(57)【要約】【課題】高い褐変防止効果と安全性を具備し、微妙な香り、味の違いが問題となる果実酒に使用した場合でも問題となることがなく、醸造工程に影響を与えないポリフェノールオキシダーゼ阻害剤を含有する果実酒、並びに果実酒の製造方法を提供すること。【解決手段】ポリフェノールオキシダーゼの活性を阻害する微生物の培養上清及び／又はその処理物を含有する果実酒、また、ポリフェノールオキシダーゼの活性を阻害する微生物の培養上清及び／又はその処理物を、果実を破砕する前又は果実を破砕している時に添加する果実酒の製造方法、また、果実酒の褐変を抑制するための添加剤であって、微生物の培養上清及び／又はその処理物を含有するポリフェノールオキシダーゼ阻害剤。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリフェノールオキシダーゼの活性を阻害する微生物の培養上清及び／又はその処理物を含有することを特徴とする果実酒。
【請求項２】
上記微生物が糸状菌である請求項１に記載の果実酒。
【請求項３】
上記糸状菌がトリコデルマ属又はハイポクレア属の糸状菌である請求項２に記載の果実酒。
【請求項４】
果実を破砕する工程を経て得られた果実破砕物又は果汁を発酵させる果実酒の製造方法であって、ポリフェノールオキシダーゼの活性を阻害する微生物の培養上清及び／又はその処理物を、果実を破砕する前又は果実を破砕している時に添加することを特徴とする果実酒の製造方法。
【請求項５】
上記微生物が糸状菌である請求項４に記載の果実酒の製造方法。
【請求項６】
上記糸状菌がトリコデルマ属又はハイポクレア属の糸状菌である請求項５に記載の果実酒の製造方法。
【請求項７】
果実酒の褐変を抑制するための添加剤であって、微生物の培養上清及び／又はその処理物を含有することを特徴とするポリフェノールオキシダーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、果実酒及びその製造方法に関し、更に詳細には、微生物の培養上清及び／又はその処理物を含有する果実酒及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食品の色は、その新鮮さや風味を指し量る目安となっているため、食品の変色（以下、「褐変」と略記する）を抑制することは、食品の商品性を高めるという意味で重要である。更に、食品の場合は、単に褐変を抑制することだけではなく、褐変を抑制することによって、おいしさが損なわれてはならないという課題も課せられている。
【０００３】
食品の褐変は、自然酸化による褐変と酵素的酸化による褐変の２つに分けることができ、特に後者に関しては、褐変に関係する酵素の活性を阻害する物質やその阻害方法に関する検討が行われている。
【０００４】
食品として、ブドウワイン、リンゴワイン、パイナップルワイン等の果実酒を見た場合、その製造工程で、果実からポリフェノールが抽出され、例えば、ブドウ赤ワインでは１００ｍＬあたり約２００ｍｇ、ロゼでは約１００ｍｇ、白ワインでは約２５ｍｇのポリフェノールが含まれている。更に、これら果実酒の原料となる果実には、ポリフェノールオキシダーゼが含まれており、褐変には、このポリフェノールとポリフェノールオキシダーゼが関与しているため、果実酒の褐変防止にはポリフェノールオキシダーゼ阻害剤の使用が有効と考えられている。
【０００５】
そこで、ブドウワインの褐変防止には、古くからポリフェノールオキシダーゼ阻害剤として、メタ重亜硫酸塩（metabisulfite）（ピロ亜硫酸塩（pyrosulfite）とも呼ばれる）が用いられてきた。例えば、ブドウワインの場合、メタ重亜硫酸塩は、赤ワイン、ロゼ、白ワインの別なく、果汁段階で約２０ｐｐｍから約５０ｐｐｍとなるよう、また、瓶詰め前において、再び約２５ｐｐｍから約５０ｐｐｍとなるように添加されることが一般的である。
【０００６】
しかしながら、メタ重亜硫酸塩は極めて長い使用経験があるものの、成長障害や肝機能障害等の健康への影響が懸念され、また味に対する影響も報告されている。そのため、健康への影響のない安全な果実酒を製造するという観点、更には、果実酒本来の新たな味を有する果実酒を製造するという観点から、メタ重亜硫酸塩を含有しないか、できるだけ減じた果実酒やその製造方法の検討が行われている。
【０００７】
一方、果実酒に限定されず一般に食品の褐変防止に関しては、例えば、特許文献１には、ポリフェノールオキシダーゼ阻害剤と可食性フィルムコーティング剤を含有する、果物及び野菜の変色防止剤が提案されており、そこには、多くの種類のポリフェノールオキシダーゼ阻害剤が記載されている。しかしながら、特許文献１に示されている変色防止剤は、主に果物や野菜に用いられるものであり、そこに示されているポリフェノールオキシダーゼ阻害剤は、公知のものの羅列であり、メタ重亜硫酸塩以外に果実酒用に用いることができるポリフェノールオキシダーゼ阻害剤は開示されていない。
