(57)【要約】【課題】細胞又は核酸を含む試料（サンプル）から核酸を単離する方法において、磁性固体支持体及び磁性固体支持体に結合した菌および核酸などが原因で起こる目詰まりを抑制して円滑なフィルターろ過を可能とし、安全かつ簡易に核酸を単離することを可能とする方法を提供する。更には、（ｉ）当該方法を実施するための核酸抽出装置、（ii）それらを用いた細胞種の同定方法、及び（iii）遺伝子検出方法を提供する。【解決手段】細胞又は核酸を含む試料からの核酸単離方法であって、所定の工程のいずれかの工程において、フィルターによって磁性固体支持体をフィルター上の一部に集積する作業を含むことを特徴とする核酸単離方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は核酸を含む試料からの核酸単離方法であって、下記工程（１）〜（４）のいずれかの工程を有し、かついずれかの工程において、フィルターが磁石又は電磁石で磁性を帯びることによって磁性固体支持体をフィルター上の一部に集積する作業を含むことを特徴とする核酸単離方法。
工程（１）：細胞又は核酸を結合し得る磁性固体支持体を含有する液を、空気圧を操作する治具により動かして、フィルターでろ過することで、磁性固体支持体をフィルター上に固定する又は堰き止める工程
工程（２）：試料を前記磁性固体支持体を固定した又は堰き止めたフィルターでろ過することで、細胞又は核酸を前記磁性固体支持体を固定したフィルターに結合する工程
工程（３）：細胞又は核酸を洗浄するバッファー液を前記磁性固体支持体を固定した又は堰き止めたフィルターでろ過することで、細胞又は核酸を洗浄する工程
工程（４）：核酸を溶出するバッファー液を前記磁性固体支持体を固定した又は堰き止めたフィルターでろ過することで、核酸を溶出する工程
【請求項２】
前記フィルターが、平均孔径０．２〜５．０μｍの微細孔を有するフィルターであることを特徴とする請求項１に記載の核酸単離方法。
【請求項３】
前記細胞が、クラミジア菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属）、及びマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）の内のいずれかに属する微生物の細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸単離方法。
【請求項４】
前記試料が、尿、血液、細胞懸濁液、又は喀痰であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸単離方法。
【請求項５】
前記空気圧を操作する治具が、シリンジ、真空管、及びポンプを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸単離方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸単離方法を実施するために用いられることを特徴とする核酸抽出装置。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸単離方法により単離された核酸を核酸増幅法により同定することを特徴とする細胞種の同定方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸単離方法により単離された核酸をマイクロチップを有する装置において増幅し、検出する操作を含むことを特徴とする遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性固体支持体とフィルターを用いて細胞又は核酸を含む試料から核酸を単離する方法、当該方法を実施するための核酸抽出装置、及びそれらを用いた細胞種の同定方法及び遺伝子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、複数の物質を含有する試料を分析する際、分析に先立って特定の分析対象を抽出し、分離する操作を必要とすることが多い。例えば、血液、尿などの生物由来試料は、分析に先立って行う検体の前処理の一つとして、試料に含まれる不要成分（タンパク質、脂質やイオン性物質など）を除去するために、抽出・分離する操作を必要とすることが通例である。
【０００３】
特に臨床現場からの試料は、ウィルス、細菌などの感染、汚染の危険性を常に内包していることから、そのような試料の前処理の全体または一部であっても安全かつ迅速に実施できる方法や装置の開発が望まれている。
【０００４】
したがって、従来、種々の抽出・分離方法が提案されている。例えば、生化学的試料中の核酸等の分析を目的として、特別な構造を有する容器や磁性粒子等を利用する抽出・分離方法が提案されている（例えば特許文献１〜４参照。）。
【０００５】
しかしながら、これらの方法は、試料の前処理として必要な操作が煩雑である上、必ずしも、上記の臨床現場からの試料を扱う際の感染、汚染の危険性等の諸問題を解決するものではない。
【０００６】
一方、近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段（例えばポンプ、バルブ、流路、センサーなど）を微細化して１チップ上に集積化したシステムが開発されている。これは、μ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ  ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）、マイクロチップ、バイオリアクタ、ラブ・オン・チップ（Ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐｓ）、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。
【０００７】
とりわけ遺伝子検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える。
【０００８】
しかし、上記のようなミクロ化分析システムにおいては、マイクロチップ等の上で検査などを行うために、試料の必要量を極少の量とし、必要とされる試薬量も少なくて済む分析の微量化を図ることは、マイクロチップ等に求められる最大課題である。
【０００９】
ところが、試料によっては、検出対象である遺伝子または核酸の濃度が希薄であることがある。チップに導入できる検体量も限られていることから、そうした検体量では測定可能な範囲内に収まらない。したがって、チップに導入する前に予備的な濃縮または分離の操作が必要となってくる。あるいは微量の反応生成物を高感度でしかも簡便に検出、または定量できる機構をチップに搭載することが必要とされる。遺伝子の検出では、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法による増幅反応を利用するのが通例である。血液などの生体液を試料とする場合、そのまま検体として分析に供することができないことが多く、通常は何らかの前処理を加えることが要求されることも多い。
【００１０】
例えば生物試料から核酸を抽出、分離する方法或いはそれに関連する方法として、化学的方法または物理的方法が用いられる。後者に属する方法として、磁性体粒子（磁性ビーズ）を利用する方法が知られている（例えば特許文献５〜６参照）。
