(57)【要約】      （修正有）【課題】有用代謝産物の蓄積に関与する遺伝子を解明し、該遺伝子を植物に導入することにより、有用代謝産物の蓄積が向上された形質転換植物およびその作出方法を提供する。【解決手段】以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子が導入された、形質転換植物。（ａ）特定の配列番号で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）特定の配列番号で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質。（ｃ）特定の配列番号で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子が導入された、形質転換植物。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子が導入された、形質転換植物。
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｇ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
【請求項３】
有用代謝産物が、セリン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、メチオニン、３−シアノアラニン、４−アミノ酪酸、オルニチン、およびγ−トコフェロールからなる群から選択される、請求項１または２に記載の形質転換植物。
【請求項４】
植物体、植物体の一部、植物培養細胞または種子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクター。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質
【請求項６】
以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｇ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換植物の作出方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質
【請求項８】
以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子を植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換植物の作出方法。
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｇ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
【請求項９】
請求項５または６に記載の組換えベクターを用いて遺伝子が導入される、請求項７または８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用代謝産物の蓄積が向上された形質転換植物およびその作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、人間を初めとする動物の生命維持に不可欠な糖類やアミノ酸、ビタミン類などの代謝物群を生産する重要な生物である。しかしながら、これらの重要な代謝物群を植物に高収量かつ安定的に生産させるための機構は、未だ不明な部分が多い。
【０００３】
近年、Fox hunting systemと呼ばれる、総合的に遺伝子機能解析を行うことができる方法が開発された（特許文献１）。この方法は、完全長ｃＤＮＡを高発現型ベクターにつないでシロイヌナズナに該ベクターを導入し、完全長ｃＤＮＡを高発現させたシロイヌナズナを作製するというものである。この方法を用いて、ＤＮＡ配列は決定されているが機能は不明な遺伝子の解析が進められている。
【０００４】
一方、代謝物蓄積量の変動の測定には、高速液体クロマトグラフィーやアミノ酸分析装置等が用いられてきた。これらの機器分析法はクロマトグラフィー部分の完全分離を前提に分析法を構築する必要があり、必然的に測定時間が長くなるといった問題があった。さらに、一度に検出できる代謝物ピーク数が、アミノ酸類や有機酸といった限られた種類の代謝物群をターゲットとするために数十程度になること、また、分析結果として得られたデータ解析も、トレーニングを積んだ研究者や技術者が手動で行うことになり、膨大な時間を要するという問題があった。
【０００５】
【特許文献１】再公表２００３／０１８８０８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、有用代謝産物の蓄積に関与する遺伝子を解明し、該遺伝子を植物に導入することにより、有用代謝産物の蓄積が向上された形質転換植物およびその作出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、Fox hunting systemと、代謝物の一斉分析に用いられるＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳによる高速代謝物群測定法を組合せることにより、有用代謝産物の蓄積の向上に関与する遺伝子を同定し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、要約すると以下の通りである。
[１]以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子が導入された、形質転換植物。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質
【０００９】
[２]以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子が導入された、形質転換植物。
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｇ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
【００１０】
[３]有用代謝産物が、セリン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、メチオニン、３−シアノアラニン、４−アミノ酪酸、オルニチン、およびγ−トコフェロールからなる群から選択される、[１]または[２]に記載の形質転換植物。
【００１１】
[４]植物体、植物体の一部、植物培養細胞または種子である、[１]〜[３]のいずれかに記載の形質転換植物。
