(57)【要約】      （修正有）【課題】経口投与によって効果が発現し、副作用が少なく、抗アレルギー効果などを有するインターロイキン−１８誘導剤を提供する。【解決手段】乳清蛋白質を加水分解酵素で、好ましくは分解率が２０〜３０％となるように加水分解し、加水分解物から限外濾過法により分子量１０，０００ダルトンを超える画分を除去して得られる乳清蛋白加水分解物を、インターロイキン−１８誘導剤の有効成分とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳清蛋白質を加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、インターロイキン−１８誘導作用を有する乳清蛋白加水分解物を有効成分として含有するインターロイキン−１８誘導剤。
【請求項２】
前記加水分解酵素がバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼ、乳酸菌由来のプロテアーゼ、及び動物又は植物由来のプロテアーゼから選択される１種又は２種以上である請求項１記載のインターロイキン−１８誘導剤。
【請求項３】
前記乳清蛋白加水分解物の分解率が２０〜３０％である請求項１又は２に記載のインターロイキン−１８誘導剤。
【請求項４】
前記乳清蛋白加水分解物は、分子量１０，０００ダルトンを超える画分が除去されている請求項１〜３のいずれか一項に記載のインターロイキン−１８誘導剤。
【請求項５】
前記乳清蛋白加水分解物が、限外濾過法により分子量１０，０００ダルトンを超える画分が除去されたものである請求項４に記載のインターロイキン−１８誘導剤。
【請求項６】
乳清蛋白加水分解物を全量に対して０．１重量％以上含有する請求項１〜５のいずれか一項に記載のインターロイキン−１８誘導剤。
【請求項７】
乳清蛋白質を加水分解酵素で加水分解し、加水分解物から限外濾過法により分子量１０，０００ダルトンを超える画分を除去することを特徴とする、インターロイキン−１８誘導作用を有する乳清蛋白加水分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳清蛋白加水分解物を有効成分とするインターロイキン−１８誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に造血細胞の増殖、分化には特定の増殖及び分化因子が必要とされており、最終的に成熟した各種の血球、例えば赤血球、顆粒球、マクロファージ、好酸球、血小板、リンパ球になるまでの間には、数多くの分化、増殖因子が関与している。
【０００３】
一方、細菌、ウィルス等の感染、腫瘍、細胞障害等に対して、生体は免疫反応により対応するが、その免疫の応答は、免疫担当細胞間の直接的又は間接的な相互作用により調節されている。近年、免疫機能に作用して異物に対する防御力を向上させる効果を有する生体応答修飾物質が、癌治療の関係から注目されている。
【０００４】
インターロイキン類、コロニー刺激因子類、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）類、インターフェロン類等のサイトカインと総称される物質は、これら分化、増殖及び免疫機能に関与していることが次々と明らかにされており、サイトカインを遺伝子工学的手法により製造して薬剤として利用する方法も研究されている。
【０００５】
現在、インターロイキンに属するサイトカインとして２３種類が確認されているが、その中で、インターロイキン−１８（以下、「ＩＬ−１８」と略記することがある。）は免疫系における情報伝達物質であるサイトカインの一種である。本サイトカインは、その発見当初には、特開平８−２７１８９号公報、特開平８−１９１０９８号公報、特開平９−２８９８９６号公報、及び［ネイチャー（Nature）、第３７８巻、第６５５２号、第８８〜９１頁、１９９５年］の報告等からインターフェロン−γ誘導因子として表現されていたが、その後ＩＬ−１８と呼称されるようになった［ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Journal of Immunology）、第１５６巻、第４２７４〜４２７９頁、１９９６年］。
【０００６】
