(57)【要約】【課題】糸状菌由来のプロモーターの転写活性を増強するエンハンサーを提供する。【解決手段】エンハンサーとして、配列番号１〜４に記載する塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列を使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４に記載する塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列を含有する糸状菌由来プロモーターのエンハンサー。
【請求項２】
糸状菌が麹菌である請求項１記載のエンハンサー。
【請求項３】
配列番号１〜４に記載する塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列が、糸状菌で機能するプロモーター領域に導入されてなる改良プロモーター。
【請求項４】
配列番号１〜４に記載する塩基配列がタンデム結合してなる塩基配列が、糸状菌で機能するプロモーター領域に導入されてなる請求項３に記載する改良プロモーター。
【請求項５】
糸状菌で機能するプロモーター領域が、α−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子またはスーパーオキサイド・ディスムターゼ遺伝子のいずれかのプロモーター領域である、請求項３または４に記載する改良プロモーター。
【請求項６】
請求項３乃至５のいずれかに記載する改良プロモーター、宿主糸状菌の形質転換体の選択に好適なマーカー遺伝子、およびターミネーターを有し、大腸菌で複製可能なＤＮＡ領域を有する、糸状菌におけるポリペプチド発現用プラスミド。
【請求項７】
マーカー遺伝子が、糸状菌由来のβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である請求項６に記載するポリペプチド発現用プラスミド。
【請求項８】
ターミネーターが、糸状菌由来のグルコアミラーゼ遺伝子のターミネーターである請求項６または７に記載するポリペプチド発現用プラスミド。
【請求項９】
ポリペプチドをコードするＤＮＡを、請求項３乃至５のいずれかに記載する改良プロモーターとターミネーターとの間に、宿主糸状菌内で発現可能なように有する請求項６乃至８のいずれかに記載するポリペプチド発現用プラスミド。
【請求項１０】
請求項９に記載するポリペプチド発現用プラスミドを糸状菌に導入し、得られた形質転換体を培養する工程を有するポリペプチドの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌を宿主として、酵素などの有用なポリペプチドを効率的に生産するために好適に使用されるプロモーターのエンハンサーに関する。または本発明は、当該エンハンサーを導入した改良プロモーター、当該改良プロモーターを含む発現用プラスミド、およびそれを用いたポリペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、遺伝子組み換えによるポリペプチドの製造には、宿主として大腸菌や酵母が汎用されている。しかし、大腸菌の場合、異種ポリペプチドを高発現させると、菌体内に不溶性のタンパク質が形成されたり、糖鎖付加等の翻訳後の修飾が起こらず、活性のあるポリペプチドが得られない場合もある。また、酵母の場合は、ポリペプチドの生産量があまり高くないという問題がある。
【０００３】
一方、糸状菌は、各種酵素などのポリペプチドを菌体外に多量に分泌生産することができるため、同種はもちろん異種のポリペプチドを大量に製造するための宿主菌として注目されている。特にアスペルギルス・オリゼやアスペルギルス・ニガーなどの糸状菌は、醸造食品の製造や食品加工用酵素の生産に利用されているものが多く、安全性の面からもポリペプチドの製造に適しているといえる。
【０００４】
ところで、分泌型タンパク質の生産量は、目的遺伝子の発現からポリペプチドの修飾、そして分泌にいたる様々な要因によって決定されている。なかでも生産過程の第一段階目にあたる遺伝子の転写効率を高めること、すなわち転写量を増大させることが目的とするポリペプチドの生産量を増大させるもっとも有効な方法である。
【０００５】
こうした観点から、糸状菌を宿主とする発現系を用いてポリペプチドの生産量を増大させる方法を開発する目的で、これまでに種々の糸状菌由来のプロモーターが単離、提案されている。例えば、アスペルギルス・ニガーからグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター（非特許文献１参照）、およびアスペルギルス・オリゼからα−アミラーゼ遺伝子のプロモーター（特許文献１、非特許文献２）が単離されている。
【０００６】
しかし、糸状菌のプロモーターに関する遺伝子発現機構はまだほとんど解明されていないのが実情である。これまでのところ、転写制御因子として遺伝子のカタボライト抑制制御に関与する因子（非特許文献３）、広域転写活性化因子であるＨＡＰ複合体の結合因子（非特許文献４）、デンプン分解酵素遺伝子群の転写活性化因子（非特許文献５）などが報告されているのみである。
【０００７】
このため、糸状菌を宿主として、目的のポリペプチドをコードする遺伝子をより効率的に転写することのできるプロモーターを開発することが切望されている。これまでにも、例えばプロモーターの発現調節力を改良する試みとしてアスペルギルス・オリゼに由来するα−グルコシダーゼ遺伝子のプロモーターに改変を施したもの（特許文献２、非特許文献６）が報告されているものの、ポリペプチドの生産を効率的に行える程の十分な発現活性が得られているとは言い難い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭62-272988号公報
【特許文献２】特開平9-9968号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Biotechnology, 5, 368(1987)
【非特許文献２】Biotechnology, 6, 1419(1988)
【非特許文献３】Mol. Microbiol., 7, 847-857(1993)
【非特許文献４】Mol. Gen. Genet., 237, 251-260(1993)
【非特許文献５】Mol. Gen. Genet., 262, 668-676(1999)
【非特許文献６】Appl. Microbiol. BiO techmol., 50, 459-467(1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、糸状菌に由来するプロモーターの転写活性を増強するために好適に使用されるエンハンサーを提供することを目的とする。また本発明は、当該エンハンサーを含有するように改変されることによって高い転写活性を発揮し、所望のポリペプチドを効率的に発現産生するために有効に用いられる改良プロモーターを提供することを目的とする。さらに本発明は、当該プロモーターを用いたポリペプチド発現用プラスミド、また当該プラスミドを用いたポリペプチドの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的に鑑み検討を重ねていたところ、糸状菌、特に麹菌に由来する遺伝子のプロモーター領域に挿入することによって、その転写活性を増強することができる４つの塩基配列を見出し、さらに、これらの塩基配列の少なくとも１つを挿入した改変プロモーターを用いることによって、アスペルギルス・オリゼの酵素高生産株を取得することに成功した。
【００１２】
これらの知見から、本発明者らは、今回見出された４つの塩基配列（ポリヌクレオチド）は、糸状菌に由来するプロモーターの転写活性を向上させる上で極めて有効であり、これをプロモーターのエンハンサーとして利用することで、糸状菌、特に麹菌を宿主とするポリペプチドの効率的な発現系を構築することができることを確認した。
