(57)【要約】【課題】インフルエンザ菌の外膜由来の新規な抗原性タンパク質を提供する。【解決手段】インフルエンザ菌の外膜タンパク質である、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される際の分子量が２６ｋＤａであるタンパク質を提供する。このようなタンパク質をコード化するＤＮＡ配列、さらにはこのタンパク質からなるワクチンやインフルエンザ菌による感染に対する被験者の免疫方法もまた提供される。本発明はまた、呼吸器感染症または中耳炎の予防または処置方法、さらにはインフルエンザ菌の検出方法、およびこのような方法に使用されるキットをも含むものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザ菌の外膜タンパク質である、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される際の分子量が２６ｋＤａであるタンパク質。
【請求項２】
図１に示されるアミノ酸配列、またはこれと実質的に相同性のある配列を有する、請求の範囲第１項に記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｎ−末端アミノ酸としての２４番目のアミノ酸から始まる図１に示されるアミノ酸配列、またはこれと実質的に相同性のある配列を有する、請求の範囲第１項に記載のタンパク質。
【請求項４】
図１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求の範囲第２項または第３項に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載のタンパク質の抗原性部分または領域であるタンパク質またはペプチド。
【請求項６】
請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載のタンパク質の抗原性部分または領域からなるタンパク質。
【請求項７】
融合タンパク質である、請求の範囲第６項に記載のタンパク質。
【請求項８】
請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項９】
ＤＮＡ配列である、請求の範囲第８項に記載の核酸配列。
【請求項１０】
図１に示される配列である、請求の範囲第９項に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１１】
請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載のタンパク質、および必要であれば一以上の担体および／またはアジュバントからなるワクチン配合物。
【請求項１２】
インフルエンザ菌に対するワクチンの調製における請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載のタンパク質の使用。
【請求項１３】
請求の範囲第１１項に記載のワクチンを被験者に投与することからなる、インフルエンザ菌による感染に対する被験者の免疫方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１１項に記載のワクチンを被験者に投与する段階からなる、呼吸器感染症または中耳炎の予防または処置方法。
【請求項１５】
インフルエンザ菌による感染の診断における請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載のタンパク質の使用。
【請求項１６】
請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載のタンパク質からなるインフルエンザ菌による感染の診断に使用されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の新規な抗原、これよりなるワクチンおよび治療や診断におけるこの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザ菌（Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）は、桿状のグラム陰性の好気性の従属栄養細菌である（非特許文献１）。また、インフルエンザ菌は、急性呼吸器感染症の病原体であり、慢性気管支炎や中耳炎の患者中にも検出される。
【非特許文献１】Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔ（ｅｄ），Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ  ５６３（１９８４）
【発明の開示】
【０００３】
我々は、ＮＴＨＩ由来の単一の２６ｋＤａの外膜タンパク質（ＯＭＰ２６と称する）を同定、単離し、さらに、驚くべきことに、このタンパク質は、免疫原として使用されると、ＮＴＨｉの同種及び異種株による感染に対して防御免疫反応を誘導できることを発見した。このタンパク質は、Ｐ５と同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を有するが、Ｐ５タンパク質とは明らかに異なることが分かった。
