(57)【要約】【課題】本発明は、低濃度のオゾンにより、貝類の生命活動の維持を図り、かつ、効率的にウイルスを不活化する、貝類の浄化方法を目的とする。【解決手段】本発明は、オゾン濃度５〜３００ｖｏｌｐｐｍのオゾン含有ガスを平均気泡径が１０ｍｍ以下の気泡として水に供給し、前記オゾン含有ガスの水中におけるボイド率を０．０１〜５体積％とした水で、貝類を処理することを特徴とする。前記貝類は二枚貝であって、該二枚貝の殻が開く方向と略直交する水流により貝類を処理することが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オゾン濃度５〜３００ｖｏｌｐｐｍのオゾン含有ガスを平均気泡径が１０ｍｍ以下の気泡として水に供給し、前記オゾン含有ガスの水中におけるボイド率を０．０１〜５体積％とした水で、貝類を処理することを特徴とする、貝類の浄化方法。
【請求項２】
前記貝類は二枚貝であって、該二枚貝の殻が開く方向と略直交する水流により貝類を処理することを特徴とする、請求項１に記載の貝類の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオゾンによる貝類の浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ノロウイルスは海中のカキ等の二枚貝に取り込まれ、冬季の食中毒の主原因の１つになっている。例えば、生カキは、水揚げ後１晩〜２晩程度、無菌海水等で畜養し、ウイルスの不活化および殺菌を目的とした、浄化処理が行われている。しかし、無菌畜養は冬季の冷水ではカキの濾水量が減るため効果が低い。
従来、カキの浄化方法として、次亜塩素酸を用いた浄化方法（例えば、特許文献１、２）や、オゾン水を用いる浄化方法（例えば、特許文献３〜６）が報告されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、酸素発生用の電極を備えた浄化水槽に、次亜塩素酸を含有する殺菌海水を貯留し、カキを浸漬し、殺菌海水中の酸素濃度を高めて、カキの吸水活動の低下を抑制して、浄化効率を高める方法が開示されている。また、特許文献２には、食塩水に次亜塩素酸を添加した水に、剥き身のカキを浸漬して行う浄化方法が開示されている。次亜塩素酸を使用した浄化方法は、浄化の効果を高めるために次亜塩素酸の濃度を高くすると、食品を劣化させ、また強い臭気を伴うため作業環境等の対策が必要である。
【０００４】
従来、オゾンは高い酸化力からウイルスの不活化効果が高いことで知られている。ここで、カキ等が持っているノロウイルスは、体内の中腸線に濃縮されている。このためカキ等貝類のウイルスの不活化には、オゾンが貝類の体内に入る必要がある。オゾンを使用した浄化方法として、例えば、特許文献３には、水中にオゾンをオゾンナノバブルとして存在させ、オゾン溶解度が０．１〜５ｍｇ／Ｌのオゾン水による、浄化方法が開示されている。また、特許文献４には、オゾンガスの微細な泡が水中に含まれるオゾン水を殺菌対象物に噴出して行う浄化方法が開示されている。また、特許文献５には、マイクロオゾンガス気泡により、殺菌浄化を行った水を利用する、浄化方法が開示されている。特許文献６には、マイナスイオン化したオゾンを海水に混和し、該海水にカキを浸漬させて浄化を行う方法が開示されている。
【特許文献１】特開２００６−２０５７０号公報
【特許文献２】特開平８−３０８４８０号公報
【特許文献３】特開２００７−２７５０８９号公報
【特許文献４】特開２０００−２３７７５７号公報
【特許文献５】特開２００５−１１０５５２号公報
【特許文献６】特開２００２−２０５０７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、オゾン水を使用したウイルスの不活化方法では、不活化の効果を上げるために高濃度のオゾンガスを使用すると、溶存オゾン濃度の上昇により貝類が拒絶反応を示して殻を閉ざし、ウイルスを不活化できない。さらに高濃度のオゾンガスを用いると、貝類が死滅してしまい、その貝類の価値が著しく損なわれてしまう。加えて、オゾンの気散により、産業衛生学会許容濃度委員会の示す０．１ｖｏｌｐｐｍを下回るための対策も必要である。加えて装置コストも莫大なため、多量の処理には向かないという問題がある。一方で、低濃度のオゾンガスでは、ウイルスの不活化ができないと言う問題がある。
