(57)【要約】【課題】次世代型の高速シーケンサーに用いてｍＲＮＡの３’側の塩基配列を決定することができるｃＤＮＡライブラリーを作製する技術を提供する。【解決手段】特定の配列からなる反復領域を含んでいるオリゴｄＴプライマーを提供する。また、このオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＴＸおよびＴＴＴＴＴＴＴＸ（ＸはＴ以外の任意の塩基を示す。）からなる群より選択される１または複数の塩基配列を連続的かつ任意に組み合わせてなる反復領域を含んでいることを特徴とするオリゴｄＴプライマー。
【請求項２】
前記反復領域の５’側に隣接してＴＸまたはＴＴＸ（ＸはＴ以外の任意の塩基を示す。）をさらに含んでいることを特徴とする請求項１に記載のオリゴｄＴプライマー。
【請求項３】
前記反復領域の３’側に隣接してＴを１つ含んでいるか、または２〜７個連続して含んでいることを特徴とする請求項１に記載のオリゴｄＴプライマー。
【請求項４】
配列番号１に示される塩基配列を含んでいることを特徴とするオリゴｄＴプライマー。
【請求項５】
前記反復領域の５’側にアダプター配列をさらに含んでおり、該アダプター配列は、核酸増幅用プライマーと対合し得る配列を含んでいることを特徴とする請求項１に記載のオリゴｄＴプライマー。
【請求項６】
前記アダプター配列の５’側にＴ７プロモータ配列をさらに含んでいることを特徴とする請求項５に記載のオリゴｄＴプライマー。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴｄＴプライマーを備えていることを特徴とするｃＤＮＡライブラリー作製キット。
【請求項８】
５〜１０個の任意の塩基からなるランダム領域を含んでいるランダムプライマーをさらに備えていることを特徴とする請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記ランダムプライマーが、互いに異なる複数のプライマーからなるプライマー群であることを特徴とする請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記オリゴｄＴプライマーが前記反復領域の５’側に第１アダプター配列をさらに含んでおり、かつ前記ランダムプライマーが前記ランダム領域の５’側に第２アダプター配列をさらに含んでおり、
第１アダプター配列および第２アダプター配列は、核酸増幅用プライマーと対合し得る配列を含んでいることを特徴とする請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記オリゴｄＴプライマーが第１アダプター配列の５’側にＴ７プロモータ配列をさらに含んでいることを特徴とする請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
第２アダプター配列の５’側にビオチンが結合していることを特徴とする請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
ｃＤＮＡライブラリーを作製する方法であって、
反復領域を含んでいるオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行う逆転写工程を包含し、
該反復領域は、ＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＴＸおよびＴＴＴＴＴＴＴＸ（ＸはＴ以外の任意の塩基を示す。）からなる群より選択される１または複数の塩基配列を連続的かつ任意に組み合わせてなることを特徴とする作製方法。
【請求項１４】
前記オリゴｄＴプライマーが、前記反復領域の５’側に隣接してＴＸまたはＴＴＸ（ＸはＴ以外の任意の塩基を示す。）をさらに含んでいることを特徴とする請求項１３に記載の作製方法。
【請求項１５】
前記オリゴｄＴプライマーが、前記反復領域の３’側に隣接してＴを１つ含んでいるか、または２〜７個連続して含んでいることを特徴とする請求項１３に記載の作製方法。
【請求項１６】
前記オリゴｄＴプライマーが、配列番号１に示される塩基配列を含んでいることを特徴とする請求項１３に記載の作製方法。
【請求項１７】
５〜１０個の任意の塩基からなるランダム領域を含んでいるランダムプライマーを用いて、前記逆転写反応の反応産物を増幅する核酸増幅工程をさらに包含することを特徴とする請求項１３に記載の作製方法。
【請求項１８】
前記核酸増幅工程が、互いに異なる複数のプライマーからなるプライマー群を前記ランダムプライマーとして用いることを特徴とする請求項１７に記載の作製方法。
【請求項１９】
前記核酸増幅工程が、前記オリゴｄＴプライマーおよび前記ランダムプライマーの対を用いて行われることを特徴とする請求項１７に記載の作製方法。
【請求項２０】
前記オリゴｄＴプライマーが前記反復領域の５’側に第１アダプター配列をさらに含んでおり、かつ前記ランダムプライマーが前記ランダム領域の５’側に第２アダプター配列をさらに含んでおり、
第１アダプター配列および第２アダプター配列は、核酸増幅用プライマーと対合し得る配列を含んでいることを特徴とする請求項１７に記載の作製方法。
【請求項２１】
第２アダプター配列の５’側にビオチンが結合していることを特徴とする請求項２０に記載の作製方法。
【請求項２２】
ｃＤＮＡライブラリーを作製する方法であって、
反復領域を含んでいるオリゴｄＴプライマーを用いて、組織由来ＲＮＡを逆転写する第１逆転写工程；
第１逆転写工程における反応産物と対合しているＲＮＡを断片化する断片化工程；
断片化したＲＮＡをプライマーとして用いて、第１逆転写工程における反応産物を増幅する第１核酸増幅工程；
第１核酸増幅工程における反応産物を転写する転写工程；
５〜１０個の任意の塩基からなるランダム領域を含んでいるランダムプライマーを用いて、該転写反応の反応産物を逆転写する第２逆転写工程；
前記オリゴｄＴプライマーを用いて、第２逆転写工程における反応産物を増幅する第２核酸増幅工程
を包含し、
該反復領域は、ＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＴＸおよびＴＴＴＴＴＴＴＸ（ＸはＴ以外の任意の塩基を示す。）からなる群より選択される１または複数の塩基配列を連続的かつ任意に組み合わせてなることを特徴とする作製方法。
【請求項２３】
第２核酸増幅工程が、前記オリゴｄＴプライマーおよび前記ランダムプライマーの対を用いて行われることを特徴とする請求項２２に記載の作製方法。
【請求項２４】
第２核酸増幅工程が、互いに異なる複数のプライマーからなるプライマー群を前記ランダムプライマーとして用いることを特徴とする請求項２３に記載の作製方法。
【請求項２５】
前記オリゴｄＴプライマーが前記反復領域の５’側に第１アダプター配列をさらに含んでおり、かつ前記ランダムプライマーが前記ランダム領域の５’側に、第２アダプター配列をさらに含んでおり、
第１アダプター配列および第２アダプター配列は、核酸増幅用プライマーと対合し得る配列を含んでいることを特徴とする請求項２２に記載の作製方法。
【請求項２６】
前記オリゴｄＴプライマーが第１アダプター配列の５’側にＴ７プロモータ配列をさらに含んでいることを特徴とする請求項２５に記載の作製方法。
【請求項２７】
第２アダプター配列の５’側にビオチンが結合していることを特徴とする請求項２５に記載の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃＤＮＡライブラリーの作製に用いるオリゴｄＴプライマー、このオリゴｄＴプライマーを備えているｃＤＮＡライブラリー作製キット、ならびにこのオリゴｄＴプライマーおよびｃＤＮＡライブラリー作製キットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲノムの網羅的な解析、および遺伝子発現の網羅的な解析がなされてきており、そのための新たな技術も開発されてきている。その技術の一つとして、短時間のうちに大規模なシーケンシングを行うことを可能とした技術が挙げられる。
【０００３】
