(57)【要約】【課題】ヒトまたは動物の疾患の治療、予防に使用される生理活性ポリペプチドまたはタンパク質と水溶性高分子とを含む微粉末を、生体分解性重合体の壁物質中へ、分散させたマイクロスフェア製剤。但し、この分散は実質上水を使用しない条件で行われる。【解決手段】生理活性ポリペプチドまたはタンパク質の変性を伴わず、失活を著しく抑制したマイクロスフェア製剤が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の製法によって得られる生理活性ポリペプチドまたはタンパク質を有効成分として含有するマイクロスフェア製剤。
（１）生理活性ポリペプチドまたはタンパク質、および水溶性高分子を混合して粉末を調製し、
（２）上記（１）で得られた粉末を、単独または生体分解性重合体の共存下に微粉砕し、
（３）上記（２）で得られた微粉末を生体分解性重合体の溶液または生体分解性重合体の良溶媒に分散させることを特徴とするマイクロスフェア製剤。
【請求項２】
生理活性ポリペプチドまたはタンパク質、および水溶性高分子からなる微粉末の粒径が１０μｍ以下である請求項１記載のマイクロスフェア製剤。
【請求項３】
マイクロスフェア製剤の粒径が２００μｍ以下である請求項１または２記載のマイクロスフェア製剤。
【請求項４】
生理活性ポリペプチドまたはタンパク質、および水溶性高分子を凍結乾燥によって粉末化することを特徴とする請求項１記載のマイクロスフェア製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトまたは動物の疾患の治療、予防に使用される生理活性ポリペプチドまたはタンパク質を、生体内へ注射したのちに長期間に亘って薬理作用を持続させるための生体分解性マイクロスフェア製剤およびその製造方法に関し、更に詳しくは、生体分解性重合体の壁物質で被覆する際の生理活性ポリペプチドまたはタンパク質の変性、失活を著しく抑制したマイクロスフェア製剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のバイオテクノロジーの進歩により、生理活性ポリペプチドまたはタンパク質が工業的に生産され、ヒトまたは動物の種々の疾患の治療、予防に広く利用されつつある。
これら生理活性ポリペプチドまたはタンパク質は、殆どの場合が毎日注射にて投与されるが、これには以下の問題点があった。
ａ）治療効果：内因性の生理活性物質あるいはその誘導体であるために、一過的に多量の薬物を体内に入れるよりも必要量を持続的に投与した方が効果が高まる場合がある。
ｂ）副作用：  一過的な体内薬物濃度の上昇により、副作用を引き起こす恐れがある。
ｃ）人的負担：患者の通院の負担、連日の注射による苦痛
医師、看護婦の投薬の煩雑さ   
この様な背景から、生理活性ポリペプチドまたはタンパク質を持続的に生体内に投与する有用性が認められ、そのための様々な方法が試みられている。
【０００３】
その一つが生体分解性重合体を用いたマイクロスフェアであり、例えば、前立腺癌治療剤の酢酸リュープロレリンを配合したマイクロスフェアが開発され、臨床使用されるに至っている。
【０００４】
このマイクロスフェアは、一般的には以下の二通りの方法で作成される。
ａ）まず、生理活性物質の水溶液を生体分解性重合体の良溶媒（塩化メチレン、  酢酸エステル等）溶液に加え、撹拌機あるいは超音波ホモジナイザー等で乳化し、ｗ／ｏエマルジョンを調製する。次にこれを撹拌下で水中で乳化して（ｗ／ｏ）／ｗエマルジョンとしたのち、減圧下で有機溶媒を留去させて生体分解  性重合体を析出させ、マイクロスフェアを得る方法。（例えば、特許文献１〜４等）
ｂ）生体分解性重合体の良溶媒溶液に生理活性物質を溶解あるいは分散させ、これを撹拌下で水中に乳化させ、ｏ／ｗエマルジョンとしたのち、減圧下で有機溶媒を留去してマイクロスフェアを得る方法。（例えば、特許文献５〜９等）
これらの方法に共通するのは、製造工程中に水を使用し、さらに何らかの方法で水相と有機溶媒相とを撹拌して乳化せねばならない点である。従って生理活性物質が水溶性の場合には、溶液状態で有機溶媒と接触し、強い撹拌ストレスを受けることとなる。
【０００５】
