(57)【要約】      （修正有）【課題】血液中のリポタンパク質を構成する各成分を効率よく、短時間にかつ再現性よく亞分画することができるキャピラリー等速電気泳動法を提供する。【解決手段】キャピラリー等速電気泳動に使用するバッファーシステムを、２種類のリーデイング (leading) バッファーからなるリーデイングバッファーサブシステムと、２種類のターミネ−テイング (terminating) バッファーからなるターミネ−テイングバッファーサブシステムとから構成し、リーデイングバッファーサブシステムをアウトレット側に、またターミネ−テイングバッファーサブシステムをインレット側に配置して、試料をリーデイングバッファーサブシステムとターミネ−テイングバッファーサブシステムとの間に挟んでキャピラリー等速電気泳動（cITP）を行うことによってリポタンパク質を各構成成分に亞分画することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バッファーシステムを２種類のリーデイングバッファーからなるリーデイングバッファーサブシステムと、２種類のターミネ−テイングバッファーからなるターミネ−テイングバッファーサブシステムとから構成し、リーデイングバッファーサブシステムをアウトレット側に、またターミネ−テイングバッファーサブシステムをインレット側に配置して、分離対象物であるリポタンパク質を含有する試料をリーデイングバッファーサブシステムとターミネ−テイングバッファーサブシステムとの間に挟んでキャピラリー等速電気泳動（cITP）を行ってリポタンパク質を各構成成分に分画することを特徴とするキャピラリー等速電気泳動（cITP）によるリポタンパク質亜分画分離方法。
【請求項２】
請求項１に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記リーデイングバッファーサブシステムが第１リーデイングバッファーと第２リーデイングバッファーとからなり、該第２リーデイングバッファーが該第１リーデイングバッファーよりもその粘度が高いこと、また前記ターミネ−テイングバッファーサブシステムが第１ターミネ−テイングバッファーと第２ターミネ−テイングバッファーとからなり、該第２ターミネ−テイングバッファーが該第１ターミネ−テイングバッファーよりもそのｐＨが高いことを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記試料を前記第２リーデイングバッファーと、前記第１ターミネ−テイングバッファーとの間に配置することを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記第１ターミネ−テイングバッファーの後側にさらに前記第２ターミネ−テイングバッファーが配置されていることを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記第１リーデイングバッファーが塩酸と、2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール（アメジオール）とからなる組成を有し、第２リーデイングバッファーが塩酸と、2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール（アメジオール）と、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）とからなる組成を有することを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記第１リーデイングバッファーと前記第２リーデイングバッファーの粘度が互いに異なることを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記第２リーデイングバッファーのｐＨが前記第１リーデイングバッファーの粘度より高いことを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記第１リーデイングバッファーが塩酸と、アメジオールとからなる組成を有していて、また前記第２リーデイングバッファーが前記第１リーデイングバッファーの組成にHPMCを更に含んでいる組成を有することを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記第１ターミネ−テイングバッファーと前記第２ターミネ−テイングバッファーのｐＨが互いに異なることを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記第２ターミネ−テイングバッファーのｐＨが前記第１ターミネ−テイングバッファーのｐＨより高いことを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記第１ターミネ−テイングバッファーがアラニンと、アメジオールとからなる組成を有していて、また前記第２ターミネ−テイングバッファーが前記第１ターミネ−テイングバッファーの組成に水酸化バリウムを更に含んでいる組成を有することを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、該電気泳動終了後に前記第１２リーデイングバッファーでキャピラリー管を洗浄することを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記試料が蛍光染料で染色されていることを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記蛍光染料が NBD−セラミドであることを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記試料にセラミドが含まれていることを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１５のいずれか１項に記載のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法において、前記試料に所持荷電の特徴から選ばれる１種または複数のスペーサーがさらに含まれていることを特徴とするキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法。
【請求項１７】
キャピラリー等速電気泳動装置に配置するキャピラリー管であって、その検出部分に対応するキャピラリー管部分が少なくともレーザー誘起蛍光を透過することができることを特徴とするキャピラリー等速電気泳動装置用キャピラリー管。
【請求項１８】
請求項１７に記載のキャピラリー等速電気泳動装置用キャピラリー管において、前記キャピラリー管がコーテイングされたキャピラリー管であって、前記キャピラリー管検出口部分がコーテイングされていないかまたは該キャピラリー管検出口部分のコーテイングが除去されていることを特徴とするキャピラリー等速電気泳動装置用キャピラリー管。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、キャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法およびそれに使用するキャピラリー管に関するものである。更に詳細には、リポタンパク質を各リポタンパク質亞分画に高効率的に短時間でかつ再現性が高く分離することができるキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法およびそれに使用するキャピラリー管に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールやトリグリセリドなどの脂質は、水に不溶性であるので、血液中にそれ単独では存在せず、アポリポタンバク質と結合した粒子状のリポタンパク質として血液中を循環している。リポタンパク質は、主に比重、粒子サイズ、泳動移動性等の物理的な性状により、カイロミクロン (Chylomicron; CM)、超低比重リポタンパク質（Very-Low-Density
Lipoprotein; VLDL）、中比重リポタンパク質（Intermediate-Density Lipoprotein; IDL）、低比重リポタンパク質（Low-Density
Lipoprotein; LDL）、高比重リポタンパク質（High-Density Lipoprotein; HDL）等に分類される。またリポタンパク質は、アポリポタンパク（アポ）組成や機能等の違いなどによりさらに分類することができ、カイロミクロン (CM)、超低比重リポタンパク質（VLDL）、中比重リポタンパク質（IDL）および低比重リポタンパク質（LDL）はアポリポタンパク（アポ）B含有リポタンパク質と、また高比重リポタンパク質（HDL）はアポリポタンパク（アポ）A-I含有リポタンパク質と分類することができる。
【０００３】
リポタンパク質のうち、血液中でコレステロールを主に運搬しているのは高比重リポタンパク質（HDL）と低比重リポタンパク質（LDL）である。このため、HDLで運搬されているコレステロールはHDLコレステロールと呼ばれ、LDLで運搬されているコレステロールはLDLコレステロールと呼ばれている。これら２つのコレステロールは、全く逆の作用機能を持っており、HDLが全身の血管壁に蓄積した余分なコレステロールを肝臓に運搬する役目を果たしているのに対して、LDLは肝臓のコレステロールを全身の組織に運搬する役目を果たしている。
LDLコレステロールが増加すると、全身の組織に運搬されるコレステロールが増加しアテローム動脈硬化の危険性を高めるため、LDLコレステロールはいわゆる悪玉コレステロールとも呼ばれ、反対にHDLコレステロールは身体中の余分のコレステロールを肝臓に運搬し、動脈硬化を予防する役目を有するため、HDLコレステロールはいわゆる善玉コレステロールとも呼ばれている。
