(57)【要約】【課題】  微量の蛋白質やペプチドの吸着が起こりにくく、プロテオーム解析にも使用できる生体試料保存用試験管、特に尿検査試験管を提供する。【解決手段】  単量体としてホスホリルコリン基を有する単量体（ａ）と疎水性単量体（ｂ）とを含み、かつその共重合比a／ｂが３５／６５〜７５／２５である共重合体を原材料である試験管にコーティングしてなることを特徴とする生体試料保存用試験管。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単量体としてホスホリルコリン基を有する単量体（ａ）と疎水性単量体（ｂ）とを含み、かつその共重合比a／ｂが３５／６５〜７５／２５である共重合体を原材料である試験管にコーティングしてなることを特徴とする生体試料保存用試験管。
【請求項２】
尿検査試験管である、請求項1に記載の生体試料保存用試験管。
【請求項３】
プロテオーム解析用試験管を兼用している、請求項１または２に記載の生体試料保存用試験管。
【請求項４】
プロテオーム解析が、分子量が１０００〜６０００の低分子量域の尿プロテオーム解析である、請求項３に記載の生体試料保存用試験管。
【請求項５】
生体試料保存用試験管が尿沈渣管である、請求項１〜４のいずれかに記載の生体試料保存用試験管。
【請求項６】
尿検査試験管が透明である、請求項１〜５のいずれかに記載の生体試料保存用試験管。
【請求項７】
ホスホリルコリン基を有する単量体が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンであり、疎水性単量体がメタクリル酸−ｎ−ブチルエステルである、請求項１〜６のいずれかに記載の生体試料保存用試験管。
【請求項８】
使い捨ての生体試料保存用試験管である、請求項１〜７のいずれかに記載の生体試料保存用試験管。
【請求項９】
共重合体の共重合比a／ｂが４０／６０〜６０／４０である、請求項１〜８のいずれかに記載の生体試料保存用試験管。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載した生体試料保存用試験管に尿を入れ、その尿中の尿検査項目を測定し、一方、残りの尿をプロテオーム解析することを特徴とするプロテオーム解析法。
【請求項１１】
原材料である試験管に、単量体としてホスホリルコリン基を有する単量体（ａ）と疎水性単量体（ｂ）とを含みかつその共重合比a／ｂが３５／６５〜７５／２５である共重合体の溶液を接触させ、得られる尿検査試験管を乾燥することを特徴とするプロテオーム解析兼用尿検査試験管の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料保存用試験管に関し、さらに詳しくは、微量の蛋白質やペプチドの吸着が起こりにくく、プロテオーム解析にも使用できる生体試料保存用試験管、特に尿検査試験管に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
尿には、病態に関連する様々な物質、例えば、蛋白質、糖、電解質、血液などが含まれており、それらの有無や濃度を測定することにより、病気の有無、状態を知ることができる。そのため、現在、尿中のグルコース、クレアチニン、ＮＡＧ、尿中アルブミン、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、クロル等の項目を測定することが実用化されている。その様な場合、人体から排泄された尿を尿検査試験管に移して、これらの項目を測定している。また、尿成分として赤血球や白血球、尿酸、細胞、細菌などの固形成分の量や種類を調べるには、尿検査試験管として尿沈渣管が用いられている（特許文献１）。
【０００３】
一方、ここ数年、プロテオーム解析の研究が急速に進展し、種々の疾患特異的マーカーが新たに報告されてきている。尿を対象としたプロテオーム解析も広く取り組まれており、腎・泌尿器科疾患を対象により良いバイオマーカーの探索が検討されている。このような疾患プロテオミク研究では、疾患に関連した尿をいかに収集・保存するかが重要な問題であり、日常検査で採取した検体をそのまま保存できれば、簡便かつ迅速に研究に着手できる。従って、日常検査で扱う尿検査試験管がそのままサンプル収集に使えると、煩雑さが伴わずに有用である。
【０００４】
しかしながら、本発明者の検討によると、日常検査に使用されている尿検査試験管をプロテオーム解析の研究に用いると、通常の尿検査では問題とならなかった、サンプル保存において微量のタンパク質やペプチド吸着が起こり、結果を間違って解釈するという問題があるということを発見した。
【特許文献１】特開平７−２８０８００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような事情のもとで、微量の蛋白質やペプチドの吸着が起こりにくく、プロテオーム解析にも使用できる生体試料保存用試験管、特に尿検査試験管を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた。その結果、驚くべきことに、特定の共重合比の共重合体を市販の尿検査試験管にコーティングすると、尿検査試験管自体に尿を入れても蛋白が吸着しにくく、尿検査項目も正確に測定できかつプロテオーム解析も正確にできることを見出し、その知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、以下のとおりである。
