(57)【要約】【課題】ヒドロキシイソロイシン又は２-アミノ-３-メチル-４-ケトペンタン酸の製造方法を提供する。【解決手段】２-アミノ-３-メチル-４-ケトペンタン酸から４-ヒドロキシイソロイシンを生成する、微生物由来の酵素の存在下で２-アミノ-３-メチル-４-ケトペンタン酸またはその塩を還元反応に供し４-ヒドロキシイソロイシンを生成させる工程を含むことを特徴とする、４-ヒドロキシイソロイシン又はその塩の製造方法。Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの存在下で、Ｌ−イソロイシンを反応させる工程を含む、２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法。４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性が低減又は欠失するように改変されている、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有する細菌の存在下で、Ｌ−イソロイシンから（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スポロボロミセス・グラシリス（Sporobolomyces gracilis）、クリプトコッカス・アルビダス(Cryptococcus albidus)、ロドトゥルラ・マリナ(Rhodotorula marina）、ロドトゥルラ・パリダ（Rhodotorula pallida）、フラボバクテリウム・エステロアロマティクム（Flavobacterium esteroaromaticum）、バシラス・チュリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）、アグロバクテリウム・ラディオバクター(Agrobacterium radiobacter)、プルラリア・プルランス(Pullularia pullulans)、フサリウム・ソラニ(Fusarium solani)、ジベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)、モルティエレラ・イザベリナ(Mortierella isabellina)、モルティエレラ・フミコーラ(Mortierella humicola）、トリコデルマ・レーゼイ(Trichoderma reesei)、オーレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、セファロスポリウム・コレミオイデス(Cephalosporium coremioides)、バーティシリウム・アルボ-アトラム（Verticillium albo-atrum）、ピトミセス・メイディカム(Pitomyces maydicum)、ロドコッカス・ルバー(Rhodococcus ruber)、ノカルディア・エスピー（Nocardia sp.）、ストレプトミセス・オリボクロモゲネス（Streptomyces olivochromogenes）、クリニペリス・スティピタリア(Crinipellis stipitaria)、フラムリナ・ベルティペス(Flammulina velutipes)、トリコロマ・マツタケ（Tricholoma matsutake）およびフォミトプシス・プベルタティス(Fomitopsis pubertatis) から選ばれる１種類または２種類以上の微生物に由来する２-アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸還元酵素を２-アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩と接触させ、４-ヒドロキシイソロイシンを生成させる工程を含むことを特徴とする、４-ヒドロキシイソロイシン又はその塩の製造方法。
【請求項２】
微生物が、Sporobolomyces gracilis AKU 4438、Cryptococcus albidus AKU 4507、Rhodotorula marina AKU 4806、Rhodotorula pallida AKU 4810、Flavobacterium esteroaromaticum AKU 146、Bacillus thuringiensis AKU 238、Bacillus thuringiensis ATCC 35646、Agrobacterium radiobacter AKU 301、Pullularia pullulans AKU 3651、Fusarium solani TG-2 AKU 3710、Gibberella fujikuroi AKU 3804、Gibberella fujikuroi AKU 3805、Mortierella isabellina AKU 3999-2、Mortierella humicola AKU 3999-5、Trichoderma reesei AKU 3999-15、Aureobasidium pullulans IFO 4466、Cephalosporium coremioides IG 212、Verticillium albo-atrum IG 504、Pitomyces maydicum IG 611、Rhodococcus ruber NOC 081、Nocardia sp. AKU 2130、Streptomyces olivochromogenes AKU 2301、Crinipellis stipitaria AKU 5507、Flammulina velutipes AKU 5518、AKU 5519、Flammulina velutipes AKU 5520、Flammulina velutipes HATSUYUKI AKU 5608、Tricholoma matsutake IFO 30604およびFomitopsis pubertatis (Lioyd) Imaz. AKU 5709、から選択される微生物である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
酵素が、
（ａ）配列番号１３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および、
（ｂ）配列番号１３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質において１から３０個のアミノ酸残基が付加、欠失、置換または挿入され、かつ、２-アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸還元酵素活性を有するものをコードするＤＮＡ、
から選ばれる一つで形質転換されたエシェリヒア属細菌を培養して得られるものである、請求項１記載の製造方法
【請求項４】
（ａ）配列番号５の塩基配列を含むＤＮＡと、
（ｂ）配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡと、
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列において、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９８％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、
から成る群から選択されるＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡをベクターＤＮＡと連結させることによって得られる組み換えＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３に記載の組み換えＤＮＡで形質転換された細胞。
【請求項７】
培地中で請求項６に記載の細胞を培養し、培地もしくは細胞またはその両方に４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを含む、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法。
【請求項８】
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質と、
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列において、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９８％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
から成る群から選択されるタンパク質。
【請求項９】
２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法であって、
水性溶媒中で、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ、及び
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質と、
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列において、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
から成る群から選択される少なくとも１つの４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの存在下で、Ｌ−イソロイシンを反応させ、
生成する２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸を単離することを含む、２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法。
【請求項１０】
２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法であって、
水性溶媒中で、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ、及び
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質と、
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列において、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
と、
から成る群から選択される少なくとも１つの４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼを含有する細菌の存在下で、Ｌ−イソロイシンを反応させ、
生成する２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸を単離することを含む、２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法。
【請求項１１】
前記細菌が前記４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性を高めるように改変されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌が、前記Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び前記４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性を高めるように改変されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質の活性が、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることによって高められる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子の発現が、前記タンパク質をコードする該遺伝子の発現制御配列を改変すること、又は該タンパク質をコードする該遺伝子のコピー数を増加させることによって増大される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌がエシェリキア属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、アルトロバクター属、アスペルギルス属又はバチルス属に属する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌が大腸菌（Escherichia coli）、アルトロバクター・シンプレックス（Arthrobacter simplex）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、アルトロバクター・グロビフォルミス（Arthrobactor globiformis）、アルトロバクター・スルフレウス（Arthrobactor sulfureus）、アルトロバクター・ビスコーサス（Arthrobactor viscosus）、又は枯草菌（Bacillus subtilis）に属する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌が細菌培養物、細胞、処理細胞、又は細胞溶解物である、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法であって、
水性溶媒中で、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性の両方を元来有する細菌の存在下で、Ｌ−イソロイシンを反応させ、
生成する（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離することを含み、前記細菌が４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性が低減又は欠失するように改変されている、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法。
【請求項１９】
前記細菌においてＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がオペロンを構成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細菌が、前記Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼの活性を高めるように改変される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細菌における４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性が、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現の減衰又は抑制によって低減又は欠失する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌がバチルス属、エンテロバクター属、又はシュードモナス属に属する、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌がバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・ワイヘンステファンエンシス（Bacillus weihenstephanensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerance）、又はシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に属する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌が細菌培養物、細胞、処理細胞、又は細胞溶解物である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４-ヒドロキシイソロイシン又は２-アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸の製造法に関する。また、本発明は、新規な４-ヒドロキシ-Ｌ-イソロイシンデヒドロゲナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
４-ヒドロキシ-Ｌ-イソロイシン（以下、単に「ＨＩＬ」と呼ぶことがある。）は、血糖値依存的なインスリン分泌活性[非特許文献１]やインスリン感受性を向上させる作用[非特許文献２]が知られており、これらの糖代謝改善作用を応用した医薬品や健康食品素材として有用である可能性が報告されている[特許文献１]。
【０００３】
ＨＩＬの製造法として、化学合成法や、化学合成法と微生物による触媒反応を併用した合成法[非特許文献３]などが報告されており、天然体と同じ(2S,3R,4S)立体配置のＨＩＬをはじめとする各種HILアイソマーや類縁体の製法が報告されている。イソロイシン水酸化酵素については、ハーブの一種であるフェヌグリーク幼若体抽出液中のジオキシゲナーゼの酵素学的性質に関する報告がある[非特許文献４]。しかし、その後の検討は報告されておらず、また、酵素は植物抽出液由来であり大量に取得することが困難であると推定される。一方、微生物由来イソロイシン水酸化酵素に関する報告はない。
【０００４】
微生物によるイソロイシン類似体の生産については、バチルス属細菌による２-アミノ-３-メチル-４-ケトペンタン酸（ＡＭＫＰ）生産の報告がある[非特許文献５]。
【０００５】
大腸菌株（Ｄａｖｉｓ１１３−３）のビタミンＢ12刺激増殖を阻害する物質を産生する微生物の調査によって、このような能力を有したバチルス・セレウス（Bacillus cereus）株が選抜された。２−アミノ−４−ケト−３−メチルペンタン酸は、バチルス・セレウス４３９の発酵からジアステレオマー混合物として単離され、大腸菌のビタミンＢ12要求株（Ｄａｖｉｓ１１３−３）に基づくバイオアッセイ系でビタミンＢ12代謝拮抗剤であることが見出された。生物活性を有する同様のジアステレオマー混合物は、２−ブロモ−３−ブタノンと、アセトアミドマロン酸ジエチルナトリウムとの縮合、その後の６ＮのＨＣｌを用いた加水分解及びイオン交換クロマトグラフィーによる精製によって合成された。代謝拮抗剤の増殖阻害効果は、ビタミンＢ12、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン、及びＤ−アラニンによって復帰した（非特許文献６）。
【０００６】
４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、フェヌグリーク種子（コロハ（Trigonella foenum-graecum L. leguminosae））から抽出及び精製することができるアミノ酸である。４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、単離灌流ラット膵臓及びヒトの膵島の両方で実証されているように、その促進効果が培地中の血漿グルコース濃度に明白に依存することから非常に興味深いインスリン分泌活性を示す（非特許文献７）。このようなグルコース依存性は、２型糖尿病（すなわち、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤ）、インスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ））の治療に現在用いられている唯一のインスリン分泌活性剤であるスルホニル尿素（非特許文献８）では確認されていない。その結果、低血糖症が依然として、スルホニル尿素治療の一般的に望ましくない副作用である（非特許文献９、非特許文献１０）。また、耐糖能の改善方法が知られている（非特許文献１１）。この糖代謝増強活性と医薬品及び健康食品への潜在用途とが報告されている（特許文献２、特許文献３）。
【０００７】
しかし、現在、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをクローニングしたという報告、並びにＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼを用いて、Ｌ−イソロイシンから２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタノン酸を産生したという報告はない。
【０００８】
植物でのみ見出される４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、その特別なインスリン分泌作用のため、様々な程度のインスリン耐性に関連するインスリン分泌不全を特徴とする疾患である２型糖尿病の治療に対して潜在的に興味深い新規の分泌促進剤として考えられ得る（非特許文献１２）。
【０００９】
フェヌグリーク抽出物においてジオキシゲナーゼ活性を利用することによって、鉄、アスコルビン酸、２−オキシグルタル酸、及び酸素依存性イソロイシンを酸化する方法が、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを製造するための方法として報告されている（非特許文献１３）。しかし、酵素活性が２０ｍＭ以上のイソロイシン濃度で基質によって阻害され、この酵素が同定されておらず、この酵素が植物抽出物由来であり、また大量に得ることが容易ではなく、この酵素が不安定であることから、この方法は、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを製造する方法として満足いくものではない。
【００１０】
全収率が３９％である、光学的に純粋な（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンの効率的な８工程合成が開示されている。この合成の鍵となる工程は、ゲオトリクム・キャンディダム（Geotrichum candidum）による２−メチルアセト酢酸エチルの（２Ｓ，３Ｓ）−２−メチル−３−ヒドロキシ−ブタン酸エチルへの生物変換及び不斉ストレッカー合成を含む（非特許文献１４）。
【００１１】
最後の工程がＥｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ（Ｅ−ＰＡＣ）上で固定した市販のペニシリンアシラーゼＧを用いた、Ｎ−フェニルアセチルラクトン誘導体の加水分解による酵素分割である、立体化学の全体制御による、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンの短い６工程の化学酵素合成も開示されている（非特許文献１５）。
【００１２】
しかし、現在、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有する細菌を用いて、特にＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性の両方を元来含有し、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性が低減又は欠失している細菌を用いて、Ｌ−イソロイシンの直接の酵素的水酸化によって（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンを産生したという報告はない。
【非特許文献１】Diabetes, Vol. 47, Issue 2, pp. 206-210, 1988
【非特許文献２】Am. J. Physiol. Endcrinol., Vol. 287, E463-E471, 2004
【非特許文献３】Eur. J. Org. Chem., Vol. 2002, pp. 834-839, 2002
【非特許文献４】Phytochemistry, Vol. 44, No. 4, pp. 563-566, 1997
【非特許文献５】Bioorganic Chemistry, Vol. 6, pp. 263-271, 1977
【特許文献１】特開平６-１５７３０２号公報
【非特許文献６】Perlman D.他, Bioorganic Chemistry, 6（3）, 263-71（1977）
【非特許文献７】Sauvaire, Y.他, Diabetes, 47: 206-210,（1998）
【非特許文献８】Drucker, D. J., Diabetes 47: 159-169,（1998）
【非特許文献９】Jackson, J.,及びBessler, R. Drugs, 22: 211-245; 295-320（1981）
【非特許文献１０】Jennings, A.他, Diabetes Care, 12: 203-208（1989）
【非特許文献１１】Am. J. Physiol. Endocrinol., Vol. 287, E463-E471, 2004
【特許文献２】特開平６−１５７３０２号公報
【特許文献３】米国出願公開第２００７−０００４６３号Ａ１
【非特許文献１２】Broca, C.他, Am. J. Physiol. 277（Endocrinol. Metab. 40）:E617-E623,（1999）
【非特許文献１３】Phytochemistry, Vol.44, No.4, pp.563-566, 1997）
【非特許文献１４】Wang, Q.他, Eur. J. Org. Chem., 834-839（2002）
【非特許文献１５】Rolland-Fulcrand, V.他, J. Org. Chem., 873-877（2004）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の解決しようとする課題は、大量調製が可能な微生物を用いて４-ヒドロキシイソロイシン（その遊離形態及び塩形態両方を含む意味として用いられ、「４ＨＩＬ」と呼ぶこともある、以下同様）を製造する方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の課題は、２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸（その遊離形態及び塩形態を含むことを意味するように用いられ、「ＡＭＫＰ」と呼ぶこともある、以下同様）を産生すること、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ、又はＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有する細菌を用いて、Ｌ−イソロイシンからＡＭＫＰを製造する方法を提供することである。すなわち、本発明の目的には、新規の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ、及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、並びにＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼを用いて、Ｌ−イソロイシンからＡＭＫＰを産生する方法を提供することが含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、ＡＭＫＰから４-ヒドロキシイソロイシンを生成する酵素活性を有する微生物を発見し、当該微生物の活用によりＡＭＫＰから４-ヒドロキシイソロイシンを簡便に製造することに成功した。すなわち、本発明によれば、微生物を用いることにより、還元反応による簡便な４-ヒドロキシイソロイシンの製造方法を提供することができる。
【００１６】
また、本発明者らは、新規な４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼを見出し、それとイソロイシンジオキシゲナーゼとを用いてＬ−イソロイシンからＡＭＫＰを製造することに成功した。本発明によれば、二つの酵素又はそれらを有する微生物を用いることによりＬ−イソロイシンからＡＭＫＰを製造する方法を提供することができる。
【００１７】
さらに、本発明者らは、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ又はＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有する細菌を用いて、Ｌ−イソロイシンの直接の酵素的水酸化によって（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンを産生する新規の方法を提案しているが、さらなる研究によって、幾つかの細菌は、生成した（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンを（ＡＭＫＰ）へ変換させることができることが明らかになった。本発明者らは、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性のレベルが高く、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードするクローニング遺伝子を有する細菌を同定し、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性の両方を元来有する細菌を用いた所望の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの合成のためには、細菌において４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性を低減又は欠失させ、所望の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンのＡＭＫＰへの変換を妨げる（これにより本発明は完了する）必要があることを見出した。本発明によれば、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を低減又は欠失させた微生物を用いることによりＬ−イソロイシンから４−ヒドロキシイソロイシンを製造する方法を提供することができる。
【００１８】
本発明は少なくとも以下のものを含む。
（１）スポロボロミセス・グラシリス（Sporobolomyces gracilis）、クリプトコッカス・アルビダス(Cryptococcus albidus)、ロドトゥルラ・マリナ(Rhodotorula marina）、ロドトゥルラ・パリダ（Rhodotorula pallida）、フラボバクテリウム・エステロアロマティクム（Flavobacterium esteroaromaticum）、バシラス・チュリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）、アグロバクテリウム・ラディオバクター(Agrobacterium radiobacter)、プルラリア・プルランス(Pullularia pullulans)、フサリウム・ソラニ(Fusarium solani)、ジベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)、モルティエレラ・イザベリナ(Mortierella isabellina)、モルティエレラ・フミコーラ(Mortierella humicola）、トリコデルマ・レーゼイ(Trichoderma reesei)、オーレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、セファロスポリウム・コレミオイデス(Cephalosporium coremioides)、バーティシリウム・アルボ-アトラム（Verticillium albo-atrum）、ピトミセス・メイディカム(Pitomyces maydicum)、ロドコッカス・ルバー(Rhodococcus ruber)、ノカルディア・エスピー（Nocardia sp.）、ストレプトミセス・オリボクロモゲネス（Streptomyces olivochromogenes）、クリニペリス・スティピタリア(Crinipellis stipitaria)、フラムリナ・ベルティペス(Flammulina velutipes)、トリコロマ・マツタケ（Tricholoma matsutake）およびフォミトプシス・プベルタティス(Fomitopsis pubertatis) から選ばれる１種類または２種類以上の微生物に由来する２-アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸還元酵素を２-アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩と接触させ、４-ヒドロキシイソロイシンを生成させる工程を含むことを特徴とする、４-ヒドロキシイソロイシン又はその塩の製造方法。
（２）微生物が、Sporobolomyces gracilis AKU 4438、Cryptococcus albidus AKU 4507、Rhodotorula marina AKU 4806、Rhodotorula pallida AKU 4810、Flavobacterium esteroaromaticum AKU 146、Bacillus thuringiensis AKU 238、Bacillus thuringiensis ATCC 35646、Agrobacterium radiobacter AKU 301、Pullularia pullulans AKU 3651、Fusarium solani TG-2 AKU 3710、Gibberella fujikuroi AKU 3804、Gibberella fujikuroi AKU 3805、Mortierella isabellina AKU 3999-2、Mortierella humicola AKU 3999-5、Trichoderma reesei AKU 3999-15、Aureobasidium pullulans IFO 4466、Cephalosporium coremioides IG 212、Verticillium albo-atrum IG 504、Pitomyces maydicum IG 611、Rhodococcus ruber NOC 081、Nocardia sp. AKU 2130、Streptomyces olivochromogenes AKU 2301、Crinipellis stipitaria AKU 5507、Flammulina velutipes AKU 5518、AKU 5519、Flammulina velutipes AKU 5520、Flammulina velutipes HATSUYUKI AKU 5608、Tricholoma matsutake IFO 30604およびFomitopsis pubertatis (Lioyd) Imaz. AKU 5709、から選択される微生物である、前項記載の製造方法。
【００１９】
本発明で使用される酵素は、好ましくは、
（ａ）配列番号１３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および、
（ｂ）配列番号１３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質において１から３０個のアミノ酸残基が付加、欠失、置換または挿入され、かつ、２-アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸還元酵素活性を有するものをコードするＤＮＡ、
から選ばれる一つで形質転換されたエシェリヒア属細菌を培養して得られるものである。
【００２０】
また、本発明の目的は、
（ａ）配列番号５の塩基配列を含むＤＮＡと、
（ｂ）配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡと、
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列において、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９８％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、
から成る群から選択されるＤＮＡを提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、上記ＤＮＡをベクターＤＮＡと連結させることによって得られる組み換えＤＮＡを提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、上記組み換えＤＮＡで形質転換された細胞を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、培地中で上記の細胞を培養し、培地もしくは細胞またはその両方に４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを含む、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質と、
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列において、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９８％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
から成る群から選択されるタンパク質を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法であって、
水性溶媒中で、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ、及び
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質と、
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列において、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
から成る群から選択される少なくとも１つの４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの存在下で、Ｌ−イソロイシンを反応させ、
生成する２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸を単離することを含む、２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法を提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法であって、
水性溶媒中で、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ、及び
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質と、
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列において、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質と、
から成る群から選択される少なくとも１つの４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼを含有する細菌の存在下で、Ｌ−イソロイシンを反応させ、
生成する２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸を単離することを含む、２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸又はその塩を製造する方法を提供することである。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、上記細菌が４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性を高めるように改変されている、上記の方法を提供することである。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、上記細菌がＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性を高めるように改変されている、上記の方法を提供することである。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼの活性が、上記タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることによって高められる、上記の方法を提供することである。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、遺伝子の発現が、タンパク質をコードする遺伝子の発現制御配列を改変すること、又はタンパク質をコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって増大される、上記の方法を提供することである。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、上記細菌がエシェリキア属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、アルトロバクター属、アスペルギルス属又はバチルス属に属する、上記の方法を提供することである。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、上記細菌が大腸菌、アルトロバクター・シンプレックス、コリネバクテリウム・グルタミカム、アルトロバクター・グロビフォルミス、アルトロバクター・スルフレウス、アルトロバクター・ビスコーサス、又は枯草菌に属する、上記の方法を提供することである。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、上記細菌が細菌培養物、細胞、処理細胞、又は細胞溶解物である、上記の方法を提供することである。
【００３４】
さらに、本発明の目的は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法であって、
水性溶媒中で、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性の両方を元来含有する細菌の存在下で、Ｌ−イソロイシンを反応させ、
生成する（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離することを含み、この細菌は４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性が低減又は欠失するように改変されている、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法(HIL製造法)を提供することである。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、上記細菌においてＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がオペロンを構成
する、上記のHIL製造法を提供することである。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、上記細菌がＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼの活性を高めるように改変される、上記のHIL製造法を提供することである。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、上記細菌における４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性が、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現の減衰又は抑制によって低減又は欠失する、上記のHIL製造法を提供することである。
【００３８】
本発明のさらなる目的は、上記細菌がバチルス属、エンテロバクター属、又はシュードモナス属に属する、上記のHIL製造法を提供することである。
【００３９】
本発明のさらなる目的は、上記細菌がバチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ワイヘンステファンエンシス、バチルス・セレウス、エンテロバクター・アグロメランス、又はシュードモナス・シリンゲに属する、上記のHIL製造法を提供することである。
【００４０】
本発明のさらなる目的は、細菌が細菌培養物、細胞、処理細胞、又は細胞溶解物である、上記のHIL製造法を提供することである。
【発明の効果】
【００４１】
本発明により、従来よりも簡便、安価な製造方法で４-ヒドロキシイソロイシン又はＡＭＫＰを、工業的に有利に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、本発明について、ＡＭＫＰからの４−ヒドロキシイソロイシンの製造法、Ｌ−イソロイシンからのＡＭＫＰの製造法、並びに、Ｌ−イソロイシンからのＬ−ヒドロキシイソロイシンの製造法について、順に説明する。
本願明細書において、２-アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸（ＡＭＫＰ）還元酵素と、４−ヒドロキシイソロイシンデヒドロゲナーゼ（ＨＩＤＨ）とは、ＡＭＫＰと４−ヒドロキシイソロイシン（ＨＩＬ）との相互間の変換反応を触媒する酵素の別の呼び名であり、同じ酵素を意味する。
【００４３】
＜１＞ＡＭＫＰからの４−ヒドロキシイソロイシンの製造法
以下、本発明について詳細に説明する。４-ヒドロキシイソロイシンは、下記式(I)に示される構造を有する。
【００４４】
【化１】
2009131254.tif 000002
【００４５】
２-アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸（ＡＭＫＰ）還元酵素が触媒する、ＡＭＫＰが還元されて４-ヒドロキシイソロイシンが生成する反応は、下記式(II)に示される。
【００４６】
【化２】
2009131254.tif 000003
【００４７】
なお、本明細書において、４-ヒドロキシイソロイシンとは、 (2S,3S,4S)-4- ヒドロキシイソロイシン[(2S,3S,4S)-4-hydroxyisoleucine]、(2R,3R,4R)-4- ヒドロキシイソロイシン[(2R,3R,4R)-4-hydroxyisoleucine]、(2S,3R,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン[(2S,3R,4R)-4-hydroxyisoleucine]、(2R,3S,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン[(2R,3S,4S)-4-hydroxyisoleucine]、(2S,3S,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン [(2S,3S,4R)-4-hydroxyisoleucine]、(2R,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン [(2R,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine]、(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン [(2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine]、及び(2R,3S,4R)-4-ヒドロキシイソロイシン [(2R,3S,4R)-4-hydroxyisoleucine]からなる群より選ばれる1種、または2種以上のジアステレオマー混合物をいう。好ましくは、(2S,3R,4S)もしくは(2S,3S,4R) -4-ヒドロキシイソロイシン、又は、それらの混合物である。更に好ましくは、(2S,3R,4S) -4-ヒドロキシイソロイシンである。
【００４８】
本発明のＡＭＫＰ還元反応を介した４-ヒドロキシイソロイシン製造方法において用いる、微生物に由来するＡＭＫＰ還元酵素としては、ＡＭＫＰを４-ヒドロキシイソロイシンに変換する活性を有する限り、微生物の培養物、菌体、風乾菌体、細胞破砕液による粗精製酵素、または精製酵素のいずれでも用いることが出来る。微生物には、形質転換体も含まれる。
【００４９】
反応には、補酵素としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを添加又は供給することが好ましい。さらに、補酵素再生系として、グルコースとグルコースデヒドロゲナーゼを添加または供給することが好ましい。補酵素再生系の概念図を図１に示す。
【００５０】
微生物としては、還元反応条件下、ＡＭＫＰを４-ヒドロキシイソロイシンに変換する活性を有する、すなわち、ＡＭＫＰ還元酵素を有する微生物であれば、いずれの微生物でも用いることができる。
【００５１】
用いられる微生物として、以下の微生物あるいはその突然変異体や誘導体などが挙げられる。
【００５２】
Sporobolomyces gracilis
Cryptococcus albidus
Rhodotorula marina
Rhodotorula pallida
Flavobacterium esteroaromaticum
Bacillus thuringiensis
Agrobacterium radiobacter
Pullularia pullulans
Fusarium solani 
Gibberella fujikuroi
Mortierella isabellina
Mortierella humicola
Trichoderma reesei
Aureobasidium pullulans
Cephalosporium coremioides
Verticillium albo-atrum
Pitomyces maydicum
Rhodococcus ruber
Nocardia sp.
