(57)【要約】      （修正有）【課題】モルヒネ等の両作用性オピオイド作用物質の鎮痛作用を選択的に増強し、同時に、両作用性オピオイド作用物質の継続的使用時にみられる身体的依存性、耐性、その他の副作用を軽減するための方法を提供する。【解決手段】神経系の侵害受容（痛覚）経路の抑制性および興奮性オピオイド受容体調節機能を活性化する両作用性オピオイド作用物質と、興奮性オピオイド受容体調節副作用を選択的に不活化するオピオイド受容体拮抗物質とを共に投与する。また、慢性的疼痛の際に顕著に増大する内因性両作用性オピオイド作用物質の興奮性副作用をブロックするために、興奮性オピオイド受容体拮抗物質のみを用いる方法。さらに、興奮性オピオイド受容体拮抗物質および両作用性オピオイド作用物質を含む組成物。【選択図】図１
2009062376.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎮痛用医薬品の製造のための、両作用性オピオイド作用物質および興奮性オピオイド受容体拮抗物質の使用において、前記医薬品が、両作用性オピオイド作用物質および興奮性オピオイド受容体拮抗物質を含み、前記興奮性オピオイド受容体拮抗物質の量が、前記両作用性オピオイド作用物質の量の１００〜１０００分の１であり、前記興奮性オピオイド受容体拮抗物質が、ナロキソンもしくはナルトレキソンであり、前記医薬品が、前記作用物質単独に比べて増強された鎮痛効果を持つ、使用。
【請求項２】
前記両作用性オピオイド作用物質が、モルヒネ、コデイン、フェンタニール、ペンタゾシン、ブプレノルフィン、メサドン、ＤＡＧＯ、Ｄ−ａｌａ２−ｌｅｕ５−enkephalin（ＤＡＤＬＥ）、エンケファリン、ジノルフィン、もしくはエンドルフィンである、請求の範囲第１項に記載の使用。
【請求項３】
前記興奮性オピオイド受容体拮抗物質が、ナルトレキソンである、請求の範囲第１項もしくは第２項に記載の使用。
【請求項４】
前記興奮性オピオイド受容体拮抗物質が、ナロキソンである、請求の範囲第１項もしくは第２項に記載の使用。
【請求項５】
前記量の前記興奮性オピオイド受容体拮抗物質が、前記両作用性オピオイド作用物質の所望されない興奮性の副作用を減ずる、請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記所望されない興奮性の副作用が、身体的依存性である、請求の範囲第５項に記載の使用。
【請求項７】
前記所望されない興奮性の副作用が、耐性である、請求の範囲第５項に記載の使用。
【請求項８】
前記量の前記興奮性オピオイド受容体拮抗物質が、前記量の前記両作用性オピオイド作用物質の１０６分の１までである、請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記医薬品が、継続的投与用である、請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬品が、舌下、筋注、皮下注、もしくは静注用である、請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記医薬品が、経口投与用である、請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
鎮痛用組成物であって、両作用性オピオイド作用物質および興奮性オピオイド受容体拮抗物質を含み、前記興奮性オピオイド受容体拮抗物質の量が、前記両作用性オピオイド作用物質の量の１００〜１０００分の１であり、前記興奮性オピオイド受容体拮抗物質が、ナロキソンもしくはナルトレキソンであり、前記組成物が、前記作用物質単独に比べて増強された鎮痛効果を持つ、組成物。
【請求項１３】
前記両作用性オピオイド作用物質が、モルヒネ、コデイン、フェンタニール、ペンタゾシン、ブプレノルフィン、メサドン、ＤＡＧＯ、Ｄ−ａｌａ２−ｌｅｕ５−enkephalin（ＤＡＤＬＥ）、エンケファリン、ジノルフィン、もしくはエンドルフィンである、請求の範囲第１２項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記興奮性オピオイド受容体拮抗物質が、ナルトレキソンである、請求の範囲第１２項もしくは第１３項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記興奮性オピオイド受容体拮抗物質が、ナロキソンである、請求の範囲第１２項もしくは第１３項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記量の前記興奮性オピオイド受容体拮抗物質が、前記両作用性オピオイド作用物質の所望されない興奮性の副作用を減ずる、請求の範囲第１２項〜第１５項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記所望されない興奮性の副作用が、身体的依存性である、請求の範囲第１６項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記所望されない興奮性の副作用が、耐性である、請求の範囲第１６項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記興奮性オピオイド受容体拮抗物質の量が、前記両作用性オピオイド作用物質の量の１０６分の１までである、請求の範囲第１２項〜第１８項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、継続的投与用である、請求の範囲第１２項〜第１９項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、舌下、筋注、皮下注、もしくは静注用である、請求の範囲第１２項〜第２０項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、経口投与用である、請求の範囲第１２項〜第２０項のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明に対する行政当局との関係
本発明は行政当局すなわち米国国立薬物中毒研究所（NIDA）から研究補助（No．DA 02031）を得て行った。従って、本発明に関しては当行政当局も部分的権利を保有する。
【０００２】
関連する出願のクロスリファレンス
本発明は、1993年７月27日に出願され現在係属中である「モルヒネその他のオピオイド作用物質による鎮痛効果増強および依存性低減の同時達成方法」出願番号08/097,460号の一部継続出願である。上記の08/097,460号は、1992年９月19日に出願され現在係属中である「非嗜癖性オピオイド鎮痛剤同定の方法、およびオピオイド嗜癖に対する治療を目的とした非嗜癖性オピオイド鎮痛剤の応用」の一部継続出願である。
【０００３】
本発明は、モルヒネ、コデインなど臨床応用されているオピオイド鎮痛剤を含む両作用（興奮および抑制）性オピオイド作用物質の鎮痛（抑制）作用を増強し、同時に、両作用性オピオイド作用物質の継続的使用時に通常みられる坑鎮痛効果、身体的依存性、耐性、過興奮性、痛覚過敏性その他（興奮性）副作用を軽減するための方法に関するものである。本明細書で用いた用語「オピオイド」は、特異的オピオイド受容体と結合し、その部位において作用（活性化）または拮抗（不活化）する化合物、すなわち作用物質であるモルヒネ、及び拮抗物質であるナロキソン等のオピオイドアルカロイド、又はエンケファリン、ジノルフィン及びエンドルフィン等のオピオイドペプタイド等を意味する用語である。また本明細書で用いた用語「オピエート」は、アヘン又はその類似体から誘導された薬物を意味する。
