(57)【要約】【課題】ＨＣＶに持続感染していても、肝細胞癌のような重篤な肝疾患に進展せずにその発症を防止することができる簡便で有効な予防法や治療法に用いられる肝疾患発症防止薬剤を提供する。【解決手段】肝疾患発症防止薬剤は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α抑制剤を含んでおり、それによりその受容体の持続的活性化が阻害又は低減して抑制され、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染誘発性の肝疾患の発症が予防、抑制、及び／又は遅延されて防止されるというものである。また、肝疾患発症防止薬剤は、脂肪肝及び／又はそれの病因症状の発症を、予防、抑制、及び／又は遅延する脂肪肝改善剤を含んでおり、それが、脂肪肝及び／又はそれの病因症状の発症を、予防、抑制、及び／又は遅延することにより、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染誘発性の肝疾患の発症が、予防、抑制、及び／又は遅延されて防止されるというものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α抑制剤を含んでおり、それによりその受容体の持続的活性化が阻害又は低減して抑制され、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染誘発性の肝疾患の発症が予防、抑制、及び／又は遅延されて防止されることを特徴とする肝疾患発症防止薬剤。
【請求項２】
前記ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α抑制剤が、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体αアンタゴニストであることを特徴とする請求項１に記載の肝疾患発症防止薬剤。
【請求項３】
前記ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体αアンタゴニストが、２-クロロ-５-ニトロ-Ｎ-（ピリジル）ベンツアミド、３-[３-tert-ブチルチオ-１-(４-クロロベンジル)-５-イソプロピル-１Ｈ-インドール-２-イル]-２,２-ジメチルプロピオン酸、及びそれらの薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも１種類であることを特徴とする請求項２に記載の肝疾患発症防止薬剤。
【請求項４】
脂肪肝及び／又はそれの病因症状の発症を、予防、抑制、及び／又は遅延する脂肪肝改善剤を含んでおり、それが、脂肪肝及び／又はそれの病因症状の発症を、予防、抑制、及び／又は遅延することにより、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染誘発性の肝疾患の発症が、予防、抑制、及び／又は遅延されて防止されることを特徴とする肝疾患発症防止薬剤。
【請求項５】
前記脂肪肝改善剤が、エイコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸エステル、並びにそれらの薬学的に許容される塩、及びフィブラート系化合物から選ばれる少なくとも１種類の化合物であることを特徴とする請求項４に記載の肝疾患発症防止薬剤。
【請求項６】
請求項１〜５の何れかに記載の肝疾患発症防止薬剤を含有しており、脂肪肝及び／又はそれの病因症状の発症を、予防、抑制、及び／又は遅延することを特徴とする飲食品。
【請求項７】
Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパクトランスジェニックマウスからなり、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染誘発性の肝疾患症状の発症を防止する薬物の峻別に用いられることを特徴とする動物モデル。
【請求項８】
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体αの活性化抑制剤を含む肝疾患発症防止薬剤の投与によって、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体αの持続的活性化が、阻害又は低減されて抑制されることにより、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染誘発性の肝疾患症状の発症が、予防、抑制、及び／又は遅延されて防止される前記Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパクトランスジェニックマウスからなり、その候補薬物の投与による前記防止を指標に、前記肝疾患発症防止薬剤を峻別するのに用いられることを特徴とする請求項７に記載の動物モデル。
【請求項９】
脂肪肝及び／又はそれの病因症状の発症を予防、抑制、及び／又は遅延する脂肪肝改善剤の投与によって、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染誘発性の肝疾患症状の発症が、予防、抑制、及び／又は遅延されて防止される前記Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパクトランスジェニックマウスからなり、その候補薬物の投与による前記防止を指標に、前記脂肪肝改善剤を峻別するのに用いられることを特徴とする請求項７に記載の動物モデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に持続感染することを病因とする脂肪肝（肝脂肪変性症）、肝細胞癌のような肝疾患の発症を防止する薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶ持続感染は、深刻な衰弱性の疾患である慢性肝疾患の主要な病因の一つである。このＨＣＶ持続感染患者は、高い発症率で、肝硬変、肝細胞癌のような重篤な肝疾患へ進展する。
【０００３】
このようなＨＣＶ感染は、我が国での原発性肝細胞癌の病因として、最も頻度の高いものである。またＨＣＶ感染で誘発される肝細胞癌は、我が国のみならず全世界でこの２０年間増加傾向にあり、特に米国で今後数十年間に急増すると言われている。
【０００４】
このようなＨＣＶ持続感染が、肝細胞癌発生に介在しているという機序の詳細は、依然としてよく分かっていない。
【０００５】
ＨＣＶ持続感染に対する根本的治療方法は、インターフェロン投与によりウイルスを排除するというものである。例えば特許文献１に、第１型のインターフェロンαと、ポリエチレングリコール部分を含む第２型のインターフェロンαとを含む組成物を投与して、肝炎ウイルス感染症を治療する方法が記載されている。しかしインターフェロンが奏効しない症例、そして加齢や重篤な全身状態の所為でインターフェロンが投与し難い症例も多数存在し、さらに経済的理由により非常に高価なインターフェロン治療を希望しない症例があるなど、その治療に限界がある。
【０００６】
しかも、ＨＣＶ感染で誘発された肝細胞癌の最大の特徴は、その再発率が高いということである。ＨＣＶ感染による肝細胞癌の場合、手術で完全にその病巣を摘出しても、非癌部の背景肝から高率に再発する。そのため、患者への侵襲・負担が増大してしまうという観点のみならず、国家の医療経済の観点からも、重大な問題となっている。
【０００７】
従って、ＨＣＶにより誘発される肝細胞癌の発症機序解明と、その機序に基づいた簡便で有効な予防法・治療法の確立が急務である。
【０００８】
ＨＣＶ持続感染症では、他のウイルス性慢性肝疾患に比べ、脂肪肝が高率に合併することが知られている。またＨＣＶ持続感染者において、脂肪肝は肝細胞癌発生の強力な予測因子であることが、我が国での疫学調査で明らかにされている。さらにＨＣＶの構成成分であるコアタンパクを持続的に肝臓に発現させたトランスジェニックマウス（ＨＣＶｃｐＴｇマウス）は、著明な脂肪肝を呈し、さらに加齢に伴い肝細胞癌を発症する。これらは、ＨＣＶ持続感染症における肝細胞癌の発症機構と、脂肪肝との密接な関連を、強く示唆している。
【０００９】