【００１１】
特許文献５には、液体及び液体中に含まれる目的高分子物質の定量・分離・分取・分注・清澄・濃縮・希釈等の作業および抽出・回収・単離作業を、分注機による液体の吸引・吐出作業および磁性体粒子の磁力体による制御または／およびフィルターと、を組み合わせることによって自動的に行う方法が開示されている。この方法においては、目的高分子物質を磁性体粒子に吸着し、分注機チップに装着したフィルターで磁性体粒子を分離する。当該磁性体粒子は、分注機チップの外側から作用する磁力によってチップ内壁面に吸着され、かつ、上記磁力の影響が及ばないときにチップ内壁面から離脱可能であることを特徴としている。
【００１２】
また、特許文献６には、非磁性及び磁性ビーズを捕捉する微小流体装置が開示されている。当該装置は、磁性ビーズを捕捉するフィルターが、ビーズの直径未満の幅を有する開口部のある多数の溝を有する壁を含むことを特徴としている。
【００１３】
特許文献７には、レーザ吸収度の異なるビーズを用いる核酸の精製装置及び当該装置を用いる核酸の精製方法が開示されている。この装置・方法においては、磁性ビーズ（固状支持体）を利用して細胞からＤＮＡを抽出する細胞溶解毛細管及び細胞溶解毛細管とＤＮＡ増幅チャンバとの間の流路内に位置し、前記固状支持体を濾過する膜などを用いることを特徴としている。
【００１４】
しかしながら、上記特許文献に開示されている方法における、磁性固体支持体（磁性ビーズ）を用いた細胞または核酸の分離、洗浄、溶出工程は、磁石を当てた状態での操作が困難で、作業ミスや液滴飛散などが起こりやすく、熟練を要するという問題がある。また、フィルターを用いた固液分離と、ビーズの添加によって、菌および核酸の収集効率を上げようとすると、その際、ビーズおよびビーズに結合した菌および核酸などが原因で、フィルターに目詰まりが起き、フィルターろ過が円滑に進まないという問題がある。
【特許文献１】特表２００１−５１１６４４号公報
【特許文献２】特表平１０−５０８１００号公報
【特許文献３】特表２００３−５１６１５６号公報
【特許文献４】特表２００３−５１６１５６号公報
【特許文献５】特開平８−３２０２７４号公報
【特許文献６】特表２００３−５３２４００号公報
【特許文献７】特開２００６−１４９３８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記問題・状況等に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、細胞又は核酸を含む試料（サンプル）から核酸を単離する方法において、磁性固体支持体及び磁性固体支持体に結合した菌および核酸などが原因で起こる目詰まりを抑制して円滑なフィルターろ過を可能とし、安全かつ簡易に核酸を単離することを可能とする方法を提供することである。更には、（ｉ）当該方法を実施するための核酸抽出装置、（ii）それらを用いた細胞種の同定方法、及び（iii）遺伝子検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
【００１７】
１．細胞又は核酸を含む試料からの核酸単離方法であって、下記工程（１）〜（４）のいずれかの工程を有し、かついずれかの工程において、フィルターが磁石又は電磁石で磁性を帯びることによって磁性固体支持体をフィルター上の一部に集積する作業を含むことを特徴とする核酸単離方法。
工程（１）：細胞又は核酸を結合し得る磁性固体支持体を含有する液を、空気圧を操作する治具により動かして、フィルターでろ過することで、磁性固体支持体をフィルター上に固定する又は堰き止める工程
工程（２）：試料を前記磁性固体支持体を固定した又は堰き止めたフィルターでろ過することで、細胞又は核酸を前記磁性固体支持体を固定したフィルターに結合する工程
工程（３）：細胞又は核酸を洗浄するバッファー液を前記磁性固体支持体を固定した又は堰き止めたフィルターでろ過することで、細胞又は核酸を洗浄する工程
工程（４）：核酸を溶出するバッファー液を前記磁性固体支持体を固定した又は堰き止めたフィルターでろ過することで、核酸を溶出する工程
２．前記フィルターが、平均孔径０．２〜５．０μｍの微細孔を有するフィルターであることを特徴とする前記１に記載の核酸単離方法。
【００１８】
３．前記細胞が、クラミジア菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属）、及びマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）の内のいずれかに属する微生物の細胞であることを特徴とする前記１又は２に記載の核酸単離方法。
【００１９】
４．前記試料が、尿、血液、細胞懸濁液、又は喀痰であることを特徴とする前記１〜３のいずれか一項に記載の核酸単離方法。
【００２０】
５．前記空気圧を操作する治具が、シリンジ、真空管、及びポンプを含むことを特徴とする前記１〜４のいずれか一項に記載の核酸単離方法。
【００２１】
６．前記１〜５のいずれか一項に記載の核酸単離方法を実施するために用いられることを特徴とする核酸抽出装置。
【００２２】
７．前記１〜５のいずれか一項に記載の核酸単離方法により単離された核酸を核酸増幅法により同定することを特徴とする細胞種の同定方法。
【００２３】
８．前記１〜５のいずれか一項に記載の核酸単離方法により単離された核酸をマイクロチップを有する装置において増幅し、検出する操作を含むことを特徴とする遺伝子検出方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の上記手段により、細胞又は核酸を含む試料（サンプル）から核酸を単離する方法において、磁性固体支持体及び磁性固体支持体に結合した菌および核酸などが原因で起こる目詰まりを抑制して円滑なフィルターろ過を可能とし、安全かつ簡易に核酸を単離することを可能とする方法を提供することができる。更には、（ｉ）当該方法を実施するための核酸抽出装置、（ii）それを用いた細胞種の同定方法、及び（iii）遺伝子検出方法を提供することができる。
【００２５】
すなわち、基本的原理の観点から本発明の効果を説明するならば、磁性固体支持体の分離にフィルターろ過を適用することによって、磁性固体支持体を効率良く分離することができる。さらに、フィルターろ過の際に磁石を当て磁性固体支持体をフィルター上の一部に集積することによって、ろ過を促進、フィルター目詰まりを抑制する。例えば、磁性固体支持体を左側に当てた状態で液を右側に通すようにすれば、磁性固体支持体を含む液体を円滑にろ過することができる。すなわち、帯磁をｏｎ／ｏｆｆできるフィルターを接続したシリンジ状の治具を用いることによって簡便に、磁性固体支持体とフィルターを併用することによって高い収率で菌を集めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の核酸単離方法は、細胞又は核酸を含む試料からの核酸単離方法であって、前記工程（１）〜（４）のいずれかの工程を有し、かついずれかの工程において、フィルターが磁気を帯びることによって磁性固体支持体をフィルター上の一部に集積する作業を含むことを特徴とする。この特徴は、請求項１〜８に係る発明に共通する技術的特徴である。
【００２７】
