(57)【要約】【課題】  受容体特異性が広く、フェノール性の水酸基への転移反応を優先的に触媒し、且つ、配糖化活性の高い新規な糖転移酵素と、これを用いたβ型配糖体の製造方法を提供することを課題とする。【解決方法】  新規なβ−グルコシダーゼとその製造方法、並びにこれを用いたβ型配糖体の製造方法であって、アリールβ−グルコシドを供与体として使用し、一段階で且つ選択的に、工業的に利用可能な製造方法を提供することにより上記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有するβ−グルコシダーゼ。
（１）基質特異性
アルブチンに作用して、アルブチンβ−グルコシド（１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコシド））を生成する。ヘリシン、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコシド、エスクリン、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコシド、サリシン、フェニルβ−Ｄ−グルコシド、フロリジンに作用する。セロビオ−ス、ゲンチオビオ−ス、ラミナリビオ−ス、ソホロ−ス、ネオトレハロ−スには実質的に作用しない。
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において９９，０００±２０，０００ダルトン。
（３）至適温度
ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコシドの加水分解活性として、ｐＨ６．０、３０分間反応の条件で約７０℃付近。
（４）至適ｐＨ
ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコシドの加水分解活性として、４０℃、３０分間反応の条件で約ｐＨ５．６乃至６．３付近。
（５）ｐＨ安定性
ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコシドの加水分解活性として、４℃、２４時間保持の条件で約ｐＨ４．９乃至１０．３付近。
（６）温度安定性
ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコシドの加水分解活性として、ｐＨ６．０、６０分間保持の条件で約６０℃付近まで安定。
（７）金属イオンによる阻害
ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコシドの加水分解活性は、銅イオン、水銀イオンにより阻害される。
【請求項２】
配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列か、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その酵素活性を保持する範囲で１個または２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する請求項１記載のβ−グルコシダーゼ。
【請求項３】
セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物由来である請求項１又は２記載のβ−グルコシダーゼ。
【請求項４】
セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物が、セルロモナス・ビアゾテア（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｂｉａｚｏｔｅａ）  Ｎ１２２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３３）である請求項３記載のβ−グルコシダーゼ。
【請求項５】
請求項２記載のβ−グルコシダーゼをコ−ドするＤＮＡ。
【請求項６】
配列表における配列番号２で示される塩基配列か、又は、配列表における配列番号２で示される塩基配列において、コ−ドするβ−グルコシダーゼの活性を保持する範囲で１個または２個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有する請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項７】
遺伝子コ−ドの縮重に基づき、コ−ドするβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号２で示される塩基配列における塩基の１個または２個以上を他の塩基で置換した請求項５又は６記載のＤＮＡ。
【請求項８】
請求項５乃至７のいずれかに記載のＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなる組換えＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８記載のＤＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項１０】
請求項１又は２記載のβ−グルコシダーゼ生産能を有するセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物か、又は、請求項９記載の形質転換体を栄養培地中で培養し、培養物から請求項１又は２記載のβ−グルコシダーゼを採取することを特徴とするβ−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項１１】
セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属の微生物が、セルロモナス・ビアゾテア（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｂｉａｚｏｔｅａ）  Ｎ１２２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３３）である請求項１０記載のβ−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項１２】
アルブチンに作用して、１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコピラノシド）を生成するβ−グルコシダーゼを、糖供与体としてのアリールβ−グルコシドと、受容体としての水酸基を有する有機化合物に作用させることを特徴とするβ型配糖体の製造方法。
【請求項１３】
β−グルコシダーゼが、請求項１乃至４のいずれかに記載のβ−グルコシダーゼである請求項１２記載のβ型配糖体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−グルコシダーゼ及びその製造方法並びにそれを利用したβ型配糖体の製造方法に関する。詳細には、本発明は、β−グルコシダーゼとそれをコードするＤＮＡ、組換えＤＮＡ、形質転換体、及び、当該β−グルコシダーゼ産生能を有する微生物又は形質転換体を利用したβ−グルコシダーゼの製造方法、並びに、当該β−グルコシダーゼを用いたβ型配糖体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本件出願人は先に、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラ−ゼを用いるL−アスコルビン酸配糖体の製造方法を特許文献１に、また、エラグ酸配糖体の製造方法を特許文献２に開示した。しかしながら、これら配糖体の糖の結合様式はα型であり、該方法では天然界に多く存在するβ型を製造することはできない。
【０００３】
一方、化学合成によりβ型配糖体を作る方法は既に知られているが、一般的に糖の水酸基の保護、脱保護等の工程を含み、合成操作が多段階に及ぶだけではなく、合成過程で多くの副産物を生じ、目的物の分離および精製は非常に困難である。さらに、化学合成における反応特異性は高いものではなく、また、有機溶媒を使用するため特殊な設備が必要である。
【０００４】
各種アルコール配糖体、芳香族アルコール配糖体、ポリフェノール配糖体は天然に広く存在し、配糖体は植物中で様々な役割を担っている。自然界に存在するこれらの配糖体のうちの多くはβ−グルコシドであり、植物などの天然物から抽出する方法も知られているものの、この方法は、植物中のβ−グルコシド含量が少なく、夾雑する物質を多く含んでいるがために、精製に時間とコストを要するという問題があった。
【０００５】
酵素の持つ高い特異性と温和な反応条件を利用した、β型配糖体の酵素的合成法としては一般的に２つが知られている。第一の方法は特許文献３に開示された植物培養細胞を用いた方法、又は、特許文献４に開示された、植物に由来する糖転移酵素、特にグルコース転移酵素の形質転換体を利用する方法（新規転移酵素及びそれを利用したクルクミン配糖体の製造）である。これらは、収率が低い、グルコース供与体として非常に高価なＵＤＰ−グルコースを使用する点などの問題があり、工業的製造は困難であった。
【０００６】
第二の方法は、微生物または植物由来のβ−グルコシダーゼによる糖転移反応を利用する方法である。以下、ハイドロキノンを受容体とする場合について例示する。特許文献５では、アスペルギルス属またはトリコデルマ属由来のセルラーゼ剤を利用したβ型ポリフェノール配糖体の製造方法が提案されている。特許文献５は、ハイドロキノンを受容体として作用させた場合、ハイドロキノン−β−Ｄ−グルコピラノシド（アルブチン）及び、ハイドロキノン−β−Ｄ−セロビオシドが生成することを開示しているものの、後者はアルブチンを受容体とした糖転移産物であり、受容体であるアルブチンの糖部分の水酸基へグルコースが転移した結果によって生成したものであって、受容体であるアルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性水酸基に転移した結果によって得られる１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコピラノシド）の生成は記載されていない。
【０００７】
非特許文献１には、サーモトーガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）由来のβ−グルコシダーゼを利用した糖転移反応が開示されており、セロビオ−スとアルブチンにβ−グルコシダーゼを作用させた場合、糖転移反応はアルブチンの糖部分の水酸基にβ−（１，６）、β−（１，４）、またはβ−（１，３）結合で起こることが記載されている。しかしながら、非特許文献１には、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性水酸基に転移した結果によって得られる１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコピラノシド）の生成は記載されていない。
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−６５０９８号公報
【特許文献２】特開２００５−２８１２０４号公報
【特許文献３】特開平７−８２２８９号公報
【特許文献４】特開２００５−３１２３２５号公報
【特許文献５】特開平６−２８４８９７号公報