【特許文献１】特表２００５−５１７６４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、ＨＣＶに持続的に感染していても、脂肪肝、肝細胞癌のような肝疾患に進展せずにその発症を防止することができる、簡便で有効な予防法や治療法に用いられる肝疾患発症防止薬剤、それを含む飲食品、及びその候補薬物を探索したりそれらの肝疾患の発症やその防止の機序解明をしたりするための動物モデルを提供することを目的とする。
【００１１】
本発明者らは、ＨＣＶｃｐＴｇマウスでの実験を通して、核内受容体であるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）、特に肝臓における脂質代謝の中心的役割を果たしているＰＰＡＲαの活性化が、脂肪肝や肝細胞癌の発生に強い因果関係があることを見出し、その機序に基づいて、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載の肝疾患発症防止薬剤は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α抑制剤を含んでおり、それによりその受容体の持続的活性化が阻害又は低減して抑制され、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染誘発性の肝疾患の発症が予防、抑制、及び／又は遅延されて防止されることを特徴とする。
【００１３】
請求項２に記載の肝疾患発症防止薬剤は、請求項１に記載されたもので、前記ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α抑制剤が、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体αアンタゴニストであることを特徴とする。
【００１４】
請求項３に記載の肝疾患発症防止薬剤は、請求項２に記載されたもので、前記ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体αアンタゴニストが、２-クロロ-５-ニトロ-Ｎ-（ピリジル）ベンツアミド、３-[３-tert-ブチルチオ-１-(４-クロロベンジル)-５-イソプロピル-１Ｈ-インドール-２-イル]-２,２-ジメチルプロピオン酸、及びそれらの薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも１種類であることを特徴とする。
【００１５】
請求項４に記載の肝疾患発症防止薬剤は、脂肪肝及び／又はそれの病因症状の発症を、予防、抑制、及び／又は遅延する脂肪肝改善剤を含んでおり、それが、脂肪肝及び／又はそれの病因症状の発症を、予防、抑制、及び／又は遅延することにより、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染誘発性の肝疾患の発症が、予防、抑制、及び／又は遅延されて防止されることを特徴とする。
【００１６】
請求項５に記載の肝疾患発症防止薬剤は、請求項４に記載されたもので、前記脂肪肝改善剤が、エイコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸エステル、並びにそれらの薬学的に許容される塩、及びフィブラート系化合物から選ばれる少なくとも１種類の化合物であることを特徴とする。
【００１７】
請求項６に記載の飲食品は、請求項１〜５の何れかに記載の肝疾患発症防止薬剤を含有しており、脂肪肝及び／又はそれの病因症状の発症を、予防、抑制、及び／又は遅延することを特徴とする。脂肪肝の病因症状は、肥満やメタボリックシンドロームのように脂肪肝に関連した病的状況であり、肝疾患発症防止薬剤の薬効により、改善される。
【００１８】
請求項７に記載の動物モデルは、Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパクトランスジェニックマウスからなり、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染誘発性の肝疾患症状の発症を防止する薬物の峻別に用いられることを特徴とする。このマウスは、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパクの遺伝子を有するペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α野生型マウスからなり、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体αの持続的・自発的活性化によりＣ型肝炎ウイルス持続感染誘発性の肝疾患症状を発症するというものである。
【００１９】
請求項８に記載の動物モデルは、請求項７に記載されたもので、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体αの活性化抑制剤を含む肝疾患発症防止薬剤の投与によって、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体αの持続的活性化が、阻害又は低減されて抑制されることにより、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染誘発性の肝疾患症状の発症が、予防、抑制、及び／又は遅延されて防止される前記Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパクトランスジェニックマウスからなり、その候補薬物の投与による前記防止を指標に、前記肝疾患発症防止薬剤を峻別するのに用いられることを特徴とする。
【００２０】
請求項９に記載の動物モデルは、請求項７に記載されたもので、脂肪肝及び／又はそれの病因症状の発症を予防、抑制、及び／又は遅延する脂肪肝改善剤の投与によって、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染誘発性の肝疾患症状の発症が、予防、抑制、及び／又は遅延されて防止される前記Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパクトランスジェニックマウスからなり、その候補薬物の投与による前記防止を指標に、前記脂肪肝改善剤を峻別するのに用いられることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の肝疾患発症防止の動物モデルから、ＨＣＶコアタンパクによる脂肪肝・肝細胞癌等の肝疾患の発症に、ＰＰＡＲαの持続的かつ強力な活性化が必須であり、ＰＰＡＲαの活性化が生じなければ、ＨＣＶコアタンパクが存在しても、これらの肝疾患が生じないことが分かった。
【００２２】
その機序に基づいた本発明のＰＰＡＲαアンタゴニストのような肝疾患発症防止薬剤は、斬新であり、ＨＣＶに感染していてもそれによって誘発される重篤なこれらの肝疾患の発症を予防、抑制、遅延して防止するものである。
【００２３】
肝疾患発症防止薬剤は、ＰＰＡＲαの活性化を抑制したり低く維持したりする治療介入のための医薬品として、また生活習慣病を是正するため食品や飲料品に添加される添加物として用いて、これらの肝疾患の発症を防止、又は改善・治癒するのに有用である。特に、ＨＣＶ誘発肝細胞癌の強力な発症予測因子である脂肪肝を合併しているＣ型慢性肝炎患者に肝疾患発症防止薬剤を投与すると、脂肪肝の改善のみならず、肝細胞癌の発症予防に有用である。さらにＨＣＶ誘発肝細胞癌治療後の再発予防にも、有用である。
【００２４】
本発明の肝疾患発症防止の動物モデルは、ＨＣＶの構成成分であるコアタンパクを持続的に肝臓に発現させたトランスジェニックマウス（ＨＣＶｃｐＴｇマウス）であるから、ＨＣＶ持続感染による肝細胞癌等の肝疾患発症機序を調べたり、肝疾患症状の発症を防止する薬物を探索したりするのに有用である。
【００２５】
ＨＣＶｃｐＴｇマウスの肝臓でのコアタンパクの発現量は、Ｃ型慢性肝炎患者の肝臓でのそれにほぼ等しい。Ｃ型慢性肝炎患者に高頻度で認められるのと同様に、ＨＣＶｃｐＴｇマウスでも加齢に伴い、重度の脂肪肝・耐糖能異常が生じる。従って、このマウスは、Ｃ型慢性肝炎患者の病的状況を適切に再現して反映する動物モデルとして、有用であり、病態を解析するのに妥当である。
【発明を実施するための好ましい形態】
【００２６】
