(57)【要約】【課題】個々の分類群の未知又は既知ウイルスを検出／同定することができるオリゴヌクレオチドの集合およびそれらを設計する方法を提供する。【解決手段】ウイルスの科、属又は種で保存されているモチーフを含む、異なるアミノ酸配列から逆翻訳された脊椎動物ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドの集合。さらに、ウイルス配列データベースを編集する工程、各ヌクレオチド及びアミノ酸配列をウイルスの目、科等に分類する工程、前記データベースからモチーフ等を含むアミノ酸配列を同定する工程、前記アミノ酸配列の集合からウイルスの科、属等にわたって保存されているモチーフのサブセットを同定する工程、前記サブセットをコードするヌクレオチド配列を決定する工程、前記ヌクレオチド配列からオリゴヌクレオチド群を設計する工程、を含むウイルススクリーニングのためのオリゴヌクレオチドを設計する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドの集合であって、複数の核酸配列を含み、前記核酸配列が少なくとも約10,000、約20,000、約30,000、約40,000、又は約50,000の異なるアミノ酸配列から逆翻訳され、各アミノ酸配列が異なるウイルスの科、属又は種で保存されているモチーフを含み、前記ウイルスの科はアスファルウイルス科、ポックスウイルス科、イリドウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポリドナウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、シルコウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、アレナウイルス科、レトロウイルス科、ブンヤウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、アストロウイルス科、フラビウイルス科、ノダウイルス科、コロナウイルス科、トガウイルス科、及びアルテリウイルス科から成る群から選択され、さらに前記ウイルスの属又は種は前記科の1つに属する、前記オリゴヌクレオチドの集合。
【請求項２】
脊椎動物ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドの集合であって、複数の核酸配列を含み、前記核酸配列が少なくとも約10,000、約20,000、約30,000、約40,000、又は約50,000の異なるアミノ酸配列から逆翻訳され、各アミノ酸配列が異なるウイルスの属で保存されているモチーフを含み、前記ウイルスの属は、アスフィウイルス、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アヴィポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシポックスウイルス、ヤタポックスウイルス、エントモポックスウイルスA、エントモポックスウイルスB、エントモポックスウイルスC、イリドウイルス、クロリリドウイルス、ラナウイルス、リンホシスチウイルス、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ムロメガロウイルス、ロセオロウイルス、リンホクリプトウイルス、ラディノウイルス、イクノウイルス、ブラコウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、マストアデノウイルス、アヴィアデノウイルス、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、コルチウイルス、アクアレオウイルス、シポウイルス、フィージウイルス、フィトレオウイルス、オリザウイルス、アクアビルナウイルス、アヴィビルナウイルス、エントモビルナウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ｄ型インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ルブラウイルス、ニューモウイルス、ボルナウイルス、マルブルグウイルス、エボラウイスル、アレナウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、D型レトロウイルス群、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス、ブンヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス、トスポウイルス、カリシウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス、カルディオウイルス、アフトウイルス、アストロウイルス、フラビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、アルファノダウイルス、コロナウイルス、トロウイルス、アルファウイルス、アルテリウイルス及びデルタウイルスから成る群から選択される、前記オリゴヌクレオチドの集合。
【請求項３】
脊椎動物ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドの集合であって、複数の核酸配列を含み、前記核酸配列は1000を超えない異なるアミノ酸配列から逆翻訳され、各アミノ酸配列は下記
（a）アスファルウイルス科、ポックスウイルス科、イリドウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポリドナウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、シルコウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、アレナウイルス科、レトロウイルス科、ブンヤウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、アストロウイルス科、フラビウイルス科、ノダウイルス科、コロナウイルス科、トガウイルス科、及びアルテリウイルス科から成る群から選択されるウイルス科；
（b）アスフィウイルス、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アヴィポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシポックスウイルス、ヤタポックスウイルス、エントモポックスウイルスA、エントモポックスウイルスB、エントモポックスウイルスC、イリドウイルス、クロリリドウイルス、ラナウイルス、リンホシスチウイルス、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ムロメガロウイルス、ロセオロウイルス、リンホクリプトウイルス、ラディノウイルス、イクノウイルス、ブラコウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、マストアデノウイルス、アヴィアデノウイルス、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、コルチウイルス、アクアレオウイルス、シポウイルス、フィージウイルス、フィトレオウイルス、オリザウイルス、アクアビルナウイルス、アヴィビルナウイルス、エントモビルナウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ｄ型インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ルブラウイルス、ニューモウイルス、ボルナウイルス、マルブルグウイルス、エボラウイスル、アレナウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、D型レトロウイルス群、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス、ブンヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス、トスポウイルス、カリシウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス、カルディオウイルス、アフトウイルス、アストロウイルス、フラビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、アルファノダウイルス、コロナウイルス、トロウイルス、アルファウイルス、アルテリウイルス及びデルタウイルスから成る群から選択されるウイルス属；及び／又は
（c）（a）のウイルス科又は（b）のウイルス属に由来する1つのウイルス種、
のいずれかにおいて保存されているモチーフを含み、脊椎動物に感染する任意のウイルスを検出することができる、前記オリゴヌクレオチドの集合。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、付属CD-ROM表に列挙されたアミノ酸配列、又は、長さが少なくとも10残基であり、さらに前記付属CD-ROM表に列挙されたアミノ酸配列と90%同一であるアミノ酸配列から成る群から選択される、請求項3に記載の集合。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドの集合中の各オリゴヌクレオチドが、長さが少なくとも20ヌクレオチドであり、さらに付属CD-ROM表に列挙された配列群から選択される配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項3に記載の集合。
【請求項６】
モチーフが、ウイルスポリメラーゼ由来又はウイルスキャプシド由来のアミノ酸配列を含む、請求項1、2又は3のいずれかに記載の集合。
【請求項７】
脊椎動物の科、属又は種で保存されている脊椎動物ウイルスの非コード領域由来のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項1に記載の集合。
【請求項８】
脊椎動物の科、属又は種で保存されている脊椎動物ウイルスの非コード領域由来のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項2に記載の集合。
【請求項９】
脊椎動物の科、属又は種で保存されている脊椎動物ウイルスの非コード領域由来のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項3に記載の集合。
【請求項１０】
脊椎動物ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドの集合であって、10,000未満の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、少なくとも10のウイルス種に由来する核酸配列とハイブリダイズし、前記集合の各オリゴヌクレオチドは、付属CD-ROM表に列挙されたアミノ酸配列から逆翻訳されたヌクレオチド配列を含む、前記オリゴヌクレオチドの集合。
【請求項１１】
脊椎動物ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドの集合であって、10,000未満の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、付属CD-ROM表に列挙されたヌクレオチド配列を含む、前記オリゴヌクレオチドの集合。
【請求項１２】
脊椎動物ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドの集合であって、10,000未満の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、付属CD-ROM表に列挙されたヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、前記オリゴヌクレオチドの集合。
【請求項１３】
以下の工程を含む、ウイルススクリーニングのためのオリゴヌクレオチドを設計する方法：
（a）ウイルス配列のデータベースを編集する工程であって、前記ウイルス配列のデータベースが少なくとも10の異なるウイルス種に代表的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含む、前記工程；
（b）各ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列をウイルスの目、科、属、及び種に分類する工程；
（c）ウイルス配列データベースからアミノ酸配列の集合を同定する工程であって、前記集合の各アミノ酸配列がタンパク質ドメイン又はモチーフを含む、前記工程；
（d）工程（c）のアミノ酸配列の集合から、ウイルスの科、属及び／又は種にわたって保存されているアミノ酸配列モチーフのサブセットを同定する工程；
（e）工程（d）のアミノ酸配列モチーフのサブセットをコードするヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記ヌクレオチド配列がウイルス配列のデータベースから入手される、前記工程；及び
（f）前記アミノ酸配列モチーフのサブセットをコードするヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド群を設計する工程。
【請求項１４】
工程（f）の設計が、ウイルスデータベース中の全てのウイルス種を代表するために、アミノ酸配列モチーフのサブセットをコードするヌクレオチド配列から選択せねばならない配列の最小数を決定する集合被覆アルゴリズムの使用を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
工程（f）において、オリゴヌクレオチド群が、ウイルスのただ1つの科で保存されているアミノ酸配列モチーフをコードするヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
工程（f）において、オリゴヌクレオチド群が、ウイルスのただ1つの属で保存されているアミノ酸配列モチーフをコードするヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１７】
ウイルス配列データベースが、本質的に脊椎動物ウイルス由来であると分類された配列から成る、請求項13に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルス配列データベースが、植物又は細菌に感染するウイルス由来の配列を含まない、請求項13に記載の方法。
【請求項１９】
編集工程が、1つ以上の公開の配列収集物からウイルス由来であると同定されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を入手する工程を含み、前記公開配列データベースが、GenBank(商標)；日本DNAデータバンク（DDBJ）；欧州分子生物学研究所（EMBL）；レフセク（RefSeq）コレクション；GenBank、EMBL及びDDBJのDNA配列から翻訳されたコード領域；プロテインインフォメーションリソース（PIR）；SWISS-PROT；プロテインリサーチファウンデーション（PRF）；及びタンパク質データバンク（PDB）；並びに任意の継承機関を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項２０】
ウイルスデータベースが少なくとも10の脊椎動物ウイルス種に由来する配列を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項２１】
ウイルスデータベースが、ウイルス種の部分ゲノム配列又はあるウイルスタンパク質の部分コード配列を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項２２】
ウイルス種のヌクレオチド配列が、前記ウイルス種の2つ以上の代表的なゲノムに由来する配列を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項２３】
分類工程がさらに、各ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のウイルス亜科、血清グループ、亜種及び／又は単離株への分類を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項２４】
分類工程が、ウイルス分類学国際委員会のウイルス分類系統樹構造基準に基づく、請求項13に記載の方法。
【請求項２５】
工程（c）の同定が隠れマルコフモデルの使用を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項２６】
工程（d）が、ウイルスの科、属及び／又は種にわたって保存されているアミノ酸配列モチーフのサブセットを工程（c）のアミノ酸配列の集合から同定するために、確率論モデルの使用を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項２７】
前記確率論モデルがMEMEアルゴリズムである、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
請求項1−3、5、7、8、9、10、11又は12のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドのいずれか1つを含むマイクロアレイ。
【請求項２９】
以下の工程を含む、環境サンプル又は臨床サンプルからウイルスを同定する方法：
（a）ウイルスを含むサンプルから核酸を単離する工程；
（b）前記核酸を標識で標識する工程；
（c）前記標識した核酸を請求項1−3、5、7、8、9、10、11又は12のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの集合とハイブリダイズさせる工程；及び
（d）請求項1−3、5、7、8、9、10、11又は12のいずれかに記載の核酸集合から前記標識核酸とハイブリダイズした核酸を同定し、それによって前記ウイルスを同定する工程。
【請求項３０】
コンピューター読み取り可能媒体に保持されたコンピュータープログラム製品であって、（a）ウイルス配列データベースを編集する工程であって、前記ウイルス配列のデータベースが少なくとも10の異なるウイルスの種の代表的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含む、前記工程；
（b）各ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列をウイルスの目、科、属、及び種に分類する工程；
（c）前記ウイルス配列のデータベースからアミノ酸配列の集合を同定する工程であって、前記集合の各アミノ酸配列がタンパク質ドメインを含む、前記工程；
（d）ウイルスの科、属及び／又は種を通して保存されているアミノ酸配列モチーフのサブセットを工程（c）のアミノ酸配列の集合から同定する工程；
（e）工程（d）のアミノ酸配列モチーフのサブセットをコードするヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記ヌクレオチド配列が前記ウイルス配列のデータベースから入手される、前記工程；及び
（f）前記アミノ酸配列モチーフのサブセットをコードするヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド群を設計する工程、
をコンピューターに実行させる命令を含む、前記コンピュータープログラム製品。
【請求項３１】
以下の工程を含む、1つ以上のプライマーを設計する方法：
（a）ツリー構造構築により一対ずつ比較することによって核酸配列アラインメントの範囲内で多重核酸配列サブアラインメントの類似性行列を作成する工程；
（b）階層クラスター分類によって工程（a）の類似性行列からノードの系統樹を作成する工程、ここで各ノードはサブアラインメントの1つ以上の核酸配列を含み；
（c）工程（b）の各ノードの1つ以上の核酸配列を1つ以上のパラメーターを基準にスコアを決定することによって同定する工程；
（d）工程（b）のサブアラインメントの核酸配列を増幅することができる、工程（c）で同定された核酸配列の最小数を集合被覆アルゴリズムにより決定する工程；及び
（e）プライマー対を形成することができる核酸配列を1つ以上のパラメーターを基準に同定する工程。
【請求項３２】
ツリー構造構築アルゴリズムが、（a）全アラインメントからサブアラインメントを抽出する方法、（b）固有性のためにサブアラインメントのフィルタリングを実施する方法、及び（c）サブアラインメントを一対ごとに比較する方法を含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
階層クラスター分類アルゴリズムがユークリッド距離を基準にする、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
スコア決定関数によって測定されるパラメーターが、融解温度、GC含量、ホモポリマー列、ヘアピン／プライマーダイマー形成、縮退性、鋳型とのハイブリダイゼーション能力、鋳型とのミスマッチ総計を含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３５】
集合被覆アルゴリズムがグリーディアルゴリズムである、請求項31に記載の方法。
【請求項３６】
プライマー対を形成することができる核酸配列を同定するために用いられるパラメーターが、アンプリコンの長さ又は核酸間の融解温度の相違を含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３７】
プライマー対がウイルスアミノ酸配列をコードすることができる、請求項31に記載の方法。
【請求項３８】
以下の工程を含む、コードウイルスオリゴヌクレオチドのデータベースを設計する方法：
（a）複数のウイルス核酸配列のデータベースを編集する工程；
（b）複数のウイルスタンパク質配列のデータベースを編集する工程；
（c）工程（b）のウイルスタンパク質データベース中の任意のウイルスタンパク質配列と少なくとも90%の配列同一性を有する1つ以上のアミノ酸配列をコードすることができるウイルス核酸配列のサブセットを工程（a）のデータベースで同定する工程であって、前記ウイルス核酸配列サブセット中の核酸配列が、長さが約10から約250ヌクレオチド、約20から約65ヌクレオチド、又は約25から約60ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む、前記工程；
（d）工程（c）のオリゴヌクレオチドを翻訳し、戻し翻訳ウイルスタンパク質配列のデータベースを作成する工程；
（e）保存されている真核細胞性、ウイルス性及び細菌性タンパク質ドメインと少なくとも60%の同一性を共有するアミノ酸配列を工程（d）の戻し翻訳ウイルスタンパク質配列中で同定する工程であって、相同なクラスターを一対ごとに比較するアルゴリズムを用いる隠れマルコフモデルアルゴリズムにより実施される、前記工程；
（f）工程（e）で同定されたアミノ酸配列をコードすることができるウイルス核酸配列を工程（a）のデータベース中で同定する工程；
（g）工程（f）のウイルス核酸配列において統計的に過剰に提示される核酸配列を同定する工程であって、確率論モデルアルゴリズムにより実施される前記工程；
（h）ハイブリダイゼーションに適したオリゴヌクレオチドを工程（g）の核酸配列から同定する工程；
（i）工程（h）で同定されたオリゴヌクレオチドをウイルスオリゴヌクレオチドのデータベースに編集する工程であって、前記データベースがコードウイルスオリゴヌクレオチドのデータベースである、前記工程。
【請求項３９】
以下の工程を含む、縮退コードウイルスオリゴヌクレオチドのデータベースを設計する方法：
（a）複数のウイルス核酸配列のデータベースを編集する工程；
（b）複数のウイルスタンパク質配列のデータベースを編集する工程；
（c）工程（b）のウイルスタンパク質データベース中の任意のウイルスタンパク質配列と少なくとも90%の配列同一性を有する1つ以上のアミノ酸配列をコードすることができるウイルス核酸配列のサブセットを工程（a）のデータベース中で同定する工程であって、前記ウイルス核酸配列サブセット中の核酸配列が、長さが約10から約250ヌクレオチド、約20から約65ヌクレオチド、又は約25から約60ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む、前記工程；
（d）工程（c）のオリゴヌクレオチドを翻訳し、戻し翻訳ウイルスタンパク質配列を生成する工程；
（e）保存されている真核細胞性、ウイルス性及び細菌性タンパク質ドメインと少なくとも60%の同一性を共有するアミノ酸配列を工程（d）の戻し翻訳ウイルスタンパク質配列中で同定する工程であって、相同なクラスターをペアずつ比較するアルゴリズムによる隠れマルコフモデルアルゴリズムを用いて実施される、前記工程；
（f）工程（e）で同定されたアミノ酸配列をコードすることができる縮退ヌクレオチド配列の最小集合を同定する工程；
（g）工程（f）のウイルス核酸配列中で統計的に過剰に提示される核酸配列を同定する工程であって、確率論モデルアルゴリズムにより実施される、前記工程；
（h）ハイブリダイゼーションに適したオリゴヌクレオチドを工程（g）の核酸配列から同定する工程；
（i）工程（h）で同定されたオリゴヌクレオチドをウイルスオリゴヌクレオチドのデータベースに編集する工程であって、前記データベースが縮退コードウイルスオリゴヌクレオチドのデータベースである、前記工程。
【請求項４０】
以下の工程を含む、非コードウイルスオリゴヌクレオチドのデータベースを設計する方法：
（a）複数のウイルス核酸配列のデータベースを編集する工程；
（b）複数のウイルスタンパク質配列のデータベースを編集する工程；
（c）工程（b）のウイルスタンパク質データベース中の任意のウイルスタンパク質配列と少なくとも80%の配列同一性を有する1つ以上のタンパク質をコードすることができないウイルス核酸配列のサブセットを工程（a）のデータベースで同定する工程であって、前記ウイルス核酸配列サブセット中の核酸配列が、長さが約10から約250ヌクレオチド、約20から約65ヌクレオチド、又は約25から約60ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む、前記工程；
（d）工程（f）のウイルス核酸配列中で統計的に過剰に提示される核酸配列を同定する工程であって、確率論モデルアルゴリズムにより実施される、前記工程；
（e）ハイブリダイゼーションに適したオリゴヌクレオチドを工程（g）の核酸配列から同定する工程；
（f）工程（h）で同定されたオリゴヌクレオチドをウイルスオリゴヌクレオチドのデータベースに編集する工程であって、前記データベースが非コードウイルスオリゴヌクレオチドのデータベースである、前記工程。
【請求項４１】
オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチド関連の応用に適している、請求項31、38−40のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチド関連の応用が、マイクロアレイスクリーニング、PCR及びRNAi分析を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
請求項38の工程（a）から（g）までの工程を含む、複数のウイルス分類群にわたって又は1つのウイルス分類群内で保存されている配列パターンを同定する方法。
【請求項４４】
請求項39の工程（a）から（g）までの工程を含む、複数のウイルス分類群にわたって又は1つのウイルス分類群内で保存されている配列パターンを同定する方法。
【請求項４５】
請求項40の工程（a）から（d）までの工程を含む、複数のウイルス分類群にわたって又は1つのウイルス分類群内で保存されている配列パターンを同定する方法。
【請求項４６】
配列パターンが核酸モチーフ、アミノ酸モチーフ又はタンパク質ドメインである、請求項43−45のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
