(57)【要約】【課題】一塩基多型を検出する技術において、野生型ホモ、ヘテロ、変異型ホモとなる3種類のモデル検体からの辞書データが存在しなくても、多型を検出できる方法を提供すること。【解決手段】基板上に、ΔGが段階的に変化する複数のプローブ群を固定し、該プローブ群からのハイブリダイゼーション・シグナルの強度を検出し、そのシグナルの変化からピークとなるΔGを求める。求められたΔGを比較することにより、多型を判定する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一塩基多型の検出方法であって、
（i）野生型の第１オリゴヌクレオチドのＳＮＰ部を含む複数の塩基配列部分の各々に対して相補的な塩基配列を有する複数のプローブからなる第１のプローブ群を用意する工程と、
（ii）変異型の第２オリゴヌクレオチドのＳＮＰ部を含む複数の塩基配列部分の各々に対して相補的な塩基配列を有する複数のプローブからなる第２のプローブ群を用意する工程と、
（iii）該第１のプローブ群及び第２のプローブ群を構成する各々のプローブを、検体中のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ反応させる工程と、
（iv）前記工程（iii）により得られる該第１のプローブ群を構成している複数のプローブの各々がハイブリッド体を形成したことを示すシグナルの強度のプロファイル及び該第２のプローブ群を構成している複数のプローブの各々がハイブリッド体を形成したことを示すシグナルの強度のプロファイルを得る工程と、
（v）前記工程（iv）で得られた、前記第１のプローブ群に関する前記シグナル強度のプロファイルと前記第２のプローブ群に関する前記シグナル強度のプロファイルとを対比する工程と、
（vi）前記シグナル強度のプロファイルの対比により多型のジェノタイプを決める工程と、
を有し、
前記第１のプローブ群を構成する複数のプローブは、各々対応する塩基配列部分との完全相補的なハイブリッド体のギブスのフリーエネルギーΔＧが段階的に変化するものであり、
且つ前記第２のプローブ群を構成する複数のプローブは、各々対応する塩基配列部分との完全相補的なハイブリッド体のギブスのフリーエネルギーΔＧが段階的に変化するものであることを特徴とする一塩基多型の検出方法。
【請求項２】
一塩基多型の検出法であって、
前記工程（iv）において得られるシグナル強度のプロファイルとして、前記ハイブリッド体を形成したことを示すシグナル強度を前記ΔGに対してプロットした際に、その変化率が最も大きくなるΔGmを求め、
前記工程(vi)において、前記第１のプローブ群および第２のプローブ群の前記ΔGmの差によって多型のジェノタイプを決めること、
を特徴とする、請求項１に記載の一塩基多型の検出法。
【請求項３】
一塩基多型の検出に用いるプローブ固定担体であって、
（i）固相、
（ii）野生型の第１オリゴヌクレオチドのＳＮＰ部を含む複数の塩基配列部分の各々に対して相補的な塩基配列を有する複数のプローブからなる第１のプローブ群、
（iii）変異型の第２オリゴヌクレオチドのＳＮＰ部を含む複数の塩基配列部分の各々に対して相補的な塩基配列を有する複数のプローブからなる第２のプローブ群、を有し、
該第１のプローブ群を構成する複数のプローブの各々、及び該第２のプローブ群を構成する複数のプローブの各々は、該固相上の互いに離間した位置に配置されており、且つ
該第１のプローブ群を構成する複数のプローブは、各々対応する塩基配列部分との完全相補的なハイブリッド体のギプスのフリーエネルギーΔＧが段階的に変化するものであり、
該第２のプローブ群を構成する複数のプローブは、各々対応する塩基配列部分との完全相補的なハイブリッド体のギプスのフリーエネルギーΔＧが段階的に変化するものであることを特徴とするプローブ固定担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ核酸を固体表面に固定して生体試料を検出するＤＮＡマイクロアレイにおいて、検出対象となる核酸の変異をより精度よく検出するための、固定オリゴ核酸(プローブ)の塩基配列を決める、プローブ設計方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々なゲノムを取り扱う技術の進歩により、遺伝子の塩基配列情報をより詳細に解析し、疾患の要因や薬剤開発、投薬の際の副作用予測に役立てようという動きが様々な方針で進められている。そのような動きの中で、ある特定の塩基配列を持つ核酸断片を複数基板上に固定したマイクロアレイは、多方面での応用が期待されている。
【０００３】
マイクロアレイは、核酸の二重鎖形成(ハイブリダイゼーション)が高い配列特異性を示すことを利用して、試料中に特定の塩基配列をもつゲノムが存在するかを判定するために用いられるデバイスである。その構成は、独自に設計された配列を持つ複数の核酸配列が基板上の特定の位置に固定されているために、試料とのハイブリダイゼーション反応及び標識操作の後に、標識からのシグナルがどの位置から出ているかを観察することで、試料中に含まれる核酸配列を調べることができる。
【０００４】
マイクロアレイ上に搭載できる固定オリゴ核酸(プローブ)の数は飛躍的に増加し、また多種類の生物ゲノムの配列解読が進む中で、人やマウスなど様々な生物の全遺伝子を搭載したマイクロアレイも開発されるようになった。そのような遺伝子を網羅的に調べるマイクロアレイを用いて、全遺伝子のｍＲＮＡの発現を網羅的に見るなどの研究が進められてきたが、近年は、SNPなどに代表されるゲノムの変異を詳細にみる目的でも、マクロアレイの利用が進んでいる。
【０００５】
