(57)【要約】【課題】有機塩素化合物により汚染された汚染土壌、地下水等を短期間のうちに効率良く、かつ低コストで浄化処理することが可能な微生物の培養方法及び汚染土壌、地下水の浄化方法を提供する。【解決手段】有機塩素化合物を分解する微生物を土壌及び腐植物質を含有する物質のうち少なくとも１つの存在下で培養することにより、有機塩素化合物により汚染された汚染土壌、地下水等を短期間のうちに効率良く、かつ低コストで浄化処理することができる微生物を得ることができる。また、土壌及び腐植物質を含有する物質のうち少なくとも１つの存在下で培養した、有機塩素化合物を分解する微生物を用いることにより、あるいは、土壌及び腐植物質を含有する物質のうち少なくとも１つを添加することにより、有機塩素化合物により汚染された汚染土壌、地下水等を短期間のうちに効率良く、かつ低コストで浄化処理することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機塩素化合物を分解する微生物を土壌及び腐植物質を含有する物質のうち少なくとも１つの存在下で培養することを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物の培養方法であって、
前記土壌が腐植物質を含有することを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の微生物の培養方法であって、
前記腐植物質がフミン酸を含有することを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物の培養方法であって、
前記微生物がデハロコッコイデス属の微生物を含むことを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物の培養方法により培養した微生物を用いて、有機塩素化合物を含む汚染土壌及び地下水のうち少なくとも１つを浄化することを特徴とする汚染土壌、地下水の浄化方法。
【請求項６】
土壌及び腐植物質を含有する物質のうち少なくとも１つを添加して、汚染土壌及び地下水のうち少なくとも１つに含まれる有機塩素化合物を分解することを特徴とする汚染土壌、地下水の浄化方法。
【請求項７】
請求項６に記載の汚染土壌、地下水の浄化方法であって、
前記土壌が腐植物質を含有することを特徴とする汚染土壌、地下水の浄化方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載の汚染土壌、地下水の浄化方法であって、
前記腐植物質がフミン酸を含有することを特徴とする汚染土壌、地下水の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の培養方法及び汚染土壌、地下水の浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）やテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）等の揮発性有機塩素化合物等に代表される有機塩素化合物による地下水等の汚染が深刻化している。このような汚染された地下水等の浄化方法としては、地下水を揚水した後に活性炭や曝気等により地下水中の汚染物質の処理を行うポンプアンドトリート法や、地下水中に酸化剤もしくは還元剤等の化学物質を添加して汚染物質を化学的に分解する手法等の物理化学的処理法が多用されている。
【０００３】
また、汚染環境中に栄養塩や有機物等を添加することにより汚染環境中に存在する汚染物質を分解する分解微生物群の活動を活発化させて汚染物質の分解、無害化を行う方法（バイオスティミュレーション）等の生物化学的処理法（バイオレメディエーション）も物理化学的処理法に比較してコスト的に有利である等の理由から適用され始めている。特に、有機塩素化合物を嫌気的に浄化するための分解微生物の栄養剤として各種の有機物が使用されている（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００４】