以下、本発明の実施のための好ましい形態を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。
【００２７】
先ず、肝疾患発症防止の動物モデルについて、詳細に説明する。
【００２８】
ＨＣＶコアタンパクに肝発癌能があることが、従来の細胞レベルの研究で報告されていた。ＨＣＶコアタンパクが、肝細胞癌発生にどのように関与しているかを生体で調べるために、慢性ＨＣＶ感染患者の肝臓と同程度の量のＨＣＶコアタンパクが肝臓で発現しているトランスジェニックマウス系統を作製した。
【００２９】
このマウスは、３ヶ月齢乃至それ以降の早い段階で、脂肪肝やインスリン抵抗性を示し、１６〜１８ヶ月齢でその症状が悪化し、肝腺腫が約３０％のマウスに発症した。２２ヶ月齢では肝細胞癌が肝腺腫中に、典型的な所謂、結節内結節の状態で認められるようになった。このマウスは、肝細胞癌を発症するが、肝炎や肝線維症を認めない。このことは、ＨＣＶコアタンパクが、肝炎とは無関係に、脂肪肝や肝細胞癌を誘発することを示唆している。
【００３０】
一方、慢性ＨＣＶ感染患者での疫学研究によると、脂肪肝の存在が肝細胞癌発症の強力な促進因子の一つであるということが明らかになっている。さらに、酸化的ＤＮＡ損傷、ミトコンドリア異常、及び肝細胞増殖促進を惹き起こす細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）産生の増加が、脂肪の蓄積した肝細胞中で生じることが示されている。従って、肝細胞中の脂肪酸代謝の変調が、ＨＣＶコアタンパクによって誘発される肝細胞癌の病因と関連する可能性が推測された。
【００３１】
ところで、ＰＰＡＲは、ステロイド／甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリーに属するリガンド活性化核内受容体であり、α型、β／δ型、γ型と呼ばれる３つのアイソフォームが存在し、何れも肝細胞における脂肪酸／トリグリセリド代謝の恒常性維持に関係している。なかでもＰＰＡＲαは、脂肪酸代謝酵素をコードする遺伝子の転写活性を強力に調整しており、主に肝臓での脂肪酸の輸送と代謝の維持に関与している。
【００３２】
これらの知見に基づき、ＰＰＡＲαが、ＨＣＶコアタンパク発現トランスジェニック（ＨＣＶｃｐＴｇ）マウスでの肝細胞癌発生の一因であるという仮説を立てた。その仮説を検証するために、ＨＣＶコアタンパク遺伝子を有しているもので、ＰＰＡＲα野生型（ＰＰＡＲα＋／＋）マウス、ＰＰＡＲαヘテロノックアウト（ＰＰＡＲα＋／−）マウス、ＰＰＡＲαノックアウト（ＰＰＡＲα−／−）マウスを作製した。以下、それらをＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスと称することにする。それらの表現型の違いについて、実験を行った。
【００３３】
ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでは、顕著なＰＰＡＲα活性化が起こっているにも関わらず、重度の脂肪肝が認められた。その発症機序として、脂肪酸取り込みの亢進や、ミトコンドリア外膜の損傷によるミトコンドリアβ酸化能減退が挙げられた。肝細胞癌が２４ヶ月齢のＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの約３５％に発症していたが、他の遺伝子型のものには、全く発症していなかった。そのことから、ＰＰＡＲα活性化の持続がこれらの現象に密接に関わっていることが、判明した。
【００３４】
ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスには、ＰＰＡＲαやＨＣＶコアタンパクが十分量存在するにも関わらず、ＰＰＡＲα活性化やそれに関係する変化が、全く起こっていなかった。このことは、このマウスではＰＰＡＲαの発現量が少ないことに関連しているようであった。
【００３５】
しかし、ＰＰＡＲαアゴニストであるクロフィブラートをＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスに長期間投与し、ＰＰＡＲαの発現量を強制的に増加させ、ＰＰＡＲαの持続的活性化を促したところ、このマウスでも脂肪肝・ミトコンドリア異常・肝細胞癌が誘発された。
【００３６】
これらのことから、ＨＣＶにより誘発される脂肪肝や肝細胞癌の発症に、ＰＰＡＲαの存在ではなく、その持続的活性化が必須であることが、判明した。
【００３７】
このようなトランスジェニックマウスは、ＨＣＶ持続感染から肝疾患へ進展する機序を反映した動物モデルであるから、ＨＣＶ誘発肝疾患の予防法ないし治療法の探索に用いることができる。
【００３８】
そのような探索の結果、肝疾患発症予防薬として有用なＰＰＡＲα活性化抑制剤を見出した。ＰＰＡＲα活性化抑制剤は、例えばＰＰＡＲαアンタゴニストと称される薬剤群、より具体的には、２-クロロ-５-ニトロ-Ｎ-（ピリジル）ベンツアミド；３-[３-tert-ブチルチオ-１-(４-クロロベンジル)-５-イソプロピル-１Ｈ-インドール-２-イル]-２,２-ジメチルプロピオン酸、そのナトリウム塩であるＭＫ−８８６（シグマ社製；商品名）が挙げられる。ＰＰＡＲα活性化抑制剤は、遊離のものであってもよく、薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、ピロ硫酸塩、リン酸塩、メタリン酸塩で例示される無機酸塩；アルカリ金属塩、アルカリ土類金属で例示される金属塩；クエン酸塩、安息香酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩のような有機酸塩であってもよい。
【００３９】
肝疾患発症防止薬剤は、ＨＣＶ持続感染患者に投与する医薬品の形態にしてもよい。肝疾患発症防止薬剤医薬品は、液剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、座剤、散剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、又は軟膏剤の剤形にして、経口、注射、塗布、又は貼付して用いるものであってもよい。
【００４０】
肝疾患発症防止薬剤は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料、ｐＨ調整剤、防腐剤、媒質、生理食塩水、別な薬効を有する薬剤を添加剤として含有していてもよい。
【００４１】
肝疾患発症防止薬剤は、食品添加物として、ヨーグルト等の乳製品のような食品や、ジュース、水のような飲料品に、添加されていてもよい。
【００４２】
これらの医薬品や飲食品は、ＨＣＶ持続感染で脂肪肝、肝細胞癌が誘発してしまうのを防止するために、継続して摂取するものであることが好ましい。
【００４３】
肝疾患発症防止薬剤として、ＰＰＡＲαアンタゴニスト薬剤群の例を示したが、それに代えて脂肪肝改善剤、即ちエイコサペンタエン酸誘導体、例えばエイコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸エチルのようなエイコサペンタエン酸エステル、あるいはフィブラート系化合物、例えばべザフィブラート、クロフィブラート、ジムフィブラジールなどを用いてもよい。それらは、遊離のものであってもよく、前記と同様な薬学的に許容される塩であってもよく、前記と同様な製剤形態であってもよく、前記と同様な添加剤を含んでいてもよい。前記と同様な飲食品に添加されてもよい。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明の実施例を詳細に説明する。本発明の実施は、以下のようにして行った。
【００４５】
（方法１．トランスジェニックマウスの作製）
ＨＣＶｃｐＴｇマウスとＰＰＡＲα−／−マウスの作製は、Moriya,Kら,Ｊ.Gen.Virol.,78巻,1527-1531頁、Lee,S.S.ら,Mol.Cell.Biol.,15巻,3012-3022頁に記載の方法に準じた。
【００４６】
