(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子と、インビボで塩基対合を形成する標的遺伝子を同定するための方法、ならびにキットの提供。【解決手段】(i)前記RNA分子を含む細胞から、RISCに組み込まれた前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合している、RISC/mRNA複合体を抽出する工程。(ii)前記RISC/mRNA複合体から、前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合しているRNA分子/mRNA複合体を得る工程。(iii)前記RNA分子/mRNA複合体を用いて、前記RNA分子又はその断片をプライマーとして、前記mRNAを鋳型とする逆転写反応を行うことにより、前記mRNAの部分塩基配列が逆転写されたDNAに前記RNA分子又はその断片が連結されてなるDNA-RNA分子を得る工程。からなる方法、および、該方法に用いられるキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を同定する方法であって、
(i)前記RNA分子を含む細胞から、RISCに組み込まれた前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合している、RISC/mRNA複合体を抽出する工程、（ここで、RISCはRNA分子又はその断片及びタンパク質因子によって構成される）；
(ii)前記RISC/mRNA複合体から、前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合しているRNA分子/mRNA複合体を得る工程；
(iii)前記RNA分子/mRNA複合体を用いて、前記RNA分子又はその断片をプライマーとして、前記mRNAを鋳型とする逆転写反応を行うことにより、前記mRNAの部分塩基配列が逆転写されたDNAに前記RNA分子又はその断片が連結されてなるDNA-RNA分子を得る工程；ならびに
(iv)前記DNA-RNA分子の塩基配列を決定することにより遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子及びその標的遺伝子を同定する工程。
【請求項２】
前記RNA分子がmiRNAである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程(ii)が、前記RNA分子又はその断片と前記mRNAの塩基対合を解離させることなく、前記RNA分子又はその断片からRISCのタンパク質因子を解離させる工程である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程(ii)が、前記RISC/mRNA複合体に対して界面活性剤処理を行う工程である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウム（SDS）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記界面活性剤処理が、０．０１〜２０重量％の最終濃度の界面活性剤の存在下に前記RISC/mRNA複合体を曝すことにより行われる、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記(iv)工程が、下記工程を含む請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
(iv-1)前記DNA-RNA分子からなる第１鎖と、該第１鎖に相補的なDNA分子からなる第２鎖が塩基対合した２本鎖分子を調製する工程；
(iv-2)前記２本鎖分子を、制限酵素によって切断した後、該切断部の末端に、PCR増幅のためのプライマーとして使用可能な配列を有するアダプターDNAをライゲーションすることにより、アダプターDNAが連結した前記第２鎖断片を得る工程；
(iv-3)前記RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマー、及び前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーからなるプライマーセットを使用して、前記アダプターDNAが連結した第１鎖断片又は第２鎖断片を鋳型としてPCR増幅を行う工程；ならびに
(iv-4)前記工程(iv-3)において得られたPCR産物の塩基配列を決定することにより、遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子が標的とする遺伝子を同定する工程。
【請求項８】
アダプターDNAの塩基数が６〜５０塩基である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記制限酵素が、NlaIII又はTaiIである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程(iv-3)におい、前記プライマーセットの前記RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーが、標識物質によって標識されてなるものであり、PCR増幅反応後に、当該標的物質を指標としてPCR産物が回収されてなる、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記標識物質がビオチンであり、PCR増幅反応後に該ビオチンをアビジンに吸着させることによりPCR産物が回収される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程(iv-3)が、前記RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマー、及び前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーからなるプライマーセットを使用して得られたPCR産物を鋳型として、さらにPCR増幅を行う工程を含む、請求項７〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を同定するためのキットであって、
RISCに組み込まれた前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合しているRISC/mRNA複合体から、前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合しているRNA分子/mRNA複合体を得るための試薬(A)を含むキット。
【請求項１４】
さらに、
前記RNA分子を含む細胞から、RISCに組み込まれた前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合しているRISC/mRNA複合体を抽出するための試薬(B)、及び／又は前記RNA分子又はその断片をプライマーとし、前記mRNAを鋳型として逆転写反応を行うための試薬(C)、
を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
さらに、
制限酵素、
前記PCR増幅のためのプライマーとして使用可能な配列を有するアダプターDNA、ならびに
前記RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマー及び前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーからなるプライマーセット、
からなる群より選択される少なくとも１種を含む請求項１３又は１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記プライマーセットのRNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーが標識物質によって標識されてなる物である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記標識物質がビオチンである、請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高効率で遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現抑制機能を有する低分子RNAとしてmicroRNA (miRNA)が知られている。miRNAは多数の発生および生理的プロセスにおいて重要な役割を発揮する約22個のヌクレオチドよりなる調節RNAである。動物miRNAは、mRNAの3'非翻訳領域（3'UTR）と不完全な塩基対を形成することによって標的遺伝子を抑制する（例えば非特許文献１を参照）。数千のmiRNAが様々な生物で発見されている（例えば非特許文献２を参照）。しかしながら、これらのmiRNAのほぼすべての標的遺伝子がまだ同定されていない。
【０００３】
標的遺伝子の同定は、miRNAの機能の解明における大きな課題である。miRNAは、種配列と呼ばれるmiRNAの5'末端から2番目〜8番目のヌクレオチド、およびmRNAの3'UTR内の相補的ヌクレオチドの間でほぼ完全な塩基対を形成することによって標的mRNAを認識する（例えば非特許文献１を参照）。配列アラインメントに基づいて各miRNAの標的遺伝子を予測し、種配列との相補配列を3'UTR内に有する遺伝子を検出するためのコンピュータアルゴリズムが開発されている（例えば非特許文献３を参照）。しかしながら、これら遺伝子は予測されたものであり、真の標的遺伝子であるかは実験的に検証する必要がある。
【０００４】
miRNAは、タンパク質因子と共にRNA誘発型サイレンシング複合体（RNA-induced silencing complex：RISC）を形成しmRNAと結合している。そこで、実験的な標的遺伝子探索法として、RISCを免疫沈降法によって回収し、その中に含まれるmRNAを解析する方法が行われている。しかしながら、この方法では得られる標的遺伝子がどのmiRNAの標的mRNAであるのかを知ることはできない（例えば非特許文献４、５を参照）。
【０００５】
また、miRNAは標的mRNAの分解を促すことから、miRNA量増加と対応した標的mRNA量低下をマイクロアレイにて検出する方法も行われている。しかしながら、この方法には、miRNA発現量が異なる２種類の比較対照サンプルを必要とし、その一方には遺伝的変異体を利用することから、多くの生物種に適用できるものではない（例えば非特許文献６、７を参照）。
【０００６】
さらに、miRNAをプライマーとする標的mRNA逆転写産物のクローン化を利用する方法が報告されている（例えば非特許文献８を参照）。しかしながら、非特許文献８には、まず対象とする遺伝子を指定した後、この遺伝子のmRNAに塩基対合するmiRNAを見つける方法を示しているに過ぎず、対象とするmiRNAに対する標的遺伝子を見つけ出せる方法ではない。
【０００７】
このような背景から、遺伝子抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を効率的に同定するための方法が強く望まれていた。
【非特許文献１】Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116, 281-297 (2004).
【非特許文献２】Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A. & Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res 34, D140-144 (2006).
【非特許文献３】Rajewsky, N. microRNA target predictions in animals. Nat Genet 38, S8-13 (2006).
【非特許文献４】Easow, G., Teleman, A. A. & Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA 13, 1198-1204 (2007).
【非特許文献５】Zhang, L. et al. Systematic identification of C. elegans miRISC proteins, miRNAs, and mRNA targets by their interactions with GW182 proteins AIN-1 and AIN-2. Mol Cell 28, 598-613 (2007).
