(57)【要約】【課題】確度が高く臨床上有用な動脈硬化性疾患のリスク検査（易罹患性の判定）を可能にすることを課題とする。また、動脈硬化性疾患の発症の阻止ないし遅延や、動脈硬化性疾患に罹患した患者の生活の質の向上に資する有益な情報を提供することを課題とする。【解決手段】被験者から採取された核酸検体において、レジスチン遺伝子の-638 G>A多型、+62 G>A多型、及びATG繰り返し多型を検出し、動脈硬化性疾患のリスクを評価する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された核酸検体において、レジスチン遺伝子の-638 G>A多型、+62 G>A多型、及びATG繰り返し多型を検出するステップを含む、動脈硬化性疾患のリスク検査法。
【請求項２】
以下の(a)〜(c)の基準に従いリスクを判定することを特徴とする、請求項１に記載のリスク検査法：
(a)-638 G>A多型について、塩基がAのアレルが検出されるとリスクが高い；
(b)+62 G>A多型について、塩基がGのアレルが検出されるとリスクが高い；
(c)ATG繰り返し多型について、繰り返し数6のアレルが検出されるとリスクが高い。
【請求項３】
以下の(d)〜(f)の基準に従いリスクを判定することを特徴とする、請求項１に記載のリスク検査法：
(d)-638 G>A多型について、遺伝子型がG/G型、G/A型、A/A型の順にリスクが高くなる；
(e)+62 G>A多型について、遺伝子型がA/A型、G/A型、G/G型の順にリスクが高くなる；
(f)ATG繰り返し多型について、遺伝子型に6回繰り返しアレルを持つとリスクが高くなる。
【請求項４】
被験者から採取された血液検体中のレジスチン濃度を測定するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリスク検査法。
【請求項５】
以下の(g)の基準に従いリスクを判定することを特徴とする、請求項４に記載のリスク検査法：
(g)血中レジスチン濃度が高いとリスクが高い。
【請求項６】
レジスチン遺伝子の-638 G>A多型についての遺伝子型と、レジスチン遺伝子の+62 G>A多型についての遺伝子型と、レジスチン遺伝子のATG繰り返し多型についての遺伝子型との組合せに対して、組合せ毎に、血中レジスチン標準濃度範囲を予め関連付けておき、以下のステップ(1)〜(4)を行うことを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク検査法：
(1)被験者から採取された核酸検体及び血液検体を用意するステップ；
(2)前記核酸検体においてレジスチン遺伝子の-638 G>A多型、+62 G>A多型、及びATG繰り返し多型を検出し、該三つの多型について遺伝子型を決定するステップ；
(3)前記血液検体中のレジスチン濃度を測定するステップ；及び
(4)ステップ(3)で得られたレジスチン濃度が、ステップ(2)で決定した三つの遺伝子型の組合せに関連付けられた血中レジスチン標準濃度範囲に属するか否かを調べるステップ。
【請求項７】
ステップ(4)において、ステップ(3)で得られたレジスチン濃度が、血中レジスチン標準濃度範囲に属する、血中レジスチン標準濃度範囲の下限値よりも低い、及び血中レジスチン標準濃度範囲の上限値よりも高い、のいずれであるかを決定することを特徴とする、請求項６に記載のリスク検査法。
【請求項８】
前記血液検体として血清又は血漿が用いられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のリスク検査法。
【請求項９】
レジスチン遺伝子の-638 G>A多型検出用核酸、レジスチン遺伝子の+62 G>A多型検出用核酸、及びレジスチン遺伝子のATG繰り返し多型検出用核酸を含む、動脈硬化性疾患のリスク検査用キット。
【請求項１０】
血液検体中のレジスチン濃度を測定するための成分を更に含む、ことを特徴とする請求項９に記載のリスク検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動脈硬化性疾患のリスク検査法、及び該リスク検査法に利用される検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪細胞から分泌されるサイトカインであるレジスチンは、マウスにおいてインスリン抵抗性および耐糖能障害を惹起することが知られている（非特許文献１）。ヒトでは、大腿部に比し腹部皮下脂肪組織および大網においてレジスチンmRNAが過剰に発現しており、中心性肥満による2型糖尿病の発症リスクの増大の説明となりうる（非特許文献２）。また、ヒトでは肥満者で有意に血清レジスチン濃度が高値であったが、血清レジスチン濃度はインスリン抵抗性の有意な規定因子ではない（非特許文献３）。一方、ヒトにおけるレジスチン遺伝子プロモーター領域の多型は、血漿レジスチン濃度の主要な決定要因である（非特許文献４）。
【０００３】
血清レジスチン濃度は遺伝の影響を強く受け、インスリン抵抗性との関連が認められることが示され、インスリン抵抗性に関連した2型糖尿病や心血管疾患の発症にレジスチンが寄与する可能性が示唆された（非特許文献５）。また、日本人集団において血漿レジスチン濃度はレジスチン遺伝子の特定の多型（SNP -420）と関連し、インスリン抵抗性、血清低HDL及び高感度CRP高値と相関することが報告された（非特許文献６）。
尚、レジスチン遺伝子の多型を利用して疾患のリスクを評価する試みがなされている（特許文献１、２）。
【非特許文献１】Steppan CM. et al., Nature; 409: 307-312, 2001
【非特許文献２】McTernan, CL. et al., Lancet; 359: 46-47, 2002
【非特許文献３】Degawa-Yamauchi M. et al., J Clin Endocrinol Metab; 88: 5452-5, 2003
【非特許文献４】Cho YM. et al., Diabetologia; 47: 559-65, 2004
【非特許文献５】Menzaghi C.et al., J Clin Endocrinol Metab; 91: 2792-5, 2006
【非特許文献６】Osawa H. et al., Diabetes Care; 30: 1501-1506, 2007
【特許文献１】特開２００６−６２９７４号公報
【特許文献２】特開２００７−２０２４１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、確度が高く臨床上有用な動脈硬化性疾患のリスク検査（易罹患性の判定）を可能にすることを課題とする。また、動脈硬化性疾患の発症の阻止ないし遅延や、動脈硬化性疾患に罹患した患者の生活の質（Quality of Life、生活の質）の向上に資する有益な情報を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以上の背景の下、本発明者らは、（１）ヒトにおける血漿レジスチン濃度と代謝性疾患（肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病、高血圧、脂質代謝異常など）との関連を解明すること、及び（２）レジスチン遺伝子多型を含め、ヒトの血漿レジスチン濃度の決定因子を明らかにすることを目的として研究を進めた。その結果、レジスチン遺伝子の-638 G>A多型、+62 G>A多型、及びATG繰り返し多型（3'非転写領域のATG繰り返し数の多型）が、血漿レジスチン濃度の独立した強い決定因子であることが明らかとなった。また、血漿レジスチン濃度は、年齢、血清尿酸濃度、血清HDLコレステロール濃度、血清トリグリセライド濃度及び血清インスリン濃度とも有意に関連していることが示された。このように、動脈硬化性疾患の危険因子とされている代謝異常と血漿レジスチン濃度との関連が示され、血漿レジスチン濃度が動脈硬化性疾患発症に関与している可能性が示唆された。換言すれば、レジスチン濃度が動脈硬化性疾患の重要且つ決定的な危険因子であることが示唆された。