先ず、雄性ＨＣＶｃｐＴｇマウスと雌性ＰＰＡＲα−／−マウスとを交配することにより、ＨＣＶコアタンパク遺伝子を有するＦ１世代マウス（ＰＰＡＲα＋／−）を得た。これらを異種交配させて、ＨＣＶコアタンパク遺伝子を有するＦ２世代マウス（ＰＰＡＲα＋／＋、ＰＰＡＲα＋／−、ＰＰＡＲα−／−）を得た。さらに交配を進め、Ｆ４世代のＨＣＶコアタンパク遺伝子を有するＰＰＡＲα＋／＋マウス、ＰＰＡＲα＋／−マウス、及びＰＰＡＲα−／−マウス、即ちそれぞれＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスを作製し、一連の実験に供した。尚、肝細胞癌は選択的に雄性ＨＣＶｃｐＴｇマウスに発現するので、雄性マウスを対象に用いることにした。月齢を一致させた対照群として、コアタンパク遺伝子を有しない雄性ＰＰＡＲα＋／＋マウスを用いた。
【００４７】
遺伝子型を同定するため、マウスの尾からゲノムＤＮＡを単離し、それをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増殖させた。プライマー対は以下のものである。ＨＣＶコア遺伝子として、５'−ＧＣＣＣＡＣＡＧＧＡＣＧＴＴＡＡＧＴＴＣ−３'、及び５'−ＴＡＧＴＴＣＡＣＧＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＧ−３'、ＰＰＡＲα遺伝子として５'−ＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡ−３'、及び５'−ＡＡＡＣＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＧＴＧＣＴＧ−３'を用いた。ＰＣＲ法で得られたＨＣＶコア遺伝子及びＰＰＡＲα遺伝子の断片長はそれぞれ４６０塩基対と４７２塩基対であった。
【００４８】
飼育ケージに５匹ずつマウスを入れ通常の食餌を与え、指針に従い特定病原菌に感染させないようにした。その中からクロフィブラート投与実験用に、２ヶ月齢雄性ＰＰＡＲα＋／−マウスとＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスとを、無作為に各２群に分けた（各群２０匹）。一方の群には通常通りの食餌を与え、他群には０．０５(w/w)％クロフィブラート（和光純薬工業株式会社製）が含有された食餌を、２４ヶ月間与えた。全マウスを頚椎脱臼させて死亡させ、肝臓を摘出した。肝臓に腫瘍がある場合は、腫瘍部分を切除し残余の肝臓細胞を生化学分析に用いた。肝腫瘍は組織学的分析に用いた。全動物実験は、全米科学アカデミーが発行する動物実験に関する指針に基づき、国立大学法人信州大学医学部によって承認された上で、行った。
【００４９】
（方法２．核画分、ミトコンドリア画分、及び細胞画分の調製）
約４００ｍｇの肝組織を氷冷下で擂り潰し、１０(w/v)％となるように単離緩衝剤（２５０ｍＭショ糖、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、０．１％ウシ血清アルブミン含有１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液、ｐＨ７．４）に入れた。試料は冷却したダウンスホモジナイザー（Ｗｈｅａｔｏｎ社製）を用いて均質にした。得られたホモジネートを遠心加速度５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。上澄みを取り出し、得られた沈殿物を単離緩衝剤で再懸濁させ、それを遠心分離した。その沈殿物の画分をさらに懸濁し、それを遠心加速度２００００×ｇ、４℃で１時間遠心分離した。得られた沈殿物を核画分とした。合わせた上澄み画分を遠心加速度７８００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して、粗ミトコンドリア沈殿物を得た。得られた沈殿物を単離緩衝剤で再懸濁し、遠心加速度７８００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して、ミトコンドリア画分を得た。最後に、全上澄み画分を合わせ、遠心加速度２００００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した。得られた上澄みを細胞質画分とした。
【００５０】
（方法３．イムノブロット分析）
タンパク濃度は、タンパク測定キットＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ社製；商品名）を用いて比色分析で測定した。脂肪酸代謝酵素の分析については、肝細胞ミトコンドリア画分又は電気泳動用処理液で可溶化した肝臓（２０μｇタンパク）を１０％ドデシル硫酸ナトリウム−アクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）電気泳動で測定を行った。ＰＰＡＲα分析には、核画分（１００μｇタンパク）を用いた。その他のタンパクの分析は、全細胞溶解物又は各画分（５０μｇタンパク）を電気泳動することにより行った。電気泳動後、タンパクをニトロセルロース膜に移した。その後、一次抗体、続いてアルカリフォスファターゼ結合の二次抗体と反応させ、発色させた。シトクロムＣ、ＣＹＰ４Ａ１、カタラーゼ、ＰＰＡＲα等に対する一次抗体は市販されているものを使用した（シトクロムＣ抗体はＢＤＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、その他の抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）。電気泳動で得られたアクチン又はヒストンＨ１に対するバンドをローディング・コントロールとして用いた。アクチン又はヒストンＨ１のバンド強度を基準に、バンド強度で濃度の測定をし、対照であるＰＰＡＲα＋／＋非トランスジェニックマウスの場合との相対値で表した。
【００５１】
（方法４．ｍＲＮＡの解析）
肝臓の全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （株式会社キアゲン社製）を用いて抽出され、ｃＤＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を用いて調製した。ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｋｉｔ及びＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。ｍＲＮＡ濃度はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルと基準とし、ＰＰＡＲα＋／＋非トランスジェニックマウスの場合との相対値で表した。
【００５２】
（方法５．光学顕微鏡検査及び免疫組織学的検査）
各マウスから得た肝臓をブロック状の小片に切り分け、１０％ホルマリン含有リン酸緩衝生理食塩水に浸けて、パラフィンで包理した。パラフィン切片（４μｍ厚）はヘマトキシリン及びエオジンで染色した。ＰＣＮＡ及び８−ＯＨｄＧの免疫組織化学的測定をするために、肝臓をリン酸緩衝生理食塩水−４％パラホルムアルデヒドで固定し、同様にパラフィンで包理した。その切片（４μｍ厚）をスライドガラスに付し、ＰＣＮＡ（１：１００希釈；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）又は８−ＯＨｄＧ（１：１０希釈；日本老化制御研究所製）に対するマウス・モノクローナル抗体と一晩反応させた。切片は３，３'−ジアミノベンジジンを基質として用いたＥｎＶｉｓｉｏｎ＋  ｋｉｔ（ＤＡＫＯ社製）により免疫染色に付された。４００倍の顕微鏡視野から無作為に選んだ１０視野において、ＰＣＮＡ又は８−ＯＨｄＧ陽性の肝細胞数を計測した。各マウスにつき肝細胞２０００個を分析し、免疫染色された肝細胞核の数を全体のパーセントで表した。
【００５３】
（方法６．肝細胞アポトーシスの評価）
ＭＥＢＳＴＡＩＮ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｋｉｔ  ＩＩ（医学生物学研究所製）を用いてＴＵＮＥＬ分析を行った。各マウスにつき肝細胞２０００個を分析し、免疫染色された肝細胞核の数を全体のパーセントで表した。
【００５４】
（方法７．パルス・ラベル及びパルス・チェイス実験）