【０００４】
本発明において、オピオイド受容体に選択的に作用するある拮抗物質のごく少量と、従来より低用量で使用されていた両作用性オピオイド作用物質とを併用することにより、鎮痛（抑制）効果を促進し、同時に副作用（興奮作用）を軽減することが可能となる。オピオイドによる鎮痛作用は、末梢および中枢神経系の侵害受容（痛覚）経路に存在するニューロンの抑制性オピオイド受容体が（オピオイド作用物質により）刺激される結果発現する。一方、坑鎮痛作用、過興奮性、痛覚過敏性、身体的依存性、その他ある種の耐性などの副作用は、末梢および中枢神経系の侵害受容（痛覚）経路に存在するニューロンの興奮性オピオイド受容体が（両作用性オピオイド作用物質により）継続的に刺激ことにより発現する。
【０００５】
さらに本発明において、興奮性オピオイド受容体拮抗物質の微量を単独、または既存の両作用性オピオイド作用物質の低用量と併用して長期間投与することは、オピエート、アルコール及びコカイン常用の既往歴を有する例に対する効果的な維持療法となる。
【背景技術】
【０００６】
モルヒネ、その他の両作用性オピオイド作用物質は重度の疼痛緩和を目的として投与されている。それら物質が侵害受容ニューロンの抑制性オピオイド受容体を刺激し、その結果、両作用性オピオイド作用物質の鎮痛効果が発現する(North,Trends Neurosci.，Vol．9，pp．114-117，1986、およびCrain and Shen，Trends Pharmacol．Sci.，Vol．11，pp．77-81，1990 参照)。さらに、両作用性オピオイド作用物質は、侵害受容ニューロンの興奮性オピオイド受容体をも刺激するため、オピオイド作用物質の鎮痛作用が低減し、その結果、身体的依存性および耐性が発現し(Shen and Crain，Brin Res.，Vol．597，pp．74-83，1992参照)、また過興奮性、痛覚過敏性、その他の（興奮性）副作用が発現する。このような点から、両作用性オピオイド作用物質の鎮痛（抑制）効果を増強し、同時にオピオイド作用物質投与による（興奮性）副作用を軽減する方法を開発することが長年の課題となっていた。
【０００７】
本発明に関連する先々回の特許出願（No．07/947,690）は、低用量／非常習性鎮痛剤として、オピオイド常習者に対する治療剤として使用される一連のオピオイド作用物質に関するものであった。それらオピオイド作用物質群は抑制性オピオイド受容体と結合して当受容体を活性化するが、興奮性オピオイド受容体とは結合せず、従って後者の受容体を活性化しないことが先々回の出願で提示された。一方、モルヒネ他のオピオイドアルカロイド、またはオピオイドペプタイドの殆どは、興奮性および抑制性オピオイド受容体の両者と結合して、それら両受容体を活性化することも先々回の出願で提示された。
【０００８】
現在までには、次の点に関する方法は発見されていなかった。すなわち、２種類のオピオイド化合物を併用投与し、そのうちの一つが抑制性オピオイド受容体と結合して選択的な鎮痛作用を発揮する一方、他の一つが興奮性オピオイド受容体と結合して選択的な拮抗作用を発揮することにより、両作用性オピオイド作用物質投与による副作用発現を軽減すると同時に、それら両作用性オピオイド作用物質の鎮痛作用を増強する方法は今まで発見されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって本発明の目的は、モルヒネその他の両作用性オピオイド作用物質の坑鎮痛性副作用を阻止することにより、これら両作用性オピオイド作用物質の鎮痛効果を増強する方法を提供することである。
【００１０】
また他の目的は、両作用性オピオイド作用物資の継続的投与によって発現する身体的依存性、耐性、過興奮性、痛覚過敏性その他の副作用を軽減することである。
【００１１】
さらに他の目的は、興奮性オピオイド受容体拮抗物質のごく低用量を、単独投与またはメサドンの低用量と長期にわたり併用投与することにより、既往にオピエート、コカイン、又はアルコールなどの常習歴を有する例に対して維持療法を提供することである。
【００１２】
さらに別の目的は、両作用性オピオイド作用物質の鎮痛効果を増強し同時に両作用性オピオイド作用物質によって発現する副作用、たとえば身体的依存性、耐性、過興奮性および痛覚過敏性などを軽減する方法を提供することである。
【００１３】
また他の目的は、オピエート、コカイン、又はアルコールなどの常用者に対する有効な治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、モルヒネなど従来の両作用性オピオイド作用物質の鎮痛作用を選択的に増強すると同時に、それらオピオイド作用物質の長期投与時にみられる身体的依存性その他の副作用を軽減する方法に関するものである。モルヒネ他の両作用性（抑制性／興奮性）オピオイド作用物質は、疼痛緩和機能を持つ侵害受容ニューロンの抑制性および興奮性オピオイド受容体の両方に結合し作用する。すなわち、これら両作用性オピオイド作用物質により、上記の抑制性受容体が活性化されると鎮痛効果が、また、上記の興奮性受容体が活性化されると坑鎮痛効果、過興奮性、痛覚過敏性などに加え、身体的依存性、耐性その他の副作用が発現する。興奮性オピオイド受容体に結合する一群の拮抗物質（例えば、ディプレノルフィリン、ナルトレキソン及びナロキソン）は、侵害受容性の後根神経節（DRG）ニューロンの興奮性オピオイド受容体の機能を選択的に阻止するが、その際に必要な当該拮抗物質の投与量は、同DRGニューロンの抑制性オピオイド受容体の機能を阻止するに必要な当該拮抗物質投与量の1,000ー10,000分の一の低用量でよい。一方、両作用性オピオイド作用物質と、興奮性（抑制性ではなく）オピオイド受容体と結合して当該受容体の機能を不活化するオピオイド拮抗物質の低用量とを併用投与することにより、DRGニューロンに対する当該オピオイド作用物質の興奮性坑鎮痛性の副作用を軽減することができる。このようにして鎮痛効果が増強されるため、モルヒネその他既存のオピオイド鎮痛剤の投与量が少なくてすむ。
【００１５】
本発明の好適な興奮性オピオイド受容体拮抗物質には、ナルトレキソン、ナロキソンのほか、エトルフィン、ジヒドロエトルフィン、さらに、前回のアメリカ合衆国における特許出願（No．08/097,460）でも取り上げたオピオイドアルカロイド及びオピオイドペプタイドと同様の作用を持つディプレノルフィン等が含まれる。また、ナロキソン及びナルトレキソンの従来の臨床投与量は、かなりの高用量（例えば 50 mg）が設定されており、それにより、抑制性オピオイド受容体の機能が阻止され鎮痛作用を発現し得た。これら拮抗物質の大量投与は、オピエート作用物質の過量投与による急性症状（例えば呼吸低下）に際する解毒剤として用いられることがある。一方、本発明において、ナルトレキソンのごく微量（例えば１μｇ）を単独、あるいはメサドンの低用量（例えば mg）との併用により、既往にオピエート、コカイン、またはアルコールの常用歴を有する例で、それらの何れかを再開した際に発現し得る身体的依存を阻止することができる。このことは、従来みられたナルトレキソンの大量投与（Trexan 50 mg 錠投与）後の影響すなわち身体違和感その他の発現、あるいはメサドンの長期間かつ大量投与後に認められた同剤に体する身体的依存性の発現などとは対照的な所見といえる。
