(57)【要約】【課題】ハイブリダイゼーション反応後、ミスマッチ結合部位を排除し、さらにミスマッチ結合を生じていた箇所を標識することで検出感度および精度を向上させる方法を提供すること。【解決手段】一塩基多型の野生型を検出するためのプローブと変異型を検出するためのプローブとを担体上に固定し、これに第１の標識物質で標識した検体を反応させ、第１の標識物質に由来する信号によりハイブリッド体の形成が検出された場合に、更に１塩基ミスマッチのハイブリッド体の有無を、１塩基ミスマッチ部位を選択的に解裂させ、さらにその３´末端側を解離させた後、残された相補鎖を鋳型として一本鎖を伸展させ、伸展部分に取り込ませた第２の標識物質を利用して検出することで、より正確な一塩基多型の検出が可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸における一塩基多型の検出方法であって、
（ｉ）野生型が有する塩基配列部分に対して相補的な第１のプローブおよび変異型が有する塩基配列部分に対して相補的な第２のプローブを表面に固定したプローブ固定担体を用意する工程；
（ｉｉ）該検体中の核酸に第１の標識物質で標識を付す工程；
（ｉｉｉ）前記プローブ固定担体上の第１および第２のプローブと工程（ｉｉ）で得た標識化核酸とをハイブリダイズさせる工程；
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で得られたプローブ固定担体からの、該第１のプローブおよび該第２のプローブの少なくとも一方が検体中の核酸とハイブリッド体を形成したことを示す該第１の標識物質からの信号を検出する工程；
（ｖ）前記工程（ｉｖ）において該第１の標識物質からの信号が検出された場合に、該プローブ固定担体上のハイブリッド体を、ハイブリッド体の二本鎖の非相補的な部分のみを消化開裂する酵素で処理する工程；
（ｖｉ）前記工程（ｖ）において該酵素による開裂を受けたハイブリッド体を構成する一本鎖の開裂部分よりも３'末端側に位置する部分を該ハイブリッド体から解離させる工程；
（ｖｉｉ）前記工程（ｖｉ）における解離により一本鎖としてプローブ固定担体上に残された部分を鋳型として、第２の標識物質で標識したヌクレオチドの存在下で伸展反応を行う工程；
（ｖｉｉｉ）前記工程（ｖｉｉ）により、伸展が行われたことを示す第２の標識物質からの信号を検出する工程、
を有することを特徴とする標的核酸における一塩基多型の検出方法。
【請求項２】
前記プローブがホスホロチオエート核酸で構成される請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記プローブがPNAで構成される請求項１記載の検出方法。
【請求項４】
前記第２の標識物質で標識した部分について、標識物質の１種または４種を準備する請求項１記載の検出方法。
【請求項５】
第２の標識物質で標識した部分がジデオキシヌクレオチドである請求項４記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイクロアレイなどのプローブ固定担体を用いた標的核酸の一塩基多型の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
検出対象核酸（標的核酸）に特異的に結合し得る多数のプローブを固相担体に所定の配置で固定したプローブ固定担体の代表例としてマイクロアレイが知られている。このマイクロアレイは、プローブの多数の微小スポットを高密度に固相担体の２次元平面上に固定したものである。このマイクロアレイに試料を反応させて、反応があったプローブと無かったプローブをこれらプローブの固定された位置によって見分け、反応があったプローブの種類に基づいて試料中に含まれる物質の検出やその構造の特定を行うことができる。つまり、マイクロアレイを用いることで、同時に複数の反応を少ない試料に対して並列に行い、各反応の結果をプローブ固定位置のアドレス情報を基に知ることができるようになっている。
【０００３】
担体に固定されているプローブには、検体ＤＮＡとハイブリダイズするための最適な条件（温度、塩濃度など）がそれぞれにある。しかしながら、高密度に形成された領域に固定されている個々のプローブの最適条件でハイブリダイゼーション反応を行うことは困難であるため、一般にはマイクロアレイの全領域において、同一条件で反応が行われている。
【０００４】
したがって、アレイ上のプローブと完全に相補的ではない検体DNAがプローブと誤ってハイブリダイズする場合がある。ミスマッチ結合とよばれるこのような現象は、ハイブリッド体からの信号検出時にノイズとなり、検出精度低下の一因となる。
