミドに関して行った、前述のＥＬＩＳＡを利用したウイルス結合アッセイの結果を図１の折れ線グラフに示す。ＥＬＩＳＡを利用したアッセイは、各ウイルスプラスミドについて３回繰り返し、得られた結果の「平均値±標準偏差」をグラフに表している。
【００５３】
図１Ａ〜Ｃは、ＨＡの１５８位や１６９位のグリコシル化が、ＨＫ２１２ＨＡ（図１Ａ）、ＶＮＭ１３３ＨＡ（図１Ｂ）及びＶＮＭ２０ＨＡ（図１Ｃ）を有するウイルスプラスミドの、α２，３ＳＰＧやα２，６ＳＰＧに対する結合活性や結合特異性に与える影響を示したものである。
【００５４】
図１Ａから分かるように、ＨＫ２１２ウイルスプラスミド（Ａ／ＨＫ２１２ＨＡ）の受容体結合特異性はその野生型ウイルスと同様であり、ヒト型受容体α２，６シアル酸に選択的に結合し、トリ型受容体α２，３シアル酸に中程度結合した。一方、ＨＡ１５８位のＡｓｎにおけるグリコシル化を可能にする、ＨＡ１６０位のＡｌａからＴｈｒへの置換を導入した変異体ウイルスプラスミド（Ａ／ＨＫ２１２ＨＡ（Ａ１６０Ｔ））は、α２，３シアル酸及びα２，６シアル酸の双方に対する結合活性が低下していた。また、１６９位におけるグリコシル化を不能にする、ＨＡ１６９位のＡｓｎからＳｅｒへの置換を導入した変異体ウイルスプラスミド（Ａ／ＨＫ２１２ＨＡ（Ｎ１６９Ｓ）やＡ／ＨＫ２１２ＨＡ（Ａ１６０Ｔ，Ｎ１６９Ｓ））は、ＨＫ２１２ウイルスプラスミドと類似の結合特異性を有していた。
【００５５】
また、図１Ｂには、ＶＮＭ１３３ウイルスプラスミドのウイルス結合アッセイの結果を示した。ＨＫ２１２ウイルスプラスミドとは異なり、ＶＮＭ１３３ウイルスプラスミドのＨＡは１５８位がグリコシル化されており、この点で、α２，３シアル酸にのみ結合する最新のヒトＨ５Ｎ１分離株と共通している（図１Ｂ）。一方、ＨＡ１５８位のＡｓｎにおけるグリコシル化を不能にする、ＨＡ１６０位のＴｈｒからＡｌａへの置換を導入した変異体ウイルスプラスミド（Ａ／ＶＮＭ１３３ＨＡ（Ｔ１６０Ａ））は、α２，３シアル酸だけでなく、α２，６シアル酸にもよく結合するようになった。また、ＨＡ１６９位のＡｓｎにおけるグリコシル化を不能にするために、ＨＡ１６９位のＡｓｎをＳｅｒへと置換した変異体ウイルスプラスミド（Ａ／ＶＮＭ１３３ＨＡ（Ｎ１６９Ｓ）やＡ／ＶＮＭ１３３ＨＡ（Ｔ１６０Ａ，Ｎ１６９Ｓ））もまた、α２，６シアル酸及びα２，３シアル酸の双方によく結合した。
【００５６】
さらに、図１Ｃには、ＶＮＭ２０ウイルスプラスミドのウイルス結合アッセイの結果を示した。ＶＮＭ２０ウイルスプラスミドについては、１５８位のＡｓｎにおけるグリコシル化を可能とする、ＨＡ上の１６０位のＡｌａをＴｈｒへと置換した変異体ウイルスプラスミド（Ａ／ＶＮＭ２０ＨＡ（Ａ１６０Ｔ））は、特にα２，６シアル酸受容体に対する受容体結合活性が減少した（図１Ｃ）。また、ＨＡ１６９位のＡｓｎにおけるグリコシル化を不能にするために、ＨＡ１６９位のＡｓｎがＳｅｒへと置換された変異体ウイルスプラスミド（Ａ／ＶＮＭ２０ＨＡ（Ｎ１６９Ｓ）やＡ／ＶＮＭ２０ＨＡ（Ｔ１６０Ａ，Ｎ１６９Ｓ））もまた、α２，６シアル酸及びα２，３シアル酸の双方によく結合した。
【００５７】
図１Ａ〜Ｃを併せ考慮すると、ＨＡ１５８位及び１６９位のＡｓｎにおけるグリコシル化を可能にすると、α２，６シアル酸に対する結合活性が低下し、逆にＨＡ１５８位又は１６９位におけるグリコシル化を不能にすると、α２，６シアル酸に対する結合活性が上昇することが分かった。
