(57)【要約】【課題】ＡｄｏＭｅｔを安全に大量産生する新規酵母株、およびそのような新規酵母株を作製する方法を提供する。【解決手段】本発明によって、セルフクローニング法によって導入された変異Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子を有する酵母が提供される。この変異遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。このタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して、低下したＳ−アデノシルホモシステイン加水分解活性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルフクローニング法によって導入された変異Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子を有する酵母であって、該変異遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、該タンパク質は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して、低下したＳ−アデノシルホモシステイン加水分解活性を有する、酵母。
【請求項２】
前記酵母が清酒酵母である、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
前記清酒酵母が、ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３０５である、請求項２に記載の酵母。
【請求項４】
前記酵母が二倍体である、請求項１に記載の酵母。
【請求項５】
前記セルフクローニング用のマーカー遺伝子を含む、請求項１に記載の酵母。
【請求項６】
請求項１に記載の酵母であって、ここで、該酵母は、二倍体または高次倍数体であり、
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して低下したＳ−アデノシルホモシステイン加水分解活性を有するタンパク質をコードする変異遺伝子であって、該変異遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列をコードする、変異遺伝子；ならびに
（ｉｉ）破壊されたＳ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子であって、該破壊された遺伝子がコードするタンパク質は、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解活性を有さないタンパク質であり、ここで該遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列をコードする、破壊された遺伝子、
を有する、酵母。
【請求項７】
請求項１に記載の酵母であって、ここで、該酵母は、二倍体または高次倍数体であり、
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して低下したＳ−アデノシルホモシステイン加水分解活性を有するタンパク質をコードする変異遺伝子であって、該変異遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列をコードする、変異遺伝子；ならびに
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸であって、該コードされるタンパク質のＳ−アデノシルホモシステイン加水分解活性が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＳ−アデノシルホモシステイン加水分解活性と同等である、核酸、
を有する、酵母。
【請求項８】
前記変異が、Ｔ２７９Ｉ点変異である、請求項１に記載の酵母。
【請求項９】
代謝物を蓄積する酵母を作製する方法であって、セルフクローニング法を用いて、代謝物を分解する酵素遺伝子に変異を導入する工程を包含し、
ここで、該変異遺伝子によってコードされるタンパク質の該代謝物分解活性は、野生型酵素遺伝子によってコードされるタンパク質と比較して低下する、方法。
【請求項１０】
少なくとも２種のセルフクローニング用マーカーを用いる、請求項９に記載の方法であって、以下：
（ｉ）第一のマーカーおよび第一の変異遺伝子による第一のセルフクローニング法を用いて前記酵母を形質転換する工程；および
（ｉｉ）第二のマーカーおよび第二の変異遺伝子による第二のセルフクローニング法を用いて、（ｉ）において得られた酵母形質転換体をさらに形質転換する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
前記第一の変異遺伝子と前記第二の変異遺伝子とが同一である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一の変異遺伝子と前記第二の変異遺伝子とが異なる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも２種のセルフクローニング用マーカーを用いる、請求項９に記載の方法であって、以下：
（ｉ）第一のマーカーおよび第一の変異遺伝子による第一のセルフクローニング法を用いて前記酵母を形質転換する工程；および
（ｉｉ）第二のマーカーによる第二のセルフクローニング法を用いて、（ｉ）において得られた酵母形質転換体をさらに形質転換する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記代謝物がＳ−アデノシルメチオニンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵母が清酒酵母である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記変異が、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記変異がＴ２７９Ｉ点変異である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項９〜１７のいずれか１項に記載の方法によって作製された、酵母。
【請求項１９】
請求項１〜８または請求項１８のいずれか１項に記載の酵母を含む、飲食用組成物。
【請求項２０】
請求項１〜８または請求項１８のいずれか１項に記載の酵母を含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項１〜８または請求項１８のいずれか１項に記載の酵母の、培養液。
【請求項２２】
請求項２１に記載の培養液を含む、飲食用組成物。
【請求項２３】
請求項２１に記載の培養液を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニン（本明細書中では、以後ＡｄｏＭｅｔと記載する）を高産生する新規酵母株およびその作製方法に関する。より詳細には、本発明は、ＡｄｏＭｅｔを高産生する新規清酒酵母変異株およびその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、脂肪肝、繊維症、肝硬変、肝細胞腫瘍などの症状となって表れるアルコール性肝臓疾患（ＡＬＤ）は、世界的に主要な疾患および死亡の原因となっている。現在、このようなアルコール性肝臓疾患とＡｄｏＭｅｔとの関係が注目されている。
【０００３】
ＡｄｏＭｅｔは生体組織全体に存在し、ホルモン、神経伝達物質、リン脂質、およびタンパク質の合成および代謝における、メチル基供与体または酵素活性化因子として、数多くの生物反応に関与する生理学的化合物である。ＡｄｏＭｅｔは、メチル基転移、硫黄基転移、およびアミノプロピル基転移の３つの代謝経路により代謝される。
【０００４】
ＡｄｏＭｅｔは、様々な肝臓疾患に対して、治療効果があることが見出されている。例えば、非特許文献１には、ヒヒを用いた研究において、エタノールにより引き起こされた肝障害がＡｄｏＭｅｔの投与により緩和されたことが記載されている。また、非特許文献２には、ＡｄｏＭｅｔの投与により、肝硬変患者の死亡率が有意に減少したことが記載されている。また、非特許文献３には、ＡｄｏＭｅｔの投与が、４塩化炭素やアセトアミノフェンなどの肝細胞毒素（ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｎｓ）により引き起こされるラットの肝障害を軽減させることが記載されている。
【０００５】
また、ＡｄｏＭｅｔは、様々な脳内神経伝達物質の生成に関与していることが知られている。それゆえ、鬱病等の治療において優れた治療効果を奏する。例えば、非特許文献４には、鬱病患者に対するＡｄｏＭｅｔ投与の効果が記載されている。鬱病患者に対して、２００〜１６００ｍｇ／ｄのＡｄｏＭｅｔの非経口および経口投与の効果は、従来の抗うつ剤のプラシーボよりも有意に勝り、三環系抗うつ剤と同様であった。さらに、ＡｄｏＭｅｔの投与は、従来の抗うつ剤よりも効き始める時間が早く、三環系抗うつ剤による効果を相乗的に高める。またＡｄｏＭｅｔは、長期使用においては治療効果の減少が少なく、副作用が少ない。
【０００６】
またＡｄｏＭｅｔは、骨関節症に対しても有意な治療効果を奏する。例えば、非特許文献５には、ＡｄｏＭｅｔの骨関節症に対する治療効果を、プラシーボおよび非ステロイド系抗炎症剤と、痛みの軽減効果、機能回復、副作用で比較検討した結果が記載されている。その結果、ＡｄｏＭｅｔは、痛みの軽減および機能回復において、非ステロイド系抗炎症剤と同程度の治療効果を奏していた。また、ＡｄｏＭｅｔは、非ステロイド系抗炎症剤にしばしば見られる副作用が見られなかった。
【０００７】
またＡｄｏＭｅｔは、細胞内での低メチル化の防御に関与していることが知られている。癌細胞では、染色体上のＤＮＡの低メチル化部位と、高メチル化部位とが普遍的に見出される。この染色体上の低メチル化部位は、癌細胞の特徴であるとされている。すなわち、細胞内でのＡｄｏＭｅｔ濃度の上昇は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの反応を刺激する。そして、このＤＮＡメチルトランスフェラーゼが、染色体上のＤＮＡの高メチル化を行なうことで、染色体を低メチル化から防御していると考えられている。
【０００８】
例えば、非特許文献５には、脱メチル化活性試験の結果が記載されている。脱メチル化活性試験では、ＨＥＫ２９３細胞にＣＭＶ‐ＧＦＰプラスミドを導入することで、このプラスミドの脱メチル化を検出している。このＣＭＶ‐ＧＦＰプラスミド上のＣＭＶ−ＧＦＰの発現は、当該ＣＭＶ−ＧＦＰの脱メチル化によって達成される。それゆえ、上記非特許文献５では、ＡｄｏＭｅｔまたはアデノシルホモシステイン存在下で、ＮＥＫ２９３細胞内でのＣＭＶ‐ＧＦＰの発現を指標に、細胞内の脱メチル化の検出を行なっている。また、ＡｄｏＭｅｔまたはアデノシルホモシステイン存在下で、試験管内にて脱メチル化酵素（Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２／ＤＮＡ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ：ＭＢＤ２／ｄＭＴａｓｅ）への影響も調べている。その結果、アデノシルホモシステインは、脱メチル化酵素の阻害効果を持たない一方で、ＡｄｏＭｅｔは、脱メチル化酵素反応を直接阻害することが示された。また、上記脱メチル化試験からも、ＡｄｏＭｅｔは、細胞内においても脱メチル化を阻害していることが示された。それゆえ、ＡｄｏＭｅｔは、細胞内で、脱メチル化酵素反応を直接阻害し、ＤＮＡの高メチル化をもたらすことが示された。
