(57)【要約】【課題】できるだけ試料に光を当てる時間を短くして観察を行うことを可能にする撮像型顕微鏡装置における透過ディテクタのゲインの決定方法を提供する。【解決手段】蛍光を使用した試料の観察が終わったら、装置の状態を変化察せず、そのときの画像の明るさをＴ、前記光源１１１の光量をＬとするとき、透過ディテクタ１１３のゲインＧをＧ＝Ｔ／（Ｌ・α）    …（１）として求める。ただし、αは、照明装置の対物レンズ１１８ａ〜１１８ｃと透過ディテクタ１１３との間にある光学要素によって予め定まる定数である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの光により試料を照明する照明装置と、前記試料からの観察光を受光して、前記試料の画像を形成する撮像装置と、前記試料を透過した光を受光して光量を測定する透過ディテクタとを有する撮像型顕微鏡装置における、前記透過ディテクタゲイン決定方法であって、前記試料からの観察光を用いて、前記試料の画像を形成したときの当該画像の明るさをＴ、前記光源の光量をＬとするとき、前記透過ディテクタのゲインＧを
Ｇ＝Ｔ／（Ｌ・α）    …（１）
として求めることを特徴とする撮像型顕微鏡装置における透過ディテクタのゲイン決定方法。
ただし、αは、前記照明装置の対物レンズと前記透過ディテクタとの間にある光学要素によって予め定まる定数である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、撮像型顕微鏡装置における透過ディテクタのゲインの決定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光源からの光により試料を照明し、前記試料からの反射光又は蛍光を、光電変換装置により電気信号に変換し、前記光電変換装置の出力から、前記試料の画像を形成する撮像型顕微鏡装置の例として、コンフォーカル顕微鏡がある。
【０００３】
コンフォーカル顕微鏡は、観察対象上に照射したスポット光を２次元走査しながら、観察対象からの光を測定することにより、顕微鏡画像を取得する光学顕微鏡である。画像の取得には観察対象に応じて、対物レンズの切り替えによって倍率の調整を行い、光源の光量値や受光素子（光電変換装置）のゲイン値などを調整することで、画像の明るさを調整する。
【０００４】
コンフォーカル顕微鏡の特徴であるピンホールによって、焦点の合った試料面からの光のみを通し，それ以外の光はピンホールの壁に遮られて、焦点面以外からの光は除去されることで鮮明な画像が得られる。焦点面のＺ方向位置（光軸方向位置）を調整することで試料の特定の断層だけを観察することができるため、高低差のある試料の場合でも、すべての部分で焦点の合った画像が得られる。
【０００５】
コンフォーカル顕微鏡は、上記に示すように多くの観察光学系の調整が必要で、このような対物レンズなどの光学パーツの切り替えに伴って生じる画像の明るさの変化の調整は、従来のコンフォーカル顕微鏡においては、倍率を変更する毎に、得られる画像の明るさの調整を輝度情報の信号のレベル調整を行うことで実施してきた。例えば、手動調整型の可変利得増幅器を通して輝度情報の信号を画像表示装置に与えるように構成し、対物レンズの切り替えに伴って画像の明るさが変化したときは、可変利得増幅器のゲインを手動調整することにより、最適な明るさの画像に調整するようにしてきた。
【０００６】
また、コンフォーカル顕微鏡の基本的な操作方法として、始めにピンホール径を大きなもので焦点面を合せながら顕微鏡画像の明るさの調整をおこなう。調整後、徐々にピンホール径を小さくしながら観察面を絞り込む。ピンホール径を小さくすることによって、より焦点面に近い部分からの光のみを得ることができ、特定の面のみ焦点の合った画像を取得することができる。
【０００７】