（１）単量体としてホスホリルコリン基を有する単量体（ａ）と疎水性単量体（ｂ）とを含み、かつその共重合比a／ｂが３５／６５〜７５／２５である共重合体を原材料である試験管にコーティングしてなることを特徴とする生体試料保存用試験管。
（２）尿検査試験管である、上記（1）に記載の生体試料保存用試験管。
（３）プロテオーム解析用試験管を兼用している、上記（１）または（２）に記載の生体試料保存用試験管。
（４）プロテオーム解析が、分子量が１０００〜６０００の低分子量域の尿プロテオーム解析である、上記（３）に記載の生体試料保存用試験管。
（５）生体試料保存用試験管が尿沈渣管である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の生体試料保存用試験管。
（６）尿検査試験管が透明である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の生体試料保存用試験管。
（７）ホスホリルコリン基を有する単量体が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンであり、疎水性単量体がメタクリル酸−ｎ−ブチルエステルである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の生体試料保存用試験管。
（８）使い捨ての生体試料保存用試験管である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の生体試料保存用試験管。
（９）共重合体の共重合比a／ｂが４０／６０〜６０／４０である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の生体試料保存用試験管。
（１０）上記（１）〜（９）のいずれかに記載した生体試料保存用試験管に尿を入れ、その尿中の尿検査項目を測定し、一方、残りの尿をプロテオーム解析することを特徴とするプロテオーム解析法。
（１１）原材料である試験管に、単量体としてホスホリルコリン基を有する単量体（ａ）と疎水性単量体（ｂ）とを含みかつその共重合比a／ｂが３５／６５〜７５／２５である共重合体の溶液を接触させ、得られる尿検査試験管を乾燥することを特徴とするプロテオーム解析兼用尿検査試験管の製造方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の生体試料保存用試験管は、単量体としてホスホリルコリン基を有する単量体（ａ）と疎水性単量体（ｂ）とを含み、かつその共重合比a／ｂが３５／６５〜７５／２５である共重合体を原材料である試験管にコーティングしてなることを特徴とする。
【０００９】
本発明に用いる共重合体中のホスホリルコリン基を有する単量体とは、下記式
【００１０】
【化１】
2009031121.tif 000002
【００１１】
で表されるホスホリルコリン基を有する単量体であれば、特に限定されないが、通常、ビニル基とホスホリルコリン基とを有する単量体が好ましく例示できる。具体的には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−アクロイルオキシエチルホスホリルコリン、３−メタクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、３−アクロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４−メタクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、４−アクロイルオキシブチルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン等を例示できる。これらの単量体のうち、下記式
【００１２】
【化２】
2009031121.tif 000003
【００１３】
で表される２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが入手の点から好ましい。
【００１４】
本発明に用いる共重合体中の疎水性単量体としては、ホスホリルコリン基を有する単量体と共重合可能な疎水性単量体が好ましい。そのような疎水性単量体としては、メタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、スチレン系単量体、ビニルエーテル単量体、アルケン単量体、モノカルボン酸ビニル単量体、イタコン酸ジアルキルエステル単量体を例示できる。
【００１５】
