(57)【要約】【課題】広大な面積にわたるヒ素汚染、ヒ素化合物の中でも特に毒性が高い亜ヒ酸による汚染を浄化しうる、亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性が人為的に調節されたトランスジェニック植物を提供することにある。【解決手段】シロイヌナズナの亜ヒ酸トランスポーターとしてＭＩＰ（Major intrinsic protein）ファミリーに属するＮＩＰ（Nodulin intrinsic protein）１；１を同定した。シロイヌナズナ内在性ＮＩＰ１；１遺伝子の全部又は一部が、欠損・置換・付加などにより変異し、該タンパクの発現又は機能が失われている亜ヒ酸耐性トランスジェニック植物を作出する。また、シロイヌナズナ内在性ＮＩＰ１；１タンパク質を過剰発現する亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性に優れたトランスジェニック植物を作出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性が人為的に調節されたトランスジェニック植物の作製において、以下のタンパク質（Ａ）〜（Ｃ）をコードする遺伝子ＤＮＡを使用する方法。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＩＰ１；１(Nodulin−intrinsic protein 1;1)；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
【請求項２】
亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性が人為的に調節されたトランスジェニック植物の作製において、以下の遺伝子ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）を使用する方法。
（ａ）ＮＩＰ１；１をコードする配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１又は３記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
【請求項３】
亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性が人為的に調節されたトランスジェニック植物が、亜ヒ酸の吸収又は蓄積が抑制された植物であることを特徴とする請求項１又は２の方法。
【請求項４】
亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性が人為的に調節されたトランスジェニック植物が、亜ヒ酸の吸収又は蓄積が促進された植物であることを特徴とする請求項１又は２の方法。
【請求項５】
植物の細胞膜上に人為的に発現させた以下のタンパク質（Ａ）〜（Ｃ）を、植物の亜ヒ酸トランスポーターとして使用する方法。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＩＰ１；１(Nodulin−intrinsic protein 1;1)；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
【請求項６】
植物の細胞膜上に、以下の遺伝子ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）を人為的に発現させたタンパク質を、植物の亜ヒ酸トランスポーターとして使用する方法。
（ａ）ＮＩＰ１；１をコードする配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１又は３記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
【請求項７】
以下のタンパク質（Ａ）〜（Ｃ）をコードする内在性遺伝子ＤＮＡの全部又は一部が、欠損・置換・付加などにより変異し、該タンパクの発現又は機能が失われていることを特徴とする亜ヒ酸耐性トランスジェニック植物。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＩＰ１；１(Nodulin−intrinsic protein 1;1)；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
【請求項８】
以下の内在性遺伝子ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）の全部又は一部が、欠損・置換・付加などにより変異し、該タンパクの発現又は機能が失われていることを特徴とする亜ヒ酸耐性トランスジェニック植物。
（ａ）ＮＩＰ１；１をコードする配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１又は３記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
【請求項９】
変異が、以下の（イ）〜（ハ）のいずれかであることを特徴とする請求項７又は８記載の亜ヒ酸耐性トランスジェニック植物。
（イ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の第６３番目のＧｌｙをコードするＤＮＡ配列のＧＧＡからＧＡＡへの変異；
（ロ）配列番号２に示されるアミノ酸配の第１８８番目のＴｈｒをコードするＤＮＡ配列のＡＣＴからＡＴＴへの変異；
（ハ）配列番号１に示されるＤＮＡ配列の転写開始点（第７９番目のａ）より第１３６２番目のＧからＡへの変異；
【請求項１０】
以下のタンパク質（Ａ）〜（Ｃ）を過剰発現することを特徴とする亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性に優れたトランスジェニック植物。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＩＰ１；１(Nodulin−intrinsic protein 1;1)；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
【請求項１１】
以下の遺伝子ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）がコードするタンパク質を過剰発現することを特徴とする亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性に優れたトランスジェニック植物。