【０００５】
マイクロアレイは、試料中の一塩基多型（SNP）検出にも応用されている。SNPとは、数百塩基に一度の割合で存在する遺伝子変異である。一般にひとつのSNPを検出するためのプローブは、変異型検出用および野生型（非変異型）検出用のセットである。このプローブセットは、互いに一塩基のみ異なる塩基配列であることが多いため、プローブセットにおける融解温度（Tｍ値）の差はほとんどない。その結果、マイクロアレイを用いたSNP検出では、プローブと標的サンプルのハイブリダイゼーション時に不完全一致による結合が高頻度で生じ、遺伝子型判定が困難となる。
【０００６】
このようなミスマッチ結合に関する問題を解決するため、（１）アレイ上のプローブに検体DNAをハイブリダイズさせる際の温度を調整する手法や（２）ハイブリダイゼーション後にミスマッチ結合している領域を排除可能な検出方法が提案されている。上記（１）の方法の詳細が開示されている先行技術としては、例えば特開２００１−２３５４７４号公報が挙げられる。上記公報では、オリゴヌクレオチドプローブとオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにおいて、個々のプローブ固定面でハイブリダイゼーションに最適な温度で生化学反応をおこさせることが可能な生化学反応検出チップが提案されている。これは、オリゴヌクレオチドプローブの相補鎖結合のTm値に着目したものである。ミスマッチ結合におけるTm値は、完全一致結合（フルマッチ結合）におけるTm値よりも低いため、フルマッチ結合のTm値よりも低温条件ではミスマッチ結合によるバックグラウンドノイズが増加する。一方、フルマッチ結合のTm値よりも高温条件ではオリゴヌクレオチドとプローブの結合が困難となる。そこで、上記特許ではミスマッチ結合を起こさずにオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションするための温度をそれぞれのプローブに関して最適に調整する方法を提供している。
【０００７】
上記（２）の方法の詳細が開示されている先行技術としては、例えば特開２００５−１０２５７９号公報が挙げられる。上記公報では、標識化検体DNAとプローブとのハイブリダイゼーション反応後、二本鎖を形成していない部位を切断することで、検出精度を向上させる手法が提案されている。これは、一本鎖DNAを特異的に切断する酵素に着目し、プローブとの間で水素結合を形成していない部位を選択的に除去するものである。切断酵素使用前後の蛍光強度を比較することで、ミスマッチ結合に関する情報が得ることを目的としている。
【０００８】
しかしながら、上記（１）の公報に記載されている方法では、マイクロアレイの個々の領域に対し、温度をモニター、調整する必要がある。また上記（２）の公報に記載されている方法では、ミスマッチ結合の除去は可能であるが、ヌクレアーゼ処理後の輝度が著しく低下してしまう。
【特許文献１】特開２００１−２３５４７４号公報
【特許文献２】特開２００５−１０２５７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
マイクロアレイにおいて、担体に固定化された個々のプローブは、検体DNAとハイブリダイズするための最適な条件を有する。しかしながら、個々のプローブが有するハイブリダイズ反応に最適な条件（温度、塩濃度など）を実現することは困難であるため、一般にハイブリダイゼーション反応は、全ての領域に対して同じ条件で行われている。その結果、マイクロアレイ上のプローブと検体DNAがハイブリダイズする際、プローブに対して完全に相補的でない検体DNAがプローブDNAと準安定的な二本鎖状態を形成する場合がある。このようなミスマッチ結合は、ハイブリダイゼーション反応の後工程である二本鎖DNA測定の際にノイズとして検出され、検出精度の低下を招く。
【００１０】
特に、マイクロアレイを用いた一塩基多型検出においては、一塩基のみ異なるプローブセットを使用する場合が多いため、上記のようなミスマッチ結合が頻繁に発生し、遺伝子型の決定に困難をきたすことが多い。
【００１１】
本発明の目的は、ハイブリダイゼーション反応後、ミスマッチ結合部位を排除し、さらにミスマッチ結合を生じていた箇所を標識することで検出感度および精度を向上させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明にかかる標的核酸における一塩基多型の検出方法は、