メタクリル酸エステル単量体としては、メタクリル酸−ｎ−ブチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ペンチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸ノニル、メタクリル酸トリデシル、２−ヒドロキシエチルメタクリレート等の単量体を例示できる。
【００１６】
アクリル酸エステル単量体としては、アクリル酸−ｎ−ブチル、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ブチル、アクリル酸ペンチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸ヘプチル、アクリル酸オクチル、アクリル酸ノニル、アクリル酸トリデシル、２−ヒドロキシエチルメタクリレート等の単量体を例示できる。
【００１７】
スチレン系単量体としては、スチレン、メチルスチレン、クロロスチレン等の単量体を例示できる。
【００１８】
ビニルエーテル単量体としては、エチルビニルエーテル、プロピルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル等の単量体を例示できる。アルケン単量体としては、エチレン、プロピレン、イソブチレンの単量体を例示できる。モノカルボン酸ビニル単量体としては、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ブタン酸ビニルの単量体を例示できる。イタコン酸ジアルキルエステル単量体としては、ジメチルイタコネート、ジエチルイタコネート、ジプロピルイタコネート、ジ−ｎ−ブチルイタコネート等の単量体を挙げることができる。
【００１９】
疎水性単量体としては、下記式
【化３】
2009031121.tif 000004
【００２０】
で表されるメタクリル酸−ｎ−ブチルエステル（ＣＡＳ番号97-88-1）が、入手の点から最も好ましい。
【００２１】
本発明に用いる共重合体においては、ホスホリルコリン基を有する単量体が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンであり、疎水性単量体がメタクリル酸−ｎ−ブチルエステルであることが最も好ましい。
【００２２】
本発明に用いる共重合体の共重合比a／ｂは、３５／６５〜７５／２５であり、４０／６０〜６０／４０がさらに好ましい。
【００２３】
本発明においては、共重合体においてどちらか一方の単量体に比が偏ると蛋白吸着防止機能が弱くなる。
【００２４】
共重合体は、その共重合体を適当な溶媒に溶解させた状態でコーティング液にして用いることが好ましい。このとき、溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール及びこれらの混合溶媒を用いることができるが、安全性の点から水が好ましい。
【００２５】
本発明において、コーティングするための原材料の試験管は、尿検査試験管が好適であり、さらに尿沈渣管であることが最も好適である。
【００２６】
原材料の試験管は、尿を入れることにより変質しない材料から構成されていることが好ましい。原材料の試験管の材質としては、具体的には、ガラス、プラスチックが好ましい。この場合、プラスチックとしては、ポリスチレン、ポリアクリロニトリルスチレンを例示できる。原材料の試験管は、さらに沈渣の状況、尿量やにごりを判別できるようにするため、透明な物質から製造されていることが好ましい。さらに、原材料の試験管は、使い捨ての試験管を用いて、本発明の生体試料保存用試験管を使い捨ての生体試料保存用試験管としてもよい。
【００２７】
用いる原材料の試験管としては、例えば、特開平７−２８０８００号公報に記載の尿沈渣用遠心試験管、すなわち、円筒形状の試験管上部と、この試験管上部の下端に連続して内周面が先細りのテーパー状に形成された試験管中部と、この試験管中部の下端に連続して内周面が小径の円筒形状に形成され、下端が底壁で閉口した試験管下部とを備えることを特徴とする尿沈渣用遠心試験管（尿沈渣管）を用いることができる。
【００２８】
本発明において、原材料の試験管から、本発明の生体試料保存用試験管を製造するには、１）共重合体の溶液に試験管を浸し、次いで乾燥させる方法、２）前記１）の方法において、試験管の浸漬及び乾燥を複数回、繰り返す方法、３）試験管の内部の表面に、共重合体の溶液を塗付して乾燥させる方法、４）前記３）の方法において、試験管への塗付及び乾燥を複数回、繰り返す方法、等を例示できる。これらの場合、共重合体の溶液に試験管を浸したり、共重合体の溶液を試験管に塗付したりした後、得られる試験管を水で洗浄した後、乾燥操作に付してもよい。
【００２９】
本発明の生体試料保存用試験管を製造する際、共重合体の溶液は、共重合体の濃度が好ましくは０．００１〜５重量％、さらに好ましくは０．００５〜３重量％である。溶液への試験管の浸漬時間は、例えば、０．５〜１０分が好ましい。乾燥温度は、例えば、２０〜８０℃が好ましい。この場合、乾燥は、自然乾燥でも減圧乾燥でもよい。