嫌気性バイオスティミュレーションにおける塩素化エチレンの主な分解経路は、例えば下記式に示すように塩素が一つずつ脱離していく段階的な反応であり、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）からトリクロロエチレン（ＴＣＥ）、シス−１，２−ジクロロエチレン（ｃ−ＤＣＥ）、ビニルクロライド（塩化ビニル：ＶＣ）を経て最終的に害の少ないエチレンまで分解されると考えられている。
【０００５】
【化１】
2009034073.tif 000002
【０００６】
また、汚染環境中に分解微生物が存在しない場合には、生物化学的処理法（バイオレメディエーション）として、分解微生物を汚染環境の外部で培養して汚染環境に添加する方法（バイオオーグメンテーション）も検討されている（例えば、特許文献４参照）。
【０００７】
【特許文献１】特許第３２３９８９９号公報
【特許文献２】特許第３５６４５７３号公報
【特許文献３】特許第３６９５２９２号公報
【特許文献４】特開２００６−２６２８４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、特許文献１〜３のような方法では、例えば有機塩素化合物、特にシス−１，２−ジクロロエチレンやビニルクロライドをエチレンまで嫌気的に分解する分解微生物を増殖する期間が長くかかり浄化期間が長いことや、汚染環境中に分解微生物が存在しない場合、または分解微生物が存在しても他の土着微生物との競合に負けてしまう場合には有機塩素化合物等の汚染有機化合物をほとんど分解できない等の問題がある。
【０００９】
また、バイオオーグメンテーションでは、汚染環境中に分解微生物が存在しない場合でも有効であるが、例えば有機塩素化合物、上記［化１］における反応において特にシス−１，２−ジクロロエチレンやビニルクロライドをエチレンまで嫌気的に分解する分解微生物を継代培養することは容易ではなく、有機塩素化合物等の汚染有機化合物の分解活性を安定して維持することは困難である。また特許文献４のような方法では培養に手間がかかり、大量に培養できずコストがかかる等の問題がある。
【００１０】
本発明は、有機塩素化合物により汚染された汚染土壌、地下水等を短期間のうちに効率良く、かつ低コストで浄化処理することが可能な微生物の培養方法及び汚染土壌、地下水の浄化方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、有機塩素化合物を分解する微生物を土壌及び腐植物質を含有する物質のうち少なくとも１つの存在下で培養する微生物の培養方法である。
【００１２】
また、前記微生物の培養方法において、前記土壌が腐植物質を含有することが好ましい。
【００１３】
また、前記微生物の培養方法において、前記腐植物質がフミン酸を含有することが好ましい。
【００１４】
また、前記微生物の培養方法において、前記微生物がデハロコッコイデス属の微生物を含むことが好ましい。
【００１５】
また、本発明は、前記微生物の培養方法により培養した微生物を用いて、有機塩素化合物を含む汚染土壌及び地下水のうち少なくとも１つを浄化する汚染土壌、地下水の浄化方法である。
【００１６】
また、本発明は、土壌及び腐植物質を含有する物質のうち少なくとも１つを添加して、汚染土壌及び地下水のうち少なくとも１つに含まれる有機塩素化合物を分解する汚染土壌、地下水の浄化方法である。
【００１７】
また、前記汚染土壌、地下水の浄化方法において、前記土壌が腐植物質を含有することが好ましい。
【００１８】
また、前記汚染土壌、地下水の浄化方法において、前記腐植物質がフミン酸を含有することが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明では、土壌及び腐植物質を含有する物質のうち少なくとも１つの存在下で有機塩素化合物を分解する微生物を培養することにより、有機塩素化合物により汚染された汚染土壌、地下水等を短期間のうちに効率良く、かつ低コストで浄化処理することができる微生物を得ることができる。
【００２０】
また、本発明では、土壌及び腐植物質を含有する物質のうち少なくとも１つの存在下で培養した、有機塩素化合物を分解する微生物を用いることにより、有機塩素化合物により汚染された汚染土壌、地下水等を短期間のうちに効率良く、かつ低コストで浄化処理することができる。
