(57)【要約】【課題】試料を通流させる流路の幅方向端部を容易に検出することができ、高精度で試料を検出できる光学的測定装置を提供する。【解決手段】レーザ光１を、サンプル流路２に、その幅ｗ方向に少なくとも一方の側壁から他方の側壁まで走査しながら、連続的に照射する。そして、散乱光検出部において、サンプル流路２のエッジ部及び微小粒子３からの散乱光を検出する。このとき、流路２のエッジ部から発せられる散乱光の強度は、微小粒子３から発せられる散乱光の強度よりも高くなるため、予め閾値を設定しておき、この閾値以上の強度を示した散乱光を、流路３のエッジ部からの散乱光として、微小粒子３からの散乱光と識別する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路内を通流する試料に光を照射し、前記試料から発せられた光を検出する光学的測定装置であって、
少なくとも前記流路の一方の側壁から他方の側壁まで、前記流路の幅方向に走査しながら光を照射し、予め設定された閾値以上の散乱光を、前記流路の幅方向端部からの散乱光として検出する光学的測定装置。
【請求項２】
前記流路の幅方向端部からの散乱光と前記試料からの散乱光とから、前記流路内における前記試料の通流位置を特定することを特徴とする請求項１に記載の光学的測定装置。
【請求項３】
測定対象の試料が通流する流路が複数配設されており、更にその配列方向最外部に前記試料が通流しない参照流路を有し、
前記参照流路に対しても、少なくとも一方の側壁から他方の側壁まで、その幅方向に走査しながら光を照射し、予め設定された閾値以上の散乱光を、前記参照流路の幅方向端部からの散乱光として検出することを特徴とする請求項１又は２に記載の光学的測定装置。
【請求項４】
前記参照流路とその他の流路とは、形状が異なることを特徴とする請求項３に記載の光学的測定装置。
【請求項５】
前記参照流路とその他の流路とは、検出される散乱光の強度が異なることを特徴とする請求項３に記載の光学的測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小粒子等の試料を光学的に検出する光学的測定装置に関する。より詳しくは、流路内を通流する試料に光を照射し、その試料から発せられた光を検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、細胞、微生物及びリポソーム等の生体関連微小粒子を識別する場合は、フローサイトメーター等の光学的測定装置が利用されている（例えば、非特許文献１参照。）。フローサイトメーターは、流路内を１列になって通流する微小粒子に特定波長のレーザ光を照射し、各微小粒子から発せられた蛍光又は散乱光を検出することで、複数の微小粒子を１個ずつ識別する装置である。
【０００３】
具体的には、フローセル内において、測定対象の微小粒子を含むサンプル液と、その周囲を流れるシース（鞘）液とで層流を形成し、更に、サンプル液とシース液との間にわずかな圧力差を生じさせることで、サンプル液中に含まれる複数の微小粒子を１列に並べる。その状態でフローセルにレーザ光を照射すると、微小粒子がレーザービームを横切るように１個ずつ通過する。このとき、レーザ光により励起されて各微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を、電気光学検出器を用いて検出する。
【０００４】
また、フローセルの代わりに、微細な流路が形成された基板を使用する方法もある（例えば、特許文献１及び２参照。）。特許文献１及び２に記載されているような従来のマイクロチップにおいては、透明基板内に、測定対象の試料を通流させるための１又は複数の流路が形成されている。この試料流路は、例えば、サンプル液導入流路の両側から２本のシース液導入流路が合流して、１本の試料流路となる構成となっており、これらの流路の合流部分において層流が形成される。
【０００５】
一方、従来、検出精度を向上させるために、測定対象の試料を含むサンプル液を通流させる流路に加えて、試料を含まない液等を通流させる参照流路を設けたマイクロチップも提案されている（特許文献３参照）。図１３は特許文献３に記載された従来のマイクロチップの流路構成を示す平面図である。図１３に示すように、特許文献３に記載のマイクロチップ１００は、基板１０１に、血液等の検体を導入するための検体導入口１０２が設けられており、この検体液導入口１０２には、検体流路１０３ａ〜１０３ｃと参照流路１０４とが連設されている。これらの流路のうち検体流路１０３ａ〜１０３ｃは、検体と反応する試薬を通流させる試薬流路１０５ａ〜１０５ｃと合流して合流流路１０６ａ〜１０６ｃとなる。また、合流流路１０６ａ〜１０６ｃ及び参照流路１０４には、それぞれ検出部１０７が設けられている。