Streptomyces olivochromogenes
Crinipellis stipitaria
Flammulina velutipes
Flammulina velutipes
Flammulina velutipes
Tricholoma matsutake
Fomitopsis pubertatis (Lioyd) Imaz.
【００５３】
具体的には表１に示す株があげられる。なお、表１には株の別名も併記する。
【００５４】
【表１】
2009131254.tif 000004
【００５５】
なお、上記微生物について、株名がAKUから始まるものは、京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻発酵生理及び醸造学研究室より分譲を受けることが出来る。株名がIFOから始まるものは、独立行政法人製品評価技術基盤機構（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）より分譲を受けることが出来る。財団法人発酵研究所（IFO）に保存されていたIFO番号が付された微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門(NBRC)に移管されている。株名がJCMから始まるものは、独立行政法人理化学研究所（〒351-0198  埼玉県和光市広沢2-1）より分譲を受けることが出来る。
【００５６】
本発明で用いられる微生物の培養は、通常の培養方法に従って行うことができる。培養に用いられる培地は、用いる微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００５７】
炭素源としては、用いる微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸、あるいはエタノール、プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。窒素源としては、用いる微生物が資化しうるかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
【００５８】
無機塩としては、用いる微生物が利用しうるかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどを用いることができる。他に微量元素としてカルシウム、亜鉛、ほう素、銅、コバルト、モリブデンなどの塩類を加えてもよい。また必要に応じてチアミン、ビオチンのようなビタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸のようなアミノ酸、アデニン、グアニンのような核酸関連物質などを添加してもよい。
【００５９】
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１０〜３７℃がよく、培養時間は５〜４０時間である。培養中ｐＨは、５．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００６０】
本発明において用いられる風乾菌体は、図３３に示すような手順により調製できる。
【００６１】
本発明において用いられる細胞破砕粗酵素、すなわち微生物の細胞破砕液としては、ＡＭＫＰ還元酵素を含むものであればよく、菌体の界面活性剤または有機溶剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、溶媒処理物、菌体の蛋白質分画、菌体処理物の固定化物などがあげられる。細胞破砕液は、対数増殖期細胞から調製することが好ましい。
【００６２】
細胞破砕液の調製法に関して、培養菌体は生理食塩水などの等張液で洗浄した後、フレンチ・プレス、ガラスビーズ、超音波破砕器、マントン・ガウリン・ホモゲナーザー、乳鉢などによる圧搾粉砕や、これらの組み合わせなど、如何なる方法でも良い。更に効率的な破砕のため、細胞を凍結処理や、酵素処理などにより細胞膜表面に物理的、化学的処理を行っても良い。細胞破砕時は、常に低温を維持し、破砕処理により破砕液の温度が上昇した場合は、速やかに冷却すれば良い。
【００６３】
細胞破砕液の水性媒体としては、水、ホウ酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス、リン酸塩、クエン酸塩、Ｇｏｏｄバッファー等の緩衝液があげられるが、これらに限定されるものでない。また酵素安定化剤としてグリセロールやDTT等を添加しても良いし、プロテアーゼ阻害剤として、EDTA、EGTA、PMSF、ペプスタチン、E-64等を添加しても良いし、阻害剤の組み合わせや、阻害剤カクテルなどを添加しても良い。
【００６４】
本発明で使用される酵素の例としては、
（ａ）配列番号１３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および、
（ｂ）配列番号１３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質において１から３０個のアミノ酸残基が付加、欠失、置換または挿入され、かつ、ＡＭＫＰ還元酵素活性を有するものをコードするＤＮＡ、
から選ばれる一つで形質転換されたエシェリヒア属細菌を培養して得られるものが挙げら
れる。
【００６５】
ＡＭＫＰ還元酵素は、菌株などによってアミノ酸配列に差異が存在することがあるため、ＡＭＫＰ還元酵素活性を有する限り、１若しくは複数の位置での１から３０個のアミノ酸の付加、欠失、置換または挿入を含む配列を有するタンパク質をコードする変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、付加、欠失、置換または挿入の数は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個である。上記の付加、欠失、置換または挿入は酵素活性が維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからAsn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
【００６６】
上記ＤＮＡの調製及び形質転換は、通常の方法で行うことができる。例えば、染色体ＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲにより、配列番号１３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡを、宿主エシェリヒア属微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これで宿主を形質転換することにより導入できる。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００６７】
以下、酵素調製物として細胞破砕液を用いた場合を例にして本発明製造方法を説明するが、他の酵素調製物、例えば、微生物の培養物、菌体、風乾菌体、精製酵素などを用いた場合も同様である。
【００６８】
上記の細胞破砕液を用いて、ＡＭＫＰ還元反応を測定する場合の基質液組成は、通常には、50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5% (w/v) AMKP, 0.6 mg/ml NAD, 0.6 mg/ml NADP, 15.2 U/ml glucose dehydrogenase, 5% (w/v) glucoseの反応液組成で、液量2 mlとし、28℃、16時間反応する。緩衝液はTris-HCl以外にも、マロン酸バッファー、リン酸カリウムバッファー酢酸ナトリウムバッファーあるいはホウ酸バッファーなど如何なる緩衝液でも良い。反応液は必要に応じて酵素失活し、遠心上清画分をフィルター濾過し、高速液体クロマトグラフィーやTLCを用いて４-ヒドロキシイソロイシンの生成を確認する。目的とするAMKP還元酵素にNADHあるいはNADPHを供給する方法としては、グルコースデヒドロゲナーゼ（基質：グルコース）を用いることができるが、これに限らず、ギ酸デヒドロゲナーゼ（基質：ギ酸）、アルコールデヒドロゲナーゼ（基質：２−プロパノール）、亜燐酸デヒドロゲナーゼ（基質：亜燐酸）など、還元力NAD(P)H供給系として利用できるものであれば良い。
【００６９】
４-ヒドロキシイソロイシンの定量は、他の成分との分離可能な分析系であればどのような方法を用いても良いが、例えばTLCや高速液体クロマトグラフィーがあげられる。この内、高速液体クロマトグラフィーは高感度・高分離であることから定量分析には優れて
いる。例えばアミノ酸分析法のウォーターズ AccQ・TagTMメソッド等があげられる。ウォーターズ AccQ・TagTMメソッドの改変法（後記実施例参照）により、４-ヒドロキシイソロイシンのジアステレオマー分離や、天然体４-ヒドロキシイソロイシンと４-ヒドロキシイソロイシンの水酸基が酸化されたケト体である、２-アミノ-３-メチル-４-ケトペンタン酸の分離が可能である。
【００７０】
本発明により製造された４-ヒドロキシイソロイシンは、通常用いられるアミノ酸の精製法を用いて単離することができる。例えば、遠心分離により固形物を除いた反応液上清から、イオン交換樹脂や膜処理法、晶析法などの操作を組み合わせて、４-ヒドロキシイソロイシンを単離することができる。
【００７１】
本発明の製造法において、ＡＭＫＰ還元反応のpHはｐＨ５〜８である事が好ましい。反応液の組成として、50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5% (w/v) AMKP, 0.6 mg/ml NAD, 0.6 mg/ml NADP, 15.2 U/ml glucose dehydrogenase, 5% (w/v) glucoseを用いることができる。
【００７２】
本発明の製造法において、ＡＭＫＰ還元反応の温度は、通常には１０〜６０℃であり、好ましくは１５〜４０℃であり、より好ましくは２５〜３７℃である事が好ましい。反応時間は、酵素量により異なるが通常には、5分〜２００時間である。反応のpHは通常はpH5〜11、好ましくはpH6〜9、特に好ましくはpH7〜8に設定して実施することが出来る。
【００７３】
還元反応に供するＡＭＫＰとしては、2S,3S、2R,3R、2S,3R、2R,3Sの光学異性体をを用いることができる。
【００７４】
反応を実施する溶媒としては、水、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液等の水性溶媒、ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などの有機溶媒や、これらを含有した水性溶媒があげられる。また必要に応じて還元反応活性化因子を添加しても良い。
【００７５】
本発明の製造法において用いられる微生物の細胞破砕液のタンパク質濃度は０．１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｍｌ（微生物菌体（湿重量）換算）である。水性媒体に、当該微生物破砕液、基質、補因子を適切な濃度添加し、温度４５℃以下、好ましくは３０℃、ｐＨ５〜１２、好ましくはｐＨ５〜７．５の条件下で、５分〜１２０時間反応させ、４-ヒドロキシイソロイシンを製造することができる。
【００７６】
＜２＞Ｌ−イソロイシンからのＡＭＫＰの製造法
本発明において、「２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸」又は「ＡＭＫＰ」という用語は、単一化合物（複数可）（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸及び／又は（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸、或いは（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸及び／又は（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸を含有する混合物を表す。
【００７７】
本発明において、「（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン」又は「（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬ」という用語は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンを含有する単一化合物又は混合物を表す。
【００７８】
本明細書で使用される「細菌」という用語は、酵素産生細菌、目的とする酵素活性が存在するか、又は高められている、当該細菌の突然変異体及び遺伝子組み換え体等を含む。
【００７９】
本発明者等は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬの産生における副生成物としてＡＫＭ
Ｐを得た。実験データに基づき、本発明者等はＡＭＫＰ合成に関する推定経路を提唱した（図３８）。これは、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）によるイソロイシンの加水分解、及び続く特定の４−ヒドロキシイソロイシンデヒドロゲナーゼ（ＨＩＤＨ）による得られた（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬの酸化を含む。バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のゲノム解析によって、ＩＤＯ遺伝子（ＲＢＴＨ＿０６８０９）の翻訳が下流の隣接遺伝子ＲＢＴＨ＿０６８１０の翻訳と結び付けられることが示された（図３９）。通常、このような「同期化」は酵素触媒逐次反応の等モル合成に用いられる。さらに、ＲＢＴＨ＿０６８１０は、３−オキソアシル−［アシル−キャリアタンパク質］還元酵素（デヒドロゲナーゼ）のホモログをコードする。したがって、この遺伝子がＨＩＤＨをコードすることが示唆された。
【００８０】
以下で、添付の図面を参照して本発明のＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼを用いて、［Ｉ］Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ、［ＩＩ］４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ、［ＩＩＩ］Ｌ−イソロイシンから２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸を産生するプロセスの詳細説明が与えられる。
【００８１】
［Ｉ］Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ
本発明者等による研究によれば、細菌株は、バチルス属において（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬを形成する能力を有するＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼを含有することが確認された。以下で、微生物細胞由来のＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼをＩＤＯと略記する。
【００８２】
（１）Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡ
本発明のバチルス・チューリンゲンシス２−ｅ−２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６８８）由来のＩＤＯをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号１で示される。さらに、配列番号１の塩基配列によってコードされるＩＤＯのアミノ酸配列は配列番号２で示される。配列番号２は、配列番号１の塩基配列によってコードされるＩＤＯのアミノ酸配列である。配列番号２のＩＤＯは、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を保有し、１分子のＬ−イソロイシンから（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬが直接合成される反応を触媒する。
【００８３】
実施例の項で言及するように同定される本発明のバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス（israelensis）血清型）株（ＡＴＣＣ３５６４６）由来のＩＤＯをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号３で示される。さらに、配列番号３の塩基配列によってコードされるＩＤＯのアミノ酸配列は配列番号４で示される。配列番号４は、配列番号３の塩基配列によってコードされるＩＤＯのアミノ酸配列である。配列番号４のＩＤＯは、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を保有し、１分子のＬ−イソロイシンから（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬが直接合成される反応を触媒する。
【００８４】
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬがL−イソロイシンから生成される反応を触媒するＩＤＯをコードするＤＮＡは、配列番号１及び配列番号３で示されるＤＮＡだけではない。これは、Ｌ−イソロイシンから（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬを産生する反応を触媒するＩＤＯを生成するバチルス種の中のそれぞれの種及び株で見られる塩基配列に差異が存在するはずであろうためである。
【００８５】
本発明のＤＮＡは、ＩＤＯをコードする単離ＤＮＡだけでなく、ＩＤＯ産生微生物の染色体ＤＮＡから単離したＩＤＯをコードするＤＮＡに突然変異が人工的に付加されているＤＮＡも、上記反応を触媒する活性を有するＩＤＯをコードしさえすれば、本発明のＤＮＡに含まれる。突然変異を人工的に付加する方法は、Method. in Enzymol., 154（1987）で記載された部位特異的な突然変異体を誘導する方法のような一般的に用いられる方法を
含む。
【００８６】
配列番号１又は配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＩＤＯ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。本明細書で用いられるように、「ストリンジェントな条件」は、特異的なハイブリッドが形成される一方で、非特異的なハイブリットは形成されない条件を表す。はっきりとした数値でこれらの条件を表すことは難しいが、例としては、例えば好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上及び特に好ましくは９５％以上の相同性等、相同性の高いＤＮＡ分子が互いにハイブリダイズするが、相同性の低いＤＮＡ分子は互いにハイブリダイズしない条件、又はサザンハイブリダイゼーションにおける通常の洗浄条件、すなわち３７℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、好ましくは６０℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、並びにさらに好ましくは６５℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに対応する塩濃度でハイブリダイゼーションが起こる条件が言及される。ハイブリダイゼーション条件によって、プローブの長さを好適に選択することができ、通常１００ｂｐ〜１ｋｂｐで変化する。さらに、「Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性」は、Ｌ−イソロイシンから（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬを合成する活性に十分であり得る。しかし、配列番号１又は配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列の場合、塩基配列は、３７℃及びｐH８の条件下で、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、及びさらにより好ましくは７０％以上維持することが好ましい。
【００８７】
ＩＤＯのＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて、Ｌ−イソロイシンからの（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬ生成の分析によって測定され得る。（実施例１７及び実施例１８を参照）
【００８８】
さらに、配列番号１及び配列番号３のＤＮＡによってコードされるＩＤＯと実質的に同一であるタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。すなわち、以下のＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる：
（ａ）配列番号１又は配列番号３の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１又は配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列において１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに
（ｅ）配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、及びさらにより好ましくは少なくとも９５％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００８９】
本明細書で、「１つ又は幾つか」は、アミノ酸残基のタンパク質の三次元構造又はＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性が大きくは損なわれない範囲、及びより具体的には１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０、及びさらにより好ましくは１〜５の範囲を表す。
【００９０】
１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位は、活性が維持され
るような保存的突然変異（複数可）でなければいけない。代表的な保存的突然変異は保存的置換である。保存的置換の例としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及びＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００９１】
（２）Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼを産生するプロセス
本発明のＩＤＯを産生するプロセスに関する説明をする。本発明のＩＤＯを産生するための２つの方法が存在する。これらは、（ｉ）ＩＤＯ産生微生物を培養し、ＩＤＯを産生及び蓄積させるプロセス、並びに（ｉｉ）組み換えＤＮＡ技術によって形質転換体を調製してＩＤＯを産生させ、またその形質転換体を培養してＩＤＯを蓄積させるプロセスから成る。
【００９２】
両方の方法とも、以下の［ＩＩ］（３）項で記載されるのと同じように行うことができる。
【００９３】
［ＩＩ］４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ
本発明者等による研究によって、バチルス属に属する細菌における細菌株が、ＩＤＯ活性によってＬ−イソロイシンから生成される、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬから（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸及び／又は（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸を生成する能力を有する４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼを含有することが確認された。以下で、細菌細胞由来の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをＨＩＤＨと略記する。
【００９４】
バチルス・チューリンゲンシス株イスラエレンシス血清型（ＡＴＣＣ３５６４６）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=genome&cmd=Retrieve&dopt=Overview&list_uids=5343）のＨＩＤＨをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号５で示される。さらに、配列番号７の塩基配列によってコードされるＨＩＤＨのアミノ酸配列は配列番号６で示される。配列番号６は、配列番号７の塩基配列によってコードされるＨＩＤＨのアミノ酸配列である。配列番号６のＨＩＤＨは、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を保有し、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬからＡＭＫＰが直接合成される反応を触媒する。
【００９５】
次に、（１）４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、（２）４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの特性、及び（３）４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼを産生するプロセスの詳細説明をこの順番でする。
【００９６】
（１）４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ
配列番号５の塩基配列を有する本発明のＨＩＤＨ遺伝子は、実施例の項で記載されるように、アクセッション番号ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７で保管されている、ロシア国立産業微生物コレクション（Russian National Collection of Industrial Microorganisms）（ＶＫ
ＰＭ）から得たバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株（ＡＴＣＣ３５６４６）の染色体ＤＮＡから単離した。配列番号６で示された、配列番号５の塩基配列によってコードされたＨＩＤＨのアミノ酸配列は、バチルス・チューリンゲンシスイスラエレンシス血清型（ＡＴＣＣ３５６４６）由来の３−オキソアシル−［アシル−キャリアタンパク質］還元酵素、バチルス・ワイヘンステファンエンシス（Bacillus weihenstephanensis）ＫＢＡＢ４由来の短鎖デヒドロゲナーゼ／還元酵素ＳＤＲ、バチルス・セレウス（ＡＴＣＣ１４５７９）由来の３−オキソアシル−［アシル−キャリアタンパク質］還元酵素、海洋（marine）メタゲノム由来の機能未知（hypothetical：仮想）タンパク質ＧＯＳ＿９２５７８０８、及びインゲンかさ枯病細菌（Pseudomonas syringae pv. phaseolicola）１４４８Ａ由来の３−オキソアシル−［アシル−キャリアタンパク質］還元酵素と、アミノ酸配列（図４１）において高いレベルの相同性を示す。
【００９７】
ＨＩＤＨをコードするＤＮＡ断片は、バチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株（ＡＴＣＣ３５６４６）の配列に基づき設計された適切なプライマーを用いて、ＰＣＲによって得ることができる。
【００９８】
ＰＣＲで用いられる手順は、White, T. J.他, Trends Genet. 5, 185（1989）等の刊行物に記載されている。染色体ＤＮＡの単離方法、及びプローブとしてＤＮＡ分子を用いて、所望のＤＮＡ分子を遺伝子ライブラリから単離する方法が、分子クローニング（Molecular Cloning）（第３版, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001））等の刊行物に記載されている。
【００９９】
ＨＩＤＨをコードする単離ＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、分子クローニングの解説書（A Practical Guide to Molecular Cloning）（John Wiley & Sons, Inc.（1985））に記載されている。さらに、塩基配列は、Applied Biosystems製のＤＮＡシークエンサーを用いることによって決定することができる。ＨＩＤＨをコードするバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株ＡＴＣＣ３５６４６（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）由来の塩基配列は配列番号５で示される。
【０１００】
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬからＡＭＫＰが形成される反応を触媒するＨＩＤＨをコードするＤＮＡは、配列番号５で示されるＤＮＡだけではない。これは、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬからＡＭＫＰを産生する反応を触媒するＨＩＤＨを生成するバチルス種中のそれぞれの種及び株で見られる塩基配列に差が存在するはずであろうためである。
【０１０１】