新たに開発された大規模シーケンシングの技術として、非特許文献１に開示されたＳｅｑｕｅｎｃｅ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法が挙げられる。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法を利用した次世代型の高速シーケンサー（例えば、Ｒｏｃｈｅ社のＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ２０）を用いた場合、一度のシーケンシングで、４０００万塩基程度の配列を決定することができ、シーケンシングに要する時間も５時間程度である。また、煩雑なクローニング作業は不要である。そのため、配列決定に要する手間とコストを抑えることができる。
【０００４】
このような次世代型の高速シーケンサーを用いてシーケンシングを行う場合には、それに適したサンプルの調製が必要となる。これまでに、この高速シーケンサーを用いて組織の遺伝子発現を解析するためのｃＤＮＡライブラリーの作製方法が開発されている（例えば、非特許文献２〜４参照）。非特許文献２に記載された方法によれば、ｍＲＮＡの不特定部位の塩基配列を決定することができる。また、非特許文献３に記載された方法によれば、ｍＲＮＡの５’側の塩基配列を決定することができる。また、非特許文献４に記載された方法によれば、ｍＲＮＡの５’側および３’側の塩基配列を決定することができる。
【非特許文献１】Ｍ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４３７：３７６−３８０（２００５）
【非特許文献２】Ａ．Ｐ．Ｗｅｂｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１４４：３２−４２（２００７）
【非特許文献３】Ｍ．Ｇｏｗｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４（１９）：ｅ１２６（２００６）
【非特許文献４】Ｐ．Ｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４（１２）：ｅ８４（２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ｍＲＮＡの３’側の配列を決定する方法である非特許文献４記載の技術には種々の問題がある。例えば、非特許文献４に記載されたｃＤＮＡライブラリーの作製方法には、ｃＤＮＡをクローニングする工程が含まれているため、煩雑な作業が増えてしまう。さらに、この作製方法により作製したライブラリーを用いて決定できるｍＲＮＡの３’側の配列の長さは、２０塩基程度と短いものである。
【０００６】
そこで、本発明は、上述した問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、次世代型の高速シーケンサーに用いてｍＲＮＡの３’側の塩基配列を決定することができるｃＤＮＡライブラリーを作製する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法においては、配列決定を行う領域に同一の塩基が８以上連続して存在すると、その後のシーケンシングの精度が著しく低下してしまうという問題点を見出した。ｍＲＮＡの３’側の配列を決定する場合には、ポリＴ配列を有しているオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行うのが一般的である。この場合、オリゴｄＴプライマーのポリＴ配列も、合成されたｃＤＮＡ中に含まれてしまう。通常、このポリＴ配列は８塩基以上であるため、上述した問題から、ｍＲＮＡの３’側の配列決定における精度を著しく低下させる。この問題を回避するために、オリゴｄＴプライマーを短くする方法も考えられる。しかし、この場合には、オリゴｄＴプライマーとｍＲＮＡのポリＡ配列との対合の効率が悪くなり、逆転写反応を十分に行うことができず、ｃＤＮＡの合成効率が低下してしまう。これらの知見から、特定の配列を反復領域に有するオリゴｄＴプライマーを用いることにより、次世代型の高速シーケンサーに用いてｍＲＮＡの３’側の塩基配列を決定することができるｃＤＮＡライブラリーを作製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明に係るオリゴｄＴプライマーは、ＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＴＸおよびＴＴＴＴＴＴＴＸ（ＸはＴ以外の任意の塩基を示す。）からなる群より選択される１または複数の塩基配列を連続的かつ任意に組み合わせてなる反復領域を含んでいることを特徴としている。
【０００９】
本発明に係るオリゴｄＴプライマーは、上記の反復領域の５’側に隣接してＴＸまたはＴＴＸ（ＸはＴ以外の任意の塩基を示す。）をさらに含んでいることが好ましい。
【００１０】
本発明に係るオリゴｄＴプライマーは、上記の反復領域の３’側に隣接してＴを１つさらに含んでいるか、または２〜７個連続してさらに含んでいることが好ましい。
【００１１】
本発明に係るオリゴｄＴプライマーは、配列番号１に示される塩基配列を含んでいることが好ましい。
【００１２】
本発明に係るオリゴｄＴプライマーは、上記の反復領域の５’側にアダプター配列をさらに含んでおり、このアダプター配列は、核酸増幅用プライマーと対合し得る配列を含んでいることが好ましい。
【００１３】
本発明に係るオリゴｄＴプライマーは、上記のアダプター配列の５’側にＴ７プロモータ配列をさらに含んでいることが好ましい。
【００１４】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリー作製キットは、上記のオリゴｄＴプライマーを備えていることを特徴としている。
【００１５】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリー作製キットは、５〜１０個の任意の塩基からなるランダム領域を含んでいるランダムプライマーをさらに備えていることが好ましい。
【００１６】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリー作製キットは、上記のランダムプライマーが、互いに異なる複数のプライマーからなるプライマー群であることが好ましい。
【００１７】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリー作製キットは、上記のオリゴｄＴプライマーが上記の反復領域の５’側に第１アダプター配列をさらに含んでおり、かつ上記のランダムプライマーが上記のランダム領域の５’側に第２アダプター配列をさらに含んでおり、第１アダプター配列および第２アダプター配列は、核酸増幅用プライマーと対合し得る配列を含んでいることがこのましい。
【００１８】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリー作製キットは、上記のオリゴｄＴプライマーが第１アダプター配列の５’側にＴ７プロモータ配列をさらに含んでいることが好ましい。
【００１９】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリー作製キットは、第２アダプター配列の５’側にビオチンが結合していることが好ましい。
【００２０】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、反復領域を含んでいるオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行う逆転写工程を包含し、この反復領域は、ＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＴＸおよびＴＴＴＴＴＴＴＸ（ＸはＴ以外の任意の塩基を示す。）からなる群より選択される１または複数の塩基配列を連続的かつ任意に組み合わせてなることを特徴としている。
【００２１】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、上記のオリゴｄＴプライマーが、上記の反復領域の５’側に隣接してＴＸまたはＴＴＸ（ＸはＴ以外の任意の塩基を示す。）をさらに含んでいることが好ましい。
