(57)【要約】【課題】  簡易に、かつ高感度に目的の生体物質を検出し、定性または定量することができる検査チップを提供すること。【解決手段】  凹部が表面に配置され、該凹部内表面に生体高分子を固定化させたディンプルチップと、蛍光物質、色素、畜光剤など含有または塗布するなどしてあらかじめ標識が施された該凹部と嵌合できるビーズとで構成する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
凹部が表面に配置されているマイクロチップと該凹部の窪みに少なくともその一部が嵌合できるビーズとで構成されていることを特徴とする検査チップ。
【請求項２】
凹部は略円形状の開口部を有し、該開口部直径が0.01μｍ乃至100μｍであり、ビーズは球状のビーズとで構成されていることを特徴とする請求項１記載の検査チップ。
【請求項３】
凹部内表面とビーズ表面に、各々、抗体を固定化していることを特徴とする請求項１乃至請求項２記載の検査チップ。
【請求項４】
蛍光物質、色素、畜光剤などの標識用物質を含有または塗布したビーズを用いることを特徴とする請求項１乃至請求項３記載の検査チップ。
【請求項５】
請求項４記載の検査チップにおいて、凹部の窪み全体に嵌合したビーズの光量を計測し、又はビーズの色若しくは発光の有無を標識としてビーズの数を計測することによって、検出対象物質を定量化することを特徴とする定量検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質を検出するための検査チップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロアレイ技術によって所定のDNAが微細配列された、いわゆるDNAチップあるいはDNAマイクロアレイと呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が開発され、遺伝子の変異解析、SNPs（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析、遺伝子ネットワーク解明等に利用されるようになり、さらには、創薬、臨床診断、病理ジェノミクス、テーラーメイド医療、進化の研究、法医学その他の分野において、幅広い応用が期待されている。
【０００３】
また、イムノクロマト法に代表される抗原抗体反応を利用した免疫検査チップは、現在日常的に用いられるようになり、臨床診断や病理学的研究等の分野において欠くことができない。
【０００４】
これらのDNAチップや免疫検査チップ等に代表されるようなセンサーチップ技術は、固相基板上に固定された検出用物質（プローブと称されることが多い。）と検出対象物質及び標識物質の間の特異的な相互作用を利用して、検出対象物質の存在を定性または定量するものである。
【０００５】
しかしながら、平面の固相基板上に固定された検出用物質と検出対象物質及び標識物質間の反応は、2次元平面の固相と液相の接触面での反応であるため、その接触面積で反応効率が制限される。また、反応の結果、検出対象物質と標識物質は分子同士が点で結合するため結合力も弱い。これらの反応効率と結合力の制限が感度向上を妨げる一因となっていた。
【０００６】
一方、特許文献１や特許文献２等で開示されている固相担体としてビーズを用いる手法は、3次元球面の固相と液相の接触面での反応であるため、上記の固相基板を用いる方法より反応効率の面で優れているものもある。
【特許文献１】特開２００７−０１０３４１号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１２３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら特許文献１や特許文献２で開示されている方法は、反応によりビーズに捕捉された標識物質を、ビーズが溶液中に分散された状態でそのまま測定しているため、ビーズに固定されている標識物質をエネルギー励起する励起光がビーズのシャドー効果や光散乱のために乱れ、バックグラウンドに対する検出シグナルの比（S/N比）が悪くなるという問題点や、定量化が困難になるという問題点がある。
【０００８】
特にマイクロチップ化により検体サンプルがμｌオーダーの微量になればなるほど、上記の問題点は顕著になり、これを解決するためには、反応後、標識物質をビーズから分離させるという操作が必要であった。