ウイルスに対する抗体を生成するための免疫原として用いることができる保存されたペプチドを生成する方法であって、請求項1−3、5、7、8、9、10、11、12、13、15、16、30、38、39又は40のいずれかに記載の1つ以上のオリゴヌクレオチドを翻訳して抗体生成のための免疫原を製造する、前記ペプチド生成方法。
【請求項４８】
プロセッサによって実行されたとき、ウイルススクリーニングのためのオリゴヌクレオチドを設計する方法を前記プロセッサに実施させるための、コンピューターが実行可能な命令を含むコンピューター読み取り可能媒体であって、前記方法が請求項13、38、39又は40のいずれかに記載の方法を含む、前記コンピューター読み取り可能媒体。
【請求項４９】
アプリケーションによるアクセスのためにデータを保存することを目的とするコンピューター読み取り可能媒体であって、保存されたツリー構造を含み、前記ツリー構造はエッジによって連結されたノードを含み、前記ノードの少なくとも1つはウイルス核酸配列を記述する最上位ノードであり、前記最上位ノードはウイルス核酸配列を記述する少なくとも2つの子ノードを有し、前記少なくとも2つの子ノードが請求項32に記載の方法によって作成される、前記コンピューター読み取り可能媒体。
【請求項５０】
請求項49に記載のアプリケーションによるアクセスのためにデータを保存することを目的とするコンピューター読み取り可能媒体であって、前記ツリー構造中のノードの少なくとも1つが、ウイルスの科、属又は種に対応する、前記コンピューター読み取り可能媒体。
【請求項５１】
インターフェース、請求項50に記載のツリー構造を収納するメモリー、及び前記メモリーとインターフェースとを連絡するプロセッサを含む、ウイルス核酸配列をツリー構造にマッピングするためのシステムであって、前記プロセッサが、
（a）核酸ハイブリダイゼーション情報を前記インターフェースから受け取り、
（b）プロセッサにより実行されたとき、プロセッサに工程（a）の核酸ハイブリダイゼーション情報を請求項50に記載のツリー構造の少なくとも1つのノードにマッピングさせ出力を発生させる命令を含む命令を前記メモリーから受け取り、
（c）前記出力を前記インターフェースに送る、
前記ウイルス核酸配列をマッピングするためのシステム。
【請求項５２】
インターフェースがネットワークと連絡している、請求項51に記載の系。
【請求項５３】
核酸ハイブリダイゼーション情報がマイクロアレイに由来する、請求項51に記載の系。
【請求項５４】
核酸ハイブリダイゼーション情報が陽性シグナルのパターンを含む、請求項51に記載の系。
【請求項５５】
プロセッサがメモリーから、
（a）前記ハイブリダイゼーション情報の陽性シグナルパターンを分析し、
（b）内部コントロール及び位置マーカー由来のシグナルを除去し、
（c）陽性シグナルのパターンがウイルスの科、属又は種と一致する確率を計算する、という命令を受け取る、請求項51に記載の系。
【請求項５６】
（a）プロセッサ、
（b）前記プロセッサと連結された記憶装置、
（c）前記記憶装置に保持された請求項1−3に記載のデータベース、及び
（d）遺伝子配列及び前記遺伝子配列のハイブリダイゼーションの結果を入力する、プロセッサと連結された入力装置、
を含む感染若しくは疾患の診断、監視、又は発見の少なくとも1つを目的とするシステムであって、
前記プロセッサは新規な遺伝子情報について前記データベースをチェックして前記データベースを前記遺伝子情報に関し更新し、
前記プロセッサは前記遺伝子配列のハイブリダイゼーションの結果を分析し、前記遺伝子配列のデータベース中における場所に関する情報を作成する、
前記システム。
【請求項５７】
以下の工程を含む、遺伝子情報のデータベースを更新する方法：
（a）少なくとも1つの情報源から1つ以上の配列をある間隔で入手する工程、
（b）工程（a）で入手した前記1つ以上の配列と請求項1−3のいずれかに記載のデータベース中の配列との間の相違を調和させる工程、
（c）前記1つ以上の配列をデータベースに加えるべきか否かを決定する工程、及び
（d）前記1つ以上の配列をデータベースに加える工程、ここで前記データベースの遺伝子情報は更新される。
【請求項５８】
決定する工程が、ヌクレオチドミスマッチのプログラム可能な相違内で、配列がデータベースに既に存在する少なくとも1つの配列によってカバーされるか否かを決定することを含む、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
請求項28に記載のマイクロアレイを含むウイルス検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願及び刊行物は参照により本明細書に含まれる。これらの文献は、本明細書に開示する本発明の発明日における当該業者に公知の技術状況をより完全に記述するために参照により本明細書に含まれる。
USSN 60/861,365（2006年11月28日）の部分として提出した7枚のコンパクトディスクはその全体が参照により本明細書に含まれる。前記CD上のファイルの名称は以下のとおりである：
【０００２】
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2009131242.tif 000007
【０００３】
前記コンパクトディスクは本明細書では“付属CD-ROM表”、“付属CD-ROMプログラムリスト”と呼ばれ、表1−5を含む。付属CD-ROM表は、種々の分類群に典型的な脊椎動物ウイルスのアミノ酸配列及び核酸配列に関する情報の表を含む。各表は、種々の脊椎動物ウイルス科についての情報を含み、前記コンパクトディスクで別個のプレーンテキスト（ASCII）ファイルとして存在する。コンパクトディスク上では、これらの表は以下の表題を有する：アデノウイルス科(Adenoviridae)、アデノウイルス科データ、アレナウイルス科(Arenaviridae)、アレナウイルス科データ、アルテリウイルス科(Arteriviridae)、アルテリウイルス科データ、アスファルウイルス科(Asfarviridae)、アスファルウイルス科データ、アストロウイルス科(Astroviridae)、アストロウイルス科データ、ビルナウイルス科(Birnaviridae)、ビルナウイルス科データ、ボルナウイルス科(Bornaviridae)、ボルナウイルス科データ、ブンヤウイスル科(Bunyaviridae)、ブンヤウイルス科データ、カリシウイルス科(Caliciviridae)、カリシウイルス科データ、シルコウイルス科(Circoviridae)、シルコウイルス科データ、コロナウイルス科(Coronaviridae)、コロナウイルス科データ、デルタウイルス(Deltavirus)、デルタウイルスデータ、フィロウイルス科(Filoviridae)、フィロウイルス科データ、フラビウイルス科(Flaviviridae)、フラビウイルス科データ、ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)、ヘパドナウイルス科データ、E型肝炎様ウイルス(Hepatitis E-like)、Ｅ型肝炎様ウイルスデータ、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、ヘルペスウイルス科データ、伝染性喉頭気管炎様ウイルス(Infectious laryngotrachetitis-like viruses)、伝染性喉頭気管炎様ウイルスデータ、イリドウイルス科(Iridoviridae)、イリドウイルス科データ、ノダウイルス科(Nodaviridae)、ノダウイルス科データ、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、オルトミクソウイルス科データ、パピローマウイルス科(Papillomaviridae)、パピローマウイルス科データ、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、パラミクソウイルス科データ、パルボウイルス科(Parvoviridae)、パルボウイルス科データ、ピコルナウイルス科(Picornaviridae)、ピコルナウイルス科データ、ポリオーマウイルス科（Polyomaviridae）、ポリオーマウイルス科データ、ポックスウイルス科(Poxviridae)、ポックスウイルス科データ、レオウイルス科(Reoviridae)、レオウイルス科データ、レトロウイルス科(Retrovirida)、レトロウイルス科データ、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)、ラブドウイルス科データ、トガウイルス科(Togaviridae)、トガウイルス科データ。
本特許書類の一部分は著作権保護の対象である構成要素（付属CD-ROMを含む）を含んでいる。本著作権所有者は、何人による本特許書類又は特許内容のファクシミリによる再生に対しても、前記が特許商標局の特許ファイル又は記録として出現するときは意義を唱えないが、それ以外においては全著作権を留保する。
【背景技術】
【０００４】
感染症の伝染病原体及び臨床管理の効果的な制御には、迅速で正確で弁別的な分析を提供することができるツールが要求される。臨床サンプル及び環境サンプル中の未知の微生物病原体を検出する遺伝学的方法は、そのような病原体の高い変異率を克服する能力を必要とする。この高い変異率及び高度の微生物の種分化を克服するために、保存配列に基づく分子プローブが必要である。しかしながらそのようなプローブは以下の理由からこれまで作成されていない：（1）包括的で正確にキュレーションされた（curated）微生物データベースが存在しない；（2）そのようなデータベースの完全な配列分析が存在しない；（3）そのようなデータベースを分析し、環境サンプル又は臨床サンプル中の広範囲の病原体を検出することができる分子プローブ収集物又は集合を分析する新規な方法が存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、個々の分類群の任意の未知又は既知ウイルスを検出／同定することができるオリゴヌクレオチドを設計する方法を提供する。本発明は、バイオインフォマティクスツール及びデータベースを確立し、これを実装しさらにその有効性を立証してマイクロアレイの設計及び更新を支援にする方法を提供する。本発明は、ウイルス配列の最新情報を取り出すための、更新され統合されたICTV/NCBIデータベースを維持及びキュレーションする（curate）ための、ウイルス標的の無作為抽出サンプルを用いてマイクロアレイの性能を試験することによりデータベースの有効性を立証するための、及びハイブリダイゼーションの結果の自動評価を目的とするアレイ分析ソフトを開発するためのソフトの設計並びに実行を提供する。
本発明はさらに、選別ウイルス性因子及びウイルスの検出並びに種同定に対して特殊化されたアレイを提供する。本発明は、オリゴヌクレオチド標的の設計、サブアレイのプリンティング、感染培養細胞から核酸抽出物の入手、及び感染培養抽出物を用いるアッセイの性能の最適化を提供する。
本発明はさらに、臨床材料と一緒に使用するためのアレイプロトコル及び方法を提供する。本発明は、生理学的に関連する区画内（血液、尿、喀痰、糞便及び組織を含む）のウイルス性選別病原因子を検出し、さらに感染した動物又は人間から核酸抽出物を入手及び分析するために最適化された方法を提供する。
本発明は、選別した優先病原因子、選別した病原因子感染による徴候及び症状と類似する徴候及び症状を引き起こす可能性がある病原因子、及びインフルエンザウイルスによる感染の弁別的診断を可能にする、保健所、病院拠点臨床検査室、及び個別ケア（point-of-care）における使用を目的とする、安定で感度の高いウイルスマイクロアレイアッセイを確立する方法を提供する。プログラムの成功の確率を高める特徴には下記が含まれる（ただしこれらに限定されない）：（1）臨床微生物学、バイオインフォマティクス、及び分子診断学における専門的知識；（2）感度が高く安定なマイクロアレイプラットフォーム；（3）選別した病原体及びウイルス配列へのアクセス；（4）感染培養細胞、自然感染及び実験的感染動物、並びに選別ウイルス性因子又はウイルスによる人間の感染犠牲者からの抽出物の包括的な目録；（5）アッセイの最適化、有効性の実証及びアッセイ実施のために臨床サンプルを共有して国際的公衆衛生を支援することができる公開国際監査ネットワークにおける提携；（6）診断試薬の製造、ライセンス取得及び販売の専門的知識を有する業務提携者。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ある特徴では、本発明は、関連を有するが必ずしも同一ではない配列標的とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を同定するための方法又はシステムを提供する。前記方法は、コンセンサスプライマー及び標的設計のための自動化された系を提供することができる。そのような方法又はシステムは、例えばコンセンサスPCR用プライマー及びDNAマイクロアレイ用標的（すなわちオリゴヌクレオチド）を設計するために用いることができる。
ある特徴では、本発明は、遺伝子ではなく分類群を識別する配列を同定する方法を提供する。前記方法は、縮退プライマー及び標的の設計を可能にする。本発明はまた、類似するが同一ではない配列の検出及び発見を促進するだけでなく、特異的診断の果敢な試みを実施するために必要なプライマー及び標的の数を減らすことによりアッセイ効率の強化を促進することができる。別の特徴では、本発明は、分子生物学ベースの診断にシャノンのエントロピーを適用することを含む方法を提供する。
ある特徴では、本発明は脊椎動物ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドの集合を提供する。前記一群のオリゴヌクレオチドは複数の核酸配列を含み、前記核酸配列は少なくとも約10,000、約20,000、約30,000、約40,000、又は約50,000の異なるアミノ酸配列から逆翻訳され(reverese translated)、各アミノ酸配列はウイルスの科の中で保存されたモチーフ（又はウイルスの科の属又は種の中で保存されたモチーフ）を含み、ここで前記ウイルスの科は以下から成る群から選択される：アデノウイルス科(Adenoviridae)、アレナウイルス科(Arenaviridae)、アルテリウイルス科(Arteriviridae)、アスファルウイルス科(Asfarviridae)、アストロウイルス科(Astroviridae)、ビルナウイルス科(Birnaviridae)、ボルナウイルス科(Bornaviridae)、ブンヤウイルス科(Bunyaviridae)、カリシウイルス科(Caliciviridae)、シルコウイルス科(Circoviridae)、コロナウイルス科(Coronaviridae)、デルタウイルス(Deltavirus)、フィロウイルス科(Filoviridae)、フラビウイルス科(Flaviviridae)、ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)、Ｅ型肝炎様ウイルス(Hepatitis E-like viruses)、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、伝染性喉頭気管炎様ウイルス(Infectious laryngotrachetitis-like viruses)、イリドウイルス科(Iridoviridae)、ノダウイルス科(Nodaviridae)、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、パピローマウイルス科(Papillomaviridae)、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、パルボウイルス科(Parvoviridae)、ピコルナウイルス科(Picornaviridae)、ポリオーマウイルス科(Polyomaviridae)、ポックスウイルス科(Poxviridae)、レオウイルス科(Reovirida)、レトロウイルス科(Retroviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)、及びトガウイルス科(Togaviridae)。これらウイルスの科の属及び種は付属CD-ROMに列挙されてあり、ウイルス学分野の業者にとってはまた公知である。別の特徴では、前記複数の核酸配列は少なくとも100の異なるアミノ酸配列から逆翻訳され、ここで、前記アミノ酸配列は、脊椎動物ウイルスの科の各々の属又は種の中で保存された少なくとも5つのモチーフを含む。ある特徴では、前記複数の核酸配列は、5,000；4,000；3,000；2,000；1000；950；900；850；800；750；700；又は500未満の異なるアミノ酸配列から逆翻訳される。ある特徴では、前記オリゴヌクレオチド集合は任意の脊椎動物ウイルスのゲノムとハイブリダイズすることができる。ある特徴では、前記アミノ酸配列は、付属CD-ROM表に列挙されてあるアミノ酸配列から選択される。
【０００７】
ある特徴では、本発明は、脊椎動物ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドの集合を提供する。前記一群のオリゴヌクレオチドは複数の核酸配列を含み、前記核酸配列は少なくとも約10,000、約20,000、約30,000、約40,000、又は約50,000の異なるアミノ酸配列から逆翻訳され、各アミノ酸配列は種々のウイルスの属内で保存されたモチーフを含み、ここで前記ウイルス属は以下から成る群から選択される：アスフィウイルス(Asfivirus)、オルトポックスウイルス(Orthopoxvirus)、パラポックスウイルス(Parapoxvirus)、アヴィポックスウイルス(Avipoxvirus)、カプリポックスウイルス(Capripoxvirus)、レポリポックスウイルス(Leporipoxvirus)、スイポックスウイルス(Suipoxvirus)、モルシポックスウイルス(Molluscipoxvirus)、ヤタポックスウイルス(Yatapoxvirus)、エントモポックスウイルスA(Entomopoxvirus A)、エントモポックスウイルスB(Entomopoxvirus B)、エントモポックスウイルスC(Entomopoxvirus C)、イリドウイルス(Iridovirus)、クロリリドウイルス(Chloriridovirus)、ラナウイルス(Ranavirus)、リンホシスチウイルス(Lymphocystivirus)、シンプレックスウイルス(Simplexvirus)、バリセロウイルス(Varicellovirus)、サイトメガロウイルス(Cytomegalovirus)、ムロメガロウイルス(Muromegalovirus)、ロセオロウイルス(Roseolovirus)、リンホクリプトウイルス(Lymphocryptovirus)、ラディノウイルス(Rhadinovirus)、イクノウイルス(Ichnovirus)、ブラコウイルス(Bracovirus)、ポリオーマウイルス(Polyomavirus)、パピローマウイルス(Papillomavirus)、マストアデノウイルス(Mastadenovirus)、アヴィアデノウイルス(Aviadenovirus)、オルトレオウイルス(Orthoreoviru)、オルビウイルス(Orbivirus)、ロタウイルス(Rotavirus)、コルチウイルス(Coltivirus)、アクアレオウイルス(Aquareovirus)、シポウイルス(Cypovirus)、フィージウイルス(Fijivirus)、フィトレオウイルス(Phytoreovirus)、オリザウイルス(Oryzavirus)、アクアビルナウイルス(Aquabirnavirus)、アヴィビルナウイルス(Avibirnavirus)、エントモビルナウイルス(Entomobirnavirus)、A型インフルエンザウイルス(Influenzavirus A)、Ｂ型インフルエンザウイルス（Influenzavirus B）、Ｃ型インフルエンザウイルス(Influenzavirus C)、Ｄ型インフルエンザウイルス(Influenzavirus D)、パラミクソウイルス(Paramyxovirus)、モルビリウイルス(Morbillivirus)、ルブラウイルス(Rubulavirus)、ニューモウイルス(Pneumovirus)、ボルナウイルス(Bornavirus)、マルブルグウイルス(Marburgvirus)、エボラウイスル(Ebolavirus)、アレナウイルス(Arenavirus)、アルファレトロウイルス(Alpharetrovirus)、ベータレトロウイルス(Betaretrovirus)、ガンマレトロウイルス(Gammaretrovirus)、D型レトロウイルス群(Type D Retrovirus group)、デルタレトロウイルス(Deltaretrovirus)、イプシロンレトロウイルス(Epsilonretrovirus)、レンチウイルス(Lentivirus)、スプマウイルス(Spumavirus)、ブンヤウイルス(Bunyavirus)、ハンタウイルス(Hantavirus)、ナイロウイルス(Nairovirus)、フレボウイルス(Phlebovirus)、トスポウイルス(Tospovirus)、カリシウイルス(Calicivirus)、エンテロウイルス(Enterovirus)、ライノウイルス(Rhinovirus)、ヘパトウイルス(Hepatovirus)、カルディオウイルス(Cardiovirus)、アフトウイルス(Aphthovirus)、アストロウイルス(Astrovirus)、フラビウイルス(Flavivirus)、ペスチウイルス(Pestivirus)、ヘパシウイルス(Hepacivirus)、アルファノダウイルス(Alphanodavirus)、コロナウイルス(Coronavirus)、トロウイルス(Torovirus)、アルファウイルス(Alphavirus)、アルテリウイルス(Arterivirus)及びデルタウイルス(Deltavirus.)。ある特徴では、前記アミノ酸配列は付属CD-ROM表に列挙されたアミノ酸配列から選択される。
【０００８】
ある特徴では、本発明は、脊椎動物ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドの集合を提供する。前記オリゴヌクレオチド集合は、アミノ酸配列から逆翻訳される複数の核酸配列を含み、各アミノ酸配列は下記（a）から（c）のいずれかで保存されたモチーフを含み、前記オリゴヌクレオチドの集合は全体として任意の脊椎動物ウイルスを検出することができる：（a）アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス科、アスファルウイルス科、アストロウイルス科、ビルナウイルス科、ボルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カリシウイルス科、シルコウイルス科、コロナウイルス科、デルタウイルス、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、Ｅ型肝炎様ウイルス、ヘルペスウイルス科、伝染性喉頭気管炎様ウイルス、イリドウイルス科、ノダウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、及びトガウイルス科から成る群から選択されるウイルス科；（b）アスフィウイルス、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アヴィポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシポックスウイルス、ヤタポックスウイルス、エントモポックスウイルスA、エントモポックスウイルスB、エントモポックスウイルスC、イリドウイルス、クロリリドウイルス、ラナウイルス、リンホシスチウイルス、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ムロメガロウイルス、ロセオロウイルス、リンホクリプトウイルス、ラディノウイルス、イクノウイルス、ブラコウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、マストアデノウイルス、アヴィアデノウイルス、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、コルチウイルス、アクアレオウイルス、シポウイルス、フィージウイルス、フィトレオウイルス、オリザウイルス、アクアビルナウイルス、アヴィビルナウイルス、エントモビルナウイルス、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、C型インフルエンザウイルス、D型インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ルブラウイルス、ニューモウイルス、ボルナウイルス、マルブルグウイルス、エボラウイスル、アレナウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、D型レトロウイルス群、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス、ブンヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス、トスポウイルス、カリシウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス、カルディオウイルス、アフトウイルス、アストロウイルス、フラビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、アルファノダウイルス、コロナウイルス、トロウイルス、アルファウイルス、アルテリウイルス及びデルタウイルスから成る群から選択されるウイルス属；及び／又は（c）（a）のウイルス科又は（b）のウイルス属に由来するウイルスの種。ある特徴では、前記アミノ酸配列は付属CD-ROM表から選択される
【０００９】
ウイルス分類群内で保存されたモチーフを含むアミノ酸配列に関連する本発明のいずれの特徴に関しても、前記モチーフは、例えばポリメラーゼ又は構造領域の一部分を含むことができる。前記構造領域はキャプシドタンパク質であってもよい。前記モチーフは非コード領域の配列を含むことができる。前記非コード領域はcis-調節領域の一部分を含むことができる。前記cis-調節領域は、転写因子、プロテアーゼ、リボソーム又は他のタンパク質の結合部位を含むことができる。前記cis-調節領域は内部リボソームエントリー部位（IRES）の一部分を含むことができる。
ある特徴では、本発明は、任意の脊椎動物ウイルスとハイブリダイズすることができる一群のオリゴヌクレオチドの集合を提供する。前記オリゴヌクレオチドの集合は保存モチーフから逆翻訳される配列を含み、前記保存モチーフは、任意の脊椎動物ウイルス種で保存されている3つを超えるモチーフを含むことはない。
ある特徴では、本発明は、任意の脊椎動物ウイルスとハイブリダイズすることができる一群のオリゴヌクレオチドの集合を提供する。前記オリゴヌクレオチドの集合は保存モチーフから逆翻訳される配列を含み、さらに前記オリゴヌクレオチド集合は10,000を超える異なる配列を含むことはない。
付属CD-ROM表のアミノ酸配列に関する本発明の任意の特徴については、そのようなアミノ酸配列は、（1）保存的変異；及び／又は（2）長さが少なくとも10アミノ酸残基で、さらに付属CD-ROM表に列挙された配列の1つと少なくとも90、95、96、97、98又は99%同一である配列を含むことができる。
ある特徴では、本発明は、脊椎動物ウイルスの検出のためのオリゴヌクレオチドの集合を提供する。前記オリゴヌクレオチド集合は複数のヌクレオチド配列を含み、ここで各ヌクレオチド配列は長さが少なくとも20ヌクレオチドであり、さらに付属CD-ROM表に列挙された配列の一部分と少なくとも90％（又は95、96、97、98、99%）の配列同一性を有する。前記オリゴヌクレオチド集合は、個々の脊椎動物ウイルスの科、属又は種由来のウイルスの検出用であり、したがって前記配列は、所望のウイルスの科、属又は種と一致する、付属CD-ROM表の配列から選択することができる。
【００１０】
