(57)【要約】【課題】分化活性の測定に用いた幹細胞を無駄にすることなく、培養途中の任意の過程で幹細胞の分化活性を解析する。【解決手段】幹細胞を含む細胞懸濁液中に高周波電圧を加えて高周波不平等電界を発生させ、該高周波不平等電界中において幹細胞に働く誘電泳動力と重力および浮力のバランスから、幹細胞の誘電泳動特性を測定する測定ステップＳ１と、該測定ステップＳ１において測定された誘電泳動特性と、所定の閾値とを比較する比較ステップＳ２と、該比較ステップＳ２による比較の結果に基づいて幹細胞の分化活性を判定する判定ステップＳ３とを備える分化活性解析方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を含む細胞懸濁液中に高周波電圧を加えて高周波不平等電界を発生させ、該高周波不平等電界中において前記幹細胞に働く誘電泳動力と重力および浮力のバランスから、前記幹細胞の誘電泳動特性を測定する測定ステップと、
該測定ステップにおいて測定された誘電泳動特性と、所定の閾値とを比較する比較ステップと、
該比較ステップによる比較の結果に基づいて幹細胞の分化活性を判定する判定ステップとを備える分化活性解析方法。
【請求項２】
前記測定ステップが、細胞懸濁液中に加える高周波電圧の周波数を変化させて誘電泳動の周波数特性を測定し、
前記比較ステップが、所定の周波数の誘電泳動特性と、当該周波数に対応する所定の閾値とを比較する請求項１に記載の分化活性解析方法。
【請求項３】
幹細胞を含む細胞懸濁液内に配置される一対の電極と、
該電極間に高周波電圧を加えて高周波不平等電界を発生させる高周波電源と、
前記電極間に供給された幹細胞の静止位置を測定する静止位置測定部と、
該静止位置測定部により測定された幹細胞の静止位置に基づいて、前記幹細胞の誘電泳動特性を算出する特性算出部と、
該特性算出部により測定された幹細胞の誘電泳動特性を所定の閾値と比較して、幹細胞の分化活性を判定する分化活性判定部とを備える分化活性解析装置。
【請求項４】
前記高周波電源が、電極間に加える高周波電圧の周波数を変化させ、
前記特性算出部が、前記幹細胞の誘電泳動の周波数特性を算出し、
前記分化活性判定部が、所定の周波数の誘電泳動特性と、当該周波数に対応する所定の閾値とを比較する請求項３に記載の分化活性解析装置。
【請求項５】
前記一対の電極間の間隔が５００μｍ以下である請求項３または請求項４に記載の分化活性解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分化活性解析方法および分化活性解析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、幹細胞の分化活性を測定、評価する方法として、例えば、培養中の幹細胞のアルカリフォスファターゼ活性を観察する方法がある。この方法は、培養中の幹細胞の一部を取り出してアルカリフォスファターゼ染色を行い、染色が見られた場合に幹細胞が骨分化能を有するとの判断を行うものである（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−１２９７３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、アルカリフォスファターゼ活性を観察する方法は、上述したように、培養中の幹細胞の一部を取り出して潰すことにより細胞膜の内部の物質にアルカリフォスファターゼを作用させる必要がある。したがって、一旦観察に用いられた幹細胞は再度培養工程に戻すことはできず、廃棄しなければならないという不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、分化活性の測定に用いた幹細胞を無駄にすることなく、培養途中の任意の過程で幹細胞の分化活性を解析することができる分化活性解析方法および分化活性解析装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、幹細胞を含む細胞懸濁液中に高周波電圧を加えて高周波不平等電界を発生させ、該高周波不平等電界中において前記幹細胞に働く誘電泳動力と重力および浮力のバランスから、前記幹細胞の誘電泳動特性を測定する測定ステップと、該測定ステップにおいて測定された誘電泳動特性と、所定の閾値とを比較する比較ステップと、該比較ステップによる比較の結果に基づいて幹細胞の分化活性を判定する判定ステップとを備える分化活性解析方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、測定ステップにおいて測定された誘電泳動特性が比較ステップにおいて所定の閾値と比較され、その比較の結果に基づいて幹細胞の分化活性が判定される。測定ステップにおける誘電泳動特性の測定は、高周波不平等電界内に幹細胞を静止させて、幹細胞に働く誘電泳動力と重力および浮力のバランスにより測定するので、幹細胞に対して非侵襲であり、測定に使用した幹細胞はそのまま培養工程に戻すことができる。したがって、分化活性の測定に用いた幹細胞を無駄にすることなく、培養途中の任意の過程で幹細胞の分化活性を解析することができる。
