(57)【要約】【課題】本発明は、従来の核酸増幅反応とハイブリダイゼーション反応とを組み合わせた検査法において、短時間で検査を行う方法、装置を提供することにある。【解決手段】上記の課題を解決するため本発明に係る方法は、試料溶液に含まれる標的核酸と、前記標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる方法であって、前記標的核酸と前記プローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程と、前記ハイブリダイゼーション工程を経た試料溶液を回収する回収工程と、前記回収された試料溶液に含まれる標的核酸を増幅する増幅工程と、前記増幅工程により増幅された標的核酸を前記プローブ核酸にハイブリダイゼーションさせる工程とを有することを特徴とする。【選択図】図７
2009034052.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液に含まれる標的核酸と、該標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる方法であって、
前記プローブ核酸を固定した基体に試料溶液を接触させて、該プローブ核酸と該試料溶液に含まれる標的核酸をハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程と、
前記ハイブリダイゼーション工程を経た試料溶液を回収する回収工程と、
前記回収された試料溶液に含まれる標的核酸を増幅する増幅工程と、
前記増幅工程を経た試料溶液を前記基体と再度接触させて、前記増幅工程により増幅した標的核酸を該基体に固定されたプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる増幅標的核酸のハイブリダイゼーション工程と、
を有することを特徴とするハイブリダイゼーション方法。
【請求項２】
前記ハイブリダイゼーション工程を行うハイブリダイゼーションチャンバと、前記増幅工程を行う増幅機構とを設け、前記ハイブリダイゼーションチャンバから該増幅機構を介して該ハイブリダイゼーションチャンバに戻る試料溶液の循環経路を形成して、前記増幅工程と前記増幅標的核酸のハイブリダイゼーション工程を繰り返し行うことを特徴とする請求項１に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項３】
前記増幅工程がポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）であることを特徴とする請求項１又は２に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項４】
前記試料溶液は、前記標的核酸に加えて、その相補鎖核酸をさらに含む試料溶液であって、前記増幅工程が前記標的核酸と前記相補鎖核酸との非対称増幅であることを特徴とする請求項１又は３に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項５】
前記増幅工程を経た後であって前記ハイブリダイゼーション工程の前に、前記標的核酸と前記標的核酸の相補鎖核酸との変性温度（Ｔｍ）以上に加熱するディネーチャー工程を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかの請求項に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項６】
試料溶液に含まれる標的核酸と、前記標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる装置であって、
前記プローブ核酸が固定された基体を載置する機構及び温度調整機構を有し、前記標的核酸と前記プローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーションチャンバと、
前記ハイブリダイゼーションチャンバから試料溶液を回収する回収機構と、
回収した試料溶液に含まれる標的核酸を増幅する増幅機構と、
増幅した標的核酸をハイブリダイゼーションチャンバへ供給する供給機構と、
を有することを特徴とするハイブリダイゼーション装置。
【請求項７】
前記回収機構と前記供給機構とにより、前記ハイブリダイゼーションチャンバから前記増幅機構を介して前記ハイブリダイゼーションチャンバに戻る前記試料溶液の循環経路が形成されている請求項６に記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項８】
前記増幅機構と前記供給機構との間に、前記標的核酸と前記標的核酸の相補鎖との変性温度（Ｔｍ）以上に加熱する温度調整機構を有することを特徴とする請求項６又は７に記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項９】
試料溶液に含まれる標的核酸と、前記標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせるためのハイブリダイゼーション用カートリッジであって、
前記プローブ核酸が固定された基体及び温度調整機構を有し、前記標的核酸と前記プローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーションチャンバと、
前記ハイブリダイゼーションチャンバから試料溶液を回収する回収機構と、
回収した試料溶液に含まれる標的核酸を増幅する増幅機構と、
増幅した標的核酸をハイブリダイゼーションチャンバへ供給する供給機構と、
を筐体中に一体化して設けたことを特徴とするハイブリダイゼーション用カートリッジ。
【請求項１０】
前記回収機構と前記供給機構とにより、前記ハイブリダイゼーションチャンバから前記増幅機構を介して前記ハイブリダイゼーションチャンバに戻る前記試料溶液の循環経路が形成されている請求項９に記載のハイブリダイゼーション用カートリッジ。
【請求項１１】
前記温度調整機構、前記回収機構、前記増幅機構及び前記供給機構の制御を、該ハイブリダイゼーション用カートリッジを取り付ける制御装置により行うための接続機構を有することを特徴とする請求項９又は１０に記載のハイブリダイゼーション用カートリッジ。
【請求項１２】
前記増幅機構により増幅された標的核酸を含む試料溶液を、前記標的核酸とその相補鎖との変性温度（Ｔｍ）以上に加熱する温度調整機構を前記筐体中に一体化して設けたことを特徴とする請求項９乃至１１のいずれかの請求項に記載のハイブリダイゼーション用カートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基体上に固定されたプローブ核酸と、試料溶液中に含まれる標的核酸とのハイブリダイゼーション反応により、試料溶液中に含まれる標的核酸の有無または量を検出する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムシーケンスプロジェクトの進展に伴って、ゲノム上の特定遺伝子の検出、ＳＮＰs解析、発現解析等がポストゲノムの課題として注目されている。そのため、最近の医療、分子生物学の分野では、標的核酸を検出する方法として、マイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を用いたハイブリダイゼーション法や、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法などの解析方法の重要性が高まっている。マイクロアレイハイブリダイゼーション法では、標的核酸と特異的に結合するプローブ核酸を基板上に固定し、プローブ核酸と標的核酸とをハイブリダイゼーションさせることにより、試料中の標的核酸の存在や量を解析する。
【０００３】
一般に、これらのハイブリダイゼーション反応は、標的核酸と特異的に結合するプローブ核酸を固定した基板に、標的核酸を含むハイブリダイゼーション溶液を滴下することで行なわれる。
【０００４】
