(57)【要約】【課題】核酸試料中の核酸の標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、擬陽性の可能性が少なく、かつ明確に標的塩基を判別することができる標的塩基特異性プライマー、及び該標的塩基特異性プライマーを用いた標的塩基判別方法の提供。【解決手段】  標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、前記標的塩基対応塩基の５’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、かつ、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の３’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が特定の塩基種であることを特徴とする標的塩基特異性プライマー、及び該標的塩基特異性プライマーを用いた標的塩基判別方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、
前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、
前記標的塩基対応塩基の５’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、かつ、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の３’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が下記（１ａ）〜（１ｍ）からなる群より選択される１であることを特徴とする標的塩基特異性プライマー。
（１ａ）前記標的塩基として予想される塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｂ）前記標的塩基として予想される塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（１ｃ）前記標的塩基として予想される塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｄ）前記標的塩基として予想される塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（１ｅ）前記標的塩基として予想される塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡである。
（１ｆ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ又はＣである。
（１ｇ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｈ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（１ｉ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＣである。
（１ｊ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
（１ｋ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｌ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡである。
（１ｍ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
【請求項２】
標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、
前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、
前記標的塩基対応塩基の５’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、前記ミスマッチ対応塩基の３’側に隣接する塩基をアンカー塩基とし、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の３’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が下記（２ａ）〜（２ｍ）からなる群より選択される１であることを特徴とする標的塩基特異性プライマー。
（２ａ）前記アンカー塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
（２ｂ）前記アンカー塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＧ又はＣである。
（２ｃ）前記アンカー塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（２ｄ）前記アンカー塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
（２ｅ）前記アンカー塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＧ又はＣである。
（２ｆ）前記アンカー塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（２ｇ）前記アンカー塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＧ又はＣである。
（２ｈ）前記アンカー塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＧ又はＣである。
（２ｉ）前記アンカー塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ又はＴである。
（２ｊ）前記アンカー塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ、Ｇ、又はＣである。
（２ｋ）前記アンカー塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
（２ｌ）前記アンカー塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ、Ｔ、又はＧである。
（２ｍ）前記アンカー塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ又はＴである。
【請求項３】
さらに、前記ミスマッチ塩基の塩基種が、下記（１ａ）〜（１ｍ）からなる群より選択される１であることを特徴とする請求項２記載の標的塩基特異性プライマー。
（１ａ）前記標的塩基として予想される塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｂ）前記標的塩基として予想される塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（１ｃ）前記標的塩基として予想される塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｄ）前記標的塩基として予想される塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（１ｅ）前記標的塩基として予想される塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡである。
（１ｆ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ又はＣである。
（１ｇ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｈ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（１ｉ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＣである。
（１ｊ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
（１ｋ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｌ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡである。
（１ｍ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
【請求項４】
前記ミスマッチ塩基が１塩基であり、
前記（１ａ）〜（１ｍ）からなる群より選択される１と、前記（２ａ）〜（２ｍ）からなる群より選択される１とにおいて、ミスマッチ塩基の塩基種が異なる場合に、前記ミスマッチ塩基が、前記（２ａ）〜（２ｍ）からなる群より選択される１の塩基種であることを特徴とする請求項３記載の標的塩基特異性プライマー。
【請求項５】
前記ミスマッチ塩基及び前記ミスマッチ対応塩基が１又は２塩基であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の標的塩基特異性プライマー。
【請求項６】
前記ミスマッチ塩基が、３’末端から４塩基以内に配置されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の標的塩基特異性プライマー。
【請求項７】
標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別する方法であって、
（Ｉ）前記核酸試料中の核酸と、請求項１〜６のいずれか記載の標的塩基特異性プライマーとをハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行う工程と、
（ＩＩ）前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種を、前記工程（Ｉ）における核酸伸長効率に基づき判別する工程と、
を有することを特徴とする標的塩基判別方法。
【請求項８】
前記工程（ＩＩ）が、
（ＩＩ−１）前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程（Ｉ）における核酸伸長効率が高い場合には前記予想される塩基であり、前記工程（Ｉ）における核酸伸長効率が低い場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別する工程、
であることを特徴とする請求項７記載の標的塩基判別方法。
【請求項９】
前記工程（Ｉ）の後前記工程（ＩＩ）の前に、
（ＩＩＩ）標的塩基の塩基種が、前記予想される塩基とは異なる種類の塩基である標的塩基配列を有する核酸と、前記標的塩基特異性プライマーとをハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行う核酸伸長工程と、
を有し、前記工程（ＩＩ）が、
（ＩＩ−２）前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程（Ｉ）において得られた伸長産物の量が前記工程（ＩＩＩ）において得られた伸長産物の量よりも多い場合には前記予想される塩基であり、前記工程（Ｉ）において得られた伸長産物の量が前記工程（ＩＩＩ）において得られた伸長産物の量以下である場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別する工程、
であることを特徴とする請求項７記載の標的塩基判別方法。
【請求項１０】
前記工程（ＩＩ−２）が、
（ＩＩ−３）前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程（Ｉ）において得られた伸長産物の量が前記工程（ＩＩＩ）において得られた伸長産物の量の３倍以上である場合には前記予想される塩基であり、前記工程（Ｉ）において得られた伸長産物の量が前記工程（ＩＩＩ）において得られた伸長産物の量の３倍未満である場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別する工程、
であることを特徴とする請求項９記載の標的塩基判別方法。
【請求項１１】
前記核酸伸長反応が、プライマー伸長反応であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか記載の標的塩基判別方法。
【請求項１２】
前記プライマー伸長反応が、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓs）法、ＲＣＲ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｉｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＰＡＬＳＡＲ（Ｐｒｏｂｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｌｉｎｋ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、及びＩＣＡＮ (Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｉｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ) 法からなる群より選択される１の塩基増幅反応であることを特徴とする請求項１１記載の標的塩基判別方法。
【請求項１３】
前記工程（ＩＩ）において、前記核酸伸長効率を、前記塩基増幅反応により産生された増幅産物量に基づき調べることを特徴とする請求項７又は８記載の標的塩基判別方法。
【請求項１４】
前記工程（ＩＩ）において、前記核酸伸長効率を、前記塩基増幅反応により産生された増幅産物の分子量に基づき調べることを特徴とする請求項７又は８記載の標的塩基判別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられる標的塩基特異性プライマー、及び該標的塩基特異性プライマーを用いた標的塩基判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子多型は、癌等の特定の疾患に対する罹り易さや、薬物代謝能等の個体差の主要な一因と考えられている。特にＳＮＰ（一塩基多型）は、遺伝子多型の中で最も高頻度で現れる多型であり、ヒトゲノム中において約０．１％の頻度で現れると考えられている。実際に、これまでにヒトゲノムにおいて３００万を超える数のＳＮＰの存在が明らかになってきており、このことはＳＮＰが遺伝子検査マーカーとして非常に有用であることを示している。これまでのＳＮＰと疾病の関連付けの研究によって、薬剤感受性の予測や糖尿病や高血圧症等の疾病とＳＮＰが深く関連していることが明らかになってきている。