【００１６】
本発明のオピオイド作用物質は、モルヒネ他の両作用（抑制／興奮）性オピオイドアルカロイド及びオピオイドペプタイド等があり、それらは、鎮痛剤として臨床応用されているコデイン、フェンタニール類似薬、ペンタゾシン、ブプレノフィン、メサドン及びエンドルフィン等を指す。
【００１７】
また、慢性的疼痛を有する患者に対し、本発明の興奮性オピオイド受容体作用物質のごく微量を単独投与することにより、鎮痛効果が増強され、さらに、内因性（外因性ではなく）オピオイドペプタイド、例えばエンケファリン、ディノルフィン及びエンドルフィン等に対する依存性の発現が抑制され、その結果、オピオイドに対する反応性および侵害受容系を正常に保つための生理学的機構を維持することになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、両作用性オピオイド作用物質投与による鎮痛効果の選択的増強と、同オピオイド作用物質の長期投与による副作用発現の軽減とを同時に得るための方法に関するものである。これは、侵害受容（疼痛）経路における興奮性オピオイド受容体ー調節機能を不活化し、同時に侵害受容ニューロンの抑制性オピオイド受容体ー調節機能を活性化することにより得られる。そのためには、両作用性オピオイド作用物質の低用量と、興奮性オピオイド受容体拮抗物質との各１種類を併用投与する。それら物質のうち、両作用性オピオイド作用物質は侵害受容ニューロンの抑制性受容体と結合して、鎮痛作用など抑制性オピオイド受容体ー調節機能を活性化すると同時に、侵害受容ニューロンの興奮性オピオイド受容体を活性化する。一方、興奮性オピオイド受容体拮抗物質は、侵害受容ニューロンの興奮性受容体と結合して、興奮性オピオイド受容体調節機能すなわち坑鎮痛効果、当該オピオイド作用物質に対する身体的依存性および耐性、過興奮性、痛覚過敏性などを不活化する。
【００１９】
一方、本発明の興奮性オピオイド受容体拮抗物質は、両作用性、外因性オピオイド投与の前治療薬としても応用でき、また、同拮抗物質の単独投与により鎮痛効果を増強すると共に、慢性疼痛患者においては管理が困難な、エンケファリン、ジノルフィン、エンドルフィン等の内因性オピオイドペプタイドに対する依存性発現を抑制する。
【００２０】
さらに本発明の興奮性オピオイド受容体拮抗物質および同作用物質は、オピエート常習の既往歴を有する例に対する維持療法にも応用できる。コカイン及びアルコール等の常習癖はオピオイド感受性の特異的脳細胞ネットワークにより媒介されており(Gardner et al．Substance Abuse 2nd ed．pp．70-99，1992)、また、コカイン常習癖もオピオイド感受性の特異的脳細胞ネットワークにより媒介されているので、本発明のオピエート常習者に対する治療方法は、コカインまたはアルコール等の常習者の治療にも応用できる。さらに本発明では、興奮性オピオイド受容体拮抗物質と両作用性オピオイド作用物質との各１種類の併用効果についても提示した。
【００２１】
本発明者らは、ある物質が興奮性オピオイド受容体拮抗物質として作用することを見いだした。すなわち、それらの物質は侵害受容経路のニューロンにおける興奮性オピオイド受容体と結合し当該受容体を不活化する。本発明の興奮性オピオイド受容体拮抗物質は、ナロキソン、ナルトレキソン、ジプレノルフィン、エトロフィン、ジヒドロエトルフィン等である。それら興奮性オピオイド受容体拮抗物質の一つであるナルトレキソンは、経口かつ超低用量で応用できる。例えばナルトレキソン 1 μg 投与により、興奮性（抑制性ではなく）オピオイド受容体に対する選択的拮抗作用を発揮する。従来のナルトレキソン及びナロキソンの臨床投与量はより大量（≧mg）であり、それにより抑制性および興奮性オピオイド受容体に対する拮抗作用を得ていた。また、それら拮抗物質は当該作用物質の鎮痛効果を増強するため、それら作用物質の投与量は低用量とならざるを得ず、その結果、当該作用物質の鎮痛効果が低減されていた。
【００２２】
本発明のオピオイド受容体拮抗物質アルカロイドの投与により、興奮性オピオイド受容体の亜型、すなわちμ,δ,κ その他の各亜型受容体が不活化される。
エトルフィン及びジヒドロエトルフィンは互いによく似た化学構造式を有し、抑制性（興奮性ではなく）オピオイド受容体を選択的に活性化して強力な鎮痛作用を発揮する(Shen and Crain，Brain Res.，Vol．636，pp．286-297，1994)。一方、ナルトレキソン、ナロキソン（図１参照）およびジプレノルフィン等の化学構造式は、エトルフィン又はジヒドロエトルフィン等の化学構造式とは少し異なっており、全ての型の抑制性および興奮性オピオイオ受容体に対する一般的拮抗物質として作用する(Shen andC rain，Brain Res.，Vol．491，pp．227-242，1989 及び Shen and Crain，Brain Res.，Vol．636，1994参照)。また、ナルトレキソン、ナロキソン及びジプレノフィン等は侵害受容DRGニューロンの興奮性（抑制性ではなく）オピオイド受容体と結合して拮抗作用を発揮する。
【００２３】
一方、本発明の両作用性オピオイド作用物質としては、モルヒネ、コデイン、メサドン、ペンタゾシン、ブプレノフィン、フェンタニール類似薬、その他のオピオイドアルカロイド及びオピオイドペプタイド等が選ばれた。本発明のオピオイド作用物質のなかでも、μ、δ、κ 及び ε型のオピオイド受容体に作用する物質が代表的であり、それら物質は疼痛経路におけるニューロンの抑制性オピオイド受容体と結合する。その結果、鎮痛効果などの抑制性オピオイド受容体ー調節機能を活性化する。
【００２４】
以下に述べるように、侵害受容DRGニューロンを含む今回の研究の結果、ある物質（当該興奮性オピオイド受容体拮抗物質）を前治療物質として、あるいは両作用性オピオイド作用物質と併用して用いる場合には、当該興奮性オピオイド受容体拮抗物質は従来の100-1000分の１の投与量により、当該両作用性オピオイド作用物質の鎮痛効果を増強し、さらに同作用物質による興奮性の坑鎮痛性副作用を軽減することができ、さらに、当該興奮性オピオイド受容体拮抗物質は、興奮性オピオイド受容体機能が持続的に活性化される結果発現する、同物質に対する耐性および依存性なども抑制する。
【００２５】
また本発明の興奮性オピオイド受容対拮抗物質を単独、または抑制性オピオイド受容体作用物質の低用量（従来は鎮痛効果が得られない程度の低用量）と併用投与することにより、オピエート、コカイン、アルコール等の常習者に対する長期間にわたる維持療法として応用でき、さらにそれら常習癖再開例にみられる持続的依存性も阻止することができる(Gold-berg，et al.，1969およびCrain，et al.，1992参照)。
【００２６】
