(57)【要約】【課題】より多くのコピー数で目的遺伝子を導入することができる、或いはより多種類の目的遺伝子を導入することができる形質転換用酵母を提供する。【解決手段】ホモタリック性を有してなり、複数の選択マーカーを付与した形質転換用酵母に対して目的遺伝子を導入する工程と、上記形質転換用酵母における選択マーカーに従って、目的遺伝子が導入された株を選択する工程とを含み、上記形質転換用酵母におけるホモタリック性により上記目的遺伝子を多重に導入する。【選択図】図１
2009034036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホモタリック性を有する酵母に複数の選択マーカーを導入した形質転換用酵母。
【請求項２】
上記酵母は胞子形成能を有することを特徴とする請求項１記載の形質転換用酵母。
【請求項３】
上記胞子形成能は０．１％以上であることを特徴とする請求項２記載の形質転換用酵母。
【請求項４】
上記選択マーカーは栄養要求性であることを特徴とする請求項１記載の形質転換用酵母。
【請求項５】
上記選択マーカーはウラシル要求性、ヒスチジン要求性及びトリプトファン要求性からなる群から選ばれる２種以上の栄養要求性であることを特徴とする請求項１記載の形質転換用酵母。
【請求項６】
上記酵母はSaccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）であることを特徴とする請求項１記載の形質転換用酵母。
【請求項７】
請求項１乃至６いずれか一項記載の形質転換用酵母に対して目的遺伝子を導入する工程と、
上記形質転換用酵母における選択マーカーに従って、目的遺伝子が導入された株を選択する工程とを含み、
上記形質転換用酵母におけるホモタリック性により上記目的遺伝子を多重に導入することを特徴とする形質転換方法。
【請求項８】
導入された選択マーカーの数に応じて、目的遺伝子を導入する上記工程及び目的遺伝子が導入された株を選択する上記工程を複数回行うことを特徴とする請求項７記載の形質転換方法。
【請求項９】
目的遺伝子が導入された株を選択した後、胞子形成培地において胞子形成を誘導する工程と、
当該胞子形成培地から分離した子嚢を発芽培地で培養する工程とを更に含むことを特徴とする請求項７記載の形質転換方法。
【請求項１０】
請求項１乃至６いずれか一項記載の形質転換用酵母に対して目的遺伝子を多重に導入してなる形質転換酵母を培養する工程を含む、物質生産方法。
【請求項１１】
上記目的遺伝子はβ-グルコシダーゼ遺伝子であり、生産対象がオリゴ糖を基質としたエタノールであることを特徴とする請求項１０記載の物質生産方法。
【請求項１２】
上記目的遺伝子は乳酸脱水素酵素遺伝子であり、生産対象が乳酸であることを特徴とする請求項１０記載の物質生産方法。
【請求項１３】
上記目的遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターの制御下に発現するものであることを特徴とする請求項１０記載の物質生産方法。
【請求項１４】
所定の栄養成分の合成に関連する栄養要求性関連遺伝子を欠失してなり、当該栄養成分要求性を付与されたホモタリック性を有する酵母に対して、
上記所定の栄養成分とは異なる他の栄養成分の合成に関連する欠失対象栄養要求性関連遺伝子の上流領域、上記栄養要求性関連遺伝子及び当該欠失対象栄養要求性関連遺伝子の下流領域をこの順で配置したDNA断片を導入する工程と、
上記栄養要求性を指標として上記DNA断片が導入された株を同定する工程と、
上記工程で同定された株のなかから上記栄養要求性関連遺伝子が脱落して、再度、栄養要求性が付与された株を選抜する工程と、
上記工程で選抜された株を胞子形成培地に接種して胞子形成を誘導する工程と、
当該胞子形成培地から分離した子嚢を発芽培地で培養する工程と、を含むホモタリック性を有する酵母に対する選択マーカーの多重付与方法。
【請求項１５】
上記栄養成分はアミノ酸又は塩基であり、上記栄養成分要求性関連遺伝子はアミノ酸合成関連遺伝子又は塩基合成関連遺伝子であることを特徴とする請求項１４記載のホモタリック性を有する酵母に対する選択マーカーの多重付与方法。
【請求項１６】
上記栄養成分はトリプトファン、ヒスチジン又はウラシルであることを特徴とする請求項１４記載のホモタリック性を有する酵母に対する選択マーカーの多重付与方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的遺伝子を導入するための形質転換用酵母、当該形質転換用酵母を用いた形質転換方法、及び当該形質転換用酵母を用いた物質生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、遺伝子工学や分子生物学等の分野におけるモデル生物として広く利用されているのみならず、発酵食品産業や発酵を利用した物質生産業においても広く利用されている。酵母を利用して有用物質を生産する際には、有用物質の生産に関連する種々の遺伝子を遺伝子組み換え技術によって酵母に導入し、形質転換酵母を作製することから始まる。有用物質の生産性には、導入対象の遺伝子高発現が重要である。このため、当該遺伝子を多重に導入することができれば、有用物質の生産性に優れた形質転換酵母として有用であるといえる。
【０００３】