【０００６】
上述したマイクロチップ１００を使用して測定を行う場合は、検体導入口１０２から血液等の検体を供給し、検体流路１０３ａ〜１０３ｃ及び参照流路１０４に検体を通流させる。また、試薬流路１０５ａ〜１０５ｃには、検体と反応する試薬を通流させ、合流流路１０６ａ〜１０６ｃにおいて検体と試薬とを反応させる。そして、検出部１０７において、合流流路１０６ａ〜１０６ｃ及び参照流路１０４を通流する各液に光を照射し、それにより発せられる散乱光又は反射光を検出する。
【０００７】
この特許文献３に記載のマイクロチップ１００では、参照流路１０４には試薬流路が合流せず、未反応の検体が通流する。このため、参照流路１０４から検出された信号は、合流流路１０６ａ〜１０６ｃから検出された信号のノイズ成分に相当し、合流流路１０６ａ〜１０６ｃからの検出信号から参照流路１０４からの検出信号を差し引く信号処理を行うことにより、試薬との反応に起因する信号のみを得ることができる。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−３０２３３０号公報
【特許文献２】特開２００４−８５３２３号公報
【特許文献３】特開２００３−４７５２号公報
【非特許文献１】中内啓光監修，「細胞工学別冊  実験プロトコルシリーズ  フローサイトメトリー自由自在」，第２版，株式会社秀潤社，２００６年８月３１日発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、前述した従来の技術には以下に示す問題点がある。即ち、フローサイトメーター等の従来の光学的測定装置においては、フローセル又は基板に形成された流路の特定位置にスポット的にレーザ光を照射し、そのレーザスポット内を試料が通過するようにしているが、試料の通流位置によって通流速度及びレーザ光の照射強度が異なるため、検出光の強度にばらつきが生じるという問題点がある。特に、測定対象の試料が細胞及びビーズ等の微小粒子であり、その微小粒子の粒径よりも流路又は層流の幅が広く、微小粒子が一列に並んでいないような場合に、上述した問題が生じやすい。
【００１０】
また、同一基板内に複数の微細流路が形成されているマイクロチップを使用する場合でも同様に、各流路の特定位置にスポット的にレーザ光が照射されるが、製造工程において微細流路の各ピッチを一定にすることは難しく、また、ロット毎の製造誤差も生じやすい。このため、予め設定した位置にレーザ光が照射されず、流路毎にレーザ光の照射位置がばらつき、検出精度が低下するという問題点もある。
【００１１】
そこで、本発明は、試料を通流させる流路の幅方向端部を容易に検出することができ、高精度で試料を検出可能な光学的測定装置を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る光学的測定装置は、流路内を通流する試料に光を照射し、前記試料から発せられた光を検出する光学的測定装置であって、少なくとも前記流路の一方の側壁から他方の側壁まで、前記流路の幅方向に走査しながら光を照射し、予め設定された閾値以上の散乱光を、前記流路の幅方向端部からの散乱光として検出するものである。
本発明の光学的測定装置では、流路の一方の側壁から他方の側壁まで流路の幅方向に光を走査しているため、検出される散乱光の強度から容易に流路の幅方向端部の位置を特定することができる。
この光学的測定装置は、前記流路の幅方向端部からの散乱光と前記試料からの散乱光とから、前記流路内における前記試料の通流位置を特定することができる。
また、測定対象の試料が通流する流路が複数配設されている場合は、更にその配列方向最外部に前記試料が通流しない参照流路を設け、前記参照流路に対しても、少なくとも一方の側壁から他方の側壁まで、その幅方向に走査しながら光を照射し、予め設定された閾値以上の散乱光を、前記参照流路の幅方向端部からの散乱光として検出することが好ましい。