以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための最良の形態・態様について詳細な説明をする。
【００２８】
（本発明の核酸単離方法）
本発明の核酸単離方法は、細胞又は核酸を含む試料からの核酸単離方法であって、下記工程（１）〜（４）のいずれかの工程を有し、かついずれかの工程において、フィルターが磁石又は電磁石で磁性を帯びることによって磁性固体支持体をフィルター上の一部に集積する作業を含むことを特徴とする。
工程（１）：細胞又は核酸を結合し得る磁性固体支持体を含有する液を、空気圧を操作する治具により動かして、フィルターでろ過することで、磁性固体支持体をフィルター上に固定する又は堰き止める工程
工程（２）：試料を前記磁性固体支持体を固定した又は堰き止めたフィルターでろ過することで、細胞又は核酸を前記磁性固体支持体を固定したフィルターに結合する工程
工程（３）：細胞又は核酸を洗浄するバッファー液を前記磁性固体支持体を固定した又は堰き止めたフィルターでろ過することで、細胞又は核酸を洗浄する工程
工程（４）：核酸を溶出するバッファー液を前記磁性固体支持体を固定した又は堰き止めたフィルターでろ過することで、核酸を溶出する工程
上記から分かるように、本発明の核酸単離においては、（ａ）細胞または核酸を結合し得る磁性固体支持体、（ｂ）磁性固体支持体を集積する磁石、（ｃ）磁性固体支持体含有液をろ過することで、磁性固体支持体を固定又は堰き止め、磁性固体支持体を分離し得るフィルター、（ｄ）磁性固体支持体含有液、試料（サンプル）液等を吸引し、ファイルターを通して排出ろ過するシリンジ状の治具等を活用することを特徴とする。
【００２９】
以下、各構成要素等について説明する。
【００３０】
〈磁性固体支持体〉
本発明にかかる「磁性固体支持体」とは、抽出・単離の目的物を吸着により担持させる固体支持体であって、磁性を有するものをいう。
【００３１】
本発明に係る磁性固体支持体は、水不溶性の担体であるであることが好ましい。本発明において、水不溶性の固体支持体を形成する材料は、特に限定されるものではないが、水に不溶であればよい。ここでいう水不溶性とは、具体的に水、他のいかなる水可溶性組成を含む水溶液に溶解しない固相を意味する。固体支持体は、固定、分離等用に現在広く使用され、提案されている公知の支持体又はマトリックスのいずれであってもよい。
【００３２】
具体的には無機化合物、金属、金属酸化物、有機化合物又はこれらを組み合わせた複合材料を含む。試料に含まれる細胞等の目的物を磁性固体支持体に吸着させるが、磁性固体支持体は、細胞等の目的物を吸着させ得るものであれば、材質、形状、サイズは特に限定されない。好ましいのは、例えば、細胞の結合、したがって、核酸の結合のためには高い表面積を与える材料である。
【００３３】
具体的に固体支持体として使用される材料は、特に限定されるものではないが、一般にポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリアミド、ラテックスなどのような合成有機高分子、ガラス、シリカ、二酸化珪素、窒化珪素、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、酸化ナトリウム、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛などの無機物又はステンレス、ジルコニアなどの金属であってもよい。これらの材料は一般に不規則な表面を持ち、例えば多孔性又は粒状、例えば粒子、繊維、ウェブ、焼結体又は篩いであることができる。
【００３４】
本発明においては、固体支持体の表面も含めた全体が同一の材料から構成されている場合のほかに、必要に応じて複数の素材から構成されるハイブリット体であってもよい。例えば分析の自動化に対応することができるために、コア部分は酸化鉄、又は酸化クロムのような磁気応答性材料で作られ、その表面を有機合成ポリマーで被覆された複合ビーズが挙げられる。
【００３５】
細胞を結合させた磁性支持体を試料液から、磁石の磁力によって容易に（固液）分離・粒子の回収をすることができる点で、その磁性支持体が常磁性体、強常磁性体、及び強磁性体などの磁性体が含有されてなるものであることが好ましく、より好ましくは、常磁性体及び強常磁性体の両方又はいずれか一方が含有されてなるものである。特に残留磁化がないか又は少ない点で、強常磁性体を用いることが好ましい。
【００３６】
かかる磁性体の具体例としては、四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル、マンガンなどの各種合金を挙げることができ、これらのうち、四三酸化鉄が特に好ましい。
【００３７】
本発明において用いられる固体支持体の形状としては、特に限定されるものではないけれども、粒状、棒状、板状、シート、ゲル、膜、繊維、毛細管、ストリップ、フィルターなどが挙げられ、好ましくは、粒状である。粒状材料、例えばビーズは、結合能力が大きいために一般に好ましい。
【００３８】
粒状の形態としては、例えば球形、楕円体形、錐体、立方形、直方体形などが挙げられる。このうち球形粒子の担体は製造しやすく、使用時に、磁性支持体の回転攪拌がしやすいことからも好ましい。細胞等の目的物を吸着する固体支持体としてのビーズの平均粒径は、０．５〜１０μｍ、好ましくは２〜６μｍであることが好ましい。平均粒径が０．５μｍ未満である場合、当該ビーズ本体が磁性体を含有してなるものである場合は、充分な磁気応答性を発現せず、当該粒子を分離するために相当に長い時間を要し、また、分離するために相当に大きい磁力が必要となる。一方、粒径が１０μｍを超える場合には、当該粒子が水性媒体中で沈降しやすいものとなるため、細胞を捕捉する際に媒体を攪拌する操作が必要となる。また、粒子本体の表面積が小さくなるため、充分な量の細胞を捕捉することが困難となることがある。
【００３９】
本発明において用いられる磁性支持体は、小粒径の粒子よりなるビーズであって、優れた磁気分離性（すなわち磁気によって短時間で分離する性能）を有し、かつ、ゆるい上下振盪の操作によって再分散し得るものであることが好ましい。
【００４０】
磁性ビーズにおける磁性体の含有割合は、非磁性体の有機物質の含有割合が３０質量％以上であることから、７０質量％以下とされるが、好ましくは、２０〜７０質量％、より好ましくは３０〜７０質量％である。この割合が２０質量％未満であると、充分な磁気応答性が発現されず、所要の磁力によって短時間で粒子を分離することが困難となることがある。一方、この割合が７０質量％を超えると、粒子本体表面に露出する磁性体の量が多くなるため、当該磁性体の構成成分、例えば、鉄イオンの溶出などが生じ、使用時に他の材料に悪影響を及ぼすことがあり、また、粒子本体が脆くなって実用的な強度が得られないことがある。
【００４１】
本発明に係る抽出・単離方法では、細胞等を含む試料液と磁性支持体（好ましくは磁性ビーズ）とを混合し、この混合により細胞等が磁性支持体に吸着（化学吸着及び物理吸着等を含む。）すると、細胞等を効率よくその表面上に集積することができる。細胞等が磁性支持体に吸着しない場合も磁力又は遠心分力で細胞を集積することが可能である。したがって、細胞等が磁性支持体に吸着することが望ましいが、吸着しなくてもよい。
【００４２】