ゲノムの構成は、同一生物種であればその類似性は非常に高く、ヒトの場合99%以上が相同といわれているが、配列解読される固体の数が増えるに従い、固体間の差に対応する多型も数多く見つかるようになってきた。多型には複数の種類があり、数kbpを超える大きな領域の欠失や重複が起るようなものから、数塩基の繰り返し配列(マイクロサテライト多型)が異なる繰り返し数を持つ場合、一塩基のみが異なる多型(SNP：Single-Nucleotide-Polymorphism)などが知られている。
【０００６】
遺伝子多型の検出法も数多くの手法が知られているが、変異の種類によって検出法も大きく異なっている。数kbpに渡る大きな領域の欠失や重複などの変異に関しては、その領域付近の増幅の際に、増幅がかかるものとかからないもので判定するなど、増幅の際のプライマーの設計に工夫が見られるものが多い。それに対して、数十〜百bpの変異であればPCR産物の電気泳動によって検出する方法が知られている。また産物の長さの差を測るためには他にもマス・スペクトロメータによる方法も開発が進み、精度の向上とともに、より小さな変異も重さの差として検出が可能となってきている。
【０００７】
SNPは変異の中でも最も小さい単位である一塩基のみの変異であるが、検出法としては、かなり多くの技術が知られている。代表的な手法のみを挙げても、例えばMALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)による方法、DASH法(Dynamic allele-specific hybridization)、一塩基伸長反応を用いる方法、インベーダー法、分子ビーコン法、ASP(Allele-Specific primer)法などが挙げられる(非特許文献１)。少数のSNPをタイピングする目的では、リアルタイムPCR法に代表される液相系での反応が主流であるが、近年網羅的な解析を目指したマイクロアレイなどが実用化されるに至り、マイクロアレイを用いたSNP解析もさかんに行われるようになってきた。
【０００８】
マイクロアレイによる解析の代表としては、Affymetrix社のGeneChipによる手法が挙げられる(非特許文献２)。Affymetrix社の開発したマイクロアレイでは、SNP部位各アレルに対応するフルマッチ、ミスマッチの25merプローブ(プローブ・カルテット)が用意され、さらに冗長性を持たせるために、SNP部位を1塩基から4塩基ほどオフセットさせた位置においたプローブ・セットも用意されている。これらプローブと、検体由来のターゲットとのハイブリダイゼーションの強度を蛍光によって検出し、SNPのタイピングを行っている。
【０００９】
このように、SNPの検出は大きく3種類に分類されると考えていて、１つはハイブリダイゼーションの際にミスマッチプローブがフルマッチプローブに比べて結合エネルギーが小さく、より不安定である性質を利用するもの、２つ目は酵素の特異性が高いことを用いて異なるアレルを認識しミスマッチを判別する方法、３つ目はそもそも異なる塩基が入っていることで重さが異なることを利用するものである。本発明では、１つ目の手法である、ハイブリダイゼーションの際のエネルギー安定性に関わるものなので、以下では１つ目の方法に関してさらに詳細に述べる。
【００１０】
ハイブリダイゼーション反応とは、Ａ‐Ｔ、Ｇ‐Ｃのように相補的な配列を持つ一本鎖の核酸配列が会合して二本鎖を形成する反応であり、配列特異性が高いことで知られている。結合の強度を見積もる手法の一つとして、古くから融解曲線とその一回微分のピークとして表されるＴｍが用いられてきた。融解曲線とは、オリゴヌクレオチドの解離度の温度依存性を示したもので、260nmの吸収が一本鎖状態と２本鎖状態で変化することを利用して測定することが多い。他にもインターカレーターを用いて測定する方法などが知られている。オリゴヌクレオチドは温度が低いと二本鎖を形成しているが、温度が上昇するに伴って一本鎖に解離してゆき、それに伴い260 nmの吸収が増大する(図1)。このとき描く曲線を融解曲線とよぶ。また、等量の相補的オリゴヌクレオチドを混合した場合に、その50％に当たる量分が解離した状態となる温度をＴｍ（融解温度）とよび、上記融解曲線の一回微分で、ピークとなる温度として表される。このＴｍは、オリゴヌクレオチドの結合強度の指標として広く用いられている。
【００１１】
マイクロアレイやその他液相系での反応に際して用いられるプローブやプライマーは10bp〜30bp程度の比較的短いオリゴヌクレオチドであり、この程度の長さの場合には、一塩基のミスマッチが存在するだけで、オリゴヌクレオチド全体の結合安定性は大きく変化する。これはフルマッチとミスマッチの融解曲線の差(Tmの差)となって現われ、図１に示すように、２種の曲線の変極点(フルマッチ、ミスマッチのTm)に挟まれた領域の温度では、フルマッチのオリゴヌクレオチド同士の結合度が高いのに対して、ミスマッチとなるオリゴの解離度が高く、これらを判別することが可能となることがわかる。
【００１２】
マイクロアレイは複数のプローブを基板上に固定できるという特徴があるため、ターゲットとなる少なくとも１箇所のSNPに対して、例えば、以下のようにフルマッチおよびミスマッチのプローブを設定することができる。まず、ターゲット配列がCTGCACGCTAC(C/T)CACCAGGCCC（CYP2D6  C100T）で与えられるとする。ここで、(C/T)とは、その位置のアレルがC(野生型)の場合とT(変異型)の場合があり得ることを示している。これに対して、プローブ配列は、野生型ターゲット配列（以下TWと表す）と相補的な配列としてgggcctggtgggtagcgtgcag(PW)を設定する。一方、変異型ターゲット（以下TVと表す）と相補的な配列としてgggcctggtgagtagcgtgcag(PV)を設定する。TWとPW、TVとPVはフルマッチ、TWとPV、TVとPWはミスマッチとなる。よって、フルマッチとミスマッチのTmの間の温度でハイブリダイゼーション反応を行った場合、ターゲットがTWであれば、PWはPVより強くTWと結合(ハイブリダイズ)し、ターゲットがTVであれば、PVがPWより強くTVとハイブリダイズすることが分かる。これらの関係から、ターゲットに含まれるＳＮＰ部位の配列がCのホモ、Tのホモ、CTヘテロの何れであるかを判定することを、SNPタイピングという。
