(57)【要約】【課題】子宮生物学および妊娠初期の分子レベルにおいて不妊症を改善することのできる不妊症改善用素材を提供すること。【解決手段】ヒト子宮内膜上皮細胞における白血病阻害因子(LIF)の分泌、ヒト子宮内膜上皮細胞におけるトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)の分泌およびグリコデリンの発現の少なくとも１つを調整することのできるイソフラボンを有することを特徴とする。【選択図】図１
2009023919.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト子宮内膜上皮細胞における白血病阻害因子(LIF)の分泌、ヒト子宮内膜上皮細胞におけるトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)の分泌およびグリコデリンの発現の少なくとも１つを調整することのできるイソフラボンを有することを特徴とする不妊症改善用素材。
【請求項２】
前記イソフラボンは、血漿中濃度範囲内において用いられることを特徴とする請求項１に記載の不妊症改善用素材。
【請求項３】
前記イソフラボンは、アグリコン型イソフラボン（腸内細菌によってアグリコン型イソフラボンに分解される配糖体イソフラボンを含む）、ゲニスタイン、ダイゼイン、エコールの１種若しくは複数種からなることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の不妊症改善用素材。
【請求項４】
前記アグリコン型イソフラボンは、豆類を麹菌によって発酵させた生成物からエタノール／水抽出によって生成された生成物であることを特徴とする請求項３に記載の不妊症改善用素材。
【請求項５】
前記アグリコン型イソフラボンは、抽出物の重量の７０％がイソフラボンで、ダイゼイン：ゲニスタイン：グリシタインが７：１：２の重量割合とされていることを特徴とする請求項４に記載の不妊症改善用素材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受精卵の着床に役立つ不妊症改善用素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、大豆は、エストロゲンに類似した構造を持つイソフラボンを含有しており、非ステロイド型エストロゲンの大きな供給源である。このイソフラボンは、エストロゲン受容体と結びついて、部分的にエストロゲン作用物質および拮抗物質として働くものである。
【０００３】
また、イソフラボンは、植物内においてはグリコシル化された構造で見つかり、動物の腸内においてゲニスタイン、ダイゼインおよびダイゼイン代謝物エコールという、生物活性アグリコンへと代謝される。
【０００４】
疫学的研究においては、イソフラボンが癌、骨粗しょう症、心臓血管系疾患のリスクを低減する可能性があることを示している。
【０００５】
また、子宮内および母乳でのエストロゲン様物質への暴露は、生殖組織の形態的および機能的発達に影響することが示されている。
【０００６】
また、イソフラボン二量体を用いて不妊症を改善することも提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５２９９００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述したように、イソフラボンは、健康への有益性との関連から、大きな注目を集めているが、イソフラボンの有益な影響に関して、子宮生物学および妊娠初期の分子レベルでは、未だ多くは総合的な理解がなされていない。
【０００９】
本発明はこれらの点に鑑みてなされたものであり、子宮生物学および妊娠初期の分子レベルにおいて不妊症を改善することのできる不妊症改善用素材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意研究し、血漿中濃度範囲内において、アグリコン型イソフラボン、ゲニスタイン、ダイゼイン、エコールを含むイソフラボンが、ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)の白血病阻害因子(LIF)およびトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)の分泌、ならびに、グリコデリンの発現を調整することができることを発見して本発明を完成させた。ここでアグリコン型イソフラボンには、人の腸内細菌によってアグリコン型イソフラボンに分解される配糖体イソフラボン（グリコシド）を含むものである。
【００１１】