一方、生理活性ポリペプチドまたはタンパク質は、水溶液の状態で有機溶媒と接触すると水／有機溶媒界面での変性を受ける場合が多く、特に撹拌下では接触界面の面積が増加するため変性が促進されることが知られている。事実、本発明者らの知見によれば、顆粒球コロニー形成刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の水溶液に塩化メチレンを加えて撹拌した場合、Ｇ−ＣＳＦが著しく変性することを確認している。従って、上記の製造方法ではこれら生理活性ポリペプチドまたはタンパク質をマイクロスフェア内に安定に封入できない場合が生じる。
【０００６】
封入時の安定化を目的とした製法改良として、生理活性タンパク質水溶液をステアリン酸アルミニウムで増粘させた大豆油と乳化してｗ／ｏエマルジョンとし、これを更に生体分解性重合体のアセトニトリル溶液と乳化してｗ／ｏ（大豆油）／ｏ（アセトニトリル）エマルジョンとしたのち、流動パラフィンで有機溶媒を抽出してマイクロスフェアを得る方法も提案されている。
【０００７】
この方法はタンパク質変性作用の少ない大豆油により水相と有機溶媒相を遮蔽して、生理活性タンパク質と有機溶媒との接触を防止しようとするものである。しかしながら、この方法は操作が煩雑であるばかりか、マイクロスフェアの構造が生体分解性重合体中に複数の大豆油相を含む二重構造となるため、粒子径が１００〜５００μｍと大きくなり、注射で投与するには問題がある。
【０００８】
このように、生体分解性重合体のマイクロスフェア内に生理活性ポリペプチドまたはタンパク質、特に有機溶媒との界面接触で変性しやすいタンパク質を安定に封入させる方法は、本発明者らの知る限り得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特公平１−５７０８７号
【特許文献２】特開昭６３−２３３９２６号
【特許文献３】特開平１−２２１３２８号
【特許文献４】特開平４−２０８２３１号
【特許文献５】特公昭６３−３６２９０号
【特許文献６】特開昭５７−９３９１２号
【特許文献７】特開平４−４６１１５号
【特許文献８】特開平４−４６１１６号
【特許文献９】特開平４−７４１１７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、生理活性ポリペプチドまたはタンパク質を、変性を伴わずに生体分解性重合体で被覆させるマイクロスフェア製剤およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記の変性を回避する方法について鋭意研究した結果、生理活性ポリペプチドまたはタンパク質は、凍結乾燥物等の固体状態であれば生体分解性重合体の良溶媒に対して比較的安定であることを見いだした。さらにはこの中に水溶性高分子が共存すると、微粉砕化の過程で生理的ストレスを与えても変性せず、この微粉末を実質的に水を用いない方法で生体分解性重合体で被覆すれば安定性を確保しつつマイクロスフェアが製造できることを見いだし本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明に従えば、
生体分解性重合体を主成分とする壁物質中に、生理活性ポリペプチドまたはタンパク質を含む微粉末を分散させた、ヒトまたは動物に注射可能なマイクロスフェアであって、次の方法で製造される。
【００１３】
該微粉末が
ａ）生理活性ポリペプチドまたはタンパク質、
ｂ）水溶性高分子
を必須成分とした、粒子径１０μｍ以下の微粉末であり、
これを実質的に水に用いない方法で生体分解性重合体を主成分とする壁物質中に分散させることを特徴とする、マイクロスフェア製剤およびその製造方法が提供される。
【００１４】
本発明では上記ａ），ｂ）から得られた混合物を、壁物質の共存下で微粉砕して、所定の微粉末を得、これを壁物質中に分散させることもできる。
以下本発明を更に詳述する。
【００１５】
本発明で使用される生理活性ポリペプチドまたはタンパク質には特に制限はなく、例えば以下のものが挙げられる。
副腎皮質刺激ホルモン、アンジオテンシン、血液凝固因子、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、細胞成長調節因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、等）、エンドルフィン、エンケファリン、胃酸分泌抑制ペプチド、成長ホルモン、造血因子（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＣＳＦ類、ＥＰＯ、ＴＰＯ、等）、インシュリン、インターフェロン、オキシトシン、上皮小体ホルモン、ソマトスタチン、バソプレッシン、腫瘍壊死因子、スーパーオキサイドジスムターゼ、β−ガラクトシダーゼ、等