【０００３】
ＳＮＰを判別する、すなわち、核酸試料中の核酸が、ＳＮＰの各塩基種のうち、いずれの塩基種であるかを判別する方法の一つに、アレル特異性プライマーを用いたプライマー伸長反応を利用する技術が知られている。ここで、アレル特異性プライマーとは、標的とするＳＮＰの塩基種のうち、検出対象である特定の塩基種と相補的な塩基を有しており、鋳型となる核酸が有する標的ＳＮＰの塩基種に依存してプライマー伸長反応効率に著しい差が生じるプライマーのことを言う。具体的には、標的ＳＮＰとして、検出対象である塩基種を有するアレルを鋳型とした場合には、プライマー伸長反応効率が高くなり、その他の塩基種を有するアレルを鋳型とした場合には、プライマー伸長反応効率が低くなる。したがって、例えば、核酸試料中の核酸を鋳型とし、アレル特異性プライマーを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、得られたＰＣＲ産物量を解析することにより、標的ＳＮＰの塩基種を特定することができる。
【０００４】
つまり、アレル特異性プライマーを用いたＳＮＰ判別方法は、プライマー伸長反応の結果得られた伸長産物の量を解析することにより、簡単にＳＮＰを判別し得ることから、他のＳＮＰ判別方法に比べて、コストや反応時間、操作の簡便性といった面において非常に有利である。例えば、アレル特異性プライマーとして、特に何も修飾されていない単なるオリゴヌクレオチドを用いた場合であっても、汎用されている電気泳動法を用いることにより、簡便に伸長産物量を解析することができる。なお、解析方法については、電気泳動法に限定されるものではなく、固相系の反応を行い、水晶発振子マイクロバランス(ＱＣＭ)や表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を解析することによっても、検出することも可能である。さらに近年では、プライマー伸長反応の副産物であるＰｐｉ（ピロリン酸）を、ルシフェラーゼ反応を利用して検出する方法も開発されており、アレル特異性プライマーを用いたＳＮＰ判別方法の簡便化や迅速化は世界中において精力的に取り組まれている。特に、アレル特異性プライマーの配列設計は、そのＳＮＰ判別能において非常に重要なファクターであり、よりＳＮＰ判別能の高い優れたアレル特異性プライマーの開発が広く試みられている。
【０００５】
これまでに幾つかの新規アレル特異性プライマーが開発されている。まず、プライマー内の何れかの場所に多型塩基部位に対応する塩基を有するプライマーが提案された（例えば、特許文献１参照。）。ここで、「多型塩基部位に対応する塩基」とは、プライマー中の塩基であって、該プライマーが多型塩基部位を有する核酸とハイブリダイズする際に、該多型塩基部位と相互作用する塩基を意味する。その後、多型塩基部位がプライマーの３’末端に限定されたプライマー、すなわち予想される標的ＳＮＰの塩基種のいずれかに相補的な塩基を３’末端に有するプライマーが現れた（例えば、特許文献２参照。）。このような、３’末端塩基が標的ＳＮＰ塩基に対応しており、それ以外の配列は標的塩基配列に対して完全に相補的であるプライマーが、現在の最も典型的なアレル特異性プライマーである。
【０００６】
しかしながら、特許文献１や２に記載のアレル特異性プライマーは、ＳＮＰ判別能が十分ではなく、プライマー伸長反応の反応時間や温度、あるいは反応に用いるｄＮＴＰｓ濃度、またはＰＣＲ法を用いるのであればサイクル数等の反応条件を厳密に規定しなければ、アレル特異性プライマーの検出対象である塩基種以外の塩基種を有する核酸を鋳型とした場合であっても、プライマー伸長反応効率が高くなり、擬陽性の問題が生じてしまう。
【０００７】
このような擬陽性の問題を解決するために、人為的にミスマッチを導入することにより特許文献２記載のプライマーを改良した新規アレル特異性プライマーが開発されている。このようなプライマーとして、例えば、（１）３’末端塩基が標的ＳＮＰ塩基に対応しており、３’末端から２番目の塩基にミスマッチを導入したアレル特異性プライマー（例えば、特許文献３参照。）や、（２）３’末端塩基が標的ＳＮＰ塩基に対応しており、３’末端から２番目及び3番目の塩基に、特定の塩基種の組合せからなるミスマッチを導入したアレル特異性プライマー（例えば、特許文献４参照。）等がある。特に特許文献４記載のアレル特異性プライマーでは、２塩基の組合せを全て吟味し、特に特異性が高く出るような塩基種の組合せを選出し、ミスマッチとして導入している。
【０００８】
また、標的ＳＮＰ塩基に対応する塩基が、プライマーの３’末端塩基に限定されないものとして、例えば、（３）標的ＳＮＰ塩基に対応する塩基に隣接する塩基を、ＤＮＡ型塩基またはＲＮＡ型塩基と相互作用のない置換基に置換することによりミスマッチを導入したアレル特異性プライマー（例えば、特許文献５参照。）や、このアレル特異性プライマーを改良したものであって、（４）プライマーの３’末端より２番目の塩基が標的ＳＮＰ塩基に対応する塩基であり、３’末端の３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基にミスマッチを導入したアレル特異性プライマー（例えば、特許文献６参照。）等がある。さらに、（５）３’末端から４塩基以内に標的ＳＮＰ塩基に対応する塩基を有し、この標的ＳＮＰ塩基に対応する塩基に隣接する塩基に、標的ＳＮＰ塩基の塩基種に応じて選択した塩基種のミスマッチを導入したアレル特異性プライマー（例えば、特許文献７参照。）等がある。
【特許文献１】特許第２７６０５５３号公報
【特許文献２】特許第２８５３８６４号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／００２２１７５号明細書
【特許文献４】特許第３８５９６８４号公報
【特許文献５】特開２００５−２８７４９９号公報
【特許文献６】国際公開２００１／０４２４９８号パンフレット
【特許文献７】特開２００４−１２１０８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献３〜７に記載のアレル特異性プライマーは、主に標的ＳＮＰ塩基に対応する塩基の隣接部にミスマッチを導入し、プライマーと標的塩基配列を有する核酸とのハイブリダイズにおけるＳＮＰ近傍をより不安定化することにより、アレル特異性プライマーのＳＮＰ識別能を向上させ、擬陽性の問題の解決を図っている。しかしながら、擬陽性を低く抑えることが可能となる場合であっても、アレルごとにプライマー伸長反応効率が大きく異なるような場合には、プライマー伸長反応効率の高低に基づいてアレルを特定することは困難であり、例えば、コントロールをおいて各試料のプライマー伸長反応効率を比較する等の煩雑な判定方式をとらなければならない場合が多い。
【００１０】
このような問題に対し、特許文献４及び７記載のアレル特異性プライマーでは、導入するミスマッチの塩基種を特定の塩基種とすることにより、擬陽性の抑制だけではなく、プライマー伸長反応効率までも調整しようとする試みがなされている。しかしながら、特許文献４記載では、プライマーにミスマッチとして導入される２塩基の組合せは、ミスマッチにのみ着目して決定されている。また、特許文献７記載では、ミスマッチとして導入される塩基は、標的ＳＮＰ塩基の塩基種にのみ着目して決定されている。このため、これらのアレル特異性プライマーは、標的塩基配列の種類によっては、プライマー伸長反応効率が十分に調整されず、プライマー伸長反応効率の高低に基づいてアレルを特定することは難しい。
【００１１】
本発明は、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、擬陽性の可能性が少なく、かつ明確に標的塩基を判別することができる標的塩基特異性プライマー、及び該標的塩基特異性プライマーを用いた標的塩基判別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的塩基に対応するプライマー上の塩基（標的塩基対応塩基）にミスマッチを導入する場合に、標的塩基に対応する塩基の５’側の隣接する塩基にミスマッチを導入すること、及び、ミスマッチとして導入される塩基（ミスマッチ塩基）の塩基種は、標的塩基の塩基種と、該ミスマッチ塩基と対応する標的塩基配列上の塩基（ミスマッチ対応塩基）の塩基種との組合せに応じて特定の塩基種とすることにより、非常に高いプライマー伸長反応効率を示すという知見を見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明の第一の態様は、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、前記標的塩基対応塩基の５’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、かつ、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の３’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が下記（１ａ）〜（１ｍ）からなる群より選択される１であることを特徴とする標的塩基特異性プライマーである。
（１ａ）前記標的塩基として予想される塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｂ）前記標的塩基として予想される塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（１ｃ）前記標的塩基として予想される塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｄ）前記標的塩基として予想される塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（１ｅ）前記標的塩基として予想される塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡである。
（１ｆ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ又はＣである。
（１ｇ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｈ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（１ｉ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＣである。
（１ｊ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
（１ｋ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｌ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡである。
（１ｍ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
また、本発明の第二の態様は、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、前記標的塩基対応塩基の５’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、前記ミスマッチ対応塩基の３’側に隣接する塩基をアンカー塩基とし、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の３’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が下記（２ａ）〜（２ｍ）からなる群より選択される１であることを特徴とする標的塩基特異性プライマーである。
（２ａ）前記アンカー塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
（２ｂ）前記アンカー塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＧ又はＣである。
（２ｃ）前記アンカー塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（２ｄ）前記アンカー塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
（２ｅ）前記アンカー塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＧ又はＣである。
（２ｆ）前記アンカー塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（２ｇ）前記アンカー塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＧ又はＣである。
（２ｈ）前記アンカー塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＧ又はＣである。
（２ｉ）前記アンカー塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ又はＴである。
（２ｊ）前記アンカー塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ、Ｇ、又はＣである。
（２ｋ）前記アンカー塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
（２ｌ）前記アンカー塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ、Ｔ、又はＧである。
（２ｍ）前記アンカー塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ又はＴである。