【０００８】
また、特許文献２には、ネギ類植物の抽出画分であるジスルフィド化合物及びトリスルフィド化合物を含有するポリフェノールオキシダーゼ阻害剤が、果物及び野菜の褐変防止のために提案されている。しかしながら、ジスルフィド化合物やトリスルフィド化合物は、ネギ臭を有するものであり、特に微妙な香りの違いも問題となる果実酒の褐変防止用としては用いることができない。
【０００９】
また、特許文献３には、ポリフェノールの１種で抗酸化作用のあることが知られているプロアントシアニジンを５００ｐｐｍ以上含有させ、亜硫酸塩を２０ｐｐｍ以下に減じたワインが記載されている。ワイン中には、元々プロアントシアニジンがある程度含まれているが、ワイン製造時にその含有量を高める方法を採った結果、亜硫酸塩が無添加でも褐変が防止できたとするものである。確かにプロアントシアニジンはブドウ果実に本来含まれている成分であることから、安全性には問題がない可能性がある。しかしながら、プロアントシアニジンは、ポリフェノールの中でも特に渋みの強い成分であるため、その成分を通常より２倍（赤ワインの場合）から１４倍（白ワインの場合）多く含有させると味に影響を与えてしまう。
【００１０】
果実酒の魅力は何といっても、栽培地域の気候や製造環境の総合的な融合に伴って創出される色調、香り、味の個性にある。従って、以上述べたように、果実酒の褐変防止に対しては、褐変防止効果、味や香りへの影響等の点で、一般に知られているポリフェノールオキシダーゼ阻害剤は使用できず、未だに健康への影響が懸念されるメタ重亜硫酸塩が使用されているのが現状である。
【００１１】
【特許文献１】特開平７−２８９１６３号公報
【特許文献２】特開２００６−３０４７９０号公報
【特許文献３】特開平９−０５１７９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、高い褐変防止効果と安全性を具備し、微妙な香り、味の違いが問題となる果実酒に使用した場合でも問題となることがなく、醸造工程に影響を与えない有用なポリフェノールオキシダーゼ阻害剤を含有する果実酒、並びに果実酒の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは先の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ポリフェノールオキシダーゼの活性を阻害する微生物の培養上清が上記課題を解決することを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、「ポリフェノールオキシダーゼの活性を阻害する微生物の培養上清及び／又はその処理物」を含有することを特徴とする果実酒を提供するものである。
【００１５】
また本発明は、果実を破砕する工程を経て得られた「果実破砕物又は果汁」を発酵させる果実酒の製造方法であって、「ポリフェノールオキシダーゼの活性を阻害する微生物の培養上清及び／又はその処理物」を、果実を破砕する前又は果実を破砕している時に添加することを特徴とする果実酒の製造方法を提供するものである。
【００１６】
また本発明は、果実酒の褐変を抑制するための添加剤であって、微生物の培養上清及び／又はその処理物を含有することを特徴とするポリフェノールオキシダーゼ阻害剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、高い褐変防止効果と安全性を具備しているため、微妙な香りや味が重要な果実酒に使用した場合に問題がなく、醸造工程に影響を与えないポリフェノールオキシダーゼ阻害剤を含有する果実酒、並びにその製造方法を提供することができる。そして、本発明によれば、健康への影響が懸念されつつも一般に果実酒に使用されているメタ重亜硫酸塩を代替することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明について説明するが、本発明は以下の具体的形態に限定されるものではなく、本発明の技術的範囲内で任意に変形することができる。
【００１９】
本発明の果実酒は、ポリフェノールオキシダーゼの活性を阻害する微生物の培養上清及び／又はその培養上清の処理物を含有する。培養上清又はその処理物を使用することによって、ポリフェノールオキシダーゼ阻害剤として単一物を単離する必要がなく簡便である、混合物による複合効果が見込める、より天然物に近く安全性が高い、加工費がかからず安価に提供できる等の効果がある。