細胞、特に細菌細胞の中には、磁性支持体に吸着しない場合もある。更に確実に細胞の吸着、付着を促進するため、磁性支持体の表面に細胞に対して親和性を有する基、アミノ基、オキシカルボニルイミダゾール基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド基といった反応性に富む官能基、或いは標的の細胞に特異的に親和性を示す糖、糖タンパク質、抗体、レクチン、細胞接着因子といった「機能性物質」などを結合させるか、その表面構造の改変、結合を促進する適当なコーティングなどを施してもよい。特異的な結合としては、抗原−抗体反応を利用した結合が代表的であり、磁性支持体の表面に細胞の抗原に対して特異的な抗体をコーティングする。
【００４３】
本発明において、好ましい常磁性表面結合担体としては、抗酸菌と結合しうる物質、例えば、レクチン類、抗酸菌結合抗体、糖類、炭水化物類などが固体支持体表面に固定された態様が挙げられる。
【００４４】
試料によっては、それに含まれる細胞、特に対象菌細胞の濃度が薄い場合、大量の試料液を処理し、分離、濃縮などの操作が必要となる。細胞を磁性支持体に結合若しくは付着させて、細胞中の核酸を簡便に抽出する本発明の方法によれば、簡便な操作で迅速にそうした試料の処理ができる。特に磁性ビーズと着脱可能なカバーを付けた磁石を利用する固液分離操作は、試料が少量しかない場合にも極めて便利である。かかる場合には、分離、抽出などの過程で、細胞又は核酸のロスが生じて、目的とする核酸の最終収量が分析に好適な量を下回るケースもあるが、本発明の方法では、そうした単離途中でのロスは殆ど生じない。後工程にある核酸増幅反応、ハイブリダイゼーション、制限酵素反応、検出反応、電気泳動分析などに影響を及ぼす、カオトロープ試薬、界面活性剤、又は溶剤菌などの薬剤を本発明の方法では使用しないため、分離（単離）された核酸はそのまま増幅反応に適用することができる。したがって、試料量が微量であっても、本発明の方法によれば、細胞から高収量でしかも純度が高い核酸を分離（単離）することができる。
【００４５】
試料によっては、それに含まれる細胞、特に対象菌細胞の濃度が薄い場合、大量の試料液を処理し、分離、濃縮などの操作が必要となる。細胞を磁性支持体に結合若しくは付着させて、細胞中の核酸を簡便に抽出する本発明の方法によれば、簡便な操作で迅速にそうした試料の処理ができる。特に磁性ビーズと着脱可能なカバーを付けた磁石を利用する本発明における固液分離操作は、試料が少量しかない場合にも極めて便利である。かかる場合には、分離、抽出などの過程で、細胞又は核酸のロスが生じて、目的とする核酸の最終収量が分析に好適な量を下回るケースもあるが、本発明の方法では、そうした単離途中でのロスは殆ど生じない。後工程にある核酸増幅反応、ハイブリダイゼーション、制限酵素反応、検出反応、電気泳動分析などに影響を及ぼす、カオトロープ試薬、界面活性剤、又は溶剤菌などの薬剤を本発明の方法では使用しないため、分離（単離）された核酸はそのまま増幅反応に適用することができる。したがって、試料量が微量であっても、本発明の方法によれば、細胞から高収量でしかも純度が高い核酸を分離（単離）することができる。
【００４６】
〈フィルター〉
本発明に係るフィルターは、試料流体中の磁性固体支持体、菌、細胞などをろ過により分離・捕捉することを目的として使用されるものである。これにより、磁性固体支持体等を効率良く分離することができる。さらに、フィルターろ過の際に磁石を当て磁性固体支持体をフィルター上の一部に集積することによって、ろ過を促進、フィルター目詰まりを抑制することができる。例えば、磁性固体支持体を左側に当てた状態で液を右側に通すようにすれば、磁性固体支持体を含む液体を円滑にろ過することができる。すなわち、帯磁をｏｎ／ｏｆｆできるフィルターを接続したシリンジ状の治具を用いることによって簡便に、磁性固体支持体とフィルターを併用することによって高い収率で菌を集めることができる。
【００４７】
なお、本発明の核酸単離法においては、細胞または核酸を結合し得る磁性固体支持体を含有する液を、空気圧を操作する治具により動かして、フィルターでろ過することで、磁性固体支持体をフィルター上に固定する又は堰き止める工程や試料を前記磁性固体支持体を固定した又は堰き止めたフィルターでろ過することで、細胞又は核酸を前記磁性固体支持体を固定したフィルターに結合する工程などを含むことが好ましい。
【００４８】
ここで、「磁性固体支持体をフィルター上に固定する」とは、フィルターの繊維の材質と、磁性固体支持体の表面との相互作用により、フィルターに磁性固体支持体が結合していることをいう。また、「磁性固体支持体をフィルター上に堰き止める」とは、磁性固体支持体よりも小さい孔径を持つフィルターに、磁性固体支持体を含む液を通すことにより、フィルター上に磁性固体支持体を物理的に堰き止めることをいう。
【００４９】
本発明に係るフィルターは、孔径０．２〜５．０μｍの微細孔を有するフィルターであることが好ましい。なお、当該孔径は、細胞、血球、ウィルス、細菌などのサイズなどを考慮したものである。すなわち、当該フィルターは、試料流体中の細胞やウィルスを捕捉することを目的とするものであることから、その平均的な０．２〜５．０μｍは、目的の核酸を含有する細胞あるいはウィルスの平均的な大きさに応じて選択される。例えば、０．２〜５μｍ、好ましくは０．５〜２μｍである。
【００５０】
当該フィルターの形状は目的に応じて種々の形状を採り得るが。膜状であることが好ましい。
【００５１】
当該フィルターの材料としては、例えばセルロースアセテート、硝酸セルロース混合エステル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルスルホン、ナイロン、ポリビニリデンジフルオリド、グラスファイバーなどを用いることができる。
【００５２】
なお、本発明においては、フィルターに磁石又は電磁石を当てることによって、当該フィルターが磁性を帯びるような態様にすることを要する。すなわち、フィルター自体が磁性を有するか、磁石を近づけたときに磁性を帯びることができる態様にする。このため、当該フィルターを構成する材料としては、前記の固体支持体と同様の磁性体或いはそれを含有させた上記樹脂（高分子）材料等を用いることができる。
【００５３】
〈空気圧を操作する治具〉
本発明に係る「空気圧を操作する治具」とは、細胞または核酸を結合し得る磁性固体支持体を含有する液をフィルターでろ過する際に、当該液に空気圧をかけてろ過させるために使用する治具（ジグ：補助工具）をいう。
【００５４】
本発明においては、当該治具として、シリンジ、真空管、及びポンプなどを用いることが好ましい。
【００５５】
〈核酸単離器具〉
本発明においては、核酸単離方法を実施するために、核酸単離器具を用いることができる。ここで、「核酸単離器具」とは、核酸単離に必要な器具、すなわちフィルター、磁石、空気圧を操作する治具、またはそれらを組み合わせたセット等をいう。
【００５６】
図１に核酸単離器具の一例の概念図を示す。この図においては、シリンジ、プレフィルター、フィルター、及び磁石の組合わせが示されている。なお、シリンジの中には、例えば、試料、磁性ビーズ含有液、及び結合バッファー等を入れる。
【００５７】
この図に示された組合わせに試薬を加えると下記の「核酸単離キット」になる。