【００１３】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施態様を包含するものである。
【００１４】
（１）糸状菌由来プロモーターのエンハンサー
（1-1）配列番号１〜４に記載する塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの
塩基配列を含有する糸状菌由来プロモーターのエンハンサー。
（1-2）糸状菌が麹菌である（1-1）記載のエンハンサー。
【００１５】
（２）改良プロモーター
（2-1）配列番号１〜４に記載する塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの
塩基配列が、糸状菌で機能するプロモーター領域に導入されてなる改良プロモーター。
（2-2）配列番号１〜４に記載する塩基配列をタンデム結合してなる塩基配列が、糸状菌
で機能するプロモーター領域に導入されてなる（2-1）に記載する改良プロモーター。
（2-3）上記の糸状菌で機能するプロモーター領域が、α−アミラーゼ遺伝子、グルコア
ミラーゼ遺伝子またはスーパーオキサイド・ディスムターゼ遺伝子のいずれかのプロモーター領域である、（2-1）または（2-2）に記載する改良プロモーター。
【００１６】
（３）ポリペプチド発現用プラスミド
（3-1）（2-1）〜（2-3）のいずれかに記載する改良プロモーター、宿主糸状菌の形質転
換体の選択に好適なマーカー遺伝子、およびターミネーターを有し、大腸菌で複製可能な
ＤＮＡ領域を有する、糸状菌におけるポリペプチド発現用プラスミド。
（3-2）マーカー遺伝子が、糸状菌由来のβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子である（3-1）に記載するポリペプチド発現用プラスミド。
（3-3）ターミネーターが、糸状菌由来のグルコアミラーゼ遺伝子のターミネーターであ
る（3-1）または（3-2）に記載するポリペプチド発現用プラスミド。
（3-4）ポリペプチドをコードするＤＮＡを、（2-1）〜（2-3）のいずれかに記載する改
良プロモーターとターミネーターとの間に、宿主糸状菌内で発現可能なように有する（3-1）乃至（3-3）のいずれかに記載するポリペプチド発現用プラスミド。
【００１７】
（４）ポリペプチドの製造法
（4-1）（3-4）に記載するポリペプチド発現用プラスミドを宿主糸状菌に導入し、得られた形質転換体を培養する工程を有するポリペプチドの製造法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のエンハンサーによれば、これを糸状菌で機能するプロモーターに導入することにより、当該プロモーターの転写活性を増大させることができる。すなわち、本発明のエンハンサーによれば、既存のプロモーターをより転写活性の高いプロモーターに改良することができる。このようにして改良されたプロモーターを含む発現プラスミドを用いれば、産業上有用な酵素などのポリペプチドを、安全性が高く高分泌能を有する糸状菌を宿主として、より効率的に大量に菌体内に蓄積あるいは培地中に分泌する事により製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１で調製したクローンＡ〜Ｄが導入された形質転換体のβ-グルクロニダーゼ活性（GUS活性）と、プラスミドpAAが導入された形質転換体のGUS活性を対比した結果を示す（実施例１）。
【図２】実施例２で調製したプラスミドpGA-A、pGA-B、pGA-C、またはpGA-Dが導入された形質転換体のGUS活性と、プラスミドpGAが導入された形質転換体のGUS活性を対比した結果を示す（実施例２）。
【図３】実施例２で調製したプラスミドpSM-A、pSM-B、pSM-C、またはpSM-Dが導入された形質転換体のGUS活性と、プラスミドpSMが導入された形質転換体のGUS活性を対比した結果を示す（実施例２）。
【図４】実施例３で調製したプラスミドpAA-Sが導入された形質転換体のGUS活性と、プラスミドpAAが導入された形質転換体のGUS活性を対比した結果を示す（実施例３）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（１）糸状菌由来プロモーターのエンハンサー
本発明において「エンハンサー」とは、糸状菌、好ましくは麹菌に由来するプロモーターのプロモーター活性、すなわち遺伝子の転写活性を高めることができる機能を少なくとも有するヌクレオチドを意味する。
【００２１】
本発明のエンハンサーは、配列表中、(1)配列番号１に記載する塩基配列、(2)配列番号２に記載する塩基配列、(3)配列番号３に記載する塩基配列、および(4)配列番号４に記載する塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列からなるか、またはこれらの塩基配列のうち少なくとも１つを含有することを特徴とする。なお、これらの塩基配列は、各々単独でエンハンサー機能を発揮しエンハンサーとして使用できる他、少なくとも任意の２以上、好ましくは４つをタンデムに組み合わせてもエンハンサー機能を発揮し、エンハンサーとして使用することができる。
【００２２】
これらの塩基配列はいずれも、本発明で提供する配列情報に基づいて、定法に従って化
学的に合成することができる。
【００２３】
これらのエンハンサーがエンハンサー機能を発揮するプロモーターは、好ましくは糸状菌、好ましくは麹菌において機能するプロモーターである。ここで糸状菌において機能するプロモーターとしては、制限されないが、好ましくはα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、セロビオハイドラーゼ、アセトアミダーゼ等の加水分解酵素遺伝子のプロモーター；ならびに３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の解糖系酵素遺伝子のプロモーターを挙げることができる。好ましくは、アスペルギルス属に由来するα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、またはα−グルコシダーゼの遺伝子のプロモーター、より好適には、アスペルギルス・オリゼのα−アミラーゼまたはグルコアミラーゼ(glaA及びglaB)の遺伝子のプロモーターである。
【００２４】
糸状菌としては、麹菌、及び麹菌が属する糸状不完全菌類を挙げることができる。中でも望ましくはアスペルギルス属（Aspergillus）、ムコール属（Mucor）、カンジダ属（Candida）、トリコデルマ属（Trichoderma）、ノイロスポラ属（Neurospora）に由来する糸状菌であり、より好ましくはアスペルギルス属（Aspergillus）に属するアスペルギルス
・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ア
スペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・
ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・グラウカス（Aspergillus glaucus）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terrus）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）である。より好ましくは、麹菌であるアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）を挙げることができる。
【００２５】
