(57)【要約】【課題】炎症性疾患を処置または予防するために適した組成物および方法を提供すること。現存する手順を伴う問題を取り扱い、現存する手順と比較して有意な利点を提供し、そして他の関連した利点をさらに提供すること。【解決手段】乾癬を処置または予防するための方法であって、該乾癬が処置または予防されるように、患者に治療有効量の抗微小管剤を投与する工程を包含する、方法。関節炎を処置または予防するための方法であって、該関節炎が処置または予防されるように、患者に治療有効量の抗微小管剤を投与する工程を包含し、ただし、該抗微小管剤は、パクリタキセル、またはそのアナログもしくは誘導体ではない、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、炎症性疾患を処置または予防するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
炎症性疾患（慢性または急性性質のいずれも）は、健康管理産業において重要な問題を提示する。簡潔には、慢性炎症は、延長した持続時間（週または月）の炎症であり、ここでは、急性炎症、組織破壊、および治癒の試みが同時に進行していると考えられる（R. S. Cotran, V. Kumar、およびS. L. Robbins, W. B. Saunders Co.による、RobbinsPathological Basis of Djsease、75頁、1989）。慢性炎症は、急性炎症発症に続いて起こり得るが、遅延した過敏症反応、内因性毒素（例えば、上昇した血漿脂質）または外因性毒素（例えば、シリカ、アスベスト、シガレットタール、外科的接着）への延長した曝露、または身体自体の組織に対する自己免疫反応（例えば、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬）を起こす持続性感染（例えば、結核、梅毒、真菌感染）の結果として、時間とともに進行する、潜伏性プロセスとしても始まり得る。慢性炎症性疾患は、従って、多くの共通の医療症状（例えば、リウマチ様関節炎、再狭窄、乾癬、多発性硬化症、外科的接着、結核、および慢性炎症性肺疾患（例えば、喘息、塵肺症、慢性閉塞肺疾患、鼻ポリープ、および肺線維症））を含む。
【０００３】
（乾癬）
乾癬は、共通の、慢性炎症性皮膚疾患であり、容易に、痒み、火傷、刺痛、および出血を起こす、惹起された病変、炎症性病変、肥厚した病変、および鱗状の病変によって特徴付けられる。約10％の患者において、乾癬は、明白なリウマチ様関節炎に見られる変化と類似の関節症状をともなう。米国人口の約２〜３％が、乾癬に罹患しており、250,000の新しい事症が毎年診断されている。
【０００４】
乾癬が多遺伝子性の自己免疫障害であるという重要な証拠が存在するが、現在、乾癬の原因は知られていない。さらに、乾癬に対する治療は、現在のところ存在しない。利用可能な処置には、局所治療（例えば、ステロイドクリームおよびステロイド軟膏、コールタールおよびアントラリン（anthralin））、および全身処置（例えば、ステロイド、ウルトラバイオレットＢ、PUVA、メトトレキサート、およびシクロスポリン）が含まれる。しかし、不満足な緩解速度および／または潜在的な重篤な副作用は、ほとんどの抗乾癬治療を特徴づけている。米国における乾癬処置の全体の費用は、一年あたり、３０億ドル〜５０億ドルの間であると見積られており、これは、乾癬を主要な保健管理問題にしている。
【０００５】
（多発性硬化症）
多発性硬化症（MS）（米国において350,000人（女性：男性＝２：１）が罹患しており、8,000の新しい事症が毎年報告されている）は、神経系に関与する、最も一般的な慢性炎症性疾患である。代表的には、MSは、臨床的に、数年間の期間にわたって存在する有害な神経学的欠損の反復性発症として存在する。およそMSの半分の事症が、より慢性相（phase）に進行する。この疾患は早期には死亡または認識機能障害を生じないが、視覚的知覚を妨害すること；複視の刺激；歩行および手の使用に影響を及ぼす運動機能を妨害すること；腸失調および膀胱失調を生じること；痙縮；ならびに感覚（触覚、痛み、および温度感受性）不損によって、患者を不自由にする。
【０００６】
MSは自己免疫疾患であるという重要な証拠があるが、MSの原因は知られていない。現在、多発性硬化症に利用可能な治癒は存在せず、そして現在の治療法は、部分的に成功しているにすぎない。例えば、メトトレキサート、シクロスポリン、およびアザチオプリンのような化学療法剤が、処置に応答しない進行性疾患を有する患者の取り扱いのために試験されているが、最小限の長期的の有利な効果が、今日までに実証されているにすぎない。近年認可されている他の治療剤には、再発性回復（relapsing-remitting）MSに罹患した外来患者の使用のためのインターフェロン-βが含まれる（Patyら、Neurology43:662-667, 1993）（特に、Betaseron（組換えインターフェロンβ-1β；17位が置換されたヒトインターフェロン、CysョSerβ；Berlex/Chiron）またはAvonex（組換えインターフェロンβ-1α；哺乳動物細胞で産生されたグリコシル化ヒトインターフェロンβ；Biogen））。不運なことに、BetaseronはMS患者に増大した生活の質を提供するが、疾患進行は顕著に改善されるようではない。Betaseron治療をともなう有害な経験には、以下が挙げられる：注射部位反応（炎症、痛み、過敏症、および壊死）、ならびにインフルエンザ様症状合併症（発熱、悪寒、不安、および錯乱）。
【０００７】
（リウマチ様関節炎）
リウマチ様関節炎（RA）は、世界人口の１％〜２％に発症している衰弱性慢性炎症性疾患である。この症状は、身体の複数の関節の痛み、膨張、および破壊を起こし、そしてまた肺および腎臓などの他の器官に損傷を生じ得る。進行した疾患を有する人々は、ガンのいくつかの形態よりも大きな死亡率を有し、そしてこのために、処置法は、不可逆的な関節障害の可能性を減少するように設計された、積極的な初期薬物治療にふかってシフトしている。AmericanCollege of Rheumatologyの最近の推奨（Arthritis and Rheumatism 39(5):713-722, 1996）には、確立された診断および発症している症状を有する任意の患者に対する疾患を改変する抗リウマチ薬物（DMARD）治療の早い開始が含まれる。抗ガン薬は、莫大な数の患者に対して、リウマチ学者の60％〜70％により選択される薬物である、化学療法薬（メトトレキサート）での第一線の治療となった。疾患の重篤度は、しばしば、この薬物での無期限の毎週の処置を確実にし、そして疾患がメトトレキサート治療にも関わらず進行する患者（患者の50％以上）では、第二線の化学療法薬（例えば、シクロスポリンおよびアザチオプリン（単独または組合せて））が頻繁に使用されている。
【０００８】
（再狭窄）
再狭窄は、血管壁肥厚化、および組織へ血管によって供給される血流の減少を導く、慢性血管創傷の形態である。これは、これは、血管閉塞を解放することを試みる実質的に任意の操作を含む血管再構築手順に応答して起こり、そして血管疾患の侵襲性処置の効果を制限する主要因子である。再狭窄は、過去15年間の心臓血管研究の主要な試みである。1994年の評価（U. S. Heart and Stroke Foundation）によると、６千万人を越えるアメリカ人が１つ以上の心血管疾患の形態を有する。これらの疾患は、同じ年に約100万人（米国における全死亡の41％）の生命を奪い、そして先進国で、死および身体障害の主要な原因であると考えされる。
【０００９】
現在、技術的に承認された、ヒトに有効であった、再狭窄の予防のための処置は存在しない。研究されている全身的治療剤には、内皮欠失の処置に指向される薬剤である、（抗血小板剤（例えば、アスピリン）、血管拡張薬（例えば、カルシウムチャンネルブロッカー）、抗トロンビン剤（例えば、ヘパリン）、抗炎症剤（例えば、ステロイド）、血管平滑筋細胞（VSMC）増殖防止剤（例えば、コルチシン）、および再内皮化（reendohelialization）の促進剤（例えば、血管内皮増殖因子））が含まれる。研究されている局所処置には、局所的薬物送達（例えば、ヘパリン）、ならびにβ線照射およびγ線照射が含まれる。全てがヒトの使用において期待はずれであった。なぜなら、第一に、それらは再狭窄プロセスの限定された部分で作用するようであるからである。全身処置はまた、好ましくない全身的合併症および毒性を引き起こすことなく、持続する生物学的効果を提供するために、疾患の部位における薬物の適切な吸収および保持を達成するという、さらなる問題に遭遇する。
【００１０】
（炎症性腸疾患）
炎症性腸疾患（IBD）は、小腸および大腸での炎症または潰瘍を引き起こす慢性障害（本来性クーロン病および潰瘍性大腸炎）をいう。簡潔には、米国では約200万人（罹患している男性と女性の数は等しい）がIBDに罹患している。発生数のピークは、15歳と30歳の年齢の間で起こり、そして第二のピークはしばしば55歳と60歳の年齢の間で報告される。多くの実証された有病割合パターンが存在するが、これは未知の原因の疾患である。
【００１１】
IBDは、しばしば、交互の緩解期間、それに続く重篤度の変化する予測不可能な再発または発赤の期間によって特徴付けられる。約50％の患者が任意の所定の時間で緩解し、そして多数が、10年間の期間で、少なくとも１つの再発を起こす。さらに、最も一般的には関節炎であるこの疾患に付随する、多くの全身的合併症が存在する。関節炎の症状は、IBDを有する全ての人々の1/4に起こる。関節炎は、結腸が、疾患プロセスに関与した場合に最もしばしば起こり、そして腸疾患が最も活性である場合は発赤が拡大する。この炎症性関節炎の形態は、永久的な変形を起こさず、そしてしばしば、短命である。この疾患の他の合併症には、眼の炎症（虹彩炎、結膜炎、および上強膜炎）、口の炎症（粘膜炎）、皮膚炎（結節性紅斑および壊疽性膿皮症）、筋骨格異常（強直性脊椎炎）、腎合併症（腎結石、および尿管への瘻孔形成）、胆石、ならびに他の肝臓疾患（例えば、肝炎）および胆汁系の疾患（硬化性胆管炎）が含まれる。不運なことに、多くの場合、長期（＞10年）の疾患はより重篤な合併症（例えば、結腸ガンおよび腸以外のガン）を導き得る。
【００１２】
現在では、IBDに対する治療は存在しない。現在の治療剤の多くは、この疾患に関連した炎症を抑制することによってこの疾患症状を制御することに焦点をあてている。IBDの処置に使用される主たる薬物には、アミノサリチレートおよびコルチコステロイドであり、これらの薬剤に良好に応答しない個体については、抗生物質および免疫抑制医薬品もまた使用され得る。薬物処置が70から80％の患者に有効であるが、より活性な疾患を有する個体には手術がしばしば必要とされる。小腸の妨害物、穿孔、膿瘍、および出血のような活性な疾患に関連した慢性症状および合併症は軽減され、そして侵襲的手術で矯正され得る。手術は永久的に疾患を治療せず、再発率が高いが、活性症状を軽減する。
【００１３】
（外科的接着）
外科的接着形成、通常別々である身体組織がともに増殖する複雑なプロセスは、手術外傷の結果として最も共通に見られる。これらの手術後接着は、主要な婦人科手術を経験した患者の60〜90％に起こり、そして先進国において腸閉塞の最も一般的な原因の１つである。これらの接着は、失敗した手術治療の主要な原因であり、そして腸閉塞および不妊症の主な原因である。他の接着処置合併症には、慢性骨盤痛、尿道閉塞、および排尿機能不全が含まれる。現在では、手術の４〜５日後に投与される予防的治療が、接着形成を阻害するために使用される。接着予防の種々の様式が研究されており、これには、（１）フィブリン沈着の呼ぶ、（２）局所的組織炎症の低減、および（３）フィブリン沈着の除去が含まれる。フィブリン沈着は、機会的または粘稠性溶液から構成される物理学的バリアの使用により予防される。多くの研究者が接着予防バリアを利用しているが、多くの技術的困難が存在する。炎症は、コルチコステロイドおよび非ステロイド抗炎症剤のような薬物の投与によって低減される。しかし、動物モデルにおけるこれらの薬物の使用による結果は、炎症応答の程度および全身的副作用による用量制限により勇気づけられるものではない。最後に、フィブリン沈着の除去は、タンパク質分解酵素および線維素溶解酵素を使用して研究されている。これらの酵素の臨床使用に可能性のある合併症は、過度の出血の可能性である。
【００１４】
（炎症性肺疾患）
慢性炎症性肺疾患には、例えば、喘息、塵肺症、慢性閉塞肺疾患、鼻ポリープ、および肺線維症が含まれる。代表的には、このような疾患は、侵襲性炎症プロセスおよび影響を受けた組織の肥厚によって特徴付けられる。
【００１５】
例えば、鼻ポリープは、鼻の内層の組織の肥厚によって特徴付けられる。ポリープは、喘息、嚢胞性繊維症、原発性線毛運動不全、および免疫不全のような呼吸性疾患に起こり得る。鼻ポリープは、上気道を含む慢性炎症性プロセスの症状として発達すると考えられる。これらは、アスピリン不耐性の患者の36％、喘息を有する患者の７％、子供の0.1％、そして嚢胞性繊維症の患者の約20％に見られる。鼻ポリープに関連した他の症状は、チャーグ-ストラウス症候群、アレルギー性真菌副鼻腔炎、および線毛運動不全症候群、およびヤングの症候群である。外科的ポリープ切除を行った患者の約40％が再発する（Settipane,Allergy Asthma Proc. 17(5):231-236, 1996）。
【００１６】
鼻ポリープ症の主な症状は、鼻の閉塞およびにおいの感度の妨害である。鼻ポリープ症の医学的処置の目的は、（1）鼻ポリープおよび鼻炎症状を除去すること、（2）鼻呼吸および嗅覚を再確立すること、および（3）再発を予防することである。少数の大きなポリープによる鼻の経路の閉塞は、簡単なポリープ切除によって処置され、患者の、鼻を通しての呼吸を援助し得る。手術の目的は、可能な限りポリープのない気道をつくり、そして感染した副鼻腔炎の排液を可能にすることによる鼻の生理学的特性を復旧することである。しかし、鼻ポリープの再発は、臨床的鼻科学の最も共通した未解決問題の１つである。ポリープの補足的医学的処置は、常に必要であり、手術では粘膜疾患の炎症性成分を処置出来ない。局所的なコルチコステロイドは、ポリープのサイズを減少するため、および手術後の再発を予防するために、最も広範に利用される処置である。ステロイドは、鼻炎を減少し、鼻呼吸を改善し、ポリープのサイズを減少し、そして再発率を減少させ、においの感受性および任意の腔病理学に対して無視できる効果を有する。しかし、プロープにおけるステロイドの使用は、抗生物質を必要とする感染性合併症をともなう。鼻ポリープの処置のための他の薬物には、H1-レセプターアンタゴニスト（例えば、アゼラスチンHCL）および抗利尿薬（例えば、フロセミド）が含まれる。これらの処置は、常に効果的であるというわけではなく、そして再発率は依然として非常に高い。鼻ポリープの現在の医学的処置は、コルチコステロイドを利用し、疾患の症状を緩和するが、この疾患の原因となる病理学に対する作用はない。さらに、この疾患の再発、またはステロイド治療に対する耐性が、鼻ポリープを有する患者に見られる。
【００１７】
（移植片拒絶）
移植片拒絶は複雑なプロセスであり、それにより、移植片組織は宿主免疫系によって外来物として認識される。形態学および基礎となる機構を元に、拒絶反応は３つのカテゴリー：超急性、急性、および慢性に分類される。乾癬の危険性が除去され、そして免疫抑制治療によって初期（急性）拒絶が管理されるとともに、慢性拒絶が、移植片機能不全および最終的な失敗の増加する重要な原因になった。現在、慢性的な血管拒絶は、最初の年後の心臓移植レシピエントにおける死または移植の失敗の主要な原因である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、炎症性疾患を処置または予防するために適した組成物および方法を提供する。これらの組成物および方法は、現存する手順を伴う問題を取り扱い、現存する手順と比較して有意な利点を提供し、そして他の関連した利点をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の要旨）
簡潔に述べると、本発明は、炎症部位に抗微小管剤を送達する工程を包含する、炎症性疾患を処置または予防するための方法を提供する。このような薬剤の化学剤は、タキサン類（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル（docetaxel））、カンポテシン、エレウテロビン（eleutherobin）、サルコジクチン類（sarcodistyin）、エポチロン（epothilone）AおよびB、ジスコデルモリド（discodermolide）、重水（D2O）、ヘキシレングリコール（2-メチル-2,4-ペンタンジオール）、ツベルシジン（7-デアザアデノシン）、LY290181（2-アミノ-4-（3-ピリジル-4H-ナフト（1,2-b）ピラン-3-カルドニトリル）、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-（スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、モノクローナル抗イディオタイプ抗体、微小管アセンブリ促進タンパク質（タキソール様タンパク質、TALP）、高浸透性（190ミリオスモル/L）状態によって誘導される細胞膨張、インスリン（100nmol/L）またはグルタミン（10mmol/L）、ダイニン結合、ジベレリン（gibberelin）、XCHO1（キネシン様タンパク質）、リソホスファチジン酸、リチウムイオン、植物細胞壁成分（例えば、ポリL-リジンおよびエキソテンシン）、グリセロール緩衝液、TritonX-100微小管安定化緩衝液、微小管結関連タンパク質（例えば、MAP2、MAP4、tau、big tau、エンスコンシン、延長因子-1-α（EF-1α）、およびE-MAP-115）、細胞体（例えば、ヒストンH1、ミエリン塩基性タンパク質、および動原体）、内因性微小管構造物（例えば、軸糸構造、プラグ、およびGTPキャップ）、安定な細管のみのポリペプチド（stabletubule only polypeptide）（例えば、STOP145およびSTOP220）、および有糸分裂応力からの張力、ならびに上記のいずれかのアナログおよび誘導体が含まれる。他の実施態様においては、抗微小管剤は、ポリマーをさらに含むように処方される。
【００２０】
処置され得る炎症性疾患の代表的な例には、多発性硬化症、乾癬、関節炎、狭窄、移植片拒絶、外科的接着、炎症性腸疾患、および炎症性肺疾患が含まれる。
【００２１】
本発明の特定の実施態様において、抗微小管剤は、例えば、軟膏、クリーム、ローション、ゲル、スプレーなどのような他の成分または組成物とともに処方され得る。特定の実施態様において、化合物または組成物は、ポリマーまたは非ポリマーのいずれかであり得るキャリアとして機能し得る。ポリマーキャリアの代表的な例には、ポリ（エチレン-ビニルアセテート）、乳酸とグリコール酸とのコポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸）とポリ（カプロラクトン）とのコポリマー、ゼラチン、ヒアルロン酸、コラーゲンマトリックス、およびアルブミンが含まれる。他の適切なキャリアの代表的な例には、エタノール；エタノールおよびグリコールの混合物（例えば、エチレングリコールまたはプロピレングリコール）；エタノールおよびイソプロピルミリステートの混合物、またはエタノール、イソプロピルミリステート、および水（例えば、55:5:40）の混合物；エタノールおよびエイネオールまtはあD-リモネンの混合物（水有りまたは無し）；グリコール（例えば、エチレングリコールまたはプロピレングリコール）ならびにプロピレングリコールおよび水、ホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、Transcutolョのようなグリコール、またはテルピノレンの混合物；イソプロピルミリステートおよび1-ヘキシル-2-ピロリドン、N-ドデシル-2-ピペリジノン、または1-ヘキシル-2-ピロリドンの混合物が含まれる。
【００２２】
さらに他の局面において、抗微小管剤は、例えば、ステント、縫合、留置カテーテル、人工器官などのような外科用または医療用デバイスもしくは移植物によって放出するために、これらの内部に含まれるか、またはこれらに適合されて処方され得る。
【００２３】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面と参照すれば明らかとなる。さらに、より詳細な特定の手順、デバイス、または組成物を記載した種々の参考文献が以下に示され、従って、それらの全体が参考として援用される。
【００２４】
本願発明は、以下の項１−３４を提供する：
１．多発性硬化症を処置または予防するための方法であって、該多発性硬化症が処置または予防されるように、患者に治療有効量の抗微小管剤を投与する工程を包含する方法。
２．前記抗微小管剤が、エポチロンＡまたはＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール、ツベルシジン、LY290181、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-（スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、およびそれらのアナログまたは誘導体からなる群から選択される、項１に記載の方法。
３．前記抗微小管剤がパクリタキセル、またはそのアナログもしくは誘導体である、項１に記載の方法。
４．乾癬を処置または予防するための方法であって、該乾癬が処置または予防されるように、患者に治療有効量の抗微小管剤を投与する工程を包含する、方法。５．前記抗微小管剤が、エポチロンＡまたはＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール、ツベルシジン、LY290181、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-（スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、およびそれらのアナログまたは誘導体からなる群から選択される、項４に記載の方法。
６．前記抗微小管剤が局所的に投与される、項５に記載の方法。
７．関節炎を処置または予防するための方法であって、該関節炎が処置または予防されるように、患者に治療有効量の抗微小管剤を投与する工程を包含し、ただし、該抗微小管剤は、パクリタキセル、またはそのアナログもしくは誘導体ではない、方法。
８．前記抗微小管剤が、エポチロンＡまたはＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール、ツベルシジン、LY290181、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-（スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、およびそれらのアナログまたは誘導体からなる群から選択される、項７に記載の方法。
９．前記抗微小管剤が、全身的または関節内に投与される、項７に記載の方法。１０．狭窄を処置するための方法であって、該狭窄が処置または予防されるように、患者に治療有効量の抗微小管剤を投与する工程を包含し、ただし、該抗微小管剤は、パクリタキセル、またはそのアナログもしくは誘導体ではない、方法。１１．前記抗微小管剤が、エポチロンＡまたはＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール、ツベルシジン、LY290181、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-（スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、およびそれらのアナログまたは誘導体からなる群から選択される、項１０に記載の方法。
１２．前記抗微小管剤が、全身的または血管周辺に投与される、項１０に記載の方法。
１３．前記抗微小管剤が、医療用デバイス上のコーティングとして投与される、項１０に記載の方法。
１４．前記医療用デバイスが、ステント、ステント移植片、血管移植片、または留置カテーテルである、項１３に記載の方法。
１５．前記抗微小管剤が、管腔内デバイスを通じて投与される、項１０に記載の方法。
１６．移植片拒絶を処置するための方法であって、患者に抗微小管剤を投与する工程を包含する、方法。
１７．前記抗微小管剤が、パクリタキセル、エポチロンＡまたはＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール、ツベルシジン、LY290181、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-（スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、およびそれらのアナログまたは誘導体からなる群から選択される、項１６に記載の方法。
１８．外科的接着を処置または予防するための方法であって、該外科的癒着は処置または予防されるように、患者に治療有効量の抗微小管剤を投与する工程を包含し、ただし、該外科的癒着は、パクリタキセル、またはそのアナログもしくは誘導体ではない、方法。
１９．前記抗微小管剤が、エポチロンＡまたはＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール、ツベルシジン、LY290181、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-（スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、およびそれらのアナログまたは誘導体からなる群から選択される、項１８に記載の方法。
２０．炎症性腸疾患を処置するための方法であって、炎症性腸疾患が処置または予防されるように、患者に有効量の抗微小管剤を投与する工程を包含する、方法。
２１．前記微小管剤が、パクリタキセル、エポチロンＡまたはＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール、ツベルシジン、LY290181、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-（スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、およびそれらのアナログまたは誘導体からなる群から選択される、項２０に記載の方法。
２２．慢性炎症性肺疾患を処置または予防するための方法であって、鼻ポリープが、処置または予防されるように、患者に治療有効量の抗微小管剤を投与する工程を包含する、方法。
２３．前記抗微小管剤が、パクリタキセル、エポチロンＡまたはＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール、ツベルシジン、LY290181、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-（スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、およびそれらのアナログまたは誘導体からなる群から選択される、項２０に記載の方法。
２４．前記抗微小管剤が、鼻に投与される、項２２に記載の方法。
２５．前記薬剤が、さらにポリマーを含む、項１、４、６、８、１４、または１６のいずれか１項に記載の方法。
２６．前記ポリマーが、0.5と200μmとの間の平均サイズを有するミクロスフェアに形成されている、項２５に記載の方法。
２７．前記ポリマーが、乳酸およびグリコール酸のコポリマーである、項２５に記載の方法。
２８．前記ポリマーが、ポリ（カプロラクトン）を含む、項２５に記載の方法。２９．前記ポリマーが、ポリ（乳酸）を含む、項２５に記載の方法。
３０．前記ポリマーが、ポリ（乳酸）およびポリ（カプロラクトン）のコポリマーである、項２５に記載の方法。
３１．前記ポリマーが、エチレンビニル酢酸を含む、項２５に記載の方法。
３２．前記ポリマーが、イソプロピルミリステートを含む、項２５に記載の方法。
３３．前記ポリマーが、Transcutolョを含む、項２５に記載の方法。
３４．前記ポリマーが、ジブロックコポリマーまたはトリブロックコポリマーである、項２５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ−Ｂ】図1Aは、好中球（5×106細胞/ml）の血漿オプソニン化CPPD結晶（50mg/ml）に対する化学発光応答を示すグラフである。（白丸）パクリタキセルなし、（黒丸）4.5μM、（白三角）14μM、（黒三角）28μM、（白四角）46μM；n=３におけるパクリタキセル（「タキソール」ともいう）の効果。図1Bは、血漿オプソニン化CPPD結晶誘導好中球化学発光のパクリタキセル阻害の経時的濃度依存性を示すグラフである。
【図１Ｃ−Ｄ】図1Cは、化学発光によって測定された場合の、オプソニン化ザイモザン（zymozan）誘導好中球活性化におけるフッ化アルミニウムの効果を示すグラフである。図1Dは、化学発光によって測定された場合の、オプソニン化ザイモザン誘導好中球活性化におけるグリシンエチルエステルの効果を示すグラフである。
【図１Ｅ】図1Eは、オプソニン化ザイモザン誘導好中球化学発光におけるLY290181の効果を示すグラフである。
【図２】図2は、血漿オプソニン化CPPD結晶（50mg/ml）の応答における好中球（5×106ml）からのリゾチーム放出を示すグラフである。（白丸）パクリタキセルなし、（黒丸）28μM、（白三角）コントロール（細胞単独）、（黒三角）コントロール（細胞および28μMのパクリタキセル）；n=３におけるパクリタキセルの効果。
【図３Ａ−Ｂ】図3Aは、血漿オプソニン化CPPD結晶（50mg/ml）への応答における好中球（5×106細胞/ml）によるスーパーオキシドアニオン産生を示すグラフである。（白丸）パクリタキセルなし、（黒丸）28μM、（白三角）コントロール（細胞単独）；n=３でのパクリタキセルの効果。図3Bは、血漿オプソニン化CPPD結晶誘導好中球スーパーオキシドアニオン産生のパクリタキセル阻害の経時的濃度依存性を示すグラフである。
【図３Ｃ】図3Cは、CPPD結晶誘導好中球スーパーオキシドアニオン産生におけるLY290181の効果を示すグラフである。
【図４】図4Aは、血漿オプソニン化サイモサン（1mg/ml）に対して応答する好中球（5×106細胞/ml）の化学発光応答を示すグラフである。（白丸）パクリタキセルなし、（黒丸）28μM；n=３でのパクリタキセルの効果。図4Bは、血漿オプソニン化サイモサン誘導好中球スーパーオキシドアニオン産生を示すグラフである。（白丸）パクリタキセルなし、（黒丸）28μM、（白三角）コントロール（細胞単独）；n=３でのパクリタキセルの効果。
【図５Ａ−Ｂ】図5Aは、血漿オプソニン化CPPD結晶（50mg/ml）への応答における好中球（5×106細胞/ml）からのミエロペルオキシダーゼ放出を示すグラフである。（白丸）パクリタキセルなし、（黒丸）28μM、（白三角）コントロール（細胞単独）、（黒三角）コントロール（細胞および28μMのパクリタキセル）；n=３でのパクリタキセルの効果。図5Bは、血漿オプソニン化CPPD結晶への応答における好中球からのミエロペルオキシダーゼ放出のパクリタキセル阻害の濃度依存性を示すグラフである；n=３。
【図５Ｃ−Ｄ】図5Cおよび5Dは、LY290181が、CPPD結晶誘導好中球におけるリゾチームおよびミエロペルオキシダーゼの両方を減少させることを示すグラフである。
【図６】図６は、種々の濃度のパクリタキセルでの星状細胞の増殖を示すグラフである。
【図７】図７は、インビトロでのケラチノサイトにおけるパクリタキセルの効果を示すグラフである。
【図８】図8Aおよび8Bは、星状細胞形態学におけるパクリタキセルの効果を示すグラフである。電子顕微鏡画像は、トランスジェニックコントロール動物の星状細胞における、厚く、良好に組織化された線維様の突起を明らかにしたが、一方で、パクリタキセルで処置したトランスジェニック動物は、形態学的に変化した星状細胞を有した。パクリタキセルは、非処置の動物と比較して、星状細胞の円形化、細い細胞の突起、および減少した細胞質線維を誘導した。
【図９】図９は、10-8Mより大きい濃度のパクリタキセルで処置したEOMA細胞の生存率を示すグラフである。
【図１０】図10は、増大した濃度のパクリタキセルで処置した培養物におけるアポトーシスEOMA細胞の割合を示す棒グラフである。
【図１１Ａ−Ｂ】図11 A〜11Eは、24時間後の滑膜細胞における種々の抗微小管剤の効果を示すグラフである。
【図１１Ｃ−Ｄ】図11A〜11Eは、24時間後の滑膜細胞における種々の抗微小管剤の効果を示すグラフである。
【図１１Ｅ】図11A〜11Eは、24時間後の滑膜細胞における種々の抗微小管剤の効果を示すグラフである。
【図１２Ａ】図12A〜12Hは、コラゲナーゼ発現を阻害する種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１２Ｂ】図12A〜12Hは、コラゲナーゼ発現を阻害する種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１２Ｃ】図12A〜12Hは、コラゲナーゼ発現を阻害する種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１２Ｄ】図12A〜12Hは、コラゲナーゼ発現を阻害する種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１２Ｅ】図12A〜12Hは、コラゲナーゼ発現を阻害する種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１２Ｆ】図12A〜12Hは、コラゲナーゼ発現を阻害する種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１２Ｇ】図12A〜12Hは、コラゲナーゼ発現を阻害する種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１２Ｈ】図12A〜12Hは、コラゲナーゼ発現を阻害する種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１３Ａ】図13A〜13Hは、プロテオグリカン発現における種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１３Ｂ】図13A〜13Hは、プロテオグリカン発現における種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１３Ｃ】図13A〜13Hは、プロテオグリカン発現における種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１３Ｄ】図13A〜13Hは、プロテオグリカン発現における種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１３Ｅ】図13A〜13Hは、プロテオグリカン発現における種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１３Ｆ】図13A〜13Hは、プロテオグリカン発現における種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１３Ｇ】図13A〜13Hは、プロテオグリカン発現における種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１３Ｈ】図13A〜13Hは、プロテオグリカン発現における種々の抗微小管剤の効果を示すブロットである。
【図１４Ａ−Ｂ】図14Aおよび14Bは、コントロール（充填されていない）サーモペースト（thermopaste）で処置した腫瘍を有するCAMの２つの写真である。簡潔には、図14Aにおいて、中央の白い塊は腫瘍組織である。全ての方向においてCAMから腫瘍へ多数の血管が侵入していることに留意すること。腫瘍は、「血管形成因子」の産生によって宿主血管の増殖を誘導する。腫瘍組織は血管形成因子を提供する血管に沿って遠位方向に広がる。図14Bは、15Aに示されるCAMの底側の観察である。簡潔には、この観察は車輪のスポークのように腫瘍に侵入する血管の放射状形態を示す。血管密度は、周囲の正常CAM組織においてよりも、腫瘍の近傍で大きいことに留意すること。
【図１４Ｃ−Ｄ】図14Cおよび14Dは、20%のパクリタキセルを充填したサーモペーストで処置した腫瘍を有するCAMの２つの写真である。簡潔には、図14Cにおいて、中央の白い塊は、腫瘍組織である。腫瘍組織の近傍における少数の血管に留意すること。抗微小管剤の持続性放出が、腫瘍によって産生される血管形成刺激を克服し得る。腫瘍自体は、血管新生化に乏しく、そして漸次サイズを減少する。図14Dは、14Cに示されるCAMの底側から撮影され、そしてコントロール腫瘍組織と比較した場合、腫瘍中への血流の妨害を示す。血管密度は腫瘍の近傍において減少し、そして正常の周辺CAM組織の腫瘍よりも空間があることに留意すること。
【図１５】図15Aは、６日目の殻のない卵を示す写真である。図15Bは、生きた、非染色毛細血管の実体顕微鏡で撮影したデジタル化コンピュータディスプレイ画像（1040×）である。図15Cは、より大きな下にある血管によって給餌される絨毛尿膜（chorioallenteicmembrane）（CAM）微小血管を示す腐食キャスティングの写真（矢印；1300×）である。図15Dは、CAMを通って横方向に切断し、そして光学顕微鏡レベルで記録した、0.5mm厚の可塑性セクションを示す写真である。この写真は、外側二重層外胚葉（Ec）、毛細血管（矢印）および散乱した外膜細胞を含む中胚葉（M）、ならびに一重層内胚葉（En）を含む、CAMの組成（400×）を示す。図15Eは、電子顕微鏡レベル（3500×）での写真であり、ここで、代表的な毛細管構造は薄い壁の内皮細胞（矢印の頭）および結合した周皮細胞を表して示される。
【図１６】図16A、16B、16C、および16Dは、10mlのメチルセルロース当たりの10μgパクリタキセルに48時間曝した後に撮影した４つの異なった非染色CAMのデジタル化画像である。パクリタキセルを含む透明なメチルセルロースディスク（*）は、各CAMに上に存在し、そして周辺血液島（Is）とともに１つの無血管性ゾーン（A）上に配置される。これらの無血管性領域は、ディスクを越えて伸長し、そして代表的には約６mmの直径を有する。図16Dは、無血管性ゾーンの周縁から小血管および大血管の両方の代表的な「押し分け（elbowing）」効果（矢印の頭）を示す。
【図１７】図17Aは、有糸分裂に止まった多数の内皮細胞を示す無血管性ゾーンに接した周辺の毛細血管（矢印の頭）を示す写真（=400×）である。外胚葉（Ec）；中胚葉（M）；内胚葉（En）。図17B（=400×）は、無血管性ゾーン内で、固有の代表的な毛細管構造から除去され、そして多数の血管外遊出した血液細胞（矢印の頭）が存在することを示す。図17C（=400×）は、無血管性ゾーンの中央領域において、赤血球細胞が中胚葉中に分散されることを示す。
【図１８】図18Aは（=2,200×）は、有糸分裂（*）が止まった３つの内皮細胞を保有する外胚葉層（Ec）のすぐ下に横たわる小毛細管を示す。外胚葉および中胚葉の両方におけるいくつかの他の細胞型もまた有糸分裂が止まっている。図18B（=2,800×）は、外胚葉の基礎的な血管外遊出した血液細胞を含む初期の無血管性相を示す；これらの血液細胞は、推定の上皮細胞（*）とそれらの突起と混ざり合う。衰退した細胞の液胞（矢印の頭）。図18C（=2,800×）は、パクリタキセルに対する応答において、表面-中胚葉海綿は、密な液胞および顆粒を含む衰退の種々の段階にある細胞が集まるようになる（矢印の頭）。
【図１９Ａ】図19Aは、マトリックス金属プロテアーゼの転写調節を図式的に示す。
【図１９Ｂ】図19Bは、IL-1は、AP-1転写活性を刺激することを示すブロットである。
【図１９Ｃ】図19Cは、IL-1が、パクリタキセルで前処理された軟骨細胞からの溶解物における減少した結合活性を誘導することを示すグラフである。
【図２０】図20は、IL-1誘導が、軟骨細胞におけるRNAレベルにおけるコラゲナーゼおよびストロメライシンを増加させること、およびこの誘導は、パクリタキセルの前処理によって阻害され得ることを示すブロットである。
【図２１】図21は、インビトロでの正常な軟骨細胞の生存率に対するパクリタキセルの効果を示す棒グラフである。
【図２２】図22は、パクリタキセルの観察された偽一次分解速度をプロットするグラフである（37℃で、それぞれ3.7および4.9のpHでの、10％HPβCDおよび10%HPγCD溶液中の20μgml-1）。
【図２３】図23は、37℃でのシクロデキストリンおよびパクリタキセルについての相溶解性を示すグラフである。
【図２４】図24は、37℃での、パクリタキセルおよびγCD、HPβCD、またはHPγCDの複合化の二次プロットである。
【図２５】図25は、PDLLA-PEG-PDLLA組成物の融解湿度、エンタルピー、分子量、多分散性、および固有の粘度を示す表である。
【図２６】図26は、PDLLA-PEG-PDLLAおよびPEGのDSCサーモグラフを示すグラフである。加熱速度は、10℃/分であった。融解温度およびエンタルピーについては、図30を参照のこと。
【図２７】図27は、37℃で、20％パクリタキセルを充填したPDLLA-PEG-PDLLAシリンダーからPBSアルブミン緩衝液へのパクリタキセルの累積的な放出を示すグラフである。エラーバーは、４サンプルの標準偏差を示す。40％PEGのシリンダーを、崩壊のために４日で中断した。
【図２８】図28A、28B、および28Cは、37℃でのパクリタキセルのインビトロ放出の間の20％パクリタキセルを充填したPDLLA-PEG-PDLLAシリンダーの大きさである、長さ（A）、直径（B）、および湿重量（C）における変化を示すグラフである。
【図２９】図29は、37℃でのPBSアルブミン緩衝液中への放出の間のPDLLA-PEG-PDLLAシリンダー（20％パクリタキセルを充填した）の質量損失およびポリマー組成変化を示す表である。
【図３０】図30は、37℃でのPBSアルブミン緩衝液中における放出の間の、20％パクリタキセルを充填したPDLLA-PEG-PDLLAシリンダー（20％PEG、１mm直径）のゲル透過性クロマトグラムを示すグラフである。
【図３１】図31A、31B、31C、および31Dは、パクリタキセル放出の前および放出の間の乾燥したPDLLA-PEG-PDLLAシリンダーのSEMである。A：20％PEG、0日；B：30%PEG、0日；C：20％PEG、69日；D：30％PEG、69日。
【図３２】図32は、37℃での、20％パクリタキセルを充填したPDLLA:PCLブレンドおよびPCLからPBSアルブミン緩衝液へのパクリタキセルの累積放出を示すグラフである。エラーバーは、４サンプルの標準偏差を示す。
【図３３】図33は、37℃で、PCLペーストからPBSへのパクリタキセルの放出を、経時的に示すグラフである。PCLペーストは、メッシュ＃140を使用して調製されたパクリタキセルの微粒子および種々の添加物を含む。エラーバーは、３サンプルの標準偏差を示す。
【図３４】図34は、37℃でのPBSへのパクリタキセル-ゼラチン-PCLペーストからのパクリタキセル放出の時間経過を示すグラフである。このグラフは、ゼラチン濃度（メッシュ＃140）、およびメッシュ＃140またはメッシュ＃60を使用して調製したパクリタキセル-ゼラチン（1：1）微粒子のサイズ効果を示す。エラーバーは、３サンプルの標準偏差を示す。
【図３５】図35Aおよび35Bは、37℃における蒸留水中の懸濁に続く、20％パクリタキセルを含むPCLペーストの膨潤挙動における、添加物（17A；メッシュ＃140）および微粒子のサイズ（17B；メッシュ＃140または＃60）および添加物（メッシュ＃140）の割合の効果を示すグラフである。マトリックスの崩壊のために、パクリタキセル-ゼラチン中に270μm微粒子で調製したペーストおよび30％ゼラチンを含むペーストに対する測定を、４時間後に中断した。エラーバーは、３サンプルの照準偏差を示す。
【図３６】図36A、36B、36C、および36Dは、37℃で６時間、蒸留水中に懸濁する前（36A）および後（36B）のパクリタキセル-ゼラチン-PCL（20:20:60）ペーストの代表的な走査電子顕微鏡写真である。写真36Cおよび36Dは、36Bより高い倍率であり、パクリタキセル（ロッド型）およびゼラチンマトリックスの緊密な結合を示す。
【図３７】図37Aおよび37Bは、パクリタキセル処理CAMにおいて無血管のゾーンを示す、ゼラチン-PCL（37A）およびパクリタキセル-ゼラチン-PCL（20:20:60；37B）ペーストで処理されたCAMの代表的な顕微鏡写真である。
【図３８】図38は、37℃での水中でのシクロデキストリンおよびパクリタキセルの相溶解性を示すグラフである。
【図３９】図39は、37℃でのパクリタキセルおよびγCD、HPβCD、またはHPγCDの複合化の二次プロットを示すグラフである。
【図４０】図40は、37℃でのパクリタキセル、および50：50水：エタノール溶液中のヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンの相溶解性を示すグラフである。
【図４１】図41は、37℃での0、5、10、または20％HPγCD溶液中のパクリタキセルの溶解速度プロファイルを示すグラフである。
【図４２】図42は、37℃、およびそれぞれ3.7および4.9のpHでの、10％HPβCDおよび10％HPγCD溶液中のパクリタキセル（20μg/ml）の、観察された偽一次分解速度をプロットしたグラフである。
【図４３Ａ】図43Aおよび43Bは、それぞれ、EVAフィルムからのパクリタキセルの放出、および経時的に同フィルムに残存するパクリタキセルの割合を示す２つのグラフである。図43Cは、経時的なパクリタキセル無しでのEVA/F127フィルムの膨潤を示すグラフである。図43Dは、経時的なパクリタキセル無しでのEVA/Span80フィルムの膨潤を示すグラフである。図43Eは、種々のEVA/F127ブレンドについてのストレス対応力曲線を示すグラフである。
【図４３Ｂ】図43Aおよび43Bは、それぞれ、EVAフィルムからのパクリタキセルの放出、および経時的に同フィルムに残存するパクリタキセルの割合を示す２つのグラフである。図43Cは、経時的なパクリタキセル無しでのEVA/F127フィルムの膨潤を示すグラフである。図43Dは、経時的なパクリタキセル無しでのEVA/Span80フィルムの膨潤を示すグラフである。図43Eは、種々のEVA/F127ブレンドについてのストレス対応力曲線を示すグラフである。
【図４３Ｃ】図43Aおよび43Bは、それぞれ、EVAフィルムからのパクリタキセルの放出、および経時的に同フィルムに残存するパクリタキセルの割合を示す２つのグラフである。図43Cは、経時的なパクリタキセル無しでのEVA/F127フィルムの膨潤を示すグラフである。図43Dは、経時的なパクリタキセル無しでのEVA/Span80フィルムの膨潤を示すグラフである。図43Eは、種々のEVA/F127ブレンドについてのストレス対応力曲線を示すグラフである。
【図４３Ｄ】図43Aおよび43Bは、それぞれ、EVAフィルムからのパクリタキセルの放出、および経時的に同フィルムに残存するパクリタキセルの割合を示す２つのグラフである。図43Cは、経時的なパクリタキセル無しでのEVA/F127フィルムの膨潤を示すグラフである。図43Dは、経時的なパクリタキセル無しでのEVA/Span80フィルムの膨潤を示すグラフである。図43Eは、種々のEVA/F127ブレンドについてのストレス対応力曲線を示すグラフである。
【図４３Ｅ】図43Aおよび43Bは、それぞれ、EVAフィルムからのパクリタキセルの放出、および経時的に同フィルムに残存するパクリタキセルの割合を示す２つのグラフである。図43Cは、経時的なパクリタキセル無しでのEVA/F127フィルムの膨潤を示すグラフである。図43Dは、経時的なパクリタキセル無しでのEVA/Span80フィルムの膨潤を示すグラフである。図43Eは、種々のEVA/F127ブレンドについてのストレス対応力曲線を示すグラフである。
【図４４】図44は、PCLミクロスフェアに対する0.5mlの細胞（濃度5×106細胞/ml）中の好中球（20mg/ml）ミクロスフェアの化学発光応答における、ポリマー性ミクロスフェアの血漿オプソニン化の効果を示すグラフである。
【図４５】図45は、PCLミクロスフェアに対する好中球（5×106細胞/ml）の化学発光応答におけるプレコーティング血漿+/-2％PluronicF127の効果を示すグラフである。
【図４６】図46は、PMMAミクロスフェアに対する好中球（5×106細胞/ml）の化学発光応答におけるプレコーティング血漿+/-2％PluronicF127の効果を示すグラフである。
【図４７】図47は、PLAミクロスフェアに対する好中球（5×106細胞/ml）の化学発光応答におけるプレコーティング血漿+/-2％Pluronic F127の効果を示すグラフである。
【図４８】図48は、EVA：PLAミクロスフェアに対する好中球（5×106細胞/ml）の化学発光応答におけるプレコーティング血漿+/-2％PluronicF127の効果を示すグラフである。
【図４９】図49は、PCLミクロスフェアに対する好中球の化学発光応答における、プレコーティングIgG（2mg/ml）または2％PluronicF127、次いでIgG（2mg/ml）の効果を示すグラフである。
【図５０】図50は、PMMAミクロスフェアに対する好中球の化学発光応答における、プレコーティングIgG（2mg/ml）または2％PluronicF127、次いでIgG（2mg/ml）の効果を示すグラフである。
【図５１】図51は、PVAミクロスフェアに対する好中球の化学発光応答における、プレコーティングIgG（2mg/ml）、または2％PluronicF127、次いでIgG（2mg/ml）の効果を示すグラフである。
【図５２】図52は、EVA:PLAミクロスフェアに対する好中球の化学発光応答における、プレコーティングIgG（2mg/ml）、または2％PluronicF127、次いでIgG（2mg/ml）の効果を示すグラフである。
【図５３Ａ】図53Aは、37℃での、１％、２％、５％、または10％パクリタキセル含有ポリカプロラクトンミクロスフェアからのリン酸緩衝化生理食塩水への放出速度プロファイルを示すグラフである。
【図５３Ｂ】図53Bは、コントロールミクロスフェアで処理したCAMを示す写真である。図53Cは、5％パクリタキセルを充填したミクロスフェアで処理されたCAMを示す写真である。
【図５４】図54は、コントロールミクロスフェア（PLLA:GA-85:15）の粒子サイズの範囲を示すグラフである。
【図５５】図55は、20％パクリタキセルを充填したミクロスフェア（PLLA:GA-85:15）の粒子サイズの範囲を示すグラフである。
【図５６】図56は、コントロールミクロスフェア（PLLA:GA-85:15）の粒子サイズの範囲を示すグラフである。
【図５７】図57は、20％パクリタキセルを充填したミクロスフェア（PLLA:GA-85:15）の粒子サイズの範囲を示すグラフである。
【図５８】図58A、58B、および58Cは、変化するミクロスフェアのサイズの範囲ならびにPLLAおよびGAの種々の比からの、パクリタキセルの放出速度プロファイルを示すグラフである。
【図５９】図59Aおよび59Bは、 PLLAおよびGAの種々の比での、ミクロスフェアからのパクリタキセルの放出速度プロファイルを示すグラフである。
【図６０】図60Aおよび60Bは、 PLLAおよびGAの種々の比での、ミクロスフェアからのパクリタキセルの放出速度プロファイルを示すグラフである。
【図６１Ａ−Ｂ】図61A、61B、および61Cは、変化するミクロスフェアのサイズならびにPLLAおよびGAの種々の比からの、パクリタキセルの放出速度プロファイルを示すグラフである。
【図６１Ｃ】図61A、61B、および61Cは、変化するミクロスフェアのサイズならびにPLLAおよびGAの種々の比からの、パクリタキセルの放出速度プロファイルを示すグラフである。
【図６２】図62は、パクリタキセルナイロンマイクロカプセルからのパクリタキセル放出を示すグラフである。
【図６３】図63Aおよび63Bは、膀胱組織におけるフィブロネクチンコートPLLAミクロスフェア（63A）、および膀胱組織におけるポリ（L-リジン）ミクロスフェアの写真である。
【図６４】図64は、ミセルのパクリタキセルが、コラーゲン誘導関節炎ラットモデルにおける毎日の平均関節炎スコアを改善することを示すグラフである。
【図６５】図65A〜65Dは、コラーゲン誘導関節炎ラットモデルにおけるミセル性パクリタキセルの効果を示す一連のX線である。
【図６６Ａ−Ｂ】図66A〜66Cは、ラット足首関節の走査電子顕微鏡写真である。
【図６６Ｃ】図66A〜66Cは、ラット足首関節の走査電子顕微鏡写真である。
【図６７】図67は、コラーゲン誘導関節炎ラットモデルにおける組織病理学を示す拡大した観察を示す。
【図６８】図68Aおよび68Bは、コラーゲン誘導関節炎ラットモデルにおける滑膜血管の拡大した観察を示す。
【図６９】図69は、マウスの耳におけるオキサゾロンによる接触過敏性反応の誘導を示すグラフである。抗原チャレンジ時、そして次いで、毎日１回の１％のパクリタキセルゲルまたはビヒクルで処置。皮膚炎は、チャレンジ前の耳の厚さと比較した場合、耳の膨張の測定によって定量した。データは平均値+/-SD（n=5）を示す。**p<0.01；***p<0.001。
【図７０】図70は、マウスの耳におけるオキサゾロンによる接触過敏性反応の誘導を示すグラフである。抗原チャレンジの24時間後に１％のパクリタキセルゲルまたはパクリタキセルビヒクルで最初の処置、そしてその後、毎日１回の処置。皮膚炎は、チャレンジ前の耳の厚さと比較した場合、耳の膨張の測定によって定量した。データは平均値+/-SD（n=5）を示す。*p<0.05；**p<0.01。
【図７１】図71は、PMAの局所適用によるマウスの耳における皮膚炎の誘導を示すグラフである。PMA適用の１時間後に１％のパクリタキセルゲルまたはビヒクルで最初の処置、そしてその後、毎日１回の処置。皮膚炎は、チャレンジ前の耳の厚さと比較した場合、耳の膨張の測定によって定量した。データは平均値+/-SD（n=5）を示す。*p<0.05；***p<0.001。
【図７２】図72は、PMAの局所適用によるマウスの耳における皮膚炎の誘導を示すグラフである。P MA適用の24時間後に１％のパクリタキセルゲルまたはパビヒクルで最初の処置、そしてその後、毎日１回の処置。皮膚炎は、チャレンジ前の耳の厚さと比較した場合、耳の膨張の測定によって定量した。データは平均値+/-SD（n=5）を示す。**p<0.01；***p<0.001。
【図７３】図73は、PMAの局所適用によるマウスの耳における皮膚炎の誘導を示す。１％のパクリタキセルゲル（右耳）またはビヒクル（左耳）での前処置。画像は、PMA適用の48時間後に撮影した。パクリタキセル処置右耳と比較した場合、ビヒクル処置左耳の発赤および拡張した血管に留意すること。同様の結果が合計５匹のマウスにおいて観察された。
【図７４】図74は、DM20トランスジェニックマウスの体重におけるパクリタキセルの効果を示すグラフである。トランスジェニックマウスを毎週３回24日間、ビヒクルまたはパクリタキセル（2.0mg/kg）で処置し、次いで27日目に屠殺した。結果は、パクリタキセルで処置した２匹の動物および１匹の未処置動物についての結果である。パクリタキセル処置動物は、最少の体重減少を示したが、一方、コントロール動物は、29gから22gへ、30％の体重減少を示した。
【図７５】図75は、トランスジェニックマウスにおける臨床症状の進行における高用量間隔的パクリタキセル治療の効果を示すグラフである。トランスジェニックマウスを１週間に１度、４週間（０週、１週、２週、および３週）20mg/kgのパクリタキセルで処置し、そして２週間毎に10週間モニターし、各症状についてスコアを決定した。データは、パクリタキセル処置トランスジェニックマウス（n=5）、およびコントロールマウス（n=3）について、平均スコア（全ての症状について累積）を示す。パクリタキセル処置は、トランスジェニックにおけるDM20の過剰発現によって引き起こされる分解を低減し、その一方、コントロールマウスは、３匹の動物のうちの２匹（実験プロトコールの最後まで生存しなかった）で非常に早く悪化した（示されるように）。
【図７６】図76Aおよび76Bは、ラット心臓動脈モデルにおいて血管周囲に（血管の外膜に）適用されたパクリタキセルペーストを示す。左の総頚動脈の外膜表面を、2.5mgのコントロールペースト（76A）、または20％パクリタキセルを充填した2.5mgのペースト（76B）のいずれかで処置した。コントロール動脈は、平滑筋細胞過剰増殖により、血管壁の厚さの増大を示したが、その一方、パクリタキセルを充填したペーストは、内膜肥厚の形跡を示さなかった。
【図７７】図77Aおよび77Bは、ラット心臓血管モデルにおける血管周囲のパクリタキセルペーストの近接効果を示す。血管周囲領域のすぐ側に適用したパクリタキセルを充填したペーストは再狭窄を防いだ；しかし、ペーストが血管壁に直接接しない場合、新内膜過形成は明らかであった。
【図７８】図78A、78B、および78Cは、星状細胞GFA P染色におけるパクリタキセルの効果を示す。ビヒクルまたはパクリタキセルで処置された正常動物およびトランスジェニック動物（多発性硬化症に類似した神経疾患を発症した動物）由来の脳切片をGFAP（活性化星状細胞のマーカー）で染色し、そして組織学的に試験した。コントロールトランスジェニックマウスにおいて、星状細胞の数が増加し、そして総GFAPレベルを正常脳切片と比較した。しかし、細胞の形態は類似であった。パクリタキセルで処置したトランスジェニックマウスの脳切片は、星状細胞の数から減少し、そしてGFAPレベルを非処置トランスジェニック動物と比較した。組織学的には、細胞の円形化および星状細胞における星状突起の薄さである。
【図７９】図79Aおよび79Bは、パクリタキセルが、ミエリン塩基性タンパク質ペプチド（GP68-88）およびConAに対する応答において、Ｔ細胞刺激を阻害することを示すグラフである。ＲＴ−１のＴ細胞増殖の48時間培養を、刺激剤として、GP68-88（A）またはConA（B）で行った。パクリタキセルおよびそのビヒクル（ミセル）を、抗原刺激の開始時または24時間後に段階的な濃度で添加した。パクリタキセルは、刺激剤とは関係なく、0.02μMほど低い濃度でＴ細胞増殖を阻害した。
【図８０Ａ−Ｂ】図80A、80B、80C、および80Dは、ツベルシジンおよびパクリタキセルが、IL-1活性およびTNF誘導NF-κB活性の両方を阻害することを示すグラフである。
【図８０Ｃ−Ｄ】図80A、80B、80C、および80Dは、ツベルシジンおよびパクリタキセルが、IL-1活性およびTNF誘導NF-κB活性の両方を阻害することを示すグラフである。
【図８１Ａ】図81Aおよび81Bは、クリスタルバイオレット（0 .5％）染色よび492nmでの吸光度による定量によって測定した場合、ヒト前立腺ガン細胞（LNCaP）（２×103細胞／ウェル）の細胞増殖における、パクリタキセルまたはカンプトテシンの増加した濃度の効果を示すグラフである。増殖の割合を、コントロールに対する％および得られた８つの結果の平均として表す。
【図８１Ｂ】図81Aおよび81Bは、クリスタルバイオレット（0.5％）染色よび492nmでの吸光度による定量によって測定した場合、ヒト前立腺ガン細胞（LNCaP）（２×103細胞／ウェル）の細胞増殖における、パクリタキセルまたはカンプトテシンの増加した濃度の効果を示すグラフである。増殖の割合を、コントロールに対する％および得られた８つの結果の平均として表す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明を提示する前に、本明細書中以下で使用される特定の提示された用語の定義を理解することは有用であり得る。
【００２７】
本明細書中で使用される「炎症性疾患」は、血管変化：浮腫および好中球の浸潤（例えば、急性炎症反応）；単核細胞による組織浸潤；炎症性細胞、結合組織細胞、およびそれらの細胞産物による組織破壊；ならびに結合組織補充による修復の試み（例えば、慢性炎症反応）によって特徴付けられる任意の多数の疾患をいう。このような疾患の代表的な例には、関節炎、アテローム性動脈硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、多発性硬化症、外科的接着、再狭窄、結核、移植片拒絶、および慢性炎症性呼吸疾患（例えば、喘息、塵肺症、慢性閉塞肺疾患、鼻ポリープ、および肺線維症）のような多くの一般的な医療状態が含まれる。
【００２８】
「抗微小管剤」は、任意のタンパク質、ペプチド、化学薬品、または例えば、重合の予防または安定化により微小管の機能を損なう他の分子が含まれることが理解されるべきである。広範な種々の方法が、特定化合物の抗微小管活性（例えば、Smithら（Cancer Lett 79(2):213-219, 1994）およびMooberryら、（Cancer
Lett. 96(2):261-266, 1995）によって記載されるアッセイ）を決定するために利用され得る。
【００２９】
上記のように、本発明は、炎症疾患処置または予防するための方法（炎症部位に抗微小管剤を送達する工程を包含する）を提供する。簡潔には、広範な種々の薬剤が、炎症疾患を処置または予防するために、キャリア（例えば、ポリマーまたは軟膏）有りまたは無しのいずれかで、炎症部位（または炎症の潜在的な部位）に送達され得る。このような薬剤の代表的な例には、タキサン類（例えば、パクリタキセル（下記により詳細に記載される）およびドセタキセル）(Schiffら、Nature 277: 665-667, 1979; LongおよびFairchild, CancerResearch 54: 4355-4361, 1994; RingelおよびHorwitz, J. Natl. Cancer Inst. 83(4):288-291, 1991; Pazdurら、Cancer Treat. Rev. 19(4): 351-386, 1993)、カンポテシン、エレンテロビン(例えば、米国特許第5,473,057号)、サルコジクチン類(サルコジクチンＡを含む)、エポチロンＡおよびＢ(Bollagら、CancerResearch 55: 2325-2333, 1995)、ジスコデルモリド(ter Haarら、Biochemislty 35: 243-250,1996)、重水(D20) (JamesおよびLefebvre, Genetics 130(2): 305-314, 1992;Sollottら、J. Clin. Invest. 95: 1869-1876, 1995)、ヘキシレングリコール(2-メチル-2,4-ペンタンジオール)(Okaら、Cell Struct. Funct. 16(2): 125-134,
1991)、ツベルシジン(7-デアザアデノシン) (Mooberryら、CancerLett. 96(2): 261-266, 1995)、LY290181 (2-アミノ-4-(3-ピリジル)-4H-ナフト(1,2-b)ピラン-3-カルドニトリル)(Pandaら、J. Biol. Chem. 272(12): 7681-7687, 1997; Woodら、Mol. Pharmacol. 52(3):437-444, 1997)、フッ化アルミニウム(Songら、J. Cell. Sci.補遺 14: 147-150, 1991)、エチレングリコールビス-(スクシンイミジルスクシネート)(CaplowおよびShanks, J. Biol. Chem. 265(15): 8935-8941, 1990)、グリシンエチルエステル(Mejillanoら、Biochemistry,31(13): 3478-3483, 1992)、モノクローナル抗イディオタイプ抗体(Leuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA91(22): 10690- 10694, 1994)、微小管アセンブリ促進タンパク質(タキソール様タンパク質、TA LP) (Hwangら、Biochem.Biophys. Res. Commun. 208(3): 1174-180, 1995)、低張によって誘導された細胞膨張(190mosmol/L)状態、インスリン(lOOnmol/L)、またはグルタミン(lO mmol/L) (Haussingerら、Biochem. Cell. Biol. 72(1-2): 12-19,1994)、ジネイン結合(Ohbaら、Biochim. Bioplys. Acta 1 158(3): 323-332, 1993)、ジベレリン(MitaおよびShibaoka,Protoplasma 119(1/2): 100-109, 1984)、XCHO1 (キネシン様タンパク質) (Yonetaniら、Mol. Biol.Cell 7(補遺): 211A, 1996)、リソホスファチジン酸(Cookら、Mol. Biol. Cell 6(補遺): 260A, 1995)、リチウムイオン(BhattacharyyaおよびWolff,Biochem. Biophys. Res. Commun. 73(2): 383-390, 1976)、植物細胞壁成分(例えば、ポリ-L-リジンおよびエクステンシン)(Akashiら、Planta 182(3): 363-369, 1990)、グリセロール緩衝液(Schilstraら、Biochem. J. 277(Pt.3): 839-847, 1991; FarrellおよびKeates, Biochem. Cell. Biol. 68(11):
1256-1261, 1990; Lopezら、J. Cell. Biochem.43(3): 281-291, 1990)、Triton X-lOO微小管安定化緩衝液(Brownら、J. Cell Sci, 104(Pt. 2):339-352, 1993; Safiejko-MroczkaおよびBell, J. Histochem. Cytochem. 44(6): 641-656,
1996)、微小管関連タンパク質(例えば、MAP2、MAP4、tau、big tau、エンスコンシン、延長因子-1-α（EF-Iα)およびE-MAP-115)(Burgessら、Cell Motil. Cytoskeleton 20(4): 289-300, 1991; Saoudiら、J. Cell. Sci.108(Pt. 1): 357-367, 1995; BulinskiおよびBossler; J. Cell. Sci. 107(Pt. lO):2839-2849, 1994; Ookataら、J. Cell Biol. 128(5): 849-862, 1995; Boyneら、J. Comp.