一方、遺伝子組み換え技術において、目的の遺伝子を導入する際には選択マーカーが必須である。選択マーカーとしては、薬剤耐性や栄養要求性といった表現型が利用されている。薬剤耐性を選択マーカーとする場合、目的遺伝子とともに薬剤耐性遺伝子を宿主に導入することによって、形質転換体は薬剤含有培地においても生育可能なものとなる。しかし薬剤耐性遺伝子は、宿主細胞の感受性にばらつきがあり、判別がわかりにくい場合があるため栄養要求性マーカーに比べて一般的ではない。また薬剤耐性遺伝子は異種遺伝子となるためカルタヘナ法に基づき安全性評価を行い、評価および所定の手続きを取る必要がある。栄養要求性を選択マーカーとする場合、先ず、所定の栄養分を含有する培地でのみ生育可能であるといった栄養要求性を付与した宿主を準備する。具体的には、宿主が本来有している栄養分合成に関連した遺伝子を破壊することで栄養要求性を付与する。そして、この栄養成分合成に関連した遺伝子を目的遺伝子とともに宿主に導入することによって、当該栄養分を含有しない培地においても生育可能なものとなる。このように、目的遺伝子を導入した形質転換体は、薬剤耐性の付与や栄養要求性の消失といった変化を指標に選択することができる。
【０００４】
特許文献１には、一対の染色体構造を有する実用酵母（２倍体）における一対のURA3遺伝子及び/又は一対のTRP1遺伝子を破壊することで、ウラシル要求性酵母、トリプトファン要求性酵母、ウラシル及びトリプトファン要求性酵母を構築したことが開示されている。しかしながら、特許文献１に開示されてこれら酵母を形質転換の宿主として使用しても、目的遺伝子を１コピーでしか導入することができず、遺伝子を多重で導入することができない。また、２種類の栄養要求性が付与された酵母を用いたとしても、目的遺伝子を最大で２コピーしか導入することができない。また、特許文献１に開示された、一対の遺伝子を破壊する手法は、実験工数が多く、また作業上の困難を多く含んでおり、如何なる酵母にも適用できる技術ではなく実用的な手法ではない。
【０００５】
一方、非特許文献１には、ホモタリック性を有するワイン酵母（Saccharomyces cerevisiae OC-2株）にトリプトファン要求性を付与した株（OC-2T株）を構築し、これを用いて目的遺伝子を一対の染色体に導入する技術が開示されている。詳細には、トリプトファン要求性を指標にして目的遺伝子を導入した後、当該酵母のホモタリック性を利用して各染色体のそれぞれに目的遺伝子を導入している。しかしながら、非特許文献１に開示されたOC-2T株は、選択マーカーが１種類しかないため、OC-2T株は栄養要求性マーカーにより、目的遺伝子を最大で２コピーしか導入することができない。
【０００６】
【特許文献１】特公平７−１１４６８９号
【非特許文献１】Applied and Environmental microbiology, May 2005, p. 2789-2792
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、酵母を宿主として目的遺伝子を導入するには栄養要求性マーカーでは最大で２コピーしか導入できない、或いは薬剤耐性マーカーを使用する場合、一応多コピー化は可能であるが、薬剤耐性マーカーの使用は、マーカー遺伝子導入の判定の不明瞭さ、外来遺伝子の安定性評価など実験室内での作業効率、開発酵母の実用化の観点から望ましいとはいえない。そこで、本発明は、このような実情に鑑み、より多くのコピー数で目的遺伝子を導入することができる、或いはより多種類の目的遺伝子を導入することができる形質転換用酵母、形質転換方法、当該形質転換用酵母を用いた物質生産方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、ホモタリック性を有する酵母を利用すれば簡便にゲノムへの多コピー遺伝子導入が可能であり、高次倍数体の酵母であっても複数の選択マーカーを付与できる新たな技術を開発することに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明者らは、ホモタリック性を有する酵母に対して、いわゆるマーカーリサイクル法を用いて選択マーカーを付与することで、特許文献１に開示された手法では困難であった複数種類の選択マーカーを付与することに成功した。
【０００９】
本発明は以下を包含する。
（１）ホモタリック性を有する酵母に複数の選択マーカーを導入した形質転換用酵母。
（２）上記酵母は胞子形成能を有することを特徴とする（１）記載の形質転換用酵母。
（３）上記胞子形成能は０．１％以上であることを特徴とする（２）記載の形質転換用酵母。
（４）上記選択マーカーは栄養要求性であることを特徴とする（１）記載の形質転換用酵母。
（５）上記選択マーカーはウラシル要求性、ヒスチジン要求性及びトリプトファン要求性からなる群から選ばれる２腫以上の栄養要求性であることを特徴とする（１）記載の形質転換用酵母。
（６）上記酵母はSaccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）であることを特徴とする（１）記載の形質転換用酵母。
（７）上記（１）乃至（６）いずれか一項記載の形質転換用酵母に対して目的遺伝子を導入する工程と、上記形質転換用酵母における選択マーカーに従って、目的遺伝子が導入された株を選択する工程とを含み、上記形質転換用酵母におけるホモタリック性により上記目的遺伝子を多重に導入することを特徴とする形質転換方法。
（８）導入された選択マーカーの数に応じて、目的遺伝子を導入する上記工程及び目的遺伝子が導入された株を選択する上記工程を複数回行うことを特徴とする（７）記載の形質転換方法。
【００１０】
（９）目的遺伝子が導入された株を選択した後、胞子形成培地において胞子形成を誘導する工程と、当該胞子形成培地から分離した子嚢を発芽培地で培養する工程とを更に含むことを特徴とする（７）記載の形質転換方法。
（１０）上記（１）乃至（６）いずれか一項記載の形質転換用酵母に対して目的遺伝子を多重に導入してなる形質転換酵母を培養する工程を含む、物質生産方法。
（１１）上記目的遺伝子はβ-グルコシダーゼ遺伝子であり、生産対象がオリゴ糖を基質としたエタノールであることを特徴とする（１０）記載の物質生産方法。
（１２）上記目的遺伝子は乳酸脱水素酵素遺伝子であり、生産対象が乳酸であることを特徴とする（１０）記載の物質生産方法。