本発明のエンハンサーのエンハンサー機能は、後述する実施例１および２で示す方法に従って評価することができる。具体的には、実施例１または２に示すように、各エンハンサーの塩基配列（配列番号１〜４）を、α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター（実施例１）、またはグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター（実施例２）またはスーパーオキサイド・ディスムターゼ遺伝子のプロモーター（実施例２）の5’側上流にそれぞれ挿入した
塩基配列からなる改良プロモーターを用いた場合のGUS活性（プロモーター活性）と、未
改良のプロモーター（α―アミラーゼ遺伝子のプロモーター、グルコアミラーゼ遺伝子のプロモーターおよびスーパーオキサイド・ディスムターゼ遺伝子のプロモーター）を用いた場合のGUS活性（プロモーター活性）とを対比し、改良プロモーターのGUS活性が未改良プロモーターのGUS活性よりも高い場合に、当該改良プロモーター上流に挿入した塩基配
列にエンハンサー機能があると判断することができる。
【００２６】
それによると、配列番号１で示す塩基配列からなるエンハンサーを含むα―アミラーゼ遺伝子のプロモーター、グルコアミラーゼ遺伝子のプロモーターおよびスーパーオキサイド・ディスムターゼ遺伝子のプロモーター（改良プロモーター）のGUS活性は、未改良プ
ロモーターのそれらに比して、それぞれ約2.6倍、約1.5倍および約1.9倍増加することが
確認された（図１中「クローンＡ」、図２中「pGA-A」、図３中「pSM-A」で示す）。また同様に下記のことが確認された。
【００２７】
(1)配列番号２で示す塩基配列からなるエンハンサーを含むα―アミラーゼ遺伝子のプ
ロモーター、グルコアミラーゼ遺伝子のプロモーターおよびスーパーオキサイド・ディスムターゼ遺伝子のプロモーター（改良プロモーター）のGUS活性は、未改良プロモーター
のそれらに比して、それぞれ約2.0倍、約1.7倍および約1.7倍増加する（図１中「クロー
ンＢ」、図２中「pGA-B」、図３中「pSM-B」で示す）。
【００２８】
(2)配列番号３で示す塩基配列からなるエンハンサーを含むα―アミラーゼ遺伝子のプ
ロモーター、グルコアミラーゼ遺伝子のプロモーターおよびスーパーオキサイド・ディスムターゼ遺伝子のプロモーター（改良プロモーター）のGUS活性は、未改良プロモーター
のそれらに比して、それぞれ約2.5倍、約2.0倍および約2.2倍増加する（図１中「クロー
ンＣ」、図２中「pGA-C」、図３中「pSM-C」で示す）。
【００２９】
(3)配列番号４で示す塩基配列からなるエンハンサーを含むα―アミラーゼ遺伝子のプ
ロモーター、グルコアミラーゼ遺伝子のプロモーターおよびスーパーオキサイド・ディスムターゼプロモーター（改良プロモーター）のGUS活性は、未改良プロモーターのそれら
に比して、それぞれ約2.7倍、約1.8倍および約2.7倍増加する（図１中「クローンＤ」、
図２中「pGA-D」、図３中「pSM-D」で示す）。
【００３０】
これらのことから、配列番号１〜４で示す塩基配列を有するポリヌクレオチド、すなわち本発明のエンハンサーは、エンハンサーとして機能することが確認された。
【００３１】
また、実施例３で示すように、配列番号１〜４で示す塩基配列を、配列番号２−配列番号３−配列番号４−配列番号１の順番でタンデムに結合してなる塩基配列（配列番号５）をα―アミラーゼ遺伝子のプロモーターの上流に挿入することによって改変されたプロモーター（改良プロモーター）のGUS活性は、未改良のα―アミラーゼ遺伝子のプロモータ
ーのそれに比して、約5.5倍増加することが確認された（図４中「クpAA-S」で示す）。このことから、配列番号１〜４で示す塩基配列を２以上、好ましくは４つ組み合わせて結合してなる塩基配列もまたエンハンサーとして機能し、エンハンサーとして利用できると判断される。
【００３２】
（２）改良プロモーター
本発明の改良プロモーターは、上記する本発明のエンハンサーの少なくとも１つが糸状菌で機能するプロモーター領域に導入されてなることを特徴とする。
【００３３】
エンハンサーを導入するプロモーターとしては、糸状菌、好ましくは麹菌において機能するものであればよく、特に制限されない。具体的なプロモーターとしては、前述する好ましくはα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、セロビオハイドラーゼ、アセトアミダーゼ等の加水分解酵素遺伝子のプロモーター；ならびに３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の解糖系酵素遺伝子のプロモーターを挙げることができる。好ましくは、アスペルギルス属に由来するα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、またはα−グルコシダーゼの遺伝子のプロモーター、より好適には、アスペルギルス・オリゼのα−アミラーゼまたはグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーターである。
【００３４】
糸状菌としては、麹菌、及び麹菌が属する糸状不完全菌類を挙げることができる。中でも望ましくはアスペルギルス属（Aspergillus）、ムコール属（Mucor）、カンジダ属（Candida）、トリコデルマ属（Trichoderma）、ノイロスポラ属（Neurospora）に由来する糸状菌であり、より好ましくはアスペルギルス属（Aspergillus）に属するアスペルギルス
・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ア
スペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・
ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・グラウカス（Aspergillus glaucus）、アスペルギルス・フミガタス（Asper
gillus fumigatus）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terrus）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）である。より好ましくは、麹菌であるアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）を挙げることができる。
【００３５】
本発明の改良プロモーターは、上記プロモーターの塩基配列に前述する本発明のエンハンサーの少なくとも１つを挿入することによって調製することができる。
【００３６】
エンハンサーのプロモーターへの導入部位は、プロモーター領域であればよく、特に制限されるものではない。好ましくは、転写開始点から上流1500bpの範囲であり、更に好ましくは、TATA-boxから上流500bpの範囲である。
【００３７】
また、エンハンサーの導入方法は、例えば以下のようにして行うことができる。
まず、導入したいプロモーター領域を適当な２種類の制限酵素（説明の便宜上、制限酵素の１つを「制限酵素ａ」、もう一つを「制限酵素ｂ」と称する）で消化する。ただし、そのうち一つ、例えば制限酵素ａは平滑末端を生じる酵素を用いることが好ましい。そうでない場合は、制限酵素ａで処理して生成した末端をＤＮＡブランチングキット（タカラバイオ社製）等を用いて平滑末端化することが好ましい。次に、５’末端から制限酵素サイトを、制限酵素ｂの認識サイト・制限酵素ａの認識サイトの順で付加したプライマーと制限酵素サイトを付加しないプライマーを用いて、エンハンサーの塩基配列を含む断片をＰＣＲ法により増幅する。このようにして増幅した断片を上記で消化したプロモーターに挿入することにより、平滑末端サイトと制限酵素ｂサイトでそれぞれ結合される。
【００３８】