そこで本発明は、低濃度のオゾンにより、貝類の生命活動の維持を図り、かつ、効率的にウイルスを不活化する、貝類の浄化方法を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討を行った結果、低いオゾン濃度の気泡を用いることで、水中の溶存オゾン濃度の上昇を抑えると共に、正常な貝にオゾン含有ガスの気泡（以下、オゾン含有ガスバブルと言うことがある）を吸い込ませるように、気泡径および曝気量および水流を制御することで貝の体内に存在するウイルスを分解し、不活化できることを見い出した。本発明は、かかる知見を基になされたものである。
【０００７】
即ち、本発明の貝類の浄化方法は、オゾン濃度５〜３００ｖｏｌｐｐｍのオゾン含有ガスを平均気泡径が１０ｍｍ以下の気泡として水に供給し、前記オゾン含有ガスの水中におけるボイド率を０．０１〜５体積％とした水で、貝類を処理することを特徴とする。前記貝類は二枚貝であって、該二枚貝の殻が開く方向と略直交する水流により貝類を処理することが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の貝類の浄化方法によれば、低濃度のオゾンにより、貝類の生命活動の維持を図り、かつ、効率的にウイルスを不活化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の浄化方法について、以下に例を挙げて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。図１は、貝類の浄化システム１００を示す模式図である。図１に示すとおり、浄化システム１００は、水槽１０と、曝気手段２０と、水流発生手段４０とを有している。
曝気手段２０は、供給管２２と、該供給管２２の先端に設けられた散気部２４とで構成されている。散気部２４は水槽１０に貯えられた水の中に浸漬され、供給管２２は図示されないオゾン含有ガス供給装置に接続されている。水流発生手段４０は、水槽１０内に設けられている。
【００１０】
水槽１０の材質は特に限定されないが、オゾンの酸化力が強いため、例えば、ガラス、テフロン（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）、チタン、オゾン処理（高濃度オゾンによる強固な酸化皮膜形成）をしたアルミニウムやステンレスを用いることが好ましい。オゾンに対する耐性が低いニトリルゴム、シリコンあるいはウレタン等の材質のものを使用する場合、処理容器の劣化に十分に注意する必要がある。
また、水槽１０の大きさは、浄化する貝類の処理数量や、水流発生装置４０の能力を勘案して決定することができる。
【００１１】
曝気手段２０は、平均気泡径が１０ｍｍ以下の気泡を発生させ、ボイド率を０．０１〜５体積％に調整できるものであれば特に限定されず、散気板、散気筒、ディフューザー等を使用することができる。
【００１２】
水流発生装置４０は、水槽１０内の水を用い、浄化対象とする貝類の近傍に水流を発生できるものであれば特に限定されず、例えば、ポンプや、攪拌装置等を挙げることができる。
【００１３】
本発明の貝類の浄化方法について、図１を用いて説明する。本発明の貝類の浄化方法は、オゾン濃度５〜３００ｖｏｌｐｐｍのオゾン含有ガスを平均気泡径が１０ｍｍ以下の気泡（以下、オゾン含有ガスバブルということがある）として水に供給し、水中における気泡のボイド率を０．０１〜５体積％とした水で貝類を処理して、貝類のウイルスを不活化する（浄化処理）ものである。
【００１４】
まず、水槽１０に任意の量の水を貯え、浄化対象である貝３０を入れる。貝３０は、二枚の殻が上下となるように、即ち、殻の合わせ部３２が、水槽１０の底面に対して略平行になるように置かれる。次いで、図示されないオゾン含有ガス供給装置からオゾン含有ガスを供給管２２に流通させ、散気部２４からオゾン含有ガスバブル２６を水中に発生する。そして、水流発生装置４０により、水槽底面と略平行な水流Ａを発生させる。その後、任意の時間、オゾン含有ガスバブル２６を発生させ、貝３０の浄化処理を行う。
【００１５】
本発明の浄化方法が対象とする貝類は、海水または淡水、汽水のいずれに生息する貝類も対象とすることができる。また、いわゆる巻貝、二枚貝等のいずれであっても良い。
【００１６】
オゾン含有ガスを供給する対象となる水槽１０内の水は特に限定されず、浄化処理を行う貝の種類等を勘案して選択することができ、海水、人工海水、淡水等を挙げることができる。例えば、海水に生息する貝を浄化する場合には、浄化対象とする貝の生命活動を妨げず、かつ、貝の濾水による浄化作用を利用するためには、無菌海水や人工海水（総じて、海水と言うことがある）または海水を淡水で希釈したものを用いることが好ましい。無菌海水や人工海水を淡水で希釈する場合には、希釈率を０．３以上１未満とすることが好ましい。希釈率は、希釈後の水における海水の割合であって体積比で表される値である。例えば、カキにおいては、塩濃度１〜３．５質量％の水中で生命活動の維持が可能である。一方、海水に比べて淡水の方が、オゾンが溶解し易く、ウイルスの不活化効果が高くなる。従って、海水の希釈率を０．３以上１未満とした水を用いることで、浄化処理中のカキの生命活動の維持と、良好なウイルスの不活化効果とを両立することができる。
