(57)【要約】【課題】マクロファージの泡沫化を阻害し、血中コレステロールを低下し、動脈硬化を予防・治療できる物質を同定することによって、動脈硬化の予防・治療剤、血中コレステロール低下剤、及びマクロファージの泡沫化阻害剤を提供すること。【解決手段】トマチジンを有効成分として含む、動脈硬化の予防・治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トマチジンを有効成分として含む、動脈硬化の予防・治療剤。
【請求項２】
トマチジンを有効成分として含む、血中コレステロール低下剤。
【請求項３】
トマチジンを有効成分として含む、マクロファージの泡沫化阻害剤。
【請求項４】
トマチジンを有効成分として含む、動脈硬化の予防・治療、血中コレステロール低下、又はマクロファージの泡沫化阻害のための飲食品。
【請求項５】
エスクレオサイドＡと併用される、請求項１から４の何れかに記載の薬剤又は飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トマチジンを有効成分として含む動脈硬化の予防・治療剤、血中コレステロール低下剤、及びマクロファージの泡沫化阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
食生活の西洋化や運動不足が原因で、肥満、脂質代謝異常、高血圧、糖尿病など、生活習慣病の発症率が激増している。現在、日本には700万人以上の糖尿病患者が存在し、本疾患に罹患すると動脈硬化症を高頻度に発症する。生活習慣病になると血中コレステロール濃度が上昇し、変性した低密度リポ蛋白(LDL)を介してマクロファージに取り込まれ、その後、コレステロールはacyl-CoA: cholesterol acyl-transferase 1(ACAT-1)という酵素の作用でコレステロールエステルに変換されマクロファージ内に蓄積する（マクロファージの泡沫化）。また、肝臓ではACAT-2が発現しており、肝臓で合成されたコレステロールの血中への放出に関与している。
【０００３】
一方、トマトの果実より単離されたエスクレオサイドAは、マクロファージの泡沫化を抑制し、高脂血症マウスで動脈硬化の発症を抑制することが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
【非特許文献１】Fujiwara Y, Kiyota N, Hori M, Matsushita S, Iijima Y, Aoki K, Shibata D, Takeya M, Ikeda T, Nohara T and Nagai R. Esculeogenin A, a new tomato sapogenol, ameliorates hyperlipidemia and atherosclerosis in apoE-deficient mice by inhibiting ACAT. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27: 2400-2406, 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、マクロファージの泡沫化を阻害し、血中コレステロールを低下し、動脈硬化を予防・治療できる物質を同定することによって、動脈硬化の予防・治療剤、血中コレステロール低下剤、及びマクロファージの泡沫化阻害剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、食品あるいは生薬の粗抽出物、あるいは単離化合物（約１００種類）についてマクロファージの泡沫化阻害活性を評価した結果、トマトの茎・葉より単離されたトマチジン（図１）がACATを阻害することによって泡沫化を抑制し（図２）、さらに高脂血症マウスにトマチジンを2ヶ月間経口投与した結果、血中コレステロールの低下（図３）、さらに、動脈硬化を有意に抑制する（図４）ことが明らかとなった。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  トマチジンを有効成分として含む、動脈硬化の予防・治療剤。
（２）  トマチジンを有効成分として含む、血中コレステロール低下剤。
（３）  トマチジンを有効成分として含む、マクロファージの泡沫化阻害剤。
（４）  トマチジンを有効成分として含む、動脈硬化の予防・治療、血中コレステロール低下、又はマクロファージの泡沫化阻害のための飲食品。
（５）  エスクレオサイドＡと併用される、（１）から（４）の何れかに記載の薬剤又は飲食品。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により新規な動脈硬化の予防・治療剤、血中コレステロール低下剤、及びマクロファージの泡沫化阻害剤が提供される。本発明においては、トマト果実収穫後の商品価値のないトマト地上部（茎・葉など）から動脈硬化予防の有効成分が発見された。なお、エスクレオサイドAはトマトの茎・葉には含まれていない。また、トマチジンの単離は、エスクレオサイドAの単離よりも比較的容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の動脈硬化の予防・治療剤、血中コレステロール低下剤、及びマクロファージの泡沫化阻害剤（以下、これらを総称して本発明の薬剤とも言う）において有効成分として用いるトマチジンは、図１に示す構造を有する（２２Ｓ，２５Ｓ）−５α−スピロソラン−３β−オールである。