結合後、平滑末端サイトの制限酵素認識サイトは消失するが、もう一方のサイトには制限酵素ｂ・制限酵素ａの認識サイトが存在する。エンハンサーの塩基配列を２個以上導入する場合には、それが１個導入されたプロモーターを制限酵素ａとｂとで消化後、以下、同様の方法で順次エンハンサーの塩基配列を導入する方法を用いることができる。なお、導入するエンハンサーの塩基配列の個数により、任意の転写活性を持つプロモーターの構築が可能となる。
【００３９】
あるいは、挿入対象となるプロモーターを含む該当プラスミドを鋳型として、任意の挿入箇所の近辺に互いに反方向を向くプライマーを設計・調製（例えばシグマアルドリッチ社で受託合成できる）する。該当プラスミドを鋳型としてＰＣＲ法により増幅し、ベクターとする。対象とするエンハンサー領域もＰＣＲ法により増幅し、T4キナーゼでリン酸化することによりインサートする。このようにして調製したベクターとインサートをライゲーションすることにより、プロモーターの任意の位置にエンハンサーを挿入することが可能になる。またエンハンサーはＰＣＲ法のみならず、タカラバイオ社などで全合成することが出来、例えば４種類のエンハンサーをタンデムに繋いだ複合エンハンサーの合成も可能である。
【００４０】
（３）ポリペプチド発現用プラスミド
さらに、本発明のポリペプチド発現用プラスミドは、上述する改良プロモーターと、同じく糸状菌で機能するターミネーター、ならびに宿主の形質転換体の選択に好適なマーカー遺伝子を有し、更に大腸菌で複製可能なＤＮＡ領域を有するものである。
【００４１】
ターミネーターは、ＤＮＡの高次構造により転写されたｍＲＮＡをＤＮＡ鎖から脱離させるものであるから、糸状菌、特に麹菌において機能するターミネーターであれば、制限なく使用することができる。好ましくはアスペルギルス属、より好ましくはアスペルギルス・オリゼに由来する、例えばα−アミラーゼ遺伝子のターミネーター、またはグルコアミラーゼ（glaB）ターミネーター（Gene. 207, 127-134,(1998））等を挙げることができ
る。
【００４２】
マーカー遺伝子は、糸状菌内、好ましくは麹菌、より好ましくはアスペルギルス属に属する麹菌内で発現できるものであればよい。例えば、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするAspergillus nidulans由来の遺伝子ANleu2(配列番号６)、硝酸還元酵素をコードする遺伝子niaD(Biosci.Biotechnol.Biochem.,59,1795-1797(1995))、オル
ニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子argB (Enzyme Microbiol Technol, 6, 386-389, (1984))、sC (Gene, 84, 329-334, (1989))、ptrA (Biosci Biotechnol Biochem, 64, 1416-1421, (2000))、pyrG (Biochem Biophys Res Commun, 112, 284-289, (1983))， アセトアミダーゼをコードする遺伝子amdS (Gene, 26, 205-221, (1983))、オーレオバシジン耐性遺伝子(Mol Gen Genet, 261, 290-296, (1999))、ベノミル耐性
遺伝子(Proc Natl Acad Sci USA, 83, 4869-4873, (1986))、及びハイグロマイシン耐性
遺伝子(Gene, 57, 21-26, (1987))からなる群より選ばれるいずれかのマーカー遺伝子、
ロイシン要求性相補遺伝子などが挙げられる。なお、この場合、宿主糸状菌は、選定された選択マーカーについての機能的遺伝子を有しない株を用いる必要がある。
【００４３】
また、宿主として、例えばロイシン要求性などの栄養要求性変異株を用いる場合、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。例えば、宿主がロイシン要求性変異株である場合、そのロイシン要求性を相補できる選択マーカー遺伝子としては、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするAspergillus nidulans由来の遺伝子ANleu2を挙げることができる。
【００４４】
本発明のポリペプチド発現用プラスミドの構築は、例えば以下のようにして行うことができる。大腸菌ベクター、例えばTベクターであるpGEM-T（プロメガ社）に uidA遺伝子(
β-グルクロニダーゼをコードする遺伝子)とグルコアミラーゼ遺伝子のターミネーターの融合遺伝子をサブクローニングする。更にこのプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行いベクターとする。続いて本発明のエンハンサーの塩基配列を導入した改良プロモーターをＰＣＲ法で増幅してインサートし、ベクターとライゲーションさせる。
【００４５】
斯くして本発明のポリペプチド発現用プラスミドを構築することができる。かかる具体的な例としては、実施例２に示す手順で構築されたプラスミドpGA-A、pGA-B、pGA-C、pGA-D、pSM-A、pSM-B、pSM-CおよびpSM-Dを挙げることができる。
【００４６】
またこれらのプラスミドは、発現させる目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、プロモーターとターミネーターの間に挿入するために好適に使用される制限酵素認識サイトを含むことが好ましい。
【００４７】
なお、本発明において「ポリペプチド」という用語は、酵素などのタンパク質を含む意味で用いられる。かかるポリペプチドは糸状菌に由来するものであってもよいし、また糸状菌に由来しない異種（外来）のポリペプチドであってもよい。
【００４８】
かかるポリペプチドとしては、糸状菌由来の分泌タンパク質が挙げられる。また、これ以外にも、例えば融合型のヒト・ラクトフェリン（特表平10-509317号公報参照）、また
はウイルスタンパク質(Production and product quality assessment of human hepatitis B virus pre-S2 antigen in submerged and solid-state cultures of Aspergillus oryzae. Maruyamaら、J Biosci Bioeng. 2000;90(1):118-20.参照）、各種酵素タンパク質
なども含まれる。酵素タンパク質としては、グルコース酸化酵素、セルロース分解酵素（セルラーゼ、エンドグルカナーゼなど）、デンプン分解酵素（グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼなど）、タンパク質分解酵素(プロテアーゼ、ペプチダー
ゼ)などが挙げられるが、これらに特に限定はされない。
【００４９】
（４）ポリペプチドの製造方法
本発明は、さらに、目的とするポリペプチドを、糸状菌を宿主として製造する方法を提供する。
【００５０】
当該方法は、まず上記ポリペプチド発現用プラスミドで宿主糸状菌を形質転換する工程、得られた形質転換体を培養する工程、および培養物から目的ポリペプチドを回収する工程を有する。
【００５１】
宿主糸状菌の形質転換方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Cohenらの方法（塩化カルシウム法）[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:2110(1972)]、プロトプラスト法[Mol.Gen.Genet.,168:111(1979)]、コンピテント法[J.Mol.Biol.,56:209(1971)]、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００５２】
宿主は糸状菌であればよいが、高いプロモーター活性を発現させるためには、アスペルギルス属の菌株が好ましい。特に好ましくは、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae
）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・グラウカス（Aspergillus glaucus）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アス
ペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terrus）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）等のアスペルギルス属に属する糸状菌である。これらの中では、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・サイトイ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・グラウカスなどが食品産業において有用な菌種である。高いタンパク質生産能及び醸造微生物としての安全性の点で、特にアスペルギルス・オリゼを宿主とすることが好ましい。
【００５３】
形質転換体の培養は、固体培養または液体培養で行うことができる。培養温度は、１５℃〜４２℃が好ましく、更に２０℃〜３７℃が好ましい。上記範囲の温度であれば、糸状菌が十分に生育ないしは増殖するため、ポリペプチドの発現量が高くなる。また、上記温度での培養は１日間〜１週間程度行えばよい。
【００５４】
固体培地は、糸状菌の培養に使用される公知の固体培地を制限無く使用できる。固体培地とはその固形の支持担体が栄養源を含むか、又は固形の支持担体に栄養源が添加されたものであり、そこに糸状菌が生育できる固形培地を指し示す。このような固体培地として主に、フスマ（小麦などの穀物の殻）、デンプン粉末、米・小麦・大豆の生あるいは蒸したもの、更にはメンブレンや多孔質の人工物（例えば園芸に使われるバーミキュライト）等に栄養源を添加したもの等が挙げられる。特にフスマ、蒸した米が好ましい。
【００５５】
また、液体培地は、糸状菌の培養に使用される公知の液体培地を制限無く使用できる。例えば、用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものが挙げられる。また無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物等）が挙げられる。これらの炭素源および窒素源は、純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養素を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、他の栄養源［例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１
）、抗生物質（例えば、アンピシリン、カナマイシン）など］を培地中に添加してもよい。
【００５６】
形質転換体の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５、好適にはｐＨ６〜８、通常１８〜４０℃、好適には２０〜３５℃で、１〜１５０時間行われるが、これらは培養条件および培養規模によって適宜変更することができる。
目的ポリペプチドは、培養上清から回収することができる。固体培地の場合も適切な緩衝液、例えば１０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ７等を加え、適宜攪拌した後、その上清を固体培地の抽出液として回収すればよい。さらに、これらの上清を、公知のタンパク質精製方法、例えばイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティなどの各種クロマトグラフィーに供することにより目的ポリペプチドを精製してもよい。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限られるものではない。
【００５８】
（実施例1）：麹菌(Aspergillus oryzae)由来エンハンサー領域の同定
（１）麹菌宿主
遺伝子を形質転換する宿主として、麹菌Aspergillus oryzae O-1013（FERM P-16528と
して独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（寄託日：平成9年11月20日））から公知の紫外線照射変異導入法を用いて取得した、ロイシン要求
性変異麹菌株Aspergillus oryzae leu-5を使用した。当該変異麹菌株は、上記寄託センターにFERM P-20079として寄託されている（寄託日：平成16年6月7日）。
【００５９】
（２）選択マーカープラスミド
選択マーカーとして、上記ロイシン要求性変異麹菌株Aspergillus oryzae leu-5のロイシン要求性変異を相補できる、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするAspergillus nidulans由来の遺伝子ANleu2(配列番号６)を利用した。ANleu2は、370アミ
ノ酸残基からなるβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であり、イントロンを２つ含んでいる。配列番号６中の塩基番号1〜319はプロモーター領域、塩基番号320〜1549はオープンリーディング領域、塩基番号1550〜3560はターミネーター領
域である。またオープンリーディング領域（配列番号６の320〜1549領域）のうち、２つ
のイントロン領域は塩基番号795〜851と1273〜1332の領域である。当該遺伝子ANleu2がコードするアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【００６０】
ANleu2遺伝子は、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）ゲノムＤＮＡを鋳型として、LA-Taq（タカラバイオ社）によるＰＣＲ増幅を、下記の条件で行うことにより取得した。この際、プライマーとして、プライマー（5’-TGCCAGTTTTACCAGCTTGACC-3’：配列番号８）及びプライマー（5’-CTTTCATGTCATGTCCCTAGAAG-3’：配列番号９）を
使用した。
【００６１】
＜PCR条件＞
・94℃（1分），１サイクル
・98℃（10秒），60℃（30秒），72℃（5分），30サイクル
・72℃（7分），１サイクル。
【００６２】
その結果、それぞれ適正なゲノム遺伝子産物が増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物をフェノール−クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿を行った。得られた増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、切り出し、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN）で抽出
した。切り出したANleu2の遺伝子断片は、LA-Taqの増幅産物よりその末端にアデニンが突
出しており、TベクターであるpGEM-T（プロメガ社）へ、T4 DNAリガーゼ（プロメガ社）
を用いて4℃で20時間処理することによりライゲーションさせた。その後、ライゲーショ
ン液を大腸菌JM109コンピテントセル（タカラバイオ社）へ形質転換した。形質転換体は
アンピシリン、IPTG及び X-galを添加したLB培地を用いて白色コロニーとして単離された。
【００６３】
各形質転換体から、常法に従いプラスミドを調製し、ANleu2がサブクローニングされたプラスミドをpANLAと命名した。
【００６４】