肝細胞を体内潅流方法により単離した。０．０５％のコラゲナーゼ溶液（和光純薬工業株式会社製）による潅流後、単離された肝細胞を分画遠心法により３回洗浄し、死滅細胞をＰｅｒｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）の密度勾配遠心分離法により除去した。生存肝細胞を洗浄し、５％のウシ胎仔血清を有するＷｉｌｌｉａｍ'ｓ  Ｅ培地に懸濁させた。トリパンブルー分染法によって測定した単離肝細胞の生存率が８５％を超えていた場合、以下の実験を行った。単離肝細胞を２回洗浄し、５％の透析リン酸緩衝生理食塩水を有する遊離メチオニン培地で３７℃で１時間培養した。３００ｍＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を有する同様な培地に取り換え３時間培養した後、標識培地を標準培地と取り換え、３時間、６時間、１２時間後に調製した。標識細胞を洗浄、均質化、遠心分離して核画分を調製した。パルスラベルされたホモジネートの放射能レベルはトランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスとで類似していた。これは前者の肝細胞中の［３５Ｓ］メチオニン吸収能力が後者のそれと類似していることを示唆している。核画分をＲＩＰＡ緩衝剤［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ７．４、０．２％デオキシコール酸ナトリウム、０．２％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．１％ＳＤＳ、０．２５ＭのＰＭＳＦ、１０ｍｇ／ｍＬアプロチニン］に溶解した。その溶解物を精製抗ＰＰＡＲα抗体により４℃で３時間反応させた。免疫複合体はアガロースビーズに結合した黄色ブドウ球菌タンパクＡによって沈殿させた。沈殿物をＲＩＰＡ緩衝剤で洗浄後、識別タンパクを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動分離させ、オートラジオグラフィーにより視覚化した。
【００５５】
（方法８．脂肪酸取り込み分析）
脂肪酸取り込みは、Graulet,Bら、J.Biochem.,124巻,1212-1219頁に準じた改良法で行った。各群３匹のマウスを一晩絶食させた。肝臓をすばやく摘出し、それを冷却した食塩水ですすぎ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて５００μｍの厚さの切片に切断した。約１５０ｍｇの調製直後の肝臓（６〜８枚の肝臓切片）をｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｐｌａｓｔｉｃ  ｃｅｎｔｅｒ  ｗｅｌｌｓ（Ｋｏｎｔｅｓ社製）を備えた２５ｍｌのフラスコに設置されたステンレス製の格子におき、脂肪酸が無いＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）により３７℃で２時間培養した。次に、培地を抗生物質混合物とウシ血清アルブミン（パルミチン酸：アルブミンモル比４：１）と０．８ｍＭ［１−１４Ｃ］パルミチン酸（４ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）が添加された新しいＲＰＭＩ−１６４０培地に取り換えた。７時間培養した後、培地を回収し薄片を２ｍｌの食塩水で洗浄し、Ｔｒｉｓ緩衝剤（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ）で均質化した。脂肪酸取り込みはＣＯ２及びケトン体に変換したパルミチン酸と溶媒後の全細胞脂質に合わせたパルミチン酸の合計で算出した。肝臓切片によるＣＯ２生成物を測定するために、中央のくぼみを、４ｍｌのシンチレーション混合物を含むシンチレーション瓶に設置し、放射能を計測した。ケトン体の生成を測定するために、一定分量の培地（５００μl）と肝臓のホモジネート（２５０μl）を冷却した２００ｍＭ過塩素酸で処理し、３０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離機にかけた。ケトン体を有する分注液をシンチレーション瓶に入れ、放射能を計測した。全細胞脂質を、肝臓ホモジネートからFolch法に従い抽出し、シンチレーション瓶に回収し、空気を吹きかけて蒸発させて乾燥させた後、放射能を測定した。実験を３回繰り返し、パルミチン酸取り込みをＰＰＡＲα＋／＋非トランスジェニックマウスの場合との相対値で表した。
【００５６】
（方法９．他の方法）
脂質及び過酸化脂質の肝臓内濃度を測定するために、全脂質を、Folch法に準じて抽出した。トリグリセリドと遊離脂肪酸をＴｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  Ｅ−ｔｅｓｔ  ｋｉｔとＮＥＦＡ  Ｃ−ｔｅｓｔ  ｋｉｔ（和光純薬工業株式会社製）を用いてそれぞれ測定した。過酸化脂質（マロンジアルデヒド及び４−ヒドロキシアルケナール）を、ＬＰＯ−５８６  ｋｉｔ（ＯＸＩＳ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）で測定した。肝臓のβ酸化活性を、Aoyama,Tらの方法(J.Biol.Chem.,273巻,5678-5684頁)に準じ測定した。カスパーゼ３活性を、Gurtu,Vらの方法（Anal.Biochem.,251巻,98-102頁）に準じ測定した。血漿グルコースとインスリン値をＧｌｕｃｏｓｅ  ＣＩＩ−ｔｅｓｔ  ｋｉｔ（和光純薬工業株式会社製）とｍｏｕｓｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｕ−ｔｙｐｅ）ＡＫＲＩＮ−０３１（株式会社シバヤギ製）とを用いて測定した。
【００５７】
（方法１０．統計的解析）
量的変数ｔ検定、又は質的変数カイ二乗検定により、統計分析を行った。定量的データを平均値±標準偏差によって表した。ｐ値が０．０５未満のものを、統計的有意とみなした。
【００５８】
前記方法に従って行った実施の結果を、以下に示す。
【００５９】
（結果１．トランスジェニックマウスでのＨＣＶコアタンパクの発現）
ＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスは外見上健康で、両遺伝子型のマウスの体重は、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇ及びＰＰＡＲα＋／＋マウスとほぼ同じであった。９ヶ月齢のトランスジェニックマウスのＨＣＶコアタンパクの肝臓での発現を、イムノブロット分析によって測定したところ、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの間で、ほぼ同じであり、さらに既に報告されているＨＣＶｃｐＴｇマウスの発現ともほぼ同じであった。月齢、性別は、ＨＣＶコアタンパクの発現量に殆ど影響がなかった。
【００６０】
（結果２．脂肪肝の発症に対するＰＰＡＲαの必要性）
各マウス系における９ヶ月齢の雄ＨＣＶｃｐＴｇマウスの肝臓を用いて実験を行った。ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの肝臓は、柔らかく黄色調で、組織学的に脂肪肝を呈していたが、肝炎や肝細胞壊死は明らかではなかった。肝臓から抽出した脂質の解析でも、トリグリセリドの著しい蓄積が認められた。それに対し、９ヶ月齢のＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの肝臓は、組織学的異常もトリグリセリドの蓄積も、認められなかった（図１参照。各群ともｎ＝６。ａ,ｂ,ｃは各々ＰＰＡＲα＋／＋非トランスジェニックマウス、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスに対しＰ＜０．０５であることを示し、以下同様である）。ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの肝臓での遊離脂肪酸含量は、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、又はＨＣＶコアタンパクを発現しないＰＰＡＲα＋／＋マウスと比べ、約３倍であった。２４ヶ月齢のＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでも、脂肪肝が認められ、肝臓でのトリグリセリド含量が一層増加していた（図１参照）が、肝炎、肝細胞の変性・壊死、肝線維症は認められなかった。一方、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスには、脂肪肝が認められなかった（図１参照）。これらの結果は、脂肪肝がＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスで発症するが、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでは発症しないことを示している。