【００３０】
本発明の生体試料保存用試験管は、原材料の試験管が透明であれば、コーティング剤が吸着されていても透明な生体試料保存用試験管となる。
【００３１】
本発明の生体試料保存用試験管は、尿プロテオーム解析に有用であり、実際に尿のプロテオームで解析されるペプチドや蛋白質の分子量は特に限定されないが、分子量が１０００〜６０００の低分子量域の尿プロテオーム解析に好適である。例えば、本発明の生体試料保存用試験管に患者や健常者の尿を入れ、尿検査として一般的な項目を測定した後、残りの尿をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等の質量分析計に付し、病態患者由来の尿と健常者由来の尿の種々の蛋白質の有無や量を比較することにより新たなマーカーを発見しうる。なお、本明細書においては、蛋白質にはペプチドも含まれるものとする。本発明の生体試料保存用試験管は蛋白質の吸着が起こりにくいので目的の蛋白質が微量に存在する物質でも構わない。また、それとは別に、尿中の微量蛋白質を測定するときに、生体試料保存用試験管への吸着がほとんどないので尿を長時間保存してもその蛋白質を正確に測定できる。
【実施例】
【００３２】
原材料の尿沈渣管としては、特開平７−２８０８００号公報に記載の尿沈渣用遠心分離管（国宗工業所製、材質はポリアクリロニトリルスチレン）を用いた。
実施例１及び実施例２    本発明の尿沈渣管の作製  
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸−ｎ−ブチルエステルとの共重合体（共重合比５０：５０）の０．０５重量％水溶液を作成し、これに原材料の尿沈渣管を１分、浸漬させ、一夜５０℃インキュベータにて放置乾燥し、さらに一晩で真空乾燥機(デシケーター)に入れ十分乾燥することにより、実施例１の尿沈渣管（１回コート）を得た。同様にして水溶性ポリマーを浸漬乾燥の操作を２回し、実施例２の尿沈渣管（２回コート）を作製した。
比較例１〜３  比較の尿沈渣管の作製
比較の尿沈渣管としては、非コートの原材料の尿沈渣管を比較例１の尿沈渣管とした。
【００３３】
また実施例１において、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸−ｎ−ブチルエステルとの共重合体の共重合比５０：５０を、共重合比３０：７０および８０：２０とした以外は同様に製造した尿沈渣管を、それぞれ比較例２および３の尿沈渣管とした。
実施例３  尿沈渣管への蛋白質の吸着の電気泳動による確認試験
上記の方法で作製した実施例１〜２、比較例１〜３の尿沈渣管に、それぞれ、尿試験紙法で尿タンパクが陰性の尿と５００ｍｇ／ｄＬ以上であった尿を１．５ｍＬ分注した。これを、４℃に一昼夜保持し、尿を丁寧に取り除いた。次いで、吸着した蛋白質を回収するため、ＰＢＳ（１０ｍＭ  りん酸バッファ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で尿沈渣管をリンスし、その沈渣管に５０μＬのサンプルバッファー（０．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ、６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２％  ＢＰＢ、ｐＨ６．８）を添加した。続いて、尿沈渣管のｖｏｒｔｅｘ攪拌を３０秒間行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動用のサンプルとした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは以下の手順で行った。１０-２０％グラジエントポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ社）にサンプルを２０μＬアプライし、定電流２０ｍＡ  ７５分の泳動を行った。
【００３４】
結果を図１に示す。尿タンパク陰性のサンプル１、３、５、７では、非コートあるいは、表面コートした尿沈渣管（実施例１、２および比較例２）および非コートの尿沈渣管（比較例１）のいずれの場合にもＣＢＢ染色でバンドは確認されなかった。一方、５００ｍｇ／ｄＬ以上のサンプル２、４、６、８では、比較例１の尿沈渣管（非コート）および比較例２の尿沈渣管（共重合比３０：７０）から、分子量６６ｋＤａ付近のアルブミンに相当するバンドが検出された。比較例３の尿沈渣管（共重合比８０：２０）も同様な結果を示した（図省略）。一方、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸−ｎ−ブチルエステルとの共重合体（共重合比５０：５０）を、１回コートした実施例１の尿沈渣管および２回コートした実施例２の尿沈渣管では、ＣＢＢ染色像からバンドがなく、タンパクの吸着が抑えられていることが明らかとなった。
実施例４  尿沈渣管への蛋白質の吸着のＳＥＬＤＩ―ＴＯＦ―ＭＳによる確認試験