前記ヒト子宮内膜腺上皮に発現する白血病阻害因子(LIF)は、ヒトおよび他の動物の着床に不可欠である。更に、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)族は、ヒト子宮内膜で豊富に発現し、これは着床準備事象での役割、特に、ヒト子宮内膜ストローマの脱落膜化を促進する役割を示している。この成長因子もまた、上皮腺によって発現し、子宮内液へと分泌され、このことから、着床前の胚との相互作用が予想される。従って、TGF-βは、ヒト子宮内膜における胚の発達を助ける上で重要である。更に、グリコデリンは、ヒト子宮内膜上皮の分化マーカーであり、生殖の初期事象の調整因子であり、これはプロゲステロンによって調整され、分泌性／脱落膜化子宮内膜腺によって、子宮卵胞腔へと分泌される。
【００１２】
前記目的を達成するために本発明の不妊症改善用素材は、ヒト子宮内膜上皮細胞における白血病阻害因子(LIF)の分泌、ヒト子宮内膜上皮細胞におけるトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)の分泌およびグリコデリンの発現の少なくとも１つを調整することのできるイソフラボンを有することを特徴とする。
【００１３】
これにより本発明の不妊症改善用素材は、イソフラボンがヒト子宮内膜上皮細胞における白血病阻害因子の分泌、ヒト子宮内膜上皮細胞におけるトランスフォーミング成長因子βの分泌およびグリコデリンの発現の少なくとも１つを調整できるので、子宮生物学および妊娠初期の分子レベルにおいて不妊症を改善することができる。
【００１４】
また、本発明の不妊症改善用素材は、イソフラボンが血漿中濃度範囲内において用いられることを特徴とする。
【００１５】
これにより本発明の不妊症改善用素材は、経口摂取してもイソフラボンが消化器官を通して血中に吸収された場合の濃度において十分に不妊症の改善の効果を奏することができる。
【００１６】
また、本発明の不妊症改善用素材は、イソフラボンが、アグリコン型イソフラボン（腸内細菌によってアグリコン型イソフラボンに分解される配糖体イソフラボンを含む）、ゲニスタイン、ダイゼイン、エコールの１種若しくは複数種からなることを特徴とする。
【００１７】
これにより本発明の不妊症改善用素材は、消化器官より吸収されやすい分子量となり、更に優れた不妊症の改善の効果を奏することができる。
【００１８】
また、本発明の不妊症改善用素材は、アグリコン型イソフラボンは、豆類を麹菌によって発酵させた生成物からエタノール／水抽出によって生成された生成物であることを特徴とする。
【００１９】
これにより本発明の不妊症改善用素材は、豆類を利用して得ることができ人体にとって安全性の高いものとなる。
【００２０】
また、本発明の不妊症改善用素材は、アグリコン型イソフラボンは、抽出物の重量の７０％がイソフラボンで、ダイゼイン：ゲニスタイン：グリシタインが７：１：２の重量割合とされていることを特徴とする。
【００２１】
これにより本発明の不妊症改善用素材は、より高い不妊症の改善の効果を奏することができる。
【発明の効果】
【００２２】
このように本発明の不妊症改善用素材は構成され作用するものであるから、子宮生物学および妊娠初期の分子レベルにおいて不妊症を改善することができるという優れた効果を奏することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
次に、本発明の不妊症改善用素材を図１から図５について説明する。
【００２４】
＜材料と機器＞
初めに、本発明に利用するイソフラボンおよび本発明の不妊症改善用素材を子宮生物学および妊娠初期の分子レベルにおいて検査する場合に用いる各種の材料や機器を説明する。
【００２５】
1)アグリコン型イソフラボンには、AglyMax-70（ニチモウ商品名）を採用した。本出願人の提案している特開２０００−２８１６７３号公報に開示されている製法によって生成されたものであり、麹菌（Aspergillus awamori）によって大豆胚珠を発酵させ、エタノール／水抽出して精製したものである。抽出物は重量の７０％がイソフラボンで、ダイゼイン：ゲニスタイン：グリシタインが７：１：２の重量割合となっている。
【００２６】
2)エコールには、Extrasynthese(フランス リオン)からのものを採用した。
【００２７】
3)H-89には、D.Western Therapeutics Institute(日本 名古屋)からのものを採用した。
【００２８】
4)PD98059には、Sigma(米国ミズーリ州セントルイス)からのものを採用した。
【００２９】
5)SB203580には、BIOMOL Research Laboratories(米国ペンシルバニア州プリマス ミーティング)からのものを採用した。
【００３０】
6)ICI-182780には、Tocris (米国ミズーリ州ボールウィン)からのものを採用した。
【００３１】
