(57)【要約】【課題】本発明は、反応液に対して加熱、冷却を繰り返す温度サイクルを印加する方法に関するものであり、迅速に加熱冷却する方法を提供するものである。特に、PCR法による核酸増幅反応に好適な温度サイクル印加法を提供することにある。【解決手段】溶液を加熱する加熱工程と冷却する冷却工程を繰り返すことによる温度サイクル印加方法であって、溶液に金属体を配置し、加熱工程において金属体に対して電磁誘導加熱を行い、冷却工程においては金属体を前記溶液外に移動させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液を加熱する加熱工程と冷却する冷却工程を繰り返すことによる温度サイクル印加方法であって
前記加熱工程では、前記溶液中に予め配置した金属体に対する電磁誘電加熱を行い、
前記冷却工程では、前記溶液中の加熱された金属体を該溶液外に移動させる
ことを特徴とする温度サイクル印加方法。
【請求項２】
前記容器への加熱および冷却の少なくとも一方を更に行う請求項１記載の温度サイクル印加方法。
【請求項３】
前記冷却工程において前記溶液外に移動した前記金属体を電磁誘導加熱しておき、次の加熱工程において用いる請求項１または２に記載の温度サイクル印加方法。
【請求項４】
前記冷却工程が、冷却用固体の前記溶液への投入による温度降下を含み、次の加熱工程において該冷却用固体を該溶液外に移動させる請求項１から３の何れかに記載の温度サイクル印加方法。
【請求項５】
前記金属体及び前記冷却用固体の少なくとも一方が磁性粒子であり、前記容器外からの磁力によって該磁性粒子を移動させる請求項１から請求項４の何れかに記載の温度サイクル印加方法。
【請求項６】
前記溶液がPCR法による核酸増幅反応に必要な試薬及び核酸を含み、前記温度サイクルが核酸増幅のための温度サイクルである請求項１から５の何れかに記載の温度サイクル印加方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度サイクルを利用した反応を行う溶液に対して、所望とする温度サイクルを印加する方法に関する。特に、PCR法による核酸増幅反応に好適な温度サイクル印加方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムシーケンスプロジェクトの進展に伴って、ゲノム上の特定遺伝子の検出、SNPS解析、発現解析等がポストゲノムの課題として注目されている。そういった中で、最近の医療、分子生物学の分野では、収集した検体から微量な標的核酸を増幅、検出する必要性が大きくなってきている。
【０００３】
核酸の増幅方法としては、PCR（Polymerase Chain Reaction）法が一般的に用いられている（特許文献１〜３参照。）。PCR法とは、増幅させたいDNA領域を挟む2種類のプライマーを用いてDNAポリメラーゼによるDNA合成反応を繰り返すことによって、目的とするDNA断片を短時間で数10万から100万倍以上に増幅させる方法である。より詳しくは、標的核酸、プライマー、DNAポリメラーゼ、各種バッファー、塩類等を含んだ反応液を、９５℃程度にすることによってDNAの2本鎖を１本鎖に乖離させる。その後６５℃程度にすることにより標的配列とプリマーを結合させ、７０℃程度にすることでDNAポリメラーゼによってプライマーから標的核酸を鋳型としたDNA合成反応が進む。この温度サイクルを２０〜４０回程度繰り返すことによって、標的核酸が３０分〜数時間で数百万倍にまで増幅する。従ってPCR法は、原理的には、DNAが１コピーあれば、これを増幅させて極めて多数個になし得る方法である。
【０００４】
PCR反応に用いられるPCR装置では、加熱及び冷却時において制御する温度勾配が極めて大きい。加熱時においては、例えば、１分間で４０℃程度から９０℃程度まで、急速に温度上昇させる必要がある。さらに、時間経過に応じて温度が変化する変温パターンに従って、高精度及び安定に温度制御する必要がある。そのため、通常、専用の加熱冷却装置を用いている。このような装置として、反応用のエッペンドルフ型サンプルチューブを挿入するためのウェルが設けられたアルミ製のブロックの温度をヒーターと冷却器を用いて制御する装置が知られている。この装置の具体例としては、DNA Thermal Cycler（Perkin-Elmer Cetus Instruments)がある。また、異なる温度部位を持つ流路に反応液を流し、流路内でPCRを行う方法も提案されている。（特許文献４）
