(57)【要約】      （修正有）【課題】生細胞内の遺伝子発現検出を可能とする核酸検出用蛍光標識マイクロビーズ、及びこの核酸検出用蛍光標識マイクロビーズを用いた二本鎖形成に関わる情報を得る方法の提供。【解決手段】検出対象核酸鎖Tに対し相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドPと、インターカレーター性蛍光色素１と、を表面に備える核酸検出用蛍光標識マイクロビーズB1。また、この核酸検出用蛍光標識マイクロビーズB1を用い、核酸検出用蛍光標識マイクロビーズB1の蛍光に係る情報を検出することによって、核酸検出用蛍光標識マイクロビーズB1と検出対象核酸鎖Tとの二本鎖形成に関わる情報を得る方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象核酸鎖に対し相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、
インターカレーター性蛍光色素と、を
表面に備える核酸検出用蛍光標識マイクロビーズ。
【請求項２】
前記インターカレーター性蛍光色素が光吸収により得た励起エネルギーを受け取って発光する蛍光色素を含有することを特徴とする請求項１記載の核酸検出用蛍光標識マイクロビーズ。
【請求項３】
請求項１記載の核酸検出用蛍光標識マイクロビーズを用い、
該核酸検出用蛍光標識マイクロビーズの蛍光に係る情報を検出することによって、
該核酸検出用蛍光標識マイクロビーズと前記検出対象核酸鎖との二本鎖形成に関わる情報を得る方法。
【請求項４】
前記検出対象核酸鎖は、生細胞内に存在することを特徴とする請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出用蛍光標識マイクロビーズ及び該核酸検出用蛍光標識マイクロビーズを用いた二本鎖形成に関わる情報を得る方法に関する。より詳しくは、インターカレーター性蛍光色素を表面に備える核酸検出用蛍光標識マイクロビーズなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
各種疾患の分子メカニズムの解明や診断方法の確立、さらには創薬ターゲットの探索等を目的として、細胞や組織内の遺伝子発現を検出する技術が種々開発され、DNAマイクロアレイやリアルタイムPCRといった遺伝子発現検出手法が広く普及してきている。
【０００３】
特許文献１には、DNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法が開示されている。また、特許文献２には、TaqMan（登録商標）プローブを用いたリアルタイムPCR法により、ヒトβディフェンシン２mRNAを定量的に検出する方法が記載されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２６９２７９号公報
【特許文献２】特開２００４−２４８６７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在汎用されているDNAマイクロアレイやリアルタイムPCRといった遺伝子発現検出手法では、まず、細胞や組織からmRNAを抽出することが必要となる。このため、生細胞内に発現する遺伝子は検出することができなかった。
【０００６】
そこで、本発明は、生細胞内の遺伝子発現検出を可能とする核酸検出用蛍光標識マイクロビーズ及びこの核酸検出用蛍光標識マイクロビーズを用いた二本鎖形成に関わる情報を得る方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題解決のため、本発明は、まず、検出対象核酸鎖に対し相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、インターカレーター性蛍光色素と、を表面に備える核酸検出用蛍光標識マイクロビーズを提供する。
この核酸検出用蛍光標識マイクロビーズは、インターカレーター性蛍光色素が光吸収により得た励起エネルギーを受け取って発光する蛍光色素を含有していてもよい。
次に、本発明は、上記核酸検出用蛍光標識マイクロビーズを用い、核酸検出用蛍光標識マイクロビーズの蛍光に係る情報を検出することによって、核酸検出用蛍光標識マイクロビーズと検出対象核酸鎖との二本鎖形成に関わる情報を得る方法を提供する。
この方法は、特に、検出対象核酸鎖が生細胞内に存在する場合、好適に用いられる。
【０００８】
ここで、本発明において、「核酸鎖」とは、一本鎖DNA及びRNAが含まれ、特にはmRNAを意味するものとする。
【０００９】
また、「インターカレーター性蛍光色素」とは、二本鎖核酸の塩基対間に結合または挿入された状態で、励起光を照射されることにより蛍光を発する蛍光色素をいうものとする。具体的には、SYBR Green（登録商標、以下同じ）、Pico Green（登録商標、以下同じ）、TOTO-1、POPO-1等のインターカレーター性蛍光色素が市販されている。本発明においては、これらを含め、上記のようなインターカレーター性を有する蛍光色素を広く採用することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、生細胞内の遺伝子発現検出を可能とする核酸検出用蛍光標識マイクロビーズ及びこの核酸検出用蛍光標識マイクロビーズを用いた二本鎖形成に関わる情報を得る方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１２】
図1は、本発明に係る核酸検出用蛍光標識マイクロビーズ（以下、単に「蛍光標識マイクロビーズ」という）の第一実施形態を示す模式図である。
【００１３】
図1中、符号B1で示す蛍光標識マイクロビーズは、検出対象核酸鎖（後述図2（B）符号T参照）に対し相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドPを表面に備えている。このオリゴヌクレオチドPは、一端で蛍光標識マイクロビーズB1本体に結合されている。
【００１４】
さらに、蛍光標識マイクロビーズB1は、オリゴヌクレオチドPの他端に標識されたかたちで、インターカレーター性蛍光色素１を表面に備えている。
【００１５】
図2は、蛍光標識マイクロビーズB1の拡大模式図である。（A）は検出対象核酸鎖Tと非結合状態の蛍光標識マイクロビーズB1、（B）は検出対象核酸鎖Tと二本鎖を形成した結合状態の蛍光標識マイクロビーズB1を示す.