その場合、前記参照流路とその他の流路とは、形状又は検出される散乱光の強度が異なっていてもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、流路の幅方向端部の位置を容易に特定することができ、更に、その位置情報に基づいて、流路内での試料の通流位置を特定することで、検出信号を補正することが可能となるため、検出信号の強度、検出感度及び精度等を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す実施形態に限定されるものではない。
【００１５】
本発明者は、上述した問題点を解決するために鋭意実験検討を行った結果、流路の幅方向の端部（以下、エッジ部という）を検出し、その結果に基づいて、流路内での試料の通流位置、各流路の幅及びピッチ等を求めることにより、検出信号の補正及びレーザ光照射位置の調整等が可能になることを見出した。
【００１６】
そこで、本発明者は、流路のエッジ部を検出する方法について検討を行い、流路の内側面に金属膜等の反射膜を設け、この反射膜からの反射光を検出したり、又は、流路の内側面に蛍光体を固定し、この蛍光体から発せられる蛍光を検出したりすることにより、エッジ部を検出できることを確認した。しかしながら、これらの方法は、いずれも基板製造時に新たな工程を追加する必要があるため、基板の歩留まりの低下及び製造コスト増加を招く可能性がある。
【００１７】
また、同一基板に複数の流路が形成されている場合、全ての流路から同様の信号が得られるため、レーザ光のスタート位置が正しいか否かの判別が難しく、検出信号のうちどれが両端の流路のエッジ部に起因するものかがわかりにくい。この問題は、試料を含有するサンプル液を通流させる流路（以下、サンプル流路という。）よりも外側に参照流路を設け、この参照流路に例えば蛍光色素で修飾されたビーズ等を充填し、サンプル流路と参照流路とで異なる信号が得られるようにすることにより解決可能である。しかしながら、その場合でも、蛍光色素が劣化して、参照流路からの検出信号の強度が安定しないという問題点が残る。
【００１８】
そこで、本発明者は、流路内側面に反射膜や蛍光色素を設けなくても、流路の幅方向端部を検出する方法について更に検討を行い、本発明に至った。即ち、本発明に係る光学的測定装置においては、流路の幅方向に少なくとも一方の側壁から他方の側壁まで走査しながら光を照射し、これにより発せられる光のうち少なくとも散乱光を検出する。そして、予め設定された閾値以上の散乱光を、流路のエッジ部からの散乱光として判別する。
【００１９】
先ず、本発明の第１の実施形態に係る光学的測定装置について説明する。本実施形態の測定装置は、フローセル又は基板に設けられたサンプル流路にサンプル液を通流させ、その中に含まれる試料の種類、状態、大きさ等を光学的に測定する装置であり、サンプル流路に光を照射する光照射部と、少なくとも散乱光を検出する光検出部と、を備えている。
【００２０】
本実施形態の光学的測定装置における光照射部は、サンプル流路の幅方向に、少なくとも一方の側壁から他方の側壁まで走査しながら光を照射するものである。光照射部から照射される光は、特に限定されるものではなく、レーザ光、紫外光、赤外光及び可視光等の種々波長の光から、試料の種類等に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
例えば、照射光がレーザ光である場合には、光照射部は、レーザ発振器、ミラー及び集光レンズ等を備え、レーザ発振器から出射され、ミラーにより流路の方向に反射されたレーザ光を、集光レンズにより集光して照射する構成とすることができる。その際使用されるレーザ発振器としては、例えば、ＹＡＧレーザ等の固体レーザ、半導体レーザ及びフェムト秒レーザ等を適用することができる。
【００２２】
また、光検出部は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）及びＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube；光電子増倍管）等の光検出装置を備え、サンプル流路のエッジ部及び試料からの発せられる光のうち、少なくとも散乱光を検出する。更に、本実施形態の光学的測定装置においては、光検出部において、散乱光と併せて蛍光を検出することも可能であり、また必要に応じて、散乱光用とは別に蛍光を検出するための他の光検出部を設けてもよい。
