(57)【要約】【課題】海洋性バクテリアを用いる毒性評価方法であって、海洋性バクテリアの発光強度の増大を抑え、被検物質が海洋性バクテリアにとって有害な物質を含む場合には、その被検物質について「毒性を有する」という評価結果を得ることができる毒性評価方法を提供すること。【解決手段】海洋性バクテリアを用いた毒性評価方法であって、海洋性バクテリアの生物活性を、被検物質、並びに、カリウム、マグネシウム、リン、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含む海洋性バクテリア活性調整物質の存在下で測定することを特徴とする毒性評価方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
海洋性バクテリアを用いた毒性評価方法であって、海洋性バクテリアの生物活性を、被検物質、並びに、カリウム、マグネシウム、リン、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含む海洋性バクテリア活性調整物質の存在下で測定することを特徴とする毒性評価方法。
【請求項２】
海洋性バクテリア活性調整物質が、カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、及びグルコースからなる群より選ばれる１種以上を含む請求項１記載の毒性評価方法。
【請求項３】
海洋性バクテリア活性調整物質が、カリウム塩を含む請求項１又は２記載の毒性評価方法。
【請求項４】
海洋性バクテリアが発光性バクテリアであり、発光性バクテリアの発光強度を測定する請求項１〜３いずれか記載の毒性評価方法。
【請求項５】
発光性バクテリアが、ビブリオ・フィシャリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）である請求項１〜４いずれか記載の毒性評価方法。
【請求項６】
被検物質が、焼却残滓である請求項１〜５いずれか記載の毒性評価方法。
【請求項７】
凍結乾燥した海洋性バクテリア及び再活性化溶液を混合し、海洋性バクテリア懸濁液を調製する工程、
焼却残滓及び抽出溶媒を混合し、焼却残滓抽出液を調製する工程、
海洋性バクテリア懸濁液及び焼却残滓抽出液を混合する工程、
を含む請求項１〜６いずれか記載の毒性評価方法。
【請求項８】
海洋性バクテリア懸濁液が、海洋性バクテリア活性調整物質を含有する請求項７記載の毒性評価方法。
【請求項９】
再活性化溶液が、海洋性バクテリア活性調整物質を含有する請求項７記載の毒性評価方法。
【請求項１０】
再活性化溶液が、さらにナトリウム塩を含有する請求項９記載の毒性評価方法。
【請求項１１】
再活性化溶液が、ナトリウム塩及びカリウム塩からなる塩の水溶液である請求項１０記載の毒性評価方法。
【請求項１２】
再活性化溶液中の海洋性バクテリア活性調整物質の濃度が、１０〜１００，０００ｍｇ／Ｌである請求項９記載の毒性評価方法。
【請求項１３】
焼却残滓抽出液が、海洋性バクテリア活性調整物質を含有する請求項７記載の毒性評価方法。
【請求項１４】
抽出溶媒が、海洋性バクテリア活性調整物質を含有する請求項７記載の毒性評価方法。
【請求項１５】
抽出溶媒中の海洋性バクテリア活性調整物質の濃度が、１０〜１００，０００ｍｇ／Ｌである請求項１４記載の毒性評価方法。
【請求項１６】
海洋性バクテリア懸濁液及び焼却残滓抽出液を混合する工程において、さらに海洋性バクテリア活性調整物質を加える請求項７記載の毒性評価方法。
【請求項１７】
生物活性を測定する際の海洋性バクテリア活性調整物質の濃度が、海洋性バクテリア懸濁液及び焼却残滓抽出液、並びに海洋性バクテリア活性調整物質を含む混合液全体に対し、５〜５０，０００ｍｇ／Ｌである請求項７〜１６いずれか記載の毒性評価方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７いずれか記載の毒性評価方法に用いられる毒性評価システムであって、海洋性バクテリアの生物活性を測定する手段を有する毒性評価システム。
【請求項１９】
さらに、得られた測定値を利用して被検物質の毒性を判定する手段を有する請求項１８記載の毒性評価システム。
【請求項２０】
請求項１〜１７いずれか記載の毒性評価方法に用いられる毒性評価用キットであって、凍結乾燥した海洋性バクテリア、再活性化溶液、焼却残滓抽出溶媒、及び海洋性バクテリア活性調整物質を備えた毒性評価用キット。
【請求項２１】
請求項１〜１７いずれか記載の毒性評価方法に用いられる毒性評価用キットであって、凍結乾燥した海洋性バクテリア、再活性化溶液、焼却残滓抽出溶媒を備え、再活性化溶液又は焼却残滓抽出溶媒が海洋性バクテリア活性調整物質を含有する毒性評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海洋性バクテリアを用いた毒性評価方法、毒性評価システム、及び毒性評価用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、土壌や焼却残滓（焼却残留物（焼却灰）及び煤塵（飛灰）を含む）の毒性を評価する方法としては、主に化学的分析方法が利用されている。この化学的分析方法は、土壌や焼却残滓に含まれる特定の毒性物質の濃度をＧＣＭＳなどにより分析する方法である。化学的分析方法によれば、含有量が微量であったとしても、土壌や焼却残滓に含まれる特定の毒性物質を検出することができるという利点を有する。しかしながら、土壌や焼却残滓中には、多種多様な毒性物質が含まれているために、この化学的分析方法によって特定の毒性物質が検出されなかったとしても、検出対象外の毒性物質の存在によって、土壌や焼却残滓が毒性を有する可能性がある。さらに、土壌や焼却残滓中には化学的分析方法では検出困難な物質が存在している可能性や、毒性物質間の相互作用により土壌や焼却残滓全体の毒性が高まっている可能性もある。つまり、化学的分析方法では、土壌や焼却残滓が生物に与える影響を総合的に評価することができない。
【０００３】
土壌や焼却残滓の毒性を評価する他の方法として、バイオアッセイによる方法がある。バイオアッセイによれば、土壌や焼却残滓が生物へ与える影響を総合的に評価することができる。バイオアッセイによる方法としては、ヒト肝臓ガン由来細胞株による細胞生存率試験、ミジンコ遊泳阻害試験、藻類生長阻害試験、海洋性発光細菌阻害試験等が知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１及び非特許文献２参照）。これらのなかでも、海洋性発光細菌阻害試験は、細胞生存率試験などと比べて、簡便である、短時間で実施することができる、大掛かりな設備を必要としないなどの利点を有する。
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−３４９４１５号公報
【非特許文献１】庄司  良、外７名、「廃棄物中の有機物の溶出試験とバイオアッセイによる有害性評価」、環境科学会誌、２００３年、第１６巻、第６号、ｐ．４７５−４８４