さらに本発明者らは、レジスチン濃度の実測値は遺伝的素因と環境要因を反映したものであることに着目し、レジスチン遺伝子の上記三つの多型を検出した結果とレジスチン濃度の実測値を利用すれば、動脈硬化性疾患について環境要因の影響を評価できると考えた。評価結果は、動脈硬化性疾患の発症の阻止ないし遅延や、動脈硬化性疾患に罹患した患者のＱＯＬ（Quality of Life、生活の質）の向上を促すための有益な情報となる。
本発明は、主として以上の知見に基づき完成されたものであり、以下の通りである。
［１］被験者から採取された核酸検体において、レジスチン遺伝子の-638 G>A多型、+62 G>A多型、及びATG繰り返し多型を検出するステップを含む、動脈硬化性疾患のリスク検査法。
［２］以下の(a)〜(c)の基準に従いリスクを判定することを特徴とする、［１］に記載のリスク検査法：
(a)-638 G>A多型について、塩基がAのアレルが検出されるとリスクが高い；
(b)+62 G>A多型について、塩基がGのアレルが検出されるとリスクが高い；
(c)ATG繰り返し多型について、繰り返し数6のアレルが検出されるとリスクが高い。
［３］以下の(d)〜(f)の基準に従いリスクを判定することを特徴とする、［１］に記載のリスク検査法：
(d)-638 G>A多型について、遺伝子型がG/G型、G/A型、A/A型の順にリスクが高くなる；
(e)+62 G>A多型について、遺伝子型がA/A型、G/A型、G/G型の順にリスクが高くなる；
(f)ATG繰り返し多型について、遺伝子型に6回繰り返しアレルを持つとリスクが高くなる。
［４］被験者から採取された血液検体中のレジスチン濃度を測定するステップをさらに含む、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のリスク検査法。
［５］以下の(g)の基準に従いリスクを判定することを特徴とする、［４］に記載のリスク検査法：
(g)血中レジスチン濃度が高いとリスクが高い。
［６］レジスチン遺伝子の-638 G>A多型についての遺伝子型と、レジスチン遺伝子の+62 G>A多型についての遺伝子型と、レジスチン遺伝子のATG繰り返し多型についての遺伝子型との組合せに対して、組合せ毎に、血中レジスチン標準濃度範囲を予め関連付けておき、以下のステップ(1)〜(4)を行うことを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク検査法：
(1)被験者から採取された核酸検体及び血液検体を用意するステップ；
(2)前記核酸検体においてレジスチン遺伝子の-638 G>A多型、+62 G>A多型、及びATG繰り返し多型を検出し、該三つの多型について遺伝子型を決定するステップ；
(3)前記血液検体中のレジスチン濃度を測定するステップ；及び
(4)ステップ(3)で得られたレジスチン濃度が、ステップ(2)で決定した三つの遺伝子型の組合せに関連付けられた血中レジスチン標準濃度範囲に属するか否かを調べるステップ。
［７］ステップ(4)において、ステップ(3)で得られたレジスチン濃度が、血中レジスチン標準濃度範囲に属する、血中レジスチン標準濃度範囲の下限値よりも低い、及び血中レジスチン標準濃度範囲の上限値よりも高い、のいずれであるかを決定することを特徴とする、［６］に記載のリスク検査法。
［８］前記血液検体として血清又は血漿が用いられる、［１］〜［７］のいずれか一項に記載のリスク検査法。
［９］レジスチン遺伝子の-638 G>A多型検出用核酸、レジスチン遺伝子の+62 G>A多型検出用核酸、及びレジスチン遺伝子のATG繰り返し多型検出用核酸を含む、動脈硬化性疾患のリスク検査用キット。
［１０］血液検体中のレジスチン濃度を測定するための成分を更に含む、ことを特徴とする［９］に記載のリスク検査用キット。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
（動脈硬化性疾患のリスク検査法）
本発明の第１の局面は動脈硬化性疾患のリスク検査法に関する。本発明において動脈硬化性疾患のリスクとは、動脈硬化性疾患の易罹患性（動脈硬化性疾患への罹りやすさ）をいう。動脈硬化性疾患には心筋梗塞、狭心症、脳血管障害（脳梗塞や一過性脳虚血発作などの虚血性脳血管障害、脳出血などの出血性脳血管障害を含む）、閉塞性動脈硬化症等が含まれる。本発明の対象疾患は好ましくは心筋梗塞、狭心症又は脳梗塞である。
【０００７】
本発明のリスク検査法の一態様では、被験者から採取された核酸検体において、レジスチン遺伝子の-638 G>A多型、+62 G>A多型、及びATG繰り返し多型が検出される。このように特定の三つの多型を検出し、検出結果に基づきリスクを判定・評価する。
【０００８】
まず、被験者から採取された核酸検体を用意する。本発明では、動脈硬化性疾患のリスク（易罹患性）判定を必要とする者（被験者）に由来する核酸検体を使用する。核酸検体は、被験者の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から公知の抽出方法、精製方法を用いて調製することができる。多型検出対象であるレジスチン遺伝子を含むものであれば任意の長さのゲノムDNAを核酸検体として用いることができる。尚、核酸検体において解析対象の遺伝子が完全な状態（即ち、遺伝子の全長が存在する状態）でなくてもよい。即ち、検出対象となる多型部位が少なくとも存在している限りにおいて断片的、部分的な状態であってもよい。
【０００９】
被験者は特に限定されない。即ち、動脈硬化性疾患のリスク判定が必要な者に対して広く本発明を適用することができる。ここでの「動脈硬化性疾患のリスク判定が必要な者」には動脈硬化性疾患の患者とそれ以外の者が含まれる。前者についての判定結果はより適切な治療方針の決定に役立ち、治療効果の向上、患者のＱＯＬ（Quality of Life、生活の質）の向上を促す。一方、後者（動脈硬化性疾患の患者以外の者）についての判定結果は動脈硬化性疾患の予防や早期診断に役立つ。即ち、リスクが高いとの情報に基づいて生活習慣の改善等を図れば、動脈硬化性疾患への罹患可能性を低下させることができる。また、リスクが高いとの情報は動脈硬化性疾患の検診を受診させる契機となり、これによって動脈硬化性疾患の早期診断（早期発見）が可能となる。
【００１０】
本発明ではレジスチン遺伝子の三箇所の多型を検出する。検出対象の多型は二つの一塩基多型（SNP）、即ち-638 G>A多型と+62 G>A多型、及びATG繰り返し多型（3'非転写領域のATG繰り返し数の多型）である。-638 G>A多型はNCBIのデータベース（Entrez SNP）にID番号（refSNP ID）rs34861192で登録されている。同様に、ATG繰り返し多型はID番号（refSNP ID）rs3833230で登録されている。一方、+62 G>A多型は、レジスチン遺伝子のエクソン4の終止コドンから62塩基下流に存在する、3’非転写領域のSNPである（Journal of Human genetics, 46;553-555, 2001）。尚、ヒトレジスチン遺伝子は例えば、For genomic structure of the RETN gene [accession number NT_077812]及びRETN cDNA [accession number NM_020415]としてGenBankに登録されている。
【００１１】
本発明において用語「多型を検出する」は、用語「多型を解析する」又は用語「アレルを検出する」と置換可能である。多型の検出によって多型位置の状態（即ち、塩基の種類や塩基の配列）が明らかとなる。
【００１２】