本発明の第一及び第二の発明においては、前記ミスマッチ塩基が１塩基であり、前記（１ａ）〜（１ｍ）からなる群より選択される１と、前記（２ａ）〜（２ｍ）からなる群より選択される１とにおいて、ミスマッチ塩基の塩基種が異なる場合に、前記ミスマッチ塩基が、前記（２ａ）〜（２ｍ）からなる群より選択される１の塩基種であることが好ましい。
また、本発明の第一及び第二の発明においては、前記ミスマッチ塩基及び前記ミスマッチ対応塩基が１又は２塩基であることが好ましい。
さらに、本発明の第一及び第二の発明においては、前記ミスマッチ塩基は、３’末端から４塩基以内に配置されていることが好ましい。
【００１４】
また、本発明の第三の態様は、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別する方法であって、（Ｉ）前記核酸試料中の核酸と、本発明の第一又は第二の態様の標的塩基特異性プライマーとをハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行う工程と、（ＩＩ）前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種を、前記工程（Ｉ）における核酸伸長効率に基づき判別する工程と、を有することを特徴とする標的塩基判別方法である。
本発明の第三の態様においては、前記工程（ＩＩ）が、（ＩＩ−１）前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程（Ｉ）における核酸伸長効率が高い場合には前記予想される塩基であり、前記工程（Ｉ）における核酸伸長効率が低い場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別する工程であることが好ましい。
また、前記工程（Ｉ）の後前記工程（ＩＩ）の前に、（ＩＩＩ）標的塩基の塩基種が、前記予想される塩基とは異なる種類の塩基である標的塩基配列を有する核酸と、前記標的塩基特異性プライマーとをハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行う核酸伸長工程と、を有し、前記工程（ＩＩ）が、（ＩＩ−２）前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程（Ｉ）において得られた伸長産物の量が前記工程（ＩＩＩ）において得られた伸長産物の量よりも多い場合には前記予想される塩基であり、前記工程（Ｉ）において得られた伸長産物の量が前記工程（ＩＩＩ）において得られた伸長産物の量以下である場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別する工程、であることが好ましい。前記工程（ＩＩ−２）が、（ＩＩ−３）前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程（Ｉ）において得られた伸長産物の量が前記工程（ＩＩＩ）において得られた伸長産物の量の３倍以上である場合には前記予想される塩基であり、前記工程（Ｉ）において得られた伸長産物の量が前記工程（ＩＩＩ）において得られた伸長産物の量の３倍未満である場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別する工程、であることも好ましい。
また、本発明の第三の態様においては、前記核酸伸長反応が、プライマー伸長反応であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の第一及び第二の態様の標的塩基特異性プライマーは、標的塩基の識別能が十分に高い上に、標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行った場合に、核酸伸長反応効率が十分に高いという特性を有する。このため、本発明の標的塩基特異性プライマーは、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために特に好適に用いられる。
また、本発明の第三の態様の標的塩基判別方法を用いて、標的塩基の塩基種を判別することにより、擬陽性の可能性が少なく、かつ明確に標的塩基を判別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明における標的塩基配列とは、解析の対象となる標的塩基を含む塩基配列であって、遺伝子組換え技術等により解析が可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列であってもよく、ｍＲＮＡ等の生物のＲＮＡに存在する塩基配列であってもよい。なお、本発明において、標的塩基配列を有する核酸を、標的核酸という。
【００１７】
本発明において、標的塩基とは、標的塩基配列中の一塩基であって、解析の対象となる塩基であり、複数の塩基種があり得るものである。ここで、塩基種とは、塩基配列を構成するヌクレオチドの種類であり、具体的には、ヌクレオチドの塩基部分が、標的塩基がＤＮＡである場合には、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）のいずれかであり、標的塩基がＲＮＡである場合には、Ａ、Ｇ、Ｕ（ウラシル）、Ｃのいずれかである。
【００１８】
本発明における標的塩基としては、複数の塩基種があり得るものであれば、特に限定されるものではないが、遺伝子多型や、疾患のマーカー遺伝子中の特徴的な塩基等であることが好ましい。なお、マーカー遺伝子中の特徴的な塩基とは、該マーカー遺伝子の塩基配列と他の遺伝子の塩基配列とを識別し得る塩基を意味する。ここで、遺伝子多型とは、ある生物種の集団内で、個体ごとに遺伝子の塩基配列が異なるものであれば、特に限定されるものではない。該遺伝子多型として、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト等がある。本発明における標的塩基としては、特にＳＮＰであることが好ましい。
【００１９】
本発明における核酸試料とは、標的塩基配列を有する核酸（以下、標的核酸ということがある。）を含んでいることが期待される試料であれば、特に限定されるものではない。該核酸試料として、例えば、動物等から採取した生体試料であってもよく、培養細胞溶液等から調製した試料であってもよく、生体試料等から抽出・精製した核酸溶液であってもよい。特に臨床検査等に用いられるヒト由来の生体試料や、ヒト由来の生体試料から抽出・精製した核酸溶液であることが好ましい。また、該核酸試料は、生物から採取された状態の試料であってもよく、調製した試料であってもよい。該調製の方法は、該生体試料中に含有されているＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、通常、生体試料に対してなされている調製方法を行うことができる。その他、生体試料から抽出・精製したＤＮＡをＰＣＲ等により増幅処理して得られたものであってもよく、生体試料中に含有されるＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡであってもよい。
【００２０】
本発明においては、標的核酸と非相補的な塩基であるミスマッチを標的塩基の隣接部に導入することにより、プライマーと標的核酸とのハイブリダイズにおける標的塩基近傍をより不安定化し、標的塩基特異性プライマーの標的塩基識別能を向上させ、擬陽性の問題の解決を図っている。特に、本発明においては、プライマー上のミスマッチ塩基に隣接する塩基とミスマッチ塩基の組み合わせを最適化することにより、標的塩基識別能を高めている。
【００２１】
通常、ミスマッチ塩基の塩基種は、標的核酸上のミスマッチ塩基と対応する塩基（以下、ミスマッチ対応塩基という。）と非相補的な３種類の塩基のいずれかであればよい。しかしながら、ミスマッチ塩基部分は不安定であり、この不安定性な部分よりプライマー全体の標的核酸からの遊離が起こるため、プライマーを標的核酸に繋ぎとめておくべき塩基、すなわちミスマッチ塩基の隣接塩基が重要である。そこで、本発明においては、ミスマッチ塩基の塩基種を、ミスマッチ対応塩基の塩基種と、標的核酸上の該ミスマッチ対応塩基と隣接する塩基の塩基種との組み合わせに対して最適な特定の塩基種としている。
【００２２】
本発明においては、標的塩基特異性プライマー上の標的塩基対応塩基の５’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とする。すなわち、標的塩基配列上の、標的塩基の３’側に隣接する塩基がミスマッチ対応塩基である。つまり、標的塩基（ミスマッチ対応塩基の５’側に隣接する塩基）の塩基種とミスマッチ対応塩基の塩基種との組み合わせ、又は、ミスマッチ対応塩基の３’側に隣接する塩基（以下、アンカー塩基という）の塩基種とミスマッチ対応塩基の塩基種との組み合わせに対応した特定の塩基種をミスマッチ塩基として導入する。
【００２３】
具体的には、本発明の第一の態様である標的塩基特異性プライマーは、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、前記標的塩基対応塩基の５’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、かつ、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の３’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が下記（１ａ）〜（１ｍ）からなる群より選択される１であることを特徴とする。
（１ａ）前記標的塩基として予想される塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｂ）前記標的塩基として予想される塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（１ｃ）前記標的塩基として予想される塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｄ）前記標的塩基として予想される塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（１ｅ）前記標的塩基として予想される塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡである。
（１ｆ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ又はＣである。
（１ｇ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｈ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（１ｉ）前記標的塩基として予想される塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＣである。
（１ｊ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
（１ｋ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴ又はＧである。
（１ｌ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡである。
（１ｍ）前記標的塩基として予想される塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
【００２４】
また、本発明の第二の態様である標的塩基特異性プライマーは、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別するために用いられるプライマーであって、前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基である標的塩基対応塩基を有し、前記標的塩基対応塩基の５’側に隣接する塩基をミスマッチ塩基とし、前記ミスマッチ対応塩基の３’側に隣接する塩基をアンカー塩基とし、前記標的塩基配列上の前記標的塩基の３’側に隣接する塩基をミスマッチ対応塩基とした場合に、前記ミスマッチ塩基の塩基種が下記（２ａ）〜（２ｍ）からなる群より選択される１であることを特徴とする。
（２ａ）前記アンカー塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
（２ｂ）前記アンカー塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＧ又はＣである。
（２ｃ）前記アンカー塩基がＡであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（２ｄ）前記アンカー塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
（２ｅ）前記アンカー塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＧ又はＣである。
（２ｆ）前記アンカー塩基がＴであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＴである。
（２ｇ）前記アンカー塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＧ又はＣである。
（２ｈ）前記アンカー塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＧ又はＣである。
（２ｉ）前記アンカー塩基がＧであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ又はＴである。
（２ｊ）前記アンカー塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＡである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ、Ｇ、又はＣである。
（２ｋ）前記アンカー塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＴである場合に、前記ミスマッチ塩基がＣである。