【非特許文献６】Lim, L. P. et al. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature 433, 769-773 (2005)
【非特許文献７】Giraldez, A. J. et al. Zebrafish MiR-430 promotes deadenylation and clearance of maternal mRNAs. Science 312, 75-79 (2006)
【非特許文献８】Vatolin, S., Navaratne, K. & Weil, R. J. A novel method to detect functional microRNA targets. J Mol Biol 358, 983-996 (2006).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子と、インビボで塩基対合を形成する標的遺伝子を同定するための方法、ならびに遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を同定するために用いられるキットを提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子（例えば内因性miRNA）をプライマーとして逆転写反応を行うことをもとに、先に指定する遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子のcDNAを効率よくクローニングする方法を見出した。
【００１０】
例えば、遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子がmiRNAである場合、miRNAはRISCに組み込まれた形で存在するため、RISCのタンパク質因子によって逆転写酵素が標的mRNA上のmiRNAに接触することを阻止され、結果的にmiRNAからのプライミングが効率良く進まない。また、mRNA上の他のRNA結合タンパク質もcDNA鎖の伸長を遮断する可能性がある。従って、miRNAをプライマーとして用いる場合は、mRNA上からRISCのタンパク質因子やRNA結合タンパク質を除去する必要があるが、タンパク質をmRNAから剥離するために変性剤処理や、高温処理を行うと、miRNAとmRNAとの間の塩基対合までもが破壊されてしまう。
【００１１】
そこで、本発明者らは、RNA分子又はその断片と前記mRNAの塩基対合を解離させることなく、RISC内のmiRNAに対する逆転写酵素の反応性を高める方法を見出した。さらに、本発明者等は、RNA分子/mRNA複合体を用いて逆転写反応を行うことにより、前記mRNAの部分塩基配列が逆転写されたDNAに前記RNA分子又はその断片が連結されてなるDNA-RNA分子を得、これに基づいてクローンを作製して該クローンの塩基配列を特定し、標的遺伝子の同定を行う方法を見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の方法を提供するものである。
項１．遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を同定する方法であって、
(i)前記RNA分子を含む細胞から、RISCに組み込まれた前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合している、RISC/mRNA複合体を抽出する工程、（ここで、RISCはRNA分子又はその断片及びタンパク質因子によって構成される）；
(ii)前記RISC/mRNA複合体から、前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合しているRNA分子/mRNA複合体を得る工程；
(iii)前記RNA分子/mRNA複合体を用いて、前記RNA分子又はその断片をプライマーとして、前記mRNAを鋳型とする逆転写反応を行うことにより、前記mRNAの部分塩基配列が逆転写されたDNAに前記RNA分子又はその断片が連結されてなるDNA-RNA分子を得る工程；ならびに
(iv)前記DNA-RNA分子の塩基配列を決定することにより遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子及びその標的遺伝子を同定する工程。
項２．前記RNA分子がmiRNAである、項１に記載の方法。
項３．前記工程(ii)が、前記RNA分子又はその断片と前記mRNAの塩基対合を解離させることなく、前記RNA分子又はその断片からRISCのタンパク質因子を解離させる工程である、項１又は２に記載の方法。
項４．前記工程(ii)が、前記RISC/mRNA複合体に対して界面活性剤処理を行う工程である、項１又は２に記載の方法。
項５．前記界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウム（SDS）である、項４に記載の方法。
項６．前記界面活性剤処理が、０．０１〜２０重量％の最終濃度の界面活性剤の存在下に前記RISC/mRNA複合体を曝すことにより行われる、項４又は５に記載の方法。
項７．前記(iv)工程が、下記工程を含む項１〜６のいずれかに記載の方法。
(iv-1)前記DNA-RNA分子からなる第１鎖と、該第１鎖に相補的なDNA分子からなる第２鎖が塩基対合した２本鎖分子を調製する工程；
(iv-2)前記２本鎖分子を、制限酵素によって切断した後、該切断部の末端に、PCR増幅のためのプライマーとして使用可能な配列を有するアダプターDNAをライゲーションすることにより、アダプターDNAが連結した前記第２鎖断片を得る工程；
(iv-3)前記RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマー、及び前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーからなるプライマーセットを使用して、前記アダプターDNAが連結した第１鎖断片又は第２鎖断片を鋳型としてPCR増幅を行う工程；ならびに
(iv-4)前記工程(iv-3)において得られたPCR産物の塩基配列を決定することにより、遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子が標的とする遺伝子を同定する工程。
項８．アダプターDNAの塩基数が６〜５０塩基である、項７に記載の方法。
項９．前記制限酵素が、NlaIII又はTaiIである、項７又は８に記載の方法。
項１０．前記工程(iv-3)におい、前記プライマーセットの前記RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーが、標識物質によって標識されてなるものであり、PCR増幅反応後に、当該標的物質を指標としてPCR産物が回収されてなる、項７〜９のいずれかに記載の方法。
項１１．前記標識物質がビオチンであり、PCR増幅反応後に該ビオチンをアビジンに吸着させることによりPCR産物が回収される、項１０に記載の方法。
項１２．前記工程(iv-3)が、前記RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマー、及び前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーからなるプライマーセットを使用して得られたPCR産物を鋳型として、さらにPCR増幅を行う工程を含む、項７〜１１のいずれかに記載の方法。
１３．遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を同定するためのキットであって、RISCに組み込まれた前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合しているRISC/mRNA複合体から、前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合しているRNA分子/mRNA複合体を得るための試薬(A)を含むキット。
項１４．さらに、前記RNA分子を含む細胞から、RISCに組み込まれた前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合しているRISC/mRNA複合体を抽出するための試薬(B)、及び／又は前記RNA分子又はその断片をプライマーとして、前記mRNAを鋳型として逆転写反応を行うための試薬(C)、を含む、項１３に記載のキット。
項１５．さらに、制限酵素、前記PCR増幅のためのプライマーとして使用可能な配列を有するアダプターDNA、ならびに前記RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマー及び前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーからなるプライマーセット、からなる群より選択される少なくとも１種を含む項１３又は１４に記載のキット。
項１６．前記プライマーセットのRNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーが標識物質によって標識されてなる物である、項１５に記載のキット。
項１７．前記標識物質がビオチンである、項１６に記載のキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、遺伝子発現の抑制作用を有するRNA分子が塩基対合によりmRNAに結合し発現を抑制する標的遺伝子を、非常に効率よく同定する方法を提供することができる。本発明の方法は、動物、植物の別を問わずいかなる生物種に対しても、遺伝子型によらず、用いることができる。また、本発明の遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を同定するためのキットを用いることによって、簡便に標的遺伝子を同定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
1.遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を同定する方法
本発明の遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を同定する方法は、以下の工程を含む。
(i)前記RNA分子を含む細胞から、RISCに組み込まれた前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合している、RISC/mRNA複合体を抽出する工程、（ここで、RISCはRNA分子又はその断片及びタンパク質因子によって構成される）；
(ii)前記RISC/mRNA複合体から、前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合しているRNA分子/mRNA複合体を得る工程；
(iii)前記RNA分子/mRNA複合体を用いて、前記RNA分子又はその断片をプライマーとして、前記mRNAを鋳型とする逆転写反応を行うことにより、前記mRNAの部分塩基配列が逆転写されたDNAに前記RNA分子又はその断片が連結されてなるDNA-RNA分子を得る工程；ならびに
(iv)前記DNA-RNA分子の塩基配列を決定することにより遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子及びその標的遺伝子を同定する工程。