ある特徴では、本発明は、脊椎動物ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドの集合を提供する。前記オリゴヌクレオチド集合は、約500から（又は約1000、1500、2500、3000、3500、4000、5000、7500、8000から）約10,000の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、ここで、前記集合の各オリゴヌクレオチドは、付属CD-ROM表のアミノ酸配列（又はその部分）から逆翻訳される配列を含む。
ある特徴では、本発明はウイルススクリーニング用オリゴヌクレオチドを設計する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）ウイルス配列データベースを編集する工程であって、前記ウイルス配列データベースがヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含む、前記工程；（b）各ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列をウイルスの目、科、属、及び種に分類する工程；（c）前記ウイルス配列データベースからアミノ酸配列の集合を同定する工程であって、前記集合の各アミノ酸配列がタンパク質ドメイン又はモチーフを含む、前記工程；（d）工程（c）のアミノ酸配列の集合から、ウイルスの科、属及び／又は種を通して保存されているアミノ酸配列モチーフのサブセットを同定する工程；（e）工程（d）のアミノ酸配列モチーフサブセットをコードするヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記サブセットをコードするヌクレオチド配列がウイルス配列データベースから入手される、前記工程；及び（f）前記アミノ酸配列モチーフのサブセットをコードするヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド群を設計する工程。
ある特徴では、工程（f）の設計は、ウイルスデータベースの全てのウイルス種を代表するためにアミノ酸配列モチーフのサブセットをコードするヌクレオチド配列から選択しなければならない最小数の配列の決定に集合被覆アルゴリズムを使用することを含む。ある特徴では、前記オリゴヌクレオチド群は、ウイルスのただ1つの科又はウイルスのただ1つの属で保存されているアミノ酸配列モチーフをコードするヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１１】
ある特徴では、前記ウイルス配列データベースは、脊椎動物ウイルス由来であると分類された配列から本質的に成る。ある特徴では、前記ウイルス配列データベースは、ウイルス種の部分ゲノム配列、又はウイルスタンパク質をコードする部分配列を含む。ある特徴では、前記ウイルスデータベースは、脊椎動物ウイルスの少なくとも25、50、75又は100の種に由来する配列を含む。別の特徴では、あるウイルスの種のためのヌクレオチド配列は、前記ウイルス種の2つ以上の代表的なゲノムに由来する配列を含む。別の特徴では、前記ウイルス配列データベースは、植物又は細菌に感染するウイルスの配列を含まない。
ある特徴では、編集工程は、ウイルス性であると同定された、1つ以上の公開の配列収集物由来のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の入手を含み、ここで、前記公開配列データベースはGenBank(登録商標)；日本DNAデータバンク（DDBJ）；欧州分子生物学研究所（EMBL）；レフセク（RefSeq）コレクション；GenBank、EMBL及びDDBJのDNA配列から翻訳されたコード領域；プロテインインフォメーションリソース（PIR）；SWISS-PROT；プロテインリサーチファウンデーション（PRF）；及びタンパク質データバンク（PDB）；並びに任意の継承機関を含む。
ある特徴では、前記分類工程はさらに、各ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のウイルス亜科、血清グループ、亜種及び／又は単離株への分類を含む。前記分類工程は、例えばウイルス分類学国際委員会のウイルス分類学系統樹基準を基にすることができる。
ある特徴では、工程（c）（すなわちウイルス配列データベースからアミノ酸配列集合を同定する工程で、ここで集合の各アミノ酸配列はタンパク質ドメイン又はモチーフを含む）では、少なくとも150,000の異なるアミノ酸配列がタンパク質ドメイン又はタンパク質ドメインの一部分を含むことが決定される。別の特徴では、工程（c）の同定工程は、隠れマルコフモデル（Hidden Markov Model, HMM）の使用を含む。別の特徴では、工程（c）のタンパク質ドメイン又はモチーフはPfamドメイン又はその部分を含む。
【００１２】
ある特徴では、工程（d）（すなわち、工程（c）のアミノ酸配列集合から、ウイルスの科、属及び／又は種を通して保存されているアミノ酸配列モチーフサブセットを同定する工程）は、工程（c）のアミノ酸配列集合からウイルスの科、属及び／又は種にわたって保存されているアミノ酸配列モチーフのサブセットを同定するために確率論モデルの使用を含む。前記確率論モデルは例えばMEMEアルゴリズムでもよい。
ある特徴では、本発明は、本発明の核酸の集合のいずれか１つを含むマイクロアレイを提供する。ある特徴では、本発明は、付属CD-ROM表に列挙されたヌクレオチド配列（若しくはその相補的配列又は付属表に列挙された配列と少なくとも90%同一である配列）を含むマイクロアレイを提供する。ある特徴では、本発明は、付属CD-ROM表に列挙されたアミノ酸配列から逆翻訳されたヌクレオチド配列を含むマイクロアレイを提供する。
ある特徴では、本発明は環境サンプル又は臨床サンプルのウイルスを同定する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）ウイルスを含むサンプルから核酸を単離する工程；（b）核酸を標識で標識する工程；（c）前記標識した核酸を本明細書に記載の集合のいずれか1つの核酸集合とハイブリダイズさせる工程；及び（d）前記核酸集合から、前記標識核酸とハイブリダイズした核酸を同定する工程。前記サンプルから単離した核酸はPCRによって増幅することができる。前記サンプル由来のウイルスはまた核酸の単離前に培養で増殖／増加させることができる。また別には、サンプルから単離した核酸は、増幅又は培養で増加させることなく直接アッセイすることもできる。
【００１３】
ある特徴では、本発明は、コンピューター読み取り可能媒体に保持されたコンピュータープログラム製品を提供する。前記コンピュータープログラム製品は、（a）ウイルス配列データベースを編集する工程（ここで、前記ウイルス配列データベースはヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含む）；（b）各ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列をウイルスの目、科、属、及び種に分類する工程；（c）前記ウイルス配列データベースからアミノ酸配列の集合を同定する工程（ここで、前記集合の各アミノ酸配列はタンパク質ドメイン又はモチーフを含む）；（d）ウイルスの科、属及び／又は種を通して保存されているアミノ酸配列モチーフのサブセットを工程（c）のアミノ酸配列の集合から同定する工程；（e）工程（d）のアミノ酸配列モチーフのサブセットをコードするヌクレオチド配列を決定する工程（ここで、前記ヌクレオチド配列は前記ウイルス配列データベースから入手される）；及び（f）前記アミノ酸配列モチーフのサブセットをコードするヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド群を設計する工程、をコンピューターに実行させる命令を含む。
【００１４】
ある特徴では、複数の異なるウイルスに対して反応性を有する抗体を生成する方法が提供される。前記方法は以下の工程を含む：（a）ウイルス配列データベースを編集する工程であって、前記ウイルス配列データベースがヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含む、前記工程；（b）各ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列をウイルスの目、科、属、及び種へ分類する工程；（c）前記ウイルス配列データベースからアミノ酸配列の集合を同定する工程であって、前記集合の各アミノ酸配列がタンパク質ドメイン又はモチーフを含む、前記工程；（d）ウイルスの科、属及び／又は種にわたって保存されているアミノ酸配列モチーフのサブセットを工程（c）のアミノ酸配列の集合から同定する工程；（e）工程（d）の配列モチーフ又はその部分を含むペプチドで動物を免疫する工程；（f）前記ペプチドと反応する抗体を含む血清を前記動物から単離するか、又は前記ペプチドと反応する抗体を産生する動物から抗体産生細胞を単離する工程。前記方法はさらに、工程（f）で単離した抗体産生細胞からハイブリドーマ細胞を作成する工程を含むことができる。
【００１５】
ある特徴では、本発明は、感染若しくは疾患の診断、監視、又は発見の少なくとも1つのためのシステムを提供する。前記システムは以下を含む：中央演算処理装置（CPU）；前記CPUと連結された記憶装置；前記記憶装置に保持された遺伝子情報のデータベース（ここで、前記CPUは新規な遺伝子情報についてデータをチェックし、前記データベースを前記遺伝子情報に関し更新する）；及び遺伝子配列及び前記遺伝子配列のハイブリダイゼーションの結果を入力する、CPUと連結された入力装置（ここで、前記CPUは前記遺伝子配列のハイブリダイゼーションの結果を分析し、データベースに前記遺伝子配列の組み入れに関する情報を作成する）。
ある特徴では、本発明は、以下の工程を含む、遺伝子情報のデータベースを更新するための方法を提供する：少なくとも1つの情報源から1つ以上の配列をある間隔でダウンロードする工程；前記1つ以上の配列間の相違を調和させる工程；前記1つ以上の配列をデータベースに加えるべきか否かを決定する工程；及び前記1つ以上の配列をデータベースに保存する工程。前記決定工程は、前記配列が、ヌクレオチドミスマッチについてプログラム可能な相違内でデータベースに既に存在する少なくとも1つの配列によってカバーされるか否かの決定を含むことができる。
ある特徴では、本発明は、以下の工程を含む、遺伝子情報の分類学的データベースの品質を維持する方法を提供する：遺伝子配列収集物のサブセットを作成する工程；前記データベースに対し、前記サブセットの各メンバーとのハイブリダイゼーションを試みる工程；及び前記データベースに対する前記サブセットのハイブリダイゼーション成功数を基にして前記データベースの変更を決定する工程。
【００１６】
ある特徴では、本発明は、以下の工程を含む、ハイブリダイゼーションの結果を判定する方法を提供する：ハイブリダイゼーションの結果の陽性シグナルのパターンを分析する工程；内部コントロール及び位置マーカー由来のシグナルを除去する工程；及び科、属及び種と一致するパターンの確率を計算する工程。
ある特徴では、以下の工程を含む、1つ以上のプライマーを生成する方法を提供する：1つ以上のプライマーの集合から行列を作成する工程；前記行列からツリーを構築する工程；前記ツリーにスコア決定関数を適用する工程；及びスコア決定関数から得られる情報に集合被覆アルゴリズムを適用する工程。生成されるプライマーは、例えば縮退プライマーであってもよい。前記ツリーの構築工程は、例えば全アラインメントからサブアラインメントを取り出す工程；固有性について前記サブアラインメントのフィルタリングを実施する工程；サブアラインメントを一対ずつ比較する工程；及びツリーを構築する工程を含むことができる。前記ツリーは、例えばユークリッド距離に基づくアルゴリズムを用いることによって作成することができる。前記スコア決定関数は、例えば、物理的拘束の外側領域に存在するプライマーを除去すること；ハイブリダイゼーションの確率を決定するためにサブアラインメントでプライマーと配列を比較すること；及び前記比較に基づいてスコアを割り当てることを含むことができる。前記集合被覆アルゴリズムは、例えばグリーディ（greedy）アルゴリズムを含むことができる。
ある特徴では、本発明は、以下の工程を含む、1つ以上のプライマーを生成する方法を提供する：データ供給源から配列情報を選択する工程；多重アラインメントを実施する工程；及びプライマーを設計する工程。前記データ供給源は、DNA配列収集物（例えば本明細書に記載のデータベースの1つ）でもよい。前記多重アラインメントを実施する工程は、例えば汎用多重配列アラインメントプログラムの使用を含むことができる。ある特徴では、前記プライマーは多面的PCRのために設計することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書で用いられる、以下の用語及び語句は下記に示す意味を有するであろう。別に規定されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、当業者の一人が通常的に理解する意味と同じ意味を有する。
単数形は文脈が明瞭に別の意味を示していない限り複数の意味も含む。
“約”という用語は、凡そ、〜の範囲内、おおざっぱに、または頃を意味するために本明細書では用いられる。“約”という用語が、数字で示される範囲と一緒に用いられるときは、前記用語は示された数値の上下で境界を拡張することによって前記範囲を修正する。一般的には、“約”という用語は、本明細書では20%の変動で記載の値より高く又は低く数値を修正するために用いられる。
“保存的残基”という用語は、一定の共通の特性を有するアミノ酸グループのメンバーであるアミノ酸を指す。“保存的アミノ酸置換”という用語は、前記のようなあるグループのアミノ酸の同じグループの別のアミノ酸による（概念的又は別の意味の）置き換えを指す。個々のアミノ酸間における共通の特性を定義するための実用的な方法は、同種生物の対応するタンパク質間における正規化したアミノ酸荷電頻度の分析である（G.E. Schulz and R.H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag）。そのような分析にしたがえば、あるグループ内のアミノ酸が互いに優先的に交換され、したがって全体的なタンパク質構造に対する影響において互いにもっとも類似する場合に、アミノ酸のグループを定義することができる（G.E. Schulz and R.H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag）。この様式で定義されるアミノ酸グループの集合の一例は以下を含む：（i）Glu及びAsp並びにLys、Arg及びHisから成る荷電グループ、（ii）Lys、Arg及びHisから成る陽性荷電グループ、（iii）Glu及びAspから成る陰性荷電グループ、（iv）Phe、Tyr及びTrpから成る芳香族グループ、（v）His及びTrpから成る窒素環グループ、（vi）Val、Leu及びIleから成る大型脂肪族非極性グループ、（vii）Met及びCysから成る微極性グループ、（viii）Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln及びProから成る小型残基グループ、（ix）Val、Leu、Ile、Met及びCysから成る脂肪族グループ、及び（x）Ser及びThrから成る小型ヒドロキシルグループ。
上記に提示したグループに加えて、各アミノ酸残基はそれ自身のグループを形成することができ、さらに個々のアミノ酸によって形成されるグループは、当分野で一般的に用いられる当該アミノ酸のための一文字及び／又は三文字の略語によって簡単に言及することができる。
【００１８】
本明細書で用いられる、“特異的にハイブリダイズする”という用語は、適用される核酸プローブ／プライマーが、少なくとも12、15、20、25、30、35、40、45、50、又は100の連続するヌクレオチドの標的配列、又はその相補的配列、又は天然に存在するその変異体とハイブリダイズし、標的遺伝子以外の細胞性核酸（例えばmRNA又はゲノムDNA）と少なくとも15%未満、10%未満、5%未満又は2%未満のバックグラウンドハイブリダイゼーションを示す能力を指す。多様なハイブリダイゼーション条件を用いて、特異的なハイブリダイゼーションを検出することができる。
適切なハイブリダイゼーション条件は当業者には公知であり、また当業者は実験的に決定することができる。例えば以下を参照されたい：Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-12.3.6；Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.；S. Agrawal (ed) Methods in Molecular Biology, volume 20；Tijssen (1993) Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes（例えば2章、I節：Overview of principles of hybridization and strategy of nucleic acid probe assays）Elsevier, N.Y.；N. Tibanyenda et al. Eur J Biochem, 1984, 139:19；及びS. Ebel et al. Biochem, 1992, 31:12083；Rees et al. Biochemstry, 1993, 32:137-144；Chakarbarti and Schutt, BioTechniques, 2002, 32:866-874；及びSantaLucia and Hicks, Annu. Rev Biomol Struc, 2004, 33:415-40。
【００１９】
本明細書で用いられる、“同一性”は、2つ以上の配列を配列の一致を最大にするように（すなわちギャップ及び挿入を考慮して）アラインメントしたとき、それら配列の対応する位置の同一ヌクレオチド又はアミノ酸残基の割合を意味する。同一性は公知の方法によって容易に計算することができる。前記方法には以下に記載されたものが含まれる（ただしこれらに限定されない）；Computational Molecular Biology, A.M. Lesk ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, D.W. Smith, ed, Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, A.M. Griffin and H.G. Griffin eds, Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von G. Heinje, Academic Press, 1987；及びSequence Analysis Primer, M. Gribskov and J. Devereux eds, M Stockton Press, New York, 1991；及びH. Carillo and D. Lipman, SIAMJ. Applied Math, 48:1073 (1988)。同一性を決定する方法は、試験する配列間で最大の一致が提供されるように案出される。2つの配列間の同一性を決定するコンピュータープログラムによる方法には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：GCGプログラムパッケージ（J. Devereux et al. Nucleic Acids Research, 1984, 12(1):387）、BLASTP、BLASTN及びFASTA（S.F. Altschul et al. J Molec Biol, 1990, 215:403-410；及びAltschul et al. Nuc Acids Res 1997, 25:3389-3402）。BLAST XプログラムはNCBI及び他の供給源（BLAST Manual, S. Altschul et al. NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894；S. Altschul et al. J Mol Biol 1990, 215:403-410）から一般に利用することができる。Smith Watermanアルゴリズムもまた同一性の決定に用いることができる。
“オリゴヌクレオチド”という用語は、短い核酸分子、例えば約10から約200ヌクレオチドを有する核酸分子を指す。オリゴヌクレオチドは一本鎖でも二本鎖でもあり得る。
【００２０】
本発明は、病原体の検出、同定及び／又は分析に用いることができるオリゴヌクレオチド集合すなわち一群のオリゴヌクレオチドを設計する方法を提供する。本発明はまた、これらの方法によって製造される組成物を提供する。前記方法は、特定の分類群の病原体を検出するその能力が包括的でありえるオリゴヌクレオチドの集合を製造する。例えば、本発明は、公開及び非公開ウイルス配列という意味で包括的であり、分類学で認定されているという意味で正確な脊椎動物ウイルスデータベースを提供する。前記データベースを選別してコード配列のサブセットを同定することができる。このサブセットをさらに選別して、タンパク質ドメイン又はPfamを含む配列のサブセットを同定することができる。続いてこのタンパク質ドメインを含むサブセットを分析し、1つ以上の分類群で保存されている、サブセット中のモチーフを同定することができる。ある分類群の病原体を検出する必要性を考慮すると、前記分類群内の病原体全体に対して群として包括的な検出／分析性能を提供することができるように、オリゴヌクレオチドを前記分類群で保存されているモチーフから誘導又は逆翻訳することができる。ある応用では、これらの一群のオリゴヌクレオチドを用いて、公共の環境にある生物兵器の病原体を同定することができる。別の応用では、これらの一群のオリゴヌクレオチドを用いて、環境サンプル又は組織サンプル由来の病原体を分析することができる。
したがって、本発明は、病原性感染症の診断（インフルエンザウイルス、選別NIAID優先病原体、及びそれらの選別病原体の感染による徴候及び症状と類似する徴候及び症状を引き起こしえる病原体による感染の弁別的診断を含む（ただしこれらに限定されない））のためのツールを提供する。ある実施態様では、本発明は、保健所、病院拠点臨床検査室、個別ケア環境及び野外活動で使用される、安定で感度の高いウイルス検出／分析キットの確立を探求する。
【００２１】
配列モチーフは、異なる種の間で配列パターンが進化的保存を示すように保存されているか否かを調べることによって同定又は発見することができる。MEME（モチーフ判断のための多重EM、Multiple EM for Motif Estimation）及びMAST（モチーフアラインメントと検索ツール、Motif Alignment and Search Tool）は大量の検索データ内の配列モチーフを同定するために用いることができる2つの例示的な方法である。
MEMEは、パターン内の各位置に存在する可能性がある文字の各々の確率を記述する位置依存文字確率行列（position-dependent letter-probability matrix）としてモチーフを表現する。個々のMEMEモチーフはギャップを含まない。可変長ギャップを含むパターンはMEMEによって2つ以上の別個のモチーフに分割される。MEMEは、DNA又はタンパク質配列群（トレーニングセット）を入力として取り入れ、要求されただけの多くのモチーフを出力する。MEMEは統計モデル作成技術を用い、各モチーフについて最善の出現幅、数、及び記述を自動的に選択する。ある実施態様では、本発明は、米国仮特許出願60/861,365（2006年11月28日出願）（前記文献は参照により本明細書に含まれる）に添付されたCD-ROMで提供される表1−5に列挙されているアミノ酸配列の入力から入手される配列モチーフを提供する。別の実施態様では、本発明は、本明細書及び図1に記載されているPFAMを含む配列の入力から入手される配列モチーフを提供する。
MASTは、1つ以上の公知のモチーフ群を含む配列についての生物学的配列データベースの検索用ツールである。MASTは、1つ以上のモチーフの記述を含むファイルを入力として取り入れ、モチーフにマッチする配列について配列データベースを検索する。
【００２２】
ある実施態様では、本発明は、複数の配列データ中の配列モチーフの同定又は発見について単純性及び／又は効率を高める方法を提供する。例えば、下記及び図1（工程1）に記載するように、ウイルス核酸配列を公開データベースからダウンロードすることができる。コード配列のみを選択することによって（図1、工程2）この配列群を縮小した後、モチーフ又はタンパク質データベース（例えばPfam、ProDom、Prosite、BLOCKS、Prints、InterPro、TIGRFAMs）又は自動ドメイン分解アルゴリズム（Automatic Domain Decomposition: ADDA）を用いて作成されるデータベース中に存在するコード配列のみを選択することによって（図1、工程4）、このコード配列群自体を縮小することができる。続いて、モチーフを含むコード配列を分析し（図1、工程6）、ウイルス分類群にわたってどのモチーフが保存されているかを決定することができ、例えば個々のウイルスの科、属又は種のメンバーで保存されているモチーフを同定することができる。ある実施態様では、ヒューリスティック解析法の使用により大量の入力配列から最小数の配列を入手することができる。別の実施態様では、最小数の配列を有するデータセットは、入力配列集合に対して縮小された任意の数の配列を有するデータセットでありえる。
Pfamはタンパク質ファミリー及びドメインの収集物であり、多重タンパク質アラインメント及びプロファイル隠れマルコフモデル（HMM）を使用することによって、これらファミリー及びドメインの配列モチーフを含む。本明細書で用いられる、“隠れマルコフモデル（HMM）”は、不連続な状態間の一連の遷移として表現することができる任意の系のための統計的モデルである。例えば、タンパク質配列に関しては、前記不連続な状態はタンパク質多重配列アラインメントの連続するカラムに対応する。原則として、HMMは何度も最適化を繰り返すことによって未アラインメント配列から発生させることができるが、実際にはタンパク質プロファイルHMMは単に、キュレーションされた（curated）多重配列アラインメントから構築される。HMM検索は、後期ラウンドPSI-BLAST検索に類似し（ただしキュレーションされた（curate）アラインメントを基準にする）配列の全長にわたってアミノ酸、挿入、及び欠失の各々に対する位置特異的スコア決定を行う。スコアは、情報量についてビットおよびE-値の両方で報告される。PFAMモデルは互いにオーバーラップしないように制限され、したがって完全長タンパク質よりもドメインについて記述し易い。
【００２３】
ProDomは、SWISS-PROT（タンパク質の機能、ドメイン構造、翻訳後修飾、変種その他に関する記述が注釈として配列に付されているキュレーションされた（curated）タンパク質配列データベース）及びTrEMBL（Swiss-Prot配列データベースに未統合のEMBLヌクレオチド登録配列の翻訳物を含む、Swiss-Protのコンピューターによる注釈付加付録）から自動的に作成されたタンパク質ドメインファミリーの包括的集合である。Prositeはタンパク質ファミリー及びドメインのデータベースであり、1000を超えるタンパク質ファミリー又はドメインに特異的なパターン及びプロファイルを含む。BLOCKSデータベースのためのブロックは、Prositeデータベースに記述されているタンパク質群でもっとも高度に保存されている領域を探索することによって自動的に作成される。あるタンパク質群についてのPrositeパターンは、BLOCKSデータベースの作成にはいかなる態様でも用いられず、前記パターンはある群に典型的なブロックの1つに含まれることも含まれないこともある。続いてこれらのブロックをSWISS-PROTデータベースに対して較正し、マッチする確率分布の測度を得る。BLOCKSデータベースを構成しているのはこれらの較正されたブロックである。PRINTSはタンパク質モチーフのフィンガープリントの要約である。フィンガープリントは、タンパク質ファミリーの特徴を示すために用いられる保存モチーフ群である。フィンガープリントは、配列アラインメントから保存モチーフを切り出し、OWL（非重複混成配列データベース）の反復探索によって精密性を高めることによって得られる。InterProは、タンパク質ファミリー、ドメイン及び機能部位のデータベースであり、前記データベースでは、既知タンパク質で見出される識別可能な特徴を未知タンパク質配列に適用することができる。TIGRFAMs（The Institute for Genomic Research Protein Families）は、キュレーションされた（curate）多重配列アラインメント、隠れマルコフモデル（HMM）、及び、配列相同性による自動化された機能的タンパク質識別を支援するために計画された関連情報を特徴とする、タンパク質ファミリーの収集物である。