【００５８】
〈核酸単離キット〉
本発明においては、核酸単離方法を実施するための、試薬、器材及び核酸単離器具を含む核酸単離キットを用いることができる。これを用いることにより、核酸単離操作を一層簡便化することができる。
【００５９】
当該キットに含まれる「試薬」としては、例えば、可溶化・雑菌除去処理剤や集菌溶液、溶菌溶液、洗浄溶液、再懸濁液等が挙げられる。
【００６０】
なお、「可溶化・雑菌除去処理剤」とは、喀痰を可溶化する作用ないし雑菌を除去する作用を有する試薬・試剤自体又はそれを含有する溶液をいう。なお、可溶化する作用又は雑菌を除去する作用のいずれか一方の作用だけを有するものであっても、両方の作用を併有するものであってもよい。
【００６１】
具体的には、成分として、セミアルカリプロテアーゼ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）、キチン、フェノール、酢酸アンモニウムから選ばれる物質を含有する試薬・試剤等であることが好ましい。
【００６２】
特に、セミアルカリプロテアーゼを含有する喀痰溶解剤（例えば、スプタザイム：商品名（極東製薬工業（株））や、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）−水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）試薬（液））が好ましい。
【００６３】
「集菌溶液」とは、菌を固体支持体に吸着等させるために菌を溶媒に予め溶解して調製した溶液、「溶菌溶液」とは、菌の細胞壁や細胞膜を破壊して核酸を溶出させるための溶液をいう。
【００６４】
なお、核酸を抽出・単離する場合には、各種緩衝液等を必要とするが、例えば、結合緩衝液（集菌溶液等）としては、例えば、酢酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の塩と、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコールとからなる緩衝液が例として挙げられる。また、洗浄緩衝液（洗浄液）としては、上記結合緩衝液を４〜５倍に希釈したものを用いてもよいが、異なる種類の緩衝液を別途用意してもよい。再懸濁液としては、水が好適である。
【００６５】
当該キットに含まれる「器材」としては、例えば、液体を保管する容器、チューブ、液体を操作するマイクロピペット等を挙げることができる。
【００６６】
（試料）
本発明において、試料（サンプル）としては、特定の物質に限られず、広範な種々の物質を対象とすることができる。特に、下記の生物試料ないし生体由来の試料を試料として、それらに含有されている細胞や核酸等を抽出・単離の目的物とすることが好ましい。
【００６７】
本発明において単離対象とすることができる細胞は、微生物（最近、カビ、酵母等）、植物、動物の細胞又は細胞培養物のいずれであってもよく、特に限定されない。好ましくは、微生物の細胞であり、特にクラミジア菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属）、及びマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）のいずれかに属する微生物の細胞が望ましい。
【００６８】
試料は前記細胞を含有する試料であり、生体由来の試料であれば、特に制限は無いが、例えば全血、血漿、血清、パフィーコート、尿、糞便、唾液、喀痰、脳脊髄液、精液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）細胞培養液（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）など生体由来の殆どの試料が該当する。核酸含有試料、微生物などが混入又は含有する可能性のある試料、その他核酸が含有されている可能性のあるあらゆる試料（食品、生物学的製剤等）が対象となる。或いは、土壌、排水のような生物を含有する可能性のある環境試料が挙げられる。試料の形態は、好ましくは流体の試料であり、通常は、溶液若しくは懸濁液の液体である。試料は溶解できる固体であるか、又は液体の中に浮遊している固体であってもよい。
【００６９】
本発明において抽出の対象とすることができる核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、及びリボ核酸（ＲＮＡ）の形態で存在するが、ＤＮＡとしては、プラスミドＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、及びゲノムＤＮＡなど、ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）などが含まれる。なお、一本鎖又は二本鎖を問わない。単離されるＤＮＡ量の好適な範囲として０．００１〜１ｍｇである。
【００７０】
本願において、「遺伝子」とは、何らかの機能を発現する遺伝情報を担う核酸、すなわちＤＮＡ又はＲＮＡをいうが、単に化学的実体であるＤＮＡ、ＲＮＡの形でいうこともある。また「塩基」とは、ヌクレオチドの核酸塩基のことをいう。
【００７１】
前記の細胞膜の破壊は、公知の種々の物理的方法を用いることができる。好ましくは熱により細胞破壊が行われる。これは加熱が簡便であり、上記のように細胞膜破壊に使用した薬剤を後で除く必要がないからである。具体的には、前記の加熱は、核酸が熱により変性しない温度範囲、すなわち、７０〜１２０℃、好ましくは８０〜１２０℃、更に好ましくは８０〜１００℃で、２０秒〜１０分間、好ましくは２０〜３００秒間の加熱による。加熱条件（温度、時間）は細胞又は菌の種類（大きさ、細胞膜の組成と厚さ等）によって異なるため、上記の範囲で適宜選択する。加熱は、あらゆる適切な加熱手段により行われるが、ドライ・ヒートブロック、湯浴、マイクロウェーブ・オーブン、各種ヒーターなどが例示される。しかし、これらに限定されるものではない。
【００７２】
なお上記行程に加えて、熱によって水分を蒸発させることにより遊離した核酸を濃縮する工程を更に含めてもよい。加える熱は、核酸が熱により変性しない温度範囲内である。上記の細胞膜破壊が加熱により行われるために、熱による細胞膜破壊工程はこの濃縮工程を兼ねることができる。
【００７３】
以上より、試料としては、特に上記のような生物試料（又は生体由来試料）であることが好ましい。また、当該生物試料（又は生体由来試料）としては、特に尿、血液、細胞懸濁液、又は喀痰であることが好ましい。
【００７４】
（核酸の増幅）
上記回転式抽出容器は、抽出し、単離された核酸を核酸増幅法により増幅し、核酸の同定をすることにより細胞種を同定する方法に好適に使用することができる。すなわち、当該同定方法に上記回転式抽出容器を用いることによって、当該方法に必須の抽出・分離（単離）操作を、簡易、迅速、かつ安全に実施することができる。
【００７５】