【０００９】
また、特許文献１には、抗炎症作用、軟骨保護作用、軟骨調節作用、軟骨安定化作用、軟骨代謝作用を促進することができる組成物として、アミノ糖、グルコサミノグリカン、およびＳ‐アデノシルメチオニンを含む組成物が開示されている。
【００１０】
ＡｄｏＭｅｔは、メチル基を供与した後、Ｓ‐アデノシルホモシステイン（ａｄｅｎｏｃｙｌ  ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ；以下ＡｄｏＨｃｙとする）になる。そして、ＡｄｏＨｃｙは、ＡｄｏＨｃｙ加水分解酵素によって、アデノシンとホモシステインとに加水分解される。ＡｄｏＨｃｙ加水分解酵素をコードする遺伝子は、様々な生物種から単離されており、種を超えて非常によく保存されている。例えば、特許文献２には、樹状細胞から単離されたＡｄｏＨｃｙ加水分解酵素遺伝子が開示されている。また、特許文献３には、ＡｄｏＨｃｙ加水分解酵素遺伝子の発現を抑制した植物が開示されている。
【００１１】
上述のように、ＡｄｏＭｅｔは広範に種々の疾患に対しての治療効果があることが見出されており、それゆえＡｄｏＭｅｔの大量生産が望まれている。この生産系としては、大腸菌のような原核生物、酵母のような真核生物を利用する方法が、主な選択肢として挙げられる。大腸菌を使用する生産系が最も普及している。確かに、大腸菌は操作が簡便である。その一方で、酵母は、大腸菌よりも操作がより煩雑であり、増殖速度は遅い。しかしながら酵母は大量培養がより容易であり、大量生産に非常に適している。
【００１２】
このように、大量生産の見地から、酵母におけるＡｄｏＭｅｔの産生が望まれていた。例えば特許文献４および５には、酵母変異株を用いたＡｄｏＭｅｔの製造方法が開示されている。特許文献６は、ＡｄｏＨｃｙ加水分解酵素遺伝子を含むメチオニン代謝系酵素に変異を導入することによって、野生型株と比較して変異導入株においてＡｄｏＭｅｔが多く蓄積することを記載している。しかしながら、このような外来遺伝子を用いた酵母変異株のアプローチは有用な手段の１つではあるが、外来遺伝子または選択マーカー遺伝子の人体に対する安全性が不明であること、体内に存在する細菌の新規形質獲得の可能性などに起因して、産業的に適用するためには大きな制限が存在している。
【非特許文献１】Ｌｉｅｂｅｒ  ＣＳら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９０年２月；１１１：６５−７２
【非特許文献２】Ｌｉｅｂｅｒ  ＣＳ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ．２０００；２０：３９５−４３０
【非特許文献３】Ｇａｓｓｏ  Ｍら，Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９６年８月；２５：２００−２０５
【非特許文献４】Ｓｏｅｋｅｎ  ＫＬら，Ｊ  Ｆａｍ．Ｐｒａｃｔ  ２００２年５月，５１：４２５−４３０
【非特許文献５】Ｄｅｔｉｃｈ  Ｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２００３年６月，６．２０８１２−２０８２０
【特許文献１】特表２００２−５１６８６６号公報
【特許文献２】特表２００２−５１３２７６号公報
【特許文献３】国際公開第９６／１４７３４号パンフレット
【特許文献４】特公平４−５５６７７号公報
【特許文献５】特公平４−３３４３９号公報
【特許文献６】特開２００５−２６１３６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述のようにＡｄｏＭｅｔは肝臓疾患、鬱病治療、骨関節症、癌治療などの広範な各種疾患治療剤として有用であるが、産業的に適用可能な程度に大量の、かつ安全にＡｄｏＭｅｔを産生する方法は、現在のところ全く存在しない。
【００１４】
従って、現在のところ有効な大量産生法が確立されていないＡｄｏＭｅｔの安全な大量産生を実現することが、本発明の課題である。特に、ＡｄｏＭｅｔを安全に大量産生する新規酵母株を提供することが、本発明の課題である。
【００１５】
そのようなＡｄｏＭｅｔを安全に大量産生する新規酵母株を作製する方法を提供することもまた、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、清酒酵母におけるＳ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子に変異を導入することにより、ＡｄｏＭｅｔが予想を超えて大量に変異清酒酵母株によって産生されることを発見した。さらに鋭意検討を重ね、清酒酵母株におけるＳ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子にセルフクローニングによって変異を導入し、ＡｄｏＭｅｔを安全に大量産生する新規変異酵母株を作製することに成功し、本発明を完成させた。
【００１７】
本発明は、上述の課題を解決するために、以下の項目を提供する。
（項目１）セルフクローニング法によって導入された変異Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子を有する酵母であって、その変異遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、そのタンパク質は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して、低下したＳ−アデノシルホモシステイン加水分解活性を有する、酵母。
（項目２）上記酵母が清酒酵母である、項目１に記載の酵母。
（項目３）上記清酒酵母が、ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３０５である、項目２に記載の酵母。
（項目４）上記酵母が二倍体である、項目１に記載の酵母。
（項目５）上記セルフクローニング用のマーカー遺伝子を含む、項目１に記載の酵母。
（項目６）項目１に記載の酵母であって、ここで、その酵母は、二倍体または高次倍数体であり、
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して低下したＳ−アデノシルホモシステイン加水分解活性を有するタンパク質をコードする変異遺伝子であって、その変異遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列をコードする、変異遺伝子；ならびに
（ｉｉ）破壊されたＳ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子であって、その破壊された遺伝子がコードするタンパク質は、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解活性を有さないタンパク質であり、ここでその遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列をコードする、破壊された遺伝子、
を有する、酵母。
（項目７）項目１に記載の酵母であって、ここで、その酵母は、二倍体または高次倍数体であり、
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して低下したＳ−アデノシルホモシステイン加水分解活性を有するタンパク質をコードする変異遺伝子であって、その変異遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列をコードする、変異遺伝子；ならびに
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸であって、そのコードされるタンパク質のＳ−アデノシルホモシステイン加水分解活性が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＳ−アデノシルホモシステイン加水分解活性と同等である、核酸、
を有する、酵母。
（項目８）上記変異が、Ｔ２７９Ｉ点変異である、項目１に記載の酵母。
（項目９）代謝物を蓄積する酵母を作製する方法であって、セルフクローニング法を用いて、代謝物を分解する酵素遺伝子に変異を導入する工程を包含し、
ここで、その変異遺伝子によってコードされるタンパク質のその代謝物分解活性は、野生型酵素遺伝子によってコードされるタンパク質と比較して低下する、方法。
（項目１０）少なくとも２種のセルフクローニング用マーカーを用いる、項目９に記載の方法であって、以下：
（ｉ）第一のマーカーおよび第一の変異遺伝子による第一のセルフクローニング法を用いて上記酵母を形質転換する工程；および
（ｉｉ）第二のマーカーおよび第二の変異遺伝子による第二のセルフクローニング法を用いて、（ｉ）において得られた酵母形質転換体をさらに形質転換する工程、
を包含する、方法。
（項目１１）上記第一の変異遺伝子と上記第二の変異遺伝子とが同一である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）上記第一の変異遺伝子と上記第二の変異遺伝子とが異なる、項目１０に記載の方法。
（項目１３）少なくとも２種のセルフクローニング用マーカーを用いる、項目９に記載の方法であって、以下：
（ｉ）第一のマーカーおよび第一の変異遺伝子による第一のセルフクローニング法を用いて上記酵母を形質転換する工程；および
（ｉｉ）第二のマーカーによる第二のセルフクローニング法を用いて、（ｉ）において得られた酵母形質転換体をさらに形質転換する工程、
を包含する、方法。
（項目１４）上記代謝物がＳ−アデノシルメチオニンである、項目９に記載の方法。
（項目１５）上記酵母が清酒酵母である、項目９に記載の方法。
（項目１６）上記変異が、配列番号２に示されるアミノ酸配列における１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加である、項目１４に記載の方法。
（項目１７）上記変異がＴ２７９Ｉ点変異である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）項目９〜１７のいずれか１項に記載の方法によって作製された、酵母。
（項目１９）項目１〜８または項目１８のいずれか１項に記載の酵母を含む、飲食用組成物。
（項目２０）項目１〜８または項目１８のいずれか１項に記載の酵母を含む、薬学的組成物。
（項目２１）項目１〜８または項目１８のいずれか１項に記載の酵母の、培養液。
（項目２２）項目２１に記載の培養液を含む、飲食用組成物。
（項目２３）項目２１に記載の培養液を含む、薬学的組成物。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によって、肝臓疾患、鬱病治療、骨関節症、癌治療などの広範な各種疾患治療剤として有用なＡｄｏＭｅｔを、安全かつ大量に産生する新規酵母株が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００２０】
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきではない。本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行なうことができることは、当業者に明らかである。
【００２１】