【００２３】
次に、本実施形態の光学的測定装置の動作、即ち、本実施形態の光学的測定装置を使用した測定方法について、レーザ光を照射して、細胞及びマイクロビーズ等の微小粒子を検出する場合を例にして説明する。図１（ａ）及び（ｂ）は流路の幅方向にレーザ光を走査したときに検出される散乱光の強度を示す図であり、図１（ａ）は走査領域に微小粒子が存在していない場合の散乱強度を示し、図１（ｂ）は走査領域に微小粒子が存在している場合の散乱強度を示す。
【００２４】
図１（ａ）及び（ｂ）に示すように、本実施形態の光学的測定装置においては、レーザ光１を、サンプル流路２に、その幅ｗ方向に少なくとも一方の側壁から他方の側壁まで走査しながら、連続的に照射する。そして、散乱光検出部において、サンプル流路２のエッジ部及び微小粒子３からの散乱光を検出する。このとき、図１（ｂ）に示すように、サンプル流路２のエッジ部から発せられる散乱光の強度は、微小粒子３から発せられる散乱光の強度よりも高くなる。
【００２５】
そこで、本実施形態の光学的測定装置では、予め試料からの散乱光の最大値よりも高い範囲で閾値を設定しておき、この閾値以上の強度を示した散乱光を、サンプル流路２のエッジ部からの散乱光として、微小粒子３からの散乱光と検出する。なお、ここで設定される閾値は、試料からの散乱光とエッジ部からの散乱光を判別できる値であればよく、試料の種類、流路の形状及び基板材料等に応じて適宜設定することができる。
【００２６】
このように流路の幅方向に照射光を走査し、それにより発せられる散乱光を検出することにより、サンプル流路２のエッジ部の位置を容易に特定することができる。これにより、このエッジ部の位置を基準にして、流路幅ｗ及び流路内における微小粒子３の通流位置等を特定することができ、更には、微小粒子３の通流位置情報と、流速分布及び／又はレーザ光の強度分布等に基づいて、検出信号を補正することが可能となるため、検出信号の強度、検出感度及び精度等を向上させることができる。
【００２７】
例えば、帯状の層流を形成し、レーザ光照射により検出を行う場合は、音響光学素子（Acousto-Optic Modulator；ＡＯＭ）を透過した後のレーザスポットの光量が、流路の中央部では大きく、端に近づくに従い減少するため、流路の側面近傍を通流する試料に由来する検出信号が、中央部を通流する試料に由来する検出信号に比べて小さくなることがある。このような場合、流路内における各試料の通流位置と、ＡＯＭ透過後のレーザ強度の分布とに基づいて、蛍光及び散乱光等の検出光の信号量や感度を補正すればよい。
【００２８】
また、帯状層流の流速は、中央部分が最も早く、端になるほど遅くなるため、流路の側面近傍を通流する試料に由来する検出信号が、中央部を通流する試料に由来する検出信号に比べて大きくなることがある。このような場合は、レーザ光の走査速度を、流路内での試料の通流速度に合わせて補正すればよい。
【００２９】
なお、図１（ａ）及び（ｂ）においては、レーザ光の走査回数が１回の場合を示しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、流路の幅方向に複数回走査してもよい。これにより、検出信号のＳＮ比を向上させることができる。また、本実施形態においては、試料が細胞及びビーズ等の微小粒子である場合について述べたが、本発明はこれに限定されるものではなく、ＤＮＡ、タンパク質、血液及び組織片等の検出にも適用することが可能である。
【００３０】
更に、図１（ａ）に示すように、先ず、微小粒子３を含まない状態で液を流してサンプル流路２のエッジ部を検出し、その位置を特定した後、図１（ｂ）に示すように、微小粒子３を含む液を流して、エッジ部の位置を比較することで各微小粒子３の位置を特定することもできる。
【００３１】
図２はその手順の一例を示すフローチャート図である。サンプル流路２のエッジ部を特定した後で微小粒子３の測定を行う場合は、例えば図２に示すように、先ず、エッジ部からの散乱光を他の部分からの散乱光と区別するために、散乱信号強度の閾値を設定する（ステップＳ１）。次に、レーザ光１を、サンプル流路２の幅ｗ方向に少なくとも一方の側壁から他方の側壁まで走査しながら、連続的に照射する（ステップＳ２）。なお、ステップＳ１の閾値の設定時期は、ステップＳ２のレーザ光照射前に限定されるものではなく、レーザ光照射中又はレーザ光照射後に閾値を設定してもよい。従って、前述したステップＳ２を先に行い、その後ステップＳ１を行うことも可能である。
