(57)【要約】【課題】本発明は、活性が高く生体成分に由来しない低分子性のヘビ毒筋壊死因子阻害剤を提供することを解決すべき課題とする。【解決手段】本発明は、一般式(I)で表される3-アミノ-2-インドリルマレイミド誘導体又はその塩を有効成分として含有する、ヘビ毒筋壊死因子の阻害剤及びヘビ咬症の治療剤に関する。2009161481.tif 000026【選択図】図１
2009161481.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式(I)：
【化１】
2009161481.tif 000024
(式中、
R1は、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアシルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアルコキシル基、置換基を有していてもよいアルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、ヒドロキシル基、又は水素原子を表し、
R2はインドール環の位置番号で2, 4, 5, 6又は7位あるいはその複数の位置についた置換基を表し、nは0〜5の数であり、nが2以上である場合はR2の種類は同じでも異なっていてもよく、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシル基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアシルオキシ基、置換基を有していてもよいアルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニルオキシ基、置換基を有していてもよいアミノカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルフィニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、オキシスルホニル基、シアノ基、ニトロ基、又は置換基を有していてもよいアミノ基を表し、
R3は、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいアラルキル基、水素原子、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアシルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアルコキシル基、置換基を有していてもよいアルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、ヒドロキシル基、又は水素原子を表し、
R4及びR5は、互いに独立に、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアシルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアルコキシル基、置換基を有していてもよいアルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、又はヒドロキシル基を表し、
又はR4及びR5は、それらが結合する窒素原子と一体になって、更なるヘテロ原子を含んでもよく、置換基を有していてもよい、飽和若しくは不飽和の環構造を形成していてもよい）
で表される3-アミノ-2-インドリルマレイミド誘導体又はその医薬として許容される塩を有効成分として含有する、ヘビ毒筋壊死因子の阻害剤。
【請求項２】
前記一般式(1)において、
R1がメチル基又はイソプロピル基であり、
nが0であり、R2は存在せず、
R3がメチル基であり、
R4が、無置換の、又は末端の炭素上に置換基としてジメチルアミノ基を有する、炭素数3〜5の直鎖アルキル基、或いは、無置換のベンジル基であり、
R5が水素原子であることを特徴とする、請求項1記載の阻害剤。
【請求項３】
前記ヘビ毒筋壊死因子がハブ毒筋壊死因子であることを特徴とする請求項1又は2記載の阻害剤。
【請求項４】
一般式(I)：
【化２】
2009161481.tif 000025
(式中R1, R2, R3, R4, R5 及びnは請求項1において定義した通りである)
で表される3-アミノ-2-インドリルマレイミド誘導体又はその医薬として許容される塩を有効成分として含有する、ヘビ咬症の治療剤。
【請求項５】
前記一般式(1)において、
R1がメチル基又はイソプロピル基であり、
nが0であり、R2は存在せず、
R3がメチル基であり、
R4が、無置換の、又は末端の炭素上に置換基としてジメチルアミノ基を有する、炭素数3〜5の直鎖アルキル基、或いは、無置換のベンジル基であり、
R5が水素原子であることを特徴とする、請求項4記載の治療剤。
【請求項６】
ヘビ咬症がハブ咬症であることを特徴とする、請求項4又は5記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、3-アミノ-2-インドリルマレイミド誘導体の、ヘビ毒（特にハブ毒）の筋壊死因子に対する阻害剤およびヘビ咬症治療剤としての新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘビ毒により生じる様々な障害のうち、未だ決定的な治療法のないものとして筋壊死が挙げられる。
【０００３】
地球上に生息する2700種以上のヘビのうち約400種は何らかの毒成分をもっている。世界的にみると、東南アジア、中東から中南米、アフリカ等を中心に、毒ヘビにより年間２５０万人が咬傷被害を受け、約１０万人が死亡している（Cell. Mol. Life. Sci. 2006, 63, 3030-3041.）。日本本土ではマムシ、沖縄や奄美諸島ではハブが生息しており、鹿児島県奄美大島ではハブによる咬傷被害者数が昭和30年代には300名を超えていた。近年では咬傷被害者数は年間100名ほどに減少し、さらに、受傷後の救急医療の発達で死亡する症例はほとんどなくなったものの、平成１０年に２名、平成１４年に１名の方が亡くなっており、現在でもなお住民に恐怖を与えている。ハブ（Trimeresurus flavoviridis）毒は出血毒であるが、その中には種々のタンパク質性毒素が含まれ、これらが単独あるいは互いに増強しながら筋肉壊死、溶血、出血などの多彩な症状を引き起こす。その治療にはantiveninと呼ばれるウマ血清抗毒素が用いられ、抗出血、抗致死の面において大きな成果をあげているが、ハブ咬症に起因した筋肉壊死には対応できておらず、運動機能障害などの大きな後遺症を残すことが依然問題となっている。
【０００４】
ヘビ咬傷治療に対する治療薬については様々な検討がなされている。筋壊死因子に対して最も有効なものはヘビ血液中から単離された毒酵素成分に対して中和能（阻害能）を持つタンパク質性阻害剤である。現在までに、ヘビ血清中からいくつかの壊死因子阻害剤が単離、構造決定されているが、これらを治療薬として用いる場合には免疫原性（アナフィキラシー）の低下、安全性など多くの解決すべき課題が残されている。そのため、免疫原性を低下させた低分子性ヘビ毒筋壊死阻害剤が求められている。
【０００５】
低分子性ヘビ毒筋壊死阻害剤として、公知文献において以下のものが報告されている。非特許文献１には免疫抑制剤として広く知られている微生物代謝産物cyclosporin Aは、ラットにおいてヘビ毒因子の一つクロトキシンにより引き起こされる筋壊死を軽減することが報告されている。非特許文献２，３には、生薬由来のwedelolactone及びその誘導体がハラクスと呼ばれる毒ヘビの毒により引き起こされるマウスの筋壊死を抑制することが報告されている。非特許文献４には、ホスホリパーゼA2 (PLA2) 阻害剤であるp-bromophenasyl bromideと抗毒素によって、マウス筋細胞に対し毒ヘビ咬傷に伴う浮腫、出血、筋壊死を中和することが報告されている。
【０００６】
大野・小川らはヘビ毒による筋壊死において主要な役割を担う因子（ヘビ毒筋壊死因子）として[Asp49]PLA2 およびbasic protein II (BP II) を単離している（非特許文献６）。さらに、筋壊死に対して有効な薬剤を得るべく、これらのヘビ毒筋壊死因子に対する阻害物質の探索を行っており、最近、生体成分から抽出したアミノ酸であるL-セリンがこれらのヘビ毒筋壊死因子を阻害することを見出している（特許文献１）。しかし、ヘビ毒による筋壊死のメカニズムはほとんどわかっていないことからどのような阻害剤が有効かも予測できず、新たな阻害剤を見出すことが困難な状態であった。
【０００７】
一方で、袖岡らは過酸化水素などの酸化的ストレスにより誘導される細胞死の抑制剤として3-アミノ-2-インドリルマレイミド誘導体を開発していた（特許文献２および非特許文献５）。しかしながら特許文献２および非特許文献５には、3-アミノ-2-インドリルマレイミド誘導体のヘビ毒筋壊死因子に対する作用に関しては言及されていない。しかも、ヘビ毒による筋壊死と酸化的ストレスとの関係については全く知見がないため、特許文献２および非特許文献５の記載から3-アミノ-2-インドリルマレイミド誘導体が筋壊死因子にどのような作用を示すかは予測することができなかった。
【０００８】
【特許文献１】特開2006-290851号公報
【特許文献２】国際公開WO01/13916号パンフレット
【特許文献３】国際公開WO91/13070号パンフレット
【０００９】
【非特許文献１】Miyabara EH, Tostes RC, Selistre de Araujo HS, Aoki MS, Salvini TF, Moriscot AS. Cyclosporin A attenuates skeltal muscle damage induced by crotoxin in rats. Toxicon, 2004, 43, 35-42.