本発明では多型の検出結果、即ち検出されたアレルの種類を基にリスクを判定する。本発明の一態様では、好ましくは以下の基準(a)〜(c)に従ってリスクを判定・評価する。尚、-638 G>A多型については、多型位置の塩基がGのアレル又は多型位置の塩基がAのアレル（ヘテロ接合型の遺伝子である場合、二つのアレルが検出される。他の多型についても同様）が検出されることになる。同様に+62 G>A多型については、多型位置の塩基がGのアレル又は多型位置の塩基がAのアレルが検出されることになる。ATG繰り返し多型については、繰り返し数が5のアレル、6のアレル、7のアレル、又は8のアレルが検出されることになる。
(a)-638 G>A多型について、塩基がAのアレルが検出されるとリスクが高い。
(b)+62 G>A多型について、塩基がGのアレルが検出されるとリスクが高い。
(c)ATG繰り返し多型について、繰り返し数6のアレルが検出されるとリスクが高い。
【００１３】
基準(a)〜(c)に従った判定・評価手法の具体例を以下に列挙する。
(1)-638 G>A多型について、塩基がAのアレルが検出されること（条件１）、+62 G>A多型について、塩基がGのアレルが検出されること（条件２）、ATG繰り返し多型について、繰り返し数6のアレルが検出されること（条件３）の全てを満たす場合に高リスクと判定し、それ以外であれば低リスクと判定する。
(2)条件１〜条件３の全てを満たす場合に最高リスクと判定し、条件１〜３の中の二つを満たす場合に中程度リスクと判定し、条件１〜３の中の一つを満たす場合に低リスクと判定し、条件１〜３のいずれも満たさない場合に最低リスクと判定する。
(3)条件１〜条件３の中の二つ以上を満たす場合に高リスクと判定し、条件１〜条件３の一つを満たす場合に中程度リスクと判定し、条件１〜３のいずれも満たさない場合に低リスクと判定する。
(4)条件１〜条件３の中の二つ以上を満たす場合に高リスクと判定し、それ以外であれば低リスクと判定する。
【００１４】
本発明の好ましい態様では、多型の検出結果より、各多型について遺伝子型（アレルの組合せ）を決定する。具体的には、-638 G>A多型については、G/G型（多型位置の塩基がGのアレルのホモ接合型）、G/A型（多型位置の塩基がGのアレルと多型位置の塩基がAのアレルのヘテロ接合体）及びA/A型（多型位置の塩基がAのアレルのホモ接合体）のいずれであるかを決定する。同様に+62 G/A多型については、G/G型（多型位置の塩基がGのアレルのホモ接合型）、G/A型（多型位置の塩基がGのアレルと多型位置の塩基がAのアレルのヘテロ接合体）及びA/A型（多型位置の塩基がAのアレルのホモ接合体）のいずれであるかを決定する。一方、ATG繰り返し多型については6回繰り返し多型を持つか否かを決定する。この態様の場合、好ましくは以下の基準(d)〜(f)に従ってリスクを判定・評価する。尚、このように遺伝子型を用いれば、より確度の高い判定・評価が可能になる。
(d)-638 G>A多型について、遺伝子型がG/G型、G/A型、A/A型の順にリスクが高くなる。
(e)+62 G>A多型について、遺伝子型がA/A型、G/A型、G/G型の順にリスクが高くなる。
(f)ATG繰り返し多型について、遺伝子型に6回繰り返しアレルを持つとリスクが高くなる。
【００１５】
基準(d)〜(f)に従った判定・評価手法の具体例を以下に列挙する。
(1)-638 G>A多型に関する遺伝子型がA/A型であること（条件１）、+62 G>A多型に関する遺伝子型がG/G型であること（条件２）、ATG繰り返し多型に関する遺伝子型が6回繰り返しアレルを有する（条件３）の全てを満たす場合に高リスクと判定し、それ以外であれば低リスクと判定する。
(2)条件１〜条件３の全てを満たす場合に最高リスクと判定し、条件１〜３の中の二つを満たす場合に中程度リスクと判定し、条件１〜３の中の一つを満たす場合に低リスクと判定し、条件１〜３のいずれも満たさない場合に最低リスクと判定する。
(3)条件１〜条件３の中の二つ以上を満たす場合に高リスクと判定し、条件１〜条件３の一つを満たす場合に中程度リスクと判定し、条件１〜３のいずれも満たさない場合に低リスクと判定する。
(4)条件１〜条件３の中の二つ以上を満たす場合に高リスクと判定し、それ以外であれば低リスクと判定する。
(5)-638 G>A多型に関する遺伝子型がA/A型又はG/A型であること（条件４）、+62 G>A多型に関する遺伝子型がG/G型又はG/A型であること（条件５）、ATG繰り返し多型に関する遺伝子型が6/6型又は6/7型であること（条件６）の全てを満たす場合に高リスクと判定し、それ以外であれば低リスクと判定する。
(6)条件４〜条件６の全てを満たす場合に最高リスクと判定し、条件４〜６の中の二つを満たす場合に中程度リスクと判定し、条件４〜６の中の一つを満たす場合に低リスクと判定し、条件４〜６のいずれも満たさない場合に最低リスクと判定する。
【００１６】
多型の検出法（解析法）は特に限定されるものではなく例えばアレル特異的プライマー（及びプローブ）を用い、PCR法による増幅、及び増幅産物の多型を蛍光又は発光によって検出する方法や、PCR(polymerase chain reaction)法を利用したPCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型)法、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism：単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide：特異的配列オリゴヌクレオチド)法、PCR-SSO法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたASO(allele specific oligonucleotide：アレル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)等)、TaqMan（登録商標、Roche Molecular Systems社）-PCR法(Livak, KJ, Genet Anal,14,143(1999),Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol.,34,2933(1996))、Invader（登録商標、Third Wave Technologies社）法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol,17,292(1999))、FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を利用した方法（Heller, Academic Press Inc, pp. 245-256(1985)、Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794(1988)、国際公開第99/28500号パンフレット、特開2004-121232号公報など）、ASP-PCR（Allele Specific Primer-PCR)法（国際公開第01/042498号公報など）、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法(Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7,378(1997))、RCA(rolling cycle amplification)法(Lizardi PM et al., Nat  Genet 19,225(1998))、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Southern,E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)）等、公知の方法を採用できる。さらに、検出対象の多型部分を直接シークエンスすることにしてもよい。尚、これらの方法を任意に組み合わせて多型を検出してもよい。また、PCR法又はPCR法を応用した方法などの核酸増幅法により核酸試料を予め増幅（核酸試料の一部領域の増幅を含む）した後、上記いずれかの検出方法を適用することもできる。