（ａ）ＮＩＰ１；１をコードする配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１又は３記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
【請求項１２】
イネであることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか記載のトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜ヒ酸に耐性を示すトランスジェニック植物や、亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性に優れたトランスジェニック植物や、亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性が人為的に調節されたトランスジェニック植物の作製における亜ヒ酸トランスポーター遺伝子の使用方法や、植物の細胞膜上に人為的に発現させた植物の亜ヒ酸トランスポーターを使用する植物の育種方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然生態系の保全や健康影響への関心の高まりから、産業や生活に伴う様々な場面における重金属などの環境汚染物質の排出・蓄積の動向が注視されている。重金属に汚染された土壌は植物の正常な成長を阻害し、農作物の汚染を招くばかりでなく、土壌中にヒ素などの重金属元素が多量に含まれる地域では、これら元素による飲料水への浸出や、野生動物への影響などが問題になっている。そして、ヒ素をはじめ殆どの重金属は人間の健康に害になるだけでなく、低濃度でも発癌性を示すことから、環境から重金属を除去することは緊急な課題とされている。このような重金属汚染に対して、近年、広範囲に拡散した比較的低濃度の様々な重金属を、長期間にわたり低コストで穏やかに処理できる新しい技術としてファイトリメディエーション（phytoremediation）が注目されている。ファイトレメディエーションとは、環境汚染物質を蓄積・分解する植物の能力を利用した汚染修復・浄化技術であり、低濃度・広範囲の汚染浄化に適応可能という特長を有している。
【０００３】
ヒ素は高い毒性をもつ元素で、環境汚染が問題となっている。ヒ素は全世界で多くの人々に健康被害をもたらしている。皮膚の損傷、肺や腎臓、肝臓のガンを引き起こすほか、神経系にもダメージを与える場合がある。ヒ素に対するファイトレメディエーションの取組みとしては、効率的にヒ素を吸収するヒ素超集積植物であるシダの一種モエジマシダ（例えば、非特許文献１参照）が知られているが、モエジマシダが生育できない環境下ではこの技術を用いることはできない。地域によって気候や土壌成分など植物の生育に影響を及ぼす外的要因は異なっており、一種類の植物で世界各地の汚染地域を浄化することはできないという問題がある。
【０００４】
また、有害物質であるヒ素を吸収性又は蓄積性が遺伝子組み換え技術により人為的に調節されたトランスジェニック植物の研究開発もなされている。例えば、細胞からヒ素等の重金属を汲み出すＰ型ＡＴＰアーゼＺｎｔＡ遺伝子で形質転換した重金属耐性が強化されて吸収力が減少したトランスジェニック植物（例えば、特許文献１参照）や、ヒ素等の環境汚染物質に対して結合能を有するオリゴまたはポリペプチドおよびアポプラズマ輸送シグナルを含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む環境修復用トランスジェニック植物（例えば、特許文献２参照）や、ヒ素等の有害物質で汚染された環境浄化に用いることができるＡＢＣ輸送  蛋白質の菌類ＭＲＰサブファミリー（酵母のＹＣＦ１遺伝子等）で形質転換されたシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)等のトランスジェニック植物（例えば、特許文献３参照）や、ヒ素等の重金属を吸収することができる、土からキレート鉄の取り込みを媒介する膜タンパク質をコードするトウモロコシのイエローストライプ１遺伝子で形質転換されたトランスジェニック植物（例えば、特許文献４参照）などが提案されている。
【０００５】
【特許文献１】特表２００４−５３３２３１号公報
【特許文献２】特開２００４−１６１３０号公報
【特許文献３】特表２００５−５０５３０２号公報
【特許文献４】特表２００５−５０１５０２号公報
【非特許文献１】Q. M. Lena, A fern that hyperaccumulates arsenic, Nature, Vol.409 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、世界中で見られるヒ素汚染土壌とヒ素汚染水の浄化が緊急な課題とされている。世界各地に見られるこのようなヒ素汚染には人為的なものと自然由来のものがあり、人為的なものとしては、鉱山や工場の跡地、ヒ素を含む殺虫剤を利用していたアメリカの綿花畑を挙げることができ、自然由来のものとしては、現在深刻な問題としてアジアにおけるヒ素汚染を挙げることができる。特に、バングラディッシュとインドの西ベンガル州では、ヒ素で汚染された地下水を飲料用として用いており、また、乾期があるこの地方では井戸水を灌漑用水として利用していることから、このヒ素汚染水を用いることにより、田畑の土壌がヒ素で汚染され、同時に作物もヒ素に汚染されている。本発明の課題は、広大な面積にわたるヒ素汚染、ヒ素化合物の中でも特に毒性が高い亜ヒ酸による汚染を浄化しうる、安価かつ簡便なファイトレメディエーション技術といえる、亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性が人為的に調節されたトランスジェニック植物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、植物は亜ヒ酸（Ａｓ(III)）を植物体内に取り込んでしまうため、Ａｓ(III)により生育が阻害される、つまり、Ａｓ(III)を取り込むことができない植物は、Ａｓ(III)耐性になると予想し、このことから、Ａｓ(III)取り込みトランスポーター（輸送体）の機能欠損株はＡｓ(III)耐性になると考えた。そこで、一般に機能欠損変異株が得られる薬剤であるエチルメタンスルホン酸により変異原処理したシロイヌナズナのＭ２世代の種子を用いて、Ａｓ(III)耐性株をスクリーニングした。これまでにシロイヌナズナでＡｓ(III)耐性株は報告されておらず、Ａｓ(III)の濃度が高すぎると耐性植物が生育してこない可能性があり、低すぎると耐性株を選抜することができなくなることから、耐性植物がどの程度のＡｓ(III)濃度まで耐性になるか全く予想することができなかった。種々のＡｓ(III)濃度で予備実験を重ね、１５μＭのＡｓ(III)濃度が適していることをまず確認した。次に、約３２０００粒の種子を１５μＭ Ａｓ(III)を含む培地に播種し、根の長さを指標に選抜したところ、３株のＡｓ(III)耐性株が得られた。
