(57)【要約】【課題】本発明は、検体中に含まれる所望の塩基配列を検出する方法に関するものであり、特定配列の有無と鎖長を同時に網羅的に検出する方法を提供するものである。特に、各種塩基配列の変異、多様性（スプライシングバリアント等）の検出、配列検出の信頼性向上、工程簡略化に寄与する。【解決手段】標的配列を含む標的核酸と、基板に固定された該標的配列と特異的に結合するプローブ核酸とをハイブリダイゼーション反応させた後に、前記基板から前記標的核酸を電気泳動担体中に遊離させ、前記電気泳動担体に電圧を印加して前記標的核酸を電気泳動することを特徴とする、核酸検出方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列を含む標的核酸と、基板に固定された該標的配列と特異的に結合するプローブ核酸とをハイブリダイゼーション反応させた後に、前記基板から前記標的核酸を電気泳動担体中に遊離させ、前記電気泳動担体に電圧を印加して前記標的核酸を電気泳動することを特徴とする、核酸検出方法。
【請求項２】
前記電気泳動担体がゲル状物質であることを特徴とする、請求項１記載の核酸検出方法。
【請求項３】
前記電気泳動担体が毛細管内に保持された液体であることを特徴とする、請求項１記載の核酸検出方法。
【請求項４】
前記ハイブリダイゼーション反応後に、前記基板を前記電気泳動担体中に移動させることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項５】
前記ハイブリダイゼーション反応を反応容器内で行い、該反応後に該反応容器からハイブリダイゼーション反応溶液を排出し、前記反応容器内に前記電気泳動担体を充填して該電気泳動担体に電圧を印加することを特徴とする、請求項１または２記載の核酸検出方法。
【請求項６】
前記ハイブリダイゼーション反応後に、前記基板の前記プローブ核酸部位を加熱して、前記標的核酸を前記プローブ核酸から遊離させることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項７】
前記ハイブリダイゼーション反応後に、前記基板の前記プローブ核酸部位の水素イオン濃度を変化させて、前記標的核酸を前記プローブ核酸から遊離させることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項８】
前記ハイブリダイゼーション反応後に、前記基板の前記プローブ核酸部位の核酸変性剤の濃度を変化させて、前記標的核酸を前記プローブ核酸から遊離させることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項９】
前記ハイブリダイゼーション反応後に、前記基板から前記プローブ核酸を遊離させることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項１０】
前記標的核酸を前記電気泳動担体の中で電気泳動させた後に、該電気泳動担体を観察することにより標的核酸を検出することを特徴とする、請求項１から９のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項１１】
前記標的核酸を前記電気泳動担体中で電気泳動させるのと同時に、該電気泳動担体の１または複数の位置において前記標的核酸の検出を行うことを特徴とする、請求項１から９いずれかに記載の核酸検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中に含まれる核酸の所望の塩基配列を検出する方法に関し、さらに各種塩基配列の変異、多様性（スプライシングバリアント等）の検出、配列検出の信頼性向上、工程簡略化に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムシーケンスプロジェクトの進展に伴って、ゲノム上の特定遺伝子の検出、ＳＮＰ解析、発現解析等がポストゲノムの課題として注目されている。近年、これらの特定塩基配列の検出に、ＤＮＡマイクロアレイが良く用いられている。ＤＮＡマイクロアレイとは、ガラス基板やシリコン基板に多種のオリゴＤＮＡやｃＤＮＡのプローブ核酸が固定化されており、このプローブ核酸と検体中の標的配列とのハイブリダイゼーション反応により、標的配列の有無を検出するものである（特許文献１）。ＤＮＡマイクロアレイには数百から数万のプローブ核酸が固定されており、一度で非常に多くの配列を網羅的に、高感度に検出することが可能である。
【０００３】
一方で、ゲノム解析や発現解析が進むにしたがって、ゲノムＤＮＡ中の欠損や繰り返し、テロメア等の繰り返し配列の存在、ｍＲＮＡスプライシングの多様性等と疾患との関連性が非常に注目されている。これらは、標的配列の有無だけではなく、繰り返しや連続性、標的核酸の鎖長に関する情報も重要になってきていることを示している。
【０００４】
このような中で、ゲノムＤＮＡ中の欠損や繰り返し配列を検出する方法としては、ＤＮＡチップを用いたＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（アレイＣＧＨ法）が良く行われている（特許文献２）。アレイＣＧＨ法とは、繰り返しや欠損の対象となる配列を検出するプローブ核酸を含んだＤＮＡアレイに対して、リファレンス核酸と標的核酸をハイブリダイゼーションさせ、両者の検出量を比較して定量する方法である。検出には蛍光色素が主に使用され、リファレンス核酸と標的核酸を異なる波長を発する蛍光色素で標識し、両者を同時にハイブリダイゼーションさせ、両波長の蛍光輝度を測定、比較する方法が良く用いられている。遺伝子が欠損していればリファレンス核酸由来の蛍光の方が強く検出され、遺伝子が増幅されていれば標的核酸由来の蛍光の方が強く検出される。