【０００４】
外膜タンパク質Ｐ５は、インフルエンザ菌株をサブタイプに分けるのに使用されるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の２本の低分子量バンドのうちの１本であり、２５〜２７ｋＤａの見かけ上の分子量を有する。このＰ５タンパク質は熱可変性（ｈｅａｔ−ｍｏｄｉｆｉａｂｌｅ）であることから、β−メルカプトエタノールの存在下で１００℃で３０分間加熱した後は３０ｋＤａの見かけ上の分子量を示す。近年、フィンブリンタンパク質と称する、ＮＴＨｉによって発現される他のタンパク質の特性が明らかにされ、前記Ｐ５と同様の分子量特性、熱可変性及び９２％の配列の相同性を有することが示された。タンパク質、ＯＭＰ２６は、Ｐ５またはフィンブリンタンパク質について説明したような配列の相同性または熱可変特性を示さない。
【０００５】
したがって、第一の概念によると、本発明は、インフルエンザ菌の外膜タンパク質である、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される際の分子量が２６ｋＤａであるタンパク質を提供するものである。このタンパク質を、ＯＭＰ２６と称する。
【０００６】
特に、本発明のタンパク質は、図１に示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に相同性のある配列を有する。別の実施態様によると、本発明のタンパク質は、２４番目のアミノ酸から始まる図１に示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に相同性のある配列を有する。初めの２３アミノ酸は、「シグナル」配列を構成し、この配列を排除したタンパク質も同様に使用できると考えられる。本発明のタンパク質は、免疫原であり、このため、インフルエンザ菌による感染に対して保護する免疫反応を誘導することが可能である。
【０００７】
本発明の明細書において、ＯＭＰ２６と「実質的に相同性のある」タンパク質とは、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の相同性を有することである。好ましくは、タンパク質は、少なくとも７０％の相同性を有し、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有し、さらにより好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、および最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する。当業者は、相同性を表す割合（％）は一つの因子でしかないと考えるであろう。重要なのは、タンパク質がその抗原性効果を維持することである。したがって、本明細書でいう抗原活性を維持していれば、例えば、４０％という比較的低い相同性を有するタンパク質であってもよい。
【０００８】
加えて、「保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）」または「半保存的（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）」変更はその基本的な活性を変えずにタンパク質のアミノ酸配列になされることは当該分野で既知である。例えば、グリシン、バリン、ロイシン及びイソロイシン等のアミノ酸は、すべて脂肪族側鎖を有するものであるが、これらのアミノ酸はしばしばタンパク質の生物学的な活性を実質的に変化させずに相互に置換される。同様にして、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン等のアミノ酸は、すべて芳香族側鎖を有するものであるが、これらのアミノ酸が相互に置換されてもよい。本明細書で記載される抗原性効果を保持するこのようなタンパク質は本発明の概念に含まれる。
【０００９】
また、ＯＭＰ２６の抗原性部分または領域を用いることによって、インフルエンザ菌に対する保護効果を誘導することも可能である。このような抗原性部分または領域もまた、本発明の概念に含まれる。
【００１０】
第二の概念によると、本発明は、本発明のタンパク質、上記したようなその変異体または抗原性部分若しくは領域をコードする核酸配列、好ましくはＤＮＡを提供するものである。特に、本発明は、ＯＭＰ２６をコードする図１に示されるＤＮＡ配列を提供するものである。当業者は、遺伝コードの縮重により、タンパク質のアミノ酸配列には変化を起こさずにＤＮＡ配列に保存的変更を行うことが可能であることを認識するであろう。したがって、このようなＤＮＡ配列もまた、本発明の概念に含まれる。好ましくは、本発明の核酸は、プラスミド等のベクターの一部を形成してもよい。