【０００８】
他方、酵母や細菌、人ではＭＩＰの中でもグリセロールを輸送するアクアポリンがＡｓ(III)を輸送することが報告されており、シロイヌナズナではＮＩＰ６；１がグリセロールを輸送することが知られている。そこで、３株のＡｓ(III)耐性株について、ＮＩＰ６；１が属するＮＩＰ（Nodulin intrinsic protein）遺伝子（ＮＩＰ１；１、ＮＩＰ１；２、ＮＩＰ２；１、ＮＩＰ３；１、ＮＩＰ４；１、ＮＩＰ５；１、ＮＩＰ６；１、ＮＩＰ７；１）の他、ＰＩＰ（Plasma intrinsic protein）遺伝子などＮＩＰが属するＭＩＰ（Major intrinsic protein）ファミリーについて遺伝子変異を調べたところ、ＮＩＰ１；１遺伝子においてのみ変異が見いだされた。次いで、ＮＩＰ１；１遺伝子を破壊したシロイヌナズナのＡｓ(III)耐性を確認した。本発明は、これらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
なお、これまでに、Ａｓ(III)を輸送することが報告されている酵母や細菌、人のタンパク質と、シロイヌナズナＮＩＰ１；１タンパク質とのアミノ酸の相同性は、Ｆｐｓ１ｐ: Saccharomyce cerevisiae（酵母）２８％、ＧｌｐＦ：Escherichia coli（大腸菌）３１％、ｈＡＱＰ７：Human（ヒト）３４％、ｈＡＱＰ９：Human（ヒト）２６％であった。
【０００９】
すなわち本発明は、［１］亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性が人為的に調節されたトランスジェニック植物の作製において、以下のタンパク質（Ａ）〜（Ｃ）をコードする遺伝子ＤＮＡを使用する方法に関する。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＩＰ１；１(Nodulin−intrinsic protein 1;1)；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質； 
【００１０】
また本発明は、［２］亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性が人為的に調節されたトランスジェニック植物の作製において、以下の遺伝子ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）を使用する方法に関する。
（ａ）ＮＩＰ１；１をコードする配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列（塩基配列）を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１又は３記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
【００１１】
さらに本発明は、［３］亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性が人為的に調節されたトランスジェニック植物が、亜ヒ酸の吸収又は蓄積が抑制された植物であることを特徴とする上記［１］又は［２］の方法や、［４］亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性が人為的に調節されたトランスジェニック植物が、亜ヒ酸の吸収又は蓄積が促進された植物であることを特徴とする上記［１］又は［２］に関する。
【００１２】
また本発明は、［５］植物の細胞膜上に人為的に発現させた以下のタンパク質（Ａ）〜（Ｃ）を、植物の亜ヒ酸トランスポーターとして使用する方法に関する。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＩＰ１；１(Nodulin−intrinsic protein 1;1)；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質； 
【００１３】
また本発明は、［６］植物の細胞膜上に、以下の遺伝子ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）を人為的に発現させたタンパク質を、植物の亜ヒ酸トランスポーターとして使用する方法に関する。
（ａ）ＮＩＰ１；１をコードする配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１又は３記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ； 
【００１４】
また本発明は、［７］以下のタンパク質（Ａ）〜（Ｃ）をコードする内在性遺伝子ＤＮＡの全部又は一部が、欠損・置換・付加などにより変異し、該タンパクの発現又は機能が失われていることを特徴とする亜ヒ酸耐性トランスジェニック植物に関する。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＩＰ１；１(Nodulin−intrinsic protein 1;1)；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質； 
【００１５】
また本発明は、［８］以下の内在性遺伝子ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）の全部又は一部が、欠損・置換・付加などにより変異し、該タンパクの発現又は機能が失われていることを特徴とする亜ヒ酸耐性トランスジェニック植物に関する。
（ａ）ＮＩＰ１；１をコードする配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１又は３記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ； 
【００１６】
