(57)【要約】【課題】ワルファリン代謝能の個人差予測に有効な一塩基多型であるＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）及びＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するためのプライマーの提供。【解決手段】ヒトＶＫＯＲＣ１遺伝子の、開始コドン（ＡＴＧ）のＡを１位としたときの１１７３位の塩基におけるＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するためのプライマーであって、３’末端の塩基がＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７２位の塩基Ｃと相補的な塩基Ｇであり、３’末端から２番目の塩基がＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７３位の塩基に対応する塩基であり、３’末端から３番目の塩基がＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７４位の塩基Ｃと非相補的な塩基ＴであるＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマー、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマー、及びＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのビタミンＫエポキシド還元酵素複合体（ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｅｐｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＶＫＯＲＣ）のサブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）遺伝子の、開始コドン（ＡＴＧ）のＡを１位としたときの１１７３位の塩基における一塩基多型ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するためのプライマーであって、
３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７２位の塩基Ｃと相補的な塩基Ｇであり、
３’末端から２番目の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７３位の塩基に対応する塩基Ｇであり、
３’末端から３番目の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７４位の塩基Ｃと非相補的な塩基Ｔであること、
を特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー。
【請求項２】
プライマーの塩基長が１６〜３５ｍｅｒであることを特徴とする、請求項１記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列を有するプライマーであることを特徴とする、請求項１又は２記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー。
【請求項４】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子の、開始コドン（ＡＴＧ）のＡを１位としたときの１１７３位の塩基における一塩基多型ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するためのプライマーであって、
３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７２位の塩基Ｃと相補的な塩基Ｇであり、
３’末端から２番目の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７３位の塩基に対応する塩基Ａであり、
３’末端から３番目の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７４位の塩基Ｃと非相補的な塩基Ｔであること、
を特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマー。
【請求項５】
プライマーの塩基長が１８〜２７ｍｅｒであることを特徴とする、請求項４記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマー。
【請求項６】
配列番号２の塩基配列を有するプライマーであることを特徴とする、請求項４又は５記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマー。
【請求項７】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）増幅して検出するために用いられるプライマーであって、
請求項１〜３に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー又は請求項４〜６に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１３０位の塩基Ｔと相同的な塩基Ｔであることを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項８】
プライマーの塩基長が１７〜２９ｍｅｒであることを特徴とする、請求項７記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項９】
配列番号３の塩基配列を有するプライマーであることを特徴とする、請求項７又は８記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項１０】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ増幅して検出するために用いられるプライマーであって、
請求項１〜３に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー又は請求項４〜６に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０７０位の塩基Ｇと相同的な塩基Ｇであることを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項１１】
プライマーの塩基長が１２〜２６ｍｅｒであることを特徴とする、請求項１０記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項１２】
配列番号４の塩基配列を有するプライマーであることを特徴とする、請求項１０又は１１記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項１３】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ増幅して検出するために用いられるプライマーであって、
請求項１〜３に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー又は請求項４〜６に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０６８位の塩基Ａと相同的な塩基Ａであることを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項１４】
プライマーの塩基長が１４〜３２ｍｅｒであることを特徴とする、請求項１３記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項１５】
配列番号５の塩基配列を有するプライマーであることを特徴とする、請求項１３又は１４記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項１６】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ増幅して検出するために用いられるプライマーであって、
請求項１〜３に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー又は請求項４〜６に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０６２位の塩基Ｇと相同的な塩基Ｇであることを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項１７】
プライマーの塩基長が１９〜４１ｍｅｒであることを特徴とする、請求項１６記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項１８】
配列番号６の塩基配列を有するプライマーであることを特徴とする、請求項１６又は１７記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項１９】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ増幅して検出するために用いられるプライマーであって、
請求項１〜３に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー又は請求項４〜６に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０６１位の塩基Ａと相同的な塩基Ａであることを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項２０】
プライマーの塩基長が１８〜４１ｍｅｒであることを特徴とする、請求項１９記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項２１】
配列番号７の塩基配列を有するプライマーであることを特徴とする、請求項１９又は２０記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項２２】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ増幅して検出するために用いられるプライマーであって、
請求項１〜３に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー又は請求項４〜６に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０６０位の塩基Ｃと相同的な塩基Ｃであることを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項２３】
プライマーの塩基長が１８〜４３ｍｅｒであることを特徴とする、請求項２２記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項２４】
配列番号８の塩基配列を有するプライマーであることを特徴とする、請求項２２又は２３記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマー。
【請求項２５】
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するためのプライマーセットであって、
請求項１〜３に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー及び請求項４〜６に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
請求項７〜２４に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
を有することを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセット。
【請求項２６】
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するためのプライマーセットであって、
請求項１〜３に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー及び請求項４〜６に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
請求項１０〜２４に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
を有することを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセット。
【請求項２７】
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するためのプライマーセットであって、
請求項１〜３に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
請求項４〜６に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
請求項７〜２４に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
を有することを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセット。
【請求項２８】
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するためのプライマーセットであって、
請求項１〜３に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
請求項４〜６に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
請求項１０〜２４に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
を有することを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセット。
【請求項２９】
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するための多型検出方法であって、
請求項１〜３に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー及び請求項４〜６に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーを用いてＰＣＲ増幅をすることを特徴とする、多型検出方法。
【請求項３０】
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するための多型検出方法であって、
請求項３記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー及び／又は請求項６記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーと、
請求項９、１２、１５、１８、２１、及び２４に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと
を、１の反応溶液に同時に用いてＰＣＲ増幅をすることを特徴とする、多型検出方法。
【請求項３１】
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するための多型検出方法であって、
請求項２５〜２８のいずれか記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅をすることを特徴とする、多型検出方法。
【請求項３２】
ヒトの肝チトクロームＰ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０：ＣＹＰ）２Ｃ９遺伝子の、開始コドン（ＡＴＧ）のＡを１位としたときの１０７５位の塩基における一塩基多型ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するためのプライマーであって、
３’末端の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７６位の塩基Ｔと相同的な塩基Ｔであり、
３’末端から２番目の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７５位の塩基に対応する塩基Ａであり、
３’末端から３番目の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７４位の塩基Ｃと非相同的な塩基Ａであること、
を特徴とする、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー。
【請求項３３】
プライマーの塩基長が１８〜２８ｍｅｒであることを特徴とする、請求項３２記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー。
【請求項３４】
配列番号９の塩基配列を有するプライマーであることを特徴とする、請求項３２又は３３記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー。
【請求項３５】
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の、開始コドン（ＡＴＧ）のＡを１位としたときの１０７５位の塩基における一塩基多型ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するためのプライマーであって、
３’末端の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７６位の塩基Ｔと相同的な塩基Ｔであり、
３’末端から２番目の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７５位の塩基に対応する塩基Ｃであり、
３’末端から３番目の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７４位の塩基Ｃと非相同的な塩基Ａであること、
を特徴とする、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマー。
【請求項３６】
プライマーの塩基長が１８〜２８ｍｅｒであることを特徴とする、請求項３５記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマー。
【請求項３７】
配列番号１０の塩基配列を有するプライマーであることを特徴とする、請求項３５又は３６記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマー。
【請求項３８】
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ増幅して検出するために用いられるプライマーであって、