【００１３】
このように、ハイブリダイゼーション時のエネルギー安定性の差に基づいたSNPタイピングにおいては、フルマッチとミスマッチの結合度の差をいかに有効に検出するかが重要であり、その目的に合わせてプローブを設計する。SNP検出のためのプローブ設計法に関しても複数の手法が知られている。上記Affymetrix社では長さを25merに固定しSNPの位置をずらしていく方法を用いているが、この方法では数百万に上るプローブを基板上に固定することが必要となる。これに対し、１つのSNP検出に対して１つのウェルを必要とするリアルタイムPCRでは、対象とするSNPに対して、上記のTmのフルマッチとミスマッチの差(ΔTm  =  Tm(フルマッチ) − Tm(ミスマッチ))が最大となるようにプローブを設計する。
【００１４】
オリゴヌクレオチドに関するTmはNearest-Neighbour(NN)モデルにより理論的に近似式を計算することができる。例えばフルマッチの配列に関するＴｍは、非特許文献3に、ミスマッチも含んだ場合の配列に関するＴｍについては、非特許文献4に記載されている。また、その値を用いてプローブ候補となりうるオリゴヌクレオチドのΔTmを計算し、その中から最適なプローブを選択するアルゴリズムに関しては、Schutzらの方法が知られている。
【００１５】
リアルタイムPCRの場合には、一つのSNPの検出に対して一つの反応系が用意されるために、複数の検出を行う場合にもTmの一致に対する要求はそれほど大きくはない。また、ウェルプレート等で複数の反応を同一の温度コントロール下で行う場合には、多少状況が異なるが、反応溶液の組成(塩濃度など)を変えることで、原理的にはある一定の温度が、すべての反応系でミスマッチとフルマッチのTmに挟まれた状態とすることが可能である。
【００１６】
これに対しチップでSNP検出を行う場合には、基板上に固定されている、異なるＳＮＰ部位を対象とする複数のプローブ全体に対して反応系が一つに統一されているために、その反応系でフルマッチとミスマッチが判別可能であるように各ＳＮＰに対するプローブを設計する必要がある。
【００１７】
しかし実際には、Tmは連続的に選択できるものではなく、SNP部位を含む周辺配列に対してどの部分をプローブとして選択するかによって決まる値となる。またSNP部位がプローブの中央部に来る場合と、末端近くにくる場合では、中央部に来るほうが判別能が高いことも知られている。このため、各SNPに対する検出力の高いプローブを、同一のハイブリダイゼーション温度に対して、フルマッチとミスマッチのターゲットが判別可能となるように、フルマッチのＴｍとミスマッチのＴｍをそろえるように設計することは、基板上に搭載するプローブ数が増えるに従い難しいものとなる。
【非特許文献１】"High-throughput SNP genotyping" Comp Funct Genom 2002; 3: 57-66
【非特許文献２】Parallel Genotyping of Over 10,000 SNPs Using a One-Primer Assay on a High-Density Oligonucleotide Array, Genome Research 14;414-425,2004
【非特許文献３】SantaLucia,J et.al "Improved Nearest-Neighbor Parameters for Predicting DNA Duplex Stability" Biochemistry 1996,35,3555-3562
【非特許文献４】Peyret.,N et.al "Nearest-Neighbour Thermodynamics and NMR of DNA Sequence with Internal AA,CC,GG,and TT Mismatches" Biochemistry 1999,38,3468-3477
【特許文献１】米国特許第6475737号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
マイクロアレイは基板上に複数のプローブを固定し、少量のターゲットに対して多数の異なる対象部位に対する検出を一度に行うことができるという特徴をもつ。しかしこの特徴をＳＮＰの検出に生かすためには、基板上に固定されたプローブと、SNP部位を含むターゲットとのハイブリダイゼーションのTmが、ハイブリ温度Thに対して、Tm(フルマッチ)＞Th＞Tm(ミスマッチ)となる必要がある。
【００１９】
しかし、複数のSNP箇所に対して同一のハイブリダイゼーション温度のもと、上記Tm(フルマッチ)＞Th>Tm(ミスマッチ)の関係を満たすようにプローブを設計することは、必ずしも簡単ではない。特に、検出したいSNP部位がプローブの末端に近い場合にその検出力が低下することが知られているため、さらに選択枝は狭くなる。
【００２０】
また、オリゴヌクレオチドのTmの計算法はあくまで近似計算であり、液相系での測定においてその精度の高さが証明されてはいるものの、自己相補などの高次構造の効果は含まれていない。このため、実際に基板上に固定してプローブとした場合に、ターゲットとの相互作用がどの程度の強さとなるかについて、つまりは各プローブに対応するマイクロアレイのスポットがどの程度の輝度を示すかについて、正確に予測できるものではない。
【００２１】
SNPのタイピングは原理的には、野生型にフルマッチのプローブ(PW)と変異型にフルマッチのプローブ(PV)の、ターゲットとのハイブリダイゼーション強度の差を比較することで可能となる。例えばターゲットに蛍光標識を行った場合には、PWに対応するスポットからの蛍光輝度IwとPVに対応するスポットからの蛍光輝度Ivを比較して、野生型ホモ：Iw＞Iv、変異型ホモ：Iw＜Iv、ヘテロ：Iw〜Ivとなることが予想される。