【００６１】
（結果３．トランスジェニックマウス肝臓での脂肪酸／トリグリセリドの代謝）
ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでの重篤な脂肪肝の発症のメカニズムを調べるために、９ヶ月齢マウスの肝臓での脂肪酸／トリグリセリドの代謝に関与する遺伝子発現について、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて分析した。図２（各群ともｎ＝６）に示すように、ｄｅ  ｎｏｖｏ脂質生合成（脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）、アセチル−ＣｏＡ  カルボキシラーゼ（ＡＣＣ））や、極低密度リポタンパクの分泌（ミクロソーム転移タンパク（ＭＴＰ）及びアポＢ（ＡｐｏＢ））に関与する遺伝子のｍＲＮＡ量は、全群で同様であった。肝細胞への脂肪酸の取り込みに関与している輸送担体（ＦＡＴ）や脂肪酸輸送タンパク（ＦＡＴＰ）のｍＲＮＡ量は、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでのみ著明に増加していた。しかし脂肪酸取り込みのもう一つの関連分子である肝性トリグリセリドリパーゼのｍＲＮＡ量は、未変化であった（不図示）。肝特異的脂肪酸結合タンパク（Ｌ−ＦＡＢＰ）のｍＲＮＡ量も、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでのみ上昇していた。ぺルオキシソーム及びミトコンドリアのβ酸化経路の律速酵素であるＡＯＸ及び中鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＭＣＡＤ）のｍＲＮＡ量は、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスで、各々かなり増加していた。脂肪酸取り込み能について、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでのみかなり促進されていた（図３Ａ参照）。さらに血漿脂肪酸濃度は、他群のマウスよりＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの方が、高かった。絶食下での血漿グルコース濃度は、何れの群でも相違がなかったが、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでのみ高インスリン血症が、認められた（図３Ｂ-１〜Ｂ-３参照。各群ともｎ＝６）。このことは、これらのマウス系で、インスリン抵抗性が生じていることを示唆した。同様な結果が、２４ヶ月齢マウスでも認められた（不図示）。これらの結果は、おそらくインスリン抵抗性によって惹き起こされた末梢での脂肪酸遊離促進による血漿脂肪酸濃度の増加や脂肪酸取り込み能の向上が、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスで観察された脂肪肝形成に矛盾しないことを示唆する。
【００６２】
（結果４．トランスジェニックマウスでのミトコンドリアβ酸化の減少）
主なβ酸化酵素の発現は顕著に増大しているが、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスに重篤な脂肪蓄積が認められた。一見矛盾したこの結果について検討するために、ペルオキシソーム及びミトコンドリアのβ酸化活性について、リグノセリン酸及びパルミチン酸を各々の基質として測定した。ＡＯＸ発現の増大に対応して、リグノセリン酸分解能は、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスで、増強していた。しかし、特にミトコンドリアで起こるパルミチン酸分解能は、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスやＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスに比べて、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでかなり減少していた（図３Ｃ参照。各群ともｎ＝６）。このように、ミトコンドリアβ酸化能の減少は、コアタンパクによって誘発される脂肪肝の有力な発症メカニズムの一つであると考えられる。
【００６３】
さらにミトコンドリア異常について検討した。電子顕微鏡で観察したところ、外膜の非連続性、及び内部構造の一様性が、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの肝臓のミトコンドリアで認められた。しかし、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスには、そのようなミトコンドリア異常が認められなかった。イムノブロット分析によれば、通常ミトコンドリアの膜間部位に局在するチトクロームｃは、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでは細胞質画分に存在していた。さらに、ミトコンドリア画分のイムノブロット分析をしたところ、ミトコンドリアのβ酸化の初期段階に不可欠な酵素であり主にミトコンドリアの外膜に局在する長鎖アシル−ＣｏＡ合成酵素（ＬＡＣＳ）とカルニチンパルミトイル−ＣｏＡトランスフェラーゼＩ型の発現量が、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでのみかなり減少していた。
【００６４】
ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスだけにミドコンドリア外膜の損傷、脂肪酸取り込み能の増大、及びミトコンドリア脂肪酸分解能の減少が生じるという結果から、ホモ型ＰＰＡＲαであることが、ＨＣＶコアタンパクによって誘発される脂肪肝の発症に、不可欠なものであることが示唆された。脂肪肝とそれに関連する変化は、ＨＣＶコアタンパクを発現しているＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでは、認められなかった。従って、このような変化は、コアタンパクのみによって惹き起こされるものではないと推察された。
【００６５】
（結果５．トランスジェニックマウスの肝癌発症に対するＰＰＡＲαの必要性）
９ヶ月齢のトランスジェニックマウスでは何れも、肝臓の結節が認められなかったが、２４ヶ月齢のＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの約３５％に、肉眼ではっきりと肝臓の結節が認められた（表１参照）。
【００６６】
【表１】
2009161489.tif 000002
【００６７】
顕微鏡観察したところ、これらの結節は肝細胞癌であった。同月齢のＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでは、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスで見られるのと同量のＨＣＶコアタンパクが存在しているにも関わらず、肝癌の発症が認められなかった（表１参照）。顕微鏡観察したところ、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウス、ＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの肝臓には、異常細胞や前癌病変が認められなかった。これらの結果は、ＨＣＶコアタンパクによって誘発される肝細胞癌発症に、ホモ型ＰＰＡＲαであることが不可欠であることを、明示している。