請求項３２〜３４に記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー又は請求項３５〜３７に記載のＣＹＰ２Ｃ９（１１７３Ｃ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１１０７位の塩基Ａと相補的な塩基Ｔであることを特徴とする、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマー。
【請求項３９】
プライマーの塩基長が１８〜４０ｍｅｒであることを特徴とする、請求項３８記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマー。
【請求項４０】
配列番号１１の塩基配列を有するプライマーであることを特徴とする、請求項３８又は３９記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマー。
【請求項４１】
ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するためのプライマーセットであって、
請求項３２〜３４に記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー及び請求項３５〜３７に記載のＣＹＰ２Ｃ９（１１７３Ｃ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
請求項３８〜４０に記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
を有することを特徴とする、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の多型検出用プライマーセット。
【請求項４２】
ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するためのプライマーセットであって、
請求項３２〜３４に記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
請求項３５〜３７に記載のＣＹＰ２Ｃ９（１１７３Ｃ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
請求項３８〜４０に記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
を有することを特徴とする、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の多型検出用プライマーセット。
【請求項４３】
ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するための多型検出方法であって、
請求項３２〜３４に記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー及び請求項３５〜３７に記載のＣＹＰ２Ｃ９（１１７３Ｃ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーを用いてＰＣＲ増幅をすることを特徴とする、多型検出方法。
【請求項４４】
ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するための多型検出方法であって、
請求項３４記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー及び／又は請求項３７記載のＣＹＰ２Ｃ９（１１７３Ｃ）フォワードプライマーと、
請求項４０記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーと
を、１の反応溶液に同時に用いてＰＣＲ増幅をすることを特徴とする、多型検出方法。
【請求項４５】
ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するための多型検出方法であって、
請求項４１又は４２記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の多型検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅をすることを特徴とする、多型検出方法。
【請求項４６】
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するための多型検出方法であって、
請求項２６記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセット又は請求項２８記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセットと、
請求項４１記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の多型検出用プライマーセット又は請求項４２記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の多型検出用プライマーセットと
を、１の反応溶液に同時に用いて、ＰＣＲ増幅を行うことを特徴とする、多型検出方法。
【請求項４７】
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するための多型検出方法であって、
請求項３記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー及び／又は請求項６記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーと、
請求項１２、１５、１８、２１、及び２４に記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、
請求項３４記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー及び／又は請求項３７記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーと、
請求項４０記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーと
を、１の反応溶液に同時に用いてＰＣＲ増幅をすることを特徴とする、多型検出方法。
【請求項４８】
電気泳動法、クロマトグラフィー法、質量分析法、ＦＣＳ（蛍光自己相関関数、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）解析法、及び免疫比濁法からなる群より選ばれる１以上の方法を用いることを特徴とする、請求項２９〜３１、４３〜４７のいずれかに記載の多型検出方法。
【請求項４９】
リガンドを用いて修飾された少なくとも１のプライマーを用いることを特徴とする、請求項２９〜３１、４３〜４８のいずれかに記載の多型検出方法。
【請求項５０】
前記リガンドが、光学的に区別可能なリガンドであることを特徴とする、請求項４９記載の多型検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワルファリンカリウム代謝能の個人差の一因である遺伝子多型を検出するためのプライマー、及び該プライマーを用いた多型検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワルファリンカリウム（以下、ワルファリンと略記する。）は、国際的にも最も広く使用されている経口抗凝固薬である。しかし、ワルファリン代謝能は非常に個人差が大きく、適正な治療域ＩＮＲ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｒａｔｉｏ、国際標準比）を得るために必要とされるワルファリン投与量は０．５〜７．０ｍｇ／日と、患者間で１０倍以上もの差がある。各患者における有効でかつ安全なワルファリン投与量を迅速に設定することは、臨床上非常に重要であり、ワルファリン代謝能の個人差を解明するために、ワルファリンの薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ：ＰＫ）や薬力学（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ：ＰＤ）における個人差要因の研究が精力的に行われている。
【０００３】
現在では、ワルファリン代謝能の個人差には、遺伝子変異が大きく影響しており、特に、ＰＫにおける個人差要因として肝薬物代謝酵素チトクロームＰ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０：ＣＹＰ）２Ｃ９分子種の遺伝子変異が、ＰＤにおける個人差要因としてビタミンＫエポキシド還元酵素複合体（ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｅｐｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＶＫＯＲＣ）のサブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）の遺伝子変異が、それぞれ大きく影響していることが明らかにされてきている。
【０００４】
ＣＹＰ２Ｃ９には、多くの一塩基多型が報告されているが、ワルファリン代謝能には、特に、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）のＡを１位としたときの１０７５位の塩基における一塩基多型ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）（ＳＮＰ  ＩＤ：ｒｓ１０５７９１０）が大きく影響していることがわかっている。ここで、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）とは、野生型アレルではＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７５位の塩基はＡ（アデニン）であるが、変異型アレルではＣ（シトシン）であることを意味する。
ＣＹＰ２Ｃ９変異型アレルの出現頻度には人種差が認められ、白人では７％と比較的変異型アレルの頻度が高いが、アフリカ系アメリカ人では１．５％、アジア人（日本人を含む）では１．８％であり、変異型アレルの頻度が非常に低い。ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出することが、ワルファリン代謝能の個人差を特定するために重要であると考えられるが、変異型アレルの検出頻度が非常に低い場合には、該変異型アレルの検出は臨床上あまり効果は期待できない。このため、アジア人に対するワルファリン応答性検査としてＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出のみを単独で行うことは、費用対効果の観点から好ましくない（例えば、非特許文献１及び２参照。）。
【０００５】
一方で、ワルファリンの標的分子であるＶＫＯＲＣのサブユニットであるＶＫＯＲＣ１遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）のＡを１位としたときの１１７３位の塩基における一塩基多型ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）（ＳＮＰ  ＩＤ：ｒｓ９９３４４３８）が大きく影響していることが、２００４年頃から報告されてきている（例えば、非特許文献３参照。）。ここで、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とは、野生型アレルではＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７３位の塩基はＣであるが、変異型アレルではＴ（チミン）であることを意味する。ＶＫＯＲＣ１の１１７３位の塩基がＴに変異することにより、ワルファリン応答性が高くなる（例えば、非特許文献４参照。）。
ＶＫＯＲＣ１変異型アレルの出現頻度にも人種差が認められ、日本人を含むアジア人では約９０％と非常に高いが、白人では約４０％、アフリカ系アメリカ人では約１０％程度である。従来から経験的に、アジア人の平均的ワルファリン投与量が、白人やアフリカ系アメリカ人よりも低いことが知られているが、これは、ワルファリン応答性の高いＶＫＯＲＣ１変異型アレルの出現頻度が、白人等に比べてアジア人において非常に高いためと考えられる（例えば、非特許文献１及び２参照。）。
【０００６】
このように、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出することにより、ワルファリン代謝能の個人差を予測することができる。特に、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）のみの検出ではほとんど予測することができなかったアジア人の予測に、非常に有用であることが期待できる。さらに、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の両方を検出することにより、従来に無く高精度に、ワルファリン代謝能の個人差を予測することが可能となる。
【０００７】
これらの学術的研究においては、通常、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）やＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）のような一塩基多型の検出は、変異部位のみを直接検出する方法ではなく、シークエンサー等を用いて、該変異部位を含む特定領域の配列情報を全て解析し、該解析結果を元に変異の型を決定する核酸配列決定（シークエンシング）法がとられている。該方法では、全ての配列情報を解析するため、信頼性の高い結果を得ることができる反面、解析の処理速度が遅く、かつ費用も高いため、実際の臨床検査として行うことは、検出の迅速性及び経済性の観点から好ましくない。また、シークエンシング法では、原理上、２箇所以上の離れた領域を、１のサンプルで同時に解析することは不可能である。このため、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出しようとする場合には、それぞれ解析を行う必要があるため、解析処理時間がさらに長期化し、費用もさらにかさむことになり、臨床現場での実用化からさらに遠のいていた。
【０００８】
塩基多型検出方法として、シークエンシング法以外に、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等の塩基配列増幅法を利用した検出方法がある。該方法は、野生型アレルにのみ完全に相補的な野生型プライマーと、変異型アレルにのみ完全に相補的な変異型プライマーを、それぞれ別個に用いてＰＣＲを行う方法である。例えば、変異型アレルのホモ接合体である遺伝子を含む核酸試料を鋳型とし、各プライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行うと、野生型プライマーを用いた場合にはＰＣＲ増幅が検出されず、変異型プライマーを用いた場合にＰＣＲ増幅が検出される。つまり、各プライマーによりＰＣＲ増幅が検出されるか否かによって、該核酸試料中の遺伝子多型を確認できる。該方法は、シークエンシング法よりも、所要時間が短く済み、また、簡便であるため、臨床検査に好適に用いることができる。
【非特許文献１】越前宏俊著、「個別化されたワルファリン療法確立への道」、２００６年、血栓止血誌、１７（４）、ｐ４３０〜４３３
【非特許文献２】高橋晴美著、「ワルファリン応答の個人差」、２００６年、ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１４（３）、ｐ１８（１９８）〜２２（２０２）
【非特許文献３】Rieder et al.  ２００５年、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３５２（２２）、ｐ２２８５〜２２９３
【非特許文献４】D'Andrea et al.  ２００５年、Ｂｌｏｏｄ、１０５（２）、ｐ６４５〜６４９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ワルファリンは、安全な投与量域が非常に狭く、投与量が不十分な場合には必要な抗凝固効果が得られず、投与量が過剰である場合には失血等の重篤な副作用が引き起こされるおそれがある。したがって、ワルファリン代謝能の個人差をより正確に予測することが非常に重要である。しかしながら、上記ＰＣＲ法を利用した検出方法では、プライマーの設計が不適切であると、非特異的なＰＣＲ増幅が起こり、多型の診断を誤るおそれがある。このため、非特異的なＰＣＲ増幅を抑え、目的の多型アレルのみを特異的に増幅することができる、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）やＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出に用いられるプライマーの開発が強く望まれている。にもかかわらず、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）やＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の多型検出用プライマー、特にＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーであって、臨床検査にも好適な精度のよいプライマーは知られていなかった。
【００１０】
本発明は、ワルファリン代謝能の個人差予測に有効な一塩基多型である、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）及びＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を、迅速かつ簡便に、精度よく検出するためのプライマー、及び該プライマーを用いた検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、非特異的なＰＣＲ増幅がなされることなく、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）及びＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）をそれぞれ特異的に検出することができる新規なプライマーの設計に成功し、これらのプライマーを用いることにより、一度のＰＣＲにより、従来に無く高精度かつ簡便に、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）及びＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、ヒトのビタミンＫエポキシド還元酵素複合体（ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｅｐｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＶＫＯＲＣ）のサブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）遺伝子の、開始コドン（ＡＴＧ）のＡを１位としたときの１１７３位の塩基における一塩基多型ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するためのプライマーであって、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７２位の塩基Ｃと相補的な塩基Ｇであり、３’末端から２番目の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７３位の塩基に対応する塩基Ｇであり、３’末端から３番目の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７４位の塩基Ｃと非相補的な塩基Ｔであること、を特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーを提供するものである。