【非特許文献２】da Silva, AJM, Melo PA, Silva NMV, Brito FV, Buarque CD, de Souza AV, Rodrigues VP, Pocas RESC, Noel F, Albuquerque EX, Costa PRR, Synthesis and preliminary pharmacological evaluation of coumestans with different patterns of oxygenation. Bioorg. Med. Chem,. Lett. 2001, 11, 283-286.
【非特許文献３】da Silva, AJM, Coelho AL, Simas ABC, Moraes RAM, Pinheiro DA, Fernandes FFA, Arruda EZ, Costa PRR, Melo PA, Synthesis and preliminary pharmacological evaluation of coumestans with different patterns of oxygenation. Bioorg. Med. Chem,. Lett. 2004, 14, 431-435.
【非特許文献４】Evans J, Ownby CL. Neutralization of edema, hemorrhage and myonecrosis induced by North American crotalid venoms in simulated first-aid treatments. Toxicon, 1999, 37, 633-650.
【非特許文献５】Dodo K, Katoh M, Shimizu T, Takahashi M, and Sodeoka M. Inhibition of hydrogen peroxide-induced necrotic cell death with 3-amino-2-indolylmaleimide derivatives. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 3114-3118.
【００１０】
【非特許文献６】Ohno, M, Menez R, Ogawa T, Danse JM, Shimohigashi Y, Fromen C, Ducancel F, Zinn-Justin S, Le Du MH, Boulain JC, Tamiya T, Menez A, Molecular evolution of snake Toxins: Is the functional diversity snake toxins associated with a mechanism of accelerated evolution. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 1998, 59, 307-364.
【非特許文献７】Ishimaru K, Kihara H, Ohno M. Purification and properties of phospholipase A from venom of Trimeresurus flavoviridis (Habu snake). J Biochem (Tokyo). 1980, 88,443-451.
【非特許文献８】Liu SY, Yoshizumi K, Oda N, Ohno M, Tokunaga F, Iwanaga S, Kihara H. Purification and amino acid sequence of basic protein II, a lysine-49-phospholipase A2 with low activity, from Trimeresurus flavoviridis venom. J Biochem (Tokyo). 1990, 107, 400-408.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、活性が高く生体成分に由来しない低分子性のヘビ毒筋壊死因子阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは驚くべきことに、ハブ毒の筋壊死因子として知られる[Asp49]PLA2 およびbasic protein II (BP II)により誘導される筋細胞の壊死が、特許文献2または3記載の3-アミノ-2-インドリルマレイミド誘導体により抑制されることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
本発明は、一般式(I)：
【００１４】
【化１】
2009161481.tif 000003
(式中、
R1は、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアシルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアルコキシル基、置換基を有していてもよいアルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、ヒドロキシル基、又は水素原子を表し、
R2はインドール環の位置番号で2, 4, 5, 6又は7位あるいはその複数の位置についた置換基を表し、nは0〜5の数であり、nが2以上である場合はR2の種類は同じでも異なっていてもよく、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシル基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアシルオキシ基、置換基を有していてもよいアルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニルオキシ基、置換基を有していてもよいアミノカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルフィニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、オキシスルホニル基、シアノ基、ニトロ基、又は置換基を有していてもよいアミノ基を表し、
R3は、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいアラルキル基、水素原子、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアシルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアルコキシル基、置換基を有していてもよいアルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、ヒドロキシル基、又は水素原子を表し、
R4及びR5は、互いに独立に、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアシルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノカルボニルオキシ基、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアルコキシル基、置換基を有していてもよいアルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、又はヒドロキシル基を表し、
又はR4及びR5は、それらが結合する窒素原子と一体になって、更なるヘテロ原子を含んでもよく、置換基を有していてもよい、飽和若しくは不飽和の環構造を形成していてもよい）
で表される3-アミノ-2-インドリルマレイミド誘導体又はその医薬として許容される塩を有効成分として含有する、ヘビ毒筋壊死因子の阻害剤、及び、ヘビ咬症の治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、活性が高く生体成分に由来しない低分子性のヘビ毒筋壊死因子阻害剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアルキル基」におけるアルキル基とは、直鎖状、分岐状、環状いずれでもよく、例えば炭素数1〜30のアルキル基であり、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、s-ブチル基、t-ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、14-メチルペンタデシル基、6-メチルペンタデシル基、オクタデシル基、イコシル基、テトラコシル基などがあげられる。
【００１７】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアルケニル基」におけるアルケニル基とは、直鎖状、分岐状、環状いずれでもよく、例えば炭素数2〜30のアルケニル基であり、具体的にはアリル基、ビニル基、クロチル基、1-ペンテン-1-イル基、2-ペンテン-1-イル基、3-ペンテン-1-イル基、1-ヘキセン-1-イル基、2-ヘキセン-1-イル基、3-ヘキセン-1-イル基、2-シクロヘキセニル基、2-シクロペンテニル基などがあげられる。
【００１８】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアルキニル基」におけるアルキニル基とは、直鎖状、分岐状、環状いずれでもよく、例えば炭素数2〜30のアルキニル基、より好ましくは炭素数2〜10のアルキニル基であり、具体的にはエチニル基、プロパルギル基、1-ペンチン-1-イル基、2-ペンチン-1-イル基、3-ペンチン-1-イル基、1-オクチン-1-イル基、8-ヘプタデシン-1-イル基などがあげられる。
【００１９】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアリール基」におけるアリール基はヘテロ原子を含んでいてもよく、炭素数(ヘテロ原子を含む場合はヘテロ原子と炭素原子との合計数)は例えば5〜30、より好ましくは5〜20であり、具体的にはフェニル基、ナフチル基、アンスラニル基、ピレニル基、ビフェニル基、4-ピリジル基、2-ピリジル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、ピリダニジル基、ピペラジニル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、キニリル基、ピロリル基、インドリル基、フリル基などがあげられる。
【００２０】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアラルキル基」におけるアラルキル基とは、ヘテロ原子を含んでいてもよく、炭素数(ヘテロ原子を含む場合はヘテロ原子と炭素原子との合計数)は例えば6〜30、より好ましくは7〜15であり、具体的にはベンジル、フェネチル、ナフチルメチルなどがあげられる。
【００２１】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアルコキシル基」におけるアルコキシル基、或いは「置換基を有していてもよいアルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシ基」におけるアルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基若しくはアラルキルオキシ基は、直鎖状、分岐状、環状のいずれでもよく、炭素数は例えば30以下、より好ましくは10以下であり、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、t-ブトキシ基、アリルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、ベンジルオキシ基、フェノキシ基などがあげられる。