Neurol, 358(2): 279-293, 1995; FerreiraおよびCaceres,J. Neurosci. 1l(2): 392-400, 1991; Thurstonら、Chromosoma 105(1): 20-30, 1996;Wangら、Brain Res. Mol, Brain Res. 38(2): 200-208. 1996; Moore aud Cyr. Mol.Biol.
Cell 7(補遺): 221-A, 1996; MassonおよびKreis. J.Cell Biol. 123(2), 357-371, 1993)、細胞体(例えば、ヒストンH1、ミエリン塩基性タンパク質および動原体) (Saoudiら、J.Cell. Sci. 108(Pt. 1): 357-367, 1995; Simerlyら、J. Cell Biol. 111(4): 1491-1504,1990)、内因性微小管構造(例えば、軸糸構造、プラグおよびGTPキャップ) (Dyeら、Cell Motil. Cytoskeleton 21(3):171-186, 1992; AzharおよびMurphy, Cell Motil. Cytoskeleton 15 15(3): 156-161,1990; Walkerら、J. Cell Biol. I14(1): 73-81, 1991; DrechselおよびKirschner, Curr.Biol. 4(12): 1053-1061, 1994)、安定な細管のみのポリペプチド(例えば、 STOP145およびSTOP220)Pirolletら、Biochim.Biophys. Acta I160(1): 113-ll9, 1992; Pirolletら、Biochemistry 31(37): 8849-8855,1992; Boscら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(5): 2125-2130, 1996; Margolisら、EMBOJ.
9(12): 4095-4102, 1990)、および有糸分裂応力からの張力(NicklasおよびWard,J. Cell Biol. 126(5): 1241-l253, 1994)、ならびに任意の上記の任意のアナログおよび誘導体が含まれる。このような化合物は、脱重合化微小管（例えば、コルチシンおよびビンブラスチン）によって、または安定化微小管形成（例えば、パクリタキセル）のいずれかによって作用し得る。
【００３０】
本発明の１つの好ましい実施態様では、治療剤は、チューブリンへ結合することにより微小管形成を破壊して異常な紡錘体を形成する化合物であるパクリタキセルである。簡単には、パクリタキセルは、高度に誘導体化されたジテルペノイドであり（Waniら, J.Am.Chem.Soc.93:2325, 1971）ジテルペノイドは、Taxus brevifolia PacificYew. の採集され乾燥された樹皮、ならびにPacific Yew.のTaxomyces AndreanaeおよびEndophytic Fungus(Stierleら, Science 60:214-216, 1993)から得られている、。「パクリタキセル」プロドラック、アナログ、および誘導体（（例えば、TAXOLョ、TAXOTEREョ、ドセタキセル（Docetaxel）、パクリタキセルの10-デスアセチルアナログ、およびパクリタキセルの3’N-デスベンゾイル-3’N-t-ブトキシカルボニルアナログ）が含まれることが本明細書中で理解されるべきである）は、当業者に公知の技術（例えば、Sciffら、Nature277:665-667,1979;LongおよびFa irchild,Cancer Reseach 54:4355-4361,1994;RingelおよびHorwitz,J.Natl.CancerInst.83(4):288-291,1991;Pazdurら、Cancer Treat.Rev.19(4):351-386,1993;WO94/07882、WO94/07881、WO94/07880、WO94/07876、WO93/23555、WO93/10076、WO94/00156、WO93/24476、EP590267、WO94/20089；米国特許第5,294,637号、同第5,283,253号、同第5,279,949号、同第5,274,137号、同第5,202,448号、同第5,200,534号、同第5,229,529号、同第5,254,580号、同第5,412,092号、同第5,395,850号、同第5,380,751号、同第5,350,866号、同第4,857,653号、同第5,272,171号、同第5,411,984号、同第5,248,796号、同第5,248,796号、同第5,422,364号、同第5,300,638号、同第5,294,637号、同第5,362,831号、同第5,440,056号、同第4,814,470号、同第5,278,324号、同第5,352,805号、同第5,411,984号、同第5,059,699号、同第4,942,184号；TetrahedronLetters 35(52):9709-9712, 1994；J.Med.Chem.35:4230-4237,1992；J.Med.Chem.34:992-998,1991；J.Natural Prod.57(10):1404-1410,1994；J.Natural Prod.57(11):1580-1583, 1994；J.Am.Chem.Soc.110:6558-6560,1988を参照のこと）を利用して容易に調製され得るか、または例えば、Sigma Chemical Co.,St.Louis,Missouri(T7402-Taxus brevifoia由来)を含む、種々の商業的供給源から得られ得る。
【００３１】
このようなパクリタキセル誘導体またはアナログの代表的な例として、7-デオキシ-ドセタキソール、7,8-シクロプロパタキサン、N-置換2-アゼチドン、6,7-エポキシパクリタキセル、6,7修飾パクリタキセル、10-デスアセトキシタキソール、10-デアセチルタキソール（10-デアセチルバカチンIII由来）、タキソールのホスホノオキシおよび炭酸塩誘導体、タキソール2',7-ジ(1,2-ベンゼンジカルボン酸ナトリウム)、10-デスアセトキシ-11,12-ジヒドロタキソール-10,12(18)-ジエン誘導体、10-デスアセトキシタキソール、プロタキソール（2'-および/または7-O-エステル誘導体）、（2'-および/または7-O-炭酸塩誘導体）、タキソール側鎖の不斉合成、フルオロタキソール、9-デオキソタキサン、(13-アセチル-9-デオキソバカチンIII)、9-デオキソタキソール、7-デオキシ-9-デオキソタキソール、10-デスアセトキシ-7-デオキシ-9-デオキソタキソール、水素またはアセチル基ならびにヒドロキシおよびtert-ブトキシカルボニルアミノを含む誘導体、スルホン化2'-アクリロイルタキソールおよびスルホン化2'-O-アシル酸タキソール誘導体、スクシニルタキソール、2'-γ-アミノブチリルタキソールホルメート、2'-アセチルタキソール、7-アセチルタキソール、7-グリシンカルバメートタキソール、2'-OH-7-PEG(5000)カルバメートタキソール、2'-ベンゾイルおよび2'-7-ジベンゾイルタキソール誘導体、他のプロドラック（2'-アセチルタキソール；2',7-ジアセチルタキソール；2'スクシニルタキソール；2'-(β-アラニル)-タキソール；2'γ-アミノ酪酸（butyryl）タキソールホルメート；2'-スクシニルタキソールのエチレングリコール誘導体；2'-グルタリルタキソール；2'-(N,N-ジメチルグルシル)タキソール；2'-[2-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル]タキソール；2'オルトカルボキシベンゾイルタキソール；タキソールの2'脂肪族カルボン酸誘導体、プロドラック｛2'(N,N-ジエチルアミノプロピオニル)タキソール、2'(N,N-ジメチルグリシル)タキソール、7(N,N-ジメチルグリシル)タキソール、2',7-ジ-(N,N-ジメチルグリシル)タキソール、7(N,N-ジエチルアミノプロピオニル)タキソール、2',7-ジ-(N, N-ジエチルアミノプロピオニル)タキソール、2'-(L-グリシル)タキソール、7-(L-グリシル)タキソール、2',7-ジ(L-グリシル)タキソール、2'-(L-アラニル)タキソール、7-(L-アラニル)タキソール、2',7-ジ(L-アラニル)タキソール、2'-(L-ロイシル)タキソール、7-(L-ロイシル)タキソール、2',7-ジ(L-ロイシル)タキソール、2'-(L-イソロイシル)タキソール、7-(L-イソロイシル)タキソール、2',7-ジ(L-イソロイシル)タキソール、2'-(L-バリル)タキソール、7-(L-バリル)タキソール、2',7-ジ(L-バリル)タキソール、2'-(L-フェニルアラニル)タキソール、7-(L-フェニルアラニル)タキソール、2',7-ジ(L-フェニルアラニル)タキソール、2'-(L-プロリル)タキソール、7-(L-プロリル)タキソール、2',7-ジ(L-プロリル)タキソール、2'-(L-リジル)タキソール、7-(L-リジル)タキソール、2',7-ジ(L-リジル)タキソール、2'-(L-グルタミル)タキソール、7-(L-グルタミル)タキソール、2',7-ジ(L-グルタミル)タキソール、2'-(L-アルギニル)タキソール、7-(L-アルギニル)タキソール、2',7-ジ(L-アルギニル)タキソール｝、修飾フェニルイソセリン側鎖を有するタキソールアナログ、タキソテレ（taxotere）、(N-デベンゾイル-N-tert-(ブトキシカルボニル)-10-デアセチルタキソール、ならびにタキサン（���えば、バカチンIII、セファロマンニン、10-デアセチルバカシンIII、ブレビフォリオール、ユナンタクシン、およびタクシン）が挙げられる。
【００３２】
微小管脱重合化剤（または不安定化剤、または崩壊剤）の代表的な例としてノコダゾールが挙げられる（Dingら、J.Exp.Med.171(3):715-727,1990;Dottoiら、J. CellSci.Suppl.15:75-84,1991;Okaら、Cell Struc,Funct.16(2):125-134,1991；Wiemerら、J.Cell.Biol.136(1)71-80,1997）;サイトカラシンB（Illingerら、Biol.Cell 73(2-3):131-138,1991）;ビンブラスチン（Dingら、J.Exp.Med.171(3):715-727,1990;Dirkら、Neurochem.Res.15(11)1135-1139,1990;Illingerら、Biol.Cell73(2-3):131-138,1991;Wiemerら、J.Cell.Biol.136(1):71-80,1997）；ビンクリスチン（Dirkら、Neurochem.Res.15(11)1135-1139;Dingら、J.Exp.Med.171(3)715-727,1990)；コルヒチン（Allenら、Am.J.Physiol.261-(4Pt.1):L315-L321,1991;Dingら、J.Exp.Med.171(3):715-727,1990;Gonzalezら、Exp.Cell.Res.192(1):10-15,1991;Stargellら、Mol.Cell.Biol.12(4):1443-1450,1992);CI980(コルヒチンアナログ）（Garciaら、Anticancer Drugs 6(4):533-544,1995;コルセミド（Barlowら、Cell.Motil.Cytoskeleton19(1):9-17,1991;Meschiniら、J.Microsc.176(Pt.3):204-210,1994;Okaら、CellStruct.Funct.16(2):125-134,1991);ポドフィロトキシン（Dingら、J.Exp.Med.171(3):715-727,1990);ベノミル剤（Hardwickら、J.Cell.Biol.131(3):709-720,1995;Sheroら、GenesDev.5(4):549-560,1991);オリザリン（oryzalin）(Stargellら、Mol.Cell.Biol.12(4):1443-1450,1992);マジュスクラミデC(Majusculamide C)(Mooreら、J.Ind.Microbiol.16(2):134-143,1996);デメコルチン（Van DolahおよびRamsdell,J.Cell.Physiol.166(1):49-56,1996;Wiemerら、J.Cell.Biol.136(1)71-80,1997);ならびにメチル-2-ベンズイミダゾールカルバメート（MBC)(Brownら、J.Cell.Biol.123(2):387-403,1993)。
【００３３】
（処方）
上記のように、本明細書中に記載される治療用抗微小管剤は、種々の様式で処方され得、したがってさらにキャリアーを含み得る。この点において、広範な種々のキャリアーが、ポリマー起源または非ポリマー起源のいずれかから選択され得る。
【００３４】
例えば、本発明の一つの実施態様では、広範な種々のポリマー性キャリアは、上記の１つ以上の治療剤を含みおよび/または送達するように利用され得る（例えば、生分解性および非生分解性の組成物の両方を含む）。生分解性組成物の代表的な例として、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、デンプン、セルロース（メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロール、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）、カゼイン、デキストラン、多糖、フィブリノーゲン、ポリ(D,Lラクチド)、ポリ(D,L-ラクチド-co-グリコリド)、ポリ（グリコリド）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（アルキルカーボネート）、およびポリ（オルトエステル）、ポリエステル、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリジオキサノン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（タルトロン酸(tartronicacid)）、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリ（アミノ酸）およびそれらのコポリマーが挙げられる（一般的には、Illum,L.,Davids,S.S.(編)「制御薬物送達におけるポリマー」Wright,Bristol,1987；Arshady, J.Controlled Release 17:1-22, 1991；Pitt,Int.J.Phar.59:173-196,1990；Hollandら, J.Controlled Release 4:155-0180, 1986を参照のこと）。非生分解性ポリマーの代表的な例として、ポリ（エチレン-ビニルアセテート）（「EVA」）コポリマー、シリコーンゴム、アクリル性ポリマー（ポリアクリル酸、ポリメチルアクリル酸、ポリメチルメタクリレート、ポリアルキルシノアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド（ナイロン6,6）、ポリウレタン、ポリ（エステルウレタン）、ポリ（エーテルウレタン）、ポリ（エステル-ウレア）、ポリエーテル（ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、プルロニック、ポリ（テトラメチレングリコール））、シリコーンゴム、およびビニルポリマー（ポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルアセテートフタレート））が挙げられる。アニオン性（例えば、アルギン酸、カラゲナン、カルボキシメチルセルロース、およびポリ（アクリル酸））またはカチオン性（例えば、キトサン、ポリ-L-リジン、ポリエチレンイミン、およびポリ（アリルアミン））のいずれかであるポリマーもまた開発され得る（一般的には、Dunnら,J.Applied Polymer Sci.50:353-365, 1993；Casconeら, J.Materials Sci.:Materials inMedicine 5:770-774, 1994；Shiraishiら, Biol.Pharm.Bull.16(11):1164-1168, 1993；ThacharodiおよびRao,Int’l J.Pharm.120:115-118,
1995；Miyazakiら, Int’l J.Pharm.118:257-263,1995を参照のこと）。特に好ましいポリマー性キャリアとして、ポリ（エチレン-ビニルアセテート）、ポリ(D,L-乳酸)オリゴマーおよびポリマー、ポリ(L-乳酸)オリゴマーおよびポリマー、ポリ（グリコール酸）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ無水物、ポリ（カプロラクトン）またはポリ（乳酸）のポリエチレングリコールとのコポリマー、ならびにこれらのブレンドが挙げられる。
【００３５】
所望の放出特徴および／または特定の所望の特性を有するポリマー性キャリアが、種々の形態で形成され得る。例えば、ポリマー性キャリアは、特定の誘発事象（例えば、pH）への曝露の際に治療剤を放出するように形成され得る(例えば、Hellerら「化学的に自己調節された薬物送達系」Polymers inMedicine III, Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam, 1988, 175-188頁；Kangら,J.Applied Polymer Sci.48:343-354, 1993；Dongら, J.Controlled Release 19:171-178,1992；DongおよびHoffman, J.Controlled Release 15:141-152, 1991；Kimら, J.ControlledRelease 28:143-152, 1994；Cornejo-Bravoら, J.Controlled Release 33:223-229, 1995；WuおよびLee,Pharm.Res.10(10):1544-1547, 1993；Serresら, Pharm.Res.13(2):196-201, 1996；Peppas「pHおよび温度感受性送達系の基礎」Gurnyら（編）,PulsatileDrug Delivery, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, 1993,41-45頁；Doelker,「セルロース誘導体」,1993, PeppasおよびLanger(編), Biopolymers 1,Springer-Verlag, Berlinを参照のこと)。pH感受性ポリマーの代表的な例として、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体（例えば、ホモポリマー（例えば、ポリ（アミノカルボン酸）；ポリ（アクリル酸）；ポリ（メチルアクリル酸））、このようなホモポリマーのコポリマー、ならびにポリ（アクリル酸）および上記のもののようなアクリルモノマーのコポリマーが挙げられる。他のpH感受性ポリマーとして、多糖（例えば、セルロースアセテートフタレート；ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート；ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート；セルロースアセテートトリメリレート；およびキトサン）が挙げられる。さらに他のpH感受性ポリマーとして、pH感受性ポリマーおよび水溶性ポリマーの任意の混合物が挙げられる。
【００３６】
同様に、温度感受性であるポリマー性キャリアが形成され得る（例えば、Chenら「膣薬物送達のための生体接着性ポリアクリル酸骨格へ融合された温度感受性プルロニックの新規のヒドロゲル」Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.22:167-168,Controlled Release Society, Inc.,1995；Okano, 「時間的な制御薬物送達のための刺激応答性ヒドロゲルの分子設計」Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.22:111-112,Controlled Release Society, Inc.,1995；Joh nstonら, Pharm.Res.9(3):425-433, 1992；Tung,Int’l J.Pharm.107:85-90, 1994；HarshおよびGehrke, J.Controlled Release 17:175-186,1991；Baeら, Pharm.Res.8(4):531-537, 1991；DinarvandおよびD’Emanuele, J.ControlledRelease 36:221-227, 1995；YuおよびGrainger,「新規の熱感受性両親媒性ゲル：ポリN -イソプロピルアクリルアミド-co-アクリル酸ナトリウム-co-n-N-アルキルアクリルアミドネットワーク合成および物理化学的特徴」Dept.ofChemical＆Bioligal Sci.,Oregon Graduate Institute of Science＆Technology,
Beaverton, OR, 820-821頁；ZhouおよびSmid,「結合スターポリマーの物理的ヒドロゲル」PolymerResearch Institute, Dept.of Chemistry, College of Environmental Science andForestry, State Univ.of New York, Syracuse, NY, 822-823頁；Hoffmanら,「刺激応答性ヒドロゲルにおける孔サイズおよび水「構造」の特徴付け」Centerfor Bioengineering, Univ.of Washington, Seattle, WA, 828頁；YuおよびGrainger,「架橋N-イソプロピルアクリルアミドネットワークにおける熱感受性膨張反応：カチオン性、アニオン性、および両親媒性ヒドロゲル」Dept.ofChemical＆Bioligical Sci.,Oregon Graduate Institute of Science＆Technology,Beaverton, OR, 829-830頁；Kimら, Pharm.Res.9(3):283-290,
1992；Baeら, Pharm.Res.8(5):624-628, 1992；Konoら,J.Controlled Release
30:69-75, 1994；Yoshidaら, J.ControlledRelease 32:97-102, 1994；Okanoら, J.Controlled Release 36:125-133, 1995；ChunおよびKim,J.Controlled Release38:39-47, 1996；D’EmanueleおよびDinarvand, Int’lJ.Pharm.118:237-242, 1995；Katonoら, J.Controlled Release 16:215-228, 1991；Hoffman,「生物学的に活性な種を含む熱可逆性ヒドロゲル」Migliaresiら（編）,Polymersin Medicine III, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1988, 161-167頁；Hoffman,「治療薬および診断薬における熱可逆性ポリマーおよびヒドロゲルの適用」ThirdInternational Symposium on Resent Advances in Drug Delivery Systems, Salt LakeCity, UT, 1987年２月24〜27日, 297-305頁；Gutowskaら, J.Controlled Release 22:95-104,1992；PalasisおよびGehrke, J.Controlled Release 18:1-12, 1992；Paavolaら,Pharm.Res.12(12）:1997-2002, 1995を参照のこと)。
【００３７】
熱ゲル化ポリマーおよびそれらのゼラチン温度(LCST(℃))の代表的な例として、ホモポリマー（例えば、ポリ（N-メチル-N-n-ポリアクリルアミド）、19.8；ポリ（N-n-プロピルアクリルアミド）、21.5；ポリ（N-メチル-N-イソプロピルアクリルアミド）、22.3；ポリ（N-n-プロピルメタクリルアミド）、28.0；ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）、30.9；ポリ（N，n-ジエチルアクリルアミド）、32.0；ポリ（N-イソプロピルメタクリルアミド）、44.0；ポリ（N-シクロプロピルアクリルアミド）、45.5；ポリ（N-エチルメチアクリルアミド）、50.0；ポリ（N-メチル-N-エチルアクリルアミド）、56.0；ポリ（N-シクロプロピルメタクリルアミド）、59.0；ポリ（N-エチルアクリルアミド）、72.0が挙げられる。さらに、熱ゲル化ポリマーは、上記のモノマー間でコポリマーを調製することによるか、またはこのようなホモポリマーを他の水溶性ポリマー（例えば、アクリルモノマー（例えば、アクリル酸およびその誘導体（例えば、メチルアクリル酸））、アクリレートおよびその誘導体（例えば、ブチルメタクリレート）、アクリルアミド、およびN-n-ブチルアクリルアミド）とを組み合わせることにより作製され得る。
【００３８】
熱ゲル化ポリマーの他の代表的な例として、セルロースエーテル誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、4 1℃；メチルセルロース、55℃；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、66℃；およびエチルヒドロキシエチルセルロース、ならびにプルロニック（例えば、F-127、10〜15℃；L-122、19℃；L-92、26℃；L-81、20℃；およびL-61、24℃）が挙げられる。
【００３９】
広範な種々の形態（例えば、桿状デバイス、ペレット、スラブ、またはカプセルを含む）が、本発明のポリマー性キャリアにより形成され得る（例えば、Goodellら, Am.J.Hosp.Pharm.43:1454-1461, 1986；Langerら,「ポリマーからの高分子の制御放出」Biomedicalpolymers, Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use,Goldberg,E.P., Nakagim,A（編）Academic Press, 113-137頁, 1980；Rhineら,J.Pharm.Sci.69:265-270, 1980；Brownら, J.Pharm.Sci.72:1181-1185, 1983；およびBawaら,J.Controlled Release 1:259-267, 1985を参照のこと）。治療剤は、ポリマーのマトリックス内で吸蔵により連結され得るか、共有結合により結合され得るか、またはマイクロカプセル内にカプセル化され得る。本発明の特定の好ましい実施態様では、治療組成物は、非カプセル処方物（例えば、ミクロスフェア（サイズがナノメーターからマイクロメーターの範囲）、ペースト、種々のサイズの糸、フィルム、およびスプレー）において提供される。
【００４０】
好ましくは、本発明の治療組成物は、意図される使用に適切な様式で形成される。本発明の特定の局面では、治療組成物は生体適合性であり、そして数日から数ヶ月の期間にわたって１つ以上の治療薬剤を放出すべきである。例えば、７日〜10日の期間にわたって治療剤（例えば、パクリタキセル）の10％、20％、または25％(w/v)を超えて放出する、「急速放出」または「バースト」治療組成物が提供される。このような「急速放出」組成物は、特定の実施態様では、化学療法レベル（適用可能な場合）の所望の薬剤を放出し得るべきである。他の実施態様では、７日〜10日の期間にわたって治療剤の１％(w/v)未満を放出する、「低放出」治療組成物が提供される。さらに、本発明の治療組成物は、好ましくは、数ヶ月間安定であり、そして無菌条件下で生成され、そして維持され得るべきである。
【００４１】
本発明の特定の局面では、治療組成物は、特定の使用に依存して、50nm〜500μmの範囲の任意のサイズで形成され得る。あるいは、このような組成物はまた、フィルムまたはコーティングに凝固する、「スプレー」として容易に適用され得る。このようなスプレーは、例えば、0.1μm〜３μm、10μm〜30μm、および30μm〜100μmを含む、広範な多数のサイズのミクロスフェアから調製され得る。
【００４２】
本発明の治療組成物はまた、種々の「ペースト」またはゲル形態で調製され得る。例えば、本発明の１つの実施態様では、ある温度（例えば、37℃を超える温度（例えば、40℃、45℃、50℃、55℃、または60℃））で液体、そして別の温度（例えば、環境(ambient)体温または37℃より低い任意の温度）で固体または半固体である治療組成物が提供される。このような「熱ペースト」は、本明細書中に提供された開示があれば容易に作製され得る。
【００４３】
本発明のさらに他の局面では、本発明の治療組成物は、フィルムとして形成され得る。好ましくは、このようなフィルムは、一般的に、５、４、３、２、または１mm厚未満、より好ましくは0.75mmまたは0.5mm厚未満、そして最も好ましくは500μm〜100μm厚未満である。このようなフィルムは、好ましくは曲げやすく、良好な引っ張り強さ（例えば、50N/cm2を超える、好ましくは100N/cm2を超える、より好ましくは150または200N/cm2を超える）、良好な接着特性を有し（すなわち、湿ったまたは濡れた表面に容易に接着する）、そして制御された浸透性を有する。
【００４４】
本発明のさらなる局面では、本発明の治療組成物は局所的適応に処方され得る。代表的な例として：エタノール；エタノールおよびグリコールの混合物（例えばエチレングリコール、またはプロピレングリコール）；エタノールおよびイソプロピルミリステート、またはエタノール、イソプロピルミリステートおよび水（例えば55:5:40）；エタノールおよびエイネオール（eineol）の混合物、またはD-リモネン（水を有する、または有さない）；グリコール（例えば、エチレングリコールまたはプロピレングリコール）ならびにプロピレングリコールのようなグリコールと水の混合物、ホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、Transcutolョ、またはテルピノレン（terpinolene);イソプロピルミリステートと1-ヘキシル-2-ピロリドンとの混合物、N-ドデシル-2-ピペリジノン、または1-ヘキシル-2-ピロリドンが挙げられる。また、他の賦形剤（例えば、酸（例えば、オレイン酸、およびリノール酸）、ならびにセッケン（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム））がまた、上記に添加され得る。上記についてのより詳細な記載については、一般に、Hoelgaardら、J.Contr.Rel.2:111,1985;Liuら、Pharm.Res.8:938,1991;Royら、J.Pharm.Sci.83:126,1991;Ogisoら、J.Pharm.Sci.84:482,1995;Sasakiら、J.Pharm.Sci.80:533,1991;Okabeら、J.Contr.Rel.32:243,1994;Yokomizoら、J.Contr.Rel.38:267,1996;Yokomizoら、J.Contr.Rel.42:37,1996;Mondら、J.Contr.Rel.33:72,1994;Michniakら、J.Contr.Rel.32:147、1994；Sasakiら、J.Pharm.Sci.80:533,1991;BakerおよびHadgraft、Pharm.Res.12:993,1995;Jastiら、AAPSProceedings,1996;Leeら、AAPS Proceedings,1996;Ritschelら、SkinPharmacol.4:235,1991;ならびにMcDaidおよびDeasy,Int.J.Pharm.133:71,1996を参照のこと。
【００４５】
本発明の特定の実施態様では、治療組成物はまた、界面活性剤（例えば、プルロニック（例えば、F-127、L-122、L-92、L-81、およびL-61）のようなさらなる成分を含み得る。
【００４６】
本発明のさらなる局面では、疎水性化合物を含みそして放出するように適合されるポリマー性キャリアが提供され、このキャリアは、炭水化物、タンパク質、またはポリペプチドと組み合わせた疎水性化合物を含む。特定の実施態様では、ポリマー性キャリアは、１つ以上の疎水性化合物の領域、ポケット、または顆粒を含む。例えば、本発明の１つの実施態様では、疎水性化合物は、疎水性化合物含むマトリックスに取り込まれ、続いてこのマトリックスはポリマー性キャリアに取り込まれ得る。種々のマトリックス（例えば、炭水化物および多糖（例えば、デンプン、セルロース、デキストラン、メチルセルロース、およびヒアルロン酸）、タンパク質またはポリペプチド（例えば、アルブミン、コラーゲン、およびゼラチン）を含む）はこれに関して利用され得る。代替の実施態様では、疎水性化合物は、疎水性コア内に含まれ得、そしてこのコアは疎水性の殻内に含まれ得る。
【００４７】
本明細書中に記載される治療薬剤を含みおよび／または送達するために同様に利用され得る他のキャリアとして以下が挙げられる：ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン(CserhatiおよびHollo, Int.J.Pharm.108:69-75, 1994)、リポソーム（例えば、Sharmaら,Cancer Res.53:5877-5881，1993；SharmaおよびStraubinger, Pharm.Res.11(60):889-896,1994；WO93/18751；米国特許第5,242,073号を参照のこと）、リポソーム／ゲル（WO94/26254）、ナノカプセル（Bartoliら,J.Microencapsulation7(2):191-197,1990）、ミセル（Alkan-Onyukselら,Pharm.Res.11(2):206-212,1994）、インプラント（Jampelら,Invest.Ophthalm.Vis.Science34(11):3076-3083, 1993；Walterら, Cancer Res.54:22017-2212, 1994）、ナノ粒子（ViolanteおよびLanzafamePAACR）、ナノ粒子−改変（米国特許第5,145,684号）、ナノ粒子（表面改変）（米国特許第5,399,363号）、タキソールエマルジョン／溶液（米国特許第5,407,683号）、ミセル（界面活性剤）（米国特許第5,403,858号）、合成リン脂質化合物（米国特許第4,534,899号）、気体媒介分散（米国特許第5,301,664号）、液体エマルジョン、泡、スプレー、ゲル、ローション、クリーム、軟膏、分散ベシクル、粒子または小滴、固体または液体エアゾール、マイクロエマルジョン（米国特許第5,330,756号）、ポリマー性殻（ナノカプセルおよびマイクロカプセル）（米国特許第5,439,686号）、表面活性剤中のタキソイドベース組成物（米国特許第5,438,072号）、エマルジョン（Tarrら,PharmRes.4:62-165, 1987）、ナノスフェア（Haganら, Proc.Intern.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.22, 1995；Kwonら, Pharm Res.12(2):192-195；Kwonら, PharmRes.10(7):970-974；Yokoyamaら, J.Contr.Rel.32:269-277, 1994；Grefら, Science263:1600-1603, 1994；Bazileら,J.Pharm.Sci.84:493-498, 1994）、およびインプラント（米国特許第4,882,168号）を参照のこと）。
【００４８】
以下により詳細に議論されるように、治療組成物を形成するために本明細書中に記載されるキャリアのうちの１つに必要に応じて取り込まれる本発明の治療剤は、広範な種々の疾患を処置または予防するために調製され、そして利用され得る。
【００４９】
（炎症性疾患の処置または予防）
上記のように、本発明は広範な炎症性疾患の処置方法または予防方法を提供し、この方法は、患者に抗微小管剤を投与する工程を包含する。処置され得る炎症性疾患の代表的な例には、以下が挙げられる。例えば、萎縮性胃炎、炎症性溶血性貧血、移植片拒絶、炎症性好中球減少症、水疱性類天疱瘡、小児脂肪便症、脱髄性神経障害、皮膚筋炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）、多発性硬化症、心筋炎、筋炎、鼻ポリープ、慢性静脈洞炎、尋常性天疱瘡、原発性糸球体腎炎、乾癬、外科的接着、狭窄、または再狭窄、強膜炎、硬皮症、湿疹（アトピー性皮膚炎、刺激性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎が挙げられる）およびI型糖尿病。
【００５０】
炎症性疾患の他の例には、以下が挙げられる、脈管炎（例えば、巨細胞性動脈炎（側鎖動脈炎、高安動脈炎）、結節性多発動脈炎、アレルギー性血管炎、および肉芽種症（チャーグ−ストラウス症候群）、脈管周囲炎重複症候群(polyangitis overlap syndrome)、過敏性血管炎（ヘーノホ−シェーンライン紫斑病）、血清病、薬剤誘導性脈管炎、感染性脈管炎、新生物脈管炎、結合組織障害に関連する脈管炎、補体系の先天性欠損に関連する脈管炎、ヴェーゲナー肉芽種症、川崎病、中枢神経系脈管炎、バーガー病、および全身硬化）；消化管疾患（例えば、膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、原発性硬化胆管炎、特発性を含む任意の原因による良性狭窄症、（例えば、胆管狭窄症、食道狭窄症、十二指腸狭窄症、小腸狭窄症、または結腸狭窄症）；気道疾患（例えば、喘息、過敏性肺炎、石綿症、珪肺、および塵肺の他の形態、慢性気管支炎、および慢性閉塞性気道疾患）；鼻涙管疾患（例えば、特発性を含む全ての狭窄症の原因）；およびエウスタキオ管疾患（例えば、特発性を含む全ての疾患の原因）。
【００５１】
これらの疾患をさらに理解するため、代表的な炎症性疾患をさらに詳細に以下に述べる。
【００５２】
（１．炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬およひ湿疹））
本明細書中に提供される薬剤、組成物、および方法を用いることにより、広範な種々の炎症性皮膚疾患が、容易に処置または予防され得る。例えば、本発明の１つの実施態様においては、炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬または湿疹）は、炎症部位（または、炎症の可能性のある部位）に微小管機能を阻害する薬剤を送達することによって、処置または予防され得る。
【００５３】
簡潔には、皮膚細胞は、通常２つの可能なプログラム（正常な増殖および創傷治癒）をたどるように遺伝的にプログラムされている。正常な増殖パターンにおいては、皮膚細胞は、基底細胞層で産生され、次いで表皮を通過して皮膚表面まで上昇する。死細胞は、健常な皮膚から新しい細胞が産生されるのと同じ速度で剥落される。正常皮膚細胞のターンオーバー時間（すなわち細胞誕生から死までの時間）は、ほぼ28日である。創傷治癒の間、促進された増殖および修復が誘発され、皮膚細胞の迅速なターンオーバー（創傷の置換および修復）を生じさせ、血液の供給が増加し（増殖に関連した増加した代謝性要求を満たすため）、そして炎症を局在化させる。
【００５４】
多くの点で、乾癬は悪化した創傷治癒プロセスに類似している。皮膚細胞が（「ケラチノサイト」と呼ばれる）産生され、２〜４日の短さで皮膚表面に押しやられる。表面の皮膚は、死細胞を十分に早く剥落させ得ず、そして過乗なケラチノサイトが蓄積し、増大した鱗状の病変を形成する。この増殖は、過剰に増殖したケラチノサイトを支持するために必要な栄養を提供するために確立された、真皮中の新しい血管（表皮の下の支持組織）によって支持される。同時に、リンパ球、好中球、およびマクロファージが、組織を侵襲し、炎症、腫脹、および痛みを引き起こし、そしてケラチノサイトの急激な増殖を増加させる増殖因子を潜在的に産生する。これら全ての細胞（ケラチノサイト、血管内皮細胞、および白血球）は、組織分解酵素、または疾患の進行および周辺組織の破壊を助けるタンパク質分解酵素を産生する。
【００５５】
上記で提供された組成物を用いて、炎症性皮膚病変を容易に処置し得る。特に、疾患を処置または予防するために、抗微小管剤を炎症部位（または炎症の潜在的部位）に直接投与する。適切な抗微小管剤は、上記で詳細に議論しており、例えば、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、カンフォテシン（campothecin）、エルーテロビン（eleutherobin）、サルコジクチン（sarcodictyins）、エポシロン（epothilones）ＡおよびＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール（2-メチル-2,4-ペンタンジオール）、ツベルシジン（7-デアザアデノシン）、LY290181（2-アミノ-4-(3-ピリジル)-4H-ナフト(1,2-b)ピラン-3-カルドニトリル）、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-(スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、モノクローナル抗イディオタイプ抗体、微小管アセンブリ促進タンパク質（タキソール様タンパク質、TALP）、低張性（190mosmol/L）条件により誘発される細胞膨張、インスリン（100nmol/L）またはグルタミン（10mmol/L）、ダイニン結合、ジベレリン、XCHO1（キネシン様タンパク質）、リソホスファチジン酸、リチウムイオン、植物細胞壁の構成要素（例えば、ポリ-L-リジンおよびエクステンシン（extensin)）、グリセロール緩衝液、TritonX-100微小管安定化緩衝液、微小管関連タンパク質（例えば、MAP2、MAP4、tau、big tau、エンスコンシン（ensconsin）、延長因子-1-α（EF-1α）およびE-MAP-115）、細胞体（entities）(例えば、ヒストンH1、ミエリン塩基性タンパク質および動原体）、内因性微小管構造（例えば、軸糸構造、プラグ、およびGTPキャップ）、安定な細管のみポリペプチド（例えば、STOP145およびSTOP220）、および有糸分裂力からの張力、ならびに上記のいずれかの任意のアナログおよび誘導体が挙げられる。特定の実施態様において、抗微小管剤は、パクリタキセル、カンフォテシン、またはエポシロン以外の薬剤である。このような薬剤は、特定の実施態様において、ポリマー性キャリアとの組成物として、あるいは上記および下記でより詳細に論じたリポソーム、クリーム、または軟膏の処方物で送達され得る。本発明の好適な実施態様において、薬剤または組成物は、局所的または皮下的投与のいずれかにて送達される。
【００５６】
乾癬の有効な抗微小管治療は以下の少なくとも一つを達成する：皮膚病変の数および重症度の減少、活性な疾患悪化の頻度および持続時間の減少、緩解した時間の長さの増加（すなわち、患者が病状を有さない場合の期間）、ならびに／または関連病状の重症度または持続期間の減少（例えば、関節痛および関節の腫脹、中心骨格痛、腸の病状）。
【００５７】
医療的に、処置は皮膚病変のサイズまたは数の減少を起こし、皮膚病状（患部皮膚の痛み、灼熱感および出血）の減少および／または関連病状（例えば関節の発赤、熱、腫脹、下痢、腹痛）の減少を起こす。病理学的に、抗微小管剤は少なくとも以下のうちの一つを産生する：ケラチノサイト増殖の阻害、皮膚炎症の減少（例えば、以下に対する衝撃によって：誘引性因子、および増殖因子、抗原提示、活性酸素腫の産生ならびにマトリクスメタロプロテイナーゼ）、ならびに皮膚血管形成の阻害。
【００５８】
抗微小管剤は、上記目的を達成するための任意の様式において投与され得るが、好ましい方法には、局所投与および全身投与が挙げられる。局部的な疾患を有する患者は、乾癬病変に直接塗布される局所用パクリタキセルクリーム、軟膏、または緩和薬を投与され得る。例えば、疾患の重症度、および患者の処置への応答に依存して、パクリタキセルを0.01重量％〜10重量％を含む局所クリームが投与され得る。好ましい実施態様においては、パクリタキセルを0.1重量％〜１重量％を含む局所調製物が、乾癬病変に投与される。あるいは、適切な薬学的ビヒクルにおけるパクリタキセルの直接皮内注射が、個々の病変の治療技術に用いられ得る。
【００５９】
広範囲の疾患または真皮外の症状（例えば、乾癬関節炎、ライター症候群、付随する脊椎炎、付随する炎症性腸疾患）を有する患者においては、全身的パクリタキセル処置が投与され得る。例えば、静脈内パクリタキセル処方物での断続的な処置は、治療応答および患者の許容範囲に依存して、10〜75 mg/m2の用量で投与され得る；等価な経口用の調製物もまた、この徴候に適している。他の抗微小管剤は、薬剤の効力および許容量について調整された「パクリタキセル等価物」用量で投与される。
【００６０】
他の状態もまた、局所的抗微小管剤からの利益を受け得、これには以下が含まれる：湿疹の疾患（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹）、免疫水疱性疾患、前悪性上皮性腫瘍、基底細胞悪性腫瘍、扁平上皮癌、角化棘細胞腫（keratocanthoma）、悪性黒色腫およびウイルス性いぼ。パクリタキセルを0.01重量％〜10重量％を含む局所用クリーム、軟膏、または緩和薬がこれらの状態の管理に適切であり得る。
【００６１】
（２．  多発性硬化症）
