(57)【要約】      （修正有）【課題】１型ヘルパーT細胞（以下、Th1細胞と略す）と2型ヘルパーT細胞（以下、Th2と略す）のバランスの乱れを改善し、Th2細胞優位な状態からTh1細胞優位な状態に誘導することにより、Th2細胞優位な状態に基因するアレルギー性の疾患やその他の炎症性疾患を改善・治療または予防できる医薬品、化粧品、飲食品、その他製品の提供。【解決手段】マイタケの子実体または菌糸体を熱水抽出し、抽出水溶性画分にアルコールを添加し、放置後、液面、もしくは液中に浮遊または容器に付着する物質を採取して得られるマイタケ抽出物を有効成分とする、Th1細胞／Th2細胞のバランスの乱れを改善し、Th２細胞優位な状態からTh１細胞優位な状態への誘導剤。該誘導剤を含有する医薬品、化粧品、飲食品、ペットフード、家畜飼料または家畜飼料添加剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイタケの子実体または菌糸体を熱水抽出し、抽出水溶性画分にアルコールを添加し、放置後、液面、もしくは液中に浮遊または容器に付着する物質を採取して得られるマイタケ抽出物を有効成分とすることを特徴とするTh１細胞／Th２細胞のバランスの乱れを改善し、Th２細胞優位な状態からTh１細胞優位な状態への誘導剤。
【請求項２】
請求項１記載のマイタケ抽出物をクロマトグラフィーで精製して得られる多糖−タンパク質複合体を有効成分とすることを特徴とするTh１細胞／Th２細胞のバランスの乱れを改善し、Th２細胞優位な状態からTh１細胞優位な状態への誘導剤。
【請求項３】
請求項２記載の多糖−タンパク質複合体において、糖とタンパク質の比率が６５：３５〜９０：１０であることを特徴とするTh１細胞／Th２細胞のバランスの乱れを改善し、Th２細胞優位な状態からTh１細胞優位な状態への誘導剤。
【請求項４】
請求項２または３記載の多糖−タンパク質複合体において、多糖を主成分とし糖の部分がβ−１，６結合を主鎖としαおよびβ−１，４結合を分枝鎖またはそのいずれかを分枝鎖として有するグルカンであることを特徴とするTh１細胞／Th２細胞のバランスの乱れを改善し、Th２細胞優位な状態からTh１細胞優位な状態への誘導剤。
【請求項５】
請求項２記載の多糖−タンパク質複合体をタンパク質分解酵素で処理して得られる多糖体を有効成分とすることを特徴とするTh１細胞／Th２細胞のバランスの乱れを改善し、Th２細胞優位な状態からTh１細胞優位な状態への誘導剤。
【請求項６】
請求項５記載の多糖体において、β−１，６結合を主鎖としαおよびβ−１，４結合を分枝鎖またはそのいずれかを分枝鎖として有するグルカンであることを特徴とするTh１細胞／Th２細胞のバランスの乱れを改善し、Th２細胞優位な状態からTh１細胞優位な状態への誘導剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の誘導剤を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の誘導剤を含有することを特徴とするアレルギー性疾患予防・改善または治療剤。
【請求項９】
請求項８記載のアレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎であることを特徴とするアトピー性皮膚炎予防・改善または治療剤。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の誘導剤を含有することを特徴とする化粧品。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載の誘導剤を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載の誘導剤を含有することを特徴とするペットフード、家畜飼料または家畜飼料添加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１型ヘルパーT細胞（以下、Th1細胞と略す）と2型ヘルパーT細胞（以下、Th2と略す）のバランスの乱れを改善し、Th2細胞優位な状態からTh1細胞優位な状態に誘導するマイタケ抽出物、マイタケ由来の多糖−タンパク質複合体およびマイタケ由来の多糖体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性疾患は、現在環境の変化により年々増加の一途をたどっている。花粉症はわが国では戦前は皆無か、あってもまれといわれていたが、最近はスギ花粉症だけでも人口の１０％を超える地域もある。また、花粉症を含めたアレルギー性鼻炎の罹患率は発症年齢も若年化している。
