(57)【要約】【課題】    ヒトや動物の細胞の増殖の抑制を容易にかつ安価に実施できる方法および薬剤を提供する。【解決手段】    本発明の細胞増殖の抑制方法は、５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる物質の少なくとも一種と、金属および金属化合物から選ばれる物質の少なくとも一種を含むナノ粒子との存在下で細胞を保持する。また、本発明の細胞増殖の抑制剤は、５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる物質の少なくとも一種と、金属および金属化合物から選ばれる物質の少なくとも一種を含むナノ粒子とを含む。細胞を暗所で保持しても細胞増殖の抑制がなされ、光照射なしでも細胞増殖の抑制を行うことができるため、煩雑な光照射や高価な光照射装置を必要とせず、従来の方法より容易にかつ安価に細胞増殖の抑制を行うことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる物質の少なくとも一種と、金属および金属化合物から選ばれる物質の少なくとも一種を含むナノ粒子との存在下で細胞を保持することを特徴とする細胞増殖の抑制方法。
【請求項２】
該金属は貴金属である請求項１に記載の細胞増殖の抑制方法。
【請求項３】
該貴金属は金である請求項２に記載の細胞増殖の抑制方法。
【請求項４】
該ナノ粒子は１００ナノメートル以下の粒子サイズを有する請求項１〜３に記載の細胞増殖の抑制方法。
【請求項５】
前記５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる物質の少なくとも一種は、５−アミノレブリン酸塩酸塩および／または５−アミノレブリン酸メチルエステル塩酸塩である請求項１〜４に記載の細胞増殖の抑制方法。
【請求項６】
５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる物質の少なくとも一種と、金属および金属化合物から選ばれる物質の少なくとも一種を含むナノ粒子と、を含むことを特徴とする細胞増殖の抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる分子と、金属および金属化合物から選ばれる物質の少なくとも一種を含むナノ粒子とを用いて、ヒトや動物の細胞の増殖を抑制する方法およびその薬剤に関する。
【背景技術】  ５−アミノレブリン酸（５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ；５−ＡＬＡ）は、ヒトや動物の細胞において、ビタミンＢ１２やヘム、クロロフィルの前駆物質であるプロトポルフィリン（Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ＩＸ；ＰｐＩＸ）を生合成するための生体物質である。こうした５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる物質として、５−アミノレブリン酸塩酸塩（５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）や５−アミノレブリン酸メチルエステル塩酸塩（５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）などが広く知られている。５−アミノレブリン酸は「５−ＡＬＡ」と表記されることが多いので、以下の説明では、５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる分子について、それらの分子を特に種類を区別しないで呼ぶときには「５−ＡＬＡ族分子」と表記することにする。また、５−アミノレブリン酸塩酸塩および５−アミノレブリン酸メチルエステル塩酸塩は、それぞれ「５−ＡＬＡ−ＨＣｌ」および「５−ＡＬＡ−Ｍｅ」と表記する。
一方、金属および金属化合物から選ばれる物質の少なくとも一種を含むナノ粒子についても、特に種類を区別しないで呼ぶときには「金属含有ナノ粒子」と呼ぶことにする。また、金属のみからなるナノ粒子については「金属」ナノ粒子（「金属」に金属名を当てる）と呼び、金属化合物のみからなるナノ粒子については「金属化合物」ナノ粒子（「金属化合物」に金属化合物の名を当てる）と呼ぶことにする。例えば金よりなる場合、金ナノ粒子と呼ぶことにする。【０００２】  さて、５−ＡＬＡ族分子を細胞に投与することで、その細胞がそれらの物質を細胞内に取り込んでＰｐＩＸを生合成することが知られ、特にガン細胞においては、こうして生合成されたＰｐＩＸが細胞内に多量に蓄積されることが広く知られている（文献例：Ｇａｕｌｌｉｅｒ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７およびＣａｓａｓ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９など）。ＰｐＩＸは光増感剤として働き、光強度の高い光の照射によって細胞毒性（光毒性）を生み出す現象が知られている。この現象をガンの治療に応用したものが光力学治療法で、例えば皮膚がんの治療に適用されている（文献例：Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．２００５、およびＦｏｔｉｎｏｓ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２００６など）。
近年、卵レシチンからなるナノ粒子と５−ＡＬＡ−ＨＣｌが含まれる薬剤を使った光力学療法が報告されている（Ｈｕｒｌｉｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、および米国特許６，５５９，１８３号）。卵レシチンは脂質の一種であり、ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ（水中油性エマルジョン）の形態でナノ粒子が形成されている。この光力学療法では、卵レシチンからなるナノ粒子と５−ＡＬＡ−ＨＣｌが含まれる薬剤を腫瘍に投与し、その薬剤の投与部位に２００ｍＷ／ｃｍ２の光強度をもつ白色光を照射することで光細胞毒性の有為な効果が得られたとされている。また、Ｈｕｒｌｉｍａｎｎらは、卵レシチンからなるナノ粒子と５−ＡＬＡ−ＨＣｌが含まれる薬剤を腫瘍に投与してから６時間後に、その腫瘍部位から強い蛍光が観測されたことを報告している。しかしながら、光照射なしで細胞増殖が抑制されることは報告していない。また、実際に使用された薬剤は１０〜２００ナノメートル（ｎｍ）の様々な粒子サイズをもつナノ粒子を含んでいるものとされており、どの粒子サイズのナノ粒子が細胞増殖の抑制に効果的であるか開示していない上に、１０ｎｍ未満の粒子サイズをもつナノ粒子の効用についても報告していない。【０００３】  一方、ヒト乳がん細胞由来の培養細胞（ＭＣＦ−７）を使って、水中油性エマルジョンと５−ＡＬＡ−ＨＣｌの存在下で１〜４時間細胞が保温されたときの細胞内で生合成されるＰｐＩＸの量に関する研究報告もある（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。Ｎｉｅｌｓｅｎらは、この研究で、細胞に取り込まれた５−ＡＬＡ−ＨＣｌから生合成されるＰｐＩＸの生合成量が促進されたことを報告しているが、細胞増殖が抑制されるかどうかについては報告していない。
他方、Ｚｅｉｓｓｅｒ−Ｌａｂｏｕｅｂｕらは、金ナノ粒子および酸化鉄ナノ粒子は生体に細胞毒性をもたらさないことの報告例を挙げながら、金属製のナノ粒子を使った光力学療法について議論している（Ｚｅｉｓｓｅｒ−Ｌａｂｏｕｅｂｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００６）。この文献で紹介されている報告例は次のものである。フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）に誘導体する分子で被覆された金ナノ粒子を用意し、その金ナノ粒子を投与して光力学療法を行ったときには、光細胞毒性に大きく関わっているとされる一重項酸素が高い量子収率で生成されうることが報告されている（Ｗｉｅｄｅｒ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２００６）。また、ポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）に属する分子で被覆された酸化鉄のナノ粒子を用意し、そのナノ粒子の存在下でＨｅＬａ細胞を５時間保温したときには、ＨｅＬａ細胞は、暗所で生ずる細胞毒性（ｄａｒｋ  ｔｏｘｉｔｙ；以下、暗毒性と称する）を示さなかったことを報告している（Ｇｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００５）。Ｚｅｉｓｓｅｒ−Ｌａｂｏｕｅｂｕらは、光増感剤を備えていないナノ粒子についても議論で取り上げており、例えば１．９ｎｍの粒子サイズをもつ金ナノ粒子がマウスの腫瘍に対して７ｍｇ／ｇの濃度で静脈投与されたとき、検体を致死（ｌｅｔｈａｌｉｔｙ）に至らしめることなく、大部分の金ナノ粒子は尿を通じて細胞外に排出されたことの報告例（Ｈａｉｎｆｅｌｄ  Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，２００４）を紹介している。【０００４】  一方、光増感剤を備えていない金ナノ粒子の細胞毒性について、この報告例の他にも最近になされた研究報告がいくつかある。１．４ｎｍの粒子サイズをもつ金ナノ粒子（Ａｕ５５クラスター）がガン細胞あるいは正常細胞の培養細胞に投与されたときに細胞毒性が示されたという報告がある（Ｔｓｏｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００５）。また、１４ｎｍの粒のサイズをもち、かつ酢酸で安定化された金ナノ粒子が用意され、その金ナノ粒子がヒト繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌｓ）に０．２〜０．８ｍｇ／ｍｌ（ｃａ．１〜４ｍＭ）の濃度で投与されて２〜６日間保持されたときにも細胞毒性が示されたという報告がある（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２００６）。しかしながら、次の報告例で示されているように、比較的低い濃度での金ナノ粒子の投与では細胞毒性を示さないことが報告されている。例えば、１８ｎｍの粒子サイズをもち、かつ酢酸あるいはビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）で安定化された金ナノ粒子が用意され、それらの各金ナノ粒子が白血病のガン細胞の一種（Ｋ５６２  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ）に対して２５０ｍＭまでの濃度で投与されたときにおいては、金ナノ粒子が細胞内に取り込まれても細胞毒性が示されなかったという報告がある（Ｃｏｎｎｏｒ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ，２００５）。また、１４〜１００ｎｍの粒径をもち、かつ酢酸で安定化されたコロイド状の親水性金ナノ粒子が用意され、その金ナノ粒子がＨｅＬａ細胞に対して比較的低濃度で投与（１４ｎｍ、５０ｎｍおよび７４ｎｍの粒径をもつ各金ナノ粒子に対し、それぞれ１．０ｍＭ、２０．０ｍＭ、および１６．０ｍＭの濃度で投与）されたときにおいては、金ナノ粒子が細胞内に取り込まれても細胞毒性が示されなかったという報告がある（Ｃｈｉｔｈｒａｎｉ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００６）。さらには、３．５ｎｍの粒子サイズをもち、かつボロハイドライド（ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）で還元化されたコロイド状の親水性金ナノ粒子が用意され、その金ナノ粒子がマクロファージ細胞の一種に対して１０〜１００ｍＭの濃度で投与されて２４〜７２時間保持されたときにおいても、有為な細胞毒性は示されなかったという報告がある（Ｓｈｕｋｌａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
なお、上記で引用した文献については、下記の説明で引用する文献と併せて次の項に一覧した。
【引用文献】
【０００５】１．Ｎａｎｏ−ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｏｆ  ５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，５５９，１８３
２．Ｃｈｉｔｈｒａｎｉ，Ｂ．Ｄ．；Ｇｈａｚａｎｉ，Ａ．Ａ．；Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．Ｗ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｉｚｅ  ａｎｄ  Ｓｈａｐｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｕｐｔａｋｅ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．６：６６２−６６８；２００６．
３．Ｃｏｎｎｏｒ，Ｅ．Ｅ．；Ｍｗａｍｕｋａ，Ｊ．；Ｇｏｌｅ，Ａ．；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｃ．Ｊ．；Ｗｙａｔｔ，Ｍ．Ｄ．Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ａｒｅ  Ｔａｋｅｎ  Ｕｐ  ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｕｔ  Ｄｏ  Ｎｏｔ  Ｃａｕｓｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．ｓｍａｌｌ  １：３２５−３２７；２００５．
４．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｔ．Ｊ．；Ｇｏｍｅｒ，Ｃ．Ｊ．；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｗ．；Ｊｏｒｉ，Ｇ．；Ｋｅｓｓｅｌ，Ｄ．；Ｋｏｒｂｅｌｉｋ，Ｍ．；Ｍｏａｎ，Ｊ．；Ｐｅｎｇ，Ｑ．ＲＥＶＩＥＷ  Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，９０：８８９−９０５，１９９８．
５．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｒ．Ｆ．；ＭｃＣａｒｒｏｎ  Ｐ．Ａ．；Ｗｏｏｌｆｓｏｎ，Ｄ．；Ｉｎｖｉｔｅｄ  ｒｅｖｉｅｗ，Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎｔｅｎｄｅｄ  ｆｏｒ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．８１：７５０−７６７；２００５．
６．Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｄ．Ｍ．；Ｅｃｋｌ，Ｐ．Ｍ．；Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｂ．Ｄｏｅｓ  δ−ａｍｉｎｏｌａｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ？  Ｐｈｏｔｏｃｈｃｍ．ＰｈｏｔｏｂＩｏｌ．Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，３３：３９−４４；１９９６．
７．Ｆｏｔｉｎｏｓ，Ｎ．；Ｃａｍｐｏ，Ｍ．Ａ．；Ｐｏｐｏｗｙｃｚ，Ｆ．；Ｇｕｒｎｙ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅ，Ｎ．５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．８２：９９４−１０１５；２００６．
８．Ｇｕ，Ｈ．；Ｘｕ，Ｋ．；Ｙａｎｇ，Ｚ．；Ｃｈａｎｇａ，Ｃ．Ｋ．；Ｘｕ，Ｂ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ｄｅｃｏｒａｔｅｄ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ−ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｆｏｒ  ｂｉｍｏｄａｌ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４２７０−４２７２，２００５．
９．Ｈａｉｎｆｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．；Ｓｌａｔｋｉｎ，Ｄ．Ｎ．；Ｓｍｉｌｏｗｉｔｚ，Ｈ．Ｍ．Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４９：Ｎ３０９−Ｎ３１５，２００４．
１０．Ｈａｉｎｆｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．；Ｓｌａｔｋｉｎ，Ｄ．Ｎ．；Ｆｏｃｅｌｌａ，Ｔ．Ｍ．；Ｓｍｉｌｏｗｉｔｚ，Ｈ．Ｍ．Ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ａ  ｎｅｗ  Ｘ−ｒａｙ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ．Ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，７９：２４８−２５３，２００６．
１１．Ｈｕｒｌｉｍａｎｎ，Ａ．Ｆ．；Ｈａｎｇｇｉ，Ｇ．；ａｎｄ  Ｐａｎｉｚｚｏｎ，Ｒ．Ｇ．Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  Ｂａｓａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｏｐｉｃａｌ  ５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎ  ａ  Ｎａｎｏｃｏｌｌｏｉｄ  Ｌｏｔｉｏｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１９７：２４８−２５４；１９９８．
１２．Ｋｎｅｉｐｐ，Ｊ．；Ｋｎｅｉｐｐ，Ｈ．；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．；Ｋｎｅｉｐｐ，Ｋ．Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏａｇｇｒｅｇａｔｅｓ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．６：２２２５−２２３１；２００６．
１３．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．；Ａｅｍｉｓｅｇｇｅｒ，Ｃ．；Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ，Ｇ．；Ｓｃｈｕｃｈｔｅｒ，Ｕ．；Ｇａｎｄｅｒ，Ｂ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｏｉｌ−ｉｎ−Ｗａｔｅｒ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ  ｏｎ  ５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｔｏ  ＰｐＩＸ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ＭＣＦ−７  Ｃｅｌｌｓ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１：２２５３−２２６０；２００４．
１４．Ｐｅｒｎｏｄｅｔ，Ｎ．；Ｆａｎｇ，Ｘ．；Ｓｕｎ，Ｙ．；Ｂａｋｈｔｉｎａ，Ａ．；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ａ．；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｊ．；Ｕｌｍａｎ，Ａ．；Ｒａｆａｉｌｏｖｉｃｈ，Ｍ．Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｉｔｒａｔｅ／Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．ｓｍａｌｌ，２：７６６−７７３；２００６．
１５．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｉ．；Ｓｏｓｔａｒｉｃ，Ｊ．Ｚ．；Ｒｉｅｓｚ，Ｐ．Ｓｏｎｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ−ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ．Ｕｌｔｒａｓｏｕ．Ｓｏｎｏｃｈｅｍ．１１：３４９−３６３；２００４．
１６．Ｓｈｕｋｌａ，Ｒ．；Ｂａｎｓａｌ，Ｖ．；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｍ．；Ｂａｓｕ，Ａ．；Ｂｈｏｎｄｅ，Ｒ．Ｒ．；Ｓａｓｔｒｙ，Ｍ．Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｔｉｃ  ｆａｔｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ：Ａ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２１：１０６４４−１０６５４；２００５．
１７．Ｔｓｏｌｉ，Ｍ．；Ｋｕｈｎ，Ｈ．；Ｂｒａｎｄａｕ，Ｗ．；Ｅｓｃｈｅ，Ｈ．；Ｓｃｈｍｉｄ，Ｇ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ａｕ５５  Ｃｌｕｓｔｅｒｓ．ｓｍａｌｌ  １：８４１−８４４；２００５．
１８．Ｗｉｅｄｅｒ，Ｍ．Ｅ．；Ｈｏｎｅ，Ｄ．Ｃ．；Ｃｏｏｋ，Ｍ．Ｊ．；Ｈａｎｄｓｌｅｙ，Ｍ．Ｍ．；Ｇａｖｒｉｌｏｖｉｃ，Ｊ．；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ａ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ−ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ‘Ｔｒｏｊａｎ  ｈｏｒｓｅ’．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．５：７２７−７３４；２００６．
１９．Ｚｅｉｓｓｅｒ−Ｌａｂｏｕｅｂｕ，Ｍ．；Ｖａｒｇａｓ，Ａ．；Ｄｅｌｉｅ，Ｆ．Ｎｏｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．ｉｎ  Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｋｕｍａｒ，Ｃ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ｋＧａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００６，ｐｐ．４０−８６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  上記のように、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび脂質の一種からなるナノ粒子が含まれる薬剤と、光強度の高い光の照射とを併用しての細胞の増殖を抑制する方法は従来より知られている。しかしながら、２００ｍＷ／ｃｍ２という高い光強度の光を照射することは煩雑な作業である上、このような高強度の光の照射を行うための装置には高価なものが多いため、この方法は必ずしも容易に実施できるものではなかった。また、脂質の一種からなるナノ粒子については、生体の有機物質であるがゆえに、例えば高温多湿の環境条件や長期保存によっては腐食あるいは劣化の恐れがある。それゆえに、従来より知られている５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび脂質の一種からなるナノ粒子が含まれる薬剤については、例えば輸送や保存などにおいてはその品質保持に大きな注意と費用が必要となってくる可能性があり、どんな場所でも手軽に使用できるものとは言えない。【０００７】  他方、金属からなるナノ粒子を用いて細胞の増殖を抑制する方法においても、従来においては十分に抑制できる方法が少なく、抑制可能な方法においても多量のナノ粒子を投与する必要があり、かつその抑制効果が現れるのに例えば２〜６日間かかるというように、時間がかかりすぎるという問題があった。
本発明は、ヒトや動物の細胞の増殖の抑制を、上記の問題が発生することなく実施できる方法および薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  上記課題を解決する本発明の細胞増殖の抑制方法は、次のように大きく分けて三つある。
上記課題を解決する本発明の一つ目の細胞増殖の抑制方法は、５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる分子（５−ＡＬＡ族分子）の少なくとも一種と、金属および金属化合物から選ばれる物質の少なくとも一種を含むナノ粒子（金属含有ナノ粒子）との存在下で細胞を保持することを特徴とする（請求項１）。
本発明によって細胞増殖が抑制されるメカニズムは明らかになっていないが、下記の実施例でも示しているように、細胞を暗所で保持しても細胞増殖の抑制が見られるので、光細胞毒性によってはもたらされていないようである。一つの考え方として、５−ＡＬＡ族分子が、金属含有ナノ粒子との共存によって細胞内に取り込まれやすくなり、細胞内に多量に取り込まれた５−ＡＬＡ族分子が直接あるいは間接的に、あるいはまたＰｐＩＸなどの他の分子に変化して細胞毒性を誘発している可能性が挙げられる。また別の考え方としては、金属含有ナノ粒子が５−ＡＬＡ族分子との共存によって細胞内に取り込まれやすくなり、細胞内に多量に取り込まれた金属含有ナノ粒子が細胞毒性を誘発している可能性も挙げられる。あるいは、５−ＡＬＡ族分子と金属含有ナノ粒子とが互いに結合あるいは付着し合って一体的となり、細胞毒性を誘発している可能性もある。いずれにせよ、５−ＡＬＡ族分子と金属含有ナノ粒子との何らかの協同作用によって細胞に暗毒性（ｄａｒｋ  ｔｏｘｉｔｙ）が誘発されることが考えられる。この暗毒性によって、光照射なしでも細胞の活性が阻害され、細胞増殖が抑制されると考えられる。【０００９】  本発明の細胞増殖の抑制方法によれば、光照射なしでも細胞増殖の抑制を行うことができるため、煩雑な光照射や高価な光照射装置を必要とせず、従来の方法より容易にかつ安価に細胞増殖の抑制を行うことができる。