この標的核酸は検体から得られる量が少ない場合がある。例えば菌血症起炎菌特定のための遺伝子検査を例にあげると、血液内に含まれる菌数は数乃至は数十ｃｆｕ／ｍＬ程度である。従ってこれらハイブリダイゼーションによる検査の場合、通常は核酸増幅を行って、標的核酸を増やしてからハイブリダイゼーションを行う。特に、核酸の増幅にはポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ法）を用いられることが多い。
【０００５】
このように核酸増幅とハイブリダイゼーション反応を組み合わせた解析には、試料溶液の取り扱いの煩雑さ、コンタミネーションなどの問題がある。これに関して特許文献１には、複数の反応部を備えたプローブ固相化反応アレイが公開されている。
【０００６】
しかしながら、コンタミネーションや操作の煩雑さもさることながら、特に臨床現場で行われる遺伝子検査では、さらなる迅速化が望まれている。これに関し、核酸増幅工程あるいはハイブリダイゼーション工程それぞれの反応を加速させる技術はこれまでにも開発されている。
【０００７】
例えば核酸増幅工程の迅速化に関しては、特許文献２で、１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて高速ＰＣＲを行う方法が開示されている。
【０００８】
ハイブリダイゼーション反応の迅速化に関しては、例えばアジテーションを行う方法があげられる。例えば特許文献３では、プローブが固定された基板を設置する台状部材と、試料溶液で満たされるべき空間を形成するよう設けられた板状部材との間の相対運動を起こす、試料溶液を攪拌するための動作手段を有する装置が公開されている。
【０００９】
また、誘電泳動を用いて検出用核酸を移動させることで短時間かつ効率よくハイブリダイゼーションを行う方法も公開されている。例えば特許文献４では、ハイブリダイゼーションチャンバ内の媒質に電界印加可能な対向電極とを備える検出部を有するＤＮＡチップの対向電極に電界を印加し、検出用核酸と標的核酸をハイブリダイゼーションさせる方法が公開されている。
【特許文献１】特開２００４−２９８０１７号公報
【特許文献２】特開２００５−３２８７０９号公報
【特許文献３】特許第３７４６７５６号
【特許文献４】特開２００６−４７１５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来のハイブリダイゼーション反応を用いた遺伝子検査法において、短時間で検査を行う方法、装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するため本発明に係る方法は、
試料溶液に含まれる標的核酸と、該標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる方法であって、
前記プローブ核酸を固定した基体に試料溶液を接触させて、該プローブ核酸と該試料溶液に含まれる標的核酸をハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程と、
前記ハイブリダイゼーション工程を経た試料溶液を回収する回収工程と、
前記回収された試料溶液に含まれる標的核酸を増幅する増幅工程と、
前記増幅工程を経た試料溶液を前記基体と再度接触させて、前記増幅工程により増幅した標的核酸を該基体に固定されたプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる増幅標的核酸のハイブリダイゼーション工程と、
を有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る装置は、
試料溶液に含まれる標的核酸と、前記標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる装置であって、
前記プローブ核酸が固定された基体及び温度調整機構を有し、前記標的核酸と前記プローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーションチャンバと、
前記ハイブリダイゼーションチャンバから試料溶液を回収する回収機構と、
回収した試料溶液に含まれる標的核酸を増幅する増幅機構と、
増幅した標的核酸をハイブリダイゼーションチャンバへ供給する供給機構と、
を有することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係るハイブリダイゼーション用カートリッジの一態様は、
試料溶液に含まれる標的核酸と、前記標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせるためのハイブリダイゼーション用カートリッジであって、
前記プローブ核酸が固定された基体及び温度調整機構を有し、前記標的核酸と前記プローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーションチャンバと、
前記ハイブリダイゼーションチャンバから試料溶液を回収する回収機構と、
回収した試料溶液に含まれる標的核酸を増幅する増幅機構と、
増幅した標的核酸をハイブリダイゼーションチャンバへ供給する供給機構と、
を筐体中に一体化して設けたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のハイブリダイゼーション方法、そのためのカートリッジおよび装置では、ハイブリダイゼーション反応中に標的核酸の濃度が高くなる。このことにより、今までのハイブリダイゼーション方法よりも反応の迅速化あるいは検出の高感度化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明していく前に、本発明に関する用語を以下のように定義する。
【００１６】
本明細書中の変性（ディネーチャー）とは二本鎖核酸のダブルへリックス構造が壊れてそれぞれ一本鎖に乖離することを言う。また、変性温度（ディネーチャー温度）とは、二本鎖核酸のダブルへリックス構造が壊れてそれぞれ一本鎖に乖離する温度と定義する。二本鎖ＤＮＡを９０℃以上に加熱すると、構造変化に起因する物理的性質の変化が見られる。狭義には物理的性質変化の中点が変性温度と定義されることもあるが、その物理的性質の変化はかなり狭い温度範囲で起こる。このため本発明ではその変化の立ち上がりの温度も変性温度に含めてよい。
【００１７】
ハイブリダイゼーション温度とは、ハイブリダイゼーション反応を生じさせるための温度であり、好適な温度条件は対象核酸の塩基長や配列、使用される試薬等の諸条件に基づいて適宜設定される。
【００１８】
標的核酸とは、本発明によるハイブリダイゼーションによって有無あるいは量を検査する検査対象の核酸を言う。例えば菌血症起炎菌特定のための遺伝子検査を目的とした場合、１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の約１．５ｋｂｐを標的核酸とすることが考えられる。また早期大腸がんの検査を目的とした場合、ＰＡＰ遺伝子、ＲＥＧ１Ａ遺伝子、ＤＰＥＰ１遺伝子などのｍＲＮＡをテンプレートとして、逆転写によってｃＤＮＡ化した核酸を標的核酸としてその量を検出する。なお、本発明に用いられるハイブリダイゼーション方法はこれに限定されるものではなく、多種の核酸を標的核酸とすることができる。
【００１９】
プローブ核酸とは、特定のターゲット（標的）と特異的に結合可能なもので、しばしばリガンドと呼ばれる。このプローブには、オリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド、あるいはその他のポリマーなどが含まれる。プローブは、個々のポリヌクレオチド分子などのプローブ機能を有するプローブ分子そのものを意味する場合と、分散した状態等で担体表面に固定された同じ配列のポリヌクレオチドなどの同じプローブ機能を有するプローブ分子の集団を意味する場合がある。なお、本発明に採用されるプローブ核酸は、その使用目的に応じて、適宜選択されるものである。本発明の方法を好適に実施する上では、プローブとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、その他の核酸あるいはその類縁体のいずれかであることが好ましい。また、必要に応じてこれらの２種以上を組み合わせて用いることができる。ハイブリダイゼーション法のプローブ核酸としては、人工的に合成されたオリゴＤＮＡや、バクテリア等のベクターで合成したＢＡＣ  ＤＮＡ、ｃＤＮＡ等が用いられる。プローブ核酸の塩基長は、短鎖のオリゴＤＮＡで１０〜１００ｍｅｒ程度、長鎖のＢＡＣＤＮＡで数ｋｍｅｒ程度が好適に用いられる。