【０００９】
そこで本発明の目的は上記の問題点を解消し、固相基板上に固定された検出用物質と検出対象物質及び標識物質間の反応における、その反応効率および検出感度を向上させる検査チップを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第一の発明は、凹部が表面に配置されているマイクロチップ（以下、ディンプルチップと称す）と該凹部の窪みに少なくともその一部が嵌合できるビーズとで構成されていることを特徴とする検査チップである。
【００１１】
第二の発明は、凹部は略円形状の開口部を有し、該開口部直径が0.01μｍ乃至100μｍであり、ビーズは球状のビーズとで構成されていることを特徴とする第一の発明記載の検査チップである。
【００１２】
第三の発明は、凹部内表面とビーズ表面に、各々、一次抗体3bと二次抗体2aとを固定化していることを特徴とする第一の発明乃至第二の発明記載の検査チップである。
【００１３】
第四の発明は、蛍光物質、色素、畜光剤などの標識用物質を含有または塗布したビーズを用いることを特徴とする一の発明乃至第三の発明記載の検査チップである。
【００１４】
第五の発明は、第四の発明記載の検査チップにおいて、凹部の窪み全体に嵌合したビーズの光量を計測し、又はビーズの色若しくは発光の有無を標識としてビーズの数を計測することによって、検出対象物質を定量化することを特徴とする定量検査方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のディンプルチップ及び球状ビーズを用いることにより、μｌオーダーの検体サンプルでもその中に含まれる目的の生体高分子を高感度に定量測定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の検査チップについて図面にもとづき説明する。なお、ここに記載する事項は本発明に関する代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１７】
図1に示すようにディンプルチップ本体1aはその表面にディンプル加工1bが施されている。標識ビーズ3aは、接触面積が小さすぎると反応効率が低くなり十分な結合力が得られないため、接触面積が大きく反応効率が高い表面積の大きな100μm以下のビーズを用いることが好適であるが、現在のビーズ作製技術では0.01μmが限界であり、それ以下では粒度分布にバラツキがでるなどビーズの品質に問題があり、実用的でない。したがって、ビーズは、その直径が、0.01〜100μmのものを使用するため、ディンプル部1bの開口部直径も、それと嵌合する直径である0.01〜100μmとする。さらに図2に示すように各ディンプル1bの表面には二次抗体2aが塗布されている。
【００１８】
一方、図3に示すように標識ビーズ3aに一次抗体3bが塗布されたものを抗体付標識ビーズ3dとして使用する。ここで、一次抗体3bと二次抗体2aはそれぞれタンパク質マーカー3cのそれぞれ異なった部位と特異的に結合する性質をもった抗体であり、これらを区別するためにここではこれらを便宜上、一次抗体3b、二次抗体2aと呼ぶこととする。二次抗体2aを表面に塗布したディンプル1bを有するディンプルチップ1a表面に、一次抗体3bを表面に塗布した標識ビーズ3a（以下、抗体付標識ビーズ3dと称す）と検出対象物質であるタンパク質マーカー3cとを流し込むことにより、抗体付標識ビーズ3dがタンパク質マーカー3cを介して二次抗体2a付ディンプル1bと結合する。
【００１９】
この時、図4に示すように、標識ビーズ3aとディンプル部1bとの結合力はその形状に起因する吸着力と球面に結合したタンパク質マーカー3cと一次抗体3bおよび二次抗体2aの分子間の結合力の和となり非常に強固なものとなる。また、各々抗体と結合したタンパク質マーカー3cの数が少なく、分子間の結合力のみでは流し込む抗体付標識ビーズ3dとタンパク質マーカー3cの混合溶液の流速に耐えられない抗体付標識ビーズ3dでも、二次抗体2a付ディンプル部１bとの嵌合による吸着力によってその結合力を補われるため、二次抗体2a付ディンプル部1bに固定され高感度となる。
【００２０】
