(57)【要約】      （修正有）【課題】ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列上の第３６７３番目の１塩基多型を検出するための方法およびプライマーセットを提供する。【解決手段】以下の（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、核酸増幅反応を等温下で行う。（ａ）特定の配列Ａで示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、特定の配列Ｂで示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、特定の配列Ｂで示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（シトシン）を有する塩基配列（Ｙ’）と、を含むオリゴヌクレオチド。（ｂ）特定の配列Ｃで示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする方法。
（１）以下の（ａ１）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、前記一塩基多型を検出するためのプライマーセットを用意する工程。
（ａ１）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（シトシン）を有する塩基配列（Ｙ１’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（２）核酸試料に対して前記プライマーセットによる核酸増幅反応を等温下で行う工程。
（３）前記核酸増幅反応で得られた核酸増幅産物を検出する工程。
【請求項２】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする方法。
（１）以下の（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１４に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、前記一塩基多型を検出するためのプライマーセットを用意する工程。
（ａ２）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号１３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号１３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（チミン）を有する塩基配列（Ｙ２’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（２）核酸試料に対して前記プライマーセットによる核酸増幅反応を等温下で行う工程。
（３）前記核酸増幅反応で得られた核酸増幅産物を検出する工程。
【請求項３】
前記プライマーセットが、さらに（ｃ）配列番号５に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
鎖置換能を有するポリメラーゼを使用する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
融解温度調整剤の存在下で核酸増幅反応を行う、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
酵素安定化剤の存在下で核酸増幅反応を行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記一塩基多型が、前記配列番号１に示される塩基配列の第７５番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
さらに以下の工程（４）を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（４）工程（３）で検出した核酸増幅産物の量から核酸増幅反応速度を検出する工程
【請求項９】
さらに以下の工程（５）を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
（５）前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的である場合と相補的でない場合とに生じる核酸増幅反応の速度差により、配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出する工程。
【請求項１０】
さらに以下の工程（６）〜（８）を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
（６）前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的である場合の核酸増幅反応速度を基準速度とし、工程（４）で検出した核酸増幅反応速度と基準速度とを比較する工程。
（７）工程（４）で検出した核酸増幅反応速度が基準速度以下となる場合、前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的でないと判定する工程。
（８）工程（４）で検出した核酸増幅反応速度が基準速度以下とならない場合、前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的であると判定する工程。
【請求項１１】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出するためのプライマーセットであって、
以下の（ａ１）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、プライマーセット。
（ａ１）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、配列番号３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（シトシン）を、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に有する塩基配列（Ｙ１’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出するためのプライマーセットであって、
以下の（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１４に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、プライマーセット。
（ａ２）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号１３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号１３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（チミン）を有する塩基配列（Ｙ２’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
さらに（ｃ）配列番号５に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項１１または１２に記載のプライマーセット。
【請求項１４】
前記一塩基多型が、前記配列番号１に示される塩基配列の第７５番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである請求項１１〜１３のいずれかに記載のプライマーセット。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれかに記載のプライマーセットを含むＶＫＯＲＣ１遺伝子の一塩基多型検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子上の１塩基多型を検出する方法およびプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝情報を担っているＤＮＡ配列は、個体毎に多くの部位が異なっていることが知られている。同じ生物種のＤＮＡ配列のうちの、異なる遺伝子・ＤＮＡ配列のことを遺伝子多型という。このような遺伝子多型として、１塩基の置換によって生じる１塩基多型、２〜数塩基からなる配列の繰り返し回数の違いであるマイクロサテライト、１から数十塩基が欠失や挿入されたものなどが知られている。