また本発明は、［９］変異が、以下の（イ）〜（ハ）のいずれかであることを特徴とする上記［７］又は［８］記載の亜ヒ酸耐性トランスジェニック植物に関する。
（イ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の第６３番目のＧｌｙをコードするＤＮＡ配列のＧＧＡからＧＡＡへの変異；
（ロ）配列番号２に示されるアミノ酸配の第１８８番目のＴｈｒをコードするＤＮＡ配列のＡＣＴからＡＴＴへの変異；
（ハ）配列番号１に示されるＤＮＡ配列の転写開始点（第７９番目のａ）より第１３６２番目のＧからＡへの変異；
【００１７】
また本発明は、［１０］以下のタンパク質（Ａ）〜（Ｃ）を過剰発現することを特徴とする亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性に優れたトランスジェニック植物に関する。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＩＰ１；１(Nodulin−intrinsic protein 1;1)；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質； 
【００１８】
また本発明は、［１１］以下の遺伝子ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）がコードするタンパク質を過剰発現することを特徴とする亜ヒ酸の吸収性又は蓄積性に優れたトランスジェニック植物に関する。
（ａ）ＮＩＰ１；１をコードする配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１又は３記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ亜ヒ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ； 
【００１９】
さらに本発明は、［１２］イネであることを特徴とする上記［７］〜［１１］のいずれか記載のトランスジェニック植物に関する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によると、Ａｓ(III)を取り込まない安全なＡｓ(III)耐性トランスジェニック植物や、土壌中からＡｓ(III)を効率よく吸収する環境浄化に有用なトランスジェニック植物を作出することができる。例えば、水田ではシロイヌナズナＮＩＰ１；１（ＡｔＮＩＰ１；１）遺伝子を組み込んだイネを用いると、灌漑水からヒ素を除去することが可能となり、また灌漑用井戸水のため池を作り、そこでＡｔＮＩＰ１；１遺伝子を発現させた浮遊植物（ウキクサ、ホテイアオイなど）を栽培することにより水中のヒ素を除去することも可能となる。その他、ＡｔＮＩＰ１；１過剰発現トランスジェニック植物がＡｓ(III)を多く吸収するという特性を生かして、この植物を高感度のＡｓ(III)センサーとして利用することも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明において、ＮＩＰ１；１をコードする配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＡｓ(III)トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（変異遺伝子）、配列番号１又は３記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｓ(III)トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（相同遺伝子）を併せて「本件ＤＮＡ群」ということがあり、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＩＰ１；１タンパク質、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｓ(III)トランスポーター活性を有するタンパク質、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｓ(III)トランスポーター活性を有するタンパク質を併せて「本件タンパク質群」ということがある。
【００２２】
本発明におけるＤＮＡとしては、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるシロイヌナズナＮＩＰ１；１のゲノム遺伝子ＤＮＡや、配列番号３で表されるヌクレオチド配列からなるシロイヌナズナＮＩＰ１；１のｃＤＮＡや、配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＡｓ(III)トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１又は３記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｓ(III)トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されず、また、本発明におけるタンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるシロイヌナズナＮＩＰ１；１タンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｓ(III)トランスポーター活性を有するタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｓ(III)トランスポーター活性を有するタンパク質であれば特に制限されず、ここで、「Ａｓ(III)トランスポーター活性を有するタンパク質」とは、植物などの細胞内にＡｓ(III)を輸送する作用を有するタンパク質を意味する。
【００２３】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を意味する。
【００２４】
例えば、これら１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００２５】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるヌクレオチド配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.（以後“モレキュラークローニング第２版”と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２６】