（ｉ）野生型が有する塩基配列部分に対して相補的な第１のプローブおよび変異型が有する塩基配列部分に対して相補的な第２のプローブを表面に固定したプローブ固定担体を用意する工程；
（ｉｉ）該検体中の核酸に第１の標識物質で標識を付す工程；
（ｉｉｉ）前記プローブ固定担体上の第１および第２のプローブと工程（ｉｉ）で得た標識化核酸とをハイブリダイズさせる工程；
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で得られたプローブ固定担体からの、該第１のプローブおよび該第２のプローブの少なくとも一方が検体中の核酸とハイブリッド体を形成したことを示す該第１の標識物質からの信号を検出する工程；
（ｖ）前記工程（ｉｖ）において該第１の標識物質からの信号が検出された場合に、該プローブ固定担体上のハイブリッド体を、ハイブリッド体の二本鎖の非相補的な部分のみを消化開裂する酵素で処理する工程；
（ｖｉ）前記工程（ｖ）において該酵素による開裂を受けたハイブリッド体を構成する一本鎖の開裂部分よりも３'末端側に位置する部分を該ハイブリッド体から解離させる工程；
（ｖｉｉ）前記工程（ｖｉ）における解離により一本鎖としてプローブ固定担体上に残された部分を鋳型として、第２の標識物質で標識したヌクレオチドの存在下で伸展反応を行う工程；
（ｖｉｉｉ）前記工程（ｖｉｉ）により、伸展が行われたことを示す第２の標識物質からの信号を検出する工程、
を有することを特徴とする標的核酸における一塩基多型の検出方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法により、ミスマッチ結合が存在する場合でも、感度を低下させることなく、遺伝子型判定精度を向上させることが可能となった。また、ミスマッチ結合を利用することで、一つのプローブから、一塩基多型の判定精度を向上させる上で有用な異なる二種類の情報を得ることが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の方法は以下の工程を有する。
（ｉ）野生型が有する塩基配列部分に対して相補的な第１のプローブおよび変異型が有する塩基配列部分に対して相補的な第２のプローブを表面に固定したプローブ固定担体を用意する工程。
（ｉｉ）該検体中の核酸に第１の標識物質で標識を付す工程。
（ｉｉｉ）前記プローブ固定担体上の第１および第２のプローブと工程（ｉｉ）で得た標識化核酸とをハイブリダイズさせる工程。
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で得られたプローブ固定担体からの、該第１のプローブおよび該第２のプローブの少なくとも一方が検体中の核酸とハイブリッド体を形成したことを示す該第１の標識物質からの信号を検出する工程。
（ｖ）前記工程（ｉｖ）において該第１の標識物質からの信号が検出された場合に、該プローブ固定担体上のハイブリッド体を、ハイブリッド体の二本鎖の非相補的な部分のみを消化開裂する酵素で処理する工程。
（ｖｉ）前記工程（ｖ）において該酵素による開裂を受けたハイブリッド体を構成する一本鎖の開裂部分よりも３'末端側に位置する部分を該ハイブリッド体から解離させる工程。
（ｖｉｉ）前記工程（ｖｉ）における解離により一本鎖としてプローブ固定担体上に残された部分を鋳型として、第２の標識物質で標識したヌクレオチドの存在下で伸展反応を行う工程。
（ｖｉｉｉ）前記工程（ｖｉｉ）により、伸展が行われたことを示す第２の標識物質からの信号を検出する工程。
【００１５】
本発明の方法では、まず、標的核酸における一塩基多型の野生型を検出するためのプローブと、変異型を検出するためのプローブとを用意する。これらのプローブのそれぞれを固定した領域（例えばスポット）を担体上に設けて、マイクロアレイなどのプローブ固定担体を調製する。
【００１６】
検体は、検出対象としての一塩基多型を含み、第１の標識物質を有する核酸断片（一本鎖）として調製しておく。この検体の長さ（塩基数）は、測定に必要な程度に調整すればよい。例えば、100〜1500塩基程度に調製する。この検体を、プローブ固定担体と反応させる。反応条件は、検体とプローブとがハイブリダイズできるように設定される。本発明においては、後述する第２の標識による検出を行うので、この段階で野生型と変異型とを区別するための厳密なハイブリダイゼーション反応のための条件設定の必要はない。第２の標識物質としては１種もしくは４種用意することができる。４種の標識物質を用意することで、標識の種類によって伸長された塩基の種類まで判定可能となる。
【００１７】