【００３２】
その後、閾値以上の強度を示した散乱光のうち、例えば上位２つの散乱信号をサンプル流路２のエッジ部からの光として認定し、エッジ部の位置を特定する（ステップＳ３）。次に、レーザ光の走査開始時からエッジ部からの散乱光と認定された散乱光を検出するまでの時間（以下、検出時間という）から、サンプル流路２の流路幅を算出し（ステップＳ４）、その値を記録媒体等に保存する（ステップＳ５）。
【００３３】
次に、サンプル流路２に微小粒子３を含む液を通流させながらレーザ光を照射して、微小粒子３からの散乱光を検出し（ステップＳ６）、検出された散乱光の信号強度及び検出時間等を記録媒体等に保存する（ステップＳ７）。そして、ステップＳ３で求めたサンプル流路２のエッジ部の位置に基づき、各微小粒子３の通流位置を求めると共に、ステップＳ４で求めた流路幅から微小粒子３の通流速度を求める（ステップＳ８）。
【００３４】
次に、本発明の第２の実施形態に係る光学的測定装置について説明する。前述した第１の実施形態の光学的測定装置は、サンプル流路が１本の場合に限らず、複数の流路が形成された基板を使用して測定する場合にも適用することができるが、このような基板を使用する場合は、サンプル流路の配列方向最外部に参照流路を設けて、各参照流路のエッジ部の位置から、各サンプル流路のエッジ部の位置を検出することが望ましい。
【００３５】
図３は本実施形態の光学的測定装置で使用する基板の流路構成の一例を示す平面図であり、図４はその検出部を示す拡大平面図である。本実施形態の光学的測定装置においては、図３に示すサンプル流路１１の外側に参照流路１２ａ，１２ｂが設けられた基板１０を使用して測定を行う。この基板１０の検出部１３には、図４に示すように、一定間隔で複数のサンプル流路１１ａ〜１１ｊが形成されており、その配列方向最外部のサンプル流路１１ａ及びサンプル流路１１ｊの外側には、それぞれ参照流路１２ａ及び参照流路１２ｂが形成されている。これら参照流路１２ａ，１２ｂには、必要に応じて試料を含まない液、サンプル液と異なる散乱光又は蛍光を発する液等を通流させる。
【００３６】
そして、光照射部からサンプル流路１１ａ〜１１ｊ及び参照流路１２ａ，１２ｂの全ての流路に対して、レーザ光等の光を、少なくとも一方の側壁から他方の側壁まで、各流路の幅方向に走査しながら照射し、光検出部において少なくとも各流路のエッジ部及び試料から発せられる散乱光を検出する。
【００３７】
図５は本実施形態の光学的測定装置により検出される散乱光の強度を示す図である。このように流路の幅方向に照射光を走査することにより、図５に示すように、各流路のエッジ部からの散乱信号を得ることができ、これにより各流路のエッジ部の位置を特定することができる。このとき、サンプル流路１１ａ〜１１ｊと参照流路１２ａ，１２ｂとで、相互に異なる検出信号が得られるように、例えば、参照流路１２ａ，１２ｂに、サンプル液よりも強い散乱光が得られる液を通流させることにより、検出されたエッジ部の散乱光が、サンプル流路１１ａ〜１１ｊのものか、参照流路１２ａ，１２ｂのものかを容易に判別することができる。
【００３８】
なお、図３に示すような複数の流路が形成された基板を使用する場合においても、前述した第１の実施形態と同様に、試料を測定する際に併せて各流路のエッジ部を検出することもできるが、各流路のエッジ部の位置を特定した後で試料の測定を行うこともできる。図６はその場合の手順の一例を示すフローチャート図である。予め各流路のエッジ部の位置を特定する場合は、図６に示すように、先ず、参照流路１２ａ，１２ｂに蛍光色素を固定したビーズ（以下、蛍光ビーズと略す）等を充填し、参照流路１２ａ，１２ｂからの散乱光と、サンプル流路１１からの散乱光とが相違するようにする（ステップＳ１１）。
【００３９】
次に、参照流路内の蛍光ビーズの散乱のみを検出するように、閾値を設定する（ステップＳ１２）。その後、各流路に対してその幅方向に少なくとも一方の側壁から他方の側壁まで走査しながら光を照射すると共に（ステップＳ１３）、蛍光ビーズから発せられた散乱光及び各流路のエッジ部から発せられた散乱光を検出し（ステップＳ１４）、それらの値を記録媒体等に保存する（ステップＳ１５）。なお、ステップＳ１２の閾値の設定時期は、ステップＳ１３の光照射前に限定されるものではなく、レーザ光照射中又はレーザ光照射後に閾値を設定することもできる。従って、前述したステップＳ１２とステップＳ１３の順番は、逆にすることも可能である。