また、本発明の細胞増殖の抑制方法によれば、正常な細胞であっても、異常なものであっても、その細胞の増殖の抑制することができる。なお、ここで言う異常な細胞とは、悪性腫瘍のガン細胞など病気の原因となる細胞を指し、悪性腫瘍に転ずる恐れのある良性腫瘍の細胞も含まれる。こうした生体内の異常な細胞の増殖を抑制して病気の治療や予防を行うことを目的とするときには、正常な細胞の増殖を抑制しないように実施する必要がある。【００１０】  さらには、金属含有ナノ粒子が、金属および金属化合物から選ばれる物質の少なくとも一種を十分に含むものであれば、例えば高温多湿や乾燥といった生体有機物質が腐食あるいは劣化しやすい環境条件や、長期保存によっても、その金属含有ナノ粒子は腐食あるいは劣化の恐れが少ないものである。それゆえに、本発明の細胞増殖の抑制方法によれば、より多くの環境下でナノ粒子を手軽に使えるようになる。【００１１】  一方、上記課題を解決する本発明の二つ目の細胞増殖の抑制方法は、５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる分子（５−ＡＬＡ族分子）の少なくとも一種と、１０ｎｍ未満の粒子サイズを持つナノ粒子との存在下で細胞を保持することを特徴とする（特許請求せず）。この方法によって細胞増殖が抑制されるメカニズムも明らかになっていないが、ナノ粒子が１０ｎｍ未満の粒径を持つがゆえのナノ粒子のサイズ効果が関与している可能性がある。【００１２】  さらに、上記課題を解決する本発明の三つ目の細胞増殖の抑制方法は、５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる分子（５−ＡＬＡ族分子）の少なくとも一種と、ナノ粒子との存在下で細胞を１２時間以上保持することを特徴とする（特許請求せず）。この方法によって細胞増殖が抑制されるメカニズムも明らかになっていないが、１２時間以上保持するがゆえの保持時間の時間効果が関与している可能性がある。【００１３】  一方、上記課題を解決する本発明の細胞増殖の抑制剤は、次のように大きく分けて二つある。
上記課題を解決する本発明の一つ目の細胞増殖の抑制剤は、５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる分子（５−ＡＬＡ族分子）の少なくとも一種と、金属および金属化合物から選ばれる物質の少なくとも一種を含むナノ粒子（金属含有ナノ粒子）と、を含むことを特徴とする（請求項６）。【００１４】  本発明の細胞増殖の抑制剤は、上記本発明の細胞増殖の抑制方法のいずれにも用いることができるが、特に、請求項１に記載の細胞増殖の抑制方法に適したものである。
また、金属含有ナノ粒子は、金属および金属化合物から選ばれる物質の少なくとも一種を十分に含むものであれば、上述のように例えば高温多湿のような生体有機物質が腐食あるいは劣化しやすい条件でも、腐食あるいは劣化の恐れが少ないものである。それゆえに本発明の細胞増殖の抑制剤は、輸送や保存などにおける品質保持に大きな注意と費用を払う必要がなくなり、どんな場所でも手軽に使用できる。【００１５】  上記課題を解決する本発明の二つ目の細胞増殖の抑制剤は、５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる分子（５−ＡＬＡ族分子）の少なくとも一種と、１０ｎｍ未満の粒子サイズを持つナノ粒子と、を含むことを特徴とする（特許請求せず）。
本発明の細胞増殖の抑制剤は、上記二つ目および三つ目の本発明の細胞増殖の抑制方法に用いることができるが、特に二つ目の本発明の細胞増殖の抑制方法に適したものである。
【発明の効果】
【００１６】  本発明の細胞増殖の抑制方法および抑制剤によれば、ヒトや動物のガン細胞の増殖を抑制することができるため、ヒトや動物のガン治療を行うことができる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】  上記課題を解決するための手段に示した本発明の三つの細胞増殖の抑制方法および二つの細胞増殖の抑制剤の実施態様について以下に順次説明する。
本発明の一つ目の細胞増殖の抑制方法（請求項１）では、５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる分子（５−ＡＬＡ族分子）の少なくとも一種と、金属および金属化合物から選ばれる物質の少なくとも一種を含むナノ粒子（金属含有ナノ粒子）との存在下で細胞を保持する。この細胞増殖の抑制方法は、５−ＡＬＡ族分子と金属含有ナノ粒子とを細胞に投与した後、これらの物質の存在下で所定の時間、細胞を保持することにより実施することができる。ここで、細胞が生合成した５−ＡＬＡを利用することも考えられなくはないが、この方法により細胞増殖の抑制作用を得るのに十分な量の５−ＡＬＡを得ることは難しく、人為的に５−ＡＬＡ族分子を投与する方が容易に実施することができるので望ましい手法である。【００１８】｛５−アミノレブリン酸類およびその塩から選ばれる分子（５−ＡＬＡ族分子）｝
本発明において、５−ＡＬＡ族分子は、製薬上許容されるものであれば、特に限定されるものではない。また、５−アミノレブリン酸類の塩は、有機酸または無機酸の酸付加塩であることが好ましく、例えば塩酸塩が挙げられる。この塩酸塩として、５−アミノレブリン酸塩酸塩（５−ＡＬＡ−ＨＣｌ）および／または５−アミノレブリン酸メチルエステル塩酸塩（５−ＡＬＡ−Ｍｅ）を用いることができる。これらの塩酸塩は、高濃度で用いない限りは生体には無害とされているため、取り扱いが容易である。また、５−ＡＬＡ−Ｍｅは、５−ＡＬＡ−ＨＣｌに比べて溶質のｐＨの値を大きく変化させないという利点をもつ。本発明においては５−ＡＬＡ族分子を一種類だけ用いてもよいし、二種類以上用いてもよい。二種類以上の５−ＡＬＡ族分子を用いるときには、それらを同時に用いてもよいし、異なった時に別々に用いてもよい。【００１９】  本発明で用いる５−ＡＬＡ族分子は、いかなる濃度で用いてもよいが、例えば５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび／または５−ＡＬＡ−Ｍｅを用いる場合には２．５〜１０ｍＭの濃度で用いることが望ましい。２．５ｍＭ未満の濃度では、細胞増殖を十分に抑制することができない恐れがある。一方、１０ｍＭを超える濃度では、単独で細胞に毒性を与えてしまう恐れがあり、取り扱いが難しくなる可能性がある。【００２０】｛金属含有ナノ粒子｝
金属および金属化合物から選ばれる物質は、遷移金属、遷移金属の酸化物、遷移金属の窒化物、および遷移金属の硫化物の少なくとも一種から選択することができる。特に、貴金属を含む金属含有ナノ粒子を用いることが好ましい。貴金属としては、例えば、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、ロジウム（Ｒｈ）、ルテニウム（Ｒｕ）、パラジウム（Ｐｄ）、およびイリジウム（Ｉｒ）が挙げられる。貴金属は化学的安定性に極めて優れるため、貴金属を十分に含む金属含有ナノ粒子は、例えば、有害な細菌の滅菌のため高温加熱処理されたり、塩酸や５−ＡＬＡ−ＨＣｌなどの強酸に曝さらされたり、生体有機分子を分解してしまう酵素に曝されたり、あるいは長期保存されても、その化学的安定性が大きく低下する恐れは少ないものである。【００２１】  上述の従来までの研究報告によれば、金ナノ粒子は大量投与しなければ生体に重大な細胞毒性を与えないため、本発明の細胞増殖の抑制方法において、金ナノ粒子を用いれば、ヒトや動物のガン治療に応用できる可能性がある。そのガン治療の候補として、皮膚ガン、乳ガンおよび白血病が挙げられる。また、本発明は暗所でも細胞増殖の抑制を行うことができるため、光照射が困難な皮下のガン治療に適用できる可能性がある。特に、金ナノ粒子は強い酸性に曝さらされたり、生体有機分子を分解してしまう酵素に曝されても、劣化したり分解したりすることがないため、胃ガンなど消化器官のガン治療にも適用できる可能性がある。【００２２】  さらには、最近、金ナノ粒子がＸ線造影剤としての利用の可能性を示す報告がある（Ｈａｉｎｆｅｌｄ  Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，２００６）。本発明の細胞増殖の抑制方法で用いるナノ粒子は、このようにＸ線などを使って視覚的に検出できる可能性があるため、ガンなどの治療を目的としてこのナノ粒子を患部に投与した後においては、金属含有ナノ粒子の追跡を可能にしうるものである。【００２３】  また、上記の遷移金属の酸化物としては、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化銅（ＣｕＯ）、および酸化チタン（ＴｉＯ２）が挙げられ、さらには酸化シリコン（ＳｉＯ２）であってもよい。さらには、このナノ粒子は、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、あるいはＣｄＴｅなどの金属化合物半導体よりなるものであってもよく、いわゆる量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）であってもよい。【００２４】  ところで、本発明で用いる金属含有ナノ粒子は、金属および金属化合物から選ばれる物質をナノ粒子の少なくとも表面に有するものとすることができる。さらには、ナノ粒子は、金属および金属化合物から選ばれる物質がナノ粒子の表面を層状に覆うものとしたものであってもよい。また、本発明で用いる金属含有ナノ粒子は、金属および金属化合物から選ばれる物質から完全になるものであってもよい。この場合には、金属含有ナノ粒子を「金属」ナノ粒子または「金属化合物」ナノ粒子と言い換えることは前に述べた。本発明で用いる金属含有ナノ粒子は、金属および金属化合物から選ばれる物質の他に、他の無機物や有機物を含むものであってもよい。【００２５】  本発明で用いる金属含有ナノ粒子は、親水性コロイドおよび疎水性コロイドのいずれであって��よいが、親水性コロイドである方が好ましい。あるいはクラスターであってもよい。
本発明で用いる金属含有ナノ粒子は、いかなる形状をもつものであってもよい。例えば、球状、多角体、柱状、棒状のものが挙げられるが、特に球状のナノ粒子が好ましい。【００２６】  本発明で用いる金属含有ナノ粒子は、いかなるサイズをもつものであってもよい。例えば球状の金属含有ナノ粒子を用いる場合には、１００ｎｍ以下の粒径をもつことが好ましく、さらには１７ｎｍ以下の粒径をもつことが望ましい。
本発明で用いる金属含有ナノ粒子は、いかなる濃度で用いてもよいが、１７〜１００ｎｍの粒径の球状の金ナノ粒子を用いる場合には２．２μＭ以上の濃度で用いることが好ましい。また、５ｎｍの粒径の球状の金ナノ粒子を用いる場合には１．４μＭ以上の濃度で用いることが好ましい。【００２７】  本発明で用いる金属含有ナノ粒子は、特定の細胞に結合または付着したり、あるいは取り込まれたりすることのできる標的物質を含むものであってもよい。この特定の細胞としては、ガン細胞のように病気や傷害の原因となる細胞が挙げられる。一方、標的物質としては、アミノ酸やタンパク質、脂質などの生体物質が好ましく、特に抗体を挙げることができる。
金属含有ナノ粒子は、こうした標的物質を粒子表面に結合または付着させて持つことが好ましい。特に、ガン細胞に特異的に結合できる抗体や、ガン細胞に特異的に取り込まれる標的物質を粒子表面にもつ金属含有ナノ粒子を用いれば、正常細胞とガン細胞が混在している組織に投与しても、この金属含有ナノ粒子はガン細胞の方に集まり、正常細胞の方には集まらないようにすることができる。ガン細胞の方に集まった金属含有ナノ粒子は、５−アミノレブリン酸類およびその塩の少なくとも一種との協同作用によって、ガン細胞を選択的に死滅させたりして、ガン細胞の増殖を抑制することができる。【００２８】  金属含有ナノ粒子は、上記の標的物質を介在物質を介在させて間接的に含むものであってもよい。この介在物質は、金属含有ナノ粒子と標的物質とを結びつけるリンカー様の物質であってもよいし、あるいは、金属含有ナノ粒子の表面に層状にコートされたコーティング物質であってもよい。このコーティング物質に上記の標的を含ませることができ、例えば、このコート物質の表面に結合または付着させたものが挙げられる。これらの介在物質として、標的物質が細胞に結合または取り込まれた後に分解あるいは洗い流されたりすることの可能なものを用いれば、標的物質によって細胞に一旦結合あるいは取り込ませた金属含有ナノ粒子を再び細胞から遊離させることができるようになり、金属含有ナノ粒子の運動の自由度を高めることができる。【００２９】  例えば、正常細胞とガン細胞が混在している組織に対して、先に、ガン細胞に特異的に結合できる抗体や、ガン細胞に特異的に取り込まれる標的物質を粒子表面にもつ金属含有ナノ粒子を投与し、金属含有ナノ粒子がガン細胞の方に集まったところを見計らって、５−ＡＬＡ族分子を投与する。これにより、ガン細胞は５−ＡＬＡ族分子および金属含有ナノ粒子の両方の存在下に置かれる。この状態を所定の時間保持することにより、ガン細胞を選択的に死滅させたりして、ガン細胞の増殖を抑制することができる。このとき、正常細胞の方には金属含有ナノ粒子が希薄なため、５−ＡＬＡ族分子が侵入してきても細胞増殖の抑制作用を受けない。【００３０】  本発明で用いる金属含有ナノ粒子は、５−ＡＬＡ族分子の少なくとも一種を含むものであってもよい。特に、金属含有ナノ粒子の表面に５−ＡＬＡ族分子が結合または付着しているものが好ましい。
金属含有ナノ粒子は、５−ＡＬＡ族分子の少なくとも一種を、介在物質を介在させて間接的に含むものであってもよい。この介在物質は、金属含有ナノ粒子と５−ＡＬＡ族分子とを結びつけるリンカー様の物質であってもよいし、あるいは、金属含有ナノ粒子の表面に層状にコートされたコーティング物質であってもよい。このコーティング物質に５−ＡＬＡ族分子を含ませることができ、例えば、このコート物質の表面に結合または付着させたものが挙げられる。【００３１】  さらには、本発明で用いる金属含有ナノ粒子は、５−ＡＬＡ族分子とともに、上記の標的物質を含むことがさらに好ましく、これら双方の物質を上述のように粒子表面に直接的または間接的に結合または付着させているものが望ましい。【００３２】  また、本発明で用いる金属含有ナノ粒子は、金属および金属化合物から選ばれる物質を含むナノ粒子（本体粒子）と、その本体粒子の内部および／または表面部に有する粒子（副粒子）と、からなるものであってもよい。この副粒子は、金属および金属化合物から選ばれる物質を含むものであってもよいし、あるいは金属および金属化合物から選ばれる物質を含まないものであってもよい。前者の副粒子は、金属および金属化合物の他に含む物質はいかなるものであってよく、後者の副粒子は、いかなる物質からなるものであってもよい。副粒子は、いかなる形状をもつものであってもよく、さらにはいかなる粒子サイズをもつものであってもよい。また、本体粒子の表面部に副粒子をもたせる場合、副粒子は本体粒子に結合および／または付着しているものであってもよい。【００３３】｛細胞｝
本発明は、ヒトおよび動物のいかなる細胞にも適用できる。すでに上述したように、その細胞は、正常なものであっても、異常なものであってもよいが、特に悪性腫瘍のガン細胞であることが好ましい。
また、本発明の細胞増殖の抑制方法は、学術的な試験または研究に用いられる培養細胞にも適用することもできる。こうした培養細胞として、例えばＨＬ−６０やＨＬ−５２５と言ったヒトの白血病のガン細胞や、ＭＣＦ−７と言ったヒトの乳ガン細胞、１５２２と言ったヒトの正常繊維芽細胞が挙げられる。こうした培養細胞の増殖を抑えたり、あるいは廃棄処分するときなどに、本発明は有用である。【００３４】｛５−ＡＬＡ族分子および金属含有ナノ粒子の投与方法｝
５−ＡＬＡ族分子および金属含有ナノ粒子を細胞に投与する方法について説明する。増殖を抑制する細胞に対して５−ＡＬＡ族分子を投与するとき、５−ＡＬＡ族分子は化学的にいかなる状態にあってもよく、例えば、液、粘性物、固形物（粉末）が挙げられる。５−ＡＬＡ族分子の投与は、いかなる方法によってもよく、例えば、５−ＡＬＡ族分子を含む溶液を投与するときには、ピペッティング、注射、および塗布などによって投与することができる。また、５−ＡＬＡ族分子を含む粘性物を投与するときには塗布によって投与することができる。【００３５】  一方、増殖を抑制する細胞に対して金属含有ナノ粒子を投与するとき、金属含有ナノ粒子についても化学的にいかなる状態にあってもよく、例えば、溶、粘性物、固形物（粉末）が挙げられる。この金属含有ナノ粒子の投与は、いかなる方法によってもよく、例えば、金属含有ナノ粒子を含む溶液を投与するときには、ピペッティング、注射、および塗布などによって投与することができる。また、金属含有ナノ粒子を含む粘性物を投与するときには塗布によって投与することができる。また、金属含有ナノ粒子は、投与されるときには、いかなる化学物質で安定化されていてもよい。例えば、金ナノ粒子が投与されるときには、金ナノ粒子は酢酸で安定化されていることが好ましい。【００３６】  ５−ＡＬＡ族分子および金属含有ナノ粒子は、同時に投与してもよいし、別々に投与してもよい。また、５−ＡＬＡ族分子を金属含有ナノ粒子より先に投与してもよいし、金属含有ナノ粒子を５−ＡＬＡ族分子より先に投与してもよい。
本発明では、５−ＡＬＡ族分子および金属含有ナノ粒子が細胞に投与されるとき、その細胞はいかなる条件にあってもよい。例えば、細胞の温度は、いかなる温度であってもよく、ｐＨの値もいかなる値であってもよい。また、細胞は、有酸素性および嫌気性の雰囲気のいずれの雰囲気の下にあってもよく、また二酸化炭素が豊富に含まれる雰囲気の下にあってもよい。さらには、細胞は、光の下にあってもよいし、暗所にあってもよい。【００３７】｛細胞の保持方法｝
本発明の細胞増殖の抑制方法では、５−ＡＬＡ族分子と金属含有ナノ粒子との存在下で細胞を保持するとき、いかなる条件で保持してもよい。
このとき、細胞の保持温度はいかなる温度でもよく、５−ＡＬＡ族分子および／または金属含有ナノ粒子が存在しない条件で細胞がよく増殖できる温度で保持することができる。この保持温度は、細胞の種類に応じて適切に選択することができる。例えばヒトの細胞であれば、３７℃およびその周辺の温度とすることができる。【００３８】  また、細胞の保持は、いかなるｐＨの値で行ってもよい。また、細胞の保持は、有酸素性および嫌気性の雰囲気のいずれの雰囲気の下で行ってもよく、また二酸化炭素が豊富に含まれる雰囲気の下で行ってもよい。さらには、細胞の保持は、光の下で行ってもよいし、暗所で行ってもよい。
細胞の保持時間は、いかなる時間で行ってもよく、５−ＡＬＡ族分子および／または金属含有ナノ粒子が存在しない条件で細胞がよく増殖できる時間で保持することができる。この保持時間は、細胞の種類に応じて適切に選択することができる。【００３９】｛光力学療法または超音波力学療法との併用｝
本発明の細胞増殖の抑制方法では、５−ＡＬＡ族分子および金属含有ナノ粒子の存在下で細胞を保持している間においては、金属含有ナノ粒子の作用の有無に関係なく、投与した５−ＡＬＡ族分子の一部が細胞内に取り込まれてＰｐＩＸが生合成されていると考えられる。従来技術の項でも述べたように、対象となる細胞がガン細胞であれば、こうして生合成されたＰｐＩＸは細胞内に蓄積されると考えられる。ＰｐＩＸは、可視光または紫外線の照射によって光毒性をガン細胞に誘発する光増感剤でもあることが知られており、こうした効果が光力学療法で応用されていることはすでに述べた。
そこで、本発明では、５−ＡＬＡ族分子および金属含有ナノ粒子の存在下でガン細胞を保持している間および／またはその後、可視光および／または紫外線を照射してもよい。この可視光および／または紫外線の照射によってガン細胞に光毒性を誘発させることができる。本手段によれば、本来、５−ＡＬＡ族分子および金属含有ナノ粒子の何らかの協同作用によって細胞に暗毒性が誘発されるが、これに可視光および／または紫外線の照射による光毒性が加わることによって、細胞の増殖がさらに抑制される。【００４０】  本手段で用いる可視光および紫外線の少なくとも一方は、いかなる波長をもつものであってよく、かつ、いかなる光強度（光量子数）をもつものであってよい。特に赤色光は、生体の皮下の光が届きにくい場所にも届きやすいことが知られている。そのため、上記可視光として赤色光を用いれば、生体の皮下の光が届きにくい患部にあるガン細胞の増殖を効果的に抑制することができる。また、ＰｐＩＸは、６３０〜６４０ｎｍの範囲の波長を有する赤色光を効率的に吸収できることが知られている。そこで、本手段で６３０〜６４０ｎｍの範囲の波長を有する赤色光を用いれば、ガン細胞の増殖をより一層効果的に抑制することができる。【００４１】  さらに、ＰｐＩＸは、超音波の照射によってある種の毒性をガン細胞に誘発する増感剤でもあることが知られており、こうした効果を超音波力学療法へ応用する試みがなされている（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，２００４）。そこで、本発明では、５−ＡＬＡ族分子および金属含有ナノ粒子の存在下でガン細胞を保持している間および／またはその後、超音波を照射してもよい。本手段によれば、本来、５−ＡＬＡ族分子および金属含有ナノ粒子の何らかの協同作用によって細胞に暗毒性が誘発されるが、これに超音波によって誘発される毒性が加わることによって、細胞の増殖がさらに抑制される。本手段で用いる超音波は、いかなる周波数をもつものであってよく、かつ、いかなる超音波強度をもつものであってよい。【００４２】｛本発明の二つ目の細胞増殖の抑制方法｝
本発明では、５−ＡＬＡ族分子の少なくとも一種と、１０ｎｍ未満の粒子サイズを持つナノ粒子との存在下で細胞を保持する。この細胞増殖の抑制方法は、５−ＡＬＡ族分子の少なくとも一種と、１０ｎｍ未満の粒子サイズを持つナノ粒子とを細胞に投与した後、これらの物質の存在下で所定の時間、細胞を保持することにより実施することができる。本発明で用いるナノ粒子は、特に５ｎｍの粒子サイズを持つことが好ましい。【００４３】  下記の実施例でも述べるように、本発明において、５ｎｍの粒子サイズを持つナノ粒子を用いれば、細胞増殖が極めて著しく抑制されることが見いだされた。また、１７ｎｍの粒子サイズを持つナノ粒子を用いた場合には、５ｎｍの粒子サイズを持つナノ粒子には及ばずとも細胞増殖が著しく抑制されることも見いだされた。これらのことから、１０ｎｍ未満の粒子サイズを持つナノ粒子を用いれば、細胞増殖が著しく抑制されることは高い確率で予測することができる。【００４４】  本発明で用いるナノ粒子は、無機物および有機物を問わず、いかなる物質からなるものであってもよい。例えば、本発明の一つ目の細胞増殖の抑制方法で述べたものと同じ金属含有ナノ粒子を用いることができるが、特に金ナノ粒子を用いれば、ヒトや動物のガン治療に応用できる可能性がある。また、本発明で用いるナノ粒子は、ダイヤモンド、フラーレン（ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ）、カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）であってもよい。
本発明は、このような材質をもち、かつ１０ｎｍ未満の粒子サイズを持つナノ粒子を用いる他は、本発明の一つ目の細胞増殖の抑制方法と同様にして実施することができる。【００４５】｛本発明の三つ目の細胞増殖の抑制方法｝
本発明では、５−ＡＬＡ族分子の少なくとも一種と、ナノ粒子との存在下で細胞を１２時間以上保持する。この細胞増殖の抑制方法は、５−ＡＬＡ族分子の少なくとも一種とナノ粒子とを細胞に投与した後、これらの物質の存在下で細胞を１２時間以上保持することにより実施することができる。【００４６】  本発明で用いるナノ粒子は、無機物および有機物を問わず、いかなる物質からなるものであってもよい。例えば、本発明の一つ目あるいは二つ目の細胞増殖の抑制方法で述べたナノ粒子を用いることができるが、特に金が含まれるナノ粒子を用いれば、ヒトや動物のガン治療に応用できる可能性がある。
本発明は、このような材質を持つナノ粒子を用い、かつ細胞を１２時間以上保持する他は、本発明の一つ目の細胞増殖の抑制方法と同様にして実施することができる。【００４７】｛本発明の一つ目の細胞増殖の抑制剤（請求項６）｝
本発明の細胞増殖の抑制剤は、５−ＡＬＡ族分子の少なくとも一種と、金属および金属化合物から選ばれる物質の少なくとも一種を含むナノ粒子（金属含有ナノ粒子）と、を含むものである。５−ＡＬＡ族分子の少なくとも一種は、本発明の一つ目の細胞増殖の抑制方法で用いるものと同じものとすることができる。また、金属含有ナノ粒子についても、本発明の一つ目の細胞増殖の抑制方法で用いる金属含有ナノ粒子と同じものとすることができる。
本発明の細胞増殖の抑制剤は、５−ＡＬＡ族分子および金属含有ナノ粒子のみからなるものであってもよいし、あるいはこれらの物質の他に別の物質を含むものであってもよい。【００４８】  本発明の細胞増殖の抑制剤は、液、粘性物、および固形物のいずれであってもよい。液であれば、水性液および油性液のいずれであってもよい。この液においては、５−ＡＬＡ族分子はいかなる濃度をもってもよいし、金属含有ナノ粒子もいかなる濃度をもってもよい。５−ＡＬＡ−ＨＣｌや５−ＡＬＡ−Ｍｅを用いる場合、これらの塩は水溶性であるため、水溶液として調製することができる。一方、粘性物であれば、水性の粘性物であってもよいし、油性の粘性物であってもよい。また、その粘性物は、いかなる粘度を有するものであってよい。他方、固形物であれば、ブロック状あるいは粉末状のいずれにあってもよい。【００４９】  本発明の細胞増殖の抑制剤は、いかなる方法によって調製してもよい。例えば、本発明の細胞増殖の抑制剤を水性液として調製する方法としては、５−ＡＬＡ族分子を含む水溶液と、金属および金属化合物から選ばれる物質の少なくとも一種を含む水性液とを混合する調製方法が挙げられる。
本発明は、ヒトや動物のガンなどの治療を目的とした薬剤として用いることの可能性をもつ。この薬剤は、水薬、丸薬、錠剤、カプセル、および軟膏のいずれのタイプのものであってもよい。【００５０】｛本発明の二つ目の細胞増殖の抑制剤｝
本発明の細胞増殖の抑制剤は、５−ＡＬＡ族分子の少なくとも一種と、１０ｎｍ未満の粒子サイズを持つナノ粒子と、を含むものである。５−ＡＬＡ族分子の少なくとも一種は、本発明の一つ目の細胞増殖の抑制方法で用いるものと同じものとすることができる。一方、１０ｎｍ未満の粒子サイズを持つナノ粒子については、本発明の二つ目の細胞増殖の抑制方法で用いるナノ粒子と同じものとすることができる。
本発明の細胞増殖の抑制剤は、５−ＡＬＡ族分子および１０ｎｍ未満の粒径を持つナノ粒子のみからなるものであってもよいし、あるいはこれらの物質の他に別の物質を含むものであってもよい。
本発明は、このような材質をもち、かつ１０ｎｍ未満の粒子サイズを持つナノ粒子を含む他は、本発明の一つ目の細胞増殖の抑制剤と同様にして実施することができる。
【実施例】
【００５１】  本発明の実施の形態を実施例によってさらに詳細に説明する。
｛実施例１−１｝
本実施例では、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、粒径の異なる５種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍ）の各金ナノ粒子との存在下でヒト白血病ガン細胞由来の培養細胞（ＨＬ−６０）を２３時間保持した。
粉末状の５−ＡＬＡ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を水に溶かして、１Ｍの濃度の５−ＡＬＡ−ＨＣｌの水溶液を調製した。一方、金ナノ粒子は、完全に金よりなるものであり、球状である。ここでは、金ナノ粒子がクエン酸バッファで安定化されて親水性のコロイドとして分散した状態にある金クエン酸コロイド液（田中貴金属工業）を用いた。本実施例で用いた金クエン酸コロイド液は、表１に示したように、５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍのいずれかの粒径の金ナノ粒子を狭い粒度分布で含有する５種類である。各金クエン酸コロイド液のｐＨ、および各金クエン酸コロイド液に含まれる金ナノ粒子の含有濃度を表１に併せて示した。【００５２】
【表１】
2009062351.tif 000003
