(57)【要約】【課題】細胞懸濁液内から不要細胞を除外して必要な細胞を高濃度で培養する。【解決手段】細胞懸濁液Ａを貯留する培養容器２と、該培養容器２に接続され、該培養容器２内に貯留されている細胞懸濁液Ａを循環させる循環流路３と、該循環流路３の途中位置に設けられ、循環流路３内に高周波不平等電界を形成して、誘電泳動力により培養に不要な細胞を吸着する電極７を有する不要細胞吸着部５とを備える細胞培養装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液を貯留する培養容器と、
該培養容器に接続され、該培養容器内に貯留されている細胞懸濁液を循環させる循環流路と、
該循環流路の途中位置に設けられ、循環流路内に高周波不平等電界を形成して、誘電泳動力により培養に不要な細胞を吸着する電極を有する不要細胞吸着部とを備える細胞培養装置。
【請求項２】
前記細胞懸濁液が、接着性の細胞と浮遊性の細胞とを含み、
前記不要細胞吸着部が、浮遊性の細胞を電極に吸着する請求項１に記載の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、骨髄液中の間葉系幹細胞等の接着細胞を濃縮・分離してから培養する方法としては、採取した骨髄液を遠心した後に、その上澄み液を除去し、残った沈殿部分のみを播種する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
この方法においては、播種の際に間葉系幹細胞が均一になるように、前記沈殿部分を一旦容器に取ってから培養容器に播種する。こうして播種された間葉系幹細胞は、培養容器中で培養される。骨髄液中の間葉系幹細胞は、培養容器の底面に付着して増殖する性質を有している。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−４９１４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記の方法を採用した場合、沈殿部分には間葉系幹細胞が濃縮されるほかに、骨髄液中の赤血球も大量に集められる。このため、播種した際に培養容器中に赤血球が大量に散在することになる。赤血球は浮遊細胞であるが、静置された培養容器中で沈降し、培養容器の底一面を覆うため、間葉系幹細胞が培養容器の底に接着するのを阻害する。
【０００５】
従って、骨髄播種後、間葉系幹細胞を回収できるまでの初代培養期間は早くても１０日、遅い場合は約２週間かかっていた。このため、より短期間で効率よく間葉系幹細胞を培養・回収できるようにするために、赤血球等の浮遊細胞を除去して、より高濃度の間葉系幹細胞液を培養する培養装置が望まれていた。
【０００６】
この発明は上述した事情に鑑みてなされてものであって、細胞懸濁液内から不要細胞を除外して必要な細胞を高濃度で培養することができる細胞培養装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、細胞懸濁液を貯留する培養容器と、該培養容器に接続され、該培養容器内に貯留されている細胞懸濁液を循環させる循環流路と、該循環流路の途中位置に設けられ、循環流路内に高周波不平等電界を形成して、誘電泳動力により培養に不要な細胞を吸着する電極を有する不要細胞吸着部とを備える細胞培養装置を提供する。
【０００８】
本発明によれば、培養容器内に貯留されている細胞懸濁液が循環流路内を循環させられる際に、循環流路の途中位置に設けられた電極によって循環流路内に形成されている高周波不平等電界中を通過させられる。細胞懸濁液内の細胞は、その種類に基づいて異なる誘電泳動特性を有しているので、高周波不平等電界の作用により異なる誘電泳動力を受ける。
【０００９】
このことを利用して、細胞懸濁液中に存在する不要な細胞は、誘電泳動力により不要細胞吸着部の電極に吸着され、必要な細胞は電極に吸着されることなく循環流路を循環させられて培養容器に戻るようにすることができる。
発明者らは、研究の結果、電極に吸着された細胞が死滅することを発見した。したがって、循環流路を循環させられる間に電極に接着した細胞を死滅させることにより、培養容器内に存在する不要な細胞の濃度を低下させることができ、必要な細胞を高濃度で培養することが可能となる。
【００１０】
上記発明においては、前記細胞懸濁液が、接着性の細胞と浮遊性の細胞とを含み、前記不要細胞吸着部が、浮遊性の細胞を電極に吸着することとしてもよい。