次に、プローブ固定担体上から第１の標識物質に由来する信号が検出された場合に、プローブ固定担体上のハイブリッド体に対して、ハイブリッド体の二本鎖の非相補的な部分のみを消化開裂する酵素で処理を施す。なお、プローブ固定担体上から第１の標識物質に由来する信号が検出されなかった場合は、一塩基ミスマッチを含めてプローブで検出し得る一塩基多型を検体が有していないと判断する。
【００１８】
上記の酵素処理を行うことで、プローブ固定担体上のハイブリッド体が１塩基ミスマッチで形成されたものであれば、そのミスマッチ部分で開裂が生じる。この開裂を利用して、ハイブリッド体を構成する一本鎖の開裂部分よりも３'末端側に位置する部分をハイブリッド体から解離させる。なお、解離した部分に対応する相補鎖部分はプローブ固定担体上に残される。次に、この残された一本鎖部分を鋳型として、一本鎖を伸展させるとともに、伸展部分を第２の標識物質で標識する。伸展処理終了後、第２の標識物質に由来する信号を検出する。各プローブ固定領域における第２の標識物質に由来する信号の検出の有無により、検体の一塩基多型を判定することができる。各プローブ固定領域における第１の標識物質に由来する信号の有無と、第２の標的物質に由来する信号の有無によって得られる判定結果の一例について表１にまとめる。なお、表１において、「○」は標的物質に由来する信号（例えば発光）が検出された場合を示し、「×」は標的物質に由来する信号が検出されなかった場合を示す。
【００１９】
【表１】
2009125019.tif 000002
【００２０】
プローブには修飾DNAもしくはPNAを用いることが好ましい。これにより、制限酵素処理工程において、検体核酸はプローブより優先的に切断される。修飾DNAの例としては、ホスホロチオエート核酸が挙げられる。プローブの塩基長は、２０塩基を目安として、マイクロアレイ上の全てのプローブがほぼ同じTm値になるように設定することが好ましい。塩基配列によってはTm値が異なるので、場合によっては、１５〜２５塩基、あるいは１８〜２２塩基の範囲から選択する。
【００２１】
また、プローブは固定担体側を３’末端とし、プローブ配列に含まれるSNP部位は、５’末端付近とすることが好ましい。
【００２２】
プローブ固定担体上に形成されたハイブリッド体に非相補部分、すなわちミスマッチが存在した場合、これに制限酵素を作用させることで、この部分に特異的に開裂を生じさせることができる。核酸がＤＮＡの場合には、ホスホジエステル結合の加水分解によりDNAの非相補的な部分のみを選択的に消化開裂する酵素を好適に利用できる。この酵素としては、ヌクレアーゼＳ１、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１、ヌクレアーゼＰ１が挙げられる。
【００２３】
制限処理後、昇温等の操作により、ミスマッチ結合部位を含むオリゴヌクレオチドの３’側を解離させる。SNP部位を、検体DNAの３’末端側に位置させておけば、Ｔｍ値が相対的に低く、昇温により優先的にハイブリッド体から解離する。
【００２４】
解離したオリゴヌクレオチドを洗浄除去後、プローブを鋳型とした一塩基伸長反応を行う。一塩基伸長反応には、第二の標識物質で標識したジデオキシヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。
【００２５】
酵素および未反応ヌクレオチドを洗浄除去後、第一および第二の標識物質からの信号を検出する。第二の標識物質からの信号が検出された場合、先の表１に示すような判定が可能である。すなわち、第二の標識物質からの信号が検出されたプローブと逆のプローブに相補的な検体の存在が明らかとなる。
【００２６】
この手法を用いることで、一つのプローブから異なる二つの情報を得ることができる。本発明の方法では第二の標識物質からの信号が検出されない場合がある。このような場合は、ミスマッチ結合がない状況であるため、第一の標識物質からの信号のみで遺伝子型の判定が十分可能である。
【００２７】
このように、ハイブリッド体中におけるミスマッチ結合を利用することにより、遺伝子型のタイピング感度および精度が向上する。
【００２８】
以下に、図面に基づいて本発明の実施形態の一例を詳細に説明する。
<実施様態例>
図１に本発明の流れを表す簡易図を示す。ここではプローブ核酸をインクジェット方式（特開平11-187900号公報）で基板担体上に固定化したDNAマイクロアレイを用いた実施例について述べるが、この方法に限定されるものではない。
【００２９】
(マイクロアレイの構成)