また、本発明は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の、開始コドン（ＡＴＧ）のＡを１位としたときの１１７３位の塩基における一塩基多型ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するためのプライマーであって、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７２位の塩基Ｃと相補的な塩基Ｇであり、３’末端から２番目の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７３位の塩基に対応する塩基Ａであり、３’末端から３番目の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７４位の塩基Ｃと非相補的な塩基Ｔであること、を特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーを提供するものである。
また、本発明は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）増幅して検出するために用いられるプライマーであって、前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー又は前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ａ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１３０位の塩基Ｔと相同的な塩基Ｔであることを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーを提供するものである。
また、本発明は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ増幅して検出するために用いられるプライマーであって、前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー又は前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ａ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０７０位の塩基Ｇと相同的な塩基Ｇであることを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーを提供するものである。
また、本発明は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ増幅して検出するために用いられるプライマーであって、前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー又は前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ａ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０６８位の塩基Ａと相同的な塩基Ａであることを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーを提供するものである。
また、本発明は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ増幅して検出するために用いられるプライマーであって、前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー又は前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ａ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０６２位の塩基Ｇと相同的な塩基Ｇであることを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーを提供するものである。
また、本発明は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ増幅して検出するために用いられるプライマーであって、前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー又は前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ａ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０６１位の塩基Ａと相同的な塩基Ａであることを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーを提供するものである。
また、本発明は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ増幅して検出するために用いられるプライマーであって、前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー又は前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ａ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０６０位の塩基Ｃと相同的な塩基Ｃであることを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーを提供するものである。
また、本発明は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するためのプライマーセットであって、前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー及び前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ａ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、を有することを特徴とする、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセットを提供するものである。
また、本発明は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するための多型検出方法であって、前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー及び前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ａ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーを用いてＰＣＲ増幅をすることを特徴とする、多型検出方法を提供するものである。
また、本発明は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するための多型検出方法であって、前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅をすることを特徴とする、多型検出方法を提供するものである。
また、本発明は、ヒトの肝チトクロームＰ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０：ＣＹＰ）２Ｃ９遺伝子の、開始コドン（ＡＴＧ）のＡを１位としたときの１０７５位の塩基における一塩基多型ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するためのプライマーであって、３’末端の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７６位の塩基Ｔと相同的な塩基Ｔであり、３’末端から２番目の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７５位の塩基に対応する塩基Ａであり、３’末端から３番目の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７４位の塩基Ｃと非相同的な塩基Ａであること、を特徴とする、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーを提供するものである。
また、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の、開始コドン（ＡＴＧ）のＡを１位としたときの１０７５位の塩基における一塩基多型ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するためのプライマーであって、３’末端の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７６位の塩基Ｔと相同的な塩基Ｔであり、３’末端から２番目の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７５位の塩基に対応する塩基Ｃであり、３’末端から３番目の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７４位の塩基Ｃと非相同的な塩基Ａであること、を特徴とする、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーを提供するものである。
また、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の塩基配列領域をＰＣＲ増幅して検出するために用いられるプライマーであって、前記記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー又は前記記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができ、かつ、３’末端の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１１０７位の塩基Ａと相補的な塩基Ｔであることを特徴とする、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーを提供するものである。
また、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するためのプライマーセットであって、前記記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー及び前記記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、前記記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、を有することを特徴とする、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の多型検出用プライマーセットを提供するものである。
また、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するための多型検出方法であって、前記記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー及び前記記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーを用いてＰＣＲ増幅をすることを特徴とする、多型検出方法を提供するものである。
また、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するための多型検出方法であって、前記記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の多型検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅をすることを特徴とする、多型検出方法を提供するものである。
また、本発明は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するための多型検出方法であって、前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセットと、前記記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の多型検出用プライマーセットとを、１の反応溶液に同時に用いて、ＰＣＲ増幅を行うことを特徴とする、多型検出方法を提供するものである。
また、本発明は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するための多型検出方法であって、前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー及び／又は前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーと、前記記載のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、前記記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー及び／又は前記記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーと、前記記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーとを、１の反応溶液に同時に用いてＰＣＲ増幅をすることを特徴とする、多型検出方法を提供するものである。
また、本発明は、電気泳動法、クロマトグラフィー法、質量分析法、ＦＣＳ（蛍光自己相関関数、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）解析法、及び免疫比濁法からなる群より選ばれる１以上の方法を用いることを特徴とする、前記いずれかに記載の多型検出方法を提供するものである。
また、本発明は、リガンドを用いて修飾された少なくとも１のプライマーを用いることを特徴とする、前記いずれかに記載の多型検出方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のプライマーを用いることにより、一度のＰＣＲにより簡便かつ迅速に、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）やＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出することができる。このため、従来に無く高精度に、ワルファリン代謝能の個人差を予測することが可能となる。また、本発明の多型検出用プライマーセットを構成する各プライマーは、互いに干渉することがないため、１の反応溶液に用いて一度にＰＣＲ増幅をすることができる。したがって、本発明の多型検出用プライマーセットを用いることにより、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）やＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出の迅速化が達成されるだけではなく、省資源化によるコストダウンにもつながる。
さらに、本発明の多型検出方法、すなわち、本発明のプライマーを用いた検出方法により、臨床検査で求められる精度を満たしつつ、簡便かつ迅速に、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）やＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において、「Ｘ位」とは、ある遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）のＡ（以下、翻訳開始点という。）を１位としたときの遺伝子上の位置を表している。つまり、「Ｘ位の塩基」とは、遺伝子上で、翻訳開始点を１位としたときのＸ位の塩基、すなわち、翻訳開始点からＸ番目の塩基を表している。
【００１５】
本発明において、プライマーの設計は、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても行うことができる。例えば、公知のゲノム配列データと汎用されているプライマー設計ツールを用いて、簡便にプライマーを設計することができる。該プライマー設計ツールとして、例えば、Ｗｅｂ上で利用可能なＰｒｉｍｅｒ３等がある。また、公知のゲノム配列データは、通常、国際的な塩基配列データベースである、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）や、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）等において入手することができる。
【００１６】
本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーと、本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーは、いずれもヒトのＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７３位の塩基における一塩基多型ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するためのプライマーである。ヒトのＶＫＯＲＣ１遺伝子は、１６番染色体上にある遺伝子であり、複数の一塩基多型が報告されている。ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子のイントロン１上に存在する一塩基多型である。なお、「ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマー」は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーとＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーの両方を意味する。
【００１７】