（１３）上記目的遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターの制御下に発現するものであることを特徴とする（１０）記載の物質生産方法。
（１４）所定の栄養成分の合成に関連する栄養要求性関連遺伝子を欠失してなり、当該栄養成分要求性を付与されたホモタリック性を有する酵母に対して、上記所定の栄養成分とは異なる他の栄養成分の合成に関連する欠失対象栄養要求性関連遺伝子の上流領域、上記栄養要求性関連遺伝子及び当該欠失対象栄養要求性関連遺伝子の下流領域をこの順で配置したDNA断片を導入する工程と、上記栄養要求性を指標として上記DNA断片が導入された株を同定する工程と、上記工程で同定された株のなかから上記栄養要求性関連遺伝子が脱落して、再度、栄養要求性が付与された株を選抜する工程と、上記工程で選抜された株を胞子形成培地に接種して胞子形成を誘導する工程と、当該胞子形成培地から分離した子嚢を発芽培地で培養する工程と、を含むホモタリック性を有する酵母に対する選択マーカーの多重付与方法。
（１５）上記栄養成分はアミノ酸又は塩基であり、上記栄養成分要求性関連遺伝子はアミノ酸合成関連遺伝子又は塩基合成関連遺伝子であることを特徴とする（１４）記載モタリック性を有する酵母に対する選択マーカーの多重付与方法。
（１６）上記栄養成分はトリプトファン、ヒスチジン又はウラシルであることを特徴とする（１４）記載のホモタリック性を有する酵母に対する選択マーカーの多重付与方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る形質転換用酵母及び形質転換方法によれば、目的遺伝子を従来と比較してより多くのコピー数で導入することができる、或いは従来と比較してより多種類の目的遺伝子を導入することができる。これにより、目的遺伝子を高発現する形質転換酵母、より多種類の目的遺伝子を発現する形質転換酵母を開発することができる。
【００１２】
また、本発明に係る物質生産方法によれば、従来の形質転換用酵母を用いた場合と比較して、目的物質の生産性を大幅に向上させることができ、物質生産にかかるコストを大幅に削減することができる。
【００１３】
さらに、本発明に係る形質転換用酵母の作製方法によれば、目的遺伝子を従来と比較してより多くのコピー数で導入することができる、或いは従来と比較してより多種類の目的遺伝子を導入することができる形質転換用酵母を非常に簡便に作製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
本発明に係る形質転換用酵母は、ホモタリック性を有する酵母に複数の選択マーカーを導入したものである。ここで、形質転換用酵母とは、目的遺伝子を導入する対象となる酵母を意味しており、目的遺伝子が導入された形質転換酵母とは異なる意味である。
【００１５】
また、ホモタリック性を有する酵母とは、ホモタリックな酵母と同義である。ホモタリック性を有する酵母では、HO遺伝子にコードされるエンドヌクレアーゼによる性転換がおこり、一倍体の母細胞から性の異なる娘細胞が出芽することになる。一倍体の酵母にはa細胞とα細胞という２種類の性（接合型）が存在し、a細胞どうし、α細胞どうしは接合しない。a細胞とα細胞はそれぞれaファクターとαファクターという特有の性ホルモン（フェロモン）を分泌しており、お互いが十分に近接して相手のフェロモン細胞膜上の受容体で感知すると、通常の増殖を停止し接合をはじめる。互いの方向に向かい細胞が伸長し、互いの細胞膜、続いて核が融合し、二倍体の細胞となる。したがって、ホモタリック性を有する酵母は、一倍体の母細胞から出芽した娘細胞が、当該母細胞と接合して二倍体となるといった生活環を形成している。この生活環によれば、ホモタリック性を有する一倍体の酵母は、接合型を決定するMAT遺伝子（MATａ遺伝子及びMATα遺伝子）以外は全く同一の遺伝子型を有する二倍体酵母へと変化することになる。なお、二倍体酵母は、培地中の窒素源が枯渇する等の栄養飢餓条件になると減数分裂をはじめ胞子を形成する。酵母の胞子は、子嚢という袋状構造のなかに２つのａ細胞及び２つのα細胞を有している。胞子は、栄養飢餓条件が解消されると発芽し、一倍体として再び出芽による増殖を開始する。
【００１６】
ホモタリック性を有する酵母としては、特に限定されず、如何なる酵母をも使用することができる。ホモタリック性を有する酵母としては、Saccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。その他にもホモタリック性を有する酵母としては、アルコール酵母（台研396号、NBRC0216）（出典：「アルコール酵母の諸特性」酒研会報、No37、p18-22(1998.8)）、ブラジルと沖縄で分離したエタノール生産酵母（出典：「ブラジルと沖縄で分離したSaccharomyces cerevisiae野生株の遺伝学的性質」日本農芸化学会誌、Vol.65、No.4、p759-762(1991.4)）及び180（出典「アルコール発酵力の強い酵母のスクリーニング」日本醸造協会誌、Vol.82、No.6、p439-443(1987.6)）を挙げることができる。また、ヘテロタリックな表現型を示す酵母においても、HO遺伝子を発現可能に導入することによってホモタリック性を有する酵母として使用することができる。すなわち、本発明において、ホモタリック性を有する酵母とは、HO遺伝子を発現可能に導入された酵母も含む意味である。
【００１７】