本発明者らは、清酒酵母におけるＳ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子に変異を導入することにより、ＡｄｏＭｅｔが予想を超えて大量に変異清酒酵母株によって産生されることを発見した。さらに鋭意検討を重ね、清酒酵母株におけるＳ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子にセルフクローニングによって変異を導入し、ＡｄｏＭｅｔを安全に大量産生する新規変異酵母株を作製することに成功し、本発明を完成させた。
【００２２】
本発明により、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子変異を有さない清酒酵母の約８倍〜約１２倍、変異Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子を有する酵母（ＦＥＲＭＰ−１９７１５株）の約７４〜９０倍、ＡｄｏＭｅｔを大量に産生する新規酵母株が作製された。本発明の新規酵母株はセルフクローニングによって作製されていることから、この酵母株によって産生されたＡｄｏＭｅｔはヒトによる摂取において非常に安全性が高い。本発明の新規酵母株のうちの一つは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物委託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３０５（寄託日：平成１９年６月１４日）として寄託された。ただし、本発明はこのＦＥＲＭ  Ｐ−２１３０５株に限定されるものではなく、本発明の方法によって作製されたＡｄｏＭｅｔ高産生酵母株は全て、本発明の範囲内にある。
【００２３】
本発明においてＳ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子に導入した変異は劣性変異であった。清酒酵母は二倍体であるが、二倍体では劣性変異株の取得は困難であるというのが、当該分野の常識であった。本発明では、少なくとも２種のセルフクローニング用のマーカー遺伝子を用い、
（ｉ）第一のマーカーおよび第一の変異遺伝子による第一のセルフクローニング法を用いて前記酵母を形質転換する工程；および
（ｉｉ）第二のマーカーおよび第二の変異遺伝子による第二のセルフクローニング法を用いて、（ｉ）において得られた酵母形質転換体をさらに形質転換する工程、
を包含する方法を用いることによって、二倍体清酒酵母において劣性変異株を取得することができた。
【００２４】
（生体内におけるメチオニンの代謝系およびメチオニン代謝系酵素）
図２に、メチオニン代謝経路の概略を示す。生体内で、メチオニンは、以下の反応により代謝される。
（ａ）Ｓ‐アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）のメチル基転移により、Ｓ‐アデノシルホモシステイン（ＡｄｏＨｃｙ）に変換する。
（ｂ）Ｓ‐アデノシルホモシステイン（ＡｄｏＨｃｙ）が、アデノシンおよびホモシステインに加水分解される。
（ｃ）ホモシステインからメチオニンになる。
（ｄ）メチオニンが、生体内のＡＴＰからアデノシル基を受け、Ｓ‐アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）になる。
【００２５】
上記（ａ）〜（ｃ）の反応経路により、メチオニンが生成される。また、生成されたメチオニンは、（ｄ）の反応により再び、Ｓ‐アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）が生成され、（ａ）〜（ｃ）の反応を経て、メチオニンが生成される。
【００２６】
また、（ｂ）の反応にて生成されたホモシステインは、シスタチオニンを経て、システインになる。
【００２７】
このような生体内のメチオニンの代謝は、様々な酵素（メチオニン代謝系酵素）の触媒によりなされる。例えば、上記（ｂ）の加水分解反応を触媒する酵素として、Ｓ‐アデノシルホモシステイン加水分解酵素がある。また、上記（ｃ）の反応を触媒する酵素としては、メチオニン合成酵素、または、ベタイン−ホモシステインメチル基転移酵素が知られている。また、上記（ｄ）の反応を触媒する酵素としては、メチオニンアデノシル基転移酵素が知られている。
【００２８】
（メチオニン代謝系酵素の変異）
本発明の酵母変異株は、代表的には、メチオニン代謝系酵素が変異している。ここで、変異しているメチオニン代謝系酵素としては、上記メチオニン代謝に関与する酵素であれば特に限定されるものではなく、メチオニン代謝系酵素が変異している酵母変異株であればよい。かかるメチオニン代謝系酵素の変異は、当該酵素をコードする遺伝子に変異が起こった結果として生ずる。本発明にかかる酵母変異株は、メチオニン代謝系酵素に変異を有することによって、メチオニン代謝系に異常が起こり、その結果メチオニン代謝産物の一つであるＡｄｏＭｅｔが細胞内に蓄積する。
【００２９】
本発明において、変異が導入される好ましいメチオニン代謝系酵素は、Ｓ‐アデノシルホモシステイン加水分解酵素である。Ｓ‐アデノシルホモシステイン加水分解酵素は、別名Ｓ‐アデノシルシホモステインヒドラターゼといい、上述のごとくメチオニン代謝系において、Ｓ‐アデノシルホモシステインの加水分解を触媒し、メチオニンの前駆体であるホモシステインの生成に関与する酵素である。変異のないＳ‐アデノシルホモシステイン加水分解酵素（以下、野生型Ｓ‐アデノシルホモシステイン加水分解酵素）のアミノ酸配列を配列番号２に示した。本発明の酵母変異株が有する変異Ｓ‐アデノシルホモシステイン加水分解酵素は、配列番号２に示される野生型Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素のアミノ酸配列において、１個またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる任意のものであり、特に限定されるものではない。
【００３０】
本発明におけるＳ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素の変異の例としては、野生型Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子（配列番号１）における８３６番目のシトシン（ｃ）がチミン（Ｔ）に置換される点変異（野生型Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素のアミノ酸配列（配列番号２）における２７９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）からイソロイシン（Ｉｌｅ）への点変異）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３１】
本発明の新規酵母株によって産生されるＡｄｏＭｅｔを含む組成物は、肝臓障害を緩和する（例えば、肝硬変による死亡率を減少させる）こと（例えば、Ｌｉｅｂｅｒ  ＣＳ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １９９９；３０：１１５５-９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｒ，  Ｌｉｅｂｅｒ  ＣＳ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＳＡＭｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｄｒｕｇｓ  １９９０；４０（ｓｕｐｐｌ）：１-２；Ｍａｔｏ  ＪＭ，  Ｃａｍａｒａ  Ｊ，  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｄｅ  Ｐａｚ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｉｎ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ．  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １９９９；３０：１０８１-９などを参照のこと）、鬱病に対して治療効果を有すること（例えば、Ｊａｎｉｃａｋ  ＰＧ，  Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  ＪＤ，  Ｃｏｍａｔｙ  ＪＥ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：  ａ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｒｅｐｏｒｔ．  Ａｌａ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  １９８８；２５：３０６-１３；Ｆｒｉｅｄｅｌ  ＨＡ，  Ｇｏａ  ＫＬ，  Ｂｅｎｆｉｅｌｄ  Ｐ．  Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  Ｄｒｕｇｓ  １９８９；３８：３８９-４１６；Ｂｒｅｓｓａ  ＧＭ．  Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  （ＳＡＭｅ）  ａｓ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ：  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃａｎｄ  １９９４；１５４：７-１４などを参照のこと）、関節炎の処置に有用であること（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ  ＪＤ，  Ｆｌｕｓｓｅｒ  Ｄ，  Ｋａｔｚ  ＢＰ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｄｏｕｂｌｅ  ｂｌｉｎｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  （ＳＡＭ）  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ｏｒａｌ  ＳＡＭ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｋｎｅｅ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９９４；２１：９０５-１１；Ｐａｄｏｖａ  Ｃ．  Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９８７；８３：６０-５を参照のこと）、骨関節症において痛みを軽減すること、骨関節症において機能回復を促進すること、抗炎���作用を促進すること、軟骨保護作用を促進すること、軟骨調節作用を促進すること、軟骨安定化作用を促進すること、軟骨代謝作用を促進すること、アルツハイマー病を改善し得ること（例えば、Ｍｏｒｉｓｏｎ，  Ｌ．  