【００４０】
そして、閾値以上の強度を示した散乱光のうち、例えば上位２つの散乱信号を参照流路１２ａ，１２ｂのエッジ部からの光として認定し、参照流路１２ａ，１２ｂのエッジ部の位置を特定する（ステップＳ１６）。更に、参照流路１２ａ，１２ｂの検出時間に基づき、各サンプル流路１１ａ〜１１ｊのエッジ部の位置、流路幅及び幅方向の中心位置等を算出する（ステップＳ１７）。以上の工程により、各流路のエッジ部の位置を特定することができたため、後述する工程において、流路のエッジ部からの散乱と、流路内の試料に起因する散乱光とを容易に区別することができる。
【００４１】
次に、各サンプル流路１１ａ〜１１ｊに試料を含む液を通流させながら光を照射して、試料からの散乱光を検出し（ステップＳ１８）、検出された散乱光の信号強度及び検出時間等を記録媒体等に保存する（ステップＳ１９）。そして、ステップＳ１６で求めた各サンプル流路１１ａ〜１１ｊのエッジ部の位置情報に基づき、検出された散乱信号がどのサンプル流路を通流していた試料からのものであるか、またその試料の流路内での通流位置を算出し、更には各サンプル流路１１ａ〜１１ｊの流路幅等から流路ごとに試料の通流速度を算出する（ステップＳ２０）。
【００４２】
以上詳述したように、本実施形態の光学的測定装置においては、参照流路のエッジ部の位置情報に基づいて、各サンプル流路のエッジ部の位置を特定しているため、流路間隔に製造上のばらつきが生じていても、各サンプル流路を通流する試料の位置を正確に検出することができる。これにより、より精度の高い測定を行うことができる。
【００４３】
また、本実施形態の光学的測定装置においては、制御されたポリゴンやガルバノミラー等を使用して照射光を走査することで、各流路の幅ｗ及び間隔を精度よく算出することができる。
【００４４】
更に、流路を流れる液が層流である場合には、中心からの相対速度を把握することも可能となる。これにより、シース液による試料のフォーカシング量調整及びシース液のバランスの調整が容易になる。
【００４５】
なお、本実施形態の光学的測定装置で使用される基板は、図３及び図４に示す構成のものに限定されるものではない。図７（ａ）はサンプル流路と参照流路とで流路幅が異なる基板を示す図であり、図７（ｂ）は図７（ａ）の基板を使用した場合に検出される散乱強度を示す図である。例えば、図７（ａ）に示すように、参照流路２２の幅をサンプル流路２１の幅よりも広くすると、図７（ｂ）に示すように参照流路２２のエッジ部からの散乱信号の間隔Ｗ１が、サンプル流路２１のエッジ部からの散乱信号の間隔Ｗ２よりも広くなる。
【００４６】
このため、図７（ａ）に示す基板では、この信号間隔の相違を利用することにより、参照流路２２に微粒子、蛍光ビーズ及び蛍光液等を充填したり、サンプル液とは異なる散乱を示す液を通流させたりしなくても、参照流路２２とサンプル流路２１とを容易に識別することが可能となる。また、このように幅広な参照流路は、機械加工や成形加工等を利用することができるため、従来に比べて低コストで形成することができる。その結果、低コストで、高精度の測定を行うことができる。
【００４７】
図８（ａ）はサンプル流路と参照流路とで流路深さが異なる基板を示す図であり、図８（ｂ）はその流路形状を示す断面図であり、図８（ｃ）は図８（ａ）の基板を使用した場合に検出される散乱強度を示す図である。また、流路幅だけでなく、例えば、図８（ａ）及び（ｂ）に示すように、参照流路２３の深さを、サンプル流路２１よりも深くしてもよい。これにより、図８（ｃ）に示すように、参照流路２３のエッジ部からの散乱信号の強度が、サンプル流路２１のエッジ部からの散乱信号の強度よりも大きくなるため、参照流路２３とサンプル流路２１とを容易に識別することができる。
【００４８】
図９（ａ）は参照流路を片側に複数設けた基板を示す図であり、図９（ｂ）は図９（ａ）の基板を使用した場合に検出される散乱強度を示す図である。更に、図９（ａ）に示すように、サンプル流路２１の外側に２以上の微細な参照流路２４ａ〜２４ｄを設けることもできる。この場合、図９（ｂ）に示すように、参照流路２４ａ〜２４ｄのエッジ部からの散乱信号と、サンプル流路２１のエッジ部からの散乱信号は、各信号の間隔で判別することができる。