実施例２の２回コート尿沈渣管と比較例１の非コート尿沈渣管に、尿試験紙法で尿タンパクが陰性および１００ｍｇ／ｄＬ以上であった尿を１．５ｍＬ分注した。これを、以下の条件で一昼夜保持した。
【００３５】
（ａ）尿サンプルを尿沈渣管に分注後、室温に２時間保持した後、４℃保冷庫で静置
（ｂ）尿サンプルを尿沈渣管に分注後、直ちに４℃保冷庫で静置
その後、尿サンプルを丁寧に取り除き、次いで、ＰＢＳ（１０ｍＭ  りん酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で尿沈渣管をリンスし、５０μＬの０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液を添加した。続いて、尿沈渣管のｖｏｒｔｅｘ攪拌を３０秒間行い、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析用のサンプルとした。このサンプルをＮＰ２０  Ａｒｒａｙ  （Ｂｉｏ  Ｒａｄ社）に添加した後、マトリックスとしてｓｉｎａｐｉｃ  ａｃｉｄ  （Ｂｉｏ  Ｒａｄ社）を塗布しＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ  （Ｂｉｏ  Ｒａｄ社）でスペクトラムについて実施例２の表面コート尿沈渣管と比較例１の非コート尿沈渣管とで比較した。
【００３６】
図２に、尿沈渣管に吸着した成分のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトラムを示す。尿タンパク陰性のサンプルにおいて、比較例１の非コート尿沈渣管に上記（ａ）と（ｂ）の保持条件で２８００ｍ／ｚ付近および４７００ｍ／ｚ付近にピークが確認され、尿紙試験法で蛋白陰性のサンプルにもかかわらず、タンパク／ペプチドの吸着していることが明らかとなった。同じ尿タンパク陰性のサンプルで共重合体を２回コートした実施例２の尿沈渣管ではいずれのピークも消失し、尿沈渣管へのタンパク／ペプチド吸着が回避されていることが判明した。同様に、尿タンパクが１００ｍｇ／ｄＬ以上のサンプルにおいて、比較例１の非コート尿沈渣管では２８００ｍ／ｚ付近、３４００ｍ／ｚ付近、４７００ｍ／ｚ付近、５０００ｍ／ｚ付近にピークが検出された。一方、同じ尿タンパクが１００ｍｇ／ｄＬ以上のサンプルで共重合体を２回コートした実施例２の尿沈渣管では、それらのピークは消失するか減衰し、タンパク／ペプチドの吸着が抑制されていることが示唆された。
実施例５  尿生化学の項目の測定
尿試験紙法でタンパクが陰性または１００ｍｇ／ｄＬ以上であった尿を、それぞれ共重合体を２回コーティングした実施例２の尿沈渣管と比較例１の非コート尿沈渣管に移し、グルコース、総タンパク、クレアチニン、ＮＡＧ、尿中アルブミン、カルシウム、マグネシウム、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌについて既存の臨床検査試薬で測定した。ここでコントロールとして、尿沈渣管に移す前の検体（以下、原尿と記す）についても、尿生化学項目の測定を行った（表１、表２）。
【００３７】
【表１】
2009031121.tif 000005
【００３８】
【表２】
2009031121.tif 000006
表１に尿試験紙法でタンパクが陰性だった検体における尿生化学項目の測定結果を示す。表２は尿試験紙法でタンパクが１００ｍｇ／ｄＬ程度だった検体における尿生化学項目の測定結果を示す。いずれの場合も、共重合体を２回コーティングした実施例２の尿沈渣管と比較例１の非コート尿沈渣管に移した検体の測定値は、原尿とほぼ同等の測定値を示した。このことにより、原料の共重合体をコーティングした尿沈渣管は従来使用していた未処理尿沈渣管と同様に日常検査に利用できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、尿沈渣管に吸着した成分のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示したものである。Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｃ２は、それぞれ、比較例１（非コート）、比較例２（共重合比３０：７０）、実施例１（１回コート）、実施例２（２回コート）の尿沈渣管の結果を示す。また、１、３、５、７は尿タンパク陰性、また、２、４、６、８は、尿タンパクが５００ｍｇ／ｄｌのサンプルを用いた結果を示す。
【図２】図２は、尿沈渣管に吸着した成分のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトラムを示したものである。試料は、尿試験紙法で尿タンパク陰性または１００ｍｇ／ｄｌのサンプルを、非コート尿沈渣管（比較例１）と共重合体を２回コートした尿沈渣管（実施例２）に入れ室温または４℃の条件で保存し、沈渣管に吸着された物質である。
【図２】
2009031121.tif 000007
【図１】
2009031121.tif 000008