【００２４】
本発明の方法はウイルスゲノム内の保存領域を同定することができ、前記領域を用いて既知又は未知ウイルスの検出を目的とする分子及びタンパク質使用アッセイを設計することができる。応用には、臨床微生物学；血液製剤、移植用組織、家畜及び野生生物の監視、及び病原体の発見が含まれる。本発明の方法は、配列の検索及び分析、パターン認識及びアラインメントのためのアルゴリズムを用いる。本発明の方法はまた、ウイルスの系統発生及び分子ウイルス学における人間の専門知識を基にした手動修正を含むことができる
ある種の実施態様では、本発明は、サンプル中の任意の未知生物の同定に用いることができるオリゴヌクレオチドの集合（又は群又は収集物）を設計する方法を提供する。ある実施態様では、前記生物は微生物である。ある実施例では、前記微生物はウイルス又は細菌である。ある実施態様では、前記ウイルスは脊椎動物ウイルス（すなわち脊椎動物に感染するウイルス）である。ある実施態様では、前記ウイルスは植物ウイルスである。ある実施態様では、前記ウイルスはファージである。
本発明の方法によって設計されるオリゴヌクレオチドの集合は包括的な被覆を提供することができる。換言すれば、前記一群のオリゴヌクレオチドは、いかなる未知ウイルスであっても、前記ウイルスが特定のウイルス分類群に属する限りこれを確認する能力を提供することができる。特定のウイルス分類群は、例えば科、亜科、属、亜属、血清グループ、サブ血清グループ、種、又は単離株であり得る。前記オリゴヌクレオチド集合は、問題の特定のウイルス分類群に対して包括的な被覆を提供するように設計することができる。例えば、図1の工程６では、PFAMモチーフを含む配列を分析して個々のウイルス分類群に存在するモチーフを同定することができる。
【００２５】
データベースの編集及びキュレーション
オリゴヌクレオチドを設計する方法は、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列のデータベースを編集する工程を含む（例えば図1の工程1参照）。ある実施態様では、データベースは利用可能なウイルス核酸配列を用いて編集される。例えば、ウイルス核酸配列（ヌクレオチド及びアミノ酸）は以下で入手することができる：GenBank(商標)；日本DNAデータバンク（DDBJ）；欧州分子生物学研究所（EMBL）；参照配列（RefSeq）コレクション；GenBank、EMBL及びDDBJのDNA配列から翻訳されたコード領域；プロテインインフォメーションリソース（PIR）；SWISS-PROT；プロテインリサーチファウンデーション（PRF）；及びタンパク質データバンク（PDB）；並びに任意の継承機関。
いったんデータベース（ウイルス、脊椎動物ウイルス、植物ウイルス、ファージウイルス、細菌などのいずれであれ）を編集したら、続いて配列を分類学的及び／又は系統発生的に分類する。公開データベースは既に、前記配列に対して分類学的又は系統発生的注釈を提供しているかもしれないが、公開データベースはしばしば重大な分類の誤りを含みえる。例えば、NCBI（全米バイオテクノロジー情報センター）（National Center for Biotechnology Information）のウイルス配列はNCBI Taxid（前記は系統発生的分類に対応する）によって分類されている。NCBI分類データベースは、ウイルスの分類、特に種レベルでの分類で重大な誤りを含んでいる。NCBIは十分にキュレーションされて（curated）おらず、さらに多くのウイルスの科についてICTV（International Committee on the Taxonomy of Viruses）と異なるウイルス分類システムを有する。NCBIのウイルス分類は認容されているウイルス系統発生を反映していない。なぜならばそのウイルス分類は投稿著者によって決定されるからである。これは以下の3つの理由のために誤りの原因となりえる：（1）著者は間違ったウイルス分類を行う可能性がある、（2）投稿時に分類が可能ではなかった、又は（3）命名における歴史的変更が配列記録において更新されていない。したがって、ある実施態様では、本発明は、ウイルス分類学国際委員会（International Committee on the Taxonomy of Viruses（ICTV））によって受け入れられている、ウイルス分類系統樹を反映するために、公開データベースの分類学注釈（例えばNCBI Taxidヒエラルキー）と独立に注釈を付す工程を提供する。独立な注釈付与工程の結果は、認容標準（例えばウイルスデータベースのためのICTV標準）に一致する正しい系統発生関係を有する配列データベースである。ウイルスデータベースについては、各属は異なる系統発生クラスを有することができる。なぜならば、ウイルスのグループ分類は、各属がクレード、遺伝子型、血清型、亜群、又は地理区すらも含みえるために変動するからである。分類学的に未分類である公開データベースの配列は、注釈を提供するために既知の配列と比較することができる。
【００２６】
ICTVオンラインデータベースは、分類系統樹のサブセットの代表的な配列を提供するが、これは網羅的なものではない。対照的に、ある種の実施態様では、本発明は包括的なタンパク質配列及び核酸配列データベースを提供し、前記は公開の集積所の核酸配列及びタンパク質配列を抽出することによって構築される。ウイルスデータベースを作出するために、各配列を単離及び株に関する一切の情報とともに、前記配列が代表するウイルス種によって適切に分類する（すなわちICTV指定）。
微生物の配列データベースの作出は、他の目的の中でとりわけ診断用検査、スクリーニングアッセイ及び疫学の進展のために重要でありえる。本発明はしたがって、正確に分類学的関係を反映するデータベースを提供する。ある実施態様では、本発明は脊椎動物ウイルスデータベースを提供する。他の非限定的実施態様では、本発明は、植物ウイルスデータベース、ファージデータベース、又は細菌データベースを提供する。ある実施態様では、本発明のデータベースは、以下のNCBI分類の2つの一般的な誤り、（１）あるウイルス種の株であるのにそれら自体が種として分類されている配列、及び（2）亜群のグループのメンバーであるが、正確に分類されていない配列を調整する。ある実施態様では、そのようなNCBI分類の誤りは、脊椎動物ウイルスの手動キュレーション（manual curation）によって訂正される。データベースの手動キュレーションには専門家が必要である。脊椎動物ウイルスデータベースでは、データベースの手動キュレーションにはウイルスの系統発生学の専門家が必要である。
ある実施態様では、本発明のデータベースは、疾病管理センター（Centers for Disease Control）の特殊病原体支部（Special Pathogens Branch、SPB）由来のウイルス（又は他の病原体）の配列を含む。前記配列は、供給源材料（例えば選別病原因子の単離株又は臨床標本）から入手することができる。CDC特殊病原体支部（SPB）のウイルス収集物は、アッセイ開発に用いることができる多数のVHFウイルス単離株を含む（例えばエボラ、マルブルク、RVF、CCHF、ラッサ、マチュポ（Machupo）、グアナリト（Guanarito）、ジュニン（Junin）、サビア（Sabia）、ニパー（Nipah）並びにHPS-及びHFRS-関連ハンタウイルス）。
【００２７】
表6：CDC特殊病原体支部（SPB）を通して入手できるウイルス収集物
2009131242.tif 000008
【００２８】
データベースの更新
上記のように編集したデータベースは、追加の新規な配列を公開データベースからダウンロードすることによって規則的な間隔で更新されるべきである。例えば、ある実施態様では、ウイルスデータベースは、少なくともGenBank／EMBL、SWISS-Prot／UniProt、ISD（インフルエンザ配列データベース）、ICTVdb及びPFAMから関連情報をダウンロードすることによって更新することができる。ダウンロードした情報は一時的に統合データベース内に入れ、存在するウイルスデータベース（例えば統合及びキュレーションされた(curated)ICTV/NCBIデータベース）と比較することができる。ある実施態様では、本発明は、新規登録配列についてGenBank／EMBL、SWISS-Prot／UniProt、ISD及びCDCデータベースに1ヶ月間隔で問い合わせるプログラミングスクリプトを提供する
新しい配列情報は、その時点で存在するオリゴヌクレオチド集合を改変する必要があるか否かに影響を与えることができる。例えば、オリゴヌクレオチド被覆アレイに表示された領域内におけるある既知ウイルス種の新しい配列の場合：新しいエントリー配列を既に存在しているアレイのプローブと比較することができる。前記配列が、4ヌクレオチド未満のミスマッチを含む既に存在する少なくとも1つのプローブによってカバーされるならば何もしなくてよい。現存するプローブ集合を用いたのではカバー範囲が不適切である場合は新しいプローブを加えることができる。アレイで表示されていない領域におけるある既知ウイルス種の新しい配列の場合：新しいエントリー配列を用いて統合ICTV/NCBIデータベースの問合わせを実施することができる。関連するエントリー配列が存在しないか、又は現存する配列に対する相同性が90%未満である場合は、新しいプローブを作成することができる。理論に拘束されないが、この場合の理由は、アレイで表示されていないあるゲノム領域における多様性は、アレイに表示されている別の領域における多様性を予測しえるということである。
【００２９】
コード配列データベースの構築
起源がウイルス性（又は他のもの）であると注釈を付された（又はキュレーションされた（curated）、又別には同定された）一般に利用可能な核酸配列を含むデータベースは、コード配列の正確さについてチェックすることができる（例えば図1の工程2を参照されたい）。ある実施態様では、Uniprotデータベースのウイルスタンパク質配列は、EMBLヌクレオチド配列データベースのタンパク質記録と相互に参照することができる。各タンパク質記録をヌクレオチド記録と参照し、前記ヌクレオチド記録からコード配列（cDNA）を抽出することができる。EMBLデータベースはコード位置においていくつかの誤りを有し、したがってDNA又はRNA配列は、ヌクレオチドを独立に翻訳し、さらに翻訳した配列を予想されるタンパク質配列と独立に比較することによってその有効性を実証することができる。これによって、モチーフの決定のために用いることができる、“戻し翻訳”されたウイルスタンパク質のデータベースを得ることができる。
【００３０】
コード配列領域の決定
コード配列を含む前記編集データベース配列を、タンパク質ドメイン又はその部分を含む配列群に区分するか狭めることができる。コード配列集合を、タンパク質ドメイン（又はその部分）又はタンパク質モチーフを含む配列に狭めるための１つの方法は、Pfam又は他のタンパク質ドメイン／モチーフデータベースに含まれるコード配列（又はその部分）のみを選択することである。多くのウイルスタンパク質は記載されたPfamドメインを有するであろうし、いくつかは2つ以上のPfamドメインを有するであろう。コード配列がPfam又は他のタンパク質ドメイン／モチーフデータベースに含まれない場合、一対ごとの比較が実施され、相同クラスターに関して配列を同定することができる。次に、Pfamドメイン（又はその部分）を含むか又はPfamドメインと相同な配列を含むウイルス配列のサブセット又はグループを抽出又は選択する。
【００３１】
Pfamを含む配列のグループ内でモチーフを見つける
初めの配列データベースの複雑度は以下によって減少させることができる：（1）データベースの配列収集物をコード配列又はコード配列の部分を含む配列に縮小し、さらに（2）このコード配列収集物をさらにタンパク質ドメイン又はモチーフを含む配列に縮小する。続いて、タンパク質ドメイン（又はその部分）又はモチーフを含むこのコード配列の集団を分析し、集団自体の中で統計的に過剰に提示されたDNA又はタンパク質配列モチーフを同定する。統計的に過剰提示されるDNA又はタンパク質配列モチーフは、分類学のいずれのレベル（すなわち科、亜科、属、亜属、血清グループ、血清型、種、亜種、単離株など）においてもDNA又はタンパク質配列モチーフが統計的に過剰提示されているか否かに対応し得る。本方法は、例えばシャンノンのエントロピーの情報理論概念を用いて配列の収集物中の保存性及び変動性を明らかにすることができる。
モチーフの発見を用いて、分類学のレベル内で過剰表示されているタンパク質ドメイン内の配列パターンを同定し、それによって複数の分類群にわたって又は1つの分類群内で保存されているモチーフを同定することができる。
確率計算アルゴリズム（例えばMEME、Gibbs Sampler、又はSplash）は、統計的に過剰提示されたDNA又はタンパク質配列を同定することができる。このアルゴリズムを網羅的に実施することができる。このことは、所望の数の有意なモチーフが同定されるまでアルゴリズムを実施できることを意味する。オリゴヌクレオチドの設計のために、統計的に過剰提示されたタンパク質モチーフは以前に確立させた戻し翻訳データベース由来のヌクレオチドコード配列と相互参照することができる。
別の実施態様では、抗体生成用免疫原として使用することができる保存ペプチドの同定のために、統計的に過剰提示されたタンパク質モチーフをヌクレオチドコード配列と相互参照することができる。そのような抗体は、1つの分類群にわたって広範囲の交差反応性を有することができるということがあり得る。この場合、前記交差反応性はおそらくペプチド配列によって示された分類学的保存レベルと一致するであろう。
【００３２】
オリゴヌクレオチドの設計
オリゴヌクレオチドを設計するために、以前に確立させた戻し翻訳データベースのヌクレオチドコード配列と統計的に過剰提示されるタンパク質モチーフを相互参照することができる。別の実施態様では、前記タンパク質モチーフがモチーフのヌクレオチド配列の入手のために戻し翻訳データベースと相互参照されることはなく、オリゴヌクレオチドはモチーフに関して縮退態様で設計される。前記モチーフに対応する戻し翻訳DNA又は縮退DNAに加えて、このオリゴヌクレオチドはさらに戻し翻訳DNAの上流（5'）又は下流（3'）に存在するヌクレオチド配列を含むことができる。
ある実施態様では、オリゴヌクレオチドは、約10から約250のオリゴヌクレオチドを含むことができる。別の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、約20から約65のオリゴヌクレオチドを含むことができる。別の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、約25から約60のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
ある実施態様では、モチーフに対応するDNAは、どの配列がハイブリダイゼーションに適しているかを決定するために分析される。ハイブリダイゼーションに適切な要件には以下のような配列を同定することが含まれる（ただしこれらに限定されない）：（1）高い融解温度を有する、（2）ほとんど又は全く二次構造をもたない、及びホモポリマーの連続部分が短い。
別の実施態様では、前記モチーフに対応するDNA（又はRNA）は、どの配列が個々のオリゴヌクレオチド関連応用（例えばマイクロアレイスクリーニング、PCR及びRNAiアッセイ）に適しているかを決定するために分析される。
ある実施態様では、オリゴヌクレオチドは、実施例6に記載するアルゴリズム及び指示にしたがって設計することができる。例えば、ある実施態様では、本発明は、指定分類群内の任意のウイルス種とハイブリダイズさせるために要求されるオリゴヌクレオチドの最小数を含むオリゴヌクレオチドの集合を提供する。特定の分類群内の任意のウイルス種とハイブリダイズさせるために要求される前記オリゴヌクレオチドの最小数（すなわち１つの分類群を包括的に被覆するオリゴヌクレオチドの集合）は、集合被覆アルゴリズム（例えば実施例6に記載するもの）によって決定することができる。
【００３３】
分類群の包括的被覆の担保
オリゴヌクレオチドの集合は、上記に記載したように、個々の分類群の任意の生物を検出しえるように設計することができる。ある実施態様では、本発明は、任意の脊椎動物ウイルスを検出することができるオリゴヌクレオチドの集合を提供する。別の実施態様では、本発明は、個々の脊椎動物ウイルス科に属するウイルスを検出することができるオリゴヌクレオチドの集合を提供する。別の実施態様では、本発明は、個々の脊椎動物ウイルス属に属するウイルスを検出することができるオリゴヌクレオチドの集合を提供する。
分類群を被覆することを担保するために、モチーフによって代表されないデータベース配列に関してオリゴヌクレオチドを設計することができる。モチーフによって代表されていない配列を分析して、保存されている可能性がある領域を同定することができる。この場合、前記分析は、変異速度を記述することができる確率行列（例えばPAM250およびBLOSUM）を用いることによって実施することができる。変異行列を用いて、低い変異確率を有するタンパク質ストレッチを同定することができる。続いてこれらのストレッチを戻し翻訳し、さらにそれらを用いてオリゴヌクレオチドを設計し、モチーフを基にしたオリゴヌクレオチドを補完し、それによって適用範囲を担保する。
ある実施態様では、本発明は保存性及び変動性領域を同定する方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、以前にコード配列及びPFAMを含むより小さな集合への縮小を実施していないデータベースのゲノムの部分の配列アラインメントを実施することによって、保存性及び変動性領域を同定する下記記載の方法を提供する。
【００３４】
このように、ある実施態様では、本方法は、シャンノンのエントロピーの情報理論概念を用いて、ウイルスゲノム中の保存性及び変動性の領域を同定する。公開配列及び私設配列からのウイルスゲノムのキュレーション（curation）及びアラインメントが実施されたデータベースは、多様性及び系統発生を反映するように維持される。ウイルスのタイプ分類及びサブタイプ分類のためのオリゴヌクレオチドは、特異性及び最小交差反応性のためのソフトによって選択される。この方法は、PCR、マイクロアレイ及び多重ビーズ使用アッセイ（例えばルミネックス技術）を含む（ただしこれらに限定されない）極めて多様なプラットフォームに対して汎用性を有する。その有用性は、オリゴヌクレオチド標的をガラススライドにスポットしてDNAマイクロアレイが作製されるアッセイで証明されている。アレイをPCR又は非特異的増幅反応から得られたプローブとハイブリダイズさせ、前記プローブが標的と相同であるときにシグナルを生じる。このアプローチはいずれの核酸の同定にも広げることができる。
シャンノンのエントロピーはシステムにおける変動性の尺度である。DNAの場合、ヌクレオチドに対応して4つの異なる状態が存在する。シャンノンのエントロピーは、変数の状態をもっとも短く二進コード化したものである。式はH(x)−E px log2であり、式中pxは与えられた状態の確率である（Shannon 1948、Cover and Thomas 1991）。ウイルスゲノムのアラインメント（又はウイルスのPFAMのアラインメント）は公開データベースに寄託された配列を用いて実施される。これらのデータベースが不十分な場合（例えば与えられた血清型を表すものがただ1つしか存在しないか、又はゲノム配列が不完全である場合）、追加の配列を主として感染動物又は培養細胞から得ることができる。これが要求された最近の例には、フラビウイルス、ブンヤウイルス及びエンテロウイルスが含まれる。アラインメントのサブ領域は、アラインメントの各位置を評価することによってエントロピー測度に基づいて保存性及び変動性について選択される。サブ領域は種分化(speciation)を可能とするウイルス生物学の知識によっても選択される。特定の領域内で既知配列を表示するアラインメントを作出するために、代表的なシードアラインメントを用い、相同なウイルス配列についてBLASTによってデータベース問合せを行う。自動検索が満足なものではない場合には、配列に相同な配列をデータベースから手動で検索することができる。配列は、ICTV策定案のラインに沿ったウイルスの系統学にしたがって分類することができる。
【００３５】
サブ領域は、変動性を定量するために、エントロピー測度を実装したソフトによって並行して分析される。本方法の主要な目的は、特定の目的のために（例えばPCR用フォワード又はリバースプライマー、リアルタイムPCR用レポーターオリゴヌクレオチド、種々の長さが用いられる多様なマイクロアレイフォーマットのためのオリゴヌクレオチド）標的を同定することである。したがって、可能な標的の全てを評価するために25、50、60、70ヌクレオチドの枠をずらしたウィンドウが用いられる。
ある実施態様では、オリゴヌクレオチドの2つのカテゴリーが、（i）未知ウイルスを含む幅広い分類群を捕捉する（例えば属特異的標的）能力、又は、（ii）ウイルス分類群の別個の種分化を許容する（例えば血清型又は株特異的標的）能力を基準に選択される。前者のアプローチは広い範囲の監視及び病原体発見を促進する一方、後者は分子疫学及び微生物科学捜査(forensics)を促進する。幅広い標的を選択する時には、高度に保存された（低いエントロピースコア、株間で類似するヌクレオチド構成を条件とする）領域が選択される。縮退オリゴヌクレオチドは、コンセンサスPCRと同様に、完全に自動化されたプログラムにより決定される。縮退標的設計アルゴリズムは、縮退位置の数を最小にしつつ、属のメンバーとのハイブリダイゼーションの機会を最大にした。
調整アルゴリズムは、ヌクレオチド変化が株間で一緒に発生する傾向に基づいて最小の縮退を選択する。種分化領域を同定するアルゴリズムによって血清型特異的及び株特異的オリゴヌクレオチドが決定される。あるウイルス分類群の全体的エントロピー（変動性）に対する科の寄与を評価することによって、その科の中では保存されるが残りの属では変動しえる領域が選択される。前記アルゴリズムは、標的に対する科の中での類似性を最大にするが、他の科に対する類似性は最小にする。潜在的標的のフィルタリングによって、Tm、ヘアピン形成及び自己アニーリングを含む重要な性能特性が調べられる。
【００３６】
脊椎動物ウイルス検出用組成物
本発明の潜在的な応用のいくつかには例えば以下が含まれる：臨床サンプル、環境サンプル及び食物サンプル中の微生物及び宿主転写物の検出並びに弁別；遺伝的適合性調査；血液製剤及び移植製品のスクリーニング；及び科学捜査。本発明によって解決される問題の1つは、正確な標的配列が知られていない可能性がある状況における遺伝子標的の感度の高い多重検出及び特性決定の取扱いである。本発明は、例えば、完全に配列が決定されているウイルスゲノムを考慮するだけではないという利点を提供する。本発明は、完全に及び部分的に配列が決定された両方の種を考慮する。本発明はまた、例えば配列が1つの種の中で極めて多様でありえるという理由により、2つ以上の種の代表を含む。
ある実施態様では、本発明は、関連するが必ずしも同一ではない配列標的とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を同定するためのツールとして有用である。ある実施態様では、本発明の方法を用いて、コンセンサスPCRのためのプライマー及びDNAマイクロアレイのための標的を設計することができる。本発明の他の非限定的な潜在的応用には例えば以下が含まれる：臨床サンプル、環境サンプル及び食物サンプル中の微生物及び宿主転写物の検出並びに弁別；遺伝的適合性調査；血液製剤及び移植製品のスクリーニング；及び医薬化合物の生物安全性検査。本発明によって設計されるオリゴヌクレオチドは配列保存に基づいているので、本発明は、正確な標的配列が知られていない可能性がある場合の遺伝子標的の感度の高い多重検出及び特徴決定のためにそのようなオリゴヌクレオチド用いる方法を提供する。
【００３７】
ある実施態様では、オリゴヌクレオチドを設計する本発明の方法は、サンプル中のウイルスを検出及び同定することができるオリゴヌクレオチドの集合の作出を可能にする。ある実施態様では、本発明は、サンプル中の任意の脊椎動物ウイルスの検出に用いることができるオリゴヌクレオチドの集合を提供する。
ある実施態様では、本発明は、脊椎動物を包括的にカバーすることができるオリゴヌクレオチドの集合を提供し、この場合、前記オリゴヌクレオチドの集合は付属CD-ROM表に列挙した核酸配列を含む。
別の実施態様では、本発明は、脊椎動物を包括的にカバーすることができるオリゴヌクレオチドの集合を提供し、この場合、前記オリゴヌクレオチドの集合は付属CD-ROM表に列挙した核酸配列に由来するか、又は前記から戻し翻訳された核酸配列を含む。
別の実施態様では、本発明は、付属CD-ROM表に列挙したアミノ酸配列に由来するか、又は前記から入手される配列モチーフを提供する。続いて、これらの配列モチーフは、前記配列モチーフをコードしえるウイルス核酸配列を同定するために、NCBI若しくはICTVデータベース又はNCBI/ICTV統合データベース中の核酸配列と比較される。オリゴヌクレオチドは前記配列モチーフに基づいて設計することができ、この場合、前記設計物には縮退配列、保存的変異、及び配列ヴァリエーション（そのオリゴヌクレオチドが、モチーフをコードするNCBI又はICTVデータベース中のヌクレオチド配列と少なくとも90、95、96、97、98又は99%同一であるようなもの）が含まれえる。
【００３８】
ある実施態様では、本発明は脊椎動物ウイルス検出用オリゴヌクレオチド集合を提供し、ここで前記オリゴヌクレオチド集合はアミノ酸配列から逆翻訳され、各アミノ酸配列は、（a）アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス科、アスファルウイルス科、アストロウイルス科、ビルナウイルス科、ボルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カリシウイルス科、シルコウイルス科、コロナウイルス科、デルタウイルス、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、Ｅ型肝炎様ウイルス、ヘルペスウイルス科、伝染性喉頭気管炎様ウイルス、イリドウイルス科、ノダウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、及びトガウイルス科から成る群から選択されるウイルス科；（bアスフィウイルス、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アヴィポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシポックスウイルス、ヤタポックスウイルス、エントモポックスウイルスA、エントモポックスウイルスB、エントモポックスウイルスC、イリドウイルス、クロリリドウイルス、ラナウイルス、リンホシスチウイルス、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ムロメガロウイルス、ロセオロウイルス、リンホクリプトウイルス、ラディノウイルス、イクノウイルス、ブラコウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、マストアデノウイルス、アヴィアデノウイルス、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、コルチウイルス、アクアレオウイルス、シポウイルス、フィージウイルス、フィトレオウイルス、オリザウイルス、アクアビルナウイルス、アヴィビルナウイルス、エントモビルナウイルス、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、C型インフルエンザウイルス、D型インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ルブラウイルス、ニューモウイルス、ボルナウイルス、マルブルグウイルス、エボラウイスル、アレナウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、D型レトロウイルス群、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス、ブンヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス、トスポウイルス、カリシウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス、カルディオウイルス、アフトウイルス、アストロウイルス、フラビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、アルファノダウイルス、コロナウイルス、トロウイルス、アルファウイルス、アルテリウイルス及びデルタウイルスから成る群から選択されるウイルス属；及び／又は（c）（a）のウイルス科又は（b）のウイルス属に由来する1つのウイルスの種のいずれかで保存されているモチーフを含み、前記オリゴヌクレオチドの集合は全体として任意の脊椎動物ウイルスを検出することができる。ある実施態様では、前記アミノ酸配列は付属CD-ROM表から選択される。