インターロイキン−１８は、構造的にはインターロイキン−１ファミリーのタンパク質であり、インターロイキン−１２と機能的には共通性がある。インターロイキン−１８は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞からのインターフェロン−γの生産を強力に誘導するが、その他にも顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、及びインターロイキン−１３を誘導する性質を有し、更にナチュラルキラー細胞の細胞障害性を増強する性質、及びナチュラルキラー細胞の生成を誘導する性質も兼備している［マクロファージ・ジャーナル（Macrophage Journal）、第６巻、第３号、第５〜６頁、１９９９年、及び、「改訂版サイトカイン・増殖因子」、宮園浩平・菅村和夫著、第４６〜４７頁、羊土社、１９９８年］。また、インターロイキン−１８は破骨細胞の形成を抑制する機能を有していると考えられ、骨形成の制御に深く関わっていると考えられる［実験医学、増刊「サイトカインの新たな機能と生命現象」、宮島篤編集、第１８巻、第１５号、第１７８〜１７９頁、羊土社、２０００年］。これらの性質故に、インターロイキン−１８は抗アレルギー剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、抗免疫疾患剤などの医薬品として広範な用途が期待され、鋭意研究が進められている。
【０００７】
近年の研究において、インターロイキン−１８自身がインターフェロン−γの産生を強く誘導することを始めとして、免疫疾患の予防や治療に重要な働きを示すとされるサイトカインを、in vivo又はin vitroで誘導又は増幅する因子の探索及び研究が盛んに行われ
ており、様々なサイトカイン誘導因子が報告されている。そして、これら誘導因子の構造や機能が解明され、様々な疾患に対する医薬品への開発が進み、実際に製品化され現在の医療の現場で利用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
その反面、これら医薬品に利用されている誘導因子の殆どが生体内への非経口投与でしか機能を発揮できず、投与方法による加療の制限及び副作用という課題を抱えていた。
【０００９】
本発明の目的は、経口投与によって効果が発現し、副作用が少なく、抗アレルギー効果などを有するインターロイキン−１８誘導剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の発明者らは、サイトカイン誘導因子の探索の中で、乳蛋白におけるサイトカイン産生への影響について鋭意研究を重ねた結果、乳清蛋白質の加水分解物にインターロイキン−１８の産生を促進する効果を発見し、本発明を完成させた。
【００１１】
前記課題を解決する本発明は、以下のとおりである。
（１）乳清蛋白質を加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、インターロイキン−１８誘導作用を有する乳清蛋白加水分解物を有効成分として含有するインターロイキン−１８誘導剤。
（２）前記加水分解酵素がバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼ、乳酸菌由来のプロテアーゼ、及び動物又は植物由来のプロテアーゼから選択される１種又は２種以上である(1)のインターロイキン−１８誘導剤。
（３）前記乳清蛋白加水分解物の分解率が２０〜３０％である(1)又は(2)のインターロイキン−１８誘導剤。
（４）前記乳清蛋白加水分解物は、分子量１０，０００ダルトンを超える画分が除去されている(1)〜(3)のいずれかのインターロイキン−１８誘導剤。
（５）前記乳清蛋白加水分解物が、限外濾過法により分子量１０，０００ダルトンを超える画分が除去されたものである(4)のインターロイキン−１８誘導剤。
（６）乳清蛋白加水分解物を全量に対して０．１重量％以上含有する(1)〜(5)のいずれかのインターロイキン−１８誘導剤。
（７）乳清蛋白質を加水分解酵素で加水分解し、加水分解物から限外濾過法により分子量１０，０００ダルトンを超える画分を除去することを特徴とする、インターロイキン−１８誘導作用を有する乳清蛋白加水分解物の製造方法。
【００１２】
尚、本明細書において百分率は、分解率を除き、特に断りのない限り重量による表示である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は乳清蛋白加水分解物を有効成分とするインターロイキン−１８誘導剤に関するものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
【００１４】
（１）インターロイキン−１８を効果的に誘導することが可能である。
（２）乳蛋白由来であることから副作用が殆どなく、長期間連続して使用することができる。
（３）経口投与が可能であり、従来の注射剤等に比較して簡便で汎用性が高い。
（４）牛乳等の比較的安価な原料から得られ、大量生産が可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