（２ｌ）前記アンカー塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＧである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ、Ｔ、又はＧである。
（２ｍ）前記アンカー塩基がＣであり、前記ミスマッチ対応塩基がＣである場合に、前記ミスマッチ塩基がＡ又はＴである。
【００２５】
図１は、本発明の第一又は第二の態様である標的塩基特異性プライマーと、標的核酸とのハイブリダイズの形態を示した図である。図１（ａ）は、標的塩基特異性プライマーと、標的塩基の塩基種が、該標的塩基特異性プライマーが特異的に識別する塩基である標的核酸とのハイブリダイズの形態を示した図であり、図１（ｂ）は、標的塩基特異性プライマーと、標的塩基の塩基種が、該標的塩基特異性プライマーが特異的に識別する塩基以外の塩基である標的核酸とのハイブリダイズの形態を示した図である。標的核酸２中、Ｓの囲い文字が予想される塩基種である標的塩基、Ｓ字のない□が予想される塩基種以外の塩基種である標的塩基、○がミスマッチ対応塩基、△がアンカー塩基である。また、標的塩基特異性プライマー１中、Ｓの塗りつぶし囲い文字が標的塩基対応塩基であり、●がミスマッチ塩基、▲がアンカー塩基に対応する塩基である。
【００２６】
つまり、本発明の第一の態様の標的塩基特異性プライマーにおいては、例えば、標的塩基配列中、標的塩基Ｓ（囲い文字）がＡであり、ミスマッチ対応塩基○がＴである場合に、ミスマッチ塩基●をＴ又はＧとする。また、標的塩基配列中、標的塩基Ｓ（囲い文字）がＣであり、ミスマッチ対応塩基○がＣである場合に、ミスマッチ塩基●をＣとする。一方、本発明の第二の態様の標的塩基特異性プライマーにおいては、例えば、標的塩基配列中、アンカー塩基△がＡであり、ミスマッチ対応塩基○がＡである場合に、ミスマッチ塩基●をＣとする。また、標的塩基配列中、アンカー塩基△がＣであり、ミスマッチ対応塩基○がＣである場合に、ミスマッチ塩基●をＡ又はＴとする。
【００２７】
第一の態様及び第二の態様において、ミスマッチ塩基として複数種類の塩基が挙げられている場合、いずれの塩基種を選択してもよい。例えば、標的塩基特異性プライマーのＴｍ値、塩基長、同時に使用する他のプライマーの種類、核酸伸長反応の反応条件等を考慮して、適宜選択することができる。
【００２８】
また、第一の態様の標的塩基特異性プライマーと、第二の態様の標的塩基特異性プライマーのいずれを用いてもよい。第一の態様と第二の態様のいずれの標的塩基特異性プライマーを用いるかは、例えば、標的塩基配列の種類、核酸伸長反応の反応条件等を考慮して、適宜選択することができる。
【００２９】
第一の態様と第二の態様を組み合わせた標的塩基特異性プライマーを用いることにより、さらに、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得るという好ましい効果を得ることができる。例えば、標的塩基配列において、標的塩基がＡであり、ミスマッチ対応塩基がＴであり、アンカー塩基がＡである場合に、第一の態様の標的塩基特異性プライマーでは、ミスマッチ塩基としてＴ又はＧを用いることができ（１ａ）、第二の態様の標的塩基特異性プライマーでは、ミスマッチ塩基としてＧ又はＣを用いることができる（２ｂ）。したがって、ミスマッチ塩基としてＧを用いることにより、最も高精度に標的塩基の塩基種を判別し得る標的塩基特異性プライマーを得ることができる。
【００３０】
なお、ミスマッチ塩基が１塩基である場合には、第一の態様と第二の態様において、選択されるミスマッチ塩基の塩基種が異なる場合がある。この場合には、第二の態様を優先させることが好ましい。つまり、前記ミスマッチ塩基が１塩基であり、前記（１ａ）〜（１ｍ）からなる群より選択される１と、前記（２ａ）〜（２ｍ）からなる群より選択される１とにおいて、ミスマッチ塩基の塩基種が異なる場合には、ミスマッチ塩基は、（２ａ）〜（２ｍ）からなる群より選択される１の塩基種とすることが好ましい。
例えば、標的塩基として予想される塩基がＣであり、ミスマッチ対応塩基がＣであり、アンカー塩基がＴである場合には、第一の態様においては、（１ｍ）よりミスマッチ塩基はＣとなるが、第二の態様においては、（２ｆ）よりミスマッチ塩基はＴとなり、塩基種が一致しない。この場合には、標的塩基特異性プライマーのミスマッチ塩基をＣよりもＴとすることが好ましい。
【００３１】
第一の態様及び第二の態様の標的塩基特異性プライマー（以下、本発明の標的塩基特異性プライマーということがある。）において、標的塩基対応塩基、ミスマッチ塩基、及びアンカー塩基に対応する塩基は、プライマーの３’末端側からこの順に配置されていればよい。つまり、標的塩基特異性プライマー上の標的塩基対応塩基の位置は、必ずしも限定されるものではないが、ミスマッチ塩基が、３’末端から４塩基以内に配置されていること、すなわち、標的塩基特異性プライマーの３’末端側から３塩基以内に標的塩基対応塩基が配置されていることが好ましい。標的塩基特異性プライマーの３’末端側近傍に標的塩基対応塩基やミスマッチ塩基を配置することにより、プライマーの標的塩基の識別能を十分に高くすることができるためである。標的塩基特異性プライマーの３’末端側から２塩基目に標的塩基対応塩基が、３塩基目にミスマッチ塩基が、それぞれ配置されていることがより好ましい。
【００３２】
また、本発明の標的塩基特異性プライマーにおいて、ミスマッチ塩基が標的塩基対応塩基の５’側に隣接する塩基であれば、ミスマッチ塩基の数は特に限定されるものではない。例えば、標的塩基対応塩基の５’側の隣接した塩基を一端とした連続した塩基をミスマッチ塩基とすることができる。ミスマッチ塩基数は、１又は２塩基であることが好ましく、１塩基であることがより好ましい。
【００３３】
本発明の標的塩基特異性プライマーにおいて、標的塩基対応塩基、ミスマッチ塩基、アンカー塩基に対応する塩基以外の塩基は、標的塩基配列と相補的な塩基であることが好ましいが、本発明の標的塩基特異性プライマーを用いて標的塩基の塩基種を判別し得る限り、特に限定されるものではなく、標的塩基配列と完全に相補的である必要はない。
【００３４】
本発明の標的塩基特異性プライマーは、標的塩基配列に応じて、常法により設計することができる。例えば、公知のゲノム配列データやＳＮＰデータ等から得られる塩基配列情報と、汎用されているプライマー設計ツールを用いて、簡便に設計することができる。公知のゲノム配列データは、通常、国際的な塩基配列データベースであるＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）等において入手することができる。また、公知のＳＮＰデータは、例えば、東京大学医科学研究所が整備した日本人のＳＮＰのデータベースＪＳＮＰ（ｈｔｔｐ：//ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ/ｉｎｄｅｘ＿ｊａ.ｈｔｍｌ）等のデータベースから入手することができる。該プライマー設計ツールとして、例えば、Ｗｅｂ上で利用可能なＰｒｉｍｅｒ３（Ｒｏｚｅｎ, Ｓ., Ｈ.Ｊ. Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ、１９９６年、ｈｔｔｐ: //ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ.ｗｉ.ｍｉｔ.ｅｄｕ/ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ/ｏｔｈｅｒ/ｐｒｉｍｅｒ３. ｈｔｍｌ）や、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（ＤＮＡ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）等がある。
このようにして設計したプライマーは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても合成することができる。例えば、オリゴ合成メーカーに合成をされ依頼してもよく、市販の合成機を用いて独自に合成してもよい。
【００３５】
また、本発明の標的塩基特異性プライマーは、標的核酸とハイブリダイズする領域以外にも、標的塩基の塩基種判別を阻害しない程度において、付加的な配列を有することができる。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列や、核酸の標識に供される配列等がある。
【００３６】
さらに、本発明の標的塩基特異性プライマーは、後述する工程（Ｉ）により得られた核酸伸張産物の検出や解析等を容易にするために、標識されたものであってもよい。該標識をするための物質は、核酸の標識に用いることができるものであれば、特に限定されるものではなく、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン等がある。
【００３７】
本発明の第三の態様である標的塩基判別方法（以下、本発明の標的塩基判別方法ということがある。）は、本発明の標的塩基特異性プライマーを用いて標的塩基の塩基種の判別を行う方法である。具体的には、本発明の標的塩基判別方法は、標的塩基の塩基種が複数ある場合に、核酸試料中の標的塩基を含む標的塩基配列を有する核酸の、標的塩基の塩基種を判別する方法であって、（Ｉ）前記核酸試料中の核酸と、本発明の標的塩基特異性プライマーとをハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行う工程と、（ＩＩ）前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種を、前記工程（Ｉ）における核酸伸長効率に基づき判別する工程と、を有することを特徴とする。
【００３８】
例えば、図１（ａ）において、標的塩基特異性プライマー１と標的核酸２は、標的塩基特異性プライマー１上のミスマッチ塩基以外では互いに相補的である、つまり、標的塩基特異性プライマー１の３’末端側は標的核酸２とハイブリダイズしているため、標的核酸２を鋳型とした標的塩基特異性プライマー１の核酸伸長反応が効率よく進行する。一方、図１（ｂ）において、標的塩基特異性プライマー１と標的核酸２は、標的塩基特異性プライマー１上のミスマッチ塩基と標的塩基対応塩基の２塩基において非相補的であり、このため、標的塩基特異性プライマー１の３’末端側は標的核酸２とハイブリダイズし難く、標的核酸２を鋳型とした標的塩基特異性プライマー１の核酸伸長反応効率は低くなる。このように、工程（ＩＩ）において、前記工程（Ｉ）における核酸伸長効率が高い場合には、前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記予想される塩基（核酸伸長反応において用いた標的塩基特異性プライマーの標的塩基対応塩基と相補的な塩基）であり、前記工程（Ｉ）における核酸伸長効率が低い場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別することができる。
【００３９】
ここで、核酸伸長反応効率の高低は、当業者であれば、核酸伸長反応の種類、反応条件等を考慮して適宜判別することができる。例えば、標的塩基の塩基種が予め分かっている標的核酸を鋳型として、工程（Ｉ）と同様に核酸伸長反応を行い、得られた核酸伸長反応効率を基準として判別することができる。
【００４０】
具体的には、前記工程（Ｉ）の後前記工程（ＩＩ）の前に、工程（ＩＩＩ）として、標的塩基の塩基種が、前記予想される塩基とは異なる種類の塩基である標的塩基配列を有する核酸と、前記標的塩基特異性プライマーとをハイブリダイズさせて、核酸伸長反応を行う核酸伸長工程と、を有し、前記工程（ＩＩ）において、前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程（Ｉ）において得られた伸長産物の量が、前記工程（ＩＩＩ）において得られた伸長産物の量よりも多い場合には前記予想される塩基であり、前記工程（Ｉ）において得られた伸長産物の量が、前記工程（ＩＩＩ）において得られた伸長産物の量以下である場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別することができる。
また、後述するように、伸長反応をリアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲ法にて行う場合には、サイクル数を基にして伸長反応効率を比較することが汎用されている。この場合には、例えば、２サイクル分程度の産物量比があれば、伸長産物量が異なると判断し得る。ここで、１サイクル当たりの増幅率を１．７５とした場合に、２サイクル分の産物量比は約３（１．７５×１．７５≒３．０６）である。このため、前記工程（ＩＩ）において、前記核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、前記工程（Ｉ）において得られた伸長産物の量が、前記工程（ＩＩＩ）において得られた伸長産物の量の３倍以上である場合には前記予想される塩基であり、前記工程（Ｉ）において得られた伸長産物の量が、前記工程（ＩＩＩ）において得られた伸長産物の量の３倍未満である場合には前記予想される塩基とは異なる種類の塩基であると判別することも好ましい。
【００４１】
工程（Ｉ）における核酸伸長反応は、核酸試料中の核酸と、本発明の標的塩基特異性プライマーとのハイブリダイズを利用するものであれば、特に限定されるものではなく、遺伝子解析等の分野で通常行われている核酸伸長反応の中から適宜選択して用いることができる。例えば、プライマー伸長反応であってもよく、リガーゼを用いて別のプライマーと結合させる反応であってもよい。
【００４２】
本発明の標的塩基判別方法においては、核酸伸長反応として、プライマー伸長反応であることが好ましい。プライマー伸長反応は、核酸試料中の核酸を鋳型とし、本発明の標的塩基特異性プライマーを伸長させる反応であれば、特に限定されるものではなく、遺伝子解析等の分野で通常行われている核酸伸長反応の中から適宜選択して用いることができる。核酸試料中の標的核酸量が微量である場合であっても、標的塩基の塩基種を判別し得ることから、本発明の標的塩基判別方法においては、プライマー伸長反応として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓs）法、ＲＣＲ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｉｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＰＡＬＳＡＲ（Ｐｒｏｂｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｌｉｎｋ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、及びＩＣＡＮ (Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｉｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ) 法等の塩基増幅反応であることがより好ましい。