本発明のＤＮＡは、ＨＩＤＨをコードする単離ＤＮＡだけでなく、ＨＩＤＨ産生微生物の染色体ＤＮＡから単離したＨＩＤＨをコードするＤＮＡに突然変異が人工的に付加されているＤＮＡも、上記反応を触媒する活性を有するＨＩＤＨをコードしさえすれば、本発明のＤＮＡに含まれる。突然変異を人工的に付加する方法は、Method. in Enzymol., 154（1987）で記載された部位特異的な突然変異体を誘導する方法のような一般的に用いられる方法を含む。
【０１０２】
配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＨＩＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。さらに、「４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性」は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬからＡＭＫＰを合成する活性に十分であり得る。しかし、配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列の場合、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質は、３７℃及びｐH８の条件下で、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、及びさらにより好ましくは７０％以上維持することが好ましい。
【０１０３】
ＨＩＤＨの４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いることによって、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬからのＡＭＫＰ生成の分析で測定され得る（実施例１７及び実施例１８を参照）。
【０１０４】
さらに、配列番号５のＤＮＡによってコードされるＨＩＤＨと実質的に同一であるタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。すなわち、以下のＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる：
（ａ）配列番号５の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列において１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、及びさらにより好ましくは少なくとも９５％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０１０５】
本明細書で、「１つ又は幾つか」は、アミノ酸残基のタンパク質の三次元構造又は４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性が大きくは損なわれない範囲、及びより具体的には１〜７８、好ましくは１〜５２、より好ましくは１〜２６、及びさらにより好ましくは１〜１３の範囲を表す。
【０１０６】
１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位は、活性が維持されるような保存的突然変異（複数可）でなければいけない。代表的な保存的突然変異は保存的置換である。保存的置換の例としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及びＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【０１０７】
さらに、「４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ」は、上記のように（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬからＡＭＫＰを合成する活性を指す。しかし、配列番号６のアミノ酸配列において１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列の場合、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質は、３０℃及びｐH７．０の条件下で、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、及びさらにより好ましくは７０％以上維持することが好ましい。本発明のＨＩＤＨの４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いることによって、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬからのＡＭＫＰ生成の分析で測定され得
る。
【０１０８】
さらに、配列番号５のホモログＤＮＡは、本発明の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子として用いることができる。ホモログＤＮＡが４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードするか否かは、細胞溶解物、又はホモログＤＮＡが過剰発現する微生物の細胞溶解物の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼを測定することによって確認することができる。
【０１０９】
配列番号５のホモログＤＮＡは、本発明の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードするような別のバチルス種、例えばバチルス・セレウス、バチルス・ワイヘンステファンエンシスのゲノムから調製することもできる。
【０１１０】
バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ワイヘンステファンエンシスのアミノ酸配列のアラインメントが図４１に示される。
【０１１１】
（２）ＨＩＤＨの特性
次に、バチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株ＡＴＣＣ３５６４６（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）に由来した精製４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ（ＨＩＤＨ）の特性の説明をする。
【０１１２】
本発明のＨＩＤＨは、遺伝子単離及び解析によって明らかにされたように、配列番号６のアミノ酸配列を有する。しかし、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列において１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、また４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性も有するタンパク質を含む。
【０１１３】
すなわち、本発明のＨＩＤＨは以下のタンパク質を含む：
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列において１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、並びに
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、及びさらにより好ましくは少なくとも９５％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つ４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【０１１４】
本明細書で、「幾つか」及び「４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ」の定義は項（１）４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡで定義されたものと同じである。
【０１１５】
本発明のＨＩＤＨは、酵素的脱水素反応によって、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬからＡＭＫＰを合成する反応を触媒する。
【０１１６】
本発明のＨＩＤＨの４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いることによって、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬからのＡＭＫＰ生成の分析によって測定され得る。
【０１１７】
バチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株ＡＴＣＣ３５６４６（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）由来のＨＩＤＨは配列番号６のアミノ酸配列を有する。
【０１１８】
（３）４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼを製造する方法
次に、本発明のＨＩＤＨを製造する方法に関する説明をする。本発明のＨＩＤＨを産生するための２つの方法が存在する。これらは、（ｉ）ＨＩＤＨ産生微生物を培養し、ＨＩＤＨを生成及び蓄積させる方法、並びに（ｉｉ）組み換えＤＮＡ技術によって形質転換体を調製してＨＩＤＨを生成し、またその形質転換体を培養してＨＩＤＨを蓄積させる方法である。
【０１１９】
（ｉ）微生物培養によってＨＩＤＨを生成及び蓄積させるプロセス
ＨＩＤＨ産生微生物を培養することによってＨＩＤＨを生成及び蓄積させるプロセスにおけるＨＩＤＨの供給源（acquisition sources）として有用な微生物の例としては、エシェリキア属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、アルトロバクター属、アスペルギルス属又はバチルス属に属する微生物が挙げられる。
【０１２０】
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬからＡＭＫＰを合成する反応を触媒するＨＩＤＨを生成する微生物であれば、バチルス属、エシェリキア属、コリネバクテリウム属、アルトロバクター属、アスペルギルス属、シュードモナス属、グラニュリバクター属（Granulibacter）、メチロバチルス属（Methylobacillus）、アシディフィリウム属（Acidiphilium）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、カウロバクター属（Caulobacter）、スティグマテラ属（Stigmatella）、ミクソコッカス属（Myxococcus）、ポラロモナス属（Polaromonas）、カウロバクター属（Caulobacter）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）、アシドボラックス属（Acidovorax）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、アゾトバクター属（Azotobacter）、ビブリオ属（Vibrio）、ポリヌクレオバクター属（Polynucleobacter）、ストレプトミセス属（Streptomyces）に属する任意の微生物を本発明に用いることができ、好ましい微生物としては、バチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株ＡＴＣＣ３５６４６（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）及びバチルス・チューリンゲンシス株２−ｅ−２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６８８）が挙げられる。これらの中でも、バチルス・チューリンゲンシス２−ｅ−２株が特に好ましい。
【０１２１】
ＨＩＤＨの供給源として有用な微生物は液体培養及び／又は固体培養等の任意の形態で培養することができるが、産業的に有益な方法は、深部通気（deep-aerated）撹拌培養である。微生物培養に一般的に用いられる炭素源、窒素源、無機塩、及び他の微量栄養素を栄養培地の栄養素として用いることができる。用いられる微生物株に有効であれば、どのような栄養源を用いてもよい。
【０１２２】
培養は、振盪培養、深部通気（deep ventilation）撹拌培養等による好気条件下で行われる。培養温度は、微生物が成長し、且つＨＩＤＨが産生される範囲内であれば十分であり得る。したがって、条件は厳しくはないが、通常培養温度は１０〜５０℃であり、好ましくは１５〜４２℃である。培養時間は、他の培養条件に従って変わる。例えば、微生物はＨＩＤＨが最大量産生されるまで培養することができ、これは通常約５時間〜７日間、及び好ましくは約１０時間〜９６時間である。
【０１２３】
培養後、微生物細胞を遠心分離（例えば、１０分間１００００×ｇ）によって回収する。大部分のＨＩＤＨが細胞に存在するので、ＨＩＤＨは微生物細胞を破壊又は溶解させることによって可溶化する。超音波破壊、フレンチプレス破壊、又はガラスビーズ破壊を用いて、微生物細胞を破壊することができる。細胞を溶解する場合、卵白リゾチーム、ペプチダーゼ処理、又はこれらの好適な組み合わせを用いる方法が採用される。
【０１２４】
ＨＩＤＨ産生微生物由来のＨＩＤＨが精製される場合、ＨＩＤＨは酵素可溶化溶液を開始材料に用いることによって精製されるが、非破壊又は非溶解の残渣が残っている場合、
可溶化溶液を再び遠心分離し、沈殿する全ての残渣を取り除くことが、精製するのに有益である。
【０１２５】
通常の酵素を精製するのに一般的に用いられる方法を全て、ＨＩＤＨを精製するために使用することができ、この例としては、硫酸アンモニウム沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィが挙げられる。結果として、比活性が高いＨＩＤＨ含有画分を得ることができる。
【０１２６】
（ｉｉ）組み換えＤＮＡ技術を用いた産生プロセス
次に、組み換えＤＮＡ技術を用いてＨＩＤＨを産生するプロセスに関する説明をする。組み換えＤＮＡ技術を用いて、酵素及び生理学的に活性な物質等の有用なタンパク質を産生する既知の例が数多く存在し、組み換えＤＮＡ技術の使用によって、自然状態では微量しか存在しない有用なタンパク質の大量生産が可能になる。
【０１２７】
最初に、本発明のＨＩＤＨをコードするＤＮＡを準備する。
【０１２８】
次に、準備したＤＮＡをベクターＤＮＡと連結させ、組み換えＤＮＡを作成し、細胞をこの組み換えＤＮＡで形質転換させ、形質転換体を産生する。続いて、形質転換体を培地中で培養し、ＨＩＤＨを生成させて、培地及び細胞のいずれか１つ、又はその両方で蓄積させる。
【０１２９】
続いて、精製したＨＩＤＨを、酵素を回収及び精製することで製造する工程までプロセスを進める。
【０１３０】
精製したＨＩＤＨ、又はＨＩＤＨが蓄積した培地及び細胞のいずれか若しくはその両方を用いることによって、所望のＡＭＫＰが大量に製造され得る。
【０１３１】
ベクターＤＮＡと連結されるＤＮＡによって、本発明のＨＩＤＨが発現し得る。
【０１３２】
本明細書で、ベクターＤＮＡに連結させるＨＩＤＨ遺伝子の例には、［ＩＩ］においてこれまでに記載されたＤＮＡが含まれる。
【０１３３】
タンパク質の大量生産に組み換えＤＮＡ技術を用いる場合、細菌細胞、アクチノミセス細胞、酵母細胞、糸状菌細胞、植物細胞、及び動物細胞等の細胞を形質転換させる宿主細胞に用いることができる。宿主ベクター系が開発されている細菌細胞の例としては、エシェリキア種、シュードモナス種、コルネバクテリウム種、アルトロバクター種、アスペルギルス種、及びバチルス種が挙げられ、好ましくは大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミカムが用いられる。これは、大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミカム、又はバチルス細菌を用いたタンパク質の大量生産技術に関してよく知られているためである。以下で、形質転換した大腸菌を用いてＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼを製造する方法の説明をする。大腸菌に関する以下の方法は、コリネバクテリウム・グルタミカム又はバチルス細菌にも適用することができる。
【０１３４】
大腸菌における異種タンパク質産生に通常用いられるプロモータを、ＨＩＤＨをコードするＤＮＡを発現するプロモータに用いることができ、その例としては、Ｔ７プロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、及びＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
【０１３５】
融合タンパク質封入体の形態でＨＩＤＨを産生するために、ＨＩＤＨ遺伝子の上流又は
下流のいずれかで別のタンパク質、好ましくは親水性ペプチドをコードする遺伝子を融合タンパク質遺伝子と連結する。別のタンパク質をコードする遺伝子は、蓄積された融合タンパク質の量を増大させ、変性工程及び再生工程後に融合タンパク質の可溶性を高める遺伝子であり得る。この遺伝子候補の例としては、Ｔ７遺伝子１０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸（dehydrofolate）還元酵素遺伝子、インターフェロン−γ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、及びプロキモシン遺伝子が挙げられる。
【０１３６】
これらの遺伝子をＨＩＤＨをコードする遺伝子と連結させる場合、コドンのリーディングフレームを適合させる。この遺伝子は、好適な制限酵素部位で、又は適切な配列の合成ＤＮＡを用いて連結することができる。
【０１３７】
産生する量を増大させるために、融合タンパク質遺伝子の下流にあるターミネータ形態の転写終結配列を連結させることが好ましい。このターミネータの例としては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子ターミネータ、及び大腸菌のｔｒｐＡ遺伝子ターミネータが挙げられる。
【０１３８】
多コピーベクターは、大腸菌にＨＩＤＨ又はＨＩＤＨと別のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を導入するのに用いられるベクターに好ましく、この例としては、ｐＵＣプラスミド、ｐＢＲ３２２プラスミド又はこれらの誘導体等のＣｏｌ  Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミドが挙げられる。本明細書で「誘導体」は、塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位による変化を受けたプラスミドを表す。本明細書で表される変化には、突然変異原若しくはＵＶ照射を用いた突然変異誘発処理、又は自然突然変異若しくはランダム突然変異によって引き起こされる変化が含まれる。
【０１３９】
このベクターは、形質転換体を選抜するためのアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドの例としては、強力なプロモータを有する市販の発現ベクター（ｐＵＣ（タカラバイオ株式会社）、ｐＰＲＯＫ（Clontech）、及びｐＫＫ２３３−２（Clontech）等）が挙げられる。
【０１４０】
遺伝子のコピー数は、遺伝子を多コピーベクターに挿入させ、その後ベクターを微生物に導入させることによって増加し得る。用いることができるベクターとしては、ｐＭＷ１１８、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＹＣ３２、ｐＭＷ１１９、又はｐＥＴ２２ｂ等の大腸菌プラスミドベクター、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＧＫ１２、ｐＬＦ１４、又はｐＬＦ２２等の大腸菌−バチルス・サブチリスシャッフルベクター、ｌ１０５９、ｌＢＦ１０１、Ｍ１３ｍｐ９、又はＭｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）等のファージベクター、及びＭｕ、Ｔｎ１０、又はＴｎ５等のトランスポゾン（Berg, D.E.及びBerg, C.M., Bio/Technol., 1, 417（1983））が挙げられる。
【０１４１】
組み換えＤＮＡは、プロモータ、ＨＩＤＨ又はＨＩＤＨと別のタンパク質とから成る融合タンパク質をコートする遺伝子、及びターミネータがこの順番で連結するＤＮＡ断片をベクターＤＮＡと連結させることによって得ることができる。
【０１４２】
組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換した後にその大腸菌を培養する場合、ＨＩＤＨ又はＨＩＤＨと別のタンパク質との融合タンパク質が発現及び産生される。異種遺伝子の発現に通常用いられる株を形質転換宿主に用いることができ、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株及び大腸菌ＪＭ１０９株が特に好ましい。形質転換方法及び形質転換体の選抜方法が、例えば分子クローニング（Molecular Cloning）（第３版, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001））に記載されている。
【０１４３】
融合タンパク質として発現する場合、認識配列としてＨＩＤＨに存在しない配列を認識する、血液凝固因子Ｘａ又はカリクレイン等の制限プロテアーゼを用いて、ＨＩＤＨを切断することができる。
【０１４４】
また、プラスミドを利用する相同組み換えで遺伝子を染色体に融合させること等によって、遺伝子のコピー数を増加させることが可能である。この場合における宿主細胞及び発現系の例は、Shaw P. C.他（J Gen Micobiol. 134（1988） p.903-911）によるアルトロバクター種における組み換え発現方法に関する報告、Sandu C.他（Appl Environ Microbiol. 71（2005） p8920-8924）によるアルトロバクター・ニコチノボランスにおける組み換え発現方法に関する報告、Morikawa, M.他（Appl Microbiol Biotechnol., 42（1994）, p.300-303）によるアルトロバクター種における組み換え発現方法に関する報告を含む。また、コリネ型細菌で発現された発現系もアルトロバクター種で適用可能であるという報告もある（Sandu C.他）。
【０１４５】
ＨＩＤＨ遺伝子がバチルス属に属する細菌由来である場合、ＨＩＤＨは、１つの好ましい形態の宿主としてエシェリキア属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、アルトロバクター属、アスペルギルス属又はバチルス属の細菌を用いることによって発現及び産生され得る。
【０１４６】
大腸菌を培養するのに通常用いられる培地を産生培地として用いることができ、この例としては、Ｍ９−カザミノ酸培地及びＬＢ培地が挙げられる。さらに、培養条件及び産生を誘導する条件は、用いるベクターのマーカー及びプロモータの種類、並びに用いる宿主微生物の種類に応じて適切に選択することができる。
【０１４７】
以下の方法を用いて、ＨＩＤＨ又はＨＩＤＨと別のタンパク質との融合タンパク質を回収することができる。ＨＩＤＨ又はその融合タンパク質は、微生物細胞内で可溶化される場合、微生物細胞を回収し、回収細胞を破壊又は溶解した後に粗酵素溶液の形態で用いられ得る。さらに、ＨＩＤＨ又はその融合タンパク質は必要に応じて、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィ、又は他の一般技法によって精製した後に用いることもできる。この場合、ＨＩＤＨ又はその融合タンパク質の抗体を精製方法に用いてもよい。
【０１４８】
タンパク質封入体が形成される場合、変性剤で可溶化される。タンパク質封入体は微生物細胞タンパク質と共に可溶化することができるが、続く精製手順を考慮すると、封入体を取り出した後に可溶化することが好ましい。従来技術分野で既知の方法を用いて、封入体を微生物細胞から回収することができる。例えば、封入体は、微生物細胞を破壊した後、遠心分離によって回収することができる。タンパク質封入体を可溶化する変性剤の例としては、塩酸グアニジン（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）及び尿素（例えば、８Ｍ）が挙げられる。
【０１４９】
タンパク質封入体は、透析等の処理でこれらの変性剤を取り除くことによって活性タンパク質として再生することができる。トリス−ＨＣｌ緩衝液又はリン酸緩衝液等の透析溶液を透析に用いてもよく、濃度は２０ｍＭ〜０．５Ｍであり、ｐＨはｐＨ５〜ｐＨ８であり得る。
【０１５０】
再生工程中のタンパク質濃度は、約５００μｇ／ｍｌ以下に維持することが好ましい。再生したＨＩＤＨが自己架橋するのを防ぐために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。さらに、活性が、上記の透析の他に希釈及び限外濾過等の変性剤を取り除くのに用いられる他の方法によって回復することも期待され得る。
【０１５１】
［ＩＩＩ］Ｌ−イソロイシンから２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸を製造す
る方法
本発明のＡＭＫＰを製造する方法は、以下の反応によって表される２つの工程を含む：
Ｌ−イソロイシン  ＋  α−ケトグルタル酸  ＋  Ｏ2  →  ４ＨＩＬ  ＋  コハク酸  ＋  ＣＯ2
４ＨＩＬ  ＋  ＮＡＤ+  →  ＡＭＫＰ  ＋  ＮＡＤＨ  ＋  Ｈ+
ここで、第１の反応は、酸素原子のうちの１つの受容体分子としてＬ−イソロイシン、別の酸素原子の受容体分子としてα−ケトグルタル酸、２つの酸素原子の供与体として１つの酸素分子、及び反応を触媒するＩＤＯの存在下で行われ、第２の反応は、２つの水素原子の供与体分子として４ＨＩＬ、水素原子の受容体分子としてＮＡＤ+、及び反応を触媒するＨＩＤＨの存在下で行われる。
【０１５２】
Ｌ−イソロイシンからＡＭＫＰを産生するために、ＩＤＯ及びＨＩＤＨの両方の発現が要求される。したがって、細菌がＩＤＯを有する場合、さらにＨＩＤＨを発現する必要があり、細菌がＨＩＤＨを有する場合、さらにＩＤＯを発現する必要があり、細菌がＩＤＯ及びＨＩＤＨを両方とも有していない場合、ＩＤＯ及びＨＩＤＨの両方を発現する必要があり、細菌がＩＤＯ及びＨＩＤＨの両方を有する場合、Ｌ−イソロイシンからＡＭＫＰを産生するためにＩＤＯ及び／又はＨＩＤＨの発現が高められることが望まれ得る。
【０１５３】
本発明において、「酵素的水酸化」はＩＤＯ酵素によって行われる水酸化反応を意味する。特に、細菌ＩＤＯが好ましい。
【０１５４】
反応を触媒するＩＤＯに関しては、特に限定されず、α−ケトグルタル酸及び酸素の存在下でＬ−イソロイシンの水酸化反応を触媒することができるれば、どんなタンパク質を用いてもよい。
【０１５５】
本発明において、「酵素的脱水素」はＨＩＤＨ酵素によって行われる脱水素反応を意味する。特に、細菌ＨＩＤＨが好ましい。
【０１５６】
反応を触媒するＨＩＤＨに関しては、特に限定されず、ＮＡＤ+の存在下で４ＨＩＬの脱水素反応を触媒することができれば、どんなタンパク質を用いてもよい。
【０１５７】
このようなＩＤＯ及びＨＩＤＨの好ましい例は、ＩＤＯを説明する［Ｉ］項及びＨＩＤＨを説明する［ＩＩ］項で説明されたＩＤＯ及びＨＩＤＨである。本発明の方法において、ＩＤＯ及びＨＩＤＨは、上記のＡＭＫＰを産生する反応を触媒する上記のＩＤＯ及びＨＩＤＨが組み込まれていれば、細菌（培養物、細菌細胞又は処理細胞を含む）、精製酵素、又は粗酵素等のいずれの形態で用いてもよい。細菌をＩＤＯ及び／又はＨＩＤＨの供給源として用いる場合、［Ｉ］及び［ＩＩ］の項で記載されたような（１）ＩＤＯ及び／又はＨＩＤＨを自然状態で産生する細菌、例えばバチルス属に属する微生物、及び（２）組み換えＤＮＡによって形質転換された組み換え微生物の両方が、そのような微生物を培養することによってＩＤＯ及びＨＩＤＨを蓄積するのに有用である。
【０１５８】
ＩＤＯの特徴付けに用いられるタンパク質配列は、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼに分類される（配列番号２、配列番号４）。
【０１５９】
ＨＩＤＨの特徴付けに用いられるタンパク質配列は、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼに分類される（配列番号６）。
【０１６０】
他の微生物由来のＩＤＯ／ＨＩＤＨをコードする注釈のない遺伝子は、既知のＩＤＯ／ＨＩＤＨ遺伝子に対する相同性とその後これらの遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の評価によって同定することができる。
【０１６１】
２つのアミノ酸配列間の相同性は、既知の方法、例えば、３つのパラメータ：スコア、同一性及び類似性を算出する、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ２．０を用いて決定することができる。
【０１６２】
したがって、全長ＩＤＯをコードする、バチルス・チューリンゲンシス２−ｅ−２株及びバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型、ＡＴＣＣ３５６４６）株由来のＤＮＡ断片、並びにバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株ＡＴＣＣ３５６４６（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）由来のＤＮＡ断片は、アミノ酸及び塩基配列の既知の断片に基づいて調製したプライマーを利用するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T. J.他, Trends Genet., 5, 185（1989）を参照されたい）によって得ることができる。他の微生物由来のＩＤＯ及びＨＩＤＨをコードするＤＮＡ断片を同様に得ることができる。