【００２２】
但し、例えばヘテロの場合に、必ずしもIwとIvが同程度の輝度となる保証はない。それは、PWとTW(野生型のターゲット)のTmと、PVとTV(変異型のターゲット)のTmはともにフルマッチであっても必ずしも同じ温度にすることができないためである。さらに、PWとTVのミスマッチ、PVとTWのミスマッチも積算された形で輝度Iw、Ivが観察されることも考えると、ヘテロの場合のIw、Ivの関係がどの程度となるかを理論的に予測するのは難しい。
【００２３】
実際に、複数のSNPに関して30検体分のタイピングを行いIw、Ivを比較した結果を見ると、たとえへテロであってもIw、Ivの輝度に大きな差が見られる例が存在する。始めにシーケンスのわかっている多数の検体をタイピングすることで野生型ホモ、ヘテロ、変異型ホモの分布をみれば、それ以降未知の検体に対してIw、Ivを比較し上記分類のどこに近いかを調べることでタイピングをすることができる。しかし、すべてのSNPに対して野生型ホモ、ヘテロ、変異型ホモとなる検体が容易に集められるわけではないため、このような、“辞書データ取り”のプロセスを前提とするタイピング法では、正確な検出ができないSNPも出てくる場合がある。
【００２４】
よって本発明の目的は、より正確なSNPのタイピング法であって、モデル検体として野生型ホモ、ヘテロ、変異型ホモの場合のデータ分布を前提とせずに、SNPのタイピングが可能となる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明に係る一塩基多型の検出方法は、
（i）野生型の第１オリゴヌクレオチドのＳＮＰ部を含む複数の塩基配列部分の各々に対して相補的な塩基配列を有する複数のプローブからなる第１のプローブ群を用意する工程と、
（ii）変異型の第２オリゴヌクレオチドのＳＮＰ部を含む複数の塩基配列部分の各々に対して相補的な塩基配列を有する複数のプローブからなる第２のプローブ群を用意する工程と、
（iii）該第１のプローブ群及び第２のプローブ群を構成する各々のプローブを、検体中のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ反応させる工程と、
（iv）前記工程（iii）により得られる該第１のプローブ群を構成している複数のプローブの各々がハイブリッド体を形成したことを示すシグナルの強度のプロファイル及び該第２のプローブ群を構成している複数のプローブの各々がハイブリッド体を形成したことを示すシグナルの強度のプロファイルを得る工程と、
（v）前記工程（iv）で得られた、前記第１のプローブ群に関する前記シグナル強度のプロファイルと前記第２のプローブ群に関する前記シグナル強度のプロファイルとを対比する工程と、
（vi）前記シグナル強度のプロファイルの対比により多型のジェノタイプを決める工程と、
を有し、
前記第１のプローブ群を構成する複数のプローブは、各々対応する塩基配列部分との完全相補的なハイブリッド体のギブスのフリーエネルギーΔＧが段階的に変化するものであり、
且つ前記第２のプローブ群を構成する複数のプローブは、各々対応する塩基配列部分との完全相補的なハイブリッド体のギブスのフリーエネルギーΔＧが段階的に変化するものであることを特徴とする一塩基多型の検出方法である。
【００２６】
本発明に係る一塩基多型の検出に用いるプローブ固定担体は、
（i）固相、
（ii）野生型の第１オリゴヌクレオチドのＳＮＰ部を含む複数の塩基配列部分の各々に対して相補的な塩基配列を有する複数のプローブからなる第１のプローブ群、
（iii）変異型の第２オリゴヌクレオチドのＳＮＰ部を含む複数の塩基配列部分の各々に対して相補的な塩基配列を有する複数のプローブからなる第２のプローブ群、を有し、
該第１のプローブ群を構成する複数のプローブの各々、及び該第２のプローブ群を構成する複数のプローブの各々は、該固相上の互いに離間した位置に配置されており、且つ
該第１のプローブ群を構成する複数のプローブは、各々対応する塩基配列部分との完全相補的なハイブリッド体のギプスのフリーエネルギーΔＧが段階的に変化するものであり、
該第２のプローブ群を構成する複数のプローブは、各々対応する塩基配列部分との完全相補的なハイブリッド体のギプスのフリーエネルギーΔＧが段階的に変化するものであることを特徴とするプローブ固定担体である。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の手法を用いれば、ＳＮＰのゲノタイプに関する検出強度の分布を予め調べた辞書データの参照をとらなくても多型の存在を検出することができ、また複数のプローブからのシグナル値を比較することで、非特異的な吸着などのエラーも検出することができる。
【００２８】
またステップとなるΔGの刻み幅を細かくしたり、プローブ数を増やしたりするなど、プローブ・セットの選択の仕方を変えることで検出の精度を上げることができるため、不確定要因が多いことが予想される多型に関しては精度を高く、比較的明確な多型に関しては精度を落とすなどの調整も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明においては、一つのSNPに対して複数のプローブ・セットを用意する。その際に、どのようにプローブ・セットを選択するかについて、以下に説明する。
【００３０】
図１において、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応の温度依存性を示す融解曲線を示した。これは、一本鎖のオリゴをA、それに相補的な配列をBとしたとき、結合乗数Ｋ、熱力学パラメータΔG(ギブスのフリーエネルギー)、ΔH(エンタルピー)、ΔS(エントロピー)などと以下の式（１）のような関係があることからも示される。ここで、結合乗数Kは、一本鎖のＡ、Ｂのそれぞれの濃度を［Ａ］、［Ｂ］とし、ＡとＢが形成する二本鎖の濃度を［Ａ・Ｂ］とすると以下のような関係になる。また、Rは気体定数でR＝1.987cal/Kmolである。