【００４３】
工程（Ｉ）における核酸伸長反応として、ＰＣＲ法等の塩基増幅反応を用いた場合には、工程（Ｉ）における核酸伸長効率を、前記塩基増幅反応により産生された増幅産物量に基づいて調べることができる。核酸伸長効率が高い場合には、増幅産物量は多くなり、核酸伸長効率が低い場合には、増幅産物量は少なくなるためである。
【００４４】
その他、前記核酸伸長効率は、前記塩基増幅反応により産生された増幅産物の分子量に基づき調べることもできる。本発明の標的塩基判別方法においては、標的塩基識別能が非常に高い本発明の標的塩基特異性プライマーを用いるため、核酸試料中の核酸に含まれている標的塩基の塩基種が、標的塩基特異性プライマーの標的塩基対応塩基と非相補的な塩基である場合の核酸伸長反応効率は非常に低く、擬陽性が生じるおそれが顕著に小さいため、増幅産物の分子量が予想される分子量であれば、核酸伸長効率が高いと判断することができるためである。
【００４５】
核酸伸長反応において用いられるポリメラーゼ等の酵素、ヌクレオチド、バッファー等の試薬は、特に限定されるものではなく、通常使用されているものを通常使用されている濃度で用いることができる。また、核酸伸長反応は常法により行うことができ、反応条件等は、標的塩基配列の種類、核酸試料の種類や量、用いる酵素の種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００４６】
例えば、プライマー伸長反応を行う場合には、次のような手順で行うことができる。まず、核酸試料に、本発明の標的塩基特異性プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、バッファー、必要に応じて塩類等を加え、反応溶液を調製する。この反応溶液を、核酸試料中の二本鎖核酸を変性させるために高温状態に置いた後、本発明の標的塩基特異性プライマーと該二本鎖核酸が結合できるように温度を下げる。その後、DNAポリメラーゼが伸長反応を行うことが可能な温度条件に設定する。これにより、核酸試料中の二本鎖核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、該標的塩基特異性プライマーからプライマー伸長反応は効率よく行われる。逆に、核酸試料中の二本鎖核酸が、該標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と非相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、該標的塩基特異性プライマーからのプライマー伸長反応効率は著しく悪くなる。したがって、このプライマー伸長反応の最中、あるいは反応後に、プライマー伸長反応効率を調べることにより、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確な標的塩基の塩基種判別が可能となる。
【００４７】
プライマー伸長反応効率の測定方法は、特に限定されるものではなく、通常用いられている方法で測定することができる。例えば、プライマー伸長反応の結果放出されるピロリン酸量を測定することにより、プライマー伸長反応効率を測定することができる。ピロリン酸量の測定方法は、特に限定されるものではなく、例えばＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの第９巻第１９号ｅ９３（２００１年）や、国際公開２００３／０７８６５５号パンフレット、特開２００４−１４１１５８号公報等で提案されている方法等、通常行われている測定方法を用いて行うことができる。その他、標的塩基特異性プライマーの５’ 末端側を水晶振動子上に固定した状態で、上記プライマー伸長反応を行い、その振動数変化を解析してプライマー伸長反応をモニタリングすることで、プライマー伸長反応効率を調べてもよく、標的塩基特異性プライマーの５’ 末端側を金表面に固定した状態で、上記プライマー伸長反応を行い、その表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を解析してプライマー伸長反応をモニタリングすることで、プライマー伸長反応効率を調べてもよい。
【００４８】
また、プライマー伸長反応を行う具体的手順は上記の手順に限られることはない。例えば、上記の手順のように、予め必要な試薬類を全て反応液中に混合した上でプライマー伸長反応を行ってもよく、核酸試料に、本発明の標的塩基特異性プライマー、バッファー、必要に応じて塩類等を加えた溶液をまず用意し、高温による変性工程および標的塩基特異性プライマーによる二本鎖核酸への結合を行った後、ポリメラーゼとヌクレオチドを順次加えることで反応を行わせるいわゆるホットスタート法で行ってもよい。また、核酸試料中の核酸が一本鎖核酸である場合、二本鎖核酸の場合と異なり、核酸を変性させるという意味での高温条件下におく工程は必要ないが、一本鎖核酸と標的塩基特異性プライマーの結合反応を制御する意味において、これら両者がまず十分解離した状態を調整する必要があるので、高温条件下におく工程が、標的塩基特異性プライマーと核酸試料中の核酸との結合工程の前にあることがより好ましい。
【００４９】
また、プライマー伸長反応において用いられるポリメラーゼは、特に限定されるものではなく、遺伝子解析等の分野で通常用いられているポリメラーゼを用いることができる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼであってもよく、ＲＮＡポリメラーゼであってもよい。また、耐熱性ポリメラーゼであってもよく、非耐熱性ポリメラーゼであってもよい。さらに、３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性を有するものであってもよく、有さないものであってもよい。その他、鎖交換活性を有するものであってもよい。
【００５０】
本発明の標的塩基判別方法においては、特に３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性が弱いポリメラーゼ、又は該活性を有さないポリメラーゼを用いることが好ましい。本発明においては、３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性のないポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行うと、核酸試料中の核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、非常に効率よく反応が進むのに対し、核酸試料中の核酸が、該標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と非相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、プライマー伸長反応はほとんど進まない。したがって、３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性が弱い又は有さないポリメラーゼを用いることにより、擬陽性の可能性を顕著に低くすることができるためである。但し、本発明の標的塩基判別方法においては、３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性がないポリメラーゼを用いることを必ずしも要求するものではなく、例えば、３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性を有する超好熱始原菌Thermococcus kodakaraensis ＫＯＤ１由来のＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合であっても、高精度に標的塩基の塩基種を判別することができる。
【００５１】
本発明の標的塩基判別方法においては、プライマー伸長反応として、標的核酸を鋳型とし、本発明の標的塩基特異性プライマーを用いたＰＣＲを行うことが特に好ましい。具体的には、核酸試料に、本発明の標的塩基特異性プライマー、この標的塩基特異性プライマーとフォワードプライマー／リバースプライマーの関係になる第２のプライマー、ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、マグネシウムイオン、バッファー、必要に応じて塩類等を加え、反応溶液を調製し、該反応溶液を、常法により、変性工程、アニール工程、伸長工程からなるサイクルを１〜４０サイクル繰り返すことにより、ＰＣＲを行うことができる。核酸試料中の二本鎖核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、標的核酸中の本発明の標的塩基特異性プライマーと該第２のプライマーとで挟まれた領域の核酸が、効率よく増幅される。逆に、核酸試料中の二本鎖核酸が、該標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と非相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、該領域の核酸はほとんど増幅されない。したがって、ＰＣＲの最中、あるいは後に、増幅産物である該領域の核酸量を調べることにより、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確な標的塩基の塩基種判別が可能となる。
【００５２】
増幅産物量の測定方法は、特に限定されるものではなく、ＰＣＲ産物量の測定等に通常用いられている方法で測定することができる。例えば、前述のように、ＰＣＲの結果放出されるピロリン酸量を測定してもよく、電気泳動法を用いて測定してもよい。また、蛍光インターカレーターを用いて蛍光強度を測定する方法によっても測定することができる。
【００５３】
その他、予め適当な蛍光物質を用いて標識された標的塩基特異性プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、一分子蛍光検出法を用いて、得られた核酸増幅産物を検出し、その量や分子量等を解析することができる。一分子蛍光検出法では、分子の拡散速度の変化をもとに、得られた核酸増幅産物を解析する。より詳しくは、核酸試料中の二本鎖核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、該標的塩基特異性プライマーと前述の第２のプライマーとで挟まれた領域の核酸が効率よく増幅されるため、蛍光標識された標的塩基特異性プライマーの分子量が大幅に増加することになる。溶液中の物質の拡散速度は、物質の分子量に依存しているため、蛍光標識された標的塩基特異性プライマーの拡散速度が著しく低下する。一方、核酸試料中の二本鎖核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と非相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、該標的塩基特異性プライマーと前述の第２のプライマーとで挟まれた領域の核酸はほとんど増幅されないため、蛍光標識された標的塩基特異性プライマーの分子量は変化せず、したがって、拡散速度はほとんど変化しない。つまり、一分子蛍光検出法により、ＰＣＲの結果得られた核酸増幅産物の拡散速度を測定することにより、標的塩基特異性プライマーの伸長の有無を調べることができ、この結果に基づいて標的塩基の塩基種を判別することができる。一分子蛍光検出法による解析方法は、特に限定されるものではなく、例えばNature Geneticsの第３８巻第３２４〜３３０ページ（２００６年）に記載の方法等、通常行われている解析方法を用いて行うことができる。なお、一分子蛍光検出法による解析方法は、一分子当たり十分な分子量の差が生じればよく、核酸増幅産物が非常に微量であっても解析可能であるため、例えば、前述の第２のプライマーを用いずに、標識された標的塩基特異性プライマーのみを用いて伸長反応を行った場合であっても、標的塩基の塩基種を判別することができる。また、異なる蛍光物質を用いて標識した複数種類の標的塩基特異性プライマーを、同一溶液内に添加し、常法に基づき、マルチプレックスＰＣＲ検出を行うこともできる。
【００５４】
また、ＰＣＲ等の核酸増幅反応により得られた核酸増幅産物は、微小ビーズの凝集に基づいて検出することもできる。微小ビーズの凝集に基づく検出方法では、第一のリガンドを用いて修飾された本発明の標的塩基特異性プライマーと、該第一のリガンドとは異なる種類の第二のリガンドを用いて修飾された前述の第２のプライマーとを用いて、核酸試料中の核酸を鋳型とし、常法によりＰＣＲを行った後、得られた増幅産物を、該第一のリガンドに特異的に結合するレセプターを結合した第一の微小ビーズと、該第二のリガンドに特異的に結合するレセプターを結合した第二の微小ビーズとを用いて検出する。核酸試料中の二本鎖核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、両末端が、それぞれ第一のリガンドと第二のリガンドにより修飾された増幅産物が得られるため、該増幅産物に第一の微小ビーズと第二の微小ビーズとを混合すると、これらの微小ビーズがこの増幅産物によって架橋された構造となり、この反応が多数生じることにより、微小ビーズは凝集する。一方で、核酸試料中の二本鎖核酸が、標的塩基特異性プライマー中の標的塩基対応塩基と非相補的な塩基種の標的塩基を有する場合には、両末端が修飾された増幅産物は得られないため、第一の微小ビーズと第二の微小ビーズとを混合しても、これらの微小ビーズは凝集しない。プライマー単独でもリガンド−レセプター反応は生じるが、架橋が生じることはなく、異なるリガンドで両末端が修飾された増幅産物が存在しなければ凝集が生じることはないためである。したがって、微小ビーズの凝集の有無を検出することにより、標的塩基の塩基種を判別することができる。微小ビーズの凝集に基づく検出方法は、特に限定されるものではなく、例えば特開２００５−９５１３４号公報に記載の方法等、通常行われている解析方法を用いて行うことができる。