【００１１】
本明細書において、本発明のタンパク質はインフルエンザ菌に対する免疫反応を刺激する。したがって、第三の概念によると、本発明は、本明細書に記載される本発明のタンパク質、および必要であれば一以上の担体および／またはアジュバントからなるワクチン配合物を提供するものである。
【００１２】
第四の概念によると、本発明は、インフルエンザ菌に対するワクチンの調製における、本明細書に記載される本発明のタンパク質の使用を提供するものである。
【００１３】
本発明のワクチン組成物は、インフルエンザ菌による感染に対して被験者を免疫するのに使用できる。したがって、第五の概念によると、本発明は、本発明のワクチン組成物を被験者に投与することからなる、インフルエンザ菌による感染に対して被験者を免疫する方法を提供するものである。本発明のワクチン組成物は、全身性免疫（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）および／または粘膜性免疫（ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を生じさせるのに使用できる。
【００１４】
第六の概念によると、本発明は、本発明のワクチン組成物を被験者に投与する段階からなる呼吸器感染症または中耳炎の予防または処置方法を提供するものである。
【００１５】
他の概念によると、本発明は、以下を提供するものである：
（ａ）インフルエンザ菌による感染の診断における、本明細書で定義される本発明のタンパク質の使用；および
（ｂ）本明細書で定義される本発明のタンパク質からなるインフルエンザ菌による感染の診断に使用されるキット。
【００１６】
本発明の各概念の好ましい態様は、必要であれば変更を加えて（ｍｕｔａｔｉｓ  ｍｕｔａｎｄｉｓ）、各他の概念について同様に好ましい。
【実施例】
【００１７】
本発明を以下の実施例を参照しながら説明するが、本発明は下記実施例に何等制限されるものではない。
【００１８】
下記実施例は以下の図面を参照する：
図１は、ＯＭＰ２６をコードするＤＮＡ配列および上記ＤＮＡ配列から誘導されるアミノ酸配列を示すものである；
図２は、ＯＭＰ２６およびより高分子量の他の２種のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示すものである；
図３は、ＯＭＰ２６（ａ）の初めの２５アミノ酸残基のＮ−末端配列を示すものであり、また、この配列とパスツレラ  ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）及びエルシニア  シュードツベルクローシス（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のタンパク質との比較をも示す；
図４は、生菌で感染させてから４時間後の気管支洗浄液中に回収されたＮＴＨＩ−Ｉ菌を示すものである；
図５は、ＯＭＰ２６で免疫されたラットの血清中のＩｇＧサブクラスのＯＭＰ２６に特異的なレベルを示すものである；
図６は、血清におけるＯＭＰ２６に特異的な抗体の検出用の免疫ブロット（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）を示すものである；および
図７は、ＯＭＰ２６−免疫および非免疫ラットのＭＬＮから単離されたリンパ球の抗原に特異的な増殖を示すものである。
【００１９】
下記実施例において、データは、平均±平均の標準誤差として表わした。肺のクリアランスデータ、全食細胞数、及び微分細胞数データ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｄａｔａ）は、分散分析の一方向分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）によってグループ間を統計学的な有意性で比較した後、多重比較分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を目的としてタッキー試験（Ｔｕｃｋｅｙ’ｓ  ｔｅｓｔ）（マッキントッシュシスタット（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｓｙｓｔａｔ））を行った。抗体データは非対ｔ−検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）によってグループ間の有意性を評価し、リンパ球の増殖データは変動（ｖａｒｉａｎｃｅ）の完全要因分析（ｆｕｌｌｙ  ｆａｃｔｏｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（マッキントッシュシスタット（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｓｙｓｔａｔ））によって評価した。２個の変数（ｖａｒｉａｂｌｅ）間の直線的な相関は、ピヤソン相関計数（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を用いて測定した（マッキントッシュシスタット（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｓｙｓｔａｔ））。