【００３１】
【数１】
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【００３２】
融解曲線は、オリゴヌクレオチド配列に対してΔH、ΔS(正確には温度依存)が決まり、温度T（図１の横軸）を変えることによる右辺の変化を反映して、AとBの結合割合（図１の縦軸）が変化する様子を示したものである。NNモデルを用いれば、フルマッチ、ミスマッチのオリゴヌクレオチド・ペアに対してΔHやΔSを計算することができ、液相系での測定においては、計算値のTmは実測値と非常によくあっている。
【００３３】
融解曲線の場合には、ΔH、ΔSを固定して一組のオリゴヌクレオチド配列に対して温度Tを変化させることによって結合割合が変化する様子を得ることができる。
【００３４】
結合割合を変化させることに関する同様の効果は、温度を固定して、ΔGを変化させることによっても得られる。ΔGを変化させるためには、オリゴヌクレオチド配列自体を変化させる必要があるので、ハイブリダイゼーションの温度Thに対して結合割合の異なるオリゴヌクレオチドをプローブ・セットとして選択する。
【００３５】
NNモデルによれば、ミスマッチの場合とフルマッチの場合の熱力学パラメタ値の違いは、SNP部位とその両側の塩基のみによって決まる(図2)。よって、SNP部位を末端から二塩基以上内側に含むオリゴヌクレオチド配列に関しては、どのような配列を選択しても、フルマッチの場合とミスマッチの場合のΔHやΔSの差は等しくなる。但しここでは、図2に示されている５’末端及び３’末端の効果（ΔG(５’init)及びΔG(３’init)）と対称性による効果(ΔG(symmetry))は考慮していない。例えば、ギブスのフリーエネルギーΔGに関してΔGTW-PW、ΔGTW-PV、ΔGTV-PW、ΔGTV-PVを考える。ここでΔGTW-PWとは、野生型ターゲット(TW)と野生型プローブ(PW)がハイブリダイゼーションした場合のフリーエネルギーを表す。同様に、ΔGTW-PVは野生型ターゲット(TW)と変異型プローブ(PV)、ΔGTV-PWは変異型ターゲット(TV)と野生型プローブ(PW)、ΔGTV-PVは変異型ターゲット(TV)と変異型プローブ(PV)とがハイブリダイゼーションした場合のフリーエネルギーを表す。あるSNP部位に対して、その部位を含む周辺配列S1を選択し、上記4種類のΔGを計算することができる。また同じSNP部位を含みS1と重なる部分を含むが完全に同じではない別の周辺配列S2を選択し、上記4種類のΔGを計算する。同様にして、複数のSiを選択してそれぞれに対応するΔGを計算した場合に、ΔGTW-PWに対する他の3種のΔGの値はつねに等しくなることが示される。
【００３６】
ΔGTW-PW − ΔGTW-PV  ＝const for all Si
ΔGTW-PW − ΔGTV-PW  ＝const for all Si
ΔGTW-PW − ΔGTV-PV  ＝const for all Si
つまり、検出したいSNP部位を定めた段階で、上記3種のパラメタ値が確定する。このパラメタ値はハイブリ温度Thに依存する。次にSNP部位を含んだオリゴヌクレオチド（プローブ配列）によって残り１つのパラメタ(例えばΔGTW-PW)が確定し、これらを用いてそれぞれのハイブリダイゼーションの結合割合が図２に示した式によって決まることになる。
【００３７】
今、式(1)においてオリゴヌクレオチドA、その相補鎖Bの濃度をそれぞれC[mol/l]とし、両者を混合した状態で、解離している割合をxとする。このとき、
[A]  ＝  [B]  ＝  Cx
[A・B]  ＝  C(1-x)
と表すことができる。今右辺の熱力学パラメタによって決まる式をαとおくと、(1)式は以下のように変形することができる。
【００３８】
【数２】
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【００３９】
これを解くと、結合割合(1-x)はCαの関数として以下のように表され、その様子は図3に示したようなグラフになる。
【００４０】
【数３】
2009232707.tif 000005
【００４１】
このように、ΔG(ΔHとΔS)の異なる配列をプローブとして選択することによって、同じ温度Thでハイブリダイゼーションを行っても、異なる結合割合を得ることができる。図4に、濃度CをC=1.0x10-6[mol/l]とした場合に、図3のx軸をLn(α)としたグラフを示す。ここで、
【００４２】
【数４】
2009232707.tif 000006
【００４３】
となる。図4には、同じグラフをX軸方向に2だけずらしたグラフを重ねて描いてあるが、これはミスマッチの場合に、ΔGが同じ値だけ異なる場合のモデル図である。
【００４４】
図4のグラフに関して、その変化率を示したグラフ(一回微分)を図5に示す。ハイブリダイゼーションの温度が、選択されたオリゴヌクレオチドのTmに一致する場合には、解離割合が50%(x=0.5)となるときにピークをもつ。このピークとなるΔGを比較することで、フルマッチとミスマッチの判別が可能となる。
【００４５】
以上のことをまとめると、図4を見ると分るように、ΔGの値をずらしたプローブを設計することで、ターゲットとの結合強度の異なるプローブを選択することが可能となる。その際に、各プローブのミスマッチ・ターゲットとのハイブリ強度を示すΔGとの差は1つのSNP部位に対してはすべて等しくなるために、図４に示したように、ミスマッチ・ターゲットとの結合強度を表す曲線は、もとの曲線をx軸上でずらした形で表される。よって、選択されたプローブと各ターゲットとの結合強度の関係が図4のように追加された縦線上の1-xの値として表されるから、複数のプローブをプローブ・セットとして選択し、それぞれのプローブからの強度比を比較することで、より正確なSNP判定を行うことができる。