Ｄ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｋｉｓｈ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｂｒａｉｎ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｒｅ  ｓｅｖｅｒｅｌｙ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，  ６７，  １３２８-１３３１  （１９９６）を参照のこと）、ＨＩＶ感染による末梢神経障害または脊髄症を改善し得ること（例えば、Ｋｅａｔｉｎｇ  ＪＮ，  Ｔｒｉｍｂｌｅ  ＫＣ，  Ｍｕｌｃａｈｙ  Ｆ，  Ｓｃｏｔｔ  ＪＭ，  Ｗｅｉｒ  ＤＧ，  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｍｅｔｈｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ＨＩＶ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｌａｎｃｅｔ，  ３３７，  ９３５−９３９，  （１９９１）；Ｓｕｒｅｔｅｅｓ  Ｒ，  Ｈｙｌａｎｄ  Ｋ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｉ．，  Ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｍｅｔｈｙｌ−ｇｒｏｕｐ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｌａｎｃｅｔ，  ３３５，  ６１９−６２１，  （１９９０）；Ｃａｓｔａｇｎａ  Ａ，  Ｌｅ  Ｇｒａｚｉｅ  Ｃ，  Ａｃｃｏｒｄｉｎｉ  Ａ，  Ｇｉｕｌｉｄｏｒｉ  Ｐ，  Ｃａｖａｌｌｉ  Ｇ，  Ｂｏｔｔｉｇｌｉｅｒｉ  Ｔ，  Ｌａｚｚａｒｉｎ  Ａ．，  Ｃｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  （ＳＡＭｅ）  ａｎｄ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ：  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＳＡＭｅ．，  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ４５，  １６７８−１６８３，  （１９９５）などを参照のこと）などの有用な効果（この有用な効果は、ここに列挙したものに限定されない）を有し得る。本発明の酵母株によって産生されたＡｄｏＭｅｔを含む任意の飲食用組成物（例えば、健康食品またはサプリメント）あるいは薬学的組成物（例えば、医薬品）が、本発明の範囲内に入る。本発明はまた、本発明の新規酵母株の培養液にも関する。別の局面においては、本発明は、この培養液を含む任意の飲食用組成物（例えば、健康食品またはサプリメント）あるいは薬学的組成物（例えば、医薬品）に関する。
【００３２】
（定義）
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子である、細胞中に存在する核酸の一定の長さの配列をいう。本発明において遺伝子は、遺伝形質を規定するものであっても規定しないものであってもよい。本明細書において、遺伝子は、通常ゲノムに存在するものをさすが、それに限定されず、染色体外の配列、ミトコンドリアの配列なども包含することもある。多くの遺伝子は、通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。本明細書において、代表的に言及される遺伝子は、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子である。本明細書において遺伝子の「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、遺伝子の塩基配列を３塩基ずつに区切った時の３通りの枠組の１つであって、開始コドンを有し、そして途中に終止コドンが出現せずある程度の長さを持ち、実際にタンパク質をコードする可能性のある読み枠をいう。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、例えば、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子というときは、通常、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子の構造遺伝子ならびにＳ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子のプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含する。本発明では、構造遺伝子のほか、転写および／または翻訳などの調節配列もまた、本発明が対象とする遺伝子として有用であることが理解される。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて容易に理解することができる。
【００３３】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００３４】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【００３５】
その文字コードは以下のとおりである。
（アミノ酸）
３文字記号  １文字記号  意味
Ａｌａ      Ａ          アラニン
Ｃｙｓ      Ｃ          システイン
Ａｓｐ      Ｄ          アスパラギン酸
Ｇｌｕ      Ｅ          グルタミン酸
Ｐｈｅ      Ｆ          フェニルアラニン
Ｇｌｙ      Ｇ          グリシン
Ｈｉｓ      Ｈ          ヒスチジン
Ｉｌｅ      Ｉ          イソロイシン
Ｌｙｓ      Ｋ          リジン
Ｌｅｕ      Ｌ          ロイシン
Ｍｅｔ      Ｍ          メチオニン
Ａｓｎ      Ｎ          アスパラギン
Ｐｒｏ      Ｐ          プロリン
Ｇｌｎ      Ｑ          グルタミン
Ａｒｇ      Ｒ          アルギニン
Ｓｅｒ      Ｓ          セリン
Ｔｈｒ      Ｔ          トレオニン
Ｖａｌ      Ｖ          バリン
Ｔｒｐ      Ｗ          トリプトファン
Ｔｙｒ      Ｙ          チロシン
Ａｓｘ                  アスパラギンまたはアスパラギン酸
Ｇｌｘ                  グルタミンまたはグルタミン酸
Ｘａａ                  不明または他のアミノ酸。
（塩基）
記号  意味  
ａ    アデニン
ｇ    グアニン
ｃ    シトシン
ｔ    チミン
ｕ    ウラシル
ｒ    グアニンまたはアデニンプリン
ｙ    チミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍ    アデニンまたはシトシンアミノ基
ｋ    グアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓ    グアニンまたはシトシン
ｗ    アデニンまたはチミン／ウラシル
ｂ    グアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄ    アデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈ    アデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖ    アデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎ    アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
【００３６】
本明細書において、遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００３７】
本明細書において、「セルフクローニング」とは、「異種のＤＮＡ」に相当しないＤＮＡを宿主に導入することで、
（１）ＤＮＡ供与体と宿主が、異種でないこと；
（２）ベクターに含まれる全ての生理活性のある遺伝子（生理活性を持つポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子ＤＮＡ、プロモーター、ターミネーター、マーカー等）についても異種でないこと；
の（１）、（２）がともに明らかである場合のものを指す。
【００３８】
本明細書において、「異種のＤＮＡ」とは、宿主の属している種に含まれていない株に由来するＤＮＡを意味する。
【００３９】
「セルフクローニング」に対して、「組換えＤＮＡ技術」とは、ある生細胞内で複製可能なＤＮＡと異種のＤＮＡとの組換え分子を作製し、それを当該生細胞に移入し異種のＤＮＡを複製させる技術をいう。この用語はまた、この技術を応用した結果、ＤＮＡの組換え分子が移入された生細胞（以下「組換え体」という）を用いる技術も含む。ただし、ＤＮＡの組換え分子が移入された生細胞と同等の遺伝子構成を持つ生細胞が自然界に存在する場合を除く。
【００４０】
組換えＤＮＡ技術を用いて、ある生物における有用物質の産生能を向上させる、またはある物質を産生する新規形質を与える試みは、多数行われている。しかしながら、そのような組換えＤＮＡ技術によって作製された生物によって産生される物質には、特に人体へ取り込まれるものの場合、いくつかの危険性が存在する可能性があり、現状ではその産業利用が大きく制限されている。この危険性としては、抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカーの安全性（例えば、人体内の細菌がその抗生物質耐性形質を獲得し得る）、異種遺伝子導入による宿主における予期されない不純物の合成などが挙げられる。この点に関して、本発明における新規変異酵母株は、セルフクローニングによって変異導入が行われており、このような危険性が存在しない（厚生労働省の組換えＤＮＡ技術応用食品・食品添加物の安全性評価指針によると、）。それゆえ、本発明の新規変異酵母株およびそれによって産生されるＡｄｏＭｅｔは安全であり、その産業的価値は極めて大きい。
【００４１】
本明細書において、「ベクター」とは、宿主にＤＮＡを導入する際に使用される、任意の核酸物質をいう。本明細書における「ベクター」は、代表的に、宿主に導入することを意図されるＤＮＡフラグメントである。
【００４２】
本明細書において、「セルフクローニング法」とは、宿主に導入することが意図される、「異種のＤＮＡ」に相当しない任意のＤＮＡ分子をいう。本明細書では、「セルフクローニング用のマーカー遺伝子」とは、代表的に、宿主の遺伝子に由来する選択マーカー（例えば、Ｕｒａ３またはＨｉｓ３）、宿主由来の変異が導入された代謝物を分解する酵素遺伝子（例えば、変異Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子）などをいうが、これらに限定されない。「セルフクローニング用のマーカー遺伝子」は、当該分野で周知の方法によって宿主に導入され得る。この方法としては、以下の実施例に記載される形質転換法だけでなく、酢酸リチウム法、ＰＥＧ法、スフェロプラスト法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書において、「変異」とは、起源を同一にする細胞あるいはその集団間で見られる形質の相違のことをいう。すなわち、変異とは、遺伝子の点突然変異や、転座・重複もしくは欠失などの染色体異常を含む遺伝子構成の相違により生じる形質をいう。