【００２０】
実施例１
（ｉ）タンパク質の精製
２６ｋＤａのタンパク質（ＯＭＰ２６）を、分離用電気泳動によってＮＴＨＩ−Ｉ株から精製した。１００寒天培地の一晩培養したものからの細菌をプレートを掻き取ることによって集めて、１０，０００×ｇで４℃で１０分間遠心することにより２回洗浄した。この外膜成分を緩衝化ツィッタージェント３−１４界面活性剤（ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）で抽出し、さらにエタノール沈殿することにより、未精製の外膜調製物を得た。この外膜抽出物を凍結乾燥し、最小量の蒸留水中に再懸濁し、さらに、４倍容のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）還元緩衝液（６２．５ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ），［ｐＨ６．８］、１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］グリセロール、２％［ｗｔ／ｖｏｌ］  ＳＤＳ、５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］  β−メルカプトエタノール、１．２×１０−３％［ｗｔ／ｖｏｌ］ブロモフェノブルー（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏ  ｂｌｕｅ））中に溶解した。このＳＤＳ−調製物を、電気泳動カラムの濃縮用ゲル上にのせる前に、少なくとも３０分間、３７℃でインキュベートした。ＯＭＰ２６を分離用（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて精製した。３７ｍｍ（内径［ｉ．ｄ．］）カラム内で１０ｍｌ  ４％  Ｔ−０．３６％  Ｃ  アクリルアミド／ＢＩＳ（４％  Ｔ−０．３６％  Ｃ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／ＢＩＳ）（Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）濃縮用ゲルが重合された６０ｍｌ  １４  Ｔ−１．４２％  Ｃ  アクリルアミド／ＢＩＳ（１４  Ｔ−１．４２％  Ｃ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／ＢＩＳ）分離用ゲルを用いたバイオ−ラッド  モデル  ４９１  プレップ  セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｏｄｅｌ  ４９１  Ｐｒｅｐ  Ｃｅｌｌ）を使用して、分離用ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＯＭＰ２６を精製した。カラムから溶出させた画分を凍結乾燥によって濃縮し、分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質含量を分析した。このような条件を用いて単離された、ＯＭＰ２６は、ＳＤＳを含んでいたので、次に、このＳＤＳをリン酸カリウム及び沈殿によって除去した。ＯＭＰ２６を含む画分を溜め、透析した後、タンパク質濃度を測定した。
【００２１】
１０〜１５％勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ  １０−１５％  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）または１２．５％均質アクリルアミドゲル（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  １２．５％  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）のいずれかを用いた分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、タンパク質の分析同定を行い、銀染色した。タンパク質濃度を、ピアスミクロＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  ａｓｓａｙ）を用いて測定した。ＬＯＳの存在を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルの銀染色およびＥ−ＴＯＸＡＴＥカブトガニ細胞分解産物試験（Ｅ−ＴＯＸＡＴＥ  Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｌｙｓａｔｅ  ｔｅｓｔ）によるアッセイによって評価した。