【実施例】
【００５５】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５６】
［鋳型ＤＮＡ作成用プライマーの準備］
鋳型ＤＮＡはｐＵＣ１９  ＤＮＡ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社製）を基本として、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によって変異を導入した。変異導入に用いたプライマーは変異を含むフォワードプライマーと通常のリバースプライマーからなる。リバースプライマーは全てのフォワードプライマーに共通のＭｉ−Ｒを用いた。また、フォワードプライマーはミスマッチに対して３’側からの影響を調べるためのＭｉ−Ｆ−ｕＸＸ（ＸＸは塩基２種の組み合わせ）シリーズと、５’側からの影響を調べるためのＭｉ−Ｆ−ｄＸＸ（ＸＸは塩基２種の組み合わせ）シリーズの２群に大きく分けられ、それぞれのフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせによって、それぞれ異なる変異が導入されたｐＵＣ１９  ＤＮＡを作成した。これらのプライマーの詳細を表１に示す。表の配列中の下線部の塩基が変異箇所である。例えば、Ｍｉ−Ｆ−ｕＡＡとＭｉ−Ｒを用いた変異導入ＰＣＲにより、標的塩基がＡであり、ミスマッチ塩基がＡである変異体が得られた。
【００５７】
【表１】
2009247231.tif 000002
【００５８】
［メチレーション］
ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の手順に従って、別途購入したｐＵＣ１９  ＤＮＡ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社製）をメチル化した。具体的には、１．６μＬの１０×メチレーションバッファーに、１００ｎｇのｐＵＣ１９  ＤＮＡ、１．６μＬの１０×ＳＡＭ、１．０μＬのＤＮＡメチラーゼ（４Ｕ／μＬ）、適量の滅菌水をそれぞれ添加し、１６μＬの反応溶液を調製した後、３７℃で１時間インキュベートした。
【００５９】
［変異導入ＰＣＲ］
前述した変異導入用プライマーをそれぞれ用いて、同じく前述したメチル化されたｐＵＣ１９  ＤＮＡに対して、変異導入ＰＣＲを行う。基本的にはＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて行った。具体的には、５μＬの１０×Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲバッファーに、１．５μＬの１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μＬの５０ｍＭの硫酸マグネシウム、１．５μＬの１０μＭのフォワードプライマー、１．５μＬの１０μＭのリバースプライマー、１２．５ｎｇのメチル化されたＤＮＡ、０．２μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（５Ｕ／μＬ）、適量の滅菌水をそれぞれ添加し、５０μＬの反応溶液を調製した。その後、該反応溶液を、９４℃で２分間処理した後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で３分間の熱サイクルを２４サイクル行い、さらに６８℃で１０分間処理することにより、変異導入ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ装置は、旧ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（現Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）のＧｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ−２００を用いて行った。
【００６０】
［トランスフォーメーション］
前述の変異導入ＰＣＲにより得られた変異導入体を導入した。基本的にはＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の手順に従って行った。コンピテントセルは、同じく該システムのキットに貼付されているＯｎｅ−Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５α（登録商標）−Ｔ１Ｒコンピテントセルを用いた。また、ＬＢ  ａｇａｒとしては、ＬＢ培地に予めアンピシリンが含まれている、ＦａｓｔＭｅｄｉａ（登録商標）ＡＭＰ  Ｘ−ＧＡＬ（ＣＡＹＬＡ社）を用いた。具体的には、氷上で融解したＤＨ５α−Ｔ１Ｒコンピテントセルに、２μＬの前述の変異導入ＰＣＲ後の反応溶液を直接添加して、タッピングした後、氷上で１０分間インキュベートした。その後、４２℃で３０秒間、ウォーターバス上でインキュベートし、速やかに氷上で１分間放置したものに、２００μＬのＳＯＣ培地を添加した。なお、ＳＯＣ培地は、予め室温まで戻しておいた。さらに、３７℃で１時間、１２５ｒｐｍで振とうさせながらインキュベートした。このコンピテントセル含有益を、予め３７℃で３０分間インキュベートしたＬＢ  ａｇａｒに播き、３７℃で１６時間インキュベートし、コロニーを得た。
【００６１】
［大腸菌含有溶液の調製］
以下に続くＰＣＲ用の鋳型として用いるために、大腸菌含有溶液を調製し、吸光度を測定後に再度濃度調整を行った。すなわち、大腸菌より抽出精製されたプラスミドを鋳型として用いるのではなく、大腸菌そのものの希釈溶液を鋳型を含む核酸溶液として用いた。前述のトランスフォーメーションにより得られたコロニーのうち、任意に１０個のコロニーを選択して、１００μＬの滅菌ＭｉｌｌｉＱ水に希釈した。十分に希釈した後、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ社製）を用いて６０１ｎｍ、２８０ｎｍの吸光度を測定した。６０１ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の間には相関があり、２８０ｎｍの吸光度が０．０１になるように希釈して濃度調整を行った。以後、得られた調製液を、鋳型を含む核酸試料溶液として用いた。
【００６２】
［プライマーの準備］
標的塩基を判別するためのプライマーをフォワードプライマーとし、３’末端から第２塩基目に標的塩基対応塩基、第３塩基目にミスマッチ塩基を、それぞれ配置した。具体的には、フォワードプライマーは、前述のｐＵＣ１９変異導入鋳型のＭｉ−Ｆ−ｕＸＸに対応するａｓＰ−Ｆ−ｕＸＸ（ＸＸは塩基２種の組み合わせ）シリーズと、Ｍｉ−Ｆ−ｄＸＸに対応するａｓＰ−Ｆ−ｄＸＸ（ＸＸは塩基２種の組み合わせ）シリーズの２群に大きく分けられる。また、リバースプライマーは全てのフォワードプライマーに共通のａｓＰ−Ｒを用いた。それぞれのフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせによって、ＰＣＲ増幅を行った。これらのプライマーの詳細を表２に示す。表の配列中の下線部の２塩基のうち、３’側の塩基が標的塩基対応塩基、５’側の塩基がミスマッチ塩基である。
【００６３】
【表２】
2009247231.tif 000003
【００６４】
［各プライマーの特異性の評価１］
アニーリング温度の上昇にしたがって、産物量は減少するが、その減少率の多少をもって特異性や増幅効率を評価することができる。そこで、アニーリング温度を５４℃、５８℃の２条件でＰＣＲを行い、５８℃での増幅産物量と５４℃での増幅産物量の比（ｐ（５８℃）／ｐ（５４℃））を増幅産物量の変動率とし、該変動率に基づき、標的塩基がＡである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。
具体的には、３μＬの１０×ＰＣＲバッファーに、３μＬの２ｍＭのｄＮＴＰ、１．２μＬの２５ｍＭの硫酸マグネシウム、０．２μＬの４５μＭのフォワードプライマー、０．２μＬの４５μＭのリバースプライマー、５μＬの核酸試料溶液、０．６μＬのＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（１．０Ｕ／μＬ）、適量の滅菌水をそれぞれ添加し、３０μＬの反応溶液を調製した。その後、該反応溶液を、９４℃で２分間処理した後、９４℃で３０秒間、５４℃又は５８℃で３０秒間、６８℃で３０秒間の熱サイクルを３５サイクル行い、さらに６８℃で２分間処理することにより、特異性評価ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ装置は、旧ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（現Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）のＧｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ−２００を用いて行った。
各ＰＣＲにおいて用いた核酸試料溶液及びフォワードプライマーは、表３に記載した。表３中、「（変異導入プライマー対）」とは、鋳型として用いた核酸試料溶液を得るために行った変異導入ＰＣＲにおいて用いたプライマー対を示している。また、「特異性評価用プライマー対」とは、特異性評価ＰＣＲにおいて用いたプライマー対を示している。
【００６５】
【表３】
2009247231.tif 000004
【００６６】
ＰＣＲ後の反応溶液中の核酸増幅産物の量を、電気泳動法により測定した。具体的には、電気泳動測定用キットとしてＤＮＡ  １０００  ＬａｂＣｈｉｐ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を、電気泳動用装置として２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を、それぞれ用いて測定した。核酸増幅産物の定量結果は、同装置上に自動的に表示される。
得られた核酸増幅産物の定量結果から算出された５８℃での増幅産物量(ｎｇ／μＬ)と５４℃での増幅産物量(ｎｇ／μＬ)の比（ｐ（５８℃）／ｐ（５４℃））を表３に示す。表中＊が付されたプライマーは、ミスマッチ塩基のない標的核酸と完全に相補的なプライマーであり、リファレンスとして用いている。すなわち、ｐ（５８℃）／ｐ（５４℃）が、標的核酸と完全に相補的なプライマーの値以下である場合（表中♯が付されたプライマー）には、ミスマッチ導入により、標的塩基の識別能が保存されている又は向上されたと判断することができる。
表３の結果から、標的塩基がＡであり、ミスマッチ対応塩基がＴである場合には、ミスマッチ塩基としてＴ又はＧを導入したプライマーを用いることにより、ミスマッチ塩基としてＣを導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
同様に、標的塩基がＡであり、ミスマッチ対応塩基がＧである場合には、ミスマッチ塩基としてＴを導入したプライマーを用いることにより、ミスマッチ塩基としてＡ又はＧを導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
【００６７】
［各プライマーの特異性の評価２］
表４記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価１と同様にして、標的塩基がＴである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表４中の「（変異導入プライマー対）」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表３と同様である。
表４の結果から、標的塩基がＴであり、ミスマッチ対応塩基がＴである場合には、ミスマッチ塩基としてＴ又はＧを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がＴであり、ミスマッチ対応塩基がＧである場合には、ミスマッチ塩基としてＴを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がＴであり、ミスマッチ対応塩基がＣである場合には、ミスマッチ塩基としてＡを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
【００６８】
【表４】
2009247231.tif 000005
【００６９】
［各プライマーの特異性の評価３］
表５記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価１と同様にして、標的塩基がＧである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表５中の「（変異導入プライマー対）」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表３と同様である。
表５の結果から、標的塩基がＧであり、ミスマッチ対応塩基がＡである場合には、ミスマッチ塩基としてＡ又はＣを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がＧであり、ミスマッチ対応塩基がＴである場合には、ミスマッチ塩基としてＴ又はＧを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がＧであり、ミスマッチ対応塩基がＧである場合には、ミスマッチ塩基としてＴを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がＧであり、ミスマッチ対応塩基がＣである場合には、ミスマッチ塩基としてＴ又はＣを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
【００７０】
【表５】
2009247231.tif 000006
【００７１】
［各プライマーの特異性の評価４］