なお、宿主細胞の受容体のシアロ糖鎖は、ＨＡの１５８位及び１６９位が共にグリコシル化されたグループＩのウイルスプラスミドの一次受容体結合部位（一次ＲＢＳ）（Nature 289, 366-373 (1981)）に接触することはできないと考えられる（図２）が、シアル酸α２，３Ｇａｌ結合複合糖質にのみ結合する２次ＲＢＳを通して感染宿主細胞に結合可能であると考えられる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 324-328 (1992)）。
【００５８】
図１Ｄ及びＥは、ＨＡの２２７位のグリコシル化が、ＨＫ２１２ＨＡ、ＶＮＭ１３３ＨＡ及びＶＮＭ２０ＨＡ等を有するウイルスプラスミドの結合特異性に与える影響を示したものである。
図１Ｄは、ＨＡの２２７位がＳｅｒであるウイルスプラスミド［Ａ／ＨＫ２１２ＨＡ（Ｎ２２７Ｓ）ウイルスプラスミド、Ａ／ＶＮＭ１３３ＨＡ（Ｔ１６０Ａ）ウイルスプラスミド、Ａ／ＶＮＭ２０ＨＡウイルスプラスミド]と、それらのウイルスプラスミドにおいてＨＡの２２７位のＳｅｒがＡｓｎであるウイルスプラスミド[Ａ／ＨＫ２１２ＨＡウイルスプラスミド、Ａ／ＶＮＭ１３３ＨＡ（Ｔ１６０Ａ、Ｓ２２７Ｎ）ウイルスプラスミド、Ａ／ＶＮＭ２０ＨＡ（Ｓ２２７Ｎ）ウイルスプラスミド］についての結果を示し、図１Ｅは、ＨＡの２２７位がＳｅｒであるウイルスプラスミド［Ａ／ＨＫ２１２ＨＡ（Ａ１６０Ｔ、Ｎ２２７Ｓ）ウイルスプラスミド、Ａ／ＶＮＭ１３３ＨＡウイルスプラスミド、Ａ／ＶＮＭ２０ＨＡ（Ａ１６０Ｔ）ウイルスプラスミド］と、それらのウイルスプラスミドにおいてＨＡの２２７位のＳｅｒがＡｓｎであるウイルスプラスミド［Ａ／ＨＫ２１２ＨＡ（Ａ１６０Ｔ）ウイルスプラスミド、Ａ／ＶＮＭ１３３ＨＡ（Ｓ２２７Ｎ）ウイルスプラスミド、Ａ／ＶＮＭ２０ＨＡ（Ａ１６０Ｔ、Ｓ２２７Ｎ）ウイルスプラスミド］についての結果を示す。図１Ｄ及びＥの結果から、ＨＡ２２７位のアミノ酸をＡｓｎへと置換すると、α２，６シアル酸に対する結合活性が若干ではあるが上昇することが示唆された。
【００５９】
本願明細書の従来技術でも述べたように、ＨＡ及びＮＡ活性の間のバランスがインフルエンザウイルス感染において重要であることは指摘されてきた。そこで、ＮＡの幹部の長さが受容体結合特異性に与える影響に注目した。図１Ｆ及びＧは、ＮＡ幹部の長さが結合特異性に与える影響を調べる実験の結果を示したものである。図１Ｆの上段及び図１Ｇの下段のパネルは、全長の幹部（stalk）を持つＮＡを有するウイルスプラスミド（Full）を表し、図１Ｆの下段及び図１Ｇの上段のパネルはＮＡ幹部に欠失を有するウイルスプラスミド（short）を表す。
図１Ｆ及びＧに示される通り、ＨＫ２１２ウイルスプラスミドのα２，３シアル酸に対する結合活性は、ＨＫ２１２のＮＡを、ＶＮＭ１３３、ＶＮＭ２０又はＹＮ１１５［A/Chicken/Yunnan/115/04 (H5N1)］等の幹部に欠失を有するＮＡと置き換えると高まったが、ＨＫ２１２のＮＡをＰＲ８ＮＡ［A/PR/8/34 (H1N1) のＮＡ］又はＳＴ２０８６ＮＡ［A/goose/Shantou/2086/05 (H5N1)］等の幹部に欠失のない通常のＮＡと置き換えても変化しなかった（図１Ｆ）。一方で、α２，３シアル酸と選択的に結合するＶＮＭ１３３ウイルスプラスミドは、幹部に欠失のないＨＫ２１２、ＰＲ８又はＳＴ２０８６のＮＡが導入されるとその活性を失った。対照的に、幹部に欠失を有するＮＡ（ＶＮＭ２０ＮＡやＹＮ１１５ＮＡ）を導入した場合は、ＶＮＭ１３３ウイルスプラスミドのα２，３シアル酸への選択的結合活性に変化はなかった（図１Ｇ）。