本発明の他の局面において、抗微小管剤は多発性硬化症の治療および予防に利用され得る。簡潔には、多発性硬化症（MS）は、ヒト中枢神経系の荒廃的な脱髄性疾患である。この病因および病原は未知であるが、遺伝的、免疫学的および環境因子が役割を担っていると考えられる。疾患の経過において、運動機能の喪失を起こす、MS患者の脳における進行性の脱髄がある。ミエリンの喪失に関わる正確な機構は理解されていないが、ミエリン破壊の領域には、星状細胞の増殖および蓄積の増加がある。これらの部位において、マクロファージ様活性、および少なくとも部分的にミエリン鞘の分解の原因である増加したプロテアーゼ活性がある。
【００６２】
抗微小管剤は、疾患を処置または予防するために、炎症部位（または炎症の潜在的部位）に投与され得る。適切な抗微小管剤は、上記で詳細に議論しており、例えば、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、カンフォテシン（campothecin）、エルーテロビン（eleutherobin）、サルコジクチン（sarcodictyins）、エポシロン（epothilones）ＡおよびＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール（2-メチル-2,4-ペンタンジオール）、ツベルシジン（7-デアザアデノシン）、LY290181（2-アミノ-4-(3-ピリジル)-4H-ナフト(1,2-b)ピラン-3-カルボニトリル）、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-(スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、モノクローナル抗イディオタイプ抗体、微小管アセンブリ促進タンパク質（タキソール様タンパク質、TALP）、低張性（190mosmol/L）条件により誘発される細胞膨張、インスリン（100nmol/L）またはグルタミン（10mmol/L）、ダイニン結合、ジベレリン、XCHO1（キネシン様タンパク質）、リソホスファチジン酸、リチウムイオン、植物細胞壁の構成要素（例えば、ポリ-L-リジンおよびエクステンシン（extensin)）、グリセロール緩衝液、TritonX-100微小管安定化緩衝液、微小管関連タンパク質（例えば、MAP2、MAP4、tau、big tau、エンスコンシン（ensconsin）、延長因子-1-α（EF-1α）およびE-MAP-115）、細胞体（entities）(例えば、ヒストンH1、ミエリン塩基性タンパク質および動原体）、内因性微小管構造（例えば、軸糸構造、プラグ、およびGTPキャップ）、安定な細管のみポリペプチド（例えば、STOP145およびSTOP220）、および有糸分裂力からの張力、ならびに上記のいずれかの任意のアナログおよび誘導体が挙げられる。このような薬剤は、特定の実施態様において、ポリマー性キャリアとの組成物として、あるいは上記および下記でより詳細に論じたリポソーム処方物で送達され得る。本発明の特定の実施態様において、薬剤または組成物は、経口的に、静脈内的に、または直接（好適には、超音波、CT、蛍光、MRI、または内視鏡誘導を用いて）、疾患部位に投与され得る。
【００６３】
多発性硬化症の有効な抗微小管治療は、以下の１つ以上を達成する：症状の重度の減少；疾患悪化の持続時間の減少；疾患の緩解期間／症状のない期間の頻度および持続期間の増加；治療した損傷および障害の予防；ならびに／または疾患の慢性的な進行の予防／減弱。臨床的には、これは視覚的な症状（視力喪失、複視）、歩行失調（衰弱、身体中心軸の不安定性、感覚喪失、痙性、反射亢進、機敏さの喪失）、上肢機能不全（衰弱、痙性、感覚喪失）、膀胱機能不全（尿意促進、失禁、排尿躊躇、残尿感）、うつ病、感情不安定、および認識障害の改善となる。病理学的に、この処置は以下の症状を１つ以上減少する、例えば、ミエリン喪失、血液脳関門の機能停止、単核細胞の血管周辺への浸潤、免疫系の異常、神経膠症の瘢痕の形成、および星状細胞の増殖、金属プロテアーゼの産生、伝達速度の障害。
【００６４】
抗微小管剤は、上記の目的を達成するために任意の様式で投与され得る。しかし好ましい投与方法には、静脈内、経口または皮下、筋肉内、あるいは髄腔内注射が挙げられる。抗微小管剤は、疾患の進行、疾患緩解の延長、または活性化された疾患における症状の減少を予防するために長期低容量治療として投与され得る。あるいは、治療剤は「パルス（pulse）」治療として、急性の活性化疾患の緩解を誘導するために、高容量で投与され得る。これらの終点を達成し得る最小用量が用いられ得、そして患者、疾患の重篤度、投与された薬剤の処方、そして投与経路によって変化し得る。例えばパクリタキセルでは、全身長期低用量治療は連続して10mg/m2〜50mg/m2のパクリタキセルが１から４週間毎に治療応答に依存して投与され得る；全身高容量「パルス」治療は、50mg/m2〜250mg/m2で、１〜21日毎に１〜６周期で投与され得る。他の抗微小管剤は薬剤の効力および許容度を調整された等価の用量で投与され得る。
【００６５】
（３．  関節炎）
炎症性関節炎は、特に高齢者の数の増加があげられる先進国において深刻な健康問題である。例えば、炎症性関節炎の１つの形態である、慢性関節リウマチ（RA）は、多システムの長期、再発性、炎症性の原因未知の疾患である。多数の臓器が影響され得るが、RAは基本的に、ときどき影響された関節の破壊、および硬直を引き起こす長期滑膜炎の重篤な形態である（RobbinsPathological Basis of Disease,by R.S.Cotran,V.Kumar,およびS.L.Robbins,W.B.SaundersCo.,1989）。病理学的に、本疾患は、滑膜の著しい肥厚によって特徴付けられる（これは関節領域に拡がる絨毛突起、滑膜細胞内層の多層化（滑膜細胞増殖）、白血球（マクロファージ、リンパ球、形質細胞、およびリンパ濾胞；「炎症性滑膜炎」と呼ばれる）の滑膜の浸潤、ならびに滑膜内における細胞性ネクローシスを伴うフィブリンの沈着を形成する）。このプロセスの結果として形成された組織はパンヌスと呼ばれ、そしてパンヌスは最終的に関節領域を満たすように増殖する。パンヌスは滑膜炎の進行に必要な血管形成のプロセスを介して新規血管の広範なネットワークを発達させる。消化酵素（マトリクスメタロプロテイナーゼ（例えば、コラゲナーゼ、ストロメライシン（stromelysin)))およびパンヌス組織の細胞からの炎症プロセスの他のメディエータ（例えば、過酸化水素、活性酸素、リソソーム酵素、およびアラキドン酸代謝産物）の放出は、軟骨組織の進行性の破壊を導く。パンヌスは、関節軟骨に侵入し、軟骨組織の腐食および断片化を導く。最終的に関与した関節の線維性の強直および最終的には骨性強直を有する軟骨下骨の腐食（erosion）がある。
【００６６】
一般的に、最終的に証明されてはいないが、RAは自己免疫疾患であり、そして多数の異なる関節性刺激が、免疫遺伝学的に感受性の宿主における免疫応答を活性化させると考えられている。外因性感染性因子（エプスタインバー(Ebstein-barr)ウイルス、風疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、マイコプラズマなど）および内因性タンパク質（コラーゲン、プロテオグリカン、改変型免疫グロブリン）の両方は、不適当な宿主免疫応答を引き起こす原因物質として結びつけられている。刺激物質とは関係なく、自己免疫は疾患の進行に役割を担っている。特に、関連抗原は、抗原提示細胞（滑膜中のマクロファージ、または樹状細胞）によって取り込まれ、プロセシングされ、そしてTリンパ球に提示される。T細胞は、細胞性免疫応答を開始し、そしてBリンパ球のプラズマ細胞への増殖、および分化を刺激する。最終結果は、宿主組織に対する過剰な不適切な免疫応答である（例えば、II型コラーゲンに対する抗体、自己IgGのFc部分に対する抗体（「リウマチ因子」と呼ばれる））。これはさらに免疫応答を増強し、そして軟骨組織の破壊を促進する。一旦、このカスケードが開始されると、軟骨細胞破壊の多数のメディエータが慢性関節リウマチの進行の原因となる。
【００６７】
従って、本発明の一つの局面においては、患者に治療的有効量の抗微小管剤を投与する工程を包含する、炎症性関節炎（例えば、慢性関節リウマチ）を処置または予防する方法が提供される。炎症性関節炎には、以下を含む多様な状態が挙げられるが、これらに限定されない。慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、全身性硬化（硬皮症）、混合結合組織病、シェーグレン症候群、硬直性脊椎炎、ベーチェット病、サルコイドーシス、および変形性関節症−これらの全てが顕著な症状として、炎症した、有痛性の関節という特徴を有する。本発明の好ましい実施態様において、抗微小管剤は、関節内注射によって、外科用ペーストとして直接関節に投与され得るか、または別の経路（例えば、全身に、または経口的に）で投与され得る。
【００６８】
適切な抗微小管剤は、上記で詳細に議論しており、例えば、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル（docetaxel））、カンフォテシン（campothecin）、エルーテロビン（eleutherobin）、サルコジクチン（sarcodictyins）、エポシロン（epothilones）ＡおよびＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール（2-メチル-2,4-ペンタンジオール）、ツベルシジン（7-デアザアデノシン）、LY290181（2-アミノ-4-(3-ピリジル)-4H-ナフト(1,2-b)ピラン-3-カルボニトリル）、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-(スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、モノクローナル抗イディオタイプ抗体、微小管アセンブリ促進タンパク質（タキソール様タンパク質、TALP）、低張性（190mosmol/L）条件により誘発される細胞膨張、インスリン（100nmol/L）またはグルタミン（10mmol/L）、ダイニン結合、ジベレリン、XCHO1（キネシン様タンパク質）、リソホスファチジン酸、リチウムイオン、植物細胞壁の構成要素（例えば、ポリ-L-リジンおよびエクステンシン（extensin)）、グリセロール緩衝液、Triton X-100微小管安定化緩衝液、微小管関連タンパク質（例えば、MAP2、MAP4、tau、bigtau、エンスコンシン（ensconsin）、延長因子-1-α（EF-1α）、およびE-MAP-115）、細胞体（entities）(例えば、ヒストンH1、ミエリン塩基性タンパク質および動原体）、内因性微小管構造（例えば、軸糸構造、プラグ、およびGTPキャップ）、安定な細管のみポリペプチド（例えば、STOP145およびSTOP220）、および有糸分裂力からの張力、ならびに上記のいずれかの任意のアナログおよび誘導体が挙げられる。このような薬剤は、特定の実施態様において、ポリマー性キャリアとの組成物として、あるいは上記および下記でより詳細に論じたリポソーム処方物中で送達され得る。特定の抗体に関して、抗微小管剤は、パクリタキセル、カンフォテシン、またはエポシロン以外の薬剤である。
【００６９】
炎症性関節炎のための効果的な抗微小管治療は、以下の１つ以上を達成する：（i）症状（患部関節の疼痛、膨張、および圧痛；朝のこわばり（morningstiffness）、虚弱(weakness)、疲労、食欲不振、体重減少）の重篤度の減少；（ii）疾患の臨床徴候（関節莢膜の肥厚、滑膜肥大、関節の浸出、軟組織の痙縮、可動範囲の減少、強直症、および固定化関節の変形）の重篤度の減少；（iii）疾患（リウマチ性結節、血管炎、肺結節、間質性線維症、心外膜炎、上強膜炎、虹彩炎、Felty症候群、骨粗鬆症）の関節外症状の減少；（iv）疾患の緩解/徴候のない期間の頻度および持続時間の増大；（v）固定化障害（fixedimpairment）および能力障害（disability）の予防；ならびに/または（vi）疾患の慢性的進行の予防/軽減。病理学的には、炎症性関節炎の効果的な抗微小管治療は、以下のうちの少なくとも１つを生成する：（i）炎症性応答の減少、（ii）炎症性サイトカイン（例えば、IL-1、TNFα、FGF、VEGF）の活性の破壊、（iii）滑膜細胞増殖の阻害、（iv）マトリックスメタロプロテイナーゼ活性の遮断、および/または（v）新血管形成の阻害。抗微小管剤は、上記の結果を達成するための最小用量で全身的に（経口的に、静脈内に、または筋肉内注射もしくは皮下注射によって）投与される。わずか少数の患部関節を有する患者、または限定された数の関節においてより顕著な疾患を有する患者については、抗微小管剤は、患部関節に直接注入（関節内注射）され得る。
【００７０】
（４．ステントおよび移植片を含むインプラントおよび外科用または医学的デバイス）
種々のインプラント、外科用デバイスまたはステントが、本明細書中に提供される任意の抗微小管剤でコートされるか、またはそうでなければそれを含有し、そして/または放出するように構築され得る。代表的な例には、心血管デバイス（例えば、移植可能な静脈カテーテル、静脈ポート、トンネル化静脈カテーテル、長期注入ラインまたはポート（肝動脈注入カテーテルを含む）、ペースメーカーワイヤ、移植可能な細動除去器）；神経学的/神経外科的デバイス（例えば、心室腹膜分路、心室心房分路、神経刺激デバイス、椎弓切除後硬膜外線維症を防止するためのデュアルパッチおよびインプラント、連続的くも膜下注入のためのデバイス）；胃腸デバイス（例えば、長期留置カテーテル、栄養管、門脈体静脈分路、腹水のための分路、薬物送達のための腹膜移植物、腹膜透析カテーテル、ヘルニアのための移植可能メッシュ、外科的接着（メッシュを含む）を防止するための懸濁液または固体インプラント）；尿生殖器デバイス（例えば、子宮インプラント（子宮内デバイス(IUD）および子宮内膜肥厚を予防するデバイスを含む）、ファロピウス管インプラント（可逆性滅菌デバイスを含む）、ファロピウス管ステント、人工括約筋、尿失禁のための尿道周囲インプラント、子宮ステント、長期留置カテーテル、膀胱増大、または精管吻合のためのラップ（wrap）または副子）；眼科インプラント（例えば、血管新生緑内障のためのマルチノ（multino）インプラントおよび他のインプラント、翼状片のための薬物溶出コンタクトレンズ、失敗した涙嚢鼻腔吻合術のための副子、角膜新血管形成のための薬物溶出コンタクトレンズ、糖尿病性網膜症のためのインプラント、高リスク角膜移植のための薬物溶出コンタクトレンズ）；耳鼻咽喉科デバイス（例えば、耳小骨インプラント、トランステンパニック（transtempanic）排出の代わりとしての膠状耳もしくは慢性耳炎のためのEusrachian管副子もしくはステント）；形成外科インプラント（例えば、胸下もしくは腺下アプローチもしくは乳房切除術後におけるゲルまたは生理食塩水含有乳房インプラント、または顎インプラントに応答する繊維質の痙縮の予防）、ならびに整形外科インプラント（例えば、セメント化整形外科プロステーシス）が含まれる。
【００７１】
適切な抗微小管剤は、上記に詳細に議論され、そして例えば、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル（docetaxel))、カンポテシン（campothecin)、エレウテロビン（eleutherobin)、サルコジクチン（sarcodictyin)、エポチロン（epothilone）ＡおよびＢ、ディスコデルモリド（discodermolide)、重水（D2O）、ヘキシレングリコール(2-メチル-2,4-ペンタンジオール）、ツベルシジン(tubercidin)（7-デアザアデノシン）、LY290181(2-アミノ-4-(3-ピリジル)-4H-ナフト(1,2,-b)ピラン-3-カルドニトリル）、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-(スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、モノクローナル抗イディオタイプ抗体、微小管凝集促進タンパク質（タキソール様タンパク質、TALP）、低張（190mosmol/L）条件によって誘導される細胞膨張、インスリン（100nmol/L）、またはグルタミン（10mmol/L）、ダイニン結合、ジベレリン、XCHO1（キネシン様タンパク質）、リゾホスファチジン酸、リチウムイオン、植物細胞壁成分（例えば、ポリ-L-リジンおよびエクステンシン（extensin)、グリセロール緩衝液、TritonX-100微小管安定化緩衝液、微小管関連タンパク質（例えば、MAP2、MAP4、tau、big tau、エンスコンシン、延長因子１α(EF-1α）、およびE-MAP-115）、細胞体（例えば、ヒストンH1、ミエリン塩基性タンパク質、および動原体）、内因性微小管構造（例えば、軸糸構造、プラグ、およびGTPキャップ）、安定な細管のみポリぺプチド（例えば、STOP145およびSTOP220）、および有糸分裂応力からの張力、ならびに上記の任意のもののアナログおよび誘導体。このような因子は、特定の実施態様において、上記および以下での両方でより詳細に記載されるように、組成物として、ポリマー性キャリアとともに、またはリポソーム処方物中で送達され得る。特定の実施態様（例えば、ステントの場合）において、抗微小管剤は、パクリタキセル、カンポテシン、またはエポチロン以外の薬剤である。
【００７２】
インプラントおよび他の外科的または医学的デバイスは、本発明の抗微小管組成物または抗微小管剤で、例えば、以下を含む種々の様式：（a）インプラントまたはデバイスに、抗微小管剤または組成物を、（例えば、インプラントまたはデバイスをポリマー/薬物フィルムでスプレーすることにより、またはポリマー/薬物溶液中にインプラントもしくはデバイスを浸けることにより、または他の共有結合もしくは非共有結合手段によりのいずれかで）直接固定することによって；（b）インプラントもしくはデバイスを基質（例えば、抗微小管組成物（または上記の抗微小管剤）を吸着するヒドロゲル）で被覆することによって；（c）抗微小管組成物で被覆した縫合糸（または、縫合糸へと成形されたポリマー自体）をインプラントもしくはデバイスに織り合わせることによって；（d）インプラントもしくはデバイスを抗微小管組成物から構成されるかもしくは被覆されたスリーブまたはメッシュに挿入することによって；（e）インプラントもしくはデバイス自体を抗微小管剤もしくは組成物で構築することによって；または（f）そうでなければインプラントもしくはデバイスが抗微小管剤を放出するように適合させることによって、被覆され得る。本発明の好ましい実施態様において、組成物は保存の間および挿入の時点で、インプラントまたはデバイスにしっかりと接着しているべきである。抗微小管剤または組成物はまた、好ましくは、保存の間、挿入の前、または（必要な場合）体内に挿入された後に体温まで温められた場合に、分解すべきではない。さらに、好ましくは、インプラントもしくはデバイスを、抗微小管剤を均一に分布して、一方でステントの輪郭を変化させないで、滑らかかつ均等に被覆すべきである。本発明の好ましい実施態様において、抗微小管剤または組成物は、一旦それが配置されたならば、抗微小管剤の、インプラントまたはデバイスの周りの組織への均一な、予測可能な、延長した放出を提供すべきである。血管ステントについて、上記の特性に加えて、組成物は、ステントを血栓形成性にする（血液凝固が形成されるようにする）べきではなく、または血流において（ステント自体が被覆されていない場合に引き起こすと予想されるよりも）有意な乱流を生じるべきではない。
【００７３】
ステントの場合には、広範な種々のステントが、以下を含む本明細書中に提供される抗微小管剤：食道ステント、胃腸管ステント、血管ステント、胆管ステント、結腸ステント、膵臓ステント、尿管および尿道ステント、流涙ステント、Eustachian管ステント、ファロピウス管ステント、ならびに気管/気管支ステントを含有および/または放出するように開発され得る。ステントは、市販の供給源から容易に得られるか、または周知の技術に従って構築され得る。ステントの代表的な例には、「HydrogelAdhesive」と題された米国特許第4,768,523号；「Expandable Intraluminal Graft, and Method andApparatus for Implanting and
Expandable Intraluminal Graft」と題された米国特許第4,776,337号；「EndovascularStent and Delivery System」と題された米国特許第5,041,126号；「Indwelling Stent and Method ofUse」と題された米国特許第5,052,998号；「Self-Expanding Prosthesis Having Stable Axial Length」と題された米国特許第5,064,435号；「Water-insolublePolysaccharide Hydrogel Foam for Medical Applications」と題された米国特許第5,089,606号；「NitinolStent for Hollow
Body Conduits」と題された米国特許第5,147,370号；「IndwellingStent」と題された米国特許第5,176,626号；「Biodegradable Polymeric Endoluminal Sealing Process」と題された米国特許第5,213,580号；および「Methodand Apparatus for Treatment of Focal Disease in Hollow Tubular Organs and OtherTissue Lumens」と題された米国特許第5,328,471号に記載されるものが含まれる。
【００７４】
本発明の他の局面において、身体通路の管腔を拡張するための方法であって、上記通路を拡張するように上記通路にステントを挿入する工程を包含し、ここで上記ステントが一般に管状構造を有し、上記構造の表面が、抗微小管組成物（または、抗微小管剤単独）で被覆（またはそうでなければ放出するように適合され）ている、方法が提供される。種々の実施態様が以下に記載され、ここで身体通路の管腔は、胆管の、胃腸管の、食道の、気管/気管支の、尿道の、または血管の障害を排除するために拡張されている。
【００７５】
一般に、ステントは、処置される部位または疾患に関わらず、類似の様式で挿入される。簡単には、予挿入検査、通常は診断画像化手順、内視鏡検査、または手術の時点での直接的可視化が、ステント挿入の適切な位置を決定するために一般にまず行われる。次いで、ガイドワイヤが、病変または挿入の予定の位置に先行され、そしてこれを通じて、ステントがその潰れた形態で挿入されることを可能にする送達カテーテルが通される。代表的には、ステントは、それらが小さな腔を通して小さなカテーテルによって挿入され、次いで一旦それらが所望の位置に到達したら、より大きい直径に拡張し得るように、圧縮され得る。一旦拡張されると、ステントは物理的には通路の壁を押し広げ、そしてそれを開けたままに保持する。このようにして、それらは小さな開口を介して挿入し得、そしてなお大きな直径の腔または通路を開けたままにすることができる。ステントは、自己拡張的（例えば、WallstentおよびGianturcoステント）、バルーン拡張性（例えば、PalmazステントおよびStreckerステント）であり得、または温度変化によって移植され得る（例えば、Nitinolステント）。
【００７６】
ステントは、代表的には、ステントを正確に処置されるべき器官の近くに配置するように特に注意しながら、放射線学的制御または直接可視の制御の下で操作されて配置される。次いで、送達カテーテルは除去され、足場としてステントをそれ自体で静置しているようにする。挿入後の検査（通常はＸ線）が、しばしば適切に位置されたことを確認するために使用される。
【００７７】
本発明の好ましい実施態様において、胆管の障害を排除するための方法であって、胆管ステントを胆管通路に挿入する工程を包含する方法が提供される。ここで、上記ステントは、一般に管状構造を有し、上記構造の表面は、胆管の障害が排除されるように、上記の薬剤または組成物で被覆（またはそうでなければ上記の薬剤または組成物を放出されるように適合）されている。簡単には、一般的な胆管の腫瘍の過増殖は、生命とは適合し得ない進行性の胆汁鬱滞性の黄疸を生じる。一般には、肝臓から十二指腸へ胆汁を排出する胆管システムは、（１）胆管細胞（胆管癌）から構成される腫瘍、（２）胆管を侵襲する腫瘍（例えば、膵癌）、または（３）外因的な圧力を発揮し、そして胆管を圧縮する腫瘍（拡張したリンパ節）によって最もしばしば妨害される。
【００７８】
原発性胆管腫瘍、および胆管樹(biliary tree)の圧迫を引き起こす他の腫瘍は共に、本明細書において記載されるステントを利用して処置され得る。原発性胆管腫瘍の１つの例は、腺ガン(これは、総肝管の分岐に見出される場合、Klatskin腫瘍とも呼ばれる)である。これらの腫瘍はまた、胆管ガン、総胆管肝管ガン(choledocholangiocarcinomas)、または胆管系の腺ガンとも呼ばれる。胆管に影響を及ぼす良性腫瘍(例えば、胆管系の腺腫)、ならびに希な症例において胆管の扁平上皮ガンおよび胆嚢の腺ガンもまた、胆管樹の圧迫を引き起こし得、したがって胆管閉塞を生じる。
【００７９】
胆管樹の圧迫は、最も一般的には、胆管を圧縮し、したがってこれを閉塞する、肝臓および膵臓の腫瘍に起因する。膵臓由来の腫瘍のほとんどが、膵管の細胞から生じる。これは、高度に致命的な形態のガン(すべてのガンによる死亡の５％；米国において、１年あたり26,000の新たな症例)であり、平均生存期間は６ヶ月であり、１年後の生存率はわずかに10％である。これらの腫瘍が、膵頭に位置する場合、これらは頻繁に胆管閉塞を引き起こし、そしてこれは、患者のクオリティーオブライフを著しく損なう。すべてのタイプの膵臓腫瘍が、一般に、「膵臓ガン」と呼ばれるが、腺ガン、腺扁平上皮ガン、嚢胞腺ガン、および腺房細胞ガンを含む組織学的なサブタイプが存在する。上記のような肝臓腫瘍もまた、胆管樹の圧迫を引き起こし、したがって胆管の閉塞を引き起こし得る。
【００８０】
本発明の１つの実施態様において、いくつかの方法のうちの１つで、胆ステントは胆の小路にまず挿入される。いくつかの方法とは、すなわち、注射針を腹壁および肝臓を通して挿入することによって上端から(経皮経肝胆管造影または「PTC」)；口、胃および十二指腸を通じて挿入した内視鏡を介して胆管にカニューレーションすることによって下端から(内視鏡的逆行性胆道造影または「ERCP」)；または外科的手順の間の直接切開によるものである。予備挿入検査、PTC、ERCP、または手術時の直接視覚化は、一般に、ステント挿入に適切な位置を決定するために実施されるべきである。次いで、ガイドワイアは、病変を通じて進められ、そしてステントがしぼんだ形態で挿入され得るように、これを越えて送達カテーテルを通す。診断検査がPTCである場合、ガイドワイアおよび送達カテーテルは、腹壁を介して挿入される。他方、元の検査がERCPである場合、ステントは口を介して配置され得る。次いで、ステントは、それが胆管中で狭窄部を横切って正確に配置されるように特別の注意を払って放射線学的、内視鏡的、または直接視覚的制御下で配置される。次いで、送達カテーテルは、ステントを、胆管開口を維持する足場としての状態にしたままで、取り出される。ステントが適切な位置にあることを実証するために、さらなる胆管造影が実施され得る。
【００８１】
本発明のなお別の実施態様において、食道閉塞を排除するための方法が提供され、この方法は、食道閉塞が排除されるように、食道ステントを食道に挿入する工程を包含し、このステントはほぼ管状構造を有し、この構造の表面は、抗微小管剤または上記の組成物でコーティングされている(または、そうでなければ、これを放出するように適合されている)。簡潔には、食道は、食物および液体を口から胃まで輸送する中空の管である。食道ガンまたは隣接する器官に生じたガン(例えば、胃ガンまたは肺ガン)による侵襲は、食物も唾液も嚥下を不可能にする。この実施態様において、予備挿入検査(通常はバリウム嚥下または内視鏡観察)は、一般に、ステント挿入に適切な位置を決定するために、実施されるべきである。次いで、カテーテルまたは内視鏡は、口を通して配置され得、そしてガイドワイアが障害を通って進められる。ステント送達カテーテルは、放射線学的または内視鏡的制御下で、ガイドワイア上を通過させられ、そしてステントは、食道中の狭窄部を横切って正確に配置される。挿入後検査(通常、バリウム嚥下、Ｘ線)が、適切な位置を確認するために利用され得る。
【００８２】
本発明の他の実施態様において、結腸閉塞を排除するための方法が提供され、この方法は、結腸閉塞が排除されるように、結腸ステントを結腸に挿入する工程を包含し、このステントがほぼ管状の構造を有し、この構造の表面は、抗微小管剤または上記の組成物でコーティングされている(または、そうでなければ、これを放出するように適合されている)。簡潔には、結腸は、消化された食物および排泄物を、小腸から肛門まで輸送する中空の管である。直腸および/または結腸ガン、または隣接する器官に生じたガン(例えば、子宮、卵巣、膀胱ガン)による侵襲は、腸からの便の排泄を不可能にする。本発明の実施態様において、予備挿入検査(通常、バリウム浣腸または結腸内視鏡検査)は、一般に、ステント挿入に適切な位置を決定するために、実施されるべきである。次いで、カテーテルまたは内視鏡は肛門を通じて配置され、そしてガイドワイアは、障害を通って進められる。ステント送達カテーテルは、放射線学的または内視鏡的制御下でガイドワイア上を通過させられ、そしてステントは、結腸または直腸の狭窄部を横切って正確に配置される。挿入後検査(通常、バリウム浣腸、Ｘ線)が、適切な位置を確認するために利用され得る。
【００８３】
本発明の他の実施態様において、気管/気管支閉塞を排除するための方法が提供され、この方法は、気管/気管支閉塞が排除されるように、気管/気管支ステントを気管または気管支に挿入する工程を包含し、このステントがほぼ管状の構造を有し、この構造の表面は、抗微小管剤または上記の組成物でコーティングされている(または、そうでなければ、これを放出するように適合されている)。簡潔には、気管および気管支は、空気を口および鼻から肺まで運ぶ管である。ガンによる気管の妨害、隣接する器官に生じたガン(例えば、肺ガン)による侵襲、または軟骨軟化(軟骨環の弱体化)に起因する気管もしくは気管支の虚脱は、呼吸を不可能にする。本発明の実施態様において、予備挿入検査(通常は内視鏡検査)は、一般に、ステント挿入に適切な位置を決定するために、実施されるべきである。次いで、カテーテルまたは内視鏡は、口を通じて配置され、そしてガイドワイアが障害を通って進められる。次いで、送達カテーテルは、しぼんだステントの挿入が可能になるように、ガイドワイア上を通過させられる。ステントは、それが狭窄部を横切って正確に配置されるように、放射線学的または内視鏡的制御下で配置される。次いで、送達カテーテルが、ステントを、それ自体の上に足場として残して取り出され得る。挿入後検査(通常は、気管支鏡検査)が、適切な位置を確認するために利用され得る。
【００８４】
本発明の別の実施態様において、尿道閉塞を排除するための方法が提供され、この方法は、尿道閉塞が排除されるように、尿道ステントを尿道に挿入する工程を包含し、このステントがほぼ管状の構造を有し、この構造の表面は、抗微小管剤または上記の組成物でコーティングされている(または、そうでなければ、これを放出するように適合されている)。簡潔には、尿道は、膀胱から陰茎を通じて排水する管である。尿道は前立腺を通過するので前立腺肥大に起因する尿道の外因性狭窄は、60歳を越えた実質的にすべての男性に生じ、徐々に排尿困難を引き起こす。本実施態様において、予備挿入検査(通常は内視鏡検査または尿道写真)は、一般に、ステント挿入に適切な位置を決定するために、まず実施されるべきである。適切な位置は、下端が外尿道括約筋の上部、そして上端が膀胱頸と同一平面近傍である。次いで、内視鏡またはカテーテルは、陰茎開口部を通じて配置され、そしてガイドワイアが膀胱中に進められる。次いで、送達カテーテルは、ステント挿入を可能とするように、ガイドワイア上を通過させられる。次いで、送達カテーテルが取り出され、ステントが適所で展開される。挿入後検査(通常は、内視鏡検査または逆行性尿道写真)が、適切な位置を確認するために利用され得る。
【００８５】
本発明の別の実施態様において、血管閉塞を排除するための方法が提供され、この方法は、血管閉塞が排除されるように、血管ステントを血管に挿入する工程を包含し、このステントがほぼ管状の構造を有し、この構造の表面は、抗微小管剤または上記の組成物でコーティングされている(または、そうでなければ、これを放出するように適合されている)。簡潔には、ステントは、血管形成に失敗した部位で再発性狭窄（本物）を防止するため、血管形成術で処置した場合に失敗する可能性がある狭窄を処置するため、および手術後の狭窄(例えば、透析移植片狭窄（本物）)を処置するために、種々の配列の血管(動脈および静脈の両方)に配置され得る。適切な部位の代表例には、腸骨、腎、および冠状動脈、上大静脈、および透析移植片が挙げられる。１つの実施態様において、ステントの配置部位を位置決めするために、血管形成術がまず実施される。これは、代表的には、Ｘ線が採用されるので、放射線不透過性造影剤を、動脈または静脈中に挿入されたカテーテルを通じて注射することによって達成される。次いで、カテーテルは、経皮的または外科的のいずれかで、大腿動脈、上腕動脈、大腿静脈、もしくは上腕静脈に挿入され得、そしてＸ線透視ガイダンスの下で、カテーテルを血管系を通じて操縦することによって適切な血管中に進められ得る。次いで、ステントは血管狭窄を横切って配置され得る。挿入後血管造影図はまた、適切な位置を確認するために利用され得る。
【００８６】
狭窄の研究に通常使用される動物モデルは、ラット頸動脈モデルである。ここで、総頸動脈は、外頸動脈を通じて導入したバルーンカテーテルの内腔通過によって内皮を剥離される(Clowesら、Lab. Invest. 49(2) 208-215, 1983)。２週間で、頸動脈は、平滑筋細胞収縮に起因して顕著に狭くなっているが、２〜12週間の間に、中膜は厚さが２倍になり、管腔サイズの減少を導く。
【００８７】
（５．炎症性腸疾患）
本明細書において提供される薬剤、組成物および方法を利用して、腸の広範な種々の炎症性疾患が処置または予防され得る。炎症性腸疾患は、胃腸管が関与する未知の病因の慢性炎症性障害群に対する一般的な用語である。慢性IBDは２群(潰瘍性結腸炎およびクローン病)に分割される。西ヨーロッパおよび米国において、潰瘍性結腸炎は、100,000人あたり６〜８症例の発生率を有する。
【００８８】
この疾患の原因は未知のままであるが、遺伝的要因、感染要因、免疫学的要因および心理学的要因がすべて、原因として提案されている。潰瘍性結腸炎において、表面の潰瘍化を導く、結腸粘膜が関与する炎症性反応が存在する。好中球浸潤が共通し、そして繰り返される炎症性エピソードが結腸の線維症および短縮を導く。長年の潰瘍性結腸炎により、表面の上皮が異形成になり得、そして結局は悪性となり得る。クローン病は、すべての層の腸壁を通じて広がる慢性的な炎症によって特徴付けられる。疾患が進行すると、腸は肥厚し、管腔の狭窄が生じる。粘膜の潰瘍化が生じ、そして潰瘍が粘膜下組織および筋層に浸透し、フィステルおよび裂溝を形成し得る。
【００８９】
抗微小管剤は、いくらかの様式で炎症性腸疾患を処置するために使用され得る。詳細には、抗微小管剤は、疾患を処置するために、炎症部位(または炎症の可能性のある部位)に投与され得る。適切な抗微小管剤は上記で詳細に議論されており、これには、例えば、タキサン(taxane)(例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル)、カンポセシン(campothecin)、エレウセロビン(eleutherobin)、サルコジクチイン(sarcodictyin)、エポチロン(epothilone)ＡおよびＢ、ジスコデルモリド(discodermolide)、重水(D2O)、へキシレングリコール(2-メチル-2,4-ペンタンジオール)、ツベルシジン(tubercidin)(7-デアザアデノシン)、LY290181(2-アミノ-4-(3-ピリジル)-4H-ナフソ(1,2-b)ピラン-3-カルドニトリル)、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-(スクシンイミジルスクシネート)、グリシンエチルエステル、モノクローナル抗イディオタイプ抗体、微小管組立促進タンパク質(タキソール様タンパク質、TALP)、低張(190オスモル/L)条件、インスリン(100nmol/L)またはグルタミン(10mmol/L)によって誘導される細胞腫脹、ダイニン結合、ジベレリン、XCHO1(キネシン様タンパク質)、リゾホスファチド酸、リチウムイオン、植物細胞壁成分(例えば、ポリ-L-リジンおよびエクステンシン(extensin))、グリセロール緩衝液、TritonX-100微小管安定化緩衝液、微小管結合タンパク質(例えば、MAP2、MAP4、tau、big tau、エンスコンシン(ensconsin)、延長因子-1-α(EF-1α)およびE-MAP-115)、細胞性実体(例えば、ヒストンH1、ミエリン塩基性タンパク質および動原体)、内因性微小管構造(例えば、アクソネーム構造、plug、およびGTPキャップ)、stabletubule only polypeptide(例えば、STOP145およびSTOP220)および有糸分裂力由来の緊張、ならびに上記のいずれかのアナログおよび誘導体が含まれる。特定の実施態様内で、このような因子は、ポリマー性キャリアとともに、または上記および下記の両方でより詳細に議論されるリポソーム処方物において、組成物として送達され得る。
【００９０】
IBDの研究のための理想的なモデルは、ヒト疾患と実質的に同一である、天然に生じるかまたは誘導可能な動物疾患であるべきである。現在、わずかに２つの天然に生じる、腸炎症のモデル(共に霊長類種)が存在する。そこでは、原因微生物は見出されていない。第１は、cotton-topタマリンは、同定可能な病原体と関連しない、自発的結腸炎の高い有病率を有し、そしてヒトにおいてと同様に、疾患プロセスの活性が自発的に大きくなったり小さくなったりする(Madaraら、Gastroenterology、88:13-19,1985)。別の自発的慢性結腸炎もまた、幼若アカゲサル(rhesus macaque)において生じる(Adlerら、Gastroenterology,98:A436, 1990)。多くの実験的に誘導される結腸動物モデルがある。マウス、ラット、モルモット、およびウサギにおいて、結腸炎は、硫酸処理した多糖(カラゲナンアミロペクチンスルフェート、硫酸デキストラン)の経口投与(MarcusおよびWatt、Lancet2:489-490, 1969)、化学刺激物(希釈酢酸)の直腸注射(MacPhersonおよびPfeiffer、Digestion 17:135-150,1978)、およびジニトロクロロベンゼン(GlickおよびFalchuk、Gut 22:120-125, 1981)もしくはトリニトロベンゼンスルホン酸(RabinおよびRogers、Gastroenterology75:29-33, 1978)に対する遅延過敏反応により誘導され得る。
【００９１】
IBDについてpathogenomicな特徴も特異的な診断試験もないので、この疾患の管理における抗微小管剤の有効性は臨床的に決定される。IBDに対する効果的な抗微小管治療は、以下のうちの少なくとも１つで達成される：発作の頻度の減少、寛解期で過ごした時間量(すなわち、患者に症状が見られない期間)の増大、および/または関連する症状発現(膿瘍形成、フィステル形成、結腸ガン、腸穿孔、腸閉塞、中毒性巨大結腸、末梢関節炎、強直性脊椎炎、胆石症、硬化性胆管炎、肝硬変、結節性紅斑、虹彩炎、ブドウ膜炎、上強膜炎、静脈血栓症)の重篤度または持続時間の減少。具体的には、血液混じりの下痢、腹痛、発熱、体重減少、直腸出血、テネスムス、および腹部膨満のような症状が減少するか軽減される。
【００９２】
抗微小管剤は、上記の終点を達成するために任意の様式で投与され得るが、好ましい方法は、経口、直腸、または管周投与(好ましくは、超音波、CT、Ｘ線透視、MRI、または内視鏡のガイダンスで；こらはまた、腹部手術と同時に直接投与により達成され得る)を包含する。いくらかの患者において、因子の静脈内、皮下、または筋肉内注射もまた、疾患を処置するために使用され得る。広範囲に及ぶかまたは腸外の症状を有する患者において、全身処置(例えば、経口、静脈内、皮下、筋肉内注射)が適切である。好ましい実施態様において、パクリタキセルは、治療応答および患者の耐性に依存して、１〜４週間毎に、10〜75mg/m2の用量で、経口的に投与され得る。重篤な急性再燃を処置するために、経口的(または静脈内)に与えられる、より高用量の50〜250mg/m2のパクリタキセルが、「パルス」治療として投与され得る。限局された直腸疾患(潰瘍性結腸炎患者の95％において直腸が関与)を有する患者において、局所的パクリタキセルは、直腸クリームまたは坐薬として投与され得る。例えば、0.01重量％〜10重量％パクリタキセルを含有する局所クリームが、疾患の重篤度および患者の治療応答に依存して投与され得る。好ましい実施態様において、0.1重量％〜１重量％のパクリタキセルを含む局所的調製物が、必要に応じて、毎日直腸に投与され得る。周管パクリタキセル(すなわち、腸の外部表面または腸間膜表面への薬物の投与)が活性な疾患を有する腸の領域に投与され得る。好ましい実施態様において、0.5重量％〜20重量％のパクリタキセルが、(実施例に記載のように)ポリマー性キャリア中に充填され、そして所定の期間にわたって薬物を放出する「ペースト」、「フィルム」、または「ラップ」として腸管膜表面に適用される。すべての実施態様において、他の抗微小管剤は、この薬剤の効力および耐性能について調整した等価用量で投与される。
【００９３】
（６．外科的手順）
上記のように、抗微小管剤および組成物は、広範な種々の外科的手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの局面において、(例えば、スプレーまたはフィルムの形態の)抗微小管剤または組成物は、正常な周囲組織を悪性組織から隔離するため、および/または周囲組織への疾患の拡大を予防するために、腫瘍の除去の前に、所定の領域にコーティングするかまたはスプレーするために利用され得る。本発明の他の局面において、(例えば、スプレー形態の)抗微小管剤または組成物は、腫瘍をコーティングするため、または所望の場所で疾患を阻害するために、内視鏡的手順を介して送達され得る。本発明のなお別の局面において、本発明の抗微小管剤または組成物でコーティングされているかまたはこれらを放出するように適合されている外科用メッシュは、外科用メッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの実施態様において、抗微小管組成物を負荷された外科用メッシュは、腹部ガン切除手術(例えば、結腸切除に続く)の間に、その構造に対して支持を提供するため、および所定量の抗微小管剤を放出するために利用され得る。
【００９４】
本発明のさらなる局面において、腫瘍切除部位を処置するための方法が提供され、この方法は、その部位でのガンの局所的再発が阻害されるように、切除に続いて、抗微小管剤または上記のような組成物を、腫瘍の切除縁に投与する工程を包含する。本発明の１つの実施態様において、抗微小管組成物(または抗微小管剤単独)は、腫瘍切除部位に直接投与される(例えば、抗微小管組成物または薬剤を、腫瘍の切除縁に綿棒で塗布するか、ブラシで塗布するか、またはそうでなければコーティングすることによって適用される)。あるいは、抗微小管組成物または薬剤は、投与前に公知の外科用ペースト中に組み込まれ得る。本発明の特に好ましい実施態様においては、抗微小管組成物は、悪性疾患に対する部分的な乳房切除術後、および神経外科手術の後に適用される。
【００９５】
本発明の１つの局面では、抗微小管剤または組成物（上記に記載のような）を、広範な種々の腫瘍（例えば、乳房腫瘍、頭部腫瘍および頸部腫瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍および肝腫瘍を含む）の摘出縁に投与し得る。例えば、本発明の１つの実施態様では、抗微小管剤または組成物を、腫瘍の再発を阻害するように、切除に引き続いて神経性腫瘍の部位に投与し得る。簡潔には、脳は高度に機能的に配置されており；すなわち、特定の解剖学的領域の各々は、特定の機能を実施するように特殊化されている。それゆえ、脳症状の型よりもしばしば重要であるのは脳症状の部位である。重要な領域での比較的小さな病変は、あまり重要ではない領域でのかなり大きな病変よりも、はるかに打撃的であり得る。同様に、脳表面の病変は、外科的に切除することは容易であり得るが、同じ腫瘍でも脳の深部に位置するものは、容易には切除し得ない（そこに到達するためには、あまりにも多くの生命維持に必要な構造を切開しなければならない）。あるいは、良性腫瘍でさえも、いくつかの理由に関しては危険であり得る：それは、重要な領域で増殖し、重大な損傷を引き起こし得る；たとえそれらを外科的切除により治療しても、これは可能ではあり得ない；そして最終的には、検査をしていないものが残っている場合は、頭蓋内圧の上昇を引き起こし得る。頭蓋は、拡張し得ない密閉空間である。それゆえ、ある位置で何かが増殖すると、何か他のものが別の位置に圧迫されなければならない。その結果、頭蓋における圧力が上昇するか、または頭蓋内圧力が上昇する。このような状況は、未処置のまま放置されると、生命維持に必要な構造が圧迫され得、結果として死に終わる。中枢神経系(CNS)悪性腫瘍の発生率は、100,000例につき８〜16例である。原発性悪性脳腫瘍の予後は、陰鬱なものである。外科的切除後でさえも、平均生存率は、１年未満である。これらの腫瘍、特に神経膠腫は、主に、外科的摘出後の疾患の本来の病巣の２cm以内に再発する局所的疾患である。
【００９６】
本明細書中に記載の薬剤、組成物、および方法を利用して治療し得る脳腫瘍の代表的な例には、以下が挙げられる：膠細胞腫瘍（例えば、未分化星状細胞腫、多形の神経膠芽腫、極細胞性(pilocytic)星状細胞腫、乏突起細胞腫、上衣細胞腫、粘液乳頭型脳室上衣細胞腫、上衣下細胞腫（subependymoma）、脈絡叢乳頭腫）；神経腫瘍（例えば、神経芽細胞腫、神経節芽細胞腫、神経節細胞腫、および髄芽腫）；松果体腫瘍（例えば、松果体芽細胞腫およびピネオサイトーマ）；髄膜腫瘍（例えば、髄膜腫、髄膜性血管外皮細胞腫、髄膜肉腫）；神経鞘細胞の腫瘍（例えば、シュワン細胞腫（神経線維鞘腫（neurolemoma））および神経線維腫）；リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫（多数のサブタイプ、原発性および続発性の両方を含む）；先天異常性(malformative)腫瘍（例えば、頭蓋咽頭腫、類表皮嚢胞、類皮嚢胞、および膠質嚢胞）；ならびに転移性腫瘍（これは、実質的に任意の腫瘍に由来し得、最も一般的には、肺腫瘍、乳房腫瘍、黒色腫、腎腫瘍、および胃腸管腫瘍に由来する））