本発明の各工程について、以下に詳述する。また、本発明の遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を同定する方法をより具体的に説明するため、遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子がmiRNAである場合を例にした概略図（図1）を引用することがある。
【００１５】
本発明は、既知の配列を有し、遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子が標的とする遺伝子を同定するための方法に関するものである。本明細書において『RNA分子』は、細胞内で標的とする遺伝子の発現を抑制し得るものであれば特に限定されず、１本鎖RNA及び２本鎖RNAのいずれをも包含するものとして記載される。本発明においてRNA分子のサイズは特に限定されず、対象となるmiRNAの由来によって異なるが、例えば、ヒトmiRNAであれば18〜28塩基程度、線虫miRNAであれば18〜26塩基程度である。
【００１６】
以下、本明細書において、遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子を単に『RNA分子』と略記することがある。
【００１７】
このようなRNA分子としては、例えばmiRNA（microRNA；１本鎖RNA）、siRNA（small-interference RNA；２本鎖RNA（21〜23塩基程度））が挙げられる。なかでも、miRNAは、従来法では標的となる遺伝子の同定が困難であったが、本発明の方法によれば効率よく標的遺伝子を同定することができる。本発明においてRNA分子がmiRNAである場合は、miRNA自身がmRNAに結合してRISC/mRNA複合体を形成し、遺伝子発現を抑制する。また、RNA分子がsiRNAである場合は、ダイサーによって切断されたsiRNA２本鎖の内の一方（アンチセンス鎖）がmRNAに結合してRISC/mRNA複合体を形成する。本明細書においてRNA分子の断片は、このアンチセンス鎖に相当する。
【００１８】
ここで、『RISC/mRNA複合体』とは、前記RNA分子と、RNA-induced silencing complex（RISC）のタンパク質因子及びmRNAが形成する複合体である。RISCに組み込まれたRNA分子はmRNAと塩基対合によって結合している。RISC/mRNA複合体の概略図は、図1(a)に示される。
【００１９】
ここで、RNA分子とmRNAの塩基対合は、RNA分子とmRNAが結合している限り、完全対合（フルマッチ）である必要はない。例えば、RNA分子がmiRNAである場合、は、少なくとも１つのバルジループ等を有する不完全な塩基対合によって結合されていてもよい。また、RNA分子がsiRNAである場合は、siRNAが不完全な塩基対合によってmRNAに結合しているものであってもよい。そのようなsiRNAを対象とすることによって、本来意図した遺伝子とは異なる遺伝子のmRNAにRNA分子（siRNA）が結合し発現が抑制される標的遺伝子（オフターゲット）を同定することができる。
【００２０】
工程(i)
工程(i)においては、前記RNA分子を含む細胞から、RISCに組み込まれた前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合している、RISC/mRNA複合体を抽出する。ここで、RISCはRNA分子又はその断片及びタンパク質因子によって構成される。本工程においてRISC/mRNA複合体は、細胞抽出液中に含有された形態で得られるものであってもよい。
【００２１】
工程(i)は、図1の概略図にあてはめると、図1(a)に示されるRNA-induced silencing complex（RISC）に組み込まれたmiRNAが、標的mRNAと塩基対合により結合した複合体を含む細胞抽出液を調製する段階に相当する。
【００２２】
RISC/mRNA複合体の抽出方法は特に限定されず、RNA分子又はその断片とmRNAの塩基対合を解離させないものであれば、従来公知の細胞質成分を含有する抽出液を得る方法に従って調製することができる。抽出方法として、簡便には、対象生物から採取されたRNA分子を含む試料（細胞、組織等）をホモジナイズし、遠心分離を行う方法が挙げられる。本発明の方法は、生物種の別を問わず、あらゆる細胞から得られるRISC/mRNA複合体から標的遺伝子の同定に適用することが可能であることから、試料となる細胞や組織の種類、生物種の別等は特に制限されない。
【００２３】
ホモジナイズを行う際、採取された試料に緩衝溶液を添加し、ホモジナイザーによって細胞を破砕して細胞抽出液を得ることができる。このとき緩衝溶液としては、通常、当該技術分野おいて使用される細胞分画用の緩衝溶液を用いることができ、例えばApplied Biosystems社（Ambion社）製 PARIS kitに含まれるCell Fractination Buffer（細胞分画用緩衝液）を用いることができる。ホモジナイズは、低温（氷冷）しながら行うことが望ましい。
【００２４】
また、遠心分離の条件としては、ゲノムDNAが除去され、RISC/mRNA複合体を含有する抽出液が得られるものであれば特に限定されず、従来公知の方法に従って適宜設定され得るが、例えば100×g〜20,000×g、1〜20分間程度、好ましくは5〜10分間程度の遠心条件を採用することができる。
【００２５】
得られたRISC/mRNA複合体を含む細胞抽出液は、4℃程度で1〜20日程度保存することも可能であるが、工程(i)から工程(ii)の作業は続けて行うことが望ましい。
【００２６】
工程(ii)
工程(ii)においては、工程(i)で抽出されたRISC/mRNA複合体から、RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合によって結合しているRNA分子/mRNA複合体を得る。
【００２７】
ここで『RNA分子/mRNA複合体』とは、前記遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子とmRNAとが塩基対合によって結合した複合体を指す。RNA分子/mRNA複合体は、図1(b)に相当する。
【００２８】
本工程によれば、RNA分子と工程(iii)において使用される逆転写酵素との反応性を高めることができる。RNA分子と逆転写酵素の反応性を高めるためには、RNA分子又はその断片とmRNAの塩基対合を解離させることなく、RNA分子又はその断片からRISCのタンパク質因子を解離させることが好ましい。
【００２９】
RISC/mRNA複合体からRISCのタンパク質因子を解離させる方法としては、例えば界面活性剤処理、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）処理等が挙げられ、好ましくは界面活性剤処理である。なお、RISC/mRNA複合体からRISCのタンパク質因子を解離させるための処理を行う間、氷上におく等してRNA分子とmRNAの解離を最小限に留めることが望ましい。
【００３０】
界面活性剤は、従来公知のものを用いることが可能であるが、例えばラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、Triton X-100、CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate)等が挙げられ、好ましくはSDSである。
【００３１】
タンパク質分解酵素としては、従来公知のものを用いることが可能であるが、例えばプロテネースＫ、トリプシン等が挙げられる。
【００３２】
また、RISCの解離に使用される界面活性剤の添加量は、RNA分子とmRNAの塩基対合を解離させることなくRISCを解離させることができる濃度であれば特に限定されないが、通常、最終濃度0.01〜20重量％、好ましくは0.05〜10重量％、より好ましくは0.05〜3重量％、さらに好ましくは0.1〜1.5重量％である。
【００３３】
上記界面活性剤、タンパク質分解酵素を上記濃度に調製する際の溶媒は、特に限定されず、通常は精製水等を用いればよい。
【００３４】
工程(iii)
工程(iii)においては、工程(ii)で得られたRNA分子/mRNA複合体を用いて、遺伝子抑制作用を有するRNA分子又はその断片をプライマーとして、前記mRNAを鋳型とする逆転写反応を行うことにより、前記mRNAの部分塩基配列が逆転写されたDNAに前記RNA分子又はその断片が連結されてなるDNA-RNA分子を得る。
【００３５】
ここで『RNA-DNA分子』とは、図1(c)に模式的に示されるように１本鎖であり（第１鎖に相当）、mRNAを鋳型として得られるcDNA部分と前記RNA分子又はその断片が連結されている分子を指す。
【００３６】
本発明の工程(iii)は、遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子又はその断片がプライマーの役割を果たし、mRNAを鋳型として逆転写反応を行うことを特徴とする。遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子又はその断片をプライマーとするためには、上記工程(ii)においてRNA分子とmRNAの塩基対合を解離させることなくRISCのタンパク質因子を解離させておくことが望ましい。また、前記RNA分子又はその断片をプライマーとして利用することによって、標的となる遺伝子を高効率で同定することが可能となる。
【００３７】
逆転写反応は、従来公知の方法に従って行うことができ、反応条件についても適宜設定することができ、例えば、SuperScriptIII 逆転写酵素(Invitorogen)等の市販される逆転写酵素を用いて行うことができる。また、より簡便には、SuperScript（登録商標）First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen）等のキットを商業的に入手することができ、これを用いて行うことができる。逆転写反応を行う際、反応温度は低温（４℃程度）で開始し、徐々に設定温度まで上昇させていくのが望ましい。
【００３８】
逆転写酵素は、上記工程(i)で得られるRISC/mRNA複合体を含む抽出液に対して、20〜30000 unit/μl、好ましくは200〜5000 unit/μl、より好ましくは500〜2000 unit/μlとなるように添加する。
【００３９】
本工程においては、前記工程(ii)で添加された界面活性剤やタンパク質分解酵素によって逆転写酵素が阻害されないように、逆転写反応溶液で希釈することが望ましい。ここで、逆転写反応溶液には、緩衝溶液及び逆転写酵素が含まれる。逆転写反応溶液は、従来公知の方法に従って調製することができる。逆転写酵素の作用が阻害されないように添加される逆転写反応溶液の量は、RISC/mRNA複合体を含む抽出液1容量部に対して、20〜1500容量部、好ましくは50〜1000容量部、より好ましくは100〜500容量部である。
【００４０】
さらに、逆転写反応後は、反応溶液中の最終濃度が0.001〜5重量％、好ましくは0.001〜3重量％、より好ましくは0.05〜0.5重量％となるようにSDS等の界面活性剤を加えてからフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（例えば25:24:1）処理を行うか、あるいはpH9.5程度のTris緩衝液で平行化したフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（例えば25:24:1）にて処理することが好ましい。逆転写反応による生成物は、mRNAとcDNA/miRNAが二重鎖を形成したものであり、このmRNAには長鎖polyAが付いていることが予想される。長鎖（150塩基程度）のpoly A鎖を持つ合成mRNAを扱う際、pH8程度のフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（例えば25:24:1）処理を行うと、この合成mRNAが水層から失われてしまうおそれがある。フェノール、クロロフォルム、イソアミルアルコールの混合比率は、合成mRNAの損失を阻止し得るものであれば特に限定されないが、例えばフェノール１容量部に対して、クロロフォルム0.85〜1容量部程度、イソアミルアルコール0.001〜0.1容量部である。この様な前記処理を行うことによって合成mRNAの水層からの損失を防ぐことができる。