【００１６】
図中、符号Ex1は、インターカレーター性蛍光色素1の励起波長に対応する励起光を示している。
【００１７】
図2（A）に示すように、オリゴヌクレオチドPが検出対象核酸鎖Tと二本鎖を形成せず、蛍光標識マイクロビーズB1が非結合状態にある場合には、励起光Ex1を蛍光標識マイクロビーズB1に照射しても、蛍光標識マイクロビーズB1から蛍光は発せられない。インターカレーター性蛍光色素１の蛍光は、二本鎖核酸の塩基対間に結合または挿入された状態においてのみ発せられるためである。
【００１８】
これに対して、図2（B）に示すように、オリゴヌクレオチドPと検出対象核酸鎖Tとが二本鎖を形成し結合状態となると、二本鎖間にインターカレーター性蛍光色素1が結合または挿入され、励起光Ex1の照射によりインターカレーター性蛍光色素1からの蛍光Em1が発せられる。
【００１９】
従って、蛍光標識マイクロビーズB1では、励起光Ex1の照射により発生する蛍光Em1を検出することにより、オリゴヌクレオチドPと検出対象核酸鎖Tとの二本鎖形成を検出し、検出対象核酸鎖Tを検出することが可能となる。
【００２０】
蛍光標識マイクロビーズB1の表面に結合するオリゴヌクレオチドPの分子数は、特に限定されない。なお、図1では、８分子のオリゴヌクレオチドPを結合した場合を示した。
【００２１】
蛍光標識マイクロビーズB1の表面へのオリゴヌクレオチドPの結合は、通常の方法によって行うことができる。一例として、アビジンとビオチンとの結合を利用し、蛍光標識マイクロビーズB1の表面にアビジンを化学結合し、オリゴヌクレオチドPの末端にビオチンを化学結合し、両者を結合する方法がある。
【００２２】
蛍光標識オリゴヌクレオチドPの配列塩基数（長さ）は、検出対象核酸鎖Tの塩基配列に応じて任意に設定することができる。通常は、15〜30bpsの長さを標準とする。また、塩基配列は検出対象核酸鎖に対して完全に相補的である必要はなく、所望のハイブリダイゼーション（二本鎖形成）反応温度において検出対象核酸鎖と二本鎖形成が可能な限りにおいて、１塩基以上のミスマッチ（非相補的塩基）を設けてもよい。
【００２３】
インターカレーター性蛍光色素１には、SYBR Green、Pico Green、TOTO-1、POPO-1等の一般に用いられるインターカレーター性蛍光色素を、必要に応じて一種以上使用することができる。２種以上のインターカレーター性蛍光色素１を用いる場合には、２波長以上の励起光を用いて各蛍光色素の蛍光検出を行う。
【００２４】
オリゴヌクレオチドP一分子に標識するインターカレーター性蛍光色素１の分子数は、特に限定されない。なお、図１では、オリゴヌクレオチドP一分子に対して一分子のインターカレーター性蛍光色素１を標識した場合を示した。
【００２５】
インターカレーター性蛍光色素1の蛍光標識オリゴヌクレオチドPへの標識方法は、インターカレーター性蛍光色素１を5’末端又は3’末端に通常の方法で標識すればよい。または、インターカレーター性蛍光色素１は、直接又はスペーサーを介して蛍光標識オリゴヌクレオチドPへ標識される。また、蛍光標識オリゴヌクレオチドPにチミンが存在するときは、インナー蛍光標識用チミンを用いて、インターカレーター性蛍光色素１を蛍光標識オリゴヌクレオチドP中に導入することもできる。なお、インナー蛍光標識用ヌクレオチドとしては、現在チミンしか提供されていないが、入手が可能であるならば、インナー蛍光標識用ヌクレオチドはチミンに限定されず、どのヌクレオチドでもよい。
【００２６】
なお、図1では、インターカレーター性蛍光色素1を5’末端、非インターカレーター性蛍光色素2を3’末端に標識した場合を示したが、これに限定されず、各蛍光色素の標識部位は任意に設定することができる。
【００２７】
図3は、蛍光標識マイクロビーズB1を用いて生細胞内の検出対象核酸鎖を検出する方法を説明するための模式図である。（A）は、生細胞内に検出対象核酸鎖Tが存在しない場合、（B）は存在する場合を示す。符号Cは生細胞を表し、符合Nは生細胞C内に存在する核酸鎖を表している。