適切な抗微小管剤は、上記で詳細に議論されており、そして例えば、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル（docetaxel））、カンポテリン、エルーテロビン(erutherobin)、サルコジクチイン(sarcodictyins)、エポチロン(epothilone)ＡおよびＢ、ジスコデルモリド、重水(D2O)、ヘキシレングリコール(2-メチル-2,4-ペンタンジオール)、ツベルシジン（7-デアザアデノシン）、LY290181(2-アミノ-4-(3-ピリジル)-4H-ナフト(1,2-b)ピラン-3-カルドニトリル、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-(スクシニルイミジルスクシネート)、グリシンエチルエステル、モノクローナル抗イデオタイプ抗体、微小管アセンブリ促進タンパク質（タキソール様タンパク質、TALP）、低張(190mosmol/L)状態により誘導された細胞膨張、インスリン(100nmol/L)またはグルタミン(10mmol/L)、ダイニン結合、ジベレリン、XCHO1(キネシン様タンパク質)、リソホスファチジン酸、リチウムイオン、植物細胞壁成分(例えば、ポリＬリジンおよびエクステンシン)、グリセロール緩衝液、TritonX-100微小管安定化緩衝液、微小管関連タンパク質(例えば、MAP2、MAP4、tau、big tau、エンスコンシン、延長薬剤-1-α(EF-1α)およびE-MAP-115)、細胞体（例えば、ヒストンH1、ミエリン塩基性タンパク質、および動原体）、内因性微小管構造（例えば、軸糸構造、プラグ、およびGTPキャップ）、ポリペプチドのみの安定な管(stabletubule only polypeptide)(例えば、STOP145およびSTOP220)および有糸分裂力の張力、ならびに上記の任意のアナログおよび誘導体)が挙げられる。このような薬剤は、特定の実施態様において、ポリマー性キャリアとともに、または上記および下記でより詳細に議論されるリポソーム処方物中の組成物として送達され得る。特定の実施態様では、抗微小管剤は、パクリタキセル、カンポテシン、またはエポチロン以外の薬剤である。
【００９７】
（７．外科的癒着）
本発明の別の局面では、抗微小管剤を患者に投与することにより、外科的癒着を処置および/または予防するための方法が提供される。簡潔には、外科的癒着形成は、通常は別々である体組織がともに増殖する複雑なプロセスである。これらの手術後癒着は、主要な婦人科的手術を受ける患者の60％から90％に生じる。組織乾燥、虚血、熱性障害、感染または異物の存在の結果として、外科的外傷は、組織癒着形成のための刺激として長い間認識されてきた。これらの癒着は、失敗した外科的治療の主要な原因である。そして、腸閉塞および不妊の主要な原因である。他の癒着を処置された合併症には、慢性骨盤痛、尿道閉塞、および排尿機能障害が挙げられる。
【００９８】
一般的に、癒着形成は、脈管透過性の上昇、およびフィブリノーゲン流入およびフィブリン堆積を生じるような因子が放出される炎症性反応である。この堆積は、隣接の組織を架橋するマトリクスを形成する。線維芽細胞は蓄積して、マトリクスに付着し、コラーゲンを沈着し、そして血管新生を誘導する。この事象のカスケードが、外科手術後４〜５日以内に予防され得る場合、次いで、癒着形成が阻害される。
【００９９】
従って、上記のように、本発明は、外科的癒着を処置および/または予防するための方法を提供する。広範の種々の動物モデルが、特定の治療的組成物または処置措置を評価するために利用され得る。簡潔には、腹膜癒着は、通常は２つの隣接する表面を含む重篤な損傷を与えられた結果として動物に生じる。虚血に起因するか、または異物の導入の結果としての傷害は、機械的なものであり得る。機械的な傷害は、腸の粉砕（Choateら、Arch.Surg. 88:249〜254,1964）および腸壁の外層から剥がすか、または削り落とすこと(Gustavssonら、Acta. Chir. Scand.109:327〜333, 1995)を含む。腸のループに主要な脈管を分割すると、虚血を誘導する（Jamesら、J. Path. Bact.90:279〜287,1965）。領域に導入され得る異物には、タルカム（Greenら、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 133:544〜550、1970）、ガーゼスポンジ(LehmanおよびBoys、Ann.Surg 111:427〜435, 1940)、毒性化学物資（Chancy, Arch. Surg. 60:1151〜1153,1950）、バクテリア（Moinら、Am.J. Med. Sci. 250:675〜679, 1965）、および糞便（Jackson, Surgery 44:507〜518, 1958）が挙げられる。
【０１００】
現在では、代表的な癒着予防モデルは、ウサギ子宮(Linskyら、J. Reprod.Med. 32(1):17〜20,1987)、ウサギ子宮角の剥離を含むウサギ子宮角モデル、子宮の剥離および非血管形成（decascularizaition）（Wisemanら、J.Invest. Surg. 7:527〜532,1994）を含む非血管形成改変モデル、ならびに腹膜頂部のパッチの切除および盲腸の剥離を含むウサギ盲腸側壁モデル（Wisemenand Johns, Fertil. Steril. 増補:25S, 1993）を含む。
【０１０１】
癒着を処置するための代表的な抗微小管剤は、上記で詳細に議論されており、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル（docetaxel））、カンフォテシン（campothecin）、エルーテロビン（eleutherobin）、サルコジクチン（sarcodictyins）、エポシロン（epothilones）ＡおよびＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール（2-メチル-2,4-ペンタンジオール）、ツベルシジン（7-デアザアデノシン）、LY290181（2-アミノ-4-(3-ピリジル)-4H-ナフト(1,2-b)ピラン-3-カルボニトリル）、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-(スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、モノクローナル抗イディオタイプ抗体、微小管アセンブリ促進タンパク質（タキソール様タンパク質、TALP）、低張性（190mosmol/L）条件により誘発される細胞膨張、インスリン（100nmol/L）またはグルタミン（10mmol/L）、ダイニン結合、ジベレリン、XCHO1（キネシン様タンパク質）、リソホスファチジン酸、リチウムイオン、植物細胞壁の構成要素（例えば、ポリ-L-リジンおよびエクステンシン）、グリセロール緩衝液、TritonX-100微小管安定化緩衝液、微小管関連タンパク質（例えば、MAP2、MAP4、tau、big tau、エンスコンシン（ensconsin）、延長因子-1-α（EF-1α）およびE-MAP-115）、細胞独立体（entities）(例えば、ヒストンH1、ミエリン塩基性タンパク質および動原体）、内因性微小管構造（例えば、軸糸構造、プラグ、およびGTPキャップ）、ポリペプチドのみの安定な管（例えば、STOP145およびSTOP220）、および有糸分裂力からの張力、ならびに上記のいずれかの任意のアナログおよび誘導体を含む。このような薬剤は、特定の実施態様において、ポリマー製キャリアとの組成物として、または上記および下記でより詳細に議論したようなリポソーム処方物で送達され得る。特定の実施態様において、抗微小管剤は、パクリタキセル、カンフォテシン、またはエポシロン以外の薬剤である。
【０１０２】
本明細書中で提供される薬剤、組成物および方法を利用すると、広範な種々の外科的癒着および外科手術の合併症が、処置または予防され得る。癒着形成または所望されない瘢組織蓄積/封入が、種々の外科的手順を困難にする。上記のように、外科的癒着は、腹腔もしくは骨盤腔における実質的に任意の開放性の外科的手順または内視鏡の外科的手順を困難にする。外科的移植片の封入はまた、乳房再建手術、関節置換手術、ヘルニア改善手術、人工的脈管移植手術、および脳外科手術を困難にする。各々の場合において、移植片は、外科的移植片（例えば、乳房移植片、人工関節、外科手術用メッシュ、脈管移植片、硬膜パッチ）の機能を損なうかまたは減じる線維性結合組織被膜によりカプセル化されることになる。慢性の炎症および瘢痕はまた、慢性の副鼻腔炎を治すかまたは慢性炎症（例えば、異物、感染（真菌性、マイコバクテリア））の他の領域を切除する外科的手術の間に生じる。
【０１０３】
抗微小管剤は、以上の終点を達成するために任意の様式で投与され得る。しかし、好ましい方法は、管周囲の投与を含む（外科的手術時または内視鏡、超音波、CT、MRI、または蛍光透視鏡ガイダンスを用いる時のいずれかに直接適用）；外科的移植片を「コーティング」すること；および手術部位に薬物を溶出するポリマー性移植片を配置すること。好ましい実施態様では、0.5重量％〜20重量％のパクリタキセルが、ポリマー性キャリアに充填され（以下の実施例に記載されるように）、そして管周囲（腸間膜）の表面に、外科的癒着の発生率が減少されるような期間にわたって薬剤を放出する「ペースト」、「フィルム」、または「ラップ」として適用される。内視鏡手順の間、内視鏡における送達部分を介して、手術の間に処置される腹腔および骨盤器官の腸間膜に、パクリタキセル−ポリマー調製物をスプレーとして適用する。特定の好ましい実施態様において、管周囲の組成物は、１重量％〜５重量％のパクリタキセルである。別の好ましい実施態様では、0.1％〜20％のパクリタキセルを含むポリマー性コーティングが、外科的移植片（例えば、乳房移植片、人工関節、脈管移植片）の表面に、移植片近傍におけるカプセル化/不適切な瘢痕を予防するために適用される。なお別の好ましい実施態様では、0.1重量％〜20重量％のパクリタキセルを含むポリマー性移植片が、炎症、癒着形成、または瘢痕の再発が減少されるように、手術部位に直接（例えば、湾曲腔（sinuscavity）、胸腔、腹腔、または脳外科手術の間に手術部位に直接）適用される。全ての実施態様において、他の抗微小管剤は、薬剤の力価および許容性を調節した等価用量で投与される。
【０１０４】
（８．気道の慢性炎症疾患）
本発明の他の局面では、抗微小管剤（および組成物）は、気道の慢性炎症疾患のような疾患を処置または予防するために利用され得る。詳細には、抗微小管剤は、疾患を処置するために、炎症部位（または炎症の可能性のある部位）に適用され得る。適切な抗微小管剤は、上記で詳細に議論されており、そして例えば、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル（docetaxel））、カンフォテシン（campothecin）、エルーテロビン（eleutherobin）、サルコジクチン（sarcodictyins）、エポシロン（epothilones）ＡおよびＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール（2-メチル-2,4-ペンタンジオール）、ツベルシジン（7-デアザアデノシン）、LY290181（2-アミノ-4-(3-ピリジル)-4H-ナフト(1,2-b)ピラン-3-カルボニトリル）、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-(スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、モノクローナル抗イディオタイプ抗体、微小管アセンブリ促進タンパク質（タキソール様タンパク質、TALP）、低張性（190mosmol/L）条件により誘発される細胞膨張、インスリン（100nmol/L）またはグルタミン（10mmol/L）、ダイニン結合、ジベレリン、XCHO1（キネシン様タンパク質）、リソホスファチジン酸、リチウムイオン、植物細胞壁の構成要素（例えば、ポリ-L-リジンおよびエクステンシン）、グリセロール緩衝液、TritonX-100微小管安定化緩衝液、微小管関連タンパク質（例えば、MAP2、MAP4、tau、big tau、エンスコンシン（ensconsin）、延長因子-1-α（EF-1α）およびE-MAP-115）、細胞独立体（entities）(例えば、ヒストンH1、ミエリン塩基性タンパク質および動原体）、内因性微小管構造（例えば、軸糸構造、プラグ、およびGTPキャップ）、ポリペプチドのみの安定な管（例えば、STOP145およびSTOP220）、および有糸分裂力からの張力、ならびに上記のいずれかの任意のアナログおよび誘導体を含む。このような薬剤は、特定の実施態様において、ポリマー性キャリアとの組成物として、または上記および下記でより詳細に議論したようなリポソーム処方物で送達され得る。本発明の特定の好ましい実施態様において、薬剤または組成物は、鼻腔内に、全身に、吸入により、局所的に（例えば、鼻ポリープの場合に）、または湾曲腔に投与され得る。
【０１０５】
（喘息）
本発明の特定の局面において、抗微小管剤は、喘息を処置または予防するために利用され得る。手短には、喘息は、自発的に、または処置に応答して解消し得る気道閉塞の再発性エピソードによって特徴付けられる状態である。その正確な病因は知られていないが、その状態は、悪化した気管支収縮、および集団の５％に影響を及ぼす刺激薬に対する免疫応答である。喘息に有効な抗微小管治療は、１つ以上の病理学的状態（例えば、炎症細胞（Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球）の浸潤および活性を低減すること、気道上皮の増殖および肥厚を減少させること、気道壁における平滑筋細胞増殖および肥厚を阻害すること、気道管腔における粘液分泌を低減させること、炎症を誘導および永続化し、そして気道分泌腺の過形成および肥厚を阻害する炎症性サイトカイン（IL-3、IL-4、IL-5、GMSF）の活性をブロックすること）を改変する。
【０１０６】
臨床的には、喘息のための有効な抗微小管治療は、以下の内の１つ以上を達成する：症状の重篤度低減する、増悪の持続期間を減少する、疾患の寛解器官の頻度および持続期間を増加する、固定した欠陥および障害を予防する、ならびに呼吸困難、咳、およびぜん鳴の慢性の進行を予防する；一方で、低酸素、FEV1（２分の１の強制された(forced)呼気容量）、気道および低炭酸／呼吸性アルカローシスに対する耐性を改善する、ならびにＶ：Ｑ（通気：灌流）ミスマッチを低減する。
【０１０７】
抗微小管剤は、上記の終点を達成するために任意の様式で投与され得る。投与の好ましい方法は、吸入処置（例えば、メーター用量呼吸器、ネブライザー、気管内チューブを介する、微粒子の吸入薬）および全身性処置（静脈内注射、皮下注射、もしくは筋肉内注射、または経口調製）を含む。全身性処置は、重篤に悪化した患者に、または吸入治療が適切でない場合に投与される。臨床的または病理学的改善を生じ得る最小の用量が使用される。例えば、パクリタキセルについて、全身性慢性低用量治療は、応答に依存して１〜４週間毎に10〜50mg/m2で投与され得；高用量「パルス」治療は、急性の疾病患者において50〜250mg/m2で投与され得る。吸入治療について、0.01％〜１％のパクリタキセルが、上記の送達ビヒクル／処方物を介して直接的に吸入され得る。このことは、気道へ直接的に、１〜50mg/m2のパクリタキセルの送達を生じる。この用量は、応答に従って滴下される。他の抗微小管剤は、薬剤の能力および寛容性に適合した等価の用量で投与され得る。
【０１０８】
（慢性閉塞性肺疾患（COPD)）
COPDは、（慢性気道閉塞を導く）種々の状態（慢性気管支炎、喘息性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、および気腫）を含む。これらの状態は、重篤な障害を引き起こし得、そして米国において４番目に主要な死因である。臨床的には、すべては、呼吸困難、咳、ぜん鳴、および気道の再発性感染によって特徴付けられる。疾患の徴候は、減少したFDV1、増加した残存容量、Ｖ：Ｑミスマッチ、および低酸血症を含む。病理学的には、増加した粘液産生、粘液腺の過形成、増加したプロテアーゼ（主に、エラスターゼ）活性、気道の炎症、および肺胞壁の破壊である。広範な病因（喫煙が最も一般的である）にもかかわらず、上記の任意の症状、徴候、または病理学的プロセスを改善することは、好ましくは、状態に影響を与え；従って、COPDに有効な抗微小管治療は、上記のうちの少なくとも１つを改変する。抗微小管剤での処置は、喘息について上記のように投与される：吸入されるパクリタキセルは、１〜50mg/m2で、必要とされる場合は繰り返し与えられ、全身性パクリタキセル治療については、10〜50mg/m2が、慢性投与において１〜４週間毎に与えられるか、または急性の疾病患者において「パルス」として50〜250mg/m2が与えられる。他の抗微小管剤は、臨床的等価用量で投与される。
【０１０９】
（９．狭窄、新生物性疾患、および閉塞）
上記のように、本発明は、身体の通路の閉塞に関連する広範な種々の疾患（例えば、脈管性疾患、新生物性閉塞、炎症性疾患、および感染性疾患を含む）を処置または予防するための方法を提供する。
【０１１０】
例えば、本発明の１つの局面において、本明細書中に記載のような広範な種々の抗微小管剤および組成物を利用して、脈管系の閉塞を引き起こす脈管性疾患を処置し得る。そのような疾患の代表的な例は、以下を含むが、これらに限定されない全ての脈管（任意の動脈、静脈、または移植片の周囲）：冠状動脈、大動脈、腸骨動脈、頸動脈、共通大腿動脈、表在(superficial)大腿動脈、膝窩動脈、および移植片吻合の部位のアテローム性動脈硬化症；血管痙攣（例えば、冠状血管痙攣およびレーノー病）；再狭窄（以前の介入（例えば、バルーン血管形成、バイパス手術、ステント挿入、および移植片挿入）の部位での脈管の閉塞）；炎症および自己免疫状態（例えば、側頭動脈炎、脈管炎）を含む。
【０１１１】
手短には、アテローム性動脈硬化症のような脈管疾患において、白血球、特に単球およびＴリンパ球は、内皮細胞に、特に動脈分枝の位置にて接着する。内皮への接着後、白血球は、ケモスタット刺激(chemostatic stimuli)に応答して内皮細胞管壁を横切って移動し、そして平滑筋細胞と共に動脈壁の内膜に蓄積する。アテローム性動脈硬化症発生のこの初期の病巣は、「脂肪縞(fattystreak)」として公知である。脂肪縞内の単球はマクロファージへ分化し；そしてマクロファージおよび平滑筋細胞は、連続的に脂肪およびリポタンパク質を取り、泡沫細胞になる。
【０１１２】
マクロファージが蓄積する場合、上層の内皮は、機械的に破壊されるようになり、そして酸化脂質、酸素由来フリーラジカル、およびマクロファージによって放出されるプロテアーゼによって化学的に改変されるようになる。泡沫細胞は、内皮表面を侵食し、脈管壁の微小潰瘍を引き起こす。潜在的なトロンボゲン形成内皮下組織（例えば、コラーゲンおよび他のタンパク質）の、血流の成分への曝露は、血小板の、破壊された内皮の領域への接着を生じる。血小板接着および他の事象は、この環境(mileau)への増殖因子（PDGF、血小板活性化因子(PAF)、IL-1、およびIL-6を含む）の生成および放出を誘発する。これらのパラクリン剤は、脈管平滑筋細胞（VSMC)の移動および増殖を刺激すると考えられている。
【０１１３】
正常な（罹患していない）血管壁において、VSMCは、収縮性表現型、および有糸分裂活性の低い指数を有する。しかし、血小板によって放出されるサイトカインおよび増殖因子の影響下で、マクロファージおよび内皮細胞VSMCは、成熟収縮性細胞から未成熟分泌細胞への表現型変化を経る。形質転換したVSMCは、血管壁の中膜で増殖し、内膜に移動し、内膜において増殖し続け、そして大量の細胞外マトリクスを生じる。これは、成長中の脈管病巣を、線維性プラークに形質転換する。分泌VSMCによって生成された細胞外マトリクスは、コラーゲン、エラスチン、糖タンパク質、およびグリコサミノグリカンを含み、コラーゲンは、アテローム性動脈硬化症プラークの主要な細胞外マトリクス成分を含む。エラスチンおよびグリコサミノグリカンは、リポタンパク質を結合し、そしてまた病巣の成長に寄与する。線維性プラークは、平滑筋細胞および上層のマクロファージマクロファージを含む、種々の厚さの高密度な結合組織の線維性キャップ、Ｔ細胞、および細胞外物質からなる。
【０１１４】
PDGFに加えて、IL-1およびIL-6、他の分裂促進因子は、以下を含む血管壁に浸潤する細胞によって生成される：TGFβ、FGF、トロンボスポンジン、セロトニン、トロンボキサンA2、ノルエピネフリン、およびアンジオテンシンII。これは、より多くの細胞の補充、さらなる細胞外マトリクスの生成、およびさらなる脂質の蓄積を生じる。これは、アテローム性動脈硬化症の病巣が脈管管腔に有意に侵食するまで、その病巣を進行的に大きくする。初期に、脈管を通る閉塞した血流は、増加した流れが必要とされる場合にのみアテローム性動脈硬化症プラークに遠位の組織の虚血を引き起こし、その後、病巣がさらに動脈をブロックするにつれ、虚血は安静な状態にて生じる。
【０１１５】
拡大しているアテローム性動脈硬化症プラーク中のマクロファージは、隣接する組織の細胞損傷および壊死を引き起こす酸化脂質、フリーラジカル、エラスターゼ、およびコラーゲナーゼを放出する。病巣は壊死性コアを発生させ、そして複合体プラークに形質転換される。複合体プラークは、以下を引き起こすの止め得る不安定な病巣である：塞栓形成；局所的出血（病巣の急速な拡大に起因する管腔閉塞を生じるプラークを提供する、脈管の脈管の破裂について二次的）；または潰瘍形成および裂形成（これは、トロンボゲン形成壊死性コアを血流に曝露し、局所的血栓症または遠位の塞栓形成を生じる）。上記の続発症のどれも生じない場合でさえ、接着性血栓は、組織化され、そしてプラークに取り込まれるようになり、それによってその増殖を加速し得る。さらに、フィブリノーゲンおよびトロンビンの局所濃度が増大するにつれ、中膜および内膜内の脈管平滑筋細胞の増殖が刺激され；このプロセスはまた、血管のさらなる狭小化を究極的に導く。
【０１１６】
正常な動脈の内膜および中膜は、酸素化され、そして動脈の管腔から、または外膜内の脈管の脈管からの栄養分を補充される。アテローム性動脈硬化症プラークの発達につれ、外膜の脈管の脈管から生じる微小脈管は、厚くなった内膜および中膜に拡張する。プラークが悪化し、そしてプラーク退行を減少するにつれ、この脈管網はより広範になる。
【０１１７】
これらの微小脈管からの出血は、動脈解離、潰瘍形成、または血栓症と関連するプラークの突然の拡張および破裂を引き起こし得る。これらの微小脈管からの血漿タンパク質の漏出が領域への炎症性浸潤を誘導し得、そしてこれらの炎症細胞が、アテローム性動脈硬化症プラークの急速な増殖、および関連する合併症（局所的水腫および炎症を介する）に寄与し得ることもまた、仮定されている。  先に議論したような脈管性疾患を処置するために、抗微小管剤（キャリアを含むか、または含まないかのいずれか）は、身体の通路の外側の部分、または身体の通路の外膜を介して平滑筋に送達され得る。この点において特に好ましい抗微小管剤は、例えばタキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル（docetaxel））、カンフォテシン（campothecin）、エルーテロビン（eleutherobin）、サルコジクチン（sarcodictyins）、エポシロン（epothilones）ＡおよびＢ、ジスコデルモリド、重水（D2O）、ヘキシレングリコール（2-メチル-2,4-ペンタンジオール）、ツベルシジン（7-デアザアデノシン）、LY290181（2-アミノ-4-(3-ピリジル)-4H-ナフト(1,2-b)ピラン-3-カルボニトリル）、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-(スクシンイミジルスクシネート）、グリシンエチルエステル、モノクローナル抗イディオタイプ抗体、微小管アセンブリ促進タンパク質（タキソール様タンパク質、TALP）、低張性（190mosmol/L）条件により誘発される細胞膨張、インスリン（100nmol/L）またはグルタミン（10mmol/L）、ダイニン結合、ジベレリン、XCHO1（キネシン様タンパク質）、リソホスファチジン酸、リチウムイオン、植物細胞壁の構成要素（例えば、ポリ-L-リジンおよびエクステンシン（extensin)）、グリセロール緩衝液、TritonX-100微小管安定化緩衝液、微小管関連タンパク質（例えば、MAP2、MAP4、tau、big tau、エンスコンシン（ensconsin）、延長因子-1-α（EF-1α）およびE-MAP-115）、細胞独立体（entities）(例えば、ヒストンH1、ミエリン塩基性タンパク質および動原体）、内因性微小管構造（例えば、軸糸構造、プラグ、およびGTPキャップ）、ポリペプチドのみの安定な管（例えば、STOP145およびSTOP220）、および有糸分裂力からの張力、ならびに上記のいずれかの任意のアナログおよび誘導体を含む。特定の実施態様において、抗微小管剤は、パクリタキセル、カンフォテシン、またはエポシロン以外の薬剤である。このような薬剤は、特定の実施態様において、ポリマー製キャリアとの組成物として、または上記および下記でより詳細に議論したようなリポソーム処方物で送達され得る。本発明の好ましい実施態様において、薬剤または組成物は、バルーンカテーテルによって、経口的に、脈管周囲的に、ステントによって、全身に投与され得る。
【０１１８】
本発明の他の局面において、本明細書中に記載される抗微小管治療剤または組成物は、新生物性閉塞を処置するために利用され得る。手短には、本明細書中で利用されるように、「新生物性閉塞」は、管の位置または存在する悪性腫瘍の組織学的型にかかわらず、身体的な管の任意の新生物性（良性または悪性）閉塞を含むことが理解されるべきである。代表的な例は、胃腸疾患（例えば、口−咽頭ガン腺ガン、食道ガン（扁平上皮細胞、腺ガン、リンパ腫、黒色腫）、胃ガン（腺ガン、形成性胃組織炎、リンパ腫、平滑筋肉腫）、小腸腫瘍（腺腫、平滑筋腫、脂肪腫、腺ガン、リンパ腫、カルチノイド）、結腸ガン（腺ガン）、および肛門直腸ガン）；胆管疾患（例えば、膵臓ガン（腺管ガン、島細胞腫瘍、嚢胞腺ガン）、胆管ガン、および肝細胞ガンのような胆管閉塞を生じる新生物）；肺疾患（例えば、肺および／または気管／気管支通路のガン（小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン））；女性生殖疾患（例えば、ファローピウス管の悪性腫瘍、子宮ガン、頸ガン、膣ガン）；男性生殖疾患（例えば、精巣ガン、精巣上体のガン、精管の腫瘍、前立腺ガン、良性前立腺肥大）；および尿路疾患（例えば、腎細胞ガン、腎盂の腫瘍、移行細胞ガン、膀胱ガンのような尿収集系の腫瘍、および良性の狭窄または悪性腫瘍に起因する尿道閉塞）を含む。
【０１１９】
例として、良性前立腺肥大(BPH)は、前立腺、特に尿道を囲む腺の中央部分の、延長したアンドロゲン性刺激に応答して生じる拡大である。それは、50歳を越える男性の80％より多くに影響を及ぼす。この拡大は、前立腺を通る尿道の部分の圧縮を生じ得、膀胱流出路の閉塞を生じる、すなわち異常に高い膀胱圧が、尿の流れを生じるのに必要とされる。1980年、米国において、BPHのための処置として367,000件の前立腺の経尿道的切除が実施された。他の処置は、投薬、経尿道的括約筋切開、経尿道的レーザーまたはマイクロ波、経尿道的高熱、経尿道的超音波、経直腸的マイクロ波、経直腸的高熱、経直腸的超音波、および外科的切除を含む。すべては、失禁および狭窄形成を生じる括約筋機構の妨害を含む不利点を有する。
【０１２０】
先に議論したような新生物疾患を処置するために、広範な種々の治療剤（重合体キャリアを含むか、または含まないのいずれか）は、身体通路の外側の部分、または身体通路の外膜を介して平滑筋細胞に送達され得る。例えば、１つの好ましい実施態様において、針またはカテーテルは、超音波ガイダンス下で経直腸的経路（あるいは経会陰的）を介して、尿道に隣接する前立腺に導き、これを通して、特に尿道の周りの、特に腺のいくつかの象限(guadrant)に治療剤を送達する。針またはカテーテルはまた、直接的な触診下、または内視鏡、蛍光透視鏡、CT、またはMRIガイダンス下で置かれ得、そして間隔をおいて投与され得る。代替として、カテーテルまたはトロカールを介するペレットの設置もまた、達成され得る。上記の手順は、単独または前立腺尿道に設置されるステントと組み合わせて達成され得る。尿道器具または尿道に対する損傷を回避することによって、括約筋機構は、完全なままであり、失禁を回避し、そして狭窄の可能性はより低くなる。
【０１２１】
本発明の他の局面において、身体通路の閉塞に影響を及ぼすか、またはそれを引き起こす炎症性疾患を予防または処置するための方法が提供される。炎症疾患は、種々の身体の管の閉塞を生じる、急性および慢性の両方の炎症を含む。代表的な例は、脈管炎（例えば、巨細胞動脈炎（側頭動脈炎、高安動脈炎）、多発性動脈炎、アレルギー性血管炎、および肉芽腫症（チャーグ−ストラウス病）、多発性血管炎オーバーラップ(overlap)症候群、過敏性血管炎（ヘーノホ−シェーライン紫斑病）、血清病、薬物誘導脈管炎、感染性脈管炎、新生物性脈管炎、結合組織障害に関連する脈管炎、補体系の先天性欠損に関連する脈管炎）、ヴェ−ゲナ−肉芽腫症、川崎病、中枢神経系の脈管炎、バーガー病、および全身性硬化症）；胃腸管疾患（例えば、膵炎、クローン病、潰瘍性結腸炎、潰瘍性直腸炎、原発性硬化症胆管炎、特発性を含む任意の原因の良性狭窄（例えば、胆管、食道、十二指腸、小腸、または結腸の狭窄））；気道疾患（例えば、喘息、過敏性肺炎、石綿症、珪肺症、およびじん肺の他の形態）、慢性気管支炎、および慢性閉塞性気道疾患）；鼻涙管疾患（例えば、特発性を含むすべての原因の狭窄）；ならびにエウスターキオ管疾患（例えば、特発性を含むすべての原因の狭窄）を含む。
【０１２２】
先に議論したような炎症性疾患を処置するために、抗微小管剤（キャリアを含むか、または含まないかのいずれか）は、身体の通路の外側の部分、または身体の通路の外膜を介して平滑筋に送達され得る。
【０１２３】
本発明のなお別の局面において、身体通路の閉塞と関連するか、またはその原因となる感染性疾患を処置または予防するための方法を提供する。手短には、感染性疾患は、いくつかの急性および慢性感染性プロセスを含み、以下を含む身体通路の閉塞を生じ得る：例えば、男性生殖路の閉塞（例えば、尿道炎、精巣上体炎、前立腺炎に起因する狭窄）；女性生殖路の閉塞（例えば、膣炎、子宮頸炎、骨盤炎症性疾患（例えば、結核、淋菌、クラミジア属、腸球菌、および梅毒））；尿路閉塞（例えば、膀胱炎、尿道炎）；気道閉塞（例えば、慢性気管支炎、結核、他のマイコバクテリア感染（MAIなど）、嫌気性感染、真菌性感染、および寄生虫感染）；および心臓血管閉塞（例えば、真菌性動脈瘤および感染性心内膜炎）を含む。
【０１２４】
先に議論したような感染性疾患を処置するために、広範な種々の治療剤（キャリアを含むか、または含まないかのいずれか）は、身体の通路の外側の部分、または身体の通路の外膜を介して平滑筋に送達され得る。この点において特に好ましい治療剤は、先に議論したような抗微小管剤を含む。
【０１２５】
（１０．移植片拒絶）
上記の抗微小管剤および組成物は、移植片拒絶を処置または予防するために利用され得るようである。手短には、慢性移植片／器官拒絶の２つの主要な組織学的徴候は、炎症およびアテローム性動脈硬化症である。この最内膜(neointimal)過形成は、長く生存している腎臓同種移植片（Humeら、J. Clin. Invest. 34: 327,1955; Buschら、Human Pathol. 2: 253, 1971)、ならびに心臓同種移植片（Johnsonら、J. HeartTransplantation 8: 349, 1989)、肝臓同種移植片(Demetrisら、Am. J. Pathol 118: 151, 1985)、ならびに肺移植片(Burkeら、LancetI:
517: 1986)において観察されている。心臓移植片は、冠状血流への心筋の依存のために、この管腔の狭小化に非常に感受性である。
【０１２６】
多くの動物モデルを用いて、慢性の心臓同種異系拒絶が研究されている。Lewis-F344ラット心臓移植モデルは、動脈硬化性の病変形成により特徴付けられる慢性拒絶をともなう心臓同種異系拒絶を生成する。このモデルは、レシピエントの80％以上が３週間以上生存し、これらの90％が冠状動脈内膜病変をともなうので有用である(Adamsら、Transplantation53:1115-1119、1992)。病変の高い発生数および重篤度を示すことに加えて、病変進行の炎症段階は、この系が免疫抑制を必要としないので、極めて認識が容易である。単核の浸潤および壊死の程度は、より重篤であるが、このモデルにおける動脈病変は、臨床移植片の動脈硬化に強く類似している。
【０１２７】
移植片拒絶に対する有効な抗微小管治療は、以下の少なくとも１つを達成する：(i)移植片の寿命を延長し、(ii)免疫抑制治療にともなう副作用を低減し、および(iii)移植にともなう促進された動脈硬化症を低減する。
【０１２８】
移植片拒絶を処置するための適切な抗微小管剤は、例えば、タキサン類(例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル)、カンプトテシン、エポシロンＡおよびＢ、ジスコデルモリド、重水(D2O)、ヘキシレングリコール(2-メチル-2,4-ペンタンジオール)、ツベルシジン(7-デアザアデノシン)、LY290181(2-アミノ-4-(3-ピリジル)-4H-ナフト(1,2-b)ピラン-3-カルドニトリル)、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-(スクシンイミジルスクシネート)、グリシンエチルエステル、モノクローナル抗イディオタイプ抗体、微小管アセンブリ促進タンパク質(タキソール様タンパク質、TALP)、低張(190mosmol/L)条件により誘導される細胞腫張、インスリン(100 nmol/L)またはグルタミン(10 mmol/L)、ダイニン結合、ジベレリン、XCHO1(キネシン様タンパク質)、リソホスファチジン酸、リチウムイオン、植物細胞壁の構成要素(例えば、ポリ-L-リジンおよびエクステンシン)、グリセロール緩衝液、TritonX-100微小管安定化緩衝液、微小管関連タンパク質(例えば、MAP2、MAP4、tau、big tau、エンスコンシン、延長因子１α(EF-1α)およびE-MAP-115)、細胞体(例えば、ヒストンH1、ミエリン塩基性タンパク質および動原体)、内因性微小管構造(例えば、軸糸構造、プラグおよびGTPキャップ)、安定な細管のみのポリペプチド(例えば、STOP145およびSTOP220)および有糸分裂力からの張力、ならびに上記いずれかの任意のアナログおよび誘導体を含む。このような薬剤は、特定の実施態様で、上記および下記の両方でより詳細に論議されるように、ポリマー性キャリアとともに、またはリポソーム処方物中の組成物として送達され得る。
【０１２９】
抗微小管剤は、上記の終点を達成するために、任意の方法で移殖物とともに投与され得る。しかし、好ましい方法には、経口投与または静脈内、皮下、または筋肉内注射を含む。抗微小管剤は、慢性の移植片拒絶を防ぐために長期の低用量治療として、または急性の移植片拒絶を防ぐためにより高い用量で投与され得る。例えば、パクリタキセルについては、全身的な長期低用量治療は、治療応答に依存して１〜４週毎に10〜50mg/m2で投与され得；高用量「パルス」治療は、１〜21日毎に50〜250mg/m2で投与され得、必要に応じて６回まで繰り返される。他の抗微小管剤は、薬剤の効力および許容力に調節された相当する用量で投与され得る。
【０１３０】
（11. 全身性エリテマトーデス）
全身性エリテマトーデス(SLE)は、核、細胞質および細胞膜抗原と反応性の抗体の産生と関連した、多くの異なる器官系における炎症により特徴付けられる未知の原因の疾患である。SLEは、いくつかの集団において2500人に１人にあり得るという高い有病率で、かなり一般的な疾患である(Michetら、MayoClini. Proc. 60:105、1985)。SLEは、10〜64才の間の年齢の女性の間で700人に１人の頻度で、女性対男性の比が９：１である女性に優勢な疾患である。SLEの全体で毎年の発生数は、集団のリスクに依存して、毎年、100,000の集団あたり約６〜35の新たな事例がある。
【０１３１】
SLEは、種々の種類の自己抗体の分泌を生じるヘルパーＴ細胞およびＢ細胞の活性化を起こすのと同時に作用する、遺伝的、ホルモン的および環境因子の間の相互作用から生じる複数因子起源の複雑な疾患であるようである。しばしば、SLEは、自己免疫疾患として分類され、特に核抗原(抗核抗体−ANA)およびリン脂質に対して惹起された、増加した数の自己抗体により特徴付けられる。抗リン脂質抗体は、狼瘡患者の20〜40％に存在し、そして多数のアニオン性リン脂質と反応することが見出されている。
【０１３２】
SLEにおける形態学的変化は、極度に可変性であり、個々の患者における疾患の臨床的徴候および経過の多様性を反映する。最も特徴的な病変は、免疫複合体の沈着から生じ、そして血管、腎臓、結合組織および皮膚において見出される。小動脈および細動脈を含む急性の壊死性の血管炎は、皮膚および筋肉が最も一般的に影響されるが、任意の組織に存在し得る。小血管の血管炎により影響された器官では、通常、最初の病変は、顆粒球浸潤および細血管周囲の浮腫により特徴付けられる。血管壁におけるフィブリノイド沈着もまた、動脈炎を特徴付ける。慢性期には、血管は、管腔が狭くなる線維性の厚膜化を受ける。脾臓では、これらの血管病変は、中央動脈を含み、そしていわゆるオニオンスキン（onionskin)病変を生成する顕著な血管周囲の線維症によって特徴付けられる。
【０１３３】
SLEを処置するための適切な抗微小管剤は、例えば、タキサン類(例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル)、カンプトテシン、エポシロンＡおよびＢ、ジスコデルモリド、重水(D2O)、ヘキシレングリコール(2-メチル-2,4-ペンタンジオール)、ツベルシジン(7-デアザアデノシン)、LY290181(2-アミノ-4-(3-ピリジル)-4H-ナフト(1,2-b)ピラン-3-カルドニトリル)、フッ化アルミニウム、エチレングリコールビス-(スクシンイミジルスクシネート)、グリシンエチルエステル、モノクローナル抗イディオタイプ抗体、微小管アセンブリ促進タンパク質(タキソール様タンパク質、TALP)、低張(190mosmol/L)条件により誘導される細胞腫張、インスリン(100 nmol/L)またはグルタミン(10 mmol/L)、ダイニン結合、ジベレリン、XCHO1(キネシン様タンパク質)、リソホスファチジン酸、リチウムイオン、植物細胞壁の構成要素(例えば、ポリ-L-リジンおよびエクステンシン)、グリセロール緩衝液、TritonX-100微小管安定化緩衝液、微小管関連タンパク質(例えば、MAP2、MAP4、tau、big tau、エンスコンシン、延長因子１α(EF-1α)およびE-MAP-115)、細胞体(例えば、ヒストンH1、ミエリン塩基性タンパク質および動原体)、内因性微小管構造(例えば、軸糸構造、プラグおよびGTPキャップ)、安定な細管のみのポリペプチド(例えば、STOP145およびSTOP220)および有糸分裂力からの張力、ならびに上記いずれかの任意のアナログおよび誘導体を含む。このような薬剤は、特定の実施態様で、上記および下記の両方でより詳細に論議されるように、ポリマー性キャリアとともに、またはリポソーム処方物中に組成物として送達され得る。本発明の好ましい実施態様では、これらの薬剤または組成物は、吸入により、鼻腔内に、全身に、または局所的に(例えば、鼻ポリープの場合)投与され得る。
【０１３４】
（処方および投与）
上記のように、本発明の抗微小管剤は、種々の形態(例えば、ミクロスフェア、ペースト、フィルム、スプレー、軟膏、クリーム、ゲルなど)で処方され得る。さらに、本発明の組成物は、１より多い抗微小管剤を含み、種々のさらなる化合物を含み、特定の物理的特性(例えば、弾力性、特定の融点、または特定された放出速度)を有するように処方され得る。本発明の特定の実施態様では、組成物は、所望の効果を達成するために組み合わせられ得る(例えば、ミクロスフェアの種々の調製物は、１つ以上の抗微小管剤の急速かつ緩慢の両方または延長した放出を達成するために組み合わせられ得る)。
【０１３５】
抗微小管剤は、単独、あるいは薬学的または生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤と組み合わせてのいずれかで投与され得る。一般に、このようなキャリアは、採用される用量および濃度では、レシピエントに非毒性であるべきである。通常、このような組成物の調製は、治療的薬剤を、緩衝液、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子量(約10の残基より少ない)ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンを含む炭水化物、EDTAのようなキレート剤、グルタチオンおよびその他の安定剤、ならびに賦形剤と組み合わせを伴う。中性の緩衝化生理食塩水または非特異的血清アルブミンと混合した生理食塩水は、模範的な適切な希釈剤である。
【０１３６】
上記のように、本明細書中に提供される、抗微小管剤、組成物、または薬学的組成物は、例えば、炎症の部位へ局所的に、経口的に、直腸から、頭蓋内に、硬膜下腔内に、鼻腔内に、眼内に、静脈内に、皮下に、腹膜内に、筋肉内に、舌下または膀胱内、を含む、種々の異なる経路による投与のために調製され得る。投与のその他の代表的な経路には、(好ましくは、超音波、CT、蛍光透視法、MRIまたは内視鏡の案内による)疾患部位への直接投与を含む。
【０１３７】
本明細書中に提供される治療剤、治療組成物、および薬学的組成物は、このような材料の使用に関する使用説明書を提供するパッケージ材料とともに、容器内に配置され得る。一般に、このような使用説明書は、試薬濃度、ならびに特定の実施態様では、抗微小管剤、抗微小管組成物、または薬学的組成物を再構成するために必要であり得る、賦形剤成分または希釈剤(例えば、水、生理食塩水、またはPBS)の相対量を記載する具体的な表現を含む。
【０１３８】
以下の実施例は、例示のために提供されるが、限定のために提供されない。
【０１３９】
（実施例）
上記のように、慢性炎症は、白血球細胞(マクロファージ、リンパ球、好中球、および形質細胞)をともなう組織浸潤、炎症細胞および細胞産物(活性酸素種、マトリクスメタロプロテイナーゼのような組織分解酵素)による組織破壊、および結合組織補充による修復の反復的な試み(血管形成および線維症)により特徴付けられるプロセスである。
【０１４０】
抗微小管剤の、慢性的な炎症に影響するそれらの能力を評価するためには以下の病理学的/生物学的終点：(1)炎症カスケードを開始する白血球細胞応答(マクロファージ、好中球およびＴ細胞)の阻害；(2)線維症の進行および器官機能の損失に至る間葉細胞(線維芽細胞、滑膜細胞など)過剰増殖の阻害；(3)組織病変を引き起こすマトリクスメタロプロテイナーゼ産生/活性の阻害；(4)炎症応答を増大し、そして線維組織の増殖および発達に必要な代謝的支持を提供し得る新血管形成の破壊；および(5)このすべて、は、正常実質細胞に対する実質的な毒性なくしてか、またはマトリックス成分(例えば、コラーゲンおよびプロテオグリカン)の正常な合成を損なうことなく達成されなければならない。
【０１４１】
以下により詳細に示されるように、微小管を安定化する薬剤、例えば、パクリタキセルの活性が、種々の組織および炎症疾患状態で検査されている。これらの薬剤は、上記の疾患パラメーターの多くを改変する能力を示す。
【０１４２】
（実施例１）
好中球活性に対する抗微小管剤の影響
この実施例は、オプソニン化CPPD結晶またはオプソニン化ザイモザンで刺激された好中球の応答に対する抗微小管剤の影響を記載する。以下に提示される実験により示されるように、抗微小管剤は、化学発光、スーパーオキシドアニオン産生、および血漿オプソニン化微結晶またはザイモザンに応答する脱顆粒により測定したとき、粒子で誘導される好中球活性化の強力なインヒビターである。
【０１４３】
（Ａ．材料および方法）
ハンクスの緩衝化生理食塩水溶液(HBSS)pH7.4をこの研究の間を通じて用いた。全ての化学薬品は、他の記載がなければ、SigmaChemical Co(St. Louis, MO)から購入した。すべての実験は、他の記載がなければ37℃で行った。
【０１４４】
１．結晶の調製および特徴付け
CPPD(三斜晶系)結晶を調製した。この結晶のサイズ分布は、10μm未満が約33％、10〜20μmの間が58％、そして20μmを超えるものが９％であった。上記の条件下で調製された結晶は、発熱物質を含まず、そして滅菌、発熱物質を含まない条件下で生成された結晶は、通常、無菌でない実験室条件下で調製された結晶と同じ程度の好中球応答を生じた。
【０１４５】
２．結晶およびザイモザンのオプソニン化
パクリタキセルの存在下で結晶またはザイモザンに対する好中球応答を調べたすべての実験は、血漿オプソニン化CPPDまたはザイモザンを用いて実施された。結晶またはザイモザンのオプソニン化は、50％血漿の１mlあたり75mgのCPPDまたは12mgのザイモザンの濃度で50％のヘパリン処理血漿を用いて行った。結晶またはザイモザンは、血漿と37℃で30分間インキュベートし、次いで過剰のHBSS中で洗浄した。
【０１４６】
３．好中球調製
好中球は、新たに採取されたヒトのクエン酸塩化の全血から調製された。簡単に述べれば、400mlの血液を、HBSS中の４％デキストランT500(Phamacia LKB、Biotechnology AB Uppsala、Sweden)80 mlと混合し、そして１時間沈降させた。血漿を連続的に集め、そして５mlを、15mlポリプロピレンチューブ(Coming、NY)中の５mlFicoll Paque(Pharmacia)に添加した。500gで30分間の遠心分離の後、好中球ペレットを、20秒間の低張ショックにより赤血球を含まないように洗浄した。好中球をHBSS中に再懸濁し、氷上に保持し、そして３時間以内に実験に用いた。好中球生存率および純度は、常に90％以上であった。