【００１２】
[５]以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクター。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質
【００１３】
[６]以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｇ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
【００１４】
[７]以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換植物の作出方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質
【００１５】
[８]以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子を植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換植物の作出方法。
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｇ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
【００１６】
[９][５]または[６]に記載の組換えベクターを用いて遺伝子が導入される、［７］または［８］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に用いられる遺伝子は、有用代謝産物の蓄積の向上に関与する遺伝子であり、該遺伝子を植物に導入し、過剰発現させることにより、有用代謝産物の蓄積が向上された植物を作出することができる。本発明の形質転換植物により、高収量かつ安定的に有用代謝産物を生産することができる。また、食用植物としての商品価値を高めることができる。形質転換技術が確立されている植物であれば、上記遺伝子を高発現させることが可能となり、扱う植物を選ばずに本発明を適用できる。
【００１８】
さらに、本発明の形質転換植物は、野生型と比較して葉が長く、あるいは葉が薄緑色であるので、園芸等の分野での新たな商品価値を付与し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（１）有用代謝産物の蓄積の向上に関与する遺伝子
本発明に用いる有用代謝産物の蓄積の向上に関与する遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質、または
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であるか、あるいは、以下の（ｄ）〜（ｇ）：
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、または
（ｇ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
である。
【００２０】
本明細書において「有用代謝産物」とは、植物により生産される有用な物質をいい、具体的には、例えばアミノ酸、ビタミン、糖質、脂質、有機酸、これらの中間体、これらの誘導体等をいう。
【００２１】
本明細書において「有用代謝産物の蓄積を向上させる活性を有するタンパク質」とは、直接的または間接的を問わず、有用代謝産物の蓄積向上に関与するタンパク質をいう。
【００２２】
本明細書において「配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよく、あるいは配列番号２に示すアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよいことを意味する。
【００２３】
本明細書において「配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」の「同一性」は、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【００２４】
本明細書において「配列番号１に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」とは、例えば、配列番号１に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が欠失してもよく、配列番号１に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が他の塩基に置換してもよく、あるいは配列番号１に示す塩基配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が付加してもよいことを意味する。
【００２５】
本明細書において「配列番号１に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列」の「同一性」は、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【００２６】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが実質的に形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い核酸、すなわち配列番号１に示す塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより同一性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
【００２７】
本発明に用いる遺伝子は、配列番号１または２のいずれかの配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、該遺伝子は、上記ライブラリー等由来の核酸を鋳型とし、該遺伝子の一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは該遺伝子は、化学合成法等の当該技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
【００２８】
上記ＤＮＡまたはアミノ酸の欠失、置換および付加は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、例えばKunkel法またはGapped duplex法等により行うことができ、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Mutan-K（タカラバイオ株式会社、日本）、LA PCR in vitro mutagenesis kit（タカラバイオ株式会社））等を用いて変異を導入できる。