7)ゲニスタイン、フォルスコリン、イソブチルメチルキサンチン(IBMX)、コラゲナーゼ、その他薬品はすべて、和光純薬工業(日本 大阪) からのものを採用した。
【００３２】
8)抗ERK1/2 MAPキナーゼ ラビット抗体には、前記Sigmaからのものを採用した。
【００３３】
9)抗リンERK1/2 MAP キナーゼ マウス モノクローナル抗体には、Upstate Biotechnology (米国ニューヨーク州レークプラシド)からのものを採用した。
【００３４】
10) 抗p38抗体、抗リンp38 MAPキナーゼ抗体、抗グリコデリン抗体には、Santa Cruz Biotechnology(米国カリフォルニア州サンタクルス) からのものを採用した。
【００３５】
11) 抗ラビット／マウス／ヤギ IgG ペルオキシダーゼ種別抗体には、Amersham Biosciences Corp.(米国Piscataway) からのものを採用した。
【００３６】
12) ECLおよびウェスタンブロット検知システムには、Amersham Biosciences Corp.(米国ニュージャージー州Piscataway) からのものを採用した。
【００３７】
13) ヒトLIFおよびTGF-β1 ELISAキットには、R&D Systems (米国ミネアポリス)からのものを採用した。
【００３８】
14) 環状AMP EIAキットには、Cayman Chemical(米国ミシガン州) からのものを採用した。
【００３９】
＜方法＞
次に、本発明の不妊症改善用素材を子宮生物学および妊娠初期の分子レベルにおいて検査する場合に用いる各種の方法を説明する。
【００４０】
1)上皮細胞の分離および細胞培養
正常なヒト子宮内膜上皮細胞を既存の方法で(Zhang他 1995年)分離した。組織をハンクス緩衝液の中で細かく切り、DMEM/ F-12ハムズ培養液(DMEM/F-12; 1:1, 容積/容積)にコラゲナーゼ0.5%で、37度で60分、温浸した。分散した細胞を目合い70-μmのフィルター、続いて、ポアサイズ38-μmのフィルターにかけた。上皮腺および細胞を第2フィルターで回収し、100mm皿に入れ、DMEM/F-12ハムズ培養液にペニシリン 100 IU/mL、ストレプトマイシン 50 mg/mL、10% FBS (容量/容量)を加えたもので、空気中の二酸化炭素5%で、37度で培養した。本実施形態においては、第1フィルターを通過した上皮細胞を培養に使用した。
【００４１】
ヒト子宮内膜上皮ガン由来細胞(Ishikawa Cell)はHuman Science Research Resources Bank(日本 大阪)から入手し、10%FBSを加えた F-12ハムズ培養液で、空気中の二酸化炭素5%で、37度で培養した。
【００４２】
2)LIFおよびTGF-β1 ELISA測定
培養上澄み液内のヒトLIFおよびTGF-β1を調べるために、サンプルを酸活性化し、ヒトLIFおよびTGF-β1判断用のELISAキット(R & D Systems、米国ミネアポリス)を使用して、メーカーの指示書に従って、量の測定を行った。簡単に説明すると、サンプル50 μL、および、ビオチニル化抗LIFもしくはTGF-β1抗体試薬50 μLを、マイクロプレートで3時間培養した。特殊な洗剤で洗浄後、 ストレプトアブジンHRP液 100 μLを加え、0.5時間培養した。洗浄後、TMB 基質を加え、30分培養し、HClで培養を止めた。プレートの読み取りは、自動ELISA読取り器を使って、450 nmにて行った。
【００４３】
3)細胞内環状AMP値の測定
100mm培養皿に入った、コンフルエント70-80%の、ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)を、16〜24時間、血清枯渇状態にし、氷点冷却したPBSバッファーで二度洗浄し、KRHバーファーに、AglyMax 0.5 μg/mLもしくはゲニスタイン0.1 μmol/Lを入れた場合と入れない場合で、37°Cで10分培養した。環状AMPホスフォジエステラーゼ阻害物質であるイソブチルメチルキサンチン(IBMX)を、ポジティブコントロールとして、0.5 mmol/Lで使用した。培養の最後に、細胞をHCl 0.1 mol/Lで溶解した。細胞内環状AMP濃度を、環状AMP EIAキット(Cayman Chemical、米国ミシガン州)を使用し、メーカーの指示書に従って測定した。結果を細胞タンパク質含有に修正し、溶解タンパク質１マイクログラムに対する、ピコグラム単位での環状AMP(pg/μg)で表した。
【００４４】
4)ウェスタンブロット測定