具体的には、本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーは、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７２位の塩基Ｃと相補的な塩基Ｇ（グアニン）であり、３’末端から２番目の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７３位の塩基に対応する塩基、すなわち、塩基Ｃ又はＴと相補的な塩基Ｇ又はＡであり、３’末端から３番目の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７４位の塩基Ｃと非相補的な塩基Ｔであること、を特徴とする。３’末端から２番目の塩基がＧであるＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーを用いることにより、ＶＫＯＲＣ１の野生型アレルを検出することができ、３’末端から２番目の塩基がＡであるＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーを用いることにより、ＶＫＯＲＣ１の変異型アレルを検出することができる。プライマー中に、検出すべき多型部位と相補的な塩基配列を有することにより、直接多型部位を識別することができるため、プライマーの伸長反応やＰＣＲ増幅が行われたか否かを検出するだけで、多型を識別することが可能である。
【００１８】
ここで、本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーは、３’末端の塩基ではなく、３’末端から２番目の塩基が、検出対象である一塩基多型（１１７３Ｃ＞Ｔ）に対応する塩基である。これにより、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いた場合であっても、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーは野生型アレルのみを、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーは変異型アレルのみを、それぞれ特異的に検出することができる。
【００１９】
さらに、本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーは、それぞれのアレルに完全に相補的なプライマーではなく、３’末端から３番目の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７４位の塩基Ｃと非相補的な塩基である。１塩基のみが非相補的なプライマーの場合には、反応条件等を厳格に設定し制御しない限り、ミス伸長が起こり、ＰＣＲ増幅がなされる場合が多い。このため、例えば、野生型アレルにのみ完全に相補的なプライマーを用いた場合には、本来であれば、野生型アレルを含有する核酸試料を用いた場合にのみＰＣＲ増幅が検出されるべきであるが、変異型アレルを含有する核酸試料を用いた場合にもＰＣＲ増幅が検出されてしまうため、変異型アレルを含有する核酸試料であるにもかかわらず、野生型アレルを含有する核酸試料と誤診されるおそれがある。
これに対し、３’末端から３番目の塩基に人為的ミスマッチ塩基を配することにより、検出対象である型のアレルではミスマッチが１塩基のみであるのに対し、検出対象とは異なる型のアレルではミスマッチが連続する２塩基となる。２塩基以上のミスマッチが生じている場合には、ミス伸長が生ずる可能性は非常に小さいため、本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーにより、反応条件等を厳格に設定することなく、特異性の高いＰＣＲ増幅が可能となる。この結果、核酸試料中の遺伝子型の誤診を効果的に防止できることが期待できる。
【００２０】
本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーの３’末端から３番目の塩基は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１７４位の塩基Ｃと非相補的な塩基Ｔである。３’末端から３番目の塩基がＡである場合に比べて、ミス伸長による非特異的なＰＣＲ増幅を効果的に抑制することができるためである。
【００２１】
本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーの塩基長は、特に限定されるものではなく、多型検出において使用するポリメラーゼの種類や、塩濃度等の反応条件等を考慮して、適宜決定することができる。
【００２２】
一般に、プライマーのＴｍ値は、ＰＣＲ増幅における特異性と効率を良好に保つため、５０〜７５℃程度の温度範囲にあることが好ましい。適当なＴｍ値を有する点から、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーの塩基長は、１６〜３５ｍｅｒであることが好ましく、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーの塩基長は、１８〜２７ｍｅｒであることが好ましい。後記の表１及び表２に示されるように、塩基長がこれらの範囲である場合には、計算方法により多少の変動はあるものの、プライマーのＴｍが５０〜７５℃程度の温度範囲にあるためである。
【００２３】
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出するためのプライマーと、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するためのプライマーを、１の反応溶液に添加してＰＣＲを行うｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲにより、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を同時に検出することができる。ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲを行う場合には、各プライマーのＴｍ値が近似していることが好ましい。この観点から、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーは、配列番号１の塩基配列を有するプライマーであることが特に好ましく、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーは、配列番号２の塩基配列を有するプライマーであることが特に好ましい。Ｔｍ値が約６８℃であり、後記表９及び表１０記載のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマーのＴｍ値を考慮すると、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）とのｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲに好適であるためである。
【００２４】
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出をＰＣＲ増幅により行う場合に用いられるＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーは、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を含むＶＫＯＲＣ１遺伝子上の塩基配列領域を鋳型とし、本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができるプライマーであれば、特に限定されるものではなく、使用するＤＮＡポリメラーゼ等を考慮して、適宜設計することができる。得られるＰＣＲ産物の塩基対が１０００ｂｐ程度までであれば、市販されている酵素ＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いれば、十分にＰＣＲ増幅することが可能であるが、ＰＣＲ産物の塩基対が長すぎる場合には、ＰＣＲ増幅効率が低下するおそれがある。このため、ＰＣＲ産物の塩基対が２０〜１０００ｂｐ程度になるように、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーを設計することが好ましい。ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーは、ＰＣＲ産物の塩基対が２０〜５００ｂｐとなるように設計することがより好ましく、２０〜２５０ｂｐとなるように設計することがさらに好ましく、２０〜１００ｂｐとなるように設計することが特に好ましい。
【００２５】
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーは、例えば、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１１３０位の塩基Ｔと相同的な塩基Ｔであるプライマー（以下、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１１３０Ｔ）という。）であることが好ましい。得られるＰＣＲ産物が約１００ｂｐであり、ＰＣＲ増幅効率に優れているため、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）をより高感度に検出することができるためである。後記の表３に示されるように、プライマーのＴｍを５０〜７５℃程度の温度範囲にすることができるため、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１１３０Ｔ）の塩基長は、１７〜２９ｍｅｒであることが好ましく、配列番号３の塩基配列を有するプライマーであることが特に好ましい。
【００２６】
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーは、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０７０位の塩基Ｇと相同的な塩基Ｇであるプライマー（以下、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）という。）であってもよく、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０６８位の塩基Ａと相同的な塩基Ａであるプライマー（以下、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）という。）であってもよく、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０６２位の塩基Ｇと相同的な塩基Ｇであるプライマー（以下、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）という。）であってもよく、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０６１位の塩基Ａと相同的な塩基Ａであるプライマー（以下、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）という。）であってもよく、３’末端の塩基が、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の１０６０位の塩基Ｃと相同的な塩基Ｃであるプライマー（以下、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）という。）であってもよい。これらの５種類のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーは、前記のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマー、後記のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマー及びＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーの、それぞれの３’末端から５塩基部分の塩基配列と相同的な配列や相補的な配列を含まないため、これらのプライマーとプライマーダイマーを形成する可能性が非常に低く、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）とのｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲにも好適である。
【００２７】
適当なＴｍ値を有する点から、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）の塩基長は、１２〜２６ｍｅｒであることが好ましく、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）の塩基長は、１４〜３２ｍｅｒであることが好ましく、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）の塩基長は、１９〜４１ｍｅｒであることが好ましく、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）の塩基長は、１８〜４１ｍｅｒであることが好ましく、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）の塩基長は、１８〜４３ｍｅｒであることが好ましい。後記の表４〜８に示されるように、塩基長がこれらの範囲である場合には、計算方法により多少の変動はあるものの、プライマーのＴｍ値が５０〜７０℃程度の温度範囲にあるためである。なお、好ましいＴｍ値の温度範囲が、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーの場合よりも若干低いのは、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーとは異なり、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマーには人為的ミスマッチが入らないためである。
【００２８】
ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）は、配列番号４の塩基配列を有するプライマーであることが特に好ましく、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）は、配列番号５の塩基配列を有するプライマーであることが特に好ましく、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）は、配列番号６の塩基配列を有するプライマーであることが特に好ましく、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）は、配列番号７の塩基配列を有するプライマーであることが特に好ましく、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）は、配列番号８の塩基配列を有するプライマーであることが特に好ましい。ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）とのｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲに好適であるためである。
【００２９】
本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマー及びＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーは、具体的には、以下のようにして得ることができる。
まず、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列を有する塩基配列データ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＴ＿０１０３９３．１５．ｆａｓ）をプライマー設計のための背景配列とし、Ｐｒｉｍｅｒ３（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）を用いて、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーの設計を行った。それぞれのプライマーのＴｍ値の計算は、シグマジェノシス株式会社のWeb Siteで公開されているＴｍ計算エンジンを用いて行った。
【００３０】
【表１】
2009247230.tif 000002
【００３１】
【表２】
2009247230.tif 000003
【００３２】
表１は、設計されたＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーを、表２は、設計されたＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーを、それぞれ示した表である。表中、プライマーの塩基配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の左端は５’末端であり、右端は３’末端である。また、表中、「ＬＥＮ」はプライマーの塩基長（ｍｅｒ）を、「Ｔｍ」はＴｍ値（℃）を、「ＧＣ」はプライマーのＧＣ含有比（％）を、「２ｎｄａｒｙ」はプライマーの二次構造のとり易さを「ｐｒｉｍｅｒ  ｄｉｍｅｒ」は、プライマーが理論上ホモダイマーを形成するか否かを、それぞれ示している。
【００３３】
また、同様にして、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーの設計を行った。表３は設計されたＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１１３０Ｔ）を、表４はＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）を、表５は設計されたＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）を、表６は設計されたＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）を、表７は設計されたＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）を、表８は設計されたＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）を、それぞれ示した表である。表中の記載は、表１と同様である。
【００３４】
【表３】
2009247230.tif 000004
【００３５】
【表４】
2009247230.tif 000005
【００３６】
【表５】
2009247230.tif 000006
【００３７】
【表６】
2009247230.tif 000007
【００３８】
【表７】
2009247230.tif 000008
【００３９】
【表８】
2009247230.tif 000009
【００４０】