【００２９】
本発明に用いられる、配列番号１に示される遺伝子は、lateral organ boundaries domain protein 37と呼ばれるイネ遺伝子である（以下、ＬＯＢ３７遺伝子ともいう。The Rice Annotation Project DatabaseにアクセッションナンバーOs03g33090で登録されている。）。該イネ遺伝子は、葉の形態形成に関わる転写制御因子のファミリーに属する転写制御因子である。しかし、それ以外の機能はこれまで明らかにされておらず、本発明者らにより初めて有用代謝産物の蓄積を向上させる機能を有することが明らかにされた。
【００３０】
該ＬＯＢ３７遺伝子の機能は、Fox hunting system（Full-length cDNA Over-expressor Gene Hunting System）とガスクロマトグラフィー−飛行時間型／質量分析計（ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ）を用いてイネの遺伝子について探索した結果、見出された。
【００３１】
Fox hunting systemは、完全長ｃＤＮＡを植物に導入して高発現させることによりもたらされる形質の変化から遺伝子の機能を明らかにする方法である（特許文献１参照）。本発明では、植物に導入する完全長ｃＤＮＡとして、イネ完全長ｃＤＮＡを用い、完全長ｃＤＮＡを導入する植物として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を用いた。
【００３２】
具体的には、独立したイネの完全長ｃＤＮＡ約１３，０００種類をｃＤＮＡの等量比のプールとして調製し（標準化という）、このｃＤＮＡを、プロモーター、エンハンサー（転写エンハンサーＥ２１、オメガ配列等）、ターミネーター等の制御領域、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー等を持ったＴ−ＤＮＡベクターに組み込む。該Ｔ−ＤＮＡベクターをアグロバクテリウムに導入してイネ完全長ｃＤＮＡ発現ライブラリー（イネＦＯＸライブラリーという）を作製し、全体のｃＤＮＡの分布が該ライブラリーに反映されているかを確認後、前記アグロバクテリウムを用いてフローラルディッピング法によりシロイヌナズナの形質転換を行い、シロイヌナズナの形質転換ライン（イネＦＯＸライン）を作製する。Fox hunting systemでは、植物を何億クローンものライブラリーに感染させても、１植物に１〜２クローンしか導入されないので、植物に別々のクローンが導入された形質転換ラインを作製することができる。
【００３３】
このようにして得られた約２０，０００のイネＦＯＸラインの組換え第１世代（Ｔ１）の表現型を登録したデータベースを作成し、それを用いて、葉の形態変化などに着目して検索を行う。検索により抽出されたイネＦＯＸラインを、ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳによるスクリーニング対象ラインとする。上記Ｔ１のシロイヌナズナからＴ２種子を回収し、該Ｔ２種子を播種して、組換え第２世代（Ｔ２）を育成する。該Ｔ２について、ｃＤＮＡを組み込んでいない空ベクターを導入したシロイヌナズナのラインをコントロールとし、ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳによる有用代謝産物の分析を行う。
【００３４】
ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳは、揮発性物質の分離・分析法であるガスクロマトグラフィー（ＧＣ）に、検出器として飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ／ＭＳ）を組み合わせた装置である。ＧＣにより分離された成分は、イオン化部（本発明で用いられた装置では電子イオン化法＝ＥＩ；electron ionizationを採用）でイオン化される。ＴＯＦ／ＭＳでは、このイオンを真空中で運動させ、電磁気力を用いてイオンを質量電荷比（ｍ／ｚ）に応じて検出する。ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳによれば、低コストで、短時間に高感度かつ大量の代謝産物データを、再現性よく測定することができる。ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳによる有用代謝産物の分析は、具体的には以下のようにして行う。
【００３５】
イネＦＯＸラインのＴ２世代の植物体に、メタノール、クロロホルム、水を含む抽出溶媒を加え、ミキサーミルで植物体を破砕し、抽出を行う。抽出液を遠心分離し、その上清を、標準物質を入れたＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ測定用ガラスインサートに移し、遠心エバポレータで濃縮乾固する。次に、乾固物をメトキシアミン―ピリジン溶液、続いてＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを用いて誘導体化を行い、代謝物の揮発性を増加させた後、ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ分析に供する。ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳを用いた一斉分析により、シロイヌナズナ地上部の分析においては３００〜６００ピークの一斉観測が可能になる。
【００３６】
ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ分析で得られたデータ行列を多変量解析し、コントロールラインおよび他のイネＦＯＸラインと異なるメタボロタイプを示すイネＦＯＸラインを見出す。このメタボロタイピングにより見出された有用代謝産物を多く蓄積するイネＦＯＸラインから、導入された遺伝子を同定する。
【００３７】
このようにして同定された遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子である。配列番号１に示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、該遺伝子のゲノム配列（イントロンを含むオープンリーディングフレーム）を配列番号３に示し、ＣＤＳ配列（イントロンを含まない）を配列番号４に示す。