すなわち、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡのヌクレオチド配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００２７】
本発明における遺伝子ＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列情報又は配列番号２に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００２８】
具体的には、本発明の遺伝子が単離されたシロイヌナズナより、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、上記植物由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００２９】
また、上記の本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。相同遺伝子の探索方法としては、例えば、シロイヌナズナＮＩＰ１；１のアミノ酸配列をクエリーとしてＤＤＢＪに登録されたヌクレオチド配列を対象にtblastnによるＢＬＡＳＴ検索を行い、得られた配列のうちscoreが１００以上のものを相同遺伝子とみなす方法等があげられる。その場合、相同遺伝子のアミノ酸配列とＮＩＰ１；１のアミノ酸配列をclustalWにより整列した後、相同遺伝子のアミノ酸における完全一致したアミノ酸の割合をホモロジーとすることができる。このようにして、イネ（Oryza sativa）からは、Ｏｓ０８ｇ０５５９０、Ｏｓ１０ｇ３６９２４、Ｏｓ０２ｇ５１１１０、Ｏｓ０１ｇ０２１９０、Ｏｓ０１ｇ１０６００、Ｏｓ０２ｇ１３８７０、Ｏｓ０５ｇ１１５６０、Ｏｓ０６ｇ１２３１０、Ｏｓ０６ｇ３５９３０、Ｏｓ０８ｇ０５６００を、トウモロコシ（Zea mays）からは、Ｑ９ＡＴＮ１、Ｑ９ＡＴ７４、Ｑ９ＡＴＮ２、Ｑ９ＡＴＮ３、Ｑ９ＡＴＮ４を、大豆（Glycine max）からはＰ０８９９５を、それぞれ得ることができる。
【００３０】
本発明におけるタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(ｔ−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００３１】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。
【００３２】
さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の一例をそれぞれ示す配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号３に示されるヌクレオチド配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてシロイヌナズナ以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００３３】
本発明における植物としては、その種類は特に限定されず、花卉、果実植物、野菜、根菜、穀類、観葉植物、果樹を含む樹木などの植物、例えばナス科、イネ科、アブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、バラ科、マメ科、ヤシ科又はアカネ科に属する植物の他、それら植物の培養細胞、組織（種子、カルスなど）のうちから適宜選択することができるが、シロイヌナズナやイネを好適に例示することができる。
【００３４】
本件タンパク質群をコードする内在性遺伝子ＤＮＡや内在性の本件ＤＮＡ群（例えば、シロイヌナズナＮＩＰ１；１遺伝子、イネのアクセッションＮｏ．Ｏｓ０８ｇ０５５９０、Ｏｓ１０ｇ３６９２４、Ｏｓ０２ｇ５１１１０、Ｏｓ０１ｇ０２１９０、Ｏｓ０１ｇ１０６００、Ｏｓ０２ｇ１３８７０、Ｏｓ０５ｇ１１５６０、Ｏｓ０６ｇ１２３１０、Ｏｓ０６ｇ３５９３０、Ｏｓ０８ｇ０５６００の各遺伝子、トウモロコシのアクセッションＮｏ．Ｑ９ＡＴＮ１、Ｑ９ＡＴ７４、Ｑ９ＡＴＮ２、Ｑ９ＡＴＮ３、Ｑ９ＡＴＮ４の各遺伝子、大豆のアクセッションＮｏ．Ｐ０８９９５遺伝子など）の全部又は一部が、欠損・置換・付加などにより変異し、該タンパクの発現又は機能が失われているＡｓ(III)耐性トランスジェニック植物、すなわちＡｓ(III)の吸収又は蓄積が抑制されたトランスジェニック植物は、以下（１）〜（３）の方法により作出することができる。
【００３５】
（１）化学的方法
メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＳ）、２−アミノプリン、５−ブロモウラシル（５−ＢＵ）、アルキル化剤など、ヌクレオチドの構造を変化させる薬剤で種子を処理する方法で、シロイヌナズナではＤＮＡのランダムな位置にヌクレオチド置換を引き起こすＥＭＳがよく用いられる。シロイヌナズナＮＩＰ１；１では、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第６３番目のＧｌｙをコードするＤＮＡ配列のＧＧＡからＧＡＡへの変異や、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１８８番目のＴｈｒをコードするＤＮＡ配列のＡＣＴからＡＴＴへの変異や、配列番号１に示されるＤＮＡ配列の転写開始点より第１３６２番目のＧからＡへの変異を好適に例示することができる。ここで、転写開始点とは配列番号１に示される第７９番目のａを＋１とする。
【００３６】
（２）物理的方法
電離放射線を用いる方法。γ線や速中性子線などを細胞に照射してＡｔＮＩＰ１；１遺伝子等の本件ＤＮＡ群の切断を引き起こし、修復される際に欠失を生じさせる。遺伝子の全部又は一部分を欠失したり、残った遺伝子領域でコドンのフレームシフトを引き起こすことが多いので、遺伝子座の機能を完全に失った対立遺伝子が得られる頻度が高い。放射線に代えて紫外線を用いることができる。
【００３７】
（３）生物的方法
Ｔ−ＤＮＡやトランスポゾンによって挿入突然変異体を作製する方法。この生物的方法の場合、Ａｓ(III)の吸収又は蓄積が抑制されたトランスジェニック植物の作製において、本件タンパク質群をコードする内在性遺伝子ＤＮＡや本件ＤＮＡ群を使用する方法に該当する。
【００３８】