上述の物質常習者に対し当該拮抗物質による長期治療を行なうことにより、内因性オピオイドペプタイドにより発現した、興奮性オピオイド受容体機能の持続的活性状態が阻止される。これら内因性ペプタイドは、慢性的にモルヒネの感作に曝され著しく低下した当該ペプタイド濃度、ならびに興奮性オピオイド受容体を活性化するに必要な限界濃度を遥かに上回る濃度で脳内に存在しており、モルヒネに対する持続的な身体的依存性に関する細胞性メカニズムを阻止する機能を持つ。また、慢性的疼痛を有する患者に対し興奮性オピオイド受容対拮抗物質を単独投与することにより、鎮痛剤の効果が増強され、さらに当該患者の内因性オピオイドペプタイド、すなわちエンケファリン、ジノフィリン、エンドルフィンなど、通常は侵害受容（疼痛）に関する感受性を調節し、慢性的な疼痛時には生体内濃度が上昇する内因性オピオイドペプタイドに対する依存性を低減する。
【００２７】
従来の両作用性オピオイド作用物質は、臨床的には mg 単位で投与されている。一方、本発明で提示したように、この両作用性オピオイド作用物質と興奮性オピオイド受容体拮抗物質とを併用投与することにより、当該作用物質を単独投与する際の投与量に比し、上記の併用投与時では当該作用物質の投与量は10-100分の１の低用量でよい。その理由は、本発明で採用した興奮性オピオイド受容体拮抗物質が、併用投与されたオピオイド作用物質による坑鎮痛性の興奮性副作用を軽減し、その結果、両作用性オピオイド作用物質の鎮痛効果が増強されるからである。従って、本発明で採用した興奮性オピオイド受容体拮抗物質と両作用性オピオイド作用物質とを併用する際には、後者の作用物質の投与量は、鎮痛剤としての従来の投与量の10-100分の１でよい。
【００２８】
また、本発明によれば、興奮性オピオイド受容体拮抗物質の投与量は、併用投与される両作用性オピオイド作用物質の投与量の100-1000分の１でよい。すなわち、当該拮抗物質の投与量は約１μgであり、併用投与される当該作用物質の投与量は、その100-1000分に１でよい。これらの投与計画は、侵害受容DRGニューロンの培養試料を用いた研究成績に基づき設定した。また、これら興奮性オピオイド受容体拮抗物質および抑制性オピオイド作用物質は、いずれも経口、舌下、筋注、皮下注または静注などによる投与が可能である。なかでもナルトレキソンは、１μｇという低用量で経口投与ができ、薬効持続時間が長く、しかもオピエート常習者に対しては 1回投与量 50 mgで、１週あたり数回を数年間にわたり継続投与することも可能であり、特に有用である(Greenstein et al.，Subst．Abuse，2nd ed.，1992およびGonzaies et al.，Drugs，Vol．35，pp．192-213，1988 参照)。
【００２９】
本発明で取り上げたオピオイド作用物質と興奮性オピオイド受容体拮抗物質とを併用投与することにより、疼痛を媒介する侵害受容ニューロンの抑制機能を活性化すると同時に、同ニューロンまたは他の侵害受容ニューロンの興奮機能を不活化する。このことを証明するために、マウスの侵害受容性DRG感覚ニューロンを組織培養し、当試料に対する当該オピオイドの効果を電気生理学的に検討した。その結果、後述のように、この両作用性モデルは当該感覚ニューロンに存在する、試験対象試料である興奮性オピオイド受容体、および事前に確認ずみの抑制性オピオイド受容体の双方を共に活性化した。
【００３０】
すなわち、モルヒネ、エンケファリン、ジノルフィン、エンドルフィン及びμ、δ、κ型などに対する特異オピオイド作用物質を含め、本発明で採用した殆ど全ての両作用性オピオイドのpMーnM という低濃度を投与した結果、DRGニューロンの活動電位持続時間（APD）に関するカルシウム依存性要素が延長された際にみられる、ナロキソンー可逆性、用量依存性の興奮効果が発現された。一方、それらのオピオイドの高用量（0.1-1.0 μＭ）を投与した際には、通常、APDが短縮される。
【００３１】
これらのうち、感覚ニューロンに対するオピオイドの興奮性効果は、オピオイド受容体により媒介される。すなわち、当該オピオイド受容体は、コレラ毒ー感受性の刺激性GTP結合タンパク(Gs)を経由し、アデニル酸シクラーゼ／サイクリックAMP/プロテインキナゼAー依存性イオン伝道機構に作用し、その結果、感覚ニューロンに対するオピオイドの興奮性作用が発現する（この点は、βーアドレナリン作動性受動体と同様である）(Crain and Shen，Trends Phrmacol．Sci.，Vol．110，pp．77-81，1990参照)。一方、オピオイドの抑制性効果もオピオイド受容体により媒介される。ただし、当該受容体は百日咳毒ー感受性の抑制性Gタンパクを経由するが、それらタンパクのうち Gi タンパクを経由した場合には当該受容体はアデニル酸／サイクリックAMP機構に、Goタンパクを経由した場合にはイオン伝道機構に作用して、いずれの場合にもAPDを短縮する(この点は、α２ーアドレナリン作動性受容体と同様である)。このように試験オピオイドにより主要な感覚ニューロンの活動電位が短縮されたことは、脊髄背側のシナプス前末端においてカルシウム流入および伝達物質遊離などが、試験オピオイド投与により抑制されていることを示す有用なモデルであり、また、それらオピオイドの生体における鎮痛作用を裏付けるものである(North，Trends Neurosci.，Vol．9，pp．114-117，1986 及び Crain and Shen，Trends Pharmacol．Sci.，Vol．11，pp．77-81，1990 参照)。
【００３２】
また、試験オピオイド投与による活動電位の延長に際し、それと同時に認められた再分極の遅延は、侵害受容型の感覚ニューロンに対する当該オピオイドの興奮性効果が発現された証拠であり(Shen and Crain，J．Neurosci.，1994 刊行中)、その結果、シナプス前末端におけるカルシウム流入および伝達物質遊離が促進されると考えられる。このことは、生体内のオピオイドにより発現するある種の痛覚過敏状態および高興奮状態などにおいても認められる(Crain and Shen，Trends Pharmacol．Sci.，Vol．11，pp．77-81，1990、Shen and Crain，Brain Res.，Vol．491，pp．227-242，1989 及び Shen and Crain，J．Neurosci.，1994 参照)。
【００３３】
DRGニューロンに対し、代表的な両作用性（興奮性／抑制性）オピオイド［例えば D-ala2-leu5 en-kephalin（DADLE）を１μg、又はモルヒネのいずれかを１週間］を継続投与することにより、これらオピオイドの高濃度投与により通常みられるAPD短縮効果に対する耐性が、更に、これらオピオイド作用物質やオピオイド拮抗物質たとえばナロキソン等の投与によりみられるAPD延長効果に関する過感受性などが認められる(Crain and Shen，Brain Res.，Vol．575，pp．13-24，1992 及び Shen and Crain，Brain Res.，Vol．597，pp．74-83，1992 参照)。このうち後者の電気生理学的効果および生化学的反応は、オピエート常習者のある時期に認められる身体的依存性に伴う細胞レベルの反応と同類である(Shen and Crain，Brain Res.，Vol．597，pp．74-83，1992 及び Terwilligeret al.，Brain Res.，Vol．548，pp．100-110，1991参照)。
【００３４】