【非特許文献１】パクら、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，第６９巻、２００５年、４１１−４２２頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、受容体特異性が広く、フェノール性の水酸基への転移反応を優先的に触媒し、且つ、配糖化活性の高い新規な糖転移酵素と、これを用いたβ型配糖体の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、β型配糖体生成活性を有する微生物を広く自然界より検索し、新規に分離した微生物、セルロモナス・ビアゾテア（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｂｉａｚｏｔｅａ）に属する微生物Ｎ１２２８株が菌体外に当該作用を有するβ−グルコシダーゼを生産することを見出した。また、該酵素をアルブチンに作用させると、１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコシド）を生成することを見出し、これに基づいて本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、新規なβ−グルコシダーゼとその製造方法、並びにこれを用いたβ型配糖体の製造方法であって、アリールβ−グルコシドを供与体として使用し、一段階で且つ選択的に、工業的に利用可能な製造方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の、受容体特異性がより広く、フェノール性の水酸基への転移反応を優先的に触媒し、且つ、配糖化活性が高い新規な糖転移酵素を用いれば、天然界に多く存在し、特に食品医薬品分野において有用でありながらも、疎水性、揮発性、または安定性の悪さなどの理由により用途が限られていたフェノール性の水酸基を有する化合物を含むアルコール化合物を配糖化することができ、それによってその水溶性、不揮発性または安定性を増大させ、諸性質を改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のβ−グルコシダーゼとは、下記の化学式１に示す構造を有するアルブチンに作用して、１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコピラノシド）を生成する酵素を意味する。アルブチン及び１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコピラノシド）は、下記の化学式１及び２にそれぞれ示す構造を有する配糖体である。本発明のβ−グルコシダーゼの特徴は、アルブチンに作用させた場合、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性の水酸基へ転移反応を触媒することにあり、１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコシド）を生成する点において、公知のβ−グルコシダーゼとは異なる酵素である。
【００１４】
化学式１：
【化１】
2009034028.tif 000002
【００１５】
化学式２：
【化２】
2009034028.tif 000003
【００１６】
本発明のβ−グルコシダーゼの酵素活性は、次のようにして測定することができる。ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコシド（以下、「ｐＮＰＧ」と略称する）を１．２５ｍＭとなるよう０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液２ｍｌに酵素液０．５ｍｌを加えて、４０℃で３０分間反応させた後、反応液１ｍｌに０．１Ｍ炭酸ナトリウム４ｍｌを添加し、加水分解により生成するｐ−ニトロフェノールの４００ｎｍの吸光度を測定する。β−グルコシダーゼの活性１単位は、上記の条件下で１分間に吸光度を０．０１増加させる酵素量と定義する。
【００１７】
本発明のβ−グルコシダーゼは、下記の理化学的性質を有している。
（１）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において、９９，０００±２０，０００ダルトン。
（２）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、約７０℃付近。
（３）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で約ｐＨ５．６乃至６．３付近。
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で約６０℃付近まで安定。
（５）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で約ｐＨ４．９乃至１０．３付近まで安定まで安定。
【００１８】
また、上記理化学的性質を有する本発明のβ−グルコシダーゼは、通常、所定のアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列か又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体酵素としては、アルブチンに作用し、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性の水酸基への転移反応を触媒することにより、１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコピシド）を生成するという酵素活性を保持する範囲で、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列において１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するものが挙げられ、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し、通常、６０％以上、望ましくは、７０％以上、さらに望ましくは、８０％以上、よりさらに望ましくは、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものが好適である。
【００１９】
しかしながら、上記アミノ酸配列を有するβ−グルコシダーゼはあくまで一例であって、上記と異なるアミノ酸配列を有する酵素も、アルブチンに作用し、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性の水酸基への転移反応を触媒することにより、１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコシド）を生成し、上記理化学的性質を有するかぎり本発明に包含される。
【００２０】
本発明のβ−グルコシダーゼは、その給源によって制限されないものの、好ましい給源として、微生物が挙げられ、とりわけ本発明者らが土壌より単離した微生物Ｎ１２２８株が好適に用いられる。以下、β−グルコシダーゼ産生能を有する微生物Ｎ１２２８株の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準じて行った。
【００２１】
また、１６Ｓ  ｒＲＮＡは多くの微生物でその配列が報告されており、いくつかの保存領域が知られている。すなわち、１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を解析して同定を行った。方法は、ウィリアムら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第１７３巻，６９７−７０３頁（１９９１年）に準じて行った。解析結果を、『リボソーマルデータベース』（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）を参考にして、公知菌との異同を検討した。同定試験の結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
2009034028.tif 000004
【００２３】
微生物Ｎ１２２８株は、表１に示す菌学的性質を示し、また、Ｎ１２２８株の１６ｓ  ｒＲＮＡはセルロモナス・ビアゾテアのタイプカルチャー（ＤＳＭ２０１１２）の１６Ｓ  ｒＤＮＡと完全に一致した。したがって、微生物Ｎ１２２８株はセルロモナス・ビアゾテア（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｂｉａｚｏｔｅａ）に属する微生物であることが判明した。これらの結果より本発明者等は、該菌株を、新規微生物セルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８と命名し、平成１９年６月５日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託し、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３３として受託された。本発明のβ−グルコシダーゼ産生能を有する微生物には、上記菌株はもとよりそれらの酵素高生産変異株なども包含される。
【００２４】
本発明のＤＮＡとは、上記β−グルコシダーゼをコードするもの全般を意味する。本発明のＤＮＡは、それが本発明のβ−グルコシダーゼをコードするものである限り、天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。天然の給源としては、例えば、セルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８を含むセルロモナス属の微生物が挙げられ、これらの菌体から本発明のＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを得ることができる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約１乃至７日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を併用したり、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの常法を適用すれば目的の遺伝子ＤＮＡが得られる。本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーとなる化学合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ合成することも有利に実施できる。
【００２５】
本発明のＤＮＡは、通常、所定の塩基配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号２で示される塩基配列又はそれに相同的な塩基配列が挙げられる。配列表における配列番号２で示される塩基配列に相同的な塩基配列を有する変異体ＤＮＡとしては、コードする酵素の活性を保持する範囲で、配列番号２で示される塩基配列において１個又は２個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有するものが挙げられ、配列番号２で示される塩基配列に対し、通常、６０％以上、望ましくは、７０％以上、さらに望ましくは、８０％以上、よりさらに望ましくは、９０％以上の相同性を有する塩基配列を有するものが好適である。また、遺伝子コードの縮重に基づき、そのコードする酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置換したものも当然、本発明のＤＮＡに包含される。
【００２６】
本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとすることも有利に実施できる。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。この内、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子ＤＮＡ及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ  ３ＡＩ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ、Ｂａｍ  ＨＩ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００２７】
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜の宿主微生物に導入することができる。形質転換体を取得するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、栄養培地で培養し、菌体内又は菌体外にβ−グルコシダーゼを生成するものを選択すればよい。
【００２８】