（３）麹菌の形質転換
麹菌ロイシン要求性変異麹菌株Aspergillus oryzae leu-5を、上記で調製したプラスミドpANLAにより形質転換する手法として、常法であるプロトプラスト-PEG-カルシウム法を用いた（Mol. Gen. Genet., 218, 99-104,（1989））。プロトプラストは、GPY液体培地
（2% グルコース、1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス）で30℃、1日間培養したAspergillus oryzae leu-5をガラスフィルター11GP250（柴田科学社）で集菌し、0.8M NaClを含むプロトプラスト化溶液（5mg/mlヤタラーゼ（タカラバイオ社）、5mg/mlセルラーゼ（和光純薬）、5mg/ml lysing enzyme（sigma）も含む）中で、30℃で3時間反応させた。ガラスフィルター11GP160（柴田科学社）でろ過したろ液をプロトプラスト液として用いた。プロ
トプラスト-PEG-カルシウム法におけるプラスミドなどの添加段階において、pANLAなどの選択マーカーを含むプラスミドと、これとは異なる選択マーカーを含まない任意のプラスミドを任意の割合で添加することにより、最小培地で選択した形質転換体の染色体に両プラスミド断片を挿入することができる（コトランスフォーメーション（co-transformation））。形質転換体の選択培地としては、Czapek-Dox最少培地（グルコース3％、硫酸マグネシウム0.1％、リン酸水素２カリウム0.1％、塩化カリウム0.05％、硝酸ナトリウム0.3
％、硫酸鉄0.00001M、0.8M NaCl、1.5%寒天、pH6.3）を用いた。30℃で7日間培養した後
、複数の形質転換体が得られた。
【００６５】
（４）レポーターアッセイ用プラスミドの構築
はじめに、麹菌でのプロモーターの転写活性を測定するために、レポーター遺伝子(uidA、β-グルクロニダーゼをコードする遺伝子)を含むレポーター解析プラスミドの構築を
試みた。まず、uidA遺伝子の下流にグルコアミラーゼ遺伝子のターミネーター遺伝子が融合した遺伝子断片を含むプラスミドpNGS1（文献：Biosci Biotechnol Biochem., 72, 48-53, (2008))）を鋳型として、プライマーuidA（5’-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGT-3
’：配列番号１０）とプライマーTglaB（5’-ATGTATACTTAGTTTGATTGCAGTGGACGT-3’：配
列番号１１）、およびLA-Taq（タカラバイオ社）を用いて下記の条件でPCR増幅を行った
。
【００６６】
＜PCR条件＞
・94℃（1分），1サイクル
・98℃（10秒），60℃（30秒），72℃（3分），30サイクル
・72℃（4分），1サイクル。
【００６７】
その結果、適正なゲノム遺伝子産物が増幅した。得られたPCR増幅産物をアガロースゲ
ル電気泳動で切り出し、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN社）で抽出した。本PCR産物はその末端にアデニンが突出しており、TベクターであるpGEM-T（プロメガ社）へ、T4 DNAリガーゼ（プロメガ社）を用いて4℃で20時間処理することによりライゲーションさせた。その後、ライゲーション液を大腸菌JM109コンピテントセル（タカラバイオ社）へ形
質転換した。形質転換体はアンピシリン、IPTG及び X-galを添加したLB培地を用いて白色コロニーとして単離された。各形質転換体から、常法に従いプラスミドを調製した。uidA遺伝子とグルコアミラーゼ遺伝子のターミネーターが融合した遺伝子断片の下流3’末端
がM13P8配列側に向いて挿入されているプラスミドを、レポーターアッセイ用プラスミドpuidAとした。
【００６８】
次に、麹菌Aspergillus oryzae O-1013のゲノムDNAを鋳型にして、α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター領域（配列番号１２）、グルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター領域（配列番号１３）、スーパーオキサイド・ディスムターゼ遺伝子のプロモーター領域（塩基配列１４）の塩基配列の増幅を試みた。
【００６９】
なお、α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター領域の増幅はプライマーP3（5’-AGGGATGCAAGACCAAAGTAGTAAAACCCC-3’：配列番号１５）とプライマー（5’-AAATGCCTTCTGTGGGGTTTATTGTTCAGA-3’： 配列番号１６）；グルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター領域の増幅
はプライマーP4（5’-GAGTATGCAAGGAGATTGCGAGACCGGACC-3’： 配列番号１７）とプライ
マー（5’-CTTGCTTCGACTTCGTTTGCTGATGTGAAA-3’： 配列番号１８）；スーパーオキサイ
ド・ディスムターゼ遺伝子のプロモーター領域の増幅はプライマーP5（5’-AGTCACATCCCGCCAACATGATTGGTAAAA-3’： 配列番号１９）とプライマー（5’-TTTGGGTGGTTTGGTTGGTATTCTGGTTGA-3’： 配列番号２０）を用い、それぞれPrimeSTAR HS（タカラバイオ社）を用いて下記条件でＰＣＲ反応することにより行った。
【００７０】
＜PCR条件＞
・98℃（20秒），1サイクル
・98℃（10秒），55℃（15秒），72℃（1分），30サイクル
・72℃（2分），1サイクル。
【００７１】
その結果、適正なゲノム遺伝子産物が増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動で切り出し、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN社）で抽出し、3種類のインサートとした。次にレポーターアッセイ用プラスミドpuidAを鋳型として、プライマ
ーM13P7-Rev（5’-GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCC-3’：配列番号２１）とプライマーuidA（5’-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGT-3’：配列番号２２）、PrimeSTAR HS（タカ
ラバイオ社）を用いて下記条件でＰＣＲ増幅を行った。
【００７２】
＜PCR条件＞
・98℃（20秒），1サイクル
・98℃（10秒），55℃（15秒），72℃（5分30秒），30サイクル
・72℃（6分），1サイクル。
【００７３】
その結果、適正なゲノム遺伝子産物が増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動で切り出し、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN）で抽出し、ベクター
とした。このようにして得られた３種類のインサートとベクターをそれぞれ平滑末端処理後にリン酸化と脱リン酸化をそれぞれ行い、ライゲーションさせた。これら一連の操作は、TaKaRa BKL Kit（タカラバイオ社）を使用した。その後、ライゲーション液を大腸菌JM109コンピテントセル（タカラバイオ社）へ形質転換した。形質転換体はアンピシリンを
添加したLB培地を用いてコロニーとして単離された。各形質転換体から、常法に従いプラスミドを調製した。プラスミドの中から、各プロモーターDNA断片（α-アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、スーパーオキサイド・ディスムターゼ遺伝子のそれぞれのプロモーター）の下流側にuidA遺伝子が接続されているプラスミドをそれぞれ選抜し、それぞれプラスミドpAA、pGA、pSMと命名した。