【００３８】
（２）組換えベクター
植物の形質転換に用いる本発明の組換えベクターは、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、または上記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ベクターとして、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができるｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系のベクター等が好適に用いられる。特にｐＢＩ系のバイナリーベクターまたは中間ベクター系が好適に用いられ、例えばｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩＧ２１１３等が挙げられる。バイナリーベクターとは、大腸菌（Escherichia coli）およびアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリウムを植物に感染させると、ベクター上にあるＬＢ配列とＲＢ配列よりなるボーダー配列で囲まれた部分のＤＮＡを植物核ＤＮＡに組み込むことができる。また、その他のベクターとして、植物に遺伝子を直接導入することができるｐＵＣ系のベクター、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等が挙げられる。さらに、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターが挙げられる。
【００３９】
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記バイナリーベクターの境界配列（ＬＢ、ＲＢ間）に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増殖する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５あるいはアグロバクテリウム・リゾゲネスＬＢＡ１３３４等に、エレクトロポレーション法等により導入し、該アグロバクテリウムを用いて植物への目的遺伝子の導入を行う。
【００４０】
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。
【００４１】
また、目的遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには目的遺伝子の上流、内部あるいは下流に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、バイナリーベクター系を使用するための複製開始点（ＴｉまたはＲｉプラスミド由来の複製開始点等）、選択マーカー遺伝子等を連結することができる。
【００４２】
プロモーターとしては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体的には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来アクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター等が挙げられる。
【００４３】
エンハンサーとしては、例えば、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域、転写エンハンサーＥ１２、オメガ配列等が挙げられる。
【００４４】
ターミネーターとしては、プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えばノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
【００４５】
選択マーカー遺伝子としては、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等が挙げられる。
【００４６】
（３）形質転換植物およびその作出方法
本発明の形質転換植物は、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子または上記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子、あるいは上記組換えベクターを対象植物に導入することによって作出することができる。本発明において「遺伝子の導入」とは、例えば公知の遺伝子工学的方法により、目的遺伝子を上記宿主植物の細胞内に発現可能な形で導入することを意味する。ここで導入された遺伝子は、宿主植物のゲノムＤＮＡに組み込まれてもよいし、外来ベクターに含有されたままで存在していてもよい。
【００４７】
遺伝子または組換えベクターの導入は、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法では、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、および植物体そのものを用いる場合（in planta法）がある。プロトプラストを用いる場合は、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドをもつアグロバクテリウム（それぞれAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenes）と共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルス（未分化培養細胞）に感染させる等により行うことができる。また、種子あるいは植物体を用いるin planta法を適用する場合、吸水種子、幼植物（幼苗）、鉢植え植物等へのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。これらの植物形質転換法は、「新版 モデル植物の実験プロトコール 遺伝学的手法からゲノム解析まで（監修 島本功 岡田清孝、秀潤社、2001年）」等の記載に従って行うことができる。
【００４８】
遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、目的遺伝子に特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲを行った後は、増幅産物についてアガロース電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらにマイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。