【０００３】
遺伝子多型の中でも特に１塩基多型は、原因遺伝子のわかっている遺伝病について将来的な危険率を診断するための有用なツールとなる。また、薬剤応答性、および副作用の有無について非常に有用な情報を提供することもできる。このような１塩基多型を有する遺伝子として、多くの薬剤代謝に関与する酵素チトクロームＰ４５０(ＣＹＰ)のファミリーおよび抗結核薬イソニアジドの代謝に関与するＮ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２(ＮＡＴ−２)、並びに経口抗凝固剤ワーファリンの効果の強さに大きく影響するＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子などが挙げられる。従って、１塩基多型の検出をより正確に行うことが求められている。
【０００４】
１塩基多型の検出方法として、核酸の等温増幅法であるＳＭＡＰ（登録商標）法（非特許文献１、特許文献１）を利用する方法がある。ＳＭＡＰ（登録商標）法では、プライマーセットに含まれるプライマーの少なくとも一つが、１塩基多型部位を認識するように設計されたプライマーセットを用いる。
【０００５】
ＳＭＡＰ（登録商標）法では、次のようにして、１塩基多型を検出する。検体となる核酸試料中にプライマーの標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応においてプライマーが当該標的核酸配列に完全にアニーリングするため、酵素がプライマーと核酸試料の二本鎖を認識することができ増幅産物が得られる。逆に検体となる核酸試料中にプライマーの標的核酸配列とは異なる配列が含まれている場合には、核酸増幅反応においてプライマーが当該標的核酸配列にアニーリングしにくくなるため、酵素がプライマーと核酸試料の二本鎖を認識しにくくなり増幅産物が得られないか、あるいはその増幅速度が著しく低下する。このようにして生じる核酸増幅速度の差によって１塩基多型を検出することができる。
【０００６】
【非特許文献１】Nature Methods (2007), Vol.4, No.3, p.257-262
【特許文献１】特公３９４２６２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列上の第３６７３番目にみられる１塩基多型の周辺配列は、ＧＣが連続している配列になっている。遺伝子増幅反応において、このようなＧＣリッチな配列をプライマーの末端の反応開始点で認識する場合に、プライマーの配列とテンプレート核酸の配列が完全に一致していなくても、プライマーとテンプレート核酸が二本鎖を形成し、その部分を酵素が認識し、増幅反応が起きてしまうため反応の特異性が低下するという問題点が知られている（遺伝子工学実験ノート（下）」、２００７年、田村隆明編、p.14）。
この問題点のため、周辺配列にＧＣが連続している１塩基多型をプライマーの末端で認識する場合に、１塩基多型部位がミスマッチになっていてもプライマーがテンプレート核酸にアニーリングしてしまい、十分な増幅速度差が得られず、変異核酸の検出を正確に行うことは困難である。
【０００８】
本発明の目的は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列上の第３６７３番目の１塩基多型を検出するための方法およびプライマーセットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列上の第３６７３番目の１塩基多型をより正確に識別することが可能なプライマーセットを見出し、本発明に至った。
すなわち、上記課題は、以下の手段により解決することができる。
１．ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする方法。
（１）以下の（ａ１）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、前記一塩基多型を検出するためのプライマーセットを用意する工程。
（ａ１）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（シトシン）を有する塩基配列（Ｙ１’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（２）核酸試料に対して前記プライマーセットによる核酸増幅反応を等温下で行う工程。
（３）前記核酸増幅反応で得られた核酸増幅産物を検出する工程。
２．ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする方法。
（１）以下の（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１４に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、前記一塩基多型を検出するためのプライマーセットを用意する工程。
（ａ２）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号１３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号１３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（チミン）を有する塩基配列（Ｙ２’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（２）核酸試料に対して前記プライマーセットによる核酸増幅反応を等温下で行う工程。
（３）前記核酸増幅反応で得られた核酸増幅産物を検出する工程。
３．前記プライマーセットが、さらに（ｃ）配列番号５に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、前項１または２に記載の方法。
４．鎖置換能を有するポリメラーゼを使用する、前項１〜３のいずれかに記載の方法。
５．融解温度調整剤の存在下で核酸増幅反応を行う、前項１〜４のいずれかに記載の方法。
６．酵素安定化剤の存在下で核酸増幅反応を行う、前項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
７．前記一塩基多型が、前記配列番号１に示される塩基配列の第７５番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである前項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
８．さらに以下の工程（４）を含むことを特徴とする前項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（４）工程（３）で検出した核酸増幅産物の量から核酸増幅反応速度を検出する工程。
９．さらに以下の工程（５）を含むことを特徴とする前項８に記載の方法。
（５）前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的である場合と相補的でない場合とに生じる核酸増幅反応の速度差により、配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出する工程。
１０．さらに以下の工程（６）〜（８）を含むことを特徴とする前項９に記載の方法。
（６）前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的である場合の核酸増幅反応速度を基準速度とし、工程（４）で検出した核酸増幅反応速度と基準速度とを比較する工程。
（７）工程（４）で検出した核酸増幅反応速度が基準速度以下となる場合、前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的でないと判定する工程。
（８）工程（４）で検出した核酸増幅反応速度が基準速度以下とならない場合、前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的であると判定する工程。