【００５３】  ＨＬ−６０細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）は、１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０液体培地で継体および培養した。ここで用いたＨＬ−６０細胞の細胞数は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれた雰囲気下で、２３±１時間（時間±ＳＥＭ）毎に２倍に増えるものである。細胞を回収して１０％のウシ胎仔血清を含む新鮮なＲＰＭＩ  １６４０液体培地で再懸濁した。２４穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５２４）を用意し、各穴に９９０μｌの細胞懸濁液を分注した。そのうちの５穴に分注された細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、金ナノ粒子の粒径が異なる上記５種類の金クエン酸コロイド液をそれぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。これらの細胞サンプルは、５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。【００５４】  また、５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むが金ナノ粒子を含まない比較用の細胞サンプルを調製するために、別の２穴の細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加えて直ぐさま、一方には１１０μｌのクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を加え、別の方には１１０μｌの水を加えた。なお、９９０μｌの細胞懸濁液に対して５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加えたとき、細胞懸濁液のｐＨが７．８から７．０に変化した。また、この５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞懸濁液に金クエン酸コロイド液またはクエン酸バッファを加えたときには、細胞懸濁液のｐＨはほとんど変化しなかった。
一方、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルと同じｐＨをもつ比較用の細胞サンプルを調製するために、他の７穴の細胞懸濁液に対して、約１ＭのＨＣｌ水溶液を５．３μｌ加えた後に、すぐさま、金ナノ粒子の粒径が異なる上記５種類の金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、および水を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。ここで、９９０μｌの細胞懸濁液に対して約１ＭのＨＣｌ水溶液を５．３μｌ加えたとき、細胞懸濁液のｐＨが７．８から７．０に変化した。また、このＨＣｌを加えた細胞懸濁液に、金クエン酸コロイド液またはクエン酸バッファを加えたときには、細胞懸濁液のｐＨはほとんど変化しなかった。【００５５】  他方、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびＨＣｌのいずれも含まない比較用の細胞サンプルを調製するために、他の７穴の細胞懸濁液に対して、金ナノ粒子の粒径が異なる上記５種類の金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、および水を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。なお、５−ＡＬＡ−ＨＣｌもＨＣｌを含まない細胞懸濁液に金クエン酸コロイド液またはクエン酸バッファを加えたときには、細胞懸濁液のｐＨはほとんど変化しなかった。
なお、上記の細胞サンプルの細胞数の濃度は、いずれもおよそ５×１０５個／ｍｌに設定された。この細胞濃度は細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した値である。以下の実施例でも同じである。ここで、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルの調製においては、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光の下において１０分以内で行った。特に、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を含む細胞サンプルは最後に調製したので、薄暗い白色光に曝されていた時間は２、３分程度であった。この薄暗い白色光の強度は、マルチプローブ（ＥＧ＆Ｇ，ｍｏｄｅｌ  ５５０−２）を備えた光強度測定器（ＥＧ＆Ｇ，ｍｏｄｅｌ  ５５０−１）で測定したところ、３．０±０．３×１０−３μＷ／ｃｍ２であった。ＨＣｌを含む細胞サンプル、および５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびＨＣｌのいずれも含まない細胞サンプルの調製についても、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルを調製した条件と同じ条件で行った。【００５６】  以上のようにして調製された細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、２３時間置いた。こうして細胞サンプルおよび比較用細胞サンプルの２３時間のインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートから全ての細胞サンプルを回収した。なお、この細胞回収の作業は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において３０分以内で行った。【００５７】  こうして回収された細胞サンプルの細胞濃度を細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した。なお、この細胞数計測装置では細胞の形を保っているものが計測されるため、生細胞だけでなく、細胞の形を保っている死細胞も計測される。図１Ａに示したように、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金ナノ粒子の少なくとも一方を用いなかった比較用の細胞サンプルではどれも２倍の細胞濃度の増加が見られたが、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルでは、いずれも細胞濃度の増加の割合が２倍より低いものであった。また、これらの細胞サンプルの間で細胞濃度を比較したところ、金ナノ粒子の粒径が小さくなるほど、細胞濃度の増加の割合がより低くなることがわかった。これらの細胞サンプルの中で、特に１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた細胞サンプルは、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金ナノ粒子の少なくとも一方を用いなかった比較用の細胞サンプルの細胞増加に対して、約１５％少ない細胞濃度の増加を示した。また、５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた細胞サンプルは、細胞濃度の増加を全く示さなかった。【００５８】  次に、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルについて、生細胞の濃度をトリパンブルー染色法（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）によって測定した。図１Ｂに示されるように、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金ナノ粒子の少なくとも一方を用いなかった比較用の細胞サンプルでは死細胞は多く観��されなかったが、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜４１ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルでは死細胞が顕著に観察された。一方、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと８２〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルでは、死細胞はそれほど多く観察されなかった。また、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜４１ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルの間で生細胞濃度を比較したところ、金ナノ粒子の粒径が小さくなるほど生細胞濃度が低くなることがわかった。これらの細胞サンプルの中で、特に１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた細胞サンプルは、比較用の細胞サンプルの生細胞濃度に対して約３０％少ない生細胞濃度を示した。また、５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた細胞サンプルは、比較用の細胞サンプルの生細胞濃度に対して約７０％少ない生細胞濃度を示した。【００５９】  さらに、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金ナノ粒子の存在下で保持したことにより細胞に誘発される細胞毒性について、細胞毒性検出試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｆ，Ｄｏｊｉｎｄｏ）および蛍光マイクロプレートリーダー（ＨＴＳ７０００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出した。この細胞毒性検出試薬はＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含むもので、この試薬を用いたアッセイ（以下、ＣＣＫ−Ｆアッセイと呼ぶことにする）は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭが生細胞と反応すると、４８５ｎｍの波長の励起光に対して５３５ｎｍの蛍光を発する蛍光物質に変化する性質を利用したものである。また、ここで用いた蛍光マイクロプレートリーダーは、４８５ｎｍの波長の励起光を通すフィルターと５３５ｎｍの発光を通すフィルターを併用して、９６穴の細胞培養プレートに用意された細胞サンプルに対し、４８５ｎｍの波長の励起光を照射して５３５ｎｍの波長の発光を測定することのできる装置である。【００６０】  上記のＣＣＫ−Ｆアッセイは、細胞サンプルの培地をリン酸バッファ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；ＤＰＢＳ）に置換してからその細胞サンプルを９６穴の細胞培養プレートに移した後、取り扱い説明書に従って実施した。ここでは、細胞サンプルの培地をＤＰＢＳに置換する作業は、遠心操作（１０００ｒｐｍ、５分）によって細胞を沈殿させてから上澄み液を除いてＤＰＢＳを加えるという操作を二度繰り返して実施した。また、このＣＣＫ−Ｆアッセイにおいて、細胞サンプルの培地をＤＰＢＳに置換する作業を始めてから細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えるまでの作業は、極めて薄暗い白色光（９．５×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において１〜２時間以内で行った。細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えてから、室温が保たれた完全な暗所で１時間放置した後、４８５ｎｍの波長の励起光により細胞サンプルから発せられる５３５ｎｍの蛍光の強度を上記の蛍光マイクロプレートリーダーを用いて測定した。なお、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えていない細胞サンプルについても同時にこの蛍光測定を行ったところ、蛍光は全く測定されなかった。【００６１】  図１Ｃに示されるように、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜４１ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持し���細胞サンプルで得られた蛍光強度は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金ナノ粒子の少なくとも一方を用いなかった比較用の細胞サンプルで得られた蛍光強度と比較して明らかに低いことがわかる。一方、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと８２〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルで得られた蛍光強度については、比較用の細胞サンプルで得られた蛍光強度と比較してそれほど低くないことがわかる。この結果は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜４１ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で細胞を保持したことによって、その細胞に暗毒性が顕著に誘発されたことを示すものである。また、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜４１ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルの間で蛍光強度を比較したところ、金ナノ粒子の粒径が小さくなるほど、その蛍光強度が低くなることもわかる。これらの細胞サンプルの中で、特に５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた細胞サンプルは、比較用の細胞サンプルの蛍光強度に対して約５０％少ない蛍光強度を示し、最も低い値を示した。【００６２】  以上の結果から、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を２３時間保持することにより、その細胞の増殖が抑制されることがわかった。また、特に５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いることにより、細胞増殖が最も抑制されることもわかった。【００６３】｛実施例１−２｝
本実施例では、５−ＡＬＡ−ＨＣｌの濃度を２．５ｍＭ、５ｍＭ、および１０ｍＭとした他は、実施例１−１と同様にして、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、粒径が異なる４種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍ）の各金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を保持した。
２４穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５２４）を用意し、各穴に９９０μｌの細胞懸濁液を分注した。そのうちの６穴に分注された細胞懸濁液に対して、２．７５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、金ナノ粒子の粒径が異なる４種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍ）の金クエン酸コロイド液（表１）、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、および水を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。また、別の６穴に分注された細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、粒径の異なる上記４種類の金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、および水を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。さらに、別の６穴に分注された細胞懸濁液に対して、１１μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、粒径の異なる上記４種類の金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、および水を、をそれぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。残る６穴に分注された細胞懸濁液に対しては、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液をそれぞれ加えずに、粒径の異なる上記４種類の金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、および水を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。【００６４】  これらの細胞サンプルは、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを０ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、および１０ｍＭのそれぞれの濃度で含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含む細胞サンプルでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含む細胞サンプルでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。
なお、９９０μｌの細胞懸濁液に対して２．７５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加えたとき、細胞懸濁液のｐＨが７．８から７．２に変化した。また、９９０μｌの細胞懸濁液に対して１１μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加えたとき、細胞懸濁液のｐＨが７．８から６．６に変化した。また、これらの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞懸濁液に金クエン酸コロイド液またはクエン酸バッファを加えたときには、細胞懸濁液のｐＨはほとんど変化しなかった。
上記の細胞サンプルのいずれについても、２３時間の保持の前の細胞数の濃度はおよそ５×１０５個／ｍｌに設定された。ここで、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルの調製において、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において１５分以内で行った。【００６５】  以上のようにして調製された細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、２３時間置いた。こうして細胞サンプルの２３時間のインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートから全ての細胞サンプルを回収した。なお、この細胞回収の作業は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において３０分以内で行った。
こうして回収された細胞サンプルの細胞濃度を細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した。図２に示したように、５−ＡＬＡ−ＨＣｌの濃度を２．５ｍＭまたは１０ｍＭとしたとき、５〜８２ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を含む細胞サンプルの細胞濃度の増加の割合は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌの濃度を５ｍＭとした細胞サンプルと同様に、金ナノ粒子が存在しない比較用の細胞サンプルのものに比べて顕著に低く、細胞増殖が効果的に抑制されたことがわかった。また、５−ＡＬＡ−ＨＣｌの濃度を５ｍＭとしたとき、金ナノ粒子を含む細胞サンプルの細胞濃度の増加が最も大きい度合いで低下することがわかった。この結果から、５−ＡＬＡ−ＨＣｌの濃度は２．５〜１０ｍＭの範囲が好ましく、特に５ｍＭの濃度とすることにより、細胞増殖が最も効果的に抑制されることがわかった。【００６６】｛実施例１−３｝
本実施例では、５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子については１．４μＭから２２μＭの範囲の様々な濃度とし、１７ｎｍ、４１ｎｍまたは８２ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子については２．２μＭから３６μＭの範囲の様々な濃度とした他は、実施例１−１と同様にして、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、粒径の異なる４種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍ）の各金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を保持した。
まず、金ナノ粒子の粒径が異なる４種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍ）の金クエン酸コロイド液（表１）について、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）で金ナノ粒子の含有濃度をそれぞれ１／２、１／４、１／８、および１／１６に希釈したものを用意した。次いで、全部で２４穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５２４）を用意し、各穴に９９０μｌの細胞懸濁液を分注した。そのうちの２０穴の細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、上記４種類の金クエン酸コロイド液、並びにそれらの希釈液（金ナノ粒子の含有濃度を１／２、１／４、１／８、および１／１６に希釈）を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。また、別の２穴に分注された細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、ｐＨの異なる二種類のクエン酸バッファ（ｐＨ３．１およびｐＨ３．３）をそれぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。これらの細胞サンプルは、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを５ｍＭの濃度で含むものである。【００６７】  上記の細胞サンプルおよび比較用細胞サンプルのいずれについても、２３時間の保持の前の細胞数の濃度は、いずれもおおよそ５×１０５個／ｍｌに設定された。ここで、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルの調製においては、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において３０分以内で行った。
以上のようにして調製された細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、２３時間置いた。こうして細胞サンプルの２３時間のインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートから全ての細胞サンプルおよび比較用細胞サンプルを回収した。なお、この細胞回収の作業は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において３０分以内で行った。【００６８】  こうして回収された細胞サンプルの細胞濃度を細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した。図３に示したように、５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子については、１．４μＭから２２μＭの範囲の濃度としたとき、金ナノ粒子を含まない比較用の細胞サンプルに対して細胞濃度の増加の割合が顕著に低くなり、金ナノ粒子の濃度が高くなるほど、細胞濃度の増加の割合がより低くなることがわかった。そして、２２μＭの濃度で細胞濃度の増加の割合が最も低くなり、細胞増殖が最も効果的に抑制されることがわかった。
一方、１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた場合、その金ナノ粒子の濃度が２．２μＭから３６μＭの範囲では、金ナノ粒子を含まない比較用細胞サンプルに対して細胞濃度の増加の割合が顕著に低く、金ナノ粒子の濃度が高くなるほど、細胞濃度の増加の割合が低くなることがわかった。そして、３６μＭの濃度で細胞濃度の増加の割合が最も低くなり、細胞増殖が最も効果的に抑制されることがわかった。
他方、４１ｎｍおよび８２ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた場合においても、その金ナノ粒子の濃度が２．２μＭから３６μＭの範囲では、金ナノ粒子を含まない比較用細胞サンプルに対して細胞濃度の増加の割合が低くなり、金ナノ粒子の濃度が高くなるほど、細胞濃度の増加の割合が低くなった。そして、３６μＭの濃度で細胞濃度の増加の割合が最も低くなり、細胞増殖が最も効果的に抑制されることがわかった。【００６９】｛実施例１−４｝
本実施例では、保持時間を０時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、および２３時間から選択した他は、実施例１−１と同様にして、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、粒径の異なる３種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、および４１ｎｍ）の各金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を保持した。
２４穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５２４）を用意し、各穴に９９０μｌの細胞懸濁液を分注した。そのうちの５穴の細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、金ナノ粒子の粒径が異なる３種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、および４１ｎｍ）の金クエン酸コロイド液（表１）、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、および水を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。これらの細胞サンプルは、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを５ｍＭの濃度で含むものである。また、残る１穴に分注された細胞懸濁液に対して１１０μｌの水を加えた。この細胞サンプルの調製を６枚の細胞培養プレートで行った。