【００２２】
結果
ＯＭＰ２６は、２６〜３０ｋＤａの間の分子量を有する３種のタンパク質の群から良好に分離された。図２は、このタンパク質と他の２つのタンパク質との位置関係を示すものであり、銀染色されたゲルから、得られた調製物が高純度を有することが示される。このタンパク質の熱可変特性の評価を、タンパク質サンプルをβ−メルカプトエタノールの存在下で１００℃で３０分間加熱することによって、行った。３０分後、煮沸されたタンパク質サンプルは同様の分子量を有したまま移動することが分かった（図２）。他の近隣のタンパク質バンドの一つが熱可変性Ｐ５であるかどうかを決定するために、この分子量範囲を有する３種のタンパク質すべてをβ−メルカプトエタノールの存在下で３０分間煮沸したところ、熱可変特性を示すタンパク質は存在しなかった（図２）。ＬＯＳ混入物の存在に関するタンパク質の評価をＥ−ＴＯＸＡＴＥアッセイキット（Ｅ−ＴＯＸＡＴＥ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）を用いて行ったところ、１ｍｇタンパク質当たり０．６μｇ未満のエンドトキシンが存在することが分かった。
【００２３】
（ｉｉ）Ｎ−末端アミノ酸配列決定用のＯＭＰ２６の調製
ＯＭＰ２６を、タンパク質バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜に移すことによって、Ｎ−末端アミノ酸配列分析用に調製した。このタンパク質サンプルを、配列を分析してもらうために、英国，クルウィド，ディーサイド，ニューテック  スクェアー，テクベース  １（Ｔｅｃｈｂａｓｅ  １，  Ｎｅｗｔｅｃｈ  Ｓｑｕａｒｅ，  Ｄｅｅｓｉｄｅ，  Ｃｌｗｙｄ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）所在のコーテックス  ダイアグノスティック（Ｃｏｒｔｅｃｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）に送った。
【００２４】
アミノ酸配列の同定
Ｎ−末端アミノ酸配列をＰＶＤＦに移したタンパク質バンドから得た。初めの２５ペプチドに関するアミノ酸配列分析を図３に示す。この配列分析から、Ｈｉｂ  Ｐ５またはフィンブリンタンパク質のＮ−末端配列との配列の相同性は見られない。このＮ−末端アミノ酸配列は、パスツレラ  ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来の２１．４ｋＤａのタンパク質とは５６％の相同性をおよびエルシニア  シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の１９ｋＤａの外膜タンパク質とは４４％の配列の相同性を示した。
【００２５】
（ｉｉｉ）免疫化および細菌の感染（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）
特定の病原体フリーの（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）オスのラットを、１日目にパイエル板内（ｉｎｔｒａ−Ｐｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈ）（ＩＰＰ）に免疫化し、１４日目に気管内に（ＩＴ）ブーストし（ｂｏｏｓｔ）、さらに最後に２１日目に生菌を感染させた（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）。動物をハロタンで鎮静化させ、尾静脈を介した抱水クロラールによる静脈内麻酔を容易にした。小腸を腹部の正中線を切開することにより露出させ、抗原を２７ゲージの針を用いて各パイエル板に漿膜下に注入した。免疫化タンパク質（ＯＭＰ２６）を、１：１の割合の不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）及びリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に１ｍｌ当たり２００または８００μｇのタンパク質を乳化させることにより調製し、１０または４０μｇのタンパク質の全接種量をそれぞれ各動物に投与した。ラットの２コントロール群は、（ｉ）未処理及び偽免疫化（ｓｈａｍ−ｉｍｍｕｎｉｓｅｄ）群（ＩＦＡ及びＰＢＳで免疫）の混合、および（ｉｉ）同種のＮＴＨＩ株の死菌で免疫したポジティブ群から構成された。ラットを、ＩＰＰ免疫化してから１４日目にＩＴブーストした（ＩＴ  ｂｏｏｓｔ）。ＯＭＰ２６を免疫したラットに、１０μｇのＯＭＰ２６をＩＴブーストした。非免疫群には５０μｌのＰＢＳを投与し、また、死菌免疫群には５０μｌの死菌（菌数：１０１０／ｍｌ）を投与した。動物に、１回目の免疫化から２１日目に生菌（菌数：５×１０８／ｍｌ）を４時間感染させた（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）。