これらの中で本発明では水と生体分解性重合体の良溶媒との界面で変性を受けやすいものが特に適している。
【００１６】
これらの生理活性物質の微粉末中の配合量は、所望とする治療効果の強度と、生体内に投与されてからの持続期間とから任意に設定されるが、通常は０．００１〜９９．５％、好ましくは０．０１〜９９％の範囲である。９９．５％を越えると水溶性高分子の配合比率が低下し、安定化効果が損なわれるので好ましくない。
【００１７】
また、本発明では、生理活性ポリペプチドまたはタンパク質の微粉末を調製する際の変性を防止するために水溶性高分子が配合されるが、この水溶性高分子には特に制限はなく、例えば以下のものが挙げられる。
タンパク質：アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、等
多糖類：アルギン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸およびこれらの塩類、ならびにデキストラン、アルギン酸プロピレングリコール、ペクチン、アラビアガム、等
セルロース誘導体：メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースおよびその塩類、等
ビニル系重合体：ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリヒドロキシ（メタ）アクリレート、ポリアクリルアミドならびにカルボキシビニルポリマー、ポリ（メタ）アクリル酸およびその塩類、
多価アルコール：ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、等
これらの微粉末中での配合量は、０．５〜３０％、好ましくは１〜１５％である。０．５％未満では本発明の安定化効果が得られず、３０％を越えると安定化効果が頭打ちとなるばかりか、生体内に投与したのち生体液により水溶性高分子が膨潤し、膨潤圧によりマイクロスフェアが破壊される恐れがあるため好ましくない。
【００１８】
また、生理活性物質と水溶性高分子とから成る粉末に壁物質を混合し、微粉砕することもできる。微粉砕時の粉末に対する壁物質の混合比は１：１〜１：１０００程度である。
本発明の微粉末中には、生理活性ポリペプチドまたはタンパク質および水溶性高分子以外に、目的に応じて公知の補助成分の１種または２種以上を添加できる。補助成分としては以下のものが挙げられ、その配合量は適宜決定される。
賦形剤：糖類：ソルビトール、マンニトール、マルトース、ラクトース、ラフィノース、サッカロース、トレハロース、等
アミノ酸：グリシン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミンならびにアスパラギン酸、グルタミン酸およびこれらの塩類、等
ｐＨ調整剤：  塩類、水酸化ナトリウム、ならびに酢酸、乳酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸およびこれらの塩類、等
浸透圧調整剤：塩化ナトリウム、塩化カリウム、等
界面活性剤：  ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、等
次に、本発明で使用される生体分解性重合体としては、以下のものが挙げられる。
ポリ脂肪酸エステル：ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリ（乳酸／カプロラクトン）共重合体、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸／吉草酸）共重合体、等 
ポリ酸無水物：ポリカルボキシフェノキシ酢酸、ポリカルボキシフェノキシ吉草酸、ポリカルボキシフェノキシオクタン酸、ポリ（ビスカルボキシフェノキシプロパン／セバシン酸）共重合体、等 
ポリアルキル−α−シアノアクリレート：ポリブチル−２−シアノアクリレート、等