【００２２】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、上記のオリゴｄＴプライマーが、上記の反復領域の３’側に隣接してＴを１つ含んでいるか、または２〜７個連続して含んでいることが好ましい。
【００２３】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、上記のオリゴｄＴプライマーが、配列番号１に示される塩基配列を含んでいることが好ましい。
【００２４】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、５〜１０個の任意の塩基からなるランダム領域を含んでいるランダムプライマーを用いて、上記の逆転写反応の反応産物を増幅する核酸増幅工程をさらに包含することが好ましい。
【００２５】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、上記の核酸増幅工程が、互いに異なる複数のプライマーからなるプライマー群を上記のランダムプライマーとして用いることが好ましい。
【００２６】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、上記の核酸増幅工程が、上記のオリゴｄＴプライマーおよび上記のランダムプライマーの対を用いて行われることが好ましい。
【００２７】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、上記のオリゴｄＴプライマーが上記の反復領域の５’側に第１アダプター配列をさらに含んでおり、かつ上記のランダムプライマーが上記のランダム領域の５’側に第２アダプター配列をさらに含んでおり、第１アダプター配列および第２アダプター配列は、核酸増幅用プライマーと対合し得る配列を含んでいることが好ましい。
【００２８】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、第２アダプター配列の５’側にビオチンが結合していることが好ましい。
【００２９】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、反復領域を含んでいるオリゴｄＴプライマーを用いて、組織由来ＲＮＡを逆転写する第１逆転写工程と、第１逆転写工程における反応産物と対合しているＲＮＡを断片化する断片化工程と、断片化したＲＮＡをプライマーとして用いて、第１逆転写工程における反応産物を増幅する第１核酸増幅工程と、第１核酸増幅工程における反応産物を転写する転写工程と、５〜１０個の任意の塩基からなるランダム領域を含んでいるランダムプライマーを用いて、この転写反応の反応産物を逆転写する第２逆転写工程と、上記のオリゴｄＴプライマーを用いて、第２逆転写工程における反応産物を増幅する第２核酸増幅工程とを包含し、この反復領域は、ＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＴＸおよびＴＴＴＴＴＴＴＸ（ＸはＴ以外の任意の塩基を示す。）からなる群より選択される１または複数の塩基配列を連続的かつ任意に組み合わせてなることを特徴としている。
【００３０】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、第２核酸増幅工程が、上記のオリゴｄＴプライマーおよび上記のランダムプライマーの対を用いて行われることが好ましい。
【００３１】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、第２核酸増幅工程が、互いに異なる複数のプライマーからなるプライマー群を上記のランダムプライマーとして用いることが好ましい。
【００３２】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、上記のオリゴｄＴプライマーが上記の反復領域の５’側に第１アダプター配列をさらに含んでおり、かつ上記のランダムプライマーが上記のランダム領域の５’側に、第２アダプター配列をさらに含んでおり、第１アダプター配列および第２アダプター配列は、核酸増幅用プライマーと対合し得る配列を含んでいることが好ましい。
【００３３】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、上記のオリゴｄＴプライマーが第１アダプター配列の５’側にＴ７プロモータ配列をさらに含んでいることが好ましい。
【００３４】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、第２アダプター配列の５’側にビオチンが結合していることが好ましい。
【発明の効果】
【００３５】
特定の配列からなる反復領域を含んでいる本発明に係るオリゴｄＴプライマーを用いれば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法によりｍＲＮＡの３’側の塩基配列を決定できるｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明に係るオリゴｄＴプライマー、ｃＤＮＡライブラリー作製キット、およびｃＤＮＡライブラリー作製方法について説明すると以下の通りである。
【００３７】
〔オリゴｄＴプライマー〕
本発明は、新たなオリゴｄＴプライマーを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴｄＴプライマー」は、逆転写反応のプライマーとして用い得る一本鎖ＤＮＡが意図され、具体的には、ｍＲＮＡのポリＡ配列と対合し得る配列を有している一本鎖ＤＮＡが意図される。
【００３８】
本発明に係るオリゴｄＴプライマーを用いれば逆転写産物（一本鎖ｃＤＮＡ）の集合を合成することができる。すなわち、本発明に係るオリゴｄＴプライマーを用いればｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。一般に、「ｃＤＮＡライブラリー」は二本鎖ｃＤＮＡの集合を指すことが多いが、本明細書中で使用される場合、一本鎖ｃＤＮＡの集合もまた「ｃＤＮＡライブラリー」の範疇に含まれる。
【００３９】
本発明に係るオリゴｄＴプライマーは、３〜７個連続するＴからなる複数のポリＴ配列がＴ以外の任意の単一塩基によって連結されている反復領域を含んでいるオリゴｄＴプライマーであることを特徴としている。本発明に係るオリゴｄＴプライマーは、この反復領域においてｍＲＮＡのポリＡ配列と対合し、この領域以外に、ポリＡ配列とは対合しない配列を含んでいてもよい。なお、本明細書中で使用される場合、用語「ｍＲＮＡ」はＲＮＡの３’側にポリＡ配列を含んでいるＲＮＡ、すなわち真核生物由来のｍＲＮＡが意図される。
【００４０】
本発明に係るオリゴｄＴプライマーの反復領域の長さは、逆転写反応の際に、ｍＲＮＡのポリＡ配列と対合することができる限り、限定されるものではない。反復領域の長さを１８ｎｔ以上にすることにより、逆転写反応の際に、反復領域とポリＡ配列とを効率よく対合させることができる。また、反復領域の長さを５０ｎｔ以下にすることにより、配列決定に含まれる反復領域の長さを減らすことができ、それにより、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの塩基配列を多く決定することができる。このように、反復領域の長さは、１８ヌクレオチド（ｎｔ）〜５０ｎｔが好ましく、１８ｎｔ〜４０ｎｔがより好ましく、２０ｎｔ〜２５ｎｔがさらに好ましい。
【００４１】
本発明に係るオリゴｄＴプライマーは、反復領域の５’側に隣接してＴＸまたはＴＴＸ（ＸはＴ以外の任意の塩基を示す。）をさらに含んでいてもよい。
【００４２】
また、本発明に係るオリゴｄＴプライマーは、反復領域の３’側に隣接してＴを１つ含んでいるか、または２〜７個連続して含んでいてもよい。反復領域の３’側に隣接して含まれるＴの数は、３〜６個が好ましく、４または５個がより好ましい。
【００４３】