【００６８】
（結果６．ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスのみに見られる肝細胞増殖の促進）
持続的な肝細胞増殖が、肝細胞癌の発症を促進するかを調べるために、実験を行なった。体重に対する肝臓の重量比と、増殖細胞核内抗原（ＰＣＮＡ）を発現する肝細胞数との両方が、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでのみ増加していた（図４Ａ及びＢ参照。各群ともｎ＝６）。それとは対照的に、肝細胞のアポトーシスの指標であるＴＵＮＥＬ（terminal  deoxynucleotidyl  transferase-mediated  nick  end  labeling）陽性の肝細胞数と肝カスパーゼ３活性は、３系統のマウス間で、ほぼ同レベルであった（図４Ｃ及びＤ参照。各群ともｎ＝６）。ＨＣＶコアタンパクが存在するにも関わらず、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスやＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでのこれらの増殖やアポトーシスの指標の値は、ＰＰＡＲα＋／＋非トランスジェニックマウスのものと、ほとんど同等であった。癌原遺伝子（ｃ−Ｆｏｓ及びｃ−Ｍｙｃ）、細胞周期調節因子（サイクリンＤ１，サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）４、及びＰＣＮＡ、及びリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）１並びに２のように、肝細胞の増殖に関与している様々なタンパクの発現濃度は、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスで増加していたが、その他の遺伝子型のマウスでは増加していなかった。
【００６９】
（結果７．ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスのみにおける酸化ストレス及びＤＮＡ損傷の増大）
ＨＣＶコアタンパクは、ＲＯＳ産生増大に関与している。ＲＯＳ産生促進により、肝細胞癌発生を開始させる細胞核ＤＮＡ損傷が誘発され、細胞小器官が損傷される結果、機能性疾病が惹き起こされる。細胞核のＤＮＡの酸化的傷害の標識である８−ヒドロキシ−２'−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）に陽性の肝細胞数は、２４ヶ月齢のＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでのみ増加していた（図５Ａ参照。各群ともｎ＝６）。過酸化脂質は、９ヶ月齢のＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの肝臓で僅かに増加しており（不図示）、２４ヶ月齢のＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの肝臓で、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスやＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスやＰＰＡＲα＋／＋非トランスジェニックマウスの肝臓よりも、遥かに増加していた（図５Ｂ参照。各群ともｎ＝６）。代表的なＲＯＳ産生酵素（ＡＯＸ、及びチトクロームＰ４５０４Ａ１（ＣＹＰ４Ａ１））、及びＲＯＳ消去酵素（カタラーゼ、及びＣｕ,Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ））の発現について検討した。イムノブロット分析によれば、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでのみ、ＡＯＸやＣＹＰ４Ａ１の発現の著しい増大や、カタラーゼの発現の緩やかな増大が、認められた。Ｃｕ,Ｚｎ−ＳＯＤの変化は、トランスジェニックマウスの全群で認められなかった。これらの結果から、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスにおいて、酸化ストレスの促進が、細胞核ＤＮＡの傷害とミトコンドリアの損傷を惹き起こしていると思われる。
【００７０】
（結果８．ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでの持続的かつ自発的ＰＰＡＲα活性化）
ぺルオキシソーム増殖剤への長期間の曝露によって誘発される肝細胞癌形成や、それに関連する持続的肝細胞増殖・酸化ストレスの増大は、持続的なＰＰＡＲαの活性化に関わっている。ＰＰＡＲαの活性化について検討するために、ＰＰＡＲα活性化によって誘発されるＰＰＡＲαのｍＲＮＡ量を測定した。ＰＰＡＲαのｍＲＮＡ量は、９ヶ月齢のＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスで、ＰＰＡＲα＋／＋非トランスジェニックマウスよりも、高かった（図６Ａ参照。各群ともｎ＝６）。このような増加傾向は、２４ヶ月齢マウスで一層顕著であった。しかし、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスとＰＰＡＲα＋／−非トランスジェニックマウスとのＰＰＡＲαのｍＲＮＡ量は、９ヶ月齢でも２４ヶ月齢でも、相違が認められなかった。代表的なＰＰＡＲα標的遺伝子、例えばＦＡＴ，ＦＡＴＰ、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＡＯＸ、ＭＣＡＤ（図２参照）、ｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４，ＰＣＮＡ（図４参照）、ＣＹＰ４Ａ１（図５参照）は、その濃度が、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスで同調して増加するが、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスやＰＰＡＲα−／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでは増加していなかった。これらの結果から、持続的なＰＰＡＲα活性化が、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでのみ起こっていることが、確認できた。ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスで認められる様々な変化、例えば脂肪酸取り込みの増大、ミトコンドリア異常、脂肪蓄積、ＲＯＳ過剰産生、肝細胞増殖促進、及び肝細胞癌発生などが、持続的なＰＰＡＲα活性化と、密接に関係していると考えられる。
【００７１】
（結果９．細胞核のＰＰＡＲαの含量）
このような結果は、前記の通り、持続的なＰＰＡＲα活性化が、ＨＣＶコアタンパクによって誘発される脂肪肝形成や肝細胞癌発生に密接に関わっていることを示している。ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスが、顕著なＰＰＡＲα活性化の特性を示さず、またＨＣＣを発症しないのは、何故なのかを明らかにするために、細胞核ＰＰＡＲα含量を測定した。ＰＰＡＲαのイムノブロット分析によれば、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでの細胞核のＰＰＡＲαタンパクの量は、ＰＰＡＲα＋／＋非トランスジェニックマウスにおける量に比べ、約２〜３倍も増加していた。その増加は、約１．２〜１．６倍というＰＰＡＲαのｍＲＮＡ量の増加（図６Ａ参照）と、不釣合いであった。ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの細胞核でのＰＰＡＲα量は、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでのそれよりもかなり低く、ＰＰＡＲα＋／＋非トランスジェニックマウスでのそれと大体同程度であった。従って、ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスに比べて、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの細胞核での、より低いＰＰＡＲα量が主因となり、長期間の自発的なＰＰＡＲα活性化に必要な閾値を高めているのかもしれない。