ポリアルキレンオキサレート：ポリテトラメチレンオキサレート、等
ポリオルソエステル：ポリ（３，９−ビス−（エチリデン−２，４，８，１０−テトラオキソスピロ［５，５］ウンデカン）／１，６−ヘキサンジオール）共重合体、ポリ（３，９−ビス−（エチリデン−２，４，８，１０−テトラオキソスピロ［５，５］ウンデカン）／シクロヘキサンジメタノール）共重合体、等
ポリカーボネート：ポリエチレンカーボネート、ポリエチレンプロピレンカーボネート、等
これらの分子量は１，０００〜２００，０００、好適には５，０００〜１００，０００のものが使用される。
【００１９】
生理活性物質を含む微粉末は、生体分解性重合体から成る壁物質中に分散されるが、微粉末と生体分解性重合体との配合比率は、１：１〜１：１０００、好適には３０：７０〜１：９９である。微粉末の配合比率が１：１０００を下まわると製造中の容器への付着ロスの割合が大きく、逆に１：１を越えるとマイクロスフェアの成形性が悪くなったり、微粉末の凝集によりマイクロスフェア内での分布が不均一となるので好ましくない。
【００２０】
次に、本発明によるマイクロスフェアの製造方法を説明する。
本発明では、まず生理活性ポリペプチドまたはタンパク質と水溶性高分子を必須成分とする粉末を調製し、これを単独もしくは壁物質の共存下で微細粉砕したのち、実質的に水を用いない従来公知の方法で生体分解性重合体を被覆させてマイクロスフェアを得る。
【００２１】
粉末の調製法としては、生理活性ポリペプチドまたはタンパク質と水溶性高分子とを水溶液中で混合し、これを生理活性を保ったまま粉末化できる方法であれば特に制限はないが、好ましくは凍結乾燥法である。なお、生理活性ポリペプチドまたはタンパク質の粉末と水溶性高分子の粉末とを、物理的に混合したのみでは本発明の効果は得られない。
【００２２】
微細化の方法も特に制限はないが、好ましい例としては、凍結乾燥品または凍結乾燥品と生体分解性重合体との混合物をジェットミルで微細化するか、あるいは生体分解性重合体の有機溶媒溶液中に凍結乾燥品を加え、これをポリトロンカッターまたは超音波ホモジナイザー等で粉砕する方法が挙げられる。
【００２３】
微粒子の径は１０μｍ以下、好ましくは５μｍ以下である。注射での投与に適したマイクロスフェアの粒子径は約２００μｍ以下、好ましくは１５０μｍ以下である。微粉末の径が大きいとマイクロスフェア内での分散が不均一となり、生理活性物質が投与後初期に放出されてしまう（初期バースト）ため好ましくない。
【００２４】
生理活性物質と水溶性高分子との水溶液をスプレードライ法により微粉末とすることも考えられる。しかし、スプレードライ法では粉末の収率を上げるためには乾燥温度を高めるか乾燥路の距離を長くせねばならない。乾燥温度の上昇はタンパク質のように熱的に不安定な物質に対しては好ましくなく、乾燥路を長くするのは生産性の面から問題がある。
【００２５】
生理活性物質を含有する固体粉末を工程中に水を用いずに生体分解性重合体のマイクロスフェア内に封入する処理は一般には以下に述べる相分離法により行われる。すなわち、
（ａ）生体分解性重合体の非水良溶媒溶液中に生理活性物質の粉末を分散する工程。
（ｂ）該分散液に、いわゆる非溶媒（またはコアセルベーション剤）、すなわち生体分解性重合体に対して貧溶媒の有機液体を添加する工程。これによりコアセルベーション（または相分離）が起こり、生体分解性重合体は分散した生理活性物質に付着し、未発達（硬化前）のマイクロスフェアが形成される。
（ｃ）未発達のマイクロスフェアから残っている有機溶媒を抽出し、該分散液に、良溶媒および非溶媒を併せた容量に対して過剰量のいわゆる硬化液体を添加することにより、それらを硬化する工程。
（ｄ）当該技術部分野で一般的に知られている任意の方法によって、硬化したマイクロスフェアを洗浄し、そして該マイクロスフェアを乾燥する工程を含む。
が開示されている。
【００２６】
本発明において使用できる溶媒は次の通りである。
生体分解性重合体の良溶媒：トルエン、キシレン、クロロホルム、塩化メチレン、酢酸メチル、酢酸エチル、アセトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ヘキサフルオロイソプロパノール、等  
非溶媒（コアセルベーション剤）：
非相溶性高分子  ：ポリブタジエン、ポリジメチルシロキサン、等