【００１０】
本発明の薬剤における有効成分としては、図１に示す構造を有する遊離形態の化合物のほか、生理学的に許容される塩を用いてもよい。生理学的に許容される塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩；マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩；アンモニア、エタノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール等のアミンとの塩などが挙げられる。この他、生理的に許容されるものであれば塩の種類は特に限定されることはない。
【００１１】
トマチジンは公知化合物であり、有機化学的に合成してもよいし、あるいは、例えば、本明細書中の実施例に記載の方法又はそれに準じた方法により、トマトより調製・入手することができる。
【００１２】
本発明の薬剤を対象者に投与する場合の投与量は、対象者の年齢、体重、症状等に応じて適宜設定することができるが、一般的には、成人一人一日当たり有効成分として０．１〜１０００mg ／kg体重、特に０．１〜５００mg／kg体重を１〜数回に分けて投与することができる。
【００１３】
本発明の薬剤の投与経路は、特に限定されず、例えば、経口投与、又は非経口投与（皮膚に塗布、又は静脈注射、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射、筋肉内投与等）を行うことができる。
【００１４】
本発明の薬剤は、有効成分として含有するトマチジンで示される化合物に加えて、医薬組成物で通常用いられている添加物を含有することができる。この様な任意の添加物としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、可溶化剤、分散剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、安定剤、等張剤等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。腑形剤としては、乳糖、白糖、ブドウ糖などの糖類、デンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム等の無機物、結晶セルロース、蒸留水、精製水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油等の一般に使用されているものを例示することができる。本発明の薬剤は、これらの添加物を用いて常法によって製剤化することができる。また、本発明の薬剤は、他の医薬品と混合して使用したり、併用することもできる。
【００１５】
また、本発明の薬剤は、飲食品の形態として製造することもできる。本発明による動脈硬化の予防・治療、血中コレステロール低下、又はマクロファージの泡沫化阻害のための飲食品の製品の具体例としては、清涼飲料、ドリンク剤、健康食品、特定保健用食品、機能性食品、機能活性型食品、栄養補助食品、サプリメント、飼料、飼料添加物などと一般に呼称される、飲料を含む健康食品または補助食品が挙げられる。
【００１６】
本発明の飲食品は、トマチジンを、食品に使われる一般的な原料に直接混合、分散したのち、公知の方法により所望の形態に加工することによって得ることができる。本発明の飲食品はあらゆる形態の飲食品を包含するものであり、その種類は特に制限されず、上記したような各種飲食物、あるいは各種栄養組成物、例えば各種の経口又は経腸栄養剤や飲料等に、トマチジンを配合して飲食品として提供することができる。飲食品の形態は特に限定されず、摂取しやすい形態であれば、固形、粉末、液体、ゲル状、スラリー状等のいずれであってもよい。
【００１７】
本発明の薬剤は、エスクレオサイドＡと併用することができ、これにより動脈硬化の予防・治療、血中コレステロール低下、並びにマクロファージの泡沫化阻害という本発明の効果をさらに高めることができる、エスクレオサイドＡを対象者に投与する場合の投与量は、対象者の年齢、体重、症状等に応じて適宜設定することができるが、一般的には、成人一人一日当たり有効成分として０．１〜１０００mg ／kg体重、特に０．１〜５００mg／kg体重を１〜数回に分けて投与することができる。
【００１８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
実施例１：Tomatidineの抽出・分離法