【０００５】
また、ｍＲＮＡのスプライシングバリアント等の配列と鎖長両方を検出する方法としては、サザンブロット法が良く利用されている。サザンブロット法は、検体に含まれる核酸を電気泳動法により分離し、分離した断片をニトロセルロース膜に固定し、標識したプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせて検出する方法である。また、サザンブロット法を改良し、異なる蛍光色素で標識したプローブを用いて解析できる種類を増やした方法も提案されている（特許文献３）。
【特許文献１】米国特許第５６８８６４２号明細書
【特許文献２】特開２００５−３０４４９７号公報
【特許文献３】特願平２−２６８３５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＤＮＡマイクロアレイを用いた解析方法では、多数の配列に対して同一条件でハイブリダイゼーション反応を行うため、配列毎の結合強度の差異により、一部のプローブにおいて数塩基のミスマッチでも結合することによる偽検出の課題があった。ミスマッチ配列のハイブリダイゼーションを回避するためには、プローブ塩基長を短くすることが有効であるが、短い塩基長では配列の特異性が下がってしまう。また、ハイブリダイゼーション反応の温度条件を高温にすると反応の特異性は向上するが、検出感度は低下してしまう。このような性能の低下を招かずに、ミスマッチ配列と標的配列のハイブリダイゼーションを区別する方法が望まれている。
【０００７】
一般にＤＮＡマイクロアレイに供する試料としては、生体物質から抽出した核酸を、ＰＣＲ法等を用いて増幅させたものが多く用いられている。この場合には、増幅した試料に含まれるＰＣＲプライマーや標識色素がハイブリダイゼーション反応の検出に影響することを防ぐため、ハイブリダイゼーション反応前にＰＣＲプライマー等を排除する精製工程が必須である。ハイブリダイゼーション反応後の検出工程において、標的核酸とＰＣＲプライマーや標識色素を区別して検出できれば、このような精製工程の省略が可能となる。
【０００８】
また、繰り返し配列や遺伝子コピー数定量の測定においても、アレイＣＧＨ法ではＤＮＡアレイにハイブリダイゼーションした標的核酸の量を、蛍光色素の輝度を測定することによって定量していた。しかし、蛍光輝度の測定では高い定量性が実現できないため、正確な定量は困難であった。
【０００９】
ＲＮＡスプライシングを含む発現解析においては、生体内では多数の遺伝子が同時に発現されているため、多数のｍＲＮＡを同時に解析する必要がある。しかしながら、サザンブロット法やその改良法では、１またはせいぜい数種類の塩基配列に関してしか解析できない。
【００１０】
本発明の目的はこのような課題を鑑みて考案されたものであり、標的核酸の配列と鎖長を同時に網羅的に検出する方法を提供するものである。配列と鎖長を同時に検出することにより、標的配列とミスマッチ配列やＰＣＲプライマーとを区別可能であり、遺伝子の欠損やコピー数増加が定量可能となる。また、ｍＲＮＡ等の鎖長の多様性を網羅的に解析する方法を提供することも可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するため本発明の核酸検出方法は、標的配列を含む標的核酸と、基板に固定された該標的配列と特異的に結合するプローブ核酸とをハイブリダイゼーション反応させた後に、前記基板から前記標的核酸を電気泳動担体中に遊離させ、前記電気泳動担体に電圧を印加して前記標的核酸を電気泳動することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明においては、前記電気泳動担体が毛細管内に保持された液体であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明においては、前記電気泳動担体がゲル状物質であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明においては、前記ハイブリダイゼーション反応後に、前記基板を前記電気泳動担体中に移動させることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明においては、前記ハイブリダイゼーション反応を反応容器内で行い、該ハイブリダイゼーション反応後にハイブリダイゼーション反応溶液を排出し、前記反応容器内に前記電気泳動担体を充填し、前記反応容器内の前記電気泳動担体に電圧を印加することを特徴とする。
【００１６】
また、本発明においては、前記ハイブリダイゼーション反応後に、前記基板の前記プローブ核酸部位を加熱することによって、前記プローブ核酸と前記標的核酸を遊離させることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明においては、前記ハイブリダイゼーション反応後に、前記基板から前記プローブ核酸を遊離させることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明においては、前記標的核酸を前記電気泳動担体中で電気泳動させた後に、前記電気泳動担体を観察することにより標的核酸を検出することを特徴とする。