【０１６３】
細菌株間のＤＮＡ配列に幾つかの差が存在し得るので、用いられるＩＤＯ及びＨＩＤＨをコードする上記の断片は、（配列番号１及び配列番号３）並びに（配列番号５）で示される塩基配列に限定されず、（配列番号１及び配列番号３）並びに（配列番号５）で示されるものと類似の塩基配列も含み得る。したがって、上記の遺伝子によってコードされるタンパク質変異体は、このタンパク質の上記反応の触媒能が維持されていれば、（配列番号２及び配列番号４）並びに（配列番号６）で示される全アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、及び最も好ましくは９５％以上の類似性を有し得る。
【０１６４】
さらに、上記のＤＮＡ断片は、機能タンパク質をコードする場合、（配列番号１及び配列番号３）並びに（配列番号５）で示される塩基配列、又はこれらの塩基配列に基づき調製されるプローブとのストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる変異体によって表され得る。本明細書で用いられる「ストリンジェントな条件」は、上記の［Ｉ］の項と同じである。
【０１６５】
本発明で利用される処理細菌細胞形態の例としては、乾燥細菌塊（bacterial mass）、凍結乾燥細菌塊、界面活性剤又は有機溶媒で処理した生成物、酵素処理生成物、超音波処理生成物、機械的に粉砕した生成物、溶媒処理生成物、細菌塊のタンパク質画分、細菌塊及び処理細菌塊の固定生成物が挙げられる。
【０１６６】
ＩＤＯ及びＨＩＤＨは、上記のように別々に調製し、反応溶液に添加することができる。ＩＤＯ及びＨＩＤＨをコードするＤＮＡを発現する細菌（宿主細胞）は、これらの活性がある宿主細胞で発現することができる形態でＩＤＯ及びＨＩＤＨをコードするＤＮＡを機能的に含有する発現ベクターのトランスフェクションによって調製することができる。さらに、ＩＤＯ及びＨＩＤＨをコードする遺伝子の発現を増大させることによって、ＩＤＯ及びＨＩＤＨの活性が高められた宿主細胞を用いるのが好ましい。
【０１６７】
「遺伝子の発現を増大させる」という語句は、遺伝子の発現が非改変株、例えば野生型株より高いことを意味する。このような改変の例としては、細胞１個当たりの発現された遺伝子（複数可）のコピー数を増加させること、遺伝子（複数可）の発現レベルを増大させること等が挙げられる。発現された遺伝子のコピー数量は、例えば、染色体ＤＮＡの制限後、遺伝子配列に基づきプローブを用いたサザンブロッティング、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等によって測定される。遺伝子発現レベルは、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等を含む様々な既知の方法によって測定することができる。遺伝子によってコードされたタンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の免疫ブロット法（ウェスタンブロッティング分析）等を含む既知の方法によって測定することができる。
【０１６８】
「タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換」とは、例えば、従来の方法によって細菌にＤＮＡを導入することを意味する。このＤＮＡの形質転換によって、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現が増大され、細菌細胞におけるタンパク質の活性が高まる。形質転換の方法は、これまでに報告されている任意の既知の方法を含む。例えば、ＤＮＡに対する細胞の浸透性を増大させるように塩化カルシウムでレシピエント細胞を処理する方法が大腸菌Ｋ−１２株について報告されており（Mandel, M.及びHiga, A., J. Mol. Biol., 53, 159（1970））、用いることができる。
【０１６９】
遺伝子発現を高める方法は、遺伝子コピー数を増加させることを含む。本発明の細菌で機能することができるベクターに遺伝子を導入することによって、遺伝子のコピー数が増加する。このような目的のために、好ましくは多コピーベクターを用いることができる。多コピーベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１９、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ２２ｂ等で例示される。
【０１７０】
遺伝子発現の増強は、例えば相同組み換え、Ｍｕ融合等によって遺伝子の複数のコピーを細菌染色体に導入することでも達成することができる。例えば、Ｍｕ融合の１回の実行によって、細菌の染色体に遺伝子のコピーを最大３個まで導入することができる。
【０１７１】
遺伝子のコピー数の増加は、遺伝子の複数のコピーを細菌の染色体ＤＮＡに導入することによっても達成することができる。遺伝子の複数のコピーを細菌の染色体に導入するために、染色体ＤＮＡにおける標的として、複数のコピーに存在する配列を用いて、相同組み換えを行う。染色体ＤＮＡにおいて複数のコピーを有する配列は、反復ＤＮＡ、又は転移因子の末端にある逆方向反復を含むが、これらに限定されない。また、米国特許第５，５９５，８８９号に開示されたように、遺伝子をトランスポゾンに組み込み、それを転移させ、遺伝子の多数のコピーを染色体ＤＮＡに導入することが可能である。
【０１７２】
遺伝子発現の増強は、強力なプロモータの制御下に本発明のＤＮＡを置くことによっても達成することができる。例えば、Ｐtacプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、λファージのＰRプロモータ又はＰLプロモータは全て強力なプロモータであることが知られている。強力なプロモータは遺伝子コピーの増加と併せて用いることができる。
【０１７３】
代替的には、プロモータの効果は、例えば、プロモータの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加するように、突然変異をプロモータに導入することによって高めることができる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ領域における幾つかのヌクレオチド、特に開始コドンのすぐ上流にある配列の置換がｍＲＮＡ翻訳能に強く影響することが知られている。例えば、開始コドンに先行する３つのヌクレオチドの性質によって、２０倍の範囲の発現レベルが見出された（Gold他, Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981、Hui他, EMBO J., 3, 623-629, 1984）。これまでに、ｒｈｔＡ２３突然変異は、ＡＴＧ開始コドンに対して−１位でＧをＡに置換することであることが示された（１９９７年のアメリカ生化学分子生物学学会総会主催の第１７回アメリカ生化学分子生物学学会国際会議の抄録（ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology）, San Francisco, California August 24-29, 1997, 抄録番号４５７）。
【０１７４】
さらに、ヌクレオチド置換を細菌染色体上の遺伝子のプロモータ領域に導入することも可能であり、これによりプロモータ機能が強められる。発現制御配列の変化は、例えば、国際公開第ＷＯ００／１８９３５号及び特開平１−２１５２８０号公報に開示されたよう
な温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様に行うことができる。
【０１７５】
プラスミドＤＮＡの調製方法としては、ＤＮＡの消化及びライゲーション、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等、又は当業者に既知の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は、例えば「分子クローニング実験マニュアル、第３版（Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition）」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001））に記載されている。
【０１７６】
（ＩＤＯ及びＨＩＤＨ）産生細菌、又は組み換えＤＮＡで形質転換された細菌細胞を用いてＬ−イソロイシンからＡＭＫＰを産生する場合、基質を培養中に培養培地に直接添加するか、又は細菌細胞若しくは培養物から単離された洗浄細菌細胞の形態で用いてもよい。さらに、破壊又は溶解された処理細菌細胞を直接用いるか、又はＩＤＯ及びＨＩＤＨを処理細菌細胞から回収し、粗酵素溶液として用いるか、又は酵素精製後に用いてもよい。すなわち、ＩＤＯ及びＨＩＤＨを有する画分形態で存在していれば、本発明のＡＭＫＰを製造する方法に用いることができる。
【０１７７】
ＩＤＯを用いる水酸化反応及びＨＩＤＨを用いる脱水素反応を行い、Ｌ−イソロイシンからＡＭＫＰを産生するために、Ｌ−イソロイシン、α−ケトグルタル酸、並びに反応を触媒するタンパク質又は（ＩＤＯ及びＨＩＤＨ）含有組成物を含有する反応溶液を２０〜５０℃の適温に調節し、静置させ、ｐＨを５〜１２に維持しながら３０分〜５日間振盪又は撹拌する。
【０１７８】
培養中、固定条件（fixed regime）の培養量で撹拌し、空気中から反応中に酸素を入れる。
【０１７９】
反応混合物で生成されるＡＭＫＰは、既知の技法に従って単離又は精製をすることができるか、又は特に反応がＩＤＯ及びＨＩＤＨを発現する組み換え微生物で行われる場合にさらに用いられる。
【０１８０】
単離及び精製の方法の例には、塩基性アミノ酸を吸着するイオン交換樹脂にＡＭＫＰを接触させた後に、溶離及び結晶化する方法、並びに溶離によって得られた生成物が変色し、活性炭による濾過の後に、結晶化を行いＡＭＫＰを得る方法が含まれ得る。
【０１８１】
＜３＞Ｌ−イソロイシンからのＬ−ヒドロキシイソロイシンの製造法
本発明の方法は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン（その遊離形態及び塩形態両方を含む意味として用いられ、「（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬ」と呼ぶこともある、以下同様）の産生を高めること、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性（４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性は低減又は欠失している）の両方を元来有する細菌を用いて、Ｌ−イソロイシンの直接の酵素的水酸化によって（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法である。
【０１８２】
本発明において、「（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン」又は「（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬ」という用語は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンを含有する単一化合物又は混合物を表す。また、「２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸」又は「ＡＭＫＰ」という用語は、２−アミノ−３−メチル−４−ケトペンタン酸の様々な光学異性体を含有する単一化合物又は混合物を表す。
【０１８３】
本明細書で使用される「細菌」という用語は、酵素産生細菌、目的とする酵素活性が存在するか、又は高められている、当該細菌の突然変異体及び遺伝子組み換え体等を含む。
【０１８４】
本発明による「Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼ活性の両方を元来含有する細菌」は、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性を有する酵素をコードする細菌の染色体上に遺伝子を含有する細菌である。すなわち、１つのオペロンに構成された、好ましくは翻訳的に結び付いたＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する細菌である。バチルス属、シュードモナス属、エンテロバクター属に属する細菌が好ましい。
【０１８５】
「バチルス属に属する細菌」という語句は、細菌が微生物学の当業者に既知の分類に従ってバチルス属に分類されることを意味する。本発明で用いられるようなバチルス属に属する細菌の例としては、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ワイヘンステファンエンシス、バチルス・セレウスが挙げられるが、これらに限定されない。バチルス・チューリンゲンシス株の具体例は、バチルス・チューリンゲンシスＡＪ１１０５８４と命名され、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に２００６年９月２７日に寄託され、ブタペスト条約の規定に従ってアクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６８８が与えられたバチルス・チューリンゲンシス株２−ｅ−２株（WO 2008/044614）、バチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株（ＡＴＣＣ３５６４６）、及びロシア国立産業微生物コレクション（Russian National Collection of Industrial Microorganisms）（ＶＫＰＭ）においてアクセッション番号ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７で寄託されたバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株である。
【０１８６】
「シュードモナス属に属する細菌」という語句は、細菌が微生物学の当業者に既知の分類に従ってシュードモナス属に分類されることを意味する。本発明で用いられるようなシュードモナス属に属する細菌の例としては、シュードモナス・シリンゲが挙げられるが、これに限定されない。
【０１８７】
「エンテロバクター属に属する細菌」という語句は、細菌が微生物学の当業者に既知の分類に従ってエンテロバクター属に分類されることを意味する。本発明で用いられるようなエンテロバクター属に属する細菌の例としては、エンテロバクター・アグロメランスが挙げられるが、これに限定されない。近年、エンテロバクター・アグロメランスの幾つかの種は、１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列解析等に基づき、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・アナナチス（Pantoea ananatis）、又はパントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）等に再分類されている（Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173（1993））。
【０１８８】
以下で、微生物細胞由来のＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼをＩＤＯと略記する。以下で、微生物細胞由来の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼをＨＩＤＨと略記する。
【０１８９】
Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼの活性は、α−ケトグルタル酸及び酸素の存在下でのＬ−イソロイシンの水酸化反応を触媒する活性を意味し、４−ＨＩＬ、コハク酸及びＣＯ2が生成される。４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性は、ＮＡＤ+又はＮＡＤＰの存在下での４−ＨＩＬからのＡＭＫＰの生成反応を触媒する活性を意味する。本発明のＩＤＯのＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼ活性は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて、Ｌ−イソロイシンからの（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬ生成の分析によって測定され得る。また、本発明のＨＩＤＨの４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼは、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて、４−ＨＩＬイソロイシンからのＡＭＫＰ生成の分析によって測定され得る。
【０１９０】
ＨＩＤＨをコードする遺伝子は、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（NIH, Bethesda, MD20894, USA）に２００７年１月１７日に提出され（アクセッション番号：ＡＡＪＭ００００００００．１、ＧＩ：７４４９４３３５）、アクセッション番号ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７で保存されたロシア国立産業微生物コレクション（ＶＫＰＭ）から得たバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株からクローニングしたバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株（ＡＴＣＣ３５６４６）の完全ゲノムの解析によって同定された。ＨＩＤＨをコードするバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株ＡＴＣＣ３５６４６由来の塩基配列が配列番号５で表される。バチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株ＡＴＣＣ３５６４６由来のＨＩＤＨのアミノ酸配列が配列番号６で表される。
【０１９１】
４ＨＩＬがＡＭＫＰに変換される反応を触媒するＨＩＤＨをコードするＤＮＡは、配列番号５で示されるＤＮＡだけではない。これは、ＩＤＯ及びＨＩＤＨをコードする遺伝子を含有する種の中のそれぞれの種及び株で見られる塩基配列に差異が存在するであろうためである。
【０１９２】
ＨＩＤＨをコードするＤＮＡは、ＨＩＤＨをコードする単離ＤＮＡだけでなく、ＨＩＤＨ産生微生物の染色体ＤＮＡから単離したＨＩＤＨをコードするＤＮＡに突然変異が人工的に付加されているＤＮＡも、上記反応を触媒する活性を有するＨＩＤＨをコードしさえすれば、本発明のＤＮＡに含まれる。突然変異を人工的に付加する方法は、Method. in Enzymol., 154（1987）で記載された部位特異的な突然変異体を誘導する方法のような一般的に用いられる方法を含む。
【０１９３】
配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＨＩＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。本明細書で用いられるように、「ストリンジェントな条件」は、特異的なハイブリッドが形成される一方で、非特異的なハイブリットは形成されない条件を表す。はっきりとした数値でこれらの条件を表すことは難しいが、例としては、例えば好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上及び特に好ましくは９５％以上の相同性等、相同性の高いＤＮＡ分子が互いにハイブリダイズするが、相同性の低いＤＮＡ分子は互いにハイブリダイズしない条件、又はサザンハイブリダイゼーションにおける通常の洗浄条件、すなわち３７℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、好ましくは６０℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、並びにさらに好ましくは６５℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに対応する塩濃度でハイブリダイゼーションが起こる条件が言及される。ハイブリダイゼーション条件によって、プローブの長さを好適に選択することができ、通常１００ｂｐ〜１ｋｂｐで変化する。さらに、「ＨＩＤＨ活性」は、４ＨＩＬからＡＭＫＰを合成する活性に十分であり得る。しかし、配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列の場合、塩基配列は、３７℃及びｐH８の条件下で、ＨＩＤＨ活性を、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、及びさらにより好ましくは７０％以上維持することが好ましい。ＨＩＤＨ活性は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて、ＡＭＫＰ生成の分析によって測定され得る。
【０１９４】
さらに、配列番号５のＤＮＡによってコードされるＨＩＤＨと実質的に同一であるタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。すなわち、以下のＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる：
（ａ）配列番号５の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＨＩＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列において１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つＨＩＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、及びさらにより好ましくは少なくとも９５％の相同性があるアミノ酸配列を有し、且つＨＩＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０１９５】
本明細書で、「１つ又は幾つか」は、ＨＩＤＨ活性を有するタンパク質の三次元構造が大きくは損なわれない範囲、及びより具体的には１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０、及びさらにより好ましくは１〜５の範囲を表す。
【０１９６】
１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位は、活性が維持されるような保存的突然変異（複数可）でなければいけない。代表的な保存的突然変異は保存的置換である。保存的置換の例としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及びＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【０１９７】
さらに、配列番号５のホモログＤＮＡは、ＨＩＤＨをコードする遺伝子として用いることができる。ホモログＤＮＡがＨＩＤＨをコードするか否かは、細胞溶解物、又はホモログＤＮＡが過剰発現する微生物の細胞溶解物のＨＩＤＨ活性を測定することによって確認することができる。
【０１９８】
配列番号５のホモログＤＮＡは、別のバチルス種、例えばバチルス・セレウス、バチルス・ワイヘンステファンエンシスのゲノムから調製することもできる。全て既知の細菌ゲノムの解析によって、幾つかの微生物がバチルス・チューリンゲンシスイスラエレンシス血清型（ＡＴＣＣ３５６４６）由来のＨＩＤＨ遺伝子と高い相同性がある遺伝子を含有することが示された。バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ワイヘンステファンエンシス、及びシュードモナス・シリンゲ由来のＨＩＤＨのアミノ酸配列のアラインメントが図４１に示される。そして、これらの遺伝子は全て、オペロンの第１遺伝子としてＩＤＯ遺伝子を含有するオペロンにおける第２遺伝子である。
【０１９９】
「細菌は４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼの活性が低減又は欠失するように改変されている」という語句は、改変細菌が、非改変細菌に比べて量が減少したＨＩＤＨタンパク質を含有するか、活性が低減した突然変異ＨＩＤＨタンパク質を含有するか、又はＨＩＤＨタンパク質を合成することができないというような方法で細菌が改変されていることを意味する。
【０２００】
ＨＩＤＨの活性を低減又は欠失させるのに可能な方法は、ＨＩＤＨをコードする遺伝子の発現の起こり得る減衰又は抑制である。細菌の染色体における遺伝子の不活性化によって、ＨＩＤＨをコードする遺伝子の発現を完全に抑制することができる。
【０２０１】
「ＨＩＤＨ遺伝子の不活性化」という語句は、改変遺伝子が完全に非機能的なタンパク質をコードすることを意味する。改変ＤＮＡ領域が、遺伝子の一部の欠失、遺伝子のリーディングフレームの移行、ミスセンス／ナンセンス突然変異（複数可）の導入、又は遺伝子の隣接領域（遺伝子発現を制御する配列、例えばプロモータ、エンハンサー、アテニュエータ、リボソーム結合部位等を含む）の改変のために遺伝子を自然状態で発現することができない可能性もある。
【０２０２】
例えば、以下の方法を利用して、遺伝子組み換えによって突然変異を導入することができる。突然変異遺伝子を調製し、改変される細菌を突然変異遺伝子を含有するＤＮＡ断片で形質転換する。次いで、相同組み換えによって、染色体上の天然遺伝子を突然変異遺伝子に置き換え、得られる株を選抜する。さらに、上記のような相同組み換えを用いた遺伝子置換による部位特異的突然変異の組み込みは、宿主における複製能が欠損したプラスミドを用いても行うことができる。
【０２０３】
遺伝子の不活性化は、従来の方法、例えばＵＶ照射又はニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）処理を用いた突然変異処理、部位特異的な突然変異誘発、相同組み換えを用いた遺伝子破壊によって行うことができる。
【０２０４】
細菌の染色体におけるＨＩＤＨ遺伝子の有無は、ＰＣＲ、サザンブロッティング等を含む既知の方法によって検出することができる。さらに、遺伝子発現レベルは、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等を含むさまざまな既知の方法を用いて、遺伝子から転写したｍＲＮＡの量を測定することによって推定することができる。遺伝子によってコードされたタンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の免疫ブロット法（ウェスタンブロッティング分析）等を含む既知の方法によって測定することができる。
【０２０５】
プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化及びライゲーション、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択の方法等は当業者に既知の通常の方法であり得る。これらの方法は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T.著「分子クローニング：実験マニュアル、第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition）」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））に記載されている。
【０２０６】
４−ＨＩＬの効率的な産生のためには、Ｌ−イソロイシンからの４−ＨＩＬの生成反応を触媒するＩＤＯタンパク質の活性を高めることが必要である。
【０２０７】
ＩＤＯをコードする塩基配列及びバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７由来のＩＤＯのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３及び配列番号４で表される。
【０２０８】
ＩＤＯ及びそれをコードするＤＮＡについては、＜２＞の製造法について説明したとおりである。
【０２０９】
配列番号３のホモログＤＮＡは、別のバチルス種、例えばバチルス・セレウス、バチルス・ワイヘンステファンエンシスのゲノムから調製することもできる。
【０２１０】
さらに、バチルス属、エシェリキア属、コリネバクテリウム属、アルトロバクター属、アスペルギルス属、シュードモナス属、グラニュリバクター属（Granulibacter）、メチ
ロバチルス属（Methylobacillus）、アシディフィリウム属（Acidiphilium）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、カウロバクター属（Caulobacter）、スティグマテラ属（Stigmatella）、ミクソコッカス属（Myxococcus）、ポラロモナス属（Polaromonas）、カウロバクター属（Caulobacter）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）、アシドボラックス属（Acidovorax）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、アゾトバクター属（Azotobacter）、ビブリオ属（Vibrio）、ポリヌクレオバクター属（Polynucleobacter）、ストレプトミセス属（Streptomyces）等からの以下に列挙する遺伝子（表２）との相同性に基づいて、クローニングによってコードされる別の細菌由来のホモログＤＮＡを得ることができる。