【００２０】
具体的には１６ｓ  ｒＲＮＡを検査するプローブとしては特開２００７−０１４３５１号公報で開示されている。また大腸がんの検査のためのプローブとしては特開２００７−１５９４９１公報で開示されているプローブが例示できる。
【００２１】
ＤＮＡチップとは、基体としての固相担体（基板）にプローブ核酸が１乃至複数固定された物である。一般にプローブ核酸は、リンカーを介して基板に固定化されていることが多い。リンカーとしては、例えばプローブ核酸がｃＤＮＡのような場合にはポリ−Ｌ−リジンの利用がよく知られている。またプローブ核酸がアミノ修飾オリゴヌクレオチドの場合は、アミノ基と反応するエポキシ基、カルボキシル基（必要によって活性化させたものを含む）などを基板表面に設ける方法なども知られている。また、メルカプト基修飾オリゴヌクレオチドの場合は、例えば、スライドガラス表面をアミノシランカップリング剤により処理した上で、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−マレイミドカプロキシルオキシ）スクシンイミド）などの二価性試薬を介して固相化することができる。また、作成したプローブ核酸を基板に結合させる方法以外にも、フォトリソグラフィー技術によって、基板上で核酸を合成する方法もある。
【００２２】
プローブ核酸を固定する基体は、目的とする検査の形態に応じて適宜選択できる。プローブ核酸の固定領域を有する平面を構成する基板が基体として好適に用いられる。基板は石英や硼珪酸等のガラスや、樹脂で形成されていることが多く、多孔質にした場合もある。図１では板状の基板であるが、これに限定される物ではなく、流路を形成するものや、反応液を透過させるフィルター状のもの、複数のプローブを固定した糸を巻き取ったものであっても良い。さらに、プローブ核酸を固定した粒子状の基体を複数チャンバに内包する構成でも良い。
【００２３】
温度調整機構とは、流路やチャンバなどの試料溶液の温度を上下できる温度制御手段であれば、どのような機構、形状でも良い。例えば、流路外周にヒーターやペルチェ素子を配置する構成が使用できる。なお、１つの温度調整機構で、試料溶液の温度を一定に保つようにしてもよいし、１つの温度調整機構で試料溶液の温度を複数の設定温度間で上下可能としてもよい。また、温度調整機構は、加熱手段や冷却手段を有する構成としても、別途用意した加熱手段や冷却手段と接続機構により接続可能であり、これらの手段によって試料溶液の温度調整が可能となっている構成としてもよい。
【００２４】
本発明で言うチャンバ（反応チャンバ、増幅チャンバ、ハイブリダイゼーションチャンバ等）は、広義の意味で用いる。すなわち、反応を行うための反応場であって、必ずしも反応室のような構造になっていなくても良い。例えば流路上で反応が行われる場合も、本明細書では包含される。
【００２５】
本発明で言うカートリッジとは、ハイブリダイゼーション反応を行うハイブリダイゼーションチャンバ、そこに試薬などを供給する流路などを１つの筐体にまとめた小型のシステムを言う。必要な試薬を包含しても良い。例えば、μＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）に代表されるような、数ｃｍ角程度のガラスやシリコン等のチップ上に送液、混合、反応、分析等の機能部を集積化した化学・生化学分析統合システムを含む。
【００２６】
本発明で言う検体とは、プローブ・ハイブリダイゼーション法によりプローブに由来する核酸の塩基配列に対する相同性を有する標的核酸を含んでいることが想定される検体を指す。標的核酸の由来するところは、例えばヒトやマウスなどの動物、植物、細菌、真菌、古細菌、ウイルスなどの微生物等の核酸が含有すると考えられるサンプルの全部および一部、またはこれらの組合せからなるものが該当する。例えば、感染症の起炎菌を同定する場合、血液中に存在する細菌の核酸が標的核酸となる。これらの検体は、前処理を行った後、試料溶液としてプローブ・ハイブリダイゼーション法に供することができる。
【００２７】
本発明で言う試料溶液は、検体又は検体を処理して得られた検査用サンプルと、ハイブリダイゼーション及び増幅のための試薬と、を少なくとも含有する。標的核酸を増幅するのに使用する試薬としては、例えば、ＰＣＲ法に使用する試薬（ＰＣＲ試薬）があり、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）などが挙げられる。本発明で言う試料溶液は、例えば、前記検体を処理して得た標的核酸を含む溶液に、ＰＣＲ試薬を適量加えることで調製することができる。また、該試料溶液には、標的核酸の増幅反応を阻害しない程度で、ハイブリダイゼーションを促進させる試薬も加えることができる。
【００２８】
本発明の核酸増幅方法は上述したＰＣＲ以外の方法も用いる事ができる。例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が用いられる。ＬＣＲでは標的ＤＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖にそれぞれアニーリングする２種類の隣りあったオリゴヌクレオチドプローブ、計４種類のプローブを用いて反応を行う。具体的には、まず、４種類のプローブと標的ＤＮＡ、耐熱性ＤＮＡリガーゼを含む反応液を加熱し、標的ＤＮＡを１本鎖に変性させ。続いて反応液を冷却することにより、１本鎖に分離した標的ＤＮＡに２種類の隣りあったオリゴヌクレオチドプローブがアニーリングさせる。さらに、耐熱性ＤＮＡリガーゼによって隣り合うオリゴヌクレオチドプローブが連結する。この一連の反応を繰り返すことによってライゲーション産物（オリゴヌクレオチドプローブの連結産物）、すなわち標的ＤＮＡ配列が指数関数的に増幅される方法である。
【００２９】
ＬＣＲの特長としては、特異性が高くＳＮＰ解析に優位に用いることができること、熱サイクルを５０サイクル以上かけてもＰＣＲに比べてテンプレートＤＮＡを忠実に増幅させる事が可能である事などがあげられる。
【００３０】
それ以外にも多くの核酸増幅技術が知られているが、用途などによって当業者は適宜選択可能である。
【００３１】
以下、本発明に係わるハイブリダイゼーション方法について簡単に説明する。まず、本発明に係るハイブリダイゼーション方法は、
試料溶液に含まれる標的核酸と、該標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる方法であって、
前記プローブ核酸を固定した基体に試料溶液を接触させて、該プローブ核酸と該試料溶液に含まれる標的核酸をハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程と、
前記ハイブリダイゼーション工程を経た試料溶液を回収する回収工程と、
前記回収された試料溶液に含まれる標的核酸を増幅する増幅工程と、
前記増幅工程を経た試料溶液を前記基体と再度接触させて、前記増幅工程により増幅した標的核酸を該基体に固定されたプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる増幅標的核酸のハイブリダイゼーション工程と、
を有することを特徴とする。
【００３２】
従来のハイブリダイゼーション方法では、標的核酸の増幅を行った後にハイブリダイゼーション反応を行っていた。（以降、この増幅工程を「プレ増幅」と呼ぶ。）それに対して、本発明のハイブリダイゼーション方法は、プレ増幅を行った後に、図７に示したフローチャートのとおり、ハイブリダイゼーション反応と標的核酸の増幅を繰り返し行うことに特徴がある。この方法により検出感度を向上させることができる。簡単に説明すると、標的核酸を増幅（Ｓ７０３）し、その溶液をハイブリダイゼーションチャンバに移送し、増幅された標的核酸（増幅標的核酸）とプローブ核酸とをハイブリダイゼーション（Ｓ７０４）させる。そして、未反応の標的核酸を含む試料溶液を回収（Ｓ７０５）し、回収した試料溶液に含まれる標的核酸を増幅（Ｓ７０３）させ、ハイブリダイゼーションチャンバに移送し、プローブ核酸とハイブリダイゼーション（Ｓ７０４）させる。これを複数回繰り返す。すなわち、図７に示すフローチャートの場合は、最初に増幅を行い、増幅（Ｓ７０３）−ハイブリダイゼーション（Ｓ７０４）−試料溶液回収（Ｓ７０５）を１単位として、これを必要サイクル数繰り返す。