【００４１】
工程(iv)
工程(iv)では、前記工程(iii)で得られたDNA-RNA分子の塩基配列を決定することにより、遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子及びその標的遺伝子を同定する。
【００４２】
下記工程(iv-4)に相当するDNA-RNA分子の塩基配列の決定は、従来公知の方法を採用することができる。本工程においては、塩基配列の決定を効率よく行うために下記工程(iv-1)〜(iv-3)が含まれていていることが望ましい。
【００４３】
工程(iv-1)
工程(iv-1)においては、前記DNA-RNA分子からなる第１鎖と、該第１鎖に相補的なDNA分子からなる第２鎖が塩基対合した２本鎖分子を調製する。
【００４４】
通常のcDNA第２鎖合成では、RNaseH等を用いた処理によるmRNAへの点切断の導入と、mRNA切断3’末端を伸長点とするDNA polymeraseIによるRNA除去及びDNA合成反応が行われる。その結果、5’ 端部分に短いRNAが残るcDNA第２鎖が作製されることになる。
【００４５】
本工程においては、cDNA第１鎖部分の第２鎖DNAだけでなく、miRNA部分の相補鎖DNAも合成する必要があるため、DNAとRNAの両方を鋳型としてDNAを合成できるDNAポリメラーゼを用いる。このようなDNAポリメラーゼとしては、例えばTth DNA polymerase（Promega社製）等が挙げられる。また、Tth DNA polymeraseを用いた場合、この種のDNAポリメラーゼはマンガンイオン存在下ではDNAのみならずRNAをも鋳型としてDNA合成を行うことが知られていることから、本工程でのDNA合成は、マンガンイオン存在下で行うことが望ましい。
【００４６】
また、本工程においては、従来DNA合成に使用されるRNaseH等を用いてもよいが、これらのを使用しない方が効率よくDNA合成が行われる。
【００４７】
DNA合成は、従来公知の方法に従えばよく、例えば商業的に入手可能なDNAポリメラーゼに添付の指示書に従って行うことができる。なお、図１(d)の第２鎖DNAの5’末端の細線部分は、5’末端部分に残る短いRNAを示すものである。
【００４８】
工程(iv-2)
工程(iv-2)においては、前記２本鎖分子を、制限酵素によって切断した後、前記第２鎖の切断部の末端に、PCR増幅のためのプライマーとして使用可能な配列を有するアダプターDNAをライゲーションすることにより、アダプターDNAが連結した前記第２鎖断片を得る。
【００４９】
なお、当該技術分野において、『アダプターDNA』は通常２本鎖のオリゴマーDNAを指すが、本明細書において単に『アダプターDNA』と記載する場合は、１本鎖及び２本鎖のいずれのオリゴマーDNAも包含されるものとする。本発明において使用されるアダプターDNAは、後述の工程(iv-3)のPCR増幅において、プライマーとして使用可能な配列を有しており、その長さは5〜60塩基、好ましくは5〜30塩基、より好ましくは5〜20塩基である。
【００５０】
本工程において使用される制限酵素としては、従来公知のものを使用することができ、特に限定されないが、例えばHaeII、NlaIII、TaiI、PstI、SacI、KpnI、AatII、ApaI、BbeI、EcoT22I、SphI、EcoRV、HaeIII等が挙げられる。
【００５１】
また、本工程の制限酵素処理によって生じる末端切断部は、特定の構造を有するもの、又は平滑末端のいずれでもよいが、作業効率の観点から、3’末端側に1〜10塩基程度、好ましくは1~5塩基程度の突出末端を形成するものが好ましく、例えば４塩基の3’突出末端を形成するものが挙げられる。このような末端構造を形成する制限酵素としては、例えばNlaIII、TaiI等が挙げられる。本発明の方法によって前記RNA分子の標的遺伝子のクローンを得るためには、標的mRNA配列上に少なくとも１個の制限酵素認識配列があることが必要であるため、認識配列が短い方が取りこぼしが少なくなると考えられる。従って、使用される制限酵素は、１〜１０塩基程度、好ましくは１〜５塩基程度、例えば４塩基程度の短い配列を認識して切断するものが望ましい。
【００５２】
例えば、４塩基の3’突出末端を形成することによって、この４塩基に相補的な3’末端配列を持つ１本鎖DNAを用いて第２鎖の5’末端にライゲーションを行い、連結することができる。さらに、この１本鎖DNAは、プライマーDNAとしての機能をも果たし、そのまま次のPCRにおけるプライマーともなり得る。アダプターDNAがPCRプライマーとして機能する場合の具体的な説明は、下記(iv-3-1)に記載する。
【００５３】
２本鎖のオリゴマーDNAをアダプターDNAとして用いた場合、通常、商業的に入手できるアダプターDNAは、5’末端にリン酸が付加されていないため、第１鎖の3’末端へのライゲーションは起こらないと予想される。１本鎖オリゴマーDNAをアダプターDNAとすることによって、PCRプライマーとして使用されないオリゴマーを持ち込まなくてすむという利点がある。
【００５４】
アダプターDNAは、制限酵素処理によって形成される末端部にライゲーションすることにより、DNA-RNA分子とその相補鎖DNA分子が塩基対合した２本鎖分子に連結される。アダプターDNAは、3’末端の相補配列に基づいて、従来公知の方法に従って化学合成を行い、得ることができる。また、簡便には、北海道システム・サイエンス株式会社、シグマアルドリッチ株式会社、インビトロジェン株式会社等の合成DNA販売会社より、必要に応じた配列に基づいて適宜DNA合成を指示し、商業的に入手することができる。
【００５５】
また、前記２本鎖分子の末端が平滑末端である場合、アダプターDNAと、アダプターDNAに相補的な配列を有する２本鎖のDNAアダプターをライゲーションによって連結させてもよい。ライゲーションは、従来公知の方法に従って行うことができる。
【００５６】
工程(iv-3)
(iv-3-1)工程(iv-3)においては、前記RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマー、及び前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーからなるプライマーセットを使用して、前記アダプターDNAが連結した第１鎖断片又は第２鎖断片を鋳型としてPCR増幅を行う。
【００５７】
本工程において鋳型となるDNA鎖は第１鎖断片又は第２鎖断片のいずれでも良いが、PCR反応においては、RNA分子に相当する部分配列がRNAとして含まれる第１鎖断片は使用されず、全てがDNAで構成される第２鎖が鋳型として用いられると考えられる。また、１本鎖のアダプターDNAをライゲーションした場合、第２鎖断片とのみ共有結合すると考えられることから、この場合も第２鎖断片が鋳型として使用され得る。従って、本工程のPCR増幅においては、通常は第２鎖断片が鋳型として用いられ得る。
【００５８】
本工程のPCR反応に使用されるプライマーは、前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーと、RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーを用いる。各プライマーの塩基数は特に限定されないが、前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーとしては、例えば14〜20塩基程度；RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーとしては、例えば12〜15塩基程度である。
【００５９】
本明細書において『アダプターDNAの全配列からなるプライマー』とは、工程(iv-2)において使用されるアダプターDNAそのものを指す。また、『アダプターDNAの部分配列からなるプライマー』とは、前記アダプターDNAにおいてPCR増幅のためのプライマーとして使用可能な配列からなるプライマーであることを指す。本工程においては、簡便には、アダプターDNAの全配列からなるプライマーを用いることが好ましい。
【００６０】
前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーがアダプターDNAそのものである場合を例に説明する。本発明においては、上記工程(iv-2)でライゲーション反応溶液が添加された試料を、ライゲーション反応溶液を除去することなくPCR反応に使用することができる。これにより、上記工程(iv-2)において加えられたアダプターDNAの内、第２鎖の5’末端にライゲーションされずに反応液中に残存しているアダプターDNAを、本工程における前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーとして用いてPCR産物を得ることができる。すなわち、PCR反応によってアダプターDNAが連結した第２鎖断片（図１(f)を参照）に対する相補鎖が形成される。この相補鎖には、アダプターDNAに対する相補配列が含まれる。この相補鎖を鋳型として、PCR反応において反応液中に残存するアダプターDNAがプライマーとしての役割を果たし得る。
【００６１】
また、ライゲーションによって連結されるアダプターDNAが２本鎖である場合は、第２鎖に結合するアダプターDNAの塩基配列を認識するプライマーが使用され得る。
【００６２】
また、RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーについても、当該RNA分子又はその断片の塩基配列に基づいて適宜設定することが可能であるが、PCR増幅においては5’末端から1〜15塩基程度の範囲内でプライマーを設定することが望ましい。
【００６３】
本工程の後、得られたPCR産物に対して分離精製処理を行うことが望ましい。従って、前記RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーの5’末端を標識化しておけば、前記RNA分子又はその断片の塩基配列を一端に持つ標識されたPCR産物が得られ、この標識に基づいて分離精製処理を行うことができる。標識の方法及びそれに基づく分離精製方法は特に限定されず、従来公知の方法から適宜選択することが可能であるが、ビオチン、FITC、ジゴキシゲニン（digoxygenin）等で標識することができる。例えばプライマーをビオチンで標識することによって、アビジンビーズ（例えばSoftLink Soft Release Avidin Resin（Promega社製））等を用い、ビオチン−アビジン結合を利用した分離精製処理を行うことができる。ビオチン以外の標識を用いる場合であっても、各々に適した公知の分離精製方法によって、目的のPCR産物を得ることができる。
【００６４】