【０００４】
しかし、コレステロール自体は、細胞膜、胆汁酸、各種ホルモン、ビタミンD前駆体の原料であって、健康な身体を維持するのに必須不可欠で重要な物質である。また、コレステロール自身は、リポタンパク質にの包まれた状態のままでは、特に身体に悪影響を及ぼすことはなく、必要とする細胞と肝臓との間を移動しているだけである。
【０００５】
ところが、コレステロールを包み込んでいるリポタンパク質は、血液中で活性酸素と接触すると酸化・破壊され、油溶性のコレステロール自身が血液中に散乱し、この散乱したコレステロールはさらに酸化されて過酸化脂質になってしまう。かかる過酸化脂質は、他の脂肪酸を酸化し、活性酸素をさらに拡散してがんや老化の原因となります。このように散乱したコレステロールを除去するために、マクロファージが動員されるが、コレステロールが多すぎると、マクロファージだけでは不足して、血管壁に存在する平滑筋細胞が働き出すことになる。コレステロールを取り込んだマクロファージや平滑筋細胞は、泡沫細胞に変化してアポトーシスを誘発し、この細胞が血管壁に付着してアテロームを形成し動脈硬化の原因となる。
【０００６】
これらの脂質には酸化されやすい不飽和脂肪酸が含まれており、活性酸素やフリーラジカルなどによる攻撃の標的となっている。不飽和脂肪酸は、酸化されると次々と連鎖反応を起こし、過酸化脂質やアルデヒドとなり、アポタンパクBが分離し、LDL粒子はその球形構造を失うとともに、酸化したLDLは粒子全体の陰性荷電を増加させる。このように酸化されたLDLは、アポタンパクBの構造と性質が変化し、LDL受容体に認識されなくなる一方、マクロファージのスカベンジャー受容体に対する親和性を得て、マクロファージに取り込まれることになる。
【０００７】
一方、LDL受容体は、LDL受け入れに限度があるため、低比重リポタンパク質（LDL）濃度が高いと、LDL受容体を介して組織にコレステロールを供給できないLDLが血液中で滞留することになる。このLDLが長く血液中に滞留すると、LDLは、血管壁の内皮細胞間隙を通って内皮下に侵入し、活性酸素などにより酸化変性LDLへと変化する。この酸化変性LDLが、LDL受容体によって取り込まれなくなるため、血中の単球を呼び寄せてマクロファージ化し、スカベンジャー受容体ファミリー（CD36などのスカベンジャー受容体）を介して自らを処理しようとする。しかし、マクロファージは、際限なく変性LDLを取り込むため、取り込みすぎて泡沫化し、動脈硬化を進展させることになる。
【０００８】
最近の研究で、低比重リポタンパク質（LDL）そのものが動脈硬化を引き起こすのではなく、酸化変性したLDLが問題であることがわかってきた。このように動脈硬化の発症ならびに進展における酸化LDLの役割が次々と明らかにされてきて、酸化変性LDLの測定は臨床評価の新しい指標としても注目を集めている。したがつて、酸化LDLを含むリポタンパク質のプロフィール、酸化のメカニズム、酸化LDL測定法の研究がさらに歩みを進めることによって、動脈硬化発症のより詳細な機序や危険因子との関連の究明にも拍車がかかるものと期待されている。
【０００９】
かかる極微量リポタンパク質を分析する方法としては、種々の方法が使用されていて、例えば、超遠心分離法、ゲル電気泳動法、クロマトグラフィー法、沈殿法、ホモジニアス免疫アツセイなどが挙げられる。その他、最近では、アポリポタンパク（アポ）含量に特異的な抗体を利用した方法も使用されている。これらの方法は、それぞれ異なる物理的性質を利用しているので、各方法間で結果が一致しないことがあり、その上方法によっては技術的に困難であったり、操作条件に左右され易かったり、特殊な装置が必要だったり、新鮮な血清や血漿などの試料の量が多く必要だったり、中にはリポタンパク質の組成を変化させてしまうものまである。したがって、リポタンパク質の本来の形状、組成、機能を損なうことなく、均一なリポタンパク質を測定するための更なる技術的改良が要請されている。
【００１０】
これらの方法のうち、電気泳動法はリポタンパク質の測定に一般的に使用されているが、最近の技術進歩によりキャピラリー等速電気泳動（cITP）が非常に少量の試料中のリポタンパク質やアポリポタンパク質の分析の鍵となる方法論の一つとなるとして注目を集めている。しかしながら、この方法では、リポ蛋白を同定するために、超遠心分離によってリポタンパク質の亜分画を分離し分取する必要があり、またリポタンパク質の亜分画を詳細に区別することはできないことが示唆されている（非特許文献１）。
【００１１】
このキャピラリー等速電気泳動（cITP）法は、リポタンパク質をその移動性に基づいてキャピラリー中に配置した断続バッファーシステムを用いて各分画に分離することができる方法であって（非特許文献２）、連続電解液層を利用する標準型ゾーン等速電気泳動と異なっている。このキャピラリー等速電気泳動（cITP）法に用いる非連続バッファーシステムは、高泳動移動度の先導（リーデイング）バッファー (leading buffer) サブシステムと低泳動移動度の終結（ターミネーテイング）バッファー (terminating buffer) サブシステムから構成されていて、これらのサブシステムの間に測定対象試料を配置して、該試料中のリポタンパク質を亜分画することができる。このキャピラリー等速電気泳動（cITP）法は、リポタンパク質の分析において、従来の電気泳動の担体媒体で発生する分子size sieving effectがないという非常な大きな利点がある。
【００１２】
また、このキャピラリー等速電気泳動（cITP）法は、リポタンパク質をその泳動移動性に基づいて各分画に分離し、高比重リポタンパク質（HDL）をさらに亞分画に、またアポＢ含有リポタンパク質を３つの主要機能グループ、つまりカイロミクロン由来粒子と大型でトリグリセリドに富む超低比重リポタンパク質（VLDL）からなる第１グループと、小型VLDLと中比重リポタンパク質（IDL）とからなる第２グループと、低比重リポタンパク質（LDL）からなる第３グループに分離されている（非特許文献１）。また、この分析法は、リポタンパク質を全血漿、血漿超遠心分画、血清ならびにその他の生物試料から直接測定することができ、またHDLコレステロールとLDLコレステロールとを同時に定量でき、その結果も従来法と高い相関性を有していると報告されている（非特許文献３）。
【００１３】
しかしながら、この方法によるHDLコレステロールとLDLコレステロールの定量結果は完全には一致していないので、コレステロール濃度がより大きな範囲でHDLコレステロールとLDLコレステロールを直接使用して測定する必要があると報告されている（非特許文献１）。また、この測定方法は、試料中の成分組成の数が増加した場合や、組成成分間に泳動移動性が僅かの差しか存在していない場合には、定常状態に達することが困難であるという欠点がある（非特許文献２）。したがって、この測定方法には、血中リポ蛋白亜分画濃度の定量はできず、アポＢリポ蛋白亜分画の同定は超遠心分画を添加する方法を使用するので、正確さが欠けていた。また、この方法では、リポタンパク質の亜分画を詳細に区分することは困難であると考えられる。そこで、かかる亜分画を詳細に分離・解析することができる方法の開発が要請されている。
【００１４】
そこで、上記要請に応えるべく、本発明者らは、キャピラリー等速電気泳動（cITP）法の利点に着目した上で、特にリポタンパク質亞分画の分離が不十分であることまたは再現性が不足しているという欠点を改善するために鋭意研究した結果、cITPのバッファーシステムを改良することによって、短時間にかつ高再現性・高性能での分析を可能にすることに成功した（非特許文献４、５、６、７）。つまり、本発明者らは、キャピラリー等速電気泳動（cITP）法ではリポタンパク質をキャピラリー管に注入したバッファー中で分離するので、キャピラリー管の内部状態と電極の状態が重要であり、またリーデイング (leading) バッファーとターミネ−テイング (terminating) バッファーとの間に試料を挟んで分離をすることから、両方のバッファーを混和しないようにバッファーシステムを工夫した（非特許文献４、５、６、７）。しかしながら、本発明者らのこれらの改良によっても未だ再現性などの性能に改善が必要であることが判明した。
【００１５】
上記背景に鑑みて、本発明者らは、上記改良方法をさらに詳細に検討した結果、特にcITPに使用するバッファーシステム処理手順ならびに装置を工夫することによって、短時間にかつ高再現性・高性能での分析を可能にすることに成功して、この発明を完成した。
同時に、本発明者らは、キャピラリー等速電気泳動（cITP）に使用する装置についても工夫を加えることによって分析再現性を向上させることに成功して、この発明を完成した。特にキャピラリー管は、一般に内径が50-200μm程度の微細なガラス製のキャピラリーを使用していて、この発明に使用する該装置に適用可能なキャピラリーの入手が困難であることから、キャピラリーに工夫を加えることによって、リポタンパク質の分離精度と再現性を向上することを可能にして、この発明を完成した。
【非特許文献１】Schlenck, A., et al. J. Lipid Res. 1999. 40:2125-2133
【非特許文献２】Schmitz, G., et al. Electrophoresis. 1997. 18:1807-1813
【非特許文献３】Boettcher, A., et al. J. Lipid Res. 2000. 41:905-913
【非特許文献４】Zhang, B., et al. J. Lipid Res. 2005. 46:2265-2277
【非特許文献５】Zhang, B., et al. Atherosclerosis. 2007. 191:153-161.