これら両作用性オピオイドとは対照的に、オピオイドアルカロイドのエトルフィン（Bent1ey and Hardy，Proc．Chem．Soc.，pp．220，1963 及び Blane et al.，Brit．J．Pharmacol．Chemother.，Vol．30，pp．11-22，1967 参照）ならびにジヒドロエトルフィン（Bentley and Hardy，J．Amer．Chem．Soc.，Vol．89，pp．3281-3286，1967参照）などは、1 pM という低濃度でDRGー脊髄の外移植片の感覚ニューロンに対し、濃度依存的、かつ、ナロキソン可逆性の特殊な抑制効果を発現するが、それら低濃度では興奮性作用は発現しない(Shen and Crain，Brain Res.，Vol．636，pp．286-297，1994参照)。さらに意外なことに、これら強力な抑制効果を有するオピオイド受容体作用物質は、DRGニューロンの興奮性オピオイド受容体に対し拮抗作用も発揮する。たとえば、エトルフィン又はジヒドロエトルフィンの低濃度(＜pM)、すなわちAPDに影響しない程度の低膿度でDRGニューロンを急速に前処置した試料に対しては、モルヒネその他の両作用性オピオイドのADP延長効果が阻止される。すなわち、エトルフィン又はジヒドロエトルフィンの高濃度により通常得られるAPD短縮効果が、それら低濃度で発現する。これら両物質の強力な抑制効果は、それら物質が、感覚ニューロンの抑制性オピオイド受容体ー媒介機能を選択的に活性化すると同時に、同ニューロンの興奮性オピオイド受容体ー媒介機能を不活化することによると考えられる。これと対象的に、両作用性オピオイドは、DRG ニューロンの興奮性および抑制性オピオイド受容体を共に活性化し、その結果それら両作用性オピオイドによる差引き抑制効果は減少することになる。このことは、全身的投与されたモルヒネによる抑制効果が、マウスの脊髄における遊離ジノルフィンAの「坑鎮痛」（興奮）効果により軽減される（Fujimoto et al.，Neuropharmacol.，Vol．29，pp．606-617，1990参照）のと同様である。
【００３５】
また、本発明においては次の事実も明らかとなった。すなわち、ナロキソン及びナルトレキソン等のごく低濃度(pM)は DRGニューロンの興奮性受容体に対し選択的拮抗物質として作用し、その結果、両作用性オピオイド作用物質による強力な抑制効果が発現される。すなわち、nM 濃度のナロキソンは、μM 濃度のオピオイド拮抗物質によるDRGニューロンにおけるAPDの短縮を阻止すると同時に、pM-nM 濃度のオピオイドによるAPDの延長も阻止することが判明した。また、ナロキソンの低濃度を用いた総合的なテストの結果、pM濃度のナロキソンは興奮性オピオイド受容体に対し選択的な拮抗作用を示すことが判明した。さらに、fM-nM濃度のモルヒネはDRGニューロンに対し濃度依存的なAPD延長作用を示し、同ニューロンに対して１pMのナロキサンを適用したテストでは、当該オピオイドによる興奮性効果が完全に阻止され、更にfM-nM濃度のモルヒネ投与により、同ニューロンによってはAPDの短縮を示すものもあった。このような低濃度のモルヒネによる強力な抑制効果は、DRGニューロンに対してfM-nM濃度のモルヒネとpM濃度のナルトレキソンとの併用投与による別のテストにおいてもみられ、一方、ナルトレキソンの高濃度（nM-μM）投与ではオピオイドの抑制ならびに興奮効果が共に阻止された（図５参照）。
【００３６】
興奮性オピオイド受容体に対し微量のナロキソンを投与して得られる選択的拮抗作用は、次のような生体を用いたデータとも一致する。すなわち、マウスに対しナロキソン 0.1 fg を投与（i.t.）した結果、内因性ジノルフィンA-(1-17)の坑鎮静作用により調整されているマウスの行動（尾の動き）が更に鎮静強化される一方、モルヒネ又はκオピオイド作用物質の直接投与（i.t.）により媒介されていた鎮静効果を確実に低下させるには、ナロキソン100 fg の投与（i.t.）を必要とした(Fujimoto et al.，J．Pharm．Exp．Ther.，Vol．251，pp．1045-1052，1989参照)。
【００３７】
DRGニューロンに対しμM 濃度のモルヒネを継続投与中に、エトロフィンの低濃度（pM）を併用投与することにより、両作用性オピオイドの慢性的投与後に通常みられるオピオイドに対する過感受性および耐性などの発現が抑制される。モルヒネ 3μM 及びエトルフィン 1 pM の継続投与（１週間以上）を受けたDRGニューロンに対し、ジノルフィンA(1-3)1 fM 又はナロキソン 10 nM を急性投与した結果、継続的なモルヒネ処置を受けた同ニューロンに通常みられるAPDの延長は、同ニューロンを平衡食塩液に戻した６週間後においても認めなかった。さらに、μM 濃度のモルヒネによるAPD短縮効果に関する耐性も殆ど認めなかった。
【００３８】
これらの際に、エトロフィンが抑制性オピオイド受容体に対して単なる作用物質としてのみ働くと仮定すれば、1 pMのエトルフィンと、106倍の高濃度のモルヒネとを併用投与しても、モルヒネにより継続処理したDRGニューロンに対する効果は無視し得る程度に止まるか、あるいは、同ニューロンのモルヒネに対する依存性発現の増強を示すに止まったと考えられる。しかし、実際に得られた結果は、モルヒネによる継続処理を受けた興奮性オピオイド受容体に対するエトルフィンの強力な拮抗作用を示し、その結果、オピオイドの興奮性過感受性および耐性などの発現が抑制された。このことは、オピオイドの継続処理を受けたDRGニューロンが、コレラ毒の亜型ーBの存在下で(Shen et al.，Brain Res.，Vol．575，pp．13-24，1992参照)、興奮性オピオイド受容体の機能であるGM1 ガングリオシドに対する調節機能を選択的に抑制する(Shen et al.，Brain Res.，Vol．531，pp．1-7，1990 及び Shen et al.，Brain Res.，Vol．559，pp．130-138，1990参照)のと同様の所見である。
【００３９】
これと同様に、μM濃度のモルヒネにより継続処理中のDRGニューロンに対し、ナロキソン又はナルトレキソンの微量（pM）を投与した結果、両作用性オピオイドの継続投与中に通常みられる当該オピオイドに対する興奮性過感受性および耐性などの発現が抑制された。モルヒネ 1M と、ナロキソン又はナルトレキソン 1 pM とにより継続（1-10 週間）処理したDRGニューロンに対し、fM濃度のジノルフィンA-(1-13)又は fM 濃度のモルヒネと、1 nM 濃度のナロキソンとを併用投与した結果、モルヒネにより継続処理した同ニューロンに通常みられるAPD延長は認めず(Crain et al.，1992 及び Shen et al.，1992参照)、このことは同ニューロンを平衡食塩液で処理した後に行なった試験成績でも同様であった。さらに、μM濃度のオピオイド投与により通常みられる抑制効果に関する耐性も認めなかった。
【００４０】
また、侵害受容型のDRGニューロンに対し、モルヒネと、ナルトレキソン又はナロキソンのごく低濃度（pM）との併用投与の結果、モルヒネにより継続処理したDRGニューロンに通常みられるモルヒネに対する同ニューロンの耐性および依存性などの発現が阻止された。モルヒネにより継続処理された侵害受容DRGニューロンに対するナルトレキソン及びナロキソンなどに関する上述のデータは次のことを証明する。すなわち、これら興奮性オピオイド受容体拮抗物質およびモルヒネ（又はコデイン）等の微量によって処理された試料が得られたことにより、それら物質による鎮痛効果の増強と、それら物質に対する依存性の軽減が証明された事になる。