【０００３】
一方、以前はアトピー性皮膚炎とは小児の病気であり、成長に伴って軽快・完治することが多かった。しかし最近は成人の発症も増えていると推定されている。このようにわが国において間違いなくアレルギー性疾患は増加し、欧米でも１０年間に２０〜５０％の率で増加しているとの指摘があり、この増加はわが国だけでなく先進国共通の現象であることがうかがえる(小川秀興等:日本医師会雑誌第１３３巻第４号４８８〜４８９頁(２００６)非特許文献１)。
【０００４】
生活環境や食生活の変化、ストレス等の要因により上述のように成人での発症、再発の例が増加しているアトピー性皮膚炎患者ではTh1細胞／Th2細胞のバランスが乱れ、Th2細胞優位となり、このTh2細胞により生産されるサイトカインであるIL-4等によりIgEの産生がおこり、炎症を亢進させる。一方、Th1細胞のサイトカインであるIFN-γはTh2細胞の活性化を抑制し、IgEの産生を減少させ、抗炎症的に働くと言われている。
【０００５】
本発明者は、マイタケは日本において食経験が豊かで、しかも国内で管理された工場で生産されているところから、研究素材として強い関心をもち、長年にわたり研究を行ってきた。そして、マイタケの子実体や菌糸体から抽出した糖−タンパク質複合体に免疫増強作用や抗腫瘍作用があることを見出している（特開平９−２３８６９７号公報、特許文献１）（特開２００７−３１６６５号公報、特許文献２）。
【０００６】
一方、本発明者はマイタケの子実体や菌糸体からの抽出物に免疫抑制効果のあること（特開平６−３１２９３４号公報、特許文献３）やマイタケ由来の、β−１，６結合を主鎖としα−１，４分岐鎖を有するプロテオグルカンがインスリン非依存型糖尿病の治療や予防に有用であること（特開平１０−１８２７０２号公報、特許文献４）も見出している。
【０００７】
【特許文献１】特開平９−２３８６９７号公報
【特許文献２】特開２００７−３１６６５号公報
【特許文献３】特開平６−３１２９３４号公報
【特許文献４】特開平１０−１８２７０２号公報
【非特許文献１】小川秀興等:日本医師会雑誌第１３３巻第４号４８８〜４８９頁(２００６)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、Th1細胞／Th2細胞のバランスの乱れを改善し、Th2細胞優位な状態からTh1細胞優位な状態に誘導することにより、Th2細胞優位な状態に基因するアレルギー性の疾患やその他の炎症性疾患を改善・治療または予防できる医薬品、化粧品、飲食品、その他製品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、免疫担当細胞であるヘルパーT細胞について研究を進める中で、マイタケ抽出物やマイタケ由来の成分にTh1細胞／Th2細胞のバランスの乱れを改善し、Th1細胞優位な状態に誘導する働きのあることを知見するに至り本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は
(１)マイタケの子実体または菌糸体を熱水抽出し、抽出水溶性画分にアルコールを添加し、放置後、液面、もしくは液中に浮遊または容器に付着する物質を採取して得られるマイタケ抽出物を有効成分とすることを特徴とするTh１細胞／Th２細胞のバランスの乱れを改善し、Th２細胞優位な状態からTh１細胞優位な状態への誘導剤、
(２)(１)記載のマイタケ抽出物をクロマトグラフィーで精製して得られる多糖−タンパク質複合体を有効成分とすることを特徴とするTh１細胞／Th２細胞のバランスの乱れを改善し、Th２細胞優位な状態からTh１細胞優位な状態への誘導剤、
(３)(２)記載の多糖−タンパク質複合体において、糖とタンパク質の比率が６５：３５〜９０：１０であることを特徴とするTh１細胞／Th２細胞のバランスの乱れを改善し、Th２細胞優位な状態からTh１細胞優位な状態への誘導剤、
(４)(２)または(３)記載の多糖−タンパク質複合体において、多糖を主成分とし糖の部分がβ−１，６結合を主鎖としαおよびβ−１，４結合を分枝鎖またはそのいずれかを分枝鎖として有するグルカンであることを特徴とするTh１細胞／Th２細胞のバランスの乱れを改善し、Th２細胞優位な状態からTh１細胞優位な状態への誘導剤、
(５)(２)記載の多糖−タンパク質複合体をタンパク分解酵素で処理して得られる多糖体を有効成分とすることを特徴とするTh１細胞／Th２細胞のバランスの乱れを改善し、Th２細胞優位な状態からTh１細胞優位な状態への誘導剤、