【非特許文献６】Zhang, B., et al. J. Lipid Res. 2007. 48: 1175-1189
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、この発明の主な目的は、キャピラリー等速電気泳動（cITP）によるリポタンパク質を高効率的に短時間にかつ再現性良好に亞分画に分離することができるキャピラリー等速電気泳動（cITP）によるリポタンパク質分離方法を提供することである。
【００１７】
また、この発明は、キャピラリー等速電気泳動（cITP）に使用するバッファーシステムの処理手順を改良したことからなるキャピラリー等速電気泳動（cITP）によるリポタンパク質分離方法を提供することを別の目的としている。
【００１８】
さらに、この発明は、上記リポタンパク質分離方法に適合するように改良したキャピラリー等速電気泳動（cITP）装置の使用に適合するキャピラリー管を提供することを別の目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この発明は、バッファーシステムを２種類のリーデイングバッファーからなるリーデイングバッファーサブシステムと、２種類のターミネ−テイングバッファーからなるターミネ−テイングバッファーサブシステムとから構成し、リーデイングバッファーサブシステムをアウトレット側に、またターミネ−テイングバッファーサブシステムをインレット側に配置して、分離対象物であるリポタンパク質を含有する試料をリーデイングバッファーサブシステムとターミネ−テイングバッファーサブシステムとの間に挟んでキャピラリー等速電気泳動（cITP）を行ってリポタンパク質を各構成成分に分画することからなるキャピラリー等速電気泳動（cITP）によるリポタンパク質分離方法を提供する。
【００２０】
また、この発明は、その好ましい態様としては、バッファーサブシステムの
リーデイングバッファーサブシステムが第１リーデイングバッファーと第２リーデイングバッファーの２種類のバッファーサブからなり、また第２リーデイングバッファーが第１リーデイングバッファーよりもその粘度が高いこと、またターミネ−テイングバッファーサブシステムが第１ターミネ−テイングバッファーと第２ターミネ−テイングバッファーとからなり、第２ターミネ−テイングバッファーが第１ターミネ−テイングバッファーよりもそのｐＨが高いことからなつているキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法を提供する。
【００２１】
この発明の更に好ましい態様としては、この発明において分析対象のリポタンパク質を含む試料が第２リーデイングバッファーと、第１ターミネ−テイングバッファーとの間に配置されていて、さらに第１ターミネ−テイングバッファーの後側に前記第２ターミネ−テイングバッファーが配置からなるキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法を提供する。
【００２２】
また、この発明の更に好ましい態様としては、第１リーデイングバッファーは、塩酸と、2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール（アメジオール）とからなる組成を有し、第２リーデイングバッファーが塩酸と、2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール（アメジオール）と、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）とからなる組成を有し、また第１リーデイングバッファーと第２リーデイングバッファーの粘度が互いに異なりかつ第２リーデイングバッファーの粘度が第１リーデイングバッファーのｐＨより高いことからなるキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法を提供する。
【００２３】
さらに、この発明の更に好ましい態様としては、第１ターミネ−テイングバッファーがアラニン、より好ましくはβーアラニンと、アメジオールとからなる組成からなり、また第２ターミネ−テイングバッファーが上記第１ターミネ−テイングバッファーの組成と酸化バリウムとからなる組成を有していることからなり、また第１ターミネ−テイングバッファーと第２ターミネ−テイングバッファーのｐＨが互いに異なりかつ第２ターミネ−テイングバッファーのｐＨが第１ターミネ−テイングバッファーのｐＨより高いことからなるキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法を提供する。
【００２４】
この発明の更に別の態様として、電気泳動後に第１リーデイングバッファーでキャピラリー等速電気泳動装置に配置したキャピラリー管を洗浄することからなるキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法を提供する。
【００２５】
この発明は、その別の態様として、キャピラリー等速電気泳動装置に配置するキャピラリー管の該装置の検出部分に対応する部分が少なくともレーザー誘起蛍光を透過する構成からなっていて、例えば、キャピラリー管がコーテイングされたキャピラリー管である場合、該キャピラリー管検出口部分がコーテイングされていないかまたは該キャピラリー管検出口部分のコーテイングが除去されていることからなるキャピラリー等速電気泳動装置用キャピラリー管を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
この発明に係るキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法は、例えば血液試料中のリポタンパク質を高精度で短時間にかつ再現性良好に亞分画することができるという効果を有している。
また、この発明に係るキャピラリー等速電気泳動装置用キャピラリー管を、装置の検出口に対応する部分を少なくともレーザー誘起蛍光が透過できる構成にすることによって、例えば血液試料中のリポタンパク質を高精度で短時間にかつ再現性良好に亞分画することができるという効果を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
この発明に係るリポタンパク質分離方法は、例えば血液試料中のリポタンパク質をキャピラリー等速電気泳動（cITP）によって各構成成分に亞分画する方法である。このキャピラリー等速電気泳動は、上記したように、非連続バッファーシステム中でリポタンパク質を分離する方法であり、電気泳動装置内に内径５０〜数百μm程度のガラスキャピラリーを装着し、バッファーを充填したキャピラリーの一端に試料を注入すると共に、キャピラリー両端に高電圧を印加して、分析対象物をキャピラリー内で分離して測定するものである。このキャピラリー電気泳動は、微細なガラスキャピラリーを使用することにより、その内部容積に対して表面積が大きいことから、高電圧の印加が可能となり、タンパク質や核酸などの極微量成分を高速かつ高分解能で分析することができるという特長を持っている。
【００２８】
この発明に使用するバッファーシステムは、２種類のリーデイング (leading) バッファーからなるリーデイングバッファーサブシステムと、２種類のターミネ−テイング (terminating) バッファーからなるタ−ミネ−テイングバッファーサブシステムとから構成されている。つまり、リーデイングバッファーサブシステムは第１リーデイングバッファーと第２リーデイングバッファーとからなり、またターミネーテイングバッファーサブシステムは第１タ−ミネ−テイングバッファーと第２タ−ミネ−テイングバッファーとから構成されている。また、バッファーシステムは、リーデイングバッファーサブシステムがキャピラリー等速電気泳動（cITP）装置に配置するキャピラリー管のアウトレット側に、またターミネ−テイングバッファーサブシステムがそのキャピラリー管のインレット側に配置され、分離対象物であるリポタンパク質を含有する試料はリーデイングバッファーサブシステムとターミネーテイングバッファーサブシステムとの間に挟んで配置される。
【００２９】