【０００８】
また、上記発明においては、前記測定ステップが、細胞懸濁液中に加える高周波電圧の周波数を変化させて誘電泳動の周波数特性を測定し、前記比較ステップが、所定の周波数の誘電泳動特性と、当該周波数に対応する所定の閾値とを比較することとしてもよい。
このようにすることで、誘電泳動特性が大きくなる周波数を選んで判定することができ、判定精度を向上することができる。
【０００９】
また、本発明は、幹細胞を含む細胞懸濁液内に配置される一対の電極と、該電極間に高周波電圧を加えて高周波不平等電界を発生させる高周波電源と、前記電極間に供給された幹細胞の静止位置を測定する静止位置測定部と、該静止位置測定部により測定された幹細胞の静止位置に基づいて、前記幹細胞の誘電泳動特性を算出する特性算出部と、該特性算出部により測定された幹細胞の誘電泳動特性を所定の閾値と比較して、幹細胞の分化活性を判定する分化活性判定部とを備える分化活性解析装置を提供する。
【００１０】
本発明によれば、高周波電源から細胞懸濁液内に配置した一対の電極間に供給した高周波電圧により、電極間に高周波不平等電界を発生させ、該高周波不平等電界内に幹細胞を静止させて、静止位置測定部により静止位置を測定する。そして、測定された静止位置に基づいて特性算出部が幹細胞の誘電泳動特性を算出し、分化活性判定部が、所定の閾値と誘電泳動特性とを比較することにより幹細胞の分化活性が判定される。これにより、非侵襲に幹細胞の分化活性を解析することができる。
【００１１】
上記発明においては、前記高周波電源が、電極間に加える高周波電圧の周波数を変化させ、前記特性算出部が、前記幹細胞の誘電泳動の周波数特性を算出し、前記分化活性判定部が、所定の周波数の誘電泳動特性と、当該周波数に対応する所定の閾値とを比較することとしてもよい。
このようにすることで、誘電泳動特性が大きくなる周波数を選んで判定することができ、判定精度を向上することができる。
また、上記発明においては、前記一対の電極間の間隔が５００μｍ以下であってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、分化活性の測定に用いた幹細胞を無駄にすることなく、培養途中の任意の過程で幹細胞の分化活性を解析することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の一実施形態に係る分化活性解析方法および分化活性解析装置について、図１〜図５を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る分化活性解析方法は、図１に示されるように、誘電泳動特性を測定する測定ステップＳ１と、測定された誘電泳動特性と所定の閾値とを比較する比較ステップＳ２と、該比較ステップＳ２による比較の結果、幹細胞の分化活性を判定する判定ステップＳ３とを備えている。
【００１４】
測定ステップＳ１は、図２に示されるように、針電極１とプレート電極２とを対向させた容器３内に幹細胞Ａを含む細胞懸濁液を貯留し、電極１，２間に高周波電圧を加えることで、細胞懸濁液を構成する媒質Ｃ内に高周波不平等電界Ｂを形成し、電極１，２間に配置された幹細胞Ａの静止位置を測定することにより行われる。
高周波不平等電界Ｂに配置された幹細胞Ａには、下式（１）に示される誘電泳動力が作用する。
【００１５】
【数１】
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【００１６】
ここで、符号ｒは幹細胞Ａの半径、εｍは周囲媒質Ｃの誘電率、Ｅは電場強度を示す。Ｒｅ［Ｋ（ω）］は、下式（２）で示されるClausis-Mossotti関数の実数部分である。
【００１７】
【数２】
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【００１８】
電極１，２間に配置された幹細胞Ａには重力、浮力および誘電泳動力が作用するので、これらがバランスして、下式（３）が成立する幹細胞Ａの静止位置を測定する。
【００１９】
【数３】
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【００２０】
ここで、ρＰ：幹細胞Ａの密度、ρｍ：周囲媒質Ｃの密度を示している。
この式（３）から下式（４）が導かれるが、Ｒｅ［Ｋ（ω）］は、幹細胞Ａの径には依存しない。そこで、このＲｅ［Ｋ（ω）］を幹細胞Ａの誘電泳動特性とみなすこととする。
【００２１】
【数４】
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【００２２】
式（１）の右辺の誘電泳動力は、幹細胞Ａと周囲の媒質Ｃの誘電率、幹細胞Ａの径、媒質Ｃの粘性率、電場強度の２乗の勾配（∇Ｅ２）により決定する。すなわち、幹細胞Ａの誘電率によって幹細胞Ａへ作用する誘電泳動力が変化する。また、∇Ｅ2は、不平等電界Ｂ内では電極１，２間の位置の関数であるため、幹細胞Ａに作用する誘電泳動力は電極１，２間の位置によって異なる。
【００２３】