又、このようなコンフォーカル顕微鏡においては、蛍光や反射光から画像を得るだけでなく、試料を透過した光の強さを測定する透過ディテクタを有するものがある。このような顕微鏡においては、蛍光や反射光から画像を得た後で、透過ディテクタの適当なゲインを得るために、その出力を観察しながら、光源や、透過ディテクタのゲインの調整を行うことが行われてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような撮像型顕微鏡は、生体試料を観察するのに使用されることが多い。この場合、画像の明るさを調整するために、何回も光を生体試料に照射し、画像を取得して光源や受光素子のゲインの調整を行うと、試料にダメージを与えるという問題がある。又、受光により、蛍光色素からの蛍光が弱くなるという問題がある。よって、生体試料を観察する場合には、できるだけ試料に光を当てる時間を短くして観察を行うことが求められてきた。
【０００９】
しかしながら、既に述べたように、１回の試料の観察には、何回もの光学系の調整が必要であった。又、例えば、３つの蛍光色素を含むサンプルでは、光量、およびゲインの調整を３回繰り返す必要がある。そのために、試料に光を当てる時間が長くならざるを得ない。透過ディテクタのゲイン調整は、これらの調整が完了した状態で可能となる。従来は、透過ディテクタのゲイン調整は、それぞれの場合に光源から照射されたすべての光について、行われてきた。そのために、試料が照射される時間が長くならざるを得ないという問題があった。
【００１０】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、できるだけ試料に光を当てる時間を短くして観察を行うことを可能にする撮像型顕微鏡装置における透過ディテクタのゲインの決定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題は、光源からの光により試料を照明する照明装置と、前記試料からの観察光を受光して、前記試料の画像を形成する撮像装置と、前記試料を透過した光を受光して光量を測定する透過ディテクタとを有する撮像型顕微鏡装置における、前記透過ディテクタゲイン決定方法であって、前記試料からの観察光を用いて、前記試料の画像を形成したときの当該画像の明るさをＴ、前記光源の光量をＬとするとき、前記透過ディテクタのゲインＧを
Ｇ＝Ｔ／（Ｌ・α）    …（１）
として求めることを特徴とする撮像型顕微鏡装置における透過ディテクタのゲイン決定方法により解決される。
【００１２】
ただし、αは、前記照明装置の対物レンズと前記透過ディテクタ間にある光学要素によって予め定まる定数である。
【００１３】
本発明においては、透過ディテクタのゲインを、出力を観察しながら光源の調整等を行って求めるのでなく、試料からの蛍光から、試料の画像を形成したときの当該画像の明るさＴと、光源の光量Ｌをそのままにしておき、計算により求めているので、透過ディテクタのゲインを調整するために試料を照射する必要が無く、その分、試料を照射する時間を短くすることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、できるだけ試料に光を当てる時間を短くして観察を行うことを可能にする撮像型顕微鏡装置における透過ディテクタのゲインの決定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態の例を、図を用いて説明する。図１は、本発明の実施の形態である撮像型顕微鏡装置における画像の明度の調整方法を使用するコンフォーカル顕微鏡の概略構成図である。この顕微鏡システムは、顕微鏡本体１０１、ＣＰＵ１０２、操作部１０３、メモリ１０４、およびモニタ１０５を備える。
【００１６】
顕微鏡本体１０１は、光源１１１、ダイクロイックミラー１１２、２次元走査機構１１４、瞳投影レンズ１１５、結像レンズ１１６、１２１、対物レンズ保持レボルバ１１７、ミラー１２０、ピンホール１２２、および受光素子１２３を含む。
【００１７】
レボルバ１１７には、複数の対物レンズ１１８ａ、１１８ｂ、１１８ｃが取り付けられている。ここでは、便宜的に３つの対物レンズが図示されているが、一般にレボルバ１１７に取り付けられる対物レンズの数は任意である。また、顕微鏡本体１０１における観察対象は試料１１９であり、光源１１１はこの試料１１９を照明するための発光源であって、例えば、レーザ光源が使用される。
【００１８】