具体的には、試料に含まれる細菌細胞等から抽出され、単離された核酸を、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：鎖置換増幅法）、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：リガーゼ連鎖反応）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：転写増幅法）、ＴＡＳ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：自己複製）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：核酸配列に基づく増幅法）などのＤＮＡ増幅法により増幅し、増幅された核酸の分析、例えば、塩基配列決定、ハイブリダイゼーション法、サザンプロット分析など行って、標準又は対象の塩基配列とを比較することにより細菌細胞等の種類を同定することができる。
【００７６】
〈核酸抽出装置〉
以下において、本発明の核酸単離方法を実施するための装置の一例について説明するが、この例の態様に限定されるものではない。
【００７７】
図２に核酸抽出装置の例として、回転式抽出器の概念図を示す。当該回転式抽出容器は、基本的には、図２に示されているように円柱型容器部Ａ、回転部Ｂ、及び蓋部Ｃで構成される。
【００７８】
円柱型容器部Ａは少なくとも二つの小室（例えば図２においては、小室Ａ１〜小室Ａ３の三つの小室）を有し、目的に応じて小室を増設してもよい。例えば、後述する実施の形態のように集菌用小室、洗浄用小室、再懸濁用小室等を設けることができる。なお、ここでいう「小室」は、上記の可溶化・雑菌除去処理剤等を入れる容器に該当する。
【００７９】
回転部Ｂは円柱型容器部に密着可能であり、小室を部分的に塞ぐ箇所と小室のいずれか一つと外部をつなぐ開口箇所Ｄ（小室の入り口と同じ開口面積）を有する。この開口箇所Ｄから円柱型容器部のいずれかの小室に、試料としての溶液、懸濁液、及び固体物質や磁性固体支持体としての磁性粒子等を出し入れすることができる。
【００８０】
蓋部Ｃは回転部Ｂの開口箇所Ｄを密閉することにより、同時に円柱型容器部Ａを密閉することができる。また、当該蓋部Ｃは、回転式抽出容器を逆さにしたときに開口箇所Ｄから出てくる物質の受器の役割も果たす。
【００８１】
なお、回転式抽出容器の回転部Ｂをその開口箇所Ｄが溶液又は固体が入っている小室の真上に来るまで回転させた後、回転式抽出容器を逆さにして当該小室から溶液又は固体を、開口箇所Ｄを経由して蓋部Ｃに移動させる。次に、回転部Ｂを回転して開口箇所Ｄが別の小室の真上更に来るように回転させた後に、溶液又は固体を蓋部Ｃから開口箇所Ｄを経由して当該別の小室へと移動させることができる。したがって、このような回転操作や移動操作を含む操作によって試料から目的物を抽出することができる。
【００８２】
すなわち、当該固体が、抽出の目的物を含有している試料としての固体物質、抽出の目的物質としての固体物質、及び抽出の目的物を吸着させた磁性固体支持体である場合、上記のような移動を含む操作で、当該固体を集めること又は目的物を吸着させた固体を集めることができる。
【００８３】
なお、固体が目的物または目的物を含む物質を吸着させる磁性固体支持体である場合には、回転式抽出容器のいずれかの箇所に磁石を当てることで、当該磁性支持体又は前記目的物あるいは目的物を含む物質を吸着させた該磁性支持体を集めることができる。
【００８４】
円柱型容器Ａ、回転部Ｂ、及び蓋部Ｃを形成する材料としては、試料内容に応じて、金属、プラスチック等種々の公知の材料を用いることができる。好ましい材料としては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネイト等を挙げることができる。
【００８５】
また、円柱型容器部Ａ、回転部Ｂ、及び蓋部Ｃのサイズも試料の内容、量や分析装置等に応じて適切なサイズにすることができる。
【００８６】
〈核酸（遺伝子）検出のための核酸単離方法〉
本発明の核酸単離方法の基本的手順は、下記の通りである。なお、本発明においては、下記手順のいずれかの段階において、フィルターによって磁性固体支持体をフィルター上の一部に集積する作業を含めることとする。
【００８７】
（ｉ）喀痰等の試料に可溶化・雑菌除去処理剤を添加し、可溶化ないし雑菌を除去する。
【００８８】
（ii）試料を可溶化・雑菌除去した後の液体をあらかじめ磁性固体支持体（例えば磁性ビーズ）分散液が入っている容器に入れ、磁性固体支持体に抗酸菌を結合・捕集させる。
【００８９】
（iii）磁石を用いて、抗酸菌等が結合・捕集されている磁性固体支持体（例えば磁性ビーズ）を洗浄液、溶出液が入った各容器に順次移動させ、抗酸菌等を洗浄し、溶出する。
【００９０】
以下において、喀痰等の試料を可溶化・雑菌除去した後の液体の取り扱い手順を実施形態の典型的な例によって詳しく説明する（図２〜図４参照）。
【００９１】
（１）予め、円柱型容器部Ａの一つの小室（Ａ１）には集菌溶液と、磁性支持体として磁性ビーズを、別の小室（Ａ２）には洗浄溶液を、また小室（Ａ３）には溶菌溶液を入れておく。
【００９２】
（２）回転部Ｂの開口箇所Ｄから上記小室（Ａ１）に試料を入れ、蓋部Ｃをセットし、密閉する。
【００９３】
（３）試料、集菌溶液、磁性ビーズを撹拌し、混合した後１分放置し、磁性ビーズに菌を吸着させる。
【００９４】
（４）回転式抽出容器を逆さにし、蓋部に磁石を当て、磁性ビーズを集め回収（集菌）する。
【００９５】
（５）回転式抽出容器の上下を戻し、開口箇所Ｄが別の小室（Ａ２）に来るように回転部２を回転させた後に、磁石をはずし、磁性ビーズを小室（Ａ２）に移動させる。
【００９６】
（６）小室（Ａ２）において洗浄溶液１ｍｌと磁性ビーズを撹拌混合し、洗浄する。
【００９７】
（７）回転式抽出容器を逆さにし、蓋部Ｃに磁石を当て（３０秒）、洗浄済みの磁性ビーズを回収する。
【００９８】
（８）回転式抽出容器の上下を戻し、開口箇所Ｄが別の小室（Ａ３）に来るように回転部Ｂを回転させた後に、磁石をはずし、磁性ビーズを小室（Ａ３）を移動させる。
【００９９】
（９）小室（Ａ２）において溶菌溶液と磁性ビーズを撹拌混合する。
【０１００】
（１０）回転式抽出容器を逆さにし、蓋部Ｃをヒーターへ入れて所定温度・時間加熱し、菌を溶解する（核酸を抽出する）。
【０１０１】
（１１）蓋部Ｃに磁石を当て磁性ビーズを保持したままで、回転式抽出容器の上下を戻し、溶液を（Ａ３）に戻す。
【０１０２】
（１２）蓋部Ｃをはずし、小室（Ａ３）からマイクロピペット又はスポイト等で核酸抽出液を回収する。または蓋部Ｃに滴下口を開け、滴下口から核酸抽出液を核酸増幅検出用マイクロチップ等に滴下する。滴下口は、小室（Ａ３）など回転式抽出容器のいずれかの箇所に設けることができるが、蓋部Ｃに設けるのが好ましい。蓋部Ｃから滴下することによって、ピペット、スポイトなどの器具および器具操作の省略、操作ミスの軽減、操作の簡便化を図ることができる。例えば溶菌溶液（１００μｌ）のうち一定量（例えば２５μｌ）を滴下すれば、複数回または複数項目の検査を行うことができる。滴下部分は、目薬のような形状が好ましい。目薬のように液滴として溶液を押し出すことができれば、簡便な動作で安定かつ正確に一定量の液を容器から取り出すことが可能である。
【０１０３】
なお、上記の小室（Ａ１）、（Ａ２）及び（Ａ３）は、それぞれ前述の集菌用小室、洗浄用小室、及び再懸濁用小室に相当する。上記実施例のように試料から前記目的物を分離するために、磁性ビーズ、洗浄液、再懸濁液のうち少なくとも一つがいずれかの小室に予め封入されていることが、安全、簡便であることから好ましい。