【０１４７】
４．好中球の抗微小管剤とのインキュベーション
(a) パクリタキセル
ジメチルスルホキシド(DMSO)中の12mMのパクリタキセルのストック溶液を、各実験前に新たに調製した。このストック溶液を、DMSO中に希釈し、１〜10mMの濃度範囲でパクリタキセル溶液を得た。これら希釈パクリタキセル溶液の等容量を、穏和なボルテックスで、5,000,000細胞/mlの好中球に添加し、0.5％の最終DMSO濃度で０〜50μMの濃度を達成した。結晶またはザイモザンの添加前に、細胞を、33℃で20分間、次いで37℃で10分間インキュベートした。
【０１４８】
(b) フッ化アルミニウム
HBSS中１Ｍのフッ化アルミニウム(AlF3)のストック溶液を新たに調製した。このストック溶液をHBSS中で希釈し、５〜100mMの濃度範囲のAlF3溶液を得た。これら希釈AlF3溶液の等容量(50μl)を、5,000,000細胞/mlの好中球に添加し、そして37℃で15分間インキュベートした。ルミノール(１μM)を添加し、次いで20μlのオプソニン化ザイモザン(最終濃度＝１mg/ml)を添加し、細胞を活性化した。
【０１４９】
(c) グリシンエチルエステル
HBSS中の100 mMのグリシンエチルエステルのストック溶液を新たに調製した。このストック溶液をHBSS中で希釈し、0.5〜10mMの濃度範囲のグリシンエチルエステル溶液を得た。これら希釈グリシンエチルエステル溶液の等容量(50μl)を、5,000,000細胞/mlの好中球に添加し、そして37℃で15分間インキュベートした。ルミノール(１μM)を添加し、次いで20μlのオプソニン化ザイモザン(最終濃度＝１mg/ml)を添加し、細胞を活性化した。
【０１５０】
(d) LY290181
HBS S中の100 μMのLY290181のストック溶液を新たに調製した。このストック溶液をHBSS中で希釈し、0.5〜50μMの濃度範囲のLY290181溶液を得た。これら希釈LY290181溶液の等容量(50μl)を、5,000,000細胞/mlの好中球に添加し、そして37℃で15分間インキュベートした。ルミノール(１μM)を添加し、次いで20μlのオプソニン化ザイモザン(最終濃度＝１mg/ml)を添加し、細胞を活性化した。
【０１５１】
５．化学発光アッセイ
すべての化学発光研究は、CPPD(50 mg/ml)を用い、HBSS中、5,000,000細胞/mlの細胞濃度で実施した。すべての実験において、0.5mlの細胞を、1.5 mlのキャップ付きEppendorfチューブ中の25 mgのCPPDまたは0.5 mgのザイモザンに添加した。HBSS中の25％DMSOに溶解したルミノールの10μlを、１μMの最終濃度になるように添加し、そしてサンプルを混合して結晶またはザイモザンによる好中球活性化を開始した。化学発光は、LKBLuminometer(Model 1250)を用い、 結晶またはザイモザンを再懸濁するために、測定直前に振とうして37℃で20分間モニターした。コントロールのチューブには、細胞、薬物およびルミノールを含めた(結晶なし)。
【０１５２】
６．スーパーオキシドアニオン生成
スーパーオキシドアニオン濃度は、チトクロムＣアッセイのスーパーオキシドジスムターゼ阻害可能な還元を用いて測定した。簡単に述べれば、25 mgの結晶または0.5 mgのザイモザンを、1.5 mlのキャップ付きEppendorfチューブに入れ、そして37℃まで加温した。37℃で0.5mlの細胞を、フェリチトクロムＣとともに添加(最終濃度1.2 mg/ml)し、そしてキャップを閉めたチューブを振とうすることにより細胞を活性化した。適切な時間に、チューブを、10,000gで10秒間遠心分離し、そして550nmの吸光度が測定されるアッセイ用に上清液を集めた。コントロールチューブは、600単位/mlでスーパーオキシドジスムターゼを含めた同一条件下でセットアップした。
【０１５３】
７．好中球脱顆粒アッセイ
25 mgのCPPDまたは１mgのザイモザンのいずれかを含む1.5 mlのEppendorfチューブを、37℃まで予備加熱した。37℃で、0.5mlの細胞を添加した後、激しく振とうし反応を開始した。適切な時間に、チューブを、10,000gで10秒間遠心分離し、そして0.4 mlの上清を後のアッセイのために-20℃で貯蔵した。
【０１５４】
リゾチームは、Micrococcus lysodeikticus懸濁液の450 nmの吸光度における減少により測定した。簡単に述べれば、Micrococcuslysodeikticusを、0.1 mg/mlで、65 mMのリン酸カリウム緩衝液pH6.2に懸濁し、そして450 nmにおける吸光度を、希釈により0.7単位に調節した。結晶(またはザイモザン)および細胞上清液(100μl)を、2.5mlのMicrococcus懸濁液に添加し、そして吸光度における減少をモニターした。０〜2000単位/mlの範囲にあるリゾチーム標準(ニワトリ卵白)を調製し、そして450nmの吸光度における減少速度に対するリゾチーム濃度の更正グラフを得た。
【０１５５】
ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性は、ジアニシジンの酸化をともなう450 nmの吸光度の増加により測定した。7.8mgのジアニシジンを、音波処理により、3.2 mMで、pH5.5の0.1Ｍクエン酸緩衝液100ml中に溶解した。１mlのキュベットに、0.89 mLのジアニシジン溶液を添加し、次いで１％Tritonｘ100を50μl、水溶液中の0.05％過酸化水素の10μl、および結晶-細胞上清液の50μlを添加した。MPO活性は、以下の等式を用いて、吸光度(450nm)/分の変化、ΔÅ450から測定した：
ジアニシジン酸化(nmol/分)＝50×ΔÅ450
８．好中球生存率
好中球生存率に対する抗微小管剤の影響を測定するために、細胞質マーカー酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出を測定した。脱顆粒実験からの薬物(結晶なし)をともなう細胞を含むコントロールチューブもまた、LDHについてアッセイした。
【０１５６】
Ｂ．結果
すべての実験において、統計学的有意差は、Studentのt-検定を用いて決定し、そして有意差はp＜0.05で主張した。誤差のバーが示されているところは、それらが、所定の数ｎに対する平均値についての１標準偏差を記載する。
【０１５７】
１．好中球生存率
(a) パクリタキセル
37℃で、１時間、46μＭのパクリタキセルで処理した好中球は、コントロールを超える増加したレベルのLDH放出をなんら示さず(常に全体の５％未満)、パクリタキセルは細胞死を引き起こさなかったことを示した。
【０１５８】
(b) フッ化アルミニウム
37℃で、１時間、５〜100 mMの濃度範囲のフッ化アルミニウムで処理した好中球は、コントロールを超える増加したレベルのLDH放出をなんら示さず、フッ化アルミニウムは細胞死を引き起こさなかったことを示した。
【０１５９】
(c) グリシンエチルエステル
37℃で、１時間、0.5〜20 mMの濃度範囲のグリシンエチルエステルで処理した好中球は、コントロールを超える増加したレベルのLDH放出をなんら示さず、グリシンエチルエステルは細胞死を引き起こさなかったことを示した。
【０１６０】
２．化学発光
(a) パクリタキセル
28μMのパクリタキセルは、それぞれ図１Ａ、１Ｂおよび図２Ａに示すように、血漿オプソニン化CPPDおよび血漿オプソニン化ザイモザンの両方の誘導性好中球化学発光の強い阻害を産生した。ピーク化学発光応答の阻害は、CPPDおよびザイモザンについて、それぞれ、52％(+/-12％)および45％(+/-11％)であった。28μMのパクリタキセルによる、血漿オプソニン化CPPDおよび血漿オプソニン化ザイモザンの両方の誘導好中球化学発光の阻害は、３〜16分のすべての時点で有意であった(図１および４Ａ)。図１Ａおよび１Ｂは、血漿オプソニン化CPPD誘導好中球化学発光のパクリタキセル阻害の濃度依存性を示す。すべての実験で、コントロールサンプルは、５mVを超える化学発光値を決して生成せず、そしてこの研究で用いたすべての濃度のパクリタキセルの添加は、コントロールの化学発光値に対して影響を有していなかった。
【０１６１】
(b) フッ化アルミニウム
５〜100 mM濃度のフッ化アルミニウムは、図１Ｃに示すように、血漿オプソニン化ザイモザン誘導好中球化学発光の強い阻害を産生した。この図は、血漿オプソニン化ザイモザン誘導好中球化学発光のAlF3阻害の濃度依存性を示す。この研究で用いたすべての濃度のAlF3の添加は、コントロールの化学発光値に対して影響を有していなかった。
【０１６２】
(c) グリシンエチルエステル
0.5〜20 mM濃度のグリシンエチルエステルは、図１Ｄに示すように、血漿オプソニン化ザイモザン誘導好中球化学発光の強い阻害を産生した。この図は、血漿オプソニン化ザイモザン誘導好中球化学発光のグリシンエチルエステル阻害の濃度依存性を示す。この研究で用いたすべての濃度のグリシンエチルエステルの添加は、コントロールの化学発光値に対して影響を有していなかった。
【０１６３】
(d) LY290181
0.5〜50μM濃度のLY290181は、図１Ｅに示すように、血漿オプソニン化ザイモザン誘導好中球化学発光の強い阻害を産生した。この図は、血漿オプソニン化ザイモザン誘導好中球化学発光のLY290181阻害の濃度依存性を示す。この研究で用いたすべての濃度のLY290181の添加は、コントロールの化学発光値に対して影響を有していなかった。
【０１６４】
３．スーパーオキシド生成
チトクロムＣのスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)阻害可能な還元により測定したときの、血漿オプソニン化CPPD結晶誘導スーパーオキシドアニオン産生の時間経過を図３に示す。28μMのパクリタキセルを用いる細胞の処理は、すべての時点において、生成するスーパーオキシド量の減少をもたらした。この減少は、図３Ａに示されるすべての時点で有意であった。この阻害の濃度依存性は図３Ｂに示される。オプソニン化ザイモザンによるスーパーオキシドアニオン産生の刺激(図４Ｂ)は、CPPD誘導活性化に類似の時間経過を示した。28μMのパクリタキセルによるザイモザン誘導スーパーオキシドアニオン産生の阻害は、CPPD活性化の阻害に比べ劇的ではなかったが、図４Ｂに示されるすべての時点で有意であった。
【０１６５】
17μMのLY290181を用いたCPPD結晶誘導好中球の処置もまた、生成するスーパーオキシドの量の減少をもたらした(図３Ｃ)。
【０１６６】
４．好中球脱顆粒
好中球脱顆粒を、ミエロペルオキシダーゼおよびリゾチームの、血漿オプソニン化CPPD結晶誘導放出により、またはミエロペルオキシダーゼの、血漿オプソニン化ザイモザン誘導放出によりモニターした。血漿コートCPPD結晶を用いて、細胞にサイトカラシンＢの添加の必要性なくして好中球を刺激するとき、これら２つの酵素の十分量が、細胞外培地中に放出されることが示された。図５および２は、血漿コートCPPDにより刺激された好中球からの、それぞれ、MPOおよびリゾチーム放出の時間経過を示す。図５Ａは、パクリタキセルが、結晶-細胞インキュベーションの最初の９分間に、血漿オプソニン化CPPD活性化好中球からのミエロペルオキシダーゼ放出を阻害することを示す。パクリタキセルは、図５Ａで示されるように、すべての時点で、CPPD誘導ミエロペルオキシダーゼ放出を顕著に阻害した。図５Ｂは、CPPD誘導ミエロペルオキシダーゼ放出のパクリタキセル阻害の濃度依存性を示す。
【０１６７】
28μMのパクリタキセルはリゾチーム放出を低減し、そしてこの脱顆粒の阻害は、図２に示されるようにすべての時点で顕著であった。
【０１６８】
好中球が、オプソニン化ザイモザンで刺激されたとき、ほんの小量のMPOおよびリゾチームが放出された。これらの低レベルにも拘わらず、統計学的に有意であった(p＜0.05)28μMのパクリタキセルの存在下で９分間のインキュベーション後のMPO放出の50％阻害をモニターすることが可能であった(データは示さず)。17μMのLY290181を用いたCPPD結晶誘導好中球の処置は、細胞からのリゾチームおよびミエロペルオキシダーゼ放出の両方を低減した（図５Ｃおよび図５Ｄ）。
【０１６９】
Ｃ．考察
これらの実験は、パクリタキセルおよび他の抗微小管剤が結晶誘導好中球活性化の強力なインヒビターであることを示す。さらに、粒子状アクチベータの別の形態であるオプソニン化ザイモザンに対する好中球応答における類似のレベルの阻害を示すことにより、パクリタキセルおよびその他の抗微小管剤の阻害活性が、結晶に対する好中球応答に制限されないことが明らかである。パクリタキセル、フッ化アルミニウム、グリシンエチルエステルおよびLY290181はまた、細胞死を引き起こすことなく、ザイモザン誘導好中球活性化の強力なインイヒビターであることが示された。LY290181は、スーパーオキシドアニオン産生およびCPDD結晶誘導好中球の脱顆粒を低減することが示された。
【０１７０】
（実施例２）
抗原刺激に対するＴ細胞応答
パクリタキセルが、刺激因子(stimulagen)に応答するＴ細胞活性化に影響するか否かを決定するために、TR1Ｔ細胞クローンを、ミエリン塩基性タンパク質ペプチドGP68-88またはレクチンconAのいずれかで、ミセル処方物中の増加する濃度のパクリタキセルの非存在下または存在下で48時間の間刺激した。パクリタキセルは、実験の開始時か、またはペプチドまたはconAを用いて、細胞の24時間刺激後に添加した。トリチウム化チミジン取り込みを、ペプチドまたはconA刺激に応答するＴ細胞増殖の尺度として測定した。
【０１７１】
結果は、Ｔ細胞刺激が、ペプチドGP68-88およびconAに応答して増加したことを示した。コントロールのポリマー性ミセルの存在下で、両方のアゴニストに応答するＴ細胞刺激は改変されなかった。しかし、パクリタキセルミセルを用いた処理は、実験の開始時か、または刺激後24時間目のいずれかで、濃度依存性様式でＴ細胞応答を低減させた。両方の条件下で、Ｔ細胞増殖は、0.02μMパクリタキセルにより完全に阻害された(図79)。
【０１７２】
これらのデータは、パクリタキセルが、抗原誘導刺激に応答するＴ細胞増殖の有効なインヒビターであることを示す。
【０１７３】
（実施例３）
インビトロ滑膜細胞細胞増殖に対するパクリタキセルの影響
トリチウム化チミジン取り込み(滑膜細胞DNA合成の測定)およびインビトロ細胞増殖に対する異なる濃度のパクリタキセルの影響を評価するために、２つの実験を行った。
【０１７４】
Ａ．材料および方法
１．滑膜細胞中への3Hチミジン取り込み
滑膜細胞を、異なる濃度のパクリタキセル(10-5M、10-6M、10-7M、および10-8M)とともに、６または24時間の間連続的にインビトロでインキュベートした。これらの時点で、１×10-6cpmの3Hチミジンを細胞培養に添加し、そして37℃で２時間インキュベートした。細胞を、細胞回収器を通して配置し、フィルターを通じて洗浄し、フィルターを切断し、そしてフィルターセクション中に含まれる照射量を測定した。一旦細胞中に取り込まれたチミジンの量が確かめられると、それは、細胞増殖速度を決定するために用いられた。この実験は３回繰り返し、そしてデータを照らし合わせた。
【０１７５】
２．滑膜細胞増殖
ウシ滑膜線維芽細胞を、異なる濃度のパクリタキセル(10-5M、10-6M、10-7M、および10-8M)の存在下または非存在下で24時間の間増殖させた。この時点の終わりに、生存滑膜細胞細胞の総数を、トリパンブルー染色を用いて色素排除計数により肉眼で測定した。この実験は、４回行い、そしてデータを照らし合わせた。
【０１７６】
Ｂ．結果
１．滑膜細胞中への3Hチミジン取り込み
この研究は、低濃度のパクリタキセルが、10-8Mと同程度の低濃度で、滑膜細胞における3Hチミジンの取り込みを(そして伸長DNA合成により)阻害することを示した。６時間で、高濃度と低濃度のパクリタキセルにより生じる阻害の程度の間の有意な差違はなかった(図８)。しかし、24時間までに、より低濃度の薬物(10-8M)で幾分かの効果が失われたが、なおコントロール動物中で観察されたより実質的に低かった。
【０１７７】
２．滑膜細胞増殖
この研究は、パクリタキセルが、増殖する滑膜線維芽細胞に対して、濃度依存性様式で細胞傷害性であることを示した。10-7Mと同程度の低濃度のパクリタキセルは、滑膜細胞の増殖を阻害し得る(図９)。より高濃度のパクリタキセル(10-6Mおよび10-5M)で、この薬物は、インビトロの滑膜線維芽細胞に細胞傷害性であった。
【０１７８】
Ｃ．考察
上記の研究は、パクリタキセルが、滑膜由来の線維芽細胞の増殖を、インビトロで、比較的低濃度で阻害し得ることを示す。従って、慢性炎症の進行における結合組織の役割および炎症疾患の病因の間のそれらの挙動を考えれば、細胞増殖をブロックすることは、インビボの疾患の結果に好ましく影響する。
【０１７９】
（実施例４）
（インビトロにおけるヒト表皮ケラチノサイトに対するパクリタキセルの活性の特徴付け）
活発に増殖する正常ヒトケラチノサイトおよびHaCATケラチノサイト(自然に不死化したヒト表皮ケラチノサイト)に対するパクリタキセルの時間および用量依存性効果を調査した。
【０１８０】
Ａ．材料および方法
ケラチノサイトに対するパクリタキセルの効果を、細胞数および細胞による3Hチミジン取り込みを測定することにより評価した。チミジン取り込みには、低密度でプレートしたケラチノサイト(10％FCS、グルタミン、抗生物質を補填したDMEM中)を、対数増殖期に６時間０〜10-4Mのパクリタキセル濃度で処理した。3Hチミジンを細胞に添加し、そしてさらに６時間インキュベートした。細胞を回収し、そして放射線活性を測定した。総細胞数を測定するために、ケラチノサイトを記載のようにプレートし、そしてパクリタキセルの存在下および非存在下で４日間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を集め、そしてトリパンブルー排除アッセイにより計数した。
【０１８１】
Ｂ．結果
生存細胞数を、非処理コントロールのパーセントとして測定した。10-9Mのパクリタキセル濃度で、細胞生存率は、非処理コントロールの100％より大きかった。その一方、10-8Mにおける生存率は、87％でわずかにより少なかった(図７)。10-7Mまたはより高い濃度のパクリタキセルでは、細胞生存率が有意に低下した。
【０１８２】
Ｃ．考察
パクリタキセルは、10-7Mと同程度の低濃度で、ヒトケラチノサイトに対して極度に細胞傷害性であった。乾癬において、ケラチノサイトは、異常に増殖する細胞であり、そしてパクリタキセルは、微小管を安定化するので、この有糸分裂が活性な系におけるその影響が期待される。その他の研究では、パクリタキセルは、増殖する滑膜細胞に対して細胞傷害性であるが、増殖しない軟骨細胞に対しては影響を持たないことが見出された。従って、パクリタキセルは、乾癬病変中の過剰増殖する細胞に対して作用し得るが、その一方、正常上皮細胞に対しては細胞傷害性はない。
【０１８３】
（実施例５）
（星状細胞増殖に対するパクリタキセルの影響）
MS病変において線維状の星状細胞の数が増加し、これは、サイトカインおよびマトリクスメタロプロテイナーゼの産生を介するミエリンの破壊に関連すると考えられている(Mastronardiら、J.Neurosci. Res. 36:315-324, 1993; Chandlerら、J. Neuroimmunol. 72:155-161, 1997)。線維状の星状細胞は、線維状の星状細胞増殖の生化学的マーカーとして供される、高レベルの神経膠筋原線維酸性タンパク質(GFAP)を有する。パクリタキセルミセルの星状細胞増殖を阻害する能力は、脱髄疾患のトランスジェニックマウス中で評価された(Mastronardiら、J.Neurosci. Res. 36:315-324, 1993)。
【０１８４】
Ａ．材料および方法
連続的パクリタキセル治療の皮下投与(２mg/kg；３×/週、合計10の注射)を、疾患の臨床的発症時(約４ケ月齢)に開始した。５匹の動物にミセル状パクリタキセルを投与し、２匹のマウスをコントロールとして用いた；１匹のマウスは非処置通常、そして１匹が非処置のトランスジェニック同腹子であった。１匹のトランスジェニックマウスのみをコントロールとして用いた。何故なら、疾患の経過は、当実験室で良く確立されていたからである。４ケ月齢の動物に、MSの神経学的病理の初期徴候が明らかとなった後、ミセル状パクリタキセルを注射した。
【０１８５】
第10回目の注射の後３日目に、実験研究を終了し、そして脳組織を、組織学的分析のために処理した。光学顕微鏡観察には、組織をホルマリンで固定し、そしてパラフィン中に包埋した。切片を、抗GFAP抗体(DACO)で染色し、洗浄し、次いでHPPを結合した二次抗体と反応させた。切片を、HPPについて染色し、そしてヘマトキシリンで対比染色した。電子顕微鏡観察には、組織を、2.5％グルタルアルデヒドおよびリン酸緩衝化生理食塩水(pH7.2)中で固定し、そして１％四酸化オスミウムで後固定した。切片を調製し、そしてJEOL 1200 EXIIトランスミッションEMで観察した。
【０１８６】
Ｂ．結果
神経学的病状が進行するにつれ、トランスジェニックマウスの脳におけるGFAPのレベルが上昇する；これは、存在する線維状の星状細胞の数の増加を反映すると考えられる。対照的に、パクリタキセルで処理されたトランスジェニックマウスは、ほぼ通常レベルのGFAPを有している(表１)。これらのデータは、パクリタキセルが、インビボ星状細胞増殖を阻害し得、それがMSにおける脱髄の防止に寄与し得ることを示唆する。
【０１８７】
【化１】
2009161555.tif 000002
脳組織中のGFAPのさらなる分析を、組織学的に評価した。図78は、通常マウス、パクリタキセルで処置していないコントロールトランスジェニックマウス、およびパクリタキセルで処理したトランスジェニックマウスからの脳切片を示す。
【０１８８】
コントロールトランスジェニックマウスは、より多い数の線維状の星状細胞を有しているが、星状細胞の形態は、通常動物で観察されるそれと類似している(細胞体から拡がる厚い星状突起)。しかし、パクリタキセルで処理されたトランスジェニックマウスでは、線維状の星状細胞の数は有意に減少した。さらに、２つの形態学的変化が観察される：線維状の星状細胞の細胞体は、丸くなるように見え(これは培養でアポトーシスに至ることが示された)、そして細胞突起は、細胞体周囲で非常に薄くなる。
【０１８９】
電子顕微鏡を用いたさらなる微細構造分析は、トランスジェニックマウスの星状細胞が、細胞体から伸びる濃く染色された星状細胞突起により特徴付けられたことを示した。これらの幅広い突起は、生存する活発な細胞を示す、良く組織化された線維のアレイを含む。しかし、パクリタキセルで処理されたトランスジェニック動物中の星状細胞の形態は、細胞円形化、薄い線維状突起、および繊維状タンパク質の細胞内枯渇および組織崩壊により特徴付けられた(図８０)。
【０１９０】
Ｃ．結論
これらのデータは、パクリタキセルが、インビボで、MS病変における最も増殖性の細胞型である線維状の星状細胞の変化を引き起こすことを示す。パクリタキセルがまた、星状細胞突起の機能を阻害しており、従って、ミエリン破壊に関与する細胞事象を改変し得るようである。
【０１９１】
（実施例６）
（内皮細胞増殖に対するパクリタキセルの影響）
パクリタキセルが、内皮細胞増殖を阻害するか否かを決定するために、EOMA細胞(内皮細胞細胞株)を低密度でプレートし、そして増加する濃度のパクリタキセルの非存在下および存在下で48時間インキュベートした。インキュベーションの後、生存細胞の数をトリパンブルー排除アッセイを用いて測定した。(図９に提供される)結果は、10-8M濃度のパクリタキセルが、内皮細胞増殖を、50％以上阻害し、そして10-7M以上の濃度が、細胞増殖を完全に阻害したことを示す。これらのデータは、パクリタキセルが、内皮細胞増殖の有効なインヒビターであることを示す。すべての細胞傷害性アッセイは３回実施し、そして個々の測定を各々３回行った。
【０１９２】
内皮細胞の周期およびアポトーシスに対するパクリタキセルの影響を測定するため、EOMA細胞を、増加する濃度のパクリタキセルの非存在下または存在下で、24時間インキュベートした。細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水中の3.7％ホルムアルデヒドで20分間固定し、DAPI(4'-6-ジアミニド-2-フェニルインドール)、１μg/mlで染色し、そしてエピ蛍光光学下で40×対物レンズで調べた。アポトーシス細胞は、断片化した核および凝縮染色質について細胞を計数することにより評価した。データは、10-8Mより大きいパクリタキセル濃度が内皮細胞アポトーシスを誘導したことを示す(図１０)。
【０１９３】
（実施例７）
（増殖アッセイプロトコル(MTT)）
１日目に、５〜10×104滑膜細胞を、ウェルあたり(96ウェルプレート)にプレートした。カラム番号１を細胞なしにした(ブランク)。２日目にプレートを軽くたたいて培地を捨て、種々の濃度の薬物を含む200μlの培地を添加した。細胞を、６時間、24時間または４日間曝した。カラム番号１および番号２には薬物は添加しなかった(それぞれ、ブランクおよび非処理コントロール)。薬物を含む培地を捨て、そして200μlの新鮮完全培地を添加した。次いで、細胞を、さらに３〜４日増殖させた。５日目に、20μlのジメチルチアゾールジフェニルテトラゾリウム臭素塩(MTT)(５mg/mlＰＢＳ)を添加し、そして37℃で４時間インキュベートさせた。培地をデカントし、そして200μlのDMSOを添加した。プレートを30分間攪拌し、そして562nmの吸光度を読みとった。
【０１９４】
（結果）
データは、処理後に残る細胞数を、非処理コントロールのカラム番号２中の細胞数(細胞数は、アッセイ前になされた標準から得た)で除することにより得た、生存の％として表現した。集団の50％を殺す薬物濃度であるIC50は、図１１Ａ〜Ｅから内挿され得る。24時間曝した場合には、LY290181化合物が、最も有効な抗微小管剤であり、５nM未満のIC50で細胞増殖を低減および阻害することが見いだされた(図Ｃ)。パクリタキセル、エポチロンＢおよびツベルシジンは、それぞれ、約30nM(図Ａ)、45nM(図Ｆ)および45nM(図Ｂ)のIC50でわずかにより少なく有効であった。最終的には、フッ化アルミニウム(AlF3)およびヘキシレングリコールのIC50は、それぞれ、約32μM(図Ｅ)および64mM(図Ｄ)の値で有意により高かった。
【０１９５】
（実施例８）
（マトリクスメタロプロテイナーゼ産生に対するパクリタキセルおよびその他の抗微小管剤の影響）
Ａ．材料および方法
１．IL-1刺激AP-1転写活性は、パクリタキセルにより阻害される
軟骨細胞を、AP-1駆動CATレポーター遺伝子を含む構築物でトランスフェクトし、そしてIL-1で刺激し、IL-1(50ng/ml)を添加し、そして種々の濃度のパクリタキセルの非存在下および存在下で24時間インキュベートした。パクリタキセル処理は、濃度依存様式でCAT活性を低減した(平均±SD)。アスタリスク(*)で注記したデータは、IL-1誘導CAT活性と比較して、t検定に従って、P＜0.05で有意性を有している。示された結果は、３つの独立した実験の代表である。
【０１９６】
２．IL-1誘導AP-1 DNA結合活性、AP-1 DNAに対するパクリタキセルの影響
結合活性を、放射線標識ヒトAP-1配列プローブおよびゲル移動度シフトアッセイを用いてアッセイした。種々の量のパクリタキセル(10-7から10-5M)次いでIL-1β(20ng/ml)で処理しない、または処理した、軟骨細胞からの抽出物を、過剰のプローブと氷上で30分間インキュベートした後、非変性ゲル電気泳動した。「com」レーンは、過剰の非標識AP-1オリゴヌクレオチドを含む。示された結果は、３つの独立した実験の代表である。
【０１９７】
３．IL-1誘導MMP-1およびMMP-3 mRNA発現に対するパクリタキセルの影響
細胞を、種々の濃度のパクリタキセル(10-7から10-5M)で24時間処理した。次いで、IL-1β(20ng/ml)でさらに18時間、パクリタキセルの存在下で処理した。総RNAを単離し、そしてMMP-1mRNAレベルを、ノーザンブロット分析により測定した。次いでブロットを、細片とし、そしてハウスキーピング遺伝子として用いられた、32Ｐ放射線標識ラットGAPDHcDNAで再プローブした。示された結果は、４つの独立の実験の代表である。コラゲナーゼ１およびストロメリシン-発現mRNAのレベルの定量化。MMP-1およびMMP-3発現レベルは、GAPDHで標準化した。
【０１９８】
４．コラゲナーゼ発現に対するその他の抗微小管剤の影響
一次軟骨細胞培養を、ウシ軟骨から新たに単離した。細胞を、100×20mm培養デッシュ中2.5×106/mlでプレートし、そして５％FBSを含むハムF12培地中、一晩、37℃でインキュベートした。細胞を、血清を含まない培地で一晩飢餓させ、次いで種々の濃度の抗微小管剤で６時間処理した。次いで各プレートに、IL-1(20ng/ml)を添加し、そしてプレートを、さらに18時間インキュベートした。総RNAを、酸性化グアニジンイソチオシアネート法により単離し、そして変性ゲル上の電気泳動に供した。変性したRNA試料(15μg)を、１％変性ゲル中ゲル電気泳動により分析し、ナイロンメンブレンに移しそして32Ｐ標識コラゲナーゼcDNAプローブとハイブリダイズした。32Ｐ標識グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロラーゼ(GAPDH)cDNAは、ほぼ等量の充填を確実にするための内部標準である。感光したフィルムをスキャンし、そしてImageQuantを用いて定量的に分析した。
【０１９９】
Ｂ．結果
１．マトリクスメタロプロテイナーゼのファミリーに対するプロモーター
図19Aは、ゼラチナーゼＢを除くすべてのマトリクスメタロプロテイナーゼが、転写要素AP-1およびPEA-3を含んでいたことを示す。コラゲナーゼおよびストロメリシンのようなマトリクスメタロプロテイナーゼの発現が、転写因子AP-1の活性化に依存することは良く確立されている。従って、AP-1のインヒビターは、マトリクスメタロプロテイナーゼの発現を阻害する。
【０２００】
２．AP-1転写活性に対するパクリタキセルの影響
図19Bに示されるように、IL-1は、AP-1転写活性を５倍刺激した。パクリタキセルによる、一時的にトランスフェクトされた軟骨細胞の前処理は、IL-1誘導AP-1レポーター遺伝子CAT活性を低減した。従って、IL-1誘導AP-1活性は、軟骨細胞において、パクリタキセルにより、濃度依存様式(10-7から10-5M)で低減された。これらのデータは、パクリタキセルが、軟骨細胞においてAP-1活性の有効なインヒビターであったことを示した。
【０２０１】
３．AP-1 DNA結合活性に対するパクリタキセルの影響
AP-1活性のパクリタキセル阻害が、非特異的影響に起因しなかったことを確認するため、軟骨細胞核溶解物を用いて、オリゴヌクレオチドへのIL-1誘導AP-1結合に対するパクリタキセルの影響を調べた。図１９Ｃに示されるように、IL-1誘導結合活性は、10-7〜10-5Mの濃度のパクリタキセルで24時間前処理された軟骨細胞からの溶解物で減少した。AP-1転写活性のパクリタキセル阻害は、DNAに対するAP-1結合における減少と緊密に相関していた。
【０２０２】
４．コラゲナーゼおよびストロメリシン発現に対するパクリタキセルの影響
パクリタキセルは、AP-1活性の有効なインヒビターであったので、炎症性疾患に関与する２つの重要なマトリックスメタロプロテイナーゼであるコラゲナーゼおよびストロメリシンの、パクリタキセルまたはIL-1誘導発現の影響を調べた。簡単に述べれば、図20に示されるように、IL-1誘導は、軟骨細胞において、コラゲナーゼおよびストロメリシンmRNAレベルを増大した。軟骨細胞のパクリタキセルによる24時間の前処理は、コラゲナーゼおよびストロメリシンmRNAのレベルを有意に低減した。10-5Mのパクリタキセルで、完全阻害があった。この結果は、パクリタキセルが、AP-1活性を阻害する濃度に類似する濃度で、２つのマトリクスメタロプロテイナーゼの発現を完全に阻害したことを示す。
【０２０３】
５．コラゲナーゼ発現に対する他の抗微小管剤の影響
図１２Ａ〜Ｈは、抗微小管剤がコラゲナーゼ発現を阻害したことを示す。コラゲナーゼの発現は、前炎症性サイトカインであるIL-1の添加により刺激された。種々の抗微小管剤、特に、LY290181、ヘキシレングルコール、重水、グリシンエチルエステル、AlF3、ツベルシジン、エポシロン、およびエチレングリコールビス、(スクシンイミジルスクシネート)を用いた軟骨細胞のプレインキュベーションは、すべて１×10-7Mと同程度の低濃度でIL-1誘導コラゲナーゼ発現を妨げる。
【０２０４】
Ｃ．考証
パクリタキセルは、インビトロで10-6Ｍの濃度でコラゲナーゼおよびストロメライシンの発現を阻害し得た。この阻害は、ゼラチナーゼＢを除く全てのマトリクスメタロプロテイナーゼの誘導に必要とされる工程であるAP-1活性の阻害によって説明され得るので、パクリタキセルがAP-1依存性である他のマトリクスメタロプロテイナーゼを阻害することが予想される。これらのマトリクスメタロプロテイナーゼのレベルは全ての炎症性疾患において上昇しており、そしてマトリクス分解、細胞遊走および細胞増殖、ならびに血管形成において主要な役割を果たす。従って、マトリクスメタロプロテイナーゼ（例えば、コラゲナーゼおよびストロメライシン）の発現のパクリタキセルによる阻害は、炎症性疾患に有利な効果を有する。
【０２０５】
（実施例９）
プロテオグリカンの発現に対する抗微小管剤の効果
初代軟骨細胞培養物を、ウシの軟骨から新鮮に単離した。この細胞を、100mm×20mm培養ディッシュ中１mlあたり2.5×106でプレーティングし、そして５％FBSを含むハムF12培地中で37℃で一晩インキュベートした。この細胞は、無血清培地中で一晩飢餓させ、次いで種々の濃度（10-7M、10-6M、10-5M、および10-4M）の抗微小管剤で６時間処置した。次いで、IL-1（20ng/ml)を各プレートに添加し、そしてこれらのプレートをさらに18時間インキュベートした。総RNAを酸性化グアニジンイソチオシアネート法により単離し、そして変性ゲル上での電気泳動に供した。変性RNAサンプル（15μg）を、１％の変性ゲルにおけるゲル電気泳動により分析し、ナイロンメンブレンに移し、そして32P-標識プロテオグリカン（アグリカン）cDNAプローブとハイブリダイズさせた。32P-標識グリセルアルデヒドリン酸デヒドラーゼ（GAPDH）cDNAを、おおよそ等量の充填を確実にするための内部標準とした。曝露フィルムをスキャンし、そしてImageQuantを用いて定量分析した。
【０２０６】
結果
図13A〜Hは、コラゲナーゼ発現に阻害効果を有した（実施例８）抗微小管剤（具体的には、LY290181、ヘキシレングリコール、重水、グリシンエチルエステル、AIF3、ツベルシジンエポチロン（tubercidinepothilone）、およびエチレングリコールビス−（スクシンイミジルスクシネート））が、評価した全ての濃度で、軟骨マトリクスの主要成分であるアグリカンの発現に影響しなかったことを示す。
【０２０７】
（実施例10）
NF-κB活性（細胞ベースの）アッセイ
IL-1およびTNFの両方は、NF-κBと称する転写因子（これはまた、炎症プロセスに関与する）により駆動される遺伝子の転写を活性化する前炎症サイトカインとして同定された。従って、IL-1およびTNFの炎症効果は、IL-1およびTNFの刺激に応答するレポーター遺伝子アッセイ（NF-κB）により間接的に評価され得る。
【０２０８】
一日目に、NF-κBレポーター構築物（Luciferase、PromegaCorp.）で安定にトランスフェクトしたNIH-3T3（マウス線維芽細胞）を、１ウェル（24ウェルプレート）当たり５×104プレートした。一旦コンフルエントになると（３〜４日目）、細胞を１mlの無血清培地を完全培地と置換することにより飢餓させた。24時間の飢餓の後、細胞を種々の濃度の抗微小管剤で６時間処置し、その後IL-1（20ng/ml）およびTNF（20ng/ml）を添加した。細胞をIL-1およびTNFに１時間および16時間曝露し、そして24時間後にNF-κB活性を測定した。５日目に、培地を捨て、そして細胞をPBSで一回リンスした。次いで、細胞を、250μlの溶解緩衝液（PromegaCorp.Wisconsin）で15分間抽出した。2.5μlの細胞抽出物を含むチューブに25μlのルシフェラーゼ基質を添加することにより、NF-κB転写活性を、評価した。チューブをすぐにルミノメーター（TurnerDesigns）に挿入し、そして光放射を10秒間測定した。次いで、ルシフェラーゼのデータをタンパク質濃度について標準化した。
【０２０９】
結果
このデータを、抗微小管剤がN F-κB誘導において示した阻害（誘導の倍数）を示すことにより表現した。図80A、図80B、図80C、および図80Dに示すように、ツベルシジンおよびパクリタキセルは、IL-1誘導NF-κB活性およびTNF誘導NF-κB活性の両方を阻害した。６時間処理および24時間処理についての、ツベルシジンおよびパクリタキセルの阻害効果は、それぞれ、約10μMおよび２μMであった。
【０２１０】
（実施例11）
パクリタキセルによる腫瘍血管形成の阻害
家畜用のニワトリ受精胚を、殻を除去する前に４日間孵化する。卵の内容物を、周りを空気で囲まれた殻を除去すること、内殻膜を分離すること、殻の反対側に穴を開けること、および平滑端から穏やかに卵の内容物を滑り出させることによって空にする。内容物を、滅菌した丸底ガラス容器へと空け、ペトリ皿の蓋で覆い、そして90％相対湿度および３％二酸化炭素で孵化する。
【０２１１】
MDAY-D2細胞（マウスリンパ系腫瘍）をマウスに注射し、そして腫瘍を0.5〜1.0gの重さになるまで増殖させる。マウスを屠殺し、腫瘍部位をアルコールで拭き、切除し、滅菌組織培養培地に置き、そして層流フード内で１mm角に刻む。切除した腫瘍を９日齢のニワトリ胚に入れる前に、CAM表面を30ゲージ針でおだやかに擦り、腫瘍移植を確実にする。次いで、腫瘍をインキュベーションの８日後（脱殻後４日間）にCAMに入れ、血管供給を確立するために４日間CAM上で増殖させる。４つの胚をこの方法を利用して調製し、各々の胚は３つの腫瘍を受ける。12日目に、胚の３つの腫瘍各々に、20％パクリタキセルを充填したサーモペースト（thermopaste)、充填していないサーモペースト、または処置無しのいずれかを与えた。処置を２日間継続してから結果を記録した。
【０２１２】
外植したMDAY-D2腫瘍は、血管形成因子を分泌し、これは毛細管（CAMに由来する）の内部へ腫瘍塊への成長を誘導し、適切な大きさにまで成長を続けさせる。すべての腫瘍の血管がCAMに由来するが、全ての腫瘍細胞は移植片に由来するので、これらの２つのプロセスに対する治療的介入の効果を独立して評価することが可能である。このアッセイは、以下に対するパクリタキセルを充填したサーモペーストの有効性を決定するのに使用されている：（a）腫瘍の血管新生の阻害および（ｂ）腫瘍細胞自身の増殖の阻害。
【０２１３】
この研究からの固定組織の、直接インビボ実体顕微鏡による評価および組織学的検査は以下を実証した。20％パクリタキセルを充填したサーモペーストで処置した腫瘍において、コントロール腫瘍（図14Aおよび図14B）と比較した場合、腫瘍に供給する血管の数の減少（図14Cおよび図14D）、腫瘍内の血管の数の減少、および腫瘍の周辺（代表的には固形腫瘍内に非常に高度に血管新生している領域）の血管の数の減少が存在した。腫瘍は、研究が行われた２日間の間に、大きさおよび質量が小さくなり始めた。さらに、多くの内皮細胞が細胞分裂を停止していることが見られ、これは、内皮細胞増殖が影響を受けたことを示唆する。腫瘍細胞はまた、しばしば、細胞分裂を停止していることが見られた。４つの胚全てが、20％パクリタキセルを充填したサーモペーストが腫瘍血管新生を抑制するが充填していないサーモペーストは効果が無かった点で一致するパターンを示した。
【０２１４】
比較すると、充填していないサーモペーストで処置したCAMにおいて、腫瘍は正常な周辺組織のものと比較した場合に、血管の数および密度の増加、およびパクリタキセルを充填したペーストで処置した腫瘍において観察されるよりも劇的に多い血管を伴って、良好に血管新生した。新たに形成された血管は、輪の中心に結合するスポークのように見える全ての角度から腫瘍に進入していた（図14Aおよび図14B）。コントロール腫瘍は、本研究の過程の間、大きさおよび質量の増加を続けた。組織学的には、多くの膨脹した薄壁毛細管が腫瘍の周囲に見られ、そして細胞分裂している内皮細胞は殆ど見られなかった。腫瘍組織は、良好に血管新生し、そしてずっと生存していた。
【０２１５】
例として、同一のCAMに入れた２つの類似の大きさ（当初、外植時）の腫瘍において、以下のデータを得た。20％パクリタキセルを充填したサーモペーストで処置した腫瘍について、腫瘍は330mm×597mmの大きさであった；腫瘍のすぐ周辺には14の血管を有するが、腫瘍塊は、３〜４の細い毛細管のみを有する。充填していないサーモペーストで処置した腫瘍について、腫瘍の大きさは623mm×678mmであった；腫瘍のすぐ周辺には54の血管をするが、腫瘍塊は、12〜14の細い血管を有する。さらに、周囲のCAM自身は、パクリタキセル処置腫瘍の周辺領域と比較してはるかに多い血管を含んでいた。
【０２１６】
本研究は、サーモペーストが腫瘍増殖および発生に伴う病理学的な血管形成を阻害するのに充分な量のパクリタキセルを放出することを示す。これらの条件下で、血管形成は、組織周辺から腫瘍塊への毛細管の内側への伸長を誘導し得る血管形成因子を産生する腫瘍細胞によって最大限に刺激される。20％パクリタキセルを充填したサーモペーストは、このプロセスをブロックし得、そして適切な血液供給を維持する腫瘍組織の能力を制限し得る。これは、腫瘍細胞自身に対するこの薬物の細胞傷害性効果を介すること、および成長および増殖に必要とされる栄養素を組織から枯渇させることの両方による、腫瘍塊の減少をもたらす。
【０２１７】
（実施例12）
パクリタキセルによる血管形成の阻害
Ａ．ニワトリ絨毛尿膜（「CAM」）アッセイ
家畜用の受精ニワトリ胚を、殻無し培養の前に３日間孵化した。この手順において、卵の内容物を周りを空気で囲まれた殻を除去することによって空にした。次いで、内殻膜を分離し、そして殻の反対端に穴を開けて卵の内容物を平滑端からおだやかに滑り出させた。卵の内容物を滅菌した丸底ガラス容器に空け、そしてペトリ皿蓋で覆った。次いで、これらを90％相対湿度、および３％CO2で孵化器に置き、そして３日間孵化した。
【０２１８】
パクリタキセル（Sigma、St .Louis、MI）を、0.5％水性メチルセルロースの10μlアリコートあたり、0.25、0.5、１、５、10、30μgの濃度で混合した。パクリタキセルは水に不溶性であるので、ガラスビーズを使用して細かな粒子を生成した。この溶液の10μlアリコートをパラフィルム上で１時間乾燥させ、直径２mmのディスクを形成させた。次いで、パクリタキセル含有乾燥ディスクを、孵化６日目の各CAMの成長端に慎重に置いた。コントロールは、パクリタキセルを含まないメチルセルロースディスクを同じ時間経過でCAM上に置くことによって得た。２日間の曝露後（孵化８日目）、脈管構造を実体顕微鏡の助けを用いて試験した。白色の不透明溶液であるLiposynIIをCAMに注射して、脈管の詳細の可視性を増大させた。染色されていない、生きている胚の脈管構造を、ビデオカメラ（Dage-MTI Inc.,Michigan City、IN）と接続されたZeiss実体顕微鏡を用いて画像化した。次いで、これらのビデオ信号を、160×の倍率で表示し、そして画像分析システム（Vidas、Kontron；Etching、Germany）を用いて捕獲した。次いで、画像のネガをグラフィックレコーダー（Model3000；Matrix Instruments、Orangeburg、NY）上で作製した。
【０２１９】
８日齢の殻無し胚の膜を、0.1Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中の２％グルタルアルデヒドに浸した。さらなる固定剤をCAMの下に注射した。10分間のインサイチュの後、CAMを除去し、そして室温で２時間新鮮な固定剤中に入れた。次いで、組織を、６％のスクロースを含むカコジル酸緩衝液中で一晩洗浄した。目的の領域を１％四酸化オスミウム中で４℃で1.5時間後固定した。次いで、組織を特級エタノール中で脱水し、溶媒をプロピレンオキシドと交換し、そしてSpurr樹脂中に包埋した。薄い切片をダイヤモンドナイフで切り、銅グリッドに置き、染色し、そしてJoel1200EX電子顕微鏡で試験した。同様に、0.5mm切片を切り、そして光学顕微鏡のためにトルエンブルーで染色した。
【０２２０】
発生11日目に、ニワトリ胚を、腐食鋳造技術のために使用した。Mercox樹脂（TedPella、Inc.、Redding、CA）を、30ゲージの皮下用針を用いてCAM脈管構造に注射した。鋳造材料は2.5グラムのMercox CL-2Bポリマーおよび0.05グラムの触媒（55％ベンゾイルペルオキシド）からなり、５分間の重合時間を有する。注射後、プラスチックをインサイチュに１時間室温で放置し、次いで65℃で一晩オーブンに放置した。次いでCAMを、水酸化ナトリウムの50％水溶液に入れてすべての有機成分を消化した。プラスチック鋳造物を徹底的に蒸留水で洗浄し、風乾し、金／パラジウムでコーティングし、そしてPhilips501B走査型電子顕微鏡で観察した。
【０２２１】
上記の実験の結果を図15〜18に示す。手短には、正常なニワトリの殻無し卵培養の一般特性を図15Aに示す。インキュベーションの６日目に、胚を血管の放射状に拡張する網に対して中心に配置した。CAMは胚に隣接して発生した。これらの成長する血管は表面に近接して存在し、そして容易に可視であり、そのためこの系を血管形成の研究のために理想化されたモデルとなる。CAMの、生きていて、染色されていない毛細管網は、実体顕微鏡で非侵襲性に画像化され得る。図15Bは、このような脈管化領域を示し、ここで毛細管内の細胞血液要素をビデオ／コンピューターインターフェースの使用により記録した。このようなCAM毛細管網の三次元構造を、腐食鋳造方法によって示し、そして走査型電子顕微鏡で観察する（図15C）。これらの鋳造によって、底にある血管がCAMの表面に向かって放射し、そこで、吻合毛細管の単層を形成することが明らかになった。
【０２２２】