１１．ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出するためのプライマーセットであって、
以下の（ａ１）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、プライマーセット。
（ａ１）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、配列番号３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（シトシン）を、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に有する塩基配列（Ｙ１’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
１２．ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出するためのプライマーセットであって、
以下の（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１４に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、プライマーセット。
（ａ２）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号１３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号１３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（チミン）を有する塩基配列（Ｙ２’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
１３．さらに（ｃ）配列番号５に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、前項１１または１２に記載のプライマーセット。
１４．前記一塩基多型が、前記配列番号１に示される塩基配列の第７５番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである前項１１〜１３のいずれかに記載のプライマーセット。
１５．前項１１〜１４のいずれかに記載のプライマーセットを含むＶＫＯＲＣ１遺伝子の一塩基多型検出用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るプライマーセットは、ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列上の第３６７３番目の１塩基多型をプライマー配列の中央部付近で認識することができる。このことによって、酵素の認識能の効果だけでなく、１塩基のミスマッチの効果によって生じるプライマーのアニーリング効率差の効果も得られるので、より大きな増幅速度差を得ることができ、正確な変異の検出が行えるようになる。従って、本発明に係る方法によれば、従来不十分であったＶＫＯＲＣ１遺伝子上の第３６７３番目の１塩基多型の同定を正確かつ速やかに行うことができ、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の関与する薬剤応答性をより迅速に解析することができる。このことにより、個体差の著しい薬剤応答性を簡易かつ迅速に解析し、適切な治療方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、ＶＫＯＲＣ１遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ＿５８７０２０に示す塩基配列に表される。また、ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列上の第３６７３番目の一塩基多型は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子上の第３６７３番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである。
なお、配列番号１および配列番号１４は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子上の第３５９９番目〜第３７４７番目の塩基配列を示しており、ＶＫＯＲＣ１遺伝子上の第３６７３番目が、配列番号１および配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目に対応する。配列番号１の第７５番目の塩基はグアニンであり、配列番号１４の第７５番目の塩基はアデニンである。
【００１２】
本発明の方法は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出する方法であって、前記工程（１）〜（３）を含む。本発明の方法には、ＳＭＡＰＴＭ法（Nature Methods (2007), Vol.4, No.3, p.257-262および特許第３９４２６２７号公報参照）を用いることが好ましい。
【００１３】
以下、各工程について説明する。
工程（１）：（ａ１）および（ｂ）、または、（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、前記一塩基多型を検出するためのプライマーセットを用意する工程
【００１４】
以下、（ａ１）、（ａ２）、および（ｂ）のオリゴヌクレオチドについて説明する。
・（ａ１）、（ａ２）のオリゴヌクレオチド
（ａ１）、（ａ２）のオリゴヌクレオチドは、ＳＭＡＰＴＭ法において増幅用プライマーとして用いるプライマーである。
まず、（ａ１）のオリゴヌクレオチドについて説明する。（ａ１）のオリゴヌクレオチドは、塩基配列（Ｘｃ'）と、塩基配列（Ｘｃ'）の５’側に存在する塩基配列（Ｙ１'）とを含む。
塩基配列（Ｘｃ'）は、図１（ａ）に示すように、鋳型となる配列番号６に示される塩基配列（配列番号１に相補的な塩基配列）の第１００番目から第１３５番目の領域である塩基配列（Ｘ）にハイブリダイズするものである。すなわち、塩基配列（Ｘｃ'）は、配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むものである。この配列番号２の塩基配列は、配列番号１の第１５番目から第５０番目と同じ配列である。
【００１５】
また、塩基配列（Ｙ１'）は、配列番号６に示される塩基配列において、前記塩基配列（Ｘ）よりも５’側に存在する、第７１番目から第８５番目の領域である塩基配列（Ｙ）の相補配列（Ｙｃ）にハイブリダイズするものである（図１（ｂ）のＹ’）。すなわち、塩基配列（Ｙ１'）は、配列番号３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含むものである。この配列番号３の塩基配列は、配列番号６の第７１番目から第８５番目と同じ配列である。
そして、塩基配列（Ｙ１'）は、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（シトシン）を有している。
塩基配列（Ｙ１’）と塩基配列（Ｙｃ）がハイブリダイズすると、塩基配列（Ｙｃ）に含まれる一塩基多型部位（グアニンまたはアデニン）は、塩基配列（Ｙ１’）の５’末端から２〜５塩基目のいずれかの塩基上に位置することになる。
【００１６】
次に、（ａ２）のオリゴヌクレオチドについて説明する。（ａ２）のオリゴヌクレオチドは、塩基配列（Ｘｃ'）と、塩基配列（Ｘｃ'）の５’側に存在する塩基配列（Ｙ２'）とを含む。
塩基配列（Ｙ２'）は、配列番号６に示される塩基配列において、前記塩基配列（Ｘ）よりも５’側に存在する第７１番目から第８５番目の領域であり、第７５番目の塩基がＴ（チミン）である塩基配列（Ｙ）の相補配列（Ｙｃ）にハイブリダイズするものである（図１（ｂ）のＹ’）。すなわち、塩基配列（Ｙ２'）は、配列番号１３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含むものである。この配列番号１３の塩基配列は、配列番号３の第５番目がチミンである塩基配列である。