図１にマイクロアレイ上にプローブが固定されている様子を示す。プローブの固定は特開平１１−１８７９００公報に詳細が示されているように、表面処理を行った基板にインクジェットにより３’末端をチオール化されたオリゴDNAを吐出する方法を用いる。ここでプローブとなるDNAは２５塩基程度の長さをもち、(株)ベックスから購入したものである。
【００３０】
(ブロッキング)
ハイブリダイゼーション反応を行う前に、以下のブロッキング反応を行う。マイクロアレイのブロッキングは、マイクロアレイのプローブ以外の部分に核酸分子が吸着することを防ぐ目的で行い、一般的にハイブリダイゼーションの直前に行う。
【００３１】
BSA（牛血清アルブミンFraction V : Sigma社製）を１ｗｔ％となるように１００ｍＭ   ＮａＣｌ／１０ｍＭりん酸緩衝液に溶解し、この溶液にDNAマイクロアレイを室温で２時間浸す。ブロッキング終了後、０．１ｗｔ％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む０．１×ＳＳＣ溶液（クエン酸三ナトリウムとＮａＣｌ）と、ＳＤＳを含まないＳＳＣ溶液で洗浄し、超純水でリンス後、スピンドライで水切りを行った。
【００３２】
(ターゲットの準備)
検体由来の核酸の増幅(PCR)反応の例を以下に示す。増幅反応液組成の例を以下に示す。
【００３３】
--PCR溶液組成−
・Expand Long Enzyme Mix (Roche)        ：0.3ml
・Template Genome DNA：〜5ng
・Forward/Reverse Primer：0.12mM each
・DNTP：0.7 ml
・buffer 1：2 ml
・H2O：11.4 ml
Total ：20ml
上記組成の反応液を図４に示す温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行った。
【００３４】
反応終了後、精製用カラム（ＱＵＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：ＱＵＩＧＥＮ社製）を用いてＰｒｉｍｅｒを除去した後、電気泳動（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ：Ａｇｉｌｅｎｔ社製）により、増幅産物の定量を行う。
【００３５】
その後、Ｃｙ３標識されたｄＣＴＰを用いてPCRを行い、検体DNAに標識を行う。このときのプロトコルを以下に示す。
--PCR溶液組成−
・AmpliTaq Gold (TAKARA)：0.1 ml
・Template Genome DNA：1.6 ng
・Forward/Reverse Primer：0.4mM each
・dNTP mix (2mM each)：0.6 ml
・10xbuffer：1 ml
H2O：7.3 ml
Total：10 ml
上記組成の反応液を図５に示す温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行った。
【００３６】
（ハイブリダイゼーション）
水切りしたＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行う。ハイブリダイゼーション装置を用いずに、スライドガラスとハイブリダイゼーション用のチャンバーを用いてマニュアルで反応を行ってもよい。
【００３７】
（ハイブリダイゼーション溶液）
以下にハイブリダイゼーション溶液の組成の一例を示す。
６×ＳＳＰＥ  ／  １０％  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ  ／  ターゲット（未知検体由来の核酸）（ＰＣＲ産物  １０ｎｇ）  ／  ０．０５％  ＳＤＳ
前述の増幅した未知検体由来の核酸１０ｎｇ相当をバッファー（ＳＳＰＥ）に溶かし、最終濃度が１０％になるように  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅを加える。この溶液に最終濃度が０．０５％になるようにＳＤＳ溶液を加え、ハイブリダイゼーション溶液とする。なお、バッファー（ＳＳＰＥ）の濃度は、最終溶液の状態で６×ＳＳＰＥとなるよう、予め計算しておく。
【００３８】
上記ハイブリダイゼーション溶液を、９２℃に加温し２分間保持したあと、さらに５０℃で４時間保持した。その後、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて、４０℃で洗浄をした。さらに２×ＳＳＣを用いて２０℃で洗浄を行い、必要に応じて通常のマニュアルに従い純水でリンス、スピンドライ装置で水切りを行った（図１a）。