(６)(５)記載の多糖体において、β−１，６結合を主鎖としαおよびβ−１，４結合を分枝鎖またはそのいずれかを分枝鎖として有するグルカンであることを特徴とするTh１細胞／Th２細胞のバランスの乱れを改善し、Th２細胞優位な状態からTh１細胞優位な状態への誘導剤、
(７)(１)〜(６)のいずれかに記載の誘導剤を含有することを特徴とする医薬品、
(８)(１)〜(６)のいずれかに記載の誘導剤を含有することを特徴とするアレルギー性疾患予防・改善または治療剤、
(９)(８)記載のアレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎であることを特徴とするアトピー性皮膚炎予防・改善または治療剤、
(１０)(１)〜(６)のいずれかに記載の誘導剤を含有することを特徴とする化粧品、
(１１)(１)〜(６)のいずれかに記載の誘導剤を含有することを特徴とする飲食品、
(１２)(１)〜(６)のいずれかに記載の誘導剤を含有することを特徴とするペットフード、家畜飼料または家畜飼料添加剤
に関する。
【００１１】
本発明においてマイタケは、マイタケ（Grifola frondosa）、白マイタケ（Grifola albicans Imaz.）、チョレイマイタケ（Dendropolyporus umbellatus）等いずれも用いることができ、使用形態としては生のものはそのままもしくは適宜カットした状態で、乾燥したものも同様そのまま、適宜カットした状態もしくは粉末で使用することができる。抽出効率を高めるためには、乾燥粉末を用いるのが好ましい。乾燥の方法としては、天日、温風、熱風、赤外線、凍結乾燥等いずれも用いることができる。
【００１２】
熱水抽出の方法としては、５０〜１３５℃で１５分から３時間行う。短時間で行うには、圧力下１００℃以上、たとえば圧力釜を用いて１〜２気圧下１２０℃前後で３０分〜１時間前後抽出を行う。
【００１３】
水としては、蒸留水、精製水、イオン交換水、水道水等使用できる。例えば乾燥マイタケ１重量に対して４〜５０倍容量程度を目安に使用する。生マイタケを使用する場合は、１重量に対して２〜２０倍程度を目安に使用する。
【００１４】
得られた熱水抽出溶液に添加するアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール等使用しうるが、エタノールを使用するのが好ましい。アルコールは抽出液に対して最終容量濃度で１０〜８０％、好ましくは３０〜６０％になるように添加する。添加後は１〜４５℃、好ましくは１〜２５℃の温度で１〜２０時間放置すると、液面もしくは液中に浮遊または容器の壁面に付着する物質が現れるのでこれら物質をろ過、ピぺット、遠心分離、網状のもので掬う等して採取する。
【００１５】
採取した物質は暗黒色の外観を呈し、アンスロン反応およびローリー反応陽性で糖とタンパク質を含有している。このまま利用することができるが、さらにクロマトグラフィーにより精製することができる。クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等一般に使用されているものが、また装置の面から、オープンカラム、高性能ポンプ、ＵＶモニターを併用した高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)等が包含される。交換体としては一般に使用されているものが使用しうるが、特にアガロース系、セルロース系のものが好ましい。最終産物は淡黄色を示す。
【００１６】
本発明における多糖−タンパク質複合体とは、多糖体と、タンパク質もしくはペプチドとからなる物質を意味し、両成分の結合様式がどのようなものであれ、構造がどのようなものであれ包含される。
【００１７】
上記のようにして得られた多糖−タンパク質複合体の物性、性状は以下の通りである。
外観：淡黄色の液体
呈色反応：アンスロン反応及びローリー反応陽性
糖とタンパク質の比率：  ６５：３５〜９０：１０
平均分子量：２０００００〜５５００００
【００１８】
多糖−タンパク質複合体を、タンパク質分解酵素で処理してタンパク質もしくはペプチドを除いた多糖体を塩酸で酸分解したところグルコースが得られ、多糖体はグルカンであることが確認された。さらに多糖体であるグルカンは、これを箱守法によるメチル化や、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼによる酵素分解等の試験の結果、β−１，６結合を主鎖とし、αおよびβ−１，４結合を分枝鎖またはそのいずれかを分枝鎖として有するグルカンであることが確認された。