なかでも、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、従来ワイン醸造の場面で利用されてきた安全性を確認されている菌株であるため好ましい。また、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、後述する実施例で示したように、高糖濃度の条件下におけるプロモーター活性が優れた菌株であるため好ましい。特にSaccharomyces cerevisiae OC-2株は、高糖濃度条件においてピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーター活性が優れているため好ましい。
【００１８】
本発明に係る形質転換用酵母は、複数の選択マーカーが付与されている。具体的に、選択マーカーとしては、宿主における所定の遺伝子を不機能化することによって、所定の条件下における生育状態が他の条件下における生育状態と区別して観察される表現型を利用するものである。ここで、遺伝子の不機能化とは、当該遺伝子の欠損、当該遺伝子の転写抑制、当該遺伝子の翻訳抑制、当該遺伝子自体の変異等を意味する。なお、高次倍数体においては、全ての染色体における遺伝子が不機能化されることとなる。より具体的に、選択マーカーとしては、生育に必須な栄養成分の生合成に関与する遺伝子を不機能化させることによって付与される栄養要求性等を挙げることができる。栄養要求性としては、酵母におけるURA3遺伝子を不機能化させることで付与されるウラシル要求性、酵母におけるHIS3遺伝子を不機能化させることで付与されるヒスチジン要求性及びTRP1遺伝子を不機能化させることで付与されるトリプトファン要求性を挙げることができる。なお、不機能化させる遺伝子は、URA3遺伝子、HIS3遺伝子及びTRP1遺伝子に限定されず、例えばLUE2遺伝子、ADE2遺伝子、LYS2遺伝子等を挙げることができる。LUE2遺伝子を不機能化させることでロイシン要求性を付与することができ、ADE2遺伝子を不機能化させることでアデニン要求性を付与することができ、またLYS2遺伝子を不機能化させることでリジン要求性を付与することができる。
【００１９】
複数の選択マーカーを付与するには、先ず、単独の選択マーカーを有する酵母を準備する。なお、当該酵母は、上述したようにホモタリック性を有するものである。このような単独の選択マーカーを有するホモタリックな酵母としては、例えばApplied and Environmental microbiology, May 2005, p. 2789-2792に開示されたSaccharomyces cerevisiae OC-2T株を使用することができる。このSaccharomyces cerevisiae OC-2T株は、ワイン酵母として知られているSaccharomyces cerevisiae OC-2株における一対のTRP1遺伝子を欠失させた株であり、トリプトファン栄養要求性を選択マーカーとして付与されたホモタリックな酵母である。また、同報に開示されたSaccharomyces cerevisiae OC-2U株を使用することもできる。このSaccharomyces cerevisiae OC-2U株は、Saccharomyces cerevisiae OC-2株における一対のURA3遺伝子を欠失させた株であり、ウラシル栄養要求性を選択マーカーとして付与されたホモタリックな酵母である。
【００２０】
次に、以下のようにして２つ目の選択マーカーを導入する。２つ目の選択マーカーとして、例えば、異なる栄養成分についての栄養要求性を付与する場合、当該栄養成分の生合成に関与する遺伝子を全ての染色体から欠失させる。一例として、ウラシル栄養要求性を付与されたホモタリックな酵母（OC-2U株）に対して、２つ目の選択マーカーとしてヒスチジン栄養要求性を付与する方法を図１に模式的に示す。先ず、宿主のHIS3遺伝子を欠損させるためのDNA断片を準備する。このDNA断片は、宿主におけるHIS3遺伝子の上流領域、URA3遺伝子及び宿主におけるHIS3遺伝子の下流領域をこの順で連結した構造を有している。次に、このDNA断片をウラシル栄養要求性を付与されたホモタリックな酵母に導入すると、図１（ａ）に示すように、導入したDNA断片に含まれる上流領域及び下流領域において宿主の染色体との間で相同組換えが生じる。DNA断片が染色体に導入されると、URA3遺伝子が発現することでウラシル要求性が消失することとなる。このため、DNA断片で形質転換された酵母は、ウラシル非含有培地において生育することができ、ウラシル要求性の消失を指標として同定することができる。このとき、DNA断片で形質転換された酵母の染色体構造は図１（ｂ）に示すように、一方の染色体におけるHIS3遺伝子に置き換わるようにしてURA3遺伝子が挿入されることとなる。他方の染色体におけるHIS3遺伝子は残存しており、この段階における酵母は栄養要求性を示さない。
【００２１】
次に、導入されたURA3遺伝子が脱落した株を選抜する。これは、5-フルオロオロト酸（5-FOAと称す）を含む培地で、ウラシル要求性が消失した酵母を培養することでポジティブに選択することができる。すなわち、ウラシルの生合成系を有する酵母を5-FOA存在下で培養すると、5-FOAを基質としてウラシルアナログが合成されることになり、ウラシルの生合成系を有する酵母は致死となる。よって、5-FOAを含む培地で、ウラシル要求性が消失した酵母を培養して生育した株は、URA3遺伝子が染色体から脱落したものとして同定できる。URA3遺伝子が染色体から脱落した酵母の染色体構造は、図１（ｃ）に示すように、一方の染色体におけるHIS3遺伝子のみが欠失したものとなる。
【００２２】