【００３９】
ある実施態様では、本発明は、特定の科の脊椎動物ウイルスを検出するオリゴヌクレオチドの集合を提供する。前記オリゴヌクレオチド集合はアミノ酸配列から逆翻訳され、各アミノ酸配列は検出されるべきウイルス科で保存されているモチーフを含み、前記ウイルス科は、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス科、アスファルウイルス科、アストロウイルス科、ビルナウイルス科、ボルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カリシウイルス科、シルコウイルス科、コロナウイルス科、デルタウイルス、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、Ｅ型肝炎様ウイルス、ヘルペスウイルス科、伝染性喉頭気管炎様ウイルス、イリドウイルス科、ノダウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、及びトガウイルス科から成る群から選択される。前記ウイルス科で保存されているモチーフは、前記科の属又は種で保存されているモチーフを含むことができる。ある実施態様では、前記アミノ酸配列は付属CD-ROM表の適切なウイルス科から選択される。
ある実施態様では、本発明は、特定の属の脊椎動物ウイルスを検出するオリゴヌクレオチドの集合を提供する。前記オリゴヌクレオチド集合はアミノ酸配列から逆翻訳され、各アミノ酸配列は検出されるべきウイルス属で保存されているモチーフを含み、前記ウイルス属は、アスフィウイルス、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アヴィポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシポックスウイルス、ヤタポックスウイルス、エントモポックスウイルスA、エントモポックスウイルスB、エントモポックスウイルスC、イリドウイルス、クロリリドウイルス、ラナウイルス、リンホシスチウイルス、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ムロメガロウイルス、ロセオロウイルス、リンホクリプトウイルス、ラディノウイルス、イクノウイルス、ブラコウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、マストアデノウイルス、アヴィアデノウイルス、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、コルチウイルス、アクアレオウイルス、シポウイルス、フィージウイルス、フィトレオウイルス、オリザウイルス、アクアビルナウイルス、アヴィビルナウイルス、エントモビルナウイルス、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、C型インフルエンザウイルス、D型インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ルブラウイルス、ニューモウイルス、ボルナウイルス、マルブルグウイルス、エボラウイスル、アレナウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、D型レトロウイルス群、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス、ブンヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス、トスポウイルス、カリシウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス、カルディオウイルス、アフトウイルス、アストロウイルス、フラビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、アルファノダウイルス、コロナウイルス、トロウイルス、アルファウイルス、アルテリウイルス及びデルタウイルスから成る群から選択される。前記ウイルス属で保存されているモチーフは、属又は前記属の種で保存されているモチーフを含むことができる。ある実施態様では、前記アミノ酸配列は付属CD-ROM表の適切なウイルス科の適切な属から選択される。
【００４０】
検出アッセイ
迅速で正確な弁別的診断は感染症の伝染病原体及び臨床管理の効果的な制御にとって必須である。一連の関連症状群が単一の病原体に特異的であることは、特に感染過程の初期においては稀である。したがって、診断ツールは同時に多数の因子を考慮する必要がある。本発明の方法は、種々の分類群内の任意の因子の検出に用いることができるオリゴヌクレオチドの集合を設計することができる。例えば、装置がピコルナウイルス科及びアデノウイルス科の中の任意のウイルスを検出することを所望される場合、本発明は、両方の科をカバーすることができるオリゴヌクレオチドの集合を提供することができる。そのようなオリゴヌクレオチドの集合は、モチーフ収集物が両方の科の全ての種をカバーすることを担保するような保存配列モチーフを基にすることができる。
臨床標本中の微生物病原体の直接検出のための分子的方法は迅速で感度が高く、さらに、病原体の複製に関する難しい要件や高レベルの生物封じ込めの要件が培養を困難にする場合には成功するかもしれない。培養に依存しない感染性因子の特性決定のために多様な方法が用いられ、また提唱されている。これらの方法はおおざっぱに、微生物の核酸配列の直接分析に基づく方法（例えばcDNAマイクロアレイ、コンセンサスPCR、典型的相違分析、ディファレンシャルディスプレイ）、微生物のタンパク質配列の直接分析（例えば質量分析）、微生物検出用免疫学的システム（例えば発現ライブラリー、ファージディスプレー）及び宿主応答プロファイリングに基づく方法に分離される。これらの従来方法は、本発明の方法及びオリゴヌクレオチド収集物を使用することにより強化することができる。
コンセンサスPCR（cPCR）は極めて能力の高い生物学のためのツールである。病原体の同定の他に、この方法は極めて多様な宿主分子（サイトカイン、イオンチャネル及びレセプターを含む）の同定を促進してきた。ウイルス学における病原体の発見にcPCRを応用するときの1つの問題は、通常的cPCR様式では交差ハイブリダイゼーション、増幅及び識別を可能にするために十分な長さの保存ウイルス配列を同定することが困難であるということであった。ドメイン特異的ディファレンシャルディスプレイはこの問題の克服を試みている。前記の方法では、cPCRで解像しえるよりも大きな分類学カテゴリーを代表するウイルス遺伝子とハイブリダイズさせるために設計された短い縮退プライマー集合が使用される。この改変により、1999年のニューヨーク市の脳炎の大流行の原因因子として西ナイルウイルスの同定が可能になったが、多重化に限界があるためにcPCRの処理能力の低さという問題は解決されなかった。
【００４１】
高度に多重化されたリアルタイムアッセイの必要性を強調すべく、質量タグPCR（Mass Tag PCR）が作出された。質量タグPCRは新規なPCRプラットフォームであり、前記プラットフォームではレポーターとして蛍光色素ではなくデジタル質量タグが供される。この方法に関する最初の記述は、22の異なるウイルス性及び細菌性の呼吸器病原体を識別するパネルの説明の中で報告された。しかしながら質量タグPCRは、より大きな数の既知病原体を考慮する必要がある事例、新規ではあるが関連する病原体が予想される事例、又は配列の多様さがPCRプライマーの結合を妨げえる事例では十分ではない。これらの欠陥を取り除くために、本発明は、一つには配列保存にそれらの基礎を置くという理由で配列の多様さに対しより寛容さを与える、オリゴヌクレオチドの集合の設計を提供する。
ウイルスマイクロアレイは、伝染病の高度に多面化された弁別的診断のためのプラットフォームを提供する。その潜在的な特徴の数は、他のいずれの既知技術をもはるかに超えている。さらにまた、70ヌクレオチドまでの配列標的は稀ではない。したがって極めて多様なウイルス標的を捕捉する能力がある。最後に、微生物標的及び宿主遺伝子標的の両方を取り込むことができる。これによって、ウイルス性因子を検出しさらに多様なクラスの感染性因子と一致するシグナチャーについて宿主の応答を判定するという両方の機会を得ることができる。種々の実施態様では、本発明は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの集合のいずれか、又は本明細書に記載の方法によって設計することができるオリゴヌクレオチドの集合のいずれかを含むウイルスマイクロアレイ提供する。
【実施例１】
【００４２】
実施例1：脊椎動物ウイルスデータベース及びマイクロアレイ
脊椎動物ウイルスはヒトの疾患に対してもっとも重要であるので、脊椎動物ウイルスデータベースを先ず初めに構築し、その後で無脊椎動物、植物及び原核細胞のウイルスデータベースに広げることが計画された。（1）ICTVデータベース（ICTVdb）に列挙されている全ての脊椎動物ウイルス、及び（2）私設収集物（すなわち疾病管理センターなど）由来の未公開配列を含むデータベースを編集した。NCBIデータベースは網羅的にキュレーションされて（curated）いない。したがって、前記データベースは、注釈が欠落しているか、時代遅れになっているか、又は不正確な多くの登録を含む。また別の問題は、ゲノムの配列決定の努力が重要視されなかった多くのウイルスについて不完全な配列しか入手できないということ、または、データがバイオディフェンス及び伝染病出現に照準を合わせたネットワーク（例えばWHOネットワーク及び国防省研究所（Department of Defense laboratories））内に制限されるということである。
NCBIデータベースのキュレーション及び命名における限界を回避するために、さらにヌクレオチド（nt）レベルでの多重アラインメントの確立にスーパーコンピューター使用の必要性を排除するために、脊椎動物ウイルスデータベースの構築をPFAM及びHMMを用いることによって実施した。NCBIデータベースは解析時には総数291,571のウイスル配列を含んでいた。NCBIのウイルスタンパク質コード配列の84%はPFAMデータベースで表わされた。残りの16%はBLASTを用いてこの集合にマッピングされた。PFAMデータベースは配列アラインメントの集合であり、これまでのところ、7973の特異的タンパク質ドメイン又は“ファミリー”（それらの配列相同性から規定される）を列挙している。
オリゴヌクレオチド設計のための配列は、生物学的パラメーター（タンパク質又はドメインの保存の程度、感染時におけるそれらの発現レベル、及び対応する領域について入手可能なデータ量を含む）を基準にこれらのファミリーから選択される。可能な場合は、酵素（例えばポリメラーゼ）のコード配列内の高度に保存された1つの領域及び構造タンパク質内のさらに2つの可変領域が選択される。より保存された配列は全体的な検出にとって極めて経済的なアプローチであるが、構造タンパク質をコードするRNAは、触媒量でのみ必要とされるタンパク質をコードするRNAよりもより高レベルで存在しえる。さらにまた、ゲノム上の非連続部位を標的とする3プローブという冗長性は、天然に存在するか又は操作されたキメラウイルスの検出を可能にしえる。この選別プロセスによって、ICTVデータベースの全ての科又は属をカバーする151,039のPFAM配列を含むデータベースがえられた。前記データベースには、可能な場合には常に3つの標的ゲノム領域の冗長性を伴う完全な配列又は部分的な配列が利用可能な脊椎動物ウイルスが列挙されている。
【００４３】
一般的なアレイ（10,000から20,000の特徴物が許容される）上にプリントするために適切な扱いやすい数にPFAMを濃縮するために、2つのアプローチを採用した。第一に、1つのウイルス種が多数のPFAMヒットを伴う事例では、例えばHIV（約80,000のPFAMヒットを伴う）では、オリゴヌクレオチドの選別を（サブタイプ、系統又は血清型を区別することなく）高度に保存された領域に限定した。第二に、長い標的領域を選択した。例えば60merの標的領域に対して設計されたオリゴヌクレオチドを選別し、ウイルスデータベースに登録されたものと前記60merの標的との間で4ヌクレオチドまでのミスマッチを許容した。この決定は、以下の事柄が確認された実験的データ（下記第一のアレイに関する考察を参照されたい）に基づくものであった；（1）アレイの性能は50merの標的の場合よりも60merの標的の場合により良好であった、（2）70merの標的では合成はより困難で高価であり性能も改善されなかった、さらに（3）意図的にミスマッチさせた標的／サンプルのペアのハイブリダイゼーションは、60mer全体に分布する8つまでのミスマッチ塩基について寛容性を示した。このミスマッチ寛容性はミスマッチが標的の末端にとどまるときさらに強かった。
実質的なウイルス適用範囲はいくつかの質量タグパネルを用いることによって達成することができるが、それにもかかわらず、多数の既知病原体を考慮しなければならない事例、新規ではあるが関連を有する病原体が予想される事例、または配列多様性がPCRプライマーの結合を妨げるおそれがある事例が存在する。この問題を扱うために、脊椎動物ウイルスデータベースを用いて、臨床材料を用いる診断に使用するために特に適切なウイルスアレイを構築した。
【００４４】
第一のテストアレイ
最初のウイルスアレイ実験は、広範囲のブンヤウイルス及びアデノウイルスに対応する、5'末端にアミノ修飾を有する又は有しない50、60及び70ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを、ポリL-リジン及びエポキシ被覆ガラススライドにスポットすることによって実施した。ポリL-リジンとエポキシ被覆、又は未修飾60ヌクレオチドと70ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド標的との間で相違は観察されなかった。しかしながら、ハイブリダイゼーションシグナルは、未修飾オリゴヌクレオチドについて、又はアミノ修飾物について50から60ヌクレオチドの標的長における増加により改善された。アミノ酸修飾によるシグナル強化は、標的が分子の一端でスライドに結合するように制御され、その結果、標的の残余部分が自由にハイブリダイズできるためであると言えよう。残念ながら、標的ライブラリーサイズが増加するとアミノ酸修飾コストは法外になりえる。したがって、第一のアレイは、ICTVdb中の1710の脊椎動物ウイルスの各々について1−2配列に対応する60ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを用いて作製した。3418標的を有するこのアレイを用いて、臨床材料中のウイルス配列の増幅、標識及び検出のための条件を確立した。このスライド中の標的サブセットは、真正のウイルス配列に対してミスマッチを5'若しくは3'末端に含むか、又は標的全体に分散したミスマッチを含むように設計された。これらのキメラ標的の分析によって、標準的な条件下では、ハイブリダイゼーションシグナルは、標的分子全体にランダムに分布する8ヌクレオチドまでのミスマッチで生じえることが示された。ミスマッチが末端にとどまるときはミスマッチへの耐性はさらに高かった。これらの実験に基づき、オリゴヌクレオチドは、4ヌクレオチドを超えないミスマッチを含む既知ウイルス配列に向けられた標的を各アレイが含むように保存的に設計することができる。
【００４５】
第二のテストアレイ（GreeneChip 1.1）
in silica実験を続行し、統合ICTV/NCBIウイルスデータベース（報告された単離株を含む1710種）中の脊椎動物ウイルスを3遺伝子領域においてカバーする（ミスマッチは4ヌクレオチド以下）合計9066のオリゴヌクレオチド（60mer）を同定した。9366オリゴヌクレオチドのパネル（宿主遺伝子マーカーを標的とする300プローブを別に含む）を用いて第二のテストアレイを作製した。
下記に記載するさらに別の情報をマイクロアレイから得るために、別の300の標的が選択された。この場合、前記標的は、有効性が確認されたオリゴヌクレオチドの集合から、サイトカイン、ケモカイン及びそれらのレセプター；インターフェン誘導性シグナリング経路の成分；免疫グロブリン（Ig）及びIgレセプター；トール（toll）様レセプター及びそれらの下流のシグナル伝達経路；補体成分；MHC分子；及び熱ショックタンパク質に関連する遺伝子を代表する。未知の原因による伝染病の流行に対しマイクロアレイを応用するとき、罹患対象者由来のサンプルでただ1つの病原体を表象するシグナルを同定することが主要な目的である。しかしながら、疾病で1つの因子を示唆するには、分子シグナチャーを明示する以上にはるかに多くのことが要求されるが、感染に対する宿主の免疫応答と一致する遺伝子発現の同一範囲の証拠によって改善されえる。本明細書に記載のマイクロアレイプラットフォームを用いて評価されるいくつかの急性期サンプルは同時感染の徴候を示すこともある：感染性因子を表象するシグナル及びサンプル間にわたる宿主免疫応答のプロファイルを調べることにより、既に存在するか又は共生している因子から病理発生に中心的に関与する病原因子をより容易に識別することができる。さらにまた、先天的及び後天的免疫経路に関連する遺伝子を表象するオリゴヌクレオチドを含めることによって、慢性疾患におけるマイクロアレイプラットフォームの応用を促進することができる。慢性症状が感染によって誘発された又は悪化したものであるかを明らかにするために、免疫応答調節異常が存在することは特異的病原体を示唆するシグナルレベルが低いことと相俟って、病理発生における感染性因子の役割を明らかにすることに役立つ。最後に、既知のいずれの病原体の明瞭な証明も発見が困難である場合又はシグナルが低い場合に、免疫活性化と対応するプロファイルが存在することは、病原体の発見に焦点を合わせたさらに別の検査を続行するか否かの決定に役立ちえる。
【００４６】
アレイの3418標的ヴァージョン（第一のテストパネル）による最初の成功の後、さらに別のバイオインフォマティクス分析を実施して、より包括的なアレイを作製した。この第二世代アレイのためのオリゴヌクレオチドは、ICTVdbの脊椎動物ウイルスの全ての科又は属の3つの別個のゲノム標的領域を表象するように選別した。反復プロセスにより、98,310配列（151,039PFAMドメイン）を同定した（ICTVによって登録された脊椎動物ウイルスのための利用可能な配列データ（完全配列又は部分配列）を含んでいた）。実施上の配慮から、in silica実験を実施し扱いやすい数になるまでこのライブラリーをさらに調整し、3遺伝子領域において前記データベース（報告された単離株を含む1710種）中の脊椎動物ウイルスをカバーする9066の60merオリゴヌクレオチド（ミスマッチは4ヌクレオチド以下）を選別した。300の宿主遺伝子標的を加えて機能性を高め、病理発生への手がかりを提供した。この9366のオリゴヌクレオチドのパネルを用いて、“GreeneChip1.1”を作製した（米国仮特許出願60/861,365号（前記文献は参照により本出願に含まれる）とともに提出された付属CD-ROM表に含まれるウイルス及び宿主標的リストを参照されたい）。
【００４７】
マスクレスプリント技術（Agilent Technologies）を用いて製造したGreeneChip1.1は以下の利点を有する：（1）9066のウイルス標的において、このアレイは第一世代のアレイよりも複雑である（ICTVdb中の1710のウイルスの各々のための、最小3つの60ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブを表示する）；（2）ハイブリダイゼーションのために最適な暴露を可能にするために、オリゴヌクレオチドは平らな表面に対して直角にin situで合成されている；（3）スポット密度の信頼度及び再現性が顕著に改善されている（図1参照）；（4）GreeneChipは20バッチで製造され、新規配列を含ませる改変が容易である（さらに大規模な生産工程はピンドライブスポット（pin-driven spotting）法を用いて実施することができる）；（5）ヒト遺伝子配列が宿主応答の評価を可能にするために導入されている；（6）アジレント（Agilent）スキャナーの実装によって分解度の改善に必要な焦平面の自動調整が可能になる。
下記の表7は、GreeneChip1.1とDeRisi及び共同研究者が開発したウイルスアレイ（D. Wang et al. 2003, “Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays”, PLoS Biol 1:E2）との比較である。2つのアレイシステムは、設計、複雑度及び脊椎動物ウイルスのカバー範囲でかなり相違する。
【００４８】
表7：ウイルスアレイの比較
2009131242.tif 000009
DeRisiデータベースは脊椎動物ウイルスの範囲においてはるかに限られており、主として完全なゲノム配列が判明している古い参照株に基づいており、PFANとHHMとの組合せよりも脆弱なアルゴリズムを利用し、GreeneChipの60mer配列とは対照的に70mer配列標的を基準にしている。標識プロトコルもまた異なっている。要約すれば、GreeneChipシステムは範囲が広く、より特異的で、より感度が高い。
【実施例２】
【００４９】
実施例2：本発明のマイクロアレイのためのプロトコル
以下のプロトコルは“GreeneChip”について述べているが、本発明の方法は一般的に本発明のオリゴヌクレオチドマイクロアレイの設計に応用することができる。
GreeneChipからウイルス配列を回収する方法
アレイにハイブリダイズしたウイルスcDNAを溶出させ、さらに配列を決定することによって、ハイブリダイゼーションシグナルの特異性を試験することができる。WNV、SARS及びシンドビス単離株を用いた実験では、200から1000ヌクレオチドの範囲のcDNAを入手した。GreeneChipは、各ウイルスについて異なるゲノム領域を表象する最少3つ又はそれ以上のプローブを提示することができる。したがって、この方法は、迅速な配列特徴決定及び系統発生分析を可能にする。このプロトコルは直接的であり、複雑な装置を要求せず、臨床検査室又は野外検査所で容易に実施することができる。シリコンガスケットをスライドに適用して、アレイ上にウェルを作ることができる。200mLの水を65℃で10分、前記ウェルに配置する。溶出したcDNAを含む水を取り出す。ハイブリダイズ産物を生成させるために用いた特異的増幅プライマーとともに、5mLをPCR増幅用鋳型として用いる（94℃で1分の変性、55℃で1分のアニーリング、72℃で90秒の伸張、35サイクル）。生成物をプラスミドベクター（pCR2.1-TOPO TA, Invitorgen）に連結し、コンピテント大腸菌の形質転換に用いることができる。直接コロニーPCR及びジデオキシシークェンシングによって白色コロニーをスクリーニングすることができる。
【００５０】
ウイルスマイクロチップサンプルの調製、ハイブリダイゼーション及び標識の方法
結果をフェノール使用抽出系（Tri-Reagent TR（組織）；Tri-Reagent LS（液体））、シリカ結合カートリッジ（Qiagen kits）、及び磁性シリカ結合溶液（MiniMag/NucliSense Systems）を用いて比較することができる。後で処理するために保存した（RNAlater, Ambion）サンプルの性能もまた試験することができる。陰性コントロールには、健常なボランティアから入手した対応する標本タイプ（血液、尿、喀痰及び便を含む）を含むことができる。
以前に診断されたサンプルの抽出物、又は実験的感染に由来するサンプル抽出物をリアルタイムPCRによって定量して、アレイ解析に先立って、材料の完全性を確認しさらに検出感度を評価することができる。各特殊化サブアレイ上で陰性のスコアを得た未知因子をGreeneChip1.1の分析に付すことができる。
臨床材料を用いるアレイの実行にとって感度は重要である。頑強な普遍的増幅方法を確立することが重要であろう。プロトコルの個々の工程の有効性をモニターし、さらにスパイクサンプル及びリアルタイムPCRを用いて最適化することができる。
TriReagent（Molecular Resource Center）を用いて感染細胞からRNAを抽出することができる。宿主DNAの除去のためにDNAse処理及びDNAse中和を実施した後、28S及び18SのrRNAをカラムクロマトグラフィーで除去することによってウイルスRNAを濃縮することができる。特異的プライマー配列（5'GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN）（配列番号:1）と結合させたランダム８量体を用いて第一鎖逆転写を開始することができる。RNase H消化の後、上記プライマー及び特異的プライマー配列を標的とするプライマー（5'CGCCGTTTCCCAGTAGGTCTC）（配列番号:2）の1：9混合物を用いてcDNAを増幅することができる。最初のPCR増幅サイクルは低いアニーリング温度（35℃）で実施することができる；その後のサイクルはストリンジェントなアニーリング温度（55℃）を用い、前記特異的配列によるプライミングを促進する。
【００５１】
続いてこの第一のPCRの生成物を、前記特異的プライマー配列を用いて第二の“標識”PCRで増幅することができる（前記特異的プライマー配列は、300を超える蛍光レポーター分子を含む3DNAデンドリマー（Genisphere Inc.）のための捕捉配列と結合されている）。このPCR生成物をハイブリダイゼーション緩衝液（最終濃度：0.25MのNaPO4、0.5％のSDS、1mMのEDTA、1xのSSC、2xのデンハルト溶液；pH7）中で変性させ、さらにハイブリダイゼーションのために回転プラットフォーム上にて65℃で1時間、GreeneChipに添加することができる。洗浄に続いて、第二のハイブリダイゼーション工程を実施し、Cy3-標識デンドリマー（Genisphere, Hartfield, PA）を添加することができる。GreeneChipをデンドリマーハイブリダイゼーションミックスとともに65℃で1時間インキュベートし、洗浄、乾燥、Agilent DNAマイクロアレイスキャナーによる画像化を実施し、さらにAgilentフィーチャーエキストラクターソフトを用いて分析することができる。
デンドリマーの使用によって、リポーター分子が直接増幅生成物に取り込まれるマイクロアレイ標識方法よりも感度において100倍の増加が提供される。