異種株である、ＮＴＨＩ−ＩＩもまた、菌の感染に使用した。菌を、１リットル寒天培地当たり５０ｍｌ脱線維素ウマ血液を添加した脳−心臓浸出物寒天培地上で５％ＣＯ２中で３７℃で一晩生育させ、回収し、洗浄し、所定の濃度までＰＢＳ中に再懸濁した。菌を気管内カニューレを介して肺中に導入し、４時間後、ラットを安楽死させた。血液を収集し、血清のアリコートを抗体分析用に−２０℃で貯蔵した。肺を５×２ｍｌのＰＢＳでフラッシュすることによって洗浄し、集めた洗浄液（ＢＡＬ）について菌数を測定した。肺洗浄後、肺を除去し、均質化し、菌数を測定した。サイトスピンスライド（ｃｙｔｏｓｐｉｎ  ｓｌｉｄｅ）を、肺の洗浄液における微分細胞数（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ）の測定用に調製した。肺の洗浄液中に存在する全細胞数を、メチレンブルーで染色し血球計算器を用いてカウントすることによって、算出した。
【００２６】
結果
ＯＭＰ２６で免疫し２１日目にＮＴＨＩ−Ｉ同種株の生菌で感染させたラットは、有意な細菌のクリアランスを示した（Ｐ＜０．００５）。１０μｇのＯＭＰ２６で免疫しかつブーストした（ｂｏｏｓｔ）ラットは、４時間後では非免疫群に比べて肺中に９２％細菌が少なく、また、ＩＰＰ免疫により４０μｇのＯＭＰ２６が投与されさらに１０μｇのＯＭＰ２６をブーストされたラットは９６％細菌が少なく、これは死菌を免疫したラットで観察された９５％のクリアランスと同等であった（図４）。
【００２７】
また、ＯＭＰ２６で免疫したラットに、異種の型別不能な株である、ＮＴＨＩ−ＩＩ由来の生菌を感染させた。表１の結果から、ＯＭＰ２６による免疫は異なる株による肺への感染においても有意に（Ｐ＜０．００５）菌を浄化した（ｃｌｅａｒ）が示される。免疫群は、４時間後ではＢＡＬにおいて非免疫群に比べて９３％細菌が少ないことから、細菌のクリアランス速度は同種株による感染の場合の速度に匹敵することが示された。また、ＯＭＰ２６による免疫により、非免疫群と比較した場合、免疫群の肺のホモジネート中に存在する菌数も減少した。ＮＴＨＩ−ＩＩ（異種株）を感染させたラット由来の肺のホモジネートは、非免疫肺に比べて有意に細菌が少なかった。しかしながら、差の度合いは、肺で８０％であり、肺では８９％のクリアランスであるのに比べてＢＡＬでは９３％のクリアランスであり、さらに、ＮＴＨＩ−Ｉ（同種株）を感染させた群ではＢＡＬにおいて８７％のクリアランスであった。ＮＴＨＩ−Ｉに関する本実験におけるクリアランスの割合（％）は、一般（一般的な接種材料は０．６〜１．４×１０１０ＣＦＵ／ｍｌの範囲であった）よりもかなりより多くの菌を含む生菌の接種材料のため、従来の実験とは異なるものであった。
【００２８】
より数多くの食細胞がＯＭＰ２６で免疫された動物のＢＡＬ中に存在し、これはこれらの動物における向上した菌のクリアランスと相関していた（表２）。免疫群における細胞のレクリートメント（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）の増加は、同種及び異種菌による感染の場合で同様であった。しかしながら、感染してから４時間後では、微分細胞数は免疫群と非免疫群で有意に異なっておらず（表２）、この際、双方の群ともマクロファージに対するＰＭＮの割合は同様の割合を示した：
【００２９】
【表１】
2009034107.tif 000002
【００３０】
【表２】
2009034107.tif 000003
【００３１】
（ｉｖ）ＯＭＰＳ２６に特異的なＥＬＩＳＡ
ポリソルブマイクロタイターウェル（ｐｏｌｙｓｏｒｂ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｗｅｌｌ）を、ＩｇＧ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＡ及びＩｇＭのアッセイを目的とした場合１μｇ／ｍｌの濃度の；およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、及びＩｇＥのアッセイを目的とした場合１０μｇ／ｍｌの濃度の、精製したＯＭＰ２６で被覆した。プレートをインキュベーション段階間に０．０５％ツィーン２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）を含むＰＢＳで５回洗浄した。ウェルを、６０分間、ＰＢＳ−０．０５％ツィーン２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）における５％スキムミルクで遮断した。ウェルを血清（１／２５〜１／３２００）と共に９０分間インキュベートした、またはＢＡＬ（１／２〜１／６）サンプルを分析用遮断緩衝液で連続的に希釈した。使用した複合免疫グロブリン（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｕｂｌｉｎ）は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／２０００）、ＩｇＡ（１／１０００）、及びＩｇＭ（１／４０００）（Ｆｃ特異的）；マウス抗ウサギＩｇＧ１（１／５００）、ＩｇＧ２ａ（１／１０００）、ＩｇＧ２ｂ（１／５００）、及びＩｇＧ２ｃ（１／５００）であった。さらに、ウェルを９０分間複合免疫グロブリンと共にインキュベートした。次に、プレートを発色させた。