【００２２】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオ基」における、アルキルチオ基、アルケニルチオ基、アルキニルチオ基、アリールチオ基若しくはアラルキルチオ基は、直鎖状、分岐状、環状のいずれでもよく、炭素数は例えば30以下、より好ましくは10以下であり、具体的にはメチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、t-ブチルチオ基、アリルチオ基、シクロペンチルチオ基、シクロヘキシルチオ基、ベンジルチオ基、フェニルチオ基などがあげられる。
【００２３】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアシル基」又は「置換基を有していてもよいアシルオキシ基」におけるアシル基とは、直鎖状、分岐状、環状、飽和、不飽和の脂肪族、あるいは芳香族いずれでもよく、例えば炭素数2〜30のアシル基、具体的にはアセチル基、プロピオニル基、イソプロピオニル基、ピバロイル基、オレオイル基、シクロヘキシルカルボニル基、アクロイル基、クロトノイル基、ベンゾイル基、ナフトイル基、ニコチノイル基などがあげられる。
【００２４】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニル基」又は「置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニルオキシ基」におけるアルキルオキシカルボキル基、アルケニルオキシカルボキル基、アルキニルオキシカルボキル基、アリールオキシカルボキル基若しくはアラルキルオキシカルボキル基は、直鎖状、分岐状、環状のいずれでも良く、炭素数は例えば30以下、より好ましくは10以下であり、具体的にはメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、s-ブトキシカルボニル基、t-ブトキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、フェニルオキシカルボニル基、ピリジルオキシカルボニル基などの基があげられる。
【００２５】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニル基」又は「置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニルオキシ基」におけるアルキルチオカルボニル基、アルケニルチオカルボニル基、アルキニルチオカルボニル基、アリールチオカルボニル基若しくはアラルキルチオカルボニル基は、直鎖状、分岐状、環状のいずれでも良く、炭素数は例えば30以下、より好ましくは10以下であり、具体的にはメチルチオカルボニル基、エチルチオカルボニル基、プロピルチオカルボニル基、イソプロピルチオカルボニル基、ブチルチオカルボニル基、t-ブチルチオカルボニル基、シクロペンチルオキシチオカルボニル基、シクロヘキシルオキシチオカルボニル基、ベンジルチオカルボニル基、フェニルチオカルボニル基、ピリジルチオカルボニル基などの基があげられる。
【００２６】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアミノカルボニル基」又は「置換基を有していてもよいアミノカルボニルオキシ基」中の「置換基を有していてもよいアミノカルボニル基」は、無置換カルバモイル基、あるいは置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよい芳香族基、水酸基、置換基を有していてもよいアルコキシル基、置換基を有していてもよいアミノ基などで置換されたカルバモイル基を示し、炭素数は例えば30以下、より好ましくは10以下であり、具体的にはカルバモイル基、エチルアミノカルボニル基、プロピルアミノカルボニル基、イソプロピルアミノカルボニル基、ブチルアミノカルボニル基、t-ブチルアミノカルボニル基、シクロペンチルアミノカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル基、ベンジルアミノカルボニル基、フェニルアミノカルボニル基、ピリジルアミノカルボニル基、ベンジルオキシアミノカルボニル基などの基があげられる。
【００２７】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルホニル基」におけるアルキルスルホニル基、アルケニルスルホニル基、アルキニルスルホニル基、アリールスルホニル基若しくはアラルキルスルホニル基は、直鎖状、分岐状、環状のいずれでも良く、炭素数は例えば30以下、より好ましくは10以下であり、具体的にはメタンスルホニル基、エタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、シクロヘキサンスルホニル基、ナフタレンスルホニル基などの基があげられる。
【００２８】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルフィニル基」におけるアルキルスルフィニル基、アルケニルスルフィニル基、アルキニルスルフィニル基、アリールスルフィニル基若しくはアラルキルスルフィニル基は、直鎖状、分岐状、環状のいずれでも良く、炭素数は例えば30以下、より好ましくは10以下であり、具体的にはメタンスルフィニル基、エタンスルフィニル基、ベンゼンスルフィニル基、シクロヘキサンスルフィニル基、ナフタレンスルフィニル基などの基があげられる。
【００２９】
本明細書中、「置換基を有していてもよいアミノ基」は、無置換アミノ基、あるいはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基などで置換されたアミノ基を示し、炭素数は例えば30以下、より好ましくは10以下であり、具体的にはエチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、t-ブチルアミノ基、ベンジルアミノ基、フェニルアミノ基、ピリジルアミノ基、ピペラジニル基、インドリニル基、アセチルアミノ基、ベンゾイルアミノ基、ベンゼンスルホニル基、メタンスルホニルアミノ基などの基があげられる。
【００３０】
本明細書中、「ハロゲン原子」はフッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子があげられる。
【００３１】
本明細書中、「置換基」とは、例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アシル基、アシルオキシ基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニル基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニルオキシ基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニル基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニルオキシ基、アミノカルボニル基、アミノカルボニルオキシ基、アルコキシル基、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシ基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオ基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルホニル基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルスルフィニル基をあげることができ、これらの具体例は前記と同様である。その他の置換基としては、ハロゲン基、ニトロ基、アミノ基(アシル基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシカルボニル基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルチオカルボニルオキシ基、カルバモイル基、置換スルホニル基、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基等を置換基として有していてもよい)、シアノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、オキシスルホニル基、エポキシ基などの基の他、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基等のアラルキル基があげられる。
【００３２】
R1として好ましいものとしては、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、及び置換基を有していてもよいアラルキル基が挙げられ、特に好ましい基としては、無置換のアルキル基、及び無置換のアラルキル基が挙げられる。無置換のアルキル基としては特に炭素数1〜10のアルキル基が好ましい。無置換のアラルキル基としては炭素数6〜10のものが好ましい。R1として特に好ましい基は、メチル基、i-プロピル基、又はベンジル基であり、メチル、又はi-プロピル基が最も好ましい。
【００３３】
nは0又は1であることが好ましく、0であることが最も好ましい。nが1〜5である場合は、R2として好ましいものとしては、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシル基、及び置換基を有していてもよいアルケニル、アルキニル、アリール若しくはアラルキルオキシ基が挙げられ、特に好ましい基としてはハロゲン原子（例えばBr又はCl）、及びメチル基が挙げられる。置換位置はインドール環の5, 6又は7位であることが好ましい。
【００３４】
R3として好ましいものとしては、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、及び置換基を有していてもよいアラルキル基が挙げられ、特に好ましい基としては無置換の、又はアルキルオキシカルボニルアミノ基により置換されたアルキル基が挙げられる。アルキル基は炭素数1〜10のものが好ましい。R3として特に好ましい基はメチル基、又は3-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノ)プロピル基であり、メチル基が最も好ましい。
【００３５】
R4及びR5の一方は水素原子であることが好ましい。
R4として好ましいものとしては、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、及び置換基を有していてもよいアラルキル基が挙げられ、特に好ましい基としては、置換基を有していてもよいアルキル基、及び置換基を有していてもよいアラルキル基が挙げられる。置換基を有していてもよいアルキル基としては、直鎖アルキル基であることが好ましく、炭素数は1〜10が好ましく、3〜5が特に好ましく、特に、無置換の、又は末端の炭素上に置換基としてジメチルアミノ基を有する、炭素数3〜5の直鎖アルキル基が好ましい。置換基を有していてもよいアラルキル基としては、無置換のベンジル基、2位、3位、若しくは4位が、塩素等のハロゲン原子若しくはメトキシ基により置換されたベンジル基、又は、3位若しくは4位がメチル基により置換されたベンジル基が挙げられ、特に無置換のベンジル基が好ましい。