【００３３】
あるいは、図８に示したフローチャートのとおり、標的核酸を含む試料溶液をハイブリダイゼーションチャンバに投入してプローブとハイブリダイゼーション（Ｓ８０３）させ、その後未反応の標的核酸を含む試料溶液を回収（Ｓ８０４）し、標的核酸を増幅（Ｓ８０５）させる。増幅された標的核酸を含む試料溶液をハイブリダイゼーションチャンバに移送する。そしてこれを複数回繰り返す。すなわち、図８に示すフローチャートの場合は、最初にハイブリダイゼーション（Ｓ８０３）を行い、ハイブリダイゼーション（Ｓ８０３）−試料溶液回収（Ｓ８０４）−増幅（Ｓ８０５）を１単位として、これを必要サイクル数繰り返す。この場合、最初のハイブリダイゼーション反応によって標的核酸の一部がプローブ核酸と反応し、試料溶液中の標的核酸は減少する。しかし、その量は微量であること、また標的核酸はその相補鎖をテンプレートとして合成されるため、最初あるいはそれ以降もハイブリダイゼーション工程で標的核酸がプローブ核酸と反応して試料溶液中から少なくなっても増幅効率が著しく低下することはない。
【００３４】
このようにすることで、これまで一定濃度でハイブリダイゼーションを行うよりも標的核酸濃度が濃くなるため迅速化あるいは高感度化が可能である。また、場合によっては、これまで行っていたプレ増幅を省略あるいは短縮することも可能となる。さらに、試料溶液を回収する量やハイブリダイゼーションチャンバに送液する量を調整することで、ハイブリダイゼーションを行っている間も標的核酸を増幅することが可能である。
【００３５】
次に、本発明に係る装置について説明をする。
【００３６】
本発明に係る装置は、
試料溶液に含まれる標的核酸と、前記標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる装置であって、
前記プローブ核酸が固定された基体及び温度調整機構を有し、前記標的核酸と前記プローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーションチャンバと、
前記ハイブリダイゼーションチャンバから試料溶液を回収する回収機構と、
回収した試料溶液に含まれる標的核酸を増幅する増幅機構と、
増幅した標的核酸をハイブリダイゼーションチャンバへ供給する供給機構と、
を有することを特徴とする。
【００３７】
前記ハイブリダイゼーションチャンバとは、その内部にプローブ核酸が固定化された基体を有し、そのプローブ核酸と試料溶液中に含まれる標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を行う装置部分である。また、該チャンバは、ハイブリダイゼーション反応が起きる条件に設定できるように温度調整機構を有している。ハイブリダイゼーションチャンバは、例えば、ＤＮＡチップをハイブリダイゼーションチャンバ用温度調整機構の上に載置し、天板等を設置することによってハイブリダイゼーションチャンバとすることができる。さらに、ハイブリダイゼーションチャンバに収納するプローブ核酸が固定化された基体は該チャンバと脱着可能に構成されていてもよい。この場合、検出対象となる標的核酸に応じてプローブ核酸を適宜選択することができる。
【００３８】
前記回収機構とは、ハイブリダイゼーションチャンバ中の試料溶液をハイブリダイゼーションチャンバ外に回収するための装置部分をいう。この回収機構により、ハイブリダイゼーション反応中の、あるいはハイブリダイゼーション反応後の試料溶液を回収し、回収した試料溶液を前記増幅機構に送り込むことができる。回収機構は、特に限定されるものではないが、例えば、回収機構と増幅機構との間にチューブなどで通液路を設け、増幅機構に試料溶液を送液可能なようにポンプを設置した構成とすることができる。
【００３９】
前記増幅機構とは、試料溶液中に含まれる標的核酸を増幅する装置部分をいい、該増幅機構では、例えば、標的核酸をＰＣＲ法により増幅することができる。また、標的核酸とその相補鎖核酸との非対称ＰＣＲにより標的核酸を増幅することもできる。増幅機構は標的核酸を増幅することができればよく、特に上記方法に制限されるものではない。増幅機構への供給される試料溶液は、ハイブリダイゼーション反応前のものでも、ハイブリダイゼーション反応中、あるいは反応後にハイブリダイゼーションチャンバから回収されたものでもよい。
【００４０】
前記供給機構とは、増幅機構で増幅した標的核酸を含む試料溶液を前記ハイブリダイゼーションチャンバに送液する装置部分をいう。特に限定されるものではないが、例えば、前記回収機構のように、増幅機構とハイブリダイゼーションチャンバとの間に通液路を設けてポンプで送液するように構成することもできるし、回収機構と供給機構とで同一のポンプを利用する構成としてもよい。
【００４１】
本発明に係る装置の形状や大きさは特に限定されるものではないが、低コスト化を図り使用する試料溶液の量を少なくするため、なるべく小型のものが好ましい。
【００４２】
また、前記ハイブリダイゼーションチャンバ、前記回収機構、前記増幅機構、前記供給機構を筐体中に一体化したハイブリダイゼーション用カートリッジとすることもできる。この場合、ハイブリダイゼーションチャンバや増幅機構の温度調整、又は回収機構や供給機構における液移動等の制御は、他の制御装置で行えるように構成し、各機構と外部装置との接続部を介して目的とする制御を行うようにしてもよい。例えば、増幅機構においては、微少のヒーターやペルチェ素子などから構成される温度調整機構に温度制御端子を取り付け、温度制御端子から電源を供給して温度を制御する構成とすることができる。
【００４３】
さらに、カートリッジ化する部分は、ハイブリダイゼーションチャンバ部分のみとすることもできる。つまり、ハイブリダイゼーションチャンバ部分が取り外し可能となっており、そのカートリッジを、その他の構成要素である回収機構、増幅機構や供給機構などを有する装置にはめ込んで使用するカートリッジとすることもできる。例えば、カートリッジ部分は、プローブ核酸が固定化された基板を収納したハイブリダイゼーションチャンバであり、該カートリッジには流出口や流入口が設けられている構成とすることができる。そして、該カートリッジをはめ込む装置の構成は、該カートリッジ化したハイブリダイゼーションチャンバの温度を制御する温度調整機構や回収機構、増幅機構、供給機構からなる構成とすることができる。
【００４４】
以下、本発明に関わるハイブリダイゼーション方法、化学反応カートリッジおよび装置の具体的な実施の形態を説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４５】
（第１の実施形態）
図１は本発明のハイブリダイゼーション装置の好適な一例を示す模式図である。図１において、ＤＮＡチップ（１）をハイブリダイゼーションチャンバ用温度調整機構（４）の上に載置し、天板等を設置することによってハイブリダイゼーションチャンバ（３）が形成される。
【００４６】
チャンバ（３）は、基板（１）上に反応液を保持できる形状であって、その反応を阻害しないものであればどのような形状、素材であっても良い。素材によっては酵素や核酸などの試薬が吸着しないように表面処理を施しておくことも好ましい。またチャンバ（３）を通して基板（１）の状態を観察する構成ならば、該観察手段に適切な素材、例えば透明素材を使用することが好ましい。また、プローブ核酸が固定化された基体は該チャンバ（３）と脱着可能に構成されていてもよい。この場合、検出対象となる標的核酸に応じてプローブ核酸を適宜選択することができる。
【００４７】
標的核酸およびその増幅に使用するための試薬を含む試料溶液を試料溶液注入口（５）より不図示の方法によって注入する。試料溶液注入口（５）は、必要に応じて、開閉自在とし、試料溶液の必要量がチャンバ（３）内に供給された状態でチャンバ（３）内を密閉できるようにしてもよい。また、チャンバ（３）は、フィルター等を介して大気と連通し得る構成としてもよい。