【００２１】
また、本発明では、土壌及び腐植物質を含有する物質のうち少なくとも１つを添加することにより、有機塩素化合物により汚染された汚染土壌、地下水等を短期間のうちに効率良く、かつ低コストで浄化処理することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。特に揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水の浄化に本実施形態に係る方法を適用する場合を中心に説明する。
【００２３】
本発明者らは様々な培地や添加物等を用いて、有機化合物、特に有機塩素化合物の分解促進について検討した結果、有機塩素化合物の主要な分解菌として知られているデハロコッコイデス（Dehalococcoides（学術名））属等を含む微生物群の培養において、土壌を添加することで顕著に分解が促進されることを見出した。また、安定して継代培養することが困難であったデハロコッコイデス属等の菌群を活性を維持したまま安定に培養をすることが可能となった。
【００２４】
さらに、本発明者らは土壌中に含まれる何の成分が有機塩素化合物分解の促進物質であるのかについて詳細に検討した。この結果、通常の土壌中に含有される腐植物質が主に有機塩素化合物の分解を促進することを見出した。
【００２５】
ここで本明細書において「土壌」とは、地殻表面の母岩が風化、崩壊したものに腐植などが加わり、気候や生物などの作用をうけて生成したものを意味する。
【００２６】
また、「腐植物質」とは、植物の葉や茎等の部分が腐植してできた有機成分のことで、地球上において土壌や天然水中に広く分布することが知られている。腐植物質の厳密な定義は国際腐植物質学会（International Humic Substances Society、略称ＩＨＳＳ）において定められている。腐植物質とは土壌をＮａＯＨ等のアルカリで抽出した分画、あるいは天然水でＸＡＤ樹脂（例えば、ローム・アンド・ハース株式会社製、アンバーライトＸＡＤ（登録商標）→不要ならば削除願います）に吸着し希アルカリ水溶液で溶出される分画である。さらに、腐植物質の中で酸により沈殿する分画をフミン酸、沈殿しない分画をフルボ酸と呼ぶ。本発明者らは、標準試薬として販売されているフミン酸を用いて実験を行ったところ、有機塩素化合物の分解促進効果を確認することができた。よって、本実施形態において、腐植物質がフミン酸を含有することが好ましいが、フルボ酸を含有しても良い。
【００２７】
すなわち、本実施形態に係る微生物の培養方法は、有機塩素化合物を嫌気的に分解する微生物を、土壌等の腐植物質を含有する物質（腐植物質含有物質）を添加して培養するものである。
【００２８】
また、有機物および栄養塩等を添加して汚染環境中の微生物を増殖、活性化させて浄化を行うバイオスティミュレーションの他、汚染物質およびそこから生成する副生成物を分解する微生物を積極的に外部から添加するバイオオーグメンテーションに対しても本実施形態に係る方法を好適に使用することができる。すなわち、本実施形態に係る微生物の培養方法で培養した微生物を汚染土壌、地下水、底泥等の汚染環境に添加して、バイオオーグメンテーションを実施することができる。また、土壌等の腐植物質を含有する物質を直接汚染土壌、地下水、底泥等の汚染環境に添加して、バイオスティミュレーションを実施することができる。
【００２９】
分解促進効果の詳細なメカニズムは現状不明であるが、デハロコッコイデス属のような浄化に関与する微生物の増殖を促進するか、または菌あたりの分解活性を促進するものと考えられる。
【００３０】
有機塩素化合物としては、主に四塩化炭素、ジクロロメタン、１，１，１−トリクロロエタン、トリクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、テトラクロロエチレン、ビニルクロライド（塩化ビニル）等の揮発性有機塩素化合物等を対象としているが、揮発性有機塩素化合物以外のダイオキシン類、その他の地下水汚染の浄化に対しても本実施形態に係る方法は有効である。
【００３１】