図１は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）近隣のＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列を示した図である。枠で囲まれた塩基Ｃが検出対象である１１７３位の塩基である。また、大文字Ｔ０がＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１１３０Ｔ）の３’末端から３番目の塩基Ｔであり、大文字Ｇ１がＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）の３’末端から３番目の塩基Ｇであり、大文字Ａ２がＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）の３’末端から３番目の塩基Ａであり、大文字Ｇ３がＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）の３’末端から３番目の塩基Ｇであり、大文字Ａ４がＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）の３’末端から３番目の塩基Ａであり、大文字Ｃ５がＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）の３’末端から３番目の塩基Ｃである。
【００４１】
本発明のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーと、本発明のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーは、いずれもヒトのＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７５位の塩基における一塩基多型ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出するためのプライマーである。ヒトのＣＹＰ２Ｃ９遺伝子は、１０番染色体上にある遺伝子であり、複数の一塩基多型が報告されている。ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のエキソン７上に存在する一塩基多型である。なお、「ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマー」は、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーとＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーの両方を意味する。
【００４２】
具体的には、本発明のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマーは、３’末端の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７６位の塩基Ｔと相同的な塩基Ｔであり、３’末端から２番目の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７５位の塩基に対応する塩基、すなわち、塩基Ａ又はＣと相同的な塩基Ａ又はＣであり、３’末端から３番目の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７４位の塩基Ｃと非相同的な塩基Ａであること、を特徴とする。３’末端から２番目の塩基がＡであるＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーを用いることにより、ＣＹＰ２Ｃ９の野生型アレルを検出することができ、３’末端から２番目の塩基がＡであるＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーを用いることにより、ＣＹＰ２Ｃ９の変異型アレルを検出することができる。
【００４３】
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子は、ＣＹＰ２Ｃ１７遺伝子等の他のＣＹＰ２Ｃサブファミリー以外にも、類似の塩基配列を有する偽遺伝子が多数報告されており、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）のみを検出するためには、特異性の高いプライマーを設計することが非常に重要である。本発明のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマーは、３’末端から３番目の塩基に人為的ミスマッチ塩基を配しているため、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出に好適である。
【００４４】
本発明のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマーの３’末端から３番目の塩基は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１０７４位の塩基Ｃと非相同的な塩基Ａである。３’末端から３番目の塩基がＴである場合に比べて、他の遺伝子等の塩基配列との類似性が低く、かつ、反応条件の設定が容易であるためである。
【００４５】
本発明のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマーの塩基長は、特に限定されるものではなく、多型検出において使用するポリメラーゼの種類や、塩濃度等の反応条件等を考慮して、適宜決定することができる。適当なＴｍ値を有する点から、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーの塩基長は、１８〜２８ｍｅｒであることが好ましく、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーの塩基長も、１８〜２８ｍｅｒであることが好ましい。後記の表９及び表１０に示されるように、塩基長がこれらの範囲である場合には、計算方法により多少の変動はあるものの、プライマーのＴｍが５０〜７５℃程度の温度範囲にあるためである。
【００４６】
ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーは、配列番号９の塩基配列を有するプライマーであることが特に好ましく、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーは、配列番号１０の塩基配列を有するプライマーであることが特に好ましい。前記の配列番号１の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーや、配列番号２の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーと、Ｔｍ値が近似しているため、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とのｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲに好適であるためである。
【００４７】
ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出をＰＣＲ増幅により行う場合に用いられるＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーは、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を含むＣＹＰ２Ｃ９遺伝子上の塩基配列領域を鋳型とし、本発明のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマーをフォワードプライマーとした場合に、リバースプライマーとして用いることができるプライマーであれば、特に限定されるものではなく、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーと同様に設計することができる。
【００４８】
ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーは、３’末端の塩基が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の１１０７位の塩基Ａと相補的な塩基Ｔであるプライマー（以下、ＣＹＰ２Ｃ９リバースプライマー（１１０７Ａ）という。）であることが好ましい。他の遺伝子等の塩基配列との類似性が低く、より特異的にＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出することができるためである。
【００４９】
後記の表１１に示されるように、プライマーのＴｍを５０〜７０℃程度の温度範囲にすることができるため、ＣＹＰ２Ｃ９リバースプライマー（１１０７Ａ）の塩基長は、１８〜４０ｍｅｒであることが好ましい。ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とのｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲに好適であるため、ＣＹＰ２Ｃ９リバースプライマー（１１０７Ａ）は、配列番号１１の塩基配列を有するプライマーであることが特に好ましい。
【００５０】
本発明のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマー及びＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーは、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマー等と同様にして得ることができる。具体的には、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の塩基配列を有する塩基配列データ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＴ＿０３００５９．１２．ｆａｓ）をプライマー設計のための背景配列とし、Ｐｒｉｍｅｒ３を用いてプライマーの設計を行った。
【００５１】
【表９】
2009247230.tif 000010
【００５２】
【表１０】
2009247230.tif 000011
【００５３】
【表１１】
2009247230.tif 000012
【００５４】
図２は、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）近隣のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の塩基配列を示した図である。枠で囲まれた塩基Ａが検出対象である１０７５位の塩基である。また、大文字Ａが、１１０７位の塩基Ａである。
【００５５】
このようにして設計したプライマーは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても合成することができる。例えば、オリゴ合成メーカーに合成をされ依頼してもよく、市販の合成機を用いて独自に合成してもよい。また、各プライマーは、検出対象の遺伝子の塩基配列と相補的又は相同的な配列以外にも、ＰＣＲによる増幅を阻害しない程度において、付加的な配列を有することができる。
【００５６】
本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーや、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマーを用いて、プライマーの伸長やプライマーを用いた核酸増幅等のために通常行われている方法を行うことにより、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）やＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を、従来になく高精度かつ簡便に検出することができる。多型検出方法として、特に、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーを用いてＰＣＲ増幅をする方法や、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマーを用いてＰＣＲ増幅をする方法であることが好ましい。ＰＣＲは汎用されている方法であり、かつ、検出感度が良好であるためである。
【００５７】
例えば、１のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーと、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１１３０Ｔ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）、及びＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）からなる群より選ばれる１のプライマーとを有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅をすることにより、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出することができる。フォワードプライマーとして、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーとＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーのいずれか一方のプライマーを用いるため、単にＰＣＲ産物が得られたか否かを検出することにより、簡便に多型を検出することができる。
【００５８】
また、１のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーと、１のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーと、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１１３０Ｔ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）、及びＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）からなる群より選ばれる１のプライマーとを有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセットを用いてもよい。該多型検出用プライマーセットを、１の反応溶液に同時に用いてＰＣＲ増幅をすることにより、ＶＫＯＲＣ１の野生型アレルと変異型アレルの両方を同時に検出することができる。配列番号１の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーと、配列番号３、４、５、６、７、及び８の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーとを有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅をすることが、特に好ましい。
【００５９】
さらに、１のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーと、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）、及びＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）からなる群より選ばれる１のプライマーとを有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセットや、１のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーと、１のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーと、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）、及びＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）からなる群より選ばれる１のプライマーとを有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセットを用いてもよい。本発明のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマー及びＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーと相同性や相補性が低く、互いに干渉し難いため、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）のｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲに好適であるためである。特に、配列番号１の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーと、配列番号４、５、６、７、及び８の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーとを有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセットを用いることが好ましい。
【００６０】
一方、１のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）フォワードプライマーと、１のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーとを有するＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の多型検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅をすることにより、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出することができる。フォワードプライマーとして、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーとＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーのいずれか一方のプライマーを用いるため、単にＰＣＲ産物が得られたか否かを検出することにより、簡便に多型を検出することができる。
【００６１】