【００４４】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００４５】
上記「１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異型タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意味する。
【００４６】
本明細書において、「酵母」とは、単細胞性の菌類（いわゆる真菌）の総称であり、一般に出芽または分裂によって増殖する。本発明においては、代表的に、酵母は出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、特定の局面においては、本発明の酵母は、清酒酵母である。本明細書において、「清酒酵母」とは、「醸造酵母」、「協会酵母」ともまたいい、これらの用語は本明細書中で互換的に使用される。本明細書中で「清酒酵母」とは、特に具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓａｋｅ  Ｋｙｏｋａｉ  Ｎｏ．７（ａ／α  ｕｒａ３Δ：：ＬＹＳ４／ｕｒａ３Δ：：ＬＹＳ４  ｈｉｓ３／ｈｉｓ３；ＲＡＫ２３５９）（協会７号変異株、以下Ｋ７−ＲＡＫ２３５９と呼ぶ）をいう。
【００４７】
本明細書において、「酵母変異株」とは、上記変異が生じた酵母細胞、または、酵母細胞の集団を意味する。また、上記酵母変異株は、１つの遺伝子に変異が生じたものに限定されず、複数の遺伝子に変異が生じた多重酵母変異株も含まれる。また変異は、ＵＶ照射、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理等の変異誘導を行なう変異であっても、自然変異であってもよいし、遺伝子組換え法を用いた場合であってもよい。なお、変異を有するタンパク質／遺伝子等を「変異型タンパク質／遺伝子」という。対照的に、変異を有さない酵母株を、「野生型酵母株」といい、変異を有しないタンパク質／遺伝子等を「野生型タンパク質／遺伝子」という。
【００４８】
本発明の酵母変異株は、優性変異、または、劣性変異のどちらの変異を有する酵母変異株でもよいが、特に、劣性変異であることが好ましい。ここでいう「劣性変異」とは、酵母野生体と酵母変異株とを掛け合わせた倍数体において、その倍数体の表現型が、酵母野生体のものとほぼ一致するような変異のことをいう。また、「優性変異」とは、上記倍数体の表現型が、酵母変異株のものとほぼ一致するような変異のことをいう。
【００４９】
このような劣性変異を有する酵母変異株は、細胞内に野生型の対立遺伝子を導入することで、その表現型が、野生型酵母のものとほぼ一致する。すなわち、酵母変異株の表現型が、野生型の対立遺伝子により相補される。「掛け合わせ」るとは、異なる接合型（例えば、出芽酵母では、ａ型とα型）の酵母を接合させることを意味する。
【００５０】
本明細書において、「低下したＳ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素活性」とは、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素のＳ−アデノシルホモシステイン加水分解活性が低下していることをいう。この低下は、実施例に記載されるようにＳ−アデノシルホモシステインの量を測定することによって決定される。ある実施形態において、培養物におけるＳ−アデノシルホモシステイン量が少なくとも約２倍増加していたとき、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素活性が低下したという。別の実施形態において、培養物におけるＳ−アデノシルホモシステイン量が少なくとも約３倍増加していたとこ、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素活性が低下したという。別の実施形態において、培養物におけるＳ−アデノシルホモシステイン量が少なくとも約４倍増加していたとこ、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素活性が低下したという。別の実施形態において、培養物におけるＳ−アデノシルホモシステイン量が少なくとも約５倍増加していたとこ、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素活性が低下したという。別の実施形態において、培養物におけるＳ−アデノシルホモシステイン量が少なくとも約６倍増加していたとこ、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素活性が低下したという。別の実施形態において、培養物におけるＳ−アデノシルホモシステイン量が少なくとも約７倍増加していたとこ、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素活性が低下したという。別の実施形態において、培養物におけるＳ−アデノシルホモシステイン量が少なくとも約８倍増加していたとこ、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素活性が低下したという。別の実施形態において、培養物におけるＳ−アデノシルホモシステイン量が少なくとも約９倍増加していたとこ、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素活性が低下したという。別の実施形態において、培養物におけるＳ−アデノシルホモシステイン量が少なくとも約１０倍増加していたとこ、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素活性が低下したという。
【００５１】
本明細書において、「二倍体」とは、ゲノムを二組有する個体をいう。酵母においては、ａ型およびα型の二つの接合型が存在し、ａ型株とα型株とが接合して互いの細胞膜、続いて核が融合し、二倍体が生じる。本明細書において、「高次倍数体」とは、三倍以上の任意の倍数性を有する個体をいう。
【００５２】
本明細書において、「マーカー遺伝子」とは、導入されたベクターを含む宿主細胞を選択する指標として機能する遺伝子をいう。選抜マーカーとしては、栄養要求性マーカー、蛍光マーカー、発光マーカー、および薬剤耐性選抜マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。「栄養要求性マーカー」としては、ウラシル栄養要求マーカー遺伝子、ヒスチジン栄養要求マーカー遺伝子、ロイシン栄養要求マーカー遺伝子、トリプトファン栄養要求マーカー、アデニン栄養要求マーカーなどが挙げられるが、これらに限定されない。「蛍光マーカー」としては、緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）、青色蛍光プロテイン（ＣＦＰ）、黄色蛍光プロテイン（ＹＦＰ）および赤色蛍光プロテイン（ｄｓＲｅｄ）のような蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。「発光マーカー」としては、ルシフェラーゼのような発光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。「薬剤耐性選抜マーカー」としては、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシンの耐性遺伝子であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、Ｇ４１８耐性遺伝子であるアミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子であるハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明においては、栄養要求性マーカーを代表的に使用し、特にウラシル栄養要求性マーカー、ヒスチジン栄養要求性マーカーなどが使用される。
【００５３】
本明細書において、「代謝物」とは、生体内に取り込まれた分子が、生体内の酵素などの作用により生じる変化した任意の物質をいう。本発明において、この代謝物は、Ｓ‐アデノシルホモシステイン（ＡｄｏＨｃｙ）であるが、これに限定されない。本明細書において、「代謝物分解活性」とは、任意の酵素の、特定の代謝物を分解する活性をいう。本明細書において、この代謝物はＡｄｏＨｃｙであり、この酵素はＳ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素であるが、これに限定されない。
【００５４】
本明細書において、「組成物」とは、本発明の新規酵母株を含む任意の物質をいう。本発明の組成物は、例えば、本発明の新規酵母株を含む培養液または健康食品が挙げられるが、これに限定されない。
【００５５】
本明細書において、「健康食品」とは、サプリメントともいわれ、健康によいと称される任意の製品をいう。本発明の健康食品には、本発明の新規酵母株を含むか、本発明の新規酵母株を使用して生産されたＡｄｏＭｅｔを含むか、または本発明の新規酵母株の培養液を含む、任意の製品が含まれる。本発明の健康食品は、代表的に、ＡｄｏＭｅｔの効果を表示して販売されている。このＡｄｏＭｅｔの効果としては、肝臓障害を緩和する（例えば、肝硬変による死亡率を減少させる）こと、鬱病に対して治療効果を有すること、関節炎の処置に有用であること、骨関節症において痛みを軽減すること、骨関節症において機能回復を促進すること、抗炎症作用を促進すること、軟骨保護作用を促進すること、軟骨調節作用を促進すること、軟骨安定化作用を促進すること、軟骨代謝作用を促進すること、アルツハイマー病を改善し得ること、ＨＩＶ感染による末梢神経障害または脊髄症を改善し得ることなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００５７】
本明細書において「ストリンジェントなハイブリダイズ条件」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行なうことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５８】
本明細書では塩基配列の同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００５９】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、６００、７００、８００、９００、１０００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００６０】
（飲食用組成物の製造）