そして、塩基配列（Ｙ２'）は、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号１３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基チミンを有している。
塩基配列（Ｙ２’）と塩基配列（Ｙｃ）がハイブリダイズすると、塩基配列（Ｙｃ）に含まれる一塩基多型部位（グアニンまたはアデニン）が、塩基配列（Ｙ２’）の５’末端から２〜５塩基目のいずれかの塩基上に位置することになる。
【００１７】
このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列（Ｘｃ'）が標的核酸配列の配列（Ｘ）にハイブリダイズした状態となる。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の５’末端側に存在する配列（Ｙ１'）または（Ｙ２'）が、同核酸中に存在する配列（Ｙｃ）にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の５’末端部分においてステム−ループ構造が形成される。
【００１８】
その結果、鋳型核酸上の配列（Ｘ）が一本鎖となり、この部分に先の（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドと同一の配列を有する他のプライマーがハイブリダイズする。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズした（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される。
【００１９】
（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドの鎖長は、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長とする。当該鎖長は、好ましくは２０〜６５ヌクレオチド、より好ましくは２０〜４５ヌクレオチドとする。また、（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドを構成する配列（Ｘｃ'）と配列（Ｙ１'）、（Ｙ２'）の長さは、それぞれ、（Ｘｃ'）は好ましくは１５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとし、（Ｙ１'）および（Ｙ２'）は好ましくは５〜２５ヌクレオチド、より好ましくは５〜１５ヌクレオチドとする。
また、必要に応じて、配列（Ｘｃ'）と配列（Ｙ１'）または（Ｙ２'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
【００２０】
配列番号１：
5’-GAAGGGTAGGTGCAACAGTAAGGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCGGGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATCCTAGCATTTTGGGAGGCCGAGGTGGGTGGATCACTTGAGGTCAGGAGTT-3’
配列番号２：
5’-ACAGTAAGGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAAGAGA-3’
配列番号３：
5’-CACCCGGCCAATGGT-3’
配列番号６：
5’-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCCACCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGATTATAGGCGTGAGCCACCGCACCCGGCCAATGGTTGTTTTTCAGGTCTTCTCTTGCTTGACTTCCCAGAGGGATCCCTTACTGTTGCACCTACCCTTC-3’
配列番号１３：
5’-CACCTGGCCAATGGT-3’
配列番号１４：
5’-GAAGGGTAGGTGCAACAGTAAGGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCAGGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATCCTAGCATTTTGGGAGGCCGAGGTGGGTGGATCACTTGAGGTCAGGAGTT-3’
【００２１】
・（ｂ）のオリゴヌクレオチド
（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列の第８０番目から第１４９番目の塩基配列（Ｚ）の相補的な配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドである。すなわち、配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドである。
（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、ＳＭＡＰＴＭ法において増幅用プライマーとして用いるプライマーである。
【００２２】
また、（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｚｃ'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｗ−Ｗｃ'）を前記配列（Ｚｃ'）の５’側に含んでなるものである。
【００２３】
（ｂ）のオリゴヌクレオチドを構成する配列（Ｚｃ'）の長さは、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド、より好ましくは１５〜４０ヌクレオチドとする。また、前記折返し配列（Ｗ−Ｗｃ'）の長さは、好ましくは２〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜６０ヌクレオチド、さらに好ましくは６〜４０ヌクレオチドとする。
【００２４】
前記折返し配列（Ｗ−Ｗｃ'）の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは２〜５００ｂｐ、より好ましくは２〜５０ｂｐ、さらに好ましくは２〜３０ｂｐ、さらに好ましくは３〜２０ｂｐとする。
折返し配列（Ｗ−Ｗｃ'）のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列（Ｚｃ'）と折返し配列（Ｗ−Ｗｃ'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
配列番号４：
5’-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCCACCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGATTATAGGCGTGAGCCACCG -3’
【００２５】
前記一塩基多型を検出するためのプライマーセットは、好ましくは、さらに（ｃ）のオリゴヌクレオチドを含む。
（ｃ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号５に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドであり、ＳＭＡＰＴＭ法において増幅促進用プライマーとして用いるプライマーである。
また、（ｃ）のオリゴヌクレオチドは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズするものであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないものとされる。ここで、「競合しない」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダイズすることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。
【００２６】