本発明に係るオリゴｄＴプライマーに含まれている塩基Ｘは、Ｃ（シトシン）であることが好ましい。ＣはＴと同じくピリミジン誘導体である。一方、Ａ（アデニン）およびＧ（グアニン）は、プリン誘導体である。したがって、ＸがＴと類似した構造を有するＣである場合には、ＸがＡまたはＧである場合と比較して、オリゴｄＴプライマーとポリＡ配列とが対合する際に、ひずみが生じ難く、安定して対合することができる。
【００４４】
本発明に係るオリゴｄＴプライマーは、ＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＴＸおよびＴＴＴＴＴＴＴＸ（ＸはＴ以外の任意の塩基を示す。）からなる群より選択される１または複数の塩基配列を連続的かつ任意に組み合わせてなる反復領域を含んでいればよいといえる。反復配列において連続するＴの数が少なすぎると、逆転写反応の際にポリＡ配列との対合の効率が低下するので、反復配列としては、ＴＴＴＴＴＸ、ＴＴＴＴＴＴＸがより好ましく、ＴＴＴＴＴＴＸがさらに好ましい。一実施形態において、本発明に係るオリゴｄＴプライマーの塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列であり得る。
【００４５】
上述したように、本発明に係るオリゴｄＴプライマーは、ｍＲＮＡのポリＡ配列と対合する領域以外に、ポリＡ配列とは対合しない配列を含んでいてもよい。例えば、本発明に係るオリゴｄＴプライマーを用いて合成した一本鎖ｃＤＮＡから、後述するランダムプライマーを用いて二本鎖ｃＤＮＡを生成することができる。この生成した二本鎖ｃＤＮＡをさらに増幅する必要がある場合は、核酸増幅用プライマーと対合し得る配列を含んでいる配列（本明細書中において、以下「アダプター配列」と称する。）を反復領域の５’側にさらに含んでいてもよい。なお、本明細書中で使用される場合、用語「アダプター配列」は、核酸増幅反応において核酸増幅用プライマーと良好に対合し得る配列である限り、任意の配列であり得るが、反復領域の配列および後述するランダムプライマーに含まれるランダム領域の配列と異なる配列が意図されている。
【００４６】
オリゴｄＴプライマーに含まれるアダプター配列（第１アダプター配列）の長さは、３０ｎｔ〜５５ｎｔが好ましく、３５ｎｔ〜５０ｎｔがより好ましく、４０ｎｔ〜４５ｎｔがさらに好ましい。
【００４７】
また、本発明に係るオリゴｄＴプライマーを用いることによって得られたｃＤＮＡの配列決定を行う必要がある場合は、シーケンシング用プライマーと対合し得る配列が、アダプター配列中に含まれていてもよい。
【００４８】
さらに、本発明に係るオリゴｄＴプライマーを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した後に、転写を行う必要がある場合は、このオリゴｄＴプライマーにおいて、アダプター配列の５’側にプロモータ配列が含まれていてもよい。これにより、逆転写反応に供されたｍＲＮＡと相補的な配列を含むＲＮＡを合成することができる。プロモータ配列としては、例えば、Ｔ７プロモータ配列、Ｔ３プロモータ配列、およびＳＰ６プロモータ配列等を挙げることができ、Ｔ７プロモータ配列がより好ましい。
【００４９】
合成した二本鎖ｃＤＮＡから転写によってＲＮＡを合成すると、一つのｃＤＮＡから複数のＲＮＡが合成される。この合成されたＲＮＡを用いて再び逆転写反応を行えば、転写を行う前のｃＤＮＡライブラリーよりも多くの量のｃＤＮＡを含んでいるｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。したがって、抽出した組織由来のＲＮＡの量が少ないため合成されるｃＤＮＡの量が少ない場合に有効な手段である。
【００５０】
また、本発明に係るオリゴｄＴプライマーは、反復領域の３’側に隣接して、または、反復領域の３’側に隣接してＴを１つ含んでいるかもしくは２〜７個連続して含んでいる場合にはその３’側に隣接して、ＶＮ（ＶはＴ以外の任意の塩基、Ｎは任意の塩基を示す。）を含んでいてもよい。それにより、逆転写反応におけるｃＤＮＡの伸長を、ポリＡ配列の５’側に隣接する３’ＵＴＲから開始することが可能となる。
【００５１】
当業者は、従来公知の方法、装置等を用いて（例えば化学合成により）本発明に係るオリゴｄＴプライマーを容易に作製することができる。本発明に係るオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した場合、８個以上連続する同一塩基からなる配列が、合成したｃＤＮＡの末端に含まれることを防ぐことができる。したがって、本発明に係るオリゴｄＴプライマーを用いれば、同一の塩基が連続している配列が存在すると精度が低下するシーケンシング技術の精度を大いに向上し得る。
【００５２】
〔ｃＤＮＡライブラリー作製キット〕
上述したように、本発明に係るオリゴｄＴプライマーを用いればｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。
【００５３】
このように、本発明はまた、ｃＤＮＡライブラリー作製キットを提供する。本発明に係るｃＤＮＡライブラリー作製キットは、少なくとも上記オリゴｄＴプライマーを備えていればよいといえる。
【００５４】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリー作製キットは、５〜１０個の任意の塩基からなるランダム領域を含んでいるランダムプライマーをさらに備えていてもよい。このようなランダムプライマーを用いれば、逆転写産物（一本鎖ｃＤＮＡ）から二本鎖ｃＤＮＡを生成することができ、さらに生成した二本鎖ｃＤＮＡを大量に増幅させることができる。なお、ランダム領域を構成する塩基数は５〜１０個の範囲内であればよいが、６〜８個であることがより好ましい。なお、本発明に係るｃＤＮＡライブラリー作製キットに含まれ得るランダムプライマーは、互いに異なる複数のプライマーからなるプライマー群であってもよい。このようなプライマー群であるランダムプライマーを用いれば、より多くの種類の一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを生成することができる。
【００５５】
本発明に用いられ得るランダムプライマーは、ランダム領域の５’側にアダプター配列（第２アダプター配列）をさらに含んでいてもよい。このようなランダムプライマーを用いて二本鎖ｃＤＮＡを生成すれば、アダプター配列の領域に対合する核酸増幅用プライマーを用いて、生成した二本鎖ｃＤＮＡをさらに増幅することができる。この場合に、上記オリゴｄＴプライマーのアダプター配列（第１アダプター配列）の領域とランダムプライマーのアダプター配列（第２アダプター配列）の領域とに対合するプライマーセット（対）を核酸増幅用プライマーとして用いて核酸増幅反応を行うことが可能である。このようなプライマーセットを用いて核酸増幅反応を効率よく行うためには、第１アダプター配列と第２アダプター配列とが互いに異なる配列であることが好ましい。また、上記オリゴｄＴプライマーとランダムプライマーとのプライマーセットを用いて、生成した二本鎖ｃＤＮＡを核酸増幅反応によりさらに増幅することが可能である。この場合にも核酸増幅反応を効率よく行うためには、第１アダプター配列と第２アダプター配列とが互いに異なる配列であることが好ましい。ランダムプライマーに含まれるアダプター配列の長さは、３０ｎｔ〜５５ｎｔが好ましく、３５ｎｔ〜５０ｎｔがより好ましく、４０ｎｔ〜４５ｎｔがさらに好ましい。
【００５６】
当業者は、従来公知の方法、装置等を用いて（例えば化学合成により）ランダムプライマーを容易に作製することができる。また、市販のランダムプライマーを用いることも可能である。
【００５７】