次に、本発明について具体的に説明する。本発明のインターロイキン−１８誘導剤は、乳清蛋白質を加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、インターロイキン−１８誘導作用を有する乳清蛋白加水分解物を有効成分として含有する。本発明のインターロイキン−１８誘導剤製造の出発物質として用いる乳清蛋白質は、乳清蛋白質を主成分とするものであれば、如何なるものでも使用することができるが、市販の各種乳清蛋白質、例えば、乳清蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）、乳清蛋白質単離物（ＷＰＩ）等が望ましい。また、牛乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳から乳清蛋白質を常法により精製することもできる。
【００１６】
次に、乳清蛋白質を加水分解酵素で加水分解する方法を説明する。前記のような原料乳清蛋白質を水又は温湯に分散し、溶解する。該溶解液の濃度は格別の制限はないが、通常、蛋白質換算で５〜１５％前後の濃度範囲にするのが効率性及び操作性の点から望ましい。
【００１７】
前記乳清蛋白質を含有する溶液を７０〜９０℃で１０分間〜１５秒間程度加熱殺菌することが、雑菌汚染による変敗防止の点から望ましい。次いで、前記乳清蛋白質を含有する溶液にアルカリ剤又は酸剤を添加し、ｐＨを使用する加水分解酵素の至適ｐＨ又はその付近に調整することが好ましい。本発明の方法に使用するアルカリ剤又は酸剤は、食品又は医薬品に許容されるものであれば如何なるアルカリ剤又は酸剤であってもよい。具体的には、アルカリ剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等を、酸剤としては、塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸等を例示することができる。
【００１８】
次いで、前記乳清蛋白溶液に加水分解酵素溶液を添加する。加水分解酵素は蛋白質を加水分解する酵素であれば特に制限されず、エンドペプチダーゼであることが好ましい。エンドペプチダーゼとしては、トリプシン、エラスターゼ等のセリンプロテアーゼ、パパイン、ブロメライン等のチオールプロテアーゼ等、種々の酵素を使用することができる。中でも、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼ、乳酸菌由来のプロテアーゼ、及び動物及び植物由来のプロテアーゼを好ましいものとして例示することができる。尚、「由来」とは、元来上記の生物が保持していることを意味し、採取原を意味するものではない。例えば、バチルス・ズブチリスが産生するプロテアーゼをコードする遺伝子をエシェリヒア・コリに導入し、同遺伝子を発現させることにより製造したプロテアーゼは、バチルス・ズブチリス「由来」である。
【００１９】
バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼは、市販品等が使用可能であり、プロテアーゼＮ（天野エンザイム社製）、ビオプラーゼ（長瀬生化学工業社製）等が好ましいものとして例示できる。バチルス・ズブチリス由来のプロテアーゼは、乳清蛋白質１ｇ当たり１００〜５，０００ＰＵＮ単位（この単位については後記する）の割合で添加する。ＰＵＮ単位は、カゼイン［メルク社製：ハマーシュタイン（Hammerstein）］にバチルス・ズブチリス由来のプロテアーゼを作用させ、３０℃で１分間に１μｇのチロシンに相当するアリルアミノ酸のフォリン試薬での呈色反応を示す酵素活性を１ＰＵＮ単位とする。
【００２０】
乳酸菌由来のプロテアーゼは、例えば特公昭５４−３６２３５号公報第６欄４行「（３）使用する酵素について」の項に記載の方法により次のとおり製造することができる。乳酸菌を公知の方法（例えば特公昭４８−４３８７８号公報記載の方法）により培養し、得られた培養液を遠心分離して乳酸菌菌体を回収し、滅菌水に菌体を懸濁し、遠心分離して乳酸菌菌体を回収する操作を２回反復し、菌体を洗浄し、２０％の濃度で菌体を滅菌水に懸濁し、菌体破砕機［例えば、ダイノミル（Willy Bachnfen Engineering Works）社製。ＫＤＬ型］により菌体を破砕し、凍結乾燥し、乳酸菌由来のプロテアーゼ粉末を得る。乳酸菌としては、ラクトコッカス・ラクチス等のラクトコッカス属細菌、ラクトバチルス・
ヘルベティカス、ラクトバチルス・ブルガリクス等のラクトバチルス属細菌、ビフィドバクテリウム・ブレビス、ビフィドバクテリウム・ロンガム等のビフィドバクテリウム属細菌等が挙げられる。前記のようにして得られる酵素を乳清蛋白質１ｇ当たり２０〜２００活性単位（この単位については後記する）の割合で添加する。活性単位は、次の方法により測定する。プロテアーゼを含有する粉末を０．２ｇ／１００ｍｌの割合で０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に分散又は溶解して酵素溶液を調製する。一方、ロイシルパラニトロアニリド（国産化学社製。以後Ｌｅｕ−ｐＮＡと記載する）を０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して２ｍＭの基質溶液を調製する。酵素溶液１ｍｌに基質溶液１ｍｌを添加し、３７℃で５分間反応させ、その後３０％の酢酸溶液２ｍｌを添加して反応を停止させる。反応液をメンブランフィルターで濾過し、波長４１０ｎｍで濾液の吸光度を測定する。プロテアーゼの活性単位は、１分間に１μｍｏｌのＬｅｕ−ｐＮＡを分解するのに必要な酵素量を１活性単位と定義し、次式により求める。