（ａ１）または（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドにより標的核酸が増幅された場合には、上述のように、増幅産物は標的核酸配列とその相補配列とを交互に有するものとなる。その増幅産物の３’末端には折返し配列またはループ構造が存在し、これにより提供される相補鎖合成起点から次々に伸長反応が起こっている。（ｃ）のオリゴヌクレオチドは、このような増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ−リングすることができる。これにより、増幅産物中の標的核酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。
【００２７】
ここで、本発明の方法において、増幅促進用プライマーは必ずしも１種類に限定されるわけではなく、核酸増幅反応の迅速性および特異性を向上させるためには２種類以上のプライマーを同時に用いてもよい。これら増幅促進用プライマーは、典型的には（ａ１）または（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズするものとしてもよい。
（ｃ）のオリゴヌクレオチドを含む増幅促進用プライマーの鎖長は、好ましくは２〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜３０ヌクレオチドとする。
配列番号５：
5’-TGGTTGTTTTTCAGGTCTTCT-3’
【００２８】
本発明のプライマーセットに含まれるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる自体公知の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法およびチオホスホネート法等により合成できる。前記プライマーは、例えば、ＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。
【００２９】
工程（２）：前記プライマーセットによる核酸増幅反応を等温下で行う工程
工程（２）は工程（１）で調製したプライマーセットを用いて等温下で核酸増幅反応を行う工程である。工程（２）の核酸増幅反応はＳＭＡＰＴＭ法により行うことが好ましい。
【００３０】
以下のア）〜オ）に、これら（ａ１）または（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドによる核酸増幅反応について考えられる作用機序を説明する（図２ａおよびｂ）。
ア）まず、（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、該プライマーの伸長反応が起きる［図２ａ（ａ）］。次いで、伸長鎖（−）上においてステム−ループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列（Ｘ）に新たな（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし［図２ａ（ｂ）］、該プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（−）が脱離する。
【００３１】
イ）次に、脱離した伸長鎖（−）上の配列（Ｚ）に（ｂ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし［図２ａ（ｃ）］、該プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される［図２ａ（ｄ）］。生成した伸長鎖（＋）の３’末端と伸長鎖（−）の５’末端ではステム−ループ構造が形成され［図２ａ（ｅ）］、遊離型の３’末端である伸長鎖（＋）のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖（−）が脱離する［図２ａ（ｆ）］。
【００３２】
ウ）ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖（＋）の３’側に配列（Ｘ）および配列（Ｙｃ）を介して伸長鎖（−）が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列（Ｘ）および配列（Ｙｃ）に（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし［図２ａ（ｇ）］、その伸長反応により伸長鎖（−）が生成する［図２ａ（ｈ）および図２ｂ（ｉ）］。
【００３３】
エ）また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の３’末端に存在する折返し配列によって遊離型の３’末端が提供され［図２ａ（ｈ）］、そこからの伸長反応により［図２ｂ（ｉ）］、両端に折返し配列を有し、（ａ１）または（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する［図２ｂ（ｊ）］。この一本鎖核酸では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため［図２ｂ（ｋ）］、同様の伸長反応が繰り返され、１回の伸長反応あたり２倍の鎖長となる［図２ｂ（ｌ）および（ｍ）］。
【００３４】
オ）また、イ）［図２ｂ（ｉ）］において脱離した（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドからの伸長鎖（−）では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため［図２ｂ（ｎ）］、そこからの伸長反応により、両端にステム−ループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する［図２ｂ（ｏ）］。この一本鎖核酸においても、３’末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。
【００３５】
上記のようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドおよび（ｂ）のオリゴヌクレオチドに由来する配列が伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）との間に含まれているため、各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。
【００３６】
核酸増幅反応に用いる核酸試料は、検体、例えばヒトから取得することができる。その場合には、該検体からの所望の組織、臓器および細胞などのサンプルから当技術分野において自体公知の方法により核酸を抽出することができ、必要に応じて、抽出の後に核酸断片の大きさおよび精製純度などの条件を適度な状態に調整することもできる。その後、さらに、一般的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによる増幅反応を行うことにより、核酸試料中の被検核酸を増幅してもよい。
【００３７】
標的核酸配列を含む核酸試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。
【００３８】
核酸試料の単離は任意の方法で行うことができ、例えば、界面活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌およびフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。また、内在性ヌクレアーゼが存在する場合には、単離された核酸を精製することが好ましい。核酸の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動および密度に依存した遠心分離などにより実施することが可能である。
【００３９】
より具体的には、前記核酸試料としては、上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖核酸および全ＲＮＡまたはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖核酸のいずれも使用可能である。上記二本鎖核酸の場合は、変性工程（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）を行なって一本鎖とすることにより、より最適に利用することができる。