【００１９】
以上のようにして得られた多糖−タンパク質複合体についてアトピー性皮膚炎モデルマウスを用いて疾患の改善効果を調べた。
【００２０】
Picryl chlorideを雌性NC/Ngaマウスの背部に塗布することで感作、誘発を行い、皮膚炎所見および血中IgE量増加によりアトピー性皮膚炎発症を確認した。次に、感作３日前より、本発明の多糖−タンパク質複合体を連日塗布し、誘発後４５日目に皮膚炎所見を調べたところ、症状の憎悪を有意に抑制するとともに、血中IgEも有意な差で減少した。一方、脾臓においては、Th2サイトカインであるIL-４のmRNA発現量減少が、また鼠径リンパ節においてTh1サイトカインであるIFN-γの発現量の増加がみられた。しかし、免疫抑制的な機能をもつCD4＋CD25＋Regulatory T細胞の脾臓における割合に変化は認められなかった。
【００２１】
以上試験の結果、本発明のマイタケ由来の多糖−タンパク質複合体はTh1細胞の応答を有意に誘導する事により血中のIgE産生量を減少させ、アレルギー性疾患、その他Th2細胞優位な状態に基因する疾患の予防、改善または治療に有効であることが分かった。
【００２２】
アレルギー疾患としては、具体的には、例えばアトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、じんま疹、接触皮膚炎、アレルギー性気管支喘息、食物性アレルギー、薬剤アレルギー、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、アナフィラキシー等があげられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明のマイタケ抽出物、マイタケ由来の多糖−タンパク質複合体およびマイタケ由来の多糖体を有効成分とするTh1細胞／Th2細胞のバランスの乱れを改善し、Th2細胞優位な状態からTh1細胞優位な状態への誘導剤を含有する医薬品とする場合は、医薬製剤に使用される担体、賦形剤、その他添加剤を配合した種々の剤形でヒトもしくは動物に投与することができる。
【００２４】
本発明の目的物は経口的または非経口的に投与可能である。経口投与するためには、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤、液剤、もしくはシロップ剤さらには吸入エアゾール等に応用可能である。非経口投与は外用剤、座剤、注射剤等が応用可能である。アトピー性喘息には吸入エアゾール、アトピー性皮膚炎には外用剤としての用途がある。
【００２５】
本発明の目的物は、水に溶け、水溶液の液性も中性〜弱酸性で、皮膚のｐＨに一致してマイルドで、外用剤、化粧品として例えば、軟膏剤、クリーム剤、乳液剤、液剤、エアゾール剤として、さらには石鹸、シャンプー、ボディーシャンプー、浴用剤として応用できる。外用剤の中には、医薬品のほか医薬部外品、化粧品の中にはスキンケアー、ヘアケアー製品等も包含される。Th2細胞優位な状態に基因するアレルギー性疾患、例えば、アトピー性皮膚炎やアレルギー性鼻炎等は慢性的経過をたどるケースが多く、これら疾患の予防、改善、治療に外用剤、化粧品は有用な利用形態である。
【００２６】
本発明の目的物は飲食品としてあるいは飲食品に配合して用いることができる。本発明における飲食品とは、牛乳、ドリンク等の飲料、あるいは日常食している食品に限定されるものではなく、いわゆる健康食品や栄養補助食品、栄養機能食品や特定機能食品を含めた保険機能食品、さらには病者用食品や高齢者用食品を含めた特別用途食品等、飲食品の範疇に含まれるものはすべて包含される。
【００２７】
ペットや家畜類におけるアレルギー性疾患、その他Th2細胞優位な状態に起因する疾患に、本発明の目的物は、ペットフード、飼料として、あるいはそれらに添加して適宜用いることができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のマイタケ抽出物、マイタケ由来の多糖−タンパク質複合体およびマイタケ由来の多糖体はTh1細胞／Th2細胞のバランスの乱れを改善し、Th2細胞優位な状態からTh1細胞優位な状態に誘導することにより、アレルギー性疾患、その他Th2細胞優位な状態に起因する疾患の予防、改善または治療することができ、しかも安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
（１）抽出方法