【００４１】
低濃度（pM-nM）のモルヒネにより処理されたDRGニューロンに対し、pM濃度のナロキソン又はナルトレキソンの強力な抑制（APD短縮）効果が発現したことは、低濃度のナロキソンにより次のような逆説的増強作用が発現したことを示す。
すなわち、(1)ヒトに対するモルヒネの鎮痛効果の増強(Gillman et al.，Intern．J．Neurosci.，Vol．48，pp．321-324，1989、Gillman et al.，J．Neurol．Sciences，Vol．49，pp．41-49，1981、South African J．Science，Vol．83，pp．560-563，1989参照)、(2)ヒト及び動物に対するブプレノフィンの鎮痛効果の増強(Pederson et al.，Grit．J．Anaesthia，Vol．57，pp．1045-1046，1985、Schmidt et al.，Anesthesia，Vol．40，pp．583-586，1985、Bergman et al.，Arch．Intl．Pharmacodyn.，Vol．291，pp．229-237，1988参照)、(3)ヒトに対するペンタゾシンの鎮痛効果の増強（Levine et al.，J．Clin．Invest.，Vol．82，pp．1574-1577，1988参照）などが発現した。
【実施例】
【００４２】
実施例１
実施例１においては、侵害受容性DRGニューロンの培養試料に対するエトロフィン及びジヒドロエトロフィン等の効果について述べる。本発明に際して行なったDRGニューロンの電気生理学的分析により、エトロフィン及びジヒドロエトルフィンは、ごく低濃度（pM）で興奮性オピオイド受容体に対する特異的拮抗作用を持つ物質として最初に採用された。従来、これら両物質を高濃度で投与した際には、抑制性オピオイド受容体に対する作用物質として知られていた事とは対照的である。
【００４３】
DRGニューロンの興奮性受容体に対し、エトルフィン及びジヒドロエトルフィンは強力かつ選択的な拮抗物質として作用し、その結果、両作用性オピオイド作用物質の抑制効果を増強する
（本実施例および次例以降で採用した）方法：各例における実験は次の材料を用いておこなった。すなわち、13 日齢の胎仔マウスから後根神経節（DRG）を伴った脊髄の外移植片を採取し3ー５週間培養後、そのDRGニューロンを実験材料とした。このDRGー脊髄の外移植片はコラーゲンで覆われたカバーグラス上に置き、それをMaxi-mow の下降スライド（depression-slide）式のケースに保管した。使用した培地は、65% Eagle最小必要培地、25% ウシ胎仔血清、10% ひよこ胚抽出物、2 mM グルタミン及び0.6% グルコース等を含有したものである。さらに、in vitro 培養の第１週めに、培地に神経成長因子（NGF-7S）を約 0.5 μg/ml追加して胎仔マウスDRGニューロンの生存および発育を計った。
【００４４】
本実験における電気生理学的操作を実施するため、培養カバーグラスをHanksの平衡食塩液の約 1mlを含有する記録ケースに移した。培養槽液、4 mM Ca2+及び 5 mM Ba2+（すなわちCa，Ba/BSS）を追加して、本理学的試験を予定どうり遂行するための基本的条件を整えた。当該細胞内の成績は、試験神経節から無作為に採取した核周囲部細胞体を対象として入手した。また、使用する微量ピペットは、3 MのKCl（約 60-100 メグオームの電気抵抗を有する）で満たし、それを塩化物化した銀のワイヤー経由で中和入力能（a neutrali-zed input capacity）を持つ前置増幅器（Axoclamp 2a）に接続して、電流ークランプ（current-clammp）を記録した。１個のDRGニューロンに対し記録電極を経由して短時間（2 msec）の脱分極電流パルスを通し、0.1 Hz の周波数における当該ニューロンの作用を惹起した。このようにして惹起されたニューロンの作用は、マイクロコンピューター（IBM AT-compatible）のP-clamp プログラムによりフロッピー（登録商標）ディスクに記録保存した。
【００４５】
試験薬物は、２〜３ml/min の速度で手動の押引ポンプによる槽潅流方式により投与した。ただし、対象ニューロンの作用能力および非作用能力が、対照のCa，Ba/BSS 中で４分間以上にわたり一定の状態を示した後に、試験薬物の潅流を開始した。オピオイド投与によるAPDの変化は、次のようなときに有意な変化ありとした。すなわち、APDの変動値が対照値に比し 10% 以上であり、その値が５分間の全テスト時間を通して維持されたとき有意な変化ありとした。APDが最大値を示した時間と、再分極相における屈曲点に到達した時間とを計り、それをAPDとした。本実施例１および以下の各例に対して使用された薬物は次の通りである。すなわち、エトロフィン、ジプレノフィン及びモルヒネ(Dr．Eric Simon より提供)、ジヒドロエトロフィン(China and United Biomedica1 社のDr．B．Y．
Qin より提供)、ナロキソン(Endo Labs 社より提供)、ナルトレキソン、DADLE、ジノルフィンその他のオピオイドペプタイド（Sigma社より提供）などが各例に対して使用された。
【００４６】
使用するオピオイドアルカロイド及びオピオイドペプタイドは、水を用いて通常の場合は 1 mM 溶液とした後、BSSを用いて注意深く希釈し、目的通りの濃度に調整した。これら 1-10 又は 1-100 の希釈系列を作成するに際しては、各希釈操作ごとにピペットの先端を捨て、試験薬物の微量（fM-pM）濃度を正確に調整するように配慮した。
成 績：細胞内記録は、小型および中型のDRGニューロンの核周囲部細胞体（直径が約 10-30 μm）を用いておこなった。これらの核周囲部細胞体は、比較的長いAPD（Ca/Ba BSS においては 3 msec 以上）を示し、また、オピオイド作用物質に対して特徴ある反応性を示し、さらに、一次性求心性侵害受容ニューロンが生体内で示すと同様な特徴をも示す。これらDRGニューロンに対し、エトルフィン等の選択的抑制性オピオイド受容体作用物質を急性使用することにより、試験細胞のAPDが80-90% 短縮する。これとは逆に、DRGニューロンに対し、モルヒネ、ジノルフィン、エンケファリン等の両作用性（興奮性／抑制性）オピオイドの低用量を使用することにより、これら試験細胞のAPDは延長する。大型のDRGニューロンのうち、比較的少数（約 10-20%）のものだけがDRG−脊髄の外移植片で生存したが、それら生存ニューロンのAPDは短時間（Ca/Ba BSS内において約1-2 msec）であり、しかも当該APD放物線の下降相には屈曲も「山」もみられなかった。また、これら大型DRGニューロンのAPDは、外因性オピオイドの投与による変化を示さなかった。
【００４７】
オピオイド投与後の、DRG核周囲部細胞体のAPD変動値を測定して、投与オピオイドに対するDRGニューロンの反応性を分析した。このため、合計64個のDRGニューロン（23個のDRGー脊髄の外移植片より）を対象として、投与濃度を順次に上げたエトロフィン（n=30）又はジヒドロエトルフィン（n=38）に対するそれらDRGニューロンの感受性を分析した。その結果、エトロフィンの1 fM（試験細胞の30%、n=26）から 1 uM（試験細胞の80%、n=16）などの濃度により、急速かつ濃度依存的にDRGニューロンのうち大型のもののAPDが、順次短縮された（図２および図３参照)。