次に、図１（ｃ）に示した染色体構成を有する酵母を胞子形成培地において培養し、減数分裂を経て胞子を形成させる。胞子形成培地としては、特に限定されず、従来公知の組成の培地を使用することができる。次に、例えばマイクロマニュピレーター等の機器を利用して、培地から胞子（子嚢）を分離する。分離した子嚢には、図１（ｃ）に示した一対の染色体のうちいずれか一方の染色体を含む胞子（一倍体）が２個と、他方の染色体を含む胞子（一倍体）が２個含まれることとなる。次に、胞子を発芽培地において培養することで、個々の胞子を栄養増殖の生活環で増殖する。このとき、ホモタリック性を有する酵母では、一倍体の母細胞から出芽した娘細胞が、当該母細胞と接合して二倍体となるといった生活環を示すため、接合型を決定するMAT遺伝子（MATａ遺伝子及びMATα遺伝子）以外は全く同一の遺伝子型を有する二倍体酵母へと変化する。したがって、図１（ｃ）に示した染色体構成を有するホモタリックな酵母を、胞子形成の後に発芽させることによって、図１（ｄ）に示すような染色体構成を有する２種類の酵母を取得することができる。一方の２倍体酵母はウラシル栄養要求性のみを示し、他方の２倍体酵母はウラシル栄養要求性に加えてヒスチジン栄養要求性が付与されものとなる。よって、ウラシル及びヒスチジン含有培地で生育するが、ウラシル及びヒスチジン非含有培地で生育しない株として、２つ目の選択マーカーとしてヒスチジン栄養要求性が付与されたホモタリックな酵母を作製することができる。
【００２３】
なお、上述した手法を繰り返すことによって、３つ目の選択マーカーを付与できることは説明するまでもないことである。すなわち、上述した手法を採用することで、ホモタリック性を有する酵母に複数の選択マーカーを順次付与することができる。上述した手法は、ホモタリック性といった特徴的な生活環及びURA3遺伝子の脱落といった現象を効果的に利用した方法である。なお、上述の説明においては、HIS3遺伝子を欠失させるためのDNA断片にURA3遺伝子を利用し、当該URA3遺伝子の脱落を判別するために5-FOAを利用する系を説明したが、欠失対象の遺伝子はHIS3遺伝子に限定されないが、マーカーリサイクル用マーカーはURA3遺伝子が好ましい。これはウラシル要求性株を選択的に取得する事を可能とする5-FOAを利用しているためである。なお、上述したHIS3遺伝子を欠失させるためのDNA断片は、マーカーリサイクル法に利用する目的でRinji Akadaらの論文（Yeast，Volume 23，Issue 5， Pages 399-405）にも開示されている。
【００２４】
以上のように構築された、ホモタリック性を有する複数の選択マーカーが付与された酵母は、当該選択マーカーを利用した形質転換に利用することができる。すなわち、当該酵母は、形質転換用酵母として幅広く利用することができる。本発明に係る形質転換用酵母はカルタヘナ法においてはセルフクローニング扱いとなるため、遺伝子組換え生物の安全性評価の観点からも簡便になる。形質転換用酵母には、何ら限定されることなく種々の目的遺伝子を導入することができる。ここで、目的遺伝子としては、有用物質の生産能を付与するための遺伝子をあげることができる。例えば、目的遺伝子としては、酵母に乳酸生成能を付与するための乳酸脱水素酵素遺伝子（Applied and Environmental microbiology, May 2005, p. 2789-2792参照）、酵母に澱粉から直接グルコース生成する能力を付与するためのグルコアミラーゼ遺伝子（Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 81, Issue 2, 1996, pages 98-103参照）、本発明で開示しているセルラーゼ遺伝子のひとつであるBGL遺伝子等を挙げることができる。
【００２５】
目的遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００２６】
また、目的遺伝子の遺伝子発現を調節するためのプロモーターやターミネーターについても、何ら限定されることなく使用することができ、目的遺伝子及びプロモーターやターミネーターを含むプラスミドとして導入することができる。プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能であるが、なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。
【００２７】
ホモタリック性を有する酵母に対して目的遺伝子を導入する際には、酵母に付与された複数の選択マーカーのうち１つを利用する。利用する選択マーカーが栄養要求性である場合には、目的遺伝子とともに栄養要求性を消失させる遺伝子を導入し、栄養要求性の消失を指標として株を選択することができる。また、その後、当該株の子嚢を分離し、一倍体の胞子を発芽培地で培養する。これにより、ホモタリック性を有する酵母では、一倍体の母細胞から出芽した娘細胞が、当該母細胞と接合して二倍体となるといった生活環を示すため、接合型を決定するMAT遺伝子（MATａ遺伝子及びMATα遺伝子）以外は全く同一の遺伝子型を有する二倍体酵母へと変化する。これにより目的遺伝子は、全ての染色体に導入されることとなるため、一回の形質転換によって多コピーで染色体に導入されることとなる。これに対して、ヘテロタリックな酵母を使用した場合には、一回の形質転換によって目的遺伝子を１コピーしか導入できない。
【００２８】
また、上述したように作製した形質転換用酵母は、簡便な手法によって複数の選択マーカーが付与されているので、選択マーカーの数に応じて複数の目的遺伝子を導入することができる。このとき、複数の目的遺伝子としては、全て同じ遺伝子でもよいし、それぞれ異なる遺伝子であってもよい。同一の遺伝子を導入する場合には、当該遺伝子を従来にないレベルで高発現する形質転換酵母を取得することができる。具体的には、２種類の選択マーカーを有するホモタリックな形質転換用酵母を使用すると最大で４コピーの目的遺伝子を導入することができる。同様に、３種類の選択マーカーを有するホモタリックな形質転換用酵母を使用すると最大で６コピーもの目的遺伝子を導入することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本実施例では、Saccharomyces cerevisiae OC-2株にウラシル要求性を付与したSaccharomyces cerevisiae OC-2U株（Saitoら、Journal of Ferment. Bioeng.81:98-103 (1996)）を宿主として、２つ目の選択マーカーとして更にヒスチジン要求性を付与した（図１（ａ）〜（ｄ）参照）。