【非特許文献２】庄司  良、外１名、「バイオアッセイを用いた環境分析・計測の動向」、環境システム計測制御学会誌、２００４年、第９巻、第１号、ｐ．２−７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、海洋性発光細菌などの海洋性バクテリアを用いて被検物質の毒性を評価した場合に、海洋性バクテリアにとって有害な物質が被検物質に含まれているにもかかわらず、被検物質によっては海洋性バクテリアの発光強度が異常に増大し、「毒性を有する」という評価結果を得ることができないという問題があった。この問題は、特に焼却残滓の毒性を評価する際に顕著に表れた。
【０００６】
したがって、本発明は、海洋性バクテリアを用いる毒性評価方法であって、海洋性バクテリアの発光強度の増大を抑え、被検物質が海洋性バクテリアにとって有害な物質を含む場合には、その被検物質について「毒性を有する」という評価結果を得ることができる毒性評価方法を提供することを目的とする。また、本発明は、海洋性バクテリアを用いた毒性評価システムであって、海洋性バクテリアの発光強度の増大を抑え、被検物質の毒性を評価することのできる毒性評価システムを提供することを目的とする。さらに、本発明は、海洋性バクテリアを備えた毒性評価用キットであって、海洋性バクテリアの発光強度の増大を抑え、被検物質の毒性を評価することのできる毒性評価用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者らは、鋭意検討の結果、海洋性バクテリアと被検物質とを接触させた際に生じる海洋性バクテリアの生物活性の異常な高まりを抑えることのできる物質を見出し本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、海洋性バクテリアを用いた毒性評価方法であって、海洋性バクテリアの生物活性を、被検物質、並びに、カリウム、マグネシウム、リン、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含む海洋性バクテリア活性調整物質の存在下で測定することを特徴とする毒性評価方法に関する。
【０００９】
上記毒性評価方法において、海洋性バクテリア活性調整物質が、カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含むことが好ましく、カリウム塩を含むことがより好ましい。また、上記毒性評価方法において、海洋性バクテリアが発光性バクテリアであり、生物活性として発光強度を測定することが好ましい。また、好ましくは、発光性バクテリアが、ビブリオ・フィシャリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）である。
【００１０】
上記毒性評価方法における被検物質としては、例えば、焼却残滓がある。
【００１１】
上記毒性評価方法の一実施態様として、凍結乾燥した海洋性バクテリア及び再活性化溶液を混合し、海洋性バクテリア懸濁液を調製する工程、焼却残滓及び抽出溶媒を混合し、焼却残滓抽出液を調製する工程、海洋性バクテリア懸濁液及び焼却残滓抽出液を混合する工程、を含む毒性評価方法を挙げることができる。
【００１２】
海洋性バクテリア活性調整物質存在下で生物活性を測定するために、例えば、海洋性バクテリア懸濁液が海洋性バクテリア活性調整物質を含有していることが好ましく、再活性化溶液が海洋性バクテリア活性調整物質を含有していることがさらに好ましい。この場合、好ましくは、再活性化溶液に含まれる海洋性バクテリア活性調整物質の濃度が、１０〜１００，０００ｍｇ／Ｌである。
【００１３】
また、海洋性バクテリア活性調整物質存在下で生物活性を測定するために、例えば、焼却残滓抽出液が海洋性バクテリア活性調整物質を含有していることが好ましく、抽出溶媒が海洋性バクテリア活性調整物質を含有していることがさらに好ましい。この場合、好ましくは、抽出溶媒に含まれる海洋性バクテリア活性調整物質の濃度が、１０〜１００，０００ｍｇ／Ｌである。
【００１４】
さらに、海洋性バクテリア活性調整物質存在下で生物活性を測定するために、例えば、海洋性バクテリア懸濁液及び焼却残滓抽出液を混合する工程において、さらに海洋性バクテリア活性化物質を加えて混合することが好ましい。
【００１５】
上記毒性評価方法において、好ましくは、生物活性を測定する際の海洋性バクテリア活性化物質の濃度が、海洋性バクテリア懸濁液及び焼却残滓抽出液、並びに海洋性バクテリア活性化物質を含む混合液全体に対し、５〜５０，０００ｍｇ／Ｌである。
【００１６】
また、本発明は、上記毒性評価方法に用いられる毒性評価システムであって、海洋性バクテリアの生物活性を測定する手段を有する毒性評価システムに関する。毒性評価システムは、さらに、得られた測定値を利用して被検物質の毒性を判定する手段を有することが好ましい。
【００１７】
さらに、本発明は、上記毒性評価方法に用いられる毒性評価用キットであって、凍結乾燥した海洋性バクテリア、再活性化溶液、焼却残滓抽出溶媒、及び海洋性バクテリア活性調整物質を備えた毒性評価用キットに関する。また、本発明は、上記毒性評価方法に用いられる毒性評価用キットであって、凍結乾燥した海洋性バクテリア、再活性化溶液、焼却残滓抽出溶媒を備え、再活性化溶液又は焼却残滓抽出溶媒が海洋性バクテリア活性調整物質を含有する毒性評価用キットに関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の毒性評価方法によれば、海洋性バクテリアの発光強度の増大を抑えることができ、被検物質が海洋性バクテリアにとって有害な物質を含む場合には、その被検物質について「毒性を有する」という評価結果を得ることができる。また、本発明の毒性評価システムによれば、海洋性バクテリアの発光強度の増大を抑え、被検物質の毒性を評価することができる。さらに、本発明の毒性評価用キットによれば、海洋性バクテリアの発光強度の増大を抑え、被検物質の毒性を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の海洋性バクテリアを用いた毒性評価方法は、海洋性バクテリアを被検物質と接触させ、海洋性バクテリアの生物活性を測定することにより、被検物質の毒性を評価する毒性評価方法である。本発明は、海洋性バクテリアを用いた毒性評価方法において、海洋性バクテリアの生物活性を、被検物質、並びに、カリウム、マグネシウム、リン、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含む海洋性バクテリア活性調整物質の存在下で測定することを特徴とする。
【００２０】
本発明において、海洋性バクテリア活性調整物質（以下、単に「活性調整物質」ともいう。）とは、海洋性バクテリアの生物活性を測定する際に、海洋性バクテリアの活性を安定化させることのできる、安定化剤として作用し得る物質をいう。本発明においては、海洋性バクテリアと被検物質とを接触させる際に、意図的に、海洋性バクテリアの生物活性を十分に高めることのできる物質を存在させることにより、海洋性バクテリアの活性を安定化させ、海洋性バクテリアと被検物質とを接触させたことに起因する海洋性バクテリアの生物活性の異常な高まりを抑制できると考えられる。したがって、海洋性バクテリア活性調整物質としては、被検物質を存在させずに海洋性バクテリアと接触させた際に、海洋性バクテリアの生物活性を高めることのできる物質が用いられる。