タンパク質を、沸騰させたTris/HCl 0.5 mmol/L、pH 6.8、グリセロール、10% SDS、0.1%先導色素、2-メルカプトエタノールで抽出した。このタンパク質を、スタッキングゲルの入ったゲルを使って、電気泳動させた。電気泳動後、タンパク質を2時間、ニトロセルロース膜へと転写した。この膜を、洗浄バッファー(TBS-Tween)に5%スキムミルクの入った中に入れ、一夜、ブロックした。ブロック後、ブロットを第一抗体(1:1000)で二時間培養した。その後、洗浄し、洗浄バッファーに第二抗体(Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州Piscataway)を1:1000で希釈したもので、一時間、最終培養した。NIHイメージソフト(v. 1.62)を使って、 吸光度を測定した。
【００４５】
5)免疫組織化学
ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)(細胞4x105 /mL)を、F-12ハムズ培養液に10%FBSを加えたものに入れ、Lab-Tek IIチェンバースライドに載せ、湿度95％、二酸化炭素5%の空気中で、37℃で24時間、培養した。次に、この培養液を、F-12ハムズ培養液に0.3% FBSを加え、ゲニスタインもしくはアグリコン型イソフラボンAglyMaxを含んだものに変え、9日間培養した。その後、細胞を10%バッファー ホルマリンで、90分固定し、リン酸緩衝液 (PBS)を3回換えて濯ぎ、内分泌性ペロキシターゼを阻害すべく H2O2で10分培養し、10%正常牛血清で、一夜、4°Cでブロックし、抗グリコデリン抗体(1:1000, Santa Cruz Biotechnology Inc.  米国サンタクルス)で、一夜、4°Cで培養した。細胞は、溶解抗ヤギ免疫グロブリン(ベクター)で、室温で1時間培養し、続いて、DABをクロマジェンとして使い、アビジン+ビオチン+ペロキシターゼ混合物(ABC Elite、ベクター)で、室温で1時間培養した。細胞はハリス ヘマトキシリンで30秒、軽く染色し、酸性アルコールで浄化し、炭酸リチウムで青色に染色した。スライドは、エタノール濃縮液で脱水し、キシレンでクリアにした。 
【００４６】
6)統計分析
実験は各々、3回以上実施した。値は、中間値+/-標準誤差(SEM)で出している。データはすべて、SPSSソフトウェアを使用して分析した（SPSSソフトウェアInc. 米国マサチューセッツ州ノーサンプトン）。中間値間の差異の統計的優位性は、一元配置分散分析を使用して判断した。両側測定P値が0.05未満の場合に、差異が統計的優位性を持つと判断した。NIH画像Jソフトウェアを使用して、band densityの数量分析を行った。ウェスタンブロット検知は二重ないし三重に実施した。
【００４７】
＜機能＞
次に、本発明の不妊症改善用素材の子宮生物学および妊娠初期の分子レベルにおける不妊症改善の機能を説明する。
【００４８】
1)機能１（図１参照）
本発明の不妊症改善用素材を形成するイソフラボンは、ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)におけるLIFおよびTGF-βの分泌を誘発する。
【００４９】
図１は、ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)の白血病阻害因子(LIF)およびトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)の分泌に対する、イソフラボンの効果を示している。同図AおよびBは、細胞を、所定の濃度のアグリコン型イソフラボンAglyMaxで、24時間処理し、同図CおよびDは、細胞を、ゲニスタイン、ダイゼイン、エコール0.1 μmol/Lで、24時間処理したものである。データは中間値±SEM、それぞれn=6、*p<0.05および**p<0.01、コントロールとの比較;##p<0.01, ゲニスタインとの比較を示している。
【００５０】
本実施形態においては、図１に示すように、まず、イソフラボンがヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)におけるサイトカイン分泌を活性化するかどうかを調べるため、サイトカインの分泌の検知を行った。本実施形態においては、極めて低いアグリコン型イソフラボンAglyMaxの処方レベル、0.0005〜5 μg/mLを使用した。この処方によって、処方依存型で、白血病阻害因子(LIF)の分泌が促され (図1A参照)、コントロールの12倍に増加した(プロテイン4.79 pg/mgから64.93 pg/mg、p<0.001)。AglyMaxはまた、ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)におけるトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)の分泌を促した(図1B、図1C参照)。AglyMaxのピーク効果は0.005 μg/mLおよび0.05 μg/mLの場合で、TGF-β1はコントロールの5倍に増えた(それぞれp<0.01)。