また、この発明で使用するバッファーシステムは、キャピラリー等速電気泳動（cITP）に適合するために調整する。そのためには、バッファーシステムは、リーデイングバッファーサブシステムがターミネーテイングバッファーサブシステムよりもその泳動移動性が高くなるように設定して調整する必要がある。更に詳細には、バッファーシステムは、キャピラリーの先端側に配置するリーデイングバッファーサブシステムが、後端側に配置するターミネーテイングバッファーサブシステムよりも高い泳動移動性を有するように調整するのがよい。また、各サブバッファーシステムにおいても、キャピラリーの先端側に配置するバッファーがその後端側に配置されるバッファーよりも高い泳動移動性を有するのがよい。また、分析対象の試料も、その前側に配置されるリーデイングバッファーサブシステムよりもその泳動移動性が低く、また後側に配置されるターミネーテイングバッファーサブシステムの泳動移動性よりも高い泳動移動性を有するように調整するのがよい。
【００３０】
この発明において、バッファーシステムに対する要求を満足させるために、リーデイングバッファーサブシステムを構成する第１リーデイングバッファーは、例えば、塩酸と、2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール（アメジオール）とからなる組成を有し、第２リーデイングバッファーは、例えば、塩酸と、2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール（アメジオール）と、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）とからなる組成を有するように構成している。また第１リーデイングバッファーと第２リーデイングバッファーは、その粘度が互いに異なりかつ第２リーデイングバッファーの粘度が第１リーデイングバッファーの粘度より高くなるように調整するのがよい。なお、リーデイングバッファーの粘度は、試料中のリポタンパク質の性質を損なわない限り、特に限定されるものではなく、この発明の目的に適うように適宜選択して決定することができる。
【００３１】
他方、ターミネーテイングバッファーサブシステムを構成する第１ターミネーテイングバッファーは、例えば、アラニン、好ましくはβ−アラニンとアメジオールとからなる組成を有し、第２ターミネーテイングバッファーは、例えば、第１ターミネーテイングバッファーの組成に加えて酸化バリウムを添加した組成を有するのがよい。第１ターミネーテイングバッファーと第２ターミネーテイングバッファーは、そのｐＨが互いに異なりかつ第１ターミネーテイングバッファーのｐＨが第２ターミネーテイングバッファーのｐＨより低くなるように調整するのがよい。なお、ターミネーテイングバッファーのｐＨは、試料中のリポタンパク質の性質を損なわずかつ試料が第２ターミネーテイングバッファーに混入しない限り、特に限定されるものではなく、この発明の目的に適うように適宜選択して決定することができる。
【００３２】
この発明のキャピラリー等速電気泳動（cITP）法によって試料中のリポタンパク質を亞分画するには、測定対象の試料をキャピラリー等速電気泳動装置のキャピラリー管に装填して、キャピラリー管中で分離された各分画をレーザー誘起蛍光で測定する。測定対象の試料をキャピラリー管に装填する手順としては、キャピラリー管中に、測定対象の試料をリーデイングバッファーサブシステムの後側に、またターミネーテイングバッファーサブシステムの前側になるように配置する。更に詳細には、測定対象の試料は、第２リーデイングバッファーの後側でかつ第１ターミネーテイングバッファーの前側に配置するのがよく、また第１ターミネーテイングバッファーの後側に第２ターミネーテイングバッファーを配置するのがよい。
【００３３】
この発明の分離方法による測定対象の試料としては、リポタンパク質を含有する生物試料であればいずれも測定対象となり。例えば、血清や、血漿、細胞培養上清などが例示される。この発明のキャピラリー等速電気泳動（cITP）法での測定に使用する生物試料は次のように調製することができる。測定用試料は、例えば、生物試料を第１リーデイングバッファーと添加し混合した後、蛍光染料、好ましくは親油性蛍光色素などを添加すると共に、スペーサーを添加して調製することができる。使用する蛍光染料としては、リポタンパク質に結合可能な蛍光染料であればいずれも使用することができ、例えは、６−（（Ｎ−（７−ニトロベンヅ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ヘキサノエル）スフィンゴシン(NBD C6−セラミド) などが例示される。
【００３４】
また、スペーサーとしては、例えば、N−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ACES）、Ｄ−グルクロン酸、１−オクタスルホン酸ナトリウム塩、３−（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸 (TAPSO)、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸 (TAPS)、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−メチオニン、グリシンなどが例示される。これらのスペーサーは、単独でもまたは組み合わせても使用することができる。また、スペーサーと共に、マーカーとして、５−カルポキシフルオレッセインなどの蛍光染料を添加するのがよい。
【００３５】
上記のように調製した測定用試料は、キャピラリー等速電気泳動装置のキャピラリー管中に、好ましくは加圧下で装填するのがよい。なお、加圧の圧力は特に限定されるものではなく、適宜選択して圧力を設定するのがよい。またキャピラリー管中での急激な熱発生を防ぐために、分析中は電圧ランプ (ramp) 時間を２分間程度に設定することによって電圧が徐々に上昇するように調整するのがよい。
【００３６】
この発明に使用するキャピラリー等速電気泳動装置に装着するキャピラリー管は、通常、ガスクロマトグラフィーに使用するキャピラリー管が使用されている。かかるキャピラリー管は、内径が約５０μｍ〜数１００μｍであるので、キャピラリー等速電気泳動装置の検出部に装着する際に折り曲げたりすると簡単に折れて破損する恐れがあることから、かかる破損を防止するためにガラスなどのキャピラリー管の外周にはコーテイングが施されている。しかしながら、このようにコーテイングしたキャピラリー管は、レーザー誘発蛍光を使用したキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質の分析にはそのままでは適用できない。また、キャピラリー等速電気泳動装置に使用されるガスクロマトグラフィー用キャピラリー管は、一般に市販されているキャピラリー電気泳動用キャピラリー管と違って、検出口を有していない。したがって、この発明においてキャピラリー等速電気泳動装置にガスクロマトグラフィー用キャピラリー管を使用するには、そのキャピラリー管に検出口を設ける必要がある。そのために、この発明においては、キャピラリー等速電気泳動装置の検出窓口に対応するかかるキャピラリー管の少なくとも検出部分のコーテイングを除去することによって、キャピラリー管に検出窓口を作成するのがよい。なお、かかるキャピラリー管の検出部分のコーテイングを除去する方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、加熱することによってコーテイングを除去することができる。当然のことであるが、この発明に使用できるキャピラリー管は上記構成のものに限定されるものではなく、レーザー誘発蛍光を使用したキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質の分析に適用できるものであればいずれも使用できる。したがって、かかるキャピラリー管が十分な強度を有しかつレーザー誘発蛍光を透過可能な材質で作成でき、かつキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質の分析に適用できるものであれば、この発明にいずれも使用することができる。
【００３７】
この発明において、リポタンパク質分析の精度と再現性を向上させるために、使用するキャピラリー等速電気泳動装置に装着するキャピラリー管の内部状態を調整するのがよい。そのために、当然のことであるが、キャピラリー管に測定用試料を装填する前ならびに分析後に、キャピラリー管の内部を水やバッファーで十分に洗浄するのがよい。
【００３８】
この発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、下記実施例はこの発明を具体的にかつ例示的に説明する意図で記載するだけであって、この発明をいかなる意味においても一切制限的に限定するものではない。
【実施例１】
【００３９】