マイタケ子実体の乾燥粉末１５０ｇに精製水１Ｌを加え、オートクレーブ中、加圧下、１２１℃で３０分間熱水抽出を行い、抽出液８５０ｍｌを得た。該抽出液にエタノールを最終容量濃度が３０〜６０％になるように加え、４℃前後で１２時間静置し、液面、もしく液中に浮遊または容器に付着する物質を、遠心分離して暗黒色の液状の物質を採取した。
【００３１】
（２）精製法
採取した抽出物を精製水に溶解したのち、DEAE-SepharoseCL-6B(3×60cm)カラムに適用し、０．０１２５Mトリス塩酸緩衝液を用いて溶出した。クロマトグラム上に二つのピークが現れ、試料注入時からの保持時間の短い頂点をピーク１、長い頂点をピーク２とし、それぞれピーク部分を採取した。
【００３２】
（３）物性試験
１）上記（２）で得られた精製物であるピーク1およびピーク2を8Ｍ尿素液で洗浄処理した後、シュリーレン分析で単一ピークを示したことから多糖−タンパク質複合体と同定した。
２）上記（２）で得られた精製物をトリプシン（豚膵臓由来）溶液（ｐH6.8）で３７℃、２時間処理したのち、さらにプロテアーゼ（Aspergillus oryzae由来）溶液（pH8.2）で24時間処理した。以上のように処理して得たタンパク質を除いた多糖体画分を３M HClで100℃60分処理した。その結果糖としてはグルコースのみが遊離物として検出され多糖体はグルカンであることが確認された。
３）上記２）の結果得られたグルカンとタンパク質をそれぞれアンスロンおよびローリー法で分析を行った結果、糖とタンパク質の比率は以下のとおりであることが確認された。
ピーク１    糖：タンパク質＝  ６５：  ３５        
ピーク２    糖：タンパク質＝  ９０：  １０        
【００３３】
上記２）で得られたグルカンの化学構造を解析するために箱守法でメチル化した後ＧＬＣ分析を行い、ピーク面積から表１に示す結果を得た。
【００３４】
【表１】
2009209092.tif 000002
【００３５】
１，４，６位の炭素結合を持つ２，３-di-methyl glucoseが２モル、１，６位に結合を持つ２，３，４-tri-methyl glucoseが２モルおよび1位に結合を持つ２，３，４，６-tetra-methyl glucoseが１モル得られた。
【００３６】
次いで、上記２）で得られたグルカンをα-、β-グルコシダーゼによる酵素分解を行った結果、いずれの酵素処理によってもグルコースの遊離を認め、かつ、大幅な分子量の低下を認めなかった。従ってこれらの酵素で切断されたのは分枝鎖であると認めた。
【００３７】
以上の結果より、多糖−タンパク質複合体の多糖体部分はβ−１，６結合を主鎖とし、αおよびβ−１，４結合を分枝鎖またはそのいずれかを分枝鎖として有するグルカンであることが判明した。
【００３８】
(４)分子量
上記のごとく得られた多糖−タンパク質複合体ならびに多糖をゲルろ過クロマトグラフィーによりそれぞれ検討した結果、
多糖−タンパク質複合体の平均分子量：２０００００〜５５００００
多糖（グルカン）の平均分子量：１５００００〜５０００００
であると確認した。
【実施例２】
【００３９】
動物試験
雌性NC/Ngaマウスの背部に、picryl chlorideを塗布することで感作、誘発を行い、皮膚炎所見および血中IgE量増加によりアトピー性皮膚炎の発症を確認した。
【００４０】
次に、感作３日前よりマウス背部に、対照として生理食塩水、実施例１で得たピーク１、ピーク２の物質それぞれ4mg/kg/day を連日塗布し、誘発後２１日、３３日、３６日および４５日皮膚炎所見を調べた。結果は表２に示すごとく、対照に比較して本発明の物質はスコアーの値が低く症状の増悪を有意に抑制し、アトピー性皮膚炎の発症が少ないことが示された。
【００４１】
【表２】
2009209092.tif 000003
【００４２】
感作誘発後３６日目血中のIgＥ量の測定結果を表３に示す。対照に比較して本発明の物質はIgE産生を有意に減少させており、マスト細胞からのヒスタミンの遊離が抑制される。  
【００４３】
【表３】
2009209092.tif 000004
【００４４】
一方、感作誘発３６日目脾臓におけるTh2細胞のサイトカインであるIL-4のmRNA発現量、並びにTh1細胞のサイトカインであるIFN-γのmRNA発現量を調べた結果を表４に示す。本発明の物質の塗布群が、対照に比較して明らかにIL-4の発現量が少なく、IFN-γの発現量の増加がみられ、本発明の物質ピーク１およびピーク２いずれもTh1優位に導いていることが示された。
【００４５】
【表４】
2009209092.tif 000005