PCR反応条件は、従来公知の方法（例えば〔Science130, 1350 (1985)〕等参照）に基づいて適宜設定することができる。本工程のPCR反応においてアニーリング温度は、RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーが機能できる上限値程度の温度を用いることが好ましい。ここで、PCR反応におけるアニーリングの温度は、好ましくは40〜60℃程度である。
【００６５】
(iv-3-2)工程(iv-3)は、前記(1v-3-1)に加え、前記RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマー、及び前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーからなるプライマーセットを使用して得られたPCR産物を鋳型として、２回目のPCR反応によりさらにPCR増幅を行う工程を含むものであってもよい。
【００６６】
前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーの設定は、上記(iv-3-1)に記載される通りである。また、RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーについては、当該RNA分子又はその断片の塩基配列に基づいて適宜設定することが可能であるが、２回目のPCR増幅においては5’末端から5〜20塩基程度の範囲内でプライマーを設定することが望ましい。
【００６７】
すなわち、図1(g)に示されるように、miRNA配列3'末端部分の配列は、miRNAを認識するプライマーには含めないことが好ましい。より具体的には、例えば22塩基のmiRNA（配列既知）のプライマーとして、上記(iv-3-1)に記載される１回目のPCR増幅においては、miRNAの5’末端より1〜14番目の配列に基づいてプライマーを設定し、PCR産物を得る。得られたPCR産物を鋳型とし、miRNAの5’末端より6〜19番目の配列に基づいて設定されたプライマーを用いて、２回目のPCR反応を行う。２回目のPCR反応によって得られたPCR産物が、miRNAをプライマーとした逆転写反応によって作製されたcDNAに由来するものであれば、使用したRNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーの配列の3’側に連結してmiRNAの5’末端より20〜22番目の既知の配列に基づいた配列が含まれているため、この配列を含まないクローンを偽陽性クローンとして排除することができる。このようにして２回目のPCR反応に用いられるプライマーを設定することによって、効率よく目的とするクローンを得ることができる。
【００６８】
また、必要に応じて、RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーの5’末端にさらに制限酵素認識配列（例えばNotI等）を付加してもよい。さらに、２回目のPCR反応においては、RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーとの間で長さを調整するため、前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーの5’末端側に1〜10塩基程度の任意の配列を付加してもよい。
【００６９】
PCR反応条件は、従来公知の方法（例えば〔Science130, 1350 (1985)〕等参照）に基づいて適宜設定することができる。本工程のPCR反応においてアニーリング温度は、RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマーが機能できる上限値程度の温度を用いることが好ましい。２回目のPCR反応におけるアニーリングの温度は、好ましくは50〜70℃程度である。
【００７０】
工程(iv-4)
工程(iv-4)においては、前記工程(iv-3)、好ましくは前記(iv-3-1)及び(iv-3-2)に記載される工程を経て得られたPCR産物の塩基配列を決定することにより、遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子が標的とする遺伝子を同定する。
【００７１】
塩基配列の決定は、従来公知の方法に従って行うことができる。すなわち、制限酵素によって得られたPCR産物を切断した後、ライゲーション反応によってベクターに結合させてクローンを作製し、その後ベクタープライマーを用いてPCR反応産物を得、サイクルシークエンス法等によって配列を決定することができる。
【００７２】
以上の工程(iv)によれば、RNA分子又はその断片が連結された配列に相補的な配列を含むPCR産物（クローン）を得ることができる。本工程においては、このPCR産物によって標的遺伝子の部分配列を知ることができ、この配列情報に基づいて遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子又はその断片の標的遺伝子を同定することができる。
【００７３】
2. 遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を同定するためのキット
本発明は、以下の遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を同定するためのキットをも提供するものである。
【００７４】
本発明のキットは、RISCに組み込まれた前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合しているRISC/mRNA複合体から、前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合により結合しているRNA分子/mRNA複合体を得るための試薬(A)を含むことを特徴とする。ここで、試薬(A)としては、上記1.工程(ii)に記載される界面活性剤、タンパク質分解酵素等を用いることができる。試薬(A)中の界面活性剤、タンパク質分解酵素等の濃度、溶媒等についても上記工程(ii)に記載される通りである。
【００７５】
また、本発明のキットは、前記RNA分子を含む細胞から、RISCに組み込まれた前記RNA分子又はその断片がmRNAに塩基対合によって結合しているRISC/mRNA複合体を抽出するための試薬(B)を含んでいてもよい。試薬(B)としては、工程(i)に記載されるホモジナイズの際に用いられる緩衝溶液を使用することができる。
【００７６】
さらに、前記RNA分子又はその断片をプライマーとして、前記mRNAを鋳型として逆転写反応を行うための試薬(C)を含んでいてもよい。試薬(C)としては、工程(iii)に記載される逆転写酵素、及び緩衝溶液を使用することができる。
【００７７】
さらに、本発明のキットは、制限酵素、PCR増幅のためのプライマーとして使用可能な配列を有するアダプターDNA、RNA分子又はその断片の塩基配列を認識するプライマー及び前記アダプターDNAの全配列又は部分配列からなるプライマーからなるプライマーセット、からなる群より選択される少なくとも１種を含むものであってもよい。制限酵素、アダプターDNA及びプライマーセットについては、上記工程(iv)に記載されるものを使用することができる。
【００７８】
本発明のキットには、上記1. に記載の遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子の標的遺伝子を同定する方法が記載されたプロトコル指示書が含まれていることが望ましい。
【００７９】
3. 適用
microRNAやsiRNA等の遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子は、医療分野での応用が期待されている。例えば、がん組織でのmiRNA発現研究では、種々のmiRNAの発現量が正常組織と異なることからがん形成の指標となることが示されており、これらmiRNAにより制御される遺伝子ががん化の原因であることが推測されている（例えばLu J, Getz et al., Nature 435, 834-8. (2005)を参照）。
【００８０】
また、マウスを用いた研究から、肝臓でのコレステロール合成にはmiRNA miR-122が関わっており、このmiRNAを抑制するため化学修飾された相補配列オリゴヌクレオチドを投与したところ、血中コレステロール値が90%低下したとの報告がある（例えばEsau C., et al., Cell Metab.3, 87-98. (2006)を参照）。
【００８１】
さらには、特定の遺伝子を発現抑制することによる疾病の治療をめざし、それら遺伝子の配列に働きかけうるmiRNAを人工合成し、投薬する方法も検討されている。このような医薬開発には、遺伝子発現抑制作用を有するRNA分子が、細胞内でどのmRNAにはたらきかけるのかを知ることが不可欠である。本発明の方法及びキットによれば、対象となるmRNAを効率的に同定することが可能である。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００８３】
方法
(1) 株
本実施例において用いられるシー・エレガンス株および変異対立遺伝子は、野生型Bristol N2、遺伝子変異株SP231[mnDp1(X;V)/+ V、 let-7 (mn112) unc-3(e151) X]及び遺伝子変異株MT7626[let-7 (n2853)X]である。
【００８４】
すべての虫の処理においては、標準的なシー・エレガンスの培養および取り扱い技術を用いた（例えばSulston, J., et al., pp. 587-606. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1988)を参照；本文件には後述のアルカリ性次亜塩素酸方、ショ糖浮遊法も記載されている）。let-7 (n2853)対立遺伝子を有する虫については許容温度15℃および制限温度20℃で成長させ、それ以外の虫については20℃で成長させた。
【００８５】
(2) 目的のmiRNAの標的を同定するためのcDNAクローンの単離
N2卵をアルカリ性次亜塩素酸法(alkaline hypochlorite procedure)により回収した。卵を大腸菌（E. coli）株OP50を含有するS培地内で24時間、36時間、48時間、および60時間培養し、それぞれL2（幼虫第2）期、L3（幼虫第3）期、L4（幼虫第4）期および若年成体期に虫を採取した。虫をショ糖浮遊法により洗浄し、ホモジナイザーを用いてPARIS(Ambion)の10容量の細胞分画用緩衝液中でホモジナイズした。抽出物を20,000×gで5分間遠心し、細胞残渣および核を沈殿させた。この操作によって、RISC/mRNA複合体を含む細胞質抽出液を得た。＜以上、工程(i)に相当＞
【００８６】
遠心分離によって得られた上清を0.1容量の10%SDSと混合し、氷上で1分間保冷した。この操作によってRNA分子/mRNA複合体を得た。＜以上、工程(ii)に相当＞
【００８７】
処理された上清を200容量の予備冷却した逆転写反応緩衝液(1×第1鎖合成用緩衝液(Invitrogen)、10mM DTT、50ng/μlアクチノマイシンD、0.5mM dNTP、1U/μl RNasin Plus Ribonuclease Inhibitor (Promega)、5 U/μl Superscript III (Invitrogen))中で保温し、miRNAをプライマーとして用いて、mRNAの部分塩基配列が逆転写されたDNAにmiRNA（RNA分子に相当）が連結されたRNA-DNA分子を合成した。＜以上、工程(iii)に相当＞
【００８８】