【０１０４】
また、回転部Ｂは、（Ａ１）→（Ａ２）→（Ａ３）の順に回るようになっており、逆回転しない、かつ回転部Ｂが外れないようにストッパーが付けてあり、蓋部Ｃも一度はめると外れないようにストッパーを付けておくことが好ましい。
【０１０５】
上記の実施形態例から分かるように、一つの回転式抽出容器を密封した状態で、円柱型容器部Ａの各小室（（Ａ１）〜（Ａ３））及び蓋部Ｃのそれぞれにおいて、集菌工程、洗浄工程及び溶菌工程の処理・操作を順々に実施できる。
【０１０６】
なお、本願において、「集菌工程」とは、目的物である菌を集菌溶液から磁性固体支持体に吸着等させることをいう。「集菌溶液」とは、菌を磁性固体支持体に吸着等させるために菌を溶媒に予め溶解して調製した溶液をいう。なお、菌の懸濁液もこれに含めることにする。「洗浄工程」とは、菌を吸着させた磁性固体支持体から、余分な溶媒や試薬等を除去するために洗浄する工程をいう。また、「溶菌工程」とは、磁性固体支持体に吸着等している菌を加熱等により、菌の細胞壁や細胞膜を破壊して核酸を溶媒中に溶出する工程をいう。「溶菌溶液」とは、菌の細胞壁や細胞膜を破壊して核酸を溶出させるための溶液をいう。
【０１０７】
上記回転式抽出容器を使用して核酸等を抽出する際には、上記のように、各種試薬、磁性支持体（磁性ビーズ）等が必要となる。これらの試薬の中には、試料を溶解又は希釈するための溶解液又は希釈液、洗浄液、各種緩衝液なども含まれる。
【０１０８】
なお、核酸を抽出・単離する場合には、各種緩衝液等を必要とするが、例えば、結合緩衝液（集菌溶液等）としては、例えば、酢酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の塩と、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコールとからなる緩衝液が例として挙げられる。また、洗浄緩衝液（洗浄液）としては、上記結合緩衝液を４〜５倍に希釈したものを用いてもよいが、異なる種類の緩衝液を別途用意してもよい。再懸濁液としては、水が好適である。
【０１０９】
好ましい態様の一つとして、上記の、磁性支持体や各種試薬等必要な器材一式を予め回転式抽出容器に封入した態様のキットとしておくことが望ましい。
【０１１０】
以上の実施形態例から分かるように、上記のような回転式抽出容器を使用することにより、従来煩雑な操作や大型で高価な装置等を必要としている生物試料又は生体由来試料からの核酸等の抽出・分離を汚染・バイオハザード等の恐れなく簡易に実施することができる。
【０１１１】
（遺伝子検査方法）
前記回転式抽出容器は、マイクロチップを有する装置で核酸（遺伝子）を増幅し、検出する段階を含む遺伝子検査方法にも好適に使用することができる。すなわち、当該遺伝子検査方法に前記回転式抽出容器を用いることによって、当該方法に必須の抽出・分離（単離）操作を、簡易、迅速、かつ安全に実施することができる。
【０１１２】
本発明に係る遺伝子検査方法を実施するための核酸分析装置として、マイクロチップ形態のものを含んでもよく、これによりハイスループットな分析が可能となる。
【０１１３】
〈核酸分析装置〉
遺伝子検査方法を実施するための核酸分析装置は、マイクロポンプ、マイクロポンプを制御する制御装置、温度を制御する温度制御装置などが一体化された装置本体と、この装置本体に装着可能な核酸増幅検出用マイクロチップとからなる。予め試薬が封入されたマイクロチップの検体受容部に検体液を注入して、そのマイクロチップを核酸分析装置の本体に装着すると、送液ポンプを作動させるための機構的連結、必要であれば制御用の電気的接続もなされる。本体とこのマイクロチップとを接合させると、マイクロチップの流路も作動状態となる。したがって、好ましい態様の一例では、操作が開始されると検体及び試薬類の送液、混合、核酸の増幅、検出などが、一連の連続的工程として自動的に実施される。
【０１１４】
送液、混合、温度の各制御に関わる制御系を受け持つユニットは、マイクロポンプとともに本発明に係る核酸分析装置の本体を構成する。この装置本体は、これに上記マイクロチップを装着することにより検体に対して共通で使用される。上記の液体の混合、送液、核酸の増幅、検出などの工程は、送液順序、容量、タイミングなどについて予め設定された条件として、マイクロポンプ及び温度の制御とともにプログラムとして核酸分析装置に搭載されたソフトウェアに組み込まれている。本発明では脱着可能な上記マイクロチップのみ交換すればよい。本発明に係る核酸分析装置は、いずれのコンポーネントも小型化され、持ち運びに便利な形態としているために、使用する場所及び時間に制約されず、作業性、操作性が良好である。送液に使用する多数のマイクロポンプユニットが装置本体側に組み込まれているので、マイクロチップはディスポーザブルタイプとして使用できる。
【０１１５】
〈核酸増幅検出用のマイクロチップ、マイクロポンプ及びポンプの接続部〉
核酸増幅検出用マイクロチップの好ましい態様の一例として、図５に掲げる実施形態を説明する。検体受容部６、試薬収容部４について、これらの収容部の内容液を送液するマイクロポンプが設けられている。マイクロポンプは、ポンプ接続部１を介して試薬収容部４の上流側に接続され、マイクロポンプにより駆動液を試薬収容部側へ供給することによって、試薬を流路へ押し出して送液している。マイクロポンプユニットは、核酸増幅検出用マイクロチップとは別途の核酸分析装置本体に組み込まれており、マイクロチップを核酸分析装置本体に装着することによって、ポンプ接続部１からマイクロチップに接続されるようになっている。
【０１１６】
本実施形態では、マイクロポンプとしてピエゾポンプを用いる。すなわち、流路抵抗が差圧に応じて変化する第一流路と、差圧の変化に対する流路抵抗の変化の割合が該第一流路よりも小さい第二流路と、該第一流路及び該第二流路に接続された加圧室と、該加圧室の内部の圧力を変化させるためのアクチュエータとを備えたピエゾポンプである。その詳細は、特開２００１−３２２０９９号公報、特開２００４−１０８２８５号公報に記載されている。
【０１１７】
上記核酸分析装置用として用いられる核酸増幅検出用チップについては、好ましい態様の一例について、以下に記載する。その態様のマイクロチップは、少なくとも検体液受容部６、試薬収容部４、廃液貯留部、マイクロポンプ接続部１及び微細流路３を有し、各部を微細流路で連通させている。検体液（単離された核酸を含有する液）５を、検体受容部下流に設けられた核酸増幅部位を構成する流路、次いで増幅された核酸を検出する部位を構成する流路へ流して、試薬収容部４の試薬７と混合することによって核酸を分析するとともに、その結果、生じる廃液を該廃液貯留部へ移して閉じ込めることを特徴とするマイクロチップである。更に各収容部、流路、ポンプ接続部に加えて、送液制御部、逆流防止部、試薬定量部、混合部などの各エレメントが、機能的に適当な位置に微細加工技術により設置されている。
【０１１８】