【００３６】
R5として好ましいものとしては、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、及び置換基を有していてもよいアラルキル基が挙げられ、特に好ましい基は水素原子である。
【００３７】
R4及びR5が、それらが結合する窒素原子と一体になって、更なるヘテロ原子を含んでもよく、置換基を有していてもよい、飽和若しくは不飽和の環構造を形成する場合、当該環は芳香族環であっても脂肪族環であってもよく、環員数は例えば5〜7である。
【００３８】
式(I)の化合物又はその医薬として許容される塩は、水との水和物や、低級アルコール等との溶媒和物の形態であってよい。式(I)の化合物又はその医薬として許容される塩の範囲内には、それらの水和物又は溶媒和物の形態も包含される。
【００３９】
式(I)の化合物の医薬として許容される塩としては、酸部位を有する式(I)の化合物については無機塩基又は有機塩基との塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩、エタノールアミン塩、リジン塩、アルギニン塩、キノリン塩、ピリジン塩等の脂肪族又は複素環芳香族アミン塩、テトラメチルアンモニウム塩等の四級アンモニウム塩など、あるいは塩基部位を有する式(I)の化合物については、無機酸又は有機酸との塩、例えば塩酸塩、臭素酸塩、ヨウ素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸、乳酸塩、サリチル酸塩、マロン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、シュウ酸、アスコルビン酸塩等が挙げられる。
式(I)の化合物は実施例に記載の方法に基づいて製造することが可能である。
【００４０】
本発明は、式(I)の化合物又はその医薬として許容される塩を有効量含有する、ヘビ毒筋壊死因子の阻害剤、またはヘビ咬症の治療剤に関する。式(I)の化合物又はその医薬として許容される塩は、ハブ毒筋壊死因子により誘導される筋細胞の壊死を in vivo 又は in vitroにおいて効果的に阻害することができる。
【００４１】
ハブ毒筋壊死因子としては、ホスホリパーゼA2 (PLA2) アイソザイムが知られているがこれらには限定されない。ホスホリパーゼA2 (PLA2) アイソザイムとしてはBasic Protein II (BP II)、[Asp49]PLA2、Basic Protein I (BP I)、[Arg49]PLA2が挙げられる。
【００４２】
ハブ毒筋壊死因子以外の他のヘビ毒筋壊死因子としてはPmK49PLA2, PeBP(R)-I, PeBP(R)-II, BaTx, Cdr-12, Cdr-13, MT-II, ACL-I PLA2, myotoxin I, myotoxin II, myotoxin IV, bothropstoxin-I, crotoxin, PLA2-H1, ACL myotoxin, BaH1, bothropstoxin-IIが挙げられる。
【００４３】
本発明により治療されうるヘビ咬症としてはヒト、マウス、奄美のクロウサギ等の哺乳動物、鳥類におけるハブ、ヒメハブ、サキシマハブ、トカラハブ、台湾ハブ、ニホンマムシ、ツシママムシ、アスプクサリヘビ、ブッシュマスター、テルシオペロ、カイカサ、ハララカ、マレーマムシ、ヒガシダイヤガレアガラヘビ、ニシダイヤガラガラヘビ、ヨコバイガラガラヘビ、カスカベルガラガラヘビ、ティンバーガラガラヘビ、イワガラガラヘビ、オグロガラガラヘビ、フタスジモンガラガラヘビ、アカダイアガラガラヘビ、モハビガラガラヘビ、トラガラガラヘビ、パシフィックガラガラヘビ、ウィラードガラガラヘビ、ヒャッポダ、メキシコツノハブ、バーバーバイパー、ラッセルクサリヘビ、ハナビラクサリヘビ、ツノメクサリヘビ等のヘビによる咬症が挙げられる。日本国内では、沖縄産ハブよりも、特にBP IおよびBP IIを含む奄美大島および徳之島ハブによる咬症に、より効果的であると考えられる。
【００４４】
本発明に係るヘビ咬症の治療は、ヘビによって咬まれた後にできるだけ迅速に、式(I)の化合物又はその医薬として許容される塩を有効量、咬傷部位又はその近傍の筋肉組織に注射等の方法により投与することにより行うことができる。投与量は投与対象、症状等を考慮して適宜決定され特に限定されないが、50 μgから200 mgが好ましい。
【００４５】
式(I)の化合物又はその医薬として許容される塩を注射剤として投与する場合の適当な溶剤としては、例えば注射用蒸留水、塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール、静脈内注射用液体(例えばクエン酸及びクエン酸ナトリウム等の水溶液)、電解質溶液等、又はこれらの混合溶液が挙げられる。これらの注射剤は予め溶解したものの他、粉末のまま或いは適当な添加物を加えたものを用時溶解する形態もとりうる。
【００４６】
式(I)の化合物又はその医薬として許容される塩の他の投与形態としては各種の形態を選択でき、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤若しくは液剤等の経口剤、直腸投与剤、皮膚外用剤、吸入剤などの非経口投与剤等が挙げられる。
【００４７】
錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等の固形薬剤は、適当な添加物を使用して製造することができる。そのような添加物としては、例えば乳糖若しくはブドウ糖等の糖類、澱粉類、例えばステアリン酸等の脂肪酸、例えばメタケイ酸アルミン酸マグネシウム若しくは無水リン酸カルシウム等の無機塩、例えばポリビニルピロリドン若しくはポリアルキレングリコールなどの合成高分子、例えばステアリン酸カルシウム若しくはステアリン酸マグネシウム等の脂肪酸塩、例えばステアリルアルコール若しくはベンジルアルコール等のアルコール類、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロース等の合成セルロース誘導体、その他、水、ゼラチン、タルク、植物油、アラビアゴム等通常用いられる添加物が挙げられる。
【００４８】
液剤は、水、アルコール類又は例えば大豆油、ピーナッツ油、ゴマ油等の植物由来の油等の、液剤において通常用いられる適当な添加物を使用し、懸濁液、シロップ剤等の形態として製造される。
【００４９】
直腸投与剤を製造するには、活性成分及びカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの坐剤用基剤とを加温して溶融し型に流し込んで冷却するか、活性成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００５０】
皮膚外用剤を製造するには、活性成分をワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて、必要ならば加温して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後、ポリエチレンなどの不織布に展延してテープ剤とする。
【００５１】
吸入剤を製造するには、活性成分をフロンガスなどの噴射剤に溶解又は分散して耐圧容器に充填しエアロゾール剤とする。
【００５２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことはいうまでもない。
【実施例】
【００５３】
本実施例では式（I）で表される化合物群を合成した。
【００５４】
【表１】
2009161481.tif 000004
【００５５】
1H NMRおよび13C NMRスペクトルは日本分光社製のJEOL AL-400, AL-300およびAL-270を用いて測定した。水素原子の化学シフトは、NMR溶媒 (CDCl3: δ 7.26) 中の残留水素核を参照とした。炭素の化学シフトは、NMR溶媒(CDCl3: δ 77.0) 中の炭素共鳴を参照した。データは、下記のように示した：化学シフト、多重性(s=一重線、d=二重線、t=三重線、q=四重線、quin=五重線、sex=六重線、sep=七重線、m=多重線及び/又は多重共鳴、br=広帯)、カップリング定数（ヘルツ：Hz）、及び積分。質量スペクトルはJEOL MStation JMS-700 (FAB-MS)およびBruker Daltonics Reflex III (MALDI-TOF/MS）を用いて測定した。 IR スペクトルはThermo Nicolet AVATAR 370 FT-IRを用いて測定した。なお本実施例において、不斉炭素を有する化合物は特に言及しない限りラセミ混合物を意味する。
【００５６】
製造反応１
１−メチル−３−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（ペンチルアミノ）−１Ｈ−ピロ−ル−２、５Ｈ−ジオン（ＩＭ−５４）の合成
【００５７】
【化２】
2009161481.tif 000005
本化合物は新規細胞死抑制剤として、製造法を含め公知の非特許文献５（Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 3114-3117.）に報告済である。
分子量：325.40
分子式：C19H23N3O2
mp 110-111 ℃ 
IR (neat, cm-1) 3330, 2962, 2931, 2853, 1753, 1692, 1648, 1613, 1543, 1512, 1442, 1385, 1328, 1293, 1232, 742.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.75 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 0.96-1.17 (m, 4H), 1.35 (tt, J = 7.0 and 7.0 Hz, 2H), 3.06 (s, 3H), 3.13 (dt, J = 6.3 and 7.0 Hz, 2H), 3.82 (s, 3H), 5.17 (br s, 1H), 7.11 (s, 1H), 7.12 (dd, J = 7.3 and 8.0 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 7.3 and 8.3 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 13.80, 22.08, 23.87, 28.50, 29.83, 32.96, 43.66, 93.56, 103.32, 109.32, 119.65, 120.11, 121.85, 128.98, 129.35, 136.55, 142.77, 168.58, 173.03; 
MALDI-TOF/MS (positive ion, α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid) calcd for (M+) C19H23N3O2 325.18; found 325.25
Anal. calcd. for C19H23N3O2: C, 70.13; H, 7.12; N, 12.91; found: C, 70.07; H, 7.20; N, 12.82。
【００５８】
製造反応２
IM-57の合成
【００５９】
【化３】
2009161481.tif 000006