【００４９】
あるいは、種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、Green fluorescent protein（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）等の遺伝子を目的遺伝子の下流域に連結したベクターを作製し、該ベクターを導入したアグロバクテリウムを用いて上記と同様にして植物を形質転換させ、該レポーター遺伝子の発現を測定することによっても確認できる。
【００５０】
本発明において形質転換に用いられる植物としては、単子葉植物または双子葉植物のいずれでもよく、例えばアブラナ科（シロイヌナズナ、キャベツ、ナタネ等）、イネ科（イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ等）、ナス科（ナス、タバコ、トマト、ジャガイモ等）に属する植物が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
【００５１】
本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物器官・植物組織、これらの切片、未分化のカルス、これを酵素処理して細胞壁を除いたプロトプラスト等の植物培養細胞のいずれであってもよい。また、in planta法の場合、吸水種子や植物体全体を利用できる。
【００５２】
植物培養細胞を形質転換の対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには、既知の組織培養法により器官または個体を再生させればよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば以下のように行うことができる。
【００５３】
まず、形質転換の対象とする植物材料として植物組織またはプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノステロイド等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。
【００５４】
カルス誘導は寒天等の固形培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率よくかつ大量に行うことができる。次に継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、さらに完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（たとえばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞および組織等）で貯蔵等を行うこともできる。
【００５５】
本発明の形質転換植物は、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子または上記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子を導入した植物体全体、植物体の一部（例えば葉、花弁、茎、根、花粉等）、植物培養細胞（例えばカルス、プロトプラスト等）、種子のいずれをも包含するものである。また、該植物体の有性生殖または無性生殖により得られる子孫の植物体、およびその子孫植物体の一部、培養細胞、種子も包含するものとする。本発明の形質転換植物は、形質転換植物から種子、プロトプラスト等の繁殖材料を取得し、それを栽培または培養することによって量産することができる。
【００５６】
このようにして得られる形質転換植物は、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子または上記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の高発現により、有用代謝産物の蓄積が向上する。有用代謝産物は特に限定されないが、アミノ酸、アミノ酸関連代謝物、ビタミン中間体、糖、脂質、有機酸等が挙げられる。具体的には、３−シアノアラニン、アルギニン、アスパラギン、４−アミノ酪酸、フルクトース−６−リン酸、ガラクチノール、グルコース−６−リン酸、グルタミン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、オルニチン、２−ピペリドン、ピログルタミン酸、セリン、テトラデカン酸、γ−トコフェロールが挙げられる。より好ましくは、セリン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、メチオニン、３−シアノアラニン、４−アミノ酪酸、オルニチン、γ−トコフェロールが挙げられる。
【００５７】
また、該形質転換植物は、寒天培地を用いた育成で、野生型に比べて、葉（葉柄および／または葉身）が長くなり、寒天培地での栽培、特に土壌栽培では植物体が薄緑色になり、園芸等の分野で新品種として有用となり得る。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）Fox hunting systemによるイネＦＯＸラインの作製
本実施例では、ベクターとして、恒常発現型ベクターｐＢＩＧ２１１３Ｎ（Taji,T.らPlant J.,2002.24(4):p.p.417-426及びBecker,D.らNucleic Acid Res.,1990.18(1):p.203）にＳｆｉＩクローニングサイトを導入したｐＢＩＧ２１１３ＳＦを以下に用いた。
(i)標準化イネ完全長ｃＤＮＡミックスの作製
イネから完全長ｃＤＮＡをＣＡＰｔｒａｐｐｅｒ法によって作製した。このｃＤＮＡをＬａｍｂｄａ ＺＡＰ、あるいはＬａｍｂｄａ ｐＬＣ−１−ＢのＳｆｉＩ制限酵素部位によって挟まれる部位にクローニングした（参考文献：Seki M. et al. Plant J., 15, 707-720 (1998)）。ベクター配列を用いてｃＤＮＡの５'末端と３'末端の配列を読み、ｃＤＮＡのグルーピングを行い、独立の２０，０００種クローンを同定した（参考文献：Seki M. et al. Plant Physiol. Biochem. 39, 211-220 (2001））。次に、５０ｎｇ／μｌに調製した各クローンから０．５μｌを分取して１本のチューブに混ぜた。この混合液１μｌ分取し、２０μｌのElectric competent cell DH10B（Gibco BRL社、米国）に形質転換した。Ａｍｐが含まれた寒天培地上で生育した独立のコロニーを約２００，０００個混合し、そこからプラスミドを回収した。これを標準化イネ完全長ｃＤＮＡミックスとした。