アクチノマイシンDを緩衝液に入れ、この反応中での第2鎖cDNAの合成を阻止した。反応温度をまず10分かけて4℃から37℃へと徐々に上昇させ、次いで37℃で60分間保持した。反応緩衝液を0.02容量の10% SDSと混合し、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1、pH9.5)で抽出した。緩衝液中のポリヌクレオチドをエタノール沈降により回収し、反応緩衝液(1×逆転写用緩衝液（Promega）、1mM MnCl2、0.2mM dNTP、1 U/μl RNasin Plus Ribonuclease Inhibitor、0.2U/μl Tth DNAポリメラーゼ（Promega）)中で、25℃で10分間のインキュベート後、70℃で30分間インキュベートし、RNA/DNA分子に対して相補的なDNAを合成した。＜以上、工程(iv-1)に相当＞
【００８９】
RNA/DNA分子とその相補的なDNAが塩基対合した二重鎖DNAをPCR精製キット(Qiagen)で精製し、制限酵素により消化した。lin-4 miRNAを対象とする実験では、制限酵素はHaeII (Promega)を用いた。let-7 miRNAを対象とする実験では、NlaIII (NEB)またはTaiI (Fermentas)のいずれかを使用した。NlaIIIおよびTaiI制限酵素がA、T、GおよびCからなる4ヌクレオチドの配列を認識することから、大部分のlet-7標的遺伝子が制限酵素の少なくとも1つの認識部位を有することが想定された。消化されたcDNA断片をアダプターDNAにライゲーションした。＜以上、工程(iv-2)に相当＞
【００９０】
アダプターDNAの塩基配列に由来するプライマー（アダプターPCRプライマー）、及びmiRNAの部分配列に対応するビオチン標識されたmiRNA PCRプライマーを用いてPCR反応により増幅した。
【００９１】
PCR条件は、熱変成（94℃、12秒）、プライマーアニーリング（12秒）、DNA伸長（72℃、2分）、反応サイクル数（30）であった。また、使用した酵素は、Ex Taq（タカラバイオ（株））であり、反応緩衝液は該酵素に添付のものを用いた。反応液量を100 μlとした。
【００９２】
lin-4およびlet-7のmiRNA PCRプライマーにおけるプライマーアニーリング温度はそれぞれ55℃および48℃であり、それらはシー・エレガンスゲノムDNAのmiRNA遺伝子を増幅可能な最高温度として実験的に決定されたものである。ここでのPCR条件は、熱変成（94℃、12秒）、プライマーアニーリング（12秒）、DNA伸長（72℃、2分）、反応サイクル数（30）であった。また、使用した酵素は、Ex Taq（タカラバイオ（株））であり、反応緩衝液は該酵素に添付のものを用いた。反応液量を20 μlとした。また、鋳型として10 ngのシー・エレガンスゲノムDNAを用いた。プライマーアニーリング温度は、40〜60℃の範囲を調べた。ビオチン標識されたPCR断片をSoftLink Soft Release Avidin Resin (Promega)への結合により回収した。＜以上、前記(iv-3-1)に記載の工程に相当＞
【００９３】
回収されたPCR断片の一定分量を、より長いアダプターDNAの塩基配列を認識するPCRプライマーおよびNotI認識配列を有するネステッドmiRNA PCRプライマーを用いた2回目PCRにより増幅した。ここでのPCR条件は、熱変成（94℃、12秒）、プライマーアニーリング（60℃、12秒）、DNA伸長（72℃、2分）、反応サイクル数（30）であった。また、使用した酵素は、Ex Taq（タカラバイオ（株））であり、反応緩衝液は該酵素に添付のものを用いた。反応液量を100μlとした。＜以上、前記(iv-3-2)に記載の工程に相当＞
【００９４】
PCR断片をNotI制限酵素およびアダプターDNAのライゲーションに用いた制限酵素と同じものにより消化し、制限酵素BbeI、SphI、およびAatIIの認識配列がPstI認識部位内に挿入されたpBluescript II KS+(Stratagene)の改変ベクターにクローニングした。
【００９５】
lin-4 miRNAを対象とする実験を、L2期である発生期から得られる試料とHaeII制限酵素の組み合わせにて、全34回実施した。
【００９６】
let-7 miRNAを対象とする実験を、L3期、L4期および若年成体期である3つの発生期から得られる試料と2種の制限酵素からの組み合わせ全6通りで実施した。L4期の試料とNlaIIIを組み合わせた実験のみ2回行った。各々よりcDNAライブラリーを作製して、各cDNAライブラリーから96個のコロニーを無作為に選択した。各クローンのインサートDNAを、ベクタープライマーを用いるコロニーPCRにより増幅した。
【００９７】
鋳型は、コロニーより一部の大腸菌を水50 μlに入れて、99℃で5分保温した液を用い、この1 μlをPCR反応液19 μlに添加した（反応液量20 μl）。PCR条件は、熱変成（94℃、12秒）、プライマーアニーリング（55℃、12秒）、DNA伸長（72℃、2分）、反応サイクル数（30）であった。また、使用した酵素は、Ex Taq（タカラバイオ（株））であり、反応緩衝液は該酵素に添付のものを用た。PCR断片の配列をNotI部位近傍のベクタープライマーを用いて、ABI3730(Applied Biosystems)を使用するサイクル配列決定法により決定した。＜以上、工程(iv-4)に相当＞
【００９８】
アダプターDNAおよびPCRプライマーの塩基配列は下記表1中に示される。なお、配列番号１、２及び３に示されるプライマーは工程(iv-2)；配列番号１、２、３、７及び８に示されるプライマーは工程(iv-3-1)；配列番号４、５、６、９及び１０に示されるプライマーは、工程(iv-3-2)；ならびに配列番号１１及び１２に示されるプライマーは工程(iv-4)においてそれぞれ使用した。ここで、配列番号１、２及び３に示される各プライマーは、アダプターDNAと１回目PCRのプライマーを兼ねていることから、工程(iv-2)及び工程(iv-3-1)の両方で使用した。また、配列番号１３に示されるlin-4に相補的な2’-O-メチルオリゴヌクレオチド配列は、下記結果及び考察（１）に記載の「対象miRNAと相補する配列のオリゴヌクレオチド」を示すものである。
【００９９】
【表１】
2009254288.tif 000002
【０１００】
なお、lin-4miRNA及びlet-7miRNAの塩基配列は、下記配列番号１４及び１５にそれぞれ示される通りである。なお、let-7 miRNAの3’末端はGUUのものが多いが、GUで終わっているものも１割程度含まれることが知られている。
lin-4 miRNA   UCCCUGAGACCUCAAGUGUGA（配列番号１４）
let-7 miRNA   UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGU(U)（配列番号１５）
(3) let-7変異体の抑制を対象とするRNAi試験
二本鎖RNA（dsRNA）試料は、cDNAクローンから作製した（Andachi, Y. Genes Cells 9, 331-344 (2004)を参照）。
【０１０１】
インジェクションRNAiにおいては、mnDp1(X;V)に対してヘテロ接合体である株SP231の成熟成虫に、dsRNAを注入した。Unc-3表現型によって区別可能な遺伝子型let-7 (mn112)unc-3(e151)F1子孫の約50匹の虫を別のNGMプレートに移し、成虫となってからの多数受精卵産生能についてスコアリングした。
【０１０２】
ソーキングRNAiにおいては、株SP231のL1虫を、上記と同様にcDNAクローンから生成した二本鎖RNAを含有する緩衝液中に24時間浸漬し（Maeda, I., Kohara, Y., Yamamoto, M. & Sugimoto, A. Curr Biol 11, 171-176 (2001)を参照）、次いでNGMプレート上にて24時間培養した。Unc-3表現型を示すSP231株の幼虫を、インジェクションRNAiにて用いられる方法と同じ方法によりスコアリングした。
【０１０３】
(4) cDNA、プラスミドコンストラクト、および形質転換体
cDNAクローンおよびそれらの配列を大規模なシー・エレガンスcDNAプロジェクトから入手した（Kohara, Y. NEXTDB (The Nematode Expression Pattern DataBase). http://nematode.lab.nig.ac.jp/ (2001)を参照）。試験遺伝子のプロモーター領域、コード領域、および3'UTR領域をシー・エレガンスゲノムDNAからPCRにより増幅した。PCRプライマー配列は下記表2に示される。
【０１０４】
GFPおよびlacZのコーディング配列は、それぞれFireベクターのpPD95.79およびpPD95.07から得た。PCR断片を連結し、3つの遺伝子領域の適切な配列を有するプラスミドコンストラクトを生成し、すべてのプラスミドコンストラクトにおける配列を検証した。
【０１０５】
【表２】
2009254288.tif 000003
【０１０６】
各プラスミドを、同一遺伝子由来のプロモーター領域、GFPコード領域、およびunc-54 3'UTR領域からなるマーカープラスミドと混合した。プラスミド混合物をN2株成虫の生殖腺に注入し、遺伝子導入株を作製した。
【０１０７】
注入に用いられるプラスミドの濃度は表3に示される。虫の写真はNomarski顕微鏡Axioplan2(Zeiss)または共焦点レーザー走査顕微鏡LMS510(Zeiss)で撮られたものである。
【０１０８】
【表３】
2009254288.tif 000004
【０１０９】
(5) X-gal染色におけるスコアリング
単一のlacZ発現プラスミドを有する遺伝子導入株の成虫をNGMプレートに移し、F1子孫の多数の虫がL4期および若年成体期に成長するまで培養した。プレート上のすべての虫を採取し、M9緩衝液で洗浄した。虫を緩衝液（80mMヘペス(pH6.9)、140mM NaCl、30mM KCl、40mM Na2HPO4、15mM KH2PO4、1.6mM MgSO4、0.8mM EGTA、3.7%ホルムアルデヒド）中に28℃で1時間保温し固定した。凍結乾燥およびアセトン透過化処理の後、虫を緩衝液（17mM NaH2PO4、83mM Na2HPO4、2mM MgCl2、5 mM K4Fe(CN)6、5 mM K3Fe(CN)6、0.005% SDS、0.024% X-gal）中、37℃で2時間染色した。野生型において分析された同じK10C3.4prom::lacZ::K10C3.4UTR遺伝子導入株に対し、MT7626株との掛け合わせによりlet-7 (n2853)遺伝子変異を持つ遺伝子導入株を作製し、この株を分析した。各虫におけるGFP蛍光およびX-gal染色の双方をNomarski顕微鏡で観察した。
【０１１０】
結果及び考察
(1)miRNA lin-4およびその標的遺伝子lin-14はすべてのmiRNAと標的遺伝子の組み合わせの中で最初に発見されたものであり、lin-14 3'UTRは７つのlin-4結合部位を有する。lin-4標的遺伝子を同定するために単離され、配列決定された全てのクローンにおけるlin-14 3'UTRクローンの割合を、量的指標として用いた。
【０１１１】
本発明の方法は、lin-14 3'UTRクローンを単離するのに有利である2つの条件下で評価された。すなわち、第1に、細胞抽出物はlin-4 miRNAが蓄積する第2幼虫（L2）期に同調したシー・エレガンス集団から調製された。第2に、lin-4結合部位の5'側に位置する認識配列を有するHaeII制限酵素（図２を参照）を使用した。本発明の方法を評価するため、多数の試験条件下でcDNAライブラリーを調製し、ライブラリーから無作為に採取した96個のクローンを分析した。