【００１７】
多数の核酸検体を検出する場合にはアレル特異的PCR法、アレル特異的ハイブリダイゼーション法、TaqMan-PCR法、Invader法、FRETを利用した方法、ASP-PCR法、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法、RCA(rolling cycle amplification)法、又はDNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法等、多数の検体を比較的短時間で検出可能な検出法を用いることが特に好ましい。
【００１８】
以上の方法では、各方法に応じたプライマーやプローブ等の核酸（本発明において「多型検出用核酸」ともいう）が使用される。多型検出用核酸の例としては、検出対象の多型を含む遺伝子において当該多型部位を含む一定領域（部分DNA領域）に相補的な配列を有する核酸（プローブ）を挙げることができる。また、検出対象の多型を含む遺伝子において当該多型部位を含む一定領域（部分DNA領域）に相補的な配列を有し、当該多型部分を含むDNAフラグメントを特異的に増幅できるように設計された核酸（プライマー）を挙げることができる。例えば、-638 G>A多型の検出用であれば、-638位塩基がGであるレジスチン遺伝子の-638位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸や、-638位塩基がAであるレジスチン遺伝子の-638位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸が当該プローブに該当する。
【００１９】
多型検出用核酸の他の具体例としては、検出対象の多型部位がいずれかの遺伝子型である場合にのみ当該多型部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットを挙げることができる。より具体的には検出対象の多型部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、多型部位がいずれかの遺伝子型であるアンチセンス鎖の当該多型部位を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セットを例示することができる。-638 G>A多型の検出用の場合、このような核酸セットとしては例えば、レジスチン遺伝子の-638位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、-638位塩基がGであるレジスチン遺伝子のアンチセンス鎖において-638位塩基を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セット、又は-638位塩基がAであるレジスチン遺伝子のアンチセンス鎖において-638位塩基を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セットが該当する。ここで、増幅される部分DNA領域の長さはその検出に適した範囲で適宜設定され例えば50bp〜200bp、好ましくは80bp〜150bpである。
【００２０】
以上の核酸プライマー、核酸プローブは単なる一例であって、核酸プライマーであれば目的の増幅反応を支障なく行える限度において、他方核酸プローブであれば目的のハイブリダイゼーション反応を支障なく行える限度において、一部の塩基配列に改変が施されたものであってもよい。ここでの「一部の改変」とは、塩基の一部が欠失、置換、挿入及び／又は付加されていることを意味する。改変にかかる塩基数は例えば1〜7個、好ましくは1〜5個、更に好ましくは、1〜3個である。
【００２１】
多型検出用核酸（プローブ、プライマー）には、検出法に応じて適宜DNA断片又はRNA断片が用いられる。多型検出用核酸の塩基長はその機能が発揮される長さであればよく、プライマーとして用いられる場合の塩基長の例としては10〜50bp程度、好ましくは15〜40bp程度、更に好ましくは15〜30bp程度である。尚、プライマーとして用いられる場合には増幅対象（鋳型）に特異的にハイブリダイズし、目的のDNAフラグメントを増幅することができる限り鋳型となる配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。プローブの場合も同様に、検出対象の配列と特異的なハイブリダイズが行える限り、検出対象の配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、１〜数個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個である。
【００２２】
多型検出用核酸（プライマー、プローブ）はホスホジエステル法など公知の方法によって合成することができる。尚、多型検出用核酸の設計、合成等に関しては成書（例えばMolecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）を参考にすることができる。
【００２３】
本発明における多型検出用核酸を予め標識物質で標識しておくことができる。このような標識化核酸を用いることにより例えば、増幅産物の標識量を指標として多型を検出することができる。また、多型を構成する各遺伝子型の遺伝子における部分DNA領域をそれぞれ特異的に増幅するように設計された２種類のプライマーを互いに異なる標識物質で標識しておけば、増幅産物から検出される標識物質及び標識量によって核酸試料の遺伝子型を判別できる。このような標識化プライマーを用いた検出方法の具体例としては、多型を構成する各遺伝子型のセンス鎖にそれぞれ特異的にハイブリダイズする２種類の核酸プライマー（アレル特異的センスプライマー）をフルオレセインイソチオシアネートとテキサスレッドでそれぞれ標識し、これら標識化プライマーとアンチセンス鎖に特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとを用いて多型部位を含む部分DNA領域を増幅し、得られた増幅産物における各蛍光物質の標識量を測定して多型を検出する方法を挙げることができる。尚、ここでのアンチセンスプライマーを例えばビオチンで標識しておけば、ビオチンとアビジンとの特異的な結合を利用して増幅産物の分離を行うことができる。
【００２４】
多型検出用核酸の標識に用いられる標識物質としては32Pなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、テキサスレッドなどの蛍光物質を例示でき、標識方法としてはアルカリフォスファターゼ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた5'末端標識法、T4 DNAポリメラーゼやKlenow断片を用いた3'末端標識法、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法（Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 9，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）などを例示できる。
【００２５】
以上の多型検出用核酸を不溶性支持体に固定化した状態で用いることもできる。固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、ビーズ状などに加工しておけば、これら固定化核酸を用いて多型の検出をより簡便に行うことができる。
【００２６】
本発明の一態様では、更なるステップとして、被験者から採取された血液検体中のレジスチン濃度を測定するステップが行われる。即ちこの態様では、レジスチン遺伝子の三つの多型と血中レジスチン濃度という二つの指標を併用して動脈硬化性疾患のリスクを判定する。このように血中レジスチン濃度をも考慮して判定すれば確度の更なる向上が図られる。