次に、マイクロチップの好ましい態様の例を示す。核酸増幅検出用のマイクロチップは、プラスチック樹脂、ガラス、シリコン、セラミックスなどの１以上の部材を適宜組み合わせて作製される一枚のマイクロチップである。その縦横のサイズは、通常、数１０ｍｍぐらい、高さが数ｍｍ程度である。好ましくは、マイクロチップの微細流路及び躯体は、加工成形が容易で安価であり、焼却廃棄が容易なプラスチック樹脂で形成される。なかでもポリプロピレンなどのポリオレフィンやポリスチレンの樹脂は成型性に優れるために望ましい。微細流路は、微細加工技術によりその幅及び高さが、約１０〜数１００μｍのサイズ、例えば幅１００μｍ、深さ１００μｍ程度に形成される。
【０１１９】
〈核酸の増幅及び検出〉
本発明の前処理方法を用いて単離された核酸は、核酸増幅検出用マイクロチップの核酸増幅部位で増幅され、次いで増幅された核酸が該マイクロチップの検出部位に送られて核酸（遺伝子）の検出が行われる。核酸の増幅は、上記のようにＰＣＲ、ＳＤＡ、ＬＣＲ、ＩＣＡＮ、ＬＡＭＰ、ＴＭＡ、ＴＡＳ、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡなどのＤＮＡ増幅法により増幅する。増幅された核酸の分析を常法、例えばハイブリダイゼーション法、金コロイド吸着法などにより行う。
【０１２０】
上記マイクロチップ及び核酸分析装置の全体又は一部についても、構造、構成、配置、形状形態、寸法、材質、方式、方法などを本発明の趣旨に合致する限り、種々のものにすることができる。
【０１２１】
なお、上記回転式抽出容器は、前述の自動核酸抽出装置として上記核酸分析装置に組み込み、核酸の分析に必要な一連の操作を最初から最後まで自動的に行うことができる。これにより汚染・バイオハザード等の恐れなく一層簡易に実施することができる。
【実施例】
【０１２２】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。
【０１２３】
クラミジア陽性尿７００μｌを５ｍｌシリンジで吸い上げ、シリンジを５μｍフィルターに接続し、シリンジを押し出して５μｍフィルターでろ過し、チューブに回収する。ＢＵＧＳ’ｎ  ＢＥＡＤＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｕの取扱説明書の使用方法（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｓａｍｐｌｅｓ）を参照し、磁性固体支持体（磁性ビーズ）分散液Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｅａｄｓ  ３０μｌ入り１ｍｌシリンジでＢ＆Ｗ  ｂｕｆｆｅｒ  ２００μｌを吸い上げる。Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｅａｄｓ  ３０μｌ入り５ｍｌシリンジでＢ＆Ｗ  ｂｕｆｆｅｒ  ２００μｌ、ろ過後の尿１．５ｍｌを吸い上げる。２本のシリンジにキャップをして同時に撹拌、混合する。１５分間、放置する。Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｅａｄｓ  ３０μｌとＢ＆Ｗ  ｂｕｆｆｅｒ  ２００μｌ入りシリンジのキャップを外して０．２μｍフィルターに接続、シリンジを押し出して０．２２μｍフィルター（以下、フィルターＡと記載する。）でろ過、廃液する。Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｅａｄｓ  ３０μｌとＢ＆Ｗ  ｂｕｆｆｅｒ  ２００μｌとろ過後の尿１．５ｍｌ入りシリンジのキャップを外してフィルターＡに接続、フィルターＡの右側に磁石を当てながら、シリンジを左側に傾けて押し出し、フィルターＡでろ過、廃液する。溶菌液ＰＯＷＥＲｌｙｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５０μｌ入りシリンジのキャップを外してフィルターＡに接続し、磁石を当てずに軽く振って、磁性固体支持体（磁性ビーズ）をＰＯＷＥＲｌｙｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに接触させる。フィルターＡの右側に磁石を当てながら、シリンジを左側に傾けて押し出し、フィルターＡでろ過、チューブに回収する。エタノール１５０μｌ入りシリンジのキャップを外して、チューブに回収した液５０μｌ（ＰＯＷＥＲｌｙｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を吸い上げる。シリンジにフィルターＡを接続し、磁石を当てずに軽く振って、磁性固体支持体（磁性ビーズ）をＰＯＷＥＲｌｙｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎとエタノールから成る混合液に接触させる。混合液がフィルターＡに接触した状態で、室温で５分、放置する。フィルターＡの右側に磁石を当てながら、シリンジを左側に傾けて押し出し、混合液をフィルターＡでろ過、廃液する。７０％エタノール１ｍｌ入りシリンジのキャップを外してフィルターＡに接続し、磁石を当てずに軽く振って、磁性固体支持体（磁性ビーズ）を７０％エタノールに接触させる。フィルターＡの右側に磁石を当てながら、シリンジを左側に傾けて押し出し、フィルターＡでろ過、廃液する。滅菌水５０μｌ入りシリンジのキャップを外してフィルターＡに接続し、磁石を当てずに軽く振って、磁性固体支持体（磁性ビーズ）を滅菌水に接触させる。フィルターＡの右側に磁石を当てながら、シリンジを左側に傾けて押し出し、フィルターＡでろ過、チューブに回収する。チューブに回収したＤＮＡ溶出液を８５℃で１０分間、加熱し、エタノールを揮発する。
【０１２４】
Ｒｏｃｈｅ社の性感染症検査キット（コバスアンプリコア  ＳＴＤ−１）を用いて取り扱い説明書の操作方法に従い、増幅検出試薬アンプリミックス  ５０μｌをＤＮＡ溶液  ５０μｌに添加し、全自動ＰＣＲ測定装置コバスアンプリコアで増幅、検出し、クラミジアの核酸抽出を確認した。
【０１２５】
上記実施例及び前記の詳細な説明から分かるように、本発明の手段により、磁性固体支持体及び磁性固体支持体に結合した菌および核酸などが原因で起こる目詰まりを抑制して円滑なフィルターろ過を可能とし、迅速、正確で高収率、かつ密閉系で液滴の飛散、コンタミネーションなどを起こすことなく、簡便・安全に、喀痰や尿から菌由等の生体由来の核酸を単離することが可能な核酸単離方法を提供することができる。また、本発明の単離方法により菌を処理して核酸（遺伝子）を抽出し、当該核酸（遺伝子）を特異的に増幅し検出する遺伝子検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】核酸単離器具の一例を示す概念図
【図２】回転式抽出容器の構成を示す概念図
【図３】核酸単離方法の一例を示す概念図
【図４】抽出液等の滴下方法の一例を示す概念図
【図５】核酸増幅検出用マイクロチップの一例を示す概念図
【符号の説明】
【０１２７】
Ａ  円柱型容器部
Ａ１、Ａ２、Ａ３  小室
Ｂ  回転部
Ｃ  蓋部Ｃ
Ｄ  開口箇所
１  マイクロポンプ接続部
２  送液制御部
３  微細流路
４  試薬収容部
５  検体液（単離された核酸を含有する液）
６  検体液受容部
７  試薬
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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