【００４８】
図２では、低濃度（pM-nM）のエトルフィンの急性投与により、非エトルフィン投与歴のDRGニューロンの活動電位持続時間（ADP）が、濃度依存的かつナロキソン投与ー可逆的に短縮される事を示した。一方、ジノルフィン（その他の量作用性オピオイド作用物質、例えばモルヒネ、DADLEなど）は（図３で示したような）低濃度で、試験ニューロンのAPDを延長する。ただし、それらの延長効果は、（図４および図５で示したように）エトルフィンの＜pM濃度、およびジプレノルフィン又はナルトレキソン等の投与により選択的に抑制される。図１の１は、５mM Ca2+及び 5 mM Ba2+を含有する平衡食塩液（BSS）中のDRGニューロンの活動電位（AP）を示す。図１の１のAP反応（その他図１の２ー６のAP反応）は、試験細胞内で生ずる短時間（2 msec）の脱分極電流パルスにより惹起される。図２Aの２〜５は、エトロフィン（Et）のfM濃度 による槽潅流では当該APDは変化しないが、Etの1 pM、1nM、１μM（各濃度とも５分間のテスト）と濃度が変わるに従い、当該APD は次第に短縮された。一方、図２Aの６は、試験ニューロンをBSS中に戻した後（９分間のテスト）には、当該APDがコントロール値になった事を示している。一方、図２Bの１及び２は、エトロフィンの１nM濃度（２分間のテスト）でAPDが短縮したDRGニューロンを示し、図２Bの３は、それらAPDが短縮したDRGニューロンが、ナロキソン（NLX）の10 nM濃度に戻した後にはコントロール値になった事を示し、さらに図２Bの４及び５は、エトロフィンの 1 nM 又は1 μM 等の濃度と、ナロキソンの10 nM 濃度との併用（５分間のテスト）によっても、当該APDは短縮されなかった事を示している。
【００４９】
図２Cの１及び２では、モルヒネの 3 nM 濃度の投与によりAPDが延長したDRGニューロンを示す。図2Cの３は、それらDRGニューロンのAPDは洗浄５分後にコントロール値に戻った事を、図2Cの４は上述のAPD値はエトロフィンの1 pM濃度投与によっても変化しなかった事を示している。さらに、図2Cの５は、モルヒネの3 nM濃度と、エトロフィンの1 pM濃度との併用投与下でも当該APDは延長せず、むしろモルヒネの高濃度単独投与時（エトロフィンの併用なし）にみられる程度の当該APDの著しい短縮が認められた。これと同様の結果は、ジプレノルフィンの 1 pM 濃度で前処置した試験ニューロンにおいても（図４）、更に、1 pM 濃度のナルトレキソン（図５）又は 1 pM濃度のナロキソンで前処置した試験ニューロンにおいても認められた。以上の成績および以下の各図で示した成績は、DRGー脊髄の外移植片のDRGニューロンを３ー４週間組織培養した試料から得た。
【００５０】
図３は、エトロフィン（Et、□）及びジヒドロエトロフィン（DHE、◇）等の全テスト濃度（fM-μM）投与により、DRGニューロンのAPDが濃度依存的に短縮される用量ー曲線を示す。これとは対照的にジノルフィンA（1-13）（図３のDyn、×）は低濃度（fM-nM）で(モルヒネその他の両作用性オピオイドと同様に)濃度依存性のAPD延長作用を示し、APD短縮のためにはジノルフィンはより高濃度（約 0.1-1,0 μM）を必要とし、そのためジノルフィンは釣り鐘型の濃度依存性曲線を示している。以上のデータは、エトロフィンに関しては11個の、ジヒドロエトロフィンに関しては13個の、ジノルフィリンに関しては35個のニューロンをそれぞれ使用した。また(図２に示したように)、エトロフィン、ジヒドロエトロフィン及びジノルフィン等の各々４濃度（fM-μM）によるテストに際しては、それら物質の順に５個、８個および９個の当該ニューロンを使用した。さらに、それら当該ニューロンの連続的濃度依存性データを得るためには、試験物質の最低濃度から開始した。
【００５１】
ジヒドロエトルフィンのAPD短縮効果は更に強かった（図３、n＝３８）。一方、エトルフィン及びジヒドロエトルフィン等の投与によりAPD短縮が誘導された試験細胞（図2B、n=12）に対し、ナロキソン（10 nM 濃度）を投与した結果、それらAPDの短縮効果は抑制された。DRGニューロンに対するトロフィン及びジヒドロエトロフィン等の低濃度による強力な抑制効果は、今回の試験で認められたモルヒネその他μ、δ、κ型などの各種オピオイド等による強力なAPD延長効果とは対象的である。今回の試験においては、エトルフィン又はジヒドロエトルフィンの各種濃度でも、確実なAPD延長を示すDRGニューロンは存在しなかった。DRGニューロンに対してエトルフィン又はジヒドロエトルフィン等がAPD延長効果を示さなかった理由は、それらオピオイド作用物質の興奮性オピオイド受容体に対する結合親和性が低いためと思われる。これとは逆に、それらオピオイドの興奮性受容体に対する親和性は強いと思われるが、それら受容体を活性化する事はなく、従ってそれらオピオイドは拮抗物質として作用する。これら両作用の機序を解明するため、APDを殆ど又は全く変化させない低濃度（fM-pM）のエトルフィンによりDRGニューロンを前処置したものに、更にモルヒネ、DAGO 又は DADLE のいずれかの nM 濃度を追加して観察した。その結果、エトルフィンによる処置の前には通常みられたAPD延長は当該細胞でみられなかった(図2C、n=11)。このようなDRGニューロンにおけるオピオイドの興奮性作用に対するエトルフィンの阻止効果は、試料洗浄後も0.5-2.0 時間持続した(n=4)。
【００５２】
以上の所見より次の事が言える。すなわち、従来エトロフィンはμ、δ、κ型などのオピオイド受容体に対する「紛れもない」作用物質と考えられており(Magnan et al.，Naunyn-Schmiedeberg's Arch．Pharmacol.，Vol．319，pp．197-205，1982 参照)、更にエトロフィンは抑制性オピオイド受容体に対する作用物質として良く知られていたが、今回の試験の結果、エトロフィンはDRGニューロンのμ、δ、κ型の興奮性オピオイド受容対に対し強力な拮抗作用を示す事が判明した。これと同様の興奮性オピオイド受容体に対する拮抗作用は、ジヒドロエトルフィン（fM-pM）により前処置した際にもみられ、その結果、nM濃度のオピオイドにより誘導されたAPD延長効果を調整する(n=2)。また、APDには殆ど影響しない程度の低濃度（fM-pM）エトルフィンで前処置されたDRGニューロンにおいて、オピオイドのAPD延長効果に対する選択的な抑制効果が発現された後に、fM-nM濃度の料作用性オピオイドを投与した結果、(試験細胞９個のうち５個において)強いAPD短縮効果を認めた(図 2C 及び図４参照)。これは、これら試験細胞における抑制性オピオイド受容体ー誘導の機能が、エトロフィンの投与により当該試験細胞の興奮性オピオイド受容体の機能が選択的に抑制されたためと思われる。
【００５３】
実施例２
低濃度のジプレノルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン等の投与により、興奮性オピオイド受容体は強力かつ選択的な拮抗作用を示す