【００４８】
ハイブリダイゼーションチャンバ用温度調整機構（４）により、試料溶液の温度をハイブリダイゼーションに最適な温度に調整可能であり、例えば３０℃乃至７０℃程度の範囲で調整可能である。この温度調整機構は不図示の方法によってユーザーあるいは制御装置などでコントロールされる。なお、ハイブリダイゼーション温度は変性温度（Ｔｍ）や、塩濃度、その他の条件によって最適値は異なり、試料などによって最適な温度を選択すればよい。
【００４９】
この時点で試料溶液に含まれる標的核酸は少量であり、測定に関して感度不足となることが多い。このような場合には標的核酸を増幅する必要がある。増幅の方法によって温度や必要な試薬は異なるが、ここではＰＣＲ法を例にとって説明する。
【００５０】
流路（１００）は、チャンバ（３）の流出口（６）と流入口（７）を連結できる物であって、反応に影響のないものであればどのような形状や素材でも良い。素材によっては酵素や核酸などの試薬が吸着しないように表面処理を施しておくことも好ましい。流路（１００）内では、送液ポンプ（１０１）によって試料溶液が流路（１００）内を移動する。この構成により、チャンバ（３）内から流出口（６）、流路（１００）及び流入路（７）からなる循環経路を形成できる。なお、循環経路内での試料溶液の移動は連続的に行っても、所定の休止時間をもって断続的に行ってもよい。この流路（１００）に沿って、複数の温度調整機構からなる増幅機構が設けられている。
【００５１】
また、流路（１００）の断面を部位によって異形とすることにより、試料溶液の流速を調整することも可能である。さらに、流路中に不図示のバッファー領域を設けて、一時的に試料溶液を滞留させる構成も可能である。
【００５２】
まず、送液ポンプ（１０１）によって試料溶液を温度調整機構１（１０２）へと回収する。回収された試料溶液中に含まれる標的核酸が一本鎖の状態にある場合は、そのまま増幅機構へ搬送する。標的核酸がその相補鎖と二本鎖を形成している状態にある場合は、温度調整機構１で標的核酸とその相補鎖の二本鎖核酸の変性温度以上に加熱し、二本鎖を変性させて一本鎖とする。例えば９０℃乃至９５℃程度が選択されるが、これに限定されるものではない。また、この操作は必要に応じて行えば良い。
【００５３】
なお、送液ポンプ（１０１）、温度調整機構１（１０２）は不図示のユーザーあるいは制御装置によってコントロールされる。（以下、その他の温度調整機構に関しても同様である。）
続いて、試料溶液を温度調整機構２（１０３）へと導く。温度調整機構２（１０３）では増幅のためのプライマーと核酸とをアニールするのに適した温度にする。例えば５０℃乃至６０℃程度が選択されるが、これに限定されるものではない。
【００５４】
次に、試料溶液を温度調整機構３（１０４）へと導く。温度調整機構３（１０４）ではプライマーを、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長(エクステンション)させる。この時の温度は酵素などによって異なるが、例えばＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ（登録商標、タカラバイオ社製）を用いる場合は６８℃乃至は７２℃が選択される。
【００５５】
必要ならば、最後に試料溶液を温度調整機構４（１０５）へと導いてもよい。温度調整機構４（１０５）では通常はハイブリダイゼーションチャンバ用温度調整機構（４）とほぼ同じ温度にしておき、試料溶液をプローブ核酸（２）上に導く前に、伸長温度からハイブリダイゼーションに最適な温度へとするために用いる。なお、この温度調整機構４（１０５）はハイブリダイゼーションチャンバ用温度調整機構（４）で代用できるため、設けなくても良い。
【００５６】
伸長反応において、二本鎖の両方を増幅する場合は試料溶液に２種類のプライマーを等量ずつ入れるのが一般的である。このような場合、熱サイクル数に応じて２本とも指数関数的に増幅される。しかし、ＤＮＡチップのプローブ核酸はセンス鎖あるいはアンチセンス鎖のうちどちらか一方の核酸を標的核酸としてハイブリダイゼーションする。伸長反応直後はセンス鎖とアンチセンス鎖が二本鎖となっている。これを一本鎖にするために温度調整機構３（１０４）と温度調整機構４（１０５）との間に不図示のディネーチャー用の温度調整機構を設けても良い。この温度は温度調整機構１（１０２）と同等の温度が用いられる。なお、ディネーチャーを行った後はハイブリダイゼーションチャンバ（３）内の溶液の温度が至適温度よりも高くならない範囲で、短時間でハイブリダイゼーションチャンバ（３）へと導く必要がある。なぜならば、基板（１）上のプローブ核酸（２）とハイブリダイゼーションする前に、試料溶液内に含まれる標的核酸とその相補鎖がハイブリダイゼーションしてしまい、プローブ核酸（２）との反応効率が遅くなるためである。
【００５７】
また、ディネーチャーを行うのではなく、標的核酸だけを相対的に多くあるいは標的核酸だけを非対称的に増幅する、いわゆる非対称ＰＣＲを行うことが好ましい。非対称ＰＣＲの方法はセンス鎖増幅用のプライマーとアンチセンス鎖増幅用のプライマーの濃度を変える、あるいは１種類のプライマーのみを用いる方法などがある。
【００５８】
前者の場合、例えばセンス鎖増幅用のプライマーとアンチセンス鎖増幅用のプライマーの濃度を例えば１００：１に設定しておく。熱サイクル数の最初の段階ではセンス鎖もアンチセンス鎖もほぼ等量ずつ指数関数的に増幅される。ところが熱サイクルの後半になってくると、少ない方のプライマー（ここではアンチセンス鎖増幅用のプライマー）が枯渇してきて、それから増幅される片鎖（ここではアンチセンス鎖）は徐々に増幅量が減ってくる。従ってプローブ核酸（２）とハイブリダイズする方鎖（ここではセンス鎖）の量は、プローブ核酸（２）とハイブリダイズしない方鎖（ここではアンチセンス鎖）の量に比べて、格段に多くなる。したがって伸長反応用の温度調整機構３（１０４）の後に不図示のディネーチャー用の温度調整機構を設ける必要が無くなる。その他にも特開２００５−０００１６２号で公開されているように、増幅すべき塩基配列領域を挟む２つのプライマーのメルティング温度Ｔｍ値が、ＰＣＲ反応条件下において、異なるような２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅反応を行う方法も好適に使用できる。
【００５９】
なお、非対称ＰＣＲの方法は上述した方法に限定されるものではなく、その他の非対称ＰＣＲの方法を採用しても良い。
【００６０】
増幅時にはＤＮＡチップの観測をしやすくするために何らかの標識をすることが好ましい。一般的にはＣｙ３、Ｃｙ５などに代表される蛍光色素を末端に標識したプライマーを用いる方法や、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）に蛍光標識されたｄＮＴＰを混ぜて蛍光標識された核酸を合成するいわゆる取り込み標識法などが用いられる。さらには、標的核酸自体に標識を行うのではなく、ＳＹＢＲ（米国登録商標） Ｇｒｅｅｎ  Ｉなどに代表される、蛍光性インターカレーターを用いる方法も使用できる。なお、ここでは蛍光標識を例に挙げたが、ＤＮＡチップの観測に用いられる他の標識も使用することが可能である。
【００６１】
図１では各温度調整機構（１０２，１０３，１０４，１０５）は同じ大きさで図示しているが、各温度調整機構のサイズを変えることも好ましい。例えばＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ（登録商標）のＰＣＲ増幅キットでは１ｋｂｐのＤＮＡを増幅させる標準プロトコルではディネーチャーは９８℃１０秒、アニールは５５℃３０秒、伸長反応は７２℃１分となっている。従って温度調整機構１（１０２）：温度調整機構２（１０３）：温度調整機構３（１０４）＝１：３：６の長さにすることができる。増幅領域が１ｋｂｐよりも長い場合は伸長反応を長く、すなわち温度調整機構３（１０４）の長さを相対的に長くし、逆に短い場合は温度調整機構３（１０４）の長さを相対的に短くする事で最適なプロトコルとなるように調整可能である。