【００２０】
本発明における「培養上清の処理物」とは、培養上清をその効果を損なわない範囲で処理したものであれば特に限定はないが、培養上清の濾液、フィルター濾過等による各種除菌処理液、溶媒による抽出液、分画液、加熱処理液、ｐＨ調整液等であり、更に、それらの濃縮物、希釈物、乾燥物、凍結乾燥物等である。分画液に関しては、ポリフェノールオキシダーゼ阻害活性をマーカーとして通常行われる分離手段を行った後の阻害活性を有する分画液も好ましい。「培養上清の処理物」は、単一物質若しくはその溶液であっても、混合物若しくはその溶液であってもよい。また、単量体でも重合体でもよい。
【００２１】
本発明で用いられる微生物の種類としては、その培養上清又はその培養上清の処理物がポリフェノールオキシダーゼの活性を阻害するものであれば特に限定はないが、好適には糸状菌が挙げられる。種々の菌を検討した結果、糸状菌の培養上清及び／又はその処理物に、特異的にポリフェノールオキシダーゼの活性を阻害する効果が認められるものが多かった。
【００２２】
本発明で用いられる糸状菌は特に限定はないが、具体的には例えば、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）又はハイポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｐ．）属等の糸状菌が、褐変防止効果に優れ、培養上清に不快なにおいが殆ど感じられない点で特に好ましい。
【００２３】
微生物の培養に用いる培地は、培養に通常用いられる培地であれば特に制限なく用いることができる。炭素源としては、グルコース、シュクロース、マンノース、ラクトース、イノシトール、キシロース、フルクトース、ラフィノース、スクラロース、アラビノース等の糖類、セルロース、ペクチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等の多糖類；窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機含窒素塩類；チロシン、プロリン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、フェニルアラニン、セリン、シイステイン等のアミノ酸類；ポリペプトン、バクトペプトン、バクトソイトン、バクトカシトン、コーンスープディカー、加水分解コラーゲン等のペプタイド類；等が好ましい。
【００２４】
培養時に特殊な物、特殊な方法を使用する必要がないことは、本法を工業的に実施する場合に有利な点となる。
【００２５】
上記の「培養上清及び／又はその処理物」は、果実酒に含有されることが特に好適である。果実酒は、ポリフェノール及び／又はポリフェノールオキシダーゼを比較的多く含むため褐変し易いからである。また、ポリフェノールオキシダーゼを失活させるために、加熱処理等ができない場合が多いからである。更に、果実酒は、「果実を破砕する工程を経て得られた果実破砕物又は果汁」を発酵させて得られるものがあるが、果実を破砕する際、特に切り口において、ポリフェノールオキシダーゼがポリフェノールに作用して褐変を起し易いからである。更には、果実酒は、微妙な香りや味の違いが問題となるからである。
【００２６】
本発明における「果実酒」には、果実をエチルアルコールと水との混合溶媒（焼酎、ブランデー等）に浸漬させることによって製造される果実混和酒も、果実又は果汁を発酵させてエチルアルコールを発生させて製造されるものも含まれる。後述するように、後者では、果実を発酵させる際に果実を破砕する場合が多く、その時に褐変が起こり、それを防止する必要がある点で、後者の果実酒に適用することが特に好ましい。
【００２７】
また、特に限定はないが、褐変防止の効果が有効に発揮されるために、発酵後に蒸留工程を有さない果実酒であることが好ましい。すなわち、本発明の果実酒は、スピリッツよりワインであることが好ましい。更には、褐変が起こり易く、基準が厳しい点で、果実がブドウである果実酒であることが好ましい。
【００２８】
果実酒は、その色調、香り、味等が、その果実酒の個性を形成するため、果実酒の香りや味わいに影響を与えるものは添加することができない。また、果実酒は瓶詰め後もその熟成が進む場合があるため、醸造時や瓶詰め後の熟成を阻害する添加剤も用いることができない。微生物の培養上清及び／又はその処理物を含有する果実酒は、これらの問題点がないことからも優れている。
【００２９】