【００１７】
オゾン含有ガス中のオゾンの発生方法は特に限定されず、電子線、放射線、紫外線等高エネルギーの光を酸素に照射する方法や、化学的方法、電解法、放電法等が挙げられる。工業的には、発生コストや発生量から無声放電法が多く用いられている。オゾンの発生には、市販のオゾン発生器が利用でき、例えば低濃度オゾン発生器として株式会社レイシー製ＹＧＲ−５０（商品名）等が市販されており、高濃度オゾン発生器としてエコデザイン株式会社製ＥＤ−ＯＧ−ＰＳＡ１（商品名）等が市販されている。オゾンは自己分解性を持つことから調製後すぐに使用することが望ましい。
オゾンの希釈に用いる希釈ガスとしては、オゾンに対して不活性あるいは反応性に乏しいガスが好ましく、例えば、ヘリウム、アルゴン、二酸化炭素、酸素、空気、窒素等を挙げることができる。
【００１８】
オゾン含有ガスバブル２６として、水に供給されるオゾン含有ガスのオゾン濃度は５〜３００ｖｏｌｐｐｍであり、より好ましくは、１０〜１００ｖｏｌｐｐｍである。５ｖｏｌｐｐｍ未満であると、ウイルスに対する不活化の効果が表れにくい。３００ｖｏｌｐｐｍを超えると、水中のオゾン濃度が高くなりすぎ、貝の生命活動の維持に支障をきたす。具体的には、水中のオゾン濃度が高くなりすぎると、貝が拒絶反応を起こし、殻を閉ざしてしまうことにより、貝内部へのオゾン供給も絶たれ、ウイルスの不活化が困難となる。
【００１９】
オゾン含有ガスバブル２６は、平均気泡径が１０ｍｍ以下であり、好ましくは２ｍｍ以下である。例えば、正常なカキの場合、殻を２０ｍｍ程度しか開かないため、平均気泡径が１０ｍｍを超える気泡では貝に取り込まれ難い。また、気泡径が大きくなると、浄化処理の際に、気泡がより大きな衝撃を貝に与えるため、防衛反応により殻を閉ざしてしまうため好ましくない。ここで、平均気泡径とは、気泡径の分布において、全気泡の直径の総和を気泡数で除した値である。
【００２０】
水中のボイド率（気泡割合）は、０．０１〜５体積％であり、好ましくは０．０１〜２体積％である。０．０１体積％未満であると、水中のオゾン量が不十分なため、ウイルス不活化の効果が得られ難い。５体積％を超えると、貝に接触するオゾン含有ガスバブル２６が多くなりすぎ、防衛反応から貝は殻を閉ざしてしまうため好ましくない。なお、ボイド率を１体積％以下とすると、水の白濁が少なく、作業性の向上が図れる。ここで、ボイド率とは、水の体積に対する気泡の体積の割合を示す値であり、体積％で表される。
【００２１】
水槽１０中の水の流れは特に限定されないが、貝３０の二枚の殻が開く方向と略直交する方向、即ち、二枚の殻の合わせ部３２に略平行の水流を与えることが好ましい。一般に扁平な形状をしたカキやホタテ、アサリ、ハマグリ等の二枚貝は、体の左右に殻を有している。貝は、合わせ部３２を開いてプランクトン等の餌を捕食したり、老廃物を排出している。浄化処理に当たり、最も効果的にオゾンを作用させるには、オゾン含有ガスバブル２６を合わせ部３２と略平行、即ち、二枚の殻が組み合わさった隙間に向かって、水流を作ることが好ましい。
なお、二枚の殻の開く方向と略直交する方向とは、二枚貝が開いた際に、二枚の殻の間に生じた隙間に、水が流入できる程度の方向を意味する。
【００２２】
上述した水流の程度は特に限定されず、浄化処理に用いる容器の大きさや、水量、浄化する貝の数量や種類に応じて、適切な流量を設定することができる。例えば、合わせ部３２近傍において、０．０５〜１．５ｍ／ｓの水流が生じていることが好ましく、０．１〜１ｍ／ｓの水流が生じていることがより好ましい。０．０５ｍ／ｓ未満であると、オゾン含有ガスバブル２６を貝の中に効率的に取り込ませることができず、浄化処理が不十分、または、浄化処理に要する時間が長くなるため好ましくない。１．５ｍ／ｓを超える水流では、水流により受ける刺激により貝が殻を閉じてしまうことが多く、オゾン含有ガスバブル２６が貝に取り込まれず、浄化処理が不十分となるおそれがある。
【００２３】
浄化処理における水のｐＨは特に限定されないが、ｐＨ６．０〜９．０の範囲とすることが好ましく、ｐＨ６．５〜８．５の範囲とすることが好ましい。ｐＨが低い環境下では、水中のオゾンの分解が抑制され、ウイルスの不活化効果が高くなる傾向にある。しかし、ｐＨ６．０未満であると、貝が生命活動を停止する確率が高くなる。また、ｐＨ９．０を超えると、貝が生命活動を停止する確率が高くなり好ましくない。