また、１のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーと、１のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーと、１のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーとを有するＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の多型検出用プライマーセットを用いてもよい。該多型検出用プライマーセットを、１の反応溶液に同時に用いてＰＣＲ増幅をすることにより、ＣＹＰ２Ｃ９の野生型アレルと変異型アレルの両方を同時に検出することができる。ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）のｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲに好適であるため、配列番号９の塩基配列を有するＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーと、配列番号１０の塩基配列を有するＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーと、配列番号１１の塩基配列を有するＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーとを有するＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の多型検出用プライマーセットであることが特に好ましい。
【００６２】
本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の多型検出用プライマーセットと、本発明のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の多型検出用プライマーセットとを、１の反応溶液に同時に用いて、ＰＣＲ増幅をすることにより、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を、高精度かつ迅速に検出することができる。１の反応溶液で、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出が可能であるため、臨床検査等のように核酸試料が少量である場合にも多型検出が可能であり、かつ省資源化によるコストダウンも期待することができる。
特に、配列番号１の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー及び／又は配列番号２の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーと、配列番号４、５、６、７、及び８の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーからなる群より選ばれる１のプライマーと、配列番号９の塩基配列を有するＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー及び／又は配列番号１０の塩基配列を有するＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーと、配列番号１１の塩基配列を有するＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーを、１の反応溶液に同時に用いてＰＣＲ増幅をすることが好ましい。これらのプライマーは、互いに干渉し難く、かつＴｍ値も調整されているため、一度のＰＣＲによって、それぞれのＰＣＲ産物が特異的かつ効率的に増幅され検出することが可能であるためである。
【００６３】
本発明の多型検出方法では、各多型に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅の有無や得られたＰＣＲ産物の量により、多型を検出する。ＰＣＲ増幅により得られたＰＣＲ産物の検出や定量の方法は、特に限定されるものではなく、通常ＰＣＲ産物の検出等に用いられているいかなる方法を用いてもよい。
【００６４】
例えば、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の両方を検出するｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲのように、複数のＰＣＲ産物が得られる場合には、それぞれのプライマーセットによって増幅されるＰＣＲ産物の塩基対長を異なるものとし、得られたＰＣＲ産物の塩基対長を検出することにより、どの多型に特異的なプライマーにより増幅されたＰＣＲ産物であるかを識別し、各多型を検出することができる。塩基対長の異なるＰＣＲ産物の識別及び検出は、電気泳動法、クロマトグラフィー法、質量分析法等を用いて行うことができる。
【００６５】
また、塩基対長が同一である複数のＰＣＲ産物が得られる場合であっても、リガンドを用いて修飾されたプライマーを用いることにより、どの多型に特異的なプライマーにより増幅されたＰＣＲ産物であるかを識別し、各多型を検出することができる。例えば、１のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーと、１のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーと、１のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）リバースプライマーを用いた場合には、野生型アレル由来のＰＣＲ産物と変異型アレル由来ＰＣＲ産物の塩基対長は同一であるが、予めそれぞれのフォワードプライマーを、別種のリガンドを用いて修飾しておくことにより、ＰＣＲ産物を該リガンドで標識することができるため、該リガンドを検出することにより、それぞれのＰＣＲ産物を区別して検出することが可能である。
【００６６】
プライマーの修飾に用いるリガンドは、核酸の標識に用いることができるものであれば、特に限定されるものではなく、通常タンパク質等の標識に用いられるものであってもよい。また、該リガンドは、核酸への標識を簡便にするために、核酸に対するリンカーを結合した化合物であってもよい。さらに、ＰＣＲに用いる全てのプライマーをリガンドで修飾してもよく、一部のプライマーのみを修飾してもよい。
【００６７】
該リガンドとして、例えば、蛍光物質、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ、ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）等の色素、ビオチン(ｂｉｏｔｉｎ)、グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、ジゴキシゲニン(ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ：ＤＩＧ)、ジゴキシン(ｄｉｇｏｘｉｎ)等がある。その他、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の汎用タグであってもよい。検出が簡便であるため、該リガンドは、蛍光物質、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ、色素等の光学的に区別可能なリガンドであることが好ましい。検出感度が高いため、該リガンドは、蛍光物質やＱｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔであることが特に好ましい。該蛍光物質として、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＴＡＭＲＡ、ＮＢＤ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）等がある。
【００６８】
光学的に区別可能なリガンドを用いてプライマーを修飾した場合には、リガンドを直接検出することにより、リガンド標識されたＰＣＲ産物を識別して検出することができる。該リガンドとして蛍光物質やＱｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔを用いた場合には、単に蛍光強度を測定することによっても検出することができるが、定量性に優れているため、ＦＣＳ解析法（例えば、特開２００１−２７２４０４号公報参照。）により検出することが好ましい。その他、ＰＣＲ産物を電気泳動等により分離した後、蛍光を調べることによっても、リガンドを検出することができる。
【００６９】
また、受容体等のリガンドと特異的に結合する物質を用いて、免疫学的手法により、リガンドを検出することもできる。該免疫学的手法として、例えば、免疫比濁法やＥＬＩＳＡ法等がある。定量性に優れているため、免疫比濁法を用いてリガンドを検出することが好ましい。
【００７０】
例えば、受容体等のリガンドに特異的に結合する物質を結合させた分散性微粒子と、リガンド標識されたＰＣＲ産物を反応させ、分散性微粒子の凝集度を測定することにより、該リガンド標識されたＰＣＲ産物の量を定量することができる。通常、粒径３００ｎｍ以下の分散性微粒子が凝集すると、該凝集塊により、近赤外光の散乱が亢進されるため、近赤外入力光に対して透過光の光度を光度計で測定することにより、分散性微粒子の凝集度を測定することができる。リガンド標識されたＰＣＲ産物の量が多ければ多いほど、凝集塊の量が多くなるため、近赤外波長における吸光度は大きくなる。
【００７１】
その他、リガンド標識によりＰＣＲ産物の大きさが変化するため、別種のリガンドで標識することにより、同一の塩基対長のＰＣＲ産物であっても、電気泳動法により区別して検出することが可能である。
【００７２】
本発明の多型検出法において、ＰＣＲの鋳型として用いる核酸試料は、ヒト由来であって、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）やＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出が望まれるＤＮＡであれば、特に限定されるものではない。例えば、血液や体液等の生体試料から、通常用いられる方法により抽出されたＤＮＡ等がある。なお、ＰＣＲにおいて用いられる核酸試料やプライマーの量は、通常用いられる量であれば、特に限定されるものではない。
【００７３】
ポリメラーゼ、ヌクレオチド、反応バッファー等の、ＰＣＲに用いられる試薬は、特に限定されるものではなく、通常ＰＣＲを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。ポリメラーゼは、多種多様な酵素が市販されているが、ＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）であることが特に好ましい。ＰＣＲ増幅の効率と精度が非常に優れているためである。また、ＰＣＲの反応条件は、用いるポリメラーゼの種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【実施例】
【００７４】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、プライマーは、シグマアルドリッチジャパン株式会社ライフサイエンス事業部に依頼して合成されたものを使用した。
【００７５】
［ヒトゲノム検体の遺伝子型の確認］
ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）やＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出に用いるため、表１２に示すヒトゲノム検体を、財団法人ヒューマンサイエンス振興財団が提供しているヒューマンサイエンス研修資源バンクより非連結匿名化された状態で入手した。これらのヒトゲノム検体の塩基配列を、シークエンサーを用いて読み取り、遺伝子型を確認した。確認した遺伝子型を表１２に示した。
【００７６】
【表１２】
2009247230.tif 000013
【００７７】
［プライマーの修飾］
まず、配列番号１の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーを、それぞれリガンドで修飾することにより、５’末端にＤＩＧを結合させた５’ＤＩＧ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーと、５’末端にＤＮＰを結合させた５’ＤＮＰ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーを作製した。
次に、配列番号３の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１１３０Ｔ）と、配列番号４の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）と、配列番号５の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）と、配列番号６の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）と、配列番号７の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）と、配列番号８の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）を、それぞれリガンドで修飾することにより、５’末端にＦＩＴＣを結合させた５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１１３０Ｔ）、５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）、５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）、５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）、５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）、５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）を作製した。
さらに同様にして、配列番号９の塩基配列を有するＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーと、配列番号１０の塩基配列を有するＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーと、配列番号１１の塩基配列を有するＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーを、それぞれリガンドで修飾することにより、５’ＦＩＴＣ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーと、５’ＤＮＰ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーと、５’ビオチン化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーを作製した。
【００７８】
［受容体結合分散性微粒子］
ＤＩＧと特異的に結合するヤギ抗ＤＩＧ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｉｎｃ．社製）を結合させた分散性微粒子（以下、抗ＤＩＧ分散性微粒子）、ＦＩＴＣと特異的に結合するヤギ抗ＦＩＴＣ抗体（ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）を結合させた分散性微粒子（以下、抗ＦＩＴＣ分散性微粒子）、ＤＮＰと特異的に結合するヤギ抗ＤＮＰ抗体（ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）を結合させた分散性微粒子（以下、抗ＤＮＰ分散性微粒子）、及びビオチンと特異的に結合するヤギ抗ビオチン抗体（ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）を結合させた分散性微粒子（以下、抗ビオチン分散性微粒子）を調製した。
各受容体結合分散性微粒子は、具体的には、以下のようにして調製した。まず、１ｍＬのＭＥＳ（Ｗａｋｏ社製）緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ６．１）に、水を加えて９ｍＬに調製した溶液を５０ｍＬ容チューブに入れ、１ｍＬの１０％ＣＭ−ＭＰ（３００ｎｍカルボキシタイプラテックス粒子、Ｃｅｒａｄｙｎ社製）スラリーを加えた後、８ｍＬの１ｍｇ／ｍＬの各抗体リン酸緩衝溶液を加えた。該５０ｍＬ容チューブを、ボルテックスミキサー（ＶＯＲＴＥＸＧＥＮＩＥ２、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）の中間回転強度にて５秒間混合した後、さらに１ｍＬの１．１５２ｇ／ＬのＥＤＡＣ（ＭＷ＝１９１．７、Ｓｉｇｍａ社製）ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．１）を加え、直ちにボルテックスミキサーの中間回転強度にて５秒間混合した。その後、該５０ｍＬ容チューブを、ローテーター（ＭＴＲ−１０３、アズワン社製）にセットし、室温で１時間混合したものを、４℃、１５，０００ｘｇで５分間遠心し、遠心分離したＣＭ−ＭＰが上清側に舞い上がることを防止するために、最低減速条件で遠心を停止させた。上清を除去した後、１０ｍＬのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．１）を加え、室温で、ソニケーター（ＶＣ−１３０、Ｓｏｎｉｃｓ社製）の３０ａｍｐｌｉｔｕｄｅの強度で３〜４秒間超音波処理を行うことにより、ＣＭ−ＭＰの塊を分散させた。再度同様に、該５０ｍＬ容チューブを遠心後、１０ｍＬのＭＥＳ緩衝液を加え、ＣＭ−ＭＰの塊を分散させた。その後、４℃で１６時間静置後、目視にて沈渣が無いことを確認した。このようにして得たＭＥＳ緩衝液中に分散したＣＭ−ＭＰを、１％の受容体結合分散性微粒子スラリーとした。
【００７９】
［実施例１］
５’ＤＩＧ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー、５’ＤＮＰ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマー、及び５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１１３０Ｔ）を用いて、３種類のヒトゲノム検体（ＰＳＣＤＡ０２０６、０１８２、０００９）のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出した。
まず、２９．７μＬのｍｉｌｌｉＱ水に、６μＬの１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）、６μＬのｄＮＴＰ（２ｍＭ）、２．４μＬの硫酸マグネシウム（２５ｍＭ）、１０μＬのヒトゲノム検体（２０ｎｇ／μＬ）、１．７μＬの５’ＤＩＧ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー、１．８μＬの５’ＤＮＰ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマー、１．２μＬの５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１１３０Ｔ）、及び１．２μＬのＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を加え、反応溶液を調製した。該反応溶液を、９４℃で５分間の変性工程、次に９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間を３５サイクルの増幅工程、６８℃で２分間の伸長工程、からなる反応条件によりＰＣＲを行った。ヒトゲノム検体に代えて、等量のｍｉｌｌｉＱ水を用いたものを、ネガティブコントロールとした。