また、ランダムプライマーは、アダプター配列を含む領域の５’側にビオチンが結合していてもよい。ビオチンは、ヌクレオチド以外の物質、例えばＴＥＧ（ｔｅｔｒａ−ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）を介してヌクレオチドに結合していることが好ましい。ビオチンは糖タンパク質であるアビジンと特異的に結合することができる。そのため、ビオチンが結合しているランダムプライマーを用いて核酸増幅反応を行えば、ビオチンとアビジンの結合を利用することにより、核酸増幅反応の産物を容易に回収することができる。また、高速シーケンサーには、ビオチンとアビジンの結合を利用してＤＮＡをアビジンビーズ上に固定して、一方の端部に第１アダプター配列を含みもう一方の端部に第２アダプター配列を含むｃＤＮＡを選択的に回収する処理を行った後に、シーケンシングを行うものもある。ビオチンが結合しているランダムプライマーを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーは、このようなシーケンサーを用いてシーケンシングを行う際に有効である。
【００５８】
また、キットの構成としては上述したものに限定されるものではなく、他の試薬や器具を備えていてもよい。例えば、逆転写反応関連試薬（逆転写酵素、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、逆転写反応用バッファー、および反応用チューブ等）、核酸増幅関連試薬（ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸増幅用バッファー等）、転写関連試薬（ＲＮＡポリメラーゼ、転写用バッファー、およびＮＴＰ等）、リボヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ用バッファー、反応停止用試薬（ＥＤＴＡ）、およびＤＮＡを安定的に保持するための試薬や緩衝液（Ｔｒｉｓバッファー）を備えていてもよい。当業者であれば、上述した反応に用いるべき試薬を適宜選択し得る。
【００５９】
上記の何れの構成であっても、ｃＤＮＡライブラリー作製に好ましい試薬等を備えている。そのため、本発明に係るｃＤＮＡライブラリー作製キットは、本発明に係るｃＤＮＡライブラリー作製方法に好適に用いることができる。したがって、本発明に係るｃＤＮＡライブラリー作製キットを用いれば、大規模シーケンシング技術を利用したシーケンサーを用いてｍＲＮＡの３’側の配列を決定することができるｃＤＮＡライブラリーを、容易に作製することができる。
【００６０】
〔ｃＤＮＡライブラリー作製方法１〕
本発明はまた、本発明に係るオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行う逆転写工程を包含することを特徴とするｃＤＮＡライブラリーの作製方法を提供する。
【００６１】
本発明に係る作製方法により作製されたｃＤＮＡライブラリーは、大規模シーケンシングに好適に用い得る。なお、大規模シーケンシングとしては、例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法によるシーケンシングが挙げられる。
【００６２】
以下の各工程後における酵素の不活化、生成物の抽出等の操作は、当業者が適宜なし得るものである。その具体的な操作方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８２）等に記載されている。また、市販のキットを用いて行うこともできる。また、例えば、ゲル電気泳動により、ＤＮＡまたはＲＮＡを分離した後に、目的とする大きさのＤＮＡまたはＲＮＡをゲルから抽出してもよい。ゲルとしては、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、および低融点アガロースゲル等が挙げられる。ゲルからのＤＮＡまたはＲＮＡの抽出は、当業者に公知の方法を用いて行うことができ、また、市販のキットを用いて行うこともできる。
【００６３】
逆転写工程は、出発原料となるＲＮＡから逆転写反応により一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程である。逆転写反応に用いるＲＮＡとしては、生物組織由来のＲＮＡを用いることができる。生物組織からのＲＮＡの抽出は、当業者に公知の方法を用いて行うことができ、また、市販のキットを用いて行うこともできる。ＲＮＡは、総ＲＮＡでもｍＲＮＡでもよく、ｍＲＮＡであることが好ましい。総ＲＮＡを用いる場合には、ＲＮＡの量は、２５μｇ以上かつ５０μｇ以下であることが好ましい。また、ｍＲＮＡを用いる場合には、ＲＮＡの量は、１５０ｎｇ以上かつ２５０ｎｇ以下であることが好ましい。
【００６４】
逆転写反応に用いる本発明に係るオリゴｄＴプライマーの反応液中の濃度は、１．５μＭ〜４．０μＭであることが好ましく、２．０μＭ〜３．５μＭであることがより好ましく、２．０μＭ〜３．０μＭであることがさらに好ましい。１．５μＭ〜４．０μＭであれば、十分な量の一本鎖ｃＤＮＡを合成することができ、かつ、ポリＡ配列以外の領域と対合してしまうオリゴｄＴプライマーを減らすことができる。
【００６５】
逆転写反応は、当業者に公知の試薬、方法および装置を用いて行われればよい。また、反応温度および反応時間などの反応条件も、用いる試料および試薬に応じて、当業者であれば容易に設定することができる。
【００６６】
本発明に係るｃＤＮＡライブラリー作製方法は、逆転写工程の他に、逆転写反応の反応産物を増幅する核酸増幅工程をさらに包含してもよい。核酸増幅工程を包含することにより、一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを生成することができ、さらに生成した二本鎖ｃＤＮＡを大量に増幅させることができる。核酸増幅反応としては、ＰＣＲ、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、およびＬＡＭＰ法等を挙げることができ、中でもＰＣＲが好ましい。
【００６７】
一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを生成する方法は、当業者に公知の方法を用いて行うことができ、また、市販のキットを用いて行うこともできる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等を挙げることができる。この中でもＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ  Ｉがより好ましい。
【００６８】
一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを生成するためのプライマーとしては、５〜１０個の任意の塩基からなるランダム領域を含んでいるランダムプライマーを用いることができる。例えば、上述したｃＤＮＡライブラリー作製キットのランダムプライマーを用いることができる。
【００６９】
二本鎖ｃＤＮＡを生成した後に、本発明に係るオリゴｄＴプライマーと上記ランダムプライマーとのプライマーセットを用いて、核酸増幅反応により、二本鎖ｃＤＮＡを増幅させてもよい。このとき、本発明に係るオリゴｄＴプライマーの代わりに、オリゴｄＴプライマーに含まれるアダプター配列と対合し得る配列を３’側に含むプライマーを用いることができる。また、上記ランダムプライマーの代わりに、上記ランダムプライマーに含まれるアダプター配列と対合し得る配列を３’側に含むプライマーを用いることができる。
【００７０】
〔ｃＤＮＡライブラリー作製方法２〕
本発明に係るｃＤＮＡライブラリーの作製方法における別の実施形態は、本発明に係るオリゴｄＴプライマーを用いて、組織由来ＲＮＡを逆転写する第１逆転写工程と、第１逆転写工程における反応産物と対合しているＲＮＡを断片化する断片化工程と、断片化したＲＮＡをプライマーとして用いて、第１逆転写工程における反応産物を増幅する第１核酸増幅工程と、第１核酸増幅工程における反応産物を転写する転写工程と、５〜１０個の任意の塩基からなるランダム領域を含んでいるランダムプライマーを用いて、該転写反応の反応産物を逆転写する第２逆転写工程と、本発明に係るオリゴｄＴプライマーを用いて、第２逆転写工程における反応産物を増幅する第２核酸増幅工程とを包含することを特徴としている。
【００７１】
各工程後における酵素の不活化、生成物の抽出等の操作は、上記「ｃＤＮＡライブラリー作製方法１」の項に示したものと同じであるため、説明を省略する。