【００２４】
浄化処理における水の温度は特に限定されないが、温度が低いほどオゾンは分解しにくくなるため効果は向上する一方、貝の生命活動は温度が高いほど活発である。よって、水の温度は、好ましくは５〜３０℃、さらに好ましくは１０〜２０℃である。
【００２５】
浄化処理を行う時間は特に限定されず、オゾン含有ガスのオゾン濃度や、浄化対象となる貝類の種類等を勘案して決定することができ、例えば、１２〜４８時間の範囲で決定することが好ましい。
【００２６】
浄化処理に用いる水には上述した成分の他、オゾン酸化反応を阻害しない範囲で、殺菌や洗浄およびｐＨ維持や味、風味、鮮度等の機能付与のために、各種ｐＨ調整剤、界面活性剤、香料、酵素、蛍光剤、増粘剤、分散剤、無機塩、アルコール類、糖類等が含まれても良い。
【００２７】
ｐＨ調整剤としては特に限定されず、公知のｐＨ調整剤の中から、目的に応じて適宜選択でき、例えば、下記（１）〜（５）等が挙げられる。
（１）各種陽イオンの水酸化物。例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等。
（２）各種陽イオンの炭酸塩あるいは炭酸。例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等。
（３）各種陽イオンの燐酸塩あるいは燐酸。例えば、燐酸、ピロリン酸、メタリン酸、ポリリン酸等。
（４）各種陽イオンのホウ酸塩あるいはホウ酸。
（５）各種陽イオンの有機酸塩あるいは有機酸。例えば、酢酸、クエン酸、乳酸、酪酸、酒石酸、シュウ酸、コハク酸、アジピン酸等。
【００２８】
糖類としては特に限定されず、従来公知の糖類の中から、目的に応じて適宜選択でき、例えば、下記（１）〜（４）等が挙げられる。
（１）グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース等。
（２）多糖類。デンプン、セルロース、アガロース、カラギーナン、キチン、ペクチン、キサンタンガム、グアーガム、カードラン等。
【００２９】
界面活性剤としては特に限定されず、従来公知の界面活性剤の中から、目的に応じて適宜選択でき、例えば、下記（１）〜（４）等が挙げられる。
（１）アルキルベンゼンスルホン酸、アルキル硫酸、アルキルフェニルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸、アシルアミドアルキル硫酸、アルキル燐酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸、パラフィンスルホン酸、α−オレフィンスルホン酸、α−スルホカルボン酸及びそれらのエステル等の水溶性塩、石鹸等のアニオン界面活性剤。
（２）ポリオキシアルキルエーテル、ポリオキシアルキルフェニルエーテル等のエトキシ化ノニオン、ポリグリセリン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グルコシドエステル、シュガーエステル、メチルグルコシドエステル、エチルグルコシドエステル、アルキルポリグルコキシド等の糖系活性剤、アルキルアミンオキサイド、アルキルジエタノールアミド、脂肪酸Ｎ−アルキルグルカミド等のアミド系活性剤、アルキルアミンオキサイド等のノニオン界面活性剤。
（３）アルキルカルボキシベタイン、アルキルスルホキシベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルアラニネート等のアミノカルボン酸塩、イミダゾリン誘導体、アルキルアミンオキシド等の両性界面活性剤。
（４）アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤。
界面活性剤は１種類のみからなるものでもよいし、複数種を含有することもできる。
【００３０】
本発明によれば、オゾン濃度５〜３００ｖｏｌｐｐｍのオゾン含有ガスを平均気泡径が１０ｍｍ以下の気泡として水に供給し、かつ、前記オゾン含有ガスの処理水中におけるボイド率を０．０１〜５体積％とすることで、貝類に効率的にオゾン含有ガスを取り込ませ、貝類が有するウイルスを効率的に不活化することができる。また、オゾン含有ガス中のオゾン濃度を５〜３００ｖｏｌｐｐｍ、かつボイド率を０．１〜５体積％とすることで、水中のオゾン濃度を浄化の対象となる貝類が生命活動を維持できる環境とすることができる。
【００３１】
また、上述の実施形態では、水槽の底面に対して略平行な水流を与えることで、浄化処理に用いる水には、二枚の殻を上下にして水槽中に置かれた貝類に対して、二枚の殻が開く方向と略直交する水流を生じている。これにより、殻の合わせ部から、オゾン含有ガスバブルを効率的に貝類に取り込ませることができ、貝類が有するウイルスの不活化効果を向上させることができる。