果実又は果汁を発酵させて得られる果実酒、特にその果実がブドウである果実酒には以上のように多くの制約があるため、これまでメタ重亜硫酸塩（ピロ亜硫酸塩）しか褐変を防止する添加剤として用いられて来なかった。本発明において、ポリフェノールオキシダーゼ活性を阻害する「微生物の培養上清及び／又はその処理物」は、果実酒の褐変防止剤として極めて好適に用いることができる。中でも、果実又は果汁を発酵させて製造されるワインに好適に用いることができ、ポリフェノールやポリフェノールオキシダーゼを多く含む赤ワインに特に好適に用いることができる。
【００３０】
本発明の果実酒を製造するにあたり、ポリフェノールオキシダーゼ活性を阻害する「微生物の培養上清及び／又はその処理物」は、果実酒製造のどの段階で添加してもよく、異なる段階で複数回添加してもよいが、ブドウ等の果実を発酵させるに先立ち、果実を破砕する場合には、少なくとも、果実を破砕したり潰したりする前及び／又は果実を破砕している最中に添加し、その後、その破砕物又は要すれば濾過等をして得た果汁を発酵させることが好ましい。すなわち、本発明の果実酒の製造方法は、果実を破砕する工程を経て得られた「果実破砕物又は果汁」を発酵させる果実酒の製造方法であって、ポリフェノールオキシダーゼの活性を阻害する「微生物の培養上清及び／又はその処理物」を、果実を破砕する前又は果実を破砕している時に添加することを特徴とする。
【００３１】
果実を破砕する前又は果実を破砕している時に添加するのは、果実酒の製造において、褐変は主に、果実破砕時に果実中のポリフェノールにポリフェノールオキシダーゼが作用して起こるのでそれを防止するため、また、本発明における「微生物の培養上清及び／又はその処理物」は、果実酒の醸造工程前に添加しても醸造工程になんら悪影響を与えないため、また、たとえ培養上清に由来する僅かな臭いや味があっても、その後の醸造工程中に失われてしまうため等の理由による。
【００３２】
ポリフェノールオキシダーゼ活性を阻害する「微生物の培養上清及び／又はその処理物」の使用量は、使用形態により適宜調整可能であり特に限定はないが、果実を破砕する前及び／又は果実を破砕している時に添加する場合、発酵前又は発酵中の果汁に添加する場合、果実酒に添加する場合、の何れの場合であっても、果実１００質量部に対して、０．００１〜５０質量部が好ましく、０．０１〜５質量部がより好ましく、０．１〜１質量部が特に好ましい。少な過ぎる場合には、褐変防止の効果が充分でなく、多過ぎる場合には、それに見合った効果が期待できない場合がある。
【００３３】
ブドウ等の果実を破砕する前及び／又は果実を破砕している時に添加する場合の添加方法は特に限定はないが、破砕された切り口に、確実に接触するように添加することが好ましい。また、添加したのち、充分混合してから、破砕を開始することが好ましい。
【実施例】
【００３４】
次に、実施例、試験例等を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、「％」は特に限定のない限り「質量％」を意味する。
【００３５】
［培養上清の作製］
伊豆諸島新島沖の水深約１００ｍの海底堆積物中から分離され、その形態学的特徴から、真菌類、線菌目、淡色線菌科の糸状菌である、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．  Ｈ１−７  と命名された菌（以下、「本菌」と略記する）を用いた。
【００３６】
本菌の生産培地は、２％グルコース、０．５％バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）を蒸留水に溶解後、ｐＨ８．０に調整し、バッフル付の５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬずつ分注して綿栓を施したのち、１２１℃で２０分間高圧滅菌した。この培地に、本菌を、一白金耳植菌したのち、２７℃において４日間、回転振とう培養（１６０ｒｐｍ）を行った。培養後、遠心分離（１３０００×Ｇ、４℃、１０分）した上清を、更に、メンブランフィルター（０．２μｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ東洋製）を用いて除菌処理した後、各種試験に用いた。
【００３７】
本菌を上記のように４日間、回転振とう培養した後の培養上清は、淡黄色の透明な液体であり、特に不快なにおい等は感じられなかった。なお、この培養上清液のｐＨは約６．０であり、色調（波長５２０ｎｍでの吸光度）は０．５６０であった。また、安全性に関しては、本菌培養上清には抗菌活性は認められず、培養細胞に１０％添加しても細胞毒性や刺激性は全く認められなかった。後述する試作ワインに対しては、この濃度では外観上及び安全性面において全く問題を認めなかった。
【００３８】
［ブドウ由来ポリフェノールオキシダーゼに対する阻害効果の評価］