【００１９】
また、本発明においては、前記標的核酸を前記電気泳動担体中で電気泳動させるのと同時に、前記泳動担体の任意の１または複数の位置において前記標的核酸の検出を行うことを特徴とする。
【００２０】
前記標的核酸を前記電気泳動担体中で電気泳動させるのと同時に、塩基長が既知の核酸を同時に電気泳動させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の核酸検出方法により、検体中の標的核酸に関して、標的配列の有無と標的核酸の鎖長を同時に網羅的に検出することが可能となり、誤検出の回避や精製工程の省略が可能となる。また、ゲノム中の遺伝子コピー数定量や欠損検出、ｍＲＮＡの発現解析におけるスプライシングバリアントの検出等を精密に行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明に係わる核酸検出方法の具体的な実施の形態を説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明において、標的核酸とは、ハイブリダイゼーション反応を用いて検出する標的配列を有する核酸を指す。標的核酸としては、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等に含まれる二本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡなどが挙げられ、それらの酵素処理物、増幅産物等を含む。また、各種ＲＮＡおよびその逆転写物も含む。
【００２４】
一般的に本発明が利用される分野としては、生体由来物質から抽出した核酸からの標的核酸の検出であるが、これに限定されるものではい。生体由来物質とは、例えば動植物組織、体液、排泄物等をいい、細胞、細菌、ウィルス等であっても良い。体液には血液、唾液、髄液、尿、乳等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明の核酸検出方法の好適な一例の模式図を図１に示す。１０１はプローブ核酸を固定するための基板であり、１０３が標的核酸と特異的に結合するプローブ核酸である。基板１０１は電解液で満たされた反応容器であるチャンバー１０６内に保持され、チャンバー１０６は電気泳動担体１０２に接触している。チャンバー１０６および電気泳動担体１０２は不図示の適当な容器に入れられており、両端に電極１０４および１０５を備えている。電極１０４、１０５は導線１０７を通して電源１０８に接続され、チャンバー１０６および電気泳動担体１０２に対して電圧を印加する構成となっている。また、不図示のヒータによってチャンバー１０６および電気泳動担体１０２を加熱することが可能である。
【００２６】
図２を用いてハイブリダイゼーション法の概要を示す。図２は標的核酸が２本鎖ＤＮＡの例を示す図である。２１０Ａ）は、２本鎖状態の標的核酸であり、標的核酸２１０は互いに塩基配列が相補的なセンス鎖２１１とアンチセンス鎖２１２が結合して構成されている。例えば、標的核酸２１０のうちの片鎖であるアンチセンス鎖２１２と、相補的な塩基配列を持つプローブ核酸２０３が、基板２０１に固定されている。標的核酸２１０が含まれたハイブリダイゼーション溶液を、プローブ核酸２０３が固定された基板２０１に接触させる。その後、反応液を９５℃程度に加熱し、２本鎖核酸をセンス鎖２１１とアンチセンス鎖２１２に解離し、Ｂ）の状態になる。その後、ハイブリダイゼーション至適温度に反応液を制御することによって、標的核酸のアンチセンス鎖２１２とプローブ核酸２０３とが結合し、Ｃ）の状態となる。至適温度はプローブ核酸２０３の種類によって異なるが、概ね３０〜６０℃程度である。至適温度で数時間反応させた後、適当な洗浄液で洗浄し、プローブ核酸２０３と結合していない標的核酸２１０等のハイブリダイゼーション反応溶液を、ハイブリダイゼーション反応容器から除去する。その後、基板上に残存した標的核酸２１２を検出することによって、標的配列の有無を確認する。検出方法としては、標的核酸２１０に蛍光色素や放射性物質で標識しておき、ハイブリダイゼーション後にその蛍光色素や放射性物質を観察する方法や、ＣＹＢＥＲ−ＧＲＥＥＮ等のインターカレータ色素を用いてプローブ核酸２０３とのハイブリダイゼーション結合を観察する方法を挙げることができる。
【００２７】
プローブ核酸とは、特定のターゲット(標的)によって特異的に認識され得るもので、しばしばリガンドと呼ばれるものである。更に、このプローブには、特定の標的によって認識され得るオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド、あるいはその他のポリマーなどが含まれる。用語「プローブ」は、個々のポリヌクレオチド分子などのプローブ機能を有するプローブ分子そのものを意味する場合と、分散した状態等で担体表面に固定された同じ配列のポリヌクレオチドなどの同じプローブ機能を有するプローブ分子の集団を意味する場合がある。また、プローブは、リガンド−抗リガンド対の一部として標的と結合し得るか、または結合するようになり得るものである。本発明におけるプローブ及び標的は、天然において見出されるような塩基、またはそのアナログを含み得る。
【００２８】