【００３２】
本発明は、上述の実施形態に限られるものではない。上述の実施形態では、水槽１０に貯えた水にオゾン含有ガスバブル２６を発生させ、浄化処理を行っているが、オゾン含有ガスの供給方法はこれに限られず、例えば、図２に示す浄化システム２００や、図３に示す浄化システム３００により浄化処理を行うことができる。
【００３３】
浄化システム２００（図２）は、貝３０を入れた水槽１０とは別の水槽５０と、送液手段５２とが設けられ、該水槽５０には曝気手段２０が設けられている。浄化システム２００では、水槽５０に貯水した水にオゾン含有ガスバブル２６を発生させ、該オゾン含有ガスバブル２６を含む水を送液手段５２で、水流Ｂとして水槽１０に供給する。そして、水槽１０内の水を水流Ｃとして水槽５０に送り、オゾン含有ガスバブル２６を含む水を水槽１０と水槽５０との間で循環させる。こうして、水槽１０内の水を平均気泡径１０ｍｍ以下のオゾン含有ガスバブル２６がボイド率０．０１〜５体積％の水とし、貝類の浄化処理を行うことができる。また、送液手段５２により、貝３０に対して二枚の殻が開く方向と略直交する水流を与えることができる。
【００３４】
また、浄化システム３００（図３）は、貝３０を入れた水槽１０とは別の水槽６０と、送液装置６２とが設けられ、送液手段６２には曝気手段２０が設けられている。浄化システム３００では、水槽６０に貯水された水を送液手段６２で水槽１０に供給する。この際、送液手段６２の流通路の水に、曝気手段２０によりオゾン含有ガスバブル２６を発生させ、オゾン含有ガスバブル２６を含む水を水流Ｄとして水槽１０へ供給する。そして、水槽１０内の水を水流Ｃとして水槽６０に送り、オゾン含有ガスバブル２６を含む水を水槽１０と水槽６０との間で循環させる。こうして、水槽１０内の水を平均気泡径１０ｍｍ以下のオゾン含有ガスバブル２６がボイド率０．０１〜５体積％の水とし、貝類の浄化処理を行うことができる。また、送液手段６２により、貝３０に対して二枚の殻が開く方向と略直交する水流を与えることができる。
【００３５】
また、例えば、水中にオゾン含有ガスを曝気して、上昇するオゾン含有ガスバブルによって、殻の腹縁部を下向きにして吊るした貝類に対して、二枚の殻が開く方向と略直交する水流を与えることができる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明するが、実施例に限定されるものではない。
【００３７】
（測定方法および評価方法）
＜オゾン濃度の測定＞
ポータブルオゾンモニタ（ＰＧ−６２０ＭＡ、荏原実業株式会社製）を使用して、オゾン含有ガス中のオゾン濃度を測定した。
【００３８】
＜オゾン発生器＞
ラボ用オゾン発生器（ＯＺＳＤ−３０００Ａ、荏原実業株式会社製）を用い、露点が−５０℃以下の空気ガスあるいは酸素ガスを用いた。
【００３９】
＜平均気泡径の測定＞
デジタルカメラ（ＥＯＳ４０Ｄ、キャノン株式会社製）により撮影した気泡画像を画像処理ソフト（ＷｉｎＲＯＯＦ、三谷商事株式会社製）によって測定した。長さの校正は、写真撮影時に同条件でノギスを撮影することで行った。
【００４０】
＜ボイド率の測定＞
ボイド率が０．５体積％未満の場合は、デジタルカメラにより水槽外から水中を撮影し、画像解析ソフト（ＷｉｎＲＯＯＦ、三谷商事株式会社製）により気泡体積を算出して、ボイド率とした。まず、水槽内に２０ｃｍ角の黒色のプラスチック平板を浸漬させる。該プラスチック平板は、デジタルカメラ、および、水槽のガラス壁面に平行に設置し、ガラス壁面との距離は１ｃｍとした。この条件で、デジタルカメラにて気泡画像を撮影した。ガラス壁面とプラスチック平板との距離、即ち、奥行きは１ｃｍとしているため、デジタルカメラと気泡との距離に対して、個々の気泡間の奥行きによる距離の差は小さい。ゆえに、デジタルカメラからの距離の違いによる気泡径の測定誤差は無視することができる。
次に、画像解析ソフト（ＷｉｎＲＯＯＦ、三谷商事株式会社製）により、デジタルカメラで撮影した画像の各気泡径を測定する。直径１ｃｍ以下の気泡は、ほぼ球状であるため、二次元の計測結果から、三次元の総気泡体積を算出することができる。また、気泡を撮影した画像内の面積と、奥行き１ｃｍとから、画像内の全体積を求める。そして、前記総気泡体積を前記画像内の全体積で除して、ボイド率を算出した。
【００４１】
ボイド率が０．５体積％以上の場合は、１Ｌメスフラスコに水を採取して質量を測定し、下記式により算出した値を体積％と見なして、ボイド率を算出した。また値は１０回の測定値を平均して算出した。