【００２８】
まず、生細胞C内に蛍光標識マイクロビーズB1を導入する。
【００２９】
この際、生細胞C内に存在する核酸鎖Nに検出対象核酸鎖Tが含まれない場合（図3（A）参照）には、蛍光標識マイクロビーズB1は図2（A）で説明した非結合状態にあり、励起光Ex1を蛍光標識マイクロビーズB1に照射しても、蛍光標識マイクロビーズB1から蛍光は発せられない。
【００３０】
これに対して、生細胞C内に存在する核酸鎖Nに検出対象核酸鎖Tが含まれる場合（図3（B）参照）には、図2（B）で示したように、オリゴヌクレオチドPと検出対象核酸鎖Tとが二本鎖を形成し、励起光Ex1の照射によりインターカレーター性蛍光色素１からの蛍光Em1が発せられ、蛍光標識マイクロビーズB1は蛍光を呈する。
【００３１】
従って、蛍光標識マイクロビーズB1によれば、励起光Ex1の照射により発生する蛍光Em1を検出することにより、オリゴヌクレオチドPと検出対象核酸鎖Tとの二本鎖形成を検出し、生細胞C内の検出対象核酸鎖Tを検出することができる。
【００３２】
これにより、従来のDNAマイクロアレイやリアルタイムPCRといった遺伝子発現検出手法とは異なり、細胞や組織からmRNAを抽出することなく、生細胞内に発現する遺伝子を検出することが可能となる。また、従来方法のように多量のmRNAを抽出することなく、細胞一つ一つの遺伝子発現を直接検出することが可能になる。
【００３３】
生細胞C内への蛍光標識マイクロビーズB1を導入は、通常使用されるリポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、ジーンガン法などの方法により行うことができる。
【００３４】
このような生細胞C内への導入のためには、蛍光標識マイクロビーズB1の大きさは、ビーズ本体の直径で10nm〜1000nmの範囲が適当である。
【００３５】
図4は、本発明に係る蛍光標識マイクロビーズの第二実施形態を示す模式図である。
【００３６】
図4中、符号B2で示す蛍光標識マイクロビーズは、図1で示した蛍光標識マイクロビーズB１と同様に、検出対象核酸鎖Tに対し相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドPと、インターカレーター性蛍光色素1と、を表面に備えている。
【００３７】
ただし、蛍光標識マイクロビーズB１とは異なり、インターカレーター性蛍光色素１はオリゴヌクレオチドPに標識されるかたちではなく、蛍光標識マイクロビーズB１の表面に直接結合されている。
【００３８】
さらに、蛍光標識マイクロビーズB2は、インターカレーター性蛍光色素１が光吸収により得た励起エネルギーを、受け取って発光する蛍光色素2（不図示）をビーズ本体に含有している。
【００３９】
このインターカレーター性蛍光色素1から蛍光色素2へ励起エネルギーが遷移する現象は、一般に「蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence resonance energy transfer: FRET）」と呼ばれる。FRETは、ドナーとなる蛍光色素とアクセプターとなる蛍光色素との間の距離が1〜10nm程度の近傍にある場合、ドナーを励起すると励起エネルギーがアクセプターへ移動し、アクセプターが励起される現象をいう。FRETの発生は、ドナーの発光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルに重なりがあり、ドナーとアクセプターがある程度近くに存在して、適切な配行を取っていることが条件となる。
【００４０】
蛍光標識マイクロビーズB2では、インターカレーター性蛍光色素1をドナー（励起対象蛍光色素）、蛍光色素2をアクセプター（検出対象蛍光色素）として構成している。
【００４１】