【００２１】
海洋性バクテリアとしては、発光性バクテリアを用いることが好ましい。発光性バクテリアとしては、例えば、ビブリオ・フィシャリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）、フォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、フォトバクテリウム・フォスフォレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）等を挙げることができる。これらの中でも、ビブリオ・フィシャリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）が好ましく用いられる。
【００２２】
海洋性バクテリアは、凍結乾燥した状態で保存し、必要な時に、再活性化して用いることができる。再活性化は、例えば、凍結乾燥状態の海洋性バクテリアに再活性化溶液を加えて懸濁液とすることにより実施可能である。海洋性バクテリアを十分に再活性化させるために、凍結乾燥状態の海洋性バクテリアに再活性化溶液を加えた後、懸濁液を適切な温度で、適切な時間静置することが好ましい。
【００２３】
再活性化溶液としては、通常、ナトリウム塩水溶液、好ましくは、ＮａＣｌ水溶液が用いられる。ナトリウム塩水溶液の濃度は、好ましくは０．０５〜１０重量％、より好ましくは０．１〜５重量％、さらに好ましくは０．５〜３重量％である。
【００２４】
再活性化溶液のｐＨは、４〜９であることが好ましく、５〜８であることがより好ましく、６〜７であることがさらに好ましい。
【００２５】
懸濁液の温度は、０〜５０℃であることが好ましく、５〜３０℃であることがより好ましく、１０〜２５℃であることがさらに好ましい。
【００２６】
懸濁液を静置する時間は、好ましくは海洋性バクテリアに再活性化溶液を加えてから海洋性バクテリアの生物活性が飽和するまでに要する時間である。時間は、用いる海洋性バクテリアに応じて適宜設定すればよく、１０分間〜２時間であることが好ましく、３０分間〜２時間であることがより好ましく、４０分間〜１時間であることがさらに好ましい。
【００２７】
海洋性バクテリアは、再活性化した後、好ましくは、生物活性が飽和した後、保存することができる。保存時間は、５時間以下であることが好ましく、２時間以下であることがより好ましい。
【００２８】
再活性化の際の凍結乾燥バクテリアと再活性化溶液との混合割合として、例えば、凍結乾燥バクテリア１ｍｇに対し、再活性化溶液を好ましくは０．１〜３ｍｌ、より好ましくは０．２〜１ｍｌ、さらに好ましくは０．３〜０．７ｍｌ用いることができる。
【００２９】
本発明の毒性評価方法においては、上記により得た懸濁液を用い、海洋性バクテリアの生物活性を測定することができる。生物活性の測定は、懸濁液を測定用のマイクロプレート、セル等に分注して行うことが好ましい。また、生物活性の測定には、懸濁液を０．５〜３ｍｌ用いることが好ましく、１〜２．５ｍｌ用いることがより好ましく、１．５〜２ｍｌ用いることがさらに好ましい。
【００３０】
測定に用いる海洋性バクテリアの量は、生物活性の測定方法、評価の対象となる被検物質などに応じて適宜調節すればよい。海洋性バクテリアは、通常１ｍｌの懸濁液中に乾燥重量で０．５〜２ｍｇ、好ましくは０．８〜１．５ｍｇ、さらに好ましくは１〜１．３ｍｇ用いられる。
【００３１】
次に、海洋性バクテリアの生物活性を測定する方法として、代謝活性を測定する方法、目視または画像処理により個体数を解析する方法、などがあるが、好ましくは代謝活性を測定する方法である。さらに、代謝活性の測定には、呼吸活性測定、消費酸素量測定、発熱量測定などがあるが、好ましくは、呼吸活性測定である。
【００３２】
呼吸活性の測定の方法としては、海洋性バクテリアが消費する酸素量を酸素電極などを用いて測定する方法、発生する二酸化炭素量を赤外式ガス分析計などを用いて測定する方法などが知られている。いずれも方法も従来公知の方法に従って行うことができる。
【００３３】
本発明においては、海洋性バクテリアとして発光性バクテリアが好ましく使用される。発光性バクテリアは、例えば、代謝（呼吸）時に熱としてのエネルギーを放出すると同時に、可視光を放出する。発光性バクテリアが放出する可視光のピーク波長は、好ましくは４００〜５５０ｎｍであり、より好ましくは４７０〜５００ｎｍである。発光性バクテリアの発光強度を測定することにより、発光性バクテリアの代謝（呼吸）活性を評価することが可能である。被検物質が毒性を有する場合、被検物質と接した発光性バクテリアの代謝（呼吸）活性が低下、すなわち、発光性バクテリアの発光強度が低下するために、発光強度を毒性評価の指標として用いることができる。
【００３４】
次に、毒性の評価の対象としては、例えば、土壌、焼却残滓、粉塵、河川水、湖水、海水、地下水、埋立地底部からの浸出水、工場排水、廃棄油、植物への付着物、植物など（以下、「土壌等」ともいう。）が挙げられる。より好ましくは、土壌又は焼却残滓であり、さらに好ましくは、焼却残滓である。
【００３５】
したがって、海洋性バクテリアと接触させる被検物質としては、例えば、土壌からの抽出物、焼却残滓からの抽出物、粉塵からの抽出物、河川水、湖水、海水、地下水、埋立地底部からの浸出水、工場排水、廃棄油、植物への付着物、植物からの抽出物などを含む試料、または、これらの混合試料が挙げられる。より好ましくは、土壌からの抽出物又は焼却残滓からの抽出物を含む試料であり、さらに好ましくは、焼却残滓からの抽出物を含む試料である。
【００３６】
土壌等から抽出されて評価の対象となる具体的な被検出物としては、土壌の汚染に係る環境基準（環境庁告示第４６号）で指定された物質、水質汚濁に係る環境基準（環境庁告示第５９号）で指定された物質、地下水の水質汚濁に係る環境基準（環境庁告示第１０号）で指定された物質などが挙げられるが、これらに限定されず、種々の物質を挙げることができる。例えば、Ｐｂ、Ｃｄ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｐｂ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｈｇ等の金属、トルエン、ベンゼン、エチルベンゼン、キシレン、四塩化炭素、ジクロロメタン、パラジクロロベンゼン、トリメチルベンゼン、クロロホルム、テトラクロロエチレン、ＴＰＨ（Ｔｏｔａｌ  Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）、ＰＡＨ（Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）等の有機化合物等である。
【００３７】