【００４２】
ボイド率（％）＝｛１０００（ｇ）−水の質量（ｇ）｝÷１０００（ｇ）×１００％・・・（１）
【００４３】
＜水流の測定＞
プロペラ式流速計（ＶＲ−２０１、検出部；ＶＲＴ−２００−２０Ｎ、株式会社ケネック製）を水槽内のカキの合わせ部近傍に設置し、水流を測定した。
【００４４】
＜カキの生命活動＞
浄化処理開始から２時間毎に、殻の開閉確認を行った。殻を２ｃｍ以上開けている場合は、棒による刺激を加えて、生死の判定を行った。生きている場合は、速やかに殻を閉じる。
カキの挙動観察から、浄化処理開始１２時間後のカキの生命活動を次の３段階に分類した。状態３の状態が１個以上、あるいは状態２が５個ある場合を「×」、「×」の場合を除いて状態２のカキが２個以上ある場合を「△」とし、それ以外を「○」とした。
状態１：殻を開け（２ｃｍ未満）、刺激に応答する
状態２：殻を閉じている
状態３：殻を２ｃｍ以上開口し、かつ刺激に応答しない
【００４５】
＜ウイルスの不活化の評価＞  
ウイルスの不活化の評価は、浄化処理をしたカキの中腸線を取り出し、該中腸線から、ＲＮＡ抽出を行い、抽出したＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡを合成した。さらにｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりＤＮＡ合成を行い、電気泳動によりプライマー由来のバンドの有無で評価した。鮮明なバンドが見られたものを「×」、わずかにバンドが見られたものを「△」とした。バンドが確認できなかったものを「○」とした。そして、「△」または「○」について、ウイルスの不活化ができたと評価した。
【００４６】
《ＲＮＡ抽出》
中腸線からのＲＮＡ抽出は、厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課通知の公定法「ノロウイルスの検出法」に準じて行った。
試薬キットＡ：ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｍｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）とエタノール（分子生物学用、和光純薬工業株式会社製）を用いて、以下の手順によりＲＮＡ抽出を行った。なお、試薬調製において使用される、エタノール以外の試薬は試薬キットＡの構成試薬である。
［試薬調製］
（１）      Ｃａｒｒｉｅｒ  ＲＮＡ−Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＶＬの調製
Ｃａｒｒｉｅｒ  ＲＮＡ３１０μｇにＢｕｆｆｅｒ  ＡＶＬ３１０μＬを添加し、完全に溶解した後、Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＶＬを加えて全量を５６０μＬとした。
（２）      Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＷ１の調製
１９ｍＬのＡＷ１にエタノール２５ｍＬを加えて調製した。
（３）      Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＷ２の調製
１３ｍＬのＡＷ２にエタノール３０ｍＬを加えて調製した。
【００４７】
［抽出］
まず、ＰＢＳ（−）粉末（日水製薬株式会社製）を所定量の純水に希釈し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を調製した。浄化処理を終えたカキ５個から取り出した中腸線に、ＰＢＳを１０倍量添加し、ストマッカーにより粉砕したものをサンプル原液とした。１．５ｍＬのマイクロチューブに、前記サンプル原液１４０μＬと前記Ｃａｒｒｉｅｒ  ＲＮＡ−Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＶＬ５６０μＬとを入れ、ボルテックスミキサで１５秒間混合し、１０分間室温で静置後、スピンダウンした。エタノール５６０μＬを前記マイクロチューブに加え、ボルテックスミキサで１５秒間混合し、１０分間室温で静置後、スピンダウンした。前記マイクロチューブ内の混合液から６３０μＬをＱＩＡａｍｐスピンカラムに入れた。前記スピンカラムを２ｍＬコレクションチューブにセットし、遠心処理（８１００ｒｐｍ、１分）をした。前記スピンカラムを新たな２ｍＬコレクションチューブにセットし、前記マイクロチューブ内の混合液６３０μＬを入れ、同様に遠心処理をした。