これらのデータの結果から、幹部に欠失のないＮＡ（全長の幹部を有するＮＡ）は、ＨＡの一次ＲＢＳに接触している受容体のシアル酸−Ｇａｌ結合、特にα２，３シアル酸結合を切断することができ、その結果としてＨＡの結合活性が明らかに低下するのに対し、幹部に欠失を有するＮＡは、ＨＡの一次ＲＢＳに接触している受容体のα２，３シアル酸結合部分に到達し得ず、その結果、α２，３シアル酸結合を切断することができず、結合活性の変化をもたらさなかったと考えられた。すなわち、宿主細胞膜から出芽した子孫ウイルスにおける、幹部に欠失を持つＮＡは、ＨＡの一次ＲＢＳと相互作用する宿主細胞膜のシアロ糖鎖末端のシアル酸を切断できなかったであろうと考えられる。
【００６０】
また、図１Ｆで用いられているウイルスプラスミドはいずれも、ＨＡの１５８位がグリコシル化されておらず、図１Ｇで用いられているウイルスプラスミドはいずれも、１５８位（及び１６９位）がグリコシル化されている。図１Ｆと図１Ｇの結果を併せ考慮すると、ＮＡが全長の幹部を有しており（Full）、かつ、ＨＡの１５８位がグリコシル化されていないウイルスプラスミドでは、α２，６シアル酸に対する結合活性が高まっていることが分かった。
【実施例６】
【００６１】
［細胞感染実験］
Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１株）の結合特異性とその複製との関連性を調査するため、以下のような細胞感染実験を行った。
【００６２】
まず、前述のウイルスプラスミドを感染させる細胞として、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、及び、ヒト肺癌細胞に由来するＡ５４９細胞を用意した。ＭＤＣＫ細胞とＡ５４９細胞中におけるシアル酸α２，６Ｇａｌ結合グリカンやシアル酸α２，３Ｇａｌ結合グリカンの有無を調べるために、両細胞のタンパク質を常法に従って単離し、それらのタンパク質と分子量マーカータンパク質（ＭＫ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで１レーンあたり１０μｇずつ電気泳動して、それをＰＶＤＦ膜へと転写した。このＰＤＶＦ膜について、ＳＮＡレクチン（α２，６位のシアル酸に結合する）染色、ＭＡＡレクチン（α２，３位のシアル酸に結合する）染色又はＣＢＢ染色を行った結果をそれぞれ図３に示す。図３の結果から、Ａ５４９細胞におけるシアル酸α２，６Ｇａｌグリカンの含有量は、ＭＤＣＫ細胞における含有量の約３倍であり、ＭＤＣＫ細胞におけるシアル酸α２，３Ｇａｌグリカンの含有量は、Ａ５４９細胞における含有量の約５倍であることが分かった。すなわち、ＭＤＣＫ細胞は、シアル酸α２，６Ｇａｌ結合グリカンよりもシアル酸α２，３Ｇａｌ結合グリカンを優先的に発現し、トリウイルスの複製に有利であるのに対し、Ａ５４９細胞は、シアル酸α２，３Ｇａｌ結合グリカンよりもシアル酸α２，６Ｇａｌ結合グリカンを発現し、ヒトウイルスの複製に有利である。
【００６３】
前述のＭＤＣＫ細胞とＡ５４９細胞に、表４記載の２１種類のウイルスプラスミドをそれぞれ接触させた。これらの細胞が、ウイルスプラスミドに感染しているかを調べるために、以下の免疫組織化学的アッセイを用いた。