【００３９】
（ヌクレアーゼ処理）
以下にヌクレアーゼＳ１溶液の組成の一例を示す。
ヌクレアーゼＳ１  １０Ｕｎｉｔ  ／  １０×ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌ  ／  Ｈ2Ｏ  １７ｌ
前記ヌクレアーゼＳ１溶液を図１a）の状態となったＤＮＡマイクロアレイに１０mｌ添加し、３７℃で１０分間反応させる。反応後、０．１×ＳＳＣ溶液を用いて４０℃で洗浄した。さらに純水でリンス、スピンドライ装置による水切りを行った。（図１b）
（一塩基伸長反応）
以下に一塩基伸長反応溶液の組成の一例を示す。ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ／Ｃｙ５標識ジデオキシヌクレオチドＭｉｘ／１０×ｂｕｆｆｅｒ／Ｈ2Ｏ
前記酵素溶液を図１、b）の状態となったＤＮＡマイクロアレイに添加し、３７℃で１０分間反応させる。反応後、０．１×ＳＳＣ溶液を用いて４０℃で洗浄した。さらに純水でリンス、スピンドライ装置による水切りを行った。（図１、d））
（蛍光測定）
図１、d)の状態となったＤＮＡマイクロアレイを、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）を用いて、以下の条件で蛍光測定を行った。蛍光測定波長をＣｙ３およびＣｙ５測定波長とし、蛍光測定値が３００００以下となるように励起光の強さを調整して測定した。
【００４０】
（スポット解析）
蛍光測定結果の画像を、マイクロアレイ用のデータ解析ソフトＡｒｒａｙＰｒｏ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製）で解析を行い、各スポットに対する輝度値のデータを得た。
【００４１】
輝度値のデータから得られる遺伝子型の判定は表１のとおりとなる。
【実施例】
【００４２】
実施例１
用いたプローブの配列と検体の有する塩基配列を以下に示す。
プローブ配列：
TGCACGCTACCCACCAGGCCC（野生型）
TGCACGCTACTACCAGGCCC（変異型）
検体配列：400塩基
GGCCGTGATAGTGGCCATCTTCCTGCTCCTGGTGGACCTGATGCACCGGCGCCAACGCTGGGCTGCACGCTACCCACCAGGCCCCCTGCCACTGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTGCTGAGGCTCCCCTACCAGAAGCAAACATGGATGGTGGGTGAAACCACAGGCTGGACCAGAAGCCAGGCTGAGAAGGGGAAGCAGGTTTGGGGGACGTCCTGGAGAAGGGCATTTATACATGGCATGAAGGACTGGATTTTCCAAAGGCCAAGGAAGAGTAGGGCAAGGGCCTGGAGGTGGAGCTGGACTTGGCAGTGGGCATGCAAGCCCAT
１つのブロックが16x16のスポットで構成され、その同一ブロックが3x3の9ブロック配置されたホスホロチオエート核酸マイクロアレイを用いる。それぞれのスポットには異なるオリゴホスホロチオエート核酸が固定されている。このマイクロアレイに対して500bp程度のCy3標識されたターゲットDNAをハイブリダイゼーション反応させる。ターゲットDNAは、CYP2D6のエクソン領域を含むPCR産物である。ターゲットDNAの調製およびハイブリ反応の各工程は実施様態例に従って行う。
【００４３】
ハイブリダイゼーション反応後のマイクロアレイに対し、ヌクレアーゼS1溶液を添加し、一本鎖DNAの切断除去を行う。ヌクレアーゼS1溶液組成、反応方法および洗浄の各工程は実施様態例に従って行う。
【００４４】
ヌクレアーゼS1処理後のマイクロアレイに対し、一塩基伸長反応溶液を添加し、プローブを鋳型とした一塩基伸長反応を行う。一塩基伸長にはCy5標識ジデオキシヌクレオチドを用いた。反応溶液組成および反応方法の各工程は実施様態例に従って行う。
【００４５】
その後、蛍光輝度を検出装置によって測定した。測定の際は、Cy3励起に波長532nmを、Cy5励起に波長635nmを用いる。得られた蛍光輝度画像を市販のアレイ解析用ソフトウェアによって解析し、各スポット位置に対して輝度の値を得る。輝度の測定、画像解析にいたるまでの各工程は実施様態例に従って行う。
【００４６】
