(57)【要約】      （修正有）【課題】牛の個体識別および親子鑑別を正確、安価、かつ迅速に実施し得るマーカーおよび方法を提供する。【解決手段】特定の配列を有する４４種の遺伝子多型、具体的には一塩基多型および挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型を見出し、牛の個体識別用および親子鑑定用マーカーとしてのこれら一塩基多型の使用、これら一塩基多型を指標として被験牛のＤＮＡを分析し、指標とした多型を判定する工程を含む牛の個体識別法または親子鑑別法、該判定に有用なプライマーセット、および該プライマーセットを含む試薬キットに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記４４種の遺伝子多型のうち少なくとも１０種の多型を指標として被験牛のＤＮＡを分析し、指標とした多型を判定する工程を含むことを特徴とする、牛の個体識別法または親子鑑別法：
１．配列番号１に示す塩基配列の２９１番目の塩基における一塩基多型、
２．配列番号２に示す塩基配列の５０５番目の塩基における一塩基多型、
３．配列番号３に示す塩基配列の６４番目の塩基における一塩基多型、
４．配列番号４に示す塩基配列の９３番目の塩基における一塩基多型、
５．配列番号５に示す塩基配列の２７番目の塩基における一塩基多型、
６．配列番号６に示す塩基配列の１４７番目の塩基における一塩基多型、
７．配列番号７に示す塩基配列の１１３番目の塩基における一塩基多型、
８．配列番号８に示す塩基配列の５９４番目の塩基における一塩基多型、
９．配列番号９に示す塩基配列の４７番目から５０番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
１０．配列番号１０に示す塩基配列の４４６番目の塩基における一塩基多型、
１１．配列番号１１に示す塩基配列の１８５番目の塩基における一塩基多型、
１２．配列番号１２に示す塩基配列の１９４番目の塩基における一塩基多型、
１３．配列番号１３に示す塩基配列の１４３番目の塩基における一塩基多型、
１４．配列番号１４に示す塩基配列の２０６番目の塩基における一塩基多型、
１５．配列番号１５に示す塩基配列の２１７番目の塩基における一塩基多型、
１６．配列番号１６に示す塩基配列の１３０番目の塩基における一塩基多型、
１７．配列番号１７に示す塩基配列の２２１番目の塩基における一塩基多型、
１８．配列番号１８に示す塩基配列の３８２番目の塩基における一塩基多型、
１９．配列番号１９に示す塩基配列の１４８番目の塩基における一塩基多型、
２０．配列番号２０に示す塩基配列の１７９番目の塩基における一塩基多型、
２１．配列番号２１に示す塩基配列の１２９番目の塩基における一塩基多型、
２２．配列番号２２に示す塩基配列の１５１番目の塩基における一塩基多型、
２３．配列番号２３に示す塩基配列の２５２番目の塩基における一塩基多型、
２４．配列番号２４に示す塩基配列の２７１番目の塩基における一塩基多型、
２５．配列番号２５に示す塩基配列の１４１番目の塩基における一塩基多型、
２６．配列番号２６に示す塩基配列の１３７番目の塩基における一塩基多型、
２７．配列番号２７に示す塩基配列の３４４番目の塩基における一塩基多型、
２８．配列番号２８に示す塩基配列の２４６番目の塩基における一塩基多型、
２９．配列番号２９に示す塩基配列の１０８番目の塩基における一塩基多型、
３０．配列番号３０に示す塩基配列の６９番目から７２番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３１．配列番号３１に示す塩基配列の６２番目の塩基における一塩基多型、
３２．配列番号３２に示す塩基配列の１５６番目の塩基における一塩基多型、
３３．配列番号３３に示す塩基配列の６６９番目の塩基における一塩基多型、
３４．配列番号３４に示す塩基配列の１８３番目の塩基における一塩基多型、
３５．配列番号３５に示す塩基配列の８９番目から９０番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３６．配列番号３６に示す塩基配列の２７番目から２８番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３７．配列番号３７に示す塩基配列の３６１番目の塩基における一塩基多型、
３８．配列番号３８に示す塩基配列の１３９番目の塩基における一塩基多型、
３９．配列番号３９に示す塩基配列の３２０番目の塩基における一塩基多型、
４０．配列番号４０に示す塩基配列の２６５番目の塩基における一塩基多型、
４１．配列番号４１に示す塩基配列の３３７番目の塩基における一塩基多型、
４２．配列番号４２に示す塩基配列の３１２番目の塩基における一塩基多型、
４３．配列番号４３に示す塩基配列の１６０番目の塩基における一塩基多型、
４４．配列番号４４に示す塩基配列の３１４番目の塩基における一塩基多型。
【請求項２】
前記４４種の遺伝子多型が下記遺伝子多型である、請求項１に記載の牛の個体識別法または親子鑑別法：
１．配列番号１に示す塩基配列の２９１番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
２．配列番号２に示す塩基配列の５０５番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
３．配列番号３に示す塩基配列の６４番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｇ」であるかにより表される一塩基多型、
４．配列番号４に示す塩基配列の９３番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
５．配列番号５に示す塩基配列の２７番目の塩基が「Ｔ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
６．配列番号６に示す塩基配列の１４７番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
７．配列番号７に示す塩基配列の１１３番目の塩基が「Ａ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表されるにおける一塩基多型、
８．配列番号８に示す塩基配列の５９４番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
９．配列番号９に示す塩基配列の４７番目から５０番目の塩基が「ＧＧＡＣ」であるかまたは「欠失」であるかにより表される挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
１０．配列番号１０に示す塩基配列の４４６番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
１１．配列番号１１に示す塩基配列の１８５番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
１２．配列番号１２に示す塩基配列の１９４番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
１３．配列番号１３に示す塩基配列の１４３番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
１４．配列番号１４に示す塩基配列の２０６番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
１５．配列番号１５に示す塩基配列の２１７番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
１６．配列番号１６に示す塩基配列の１３０番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
１７．配列番号１７に示す塩基配列の２２１番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
１８．配列番号１８に示す塩基配列の３８２番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
１９．配列番号１９に示す塩基配列の１４８番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
２０．配列番号２０に示す塩基配列の１７９番目の塩基が「Ｔ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
２１．配列番号２１に示す塩基配列の１２９番目の塩基が「Ａ」であるかまたは「Ｇ」であるかにより表される一塩基多型、
２２．配列番号２２に示す塩基配列の１５１番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
２３．配列番号２３に示す塩基配列の２５２番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
２４．配列番号２４に示す塩基配列の２７１番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
２５．配列番号２５に示す塩基配列の１４１番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
２６．配列番号２６に示す塩基配列の１３７番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
２７．配列番号２７に示す塩基配列の３４４番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
２８．配列番号２８に示す塩基配列の２４６番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
２９．配列番号２９に示す塩基配列の１０８番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
３０．配列番号３０に示す塩基配列の６９番目から７２番目の塩基が「ＴＡＡＴ」であるかまたは「欠失」であるかにより表される挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３１．配列番号３１に示す塩基配列の６２番目の塩基が「Ｔ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
３２．配列番号３２に示す塩基配列の１５６番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
３３．配列番号３３に示す塩基配列の６６９番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
３４．配列番号３４に示す塩基配列の１８３番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
３５．配列番号３５に示す塩基配列の８９番目から９０番目の塩基が「ＧＡ」であるかまたは「欠失」であるかにより表される挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３６．配列番号３６に示す塩基配列の２７番目から２８番目の塩基が「ＡＧ」であるかまたは「欠失」であるかにより表される挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３７．配列番号３７に示す塩基配列の３６１番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
３８．配列番号３８に示す塩基配列の１３９番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
３９．配列番号３９に示す塩基配列の３２０番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
４０．配列番号４０に示す塩基配列の２６５番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
４１．配列番号４１に示す塩基配列の３３７番目の塩基が「Ａ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
４２．配列番号４２に示す塩基配列の３１２番目の塩基が「Ａ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
４３．配列番号４３に示す塩基配列の１６０番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
４４．配列番号４４に示す塩基配列の３１４番目の塩基が「Ｔ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型。
【請求項３】
遺伝子多型を指標として被験牛のＤＮＡを分析し、指標とした多型を判定する前記工程が、各多型を含むＤＮＡ断片を遺伝子増幅法により増幅し、指標とした多型を判定する工程である、請求項１または２に記載の牛の個体識別法または親子鑑別法。
【請求項４】
各多型を含むＤＮＡ断片を遺伝子増幅法により増幅する前記工程が、下記プライマーセットから選択されるプライマーセットを用いて各多型を含むＤＮＡ断片を増幅する工程である、請求項３に記載の牛の個体識別法または親子鑑別法：
１．配列番号１に示す塩基配列の２９１番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２．配列番号２に示す塩基配列の５０５番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３．配列番号３に示す塩基配列の６４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
４．配列番号４に示す塩基配列の９３番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
５．配列番号５に示す塩基配列の２７番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号５に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
６．配列番号６に示す塩基配列の１４７番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号６に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
７．配列番号７に示す塩基配列の１１３番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号７に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
８．配列番号８に示す塩基配列の５９４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号８に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
９．配列番号９に示す塩基配列の４７番目から５０番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号９に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１０．配列番号１０に示す塩基配列の４４６番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１０に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１１．配列番号１１に示す塩基配列の１８５番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１２．配列番号１２に示す塩基配列の１９４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１３．配列番号１３に示す塩基配列の１４３番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１４．配列番号１４に示す塩基配列の２０６番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１５．配列番号１５に示す塩基配列の２１７番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１５に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１６．配列番号１６に示す塩基配列の１３０番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１６に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１７．配列番号１７に示す塩基配列の２２１番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１７に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１８．配列番号１８に示す塩基配列の３８２番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１８に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１９．配列番号１９に示す塩基配列の１４８番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１９に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２０．配列番号２０に示す塩基配列の１７９番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２０に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２１．配列番号２１に示す塩基配列の１２９番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２２．配列番号２２に示す塩基配列の１５１番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２３．配列番号２３に示す塩基配列の２５２番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２４．配列番号２４に示す塩基配列の２７１番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２５．配列番号２５に示す塩基配列の１４１番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２５に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２６．配列番号２６に示す塩基配列の１３７番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２６に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２７．配列番号２７に示す塩基配列の３４４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２７に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２８．配列番号２８に示す塩基配列の２４６番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２８に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２９．配列番号２９に示す塩基配列の１０８番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２９に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３０．配列番号３０に示す塩基配列の６９番目から７２番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３０に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３１．配列番号３１に示す塩基配列の６２番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３２．配列番号３２に示す塩基配列の１５６番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３３．配列番号３３に示す塩基配列の６６９番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３４．配列番号３４に示す塩基配列の１８３番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３５．配列番号３５に示す塩基配列の８９番目から９０番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３５に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３６．配列番号３６に示す塩基配列の２７番目から２８番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３６に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３７．配列番号３７に示す塩基配列の３６１番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３７に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３８．配列番号３８に示す塩基配列の１３９番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３８に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３９．配列番号３９に示す塩基配列の３２０番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３９に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
４０．配列番号４０に示す塩基配列の２６５番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４０に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