【００２７】
血液検体としては全血、血漿又は血清を用いる。好ましくは血漿又は血清を用いる。血漿や血清の調製は常法に従えばよい。尚、本明細書では、血液検体中のレジスチン濃度のことを「血中レジスチン濃度」という。用語「血中レジスチン濃度」は、用語「全血中レジスチン濃度」、用語「血漿レジスチン濃度」及び用語「血清レジスチン濃度」を包括する表現として使用される。
【００２８】
血中レジスチン濃度は、これに限定されるものではないが、好ましくは免疫学的手法を利用して測定する。免疫学的手法によれば迅速に且つ感度よくレジスチン濃度を測定できる。また、操作も簡便である。免疫学的手法によるレジスチン濃度の測定ではレジスチンに特異的結合性を有する物質が使用される。当該物質としては通常は抗レジスチン抗体が使用されるが、レジスチンに特異的結合性を有し、その結合量を測定可能な物質であれば抗レジスチン抗体に限らず使用することができる。
【００２９】
免疫学的手法の中でもELISA法（サンドイッチELISAや競合ELISA等）を利用してレジスチン濃度を測定することが好ましい。ELISA法は検出感度が高いことや特異性が高いこと、定量性に優れること、操作が簡便であること、多検体の同時処理に適することなど、多くの利点を有する。ELISA法を利用する場合の具体的な操作法の一例を以下に示す。まず、抗レジスチン抗体を不溶性支持体に固定化する。具体的には例えばマイクロプレートの表面を抗モノクローナル抗体で感作する（コートする）。このように固相化した抗体に対して血液検体を接触させる。この操作の結果、固相化した抗レジスチン抗体に対する抗原（レジスチン）が検体中に存在していれば免疫複合体が形成される。洗浄操作によって非特異的結合成分を除去した後、酵素を結合させた抗体を添加することで免疫複合体を標識し、次いで酵素の基質を反応させて発色させる。そして、発色量を指標として免疫複合体を検出する。尚、ELISA法の詳細については数多くの成書や論文に記載されており、各方法の実験手順や実験条件を設定する際にはそれらを参考にできる。また、レジスチン測定用のキットとしてHuman Resistin Quantikine ELISA Kit（R&D systems製）、Resistin ELISA（Biovendor Laboratory Medicine製、コスモ・バイオ株式会社販売）、Resistin ELISA Kit（Alexis Corporation製、コスモ・バイオ株式会社販売）、ヒトレジスチンELISAキット／Resistin ELISA Kit（American Research Products,Inc製、コスモ・バイオ株式会社販売）、Resistin ELISA Development（Pepro Tech Ec, Inc.製、コスモ・バイオ株式会社販売）などのELISAキットが市販されており、本発明ではこれらのキットを利用してレジスチン濃度を測定してもよい。
【００３０】
血中レジスチン濃度の評価には、「血中レジスチン濃度が高いとリスクが高い」という基準が採用される。レジスチン濃度の高低を分ける境界値として、ある集団を対象としてレジスチン濃度を測定したときの中央値又は平均値を用いることができる。ここでの「ある集団」とは例えば、特定の疾患（例えば糖尿病）の患者集団、特定の疾患に罹患した特定の年齢層（例えば３０代、４０代、５０代など）の集団、或いは病歴や年齢などに関係なく無作為に集めた集団などである。レジスチン濃度の高低を分ける境界値は例えば 4ng/ml〜50ng/ml（血漿又は血清濃度）の範囲内において設定することができる。より具体的には、4ng/ml〜43ng/ml（血漿又は血清濃度）の範囲内（例えば、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml）に境界値を設定することができる。尚、以上ではレジスチン濃度の範囲を高低の二つに分けることにしたが、これに限られるものではない。即ち、レジスチン濃度の範囲を３以上に分けた上で区分の設定をしてもよい。
【００３１】
本発明は更なる態様として、動脈硬化性疾患の環境因子に関する有益な情報が得られるリスク検査法を提供する。この態様のリスク検査法によって得られる情報は、動脈硬化性疾患の発症の阻止ないし遅延や、動脈硬化性疾患に罹患した患者の生活の質（Quality of Life: QOL）の向上を促す上で有用である。この態様のリスク検査法では、レジスチン遺伝子の-638 G>A多型についての遺伝子型と、レジスチン遺伝子の+62 G>A多型についての遺伝子型と、レジスチン遺伝子のATG繰り返し多型についての遺伝子型との組合せに対して、組合せ毎に、血中レジスチン標準濃度範囲（血中レジスチン濃度の標準的な範囲）を予め関連付けておき、以下のステップ(1)〜(4)を行う。
(1)被験者から採取された核酸検体及び血液検体を用意するステップ。
(2)前記核酸検体においてレジスチン遺伝子の-638 G>A多型、+62 G>A多型、及びATG繰り返し多型を検出し、該三つの多型について遺伝子型を決定するステップ。
(3)前記血液検体中のレジスチン濃度を測定するステップ。
(4)ステップ(3)で得られたレジスチン濃度が、ステップ(2)で決定した三つの遺伝子型の組合せに関連付けられた血中レジスチン標準濃度範囲に属するか否かを調べるステップ。
【００３２】
この態様では、被検者の検体を用いた多型の検出及びレジスチン濃度の測定に先立って、三つの遺伝子型の組合せ毎に血中レジスチン標準濃度範囲を関連付けておく。例えば、以下に示すような表を作成しておく。
【００３３】
三つの遺伝子型の組合せ１：血中レジスチン標準濃度範囲１
三つの遺伝子型の組合せ２：血中レジスチン標準濃度範囲２
三つの遺伝子型の組合せ３：血中レジスチン標準濃度範囲３
・
・
三つの遺伝子型の組合せｎ：血中レジスチン標準濃度範囲ｎ
【００３４】
「三つの遺伝子型の組合せ」とは、レジスチン遺伝子の塩基番号-638位の多型に関する遺伝子型（以下、「第１の遺伝子型」）と、レジスチン遺伝子の塩基番号+62位の多型に関する遺伝子型（以下、「第２の遺伝子型」）と、レジスチン遺伝子のATG繰り返し多型に関する遺伝子型（以下、「第３の遺伝子型」）の組合せであり、例えば（第１の遺伝子型、第２の遺伝子型、第３の遺伝子型）のように表される。ここでの「遺伝子型」はアレルの組合せ、又は特定のアレルを有するか否かによって規定される。前者の規定の仕方及び後者の規定の仕方の例を以下に示す。
＜アレルの組合せによる規定の例（-638 G>A多型の場合）＞
A/A型、A/G型、G/G型の３種類
＜特定のアレルを有するか否かによる規定の例（ATG繰り返し多型の場合）＞
繰り返し数6のアレルを有する型と、繰り返し数6のアレルを有しない型の２種類（繰り返し数7のアレルを有する型と、繰り返し数7のアレルを有しない型の２種類のように、他のアレルに注目して規定してもよい）。
【００３５】
多型の組合せに関連付けられる血中レジスチン標準濃度範囲は、多数の検体を用いた統計的解析によって決定することができる。具体例として、後述の実施例に示す解析によって決定された血中レジスチン標準濃度範囲を、対応する多型の組合せとともに示す。
（G/G型、G/G型、繰り返し数6のアレルを持たない型）：4ng/ml〜26ng/ml
（A/G型、G/G型、繰り返し数6のアレルを持たない型）：9ng/ml〜46ng/ml
（G/G型、G/A型、繰り返し数6のアレルを持たない型）：3ng/ml〜22ng/ml
【００３６】
この態様のリスク検査法ではまず、ステップ(1)〜(3)を実施し、被検者の遺伝子多型の組合せを決定するとともに、レジスチン濃度の測定値を得る。ステップ(1)〜(3)の操作は、上記各態様における対応する操作と同様であるため、その説明を省略する。
【００３７】
続くステップ(4)では、レジスチン濃度の測定値が、遺伝子型の組合せに関連付けられた血中レジスチン標準濃度範囲に属するか否かを調べる。レジスチン濃度が血中レジスチン標準濃度範囲内から逸脱していれば、その原因・理由が遺伝的素因ではなく環境因子にあると判断できる。