本菌の培養上清の、ブドウ由来のポリフェノールオキシダーゼに対する活性阻害効果を確認するために、実際にブドウから粗ポリフェノールオキシダーゼを抽出して試験を行った。ブドウ由来のポリフェノールオキシダーゼ粗酵素液の調製にあたっては、レッドグローブ種を用い、果実を洗浄後、果皮を剥いて種子を除去した果肉１０ｇに対して、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００含有ＰＢＳ（ｐＨ６．９）を５ｍＬ加えて、氷冷下でガラス製ホモジナイザーを用いてよく磨り潰した。得られたホモジネート液を遠心分離（１４００×Ｇ、４℃、１０分）して、その上清液をポリフェノールオキシダーゼ粗酵素液として以下の評価に供した。
【００３９】
＜試験例１＞
９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５０μＬに先のブドウ由来ポリフェノールオキシダーゼ粗酵素液を３０μＬ添加し、本菌培養上清液を最終濃度として１％及び２％になるように評価系に添加した後、基質として４ｍＭエピカテキン（緑茶由来、和光純薬工業）１００μＬを添加して、総量２００μＬ系で、２０℃で３０分間反応させた。反応後マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製、Ｍｏｄｅｌ  ５５０）により４９０ｎｍの吸光度を測定して、残存するポリフェノールオキシダーゼ活性の指標とした。
【００４０】
ブドウ由来ポリフェノールオキシダーゼに対する本菌培養上清の活性阻害効果を評価した結果、図１に示す通り、本菌培養上清液の添加濃度に依存してポリフェノールオキシダーゼ活性が阻害された。これにより本菌培養上清はブドウ由来のポリフェノールオキシダーゼ活性を顕著に阻害することが分かった。
【００４１】
［ポリフェノールオキシダーゼにより褐変するモデルワイン系の構築］
本菌培養上清の効果についての基礎的な情報を得るために、モデルワイン系を構築して検討を行った。モデルワイン系の構築にあたり、その主要構成成分は、ポリフェノール、ポリフェノールオキシダーゼ、有機酸及びアルコールとした。
【００４２】
ポリフェノールオキシダーゼの基質であるポリフェノールは、モノマーとしてはエピカテキン（緑茶由来、和光純薬工業）を用い、ポリマーとしては市販のブドウ由来ポリフェノール（商品名：ぶどうポリフェノールＰＰＲ、サンブライト）を用いた。ポリフェノールオキシダーゼとしては、高い活性を有し、かつ入手が容易であるチロシナーゼ（マッシュルーム由来、和光純薬工業）を用いた。有機酸としては、ワイン中に多く含有される酒石酸（特級、和光純薬工業）を、またアルコールにはエタノール（特級、和光純薬工業）を用いた。
【００４３】
［モデルワイン系におけるポリフェノールオキシダーゼ濃度の検討］
モデルワイン系における酒石酸及びエタノール濃度は、実際のワインを想定し、それぞれ０．３％及び１２．５％とし、基質のポリフェノール量として、エピカテキンは最終濃度２ｍＭとし、ブドウ由来ポリフェノールは最終濃度が０．１％となるように設定した。ポリフェノールオキシダーゼの濃度検討にあたっては、それぞれ１２５０、２５００及び５０００  ｕｎｉｔｓ／ｍＬの濃度に調製したチロシナーゼ溶液を添加し、室温条件である２０℃で活性を発現する濃度について検討を行った。本評価系におけるポリフェノールオキシダーゼ活性については、試験例１と同様に操作を行い、２０分間経過後の４９０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製、Ｍｏｄｅｌ５５０）により測定して評価した。
【００４４】
上記モデルワイン系中には、ポリフェノールオキシダーゼ活性を低下させる要因である有機酸及びエタノールを多く含む。更に本系の評価は実際の経過時間を短縮して経時変化を反映させる、いわゆる加速試験としての性格を持たせることを目標として、上述の条件下でもポリフェノールの酸化反応が十分に進捗し得るポリフェノールオキシダーゼの必要量について検討を行った。
【００４５】
基質としてはエピカテキンを、またポリフェノールオキシダーゼとしてチロシナーゼを用いたモデルワイン系で反応を行ったところ、図２に示す通り、ポリフェノールオキシダーゼの添加量に依存して酵素反応の上昇が認められた。この結果から明らかなように、本モデルワイン系におけるポリフェノールオキシダーゼとしてのチロシナーゼ活性は、最終濃度として７５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以上が必要であり、十分な活性を考慮すると１５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ程度が望ましいことが分かった。