【００５１】
次に、異なるイソフラボン要素の効果を見るため、本実施形態においては、LIFおよびTGF-β1の分泌に対するゲニスタイン、エコール、ダイゼインの効果を調べた。本実施形態においては、イソフラボンの血清濃縮に近い処方を使用した。その結果、ダイゼインの腸内メタボライトであるエコール 0.1 μmol/Lが、LIFおよびTGF-β1の分泌を非常に大きく誘引し (コントロールの最大32倍と22倍、それぞれp<0.01)、 TGF-β1の分泌調整において、ゲニスタインより高い活性を示したことを発見した。反対に、ダイゼインはサイトカインの分泌を誘引しなかった(図1C、図1D参照)。
【００５２】
2)機能２（図２参照）
ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)でのイソフラボン誘引型サイトカイン分泌における、エストロゲン受容体、ERK1/2およびp38 MAPキナーゼ経路の役割
図２は、ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)の白血病阻害因子(LIF)およびトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)のイソフラボン誘引型分泌に対する、ICI 182,780、PD98059、SB203580の、阻害効果を示している。同図AおよびBは、ERK1/2およびp38のイソフラボン誘引型リン酸化を示している。Ishikawa Cellは、AglyMax0.5 μg/mL、もしくは、ゲニスタイン0.1 μmol/Lで、所定の期間、処理をした場合を示す。同図CおよびDは、細胞を、ゲニスタインのみ0.1 μmol/L 、あるいは、エストロゲン受容体拮抗剤ICI 182 780を10 μmol/L、もしくは、MEK 阻害物質PD98059を20 μmol/L、もしくは、p38 MAPキナーゼ阻害物質SB203580を20 μmol/L加えて、24時間処理をした場合を示す。データは中間値± SEM、それぞれ n=6、 *p<0.001、コントロールもしくはゲニスタインとの比較を示している。
【００５３】
本実施形態においては、エストロゲン受容体、ERK1/2キナーゼおよびp38キナーゼ経路が、このイソフラボン誘引型サイトカイン分泌を仲介しているかをテストした。アグリコン型イソフラボンAglyMaxおよびゲニスタインは、時間依存型で、イソフラボンが非ゲノムエストロゲン受容体活動を活性化していることを示す、ERK1/2およびp38 MAPキナーゼのリン酸化を促した。ピークは10〜15分および15〜20分であった(図2A、図2B参照)。イソフラボンは非ゲノム エストロゲン受容体活動を活性化するものの、細胞膜エストロゲン受容体、ERK1/2およびp38キナーゼ経路がサイトカイン分泌に対するイソフラボン効果を仲介しているかどうかは明確でない。従って、細胞膜エストロゲン受容体の役割を見るために、細胞をゲニスタイン0.1 μmol/Lのみ、あるいは、エストロゲン受容体拮抗剤ICI 182 780を10 μmol/L、もしくは、MEK阻害物質PD98059を20 μmol/L、もしくは、p38 MAPキナーゼ阻害物質SB203580を20 μmol/L加えて、24時間処理した。図2Cおよび2Dに示すように、結果から、ICI 182 780およびPD98059が、イソフラボン誘引型のLIF分泌(プロテイン帰属171.03±36.07 pg/mgが4.35±5.79 pg/mgおよび57.65±14.72 pg/mgに、n=6、 p<0.001)およびTGF-β1分泌（プロテイン帰属392.74±21.12 pg/mgから 141.42±46.04 pg/mgおよび88.15±28.26 pg/mgに、n=6、p<0.001）を効果的にブロックしていることが示された。一方、SB203580も、LIF(プロテイン帰属59.15±3.58 pg/mg、n=6、p<0.001、ゲニスタインとの比較、（図2C参照)およびTGF-β1(プロテイン帰属46.37±20.27 pg/mg、n=6、p<0.001, ゲニスタインとの比較、（図2D参照)の分泌を阻害した。
【００５４】
3)機能３（図３参照）
本発明の不妊症改善用素材を形成するイソフラボンは、ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)のグリコデリン発現を上昇させる。
【００５５】