【００７２】
以下、各工程について図１に基づいて具体的に説明する。図１は、本実施の形態に係るｃＤＮＡライブラリー作製方法の原理を模式的に表した図である。なお、図１では、核酸増幅反応としてＰＣＲを用いた場合を示している。図１では、直線の線分をＤＮＡ、波線の線分をＲＮＡとして表している。
【００７３】
第１逆転写工程は、出発原料となるＲＮＡから逆転写反応により一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程である（図１（１））。第１逆転写工程に用い得るＲＮＡは、上記「ｃＤＮＡライブラリー作製方法１」の項に示したものと同じであるため、説明を省略する。逆転写工程に用いるオリゴｄＴプライマーの反応液中の濃度は、１．５μＭ〜４．０μＭであることが好ましく、２．０μＭ〜３．５μＭであることがより好ましく、２．０μＭ〜３．０μＭであることがさらに好ましい。１．５μＭ〜４．０μＭであれば、十分な量の一本鎖ｃＤＮＡを合成することができ、かつ、ポリＡ配列以外の領域と対合してしまうオリゴｄＴプライマーを減らすことができる。逆転写反応は、当業者に公知の試薬、方法、および装置を用いて行えばよい。また、反応温度および反応時間などの反応条件も、用いる試料および試薬に応じて当業者であれば容易に設定することができる。
【００７４】
断片化工程は、断片化工程に引き続く第１核酸増幅工程において用いる核酸増幅用プライマーを、ＲＮＡを断片化することにより生成する工程である。ＲＮＡの断片化に用いる酵素は、ＤＮＡを断片化せずＲＮＡを断片化する酵素（リボヌクレアーゼ）であれば制限はないが、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）であることが好ましい。ＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡとＤＮＡとの混成二本鎖のＲＮＡ鎖を特異的に切断することができる。ＲＮＡとＤＮＡとの混成二本鎖のＲＮＡ鎖を特異的に切断した場合、切断されたＲＮＡはｃＤＮＡと対合したままである。したがって、断片化工程に引き続く第１核酸増幅工程において、プライマーとｃＤＮＡとを対合させるステップを省略することができる。ＲＮＡの断片化の反応は、当業者に公知の試薬、方法、および装置を用いて行われればよい。また、反応温度および反応時間などの反応条件も、用いる試薬に応じて当業者であれば容易に設定することができる。
【００７５】
第１核酸増幅工程は、一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを生成する工程である（図１（２））。この工程は、断片化工程において断片化したＲＮＡを核酸増幅用プライマーとして用いる核酸増幅反応を行う工程ともいえる。二本鎖ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼ反応によって一本鎖ｃＤＮＡから生成される。一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを生成する方法は、当業者に公知の方法を用いて行うことができ、また、市販のキットを用いて行うこともできる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等を挙げることができる。この中でもＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩがより好ましい。
【００７６】
上述したように、断片化工程においてＲＮａｓｅ  Ｈが用いられた場合には、プライマーとして用いるＲＮＡがすでにｃＤＮＡと対合しているので、第１核酸増幅工程においてプライマーとｃＤＮＡとを対合させるステップを省略することができる。断片化工程においてＲＮａｓｅ  Ｈ以外の酵素を用いた場合には、第１核酸増幅工程は、プライマーとｃＤＮＡとを対合させるステップを含んでいることが好ましい。
【００７７】
第１核酸増幅工程における反応液は、ＤＮＡリガーゼを含んでいることが好ましい。第１核酸増幅工程においては、断片化工程において断片化した複数のＲＮＡを核酸増幅用のプライマーとして用いており、増幅されるＤＮＡ鎖は不連続である。ＤＮＡリガーゼにより、これらの不連続なＤＮＡ鎖を互いに結合させることができ、一本の長いＤＮＡ鎖にすることができる。それにより、配列決定することのできる領域を長くすることができる。ＤＮＡリガーゼとしては、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ等を挙げることができ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼがより好ましい。
【００７８】
なお、断片化工程および第１核酸増幅工程を同一反応液中にて行うことも可能である。すなわち、リボヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの両方を含む反応液を用いて、それぞれの反応を同時に行うことが可能である。この場合には、核酸増幅反応に適するように調製した反応液に、リボヌクレアーゼを添加することが好ましい。
【００７９】
転写工程は、第１核酸増幅工程において生成した二本鎖ｃＤＮＡから、ＲＮＡを合成する工程である（図１（３））。転写工程において行われる転写反応は、当業者に公知の方法を用いて行うことができ、また、市販のキットを用いて行うこともできる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ等を挙げることができる。この中でもＴ７  ＲＮＡポリメラーゼがより好ましい。なお、転写反応を行うために、オリゴｄＴプライマーがプロモータ配列を含んでいることが好ましい。
【００８０】
第２逆転写工程は、転写工程において合成したＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う工程である（図１（４））。第２逆転写工程にて行われる逆転写反応は、当業者に公知の試薬、方法、および装置を用いて行われればよい。また、反応温度および反応時間などの反応条件も、用いる試料および試薬に応じて当業者であれば容易に設定することができる。逆転写反応に用いるプライマーとしては、５〜１０個の任意の塩基からなるランダム領域を含んでいるランダムプライマーを用いることができる。例えば、上述したｃＤＮＡライブラリー作製キットのランダムプライマーを用いることができる。逆転写反応後のＲＮＡを断片化するために、逆転写反応の後に反応液中にリボヌクレアーゼを添加してもよい。ＲＮＡの断片化に用いる酵素は、ＤＮＡを断片化せずＲＮＡを断片化する酵素（リボヌクレアーゼ）であれば限定されないが、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）であることが好ましい。ＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡとＤＮＡとの混成二本鎖のＲＮＡ鎖を切断することができるので、合成した一本鎖ｃＤＮＡの精製が容易となる。
【００８１】
第２核酸増幅工程は、第２逆転写工程において合成した一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを生成する工程である（図１（５））。第２核酸増幅工程においては、生成した二本鎖ｃＤＮＡをさらに増幅させることも可能である。二本鎖ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼ反応により一本鎖ｃＤＮＡから生成される。一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを生成するためのプライマーとしては、本発明に係るオリゴｄＴプライマー、または、オリゴｄＴプライマーに含まれるアダプター配列と対合し得る配列を３’側に含むプライマーを用いることができる。二本鎖ｃＤＮＡの生成に用いるオリゴｄＴプライマーの反応液中の濃度は、０．２μＭ〜１．４μＭであることが好ましく、０．４μＭ〜１．２μＭであることがより好ましく、０．６μＭ〜１．０μＭであることがさらに好ましい。生成した二本鎖ｃＤＮＡをさらに増幅させる反応としては、ＰＣＲ、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、およびＬＡＭＰ法等を挙げることができ、中でもＰＣＲが好ましい。