【００４６】
よって、本発明にかかる一塩基多型の検出方法は以下の（i）から（vi）の工程を有する。
（i）野生型の第１オリゴヌクレオチドのＳＮＰ部を含む複数の塩基配列部分の各々に対して相補的な塩基配列を有する複数のプローブからなる第１のプローブ群を用意する工程。
（ii）変異型の第２オリゴヌクレオチドのＳＮＰ部を含む複数の塩基配列部分の各々に対して相補的な塩基配列を有する複数のプローブからなる第２のプローブ群を用意する工程。
（iii）第１のプローブ群及び第２のプローブ群を構成する各々のプローブを、検体中のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ反応させる工程。
（iv）工程（iii）により得られる該第１のプローブ群を構成している複数のプローブの各々がハイブリッド体を形成したことを示すシグナルの強度のプロファイル及び該第２のプローブ群を構成している複数のプローブの各々がハイブリッド体を形成したことを示すシグナルの強度のプロファイルを得る工程。
（v）工程（iv）で得られた、第１のプローブ群に関する前記シグナル強度のプロファイルと第２のプローブ群に関する前記シグナル強度のプロファイルとを対比する工程。
（vi）前記シグナル強度のプロファイルの対比により多型のジェノタイプを決める工程。
【００４７】
その上、第１のプローブ群を構成する複数のプローブおよび第２のプローブ群を構成する複数のプローブはそれぞれ、各々対応する塩基配列部分との完全相補的なハイブリッド体のギブスのフリーエネルギーΔＧが段階的に変化するものであることを特徴とする。フリーエネルギーΔＧの段階的な変化の値としては、０．１〜５ [kcal/mol]の範囲であることが好ましい。
【００４８】
好ましい態様の一つとして、工程（iv）において得られるシグナル強度のプロファイルとして、工程（iii）の反応によりハイブリッド体を形成したことを示すシグナル強度をフリーエネルギーΔGに対してプロットした際に、その変化率が最も大きくなるΔGmを求め、かつ工程(vi)において、第１のプローブ群および第２のプローブ群のΔGmの差によって多型のジェノタイプを決める方法を行うことができる。
【００４９】
また、本発明は、一塩基多型の検出に用いるプローブ固定担体は、
（i）固相、
（ii）野生型の第１オリゴヌクレオチドのＳＮＰ部を含む複数の塩基配列部分の各々に対して相補的な塩基配列を有する複数のプローブからなる第１のプローブ群、
（iii）変異型の第２オリゴヌクレオチドのＳＮＰ部を含む複数の塩基配列部分の各々に対して相補的な塩基配列を有する複数のプローブからなる第２のプローブ群、を有し、
第１のプローブ群を構成する複数のプローブの各々、及び該第２のプローブ群を構成する複数のプローブの各々は、該固相上の互いに離間した位置に配置されており、且つ
第１のプローブ群を構成する複数のプローブ及び第２のプローブ群を構成する複数のプローブはそれぞれ、各々対応する塩基配列部分との完全相補的なハイブリッド体のギプスのフリーエネルギーΔＧが段階的に変化するものであることを特徴とする、一塩基多型の検出用プローブ固定担体を包含する。
【００５０】
以下に、図面に基づいて本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【実施例】
【００５１】
<実施様態例>
モデル系として、P450ファミリーとして有名な代謝酵素群の中でも、特に多くの薬剤代謝に関わることが知られている遺伝子の1つであるCYP2D6の一塩基多型を用いる。このモデル系を例として、プローブ設計およびマイクロアレイの作製、ターゲットの調製からハイブリダイゼーション反応＆蛍光検出、データ解析までの流れを示す。本発明の主題であるプローブ設計とデータ解析部分については、実施例1、2の中で詳細に示す。
【００５２】
(マイクロアレイの構成)
プローブの固定は特開平11-187900号公報に詳細が示されているように、表面処理を行った基板にインクジェットにより5’末端をチオール化したオリゴDNAを吐出する方法を用いる。ここでプローブとなるDNAは20塩基程度の長さをもち、(株)ベックスから購入したものである。
【００５３】
(ブロッキング)
ハイブリダイゼーション反応を行う前に、以下のブロッキング反応を行う。マイクロアレイのブロッキングは、マイクロアレイのプローブ以外の部分に核酸分子が吸着するのを防ぐために行う。ハイブリダイゼーションの直前に行うのが一般的である。
【００５４】
BSA（牛血清アルブミンFraction  V:Sigma社製）を１wt％となるように100ｍM  NaCl/10mMリン酸バッファに溶解し、この溶液にDNAマイクロアレイを室温で2時間浸す。ブロッキング終了後、0.1wt%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む0.1xSSC溶液（クエン酸三ナトリウムとNaCl）と、SDSを含まないSSC溶液で洗浄し、超純水でリンスしてから、スピンドライで水切りを行う。
【００５５】
(ターゲットの準備)
抽出されたヒトゲノムの増幅(PCR)反応の例を以下に示す。増幅反応液組成の例を以下の表１に示す。
【００５６】
【表１】
2009232707.tif 000007
【００５７】
上記組成の反応液を以下の表２の温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行う。
【００５８】
【表２】
2009232707.tif 000008
【００５９】
反応終了後、精製用カラム(QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit: QIAGEN社製)を用いてPrimerを除去した後、電気泳動(Bioanalyzer：Agilent社製)により、増幅産物の定量を行う。