図３は、Ishikawa Cellにおけるグリコデリン発現に対する、イソフラボンの効果を示している。同図Aは、ウェスタンブロット検知によるIshikawa Cellにおけるグリコデリン発現の内容を示している。細胞を、AglyMax 0.5 μg/mL有り／無し、あるいは、ゲニスタインもしくはゲニスタイン＋ICI 182 780を0.1 μmol/Lで処理し、0.3% FBSで補足したF-12 ハムズ培養液で9日間培養した。データは独立した3つの実験の中間値±SEMとして採用した。ゲルは、グリコデリンに対して保護バンドを示し（上）、a-チューブリンに対して正常バンドを示した(下)。データは中間値±SEM、それぞれn=3、*p<0.005もしくは**p<0.001、コントロールもしくはゲニスタインとの比較を示す。同図Bは、Ishikawa Cellにおけるグリコデリンの免疫組織化学（黒い矢印箇所）を示す。細胞は、チェンバースライドに載せ、AglyMax 0.5 μg/mL有り／無し、あるいは、ゲニスタインもしくはゲニスタイン＋ICI 182 780を0.1 μmol/Lで処理し、0.3% FBSで補足したF-12 ハムズ培養液で9日間培養した。倍率は200倍である。
【００５６】
本実施形態においては、ヒト子宮内膜上皮の分化マーカーであり、生殖の初期事象の調整物質であるグリコタンパク質、グリコデリンの発現に対する、イソフラボンの影響を分析した。ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)をAglyMax 0.5 μg/mL、もしくは、ゲニスタイン0.1 μmol/Lで9日培養すると、グリコデリンの発現が1.9倍および2.7倍になることが、ウェスタンブロットで検知された(それぞれn=3、AglyMaxがp<0.005、ゲニスタインがp<0.001、図3A参照)。免疫組織化学染色においても、AglyMaxもしくはゲニスタイン処理によるグリコデリンの顕著な累積が示された(図3B参照)。更に、エストロゲン受容体拮抗剤のICI 182 780は、ゲニスタイン誘引型グリコデリン発現の増加をブロックした。ゲニスタイン処理した細胞と比較すると、ICI 182 780暴露細胞におけるグリコデリン発現の量および累積は、コントロール値に近かった(n=3、p<0.001、ゲニスタインとの比較、図3A、図3B参照)。
【００５７】
4)機能４（図４参照）
ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)での、イソフラボン誘引型グリコデリン発現における、環状AMPの役割。
【００５８】
図４は、ヒト子宮内膜Ishikawa Cellでのイソフラボン誘引型グロコデリン発現における、環状AMPの役割を示している。同図Aは、Ishikawa Cellを、16〜24時間、血清枯渇状態にし、PBSバッファーで二度洗浄した後、異なる条件の媒体（KRHバーファー、あるいは、KRHバーファーにゲニスタイン0.1μMもしくはIBMX 50μM）で15分処理した場合を示している。媒体をすぐに取り除き、氷点冷却した0.1M HCLを1mL加えて、反応を止めた。EIA分析キットを使用し、メーカーの指示書に従って、細胞抽出物中のcAMP値を調べた。異なるグループの細胞内cAMP値を比較した。各グループで、細胞4皿分を使用した。同図Bは、Ishikawa Cellを9日間、ゲニスタインで培養、もしくは、ゲニスタインにH89を10μmol/L加えたもので処理、もしくは、フォルスコリン10μmol/Lで刺激した場合を示している。ウェスタンブロットで、グリコデリン発現を分析した。データは中間値±SEMで表現し、それぞれ n=6、 *p<0.05および**p<0.01とした。
【００５９】
続いて本実施形態においては、ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)における細胞内環状AMP形成を促す、AglyMaxおよびゲニスタインの能力を確認した。AglyMax 0.5 μg/mL、もしくはゲニスタイン0.1 μmol/Lで10分間処理すると、細胞内環状AMP形成が誘引された(図4A参照)。環状AMPの値は、コントロール細胞の9.76±1.51 pmol/ml/106セルから、AglyMax処理した細胞では、12.05±1.59 pmol/ml/106セル(n=3, p<0.05)に上がり、ゲニスタイン処理した細胞では、13.70±1.61 pmol/ml/106セル(n=3, p<0.001)に上がった。ポジティブコントロールとして、細胞を、環状AMPホスフォジエステラーゼ阻害物質であるイソブチルメチルキサンチン(IBMX)0.5 mmol/Lで10分間処理した。これも、細胞内環状AMPの飛躍的上昇が誘引された(n=3, p<0.001, 図4A参照)。