CAMを横断する断面図は、二重細胞膜、外胚葉に隣接して存在する毛細管を含む、より広い中胚葉層、外膜細胞、および内部の単一内胚葉細胞層からなる外側の外胚葉を示す（図15D）。電子顕微鏡レベルで、CAM毛細管の代表的な構造の詳細を示す。代表的には、これらの血管は、外胚葉の内部の細胞層と緊密に関連する位置に存在する（図15E）。
【０２２３】
0.25、0.5、１、５、10、または30μgの濃度のパクリタキセルに48時間曝露した後、各CAMを、血管形成に対する効果を評価するために、ビデオ／コンピューターインターフェースを備えた実体顕微鏡を用いて、生きている条件下で試験した。この画像化設定において、160×倍率が使用され、これによって毛細管内の血液細胞の直接の可視化が可能になり；それにより、目的の領域における血流が容易に評価され、そして記録され得た。本研究について、血液形成の阻害を、毛細管網および血管血流を欠くCAMの領域（直径２〜６mmと測定される）と規定した。実験を通して、無血管域を４点の無血管勾配で評価した（表１）。この段階は、全体の阻害の程度を表し、そして最大の阻害を無血管勾配段階において３で表す。パクリタキセルは、非常に一致しており、そしてその濃度に依存して48時間以内に最大の無血管域（直径６mmまたは無血管勾配段階で３）を誘導した。
【０２２４】
【化２】
2009161555.tif 000003
種々の治療剤の異なる濃度での効果の用量依存性の実験データを表２に示す。
【０２２５】
【化３】
2009161555.tif 000004
【０２２６】
【化４】
2009161555.tif 000005
【０２２７】
【化５】
2009161555.tif 000006
【０２２８】
【化６】
2009161555.tif 000007
【０２２９】
【化７】
2009161555.tif 000008
【０２３０】
【化８】
2009161555.tif 000009
代表的なパクリタキセル処置CAMはまた、直径６mmと測定される無血管域に対して中心に位置する透明のメチルセルロースディスクとともに示す。いくらか高い倍率で、このような無血管域の周辺は明らかに明瞭である（図16C）；周辺の機能的な血管は、しばしば、パクリタキセルの供給源から再配向されていた（図16Cおよび図16D）。このような血流の曲がった再配向は、決して正常な条件下では観察されなかった。パクリタキセルの効果の別の特徴は、血液細胞凝集を示す無血管域内での血島の形成であった。
【０２３１】
パクリタキセル処置CAMの関連する形態学的変化は、光学顕微鏡および電子顕微鏡レベルの両方で容易に明らかになる。簡便な提示のために、正常から無血管状態までの一般的な転移の３つの異なる相を示す。無血管域の周辺付近では、CAMは、３つの全ての胚葉内の分裂期の細胞の豊富さによって特徴づけられる（図17Aおよび図18A）。この増強された有糸分裂はまた、毛細管内皮細胞についての観察と一致していた。しかし、内皮細胞は、血液細胞の血管外溢出を伴わないで無傷で接合部に留まっていた。さらなる分解とともに、CAMは、毛細管の崩壊および溶解によって特徴づけられる（図17Ｂおよび図18B）。推定上の内皮細胞は、代表的には、分裂を停止しているが、血液細胞との空間的に緊密な関係を維持し、そして外胚葉の下に存在する。しかし、これらの細胞は、接合部では連結していない。無血管域の最も中心部分は、厚くなった外胚葉層および内胚葉層によって特徴づけられる（図17Cおよび図18C）。これらの層は、厚くなっていたが、細胞接合部は、無傷のままで、そして層はそれらの構造的な特徴を維持していた。中胚葉内において、散在した分裂停止細胞が豊富であった。これらの細胞は、以前の相で観察された内皮細胞の局在化を示さなかった。また、この無血管域を通して、変性細胞は、電子が濃い液胞および細胞残渣によって示されるように通常であった（図18C）。
【０２３２】
まとめると、本研究によって、パクリタキセルのCAMへの適用後48時間で血管形成が阻害されたことが示された。血管阻害は、パクリタキセルの効果の３つの遷移相によって代表される無血管域を形成した。無血管域の中心の最も影響を受けた領域は、溢出した赤血球を伴う壊れた毛細管を含んでいた。これは、内皮細胞間の細胞間接合部が存在しなかったことを示した。外胚葉および内胚葉の細胞は、それらの細胞間接合部を維持し、それによりこれらの胚葉が無傷のままであった。しかし、それらは、わずかに厚くなっていた。正常の血管域に近付くにつれ、血管は、それらの接合部複合体を保持し、それによってまた無傷のままであった。パクリタキセル処置域の周辺では、さらなる血管増殖が阻害された。これは、血管の代表的な再配向すなわち「くの字曲がり」効果によって明らかであった（図16D）。
【０２３３】
パクリタキセル処置無血管域によってまた、CAMの３つの全ての胚葉において多くの細胞が分裂停止していることが明らかになった。これは、パクリタキセルに特有であった。なぜなら、以前の研究においてはそのような事象は示されていないからである。分裂停止することによって、内皮細胞は、血管形成に関与する、それらの正常な代謝機能を受け得ない。比較すると、スラミンおよび酢酸コルチゾンによって形成された無血管域は、CAMにおいて分裂停止細胞を産生しない。それらは、処置された領域へのさらなる血管成長を抑制しただけであった。従って、たとえ、これらの因子が抗血管形成因子であるとしても、血管形成過程が標的化されうる点は多く存在する。
【０２３４】
パクリタキセルの48時間の期間にわたる効果もまた、観察した。この期間の観察の間に、適用後９時間後にすでに血管形成の阻害が起こっていることが認められた。組織学的な切片によって、図17Aおよび図18Aにおいて示される48時間後での無血管域の第一の遷移相に見られるのと類似の形態が明らかになった。また、本発明者らは、以前に観察された無血管域への再血管形成過程を観察した。ヘパリンおよび止血性ステロイドによって形成された無血管域が、適用後60時間後に再血管形成されたことが見い出された。１つの研究において、パクリタキセル処置無血管域は、適用後少なくとも７日間再血管形成せず、これは、より長期の強力な効果を示唆した。
【０２３５】
（実施例13）
（LNCaP細胞増殖に対するパクリタキセルおよびカンプトテシンの効果）
材料および方法
LNCaP細胞を、96ウェルプレートにそれぞれ、２×103細胞／ウェルおよび１×103細胞／ウェルの濃度で播種した。48時間後、異なる濃度のパクリタキセルまたはカンプトテシン（25μl）を各培養ウェルに添加し、そしてプレートを37℃で５日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１％グリセルアルデヒド溶液で固定し、そして0.5%クリスタルバイオレットで５分間染色した。色素は、100μlの緩衝液で連続的に溶出し、そして吸光度を、492nmの吸光度の波長を用いて、TitertekMultiskanマイクロプレート読み取り機で読み取った。細胞増殖を、化合物の非存在下でのコントロールウェル（100％に設定）に対する百分率として表現した。
【０２３６】
結果
パクリタキセルは、約0.09nMのEC50でLNCaP細胞増殖を阻害した。アポトーシス実験をDNA断片化アッセイを用いて、パクリタキセル処置後にウェル中の細胞で実施した。細胞の広範なアポトーシスが観察された。これは、パクリタキセルがアポトーシス機構によって細胞傷害性であることを示唆する。
【０２３７】
カンプトテシンのLNCaP細胞に対する細胞傷害性作用は、極めて強力であった。0.001nMという低い濃度でさえ、60％を超える細胞に毒性であった。従って、この薬物のLNCaP細胞に対するEC50は、フェムトモル濃度範囲にあるに違いない。
【０２３８】
【化９】
2009161555.tif 000010
コントロールの492nm吸光度＝0.49±0.06
【０２３９】
【化１０】
2009161555.tif 000011
コントロールの492nm吸光度＝0.47±0.05。
【０２４０】
（実施例14）
さらなる抗微小管剤の抗血管形成活性
パクリタキセルに加えて、他の抗微小管剤も同様に、ポリマーキャリア内に取り込まれ得る。以下に提供する代表的な例は、カンプトテシン（campothecin）およびビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチンおよびビンクリスチン）を含み、そして微小管安定化剤（例えば、ツベルシジン、フッ化アルミニウムおよびLY290181）を含む。
【０２４１】
Ａ．PCLへの薬剤の組込み
薬剤は、乳鉢および乳棒で挽いて、粒子径を５ミクロン未満に減じた。次いで、これを乾燥粉末としてポリカプロラクトン（分子量18,000、Birmingham Polymers、AL USA）と混合した。混合物を65℃に５分間加熱し、そして融解ポリマー／薬剤混合物を５分間滑らかなペーストへと撹拌した。次いで、融解ペーストを１mlシリンジへ入れ、そして押し出して３mgのペレットを形成した。次いで、これらのペレットを妊娠６日目にCAMに入れてそれらの抗血管形成特性を評価した。
【０２４２】
Ｂ．CAMに対するカンプトテシンを充填したPCLペーストの効果
カンプトテシンを充填したサーモペーストは、コントロールのPCLペレットと比較した場合に血管形成を阻害するに有効であった。５％の薬物を充填して、試験した4/5のCAMが強力な血管形成阻害を示した。さらに、１％および0.25％を充填して、それぞれ、2/3および3/4のCAMが血管形成阻害を示した。それゆえ、これらの結果から、カンプトテシンがPCLサーモペーストから十分に放出され、そして治療的抗血管形成効力を有することは明白である。
【０２４３】
Ｃ．ビンブラスチンを充填したPCLペーストおよびビンクリスチンを充填したPCLペーストのCAMに対する効果
処方物をCAMに対して試験する場合、薬剤が生物学的効果を誘発するに充分な量でPCLペレットから放出されたことは明白であった。ビンブラスチンおよびビンクリスチンの両方は、コントロールPCLサーモペーストペレットと比較した場合、CAMアッセイにおいて抗血管形成効果を誘導した。
【０２４４】
0.5％および0.1％の薬物充填濃度で、ビンクリスチンは、試験したCAMの全てで血管形成阻害を誘導した。２％を超える濃度を試験した場合、有毒な薬物レベルに達し、そして予期しなかった胚の死が起こった。
【０２４５】
ビンブラスチンはまた、0.25％、0.5％および１％の濃度でCAMに対して血管形成を阻害するに有効であった。しかし、２％を超える濃度では、ビンブラスチンは胚に対して毒性であった。
【０２４６】
Ｄ．ツベルシジンを充填したPCLペーストのCAMに対する効果
ツベルシジンを充填したペーストは、コントロールペレットと比較した場合、血管形成を阻害するに有効であった。１％薬物充填で、ツベルシジンは、試験した1/3のCAMで血管形成阻害を誘導した。しかし、５％薬物充填を超える薬物濃度では、ツベルシジンは、2/3のCAMにおいて協力に血管形成を阻害した。従って、これらの結果から、ツベルシジンは、PCLペーストから充分に放出され、そして強力な抗血管形成活性を有することは明白であった。
【０２４７】
Ｅ．フッ化アルミニウムを充填したPCTペーストのCAMに対する効果
フッ化アルミニウム（AlF3）を充填したPCLペーストは、コントロールペレットと比較した場合、20％薬物充填で血管形成を阻害するに有効であった。20％薬物充填で、2/4のCAMが、直径２〜６mmと測定される無血管域によって明らかなように、血管形成阻害を示した。しかし、より低い薬物充填である１％および５％では、血管形成阻害は明白ではなかった（それぞれ、0/6のCAMおよび0/5のCAM）。従って、フッ化アルミニウムは、より高い薬物濃度でのみ血管形成阻害を誘導するに有効であった。
【０２４８】
Ｆ．LY290181を充填したPCLペーストのCAMに対する効果
５％LY290181を充填したPCLペーストのCAMに対する評価によって、LY290181が試験した1/3のCAMにおいて血管形成阻害を誘発したことが示された。しかし、１％薬物充填で、LY290181は抗血管形成応答を誘発しなかった（n=2）。
【０２４９】
（実施例15）
パクリタキセルの非増殖性細胞の生存度に対する効果
疾患改変剤が、慢性炎症の発症の間に過度に生じる、種々の適切でない細胞活性（増殖、炎症、タンパク質分解酵素産生）を強力に阻害し得ることは重要であるが、正常組織に対して毒性であってはならない。特に、正常細胞が障害を受けないことは重要である。なぜなら、これは、疾患の進行をもたらすからである。本実施例では、パクリタキセルの正常な非分裂細胞のインビトロでの生存度に対する効果を、コンフルエンスにまで増殖させた培養軟骨細胞を利用して試験した。
【０２５０】
手短には、軟骨細胞を、パクリタキセルの存在（10-5M、10-7M、および10-9M）下または非存在下（コントロール）下で72時間インキュベートした。この期間の最後に、生存している細胞の総数を、トリパンブルー染色除外によって肉眼で決定した。この実験はを４回行い、そしてデータを照合した。
【０２５１】
この実験結果を図21に示す。手短には、図21から明白なように、パクリタキセルは、高濃度（10-5M）のパクリタキセルでさえ、正常の非増殖性細胞のインビトロでの生存度には影響しなかった。より詳細には、以前の実施例において記載された病理過程を遮断するに充分な薬物濃度でさえ、正常軟骨細胞に対する細胞傷害性は存在しない。
【０２５２】
（実施例16）
局所的なパクリタキセル処方物のための透過増強剤の選択
Ａ．種々の増強剤におけるパクリタキセルの溶解性
以下の透過増強剤を試験した。Transcutolョ、エタノール、プロピレングリコール、イソプロピルミリステート、オレイン酸、およびTranscutol：イソプロピルミリステート（9:1v:v）。ガラスバイアル中の１mlの各増強剤を予め37℃に加熱し、そして過度のパクリタキセルを添加した。各バイアルからの0.5mlの液体のサンプルを37℃、および13000rpmで２分間遠心分離した。遠心分離チューブからの上清のアリコート（0.1ml）を、メスフラスコに移し、そしてメタノールで希釈した。パクリタキセル含量を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって評価した。
【０２５３】
（Ｂ．分配係数）
特定量のパクリタキセルを37℃に加熱した増強剤の一定容積に溶解した。この溶液のアリコート（1ml）を４mlのガラスバイアル中の1mlのオクタノールへ添加した。次いで、リン酸緩衝化生理食塩水（1ml）（pH7.4）を添加し、そしてバイアルをボルテックスして、乳濁液を作製した。バイアルを37℃のオーブンに16時間入れ、その後、0.1mlのオクタノール相を各バイアルから取り出し、そして9.9mlのメタノールを用いて希釈した。水相について、0.5mlをオレイン酸のバイアルおよびイソプロピルミリステートのバイアルからサンプリングし、そして0.5mlをプロピレングリコールのバイアルからサンプリングし、そして0.5mlのメタノールで希釈した。Transcutolバイアルから、0.1mlをサンプリングし、そして9.9mlの50:50Transcutol：PBSで希釈し、そして0.1mlをエタノールのバイアルからサンプリングし、そして50：50のエタノール：PBSで希釈した。パクリタキセル含量をHPLCで決定した。各決定を三連で実施した。
【０２５４】
Ｃ．結果
37℃での各増強剤におけるパクリタキセルの溶解度を表１に列挙する。
【０２５５】
【化１１】
2009161555.tif 000012
オクタノール／水分配係数Ko/wを表２に列挙する。
【０２５６】
【化１２】
2009161555.tif 000013
有効に作用させるために、パクリタキセルは生きている表皮の下層にまで皮膚を透過しなければならない。薬物が生きている表皮を透過することは確立されており、薬物は、100に近いオクタノール／水分配係数を有していなければならない（Hadgraft J.H.およびWalters K.、Drugabsorption enhancement、A.G. de Boers編、Harwood Publishers、1994）。表１および表２の結果に基づき、プロピレングリコールおよびTranscutolが、パクリタキセルの溶解およびその油相から水相への分配の増強の最良の組合せを示した。
【０２５７】
しかし、Transcutolおよびプロピレングリコールの両方によって産生されるKo/wは、いくらか低くあり得、それゆえ、それらは、オクタノール相におけるパクリタキセルの溶解度を増大するために無限大のKo/wを有するイソプロピルミリステートと合わされた。イソプロピルミリステートおよびTranscutolを１：９の容積比で混合した。イソプロピルミリステートは、Transcutol中に室温で容易に溶解した。均質な相を形成させるために、プロピレングリコールおよびイソプロピルミリステートもまた、エタノールと、4:3.5:0.5のプロピレングリコール：エタノール：イソプロピルミリステートの比で混合した。Ko/wの結果を表３に示す。
【０２５８】
【化１３】
2009161555.tif 000014
イソプロピルミリステートのTranscutolへの添加は、分配係数の有意な増加をもたらした。しかし、プロピレングリコール：エタノール：イソプロピルミリステート溶液の分配係数は、プロピレングリコール単独の分配係数よりも有意な改良をもたらさなかった。この最後の結果、およびエタノールが乾癬状態を悪化させるという事実によって、この増強剤の組合せを、さらなる考慮から効率的に除外した。さらに、イソプロピルミリステートの添加は、実際に、パクリタキセルの溶解度をTranscutol単独における溶解度よりも増加させた。パクリタキセルのTranscutolにおける溶解度は346.9mg/mlであったが、イソプロピルミリステートの組合せにおいては、Transcutol：溶解度は353.9mg/mlに増加した。従って、この増強剤の組合せを皮膚研究に選択した。
【０２５９】
（実施例17）
局所的パクリタキセル処方物の調製および分析
Ａ．パクリタキセル軟膏Ａの調製
Transcutol（3.2g）、イソプロピルミリステート（0.3g）、ラブラソール（2.5g）、パクリタキセル（0.01g）および0.5mCi/ml3Hパクリタキセル（0.3ml）を、20mlのシンチレーションバイアル中で合わせた。別々のシンチレーションバイアル中に、ラブラフィル（2.5g）、アルラセル165（1.2g）およびコンプリトール（0.3g）を合わせ、そして完全に融解するまで70℃で加熱した。最初のシンチレーションバイアルの内容物をこの融解物に添加し、均質になるまでボルテックスし、そして放冷した。
【０２６０】
Ｂ．パクリタキセル軟膏Ｂの調製
Transcutol（2.5g）、イソプロピルミリステート（1.0g）、ラブラソール（labrasol）（2.5g）、パクリタキセル（0.01g）および0.5mCi/ml3H-パクリタキセル（0.3ml）を、20mlのシンチレーションバイアル中で合わせた。別々のシンチレーションバイアル中に、ラブラフィル（labrafil）（2.5g）、アルラセル（arlacel）165（1.2g）およびコンプリトール（compritol）（0.3g）を合わせ、そして完全に融解するまで70℃で加熱した。最初のシンチレーションバイアルの内容物をこの融解物に添加し、均質になるまでボルテックスし、そして放冷した。
【０２６１】
Ｃ．皮膚の調製、および透過研究
凍結し、切除したユカタンミニブタの皮膚を使用するまで−70℃に保存した。皮膚サンプルを、凍結皮膚からディスクを穴開けするためのno.10のコルク穴開け器を用いて調製した。サンプルをストレプトマイシン−ペニシリン溶液でリンスし、そして凍結用バッグに入れ、そして−70℃で保存した。
【０２６２】
皮膚切片を、角質層を上にしてFranz拡散セル上にマウントした。底の受取溶液はR.O水中の0.05％アモキシシリン溶液であった。供与セルを、各皮膚表面に取り付けた。パクリタキセル軟膏を融解するまで（40〜50℃）加熱し、そしてシリンジ中に入れた。まだ融解している間に、0.1mlを各皮膚表面に押し出した。供与セルをガラスディスクで覆い、そしてこの集合体を24時間放置した。
【０２６３】
24時間後、セルを取り外し、過剰な軟膏を除去し、そしてシンチレーションバイアルに保存した。皮膚表面を、3mlのジクロロメタン（DCM）で素早く洗浄し、そして乾燥させた。洗浄DCMを過度の軟膏と同じバイアルに保存した。皮膚切片および受取溶液を別々のシンチレーションバイアルに入れた。皮膚を−30℃で30μm断片にに凍結切片化（cryotome）し、そして別々のバイアルに採取した。最初に刈り取ったものおよび残っている皮膚もまた、別々のバイアルに採取した。切片化した皮膚サンプルを各バイアルに0.5mlの組織溶解剤を添加することにより溶解した。サンプルを一晩放置して室温で溶解させた。翌日、３mlのシンチレーション混液をバイアルに添加した。DCM洗浄溶液について、100μlを１mlのアセトニトリルに移し、次いで３mlのシンチレーション混液を添加した。全ての溶液の放射能をβカウンターを用いて測定した。
【０２６４】
皮膚サンプルをFranz分散セルにマウントし、そして３群に分割した。各サンプルを適切に処置した（処置なしまたはパクリタキセル含有軟膏Ｂもしくは非含有軟膏Ｂ）。24時間後、サンプルを取り出し、そして標準的な組織学技術を用いて処理した。
【０２６５】
Ｄ．結果
組織学的切片から、処理していない皮膚の角質層切片が50〜120μmの間の厚さであることが見い出された一方、生きている表皮は400〜700μmの厚さであった。３％w/wイソプロピルミリステートを含んだ軟膏（軟膏Ａ）について、皮膚におけるパクリタキセルの濃度は、角質層および生きている表皮全体において、本質的に１μg/ml（1.2×10-6M）で一定であった。10％w/wイソプロピルミリステートを含んだ軟膏（軟膏Ｂ）について、パクリタキセルの濃度は、角質層および生きている上皮全体において、一定であったが、角質層においてより高かった（６μg/ml対２μg/ml）。各軟膏試験のための受取溶液中の放射能は存在せず、このことは、パクリタキセルが皮膚切片を完全には透過しなかったことを示唆した。
【０２６６】
パクリタキセルを含む軟膏を適用した場合、全体としては差異は認められなかった。
【０２６７】
（実施例18）
乾癬の処置のためのパクリタキセルの全身用処方物の開発
乾癬の重篤な症例において、より積極的な処置が受容可能と見なされ、それゆえパクリタキセルでの全身処置に関連する毒性は受容可能であり得る。
【０２６８】
パクリタキセルのための全身用処方物は、両親媒性ジブロックコポリマー（copyolymer）を含む。このコポリマーは、水溶液中で、水中で疎水性の芯および親水性の殻からなるミセルを形成する。ポリ（DL-ラクチド）−ブロック−メトキシポリエチレングリコール（PDLLA-MePEG）、ポリカプロラクトン−ブロック−メトキシポリエチレングリコール（PCL-MePEG）およびポリ（DL-ラクチド-コ-カプロラクトン）−ブロック−メトキシポリエチレングリコール（PDLLACL-MePEG）のジブロックコポリマーは、大量融解重合化手順（bulkmelt polymerization
procedure）、または類似の方法を用いて合成され得る。手短には、所定量のモノマーDL-ラクチド、カプロラクトン、および異なる分子量を有するメトキシポリエチレングリコールを加熱（130℃）して、窒素通気下で融解させ、そして撹拌した。触媒オクタン酸スズ（0.2％w/w）を融解したモノマーに添加した。重合化を４時間実施した。分子量、臨界ミセル濃度、および最大のパクリタキセルを充填したを、それぞれ、GPC、蛍光、および溶解性試験で測定した（図22）。高いパクリタキセル保有能力が得られた。パクリタキセルを溶解する能力は、組成物およびコポリマーの濃度に依存する（図22および図23）。PDLLA-MePEGが最も安定した溶解パクリタキセルを与えた（図23および図24）。
【０２６９】
ポリマーミセルの内部芯内の強力な会合は、パクリタキセルのような疎水性薬物を運ぶための高容量の環境を提示する。これらの薬物は、ブロックコポリマーと共有結合してミセル構造を形成し得るか、または物理的にミセルの疎水性の芯内へと取り込まれ得る。ミセルからの薬物放出の機構は、芯からの拡散および単一のポリマー鎖とミセルとの間の交換を含む。小さな大きさのミセル（通常100nm未満）は、大きな粒子の注射に関連する困難を解消する。
【０２７０】
（実施例19）
サーモペーストの生成手順
20mlガラスシンチレーションバイアル中の５gのポリカプロラクトン（分子量10,000〜20,000）（Polysciences、WarringtonPenn. USA）を50mlの測定した水を含む600mlビーカー中へ入れた。ビーカーを穏やかに65℃に加熱し、そしてその温度をポリマーが融解するまで20分間維持した。既知量のパクリタキセルまたは他の血管形成インヒビターを、65℃で完全に混合して融解ポリマーとした。融解ポリマーを予め加温した（60℃オーブン）鋳型へ注ぎ、そしてポリマーが固化するまで放冷した。ポリマーを小片（約２mm×約２mmの大きさ）に切り、そして１mlのガラスシリンジに入れた。
【０２７１】
次いで、ガラスシリンジを、ポリマーが完全に融解するまで、65℃（コーニングホットプレート）で蒸留水を含む500mlガラスビーカー中に直立して置いた（下向きに先端に栓をした）。次いで、プランジャをシリンジに挿入して融解ポリマーを容器の先端で粘着性の塊へと圧縮した。シリンジにキャップをし、そして室温にまで放冷した。
【０２７２】
適用のために、シリンジを60℃に再加熱し、そして体温にまで冷却した場合に固化する液体として投与した。
【０２７３】
（実施例20）
PDLLA-PEG-PDLLAおよび低分子量ポリ（D,L乳酸）を用いたサーモペーストからのパクリタキセルの放出の改変
Ａ．PDLLA-PEG-PDLLAおよび低分子量PDLLAの調製
DL-ラクチドをAldrichから購入した。分子量8,000を有するポリエチレングリコール（PEG）、オクタン酸スズ、およびDL-乳酸をSigmaから得た。分子量20,000を有するポリ−ε−カプロラクトン（PCL）をBirminghamPolymers（Birmingham、AL）から得た。パクリタキセルをHauser Chemicals（Boulder、CO）から購入した。狭い分子量分布を有するポリスチレン標準をPolysciences（Warrington、PA）から購入した。アセトニトリルおよび塩化メチレンはHPLC級であった（FisherScientific）。
【０２７４】
PDLLA-PEG-PDLLAのトリブロックコポリマーを開環重合化によって合成した。異なる比のDL-ラクチドのモノマーおよびPEGを混合し、そして0.5重量％のオクタン酸スズを添加した。重合化を150℃で3.5時間実施した。低分子量PDLLAを、DL-乳酸の重縮合によって合成した。反応をガラスフラスコ内で穏やかな窒素パージ、機械撹拌、および180℃での1.5時間の加熱の条件下で実施した。PDLLAの分子量は、カルボン酸末端基を力価測定することによって、約800と測定された。
【０２７５】
Ｂ．ペースト処方物の製造
パクリタキセルを20％または30％の充填で、約60℃で融解させた、PDLLA-PEG-PDLLAコポリマーまたはPDLLA：PCL90：10、80；20、および70：30の混和物のいずれかの中で完全に混合した。パクリタキセルを充填したペーストを１mlシリンジ中で重量測定し、そして４℃で保存した。
【０２７６】
Ｃ．PDLLA-PEG-PDLLAおよびペースト混和物の特徴付け
PDLLA-PEG-PDLLAコポリマーの分子量および分布を、周囲温度で、104ÅのHewlettPackard Plゲルカラムに連結したShimadzu LC-10AD HPLCポンプおよびShimadzu RID-6A屈折指標検出器（Kyoto,Japan）を用いるGPCによって決定した。移動相はクロロホルムで、流速は1ml／分であった。サンプルの注射容積は、0.2％（w/v）のポリマー濃度で20μlであった。ポリマーの分子量を、ポリスチレン標準と比較して決定した。CHCl3中のPDLLA-PEG-PDLLAの25℃での固有粘度をCannon-Fenske粘度計を用いて測定した。
【０２７７】
コポリマーの熱分析を、TA Instruments 2000コントローラーおよびDuPont 910S DSC（Newcastle、Delaware）を用いて、示差走査熱量測定（DSC）によって実施した。加熱速度は、10℃／分であり、そしてコポリマーおよびパクリタキセル／コポリマーマトリクスサンプルを、襞付き開放型アルミニウム試料天秤皿において重量測定した（３〜５mg）。
【０２７８】
1H核磁気共鳴（NMR）を使用して、ポリマーの化学組成を決定した。パクリタキセルを充填したPDLLA-PEG-PDLLAの1HNMRのスペクトルをCDCl3中で、NMR装置（Bruker、AC-200E）を200MHzで用いて得た。ポリマーの濃度は１〜２％であった。
【０２７９】
パクリタキセル／PDLLA-PEG-PDLLAペーストの形態を、走査型電子顕微鏡（SEM）（HitachiF-2300）を用いて検査した。サンプルを、Hummer装置（Technics、USA）を用いて60％Auおよび40％Pdで覆った（厚さ10〜15nm）。
【０２８０】
Ｄ．パクリタキセルのインビトロ放出
20％パクリタキセルを充填したPDLLA:PCLペーストの小ペレット（約２ｍｇ）または20％パクリタキセルを充填したPDLLA-PEG-PDLLAペーストのシリンダー（シリンジを通って溶融ペーストを押し出しすることにより作製された）を、0.4g/Lアルブミンを有する10mlリン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）を含む、蓋をした14mlガラス管中に入れた。管を、穏やかに旋回して混合させながら37℃でインキュベートした。パクリタキセル分析のために、上清を定期的に取り出し、そして新鮮なPBS/アルブミン緩衝液と置き換えた。上清（10ml）を１ml塩化メチレンで抽出した。水相をデカントし、そして塩化メチレン相を60℃の窒素流下で乾燥した。乾燥残渣を40:60の水：アセトニトリル混合液中に再構成し、そして約１分間10,000ｇで遠心分離した。次いで、上清中のパクリタキセルの量をHPLCにより分析した。HPLC分析を、110AポンプおよびC-8超球(ultrasphere)カラム（Beckman）、ならびにSPD-6AUV検出器（232nmに設定）、SIL-9A自動注入器およびC-R3Aインテグレーター（Shimadzu）を用いて実施した。注入容積は20μlであり、流速は１ml／分であった。移動相は、58％アセトニトリル、５％メタノール、および37％蒸留水であった。
【０２８１】
Ｅ．結果および考察
ポリスチレン標準に関するPDLLA-PEG-PDLLAの分子量および分子量分布を、GPCにより測定した（図３０）。25℃でのCHCl3中のコポリマーの固有粘度を、Canon-Fenske粘度計を用いて測定した。分子量および固有粘度は、PEG含量の増加に伴って減少した。10％〜40％のPEG含量を伴うPDLLA-PEG-PDLLAの多分散性は2.4〜3.5であった。しかし、70％PEGを伴うコポリマーは、狭い分子量分布を有し、これは1.21の多分散性であった。これは、ポリマー分子量の広い分布を生じる側鎖反応（例えば、エステル交換）の機会を減少させる高PEG含量に起因し得る。あるいは、疎水性−親水性ブロックコポリマーのコイル状構造は、人為的な低い多分散性値を生じ得る。
【０２８２】
純粋PEGおよびPDLLA-PEG-PDLLAコポリマーのDSC走査を、図２５および２６に示す。70％および40％のPEG含量を伴うPEGおよびPDLLA-PEG-PDLLAは吸熱ピークを示し、コポリマーのPEG含量が低下するにつれてエンタルピーおよび温度の低下を伴った。40％および70％のPEGのコポリマーの吸熱ピークは、おそらくPEG領域の溶融に起因した。これは、相分離の発生を示す。純粋PEGは鋭い溶融ピークを有したが、70％および40％PEGの両方のコポリマーはブ充填なピークを示し、70％PEGの場合、明瞭なショルダーを有した。ブ充填な溶融ピークは、PDLLAがPEGの結晶化を妨害することから生じたとされ得る。70％PEGの場合におけるショルダーは、PDLLA領域のガラス転移を表し得る。10〜250℃の温度範囲における10％、20％、および30％のPEG含量を伴うコポリマーでは、温度変化は生じなかった。これは、有意な結晶化が生じなかった（従って、相分離であり得る）ことを示す。
【０２８３】
パクリタキセルを含まないまたは20％パクリタキセルを含むPDLLA:PCL（70:30、80:20、90:10）ブレンドのDSCサーモグラムは、約60℃で吸熱ピークを示し、PCLの溶融から生じた。PDLLAの無定形性質およびその低い分子量（800）に起因して、PDLLAの溶融およびガラス転移は観察されなかった。パクリタキセルの再結晶または溶融に起因する温度変化は、観察されなかった。
【０２８４】
20％および30％PEG含量のPDLLA-PEG-PDLLAコポリマーを、以下の理由のために、ペーストのための最適な処方材料として選択した：10％PEGのPDLLA-PEG-PDLLAは約60℃の温度で溶融され得なかった；40％および70%PEGのコポリマーは、60℃で容易に溶融し、そして20％および30％PEGコポリマーは、50℃〜60℃の間で粘性の液体になった；そして40％および70%PEGコポリマーの水中での膨潤は非常に高く、水中でペーストの迅速な分散を生じた。
【０２８５】
PDLLA-PEG-PDLLAシリンダーからのパクリタキセルのインビトロ放出プロフィールを図２７に示す。40％PEGシリンダーからの放出を測定する実験は、シリンダーが非常に高い膨潤度を有し（１日で約200％の水分取り込み）、そして数日内で崩壊したので、終結した。30％PEGシリンダーからのパクリタキセルの放出割合は、70日間にわたり漸増した。20％PEGシリンダーからの放出割合は、30日までゆっくりと増大し、次いで急激に増大し、次いで別の漸増期間が続いた。各個々のシリンダー（20％PEG含量）がパクリタキセル放出の急激な変化を示した程度で、有意な差異が存在した。急激な増大の前では、パクリタキセルの放出割合は、同じシリンダー直径（１mm）ではより低いPEG含量のコポリマーに対してより低い。40％および30％PEGシリンダーは、20％PEGシリンダーよりもずっと高いパクリタキセル放出速度を示した。例えば、30％PEGのシリンダーは、30日で、20％PEGシリンダーからの放出が２％であることに比較して、17％のパクリタキセルを放出した。より小さい直径を有するシリンダーは、より速い放出速度を生じ（例えば、30日で、0.65mmおよび１mmの直径を有する30％のPEGシリンダーは、それぞれ、26％および17％のパクリタキセルを放出した（図２７）。
【０２８６】
上記の観察は、シリンダーからのパクリタキセルの放出機構によって説明され得る。パクリタキセルは、光学顕微鏡で観察されるように結晶としてポリマー中に分散された。結晶は、ホットステージ顕微鏡により観察されるように、170℃でコポリマーマトリックス中に溶解し始め、そして180℃で完全に溶解した。20％パクリタキセルを充填したPDLLA-PEG-PDLLA（30％PEG）ペーストのDSCサーモグラムは、パクリタキセルについて小さな再結晶発熱（16J/g、190℃）および溶融吸熱（６J/g、212℃）を示した（図２５）。これは、180℃の後に溶融したコポリマーからのパクリタキセルの再結晶を示す。このタイプの薬物／ポリマーマトリックスでは、パクリタキセルは、拡散および／またはポリマー侵食を介して放出され得た。
【０２８７】
拡散制御の場合、薬物は、ポリマー中の分子拡散によって、および／または連結された薬物粒子により形成された開口チャネルを通じて放出され得る。従って、20％充填では、パクリタキセルのいくらかの粒子が単離され、そしてパクリタキセルは、コポリマー中の溶解に続く拡散によって放出され得る。パクリタキセルの他の粒子は、表面に連結するクラスターを形成し、チャネル拡散を通じて放出され得た。両場合とも、より小さい寸法を有するシリンダーが、より短い拡散通路に起因してより速い薬物放出を与えた（図２７）。
【０２８８】
シリンダーの寸法変化および水分取り込みを、放出の間記録した（図２８）。30％PEGシリンダーの長さ、直径、および湿潤重量の変化は急速に増大して２日内に最大になり、約15日間変化しないままであり、次いで漸減した。シリンダーの開始直径は、膨潤挙動に影響を及ぼさなかった。20％PEGのシリンダーについては、長さは、１日で10％減少し、そして横這いになり、一方、直径および水分取り込みは時間の経過に伴って漸増した。コポリマー中のPEGが多くなるにつれてパクリタキセルの拡散を容易にするために水分をより多く取り込むので、より速い放出が観察された（図２７）。
【０２８９】
PDLLA-PEG-PDLLAペーストのコポリマー分子量低下をgpcによりモニターした。20％PEGシリンダーについては、ピーク位置の溶出容積は経時的に増大し、これは放出実験の過程の間にポリマー分子量が低下したことを示している（図３０）。二相性の分子量分布が69日目に観察された。ポリマー分子量はまた、30％PEGシリンダー（１mmおよび0.65mm）について減少した。しかし、二相性分布は観察されなかった。
【０２９０】
NMRスペクトルは、3.6ppmでPEGピークを、そして1.65ppmおよび5.1ppmでPDLLAピークを示した。コポリマーにおけるPDLLAに関するPEGのピーク面積は、69日目の後に有意に減少した（図２９）。これは、PDLLAからの解離後のPEGの溶解を示す。シリンダーの乾燥重量損失もまた記録した（図２９）。これは、30％PEG-0.65mm>30%  PEG-1mm>20％PEG-1mmの順で減少する分解速度を示す。
【０２９１】
パクリタキセル放出前およびその間の乾燥シリンダーの形態学的変化をSEMを用いて観察した（図３１）。簡単に述べれば、固体パクリタキセル結晶および無孔性ポリマーマトリックスが放出前に見られた（図３１Ａおよび３１Ｂ）。放出の69日目の後では、パクリタキセル結晶は観察されず、そしてマトリックスは、ポリマー分解および水分取り込みに起因して、多くの孔を含んだ（図３１Ｃおよび３１Ｄ）。
【０２９２】
30％PEGシリンダーは、水中でたった２日後に多量の膨潤を示し（図２８）、従って、脱離した水溶性PEGブロックおよび分解したPDLLA（すなわち、DL-乳酸オリゴマー）の拡散に対する障害が減少した。30％PEGシリンダーの質量損失および分解は継続的なので、侵食放出の寄与は漸増し、いかなる急激な変化も伴うことのないパクリタキセルの持続放出を生じた（図２７）。20％PEGシリンダーについては、膨潤は初期には低く（図２８）、分解生成物の緩慢な拡散を生じた。従って、内部領域における分解生成物が主として保持され、一方、短い拡散通路に起因して、外部領域においては分解生成物はより少なかった。分解生成物は、分解速度を加速した。これは、オリゴマーのカルボン酸末端基が加水分解を触媒したからである。これは、二相性コポリマー分子量分布により示されるように、高分子量のシェルおよび低分子量の内部を生じた（図３０、６９日目）。シェル破裂は、シェルおよび内部分解生成物の強度、厚さ、および欠損のような要因に依存したので、内部分解生成物の損失の開始および程度は非常に可変性であった。シェル破裂は一貫せず、そしてポリマー中の薬物は、顕微鏡下で同質でなかったので、放出バーストの時点およびバーストの程度は、試験した４つのサンプルにおいて異なっていた（図２７）。
【０２９３】
PDLLAおよびPCLブレンドならびに純粋PCLからのパクリタキセルの放出を、図３２に示す。簡単に述べれば、放出割合は、ブレンド中のPDLLA含量に伴って増大した。例えば、10日以内で、80:20、70:30、および0:100PDLLA:PCLからの放出パクリタキセルはそれぞれ、17％、11％、および６％であった。１日における初期バースト後、ほぼ一定の放出が80:20PDLLA:PCLペーストから得られた。有意な膨潤度は、放出の間で観察されなかった。PDLLA:PCLブレンドについては、PDLLAは、約800の非常に低い分子量を有したので、水溶性の生成物に急速に加水分解され、質量損失は長く遅れることはなかった。PCLは、ペーストが急速に崩壊することを防ぐ「保持(holding)」材として働いた。従って、放出速度は、分解の増強に起因するブレンド中のPDLLA含量に伴って増大した。PDLLAの継続的な侵食は、パクリタキセルの放出を制御し、そして一定の放出を生じた。純粋PCLからのパクリタキセルの放出は、おそらく、PCLの緩慢な分解速度（１〜２年における）に起因して制御された拡散であった。
【０２９４】
20％パクリタキセルを充填した90:10 PDLLA:PCLペーストについての放出研究においては、24時間のインキュベーション内でのペーストペレットの崩壊に起因して、困難に直面した。簡単に述べれば、最初の12時間のインキュベーションの間、パクリタキセル放出についてシンク状態を確実にするために、サンプルを１時間毎に採取した。90:10ペーストからの放出パクリタキセルは、10時間内で25〜35％であった。
【０２９５】
30％パクリタキセルを含む90:10 PDLLA:PCLペーストは、20％パクリタキセルを含む90:10PDLLA:PCLペーストより多くのパクリタキセルを放出した。従って、パクリタキセルの放出速度の調整は、ポリマーおよび化学療法剤の特性ならびに投与部位によって調節され、これは、局所療法の開発において重要であった。
【０２９６】
（実施例２１）
水溶性添加剤およびパクリタキセルを含有するポリマー性組成物の調製
Ａ．ポリマー性組成物の調製
パクリタキセル／添加剤の共沈殿物の微粒子を調製し、続いてPCLに添加してペーストを形成させた。簡単に述べれば、パクリタキセル（100mg）を0.5mlのエタノール（95％）中に溶解し、そして1.0mlの蒸留水中に予め溶解または分散した添加剤（100mg）と混合した。混合物を、平滑状のペーストが形成されるまで粉末化した。ペーストをペトリ皿上に拡げ、37℃で一晩風乾した。乾燥塊を乳鉢および乳棒を用いて粉砕し、そしてメッシュ#140（106μm）篩（EndecottsTest
Sieves Ltd, London, England）を通過させた。次いで、微粒子（40％）を、65℃で溶融PCL（60％）に組み込ませた。これは、パクリタキセルの20％充填に相当する。本研究に用いた添加剤は、ゼラチン（TypeB、100ブルーム、Fisher Scientific）、メチルセルロース、（British Drug Houses）、デキストラン、T500（Pharmacia,Sweden）、アルブミン（Fisher Scientific）、および塩化ナトリウム（Fisher Scientific）であった。パクリタキセルと、ゼラチンまたはアルブミンとの微粒子を上記のように調製したが、メッシュ#60（270μm）篩（EndecottsTest Sieves Ltd, London, England）を通過させて、ペーストからのパクリタキセルの放出に対する微粒子サイズの効果を評価した。ペーストをまた、10％、20％、または30％のゼラチン、および20％のパクリタキセルをPCL中に含有させるように調製し、薬物放出に対する添加剤の割合の効果を研究した。他に特定しない限り、PCL中に分散させた20％パクリタキセルを含有するペーストを、放出速度研究についてコントロールとして供するために調製した。
【０２９７】
Ｂ．薬物放出研究
パクリタキセルを充填したペーストのほぼ2.5mgのペレットを、ネジ蓋付き管中で50mlの10mMPBS (pH 7.4) 中に懸濁した。この管を37℃でとんぼ返りに転倒させ、そして所定の時間間隔で、49.5mlの上清を取り出し、0.45μmメンブレンフィルターを通して濾過し、パクリタキセル分析のために保持した。各管中に等容量のPBSを入れ替え、本研究を通してシンク状態を維持した。分析のために、濾液を３×１mlのジクロロメタン（DCM）で抽出し、DCM抽出物を乾燥するまで窒素流下でエバポレートし、そして１mlアセトニトリル中に再溶解した。分析は、流速１ml/分の水：メタノール：アセトニトリル（37:5:58）の移動相を用いるHPLC（BeckmanIsocratic Pump）、C18逆相カラム（Beckman）、および232nmでのUV検出器（Shimadzu SPD A）によって行った。
【０２９８】
Ｃ．膨潤研究
パクリタキセル／添加剤／PCLペースト（メッシュサイズ#140（およびゼラチンのみについては#60）のパクリタキセル−添加剤微粒子を用いて調製した）を押し出してシリンダーを形成させ、断片に切断し、秤量し、そして各断片の直径および長さをマイクロメーター（MitutoyoDigimatic）を用いて測定した。断片を37℃で蒸留水（10ml）中に懸濁し、所定の間隔で水を捨て、シリンダー断片の直径および長さを測定し、そしてサンプルを秤量した。サンプルの形態（水中に懸濁する前および後）を、走査電子顕微鏡（SEM)(HitachiF-2300）を用いて調べた。サンプルを、Hummer Instrument（Technics, USA）を用いて60％Auおよび40％Pdで被覆した（厚さ10〜15nm）。
【０２９９】
Ｄ．ニワトリ胚漿尿膜（CAM）研究
受精した家畜ニワトリ胚を、無殻培養前に、４日間インキュベートした。卵の中身を90％相対湿度および３％CO2でインキュベートし、インキュベーション６日目に、パクリタキセルを充填したぺースト（６％パクリタキセル、24％ゼラチン、および70％PCLを含有する）またはコントロール（PCL中30％ゼラチン）ペーストの1mg断片をCAM表面上に直接置いた。２日曝露後、血管系を、ビデオカメラとつないだ実体顕微鏡を用いて調べた。次いで、画像信号をコンピューター上に表示し、画像をプリントした。
【０３００】
Ｅ．結果および考察
共沈澱したパクリタキセルとゼラチンまたはアルブミンとの微粒子は、硬質でかつ脆弱であり、そして容易にPCL中に組み込まれた。一方、他の添加剤は、軟質の粒子を生成した。この粒子は、ペーストの調製の間に壊れる傾向を示した。
【０３０１】
図３３は、PCL中の20％パクリタキセル、または20％パクリタキセル、20％添加剤、および60％PCLを含有するペーストからのパクリタキセル放出の時間経過を示す。添加剤を伴うまたは伴わないPCLからのパクリタキセルの放出は、二相性放出パターンに従った：まず、より速い薬物放出速度があり、その後薬物のより緩慢な薬物放出が起こった。ペーストからのパクリタキセルのより速い放出速度の初期期間は、表面に位置するパクリタキセルの溶解またはペーストの表層領域からのパクリタキセルの拡散に起因すると考えられた。放出プロフィールの続くより緩慢な相は、緩衝液と接触した薬物粒子の有効表面面積の減少、ポリマーマトリックスへの緩衝液の緩慢な進入、またはポリマーマトリックスを通る薬物の平均拡散通路の増大に起因し得る。
【０３０２】