【０１１２】
試験条件の一つは、細胞からの抽出後に遊離したmiRNAの発現抑制と無関係なmRNAへの塩基対合が、高頻度に起こっているのかを調べるものである。この様な遊離miRNAは、逆転写反応時およびそれ以前に、RICSや標的mRNAからの解離によって生じる可能性がある。遊離miRNAの結合による発現抑制と無関係なmRNAの逆転写は、疑陽性cDNAクローンの増加をもたらし、96クローン中に含まれるlin-14 3'UTRクローン割合の低下となって示される。
【０１１３】
そこで、この様な遊離miRNAが、発現抑制と無関係なmRNAに結合するのを防ぐ目的で、対象miRNAと相補する配列のオリゴヌクレオチド（配列番号１３に示されるオリゴヌクレオチド）を抽出液へ多量に加えた。遊離miRNAは、このオリゴヌクレオチドと優先的に結合すると考えられ、結果として発現抑制と無関係なmRNAへの結合を抑制することが期待される。しかしながら、この試験条件での結果は、オリゴヌクレオチドを加えない試験条件での結果とほぼ同じであったことから、遊離miRNAによる発現抑制と無関係なmRNAへの結合はほとんど起こっていないと推測された。それゆえ、オリゴヌクレオチドの抽出液への添加は、本試験例においては採用しなかった。
【０１１４】
様々な試験条件を採用してcDNAライブラリーの作製を行い、lin-14 3'UTRクローンの含まれる頻度を指標に最適条件の設定を試みた。その結果、本発明の方法によって行った実験では、lin-14 3'UTRクローン比率の高い上位10回の実験結果において、得られるlin-14 3'UTRクローンの平均頻度が73.8%に達した。従って、本発明の方法が標的クローンを単離するのに極めて効率的であることが示された。
【０１１５】
lin-4 miRNAを対象とする実験は34回行い、lin-14 3'UTRの部分配列からなる1,451個のクローンが単離された（図2）。3'UTRを有するクローンの配列をlin-14 3'UTR配列にアラインメントすると、多数のクローンにおいて各クローンの3'末端が、lin-4結合部位のいずれか１つの5'側近傍に位置し、かつ、７番目のlin-4結合部位より3’側の配列を含むlin-14 3'UTRクローンは全く無かったことから、本発明の方法が極めて特異的に標的クローンを単離できる方法であることが示された。
【０１１６】
(2) 本発明者らは、発生過程において多面的機能を有する別のC. elegans miRNA、let-7の新規標的遺伝子の同定を試みることによって本方法をさらに評価した。
【０１１７】
let-7変異体は、L4から成体への移行時に側面表皮細胞の分裂パターンに発生後期シフト型の異時性変異を示し、かつ成体期に１回余分の脱皮を行う。完全機能欠損変異let-7(mn112)に対してホモ接合性であるすべての虫は、若年成体期に陰門部分の破れによる致死となる結果、受精卵を産生する個体は極まれにしかいない。let-7はL3及びL3よりも後期に発現する。lin-41、let-60およびdaf-12を含む数種類の遺伝子がlet-7の標的遺伝子であることが同定されているが、これらの遺伝子の変異が、let-7変異体の陰門破れによる致死表現型を部分的に抑制するにすぎないことから、致死性の表現型に関与する他の遺伝子が同定されないままであることが示唆される。
【０１１８】
そこで本発明者は、let-7変異体におけるL3、L4期および若年成体期のサンプルを用いて、致死表現型を担う新たなlet-7標的遺伝子を探索した。上記(2)に記載される方法に従って672個のクローンを単離し、その配列分析より、162個のクローンがlet-7 miRNA配列を有し、それらクローンが75個の遺伝子に対応することを見出した。
【０１１９】
得られた遺伝子において、let-7結合部位の存在はlet-7標的遺伝子である可能性を高めるものであることから、遺伝子の各々においてクローン化された配列の3'側に隣接する50ヌクレオチドの範囲に存在するlet-7種配列に相補的な配列を探した。その結果、相補配列は11個の遺伝子に含まれることが確認された。また、G/U塩基対がmiRNA結合部位内で許容されることが報告されていることから、G/Uゆらぎ塩基対を含めた場合、他に15個の遺伝子に存在することが確認された。
【０１２０】
クローン配列の遺伝子配列とのアラインメントにより、クローン配列の3'末端が40個の遺伝子においては3'UTR内または停止コドン上のいずれかに位置することも示され、それらを標的遺伝子の一次候補として選択した。
【０１２１】
候補遺伝子の活性の低下により既知のlet-7標的遺伝子の場合と同様に陰門破れ致死表現型が抑圧できるか否かを調べるため、40個の各遺伝子について、let-7 (mn112) の虫に対し、上記(3)の方法に従ってRNAiを施した。致死性の部分的抑圧は多数の受精卵の生成によって確認され、これは5個の遺伝子について観察された。
【０１２２】
3'UTRを介する調節を伴わない5個の各遺伝子の発現によりlet-7変異体と同様の異常が誘発されることを確認するため、プロモーターとともに各遺伝子のコード領域を有するゲノムDNAをクローニングし、発現調節を担っていないと考えられているunc-54ミオシン遺伝子3'UTRとつないだコンストラクトを作製した。先の5遺伝子のうちの1つであるK10C3.4においては、そのコンストラクトを有する遺伝子導入株の相当数個体が陰門の破れ表現型を示した（図５）。なお、トランスジェニック個体は、上記(5)の方法に従って得たものである。
【０１２３】
K10C3.4の3’UTRの全長配列は下記配列番号５２に示される。配列番号５２において第528〜534番目の塩基配列は、let-7種配列に相補的な配列である。配列番号５３は、工程(iv)で得られたK10C3.4遺伝子のクローン配列を示す。配列番号５３において第101〜116番目の塩基配列は、let-7配列の部分配列に基ずく配列である。また、K10C3.4クローンには、配列番号５２において第381〜488番目の塩基配列に相当する部分が含まれていた。配列番号５３において、K10C3.4のクローン配列の第117〜224番目の塩基配列は、前記配列番号５２において示されるK10C3.4クローンに含まれる塩基配列（すなわち相補鎖配列）に相当する。なお、このクローンの第221〜224番目にあるTaiI制限酵素の認識配列以降には、第225〜592番目にリボソームRNA由来の配列が結合しておりキメラクローンであることが示されたが、制限酵素Tai Iの認識配列により容易に分離することができた。
【０１２４】
【表４−１】
2009254288.tif 000005
【０１２５】
【表４−２】
2009254288.tif 000006
【０１２６】
K10C3.4遺伝子は、大規模なシー・エレガンスcDNAプロジェクトにより得られたK10C3.4 cDNAクローンの構造から推定される2つのプロモーターを有し、それら双方は5'末端にトランス-スプライシングリーダーSL1を有する（図3a）。K10C3.4コード領域の上流の8.6-kbのゲノムDNAを有するGFPレポーターの発現が胚期に開始し、発現はL4期に陰門細胞、側面表皮細胞、生殖腺遠端細胞（distal tip cells）、咽頭、直腸上皮細胞、およびいくつかの神経細胞において観察された（図3b）。これら組織の内で、let-7プロモーターによるGFPレポーターの発現は、後期幼虫期には陰門細胞および側面表皮細胞で、成虫期には生殖腺遠端細胞内で観察されている。K10C3.4が発現される組織の内で、上流プロモーターによる発現は咽頭に限られる（図3c）。一方、大部分の組織での発現が下流プロモーターによることが示された（図3d）。
【０１２７】
C. eleganceと系統発生的に近縁な線虫C. briggsaeおよびC. remaneiは、K10C3.4の相同遺伝子を有し、さらに脊椎動物で高度に保存されたTransmembrane protein 98という同じ名称を共有する遺伝子に対しても相同性を示す（図3g）。これらの遺伝子の機能は未知であるが、それらはN末端に保存された膜貫通ドメインを有する。実際に、K10C3.4タンパク質のC末端でのGFP融合タンパク質の細胞内局在を調べたところ、細胞膜への局在化が観察された（図3e、f）。線虫双方の相同遺伝子には3'UTR内にlet-7種配列と相補的な配列を保存している（図3h）。なお、トランスジェニック個体は、上記(5)の方法に従って得たものである。
【０１２８】
K10C3.4 3'UTRが遺伝子の抑制を媒介するか否かを検証するため、本発明者らは、レポーターコンストラクトK10C3.4prom:: lacZ::K10C3.4UTRからの発現を別のレポーターコンストラクトK10C3.4prom::lacZ:: unc-54UTRの発現と比較した。上記(4)の方法に従って各コンストラクトと、マーカーコンストラクトK10C3.4prom::GFP:: unc-54UTRとを混合した遺伝子導入株を作製し、上記(5)の方法に従ってこの株の虫をX-galで染色した。
【０１２９】
細胞内でのGFP蛍光がレポーターおよびマーカーコンストラクト双方のこの細胞への伝達を示すことから、L4期および若年成体期における蛍光を示す細胞に対し、特に側面表皮細胞でのX-gal染色についてスコアリングした。LacZの発現はK10C3.4prom::lacZ::unc-54UTR遺伝子導入株の大部分の虫で確認された（図4a、b）。一方、lacZの発現は、K10C3.4prom::lacZ::K10C3.4UTR遺伝子導入株の大部分の虫では抑圧された。しかしながら、これら虫においても、その多数ではいくつかの頭部および尾部の同定されていない細胞でlacZの発現が確認された（図4c-e）。
【０１３０】
抑圧がlet-7 miRNAに依存するか否かを判定するため、温度感受性変異let-7 (n2853)の遺伝的バックグラウンドで、同じK10C3.4prom::lacZ::K10C3.4UTR系の虫におけるX-gal染色についてスコアリングしたところ、抑圧は制限温度で部分的に軽減された（図4e；Genotype let-7に相当）
これらの結果は、let-7 miRNAが3'UTRを介してK10C3.4の発現を抑圧することを示すものである。
【０１３１】
遺伝子発現の3'UTRを介する抑圧により、K10C3.4prom::K10C3.4::unc-54UTRの発現によって誘発される陰門部破れ表現型も抑圧されることについて試験するため、K10C3.4prom::K10C3.4::K10C3.4UTR遺伝子導入株の虫における陰門部破れ表現型についてスコアリングした。陰門部破れ表現型は、若年成体期（図4f）および妊娠-成体期（図4g）という2つの分離可能な成体期に生じる。両方の成体期での陰門部破れを示す頻度は、K10C3.4prom::K10C3.4::unc-54UTR遺伝子導入株と比較すると、K10C3.4prom::K10C3.4::K10C3.4UTR遺伝子導入株では有意に低下した（図4j）。let-7(mn112)における陰門部破れ表現型もRNAiによりK10C3.4産物を枯渇させると抑圧されるが（図4h、I）、この抑圧の再現性はgfp（RNAi）を対照実験として確認された（図4k）。
【０１３２】