同時に、これらの改変は1,000,000 RNA分子（標準的DOP-PCRプロトコル）から1000 RNA分子（上記に提示したGreeneChipプロトコル）への感度の増加を提供することができ、臨床応用及び監視的応用で要求される感度により任意の1710の既知脊椎動物ウイルス又は関連ウイルスの検出を可能にするために十分でありえる。
【００５２】
感染培養抽出物を用いるアッセイ性能を最適化する方法
標的遺伝子を通常のRT-PCRクローニング方法によってpGEM-Teasy（Promega）又はpCR2.1-TOPO（Invitrogen）にてクローニングすることができる。最初のアッセイ確立には定量化したプラスミド標準物を用いることができる。その後、in vitro転写によって生成し、定量化し、ランダムヒトRNA（脳、肝、脾、肺及び胎盤を等しい割合で表す）のバックグラウンド中で稀釈したRNA転写物を用いて、感度及び特異性パラメーターを確立することができる。
各ウイルス性選別病原因子／遺伝子の代表的な1単離株並びにインフルエンザH及びN各サブタイプの1単離株を最初のアッセイ確立時に用いることができる。較正用試薬はネットワーク研究室及び最終的にはカスタマーに分配されるキットの構成要素でありえる。3つのタイプの較正用試薬を提供することができる：1）性能テスト用クローン化標的遺伝子、2）リアルタイムPCRによって較正された感度評価用の組織培養抽出物、及び3）内部陽性コントロールとして、逆転写前に各サンプルでスパイクとして添加される合成RNA標的（この内部コントロールにマッチするプローブはアレイにプリントされている）。
真正病原体の細胞培養抽出物を用いて、RT転写反応の性能を最適化し、さらにそのmRNA転写物によりDNAウイルス（ポックスウイルス科）の検出を確認することができる。組織培養上清のウイルス及び感染細胞層由来のRNAを市販の抽出キットを用いて抽出し、続いてDNaseで処理することができる。
DNase処理によってGreeneChip1.1の感度を高めることができる。種々のRT酵素の有効性は、同じサンプルの同一アリコットから生成したcDNAのリアルタイムPCR定量化を用いることによって比較される。
【００５３】
ハイブリダイゼーションの自動評価のためのアレイ分析アルゴリズム／ソフトウェア
ソフトウェアツールは、陽性シグナル（平均バックグラウンド＋3標準偏差と定義される、閾値を越える蛍光を有するプローブ）のパターンを分析するように調整することができる。このソフトウェアは内部コントロール及び位置マーカー由来のシグナルを除去することができる。統合Greeneデータベースで提供されている分類学的情報に基づいて、このソフトは検出されたハイブリダイゼーションパターンを分析し、与えられたウイルスの科、属及び種と当該パターンがマッチする、等級付けされた確率を算出することができる。
【００５４】
データベースの品質管理のための方法及びアルゴリズム／ソフトウェア
432の脊椎動物ウイルスから選択されたランダムサブセットをアメリカンタイプカルチャーセンター（ATCC）から購入することができる。432の入手可能な単離株からランダムに選択した30ウイルスのサブセットとのハイブリダイゼーションの成功によって1.0という正の予想値が得られよう。
適切なプローブがシグナルを生じ、予想される結果を提供し、さらに正のスコアを示す場合は、更なる作業は要求されないであろう。
適切なプローブのいずれもシグナルを生じない場合又はただ1つのサブセットしかシグナルを生じない場合、得られた結果は、技術的な問題（シグナルが全く発生しない場合）又は標的が相対的に多すぎることと関係があるかもしれない。標的鋳型の存在を定量的PCRによって確認するために、ハイブリダイゼーションを繰り返すことができる。パターンが転写グラディエントと一致する場合、正のスコアを付すことができ、更なる作業は要求されないであろう。プローブが成功しない場合はプローブを再設計することができる。
適切なプローブ（又はそのサブセット）がシグナルを生じるが、不適切なプローブもまたシグナルを生じる場合、それらに正のスコアを付し、配列相同性について判定することができる。相同性が存在しない場合はプローブを交換することができる。相同性が存在する場合は、そのプローブはアッセイソフトウェアに潜在的交差ハイブリダイズ標的として記録され、代用マーカーとして機能しえるので適切な場合にはプローブの交換について考慮することができる。
【実施例３】
【００５５】
実施例3：脊椎動物ウイルスデータベースの維持、更新、試験、及びソフトウェア
本ソフトウェアは、マイクロアレイの設計及び更新を支援する、バイオインフォマティクスツール及びデータベースを確立し、実行し、さらに有効性を実証するために設計することができる。
ウイルス配列の最新情報を抽出するための設計及び実行ソフトウェア
病原体、特にRNAウイルス（例えばインフルエンザ）の急激な進化は、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ技術によってさえも検出を困難にする可能性がある。したがって、本発明の方法は、データベース及びオリゴヌクレオチド集合の持続的な更新を可能にする。Agilentマスクレスプリント技術の主要な利点は、新たなコストを要求することなくGreeneChipを迅速に改変することができるということである。したがって、必要な場合には、GreeneChipの新ヴァージョンを月単位で導入することができる。
包括的ウイルスデータベース作成のための公開及び独占的配列データの統合
公表されず公開データベースに寄託もされていないウイルス配列へアクセスすることによってより網羅的なデータベースが提供されえる。例えば、独占的収集物からの最初のインストールとして以下の選別病原因子の完全なゲノム配列を入手し、脊椎動物ウイルスデータベースに加えた：クリミア-コンゴ出血熱ウイルス、株AP92、ArD8194、ArD15786、ArD39554、C-68031、Drosdov、Kashmanov、Oman、SPU97/85、SPU103/87、SPU415/85、Turkey200310849、UG30010；リフトヴァレー熱ウイルス、株ZH-501、ZM-657、ZC-3349、ZSS-6365、ZS-501-777、ZH-501-T1、763/70 Rhodesia、2250/74 Rhodesia、1260/78 Rhodesia、Kenya 98000523、Saudi 10911、Entebbe、Os-1、SA-75、Smithburn、Kenya56、Kenya57、MP12、Clone 13、CAR R1662、AnK6087、ANK3837、73HB1449、MgHb24；マルブルグウイルス、株Ravn、DRC Nga、 DRC Aru、 DRC Dra、Angola05及びVoege67。データベースへの前記の追加は最初のプローブ設計の正確さを高め、さらに更新によりアレイが最新であることを担保する。この関係では、GenBankはマルブルグウイルスの2つの株について完全なゲノム配列を含むが、一方、前記拡張データベースはマルブルグウイルスの15の株について完全な配列を表示し、同様に、GenBankはクリミア-コンゴ出血熱ウイルス（CCHFV）の2つの株について完全なゲノム配列を含むが、一方、前記拡張データベースはCCHFVの15の株について完全な配列を表示していることは注目に値する。
【００５６】
スクリプトの更新
GenBank/EMBL、SwissProt/UniProt、ISD及びCDCデータベースに1ヶ月間隔で新規配列エントリーについて問い合わせるスクリプトを設計することができる。新規な配列エントリーは関連性（脊椎動物ウイルス）についてキュレーションする（curate）ことができる。この過程は、例えば4つのタイプの新規なエントリーを明らかにすることができる：（1）アレイ上に提示された領域内の、既知ウイルス種の新規な配列；（2）アレイ上に提示されていない領域内の、既知ウイルス種の新規な配列；（3）アレイ上に提示された領域内の、以前に特徴が決定されていないウイルス種の新規な配列；（4）アレイ上に提示されていない領域内の、以前に特徴が決定されていないウイルス種の新規な配列。
（1）アレイ上に提示された領域内の既知ウイルス種の新規な配列：新規配列エントリーを既存アレイ上でプローブと比較することができる。前記配列が少なくとも1つの既存プローブにより4ヌクレオチド未満のミスマッチでカバーされる場合は、更なる作業は要求されないであろう。既存のプローブ集合を用いたとき前記カバーが不十分である場合に新規プローブを加えることができる。
（2）アレイ上に提示されていない領域内の既知ウイルス種の新規な配列：新規配列エントリーを脊椎動物ウイルスデータベースの問合わせに用いることができる。関連するエントリーが存在しない場合、又は既存配列との相同性が90％未満である場合は、新規なプローブを作製することができる。理論に拘束されないが、この場合の根拠は、アレイに提示されていないある領域内の多様性は、アレイ上に提示されている別の領域内の多様性を予想することができるということである。
（3）アレイ上に提示された領域内の以前に特徴が決定されていないウイルス種の新規な配列：新規配列エントリーを既存アレイ上でプローブと比較することができる。前記配列が少なくとも1つの既存プローブにより4ヌクレオチド未満のミスマッチでカバーされる場合は、更なる作業は要求されないであろう。既存のプローブ集合を用いたときカバーが不十分である場合は新規プローブを加えることができる。
（4）アレイ上に提示されていない領域内の以前に特徴が決定されていないウイルス種の新規な配列：新規配列エントリーを脊椎動物ウイルスデータベースの問合わせに用いることができる。関連するエントリーが存在しない場合、又は既存配列との相同性が90％未満である場合は、新規なプローブを作製することができる。理論に拘束されないが、この場合の根拠は、アレイで提示されていないある領域内の多様性は、アレイ上で提示されている別の領域内の多様性を予想することができるということである。
【００５７】
更新された統合ICTV/NCBIウイルスデータベース（脊椎動物ウイルスデータベース；Greeneウイルスデータベース）の維持及びキュレーション
デ新規な配列の蓄積並びにタンパク質の構造及び機能についての洞察の結果として、ータベースは進化し、分類学による命名法及びタンパク質ドメインの割り当ては変化しえる。このことに対処するため、6ヶ月間隔で関連する情報をGenBank/EMBL、SwissProt/UniProt、ISD、CDCデータベース、ICTVdb及びPFAMからダウンロードすることができる。ダウンロードした情報を一時的な統合データベースに入れ既存のデータベースと比較することができる。
ランダムなウイルス標的サンプルを用いるGreeneChip1.1の性能試験によるデータベースの有効性の実証
計算上の制約により、1710の脊椎動物ウイルス、それらの変種及びサブタイプのハイブリダイゼーションの有効性の実証は非現実的になっている。したがって、オリゴヌクレオチド選別プロセス及びランダムサンプリングアプローチにより得られたGreeneChip1.1の有効性の実証を行うことができる。
ランダムサンプリングアプローチはサンプリング理論に基づくことができる。この理論は、“安定な確率系”は予想及び測定の両方が可能な内在性パターンにしたがった動きを示すであろうということを予測する。各予測可能なパターン内の変動は必然的である。このパターンから外れるヴァリエーションは、統計的品質管理測定値（statistical quality control measurements）（E. Grant and R. Leavenworth, 1980, Statistical Quality Control, McGraw Hill, 5th Ed）を用いて検出することができる。西ナイルウイルス、SARSコロナウイルス及びエボラウイルスによるハイブリダイゼーション実験の結果は一貫性があった。したがって、可能な実験総数（すなわちデータベース中の種々の生物種の数、ここでは1710の脊椎動物ウイルス）をランダムにサンプリングすることによって各標的因子に対する感度及び特異性についての信頼区間を概算することができる。
N個（例えば1710までの種）の可能な実験群では（前記群から我々はサイズｎ（例えば30種）のサンプルを選択する）、合計ｋの可能な成功（予想される値）からｘの成功が測定される確率は超幾何学的分布（hypergeometric distribution）にしたがう。したがって“サンプリング実験”は超幾何学的実験として知られる（N. Johnson et al. 1993, Univariate Discrete Distributions, 2nd Ed. John Wiley and Sons, Inc.）。以前の記載に従えば、実験の失敗率はｎ−ｘであり、さらに我々が評価しようとしているGreeneChipの失敗率はＮ−ｋに等しい。
【００５８】
式１は超幾何学的分布の計算を示している。n/Nの割合が＜10については、式2で提供される二項分布を用いて超幾何学的分布を概算することができる。
式1：超幾何学的分布。サイズｎのランダムサンプルにおいてｘ個の成功（種の真の正の予測）の確率は、可能な成功の組合せ[k/x]と失敗アレイの可能な組合せ[(n-k)/(n-x)]との積を、我々が入手可能な単離株を有している種の総数（N）から取り出すことができるサイズｎのサンプルの可能な組合せ[N/n]によって割ったものと等しく、n/N＜10のとき下記式で与えられる：
【００５９】
【数１】
2009131242.tif 000010
（n/N＜10の場合）
【００６０】
式2：超幾何学的分布に対する近似としての二項分布。n/N＜10のとき、超幾何学的分布はより単純な二項分布を用いて概算することができる。［k/N］は正の予想値であり、[1−k/N]は負の予想値である。
アメリカンタイプカルチャーセンター（ATCC）から購入することができる合計432の脊椎動物ウイルスからランダムサブセットのサンプルを選択することができる。前記432の入手可能な単離株からランダムに選択した30ウイルスのサブセットを用いて成功したハイブリダイゼーションによって、1.0の正の予想値が得られる（下記表8）。表8は、ｎ＝30のランダムに選択した脊椎動物ウイルスのサンプルを用いた実験で正確に検出されたウイルス数にしたがい、GreeneChipによって検出されそうなウイルス総数に対する信頼区間の概算を示す。
【００６１】
表8：信頼区間の概算
2009131242.tif 000011
【００６２】
表8及び図2は、5％ずつ増加させた正の予想値（PPV）の全ての値に対応する、ｎ＝30のサンプルサイズ及びサイズＮ＝432の種のグループについて二項分布を基準にした種々の成功及び失敗率に対する信頼区間、並びにサンプルで測定された全てのPPVについての信頼区間を示す。432の全集合の概算PPVを見出すために、サンプルのPPVを決定し、対応する概算信頼区間を探す。
【００６３】
【数２】
2009131242.tif 000012
【００６４】
サンプリングプラン：ATCCから購入することが可能な432の脊椎動物ウイルスから30のウイルス単離株がランダムに選択されるであろう。組織培養での増殖に続いて、核酸を抽出しアレイハイブリダイゼーションのための鋳型として用いられるであろう。図2は、30単離株のサンプルについてのGreeneChipによる検出成功数に対応するPPVの信頼区間を示す。サンプルサイズの30は、より大きな数により得られるPPV測定の正確さの増加と実験の実施に利用可能な時間との間での妥協の結果として選択されえる。30単離株のサンプルを用いた表8で示されるように、90％のPPVの信頼区間は80％−97％である。対照的に、10単離株のより小さなサンプルでは、90％のPPVの信頼区間は70％−99％に広がるであろう。60単離株のサンプルを用いたとき、90％のPPVの信頼区間は83％−97％であり、前記は、90％のPPV及び30のサンプルサイズに付随する80−97％の信頼区間と比較してほんのわずかしか減少しない。このように、サンプルサイズを30から60に2倍にすることによる正確さの増加は極めて小さいが、一方、必要となる実験数の増加に付随する追加のコストは相当なものである。
【００６５】
正確さの測定
各アッセイについて、3つの潜在的な結果が存在する：（1）適切なプローブがシグナルを生じる；（2）適切なプローブのいずれも又は適切なプローブのサブセットしかシグナルを生じない；（3）適切なプローブ（又はそのサブセット）がシグナルを生じるが、不適切なプローブもまたシグナルを生じる。
（1）適切なプローブがシグナルを生じる：これは予想される結果であり、この結果は陽性と採点することができる。更なる作業は必要ではない。
（2）適切なプローブのいずれも又は適切なプローブのサブセットしかシグナルを生じない：この結果は、技術的な問題（シグナルが全く発生しない）又は標的が相対的に多すぎることと関係がある可能性がある。標的鋳型の存在を定量的PCRによって確認することができ、ハイブリダイゼーションを繰り返すことができる。パターンが転写グラディエントと一致する場合、結果は陽性とスコアリングすることができる。更なる作業は要求されない。プローブが成功しない場合は、プローブを再設計することができる。
（3）適切なプローブ（又はそのサブセット）がシグナルを生じるが、不適切なプローブもまたシグナルを生じる：この結果は陽性とスコアリングすることができ、配列相同性について評価することができる。相同性が存在しない場合はプローブを交換することができる。相同性が存在する場合は、このアッセイは潜在的交叉ハイブリダイズ標的として記録することができ、プローブの取替えが適切であるか否かを決定することが出来、代用マーカーとして機能するかもしれない。不適切なシグナル又は偽陽性シグナルもまた陰性コントロールRNAを用いて検出することができる。偽陽性シグナルをもたらすプローブは再設計することができる。
【００６６】
ハイブリダイゼーション結果の自動判定のためのアレイ分析ソフトの開発
本発明の1つの目的は、病院拠点臨床検査室および個別ケア弁別的診断のために開発することができる、ユーザーフレンドリーなアッセイを作成することである。したがって、アレイの結果の自動解釈を可能にするバイオインフォマティクスツールが開発される。GreeneChipマイクロアレイの結果は、発現プロファイリングで用いられるツールによる分析になじまない。すなわち、発現プロファイリングの結果は、2つのチャネルにおけるシグナル強度の相違の比較に依存するが、GreeneChipの結果は主としてオン-オフパターンにしたがう。ソフトウェアツールを調整して、陽性シグナル（閾値レベルを超える蛍光を有するプローブ、平均バックグラウンドプラス3標準偏差と定義される）のパターンを分析することができる。このソフトウェアは、内部コントロール及び位置マーカー由来のシグナルを除去するであろう。統合Greeneデータベースに実装された分類学的情報を基に、このソフトウェアは検出されたハイブリダイゼーションパターンを分析し、与えられたウイルスの科、属及び種と当該パターンがマッチする、等級付けされた確率を算出することができる。図3および表9はプロトタイプのスクリプトを用いるこのプロセスを説明する。
【００６７】
表9：等級付けされた確率
2009131242.tif 000013
2009131242.tif 000014
【実施例４】
【００６８】
実施例4：選別ウイルス性因子及びインフルエンザウイルスの検出並びに種分化のための特殊化アレイの作製
オリゴヌクレオチド標的の設計：臨床材料において包括的にH及びN亜型を直接検出できるシステムはこれまでのところ存在しない。インフルエンザのための他のアレイが報告されているが、それらは検出前に培養で増殖させる必要があり、Ｂ型インフルエンザしか標的としないか、又は500bpのスポットcDNAを使用しているために解像性を欠く。インフルエンザウイルスA、B及びCを標的とするGreeneChip1.1プローブ（約600プローブ）を、H及びN亜型への適用性及び弁別的検出について判定することができる。必要に応じて、追加のプローブを設計し、完全な適用性を達成することができる。これまでのプラットフォームは60merのオリゴヌクレオチドを利用する。したがって、前記はH及びN血清型を同定しそれらの主要な遺伝子型を識別する潜在能力を有するが、一方、塩基組成における微妙な相違に対しては鋭敏ではない可能性がある。もしこれが診断において重大な問題となる場合は、ただ1つの塩基対の相違を検出することができるより短いオリゴヌクレオチド（25mer）を用いてサブアレイを作製することができる。しかしながら、直接的シークェンシングのためにハイブリダイズした核酸を回収するほうがより実際的でありえよう。
インフルエンザウイルスの種分化のための方法を開発する意義が、インフルエンザゲノムシークエンシングプロジェクトで得られたゲノムデータによって力説されている。このデータは、2003−04年の年次ワクチンがなぜ完全な防御を示さなかったかを説明している。2002−03年のシーズンの間にH3N2ウイルスの種々の株が遺伝子混合を受けた。得られた株は前記シーズンの遅くに出現し、2003-04年のワクチンによっては標的とされなかった。インフルエンザウイルスの種分化用アレイは、株の進化を追跡し、ワクチン設計を促進するための安価な高処理解決法を提供する。
【００６９】
既存アレイのプローブを調整して選別病原因子の検出に応用することができ、さらにまた種レベルで使用するために設計することができる。エボラザイール、スーダン、コートジボアール及びレストンウイルス間の識別は可能であるが、血清型、変種又は株レベルでの識別は可能ではない。後者は疫学的及び科学捜査での応用で重要でありえる。亜型分類が多くの情報を提供する種レベル以下の識別に取り組むため（例えば東部ウマ脳炎ウイルス（EEEV）の4系統又はベネズエラウマ脳炎ウイルス（VEEV）の血清型）、新規なプローブを加えることができる。追加されるプローブには、より病原性が低いウイルスに自然に又は故意に移行し得る、病理発生において重要な配列を検出することを目的とするプローブが含まれえる。それらの例には、エボラウイルスG、p24、及びp35タンパク質（免疫抑制及び／又は血管症に関与している）が含まれる。ゲノムサイズ及び病原性マーカーの規模が包括的な適用性を妨げる可能性がある他の事例（例えばポックスウイルス）では、少なくとも8つの関連するゲノム領域を標的にしてキメラゲノムの認識を改善し、さらに反復する特異的マーカーを基にして他のポックスウイルスから痘瘡ウイルスメージャー／マイナーを確実に識別することができる。さらにまた、前記プローブ集合に、選別病原因子の感染に類似する徴候及び症状を引き起こす可能性があるために弁別的診断に関係を有する非選別因子を同定するプローブを補充することができる。
プローブ集合を更新し、さらにバイオディフェンス及びインフルエンザの疫学を目的とするアレイを作製するために、新規なプローブを設計することができる。新規な配列又は追加の配列をPFAMドメインに対してマッピングし、プローブを設計することができる。
多くの応用が、脊椎動物ウイルス標的の全範囲を表象するために9,000−10,000ものプローブを用いるスライドを必要とするが、目的が単にインフルエンザウイルス又は出血性熱ウイルス又はいくつかの他のより小さなウイルス分類群を識別することであるためにわずかなプローブを要求する事例も存在しえる。たった1枚のスライド上で独立した実験として、8つのアレイを同時に調べることができるプロトタイプが作製された（Agilent Technologies）。このプロジェクト及び他の高処理応用の要求に合致させるために、24個の独立した1500-プローブアレイを個々のスライドにプリントすることができる（Agilent Technologies）。
【実施例５】
【００７０】
実施例5：アッセイ性能の最適化及び試験
感染培養抽出物を用いるアッセイ性能の最適化
通常のRT-PCRクローニング方法によって、標的遺伝子を転写ベクターpGEM-Teasy（Promega）又はpCR2.1-TOPO（Invitrogen）にクローニングすることができる。定量化したプラスミド標準物を最初のアッセイ確立で用いることができる。その後、in vitro転写によって生成し、定量し、ランダムヒトRNA（脳、肝、脾、肺及び胎盤を等しい割合で表す）のバックグラウンド中で稀釈したRNA転写物を用いて、感度及び特異性パラメーターを確立することができる。各ウイルス性選別病原因子／遺伝子の代表的な単離株の1つ並びにインフルエンザH及びN各サブタイプの単離株の1つを最初のアッセイ確立時に用いることができる。
較正用試薬は、ネットワーク研究室及びにカスタマーに配布されるキットの構成要素でありえる。例えば3つのタイプの較正用試薬を提供することができる：1）性能テスト用クローン化標的遺伝子、2）感度評価用リアルタイムPCR較正組織培養抽出物、及び3）内部陽性コントロールとして逆転写前に各サンプルにスパイクさせるべき合成RNA標的（この内部コントロールにマッチするプローブはアレイにプリントされている）。
真正病原体の細胞培養抽出物を用いて、RT転写反応の性能を最適化し、さらにそのmRNA転写物によりDNAウイルス（ポックスウイルス科）の検出を確認することができる。組織培養上清のウイルス及び感染細胞層からRNAを市販の抽出キットを用いて抽出し、続いてDNaseで処理することができる。DNase処理によってGreeneChip1.1の感度を高めることができる。種々のRT酵素の有効性は、同じサンプルの同一アリコットから生成したcDNAのリアルタイムPCR定量化によって比較されるであろう。
GreeneChip1.1のための増幅プロトコルは、逆転写のためのランダムオクタマー駆動プライミングアプローチとそれに続くcDNAのランダムPCR増幅を利用する。ウイルス性選別因子又はインフルエンザウイルスを標的とする、より特異的なサブアレイを求めて、別のアプローチが103コピー/アッセイという閾値を越える感度の増加をもたらすことができるか否かを調べることができる（下記の表10を参照されたい）。インフルエンザの場合は、A型インフルエンザウイルスセグメント4（HA）及び6（NA）、又はB型及びC型インフルエンザの対応するセグメントの保存された末端配列を標的とするユニバーサルプライマー配列の使用を試験することができる。選別病原因子サブアレイで標的とされるこのウイルスの多くは保存された末端配列を有する。したがって、ランダムプライマーの代わりに、縮退プライマープールを用いることによって感度を高めることが可能である。対応する配列の濃縮は、特異的増幅が要求されるか否かにかかわらず、30から60の縮退プライマー対を含むプールを用いて得ることができる。別の選択肢の増幅方法の値は、各選別ウイルス種及びH型およびN型インフルエンザの各血清型を代表する1つの単離株を用いて試験されるであろう。
【００７１】
表10：リアルタイムRT-PCRによるGreeneChip1.1上でのWNV検出の定量的分析
2009131242.tif 000015
aRNA、リアルタイムPCRによって決定されたインプットコピー数；bRT、逆転写後のコピー数；cR-PCR、ランダムPCR後のコピー数；dL-PCR、標識PCR後のコピー数
【００７２】
選別病原因子について、本発明の方法によって設計されたオリゴヌクレオチドプローブが標的とする領域において遺伝的に相違する、CDC SPBウイルス収集物から入手可能な単離株で試験を実施することができる。それらが万一CDC SPB在庫目録に示されていない場合には、さらに別の単離株を他の収集物から加えることができる。A型インフルエンザウイルスのためには、試験は、各血清型の代表的な1つで始めることができる。その後、北アメリカ、オセアニア、アジア及びヨーロッパで過去57年間に収集された400のランダムな単離株で試験を実施することができる。
【００７３】
ニューヨーク州のインフルエンザウイルスサンプルでのアレイの試験
最後の13シーズンのインフルエンザ単離株を回収し、合計130単離株を試験及び分析することができる。前記単離株の全ゲノム配列データはGenBankで入手できる。1992年から2005年の13シーズンの各々について、当該シーズン中にニューヨーク州で検出されたインフルエンザA型及びB型をカバーするという観点から10単離株が選択されるであろう。これら130単離株を抽出し、増幅し、さらにマイクロアレイで試験して、過去13年間の株を検出するマイクロアレイの能力が確認されるであろう。
オーストラリアのインフルエンザ単離株