【００８０】
その後、受容体結合分散性微粒子を用いた免疫比濁法により、ＰＣＲ増幅の有無を調べた。
まず、各ＰＣＲ済反応溶液中の、５’ＤＩＧ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーによるＰＣＲ増幅の有無を調べた。各２μＬのＰＣＲ済反応溶液に、それぞれ１μＬの１％抗ＤＩＧ分散性微粒子スラリーと、１μＬの１％抗ＦＩＴＣ分散性微粒子スラリーを加え、ボルテックスミキサーを用いて混合した後、室温で５分間放置した。分光高度計（ＳＰＥＣＴＲＡ ｍａｘ ＰＬＵＳ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて、該ＰＣＲ済反応溶液の分散性微粒子添加前と凝集塊生成後の、それぞれの８００ｎｍの吸光度（Ａ８００）を測定し、分散性微粒子の添加による該ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化を測定した。
次に、各ＰＣＲ済反応溶液中の、５’ＤＮＰ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーによるＰＣＲ増幅の有無を調べるため、各２μＬの該ＰＣＲ済反応溶液に、それぞれ１μＬの１％抗ＤＮＰ分散性微粒子スラリーと、１μＬの１％抗ＦＩＴＣ分散性微粒子スラリーを加え、同様にして、分散性微粒子の添加による該ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化を測定した。
【００８１】
図３は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＤＩＧ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。●はＰＳＣＤＡ０１８２の結果を、○はＰＳＣＤＡ０２０６の結果を、▲はＰＳＣＤＡ０００９の結果を、×はネガティブコントロールの結果を、それぞれ示している。
【００８２】
３種全てのヒトゲノム検体において、抗ＤＮＰ分散性微粒子を加えた場合にＡ８００が大きくなった。一方、抗ＤＩＧ分散性微粒子を加えた場合には、ＰＳＣＤＡ０１８２ではＡ８００が大きくなっていたが、他の２種のヒトゲノム検体ではＡ８００はあまり変化しなかった。さらに、ネガティブコントロールでは、いずれの場合でもＡ８００の変化はほとんど観察されなかった。すなわち、５’ＤＮＰ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーによるＰＣＲ増幅は、３種全てのヒトゲノム検体においてなされたが、５’ＤＩＧ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーによるＰＣＲ増幅は、ＰＳＣＤＡ０１８２においてのみなされたことが分かった。つまり、ＰＳＣＤＡ０１８２はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ／Ｔ）、ＰＳＣＤＡ０２０６及び０００９はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ／Ｔ）であるという結果が得られた。該結果は、シークエンス解析による多型判定の結果と一致しており、本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマー、及びＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１１３０Ｔ）を用いることにより、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）を検出できることが明らかである。
【００８３】
［実施例２］
５’ＦＩＴＣ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー、５’ＤＮＰ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマー、及び５’ビオチン化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーを用いて、３種類のヒトゲノム検体（ＰＳＣＤＡ０２０６、０１８２、０００９）のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出した。
まず、２８．４μＬのｍｉｌｌｉＱ水に、６μＬの１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）、６μＬのｄＮＴＰ（２ｍＭ）、２．４μＬの硫酸マグネシウム（２５ｍＭ）、１０μＬのヒトゲノム検体（２０ｎｇ／μＬ）、１．８μＬの５’ＦＩＴＣ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー、１．８μＬの５’ＤＮＰ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマー、２．４μＬの５’ビオチン化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマー、及び１．２μＬのＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を加え、反応溶液を調製した。該反応溶液を、９４℃で５分間の変性工程、次に９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間を３５サイクルの増幅工程、６８℃で２分間の伸長工程、からなる反応条件によりＰＣＲを行った。ヒトゲノム検体に代えて、等量のｍｉｌｌｉＱ水を用いたものを、ネガティブコントロールとした。
【００８４】
その後、各２μＬの該ＰＣＲ済反応溶液に、それぞれ１μＬの１％抗ＦＩＴＣ分散性微粒子スラリーと、１μＬの１％抗ビオチン分散性微粒子スラリーを加え、実施例１と同様にして、分散性微粒子の添加による該ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化を測定し、５’ ＦＩＴＣ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーによるＰＣＲ増幅の有無を調べた。
次に、各ＰＣＲ済反応溶液中の、５’ＤＮＰ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーによるＰＣＲ増幅の有無を調べるため、各２μＬの該ＰＣＲ済反応溶液に、それぞれ１μＬの１％抗ＤＮＰ分散性微粒子スラリーと、１μＬの１％抗ビオチン分散性微粒子スラリーを加え、同様にして、分散性微粒子の添加による該ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化を測定した。
【００８５】
図４は、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＦＩＴＣ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。●はＰＳＣＤＡ０１８２の結果を、○はＰＳＣＤＡ０２０６の結果を、▲はＰＳＣＤＡ０００９の結果を、×はネガティブコントロールの結果を、それぞれ示している。
【００８６】
３種全てのヒトゲノム検体において、抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた場合にＡ８００が大きくなった。一方、抗ＤＮＰ分散性微粒子を加えた場合には、ＰＳＣＤＡ０２０６ではＡ８００が大きくなっていたが、他の２種のヒトゲノム検体ではＡ８００はあまり変化しなかった。さらに、ネガティブコントロールでは、いずれの場合でもＡ８００の変化はほとんど観察されなかった。すなわち、５’ ＦＩＴＣ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーによるＰＣＲ増幅は、３種全てのヒトゲノム検体においてなされたが、５’ ＤＮＰ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーによるＰＣＲ増幅は、ＰＳＣＤＡ０２０６においてのみなされたことが分かった。つまり、ＰＳＣＤＡ０２０６はＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ／Ｃ）、ＰＳＣＤＡ０１８２及び０００９はＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ／Ａ）であるという結果が得られた。該結果は、シークエンス解析による多型判定の結果と一致しており、本発明のＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマー、及びＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーを用いることにより、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出できることが明らかである。
【００８７】
［実施例３］
５’ＤＩＧ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー、５’ＤＮＰ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマー、５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）、５’ＦＩＴＣ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー、５’ＤＮＰ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマー、及び５’ビオチン化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーを用いて、６種類のヒトゲノム検体（ＰＳＣＤＡ０２０６、０５３２、０１８２、０１９４、００１５、００２９）のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出した。
まず、２３．７μＬのｍｉｌｌｉＱ水に、６μＬの１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）、６μＬのｄＮＴＰ（２ｍＭ）、２．４μＬの硫酸マグネシウム（２５ｍＭ）、１０μＬのヒトゲノム検体（２０ｎｇ／μＬ）、１．７μＬの５’ＤＩＧ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー、１．８μＬの５’ＤＮＰ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマー、１．２μＬの５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）、１．８μＬの５’ＦＩＴＣ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー、１．８μＬの５’ＤＮＰ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマー、２．４μＬの５’ビオチン化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマー、及び１．２μＬのＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を加え、反応溶液を調製した。該反応溶液を、９４℃で５分間の変性工程、次に９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間を３５サイクルの増幅工程、６８℃で２分間の伸長工程、からなる反応条件によりＰＣＲを行った。ヒトゲノム検体に代えて、等量のｍｉｌｌｉＱ水を用いたものを、ネガティブコントロールとした。
【００８８】
その後、実施例１と同様にして、各ＰＣＲ済反応溶液における５’ＤＩＧ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマーによるＰＣＲ増幅の有無、及び５’ＤＮＰ化ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマーによるＰＣＲ増幅の有無を、それぞれ調べた。また、実施例２と同様にして、各ＰＣＲ済反応溶液における５’ＦＩＴＣ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマーによるＰＣＲ増幅の有無、及び５’ＤＮＰ化ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマーによるＰＣＲ増幅の有無を、それぞれ調べた。
【００８９】
図５は、各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化の測定結果を表したクラスター図である。（ａ）は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＤＩＧ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。（ｂ）は、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＦＩＴＣ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。●はＰＳＣＤＡ０１８２の結果を、▲はＰＳＣＤＡ０１９４の結果を、○はＰＳＣＤＡ０２０６の結果を、△はＰＳＣＤＡ０５３２の結果を、▽はＰＳＣＤＡ００１５の結果を、▼はＰＳＣＤＡ００２９の結果を、×はネガティブコントロールの結果を、それぞれ示している。
【００９０】
６種全てのヒトゲノム検体において、抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた場合にＡ８００が大きくなった。これに対して、抗ＤＩＧ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた場合には、ＰＳＣＤＡ０１８２と０１９４ではＡ８００が大きくなっていたが、他の４種のヒトゲノム検体ではＡ８００はあまり変化しなかった。
一方、６種全てのヒトゲノム検体において、抗ＦＩＴＣ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた場合にＡ８００が大きくなった。これに対して、抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた場合には、ＰＳＣＤＡ０２０６と０５３２ではＡ８００が大きくなっていたが、他の４種のヒトゲノム検体ではＡ８００はあまり変化しなかった。
さらに、ネガティブコントロールでは、いずれの場合でもＡ８００の変化はほとんど観察されなかった。
【００９１】
つまり、ＰＳＣＤＡ０２０６と０５３２はＶＫＯＲＣ１（１１７３ＣＴ／Ｔ）かつＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ／Ｃ）であり、ＰＳＣＤＡ０１８２及び０１９４はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ／Ｔ）かつＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ／Ａ）であり、ＰＳＣＤＡ００１５及び００２９はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ／Ｔ）かつＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ／Ａ）であるという結果が得られた。該結果は、シークエンス解析による多型判定の結果と一致しており、本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ）フォワードプライマー、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ）フォワードプライマー、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ｃ）フォワードプライマー、及びＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）リバースプライマーを、１の反応溶液に同時に用いてＰＣＲ増幅をすることにより、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出できることが明らかである。
【００９２】
［実施例４］
５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）に代えて５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）を用いた以外は、実施例３と同様にして、３種類のヒトゲノム検体（ＰＳＣＤＡ０２０６、０１８２、０００９）のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出した。  
【００９３】
図６は、各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化の測定結果を表したクラスター図である。（ａ）は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＤＩＧ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。（ｂ）は、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＦＩＴＣ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。●はＰＳＣＤＡ０１８２の結果を、○はＰＳＣＤＡ０２０６の結果を、▲はＰＳＣＤＡ０００９の結果を、×はネガティブコントロールの結果を、それぞれ示している。
【００９４】
３種全てのヒトゲノム検体において、抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた場合にＡ８００が大きくなった。これに対して、抗ＤＩＧ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた場合には、ＰＳＣＤＡ０１８２ではＡ８００が大きくなっていたが、他の２種のヒトゲノム検体ではＡ８００はあまり変化しなかった。
一方、３種全てのヒトゲノム検体において、抗ＦＩＴＣ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた場合にＡ８００が大きくなった。これに対して、抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた場合には、ＰＳＣＤＡ０２０６ではＡ８００が大きくなっていたが、他の２種のヒトゲノム検体ではＡ８００はあまり変化しなかった。
さらに、ネガティブコントロールでは、いずれの場合でもＡ８００の変化はほとんど観察されなかった。
【００９５】