公知の方法（Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 3114-3117.）と同様の方法に従って、3-クロロ-1-メチル-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン（191 mg, 0.696 mmol）をTHF (3.5 mL) に溶解し、室温で市販のベンジルアミン（0.38 mL , 3.48 mmol）を加え、40℃で48時間攪拌した後、反応溶液を酢酸エチルで薄め、フロリジルでろ過して、減圧下濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ヘキサン→ヘキサン／酢酸エチル＝９／１→６／１）することによりIM-57 (0.226 g, 94%)が黄色固体として得られた。
分子量：345.39
分子式：C21H19N3O2
mp 170-171 ℃
IR (neat, cm-1) 3308, 3045, 3019, 2931, 1753, 1696, 1648, 1608, 1543, 1508, 1438, 1385, 1354, 1328, 1289, 1232, 1096, 978, 904, 794, 724, 693.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.07 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 4.31 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 5.42 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.02 (s, 1H), 7.14 (dd, J = 7.3 and 8.0 Hz, 1H), 7.20-7.29 (m, 4H), 7.33 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8.0 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 23.92, 32.95, 47.70, 95.27, 102.94, 109.43, 119.85, 120.44, 121.95, 127.47 (2C), 127.65, 128.62 (2C), 129.00, 129.52, 136.53, 137.69, 142.13, 168.55, 172.90.
MALDI-TOF/MS (positive ion, α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid) calcd for C21H19N3O2(M+) 345.15; found 345.15.
Anal calcd. for C21H19N3O2: C, 73.03; H, 5.54; N, 12.07; found C, 73.01; H, 5.71; N, 12.02。
【００６０】
製造反応３
IM-87の合成
【００６１】
【化４】
2009161481.tif 000007
公知の方法（Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 3114-3117.）と同様の方法に従って、3-ブロモ-1-メチル-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン（17.3 mg, 0.054 mmol）をTHF (0.54 mL) に溶解し、室温で市販のN,N−ジメチル−1，3−プロパンジアミン（0.203 mL , 1.63 mmol）を加え、40℃で72時間攪拌した後、反応溶液を酢酸エチルで薄め、フロリジルでろ過して、減圧下濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ジクロロメタン→酢酸エチル→アンモニア飽和ジクロロメタン）することによりIM-87 (15.0 mg, 82%)が橙色固体として得られた。
（アンモニア飽和ジクロロメタン： 30%アンモニア水と混合した後に分液したジクロロメタン）
分子量：340.42
分子式：C19H24N4O2
mp 120-122 ℃
IR (neat, cm-1) 3317, 2940, 2857, 2813, 2765, 1749, 1697, 1653, 1609, 1539, 1508, 1442, 1381, 1328, 1293, 1232, 1153, 1127, 1096, 1035, 1009, 978, 816, 732, 658.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.49 (tt, J = 6.4 and 6.4 Hz, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.13 (s, 6H), 2.21 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.05 (s, 3H), 3.24 (dt, J = 6.4 and 6.4 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 6.79 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 7.11 (s, 1H), 7.12 (dd, J = 7.1 and 8.1 Hz, 1H), 7.22 (dd, J = 7.1 and 8.3 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.1 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 23.75, 26.46, 32.93, 43.66, 45.17 (2C), 58.07, 92.74, 103.60, 109.23, 119.56, 120.20, 121.76, 129.05, 129.28, 136.52, 143.33, 168.51, 173.13.
MALDI-TOF/MS (positive ion, α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid) calcd for C19H24N4O2(M+) 340.19; found 340.18.
Anal. calced. for C19H24N4O2 C, 67.04; H, 7.11; N, 16.46: found C, 66.87; H, 7.18; N, 16.52。
【００６２】
製造反応４
IM-93の合成
工程1: 3,4-ジクロロ-1-イソプロピル-1H-ピロール-2,5-ジオンの合成
【００６３】
【化５】
2009161481.tif 000008
市販の２，３−ジクロロマレイン酸無水物（3.34 g, 20 mmol）を酢酸(20 mL)に溶解し、氷冷下イソプロピルアミン(1.87 mL, 22 mmol) をゆっくりと滴下した。室温に昇温後15時間攪拌した後、24時間還流した。氷冷下で冷却後、反応溶液を減圧下濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ヘキサン→ヘキサン／酢酸エチル＝５０／１→２０／１）し、3,4-ジクロロ-1-イソプロピル-1H-ピロール-2,5-ジオン (2.21 g, 49%)が白色固体として得られた。
分子量：208.04
分子式：C7H7Cl2NO2
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.41 (d, J = 7.1 Hz, 6H), 4.41 (sep, J = 7.1 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 20.13 (2C), 44.86, 132.99 (2C), 162.82 (2C)。
【００６４】
工程2: 3-クロロ-4-(1H-インドール-3-イル)-1-イソプロピル-1H-ピロール-2,5-ジオンの合成
【００６５】
【化６】
2009161481.tif 000009
市販のインドール（1.27 g, 10.8 mmol）をTHF (15 mL) に溶解し、40 ℃に昇温後0.86 MのエチルマグネシウムブロミドのTHF溶液（12.6 mL, 10.8 mmol）をゆっくりと滴下した。10分攪拌した後、3,4-ジクロロ-1-イソプロピル-1H-ピロール-2,5-ジオン（1.02 g, 4.91 mmol）を加え20分攪拌した。氷冷下で冷却後、20%クエン酸水溶液を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮し、得られた固体を酢酸エチルより再結晶することにより3-クロロ-4-(1H-インドル-3-イル)-1-イソプロピル-1H-ピロール-2,5-ジオン(1.14 g, 80%)が橙色固体として得られた。
分子量：288.73
分子式：C15H13ClN2O2
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.47 (d, J = 6.8 Hz, 6H), 4.48 (sep, J = 6.8 Hz, 1H), 7.26 (dd, J = 8.1 and 8.1 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 8.1 and 8.1 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.96 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.87 (br s, 1H)。
【００６６】
工程3: 3-クロロ-1-イソプロピル-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオンの合成
【００６７】
【化７】
2009161481.tif 000010
3-クロロ-4-(1H-インドール-3-イル)-1-イソプロピル-1H-ピロール-2,5-ジオン（1.14 g, 3.94 mmol）をDMF (20 mL) に溶解し、氷冷下で炭酸カリウム（1.6 g, 11.8 mmol）およびヨウ化メチル（0.73 mL, 11.8 mmol）を加え、2時間攪拌した後、水を加えて反応を停止した。酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ヘキサン／酢酸エチル＝２０／１→１０ ／１→４／１）することにより3-クロロ-1-イソプロピル-4-(1-メチル-1H-インドル-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン (1.09 g, 91%)が橙色固体として得られた。
分子量：302.76
分子式：C16H15ClN2O2
mp 201-206 ℃ (sub)
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.47 (d, J = 6.8 Hz, 6H), 3.88 (s, 3H), 4.48 (sep, J = 6.8 Hz, 1H), 7.25 (dd, J = 8.1 and 8.1 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 8.1 and 8.1 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 8.06 (d, J = 8.1 Hz, 1H).