また、被検出物として、土壌等に含まれることに起因して人の健康に係る被害を生ずるおそれがある物質が挙げられ、具体的には、土壌汚染対策法に基づく調査等の対象である、揮発性物質（四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、１，３−ジクロロプロペン、ジクロロメタン、テトラクロロエチレン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、トリクロロエチレン、ベンゼン）、重金属等（カドミウム及びその化合物、六価クロム化合物、シアン化合物、水銀及びその化合物、セレン及びその化合物、鉛及びその化合物、砒素及びその化合物、ふっ素及びその化合物、ほう素及びその化合物）、農薬等（シマジン、チオベンカルブ、チウラム、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、有機リン化合物）などの物質が挙げられる。
【００３８】
毒性評価の対象となる土壌等は、測定が必要とされる場所について、目的に応じて採取すればよく、採取箇所、採取深さ、採取量等、適宜設定することができる。揮発性有機化合物の評価を目的とする場合には、土壌等を密閉容器内に採取することが好ましい。
【００３９】
被検出物を土壌等から抽出する方法としては、目的に応じ種々の方法を用いることが可能である。例えば、土壌等と、適宜選択された抽出溶媒とを混合し、一定時間激しく撹拌して抽出液を得る方法が挙げられる。さらに得られた抽出液について、固形成分と溶出成分（抽出物）とをフィルターなどにより分離し、固形成分が除去された抽出液を得ることもできる。
【００４０】
また、環境庁告示第４６号、第１９号、又は第１３号で規定された抽出方法を用いてもよい。
【００４１】
抽出溶媒としては、目的に応じ種々の溶媒を用いることが可能である。例えば、被検出物として金属を抽出したい場合には酸性水溶液、好ましくは０．１〜１規定の塩酸を使用することができる。また、例えば、有機化合物を抽出したい場合には有機溶媒、好ましくはメチルアルコール、エチルアルコール、アセトン等を使用することができる。さらに、例えば、水溶性物質を抽出したい場合には水、好ましくは蒸留水やイオン交換水等を使用することができる。
【００４２】
さらに、環境庁告示第４６号、第１９号、又は第１３号で規定された抽出溶媒を用いてもよい。
【００４３】
抽出の際の土壌等と抽出溶媒との混合割合として、例えば、土壌等など１ｍｌに対し、抽出溶媒を好ましくは０．１〜１０ｍｌ、より好ましくは１〜５ｍｌ、さらに好ましくは１．５〜２．５ｍｌ用いることができる。
【００４４】
撹拌時間は特に限定されないが、迅速な毒性評価を行う観点から、２分間〜５時間であることが好ましく、２分間〜２時間であることがより好ましく、２分間〜１時間３０分であることがさらに好ましい。
【００４５】
固形成分が除去された抽出液を得るためには、土壌等と抽出溶媒とを含む懸濁液をしばらく静置した後、上澄み液をろ過することが好ましい。ろ過には、好ましくは孔径０．６５μｍ以下、より好ましくは０．５μｍ以下、さらに好ましくは０．４５μｍ以下のフィルターを用いることが可能である。
【００４６】
なお、工場廃水などの液体を毒性評価の対象とする場合には、被検出物を抽出する工程を行う必要はない。工場廃水などの液体は、そのままで被検物質とするか、あるいは、適宜、フィルターを用いてろ過する、抽出溶媒を用いて希釈するなどして被検物質とすることができる。
【００４７】
本発明の毒性評価方法においては、被検物質（抽出液）を上述の海洋性バクテリア懸濁液を分注したマイクロプレート、セル等に加え、海洋性バクテリアの生物活性を測定することができる。また、生物活性の測定には、被検物質（抽出液）を０．０１〜５ｍｌ用いることが好ましく、０．０２〜２ｍｌ用いることがより好ましく、０．０５〜１ｍｌ用いることがさらに好ましい。
【００４８】
本発明の毒性評価方法は、カリウム、マグネシウム、リン、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含む海洋性バクテリア活性調整物質の存在下で海洋性バクテリアを被検物質と接触させ、海洋性バクテリアの生物活性を測定する方法である。活性調整物質は、カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、及びグルコースからなる群より選ばれる物質であることが好ましく、カリウム塩であることがさらに好ましい。活性調整物質は、水溶液の状態で用いることが好ましい場合もある。
【００４９】
カリウム塩としては、塩化カリウム、硫酸カリウム、硝酸カリウム、臭化カリウム、亜硫酸カリウムなどを用いることができる。好ましくは塩化カリウムである。
【００５０】
マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウムなどを用いることができる。好ましくは塩化マグネシウムである。
【００５１】
リンを含む海洋性バクテリア活性調整物質としては、リン酸塩を用いることができる。リン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウムなどを用いることができる。
【００５２】
糖を含む海洋性バクテリア活性調整物質としては、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マルトースなどを用いることができる。好ましくはグルコースである。
これらの活性調整物質は、単独でまたは２種類以上を混合して用いることができる。
【００５３】
生物活性測定時の活性調整物質の濃度は、海洋性バクテリア、被検物質、及び活性調整物質を含む混合物（好ましくは混合液）全体に対し、５〜５０，０００ｍｇ／Ｌであることが好ましく、５０〜５，０００ｍｇ／Ｌであることがより好ましい。特に、活性調整物質がカリウム塩である場合は５０〜５，０００ｍｇ／Ｌ、マグネシウム塩である場合は５０〜５，０００ｍｇ／Ｌ、リン酸塩である場合は５０〜１０，０００ｍｇ／Ｌ、グルコースである場合は５００〜５０，０００ｍｇ／Ｌであることが好ましい。なお、海洋性バクテリア、被検物質、及び活性調整物質を含む混合物（好ましくは混合液）全体とは、例えば、海洋性バクテリアとして海洋性バクテリアの懸濁液を使用し、被検物質として土壌等の抽出液を使用し、活性調整物質として活性調整物質の水溶液を使用した場合には、海洋性バクテリアの懸濁液、土壌等の抽出液、及び活性調整物質の水溶液を混合して得た混合液全体である。
【００５４】
活性調整物質は、海洋性バクテリアの生物活性測定時に、海洋性バクテリア及び被検物質と共に存在すればよい。
【００５５】
したがって、活性調整物質を、上述の海洋性バクテリア及び被検物質を分注した（あるいは、分注する）マイクロプレート、セル等に、直接加えることができる。この場合、活性調整物質の水溶液として加えることが好ましい。また、活性調整物質の濃度が、上述の濃度となるように加えることが好ましい。なお、マイクロプレート、セル等へ加える順序としては、活性調整物質、海洋性バクテリア、被検物質の順、海洋性バクテリア、活性調整物質、被検物質の順、海洋性バクテリア、被検物質、活性調整物質の順などが挙げられる。
【００５６】