【００７４】
（５）麹菌(Aspergillus oryzae)由来エンハンサーライブラリーの作成
麹菌Aspergillus oryzae O-1013のゲノムDNAを超音波破砕装置にて断片化し、インサートライブラリーとした。次に上記で調製したプラスミドpAAを鋳型にして、プライマーM13
P7-Rev（配列番号２１） とプライマーP3（配列番号１５）、およびPrimeSTAR HS（タカ
ラバイオ社）を用いて下記条件でＰＣＲ増幅を行った。
【００７５】
＜PCR条件＞
・98℃（20秒），1サイクル
・98℃（10秒），55℃（15秒），72℃（6分），30サイクル
・72℃（6分），1サイクル
その結果、適正なライブラリー構築用ベクター断片が増幅した。得られたPCR増幅産物
をアガロースゲル電気泳動で切り出し、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN社）で抽
出し、ベクター(i)とした。このようにして得られたインサートライブラリーとベクター(i)をそれぞれ平滑末端処理後にリン酸化と脱リン酸化をそれぞれ行い、ライゲーションさせた。これら一連の操作は、TaKaRa BKL Kit（タカラバイオ社）を使用した。その後、ライゲーション液を大腸菌JM109コンピテントセル（タカラバイオ社）へ形質転換した。形
質転換体はアンピシリンを添加したLB培地を用いてコロニーとして単離された。各形質転換体から、常法に従いプラスミドを調製した。α―アミラーゼ遺伝子のプロモーターDNA
断片の上流側にインサートが挿入されているものを1000クローン単離し、エンハンサーライブラリープラスミドとした。
【００７６】
（６）形質転換体の確認とサンプル調製
麹菌ロイシン要求性変異麹菌株Aspergillus oryzae leu-5を、プラスミドpANLAとpAAあるいはエンハンサーライブラリープラスミドのいずれか1クローンを組み合わせてコトラ
ンスフォーメーションを行った。麹菌を形質転換する手法は常法であるプロトプラスト-PEG-カルシウム法を用いた。得られた形質転換体の導入遺伝子（uidA遺伝子1コピー導入体）は、uidA遺伝子をプローブとしたゲノムサザン及びその有無をＰＣＲにより確認した。その結果、プラスミドpAAあるいはエンハンサーライブラリープラスミドが1コピー導入された形質転換体のライブラリーを得ることが出来た。
【００７７】
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc)が塗布された寒天最少培地（2％グルコース、1.5％アガー、硫酸マグネシウム0.1％、リン酸水素2カリウム0.1％、塩
化カリウム0.05％、硝酸ナトリウム0.3％、硫酸鉄0.00001M pH6.3）に各形質転換体（1000クローン）を植菌し、pAAが導入された形質転換体よりも濃い青色のハロを形成した形質転換体（12クローン）を選抜した。
【００７８】
各形質転換体を改変型DPY液体培地（2% デキストリン、1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、硫酸マグネシウム0.1％、リン酸水素2カリウム0.1％、塩化カリウム0.05％、硝酸ナ
トリウム0.3％、硫酸鉄0.00001M pH6.3）30ｍLに植菌し、30℃3日間振とう培養後、菌体
を回収した。回収した菌体を海砂B（ナカライテスク）と混和した後、乳鉢と乳棒を用い
てペースト状になるまで磨り潰し、適量のリン酸緩衝液（10mM、pH7.0）を加え懸濁した
。懸濁液をマイクロチューブに移し、遠心ろ過を行い、その上清を回収しサンプルとした。
【００７９】
（７）レポーターアッセイ
調製された各サンプルのβ-グルクロニダーゼ活性（GUS活性）をJefferson 等の方法によって測定した (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8447-8451 (1986)) 。プラスミドpAAが導入された形質転換体と比較して、β-グルクロニダーゼ活性（GUS活性）が約２倍以
上向上している形質転換体を形質転換ライブラリーから４クローン（クローンＡ〜Ｄ）選抜することができた（図１参照）。
【００８０】
（８）インサート配列の決定
上記で選抜したクローンＡ、Ｂ、ＣおよびＤの各インサートの塩基配列をDNAシーケン
サーで決定した。その結果、クローンＡのインサート配列は配列番号１に示す塩基配列、クローンＢのインサート配列は配列番号２に示す塩基配列、クローンＣのインサート配列は配列番号３に示す塩基配列、クローンＤのインサート配列は配列番号４に示す塩基配列であることが明らかとなった。
【００８１】
（実施例２）  エンハンサーによるプロモーターの改良
（１）麹菌(Aspergillus oryzae)由来プロモーター（グルコアミラーゼプロモーター、スーパーオキサイド・ディスムターゼプロモーター）の改良
麹菌Aspergillus oryzae O-1013のゲノムDNAを鋳型にして、配列番号１に示す塩基配列（以下「配列１」という）をプライマー（5’-CCCAATGACACTCCTCTATTGAATATCATT-3’：配列番号２３）とプライマー（5’-TAGGGTTGTTCCTGAACCCTTGACTTTTGG-3’： 配列番号２４
）で、配列番号２に示す塩基配列（以下、「配列２」という）をプライマー（5’-ACCGTATTTGGAACAATACCACAACAACTA-3’： 配列番号２５）とプライマー（5’-ACGACGCGGTGAGGGTGACGTTGGGCCGCC-3’： 配列番号２６）で、配列番号３に示す塩基配列（以下、「配列３」という）をプライマー（5’-AATTACGTGGCACCAAAACAAAACAAACCA-3’： 配列番号２７）と
プライマー（5’-AGTGATGTCTAGCTGGTTGGAAAGCTCCTG-3’：配列番号２８）で、配列番号４に示す塩基配列（以下、「配列４」という）をプライマー（5’-TCAAAATATGAGATGCTTCCAAACCAAGCA-3’：配列番号２９）とプライマー（5’-ATCGCGAGGTGGGGCGTCGGTACCTGGATT-3’：配列番号３０）で、それぞれをPrimeSTAR HS（タカラバイオ社）を用いて下記条件でPCR増幅を行った。
【００８２】
＜ＰＣＲ条件＞
・98℃（20秒），1サイクル
・98℃（10秒），55℃（15秒），72℃（30秒），30サイクル
・72℃（1分），1サイクル。
【００８３】
その結果、適正なゲノム遺伝子産物が増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動で切り出し、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN）で抽出し、4種類のインサートとした。次に実施例1で得られたプラスミドpGAを鋳型としてプライマーM13P7-Rev（配列番号２１）とプライマーP4（配列番号１７）で、同じく実施例1で得られたプラスミドpSMを鋳型としてプライマーM13P7-Rev（配列番号２１）とプライマーP5（配列番号１９）で、それぞれをPrimeSTAR HS（タカラバイオ社）を用いて下記条件でPCR増幅を行っ
た。
【００８４】
＜PCR条件＞
・98℃（20秒），1サイクル
・98℃（10秒），55℃（15秒），72℃（6分），30サイクル
・72℃（6分），1サイクル。
【００８５】
その結果、適正なベクター断片が増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動で切り出し、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN）で抽出し、ベクターとし