本発明の好適な態様は飲食用組成物である。代表的には、本発明の新規酵母株によって産生されたＡｄｏＭｅｔを有効成分として含む薬学的組成物または飲食用組成物は、これをそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えば、健康食品、サプリメント、栄養補助食品、ジュース、清涼飲料、コーヒー、紅茶、日本茶、ウーロン茶、野菜ジュース、天然果汁、乳飲料、牛乳、豆乳、スポーツ飲料、ニアウォーター系飲料、栄養補給飲料、コーヒー飲料、ココア、スープ、ドレッシング、ムース、ゼリー、ヨーグルト、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、加工乳、スポーツドリンク、栄養ドリンク、ケーキミックス、パン、ピザ、パイ、クラッカー、ビスケット、ケーキ、クッキー、スパゲティー、マカロニ、パスタ、うどん、そば、ラーメン、キャンデー、ソフトキャンデー、ガム、チョコレート、おかき、ポテトチップス、スナック、アイスクリーム、シャーベット、クリーム、チーズ、粉乳、練乳、乳飲料などの粉末状または液状の乳製品、饅頭、ういろ、もち、おはぎ、醤油、たれ、麺つゆ、ソース、だしの素、シチューの素、スープの素、複合調味料、カレーの素、マヨネーズ、ケチャップ、レトルトカレー、レトルトシチュー、レトルトスープ、レトルトどんぶり、缶詰、ハム、ハンバーグ、ミートボール、コロッケ、餃子、ピラフ、おにぎり、冷凍食品および冷蔵食品、ちくわ、蒲鉾、弁当のご飯、寿司、乳児用ミルク、離乳食、ベビーフード、スポーツ食品等に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦型剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。これらの食品類あるいは飲食用組成物における本発明の酵母、ＡｄｏＭｅｔまたは培養液の配合量は、当該食品や組成物の種類や状態等により一律に規定しがたいが、ＡｄｏＭｅｔ含量で１０〜５０００ｍｇ／１食、好ましくは１００〜１０００ｍｇ／１食であり、サプリメントの場合には約１０〜１００％（好ましくは、３０〜１００％、より好ましくは５０〜１００％、さらにより好ましくは８０〜１００％）、飲料もしくは一般食品などの場合には約０．０１％以下であり得る。
【００６１】
（薬学的組成物）
本発明はまた、有効量の治療剤の被験体への投与によって、肝臓障害を緩和するため、肝硬変による死亡率を減少させるため、鬱病に対して治療効果を奏すため、関節炎を処置するため、骨関節症において痛みを軽減するため、骨関節症において機能回復を促進するため、抗炎症作用を促進するため、軟骨保護作用を促進するため、軟骨調節作用を促進するため、軟骨安定化作用を促進するため、軟骨代謝作用を促進するため、アルツハイマー病を改善するため、あるいはＨＩＶ感染による末梢神経障害または脊髄症を改善するための薬学的組成物を提供する。治療剤は、薬学的に受容可能なキャリア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合せた、本発明の組成物を意味する。
【００６２】
治療剤を、個々の患者の臨床状態（特に、治療剤単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ＧＭＰ＝ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。
【００６３】
一般的提案として、用量当り、経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約２μｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、本発明の抽出物について、この用量は、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約２０ｍｇ／ｋｇ／日と約１０００ｍｇ／ｋｇ／日との間である。また、一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約０．２μｇ／ｋｇ／日〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、本発明の抽出物について、この用量は、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約５ｍｇ／ｋｇ／日と約２５ｍｇ／ｋｇ／日との間である。
【００６４】
例えば、肝臓障害（例えば、胆汁うっ滞）の処置のためのＡｄｏＭｅｔの推奨される日用量は、非経口的に８００ｍｇ、または経口的に１６００ｍｇである。鬱病における非経口投与のためには、２００〜４００ｍｇ／日の量のＡｄｏＭｅｔが、１５〜２０日間にわたって与えられ得る。経口治療では、代表的に、４００〜１６００ｍｇ／日のＡｄｏＭｅｔ用量範囲である。
【００６５】
治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。本発明の薬学的組成物の代表的投与経路は、経口投与である。
【００６６】
「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。
【００６７】
本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【００６８】
本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。
【００６９】
徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：  １６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【００７０】
徐放性治療剤はまた、リポソームに包まれた本発明の治療剤を包含する（一般に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治療剤を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製され得る：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出  願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適治療剤のために調整される。
【００７１】
なおさらなる実施態様において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達されうる（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【００７２】
他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説において議論される。
【００７３】
非経口投与のために、１つの実施態様において、一般に、治療剤は、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化、および治療剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【００７４】
一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【００７５】
キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００７６】
治療剤は、代表的には約１０ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜１０００ｍｇ／ｍｌの濃度で、約６〜９のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、塩が形成されることが理解される。
【００７７】
治療的投与に用いられるべき任意の薬剤は、有効成分としてのウイルス以外の生物・ウイルスを含まない状態、すなわち、無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。
【００７８】
治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した５％（ｗ／ｖ）治療剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥した治療剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【００７９】
本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。
【００８０】
本発明の治療剤は、単独または他の治療剤と組み合わせて投与され得る。組み合わせは、例えば、混合物として同時に；同時にまたは並行してだが別々に；あるいは経時的のいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療用混合物として共に投与されるという提示、およびまた、組み合わされた薬剤が、別々にしかし同時に、例えば、同じ個体に別々の静脈ラインを通じて投与される手順を含む。「組み合わせて」の投与は、一番目、続いて二番目に与えられる化合物または薬剤のうち１つの別々の投与をさらに含む。
【００８１】
（一般生化学・分子生物学）
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００８２】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００８３】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００８４】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００８５】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
【００８６】
（一般的実施例）
（使用菌株）
本発明における清酒酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓａｋｅ  Ｋｙｏｋａｉ  Ｎｏ．７（ａ／α  ｕｒａ３Δ：：ＬＹＳ４／ｕｒａ３Δ：：ＬＹＳ４  ｈｉｓ３／ｈｉｓ３；ＲＡＫ２３５９）（協会７号変異株、以下Ｋ７−ＲＡＫ２３５９と呼ぶ）を使用した。また、本発明の新規変異酵母株の比較対象として、研究室酵母にＳＡＨ１Ｔ２７９Ｉ変異が導入されたＦＥＲＭＰ−１９７１５株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物委託センターより入手可能）を使用した。
【００８７】
（培養方法）
種培養として、ＹＰＤ（２０ｇ／Ｌグルコース、２０ｇ／Ｌポリペプトン、および１０ｇ／Ｌ酵母抽出物）に寒天を２０ｇ／Ｌで加えたＹＰＤ寒天平面培地上に塗布した。２８℃で１日以上生育させた寒天平面培地を４℃に保管しておいた（〜１週間）。前培養として寒天平面培地上に生育した１コロニーをＹＰＤが２ｍＬ入った試験管に植菌し、２８℃で２４時間試験管ローテーターを用いて培養した。本培養としてＹＰＤが１００ｍＬ入った５００ｍＬ容三角フラスコに前培養培養液１ｍＬを植菌し、２８℃、１５０ｒｐｍ回転振とう培養を行った。
【００８８】
（菌体およびグルコース量の測定）
適宜試料を２ｍＬほど採取し、希釈した培養液の濁度（ＯＤ６６０）を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ社製Ｕ−２８００）で測定した（濁度はこれまでの結果より得られた換算係数ｆ＝０．６５８１を用いて乾燥菌体重量（ｃＤＣＷ）に換算した）。培養液１ｍＬを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，１０分）し、菌体を脱イオン水１ｍＬで洗浄した後、１０５℃で一晩乾燥させ乾燥菌体重量（ＤＣＷ）を測定した。また、上清中のグルコース残存濃度（ＲＧＣ）をグルコースアナライザー（ＴＯＡ社製ＧＬＵ−１１）を用いて測定した。
【００８９】
（ＡｄｏＭｅｔおよびＡｄｏＨｃｙ量の測定）