なお、本発明の方法に採用されるプローブは、その使用目的に応じて適宜選択されるものである。本発明の方法を好適に実施する上では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ＰＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはその他の核酸が好ましく、必要に応じてこれらの２種以上を組合せて用いることができる。
【００２９】
ハイブリダイゼーション法のプローブ核酸としては、人工的に合成されたオリゴＤＮＡ、バクテリア等のベクターで合成したＢＡＣ  ＤＮＡ、ｃＤＮＡ等が用いられる。プローブ核酸の塩基長は、短鎖のオリゴＤＮＡで２０〜６０ｍｅｒ程度、長鎖のＢＡＣ  ＤＮＡで数ｋｍｅｒ程度が好適に用いられる。
【００３０】
プローブ２０３は、不図示のリンカーを介して基板２０１に固定化されていることが多い。リンカーとしては、アミノ修飾オリゴヌクレオチドの場合は、ポリ−Ｌ−リジンの利用がよく知られている。また、ＳＨ基修飾オリゴヌクレオチドの場合は、例えばスライドガラス表面をアミノシランカップリング剤により処理した上で、ＥＭＣＳ（Ｎ−(６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ)ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）などの二価性試薬を介して固相化することができる。また、作製したプローブ核酸を基板に結合させる方法以外にも、フォトリソグラフィー技術によって基板上で核酸を合成する方法もある。
【００３１】
基板２０１は、石英や硼珪酸等のガラスや樹脂で形成されていることが多く、不織布や金属等の場合もある。図１では棒状の基板であるが、これに限定されるのではなく、板状や粒子状、または反応液を透過させるフィルター状のものでも良い。
【００３２】
チャンバー１０６は基板１０１を保持できるものであれば、いずれの素材や形状でも可能であり、個別に形成せずに例えば電気泳動担体１０２の一部に設けることもできる。ただし、チャンバー１０６内には電極１０４の表面が露出しているか、または電極１０４から電流をチャンバー１０６内に導通させる構造とする。さらに、チャンバー１０６から電気泳動担体１０２へは、標的核酸または標的核酸とプローブ核酸との結合体が自由に移動できる必要がある。プローブ核酸１０３と不図示の標的核酸とのハイブリダイゼーション反応は、チャンバー１０６に載置する以前に完了していても良いし、チャンバー１０６内で行っても良い。ハイブリダイゼーション反応をチャンバー１０６内で行う場合には、チャンバー１０６に廃液や洗浄液の入出口や温度制御機構を設ける必要がある。チャンバー１０６内に充填する電解液は、電気泳動を行う際に電気泳動担体１０２を浸潤するものと同じでよい。一般にはＴＡＥ緩衝液が好適に用いられる。
【００３３】
電気泳動担体は、ゲル状物質を用いることができ、特にアガロースゲルおよびポリアクリルアミドゲルが好適に用いられる。アガロースゲルでは０．８〜４％程度の溶液を固めたもの、ポリアクリルアミドでは３〜２０％程度の溶液を固めたものが良い。また、スタッキングゲルにゲル濃度分布、変性剤やショ糖等の濃度勾配を設けることにより、より精密で多様な泳動効果が得られる。さらに、電気泳動担体は図１のように平板状に成型した物でも良いし、ガラス等の毛細管に保持された液体の構成でも良い。平板状の場合には、電気泳動後に電気泳動担体中を移動した標的核酸を検出するために、電気泳動担体１０２の厚さはごく薄いことが好ましく、より好ましくは０．５ｍｍ以下である。電気泳動担体１０２がごく薄い平板状である場合や毛細管内に充填されている場合には、電気泳動方向と垂直方向への標的核酸の拡散が少なく、電気泳動担体１０２をスキャナー等で観察することによる標的核酸の検出が容易である。電気泳動担体１０２が厚い場合には標的核酸が電気泳動方向と垂直方向にも拡散してしまうため、共焦点顕微鏡等を用いて電気泳動担体１０２の複数の断面を観察し、それらの観察結果を足し合わせることによって標的核酸を検出する等の方法が可能である。
【００３４】
電極１０４、１０５は電気泳動に用いる一般的な電極でよい。通常は１００〜数百Ｖの電圧を印加する。電気泳動担体１０３の体積や印加電圧にもよるが、数分〜数十分印加する。
【００３５】
電源１０８は１００〜数百Ｖの電位差を発生させるものであれば、特に限定はない。一般的な電気泳動には直流電源を用いるが、交流電源を用いて誘電効果による泳動を行っても良い。
【００３６】
図３、図４、図５を用いて本発明の核酸検出方法の流れを説明する。
【００３７】
図３は本発明に好適なハイブリダイゼーション方法の一例を示している。図３−Ａ）の３１３がハイブリダイゼーションチャンバーであり、内部にワイヤ状の基板３０１を載置し、温度を制御するための温度制御機構３１４を具備している反応容器である。生体物質から抽出し、蛍光色素等で標識した標的核酸を含んだハイブリダイゼーション溶液３１５を、図３−Ｂ）に示すように、基板３０１が載置されているハイブリダイゼーションチャンバー３１３内に注入する。溶液組成の一例としては、ＳＳＰＥ等のバッファー、ホルムアミド等の変性剤、消泡剤がある。基板３０１がハイブリダイゼーション溶液３１５に浸潤している状態で、温度制御機構３１４により適当な温度条件で標的核酸とプローブ核酸３０３とのハイブリダイゼーション反応をその反応容器内で行う。反応が終了した後、ハイブリダイゼーションチャンバー３１３からハイブリダイゼーション溶液３１５を排出し、界面活性剤等の洗浄液で基板３０１を洗浄し、基板３０１を取り出す。ハイブリダイゼーション反応後の基板３０１は図３−Ｃ）に示すように、各プローブ３０３−１〜７にそれぞれ相補配列を持つ標的核酸が結合している。図３−Ｄにプローブ核酸３０３と標的核酸３１６との結合状態の模式図を示す。本発明の対象とする標的核酸のひとつとして、ｍＲＮＡのスプライシングバリアント等の同一配列を含む塩基長多様な核酸がある。このような標的核酸のハイブリダイゼーション反応では、塩基長が異なる標的核酸３１６−１、３１６−２共に共通配列部位においてプローブ核酸３０３に結合する。通常のハイブリダイゼーション検出では、プローブ核酸３０３に結合している両標的核酸の区別がつかない。本発明は、この両標的核酸を区別して検出することを可能とするものである。