本発明のβ−グルコシダーゼ産生能を有する形質転換体も含めた微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、本発明のβ−グルコシダーゼを産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できるものであればよく、例えば、植物由来の澱粉やセルロース、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、デキストラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、セロビオース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
【００２９】
培養は、通常、温度１５乃至３７℃でｐＨ５．５乃至１０の範囲、好ましくは温度２０乃至３４℃でｐＨ５．５乃至８．５の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０時間乃至２４０時間である。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したりするなどの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養、半連続培養又は連続培養のいずれでもよい。
【００３０】
このようにしてβ−グルコシダーゼ産生能を有する微生物を培養した後、本発明のβ−グルコシダーゼを含む培養物を回収する。β−グルコシダーゼ活性は、培養微生物がセルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８株の場合は、主に培養物の除菌液に認められ、除菌液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには常法の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。除菌液をそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。
【００３１】
更に、β−グルコシダーゼ活性を有する除菌液及びその濃縮液を用いて、β−グルコシダーゼを斯界において常用されている適宜の方法により固定化することもできる。固定化の方法としては、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
【００３２】
上記のように本発明のβ−グルコシダーゼは、粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、斯界において常用されている適宜の方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。例えば、セルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８株の培養液の上清を硫安塩析又は平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法により濃縮操作を行った酵素標品を透析後、『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー、続いて、『ＤＥＡＥ−５ＰＷ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製することにより、本発明のセルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８株由来のβ−グルコシダーゼを、精製酵素として得ることができる。
【００３３】
β−グルコシダーゼが組換え型酵素である場合には、宿主の種類によっては菌体内に酵素が蓄積することがある。このような場合には、菌体又は培養物をそのまま使用することも可能であるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出した後、又は、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより組換え型酵素を菌体又は菌体破砕物から分離して用いることも有利に実施できる。
【００３４】
本発明のβ−グルコシダーゼの基質及びグルコシル供与体となるアリールβ−グルコシド類としては、例えば、アルブチン、ヘリシン、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコシド、エスクリン、４‐メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコシド、サリシン、フェニルβ−Ｄ−グルコシド、フロリジンなどのアグリコンがアリール基を有する化合物とグルコースがβ−結合した配糖体が挙げられる。
【００３５】
本発明のβ−グルコシダーゼを基質に作用させるに際し、その基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度０．１％（ｗ／ｖ）の比較的低濃度の溶液を用いた場合でも、本発明のβ−グルコシダーゼの反応は進行する。工業的には、基質濃度０．５％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上が好適であり、この条件下で、目的とする配糖体を有利に生成できる。反応温度は反応が進行する温度、即ち７５℃付近までで行えばよい。好ましくは４０乃至７０℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、４乃至１０の範囲、好ましくはｐＨ４．５乃至９の範囲に調整するのがよい。基質と受容体の種類、酵素の使用量及び反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。
【００３６】
上記のような作用を有する本発明のβ−グルコシダーゼは、アルブチンに作用し、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性の水酸基への転移反応を触媒することにより、１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコピラノシド）を生成するが、フェノール性の水酸基を有する化合物を含むアルコール化合物を受容体として反応系に加えることにより、その化合物を配糖化することができる。
【００３７】
１以上のフェノール性水酸基又はアルコール性水酸基を有する化合物は、本発明において、β型配糖体を調製するための受容体として用いることができる。フェノール性水酸基を有する化合物の例としては、ジメトキシフェノール（例えば、３,４−ジメトキシフェノール、３，５−ジメトキシフェノール）、ハイドロキノン、トリヒドロキシベンゼン（例えば１，２，３−トリヒドロキシベンゼン、１，２，５−トリヒドロキシベンゼン）、オイゲノール、セロトニン、ドーパミン、クロロゲン酸、４−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノン、メトキシフェノール（例えば４−メトキシフェノール、２−メトキシフェノール）、ナフトール（例えば１−ナフトール、２−ナフトール）、カテコール、レゾルシノール、ジヒドロキシ安息香酸（例えば３，４−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸）、トリヒドロキシベンゼン（例えば１，３，５−トリヒドロキシベンゼン、１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）、エスクレチン、セサモール、エクオール、Ｌ−ドーパ、エピネフリン、５−ヒドロキシトリプトファン、コーヒー酸、モリン、クマル酸（例えば、ｐ−クマル酸、ｍ−クマル酸）、ヒドロキシ安息香酸（例えば、４−ヒドロキシ安息香酸、３−ヒドロキシ安息香酸）、ヒドロキシベンズアルデヒド（例えば、４−ヒドロキシベンズアルデヒド、３−ヒドロキシベンズアルデヒド）、クレゾール（例えば、ｐ−クレゾール、ｍ−クレゾール）、没食子酸、ウンベリフェロン、カプサイシン、バニリン、フェルラ酸およびエラグ酸などが挙げられる。
【００３８】
アルコール性水酸基を有する化合物の例としては、ベンジルアルコール、４−ヒドロキシベンジルアルコール、フェネチルアルコール、コウジ酸、アスコルビン酸、リボフラビン、シクロヘキサノール、メタノール、エタノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−メチル−１−プロパノールおよび１，４−ブタンジオールなどが挙げられる。
【００３９】
アルコールの１つの好ましい実施形態では、水溶性のアルコールである。水溶性とは、室温で水１リットルに好ましくは約１０ｇ以上、さらに好ましくは約１００ｇ以上溶解することをいう。水溶性であれば、均一な一相での糖転移反応が可能となる。
【００４０】
別の実施形態では、アルコールは水に難溶性または不溶性である。水に難溶性または不溶性とは、室温で水１リットルに、例えば、約１０ｇ未満または約０．１ｇ未満しか溶解しないことをいう。水に難溶性または不溶性であって、かつ有機溶媒に可溶性のアルコールについては、有機溶媒に溶解して有機相を形成させ、他の反応成分を含有する水溶液との、有機相／水相の２相状態で、その界面付近で反応を進行させることが可能である。また、有機溶媒が水と容易に混ざり合う場合は、均一な一相での反応が可能である。
【００４１】
本発明のβ型配糖体は必要に応じて精製することができる。精製方法としては、糖または配糖体の精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、イオン交換、逆相または順相カラムクロマトグラフィーによる分離などの１種または２種以上の精製方法が適宜採用できる。
【００４２】
本発明の酵素を用いることにより、天然界に多く存在し、特に食品医薬品分野において有用でありながらも、疎水性、揮発性、または安定性の悪さなどの理由により用途が限られていた化合物の水溶性、不揮発性または安定性を増大させ、諸性質を改善したβ型配糖体を調製することができる。
【００４３】
以下、実験により本発明を詳細に説明する。
【００４４】
＜実験１：β−グルコシダーゼの調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社製造）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、硫酸第一鉄・７水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸マンガン・ｎ水和物０．００１ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、セルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８株を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで７２時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００４５】
種培養の組成から澱粉部分分解物を含まない液体培地を５００ｍｌ容三角フラスコ７０本に１００ｍｌずつ入れて、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｍｌを接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至８．５に保ちつつ、１６８時間回転振盪培養した。培養後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約７Ｌを得た。培養液及び培養上清について、β−グルコシダーゼ活性を測定したところ、培養液の該酵素活性は約８．０単位／ｍｌ、培養上清の該酵素活性は約７．９単位／ｍｌであった。セルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８株によって生産される本発明のβ−グルコシダーゼはその大部分が菌体外に存在することがわかった。β−グルコシダーゼの酵素活性は、以下の方法で測定した。ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドを１．２５ｍＭとなるよう０．１Ｍ酢緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液２ｍｌに酵素液０．５ｍｌを加えて、４０℃で３０分間酵素反応させた後、反応液１ｍｌに０．１Ｍ炭酸ナトリウム４ｍｌを添加し、４００ｎｍの吸光度を測定する。β−グルコシダーゼの活性１単位は、上記の条件下で１分間に吸光度を０．０１増加させる酵素量と定義した。