トマト (Lycopersicon esculentum) の新鮮地上部 (5.0 kg) を容積20Lのプラスチック容器に入れ、その容器にトマト地上部が浸る程度のメタノールを入れ、その後、80〜100℃の水浴で5時間熱をかけ、トマト地上部に含まれる成分をメタノールに溶出させる。そのメタノール溶出液をナス型フラスコに入れ、フラスコをエバポレーターに装着し、メタノールを留去していき液量が約3 Lになるまで濃縮する。このメタノール濃縮液を分液漏斗に移し、ヘキサン1 Lを加えて分配操作を行った。下層（メタノール層）をさらにヘキサン1 Lと分配操作を行った後、メタノール層をエバポレーターで減圧乾固しメタノール抽出エキス（104 g）を得た。このメタノール抽出エキスをDiaion HP-20カラムクロマトグラフィー（70 mm×600 mmガラスオープンカラム）にかけ、水（8 L）、メタノール（6 L）で連続的に溶出した。次に、減圧乾固したメタノール溶出画分（25 g）をシリカゲルクロマトグラフィー（70 mm×500 mmガラスオープンカラム）にかけ、溶媒システム（クロロホルム：メタノール：水=7:3:0.5, 5 L）で溶出することでa-tomatine（2.35 g）をトマトの湿重量から計算して0.047%の収率で得た。
【００２０】
200 mLのナス型フラスコにa-tomatine（2.35 g）と4 N 塩酸（20 mL）、1,4-ジオキサン（20 mL）を加え、ジムロート冷却管を装着して、油浴上100〜110℃にて3時間還流した。反応液はそのままエバポレーターで濃縮し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（35 mm×300 mmガラスオープンカラム）にかけ、溶媒システム（ヘキサン：アセトン = 7:1, 2 L）で溶出することでtomatidine（0.75 g）を80%の収率で得た。
【００２１】
実施例２：細胞内CE蓄積量の測定
（１）LDLの調製と化学修飾法
ヒトのLDL（d=1.019-1.063 g/ml）は健常者のヒト血漿から連続超遠心（36,000 rpm、20時間、4℃）により分離し、直ちにエチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetracetic acid, EDTA）を含む生理食塩水（EDTA-saline; 0.15 M NaCl and 1 mM EDTA (pH 7.4)）にて透析したものを用いた。acetyl-LDLの調製は、20 mgのヒトLDLに5 mlの飽和酢酸（LDLと等量の飽和酢酸を加えた）を加え、その後、氷上にて穏やかに撹拌しながら無水酢酸を20 ml以下ずつ滴下した。撹拌しながら氷上で1時間反応させながら、5 N NaOHを滴下しpHを6.5〜7.0に保ち、その後直ちにEDTA-salineにて透析し、限外濾過法により濃縮した。得られたacetyl-LDLは、定性的に修飾の程度を確認するためにアガロース電気泳動を行い、十分に修飾されていることを確認した。
【００２２】
（２）ヒト単球由来マクロファージの調製
ヒト末梢血由来の単核球は、Ficoll密度勾配遠心分離法（Ficoll-Paque: Amersham bioscience）によって分離した。単球は、balanced salt solutionで洗浄後、4℃下での低温単球凝集法によって凝集した単球とその他の単核球を分離し、単球のみを単離した。単離した単球は、2×106  cells/mlでRPMI 1640に再懸濁され、24 well plateに4×106  cells/well（Falcon-PRIMARIA plate: Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA）の濃度で播種した。37℃で1時間付着させた後、RPMI 1640に10％不活化ヒト血清及びストレプトマイシン硫酸塩（0.1 mg/ml）とペニシリンG（100 units/ml）を加えた培養液に交換した。その後、培養液は3日ごとに交換し、マクロファージに分化するまで7日間培養（CO2濃度5％、温度37℃、湿度100％）で培養した。
【００２３】
（３）[3H]オレイン酸塩を用いた細胞内CE蓄積量の測定
上記のように調製したヒト単球由来マクロファージを24 well platesに播種し、分化させた後、3％ BSA-RPMI中に各濃度のTomatidineを添加し、acetyl-LDL及び0.1 mM [3H]oleate-BSA（5×103 dpm/nmol）存在下で16時間培養した。その後の細胞をPBSで3回洗浄し、脂質抽出液（Hexane : Isopropanol = 3 : 2）で30分間、細胞中の脂質を抽出した。脂質抽出液は窒素ガスで乾固し、これを展開溶媒（Hexane : Dietylether : Acetic acid = 90 : 10 : 1）（100 ml）で再懸濁した。この一部（20 ml）を、あらかじめスタンダードとしてcholesteryl oleate、triolein及びcholesterolをスポットしておいたTCL板にスポットし、展開溶媒にて展開後ヨードで発色させ、cholesteryl[3H]oleate、[3H]trioleinを回収した。同時に、展開しない20 mlの脂質抽出液の放射活性も測定し、total [3H]oleate-BSAの細胞内取り込み量とした。各々の放射活性は液体シンチレーターを加え測定した。脂質抽出後の細胞は0.1 N NaOHで可溶化し、各々の細胞タンパク量をBCA法にて測定した。
【００２４】
上記の測定結果を図２−１に示す。TomatidineおよびEsculeogenin Aは、濃度依存的にCEの蓄積（泡沫化）を抑制した。また、TomtidineとEsculeogenin Aの併用によりCE蓄積抑制作用の相加効果がみられた。
【００２５】