【００６０】
その後Cy3-dCTPを含んだdNTP mixを用いてターゲットに標識を行う。
【００６１】
【表３】
2009232707.tif 000009
【００６２】
上記組成の表３の反応液を以下の表４の温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行う。
【００６３】
【表４】
2009232707.tif 000010
【００６４】
（ハイブリダイゼーション）
水切りしたＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置(Genomic Solutions Inc. Hybridization Station)にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行う。
【００６５】
ハイブリダイゼーション溶液；6xSSPE / 10% Formamide / PCR product 20ng / 標識付きプローブ相補鎖（0.2nＭ）
上記ハイブリダイゼーション溶液を、６５℃に加温し3分間保持した後、さらに９２℃で２分間、続いて４５℃で４時間保持する。その後、2xSSCおよび0.1％SDSを用いて、４０℃で洗浄する。さらに2xSSCを用いて２０℃で洗浄を行い、純水でリンスしてプローブと未反応の標識付きプローブ相補体を除去し、スピンドライ装置で水切りを行う。
【００６６】
（蛍光測定）
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡマイクロアレイを、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Axon社製、GenePix 4000B）を用いて、以下の条件で蛍光測定を行う。蛍光測定波長を標識付きプローブ相補鎖に含まれる蛍光物質の波長と合わせて、蛍光測定値が30000以下になるように励起光の強さを調製して、測定する。
【００６７】
（スポット解析）
蛍光測定結果の画像を、マイクロアレイ用のデータ解析ソフトArrayPro(Media Cybernetics社製)で解析を行い、各スポットに対する輝度値のデータを得る。
【００６８】
（実施例１）
CYP2D6のSNPの1つであるC100Tに着目する。その周辺の配列を示すと以下のようになる。
CAACGCTGGGCTGCACGCTAC(C/T)CACCAGGCCCCCTGCCACTG（配列番号１）
ここで検出プローブの候補として、C100T部位を含む周辺配列を考える。だいたい５０℃前後でハイブリダイゼーション反応を行いCとTの判別を行うことを考え、プローブ長としては16〜30merを検討する。またSNP部位が末端近くにくるプローブは望ましくないために、C100T部分から末端までに、C100T部分を除いて少なくとも4塩基が存在するもののみを検討する。
【００６９】
プローブ候補の配列を、その5’末端の塩基と配列長によって整理する。末端から少なくとも4塩基より内側にC100T部位がある必要があるために、最もC100T部位に近い5’末端塩基はC(CTAC(C/T)の左端のC)となる。そこから長さが17bpのものから、30bpのものまでがプローブの候補となりうる。逆に、配列長が16bpのときに、3’末端がC100T部位よりも4塩基右側((C/T)CACCの右端のC)になくてはいけないので、その場合の5’末端塩基はC(CTGCAの左端のC)となる。これより右側の塩基を5’末端にもつプローブ候補は、配列長が16bpよりも長いものとなる。
【００７０】
このようにして求めたプローブ候補と、その配列より計算されるΔGを図６に示す。図６で横軸は5’末端の塩基の位置を示し、縦軸は配列長を表す。配列長は図の最も上が16bpで下にいくに従い長くなる。最も下では29bpとなっている。左上部分に三角形に抜けている領域は、この領域内の5’末端の塩基と配列長の組み合わせでは、SNP部位を末端から4塩基より内側に含んで持つことができないために、候補外となることを示している。
【００７１】
また図６は対応するプローブ候補のΔGの値も示している。但しここで、Th＝323.15K  (50℃)、オリゴ濃度[C]＝1.5nM、塩濃度[Na]＝900mM、DMSO＝10％を用いた。図６より、配列長が長くなれば｜ΔG｜の大きさが大きくなる傾向が見て取れるが、たとえ同じプローブ長であっても、配列によってΔGにばらつきが出ることも示されている。この傾向は、より細部を拡大してTmの値を示した図６の下方図でより顕著に示されている。
【００７２】
次に、選択されたプローブ候補に対して、ミスマッチの場合のΔGを求める。図６で示したのは、５’末端の塩基とその配列長に対応したオリゴヌクレオチド(SNP部位は野生型)と、その相補鎖とのΔG、Tmであり、センス鎖、アンチセンス鎖ともに野生型の場合(ww)であった。これに対し図７では、センス鎖、アンチセンス鎖に変異型がはいった場合の４つの組み合わせを示す(ww、wm、mm、mw)。このとき、x軸はwwの場合のΔGであり、同じ配列でSNP部位のみが異なる組み合わせに関しては、同一x座標で表示されるようになっている。図７のグラフ中でww、wm、mm、mwの順でより高いTｍを示している。
【００７３】
基板上でのTmは液相系でのTmよりも10℃程度低いことが知られていて、実際にSNP判定に適した領域は、フルマッチ(ww,mm)とミスマッチ(wm,mw)のTmが59℃〜61℃の上下にくるプローブである。よってこの領域を中心として、ΔGwwを0.5〜1.0[kcal/mol]刻みとなるように9種のプローブ(A〜I)を選択した(図８)。各プローブ配列は以下のとおりである。これらのプローブ配列はアンチセンス鎖の配列であり、上記C100T周辺の配列とは相補の関係となる。