本件タンパク質群や本件ＤＮＡ群がコードするタンパク質を過剰発現するＡｓ(III)の吸収性又は蓄積性に優れたトランスジェニック植物、すなわちＡｓ(III)の吸収又は蓄積が促進されたトランスジェニック植物は、以下（４）〜（６）の方法により作出することができる。この作出方法は、Ａｓ(III)の吸収又は蓄積が促進されたトランスジェニック植物の作製において、本件タンパク質群をコードする遺伝子ＤＮＡや本件ＤＮＡ群を使用する方法に該当する。
【００３９】
（４）アグロバクテリウム法
アグロバクテリウムは、接触した植物の細胞に、自分の遺伝子の一部であるＴ−ＤＮＡ遺伝子を送り込む性質がある。この性質を利用して、アグロバクテリウムが持つプラスミドのＴ−ＤＮＡ遺伝子を除去し、そこにＡｔＮＩＰ１；１遺伝子等の本件ＤＮＡ群を組み込み、トランスジェニック植物を作出する。
【００４０】
（５）パーティクルガン法
パーティクルガン法は、ＡｔＮＩＰ１；１遺伝子等の本件ＤＮＡ群を金などの微細な金属粒子に付着させ、ガスなどの圧力で植物組織、細胞に高速で打ち込むことにより、ＤＮＡを導入する方法である。本方法は、宿主細胞の限定を受けないため、例えば、アグロバクテリウムに感染し難い植物細胞や、プロトプラストの調製が困難か、又はプロトプラストからの再生系が確立されていない植物細胞に好適に用いることができる。
【００４１】
（６）エレクトロポレーション法
ＡｔＮＩＰ１；１遺伝子等の本件ＤＮＡ群とプロトプラストとを混合し、電気刺激により細胞膜に穴をあけることにより、ＤＮＡを導入する方法である。本方法は再現性が高いことから、プロトプラストの培養が安定且つ容易であり、プロトプラストから植物体の再生が容易な植物細胞に好適に用いることができる。
【００４２】
上記（５）パーティクルガン法や（６）エレクトロポレーション法などの場合、植物細胞用の発現ベクター、例えば、Ｔｉプラスミド（Tumor inducing plasmid）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ-Ｔベクター、ｐＩＧ１２１-Ｈｍ〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、ｐＢＩ１２１〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕などのプラスミド、あるいはタバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルスなどの植物ウイルスベクター等を用いることができる。植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター〔Mol.Gen.Genet(1990) 220, 389-392〕、ルブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニットプロモーター等を挙げることができ、ターミネーターとしては、例えばノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターを挙げることができる。
【００４３】
本件タンパク質群や本件ＤＮＡ群がコードするタンパク質を過剰発現するＡｓ(III)の吸収性又は蓄積性に優れたトランスジェニック植物、すなわちＡｓ(III)の吸収又は蓄積が促進されたトランスジェニック植物は、植物の細胞膜上に本件タンパク質群や本件ＤＮＡ群を人為的に発現させたタンパク質が発現しており、このトランスジェニック植物を環境浄化等に利用することは、植物の細胞膜上に人為的に発現させた本件タンパク質群や本件ＤＮＡ群を人為的に発現させたタンパク質を、植物のＡｓ(III)トランスポーターとして使用する方法に該当する。
【００４４】
また、Ａｓ(III)の吸収性又は蓄積性に優れたトランスジェニック植物が、Ａｓ(III)を多く吸収するという特性を生かして、この植物を高感度のＡｓ(III)センサーとして利用する場合も、植物の細胞膜上に人為的に発現させた本件タンパク質群や本件ＤＮＡ群を人為的に発現させたタンパク質を、植物のＡｓ(III)トランスポーターとして使用する方法に該当する。具体的には、Saccharomyces cerevisiaeのＡｓ(III)応答性プロモーターの下流にレポーター遺伝子をつないだコンストラクトを導入した植物でＡｔＮＩＰ１；１を過剰発現させる。この植物の種子を調査区に播種し、レポーター遺伝子の応答で汚染の有無を調べることにより、広域の汚染調査を容易に進めることが可能になる。
【００４５】
さらに、Ａｓ(III)の吸収性又は蓄積性に優れたトランスジェニック植物の細胞に、被検物質の存在下、１５μＭのＡｓ(III)を接触させ、細胞内へのＡｓ(III)の取り込みの程度を測定・評価することにより、Ａｓ(III)トランスポーター活性を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。ＮＩＰ１；１のｃＲＮＡなどの本件ＤＮＡ群を注入し、Ａｓ(III)トランスポーターを細胞表面に発現している卵母細胞を用いて、同様にＡｓ(III)トランスポーター活性を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。
【００４６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
［ＮＩＰ１；１破壊株はＡｓ(III)耐性になる］
植物はＡｓ(III)を植物体内に取り込んでしまうため、Ａｓ(III)により生育が阻害される。つまり、Ａｓ(III)を取り込むことができない植物は、Ａｓ(III)耐性になることが予想される。このことから、Ａｓ(III)取り込みトランスポーターの機能欠損株はＡｓ(III)耐性になると考えられた。そこで、一般に機能欠損変異株が得られる薬剤であるエチルメタンスルホン酸により変異原処理したシロイヌナズナのＭ２世代の種子を用いて、Ａｓ(III)耐性株をスクリーニングした。約３２０００粒の種子を１５μＭ Ａｓ(III)を含む培地に播種し、根の長さを指標に選抜したところ３株（７−１，９−１，１０−１）のＡｓ(III)耐性株を得た（図１）。これらの株は野生株の根がほとんど伸びない３０μＭ  Ａｓ(III)存在下でも根の伸長が観察された。
【００４８】