また、活性調整物質が、海洋性バクテリア懸濁液に含有されていてもよい。この場合、活性調整物質は、予め再活性化溶液に含有されていてもよく、あるいは、再活性化した海洋性バクテリアが含有されている懸濁液に活性調整物質を添加してもよい。または、再活性化溶液として、活性調整物質を含有する溶液を用いることもできる。すなわち、従来好ましく用いられていたＮａＣｌ水溶液に活性調整物質を加えてもよく、あるいは、ＮａＣｌ水溶液に代え活性調整物質の水溶液を用いてもよい。本発明においては、再活性化溶液として、ナトリウム塩及びカリウム塩とからなる塩の水溶液を用いることが好ましく、ＮａＣｌ及びＫＣｌとからなる塩の水溶液を用いることがより好ましい。
【００５７】
再活性化溶液に含有される活性調整物質の濃度は、１０〜１００，０００ｍｇ／Ｌであることが好ましく、１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌであることがより好ましい。特に、活性調整物質がカリウム塩である場合は１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌ、マグネシウム塩である場合は１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌ、リン酸塩である場合は１００〜２０，０００ｍｇ／Ｌ、グルコースである場合は１，０００〜１００，０００ｍｇ／Ｌであることが好ましい。
【００５８】
さらには、活性調整物質が、被検物質に含まれていてもよい。被検物質が土壌等の抽出液である場合、活性調整物質は、予め抽出溶媒に含まれていてもよく、あるいは、土壌等から抽出された被検出物を含む抽出液に活性調整物質を添加してもよい。すなわち、活性化調整物質を、上述の酸性水溶液、有機溶媒、水などの抽出溶媒や、これらを用いた抽出液に加えることができる。工場廃水等の液体を被検物質とする場合には、被検物質に直接、活性調整物質を加えればよい。
【００５９】
抽出溶媒に含まれる活性調整物質の濃度は、１０〜１００，０００ｍｇ／Ｌであることが好ましく、１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌであることがより好ましい。特に、活性調整物質がカリウム塩である場合は１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌ、マグネシウム塩である場合は１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌ、リン酸塩である場合は１００〜２０，０００ｍｇ／Ｌ、グルコースである場合は１，０００〜１００，０００ｍｇ／Ｌであることが好ましい。
【００６０】
本発明の毒性評価方法においては、具体的には、被検物質と接触させる前の海洋性バクテリアの生物活性と、被検物質と接触させた後の海洋性バクテリアの生物活性とを測定し、生物活性測定値の相対変化を利用して評価することが好ましい。相対変化を利用して評価する場合には、測定値については単位補正を行わなくてもよい。この方法は、海洋性バクテリア懸濁液が海洋性バクテリア活性調整物質を含有する場合、海洋性バクテリア懸濁液及び海洋性バクテリア活性調整物質を分注したマイクロプレート、セル等に、被検物質を加える場合に有効である。
【００６１】
相対評価を行う方法について、海洋性バクテリア懸濁液が海洋性バクテリア活性調整物質を含有する場合を例に説明する。まず、生物活性測定用のセルに海洋性バクテリア活性調整物質を含む海洋性バクテリア懸濁液を加え、被検物質を海洋性バクテリアと接触させる前の生物活性（生物活性１（任意単位））を測定する。次いで被検物質を加え、被検物質を海洋性バクテリアと接触させた後の生物活性（生物活性２（任意単位））を測定する。（生物活性２／生物活性１）×１００［％］で求められる値、あるいは単に（生物活性２／生物活性１）で求められる値が、一定の基準値未満である場合を「毒性あり」と、一定の基準値以上である場合を「毒性なし」と評価することができる。
【００６２】
さらに、被検物質と接触させない海洋性バクテリアの生物活性（コントロール）に対する、被検物質と接触させた後の海洋性バクテリアの生物活性の比率を求めることにより評価することも可能である。この方法は、海洋性バクテリア懸濁液が海洋性バクテリア活性調整物質を含有する場合、被検物質が海洋性バクテリア活性調整物質を含有する場合、海洋性バクテリア懸濁液及び被検物質を分注したマイクロプレート、セル等に、海洋性バクテリア活性調整物質を加える場合に有効である。
【００６３】
コントロールを用いる方法について、被検物質が海洋性バクテリア活性調整物質を含有する場合を例に説明する。まず、生物活性測定用のセルＡに海洋性バクテリア懸濁液、被検物質をこの順に加え、被検物質を海洋性バクテリアと接触させた後の生物活性（生物活性Ａ（任意単位））を測定する。次いで、別のセルＢに海洋性バクテリア懸濁液、海洋性バクテリア活性調整物質をこの順に加え、被検物質と接触させない海洋性バクテリアの生物活性（生物活性Ｂ（任意単位）、コントロール）を測定する。（生物活性Ａ／生物活性Ｂ）×１００［％］で求められる値、あるいは単に（生物活性Ａ／生物活性Ｂ）で求められる値が、一定の基準値未満である場合を「毒性あり」と、一定の基準値以上である場合を「毒性なし」と評価することができる。
【００６４】
なお、被検物質と接触させた後の海洋性バクテリアの生物活性測定値の絶対値により毒性を評価することもできる。
【００６５】
被検物質が、酸性水溶液である場合、酸性分により海洋性バクテリアが失活することを防ぐ目的で、緩衝液、アルカリ水溶液等を用いて生物活性測定時のｐＨを調整することが好ましい。生物活性測定時のｐＨは、４〜９であることが好ましく、５〜８であることがより好ましく、６〜７であることがさらに好ましい。
【００６６】
被検物質を海洋性バクテリアと接触させてから生物活性測定までの時間は、用いる海洋性バクテリアの種類によって適宜設定することができ、好ましくは５〜６０分、より好ましくは７〜３０分、さらに好ましくは１０〜２０分である。
【００６７】
次に本発明の毒性評価システムについて説明する。本発明の毒性評価システムは、海洋性バクテリアの生物活性を測定する手段を有する。生物活性を測定する手段としては、発光測定装置、生物学的酸素消費量（ＢＯＤ）測定器、質量分析機などを挙げることができる。好ましくは、発光測定装置である。発光測定装置は特に限定されず、受光部は外部からの光が入らないよう遮光された構造であり、かつ、発光性バクテリアからの発光のみを内蔵のフォトマル、フォトダイオード、ＣＣＤ等の受光部により検出できる装置を用いることができる。測定値は受光部が検出する光子（フォトン）の数量に比例する値であればよい。発光測定装置としては、市販のルミノメーターを使用することができる。さらに、毒性評価システムは、生物活性を測定する手段により得られた測定値を利用し、被検物質の毒性を判定する手段、例えば、コンピューターを備えていることが好ましい。
【００６８】