【００３８】
好ましくは、レジスチン濃度が、(1)血中レジスチン標準濃度範囲に属する、(2)血中レジスチン標準濃度範囲の下限値よりも低い、及び(3)血中レジスチン標準濃度範囲の上限値よりも高い、のいずれであるかを決定する。(1)の場合、遺伝的素因から予想される範囲内にレジスチン濃度があり、環境要因による悪影響はないと判断できる。従って、「現在の生活様式（ライフスタイル）を維持するとよい」といった助言を行うことができる。(2)の場合も同様に、環境要因による悪影響はないと判断でき、「現在の生活様式（ライフスタイル）を維持するとよい」といった助言を行うことができる。一方、(3)の場合、遺伝的素因ではなく環境要因にその原因があると判断でき、助言としては環境要因の改善を促すことになる。
【００３９】
（動脈硬化性疾患のリスク検査用キット）
本発明の第２の局面は、本発明のリスク検査法に使用されるキット（動脈硬化性疾患のリスク検査用キット）を提供する。本発明のキットには-638 G>A多型検出用核酸、+62 G>A多型検出用核酸、及びATG繰り返し多型検出用核酸（以下、これら三つをまとめて「多型検出用核酸」と呼ぶ）が含まれる。血中レジスチン濃度の測定も行う態様に使用されるキットの場合は、血液検体中のレジスチン濃度を測定するための成分（レジスチン濃度測定用成分）が更に含まれる。
【００４０】
多型検出用核酸は、それが適用される検出法（上述したアレル特異的核酸等を用いたPCR法を利用する方法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP、TaqMan-PCR法、Invader法等）において、検出対象である多型部分を含むDNA領域を特異的に増幅できるもの（プライマー）又は特異的に検出できるもの（プローブ）として設計される。多型用核酸の詳細については既に多型検出ステップの欄で説明したが、キットの成分として利用可能な多型検出用核酸又は多型検出用核酸のセットの具体例を以下に示す。
【００４１】
＜-638 G>A多型検出用＞
(1)-638位塩基がGであるレジスチン遺伝子の-638位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(2)-638位塩基がAであるレジスチン遺伝子の-638位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(3)(1)の核酸と(2)の核酸との組合せ
(4)核酸検体中のレジスチン遺伝子の-638位塩基がGである場合にのみ、該レジスチン遺伝子の-638位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット
(5)核酸検体中のレジスチン遺伝子の-638位塩基がAである場合にのみ、該レジスチン遺伝子の-638位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット
(6)(4)の核酸セットと(5)の核酸セットとの組合せ
(7)レジスチン遺伝子の-638位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、-638位塩基がGであるレジスチン遺伝子の-638位塩基を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー、及び／又は-638位塩基がAであるレジスチン遺伝子において-638位塩基を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、レジスチン遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット
(8)-638位がGであるレジスチン遺伝子のアンチセンス鎖において-638位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、-638位塩基がAであるレジスチン遺伝子のアンチセンス鎖において-638位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びレジスチン遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されてレジスチン遺伝子の-638位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット
【００４２】
＜+62 G>A多型検出用＞
(1)エクソン4の終止コドンから62塩基下流の塩基がGであるレジスチン遺伝子の当該塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(2)エクソン4の終止コドンから62塩基下流の塩基がAであるレジスチン遺伝子の当該塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(3)(1)の核酸と(2)の核酸との組合せ
(4)核酸検体中のレジスチン遺伝子において、エクソン4の終止コドンから62塩基下流の塩基がGである場合にのみ、該レジスチン遺伝子の該塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット
(5)核酸検体中のレジスチン遺伝子において、エクソン4の終止コドンから62塩基下流の塩基がAである場合にのみ、該レジスチン遺伝子の該塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット
(6)(4)の核酸セットと(5)の核酸セットとの組合せ
(7)レジスチン遺伝子のエクソン4の終止コドンから62塩基下流の塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、該塩基がGであるレジスチン遺伝子の該塩基を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー、及び／又は該塩基がAであるレジスチン遺伝子において該塩基を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、レジスチン遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット
(8)レジスチン遺伝子のエクソン4の終止コドンから62塩基下流の塩基がGであるレジスチン遺伝子のアンチセンス鎖において該塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、レジスチン遺伝子のエクソン4の終止コドンから62塩基下流の塩基がAであるレジスチン遺伝子のアンチセンス鎖において該塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びレジスチン遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されてレジスチン遺伝子のエクソン4の終止コドンから62塩基下流の塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット
【００４３】
＜ATG繰り返し多型検出用＞
(1)ATG繰り返し数が5であるレジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(2)ATG繰り返し数が6であるレジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(3)ATG繰り返し数が7であるレジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(4)ATG繰り返し数が8であるレジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(5)(1)〜(4)からなる群より選択される二以上の核酸の組合せ