上記の細胞サンプルのいずれについても、保持する前の細胞数の濃度はおよそ５×１０５個／ｍｌに設定された。ここで、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルの調製において、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において、１枚の細胞培養プレートにつき１０分以内で行った。【００７０】  以上のようにして調製された細胞サンプルをもつ６枚の細胞培養プレートのうち５枚を、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、これらの細胞サンプルをこのインキュベータ内にそれぞれ４時間、８時間、１２時間、１８時間、および２３時間置いた。こうして細胞サンプルの各時間のインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートから全ての細胞サンプルを回収した。残り１枚の細胞培養プレートについては、インキュベータ内に移さずに、すぐさま細胞培養プレートから全ての細胞サンプルを回収した。これを０時間の保持を行った細胞サンプルとした。なお、細胞回収の作業は、いずれの細胞培養プレートにおいても、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において、１枚の細胞培養プレートにつき２０分以内で行った。
こうして回収された細胞サンプルの細胞濃度を細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した。図４Ａに示したように、０時間、４時間、および８時間の保持を行った細胞サンプルにおいては、金ナノ粒子を含まない比較用の細胞サンプルに対して細胞濃度の大きな低下は見られなかったが、１２時間、１８時間、および２３時間の保持を行った細胞サンプルにおいて、金ナノ粒子を含まない比較用の細胞サンプルに対して細胞濃度の顕著な低下が見られた。この結果から、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を保持することによって細胞増殖を抑制するには、１２時間以上の保持時間が好ましいことがわかる。【００７１】  この実験とは別に、保持時間を４時間とした他は、実施例１−１と同様にして、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、粒径の異なる５種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍ）の各金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を４時間保持した。
２４穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５２４）を用意し、各穴に９９０μｌの細胞懸濁液を分注した。そのうちの１５穴の細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、金ナノ粒子の粒径が異なる５種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍ）の金クエン酸コロイド液（表１）をそれぞれ３穴の細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。別の４穴の細胞懸濁液に対して、ｐＨの異なる３種類のクエン酸バッファ（ｐＨ３．１、３．３、あるいは６．５）および水をそれぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。これらの細胞サンプルは、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを５ｍＭの濃度で含むものである。また、別の１穴に分注された細胞懸濁液に対しては、１１０μｌの水を加えた。【００７２】  上記の細胞サンプルのいずれについても、保持する前の細胞数の濃度はおよそ５×１０５個／ｍｌに設定された。この細胞濃度は細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した値である。ここで、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルの調製において、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において３０分以内で行った。
以上のようにして調製された細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、４時間置いた。こうして細胞サンプルのインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートから全ての細胞サンプルを回収した。なお、細胞回収の作業は、いずれの細胞培養プレートにおいても、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において３０分以内で行った。【００７３】  こうして回収された細胞サンプルについて、細胞毒性検出試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｆ，Ｄｏｊｉｎｄｏ）および蛍光マイクロプレートリーダー（ＨＴＳ  ７０００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてＣＣＫ−Ｆアッセイを行った。このＣＣＫ−Ｆアッセイは、細胞サンプルの培地をＤＰＢＳに置換してからその細胞サンプルを９６穴の細胞培養プレートに移した後、取り扱い説明書に従って実施した。ここでは、細胞サンプルの培地をＤＰＢＳに置換する作業は、遠心操作（１０００ｒｐｍ、５分）によって細胞を沈殿させてから上澄み液を除いてＤＰＢＳを加えるという操作を二度繰り返して実施した。また、このＣＣＫ−Ｆアッセイにおいて、細胞サンプルの培地をＤＰＢＳに置換する作業を始めてから細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えるまでの作業は、極めて薄暗い白色光（９．５×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において１〜２時間以内で行った。細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えてから、室温が保たれた完全な暗所で１時間放置した後、４８５ｎｍの波長の励起光により細胞サンプルから発せられる５３５ｎｍの蛍光の強度を上記の蛍光マイクロプレートリーダーを用いて測定した。なお、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えていない細胞サンプルについても同時にこの蛍光測定を行ったところ、蛍光は全く測定されなかった。【００７４】  図４Ｂに示されるように、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと１７〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルで得られた蛍光強度は、金ナノ粒子を用いなかった比較用の細胞サンプルで得られた蛍光強度とほとんど同じであることがわかった。一方、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルで得られた蛍光強度については、比較用細胞サンプルで得られた蛍光強度と比較して明らかに低いことがわかる。この結果は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと１７〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で細胞を保持する場合、４時間の保持時間では細胞増殖の抑制は十分になされないことを示している。一方、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと粒径が５ｎｍの金ナノ粒子との存在下で細胞を保持する場合には、４時間の保持時間でも細胞増殖の抑制がなされることを示している。【００７５】｛実施例１−５｝
本実施例では、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、粒径の異なる３種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、および４１ｎｍ）の各金ナノ粒子とを混ぜ合わせてから細胞に投与した他は、実施例１−１と同様にして、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金ナノ粒子の存在下でＨＬ−６０細胞を保持した。
１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と、金ナノ粒子の粒径が異なる３種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、および４１ｎｍ）の金クエン酸コロイド液（表１）の各液とを１：２０の体積比の割合で混合し、室温で１時間放置した。この金クエン酸コロイド液と５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液との混合液は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子を含む細胞増殖の抑制剤である。また、１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液とクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を１：２０の体積比の割合で混合し、室温で１時間放置した。また、１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と水を１：２０の体積比の割合で混合し、室温で１時間放置した。
２４穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５２４）を用意し、各穴に９９０μｌの細胞懸濁液を分注した。そのうちの５穴の細胞懸濁液に対して、上記３種類の５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と金クエン酸コロイド液との混合液、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液とクエン酸バッファとの混合液、および５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と水との混合液を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。【００７６】  一方、別の５穴の細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、上記３種類の金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）および水を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。
上記の細胞サンプルのいずれについても、保持する前の細胞数の濃度は、およそ５×１０５個／ｍｌに設定された。ここで、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルの調製において、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において３０分以内で行った。
以上のようにして調製された細胞サンプルおよび比較用細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、２３時間置いた。こうして細胞サンプルのインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートから全ての細胞サンプルを回収した。なお、細胞回収の作業は、いずれの細胞培養プレートにおいても、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において３０分以内で行った。【００７７】  こうして回収された細胞サンプルの細胞濃度を細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した。図５に示したように、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液とクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）または水とを混合して細胞懸濁液に加えた細胞サンプルにおいては、それらを混合せずに加えた細胞サンプルと同様に２倍の細胞濃度の増加が見られた。
一方、粒径が５ｎｍの金ナノ粒子を用いた場合、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液とその金クエン酸コロイド液とを混合して細胞懸濁液に加えた細胞サンプルにおいては、細胞濃度の増加はほとんど見られなかった。また、その細胞濃度の増加の割合は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と金クエン酸コロイド液とを混合せずに加えた細胞サンプルのものより若干高いものであった。また、これらの細胞サンプルについてトリパンブルー染色法によって得られた生細胞濃度をそれぞれ比較したところ、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と金クエン酸コロイド液とを混合して加えた細胞サンプルの方が、それらをを混合せずに加えた細胞サンプルよりも生細胞濃度が高いことがわかった。【００７８】  また、粒径が１７ｎｍの金ナノ粒子を用いた場合、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液とその金クエン酸コロイド液とを混合して細胞懸濁液に加えた細胞サンプルについても、その細胞濃度の増加の割合は、それらを混合せずに加えた細胞サンプルのものより高いものであった。また、これらの細胞サンプルについてトリパンブルー染色法によって得られた生細胞濃度をそれぞれ比較したところ、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と金クエン酸コロイド液とを混合して加えた細胞サンプルの方が、それらを混合せずに加えた細胞サンプルよりも生細胞濃度が高いことがわかった。
さらに、粒径が４１ｎｍの金ナノ粒子を用いた場合、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と金クエン酸コロイド液とを混合して細胞懸濁液に加えた細胞サンプルについても、その細胞濃度の増加の割合は、それらを混合せずに加えた細胞サンプルのものより高いものであった。また、これらの細胞サンプルについてトリパンブルー染色法によって得られた生細胞濃度をそれぞれ比較したところ、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と金クエン酸コロイド液を混合して加えた細胞サンプルの方が、それらを混合せずに加えた細胞サンプルよりも生細胞濃度が高いことがわかった。【００７９】  これらの結果は、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加えてから金クエン酸コロイド液を加えた方が、それらを混合して加えるよりも細胞を殺す効果が高いことを示している。しかしながら、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と金クエン酸コロイド液とを混合して加える方法でも、粒径が５ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液を用いたときには、細胞増殖が十分に抑制されることがわかった。【００８０】｛実施例２−１｝
本実施例では、５−ＡＬＡ−Ｍｅと、粒径の異なる５種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍ）の各金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を２４時間保持した。
粉末状の５−ＡＬＡ−Ｍｅ（Ｍｅｔｈｙｌ  δ−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を水に溶かして、１Ｍの濃度の５−ＡＬＡ−Ｍｅの水溶液を調製した。２４穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５２４）を用意し、各穴に９９０μｌの細胞懸濁液を分注した。そのうちの５穴に分注された細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、金ナノ粒子の粒径が異なる上記５種類の金クエン酸コロイド液（表１）をそれぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。これらの細胞サンプルは、５ｍＭの５−ＡＬＡ−Ｍｅを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。【００８１】  また、５ｍＭの５−ＡＬＡ−Ｍｅを含むが金ナノ粒子を含まない比較用の細胞サンプルを調製するために、別の２穴の細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液を加えて直ぐさま、一方には１１０μｌのクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を加え、別の方には１１０μｌの水を加えた。なお、９９０μｌの細胞懸濁液に対して５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液を加えたとき、細胞懸濁液のｐＨが７．８から７．０に変化した。また、この５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞懸濁液に金クエン酸コロイド液またはクエン酸バッファを加えたときには、細胞懸濁液のｐＨはほとんど変化しなかった。
一方、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む比較用細胞サンプルを調製するために、他の８穴に分注された細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、金ナノ粒子の粒径が異なる上記６種類の金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、および水を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。【００８２】  なお、上記の細胞サンプルの細胞数の濃度は、いずれもおおよそ５×１０５個／ｍｌに設定された。この細胞濃度は細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した値である。ここで、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−Ｍｅを加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光の下において１０分以内で行った。特に、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよび５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を含む細胞サンプルは最後に調製したので、薄暗い白色光に曝されていた時間は２、３分程度であった。５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む比較用細胞の調製についても、５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む細胞サンプルを調製した条件と同じ条件で行った。
以上のようにして調製された細胞サンプルおよび比較用細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、２４時間置いた。こうして細胞サンプルの２４時間のインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートから全ての細胞サンプルを回収した。なお、この細胞回収の作業は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において３０分以内で行った。【００８３】  こうして回収された細胞サンプルの細胞濃度を細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した。図６に示したように、５−ＡＬＡ−Ｍｅと、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）または水とを加えた細胞サンプルでは１．６倍の細胞濃度の増加が見られた。これらの細胞サンプルに対し、５−ＡＬＡ−Ｍｅと５〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルでは、いずれも１．６倍より低い細胞濃度の増加が見られた。これらのことから、５−ＡＬＡ−Ｍｅと５〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で細胞を保持することにより、５−ＡＬＡ−Ｍｅが存在しても金ナノ粒子が不在下で保持した細胞サンプルに対して、細胞増殖がさらに抑制されることがわかった。また、これらの細胞サンプルの間で細胞濃度を比較したところ、金ナノ粒子の粒径が小さくなるほど、細胞増殖がより一層抑制されることがわかった。これらの細胞サンプルの中で、特に５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた細胞サンプルは、細胞濃度の増加を全く示さなかった。【００８４】｛実施例２−２｝
本実施例では、５−ＡＬＡ−Ｍｅの濃度を２．５ｍＭ、３．７５ｍＭ、および５ｍＭとした他は、実施例２−１と同様にして、５−ＡＬＡ−Ｍｅと、粒径の異なる４種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍ）の各金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を保持した。
２４穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５２４）を用意し、各穴に９９０μｌの細胞懸濁液を分注した。そのうちの６穴に分注された細胞懸濁液に対して、２．７５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、金ナノ粒子の粒径が異なる上記４種類の金クエン酸コロイド液（表１）、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、および水を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。また、別の６穴に分注された細胞懸濁液に対して、４．１μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、金ナノ粒子の粒径が異なる４種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍ）の金クエン酸コロイド液（表１）、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、および水を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。さらに、別の６穴に分注された細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、上記４種類の金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、および水を、をそれぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。残る６穴に分注された細胞懸濁液に対しては、５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液をそれぞれ加えずに、上記４種類の金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、および水を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。【００８５】  これらの細胞サンプルは、５−ＡＬＡ−Ｍｅを０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．７５ｍＭ、および５．５ｍＭのそれぞれの濃度で含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含む細胞サンプルでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含む細胞サンプルでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。
なお、９９０μｌの細胞懸濁液に対して２．７５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液を加えたとき、細胞懸濁液のｐＨが７．９から７．８に変化した。また、９９０μｌの細胞懸濁液に対して４．１μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液を加えたとき、細胞懸濁液のｐＨが７．９から７．７に変化した。また、これらの５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む細胞懸濁液に金クエン酸コロイド液またはクエン酸バッファを加えたときには、細胞懸濁液のｐＨはほとんど変化しなかった。
上記の細胞サンプルのいずれについても、２４時間の保持の前の細胞数の濃度はおよそ５×１０５個／ｍｌに設定された。ここで、５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む細胞サンプルおよびその比較用細胞サンプルの調製においては、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−Ｍｅを加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において１５分以内で行った。【００８６】  以上のようにして調製された細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、２４時間置いた。こうして細胞サンプルの２４時間のインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートから全ての細胞サンプルを回収した。なお、この細胞回収の作業は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において３０分以内で行った。
こうして回収された細胞サンプルの細胞濃度を細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した。図７に示したように、５−ＡＬＡ−Ｍｅを２．５ｍＭまたは３．７５ｍＭの濃度で含む細胞サンプルにおいて、粒径が５〜８２ｎｍの金ナノ粒子を含むものでは、５−ＡＬＡ−Ｍｅを５ｍＭの濃度で含む細胞サンプルと同様に、金ナノ粒子を用いなかった比較用の細胞サンプルに対して、細胞濃度の増加の割合が低くなり、細胞増殖が効果的に抑制されたことがわかった。また、５−ＡＬＡ−Ｍｅの濃度を５ｍＭとしたとき、金ナノ粒子を含む細胞サンプルの細胞濃度の増加が最も大きい度合いで低下することがわかった。
これらの結果から、５−ＡＬＡ−Ｍｅの濃度は２．５〜５ｍＭの範囲が好ましく、特に５ｍＭの濃度とすることにより、細胞増殖が最も効果的に抑制されることがわかった。【００８７】｛実施例２−３｝