この場合、観察光学系としては、光源１１１からの照明光を試料１１９に照射し、試料１１９からの光を受光素子１２３に導く共焦点光学系が設けられている。共焦点光学系の受光部は、結像レンズ１２１、ピンホール１２２、および受光素子１２３からなり、ピンホール１２２は、試料１１９上の結像位置と光学的に共役な位置に配置されている。
【００１９】
光源１１１から出射された照明光は、ダイクロイックミラー１１２を通過し、２次元走査機構１１４に導かれる。２次元走査機構１１４は、照明光を２次元走査することで、試料１１９上でスポット光をＸ−Ｙ方向に走査する。２次元走査機構１１４としては、例えば、ガルバノミラーが使用される。
【００２０】
２次元走査機構１１４によりＸ−Ｙ走査された照明光は、瞳投影レンズ１１５および結像レンズ１１６を通過して、対物レンズ１１８ｂに導かれる。対物レンズの切り替えはレボルバ１１７を回転させて、照明光の光路上に配される対物レンズを変更することにより行われる。レボルバ１１７の回転は電動で行ってもよく、手動で行ってもよい。
【００２１】
このとき、２次元走査機構１１４によりＸ−Ｙ走査された照明光は、対物レンズ１１８ｂの瞳位置を常に通過するよう構成されている。対物レンズ１１８ｂを通過した照明光は、対物レンズ１１８ｂにより試料１１９上に集光されてスポット光となり、試料１１９上をＸ−Ｙ方向に走査する。
【００２２】
照明光による試料１１９からの光は、対物レンズ１１８ｂ、結像レンズ１１６、瞳投影レンズ１１５、２次元走査機構１１４に導かれ、非走査光に変換されてダイクロイックミラー１１２に到達する。このとき、ダイクロイックミラー１１２によって光は、光源１１１の方ではなく受光素子１２３の方へと導かれる。
【００２３】
受光素子１２３へと導かれる光は、ダイクロイックミラー１１２においてある波長以上の光だけとなる。結像レンズ１２１、ピンホール１２２、および受光素子１２３からなる共焦点光学系の受光部へと導かれる。
【００２４】
受光素子１２３は、光の輝度情報を検出し、電気信号に変換して出力する素子である。これらの受光素子としては、例えば、フォトマルチプライヤ、フォトダイオード等が使用される。フォトマルチプライヤの場合は、その印加電圧によって感度を調節することで、出力される電気信号のゲインが決定される。また、フォトダイオードの場合は、内蔵された増幅回路を調節することで、出力される電気信号のゲインが決定される。
【００２５】
受光素子１２３から出力された電気信号は、データ処理により画像データに変換され、顕微鏡画像としてモニタ１０５の画面上に表示される。このとき、受光素子１２３から出力される電気信号の大きさによって、表示される顕微鏡画像の明るさが決定される。
【００２６】
ＣＰＵ１０２およびメモリ１０４は、例えば、パーソナルコンピュータ等の情報処理装置（コンピュータ）に相当し、メモリ１０４にはＲＯＭが含まれる。ＣＰＵ１０２は、メモリ１０４を利用して制御プログラムを実行することにより、顕微鏡本体１０１を制御し、画像の明るさ調整のために必要な処理を行う。これにより、レボルバ１１７および受光素子１２３、１２４がＣＰＵ１０２により制御される。
【００２７】
ＣＰＵ１０２が使用するプログラムおよびデータは、ＨＤＤ等の任意のコンピュータ読み取り可能な記録媒体を介してメモリ１０４にロードすることができる。また、これらのプログラムおよびデータを、外部の装置から通信ネットワークを介してメモリ１０４にロードすることも可能である。この場合、その外部の装置は、プログラムおよびデータを搬送する搬送信号を生成し、通信ネットワークを介してコンフォーカル顕微鏡に送信する。
【００２８】
操作部１０３は、例えば、キーボード、マウス等のポインティングデバイス、タッチパネル等の入力装置であり、不図示のＧＵＩを介して、操作者からの指示や情報をＣＰＵ１０２に入力する。また、モニタ１０５は、顕微鏡画像を表示する表示装置であり、画像とともにＧＵＩの操作画面も表示する。
【００２９】
又、このコンフォーカル顕微鏡は、透過ディテクタ１１３を有しており、試料１１９を通過した光は、透過ディテクタ１１３へと導かれる。透過ディテクタ１１３は、光の輝度（光量）情報を検出し、電気信号に変換して出力する素子である。これらの受光素子としては、例えば、フォトマルチプライヤ、フォトダイオード等が使用される。フォトマルチプライヤの場合は、その印加電圧によって感度を調節することで、出力される電気信号のゲインが決定される。また、フォトダイオードの場合は、内蔵された増幅回路を調節することで、出力される電気信号のゲインが決定される。