(6)核酸検体中のレジスチン遺伝子のATG繰り返し数が5である場合にのみ、該レジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット
(7)核酸検体中のレジスチン遺伝子のATG繰り返し数が6である場合にのみ、該レジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット
(8)核酸検体中のレジスチン遺伝子のATG繰り返し数が7である場合にのみ、該レジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット
(9)核酸検体中のレジスチン遺伝子のATG繰り返し数が8である場合にのみ、該レジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット
(10)(5)〜(9)からなる群より選択される二以上の核酸セットの組合せ
(11)レジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、ATG繰り返し数が5であるレジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー、ATG繰り返し数が6であるレジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー、ATG繰り返し数が7であるレジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー、及びATG繰り返し数が8であるレジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーからなる群より選択される一以上のセンスプライマーと、レジスチン遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット
(12)ATG繰り返し数が5であるレジスチン遺伝子のアンチセンス鎖においてATG繰り返し部位に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸、ATG繰り返し数が6であるレジスチン遺伝子のアンチセンス鎖においてATG繰り返し部位に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸、ATG繰り返し数が7であるレジスチン遺伝子のアンチセンス鎖においてATG繰り返し部位に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第３の標識物質で標識された第３核酸、及びATG繰り返し数が8であるレジスチン遺伝子のアンチセンス鎖においてATG繰り返し部位に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第４の標識物質で標識された第４核酸からなる群から選択される二以上の核酸と、レジスチン遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ該二以上の核酸のいずれかと使用されてレジスチン遺伝子のATG繰り返し部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第５核酸と、からなる核酸セット
【００４４】
一方、レジスチン濃度測定用成分についても測定方法に応じた物質が採用される。例えば免疫学的測定法の実施に必要な抗レジスチン抗体（例えばELISA法用として固相化抗レジスチン抗体と標識化抗レジスチン抗体の組合せ）をレジスチン濃度測定用成分として用いることができる。
【００４５】
多型検出用核酸を使用する際（即ち多型検出の際）に必要な試薬（DNAポリメラーゼ、制限酵素、緩衝液、発色試薬など）や容器、器具等、及び／又はレジスチン濃度測定用成分を使用する際（即ちレジスチン濃度の測定の際）に必要な試薬（緩衝液、ブロッキング用試薬、発色試薬など）や容器、器具等を本発明のキットに含めてもよい。尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
【実施例】
【００４６】
ヒトにおける血漿レジスチン濃度と、肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病、高血圧及び脂質代謝異常といった代謝性疾患との関連を解明すること、及びレジスチン遺伝子多型を含め、ヒトの血漿レジスチン濃度の決定因子を明らかにすることを目的として大規模解析を行った。
【００４７】
１．方法
（１）対象
愛知県KN市在住で、KN市自治体健康診査を受診し、研究協力の同意が得られた2,534名の地域住民（男性1,156名、女性1,378名）を対象とした。
（２）評価項目
身長、体重、BMI（body mass index)、血圧、空腹時血糖値、IRI(空腹時インスリン濃度)、HbA1C(ヘモグロビンA1c)、血清脂質値（総コレステロール、トリグリセライド、HDLコレステロール)、尿酸値、HOMA-IR（homeostasis model assessment of insurin resistance)、血漿レジスチン濃度(LINCO Research)などを測定した。
（３）DNA抽出
EDTA 50mmolを含む採血管を用い、約10mlの静脈血を採取し、Qiagen FlexiGene DNA Kitを用いDNAの抽出を行なった。
（４）遺伝子多型解析
以前に血漿レジスチン濃度、耐糖能異常、2型糖尿病、高血圧、肥満などとの間に関連が指摘されたレジスチン遺伝子多型、及び日本人（あるいはアジア人）においてマイナーアレル頻度（minor allele frequency）が5%以上と報告されているコモン・バリアント（common variants）を公共データベース(NCBI、OMIM、PubMed)を利用して調べ、12多型（図１）を選択した。一塩基多型(SNP)の解析には、ASP-PCR(Allele Specific Primer-PCR)法(株式会社  東洋紡ジーンアナリシス)及びIFP（Intercalater mediated FRET Probe）法を利用した。ASP-PCRでは、5’末端にテキサスレッド又はビオチンをラベルしたアレル特異的プライマー（センス及びアンチセンス)を用い、PCRにより増幅を行い、増幅産物の標識を測定することでアレルを決定した。IFP法とは、２本鎖のDNAが温度上昇に伴って分離(融解)する現象を、蛍光インターカレーターと蛍光標識プローブとの蛍光共鳴エネルギー転移(FRET）を利用して検出する方法である。
繰り返し多型の解析にはフラグメント解析法(株式会社  東洋紡ジーンアナリシス)を利用した。繰り返し部位を挟む形でPCRを行い、その増幅断片（フラグメント）をキャピラリー電気泳動することによってフラグメント長を測定し、リピート数の判定を行なった。
（５）一次スクリーニング
全体の症例から無作為に選択した501名に関し、レジスチン遺伝子の12多型と血漿レジスチン濃度、2型糖尿病、高血圧症、脂質、代謝異常などの代謝性疾患との関連を単回帰分析及び重回帰分析（ステップワイズ法）を用い調査した。
（６）大規模解析
残りの2,033名に対して、一次スクリーニングで、血漿レジスチン濃度との有意な関連が認められた3多型について多型解析を行い、血漿レジスチン濃度、代謝性疾患との関連を単回帰分析および重回帰分析（ステップワイズ法）を用い解析を行った。
【００４８】
２．結果
一次スクリーニングの対象とした501名の背景を図２に示す。501名を対象とした多型解析及び一次スクリーニングの結果を図３〜７に示す。一次スクリーニングの単回帰分析の結果、血漿レジスチン濃度に影響を与える遺伝子多型は、-638 G>A多型、-537 A>C多型、-420 C>G多型、-358 G>A多型、+62 G>A多型、+299 G>A多型、+602 C>T多型、+876 C>G多型、+1084 G>A多型、ATG繰り返し多型であった（図５）。連鎖不平衡解析により、-638 G>A多型、-420 C>G多型、-358 G>A多型、+299 G>A多型は連鎖不平衡にあり、また、-537 A>C多型、+62 G>A多型、+1084 G>A多型も連鎖不平衡にあった（図６）。重回帰解析（ステップワイズ法）により選択された多型は、-638 G>A多型、+62 G>A多型、ATG繰り返し多型であり、これらの3多型は、独立して血漿レジスチン濃度に影響を与えていた（図７）。