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号
【特許文献３】米国特許第４９６５１８８号
【特許文献４】特開平６−３０７７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、ヒートブロックを用いた装置においては、ヒートブロックの温度を変化させ始めてからサンプルチューブ内の反応液の温度が目的温度に到達するまでに１０ないし３０秒程度の遅れがあった。このため、この様な時間的遅れによって、酵素が失活したり、非特異な増幅産物が生成され、その結果増幅効率が低下してしまう場合がある。そこで、加熱冷却手段として、電源極性の切換により加熱側と冷却側に容易に切換可能で比較的大きい温度勾配にも対応可能なペルチェ素子を用いることが多い。しかし、ペルチェ素子を用いたとしても、溶液外から加熱または冷却を行うために、溶液の温度追従性が悪く、液温の温度制御が不安定で過加熱や過冷却が起こり、高精度で安定した温度制御を実現できない場合がある。
【０００６】
流路によるPCR方法のおいても、反応系を流しながら所定の温度まで加熱冷却を制御することが困難な場合がある。また、流路設計時点で温度サイクルがある程度固定されてしまい、温度サイクルの自由な変更が困難な場合がある。特に大容量の検体を処理する場合には、反応液全体を加熱または冷却する時間が長くなり、より一層効率が低下してしまう。
【０００７】
本発明の目的は、これらの課題を克服し、温度サイクルを印加する反応において、短時間での加熱冷却を可能とし、反応効率を向上させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するため本発明は、温度上昇と温度降下を繰り返す温度サイクルを容器内の溶液に印加する温度サイクル印加方法において、
前記加熱工程では、前記溶液中に予め配置した金属体に対する電磁誘電加熱を行い、
前記冷却工程では、前記溶液中の加熱された金属体を該溶液外に移動させる
ことを特徴とする温度サイクル印加方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の温度サイクル印加方法により、反応液を迅速に加熱または冷却することが可能となる。ひいては、PCR反応において、所望の温度への到達時間が短くなり、酵素の失活や非特異産物の生成の少なくなり、高効率な反応が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明にかかる温度サイクルの印加方法における加熱工程には、少なくとも、溶液中に配置した金属体に対する電磁誘電加熱が用いられる。金属体の電磁誘電加熱に加えて、溶液の容器を加熱するヒーターなどの加熱手段を追加的に用いて、冷却効率の向上や温度上昇の更に詳細な制御を行うこともできる。また、容器を冷却する手段、例えば、冷媒体（容器内の溶液よりも低い温度の媒体）を容器と温度交換可能に接触させる手段やペルチェ素子などの温度制御手段を更に設けても良い。あるいは、溶液の温度よりも低い温度の冷却用固体を溶液中に投入することで冷却効率の向上や温度効果の更に詳細な制御を行うこともできる。容器の冷却手段及び冷却用固体はこれらを併用してもよい。冷却用固体は溶液外に移動させるようにしてもよい。
【００１１】
また、冷却工程は、溶液中にある電磁誘電加熱された金属体を溶液外に移動させることにより行われる。更に、容器を冷却する冷却手段を設けて、容器内の溶液の温度降下を効率よく行うようにしてもよい。この容器の冷却手段としては、冷媒体を容器と温度交換可能に接触させる手段が好適に利用できる。
【００１２】
加熱工程における加熱効率を向上させる上で、冷却工程中に溶液外に移動させた金属体を電磁誘導加熱しておき、次の加熱工程において用いることもできる。
【００１３】
加熱工程に用いる金属体及び冷却用固体の少なくとも一方を磁性粒子とすることで、容器外からの磁力によってこれらの移動の制御が容易となる。