次いで、ＱＩＡａｍｐスピンカラムにＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ１を５００μＬ添加し、遠心処理（８１００ｒｐｍ、１分）を行った。続いて、ＱＩＡａｍｐスピンカラムにＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ２を５００μＬ添加し、遠心処理（１３２００ｒｐｍ、３分）を行った。
ＱＩＡａｍｐスピンカラムを新しい２ｍＬコレクションチューブに移し、遠心処理（１３２００ｒｐｍ、１分）を行った。
ＱＩＡａｍｐスピンカラムを新しい１．５ｍＬコレクションチューブにセットし、ＡＷＥ６０μＬを添加し、室温で静置後、遠心処理（８１００ｒｐｍ、１分）を行い、濾液として抽出ＲＮＡを得た。
【００４８】
《逆転写反応》ＲＴ反応：ＲＮＡからｃＤＮＡ合成
試薬キットＢ：ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ｐｌｕｓ（東洋紡績株式会社製）と前記抽出ＲＮＡにより反応液を調製した。なお、反応液の調製において使用される、抽出ＲＮＡ以外の試薬は試薬キットＢの構成試薬である。
［反応液の調製］
ＰＣＲチューブにＲＮａｓｅフリー水９μＬ、ランダムプライマー１μＬ、ＲＮＡ抽出物２μＬを入れ、６５℃の湯浴で５分間インキュベートした後、氷上で急冷した。
続いて、前記ＰＣＲチューブに５ＸＲＴバッファー４μＬ、１０ｍＭ−４ｄＮＴＰ２μＬ、１０Ｕ／μＬ−ＲＮａｓｅインヒビター１μＬ、ＲｅｖｅｒＴｒａＡＣＥ１μＬを加えて反応液を調製した。
［ｃＤＮＡ合成］
調製した反応液を、下記条件にてｃＤＮＡを合成した。
反応条件：アニーリング３０℃１０分、逆転写４２℃６０分、変性８５℃５分
使用機器：ＲＣ３２０（株式会社アステック製）
【００４９】
《ｃＤＮＡからのＤＮＡ合成》
［サンプル液］
試薬キットＣ：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ社製）と、プライマー（Ｆ）、プライマー（Ｒ）、ｃＤＮＡによりサンプル液を調製した。なお、サンプル液の調製において使用される、下記（１）〜（３）の試薬は、前記試薬キットＣの構成試薬である。
（１）Ｈ２Ｏ                         バランス
（２）ＭｇＣｌ２    ２μＬ
（３）ＳＹＢＧｒｅｅｎＩ              ２μＬ
（４）プライマー（Ｆ）            ０．４μＬ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：５’−３’
塩基配列：ＡＣＣＣＧＡＧＣＡＡＧＧＡＡＣＡＡＴＧＧＴ
（塩基配列におけるＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇはそれぞれアデニン、チミン、シトシン、グアニンを表す。以下同様とする。）
（５）プライマー（Ｒ）            ０．４μＬ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：５’−３’
塩基配列：ＧＡＧＣＡＡＡＧＧＧＣＣＴＡＡＧＧＡＴＴＧＴ
（６）逆転写物（ｃＤＮＡ）              ２μＬ
上記内容にて試薬、プライマー、ｃＤＮＡにてサンプル液を調製した。
（１）〜（６）の合計量は２０μＬとし、（４）、（５）はサンプル液中それぞれ０．２μｍｏｌになるように調製した。
【００５０】
得られたサンプル液を下記条件にて、ＰＣＲ法によりＤＮＡの合成を行い、電気泳動用サンプルを得た。
反応条件：９５℃、１０分
ＰＣＲ反応：４５サイクル（９５℃１０秒、６３℃１０秒、７２℃５秒）
使用機器：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）
【００５１】
《電気泳動》
１８ｇのＴｒｉｓ  ｂａｓｅと、５５ｇのホウ酸と、７．４３ｇのＥＤＴＡ・２Ｎａとを超純水で溶解して１Ｌとして、１０倍ＴＢＥを得、これを泳動バッファーとした。
【００５２】
得られた電気泳動用サンプルを２質量％アガロースゲルにて電気泳動（Ｍｕｐｉｄ−２、コスモ・バイオ株式会社製）を行った。電気泳動後、泳動バッファーをバットに入れ、泳動バッファー１００ｍＬ当たり１０ｍｇ／ｍＬのエチジウムブロマイド溶液５μＬを添加し、電気泳動後の２質量％アガロースゲルを入れて室温で１５分間インキュベートして染色した。染色後のゲルはＵＶトランスイルミネーターを用いプライマー由来の２００ｂｐのバンドの有無で判定を行った。
【００５３】
＜溶存オゾン濃度の測定＞