【００４０】
前記逆転写反応に用いられる酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ  ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。
【００４１】
標的核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖核酸は、そのまま核酸試料として用いてもよいし、ファージおよびプラスミドなどのベクターで増幅されたものを用いてもよい。
【００４２】
標的核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま核酸増幅反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、標的核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行なうこともできる。温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、ｐＨを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにｐＨを低下させる必要がある。
【００４３】
本明細書において「標的核酸」または「標的核酸配列」とは、増幅しようとする核酸またはその配列そのものだけでなく、これに相補的な配列または該配列を有する核酸をも意味する。
【００４４】
また、本明細書において「二本鎖核酸」とは、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡのいずれをも意味する。
【００４５】
核酸増幅反応に用いるポリメラーゼは、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性および耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。
【００４６】
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。
【００４７】
ＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、例えば、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｉｎａｔｅｒ  ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
【００４８】
また、上記核酸増幅反応において、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等を使うことにより、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡからの逆転写反応とｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡポリメラーゼ反応を１種類のポリメラーゼで行なうことが可能である。また、ＤＮＡポリメラーゼと、ＭＭＬＶ逆転写酵素などの上述の逆転写酵素とを組み合わせて用いてもよい。
【００４９】
核酸増幅反応において使用するその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）やベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
【００５０】
核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Ｔｍ）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、変化させることができる。したがって、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロールが挙げられる。融解温度調整剤は、一種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
【００５１】
さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミンおよび糖類などの、当該技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
【００５２】
さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの複数種の混合物とする。
【００５３】
また、核酸増幅反応において、ミスマッチ結合タンパク質を反応溶液中に添加することにより、より正確に変異を検出することが可能となる。ミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、ＨｅｘＡ、ＭＳＨ１〜６、Ｒｅｐ３、ＲＮａｓｅＡ、ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩおよびレゾルバーゼなどが挙げられる。
【００５４】
本発明の方法における核酸増幅反応は、等温で実施する。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。また、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。
【００５５】
前記一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、当該核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。
【００５６】
上記の核酸増幅反応においては、酵素が失活するか、またはプライマーをはじめとする試薬のうちの一つが使い尽くされるかのいずれかまで増幅反応が繰り返される。
【００５７】
工程（３）：核酸増幅反応で得られた核酸増幅産物を検出する工程
工程（３）は、工程（２）の核酸増幅反応で得られた核酸増幅産物を検出する工程である。当該核酸増幅産物の存在は、自体公知の核酸検出方法により検出が可能である。例えば、工程（２）において標識ヌクレオチドを使用することにより、増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出を容易にすることや該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うことができ、さらに蛍光偏光法、蛍光エネルギー転移等を利用した検出を行うことも可能である。さらに、適切な検出系を構築することにより、標的核酸を自動的に検出することや、あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。
【００５８】
また、ハイブリッドクロマト法による肉眼検出法も好適に挙げられる。例えば、電気泳動により特定のサイズの反応産物を検出する方法や、プローブとのハイブリダイゼーションによる検出等が挙げられる。さらに、磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好適に挙げられる。電気泳動による検出には、通常、エチジウムブロマイド等の蛍光物質が使用されるが、プローブとのハイブリダイゼーションを組み合わせてもよい。また、プローブは放射性同位元素による標識の他、ビオチンや蛍光物質のような非放射性の標識を施したものが使用できる。
【００５９】
本発明の方法は、さらに以下の工程（４）を含むことができる。
工程（４）：工程（３）で検出した核酸増幅産物の量から核酸増幅反応速度を検出する工程
工程（４）は、工程（３）で検出した核酸増幅産物の量を定量し、核酸増幅反応速度を検出する工程である。核酸増幅反応速度は、例えば、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ・Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ・ロシュ社製）等により検出する。
【００６０】