【００３２】
結果
ＯＭＰ２６で免疫したラットの、さらには４種の異なるインフルエンザ菌株由来の死菌で予め免疫したラットの、血清及びＢＡＬサンプル中の、ＯＭＰ２６に特異的な抗体を測定した。ＯＭＰ２６で免疫したラットの血清では、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭに関する高いＯＭＰ２６に特異的な抗体力価が、およびＯＭＰ２６で免疫したラットのＢＡＬでは、ＩｇＧ及びＩｇＡに関する高いＯＭＰ２６に特異的な抗体力価が、それぞれ、検出され、さらに、４０μｇのより高い免疫投与量を投与した群で最高レベルが観察された（表３）。血清中のＯＭＰ２６に特異的なＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ、およびＢＡＬ中のＩｇＧ及びＩｇＡの検出可能なレベルもまた、異なるインフルエンザ菌株で予め免疫したラットで観察された（表３）が、これらの群で観察されたレベルはＯＭＰ２６で免疫された群のレベルに比べて有意に低かった。ＯＭＰ２６ラット群の血清について、ＩｇＥのＥＬＩＳＡもまた行ったが、ＯＭＰ２６に特異的なＩｇＥのレベルは検出されなかった（データは示さず）。
【００３３】
ＯＭＰ２６に特異的なＩｇＧのサブクラス（ｓｕｂｃｌａｓｓ）を測定した結果、ＯＭＰ２６に特異的なＩｇＧ１は４０μｇの免疫化以降のみ検出可能であったが、有意なレベルのＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂのサブクラスが１０μｇ及び４０μｇのＯＭＰ２６免疫群双方で検出されたことが示された（図５）。ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂのレベルは双方とも、ＩＰＰ接種材料中のＯＭＰ２６の濃度が１０μｇ〜４０μｇと増加するに従って有意に（Ｐ＜０．０５）増加した。ＩｇＧ２ｃもまた測定したが、有意なレベルのこのサブクラスのＯＭＰ２６に特異的な抗体は検出できなかった。（データ示さず）。
【００３４】
【表３】
2009034107.tif 000004
【００３５】
（ｖ）免疫ブロット
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質を電気泳動によりニトロセルロース（０．２μｍポアサイズ）に移した。ＯＭＰ２６、ＮＴＨＩ−Ｉ、ＮＴＨＩ−ＩＩ、さらにはＨＩ−ＣＤ、及びＨｉｂ−ＩＩで免疫した群由来のラットの血清をＴＴＢＳ−５％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末で１０倍に希釈し、１次抗体として使用した。ＴＴＢＳ−５％スキムミルクにおける西洋ワサビペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｔ  ＩｇＧ）（Ｆｃに特異的）の５００倍希釈液を２次抗体として使用した。
【００３６】
結果
非免疫、ＯＭＰ２６−免疫及びインフルエンザ菌−（４株）免疫ラットの血清中に存在する抗体によるＯＭＰ２６の認識に関する免疫ブロット分析から、このタンパク質は、各免疫群の血清中に存在する抗体によっては認識されるが、非免疫群の血清中に存在する抗体によっては認識されないことが示された（図６）。これから、抗体反応の交差反応性がＮＴＨＩ−Ｉ株から精製されたＯＭＰ２６による研究に使用されたインフルエンザ菌株による免疫化によって生じることが示される。
【００３７】
（ｖｉ）抗原に特異的なリンパ球アッセイ
腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）から得られたリンパ球を１０６細胞／ｍｌの濃度で培養した。抗原（ＯＭＰ２６）を連続して１０倍希釈率で培養液中に懸濁し、瀘過滅菌した。細胞懸濁液及び抗原を、最終容積を０．２ｍｌ／ウェルになるように、平底マルチウェル（ｆｌａｔ−ｂｏｔｔｏｍｅｄ  ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ）プレートに３連で添加した。リンパ球の増殖を４日間の培養の最後の８時間の［３Ｈ］チミジンの取り込みによって評価した。結果を３連のウェルの幾何平均からバックグラウンドを引くことによって算出し、全処置群の幾何平均＋／−標準誤差とした。
【００３８】
結果