【００１４】
以下、本発明に係わる温度サイクル印加方法の具体的な実施の形態を説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１５】
本発明が利用される主な分野としては、生体由来物質から抽出したDNA等を標的核酸としたPCR法による核酸増幅処理であるが、これに限定されるものではない。すなわち、温度サイクルを利用して溶液中での反応や各種処理を行う場合に本発明は好適に利用可能である。
【００１６】
PCR法とは、PCR反応液に対して加熱と冷却を繰り返して行って温度サイクルをかけることが基本となる。一般的なPCR反応液は、PCR用の試薬として、pH緩衝用バッファー、塩類、プライマー、dNTP等の基質及びDNAポリメラーゼを含むものである。さらに、界面活性剤やゼラチン等を含む場合もある。
【００１７】
pH緩衝用バッファーとしては、Tris-HCl等の10mMから100mM程度の濃度のものが好適に使用される。pHは8〜9付近に調整することが多い。DNAポリメラーゼは、Taq DNA Polimerase等が使用可能であるが、増幅対象や増幅反応を勘案して適宜選択する。さらに、DNAポリメラーゼに各種抗体を付加して不活性化しておき、PCRの1回目の加熱工程で抗体を乖離させてDNAポリメラーゼを活性化する方法等もあるので、適宜反応条件も含めて選択する。通常１反応に0.5〜2.5単位のDNAポリメラーゼを加える。塩ではMgCl2が好適に用いられ、通常1.5mM程度の濃度で添加されるが、増幅対象等によって最適化して使用する場合が多い。
【００１８】
温度サイクルは、標的核酸である2本鎖DNAを１本鎖に乖離する工程（熱変性）、前記１本鎖とプライマーを結合させる工程（アニーリング）、プライマーからDNAを合成させる工程（伸長）の繰り返しである。熱変性工程は一般的には95℃程度で行い、20〜60秒程度行うことが多い。アニーリング工程はプライマーの構成によって異なるが、通常は50〜65℃程度で、10〜90秒程度である。伸長工程は選択したDNAポリメラーゼによって異なるが、概ね72℃程度であり、10〜60秒程度が一般的である。このようなサイクル以外にも、アニール工程と伸長工程を同一温度で行う場合もある。また、上記温度サイクルの前後に補助的な温度条件を与える場合もある。
【００１９】
図１は本発明の温度サイクル印加方法をPCR法に適用する場合の好適なシステムの一例を示す模式図である。図１に示すシステムは、反応液１０２を入れる反応容器１０１、反応容器１０１を加熱するためのヒートブロック１０６、金属体１０３、コイル１０４と交流電源１０５を有する磁場印加手段、金属体１０３の位置制御のための磁石１０７を有する。
【００２０】
反応容器１０１の素材は問わないが、一般的に樹脂製の使い捨てチューブが使用される。目的によって、チューブ内壁への核酸吸着を防ぐ表面処理をしたものや、熱伝導性を考慮した形状の物でも良い。
【００２１】
本発明の特徴の一つは電磁誘導加熱を受けるための金属体１０３を用いる点にある。
【００２２】
電磁誘導加熱方式の原理を図５に示す。コイル５１５（加熱コイルや誘導コイル、誘導子と呼ばれる）の近傍にワーク５１７を置き、加熱コイル５１５に交流電源５１６から交流電流を流す。この電流により発生する交番磁界が、ワーク５１７中に誘導電流（渦電流）を発生させ、この渦電流によりワーク５１７にジュール熱が発生してワーク５１７自身が発熱し、加熱が行われるものである。この方式は温度制御の応答性がよく、熱効率が優れていることで知られている。
【００２３】
本発明で用いるシステムにおいては金属体１０３がワークにあたる。金属体１０３の素材は、鉄やステンレスなどのある程度電気抵抗が大きな金属が好適である。電磁誘導加熱が可能であり、反応に対して不活性であれば、それ以外の金属も使用可能である。セラミック等の不導体に金属体をコーティングした構成を有する複合構造体の有する金属体も利用可能である。金属体の形状に制限はなく、反応溶液１０１に入るものであれば良い。電磁誘導加熱では、照射周波数にもよるが、ワーク表層が最も加熱されやすいので、表面積が大きな形状が優利で効率的に加熱できる。さらに、金属体の表面積が大きい方が、金属体から溶液への熱移動の効率も良い。金属体の大きさに特に制限はないが、あまり大きいと体積に対する表面積が小さいので、１μｍ〜1ｍｍ程度が望ましい。