このようにすることで、培養容器内の浮遊性の細胞の濃度を低減し、接着性の細胞の濃度を増大させて、培養容器の底面等の接着面を浮遊性の細胞に占有されることを防止して、接着性の細胞を効率よく培養することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、細胞懸濁液内から不要細胞を除外して必要な細胞を高濃度で培養することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の一実施形態に係る細胞培養装置１について、図１〜図６を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る細胞培養装置１は、図１に示されるように、例えば、骨髄液を培地に混合して得られた細胞懸濁液Ａを貯留する培養容器２と、該培養容器２に接続された循環流路３と、該循環流路３に設けられ、循環流路３内の細胞懸濁液Ａを流動させるポンプ４と、循環流路３の途中位置に配置され、細胞懸濁液Ａ内の浮遊性の細胞を吸着し、接着性の細胞を通過させる誘電フィルタ５とを備えている。
【００１３】
循環流路は、培養容器２から流出させた細胞懸濁液Ａを培養容器２の外部で循環させて培養容器２内に戻すように環状に形成されている。
誘電フィルタ５は、フィルタ容器６と、該フィルタ容器６内を２つの領域６ａ，６ｂに区画するように配置される電極７と、該電極７に高周波電圧を加える電圧供給部８と、培養容器２側から流れてくる細胞懸濁液Ａを一方の領域６ａに流入させる流入口６ｃと、該一方の領域６ａを通過した細胞懸濁液Ａをフィルタ容器６外に流出させる第１の流出口６ｄと、前記一方の領域６ａから電極７を通過して他方の領域６ｂに流入した細胞懸濁液Ａをフィルタ容器６外に流出させる第２の流出口６ｅとを備えている。
【００１４】
また、第２の流出口６ｅには該第２の流出口６ｅから流出する細胞懸濁液Ａの流量を調節するバルブ９が設けられている。
第１，第２の流出口６ｄ，６ｅに接続する配管１０，１１は、前記ポンプ４に接続する前に合流されている。これにより、ポンプ４による吸引力によって、細胞懸濁液Ａは第１、第２の流出口６ｄ，６ｅの両方からそれぞれ吸引されて循環流路３内を流通させられるようになっている。
【００１５】
電極７は、例えば、図２に示されるように、複数の直棒状電極部７ａ，７ｂを平行に間隔をあけて配列してなる２つの櫛歯状電極７Ａ，７Ｂを、各櫛歯状電極７Ａ，６７の直棒状電極部７ａ，７ｂが交互に配置されるように配置することにより構成されている。
【００１６】
このような櫛歯状電極７Ａ，７Ｂに高周波電圧を加えると、図３に示されるように、電界強度の勾配を有する高周波不平等電界Ｅが発生するようになっている。図３は電界強度を等高線により示しており、電界強度は、直棒状電極部７ａ，７ｂに近いほど強く、離れる程弱くなっている。
【００１７】
このように構成された本実施形態に係る細胞培養装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る細胞培養装置１によれば、細胞懸濁液Ａを培養容器２内に貯留した状態で、ポンプ４を作動させることにより、培養容器２内の細胞懸濁液Ａが循環流路３内に吸引されて循環させられる。そして、電圧供給部８の作動により、フィルタ容器６内の櫛歯状電極７Ａ，７Ｂに高周波電圧を加えることによって、直棒状電極部７ａ，７ｂの周囲に高周波不平等電界Ｅを発生させる。これにより、細胞懸濁液Ａ内に含まれている各細胞が高周波不平等電界Ｅ中を流動させられる際に、各細胞の誘電泳動特性に応じた誘電泳動力を受ける。
【００１８】
この場合に、細胞懸濁液Ａ中の不要な浮遊性の細胞、例えば、血球系の細胞が正の誘電泳動特性を有し、必要な接着性の細胞、例えば、間葉系幹細胞等の非血球系の細胞が負の誘電泳動特性を有するような周波数の高周波不平等電界Ｅに調節しておくことにより、循環経路３を流動してきた細胞懸濁液Ａがフィルタ容器６内に流入すると、血球系の細胞は、高周波不平等電界Ｅの電界強度が高くなる方向、すなわち、直棒状電極部７ａ，７ｂに向かう方向に引き寄せられて、あるものは直棒状電極部７ａ，７ｂに接触し、あるものは直棒状電極部７ａ，７ｂ間の隙間を通過して第２の流出口６ｅからフィルタ容器６外に流出する。一方、細胞懸濁液Ａ中に含まれる非血球系の細胞は、直棒状電極部７ａ，７ｂから離れる方向に移動して直棒状電極部７ａ，７ｂに接触することなく、第１の流出口６ｄからフィルタ容器６外に流出する。
【００１９】
血球系の細胞が櫛歯状電極７Ａ，７Ｂに捉えられることなく透過するためには、櫛歯状電極７Ａ，７Ｂ近傍に引き留めようとする誘電泳動力より細胞懸濁液Ａの流れにより受ける力を大きくしておく必要があり、バルブ９の開度を適宜調節することで、この条件を設定することができる。
【００２０】
図４および図５に、８０ｋＨｚ２０Ｖｐｐと４０Ｖｐｐの高周波電圧を加えた誘電フィルタ５に流入して、電極７を透過した透過液内の細胞、電極７を透過することなくフィルタ容器６から流出した保持液内の細胞および直棒状電極部７ａ，７ｂに接触した細胞（いずれも細胞は３−２Ｈ３）を５×１０５cells／ｍLの細胞密度で、８．５重量％濃度のスクロース＋０．３重量％濃度のグルコース溶液内で培養したときの培養１日目と２日目の比増殖速度を示す。