ウイルスプラスミドを接触させた後１２時間経過した細胞を、４重量％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで、プレート上に室温下１０分間固定した。プレート上に固定した細胞をＰＢＳで５回洗浄した後、ウイルスプラスミドの核タンパク質に対するモノクローナル抗体（４Ｅ６）と、３７℃で１時間インキュベートした。プレートから抗体溶液を除去して十分洗浄した後、プレート上の細胞を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役抗マウスＩｇＧ＋Ｍ抗体（ICN Pharmaceuticals,Inc.製）と共に１時間インキュベートした。その後、前述の基質溶液Ｉを用いて感染細胞を可視化し、顕微鏡下で感染細胞数を測定した。その結果を表４の“Infected cell number”の項目に示す。
【００６４】
また、ウイルスプラスミドの複製については、プラークアッセイにより調べた。プラークアッセイは以下のような方法で行った。
まず、ＭＤＣＫ細胞又はＡ５４９細胞に、表４記載の２１種類の希釈ウイルスプラスミドをそれぞれ３７℃で１時間接触させた。これらの細胞をＰＢＳで３時間洗浄してこれらの細胞の周囲に付着したウイルスプラスミドを除去した後、この細胞を、１重量％アガロース及び２μｇ／ｍｌアセチル化トリプシンを含むＭＥＭ培地上に播種した。ウイルスプラスミドの接触から７２時間後に、細胞を０．５重量％アミドブラック溶液（エタノール：酢酸：水の体積比＝４５：１０：４５）で染色し、最後に、プラークの大きさ及び数を測定した。その結果を表４の“Plaque size”の項目に示す。
なお、表４中のＲａｔｅ（％）は、ＭＤＣＫ細胞における感染細胞数又はプラークサイズ（ｍｍ）を、Ａ５４９細胞のそれに対して１００分率で表した値である。
【００６５】
前述の免疫組織化学的アッセイやプラークアッセイの結果を踏まえ、ヒト細胞に対する適応の程度に応じて、２３種類のウイルスプラスミドを４段階に分類した（表４）。
「Ｄｅｇｒｅｅ０」のグループのウイルスプラスミドは、ＭＤＣＫ細胞（α２，３シアル酸＞α２，６シアル酸）及びＡ５４９細胞（α２，６シアル酸＞α２，３シアル酸）の両方に関して感染力が低い（Infected cell numberが少ない）だけでなく、ＭＤＣＫ細胞における複製力も弱く（Plaque sizeが小さく）、Ａ５４９細胞では複製を検出できなかった。なお、「Ｄｅｇｒｅｅ０」のウイルスプラスミドは、１５８位（及び１６９位）がグリコシル化されたＨＡ、及び、幹部に欠失のない全長のＮＡを有していた。
【００６６】
「ＤｅｇｒｅｅＩ」のグループのウイルスプラスミドは、感染力については「Ｄｅｇｒｅｅ０」のウイルスプラスミドと同様であったが、複製力に関しては、弱いながらも、ＭＤＣＫ細胞においてだけでなく、Ａ５４９細胞での複製もみられた。なお、「ＤｅｇｒｅｅＩ」のウイルスプラスミドは、１５８位（及び１６９位）でグリコシル化されたＨＡ、及び、幹部に欠失を持つＮＡを有していた。
【００６７】
「ＤｅｇｒｅｅII」のグループのウイルスプラスミドは、「Ｄｅｇｒｅｅ０」や「ＤｅｇｒｅｅＩ」のウイルスプラスミドに比べて、より高い感染力及び複製力を示したが、感染力についてはＭＤＣＫ細胞よりＡ５４９細胞で低く、複製力についてはＭＤＣＫ細胞よりＡ５４９細胞で顕著に劣っていた。なお、「ＤｅｇｒｅｅII」のウイルスプラスミドは、ＨＡ１６９位ではグリコシル化されているものの、ＨＡ１５８位はグリコシル化されておらず、また、幹部に欠失を持つＮＡを有していた。