【００２４】
反応容器内の金属体の位置制御方法に特に限定はなく、フィルタレーションによる位置制御等が可能である。また、金属体１０３に磁性体を使用することにより、反応容器１０１の外から、位置制御磁石１０７を使用して金属体１０３の位置を制御する構成も可能である。さらに、金属体１０３に対して、BSAのような核酸の吸着をブロックするような物質や、逆にシリカのような一定条件下で核酸を吸着するような物質で表面被覆することも可能である。
【００２５】
加熱コイル１０４により、金属体１０３に対して高周波磁場を与えて電磁誘導加熱を行う。加熱コイル１０４は銅などの電気抵抗の低い素材で作られており、必要に応じて冷却機構をもつ。コイルの巻き数や、形状は、加熱する金属体の形状や大きさ、位置等を勘案して適宜選択する。
【００２６】
コイル１０４に対して、交流電源１０５を用いて交流電流を流す。数kHzから数百kHz程度の周波数の交流電流を発生させられるものを使用すれば良い。出力は、加熱する容量に対して適宜選択する。
【００２７】
反応容器１０１の加熱手段としては、少なくとも上述した電磁誘導加熱が用いられるが、反応容器１０１を加熱する手段を別途も設けることもできる。図１のシステムでは、反応容器１０１の温度を制御するヒートブロック１０６が設けられている。ヒートブロック１０６には、一般的なPCR反応に用いられる、熱応答性の高いペルチェ素子を用いたヒートブロックが好適である。反応溶液１０２の温度は、ヒートブロックの温度をモニターすることによって制御しても良いが、より正確な温度制御が必要な場合には、赤外線センサーや熱伝対等を用いて、直接液温を測定して制御する構成がより好ましい。
【００２８】
図２は本発明の形態の他例である。反応容器２０１、反応液２０２、金属体２０３は、図１に示したものと同じである。本例では、ヒートブロック２０６と反応容器２０１の接触面積が大きく、ヒートブロック２０６の外側に加熱コイル２０４を配置している。ヒートブロック２０６に使用する素材をアルミニウム等にしておき、印加する周波数を選択することで、溶液内の金属体２０３の誘導加熱が可能である。ヒートブロック２０６と反応容器２０１の接触面積が大きいので、冷却時にヒートブロック２０６からの冷却効率が良い。また、加熱時には金属体２０３と同時にヒートブロック２０６も加熱されるので、反応容器２０１の内外から同時に加熱できる。
【００２９】
図１および図４を用いて、本発明の温度サイクル印加方法を用いたPCR反応の流れを示す。なお、本例でのPCR反応は９２℃と６５℃を繰り返す温度サイクルとする。まず、PCR反応溶液を反応容器１０１に注入して密閉し、図１に示すようにヒートブロック１０６にセットする。容器内の気相部分には空気が入っており、反応中は容器内は密閉される。位置制御磁石１０７を反応容器１０１の底部へ配置し、反応容器１０１内部の金属体１０３を反応容器１０１の底部に集める。ヒートブロック１０６を加熱すると同時に、高周波電源１０５を用いて加熱コイル１０４に交流電流を通電し、金属体１０３を誘導加熱する。反応液１０２が９２℃まで加熱されると、交流電流の印加を停止し、ヒートブロック１０６により液温を維持する。なお、加熱方式としては、誘導加熱のみで加熱して、そのまま温度を維持する構成としてもよい。更に、ヒートブロックでの加熱と、金属体の電磁誘導加熱の両方を同時開始し、所定温度に到達し、更に、ヒートブロックによる加熱により所定温度の維持が可能となった段階で、電磁誘導加熱を停止することが更に好ましい。
【００３０】
一定時間温度を維持した後、ヒートブロック４０６を冷却手段（不図示）で冷却すると同時に、図４に示すように位置制御磁石４０７を反応容器４０１の上方に移動させる。金属体４０３の移動位置は反応容器４０１の上方の溶液４０２外とする。このように、金属体４０３を溶液４０２外に移動させることにより、冷却する熱容量が小さくなり、反応溶液４０２を迅速に冷却することが可能となる。ヒートブロック４０６により、液温を６５℃に維持する。次の加熱工程においては図１で図示するように、位置制御磁石１０７を反応容器１０１の底部への配置し、金属体１０３を反応容器１０１の底部に集め、ヒートブロック１０６を加熱すると同時に金属体１０３を誘導加熱する。以上の加熱工程による温度上昇及び冷却工程による温度降下のサイクルを指定されたサイクル数で繰り返す。