【００４９】
続いて、残りの2,033名（図８）を対象として、これら3多型と血漿レジスチン濃度との関連について大規模解析（単回帰分析及び重回帰分析）を行った。大規模解析の単回帰分析の結果、一次スクリーニングと同様にレジスチン遺伝子の3多型（-638 G>A多型、+62 G>A多型、ATG繰り返し多型）が血漿レジスチン濃度に強い影響を与えることが明らかとなった（図９、１０）。また、これらの遺伝子多型以外には、年齢、トリグリセライド、HDLコレステロール、空腹時IRI、尿酸も血漿レジスチン値との関連が認められたが、遺伝子多型の影響が最も強いことが示された（図１０）。さらに、重回帰解析により、血漿レジスチン値を規定する因子は、三つのレジスチン遺伝子多型(-638 G>A多型、+62 G>A多型、ATG繰り返し多型)、年齢、尿酸、空腹時血糖、HDLコレステロール、トリグリセライドであった（図１１）。
【００５０】
以上のように、レジスチン遺伝子における-638 G>A多型、+62 G>A多型およびATG繰り返し多型が、血漿レジスチン濃度の独立した強い決定因子であることが明らかとなった。また、血漿レジスチン濃度は、年齢、血清尿酸濃度、血清HDLコレステロール濃度、血清トリグリセライド濃度及び血清インスリン濃度とも有意に関連していることが示された。このように、血漿レジスチン濃度が動脈硬化性疾患発症に関与している可能性が示唆された。
【００５１】
ここで、3多型（-638 G>A多型、+62 G>A多型、ATG繰り返し多型）の組合せ毎に血漿レジスチン濃度の範囲を算出し、表形式にまとめた（図１２）。ATG繰り返し多型については、6回繰り返しを持つ場合（表中では0で示される）と、6回繰り返しを持たない場合（表中では1で示される）で区分けした。表中(10)、(13)及び(15)で示す群は十分に頻度が高く、信頼度の高い結果を与える。(10)の群（-638 G>A多型に関してA/G型、+62 G>A多型に関してG/G型、ATG繰り返し多型に関して6回繰り返しを持たない型）の場合は約9ng/ml〜46ng/ml（95%信頼区間）を標準的な血中レジスチン濃度範囲（血中レジスチン標準濃度範囲）と捉えることができる。同様に、(13)で示す群（-638 G>A多型に関してG/G型、+62 G>A多型に関してG/A型、ATG繰り返し多型に関して6回繰り返しを持たない型）場合は約3ng/ml〜22ng/ml（95%信頼区間）を標準的な血中レジスチン濃度範囲（血中レジスチン標準濃度範囲）と捉えることができ、(15)の群（-638 G>A多型に関してG/G型、+62 G>A多型に関してG/G型、ATG繰り返し多型に関して6回繰り返しを持たない型）の場合、約4ng/ml〜約26ng/ml（95%信頼区間）を標準的な血中レジスチン濃度範囲（血中レジスチン標準濃度範囲）と捉えることができる。
【００５２】
以上のような方法によって、遺伝的素因から想定される血中レジスチン標準濃度範囲を決定することができる。被検者の血中レジスチン濃度を調べ、その値が血中レジスチン標準濃度範囲内にあるか否かを判定すれば、遺伝的素因ではなく環境要因の影響の有無及び程度を把握することができる。このようにして得られる情報は、動脈硬化性疾患の発症の阻止ないし遅延や、動脈硬化性疾患に罹患した患者の生活の質（Quality of Life: QOL）の向上を図る上で有用である。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のリスク検査法は、動脈硬化性疾患に関して確度が高く臨床上有用なリスク情報（易罹患性に関する情報）を与える。リスク情報は、動脈硬化性疾患の予防や早期診断、より適切な治療方針の決定、治療効果の向上、患者のＱＯＬ（Quality of Life、生活の質）の向上などに役立つ。また、無駄な医療行為を未然に防止することによる医療経済への貢献も期待される。
尚、多型によっては、集団（日本人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なる。その一方で、遺伝的に近い集団（例えば日本人集団に対して中国人集団や韓国人集団は近い）では多型の種類・頻度が同様の傾向を示すことが多い。この事実を考慮すれば、日本人を対象とした大規模解析によって得られた知見に基づくものであるものの、本発明の適用範囲は日本人に限られないといえる。
【００５４】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】解析対象とした、レジスチン遺伝子の12多型。上段の表に示す多型はASP-PCR法又はIFP法で検出した。下段の表に示す多型はフラグメント解析法で検出した。
【図２】一次スクリーニングの対象（501名）の背景。項目名を左欄に、集計結果を右欄に示した。年齢、身長、体重、BMI（body mass index)、SBP（収縮期血圧）、DBP（拡張期血圧）、TC（総コレステロール）、TG（トリグリセリド）、HDL-C（HDL-コレステロール）、UA（尿酸）、FPG（空腹時血糖値）、IRI(空腹時インスリン濃度)、HOMA-IR（homeostasis model assessment of insurin resistance）、HbA1C（ヘモグロビンA1c）及びレジスチンについては平均値±標準偏差で表した。また、性別は比率を示した。高血圧症、2型糖尿病、脂質異常症、高尿酸血症、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞は該当者数（患者数）及び比率（％）を表した。
【図３】遺伝子多型と血漿レジスチン濃度の関連を示すグラフ。
【図４】遺伝子多型と血漿レジスチン濃度の関連を示すグラフ。
【図５】一次スクリーニングにおける単回帰分析の結果を示す表。
【図６】ハプロタイプ解析の結果。
【図７】一次スクリーニングにおける重回帰分析の結果（目的変数：血漿レジスチン濃度）。
【図８】大規模解析の対象（2,033名）の背景。年齢、身長、体重、BMI（body mass index)、SBP（収縮期血圧）、DBP（拡張期血圧）、TC（総コレステロール）、TG（トリグリセリド）、HDL-C（HDL-コレステロール）、UA（尿酸）、FPG（空腹時血糖値）、IRI(空腹時インスリン濃度)、HOMA-IR（homeostasis model assessment of insurin resistance）、HbA1C（ヘモグロビンA1c）及びレジスチンについては平均値±標準偏差で表した。また、性別は比率を示した。高血圧症、2型糖尿病、脂質異常症、高尿酸血症、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞は該当者数（患者数）及び比率（％）を表した。
【図９】レジスチン遺伝子3多型（-638 G>A多型、+62 G>A多型、ATG繰り返し多型）と血漿レジスチン濃度との関連。
【図１０】大規模解析（単回帰分析）の結果。
【図１１】大規模解析（重回帰分析）の結果（目的変数：血漿レジスチン濃度）。
【図１２】3多型（-638 G>A多型、+62 G>A多型、ATG繰り返し多型）の組合せと、血漿レジスチン濃度の範囲の関係。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図９】
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【配列表】
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