【００６８】
「ＤｅｇｒｅｅIII」のグループのウイルスプラスミドは、「Ｄｅｇｒｅｅ０」や「ＤｅｇｒｅｅＩ」のウイルスプラスミドに比べて、高い感染力及び複製力を示したが、感染力についてはＡ５４９細胞よりＭＤＣＫ細胞で低く、複製力については、Ａ５４９細胞よりＭＤＣＫ細胞で顕著に劣っていた。なお、「ＤｅｇｒｅｅIII」のウイルスプラスミドは、ＨＡ１６９位ではグリコシル化されているものの、ＨＡ１５８位はグリコシル化されておらず、また、幹部に欠失のないＮＡを有していた。
【００６９】
以上の結果から、ＨＡ１５８位がグリコシル化されていないことや、ＮＡの幹部が欠失を有していないことが、シアル酸α２，６Ｇａｌ−結合グリカンを有する細胞における効率的複製を促進する二つの要因であることが示された。これらの両要因を兼ね備えたＤｅｇｒｅｅIIIのウイルスプラスミドは、ヒトからヒトへ感染する可能性が高く、その流行は大きな脅威となると予想される。
【実施例７】
【００７０】
［ウイルスデータベースにおけるウイルスの解析］
近年単離されたインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスのＨＡ１５８位におけるグリコシル化の有無並びにＮＡ幹部における欠失の有無を調べるため、ＮＣＢＩのホームページ上の「Influenza Virus Resource」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/select.cgi?go=1）のデータベース及びFluwikisのホームページ上のデータベース（http://www.fluwikie.com/pmwiki.php?n=Main.HomePage）からダウンロードしたＨ５Ｎ１Ａ型インフルエンザウイルスにおける、１２４０個のＨＡ配列と８６１個のＮＡ配列について分析を行った。その結果を図４に示す。ＨＡ１５８位がグリコシル化されたウイルスの比率（図４Ａ）、及び、欠失した幹部を持つＮＡを有するウイルスの比率（図４Ｂ）は２０００年以来徐々に増加傾向を示しているが、ＨＡ１５８位がグリコシル化されたウイルスについては２００５年以降減少傾向が見られた。
【００７１】
また、同様のデータベースを用いて、ＨＡ１５８〜１６０位のアミノ酸配列を解析した結果を図４Ｃに示す。図４Ｃに示されているように、ＨＡ１５８〜１６０位のアミノ酸配列には２０タイプものアミノ酸配列が存在し、Ｈ５Ｎ１Ａ型インフルエンザウイルスがこの部分のアミノ酸配列について急速に進化していることが分かる。非グリコシル化モチーフの主要なタイプはＮＳＡ、ＮＮＡ、ＤＮＡ及びＮＤＡであり、グリコシル化モチーフの主要なタイプはＮＳＴ、ＮＮＴ及びＮＳＳである。
【００７２】
また、同様のデータベースを用いてＨＡ１５８〜１６０位のアミノ酸配列を、ウイルスの単離源（ヒト、ガチョウ、ニワトリ）ごとに分類した結果を図４Ｄに示す。図４Ｄに示されているように、グリコシル化モチーフで主要なのは、ＮＳＴ（全単離株の３１．１％）及びＮＮＴ（全単離株の２７．４％）であり、非グリコシル化モチーフで主要なのは、ＮＳＡ（全単離株の１４．０％）であった。
【００７３】