【００２１】
活性単位（粉末１ｇ当たり）＝２０×（Ａ／Ｂ）
ただし、前記の式においてＡ及びＢは、それぞれ波長４１０ｎｍにおける試料の吸光度及び０．２５ｍＭパラニトロアニリンの吸光度を示す。
【００２２】
動物及び植物由来のプロテアーゼとしては、トリプシン、パパイン、ブロメライン等を使用することができる。
【００２３】
本発明において用いる加水分解酵素は１種でもよく、２種以上用いてもよい。２種以上の酵素を用いる場合は、それぞれの酵素反応は同時に行ってもよく、別々に行ってもよい。
【００２４】
酵素を添加した溶液を、酵素の種類に応じて適当な温度、例えば３０〜６０℃、望ましくは４５〜５５℃に保持して乳清蛋白質の加水分解を開始する。加水分解反応時間は、酵素反応の分解率をモニターしながら、好ましい分解率に達するまで反応を続ける。本発明インターロイキン−１８誘導剤の有効成分である乳清蛋白加水分解物を得るためには、分解率は２０〜３０％が望ましい。
【００２５】
尚、蛋白質の分解率の算出方法は、ケルダール法（日本食品工業学会編、「食品分析法」、第１０２頁、株式会社光琳、昭和５９年）により試料の全窒素量を測定し、ホルモール滴定法（満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第５４７ページ、養賢堂、１９７０年）により試料のホルモール態窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を次式により算出する。
分解率（％）＝（ホルモール態窒素量／全窒素量）×１００
【００２６】
酵素反応の停止は、加水分解液中の酵素の失活により行われ、常法による加熱失活処理により実施することができる。
加熱失活処理の加熱温度と保持時間は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができるが、例えば、８０〜１３０℃の温度範囲で３０分間〜２秒間の保持時間で行うことができる。
【００２７】
得られた反応液はクエン酸等の酸によりｐＨを５．５〜７の範囲に調整することが好ましい。
【００２８】
上記のようにして得られる乳清蛋白加水分解物は、分子量１０，０００ダルトンを超える画分が除去されていることが好ましい。「除去」とは、分子量１０，０００ダルトンを超える画分が完全に除去されていることに加えて、一部が除去されていることを含むが、完全に除去されていることが好ましい。尚、分子量１０，０００ダルトンを超える画分の
除去に伴い、分子量１０，０００ダルトン以下の画分のうち、高分子量の成分の含有量が低下しても、インターロイキン−１８誘導作用を有する限り、構わない。分子量１０，０００ダルトンを超える画分の除去は、例えば限外濾過法により行うことができる。限外濾過は、公知の装置［例えば、限外濾過モジュール（旭化成工業社製）等］を用いて行うことができる。
【００２９】
得られた乳清蛋白加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することも可能であり、また、必要に応じて、この溶液を公知の方法により濃縮した濃縮液、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥した粉末、として使用することもできる。
【００３０】
上記のようにして得られる乳清蛋白加水分解物は、インターロイキン−１８誘導作用を有する。したがって、インターロイキン−１８誘導作用を指標として、乳清蛋白加水分解物を製造する際の条件は、適宜設定することができる。尚、本発明において「インターロイキン−１８誘導」とは、インターロイキン−１８産生細胞のインターロイキン−１８産生を誘導することを意味する。
【００３１】
インターロイキン−１８は、肝クッパー細胞等のマクロファージ類、腸管上皮細胞、及び表皮ケラチノサイト等の生体内の細胞及び生体組織において産生していると考えられているが、この中でも腸上皮組織でインターロイキン−１８の産生量は際立って多く、生体内でのインターロイキン−１８産生の大部分を腸管上皮細胞が担っていると考えられている。従って、本発明のインターロイキン−１８誘導剤によるインターロイキン−１８の産生は、生体組織での発現系に関する環境を再現することが可能な連続継代性細胞系の細胞株を使用してインターロイキン−１８を産生させることにより、より簡便に確認することが可能である。インターロイキン−１８を産生するために用いられる細胞株は結腸由来の上皮細胞が好ましく、例えばＣａｃｏ−２、ＣＯＬＯ２０５、ＳＫ−ＣＯ−１、ＳＷ４８、Ｔ８４、ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１５、ＬＳ１８０等の細胞株を使用することが可能である。