【００６２】
また、時間に関しては、流路の幅、送液ポンプ（１０１）の速度などで調節することができる。
【００６３】
このようにして増幅された標的核酸はハイブリダイゼーションチャンバ（３）に戻され、プローブ核酸（２）とハイブリダイゼーションする。図７に示すフローチャートに従った方法の場合は、チャンバ（３）に最初に試料溶液を充填した段階ではハイブリダイゼーションを行わず、先に増幅を行ってから増幅された標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーションを行う。図８に示すフローチャートに従った方法の場合は、チャンバ（３）に最初に試料溶液を充填した段階でハイブリダイゼーションを開始し、チャンバ（３）中でのハイブリダイゼーション反応を継続しながら、試料溶液の一部を増幅機構に搬送して増幅を行い、増幅された標的核酸をチャンバ(３)に戻してプローブとハイブリダイゼーションさせる。チャンバ（３）中でのハイブリダイゼーション反応は、チャンバ（３）中でのハイブリダイゼーション反応のための条件設定を維持することで継続させることができる。
【００６４】
試料溶液を送液ポンプで装置内を循環させ、上記一連の動作を繰り返すことで、核酸増幅を行いながらハイブリダイゼーションを連続的に行うことができ、迅速化が達成される。
【００６５】
なお、本実施形態において、回収機構と供給機構は同一の液移動手段（ポンプ）を利用していることになる。また、ハイブリダイゼーションチャンバ（３）から前記増幅機構（温度調整機構１乃至３）へと試料溶液を移動させるための第一の流路は、本発明における回収機構の一部にあたることになる。また、前記増幅機構から前記ハイブリダイゼーションチャンバ（３）へと試料溶液を移動させるための第二の流路は、本発明における供給機構の一部にあたることになる。
【００６６】
所定の回数あるいは所定の時間反応を行った後、不図示の方法でプローブ核酸と未反応の試薬を洗浄し、不図示の方法でＤＮＡチップを乾燥させる。このようにして得られた反応済みＤＮＡチップは既存の測定装置を用いて観測する。例えば標的核酸が蛍光色素で標識されている場合は、例えばＧｅｎｅＰｉｘ（米国登録商標）マイクロアレイスキャナ（Ａｘｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）など、既存のマイクロアレイスキャナが使用可能である。
【００６７】
次に、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：蛍光共鳴エネルギー移動）を用いた検出に関して図４を用いて説明する。基板（５０１）に、プローブ核酸（５０３）が固定されている。プローブ核酸（５０３）は、標的核酸（５１２）と特異的に結合する核酸配列を持っている。本実施形態の特徴となるのが、プローブ核酸（５０３）に標識されている第一の色素（５２０）と、標的核酸（５１２）に標識されている第二の色素（５２１）である。第一の色素（５２０）と第二の色素（５２１）は、この両者においてＦＲＥＴを起こすことが出来る１対の蛍光色素である。第一の色素（５２０）および、第二の色素（５２１）は、プローブ核酸（５０３）もしくは標的核酸（５１２）のどの位置に結合されていても良いが、結合時に両者がＦＲＥＴ現象を起こせる距離であることが必要である。ＦＲＥＴとは、ある蛍光分子（ドナー分子）から他の分子（アクセプター分子）へ励起エネルギーが移動する現象である。ＦＲＥＴ現象が起こるのは、ドナー分子とアクセプター分子が近い場合（通常５０乃至１００Å以内）に限られるため、両化合物の距離に応じて外部から観察される蛍光強度が変化することになる。図４のように、プローブ核酸（５０３）にドナー色素として第一の色素（５２０）を、標的核酸（５１２）にアクセプター色素として第二の色素（５２１）を結合させておく。すると、プローブ核酸（５０３）と標的核酸（５１２）が結合しているときのみＦＲＥＴ現象が起こり、蛍光が発せられる。プローブ核酸（５０３）に結合していない標的核酸（５１２）においては、ＦＲＥＴ現象が起こらないため発光しない。よって、標識された標的核酸を含有した反応液中においても、未結合の標的核酸の影響を排除でき、正確にプローブ核酸と標的核酸の結合を検出することが可能となる。
【００６８】
さらに、本発明のもう一つのハイブリダイゼーション検出方法について、図５を用いて説明する。基板（６０１）に、プローブ核酸（６０３）が固定されている。プローブ核酸（６０３）は、標的核酸（６１２）と特異的に結合する核酸配列を持っている。標識プローブ（６２２）は、標的核酸（６１２）のプローブ核酸（６０３）結合部位に近接した部位と特異的に結合する構成となっている。本方法の特徴となるのが、プローブ核酸（６０３）に標識されている第一の色素（６２０）と、標識プローブ（６２２）に標識されている第三の色素（６２３）である。第一の色素（６２０）と第三の色素（６２３）は、この両者においてＦＲＥＴを起こすことが出来る１対の蛍光色素である。第一の色素（６２０）および第三の色素（６２３）は、プローブ核酸（６０３）もしくは標識プローブ（６２２）のどの位置に結合されていても良いが、結合時に両者がＦＲＥＴ現象を起こせる距離であることが必要である。プローブ核酸（６０３）と標的核酸（６１２）が結合しているときのみ、第一の色素（６２０）と第三の色素（６２３）間でＦＲＥＴ現象が起こり、蛍光が発せられる。標的核酸（６１２）がプローブ核酸（６０３）に結合していない場合には、ＦＲＥＴ現象が起こらないために発光しない。よって、標的核酸を標識する必要がなく、正確にプローブ核酸と標的核酸の結合を検出することが可能となる。
【００６９】
増幅方法がＰＣＲ法の場合、試料溶液は、標的核酸とＰＣＲ試薬を含むように調製することになる。ＰＣＲ試薬とは、ＰＣＲ反応に利用される試薬であり、一例として以下を含む。
１．標的配列の増幅部位の両端に特異的に結合するプライマーＤＮＡ
２．標的核酸に結合したプライマーから標的配列に相補的にＤＮＡを合成するＤＮＡポリメラーゼ
３．ＤＮＡ合成に必要な各種ヌクレオチド（ｄＮＴＰなど）
４．塩化マグネシウムや塩化カリウム等の塩類
５．トリス等のバッファー
なお、上述したとおりプライマーやｄＮＴＰは蛍光あるいはその他の標識をしているものも含む。
【００７０】
また、ハイブリダイゼーション反応を促進させるために他の試薬を添加することができ、その一例としては、バッファー、フォルムアミド等の変性剤、消泡剤があるが、前記のＰＣＲ試薬の機能を阻害しないものが望ましい。また、ハイブリダイゼーションの検出のために、標識プライマーや、ＳＹＢＲ（米国登録商標）  Ｇｒｅｅｎ等のインターカレーター、標識ヌクレオチドを含む場合もある。
【００７１】
（第２の実施形態）
次に、本発明の他の実施の形態を、図２を用いて説明する。図２は、第１の実施形態のように流路に沿って複数の温度調整機構からなる増幅機構ではなく、増幅機構として増幅チャンバ（１０６）を設けた装置である。
【００７２】
注入された試料溶液の一部を送液ポンプ（１０１）を用いて増幅チャンバ（１０６）へと回収する。増幅チャンバ（１０６）には増幅チャンバ用温度調整機構（１０７）が設置されており、増幅チャンバ（１０６）内の試料溶液を任意の温度に加熱あるいは冷却できる。この時、残りの試料溶液はハイブリダイゼーションチャンバ（３）内にてハイブリダイゼーション反応が行われているか、流路内に滞留している。
【００７３】
第１の実施形態と同様に、増幅反応にＰＣＲ法を用いる場合、増幅チャンバ（１０６）に入った試料溶液はディネーチャー、アニール、エクステンションに適した温度、時間で熱サイクルをかける。
【００７４】
１回あるいは複数回の熱サイクルをかけて増幅された試料溶液は、再度送液ポンプ（１０１）を始動させてハイブリダイゼーションチャンバ（３）へと導かれる。この時、残りの試料溶液は増幅チャンバ（１０６）へと導かれ、増幅反応が行われる。
【００７５】
（第３の実施形態）
次に、本発明の他の実施の形態を、図３を用いて説明する。図３は、温度調整機構が１つの場合を示している。流出口（６）から回収された試料溶液は送液ポンプ（１０１）で温度調整機構５（１０８）へと送られる。温度調整機構５（１０８）は、試料溶液が通過する間に、１回乃至は複数回の温度サイクルがかけられる。すなわち、流出口（６）から流入口（７）までの間に、試料溶液はディネーチャー、アニール、伸長という工程を１回乃至複数回行われる。これらの温度や時間などのシーケンスは第１の実施例で示したとおりである。