MALDI-TOF/MS (positive ion, α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid) calcd for C16H15ClN2O2 (M+) 302.08; found 301.98。
【００６８】
工程4: IM-93の合成
【００６９】
【化８】
2009161481.tif 000011
3-クロロ-1-イソプロピル-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン （1.09 g, 3.59 mmol）をTHF (18 mL) に溶解し、室温で市販のN,N−ジメチル−1，3−プロパンジアミン（2.24 mL , 18.0 mmol）を加え、40 ℃で72時間攪拌した後、反応溶液を酢酸エチルで薄め、フロリジルでろ過して、減圧下濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ジクロロメタン→酢酸エチル→アンモニア飽和ジクロロメタン）することによりIM-93 (1.19 g, 90%)が橙色固体として得られた。
（アンモニア飽和ジクロロメタン： 30%アンモニア水と混合した後に分液したジクロロメタン）
分子量：368.47
分子式：C21H28N4O2
mp 102-103 ℃
IR (neat, cm-1) 3334, 2971, 2936, 2866, 2818, 2787, 2765, 1753, 1696, 1652, 1613, 1539, 1504, 1455, 1407, 1381, 1354, 1328, 1289, 1237, 1149, 1131, 1022, 860, 733, 658.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.42 (d, J = 6.8 Hz, 6H), 1.49 (tt, J = 6.4 and 6.4 Hz, 2H), 2.19 (s, 6H), 2.21 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.24 (dt, J = 6.4 and 6.4 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 4.37 (sep, J = 6.8 Hz, 1H), 6.66 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 6.79 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 7.11 (s, 1H), 7.11 (dd, J = 7.1 and 8.1 Hz, 1H), 7.22 (dd, J = 7.1 and 8.3 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 8.1 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 20.31 (2C), 26.56, 32.91, 42.53, 43.64, 45.25 (2C), 58.15, 92.48, 103.76, 109.19, 119.51, 120.29, 121.72, 129.14, 129.28, 136.53, 142.93, 168.23, 172.95. 
MALDI-TOF/MS (positive ion, α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid) calcd for C21H28N4O2(M+) 368.22; found 368.24.
Anal calcd. for C21H28N4O2: C, 68.45; H, 7.66; N, 15.21; found C, 68.37; H, 7.77; N, 15.12。
【００７０】
製造反応５
IM-103の合成
工程1: tert-ブチル  3-(3-(4-クロロ -2,5-ジヒドロ−1−メチル−2,5−ジオキソ−1H-ピロール-3-イル)-1H-インドール-1-イル) プロピルカーバメートの合成
【００７１】
【化９】
2009161481.tif 000012
3-クロロ-4-(1H-インドル-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン（1.01 g, 3.88 mmol）およびtert-ブチル  3-ヨードプロピルカーバメート (3.32 g, 11.6 mmol)をDMF (7.7 mL) に溶解し、氷冷下で炭酸カリウム（1.60 g, 11.6 mmol）を加え、40 ℃で2時間攪拌した後、水を加えて反応を停止した。酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１→２／１）することによりtert-ブチル  3-(3-(4-クロロ-2,5-ジヒドロ−1−メチル−2,5−ジオキソ−1H-ピロール-3-イル)-1H-インドール-1-イル) プロピルカーバメート (0.469 g, 29%)が赤色アモルファスとして得られた。 
分子量：417.89
分子式：C21H24ClN3O4
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.44 (s, 9H), 2.09 (tt, J = 6.8 and 7.0 Hz, 2H), 3.13 (s, 3H), 3.17 (br, 2H), 4.25 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 4.60-4.70 (br, 1H),  7.26 (dd, J = 8.0 and 8.0 Hz, 1H), 7.31 (dd, J = 8.0 and 8.0 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 8.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 
MALDI-TOF/MS (positive ion, α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid) calcd for C21H24ClN3O4 ([M]+) 417.15; found 417.27。
【００７２】
工程２: IM-103の合成
【００７３】
【化１０】
2009161481.tif 000013
公知の方法（Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 3114-3117.）と同様の方法に従って、tert-ブチル  3-(3-(4-クロロ -2,5-ジヒドロ−1−メチル−2,5−ジオキソ−1H-ピロール-3-イル)-1H-インドール-1-イル) プロピルカーバメート（35.3 mg, 0.085 mmol）をTHF (0.85 mL) に溶解し、室温で市販のペンチルアミン（196 μL, 1.68 mmol）を加え、40℃で96時間攪拌した後、反応溶液を酢酸エチルで薄め、フロリジルでろ過して、減圧下濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ヘキサン→ヘキサン／酢酸エチル＝4／１）することによりIM-103 (31.2 mg, 78%)が赤色アモルファスとして得られた。
分子量：468.59
分子式：C26H36N4O4
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.76 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 0.98-1.16 (m, 4H), 1.36 (tt, J = 7.0 and 7.0 Hz, 2H), 1.36 (s, 9H), 2.05 (tt, J = 6.9 and 6.9 Hz, 2H), 3.06 (s, 3H), 3.10-3.20 (m, 4H), 4.19 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 4.60 (brs, 1H), 5.21 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 7.11 (dd, J = 7.5 and 7.5 Hz, 1H), 7.16 (s, 1H), 7.21 (dd, J = 7.5 and 7.5 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 7.5 Hz, 1H).
13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 13.80, 22.09, 23.83, 28.34 (3C), 28.52, 29.83, 30.48, 38.04, 43.70, 43.81, 79.44, 93.52, 103.79, 109.37, 119.77, 102.41, 121.94, 128.30, 129.06, 135.73, 142.77, 155.98, 168.52, 172.90.