微生物としては、有機塩素化合物を分解することができる微生物であれば良く特に制限はないが、例えば、有機塩素化合物の分解菌として知られているデハロコッコイデス（Dehalococcoides（学術名））属、硫酸還元菌（Desulfitobacterium（学術名）属等）、ＰＣＥを分解できると知られているメタン菌（Methanosarcina（学術名）属等）、デハロバクター（Dehalobacter（学術名））属、クロストリジウム（Clostridium（学術名））属等が挙げられる。
【００３２】
一般に、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）及びトリクロロエチレン（ＴＣＥ）をシス−１，２−ジクロロエチレン（ｃ−ＤＣＥ）まで嫌気的に分解する微生物は比較的広く存在するが、シス−１，２−ジクロロエチレンをビニルクロライド（ＶＣ）、エチレンまで嫌気的に分解する微生物はその存在が限られている。シス−１，２−ジクロロエチレンをエチレンまで嫌気的に分解する微生物として知られているのがデハロコッコイデス属の微生物である。このデハロコッコイデス属の微生物は通常、場所によっては存在しなかったり、存在したとしてもその量が非常に低い。そのため、テトラクロロエチレンやトリクロロエチレンにより汚染された地下水等において、自然状態で発生した嫌気性環境による微生物による分解でシス−１，２−ジクロロエチレンが生成、蓄積することが多い。また、デハロコッコイデス属の微生物は、増殖する期間が長くかかり浄化期間が長く、継代培養することが容易ではなく、有機塩素化合物の分解活性を安定して維持することが困難である。本実施形態に係る微生物の培養方法によれば、このようなデハロコッコイデス属の微生物を短期間で増殖することができ、有機塩素化合物の分解活性を安定して維持しつつ容易に継代培養することができる。
【００３３】
本実施形態においては、まず現地調査により汚染された地下水の範囲およびその濃度範囲を確定することができる。これに基づき実験室でプレテストを行い、最適な腐植物質含有物質の添加量、添加方法等を決定する。このプレテストは地下水中に対象汚染物質もしくは汚染物質が分解して生成する分解生成物を分解することのできる微生物が存在するかどうかの微生物学的試験および実際に採取した地下水に腐植物質含有物質を添加して汚染物質濃度の濃度変化を確認するビーカースケール試験、実際に汚染現場において腐植物質含有物質を添加して汚染物質濃度の変化を確認する現場試験等から適宜選択する。
【００３４】
浄化対象現場に、汚染物質の分解菌が存在せずプレテスト結果によっても、浄化の傾向が確認されない時には、培養した分解微生物（分解菌）を汚染現場に添加する手法であるバイオオーグメンテーションが有効となる。デハロコッコイデス属に代表されるような分解微生物を外部で培養する際には、例えば嫌気的条件下でＢＳ培地、ペプトン等を主体とした培地等の液体培地でｐＨ６．０〜８．０、１０℃〜４０℃で培養することになる。この際に土壌、好ましくは腐植物質に富んだ土壌を、培地容積に対して好ましくは０．０５〜７５％（ｗｔ／ｖｏｌ）、より好ましくは０．５〜２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）程度添加し、スラリー状で撹拌しながら培養する。または、腐植物質、フミン酸（培地容積に対して好ましくは０．０１〜２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）、より好ましくは０．１〜５．０％（ｗｔ／ｖｏｌ）程度）、腐葉土、フルボ酸等（市販されている商品含む）を含む腐植物質含有物質を利用することも可能である。培養時に有機塩素化合物を添加する場合には、その有機塩素化合物が分解していることを確認した培養液を汚染現場の原位置に注入を行う。この際、添加した土壌が井戸中や地下水中で詰まりを起こす可能性があると考えられる場合には、静置したスラリー上澄み液、遠心分離、スクリーン等で分離した培養液を添加することも可能である。または、掘削された汚染土壌、揚水された汚染地下水に分解微生物を添加し分解することも可能である。
【００３５】