【００７６】
なお、送液ポンプ（１０１）は、連続して稼働しても良いし、場合によって停止させても良い。送液ポンプを連続して稼働させた場合、例えばアニール温度に設定されている時点など、温度サイクルの途中で試料溶液が温度調整機構５（１０８）に投入される場合がある。しかし、温度サイクルの途中で投入されても問題ないことは当業者であれば理解できる。
【００７７】
（第４の実施形態）
次に、第４の実施形態として、上記の実施形態の装置構成をカートリッジ化させたハイブリダイゼーション用カートリッジ（２０１）を提供する。
【００７８】
すなわち、図６に示したように、前記ハイブリダイゼーションチャンバと、前記回収機構と、前記増幅機構と、前記供給機構などを筐体中に一体化してカートリッジを構成することができる。すなわち、このハイブリダイゼーション用カートリッジは、以下の各部分を有する。
・プローブ核酸を固定した基体を収納するハイブリダイゼーションチャンバ（３）
・カートリッジ（２０１）に標的核酸及びＰＣＲ試薬を含む試料溶液を供給するための試料注入口（５）
・供給された試料溶液を回収するための流路（１００）
・標的核酸を増幅するための温度調整機構（１０２、１０３、１０４、１０５）
これら温度調整機構（１０２、１０３、１０４、１０５）は制御端子（２０２）を通して、不図示の制御装置からコントロール可能である。
【００７９】
図６に示す実施形態は第１の実施形態と同じであるが、試料溶液が接する部材をカートリッジ化し、密閉することで、他の試料溶液や汚染物質などのコンタミネーションが省けることから、好ましい実施形態である。
【００８０】
図６の実施形態では増幅に関する温度調整機構（１０２、１０３、１０４、１０５）は金属などの熱伝導性の良い部材で構成されており、その部材が流路を覆っているか、流路内の試料溶液との間での熱移動が可能なように設置されている。温度制御端子（２０２）に外部から熱を印加することで、流路内の試料溶液の温度を調整可能である。この場合、熱伝導が素早く、かつ正確に伝わるよう、温度制御端子（２０２）から各温度調整機構（１０２、１０３、１０４、１０５）の距離は短い方がよい。
【００８１】
また、微少のヒーターやペルチェ素子などの温度調整機構手段をハイブリダイゼーション用カートリッジ内に設け、温度制御端子（２０２）から、その電源を供給して温度を制御する構成でも良い。
【００８２】
このようなハイブリダイゼーション用カートリッジは、樹脂成型技術やμＴＡＳ技術を使用すれば当業者において製造できる。
【００８３】
また、複数サンプルの一括処理のために、上記の反応系を複数保持したハイブリダイゼーション用カートリッジ、またはハイブリダイゼーション用カートリッジを複数保持できる装置の構成も本発明に含まれる。
【００８４】
（第５の実施形態）
（１）基板作成
１インチ×３インチ角の合成石英ガラス基板を、純水ブラシ洗浄、純水リンス、アルカリ性洗剤超音波洗浄、純水リンス、純水超音波洗浄、純水リンス、窒素ブロー乾燥にて洗浄し、清浄面を有する石英ガラス基板を用意する。
【００８５】
アミノシランカップリング剤(商品名：KBM-903；信越化学工業(株)社製)を１重量％になるように水に溶解し、30分間撹拌してメトキシ基を加水分解させる。この水溶液にスライドガラスを30分間浸漬させた後、取り出して純水で洗浄し、オーブン中120℃で１時間ベーク処理を行う。真空オーブンにてベークさせると５分程度でもよい。
【００８６】
次いで、ＥＭＣＳを０．３ｍｇ／ｍｌとなるように１，４−ジオキサンに溶解する。ベーク処理したアミノ基導入石英ガラス基板をＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、表面にマレイミド基を導入する。ＥＭＣＳ溶液処理後、基板を洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥させる。
【００８７】
（２）プローブＤＮＡの合成
本実施形態においてプローブは、検出しようとする標的核酸の全部または一部に対して相補的な塩基配列を有し、該標的核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズ（交雑反応）することで該標的核酸を検出することが可能な一本鎖核酸を用いる。ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号１の一本鎖核酸を合成する。なお、配列番号１の一本鎖ＤＮＡ末端にはＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いる事によってメルカプト基を導入する。続いて通常の脱保護を行い、ＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製する。
【００８８】
なお、配列番号１のプローブ核酸は、特開２００７−０１４３５１号で公開されているエンテロバクター  クロアカエ株の16s RNAをコーディングしている部分である。
【００８９】
５’HS- GTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCG ３’（配列番号：１）
（３）プローブの固定
上記(２)で合成したDNA断片（配列番号：１）をグリセリン１５％、尿素１５％、ジエチレングリコール９％、アセチレンアルコール(商品名：アセチレノールＥ１００；川研ファインケミカル(株)社製)０．０１％を含む水溶液に、約９μＭになるよう溶解させる。
これらのDNA断片を含む水溶液をインクジェット法で、上記(1)の方法によって作製したスライドガラスに別々にスポッティングする。さらに室温で３０分間放置し、1MNaCl/50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)で洗浄する。
【００９０】
続いてBSA（牛血清アルブミンFraction V：Sigma社製）を1％となるように100mM NaCl/10mM Phosphate Bufferに溶解した液にプローブが固定されたスライドガラスを室温で１時間浸し、ブロッキングを行う。
【００９１】
ブロッキング終了後、0.1％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２×ＳＳＣ溶液(NaCl 300mM、Sodium Citrate (trisodium citrate dihydrate, C6H5Na3・2H2O) 30mM、ｐＨ 7.0)で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライを行って乾燥させる。
【００９２】
（４）検体増幅用ＰＣＲプライマーの準備
プライマーは特開２００７−０１４３５１号公報で公開されている起炎菌検出用の為の16s rRNA遺伝子（標的遺伝子）増幅用PCR Primerとして表１に示す核酸配列を用いる。
【００９３】
【表１】
2009034052.tif 000003
【００９４】
表１中に示したPrimerは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、Forward Primer３種を混合し、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度0.2pmol/μlとなるようにＴＥ緩衝液に溶解する。またReverse Primer３種を混合し、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度10pmol/μlとなるようにＴＥ緩衝液に溶解する。
【００９５】
（５）微生物の培養
まず、エンテロバクター  クロアカエ標準株（ATCC13047）を、定法に従って培養する。この微生物培養液を１．５ml容量のマイクロチューブに1.0ml（OD600=0.7）採取し、遠心分離で菌体を回収する（8500rpm、5min、4℃）。次に、上清を捨てた後、Enzyme Buffer（50mM Tris-HCl：pH 8.0、25mM EDTA）300μlを加え、ミキサーを用いて再縣濁させる。再縣濁した菌液は、再度、遠心分離で菌体を回収する（8500rpm、5min、4℃）。上清を捨てた後、回収された菌体に、以下の酵素溶液を加え、ミキサーを用いて再縣濁させる。