【００３０】
先ず、AkadaらYeast 2006 23:399-405に記載のHIS3破壊DNA断片(PCR fragment that consisted of a URA3 marker attached to a 40 base repeated-generating sequence franked by the HIS3 targeteing sequence at both ends.)を作製し、OC-2U株をFrozen EZ transformation kitII：Zymo Research社により、形質転換を行い、SDプレートで生育するコロニーを分離した。SD培地は、ウラシル要求性株は生育できず、ウラシル要求性が消失した株が生育可能なプレート、すなわち、HIS3破壊DNA断片に含まれるURA3遺伝子の発現に起因するウラシル要求性の消失を指標として、形質転換体を選抜した。
【００３１】
次に、得られたコロニーをSDプレートにてシングルコロニーにした後、YPD液体培地で３０℃１日培養を行い、培養液0.2mlをFOAプレートに撒いた。ここで、FOAプレートの組成は、Bacto yeast nitrogen baseを0.67%、グルコースを2%、ウラシルを50μg/ml、及び5-FOAを0.1%である。このFOAプレートで生育したコロニーは、導入された遺伝子断片に含まれるURA3遺伝子が脱落し、OC-2U株本来のウラシル要求性が回復した株である。
【００３２】
次に、FOAプレートで生育したコロニーをYPDプレートで３０℃１日、前培養した。その後に、胞子形成培地であるShermanプレートに接種し、２５℃で３日間培養を行い、胞子形成を確認した。そして、株式会社ナリシゲ社製のマイクロマニュピレーターを用いて胞子分離を行った。
【００３３】
得られた子嚢には、胞子が３個ないし４個含まれていた。OC-2U株は、本来、酵母の性を変換するHO遺伝子を有するホモタリック性を有するため、減数分裂後１倍体の胞子が栄養細胞化に伴い２倍体化する。このため、形質転換株の４胞子のうち２胞子については、URA3遺伝子が抜け落ちHIS３遺伝子が破壊され、ウラシル要求性が回復したため、ウラシル要求性、ヒスチジン要求性を併せ持つ株として分離した。残りの２個については、正常なHIS３遺伝子をもつためウラシル要求性のみをもつ株となる。
そこで、得られた４胞子をSDプレート、SDプレート+ウラシル（20mg/L）、SDプレート+ヒスチジン（20mg/L）、SDプレート+ウラシル+ヒスチジンの４種のプレートにてそれぞれ培養を行った。その結果、SD+ウラシル+ヒスチジンプレートでのみ生育する菌株を単離することに成功した。すなわち、ウラシル要求性に加えて、ヒスチジン要求性を付与されたSaccharomyces cerevisiae OC-2U株を作製することに成功した。本実施例で作製したウラシル要求性及びヒスチジン要求性を合わせもつホモタリックな酵母をSaccharomyces cerevisiae OC-2HU株と命名した。
【００３４】
〔実施例２〕
本実施例では、Saccharomyces cerevisiae OC-2株に由来する菌株が物質生産における生産性に優れることを検証した。すなわち、異種遺伝子を形質転換により導入して高い物質生産性を目的とした場合、高発現プロモーターを活用する必要がある。プロモーターには、恒常性プロモーター、誘導性プロモーターがあるが、いずれのプロモーターを使用する場合でも高生産性を目的とする場合には、高糖濃度でのプロモーター発現量の高いものを選択する必要がある。そこで、YPH500株（実験室酵母）、OC-2T株（Saitoら、Journal of Ferment. Bioeng.81:98-103 (1996)）について、酵母の遺伝子組換え技術において一般的に使用されるTDH1プロモーター、TDH3プロモーター及びPDC1プロモーターのプロモーター活性を、それぞれのプロモーターによって転写される遺伝子の発現量を比較することで検討した。
【００３５】
先ず、YPH500株及びOC-2T株について、グルコース量２％或いは１０％の２水準でYPD液体培養（しんとう）を行った。得られた培養菌体をサンプリングしRoche製、1ststrand cDNA synthesis kit for RT-PCRを用いてcDNAを調整し、以下のプライマーによりTDH1遺伝子、TDH3遺伝子及びPDC1遺伝子の発現量を、Roche Light cycler 330を用いて定量PCRを行った。使用したプライマー配列を表１に示す。
【００３６】
【表１】
2009034036.tif 000003
【００３７】
また、図２(a)にYPH500株、図２(b)にOC-2T株のグルコース濃度の違いによるTDH1遺伝子、TDH3遺伝子及びPDC1遺伝子の発現量を示した。実験室酵母であるYPH500株はグルコース濃度を２％から１０％へ上昇させた場合、実験に供したTDH3遺伝子及びPDC1遺伝子については、全て発現量が下がる傾向を示した。これに対して、OC-2T株では、逆にグルコース濃度を２％から１０％へ上昇させるとTDH1遺伝子、TDH3遺伝子及びPDC1遺伝子の全てにおいて発現量が増大する傾向を示した。この結果からは、YPH500株が本来、実験室酵母としてきて使用されてきたため、通常の２％グルコース含有YPD培地では、十分な性能は発揮できる株が選択されてきたのに対して、OC-2株は、従来日本国内のワイン醸造等に使用されてきた酵母であるため糖濃度が高い培地で、菌株の性能を発揮しやすくなっている事をサポートしているものと考えられる。