培養液１ｍＬから分離した菌体に、１０％過塩素酸溶液３７５μＬを加えて混合した後、試験管振とう機を用いて室温で１時間抽出し、遠心分離により得られた上清中のＡｄｏＭｅｔ濃度およびＡｄｏＨｃｙ濃度を、ＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製１０ＡＤ  ｖｐ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は、以下の通りであった：カラム；ＵＫ−Ｃ１８（Ｉｎｔａｋｔ社製）、カラム温度；４０℃、検出波長；２６０ｎｍ、流速；０．４ｍＬ／ｍｉｎ、移動相；２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４：メタノール＝９２：８、サンプル量；１０μＬ。
【００９０】
（酵母染色体ＤＮＡの単離）
２８℃で１８時間培養された酵母株のシングルコロニーをピックアップし、それをＹＰＤプレート培地または３ｍｌのＹＰＤ液体培地中で、２８℃で１８〜２４時間培養する。液体培地で培養した場合は、１２，０００ｒｐｍで３分間の遠心分離により菌体を沈殿させる。プレート培地から集めた菌体、またはこの遠心分離による沈殿した菌体に、３００μｌのＳＥＴ（１．２Ｍソルビトール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、および１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））を加え、続いて２０μｌのＺｙｍｏ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＥＴ−１０％β−ＭｅＯＨ中の３ｍｇ／ｍｌのＺｙｍｏｌｙａｓｅ  １００Ｔ；３ｍｇのＺｙｍｏｌｙａｓｅ  １００Ｔ、０．９ｍｌのＳＥＴおよび０．１ｍｌのβメルカプトエタノール）を加え、ボルテックスする。３７℃で３０分間放置し、５０μｌのＳＤＳを加えて手で混合する。２００μｌのフェノール／クロロホルム（Ｐｈｅ／Ｃｈｌ）を加え、２０秒〜３０秒間ボルテックスする。１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、その上清を、予め９９．５％エタノール８００μｌと３ＭのＮａＯＡｃ３４．８μｌを入れておいたチューブに移し、手で混合する。上清を除いた沈殿に、２００〜３００μｌのＴＥ（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を加え、次いで１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを２μｌ加えて、３７℃で１５分間放置する。これに２００μｌのＰｈｅ／Ｃｈｌを加え、２０〜３０秒間ボルテックスする。１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、その上清を、予め９９．５％エタノール５００μｌと３ＭのＮａＯＡｃ２０μｌを入れておいたチューブに移し、手で混合する。１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離することによって沈殿させ、上清を捨ててこの沈殿に１００〜２００μｌのＴＥを加えて、酵母染色体ＤＮＡ溶液とする。
【００９１】
（酵母の形質転換）
宿主菌株の冷蔵庫ストックから菌体を採取し、２ｍｌのＹＰＤ培地で２８℃において２４時間、回転培養する。培養液１ｍｌをＹＰＤ培地９ｍｌに植菌し、２８℃で５時間、回転振盪培養する。この培養物を８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を捨てる。沈殿に蒸留水１０ｍｌを加え、ボルテックスする。次いで、８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して沈殿させ、これをＣｅｌｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎとする。６０％のＰＥＧ３３５０を１２０μＬ、４ＭのＬｉＯＡｃを５μｌ、１０μｇ／ｍｌのキャリアＤＮＡを１０μｌ、ＤＮＡ（ＰＣＲ産物またはプラスミド）５μｌ、およびＣｅｌｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ６０μｌ（計２００μｌ）をチューブに入れ（ここで、ＰＥＧとＬｉＯＡｃとを予め混合しておき、キャリアとＤＮＡとを予め混合しておく）、ボルテックスする。ここで、１０μｇ／ｍｌのキャリアＤＮＡは、９７℃で３分間加熱処理し、次いで氷水中に５分間浸したものである。４２℃で６０分間放置し、蒸留水１００μｌを加えて、適切な選択培地プレートに塗り、２８℃で３日間放置する。シングルコロニーを選択培地プレートにストリークし、２８℃で１日間放置して、これを形質転換体とする。
【００９２】
（ＤＮＡの精製）
・フェノール／クロロホルム法
蒸留水５０μｌにＤＮＡを溶解し、それに５０μｌのＰｈｅ／Ｃｈｌを加える。ボルテックスし、６，０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。上清を別のチューブに移し、それに５μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃおよび１２０μｌの９９％ＥｔＯＨを加えてボルテックスする。これを−２０℃で１０分間インキュベートし、これをボルテックスする。次いで、これを１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離することによって沈殿させる。この沈殿に、２００μｌの７０％ＥｔＯＨを加え、これを１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。生じた沈殿を乾燥させ、これを１０μｌの蒸留水に溶解し、ＤＮＡ溶液とする。
【００９３】
・エタノール沈殿
蒸留水１０μｌにＤＮＡを溶解し、それに１μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃおよび２０μｌの９９％  ＥｔＯＨを加えて、ボルテックスする。これを−２０℃で１０分間インキュベートし、次いで１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。沈殿に７０％のエタノールを２００μｌ加え、これを１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。生じた沈殿を乾燥させ、これを１０μｌの蒸留水に溶解し、ＤＮＡ溶液とする。
【００９４】
（実施例１：Ｋ７株へのＡｄｏＭｅｔ高蓄積変異の導入）
・変異遺伝子フラグメントの合成
変異遺伝子部位の増幅は、ＡｄｏＭｅｔ高蓄積変異遺伝子を含むｐＵＣ１１９−ＳＡＨ１Ｔ２７９Ｉ（Ｍｉｚｕｎｕｍａら、ＰＮＡＳ，２００４年４月２０日，ｖｏｌ．１０１，Ｎｏ．１６，ｐ．６０８６−６０９１）をテンプレートとして、
フォワードプライマー；
ＳＡＨ１−２８２：ＡＡＧＴＡＴＣＣＣＴＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＴＣ（配列番号３）、もしくは
ＳＡＨ１ａｔｇ５０−ＥＲＶ：ＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＴＣＧＣＴＧＡＴＡＴＴＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号４）、
リバースプライマー；
ＳＡＨ１−１３５０ｃ：ＴＣＡＡＴＡＴＣＴＧＴＡＧＴＧＧＴＣＧＧＣＣＴＴＧ（配列番号５）、もしくは
ＳＡＨ１−１４５０ｃ：ＡＴＴＴＧＣＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＴＣＴＴＴＴ（配列番号６）、
を用い、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、以下に示すＰＣＲ条件で増幅した。
初回変性（９４℃で１分間）；
変性（９４℃で２０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒）および伸長（６８℃で１．５分間）を３０サイクル。
（この条件を、本明細書中ではＰＣＲ条件１と呼ぶ。）得られたＰＣＲ産物から、電気泳動によって目的のバンドのみ切り出し変異遺伝子断片とした。
【００９５】
・選択マーカー１の合成
選択マーカー１の増幅は、選択マーカー１としてＨＩＳ３を使用する場合はｐＳｃ  ＨＩＳ３ＴＤＨ３ｐ（赤田ら，山口大学；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２００５，  ７１，  ３１２−３１９）をテンプレートとして、選択マーカー１としてＵＲＡ３を使用する場合はｐＳＴ１０６（赤田ら，山口大学；Ｋａｋｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＴＥ  Ｌｅｔｔ．，  ２００５，  １３５−１３９．この論文中ではｐＳｃＵＲＡ３ＴＤＨ３ｐと呼ばれている）をテンプレートとして、
フォワードプライマー；
ＳＡＨ１＋１３５０＋ＡＳＣ：ＣＣＡＴＴＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＡＧＡＴＡＴＴＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧ（配列番号７）、もしくは
ＳＡＨ１＋１４５０＋ＡＳＣ：ＡＴＣＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧ（配列番号８）、
リバースプライマー；
ＳＡＨ１ｄ１００−４０ｃＴＤＨｕ１：ＧＴＡＴＴＡＡＴＡＣＴＧＴＧＡＴＡＧＧＡＴＴＧＴＴＡＧＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴＧＡＴＡＡＴ（配列番号９）
を用い、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＰＣＲ条件１で増幅した。得られたＰＣＲ産物から、電気泳動によって目的のバンドのみ切り出し選択マーカー１とした。
【００９６】
・選択マーカー１を含む変異遺伝子フラグメントの合成
選択マーカー１を含む変異遺伝子フラグメントは、変異遺伝子フラグメントおよび選択マーカー１をテンプレートとして、
フォワードプライマー；ＳＡＨ１−２８２（配列番号３）、もしくはＳＡＨ１ａｔｇ５０−ＥＲＶ（配列番号４）、
リバースプライマー；ＳＡＨ１ｄ１００−４０ｃＴＤＨｕ１（配列番号９）
を用い、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ  社製）を用いて以下のＰＣＲ条件で増幅した。
初回変性（９４℃で１分間）；
変性（９４℃で２０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒）および伸長（６８℃で３分間）を３０サイクル。
（この条件を、本明細書中ではＰＣＲ条件２と呼ぶ。）電気泳動によって、選択マーカー１を含む変異遺伝子フラグメントを得たことを確認し、これをＫ７株に形質転換した。得られた形質転換体数を、表１に示す。
【００９７】
【表１】
2009034043.tif 000002
得られた形質転換体の染色体ＤＮＡ（上述の一般的実施例を参照のこと）をテンプレートとし、
フォワードプライマー；
ＳＡＨ１＋３０４：ＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号１０）
リバースプライマー；
ＳＡＨ１−１３５０ｃ（配列番号５）