本発明の方法では、プライマーの配列と標的塩基配列中の対応する配列とが相補的である場合と、相補的でない場合との間に生じる核酸増幅反応の速度差により１塩基多型を検出することができる。例えば、目的とする変異（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目のグアニンがアデニンになっている変異）を有する核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた場合、当該変異が核酸試料中に存在しない場合（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目がグアニンである場合）は、当該変異が核酸試料中に存在する場合（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目がアデニンである場合）と比較して、核酸増幅反応速度が低下することとなる。
【００６１】
また、例えば、目的とする変異（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目のグアニンがアデニンになっている変異）を有しない核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた場合、当該変異が核酸試料中に存在する場合は（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目がアデニンである場合）、当該変異が核酸試料中に存在しない場合（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目のグアニンである場合）と比較して、核酸増幅反応速度が低下することとなる。
【００６２】
本発明の方法は、さらに以下の工程（５）を含むことができる。
工程（５）：配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の塩基において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが相補的である場合と相補的でない場合とに生じる核酸増幅反応の速度差により、配列番号１または配列番号１４に示されるＶＫＯＲＣ１遺伝子の第７５番目の一塩基多型を検出する工程
【００６３】
ここで、核酸増幅反応速度の速度差は、例えば、核酸増幅産物が得られるまでの時間が、好ましくは３０分以上、より好ましくは１０分以上遅れる場合に、核酸増幅反応速度の速度差があり、核酸増幅反応速度が低下したとする。
【００６４】
具体的には、例えば、同一の検体からの核酸試料を鋳型とした場合に、目的とする変異（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目のグアニンがアデニンになっている変異）を有する核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた核酸増幅反応の速度と比較して、当該変異を有しない核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた核酸増幅反応の速度が低下している場合、検体からの核酸試料には当該変異が存在すると判定することができる。
【００６５】
また、例えば、同一の検体からの核酸試料を鋳型とした場合に、目的とする変異（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目のグアニンがアデニンになっている変異）を有しない核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた核酸増幅反応の速度と比較して、当該変異を有する核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた核酸増幅反応の速度が低下している場合、検体からの核酸試料には当該変異が存在しないと判定することができる。
【００６６】
本発明の方法はさらに以下の工程（６）〜（８）を含むことができる。
工程（６）：配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的である場合の核酸増幅反応速度を基準速度とし、工程（４）で検出した核酸増幅反応速度と基準速度とを比較する工程。
工程（７）：工程（４）で検出した核酸増幅反応速度が基準速度以下となる場合、前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的でないと判定する工程。
工程（８）：工程（４）で検出した核酸増幅反応速度が基準速度以下とならない場合、前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的であると判定する工程。
【００６７】
ここで、基準速度以下とは、例えば、配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または（Ｙ２’）と核酸試料の塩基配列とが相補的である場合の核酸増幅反応速度と比較して、核酸増幅産物が得られるまでの時間が、好ましくは３０分以上、より好ましくは１０分以上遅れる場合に、基準速度以下とする。
【００６８】
具体的には、例えば、目的とする変異（例えば、配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目のグアニンがアデニンになっている変異）を有しない核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた場合、あらかじめ塩基配列を同定した当該変異を有しない核酸試料を鋳型とした場合の核酸増幅反応速度を基準速度とする。そして、工程（４）で検出した検体からの核酸試料を鋳型とした場合の核酸増幅反応速度と基準速度を比較する［工程（６）］。
【００６９】
そして、工程（４）で検出した検体からの核酸試料を鋳型とした場合の核酸増幅反応速度と基準速度を比較した結果、当該核酸増幅反応速度が基準速度以下となる場合、検体からの核酸試料には当該変異が存在すると判定することができる［工程（７）］。
【００７０】
また、工程（４）で検出した検体からの核酸試料を鋳型とした場合の核酸増幅反応速度と基準速度を比較した結果、当該核酸増幅反応速度が基準速度以下とならず、同程度の反応速度である場合、検体からの核酸試料には当該変異が存在しないと判定することができる［工程（８）］。
【００７１】
本発明の方法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。該キットは、本発明のプライマーセットを含む。また、該キットは、好ましくは少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸、少なくとも一種の鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼを含む。さらに、該キットは、融解温度調整剤、上述の酵素安定化剤、緩衝液、ミスマッチ結合タンパク質などの試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。また、以下、実施例において、ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ→Ａ）とは、配列番号１に示される塩基配列の第７５番目のグアニンがアデニンに変化した１塩基多型を示す。ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ）は、配列番号１に示される塩基配列（第７５番目の塩基がグアニン）を含む塩基配列を示す。ＶＫＯＲＣ１（７５Ａ）は、配列番号１４に示される塩基配列（第７５番目の塩基がアデニン）を含む塩基配列を示す。
【００７３】
＜実施例１＞
ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ→Ａ）の１塩基多型の検出
（１）核酸試料液の調製
すでに遺伝子配列がＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ）またはＶＫＯＲＣ１（７５Ａ）であると同定されているヒトの血液より抽出したゲノムＤＮＡ３０ｎｇを１μｌの精製水に溶解し、９８℃にて３分間加熱して１本鎖にした後、核酸試料液として用いた。
【００７４】
（２）核酸増幅反応