ＯＭＰ２６−免疫及び非免疫ラットのＭＬＮ由来のリンパ球について抗原に特異的な増殖反応を評価した。ＯＭＰ２６−免疫群由来の細胞はインビトロにおいて培養物中のＯＭＰ２６に対して有意に応答したが、非免疫ラット由来の細胞は有意な増殖を示さなかった（図７Ａ）。また、ＯＭＰ２６で免疫したラットのリンパ球をインフルエンザ菌株のＯＭＰ抽出物と共に培養し、交差反応の応答性を評価した。有意な増殖応答性がＮＴＨＩ−Ｉ、ＮＴＨＩ−ＩＩ及びＨＩ−ＣＤ株由来のＯＭＰ抽出物ではＯＭＰ２６免疫群由来のリンパ球において検出されたが、Ｈｉｂ−ＩＩ株由来の抽出物では有意な増殖が観察されなかった（図７Ｂ〜Ｅ）。
【００３９】
実施例２−ＯＭＰ２６のクローニング及び配列決定
ＤＮＡをＮＴＨｉから抽出した。ＯＭＰ２６をコード化するＤＮＡの領域を同定し、遺伝子（バイオモレキュラー  レソース  ファシリティー（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、ジョン  カーティン  スクール  オブ  メディカル  リサーチ（Ｊｏｈｎ  Ｃｕｒｔｉｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、キャンベラ、エーティーシー（Ｃａｎｂｅｒｒａ，  ＡＣＴ）、オーストラリアで合成）を認識するように設計されたプライマーを用いた標準的なＰＣＲ法によって増幅した。分析して正確な産物を良好に認識した後、ＰＣＲ  ＤＮＡ産物を抽出した。
【００４０】
２個のプラスミドを調製した。一方のＤＮＡ産物はシグナルペプチド及び成熟ＯＭＰ２６産物をコード化する領域を含み、他方は最終的な成熟ＯＭＰ２６（リーダーシグナルペプチドを含まない）をコード化する領域を含んだ。これらのＰＣＲ  ＤＮＡ産物を、ＯＭＰ２６＋シグナルペプチドでは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩでおよび成熟ＯＭＰ２６ではＮｓｐＢＩＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化されたＤＮＡを回収し、これを、ＯＭＰ２６＋シグナルペプチドまたはＯＭＰ２６成熟タンパク質で、それぞれ、プラスミドｐＱＥ３０またはｐＱＥ３１（ギアゲン  ジーエムビーエッチ（Ｇｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ），ドイツ）中にＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで連結した。次に、これらのプラスミドを精製し、沈殿させて、バイオモレキュラー  レソース  ファシリティー（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、ジョン  カーティン  スクール  オブ  メディカル  リサーチ（Ｊｏｈｎ  Ｃｕｒｔｉｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、キャンベラ（Ｃａｎｂｅｒｒａ）、オーストラリアのダイ  デオキシ−ターミネーター法（ｄｙｅ  ｄｅｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって配列決定を行った。
【００４１】
結果
図１に示される配列は、成熟ＯＭＰ２６＋シグナルペプチドを表すものである。このシグナルペプチド配列は、初めの２３個のアミノ酸を含む。外膜上のＮＴＨｉによって発現される最終産物は２４番目のアミノ酸で始まる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＯＭＰ２６をコードするＤＮＡ配列および上記ＤＮＡ配列から誘導されるアミノ酸配列を示すものである。
【図２】ＯＭＰ２６およびより高分子量の他の２種のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示すものである。
【図３】ＯＭＰ２６（ａ）の初めの２５アミノ酸残基のＮ−末端配列を示すものであり、また、この配列とパスツレラ  ムルトシダ（Ｐ．  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）及びエルシニア  シュードツベルクローシス（Ｙ．  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のタンパク質との比較をも示す。
【図４】生菌で感染させてから４時間後の気管支洗浄液中に回収されたＮＴＨＩ−Ｉ菌を示すものである。
【図５】ＯＭＰ２６で免疫されたラットの血清中のＩｇＧサブクラスのＯＭＰ２６に特異的なレベルを示すものである。
【図６】血清におけるＯＭＰ２６に特異的な抗体の検出用の免疫ブロット（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）を示すものである。
【図７】ＯＭＰ２６−免疫および非免疫ラットのＭＬＮから単離されたリンパ球の抗原に特異的な増殖を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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