【００３２】
インターロイキン−１８の産生は、前記細胞株の培養系に本発明のインターロイキン−１８誘導剤を添加し、共培養することによって実施することが可能である。このとき、培養系には有効成分である乳清蛋白加水分解物は少なくとも１μｇ／ｍｌ含有されていることが好ましい。前記細胞株の培養には、ＲＰＭＩ−１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（以下、ＤＭＥＭ培地と略記することがある。）などの適当な市販された培地を使用することができるが、特にダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２混合培地（以下、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と略記することがある。）の使用で良好な培養が継続できる。これら培地には、５〜２０％程度のヒト血清、ウシ血清、又はウシ胎児血清を添加して使用することができ、必要に応じて、ヒト血清アルブミン及びウシ血清アルブミン、並びに抗生物質、抗体及び２−メルカプトエタノール等を添加することが可能である。
【００３３】
産生されたインターロイキン−１８は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離されたインターロイキン−１８を、抗ＩＬ−１８抗体を用いたウェスタンブロッティング法により検出することが可能である。
【００３４】
気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー等のアレルギー症状は、一般に免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体によって惹起されることが知られているが、インターロイキン−１８は生体内でＩｇＥ抗体の産生を抑制することが知られている〔（実験医学、増刊「免疫総集編２００１」、烏山一ら編、第１９巻、第５号、第１８９頁、羊土社、２００１年）、（臨床免疫、第３０巻、第１９１〜１９８頁、科学評論社、１９９８年）〕。これにより、生体内における本発明のインターロイキン−１８誘導剤の経口投与によるインターロイキン−１８の誘導効果は、ＩｇＥ抗体産生の抑制効果を検討す
ることによっても確認することが可能である。
【００３５】
他方、インターロイキン−１８のＩｇＥ抗体の産生抑制効果は、Ｔヘルパー細胞の２つのクラスである、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスにおいて、Ｔｈ１を優位に誘導することによって達成されると考えられている。また、in vivoでのＴｈ１、Ｔｈ２バランスの指標として、ＩｇＧ１抗体、及びＩｇＧ２ａ抗体の産生が反映されることが証明されており〔（細胞工学、第１９巻、第１２号、第１８２８〜１８３５頁、２０００年）、（臨床免疫、第３０巻、第１９１〜１９８頁、科学評論社、１９９８年）〕、これらの抗体の血液中の濃度の比を測定することでインターロイキン−１８誘導効果を判定することができる。
【００３６】
本発明のインターロイキン−１８誘導剤の有効成分である乳清蛋白加水分解物は、乳由来の天然物であって、摂取した場合の安全性が高く、牛乳等の食品中に含有され、日常的に摂取されており、毒性を示さず、長期間連続的に摂取しても副作用がほとんど認められない。従って、経口等の投与方法により適宜使用することが可能であり、公知の方法により錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、顆粒剤、散剤、軟膏等に加工することも可能である。製剤化に際して、乳清蛋白加水分解物の他に、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。また、公知の、もしくは将来的に見出されるインターロイキン−１８誘導作用を有する薬剤を併用することもできる。
【００３７】
また、乳清蛋白加水分解物を有効成分として食品中に含有させ、インターロイキン−１８誘導剤の一態様として、インターロイキン−１８誘導効果の機能を有する食品として加工することも可能である。
【００３８】
本発明のインターロイキン−１８誘導剤において、インターロイキン−１８誘導の効果を発揮させるために必要な有効成分である乳清蛋白加水分解物の配合量は、インターロイキン−１８誘導剤中の配合量として、有効成分を最終組成物に対し少なくとも０．１重量％含有されていることが好ましい。
【００３９】
本発明のインターロイキン−１８誘導剤の投与量は、年齢、症状等により異なるが、インターロイキン−１８誘導の効果を発揮させるためには、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の割合で投与することが好ましい。
【実施例】
【００４０】