K10C3.4遺伝子に対するRNAiを受けた野生型の成虫は、卵の産卵能を有することから（データは示さず）、RNAi抑圧が陰門の発生における異常に起因した可能性は低い。let-7 (mn112);K10C3.4(RNAi)の虫が若年成体期を生き延びても（図4h）、ほぼすべての虫が多数の受精卵の産生後に産卵することなく陰門部破れ表現型を示す結果となることから（図4i）、K10C3.4の機能は、陰門発生における初期段階において必要であることが示唆される。以上より、K10C3.4は陰門部破れ致死表現型に関わるlet-7標的遺伝子の一つであることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】図１は、内因性miRNAと塩基対を形成するmRNAのcDNAクローンを単離する方法の概略図を示す。(a)本発明の方法を段階的に示す図である。図中、DNAを太字で示している。(b)miRNAをプライマーとして用いた逆転写反応によりcDNA合成で得られたクローンの構造を示す。mRNA配列の5’から3’方向及びmiRNA配列の方向を矢印で示す。
【図２】図２は、lin-4標的を同定するために単離されたlin-14 3’UTRクローンを示す。最上段のlin-14 3’UTRの概略図において、HaeII認識部位を矢印で示し、lin-4結合部位を三角印で示す。lin-14 3’UTRの部分配列において、lin-4結合部位を長方形で囲んで示す。クローニングされた配列の3’末端を水平な矢印で示す。数字は、矢印に対応する少なくとも１つのクローンが単離された実験の数を示し、クローンの総数は括弧内に示される。lin-14 3’UTRクローンは、図に示されているもの以外は単離されなかった。
【図３】K10C3.4遺伝子、発現及び相同遺伝子を示す。(a)においてコード領域を四角、UTRを黒く塗りつぶした四角で示す。(b)〜(d)は、全プロモーター(b)、上流プロモーター(c)及び下流プロモーター(d)を含むGFPコンストラクトの発現を示す。(e)〜(f)は、陰門細胞(e)、及び側面表皮細胞 (f)におけるGFP融合タンパク質の局在を示す。虫は全てL4段階であり、左が前である。(g)は相同遺伝子間のアミノ酸相同性を示す。CeはC. elegans；CbはC. briggsae；CrはC. remanei；HsはHomo sapiensのTransmembrane protein 98を示す。膜貫通ドメインは黒で示される。(h)は、3’UTR配列のアラインメントを示す。let-7種配列に相補的な保存された配列は長方形で囲んで示される。保存されていない部分相補配列は、小さい点線の長方形で囲んで示される。矢印は、クローン配列の3’末端を示す。
【図４】図４は、K10C3.4の発現抑制、及びlet-7の陰門部破れ表現型におけるK10C3.4の関与を示す。(a)〜(d)は、unc-54 3’UTR(a,b)及びK10C3.4 3’UTR (c,d)を含むLacZコンストラクトの発現を示す。写真は、GFP蛍光像(a,c)及び明視野像(b,d)を表す。両方の虫ともにL4段階であり、左側が前である。(d)では、頭及び尾のいくつかの細胞を除いて、LacZ発現が抑圧されている。(e)は、遺伝子導入８株（各系20匹以上の虫）を対象とした、LacZ発現の頻度を示す。(f)〜(i)は、unc-54 3’UTRを含むK10C3.4遺伝子導入株における若年成体期(f)及び(g)妊娠-成体期、ならびにlet-7(mn112)unc-3(e151)(h)及びlet-7(mn112)unc-3(e151); K10C3.4(RNAi) (i)での、陰門部破れを示す。多数の受精卵が(i)においては観察される。(j)は、遺伝子導入８株（各株100匹以上の虫）を対象とした、K10C3.4遺伝子導入株での陰門部破れの頻度を示す。(k)は、５回の独立なRNAi試験（各試験100匹以上の虫）を対象とした、let-7(mn112)unc-3(e151)遺伝子型虫の若年成体期における生存率を示す。棒線は平均±標準偏差を表し、両側Student-t検定を用いて有意差を示した(e,j,k)。
【図５】図５は、3’UTRによる遺伝子発現制御を伴わない各遺伝子の発現によって引き起こされる陰門部破れを表す。(a)プロモーターと共に各遺伝子のコード領域を含むゲノムDNAは、unc-54遺伝子の3’UTRを含むコンストラクトを作製するためにクローニングされた。(b)遺伝子導入２株（各株100匹以上の虫）間での陰門部破れの頻度を表す。
【配列表フリーテキスト】
【０１３４】
配列番号１は、HaeIIに対するアダプターDNA及びPCRプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２は、NlaIIIに対するアダプターDNA及びPCRプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３は、TaiIに対するアダプターDNA及びPCRプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４は、HaeIIに対するより長いアダプターDNA及びPCRプライマーの塩基配列を示す。
配列番号５は、NlaIIIに対するより長いアダプターDNA及びPCRプライマーの塩基配列を示す。
配列番号６は、TaiIに対するより長いアダプターDNA及びPCRプライマーの塩基配列を示す。
配列番号７は、lin-4 miRNA PCRプライマーの塩基配列を示す。
配列番号８は、let-7 miRNA PCRプライマーの塩基配列を示す。
配列番号９は、ネステッドlin-4 miRNA PCRプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１０は、ネステッドlet-7 miRNA PCRプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１１は、pBluescript vector PCRプライマー１の塩基配列を示す。
配列番号１２は、pBluescript vector PCRプライマー２の塩基配列を示す。
配列番号１３は、lim-4に相補的な2’-O-メチルオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
配列番号１４は、lin-4 miRNAの塩基配列を示す。
配列番号１５は、let-7 miRNAの塩基配列を示す。
配列番号１６は、pdi-2遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号１７は、pdi-2遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号１８は、pdi-2遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号１９は、pdi-2遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号２０は、sqt-3遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号２１は、sqt-3遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号２２は、sqt-3遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号２３は、sqt-3遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号２４は、ubc-25遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号２５は、ubc-25遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号２６は、ubc-25遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号２７は、ubc-25遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号２８は、pqn-47遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号２９は、pqn-47遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号３０は、pqn-47遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号３１は、pqn-47遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号３２は、K10C3.4遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号３３は、K10C3.4遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号３４は、K10C3.4遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号３５は、K10C3.4遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号３６は、K10C3.4遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号３７は、K10C3.4遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号３８は、K10C3.4遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号３９は、K10C3.4遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号４０は、K10C3.4遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号４１は、K10C3.4遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号４２は、K10C3.4遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号４３は、K10C3.4遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号４４は、K10C3.4遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号４５は、K10C3.4遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号４６は、GFP遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号４７は、GFP遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号４８は、lacZ遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号４９は、lacZ遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号５０は、unc-54遺伝子に対するフォワードPCRプライマーを示す。
配列番号５１は、unc-54遺伝子に対するリバースPCRプライマーを示す。
配列番号５２は、K10C3.4の3’UTRの全長DNA配列配列を示す。
配列番号５３は、工程(iv)で得られたK10C3.4のクローン配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2009254288.tif 000010
【図５】
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【配列表】
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