４１．配列番号４１に示す塩基配列の３３７番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
４２．配列番号４２に示す塩基配列の３１２番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
４３．配列番号４３に示す塩基配列の１６０番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
４４．配列番号４４に示す塩基配列の３１４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット。
【請求項５】
各多型を含むＤＮＡ断片を遺伝子増幅法により増幅する前記工程が、下記ポリヌクレオチドの組み合わせから選択されるプライマーセットを用いて各多型を含むＤＮＡ断片を増幅する工程である、請求項３に記載の牛の個体識別法または親子鑑別法：
１．配列番号５３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号５４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２．配列番号５５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号５６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３．配列番号５７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号５８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４．配列番号５９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
５．配列番号６１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
６．配列番号６３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
７．配列番号６５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
８．配列番号６７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
９．配列番号６９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１０．配列番号７１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１１．配列番号７３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１２．配列番号７５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１３．配列番号７７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１４．配列番号７９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１５．配列番号８１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１６．配列番号８３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１７．配列番号８５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１８．配列番号８７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１９．配列番号８９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２０．配列番号９１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２１．配列番号９３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２２．配列番号９５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２３．配列番号９７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２４．配列番号９９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１００に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２５．配列番号１０１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１０２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２６．配列番号１０３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１０４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２７．配列番号１０５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１０６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２８．配列番号１０７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１０８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２９．配列番号１０９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３０．配列番号１１１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３１．配列番号１１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３２．配列番号１１５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３３．配列番号１１７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３４．配列番号１１９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３５．配列番号１２１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３６．配列番号１２３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３７．配列番号１２５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３８．配列番号１２７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３９．配列番号１２９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４０．配列番号１３１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４１．配列番号１３３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４２．配列番号１３５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４３．配列番号１３７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４４．配列番号１３９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１４０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ。
【請求項６】
牛が黒毛和種牛である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の牛の個体識別法または親子鑑別法。
【請求項７】
下記４４種の遺伝子多型から選ばれるいずれか１の多型の、牛の個体識別用または親子鑑別用マーカーとしての使用：
１．配列番号１に示す塩基配列の２９１番目の塩基における一塩基多型、
２．配列番号２に示す塩基配列の５０５番目の塩基における一塩基多型、
３．配列番号３に示す塩基配列の６４番目の塩基における一塩基多型、
４．配列番号４に示す塩基配列の９３番目の塩基における一塩基多型、
５．配列番号５に示す塩基配列の２７番目の塩基における一塩基多型、
６．配列番号６に示す塩基配列の１４７番目の塩基における一塩基多型、
７．配列番号７に示す塩基配列の１１３番目の塩基における一塩基多型、
８．配列番号８に示す塩基配列の５９４番目の塩基における一塩基多型、
９．配列番号９に示す塩基配列の４７番目から５０番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
１０．配列番号１０に示す塩基配列の４４６番目の塩基における一塩基多型、
１１．配列番号１１に示す塩基配列の１８５番目の塩基における一塩基多型、
１２．配列番号１２に示す塩基配列の１９４番目の塩基における一塩基多型、
１３．配列番号１３に示す塩基配列の１４３番目の塩基における一塩基多型、
１４．配列番号１４に示す塩基配列の２０６番目の塩基における一塩基多型、
１５．配列番号１５に示す塩基配列の２１７番目の塩基における一塩基多型、
１６．配列番号１６に示す塩基配列の１３０番目の塩基における一塩基多型、
１７．配列番号１７に示す塩基配列の２２１番目の塩基における一塩基多型、
１８．配列番号１８に示す塩基配列の３８２番目の塩基における一塩基多型、
１９．配列番号１９に示す塩基配列の１４８番目の塩基における一塩基多型、
２０．配列番号２０に示す塩基配列の１７９番目の塩基における一塩基多型、
２１．配列番号２１に示す塩基配列の１２９番目の塩基における一塩基多型、
２２．配列番号２２に示す塩基配列の１５１番目の塩基における一塩基多型、
２３．配列番号２３に示す塩基配列の２５２番目の塩基における一塩基多型、
２４．配列番号２４に示す塩基配列の２７１番目の塩基における一塩基多型、
２５．配列番号２５に示す塩基配列の１４１番目の塩基における一塩基多型、
２６．配列番号２６に示す塩基配列の１３７番目の塩基における一塩基多型、
２７．配列番号２７に示す塩基配列の３４４番目の塩基における一塩基多型、
２８．配列番号２８に示す塩基配列の２４６番目の塩基における一塩基多型、
２９．配列番号２９に示す塩基配列の１０８番目の塩基における一塩基多型、
３０．配列番号３０に示す塩基配列の６９番目から７２番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３１．配列番号３１に示す塩基配列の６２番目の塩基における一塩基多型、
３２．配列番号３２に示す塩基配列の１５６番目の塩基における一塩基多型、
３３．配列番号３３に示す塩基配列の６６９番目の塩基における一塩基多型、
３４．配列番号３４に示す塩基配列の１８３番目の塩基における一塩基多型、
３５．配列番号３５に示す塩基配列の８９番目から９０番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３６．配列番号３６に示す塩基配列の２７番目から２８番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３７．配列番号３７に示す塩基配列の３６１番目の塩基における一塩基多型、
３８．配列番号３８に示す塩基配列の１３９番目の塩基における一塩基多型、
３９．配列番号３９に示す塩基配列の３２０番目の塩基における一塩基多型、
４０．配列番号４０に示す塩基配列の２６５番目の塩基における一塩基多型、
４１．配列番号４１に示す塩基配列の３３７番目の塩基における一塩基多型、
４２．配列番号４２に示す塩基配列の３１２番目の塩基における一塩基多型、
４３．配列番号４３に示す塩基配列の１６０番目の塩基における一塩基多型、
４４．配列番号４４に示す塩基配列の３１４番目の塩基における一塩基多型。
【請求項８】
下記ポリヌクレオチドの組み合わせから選択されるいずれか１の組み合わせ：
１．配列番号５３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号５４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２．配列番号５５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号５６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３．配列番号５７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号５８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４．配列番号５９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
５．配列番号６１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
６．配列番号６３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
７．配列番号６５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
８．配列番号６７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
９．配列番号６９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１０．配列番号７１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１１．配列番号７３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１２．配列番号７５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１３．配列番号７７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１４．配列番号７９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１５．配列番号８１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１６．配列番号８３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１７．配列番号８５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１８．配列番号８７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１９．配列番号８９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２０．配列番号９１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２１．配列番号９３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２２．配列番号９５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２３．配列番号９７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２４．配列番号９９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１００に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２５．配列番号１０１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１０２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２６．配列番号１０３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１０４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２７．配列番号１０５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１０６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２８．配列番号１０７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１０８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２９．配列番号１０９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３０．配列番号１１１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３１．配列番号１１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３２．配列番号１１５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３３．配列番号１１７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３４．配列番号１１９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３５．配列番号１２１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３６．配列番号１２３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３７．配列番号１２５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３８．配列番号１２７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３９．配列番号１２９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４０．配列番号１３１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４１．配列番号１３３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４２．配列番号１３５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４３．配列番号１３７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４４．配列番号１３９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１４０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ。
【請求項９】
請求項７に記載のポリヌクレオチドの組み合わせを少なくとも含む試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子多型、具体的には一塩基多型および挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型を指標として被験牛のＤＮＡを分析し、指標とした多型を判定する工程を含むことを特徴とする、牛の個体識別法および親子鑑別法に関する。また本発明は、ウシ遺伝子における遺伝子多型、具体的には一塩基多型および挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型の、牛の個体識別用および親子鑑別用マーカーとしての使用に関する。さらに本発明は、前記遺伝子多型の検出に使用するプライマーおよび該プライマーを含む試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、飼育されている日本固有の和牛種として黒毛和種、褐色和種、無角和種、日本短角種の４品種がある。中でも黒毛和種は脂肪交雑、肉の色択、きめ締まり等の枝肉形質において優れた遺伝的特性を持ち、高級牛肉として国内市場で扱われ、国際的にも注目を集めている。しかし、近年ではＢＳＥ問題に関連して、安価な外国産牛肉や、国内産ではホルスタイン種と黒毛和種との雑種第一代（Ｆ１）等が黒毛和種と不当表示され販売される、いわゆる食品の偽装問題が発生しており、消費者の食品への不安は募り、その安全性への関心が高まっている。そのため、食品の安全性を確保し、消費者の信頼を回復する手段として、昨今では遺伝学的な解析技術を応用したトレーサビリティーが注目を集めている。トレーサビリティーとは生産地や流通経路等、子牛が生まれてから市場に出回るまでの記録を追跡できるシステムのことであり、現在では国産牛肉の生産履歴を一般に公開することが義務付けられている。また、近年の分子生物学と遺伝子工学の発達に伴って、ＤＮＡ本体の多型を分析する方法が注目されている。家畜では『ＤＮＡ多型に基づく家畜選抜』を行うことを目的として、ＤＮＡ多型マーカーの開発が行われるようになってきた（非特許文献１）。現在では、ＤＮＡマーカーは有用な遺伝標識として、トレーサビリティーを補完するため、家畜の親子判定や個体識別に広く利用されている。
【０００３】
現在、黒毛和種の親子判定や個体識別において、最も一般的に用いられているＤＮＡマーカーはマイクロサテライト（ＭＳ）マーカーである。ＭＳとは非コード領域に見出される２〜数ｂｐの単純な配列の反復配列のことであり、ゲノム中に広く分布している。ＭＳはその反復数の違いが多型の原因となり、その対立遺伝子は多様性に富み、遺伝的情報量の多い有用なマーカーとしての利用がされている。しかし、親から子への遺伝の際に、ＤＮＡ複製時のスリップにより、その反復数が変化することがあり、その突然変異率は１世代当たり１０−２〜１０−５である（非特許文献２）。そのため、親子判定においては、マーカーとしての信頼性に欠けるという難点が存在する。
【０００４】