【００７４】
プローブＡ：AGGGGGCCTGGTGGGTAGCG  （配列番号５）
プローブＢ：GGGCCTGGTGGGTAGCGTGC  （配列番号６）
プローブＣ：GGCCTGGTGGGTAGCGTGCA  （配列番号７）
プローブＤ：GGTGGGTAGCGTGCAGCCCA  （配列番号８）
プローブＥ：GCCTGGTGGGTAGCGTGCAG  （配列番号９）
プローブＦ：GGCCTGGTGGGTAGCGTGC    （配列番号１０）
プローブＧ：GCCTGGTGGGTAGCGTGCA    （配列番号１１）
プローブＨ：GGGGCCTGGTGGGTAGCG      （配列番号１２）
プローブＩ：GCCTGGTGGGTAGCGTGC      （配列番号１３）
各プローブ候補に対して、野生型センス鎖、変異型センス鎖、野生型アンチセンス鎖、変異型アンチセンス鎖の4種を合成し、上記実施の様態に従って基板上に固定したマイクロアレイを作製した。
【００７５】
次に、上記実施の様態にならって、C100Tに関するジェノタイピングがCC(野生型ホモ)と分かっている検体を用いてCYP2D6領域を増幅した。このとき用いたプライマーは偽遺伝子である2D7、2D8の干渉を受けず、選択的に2D7を増幅することで知られている以下の配列を用いた("Novel Nonsynonymous Single Nucleotide Polymorphisms in the CYP2D6 Gene" Drug Metab. Pharmacokin. 19(4):SNP19(313)SNP25(319)2004)。
【００７６】
2D6-DPKup  ：  GTTATCCCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA  （配列番号２）
2D6-DPKlow  ：  GCCGACTGAGCCCTGGGAGGTAGGTA  （配列番号３）
さらに上記PCR産物をテンプレートとして、C100T周辺を増幅するプライマーを設計して、上記実施の様態にならって標識付きの増幅産物を生成し、作製したマイクロアレイとハイブリダイゼーション反応を行った。各プローブからの蛍光輝度を比較すると、AからIに向かうに従い輝度が小さくなることがわかる(図9A)。また輝度値が大きく変化する変極点に対応するΔGが、ターゲットとなる検体のジェノタイピングによって異なり、それをもとに多型を判定することが可能であることが示された。図９において、C100T SWは、野生型プローブから得られた蛍光輝度であり、C100T SMは変異型プローブから得られた蛍光輝度を示している。
【００７７】
（実施例２）
実施例１と同様の手順で、同じくCYP2D6遺伝子上の多型C1039Tを検討した。C1039T周辺の配列を以下に示す。
【００７８】
ATCACCCAGATCCTGGGTTT(C/T)GGGCCGCGTTCCCAAGGCAA  （配列番号４）
実施例1と同様、C1039T部位を含む周辺配列の中から、配列長が16bp~30bpで、SNP部位を末端から4塩基よりも内部に含む配列をプローブ候補として、そのΔGおよびTmを計算した。そして、Tmが59℃〜61℃となるプローブの中から、今度はC100Tの場合に比べてΔGwwの間隔を広め(1.0〜[kcal/mol])にして6種類のプローブ（プローブ１〜６）を選択した。各プローブ配列は以下のとおりである。これらのプローブ配列はアンチセンス鎖の配列であり、上記C1039T周辺の配列とは相補の関係となる。
【００７９】
プローブ１：ACGCGGCCCGAAACCCAGGAT  （配列番号１４）
プローブ２：GAACGCGGCCCGAAACCCAG    （配列番号１５）
プローブ３：GCGGCCCGAAACCCAGGATC    （配列番号１６）
プローブ４：CGCGGCCCCAAACCCAGG      （配列番号１７）
プローブ５：ACGCGGCCCCAAACCCA        （配列番号１８）
プローブ６：CGCGGCCCCAAACCCA          （配列番号１９）
これら選択されたプローブ・セットを、実施の様態にならって基板上に固定したマイクロアレイを作成し、同じく実施の様態にならって増幅および標識したターゲットとのハイブリダイゼーション反応を行った。ターゲットは、変異を有し得る位置の塩基の組み合わせがCCホモ、CTヘテロ、TTホモの3種類の、シーケンス結果のわかっている検体を用いた。
【００８０】
蛍光輝度を観察し、上記の3種類が判定可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】融解曲線(Melting Curve)の概略図である。
【図２】Nearest−Neighbour法による熱力学パラメタの計算法を示す。
【図３】ΔG、濃度と結合割合の関係を示すグラフである。
【図４】濃度C =1.0x10-6[mol/l]で、図3のグラフのx軸をLn(α)とした場合の結合割合を示すグラフである。
【図５】図4の変化率(一回微分)を示したグラフである。
【図６】C100T周辺配列から選んだプローブ候補とそのΔG、Tmの分布を示すグラフである。
【図７】フルマッチ、ミスマッチの場合のTmを示すグラフである。
【図８】選択されたプローブ候補（A-I）を示す図７を拡大したグラフである。
【図９】選択されたプローブ（A-I）の蛍光輝度を示すグラフである。(A)ハイブリダイゼーション後の蛍光輝度。(B)プローブ間の輝度の差。
【図２】
2009232707.tif 000011
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009232707.tif 000018
【図９】
2009232707.tif 000019
【配列表】
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