結果は、AglyMaxおよびゲニスタインがヒト子宮内膜上皮細胞において、環状AMP依存型メカニズムを通して、急性効果を発揮することを示した。グリコデリン発現における環状AMPの役割を見るため、環状AMP依存型タンパク質キナーゼの阻害物質H89を取り入れた。本実施形態においては、H89がグリコデリン発現を効果的に阻害することを、ウェスタンブロット バンドデンシティの数量分析で発見した(n=3, p<0.05, ゲニスタイン処理細胞との比較、図4B参照)。PD98059処理もまた、グリコデリン発現を阻害した(n=3, p<0.05, ゲニスタイン処理細胞との比較)が、SB203580はグリコデリン発現を阻害しなかった。一方、環状AMPを誘引するフォルスコリンは、グリコデリン発現を強力に促した(n=3, p<0.01, コントロール細胞との比較、図4B参照)。
【００６０】
5)機能５（図５参照）
本発明の不妊症改善用素材を形成するイソフラボンは、分離ヒト初代子宮内膜上皮細胞におけるLIFおよびTGF-β1の分泌、ならびに、グリコデリンの発現を誘引した。
【００６１】
図５は、健康体ドナーからの、ヒト初代子宮内膜上皮細胞におけるLIF、TGF-βの分泌およびグリコデリンの発現に対する、イソフラボンの影響を示している。同図AおよびBは、卵胞期の初代細胞を、ペトリディッシュにとり、アグリコン型イソフラボンAglyMax 0.5 μg/mLで処理し、0.3% FBSで補足したF-12 ハムズ培養液で24時間培養した場合を示している。データは中間値±SEM、それぞれ n=3、*p<0.05もしくは**p<0.01で、コントロールとの比較をした。同図Cは、黄体期の初代細胞を、AglyMax 0.5 μg/mL有り／無しで、12日間培養した場合を示している。ウェスタンブロットで、グリコデリン発現を分析した。
【００６２】
本実施形態においては、ドナーから分離した卵胞期のヒト初代子宮内膜上皮細胞を使用して、LIFおよびTGF-β1の分泌におけるイソフラボンの効果を分析した(図5A、図5B参照)。一方で、AglyMax 0.5 μg/mLで24時間刺激した卵胞期の初代ヒト子宮内膜上皮細胞においては、LIFがプロテイン22.67±5.43 pg/mg (p<0.05, 図5A)まで増え、TGF-β1はプロテイン153.94±16.35 pg/ mgから384.52±61.51 pg/ mgまで上昇した (p<0.01, 図5B)。一方で、AglyMax 0.5 μg/mLで刺激すると、黄体期の初代ヒト子宮内膜上皮細胞におけるグリコデリン発現が上昇した(図5C参照)。
【００６３】
＜機能の纏め＞
本実施形態においては、白血病阻害因子(LIF)およびトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)およびグリコデリンをターゲットとして選び、子宮の上皮部分および組織の再模型化に対するイソフラボンの効果を観測して、本発明の不妊症改善用素材の作用効果を確認した。
【００６４】
具体的には、植物エストロゲンであるアグリコン型イソフラボンAglyMax、ゲニスタイン、エコールが、ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)および分離ヒト初代子宮内膜上皮細胞におけるLIFおよびTGF-β分泌を誘引することを確認した(図1、図5参照)。細胞膜エストロゲン受容体の行動、ならびに、ERK1/2およびp38 MAPキナーゼ経路を通して、その拮抗剤もしくは阻害物質のICI 182 780、PD98059、SB203580がイソフラボン効果を効果的にブロックすることで、LIF分泌が上昇した(図2参照)。
【００６５】
更に、低濃度のアグリコン型イソフラボンAglyMaxおよびゲニスタインが、グリコデリン発現の増加を引き起こす可能性を示していることを確認した。これはまた、エストロゲン拮抗剤ICI 182 780によってブロックされ(図3A、図3B参照)、イソフラボンが調節するグリコデリン発現が、選択性エストロゲン受容体活動を通したものであることを示唆している。更に、ゲニスタインおよびアグリコン型イソフラボンAglyMaxが、ヒト子宮内膜上皮細胞における環状AMPシグナル経路を活性化し(図4A参照)、グリコデリン発現がタンパク質キナーゼA阻害物質H89によってブロックされることから、環状AMPシグナルがイソフラボン誘引型グリコデリン発現にかかわっている(図4B参照)こと、p38阻害物質SB203580ではなく、MEK1/ 阻害物質PD98059が、ゲニスタインが誘引するグリコデリン発現を阻害(図4B参照)することを確認した。これは、イソフラボンがヒト子宮内膜上皮細胞におけるグリコデリン発現の調節において、非ゲノム エストロゲン受容体効果を持つことを示唆している。