実施例３：再構成法によるACAT酵素活性の測定
（１）リポソームの調製
ACAT酵素活性の測定に当たり、遊離コレステロール/ホスファチジルコリンからなるリポソーム（Taurocholate 9.3mM:PC 11.2mM:Cholesterol 1.6mM）の調製を行った。150 μlのコレステロール (20 mg/ml in benzene)と200μlのホスファチジルコリン（100 mg/ml in CHCl3）を十分に混合させ窒素ガスで乾固した。これに100μlの10%タウロコール酸、100 μlのバッファー（500 mM Tris-HCl (pH 7.8)、10 mM EDTA）、800μlの超純水（D2W）を加え混和し、透明になるまで遮光しながら室温で超音波をかけた。最後に1 mlの超純水を加えて、4℃で保存した。
【００２６】
（２）再構成ACAT活性測定
測定に用いる細胞のホモジネートは氷冷したバッファーA（50 mM Tris、1 mM EDTA (pH 7.4)、プロテアーゼ阻害剤 (PMSF, pepstatin A, luepeptin, aprotinin)）で細胞を回収し、テフロン（登録商標）ホモジナイザーを用いて破砕した。ホモジネートした細胞に、KClとCHAPS（1 M KCl: 2% CHAPS）を添加し可溶化した。可溶化した細胞抽出物はBCA法によるタンパク定量後、バッファーAで濃度を4 mg/mlに調整した。可溶化した細胞抽出物20μl（80μg）に調製したリポソーム140μlを加え軽く混和しACATタンパクを再構成し、30μMTomatidineを添加し10分間氷令した後、[14 C]オレオイルCoA（25 mM [14C]oleoyl CoA: 12.5 mg/ml fatty acid-free BSA: 0.02 M Tris-HCl (pH 7.8)、40 dpm/pmol）を添加し、15分間37℃で保温した。3 mlの反応停止液（CHCl3 : CH3OH = 2 : 1）を添加することにより酵素反応は停止させた。室温で低速遠心（2,000 rpm、10分間）により水層と油層を分離し、水層を廃棄し残った油層を窒素ガスで乾固させ、120μlの展開溶媒（Hexane: Diethylether: Acetic acid = 90 : 10 : 1）で再懸濁し、TLCにスポットし展開させコレステロール[3H]オレイン酸の放射活性を測定してACAT活性とした。
【００２７】
上記の測定結果を図２−２に示す。TomatidineはControlと比較してACAT活性を抑制した。
【００２８】
実施例４：動物実験
実験手順は、熊本大学動物実験倫理学調査委員会によって承認されている。
6週齢のapoprotein E（apoE）欠損マウス（C57BL/6.KOR-Apoeshl）はSLCより購入した。これらのマウスは、12時間毎に点灯/消灯で、温度と湿度が一定に保たれた部屋（22±2℃、55±2％）で飼育し、購入後1週間は普通食（CLEA）を与えた。その後、Tomatidine（50 mg/kg of body weight）を60日間経口投与した。20匹のapoprotein E（apoE）欠損マウスを2群（10匹：controls、10 匹：50 mg/kg Tomatidine）にわけ実験を行った。血液サンプルは経口投与終了後に腹大動脈より採血した。血清中の総コレステロール、LDLコレステロール、トリグリセリド濃度は酵素法を用いてOlympus AU5200 自動分析装置により測定した。測定結果を図３に示す。Tomatidine投与により、血中総コレステロールおよびLDLコレステロールが低下した。
【００２９】
また、動脈硬化の測定は採血後に行った。心臓の近位大動脈はoil redにより染色した。心臓は4%パラホルムアルデヒド（wt/vol）で固定し、optimal cutting temperature (OTC) compound（Sakura Tissue-Tek）包埋し、Cryostat（Leica）を用いて6μmの厚さにスライスした。1個体につき3 section（First section:冠動脈起始部、Second section:弁尖中腹部、Third section:弁尖付着部）をoil redおよびhematoxylinにより染色した。染色された部位の面積はIPAP-WIN（Sumika Technoservice）を用いて解析および測定し、3 sectionにおける動脈硬化の面積を平均してグラフ化した。結果を図４に示す。Tomatidine投与により有意に動脈硬化が抑制された。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、トマチジンの化学構造を示す。
【図２】図２は、トマチジンはマクロファージの泡沫化を抑制し、そのメカニズムはACAT活性阻害であることを示す実験結果である。
【図３】図３は、トマチジンは血中コレステロール値を低下させることを示す実験結果である。
【図４】図４は、トマチジン摂取は動脈硬化を抑制することを示す実験結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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