【００３１】
位置制御磁石の位置移動には、位置制御磁石を保持する保持手段をガイドに沿って位置制御可能に移動させることを可能とする各種の機構が利用できる。
【００３２】
なお、図１及び図４に示したシステムにおいては、少なくとも、ヒートブロックと、加熱コイル及び交流電源を有する磁場印加手段と、磁石とを用いて温度サイクル印加装置を構成することができる。
【００３３】
次に、本発明のもう一つの実施の形態および流れを、図３を用いて説明する。図３のＡ)は、金属体による誘導加熱と、冷却用固体による冷却を行うシステムを示している。このシステムでは、反応容器３０１は、その上部に加熱部位３０８と冷却部位３１２を具備している。加熱部位３０８には、第二加熱コイル３０９と第二交流電源３１０を具備し、加熱部位３０８で誘導加熱することができる。冷却部位３１２には、ヒートブロック３１３を具備し、所望の温度まで冷却することが可能となっている。３０３が加熱用の金属体であり、３１１が冷却用固体である。金属体３０３は図１に示したものと同じである。冷却用固体３１１は熱容量が大きい物質が好ましく、金属以外でもセラミックやガラス等が使用可能であるが、磁性物質で表面処理しておくと磁場により外部からの位置制御が可能である。金属体３０３の移動は位置制御用磁石３０７により行われる。冷却用固体３１１の移動は第二の位置制御用磁石３１４により行われる。本例においても、図１に示したシステムと同じように、加熱コイル３０４、交流電源３０５により反応液３０２中の金属体３０３を加熱可能である。また、ヒートブロック３０６も具備しており、反応溶液３０１の加熱冷却が可能である。
【００３４】
次に、図３のＡ）、Ｂ）、Ｃ）、Ｄ）、Ｅ）を用いて本例での実施の流れを説明する。本例でも９２℃、６５℃の2温度のPCR反応とする。まず図３のＡ）が加熱時の構成を示している。金属体３０３は位置制御磁石３０７によって、反応容器３０１の底部に配置されている。この状態でヒートブロック３０６を加熱すると同時に、交流電源３０５を用いて加熱コイル３０４に交流電流を通電し、金属体３０３を誘導加熱する。反応溶液３０２が９２℃程度に加熱された段階で、交流電流を停止し、誘導加熱を停止する。ヒートブロックによって、指定された時間温度を維持する。その後の冷却工程では、ヒートブロック３０６で反応溶液３０２を冷却すると同時に、位置制御磁石３０７をＢ）の３０７−２に移動させ、金属体３０３を加熱部位３０８に移動する。代わって、第二の位置制御磁石３１４をＣ）の３１４−２の位置に移動し、冷却部位３１２において第二のヒートブロック３１３で６５℃以下に冷却していた冷却用固体３１１を反応溶液３０２内に投入する。冷却用固体３１１によって反応溶液３０２は急激に冷却され、迅速な冷却が可能となる。この冷却工程の間にも、金属体３０３は加熱部位３０８において第二の加熱コイル３０９によって加熱されている。次の加熱工程においては、ヒートブロック３０６を加熱すると同時に、図Ｄ）のように第二の位置制御磁石３１４を冷却部位３１２の上部に移動し、冷却用固体３１１を冷却部位３１２に移動させる。同時に図Ｅ）のように、位置制御用磁石３０７を反応容器３０１の底部に移動させ、加熱部位３０８において加熱されていた金属体３０３を反応溶液３０２内に投入する。交流電源３０５を用いて加熱コイル３０４に交流電流を流し、金属体３０３を誘導加熱し、反応溶液３０２を９５℃まで加熱する。このような工程を指定サイクル数繰り返す。
【実施例】
【００３５】
以下に本発明の温度サイクル印加方法の実施例を示すが、以下の実施例で本発明の内容が限定されるものではない。
（実施例１）
まず、細菌ゲノム中に存在する標的核酸配列の両端配列に相補な２種の22merプライマーを設計した。そして、公知の技術を用いてプライマーを合成した。
【００３６】
PCR溶液の組成として、PCRバッファー（Applied Biosystems社製）、2.5mM MgCl2、1mM dNTP（dATP、dCTP、dUTP、dGTP混合物）、2単位AmpliTaq Gold（Applied Biosystems社製）、前記プライマー濃度を各0.5μMとし、標的核酸配列が10000コピー程度含まれる細菌核酸抽出物2μlを含め、液量は１００μlとした。