次に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４１】
［実施例１］  乳清蛋白加水分解物の調製
市販の乳清蛋白質濃縮物（蛋白質含有量８３％：アーラ・フーズ・イングレディエンツ社製）１０ｇを精製水９０ｇに溶解し、水酸化ナトリウム（三栄源エフ・エフ・アイ社製）１０６ｍｇを添加してｐＨを８．５に調整した乳清蛋白質溶液を調製した。該乳清蛋白質溶液にプロテアーゼＮ（天野エンザイム社製）１４９４０活性単位（蛋白質１ｇ当たり１８００活性単位）、ビオプラーゼ（長瀬生化学工業社製）１６６０活性単位（蛋白質１ｇ当たり２００活性単位）、ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体破砕物８３０活性単位（蛋白質１ｇ当たり１００活性単位）、及びトリプシン（ノボザイム社製）１０３７５活性単位（蛋白質１ｇ当たり１２５０活性単位）を添加し、５０℃で保温して加水分解した。酵素反応を分解率によりモニターし、分解率が２５．７％に達した時点で、８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、１０℃に冷却して乳清蛋白加水分解物を調製した。前記乳清蛋白加水分解物を分画分子量１０，０００の限外濾過膜モジュール（旭化成社製。コード番号：ＳＬＰ−００５３）により処理して膜透過画分を回収し、凍結乾燥して粉末状
の乳清蛋白加水分解物約８．３ｇを得た。
【００４２】
［実施例２］  インターロイキン−１８誘導剤の製造（１）
１０００ｍｌ容量の乳鉢（中島製作所社製）に結晶セルロース（和光純薬工業社製）２０ｇを採取し、水２０ｍｌを添加して混和し、次いで予め４８メッシュのふるい（和科盛社製）で篩い分けした乳糖（メグレ社製）２５ｇを添加し、前記実施例１で調製した乳清蛋白加水分解物５５ｇを添加し、混和した。得られた湿塊をステンレス製２０メッシュふるい（和科盛社製）上に取り、乾燥用ステンレス板の上に手で押し出して顆粒を形成し、手早く均等に分布させ、乾燥機に入れ、２５℃で２日間乾燥し、微細な顆粒とした。該顆粒を、ポリエチレン製２０メッシュふるい（和科盛社製）で篩い分けし、ふるいを通過した顆粒を広い紙上に広げ、予め４８メッシュで篩い分けしたステアリン酸マグネシウム（関東化学社製）２ｇを添加し、手で混ぜて均質にした。これを打錠機（木村製作所社製、ＫＴ−２型）により、直径８ｍｍのＲ杵を使用して打錠数を１０、錠剤重量６．２ｇ、及びモンサント硬度３.５乃至５.０ｋｇの条件で圧縮圧力を設定して、打錠し、乳清蛋白加水分解物約５０％を含有するインターロイキン−１８誘導効果を有する錠剤１６個を得た。
【００４３】
［実施例３］  インターロイキン−１８誘導剤の製造（２）
乳糖（メグレ社製）６００ｇ、トウモロコシデンプン（日清製粉社製）４００ｇ、結晶セルロース（和光純薬工業社製）４００ｇ及び前記実施例１で調製した乳清蛋白加水分解物６００ｇを５０メッシュのふるい（ヤマト科学社製）により篩い分けし、厚さ０．５ｍｍのポリエチレン製の袋にとり、転倒混合し、全自動カプセル充填機（セセレ・ペディーニ社製。プレス式）を用い、前記粉末をカプセル（日本エランコ社製。１号ゼラチンカプセル、Op. Yellow No.6 Body、空重量７５ｍｇ）に内容量２７５ｍｇで充填し、インターロイキン−１８誘導効果を有するカプセル剤７０００個を得た。
【００４４】
［試験例１］
本試験では、インターロイキン−１８の誘導効果を検討した。
【００４５】
（１）試験試料
実施例１で製造した乳清蛋白加水分解物を、５％ウシ胎児血清（ギブコ社製）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（アイ・シー・エヌ バイオメディカルズ社製：カタログ番号1-800-854-0530）溶液にて０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、及び１００μｇ／ｍｌの濃度になるように希釈して試料１、試料２、試料３、及び試料４を調製した。また、ウシ血清アルブミンを、５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地溶液を用いて１００μｇ／ｍｌに希釈して対照試料を調製した。更に、実施例１の乳清蛋白質濃縮物をカゼインに変更して加水分解したカゼイン加水分解物を５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地溶液を用いて１００μｇ／ｍｌに希釈して乳蛋白対照試料を調製した。
【００４６】
インターロイキン−１８を誘導するために用いる細胞は、ヒト腸管上皮細胞株Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３７：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を使用した。
【００４７】
（２）試験方法