【００４６】
＜実験２：β−グルコシダーゼの精製＞
実験１で得た培養上清約７Ｌを限外ろ過モジュール（ＡＩＰ−１０１０、旭化成製造）にて約１０倍に濃縮した。これを２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析し、粗酵素液約７００ｍｌを得た。粗酵素液中のβ−グルコシダーゼ活性は約５８単位／ｍｌであった（総活性約４０，０００単位）。この粗酵素液を東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）  ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量３５０ｍｌ）に供した。本発明のβ−グルコシダーゼ活性は、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）  ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．７Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．３Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１Ｍとなるように硫安を添加して４℃、２４時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）  ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１０５ｍｌ）に供した。本発明のβ−グルコシダーゼ活性は、１Ｍ硫安を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）  ６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．７Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、これを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に対して透析した。東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−５ＰＷ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量３．３ｍｌ）に供した。本発明のβ−グルコシダーゼ活性は、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化した『ＤＥＡＥ−５ＰＷ』ゲルに吸着し、リン酸濃度１０ｍＭから０．４Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、リン酸濃度約０．２Ｍ付近に溶出した。精製の各工程におけるβ−グルコシダーゼ活性、β−グルコシダーゼの比活性及び収率を表２に示す。
【００４７】
【表２】
2009034028.tif 000005
【００４８】
＜実験３：β−グルコシダーゼの性質＞
【００４９】
＜実験３−１：分子量＞
実験２の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、本発明のβ−グルコシダーゼの分子量は約９９，０００±２０，０００ダルトンであることが判明した。
【００５０】
＜実験３−２：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験２の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図１（至適温度）、図２（至適ｐＨ）に示した。本発明のβ−グルコシダーゼの至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で約７０℃付近であり、至適ｐＨは４０℃、３０分間反応の条件で約ｐＨ５．６乃至６．３付近であることが判明した。
【００５１】
＜実験３−３：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験２の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（１００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの１００ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図３（温度安定性）、図４（ｐＨ安定性）に示した。図３から明らかなように、本発明のβ−グルコシダーゼの温度安定性は、約６０℃付近までであることが判明し、また、図４から明らかなように、本発明のβ−グルコシダーゼのｐＨ安定性は約ｐＨ４．９乃至１０．３付近の範囲であることが判明した。
【００５２】
＜実験３−４：酵素活性に及ぼす金属塩の影響＞
実験２の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩の塩化物存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表３に示す。表３の結果から明らかなように、本発明のβ−グルコシダーゼの活性は、Ｈｇ２＋イオンで著しく阻害され、Ｃｕ２＋イオンで阻害されることが判明した。
【００５３】
【表３】
2009034028.tif 000006
【００５４】
＜実験３−５：部分アミノ酸配列＞
実験２の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を適量とり、常法によりＳＤＳ−ゲル電気泳動を行い、β−グルコシダーゼの蛋白バンドを切り出し０．２Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）に浸漬した。これに修飾トリプシン（プロメガ株式会社販売）０．５μｇを加えて、３７℃、１８時間保持して酵素蛋白を加水分解した。加水分解物をアセトニトリルにて抽出した後、予め０．０６５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で平衡化させておいたＨＰＬＣ用カラム（商品名『μＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８  ＳＣ２．１／１０』、直径２．１ｍｍ×長さ１００ｍｍ、アマシャム・バイオサイエンス株式会社製）に注入し、流速０．１ｍｌ／分、室温の条件下、０．０６５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸溶液から０．０５５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸−８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液の１６０分間のリニアグラジエントで通液し、ペプチド断片を分画した。カラムから溶出したペプチド断片は波長２１４ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。グラジエント開始から約４２分、約５０分、約５４分及び約８２分に溶出した４種のペプチド断片のアミノ酸配列を、それぞれプロテインシーケンサー  モデル４９２ＨＴ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、それぞれ配列表における配列番号３乃至６に示されるアミノ酸配列を有していた。
【００５５】
＜実験４：セルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３３）由来β−グルコシダーゼをコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製＞
β−グルコシダーゼをコードするＤＮＡをセルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３３）からクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、当該酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の決定、及び形質転換体の調製を行った。
【００５６】
＜実験４−１：染色体ＤＮＡの調製＞
実験1で使用した液体培地１００ｍｌに、セルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３３）を接種し、２７℃で２日間回転振盪培養した。
培養物を遠心分離して菌体を分離し、適量のＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートし、−８０℃で１時間凍結した後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加え、６０℃に予温したＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、冷却し、遠心分離して上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、染色体ＤＮＡを含む沈澱部を採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、リボヌクレアーゼ７．５μｇとプロテアーゼ１２５μｇをそれぞれ加え、３７℃で１時間反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、抽出物に冷エタノールを加え、静置したところ、精製染色体ＤＮＡを含む沈澱が得られた。この沈澱を濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【００５７】
＜実験４−２：コロニーハイブリダイゼーションによるβ−グルコシダーゼ遺伝子のクローニング＞
実験４−１の方法により得た精製染色体ＤＮＡ２０μｇに、制限酵素Ｋｐｎ  Ｉを２００単位加え、３７℃で２４時間反応させて染色体ＤＮＡを完全に切断した後、アガロースゲル電気泳動法により約７，０００乃至８，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を回収した。別途、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）を制限酵素Ｋｐｎ  Ｉにより切断し、そのベクター断片０．０５μｇとＤＮＡ断片０．１２５μｇを市販のキット（商品名『ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ』、タカラバイオ製）を用いて連結した。得られた組換えＤＮＡを含む反応液にコンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、タカラバイオ製）を５０μｌ加え、４２℃で４５秒間処理することによりに組換えＤＮＡを大腸菌に導入し、ゲノミックライブラリーを作製した。このようにして得た遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、アンピシリンナトリウム塩１００ｍｇ／ｌ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０ｍｇ／ｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培地上で形成された白色コロニー約６００個をナイロン膜（商品名『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』、アマシャム製）上に固定した。
【００５８】