【００４６】
なお、常法によるリン酸緩衝液系（ｐＨ６．９、アルコール未含有）においては、チロシナーゼ活性として２５０〜５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ程度でも十分な反応速度が得られているが、このモデルワイン系では、そのおよそ３〜６倍量のチロシナーゼ活性が必要であった。このことは、このモデルワイン系のｐＨとエタノールの存在がチロシナーゼ活性を大幅に低減させているためと推察された。
【００４７】
次いで、モデルワイン系における基質として、市販のブドウ由来ポリフェノールを用いたポリフェノールオキシダーゼ反応の結果を図３に示す。反応時間に対する吸光度の変動からも分かるように、本基質を用いた系では反応自体が緩慢であり、更に反応開始５分以後に酵素反応の顕著な鈍化現象が見られた。この原因として、基質に用いた市販のブドウ由来ポリフェノール中には種々の重合度のポリフェノールポリマーが含まれており、ポリフェノールオキシダーゼ反応により更に種々のポリフェノールポリマーが形成されて、これらのポリフェノールポリマーがポリフェノールオキシダーゼ自身の活性を阻害することによるものと推察された。この結果から、モデルワイン系にブドウ由来のポリフェノールを基質として選択する場合には、酵素反応が鈍化するまでの初期段階（反応開始５分後）に評価判定することが望ましいことが分かった。
【００４８】
＜試験例２＞
［モデルワイン系における、本菌の培養上清のポリフェノールオキシダーゼ活性阻害効果の測定］
上記のモデルワイン系において、精製水の代わりに本菌培養上清液を１％及び１０％添加して２０℃で３０分間反応させたのち、４９０ｎｍにおける吸光度を測定してポリフェノールオキシダーゼ活性とした。なお、ポリフェノールオキシダーゼ活性阻害率は下式により算出した。
活性阻害率（％）
＝１００−１００×［本菌培養上清添加系の吸光度］／［ブランクの吸光度]
【００４９】
得られた結果を表１に示す。表１中、ポリフェノールオキシダーゼを「ＰＰＯ」と表わしている。その結果、本菌の培養上清は基質として用いたエピカテキン及びブドウ由来ポリフェノールの何れの系においても高い阻害効果が認められた。これらの結果から、本菌培養上清はモデルワイン系において、ポリフェノールのモノマー及びポリマーの基質において幅広くかつ十分なポリフェノールオキシダーゼ阻害活性を有しており、実際のワイン製造を鑑みても本菌の培養上清の使用は、ワインの色調の劣化に対する有効な防止策として十分応用が可能であることが判明した。
【００５０】
本菌の培養上清の、ポリフェノールオキシダーゼの活性阻害率
【表１】
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【００５１】
［赤ワインにおける、本菌の培養上清のポリフェノールオキシダーゼ活性阻害効果の測定］
本菌の培養上清の実際の食品への適用について、食品としてワインを選択し、実際にワインの試作工程中で添加することを試みた。ワインとしてはポリフェノール含量が高く、本菌培養上清の効果を明確に確認することができる赤ワインを選択した。また、ブドウの品種としては入手が容易な市販のブドウ３品種を用いて検討を行った。
【００５２】
（１）レッドグローブ種による試作
市販のレッドグローブ種を水道水でよく洗浄後、約５０ｇずつを４試験区に分別した。これらの試験区には、精製水をブランクとして用い、ポジティブコントロールにはそれぞれ最終濃度が７５μｇ／１００ｍＬのメタ重亜硫酸カリウム（Potassium  metabisulfite）（局方、和光純薬工業社製）、及び１００μｇ／１００ｍＬのビタミンＣ（アスコルビン酸）を添加した。なお、本菌の培養上清液は、最終濃度として１０ｍＬ／１００ｍＬとなるように添加した。
【００５３】
予めこれらの添加を行ったのち、除梗破砕してブドウ破砕物（マスト）を作製し、これを３％酒石酸水溶液でｐＨ３．０に調整した。これらのマストを、２３°Ｂｒｉｘになるまで白糖で補糖したのち、「Saccharomyces  cereviciaeの乾燥物１０ｇを、約３７℃に保温した精製水１００ｍＬに攪拌分散して室温まで冷却した酵母溶液」を、各マストに対して０．２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）量添加して２０℃で発酵を行った。発酵の終点は、炭酸ガス減量にともなう重量変化が安定した時点とした。発酵終了後、遠心分離（１３０００×Ｇ、１０分）を行い、得られた上清液を、更にメンブランフィルター（０．２μｍ）で濾過して以後の試験に供した。
【００５４】
（２）スチューベン種及びデラウエア種による試作