【００４９】
図１０（ａ）はサンプル流路と参照流路とで断面形状が異なる基板を示す平面図であり、図１０（ｂ）及び（ｃ）はその流路形状の一例を示す断面図である。また、図１０（ｄ）及び図１１（ａ）は平面視で曲線状又は破線状の参照流路が形成された基板を示す図であり、図１１（ｂ）は図１１（ａ）に示す基板を使用した場合に検出される散乱強度を示す図である。更にまた、図１０（ａ）〜（ｃ）に示す基板のように、通流方向に対して垂直な断面形状が、サンプル流路２１と参照流路２５とで異なるようにしたり、又は図１０（ｄ）及び図１１（ａ）に示す基板のように、基板表面に平行な断面形状がサンプル流路２１と参照流路２６，２７とで異なるようにしたりすることもできる。
【００５０】
その場合、例えば、図１１（ｂ）に示すように、参照流路２７のエッジ部からの散乱信号と、サンプル流路２１のエッジ部からの散乱信号は、その信号強度で判別することができる。そして、照射光の参照流路２７に対する位置は、参照流路２７からの散乱信号の非対称性で判別することができる。
【００５１】
図１２は波長が異なる複数の光を照射する場合の参照流路を示す図である。更にまた、波長が異なる複数の光を照射する場合でも、図１２に示すように、参照流路２８を複数設けることで、参照流路２８からの散乱信号と、サンプル流路２１からの散乱信号とを容易に識別することができる。
【００５２】
なお、本実施形態の光学的測定装置における上記以外の構成及び効果は、前述した第１の実施形態の光学的測定装置と同様である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は流路の幅方向にレーザ光を走査したとき検出される散乱強度を示す図であり、（ａ）は走査領域に微小粒子が存在していない場合の散乱強度を示し、（ｂ）は走査領域に微小粒子が存在している場合の散乱強度を示す。
【図２】各流路のエッジ部を検出した後、微小粒子の測定を行う場合の手順の一例を示すフローチャート図である。
【図３】本発明の第２の実施形態の光学的測定装置で使用する基板の流路構成の一例を示す平面図である。
【図４】図３に示す検出部を示す拡大平面図である。
【図５】本発明の第２の実施形態の光学的測定装置により検出される散乱光の強度を示す図である。
【図６】図３に示す基板を使用して測定する際に、各流路のエッジ部を検出した後、試料の測定を行う場合の手順の一例を示すフローチャート図である。
【図７】（ａ）はサンプル流路と参照流路とで流路幅が異なる基板を示す図であり、（ｂ）は（ａ）の基板を使用した場合に検出される散乱強度を示す図である。
【図８】（ａ）はサンプル流路と参照流路とで流路深さが異なる基板を示す図であり、（ｂ）はその流路形状を示す断面図であり、（ｃ）は（ａ）の基板を使用した場合に検出される散乱強度を示す図である。
【図９】（ａ）は参照流路を片側に複数設けた基板を示す図である。（ｂ）は（ａ）の基板を使用した場合に検出される散乱強度を示す図である。
【図１０】（ａ）はサンプル流路と参照流路とで断面形状が異なる基板を示す平面図であり、（ｂ）及び（ｃ）はその流路形状の一例を示す断面図であり、（ｄ）は平面視で曲線状の参照流路が形成された基板を示す図である。
【図１１】（ａ）は平面視で破線状の参照流路が形成された基板を示す図であり、（ｂ）は（ａ）に示す基板を使用した場合に検出される散乱強度を示す図である。
【図１２】波長が異なる複数の光を照射する場合の参照流路を示す図である。
【図１３】特許文献３に記載された従来のマイクロチップの流路構成を示す平面図である。
【符号の説明】
【００５４】
１  レーザ光
２、１１、１１ａ〜１１ｊ、２１  サンプル流路
３  微小粒子
１０、１０１  基板
１２ａ、１２ｂ、２２、２３、２４ａ〜２４ｄ、２５〜２８  参照流路
１３  検出部
１００  マイクロチップ
１０２  検体導入口
１０３ａ〜１０３ｃ  検体流路
１０４  参照流路
１０５ａ〜１０５ｃ  試薬流路
１０６ａ〜１０６ｃ  合流流路
１０７  検出部
ｗ、Ｗ１、Ｗ２  流路幅
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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