表６記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価１と同様にして、標的塩基がＣである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表６中の「（変異導入プライマー対）」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表３と同様である。
表６の結果から、標的塩基がＣであり、ミスマッチ対応塩基がＡである場合には、ミスマッチ塩基としてＣを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がＣであり、ミスマッチ対応塩基がＴである場合には、ミスマッチ塩基としてＴ又はＧを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がＣであり、ミスマッチ対応塩基がＧである場合には、ミスマッチ塩基としてＡを導入したプライマーを用いることにより、標的塩基がＣであり、ミスマッチ対応塩基がＣである場合には、ミスマッチ塩基としてＣを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
【００７２】
【表６】
2009247231.tif 000007
【００７３】
［各プライマーの特異性の評価５］
表７記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価１と同様にして、アンカー塩基がＡである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表７中の「（変異導入プライマー対）」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表３と同様である。
表７の結果から、アンカー塩基がＡであり、ミスマッチ対応塩基がＡである場合には、ミスマッチ塩基としてＣを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がＡであり、ミスマッチ対応塩基がＴである場合には、ミスマッチ塩基としてＧ又はＣを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がＡであり、ミスマッチ対応塩基がＣである場合には、ミスマッチ塩基としてＴを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
【００７４】
【表７】
2009247231.tif 000008
【００７５】
［各プライマーの特異性の評価６］
表８記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価１と同様にして、アンカー塩基がＴである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表８中の「（変異導入プライマー対）」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表３と同様である。
表８の結果から、アンカー塩基がＴであり、ミスマッチ対応塩基がＡである場合には、ミスマッチ塩基としてＣを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がＴであり、ミスマッチ対応塩基がＴである場合には、ミスマッチ塩基としてＧ又はＣを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がＴであり、ミスマッチ対応塩基がＣである場合には、ミスマッチ塩基としてＴを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
【００７６】
【表８】
2009247231.tif 000009
【００７７】
［各プライマーの特異性の評価７］
表９記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価１と同様にして、アンカー塩基がＧである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表９中の「（変異導入プライマー対）」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表３と同様である。
表９の結果から、アンカー塩基がＧであり、ミスマッチ対応塩基がＡである場合には、ミスマッチ塩基としてＧ又はＣを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がＧであり、ミスマッチ対応塩基がＴである場合には、ミスマッチ塩基としてＧ又はＣを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がＧであり、ミスマッチ対応塩基がＣである場合には、ミスマッチ塩基としてＡ又はＴを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
【００７８】
【表９】
2009247231.tif 000010
【００７９】
［各プライマーの特異性の評価８］
表１０記載の核酸試料溶液とプライマーを用いて、各プライマーの特異性の評価１と同様にして、アンカー塩基がＣである場合の、ミスマッチ塩基の塩基種と、それに対応する標的核酸上のミスマッチ対応塩基の塩基種との可能な組み合わせにおける各フォワードプライマーの、標的塩基への特異性及び増幅効率を評価した。なお、表１０中の「（変異導入プライマー対）」、「特異性評価用プライマー対」の記載は、表３と同様である。
表１０の結果から、アンカー塩基がＣであり、ミスマッチ対応塩基がＡである場合には、ミスマッチ塩基としてＡ、Ｇ、又はＣを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がＣであり、ミスマッチ対応塩基がＴである場合には、ミスマッチ塩基としてＣを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がＣであり、ミスマッチ対応塩基がＧである場合には、ミスマッチ塩基としてＡ、Ｔ、又はＧを導入したプライマーを用いることにより、アンカー塩基がＣであり、ミスマッチ対応塩基がＣである場合には、ミスマッチ塩基としてＡ又はＴを導入したプライマーを用いることにより、それぞれ他の塩基種を導入したプライマーを用いるよりも、高精度に標的塩基の塩基種を判別し得ることが明らかである。
【００８０】
【表１０】
2009247231.tif 000011
【００８１】
［標的塩基特異性プライマーを用いたＳＮＰ検出］
ヒトのビタミンＫエポキシド還元酵素複合体（ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｅｐｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＶＫＯＲＣ）のサブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）遺伝子の、開始コドン（ＡＴＧ）のＡを１位としたときの１１７３位の塩基における一塩基多型ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）（ＳＮＰ  ＩＤ：ｒｓ９９３４４３８）を、本発明の標的塩基特異性プライマーを用いて検出した。なお、各プライマーは、シグマアルドリッチジャパン株式会社ライフサイエンス事業部に依頼して合成されたものを使用した。
【００８２】
＜ヒトゲノム検体の遺伝子型の確認＞
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出に用いるため、表１１に示すヒトゲノム検体を、財団法人ヒューマンサイエンス振興財団が提供しているヒューマンサイエンス研究資源バンクより非連結匿名化された状態で入手した。これらのヒトゲノム検体の塩基配列を、シークエンサーを用いて読み取り、遺伝子型を確認した。確認した遺伝子型を表１１に示した。
【００８３】
【表１１】
2009247231.tif 000012
【００８４】
＜プライマーの設計＞
標的塩基をＶＫＯＲＣ１の１１７３位の塩基とし、予想される塩基種をＣ（１１７３Ｃ）又はＴ（１１７３Ｔ）として、プライマーの設計を行った。設計したプライマーは、本発明の標的塩基特異性プライマーである、１１７３Ｃを特異的に検出し得るプライマーと１１７３Ｔを特異的に検出し得るプライマー、本発明のプライマーではない１１７３Ｃを特異的に検出し得るプライマー、及びこれらのプライマーをフォワードプライマーとし、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）近隣のＶＫＯＲＣ１遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行うためのリバースプライマーであるＶＫＯＲＣ１―Ｒプライマーを設計した。なお、図２は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）近隣のＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列を示した図である。枠で囲まれた塩基Ｃが検出対象である１１７３位の塩基である。
まず、１１７３Ｃを特異的に検出するプライマーを設計した。ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列より明らかであるように、ミスマッチ対応塩基はＣであり、アンカー塩基はＴである。このため、本発明の第一の態様のプライマーでは、前記（１ｍ）より、ミスマッチ塩基はＣとなるが、本発明の第二の態様のプライマーでは、前記（２ｆ）より、ミスマッチ塩基はＴとなり、両者の塩基種は異なる。本実施例では、本発明の第二の態様のプライマーとし、ミスマッチ塩基をＴとして、ＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマーを設計した。
次に、１１７３Ｔを特異的に検出するプライマーを設計した。この場合、本発明の第一の態様のプライマーでは、前記（１ｅ）より、ミスマッチ塩基はＡとなるが、本発明の第二の態様のプライマーでは、前記（２ｆ）より、ミスマッチ塩基はＴとなり、両者の塩基種は異なる。本実施例では、本発明の第二の態様のプライマーとし、ミスマッチ塩基をＴとして、ＶＫＯＲＣ１―Ｔ（Ｔ）プライマーを設計した。
また、本発明のプライマーではない１１７３Ｃを特異的に検出し得るプライマーとして、ミスマッチ塩基をＡとした以外はＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマーと同じ塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ａ）プライマーを設計した。
さらに、これらの３種のプライマーをフォワードプライマーとした場合にリバースプライマーとして機能し得るＶＫＯＲＣ１―Ｒプライマーを設計した。
作成した４種のプライマーの塩基配列を表１２に示す。
【００８５】
【表１２】
2009247231.tif 000013
【００８６】
＜プライマーの修飾＞
まず、表１２記載の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマーと、ＶＫＯＲＣ１―Ｔ（Ｔ）プライマーを、それぞれリガンドで修飾することにより、５’末端にジゴキシゲニン(ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ：ＤＩＧ)を結合させた５’ＤＩＧ化ＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマーと、５’末端にＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）を結合させた５’ＤＮＰ化ＶＫＯＲＣ１―Ｔ（Ｔ）プライマーを作製した。
次に、表１２記載の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１―Ｒプライマーを、リガンドで修飾することにより、５’末端にＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）を結合させた５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１―Ｒプライマーを作製した。
【００８７】
＜受容体結合分散性微粒子の調製＞
ＤＩＧと特異的に結合するヤギ抗ＤＩＧ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｉｎｃ．社製）を結合させた分散性微粒子（以下、抗ＤＩＧ分散性微粒子）、ＦＩＴＣと特異的に結合するヤギ抗ＦＩＴＣ抗体（ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）を結合させた分散性微粒子（以下、抗ＦＩＴＣ分散性微粒子）、及びＤＮＰと特異的に結合するヤギ抗ＤＮＰ抗体（ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）を結合させた分散性微粒子（以下、抗ＤＮＰ分散性微粒子）を調製した。
各受容体結合分散性微粒子は、具体的には、以下のようにして調製した。まず、１ｍＬのＭＥＳ（Ｗａｋｏ社製）緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ６．１）に、水を加えて９ｍＬに調製した溶液を５０ｍＬ容チューブに入れ、１ｍＬの１０％ＣＭ−ＭＰ（３００ｎｍカルボキシタイプラテックス粒子、Ｃｅｒａｄｙｎ社製）スラリーを加えた後、８ｍＬの１ｍｇ／ｍＬの各抗体リン酸緩衝溶液を加えた。該５０ｍＬ容チューブを、ボルテックスミキサー（ＶＯＲＴＥＸＧＥＮＩＥ２、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）の中間回転強度にて５秒間混合した後、さらに１ｍＬの１．１５２ｇ／ＬのＥＤＡＣ（ＭＷ＝１９１．７、Ｓｉｇｍａ社製）ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．１）を加え、直ちにボルテックスミキサーの中間回転強度にて５秒間混合した。その後、該５０ｍＬ容チューブを、ローテーター（ＭＴＲ−１０３、アズワン社製）にセットし、室温で１時間混合したものを、４℃、１５，０００ｘｇで５分間遠心し、遠心分離したＣＭ−ＭＰが上清側に舞い上がることを防止するために、最低減速条件で遠心を停止させた。上清を除去した後、１０ｍＬのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．１）を加え、室温で、ソニケーター（ＶＣ−１３０、Ｓｏｎｉｃｓ社製）の３０ａｍｐｌｉｔｕｄｅの強度で３〜４秒間超音波処理を行うことにより、ＣＭ−ＭＰの塊を分散させた。再度同様に、該５０ｍＬ容チューブを遠心後、１０ｍＬのＭＥＳ緩衝液を加え、ＣＭ−ＭＰの塊を分散させた。その後、４℃で１６時間静置後、目視にて沈渣が無いことを確認した。このようにして得たＭＥＳ緩衝液中に分散したＣＭ−ＭＰを、１％の受容体結合分散性微粒子スラリーとした。