蛍光色素2には、通常使用されるCy3、Cy5等やAlexa Fluor（登録商標、以下同じ）などであって、その励起スペクトルがインターカレーター性蛍光色素1の発光スペクトルと重複するものを使用する。インターカレーター性蛍光色素1及び蛍光色素2としては、例えば「表1」に示すような組合せを採用できる。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
図5は、蛍光標識マイクロビーズB2の拡大模式図である。（A）は検出対象核酸鎖Tと非結合状態の蛍光標識マイクロビーズB2、（B）は検出対象核酸鎖Tと二本鎖を形成した結合状態の蛍光標識マイクロビーズB2を示す.
【００４４】
図中、符号Ex1は、インターカレーター性蛍光色素1の励起波長に対応する励起光を示している。
【００４５】
図5（A）に示すように、オリゴヌクレオチドPが検出対象核酸鎖Tと二本鎖を形成せず、蛍光標識マイクロビーズB2が非結合状態にある場合には、励起光Ex1を蛍光標識マイクロビーズB2に照射しても、蛍光標識マイクロビーズB2から蛍光は発せられない。
【００４６】
これに対して、図5（B）に示す、オリゴヌクレオチドPと検出対象核酸鎖Tとが二本鎖を形成した結合状態では、蛍光標識マイクロビーズB2に対し励起光Ex1を照射すると、インターカレーター性蛍光色素１が励起され、FRET（図中、白抜き矢印参照）により励起エネルギーがビーズ本体に含有される蛍光色素2（不図示）に移動し、蛍光色素2から蛍光Em2が発せられる。
【００４７】
従って、蛍光標識マイクロビーズB2では、励起光Ex1の照射により発生する蛍光Em2を検出することにより、オリゴヌクレオチドPと検出対象核酸鎖Tとの二本鎖形成を検出し、検出対象核酸鎖Tを検出することが可能となる。
【００４８】
ここで、蛍光標識マイクロビーズB2のビーズ本体に蛍光色素２を含有させない場合には、図2で説明した蛍光標識マイクロビーズB1における検出と同様に、励起光Ex1の照射によりインターカレーター性蛍光色素1から発生する蛍光Em1を、FRETを介さず直接検出し、検出対象核酸鎖Tを検出することも当然に可能である。
【００４９】
蛍光標識マイクロビーズB2の表面に結合するオリゴヌクレオチドPの分子数及び塩基配列（長さ及びミスマッチの有無）、結合方法については、蛍光標識マイクロビーズB1と同様である。
【００５０】
蛍光標識マイクロビーズB2の表面に結合するインターカレーター性蛍光色素１の分子数は、特に限定されない。なお、図4では、オリゴヌクレオチドP１と同数の8分子を結合した場合を示した。
【００５１】
インターカレーター性蛍光色素1の蛍光標識マイクロビーズB2の表面への結合方法は、通常の化学結合によって行うことができるが、図5に示したように、オリゴヌクレオチドPと検出対象核酸鎖Tとが形成する二本鎖間にインターカレーター性蛍光色素1が結合、挿入可能な位置に結合する必要がある。このため、インターカレーター性蛍光色素1は、図4に示したように、マイクロビーズB2の表面のオリゴヌクレオチドP結合部位の近傍に結合する。
【００５２】
さらに、インターカレーター性蛍光色素１はビーズ表面近くに位置し、インターカレーター性蛍光色素1とビーズ本体に含有される蛍光色素2とがFRETの発生条件を満たす距離間隔（1〜10nm）に位置することが必要である。
【００５３】
図6は、蛍光標識マイクロビーズB2を用いて生細胞内の検出対象核酸鎖を検出する方法を説明するための模式図である。（A）は、生細胞内に検出対象核酸鎖が存在しない場合、（B）は存在する場合を示す。
【００５４】
図3で説明したのと同様に、生細胞C内に蛍光標識マイクロビーズB2を導入し、励起光Ex1を照射すると、生細胞C内に存在する核酸鎖Nに検出対象核酸鎖Tが含まれない場合（図6（A）参照）には、蛍光標識マイクロビーズB2から蛍光は発せられない。
【００５５】