輝度測定および画像解析の結果得られたCYP2D6領域に含まれる多型（C100T）に関する輝度データを図２に示す。Cy3に由来する蛍光（ex 532nm）輝度から、当該多型は変異型ホモであることが示唆される。さらに、Cy5に由来する蛍光（ex 635nm）輝度から、野生型にミスマッチ結合が存在し、変異型にミスマッチ結合が認められないことがわかるため、当該多型は変異型ホモすなわちTTであることが明らかとなる。遺伝子型の決定法は、表１を参照した。
【００４７】
（実施例２）
用いたプローブの配列と検体の有する塩基配列を以下に示す。
プローブ配列：
GGCGCTTCTCCGTGTCCACC（野生型）
GGCGCTTCTCCGTCTCCACC（変異型）
検体配列：484塩基
GATGGTGGGGCTAATGCCTTCATGGCCACGCGCACGTGCCCGTCCCACCCCCAGGGGTGTTCCTGGCGCGCTATGGGCCCGCGTGGCGCGAGCAGAGGCGCTTCTCCGTGTCCACCTTGCGCAACTTGGGCCTGGGCAAGAAGTCGCTGGAGCAGTGGGTGACCGAGGAGGCCGCCTGCCTTTGTGCCGCCTTCGCCAACCACTCCGGTGGGTGATGGGCAGAAGGGCACAAAGCGGGAACTGGGAAGGCGGGGGACGGGGAAGGCGACCCCTTACCCGCATCTCCCACCCCCAGGACGCCCCTTTCGCCCCAACGGTCTCTTGGACAAAGCCGTGAGCAACGTGATCGCCTCCCTCACCTGCGGGCGCCGCTTCGAGTACGACGACCCTCGCTTCCTCAGGCTGCTGGACCTAGCTCAGGAGGGACTGAAGGAGGAGTCGGGCTTTCTGCGCGAGGTGCGGAGCGAGAGACCGAGGAGTCTCT
１つのブロックが16x16のスポットで構成され、その同一ブロックが3x3の9ブロック配置されたホスホロチオエート核酸マイクロアレイを用いる。それぞれのスポットには異なるオリゴホスホロチオエート核酸が固定されている。このマイクロアレイに対して500bp程度のCy3標識されたターゲットDNAをハイブリダイゼーション反応させる。ターゲットDNAは、CYP2D6のエクソン領域を含むPCR産物である。ターゲットDNAの調製およびハイブリ反応の各工程は実施様態例に従って行う。
【００４８】
ハイブリダイゼーション反応後のマイクロアレイに対し、ヌクレアーゼS1溶液を添加し、一本鎖DNAの切断除去を行う。ヌクレアーゼS1溶液組成、反応方法および洗浄の各工程は実施様態例に従って行う。
【００４９】
ヌクレアーゼS1処理後のマイクロアレイに対し、一塩基伸長反応溶液を添加し、プローブを鋳型とした一塩基伸長反応を行う。一塩基伸長にはCy5標識ジデオキシヌクレオチドを用いた。反応溶液組成および反応方法の各工程は実施様態例に従って行う。
【００５０】
その後、蛍光輝度を検出装置によって測定した。測定の際は、Cy3励起に波長532nmを、Cy5励起に波長635nmを用いる。得られた蛍光輝度画像を市販のアレイ解析用ソフトウェアによって解析し、各スポット位置に対して輝度の値を得る。輝度の測定、画像解析にいたるまでの各工程は実施様態例に従って行う。
【００５１】
輝度測定および画像解析の結果得られたCYP2D6領域に含まれる多型（G1661C）に関する輝度データを図３に示す。Cy3に由来する蛍光（ex 532nm）輝度から、当該多型はヘテロであることが示唆される。さらに、Cy5に由来する蛍光（ex 635nm）輝度から、野生型、変異型共にミスマッチ結合が存在することが明らかであるため、当該多型はヘテロすなわちGCであることが明らかとなる。遺伝子型の決定法は、表１を参照した。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明にかかる検出方法の概要を示す図である。
【図２】多型C100Tの蛍光輝度測定結果を示す図である。
【図３】多型G1661Cの蛍光輝度測定結果を示す図である。
【図４】ＰＣＲの温度サイクルを示す図である。
【図５】ＰＣＲの温度サイクルを示す図である。
【符号の説明】
【００５３】
１  基板
２  プローブ
３  SNP部位
４  標識化DNA
５  標識化ジデオキシヌクレオチド
【図１】
2009125019.tif 000003
【図４】
2009125019.tif 000004
【図５】
2009125019.tif 000005
【図２】
2009125019.tif 000006
【図３】
2009125019.tif 000007
【配列表】
2009125019000001.app