【００３８】
以上の結果及び考察からすると、実施例１で作製したOC-2HU株は、物質の生産性に優れるため実用酵母として有益であるといえる。
【００３９】
〔実施例３〕
本実施例では、実施例１で作製したOC-2HU株の胞子形成率を確認した。なお胞子形成率が０．１％以上である場合には、後述の実施例で説明するように、マイクロマニュピレーターを用いて子嚢を分離する作業を行いやすいため好ましい。実施例１で作製したOC-2HU株をグルコース２％含有するYPDプレートにて画線し、３０℃で１日培養した後、胞子形成培地であるShermanプレートに培養菌体を移し、２５℃で3〜４日間培養し顕微鏡にて胞子形成を確認した。OC-2HU株の胞子形成率を表２に示した。なお、胞子形成率は以下の式に従って算出した。
胞子形成率＝（胞子数）×１００/（計測細胞数）
【００４０】
【表２】
2009034036.tif 000004
【００４１】
本実施例の結果から、実施例１で作製したOC-2HU株は、培養開始から２日目程度でマイクロマニュピレーターを用いた子嚢分離を行えることが明らかとなった。
【００４２】
〔実施例４〕
本実施例では、実施例１で作製したOC-2HU株を形質転換用酵母として用い、目的遺伝子として表層提示型BGL遺伝子を４コピー導入した。
【００４３】
（１）アーミングBGL２コピー導入株の作製
先ず、実施例１で作製したOC-2HU株に、以下のようにして構築したアーミングBGL-DNAであるpIBG13(HIS3マーカー)を制限酵素NdeIで線状化したプラスミドにより、Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research社)により形質転換を行った。選択プレートはSD+Histidineプレートを用いた。形質転換により得られたコロニーを同じプレートを用いて分離し、擬陽性株を排除した。
【００４４】
次に、得られたコロニーをYPDプレートにて３０℃で１日培養を行った後、胞子形成培地（sherman）に菌体を塗り、25℃でプレート培養を行い、培養３日目に胞子形成を確認し、ナリシゲ製マイクロマニュピレーターを用いて子嚢に含まれる４胞子を分離した。これにより、２コピーpIBG13が導入された株と、pIBG13が脱落した株が２：２に分離することになる。そこで、得られた胞子をSD培地にて３０℃２日間培養し、ヒスチジン要求性が消失した株を同定した。得られた株は、pIBG13が２コピー導入された株でありOC-2ABGL２と命名した。
【００４５】
なお、pIBG13は、図３に示すように、pIHCS（Yasuya Fujitaら"Direct and Efficient Production of Ethanol from Cellulosic Material with a Yeast Strain Displaying Cellulolytic Enzymes" Appl Environ Microbiol. 2002 October; 68(10): 5136-5141参照）とpBG211（Murai, Tら"Assimilation of cellooligosaccharides by a cell surface-engineered yeast expressing β-glucosidase and carboxymethylcellulase from Aspergillus aculeatusAspergillus aculeatus." Appl. Environ. Microbiol. 1998 64:4857-4861参照）とから構築した。具体的には、pBG211を鋳型として以下の一対のプライマーセットを用いたPCRによってNcoI/XhoIサイトを両末端に持つBGL1断片（2.5kbp）を増幅した。
5′-GATCTCCATGGCTGATGAACTGGCGTTCTCTCCTCCTTTC-3′（配列番号７）
5′-TGGCGCTCGAGCCTTGCACCTTCGGGAGCGCCGCGTGAAG-3′（配列番号８）
増幅したBGL1断片は、NcoI/XhoIで処理した。また、pIHCSをNcoI/XhoIで処理し、NcoI/XhoI処理後のBGL1断片とライゲーションすることによってpIBG13を構築した。
【００４６】
（２）アーミングBGL４コピー導入株の作製
上記（１）で作製したOC-2ABGL２を用いて、以下のようにして構築したpRS406BGL1 (URA3マーカー)を制限酵素NdeIで線状化したプラスミドにより、Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research社）により形質転換を行った。選択プレートはSDプレートを用いた。形質転換により得られたコロニーを同じプレートに分離し、擬陽性株を排除した。
【００４７】
次に、得られたコロニーをYPDプレートにて３０℃で１日培養を行った後、胞子形成培地であるshermanプレートに菌体を塗り、25℃でプレート培養を行い、培養３日目に胞子形成を確認し、ナリシゲ製マイクロマニュピレーターを用いて子嚢に含まれる４胞子を分離した。そして、得られた胞子をSD培地にて３０℃２日間培養し、ウラシル要求性が消失した株を同定した。同定した株は、２コピーのpIBG13と２コピーのpRS406BGL1が導入され、合計でゲノムへ４コピーのアーミングBGL遺伝子断片が導入された株であり、OC-2ABGL4と命名した。
【００４８】