この反応の際、各々の抗体付標識ビーズ3dに結合するタンパク質マーカー3cの数の平均値は検体サンプル中のタンパク質マーカー3cの濃度に依存し、その分散値は抗体付標識ビーズ3dの数や濃度及び反応時間等の諸条件によって決まる。そして、ディンプル部１bとの嵌合による吸着力と抗体とそれに結合したタンパク質マーカー3cの分子間の結合力の和が、流し込む抗体付標識ビーズ3dとタンパク質マーカー3cの混合溶液の流速によって押し流される力より大きい結合力を有した抗体付標識ビーズ3dは、洗い流されることなく二次抗体2a付ディンプル部1bに固定される。この固定された抗体付標識ビーズ3dの数と検体サンプル中のタンパク質マーカー3cの濃度との相関関数より検出対象物質の濃度を定量することができる。
【００２１】
ここで、標識ビーズ3a自身に色素、蛍光、蓄光剤等を保持させることにより、二次抗体2a付ディンプル部1b全体の蛍光や発光の光量を光検出器により測定したり、あるいはイメージセンサにより二次抗体2a付ディンプル部1b全体の画像を取り込み、解析することにより、二次抗体2a付ディンプル部1bに固定された抗体付標識ビーズ3dの数を感度よく計測することができる。
【実施例１】
【００２２】
図5はpH試験紙で測定する感覚で簡便に10分以内に前立腺癌マーカーである前立腺特異抗原（以下PSAと称す。）を検出可能な検査チップである。チップはポリジメチルシロキサン(PDMS)樹脂をベースとした高透明、柔軟な素材で構成されている。
【００２３】
また、標識ビーズ3aとしてダイナル社製ダイナビーズ（直径4.5μm）を用い、各ディンプル1bに標識ビーズが1個ずつ収まるように、ディンプル加工領域5aには直径5μmのディンプル加工を施した。ここで、標識ビーズ3aの表面には抗PSA一次抗体3bを塗布し、各ディンプル1bの表面には抗PSA二次抗体2aを塗布した。また、ディンプル対照領域5bにも同様に直径5μmのディンプル加工を施しているが、バックグラウンドシグナルレベル（ノイズレベル）のコントロールを目的とするため抗PSA二次抗体2aは塗布しない対照領域とした。
【００２４】
検出対象物質であるPSA（タンパク質マーカー）3cを含んでいる可能性のある検体サンプルと抗体付標識ビーズ3dの混合溶液に試験紙型チップ5cを浸漬させ、攪拌することにより、標識ビーズ3aがPSA 3c、抗PSA一次抗体3bおよび抗PSA二次抗体2aを介してディンプル加工領域5aに固定化される。標識ビーズ3aには赤褐色の色素として酸化鉄が含有されているため、容易に目視により標識ビーズ3aの固定化を確認することができ、検出対象物質であるPSA 3cの存在を簡便に認識でき、その結果、通常20分以上かかる検査を10分以内で完了できる。
【００２５】
また、抽出対象物の数をカウントできる機能を有する画像処理装置等を利用すれば、固定化されたビーズの量の計測や定量検査の自動化を行うことができる。具体的には、画像処理装置において、事前にビーズを抽出対象として設定しその大きさを指定し計測する。今回用いた標識ビーズ3aは赤褐色に着色されているため、標識ビーズ3aが結合したディンプルは、ディンプル対照領域5bやディンプル加工領域5aの標識ビーズ3aが結合していないディンプルと明確に識別（二値化）できるため、容易に場所の特定と数をカウントできる。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
以上、本発明の好ましい実施形態について説明してきたが、本発明は図示された実施形態のみに限定されない。例えば、本発明はハイブリダイゼーション検出に適用することも可能で、様々な分野での遺伝子検査や免疫検査などに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ディンプルチップ
【図２】ディンプル部表面の物質構成を模式的に示す図
【図３】ビーズ表面の物質構成を模式的に示す図
【図４】ビーズとディンプルの結合の仕組みを模式的に示す図
【図５】ディンプルチップを利用した検査チップの一例を示す図
【符号の説明】
【００２８】
１ａ  ディンプルチップ
１ｂ  ディンプル
２ａ  二次抗体
３ａ  標識ビーズ
３ｂ  一次抗体
３ｃ  タンパク質マーカー
３ｄ  抗体付標識ビーズ
５ａ  ディンプル加工領域
５ｂ  ディンプル対照領域
５ｃ  試験紙型チップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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