【００２１】
また、誘電フィルタ５を通過させない細胞３−２Ｈ３の通常濃度（５×１０５cells／ｍL）での培養時の比増殖速度および低濃度（４×１０４cells／ｍL）での培養時の比増殖速度を図６に示す。通常の濃度での培養時には、図５の透過液および保持液内の細胞と同様に１日目の比増殖速度が２日目の比増殖速度より高いことがわかる。一方、低濃度での培養時には、図５のフィルタに接触した細胞と同様の比増殖速度の変化が示されている。
【００２２】
この図５から、発明者らは、研究の結果、電極７に吸着された細胞が、電極７に接触することなく透過あるいは保持された細胞と比較して培養１日目の比増殖速度が著しく低くなることを発見した。特に、電極７に加える高周波電圧の電圧値が高い４０Ｖｐｐの方が２０Ｖｐｐよりも培養１日目の比増殖速度が著しく低くなることを発見した。
【００２３】
また、電極７に接触させることなく低濃度で培養した場合においては、培養１日目で１．５程度の比増殖速度を示しているのに対し、電極７に接触した細胞は、培養１日目で０．５〜０．９の比増殖速度しか示していないことがわかる。この結果、電極７に接触した細胞は、その電圧が高い程、ダメージを受けて死滅あるいは活性が低下することがわかった。
【００２４】
本実施形態に係る細胞培養装置１は、この現象を利用して、誘電フィルタ５内に流入した細胞の誘電泳動特性の差に基づいて不要な血球系の細胞を電極７に接触させ、必要な非血球系の細胞を電極７に接触させることなくフィルタ容器６内から流出させて、循環経路３を介して培養容器２内に戻す。この動作を繰り返すことにより、血球系の細胞については電極７に接触させてダメージを与え、死滅あるいは活性を低下させる一方、非血球系の細胞についてはダメージを与えることなく培養容器２に戻すことができる。そして、これにより、培養容器２内の不要な血球系の浮遊性の細胞の濃度を下げ、必要な非血球系の接着性の細胞の濃度を増大させて、純度の高い接着性の細胞群が得られるように培養することができるという利点がある。
【００２５】
なお、接着性の細胞を十分に増殖させるためには、該細胞を培養容器２の底面等に接着させる必要があるため、循環流路３を循環させて不要な細胞を死滅あるいは活性を低下させる工程と、ポンプ４を停止して循環を停止し、細胞を沈降させて培養容器２の底面に接着させる工程とを繰り返し行うことが有効である。所定時間、例えば、１日静置することにより、接着性の細胞は培養容器２の底面に接着するが、一旦沈降した浮遊性の細胞はポンプ４の作動により再度舞い上がって循環流路３に流入する。
したがって、その後の循環動作においては、接着性の細胞の多くを循環させずに済み、浮遊性の細胞のみについて誘電フィルタ５による活性の低下処理を繰り返すことができる。
【００２６】
なお、本実施形態においては、骨髄液を培地に混合して得られた細胞懸濁液Ａについて、必要な接着性の細胞の高純度に増殖させる場合について説明したが、細胞ソースは骨髄液に限定されるものではなく、臍帯血、末梢血、脂肪組織等の生体組織を分解して得られた細胞懸濁液Ａ等の他の任意の細胞ソースを使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞培養装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の細胞培養装置の誘電フィルタ内の電極の一例を示す図である。
【図３】図２の電極の周囲に形成される高周波不平等電界を等高線により示す図である。
【図４】図１の細胞培養装置において、２０Ｖｐｐの高周波電圧を加えた誘電フィルタ内の電極を透過した透過液および電極を透過しない保持液内の細胞、および電極に接触した細胞の培養１日目と培養２日目の比増殖速度を示すグラフである。
【図５】図１の細胞培養装置において、４０Ｖｐｐの高周波電圧を加えた誘電フィルタ内の電極を透過した透過液および電極を透過しない保持液内の細胞、および電極に接触した細胞の培養１日目と培養２日目の比増殖速度を示すグラフである。
【図６】誘電フィルタを使用することなく培養した通常濃度の細胞および低濃度の細胞の培養１日目と培養２日目の比増殖速度を示すグラフである。
【符号の説明】
【００２８】
Ａ  細胞懸濁液
Ｅ  高周波不平等電界
１  細胞培養装置
２  培養容器
３  循環流路
５  誘電フィルタ（不要細胞吸着部）
７  電極
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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