なお、pRS406BGL1は、図４及び５に示すように、pRS404（ATCC Number: 87515）及びpIBG13から構築したpIWBGL1と、pRS406（ATCC Number: 87517）とから構築した。pIWBGL1を構築する際には、先ず、pRS404をNotIで処理した後にアルカリフォスファターゼ処理を行った。そして、pIBG13をNotI処理することによってGAPDH promoter-BGL1 gene-3'half of a-agglutinin geneを切り出し、NotI処理及びアルカリフォスファターゼ処理後のpRS404とライゲーションした。これによりpIWBGL1を構築した。
【００４９】
次に、本実施例で使用したpRS406BGL1を構築する際には、pIWBGL1を NotI処理することによってGAPDH promoter-BGL1 gene-3'half of a-agglutinin geneを切り出し、NotI処理及びアルカリフォスファターゼ処理後のpRS406とライゲーションした。これによりpRS406BGL1を構築した。
【００５０】
（３）p-ニトロフェニル-β-D-グルコシド（PNPG）活性の測定
次に、上記（１）で作製したOC-2ABGL2及び上記（２）で作製したOC-2ABGL4における、BGL遺伝子産物であるβ-グルコシダーゼ活性を評価した。具体的には、β-グルコシダーゼがPNPGを基質としてp-nitrophenolとD-glucoseを生成するので、p-nitrophenol量を測定（PNPG活性）して評価した。なお、下記の条件で１分間に１マイクロモルのp-nitrophenolを生成する酵素量を１Uと定義した。
【００５１】
測定に使用する試薬は下記の通りである。
・0.1M 酢酸緩衝液 pH5.0（25℃）
・20mM PNPG水溶液（603ｍｇのPNPGを100ｍｌの蒸留水に溶解）
・0.2M Na2CO3溶液（21.2gの無水炭酸ナトリウムを蒸留水に溶解）
【００５２】
測定の手順は、先ず試験管に反応混液（1.0mlの0.1M酢酸緩衝液及び0.5mlのPNPG水溶液）を調整し、37℃で約５分間予備加温した。次に、希釈した培養液を0.5ml加え、反応を開始した。次に、37℃で正確に15分間反応させた後、Na2CO3溶液2mlを加え、反応を停止した。次に、反応液における400nm吸光度を測定した。盲検は反応液を37℃で15分間放置後、Na2CO3溶液2mlを加えて混和し、次いで酵素溶液0.5ｍｌを加えて調整した。
【００５３】
なお、本実施例では希釈した培養液として以下を調製した。すなわち、先ず、YPD培地でOD660＝20となるよう培養組成を調整し、セロビオース５％、イーストエキス１％及びペプトン２％添加した培地に上記（１）で作製したOC-2ABGL2若しくは上記（２）で作製したOC-2ABGL4を接種し全量２０mlとし、30℃、60rpmの条件でしんとう培養を行った。培養開始１日目、２日目及び３日目に培地を１ml採取し、これを５０倍に希釈して本実験に供した。結果を図６に示した。
【００５４】
図６から明らかなように、アーミングBGL遺伝子が導入されていない親株（OC-2HU株）については、PNPG活性が検出されていないのに対して、アーミングBGL遺伝子数の増加に伴い、PNPG活性は顕著に向上した。
【００５５】
〔実施例４〕
本実施例では、実施例３で作製したOC-2ABGL2及びOC-2ABGL4におけるエタノール生成能を評価した。先ず、YPD培地でOD660＝20となるよう培養組成を調整し、セロビオース５％、イーストエキス１％及びペプトン２％添加した培地に実施例３（１）で作製したOC-2ABGL2若しくは実施例３（２）で作製したOC-2ABGL4を接種し、30℃、60rpmの条件でしんとう培養を行った。
【００５６】
そして、培養開始から１日目で培養液に含まれるエタノール濃度を測定した。エタノール濃度の測定は、酵素センサー（王子計測機器株式会社製、型番BF4）を使用して測定した。その測定結果を図７に示した。
【００５７】
図７から明らかなように、OC-2ABGL4は、培養１日目で培地に含まれる４％セロビオースから２％エタノールを合成することができた。これは、セロビオースからエタノールへの理論変換収率であることから、OC-2HUが本来保有していないセロビオースを基質としたエタノール発酵能力を付与できる程度にBGL活性を確認することができた。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明を適用してホモタリック性を有する複数の選択マーカーを有する形質転換用酵母を構築する際の工程を模式的に示す図である。
【図２】YPH500株及びOC-2T株について、培地中の糖濃度とTDH１遺伝子、TDH３遺伝子及びPDC1遺伝子の発現量との関係を測定した結果を示す特性図である。
【図３】pIHCS及びpBG211からpIBG13を構築するフローを説明する図である。
【図４】pRS404及びpBlue-BGL1からpIWBGL1を構築するフローを説明する図である。
【図５】pRS406及びpIWBGL1からpRS406BGL1を構築するフローを説明する図である。
【図６】OC-2HU株、OC-2ABGL2株及びOC-2ABGL4株におけるPNPG活性を比較した結果を示す特性図である。
【図７】OC-2HU株、OC-2ABGL2株及びOC-2ABGL4株におけるエタノール生成能を比較した結果を示す特性図である。
【図１】
2009034036.tif 000005
【図２】
2009034036.tif 000006
【図３】
2009034036.tif 000007
【図４】
2009034036.tif 000008
【図５】
2009034036.tif 000009
【図６】
2009034036.tif 000010
【図７】
2009034036.tif 000011
【配列表】
2009034036000001.app