ヒト腸管上皮細胞株Ｃａｃｏ−２を、細胞数が１×１０4個となるように５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を用いて懸濁して細胞溶液を調製した。この細胞溶液１ｍｌを１２穴培養用プレート（ファルコン社製）に添加して、６日間、細胞がコンフルエントの状態に達するまで培養を行った。その後、ウェルをＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地溶液で２回洗浄し、試料１〜試料４、対照試料、乳蛋白対照試料、及び５％ウシ胎児血清
を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地溶液をそれぞれ１ｍｌずつ添加して、更に８時間培養を続けた。培養後、培養上清液をアスピレーターで吸引して取り除き、４℃のダルベッコリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と略記する。）で細胞を２回洗浄した。その後、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（以下、「ＳＤＳ」と略記する。）、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、及び０．５ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリドを含むＰＢＳ溶液０．２ｍｌで細胞を溶解し、細胞溶解液を１０，０００回転で１０分間、４℃にて遠心分離して、その上清を回収した。この時、試料１〜試料４、対照試料、乳蛋白対照試料、及び５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地溶液をそれぞれ添加して培養した細胞の溶解上清液を、試料群１〜試料群４、対照群、乳蛋白対照群、及び陰性群とした。
【００４８】
各群を蛋白定量し、各群蛋白質量１０μｇに相当する量を用いて非還元状態で、１６％
ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲル（テフコ社製）にて電気泳動を行った。泳動後、ゲル中に分離したタンパク質をブロッティング膜（アマシャムファルマシア社製：商品名Hybond-P）に転写し、５％となるようにＰＢＳで希釈したスキムミルク（ディフコ社製）溶液でブロッティング膜をブロッキング処理した後、０．５μｇ／ｍｌのヒトインターロイキン−１８抗体（エムビーエル社製）溶液で４℃にて１２時間、一次抗体処理した。その後、ブロッティング膜を洗浄し、５０００倍に希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（エムビーエル社製）溶液にて１時間、二次抗体処理を行った。二次抗体処理後、ブロッティング膜を洗浄し、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ（アマシャムファルマシア社製）蛍光基質溶液を用いてブロッティング膜を処理し、直ちにＸ線フィルムによって蛍光反応の検出を行った。検出された画像をデンシトメーターによって数値化し、各群のインターロイキン−１８誘導活性は、陰性群の活性を１００％としたときの相対活性として算出した。
【００４９】
（３）試験結果
本試験の結果は、表１に示すとおりである。表１は各群のインターロイキン−１８誘導活性を示す表である。表１から明らかなとおり、試料群１〜試料群４から、乳清蛋白加水分解物の濃度の上昇とともにインターロイキン−１８を誘導する活性が増加する傾向が確認された。また、前記条件では、培養液に少なくとも１μｇ／ｍｌ含有されていると、インターロイキン−１８誘導活性を示すことが確認された。対照群であるウシ血清アルブミン、及び乳蛋白対照群であるカゼイン加水分解物にはインターロイキン−１８産生促進活性が存在しなかったことから、本試験においてインターロイキン−１８の誘導活性は乳清蛋白加水分解物によるものであることが判明した。
【００５０】
【表１】
2009137982.tif 000002
【００５１】
［試験例２］
この試験は、血清中のＩｇＥ抗体量を指標として、本発明のインターロイキン−１８誘導剤の有効投与量を調べるために行った。
【００５２】
（１）試験試料
実施例１で製造した乳清蛋白加水分解物を生理食塩水（大塚製薬社製）に３００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を使用し、空試験には、生理食塩水（大塚製薬社製）を使用した。
【００５３】
（２）試験方法
試験動物として、６週齢ＢＡＬＢ／ｃ系雄性マウス（日本チャールスリバー社から購入）５０匹を、無作為に１試験群１０匹に分けて使用した。
【００５４】