また、合計40のオーストラリア単離株をマイクロアレイでの分析のために選択し、地理的に離れた場所で数年間にわたってある範囲の株を検出しえることが決定されるであろう。サンプルの約10％が、結果を立証するために、臨床検査室で用いられる従来の分子的方法（インフルエンザについてはリアルタイムRT-PCR、サブタイプ決定については通常のPCR、及び株分析については配列決定）による再検査を必要とする可能性があると推測される。
歴史的単離株
合計40の歴史的サンプルが従来のマイクロアッセイ実験での分析のために選択されるであろう。分析のために十分なウイルスを担保するために、これらサンプルを再構成して、卵及びアカゲザル（Rhesus Monkey）腎細胞の両方に接種されるであろう。これら単離株の病毒性についての情報がなく、さらにいくつかはH2N2であるので、核酸抽出前及び核酸抽出を含むこれらのウイルスに関する作業はBSL-3封じ込め下で実施されるであろう。さらにまた、これらの単離株については以前に分子的分析が実施されていないので、インフルエンザについてはリアルタイムRT-PCRによって、サブタイプ決定については通常のPCR、並びに株分析についてはHA及びNA遺伝子の両方向における配列決定によって試験されるであろう。これらのサンプルの分析によって、過去57年間ニューヨーク州でヒトの集団において循環してきた入手可能なインフルエンザ株を検出するマイクロアレイの能力が確認されるであろう。
【００７４】
一次臨床サンプル
このサンプル集積所から、2004−08年の4シーズンの各々から100標本を新規なマイクロアレイでの試験のために選択することができる。各シーズンについて、75サンプルは検査室で従来利用可能な1つ以上の方法による試験の結果、インフルエンザウイルスが陽性であり、25がインフルエンザについて陰性であるが、他のヒトの呼吸器病原体について陽性であったサンプルが含まれるであろう。これらのサンプルは、タイプ、サブタイプ、株、患者の年齢、及び州全体に及ぶ地理的分布に関して可能な限りの多様性を示すであろう。約10％のサンプルが、結果を立証するために、臨床検査室で用いられる従来の分子的方法（インフルエンザについてはリアルタイムRT-PCR、サブタイプ決定については通常のPCR、及び株分析については配列決定）による再検査を必要とする可能性がある。これらのサンプルの試験を用いて、最近及び従来循環している株を直接臨床サンプルから検出する、本発明の方法により設計されたオリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイの能力を確認し、さらにその検出感度を従来利用可能な他の診断技術の検出感度と比較することができる。
【実施例６】
【００７５】
実施例6：核酸アラインメントからの迅速な多重プライマー設計
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は基本的な分子生物学的ツールであり、病原体の検出に広く応用されてきた。自動的にプライマーを作成する種々のプログラムが存在するが、インプットとして多重配列アラインメントを用いるプログラムはほとんどない。本発明は、ツリー構築及び集合被覆アルゴリズムの適用によって縮退プライマーを作製する新規な方法を提供する。ウイルス性出血熱のためのプライマー対を作製し、続いて多面的PCRで感度及び特異性についてDNA標準物に対して試験した。実験結果により病原体検出におけるこのプライマー設計アルゴリズムの有用性が確認された。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、そのスピード、感度及び特異性のゆえに病原体の臨床検出のために最も広く利用されている。病原体検出用プライマーは、高度の保存されたコード領域を増幅するように設計されるが、ただしこれらは、第三のコドンにおけるゆらぎのためにハイブリダイズできない可能性がある。この問題は、標的鎖の可能な変種をカバーする縮退位置をもつプライマーを合成することによって解決することができる。この方法は、病原体の発見及び相同な遺伝子のクローニングの両方で利用され成功してきた。
シークェンシングプライマーのために、適切なGC含量、許容可能なヘアピンの長さ、融解温度、及び最大のホモポリマー連続域についてコンセンサスが存在する（G.A. Buck et al. Biotechniques, 1999, 27（3）：528-36）。これらのパラメーターはまた、診断用PCRのための最低限の要件を構成する。臨床的応用では、3'ミスマッチ、縮退及び多面性の能力は、プライマー設計についてのさらに別の懸念である。プライマーの3'末端塩基は標的鋳型と正確に相補的でなければならない。なぜならばポリメラーゼはそのようなミスマッチをもつプライマーをほとんど伸張させないからである（M.N. Kuppuswamy et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88(4):1143-7）。この特徴は、一ヌクレオチド多型（SNP）の遺伝子型決定のために用いられる（P. Ross et al. Nat Biotechnol 1998, 16(13):1347-51）。ミスマッチは一般的にはプライマーと鋳型との結合を不安定化させる。プライマーがそれらの鋳型に対してミスマッチを有しなければならない場合は、伸張効率を高く維持するためにミスマッチは5'末端により近く存在するべきである。
【００７６】
縮退はPCRの感度にとって決定的因子である。高度に縮退的なプライマーは鋳型と正確にマッチする種をほとんど持たないであろう。PCRの初期ラウンドでは、もっとも相同性の高いプライマーがアンプリコンに取り込まれ、したがって正確にマッチするプライマーは使い果たされる。検出可能な量のアンプリコンを生成するために十分に反応が進行するか否かは、溶液中の残存プライマーの類似性に左右される。いくつかの密接に関連するプライマーは、たとえそれらが正確にマッチしていないとしても生成物をさらに増幅させ、反応をプラトーに到達させることができるかもしれない。この作用のカイネティクスを予想することは困難である。なぜならば、前記カイネティクスは、プライマーの類似性、初期に好成績をもたらすアンプリコンの濃度、及び反応のストリンジェンシーの関数だからである。1つの手法は、最少の縮退数でプライマーを設計することである。これが可能でない場合、タッチダウンPCRのようなサイクリング手法を用いて、ストリンジェンシーをだんだんと低下させることができる。これは初期サイクルでは正確なマッチに有利に働くが、後期サイクルでミスマッチプライマーの増幅持続を可能にする。
【００７７】
プライマー設計ソフトウェア
従来のプライマー設計プログラムは、PCRに用いることができる短いDNA配列を見つけるために発見的学習を実行する。この発見的学習は、実験的に決定された成功プライマーのためのパラメーターに基づく採点機能である。縮退のないプライマーの設計のために多くのツールが存在し、もっとも普及している2つは、プライマー3（S. Rozen and H. Skaletsky, Methods Mol Biol 2000, 132:365-386）及びプライマーエクスプレス（Primer Express（www appliedbiosystems com）である。
遺伝子又は因子の全ファミリーを増幅するために、コンセンサス配列を多重アラインメントから作製し、続いて前記を用いてプライマーを合成することができる。CODEHOP（コンセンサス縮退ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー、COonsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer）は、アミノ酸の多重アラインメントを利用して前記のような態様で縮退コンセンサスプライマーを作り出すツールである（T.M. Rose et al. Nucleic Acids Res 2003, 31（13）：3763-6）。非常に有用ではあるが、このプログラムは高度に縮退したプライマーを作製し、診断PCRではミスプライミングゆえに有用ではないかもしれない。アンプリコンは、最近開発されたプライマー設計用グラフィックツールであり、前記は多重アラインメント内にプライマーのための潜在的部位を同定した（S.N. Jarman, Amplicon:software for designing PCR primers on aligned DNA sequences. Bioinformatics, 2004）。ユーザーは推奨される結合領域を利用するプライマー配列を入力することができ、続いて前記プログラムは、溶解温度及び二次構造についてプライマーを採点する。このプログラムは、該当配列とのミスマッチを最小にするためのメカニズム（前記は縮退プライマー設計のもっとも困難な部分である）は提供しない。
【００７８】
プライマー設計課題のコンピューター処理による詳細
プライマー設計は、配列に等級をつけるために予め規定されたスコア決定関数を用いる多基準決定の課題と考えることができる。スコア決定関数のいずれのパラメーターの上方及び下方境界も、PCRの要件及び限界によって決定されえる。パラメーターは理想型、派生に対するペナルティー及び絶対的要件を有することができる（T. Kampke et al. Bioinformatics 2001, 17(3):214-25）。前記課題は、長さｍの文字列において、関数S(p)にしたがえば最大スコアを有する、長さｌとｒの間の2つのサブ文字列の発見によって規定することができる。縮退コンセンサスプライマーを作製するために多重アラインメントを使用することによって、一般的な問題に別のレベルの複雑さが導入される。アルファベット[A,T,G,C]および長さlの文字列ａについて、最少の縮退位置を有するアラインメントにおける変動性をカバーする縮退アルファベット（すなわち、R=AまたはG）をIUPACから発見する。プライマーの検索空間は、PCR反応で許容されえる縮退量及びプライマーに許されるミスマッチの数によって拘束される。プライマーを選択するときは、同じ数のミスマッチを有する他の縮退に優先して、最少の縮退が常に所望される。
【００７９】
集合被覆問題（Set Covering problem, SCP）は、古典的には、乗務員のグループは最少コストで一組の目的地に到着しなければならないという定期航空乗務員のスケジュール作成問題を記述するために用いられてきた。ブルートフォース（brute force）解（部分解の組合せの評価）はわずか数千の可能性でもコンピューター処理が困難なものになる。SCPはNP-困難と記述され（Johnson, M.R.G.a.D.S., Computers and Intractability:A Guide to the Theory of NP-Completeness. 1979, New York: W.H. Freeman）、前記は多項式時間解がおそらく存在しないことを意味する。SCPを解決するための多様な近似アルゴリズムが存在し、以下が含まれる：遺伝アルゴリズム（Genetic Algorithms）（U. Aickelin, An indirect genetic algorithm for set covering problems. J Operational Res Soc., 2002, 53(10):1118-1126）、模擬アニーリング（Simulated Annealing）（S. Sen, Minimal Cost Set covering Using Probabilistic Methods. In ACM. 1993）、ブランチ及びバウンド方法によるリニアプログラミング（A. Caprara et al. Operations Research, 1999, 47(5):730-743）並びに古典的グリーディ方法によるリニアプログラミング（P. Slavik 1997, J Algorithms, 25(2):237-254）。概論には以下を参照されたい：A. Caparara et al. Annals of Operations Research, 2000, 98:353-371。SCPは、HLA型分類から生物学的文献で応用され（M.A. Woodbury et al. Comput Programs Biomed, 1979, 9(3):263-73）、RNAi配列が同定され（W. Zhao et al. Artif Intell Med, 2005）、つい最近には細菌ゲノムの同定を目的とするオリゴヌクレオチドが同定された（B. DasGupta et al. Computational Science-Iccs, 2005, Pt 2, 2005. 3515:1020-1028；B. Dasgupta et al. Bioinformatics, 2005, 21(16):3424-6）。
ある実施態様では、本発明は、核酸多重アラインメント群から自動的に最適プライマー対を決定するプログラムを提供する。このプログラムはプライマー設計問題をSCPとして公式化し、続いて迅速でグリーディなアルゴリズムを動かし、配列を増幅することができる最少プライマー集合をアラインメント中に見つける。前記プログラムを、ウイルス性出血熱（VHF）を引き起こすウイルスを検出するプライマーを設計することによって試験した。前記ウイルスは、それらのRNAゲノムのために顕著な配列変動性を有し、医学的に重要である。
【００８０】
材料と方法
アルゴリズム及び実行：このプライマー設計アルゴリズムは、ツリー構築アルゴリズム、スコア決定関数、SCP近似及びプライマー対のマッチングの4つの部分から成る（図5）。アルゴリズムは、配列操作のためのBioPerlディストリビューション（http://www bioperl org）から得られるモジュールを用いてPerlでプログラムされた。
ペアワイズ比較及びツリー構築：ユーザーが指定した最小から最大のプライマー長のサブアラインメントを全アラインメントから抽出し、一意性についてフィルタリングを実施する。一対毎に比較して各サブアラインメントについて類似性行列を作成する。前記行列を用い、オープンソースCクラスタリングライブラリー（M.J.L. de Hoon et al. Bioinformatics, 2004, 20(9):1453-1454）から提供されるユークリッド距離に基づく階層クラスター分類アルゴリズムを利用して系統樹を作製する。
スコア決定関数：系統樹の各ノードの厳密なコンセンサスをコンピューターで計算し、続いてユーザー指定パラメーターについてスコアリングする。第一に、プライマーをTm、GC含量、ホモポリマー連続域、ヘアピン／プライマー-ダイマー形形成及び縮退のような物理的拘束についてチェックする。許容可能なカットオフ値から外れるプライマーは更なる考慮から除かれる。残余のプライマーをサブアラインメント内の配列と比較し、それらがハイブリダイズして鋳型を伸張しそうか否かを決定する。このスコア決定相では、鋳型に対する全ミスマッチ、3'ミスマッチ及び末端の3'ミスマッチが、各プライマーについて同定される（図5、工程4−プライマースコア決定及びフィルタリング）。ミスマッチ関数の出力は二進値であり、１は、プライマーは配列鋳型を伸張できることを意味し、0はできないことを意味する。計算機科学的表現では、この行列は整数行列であり、カバーするべき集合（列として配列）及び前記カバーを達成するエレメント（プライマー、行として）を表す。この行列は図5の工程5に示されている。
【００８１】
集合被覆アルゴリズム：プライマーハイブリダイゼーション行列はグリーディSCP近似アルゴリズムのためのインプットである。SCPのこの定式化では、プライマーカウントは最適化のためのコスト関数として用いられる。SCPアルゴリズムは［16］に記載された方法を用いてPerlで実行される。アルゴリズムの出力は、（存在する場合には）サブアラインメント内の配列を増幅することができる最小集合のプライマーである。
【００８２】
プライマーマッチング：最終段階は、PCRのための有用なアンプリコンを形成するプライマー対の同定である。ユーザーは、最小及び最大長アンプリコンを指定することができ、パラメーターに合格するプライマー集合及びプライマー対間のTmにおける最大相違が表の様式で返されてくるであろう。このソフトウェアはGNU GPLの下でライセンスを付与され、非商業的、学術的使用については無料である。ウェブ版は、http://www greeneidlab columbia edu/PrimerDesignで入手できる。
ウイルス性出血熱（VHF）PCR：種々の遺伝子のVHF配列をNCBI GenBankから抽出した。設計のためのウイルス標的には、エボラザイール、クリミアコンゴ出血熱（CCHV）、ソウルハンタウイルス、キャサヌール（Kyasanur）森林ウイルス及びリフトヴァレー熱ウイルスが含まれていた。それらをClustalW（Nucleic Acids Res, 2003, 31(13):3497-500）を用いてアラインメントし、続いてプライマー設計プログラムに付した。用いたパラメーターは以下のとおりであった：長さは20から29bp、Tmは50−65℃、GCは40−60％、8bpの最大許容ヘアピン、最大連続4ヌクレオチド、最大縮退8、3'末端の5bpにはミスマッチは許容されず、いずれの鋳型に対しても最大5ミスマッチ、及びアンプリコンサイズは60−150bp。最後に、プライマー対は互いに3℃以内の融解温度差を持たねばならない。許容可能な集合のうちで、一部分を試験用に合成した。
【００８３】
VHF PCRのための標準物及びサイクリングプロトコル：プライマーの感度及び特異性を実証するために、DNA標準物をVHFの参照株のオーバーラッピングPCRによって作成した。20bpの重複セグメントを有する長い60bpのオリゴヌクレオチドを合成し、アニールさせ、ハイフィデリティPCRマスターキット（Roche, Indianapolis, IN）を用いて増幅させた。アンプリコンをpGEM-T-Easyベクター（Promega, Madison, WI）においてクローニングし、続いて配列を決定してエラーのないことを担保してポリメラーゼによって導入した。線状化プラスミドを25μg/μLのヒト胎盤DNA（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）で稀釈することによって標準物を作製した。
HotStartTaqポリメラーゼマルチプレックスPCRキット（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて鋳型を増幅した。プライマーは、一元様式については1.25μM、多重様式についてはそれぞれ0.5μMの最終濃度で、0.5mMのMgCl2及び5μＭのdNTPとともに用いた。以下のサイクリングプロトコルを用いた：MJ PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Waltham, MA, USA）中で、最初の15サイクルの間は65℃から51℃まで1℃ずつ温度を下げるアニーリング工程、続いて94℃で20秒、50℃で20秒、及び72℃で30秒のサイクリングプロファイルで35サイクル。
【００８４】
結果と考察
ウイルス性出血熱PCR：種々の科のRNAウイルスが出血熱をもたらす因子であり、それらには以下が含まれる：フィロウイルス科（エボラ及びマルブルグウイルス）、アレナウイルス科（ラッサウイルス、ジュニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス及びサビアウイルス）、ブンヤウイルス科（CCHFウイルス、リフトヴァレー熱ウイルス（RVF）、及びフラビウイルス科（黄熱ウイルス、キャサヌール森林ウイルス及びデングウイルス）。これらウイルスのもっとも際立った症状は感染後の出血性体質である。他の症状には、発熱、ショック、頭痛、筋肉痛、及び上気道疾患が含まれ、これらの大半がVHF感染の診断に役立たない。治療薬はないが、リバヴィリンが、ラッサウイルス、ハンタウイルス又はCCHFウイルスの感染後早期に与えられるならば有効であることが示された。
VHFの症状は感染初期には非特異的であるので、臨床医は流行を抑えるために、迅速な弁別的診断を必要とする。PCRは、迅速で、融通性があり、野外で実施できるので、うってつけの方法である。多重化することが可能な、多様な病原体用PCRプライマー集合の設計は、特に急速に変異するRNAウイルスでは尻込みさせる作業である。SCP使用アルゴリズムの有効性を立証し、前記が多重解析のための高品質プライマーを作出することができることを示すために5つのVHF病原体についてプライマーを設計した。ヌクレオチドアラインメントは、エボラザイール、クリミアコンゴ出血熱ウイルス（CCHV）、ソウルハンタウイルス、キャサヌール森林ウイルス及びリフトヴァレー熱ウイルスについて作製された。アラインメントはほとんどの事例で30未満の配列を含み、高い保存性の領域を含んでいた。プライマーは、本方法に記載のパラメーターを用いて設計された。配列の詳細は表11に示されている。アラインメントは小さいので（ほとんどの事例で30未満の配列）、設計時間は無視しえるほど短かった。パラメーターと一致するプライマー対はCCHV以外のウイルスについて同定された。フォワードプライマーは非常に高いTmを有するが、前記は末端のミスマッチの要件に違反することのない唯一の選択肢であった。
【００８５】
表11.ウイルス性出血熱プライマー配列
2009131242.tif 000016
【００８６】
VHF参照株の線状化DNA標準物を用い、PCRプライマーの感度を一元的様式でアッセイした。適切なサイズのアンプリコンを50,000コピーで用い配列を増幅させた。多重様式でプライマーの有用性について更なる試験を実施した。VHFのためのプライマー対を最終濃度0.5μM/プライマーで混合した。DNA標準物を多面的PCRによって別々に試験した。全てのVHFは50,000コピーで検出することができ、ヒトDNAのミスプライミングは最小限であった（図6）。プライマー結合部位の分析によって、前記結合部位は高度に保存された領域であることが示され、いくつかはほぼ100％の保存を有していた。
多重解析に使用可能なPCRプライマーの迅速で良好な結果をもたらす設計は病原体検出に有用である。この小さなウイルス集合のための設計は1日未満で完了し、オリゴヌクレオチド合成は一晩で完了させることができた。この方法を、弁別的診断のためのプライマー集合が要求される大流行の状況で用いることができる。
【００８７】
計算複雑性
グリーディな集合被覆アルゴリズムの使用は、NP-困難問題に対して極めて有益であるO log2mnを保証する（P. Slavik, J Algorithms, 1997, 25(2):237-254）。可能な解の集合はPCR増幅要件に強く拘束されるので、グリーディアルゴリズムによって見出されるプライマー集合が最適な集合である高い確率が存在する。
グリーディなヒューリスティック解と正確なブルートフォース解との比較をインフルエンザヘマグルチニン遺伝子（HA5）の大きなアラインメントで実施した。前記アラインメントはインフルエンザ配列データベース（flu.lanl.gov）からダウンロードされ、550の2kb配列を含んでいる。図7は、可能なプライマーの数を増加させるために必要な計算時間を示す。期待されたように、グリーディな実行のための時間は対数的に増加するが、一方ブルートフォースアプローチは指数関数的である。アラインメントが550配列を含んでいたとしても、1つの位置のための可能なプライマーの数は21を超えない。これは、Tm、二次構造及び3'ミスマッチにおける厳密な要件のためである。
興味深いことには、分析した全てのプライマーカバー問題について、両アルゴリズムが正確に同じ解を返してきた。この関係をさらに究明するために、ランダムに発生させたカバー行列を作成し、グリーディ及びブルートフォースの実施によって解を得た。この複雑なデータセットを用いて両者の間にわずかな相違が存在した。期待されたように、両者が相違する場合、ブルートフォースは良好なスコアを得た。プライマーの基礎となるツリー構造はグリーディの実行の成功に寄与するかもしれない。この関係は、他のウイルスファミリー又は数学的アプローチを用いる更なる研究の論題となりえる。
【００８８】
アルゴリズムの最適化
3つの最適化を実施し、プライマー設計プログラムの速度を改善した。第一に、系統樹の各枝に対してコンセンサスである配列を考慮することによってのみプライマー検索空間を限定した。考慮するべきプライマーの最大数は系統樹のノードの数、又は(n*2)-1である。これは、縮退性、Tm、二次構造及び他の要件をパスしたプライマーの数まで減少させられる。
第二の最適化は、段階付けされたスコア決定関数の使用である。本アルゴリズムは、近接融解温度又は二次構造予想のために計算が非常に多くなり得る（評価される各プライマーについて実施される必要があるため）。実際の実行においては、プライマーのための最少要件集合は非常に厳しく、可能なペアは極めてわずかしか残らない。実施が不経済ではない計算は選び抜かれたものでありえる。例えばGC含量、一ヌクレオチドリピート及び鋳型に対する末端ミスマッチは軽量級のパターンマッチングである。過剰な計算時間を避けるために、スコア決定機能は最少要件が満たされるまで不経済な計算を先送りする。
最後に、多数の配列をカバーするプライマーのみがSCP解法へと続く。SCPの最初の工程は被覆行列中のサブセットを同定し、それらを排除することである。例えば、プライマーAが配列1−5をカバーし、プライマーBが配列3−5をカバーする場合、Bは無視される。なぜならばBはAのサブセットであるからである。SCPはビット毎に比較することによって実行され、したがって集合理論のコンピューター計算は機械語で実施される。Perlのような高レベル言語で同じ行列を作成するよりも格段に速く、メモリーの使用が少ない。
【００８９】
病原体検出への適用
このプログラムは、病原体検出用プライマーの設計におけるウイルス学者及び細菌学者の特別な要望に応えるために作製された。設計によって、本プログラムはユーザーの基準に合格するプライマーを提供する。“最適な”配列はより複雑なスコア決定メカニズムによって判断されえようが、これは実験的PCRの実態を反映しないであろう。感度が10−50分子の範囲の感度を有するプライマー対を作製しようと考える研究者は、一般的にはPCR条件（例えばアニーリング温度、MgCl2濃度、サイクリング時間及び数）を改変することによって5つ以上の潜在的なペアを調整する。極めて感度が高くさらに特異的なプライマーに必要な有効性の確認のためにはかなりの評価時間が必要なので、研究者が用いるパラメーターを取り込む自動設計プログラムは実験遂行のための信頼できる出発点を提供する。
SCPのこの新規な適用は複雑なアラインメントにおけるプライマーの特異性を顕著に改善する。高度に縮退した単一のプライマーを2つの分岐群をカバーするように設計することができよう。実際、サブグループの配列を標的とする2つの異なるプライマーが設計され、縮退性がより少ないプライマーが得られるとしたら、PCRはより良好な結果を生むであろう。プライマーを手動で設計する場合、サブグループをカバーするためにどこで高度に縮退した単一のプライマーを切り分けるかの選択は明確ではない。系統発生論を用い、クレードによってアラインメントを分割し、続いて各グループのコンセンサス配列を同定することができよう。系統樹は大きな領域を用いて作成されるので、プライマー結合部位は同じ関係を再現しないかもしれない。アラインメントの各位置で類似性ツリーを算出し、それを用いてプライマー設計の手引きとすることはより簡単な解決策である。SCP使用プライマー設計プログラムはこのタイプの問題について最適に近い結果を保証する。
【００９０】
感染過程において、ウイルス及び細菌は純化淘汰を伴う高い変異率を示す。これは（病原性及び宿主で変化を示しえる）とてつもない株の多様性をもたらす。VHFウイルスはこの多様性の医学的に重要な例であるので、プライマー設計の方法論のための試験として選択した。このプライマー設計プログラムは任意の核酸アラインメントに応用することができる。当面の使用には、VHFファミリーのためのコンセンサスプライマーの同定が含まれる。PCRパネルを用いてVHFの病原体保有動物を見つけ、既存の株がヒトに感染する能力を獲得する前にそれらを同定することができよう。