そのため、新たなＤＮＡマーカーとして、一塩基多型（ＳＮＰｓ；Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）マーカーが注目されている。ＳＮＰｓとは一塩基置換により生じる多型であり、数百〜１０００ｐに１箇所の割合で存在すると推定され、１ゲノム当たりでは、３００〜１０００万個のＳＮＰｓが存在していると言われている。ＳＮＰｓはそのほとんどが２対立遺伝子から成り、ＭＳよりも１個のマーカー当たりの多型性が低く、遺伝的情報量も少ない。したがって、ＳＮＰｓを用いて親子判定や個体識別を行う場合、ＭＳより多くのマーカーを開発する必要がある。一方、ＳＮＰｓは親子間での突然変異率は１世代当たり、〜２．５×１０−８であり（非特許文献２）、ＭＳに比べて１０００倍から１００万倍突然変異率が低いという特徴を持つ。したがって、ＳＮＰｓマーカーを使用した親子鑑別には安定した鑑別率が期待できる。さらに自動解析が可能であり、低コスト化が可能となることから、ＳＮＰｓマーカーはＭＳマーカーに替わる有用なマーカーに成り得ると期待されている。ヒトではＳＮＰｓの利用による個体識別システムの構築が進んでいる（非特許文献３）。また、ＳＮＰｓを利用したブタの個体識別と親子判定の鑑定能の評価を行っている報告がある（非特許文献４）。しかし、ウシのＳＮＰｓマーカーは親子判定や個体識別において実用可能な個数までは未だ開発されていない。それは、同定されたＳＮＰｓの染色体上での位置を特定し、マーカー化するまでには、多大な労力およびコストが必要であったからである。一方現在では、世界各国で進められているゲノムプロジェクトの成果により、ウシゲノムの全塩基配列が明らかとなってきており、これに従い、ウシゲノムデータベースの利用が可能となってきた。
【０００５】
【非特許文献１】万年英之、「平成９年度食肉に関する助成研究調査報告書」、１９９８年、第１６巻、ｐ．１４５−１４８
【非特許文献２】Ａｇｒａｆｉｏｔｉ  Ｉ．ら、「ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００６年、第３５巻、データベース  イシュー、ｐ．Ｄ７１−７５
【非特許文献３】Ｐａｋｓｔｉｓ  Ａ．Ｊ．ら、「ヒューマン  ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、２００７年、第１２１巻、第３−４号、ｐ．３０５−３１７
【非特許文献４】Ｒｏｈｒｅｒ  Ｇ．Ａ．ら、「アニマル  ジェネティクス（Ａｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、２００７年、第３８巻、ｐ．２５３−２５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＳＮＰｓを用いた親子判定や個体識別では、鑑定能の高いマーカーを得るためには、より遺伝的情報量の高いマーカーを開発する必要がある。遺伝的情報量を最大にするためには、各々の集団や品種に適したマーカー開発が必須となる。
【０００７】
本発明は、上記の解決すべき課題に鑑みてなされたものであり、牛の個体識別と親子鑑別を正確、安価、かつ迅速に実施し得るマーカーおよび方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、情報量の高いＳＮＰｓを探索する手段として、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ；Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法（Ｖｏｓ  Ｐ．ら、「ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９５年、第２３巻、第２１号、ｐ．４４０７−４４１４）に注目した。本法は、遺伝的類縁関係（Ｍｏｒｅｎｏ  Ｙ．ら、「フェムス  マイクロバイオロジー  レターズ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、２００２年、第２１１巻、第１号、ｐ．９７−１０３）、ＱＴＬ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｉ）解析（Ｏｔｓｅｎ  Ｍ．ら、「ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」、１９９６年、第３７巻、第３号、ｐ．２８９−２９４）、連鎖地図作成（Ｌｅｅ  Ｅ．Ｊ．ら、「アニマル  ジェネティクス（Ａｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、２００２年、第３３巻、第１号、ｐ．４２−４８）、等の幅広い研究に応用されている。このＡＦＬＰ法を用いることにより、各ＳＮＰｓの集団内における対立遺伝子頻度を予測することが可能となり、遺伝的情報量の高い有用なマーカーをより効率よく探索することが可能であると考えることができる。
【０００９】
本発明者らは、ＡＦＬＰ法を利用して、国内の黒毛和種における親子判定や個体識別への応用に向けたＳＮＰｓの探索、さらにはそのマーカー化を行った。また、推定された遺伝子頻度より、その鑑定能を計算することによって、開発されたマーカーの有効度を評価した。さらに、ＡＦＬＰ法による解析結果から予測された対立遺伝子頻度と、開発されたマーカーの対立遺伝子頻度を比較することによって、ＳＮＰｓ開発におけるＡＦＬＰ法の有効性を検証した。そして、これら検証結果から、牛の個体識別と親子鑑別を正確、安価、かつ迅速に実施し得るマーカーを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下からなる。
【００１１】
（１）．下記４４種の遺伝子多型のうち少なくとも１０種の多型を指標として被験牛のＤＮＡを分析し、指標とした多型を判定する工程を含むことを特徴とする、牛の個体識別法または親子鑑別法：
１．配列番号１に示す塩基配列の２９１番目の塩基における一塩基多型、
２．配列番号２に示す塩基配列の５０５番目の塩基における一塩基多型、
３．配列番号３に示す塩基配列の６４番目の塩基における一塩基多型、
４．配列番号４に示す塩基配列の９３番目の塩基における一塩基多型、
５．配列番号５に示す塩基配列の２７番目の塩基における一塩基多型、
６．配列番号６に示す塩基配列の１４７番目の塩基における一塩基多型、
７．配列番号７に示す塩基配列の１１３番目の塩基における一塩基多型、
８．配列番号８に示す塩基配列の５９４番目の塩基における一塩基多型、
９．配列番号９に示す塩基配列の４７番目から５０番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
１０．配列番号１０に示す塩基配列の４４６番目の塩基における一塩基多型、
１１．配列番号１１に示す塩基配列の１８５番目の塩基における一塩基多型、
１２．配列番号１２に示す塩基配列の１９４番目の塩基における一塩基多型、
１３．配列番号１３に示す塩基配列の１４３番目の塩基における一塩基多型、
１４．配列番号１４に示す塩基配列の２０６番目の塩基における一塩基多型、
１５．配列番号１５に示す塩基配列の２１７番目の塩基における一塩基多型、
１６．配列番号１６に示す塩基配列の１３０番目の塩基における一塩基多型、
１７．配列番号１７に示す塩基配列の２２１番目の塩基における一塩基多型、
１８．配列番号１８に示す塩基配列の３８２番目の塩基における一塩基多型、
１９．配列番号１９に示す塩基配列の１４８番目の塩基における一塩基多型、
２０．配列番号２０に示す塩基配列の１７９番目の塩基における一塩基多型、
２１．配列番号２１に示す塩基配列の１２９番目の塩基における一塩基多型、
２２．配列番号２２に示す塩基配列の１５１番目の塩基における一塩基多型、
２３．配列番号２３に示す塩基配列の２５２番目の塩基における一塩基多型、
２４．配列番号２４に示す塩基配列の２７１番目の塩基における一塩基多型、
２５．配列番号２５に示す塩基配列の１４１番目の塩基における一塩基多型、
２６．配列番号２６に示す塩基配列の１３７番目の塩基における一塩基多型、
２７．配列番号２７に示す塩基配列の３４４番目の塩基における一塩基多型、
２８．配列番号２８に示す塩基配列の２４６番目の塩基における一塩基多型、
２９．配列番号２９に示す塩基配列の１０８番目の塩基における一塩基多型、
３０．配列番号３０に示す塩基配列の６９番目から７２番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３１．配列番号３１に示す塩基配列の６２番目の塩基における一塩基多型、
３２．配列番号３２に示す塩基配列の１５６番目の塩基における一塩基多型、
３３．配列番号３３に示す塩基配列の６６９番目の塩基における一塩基多型、
３４．配列番号３４に示す塩基配列の１８３番目の塩基における一塩基多型、
３５．配列番号３５に示す塩基配列の８９番目から９０番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３６．配列番号３６に示す塩基配列の２７番目から２８番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３７．配列番号３７に示す塩基配列の３６１番目の塩基における一塩基多型、
３８．配列番号３８に示す塩基配列の１３９番目の塩基における一塩基多型、
３９．配列番号３９に示す塩基配列の３２０番目の塩基における一塩基多型、
４０．配列番号４０に示す塩基配列の２６５番目の塩基における一塩基多型、
４１．配列番号４１に示す塩基配列の３３７番目の塩基における一塩基多型、
４２．配列番号４２に示す塩基配列の３１２番目の塩基における一塩基多型、
４３．配列番号４３に示す塩基配列の１６０番目の塩基における一塩基多型、
４４．配列番号４４に示す塩基配列の３１４番目の塩基における一塩基多型。
【００１２】
（２）前記４４種の遺伝子多型が下記遺伝子多型である、前記（１）の牛の個体識別法または親子鑑別法：
１．配列番号１に示す塩基配列の２９１番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
２．配列番号２に示す塩基配列の５０５番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
３．配列番号３に示す塩基配列の６４番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｇ」であるかにより表される一塩基多型、
４．配列番号４に示す塩基配列の９３番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
５．配列番号５に示す塩基配列の２７番目の塩基が「Ｔ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
６．配列番号６に示す塩基配列の１４７番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
７．配列番号７に示す塩基配列の１１３番目の塩基が「Ａ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表されるにおける一塩基多型、
８．配列番号８に示す塩基配列の５９４番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
９．配列番号９に示す塩基配列の４７番目から５０番目の塩基が「ＧＧＡＣ」であるかまたは「欠失」であるかにより表される挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
１０．配列番号１０に示す塩基配列の４４６番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
１１．配列番号１１に示す塩基配列の１８５番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
１２．配列番号１２に示す塩基配列の１９４番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
１３．配列番号１３に示す塩基配列の１４３番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
１４．配列番号１４に示す塩基配列の２０６番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
１５．配列番号１５に示す塩基配列の２１７番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
１６．配列番号１６に示す塩基配列の１３０番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
１７．配列番号１７に示す塩基配列の２２１番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
１８．配列番号１８に示す塩基配列の３８２番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
１９．配列番号１９に示す塩基配列の１４８番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
２０．配列番号２０に示す塩基配列の１７９番目の塩基が「Ｔ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
２１．配列番号２１に示す塩基配列の１２９番目の塩基が「Ａ」であるかまたは「Ｇ」であるかにより表される一塩基多型、
２２．配列番号２２に示す塩基配列の１５１番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
２３．配列番号２３に示す塩基配列の２５２番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
２４．配列番号２４に示す塩基配列の２７１番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
２５．配列番号２５に示す塩基配列の１４１番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
２６．配列番号２６に示す塩基配列の１３７番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
２７．配列番号２７に示す塩基配列の３４４番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
２８．配列番号２８に示す塩基配列の２４６番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
２９．配列番号２９に示す塩基配列の１０８番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
３０．配列番号３０に示す塩基配列の６９番目から７２番目の塩基が「ＴＡＡＴ」であるかまたは「欠失」であるかにより表される挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３１．配列番号３１に示す塩基配列の６２番目の塩基が「Ｔ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
３２．配列番号３２に示す塩基配列の１５６番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
３３．配列番号３３に示す塩基配列の６６９番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
３４．配列番号３４に示す塩基配列の１８３番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
３５．配列番号３５に示す塩基配列の８９番目から９０番目の塩基が「ＧＡ」であるかまたは「欠失」であるかにより表される挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３６．配列番号３６に示す塩基配列の２７番目から２８番目の塩基が「ＡＧ」であるかまたは「欠失」であるかにより表される挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３７．配列番号３７に示す塩基配列の３６１番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
３８．配列番号３８に示す塩基配列の１３９番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
３９．配列番号３９に示す塩基配列の３２０番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型、
４０．配列番号４０に示す塩基配列の２６５番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
４１．配列番号４１に示す塩基配列の３３７番目の塩基が「Ａ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
４２．配列番号４２に示す塩基配列の３１２番目の塩基が「Ａ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型、
４３．配列番号４３に示す塩基配列の１６０番目の塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型、
４４．配列番号４４に示す塩基配列の３１４番目の塩基が「Ｔ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型。
【００１３】
（３）遺伝子多型を指標として被験牛のＤＮＡを分析し、指標とした多型を判定する前記工程が、各多型を含むＤＮＡ断片を遺伝子増幅法により増幅し、指標とした多型を判定する工程である、前記（１）または（２）の牛の個体識別法または親子鑑別法。
【００１４】
（４）各多型を含むＤＮＡ断片を遺伝子増幅法により増幅する前記工程が、下記プライマーセットから選択されるプライマーセットを用いて各多型を含むＤＮＡ断片を増幅する工程である、前記（３）の牛の個体識別法または親子鑑別法：
１．配列番号１に示す塩基配列の２９１番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２．配列番号２に示す塩基配列の５０５番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３．配列番号３に示す塩基配列の６４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
４．配列番号４に示す塩基配列の９３番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
５．配列番号５に示す塩基配列の２７番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号５に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
６．配列番号６に示す塩基配列の１４７番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号６に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
７．配列番号７に示す塩基配列の１１３番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号７に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
８．配列番号８に示す塩基配列の５９４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号８に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
９．配列番号９に示す塩基配列の４７番目から５０番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号９に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１０．配列番号１０に示す塩基配列の４４６番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１０に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１１．配列番号１１に示す塩基配列の１８５番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１２．配列番号１２に示す塩基配列の１９４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１３．配列番号１３に示す塩基配列の１４３番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１４．配列番号１４に示す塩基配列の２０６番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１５．配列番号１５に示す塩基配列の２１７番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１５に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１６．配列番号１６に示す塩基配列の１３０番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１６に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１７．配列番号１７に示す塩基配列の２２１番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１７に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１８．配列番号１８に示す塩基配列の３８２番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１８に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