また、ヒト単離株におけるＮＳＴグリコシル化モチーフの比率（１０９株のヒト単離株のうちの５９．５％）は、ニワトリ単離株における同比率（３９３株のニワトリ単離株のうちの５１．８％）と近いが、ガチョウ単離株における同比率は（３７１のガチョウ単離体中）１６．１％に過ぎなかった（図４Ｄ）。このことは、ヒトへの感染は、ガチョウからよりもニワトリから生じていることが多いことを反映していると考えられる。さらに、８３４株のＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスを、ヒト細胞への適応の度合に応じた前述の分類（Ｄｅｇｒｅｅ０〜III）にしたがって分類した場合の、分類ごとの株数の推移を図４Ｅに示す。図４Ｅに示されているように、ヒトへの感染に最も適したＤｅｇｒｅｅIIIは２００年以降、減少傾向が見られるが、ＤｅｇｒｅｅIIIに次いでヒトへの感染に適したＤｅｇｒｅｅIIのウイルスは２０００年以降、増加傾向が見られた。
【００７４】
また、前述の両データベース上の全てのＨ５Ｎ１型インフルエンザウイルスについて、前述の分類（Ｄｅｇｒｅｅ０〜III）にしたがって分類したところ、その９０％以上が、ＤｅｇｒｅｅＩ又はIIに属することが判明した。
欠失したＮＡを有してはいるものの、ＨＡ１５８位のグリコシル化を欠いており、それゆえヒト受容体（α２，６シアル酸）に結合する適応性を獲得したＤｅｇｒｅｅIIのウイルスは、２００６年以来、特にアフリカ、ヨーロッパ及び中東地域で劇的に増加している（図４Ｆ）。したがって、ＤｅｇｒｅｅIIのウイルスの受容体結合特異性の表現型変異の調査が、ウイルスのヒトからヒトへの感染を予想するために特に重要であろうと考えられる。
【００７５】
また、ヒトの下気道の上皮細胞において、シアル酸α２，３Ｇａｌ−結合糖鎖が発現することが見出されているものの（非特許文献８、Nature 440, 435-436 (2006)、Science 312, 399 (2006)）、一般に、ヒトインフルエンザウイルスは、α２，６シアル酸受容体を通して上気道の上皮細胞に感染するとされている。こうした考えは、１９１８年のＨ１Ｎ１型ウイルス（Science 303, 1838-1842 (2004)、Science 303, 1866-1870 (2004)）、１９５７年のＨ２Ｎ２型ウイルス及び１９６８年のＨ３Ｎ２型ウイルスのそれぞれの流行時の初期の単離株が、それらのＨＡがトリウイルスに由来するにもかかわらず、α２，６シアル酸を選択的に認識する（J. Virol. 74, 8502-8512 (2000)、Virus Res. 56, 169-176 (1998)）との発見により裏付けられている。しかし、本発明者らによって、ヒト単離株を含む近年のＨ５Ｎ１型ウイルスのほとんど（調査した単離株の約８７．５％）が依然としてα２，３シアル酸受容体に選択的に結合することが判明した。
【００７６】
ＤｅｇｒｅｅIIに分類されるヒト単離株は、二次ＲＢＳのα２，３シアル酸受容体に対する結合によってヒト細胞に感染する可能性が考えられた。ＷＨＯのウェブサイトによると、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザウイルスの患者の６０〜７０％が子供又は２０歳以下である。このことは、子供の気道が大人に比べて生理学的に短く、ビリオンが気道末端まで容易に到達することと関連していることも予想された。