比較ステップＳ２は、測定ステップＳ１において測定された誘電泳動特性を、高周波電圧の周波数毎に記憶されている閾値と比較することにより行われる。
判定ステップＳ３は、比較ステップＳ２における比較の結果、所定の周波数における誘電泳動特性が、当該周波数に対応して記憶されている閾値よりも大きい場合に、幹細胞Ａの分化活性が十分にあると判定し、閾値以下の場合には、幹細胞Ａの分化活性が足りないと判定するようになっている。
【００２４】
発明者らは、図３に示されるように、ラットの幹細胞Ａの培養における継代回数と誘電泳動特性との関係を測定し、継代回数１〜３回までの誘電泳動特性と継代回数４回以上の誘電泳動特性とで顕著な差が存在することを発見した。そして、同じラットの幹細胞Ａについて、継代回数３回まではアルカリフォスファターゼ活性が見られる一方、継代回数４回以上になるとアルカリフォスファターゼ活性が見られないことを確認した。
【００２５】
すなわち、幹細胞Ａの誘電泳動特性は幹細胞Ａの分化活性の指標となっていると判断することができ、周波数毎に記憶している閾値との比較により簡易に分化活性を判定できることがわかる。
そこで、例えば、図３において最も誘電泳動特性の高い５００ｋＨｚの高周波電圧を加えたときの継代回数と誘電泳動特性との関係を図４に示す。この図４によれば、例えば、閾値として１．４程度の値を設定しておくことにより、閾値との比較により容易に分化活性を判定することができる。
【００２６】
このような分化活性解析方法は、図５に示される分化活性解析装置１０により実施することができる。
この分化活性解析装置１０は、幹細胞Ａを含む細胞懸濁液を貯留した容器３内に配置される一対の電極１．２と、該電極１．２間に高周波電圧を加えて高周波不平等電界Ｂを発生させる高周波電源１１と、電極１，２間に供給された幹細胞Ａの静止位置を測定する静止位置測定部１２と、該静止位置測定部１２により測定された幹細胞Ａの静止位置に基づいて、幹細胞Ａの誘電泳動特性を算出する特性算出部１３と、該特性算出部１３により測定された幹細胞Ａの誘電泳動特性を所定の閾値と比較して、幹細胞Ａの分化活性を判定する分化活性判定部１４とを備えている。
【００２７】
静止位置測定部１２は、例えば、電極１，２対の側方に配置されたカメラ１５と画像処理部１６とを備え、カメラ１５において取得された画像を画像処理部１６において処理することで、幹細胞Ａの静止位置を測定することができるようになっている。また、静止位置測定部１２に電源制御部１７が接続されており、画像処理部１６における画像の処理により、幹細胞Ａが移動していると判定された場合には、高周波電源１１に対し出力電圧の周波数を変化させるように指令するようになっている。
特性算出部１３は、数４の式に基づいて誘電泳動特性を算出するようになっている。
【００２８】
分化活性判定部１４は、高周波電源１１により発生する電圧の周波数毎に閾値を記憶する記憶部１８を備え、算出された誘電泳動特性と、記憶部１８に記憶されている閾値とを比較するようになっている。
例えば、特性算出部１３により算出される誘電泳動特性が最も大きくなる周波数における誘電泳動特性と閾値とを比較することにより、幹細胞Ａの分化活性を精度よく判定することができる。
【００２９】
また、分化活性判定部１４には表示部１９が接続されており、分化活性判定部１４による判定結果が表示部１９に表示されるようになっている。
その結果、誘電泳動特性を用いて非侵襲に幹細胞Ａの分化活性を解析することができる。
【００３０】
したがって、従来、アルカリフォスファターゼ活性を判断する場合に、培養途中の幹細胞群から採取したサンプルの幹細胞Ａを潰して染色状態を判定するのと比較して、幹細胞Ａを潰すことなく非侵襲に分化活性を解析できる。これにより、幹細胞Ａを無駄にせず、培養工程の途中においても分化活性を解析することができるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の一実施形態に係る分化活性解析方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の分化活性解析方法の測定ステップを説明する図である。
【図３】図２の測定ステップにおいて測定された継代回数毎の幹細胞の誘電泳動特性を示すグラフである。
【図４】図３において高周波電圧の周波数が５００ｋＨｚの場合の継代回数と誘電泳動特性との関係を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施形態に係る分化活性解析装置を示すブロック図である。
【符号の説明】
【００３２】
Ａ  幹細胞
Ｂ  高周波不平等電界
Ｃ  媒質（細胞懸濁液）
Ｓ１  測定ステップ
Ｓ２  比較ステップ
Ｓ３  判定ステップ
１  針電極（電極）
２  プレート電極（電極）
１０  分化活性解析装置
１１  高周波電源
１２  静止位置測定部
１３  特性算出部
１４  分化活性判定部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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