【０２１１】
【表２】
2009131254.tif 000005
【０２１２】
「細菌がＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼの活性を高めるように改変されている」と
いう語句は、改変細菌が、非改変細菌に比べて量が増加したＩＤＯタンパク質を含有するというような方法で細菌が改変されていることを意味する。ＩＤＯタンパク質の量を増加させるのに可能な方法は、ＩＤＯタンパク質をコードする遺伝子の発現の増大である。
【０２１３】
「遺伝子の発現を増大させる」という語句は、遺伝子の発現が非改変株、例えば野生型株より高いことを意味する。このような改変の例としては、細胞１個当たりの発現された遺伝子（複数可）のコピー数を増加させること、遺伝子（複数可）の発現レベルを増大させること等が挙げられる。発現された遺伝子のコピー数量は、例えば、染色体ＤＮＡの制限後、遺伝子配列に基づきプローブを用いたサザンブロッティング、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等によって測定される。遺伝子発現レベルは、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等を含む様々な既知の方法によって測定することができる。遺伝子によってコードされたタンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の免疫ブロット法（ウェスタンブロッティング分析）等を含む既知の方法によって測定することができる。
【０２１４】
「タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換」とは、例えば、従来の方法によって細菌にＤＮＡを導入することを意味する。このＤＮＡの形質転換によって、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現が増大され、細菌細胞におけるタンパク質の活性が高まる。形質転換の方法は、これまでに報告されている任意の既知の方法を含む。
【０２１５】
遺伝子発現を高める方法は、遺伝子コピー数を増加させることを含む。本発明の細菌で機能することができるベクターに遺伝子を導入することによって、遺伝子のコピー数が増加する。このような目的のために、好ましくは多コピーベクターを用いることができる。
【０２１６】
遺伝子発現の増強は、例えば相同組み換えによって遺伝子の複数のコピーを細菌染色体に導入することでも達成することができる。
【０２１７】
遺伝子のコピー数の増加は、遺伝子の複数のコピーを細菌の染色体ＤＮＡに導入することによっても達成することができる。遺伝子の複数のコピーを細菌の染色体に導入するために、染色体ＤＮＡにおける標的として、複数のコピーに存在する配列を用いて、相同組み換えを行う。染色体ＤＮＡにおいて複数のコピーを有する配列は、反復ＤＮＡ、又は転移因子の末端にある逆方向反復を含むが、これらに限定されない。
【０２１８】
遺伝子発現の増強は、強力なプロモータの制御下に本発明のＤＮＡを置くことによっても達成することができる。強力なプロモータは遺伝子コピーの増加と併せて用いることができる。
【０２１９】
さらに、ヌクレオチド置換を細菌染色体上の遺伝子のプロモータ領域に導入することも可能であり、これによりプロモータ機能が強められる。発現制御配列の変化は、例えば、国際公開第ＷＯ００／１８９３５号及び特開平１−２１５２８０号公報に開示されたような温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様に行うことができる。
【０２２０】
プラスミドＤＮＡの調製方法としては、ＤＮＡの消化及びライゲーション、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等、又は当業者に既知の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は、例えば「分子クローニング実験マニュアル、第３版（Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition）」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001））に記載されている。
【０２２１】
本発明の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを製造する方法は、以下の反応によって表される（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬを産生するためのＬ−イ
ソロイシンの直接的な酵素的水酸化の１工程反応を含む：
Ｌ−イソロイシン  ＋  α−ケトグルタル酸  ＋  Ｏ2  →  ４ＨＩＬ  ＋  コハク酸  ＋  ＣＯ2
（式中、この反応は、酸素原子のうちの１つの受容体分子としてＬ−イソロイシン、別の酸素原子の受容体分子としてα−ケトグルタル酸、２つの酸素原子の供与体として１つの酸素分子、及び反応を触媒するＩＤＯを含有する細菌の存在下で行われる）。
【０２２２】
ＩＤＯを用いる水酸化反応を行うために、Ｌ−イソロイシン、α−ケトグルタル酸、並びに反応を触媒するＩＤＯを含有する細菌を含有する反応溶液を２０〜５０℃の適温に調節し、静置させ、ｐＨを５〜１２に維持しながら３０分〜５日間振盪又は撹拌する。
【０２２３】
反応混合物で生成される（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬは、既知の技法に従って単離又は精製をすることができる。
【０２２４】
単離及び精製の方法の例には、塩基性アミノ酸を吸着するイオン交換樹脂に（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬを接触させた後に、溶離及び結晶化する方法、並びに溶離によって得られた生成物が変色し、活性炭による濾過の後に、結晶化を行い（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４ＨＩＬを得る方法が含まれ得る。
【０２２５】
本発明による方法において、細菌は、細菌培養物、細胞、処理細胞又は細胞溶解物である。
【０２２６】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。なお本発明は、この実施例により何ら限定されない。
【０２２７】
［実施例１］ＨＩＬ生産に有用なＡＭＫＰ還元活性を有する微生物の探索
（1）保存風乾菌体を用いた1次スクリーニング
＜目的＞
保存風乾乾燥菌体を用いて、AMKPを基質とし、NADH、NADPHを補酵素として還元反応を行う。その反応液を薄層クロマトグラフィー（TLC）ならびに高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて分析し、HILの生成を確認する。これによりAMKPからHILへの還元反応を行う微生物の探索を行う。
【０２２８】
＜方法＞
図３３に示す手順により調製し、保存している微生物（Graduate School of Agriculture Kyoto University：AKU Culture Collection）の風乾菌体約1100サンプルを用い、以下の反応、分析を行った（図２）。
【０２２９】
細試験管(10×105 mm)に小スパテル約五分の一杯の風乾菌体を入れ、そこに反応液100 μl(表３)を加えて反応を開始し、28℃で約1.5日間振とうした後、メタノール200 μlを加えた。反応液は基質AMKPを加えたものと加えていないコントロールを作り、各菌株において反応を行った。
【０２３０】
【表３】
2009131254.tif 000006
【０２３１】
AMKPを基質、NADH、NADPHを補酵素として反応させて、TLC分析及びHPLC分析を行った。この反応では、補酵素再生系としてグルコースとグルコースデヒドロゲナーゼを添加しているので、NAD+ならびにNADP+からNADH，NADPHが供給される。(図１)
【０２３２】
TLC分析
反応液を3000 rpmで10分間遠心分離し、上清をTLCプレートにスポットした。この反応液をニンヒドリン発色によって分析した。(TLC分析条件については表４に示した。)  また、標品AMKPとHILのスポットを図３に示した。活性はHILと同じスポット位置で、かつHILと同じ発色を示した菌株を選択した。
【０２３３】
【表４】
2009131254.tif 000007
【０２３４】
HPLC分析
TLC分析と同じく、すべてのサンプルに対してHPLC分析も行った。反応上清を蒸留水で50倍に希釈し、アミノ酸を蛍光誘導体化した。アミノ酸の誘導体化にはAccQ・Fluor 試薬6-アミノキノイル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートを用いた。この試薬は1級、2級アミンを単純な反応で誘導体化し、395 nmに強く蛍光を持つ安定な尿素系化合物を生成する。これによりアミノ酸を正確に数pmolレベルで検出できる。誘導体化した後、HPLCにより分析し250 nm〜395 nmの蛍光を測定した。分析の方法については図４に示した。
【０２３５】
この１次スクリーニングでは、TLCの発色及びHPLC分析において主に天然型HIL (HIL 4)
のピークの出現を確かめた。
その後、HIL異性体と思われるピークの位置を確認した。（異性体のピークの種類については５に示した。）
【０２３６】
【表５】
2009131254.tif 000008
【０２３７】
＜結果及び考察＞
保存乾燥菌体約1100サンプルについて反応させ、TLCで分析を行った。
1次スクリーニングとして、風乾菌体を用いて図１の反応を行った結果、TLC分析においてHILに相当すると思われるスポットを持つ菌株が多数得られた。
【０２３８】
また、同時にHPLCで分析を行うことでHILを同定し、その生成量を調べた。TLC分析で明確な活性が認められるサンプルのほとんどが、HPLC分析の結果、天然型異性体のHILと同じ位置にピークを示した。HPLC分析におけるHIL天然型異性体のピーク位置、及びAMKPのピーク位置は図５に示してある。
また、HPLC分析で微量に活性が確認できる株も多く存在した。微量なピークを持つ株は酵母や担子菌で多く確認できた。
【０２３９】
TLC分析において活性が見られた株でもHPLC分析において天然型のHILの生成が確認できない株もあった。しかし、天然型以外の異性体が生成している可能性も考えて、TLC分析において活性の高いと思われる株も選抜した。
【０２４０】
以上の分析結果から活性が確認できた株の数を表６に、その微生物保存番号を表７に示してある。
【０２４１】
【表６】
2009131254.tif 000009
【０２４２】
【表７】
2009131254.tif 000010
【０２４３】
その中でも、１次スクリーニングにおいて、HPLC分析でHILの天然型異性体と同じリテンションタイムに明確なピークを有した株、もしくは、HPLCで活性が認められなくてもTLC分析でHILと同じ位置に明確なスポットが確認できた株を選抜した。（表１）
【０２４４】
（2）選抜株を用いた反応に対するpHの影響と生成物の異性体組成分析
＜目的＞
1次スクリーニングにおける選抜株を用いて、もう一度pH 5.0, 7.4, 9.0で反応を行い、再現性を確認するとともにpHによるHIL生成量の影響を確認する。
また、HIL異性体の分析が可能になったことにより、pHによる異性体組成への影響も分析している。
【０２４５】
＜方法＞
1次スクリーニングで選抜した27株(表１) を用いて次の実験を行った。反応、分析の方法は方法1と同様である(図２)が、反応の際のpH変化の影響を調べるために3種類のバッファーを用意した。pH 5.0（50 mＭマロン酸バッファー）、 pH 7.4（50 mMトリスバッファー）、 pH 9.0（50 mMトリスバッファー）の3種類のバッファーを用いて、反応液を調製し(表８)、 (1)と同様の反応、分析を行った。
【０２４６】
【表８】
2009131254.tif 000011
【０２４７】
分析は各種異性体の生成を確認するため、前述の6-アミノキノイル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートを用いた誘導体化法を用いて実施した。
また、反応の再現性を確認するためにもう一度、同実験を試み、HILの生成量と異性体組成の確認を行った。
【０２４８】
＜結果及び考察＞
（1）における選抜株27株に対して前述の反応、分析を行った。
各種異性体組成の分析結果を図６（pH 5.0），図７（pH 7.4)，図８（pH 9.0）に示した。ただし、このHIL濃度はメタノール添加後の濃度であり、実際の反応液中のHIL濃度はこの3倍の濃度となっている。
【０２４９】
この結果より、ほとんどの株ではpH 9.0 での反応において活性が高かった。また、分析の結果からHPLCで分離可能な4パターンすべての異性体が生成していることがわかった。
【０２５０】
pH 5.0ではほとんどの株で活性は低下、もしくは無くなっていた。その中で、特徴的な活性が見られたのはAKU 3804, AKU 3805であった。どちらも生成量は少量だが、酸性側でも活性が維持され、他の株ではほとんど見られないHIL 3 の生成が確認できた。その他、酸性側でも比較的活性が確認できたものには、AKU 3710とIG 611があった。
【０２５１】
pH 7.4 の反応ではAKU 3999-2, AKU 3999-5 を除く25 株で再現性が確認できた。これ
までTLCのみの活性しか確認できなかった株（IG 212, IG 504, AKU 3805）においても予想していた通り、天然型以外のHIL異性体が少量ながらも生成していることを確認できた。
【０２５２】
pH 9.0 では、多くの株において中性での反応よりもHILの生成量が増加していた。また、HILの異性体パターンもpH により大きく変化している株もあった。
その中でも、HIL生成量が多く、中性とアルカリ性で各種異性体組成が大きく変化する、次の特徴的な3株について調べた。
【０２５３】
AKU 238 株はpH 7 においてHIL 4 の活性が高いが、pH 9 においてはHIL 2 の活性が高くなっていた。
【０２５４】
AKU 4438 株はpH 9.0 で反応させるとHIL 1及びHIL 4 の生成量が著しく増大し、選抜した株の中でHIL総生成量が最大であった。
【０２５５】
IFO 4466 株は主にHIL 4 の活性を示すが、中性とアルカリ性での活性が急激に変化していた。
【０２５６】
HIL各種異性体についての分析結果
スクリーニングの分析を進めていく中で、TLC分析で明らかな活性が見られる株において、HPLC分析でHIL異性体と思われる特徴的なピークが観察されることがわかった。
【０２５７】
その後、前述した通り選抜株での反応液を分析したところ、HIL１〜４の異性体量の生成を確認できた。（図６、図７、図８）
【０２５８】
HIL異性体のうち、HIL 4は天然型異性体2S, 3R, 4S-HIL (以下、（2S, 3R, 4S） と表示する。他の異性体も同様。) と（2R, 3S, 4R）からなるジアステレオマーである。また、HIL 2は天然において微量に含まれる（2S, 3S, 4R）、と（2R, 3R, 4S）からなるジアステレオマーである。
【０２５９】
この結果から、未知ピークの中でHIL 1 [（2S, 3S, 4S），（2R, 3R, 4R）]に相当すると思われるピークも確認することができた。
【０２６０】
HPLC分析はメタノール法で分析を行っているため、HIL 3は基質AMKPのピークと重なってしまう。そのため、HIL 3の生成量はわからなかったが、HIL 1，2，4 の生成が確認できた。HIL 1，2，4の生成例として、AKU 238株とAKU 4438株のHPLC分析結果によるHIL 1，2，4 のピーク位置を示す。（図９、図１０）
【０２６１】
再現性確認結果
また、分析した活性菌株の異性体組成と生成量の再現性確認実験を行った。中性及びアルカリ性でHIL生成活性が高かったことから、pH 7.0, 9.0において再現性を確認した。その結果をpH 7.0 は図１１ 、pH9.0は図１２に示した。ただし、メタノール添加後濃度であり、実際の反応液中のHIL濃度はこの3倍の濃度となっている。また、HIL 3 の分析は行っていない。
【０２６２】
前回の分析結果と比較して、生成量に少しの変化があったが、異性体組成などにほとんど変化は見られなかった。大きな変化があったものとしては、再現性実験の結果ではpH 7.0 においてIG 212株でHIL 1 およびHIL 2 の活性が明確に現れた。一方で、IG 504株で活性が見られなかった。AKU 2130 株の活性も不安定で、前回とは逆にpH7.0 ではなくpH 9.0でHIL 1 の生成が確認された。また、AKU 5519 株ではpH 7.0でHIL 4 を生成する活性
が失われた。AKU 3999-2, AKU 3999-5 は前回と同様、活性を確認できなかった。
【０２６３】
以上の結果から、反応開始時のpHにより生成量、異性体組成に大きな影響があることが確認できた。しかし、本実験の反応後サンプルをpH試験紙で測定したところ初めのpHよりも大幅に減少し、pH 3〜4 付近まで低下していることが確認された。これは、今回の反応系で使用したGDHが補酵素を再生するときに生じるグルコン酸によって、pHの大幅な減少が引き起こされるためと考えられた。（図１）
このため、以下では特徴的な株について、更なる反応、分析を試みた。
【０２６４】
［実施例２］特徴的な株AKU 238、AKU 4438、IFO 4466 を用いた反応の解析
＜目的＞
実施例１の結果より、反応液におけるpHの変化がHIL生成活性に大きな影響を与えていることが確認できた。しかし、前述した通り、補酵素再生系で生じるグルコン酸により開始pHと最終pHが大きく変化していたことが明らかになり、pHの詳しい影響が確認できなかった。そのためこの章ではpH変化に影響を受けていた株の中でも、特に影響の大きいと思われる株AKU 238、AKU 4438、IFO 4466を用いて更なる反応の解析を行った。
【０２６５】
（1）AKU 238、AKU 4438、IFO 4466 を用いた反応の経時変化
＜目的＞
特徴的な活性を持った株AKU 238、AKU 4438、IFO 4466 を用いて実施例１と同じ反応を行った。今回は一定時間ごとに反応液を採取し、反応中のpH変化と各種HIL異性体蓄積量の変化を調べた。
【０２６６】
＜方法＞
実験は2回行い、反応液の組成は表９に示しているように1 回目はpH 7.0の 50 mMリン酸バッファーを用い、2回目にはpH 9.0の 50 mMトリスバッファーを用いた。
【０２６７】
【表９】
2009131254.tif 000012
【０２６８】
(i) 1回目の反応では細試験管(10×105 mm)に小スパテル約二分の一杯の風乾菌体をそれぞれ入れ、そこに反応液を2 mlずつ入れ反応を開始し、0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 28, 101 時間での反応液を100 μlずつサンプリングした。その反応液100 μl にメタノール200 μl を加え遠心し,上清をTLC及びHPLCで分析した。（図１３）この実験では、pHの測定をメタノール添加後に行っているため、正確なpH変化を測定できなかった。
【０２６９】
(ii) ２回目の実験では、1回目の反応で大きな変化が確認できなかったため、サンプリングの時間を伸ばし6時間ごとの反応を分析した。ここでは、アルカリ側からの反応を行い、より幅広いpH変化を確認することを試みた。今回はサンプリングと同時に希釈前の正確
なpHを測定した。
【０２７０】
＜結果及び考察＞
(i)におけるpHの経時変化を図１４に示し、HIL生成量の経時変化を図１５（AKU 238）,
図１６（AKU 4438）, 図１７（IFO 4466） に示した。
【０２７１】
その結果より、反応液のpHがほとんど変化しなくても時間の経過とともにHILが蓄積してくることが確認できた。3時間後にはすでにHIL 4 の生成が確認されたが、他の異性体は、それよりも遅く生成し、蓄積量としても微量であった。この結果より、中性付近でHIL 4 の生成が効率よく進むこと、ならびに、pH の低下によりHIL 4 の生成が抑制されることが確認された。
【０２７２】
また、 実施例１でのスクリーニングの反応よりも反応が遅く、生成量が少なかったのは、サンプリングのために反応液の量を多くしたことで、菌体量とのバランスがスクリーニング時とは異なってしまっていたことに起因していると考えられる。
【０２７３】
また、今回のpH変化はメタノール添加後に行ってしまったため、反応原液がメタノールにより希釈され、中性に近づいていると考えられる。このため、正確なpH測定ができず、pHの経時変化をとらえることが出来なかった。そのため、再実験を行った。
【０２７４】
(ii)におけるpHの経時変化を図１８に示し、HIL生成量の経時変化を図１９（AKU 238）, 図２０（AKU 4438）, 図２１（IFO 4466） に示した。今回は正確なpHの測定が行えたが、反応液のpHはあまり変化しなかった。そのため、pHにおける影響を確認することが出来なかった。
【０２７５】
ただ、前回と同様HIL 4 の活性が確認でき、前回よりもAKU 4438, IFO 4466株でHIL生成量が増加した。AKU 4438 においてはHIL生成量が減少に転じるタイミングが遅いことから、比較的安定な酵素を有しているとも考えられる。また、AKU 238 株だけは中性における反応の方が高い活性を示すことが確認できた。
【０２７６】
グラフからも確認できるように、HIL 4はある程度生成した後に、36〜49時間の間に減少に転じていた。この間、pHはほとんど変化していないことから、pHに影響されておらず、pH変化以外の要因による時間の経過に伴うHILの分解が起きていると考えられる。
【０２７７】
（2）AKU 238、AKU 4438、IFO 4466を用いた反応に対するpHの影響
＜目的＞
実施例２（1）の結果において、各種異性体生成のpHにおける影響を判断することが難しかった。そこで、pH低下を引き起こす補酵素再生系を取り外し、その代わりに、補酵素NADH, NADPHを多量投入して反応を開始した。これにより完全にpHを固定した反応で、pHが各種異性体生成へ与える影響を調べた。
【０２７８】
＜方法＞
今回の反応ではpHを正確に固定するために、GDH、グルコースを加えない。そのため、初めから補酵素NADH, NADPHを各8.0 mg／ml 加えて反応液を調整した。反応液のpHは 4.5〜9.0 まで 0.5 刻みで調整し、反応させた。バッファーは各緩衝能を考慮して、pH 4.5,
5.0, 5.5 では酢酸バッファーを、pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 ではリン酸バッファーを、pH
8.0, 8.5, 9.0 ではトリスバッファーを用いた。反応液の組成は表１０に示してある。
【０２７９】
【表１０】
2009131254.tif 000013
【０２８０】
細試験管(10×105 mm)に小スパテル約五分の一杯の風乾菌体を入れ、そこに各pHの反応液100 μlを加えて反応を開始し、28 ℃で8〜9 時間振とうした後、メタノール200 μlを加えた。（図２２）
【０２８１】
AKU 238、AKU 4438、IFO 4466を用いて反応を行った。また、その他の24の選抜株の中で、実施例１（2）の分析結果でpHによりHILの異性体組成や生成量に影響を受けていると考えられる5株についても、同様の反応、分析を行った。
【０２８２】
＜結果及び考察＞
それぞれの結果を図２３から図３０に示した。多くの株が中性付近を中心として活性が高くなっていることが確認できた。しかし、HIL異性体組成がpHによって変化している株も見られた。
【０２８３】
それぞれの株について、実施例１でのHIL異性体組成の分析結果とも比較して以下に考察した。
【０２８４】
AKU 238（図２３）
HIL 4 生成活性はpH 6.0から7.0で高いことが確認でき、HIL 2 生成活性も同じ領域で高くなっていた。しかし、AKU 238 株は、実施例１の分析結果ではpH 9.0 からの反応においてHIL 2 がHIL 4 よりも多く生成していた。pH 8.5, 9.0 でHIL 2の活性がHIL 4 の活性を越えてはいるものの量は少なく、今回の結果を見る限り、図８に示されているような異性体組成の結果が出るとは考えにくい。ここで考えられることは、実施例２（1）での経時変化（図１９）からも確認できるように、HIL 4 の生成が速く進み、後に分解されてしまったため減少し、最終的にはHIL 4 の生成量はHIL 2 の生成量よりも少なくなっていたと考えられる。
【０２８５】
AKU 4438（図２４）
中性〜弱アルカリ性で活性が上昇し、pH 8.0 が最適pHであることが確認できた。特にHIL 1 についてpH 6.5 以上で生成量が多くなることは、実施例１において、開始pHの違いが異性体パターンや生成量に影響を与えていたことを説明し得る結果であると考えられた。
【０２８６】
IFO 4466（図２５）
pH 5.5 とpH 7.5 の2ヶ所でHIL 4 生成活性が高くなっていると考えられる。また、再現性の確認が必要ではあるが、pH 8.0 でHIL 2 が、pH 4.5 でHIL 1 が微量ながら生成しているため、中性付近で活性を持つ還元酵素とpH 5.5 付近で活性を持つ還元酵素の、立体選択性が異なる２種の酵素があるとも考えられる。
【０２８７】
AKU 2130（図２６）
どのpHにおいてもHIL 1 のみが生成しており、pH 5.0から8.5まで幅広いpH領域である程度の活性が確認できた。
【０２８８】
AKU 2301（図２７）
スクリーニング時の結果と異なり、HIL 1 の生成も確認された。しかし、HIL 1 はpH 6.0から7.0 の狭い範囲でしか生成が見られなかった。これは、スクリーニング時はpHが4付近まで低下していたため、HIL 1 の生成が抑制されていたことが考えられた。また、酸性領域でHIL 1 が分解を受けた、あるいは逆反応が進行したとも考えられる。また、微妙なpH変化に伴い、異性体組成が変化していた。
【０２８９】
IG 611（図２８）
pH 6.0から6.5でHIL 4 生成の最適pHであるが、HIL 2 の生成はpH 7.0から8.0 にて比較的高くなっていた。
【０２９０】
AKU 5507（図２９）
中性付近では一定の活性を保っていることが確認できた。実施例１の結果でアルカリ性から開始したpHが中性付近に低下し、中性条件下でHILが多く生成されていたのだと考えられる。
【０２９１】
AKU 3710（図３０）
生成量が低かった。しかし、HIL 1 と HIL 4 の生成する領域がpH 4.5 とpH 8.0 で分かれていた。実施例１においてpH 5.0 からの反応でHIL 1 が生成したことからも酸性側に活性があることが予想される。
【０２９２】
また、pH 9.0 の反応ではTLC分析で活性が見られたが、HPLC分析でHILピークは微量であった。
【０２９３】
今回の反応において酸性側で活性が減少しているのは、pHの酵素活性への影響の他にも、補酵素NADH, NADPHの各pHでの安定性も影響していると考えられる。図３１、図３２に示しているように、溶液中でNADH, NADPHはアルカリ側では比較的安定であるが、酸性側では非常に不安定であり、分解が著しく進んでしまう。そのため、酸性側では投入したすべての補酵素が使える状態で存在できてはおらず、十分な反応が進まなかったことも考えられる。
【０２９４】
1次スクリーニングでの選抜株27株が生産する各種HIL異性体を分析したところ、様々な種類の異性体の生成を確認できた。HILの総生成量が最も多かった株はAKU 4438 Sporobolomyces gracilis であった。この株はpH 8 に最適反応pHが存在し、主にHIL 1 とHIL 4 を蓄積した。他にもHIL 1 とHIL 4 の生成は多くの株で確認できた。
【０２９５】
HIL 1 のみを生成する株で比較的活性の高いものはAKU 2130 Nocardia sp.であった。
【０２９６】
HIL 2 を生産する菌株は少なく、その中ではAKU 238 Bacillus thuringiensis,  AKU 2301 Streptomyces olivochromogenesが高い活性を示した。また、AKU 238 はHIL 4 を著量併産し、AKU 2301 はHIL 1 ならびにHIL 4 を併産した。HIL 3 を生産する菌株はさらに少なく、いずれの株においても活性は低かったが、その中ではAKU 3805 Gibberella fujikuroiが最も高い活性を示していた。
【０２９７】
［実施例３］  至適ｐＨ、至適基質濃度及び至適反応温度の検討
代表的な下記の６株を用いて至適条件を検討した。反応は、下記の反応条件を用いた他は、実施例１の(1)と同様に行った。
【０２９８】
供試乾燥菌株
AKU 238、AKU4438、AKU 4806、AKU 3710、IFO4466、AKU 5507 計 6株
【０２９９】
【表１１】
2009131254.tif 000014
【０３００】
結果を図３４に示す。10−20℃では生産量は少ないものの、10−40℃の範囲ではほとんどの株でHIL生産活性が見られた。TLCのHILスポットの濃淡で判断すると、HIL生産量は28−40℃のとき多かった。
【０３０１】
【表１２】
2009131254.tif 000015
【０３０２】
結果を図３５に示す。全体的には基質濃度を上げるとHIL生産活性をもつ株数が増え、それぞれのHIL生産量も増えていた。しかし一部の株（AKU4806）については反応液中の基質濃度が1.25 mg / mlの時HIL生産量が一番高く、それ以上の基質濃度になると生産量が減少に転じ、さらには10-20 mg / mlではほとんどHIL生産しなくなった。