【００５９】
(ii)イネＦＯＸライブラリーの作製
２μｇの標準化イネ完全長ｃＤＮＡミックスと、７００μｇのｐＢＩＧ２１１３ＳＦを混ぜてから同時にＳｆｉＩで完全に切断した。切断後、イソプロパノール沈殿により濃縮し、８μｌの水に溶かし１μｌの１０×バッファーと１μｌのＴ４リガーゼを混ぜ、１６℃で１昼夜反応させた。２μｌの反応液を４０μｌのElectric competent cell DH10Bに混ぜて形質転換した。
【００６０】
カナマイシン（Ｋｍ）が含まれた寒天培地上で生育した独立のコロニーを約１５０，０００個混合し、そこからプラスミド回収をした。回収した２μｌのプラスミド液を、４０μｌのElectric competent Agrobacterium cell GV3101に混ぜて形質転換した。Ｋｍが含まれる寒天培地上で生育した独立のコロニーを約１５０，０００個ＬＢ液体培地に懸濁し、１５％になるようグリセロールを加え、−８０℃にて保存した。このグリセロール溶液をイネＦＯＸライブラリーとした。
【００６１】
(iii)イネＦＯＸラインの作製
上記イネＦＯＸライブラリーを約２００，０００コロニー生育させ、ディッピング溶液に懸濁させた後、野生型シロイヌナズナ（コロンビア（Ｃｏｌ−０））のフローラルディッピングを行った。種（Ｔ１種子）を収穫し、ハイグロマイシンを含む貧栄養培地ＢＡＭ上で発芽させ、ハイグロマイシン耐性を示す約２０，０００ラインの植物のみを土に移植した。
【００６２】
（２）イネＦＯＸラインＴ２世代のＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳによるスクリーニング
(i)ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳスクリーニング対象ラインの選抜
上記（１）(iii)で得られた約２０，０００ラインのＴ１世代の表現型を登録したデータベースを作成した。このデータベースを利用して、主に葉の形態変化、あるいは色素の変化に着目して検索を行い、これらをＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳスクリーニング対象ラインとした。ここで８２１のラインが選抜された。これらのイネＦＯＸラインのＴ２種子を回収し、Ｔ２植物３５０ラインについて、ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳによるスクリーニングを行った。コントロールには、ｃＤＮＡを組み込んでいない空ベクターを導入したシロイヌナズナ（ｐＢＩＧ６ラインという）を用いた。
【００６３】
(ii)サンプリング
Ｔ２種子は、７０％エタノールおよび０．５％次亜塩素酸ナトリウム・Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００混合水溶液を用いて表面殺菌後、暗所４℃で２日間春化処理を行った。その後、１％ショ糖含有ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）寒天培地に播種した。植物生育には人工気象器（ＭＬＲ−３５０Ｈ、サンヨー社、日本）を用い、２２℃で１６時間／８時間の明暗サイクルでＴ２植物を生育させた。生育開始後１８日目に地上部をサンプリングし、３ｍｍのジルコニアボール入り２ｍｌチューブに入れ、液体窒素で直ちに凍結した。
【００６４】
(iii)試薬
ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ分析に使用する内部標準物質およびシリル化剤以外の試薬は、シグマ・アルドリッチ社（米国）のものを使用した。また、後述の抽出に用いる溶媒については和光純薬工業株式会社（日本）製の特級もしくは分析グレード以上のものを用いた。
【００６５】
(iv)サンプルの調製
スクリーニング対象の各イネＦＯＸラインにつき６個体をＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ分析に供した。植物体湿重量５０ｍｌあたり１ｍｌの抽出溶媒が、メタノール：クロロホルム：ミリＱ水＝３：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）の濃度になるよう、抽出溶媒を各植物個体に加えた。その後、ミキサーミル（ＭＭ３１０、Retsch社、ドイツ）を用いて４℃で３０Ｈｚ、３分間破砕、抽出を行った。４℃で１４０００ｘｇ、５分間遠心後、抽出液の上清１００μｌをＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ分析用内部標準物質１０種類（６種類([13C5]-proline、[2H4]-succinic acid、[2H6]-2-hydroxybenzoic acid、[13C3]-myristic acid、[13C12]-sucrose、[2H7]-cholesterol) は Cambridge Isotope Laboratories社（米国)より入手； [13C5, 15N] glutamic acid および [13C6]-glucose はSpectra Stable Isotopes社 (米国)より入手； [2H4]-1,4-diaminobutane は C/D/N ISOTOPES社(カナダ)より入手； [13C4]-hexadecanoic acid は Icon社(米国)より入手）を入れたＧＣ−ＭＳ測定用ガラスインサートに移し、溶液を遠心エバポレータ（Savant SPD2010 SpeedVac Concentrator（Thermo Electron社、米国））で濃縮乾固した。
【００６６】
次に、窒素充填したグローブボックス内で誘導体化を行った。具体的には、メトキシアミン・ピリジン溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を３０μｌ分注し、キャップをして室温で１時間振とうした。振とう後、室温で１２時間以上放置した。その後、ＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド、１％トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）、Pierce 社(米国)より入手）を３０μｌ加え、３７℃で振とうしつつ１時間反応させた。反応終了後、ｎ−ヘプタンを３０μｌ加えてＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ分析に用いた。