つまり、ＰＳＣＤＡ０２０６はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ／Ｔ）かつＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ／Ｃ）であり、ＰＳＣＤＡ０１８２はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ／Ｔ）かつＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ／Ａ）であり、ＰＳＣＤＡ０００９はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ／Ｔ）かつＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ／Ａ）であるという結果が得られた。該結果は、シークエンス解析による多型判定の結果と一致しており、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）に代えてＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）を用いた場合であっても、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出できることが明らかである。
【００９６】
［実施例５］
５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）に代えて５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）を用いた以外は、実施例３と同様にして、３種類のヒトゲノム検体（ＰＳＣＤＡ０２０６、０１８２、０００９）のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出した。
実施例４の結果と同様に、３種全てのヒトゲノム検体において、抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた場合にＡ８００が大きくなった。これに対して、抗ＤＩＧ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた場合には、ＰＳＣＤＡ０１８２ではＡ８００が大きくなっていたが、他の２種のヒトゲノム検体ではＡ８００はあまり変化しなかった。
一方、３種全てのヒトゲノム検体において、抗ＦＩＴＣ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた場合にＡ８００が大きくなった。これに対して、抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた場合には、ＰＳＣＤＡ０２０６ではＡ８００が大きくなっていたが、他の２種のヒトゲノム検体ではＡ８００はあまり変化しなかった。
さらに、ネガティブコントロールでは、いずれの場合でもＡ８００の変化はほとんど観察されなかった。
したがって、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）に代えてＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）を用いた場合であっても、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出できることが明らかである。
【００９７】
［実施例６］
５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）に代えて５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）を用いた以外は、実施例３と同様にして、３種類のヒトゲノム検体（ＰＳＣＤＡ０２０６、０１８２、０００９）のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出した。
実施例４の結果と同様に、３種全てのヒトゲノム検体において、抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた場合にＡ８００が大きくなった。これに対して、抗ＤＩＧ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた場合には、ＰＳＣＤＡ０１８２ではＡ８００が大きくなっていたが、他の２種のヒトゲノム検体ではＡ８００はあまり変化しなかった。
一方、３種全てのヒトゲノム検体において、抗ＦＩＴＣ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた場合にＡ８００が大きくなった。これに対して、抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた場合には、ＰＳＣＤＡ０２０６ではＡ８００が大きくなっていたが、他の２種のヒトゲノム検体ではＡ８００はあまり変化しなかった。
さらに、ネガティブコントロールでは、いずれの場合でもＡ８００の変化はほとんど観察されなかった。
したがって、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）に代えてＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）を用いた場合であっても、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出できることが明らかである。
【００９８】
［実施例７］
５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）に代えて５’ＦＩＴＣ化ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）を用いた以外は、実施例３と同様にして、３種類のヒトゲノム検体（ＰＳＣＤＡ０２０６、０１８２、０００９）のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出した。
実施例４の結果と同様に、３種全てのヒトゲノム検体において、抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた場合にＡ８００が大きくなった。これに対して、抗ＤＩＧ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた場合には、ＰＳＣＤＡ０１８２ではＡ８００が大きくなっていたが、他の２種のヒトゲノム検体ではＡ８００はあまり変化しなかった。
一方、３種全てのヒトゲノム検体において、抗ＦＩＴＣ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた場合にＡ８００が大きくなった。これに対して、抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた場合には、ＰＳＣＤＡ０２０６ではＡ８００が大きくなっていたが、他の２種のヒトゲノム検体ではＡ８００はあまり変化しなかった。
さらに、ネガティブコントロールでは、いずれの場合でもＡ８００の変化はほとんど観察されなかった。
したがって、ＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）に代えてＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）を用いた場合であっても、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）とＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出できることが明らかである。
【００９９】
［実施例８］
フォワードプライマーとして、配列番号１の塩基配列を有するプライマー｛ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ｔ）｝又は配列番号１２の塩基配列を有するプライマー｛ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ａ）｝を、リバースプライマーとしてＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１１３０Ｔ）を、鋳型として２種類のヒトゲノム検体（ＰＳＣＤＡ０２１０及び０５３２）を、それぞれ用いてＰＣＲを行った。なお、配列番号１２の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ａ）は、３’末端から３番目の塩基がＡであること以外は、全て配列番号１の塩基配列を有するＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ｔ）と同一のプライマーである。
まず、３１μＬのｍｉｌｌｉＱ水に、６μＬの５×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）、５μＬのｄＮＴＰ（２ｍＭ）、２μＬの硫酸マグネシウム（２５ｍＭ）、１μＬのヒトゲノム検体（２０ｎｇ／μＬ）、２．５μＬのフォワードプライマー、２．５μＬのリバースプライマー、及び１μＬのＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を加え、反応溶液を調製した。該反応溶液を、９４℃で５分間の変性工程、次に９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間を３５サイクルの増幅工程、６８℃で２分間の伸長工程、からなる反応条件によりＰＣＲを行った。アガロース電気泳動により、得られたＰＣＲ産物を分離した後、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００  ＢＩＯＡＮＡＬＹＺＥＲ（ＤＮＡ１０００ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いてバンドパターンを確認した。
【０１００】
得られたバンドパターンを図７に示す。（ａ）はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ｔ）とＰＳＣＤＡ０２１０を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンであり、（ｂ）はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ｔ）とＰＳＣＤＡ０５３２を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンであり、（ｃ）はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ａ）とＰＳＣＤＡ０２１０を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンであり、（ｄ）はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ａ）とＰＳＣＤＡ０５３２を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンである。矢印アがＰＣＲ産物のバンドであり、矢印イとウはマーカーのバンドである。（ａ）、（ｃ）、及び（ｄ）において、ＰＣＲ産物のバンドが検出された。
【０１０１】
シークエンス解析の結果から、ＰＳＣＤＡ０２１０はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ／Ｔ）であり、ＰＳＣＤＡ０５３２はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｔ／Ｔ）であった。実際に、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ｔ）により、ＰＳＣＤＡ０２１０ではＰＣＲ産物が検出されたが、ＰＳＣＤＡ０５３２では検出されなかった。一方、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ａ）により、ＰＳＣＤＡ０２１０とＰＳＣＤＡ０５３２の両方でＰＣＲ産物が検出された。つまり、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ａ）では、ミス伸長による非特異的なＰＣＲ増幅が起こっていた。
この結果から、３’末端から３番目の塩基がＴであることにより、本発明のＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）フォワードプライマーが、非常に特異性に優れていることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明のプライマーを用いることにより、高精度かつ簡便にＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）やＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）を検出することができるため、ワルファリン投与量予測のために重要なワルファリン代謝能の個人差を迅速に予測することが可能となり、医療機関等における検体の遺伝子解析等の分野において利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）近隣のＶＫＯＲＣ１遺伝子の塩基配列を示した図である。枠で囲まれた塩基Ｃが検出対象である１１７３位の塩基である。また、大文字Ｔ０がＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１１３０Ｔ）の３’末端から３番目の塩基Ｔであり、大文字Ｇ１がＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０７０Ｇ）の３’末端から３番目の塩基Ｇであり、大文字Ａ２がＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６８Ａ）の３’末端から３番目の塩基Ａであり、大文字Ｇ３がＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６２Ｇ）の３’末端から３番目の塩基Ｇであり、大文字Ａ４がＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６１Ａ）の３’末端から３番目の塩基Ａであり、大文字Ｃ５がＶＫＯＲＣ１リバースプライマー（１０６０Ｃ）の３’末端から３番目の塩基Ｃである。
【図２】ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）近隣のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の塩基配列を示した図である。枠で囲まれた塩基Ａが検出対象である１０７５位の塩基である。また、大文字Ａが、１１０７位の塩基Ａである。
【図３】実施例１において、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＤＩＧ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。●はＰＳＣＤＡ０１８２の結果を、○はＰＳＣＤＡ０２０６の結果を、▲はＰＳＣＤＡ０００９の結果を、×はネガティブコントロールの結果を、それぞれ示している。
【図４】実施例２において、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＦＩＴＣ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。●はＰＳＣＤＡ０１８２の結果を、○はＰＳＣＤＡ０２０６の結果を、▲はＰＳＣＤＡ０００９の結果を、×はネガティブコントロールの結果を、それぞれ示している。
【図５】実施例３において、各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化の測定結果を表したクラスター図である。（ａ）は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＤＩＧ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。（ｂ）は、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＦＩＴＣ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。●はＰＳＣＤＡ０１８２の結果を、▲はＰＳＣＤＡ０１９４の結果を、○はＰＳＣＤＡ０２０６の結果を、△はＰＳＣＤＡ０５３２の結果を、▽はＰＳＣＤＡ００１５の結果を、▼はＰＳＣＤＡ００２９の結果を、×はネガティブコントロールの結果を、それぞれ示している。
【図６】実施例４において、各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化の測定結果を表したクラスター図である。（ａ）は、ＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ＞Ｔ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＤＩＧ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ＦＩＴＣ分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。（ｂ）は、ＣＹＰ２Ｃ９（１０７５Ａ＞Ｃ）の検出結果を表したクラスター図である。縦軸を抗ＦＩＴＣ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とし、横軸を抗ＤＮＰ分散性微粒子と抗ビオチン分散性微粒子を加えた時の各ＰＣＲ済反応溶液のＡ８００の変化とした。●はＰＳＣＤＡ０１８２の結果を、○はＰＳＣＤＡ０２０６の結果を、▲はＰＳＣＤＡ０００９の結果を、×はネガティブコントロールの結果を、それぞれ示している。
【図７】実施例８において、得られたバンドパターンを示した図である。（ａ）はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ｔ）とＰＳＣＤＡ０２１０を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンであり、（ｂ）はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ｔ）とＰＳＣＤＡ０５３２を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンであり、（ｃ）はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ａ）とＰＳＣＤＡ０２１０を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンであり、（ｄ）はＶＫＯＲＣ１（１１７３Ｃ）フォワードプライマー（Ａ）とＰＳＣＤＡ０５３２を用いて得たＰＣＲ産物のバンドパターンである。矢印アがＰＣＲ産物のバンドであり、矢印イとウはマーカーのバンドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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