【００６６】
これらを総合すると、本発明によれば、イソフラボンがヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)および分離ヒト初代子宮内膜上皮細胞における、LIFおよびTGF-βの分泌を引き上げることを実証した。これは、阻害物質であるPD98059およびp38 SB203580がイソフラボン効果をブロックすることから、イソフラボンの効果が、ERK1/2およびp38 MAPキナーゼのシグナル経路に依存することを示している。次に、イソフラボンを9日ないし12日処方すると、グリコデリンの発現を誘引した。PKA阻害物質H89およびPD98059の双方が、このグリコタンパク質の発現を弱めた。従って、食品サプリメントしての大豆イソフラボンには、子宮生物学および早期妊娠に関するメリットがある可能性がある。
【００６７】
なお、本発明は、前述した実施の形態に限定されるものではなく、必要に応じて種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の不妊症改善用素材を形成するイソフラボンによるヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)の白血病阻害因子(LIF)およびトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)の分泌に対する効果を示す特性図であり、AおよびBは、細胞を、所定の濃度のアグリコン型イソフラボンAglyMaxで、24時間処理した場合を示し、CおよびDへ、細胞を、ゲニスタイン、ダイゼイン、エコール0.1 μmol/Lで、24時間処理した場合を示す。
【図２】ヒト子宮内膜ガン由来細胞(Ishikawa Cell)の白血病阻害因子(LIF)およびトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)のイソフラボン誘引型分泌に対する、ICI 182,780、PD98059、SB203580の、阻害効果を示し、AおよびBは、ERK1/2およびp38のイソフラボン誘引型リン酸化を行い、Ishikawa CellをAglyMax0.5 μg/mL、もしくは、ゲニスタイン0.1 μmol/Lで、所定の期間、処理した場合を示パターン図であり、CおよびDは、細胞を、ゲニスタインのみ0.1 μmol/L 、あるいは、エストロゲン受容体拮抗剤ICI 182 780を10 μmol/L、もしくは、MEK 阻害物質PD98059を20 μmol/L、もしくは、p38 MAPキナーゼ阻害物質SB203580を20 μmol/L加えて、24時間処理した場合を示す線図である。
【図３】Ishikawa Cellにおけるグリコデリン発現に対する、イソフラボンの効果を示し、Aは、ウェスタンブロット検知での、Ishikawa Cellにおけるグリコデリン発現を示すパターン図および特性図、Bは、Ishikawa Cellにおけるグリコデリンの免疫組織化学（黒い矢印箇所）を示す200倍顕微鏡写真を示す図である。
【図４】ヒト子宮内膜Ishikawa Cellでのイソフラボン誘引型グロコデリン発現における、環状AMPの役割を示し、Aは、Ishikawa Cellを、16〜24時間、血清枯渇状態にし、PBSバッファーで二度洗浄した後、異なる条件の媒体（KRHバーファー、あるいは、KRHバーファーにゲニスタイン0.1μMもしくはIBMX 50μM）で15分処理し、媒体をすぐに取り除き、氷点冷却した0.1M HCLを1ml加えて、反応を止め、EIA分析キットを使用して測定した細胞抽出物中のcAMP値を示す特性図、Bは、Ishikawa Cellを9日間、ゲニスタインで培養、もしくは、ゲニスタインにH89を10μmol/L加えたもので処理、もしくは、フォルスコリン10μmol/Lで刺激し、ウェスタンブロットで分析したグリコデリン発現を示すパターン図および特性図である。
【図５】健康体ドナーからの、ヒト初代子宮内膜上皮細胞におけるLIF、TGF-βの分泌およびグリコデリンの発現に対する、イソフラボンの影響を示し、AおよびBは、卵胞期の初代細胞を、ペトリディッシュにとり、アグリコン型イソフラボンAglyMax 0.5 μg/mLで処理し、0.3% FBSで補足したF-12 ハムズ培養液で24時間培養した場合の値を示す特性図、Cは、黄体期の初代細胞を、AglyMax 0.5 μg/mL有り／無しで、12日間培養し、ウェスタンブロットで分析したグリコデリン発現を示すパターン図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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