実際、Ｈ５Ｎ１型ヒトインフルエンザウイルスは、α２，３シアル酸受容体を通して下気道のII型肺胞に感染する（Nature 440, 435-436 (2006)、Science 312, 399 (2006)）。このことは、Ｈ５Ｎ１型ウイルスのヒトからヒトへの感染が非効率的であることに寄与していると考えられる。仮に、Ｈ５Ｎ１型ウイルスがα２，６シアル酸受容体に容易に結合するヒト適応ウイルスへと変異すれば、上気道で複製し、くしゃみやせきによって他の宿主へと容易に伝播可能となり、その結果、このウイルスのヒトからヒトへの感染力は劇的に向上するだろう。２００５年以来、α２，３シアル酸及びα２，６シアル酸受容体の双方に結合するＤｅｇｒｅｅIIグループを含む、ヒトや家禽由来のＨ５Ｎ１型ウイルスが、アフリカ、ヨーロッパ及び中東地域で劇的に増加している（図４Ｆ）。したがって、ＤｅｇｒｅｅIIのウイルスの受容体結合特異性の表現型変異の研究が、ヒトからヒトへのウイルス感染を予測するために特に重要であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】各再集合体ウイルスについての結合アッセイの結果を示す図である。折れ線グラフは、ＥＬＩＳＡを利用したウイルス結合アッセイの結果示し、グラフ内の左上のパネルは、ＴＬＣを利用したウイルス結合アッセイの結果を示す。
【図２】A/Vietnam/1203/2004 (2FK0)の一次ＲＢＳにおける、ＨＡ上１５８位及び１６９位におけるグリコシル化及びシアル酸−ガラクトース結合リガンドの推定配置（Virology 189, 121-131 (1992)）を示す図である。中央で三角形を形成する点線は、ＨＡの三つのモノマー（ａ、ｂ及びｃ）を分ける。また、中央にて円を形成する点線は、ＨＡにおける一次ＲＢＳの三つのユニットを分ける。中央にて円を形成する点線の上部ユニットでは、１５８位Ａｓｎに結合した糖鎖が、隣接する別のＨＡモノマー上の１６９位Ａｓｎに結合した糖鎖と共にＨＡの一次ＲＢＳを覆い、その結果、ＨＡの一次ＲＢＳが、受容体のシアロ−糖残基に接触できなくなると考えられる。中央にて円を形成する点線の右下及び左下のユニットは、それぞれモノマーａの１６９位Ａｓｎ又は１５８位Ａｓｎのいずれかに糖鎖が結合しており、それゆえＨＡの一次ＲＢＳは受容体シアル化糖鎖に接触できると考えられる。
【図３】Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、及び、ヒト肺癌細胞に由来するＡ５４９細胞に、シアル酸α２，６Ｇａｌ結合グリカンやシアル酸α２，３Ｇａｌ結合グリカンがあるかどうかを調べるために行った、ＳＮＡレクチン（α２，６位のシアル酸に結合する）染色、ＭＡＡレクチン（α２，３位のシアル酸に結合する）染色及びＣＢＢ染色を行った結果を示す図である。
【図４】近年単離されたインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスのＨＡ１５８位及び１６９位におけるグリコシル化の有無並びにＮＡ幹部における欠失の有無を調べるため、ＮＣＢＩのホームページ及びFluwikisのホームページ上のデータベースからダウンロードしたＨ５Ｎ１Ａ型インフルエンザウイルスにおける、１２４０個のＨＡ配列と８６１個のＮＡ配列について分析を行った結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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