【００３８】
図４は本発明の電気泳動工程に用いる装置の一例を示している。基本的な構成は図１と同様である。電気泳動担体４０２を電気泳動担体容器４１７に保持している。電気泳動担体４０２に、一端はチャンバー４０６を通して電極４０４、一端は直接電極４０５と接している。図４のＡ）のＸ−Ｘ'断面を図４のＢ）に示す。図４のＢ）で示すように、電気泳動担体４０２が電気泳動担体容器４１７内のごく薄い微小空間に充填される。電気泳動担体容器４１７の材質は特に限定しないが、電気泳動後に電気泳動担体容器４１７を通して電気泳動担体４０２を観察するためには、当該検出波長に対して透明であることが望ましい。本装置に基板を載置した状態の模式図を図４のＣ）に示す。４０１が基板であり、チャンバー４０６内に載置される。
【００３９】
電気泳動時の動作を、図５を用いて説明する。図５の５１６が標的核酸であり、基板５０１上のプローブ核酸と結合している、すなわちハイブリダイゼーション反応後の状態である。図５のＡ)のように基板５０１をチャンバー５０６に載置する。電源５０８を用いて、電極５０４と５０５の間に電圧を印加する。印加する電圧は、電気泳動担体５０２が薄く電気抵抗が大きい場合には、例えば５００Ｖ程度である。電圧を印加すると同時に、チャンバー５０６を不図示のヒータを用いて９０℃程度に加熱し、標的核酸５１６を基板５０１上のプローブ核酸から遊離させる。加熱温度は塩基配列にもよるが、通常、５０〜１００℃である。プローブ核酸からの標的核酸５１６の遊離には、チャンバー５０６内の水素イオン濃度を変化させる方法や、ホルムアミド等の核酸変性剤の濃度を変化させる方法も使用可能である。また、制限酵素やその他の薬品を用いて、基板５０１からプローブ核酸と標的核酸５１６の複合体を遊離させても良い。電圧を印加して数分すると、基板５０１から遊離した標的核酸５１６は、電極５０５の方向に泳動され、図５のＢ）のような状態となる。その後、電気泳動担体５０２を蛍光スキャナーで読み取り、標的核酸５１６の位置を計測する。電気泳動後の電気泳動担体５０２の計測例を図５のＣ)に示す。５１６−１、５１６−２がそれぞれ異なったプローブ核酸部位から電気泳動された標的核酸である。また、同じプローブ核酸にハイブリダイゼーションしていた標的核酸であっても、その鎖長によって、５１６−１−１、５１６−１−２、５１６−１−３のように分かれて検出される。図中のＸ方向の位置により標的核酸の配列を測定し、Ｙ方向の位置によって標的核酸の塩基長を測定する。また、電気泳動の際に塩基長が既知の核酸をマーカーとして添加しておけば、マーカーとの電気泳動距離の相対比較によって塩基長の決定が可能である。
【００４０】
このように本発明を用いれば、標的核酸の配列と塩基長を同時に網羅的に検出することが可能となる。また、標的配列に近似している核酸による非特異なハイブリダイゼーションが起こった場合にも、通常は標的核酸と非標的核酸は塩基長が異なるために、本発明の方法で別個に検出することによって区別可能である。ひいては、前工程から持ち込まれるプライマー等の共雑核酸を区別することも可能となる。
【００４１】
次に、本発明のもう一つの実施の形態および流れを、図６を用いて説明する。図６のＡ）が平板状基板を使用した実施形態の一例を示す模式図である。６０１が基板であり、６０３がプローブ核酸である。６１３がハイブリダイゼーションチャンバーであり、液体を保持する機能と液体を注入する注入口６１８と排出口６１９を有し、ハイブリダイゼーション反応等を制御するために不図示の温度制御機構を有している。さらに、ハイブリダイゼーションチャンバー６１３には電極６０４と６０５を具備し、導線６０７を通して電源６０８と接続されている。Ｂ）はＡ）のＸ−Ｘ'断面を示す模式図である。
【００４２】
生体物質から抽出し、蛍光色素等で標識した標的核酸を含んだハイブリダイゼーション溶液６１５を、注入口６１８を通してハイブリダイゼーションチャンバー６１３内に注入する。ハイブリダイゼーションチャンバー６１３を、標的核酸とプローブ核酸６０３のハイブリダイゼーション反応に適切な温度条件に制御し、任意の時間、反応を行う。
【００４３】
反応後、ハイブリダイゼーション溶液を排出口６１９から排出し、適当な洗浄液を注入口６１８から注入して、基板の洗浄を行う。図６のＣ）が、ハイブリダイゼーション反応後を示す模式図である。基板６０１のプローブ核酸６０３には標的核酸６１６が結合している。プローブ核酸の配列に応じて、その相補配列を持つ６１６−１、６１６−２等が異なる位置に結合する。
【００４４】
次に、ハイブリダイゼーションチャンバー６１３の注入口から電気泳動担体を注入する。電気泳動担体がアガロースゲル等の場合には融解した状態で注入するが、あまり高温であると標的核酸がプローブ核酸から遊離してしまうので、低融点ゲルを用いるのが好ましい。また、電気泳動担体として微小粒子を用いることも可能であるが、光を通しにくく蛍光検出が困難であるので、放射性物質による標識等が必要となる。注入後、温度を低下させてゲルを硬化させる。