植物油          ：大豆油、アマニ油、キリ油、綿実油、オリーブ油、ツバキ油、ヒマシ油、トウモロコシ油、ナタネ油、ヤシ油、小麦油、ケシ油、シイタケ油、エゴマ油、ミカン油、レモン油、等
硬化液体：
アルカン炭化水素：ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、等
フルオロ炭化水素：１，１，２−トリクロロトリフルオロエタン、トリクロロフルオロメタン、等
アルコール、多価アルコール、多価アルコールエステル
Ｃ１２〜１８脂肪酸のエチルまたはイソプロピルエステル：ステアリン酸エチル、ステアリン酸イソプロピル、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、等 
植物油：大豆油、ゴマ油、ヒマシ油、等
非相溶性高分子：ポリブタジエン、ポリジメチルシロキサン、等
本発明の効果の作用機序は未だ明確ではないが、恐らくは粉末内の生理活性ポリペプチドまたはタンパク質が水溶性高分子中に均一分散するため有機溶媒との接触が阻害され、さらには水溶性高分子との何らかの相互作用により、微粉砕化の物理的ストレスに対して生理活性ポリペプチドまたはタンパク質の構造変化が生じにくくなるためと推察される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明によって製造されたマイクロスフェア剤における生理活性物質の経時的放出量を示すグラフである。
【実施例】
【００２８】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明が以下の実施例に限定されるものではないことは言うまでもない。
実施例１
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解した５００μｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ水溶液５０ｍｌ、１５％マンニトール水溶液６．９ｍｌ、９．３８％ゼラチン水溶液２．０ｍｌ、１％  Ｔｗｅｅｎ−２０水溶液０．２５ｍｌを混合し、全量を５９．１５ｍｌとした。この溶液をガラス製バイアルに充填し、凍結乾燥（バーチス社製凍結乾燥機Ｍｏｄｅｌ  １５−ＳＲＣ−３Ｘ−ＣＲ）してＧ−ＣＳＦおよびゼラチン含有の凍結乾燥品を得た。この凍結乾燥品をジェットミル（セイシン企業製Ｍｏｄｅｌ  Ａ−０）を用いて圧力６０ｐｓｉで粉砕した。
【００２９】
次に、ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体（乳酸：グリコール酸＝５０：５０モル、平均分子量２０，０００）２００ｍｇをガラス製試験管に入れ、塩化メチレン４ｍｌを加えて溶解した。これに前記のＧ−ＣＳＦおよびゼラチン含有の微粉末６ｍｇを入れ、ボルテックスミキサーで撹拌して分散させた。
【００３０】
この分散液を容量２０ｍｌのガラスビーカーに移し、室温でマグネチックスターラにて撹拌しつつシリコン油（信越シリコン、ＫＦ−９６−３５０ｃｓ）１６ｍｌを滴下した。シリコン油の滴下に伴い凍結乾燥品微粉末を内包したコアセルベートが形成された。
【００３１】
次に、容量５００ｍｌのガラスビーカーにミリスチン酸イソプロピル３００ｍｌを入れ、室温でプロペラ撹拌機にて１５０ｒｐｍの速度で撹拌しながら、これにコアセルベート液を加えてコアセルベートを硬化させ、マイクロスフェアを形成させた。約１０分後に撹拌を止めてマイクロスフェアを沈殿させ、室温で一晩放置したのち、ミリスチン酸イソプロピルをデカンテーションした。マイクロスフェアにｎ−ヘプタン約１００ｍｌを加え、ゆるく撹拌したのちｎ−ヘプタンをデカンテーションし、残存するミリスチン酸イソプロピルを洗浄した。ガラスビーカーに沈殿したマイクロスフェアを室温で風乾し、スパーテルでガラス製試験管に回収した。マイクロスフェアを更に洗浄するためにｎ−ヘプタン約１０ｍｌを加えて振とうし、デカンテーションしたのち、室温減圧下で溶媒を蒸発させた。この時点で回収されたマイクロスフェアは１５３ｍｇ、収率は７４．３％であった。
【００３２】
次にこのマイクロスフェアを約５０ｍｌのｎ−ヘプタンに分散させ、メッシュ隙間が３２μｍおよび７５μｍの篩いを用いて粒子径３２〜７５μｍの分画を採取し、本発明のＧ−ＣＳＦ含有マイクロスフェアを得た。
評価例１