紫外可視吸光光度計（ＵＶ５５７、株式会社日立製作所製）を用い、セル長５ｃｍの石英セルをポリテトラフルオロエチレン板により密閉し、ガスおよび液体が連続的に測定できるように改造した自作機で測定した（検出オゾン濃度の校正は荏原実業製ＰＧ−６２０ＭＡとの比較によって行った）。送液はチューブポンプを用いて測定セル間を８０ｍＬ／ｍｉｎで循環した。
【００５４】
（調製例１）
リン酸緩衝液に、細胞培養により得られたＡＴＣＣのＦ−９株のネコカリシウイルスを添加してウイルス懸濁液を調製した。
【００５５】
（実施例１〜１５、比較例１〜７）
ガラス製水槽（Ｗ４１ｃｍ×Ｄ２６ｃｍ×Ｈ２８ｃｍ）に、２０Ｌの人工海水（マリンアート・ハイ、富田製薬株式会社製、塩濃度約３．５質量％）を調製した。１分間に１Ｌ／ｍｉｎの流量で、空気あるいはオゾン含有ガスを曝気した。１０ｍｍ以下の気泡径を発生する際は、散気管（木下式ガラスボールフィルターＧ５０３）を用い、フィルターの目の粗さを変更して調整した。１０ｍｍを超える気泡径のオゾン含有ガスの発生には、内径３ｍｍまたは６ｍｍのガラス管を用いてオゾン含有ガスを水槽内に供給して、気泡を発生させた。
１水槽あたりに５個のカキ（岩手県産、殻付真カキ）を殻の合わせ部が、水槽底面と略水平になるように配置し、表１に示した各条件下で浄化処理を１２時間行った。この際、４時間毎に、調製例１で調製したウイルス懸濁液１０ｍＬをカキの餌（キートセラスグラシリス、田崎真珠株式会社製）と共に与え、カキの中腸線にウイルスを取り込ませた。
浄化処理開始１２時間後のカキについて、生命活動、ウイルスの不活化について評価し、その結果を表１に示す。なお、浄化処理中の水槽内の水流については、水槽底面に対し平行方向の水流を発生させながら浄化処理を行った場合を「水平」、水槽底面に対し垂直方向の水流を発生させながら浄化処理を行った場合を「鉛直」と記載した。水流の発生には、コンパクトポンプ６００（５０Ｈｚ用、エーハイム社製）を用いた。なお、浄化処理においては、水槽中の水をコンパクトｐＨメーターＢ−２１２（株式会社堀場製作所製）を用いて、ｐＨ８．０〜８．５であることを監視した。また、浄化処理中の水温は２０℃とした。
【００５６】
【表１】
2009284874.tif 000003
【００５７】
表１に示す通り、本発明の浄化方法を用いた実施例１〜１５は、いずれも状態３のカキは見られず、生命活動を維持していた。加えて、実施例１〜１５は、いずれもウイルスを不活化できていた。このことから、実施例１〜１５では、浄化処理中のカキの生命活動を維持したまま、ウイルスの不活化が図れることが判った。
これに対し、比較例１〜７は、生命活動の総合判定が「×」、あるいは、ウイルスの不活化が「×」であった。
【００５８】
実施例５および実施例１５と、比較例５および比較例６とを比較すると、オゾン含有ガス中のオゾン濃度の上昇に伴い、カキの生命活動の維持が困難になることが判った。
平均気泡径を１０ｍｍとした実施例４と、平均気泡径を２ｍｍとした実施例５と、平均気泡径を２０とした比較例２との比較において、実施例５では、全てのカキが状態１であったのに対し、実施例４では状態２のカキが２個見られ、比較例２では全てのカキが状態２であった。このことから、平均粒子径が大きくなると、カキへの衝撃が増し、生命活動の維持に影響することが判った。
【００５９】
実施例５と、比較例３との比較において、実施例５では、ウイルスを不活化できたのに対し、比較例３ではウイルスを不活化できなかった。また、実施例５と、比較例４との比較において、実施例５では全てのカキが状態１であったのに対し、比較例４では全てのカキが状態２であった。このことから、適切なボイド率で処理することで、カキの生命活動の維持と、ウイルスの不活化とを両立できることが判った。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の浄化処理に用いる浄化システムの一例を示す模式図である。
【図２】本発明の浄化処理に用いる浄化システムの一例を示す模式図である。
【図３】本発明の浄化処理に用いる浄化システムの一例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００６１】
１００、２００、３００  浄化システム
１０、５０、６０        水槽
２０                    曝気手段
３０                    貝
３２                    合わせ部
４０                    水流発生手段
５２、６２              送液手段
【図１】
2009284874.tif 000004
【図２】
2009284874.tif 000005
【図３】
2009284874.tif 000006