本実施例では、５−ＡＬＡ−Ｍｅと、粒径の異なる３種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、および４１ｎｍ）の各金ナノ粒子とを混ぜ合わせてから細胞に投与した他は、実施例１−１と同様にして、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよび金ナノ粒子の存在下でＨＬ−６０細胞を保持した。
１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と、金ナノ粒子の粒径が異なる３種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、および４１ｎｍ）の金クエン酸コロイド液（表１）の各液を１：２０の割合で混合し、室温で１時間、２時間、または３時間放置したものを用意した。この５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と金クエン酸コロイド液の混合液は、５−ＡＬＡ−Ｍｅと金ナノ粒子を含む細胞増殖の抑制剤である。また、１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液とクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を１：２０の割合で混合し、室温で１時間、２時間、または３時間放置したものを用意した。さらに、１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と上記３種類の金クエン酸コロイド液の各液を１：２０の割合で混合し、室温で１時間、２時間、または３時間放置したものを用意した。
２４穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５２４）を用意し、各穴に９９０μｌの細胞懸濁液を分注した。そのうちの５穴の細胞懸濁液に対して、上記の５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と金クエン酸コロイド液との混合液、５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液とクエン酸バッファとの混合液、および５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と金クエン酸コロイド液との混合液を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。【００８８】  一方、１Ｍ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と上記３種類の金クエン酸コロイド液の各液を１：２０の割合で混ぜ合わせてから直ぐさま、この混合液を別の３穴の細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。また、１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と、クエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を１：２０の割合で混ぜ合わせてから直ぐさま、この混合液を別の１穴の細胞懸濁液に１１０μｌ加えた。さらに、１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と、粒径が１７ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液とを１：２０の割合で混ぜ合わせてから直ぐさま、この混合液を別の１穴の細胞懸濁液に１１０μｌ加えた。
他方、別の５穴の細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、上記３種類の金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を、それぞれの細胞懸濁液に１１０μｌずつ加えた。さらに、別の１穴の細胞懸濁液に対して、５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加えて直ぐさま、粒径が１７ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液を１１０μｌ加えた。【００８９】  上記の細胞サンプルのいずれについても、２３時間の保持の前の細胞数の濃度はおよそ５×１０５個／ｍｌに設定された。ここで、５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と金クエン酸コロイド液との混合液を細胞懸濁液に加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において３０分以内で行った。
以上のようにして調製された細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、２３時間置いた。こうして細胞サンプルおよび比較用細胞サンプルの２３時間のインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートから全ての細胞サンプルを回収した。なお、この細胞回収の作業は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において３０分以内で行った。【００９０】  こうして回収された細胞サンプルの細胞濃度を細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した。図８に示したように、粒径が５ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液と５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液とを混合して細胞懸濁液に加えた細胞サンプルの細胞濃度の増加の割合は、それらを混合せずに加えた細胞サンプルのものに比べてわずかに大きくなることがわかった。このことは、３時間以内の放置時間では、混合液の放置時間に影響されないものであることもわかった。また、粒径が４１ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液と５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液とを混合して細胞懸濁液に加えた細胞サンプルの細胞濃度の増加の割合は、それらを混合せずに加えた細胞サンプルのものと比べて大きな違いはなかった。このことは、３時間以内の放置時間では、混合液の放置時間に影響されないものであることもわかった。【００９１】  しかしながら、５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と、粒径が１７ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液との混合液を細胞懸濁液に加えた細胞サンプルについては、１時間以上放置することにより、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液を加えてから粒径が１７ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液を加えた細胞サンプルのものよりも細胞濃度の増加の割合が著しく低くなることがわかった。
これに対し、粒径が１７ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液と５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液とを混合して細胞懸濁液に加えた細胞サンプルの細胞濃度の増加の割合は、それらを混合せずに加えた細胞サンプルのものに比べて大きいものであった。このことは、３時間以内の放置時間では、混合液の放置時間に影響されないものであることもわかった。【００９２】  また、クエン酸バッファ（ｐＨ６．５）と５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液とを混合して細胞懸濁液に加えた細胞サンプルの細胞濃度の増加の割合は、それらを混合せずに加えた細胞サンプルのものと比べて大きな違いはなかった。このことは、３時間以内の放置時間では、混合液の放置時間に影響されないものであることもわかった。
これらの結果から、５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と、粒径が１７ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液とを混合し、その後１時間以上置いたものを細胞懸濁液に加えることにより、細胞増殖をさらに抑制できることがわかった。【００９３】｛実施例３｝
本実施例では、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、粒径の異なる５種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍ）の各金ナノ粒子との存在下でヒト白血病ガン細胞由来の培養細胞（ＨＬ−５２５）を２２時間保持した。
ＨＬ−５２５細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）は、１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０液体培地で培養した。ここで用いたＨＬ−５２５細胞の細胞数は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれた雰囲気下で、２２±１時間（時間±ＳＥＭ）毎に２倍に増えるものである。回収された細胞は、１０％のウシ胎仔血清を含む新鮮なＲＰＭＩ  １６４０液体培地で再懸濁された。【００９４】  粉末状の５−ＡＬＡ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を水に溶かして、１Ｍの濃度の５−ＡＬＡ−ＨＣｌの水溶液を調製した。２４穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５２４）を用意し、各穴に９６０μｌの細胞懸濁液を分注した。そのうちの５穴に分注された細胞懸濁液に対して、６μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液をそれぞれ加えて直ぐさま、金ナノ粒子の粒径が異なる５種類の金クエン酸コロイド液（表１）をそれぞれの細胞懸濁液に２４０μｌずつ加えた。これらの細胞サンプルは、５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは４４μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは７２μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。
また、５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むが金ナノ粒子を含まない比較用の細胞サンプルを調製するために、別の２穴の細胞懸濁液に対して、６μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加えて直ぐさま、一方には２４０μｌのクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を加え、別の方には２４０μｌの水を加えた。【００９５】  なお、上記の細胞サンプルの細胞数の濃度は、いずれも約５×１０５個／ｍｌに設定された。この細胞濃度は細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した値である。ここで、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光の下において１０分以内で行った。特に、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を含む細胞サンプルは最後に調製したので、薄暗い白色光に曝されていた時間は２、３分程度であった。
以上のようにして調製された細胞サンプルおよび比較用細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、２２時間置いた。こうして細胞サンプルの２２時間のインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートから全ての細胞サンプルを回収した。なお、この細胞回収の作業は、極めて薄暗い白色光（３．０×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において３０分以内で行った。【００９６】  こうして回収された細胞サンプルの細胞濃度を細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した。図９に示したように、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）または水とを加えた細胞サンプルでは１．８倍の細胞濃度の増加が見られた。これらの細胞サンプルに対し、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルでは、いずれも１．８倍より低い細胞濃度の増加が見られた。これらのことから、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で細胞を保持することにより、５−ＡＬＡ−ＨＣｌが存在しても金ナノ粒子が不在下で保持した細胞サンプルに対して、細胞増殖がさらに抑制されることがわかった。また、これらの細胞サンプルの間で細胞濃度を比較したところ、金ナノ粒子の粒径が小さくなるほど、細胞濃度の増加の割合がより低くなることがわかった。これらの細胞サンプルの中で、特に１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた細胞サンプルは、金ナノ粒子を用いなかった細胞サンプルの細胞濃度の増加に対して約３０％少ない細胞濃度の増加を示した。また、５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた細胞サンプルは、金ナノ粒子を用いなかった細胞サンプルの細胞濃度の増加に対して約５０％少ない細胞濃度の増加を示した。【００９７】｛実施例４−１｝
本実施例では、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、粒径の異なる５種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍ）の各金ナノ粒子との存在下でヒト乳ガン細胞由来の培養細胞（ＭＣＦ−７）を１９時間保持した。
粉末状の５−ＡＬＡ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を水に溶かして、１Ｍの濃度の５−ＡＬＡ−ＨＣｌの水溶液を調製した。１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を５本のチューブに９９０μｌずつ用意し、それぞれに５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加え、金ナノ粒子の粒径が異なる上記５種類の金クエン酸コロイド液（表１）をそれぞれの液体培地に１１０μｌずつ加えた。これらの５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と金クエン酸コロイド液とが加えられた液体培地は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子を含む細胞増殖の抑制剤である。また、１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を２本のチューブに９９０μｌずつ用意し、それぞれに５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加え、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）または水をそれぞれの液体培地に１１０μｌずつ加えた。これらの液体培地は、５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。【００９８】  上記の５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む液体培地と同じｐＨをもつ液体培地を調製するため、１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を５本のチューブに９９０μｌずつ用意し、それぞれに約１ＭのＨＣｌ水溶液を５．３μｌずつ加え、金ナノ粒子の粒径が異なる上記５種類の金クエン酸コロイド液をそれぞれの液体培地に１１０μｌずつ加えた。また、１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を２本のチューブに９９０μｌずつ用意し、それぞれに５．３μｌの約１Ｍ  ＨＣｌ水溶液を加え、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）または水をそれぞれの液体培地に１１０μｌずつ加えた。
５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびＨＣｌのいずれも含まず金ナノ粒子を含む液体培地を調製するため、１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を５本のチューブに９９０μｌずつ用意し、金ナノ粒子の粒径が異なる上記５種類の金クエン酸コロイド液をそれぞれの液体培地に１１０μｌずつ加えた。また、１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を２本のチューブに９９０μｌずつ用意し、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）または水をそれぞれの液体培地に１１０μｌずつ加えた。【００９９】  ＭＣＦ−７細胞は、１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０液体培地で培養した。ここで用いたＭＣＦ−７細胞の細胞数は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれた雰囲気下で、１８〜２０時間毎に２倍に増えるものである。Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理して浮遊化させた細胞を、フェノールレッドが含まれないＲＰＭＩ  １６４０液体培地に再懸濁し、約４×１０４個／ｍｌの細胞濃度の細胞懸濁液を得た。この細胞濃度は細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した値である。９６穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５９６）を用意し、この細胞懸濁液を各穴に１００μｌずつ分注した。この細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれるインキュベータ内に２４時間置いた。【０１００】  各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除き、それぞれに上記の５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む液体培地、上記のＨＣｌを含む液体培地、並びに、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびＨＣｌのいずれも含まない液体培地を１００μｌずつ加えた。
ここで、上記の５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む液体培地を細胞サンプルに加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光の下において１０分以内で行った。特に、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を含む細胞サンプルは最後に調製したので、薄暗い白色光に曝されていた時間は１分程度であった。ＨＣｌを含む細胞サンプル、並びに５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびＨＣｌのいずれも含まない細胞サンプルの調製についても、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルを調製した条件と同じ条件で行った。【０１０１】  以上のようにして調製された細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、１９時間置いた。こうして細胞サンプルの１９時間のインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートをインキュベータから取り出した。各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除いてＤＰＢＳを１００μｌずつ加えた後、細胞毒性検出試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｆ，Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いたＣＣＫ−Ｆアッセイを取り扱い説明書に従って実施した。このＣＣＫ−Ｆアッセイにおいて、細胞サンプルの培地をＤＰＢＳに置換する作業を始めてから細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えるまでの作業は、極めて薄暗い白色光（９．５×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において２０分以内で行った。細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えてから、室温が保たれた完全な暗所で１時間放置した後、４８５ｎｍの波長の励起光により細胞サンプルから発せられる５３５ｎｍの蛍光の強度を、蛍光マイクロプレートリーダー（ＨＴＳ  ７０００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。なお、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えていない細胞サンプルについても同時にこの蛍光測定を行ったところ、蛍光は全く測定されなかった。【０１０２】  図１０に示されるように、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルで得られた蛍光強度は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金ナノ粒子の少なくとも一方を含まない比較用細胞サンプルで得られた蛍光強度と比較して顕著に低いことがわかる。この結果は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で細胞を保持したことによって、その細胞に暗毒性が顕著に誘発されたことを示すものである。また、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルの間で蛍光強度を比較したところ、金ナノ粒子の粒径が小さくなるほど、その蛍光強度が低くなることもわかる。これらの細胞サンプルの中で、特に１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた細胞サンプルは、比較用の細胞サンプルの蛍光強度に対して約８０％少ない蛍光強度を示した。また、５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた細胞サンプルは、ほとんど蛍光を発しなかった。このことは、細胞がほぼ全て死んでいること示している。
以上の結果から、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下でＭＣＦ−７細胞を２３時間保持することにより、それらの細胞増殖が抑制されることがわかった。また、特に５ｎｍまたは１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いることにより、細胞増殖が極めて効果的に抑制されることもわかった。【０１０３】｛実施例４−２｝
本実施例では、保持時間を０時間、６時間、１２時間、および１８時間から選択した他は、実施例４−１と同様にして、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、粒径の異なる５種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍ）の各金ナノ粒子との存在下でＭＣＦ−７細胞を保持した。
１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を５本のチューブに９９０μｌずつ用意し、それぞれに５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加え、金ナノ粒子の粒径が異なる上記５種類の金クエン酸コロイド液（表１）をそれぞれの液体培地に１１０μｌずつ加えた。また、１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を４本のチューブに９９０μｌずつ用意し、それぞれに５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加え、ｐＨの値が異なる３種類のクエン酸バッファ（ｐＨ３．１、３．３、および６．５）または水をそれぞれの液体培地に１１０μｌずつ加えた。これらの液体培地は、５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。【０１０４】  さらに、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびＨＣｌのいずれも含まず、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含む液体培地を調製するため、１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を１本のチューブに９９０μｌ用意し、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液を１１０μｌ加えた。また、１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を１本のチューブに９９０μｌ用意し、水を１１０μｌ加えた。