別途、実験３−６の方法で明らかにした、β−グルコシダーゼの内部部分アミノ酸配列である配列表における配列番号３で表されるアミノ酸配列における第２乃至第９番目のアミノ酸配列に基づき配列表における配列番号７に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成した。さらに、配列表における配列番号４で表されるアミノ酸配列における第１乃至第７番目のアミノ酸配列に基づき配列表における配列番号８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成した。これら２つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、鋳型として実験４−１の方法により得た染色体ＤＮＡ０．０５μｇを用いて、ＰＣＲを行った。その結果、得られた約９００塩基対の増幅断片を、ＤＩＧ  ＤＮＡ標識および検出キット（ロッシュダイアグノスティックス）の説明書に従い、ＤＩＧ標識プローブを作製した。
【００５９】
ナイロン膜上に固定した形質転換体について、ＤＩＧ標識プローブと顕著な会合を示すコロニーをコロニーハイブリダイゼーション法によって選択した。選択した１株の形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。遠心分離により培養物から菌体を採取し、アルカリ法により組換えＤＮＡを菌体外に溶出させ、これを常法により精製し分析したところ、約７，０００塩基対の挿入ＤＮＡ断片を有する組換えＤＮＡを有していた。この組換えＤＮＡを「ｐＢＧ１２２」と命名し、これを保持する形質転換体を「ＢＧ１２２」と命名した。組換えＤＮＡ、ｐＢＧ１２２を図５に示した。
【００６０】
＜実験４−３：β−グルコシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列の決定＞
ベックマン・コールター製ＤＴＣＳ『クイック・スタート・キット』と『遺伝子解析システムＣＥＱ８０００』を用いて塩基配列決定を行った。塩基配列解析には市販のソフトウェア（商品名『ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ』、ジェネティクス社販売』を用いた。組換えＤＮＡ、ｐＢＧ１２２における挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を分析したところ、当該組換えＤＮＡは、セルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３３）に由来する、配列表における配列番号２で示される鎖長２，７４５塩基対の塩基配列を有するＤＮＡを含んでいた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、配列表における配列番号２で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験３−６の方法で明らかにされた部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号３乃至６で示されるアミノ酸配列と比較したところ、配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列は、配列表における配列番号２で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における第４８６乃至５０２番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号４、５及び６に示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列表における配列番号２で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における第７６７乃至７８６番目、第１８２乃至２０１番目、第及び第４４３乃至４６２番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、本発明のβ−グルコシダーゼが、配列表における配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むことがあり、当該酵素はセルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３３）においては、配列表における配列番号２で示される塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。分泌シグナル配列の予測をＳｉｇｎａｌＰ
３．０ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）で実施した。その結果、配列表における配列番号２で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における第１乃至３２番目のアミノ酸配列は、当該酵素の分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該酵素の分泌前の前駆体は、配列表における配列番号２の塩基配列に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号２に示す塩基配列にコードされていることが判明した。
【００６１】
＜実験５：発現用組換えＤＮＡ、ｐＱＢＧ１２２の作製とその形質転換体ＱＢＧ１２２による組換え型β−グルコシダーゼの産生＞
組換えＤＮＡ『ｐＢＧ１２２』中のβ−グルコシダーゼ遺伝子を発現用ベクターに挿入し、組換え型β−グルコシダーゼの大腸菌における発現を検討した。
【００６２】
＜実験５−１：発現用組換えＤＮＡ、ｐＱＢＧ１２２の作製及び形質転換体ＱＢＧ１２２の調製＞
組換えＤＮＡ、ｐＢＧ１２２中のβ−グルコシダーゼを発現用ベクターに組込むに際し、β−グルコシダーゼの構造遺伝子より分泌シグナルをコードする領域を除き、開始コドンを付加した後、上流に制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩ認識部位を、下流にＨｉｎ  ｄＩＩＩ認識部位を導入する目的でＰＣＲを行った。ｐＢＧ１２２を鋳型として用い、合成した配列表における配列番号９で示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表における配列番号１０で示される塩基配列を有するアンチセンスプライマーの組合せでＰＣＲを行い、目的とするβ−グルコシダーゼ遺伝子を増幅した。常法により、制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩ及びＨｉｎ  ｄＩＩＩで消化した発現用ベクターｐＱＥ−１６（キアゲン社製）に、上記で増幅した後、Ｅｃｏ  ＲＩ及びＨｉｎ  ｄＩＩＩで消化したＤＮＡを組込んで得られた組換えＤＮＡの挿入配列を実験４−３の方法に準じて確認し、組換えＤＮＡを『ｐＱＢＧ１２２』と命名した。ｐＱＢＧ１２２を図６に示す。得られたｐＱＢＧ１２２を用いて宿主大腸菌ＢＬ２１（ノバジェン社製）を形質転換して形質転換体『ＱＢＧ１２２』を調製した。
【００６３】
＜実験５−２：形質転換体ＱＢＧ１２２による組換え型β−グルコシダーゼの産生＞
トリプトン（商品名『Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ』、Ｄｉｆｃｏ社販売）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（商品名『Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ』、Ｄｉｆｃｏ社販売）５ｇ／ｌ、食塩１０ｇ／ｌ、ソルビトール０．５乃至１．０Ｍ及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに５０ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却後、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験５−１の方法で得た形質転換体ＱＢＧ１２２を接種し、２７℃で３０時間回転振盪培養した。得られた培養物を、遠心分離して菌体を回収し、超音波破砕法により細胞からの全抽出物を調製した。超音波破砕法は、菌体を１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で超音波ホモジナイザー（モデルＵＨ−６００、株式会社エスエムテー製）により細胞破砕することによって行い、破砕後の遠心分離上清を全細胞抽出物とした。
このようにして調製した全細胞抽出物について、β−グルコシダーゼ活性を測定し、それぞれの活性値を培養物１ｍｌ当りに換算した。なお、対照としてプラスミドｐＱＥ−１６を保持する大腸菌ＢＬ２１を上述の形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から全細胞抽出物を調製し、同様にβ−グルコシダーゼ活性を測定した。これらの結果を表４に示す。
【００６４】
【表４】
2009034028.tif 000007
【００６５】
表４の結果から明らかなように、形質転換体ＱＢＧ１２２は、本発明のβ−グルコシダーゼを細胞内に産生することが判明した。宿主である対照の大腸菌では当該酵素活性は全く認められなかった。この実験５の方法で得た全細胞抽出物を、さらに実験２に示した方法に準じて、塩析、透析し、ＤＥＡＥ−トヨパール  ６５０Ｓゲル、ブチル−トヨパール  ６５０Ｍゲル、ＤＥＡＥ−５ＰＷを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、さらにこの精製酵素標品を実験３に示した方法に準じて分析した。その結果、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は約１００，０００±１０，０００ダルトン、β−グルコシダーゼ活性の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応の条件で約７０℃付近であり、至適ｐＨは４０℃、３０分間反応の条件で約ｐＨ５．６乃至６．３付近、温度安定性は、ｐＨ６．０、６０分間保持の条件で約６０℃付近まで安定であり、ｐＨ安定性は、４℃、２４時間保持の条件で約ｐＨ４．９乃至１０．３付近の範囲で安定であった。これらの理化学的性質は、実験２に示された方法で調製された当該酵素のそれと実質的に同一であった。以上の結果は、本発明のβ−グルコシダーゼは、組換えＤＮＡ技術によって良好に製造できることを示している。
【００６６】
＜実験７：基質特異性＞
実験２の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を用いて、本酵素の基質特異性を調べた。最終濃度１０ｍＭの各基質に、最終濃度１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験２の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を、基質である基質1ミリモル当たり１５０単位加え、この混液を５０℃にて１８時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液の糖組成を高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略称する。）又はガスクロマトグラフィー（以下、ＧＣと略称する。）を用いて測定した。
【００６７】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム:ＹＭＣ−ＰＡＣ  ＯＤＳ−ＡＱ−３１３−１５
（内径６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、株式会社ワイエムシィ製造）
カラム温度：４０℃
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：１％（ｖ／ｖ）酢酸を含む３０乃至６０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液
検出：２５０乃至３２０ｎｍにおける各基質の最大吸収波長
【００６８】
＜ＧＣ分析条件＞
カラム：２％シリコンＯＶ−１７  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  Ｗ／ＡＷ−ＤＭＳ（株式会社ジー・エル・サイエンス製造）
キャリアーガス:窒素ガスＧＣ
昇温プログラム：１分間当り７．５℃の昇温速度で温度１６０℃から３２０℃まで昇温
検出：ＦＩＤ法
サンプル：常法に従ってＴＭＳ化
【００６９】