【００６７】
(v)ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳによる分析
ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ分析条件は、Kusano M.ら，J.Chromatogr.B, 2007.855:p.p.71-79を参考に、以下の通り行った。ＧＣ条件については、調製サンプル１μｌを、CTC CombiPAL autosampler（CTC analytics社、スイス）を用いて Agilent 6890N gas chromatograph（Agilent Technologies社、米国）にスプリットレスモードで注入した。ＧＣカラムは ３０ｍ長×０．２５ｍｍ内径 のフューズドシリカキャピラリーカラム（膜厚０．２５μｍ）Ｒｔｘ-５ Ｓｉｌ ＭＳ（RESTEK社、米国）を用いた。分析時のヘリウム流量は１ ｍｌ／分（定流量モード）、ＧＣ注入口温度は２５０℃、昇温設定を８０℃(２分)−３０℃／分−３２０℃（３．５分）とした。ＭＳ分析条件については、トランスファーライン温度を２５０℃、質量測定範囲をｍ／ｚ＝６０−８００、スペクトル取り込み時間を３０スペクトル／秒とした。
【００６８】
(vi)ＭＳスペクトルデータの加工処理
上記(v)によって得られたデータは、以下の工程によって加工処理を行った。まず、得られたデータについて、何ら処理を加えない状態でＮｅｔＣＤＦ形式により出力した。次に、本形式のデータをＭＡＴＬＡＢソフトウェア バージョン７．０(Mathworks社、米国)に取り込み、ベースライン補正、ピーク合わせ、エリア面積の行列化等を行った。最終的にサンプル×代謝物ピーク面積で構成される行列と代謝物ピークにそれぞれに対応するＭＳスペクトルを得た。代謝物ピーク同定・推定については、ＮＩＳＴ／ＥＰＡ／ＮＩＨマススペクトルライブラリ用のＮＩＳＴマススペクトルサーチプログラム（バージョン ２．０）および発明者らによるＪＡＶＡ言語のピークアノテーション用のソフトウェアを用いて、得られたマススペクトルをリファレンスマススペクトルと照合することにより行った。リファレンスマススペクトルには、Golm metabolome Database（ＧＭＤ）および理化学研究所のスペクトルライブラリーを用い、該リファレンスマススペクトルとの比較、保持指標（ＲＩ）に基づいて、代謝物ピークを同定・推定した。
【００６９】
（３）ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ分析を用いたメタボロタイピング
上記（２）(v)のＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ分析から得られた行列（サンプル×代謝物ピーク面積）に対し、ＳＩＭＣＡ−Ｐ  バージョン１１.０（Umetrics AB社、スウェーデン）を用いて多変量解析を行い、代謝物変化が認められるラインを選抜した。２つのタイプの多変量解析、すなわち教師なしの分析として主成分分析（ＰＣＡ）と、教師付き分析として部分最小二乗法−判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を行った。サンプルの分布を確認するため、ＰＬＳ−ＤＡの前にＰＣＡを行った。ＰＬＳ−ＤＡでのグループ分離に寄与するローディングを絞り込むため、各モデルの主成分１のローディングを、ジャックナイフ法を用いて算出した９９％信頼区間とファーストウエイトベクター（ｗ* 1）の値に従って選択した。
【００７０】
ＰＬＳ−ＤＡで解析した結果を図１に示す。図１のＦＯＸライン１〜１４は、上記ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ分析の対象とされたイネＦＯＸラインである。ＦＯＸライン８（以下、Ｋ１６３３１ラインという）は、他のクラスと比べてユニークなメタボロタイプを示した。ユニークなメタボロタイプを示す原因となる代謝産物を調べたところ、グルタミンやアスパラギンを初めとした代謝産物が高蓄積していることが明らかとなった。Ｋ１６３３１ラインは、ＭＳ寒天培地上で葉が少し長くなる形態変化および少し薄緑色になるといった形態変化が見られたラインであった（図２）。Ｋ１６３３１ラインに挿入されている遺伝子を調べたところ、The Rice Annotation Project DatabaseにアクセッションナンバーOs03g33090で登録されている、lateral organ boundaries domain protein 37（ＬＯＢ３７遺伝子）であることが判明した。
【００７１】
（４）ＬＯＢ３７遺伝子による有用代謝物の蓄積向上の確認
上記（３）で観察された、代謝産物が高蓄積する現象の再現性を確認するため、上記Ｋ１６３３１ラインのＬＯＢ３７遺伝子挿入部位とは異なる部位に同じ遺伝子が挿入されている独立したイネＦＯＸライン（第２世代、該ラインをＫ１９６２４ラインという）を用いて、上記と同様にしてメタボロタイピングを行った。表１に、空ベクターを導入したイネＦＯＸライン（ｐＢＩＧ６ライン）をコントロールとして、Ｋ１６３３１およびＫ１９６２４のラインで有意に変化した代謝産物とその変化を示す。Ｋ１６３３１およびＫ１９６２４のラインでは、アミノ酸類、ビタミン類、糖類等の代謝産物が有意に高蓄積することが明らかとなった。
【００７２】
【表１】
2009219357.tif 000002
【００７３】
表１に示すように、ＬＯＢ３７遺伝子を過剰発現させたシロイヌナズナでは、健康機能面での有用性がクローズアップされている４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）や、オルニチンを初めとしたアミノ酸等の有用代謝産物を恒常的に高蓄積することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】イネＦＯＸラインのＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ分析により得られたデータを多変量解析した結果を示す。
【図２】コントロールのイネＦＯＸライン（ｐＢＩＧ６）とＬＯＢ３７遺伝子が導入されたイネＦＯＸライン（Ｋ１６３３１）の寒天培地栽培での表現型（１８日目）を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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