上記（１）で調製した核酸試料液および表１に示す組み合わせの各プライマーセットを用いて、核酸増幅反応を行った。核酸増幅反応は、６０℃にて４０分間反応させて増幅反応を実施した。また、酵素は、ＮＥＢ社のＢｓｔ．ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。
【００７５】
【表１】
2009219445.tif 000002
【００７６】
（各プライマーの配列）
〔Ｐ１〕［検出用プライマー：ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ）検出用］
５’−ACCCGGCCAATTCTGGGAAGTCAAGCA−３’（配列番号７）
〔Ｐ２〕［検出用プライマー：ＶＫＯＲＣ１（７５Ａ）検出用］
５’−ACCTGGCCAATTCTGGGAAGTCAAGCA−３’（配列番号８）
〔Ｐ３〕［検出用プライマー：ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ）検出用］
５’−CGGCCAATGGTTCTGGGAAGTCAAGCA−３’（配列番号９）
〔Ｐ４〕［検出用プライマー：ＶＫＯＲＣ１（７５Ａ）検出用］
５’−TGGCCAATGGTTCTGGGAAGTCAAGCA−３’（配列番号１０）
〔Ｐ５〕
５’−GGTATATATATATACCCACCCACCTCGGCCTC−３’（配列番号１１）
〔Ｐ６〕
５’−GTTTTTCAGGTCTTCT−３’（配列番号１２）
【００７７】
なお、〔Ｐ１〕は、配列番号３の第２番目から第１２番目の配列と、配列番号２の第１６番目から第３１番目の配列とからなるものである。〔Ｐ２〕は、配列番号１３の第２番目から第１２番目の配列と、配列番号２の第１６番目から第３１番目の配列とからなるものである。それぞれ（ａ１）、（ａ２）のオリゴヌクレオチドに相当する。
〔Ｐ１〕、〔Ｐ２〕は配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の塩基を、配列の５’末端から４塩基目で認識するプライマーであり、〔Ｐ３〕、〔Ｐ４〕は配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の塩基を、配列の５’末端で認識するプライマーである。すなわち、〔Ｐ３〕は５’末端にシトシン、〔Ｐ４〕は５’末端にチミンを有する。
〔Ｐ５〕は、配列番号４の第２２番目から第３７番目の配列を含むプライマーであり、〔Ｐ６〕は、配列番号５の第６番目から第２１番目の配列を含むプライマーである。それぞれ（ｂ）、（ｃ）のオリゴヌクレオチドに相当する。
【００７８】
（反応液の組成）
１０×Ｂｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ(ＤＦ)            ２．５μＬ
１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４                       １．５μＬ
１０％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０            ０．２５μＬ
１００％  ＤＭＳＯ                          １．２５μＬ
２５ｍＭ  各ｄＮＴＰ                        １．４μＬ
ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（２０００倍）        ０．５μＬ
１００μＭ〔Ｐ１〜４のいずれか〕            ０．８８μＬ
１００μＭ〔Ｐ５〕                          ０．８８μＬ
１００μＭ〔Ｐ６〕                          ０．４４μＬ
Ｂｓｔ.Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                 １．０μＬ
１）で得た核酸試料液(３０ｎｇ)              １．０μＬ
精製水                                      １２．４μＬ
合計                                        ２５．０μＬ
【００７９】
（３）ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ→Ａ）の１塩基多型の検出
前記（２）における核酸増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて検出した。その結果を図３および４に示す。
図３および４から分かるように、蛍光値の増幅より核酸増幅反応が起きていることが分かった。また、核酸試料の配列と検出用プライマーの配列が相補的でない場合［増幅サンプル２）、３）］は相補的である場合［増幅サンプル１）、４）］と比較して核酸増幅反応速度が低下していることが分かった。すなわち、より核酸増幅反応速度が早い検出用プライマーの種類から、検体からの核酸試料における塩基配列の第７５番目の１塩基多型が判別できることが分かった。
【００８０】
＜実施例２＞
ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ→Ａ）の１塩基多型の検出におけるプライマー配列上の１塩基多型認識部位の位置の効果
（１）核酸試料液の調製
実施例１と同じ核酸試料を用いた。
（２）核酸増幅反応
実施例１と同じ条件で、表２に示す組み合わせの各プライマーと検体を用いて核酸増幅反応を行った。
【００８１】
【表２】
2009219445.tif 000003
【００８２】
３）ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ→Ａ）の１塩基多型の検出におけるプライマー配列上の１塩基多型認識部位の位置の効果
前記（２）における核酸増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて検出した。その結果を図３および５に示す。
ここでＭｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、図３および５において蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ｃｔ値）を算出した。
【００８３】
【表３】
2009219445.tif 000004
【００８４】
表３から分かるとおり、配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列上の第７５番目の塩基を配列の５’末端から４塩基目で認識するプライマーである〔Ｐ１〕、〔Ｐ２〕を使った場合の方が、配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列上の第７５番目の塩基を配列の５’末端で認識するプライマーである〔Ｐ３〕、〔Ｐ４〕を使った場合と比べてより大きなＣｔ値差になっていることが分かる。
これらのことから、本発明の方法によれば、目的としている１塩基多型の周辺配列にＧＣが連続している配列であってもその１塩基多型の識別が行えることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドの構成を説明するための模式図である。
【図２ａ】本発明のプライマーセットを用いた核酸増幅反応の作用機序を示す模式図である。
【図２ｂ】本発明のプライマーセットを用いた核酸増幅反応の作用機序を示す模式図である。
【図３】核酸増幅反応をリアルタイム蛍光検出装置を用いて検出した結果を示す。（実施例１および２）
【図４】核酸増幅反応をリアルタイム蛍光検出装置を用いて検出した結果を示す。（実施例１）
【図５】核酸増幅反応をリアルタイム蛍光検出装置を用いて検出した結果を示す。（実施例２）
【図１】
2009219445.tif 000005
【図２ａ】
2009219445.tif 000006
【図２ｂ】
2009219445.tif 000007
【図３】
2009219445.tif 000008
【図４】
2009219445.tif 000009
【図５】
2009219445.tif 000010
【配列表】
2009219445000001.app