FAB-LRMS (positive ion, m-nitro benzyl alcohol) calcd for C26H36N4O4(M+) 468.27; found 467.85。
【００７４】
製造反応６
IM-109の合成
工程1: 3-クロロ-4-(1,5-ジメチル-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオンの合成
【００７５】
【化１１】
2009161481.tif 000014
市販の5−メチルインドール（274 mg, 2.1 mmol）をTHF (4.0 mL) に溶解し、40 ℃に昇温後0.86 MのエチルマグネシウムブロミドのTHF溶液（2.4 mL, 2.1 mmol）をゆっくりと滴下した。10分攪拌した後、3,4-ジクロロ-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン（171 mg, 0.95 mmol）を加え20分攪拌した。氷冷下で冷却後、20%クエン酸水溶液を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮し、3-クロロ-4-(5-メチル-1H-インドル-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオンの粗生成物を得た。
【００７６】
3-クロロ-4-(5-メチル-1H-インドル-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオンの粗生成物をDMF (4.0 mL) に溶解し、氷冷下で炭酸カリウム（368 mg, 2.7 mmol）およびヨウ化メチル（0.17 mL, 2.7 mmol）を加え、2時間攪拌した後、水を加えて反応を停止した。酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ヘキサン／酢酸エチル＝２０／１→１０ ／１→４／１）することにより3-クロロ-4-(1,5-ジメチル-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン(256 mg, 93%)が橙色固体として得られた。
分子量：288.73
分子式：C15H13ClN2O2
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ2.49 (s, 3H), 3.14 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 7.16 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.86 (s, 1H)。
【００７７】
工程2: IM-109の合成
【００７８】
【化１２】
2009161481.tif 000015
3-クロロ-4-(1,5-ジメチル-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン（20.7 mg, 0.072 mmol）をTHF (0.72 mL) に溶解し、室温で市販のN,N−ジメチル−1，3−プロパンジアミン（0.09 mL, 0.72 mmol）を加え、40 ℃で36時間攪拌した後、反応溶液を酢酸エチルで薄め、フロリジルでろ過して、減圧下濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ジクロロメタン→酢酸エチル→アンモニア飽和ジクロロメタン）することによりIM-109 (18.5 mg, 73%)が赤色アモルファスとして得られた。
（アンモニア飽和ジクロロメタン： 30%アンモニア水と混合した後に分液したジクロロメタン）
分子量：354.45
分子式：C20H26N4O2
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ1.50 (tt, J = 6.6 and 6.6 Hz, 2H), 2.13 (s, 6H), 2.20 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.44 (s, 3H), 3.05 (s, 3H), 3.24 (dt, J = 5.7 and 6.6 Hz, 2H), 3.78 (s, 3H), 6.67 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.06 (s, 1H), 7.19 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.28 (s, 1H); 
13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ21.48, 23.73, 26.60, 32.94, 43.58, 45.20 (2C) 58.06, 93.10, 102.98, 108.95, 119.82, 123.41, 128.78, 129.25, 129.33, 135.01, 143.21, 168.57, 173.14; 
FAB-LRMS (positive ion, m-nitro benzyl alcohol) calcd for C20H26N4O2(M+) 354.21; found 354.06。
【００７９】
製造反応7
IM-113の合成
工程1: 3-クロロ-4-(1,6-ジメチル-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオンの合成
【００８０】
【化１３】
2009161481.tif 000016
市販の6−メチルインドール（168 mg, 1.3 mmol）をTHF (2.5 mL) に溶解し、40 ℃に昇温後0.86 MのエチルマグネシウムブロミドのTHF溶液（1.5 mL, 1.3 mmol）をゆっくりと滴下した。10分攪拌した後、3,4-ジクロロ-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン（104 mg, 0.58 mmol）を加え20分攪拌した。氷冷下で冷却後、20%クエン酸水溶液を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮し、3-クロロ-4-(6-メチル-1H-インドル-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオンの粗生成物を得た。
【００８１】
3-クロロ-4-(6-メチル-1H-インドル-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオンの粗生成物をDMF (2.0 mL) に溶解し、氷冷下で炭酸カリウム（240 mg, 1.7 mmol）およびヨウ化メチル（0.11 mL, 1.7 mmol）を加え、2時間攪拌した後、水を加えて反応を停止した。酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ヘキサン／酢酸エチル＝２０／１→１０ ／１→４／１）することにより3-クロロ-4-(1,6-ジメチル-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン(127 mg, 83%)が橙色固体として得られた。
分子量：288.73
分子式：C15H13ClN2O2
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ2.49 (s, 3H), 3.16 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 7.10 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.26 (dd, J = 2.4 and 7.5 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 2.4 Hz, 1H)。
【００８２】
工程2: IM-113の合成
【００８３】
【化１４】
2009161481.tif 000017
3-クロロ-4-(1,6-ジメチル-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン（20.5 mg, 0.071 mmol）をTHF (0.71 mL) に溶解し、室温で市販のN,N−ジメチル−1，3−プロパンジアミン（0.09 mL , 0.71 mmol）を加え、40 ℃で36時間攪拌した後、反応溶液を酢酸エチルで薄め、フロリジルでろ過して、減圧下濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ジクロロメタン→酢酸エチル→アンモニア飽和ジクロロメタン）することによりIM-113 (14.5 mg, 58%)が赤色アモルファスとして得られた。
（アンモニア飽和ジクロロメタン： 30%アンモニア水と混合した後に分液したジクロロメタン）
分子量：354.45
分子式：C20H26N4O2
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ1.49 (tt, J = 6.6 and 6.6 Hz, 2H), 2.13 (s, 6H), 2.21 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.48 (s, 3H), 3.05 (s, 3H), 3.25 (dt, J = 5.7 and 6.6 Hz, 2H), 3.77 (s, 3H), 6.70 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.03 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 1H).
13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ21.81, 23.73, 26.57, 32.83, 43.65, 45.22 (2C) 58.09, 93.16, 103.46, 109.22, 119.91, 121.36, 126.94, 128.70, 131.59, 136.94, 143.16, 168.59, 173.12.
FAB-LRMS (positive ion, m-nitro benzyl alcohol) calcd for C20H26N4O2(M+) 354.21; found 354.05。
【００８４】
製造反応8
IM-106の合成
工程1: 3-クロロ-4-(7-メチル-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオンの合成
【００８５】
【化１５】
2009161481.tif 000018
市販の7−メチルインドール（122 mg, 0.93 mmol）をTHF (2.0 mL) に溶解し、40 ℃に昇温後0.86 MのエチルマグネシウムブロミドのTHF溶液（1.1 mL, 0.93 mmol）をゆっくりと滴下した。10分攪拌した後、3,4-ジクロロ-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン（76 mg, 0.42 mmol）を加え20分攪拌した。氷冷下で冷却後、20%クエン酸水溶液を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）することにより3-クロロ-4-(7-メチル-1H-インドル-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン（116 mg, 100%）を得た。
分子量：274.70
分子式：C14H11ClN2O2
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ2.54 (s, 3H), 3.16 (s, 3H), 7.11 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 7.6 and 8.4 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 8.80 (bs, 1H)。
【００８６】
工程2: 3-クロロ-4-(1,7-ジメチル-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオンの合成
【００８７】
【化１６】
2009161481.tif 000019
3-クロロ-4-(7-メチル-1H-インドル-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン（96 mg, 0.35 mmol）をDMF (1.2 mL) に溶解し、氷冷下で炭酸カリウム（142 mg, 1.1 mmol）およびヨウ化メチル（0.066 mL, 1.1 mmol）を加え、2時間攪拌した後、水を加えて反応を停止した。酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮し、粗生成物を酢酸エチルから再結晶することにより3-クロロ-4-(1,7-ジメチル-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン (99 mg, 98%)が橙色固体として得られた。
分子量：288.73
分子式：C15H13ClN2O2
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ2.79 (s, 3H), 3.14 (s, 3H), 4.14 (s, 3H), 7.01 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.11 (dd, J = 7.2 and 7.6 Hz, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.89 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H)。
【００８８】
工程3: IM-106の合成
【００８９】
【化１７】
2009161481.tif 000020
3-クロロ-4-(1,7-ジメチル-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン（19.3 mg, 0.067 mmol）をTHF (0.67 mL) に溶解し、室温で市販のN,N−ジメチル−1，3−プロパンジアミン（0.18 mL , 1.41 mmol）を加え、40 ℃で18時間攪拌した後、反応溶液を酢酸エチルで薄め、フロリジルでろ過して、減圧下濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ジクロロメタン→酢酸エチル→アンモニア飽和ジクロロメタン）することによりIM-106 (18.5 mg, 78%)が赤色アモルファスとして得られた。
（アンモニア飽和ジクロロメタン： 30%アンモニア水と混合した後に分液したジクロロメタン）
分子量：354.45
分子式：C20H26N4O2
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ1.49 (tt, J = 6.3 and 6.3 Hz, 2H), 2.14 (s, 6H), 2.21 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.76 (s, 3H), 3.04 (s, 3H), 3.22 (dt, J = 5.4 and 6.3 Hz, 2H), 4.07 (s, 3H), 6.75 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 6.96 (dd, J = 6.9 and 7.8 Hz, 1H), 6.98 (s, 1H), 7.30 (d, J = 7.8 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ19.66, 23.74, 26.49, 36.92, 43.59, 45.21(2C), 58.10, 92.62, 103.37, 118.34, 119.79, 121.21, 124.42, 130.22, 130.93, 135.24, 143.40, 168.53, 173.15.