【０３０３】
【表１３】
2009131254.tif 000016
【０３０４】
結果を図３６に示す。HIL生産活性に適した反応液のpHは5−10.5であった。より活性が期待できるのはpH 6−9であり、用いた菌株全てで活性が見られたのはpH 8であった。
【０３０５】
［実施例４］  B.thuringiensis israelensis ATCC35646由来hildh遺伝子のクローニング(1) ＰＣＲによるhildh遺伝子の取得
B.thuringiensis israelensis ATCC35646株のido遺伝子下流に存在するorfであるhilBを増幅するために、以下のプライマー（配列番号１０及び１１）を合成した。
【０３０６】
【表１４】
2009131254.tif 000017
【０３０７】
作製したプライマーを用いて、B.thuringiensis israelensis ATCC35646株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲ反応は、PCR Thermal PERSONEL（TaKaRa社製）を用いて行い、以下の条件で３０サイクル行った。
98℃  10秒
52℃  15秒
72℃  １分
【０３０８】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約750ｂｐの断片の増幅が認められた。該ＤＮＡ断片を回収し、制限酵素NdeIおよびXhoIで処理した後に、同じ制限酵素で処理した発現ベクターｐＥＴ21ｂ（Novagene, USA）にクローニングしたプラスミドpETHILDHを構築した。
【０３０９】
［実施例５］  E. coliでのhildh遺伝子の発現とAMKPからのＨＩＬ生産
（１）  E. coliでのhildh遺伝子の発現
実施例４で構築したB.thuringiensis israelensis ATCC35646株由来hildh発現プラスミドpETHILDHをE.coli Rosetta2 (DE3)に導入し、形質転換体を５０μg/ｍｌアンピシリンを
含むＬＢ培地で一昼夜３７℃で振盪させた（前培養）。前培養液を５０ｍｌのＬＢ培地に１％シードし、３７℃にて本培養を行った。培養開始約２時間後に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、１
ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７．６)に懸濁し、ソニケーター（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ  ２０１Ｍ・ＫＵＢＯＴＡ製）を用いて菌体を破砕した。破砕液を15000 rpmで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
【０３１０】
（２）粗酵素液を用いたIleからのＨＩＬ生産
（１）で調製した粗酵素液を用いて、AMKPからのＨＩＬへの変換活性およびHILからＡＭＫＰへの変換活性を測定した。反応液組成は以下に示す通りで、28℃で振とう（300 rpm）させながら3時間反応後、ＨＰＬＣにて生成したＨＩＬあるいはＡＭＫＰを定量した。定量結果を下記に示す。
【０３１１】
【表１５】
2009131254.tif 000018
【０３１２】
【表１６】
2009131254.tif 000019
【０３１３】
その結果、pETHILDHを導入したE. coliの粗抽出液を用いた場合に、NAD(H)依存的かつ可逆的なＡＭＫＰからＨＩＬへの変換活性が認められ、目的とするhildh遺伝子であることが確認された。
【０３１４】
［実施例６］  Bacillus thuringiensis israelensis ATCC 35646、B. thuringiensis 2-e-2、B. thuringiensis AKU238、B. cereus ATCC14579及びB. weihenstephanensis KBAB4由来AMKP reductase(ar)遺伝子のクローニング
(1) 染色体ＤＮＡの調製
B. thuringiensis israelensis ATCC 35646株、B. thuringiensis 2-e-2株(FERM BP-10688)、B. thuringiensis AKU238株、B. cereus ATCC14579株及びB. weihenstephanensis KBAB4株をそれぞれ５ ｍｌのＬＢ培地を用いて２８ ℃で一晩培養した（前培養）。この培養液１．５ ｍｌを種菌として、５０ ｍｌのＬＢ培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液５０ ｍｌを遠心分離操作（12000 ×ｇ、４ ℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
【０３１５】
(2) B. thuringiensis 2-e-2株及びB. thuringiensis AKU238株由来ar遺伝子の配列決定
B. thuringiensis 2-e-2株及びB. thuringiensis AKU238株のar遺伝子は新規に配列決定を行なった。B. thuringiensis israelensis ATCC 35646について公開されているゲノム配列情報より(GenBank accession No. AAJM01000012)、ar遺伝子の上流及び下流の非コーディング領域を取得し、以下のプライマーを合成した。
GGAACAGAATGTAGTACGGAGGCTTTTCGT (配列番号２２)
GGACAGGTGCTTTTCCTCAAAAACACTCAA (配列番号２３)
【０３１６】
作製したプライマーを用いて、B. thuringiensis 2-e-2株及びB. thuringiensis AKU238株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲ反応は、PrimeSTAR（TaKaRa社製）を用いて行い、98 ℃ 10秒、52 ℃ 15秒及び72 ℃ １分の条件で３０サイクル行った。
【０３１７】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約750 ｂｐの断片の増幅が認められた。このＰＣＲ産物をＤＮＡシーケンサーCEQ8000（Beckman Coulter社製）を用いて塩基配列解読を行い、B. thuringiensis 2-e-2株及びB. thuringiensis AKU238株のar遺伝子のコーディング配列を決定した（塩基配列及びコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１４及び１５並びに１６及び１７に示す）。
【０３１８】
(3) ＰＣＲによるar遺伝子の取得
B. thuringiensis israelensis ATCC 35646について公開されているゲノム配列情報をもとに (GenBank accession No. AAJM01000012)、以下のプライマーを合成した。
CATATGAGAGAGAATAAAATAATTATGATTTCT (配列番号２４)
CTCGAGCTACAAGTTTTTCCCAGCAGTCCAA (配列番号２５)
【０３１９】
作製したプライマーを用いて、B. thuringiensis israelensis ATCC 35646株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲ反応は、PrimeSTAR（TaKaRa社製）を用いて行い、98 ℃ 10秒、52 ℃ 15秒及び72 ℃ １分の条件で３０サイクル行った。
【０３２０】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約750 ｂｐの断片の増幅が認められた。該ＤＮＡ断片を回収し、制限酵素NdeI及びXhoIで処理した後に、同じ制限酵素で処理した発現ベクターｐＥＴ21ｂ（Novagene）にクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、取得したＤＮＡ断片の相同性から、ar相同遺伝子が取得されたことが確認された（塩基配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号１２及び１３に示す）。
【０３２１】
B. thuringiensis 2-e-2株については、(2)で得られたB. thuringiensis 2-e-2株のar遺伝子配列をもとに、以下のプライマーを合成した。上記と同様にＰＣＲにてar遺伝子をクローニングした（塩基配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号１４及び１５に示す）。塩基配列レベルでの相同性はB. thuringiensis israelensis ATCC35646株由来のar遺伝子と比較して98 %であった。
CATATGAGAGAGAATAAAATAATTATGATTTCT (配列番号２６)
CTCGAGCTACAAGTTTTTCCCAGCAGTCCAA (配列番号２７)
【０３２２】
B. thuringiensis AKU238株については、(2)で得られたB. thuringiensis AKU238株のar遺伝子配列をもとに、以下のプライマーを合成した。上記と同様にＰＣＲにてar遺伝子をクローニングした（塩基配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号１６及び１７に示す）。塩基配列レベルでの相同性はB. thuringiensis israelensis ATCC35646株由来のar遺伝子と比較して97 %であった。
CATATGAGAGAGAATAAAATAATTATGATTTCT (配列番号２８)
CTCGAGTTATAATTTTTTCCCAGCAGTCCAA (配列番号２９)
【０３２３】
B. cereus ATCC14579株については、B. cereus ATCC14579株について公開されているゲノム配列情報 (GenBank accession No. AE016877)をもとに、以下のプライマーを合成した。上記と同様にＰＣＲにてar遺伝子をクローニングした（塩基配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号１８及び１９に示す）。塩基配列レベルでの相同性はB. thuringiensis israelensis ATCC35646株由来のar遺伝子と比較して97 %であった。
CATATGAGAGAGAATAAAATAATTATGATTTCT (配列番号３０)
CTCGAGTTATAAATTTTTCCCAGCAGTCCAA (配列番号３１)
【０３２４】
B. weihenstephanensis KBAB4株については、B. weihenstephanensis KBAB4株について公開されているゲノム配列情報 (GenBank accession No. NZ_AAOY01000001)をもとに、以下のプライマーを合成した。上記と同様にＰＣＲにてar遺伝子をクローニングした（塩基配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号２０及び２１に示す）。塩基配列レベルでの相同性はB. thuringiensis israelensis ATCC35646株由来のar遺伝子と比較して80 %であった。
CATATGATAAAAAATAAGACTATTATGATCTCA (配列番号３２)
CTCGAGTTATAAATTCTTCCCAGCTGTCCAA (配列番号３３)
【０３２５】
［実施例７］  Escherichia coliでのar遺伝子の発現とＡＭＫＰからのＨＩＬ生産及びＨＩＬからのＡＭＫＰ生産
（１）  E. coliでのar遺伝子の発現
実施例８で構築したB. thuringiensis israelensis ATCC 35646、B. thuringiensis 2-e-2、B. thuringiensis AKU238株、B. cereus ATCC14579株及びB. weihenstephanensis KBAB4由来ar発現プラスミドをE.coli Rosetta2 (DE3)に導入し、形質転換体を５０ μg/ｍｌ アンピシリンを含むＬＢ培地で一昼夜３７ ℃で振盪培養した（前培養）。前培養液を５０ ｍｌのＬＢ培地に１ ％シードし、３７ ℃にて本培養を行った。培養開始約２時間後に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、１ ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ ７．６)に懸濁し、ソニケーター（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ  ２０１Ｍ・ＫＵＢＯＴＡ製）を用いて菌体を破砕した。破砕液を15000 rpmで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
【０３２６】
（２）粗酵素液を用いたＡＭＫＰからのＨＩＬ生産ならびにＨＩＬからのＡＭＫＰ生産
（１）で調製した粗酵素液を用いて、ＡＭＫＰからのＨＩＬへの変換活性ならびにＨＩＬからのＡＭＫＰへの変換活性を測定した。反応液組成は表１７に示す通りで、28 ℃で振とう（300 rpm）させながら3時間反応後、ＨＰＬＣにて生成したＨＩＬを定量した。定量結果を表１８に示す。
【０３２７】
【表１７】
2009131254.tif 000020
【０３２８】
【表１８】
2009131254.tif 000021
【０３２９】
その結果、B. thuringiensis israelensis ATCC 35646、B. thuringiensis 2-e-2、B. thuringiensis AKU238、B. cereus ATCC14579及びB. weihenstephanensis KBAB4由来ar発現株を用いた場合も、明らかにＡＭＫＰからのＨＩＬの生成およびＨＩＬからのＡＭＫＰ
の生成が認められ、これらの遺伝子がHIL生産およびＡＭＫＰ生産に使用できることが確認された。
【０３３０】
［実施例８］AMKP還元酵素の精製
以下の方法に従って、オウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）NBRC 4466株より2‐アミノ‐3‐メチル‐4‐ケトペンタン酸（AMKP）を還元して 4‐ヒドロキシイソロイシン（HIL）を生成する活性を有するAMKP還元酵素を電気泳動的に単一に精製した。
【０３３１】
精製の際、活性測定は参考例1の表３２に示す反応溶液で30 ℃、3〜15時間振とうしAMKP還元反応を行い、TLC分析によりHILの生成を確認している。
【０３３２】
(a)培養
培地（グルコース  5 ％、ペプトン  0.5 ％、酵母エキス  0.2 ％、リン酸水素二カリウム  0.4 ％、リン酸二水素カリウム  0.2 ％、硫酸マグネシウム・７水和物  0.02 ％、pH 5.8）4,000 mlを調製し、2 L容坂口フラスコに500 mlずつ分注して、121 ℃で20分間蒸気殺菌を行った。予め同培地中で前培養しておいたオウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）NBRC 4466株の培養液を3 mlずつ接種し、28℃で3日間振とう培養した。この培養液から吸引ろ過により菌体を集め、0.85 ％NaCl aqにて2回洗浄を行った。このようにして得られた湿菌体83 gは、使用直前まで−20 ℃で凍結保存した。
【０３３３】
(b)無細胞抽出液の調製
湿菌体83 gを室温で融解し、200 mlの0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）に懸濁した後、菌体をDYNO-MILL（ウィリー・エ・バツコーフェン社製）で破砕した。この菌体破砕物から遠心分離（10,000 ×g、30分間、4 ℃）にて菌体残渣を取り除き、無細胞抽出液283 mlを得た。これを一晩、10 Lの0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で透析を行った。
【０３３４】
(c)硫安分画
無細胞抽出液に60 ％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、これを溶解させ、次いで生じた沈殿を遠心分離（10,000 ×g、30分間、4 ℃）により除去し、60 ％飽和溶液を得た。この溶液に100 ％飽和となるようにさらに硫酸アンモニウムを添加、溶解し、遠心分離（10,000 ×g、30分間、4 ℃）により塩析物を集めた。得られた塩析物を20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）に溶解した。これを一晩、10 Lの0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で透析を行い、52 mlの粗酵素液を得た。
【０３３５】
(d)陰イオン交換クロマトグラフィー
得られた粗酵素液を0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で予め平衡化したDEAE-sephacel（GE ヘルスケア製）ゲル38 mlを詰めたカラムに添加し、同緩衝液で洗浄し、次いで塩化ナトリウム（0 Mから1 M）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０３３６】
(e)青色色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー
得られた活性画分を一晩、10 Lの0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で透析を行い、58 mlの粗酵素液を得た。これを、同緩衝液で平衡化したBlue-  sepharose（GE ヘルスケア製）ゲル20 mlを詰めたカラムに添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（0 Mから1 Mまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０３３７】
(f)陰イオン交換クロマトグラフィー
得られた活性画分（95 ml）を集め、限外ろ過による脱塩濃縮を行い、予め0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で平衡化したMono Q HR 10/10（GE ヘルスケア製）カラム8 mlに添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（0 Mから0.5 Mまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０３３８】
(g)青色色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー
得られた活性画分を集め、限外ろ過による脱塩濃縮を行い、予め0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で平衡化したBlue-sepharose（GE ヘルスケア製）カラム2 mlに添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（0 Mから0.5 Mまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０３３９】
(h)陰イオン交換クロマトグラフィー
得られた活性画分を集め、限外ろ過による脱塩濃縮を行い、予め0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で平衡化し、SMARTシステム（GE ヘルスケア製）に装着した Mono Q PC 1.6/5 （GE ヘルスケア製）カラム0.1mlに添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（0 Mから0.5 Mまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０３４０】
(i)ゲルろ過クロマトグラフィー
得られた活性画分を集め、限外ろ過による脱塩濃縮を行い、予め0.1 mM DTT及び0.2 M 塩化ナトリウムを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で平衡化したSuperdex
200 HR 10/30（GE ヘルスケア製）カラム24 mlに添加した。同緩衝液で活性画分を溶出させた。
各活性画分をSDS-PAGEにより解析した結果、単一バンドであることが確認できた。これらを精製酵素標品として得た。
【０３４１】
［実施例９］AMKP還元酵素の性質の測定
実施例８において得られた精製酵素標品の酵素学的性質について検討した。
酵素活性の測定は、基本的には、50 mMトリス-塩酸緩衝液（pH 8.0）中に、基質AMKP 30 mM、補酵素NADPH  2.3 mM、および酵素溶液40 μlを含む400 μlの反応液を35 ℃で反応させ、波長340 nmの吸光度の減少を測定することにより行った。１分間に1マイクロモルのNADPHをNADP+ に変換させる酵素量を１単位（U）とした。結果は以下の通りであった。
【０３４２】
(1)作用：NADPHを補酵素として、AMKPに作用し、HILを生成した。
(2)補酵素：NADPH依存性であり、NADHは補酵素として利用しない。また、NA  DPを補酵素とするHILの酸化反応も触媒する。
(3)作用至適pH：50 mMトリス-塩酸緩衝液を用いてpHを変化させて、AMKP還  元活性を測定した。反応の至適pHは8.0-8.5であった。またpH 6.0からpH 9.2  で最大活性の60 ％の活性を維持した。
(4)作用至適温度：標準反応条件のうち、温度だけを変化させて、AMKP還元活  性を測定した。反応の至適温度は45 ℃付近にあった。
(5)分子量：精製酵素のサブユニットの分子量をSDS-PAGEにより求めた結果、  約36,000 Daであった。
【０３４３】
［実施例１０］AMKP還元酵素の部分アミノ酸配列の解析
実施例８で得られた精製AMKP還元酵素を８ M尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬製）で消化し、得られた消化物をSmartシステム（アマシャムバイオサイエンス製）によって分離した。分取したペプチドピーク
9種をK14、K16、K19、K21、K24、K30、K31、K33、K35、K36、K41とし、それぞれプロテインシーケンサー（Applied Biosystems製、model 476A）によりアミノ酸配列の解析を行った。K14、K16、K19、K21、K24、K30、K31、K33、K35、K36及びK41のアミノ酸配列を表１に示す。配列類似性検索プログラムBLASTおよびFASTAを用いることにより、これらのアミノ酸配列を3種類のタンパク質配列データベース（PTR、PRF、およびSWISS-PROT）内の配列と比較した結果、K21,K24,K30,K31,K35及びK36配列はそれぞれ、SDRファミリーに属するクロストリジジウム  ボルテアエ（Clostridium bolteae）の3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] reductase（GeneID: 160937957)(K21)、ピレノフォラ  トリチシ-レペンチス（Pyrenophora tritici-repentis）の3-ketoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase  （GeneID: 189205264）(K24、K35)、ニューロスポラ  クラッサ（Neurospora crassa）の3-ketoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase (GeneID: 3876592)(K30)、ロドバクテラルス  バクテリウム  （Rhodobacterales bacterium）のD-beta-hydroxybutyrate dehydrogenase  (GeneID: 84686397)(K31)、アスペルギルス  テレウス（Aspergillus terreus）の3-ketoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase  (GeneID: 4316619)(K36）の部分アミノ酸配列と類似していた。しかし、K14、K16、K19、K33およびK41には、データベース上のタンパク質との類似性は認められなかった。
【０３４４】
【表１９】
2009131254.tif 000022
【０３４５】
［実施例１１］AMKP還元酵素遺伝子のクローニング
オウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）NBRC 4466株を実施例８で示した培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体DNAの抽出ならびに精製は、一般的な方法により行った。
【０３４６】
(a) AMKP還元酵素遺伝子部分断片のクローニング
AMKP還元酵素の内部ペプチド断片K21およびK24のアミノ酸配列を基に、表２０に示すPCR用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。AR1は上流のプライマーとして、AR2は下流のプライマーとして作成した。
【０３４７】
【表２０】
2009131254.tif 000023
【０３４８】
PCRの反応液組成と反応条件は、表２１および表２２に示す。まず、染色体DNA 10 ngを鋳型にし、プライマーAR1及びAR2を用いてPCRを行ったところ、約650 bpの特異的な増幅産物を得た。PCR反応液をアガロース電気泳動を行い、目的のバンド部分を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）によって精製した。得られたDNA断片をQIAGEN PCR Cloning Kit （QIAGEN製）を用いて、pDriveベクターに結合させ、大腸菌JM109株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン100 μg/mlを含むLB培地（ペプトン 1 %、酵母エキス 0.5 %、塩化ナトリウム 1 %、pH 7.0）で培養し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN製）を用いてDNAシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。続いて、pDriveベクターに由来するM13 forwardプライマーおよびM13 reverseを用いて自動シークエンサーによって、挿入断片の塩基配列を決定した。配列解析の結果から、PCR産物が640 bp（表２３）のヌクレオチドからなり、推定アミノ酸配列が天然のAMKP還元酵素の内部アミノ酸配列と一致することが明らかになった。また、K35ペプチドをコードする領域は、1つのイントロンにより分断されることも判明した。
【０３４９】
【表２１】
2009131254.tif 000024
【０３５０】
【表２２】
2009131254.tif 000025
【０３５１】
【表２３】
2009131254.tif 000026
【０３５２】
(b)Inverse法によるAMKP還元酵素をコードする遺伝子の5'及び3'末端の塩基配列解析
オウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）NBRC 4466株のDNAを制限酵素MseIを用いて表２５に示す組成で65 ℃で一晩処理し、一度QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN製)で精製した後、等量のSolution I（タカラバイオ製）と混合し、16℃で一晩インキュベートすることで環状にした。
【０３５３】
(a)で得られたAMKP還元酵素の内部配列情報を基に、表２４に示すPCR用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。AR-inv3は上流のプライマーとして、ＡR-inv4は下流のプライマーとして外向きに作成した。
【０３５４】
【表２４】
2009131254.tif 000027
【０３５５】
PCRの反応液組成と反応条件は、表２６および表２７に示す。まず、環状にしたDNAを鋳型にし、プライマーAR-inv3及びAR-inv4を用いてPCRを行ったところ、約1500 bpの特異的な増幅産物を得た。PCR反応液をアガロース電気泳動を行い、目的のバンド部分を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）によって精製した。得られたDNA断片をQIAGEN PCR Cloning Kit （QIAGEN製）を用いて、pDriveベクターに結合させ、大腸菌JM 109株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン100 μg/mlを含むLB培地（ペプトン 1 %、酵母エキス 0.5 %、塩化ナトリウム 1 %、pH 7.0）で培養し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN製）を用いてDNAシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。続いて、pDriveベクターに由来するM13 forwardプライマーおよびM13 reverseプライマーを用いて自動DNAシークエンサーCEQ8000（Beckman Coulter製）によって、挿入断片の塩基配列を決定した。配列解析の結果から、遺伝子全長のDNA配列（表２８）が決定し、遺伝子コード領域の5'及び3'末端の塩基配列を決定した。