（Bo Zhang et al., J. Lipid Res. 2005. 46:2265-2277参照）
（バッファーシステムの調製）
このバッファーシステムを構成するバッファーはそれぞれ文献記載の方法で調製した（非特許文献４）。つまり、リーデイングバッファー１（ＬＢ１）は、10 mM HCl と 18 mM アメジオール（2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール）とを蒸留水に溶解しpH 8.8 に調整して調製した。リーデイングバッファー２（ＬＢ２）は、ＬＢ１を、バッファー粘度調整剤（HDLの分離を安定させるため）としての0.35% ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）とを混合して作製した。また、内部マーカーとして５−カルボキシフルオレッセインを使用し、N−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ACES）、Ｄ−グルクロン酸、１−オクタスルホン酸ナトリウム塩、３−（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸 (TAPSO)、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸 (TAPS)、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミンおよびグリシンを使用した。
一方、ターミネ−テイングバッファー１（ＴＢ１）は、24 mM β―アラニンと13 mMアメジオールとを蒸留水に溶解して作製した。ターミネ−テイングバッファー２（ＴＢ２）は、ターミネ−テイングバッファー１（ＴＢ１）に飽和水酸化バリウム 47μl を添加して pH 10.5 に調整して作製した。
【００４０】
（試料の調製）
測定試料 6μl をリーデイングバッファー１（ＬＢ１）14μl で希釈し、この混合物に、別途調製した下記蛍光染料溶液を添加した。さらに、この混合物に、上記スペーサーを混合したマーカーミックスダイ（５−カルボキシフルオレッセインダイとスペーサーの混合物）50μl を添加して試料を調製した。
使用した蛍光染料は、６−（（Ｎ−（７−ニトロベンヅ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ヘキサノエル）スフィンゴシン（NBD C6−セラミド） 1 mgを無水エタノール 1 ml に溶解し、無水エチレングリコールを用いて室温で混合して１０倍に希釈して調製した。
【００４１】
（測定法）
上記で調整した測定試料を、キャピラリー等速電気泳動装置（Beckman P/ACE MDQ system）に装着した30 cm 長のキャピラリー（内径 180μm；ジメチルポリシロキサン被覆融着シリカキャピラリー）に注入した。なお、キャピラリーの検出口部分の被覆は熱で予め除去した。キャピラリー等速電気泳動による分離は、定常電流 30μA を１分間流し、キャピラリー両端を加圧して電圧 10 kV を７分間印加して行った。分離されたゾーンはアルゴンレーザー誘起蛍光（励起波長：488 nm；蛍光波長：520 nm）で検出して測定した。各リポタンパク質の分画ピーク面積は内部マーカーの該当面積の相対値として算出した。その結果を図１に示す（非特許文献４のFig. 2）。
【００４２】
（図１の説明）（非特許文献４のFig. 2）
図１では、血漿中で直接分析したLDL亞分画を超遠心分離によって分離したLDLと比較した。
図１Ａはキャピラリー等速電気泳動による女性のリポタンパク質プロフィールを示している。HDL分画はアポＢ含有リポタンパク質を沈殿させて同定した。図１Ｂに図示するように、図１Ａで見られたピーク４−７はアポＢ除去血漿には認められなかった。このことは図１Ａで見られたピーク１−３はHDL亞分画であることを示している。またLDL亞分画は超遠心分離で単離したLDLをアポＢ除去血漿に添加して同定した。図１Ｃ−Ｇに図示するように、添加したLDLの亞分画は、全血漿から分離したものと同一の移動時間と同様な泳動パターンを有していた。図中、超遠心分離LDLにおける高速移動性LDL（fLDL(-)）（ピーク６）の対主LDL（ピーク７）（低速移動性LDL：sLDL）割合は、全血漿LDLにおける割合よりも低くなっていて、これば超遠心分離によってfLDL亞分画が喪失していることを示している。
【００４３】
LDL亞分画を測定するためのキャピラリー等速電気泳動法とクロマトグラフィー法との１つの違いは、キャピラリー等速電気泳動法がLDL亞分画の脂質含量を測定しているのに対して、クロマトグラフィー法はLDL亞分画のタンパク質含量を測定していることである。図１Ｃ−Ｇにおいては、異なる量のLDLタンパク質をアポＢ除去血漿に添加して、キャピラリー等速電気泳動によるLDL亞分画とLDLのタンパク質含量との関係を調べた。その結果、キャピラリー等速電気泳動によるfLDL亞分画とsLDL亞分画はLDLタンパク質の増加と共に増加し、それらの相対ピーク面積はLDLのタンパク質含量と正比例することが認められた。この結果はキャピラリー等速電気泳動法が電荷をベースにしたLDL亞分画を定量する正確で高感受性の測定方法であることを示している。
【実施例２】
【００４４】
（Bo Zhang et al., J. Lipid Res. 2005. 46:2265-2277参照）
（LDLの酸化）
酸化の前に、超遠心分離によって単離したLDLをPBS (pH 7.4) で透析してEDTAを除去した。LDL (0.5 mg/ml) を硫酸銅水溶液 (10μM) と共に37℃で攪拌水浴中においてインキュベ−ト酸化させた。反応液を、反応開始時、反応30分後、1 時間後、2 時間後、3時間後に取り出して、氷冷後、EDTA-Na2 とブチル化ヒドロキシトルエンとを添加して酸化を停止させた。酸化LDL (10μl) を硫酸銅の除去なしに直ちにキャピラリー等速電気泳動測定に使用した。
LDLの荷電変化測定は、血漿コントロール (1μl) と酸化LDL (0.5 mg/ml) を1% アガロースゲルを用いて90 V で40分間電気泳動した。リポタンバク質はファットレッド7Bで染色した。共役ジエンは分光光度計によって234 nm の吸光度を測定して検出した。チオバルビツール酸反応性物質（TBARS）は蛍光測定法で測定した。アポB蛍光は分光蛍光光度計を用いて430 nm の吸光度を測定して検出した。その結果を図２に示す。（非特許文献４のFig. 3）
【００４５】
（図２の説明）（非特許文献４のFig. 3）
LDLの酸化の結果、共役ジエンとチオバルビツール酸反応性物質（TBARS）とが急激に増加した。またアガロースゲル上での泳動移動性（図２Ａ）も、アポB蛍光も増加した。また図２Ａに示すように、酸化LDLの負電荷の増加は酸化時間１時間後にアガロースゲル上で観察された。キャピラリー等速電気泳動によるLDL亞分画の変化は、酸化LDLを異なる時間に採取し、アポB欠損血漿に添加することによって測定した。図２Ｂに酸化LDLの電気泳動図を示す。sLDL亞分画（ピーク７）は、図２Ｂｂ−ｃに示すように、酸化時間30分から徐々に減少するのに対して、fLDL亞分画（ピーク６）は、図２Ｂｂ−ｄに示すように、酸化時間30分から1.5時間の間に徐々に増加した。この結果は、酸化の初期段階では、sLDL亞分画（ピーク７）はfLDL亞分画（ピーク６）に変換していて、またfLDL亞分画の増加と平行してアガロースゲル上での移動性も増加した。酸化1.5時間から3 時間の間は、fLDL亞分画（ピーク６）は減少したのに対して、新たなLDL亞分画（ピーク５）が酸化1時間後から発生し（図３Ｂｃ）、その後急激に増加した（図３Ｂｄ−ｆ）。この結果は、酸化反応中には、sLDL亞分画（ピーク７）はfLDL亞分画（ピーク６）に変換するけれども、fLDL亞分画（ピーク６）はさらに変換されて新しいより一層陰性電荷のLDL亞分画（ピーク５）になっていることを示している。したがって、キャピラリー等速電気泳動によるLDL亞分画の分布はLDLの酸化により徐々に変化し、LDL亞分画はより陰性度の高い電荷に変化していることが見出された。このことはfLDL亞分画がインビボでのLDL(−)亞分画を表していることを示している。
【実施例３】
【００４６】
(Bo Zhang, et al., Atheroscl. 2007. 191:153-161参照）
（アポＢ含有リポタンパク亞分画の定量）