【００９６】
Lysozyme                   50 μl （20 mg/ml in Enzyme Buffer）
N-Acetylmuramidase SG      50 μl （0.2 mg/ml in Enzyme Buffer）。
【００９７】
次に、酵素溶液を加え再縣濁した菌液を、37℃のインキュベーター内で30分間静置し、細胞壁の溶解処理を行う。
【００９８】
（６）Genome ＤＮＡ 抽出
以下に示す微生物のGenome DNA抽出は、核酸精製キット（MagExtractor -Genome-：TOYOBO社製）を用いて行う。
【００９９】
具体的には、まず、前処理した微生物縣濁液に溶解・吸着液750μlと磁性ビーズ40μlを加え、チューブミキサーを用いて、10分間激しく攪拌する（ステップ１）。次に、分離用スタンド（Magical Trapper）にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上清を捨てる（ステップ２）。次に、洗浄液900μlを加え、ミキサーで５sec程度攪拌して再縣濁を行う（ステップ３）。次に、分離用スタンド（Magical Trapper）にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上清を捨てる（ステップ４）。上記ステップ３、４を繰り返して２度目の洗浄を行う（ステップ５）。その後、70％エタノール900μlを加え、ミキサーで5sec程度攪拌して再縣濁させる（ステップ６）。次に、分離用スタンド（Magical Trapper）にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上清を捨てる（ステップ７）。ステップ６、７を繰り返して70％エタノールによる２度目の洗浄（ステップ８）を行った後、回収された磁性粒子に純水100μlを加え、チューブミキサーで10分間攪拌を行う（ステップ９）。次に分離用スタンド（Magical Trapper）にマイクロチューブをセットし、30sec静置して磁性粒子をチューブ壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上清を新しいチューブに回収する。
【０１００】
（７） 回収したGenome ＤＮＡの検査
回収された微生物（エンテロバクター  クロアカエ株）のGenome ＤＮＡは、定法に従って、アガロース電気泳動と260/280nmの吸光度測定を行い、その品質（低分子核酸の混入量、分解の程度）と回収量を検定する。このようにして回収するGenome ＤＮＡにはデグラデーションやｒRNAの混入は認められない。回収したGenome ＤＮＡを、最終濃度1ng/μlとなるようにＴＥ緩衝液に溶解する。
【０１０１】
なお、必要によっては、得られたGenome ＤＮＡをＰＣＲなど既知の方法でプレ増幅させても良い。
【０１０２】
（８）ハイブリダイゼーション用カートリッジの作製
（３）で作成したＤＮＡチップに、天板および流路を有するポリオレフィンで作製した天板を接着し、ハイブリダイゼーションチャンバを作製する。このハイブリダイゼーションチャンバは５ｍｍ×１０ｍｍ×０．５ｍｍの大きさである。
【０１０３】
また、ハイブリダイゼーションチャンバには試料溶液を入れる試料溶液注入口、洗浄液の排出口（それぞれ直径２ｍｍ）と、試料溶液の流出口、流入口（ともに直径２.４ｍｍ）を設ける。流出口と流入口の間を内径０．８ｍｍの長さ約２０ｃｍのチューブを接続する。その一部に、送液ポンプとして、チューブを一方向にしごく手段を設ける。また、長さ４ｃｍの板状ヒーターをチューブに４ヶ所固定する。（各ヒーター間は熱の干渉を避けるため約１ｃｍずつ空間を設ける。）
また、ハイブリダイゼーションチャンバ内の試料溶液の温度を調整するため、ＤＮＡチップの裏面にヒーターを設置する。各ヒーターにはＫ型熱電対を設け、温度の測定が可能なようにする。
【０１０４】
こうして作成する装置内の容積は約１２５μＬとなる。
【０１０５】
（９）試料溶液の調製
表２に示す液組成を調製する。
【０１０６】
【表２】
2009034052.tif 000004
【０１０７】
（１０）ＰＣＲ  ＆  ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションチャンバ用のヒーターを４５℃、ディネーチャー用のヒーターを９２℃、アニーリング用のヒーターを５５℃、エクステンション用のヒーターを７２℃に設定する。
【０１０８】
試料溶液注入口から表２の組成の溶液を試料溶液としてハイブリダイゼーションチャンバに注入し、０．４５μＬ／ｓｅｃになるように送液ポンプを調整する。これにより、ハイブリダイゼーションチャンバ及びチューブが試料溶液で充填され、かつハイブリダイゼーションチャンバ内に試料溶液が保持された状態で、試料溶液の一部がチューブを介して循環する流れを形成する。
【０１０９】
循環開始から２時間後、流入口、流出口を閉じ、ＤＮＡチップ裏面に設置したヒーターをはずし、代わりに２５℃のヒートブロックを設置して、試料溶液を冷却する。そして、試料溶液注入口から２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ混合溶液を１ｍＬ、２×ＳＳＣを１ｍＬ注入してＤＮＡチップを洗浄する。
【０１１０】
続いて天板を取り外して純水で洗浄して、スピンドライを行って乾燥させる。
【０１１１】
（１１）蛍光測定
上記ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡチップを蛍光検出装置（例えばAxon社製、GenePix 4000B）を用いで蛍光測定を行う。
【０１１２】
以上説明した実施形態の装置やハイブリダイゼーション用カートリッジを用いた方法は、反応を行うにつれ、標的核酸が増幅される。このため、これまでのハイブリダイゼーション方法に比べて、ハイブリダイゼーション反応に必要な時間が短縮される。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】本発明の方法を行うのに好適な装置の一例を示す模式図である。
【図２】本発明の方法を行うのに好適な装置の一例を示す模式図である。
【図３】本発明の方法を行うのに好適な装置の一例を示す模式図である。
【図４】本発明の検出方法の一例を示す模式図である。
【図５】本発明の検出方法の一例を示す模式図である。
【図６】本発明の方法を行うのに好適なカートリッジの一例を示す模式図である。
【図７】本発明の方法の一例を示すフローチャートである。
【図８】本発明の方法の一例を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【０１１４】
1   ＤＮＡチップ
2   プローブ核酸
3   ハイブリダイゼーションチャンバ
4   ハイブリダイゼーションチャンバ用温度調整機構
5   試料溶液注入口
6   流出口
7   流入口
100   流路
101   送液ポンプ
102   温度調整機構1
103   温度調整機構2
104   温度調整機構3
105   温度調整機構4
106   増幅チャンバ
107   増幅チャンバ用温度調整機構
108   温度調整機構5
201   ハイブリダイゼーション用カートリッジ
202   温度調整機構制御端子
501   基板
503   プローブ核酸
512   標的核酸
520   第一の色素
521   第二の色素
601   基板
603   プローブ核酸
612   標的核酸
620   第一の色素
622   標識プローブ
623   第二の色素
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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