毒性評価システムによれば、例えば、以下のステップに沿って被検物質の毒性を評価することができる（図１）。まず、海洋性バクテリア活性調整物質を含む海洋性バクテリア懸濁液の生物活性を、生物活性を測定する手段により測定することにより初期測定値（生物活性１）を得て（Ｓ１）、この初期測定値（生物活性１）を被検物質の毒性を判定する手段に記憶させる（Ｓ２）。次いで、海洋性バクテリア懸濁液に被検物質を加えた混合液の生物活性を、生物活性を測定する手段により測定し（生物活性２）（Ｓ３）、混合液の測定値（生物活性２）を被検物質の毒性を判定する手段に記憶させる（Ｓ４）。その後、被検物質の毒性を判定する手段により、生物活性１を１００とした生物活性２の相対値について、評価基準値に従い判定する（Ｓ５）。
【００６９】
次に本発明の毒性評価用キットについて説明する。毒性評価用キットは、凍結乾燥海洋性バクテリア、再活性化溶液、焼却残滓抽出溶媒を備え、再活性化溶液又は焼却残滓抽出溶媒がカリウム、マグネシウム、リン、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含む海洋性バクテリア活性調整物質を含有している。あるいは、本発明の毒性評価キットは、凍結乾燥海洋性バクテリア、再活性化溶液、焼却残滓抽出溶媒、カリウム、マグネシウム、リン、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含む海洋性バクテリア活性調整物質を備える。
【００７０】
さらにこれらの毒性評価キットは、本発明の毒性評価方法に用いることができる、マイクロプレート、セル、ｐＨ試験紙、フィルター、ピペット、シリンジなどを備えることも可能である。
【００７１】
次いで本発明の毒性評価方法について、海洋性バクテリアとしてビブリオ・フィシャリを用い、焼却残滓の毒性を評価する場合を例に、さらに詳細に説明する。この例においては、ビブリオ・フィシャリを、海洋性バクテリア活性調整物質を含有する再活性化溶液を用いて再活性化した。
【００７２】
１．ビブリオ・フィシャリの再活性化
凍結乾燥ビブリオ・フィシャリ（目的に応じ５０又は７５ｍｇ）に対し、海洋性バクテリア活性調整物質を含有する再活性化溶液として１，０００ｍｇ／Ｌの塩化カリウム水溶液と２重量％のＮａＣｌ水溶液との混合水溶液（目的に応じ２７又は５０ｍｌ）を加え、室温で５０分間保持し、ビブリオ・フィシャリ懸濁液を得る。懸濁液のｐＨは、６．５〜７．５であることが好ましい。
【００７３】
２．発光性バクテリアの発光強度測定
上記により得られたビブリオ・フィシャリ懸濁液（目的に応じ１又は２ｍｌ）を、発光強度測定用のセルに加え、ビブリオ・フィシャリ懸濁液の発光強度（発光強度１）を測定する。
【００７４】
発光強度の測定には、プラスチック製の多検体測定セルを用いることができる。セル底面が透明であれば、その下部に受光部を設置することにより、個々のセル内の発光強度を測定することができる。この場合、各セル同士は、非透明のプラスチックにより遮光され、相互のセル内における発光が周囲に広がらない構造とする。また、発光強度の測定に、黒色等の有色のマイクロタイタープレートを用いた場合は、各ウェル上部の光を測光するように受光部が設置されたスキャン式のプレートリーダー（ルミノメーター）等を用いて、効率的に発光量を測定することができる。底面部のみが透明のマイクロプレートを用いた場合は、受光部が下部に設置されたタイプのプレートリーダーを用いることができる。
【００７５】
３．焼却残滓の採取
５ｍｌの焼却残滓をへらなどを用いて、シリンジ内にサンプリングする。シリンジ先端はキャップができる構造であることが好ましく、特に揮発性有機化合物の測定をする場合や、サンプルの測定が速やかにできない場合等は、焼却残滓を採取した後キャップをし、密閉する。
【００７６】
４．被検出物の抽出
５ｍｌの焼却残滓試料中に、１０ｍｌの溶媒（焼却残滓：溶媒＝１：２（体積比））を加え、２分間以上激しく撹拌して焼却残滓抽出液（懸濁液）を得る。迅速な評価を行う観点から、撹拌時間は短時間であることが好ましい。
【００７７】
溶媒は、金属（例えば、重金属等の含有毒性）を測定する場合は０．１Ｍ塩酸水溶液を用い、水溶性物質（例えば、重金属等の溶出毒性もしくは浸出性水溶毒性）を測定する場合はイオン交換水または蒸留水などの水を用い、また有機化合物（例えば、揮発性有機化合物や有機性毒性物質）を測定する場合はメチルアルコール（好ましくは試薬１級以上）を用いることができる。抽出溶媒のｐＨは、抽出が可能であればいずれのｐＨであってもよい。
【００７８】
５．被検物質の調整
さらに、上記により得られた抽出液（懸濁液）をしばらく静置後、上澄み液を孔径０．４５μｍ以下のフィルターを用いろ過し、固形成分を除去した抽出液を被検物質として用いることが好ましい。
【００７９】
６．毒性の評価
バクテリア懸濁液と被検物質は、プラスチック製の多検体測定セル内で混合される。
酸抽出により調製された被検物質については、バクテリア懸濁液１ｍｌ（乾燥重量にして１．８５ｍｇの発光性バクテリアを含む）に、アルカリ水溶液を加えｐＨを７とし、これに被検物質１ｍｌを加え発光強度の変化を測定する。
【００８０】
水抽出により調製された被検物質については、バクテリア懸濁液１ｍｌ（乾燥重量にして１．８５ｍｇの発光性バクテリアを含む）に対し被検物質１ｍｌを加えて発光強度の変化を測定する。
【００８１】
有機溶媒抽出により調製された被検物質については、バクテリア懸濁液２ｍｌ（乾燥重量にして３ｍｇの発光性バクテリアを含む）に被検物質０．０５ｍｌ（５０μｌ）を加え発光強度の変化を測定する。
【００８２】
バクテリア懸濁液と抽出液を混合した後、１５分間静置し、１５分後の発光強度を測定し、これを測定値（発光強度２）とする。また、０分から１５分までの間の測定値を、連続的にデータとして保存し、発光強度の変化を追跡することも可能である。
【００８３】
測定値は、発光強度測定装置（ルミノメーター）と付随のコンピュータープログラムによって処理される。フォトダイオードを内蔵した測定装置により、発光強度の絶対値がコンピューターに送り続けられ、コンピューターが測定データを記憶する。コンピューターは、「発光強度１」の絶対値を記憶し、１５分後に「発光強度２」の絶対値を記憶し、「発光強度１」に対する「発光強度２」の相対値を算出し、被検物質の毒性を判定する。
【００８４】
毒性の判定には、発光強度の相対変化を１００分率（％）（あるいは単なる比）で表した数値を用いる。すなわち、バクテリア懸濁液のみの発光強度（発光強度１）を１００とし、バクテリア懸濁液と抽出液との反応後の発光強度（発光強度２）の相対変化を０〜１００％（しばし１００％を超えることもある）の整数値で表す。
【００８５】
本発明の毒性評価方法によれば、土壌や焼却残滓が総合的に生物に与える影響を総合的に、評価することが可能である。
【００８６】
また、本発明の毒性評価方法は、現場での迅速な評価が可能な、簡便な評価方法であるために、吸光光度分析装置、原子吸光分析装置、ＩＣＰ発光分光分析装置、ＧＣＭＳ等の化学的分析方法による評価に先立ち、生体への毒性を即座に判断する方法、特に急性毒性を評価する方法として用いることができる。
【００８７】