食後の血漿について実施例１と同様にキャピラリー等速電気泳動を行った。まず、試料は、その血漿 6μl を、10 mM HCl と 18 mM アメジオールとを蒸留水に溶解しpH 8.8 に調整して調製したリーデイングバッファー１（ＬＢ１、pH 8.8）14μl で希釈して調製した。この血漿試料を、実施例１で調整したNBD C6−セラミド蛍光染料 (0.1 mg/ml)
10μl を用いて室温で１分間染色した。続いて、染色した血漿試料を、ＬＢ１とバッファー粘度調整剤としての0.35% ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）とを混合して作製したリーデイングバッファー２（ＬＢ２）、内部マーカーとしての５−カルボキシフルオレッセインと、スペーサーを混合して作成したスペーサーミックス50μl と混合した。さらに、血漿とHDL（アポB除去血漿）とをLB1と２：５の割合で混合し、希釈血漿とHDLとを所定割合で混合した。したがって、HDLと血漿タンパク質の量は変えずに、アポB含有リポタンパク質を希釈した。この混合液 20μl をプレ染色に使用した。本実施例では、スペーサーとして、N−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ACES）、Ｄ−グルクロン酸、１−オクタスルホン酸ナトリウム塩、３−（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸 (TAPSO)、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸 (TAPS)、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−メチオニンおよびグリシンを含んでいる。一方、ターミネ−テイングバッファー１（ＴＢ１）は、24 mM β−アラニンと13 mMアメジオールとを蒸留水に溶解して作製した。ターミネ−テイングバッファー２（ＴＢ２）は、ターミネ−テイングバッファー１（ＴＢ１）に飽和水酸化バリウム 47μl を添加して pH 10.5 に調整して作製した。
【００４７】
上記で調整した試料を実施例１と同様にキャピラリー等速電気泳動を行った。その結果を図３（Bo Zhang, et al., Atheroscl. 2007. 191:153-161  Fig. 1a-1d）に示す。図３ａは全血漿のリポタンパク質の亞分画のプロフィールを示している。図中、血漿は８個の亞分画（ピーク１−８）に亞分画されている。ピーク４−８がアポＢ含有リポタンパク亞分画であることを確認するために、血漿をホスホタングステン酸／塩化マグネシウムで沈殿させ、キャピラリー等速電気泳動を行った。その結果は図３ｂに示す通りであった。図中、アポＢ除去血漿はピーク１−３で表される分画を含んでいたが、ピーク４−８で表される分画を含んでいなかった。これはピーク１−３がHDL亞分画であり、ピーク４−８はアポＢ含有リポタンパク亞分画であることを示している。
【００４８】
さらに、カイロミクロン分画を同定するために、血漿から Sf>400 svedbergsの粒子を遠心分離で除去し、同様にキャピラリー等速電気泳動を行った。その結果を図３ｃに示した。図中、ピーク５−７に対するピーク４の相対面積は、全血漿（図３ａ）に比べて著しく減少している。このことはカイロミクロンがピーク４に含有されていることを示している。
【００４９】
また、VLDL 分画と IDL 分画を特定するために、血漿のd＞1.006 g/ml 分画とd＞1.019 g/ml 分画とを同様にキャピラリー等速電気泳動を行った。d＜1.006 g/ml 分画が除去されている血漿とd＜1.019 g/ml 分画が除去されている血漿（図３ｄ）とは同様の泳動プロフィールバターンを示した。図示したように、ピーク５はほとんど存在していないところから、ピーク５はVLDLであることを示している。全血漿に比べて著しく減少したピーク４はd＞1.006 g/ml 分画の血漿には現れていないことから、このピーク４は、VLDLバルクよりも早い泳動移動性を有するVLDL亞分画を含んでいることを示している。したがって、ピーク４と５は超遠心分離によって特定されたトリグリセリドリッチリポタンパク質（fTRL:高速移動性トリグリセリドリッチリポタンパク質ならびにsTRL:低速移動性トリグリセリドリッチリポタンパク質）を表している。血漿のd＞1.019 g/ml 分画は HDL と LDLだけからなることが知られているので、ピーク６−８が LDL 亞分画であることは容易に特定できる。ピーク６と７はそれぞれ fLDL と sLDL を表し、ピーク８は minor LDL を表している。
【００５０】
全血漿(図３ａ）と分画（図３ｃ）を比較して、ピーク６はd＞1.019 g/ml 分画（図３ｄ）よりも相当小さいことから、fLDL にはLDL分画と同一移動性を有するVLDL亞分画、つまりβ-VLDLが含まれている。
【実施例４】
【００５１】
(Bo Zhang, et al., Atheroscl. 2007. 191:153-161参照）
絶食したボランテイアからの空腹時血漿を実施例１と同様に調製した試料を使用してアポＢ含有リポタンバク質の定量をキャピラリー等速電気泳動によって同様に行った。その結果を図４に示す（Bo Zhang, et al., Atheroscl. 2007. 191:153-161のFig. ２）。
図４ａと図４ｂに示すように、アポＢ欠損除去で２倍に希釈した血漿中のアポＢ含有リポタンバク質のレベル（図３ｂのピーク４−７の面積）は、無希釈の血漿のレベルの半分（図３ａのピーク４−７の面積）であった。図４ｃに示すように、希釈割合に対するキャピラリー等速電気泳動によって分離されたfTRL亞分画、sTRL亞分画、fLDL亞分画ならびにsLDL亞分画のピーク面積（内部マーカーに対する相対値）のプロットは直線（それぞれr = 0.896、0.984、0.986ならびに0.997）であった。
【実施例５】
【００５２】
（Bo Zhang, et al., Atheroscl.
2007. 191:153-161のFig. ３）
キャピラリー等速電気泳動によるアポＢリポタンパク質亜分画が脂質とアポリポタンパク質組成によって特長付けるために、fTRL、 sTRL、fLDLならびに sLDLのレベルと、トリグリセリド (TG)、レムネント様粒子コレステロール (RLP-C) 、LDLコレステロール (LDL-C)、アポ B、アポ C-II、アポ C-IIIならびにアポ Eの血清レベルとの関係を調べた。結果を図５に示す。
図示するように、fTRLとsTRLのレベルは、TG（図５ａ、ｂ）とRLP-C（図５ｅ、ｆ）のレベルと有意的に関連していた（＊で示すように）。fLDLとsLDLのレベルは、LDL-Cのレベルと有意的に関連していた（図５ｋ、ｌ）。また、図５ｃと図５ｇに示すように、fLDLレベルはTGとRLP-Cレベルとも関連していた。
【００５３】
（Bo Zhang, et al., Atheroscl. 2007. 191:153-161のFig. ４）
図６に示すように、fTRL、 sTRL、 fLDLならびに sLDLレベルは、血清アポＢレベル（図６ａ−ｄ）と関連していた。またfTRL、 sTRLならびに fLDLレベルは、アポ C-II（図６ｅ−ｇ）とアポ C-III（図６ｉ−ｋ）のレベルと関連していた。sTRLおよび fLDLのレベルはアポ E（図６ｎ、ｏ）レベルと関連していた。
【００５４】
（Bo Zhang, et
al., Atheroscl. 2007. 191:153-161のFig. ５）
RLP-CレベルはTGレベルと密接に関連することが知られているが、RLP-C、TG、fTRL、 sTRLならびにfLDLのレベル間の関係を調べた。図７に示すように、RLP-Cレベルは低fTRLと高fTRLグループ（図７Ａ）、低sTRLと高sTRLグループ（図７Ｂ）および低fLDLと高fLDLグループ（図７Ｃ）の各TGレベルと有意に関連している。しかしながら、fTRL （図７A）、sTRL（図７B）ならびにfLDL（図７C）の高レベルグループにおける対TGレベルのRLP-Cレベルの回帰直線は、それぞれの低レベルグループよりも高い傾斜を有していた。RLP-CレベルとTGレベル間の関係と、fTRL、sTRLならびにfLDLレベルとの交互作用は有意であると評価されたこれらの結果は、fTRL、sTRLならびにfLDLレベルがRLP-CレベルとTGレベルとの間の関係を変化させることを示している。
【実施例６】
【００５５】
（Bo Zhang, et al., J. Lipid Res.