本発明は、縮退プライマー集合を同定するためにツリー構築アプローチと組み合わされた、十分に研究された集合被覆問題を用いるプログラムを提供する。このアルゴリズムをウイルス性出血熱病原体のアラインメントで試験し、感度が高く特異的なプライマーの設計に成功した。この方法は、応用できる範囲が広く、例えば診断用PCR、遺伝子の全ファミリーのPCRクローニング、及びマイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの設計に応用できる。
このアルゴリズムは、SCP設計を解決するために近代的なリニア・プログラミング法を用いることによってさらに最適化されえる。これは、ブルート・フォース法に必要な時間を要することなく、正確な解の利益をもたらすであろう。さらにまた、このプログラムはコード情報を考慮するために改変することができる。多くのウイルス診断用PCRは発現される遺伝子を標的とし、したがって配列ヴァリエーションは選択圧力によって制限されるであろう。タンパク質及び核酸の多重アラインメントが提供されるならば、揺らぎコドンを同定することができる。保存的変異を列挙し、プライマー設計プロセスに加えることによって、関係の薄い類似体を検出するプライマーを設計することができよう。
【実施例７】
【００９１】
実施例7：オリゴヌクレオチド・マイクロアレイ・ハイブリダイゼーションによるアデノウイルスの型分類
本発明は、ヒトアデノウイルス（HAdV）遺伝子標的を載せたオリゴヌクレオチドアレイに対する、PCRによって増幅したヘキソン遺伝子生成物のハイブリダイゼーションに基づくHAdVの型分類のための迅速で感度の高い分子系を提供する。この系は臨床単離株を用いて有効性が実証されたが、疫学的な応用を目的とする高い処理能力をもつ血清型分類になじみやすい。
HAdVは気道感染の重要な原因であり、いくつかは小児又は免疫が抑制されている成人で致死的な肺炎若しくは細気管支炎を引き起こす。このウイルスはまた、胃腸炎、結膜炎及び角結膜炎並びに骨髄移植レシピエントの感染の一般的因子である。アデノウイルスに対する治療は存在しないが、病毒性は株により変動する。したがって、アデノウイルス感染の型分類は臨床的及び疫学的に重要である。
アデノウイルス（アデノウイルス科に属する）は、エンベロープがなく、26−45kbのゲノムを含む直鎖状二本鎖DNAを有する。このウイルスの正二十面体のキャプシドはヘキソン構造タンパク質及び線維タンパク質（ウイルスの宿主への進入を仲介する）で構成される。HAdVは、分子的系統発生、線維タンパク質のヴァリエーション及び生物学的活性を基準にして6つの種（AからF）に分類される。HAdV同定の伝統的技術（例えばウイルス培養又は血清中和）は、検出及び血清型分類のための分子的方法に急速に取って代わられている。PCRを使用する多様な方法は確立されており、前記には、蛍光使用アッセイ、一面的PCR、多面的PCR、及び制限酵素による型分類と組み合わせたPCRが含まれる。分子の系統発生によるアプローチがもっとも厳密であるが、シークェンシングを必要とし分析のために選択したゲノム領域に応じて異なる関連性を示す可能性がある。
【００９２】
DNAマイクロアレイ（もともとは宿主遺伝子発現の分析に応用された）は、ウイルスの疫学のためのツールとして最近評価されつつある。アレイによる検出のための標的とされるウイルスの科には、ヘルペス、レトロウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス及びオルトポックスウイルスが含まれる。アデノウイルス型分類アレイは、ヘキソン、線維、及びE1A遺伝子内の領域に基づいて開発され、51の既知血清型の5つを弁別することができる。しかしながら、3つのPCRとそれに続くハイブリダイゼーション工程を必要とするので臨床の場でのその有用性は限定されている。対照的に、本発明は、高処理能力をもつ臨床的セッティングでの実施を目的として設計された迅速な型分類方法を提供する。
臨床サンプル中の既知のADVのヘキソン遺伝子配列を検出する、感度の高い普遍的なPCRが確立された。ウイルスストック（ATCC, Manassas VA）又は培養サンプルに由来するADVの47の異なる血清型について、DNA標準物が作製された。生成物をpGEM-T-Easy（Promega, Madison, WI）にてクローニングし、シークェンシングしてPCRの忠実性を確認した。25ng/μLのヒト胎盤DNA（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）中で稀釈した直線化プラスミドDNAをPCR条件の最適化のための標準物として用いた。Avellonら（J Virol Methods, 2001, 92:113-20）のPCRプロトコルを改変してネスティングの必要性を排除した。PCR増幅は、HotStart Taq PCR（Qiagen, Hilden, Germany）、各々1.25μMのプライマー、2mMのMgCl2、各々0.2mMのdNTP、及びMJ PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Waltham, MA）を用い、以下のサイクリングプロトコル（94℃で10分、最初の15サイクルの間1℃ずつ65℃から51℃に低下させた温度を用いるにアニーリング工程、続いて94℃で20秒及び72℃で30秒のサイクリングプロファイルで継続）で実施した。
ヘキソン配列のためのデータベースをGenBankのHAdV配列を抽出することによって作製した。系統発生的推論を用いて前記配列を血清型に分類した。血清型12、31、18、21、7、3、8、4、5、1、6、2、40、41は、特異的オリゴヌクレオチド標的の設計を可能にする固有の配列特徴を有していた（図10）。種DのHAdV-8並びに種BのHAdV-3、-7及び-21を除いて、全ての種D又は種B血清型は、460bpのヘキソンフラグメントを用いたとき解析することができなかった。
【００９３】
Perlベースのプログラムを作製して、アレイ用の25bpオリゴヌクレオチドを設計した。標的血清型のメンバーと特異的にハイブリダイズさせるためにプローブを選択した。48血清型をカバーするために116のオリゴヌクレオチド標的を設計した（図10）。パイロット実験によって6ミスマッチがハイブリダイゼーションを妨げるために十分であることが示された。したがって適切な場合には、血清型特異的プローブは他の血清型と少なくとも6ミスマッチを有するように設計した。種D及び種Bプローブは、この種の範囲外の血清型とのハイブリダイゼーションを最少にするように設計された。各血清型について3つの異なるプローブを設計して、二次構造、溶解温度、又は高い配列分岐による失敗の潜在性を最小限にした（図10A−C）。
5'アミノ結合を有する標的オリゴヌクレオチドを合成し、エポキシ被覆スライド上に25μMでスポットした（。MWG Biotech, High Point, NC）。各標的を三つ組でプリントし、技術的な人為的現象の影響を最小限にした。処理能力を高め、さらに試薬コストを低くするために、前記スポットはスライド当たり16サブアレイとして配置した。サブアレイをシリコンガスケットで単離し、16がそれぞれ独立してハイブリダイズするのを可能にした。4枚のスライドをマイクロタイタープレートアダプタートレーに固定し、64サンプルを同時に処理することができる（Grace BioLabs, Bend, OR）。品質コントロール用オリゴヌクレオチド（GAAACTGTAGATTCTCCAAGATCCA）（配列番号:13）を各標的スポットに0.5μMで含ませた。このコントロール標的は、スポットの形態及びDNA濃度の判定のためにプローブとして蛍光標識補体とハイブリダイズさせた。
HAdVヘキソン配列の存在を確認するための最初のPCRスクリーニングの後で、残留増幅生成物を非対称PCRに付し、ハイブリダイゼーション用の一本鎖プローブを作製した。非対称PCRの際、最初のPCRで用いたリバースプライマーHEX2Rを改変して蛍光タグ付加3DNA分子への二次ハイブリダイゼーションのための配列を取り込んだ（Genisphere, Hatfield PA）。前記改変リバースプライマーを、AmpliTaqポリメラーゼ（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いる標準的PCRで20μMのフォワードプライマーに対して100：1の濃度で用いた。一本鎖の生成物を、3ｘSSC、5ｘデンハルト溶液、及び0.01％のSDSを含む緩衝液中にて1時間42℃でハイブリダイズさせた。スライドを4ｘSSCで5分間洗浄し、乾燥させ、続いて0.2μLの3DNA-Cy3及び1μLの1μM Cy5タグ付加品質コントロール用オリゴヌクレオチドを同じ緩衝液中にて42℃1時間ハイブリダイズさせた。スライドを4ｘSSCで洗浄し、乾燥させ、続いてAxon GenePix400Bアレイスキャナー（Union City, CA）でスキャンした。GenePix Pro5を用いて画像を分析した。過剰なバックグラウンドを有するアレイスポットは分析から除外した。フォアグラウンド532nm Cy3蛍光−バックグラウンドCy3蛍光（F532−B532）を用いてスポットの強度を測定した。実験を通してデータの比較を可能にするために、F532−B532の値を最高値の割合として正規化した。
【００９４】
それぞれの種のHAdVの参照株をアレイでのハイブリダイゼーションのために処理した。最初に、スポットの蛍光をDNA濃度及び分析のために算出したZ-スコアによって正規化した。アレイプリンティングは高度に均一であるので、この方法は不必要に複雑であることが証明された。分析を単純化するために、正規化した前記Cy3蛍光測定値を四分位分割した。最大の75％を超えるシグナルを“強”と、75％から50％の間を“中”と、50％から25％の間を“弱”と分類した。
特定の血清型のために設計したプローブはそれらの同族標的に対して強のシグナルを示した（図9）。図9は、同じ血清型（SO4367）の適合臨床サンプルとHAdV-5のハイブリダイゼーションを示し、ハイブリダイゼーションシグナルの特異性を示している。
47HAdVプローブのパネル内で、結合が無差別的である一事例が見出された。種Dの1つのプローブがHAdV-40（種F）のヘキソン生成物と高いシグナルを生じたが、血清型40のプローブによりこの生成物に対してさらに高いシグナルが得られた。したがって、交差反応性にもかかわらず、このアレイは血清型の正確な同定を可能にした。
このマイクロアレイの臨床微生物学における有用性を判定するために、スペインでのHadVの流行時に呼吸器系サンプル及び糞便サンプルを収集した。種B、C、D及びE血清型を表す19サンプルをマイクロアレイ及び配列分析のために処理した。2つの方法を用いた結果は一致した（図12）。
ヘキソン遺伝子アレイアッセイは、HAdVの血清型分類のための古典的方法と比較して大きな利点を有する。最初のPCRはネスティング無しに既知のHAdV血清型を検出し、さらにまた、前記は高度に保存された領域を基にしているので、新規なHAdV株の発見のために用いることができる。疫学及び臨床微生物学での実施について重要なことに、アレイ使用ハイブリダイゼーションは安価で、高処理ロボット工学に適している。
【実施例８】
【００９５】
実施例8：質量タグPCRによるウイルス性出血熱の弁別的診断
ウイルス性出血熱（VHF）は高い罹患率及び死亡率を伴う。従来の治療選択肢は限定されているが、早期弁別的診断は接触伝染病の封じ込めと密接な関係を有し、臨床管理にとって重要になりえる。本発明は、VHFの異なる10原因の迅速な多面的PCR同定のための診断システムを提供する。
増え続ける国家間の旅行、野生生物中の踏破、政治的不安定及びテロは伝染病の出現を地球規模の懸念にした。ウイルス性出血熱（VHF）は、それらの高い罹患率及び死亡率、並びに人から人へ伝達されることによる急速な伝播ゆえに特別な強調が認められる。“ウイルス性出血熱”は、発熱、ショック及び出血体質を伴う重篤な多系統症候群を特徴とする。前記症状は、エボラ及びマルブルグウイルス（フィロウイルス科）、ラッサウイルス及び南アメリカ出血熱ウイルスグアナリト、ジュニン、マチュポ及びサビア（アレナウイルス科）リフトヴァレー熱、クリミア-コンゴ出血熱、及びハンタウイルス（ブンヤウイルス科）、並びにキャサヌール森林病、オムスク出血熱、黄熱及びデングウイルス（フラビウイルス科）を含むいくつかのRNAウイルスの1つによる感染で引き起こされる。VHFの臨床的管理は主として対症的であるが、早期診断は、接触伝染病の封じ込め及び、特に前記病原因子にその天然の地理的環境外で遭遇する事例においては集団検診の実施のためにもっとも重要である。黄熱病、リフトヴァレー熱、ジュニン、キャサヌール森林病、及びハンタウイルスについてはワクチンが開発されているが、黄熱病ワクチンのみが広く入手できるだけである。免疫血漿による早期治療がジュニンウイルス感染で有効であることが示された。ヌクレオシド類似体リバビリンは、ラッサ熱、クリミア-コンゴ出血熱、又は腎症状を伴う出血熱（HFRS）の経過で早期に投与される場合は有用でありえ、さらに、アレナウイルス感染及びブンヤウイルス感染の暴露後の予防並びに早期治療で推奨されている。
【００９６】
臨床標本中の微生物病原体の核酸を直接検出する方法は、迅速で感度が高く、培養を基本とする方法を用いるVHF症例に付き物の高レベルの生物封じ込めの必要性を回避する。VHF因子の核酸検出について多くの系が記載されているが、いずれも多面的ではない。疑われる症例の地理的位置又は旅行歴は古典的には考慮すべき病原因子の数を限定したが、そのような情報を欠く意図的放出の例では、VHFの診断は困難でありえる。VHFの症状は、初期には非特異的であり、発熱、頭痛、筋肉痛、及び胃腸管及び上気道の愁訴を含みえる。したがって、多方面にわたる因子の同時考慮を可能にするアッセイが要求される。
質量タグPCR(MassTag PCR)は、微生物の遺伝子標的が64の別個の質量タグライブラリーによってコードされる多重アッセイである。核酸（RNA又はDNA）は、64までのプライマーを用いて多重(RT)-PCRによって増幅される。前記プライマーは各々が、光切断性結合を介して異なる分子量のタグで標識されている。取り込まれなかったプライマーから増幅生成物を分離し、さらにアンプリコンからUV-照射により前記質量タグを遊離させた後、タグの実体を質量分析によって分析する。臨床サンプル中の微生物の実体は、その2つの同系タグ（各プライマーから1つ）の存在によって同定される。
VHF因子の迅速で弁別的な診断を容易にするために、本発明は、以下の標的を含むGreene質量タグパネルVHF v1.0を提供する：エボラザイールウイルス（ZEBOV）、エボラスーダンウイルス（SEBOV）、マルブルグウイルス（MARV）、ラッサ熱ウイルス（LASV）、リフトヴァレー熱ウイルス（RVFV）、クリミア-コンゴ出血熱ウイルス（CCHFV）、ハンタンウイルス（HNTV）、ソウルウイルス（SEOV）、黄熱ウイルス（YFV）、及びキャサヌール森林病ウイルス（KHDV）。与えられた病原体の種について最大数のメンバーを検出するために、保存されたゲノム領域でオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。GenBankから配列情報を選び抜き、ClustalWを用いて多重アラインメントを実施し、多面的PCRのために最適化されたプライマーを設計するソフトウェアを開発する。プログラムは、グリーディアルゴリズムを用いて、保存配列を同定しさらにアラインメントで配列を増幅するための最少プライマー集合を作製する。プライマーは可能なときはいつでも標準的な設計拘束（Tm=55℃−65℃、GC含量＝40％−60％、ヘアピン無し）内で選択され、縮退の位置は、鋳型分岐がより多くの融通性を要求する場合に導入される。縮退は5つの3'-ヌクレオチド内では許容されないが、質量タグPCRは、プライマーに付き4つまでの非隣接可変位置を許容する。プライマーは、配列決定された脊椎動物ゲノムとの潜在的なハイブリダイゼーションについてBLASTによってチェックされる（表12）。
【００９７】
表12. Greene質量タグパネル
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表１２続き
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【００９８】
遊離された質量タグのみが分析されるので、多重反応で生成される増幅生成物のサイズを様々に変化させる必要はない。したがって、プライマーは、アンプリコンサイズとは無関係に、有効で一定の性能を目標に選択される（典型的には80から200塩基対）。タグ付加プライマーの合成を開始する前に、候補多重プライマーパネルの機能性を、個々の微生物標的を表象するプロトタイプ鋳型を用いて一連の増幅反応で調べる。アガロースゲル分析で特異的な単一生成物バンドを生成することができないプライマーは交換する。感染培養細胞の抽出物の逆転写によって又はオーバーラップする合成ポリヌクレオチドのアッセンブリーによって入手されるcDNA鋳型のPCR増幅を用いて、評価のための標的配列標準物をpCR2.1-TOPO（Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローニングする。
VHFパネルでアッセイされる病原因子はRNAゲノムを有する。したがって、アッセイ感度を合成RNA標準物を用いて決定した。合成RNA標準物は、T7ポリメラーゼ（mMessage mMachine, Invitrogen, Carlsbad, CA）を用い直線化標的配列プラスミドから生成した。UV分光分析によって定量した後、RNAを2.5mg/mLの酵母tRNA（Sigma）中で連続稀釈し、Superscript II（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてランダムヘキサマーとともに逆転写し、さらに以前に記載したように質量タグPCRによって分析した（94℃で20秒、50℃で20秒、72℃で30秒、アニーリング温度は65℃から51℃まで1℃ずつ低下させ、その後50℃で35サイクル（14））。Q1Aquick96 PCR精製カートリッジ（Qiagen, Hilden, Germany, 改変した結合及び洗浄緩衝液を使用）を用いて取り込まれなかったプライマーを除去した後で、フローセル中でUV光分解によってタグを増幅生成物から脱結合させ、単四極子質量分析計でポジティブモード大気圧下の化学的イオン化（APCI）（Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）により分析した。合成RNA標準物を用いたこの10面-VHFパネルの感度は、アッセイ当たり50 RNAコピー以下であった。
【００９９】
表13：合成RNA標準物を用いる検出の感度
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*RNAコピーはRTに付した分子の数を指し、続いてRT反応の半分をPCR増幅に用いた。
【０１００】
組織培養抽出物を用いてアッセイの特異性を調べた。ガンビア及びコートジボワール由来のZEBOV、SEBOV、MARV、YFV単離株、RVFV、CCHFV、HTNV、SEOV及びLASV株のJosiah、NL及びAVの培養物から得た、ランダムプライミングしたcDNAを質量タグ分析に付した。全ての事例で、適切な同系質量タグのみが検出された。水又はRNAコントロールを用いたアッセイでは偽シグナルは検出されなかった。
臨床材料による性能を24人のVHF患者から得た血液、血清又は口腔スワブを用いて試験した。前記患者には以下が含まれる：コンゴ民主共和国（DRC）の1995年のキクウィットでの流行に由来するエボラ出血熱の5症例；DRCのドゥールバでの流行中に2000年に、及びアンゴラのウイジで2005年に収集されたマルブルグ出血熱の6症例；シェラレオーネから2004年に入手したラッサ熱の4症例；2004年にナンビアで、及び1998年にケニアで得られたリフトヴァレー熱の4症例；及び1986−93年に南アフリカで収集されたクリミア-コンゴ出血熱の5症例。対応する因子による感染は、ウイルス単離、RT-PCR及びラッサウイルス感染の事例では抗原検出ELISAにより以前に診断されている。盲検質量タグ分析による弁別的診断は全ての症例で正確であった（表14）。
【０１０１】
表14. 盲検質量タグPCRによる弁別的診断
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【０１０２】
これらの結果は呼吸器疾患における以前の調査を確認し、質量タグPCRは、伝染病の弁別的診断に迅速で感度が高く、特異的で経済的なアプローチを提供することを示している。小型で低コスト又は携帯APCI-MSユニットは選択参照試験所を越えてこの技術の適用可能性を拡大した。この方法が32までの遺伝子標的をコードする能力があることを考慮し、前記出血熱パネルはさらに別のウイルス（デング熱及び南アメリカ出血熱ウイルス）を含むように拡大されつつある。類似の臨床的様相を生じ、したがって弁別的診断で考慮されねばならない細菌及び寄生虫因子を含めることもまた探求されつつある。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】脊椎動物ウイルスを検出するためにオリゴヌクレオチドの集合を設計する方法の1つの実施態様におけるフローチャート。
【図２】n=30のサンプルサイズにおいて予想が成功した数に対する信頼区間の図。実施例3を参照されたい。
【図３】統合Greeneデータベースで提供される分類学的情報に基づく、検出されたハイブリダイゼーションパターンの分析及び、与えられたウイルスの科、属及び種とマッチする前記パターンの等級付けされた確率の算出。
【図４】GreeneChip1.1による未分類ウイルス単離株の同定。未分類ウイルス単離株由来のRNAをGreeneChi1.1によって分析し、プロトタイプ分析ツールによって“シンドビスウイルス”として同定された（図3及び表9）。ハイブリダイズした配列をチップから溶出させ、配列を決定した。配列分析によって、呼吸器系に保存されていた前記“未分類”単離株は、最近既に性状が調べられていたシンドビス単離株と同定された（GenBank Acc. AF429428）。
【図５】プライマー設計方法の概要（実施例6を参照されたい）。所望のプライマーサイズのウィンドウ内で配列を比較し（1）、類似性行列を作製する（2）。続いてこれを用いて系統樹を構築する（3）。前記系統樹の各枝のコンセンサス配列を決定し、続いてスコアリングする（4）。基準に合格しないプライマーをフィルターで排除する。鋳型を増幅するプライマーの能力に対応する行列を構築する（この場合1は真、2は偽である）（5）。前記行列を集合被覆アルゴリズムによって使用し、ウィンドウ内の配列を増幅することができる最少のプライマー集合を決定する。完全な配列に由来する許容可能なプライマーをTmについて適合させ、ユーザーが検討できるようにアンプリコンサイズによって分類する。
【図６】ウイルス性出血熱の多重PCR（実施例6を参照されたい）。エボラザイール、クリミアコンゴ出血熱（CCHV）、ソウルハンタウイルス、キャサヌール森林ウイルス及びリフトヴァレー熱ウイルスのためのプライマーを一緒に混合し、ヒトDNAのバックグラウンドの中からウイルス性出血熱（VHF）標準物を増幅させるために用いた。アンプリコンをアガロースゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。多重PCRは全ての標準物を500,000から50,000コピーで良好に増幅させ、偽陽性は検出されなかった。
【図７】グリーディとブルートフォースのSCP実施のための実行時間（実施例6を参照されたい）。可能なプライマーに対する計算時間が図に記入されている。各データ点は数百の試験の平均を示し、変動はごくわずかであった。両アルゴリズムの解は全ての事例で同一であった。時間データは指数及び対数式にフィッティングした。
【図８】ヘキソンフラグメントから誘導されたHAdVの系統発生。系統樹は、近隣結合法とそれに続くブートストラップの実施によってヘキソン遺伝子内のPCR増幅領域のアラインメントから構築された。明快にするために未分化の枝で系統樹の葉を圧縮した。HAdVプローブを設計し、分子系統発生によって分離可能である場合は個々の血清型を同定した（HAdV-12、-31、-18、-21、-7、-3、-8、-4、-5、-1、-6、-2、-40及び-41）。血清型間のブートストラップ値が低かった場合は、プローブを設計して種D及びBの場合のように種を同定した。HAdV-7は2つの遺伝子群に分離され、G1はG2よりもHAdV-3と関連が強い。
【図９】HAdV-5のハイブリダイゼーション。HAdV-5参照株および臨床サンプルを増幅し、記載したプロトコルを用いてアレイにハイブリダイズさせた。（a）アレイ、Cy3蛍光（緑色）は標識アンプリコンによって発生し、Cy5（赤色）は品質コントロールオリゴヌクレオチドである。（b）Cy3蛍光のみ、HAdV-5特異的プローブは枠で囲まれている。（c）（b）のハイブリダイゼーションのトリプリケートスポットの相対的蛍光の平均、エラーバーは1標準偏差を示す。（d）臨床サンプルSO4367のハイブリダイゼーションデータ。後の配列分析によって、それがHAdV-5であることが確認される。
【図１０Ａ】HAdVアレイの配列。分子系統発生により識別が可能である場合には特異的なHAdV血清型を同定するようにプローブを設計した（合計14、太字）。冗長性によってアッセイの強靭さを高めるため、種々の領域に由来する3つのプローブを設計した。種B及びDの高い類似性のために、特異的プローブはHAdV-3、-7、-21、及び-8に対してのみ設計することができた。
【図１０Ｂ】HAdVアレイの配列。分子系統発生により識別が可能である場合には特異的なHAdV血清型を同定するようにプローブを設計した（合計14、太字）。冗長性によってアッセイの強靭さを高めるため、種々の領域に由来する3つのプローブを設計した。種B及びDの高い類似性のために、特異的プローブはHAdV-3、-7、-21、及び-8に対してのみ設計することができた。
【図１０Ｃ】HAdVアレイの配列。分子系統発生により識別が可能である場合には特異的なHAdV血清型を同定するようにプローブを設計した（合計14、太字）。冗長性によってアッセイの強靭さを高めるため、種々の領域に由来する3つのプローブを設計した。種B及びDの高い類似性のために、特異的プローブはHAdV-3、-7、-21、及び-8に対してのみ設計することができた。
【図１１】HAdV参照株のハイブリダイゼーションによる同定。各々の種に由来するアデノウイルスの参照株をアレイにハイブリダイズさせた。蛍光データを最大シグナルの割合によって正規化し、続いてスポットを四分位数によって分類した。星印（*）は最も高いハイブリダイゼーションシグナルを示している。
【図１２】アデノウイルス臨床サンプルのハイブリダイゼーションによる同定。アデノウイルスの19の臨床サンプルをアレイにハイブリダイズさせた。前記臨床サンプルをシークェンシング及び分子系統発生によって血清型分類を行い、結果を確認した。蛍光データを最大シグナルに対する割合によって正規化し、続いてスポットを四分位数によって分類した。星印（*）は最も高いハイブリダイゼーションシグナルを示している。
【図１３】臨床材料による性能を24人のVHF患者から得た血液、血清又は口腔スワップを用いて試験した。前記患者には以下が含まれる：コンゴ民主共和国（DRC）の1995年のキクウィットでの流行に由来するエボラ出血熱の5症例；DRCのドゥールバでの流行中に2000年に、及びアンゴラのウイジで2005年に収集されたマルブルグ出血熱の6症例；シェラレオンから2004年に入手したラッサ熱の4症例；2004年にナンビアで、及び1998年にケニアで得られたリフトヴァレー熱の4症例；及び1986−93年に南アフリカで収集されたクリミア-コンゴ出血熱の5症例。それぞれの病原因子による感染は、ウイルス単離、RT-PCR及びラッサウイルス感染の事例では抗原検出ELISAにより以前に診断されている。盲検質量タグ分析による弁別的診断は全ての症例で正確であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図４】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月11日(2008.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【外国語明細書】
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