１９．配列番号１９に示す塩基配列の１４８番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１９に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２０．配列番号２０に示す塩基配列の１７９番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２０に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２１．配列番号２１に示す塩基配列の１２９番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２２．配列番号２２に示す塩基配列の１５１番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２３．配列番号２３に示す塩基配列の２５２番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２４．配列番号２４に示す塩基配列の２７１番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２５．配列番号２５に示す塩基配列の１４１番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２５に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２６．配列番号２６に示す塩基配列の１３７番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２６に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２７．配列番号２７に示す塩基配列の３４４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２７に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２８．配列番号２８に示す塩基配列の２４６番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２８に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
２９．配列番号２９に示す塩基配列の１０８番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２９に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３０．配列番号３０に示す塩基配列の６９番目から７２番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３０に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３１．配列番号３１に示す塩基配列の６２番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３２．配列番号３２に示す塩基配列の１５６番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３３．配列番号３３に示す塩基配列の６６９番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３４．配列番号３４に示す塩基配列の１８３番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３５．配列番号３５に示す塩基配列の８９番目から９０番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３５に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３６．配列番号３６に示す塩基配列の２７番目から２８番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３６に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３７．配列番号３７に示す塩基配列の３６１番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３７に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３８．配列番号３８に示す塩基配列の１３９番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３８に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
３９．配列番号３９に示す塩基配列の３２０番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３９に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
４０．配列番号４０に示す塩基配列の２６５番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４０に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
４１．配列番号４１に示す塩基配列の３３７番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
４２．配列番号４２に示す塩基配列の３１２番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
４３．配列番号４３に示す塩基配列の１６０番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット、
４４．配列番号４４に示す塩基配列の３１４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセット。
【００１５】
各多型を含むＤＮＡ断片を遺伝子増幅法により増幅する前記工程が、下記ポリヌクレオチドの組み合わせから選択されるプライマーセットを用いて各多型を含むＤＮＡ断片を増幅する工程である、前記（３）の牛の個体識別法または親子鑑別法：
１．配列番号５３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号５４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２．配列番号５５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号５６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３．配列番号５７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号５８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４．配列番号５９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
５．配列番号６１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
６．配列番号６３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
７．配列番号６５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
８．配列番号６７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号６８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
９．配列番号６９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１０．配列番号７１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１１．配列番号７３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１２．配列番号７５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１３．配列番号７７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号７８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１４．配列番号７９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１５．配列番号８１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１６．配列番号８３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１７．配列番号８５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１８．配列番号８７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
１９．配列番号８９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２０．配列番号９１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２１．配列番号９３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２２．配列番号９５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２３．配列番号９７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号９８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２４．配列番号９９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１００に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２５．配列番号１０１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１０２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２６．配列番号１０３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１０４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２７．配列番号１０５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１０６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２８．配列番号１０７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１０８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
２９．配列番号１０９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３０．配列番号１１１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３１．配列番号１１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３２．配列番号１１５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３３．配列番号１１７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３４．配列番号１１９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３５．配列番号１２１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３６．配列番号１２３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３７．配列番号１２５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３８．配列番号１２７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
３９．配列番号１２９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４０．配列番号１３１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４１．配列番号１３３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４２．配列番号１３５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４３．配列番号１３７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１３８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ、
４４．配列番号１３９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１４０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ。
【００１６】
（６）牛が黒毛和種牛である、前記（１）から（５）のいずれかの牛の個体識別法または親子鑑別法。
【００１７】
（７）前記４４種の遺伝子多型から選ばれるいずれか１の多型の、牛の個体識別用または親子鑑別用マーカーとしての使用。
【００１８】
（８）前記ポリヌクレオチドの組み合わせから選択されるいずれか１の組み合わせ。
【００１９】
（９）前記ポリヌクレオチドの組み合わせから選択されるいずれか１の組み合わせを少なくとも含む試薬キット。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、牛、特に黒毛和種牛の個体識別と親子鑑別に有用な遺伝子多型マーカー、具体的には一塩基多型マーカーおよび挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型マーカーを提供できる。また、本発明によれば、被験牛のＤＮＡを分析してこれら多型マーカーを判定する工程を含むことを特徴とする、牛、特に黒毛和種牛の個体識別法および親子鑑別法を提供できる。本発明に係る牛の個体識別法および親子鑑別法により、牛生体より採取した試料や牛から製造した精肉より採取した試料について、正確、安価、かつ迅速に個体識別および親子鑑別を実施できる。このように本発明は、食品の安全性や信頼性を確保する手段として、食品のトレーサビリティーの確立に極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、遺伝子多型を指標として被験牛のＤＮＡを分析し、指標とした多型を判定する工程を含むことを特徴とする、牛の個体識別法および親子鑑別法に関する。個体識別とは対象集団に含まれる個体を区別することをいう。親子鑑別とは、ある個体の生物学上の父または母を決定的な確率で判定することをいう。
【００２２】
本発明に係る牛の個体識別法および親子鑑別法は、好ましくは黒毛和種牛（以下、単に黒毛和種と称する）の個体識別法および親子鑑別法に適用される。
【００２３】
本発明において見出したウシ遺伝子の遺伝子多型は４４種であり、そのうち４０種は一塩基多型であり、４種は挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型である。これら遺伝子多型は、牛の個体識別法および親子鑑別法を実施するための指標、すなわち遺伝子多型マーカーとして有用である。これら遺伝子多型はＡＦＬＰ法を利用して９１頭の黒毛和種のゲノムＤＮＡを解析することにより見出した。ＡＦＬＰ法は、２種類の制限酵素で切断したゲノムＤＮＡに各制限酵素特有のアダプターを付加したものを増幅のための鋳型ＤＮＡとし、３´末端に任意の塩基を付加した選択的プライマーを用いて増幅することに基づいており、以下のような利点を持っている。（１）必要とするゲノムＤＮＡの量が少なくてすむ。５００ｎｇのゲノムＤＮＡで理論的には１万回以上の電気泳動が可能である。（２）ゲノムＤＮＡの塩基配列に関する情報が必要でない。（３）操作が簡便で、再現性が高い。（４）１回の電気泳動で多くの多型バンドを検出できる。（５）プライマーの組み合わせを変えることにより多数のバンド検出が可能。（６）３つの選択的塩基を用いることにより、同じ鋳型ＤＮＡに対して４６＝４０９６のプライマーセットが使用できる。また本法は、これらの利点のため、遺伝的類縁関係、ＱＴＬ解析等の幅広い研究に応用されている。このＡＦＬＰ法を用いることにより、各ＳＮＰｓの集団内における対立遺伝子頻度を予測することが可能となり、遺伝的情報量の高い有用なマーカーをより効率よく探索することが可能である。
【００２４】
遺伝子多型とは、ある生物種集団の遺伝子を構成しているＤＮＡ配列において突然変異等により生じた個体間の多様性をいう。一塩基多型とは、ある生物種集団のゲノム塩基配列において一塩基が変異（核酸塩基の置換）したことによるＤＮＡ配列の多様性をいう。挿入欠失多型とは、ある生物種集団のゲノム塩基配列において短い核酸塩基の挿入・欠失により生じたＤＮＡ配列の多様性をいう。多型の判定とは、多型部位における核酸塩基の種類や挿入欠失の有無を決定することをいう。ここで、核酸塩基の表示はＩＵＰＡＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に規定された表示に従い、「Ａ」はアデニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、および「Ｔ」はチミンである。
【００２５】
本発明に係る牛の個体識別法および親子鑑別法は、下記４４種の遺伝子多型から選ばれる多型を指標にして被験牛のＤＮＡを分析し、指標とした多型を判定する工程を含むことを特徴とする：
１．配列番号１に示す塩基配列の２９１番目の塩基における一塩基多型、
２．配列番号２に示す塩基配列の５０５番目の塩基における一塩基多型、
３．配列番号３に示す塩基配列の６４番目の塩基における一塩基多型、
４．配列番号４に示す塩基配列の９３番目の塩基における一塩基多型、
５．配列番号５に示す塩基配列の２７番目の塩基における一塩基多型、
６．配列番号６に示す塩基配列の１４７番目の塩基における一塩基多型、
７．配列番号７に示す塩基配列の１１３番目の塩基における一塩基多型、
８．配列番号８に示す塩基配列の５９４番目の塩基における一塩基多型、
９．配列番号９に示す塩基配列の４７番目から５０番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
１０．配列番号１０に示す塩基配列の４４６番目の塩基における一塩基多型、
１１．配列番号１１に示す塩基配列の１８５番目の塩基における一塩基多型、
１２．配列番号１２に示す塩基配列の１９４番目の塩基における一塩基多型、
１３．配列番号１３に示す塩基配列の１４３番目の塩基における一塩基多型、
１４．配列番号１４に示す塩基配列の２０６番目の塩基における一塩基多型、
１５．配列番号１５に示す塩基配列の２１７番目の塩基における一塩基多型、
１６．配列番号１６に示す塩基配列の１３０番目の塩基における一塩基多型、
１７．配列番号１７に示す塩基配列の２２１番目の塩基における一塩基多型、
１８．配列番号１８に示す塩基配列の３８２番目の塩基における一塩基多型、
１９．配列番号１９に示す塩基配列の１４８番目の塩基における一塩基多型、
２０．配列番号２０に示す塩基配列の１７９番目の塩基における一塩基多型、
２１．配列番号２１に示す塩基配列の１２９番目の塩基における一塩基多型、
２２．配列番号２２に示す塩基配列の１５１番目の塩基における一塩基多型、
２３．配列番号２３に示す塩基配列の２５２番目の塩基における一塩基多型、
２４．配列番号２４に示す塩基配列の２７１番目の塩基における一塩基多型、
２５．配列番号２５に示す塩基配列の１４１番目の塩基における一塩基多型、
２６．配列番号２６に示す塩基配列の１３７番目の塩基における一塩基多型、
２７．配列番号２７に示す塩基配列の３４４番目の塩基における一塩基多型、
２８．配列番号２８に示す塩基配列の２４６番目の塩基における一塩基多型、
２９．配列番号２９に示す塩基配列の１０８番目の塩基における一塩基多型、
３０．配列番号３０に示す塩基配列の６９番目から７２番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３１．配列番号３１に示す塩基配列の６２番目の塩基における一塩基多型、
３２．配列番号３２に示す塩基配列の１５６番目の塩基における一塩基多型、
３３．配列番号３３に示す塩基配列の６６９番目の塩基における一塩基多型、
３４．配列番号３４に示す塩基配列の１８３番目の塩基における一塩基多型、
３５．配列番号３５に示す塩基配列の８９番目から９０番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３６．配列番号３６に示す塩基配列の２７番目から２８番目の塩基における挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型、
３７．配列番号３７に示す塩基配列の３６１番目の塩基における一塩基多型、
３８．配列番号３８に示す塩基配列の１３９番目の塩基における一塩基多型、
３９．配列番号３９に示す塩基配列の３２０番目の塩基における一塩基多型、
４０．配列番号４０に示す塩基配列の２６５番目の塩基における一塩基多型、
４１．配列番号４１に示す塩基配列の３３７番目の塩基における一塩基多型、
４２．配列番号４２に示す塩基配列の３１２番目の塩基における一塩基多型、
４３．配列番号４３に示す塩基配列の１６０番目の塩基における一塩基多型、
４４．配列番号４４に示す塩基配列の３１４番目の塩基における一塩基多型。
【００２６】
配列番号１に示す塩基配列の２９１番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００２７】
配列番号２に示す塩基配列の５０５番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００２８】
配列番号３に示す塩基配列の６４番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｇ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００２９】
配列番号４に示す塩基配列の９３番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００３０】
配列番号５に示す塩基配列の２７番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｔ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００３１】