これらの結果を表５に示した。表５から明らかなように、本発明のβ−グルコシダーゼはアルブチン、へリシン、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコシド、エスクリン、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコシド、サリシン、フェニルβ−Ｄ−グルコシド、フロリジンに作用し、セロビオ−ス、ゲンチオビオ−ス、ラミナリビオ−ス、ソホロ−ス、ネオトレハロ−スには実質的に作用しないことが分かった。
【００７０】
【表５】
2009034028.tif 000008
【００７１】
＜実験８：受容体特異性＞
実験２の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を用いて、本酵素の糖転移反応における受容体特異性を調べた。最終濃度１０ｍＭのフェニルβ−Ｄ−グルコシドに、最終濃度１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加え、アセトニトリルまたはジメチルスルホキシド（最終濃度２０％）に溶解した最終濃度１ｍＭの受容体化合物を加えた後、実験２の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を、基質である基質1ミリモル当たりあたり５０単位加え、この混液を５０℃にて１８時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液に含まれる配糖体生成量を薄相クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略称する。）またはＨＰＬＣにより分析した。なお、反応前の受容体化合物に対する反応後の生成した配糖体の割合を配糖化率とした。結果を表６に示した。
【００７２】
＜ＴＬＣ分析条件＞
プレート：メルク社製『キーゼルゲル６０Ｆ２５４』アルミプレート（１０×２０ｃｍ）
移動相：クロロホルム／酢酸／水＝６／７／１（体積比）
検出：硫酸／メタノール＝２０／８０（体積比）を噴霧し、１１０℃で５分間加熱
【００７３】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム: ＹＭＣ−ＰＡＣ  ＯＤＳ−ＡＱ−３０３  内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ（株式会社ワイエムシィ製造）
カラム温度：４０℃
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：５乃至４５％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液、リン酸でｐＨ２．５に調整
検出：２１４乃至３４９ｎｍにおける各受容体の最大吸収波長
【００７４】
【表６】
2009034028.tif 000009
【００７５】
表６から明らかなように、３,４−ジメトキシフェノール、３，５−ジメトキシフェノール、ハイドロキノン、１，２，３−トリヒドロキシベンゼン、１，２，５−トリヒドロキシベンゼン、オイゲノール、セロトニン、ドーパミン、クロロゲン酸、４−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノン、４−メトキシフェノール、３−メトキシフェノール、２−メトキシフェノール、１−ナフトール、２−ナフトール、カテコール、レゾルシノール、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン、１，２，３−トリヒドロキシベンゼン、エスクレチン、セサモール、エクオール、Ｌ−ドーパ、エピネフリン、５−ヒドロキシトリプトファン、コーヒー酸、モリン、ｏ−クマル酸、ｐ−クマル酸、ｍ−クマル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシベンズアルデヒド、３−ヒドロキシベンズアルデヒド、ｐ−クレゾール、ｍ−クレゾール、没食子酸、ウンベリフェロン、カプサイシン、バニリン、フェルラ酸およびエラグ酸などのフェノール性水酸基を有する化合物に効率よく転移反応を行った。ベンジルアルコール、４−ヒドロキシベンジルアルコール、フェネチルアルコール、コウジ酸などのアルコール性水酸基を有する化合物にも効率よく転移反応を行った。
【００７６】
＜実験９：アルブチンからの生成物＞
本発明のβ−グルコシダーゼをアルブチンに作用させた際、得られる生成物の構造を調べた。
【００７７】
＜実験９−１：アルブチンからの生成物の単離＞
最終濃度５ｗ／ｖ％のアルブチン水溶液に、最終濃度１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験２の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を、基質であるアルブチン1ミリモル当たり１００単位加え、この混液を４０℃にて１８時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液をＴＬＣ及びＨＰＬＣにより分析した。
【００７８】
＜ＴＬＣ分析の条件＞
プレート：メルク社製『キーゼルゲル６０Ｆ２５４』（アルミプレート、１０×２０ｃｍ）
移動相：１−ブタノール／ピリジン／水＝６／４／１（体積比）
検出：硫酸／メタノール＝２０／８０（体積比）を噴霧し、１１０℃で５分間加熱
【００７９】
図７にＴＬＣ分析の結果を示す。図７に示すように、ＴＬＣクロマトグラムにおいて、反応液中にアルブチンと比較して移動度の小さい生成物が認められた。このことから、反応終了液中にはアルブチン、グルコースとは異なる新たな糖質が生成されたことが確認された。
【００８０】
＜ＨＰＬＣ分析の条件＞
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣ  ＯＤＳ−ＡＱ−３１３−１５  内径６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ（株式会社ワイエムシィ製造）
カラム温度：４０℃
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：メタノール／水／酢酸＝１０／９０／１（体積比）
検出波長：２８０ｎｍ
【００８１】
図８にＨＰＬＣ分析の結果を示す。１５分にアルブチンのピーク（図８における符号ｂ）が、２０分にアルブチンから遊離したヒドロキノン（図８における符号ｃ）のピークが認められ、１１分にアルブチンへグルコース残基が転移することにより生成したと考えられる生成物Ａのピーク（図８における符号ａ）が認められた。反応液１００ｍｌを予め０．１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液で平衡化したオルガノ製ＯＤＳ『ＦＳ―１８３０カラム』に通液し、目的画分を回収、精密濾過したものを分画原料とした。ＨＰＬＣに３０回に分けて供して精製し、凍結乾燥した結果、上記のアルブチン反応終了液１００ｍｌから、純度約９９．５％以上の生成物Ａ標品を約０．７ｇ得た。
【００８２】
＜ＨＰＬＣによる精製条件＞
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣ  ＯＤＳ−Ａ  内径２０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ（株式会社ワイエムシィ製造）
カラム温度：４０℃
流速：４ｍｌ／分
移動相：メタノール／水＝５／９５（体積比）
検出波長:２８０ｎｍ
【００８３】
＜実験９−２：生成物Ａの構造解析＞
実験９−１で得た生成物Ａの精製標品を用いて生成物Ａの構造解析を行った。
【００８４】
＜実験９−２−１：質量分析＞
実験９−１の方法で得た生成物Ａ精製標品について、質量分析装置『ＬＣＱ−Ａｄｖａｎｔａｇｅ』（サーモエレクトロン社製）を用いて質量分析したところ、質量数４５７のナトリウム付加分子イオンが顕著に検出され、生成物Ａの質量数が４３４であることが判明した。この質量数から、生成物Ａは１分子のアルブチンが１分子のグルコースと結合していることが示唆された。
【００８５】
＜実験９−２−２：核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析＞
実験９−１の方法で得た生成物Ａ精製標品について、ＮＭＲ装置『ＪＭＮ−ＡＬ３００型』（ＪＥＯＬ製）を用い、重水溶媒中で１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行った。１３Ｃ−ＮＭＲにおいて、８本のシグナルが６２．９ｐｐｍから１５４．８ｐｐｍの間に確認された。グルコースに由来すると考えられるシグナルが１０３．３、７８．５、７８．０、７５．４、７１．８及び６２．９ｐｐｍに、ベンゼン環に由来すると考えられるシグナルが１５４．８ｐｐｍと１２０．４ｐｐｍにそれぞれ確認され、１２０．４ｐｐｍのシグナルは、他のシグナルと比較して非常に強いシグナルとして確認された。よって、９個の炭素原子の存在が考えられたが、実験９−２−１における分子量分析の結果より生成物Ａは１８個の炭素原子から構成されていると考えられた。これらの結果より、得られた精製標品はアルブチンのアグリコン部分の水酸基、即ち、フェノール性の水酸基にグルコースが結合した物質であることが確認できた。１Ｈ−ＮＭＲにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル（４．８９ｐｐｍ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）の結合定数がβ型のみであることを示していることから、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、即ち、フェノール性の水酸基にグルコースの１位の水酸基がβ結合していることが確認された。以上の分析結果より、生成物Ａは、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、即ち、フェノール性の水酸基にグルコースがβ結合した配糖体、１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコピラノシド）であることが分かった。
【００８６】
＜実験１０：市販β−グルコシダーゼの転移反応特性との比較＞
市販のβ−グルコシダーゼ活性を有する酵素剤は、糖転移活性を有していることが知られている。本発明のβ−グルコシダーゼと市販の酵素剤を比較するために、次に示す３種類の市販酵素剤をアルブチンに作用させ、１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコピラノシド）の生成が認められるかどうか調べた。
（１）トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）由来セルラーゼ（Ｏｎｏｚｕｋａ
ＲＳ、ヤクルト製造）
（２）アスベルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来セロビアーゼ（ノボザイム１８８、ノボザイム製造）
（３）アーモンド由来β−グルコシダーゼ（オリエンタル酵母製造）
【００８７】
最終濃度２０ｍＭのアルブチン水溶液に、最終濃度１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験２の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品または、市販の酵素剤を、基質であるアルブチン1ミリモル当たり２単位乃至６，２５０単位加えこの混液を４０℃にて１５時間反応させた。反応液を実験８−１記載のＨＰＬＣによる分析法に従い分析した。結果を表７に示す。
【００８８】
【表７】
2009034028.tif 000010
【００８９】
表７の結果より明らかなように、１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコシド）を生成することができる酵素は本発明のβ−グルコシダーゼのみであった。したがって、当該酵素は、アルブチンに作用させた場合、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性の水酸基へ転移反応を触媒し、１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコシド）を生成する点で、公知のβ−グルコシダーゼとは異なる酵素である。