PCLからのパクリタキセルの放出プロフィールの両相は親水性添加剤の存在下で増大し、ゼラチン、アルブミン、およびメチルセルロースが、薬物放出速度の最大の増大を生じた（図３３）。より小さなパクリタキセル−添加剤粒子（106μm）を用いた場合と比較して、より大きなパクリタキセル−添加剤粒子（270μm）をペーストを調製するために用いた場合、ポリマーマトリックスからのパクリタキセルの放出においてさらなる増大があった（図３４）。添加剤（例えば、ゼラチン）の量の増大は、薬物放出の対応する増大を生じた（図３４）。図３５Ａは、20％パクリタキセル、20％添加剤、および60％PCLを含有するペーストの膨潤挙動を示す。膨潤速度は、以下の順に従った：ゼラチン＞アルブミン＞メチルセルロース＞デキストラン＞塩化ナトリウム。さらに、膨潤速度は、より高い割合の水溶性ポリマーをペーストに添加したとき増大した（図３５Ｂ）。ゼラチンまたはアルブミンを含むペーストは、最初の８〜10時間内で急速に膨潤し、続いて膨潤速度は、サンプルの体積の変化が40％より大きくなったとき減少した。より大きな（270μm）パクリタキセル−ゼラチン粒子を用いて調製したペーストは、より小さい（106μm）のパクリタキセル−ゼラチン粒子で調製したものよりも速い速度で膨潤した。全てのペーストは、体積が50％より大きく増大したとき崩壊した。SEM研究は、ペーストの膨潤にはマトリックスの亀裂が伴うことを示した（図３６）。高い倍率では（図３６Ｃおよび３６Ｄ）、ペーストの表面上に、かつ膨潤後ゼラチンと密に結合した、針状または稈状のパクリタキセル結晶の形跡があった（図３６Ｃおよび３６Ｄ）。
【０３０３】
疎水性ポリマーにおいて個別の粒子として包埋された浸透剤または膨潤剤のような親水性薬剤は、マトリックス侵食、ポリマーマトリックスを通る薬物の拡散、ならびに／または水溶性添加剤の溶解によりマトリックスに作出された孔を通る拡散および／または対流の組み合わせによる薬物放出を生じた。疎水性ポリマー中に分散された浸透剤および膨潤性ポリマーは、吸水し（ウィッキング剤(wicking agent)として作用する）、溶解または膨潤し、そして隣接粒子間の隔壁（ポリマー層）を破裂させ得る膨圧を及ぼして、マイクロチャネルを作出し、従って、拡散または対流による周囲媒体への薬物分子の漏出を容易にする。ペーストマトリックスの膨潤および亀裂（図３６）は同様に、マトリックスの内部全体にマイクロチャネルの形成を生じた。ポリマーの膨潤の異なる速度および程度（図３５）が、観察されたパクリタキセル放出速度の差異（図３３および３４）の原因であり得る。
【０３０４】
図３７は、コントロールゼラチン−PCLペースト（図３７Ａ）および20％パクリタキセル−ゼラチン−PCLペースト（図３７Ｂ）で処理したCAMを示す。CAMの表面上のペーストを、図中、矢印で示す。コントロールペーストを有するCAMは、正常な毛管網構造を示す。パクリタキセル−PCL−ペーストで処理したCAMは、血管退行および毛管網を欠損した域を一貫して示した。ペースト中の添加剤の組み込みは、無血管域の直径を顕著に増大した（図３７）。
【０３０５】
本研究は、PC Lからのパクリタキセルのインビトロ放出が、パクリタキセル／親水性ポリマー微粒子のPCLマトリックスへの組み込みにより増大され得たことを示す。マウスにおいて皮下腫瘍を処置することにおける処方物の効力を評価するインビボ研究もまた、パクリタキセル／ゼラチン／PCLペーストが腫瘍塊を有意に減少することを示した。水溶性薬剤のタイプ、微粒子サイズ、および添加剤の割合のような要因が、薬物の放出特性に影響を及ぼすことが示された。
【０３０６】
（実施例２２）
ナノペーストを製造するための手順
ナノペーストは、親水性ゲル中のミクロスフェアの懸濁液である。本発明の１つの局面において、ゲルまたはペーストは、標的組織の近くに薬物を充填したミクロスフェアを位置させる方法として、組織に塗布され得る。水ベースであれば、ペーストはすぐに体液で希釈されるようになり、ペーストの固着性（stickiness）の減少およびミクロスフェアが隣接組織に堆積される傾向を引き起こす。ミクロスフェアカプセル化薬物のプールが、これにより、標的部位の近くに位置される。
【０３０７】
これらの実験で利用された試薬および装置は、ガラスビーカー、Carbopol 925（製薬級、GoodyearChemical Co.）、蒸留水、水酸化ナトリウム（１Ｍ）水溶液、水酸化ナトリウム（５Ｍ）水溶液、20％w/vで水中に懸濁した0.1lm〜３lmのサイズ範囲のミクロスフェアを包含する（前記を参照のこと）。
【０３０８】
１．５％w/v Carbopolゲルの調製
十分量のcarbopolを１Ｍ水酸化ナトリウムに添加し、５％w/v溶液を達成させた。１Ｍ水酸化ナトリウム中にcarbopolを溶解させるために、混合物を、ほぼ１時間静置させた。この時間の間、混合物を撹拌し、そして１時間後、pHを、５Ｍ水酸化ナトリウムを用いて7.4に調整し、carbopolを完全に溶解させた。pHが7.4に達すると、ゲルを覆い、２〜３時間静置させた。
【０３０９】
２．ナノペーストの製造についての手順
十分量の0.1μm〜３μmのミクロスフェアを水に添加し、ミクロスフェアの20％懸濁液を生成した。Carbopolゲル（８mlの５％w/v）を、ガラスビーカー中に入れ、２mlの20％ミクロスフェア懸濁液を添加した。混合物を撹拌してミクロスフェアをゲル全体に分散させた。混合物を４℃で保存した。
【０３１０】
（実施例２３）
シクロデキストリンとのパクリタキセルの複合体形成
Ａ．材料
パクリタキセルをHauser Chemical Inc. (Boulder,Colorado）から入手した。リン酸二ナトリウム（Fisher）、クエン酸（British Drug Houses）、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン（HPβCD）、γ-シクロデキストリン（γ-CD）、およびヒドロキシプロピル-γ-シクロデキストリン（HPγCD）をAmerican
Maize-Products Company（Hammond. Indiana）から入手し、そして受け取った通りに使用した。
【０３１１】
Ｂ．方法
１．溶解度研究
過剰量のパクリタキセル（５mg）を、種々の濃度のγ-CD、HPγ-CD、またはHPβ-CDを含有する水溶液に添加し、そして37℃で約24時間穏やかに転倒させた。平衡化後、懸濁液のアリコートを0.45μmメンブレンフィルター（Millipore）を通して濾過し、適切に希釈し、HPLCを用いて分析した。移動相は、1.0ml／分の流速のアセトニトリル、メタノール、および水（58:5:37）の混合物で構成された。10％までの種々の濃度のHPβ-CDを含有する50:50の水およびエタノール（95％）で構成された溶媒中のパクリタキセルの溶解度もまた、調べた。さらに、パクリタキセルの溶解速度プロフィルを、２mgのパクリタキセル（受け取った通り）を０％、５％、10％、または20％のHPγ-CD溶液に添加するか、あるいは２mgの予め水和させたパクリタキセル（７日間水中に懸濁させることにより）を純水に添加し、37℃で穏やかに転倒させることにより、調べた。アリコートを種々の時間間隔で採取し、パクリタキセルについてアッセイした。
【０３１２】
２．安定性研究
20％HPβCDまたはHPγCDを含有する溶液はそれぞれ、3.9および5.2のpH値を有した。シクロデキストリン溶液中のパクリタキセルの安定性を、種々の時間間隔で、37℃または55℃で、水または50:50の水−エタノール混合液中10％または20％HPγ-CDまたはHPβ-CDを含有する溶液中のパクリタキセル（20mgml）をアッセイすることにより調べた。さらに、１％、２％、または５％HPβCDを含有する溶液中のパクリタキセル（１μg/ml）の55℃での安定性を測定した。
【０３１３】
Ｃ．結果
１．溶解度研究
パクリタキセルの溶解度は、研究した全体のＣＤ濃度範囲にわたって増大した；HPβ-CDは、パクリタキセルの溶解度の最大の増大を生じる（図３８）。溶解度曲線の形状は、化学量論が１：１複合体より高次であることを示唆する。パクリタキセルは、HPβ-CDおよびHPγ-CDの両方を伴うタイプＡP曲線、ならびにγ-CDを伴うタイプＡN曲線を形成した。HPβ-CDの50％水溶液におけるパクリタキセルの溶解度は、37℃で3.2mg/mlであり、これは水におけるパクリタキセルの溶解度の約2,000倍であった。パクリタキセル−シクロデキストリンの一次複合体についての概算安定度定数（図３９から）は、γ-CD、HPγーCD、およびHPβ-CDに対してそれぞれ3.1、5.8、および7.2Ｍ-1であり、二次複合体についての概算溶解度定数は、γ-CD、HPγーCD、およびHPβ-CDに対してそれぞれ0.785×103、1.886×103、および7.965×103Ｍ-1であった。実測安定度定数の値は、シクロデキストリンと共にパクリタキセルにより形成された包括複合体が主に二次複合体であることを示唆した。
【０３１４】
50:50の水：エタノール混合液中のパクリタキセルの溶解度は、純水中の複合体形成について観察されるようなシクロデキストリン濃度の増大（図４０）に伴って増大した。50％エタノールの存在下でのパクリタキセルおよびHPβ-CDの複合体形成の見かけ安定度定数（26.57Ｍ-1）は、エタノール不在下の安定度定数より有意に低かった（約300倍）。安定度定数がより低いことは、エタノールの存在下の溶媒の誘電率または極性の変化に起因し得る。
【０３１５】
０％、５％、10％、および20％γ-CD溶液中のパクリタキセルの溶解プロフィル（図４１）は、純水またはシクロデキストリン溶液中のパクリタキセルの準安定溶液の形成を説明する；溶液中のパクリタキセルの量は漸増し、最大に達し、そしてその後減少した。48時間水中に懸濁することにより予め水和したパクリタキセルサンプルを用いる溶解研究は、準安定溶液の形成を示さなかった。さらに、水和パクリタキセル（室温で真空オーブン中で乾燥させた）のDSC分析は、60〜110℃の間で２つのブ充填な吸熱ピークを示した。これらのピークには、水和物の存在を示す約4.5％重量損失（熱重量分析により測定した）が伴った。約2.1％の重量の損失は、パクリタキセル一水和物の形成を示唆する。従って、60℃〜110℃の間のDSCピークの発生および約4.5％の重量の損失は、二水和物の存在を示唆する。受け取ったパクリタキセルサンプルの60℃〜110℃の間の吸熱ピーク（DSC結果）または重量損失（TGA結果）の形跡はなかった。従って、（受け取ったままの）パクリタキセルは無水であり、そして水中への懸濁の際に、これは溶解して過飽和溶液を形成し、より低い溶解度の水和物として再結晶した（図４１）。
【０３１６】
２．安定性研究
パクリタキセル分解は、シクロデキストリンの濃度に依存し、疑似一次分解速度論に従った（例えば、図４２）。55℃での１％HPβ-CDを含有する溶液中のパクリタキセル（１μg/mlパクリタキセル）の分解速度は、より高いシクロデキストリン濃度での速度より速かった（ｋ＝3.38×10-3h-1）。1.78×10-3h-1および0.96×10-3h-1の分解速度定数はそれぞれ、10％HPβ-CDおよびHPγ-CD中のパクリタキセルについて観察された。２、４、６、または８％HPβ-CDを含有するパクリタキセル溶液（１μg/ml）は、10または20％HPβ-CD溶液（20μg/ml）で得られたものとは分解速度において有意差は示さなかった。エタノールの存在は、シクロデキストリン溶液中のパクリタキセルの安定性に有害な影響を及ぼさなかった。
【０３１７】
Ｄ．考察
本研究は、パクリタキセルの溶解度がシクロデキストリンとの複合体形成により増大し得ることを示した。これらの水性ベースのシクロデキストリン処方物は、種々の炎症性疾患の処置において利用され得る。
【０３１８】
（実施例２４）
パクリタキセルの増大濃度を有するポリマー性組成物
PDLLA-MePEGおよびPDLLA-PEG-PDLLAは、疎水性（PDLLA）および親水性（PEGまたはMePEG）領域を有するブロックコポリマーである。適切な分子量および化学組成で、それらは、疎水性PDLLAコアおよび親水性MePEGシェルの小さな凝集を形成し得る。パクリタキセルは、疎水性コアに充填され得、それにより増大した「溶解度」を有するパクリタキセルを提供する。
【０３１９】
Ａ．材料
D,L-ラクチドを、Aldrichから購入し、オクタン酸第一スズ（Stannousoctoate）、ポリ（エチレングリコール）（分子量8,000）、MePEG（分子量2,000および5,000）をSigmaから購入した。MePEG（分子量750）をUnionCarbideから購入した。コポリマーを、触媒としてオクタン酸第一スズを用いる開環重合手順によって合成した（Dengら、J. Polym. Sci.,Polym, Lett. 28:411-416, 1990；Cohnら、J. Biomed. Mater. Res. 22:993-1009, 1988）。
【０３２０】
PDLLA-MePEGの合成について、DL-ラクチド／MePEG／オクタン酸第一スズの混合物を10mlガラスアンプルに添加した。アンプルをバキュームに連結し、そして炎で密封した。重合を、アンプルを150℃油浴中で３時間インキュベートすることにより達成した。PDLLA-PEG-PDLLAの合成について、D,L-ラクチド／PEG／オクタン酸第一スズの混合物をガラスフラスコに移し、ゴムストッパーで密封し、そして150℃オーブン中で３時間加熱した。コポリマーの出発組成物を表１および２中に示す。全ての場合において、オクタン酸第一スズの量は0.5％〜0.7％であった。
【０３２１】
Ｂ．方法
ポリマーをアセトニトリル中に溶解し、そして10,000ｇで５分間遠心分離し、非溶解性の不純物を捨てた。次いで、パクリタキセルアセトニトリル溶液を各ポリマー溶液に添加し、10重量％のパクリタキセル（パクリタキセル＋ポリマー）を有する溶液を与えた。次いで、溶媒アセトニトリルを除去し、窒素流および60℃加温下で、透明なパクリタキセル／PDLLA-MePEGマトリックスを得た。蒸留水、0.9％NaCl生理食塩水、または５％デキストロースを、マトリックスの４倍重量で添加した。マトリックスをボルテックス混合および60℃での定期加温の助けを借りて、最終的に「溶解」した。透明な溶液が全ての場合において得られた。粒子サイズは、サブミクロン粒子サイズ測定器（NICOMPModel 270）により測定されたように全て50nm未満であった。処方を表１に示す。
【０３２２】
【化１４】
2009161555.tif 000015
PDLLA-PEG-PDLLAの場合（表２）、コポリマーは水中には溶解し得ないので、パクリタキセルおよびポリマーをアセトン中に共溶解した。水または水／アセトンの混合物をこのパクリタキセルポリマー溶液に徐々に添加し、パクリタキセル／ポリマー球の形成を誘導した。
【０３２３】
【化１５】
2009161555.tif 000016
Ｃ．結果
PDLLA-MePEG組成物の多くは、水、９％生理食塩水、または５％デキストロース中で透明な溶液を形成する。これは、ナノメーターの範囲の小さな凝集体の形成を示している。パクリタキセルは、PDLLA-MePEGミセルに首尾よく充填された。例えば、％充填（これは、１mlパクリタキセル／PDLLA-MePEG／水系中の10mgパクリタキセルを表す）で、透明な溶液が2000-50/50および2000-40/60から得られた。粒子サイズは約60nmであった。
【０３２４】
（実施例２５）
フィルム製造のための手順
用語フィルムは、多くの幾何学的形状の１つに形成されたポリマーを指す。フィルムは、薄い、弾性のポリマーシート、または２mm厚のポリマーディスクであり得る。そのいずれかが、続く瘢痕および付着形成を防ぐように組織表面に適用され得る。このフィルムは、曝露された組織上に、カプセル化薬物が組織部位で長期にわたってポリマーから放出され得るように配置されるように設計した。フィルムは、いくつかのプロセスにより作製され得る。例えば、キャスティングによる、およびスプレーによることを包含する。
【０３２５】
キャスティング法では、ポリマーを溶融して型に注入するか、ジクロロメタン中に溶解し型に注入するかのいずれかを行った。次いで、それぞれポリマーは、それが冷却するにつれて固形化するか、または溶媒がエバポレートするにつれて固形化した。スプレー法では、ポリマーを溶媒に溶解し、ガラス上に吹き付け、そして溶媒がエバポレートするにつれてポリマーはガラス上で固形化した。繰り返し吹き付けは、ガラスから剥離され得るフィルムへのポリマーのビルドアップ（build up）を可能にした。
【０３２６】
これらの実験において利用された試薬および装置は、小ビーカー、Corningホットプレートスターラー、キャスティング型（例えば、50ml遠沈管キャップ）および型保持装置、20mlガラスシンチレーション蓋付きバイアル（プラスチックインサートタイプ）、TLC噴霧器、窒素ガスタンク、ポリカプロラクトン（「PCL」−分子量10,000〜20,000；Polysciences）、パクリタキセル（Sigma95％純度）、エタノール、「洗浄」（前記を参照のこと）エチレンビニルアセテート（「EVA」）、ポリ（DL）乳酸（「PLA」−分子量15,000〜25,000；Polysciences）、DCM(HPLC級；FisherScientific）を包含する。
【０３２７】
１．フィルム製造のための手順−溶融キャスティング
既知重量のPCLを有する小さなガラスビーカーを、水の入ったより大きなビーカー（水浴として作用する）中に置き、そしてポリマーが充分に溶融されるまで、70℃のホットプレート上に置いた。既知重量の薬物を溶融ポリマーに添加し、混合物を十分に撹拌した。溶融ポリマーを型に注入し、そして冷却させた。
【０３２８】
２．フィルム製造のための手順−溶媒キャスティング
既知重量のPCLを20mlガラスシンチレーションバイアル中で直接秤量し、10％w/v溶液を達成するのに十分なDCMを添加した。溶液を混合した後、所望の最終パクリタキセル濃度を達成するのに十分なパクリタキセルを添加した。この溶液をボルテックスに供してパクリタキセルを溶解し、１時間静置させ（気泡の存在がなくなるまで）、次いでゆっくりと型に注入した。型を一晩換気フードに置き、DCMをエバポレートさせた。
【０３２９】
３．フィルム製造のための手順−スプレー
十分量のポリマーを20mlガラスシンチレーションバイアル中で直接秤量し、２％w/v溶液を達成するのに十分なDCMを添加した。溶液を混合してポリマーを溶解させた。自動化ピペットを用いて、適切な容積（最小5ml）の２％ポリマー溶液を、別の20mlガラスシンチレーションバイアルに移した。十分なパクリタキセルを溶液に添加し、蓋をしたバイアルを振盪することにより溶解した。スプレー用に調製するために、バイアルの蓋を外し、TLC噴霧器のバレルをポリマー溶液に突っ込んだ。
【０３３０】
窒素タンクを噴霧器のガス注入口に連結し、そして圧力を噴霧および吹き付けが開始するまで漸増させた。型を、スプレー間に15秒乾燥時間を伴う５秒振動スプレーを用いて吹き付けた。吹き付けは、ポリマーの適切な厚さが型上に堆積されるまで続けた。
【０３３１】
（実施例２６）
（エチレンビニルアセテートおよび界面活性剤で構成された治療剤を充填したポリマー性フィルム）
２つのタイプのフィルムを本実施例で調査した：パクリタキセルを充填した純粋EVAフィルムおよびパクリタキセルを充填したEVA／界面活性剤ブレンドフィルム。
【０３３２】
試験される界面活性剤は２つの疎水性界面活性剤（Span 80およびPluronicL101）および１つの親水性界面活性剤（Pluronic F127）である。Pluronic界面活性剤はそれ自体、誘引性のポリマーであった。なぜなら、それらは、種々の薬物送達特性を至適化するためにEVAとブレンドされ得るからである。Span80は、ポリマーマトリックス中に分散する小分子であり、ブレンドを形成しない。
【０３３３】
界面活性剤は、フィルムからのパクリタキセルの放出速度を調整すること、およびフィルムの特定の物理的パラメーターを至適化することにおいて有用であった。薬物放出速度が制御され得ることを示した界面活性剤ブレンドフィルムの一つの局面は、化合物が水中で膨潤する速度および程度を変化させる能力であった。水のポリマー−薬物マトリックスへの拡散は、キャリアからの薬物の放出に重要であった。図４３Ｃおよび４３Ｄは、ブレンド中の界面活性剤のレベルが変化するにつれてのフィルムの膨潤度を示す。純粋EVAフィルムは、２ヶ月を超えても有意な程度に膨潤しなかった。しかし、EVAに添加される界面活性剤のレベルを増大させることにより、化合物の膨潤度を増大させることが可能であり、そして親水性を増大させることにより、膨潤が増大した。
【０３３４】
これらのフィルムを用いた実験の結果を以下の図４３Ａ〜Ｅに示す。簡単に述べれば、図４３Ａは、純粋EVAフィルムからの時間の経過に伴うパクリタキセル放出（mg単位）を示す。図４３Ｂは、同じフィルムに関して残存する薬物の割合を示す。これらの２つの図面から理解され得るように、パクリタキセル充填が増大する（すなわち、パクリタキセル重量％が増大する）につれて、薬物放出速度が増大した。これは、予期された濃度依存性を示す。パクリタキセル充填が増大するにつれて、フィルム中に残存するパクリタキセルの割合もまた増大した。これは、充填がより高いことが、長期放出処方物にとってより魅力的であり得ることを示す。
【０３３５】
フィルムの物理的強度および弾性を評価し、そして図４３Ｅに示す。簡単に述べれば、図４３Ｅは、純粋PVAおよびEVA／界面活性剤ブレンドフィルムについての応力／歪み曲線を示す。この応力の粗測定値は、フィルムの弾性がPluronicF127の添加を伴って増大すること、および引っ張り強度（破壊時の応力）がPluronic F127の添加を伴って濃度依存様式で増大することを実証した。弾性および強度は、化合物の永久変形を引き起こすことなく特定の臨床適用について操作されなければならないフィルムの設計において、重要な考慮要件である。
【０３３６】
上記データは、特定の界面活性剤添加剤の、薬物放出速度を制御し、そしてビヒクルの物理的特性を変化させる能力を実証する。
【０３３７】
（実施例２７）
ナノスプレーを製造するための手順
ナノスプレーは、生理食塩水中の小ミクロスフェアの懸濁液である。ミクロスフェアが非常に小さい（すなわち、直径１μm以下である）場合、それらは、懸濁液が重力下でも沈降しないようなコロイドを形成する。以下により詳細に説明するように、0.1μm〜１μmの微粒子の懸濁液が、手術時における直接の（例えば、血管癒合のために）、ラプロスコピック(laproscopic)介入を介する、または指ポンプエアロゾルによる（例えば、局所的に送達される）、組織上のエアロゾル化堆積に適切なように作製され得る。ナノスプレーを製造するために利用された装置および材料は、200ml水ジャケットビーカー（KimaxまたはPyrex）、Haake循環水浴、２インチ直径を有するオーバーヘッドスターラーおよびコントローラー（４ブレードのプロペラタイプのステンレス鋼スターラー；Fisher商標）、500mlガラスビーカー、ホットプレート／スターラー（Corning商標）、４×50mlポリプロピレン遠沈管（Nalgene）、プラスチックインサートキャップを有するガラスシンチレーションバイアル、卓上遠心機（Beckman）、高速遠心床モデル（JS21 Beckman）、Mettler分析用天秤（AJ 100, 0.1mg）、Mettlerデジタル天井荷重天秤（AE 163, 0.01mg）、自動化ピペッター（Gilson）、滅菌ピペットチップ、ポンプ作動エアロゾル（Pfeifferpharmaceuticals）20ml、層流フード、PCL（分子量10,000〜20,000；Polysciences, Warrington,Pennsylvania USA）、「洗浄」（前記を参照のこと）EVA、PLA（分子量15,000〜25,000；Polysciences）、ポリビニルアルコール（「PVA」−分子量124,000〜186,000；99％加水分解；AldrichChemical Co., Milwaukee, WI USA）、DCMまたは「塩化メチレン」；HPLC級 Fisher scientific）、蒸留水、滅菌生理食塩水（BectonおよびDickensonまたは等価物）を包含する。
【０３３８】
１．５％(w/v)ポリマー溶液の調製
調製されるポリマー溶液に依存して、以下を20mlガラスシンチレーションバイアル中で直接秤量した：1.00ｇのPCLもしくはPLA、または0.50ｇの各PLAおよび洗浄EVA。メスシリンダーを用いて、20mlのDCMを添加し、そしてバイアルの蓋をきつく閉めた。全てのポリマーが溶解するまで、バイアルを室温（25℃）で静置させた。
【０３３９】
２．3.5％(w/v)PVAストック溶液の調製
溶液を、以下に示す手順に従うか、またはミクロスフェアの製造のために調製した５％（w/v）PVAストック溶液（実施例２８を参照のこと）を希釈することにより調製した。簡単に述べれば、17.5ｇのPVAを600mlガラスビーカー中で直接秤量し、そして500mlの蒸留水を添加した。ビーカーを覆い、300mlの水を入れた2000mlガラスビーカー中に置いた。PVAを85℃で300rpmで、充分に溶解するまで撹拌した。
【０３４０】
３．ナノスプレーの製造のための手順
簡単に述べれば、100mlの3.5％PVA溶液を、連結されたHaake水浴を有する200ml水ジャケットビーカー中に置いた。ビーカーの中身を3000rpmで撹拌し、10mlのポリマー溶液（製造されるナノスプレーのタイプに基づいてポリマー溶液を用いた）を、5ml自動化ピペッターを用いて２分間にわたって、撹拌中のPVAに滴下した。３分後、撹拌速度を、2.5時間、2500rpm（+/-200rpm）に調整した。2.5時間後、撹拌ブレードをナノスプレー調製物から取り出し、10mlの蒸留水でリンスし、リンス溶液もナノスプレー調製物中に入るようにした。
【０３４１】
ミクロスフェア調製物を500mlビーカーに流し込んだ。ジャケット水浴を70mlの蒸留水で洗浄し、この70mlリンス溶液もミクロスフェア調製物中に入るようにした。180mlミクロスフェア調製物をガラス棒で撹拌し、４つのポリプロピレン50ml遠沈管に等分に流し込み、10,000g（+/-1000g）で10分間遠心分離した。PVA溶液を各ミクロスフェアペレットから排水して捨てた。蒸留水（5ml）を各遠沈管に添加し、これをボルテックスに供した。４つのミクロスフェア懸濁液を20mlの蒸留水を用いて１つの遠沈管中にプールし、そして10,000ｇ（+/-1000g）で10分間遠沈した。上清をミクロスフェアペレットから排水し、そして40mlの蒸留水を添加し、そしてミクロスフェア調製物をボルテックスに供した（このプロセスを３回繰り返した）。次いで、ミクロスフェア調製物を予め秤量したガラスシンチレーションバイアルに移した。
【０３４２】
バイアルを、室温（25℃）で１時間静置させ、２μmおよび３μm直径ミクロスフェアを重力下で沈降させた。１時間後、上部の9mlの懸濁液を排水し、滅菌キャップした50ml遠沈管に入れ、そして10,000（+/-1000g）で10分間遠心分離した。上清を捨て、そしてペレットを20mlの滅菌生理食塩水中に、懸濁液を10,000ｇ（+/-1000g）で10分間遠心分離することにより再懸濁した。上清を捨て、そしてペレットを滅菌生理食塩水中に再懸濁した。使用する生理食塩水の量は、最終の必要とされる懸濁液濃度（通常10％w/v）に依存した。ナノスプレー懸濁液をエアロゾルに添加した。
【０３４３】
（実施例28）
ミクロスフェアの製造
ミクロスフェアを製造するのに用いられる装置には、以下のものが挙げられる：200mlウォータージャケットビーカー（KimaxまたはPyrex）、Haake循環水浴、２インチの直径を有するオーバーヘッドスターラーおよびコントローラー（４枚刃の、プロペラ型ステンレススチールスターラー-Fisher製）、500mlガラスビーカー、ホットプレート/スターラー（Corning製）、４×50mlポリプロピレン遠心管（Nalgene）、プラスチック挿入キャップ付きガラスシンチレーションバイアル、卓上型遠心分離機（GPRBeckman）、高速遠心分離機-フロアモデル（JS 21 Beckman）、Mettler化学天秤（AJ 100、0.1mg）、Mettlerデジタルトップローディング天秤（AE163、0.01mg）、自動ピペッター（Gilson）。試薬には以下のものが挙げられる：PCL（分子量10,000〜20, 000；Polysciences,Warrington Pennsylvania, USA）、「洗浄した」（下記の「洗浄」の方法を参照のこと）EVA、PLA（分子量15,000〜25,000；Polysciences）、ポリビニルアルコール（「PVA」-分子量124,000〜186,000；99％加水分解化；AldrichChemical Co., Milwaukee WI, USA）、DCMまたは「塩化メチレン」；HPLCグレード、Fisher scientific、および蒸留水。
【０３４４】
Ａ．５％（w/v）ポリマー溶液の調製
DCL（1.00g）もしくはPLA、またはPLAおよび洗浄したEVAの各0.50gを、20mlガラスシンチレーションバイアルに直接量り入れた。次いで、20mlのDCMを添加した。バイアルにキャップをし、室温（25℃）で、１時間（場合によっては振盪を用い得る）、または全てのポリマーが溶解するまで、保存した。この溶液は室温で、少なくとも２週間保存し得る。
【０３４５】
Ｂ．５％（w/v）PVAストック溶液の調製
25gのPVAを600mlガラスビーカーに直接量り取り、そして３インチのTefronコートした攪拌子と共に500mlの蒸留水を添加した。ビーカーを蒸発損失を減少させるためにガラスで蓋をし、300mlの水を含有する2000mlのガラスビーカーに入れた。PVAを300rpm、85℃（Corningホットプレート/スターラー）で、２時間または完全に溶解するまで、攪拌した。PVAの溶解を視覚的チェックで決定した；溶液は透明であるべきである。溶液をガラススクリュートップ保存容器に移し、４℃で最高２ヶ月間保存した。しかしながら、溶液を使用前または希釈前に室温まで加温しなければならない。
【０３４６】
Ｃ．ミクロスフェアを生成する手順
作成するミクロスフェアのサイズに基づき（表１参照）、100mlのPVA溶液（表１に示す濃度）を200mlウォータージャケットビーカーに入れた。Haake循環水浴をこのビーカーに接続し、内容物を27℃（+/-１℃）で、10分間平衡化した。作成するミクロスフェアのサイズに基づき（表I参照）、オーバーヘッドスターラーの開始速度を設定し、そしてオーバーヘッドスターラーの刃をPVA溶液中に中程まで降ろした。次に、スターラーを開始し、次いで、10mlのポリマー溶液（生成するミクロスフェアの型に基づいて用いるポリマー溶液）を、２分間にわたって、５ml自動ピペッターを用いて攪拌しているPVA中に滴下した。３分後、攪拌速度を調整し（表１参照）、溶液をさらに2.5時間攪拌した。次いで、攪拌刃をミクロスフェア調製物から取り除き、そして10mlの蒸留水でリンスし、その後、リンス溶液をミクロスフェア調製物中に流し込んだ。次いで、ミクロスフェア調製物を500mlビーカーに注ぎ入れ、そしてジャケット水浴を70mlの蒸留水で洗浄した。これをまた、ミクロスフェア調製物中に流し込んだ。次いで、180mlのミクロスフェア調製物をガラス棒で攪拌し、等量を４個のポリプロピレン50ml遠心管に注ぎ込んだ。次いで、管を蓋し、そして10分間遠心分離した（表１に示した力）。各ミクロスフェアのペレットから45mlのPVA溶液を抜き取った。
【０３４７】
【化１６】
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次いで、５mlの蒸留水を各遠心管に添加し、ボルテックスしてミクロスフェアを再懸濁した。次いで、４つのミクロスフェア懸濁液を１つの遠心管に、20mlの蒸留水と共にプールし、そしてさらに10分間遠心分離した（表１に示す力）。このプロセスを、合計で３回洗浄するためさらに２回繰り返した。次いで、ミクロスフェアを最後に１回遠心分離し、10mlの蒸留水で再懸濁した。最終洗浄後、ミクロスフェア調製物を予め秤量したガラスシンチレーションバイアル中に移した。バイアルをキャップし、そしてミクロスフェアを重力下で沈降させるため、室温（25℃）で一晩放置した。0.1um〜３umのサイズ範囲に該当するミクロスフェアは重力下で沈降しないので、これらは10mlの懸濁液中に残された。
【０３４８】
Ｄ．10μm〜30μmまたは30μm〜100μmの直径のミクロスフェアの乾燥
ミクロスフェアを室温で一晩放置した後、上清を沈降したミクロスフェアから流し出した。ミクロスフェアを蓋をしていないバイアルで、引き出しの中で、１週間の間またはこれらが完全に乾燥するまで（一定重量のバイアル）、乾燥した。より速い乾燥は、蓋をしていないバイアルを、ヒュームフード中、窒素ガスの緩慢な流動下（流速約10ml/分）に放置することにより達成され得る。完全に乾燥した時（一定重量のバイアル）、バイアルを秤量し、蓋をする。ラベルを貼り、蓋をしたバイアルを、室温で、引き出し中に保存した。ミクロスフェアは通常、３ヶ月しか保存されなかった。
【０３４９】
Ｅ．0.1μm〜３μm直径のミクロスフェアの懸濁液の濃度測定
このサイズ範囲のミクロスフェアは沈降せず、そのためこれらは４℃で、最大４週間懸濁液のままであった。10mlの懸濁液中のミクロスフェアの濃度を測定するため、懸濁液の200μlのサンプルを1.5mlの予め秤量した微量遠心管中にピペッティングした。次いで、管を10,000gで遠心分離し（Eppendorf卓上微量遠心機）、上清を取り除き、そして管を50℃で一晩乾燥させた。次いで、管中の乾燥させたミクロスフェアの重量を測定するために管を再秤量した。
【０３５０】
Ｆ．パクリタキセルを充填したミクロスフェアの製造
パクリタキセル含有ミクロスフェアを調製するため、適切な量の秤量したパクリタキセル（カプセル化されるべきパクリタキセルのパーセントに基づく）を、20mlガラスシンチレーションバイアル中に直接入れた。次に、10mlの適切なポリマー溶液をパクリタキセル含有バイアルに添加し、次いでこれをパクリタキセルが溶解するまでボルテックスした。
【０３５１】
次いで、パクリタキセル含有ミクロスフェアを基本的に上記工程（Ｃ）〜（Ｅ）の様に生成し得る。
【０３５２】
（実施例29）
（界面活性剤コーティングミクロスフェア）
Ａ．材料および方法
ミクロスフェアを、ポリ(DL)乳酸（PLA）、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリカプロラクトン（PCL）およびエチレンビニルアセテート（EVA）:PLA（50:50）から、基本的に上記のように製造した。サイズは10〜100umの範囲であり、平均直径45umを有した。
【０３５３】
ヒト血液を健常なボランティアから得た。好中球（白血球）を、デキストラン沈降法およびFicollHypaque遠心分離技法を用いて、血液から分離した。好中球をHBSS１mlあたり500万細胞で懸濁した。
【０３５４】
好中球活性化レベルを化学発光により測定されるような活性酸素種の産生によって測定した。特に、１uMルミノールエンサンサーを用いたLKB照度計を使用することによって化学発光を測定した。ミクロスフェアの血漿プレコーティング（またはオプソニン化）を、0.5mlの血漿中に10mgのミクロスフェアを懸濁し、そして37℃、30分間のタンブリングすることにより行った。
【０３５５】
次いで、ミクロスフェアを１mlのHBBSで洗浄し、そして遠心分離したミクロスフェアペレットを好中球懸濁液に、37℃、時間ｔ＝０で添加した。ミクロスフェア表面を、Pluronic F127（BASF）と呼ばれる界面活性剤を用いて、F127の２％w/wHBBS溶液0.5mlに10mgのミクロスフェアを、30分間37℃で懸濁することによって改変した。次いで、ミクロスフェアを、好中球にまたはさらにプレコーティングするために血漿に添加する前に、１mlのHBBSで２回洗浄した。
【０３５６】
（Ｂ．結果）
図44は、未処理のミクロスフェアが50mV未満の化学発光値を生じることを示す。これらの値は低レベルの好中球の活性化を示す。比較のため、炎症性微結晶は1000mVに近い値を生じ得、可溶性化学アクチベーターは5000mVに近い値を生じ得る。しかしながら、ミクロスフェアを血漿でプレコーティングした場合、全ての化学発光値は100〜300mVの範囲に増幅される（図44）。このレベルの好中球応答または活性化は、中程度に炎症性であると考えられ得る。PMMAは最も大きな応答を生じ、最も炎症性であると考えられ得た。PLAおよびPLCは両方とも、血漿前処理（またはオプソニン化）後、好中球の活性化において３〜４倍より強力になったが、この点で、２つのポリマー間に差異はほとんどない。EVA:PLAは血管新生処方物に用いられる可能性はない。なぜならこのミクロスフェアは乾燥および水性緩衝液に再懸濁し難いからである。この血漿の効果はオプソニン作用と名付けられ、表面上への抗体もしくは補体分子の吸着に起因する。これらの吸着種は白血球上のレセプターと相互作用し、増幅された細胞活性化を引き起こす。
【０３５７】
図45〜48は、PCL、PMMA、PLAおよびEVA:PLAそれぞれの血漿プレコーティングの効果を記載し、そしてミクロスフェアの血漿プレコーティング前のPluronicF127プレコーティングの効果を示す。これらの図は全て、同様の効果を示す：（１）血漿プレコーティングは応答を増幅する；（２）Pluronic F127プレコーティングはそれ自身に対する効果を有さない；（３）血漿プレコーティングにより引き起こされた増幅された好中球応答は、ミクロスフェア表面を２％PluronicF127でプレコーティングすることにより強力に阻害され得る。
【０３５８】
血漿由来の吸着されたタンパク質種の性質をまた、電気泳動により研究した。この方法を用いて、ポリマー表面をPluronic F127で前処理することが、抗体のポリマー表面への吸着を阻害することが示された。
【０３５９】
図49〜52は同様に、PCL、PMMA、PLAまたはEVA:PLAミクロスフェアを（それぞれ）、IgG（２mg/ml）または２％PluronicF127次いでIgG（２mg/ml）でプレコーティングする効果を示す。これらの図から理解され得るように、ミクロスフェアをIgGでプレコーティングすることにより引き起こされる増幅された応答は、PluronicF127での処理により阻害され得る。
【０３６０】
この結果は、４つ全ての型のミクロスフェアのポリマー表面をPluronic F127でプレコーティングすることによって、ミクロスフェアに対する好中球の「炎症」応答は阻害され得ることを示す。
【０３６１】
（実施例30）
ポリ(E-カプロラクトン)ミクロスフェアへの治療薬のカプセル化。
【０３６２】
（パクリタキセルを充填したミクロスフェアによるCAMアッセイにおける血管新生の阻害）
本実施例は、ポリ(ε-カプロラクトン)（PCL）の生分解性ミクロスフェアからのパクリタキセルのインビトロ放出速度プロフィールを評価し、そしてCAM上に配置した場合のこれらのミクロスフェアから放出されるパクリタキセルのインビボ抗血管新生活性を示す。
【０３６３】
これらの実験に利用した試薬には以下のものが挙げられる：PCL（分子量35,000〜45,000；Polysciences（Warrington,PA）から購入）；Fisher Scientific Co., CanadaのDCM；Aldrich Chemical Co.（Milwaukee, Wis）のポリビニルアルコール（PVP）（分子量12,000〜18,000、99％加水分解化）、およびSigmaChemical Co.（St. Louis, MO）のパクリタキセル。別に記述していなければ、全ての化学薬品および試薬を供給されたまま使用する。蒸留水を全てにわたり使用する。
【０３６４】
Ａ．ミクロスフェアの調製
ミクロスフェアを溶媒エバポレーション法を用いて、実施例28に記載のように基本的に調製した。手短に言うと、５％w/wパクリタキセルを充填したミクロスフェアを10mgのパクリタキセルおよび190mgのPCLを２mlのDCMに溶解し、100mlの１％PVP水溶液に添加し、そして1000rpmで、25℃２時間攪拌することにより調製した。ミクロスフェアの懸濁液を1000×ｇで10分間遠心分離し（BeckmanGPR）、上清を除去し、そしてミクロスフェアを３回水で洗浄した。洗浄したミクロスフェアを一晩風乾し、室温で保存した。コントロールミクロスフェア（パクリタキセル非充填）を上記のように調製した。１％および２％パクリタキセル含有ミクロスフェアをまた調製した。ミクロスフェアを対物ミクロメーターを備えた光学顕微鏡を用いてサイズを測った。
【０３６５】
Ｂ．カプセル化効率
既知の重量の薬物を充填したミクロスフェア（約５mg）を８mlのアセトニトリルに溶解し、そして２mlの蒸留水を添加してポリマーを沈殿させた。混合物を1000ｇで10分間遠心分離し、カプセル化されたパクリタキセル量をUV分光光度計（Hewlett-Packard8452A ダイオードアレイ分光光度計）で、232nmで測定した上清の吸光度から計算した。
【０３６６】
Ｃ．薬物放出研究
約10mgのパクリタキセルを充填したミクロスフェアを、スクリューキャップしたチューブ中、20mlの10mMPBS（pH 7.4）に懸濁した。チューブを37℃で所定の時間間隔で隅々まで振盪し、19.5mlの上清を除去し（ミクロスフェアを底に沈降させた後）、0.45μmメンブランフィルターを通して濾過し、そしてパクリタキセル分析のため保持した。研究中ずっとシンク状態を保持するため、等容量のPBSを各チューブにおいて置換した。濾液を３×１mlDCMで抽出し、DCM抽出物を窒素流動下でエバポレートして乾燥させ、１mlのアセトニトリルに再溶解し、そして１ml/分の流速（BeckmanIsocratic Pump）の水：メタノール：アセトニトリル（37:5:58）の移動相、C8逆相カラム（Beckman）、および232nmのUV検出器（ShimadzuSPD A）を用いたHPLCによって分析した。
【０３６７】
Ｄ．CAM研究
受精した家ニワトリ胚を、シェルレス培養前に４日間インキュベートした。インキュベーションの６日目、５％パクリタキセルを充填したまたはコントロール（パクリタキセル非充填）ミクロスフェアの１mgアリコートをCAM表面に直接置いた。２日曝露後、血管系を、ビデオカメラに接続した実体顕微鏡を用いて検査した；次いで、映像信号をコンピューター上に表示し、映像を印刷した。
【０３６８】
Ｅ．走査電子顕微鏡観察
ミクロスフェアをサンプルホルダーに入れ、金でスパッタリングコーティングし、次いで、15kVで作動するPhilips501B SEMに配置した。
【０３６９】
Ｆ．結果
ミクロスフェアのサンプルのサイズ範囲は30〜100μmであったが、全てのパクリタキセルを充填したまたはコントロールミクロスフェアバッチで、いくらかのミクロスフェアがこの範囲から外れていることは明らかであった。PCLミクロスフェアをパクリタキセルで充填する効率は、全ての薬物充填研究について、常に95％より大きかった。走査電子顕微鏡観察は、ミクロスフェアが全て球形であり、多くが粗いかまたはあばたのある表面形態を示すことを実証した。ミクロスフェアの表面上の固形薬物の証拠はないようであった。
【０３７０】
１％、２％および５％充填PCLミクロスフェアからのパクリタキセル放出の経時変化を図53Aに示す。この放出速度プロフィールは二相性であった。全ての薬物充填において、パクリタキセルの初期急速放出または「バースト相」があった。バースト相は、１％および２％パクリタキセル充填で１〜２日にわたり、そして５％充填ミクロスフェアで３〜４日にわたり生じた。急速放出の初期相に、有意により緩慢な薬物放出相が続いた。１％または２％パクリタキセル含有ミクロスフェアについては、21日後、さらなる薬物放出はなかった。５％パクリタキセル充填で、ミクロスフェアは、21日後、全薬物含有量の約20％を放出した。
【０３７１】
図53BはコントロールPCLミクロスフェアで処理したCAMを示し、図53Cは５％パクリタキセルを充填したミクロスフェアでの処理を示す。コントロールミクロスフェアでのCAMは、正常な毛細血管網様構造を示した。パクリタキセル-PCLミクロスフェアで処理したCAMは、顕著な血管退行および毛細血管網を欠いている領域を示した。
【０３７２】
Ｇ．考察
パクリタキセルを充填したミクロスフェアを製造する溶媒エバポレーション法は、95〜100％の間の非常に高いパクリタキセルカプセル化効率を生じた。これはパクリタキセルの低い水溶性、およびポリマー含有有機溶媒相をにおける分配を好むその疎水性の性質に起因した。
【０３７３】
パクリタキセルの二相性放出プロフィールは、生分解性ポリマーマトリックスからの多くの薬物の放出パターンの典型であった。ポリ(ε-カプロラクトン)は、生理的条件下で加水分解によって分解され得る脂肪族ポリエステルであり、そしてそれは非毒性およびそして組織適合性である。PCLの分解は、広範に研究された酪酸およびグリコール酸のポリマーおよびコポリマーの分解よりも有意に緩慢であり、それ故、長期薬物送達システムの設計に適している。パクリタキセル放出の初期急速相またはバースト相は、ミクロスフェアの表在領域（ミクロスフェア表面の近傍）からの薬物の拡散放出によると考えられた。放出プロフィールの第２（より緩慢な）相におけるパクリタキセルの放出は、PCLの分解または侵食に依らないようである。なぜなら、研究により、水中のインビトロ条件下では、7.5週間にわたるPCLの有意な重量損失または表面侵食は存在しないことが示されているからである。パクリタキセル放出のより緩慢な相はおそらく、ポリマーマトリックスの液体が充満した孔内の薬物の溶解および孔を介した拡散に依ったのであろう。より高いパクリタキセル充填におけるより高い放出速度はおそらく、ポリマーマトリックス内のより広範囲な孔網の結果であったのであろう。
【０３７４】
５％充填パクリタキセルミクロスフェアは、CAM上に配置した場合、血管新生の広範な阻害を産生するために十分な薬物を放出することが示された。血管増殖の阻害は、図53Cに示したような無血管性領域を生じた。
【０３７５】
（実施例31）
（PLGAミクロスフェアの製造）
ミクロスフェアを酪酸-グリコール酸コポリマー（PLGA）から製造した。
【０３７６】
Ａ．方法
ミクロスフェアを0.5〜10μm、10〜20μmおよび30〜100μmのサイズ範囲で、標準的方法を用いて製造した（PCLまたはPDLLAミクロスフェア製造法に前記したように、ポリマーをジクロロメタンに溶解し、攪拌しつつポリビニルアルコール溶液に乳化した）。PLLA対GAの様々な比を、異なる分子量（固有粘度（I.V.）として示した）を有するポリマーとして用いた。
【０３７７】
Ｂ．結果
ミクロスフェアを以下の出発ポリマーから首尾よく製造した：
PLLA      :      GA      I.V.