ＭＣＦ−７細胞は、１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０液体培地で培養した。Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理して浮遊化させた細胞を、フェノールレッドが含まれないＲＰＭＩ  １６４０液体培地に再懸濁し、約４×１０４個／ｍｌの細胞濃度の細胞懸濁液を得た。４枚の９６穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５９６）を用意し、各細胞培養プレートの各穴に細胞懸濁液を１００μｌずつ分注した。この細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれるインキュベータ内に２４時間置いた。【０１０５】  各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除き、それぞれに上記の５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む液体培地、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含まない液体培地を１００μｌずつ加えた。ここで、上記の５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む液体培地を細胞サンプルに加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光の下において１０分以内で行った。特に、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を含む細胞サンプルは最後に調製したので、薄暗い白色光に曝されていた時間は１分程度であった。５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含まない細胞サンプルの調製についても、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルを調製した条件と同じ条件で行った。【０１０６】  以上のようにして調製された細胞サンプルおよび比較用細胞サンプルをもつ細胞培養プレートのうちの３枚を、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、それぞれ６時間、１２時間、および１８時間置いた。１枚の細胞培養プレートについては、インキュベータ内に移さずに、すぐさま下記のＣＣＫ−Ｆアッセイを行った。これを０時間のインキュベーションを行った細胞サンプルとした。こうして細胞サンプルおよび比較用細胞サンプルのインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートをインキュベータから取り出した。
各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除いてＤＰＢＳを１００μｌずつ加えた後、細胞毒性検出試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｆ，Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いたＣＣＫ−Ｆアッセイを取り扱い説明書に従って実施した。このＣＣＫ−Ｆアッセイにおいて、細胞サンプルの培地をＤＰＢＳに置換する作業を始めてから細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えるまでの作業は、極めて薄暗い白色光（９．５×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において２０分以内で行った。細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えてから、室温が保たれた完全な暗所で１時間放置した後、４８５ｎｍの波長の励起光により細胞サンプルから発せられる５３５ｎｍの蛍光の強度を、蛍光マイクロプレートリーダー（ＨＴＳ  ７０００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。なお、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えていない細胞サンプルについても同時にこの蛍光測定を行ったところ、蛍光は全く測定されなかった。【０１０７】  図１１Ａに示されるように、０時間の保持ではいずれの細胞サンプルもほぼ同じ蛍光強度を示したが、図１１Ｂに示されるように、６時間の保持時間では、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルが、他の細胞サンプルに対して低い蛍光強度を示した。また、図１１Ｃに示されるように、１２時間の保持時間では、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルが、他の細胞サンプルに対してさらに低い蛍光強度を示したとともに、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルも、他の細胞サンプルに対して低い蛍光強度を示した。また、図１１Ｄに示されるように、１８時間の保持時間では、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルが、ほとんど蛍光を示さなくなったとともに、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルも、他の細胞サンプルに対して極めて低い蛍光強度を示した。【０１０８】  これらの結果より、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下でＭＣＦ−７細胞を保持する場合には、４時間以上の保持時間で細胞増殖の抑制が得られ、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で細胞を保持する場合には、１２時間以上の保持時間で細胞増殖の抑制が得られることがわかった。【０１０９】｛実施例４−３｝
本実施例では、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、粒径の異なる５種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍ）の各金ナノ粒子との存在下でＭＣＦ−７細胞を２６時間保持した。
ＭＣＦ−７細胞は、１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０液体培地で培養した。Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理して浮遊化させた細胞をＲＰＭＩ  １６４０液体培地に再懸濁し、１０４個／ｍｌのオーダーの細胞濃度の細胞懸濁液を得た。１２穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５１２）を用意し、各穴に細胞懸濁液を２ｍｌずつ分注した。この細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれるインキュベータ内に２５時間置いた。
各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除いて直ぐさま、２ｍｌの１０％のウシ胎仔血清を含む新鮮なＲＰＭＩ  １６４０液体培地を加えた。それぞれの細胞サンプルに１１μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加え、金ナノ粒子の粒径が異なる上記５種類の金クエン酸コロイド液（表１）をそれぞれの培養液に２２０μｌずつ加えた。これらの培養液は、５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。【０１１０】  ここで、上記の５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む液体培地を細胞サンプルに加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光の下において１０分以内で行った。特に、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を含む細胞サンプルは最後に調製したので、薄暗い白色光に曝されていた時間は１分程度であった。５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含まない細胞サンプルの調製についても、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルを調製した条件と同じ条件で行った。
以上のようにして調製された細胞サンプルおよび比較用細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、２６時間置いた。こうして細胞サンプルの２６時間のインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートをインキュベータから取り出して、各細胞サンプルの細胞の形態的観察を、デジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｏｌｐｉｘ  ４５００）を備えた実体顕微鏡（Ｎｉｃｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００）を用いて行った。【０１１１】  図１２に示されるように、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金ナノ粒子の少なくとも一方を含まない比較用細胞サンプルの細胞は、いずれも正常な形状を有するものであった。しかしながら、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルにおいては、全ての細胞が球状に収縮して、異常な形状を有するものであった。また、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルにおいても、ほとんどの細胞が球状に収縮した異常な形状を有するものであった。さらに、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと４１ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルも、多くの細胞が球状に収縮した異常な形状を有するものであった。この結果も、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜４１ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で細胞を保持したことによって、その細胞に暗毒性が顕著に誘発されたことを示すものである。なお、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、８２ｎｍおよび１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルにおいては、球状に収縮した異常な形状を有する細胞は見られなかった。【０１１２】  以上の結果から、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜４１ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下でＭＣＦ−７細胞を２６時間保持することにより、それらの細胞増殖が抑制されることが形態的観察からもわかった。また、特に５ｎｍまたは１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いることにより、細胞増殖が極めて効果的に抑制されることもわかった。【０１１３】｛実施例４−４｝
本実施例では、５−ＡＬＡ−Ｍｅと、粒径の異なる４種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍ）の各金ナノ粒子との存在下で乳ガン細胞由来の培養細胞（ＭＣＦ−７）を１９時間保持した。
粉末状の５−ＡＬＡ−Ｍｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を水に溶かして、１Ｍの５−ＡＬＡ−Ｍｅの水溶液を調製した。１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を４本のチューブに９９０μｌずつ用意し、それぞれに５．５μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液を加え、金ナノ粒子の粒径が異なる４種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍ）の金クエン酸コロイド液（表１）をそれぞれの液体培地に１１０μｌずつ加えた。これらの５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と金クエン酸コロイド液とが加えられた液体培地は、５−ＡＬＡ−Ｍｅと金ナノ粒子を含む細胞増殖の抑制剤である。また、１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を２本のチューブに９９０μｌずつ用意し、それぞれに５．５μｌの１Ｍ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液を加え、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）または水をそれぞれの液体培地に１１０μｌずつ加えた。これらの液体培地は、５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。【０１１４】  比較として、５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む液体培地を調製するため、１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を４本のチューブに９９０μｌずつ用意し、それぞれに１Ｍの５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を５．５μｌずつ加え、金ナノ粒子の粒径が異なる上記４種類の金クエン酸コロイド液をそれぞれの液体培地に１１０μｌずつ加えた。また、１０％のウシ胎仔血清を含みかつフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０液体培地を２本のチューブに９９０μｌずつ用意し、それぞれに５．５μｌの約１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加え、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）または水をそれぞれの液体培地に１１０μｌずつ加えた。【０１１５】  ＭＣＦ−７細胞は、１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０液体培地で培養した。ここで用いたＭＣＦ−７細胞の細胞数は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれた雰囲気下で、１８〜２０時間毎に二倍に増えるものである。Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理して浮遊化させた細胞を、フェノールレッドが含まれないＲＰＭＩ  １６４０液体培地に再懸濁し、約４×１０４個／ｍｌの細胞濃度の細胞懸濁液を得た。９６穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ３５９６）を用意し、この細胞懸濁液を各穴に１００μｌずつ分注した。この細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれるインキュベータ内で２４時間放置した。
各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除き、それぞれに上記の５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む液体培地、上記の５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む液体培地を１００μｌずつ加えた。
ここで、上記の５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む液体培地を細胞サンプルに加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光の下において１０分以内で行った。５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルの調製についても、５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む細胞サンプルを調製した条件と同じ条件で行った。【０１１６】  以上のようにして調製された細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、１９時間置いた。こうして細胞サンプルの１９時間のインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートをインキュベータから取り出した。各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除いてＤＰＢＳを１００μｌずつ加えた後、細胞毒性検出試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｆ，Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いたＣＣＫ−Ｆアッセイを取り扱い説明書に従って実施した。このＣＣＫ−Ｆアッセイにおいて、細胞サンプルの培地をＤＰＢＳに置換する作業を始めてから細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えるまでの作業は、極めて薄暗い白色光（９．５×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において２０分以内で行った。細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えてから、室温が保たれた完全な暗所で１時間放置した後、４８５ｎｍの波長の励起光により細胞サンプルから発せられる５３５ｎｍの蛍光の強度を、蛍光マイクロプレートリーダー（ＨＴＳ  ７０００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。なお、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えていない細胞サンプルについても同時にこの蛍光測定を行ったところ、蛍光は全く測定されなかった。【０１１７】  図１３に示されるように、５−ＡＬＡ−Ｍｅと、粒径が５〜８２ｎｍの金ナノ粒子との存在下で保持した各細胞サンプルで得られた蛍光強度は、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよびクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を加えた液体培地、または５−ＡＬＡ−Ｍｅおよび水を加えた液体培地を用いた比較用の細胞サンプルで得られた蛍光強度と比較して顕著に低いことがわかる。この結果は、５−ＡＬＡ−Ｍｅと、粒径が５〜８２ｎｍの金ナノ粒子との存在下で細胞を保持したことによって、その細胞に暗毒性が顕著に誘発されたことを示すものである。また、５−ＡＬＡ−Ｍｅと、粒径が５〜８２ｎｍの金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルの間で蛍光強度を比較したところ、金ナノ粒子の粒径が小さくなるほど、その蛍光強度が低くなることもわかる。これらの細胞サンプルの中で、特に１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた細胞サンプルは、比較用細胞サンプルの蛍光強度に対して約８０％少ない蛍光強度を示した。また、５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いた細胞サンプルは、ほとんど蛍光を発しなかった。このことは、細胞がほぼ全て死んでいること示している。【０１１８】  以上の結果から、５−ＡＬＡ−Ｍｅと、粒径が５〜８２ｎｍの金ナノ粒子との存在下でＭＣＦ−７細胞を１９時間保持することにより、それらの細胞増殖が抑制されることがわかった。このとき特に５ｎｍまたは１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を用いることにより、細胞増殖が極めて効果的に抑制されることもわかった。【０１１９】｛実施例５−��｝
本実施例では、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、粒径の異なる５種類（５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍ）の各金ナノ粒子との存在下でヒト繊維芽正常細胞（１５２２）を２４時間保持した。
粉末状の５−ＡＬＡ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を水に溶かして、１Ｍの濃度の５−ＡＬＡ−ＨＣｌの水溶液を調製した。また、非加熱のウシ胎仔血清を２０％含むＦ１２液体培地を用意した。なお、以下で単に「Ｆ１２液体培地」と書いたものは非加熱のウシ胎仔血清を２０％含むものである。このＦ１２液体培地を５本のチューブに４８０μｌずつ取り、それぞれに３μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加え、金ナノ粒子の粒径が異なる上記５種類の金クエン酸コロイド液（表１）をそれぞれのＦ１２液体培地に１２０μｌずつ加えた。これらの５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と金クエン酸コロイド液とが加えられたＦ１２液体培地は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子を含む細胞増殖の抑制剤である。また、Ｆ１２液体培地を２本のチューブに４８０μｌずつ取り、それぞれに３μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加え、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）または水をそれぞれの液体培地に１２０μｌずつ加えた。これらの液体培地は、５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは４４μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは７２μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。【０１２０】  上記の５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むＦ１２液体培地と同じｐＨをもつＦ１２液体培地を調製するため、Ｆ１２液体培地を５本のチューブに４８０μｌずつ取り、それぞれに約１ＭのＨＣｌ水溶液を約３μｌずつ加え、金ナノ粒子の粒径が異なる上記５種類の金クエン酸コロイド液をそれぞれのＦ１２液体培地に１２０μｌずつ加えた。また、Ｆ１２液体培地を２本のチューブに４８０μｌずつ取り、それぞれに約３μｌの約１ＭＨＣｌ水溶液を加え、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）または水をそれぞれの液体培地に１２０μｌずつ加えた。
５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびＨＣｌのいずれも含まず金ナノ粒子を含むＦ１２液体培地を調製するため、Ｆ１２液体培地を５本のチューブに４８０μｌずつ取り、金ナノ粒子の粒径が異なる上記５種類の金クエン酸コロイド液をそれぞれのＦ１２液体培地に１２０μｌずつ加えた。また、Ｆ１２液体培地を２本のチューブに４８０μｌずつ取り、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）または水をそれぞれのＦ１２液体培地に１２０μｌずつ加えた。【０１２１】  Ｆ１２液体培地で培養した１５２２細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理して浮遊化させ、新鮮なＦ１２液体培地に再懸濁して約５×１０４個／ｍｌの細胞濃度の細胞懸濁液を得た。この細胞濃度は細胞数計測装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ，ｍｏｄｅｌ  Ｚ２）で測定した値である。９６穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５９６）を用意し、この細胞懸濁液を各穴に１００μｌずつ分注した。この細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれるインキュベータ内に２４時間置いた。
各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除き、上述のようにしてあらかじめ用意しておいた５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むＦ１２液体培地、ＨＣｌを含むＦ１２液体培地、並びに、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびＨＣｌのいずれも含まないＦ１２液体培地を各穴に１００μｌずつ加えた。【０１２２】  ここで、上記の５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むＦ１２液体培地を細胞サンプルに加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光の下において１０分以内で行った。特に、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を含む細胞サンプルは最後に調製したので、薄暗い白色光に曝されていた時間は１分程度であった。ＨＣｌを含む細胞サンプル、並びに５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびＨＣｌのいずれも含まない細胞サンプルの調製についても、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルを調製した条件と同じ条件で行った。【０１２３】  以上のようにして調製された細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、２４時間置いた。こうして細胞サンプルの２４時間のインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートをインキュベータから取り出した。各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除いてＤＰＢＳを１００μｌずつ加えた後、細胞毒性検出試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｆ，Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いたＣＣＫ−Ｆアッセイを取り扱い説明書に従って実施した。このＣＣＫ−Ｆアッセイにおいて、細胞サンプルの培地をＤＰＢＳに置換する作業を始めてから細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えるまでの作業は、極めて薄暗い白色光（９．５×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において２０分以内で行った。細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えてから、室温が保たれた完全な暗所で２時間放置した後、４８５ｎｍの波長の励起光により細胞サンプルから発せられる５３５ｎｍの蛍光の強度を、蛍光マイクロプレートリーダー（ＨＴＳ  ７０００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。なお、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えていない細胞サンプルについても同時にこの蛍光測定を行ったところ、蛍光は全く測定されなかった。【０１２４】  図１４に示されるように、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルで得られた蛍光強度は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金ナノ粒子の少なくとも一方を含まない比較用細胞サンプルで得られた蛍光強度と比較して約４０％減の蛍光強度を示した。５−ＡＬＡ−ＨＣｌと１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルで得られた蛍光強度は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金ナノ粒子の少なくとも一方を含まない比較用細胞サンプルで得られた蛍光強度と比較して約２０％少ない蛍光強度を示した。一方、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと４１〜１０３ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルで得られた蛍光強度については、比較用細胞サンプルで得られた蛍光強度と比較してそれほど低くないことがわかる。この結果は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で１５２２細胞を保持したことによって、その細胞に暗毒性が顕著に誘発されたことを示すものである。