【００７２】
細胞核でのＰＰＡＲα量の増加程度は、ＨＣＶｃｐＴｇマウスのＰＰＡＲαのｍＲＮＡ量の増加程度よりも、大きいようである（図６Ａ参照。各群ともｎ＝６）。このような相違について検討するために、細胞核でのＰＰＡＲαの安定性について、これらのマウスから得た肝細胞を用いたパルス−チェイス法によって、評価した。ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの細胞核でのＰＰＡＲαの半減期は、ＰＰＡＲα＋／＋非トランスジェニックマウスよりもかなり長かった（１１．５±２．３時間  対  ５．８±１．４時間、Ｐ＜０．０５、図６Ｂ参照）。
【００７３】
ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの細胞核でのＰＰＡＲαの半減期は、ＰＰＡＲα＋／−非トランスジェニックマウスに比べて、長くなる傾向であった（図６Ｂ参照）。これらの結果から、ＨＣＶコアタンパクのために、細胞核のＰＰＡＲαの安定性が、増大しているものと推察された。コアタンパクがレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）αと相互作用し、ＰＰＡＲαの安定性に影響していることは、おおむね予想されてきた。コアタンパクが、ＰＰＡＲα−ＲＸＲαへテロダイマーとの相互作用やＰＰＡＲαの安定化により、細胞核での作用に強く影響していることが、一連の研究結果から、より明確になった。
【００７４】
（結果１０．ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスにおけるクロフィブラート投与による脂肪肝と肝細胞癌の発症）
コアタンパク誘発性の病理学的変化についての、持続的ＰＰＡＲα活性化の意義を調べるために、ＰＰＡＲα＋／−マウスとＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスとを、２４ヶ月間、０．０５％クロフィブラート含有の標準食餌で、飼育した。同薬剤は代表的なＰＰＡＲαアゴニスト（活性化剤）である。クロフィブラート投与ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでは脂肪肝が認められたが、同条件で飼育したＰＰＡＲα＋／−マウスでは認められなかった（図７Ａ参照。各群ともｎ＝６）。クロフィブラートを投与したＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスにおいて、不連続な外膜を有する異常ミトコンドリアが検出され、かつ、パルミチン酸β酸化活性が減少することが観察された（図７Ｂ−１及びＢ−２参照。各群ともｎ＝６）。さらに、ＭＣＡＤのｍＲＮＡ、ＡＯＸ並びにＣＹＰ４Ａ１タンパク、ＰＰＡＲαのｍＲＮＡ、及び細胞核のＰＰＡＲαタンパクの各々の濃度は、クロフィブラート投与ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの方が、クロフィブラート投与ＰＰＡＲα＋／−マウスよりも、高かった（図７Ｃ及びＤ参照。各群ともｎ＝６）。このことは、前者の群でのＰＰＡＲα活性化の程度は、後者の群よりもはるかに大きく、クロフィブラート投与をしていないＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスと同様であるということを、示している。クロフィブラート投与した後の肝細胞癌の発生は、ＰＰＡＲα＋／−：ＨＣＶｃｐＴｇマウスの方が、ＰＰＡＲα＋／−マウスよりも高かった（２５％（２０匹中５匹）  対  ５％（２０匹中１匹））。これらのことから、トランスジェニックマウスでの脂肪肝や肝細胞癌の発症に、持続的なＰＰＡＲα活性化が必須であることが、さらに確定された。
【００７５】
以上をまとめると、以下の通りである。
【００７６】
ＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスでは、ＰＰＡＲα活性化、ミトコンドリア機能障害、及び脂肪肝が９ヶ月齢から２４ヶ月齢までの期間に生じ、２４ヶ月齢までに肝細胞癌が発症する。このモデルマウスの示す一連の特徴と経時変化を確定し、それらの分子機構を明確化した。
【００７７】
この結果は、ＨＣＶコアタンパクが誘発する脂肪肝や肝細胞癌の発症に、ＰＰＡＲαの存在だけでなく、持続的なＰＰＡＲαの活性化が必須であることを示した。加えて、持続的なＰＰＡＲα活性化、脂肪肝、及び肝細胞癌発症にかかわる強い相関性とメカニズムを分子レベルで確定させた。
【００７８】
従って、ＰＰＡＲα活性化を抑制することにより、ＨＣＶ持続感染者に特徴的な脂肪肝や肝細胞癌の発症を予防、もしくは遅延させる可能性を提示するものである。
【００７９】
さらに、脂肪肝及び肝細胞癌の発症は強い連動性があることが確定された。すなわち、脂肪肝の発症はすべてのＰＰＡＲα＋／＋：ＨＣＶｃｐＴｇマウスに先行的に生じ、脂肪肝発症を長期的に維持したマウスのうち約３５％の頻度で、２４ヶ月齢の時点で肝細胞癌の発症が生じた。この結果から、脂肪肝の発症を阻止・低減することにより肝細胞癌の発症を防止・遅延させうることが示唆された。
【００８０】
（実施例）
Ｈｕｈ−７細胞において、ＨＣＶの複製がＰＰＡＲα活性化抑制剤（２-クロロ-５-ニトロ-Ｎ-（ピリジル）ベンツアミド）により抑制された。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
脂肪肝や肝細胞癌発生とのメカニズムが慢性的ＨＣＶ感染患者にもある程度当てはまるので、持続的で過度のＰＰＡＲα活性化を緩和するために、本発明の肝疾患発症防止薬剤や脂肪肝改善薬・生活習慣是正を行うという治療方法が、肝細胞癌の予防のために有益である。
【００８２】
この肝疾患発症防止薬剤は、医薬品として、また飲食品に添加する添加剤として、有用である。これらの医薬品や飲食品は、持続的ＨＣＶ感染患者の脂肪肝や肝細胞癌のような肝疾患の発症を防止するのに用いられる。
【００８３】
本発明の肝疾患発症防止の動物モデルは、病態の発症メカニズムを解明したり肝疾患発症防止薬剤を探索したりするのに、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明を適用する肝疾患発症防止動物モデル等での肝臓のトリグリセリド量を示す図である。
【図２】本発明を適用する肝疾患発症防止動物モデル等でのＦＡＳ、ＡＣＣ、ＦＡＴ、ＦＡＴＰ、ＭＴＰ、ＡｐｏＢ、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＡＯＸ、ＭＣＡＤの各ｍＲＮＡ量を示す図である。
【図３】本発明を適用する肝疾患発症防止動物モデル等での脂肪酸取り込み量、血漿脂肪酸・血漿グルコース・血漿インスリンの量、リグノセリン酸のβ酸化活性を示す図である。
【図４】本発明を適用する肝疾患発症防止動物モデル等での肝重量対体重比、ＰＣＮＡ陽性肝細胞数、ＴＵＮＥＬ陽性肝細胞数、カスパーゼ３活性を示す図である。
【図５】本発明を適用する肝疾患発症防止動物モデル等での８−ＯＨｄＧ陽性肝細胞数、肝内過酸化脂質量を示す図である。
【図６】本発明を適用する本発明を適用する肝疾患発症防止動物モデル等でのＰＰＡＲα量、ＰＰＡＲαの半減期を示す図である。
【図７】本発明を適用する肝疾患発症防止動物モデル等でのクロフィブラート投与の有無と、肝臓の中性脂肪量、リグノセリン酸又はパルミチン酸のβ酸化活性、ＭＣＡＤ又はＰＰＡＲαのｍＲＮＡ量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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