【００８２】
一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを生成する方法は、当業者に公知の方法を用いて行うことができ、また、市販のキットを用いて行うこともできる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等を挙げることができる。この中でもＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩがより好ましい。
【００８３】
二本鎖ｃＤＮＡを生成した後に、核酸増幅反応により二本鎖ｃＤＮＡを増幅させる場合には、本発明に係るオリゴｄＴプライマーと上記ランダムプライマーとのプライマーセットを用いることができる。このとき、本発明に係るオリゴｄＴプライマーの代わりに、オリゴｄＴプライマーに含まれるアダプター配列と対合し得る配列を３’側に含むプライマーを用いることができる。また、上記ランダムプライマーの代わりに、上記ランダムプライマーに含まれるアダプター配列と対合し得る配列を３’側に含むプライマーを用いることができる。
【００８４】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００８５】
〔ＲＮＡの調製〕
ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）の原糸体、茎葉体、分化転換組織、胞子体、並びに、造精器および造卵器の各組織から、ＲＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ−ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、キットに付属するプロトコールに従い、各組織の総ＲＮＡを抽出した。
【００８６】
次いで、ＦａｓｔＴｒａｃｋＭＡＧ  ｍＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、キットに付属するプロトコールに従い、抽出した総ＲＮＡから各組織のｍＲＮＡ（ｐｏｌｙＡ  ＲＮＡ）を精製した。次いで、エタノール沈殿を行い、沈殿したｍＲＮＡを１１μｌのＨ２Ｏに溶解した。抽出されたｍＲＮＡの量は、１５０ｎｇ〜２５０ｎｇである。
【００８７】
〔ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
調製したｍＲＮＡ溶液を１１μｌ、および５０μＭ  Ｔ７−ａｄＡ−ｄＴＣｘ３を１μｌ混合し、この混合液を７４℃で１０分間インキュベートした後、氷上で冷却した。Ｔ７−ａｄＡ−ｄＴＣｘ３は、配列番号２に示す配列の５’側に４７ｎｔからなるアダプター配列Ａを含み、さらにその５’側にＴ７プロモータ配列を含む配列からなるプライマーである。アダプター配列Ａは、最終的に得られるｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡを、後述するＧＳ  ｅｍＰＣＲ  ｋｉｔＩ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて増幅できるように設計されている。次いで、この混合液に、４μｌのＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ、１μｌのＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１μｌのｄＮＴＰ、および１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加し、４２℃で１時間インキュベートすることにより一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００８８】
得られた一本鎖ｃＤＮＡを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。２０μｌの一本鎖ｃＤＮＡの溶液に、ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｕｅｒを１５μｌ、ｄＮＴＰを３μｌ、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１μｌ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉを４μｌ、およびＲＮａｓｅ  Ｈを１μｌ混合し、Ｈ２Ｏを添加して全量１５０μｌの反応液を調製した。この反応液を１６℃で２時間インキュベートした。この反応液に、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を２μｌ添加した後、１６℃で５分間さらにインキュベートし、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを１０μｌ添加することにより、反応を停止した。この反応液を、フェノール／クロロホルム抽出、引き続くクロロホルム抽出に供した。抽出液に、酢酸アンモニウムを添加した後に、エタノール沈殿を行い、沈殿した二本鎖ｃＤＮＡを８μｌのＨ２Ｏに溶解した。
【００８９】
合成した二本鎖ｃＤＮＡを鋳型にして、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ−Ｔ７  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、キットに付属するプロトコールに従い、転写反応を行った。得られた二本鎖ｃＤＮＡの溶液を８μｌ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰをそれぞれ２μｌ、キットに付属の１０×  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを２μｌ、ならびにＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ−Ｔ７を２μｌ混合して転写反応液を調製した。この転写反応液を３７℃で一晩インキュベートした。続いて、キットに付属するＬｉＣｌ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３０μｌを添加した後、−３０℃で３０分間以上保持した後、１５分間の冷却遠心によってＲＮＡを沈殿させた。沈殿したＲＮＡをＨ２Ｏに溶解した。ＲＮＡの溶液の吸光度を測定し、合成したＲＮＡ量を定量した。
【００９０】
合成したＲＮＡを１〜２μｇ、および１μｌの１００μＭ  Ｂ−ｒａｎｄｏｍを混合し、Ｈ２Ｏを添加して全量１１μｌの混合液を調製した。Ｂ−ｒａｎｄｏｍは、ＮＮＮＮＮＮＣ（Ｎは任意の塩基）からなる配列の５’側に４４ｎｔからなるアダプター配列Ｂを含む配列からなるプライマーである。アダプター配列Ｂは、最終的に得られるｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡを、後述するＧＳ  ｅｍＰＣＲ  ｋｉｔＩ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて増幅できるように設計されている。この混合液を７４℃で１０分間インキュベートした後、氷上で冷却した。次いで、この混合液に、４μｌのＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ、１μｌのＤＴＴ、１μｌのｄＮＴＰ、および２μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩを添加し、４２℃で１時間インキュベートすることにより一本鎖ｃＤＮＡを合成した。この一本鎖ｃＤＮＡの溶液に、１μｌのＲＮａｓｅ  Ｈを添加し、３７℃で２０分間インキュベートした後、９５℃で５分間さらにインキュベートした。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、キットに付属するプロトコールを改変し、プライマーダイマーの混入を防ぐためにカラムを３５％塩酸グアニジン水溶液で洗浄するステップを追加して、一本鎖ｃＤＮＡを回収した。