市販のスチューベン種及びデラウエア種を用いた以外は、上記レッドグローブ種と同一操作で試作を行った。
【００５５】
＜試験例３＞
［試作赤ワインの評価］
先に得られた４区分の試作ワインについての分析は、同一試料について２回以上行い、分析値として得られた値の平均値を採用した。なお、試作中におけるマストの発酵過程については炭酸ガス減量にともなう重量変化を経日的に追跡した。また得られた試作ワインについては、横塚らの方法(K.Yokotsuka,  T.Okuda,  and  M.Sato.  Effect  of  initial  pH  of  Muscat  Bailey  A  grape  must  on  the  color  of  red  wine  produced.  J.ASEV  Jpn..  9:2-12  (1998).)を参考にして、ｐＨ、°Brix及び色調（日立製作所製、Ｕ−１５００を用いて測定）を測定して、本菌の培養上清、メタ重亜硫酸カリウム及びビタミンＣの、試作ワインの褐変に対する影響を観察した。
【００５６】
更に、試作赤ワインにおけるアルコール濃度をガスマススペクログラフィー（Ｙｏｋｏｇａｗａ：ＨＰ  Ｇ１８００Ａ）により測定した。また赤ワインについては、フォリン試薬を用いる津志田らの方法（津志田藤二郎、鈴木雅博、黒木柾吉、各種野菜類の抗酸化性の評価及び数種の抗酸化成分の同定  日食工誌  ４１：６１１−６１８（１９９４））により、没食子酸相当量としてポリフェノール含有量を測定した。
【００５７】
（１）ワインカラー  (wine  color,  ＷＣ)
赤ワインを重酒石酸カリウムで飽和した１０％エタノール水溶液（ｐＨ３．７）で１０倍に希釈後、１０ｍｍのガラス製セルを用いて色調（波長５２０ｎｍ）を測定後得られた値を１０倍して、ｐＨ３．７におけるワインカラーとした。
（２）酸性でのワインカラー  (wine  color  at  pH0.4,  ＷＣＡ)
無色のカルビノールベースを赤色のフラビリウムベースとするために、赤ワインを１Ｎ塩酸で１０倍に希釈後、同様に色調を測定して、ｐＨ０．４（酸性）におけるワインカラーとした。
（３）酸化・褐色度  (degree  of  pigment  coloration,  ＤＰＣ)
酸化・褐色度の指標となるＤＰＣは下式により算出し、各ブドウ品種における試作赤ワインの精製水添加区の値を１．０として換算比較した。
ＤＰＣ（％）＝１００×ＷＣ／ＷＣＡ
【００５８】
試験例３で得られた結果について以下に解析を行った。
（１）試作赤ワインにおける、本菌の培養上清の発酵工程への影響の有無
レッドグローブ種、スチューベン種及びデラウエア種の３種を用いて試作した各４試験区の赤ワインの発酵工程について、炭酸ガス減量にともなう重量変化を観察したところ、何れのブドウ品種を用いた試作赤ワインにおいても、図４−ａ）、−ｂ）及び−ｃ）に示すように、本菌の培養上清添加区は精製水添加区と同様に速やかな重量減少が認められており、順調に発酵が進捗していることが分かった。
【００５９】
また、レッドグローブ種で、２３．５°Ｂｒｉｘ、スチューベン種、及びデラウエア種で、２３°Ｂｒｉｘで発酵を開始したマストは、重量変化が一定となった１１日後の発酵終了時には、３品種の試作赤ワインすべてが６．５°Ｂｒｉｘに低下していた（表２）。これらの結果から本菌培養上清の添加は赤ワインの発酵に際して何ら障害とならないことが分かった。
【００６０】
一方、これまで褐変防止剤として汎用されているメタ重亜硫酸カリウム添加区は、精製水添加区及び本菌培養上清添加区に比べて発酵初期における重量減少の速度は緩やかであったが、発酵開始から１１日後には重量変化が精製水添加区とほぼ同一となり、発酵終了時点では３品種の試作赤ワインともに６．５°Ｂｒｉｘとなって順調に発酵が進んだことが分かった。
【００６１】
また、ビタミンＣ添加区においては、初発として２２．５°Ｂｒｉｘ〜２３．０°Ｂｒｉｘで発酵を開始したが、発酵終了時点の１１日後では、７．０〜７．５°Ｂｒｉｘであり、他の試験区に比べて高い値を示した。この原因についての詳細は不明であるが、安全性に優れており更に酸化防止作用を有するビタミンＣではあるが、赤ワイン製造においては必ずしも適当な褐変防止剤ではないことが分かった。
【００６２】
（２）試作赤ワインにおける、褐変防止効果の評価
上述の通り、発酵過程の目安となる重量変化が一定となった時点を発酵終点として濾過精製したのち、更に除菌濾過（０．２μｍ）して赤ワインを調製した。なお、赤ワインの色調（ＷＣ）については、用いたブドウの品種の色調に合致して相違が見られた。すなわち、果皮の色がスチューベン種やデラウエア種に比べて淡いレッドグローブ種で試作した赤ワインのＷＣは、他の２種で試作した赤ワインのＷＣに比べて低い値を示した。この傾向はメタ重亜硫酸カリウム添加区をはじめ、ビタミンＣ添加区及び本菌の培養上清添加区の何れにも見られた。