【００４５】
その後、基板６０１を加熱して、プローブ核酸から標的核酸を遊離させる。同時に電極６０４、６０５に電源６０８によって電圧を印加して電気泳動を開始し、任意の時間電気泳動を行う。
【００４６】
電気泳動後の状態を図６のＤ)に示す。標的核酸６１６は電極６０５側に泳動され、その塩基長によって分離される。標的核酸６１６−２は鎖長によって６１６−２−１と６１６−２−２に分離される。
【００４７】
その後、ハイブリチャンバー６１３内の電気泳動担体を蛍光スキャナーで読み取り、標的核酸６１６の位置を計測する。図中のＸ方向の位置により標的核酸の配列を測定し、Ｙ方向の位置によって標的核酸の塩基長を測定する。
【００４８】
本例では電気泳動方向が基板６０１のプローブ面と平行方向であったが、垂直方向に泳動することも可能である。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明の核酸検出方法の実施例を示すが、以下の実施例で本発明の内容が限定されるものではない。
【００５０】
（実施例１）
現在、ヒトの腫瘍と、ＰＴＣＨ１、ＣＤ４４遺伝子でのスプライシングバリアントとの関連が指摘されている。ヒトの腫瘍細胞においては、ＰＴＣＨ１遺伝子のＥｘｏｎ１、２が欠損するバリアントが多く、ＣＤ４４遺伝子のＥｘｏｎ６〜１５が欠損するバリアントが多く存在することが一般に知られている。本実施例はこの両者を検出する場合の本発明の一例である。
【００５１】
まず、ＰＴＣＨ１遺伝子とＣＤ４４遺伝子の非バリアント部位の配列とそれぞれ特異的に結合する６０ｍｅｒの１本鎖ＤＮＡをプローブ核酸として公知の技術で合成した。この２種類のプローブ核酸を、直径０．５ｍｍ、長さ２ｃｍの円柱形ガラス基板の表面に、特開平１１−１８７９００号公報で開示されている方法を利用して固定した。図７に作製した基板の模式図を示す。７０１がガラス基板であり、７０３−１がＰＴＣＨ１遺伝子用プローブ、７０３−２がＣＤ４４遺伝子用プローブである。
【００５２】
次に、ＰＴＣＨ１遺伝子とＣＤ４４遺伝子のプローブ領域とバリアント領域を含む配列を増幅するためのＰＣＲプライマーを設計した。ＰＴＣＨ１の増幅領域は２０００塩基でありＥｘｏｎ１およびＥｘｏｎ２を含むものである。ＣＤ４４の増幅領域は、Ｅｘｏｎ１からＥｘｏｎ１８までを含む約２２００塩基の領域である。設計した配列で末端を蛍光色素Ｃｙ３で修飾したプライマーを合成した。
【００５３】
次に電気泳動担体を準備した。図８のＡ）、Ｂ）のように、厚さ０．５ｍｍ程度のガラス板８２０を、スペーサ８２１、８２２を挟んで２枚重ね、隙間に溶解した０．８％アガロースゲル８０２を空気が入らないように充填した。図８のＢ）はＡ）のＸ−Ｘ'断面を示している。アガロースゲルの硬化後、スペーサ８２２を除去し、基板を挿入するチャンバー８０６とした。
【００５４】
ヒト正常細胞から既知の方法を用いてＲＮＡを抽出し、逆転写反応を行って、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡから上記プライマーを用いて標的核酸を増幅した。ＰＣＲ溶液の組成として、ＰＣＲバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ混合物）、２単位ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、前記プライマー濃度を各０．５μＭとし、液量は５０μlとした。温度サイクルは、変性：９２℃−４５秒、アニーリング：６５℃−４５秒、伸長：７２℃−４５秒を１サイクルとし、４０サイクル行った。反応後、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、プライマー等の不純物を除く精製工程を行った。
【００５５】
精製した増幅産物をハイブリダイゼーション溶液と混合し、図３で示すようなハイブリダイゼーションチャンバーに注入した。ハイブリダイゼーション溶液の組成は、一般的に使用されている以下の組成を用いた
６×ＳＳＰＥ／１０％ホルムアミド／０．０５％ＳＤＳ
（６×ＳＳＰＥ：ＮａＣｌ  ９００ｍＭ，ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ  ６０ｍＭ，ＥＤＴＡ６ｍＭ，ｐＨ７．４）。
【００５６】
ハイブリダイゼーションチャンバーに前記ガラス基板を投入して密閉した。密閉したハイブリダイゼーションチャンバーを５５℃に設定したオーブンに載置し、４時間ハイブリダイゼーション反応を行った。反応後、ハイブリダイゼーションチャンバーからガラス基板を取り出し、ＳＳＣバッファーで軽くすすいだ後、純水で洗浄し、乾燥させた。
【００５７】
次に、ハイブリダイゼーション反応した基板を図９のように電気泳動装置にセットした。チャンバー９０６に基板９０１を挿入し、ＴＡＥで満たした電気泳動漕９２３に投入した。電極９０４、９０５に５００Ｖの電圧を印加し、ヒータによってチャンバー９０６付近のみ９０℃に２分間加熱した。加熱終了後、１０分間電圧を印加して、電圧印加を停止した。
【００５８】
電気泳動担体を内包したガラス基板を電気泳動装漕から取り出し、適当な板に固定して、ＤＮＡアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）を用いて蛍光測定を行った。