抗原としてオボアルブミン（シグマ社製）２．５μｇを使用し、これをアジュバントである水酸化アルミニウム（和光純薬社製）１ｍｇに吸着させ、前記各試験動物の腹腔内に投与した。投与後３日間放置し、試料を、試料中の乳清蛋白加水分解物の投与量が、試験群毎に、０ｍｇ／ｋｇ体重／日（空試験）、３０ｍｇ／ｋｇ体重／日、１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、又は３００ｍｇ／ｋｇ体重／日の量で、１日１回、経口ゾンデ使用して強制的に３日間連続して投与し、４日間放置し、再び試料を３日間連続して投与し、１日間放置し、のちマウスの心臓より採血し、血清サンプルを得た。
【００５５】
各血清サンプル中のＩｇＥ濃度はＥＬＩＳＡ法により測定した。即ち、一次抗体である抗マウスＩｇＥモノクローナル抗体Ｒ３５−９２（ファーミンジェン社製）溶液を９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社製）に添加して、一晩４℃で吸着させた。次いでウシ血清アルブミン（シグマ社製）を使用してブロッキング処理を行った後、血清サンプルを添加して反応させた。続いて、二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＥモノクローナル抗体Ｒ３５−１１８（ファーミンジェン社製）溶液を添加して反応させた後、ペルオキシダーゼ標識アビジンＤ（ベクター・ラボラトリー社製）を添加して反応させ、発色用緩衝液であるパーオキシダーゼ基質溶液（キルケガード・ペリー・ラボラトリー社製）を添加して発色させた。この反応液の４０５ｎｍの吸光度を測定してＩｇＥ濃度を求め、各試験群１０匹の平均値を算出し、試験群毎の血清中のＩｇＥ濃度を検討した。
【００５６】
（３）試験結果
本試験の結果は、表２に示すとおりである。表２は、ＩＬ−１８誘導剤の投与量とＩｇＥ濃度の関係を示している。表２から明らかなとおり、有効成分である乳清蛋白加水分解物は、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の割合で投与することにより顕著なＩｇＥ抗体の産生抑制効果を示した。これは、生体内でＩｇＥ抗体の産生を抑制する効果を有するインターロイキン−１８が効果的に誘導されていることを示すものとして考えられる。
【００５７】
【表２】
2009137982.tif 000003
【００５８】
［試験例３］
この試験は、血清中のＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの抗体濃度の比を指標として、本発明のインターロイキン−１８誘導剤の有効投与量を調べるために行った。
【００５９】
（１）試験試料
実施例１で製造した乳清蛋白加水分解物を生理食塩水（大塚製薬社製）に３００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を使用し、空試験には、生理食塩水（大塚製薬社製）を使用した。
【００６０】
（２）試験方法
一次抗体に抗マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体Ａ８５−３（ファーミンジェン社製）溶液、及び抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｒ１１−８９（ファーミンジェン社製）溶液、並びに二次抗体にビオチン標識抗マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体Ａ８５−１（ファーミンジェン社製）溶液、及びビオチン標識抗マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｒ１９−１５（ファーミンジェン社製）溶液を使用したこと以外は、試験例２の試験方法と同様の方法で、各血清サンプル中のＩｇＧ１濃度及びＩｇＧ２ａ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定し、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ濃度比を検討した。
【００６１】
（３）試験結果
本試験の結果は表３に示すとおりである。表３はインターロイキン−１８誘導剤の投与量とＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａの濃度比の関係を示している。表３から明らかなとおり、本発明のインターロイキン−１８誘導剤の投与量の増加とともにＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａの濃度比は減少し、１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与量以上で有意な効果が確認された。この効果はインターロイキン−１８の産生誘導を介したＴｈ１優位の環境が誘導されていることを示す。尚、この至適投与量は試験例２の結果と一致するものであった。
【００６２】
【表３】
2009137982.tif 000004