【０３５６】
【表２５】
2009131254.tif 000028
【０３５７】
【表２６】
2009131254.tif 000029
【０３５８】
【表２７】
2009131254.tif 000030
【０３５９】
【表２８】
2009131254.tif 000031
【０３６０】
［実施例１２］AMKP還元酵素のcDNAクローニング
オウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）NBRC 4466株のAMKP還元酵素をコードするゲノム領域には、イントロンが複数存在することが示唆された。AMKP還元酵素のコード領域を明らかにするために以下に示す方法によりAMKP還元酵素のcDNAをクローニングした。
【０３６１】
(a)AMKP還元酵素生産菌オウレオバシディウム・プルランス（Aureobas  idium pullulans）NBRC 4466株からのmRNAの抽出
オウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）NBRC 4466株を実施例８で示した培地で培養し、得られた菌体は使用直前まで−20 ℃で凍結保存し、以下の手順でtotal RNAを調製した。液体窒素で凍結した菌体を乳鉢で3回破砕し、 約0.1 gの菌体を回収し、IsoGENE(ニッポン ジーン製)を１ ml加えて撹拌し室温で5分静置した。次に、200 μlのクロロホルムを加えて撹拌後、遠心分離（16,500 ×g、15分間、4 ℃）した。上層の水層を分取して再度500μlのクロロホルムを加えて撹拌後、遠心分離（16,500 ×g、5分間、4 ℃）した。上層の水層を分取して等量のイソプロパノールを加え、室温で20分静置した。遠心分離（16,500 ×g、20分間、4 ℃）した後、上清を除いて200 μlの70 %エタノールを加えて再度遠心分離（16,500 ×g、5分間、4 ℃）した。沈殿物を風乾してエタノールを完全に除去した後、100 μlのRNase−free水を加え、4 ℃で１時間静置し、total-RNAを溶解した。
【０３６２】
(b)AMKP還元酵素をコードするcDNAのクローニング
inverse法により得られた塩基配列を基に、開始コドンあるいは終止コドンを含む表２９に示すプライマーAR-forward-BamHIおよびAR-reverse-HindIIIを設計した。total−RNAを鋳型としてFirst-strand cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ製）を用いて1本鎖cDNAを
合成し、これを鋳型としてPCRを行った。約900 bpの特異的な増幅産物が得られたので、この断片をBamHIおよびHindIIIで二重消化し、プラスミドpQE-80LのT5プロモーターの下流に位置するBamHI−HindIII部位に挿入することにより、組換えプラスミドpQARAPを得た。プラスミドpQE-80L上の配列をプライマーにして挿入断片の塩基配列を決定した。得られたAMKP還元酵素をコードするcDNAの配列を表３０に、当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を表３１に示す。実施例１０で得られたペプチドシーケンスと比較した結果、天然のAMKP還元酵素の内部アミノ酸配列は、11個すべて塩基配列から推定されるアミノ酸配列中に存在し、完全に一致した。
【０３６３】
【表２９】
2009131254.tif 000032
【０３６４】
【表３０】
2009131254.tif 000033
【０３６５】
【表３１】
2009131254.tif 000034
【０３６６】
（参考例１：AMKP還元酵素遺伝子を発現する組換え大腸菌のAMKP還元活性）
実施例１２で作成したAMKP還元酵素遺伝子をpQE-80LのBamHI-HindIII部位に挿入したpQARAPを用いて、大腸菌JM109株を形質転換した。
【０３６７】
得た組換え大腸菌を100 μg/mlのアンピシリンとラクトース系プロモーターの発現誘導試薬である1 mM IPTGを添加した4 mlのLB培地（ペプトン 1 %、酵母エキス 0.5 %、塩化ナトリウム 1 %、pH 7.2）、30 ℃で培養した。
【０３６８】
培養液から遠心分離（10,000 ×g、10分間、4℃）により菌体を集め、表３２の反応溶液を添加して、35℃で3時間振とうしAMKP還元反応を行った。その反応液の遠心分離後の上清をHPLCにより分析し、1.5 mMのHILの生成が確認できた。
【０３６９】
また、表３３の反応液を用いて、35 ℃で3時間振とうHIL酸化反応を行った。その反応液の遠心分離後の上清をHPLCにより分析し、0.76 mMのAMKPの生成が確認できた。
【０３７０】
両反応においての結果を表３４に示した。
【０３７１】
【表３２】
2009131254.tif 000035
【０３７２】
【表３３】
2009131254.tif 000036
【０３７３】
【表３４】
2009131254.tif 000037
【０３７４】
［実施例１３］AMKP還元酵素の精製
以下の方法に従って、ロドトルラ・マリナ（Rhodotolura marina）NBRC 0879株より2‐アミノ‐3‐メチル‐4‐ケトペンタン酸（AMKP）を還元して 4‐ヒドロキシイソロイシン（HIL）を生成する活性を有するAMKP還元酵素を電気泳動的に単一に精製した。
精製の際、活性測定は表３５で示す反応溶液で30℃、3〜15時間振とうし、AMKP還元反応を行い、TLC分析によりHILの生成を確認している。
【０３７５】
(a)培養
培地（グルコース  5 ％、ペプトン  1 ％、酵母エキス  0.4 ％、リン酸水素二カリウム  0.4 ％、リン酸二水素カリウム  0.2 ％、硫酸マグネシウム・７水和物  0.02 ％、pH 5.8）6,000 mlを調製し、2 L容坂口フラスコに500mlずつ分注して、121℃で20分間蒸気殺菌を行った。予め同培地中で前培養しておいたロドトルラ  マリナ（Rhodotolura marina）NBRC 0879株の培養液を3 mlずつ接種し、28℃で2日間振とう培養した。この培養液から遠心分離（5,000×g、20分間、4℃）により菌体を集め、0.85 ％NaCl aqにて洗浄を行った。このようにして得られた湿菌体150gは、使用直前まで−20℃で凍結保存した。
【０３７６】
(b)無細胞抽出液の調製
湿菌体150gを室温で融解し、200 mlの0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）に懸濁した後、菌体をDYNO-MILL（ウィリー・エ・バツコーフェン社製）で破砕した。この菌体破砕物から遠心分離（10,000 ×g、30分間、4℃）にて菌体残渣を取り除き、無細胞抽出液270 mlを得た。これを一晩、8 Lの0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で透析を行った。
【０３７７】
(c)硫安分画1
無細胞抽出液に45 ％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、これを溶解させ、次いで生じた沈殿を遠心分離（10,000 ×g、30分間、4℃）により塩析物として集めた。得られた塩析物を20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）に溶解した。これを一晩、8 Lの0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で透析を行い、その後、遠心分離（10,000×g、30分間、4℃）し、155 mlの粗酵素液を得た。
【０３７８】
(d)硫安分画2
粗酵素液155 mlに30 ％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、これを溶解させ、次いで生じた沈殿を遠心分離（10,000 ×g、30分間、4℃）により除去し、30 ％飽和溶液を得た。この溶液に50 ％飽和となるようにさらに硫酸アンモニウムを添加、溶解し、遠心分離（10,000 ×g、30分間、4℃）により塩析物を集めた。得られた塩析物を20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）に溶解した。これを一晩、8 Lの0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で透析を行い、その後、遠心分離（10,000×g、30分間、4℃）し、粗酵素液を得た。
【０３７９】
(e)陰イオン交換クロマトグラフィー
得られた粗酵素液を0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で予
め平衡化したDEAE-sephacel（GE Healthcare製）ゲル80 mlを詰めたカラムに添加し、同緩衝液で洗浄し、次いで塩化ナトリウム（0 Mから1 M）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０３８０】
(f)青色色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー
得られた活性画分を0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で限外ろ過によるバッファー置換を行った。これを、同緩衝液で平衡化したBlue-sepharose（GE Healthcare製）ゲル25 mlを詰めたカラムに添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、1 M塩化ナトリウムの入った緩衝液により、活性画分を溶出させた。
【０３８１】
(g)陰イオン交換クロマトグラフィー
得られた活性画分を集め、限外ろ過による脱塩濃縮を行い、予め0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で平衡化したMono Q HR 10/10（GE Healthcare製）カラム8 mlに添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（0 Mから0.5
Mまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０３８２】
(h)陰イオン交換クロマトグラフィー
得られた活性画分（10 ml）を集め、限外ろ過による脱塩濃縮を行い75 mMトリス‐酢酸緩衝液（pH 9.3）に置換した。予め0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.3）で平衡化したMono Q HR 10/10（GE Healthcare製）カラム8 mlに添加した。10 ％
polybuffer96(pH 6.0) で活性画分を溶出した。
【０３８３】
(i)青色色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー
得られた活性画分を集め、限外ろ過による脱塩濃縮を行い、予め0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で平衡化したBlue-sepharose（GE Healthcare製）カラム2 mlに添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（0 Mから0.5 Mまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０３８４】
(j)陰イオン交換クロマトグラフィー
得られた活性画分(2ml)を集め、限外ろ過による脱塩濃縮を行い、予め0.1 mM DTTを溶解させた20 mMトリス‐塩酸緩衝液（pH 9.0）で平衡化したSmart システム（GE Healthcare製）に装着したMono Q PC 1.6/5（GE Healthcare製）カラム0.1mlに添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（0 Mから0.3 Mまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【０３８５】
各活性画分をSDS-PAGEにより解析した結果、1画分において単一バンドであることが確認できた。これを精製酵素標品として得た。
【０３８６】
【表３５】
2009131254.tif 000038
【０３８７】
［実施例１４］AMKP還元酵素の部分アミノ酸配列の解析
実施例１３で得られた精製AMKP還元酵素を８M尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬製）で消化し、得られた消化物をSmar
tシステム（GE Healthcare製）によって分離した。分取したペプチドピーク4種をK21、K34、K36、K42とし、それぞれプロテインシーケンサー（Applied Biosystems製、model 476A）によりアミノ酸配列の解析を行った。K21、K34、K36及びK42のアミノ酸配列を表３６に示す。
【０３８８】
【表３６】
2009131254.tif 000039
【０３８９】
［実施例１５］AMKP還元酵素遺伝子のクローニング
ロドトルラ・マリナ（Rhodotolura marina）NBRC 0879株を実施例１３で示した培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体DNAの抽出ならびに精製は、一般的な方法により行った。
【０３９０】
(a) AMKP還元酵素部分断片のクローニング
AMKP還元酵素の内部ペプチド断片K34およびK36のアミノ酸配列を基に、表３７に示すPCR用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。AR1は上流のプライマーとして、AR2は下流のプライマーとして作成した。
【０３９１】
【表３７】
2009131254.tif 000040
【０３９２】
PCRの反応液組成と反応条件は、表３８および表３９に示す。まず、染色体DNA 160ngを鋳型にし、プライマーAR1及びAR2を用いてPCRを行ったところ、約250bpの特異的な増幅産物を得た。PCR反応液をアガロース電気泳動を行い、目的のバンド部分を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）によって精製した。得られたDNA断片をQIAGEN PCR Cloning Kit （QIAGEN製）を用いて、pDriveベクターに結合させ、大腸菌JM 109株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン100μg/mlを含むLB培地（ペプトン 1 %、酵母エキス 0.5 %、塩化ナトリウム 1 %、pH 7.0）で培養し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN製）を用いてDNAシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。続いて、pDriveベクターに由来するM13 forwardプライマーおよびM13 reverseプライマーを用いて自動DNAシークエンサーCEQ8000（Beckman Coulter製）によって、挿入断片の塩基配列を決定した。配列解析の結果から、PCR産物が246 bp（表４０）のヌクレオチドからなることが判明した。
【０３９３】
【表３８】
2009131254.tif 000041
【０３９４】
【表３９】
2009131254.tif 000042
【０３９５】
【表４０】
2009131254.tif 000043
【０３９６】
(b) Inverse法によるAMKP還元酵素をコードする遺伝子の5'及び3'末端の塩基配列解析1
ロドトルラ・マリナ（Rhodotolura marina）NBRC 0879株のDNAを制限酵素MseIを用いて表４２に示す組成で65℃で一晩処理し、一度QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN製)で精製した後、等量のSolution I（タカラバイオ製）と混合し、16℃で一晩インキュベートすることで環状にした。
【０３９７】
(a)で得られたAMKP還元酵素の内部配列情報を基に、表４１に示すPCR用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。AR-inv3は上流のプライマーとして、ＡR-inv4は下流のプライマーとして外向きに作成した。
【０３９８】
【表４１】
2009131254.tif 000044
【０３９９】
PCRの反応液組成と反応条件は、表４３および表４４に示す。まず、環状にしたDNAを鋳型にし、プライマーAR-inv3及びAR-inv4を用いてPCRを行ったところ、約2000bpの特異的な増幅産物を得た。PCR反応液をアガロース電気泳動を行い、目的のバンド部分を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）によって精製した。得られたDNA断片をQIAGEN PCR Cloning Kit （QIAGEN製）を用いて、pDriveベクターに結合させ、大腸菌JM 109株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン100μg/mlを含むLB培地（ペプトン 1%、酵母エキス 0.5%、塩化ナトリウム 1%、pH7.0）で培養し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN製）を用いてDNAシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。続いて、pDriveベクターに由来するM13 forwardプライマーおよびM13 reverseプライマーを用いて自動シークエンサーによって、挿入断片の塩基配列を決定した。配列解析の結果から、遺伝子全長のDNA配列（表４９）が決定し、遺伝子コード領域の5'及び3'末端の塩基配列を決定した。
【０４００】
【表４２】
2009131254.tif 000045
【０４０１】
【表４３】
2009131254.tif 000046
【０４０２】
【表４４】
2009131254.tif 000047
【０４０３】
(c) Inverse法によるAMKP還元酵素をコードする遺伝子の5'及び3'末端の塩基配列解析2
ロドトルラ・マリナ（Rhodotolura marina）NBRC 0879株のDNAを制限酵素MspIを用いて表４６に示す組成で37℃で一晩処理し、一度QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN製)で精製した後、等量のSolution I（タカラバイオ製）と混合し、16℃で一晩インキュベー
トすることで環状にした。
【０４０４】
(a)で得られたAMKP還元酵素の内部配列情報を基に、表４５に示すPCR用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。AR-inv5は上流のプライマーとして、ＡR-inv6は下流のプライマーとして外向きに作成した。
【０４０５】
【表４５】
2009131254.tif 000048
【０４０６】
PCRの反応液組成と反応条件は、表４７および表４８に示す。まず、環状にしたDNAを鋳型にし、プライマーARinv5及びARinv6を用いてPCRを行ったところ、約800bpの特異的な増幅産物を得た。PCR反応液をアガロース電気泳動を行い、目的のバンド部分を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）によって精製した。得られたDNA断片をQIAGEN PCR Cloning Kit （QIAGEN製）を用いて、pDriveベクターに結合させ、大腸菌JM109株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン100 μg/mlを含むLB培地（ペプトン 1 %、酵母エキス 0.5 %、塩化ナトリウム 1 %、pH 7.0）で培養し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN製）を用いてDNAシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。続いて、pDriveベクターに由来するM13 forwardプライマーおよびM13 reverseプライマーを用いて自動シークエンサーによって、挿入断片の塩基配列を決定した。
【０４０７】
(b)及び(c)で得られた配列解析の結果から、遺伝子全長のDNA配列（表４９）が決定し、遺伝子コード領域の5'及び3'末端の塩基配列を決定した。
【０４０８】
【表４６】
2009131254.tif 000049
【０４０９】
【表４７】
2009131254.tif 000050
【０４１０】
【表４８】
2009131254.tif 000051
【０４１１】
【表４９】
2009131254.tif 000052
【０４１２】
［実施例１６］AMKP還元酵素のcDNAクローニング
ロドトルラ・マリナ（Rhodotolura marina）NBRC 0879株のAMKP還元酵素をコードするゲノム領域には、イントロンが複数存在することが示唆された。AMKP還元酵素のコード領域を明らかにするために以下に示す方法によりAMKP還元酵素のcDNAをクローニングした。
【０４１３】
(a)AMKP還元酵素生産菌ロドトルラ・マリナ（Rhodotolura marina）NBRC 0879株からのmR
NAの抽出
ロドトルラ・マリナ（Rhodotolura marina）NBRC 0879株を実施例１３で示した培地で培養し、得られた菌体は使用直前まで−20℃で凍結保存し、以下の手順でtotal RNAを調製した。液体窒素で凍結した菌体をビードスマッシャー(トミー製)で破砕し、 約0.1gの菌体を回収し、IsoGENE(ニッポン ジーン製)を１ml加えて撹拌し室温で5分静置した。次に、200 μlのクロロホルムを加えて撹拌後、遠心分離（16,500× g、15分間、4℃）した。上層の水層を分取して再度500μlのクロロホルムを加えて撹拌後、遠心分離（16,500×g、5分間、4℃）した。上層の水層を分取して等量のイソプロパノールを加え、室温で20分静置した。遠心分離（16,500×g、20分間、4℃）した後、上清を除いて200 μlの70 %エタノールを加えて再度遠心分離（16,500 ×g、5分間、4℃）した。沈殿物を風乾してエタノールを完全に除去した後、100 μlのRNase−free水を加え、4 ℃で１時間静置し、total-RNAを溶解した。
【０４１４】
(b)AMKP還元酵素をコードするcDNAのクローニング
inverse法により得られた塩基配列を基に、開始コドンあるいは終止コドンを含む表５０に示すプライマーAR-forward-SphIおよびAR-reverse-PstIを設計した。total−RNAを鋳型としてFirst-strand cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ製）を用いて1本鎖cDNAを合成し、これを鋳型としてPCRを行った。約850 bpの特異的な増幅産物が得られたので、この断片をSphIおよびPstIで二重消化し、プラスミドpQE-80LのT5プロモーターの下流に位置するSphI−PstI部位に挿入することにより、組換えプラスミドpQARRMを得た。プラスミドpQE-80L上の配列をプライマーにして挿入断片の塩基配列を決定した。得られたAMKP還元酵素をコードするcDNAの配列を表５２に、当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を表５３に示す。実施例１４で得られたペプチドシーケンスと比較した結果、天然のAMKP還元酵素の内部アミノ酸配列は、4個すべて塩基配列から推定されるアミノ酸配列中に存在し、完全に一致した。
【０４１５】
【表５０】
2009131254.tif 000053
【０４１６】
【表５１】
2009131254.tif 000054
【０４１７】
【表５２】
2009131254.tif 000055
【０４１８】
（参考例２：AMKP還元酵素遺伝子を発現する組換え大腸菌のAMKP還元活性）
実施例１６で作成したAMKP還元酵素遺伝子をpQE-80LのSphI−PstI部位に挿入したpQARRMを用いて、大腸菌JM109株を形質転換した。
【０４１９】
得た組換え大腸菌を100μg/mlのアンピシリンを添加した50 mlのLB培地（ペプトン 1%、酵母エキス 0.5 %、塩化ナトリウム 1 %、pH 7.2）、30 ℃でOD=0.7まで培養した。その後、ラクトース系プロモーターの発現誘導試薬である1 mM IPTGを添加し、20 ℃で一晩培養した。培養液から遠心分離（10,000 ×g、20分間、4 ℃）により菌体を集め、生理食塩水で洗浄した。
【０４２０】
回収した菌体を0.1 mMのDTTを加えた20 mMトリス-塩酸緩衝液(pH 7.6)5 mlで懸濁し、超音波破砕を行い、遠心分離（10,000 ×g、30分間、4 ℃）で無細胞抽出液を取得し、これを未精製酵素とした。この酵素液を予め0.1 mMのDTTと0.5 M NaCl及び5 mMイミダゾールを添加した20mMトリス-塩酸緩衝液(pH 7.6)で平衡化したHis Trap 5 ml（GE Healthcare製）に添加した。次いで、同緩衝液で洗浄し、イミダゾール（5 mMから0.5 M）のリニア
グラジエントで活性画分を溶出し、活性画分を精製酵素とした。
【０４２１】
これらの酵素サンプルを用いて活性測定を行った。酵素活性の測定は、表５３の反応液を35 ℃で1800秒間反応させ、波長340 nmの吸光度の減少を測定することにより行った。基質AMKPを添加した反応液では、NADPHが消費され340 nmの吸収が減少しており、組み換え酵素によるAMKPの還元反応活性を確認できた。(図３７)
【０４２２】
【表５３】
2009131254.tif 000056
【０４２３】
［実施例１７］
バチルス・チューリンゲンシスのゲノム解析及びバチルス・チューリンゲンシスからのＩＤＯ−ＨＩＤＨオペロンのクローニング
バチルス・チューリンゲンシスのゲノム解析によって、ＩＤＯ遺伝子（ＲＢＴＨ＿０６８０９）の翻訳が下流の隣接遺伝子ＲＢＴＨ＿０６８１０と翻訳的に共役していることが示された（図３９、Ａ）。通常、このような「同期化」は酵素触媒逐次反応の等モル合成に用いられる。さらに、ＲＢＴＨ＿０６８１０は、３−オキソアシル−［アシル−キャリアタンパク質］還元酵素（デヒドロゲナーゼ）のホモログをコードする。したがって、この遺伝子がＨＩＤＨをコードしていることが示唆された。
【０４２４】
本発明者等の仮説を確認するために、バチルス・チューリンゲンシス２−ｅ−２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６８８）及びバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）由来のＩＤＯ−ＨＩＤＨオペロンをクローニングした。詳しくは、下記の通りに行った。
【０４２５】
［１］バチルス・チューリンゲンシス２−ｅ−２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６８８）及びバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株ＡＴＣＣ３５６４６（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）からのＩＤＯ−ＨＩＤＨ遺伝子のクローニング
ＩＤＯ−ＨＩＤＨ遺伝子を含有し、且つＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ部位に挟まれたＤＮＡ断片が、プライマーＰ１（ＳＶＳ１７０）（配列番号７）及びプライマーＰ２（ＳＶＳ１７１）（配列番号８）、並びに鋳型としてバチルス・チューリンゲンシス２−ｅ−２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６８８）の染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによって得られた。ＰＣＲの条件は以下の通りであった：９５℃で３分間の変性工程；２回の第１のサイクルのプロファイル：９５℃で１分間、５０℃で３０秒間、７２℃で４０秒間；２５回の最後のサイクルのプロファイル：９５℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、７２℃で４０秒間；最終工程：７２℃で５分間。
【０４２６】
１．５ｋｂのＰＣＲ産物が得られ、アガロースゲルで精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで処理した後、予め同じ制限酵素で処理したベクターｐＭＷ１１９に連結させた。このようにして、プラスミドｐＭＷ１１９−ＩＤＯ−ＨＩＤＨ（２−ｅ−２）が得られた。
【０４２７】
ＩＤＯ−ＨＩＤＨ遺伝子を含有し、且つＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ部位に挟まれた別のＤＮＡ断片が、プライマーＰ１（ＳＶＳ１７０）（配列番号７）及びプライマーＰ２（ＳＶ
Ｓ１７１）（配列番号８）、並びに鋳型としてバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株ＡＴＣＣ３５６４６（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）の染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによって得られた。ＰＣＲ条件は上記の通りであった。
【０４２８】