また、例えば、化学的分析方法によって毒性なしと判断された被検物質について、本発明の毒性評価方法により評価を行うことにより、複合毒性の可能性を含め、被検物質が生体へ毒性を有するものであるか否かを総合的に確認することができる。
【００８８】
これらの他、本発明の毒性評価方法において、使用する海洋性バクテリアの量、被検出物の抽出方法、発光強度を測定するまでの時間、判定基準等を適宜設定することにより、環境基準に沿った評価を行うことも可能である。
【００８９】
また、汚染された土壌等を、抽出処理、洗浄処理、熱処理、化学処理、生物処理等により浄化する際に、本発明の毒性評価方法によって浄化の程度を確認しながら、土壌の浄化を行うこともできる。
【実施例】
【００９０】
本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９１】
（実施例１）
再活性化溶液として、１、１０、１００、１，０００、１０，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ水溶液と２重量％のＮａＣｌ水溶液との混合水溶液（実施例中、「１０，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液」などと表す場合もある。）、又は２重量％ＮａＣｌ水溶液を用いて、海洋性バクテリアを再活性化し、６種類の海洋性バクテリア懸濁液を得た。
６種類の海洋性バクテリア懸濁液について、海洋性バクテリアの生物活性（発光強度）を測定した。発光強度の測定には、Ｒａｐｉｄ  Ｏｎｓｉｔｅ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｕｄｉｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（略称ＲＯＴＡＳ、発光性バクテリアを用いたバイオアッセイシステム、Ｃｙｂｅｒｓｅｎｓｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。
【００９２】
海洋性バクテリア：ビブリオ・フィシャリ  ５０ｍｇ
再活性化溶液：１、１０、１００、１，０００、１０，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液、２重量％ＮａＣｌ水溶液  各２７ｍｌ
海洋性バクテリア懸濁液ｐＨ：７
１セル中の海洋性バクテリア懸濁液量：１ｍＬ（乾燥重量にして１．８５ｍｇのバクテリアを含む）
測定時間：海洋性バクテリア懸濁液を調製してから５０分後に測定
【００９３】
結果を図２に示す。グラフ縦軸は、発光強度の実測値（任意単位）である。２重量％ＮａＣｌ水溶液を用いた場合の発光強度は、８００であった。再活性化溶液としてＫＣｌ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液を用いた場合は、従来のＮａＣｌ水溶液を用いた場合と比べ、海洋性バクテリアの生物活性が高められた。
【００９４】
（実施例２）
ＫＣｌに代えＫ２ＳＯ４又はＫＢｒを用いた他は、実施例１と同様にして海洋性バクテリアの生物活性を測定した。
Ｋ２ＳＯ４又はＫＢｒとＮａＣｌとからなる水溶液を用いた場合にも、ＮａＣｌ水溶液を用いた場合と比べ、海洋性バクテリアの生物活性を高めることができた。
【００９５】
（実施例３）
１０、１００、１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ水溶液を調製した。ＲＯＴＡＳ−Ｌｅａｃｈａｂｌｅプロトコルに従い、２重量％ＮａＣｌ水溶液を用いて海洋性バクテリアを再活性化し、海洋性バクテリア懸濁液を得た。海洋性バクテリア懸濁液とＫＣｌ水溶液とを混合した後、海洋性バクテリアの生物活性（発光強度）を測定した。
【００９６】
海洋性バクテリア：ビブリオ・フィシャリ  ５０ｍｇ
再活性化溶液：２重量％ＮａＣｌ水溶液  ２７ｍｌ
海洋性バクテリア懸濁液ｐＨ：７
１セル中の海洋性バクテリア懸濁液量：１ｍＬ（乾燥重量にして１．８５ｍｇのバクテリアを含む）
１セル中のＫＣｌ水溶液の添加量：１ｍＬ
測定時間：海洋性バクテリア懸濁液を調製してから５０分後の発光強度（ＫＣｌ添加前の発光強度）を測定、その後、海洋性バクテリア懸濁液にＫＣｌ水溶液を添加してから１５分後の発光強度（ＫＣｌ添加後の発光強度）を測定
【００９７】
図３に結果を示す。縦軸は、（ＫＣｌ添加後の発光強度／ＫＣｌ添加前の発光強度）を表す。海洋性バクテリア懸濁液にＫＣｌ水溶液を添加することにより、海洋性バクテリアの生物活性が高められた。
【００９８】
（実施例４）
焼却灰Ａ、Ｂ及びＣについて、ＲＯＴＡＳ−Ｌｅａｃｈａｂｌｅプロトコル（水抽出）に従い焼却灰抽出液及びそれらの希釈液を調製し、毒性の評価を行った。再活性化溶液には、１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液、又は２重量％ＮａＣｌ水溶液を用いた。なお、焼却灰Ｂ及びＣは、化学的分析方法により毒性を有する物質を含有することが確認されている。
【００９９】
海洋性バクテリア：ビブリオ・フィシャリ、５０ｍｇ
再活性化溶液：１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液、又は２重量％ＮａＣｌ水溶液  各２７ｍｌ
海洋性バクテリア懸濁液ｐＨ：７
１セル中の海洋性バクテリア懸濁液量：１ｍＬ（乾燥重量にして１．８５ｍｇのバクテリアを含む）
１セル中の焼却灰抽出液の添加量：１ｍＬ
測定時間：海洋性バクテリア懸濁液を調製してから５０分後の発光強度（焼却灰抽出液添加前の発光強度）を測定、その後、海洋性バクテリア懸濁液に焼却灰抽出液を添加してから１５分後の発光強度（焼却灰抽出液添加後の発光強度）を測定
【０１００】
結果を図４（ａ）及び（ｂ）に示す。グラフ縦軸は、（焼却灰抽出液添加後の発光強度／焼却灰抽出液添加前の発光強度）を表す。グラフ横軸は、焼却灰抽出液（原液）を１とした場合の希釈液濃度を表す。（ａ）は、再活性化溶液としてＫＣｌ＋ＮａＣｌ水溶液を用いた場合の結果、（ｂ）は、再活性化溶液としてＮａＣｌ水溶液を用いた場合の結果である。ＫＣｌ＋ＮａＣｌ水溶液を用いた場合には、焼却灰抽出液Ｂ及びＣと接触させた海洋性バクテリアの生物活性が低下しており、焼却灰抽出液Ｂ及びＣを毒性があると評価することができた。ＮａＣｌ水溶液を用いた場合には、焼却灰Ｂ及びＣと接触させた海洋性バクテリアの生物活性が増しており、焼却灰Ｂ及びＣを毒性があると評価することができなかった。
【０１０１】
（実施例５）
１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液に代え、１，０００ｍｇ／ＬのＫ２ＳＯ４＋２重量％のＮａＣｌ水溶液、又は１，０００ｍｇ／ＬのＫＢｒ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液を用いた他は、実施例４と同様にして海洋性バクテリアの生物活性を測定した。
Ｋ２ＳＯ４＋ＮａＣｌ水溶液、又はＫＢｒ＋ＮａＣｌ水溶液を用いた場合にも、焼却灰Ｂ及びＣと接触させた海洋性バクテリアの生物活性が低下しており、焼却灰Ｂ及びＣを毒性があると評価することができた。