実施例１で作成したマイクロスフェア２０ｍｇを容量１．５ｍｌの蓋付きポリプロピレン製遠心チューブに取り、これに塩化メチレン１ｍｌを加えて振とうした。マイクロスフェアが溶解し、凍結乾燥品微粉末の分散液が得られた。この分散液を１０℃で１０，０００ｒｐｍ×１０分間遠心分離し、ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体の溶解した上澄を除去した。更に微粉末を洗浄するために、沈殿に塩化メチレン１ｍｌを加えて振とう分散させ、遠心分離したのち上澄を除去する操作を４回繰り返した。沈殿を室温減圧下で溶媒蒸発させたのち、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）０．５ｍｌに溶解させ、Ｇ−ＣＳＦ量（非変性体）を高速液体クロマトグラフィーにて定量した。結果を表−１に示す。
【００３３】
実施例１のＧ−ＣＳＦおよびポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体の仕込み量から計算したマイクロスフェア２０ｍｇ中のＧ−ＣＳＦ量（計算量）に対して１０７．５％のＧ−ＣＳＦが検出され、本発明の調製法ではＧ−ＣＳＦが変性を受けないことが確認された。
【００３４】
【表１】
2009161561.tif 000002
【００３５】
実施例２
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した６６７ｎｇ／ｍｌ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）水溶液１０ｍｌ、１５％マンニトール水溶液０．９ｍｌ、５％ゼラチン水溶液０．３ｍｌを混合し、全量を１１．２ｍｌとした。この溶液をガラス製バイアルに充填し、凍結乾燥してＴＮＦおよびゼラチン含有の凍結乾燥品を得た。この凍結乾燥品９０ｍｇとポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体（乳酸：グリコール酸＝５０：５０モル、平均分子量２０，０００）３ｇを乳鉢で均一混合したのち、ジェットミル（セイシン企業製Ｍｏｄｅｌ  Ａ−０）を用いて圧力６０ｐｓｉで微粉砕した。
【００３６】
この微粉末２．０６ｇを容量２００ｍｌのガラスビーカーに入れ、塩化メチレン４０ｍｌを加えてポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体を溶解し、ＴＮＦおよびゼラチン含有の微粉末を分散させた。これに室温でマグネチックスターラにて撹拌しつつシリコン油（信越シリコン、ＫＦ−９６−３５０ｃｓ）１２０ｍｌを滴下し、凍結乾燥品微粉末を内包したコアセルベートを形成させた。
【００３７】
次に、容量１０００ｍｌのガラスビーカーにミリスチン酸イソプロピル６００ｍｌを入れ、室温でプロペラ撹拌機にて２００ｒｐｍの速度で撹拌しながら、これにコアセルベート液を加えてコアセルベートを硬化させ、マイクロスフェアを形成させた。約１０分後に撹拌を止めてマイクロスフェアを沈殿させ、室温で一晩放置したのち、ミリスチン酸イソプロピルをデカンテーションした。マイクロスフェアにｎ−ヘプタン約１００ｍｌを加え、ゆるく撹拌したのちｎ−ヘプタンをデカンテーションし、残存するミリスチン酸イソプロピルを洗浄した。ガラスビーカーに沈殿したマイクロスフェアを室温で風乾し、スパーテルでガラス製試験管に回収した。マイクロスフェアを更に洗浄するためにｎ−ヘプタン約１０ｍｌを加えて振とうし、デカンテーションしたのち、室温減圧下で溶媒を蒸発させた。
【００３８】
次にこのマイクロスフェアを約５０ｍｌのｎ−ヘプタンに分散させ、メッシュ隙間が３２μｍおよび７５μｍの篩いを用いて粒子径３２〜７５μｍの分画を採取し、本発明のＴＮＦ含有マイクロスフェアを得た。
評価例２
実施例２で作成したマイクロスフェア３０ｍｇを容量１．５ｍｌの蓋付きポリブロピレン製遠心チューブに取り、これに塩化メチレン１ｍｌを加えて振とうした。マイクロスフェアが溶解し、凍結乾燥品微粉末の分散液が得られた。この分散液を１０℃で１０，０００ｒｐｍ×１０分間遠心分離し、ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体の溶解した上澄を除去した。更に微粉末を洗浄するために、沈殿に塩化メチレン１ｍｌを加えて振とう分散させ、遠心分離したのち上澄を除去する操作を４回繰り返した。沈殿を室温減圧下で溶媒蒸発させたのち、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌに溶解させ、ＴＮＦ量をエンザイムノアッセイで定量した。結果を表−２に示す。