以上の結果から、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと５〜１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で１５２２細胞を２４時間保持することにより、それらの細胞増殖が抑制されることがわかった。【０１２５】｛実施例５−２｝
本実施例では、５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子の濃度については２２μＭ、３３μＭ、または４４μＭとし、５−ＡＬＡ−ＨＣｌの濃度については２．５ｍＭ、５ｍＭ、または１０ｍＭとした他は、実施例５−１と同様にして、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、粒径が５ｎｍの金ナノ粒子との存在下で１５２２細胞を保持した。
まず、粒径が５ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液（表１）について、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）で金ナノ粒子の含有濃度をそれぞれ３／４、および１／２に希釈したものを用意した。次いで、Ｆ１２液体培地を１６本のチューブに４８０μｌずつ取り、そのうちの４本のチューブのＦ１２液体培地に１．５μｌの１Ｍ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加え、金クエン酸コロイド液、それらの希釈液（金ナノ粒子の含有濃度を３／４または１／２に希釈）、並びにクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を、それぞれのＦ１２液体培地に１２０μｌずつ加えた。【０１２６】  別の４本のチューブのＦ１２液体培地には３μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加え、金クエン酸コロイド液、それらの希釈液（金ナノ粒子の含有濃度を３／４または１／２に希釈）、並びにクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を、それぞれのＦ１２液体培地に１２０μｌずつ加えた。さらに別の４本のチューブのＦ１２液体培地には６μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加え、金クエン酸コロイド液、それらの希釈液（金ナノ粒子の含有濃度を３／４または１／２に希釈）、並びにクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を、それぞれの液体培地に１２０μｌずつ加えた。
残りの４本のチューブのＦ１２液体培地には５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加えずに、金クエン酸コロイド液、それらの希釈液（金ナノ粒子の含有濃度を３／４または１／２に希釈）、並びにクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を、それぞれのＦ１２液体培地に１２０μｌずつ加えた。こうして、金ナノ粒子については０μＭ、２２μＭ、３３μＭ、および４４μＭの濃度と、５−ＡＬＡ−ＨＣｌについては０ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、および１０ｍＭの濃度との組み合わせの１６種類のＦ１２液体培地を調製した。【０１２７】  Ｆ１２液体培地で培養した１５２２細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理して浮遊化させ、新鮮なＦ１２液体培地に再懸濁して、約５×１０４個／ｍｌの細胞濃度の細胞懸濁液を得た。９６穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５９６）を用意し、この細胞懸濁液を各穴に１００μｌずつ分注した。この細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれたインキュベータ内に２４時間置いた。
各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除き、それぞれに上記の１６種類の液体培地を１００μｌずつ加えた。ここで、液体培地を細胞サンプルに加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光の下において３０分以内で行った。【０１２８】  以上のようにして調製された細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、２４時間置いた。こうして細胞サンプルの２４時間の保持が終了した後、細胞培養プレートをインキュベータから取り出した。各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除いてＤＰＢＳを１００μｌずつ加えた後、細胞毒性検出試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｆ，Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いたＣＣＫ−Ｆアッセイを取り扱い説明書に従って実施した。このＣＣＫ−Ｆアッセイにおいて、細胞サンプルの培地をＤＰＢＳに置換する作業を始めてから細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えるまでの作業は、極めて薄暗い白色光（９．５×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において２０分以内で行った。細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えてから、室温が保たれた完全な暗所で２時間放置した後、４８５ｎｍの波長の励起光により細胞サンプルから発せられる５３５ｎｍの蛍光の強度を、蛍光マイクロプレートリーダー（ＨＴＳ７０００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。なお、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えていない細胞サンプルについても同時にこの蛍光測定を行ったところ、蛍光は全く測定されなかった。【０１２９】  図１５に示したように、５−ＡＬＡ−ＨＣｌが加えられていない液体培地を用いた場合、５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子が４４μＭ以下の濃度で加えられた細胞サンプルの間では、蛍光強度に大きな差は見られなかった。一方、５−ＡＬＡ−ＨＣｌの濃度が２．５ｍＭの場合は、金ナノ粒子が加えられていない細胞サンプルにおいて、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金ナノ粒子が加えられていない液体培地を用いた細胞サンプルの蛍光強度に対し、１０％近くの蛍光強度の低下が見られ、５−ＡＬＡ−ＨＣｌのみでわずかな細胞毒性が見られた。この細胞サンプルに対して、さらに金ナノ粒子を４４μＭ以下の濃度で加えた細胞サンプルの間では、蛍光強度に大きな差は見られなかった。
５−ＡＬＡ−ＨＣｌの濃度が５ｍＭの場合は、５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子が加えられていない細胞サンプルにおいて、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金ナノ粒子が加えられていない液体培地を用いた細胞サンプルの蛍光強度に対し、２０％近くの蛍光強度の低下が見られ、５−ＡＬＡ−ＨＣｌのみで幾分かの細胞毒性が見られた。この細胞サンプルに対して、さらに金ナノ粒子を４４μＭの濃度で加えた細胞サンプルでは、５０％近くの蛍光強度の低下が見られた。この結果より、５−ＡＬＡ−ＨＣｌの濃度が５ｍＭの場合は、金ナノ粒子を４４μＭの濃度で加えることにより、暗毒性が顕著に相乗されることがわかった。【０１３０】  また、５−ＡＬＡ−ＨＣｌの濃度が１０ｍＭの場合は、５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子が加えられていない細胞サンプルにおいて、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金ナノ粒子が加えられていない液体培地を用いた細胞サンプルの蛍光強度に対し、５０％近い蛍光強度の低下が見られ、５−ＡＬＡ−ＨＣｌのみでかなりの細胞毒性が見られた。この細胞サンプルに対して、さらに金ナノ粒子を３３μＭの濃度で加えた細胞サンプルでは５０％近くの蛍光強度の低下が見られ、また金ナノ粒子を４４μＭの濃度で加えた細胞サンプルでは７５％近くの蛍光強度の低下が見られた。この結果より、５−ＡＬＡ−ＨＣｌの濃度が１０ｍＭの場合は、金ナノ粒子を３３μＭまたは４４μＭの濃度で加えることにより、暗毒性が顕著に相乗されることがわかった。【０１３１】｛実施例５−３｝
本実施例では、５−ＡＬＡ−Ｍｅと５ｎｍまたは１７ｎｍの粒径の金ナノ粒子との存在下でヒト繊維芽正常細胞（１５２２）を２４時間保持した。
粉末状の５−ＡＬＡ−Ｍｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を水に溶かして、１Ｍの濃度の５−ＡＬＡ−Ｍｅの水溶液を調製した。Ｆ１２液体培地を２本のチューブに４８０μｌずつ取り、それぞれに３μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液を加え、５ｎｍまたは１７ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液（表１）をそれぞれのＦ１２液体培地に１２０μｌずつ加えた。これらの５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と金クエン酸コロイド液とが加えられたＦ１２液体培地は、５−ＡＬＡ−Ｍｅと金ナノ粒子を含む細胞増殖の抑制剤である。また、Ｆ１２液体培地を１本のチューブに４８０μｌ取り、３μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液を加え、１２０μｌのクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を加えた。これらの液体培地は、５ｍＭの５−ＡＬＡ−Ｍｅを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは４４μＭの濃度で、１７ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは７２μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。【０１３２】  一方、５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む比較用Ｆ１２液体培地を調製するため、Ｆ１２液体培地を２本のチューブに４８０μｌずつ取り、それぞれに３μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加え、５ｎｍまたは１７ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液をそれぞれのＦ１２液体培地に１２０μｌずつ加えた。また、Ｆ１２液体培地を１本のチューブに４８０μｌ取り、３μｌの１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を加え、１２０μｌのクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を加えた。これらの液体培地は、５ｍＭの５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。
Ｆ１２液体培地で培養した１５２２細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理して浮遊化させ、新鮮なＦ１２液体培地に再懸濁して、約５×１０４個／ｍｌの細胞濃度の細胞懸濁液を得た。９６穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５９６）を用意し、この細胞懸濁液を各穴に１００μｌずつ分注した。この細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれるインキュベータ内に２４時間置いた。【０１３３】  各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除き、それぞれに上記の５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む液体培地、または上記の５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む液体培地を１００μｌずつ加えた。
ここで、上記の５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む液体培地を細胞サンプルに加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光の下において１０分以内で行った。特に、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよび５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を含む細胞サンプルは最後に調製したので、薄暗い白色光に曝されていた時間は１分程度であった。５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルの調製についても、５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む細胞サンプルを調製した条件と同じ条件で行った。【０１３４】  以上のようにして調製された細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、２４時間置いた。こうして細胞サンプルの２４時間の保持が終了した後、細胞培養プレートをインキュベータから取り出した。各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除いてＤＰＢＳを１００μｌずつ加えた後、細胞毒性検出試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｆ，Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いたＣＣＫ−Ｆアッセイを取り扱い説明書に従って実施した。このＣＣＫ−Ｆアッセイにおいて、細胞サンプルの培地をＤＰＢＳに置換する作業を始めてから細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えるまでの作業は、極めて薄暗い白色光（９．５×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において２０分以内で行った。細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えてから、室温が保たれた完全な暗所で２時間放置した後、４８５ｎｍの波長の励起光により細胞サンプルから発せられる５３５ｎｍの蛍光の強度を、蛍光マイクロプレートリーダー（ＨＴＳ  ７０００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。なお、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えていない細胞サンプルについても同時にこの蛍光測定を行ったところ、蛍光は全く測定されなかった。【０１３５】  図１６に示されるように、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよびクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を含む細胞サンプルで得られた蛍光強度は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を含む細胞サンプルで得られた蛍光強度と大きく変わらないものでった。
５−ＡＬＡ−Ｍｅと５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルで得られた蛍光強度は、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよびクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を含む細胞サンプルで得られた蛍光強度と比較して８５％近くの蛍光強度の低下を示した。また、その蛍光強度は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を含む細胞サンプルで得られた蛍光強度とほぼ同じであった。この結果は、５−ＡＬＡ−Ｍｅと５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で１５２２細胞を保持したことによって、その細胞に暗毒性が顕著に誘発されたことを示すものである。【０１３６】  一方、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で保持した細胞サンプルで得られた蛍光強度は、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよびクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を含む細胞サンプルで得られた蛍光強度とほぼ同じ蛍光強度を示した。また、その蛍光強度は、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を含む細胞サンプルで得られた蛍光強度の２倍である。
以上の結果から、５−ＡＬＡ−Ｍｅと５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で１５２２細胞を２４時間保持することにより、それらの細胞増殖が抑制されることがわかった。【０１３７】｛実施例５−４｝
本実施例では、５−ＡＬＡ−Ｍｅと、粒径が５ｎｍまたは１７ｎｍの金ナノ粒子とを混ぜ合わせて細胞に投与した他は、実施例５−２と同様にして、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよび金ナノ粒子の存在下で１５２２細胞を保持した。また、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと、粒径が５ｎｍまたは１７ｎｍの金ナノ粒子とを混ぜ合わせて細胞に投与した他は、実施例５−２と同様にして、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよび金ナノ粒子の存在下で１５２２細胞を保持した。
１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と、粒径が５ｎｍまたは１７ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液（表１）を１：２０の割合で混合し、室温で４時間放置したものを用意した。また、１Ｍ  ５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液とクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を１：２０の割合で混合し、室温で４時間放置したものを用意した。【０１３８】  また、１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と、粒径が５ｎｍまたは１７ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液を１：２０の割合で混合し、室温で４時間放置したものを用意した。また、１Ｍ  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液とクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を１：２０の割合で混合し、室温で４時間放置したものを用意した。
Ｆ１２液体培地で培養した１５２２細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理して浮遊化させ、新鮮なＦ１２液体培地に再懸濁して、約５×１０４個／ｍｌの細胞濃度の細胞懸濁液を得た。９６穴の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｍｏｄｅｌ  ３５９６）を用意し、この細胞懸濁液を各穴に１００μｌずつ分注した。この細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれるインキュベータ内に２４時間置いた。【０１３９】  各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除き、それぞれに上述のようにして用意した５−ＡＬＡ−Ｍｅを含むＦ１２液体培地、および５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むＦ１２液体培地を１００μｌずつ加えた。ここで、上記の５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む液体培地を細胞サンプルに加え始めてから細胞サンプルを下記のインキュベータ内の暗所に設置するまでの操作は、極めて薄暗い白色光の下において１０分以内で行った。特に、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよび５ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子を含む細胞サンプルは最後に調製したので、薄暗い白色光に曝されていた時間は１分程度であった。５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルの調製についても、５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む細胞サンプルを調製した条件と同じ条件で行った。【０１４０】  以上のようにして調製された細胞サンプルをもつ細胞培養プレートを、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内に移し、２４時間置いた。こうして細胞サンプルの２４時間のインキュベーションが終了した後、細胞培養プレートをインキュベータから取り出した。各穴の細胞サンプルから培地のみ（上清液）を除いてＤＰＢＳを１００μｌずり加えた後、細胞毒性検出試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｆ，Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いたＣＣＫ−Ｆアッセイを取り扱い説明書に従って実施した。このＣＣＫ−Ｆアッセイにおいて、細胞サンプルの培地をＤＰＢＳに置換する作業を始めてから細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えるまでの作業は、極めて薄暗い白色光（９．５×１０−３μＷ／ｃｍ２）の下において２０分以内で行った。細胞サンプルにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えてから、室温が保たれた完全な暗所で２時間放置した後、４８５ｎｍの波長の励起光により細胞サンプルから発せられる５３５ｎｍの蛍光の強度を、蛍光マイクロプレートリーダー（ＨＴＳ  ７０００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。なお、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを加えていない細胞サンプルについても同時にこの蛍光測定を行ったところ、蛍光は全く測定されなかった。【０１４１】  図１６に示したように、５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と、粒径が５ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液との混合液を液体培地に加えた場合、この液体培地を用いた細胞サンプルの蛍光強度は、それらを混合せずに液体培地に加えた場合のものに比べてわずかに大きくなることがわかった。また、粒径が５ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液と５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液とを混合して液体培地に加えた場合、この液体培地を用いた細胞サンプルの蛍光強度は、それらを混合せずに液体培地に加えた場合のものと比べて大きな違いはなかった。【０１４２】  しかしながら、５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と、粒径が１７ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液との混合液を液体培地に加えた場合、この液体培地を用いた細胞サンプルの蛍光強度は、それらを混合せずに液体培地に加えた場合のものより著しく低くなることがわかった。これに対し、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と、粒径が１７ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液との混合液を液体培地に加えた場合、この液体培地を用いた細胞サンプルの蛍光強度は、それらを混合せずに加えた細胞サンプルのものに比べてわずかに大きいものであった。また、５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液とクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）との混合液を液体培地に加えた場合、この液体培地を用いた細胞サンプルの蛍光強度は、それらを混合せずに加えた場合のものと比べて大きな違いはなかった。