【００９１】
回収した一本鎖ｃＤＮＡを用いて、二本鎖ｃＤＮＡを生成した。回収した一本鎖ｃＤＮＡの溶液４７μｌに、１００μＭ  ａｄＡ−ｄＴＣｘ３（Ｔ７−ａｄＡ−ｄＴＣｘ３からＴ７プロモータ配列を除いた配列からなるプライマー）を１μｌ、およびＨ２Ｏを２μｌ混合して反応液を調製した。この反応液を、７２℃で６分間インキュベートした後、氷上で冷却した。次いで、この反応液に、ｄＮＴＰを３μｌ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩを４μｌ、ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒを１５μｌ、およびＨ２Ｏを７８μｌ添加し、１６℃で２時間インキュベートした。この反応液に、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを２μｌ添加し、１６℃で５分間さらにインキュベートし、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを１０μｌ添加することにより、反応を停止した。この反応液を、フェノール／クロロホルム抽出、引き続くクロロホルム抽出に供した。抽出液に対してエタノール沈殿を行い、沈殿した二本鎖ｃＤＮＡを８μｌのＨ２Ｏに溶解した。
【００９２】
次いで、アガロースゲルを用いて、二本鎖ｃＤＮＡを抽出した。２％アガロースゲルを用いた電気泳動により、二本鎖ｃＤＮＡを分離した。ＤＮＡサイズマーカーに基づき、２００ｂｐ〜８５０ｂｐのサイズのｃＤＮＡを含むアガロースゲルを切り出した。ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、キットに付属するプロトコールを改変し、プライマーダイマーの混入を防ぐためにカラムを３５％塩酸グアニジン水溶液で洗浄するステップを追加して、アガロースゲルから二本鎖ｃＤＮＡを抽出した。
【００９３】
抽出した二本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。抽出した二本鎖ｃＤＮＡの溶液を２〜４μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４を１μｌ、ｄＮＴＰを１μｌ、１００μＭ  ＢｉｏＴＥＧ／Ｂ−ｒａｎｄｏｍ（Ｂ−ｒａｎｄｏｍの５’末端にＴＥＧ（ｔｅｔｒａ−ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）をスペーサーにして、Ｂｉｏｔｉｎが付加されているプライマー）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を０．１μｌ、１００μＭ  ａｄＡ−ｄＴＣｘ３を０．１μｌ、１０×  ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｂｕｆｆｅｒを２μｌ、およびＫＯＤ  ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）を０．４μｌ混合し、Ｈ２Ｏを添加して全量２０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
【００９４】
９４℃で２分間の後に、９４℃で１５秒間、５７℃で３０秒間および６８℃で４０秒間を２４サイクルの条件でＰＣＲを行った。その後、ＰＣＲ反応液を４℃で保持した。
【００９５】
次いで、アガロースゲルを用いて、ＰＣＲ産物を抽出した。２％アガロースゲルを用いた電気泳動により、ＰＣＲ産物を分離した。ＤＮＡサイズマーカーに基づき、２００ｂｐ〜８５０ｂｐのサイズのＰＣＲ産物を含むアガロースゲルを切り出した。ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、キットに付属するプロトコールを改変し、プライマーダイマーの混入を防ぐためにカラムを３５％塩酸グアニジン水溶液で洗浄するステップを追加して、アガロースゲルからＰＣＲ産物を抽出した。
【００９６】
抽出したＰＣＲ産物を、キットに含まれているＥＢ  ｂｕｆｆｅｒ１０μｌに溶解してｃＤＮＡライブラリーを得た。
【００９７】
〔遺伝子発現解析〕
ＧＳ  ｅｍＰＣＲ  ｋｉｔＩ（Ｒｏｃｈｅ社）、ＧＳ  Ｐｉｃｏ  ＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）、およびＧＳ  ２０  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、それぞれのキットに付属するプロトコールに従い、各組織のｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡを１５０ｎｇ〜３００ｎｇ用いてシーケンシング用のサンプルを調製した。サンプルを調製した後、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ２０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。配列決定した塩基の総数を表１に示す。
【００９８】
【表１】
2009125001.tif 000002
【００９９】
表１に示すように、各組織のｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を決定したところ、何れのｃＤＮＡライブラリーについても、３０万以上の数のｃＤＮＡについて配列の一部を決定することができた。各ｃＤＮＡライブラリーについて配列の一部を決定したｃＤＮＡの総数は、１，９０７，０７３である。
【０１００】
配列決定したｃＤＮＡの塩基配列の一例を、配列番号３〜１０の配列に示す。各配列が示すように、オリゴｄＴプライマーの反復領域の配列を超えて、塩基配列を決定することができている。
【０１０１】
ＢＬＡＴ（ＢＬＡＳＴ  Ｌｉｋｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ）を用いて、ＪＧＩ（Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から提供されているヒメツリガネゴケ概要ゲノム塩基配列ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｖ１．１を対象配列とし、配列決定した各ｃＤＮＡの配列を参照（Ｑｕｅｒｙ）配列として類似性検索を行った。次いで、概要ゲノム塩基配列に対して、５０ｎｔ以上一致したｃＤＮＡ配列について、ゲノム上の推定遺伝子領域へのマッピングを行った。マッピングにはＵＴ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ）、およびＪＧＩから提供されているヒメツリガネゴケゲノム情報を使用した。その結果、図２に示すように、多くの配列が推定遺伝子の３’末端付近にマッピングされていた。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、組織または生物個体全体の遺伝子発現の情報を、質および量をともに向上させて取得することができる。したがって、本発明は、遺伝子の発現解析が必要とされるあらゆる産業において利用可能であり、特に、医学、製薬産業において、非常に有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】本発明の一実施形態に係るｃＤＮＡライブラリー作製方法の原理を模式的に表した図である。
【図２】本発明の一実施形態を用いて取得した配列の一部をゲノム上にマッピングさせた結果を示す図である。
【図１】
2009125001.tif 000003
【図２】
2009125001.tif 000004
【配列表】
2009125001000001.app