50        :      50      0.74
50        :      50      0.78
50        :      50      1.06
65        :      35      0.55
75        :      25      0.55
85        :      15      0.56
10％または20％充填のパクリタキセルを、これら全てのミクロスフェアに首尾よく組み入れた。１つの出発ポリマー（85:15、IV＝0.56）のサイズ分布の例を図54〜57に示す。パクリタキセル放出実験を、様々なサイズおよび様々な組成のミクロスフェアを用いて行った。放出速度を図58〜61に示す。
【０３７８】
（実施例32）
パクリタキセルのナイロンマイクロカプセルへのカプセル化
治療薬はまた、選択された形態またはデバイスに形成され得る広範なキャリア中にカプセル化され得る。例えば、以下により詳細に記載するように、パクリタキセルは、人工心臓弁、血管移植片、外科手術用メッシュ、または縫合糸に処方され得るナイロンマイクロカプセル中に組み込まれ得る。
【０３７９】
Ａ．パクリタキセルを充填したマイクロカプセルの調製
パクリタキセルを、界面重合化技術を用いて、ナイロンマイクロカプセル中にカプセル化した。簡潔には、100mgのパクリタキセルおよび100mgのPluronic F-127を１mlのDCM中に溶解させ、そして0.4ml（約500mg）のアジポイルクロリド（ADC）を添加した。この溶液を、Polytronホモジナイザー（設定１）を用いて、15秒間にわたり、２％PVA溶液中にホモジナイズした。ホモジナイズの間、5ml蒸留水中の1,6-ヘキサンジアミン（HMD）の溶液を滴下した。HMD溶液の添加後、さらに10秒間、この混合物をホモジナイズした。この混合物をビーカーに移し、そしてマグネチックスターラーで３時間にわたって撹拌した。この混合物を遠心分離し、回収し、そして１mlの蒸留水中に再懸濁させた。
【０３８０】
Ｂ．カプセル化効率／パクリタキセルローディング
約0.5mlの懸濁液を濾過し、そしてミクロスフェアを乾燥させた。約2.5mgのマイクロカプセルを秤量し、そして10mlのアセトニトリル中に、24時間にわたって懸濁させた。上清をパクリタキセルについて分析し、そして結果をパクリタキセルの百分率として表した。予備的研究は、パクリタキセルが、高いローディング（60％まで）および高いカプセル化効率（80％を越える）で、ナイロンマイクロカプセル中にカプセル化され得たことを示している。
【０３８１】
Ｃ．パクリタキセル放出の研究
約2.5mgのパクリタキセル−ナイロンミクロスフェアを、それぞれ1Mの塩化ナトリウムおよび尿素を含む50mlの水中に懸濁させ、そして定期的に分析した。マイクロカプセルからのパクリタキセルの放出は速く、72時間後、95％を越える薬物が放出された（図62）。
【０３８２】
（実施例33）
生体接着性ミクロスフェア
Ａ．生体接着性ミクロスフェアの調製
ミクロスフェアを、10μm 〜60μmの粒子直径範囲を有するPLLA 100kg/molから調製した。ミクロスフェアを、水酸化ナトリウム溶液中でインキュベートして、ポリエステルの加水分解により、表面上にカルボン酸基を生成させた。表面の電荷を測定することにより、水酸化ナトリウム濃度およびインキュベーション時間について、反応をキャラクタライズした。反応は、0.1M水酸化ナトリウム中での45分のインキュベーションの後、完結に達した。塩基処理の後、ミクロスフェアをジメチルアミノプロピル（proyl）カルボジイミド（DEC）（架橋剤）のアルコール性溶液に懸濁させ、そして混合物を乾燥させて分散可能な粉末にすることにより、ミクロスフェアを、DECでコーティングした。ミクロスフェアとDECの重量比は、９：１であった。ミクロスフェアが乾燥した後、これらを撹拌しながら、ポリ（アクリル酸）(PAA）の２％w/v溶液中に分散させ、そしてDECをPAAと反応させて、ミクロスフェア表面上に、水不溶性の架橋PAA網目を生成させた。ミクロスフェア表面上のPAAの存在を確認するために、走査電子顕微鏡を用いた。
【０３８３】
塩基での処理前および処理後における、ミクロスフェアの示差走査熱量分析は、バルク熱（bulkthermal）特性（Tg、融解、および結晶化度）における変化がなかったことがSEMによって観察されたことを明らかにした。
【０３８４】
Ｂ．インビトロでのパクリタキセル放出速度
同じ粒子直径サイズ範囲を有する、パクリタキセルを充填したミクロスフェア（10％および30％w/wのローディング）を製造し、そしてPBS中10日にわたる放出におけるインビトロ放出プロフィールを作成した。放出は、薬物ローディングに比例し、10日の間、30％充填ミクロスフェアの５mgから放出されたパクリタキセルは400μgであり、そして同様の期間中、10％充填ミクロスフェアから放出されたパクリタキセルは150μgであった。カプセル化の効率は、約80％であった。パクリタキセルを充填したミクロスフェアを、0.1Ｍの水酸化ナトリウム中で45分間にわたってインキュベートし、そして水酸化ナトリウム中でのインキュベーションの前後で、ゼータポテンシャルを測定した。パクリタキセルを充填したミクロスフェアの表面電荷は、塩基による処理の前後の両方で、パクリタキセルを有しないミクロスフェアよりも低かった。
【０３８５】
Ｃ．ポリリジンまたはフィブロネクチンのいずれかでコーティングされたPLLAの調製およびインビトロでの評価
１％スーダンブラック（sudan black）を含む（ミクロスフェアを着色するため）PLLAミクロスフェアを調製した。これらのスフェアを、ポリリジン（Sigmachemicals-ヒドロブロメル形態（Hydrobromell form））またはフィブロネクチン（Sigma）のいずれかの２％（w/体積）溶液中に、10分間にわたって懸濁させた。このミクロスフェアを、緩衝液中で１回洗浄し、そして新たに準備したラットの膀胱の内部表面に配置した。膀胱を10分間放置し、次いで緩衝液中で３回洗浄した。このプロセス後、膀胱壁に存在している残存（結合）したミクロスフェア（従って、生体接着を示すミクロスフェア）は、フィブロネクチンをコーティングしたミクロスフェアおよびポリ-l-リジンをコーティングしたミクロスフェアの両方について、生じた（図63Ａおよび63Ｂ）。
【０３８６】
（実施例34）
CIAラットモデルにおける、パクリタキセルによる関節炎発症の防止
Ａ．材料および方法
同系の雌性Louvainラット（体重120〜150グラム）に、0.1Ｍ酢酸で可溶化しそしてFIA（Difco、Detroit、MI）で乳化した、0.5mgの天然のチック（chick）コラーゲンII（Genzyme、Boston、MA）を皮内注射した。免疫処置のほぼ９日後、動物は、パンヌス形成および骨／軟骨侵食の組織学的変化を伴う多発性関節炎を発現した。４つのプロトコル（ビヒクルを単独で受容したコントロール群（n=17）、ならびに１つの防止プロトコルおよび２つの抑制プロトコルからなる、３つのパクリタキセル処置群）中、計45匹のラットが用いられた。パクリタキセルの効果を評価するために、パクリタキセル（エタノールとCremophorE.L.(登録商標）(Sigma）との１：１希釈物中で可溶化し、生理食塩水に添加して、５％w/vエタノールおよびCremophor E.L.中のパクリタキセルの最終濃度を4.8mg/mlにした）を、そして免疫処置後第２日目（防止プロトコル）または第９日目の関節炎発症時（抑制プロトコル）に、腹腔内（i.p.）投与を開始した。防止プロトコル（n=8）については、パクリタキセルを、1mg/kg体重の濃度で、第２日目から開始して、その後の５回の投与（第５日目、第７日目、第９日目、第12日目、および第14日目）により与えた。高用量の抑制プロトコル（n=10）については、パクリタキセル（1mg/kg体重）を、第９日目から開始して１日おきに与えた。低用量の抑制プロトコル（n=10）では、パクリタキセルを、1mg/kg体重で、第９日目、第11日目、および第13日目に与え、次いでこの用量レベルの75％（0.75mg/kg体重）を、１日おきに、第21日目まで与えた。コントロール動物および実験動物を、疾患の重篤度について、処置群を知らされていない（blindedto）個人によって、臨床的におよびＸ線写真により評価した。
【０３８７】
各肢についての炎症の重篤度を、日毎に評価し、そして腫脹および関節周囲の紅斑の標準化されたレベル（０は正常であり、４は重篤である）に基づいて評定した。動物を、実験の第28日目に、 Ｘ線写真により評価した。両方の後肢のＸ線写真を、軟組織の腫脹、関節の間隙の狭さ、骨の破壊、および骨膜の新骨形成の程度によりランク付けした。各肢を数量化するために、０〜３のスケールを用いた（０＝正常、１＝軟組織腫脹、２＝骨の初期侵食、３＝重篤な骨の破壊および／または強直症）。関節の組織学的評価を、この実験の終わりに完結させた。
【０３８８】
CIIに対する、遅延型過敏症（DTH）を、第28日目に完結した放射線耳アッセイ（radiometricear assay）により測定した。1.4以上の放射線耳指数（radiometric ear index）は、CIIへの顕著な応答を表す。抗-CII IgG抗体の存在は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により測定された。第26日目に得られた血清サンプルを、１：2560に希釈し、そして結果を、490nmにおける平均光学密度（４連のアリコート中）として表した。この希釈率での正常なラット血清中のバックグラウンドレベルは０であり、そしてこれらは、コラーゲンで免疫処置したラット血清から容易に識別可能である。
【０３８９】
Ｂ．結果
このモデルにおいて、関節炎発症の前に実施されたパクリタキセル処置は、ビヒクルコントロール群と比較すると、全ての処置されたラットにおいて（パクリタキセル処置を中断した後でさえも）、疾患の発現を完全に防止した。
【０３９０】
コントロール動物において、疾患の臨床的症状は、変形および関節機能の喪失が起こるまで漸進的に増加した。関節炎の発症後、低用量および高用量のパクリタキセルを受容した動物は共に、顕著な臨床的改善を示した。平均して、臨床的評点は、処置の開始時に見られた評点と同等であり、このことはパクリタキセルが疾患の臨床的進行を防止する能力を示した。
【０３９１】
パクリタキセルを受容した動物は、体重を支えること（weight bear）ができ、歩行可能であり、そして仮に処置に何らかの毒性効果があるとしても、それらを少しも示さなかった。処置された動物において、ワクチン接種部位における創傷治癒および体毛再成長が観察された。パクリタキセルで処置した動物は、コントロールと比較して、体重が増加した。
【０３９２】
パクリタキセル関節炎防止プロトコルにおけるラットはいずれも、いかなるＸ線写真での変化も、臨床的関節炎も表さなかった。高用量および低用量のパクリタキセルの群の両方とも、コントロール群と比較して、Ｘ線写真で観察される疾患が顕著に少なかった。さらに、組織学的評価により、コントロール群のラットは顕著なパンヌス（骨および軟骨の侵食を伴う）を示したが、パクリタキセルで処理したラットは、たとえパンヌスを有しても最小限であり、関節の軟骨が保護されたことが明らかになった。
【０３９３】
ELISAアッセイを用いると、II型コラーゲンに対するI gG抗体は、コントロール群と比較して、パクリタキセルで処理したラットにおいて顕著に低かった；防止プロトコルにおけるラットは、高用量および低用量のパクリタキセル投与抑制プロトコルにおけるラットと比較して、顕著に低いIgG抗体を有した。
【０３９４】
Ｃ．考察
パクリタキセルは、関節炎およびおそらくは他のタイプの自己免疫疾患のための実行可能な処置である。なぜなら、これは、免疫処置の後であるが関節炎の発症の前に投与される場合、疾患のプロセスを遮断するからである。この結果は、パクリタキセルが、CII免疫処置の２日後に開始された場合、関節炎発症を完全に抑止し得ることを示す。抑制プロトコルにおけるパクリタキセル処置に関して、関節炎の重篤性は、パクリタキセル投与の期間中減少し続けたが、両方の抑制プロトコルにおいて、処置を中止した後４日以内に増加し始めた。しかし、パクリタキセルを用いる早期介入により、連続的な治療の必要性が緩和されるようであった。
【０３９５】
（実施例35）
パクリタキセルを用いる、コラーゲン誘発関節炎の後退
パクリタキセルは、ミセル製剤中で全身投与される場合、CIAモデルにおける疾患改変効果（disease-modifyingeffect）を示した。パクリタキセルの潜在的な疾患改変効果を評価するために、ミセル性（Cremophorを有さない）パクリタキセルを、４日毎に（q.o.d.）、５mg/kg（第１群）または10mg/kg（第２群）で、臨床的に検出可能な関節炎の発症時（第９日目）に、免疫処置した動物に腹腔内（i.p.）投与した。評価期間を通して、パクリタキセルを投与した。標準的治療との比較として、第３の群は、関節炎の発症後第０日目、第５日目、および第10日目に、0.3mg/kg（i.p.）(ヒト等価用量）で、メトトレキセートを受容した。第４の群は、メトトレキセート（0.3mg/kg）およびミセル性パクリタキセル（10mg/kg）の組み合わせ治療を受けた。コントロール（第５群）および実験動物を、処置群について知らされていない個人によって、臨床的およびＸ線写真の両方により、疾患の重篤性について評価した。
【０３９６】
各肢についての炎症の重篤度を、日毎に評価し、そして腫脹および関節周囲の紅斑の標準化されたレベル（０は正常であり、４は重篤である）に基づいて評定した。動物を、実験の第28日目に、Ｘ線写真により評価した。両方の後肢のＸ線写真を、軟組織の腫脹、関節の間隙の狭さ、骨の破壊、および骨膜の新骨形成の程度によりランク付けした。各後肢を数量化するために、０〜３のスケールを用いた（０＝正常、１＝軟組織腫脹、２＝骨の初期侵食、３＝重篤な骨の破壊および／または強直症）（Brahnら、ArthritisRheum. 37: 839-845, 1994；Oliverら、Cell. Immunol. 157：291-299、1994）。関節の組織学的評価を、この実験の終わりに完結させた。
【０３９７】
このモデルにおいて、関節炎発症の前に実施されたミセル性パクリタキセル処置は、パクリタキセル処置を中断した後でさえも、疾患の発現を完全に防止した。コントロール動物において、疾患の臨床的症状（図64）は、変形および関節機能の喪失が起こるまで漸進的に増加した。メトトレキセート治療を受容した動物は、コントロールと比較して、統計的に改善されなかった（図64および表１）。関節炎の発症後、低用量ミセル性パクリタキセル（５mg/kg）を受容した動物は、幾分か改善を示したが、10mg/kgの用量のミセル性パクリタキセルを受容した動物は、高度に有意な（p=0.0002）臨床的改善を示した（図64）。平均して、臨床的評点は、処置の開始時において見られた評点と同等であり、ミセル性パクリタキセルが疾患の臨床的進行を防止する能力を示した（表１）。
【０３９８】
【化１７】
2009161555.tif 000018
ミセル性パクリタキセルを受容した動物は、体重を支えることができ、歩行可能であり、そして処置のいかなる毒性の影響も示さなかった。処置された動物において、ワクチン接種部位における創傷治癒および体毛再成長が観察された。ミセル性パクリタキセル処置動物は、非処置コントロールと比較して、体重が増加した。ミセル性パクリタキセルおよびメトトレキセートを受容した動物は共に、コントロールと比較して、治療に良好に耐え、そして印象的な臨床的改善を示した（p≦0.0001）(図64）。酵素結合免疫吸着抗体（ELISA）アッセイを用いると、II型コラーゲンに対するIgG抗体は、パクリタキセルでおよび組み合わせ（MTX/パクリタキセル）で処置されたラットにおいて、コントロールと比較して低かった。
【０３９９】
Ｘ線写真の研究はまた、パクリタキセル治療について顕著な改善を示した。コントロール動物およびメトトレキサートで処置した動物は、軟組織の腫脹、関節の間隙が狭くなっていること、骨破壊、および骨膜の新骨形成のＸ線写真による証拠を示したが、パクリタキセルで処置した動物は、Ｘ線上で、ほぼ正常な関節の形状を有した（図65）。
【０４００】
実際に、ミセル性パクリタキセル単独（10mg/kg）またはメトトレキセートとの組み合わせを受容した動物のうち、軟骨の侵食を発現したのはごく小さい割合（17〜18％）の動物であった。疾患の進行／結果の重要な指標である軟骨の侵食は、ミセル性パクリタキセル治療を受容する動物と比較して、コントロール動物（72％）またはメトトレキセートを単独で受容する動物では、４倍起こりやすい（表２）。
【０４０１】
【化１８】
2009161555.tif 000019
・コラーゲン誘発関節炎（CIA）ラットの両方の後肢のＸ線写真は、軟組織の腫脹、関節の間隙が狭くなっていること、骨破壊、および骨膜の新骨形成の程度によりランク付けされた。０〜３の整数スケールを用いて、各肢を数量化した（両方の肢の和からの、最大のとり得る評点は６である）。
・疾患の進行／結果の重要な指標である軟骨侵食の存在は、ミセル性パクリタキセル治療を受容する動物（18％）と比較して、コントロール動物では、４倍起こりやすい（72％）。
【０４０２】
走査型電子顕微鏡写真は、インビボにおけるパクリタキセル治療の軟骨保護効果を明らかにする。正常な関節表面は、薄い骨膜内層によって囲まれた、滑らかな無傷の軟骨マトリックスにより特徴付けられる（A）。CIAにおいて、軟骨表面はパンヌス組織により産生されたMMP、および炎症を起こした骨膜で侵食されている（図66B）。浅在性軟骨マトリックスは消化され、軟骨細胞またはかつては軟骨細胞が占めていた空小腔を曝す（図66B挿入図）。臨床関節炎の発症後にパクリタキセル処置を受けた、CIAを有する動物では、関節表面は無傷のままであり（図66C）、そして軟骨マトリックスは、高倍率でさえ大部分が正常なようであった（図66C挿入図）。パンヌス組織形成、および骨膜肥大はパクリタキセル処置群においては見られなかった。
【０４０３】
組織学的には、CIAは、顕著な骨膜肥大、骨膜の炎症性細胞浸潤、および軟骨破壊によって特徴付けられる（図67A）。パクリタキセル処置動物においては、骨膜は１〜２層の骨膜細胞のみを有して正常であるように見え、炎症細胞浸潤は観察されなかった（図67B）。
【０４０４】
また、腐食鋳造物を、パクリタキセルがCIAを有する動物の骨における新血管形成をブロックし得るかを決定するために評価した。メルコックス（mercox）ポリマーを、屠殺した動物の大腿動脈に100mmHgの圧力で注入し、インサイチュで固化させ、続いて、組織を消化して、下肢血管系の鋳造物を作った。CIAを有する動物の骨膜血管系の鋳造物の走査電子顕微鏡写真により、関節空間に向かう内向きに突出した末端部が判別不可能な（blind-ended）毛細血管新芽が明らかになった。これらの血管は、固形腫瘍および他の血管形成形態で記載される成長中の血管形成性血管に形態学的に類似するようであった（図68A挿入図）。対照的に、パクリタキセル処置動物の骨膜血管は、毛細血管ループに配置され（図68B）、血管新生芽の証拠はなかった。
【０４０５】
投薬を受けていないコントロールに見出されるものと同じく、パクリタキセル／MTXレシピエントにおいて、血管増殖の退行および形態学的な血管構造が存在した。これらの研究は、ミセルのパクリタキセル、およびパクリタキセル／メトトレキセート組合せ治療が、新生血管形成を退行させ、炎症プロセスを阻害し、定着した骨膜炎を退縮させ、そして関節破壊を防止し得ることを示唆する。
【０４０６】
パクリタキセルの全身投与は、関節炎に対する実行可能な治療であることが示された。疾患の本来の過程は、発赤および軽減であり、連続する発赤のそれぞれが、加算的な損傷を生じ、最終的に関節の破壊を導く。疾患の緩解傾向を導くために用いられる、短期的で高容量の全身治療、または疾患制御を維持するための、持続的低容量治療の可能性が存在する。パクリタキセルを送達する他の方法には、１ヶ所または２ヶ所の顕著な関節疾患を有する患者の罹患関節への薬物の直接的な関節内注射が挙げられる。
【０４０７】
（実施例36）
乾癬の動物モデルにおけるパクリタキセル処方物の評価
A.  皮膚血管形成モデル
皮膚特異的血管形成を研究するため、新規の動物モデルを用いた。免疫不全SCIDマウスを、センス方向、またはアンチセンス方向で血管内皮増殖因子（VEGF)をトランスフェクトしたヒトケラチノサイト株の表面移植物のレシピエントとして、用いる。ケラチノサイトを、改変型シリコーン移植チャンバーアッセイの使用を介してレシピエントマウスの皮膚上に移植する。ケラチノサイトを、分化させ、そして皮膚血管形成を誘導させる。次いでパクリタキセルを全身、または局所的（クリーム、軟膏、ローション、ゲル）に投与し、そして処置群および非処置群において、血管数およびサイズの形態計測的測定を行う。
【０４０８】
B.  皮膚遅延型過敏反応に対するマウスモデル
皮膚遅延型過敏反応に対するマウスモデルを用いて、誘導性皮膚炎症に対するパクリタキセルの効果を研究した。簡潔には、皮膚上にオキサゾロン(oxazolone)を局所的に適用することにより、マウスをこの化合物に感作させた。５日後、耳の皮膚に局所的に適用することでマウスをオキサゾロンで攻撃し（左耳：オキサゾロン、右耳；ビヒクル単独）、皮膚炎症性の「遅延型過敏」反応を起こした。炎症の程度を、48時間にわたって、生じた耳の腫脹を測定することにより数値化した（図69および70を参照のこと）。Eponに包埋し、Giesmaで染色した１μm組織切片を、炎症細胞の存在、組織肥満脂肪の存在およびその活性化の状態、ならびに上皮過形成の程度について評価した。このインビボモデルにおける、皮膚炎症反応に対するパクリタキセルの効果を定量化するため、全身または局所的のいずれかでパクリタキセルを投与した。
【０４０９】
C.  結果
これらの研究は、マウスにおいて実験的に誘導した皮膚炎症の処置における１％パクリタキセルの局所投与と、ビヒクル単独の局所投与との比較は、パクリタキセルが皮膚炎症に阻害効果を及ぼすことを示した。実験的に誘導した遅延型過敏反応において、ビヒクル単独で局所的に処置した耳と比較して、１％パクリタキセルで局所的に処置した耳の耳腫脹に有意な減少が存在した。１％パクリタキセル処方物の局所的適用は、PMA(ホルボル12-ミリストール13-アセテート）の局所適用によって誘導された、耳の腫脹および紅斑（発赤）を有意に阻害した（図71および図72を参照のこと）。図73に例示したように、パクリタキセルで処置した耳（右耳）は、コントロール（左耳）と比較して外見上は正常であった。計５匹のマウスで類似の結果が得られた。
【０４１０】
１％パクリタキセルの皮膚刺激を、ビヒクル単独と比較して評価するために、これらの２つの処方物の適用を８日間にわたって、両耳の各側にそれぞれ、毎日20μl適用した。８日後、正常または炎症の起きたマウス耳皮膚へのビヒクル単独、および１％パクリタキセル処方物いずれの適用後も、皮膚刺激は検出されなかった。
【０４１１】
（実施例37）
動物モデルにおける慢性拒絶の評価
促進型のアテローム性動脈硬化症が、心臓移植レシピエントの大部分で進展し、長期の移植片の生存を制限する。慢性拒絶のLewis-F344異所性ラット心臓移植モデルは有用な実験モデルである。なぜなら、これは、アテローム性動脈硬化症の病変を、中期および長期生存同種移植片において段階的に産生するからである。Lewis-F344モデルの利点は：(i)長期生存移植片における、アテローム性動脈硬化症の病変の発生率および重篤度が極めて高く；そして（ii)この系は免疫抑制を必要としないので、病変進展の炎症段階が容易に認識されるということである。
【０４１２】
成体雄性Lewisラットはドナーとして供され、そしてF-344ラットはレシピエントとして供される。麻酔したレシピエントにおいて腹部に長い正中切開を行い、大動脈および下大静脈を露出させることによって、20の異所性腹部心臓同種移植片を移植した。２つの血管を、互いに分離し、そして周囲の結合組織から分離し、血管上に小さい留め具を付ける。各血管に吻合部位で縦方向の切開（２mm〜３mm）を行う。
【０４１３】
麻酔されたドナーラットの腹部を、下大静脈内に300ユニットの水性ヘパリンを注入するために切開する。胸壁を心臓が露出するように切開する。大静脈を結紮し、次いで上大動脈および主肺動脈を切除し、２〜３mmの長さで残った血管起点を心臓に接続する。結紮に対して遠位側の大静脈を分割し、そして結紮を左心房および肺静脈の集団のまわりに配置する。結紮の肺側の血管を分割し、そして心臓を除去する。
【０４１４】
ドナー心臓をレシピエントの腹腔内に配置し、そして大動脈をレシピエントの血管の切開部位で一緒に縫合する。同様に、肺動脈を下大静脈の切開部位に同様の様式で接続する。血管クランプを放し(近位大静脈、遠位静脈および動脈、ならびに近位大静脈)、針穴からの出血を最小限にする。
【０４１５】
移植後、ポリカプロラクトン(PCL)ペースト(n=10)中のパクリタキセル(33％)またはPCLペースト単独(n=10)を10匹のラットの冠状動脈の外側表面の長さにわたって心外膜を通じて注射し、その結果心筋に包埋された動脈領域が未処置のまま残る。
【０４１６】
全てのレシピエントは、移植時にペニシリンＧ(100,000ユニット)の単回筋肉内注射を受ける。同種移植に次いで日々の触診を行い、そして１〜４のスケールで(４が通常の心拍を表し、そして０が機械的活動の欠如を表す)それらの機能を評価する。各グループからの５匹のラットを14日間で屠殺し、残りの５匹のラットも28日間で屠殺する。ラットを重量の減少および他の全身性疾病の徴候に関して観察する。14または28日後、動物を麻酔し、そして最初の実験の様式で心臓を露出させる。被覆されたおよび被覆されていない冠状動脈を単離し、10％緩衝化ホルムアルデヒドで固定化し、そして組織学的に検査する。
【０４１７】
最初の実験は、移植後の冠状動脈でのパクリタキセル/EVAフィルムまたは被覆されたステントの使用のために改変され得る。EVAフィルムは、被覆されたステントを管腔内に設置しながら、冠状動脈の管腔外表面に上記と同様の様式で適用される。
【０４１８】
さらに、これらの調査は他の組織移植ならびに移植片移植(例えば、静脈、皮膚)を含むようにさらに拡張され得る。
【０４１９】
（実施例38）
MSの動物モデルにおけるパクリタキセルの効果
脱髄性トランスジェニックマウスのMS症状の進行および病原性を阻害するパクリタキセルミセルの能力(Mastronardiら、J.Neurosci. Res. 36：315-324、1993)は検査された。これらのトランスジェニックマウスは、70コピーのトランスジーンDM20(ミエリンプロテオリピド)含む。臨床的に、動物は３月齢まで通常である。３ヶ月後、神経学的病理の証拠(例えば、発作、震え、後肢可動性(hindlimb mobility)、歩行不安定、びっこ引き(limp tail)、ゆらぎ歩行および活動性の程度の減少)が明らかであり、そして動物が６月齢と８月齢との間で死ぬまで重症度が進行的に増大する。臨床的な徴候は、脳内の脱髄および増加した線維性星状細胞増殖と組織学的に相関する(Mastronardiら、J.Neurosci. Res. 36：315-324、1993)。
【０４２０】
（Ａ．材料および方法）
２つの動物研究を、低容量継続治療パクリタキセルプロトコール(2. 0mg/kg；１週間当たり３回、合計10回の注射)または疾患の臨床的発症で開始される高用量「パルス」治療パクリタキセルプロトコール(20mg/kg；４回、１週間に１度)のいずれかの皮下投与を用いて実施された(約４月齢)。低容量プロトコールに関して、５匹の動物がミセルパクリタキセルを受け、２匹のマウスをコントロールとして用いた；１方のマウスは未処置の正常であり、そしてもう一方は未処置のトランスジェニック同腹仔であった。疾患の過程が研究室内で十分に確立されるので、１方のマウスのみがコントロールとして使用された。MSの最初の徴候が上記の症状カテゴリーの１＋のスコアに達した後、４月齢の動物をミセルパクリタキセルで注射した。処置の過程は、24日間であった(2.0mg/kgパクリタキセル、１週間当たり３回、10回用量)。体重および臨床的徴候を各注射の日に決定した。
【０４２１】
Ｂ．結果
パクリタキセルを受けた５匹の動物は、顕著な体重減少を示さなかった。しかし、未処置のトランスジェニックマウスは30％の体重減少(29gから22g(図74))を示し、疾患の進行に正常に関連している。
【０４２２】
MSの臨床的指標(例えば、震え、後肢可動性、発作、頭部震動、歩行不安定、ゆらぎ歩行および活動性の程度の減少)は、日々モニターされた。処置の開始において、動物は主な症状カテゴリーの１＋のスコアを有した。未処置の動物は、多くの症状において次の27日間にわたって１＋から４＋へスコアが進行した；３＋は貧弱な平衡感覚で特徴づけられ、疾患の主な特徴の１つである。パクリタキセル処置グループにおいて、全５匹の動物はモニターされた症状の全てにおいて同じ期間にわたって１＋のスコアのままであった(表１)。
【０４２３】
【化１９】
2009161555.tif 000020
高用量プロトコールに関して、マウスは腫瘍患者に使用されるように(乳ガンおよび卵巣ガンに関して月々与えられる)疑似間隔パルス化学療法に４週間の間、20mg/kgのパクリタキセルで週に１度処置された。動物を１０週間、２日おきにモニターし、そしてスコアを各症状ごとに決定した。３匹の未処置の動物において、実験の過程の間に神経学的症状が急速に進行し、そしてそれらの動物のうち２匹が(５週間および９週間で)死亡した；第３の生き残っている動物は、重篤な臨床的症状を有した。症状の発症後に開始されたパクリタキセル処置を受けている５匹のトランスジェニック動物において、モニターした最初の１週間後、コントロールに対してMSスコアの減少があり、そしてその後、さらなる神経学的悪化は観察されなかった。これらの動物において、疾患の進行は、観察されず、そして動物は治療の間(０〜３週間)および薬物処置の中止の後(４〜10週間)の両方で臨床的に緩解のままである(図75)。
【０４２４】
Ｃ．結論
パクリタキセルは、低容量および高用量でのMSのこの動物モデルにおいて観察された神経学的症状の急速な進行を防止した。これらのデータは、パクリタキセルが脱髄疾患の強力な治療剤であり得ることを示唆する。
【０４２５】
（実施例39）
鼻ポリープの処置のためのパクリタキセルおよび他の微小管安定剤の評価
上皮細胞培養物および/または鼻ポリープ組織培養物は、鼻ポリープの処置におけるパクリタキセルまたは他の薬剤を含む処方物の効力を評価するために使用される。このアプローチは、上皮細胞がサイトカインを放出し、そして鼻ポリープ症および鼻炎ならびに喘息で検出される慢性的な炎症に寄与すること、および延長された放出投薬が、好酸球増加症を予防し、サイトカイン遺伝子発現を阻害するという前述の事項に基づいている。
【０４２６】
鼻スプレーとして使用するための粘膜接着性ポリマー中にカプセル化されたパクリタキセルを含有する溶液(シクロデキストリンの使用)または懸濁液を含むパクリタキセル処方物、および/または粘膜接着性ポリマー中のマイクロカプセル化パクリタキセルは、ガス注入として使用される。これらの処方物は以下に詳述された研究に使用される。
【０４２７】
Ａ．インビトロでのパクリタキセルの効果
組織の取り扱い−正常鼻粘膜(NM)標本を、鼻炎の臨床的な証拠がなく、そして鼻再建手術中に肌刺しテスト(skin-pricktest)で陰性である患者から得る。鼻ポリープ(NP)標本を鼻ポリープ切除を施した肌刺しテスト(skin-prick test)で陽性および陰性である患者から得る。鼻の標本は、100UI/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび２μg/mlアンホテリシンＢを補充したHam'sF12培地に設置され、そして直ちに研究室に移される。
【０４２８】
上皮細胞培養物−NMおよびNPからの鼻上皮細胞を、以下のようにプロテアーゼ消化によって単離する。組織標本を100UI/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび２μg/mlアンホテリシンＢを補充したHam'sF12で２〜３回リンスし、次いでHam's F12中の0.1％プロテアーゼXIV型で４℃で一晩インキュベートする。インキュベートの後、10％FBSをプロテアーゼ活性を中和するために添加し、そして上皮細胞を穏やかな撹拌により剥離する。細胞懸濁液を60メッシュ細胞解離シーブでろ過し、そして500gで10分間室温で遠心する。次いで細胞ペレットを、以下の試薬を含むホルモン規定Ham'sF12培地(Ham's HD)に再懸濁する：100UI/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、２μg/mlアンホテリシンＢ、15 0μg/mlグルタミン、５μg/mlトランスフェリン、５μg/mlインスリン、25ng/ml上皮成長因子、15μg/ml内皮細胞成長補充物、200pMトリヨードチロニン(triiodothryonine)および100nMヒドロコルチゾン。次いで、細胞懸濁液(105細胞/ウェル)を２mlのHam'sHD中にコラーゲンコーティングされたウェルにプレートし、そして５％CO2加湿雰囲気で37℃で培養する。培地を１日で、次いで１日おきに交換する。単層細胞コンフルエンスは培養６〜10日後に達成される。
【０４２９】
ヒト上皮条件培地(HECM)生成−上皮細胞培養物がコンフルエンスに達した場合、Ham'sHDを、100UI/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、２μg/mlアンホテリシンＢ、150μg/mlグルタミンおよび25mM Hepes緩衝液で補充されたRPMI1640培地(Irvin、Scotland)に切り替える(RPMI10%)。RPMI(10%)とのインキュベートの48時間後に生じるHECMを培養物から収集し、室温(RT)で10分間400gで遠心し、0.22μmフィルターでろ過して滅菌し、そして使用するまで-70℃で貯蔵する。
【０４３０】
好酸球生存およびパクリタキセルの効果−好酸球を末梢血から単離し、そして好酸球生存におけるNMおよびNP両方からのHECMの効果を以下の２つの異なる方法で決定する：時間経過および用量応答分析。時間経過実験において、約250,000/mlの濃度の好酸球を、50％HECMを有するまたは有さない(ネガティブコントロール)６ウェル組織培養物中でインキュベートし、そして生存指数を２、４、６および８日で評価する。他の実験は１〜50％HECMで行う。HECM誘導好酸球生存における薬物(例えば、パクリタキセル)の効果が試験される実験において、0.1nM〜10μMの薬物(パクリタキセル)をHECMの添加の前の１時間にわたって37℃で好酸球とインキュベートする。各実験において、ネガティブコントロール(培地のみ)およびポジティブコントロール(HECM含有培地)ウェルを常に評価する。薬物がいかなる毒性効果を有するかを調査するために、薬物(種々の濃度)とインキュベートされた好酸球の生存度を、24時間にわたってRPMI10％のみで培養した好酸球と比較する。
【０４３１】
Ｂ．サイトカイン遺伝子発現におけるパクリタキセルの効果および上皮細胞からの放出
鼻ポリープおよび正常鼻粘膜から得た上皮細胞をコンフルエンスまで培養し、パクリタキセル(または他の薬剤)を有するまたは有さずに生成したヒト上皮細胞条件培地および上清をELISAで測定する。サイトカイン遺伝子発現を、Mullolら、Clinicaland Experimental Allergy 25:607-615、1995で記載されるように逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)で調査する。
【０４３２】
結果は、パクリタキセルが好酸球生存を阻害する手段としてサイトカイン遺伝子発現を調節するかどうかを示す。１次細胞培養物を用いる主な欠点は、細胞がコンフルエントに達するまで10日かかることであり、局所環境および全身性効果から細胞機能を切り離し、これが第一に疾患を導く。しかし、これは構造細胞(例えば、上皮細胞)の機能および増殖を調節する成長因子を研究するために優れたインビトロ/エクスビボモデルであり、それにより粘膜炎症のいくつかの局面を明らかにする。
【０４３３】
Ｃ．ヒト鼻ポリープからの化学的メディエータの免疫性放出
パクリタキセルおよび他の薬剤による媒介−ポリープを切除の時に得、Tyrode's緩衝液で５回洗浄し、そして鋭いハサミで断片化し、湿潤重量で約200mgの複製物にする。複製物を種々の濃度のパクリタキセルを含む３mlの緩衝液に37℃で懸濁し、0.2μg/mlの抗原Ｅで(５分後)チャレンジする。抗原とインキュベートした15分後、拡散気体を除去し、そして組織を新鮮な緩衝液で10分間ボイルし、残留ヒスタミンを抽出する。放出されたヒスタミンおよびSRS-AをHPLCを用いてアッセイする。
【０４３４】
（実施例40）
微小管機能を破壊する薬剤の血管周囲投与
再狭窄についての血管周囲処置としてのパクリタキセル-カンプトテシンを充填した外科用ペースト(PCL)および/またはEVAフィルムの効力を評価するために研究を行った。
【０４３５】
Ａ．材料および方法
体重250〜300gのWISTERラットをInnovar(0.33ml/kg)の筋肉内注射によって麻酔した。一旦鎮静されると、それらをハロタン麻酔下においた。全身麻酔を確立した後、頚部領域にわたって剃毛し、皮膚をクランプし、そしてベタジン(betadine)を塗布した。左頚動脈の上を垂直切開し、そして外部左頚動脈を露出させた。２つの結紮を外部左頚動脈のまわりに配置し、そして横断動脈切開を施した。次いで、番号２のFrenchFogartyバルーンカテーテルを頚動脈内に導入し、そして左総頚動脈内に通し、そしてバルーンを生理食塩水で膨らませた。内皮を、膨らませたバルーンを通して頚動脈を３度膨らませそしてしぼませることにより剥皮した。次いで、カテーテルを除去し、そして結紮を左外部頚動脈上で結んだ。
【０４３６】
ラットを、処置を受けない、ポリマーのみ(EVAフィルムまたはPCLペースト)、またはポリマーおよび20％パクリタキセルを受ける10のグループに無作為化した。ポリマー混合物(2.5mg)を頚動脈のまわりの周囲の様式で配置された。次いで創傷を閉じた。各グループから５匹のラットを14日で屠殺し、そして残りの５匹を28日で屠殺した。その間に、ラットを重量減少または全身系の疾患の他の徴候に関して観察した。14日または28日後、動物を麻酔し、そして左頚動脈を単離し、10％ホルムアルデヒド緩衝液で固定し、そして組織学的に検査した。
【０４３７】
予備研究として、２匹のラットを10％カンプトテシンを充填したEVAフィルムで14日間処置し、この疾患モデルにおけるカンプトテシンの効力を評価した。
【０４３８】
Ｂ．結果
これらの研究からの結果によって、パクリタキセルを充填した(20％)ポリマーは再狭窄を完全に予防するが、コントロールの動物およびポリマーのみを受けた動物は、バルーン損傷後14日および28日で、28％と55％との間で管腔損傷が進行したことが明らかになった(図76Aおよび76B)。
【０４３９】
パクリタキセルが血管壁に接触した場所で、初期過形成の絶対阻害があった。しかし、血管壁に隣接する薬物を保持することができない場所でのパクリタキセルの不均一な効果によって証明されるように、効果は非常に局所的であった(図77Aおよび77B)。
【０４４０】
予備データはカンプトテシンを充填したEVAフィルムが疾患の動物モデルでの再狭窄応答の予防において有効であることを示している。カンプトテシンは、試験された２匹の動物で初期過形成を完全に阻害した。
【０４４１】
（実施例41）
外科的癒着の動物モデルにおけるパクリタキセルの効果
癒着形成を減少するためのパクリタキセルを充填したEVAフィルムの使用をウサギ子宮角モデルで検査する。
【０４４２】
ニュージーランド雌性シロウサギを麻酔し、そして開腹を正中線切開によって行う。子宮角を露出し、そしてそれぞれ５cm長の切片をメスを用いて剥離する。この剥離は漿膜を除去するのに十分であり、点状出血を生じる。ウサギを無作為にコントロールまたはパクリタキセル処置グループおよび２、４および８週間の術後評価期間に割り当てる。パクリタキセル処置グループにおいて、各ウサギ子宮角を剥離後にパクリタキセルを充填したEVAフィルムで完全に包む。筋腹膜(musculoperitoneal)層を縫合で閉じ、そして皮膚ステープルで皮膚層を閉じる。
【０４４３】
動物を、術後２、４および８週間での癒着形成に関して評価する。動物を人道的に安楽死させ、そして検死を行う。子宮角を肉眼で、および標準的な顕微鏡技術を用いて組織学的に検査する。肉眼では、癒着は標準的な評価システムを用いて等級を付け、これは５cmの子宮角が外傷を受けている事実に基づく；従って、癒着形成の程度を、癒着を含む領域の長さを測定することにより決定する。以下の等級付けシステムを用いる：０＝癒着無し、１＝領域の25％で癒着、２＝領域の50％で癒着および３＝総癒着関与。癒着の重篤度を以下のように測定する：０＝分離に抵抗無し、0.5＝いくらか抵抗あり(中程度の力を要する)、および１＝鋭い解剖を要する。総等級は相加的であり、程度および重篤度の両方を表す０〜４の癒着評価範囲を有する。
【０４４４】
（実施例42）
炎症性腸疾患(IBD)の処置におけるミセルパクリタキセル
炎症性腸疾患(IBD)、すなわちクローン病および潰瘍性大腸炎は、再発および緩解の期間によって特徴づけられる。IBDの最もよく利用されるモデルは、エタノールおよび生理食塩水の溶液中の2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNB)の結腸内注射によってラットに生じさせる(Morrisら、Gastroenterology、96：795-803、1989)。単回投与は、急性および数週間持続する慢性の炎症を惹起する。しかし、薬理学的に、ウサギ結腸はラットが似ているよりもヒト結腸に似ていることが示されている(Gastroenterology、99:13424-1332、1990)。
【０４４５】
雌性ニュージーランド白ウサギを全ての実験で用いる。動物をペンタバルビトールを用いて静脈内注射(i.v.)で麻酔する。TNB(0.6ml；生理食塩水中25％エタノールに40mg)の注入のために、乳児用摂食チューブを直腸に挿入し、その結果先端は肛門に対して20cm近位である。TNB投与の１週間後に、ウサギを３つの処置グループに無作為化する。この時に、動物は、無処置、ミセル単独(i.v.)またはミセルパクリタキセル(i.v.)のいずれかを受ける。これを全部で４回の処置の間、４日ごとに繰り返す。
【０４４６】
研究の過程の間、ウサギを一般的な麻酔の状態で小児用気管支鏡を用いて内視鏡により週ごとに検査され、上記のように誘導される。損傷を以下のスケールに従って内視鏡操作者(知らされていない)によってスコアをつける：０、異常無し；１、炎症、しかし潰瘍形成無し；２、１部位(＜1cm)において炎症および潰瘍形成；３、結腸の長さに沿って２つ以上の部位の炎症および潰瘍形成、または１つの主な部位の炎症および潰瘍形成(＞１cm)。
【０４４７】
最後の処置に次いで、ウサギをEuthanolを用いて24時間、ならびに１、２、４および６週間で屠殺する。全体の結腸を単離し、切除しそして抗腸管膜の境界にそって切開し、生理食塩水で洗浄し、そして抗生物質を含むHank's平衡化塩溶液中に配置される。結腸を立体顕微鏡で検査し、そして内視鏡と同じ判断基準に従ってスコアを付ける。また、結腸標本を、明らかに炎症性および潰瘍形成領域から、ならびに肛門から上向きに結腸への全体の長さにわたる正常結腸からの両方で部検において選択される。組織を10％ホルムアルデヒド中で固定し、そしてパラフィン中に埋め込むように加工し；５(ｍセクションを切断し、そしてヘモトキシリン(hemotoxylin)およびエオシンで染色する。スライドをIBD組織病理学の存在または非存在に関して検査する。
【０４４８】
最初の実験は、TNBの結腸内注射によってウサギに大腸炎を誘導した後、経口パクリタキセルの使用のために改変され得る。動物を、無処置、ビヒクル単独または経口処方されたパクリタキセルを受ける３つのグループに無作為化される。
【０４４９】
（実施例43）
全身性紅斑性狼蒼の動物モデルにおけるパクリタキセルの効果
全身性紅斑性狼蒼におけるパクリタキセルの効力は、雌性NZB/NZWF1マウス(B/W)をミセルパクリタキセルで処置することにより決定される。このマウスの系統はヒトSLEに類似の疾患を進行する。１月齢において、これらのマウスは、正常マウスに比べて自発的に免疫グロブリンを分泌する上昇したレベルの脾臓Ｂ細胞を有する。高レベルの抗ssDNA抗体は、２月齢で生じる。５月齢で、免疫グロブリンは、糸球体の毛細血管壁に沿って蓄積する。重篤な糸球体腎炎は進行し、そして９月齢までにB/Wマウスの50％が死亡する。
【０４５０】
Ａ．材料および方法
雌性B/Wマウスを、The Jackson Laboratory(BarHarbor、ME、USA)から購入する。５月齢雌性B/Wマウスを、処置およびコントロールグループに無作為に割り当てる。処置グループは、低容量継続ミセルパクリタキセル(2.0mg/kg；１週間当たり３回、合計10回の注射)または高用量「パルス」ミセルパクリタキセル(20mg/kg；４回、１週間に１度)のいずれかを受ける。コントロールグループはコントロールミセルを受ける。
【０４５１】
所定の時間間隔で、類似の年齢のパクリタキセル処置されたB/Wマウスおよび未処置のコントロールB/Wマウスを屠殺し、これらの脾臓を無菌的に除去し、そして単一細胞懸濁液をリンパ球を数えるために調製する。脾臓リンパ球亜集団を同定するために、蛍光分析を行う。自発的に免疫グロブリンまたは抗ssDNA抗体(IgG、IgM、総免疫グロブリン)を分泌する脾臓Ｂ細胞数(細胞/百万)を、ELISAを用いて決定する。
【０４５２】
上記より、本発明の特定の実施態様は例示のために本明細書中で記載されたが、種々の改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲による以外は制限されない。
【０４５３】
本発明は、乾癬または多発性硬化症のような炎症性疾患を処置または予防するための方法であって、炎症部位に抗微小管剤またはそのアナログもしくは誘導体を送達する工程を包含する方法を提供する。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ−Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１４Ｃ−Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【図４３Ｅ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１Ａ−Ｂ】
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【図６１Ｃ】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６Ａ−Ｂ】
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【図６６Ｃ】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０Ａ−Ｂ】
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【図８０Ｃ−Ｄ】
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【図８１Ａ】
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【図８１Ｂ】
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