これらの結果から、５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と、粒径が１７ｎｍの金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液とを混合して４時間置き、この混合液を加えた液体培地を用いて、５−ＡＬＡ−Ｍｅと１７ｎｍの粒径をもつ金ナノ粒子との存在下で１５２２細胞を２４時間保持することによっても、細胞増殖を抑制できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を２３時間保持したときの細胞増殖の抑制の効果を示すグラフである。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルは、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加えてから、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、または水を加えて調製したものであり、５ｍＭの濃度で５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。また、比較のために、細胞懸濁液にＨＣｌを加えてから、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、または水を加えて調製した細胞サンプルについても併せて示した。さらには、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびＨＣｌのいずれも加えないで、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、または水を加えて調製したものについても併せて示した。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で行った。（Ａ）は、細胞数計測装置を用いて得られた各細胞サンプルの細胞濃度を示す。（Ｂ）は、トリパンブルー染色法によって得られた各細胞サンプル（ｎ＝２）の平均の生細胞濃度を示す。（Ｃ）は、ＣＣＫ−Ｆアッセイによって得られた各細胞サンプル（ｎ＝５）の平均の蛍光強度を示す。
【０１４４】
【図２】  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を保持するときに、５−ＡＬＡ−ＨＣｌの濃度を１０ｍＭ以下の様々な値に設定したときの細胞濃度の増加の違いを示すグラフである。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。細胞サンプルは、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを様々な濃度で加えてから、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、または水を加えて調製した。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で２３時間行った。
【０１４５】
【図３】  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を保持するときに、金ナノ粒子の濃度を４０μＭより低い様々な値に設定したときの細胞濃度の増加の違いを示すグラフである。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。細胞サンプルは、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加えてから、金ナノ粒子を様々な濃度で含む金クエン酸コロイド液、またはクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を加えて調製した。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で２３時間行った。
【０１４６】
【図４】  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を保持するときに、保持時間を２３時間以内の様々な値に設定したときの細胞増殖の抑制の効果を示すグラフである。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。細胞サンプルは、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加えてから、金ナノ粒子を様々な濃度で含む金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）または水を加えて調製した。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で行った。（Ａ）は、細胞の保持時間を０時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、または２３時間としたときの細胞濃度の時間変化を示す。（Ｂ）は、細胞の保持時間を４時間としたときに、ＣＣＫ−Ｆアッセイによって得られた各細胞サンプル（ｎ＝３）の平均の蛍光強度を示す。
【０１４７】
【図５】  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を保持するときに、５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子とを混合して１時間おいてから細胞に投与したときの細胞増殖の抑制の効果を示すグラフである。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、および４１ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。細胞サンプルは、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と金クエン酸コロイド液との混合液、５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液とクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）との混合液、または５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液を水で希釈した希釈液を、それぞれ細胞懸濁液に加えて調製したものである。比較のために、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加えてから、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、または水を加えて調製した細胞サンプルについても併せて示した。このグラフに示したいずれの細胞サンプルも、５ｍＭの濃度で５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含み、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で２３時間行った。棒グラフは、細胞数計測装置を用いて得られた各細胞サンプルの細胞濃度を示す。折れ線グラフは、トリパンブルー染色法によって得られた各細胞サンプルの生細胞濃度を示す。
【０１４８】
【図６】  ５−ＡＬＡ−Ｍｅと金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を保持したときの細胞濃度の増加の違いを示すグラフである。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む細胞サンプルは、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−Ｍｅを加えてから、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、または水を加えて調製したものであり、５ｍＭの濃度で５−ＡＬＡ−Ｍｅを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。また、比較のために、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加えてから、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、または水を加えて調製した細胞サンプルについても併せて示した。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で行った。
【０１４９】
【図７】  ５−ＡＬＡ−Ｍｅと金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を保持するときに、５−ＡＬＡ−Ｍｅの濃度を５ｍＭ以下の様々な値に設定したときの細胞濃度の増加の違いを示すグラフである。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。細胞サンプルは、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−Ｍｅを様々な濃度で加えてから、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、または水を加えて調製した。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で２４時間行った。
【０１５０】
【図８】  ５−ＡＬＡ−Ｍｅと金ナノ粒子との存在下でＨＬ−６０細胞を保持するときに、５−ＡＬＡ−Ｍｅと金ナノ粒子とを混合して３時間以内の様々な時間おいてから細胞に投与したときの細胞濃度の増加の違いを示すグラフである。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、および４１ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。細胞サンプル（ｎ＝２）は、５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液と金クエン酸コロイド液とを混合して０〜３時間おいた混合液、５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液とクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）とを混合して０〜３時間おいた混合液、または５−ＡＬＡ−Ｍｅ水溶液を水で希釈して０〜３時間おいた希釈液を、それぞれ細胞懸濁液に加えて調製したものである。比較のために、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−Ｍｅを加えてから、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ６．５）、または水を加えて調製した細胞サンプルについても併せて示した。さらには５−ＡＬＡ−ＨＣｌ水溶液と１７ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液とを混合して０〜３時間置いた混合液を細胞懸濁液に加えて調製した細胞サンプルと、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加えてから、１７ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液を加えて調製した細胞サンプルについても併せて示した。このグラフに示したいずれの細胞サンプルも、５ｍＭの濃度で５−ＡＬＡ−Ｍｅまたは５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含み、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、および４１ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で２３時間行った。なお、このグラフでは、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−Ｍｅおよび５−ＡＬＡ−ＨＣｌのいずれも加えないでクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を加えて調製した細胞サンプルで測定された細胞濃度を１とし（図示せず）、他の全ての細胞サンプルで得られた細胞濃度はそれに対する比の値をとって、その平均値を示した。
【０１５１】
【図９】  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子との存在下でＨＬ−５２５細胞を２２時間保持したときの細胞濃度の増加の違いを示すグラフである。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルは、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加えてから、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、または水を加えて調製したものであり、５ｍＭの濃度で５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは４４μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは７２μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。また、比較のために、細胞懸濁液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加えないで、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、または水を加えて調製したものについても併せて示した。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で行った。
【０１５２】
【図１０】  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子との存在下でＭＣＦ−７細胞を２４時間保持したときの細胞増殖の抑制の効果を示すグラフである。ここではＣＣＫ−Ｆアッセイによって得られた各細胞サンプル（ｎ＝２）の平均の蛍光強度を示した。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルは、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金クエン酸コロイド液を加えた液体培地、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を加えた液体培地、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび水を加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与したものであり、５ｍＭの濃度で５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。また、比較のために、ＨＣｌおよび金クエン酸コロイド液を加えた液体培地、ＨＣｌおよびクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を加えた液体培地、ＨＣｌおよび水を加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与した細胞サンプルについても併せて示した。さらには、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、または水のみを加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与した細胞サンプルについても併せて示した。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で行った。なお、このグラフでは、水のみを加えた液体培地を細胞に投与した細胞サンプルで測定された蛍光強度を１とし、他の全ての細胞サンプルで得られた蛍光強度は、それに対する比の値を示した。
【０１５３】
【図１１】  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子との存在下でＭＣＦ−７細胞を保持するときに、保持時間を１８時間以内の様々な値に設定したときの細胞増殖の抑制の効果を示すグラフである。ここではＣＣＫ−Ｆアッセイによって得られた各細胞サンプル（ｎ＝２）の平均の蛍光強度を示した。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルは、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金クエン酸コロイド液を加えた液体培地、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を加えた液体培地、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび水を加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与したものであり、５１ｍＭの濃度で５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。さらには、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液または水のみを加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与した細胞サンプルについても併せて示した。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で行った。（Ａ）は、保持時間を０時間としたときの蛍光強度を示す。（Ｂ）は、保持時間を６時間としたときの蛍光強度を示す。（Ｃ）は、保持時間を１２時間としたときの蛍光強度を示す。（Ｄ）は、保持時間を１８時間としたときの蛍光強度を示す。
【０１５４】
【図１２】  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子との存在下でＭＣＦ−７細胞を保持したときの細胞の形態的な変化を示す写真である。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルは、細胞培養液に５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加えてから、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、または水を加えて調製したものであり、５ｍＭの濃度で５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。また、比較のために、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含む金クエン酸コロイド液を細胞培養液に加えて調製した細胞サンプルと、何も細胞培養液に加えなかった細胞サンプルについても、細胞の形態的な観察を行った。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で行った。
【０１５５】
【図１３】  ５−ＡＬＡ−Ｍｅと金ナノ粒子との存在下でＭＣＦ−７細胞を２４時間保持したときの細胞増殖の抑制の効果を示すグラフである。ここではＣＣＫ−Ｆアッセイによって得られた各細胞サンプル（ｎ＝２）の平均の蛍光強度を示した。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む細胞サンプルは、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよび金クエン酸コロイド液を加えた液体培地、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよびクエン酸バッファ（ｐＨ３．１または６．５）を加えた液体培地、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよび水を加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与したものであり、５ｍＭの濃度で５−ＡＬＡ−Ｍｅを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、および８２ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。また、比較のために、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金クエン酸コロイド液を加えた液体培地、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびクエン酸バッファ（ｐＨ３．３または６．５）を加えた液体培地、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび水を加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与した細胞サンプルについても併せて示した。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で行った。
【０１５６】
【図１４】  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌと金ナノ粒子との存在下で１５２２細胞を２４時間保持したときの細胞増殖の抑制の効果を示すグラフである。ここではＣＣＫ−Ｆアッセイによって得られた各細胞サンプル（ｎ＝６）の平均の蛍光強度を示した。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍ、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルは、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金クエン酸コロイド液を加えた液体培地、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を加えた液体培地、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび水を加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与したものであり、５ｍＭの濃度で５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含むものである。また、５ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは２２μＭの濃度で、１７ｎｍ、４１ｎｍ、８２ｎｍ、および１０３ｎｍの粒径の金ナノ粒子を含むものでは３６μＭの濃度で、それぞれ金ナノ粒子を含むものである。また、比較のために、ＨＣｌおよび金クエン酸コロイド液を加えた液体培地、ＨＣｌおよびクエン酸バッファ（ｐＨ３．３）を加えた液体培地、ＨＣｌおよび水を加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与した細胞サンプルについても併せて示した。さらには、金クエン酸コロイド液、クエン酸バッファ（ｐＨ３．３）、または水のみを加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与した細胞サンプルについても併せて示した。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で行った。
【０１５７】
【図１５】  ５−ＡＬＡ−ＨＣｌと粒径が５ｎｍの金ナノ粒子との存在下で１５２２細胞を保持するときに、金ナノ粒子については０μＭ、２２μＭ、３３μＭ、および４４μＭの濃度から選択し、５−ＡＬＡ−ＨＣｌについては０ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、および１０ｍＭの濃度から選択して１５２２細胞を保持したときの細胞増殖の抑制の効果を示すグラフである。ここではＣＣＫ−Ｆアッセイによって得られた各細胞サンプル（ｎ＝２）の平均の蛍光強度を示した。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍの粒径を狭い粒度分布で有する。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で２４時間行った。
【０１５８】
【図１６】  ５−ＡＬＡ−Ｍｅと金ナノ粒子との存在下で１５２２細胞を保持したときの細胞増殖の抑制の効果を示すグラフである。ここではＣＣＫ−Ｆアッセイによって得られた各細胞サンプル（ｎ＝２）の平均の蛍光強度を示した。金ナノ粒子は球状であり、５ｎｍおよび１７ｎｍのいずれかの粒径を狭い粒度分布で有する。５−ＡＬＡ−Ｍｅを含む細胞サンプルは、５−ＡＬＡ−Ｍｅを加えてから金クエン酸コロイド液を加えた液体培地、および５−ＡＬＡ−Ｍｅを加えてからクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与したものと、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよび金クエン酸コロイド液を混合して４時間おいてから加えた液体培地、５−ＡＬＡ−Ｍｅおよびクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を混合して４時間おいてから加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与したものとを調製した。一方、比較のための５−ＡＬＡ−ＨＣｌを含む細胞サンプルは、５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加えてから金クエン酸コロイド液を加えた液体培地、および５−ＡＬＡ−ＨＣｌを加えてからクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与したものと、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよび金クエン酸コロイド液を混合して４時間おいてから加えた液体培地、５−ＡＬＡ−ＨＣｌおよびクエン酸バッファ（ｐＨ６．５）を混合して４時間おいてから加えた液体培地を用意し、これらの液体培地をそれぞれ細胞に投与したものとをそれぞれ調製した。細胞の保持は、３７℃および５％のＣＯ２濃度が保たれ、かつ完全に真っ暗なインキュベータ内で行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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