【００３７】
温度サイクルは、ディネーチャ工程９２℃―１５秒、アニーリング工程を６２℃―２０秒、エクステンション７２℃―２０秒、サイクル数３０回とした。
【００３８】
金属体として、直径１ｍｍの磁性ステンレス球を使用した。金属体は、あらかじめ洗浄、DNAse処理を行って、汚染物質を除去した。
【００３９】
前記溶液および前記金属体5個を、直径５ｍｍ、高さ２ｃｍの樹脂製円筒形容器に投入し、図１に示す構成を有する装置にセットした。装置には、ペルチェ素子で温度制御可能なヒートブロックを有し、０〜１００℃の範囲で所望の温度に制御可能である。加熱コイルは、容器中心軸に対して同心円状に巻く状態に配置し、交流電源としては、20kHz出力が可能な高周波電源を使用した。
【００４０】
位置制御磁石を容器底部に移動し、金属体を容器底部に移動させた。
【００４１】
ヒートブロックを加熱すると同時に、加熱コイルに周波数２０kHz、１００Wの電力を５秒間印加した。反応液の温度が９２℃に達し、その後はヒートブロックによって温度を５分間維持し、ディネーチャ工程を行った。
【００４２】
次に、ヒートブロックを急冷すると同時に、位置制御磁石を上方に移動して金属体を溶液外に移動させた。反応液の温度が６２℃に達した後は、ヒートブロックによって温度を２０秒間維持し、アニーリング工程を行った。
【００４３】
次に、ヒートブロックを加熱すると同時に、加熱コイルに周波数２０kHz、１００Wの電力を１秒間印加した。反応液の温度が７２℃に達した後は、ヒートブロックによって温度を２０秒間維持し、エクステンション工程を行った。
【００４４】
次に、ヒートブロックを加熱すると同時に、加熱コイルに周波数２０kHz、１００Wの電力を２秒間印加した。反応液の温度が９２℃に達した後は、ヒートブロックによって温度を２０秒間維持し、ディネーチャ工程を行った。
【００４５】
これら、ディネーチャ、アニーリング、エクステンション工程を３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間維持して反応を終了した。総反応時間は５５分であった。
【００４６】
同じ検体に対して、同様の操作を５回行った。反応後、BioAnalyzer（Agilent社製）を用いて、電気泳動法による核酸の存在確認を行った。電気泳動の結果を図６に示す。図中、(a)〜(e)が増幅産物を示す結果である。図から明らかなように、本発明の方法による５回の増幅では全て特定の大きさの増幅産物が大量に生成されていることが分かる。
【００４７】
（比較例１）
実施例１と同様の反応液を市販の微量遠心管に入れ、市販のPCR装置（Biometra社製 T3000）を用いて同様の温度サイクルでPCRを行った。総反応時間は６５分であった。同じ検体に対して、同様の操作を５回行った。反応後、BioAnalyzer（Agilent社製）を用いて、電気泳動法による核酸の存在確認を行った。電気泳動の結果を図７に示す。図中、(a)〜(e)が増幅産物を示す結果である。また、実施例１と比較例１の所望増幅産物の平均濃度を以下の表に示す。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
図および表から明らかなように、実施例１では比較例１の結果と比較して増幅産物の量が多く、効率が良かった。また、比較例では所望の増幅産物長以外のピークが確認でき、非特異的な増幅産物が出来ていることが分かる。このように、本発明の方法を用いると、反応効率が向上し、反応時間の短縮、非特異産物の発生防止が可能である。
【００５０】
（実施例２）
次に、本発明のもう一つの実施例を説明する。本例は図３のような装置を用いて、実施例１と同様のPCR反応を行う例を示す。まず、実施例１と同様に、PCR反応溶液を準備した。反応溶液を図３に示す構成の反応容器に投入した。
【００５１】
金属体は実施例１と同様に磁性ステンレスの直径１ｍｍの球とし、冷却用固体も磁性ステンレスの直径１ｍｍの球とした。反応溶液に金属体を投入し、位置制御磁石で容器の底部に配置させた。その後、容器の冷却部位に第二の位置制御磁石を位置させた状態で冷却用固体を冷却部位に投入し、冷却部位に配置させた。この状態で、冷却部位の第二ヒートブロックを１０℃にセットしておく。