次に、ＮＩＰ遺伝子破壊株のＡｓ(III)耐性を観察した。ＮＩＰ１；１はアクアグリセロポリンと呼ばれる膜タンパク質に分類される。アクアグリセロポリンは酵母や細菌、人ではＡｓ(III)の取り込みを行っていることが報告されている。シロイヌナズナが持つ８個のＮＩＰ遺伝子破壊株についてＡｓ(III)耐性を観察したところ、ＮＩＰ１；１破壊株（ｎｉｐ１；１−１，ｎｉｐ１；１−２）だけがＡｓ(III)耐性を示した（図２Ａ）。アミノ酸配列でＮＩＰ１；１と最も似ているＮＩＰ１；２やホウ素のトランスポーターであるＮＩＰ５；１はＡｓ（ＩＩＩ）耐性を示さなかった（図２Ａ）。ｎｉｐ１；１−１とｎｉｐ１；１−２はそれぞれ、第３イントロンと第５エキソンにＴ−ＤＮＡが挿入されており、ＰＣＲとリアルタイムＰＣＲにより、ｎｉｐ１；１−１とｎｉｐ１；１−２のＮＩＰ１；１のｍＲＮＡは検出されない、もしくは非常に低い発現であることを確認した（図２Ｃ，Ｄ）。
【００４９】
そこで、スクリーニングにより得られたＡｓ(III)耐性株のＮＩＰ１；１のゲノム領域のヌクレオチド配列を解析したところ、いずれの耐性株もＮＩＰ１；１にヌクレオチド置換が見つかった（図２Ｂ）。７−１と９−１はエキソン領域にヌクレオチド置換が見つかり、それぞれＧｌｙ６３をＧｌｕに、Ｔｈｒ１８８をＩｌｅに変異させるヌクレオチド置換であった。１０−１はイントロン（エキソンとイントロンの連結部）にヌクレオチド置換が見つかった（図２Ｂ）。
【００５０】
７−１，９−１，１０−１耐性株でＮＩＰ１；１のＯＲＦ (open reading frame)を増幅するプライマーでＰＣＲしたところ、１０−１のみ野生型より大きなサイズにバンドが検出された（図２Ｅ）。ヌクレオチド配列を解析した結果、１０−１では第４イントロンがスプライシングされないことがわかった。リアルタイムＰＣＲによりＮＩＰ１；１の発現量を調べたところ、野生型と７−１，９−１耐性株の間に差はなかった（図２Ｆ）。このことから、Ａｓ(III)耐性はｍＲＮＡ発現量の低下ではなくＮＩＰ１；１タンパク質の機能に異常が生じたことによると考えられる。すなわち、Ｇｌｙ６３とＴｈｒ１８８が基質の輸送に重要であることが示唆された。
【００５１】
以上の結果から、スクリーニングにより得られたＡｓ(III)耐性株の原因遺伝子はＮＩＰ１；１であること、ＮＩＰ１；１の破壊株はＡｓ(III)耐性になることが示された。
【００５２】
［ｎｉｐ１；１株では根におけるヒ素含量が低下している］
次に、ｎｉｐ１；１株のヒ素含量を測定した（図３）。１０日間、５μＭ Ａｓ(III)を含む培地で植物を栽培し、地上部と根におけるヒ素含量をＩＣＰ−ＭＳを用いて測定した。その結果、ｎｉｐ１；１−１の根におけるヒ素含量は野生株の７０％に低下していた。一方で、地上部のヒ素含量には変化がなかった。また、地上部のヒ素含量は根の１／５０であり、シロイヌナズナでは、Ａｓ(III)は地上部へ移行しにくいことがわかった。
【００５３】
［ＮＩＰ１；１はＡｓ(III)を輸送する］
これまでの実験から、ＮＩＰ１；１がＡｓ(III)を輸送することが示唆された。そこで、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)の卵母細胞を用いた実験系によりＡｓ(III)輸送活性を測定した。図４に示すように、ＮＩＰ１；１のｃＲＮＡを注入した卵母細胞はコントロールよりも多くＡｓ(III)を蓄積した。以上のことから、ＮＩＰ１；１はＡｓ(III)トランスポーターであると判断した。
【００５４】
［ＮＩＰ１；１は根で多く発現している］
ＮＩＰ１；１の発現部位をリアルタイムＰＣＲにより調べた（図５）。１０日間栽培した植物体の根と地上部から別々にＲＮＡを調製した。その結果、ＮＩＰ１；１は根で地上部の２０倍多く発現している事がわかった。これらのことから、ＮＩＰ１；１は土壌中から植物体内にＡｓ(III)を取り込むトランスポーターであることが示唆された。
【００５５】
［まとめ］
Ａｓ(III)耐性株をスクリーニングにより取得した。これらの株はＮＩＰ１；１にヌクレオチド置換が生じており、ｎｉｐ１；１株の根におけるヒ素含量は野生株より低下していた。さらに、卵母細胞の発現系を用いてＮＩＰ１；１がＡｓ(III)を輸送することを示した。また、リアルタイムＰＣＲによりＮＩＰ１；１は根で多く発現していることを明らかにした。以上のことから、ＮＩＰ１；１は土壌から植物体内にＡｓ(III)を取り込むトランスポーターである事が示唆された。以下、材料と方法について説明する。
【００５６】
［植物材料］
植物はシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana ecotype Col-0）を用いた。エチルメタンスルホン酸による変異導入種子（Arabidopsis thaliana ecotype Col-0, gl1 marker） はLEHLE SEEDSより購入した。Ｔ−ＤＮＡ挿入株はＡＢＲＣ（Arabidopsis Biological Resource Center）より入手した。ｎｉｐ１；１−１，ｎｉｐ１；１−２はそれぞれ、ＳＡＬＫ＿０１６６１７とＳＡＬＫ＿０１７９１６を取り寄せ、ＰＣＲによりＴ−ＤＮＡをホモに持つ株を選抜し実験に用いた。
【００５７】
［植物の栽培条件］
栽培に用いた培地の組成は次の通りである。１／２ MurAshige-skoog(Wako)、１％  スクロース、０．０２５％  ＭＥＳ (2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid)。ｐＨはＫＯＨで５．７に調製した。１．２％ゲランガムにより培地を固化した。Ａｓ(III)はArsenious trioxide（Wako）を用いた。ブリーチにより滅菌した種子を、固形培地に播種した。４℃で２日間春化処理した後、プレートを垂直にして２２℃、１６時間明期／８時間暗期の条件下で栽培した。
【００５８】
［ＲＮＡの調製とＰＣＲ］
全ＲＮＡの調製はRNeAsy Plant Mini kit（Qiagen）を用いて行い、RNAse-free DNAse Set (Qiagen)によりＤＮＡｓｅ処理を行った。ｃＤＮＡの合成はPrimeScript RN reagent Kit (TaKaRa)により行った。リアルタイムＰＣＲは１０倍希釈したｃＤＮＡを用い、SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa)とDicer (TaKaRa)を用いて行った。リアルタイムＰＣＲに用いたプライマーは次の通りである。ＮＩＰ１；１は５’-GCCAACTCTTGGTGCGATTG-３’（配列番号４）と５’- GTGCTACCGATTCTCACGGTC-３’（配列番号５）、ＥＦ１αは５’-CCTTGGTGTCAAGCAGATGA-３’（配列番号６）と５’-TGAAGACACCTCCTTGATGATTT-３’（配列番号７）を用いた。
【００５９】