１．５ｋｂのＰＣＲ産物が得られ、アガロースゲルで精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで処理した後、予め同じ制限酵素で処理したベクターｐＭＷ１１９に連結させた。このようにして、プラスミドｐＭＷ１１９−ＩＤＯ−ＨＩＤＨ（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）が得られた。
【０４２９】
大腸菌ＴＧ１株をプラスミドｐＭＷ１１９−ＩＤＯ−ＨＩＤＨ（２−ｅ−２）で形質転換した。このようにして、ＩＤＯ／ＨＩＤＨ産生大腸菌ＴＧ１株［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ−ＨＩＤＨ（２−ｅ−２）］が構築された。
【０４３０】
大腸菌ＴＧ１株をプラスミドｐＭＷ１１９−ＩＤＯ−ＨＩＤＨ（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）で形質転換した。このようにして、ＩＤＯ／ＨＩＤＨ産生大腸菌ＴＧ１株［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ−ＨＩＤＨ（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）］が構築された。
【０４３１】
［２］バチルス・チューリンゲンシス２−ｅ−２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６８８）及びバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株ＡＴＣＣ３５６４６（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）からのＩＤＯ遺伝子のクローニング
ＩＤＯ遺伝子を含有し、且つＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ部位に挟まれたＤＮＡ断片が、プライマーＰ１（ＳＶＳ１７０）（配列番号７）及びプライマーＰ３（ＳＶＳ１６９）（配列番号９）、並びに鋳型としてバチルス・チューリンゲンシス２−ｅ−２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６８８）の染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによって得られた。ＰＣＲの条件は以下の通りであった：９５℃で３分間の変性工程；９４℃で３０秒間の最初のサイクル；９４℃で４０秒間、４９℃で３０秒間、７２℃で４０秒間の４サイクル；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の３５サイクル。０．８ｋｂのＰＣＲ産物が得られ、アガロースゲルで精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで処理した後、予め同じ制限酵素で処理したベクターｐＭＷ１１９に連結させた。このようにして、プラスミドｐＭＷ１１９−ＩＤＯ（２−ｅ−２）が得られた。
【０４３２】
ＩＤＯ遺伝子を含有し、且つＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ部位に挟まれた別のＤＮＡ断片が、プライマーＰ１（ＳＶＳ１７０）（配列番号７）及びプライマーＰ３（ＳＶＳ１６９）（配列番号９）、並びに鋳型としてバチルス・チューリンゲンシス（イスラエレンシス血清型）株ＡＴＣＣ３５６４６（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）の染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによって得られた。ＰＣＲ条件は上記の通りであった。０．８ｋｂのＰＣＲ産物が得られ、アガロースゲルで精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで処理した後、予め同じ制限酵素で処理したベクターｐＭＷ１１９に連結させた。このようにして、プラスミドｐＭＷ１１９−ＩＤＯ（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）が得られた。
【０４３３】
大腸菌ＴＧ１株をプラスミドｐＭＷ１１９−ＩＤＯ（２−ｅ−２）で形質転換した。このようにして、ＩＤＯ産生大腸菌ＴＧ１株［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ（２−ｅ−２）］が構築された。
【０４３４】
大腸菌ＴＧ１株をプラスミドｐＭＷ１１９−ＩＤＯ（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）で形質転換した。このようにして、ＩＤＯ産生大腸菌ＴＧ１株［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ（ＶＫＰＭ
Ｂ−１９７）］が構築された。
【０４３５】
［３］ＩＤＯ産生株及びＩＤＯ／ＨＩＤＨ産生株を用いたイソロイシンの４ＨＩＬ及びＡＭＫＰへの生物変換
大腸菌ＴＧ１株［ｐＭＷ１１９］、ＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ（２−ｅ−２）］、ＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）］、ＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ−ＨＩＤＨ（２−ｅ−２）］及びＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ−ＨＩＤＨ（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）］株の細胞をそれぞれＭＩ５０培地２ｍｌに接種し、激しくかき混ぜながら試験管で３２℃で７２時間培養した。培養後、培養ブロス中のＡＭＫＰ及び４ＨＩＬの濃度をＴＬＣ分析及びＨＰＬＣ分析を用いて求めた。ＴＬＣ分析には、蛍光指示薬を含有しない０．１１ｍｍ厚のＳｏｒｂｆｉｌシリカゲル層でコーティングした１０×１５ｃｍのＴＬＣプレート（Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia）を用いた。プロパン−２−オール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水＝４０：４０：７：１６（ｖ／ｖ）から成る移動相でＳｏｒｂｆｉｌプレートを展開した。ニンヒドリン（２％）のアセトン溶液を可視化試薬として用いた。ＨＰＬＣ分析は実施例１８に記載の方法により行った。ＴＬＣ分析及びＨＰＬＣ分析の結果を図４０及び表５４に示す。図４０及び表５４から分かるように、ＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ（２−ｅ−２）］株及びＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）］株は４ＨＩＬが蓄積され、ＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ−ＨＩＤＨ（２−ｅ−２）］株及びＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ−ＨＩＤＨ（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）］株はＡＭＫＰが蓄積された。これらのデータによって、ＩＤＯの発現がＬ−イソロイシンからの４ＨＩＬの合成をもたらす一方で、ＩＤＯ−ＨＩＤＨの発現が主にＬ−イソロイシンからのＡＭＫＰの合成をもたらすことが確認される。
【０４３６】
ＭＩ５０培地（ｇ／ｌ）の組成物は以下の通りであった：
Ｋ2ＨＰＯ4      １００ｍＭ
ＮＨ4Ｃｌ          ２０ｍＭ
ＭｇＳＯ4            ２ｍＭ
グリセロール            １％
イソロイシン        ５０ｍＭ
ＩＰＴＧ              １ｍＭ
アンピシリン  １５０ｍｇ／ｌ
ＣａＣＯ3        １４ｇ／ｌ
ＣａＣＯ3は、１８０℃で２時間、乾熱滅菌した。ｐＨはＮａＯＨで７．０に調整した。
【０４３７】
【表５４】
2009131254.tif 000057
【０４３８】
[実施例１８]
蓄積したＡＭＫＰ及び４−ＨＩＬのＨＰＬＣ測定
ＨＰＬＣ分析：分光光度計１１００シリーズ（Agilent, USA）を備えた高速クロマトグラフィ（Waters, USA）を用いた。選択した検出波範囲は、２５０ｎｍの励起波長、３２０〜５６０ｎｍの発光波長範囲であった。ａｃｃｑ−タグ法による分離は、Ｎｏｖａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ１８（１５０×３．９ｍｍ、４μｍ）（Waters, USA）カラムにおいて、＋４００℃で行った。試料の注入量は５μｌであった。アミノ酸誘導体の形成及びそれらの分離は、製造業者Watersの推奨（Liu, H.他, J. Chromatogr. A, 828, 383-395（1998）、Watersのａｃｃｑ−タグ化学パッケージの取扱説明書（accq-tag chemistry package. Instruction manual）Millipore Corporation, pp.1-9 （1993））に従って行った。６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（hydroxysuccinymidyl）カルバミン酸によってアミノ酸誘導体を得るために、Ａｃｃｑ−Ｆｌｕｏｒ（商標）（Waters, USA）キットを用いた。ａｃｃｑ−タグ法による分析は、濃Ａｃｃｑ−タグ溶離液А（Waters, USA）を用いて行なった。溶液は全てＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて調製し、標準液は＋４℃で保存した。
【０４３９】
［実施例１９］バチルス・チューリンゲンシスイスラエレンシス血清型（ＡＴＣＣ３５６４６）由来のＨＩＤＨのホモログに関する調査
既知の細菌ゲノムの解析によって、幾つかの微生物がバチルス・チューリンゲンシスイスラエレンシス血清型（ＡＴＣＣ３５６４６）由来のＨＩＤＨ遺伝子との相同性が高い遺伝子を含有することが示された。バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ワイヘンステファンエンシス、及びシュードモナス・シリンゲ由来のＨＩＤＨのアミノ酸配列のアラインメントが図４１に示される。これらのタンパク質は全てＨＩＤＨの活性を有することが示唆された。
【０４４０】
［実施例２０］不活性化ＨＩＤＨ遺伝子による株の構築
１．ＨＩＤＨ遺伝子の欠失
ＨＩＤＨ遺伝子が欠失した株を、以下の技法によって構築することができる。選択マーカーを含有するＤＮＡ断片は、好適なプライマーを用いてＰＣＲによって得ることができる。それぞれのプライマーはＨＩＤＨ遺伝子の５’末端又は３’末端に位置する領域と相補的な領域を含有している必要がある。ＨＩＤＨ遺伝子の欠失は、相同組み換えを用いて、天然ＨＩＤＨ遺伝子を得られたＤＮＡ断片に置き換えることによって行うことができる。
【０４４１】
２．ＰＣＲによるＨＩＤＨ遺伝子欠失の検証
ＨＩＤＨ遺伝子が欠失し、且つ選択マーカー遺伝子を含有する突然変異体をＰＣＲによって検証することができる。遺伝子座特異的なプライマーを検証のためのＰＣＲに用いる必要がある。ＨＩＤＨ遺伝子の欠失は、親株及び突然変異株から得られたＰＣＲ産物の長さの差異によって確認することができる。
【０４４２】
本発明は、その好ましい実施形態を参照して詳細に記載されているが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行い、均等物を用いることができることは当業者にとって明らかである。本明細書で言及される参考文献は全て、参照により本願の一部として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０４４３】
本発明によれば、ＡＭＫＰの還元反応により４-ヒドロキシイソロイシンを生成する反応を触媒する微生物により４-ヒドロキシイソロイシンを製造する方法が提供される。本発明は医薬分野、食品分野において極めて有用である。
【０４４４】
本発明のＬ−イソロイシンジオキシゲナーゼは、Ｌ−イソロイシンの水酸化反応を触媒する新規のジオキシゲナーゼであり、好ましくは、インスリン分泌促進活性を有する薬学
的組成物の成分として有用である（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを合成するのに用いられ得る。
【０４４５】
また、本発明によれば、Ｌ−イソロイシンジオキシゲナーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンデヒドロゲナーゼを用いて、Ｌ−イソロイシンからＡＭＫＰを製造する方法が提供される。
【０４４６】
＜配列の説明＞
1: B. thuringiensis 2-e-2 IDO gene
2: B. thuringiensis 2-e-2 IDO 
3: B. thuringiensis israelensis ATCC35646 IDO gene
4: B. thuringiensis israelensis ATCC35646 IDO
5: B. thuringiensis israelensis ATCC35646 HIDH gene (stop codon: taa)
6: B. thuringiensis israelensis ATCC35646 HIDH
7: Primer SVS170
8: Primer SVS171
9: Primer SVS169
10: B. thuringiensis israelensis ATCC35646 hilB増幅用プライマー
11: B. thuringiensis israelensis ATCC35646 hilB増幅用プライマー
12: B. thuringiensis israelensis ATCC35646 HIDH gene (stop codon: tag)
13: B. thuringiensis israelensis ATCC35646 HIDH
14: B. thuringiensis 2-e-2 HIDH gene
15: B. thuringiensis 2-e-2 HIDH
16: B. thuringiensis Berliner 1915 NBRC3951 (AKU238) HIDH gene
17: B. thuringiensis Berliner 1915 NBRC3951 (AKU238) HIDH
18: B. cereus ATCC14579 HIDH gene
19: B. cereus ATCC14579 HIDH
20: B. weihenstephanensis KBAB4 HIDH gene
21: B. weihenstephanensis KBAB4 HIDH
22: B. thuringiensis 2-e-2又はB. thuringiensis Berliner 1915 NBRC3951 (AKU238) AMKP還元酵素(ar)増幅用プライマー
23: B. thuringiensis 2-e-2又はB. thuringiensis Berliner 1915 NBRC3951 (AKU238) ar増幅用プライマー
24: B. thuringiensis israelensis ATCC35646 ar増幅用プライマー
25: B. thuringiensis israelensis ATCC35646 ar増幅用プライマー
26: B. thuringiensis 2-e-2 ar増幅用プライマー
27: B. thuringiensis 2-e-2 ar増幅用プライマー
28: B. thuringiensis Berliner 1915 NBRC3951 (AKU238) ar増幅用プライマー
29: B. thuringiensis Berliner 1915 NBRC3951 (AKU238) ar増幅用プライマー
30: B. cereus ATCC14579 ar増幅用プライマー
31: B. cereus ATCC14579 ar増幅用プライマー
32: B. weihenstephanensis KBAB4 ar増幅用プライマー
33: B. weihenstephanensis KBAB4 ar増幅用プライマー
34: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDHの部分ペプチドK14
35: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDHの部分ペプチドK16
36: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDHの部分ペプチドK19
37: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDHの部分ペプチドK21
38: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDHの部分ペプチドK24
39: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDHの部分ペプチドK30
40: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDHの部分ペプチドK31
41: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDHの部分ペプチドK33
42: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDHの部分ペプチドK35
43: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDHの部分ペプチドK36
44: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDHの部分ペプチドK41
45: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDH遺伝子クローニング用縮重プライマーAR1
46: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDH遺伝子クローニング用縮重プライマーAR2
47: プライマーAR1及びAR2を用いて得られるPCR産物
48: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDH遺伝子クローニング用プライマーAR-inv3
49: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDH遺伝子クローニング用プライマーAR-inv4
50: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDHゲノム遺伝子全長
51: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDH遺伝子増幅用プライマーAR-forward-BamHI
52: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDH遺伝子増幅用プライマーAR-reverse-HindIII
53: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDH構造遺伝子全長
54: Aureobasidium pullulans NBRC4466 HIDH
55: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDHの部分ペプチドK21
56: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDHの部分ペプチドK34
57: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDHの部分ペプチドK36
58: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDHの部分ペプチドK42
59: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDH遺伝子クローニング用縮重プライマーAR1
60: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDH遺伝子クローニング用縮重プライマーAR2
61: プライマーAR1及びAR2を用いて得られるPCR産物
62: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDH遺伝子クローニング用プライマーAR-inv3
63: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDH遺伝子クローニング用プライマーAR-inv4
64: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDH遺伝子クローニング用プライマーAR-inv5
65: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDH遺伝子クローニング用プライマーAR-inv6
66: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDHゲノム遺伝子全長
67: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDH遺伝子増幅用プライマーAR-forward-SphI
68: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDH遺伝子増幅用プライマーAR-reverse-PstI
69: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDH構造遺伝子全長
70: Rhodotorula marina NBRC0879 HIDH
【図面の簡単な説明】
【０４４７】
【図１】GDHによる補酵素再生系との共役反応を示す図である。
【図２】AMKP還元活性のスクリーニングを示す図である。
【図３】TLC分析でのHIL, AMKPスポット(クロマトグラムの写真) を示す図である。
【図４】アミノ酸の蛍光誘導体化とHPLC分析法を示す図である。
【図５】HPLC分析によるAMKPとHILの標品ピーク（天然型HILを用いたため、HIL 1、HIL 3 は含まれない。図中、太字は天然型異性体を示す。）を示す図である。
【図６】HIL各種異性体分析結果（pH 5.0）を示す図である。
【図７】HIL各種異性体分析結果（pH 7.4）を示す図である。
【図８】HIL各種異性体分析結果（pH 9.0）を示す図である。
【図９】Bacillus thuringiensis AKU 238 反応液のHPLC分析結果を示す図である。
【図１０】Sporobolomyces gracilis AKU 4438反応液のHPLC分析結果を示す図である。
【図１１】HIL各種異性体分析再現性結果（pH 7.0）を示す図である。
【図１２】HIL各種異性体分析再現性結果（pH 9.0）を示す図である。
【図１３】反応経時変化の評価法を示す図である。
【図１４】各反応液におけるpHの経時変化（開始pH 7.0）を示す図である。
【図１５】HIL生成量の経時変化（AKU 238）を示す図である。
【図１６】HIL生成量の経時変化（AKU 4438）を示す図である。
【図１７】HIL生成量の経時変化（IFO 4466）を示す図である。
【図１８】各反応液におけるpHの経時変化（開始pH 9.0）を示す図である。
【図１９】HIL生成量の経時変化（AKU 238）を示す図である。
【図２０】HIL生成量の経時変化（AKU 4438）を示す図である。
【図２１】HIL生成量の経時変化（IFO 4466）を示す図である。
【図２２】一定pH条件下での反応方法を示す図である。
【図２３】AKU 238 各pHでの活性を示す図である。
【図２４】AKU 4438 各pHでの活性を示す図である。
【図２５】IFO 4466 各pHでの活性を示す図である。
【図２６】AKU 2130 各pHでの活性を示す図である。
【図２７】AKU 2301 各pHでの活性を示す図である。
【図２８】IG 611 各pHでの活性を示す図である。
【図２９】AKU 5507 各pHでの活性を示す図である。
【図３０】AKU 3710 各pHでの活性を示す図である。
【図３１】NADHの安定性を示す図である。
【図３２】NADPHの安定性を示す図である。
【図３３】風乾菌体の調製方法を示す図である。
【図３４】活性に対する温度の影響を示す図である。
【図３５】活性に対する基質濃度の影響を示す図である。
【図３６】活性に対するｐＨの影響を示す図である。
【図３７】AMKP還元酵素活性の測定結果を示す図である。
【図３８】バチルス・チューリンゲンシスにおける推定のＡＭＫＰ合成経路を示す図である。
【図３９】Ａは、「ＡＴＧＡ」配列を用いて翻訳的に共役したバチルス・チューリンゲンシスイスラエレンシス血清型（ＡＴＣＣ３５６４６）由来のＩＤＯ及びＨＩＤＨをコードする遺伝子を含有するオペロン構造を示し、Ｂは、ＩＤＯ−ＨＩＤＨオペロンを有する構築された組み換えプラスミド構造を示す図である。
【図４０】ＩＤＯ及びＨＩＤＨ活性を有する大腸菌株を用いたイソロイシンのＡＭＫＰへの生物変換を示す図である。Ａは、ＡＭＫＰ生成のＴＬＣ分析を示す（クロマトグラフ写真）。トラック：１、１４−４ＨＩＬ標準、１２−ＡＭＫＰ標準、１３−Ｉｌｅ標準、２−ＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ（２−ｅ−２）］株の培養ブロス、３〜７−ＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ−ＨＩＤＨ（２−ｅ−２）］株の培養ブロス（５つの独立クローン）、８−ＴＧ１［ｐＭＷ１１９］株の培養ブロス、９−ＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）］株の培養ブロス、１０、１１−ＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ−ＨＩＤＨ（ＶＫＰＭ  Ｂ−１９７）］株の培養ブロス（２つの独立クローン）。Ｂは、ＡＭＫＰ生成のＨＰＬＣ分析を示す。ｂ１−ＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ−ＨＩＤＨ（２−ｅ−２）］株の培養ブロス、ｂ２−ＴＧ１［ｐＭＷ１１９−ＩＤＯ（２−ｅ−２）］株の培養ブロス、ｂ３−ＡＭＫＰ標準、ｂ４−４ＨＩＬ標準。
【図４１】バチルス・チューリンゲンシスイスラエレンシス血清型ＡＴＣＣ３５６４６（ＺＰ＿００７３８９０９）由来のＨＩＤＨと、バチルス・ワイヘンステファンエンシスＫＢＡＢ４（ＺＰ＿０１１８２５９１）由来の短鎖デヒドロゲナーゼ／還元酵素ＳＤＲ、バチルス・セレウスＡＴＣＣ１４５７９（ＮＰ＿８３０８４８）由来の３−オキソアシル−［アシル−キャリアタンパク質］還元酵素、機能未知タンパク質ＧＯＳ＿９２５７８０８［海洋メタゲノム］（ＥＢＨ４６６８１）、及びインゲンかさ枯病細菌１４４８Ａ（ＹＰ＿２７６１１８）由来の３−オキソアシル−［アシル−キャリアタンパク質］還元酵素とのアラインメントを示す図である。
【図１】
2009131254.tif 000058
【図２】
2009131254.tif 000059
【図３】
2009131254.tif 000060
【図４】
2009131254.tif 000061
【図５】
2009131254.tif 000062
【図６】
2009131254.tif 000063
【図７】
2009131254.tif 000064
【図８】
2009131254.tif 000065
【図９】
2009131254.tif 000066
【図１０】
2009131254.tif 000067
【図１１】
2009131254.tif 000068
【図１２】
2009131254.tif 000069
【図１３】
2009131254.tif 000070
【図１４】
2009131254.tif 000071
【図１５】
2009131254.tif 000072
【図１６】
2009131254.tif 000073
【図１７】
2009131254.tif 000074
【図１８】
2009131254.tif 000075
【図１９】
2009131254.tif 000076
【図２０】
2009131254.tif 000077
【図２１】
2009131254.tif 000078
【図２２】
2009131254.tif 000079
【図２３】
2009131254.tif 000080
【図２４】
2009131254.tif 000081
【図２５】
2009131254.tif 000082
【図２６】
2009131254.tif 000083
【図２７】
2009131254.tif 000084
【図２８】
2009131254.tif 000085
【図２９】
2009131254.tif 000086
【図３０】
2009131254.tif 000087
【図３１】
2009131254.tif 000088
【図３２】
2009131254.tif 000089
【図３３】
2009131254.tif 000090
【図３４】
2009131254.tif 000091
【図３５】
2009131254.tif 000092
【図３６】
2009131254.tif 000093
【図３７】
2009131254.tif 000094
【図３８】
2009131254.tif 000095
【図３９】
2009131254.tif 000096
【図４０】
2009131254.tif 000097
【図４１】
2009131254.tif 000098
【配列表】
2009131254000001.app