を用い、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてＰＣＲ条件１で増幅した。Ｐｈｅ／Ｃｈｌ処理（上述の一般的実施例を参照のこと）によりＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＢｓｒＩ（６５℃，３ｈ）で処理した。ＤＮＡを精製（上述の一般的実施例を参照のこと）した後、電気泳動にてバンドを確認した（示さず）。Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ（ＳＡＨ１）ではＢｓｒＩサイトが２箇所あり、電気泳動の際に５３６，２２６，２２５ｂｐの３本のバンドが見られるが、変異遺伝子断片（ＳＡＨ１Ｔ２７９Ｉ）では１つのＢｓｒＩサイトに変異が入る為７６１，２２６ｂｐの２本のバンドが見られる。よって２倍体であるＫ７株では、変異が導入された場合には、７６１，５３６，２２６，２２５ｂｐの４本のバンドが見られることとなる。
【００９８】
表１に示す形質転換体に関して、ＰＣＲ産物とＢｓｒＩ処理したＰＣＲ産物とを電気泳動した結果、全ての組み合わせにおいてマーカーを含む変異遺伝子断片の導入が確認された。
【００９９】
（実施例２：対遺伝子（ＳＡＨ１野生型）の破壊）
１．ＳＡＨ１の選択マーカー２での置換による破壊
選択マーカー２の増幅は、選択マーカー２としてＨＩＳ３を使用する場合はｐＳｃ  ＨＩＳ３ＴＤＨ３ｐ（赤田ら，山口大学；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２００５，  ７１，  ３１２−３１９）をテンプレートとして、選択マーカー２としてＵＲＡ３を使用する場合はｐＳＴ１０６（赤田ら，山口大学；Ｋａｋｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＴＥ  Ｌｅｔｔ．，  ２００５，  １３５−１３９．この論文中ではｐＳｃＵＲＡ３ＴＤＨ３ｐと呼ばれている）をテンプレートとして
フォワードプライマー；
ＳＡＨ１−４０１：ＣＴＣＣＴＣＧＡＡＡＴＡＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＡＴＴＣＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧ（配列番号１１）、
リバースプライマー；
ＳＡＨ１ｄ１００−４０ｃＴＤＨｕ１（配列番号９）
を用い、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＰＣＲ条件１で増幅した。電気泳動によって目的とする選択マーカー２が得られたことを確認した後、上記で得られた変異が導入された菌株に形質転換した。ここで、選択マーカー１にＵＲＡ３を用いたものには選択マーカー２にＨＩＳ３を用い、選択マーカー１にＨＩＳ３を用いたものには
選択マーカー２にＵＲＡ３を用いた。
【０１００】
２．ＳＡＨ１への選択マーカー２の挿入による破壊
選択マーカー２の増幅は、ＨＩＳ３の場合ｐＳｃＨＩＳ３ＴＤＨ３ｐをテンプレートとして、ＵＲＡ３の場合ｐＳＴ１０６をテンプレートとして、
フォワードプライマー；
ＳＡＨ１−５０１−４０１：ＡＴＡＣＡＧＡＡＴＧＧＴＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧ（配列番号１２）、
リバースプライマー；
ＳＡＨ１−５００ｃ−ＴＤＨｕ１：ＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＣＡＣＣＧＧＴＧＧＴＡＧＴＴＴＣＴＴＣＧＧＡＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＣＡＧＴＡＴＴＧＡＴＡＡＴ（配列番号１３）
を用い、１．と同様の方法で形質転換を行った。
【０１０１】
上記１．および２．で得られた、本発明の新規酵母変異株の数を表２に示す。
【０１０２】
【表２】
2009034043.tif 000003
得られた形質転換体の染色体ＤＮＡをテンプレートとし、フォワードプライマー；ＳＡＨ１＋３０４（配列番号１０）、およびリバースプライマー；ＳＡＨ１−１３５０ｃ（配列番号５）を用い、ＫＯＤ  ｐｌｕｓを用いて、ＰＣＲ条件１で増幅し、Ｐｈｅ／Ｃｈｌ処理によりＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＢｓｒＩ（６５℃，３ｈ）で処理した。ＤＮＡをＥｔＯＨ沈殿で精製し、電気泳動にてバンドを確認した（示さず）。野生型（ＳＡＨ１）ではＢｓｒＩサイトが２箇所あり、電気泳動の際に５３６，２２６，２２５ｂｐの３本のバンドが見られるが、変異遺伝子断片（ＳＡＨ１Ｔ２７９Ｉ）では１つのＢｓｒＩサイトに変異が入る為７６１，２２６ｂｐの２本のバンドが見られる。よって対遺伝子が置換、もしくは挿入により破壊された場合には、７６１，２２６ｂｐの２本のバンドが見られることとなる。
【０１０３】
マーカー１にＵＲＡ３を用いて表１の（２）の方法で変異遺伝子断片を増幅し、マーカー２にＨＩＳ３を用いて対遺伝子に挿入することで破壊した形質転換体（Ｓ−Ｕ（２）／Ｈ  ｉｎ；ｓａｈ１Ｔ２７９Ｉ−ＵＲＡ３（２）／ＨＩＳ３（ｉｎ））と、マーカー１にＨＩＳ３を用いて表１の（１０）の方法で変異遺伝子断片を増幅し、マーカー２にＵＲＡ３を用いて置換したもの（Ｓ−Ｈ（１０）／Ｕ  ｒｅｐ；ｓａｈ１Ｔ２７９Ｉ−ＨＩＳ３（１０）／ＵＲＡ３（ｒｅｐ））、および対遺伝子に挿入することで破壊したもの（Ｓ−Ｈ（１０）／Ｕ  ｉｎ；ｓａｈ１Ｔ２７９Ｉ−ＨＩＳ３（１０）／ＵＲＡ３（ｉｎ））等の１６株が取得されたことを確認した。Ｓ−Ｈ（１０）／Ｕ  ｒｅｐ；ｓａｈ１Ｔ２７９Ｉ−ＨＩＳ３（１０）／ＵＲＡ３（置換）を、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物委託センターに寄託した（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３０５（寄託日：平成１９年６月１４日））。ただし、本発明はこのＦＥＲＭ  Ｐ−２１３０５株に限定されるものではなく、本発明の方法によって作製されたＡｄｏＭｅｔ高産生酵母株は全て、本発明の範囲内にある。
【０１０４】
（実施例３：ＡｄｏＭｅｔ生産能比較）
１．新規酵母変異株とＫ７株（親株）とのＡｄｏＭｅｔ生産能比較
親株であるＫ７株をコントロールとして、選択マーカー１を含む変異遺伝子フラグメントを形質転換し、対遺伝子（ＳＡＨ１野生型）が残っているもの（Ｓ−Ｕ（２）／ＷＴ（Ｕ（２）／ＷＴ）；ｓａｈ１Ｔ２７９Ｉ−ＵＲＡ３（２）／ＳＡＨ１，Ｓ−Ｈ（１０）／ＷＴ（Ｈ（１０）／ＷＴ）；ｓａｈ１Ｔ２７９Ｉ−ＨＩＳ３（１０）／ＳＡＨ１）、および３種類の取得された選択マーカー１を含む変異遺伝子断片を形質転換し、対遺伝子を選択マーカー２で破壊したもの（Ｓ−Ｕ（２）／Ｈ  ｉｎ；ｓａｈ１Ｔ２７９Ｉ−ＵＲＡ３（２）／ＨＩＳ３（ｉｎ）、Ｓ−Ｈ（１０）／Ｕ  ｒｅｐ；ｓａｈ１Ｔ２７９Ｉ−ＨＩＳ３（１０）／ＵＲＡ３（ｒｅｐ）、Ｓ−Ｈ（１０）／Ｕ  ｉｎ；ｓａｈ１Ｔ２７９Ｉ−ＨＩＳ３（１０）／ＵＲＡ３（ｉｎ））の合計６菌株の培養比較を行った。また、変異遺伝子断片（ｓａｈ１Ｔ２７９Ｉ）は温度感受性を示すことが報告されている（特開２００５−２６１３６１号公報、Ｍｉｚｕｎｕｍａら、ＰＮＡＳ，２００４年４月２０日，ｖｏｌ．１０１，Ｎｏ．１６，ｐ．６０８６−６０９１などを参照のこと）ことから２８℃で本培養を開始し、残糖量が枯渇した時点から３７℃に培養温度上げて培養を行い、研究室酵母での性質が本発明の酵母株においても現れるかを検証した。
【０１０５】
２８℃で培養した場合、選択マーカー１を含む変異遺伝子フラグメントを形質転換した菌株ではＡｄｏＭｅｔ含有量に余り大きな変化は無かったものの、対遺伝子を破壊することでＡｄｏＭｅｔ含有量が８〜９倍もの予想外に大きな増加が確認された。更に培養温度を２８℃から３７℃にシフトした培養では、各菌株共に１．２〜１．５倍ものＡｄｏＭｅｔ含有量の増加が確認された。これらの結果から、ＡｄｏＭｅｔ含有量は最大で親株の約１２倍に増加させることができた。他の１３株についても、同様の結果を得ることができる。
【０１０６】
【表３】
2009034043.tif 000004
２．新規酵母変異株とＦＥＲＭＰ−１９７１５株とのＡｄｏＭｅｔ含有量比較
本発明の新規酵母変異株とＦＥＲＭＰ−１９７１５株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物委託センターより入手可能）との間の、ＡｄｏＭｅｔ含有量およびＡｄｏＨｃｙ含有量を、上述と同様に比較した。
【０１０７】
【表４】
2009034043.tif 000005
以上の結果から、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子変異を有さない清酒酵母の約８倍〜約１２倍、変異Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子を有する酵母（ＦＥＲＭＰ−１９７１５株）の約７４〜９０倍、ＡｄｏＭｅｔを大量に産生する新規酵母株が作製されたことが明らかになった。他の１３株についても、同様の結果を得ることができる。本発明の新規酵母株はセルフクローニングによって作製されていることから、この酵母株によって産生されたＡｄｏＭｅｔはヒトによる摂取において非常に安全性が高い。
【０１０８】
本発明の他の実施形態は、本明細書の考慮および開示される実施形態から当業者に明らかである。明細書および実施例は例示としてのみ考えられ、本発明の真の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によってのみ示される。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１Ａは、コントロールＫ７株の、乾燥菌体重量（上段）、ならびにＡｄｏＭｅｔ含有量およびＡｄｏＨｃｙ含有量（下段）を示す。図１ＢおよびＣは、選択マーカー１を含む変異遺伝子フラグメントを形質転換し、対遺伝子（ＳＡＨ１野生型）が残っているものの、乾燥菌体重量（上段）、ならびにＡｄｏＭｅｔ含有量およびＡｄｏＨｃｙ含有量（下段）を示す。図１Ｄ〜Ｆは、取得された選択マーカー１を含む変異遺伝子断片を形質転換し、対遺伝子を選択マーカー２で破壊したものの、乾燥菌体重量（上段）、ならびにＡｄｏＭｅｔ含有量およびＡｄｏＨｃｙ含有量（下段）を示す。
【図２】図２は、細胞内でのＳ−アデノシルメチオニンの生成経路の概略を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１１０】
配列番号１＝野生型Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素の核酸配列
配列番号２＝野生型Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素のアミノ酸配列
配列番号３＝プライマーＳＡＨ１−２８２
配列番号４＝プライマーＳＡＨ１ａｔｇ５０−ＥＲＶ
配列番号５＝プライマーＳＡＨ１−１３５０ｃ
配列番号６＝プライマーＳＡＨ１−１４５０ｃ
配列番号７＝プライマーＳＡＨ１＋１３５０＋ＡＳＣ
配列番号８＝プライマーＳＡＨ１＋１４５０＋ＡＳＣ
配列番号９＝プライマーＳＡＨ１ｄ１００−４０ｃＴＤＨｕ１
配列番号１０＝プライマーＳＡＨ１＋３０４
配列番号１１＝プライマーＳＡＨ１−４０１
配列番号１２＝プライマーＳＡＨ１−５０１−４０１
配列番号１３＝プライマーＳＡＨ１−５００ｃ−ＴＤＨｕ１
【図２】
2009034043.tif 000006
【図１】
2009034043.tif 000007
【配列表】
2009034043000001.app