［Xenopus laevisの卵母細胞を用いたＡｓ(III)吸収実験］
ＮＩＰ１；１を５’-GACTAGTAGATGGCGGATATCTCGGGAAACG-３’（配列番号８）と５’- GGAATTCTCAAGTGCTACCGATTCTCACGGTC-３’（配列番号９） (下線部はそれぞれ、ＳｐｅＩとＥｃｏＲＩを示す）で増幅し、ＳｐｅＩとＥｃｏＲＩで処理したのちｐＯＯ２（Ludewig, U., von Wiren, N., and Frommer, W. B. (2002). Uniport of NH4+ by the root hair plＡｓma membrane ammonium transporter LeAMT1;1. J. Biol. Chem. 277, 13548-13555）のＳｐｅ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。ｃＲＮＡはmMESSAGE mMACHINE SP6 Kit (Ambion)を用いて合成した。MEGA clear column (Ambion)により精製したｃＲＮＡ５０ｎＬ（２５ｎｇ）をXenopus laevisの卵母細胞に注入し、ＭＢＳ（８８ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＫＣｌ，２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，１５ｍＭ  Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．３ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２，０．４１ｍＭＣａＣｌ２，０．８２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１０μｇ／ｍｌ sodium penicillin, １０μｇ/ｍｌ streptomycin sulfate）溶液で２４時間、１８℃で培養した卵母細胞をＡｓ(III)吸収実験に用いた。１点に６粒の卵母細胞を用いた。１００μＭのＡｓ(III)を含むＭＢＳ溶液で培養した後、冷やしたＭＢＳ溶液で４回洗浄することにより吸収反応を停止した。
【００６０】
［ヒ素含量の測定］
試料（植物体、卵母細胞）に濃硝酸を加え、１１０℃で硝酸がなくなるまで処理した。沈殿を１０ｐｐｂゲルマニウムを含む０．０８Ｎ硝酸に懸濁し、ＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析装置）により定量した。ゲルマニウムを同時に定量し内部標準補正を加えた。また４０Ａｒ３５Ｃｌによる干渉を補正するためにＳｅ７７とＳｅ８２を測定し、ＥＰＡ（アメリカ環境保護庁）が採用している補正式（Ａｓ７５＝Ａｓ７５−３．１２７＊［Ｓｅ７７−（０．８１＊Ｓｅ８２）］）を用いてヒ素含量を算出した。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明におけるＡｓ(III)耐性株の取得を示す図である。（Ａ）Ａｓ(III)耐性株のＡｓ(III)を含む培地での生育。Ａｓ(III)耐性株の種子を、１／２ＭＳと１５ｍＭ  Ａｓ(III)を含む１／２ＭＳプレートに播種し、垂直に立てて１０日間栽培した。スケールバーは１ｃｍを示す。（Ｂ）Ａｓ(III)を０，５，１０，１５，３０ｍＭ含む１／２ＭＳ培地で１０日間栽培し、根の長さを測定した。データは１０〜１５個体の根の長さを測定した平均値と標準偏差を示す。
【図２】本発明において、ＮＩＰ１；１破壊株はＡｓ(III)耐性になることを示す図である。（Ａ）ＮＩＰ破壊株のＡｓ(III)耐性。破壊株の種子を１／２ＭＳと１５ｍＭ Ａｓ(III)を含む１／２ＭＳプレートに播種し、垂直に立てて１０日間栽培した。スケールバーは１ｃｍを示す。（Ｂ）ＮＩＰ１；１破壊株のＴ−ＤＮＡ挿入部位とＡｓ(III)耐性株のヌクレオチド置換部位。ボックスと線はそれぞれエキソンとイントロンを示す。黒いボックスはＯＲＦを示す。ゲノム図下の数値は開始コドンのＡを１番目としたときのヌクレオチド置換部位を示す。（Ｃ）、（Ｄ）野生株（Ｃｏｌ−０）と破壊株でのＮＩＰ１；１発現量。１０日間栽培した植物体よりｃＤＮＡを合成し、ＯＲＦを増幅するプライマーでＰＣＲを行った（Ｃ）。また、同じサンプルを用いてリアルタイムＰＣＲを行った（Ｄ）。（Ｅ）１０日間栽培したＡｓ(III)耐性株より調製したｃＤＮＡを用いてＯＲＦを増幅するプライマーでＰＣＲを行った。（Ｆ）（Ｅ）と同じサンプルを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。（Ｄ）と（Ｆ）相対発現量はＥＦ１αにより補正し、Ｃｏｌ−０の発現量を１とした値を示す。リアルタイムＰＣＲには（Ｂ）に示した領域を増幅するプライマーを用いた。２連でＲＮＡを抽出し、それぞれ２連でリアルタイムＰＣＲにより定量した平均値と標準偏差を示す。（ＮＤ＝not determined）
【図３】本発明のｎｉｐ１；１破壊株では根におけるヒ素含量が低下していることを示す図である。野生株（Ｃｏｌ−０）とｎｉｐ１；１−１破壊株を、５ｍＭ  Ａｓ(III)を含む１／２ＭＳ培地で１０日間栽培した。根と地上部を回収し硝酸分解した後、ＩＣＰ−ＭＳによりヒ素含量を測定した。データは３連で行った平均値と標準偏差を示す。アスタリスクは５％水準で有意に差がある事を示す（ｔ検定）。
【図４】ＮＩＰ１；１はＡｓ(III)を輸送することを示す図である。ＮＩＰ１；１  ｃＲＮＡもしくは水（Control)を注入した卵母細胞を１００ｍＭ  Ａｓ(III)を含むＭＢＳで、５，１５，３０分培養した。ＭＢＳで洗浄した後、卵母細胞に取り込まれたヒ素をＩＣＰ−ＭＳにより測定した。データは３連で実験を行った平均値と標準偏差を示す。
【図５】ＮＩＰ１；１は根で多く発現していることを示す図である。１／２ＭＳで１０日間栽培した植物体の根と地上部より調製したｃＤＮＡを用いて図２（Ｂ）に示すプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。相対発現量はＥＦ１αにより補正し、Ｃｏｌ−０の発現量を１とした値を示す。２連でＲＮＡを抽出し、それぞれ２連でリアルタイムＰＣＲにより定量した平均値と標準偏差を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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