【００９０】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に例示するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。本発明のβ−グルコシダーゼの製造法を実施例１に、本発明のβ−グルコシダーゼを用いたβ型配糖体の製造方法を実施例２乃至６に示す。
【実施例１】
【００９１】
＜β−グルコシダーゼ酵素剤の製造＞
セルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３３）を実験１の方法に準じて、三角フラスコにて１６８時間回転振盪培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、限外ろ過モジュール（ＡＩＰ−１０１０、旭化成製造）にて濃縮、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液を交換した。約２０倍に濃縮して濃縮酵素液を調製した。本濃縮酵素液のβ−グルコシダーゼ活性は２４４単位／ｍｌであった。本酵素剤はアリールβ−グルコシドを供与体とした、フェノ−ル性化合物を含むアルコ−ル類のβ型配糖体の製造に有利に利用できる。
【実施例２】
【００９２】
＜アルブチン配糖体の合成＞
セルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３３）を実験１の方法に準じて、三角フラスコにて１６８時間回転振盪培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、ｐＨを６．０に調整後、除菌ろ過を行った。この培養上清７．５ｍｌを、アルブチン０．１５ｇを７．５ｍｌの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させた液に混合し、４０℃で２４時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液を実験９−１と同じ条件でＨＰＬＣにより分析した。その結果、反応終了液中に実験９で生成が確認された１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコシド）のピークが確認された。得られた生成物の構造をより詳細に確認するために、反応終了液を以下のように精製した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』とオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１Ｓ』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、分画原料とした。分析と同じ条件でＨＰＬＣに複数回に分けて供し配糖体を含む画分を集め、濃縮、乾固することにより、アルブチン配糖体（精製標品）を約０．０３ｇ得た。この精製標品の構造を実験９−２と同様の方法によりＮＭＲで確認したところ、実験９−２−２と同じ結果を得た。アルブチンのアグリコン部分の水酸基、即ち、フェノール性の水酸基にグルコースの１位の水酸基がβ結合している化合物、１，４−フェニレン  ビス（β−Ｄ−グルコシド）であることが確認された。
【実施例３】
【００９３】
＜セロトニン配糖体の合成＞
セロトニン１ｇとフェニルβ−Ｄ−グルコシド１２ｇを４６０ｍｌの脱イオン水に溶解し、ｐＨを６．０に調整して混合液を得た後、実施例1で調製したβ−グルコシダーゼ酵素剤２，３４０単位（９．６ｍｌ）を加え、この混合液を４０℃にて１５時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液を以下の条件でＨＰＬＣにより分析した。
＜ＨＰＬＣ分析の条件＞
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣ  ＯＤＳ−ＡＱ−３０３  内径４．６ｍｍ  長さ２５０ｍｍ（株式会社ワイエムシィ製造）
カラム温度４０℃
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：メタノール／水＝５／９５（体積比）リン酸でｐＨ２．７に調整
検出波長：２７６ｎｍ
【００９４】
図９にＨＰＬＣの結果を示す。この結果、対照反応液と反応終了液との比較から、セロトニンが減少し、反応後の混合液中にフェノール及びセロトニンよりも早く流出する生成物が出現したことが確認された。すなわち、基質であるフェニルβ−Ｄ−グルコシドのグルコース部分がセロトニンに転移してセロトニン配糖体が形成された。セロトニンの配糖化率は約８６％であった。得られたセロトニン配糖体の構造をより詳細に確認するために、反応終了液を以下のように精製した。脱イオン水で平衡化した三菱化学製『ダイヤイオンＨＰ−２０』（６００ｍｌ）カラムに反応終了液を通液することにより、未反応の基質であるフェニルβ−Ｄ−グルコシド及び生成したフェノールを吸着させ、非吸着画分を回収した。次いで、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含む５％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液で平衡化したＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ（内径２０ｍｍ  長さ２５０ｍｍ、株式会社ワイエムシィ製造）カラムクロマトグラフィーに複数回に分けて供した。配糖体を含む画分を集め、濃縮後、更に５％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液で平衡化した同カラムクロマトグラフィーに複数回に分けて供した。配糖体を含む画分を集め、濃縮、凍結乾燥することにより純度約９９．５％以上のセロトニン配糖体（精製標品）を、約１．２ｇ得た。この精製標品の構造を実験９−２と同様の方法によりＮＭＲおよび質量分析により確認した。ＮＭＲは、重水溶媒中で１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行った。１３Ｃ−ＮＭＲにおいて、グルコース由来のシグナル（１０２．７、７７．０、７６．５、７３．９、７０．４、６１．５（ｐｐｍ））及びセロトニン由来のシグナル（１５１．４、１３３．８、１２７．５、１２６．４、１１４．２、１１３．６、１０９．８、１０６．０、４０．４、２３．４（ｐｐｍ））が検出された。１Ｈ−ＮＭＲにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル（４．７６ｐｐｍ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）の結合定数がβ型であることが確認された。質量分析及びＮＭＲの結果より、得られた配糖体の分子量は３３８であり、１分子のセロトニンが１分子のグルコースの１位の水酸基にβ結合した配糖体であることが分かった。
【実施例４】
【００９５】
＜５−ヒドロキシトリプトファン配糖体の合成＞
５−ヒドロキシトリプトファン０．７ｇとフェニルβ−Ｄ−グルコシド７．４ｇを３００ｍｌの脱イオン水に溶解し、ｐＨを５．７に調整して混合液を得た後、実施例1で調製したβ−グルコシダーゼ酵素剤２，９００単位（１１．９ｍｌ）を加え、この混合液を４０℃にて１６時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液は実施例３と同様の条件によりＨＰＬＣで分析した。その結果、対照反応液と反応終了液との比較から、基質であるフェニルβ−Ｄ−グルコシド及び５−ヒドロキシトリプトファンが減少し、反応後の混合液中にフェノール及び５−ヒドロキシトリプトファンよりも早く流出する生成物が出現したことが確認された。すなわち、基質であるフェニルβ−Ｄ−グルコシドのグルコース部分が５−ヒドロキシトリプトファンに転移して５−ヒドロキシトリプトファン配糖体が形成された。得られた５−ヒドロキシトリプトファン配糖体の構造をより詳細に確認するために、実施例３と同様の方法で精製を行うことにより、純度約９９．５％以上の５−ヒドロキシトリプトファン配糖体（精製標品）を約０．２２ｇ得た。この精製標品の構造を実験９−２と同様の方法によりＮＭＲおよび質量分析により確認した。ＮＭＲは、ジメチルスルホキシド−ｄ６溶媒中で１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行った。１３Ｃ−ＮＭＲにおいて、グルコース由来のシグナル（１０２．６、７７．３、７７．１、７３．６、７０．４、６１．２（ｐｐｍ））及び５−ヒドロキシトリプトファン由来のシグナル（１７１．２、１５１．３、１３２．６、１２７．７、１２５．３、１１２．８、１１１．６、１０９．２、１０５．７、５４．７、２７．２（ｐｐｍ））が検出された。１Ｈ−ＮＭＲにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル（４．６８ｐｐｍ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）の結合定数がβ型であることが確認された。質量分析及びＮＭＲの結果より、得られた配糖体の分子量は３８２であり、１分子のグルコースが１分子の５−ヒドロキシトリプトファンの水酸基にβ結合した配糖体であることが分かった。
【実施例５】
【００９６】
＜オイゲノール配糖体の合成＞
オイゲノール０．９８５ｇをアセトニトリル１５０ｍｌに溶解した液と、フェニルβ−Ｄ−グルコシド７．６９ｇを脱イオン水１３５０ｍｌに溶解した液を混合し、ｐＨを５．８に調整して混合液を得た後、実施例1で調製したβ−グルコシダーゼ酵素剤７６０単位（３．１ｍｌ）を加え、この混合液を４０℃にて１５時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液を以下の条件でＨＰＬＣにより分析した。
［ＨＰＬＣ分析の条件］
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣ  ＯＤＳ−ＡＱ−３０３  内径４．６ｍｍ  長さ２５０ｍｍ（株式会社ワイエムシィ製造）
カラム温度：４０℃
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：メタノール／水／酢酸＝５０／５０／１（体積比）
検出波長：２７５ｎｍ
その結果、対照反応液と反応終了液との比較から、基質であるフェニルβ−Ｄ−グルコシド及びオイゲノールが減少し、反応後の混合液中にオイゲノールよりも早く流出する生成物が出現したことが確認された。すなわち、基質であるフェニルβ−Ｄ−グルコシドのグルコース部分がオイゲノールに転移してオイゲノール配糖体が形成された。得られたオイゲノール配糖体の構造をより詳細に確認するために、反応終了液を以下のように精製した。反応終了液を濃縮乾固し、未反応のオイゲノール及び生成したフェノールを除去した後、脱イオン水に溶解させ、脱イオン水で平衡化した三菱化学製『ダイヤイオンＨＰ−２０』（４００ｍｌ）カラムに吸着させた。２０％エタノールを通液することにより未反応の基質であるフェニルβ−Ｄ−グルコシドを溶出した後、５０％エタノールを通液して配糖体を溶出させた。濃縮後、５０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液で平衡化したＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ（内径２０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、株式会社ワイエムシィ製造）カラムクロマトグラフィーに３回に分けて供した。配糖体を含む画分を集め、濃縮、凍結乾燥することにより、純度約９９．５％以上のオイゲノール配糖体（精製標品）を約０．２６ｇ得た。この精製標品の構造を実験９−２と同様の方法によりＮＭＲおよび質量分析により確認した。ＮＭＲは、ジメチルスルホキシド−ｄ６溶媒中で１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行った。１３Ｃ−ＮＭＲにおいて、グルコース由来のシグナル（１００．４、７７．１、７７．０、７３．３、６９．８、６０．８（ｐｐｍ））及びオイゲノール由来のシグナル（１４９．０、１４５．０、１３８．０、１３３．６、１２０．４、１１５．６、１１５．６、１１３．１、５５．８、３９．２（ｐｐｍ））が検出された。１Ｈ−ＮＭＲにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル（４．８５ｐｐｍ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）の結合定数より結合様式はβ型であることが確認された。また、質量分析の結果、この配糖体の分子量は３２６であることが分かった。これらの結果から、得られた配糖体は、１分子のグルコースが１分子のオイゲノールの水酸基にβ結合した構造を有することが分かった。