【００５９】
同様の手順でヒトの腫瘍細胞から抽出したＲＮＡに対してもハイブリダイゼーション反応を行い、測定を行った。
【００６０】
図１０に両者の結果を示す。図１０のＡ）が正常細胞の測定結果であり、Ｂ）が腫瘍細胞の結果である。１００１が電気泳動前に標的核酸が結合していた基板である。Ａ）の１０２４がＰＴＣＨ１の完全長増幅産物のバンドであり、１０２５がＣＤ４４の完全長増幅産物のバンドである。バンドが１箇所に集中しており、一定の塩基長の増幅産物であったことが分かる。一方でＢ）の１０２４−１が完全長配列のバンドであるが、その上部に１０２４−２と１０２４−３というそれよりも短い産物のバンドが見える。ＰＴＣＨ１のＥｘｏｎ１およびＥｘｏｎ２は２００塩基程度であり、この配列がスプライシングされると増幅産物の全長が２００〜４００塩基程度短くなる。全長が短くなることにより、より電気泳動されやすくなり１０２４−２、１０２４−３の位置まで泳動されている。同様にＣＤ４４においても、完全長のバンドである１０２５−１以外に１０２５−２のバンドが検出され、Ｅｘｏｎ欠損による配列長の短縮が検出できた。
【００６１】
このように、本発明の核酸検出方法を使用することによって、特定配列を持つ核酸の塩基配列長を同時にかつ網羅的に検出することが可能となる。この方法は腫瘍の遺伝子診断などの複数の遺伝子に関する検査を同時に行う場合に適している。
【００６２】
（実施例２）
次に本発明における他の実施形態の一例を示す。ハイブリダイゼーション反応に供する検体としてＰＣＲ産物がよく用いられるが、ＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションさせる場合、ＰＣＲプライマーの影響を排除するために、精製工程が必要である。また、プライマーダイマー等のＰＣＲにおける非特異増幅産物による偽検出が起こる場合がある。本例はこれらの課題に対処するための一例である。
【００６３】
まず、黄色ブドウ球菌の１６ｓｒＲＮＡ配列を増幅するための２５ｍｅｒのプライマー配列を設計した。設計した配列の末端を蛍光色素Ｃｙ３で修飾したプライマー合成した。増幅産物長は約１５００塩基であった。
【００６４】
次に上記増幅配列中で他の微生物や哺乳類ゲノム中の配列に対して特異性のある配列に３０ｍｅｒのプローブ核酸を設計したところ、プライマー設計部位と１５ｍｅｒ重複する部位となった。実施例１と同様にプローブ核酸を基板に固定した。ただし、本例ではプローブ核酸は１種類である。
【００６５】
ヒト敗血症患者の血液検体から、Ｄｎｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて核酸を抽出した。抽出液量は５０μlであった。この抽出液５μlを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ溶液の組成として、ＰＣＲバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ混合物）、２単位ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、前記プライマー濃度を各０．５μＭとし、液量は５０μlとした。温度サイクルは、変性：９２℃−４５秒、アニーリング：６５℃−４５秒、伸長：７２℃−４５秒を１サイクルとし、４０サイクル繰り返した。反応後、反応物の半量をＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。残りの半量は精製しなかった。
【００６６】
同様の操作を、血液検体の替わりに純水を用いて行った。
【００６７】
準備した４サンプル（（１）血液検体−精製済み、（２）血液検体−精製なし、（３）純水−精製済み、（４）純水−精製なし）に対して、実施例１と同様の方法でハイブリダイゼーション反応を行った。この時点で基板の蛍光強度を観察した結果を図１１に示す。１１２６が（１）血液検体−精製済み、１１２７が（２）血液検体−精製なし、１１２８が（３）純水−精製済み、１１２９が（４）純水−精製なし、の結果である。１１２９から分かるように、本来はハイブリダイゼーションを行う標的核酸が含まれていないにも係わらず、混在するＰＣＲプライマーによる蛍光が検出されている。同様に１１２７には、標的核酸由来の蛍光だけではなくプライマー由来の蛍光も含まれているはずである。このように、通常のハイブリダイゼーション反応の検出だけでは、検出した蛍光が本来想定している標的核酸によるものなのかが確認できない。
【００６８】
次に、ハイブリダイゼーション反応した基板を図９の電気泳動装置にセットし、実施例１と同様に電気泳動を行った。図１２に、各々の基板の蛍光を測定した結果を示す。Ａ）が（１）血液検体−精製済み、Ｂ）が（２）血液検体−精製なし、Ｃ）が（３）純水−精製済み、Ｄ）が（４）純水−精製なし、の結果である。図中、１２３０が標的核酸である黄色ブドウ球菌の１６ｓｒＲＮＡの増幅産物由来の蛍光であり、１２３１がプライマー由来の蛍光である。また、血液検体においては、別に１２３２で示される由来不明の蛍光が検出された。
【００６９】
図１２のＢ）およびＤ）から明らかなように、１２３０で示す位置を観察することにより標的核酸の有無を正確に検出可能である。除去しなかったプライマーがプローブ核酸に結合していた場合、ハイブリダイゼーション反応後の測定だけでは、標的核酸の蛍光かプライマーの蛍光か判断が不可能であるが、１２３０と１２３１のように標的核酸と異なる位置に泳動されるため、区別して検出することが可能となる。また、図１２のＡ）およびＢ）の１２３２が示すように、ＰＣＲの非特異増幅産物による蛍光も標的核酸の蛍光と区別でき、偽検出を防ぐことが可能となる。