2007. 48: 1175-1189のFig. 2）
本実施例では、apoA-I/POPC （ホスファチジルコリン）デイスクの負電荷が増加した変性LDLに対する効果を調べるために、血漿中のLDLとインビトロで酸化したLDLとの分布を調べた。
各種血漿について、上記と同様に、キャピラリー等速電気泳動によってリポタンパク質の分析を行った。その結果を図８に示す。
図８Ａは、正常脂血値の健常人の典型的なリポタンパク質のプロフィールを示している。図中、血漿リポタンパク質は、HDLが高速移動性HDL (fHDL)
亞分画、中速移動性HDL (iHDL)
亞分画ならびに低速移動性HDL (sHDL)
亞分画（ピーク１−３）の３つの亞分画に、トリグリセリドリッチリポタンパク質 (TRL) が高速移動性トリグリセリドリッチリポタンパク質 (fTRL) 亞分画と低速移動性トリグリセリドリッチリポタンパク質 (sTRL) 亞分画（ピーク４−５）の２つの亞分画に、LDLが高速移動性LDL (fLDL) 亞分画と低速移動性LDL (sLDL) 亞分画（ピーク６−７）と、超小分画として (very minor) LDL (vmLDL) 亞分画（ピーク８）とに分画された。
【００５６】
本実験では、正常脂血値の健康人から超遠心分離して単離したLDLを同一人からのアポＢ除去血漿を用いてキャピラリー等速電気泳動によってリポタンパク質亞分析をした結果を図８Ｂに示す。図中、（ａ）に図示するように、アポＢ除去血漿にはHDL分画（ピーク１−３）と無視できる量のアポＢリポタンパク質分画（ピーク４）が検出された。（ｂ）に図示するように、アポＢ除去血漿の存在下でネーテイブLDL（酸化を受けていないLDL）にはfLDLが小分画（ピーク６）として、またsLDLが大分画（ピーク７）として検出された。また、非常に小さい分画（ピーク５）も検出された。（ｃ）には、小程度（マイルドに）酸化されたLDLでは、ネーテイブLDLに比べて、fLDL分画（ピーク６）が増加しているのに対して、sLDL分画（ピーク７）が減少していることが示されている。（ｄ）は、中程度酸化されたLDLにおいては、fLDL分画（ピーク６）がさらに増加しているのに対して、sLDL分画（ピーク７）が著しく減少していることを示されている。またネーテイブLDLの極小分画（ピーク５）が中程度酸化されたLDLでは非常に増加し新しい分画（ピーク５）として検出された。この新分画はfLDL分画（ピーク６）よりも高速の移動性を有することから超高速移動性LDL (vfLDL) と称する。
【００５７】
図８Ｃは、キャピラリー等速電気泳動による高トリグリセリド血症 (HTG) 患者のリポタンパク質亞分画を示している。図中、（ａ）に示すように、本患者の全血漿中のfTRL分画（ピーク４）とsTRL分画（ピーク５）は、図８Ａに示した健康人に比べてトリグリセリドレベルが増加しているために明らかに高かった。（ｂ）に図示するように、d＞1.019 g/ml血漿分画（TRL除去されている）のリポタンパク質亞分画においては、fTRL分画（ピーク４）は存在せず、sTRL分画（ピーク５）が無視できる量の分画として検出された。しかし、d＞1.019 g/ml血漿分画（ｂ）におけるfLDL分画（ピーク６）は、全血漿（ａ）よりも明白に低くかった。このことは、全血漿においては、超低速移動性TRL (vsTRL) と定義付けられるTRL分画がfLDLと共に移動していることを示している。図８Ｃ（ｂ）と図８Ａに図示するように、本患者は、LDL-Cレベルが類似していたにも拘わらず、健康人よりもfLDLが高く、sLDLが低かった。このLDL亞分画の分布はインビトロで小程度酸化されたLDLに類似していたこと（図８Ｂｃ）から、本患者のLDLは小程度（マイルドに）に酸化されていることを示している。
【００５８】
本実験では、異なる電気泳動性を有するLDL亞分画は小型高密度（小型化）LDL (sdLDL) の内容が異なるかどうかを調べた。その結果、HTG 患者からのd＞1.040 g/ml 血漿分画（TRL、大型浮遊性LDL（lbLDL）、中密度LDL（idLDL）除去されている）においては、d＞1.019 g/ml血漿分画（図８Ｃｂ）に比べて、fLDL 亞分画（ピーク６）は僅かに減少したが、sLDL亞分画（ピーク７）は著明に減少した。このことは、fLDLはほとんどがsdLDLであり、sLDLはsdLDLばかりではなく、lbLDLとidLDLも含んでいることを示している。
【００５９】
本実験では、人体内に中程度酸化されたLDLが存在しているかを調べた。HDL欠損 (HDLD) 高トリグリセリド血症 (HDLD-HTG) 患者の全血漿（sLDLは非常に低レベル、fLDLとsTRLとは増加）のd＞1.019 g/ml 分画とd＞1.040 g/ml分画を単離して調べた結果を図８Ｄに示す。図８Ｄ（ａ）に図示するように、fLDL（ピーク６）とvfLDL（ピーク５）は、健康人（図８Ａ）と高トリグリセリド血症 (HTG) 患者（図８Ｃｂ）に比べて、d＞1.019 g/ml 血漿分画において増加していた。このLDL亜分画の分布は、インビトロで中程度に変性されたLDL分布（図８Ｂｄ）と非常に類似していた。したがって、このことは中程度に酸化されたLDLはインビボで人体に存在していることを示している。同様に、図８Ｄ（ｂ）に示すように、vfLDL（ピーク５）には主にsdLDLが含まれていて、fLDL（ピーク６）には、sdLDLよりも、lbLDLとidLDLが多く含まれていた。これらの結果は、異なる電気泳動移動度を有するLDL亜分画は異なる内容のsdLDLを有することを示している。
【実施例７】
【００６０】
（Bo Zhang, et al., J. Lipid Res.
2007. 48: 1175-1189のFig. ３）
本実施例では、図８Ｃ（ａ）と（ｂ）に示すようにトリグリセリドリッチリポタンパク質（TRL）として存在する超低速移動性TRL (vsTRL)亜分画がfLDLと共に移動しているので、apoA-I/POPC （ホスファチジルコリン）ディスクがキャピラリー等速電気泳動による異なる分布のLDL亜分画に対する効果をTRL除去血漿（d＞1.019 g/ml 血漿分画）について調べた。本実施例では、各種試料について、キャピラリー等速電気泳動を実施例１と同様に行って、リポタンパク質亜分画の分析を行った。その結果を図９に示す。（Ａ）はapoA-I/POPC ディスク不存在下のd＞1.019 g/ml 血漿分画のリポタンパク質亞分画を示し、（Ｂ）はapoA-I 濃度0.5 mg/mlのapoA-I/POPC ディスクの存在下３７℃で３０分間（ａ、ｂ）または６０分間（ｃ）インキュベートしたd＞1.019 g/ml 血漿分画のリポタンパク質亞分画を示す。図中、（ａ）は正常脂血の人からの血漿、（ｂ）は高コレステロール血症患者からの血漿、（ｃ）はHDL欠損 (HDLD) 高トリグリセリド血症 (HTG) 患者からの血漿を表している。
【００６１】
図中、ピーク１−３はfHDL亞分画、iHDL亞分画、sHDL亞分画をそれぞれ表し、ピーク４はfTRL亞分画（Ａ）とapoA-I/POPC ディスク分画（Ｂ）をそれぞれ表し、ピーク５はsTRL亞分画（Ａ）とapoA-I/POPC ディスク分画（Ｂ）をそれぞれ表し、ピーク６−７はfLDL亞分画とsLDL亞分画とをそれぞれ表し、ピーク８はvmLDL 亞分画を表している。
【００６２】
図９Ａ（ａ−ｃ）に示すように、健常者、高コレステロール血症 (HC) 患者ならびにHDLD-HTG 患者は、ネーテイブLDL（図８Ｂｂ）、小程度変性されたLDL（図８Ｂｃ）ならびに中程度変性されたLDL（図８Ｂｄ）をそれぞれ有していた。
図９Ａと図９Ｂに示すように、d＞1.019 g/ml 血漿分画をapoA-I/POPC ディスクの存在下に３７℃でインキュベートすると、HDL亞分画（ピーク１−３）とLDL亞分画（ピ−ク６、７）に有意的な変化が生じた。健常者（図９Ｂａ、図９Ａａ）と HC 患者（図９Ｂｂ、図９Ａｂ）のd＞1.019 g/ml 血漿分画をapoA -I/POPC ディスクの存在下にインキュベートすると、fHDL亞分画（ピーク１）とiHDL亞分画（ピーク２）は劇的に減少したが、sHDL亞分画（ピーク３）は劇的に増加した。また、fLDL亞分画は著しく減少したのに対して、sLDL亞分画は増加した（図９Ｂ，Ａ）。このことはapoA-I/POPC ディスクがfLDLとsLDLとを変化させてことを示している。
【００６３】
図９Ｂａと図９Ａａに示すように、HDLD-HTG 患者のd＞1.019 g/ml 血漿分画をapoA-I/POPC ディスクの存在下でインキュベートすると、sHDL亞分画（ピーク３）とapoA-I/POPC ディスク分画（ピーク４）は増加した。一方、vfLDL 亞分画と fLDL 亞分画とは、apoA-I/POPC ディスク不存在下の場合に比べて、著しく減少した。さらに、驚いたことに、apoA-I/POPC ディスク不存在下のd＞1.019 g/ml 血漿分画（図９Ａｃ、ピーク７）では無視できる量しか存在していなかったsLDL亞分画（ピーク７）が、apoA-I/POPC ディスク存在下でインキュベートしたd＞1.019 g/ml 血漿分画（図９Ｂｃ、ピーク７）に発生した。これらの結果は、apoA-I/POPC ディスクが、fLDLとvfLDLとをsLDLに変換して、HDLD-HTG 患者のLDL亞分画の分布を変化させて正常化していることを示している。
【実施例８】
【００６４】
（Bo Zhang, et al., J. Lipid Res.