配列番号６に示す塩基配列の１４７番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００３２】
配列番号７に示す塩基配列の１１３番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ａ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表されるにおける一塩基多型である。
【００３３】
配列番号８に示す塩基配列の５９４番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００３４】
配列番号９に示す塩基配列の４７番目から５０番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「ＧＧＡＣ」であるかまたは「欠失」であるかにより表される挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型である。
【００３５】
配列番号１０に示す塩基配列の４４６番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００３６】
配列番号１１に示す塩基配列の１８５番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００３７】
配列番号１２に示す塩基配列の１９４番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００３８】
配列番号１３に示す塩基配列の１４３番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００３９】
配列番号１４に示す塩基配列の２０６番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００４０】
配列番号１５に示す塩基配列の２１７番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００４１】
配列番号１６に示す塩基配列の１３０番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００４２】
配列番号１７に示す塩基配列の２２１番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００４３】
配列番号１８に示す塩基配列の３８２番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００４４】
配列番号１９に示す塩基配列の１４８番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００４５】
配列番号２０に示す塩基配列の１７９番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｔ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００４６】
配列番号２１に示す塩基配列の１２９番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ａ」であるかまたは「Ｇ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００４７】
配列番号２２に示す塩基配列の１５１番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００４８】
配列番号２３に示す塩基配列の２５２番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００４９】
配列番号２４に示す塩基配列の２７１番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００５０】
配列番号２５に示す塩基配列の１４１番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００５１】
配列番号２６に示す塩基配列の１３７番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００５２】
配列番号２７に示す塩基配列の３４４番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００５３】
配列番号２８に示す塩基配列の２４６番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００５４】
配列番号２９に示す塩基配列の１０８番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００５５】
配列番号３０に示す塩基配列の６９番目から７２番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「ＴＡＡＴ」であるかまたは「欠失」であるかにより表される挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型である。
【００５６】
配列番号３１に示す塩基配列の６２番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｔ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００５７】
配列番号３２に示す塩基配列の１５６番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００５８】
配列番号３３に示す塩基配列の６６９番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００５９】
配列番号３４に示す塩基配列の１８３番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００６０】
配列番号３５に示す塩基配列の８９番目から９０番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「ＧＡ」であるかまたは「欠失」であるかにより表される挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型である。
【００６１】
配列番号３６に示す塩基配列の２７番目から２８番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「ＡＧ」であるかまたは「欠失」であるかにより表される挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型である。
【００６２】
配列番号３７に示す塩基配列の３６１番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００６３】
配列番号３８に示す塩基配列の１３９番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００６４】
配列番号３９に示す塩基配列の３２０番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｔ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００６５】
配列番号４０に示す塩基配列の２６５番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００６６】
配列番号４１に示す塩基配列の３３７番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ａ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００６７】
配列番号４２に示す塩基配列の３１２番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ａ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００６８】
配列番号４３に示す塩基配列の１６０番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｇ」であるかまたは「Ａ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００６９】
配列番号４４に示す塩基配列の３１４番目の塩基における一塩基多型は、好ましくは該塩基が「Ｔ」であるかまたは「Ｃ」であるかにより表される一塩基多型である。
【００７０】
本発明に係る牛の個体識別法および親子鑑別法は、上記４４種の遺伝子多型のうち、少なくとも１０種以上、好ましくは１２種以上、より好ましくは１４種以上、さらに好ましは１７種以上、さらにより好ましくは２０種以上の多型を指標として実施できる。
【００７１】
個体識別において指標とする遺伝子多型の種類や数は、各多型の遺伝子型頻度に基づいて個体識別確率を算出し、高い個体識別確率が得られる多型の種類や数を選択することにより決定できる。個体識別確率とは、無作為に選出された関連性の無い二個体が、全く同じ遺伝子型を持つ確率として定義される。個体識別確率の算出は、例えばＨｏｌｔら（「フォレンシック  サイエンス  インターナショナル（Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、２０００年、第１１２巻、第２−３号、ｐ．９１−１０９）の計算式に従って実施できる（実施例１参照）。本発明に係る牛の個体識別法を、上記４４種の遺伝子多型のうち、配列番号３に示す塩基配列の６４番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｇ」であるかにより表される一塩基多型を除く４３種の多型を指標として実施したときの黒毛和種の個体識別確率は１．３１×１０−１６であり、日本における黒毛和種の飼育頭数（約１６４万頭）全てを識別できる（実施例１参照）。また、上記４４種の遺伝子多型のうち、１７種の多型を指標として同様に個体識別確率を算出した結果、個体識別確率は７．２９×１０−８であり、１３７０万頭に１頭の割合で１７種の多型が一致する（実施例１参照）。このように、１７種の遺伝子多型を指標として使用した個体識別法は、個体識別確率からみて十分高い個体識別能を有する。さらに、１７種の遺伝子多型を指標として使用した場合の個体識別確率が、日本における黒毛和種の飼育頭数（約１６４万頭）全てを識別し得る確率の約１０倍であることから、２００万頭程度の個体識別は、当該１７種の遺伝子多型より少ない種類の一塩基多型を指標として使用した個体識別法によっても十分に実施し得ると考えることができる。指標とする遺伝子多型の種類は少なすぎると個体識別確率が低下することから、上記のように１０種以上、好ましくは１２種以上、より好ましくは１４種以上、さらに好ましは１７種以上、さらにより好ましくは２０種以上の多型を使用することが適当である。勿論、指標とする遺伝子多型の種類が多ければ、高い個体識別確率を得ることができる。また、飼育頭数の変化に応じて、指標とする一塩基多型の種類を増減することができる。
【００７２】
親子鑑別において指標とする遺伝子多型の種類や数は、各多型の対立遺伝子頻度に基づいて父権否定確率を算出し、高い父権否定確率が得られる多型の種類や数を選択することにより決定できる。父権否定確率とは、父牛の候補として考えられる雄牛の中から、真に父牛でない雄牛の父権が排除される確率として定義される。父権否定確率が高いほど親子鑑別の精度は高くなる。また、父権否定確率は、指標とする遺伝子多型の種類を増やすことでより高くなり、その結果親子鑑別の精度が高くなる。父権否定確率の算出は、例えば母ウシの遺伝子型が判明している場合は、Ｊａｍｉｅｓｏｎら（「へレディティ（Ｈｅｒｅｄｉｔｙ）」、１９６５年、第２０巻、ｐ．４１９−４４１；「プロシーディングス  オブ  ザ  １６ｔｈ  インターナショナル  カンファレンス  オン  アニマル  ブラッド  グループ  アンド  バイオケミカル  ポリモルフィズム，レニングラード  １９７８（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＸＶＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，  Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ  １９７８）」、１９７９年、第４巻、ｐ．２７）の計算式に従って実施でき、また、母ウシの遺伝子型が判明していない場合、Ｇｒａｂａｒ  ＆  Ｍｏｒｒｉｃｅら（「インクルージョン  プロバビリティーズ  イン  ペアレンティッジ  テスティング（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔａｇｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）」、１９８３年、ｐ．２７７−２８０）の計算式に従って実施できる（実施例１参照）。本発明に係る牛の親子鑑別法を、上記４４種の遺伝子多型のうち、配列番号３に示す塩基配列の６４番目の塩基が「Ｃ」であるかまたは「Ｇ」であるかにより表される一塩基多型を除く４３種の多型を指標として実施したときの黒毛和種の父権否定確率は、母ウシの遺伝子型が判明している場合は９９．９６５３％であり、母ウシの遺伝子型が不明の場合は９９．０６１９％であった。このことから、上記４３種の遺伝子多型を指標とする親子鑑別法は高い鑑別能を有することが判明した。牛の親子鑑別を実施する場合、好ましくは上記４３種の遺伝子多型、より好ましくは上記４４種の遺伝子多型を指標とすることが適当である。また、より高い精度で親子鑑別を行う目的で、上記４４種の遺伝子多型に加えて、他の遺伝子多型を組み合わせて指標とし、親子鑑別を実施することもできる。
【００７３】
このように、上記４４種の遺伝子多型は、牛の個体識別用または親子鑑別用マーカーとして有用である。個体識別用マーカーとは、識別対象である集団内の個体を区別し得る指標を意味する。親子鑑別用マーカーとは、ある個体の生物学上の父または母を高い確率で確率で判定し得る指標を意味する。
【００７４】
本発明は、上記４４種の遺伝子多型から選ばれるいずれか１の多型の、牛の個体識別用または親子鑑別用マーカーとしての使用を提供する。本発明に係る牛の個体識別用または親子鑑別用マーカーは、それぞれ組み合わせて使用でき、また、牛の個体識別または親子鑑別に有用な他の遺伝子多型マーカー、例えば他の一塩基多型マーカーと組み合わせて使用することができる。
【００７５】
遺伝子多型を指標とした被験牛のＤＮＡの分析は、被験牛から採取した試料（被験試料）を使用して実施できる。被験試料は、牛生体より採取した試料や牛から製造した精肉より採取した試料であって、ＤＮＡ、好ましくはゲノムＤＮＡを含む試料であればいずれも使用できる。具体的には、被験試料として、筋肉組織、内臓組織、血液、末梢血白血球、髄液、毛根細胞等を例示できる。被験試料からの核酸の調製は、自体公知の核酸調製法により実施できる。核酸試料として、ゲノムＤＮＡが好ましく使用できる。上記遺伝子多型が、タンパク質コード領域に存在するものである場合、核酸試料としてｃＤＮＡまたはＲＮＡを使用することができる。ｃＤＮＡまたはＲＮＡを用いて遺伝子多型を判定する場合は、ゲノム塩基配列において該遺伝子多型が存在する位置に対応する、ｃＤＮＡまたはＲＮＡにおける位置の塩基の決定を行なう。調製した核酸は直接使用してもよく、あるいは分析前に所望の領域をポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）またはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。
【００７６】
個体識別において、指標とした遺伝子多型の全てが複数の被験試料で一致した場合、該複数の被験試料は同一個体由来の試料である可能性が極めて高いと判定することができる。あるいは、親子鑑別において、指標とした遺伝子多型の全てが一致した場合、該指標とした遺伝子多型を有する牛は親子である可能性が極めて高いと判定することができる。
【００７７】
遺伝子多型の判定は、自体公知の方法を使用して実施できる。例えば、ＰＣＲにより、所望の多型部位を含む部分配列を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法、例えばダイレクトシークエンシング法により配列決定する方法を用いることができる。配列決定法としてはシークエンス法以外に、ハイブリダイゼーション法および制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析法等が利用できる。そのほか、一塩基多型の解析方法として、蛍光を用いる方法、例えばインベーダーアッセイ（リアミチェフ（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．）ら、「ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、第１７巻、ｐ．２９２−２９６）やルミネックス法（チェン（Ｃｈｅｎ，Ｊ．）ら、「ゲノム  リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．５４９−５５７）が知られている。また、マススペクトルを用いる方法、例えばプライマー伸張法を応用した方法を用いることもできる。このよう方法としては、ピンポイントアッセイ（ロス（Ｒｏｓｓ，Ｐ．）ら、「ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．１３４７−１３５１）やプローブ法（ブラウン（Ｂｒａｕｎ，Ａ．）ら、「クリニカル  ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第４３巻、ｐ．１１５１−１１５８）等が例示できる。さらに、ドールアッセイ（ＤＯＬ  ａｓｓａｙ、チェン（Ｃｈｅｎ，Ｘ．）ら、「プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９７年、第９４巻、ｐ．１０７５６−１０７６１）、スナイパーアッセイ（ピアテク（Ｐｉａｔｅｋ，Ａ．Ｓ．）ら、「ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．３５９−３６３）およびタグアレイ法（ファン（Ｆａｎ，Ｊ−Ｂ．）ら、「ゲノム  リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．８５３−８６０）等も使用できる。これら方法は、これらが報告されている引用文献を参照することにより容易に実施することができる。また、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）やタックマン（Ｔａｑｍａｎ）法等、一塩基多型の検出方法としてよく知られた方法を用いることができる。
【００７８】
上記４４種の遺伝子多型は、そのうち２８種が制限酵素ＴａｑＩ認識部位における一塩基多型であり、４種が制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位における一塩基多型であり、８種が３塩基選択部位における一塩基多型であり、４種が挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）多型であった（実施例１および表４−１〜４−５参照）。３塩基選択部位における８種の一塩基多型はいずれも制限酵素認識部位におけるものであった。制限酵素認識部位における一塩基多型の判定は、ＰＣＲにより所望の一塩基多型部位を含む部分配列を増幅し、得られた増幅産物について該当する制限酵素を使用してＲＦＬＰ解析法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）により解析することで簡便に実施できる。ｉｎｄｅｌの判定は、ＰＣＲにより増幅した増幅産物の断片長をアガロースやポリアクリルアミドゲル電気泳動等の公知方法で検出することにより実施できる。
【００７９】
上記４４種の各遺伝子多型を含むそれぞれのＤＮＡ断片の増幅は、配列番号１〜４４に示す塩基配列から設計されるプライマーセットを用いて実施できる。プライマーは、所望のＤＮＡ断片を、好ましくは特異的に、増幅し得るものであればよく、該ＤＮＡ断片の塩基配列、具体的には配列番号１〜４４の各塩基配列またはその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成等により作製できる。プライマーは、塩基配列長が一般的に５〜５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０〜３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５〜３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。
【００８０】
配列番号１に示す塩基配列の２９１番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号５３に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号５４に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００８１】
配列番号２に示す塩基配列の５０５番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号５５に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号５６に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００８２】
配列番号３に示す塩基配列の６４番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号５７に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号５８に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００８３】
配列番号４に示す塩基配列の９３番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号５９に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号６０に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００８４】