栄養塩を注入するバイオスティミュレーション時には、注入する栄養液と共に、腐植物質含有物質をスラリー状、または上記上澄み液などとして添加することができる。
【００３６】
本実施形態に係る微生物の培養方法により、バイオオーグメンテーションに使用する分解微生物を汚染物質の分解活性を維持しつつ安定して、短期間に準備することが可能となり、汚染サイトの浄化期間の短縮、浄化コストの低減に有効である。また、バイオスティミュレーション実施の浄化促進方法としても有効であり、簡易な方法で浄化期間を短縮可能である。特に、有機塩素化合物の分解微生物をより短期間に安定して培養し、汚染サイトに添加することが可能となり、有機塩素化合物により汚染された汚染土壌、地下水等の浄化に好適に適用できる。また、汚染原位置で浄化に関与する分解微生物を培養し、より短期間に効率よく、しかも低コストで浄化処理することが可能になる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３８】
＜実施例１＞
窒素パージしたグローブボックス内で、７００ｍＬのバイアルビンに、表１に示すＢＳ培地５００ｍＬ、デハロコッコイデス属を含む有機塩素化合物の分解微生物（培養液５ｍＬ（１０７個／ｍＬ））、土壌（黒ぼく土）５ｇ（ＢＳ培地に対して１％（ｗｔ／ｖｏｌ））をそれぞれ添加した後、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）及びシス−１，２−ジクロロエチレン（ｃ−ＤＣＥ）をそれぞれ添加（初期量２ｍｇ／Ｌ）した。ｐＨは７±０．２に調整した。バイアルビンを２０℃に設定したインキュベータ内に静置し、経時的に有機塩素化合物の濃度について測定した。各バイアルビンのヘッドスペースから経時的にシリンジでガスを採取し、日本電子（株）製ＧＣ−３１１型のガスクロマトグラフィ（ＰＩＤ検出器）でＴＣＥ及びｃ−ＤＣＥの濃度をそれぞれ測定した。図１にＴＣＥ濃度を、図２にｃ−ＤＣＥ濃度の測定結果を示す。
【００３９】
【表１】
2009034073.tif 000003
【００４０】
＜実施例２＞
土壌（黒ぼく土）５ｇの代わりに、フミン酸（和光純薬工業（株）製試薬）１ｇ（ＢＳ培地に対して０．２％（ｗｔ／ｖｏｌ））を添加した以外は、実施例１と同様にして実験を行った。結果を図１及び図２に示す。
【００４１】
＜比較例１＞
７００ｍＬのバイアルビンに、表１に示すＢＳ培地５００ｍＬを添加した後、ＴＣＥ及びｃ−ＤＣＥをそれぞれ添加（初期量２ｍｇ／Ｌ）した以外は、実施例１と同様にして実験を行った。結果を図１及び図２に示す。
【００４２】
＜比較例２＞
２本の７００ｍＬのバイアルビンに、表１に示すＢＳ培地５００ｍＬ、デハロコッコイデス属を含む有機塩素化合物の分解微生物（培養液５ｍＬ（１０７個／ｍＬ））をそれぞれ添加した後、ＴＣＥ及びｃ−ＤＣＥをそれぞれ添加（初期量２ｍｇ／Ｌ）した以外は、実施例１と同様にして実験を行った。結果を図１及び図２に示す。
【００４３】
図１にＴＣＥ濃度を図２にｃ−ＤＣＥ濃度の結果を示す。比較例１では、分解微生物を添加していないためＴＣＥ、ｃ−ＤＣＥ濃度の変化がほとんど認められない。比較例２では、分解微生物を添加しているためＴＣＥ、ｃ−ＤＣＥ共に濃度の低下が認められるが、特にｃ−ＤＣＥの分解はＴＣＥに比較して分解期間が非常に長いことが確認された。これに対し、比較例２の条件に土壌、またはフミン酸を添加した実施例１、２では、比較例２に対してＴＣＥの分解期間は有意な差は認められないものの、ｃ−ＤＣＥの分解時間が顕著に促進していることを確認した。なお、図２のｃ−ＤＣＥ濃度がブランク（比較例１）以外の系で一旦上昇しているのは、ＴＣＥの分解により生成したｃ−ＤＣＥによるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の実施例及び比較例における、ＴＣＥ濃度の経時変化を示す図である。
【図２】本発明の実施例及び比較例における、ｃ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示す図である。
【図１】
2009034073.tif 000004
【図２】
2009034073.tif 000005