これに対して、生細胞C内に存在する核酸鎖Nに検出対象核酸鎖Tが含まれる場合（図6（B）参照）には、図5（B）で示したように、励起光Ex1の照射によりインターカレーター性蛍光色素１が励起され、FRETを介して、ビーズ本体に含有される蛍光色素2から蛍光Em2が発せられる。
【００５６】
従って、蛍光標識マイクロビーズB2によれば、励起光Ex1の照射により発生する蛍光Em2を検出することにより、オリゴヌクレオチドPと検出対象核酸鎖Tとの二本鎖形成を検出し、生細胞C内の検出対象核酸鎖Tを検出することができる。
【００５７】
励起光Ex1及び蛍光Em2は、具体的には、例えば、インターカレーター性蛍光色素１としてSYBR Green（中心励起波長：494nm、発光中心波長：521nm）、蛍光色素２としてCy3（中心励起波長：540nm、発光中心波長：563nm）を使用する場合、励起光Ex1は488nm、蛍光Em2は580nmとする。
【００５８】
このように本発明に係る蛍光標識マイクロビーズ、及びこのマイクロビーズの二本鎖形成に関わる情報を得る方法によれば、従来のDNAマイクロアレイやリアルタイムPCRといった遺伝子発現検出手法とは異なり、細胞や組織からmRNAを抽出することなく、生細胞内に発現する遺伝子を検出することが可能となる。また、従来方法のように多量のmRNAを抽出することなく、細胞一つ一つの遺伝子発現を直接検出することが可能になる。
【００５９】
従って、例えば、本発明に係る蛍光標識マイクロビーズを用いて細胞中に発現するウイルス遺伝子を検出することにより、ウイルスに感染した細胞を、細胞が生きたままの状態で判定することが可能となる。
【００６０】
また、例えば、癌細胞中に特異的に発現する遺伝子を検出することにより、病巣組織内の癌細胞を判定し、癌の浸潤範囲を特定することが可能となる。これは癌細胞の外科的切除術への適用が考えられる。この場合細胞内への蛍光標識マイクロビーズの導入は、上記のリポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、ジーンガン法によって行う。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明に係る蛍光標識マイクロビーズ、及びこのマイクロビーズの二本鎖形成に関わる情報を得る方法は、核酸鎖の検出のために用いることができ、特に生細胞内の核酸鎖の検出のために好適に用いられる。
【００６２】
このため、細胞が生きたままの状態で、ウイルス感染細胞や癌細胞を判定することが可能となり、薬剤投与や外科手術の際に、治療又は切除対象とするこれらの細胞を特定するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明に係る核酸検出用蛍光標識マイクロビーズの第一実施形態を示す模式図である。
【図２】蛍光標識マイクロビーズB1の拡大模式図である。
【図３】蛍光標識マイクロビーズB1を用いて生細胞内の検出対象核酸鎖を検出する方法を説明するための模式図である。
【図４】本発明に係る核酸検出用蛍光標識マイクロビーズの第二実施形態を示す模式図である。
【図５】蛍光標識マイクロビーズB2の拡大模式図である。
【図６】蛍光標識マイクロビーズB2を用いて生細胞内の検出対象核酸鎖を検出する方法を説明するための模式図である。
【符号の説明】
【００６４】
B1  蛍光標識マイクロビーズ（第一実施形態）
B2  蛍光標識マイクロビーズ（第一実施形態）
C  細胞
N  核酸鎖
P  オリゴヌクレオチド
T  検出対象核酸鎖
1  インターカレーター性蛍光色素
Ex1  励起光（インターカレーター性蛍光色素）
Em1  蛍光（インターカレーター性蛍光色素）
Em2  蛍光（蛍光色素）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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