配列番号５に示す塩基配列の２７番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号５に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号６１に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号６２に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００８５】
配列番号６に示す塩基配列の１４７番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号６に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号６３に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号６４に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００８６】
配列番号７に示す塩基配列の１１３番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号７に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号６５に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号６６に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００８７】
配列番号８に示す塩基配列の５９４番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号８に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号６７に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号６８に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００８８】
配列番号９に示す塩基配列の４７番目から５０番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号９に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号６９に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号７０に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００８９】
配列番号１０に示す塩基配列の４４６番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１０に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号７１に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号７２に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００９０】
配列番号１１に示す塩基配列の１８５番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号７３に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号７４に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００９１】
配列番号１２に示す塩基配列の１９４番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号７５に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号７６に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００９２】
配列番号１３に示す塩基配列の１４３番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号７７に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号７８に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００９３】
配列番号１４に示す塩基配列の２０６番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号７９に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号８０に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００９４】
配列番号１５に示す塩基配列の２１７番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１５に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号８１に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号８２に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００９５】
配列番号１６に示す塩基配列の１３０番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１６に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号８３に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号８４に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００９６】
配列番号１７に示す塩基配列の２２１番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１７に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号８５に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号８６に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００９７】
配列番号１８に示す塩基配列の３８２番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１８に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号８７に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号８８に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００９８】
配列番号１９に示す塩基配列の１４８番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１９に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号８９に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号９０に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【００９９】
配列番号２０に示す塩基配列の１７９番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２０に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号９１に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号９２に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１００】
配列番号２１に示す塩基配列の１２９番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号９３に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号９４に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１０１】
配列番号２２に示す塩基配列の１５１番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号９５に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号９６に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１０２】
配列番号２３に示す塩基配列の２５２番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号９７に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号９８に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１０３】
配列番号２４に示す塩基配列の２７１番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号９９に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１００に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１０４】
配列番号２５に示す塩基配列の１４１番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２５に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１０１に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１０２に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１０５】
配列番号２６に示す塩基配列の１３７番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２６に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１０３に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１０４に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１０６】
配列番号２７に示す塩基配列の３４４番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２７に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１０５に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１０６に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１０７】
配列番号２８に示す塩基配列の２４６番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２８に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１０７に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１０８に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１０８】
配列番号２９に示す塩基配列の１０８番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２９に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１０９に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１１０に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１０９】
配列番号３０に示す塩基配列の６９番目から７２番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３０に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１１１に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１１２に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１１０】
配列番号３１に示す塩基配列の６２番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１１３に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１１４に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１１１】
配列番号３２に示す塩基配列の１５６番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１１５に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１１６に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１１２】
配列番号３３に示す塩基配列の６６９番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１１７に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１１８に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１１３】
配列番号３４に示す塩基配列の１８３番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１１９に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１２０に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１１４】
配列番号３５に示す塩基配列の８９番目から９０番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３５に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１２１に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１２２に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１１５】
配列番号３６に示す塩基配列の２７番目から２８番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３６に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１２３に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１２４に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１１６】
配列番号３７に示す塩基配列の３６１番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３７に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１２５に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１２６に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１１７】
配列番号３８に示す塩基配列の１３９番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３８に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１２７に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１２８に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１１８】
配列番号３９に示す塩基配列の３２０番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３９に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１２９に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１３０に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１１９】
配列番号４０に示す塩基配列の２６５番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４０に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１３１に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１３２に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１２０】
配列番号４１に示す塩基配列の３３７番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４１に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１３３に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１３４に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１２１】
配列番号４２に示す塩基配列の３１２番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４２に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１３５に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１３６に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１２２】
配列番号４３に示す塩基配列の１６０番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４３に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１３７に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１３８に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１２３】
配列番号４４に示す塩基配列の３１４番目の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅用プライマーセットとして、該塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号４４に示す塩基配列に基づいて設計されたプライマーセットを挙げることができる。具体的には、配列番号１３９に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１４０に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせを好ましく例示できる。
【０１２４】
上記プライマーセットはいずれも試薬として使用できる。また、これらプライマーセットの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも本発明の範囲に包含される。本試薬キットは、遺伝子多型検出用の標識物質、緩衝液、並びに塩等、測定の実施に必要とされる物質をさらに含むことができる。またさらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質、例えばポリヌクレオチドに応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。このような試薬および試薬キットは本発明に係る牛の個体識別法および親子鑑別法に好ましく使用される。
【実施例１】
【０１２５】
黒毛和種における個体識別と親子鑑別に有用なDNAマーカーの探索を、AFLP法を利用して実施した。また、開発されたマーカーの有効度の評価を、推定された遺伝子頻度よりその鑑別能を計算することにより行った。
【０１２６】
［材料と方法］
供試動物
黒毛和種111頭を実験に供した。1992年に開催された第6回全国和牛能力共進会出品牛のうち同一県、同一種雄牛にまたがらないように選んだ20頭分の肝臓サンプルと、2002年に開催された第8回全国和牛能力共進会出品牛のうちなるべく出品県の偏りがないように選んだ91頭分の肝臓サンプルを用いた。
【０１２７】
肝臓組織からのゲノムDNAの精製