【００３９】
実施例２のＴＮＦおよびポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体の仕込み量から計算したマイクロスフェア３０ｍｇ当たりのＴＮＦ量（計算量）に対して９０．８％のＴＮＦが検出され、本発明の調製法ではＴＮＦが変性を受けないことが確認された。
【００４０】
【表２】
2009161561.tif 000003
【００４１】
実施例３
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した１．３５ｍｇ／ｍｌスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）水溶液１０ｍｌ、５％ゼラチン水溶液０．３ｍｌを混合し、全量を１０．３ｍｌとした。この溶液をガラス製バイアルに充填し、凍結乾燥してＳＯＤおよびゼラチン含有の凍結乾燥品を得た。この凍結乾燥品１２０ｍｇとポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体（乳酸：グリコール酸＝５０：５０モル、平均分子量２０，０００）４ｇを乳鉢で均一混合したのち、ジェットミル（セイシン企業製Ｍｏｄｅｌ  Ａ−０）を用いて圧力６０ｐｓｉで微粉砕した。
【００４２】
この微粉末２．０６ｇを容量２００ｍｌのガラスビーカーに入れ、塩化メチレン４０ｍｌを加えてポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体を溶解し、ＳＯＤおよびゼラチン含有の微粉末を分散させた。これに室温でマグネチックスターラにて撹拌しつつシリコン油（信越シリコン、ＫＦ−９６−３５０ｃｓ）１２０ｍｌを滴下し、凍結乾燥品微粉末を内包したコアセルベートを形成させた。
【００４３】
次に、容量１０００ｍｌのガラスビーカーにミリスチン酸イソプロピル６００ｍｌを入れ、室温でプロペラ撹拌機にて２００ｒｐｍの速度で撹拌しながら、これにコアセルベート液を加えてコアセルベートを硬化させ、マイクロスフェアを形成させた。約１０分後に撹拌を止めてマイクロスフェアを沈殿させ、室温で一晩放置したのち、ミリスチン酸イソプロピルをデカンテーションした。マイクロスフェアにｎ−ヘプタン約１００ｍｌを加え、ゆるく撹拌したのちｎ−ヘプタンをデカンテーションし、残存するミリスチン酸イソプロピルを洗浄した。ガラスビーカーに沈殿したマイクロスフェアを室温で風乾し、スパーテルでガラス製試験管に回収した。マイクロスフェアを更に洗浄するためにｎ−ヘプタン約１０ｍｌを加えて振とうし、デカンテーションしたのち、室温減圧下で溶媒を蒸発させた。
【００４４】
次にこのマイクロスフェアを約５０ｍｌのｎ−ヘプタンに分散させ、メッシュ隙間が７５μｍおよび１８０μｍの篩いを用いて粒子径７５〜１８０μｍの分画を採取し、本発明のＳＯＤ含有マイクロスフェアを得た。
評価例３
容量７ｍｌのテフロン製蓋付バイアルに実施例３で作成したマイクロスフェア３０ｍｇと放出液（１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８））１ｍｌを加え、３７℃の恒温槽中で７０ｓｔｒｏｋｅ／分の速度で振とうした。所定の日時に放出液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ×３分間）により回収し、その中に含まれるＳＯＤ量をＳＯＤ活性から定量した。また、遠心分離後に残ったマイクロスフェアには新たに放出液１ｍｌを加えて放出試験を継続した。試験開始後４０日目までの累積放出率を図１に示す。約４０日後の合計放出量は９５％を越えた。
【００４５】
実施例３で作成したマイクロスフェアは１日目の放出（初期バースト）が１２％と少なく、かつ約３０日間にわたってほぼ一定速度でＳＯＤを放出することが確認された。
【図１】
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