2007. 48: 1175-1189のFig. ４）
陰性荷電LDLは複数起源から由来していることから、異なる由来のLDL亞分画に対するapoA-I/POPC デイスクの効果を調べた。患者からの試料を実施例１と同様にキャピラリー等速電気泳動をしてリポタンパク質亜分画の分析を行った。その結果を図１０に示す。（Ａ）はapoA-I/POPC デイスク不存在下の全血漿のリポタンパク質亞分画を示し、（Ｂ）はapoA-I 濃度0.8 mg/mlのapoA-I/POPC デイスクの存在下３７℃で９０分間インキュベートした全血漿のリポタンパク質亞分画を示す。（ａ）は酸化LDL抗体 (OxLDL Ab) が増加した患者、（ｂ）はLDL含有血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ (LDL-PAF-AH) が増加した患者、（ｃ）は小型高密度（小型化）LDLが増加した患者、（ｄ）糖尿病患者、（ｅ）血液透析患者からの血漿リポ蛋白プロフィールをそれぞれ示している。
【００６５】
図中、ピーク１−３はfHDL亞分画、iHDL亞分画、sHDL亞分画をそれぞれ表し、ピーク４はfTRL亞分画（Ａ）とapoA-I/POPC デイスク分画（Ｂ）をそれぞれ表し、ピーク５はsTRL亞分画（Ａ）とapoA-I/POPC デイスク分画（Ｂ）をそれぞれ表し、ピーク６−７はfLDL亞分画とsLDL亞分画とをそれぞれ表し、ピーク８はvmLDL 亞分画を表している。
【００６６】
図１０Ａ（ａ−ｅ）に示すように、全ての患者は、健常者（図７Ａ）に比べて、fLDL（ピーク６）が高かった。図１０Ｂと図１０Ａに示すように、患者からの全血漿をapoA-I/POPC デイスク存在下３７℃でインキュベートすると、健常者とHC患者からのd＞1.019 g/ml 血漿分画と同様に変化した。この結果、apoA-I/POPC デイスクはfLDL（ピーク６）を減少させたのに対して、sLDL（ピーク７）を増加させた。また、d＞1.019 g/ml 血漿分画中のピーク４がapoA-I/POPC デイスク分画であることから、TRL亞分画（ピーク４、５）も著しく減少したことを示している（図１０Ｂ、Ａ）。
【実施例９】
【００６７】
（Bo Zhang, et al., J. Lipid Res.
2007. 48: 1175-1189のFig. ５）
ApoA-I/POPCデイスクによるLDLの荷電変化がLDLの粥腫形成性質を減少させることができるかを明らかにするために、LDLの脂質と酵素組成、LDL亞分画の密度分布、LDLの脂質含量ならびにLDL含有血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ (LDL-PAF-AH) 活性に対するapoA-I/POPCデイスクの効果を調べた。
高LDL-PAF-AH 患者からの全血漿を実施例１と同様にキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質の分析を行った結果を図１１に示す。（Ａ）はapoA-I/POPCデイスク不存在下の全血漿のリポタンパク質亞分画を示し、（Ｂ）はapoA-I 濃度 1.2 mg/mlのapoA-I/POPC デイスクの存在下３７℃で９０分間インキュベートした全血漿のリポタンパク質亞分画を示す。（ａ）は全血漿、（ｂ）はd＞1.019 g/ml血漿分画、（ｃ）はd＞1.035 g/ml血漿分画、（ｄ）はd＞1.040 g/ml血漿分画、（ｅ）d＞1.063 g/ml血漿分画をそれぞれ示している。
【００６８】
図中、ピーク１−３はfHDL亞分画、iHDL亞分画、sHDL亞分画をそれぞれ表し、ピーク４はfTRL亞分画（Ａ）とapoA-I/POPC デイスク分画（Ｂ）をそれぞれ表し、ピーク５はsTRL亞分画（Ａ）とapoA-I/POPC デイスク分画（Ｂ）をそれぞれ表し、ピーク６−７はfLDL亞分画とsLDL亞分画とをそれぞれ表し、ピーク８はvmLDL 亞分画を表している。
【００６９】
超遠心分離技法を用いて、lbLDL、idLDLならびにsdLDLサブクラス中のLDL亞分画、LDL分画とlbLDL、idLDLならびにsdLDLサブクラス中の脂質濃度とPAF-AH活性を測定した。アポＢ含有リポタンパク質は、HDLと血漿タンパク質から単離後変性しやすいので、LDL分画とlbLDL、idLDLならびにsdLDLサブクラス中の脂質パラメーターは、これらのリポタンパク質を含んだ血漿分画とかかるリポタンパク質除去血漿分画（HDLと血漿タンパク質は除去してない）とを比較して測定した。
【００７０】
図１１Ａは、高LDL-PAF-AH患者からの全血漿と、同一患者からのd＞1.019 g/ml血漿分画、d＞1.035 g/ml血漿分画、d＞1.040 g/ml血漿分画ならびにd＞1.063 g/ml血漿分画のキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質プロフィールを示している。図１１Ａｂに示すように、全血漿（図１１Ａａ）はTRL分画が除去されているので、d＞1.019 g/ml血漿分画にはHDLとLDLが含まれていた。図１１Ａｃは、全血漿からTRLと大型浮遊性LDLが除去されているので、d＞1.035 g/ml血漿分画は、HDL、idLDLならびにsdLDLを含んでいることを示している。また、d＞1.040 g/ml血漿分画はHDLとsdLDLとを含んであり（図１１Ａｄ）、d＞1.063 g/ml血漿分画はHDLだけを含んでいた（図１１Ａｅ）。
【００７１】
図１１Ｂは、apoA-I/POPC デイスク存在下での培養後の同一高LDL-PAF-AH 患者からの全血漿と、d＞1.019 g/ml血漿分画、d＞1.035 g/ml血漿分画、d＞1.040 g/ml血漿分画ならびにd＞1.063 g/ml血漿分画とのキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質プロフィールを示している。図１１Ａａと図１１Ｂａに示すように、apoA-I/POPC デイスクはリポタンパク質亞分画を有意的に変化させた。図１１Ｂｂには、d＞1.019 g/ml血漿分画中のsLDLが全血漿中のsLDL（図１１Ｂａ）に比べて明らかに減少しているのが示されている。この結果は、全血漿をapoA-I/POPC デイスク存在下でインキュベートすると、sLDLと共に移動する新たな粒子が生成されたことを示している。また、この新粒子はLDLよりも軽かったので、TRL由来である可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
この発明に係るキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分離方法は、リポタンパク質の各成分を効率的に、短時間にかつ再現性よく亞分画することができることから、血液検査などにより病態をより正確に診断できることから、病気の予防や治療をより適切に行うことができる。したがって、この発明は、特に血液検査の分野に利用することができることから、医学の分野、特に疾患の診断ならびに治療に分野に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】血漿中で直接分析したLDL亞分画と超遠心分離によって分離したLDLとの比較を示すキャピラリー等速電気泳動図。
【図２】酸化LDLとLDL荷電との関係を示すアガロス電気泳動の結果および酸化LDLとLDL亜分画の関係を示すキャピラリー等速電気泳動の結果を示す図。
【図３】食後の血漿アポＢ含有リポタンパク亞分画の同定結果を示すキャピラリー等速電気泳動図。
【図４】ボランテイアからの空腹時血漿についてのアポＢ含有リポタンバク質の定量性を示すキャピラリー等速電気泳動図ならびにグラフ。
【図５】キャピラリー等速電気泳動によるアポＢリポタンパク質亜分画と、脂質ならびにリポタンパク質組成との関係を示す図。
【図６】アポＢリポタンパク質亜分画における脂質とアポリポタンパク質組成の関係を示す図。
【図７】RLP-CレベルはTGレベルと密接に関連することが知られているが、RLP-C、TG、fTRL、 sTRLならびにfLDLのレベル間の関係を示す図。
【図８】ヒト血漿中のLDLとインビトロで酸化したLDLとの分布を示すキャピラリー等速電気泳動図。
【図９】apoA-I/POPCディスクの異なる分布のLDL亜分画に対する効果を示すキャピラリー等速電気泳動図。
【図１０】異なる由来のLDL亞分画に対するapoA-I/POPC デイスクの効果を示すキャピラリー等速電気泳動図。
【図１１】高LDL-PAF-AH 患者からの全血漿に対するキャピラリー等速電気泳動によるリポタンパク質分析の結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月10日(2007.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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