【００５２】
ヒートブロックを加熱すると同時に、加熱コイルに周波数２０kHz、１００Wの電力を５秒間印加した。反応液の温度が９２℃に達した後は、ヒートブロックによって温度を５分間維持し、ディネーチャ工程を行った。
【００５３】
次に、ヒートブロックを急冷すると同時に、位置制御磁石を上方の加熱部位側に移動して金属体を加熱部位に移動させた。さらに、冷却部位において１０℃に冷却されていた冷却用固体を第二の位置制御磁石を用いて溶液内に投入した。反応液の温度が６２℃に達した後は、ヒートブロックによって温度を２０秒間維持し、アニーリング工程を行った。アニーリング工程の間に、第二の加熱コイルを用いて1秒間隔で高周波磁場を照射し、加熱部位に配置した金属体を９５℃に保温した。
【００５４】
次に、ヒートブロックを加熱すると同時に、第二位置制御磁石を上方の冷却部位に移動して冷却用個体を冷却部位に移動させ、位置制御磁石を用いて加熱部位にある金属体を溶液底部に移動させた。さらに、加熱コイルに周波数２０kHz、１００Wの電力を１秒間印加した。反応液の温度が７２℃に達した後は、ヒートブロックによって温度を２０秒間維持し、エクステンション工程を行った。エクステンション工程においても、冷却部位の第二ヒートブロックによって冷却用固体を１０℃に維持した。
【００５５】
次に、ヒートブロックを加熱すると同時に、加熱コイルに周波数２０kHz、１００Wの電力を２秒間印加した。反応液の温度が９２℃に達した後は、ヒートブロックによって温度を２０秒間維持し、ディネーチャ工程を行った。ディネーチャ工程においても、冷却部位の第二ヒートブロックによって冷却用固体を１０℃に維持した。
【００５６】
これら、ディネーチャ、アニーリング、エクステンション工程を３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間維持して反応を終了した。総反応時間は５０分であった。
【００５７】
同じ検体に対して、同様の操作を５回行った。反応後、BioAnalyzer（Agilent社製）を用いて、電気泳動法による核酸の存在確認を行った。電気泳動の結果を図８に示す。図中、(a)〜(e)が増幅産物を示す結果である。図から明らかなように、本発明の方法による５回の増幅では全て特定の大きさの増幅産物が大量に生成されていることが分かる。増幅産物の平均濃度を実施例１および比較例１と比較する表を以下に示す。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
これら実施例及び比較例の結果から、本発明の方法によれば、大容量であっても効率良く特異的なPCR反応が可能となることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の方法の好適な構成の模式図である。
【図２】本発明の方法の好適な構成の模式図である。
【図３】本発明の方法の好適な構成および流れを示す模式図である。
【図４】本発明の方法の流れを示す模式図である。
【図５】誘導加熱の構成を示す模式図である。
【図６】実施例１の結果を示す図である。
【図７】比較例１の結果を示す図である。
【図８】実施例２の結果を示す図である。
【符号の説明】
【００６１】
１０１、２０１、３０１、４０１  反応容器
１０２、２０２、３０２、４０２  反応溶液
１０３、２０３、３０３、４０３  金属体
１０４、２０４、３０４、４０４  加熱コイル
１０５、２０５、３０５、４０５  交流電源
１０６、２０６、３０６、４０６  ヒートブロック
１０７、２０７、３０７、４０７  位置制御磁石
３０８  加熱部位
３０９  第二加熱コイル
３１０  第二交流電源
３１１  冷却用固体
３１２  冷却部位
３１３  第二ヒートブロック
３１４  第二位置制御磁石
５１５  コイル
５１６  交流電源
５１７  ワーク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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