組織からのゲノムDNAは以下のように抽出した。組織約1.0gをホモジナイザーでホモジナイズし、TNE溶液（10mM Tris-HCl pH7.5, 0.1M NaCl, 1mM EDTA）20mlを加えながらガーゼを用いて濾過し、3,000rpmで10分間遠心分離した。その後上清を除き、TNE溶液を15ml加え良く混和して、再び3,000rpmで10分間遠心分離し上清を除いた。そして生理食塩水/EDTA（0.16M NaCl, 1mM EDTA）1mlに良く混和し、ザルコシル溶液（0.5% N-lauroylsarcosine sodium salt, 10mM Tris-HCl pH8.0, 10mM EDTA）15mlを加えてDNAを切断しないようにゆっくりと振とうしてDNAを溶出させた。そしてProteinase K溶液（10mg/ml in water）200μlを加え、37℃で一晩インキュベートした。当量のTE-フェノール（フェノールを60℃で溶かし、0.1％になるように8-hydroxyquinolineを加え、TE buffer（10mM Tris-HCl;pH8.0, 1mM EDTA）で水飽和したもの）を加え10分間ゆっくりと混和した。3,000rpmで10分間遠心分離し、水層とフェノール層の間にできる蛋白質を取らないように水層を分取した。この水層にフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール（25:24:1, 0.05%の8-hydroxyquinoiineを含む）を加え、10分間遠心分離し水層を分取した。この水層に当量のクロロフォルム・イソアミルアルコール（24:1）を加え10分間混和した後、3,000rpmで5分間遠心分離した。次に水層を分取し、当量のジエチルエーテルを加え、白色になった水層が透明になるまでやや強めに振とうした後3,000rpmで数秒間遠心分離し、エーテルを通風除去した。そして10分の1量の3M酢酸ナトリウム溶液（酢酸でpH5.2に調整）を加え、-20℃で冷却した100％エタノールを2倍量混合しDNAを沈殿させた。そのDNAは70％エタノールで洗浄し室温で乾燥させた後、2mlのTE bufferに溶解して4℃で保存した。
【０１２８】
DNAの定量
DNAの定量は260nmの吸光度の測定で行った。OD260=1.00は2本鎖のDNAが50μg/mlの濃度に相当する。また同時に280nmの吸光度も測定し、OD260/OD280比が1.8±0.1であれば、蛋白質、界面活性剤、フェノール等の不純物のない純度の高いDNAを回収できたとみなした。
【０１２９】
AFLP法
多型バンドの検出にはAFLP法を用いた。AFLP法における操作は、基本的には、Vosら（「ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucleic Acids Research）」、1995年、第23巻、第21号、p.4407-4414）の方法に従って行った。図１にその概要を示した。方法の詳細については以下に示す。
【０１３０】
１）制限酵素によるDNAの切断
500ngのDNAをフリークエントカッターであるTaqIとレアカッターであるEcoRIの組み合わせで切断した。各制限酵素はそれぞれ特有の塩基配列を認識して切断する。制限酵素認識部位の塩基配列については表１に示した。EcoRIとTaqIは共に、二本鎖DNAを切断した際に突出末端を形成する。
【０１３１】
【表１】
2009219451.tif 000002
【０１３２】
具体的にはまず、超純水1.0μl、10×制限酵素buffer 2.5μl、10×BSA（Bovine Serum Albumin） 1.0μl、TaqI（10unit/μl）0.5μl、DNA溶液 20μlをよく混和し、65℃で1時間インキュベートした。その後、超純水12.5μl、10×制限酵素buffer 1.5μl、EcoRI（10unit/μl）1.0μlを加えてよく混和し、37℃で1時間インキュベートした。
【０１３３】
２）アダプターの付加
制限酵素で処理した断片にTaqIアダプターとEcoRIアダプターを付加した。アダプター配列については、表２に示した。各アダプターは一本鎖のDNAをアニーリングさせて、二本鎖にすることにより作成した。一本鎖の溶液 100pmol/μl等量ずつをよく混和し、65℃のウォーターバスで温浴後、電源を切り、一晩放置して二本鎖にした。
【０１３４】
【表２】
2009219451.tif 000003
【０１３５】
表２において、各プライマーの3'末端におけるNは選択的塩基を示し、A,C,G,Tのうち任意の塩基が入る。
【０１３６】
DNA溶液 40μlに、10×ligase buffer 1.0μl、1mM ATP 1.0μl、TaqIアダプター 50pmol、EcoRIアダプター 5.0pmol、T4 DNA ligase（7.5unit/μl）0.2μlを含む10μlの溶液を加えて全量を50μlとし、37℃で3時間インキュベートした。その後、10ｍM Tris-HCl/0.1mM EDTA（pH8.0）で10倍に希釈し、これをPCRのための鋳型DNAとした。また、得られた産物は-20℃で保存した。
【０１３７】
３）1st PCR（Pre-amplification PCR）
アダプターを付加した鋳型DNA 5.0μlに、10×PCR buffer（100mM Tris-HCl, 15mM MgCl2, 500mM KCl ; pH8.6）5.0μl、dNTP Mixture（各2.5mM）4.0μl、TaKaRa Ex TaqTM Hot Start Version（5unit/μl）0.2μl、1つの塩基を付加させたアダプターに特異的に結合するTaqIプライマーとEcoRIプライマーをそれぞれ75ngずつ加えて超純水で全量を50μlとして反応を行った。反応はサーマルサイクラーを用い、以下の条件により Pre-amplificationを行った。まず94℃ 30秒間、56℃ 1分間、72℃ 1分間を20サイクル行い、その後72℃ 10分間の伸長反応を行った。PCR反応後、超純水により10倍に希釈した。その後、PCR産物は-20℃で保存した。
【０１３８】
４）2nd PCR（Selective-amplification PCR）
Pre-amplification PCRで得られた産物に、3塩基を付加させたTaqIプライマーとEcoRIプライマーを加えて増幅した。PCR産物 5.0μl、10×PCR buffer 2.0μl、dNTP Mixture 1.6μl、TaKaRa Ex TaqTM Hot Start Version 0.08μl、3塩基を付加させたTaqIプライマー 30ngとEcoRIプライマー 5ngをそれぞれ加え、超純水で全量を20μlとして反応を行った。加えるプライマーは付加されたアダプターの種類に従った。反応はサーマルサイクラーを用いた。条件は、94℃ 30秒間、65℃ 30秒間、72℃ 1分間を1サイクルとして13サイクル繰り返した。さらに94℃ 30秒間、56℃ 30秒間、72℃ 1分間のサイクルを23サイクル繰り返した。その際に、1サイクルごとに0.7℃ずつ温度を下げるタッチダウンを行った。そして、反応後はStop/Loading buffer（100ml中に95％ Formamid 95ml, 1M EDTA 2ml, 超純水 3ml, Xylen Cyanol FF 0.1g, Bromophenol Blue 0.1g）を8μl加え、混合した。1st amplificationプライマーおよび2nd amplificationプライマーの配列は表２に示した。
【０１３９】
５）バンドの検出
AFLP法で増幅されたバンドの検出には銀染色法を用いた。銀染色法にはSILVER SEQUENCETM DNA Staining Reagents（Promega, Tokyo, Japan）を用いた。方法はプロトコールに従った。
【０１４０】
ゲル溶液の作成は、尿素 35g、10×TBE（1L中にTris 108g, Boric Acid 55g, Na3EDTA・２H2O 9.3g）10ml、Long Rangerregistered TM Gel Solution 10 ml、これに超純水を加えてよく撹拌し、尿素が完全に溶けた後、超純水を加えて全量を70mlにした。この溶液を0.45μmのフィルターで濾過し、10分間脱気した。これに10％APS 350μl、TEMED 35μlを加え、ゲル板にゆっくり流し込み、上部にコームを差し込み2時間以上放置した。電気泳動は、スラブ型電気泳動装置を用いた。bufferには0.6×TBEを使用し、1,800Vで2時間行った。
【０１４１】
電気泳動後、ゲル板をはがし染色した。染色には、10%酢酸溶液 500μl（停止液）、1g AgNO3・37% Formaldehyde 1L（染色液）、30g NaCO3 1L（現像液）を用いた。また現像液は氷上に保存し、使用する直前に37% Formaldehyde 1.5mlとSodium Thiosulfate 200μlを加えた。
【０１４２】
ゲル板をトレイに入れ、停止液を加え、20分間振とうした。その後、超純水で3回洗浄し、染色液にゲル板を浸し、30分間振とうした。染色が終わったゲル板は、銀が落ちすぎない程度に超純水に軽く浸し、すばやく現像液に浸し、バンドが現れるまで振とうした。その後、適度なところで停止液を加えて反応を止めた後、超純水で再び洗浄し、DNAバンドを観察した。
【０１４３】
AFLP多型断片の抽出
銀染色法により検出されたAFLP多型断片を超純水でよく拭いたメスを用いてポリアクリルアミドゲルから切り出した。その後、TE buffer 20.0μlに浸し、ゲル切片からAFLP多型断片を浸出させた。そのDNA溶液を鋳型としてSelective-amplification PCRを行い、40%グリセロール液（40% グリセロール, 0.25% Bromophenol Blue, 0.25% Xylene Cyanol FF）を加えて1.5%アガロースゲル（アガロース S 60mg, 1×TBE buffer 40ml, エチジウムブロマイド溶液（10mg/ml in water）2.0μl）で100Vにて20分間電気泳動した。その後UV照射下でゲルを切り出し、1.5mlチューブに移し、ゲル回収を行った。アガロースゲルからのDNAバンドの回収はUltra CleanTM 15 DNA Purification Kit（Mo Bio Laboratories, Inc. Carlsbad, CA,USA）を用いた。全ての手順はプロトコールに従った。抽出したDNAは超純水15μlに溶解した。
【０１４４】
AFLP多型断片の塩基配列決定
キャピラリーシーケンサーにより、得られた多型断片の塩基配列を決定した。
【０１４５】
最初に、AFLP多型断片の抽出により得られたDNAをNano Drop ND-1000（NanoDrop Technologies, Wilmington DE, USA）を用いて濃度を測定した。濃度を測定したDNAは10〜20 ng/μlになるように調整し、シーケンス反応の鋳型DNAとした。鋳型DNAを1.0μl、Ready Reaction Premixを2.0μl、BigDye Sequencing Bufferを3.0 μl、プライマー3.2 μl（1.0pmol）、滅菌超純水で全量が20μlになるよう混合して反応を行った。この作業は遮光して行った。反応はサーマルサイクラーを用い、以下の条件で行った。まず94℃ 1分間の熱変性の後、96℃ 10秒間、アニーリング温度 5秒間、60℃ 4分間を25サイクル行い、4℃で保存した。
【０１４６】
次に、反応させた産物からより正確なデータをよみとるため、未反応の蛍光ターミネーターを除去するEthanol/EDTA沈殿法を行うことによりシーケンス産物の精製を行った。BigDyeregistered TM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitのプロトコールに従い、まずシーケンス産物に125mM EDTAを5μl、100％エタノールを60μl加えて4回転倒混和し、室温で15分間インキュベートした。次に、室温で14,000rpm、25分間遠心分離し、上清を除いた（このとき沈殿は見えない）。さらに、70％エタノールを60μl加え数回転倒混和し、再び室温で14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を除いた。これを15分間室温で風乾させた。乾燥した状態では遮光するよう注意した。実験を中断する時はこの状態で遮光し4℃で保存した。次に沈殿にインジェクションバッファー（Hi-Diホルムアミド）を20μl加えて4分間vortexし沈殿を溶解させた。この溶液を95℃、２分間のボイルにかけ、すぐに氷上で5分間冷却した。これをキャピラリーシーケンサー用の96ウェルプレートに全量移しキャピラリーシーケンサー ABI PRISMregistered TM 3100 Genetic Analyzer（Applied Biosystems, Tokyo, Japan）にセットし、塩基配列を決定した。
【０１４７】
多型部位の特定
多型部位は、EcoRI、TaqIの制限酵素認識部位、3塩基選択部位、そしてAFLP多型断片内の挿入欠失（indel）である可能性がある。制限酵素認識部位や3塩基選択部位における変異は、AFLP断片内の塩基配列決定では同定することができない。これら変異を同定するためにはAFLP断片の外側周辺の塩基配列が必要となる。多型部位や外側周辺の塩基配列の特定はウシゲノム配列に対するBLAST相同検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.shtml）により行った。またAFLP断片から多型部位が特定できなかった場合、AFLP断片の得られなかった個体サンプルの塩基配列を決定することにより多型部位を特定した。
【０１４８】
遺伝子型判定
塩基配列の比較により特定された変異を用いて、黒毛和種113頭の遺伝子型判定を行った。方法は変異の種類に応じてPCRもしくはPCR-RFLPを行った。PCRの条件は基本的には以下のように設定した。すなわち、94℃ 2分間後、94℃30秒間、62℃ 30秒間、72℃ 1分間を1サイクルとして35サイクル繰り返した後、72℃ 7分間の伸長反応を行った。制限酵素認識部位において特定された変異については基本的に以下のような条件で制限酵素処理を行った。すなわち、PCR産物5.0μl、10×制限酵素Buffer 1.5μl、当該の制限酵素0.25 μl、また必要であればBSA、SAM（S-Adenosyl-L-methionine）等を必要量加え、全量15.0μlになるように超滅菌水を加えた。それらを各制限酵素の適正温度でウォーターバスを用い、8時間以上インキュベートした。また、PCR産物および制限酵素断片のサイズに応じて、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲル電気泳動により検出した。
【０１４９】
SNPsマーカーを利用した個体識別確率と父権否定確率の計算
AFLP法で得られたSNPsマーカーを利用し、上記遺伝子型判定の結果得られた遺伝子型頻度および遺伝子頻度をもとに黒毛和種の個体識別確率と父権否定確率を計算した。個体識別確率（PI）の計算は基本的には数式(a)に示したHoltら（「フォレンシック  サイエンス  インターナショナル（Forensic Science International）」、2000年、第112巻、第2-3号、p.91-109）の計算式に従った。数式(a)において、pp、pq、およびqqは各SNPsマーカーで得られた遺伝子型頻度の値を示す。
【０１５０】
【数１】
2009219451.tif 000004
【０１５１】
また、父権否定確率(PE)の計算については基本的には数式(b)および数式(c)に示した計算式に従った。式(b)および式(c)において、piおよびpｊは各SNPsマーカーで得られた対立遺伝子頻度の値を示す。
【０１５２】
【数２】
2009219451.tif 000005
【０１５３】
【数３】
2009219451.tif 000006
【０１５４】
すなわち、母ウシの遺伝子型が判明している場合、Jamiesonら（「へレディティ（Heredity）」、1965年、第20巻、p. 419-441)；「プロシーディングス  オブ  ザ  １６ｔｈ  インターナショナル  カンファレンス  オン  アニマル  ブラッド  グループ  アンド  バイオケミカル  ポリモルフィズム，レニングラード  １９７８（Proceedings of the XVIth International Conference on Animal Blood Groups and Biochemical Polymorphism, Leningrad 1978）」、1979年、 第4巻、p. 27）の式(b)で得られる値を父権否定確率とする。また、母ウシの遺伝子型が判明していない場合、Grabar & Morriceら（「インクルージョン  プロバビリティーズ  イン  ペアレンティッジ  テスティング（Inclusion Probabilities in Parentage Testing）」、1983年、p. 277-280）の式(c)で得られる値を父権否定確率とする。
【０１５５】
［結果］
AFLP法による多型断片の検出
レアカッターのEcoRI、フリークエントカッターのTaqIによりゲノムDNAを切断してAFLP法を行った。EcoRIプライマー16種類とTaqIプライマー16種類の組み合わせにより合計220種類のプライマーセットにおいて黒毛和種における多型を調べた。まず、第6回全国和牛能力共進会出品牛から同一県、同一種雄牛に偏らないように選んだ黒毛和種20頭を供試し、AFLP多型断片を検出した。用いたプライマーセットの詳細は表３に示した。表３において塗りつぶした箇所は用いた選択的塩基の組み合わせを示す。
【０１５６】
【表３】
2009219451.tif 000007
【０１５７】
SNPsマーカーは二対立遺伝子を持つ場合、その遺伝子頻度が0.5に近いマーカーほど個体識別や親子判定において有用であると考えられる。ここでは、集団内でのマイナーアリル頻度が0.3以上のSNPsマーカーを開発することを目的とし、AFLP多型断片の選択基準は、AFLP多型断片の出現頻度が65%から85%（全20頭中13頭から17頭）とした。黒毛和種20頭でのスクリーニングの結果、基準を満たす多型断片が115本得られた。基準を満たすAFLP多型断片はおよそ0.52プライマーセットにつき1本の割合で検出された。それらをTSA1-TSA115（Traseability SNPs markers from AFLP）と名付け、以降これらのSNPsマーカーへの転化を試みた。
【０１５８】
AFLP多型断片のSNPsマーカーへの転化
マーカー候補となる115本の多型断片中の変異箇所を特定するため、断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定にはキャピラリーシーケンサーを用いた。塩基配列決定の後、BLAST相同検索により断片周辺配列の同定を試みた。その結果、28本の多型バンドがTaqIの制限酵素認識部位での点突然変異、4本の多型バンドがEcoRIの制限酵素認識部位での点突然変異、8本の多型バンドが3塩基選択部位での点突然変異、4本の多型バンドが4bp以下のinsertion/deletion（indel）であった。多型の原因となる変異の同定が可能であった以上の計44本の多型バンドにおいてSNPsマーカーへの転化がなされた。また、SNPs検出のために作成したプライマー、およびアニーリング温度等についてまとめて表４−１、表４−２、表４−３、表４−４、および表４−５に示した。
【０１５９】
【表４−１】
2009219451.tif 000008
【０１６０】
【表４−２】
2009219451.tif 000009
【０１６１】
【表４−３】
2009219451.tif 000010
【０１６２】
【表４−４】
2009219451.tif 000011
【０１６３】
【表４−５】
2009219451.tif 000012
【０１６４】
マーカーに転化されなかった他の71本のバンドについては、16本が多型断片から抽出したDNA濃度が非常に薄くクローニングが困難であったため塩基配列が決定されなかった。また、再増幅されたバンドについても27本がDNAの混雑や適切な濃度からの逸脱により塩基配列の解析が困難であった。塩基配列が決定され、多型の原因が特定されたバンドについても、5bp以上のindel(6)、反復配列(17)、X染色体上の変異(3)、遺伝子型判定の際に一方のアリルをホモで持つ個体が存在しない(1)、3塩基選択部位の変異であると考えられたが再現性が低い(1)等の理由から解析を断念した（括弧の中は候補バンドの本数を示す）。
【０１６５】
以下、各SNPsマーカーの変異箇所の詳細について述べる。なお、各マーカーの存在する染色体と、それらの染色体上での位置を表５−１および表５−２に示した。
【０１６６】
TSA 1：17頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第29番染色体上に存在する。内部にTaqIの制限酵素認識部位とEcoRIの制限酵素認識部位の重なる配列が存在し、その部位において(TCGAATTC)から(TCAAATTC)に点突然変異したものであった。PCR-RFLPはTaqIを用いて行った。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号１に示す。
【０１６７】
TSA2：12頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおけるX染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCAA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号２に示す。
【０１６８】
TSA 3：12頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおけるX染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TGGA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号３に示す。
【０１６９】
TSA4：15頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第21番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TTGA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号４に示す。
【０１７０】
TSA 6：15頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第15番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(CCGA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号５に示す。
【０１７１】
TSA10：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、存在する染色体は不明である。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCAA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号６に示す。
【０１７２】
TSA12：11頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第29番染色体上に存在する。3塩基選択部位において(CCT)から(CCA)に点突然変異したものであった。配列内部において3塩基選択部位の変異部分に連鎖すると考えられる変異が存在し、制限酵素BsrIの認識部位(CCAGT、AFLP断片の配列ではTがCへ点突然変異)が含まれていたため、PCR-RFLPにより遺伝子型判定を行った。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号７に示す。