【００３０】
図２は、本発明の実施の形態である撮像型顕微鏡装置における透過ディテクタのゲインの決定方法の概要を示す図である。
【００３１】
操作者は、はじめに試料１１９を顕微鏡本体１０１にセットして顕微鏡システムを起動し、走査を開始する（ステップＳ１）。次に、観察に使用する対物レンズや観察光学系等を設定することにより、ピント調整、顕微鏡画像のズーム調整等を行い、観察したい顕微鏡画像をモニタ１０５に表示させる（ステップＳ２）。次に、操作者は、ＧＵＩから画像の明るさを調整する。これは、光源の光量Ｌや受光素子のゲインを調整することによって行われる（ステップＳ３）。この調整は、操作部１０３を介して手動で行われる。操作部１０３により調整された明るさの値は、ＣＰＵ１０２を介して、現在選択されている観察光学系の受光素子に指示される。又、調整後の光源１１１の光量Ｌが記憶される。
【００３２】
基本的な使い方として、初めに低倍の対物レンズを選択して視野を広くし、ピンホールは最大径のものを選択して視野を明るくする。そして、順次高倍率の対物レンズを使用して順次倍率を拡大し、且つ、順次ピンホールを小さくして、より焦点面に近い部分からの光のみを得る。このように、蛍光を使用した試料の観察は何段階にも亘って行われ、そのたびに、光源の調整、視野の明るさの調整が行われるが、図２では、これらの段階を省略し、最終段階の観察のみを示している。
【００３３】
顕微鏡画像が最適な明るさに調整された後、操作者は、ＧＵＩから、その画像の明るさを望ましい画像の明るさ(基準値)Ｔとして設定する（ステップＳ４）。設定後、AutoGainボタンをクリックする（ステップＳ５）。すると、ＣＰＵ１０２は、そのときの、先に記憶された画像の明るさ情報Ｔ、光源の光量Ｌ、及び透過ディテクタの光学特性パラメータαを読み出し（ステップＳ６、）それらのデータを用いて切り替え後の受光素子のゲイン値Ｇを以下の計算式により算出する（ステップＳ７）。
Ｇ＝Ｔ／（Ｌ・α）    …（１）
【００３４】
ここで、透過ディテクタの光学特性パラメータαは、照明装置の対物レンズと透過ディテクタのゲインとの間にある光学要素（シャーレ、スライドガラス等）によって予め定まる定数である。この光学特性パラメータαは、例えば図３に示されるように、サンプルケースに応じてメモリ１０４に登録されている。
【００３５】
このようにして、透過ディテクタ１１３のゲインＧが決まると、その値が透過ディテクタ１１３に設定され（ステップＳ７）、透過光量の測定が行われる。
【００３６】
透過ディテクタ１１３への光は、生物サンプルにおいては吸収、遮断による光量の変化はほとんど無いものと考えられるため、サンプルごとの違いは無いものと考えられる。よって、上記のように、計算によりゲインを決定しても、ゲインが高すぎて透過ディテクタ１１３の出力が飽和したり、ゲインが低すぎて、出力が小さくＳ／Ｎ比が悪くなったりすることがない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の実施の形態である撮像型顕微鏡装置における画像の明度の調整方法を使用するコンフォーカル顕微鏡の概略構成図である。
【図２】本発明の実施の形態である撮像型顕微鏡装置における透過ディテクタのゲインの決定方法の概要を示す図である。
【図３】光学特性パラメータαの例を示す図である。
【符号の説明】
【００３８】
１０１…顕微鏡本体、１０２…ＣＰＵ、１０３…操作部、１０４…メモリ、１０５…モニタ、１１１…光源、１１２…ダイクロイックミラー、１１３…透過ディテクタ、１１４…２次元走査機構、１１５…瞳投影レンズ、１１６…結像レンズ、１１７…レボルバ、１１８ａ、１１８ｂ、１１８ｃ…対物レンズ、１１９…試料、１２０…ミラー、１２１…結像レンズ、１２２…ピンホール、１２３…受光素子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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