【００７０】
このように、本発明の核酸検出方法を使用することによって、標的核酸と、非特異増幅産物、残存プライマー類等と区別して検出することも可能となり、信頼性の高い核酸検出が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の方法の好適な構成の模式図である。
【図２】ハイブリダイゼーション反応の模式図である。
【図３】ハイブリダイゼーション方法の好適な一例の模式図である。
【図４】本発明の電気泳動装置の好適な一例の模式図である。
【図５】本発明の電気泳動方法を示す模式図である。
【図６】本発明の方法の好適な構成の模式図である。
【図７】実施例１に用いる基板を示す図である。
【図８】実施例１に用いる電気泳動装置を示す図である。
【図９】実施例１に用いる電気泳動装置を示す図である。
【図１０】実施例１の結果を示す図である。
【図１１】実施例２の結果を示す図である。
【図１２】実施例２の結果を示す図である。
【符号の説明】
【００７２】
１０１、２０１、３０１、５０１  、６０１、７０１、９０１、１００１、１２０１    基板
１０２、４０２、５０２、８０２、９０２、１００２、１２０２      電気泳動担体
１０３、２０３、３０３、６０３、７０３          プローブ核酸
１０４、４０４、５０４、６０４、９０４          電極
１０５、４０５、５０５、６０５、９０５          電極
１０６、４０６、５０６、８０６、９０６          チャンバー
１０７、４０７、５０７、６０７                  導線
１０８、４０８、５０８、６０８                  電源
２１０                                  標的核酸
２１１                                  センス鎖
２１２                                  アンチセンス鎖
３１３、６１３                          ハイブリダイゼーションチャンバー
３１４                                  温度制御機構
３１５、６１５                          ハイブリダイゼーション溶液
３１６、５１６、６１６                  標的核酸
４１７、５１７                          電気泳動担体容器
６１８                                  注入口
６１９                                  排出口
８２０                                  ガラス板
８２１、９２１                          スペーサ
８２２                                  スペーサ
９２３                                  電気泳動漕
１０２４                                        ＰＴＣＨ１由来のバンド
１０２５                                        ＣＤ４４由来のバンド
１１２６                                        ハイブリダイゼーション結果（１）
１１２７                                        ハイブリダイゼーション結果（２）
１１２８                                        ハイブリダイゼーション結果（３）
１１２９                                        ハイブリダイゼーション結果（４）
１２３０                                        標的核酸由来のバンド
１２３１                                        プライマー由来のバンド
１２３２                                        非特異増幅産物のバンド
【図１】
2009247295.tif 000003
【図２】
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【図３】
2009247295.tif 000005
【図４】
2009247295.tif 000006
【図５】
2009247295.tif 000007
【図６】
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【図７】
2009247295.tif 000009
【図８】
2009247295.tif 000010
【図９】
2009247295.tif 000011
【図１０】
2009247295.tif 000012
【図１１】
2009247295.tif 000013
【図１２】
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