【００８８】
＜ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出１＞
５’ＤＩＧ化ＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマー、５’ＤＮＰ化ＶＫＯＲＣ１―Ｔ（Ｔ）プライマー、及び５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１―Ｒプライマーを用いて、３種類のヒトゲノム検体（ＰＳＣＤＡ０２０６、０１８２、０００９）のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出した。
まず、２９．７μＬのｍｉｌｌｉＱ水に、６μＬの１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）、６μＬのｄＮＴＰ（２ｍＭ）、２．４μＬの硫酸マグネシウム（２５ｍＭ）、１０μＬのヒトゲノム検体（２０ｎｇ／μＬ）、１．７μＬの５’ＤＩＧ化ＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマー、１．８μＬの５’ＤＮＰ化ＶＫＯＲＣ１―Ｔ（Ｔ）プライマー、１．２μＬの５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１―Ｒプライマー、及び１．２μＬのＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を加え、反応溶液を調製した。該反応溶液を、９４℃で５分間の変性工程、次に９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間を３５サイクルの増幅工程、６８℃で２分間の伸長工程、からなる反応条件によりＰＣＲを行った。ヒトゲノム検体に代えて、等量のｍｉｌｌｉＱ水を用いたものを、ネガティブコントロールとした。
その後、受容体結合分散性微粒子を用いた免疫比濁法により、ＰＣＲ増幅の有無を調べた。まず、各ＰＣＲ済反応溶液中の、５’ＤＩＧ化ＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマーによるＰＣＲ増幅の有無を調べた。各２μＬのＰＣＲ済反応溶液に、それぞれ１μＬの１％抗ＤＩＧ分散性微粒子スラリーと、１μＬの１％抗ＦＩＴＣ分散性微粒子スラリーを加え、ボルテックスミキサーを用いて混合した後、室温で５分間放置した。分光高度計（ＳＰＥＣＴＲＡ ｍａｘ ＰＬＵＳ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて、該ＰＣＲ済反応溶液の分散性微粒子添加前と凝集塊生成後の、それぞれの８００ｎｍの吸光度（Ａ８００）を測定し、分散性微粒子の添加による該ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化を測定した。
次に、各ＰＣＲ済反応溶液中の、５’ＤＮＰ化ＶＫＯＲＣ１―Ｔ（Ｔ）プライマーによるＰＣＲ増幅の有無を調べるため、各２μＬの該ＰＣＲ済反応溶液に、それぞれ１μＬの１％抗ＤＮＰ分散性微粒子スラリーと、１μＬの１％抗ＦＩＴＣ分散性微粒子スラリーを加え、同様にして、分散性微粒子の添加による該ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化を測定した。
【００８９】
図３は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＤＩＧ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。●はＰＳＣＤＡ０１８２の結果を、○はＰＳＣＤＡ０２０６の結果を、▲はＰＳＣＤＡ０００９の結果を、×はネガティブコントロールの結果を、それぞれ示している。
３種全てのヒトゲノム検体において、抗ＤＮＰ分散性微粒子を加えた場合にＡ８００が大きくなった。一方、抗ＤＩＧ分散性微粒子を加えた場合には、ＰＳＣＤＡ０１８２ではＡ８００が大きくなっていたが、他の２種のヒトゲノム検体ではＡ８００はあまり変化しなかった。さらに、ネガティブコントロールでは、いずれの場合でもＡ８００の変化はほとんど観察されなかった。すなわち、５’ＤＮＰ化ＶＫＯＲＣ１―Ｔ（Ｔ）プライマーによるＰＣＲ増幅は、３種全てのヒトゲノム検体においてなされたが、５’ＤＩＧ化ＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマーによるＰＣＲ増幅は、ＰＳＣＤＡ０１８２においてのみなされたことが分かった。つまり、ＰＳＣＤＡ０１８２はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ／Ｔ）、ＰＳＣＤＡ０２０６及び０００９はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ／Ｔ）であるという結果が得られた。該結果は、シークエンス解析による多型判定の結果と一致しており、本発明の標的塩基特異性プライマーであるＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマー、ＶＫＯＲＣ１―Ｔ（Ｔ）プライマーを用いることにより、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出できることが明らかである。
【００９０】
＜ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出２＞
フォワードプライマーとして表１２記載の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマー又はＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ａ）プライマーを、リバースプライマーとしてＶＫＯＲＣ１―Ｒプライマーを、鋳型として２種類のヒトゲノム検体（ＰＳＣＤＡ０２１０及び０５３２）を、それぞれ用いてＰＣＲを行った。
具体的には、まず、３１μＬのｍｉｌｌｉＱ水に、６μＬの５×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製）、５μＬのｄＮＴＰ（２ｍＭ）、２μＬの硫酸マグネシウム（２５ｍＭ）、１μＬのヒトゲノム検体（２０ｎｇ／μＬ）、２．５μＬのフォワードプライマー、２．５μＬのリバースプライマー、及び１μＬのＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を加え、反応溶液を調製した。該反応溶液を、＜ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出１＞と同じ反応条件でＰＣＲを行った。アガロース電気泳動により、得られたＰＣＲ産物を分離した後、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００  ＢＩＯＡＮＡＬＹＺＥＲ（ＤＮＡ１０００ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いてバンドパターンを確認した。
【００９１】
得られたバンドパターンを図４に示す。（ａ）はＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマーとＰＳＣＤＡ０２１０を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンであり、（ｂ）はＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマーとＰＳＣＤＡ０５３２を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンであり、（ｃ）はＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ａ）プライマーとＰＳＣＤＡ０２１０を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンであり、（ｄ）はＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ａ）プライマーとＰＳＣＤＡ０５３２を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンである。矢印アがＰＣＲ産物のバンドであり、矢印イとウはマーカーのバンドである。（ａ）、（ｃ）、及び（ｄ）において、ＰＣＲ産物のバンドが検出された。
シークエンス解析の結果から、ＰＳＣＤＡ０２１０はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ／Ｔ）であり、ＰＳＣＤＡ０５３２はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ／Ｔ）であった。実際に、ＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマーにより、ＰＳＣＤＡ０２１０ではＰＣＲ産物が検出されたが、ＰＳＣＤＡ０５３２では検出されなかった。一方、ＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ａ）プライマーにより、ＰＳＣＤＡ０２１０とＰＳＣＤＡ０５３２の両方でＰＣＲ産物が検出された。つまり、ＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ａ）プライマーでは、ミス伸長による非特異的なＰＣＲ増幅が起こっていた。
この結果から、プライマーのミスマッチ塩基の塩基種を、前記（１ａ）〜（１ｍ）や前記（２ａ）〜（２ｍ）により選択する、本発明の標的塩基特異性プライマーは、非常に特異性に優れていることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の標的塩基特異性プライマーを用いることにより、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確に標的塩基の塩基種を判別することが可能であるため、ＳＮＰ解析等の、一塩基の相違を高精度に判別することが要求されるような遺伝子解析医療機関等における遺伝子解析等の分野において利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明の第一又は第二の態様である標的塩基特異性プライマーと、標的核酸とのハイブリダイズの形態を示した図である。図１（ａ）は、標的塩基特異性プライマーと、標的塩基の塩基種が、該標的塩基特異性プライマーが特異的に識別する塩基である標的核酸とのハイブリダイズの形態を示した図であり、図１（ｂ）は、標的塩基特異性プライマーと、標的塩基の塩基種が、該標的塩基特異性プライマーが特異的に識別する塩基以外の塩基である標的核酸とのハイブリダイズの形態を示した図である。
【図２】ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）近隣のＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列を示した図である。枠で囲まれた塩基Ｃが検出対象である１１７３位の塩基である。
【図３】＜ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出１＞において、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＤＩＧ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。●はＰＳＣＤＡ０１８２の結果を、○はＰＳＣＤＡ０２０６の結果を、▲はＰＳＣＤＡ０００９の結果を、×はネガティブコントロールの結果を、それぞれ示している。
【図４】＜ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出２＞において、得られたバンドパターンを示した図である。（ａ）はＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマーとＰＳＣＤＡ０２１０を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンであり、（ｂ）はＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ｔ）プライマーとＰＳＣＤＡ０５３２を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンであり、（ｃ）はＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ａ）プライマーとＰＳＣＤＡ０２１０を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンであり、（ｄ）はＶＫＯＲＣ１―Ｃ（Ａ）プライマーとＰＳＣＤＡ０５３２を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンである。矢印アがＰＣＲ産物のバンドであり、矢印イとウはマーカーのバンドである。
【符号の説明】
【００９４】
１…標的塩基特異性プライマー、２…標的核酸。
【図１】
2009247231.tif 000014
【図２】
2009247231.tif 000015
【図３】
2009247231.tif 000016
【図４】
2009247231.tif 000017
【配列表】
2009247231000001.app