FAB-LRMS (positive ion, m-nitro benzyl alcohol) calcd for C20H26N4O2(M+) 354.21; found 354.03。
【００９０】
製造反応９
IM-174の合成
工程1: 3-クロロ-4-(5-ブロモ-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオンの合成
【００９１】
【化１８】
2009161481.tif 000021
市販の5−ブロモインドール（1.4 g, 7.0 mmol）をTHF (7.0 mL) に溶解し、40 ℃に昇温後0.91 MのエチルマグネシウムブロミドのTHF溶液（6.4 mL, 7.0 mmol）をゆっくりと滴下した。10分攪拌した後、3,4-ジクロロ-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン（0.57 g, 3.2 mmol）を加え20分攪拌した。氷冷下で冷却後、20%クエン酸水溶液を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）することにより3-クロロ-4-(5-ブロモ-1H-インドル-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン（1.7 g, 72%）を得た。
分子量：339.57
分子式：C13H8BrClN2O2
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.18 (s, 3H), 7.24 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.03 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 8.78 (br s, 1H)。
【００９２】
工程2: 3-クロロ-4-(5-ブロモ-1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオンの合成
【００９３】
【化１９】
2009161481.tif 000022
3-クロロ-4-(5-ブロモ-1H-インドル-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン（665 mg, 1.96 mmol）をDMF (10 mL) に溶解し、氷冷下で炭酸カリウム（541 mg, 3.91 mmol）およびヨウ化メチル（0.24 mL, 3.91 mmol）を加え、2時間攪拌した後、水を加えて反応を停止した。酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮し、粗生成物を酢酸エチルから再結晶することにより3-クロロ-4-(5-ブロモ-1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン (540 mg, 78%)が橙色固体として得られた。
分子量：353.60
分子式：C14H10BrClN2O2
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.18 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 7.15 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.03 (s, 1H), 8.09 (s, 1H)。
【００９４】
工程3: IM-174の合成
【００９５】
【化２０】
2009161481.tif 000023
3-クロロ-4-(5-ブロモ-1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1-メチル-1H-ピロール-2,5-ジオン（191 mg, 0.562 mmol）をTHF (3.0 mL) に溶解し、室温で市販のベンジルアミン（0.30 mL , 2.81 mmol）を加え、室温で60時間攪拌した後、反応溶液を酢酸エチルで薄め、フロリジルでろ過して、減圧下濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）することによりIM-174 (183 mg, 77%)が橙色固体として得られた。
分子量：424.29
分子式：C21H18BrN3O2
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ3.09 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 4.31 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 5.57 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 7.00-7.09 (m, 5H), 7.20 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 2.1 and 9.0 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 2.1 Hz, 1H)。
【００９６】
試験例
ヒト骨格筋細胞SkMC細胞において、ハブ毒ホスホリパーゼA2 (PLA2) アイソザイムとして[Asp49]PLA2またはBasic Protein II（BPII）で細胞死を誘導する条件で、IM誘導体の細胞死抑制効果を調べた。さらにマウス（２週齢）をもちいて、in vivoでのIM誘導体の細胞死抑制効果を検討した。
【００９７】
以下の試験において用いた[Asp49]PLA2およびBPIIは非特許文献7および8記載の手順により調製されたものである。
【００９８】
試験例１：PLA2による細胞死に対する抑制効果
正常ヒト骨格筋細胞SkMC細胞を96穴プレートに播種し、12-24時間培養した。ついでこれにDMSO（化合物無添加群）ないしは各化合物のDMSO溶液（終濃度10 μM）を加えた。その後[Asp49]PLA2を終濃度500 μg/mLとなるように培地を加え、12時間培養して細胞死を誘導した。最後にCell Counting Kit（同仁化学）を加え、３時間培養後により細胞生存率の指標として450 nmの吸光度（A450）を測定した（図１）。
【００９９】
試験例２：BPIIによる細胞死に対する抑制効果
正常ヒト骨格筋細胞SkMC細胞を96穴プレートに播種し、12-24時間培養した。ついでこれにDMSO（化合物無添加群）ないしは各化合物のDMSO溶液（終濃度5 μM）を加えた。その後BPIIを終濃度200 μg/mLとなるように培地を加え、12時間培養して細胞死を誘導した。最後にCell Counting Kit（同仁化学）を加え、３時間培養後により細胞生存率の指標として450nmの吸光度（A450）を測定した（図２）。
【０１００】
試験例１及び２の結果、IM誘導体はヘビ毒筋壊死因子である[Asp49]PLA2およびBasic Protein II（BPII）による骨格筋の細胞死を抑制することがわかった。このことからIM誘導体はヘビ毒筋壊死因子阻害剤として有効であることが明らかとなった。
【０１０１】
試験例３：BPIIによる筋壊死に対するin vitroでの抑制効果
４週齢のICRマウス（♂，17〜19 g）を予備飼育後、ハブ毒筋壊死因子BPII 20μgとIM-93 60μg（コントロールとしてIM-93を0μg）を、マウス右後足、大腿筋部に注入し、２４時間後に解剖した。１０％ホルマリン固定後、エタノール（７０％，８０％，９０％，９５％，９９％各段階）で脱水、キシレンで置換した後、パラフィンでの包埋をおこなった。組織薄膜切片を作成し、HE染色後、検鏡した。図3のAにコントロールの観察結果を、BにIM-93を投与した場合の観察結果をそれぞれ示す。
【０１０２】
その結果、BPII 20μgの投与で筋組織の強い壊死がみられた(図3(A))のに対して、IM-93の投与により、BPIIによる壊死を完全には抑えてはいないものの、壊死は軽減され、筋壊死を部分的に抑制している(図3(B))ことがわかった。
【０１０３】
参考例
本参考例では、従来からハブ咬症の治療に使用されているantiveninと呼ばれるウマ血清抗毒素の細胞死抑制効果の有無を確認した。
【０１０４】
ヒト骨格筋細胞SkMC細胞において、ハブ毒PLA2アイソザイムとしてBasic Protein II（BPII）で細胞死を誘導する条件で、ウマ血清抗毒素（ロット番号33、34の2種）の細胞死抑制効果を調べた。
【０１０５】
正常ヒト骨格筋細胞SkMC細胞を96穴プレートに播種し、12-24時間培養した。ついでこれに抗毒素無添加群ないしは抗毒素（終濃度0.16, 0.8, 4, 20%）を加えた。その後BPIIを終濃度250 μg/mLとなるように培地を加え、12時間培養して細胞死を誘導した。最後にCell Counting Kit（同仁化学）を加え、３時間培養後により細胞生存率の指標として450nmの吸光度（A450）を測定した（図４）。
【０１０６】
その結果、はぶウマ抗毒素はヘビ毒筋壊死因子であるBasic Protein II（BPII）による骨格筋の細胞死を抑制しないことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】[Asp49]PLA2のSkMC細胞に対する細胞毒性への本発明の化合物による抑制効果（試験例１）を示す図である。
【図２】BPIIのSkMC細胞に対する細胞毒性への本発明の化合物による抑制効果（試験例２）を示す図である。
【図３】マウス大腿筋部組織像を示す写真である。(A) BPIIによる筋組織の壊死; (B) IM-93誘導体の抑制効果
【図４】BPIIのSkMC細胞に対する細胞毒性への抑制効果（参考例）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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