【０１０２】
（実施例６）
海洋性バクテリア活性調整物質として１００、１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ水溶液、１００、１，０００ｍｇ／ＬのＫ２ＳＯ４水溶液、及び１００、１，０００ｍｇ／ＬのＫＢｒ水溶液を調製し、ＲＯＴＡＳを用いて焼却灰Ａ、Ｂ及びＣの毒性評価を行った。
【０１０３】
海洋性バクテリア：ビブリオ・フィシャリ  ５０ｍｇ
再活性化溶液：２重量％ＮａＣｌ水溶液  ２７ｍｌ
海洋性バクテリア懸濁液ｐＨ：７
１セル中の海洋性バクテリア懸濁液量：１ｍＬ（乾燥重量にして１．８５ｍｇのバクテリアを含む）
１セル中の焼却灰抽出液の添加量：１ｍＬ
１セル中の海洋性バクテリア活性調整物質の添加量：１００μＬ
測定時間：海洋性バクテリア懸濁液を調製してから５０分後の発光強度（焼却灰抽出液添加前の発光強度）を測定、その後、海洋性バクテリア懸濁液に焼却灰抽出液及び海洋性バクテリア活性調整物質を添加してから１５分後の発光強度（焼却灰抽出液添加後の発光強度）を測定
【０１０４】
海洋性バクテリア活性調整物質としてＫＣｌ水溶液、Ｋ２ＳＯ４水溶液、又はＫＢｒ水溶液を加えた場合のいずれにおいても、焼却灰Ｂ及びＣを毒性があると評価することができた。
【０１０５】
（実施例７）
抽出溶媒として１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ水溶液、１，０００ｍｇ／ＬのＫ２ＳＯ４水溶液、及び１，０００ｍｇ／ＬのＫＢｒ水溶液を用いて、焼却灰Ａ、Ｂ及びＣより焼却灰抽出液を調製した。ＲＯＴＡＳを用いて焼却灰Ａ、Ｂ及びＣの毒性評価を行った。
【０１０６】
海洋性バクテリア：ビブリオ・フィシャリ  ５０ｍｇ
再活性化溶液：２重量％ＮａＣｌ水溶液  ２７ｍｌ
海洋性バクテリア懸濁液ｐＨ：７
１セル中の海洋性バクテリア懸濁液量：１ｍＬ（乾燥重量にして１．８５ｍｇのバクテリアを含む）
１セル中の焼却灰抽出液の添加量：１ｍＬ
測定時間：海洋性バクテリア懸濁液を調製してから５０分後の発光強度（焼却灰抽出液添加前の発光強度）を測定、その後、海洋性バクテリア懸濁液に焼却灰抽出液を添加してから１５分後の発光強度（焼却灰抽出液添加後の発光強度）を測定
【０１０７】
抽出溶媒としてＫＣｌ水溶液、Ｋ２ＳＯ４水溶液、又はＫＢｒ水溶液を用いた場合のいずれにおいても、焼却灰Ｂ及びＣを毒性があると評価することができた。
【０１０８】
（実施例８）
以下の組成を有する４種の水溶液を調製した。
水溶液ａ：２０，０００ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２００ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４
水溶液ｂ：２０，０００ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、３，７００ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１，０００ｍｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、５００ｍｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＨＰＯ４
水溶液ｃ：２０，０００ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２，０００ｍｇ／Ｌ  グルコース
水溶液ｄ：２０，０００ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ
再活性化溶液として水溶液ａ〜ｄを用い、被検物質として焼却灰抽出液Ｄを用いた他は実施例４と同様にして、海洋性バクテリア懸濁液に焼却灰抽出液Ｄを添加してから１５分後の発光強度を測定した。
【０１０９】
評価結果を表１に示す。水溶液ａ〜ｃを用いた場合には、水溶液ｄを用いた場合と比べ、発光強度が低下した。
【０１１０】
【表１】
2009085929.tif 000003
【０１１１】
（実施例９）
以下の組成を有する３種の水溶液を調製した。
水溶液ｅ：２０，０００ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２，０００ｍｇ／Ｌ  グルコース
水溶液ｆ：２０，０００ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２，０００ｍｇ／Ｌ  グルコース、２００ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４
水溶液ｇ：２０，０００ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ
再活性化溶液として水溶液ｅ〜ｇを用い、被検物質として焼却灰抽出液Ｆを用いた他は実施例４と同様にして、毒性を評価した。
【０１１２】
評価結果を表２に示す。水溶液ｅ又はｆを用いた場合には、焼却灰抽出液Ｆを毒性があると評価することができた。
【０１１３】
【表２】
2009085929.tif 000004
【０１１４】
（実施例１０）
再活性化溶液として、人工海水を用いて海洋性バクテリアを再活性化し、海洋性バクテリア懸濁液を得た。人工海水の主成分は、次のとおりである。塩素１９．３５４ｇ／ｋｇ、ナトリウム１０．７７ｇ／ｋｇ、硫黄２．７１２ｇ／ｋｇ、マグネシウム１．２９ｇ／ｋｇ、カルシウム０．４１２ｇ／ｋｇ、カリウム０．３９９ｇ／ｋｇ、炭素０．１４２ｇ／ｋｇ、臭素０．０６７３ｇ／ｋｇ、ストロンチウム０．０００７９ｇ／ｋｇ、ホウ素０．００４５ｇ／ｋｇ、及びフッ素０．００１３ｇ／ｋｇ
得られた海洋性バクテリア懸濁液について、実施例１と同様の方法で海洋性バクテリアの生物活性（発光強度）を測定した。
その結果、実施例１の再活性化溶液として１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ水溶液と２重量％のＮａＣｌ水溶液との混合水溶液を用いた例に対して、４０％程度の発光強度が得られた。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】被検物質の毒性を評価する手順を示すフロー図の一例である。
【図２】再活性化溶液としてＫＣｌを含む水溶液を用いて再活性化した場合の海洋性バクテリアの生物活性（任意単位）を示すグラフである。
【図３】海洋性バクテリア懸濁液にＫＣｌを添加した場合の海洋性バクテリアの生物活性（任意単位）を示すグラフである。
【図４】焼却灰の毒性評価の結果を示すグラフである。（ａ）は再活性化溶液としてＫＣｌ＋ＮａＣｌ水溶液を用いた場合、（ｂ）は再活性化溶液としてＮａＣｌ水溶液を用いた場合を示す。
【図１】
2009085929.tif 000005
【図２】
2009085929.tif 000006
【図３】
2009085929.tif 000007
【図４】
2009085929.tif 000008