【００６３】
表２に本検討において試作に用いた３種のブドウ品種から得られた赤ワインの概要を示す。この表から分かるように、赤ワインのＷＣはポリフェノールの含有量に依存していた。なお、ビタミンＣ添加区のポリフェノール量については、上記フォリン試薬を用いる津志田らの方法では、正しく測定できない可能性があるため除外した。本菌の培養上清添加区の赤ワインのＷＣは精製水添加区及びメタ重亜硫酸カリウム添加区の赤ワインと同様の値を示したことから、本菌培養上清は赤ワイン製造において重要な要素であるブドウ果皮からの色素の溶出を阻害しないことが示唆された。なお、ビタミンＣ添加区のＷＣは、他の添加区に比べて高い値を示したが、これはビタミンＣ自身の褐変によるものと推察された。
【００６４】
４試験区添加後の赤ワインの特性
【表２】
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【００６５】
赤ワインの酸化及び褐変の指標であるＤＰＣについては、図５に示すように、培養上清添加区とメタ重亜硫酸カリウム添加区は、精製水添加区及びビタミンＣ添加区に比べて低い値を示し、本菌の培養上清は、メタ重亜硫酸カリウムと同様、赤ワインの酸化及び褐変を抑制することが確認された。
【００６６】
上述の結果から、本菌の培養上清の添加は、今日まで酸化及び褐変の防止目的で汎用され続けているメタ重亜硫酸カリウムと同様、赤ワインの製造に有用であることが確認された。また、果実を破砕し、その果汁を発酵して製造される果実酒においては、赤ワインと同様のメカニズムで褐変化が起こっており、果実又は果汁を発酵させて製造される果実酒の褐変防止全般に、本菌の培養上清は有効に用いられると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明における「ポリフェノールオキシダーゼの活性を阻害する微生物の培養上清及び／又はその処理物」は、健康に対して悪影響を及ぼさず、ポリフェノールオキシダーゼが関与する食品の褐変抑制に極めて優れているので、果実酒に含有させて広く利用できるものである。また、少なくとも、果実を破砕する前及び／又は果実を破砕している時に添加すれば、より効果的に果実酒の褐変抑制に効果的であるため、ワイン製造に広く用いられるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ブドウ由来ポリフェノールオキシダーゼ粗酵素液における、本菌の培養上清のポリフェノールオキシダーゼ活性阻害効果を表したグラフである。  本菌培養上清を、０％、１％、２％添加したときの変化を、それぞれ、○、●、■、で表している。
【図２】モデルワイン系（基質としてエピカテキン）において、ポリフェノールオキシダーゼ（チロシナーゼ）添加量の違いによるポリフェノールオキシダーゼ活性を表したグラフである。  チロシナーゼ添加量が、１５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、７５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、３７５ｕｎｉｔｓ／ｍＬのときの変化を、それぞれ、●、▲、■で表している。
【図３】モデルワイン系（基質として市販のブドウ由来ポリフェノール）において、ポリフェノールオキシダーゼ（チロシナーゼ）添加量の違いによるポリフェノールオキシダーゼ活性を表したグラフである。  チロシナーゼ添加量が、１５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、７５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、３７５ｕｎｉｔｓ／ｍＬのときの変化を、それぞれ、●、▲、■で表している。
【図４】レッドグローブ種（ａ）、スチューベン種（ｂ）及びデラウエア種（ｃ）のそれぞれにおける、４試験区（○：精製水、■：メタ重亜硫酸カリウム、▲：ビタミンＣ、●：本菌培養上清）の発酵過程における重量減少を表したグラフである。
【図５】レッドグローブ種、スチューベン種及びデラウエア種のそれぞれにおける、４試験区（精製水、メタ重亜硫酸カリウム、ビタミンＣ、本菌培養上清）のＤＰＣ値を表したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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