た。このようにして得られた4種類のインサートと2種類ベクターをそれぞれ平滑末端処理後にリン酸化と脱リン酸化をそれぞれ行い、ライゲーションさせた。これら一連の操作は、TaKaRa BKL Kit（タカラバイオ社）を使用した。その後、ライゲーション液を大腸菌JM109コンピテントセル（タカラバイオ社）へ形質転換した。形質転換体はアンピシリンを
添加したLB培地を用いてコロニーとして単離された。各形質転換体から、常法に従いプラスミドを調製した。プラスミドpGAのプロモーターの塩基配列（配列番号１３）の上流に
配列1の3’末端が接続したプラスミドをpGA-A、プラスミドpGAのプロモーターの塩基配列（配列番号１３）の上流に配列２の3’末端が接続したプラスミドをpGA-B、プラスミドpGAのプロモーターの塩基配列（配列番号１３）の上流に配列３の3’末端が接続したプラス
ミドをpGA-C、プラスミドpGAのプロモーターの塩基配列（配列番号１３）の上流に配列４の3’末端が接続したプラスミドをpGA-Dとした。
【００８６】
同じく、各形質転換体から、常法に従いプラスミドを調製した。プラスミドpSMのプロ
モーターの塩基配列（配列番号１４）の上流に配列１の3’末端が接続したプラスミドをpSM-A、プラスミドpSMのプロモーターの塩基配列（配列番号１４）の上流に配列２の3’末端が接続したプラスミドをpSM-B、プラスミドpSMのプロモーターの塩基配列（配列番号１４）の上流に配列３の3’末端が接続したプラスミドをpSM-C、プラスミドpSMのプロモー
ターの塩基配列（配列番号１４）の上流に配列４の3’末端が接続したプラスミドをpSM-Dとした。
【００８７】
（２）形質転換体の確認とサンプル調製
麹菌ロイシン要求性変異麹菌株Aspergillus oryzae leu-5をpANLAとpGAあるいはpSM、pGA-A、pGA-B、pGA-C、pGA-D、pSM-A、pSM-B、pSM-C、pSM-Dのいずれか1種類のプラスミドを組み合わせてコトランスフォーメーションにより行った。麹菌を形質転換する手法は常法であるプロトプラスト-PEG-カルシウム法を用いた。得られた形質転換体の導入遺伝子
（uidA遺伝子1コピー導入体）は、uidA遺伝子をプローブとしたゲノムサザン及びその有
無をPCRにより確認し、pGAあるいはpSM、pGA-A、pGA-B、pGA-C、pGA-D、pSM-A、pSM-B、pSM-C、pSM-Dが1コピー導入された形質転換体を得ることが出来た。
【００８８】
各形質転換体を改変型DPY液体培地（2% デキストリン、1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、硫酸マグネシウム0.1％、リン酸水素2カリウム0.1％、塩化カリウム0.05％、硝酸ナ
トリウム0.3％、硫酸鉄0.00001M pH6.3）30ｍLに植菌し、30℃3日間振とう培養後、菌体
を回収した。回収した菌体を海砂B（ナカライテスク）と混和した後、乳鉢と乳棒を用い
てペースト状になるまで磨り潰し、適量のリン酸緩衝液（10mM、pH7.0）を加え懸濁した
。懸濁液をマイクロチューブに移し、遠心ろ過を行い、その上清を回収しサンプルとした。
【００８９】
（３）レポーターアッセイ
調製された各サンプルのβ-グルクロニダーゼ活性（GUS活性）をJefferson 等の方法によって測定した (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8447-8451 (1986)) 。pGAが導入さ
れた形質転換体と比較して、pGA-A、pGA-B、pGA-C、pGA-Dが導入された形質転換体はいずれもβ-グルクロニダーゼ活性（GUS活性）が1.5倍以上向上していた（図２参照）。
【００９０】
またpSMが導入された形質転換体と比較して、pSM-A、pSM-B、pSM-C、pSM-Dが導入され
た株はいずれもβ-グルクロニダーゼ活性（GUS活性）が1.7倍以上向上していた（図３参
照）。
【００９１】
これらのことから、配列１〜４の塩基配列は、いずれも糸状菌、特に麹菌のプロモーターの転写活性を増強するエンハンサーとして機能することが確認された。
【００９２】
（実施例３）  エンハンサーの組み合せによるプロモーターの更なる改良
（１）麹菌(Aspergillus oryzae)由来プロモーターの改良
配列番号２、３、４および１に記載する塩基配列を、タンデムに結合させたDNA断片（
配列番号５、タカラバイオ社で受託合成）と実施例1で得られたベクター（i）をそれぞれ平滑末端処理後にリン酸化と脱リン酸化をそれぞれ行い、ライゲーションさせた。これら一連の操作は、TaKaRa BKL Kit（タカラバイオ社）を使用した。その後、ライゲーション液を大腸菌JM109コンピテントセル（タカラバイオ社）へ形質転換した。形質転換体はア
ンピシリンを添加したLB培地を用いてコロニーとして単離された。各形質転換体から、常法に従いプラスミドを調製した。プラスミドpAAのプロモーターの塩基配列（配列番号１
２）の上流に、配列番号５に示す塩基配列の3’末端が接続したプラスミドをpAA-Sとした。
【００９３】
（２）形質転換体の確認とサンプル調製
麹菌ロイシン要求性変異麹菌株Aspergillus oryzae leu-5を、プラスミドpANLA、pAAあるいはpAA-Sのいずれか1種類のプラスミドを組み合わせてコトランスフォーメーションにより行った。麹菌を形質転換する手法は常法であるプロトプラスト-PEG-カルシウム法を
用いた。得られた形質転換体の導入遺伝子（uidA遺伝子1コピー導入体）は、uidA遺伝子
をプローブとしたゲノムサザン及びその有無をPCRにより確認し、プラスミドpAAあるいはプラスミドpAA-Sが1コピー導入された形質転換体を得ることが出来た。
【００９４】
各形質転換体を改変型DPY液体培地（2% デキストリン、1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、硫酸マグネシウム0.1％、リン酸水素2カリウム0.1％、塩化カリウム0.05％、硝酸ナ
トリウム0.3％、硫酸鉄0.00001M pH6.3）30ｍLに植菌し、30℃3日間振とう培養後、菌体
を回収した。回収した菌体を海砂B（ナカライテスク社）と混和した後、乳鉢と乳棒を用
いてペースト状になるまで磨り潰し、適量のリン酸緩衝液（10mM、pH7.0）を加え懸濁し
た。懸濁液をマイクロチューブに移し、遠心ろ過を行い、その上清を回収しサンプルとした。
【００９５】
（３）レポーターアッセイ
調製された各サンプルのβ-グルクロニダーゼ活性（GUS活性）をJefferson 等の方法によって測定した (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8447-8451 (1986)) 。
【００９６】
結果を図４に示す。図４からわかるように、プラスミドpAAが導入された形質転換体と
比較して、プラスミドpAA-Sが導入された形質転換体は、β-グルクロニダーゼ活性（GUS
活性）が約5.5倍向上していた（図４参照）。このことから、実施例１と２でエンハンサ
ーとして機能することが確認された配列１〜４は、これらを互いに結合しても、エンハンサーとして機能すること、しかも一層エンハンサー活性を向上させることができることが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【００９７】
配列番号５は、配列番号１〜４に示すエンハンサーの塩基配列を、配列番号２，３，４および１の順番で結合させた塩基配列を示す。
配列番号８〜１１および配列番号１５〜３０は、実施例においてＰＣＲ増幅に使用したプラーマーの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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