【０１７３】
TSA18：17頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第3番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TTGA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号８に示す。
【０１７４】
TSA22：14頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、内部に4bpのindelが検出されたものであった。Bos taurusにおける第15番染色体上に存在する。PCRにより遺伝子型判定を行った。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号９に示す。
【０１７５】
TSA34：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第17番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCCA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号１０に示す。
【０１７６】
TSA35：14頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第29番染色体上に存在する。3塩基選択部位において(ACC)から(ATC)に点突然変異したものであった。変異部分に制限酵素HphIの認識部位(TCACC)が含まれていたため、PCR-RFLPにより遺伝子型判定を行った。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号１１に示す。
【０１７７】
TSA36：15頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第28番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCCA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号１２に示す。
【０１７８】
TSA37：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第8番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCAA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号１３に示す。
【０１７９】
TSA38：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、存在する染色体は不明である。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCTA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号１４に示す。
【０１８０】
TSA39：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第5番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCAA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号１５に示す。
【０１８１】
TSA40：15頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第7番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCAA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号１６に示す。
【０１８２】
TSA43：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第21番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TTGA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号１７に示す。
【０１８３】
TSA44：14頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第21番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCAA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号１８に示す。
【０１８４】
TSA45：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、存在する染色体は不明である。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TTGA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号１９に示す。
【０１８５】
TSA48：15頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第10番染色体上に存在する。EcoRIの制限酵素認識部位において(GAATTC)から(GAATCC)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号２０に示す。
【０１８６】
TSA49：14頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第19番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCGG)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号２１に示す。
【０１８７】
TSA55：14頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第22番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCAA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号２２に示す。
【０１８８】
TSA57：13頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第9番染色体上に存在する。3塩基選択部位において(AGG)から(AGA)に点突然変異したものであった。変異部分に制限酵素Hpy188Iの認識部位(TCNGA)が含まれていたため、PCR-RFLPにより遺伝子型判定を行った。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号２３に示す。
【０１８９】
TSA59：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第16番染色体上に存在する。3塩基選択部位において(ACG)から(ATG)に点突然変異したものであった。変異部分に制限酵素Nla3の認識部位(CATG)が含まれていたため、PCR-RFLPにより遺伝子型判定を行った。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号２４に示す。
【０１９０】
TSA60：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第24番染色体上に存在する。3塩基選択部位において(ACG)から(ACA)に点突然変異したものであった。近隣部に、この変異と連鎖していると考えられる変異が存在し、その変異部分に制限酵素RsaIの認識部位(CATG)が含まれていたため、PCR-RFLPにより遺伝子型判定を行った。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号２５に示す。
【０１９１】
TSA63：14頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第23番染色体上に存在する。EcoRIの制限酵素認識部位において(GAATTC)から(AAATTC)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号２６に示す。
【０１９２】
TSA67：17頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第16番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCAA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号２７に示す。
【０１９３】
TSA68：14頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第9番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TTGA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号２８に示す。
【０１９４】
TSA69：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第9番染色体上に存在する。EcoRIの制限酵素認識部位において(GAATTC)から(GAATTT)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号２９に示す。
【０１９５】
TSA70：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、内部に4bpのindelが検出されたものであった。Bos taurusにおける第2番染色体上に存在する。PCRにより遺伝子型判定を行った。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号３０に示す。
【０１９６】
TSA71：17頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第25番染色体上に存在する。3塩基選択部位において(ATG)から(ACG)に点突然変異したものであった。変異部分に制限酵素Nla3の認識部位(CATG)が含まれていたため、PCR-RFLPにより遺伝子型判定を行った。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号３１に示す。
【０１９７】
TSA72：13頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第24番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCTA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号３２に示す。
【０１９８】
TSA77：14頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、存在する染色体は不明である。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCAA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号３３に示す。
【０１９９】
TSA78：13頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第10番染色体上に存在する。3塩基選択部位において(AAG)から(AAC)に点突然変異したものであった。変異部分に制限酵素BspCNIの認識部位(N8CTGAG(配列番号１４１))が含まれていたため、PCR-RFLPにより遺伝子型判定を行った。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号３４に示す。
【０２００】
TSA81：15頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、内部に2bpのindelが検出されたものであった。Bos taurusにおける第16番染色体上に存在する。PCRにより遺伝子型判定を行った。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号３５に示す。
【０２０１】
TSA82：13頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、内部に2bpのindelが検出されたものであった。Bos taurusにおける第3番染色体上に存在する。PCRにより遺伝子型判定を行った。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号３６に示す。
【０２０２】
TSA84：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第17番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TTGA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号３７に示す。
【０２０３】
TSA87：15頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第16番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCAA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号３８に示す。
【０２０４】
TSA90：14頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第27番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TTGA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号３９に示す。
【０２０５】
TSA91：14頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第4番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCAA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号４０に示す。
【０２０６】
TSA92：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、存在する染色体は不明である。3塩基選択部位において(ACA)から（ACC）に点突然変異したものであった。変異部分に制限酵素MspIの認識部位(CCGG)が含まれていたため、PCR-RFLPにより遺伝子型判定を行った。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号４１に示す。
【０２０７】
TSA102：14頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第2番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(TCGC)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号４２に示す。
【０２０８】
TSA110：16頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第2番染色体上に存在する。EcoRIの制限酵素認識部位において(GAATTC)から(AAATTC)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号４３に示す。
【０２０９】
TSA113：17頭の黒毛和種から検出されたAFLP断片の配列であり、Bos taurusにおける第27番染色体上に存在する。TaqIの制限酵素認識部位において(TCGA)から(CCGA)に点突然変異したものであった。本変異部位を含むAFLP断片の塩基配列を配列番号４４に示す。
【０２１０】
【表５−１】
2009219451.tif 000013
【０２１１】
【表５−２】
2009219451.tif 000014
【０２１２】
SNPsマーカーを用いた遺伝子型判定
各SNPsマーカーを用いて黒毛和種での遺伝子型頻度および遺伝子頻度を判定した。遺伝子型判定には表４−１〜４−５で示したプライマーを利用し、PCR-RFLPあるいはPCRを行った。SNPsマーカーによる遺伝子型判別には黒毛和種111頭を用いた。結果については表６−１および表６−２に示した。表示法において、対立遺伝子PはAFLP法を行った際に多型断片が検出される配列、対立遺伝子Qは多型断片が検出されない配列を示す。また、pは対立遺伝子Pの遺伝子頻度を、qは対立遺伝子Qの遺伝子頻度を示す。AFLP法を行った個体における判定結果とRFLP遺伝子型判別の結果について比較したところ、各マーカーにつき1頭程度の不一致が見られることがあったがAFLP断片の有無の判定とSNPsの遺伝子型はほぼ一致していた。
【０２１３】
【表６−１】
2009219451.tif 000015
【０２１４】
【表６−２】
2009219451.tif 000016
【０２１５】
SNPsマーカーを利用した個体識別確率と父権否定確率の計算
AFLP法で得られたSNPsマーカーを利用し、上記遺伝子型判定の結果得られた遺伝子型頻度および遺伝子頻度をもとに黒毛和種の個体識別確率と父権否定確率を計算した。具体的には、上記44種のマーカーの中から、TSA3を除いた43種のマーカーについて、その遺伝子型頻度および遺伝子頻度から個体識別確率と父権否定確率を算出した。TSA3を取り除いた理由は、そのマーカーがX染色体上に存在し、また本研究で用いた全国和牛能力共進会出品牛が全て雄であるためである。雄のX染色体は通常1本しか存在せず、全て母親由来であり、雄親のX染色体上の遺伝子は雄の子どもには遺伝しない。そのため、同じ確率計算方法をTSA3に適用できないことから、計算時においてTSA3を除外した。なお、TSA2もTSA3と同様にX染色体上に存在するが、遺伝子型判定においてヘテロが観察されることから、その多型部位がY染色体上に相同領域を持つと考えられる。そのため、親子判定に有効であるとして確率計算に用いた。
【０２１６】
それぞれの結果については表７に示した。なお、個体識別確率（PI）とは、無作為に選出された関連性の無い二個体が、全く同じ遺伝子型を持つ確率として定義される。また、父権否定確率（PE）とは、父牛の候補として考えられる雄牛の中から、真に父牛でない雄牛の父権が排除される確率として定義される。
【０２１７】
【表７】
2009219451.tif 000017
【０２１８】
表７において、片親のみの遺伝子型が利用な場合の父権否定確率をPE1、両親の遺伝子型が利用可能な場合の父権否定確率をPE2と示す。
【０２１９】
表７に示すように、算出された個体識別確率は1.31×10-16であり、日本の黒毛和種の飼育頭数（約164万頭）全てを識別できることが判明した。
【０２２０】
また、上記44種のマーカーのうち、17種のマーカー、すなわちTSA102, TSA4, TSA55,TSA68, TSA113, TSA49, TSA78, TSA70, TSA63, TSA57, TSA72, TSA69, TSA35, TSA84, TSA10, TSA39およびTSA91を利用して、同様に個体識別確率を算出した。その結果、個体識別確率は、7.29×10-8となり、1370万頭に1頭の割合で一致する。日本の黒毛和種の飼育頭数は200万頭以下であるため、これら17種のマーカーを利用した個体識別法は、十分な個体識別能を有すると考えることができる。
【０２２１】
一方、表７に示すように、父権否定確率では、母牛の遺伝子型が入手不可能である状況下での確率（PE1）と、入手可能である状況下での確率（PE2)の2つの確率を算出した。前者の確率（PE1）は0.990619、後者の確率（PE2）は0.999653であった。上記44種のマーカーのうちTSA3を除く43種のマーカーを利用した親子鑑別法は、このように高い鑑定能を有すること考えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】AFLP法における操作の概要を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０２２３】
配列番号４５：ＥｃｏＲＩアダプターとして使用するために設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４６：ＥｃｏＲＩアダプターとして使用するために設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４７：ＴａｑＩアダプターとして使用するために設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４８：ＴａｑＩアダプターとして使用するために設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４９：ＥｃｏＲＩプライマーとして使用するために設計されたポリヌクレオチド。（１７）．．（１７）：「ｎ」は、「ａ」または「ｃ」または「ｇ」または「ｔ」であり得る。
配列番号５０：ＴａｑＩプライマーとして使用するために設計されたポリヌクレオチド。（１７）．．（１７）：「ｎ」は、「ａ」または「ｃ」または「ｇ」または「ｔ」であり得る。
配列番号５１：ＥｃｏＲＩプライマーとして使用するために設計されたポリヌクレオチド。（１７）．．（１９）：「ｎ」は、「ａ」または「ｃ」または「ｇ」または「ｔ」であり得る。
配列番号５２：ＴａｑＩプライマーとして使用するために設計されたポリヌクレオチド。（１７）．．（１９）：「ｎ」は、「ａ」または「ｃ」または「ｇ」または「ｔ」であり得る。
配列番号５３〜１４０：プライマーとして使用するために設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１４１：（１）．．（８）：「ｎ」は、「ａ」または「ｃ」または「ｇ」または「ｔ」であり得る。
【図１】
2009219451.tif 000018
【配列表】
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