【実施例６】
【００９７】
＜バニリン配糖体の合成＞
セルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３３）を実験１の方法に準じて、三角フラスコにて１６８時間回転振盪培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、ｐＨを６．０に調整後、除菌ろ過を行った。この培養上清７．５ｍｌを、バニリン０．１５ｇとアルブチン０．１５ｇを７．５ｍｌの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させた液と混合し、４０℃で４８時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液を以下の条件でＨＰＬＣにより分析した。
＜ＨＰＬＣ分析の条件＞
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣ  ＯＤＳ−ＡＱ−３１３−１５  内径６．０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ（株式会社ワイエムシィ製造）
カラム温度：４０℃
流速：０．５ｍｌ／分
移動相：メタノール／水／酢酸＝２５／７５／１（体積比）
検出波長：２８０ｎｍ
その結果、反応後の混合液中にバニリンよりも早く溶出する生成物が認められた。得られた生成物の構造をより詳細に確認するために、反応終了液を以下のように精製した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』とオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１Ｓ』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、分画原料とした。分析と同じ条件でＨＰＬＣに複数回に分けて供し配糖体を含む画分を集め、濃縮、乾固することにより、純度約９９．５％以上のバニリン配糖体（精製標品）を約０．０１ｇ得た。この精製標品の構造を実験９−２と同様の方法によりＮＭＲおよび質量分析により確認した。ＮＭＲは、重水溶媒中で１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行った。１３Ｃ−ＮＭＲにおいて、グルコース由来のシグナル（１０２．０、７８．７、７７．８、７５．１、７１．６、６２．８（ｐｐｍ））及びバニリン由来のシグナル（１９７．１、１５３．５、１５１．２、１３３．４、１２９．２、１１７．２、１１３．６、５８．２（ｐｐｍ））が検出された。１Ｈ−ＮＭＲにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル（５．０７ｐｐｍ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）の結合定数よりグルコースの結合様式はβ型であることが確認された。質量分析及びＮＭＲの結果より、得られた配糖体の分子量は３１４であり、グルコース１分子が１分子のバニリンにβ結合した配糖体であることが分かった。
【実施例７】
【００９８】
＜エクオール配糖体の合成＞
０．１ｇエクオールをエタノール１０ｍｌに溶解した液と、アルブチン１．０ｇを９０ｍｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた液を混合し、実施例1で調製したβ−グルコシダーゼ酵素剤３２０単位（１．３ｍｌ）を加え、この混合液を４０℃にて１５時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液を以下の条件でＨＰＬＣにより分析した。
＜ＨＰＬＣ分析の条件＞
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣ  ＯＤＳ−ＡＱ−３０３  内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ（株式会社ワイエムシィ製造）
カラム温度：３５℃
流速：０．８ｍｌ／分
移動相：（Ａ）アセトニトリル／水／酢酸＝２０／８０／０．１（体積比）
（Ｂ）アセトニトリル／水／酢酸＝４０／６０／０．１（体積比）
グラジエント：０−２５分  ％Ｂ＝０    ２５−３５分  ％Ｂ＝０−１００
検出波長：２８０ｎｍ
【００９９】
その結果、反応後の混合液中にエクオールよりも早く溶出する２本の生成物のピークが認められた（それぞれ、ＥＱ−Ｇａ、ＥＱ−Ｇｂとする）。得られた生成物の構造をより詳細に確認するために、反応終了液を以下のように精製した。エバポレーターで濃縮乾固後、５０％メタノール１３ｍｌに溶解させ、室温に放置し沈殿を形成させた。上清を回収し、精密濾過した後、以下に示す条件でＨＰＬＣに複数回に分けて供し配糖体を含む画分をそれぞれ集め、濃縮、乾固することにより、純度約８９％（ＥＱ−Ｇａ）と約９７％（ＥＱ−Ｇｂ）の２種類のエクオール配糖体（精製標品）を約０．０２ｇずつ得た。
＜ＨＰＬＣによる精製の条件＞
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣ  ＯＤＳ−ＡＱ−３１３  内径６．０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ（株式会社ワイエムシィ製造）
カラム温度：３５℃
流速：１．０ｍｌ／分
移動相：（Ａ）アセトニトリル／水／酢酸＝１６／８４／０．１（体積比）
（Ｂ）アセトニトリル／水／酢酸＝４０／６０／０．１（体積比）
グラジエント：０−５０分  ％Ｂ＝０    ５０−６２分  ％Ｂ＝０−１００
検出波長：２８０ｎｍ
【０１００】
ＥＱ−Ｇａ及びＥＱ−Ｇｂ精製標品の構造を実験９−２と同様の方法によりＮＭＲおよび質量分析により確認した。ＮＭＲは、メタノール−ｄ４溶媒中で１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行ったところ、ＥＱ−Ｇａは１３Ｃ−ＮＭＲにおいて、グルコース由来のシグナル（１０２．３、７８．１、７７．９、７４．９、７１．３、６２．５（ｐｐｍ））及びエクオール由来のシグナル（１５８．０、１５７．６、１５６．２、１３１．２、１３７．０、１２９．４、１１８．０、１１４．４、１０９．２、１０３．８、７１．９、３４．９、３２．９（ｐｐｍ））が検出された。１Ｈ−ＮＭＲにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル（４．７８ｐｐｍ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）の結合定数よりグルコースの結合様式はβ型であることが確認された。質量分析及びＮＭＲの結果より、ＥＱ−Ｇａの分子量は４０４であり、グルコース１分子が１分子のエクオールの４’位にβ結合した配糖体であることが分かった。一方、ＥＱ−Ｇｂは１３Ｃ−ＮＭＲにおいて、グルコース由来のシグナル（１０２．４、７８．０、７７．９、７４．９、７１．３、６２．５（ｐｐｍ））及びエクオール由来のシグナル（１５８．４、１５７．４、１５６．２、１３３．６、１３１．２、１２９．４、１１７．６、１１６．４、１１０．３、１０５．６、７２．２、３９．１、３３．０、（ｐｐｍ））が検出された。１Ｈ−ＮＭＲにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル（４．７７ｐｐｍ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）の結合定数よりグルコースの結合様式はβ型であることが確認された。質量分析及びＮＭＲの結果より、ＥＱ−Ｇｂの分子量は４０４であり、グルコース１分子が１分子のエクオールの７位にβ結合した配糖体であることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明のβ−グルコシダーゼの至適温度を示す図である。
【図２】本発明のβ−グルコシダーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図３】本発明のβ−グルコシダーゼの温度安定性を示す図である。
【図４】本発明のβ−グルコシダーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図５】組換えＤＮＡ、ｐＢＧ１２２を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、セルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３３）由来の本発明のβ−グルコシダーゼをコードするＤＮＡである。
【図６】組換えＤＮＡ、ｐＱＢＧ１２２を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、セルロモナス・ビアゾテア  Ｎ１２２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３３）由来の本発明のβ−グルコシダーゼをコードするＤＮＡである。
【図７】本発明のβ−グルコシダーゼをアルブチンに作用させた反応液の薄層クロマトグラムを示す図である。
【図８】本発明のβ−グルコシダーゼをアルブチンに作用させた反応液のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図９】本発明のβ−グルコシダーゼを受容体としてのセロトニン存在下でグルコシル供与体としてのフェニルβ−Ｄ−グルコシドに作用させた反応液のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【符号の説明】
【０１０２】
図５及び６において
ｆ１（＋）  ｏｒｉｇｉｎ：ｆ１（＋）複製開始点
Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ：アンピシリン耐性遺伝子
Ｃｏｌ  Ｅ１  ｏｒｉｇｉｎ：コリシンＥ１遺伝子複製開始点
ＰＴ５：Ｔ５プロモーター
Ｔ０：ラムダｔ０ターミネーター
β−ＧＬＵ：本発明のβ−グルコシダーゼをコードするＤＮＡ
図７において
１：グルコース及びマルトオリゴ糖マーカー
２：アルブチン
３：アルブチン１ミリモル当たり２単位のβ−グルコシダーゼ精製標品を作用させた反応液
４：アルブチン１ミリモル当たり１００単位のβ−グルコシダーゼ精製標品を作用させた反応液
ａ：生成物Ａのスポット
ｂ：アルブチンのスポット
ｃ：ハイドロキノンのスポット
図８において、
ａ：生成物Ａのピーク
ｂ：アルブチンのピーク
ｃ：ハイドロキノンのピーク
図９において、
ａ：セロトニン配糖体のピーク
ｂ：セロトニンのピーク
ｃ：フェニルβ−Ｄ−グルコシドのピーク
ｄ：フェノールのピーク
【図１】
2009034028.tif 000011
【図２】
2009034028.tif 000012
【図３】
2009034028.tif 000013
【図４】
2009034028.tif 000014
【図５】
2009034028.tif 000015
【図６】
2009034028.tif 000016
【図８】
2009034028.tif 000017
【図９】
2009034028.tif 000018
【図７】
2009034028.tif 000019
【配列表】
2009034028000001.app