方 法 : 例１の場合と同様に３週間以上にわたり培養したマウスDRGー脊髄の外移植片に対し、オピオイド拮抗物質すなわちジプレノフィン、ナルトレキソン、ナロキソン等を投与した。また、本例に関する電気生理学的な記録も例１の場合と同様にして行なった。
成 績 : オピオイド受容体拮抗物質のナロキソン及びジプレノルフィンは、従来、各々のnM濃度により、μM濃度のオピオイド作用物質によるDRGニューロンのAPD短縮効果を阻止し、さらにnM濃度のオピオイドによるAPD延長効果を阻止する事が認められていた。ところが今回の試験においては、ジプレノルフィン、ナロキソン又はナルトレキソン等の各々pM濃度という低濃度によっても、μ、δ、κ型などの興奮性オピオイド受容体に対し、エトロフィン及びジヒドロエトロフィン等と同じく選択的な拮抗作用を発揮した。ただし、ジプレノルフィン（pM濃度）、モルヒネ（n=7）及びDAGO（n=7）等の低濃度（pM-nM）によるAPD延長は認めなかった（図４A参照）。それとは逆に、ジプレノノルフィン、モルヒネ、DAGO等は、それぞれfM-μM濃度下を通して濃度依存性のAPD短縮作用を発揮し（図４B）、この点はエトロフィン及びジヒドロエトロフィンなどが示した濃度ー反応曲線（図３及び図２C）と同様であった。オピオイド受容体ー媒介に基づくAPD短縮効果に対する、ジプレノルフィンのpM濃度による抑制作用は、モルヒネの高濃度(10培の濃度)の存在下でも認められた（図４Aの５及び11参照）。
【００５４】
図４で示すように、DRGニューロンに対するモルヒネのAPD延長効果は、ジプレノルフィンの低濃度（pM）の併用により選択的に抑制され、また、モルヒネの低濃度によりAPDは濃度依存性に短縮される。図４Aの１ー４では、モルヒネ（Mor）の3 fM-3 pM 濃度による逐次的な槽潅流により、DRGニューロンのAPDが次第に延長する事を示した。また、図４Aの５では、モルヒネの濃度を3 pMに増加した際に、試験細胞のAPDが僅かに短縮する事を示した。図４Aの６−７では、試験ニューロンを 1 pMのジプレロルフィリン（DPN）で前処置した際には、当該APDは僅かに短縮する事を示した。また、図４Aの8-11では、DPNで前処理した当該APDが定常値に達した後は、モルヒネの濃度を逐次的に3 fM、3 pM、3 nM、3 μMと変えることにより、当該APDは次第に短縮摩る事を示したが、この事は、モルヒネの同系列の濃度変化によっても、DPNを併用しない場合には当該APDが延長する事(図２C)と対照的な事実である。一方、図４Bで示した濃度ー反応曲線は、DPNのpM濃度と、モルヒネ（□）との併用により、DRGニューロン群（n=7）のAPDが濃度依存的に著しく短縮した事を示すものであるが、DPN（X）の使用前にはこれらDRGニューロンの全てはAPDの延長のみを示した。DPNとモルヒネとの併用による上述の抑制作用は、エトルフィン及びジヒドロエトルフィン等による抑制作用（図３）と比肩さるべきである。これに反し、DPNの高濃度（nM）で前処置した上で、モルヒネ（●）を使用する際にはモルヒネの抑制効果および興奮効果は共に阻害される。
【００５５】
図５で示すように、DRGニューロンに対するモルヒネのAPD延長効果（○）は、ナルトレキソン（NTX）の低濃度（pM）を併用することによっても選択的に阻止され、従って、モルヒネの低濃度による濃度依存性の強力なAPD短縮効果（×）
を表わしている。これとは対照的に、NTXの高濃度（μM）で試験ニューロンを前処置した場合には、モルヒネ投与による抑制効果および興奮効果が共に阻止される（□）(同様の阻止作用は、NTXの１nM 濃度による前処置の場合にもみられる)。図５の用量ー反応曲線は、18個のニューロンから得たデータに基づいて作成したが、これら全ての試験ニューロンはNTXによる前処置以前にはAPD延長効果のみを示した。NTXのpM濃度と併用した際のモルヒネの抑制効果は、エトルフィン及びジヒドロエトルフィン等の抑制効果と比肩し得る（図３参照）。
【００５６】
実施例３
DRGニューロンに対し、モルヒネと、ナロキソン又はナルトレキソンの各々微量とを併用する事により、オピオイドに対する興奮性の過感受性（「依存性」）および耐性などの発現を阻止する事ができる
モルヒネのμM 濃度の継続投与を受けたDRGニューロンに対し、ナロキソン又はナルトレキソンの各々微量（pM）を併用することは、両作用性オピオイドの継続的投与時に通常みられる、オピオイドに対する興奮性過感受性および耐性などを阻止するのに有効である。1 μM濃度のモルヒネと、1 pM濃度のナロキソン又はナルトレキソンとを継続（1-10週間）かつ併用投与したDRGニューロンに対し、fM濃度のジノルフィンA-(1-13)、fM濃度のモルヒネ(n=21)、1 nM濃度のナロキソン(n=11)のいずれかを追加で急性投与した結果、BSSで洗浄後、モルヒネを継続投与した試験ニューロンにおいて通常認められるAPD延長効果は発現しなかった（図６参照）。さらに、μM濃度のオピオイド投与（n=6）により通常みられた抑制効果に関する耐性も認めなかった(図６)。
【００５７】
これらの所見は、すでに報告されている以下の知見とも一致する。すなわち、モルヒネを継続投与したDRGニューロンに対し、コレラ毒の亜型を投与して得られるオピオイドの持続性興奮性効果が阻止される結果、オピオイドに対する耐性およびイオン性などの発現が抑えられる(Shen and Crain，Brain Res.，Vol．597，pp．74-83，192参照)．さらに、当コレラ毒の亜型はオピオイドの興奮性機能に関するガングリオシドGM1による調整機能を選択的に阻止する(Shen and Crain，Brain Res.，Vol．531，pp．1-7，1990 及び Shen et al.，Brain Res.，Vol．559，pp．130-138，1991参照)。
【００５８】
これと同様に、pM濃度のエトロフィンの存在下では、μM濃度のモルヒネの継続投与による耐性または依存性は発現しない。図６では、DRGニューロンに対し、モルヒネと各種拮抗物質とを併用することにより、興奮性オピオイド受容体における耐性／依存性発現の抑制効果に関するテスト方法を表示した。
【００５９】
興奮性オピオイド受容体拮抗物質と、モルヒネその他従来のオピオイド作用物質とを併用することにより、オピオイド作用物質の鎮痛効果を増強すると同時に、それら作用物質に関する依存性その他の副作用を軽減する
今回行った培養DRGニューロンに対する電気生理学的研究の結果、ナルトレキソン、ナロキソン、ジプレノルフィン、エトルフィン又はジヒドロエトルフィン等の各々低濃度（fM-pM）によって前処置を行う事により、モルヒネその他の両作用性オピオイド作用物質のAPD延長効果は、当該ニューロンのμ、δ、κ型興奮性オピオイド受容体の選択的な拮抗作用により確実に阻止される事が判明した。上述のような興奮性オピオイド受容体拮抗物質と併用することにより、モルヒネその他臨床応用されている両作用性オピオイド作用物質は、生体に対するオピオイド投与時に通常みられると同様な感覚ニューロンの作用に対する抑制効果が著しく増強された。
【００６０】
このような条件下では、これら両作用性オピオイド作用物質は、pM-nM（すなわち、10-12-10-9 M）濃度により当該APDを短縮（延長ではなく）したが、通常ではこれら作用物質が当該APDを短縮するために必要とする濃度は、0.1-1.0（すなわち、10-7-10-6 M）である（図４及び図５）。また、これら両作用性オピオイド作用物質の興奮性副作用を確実に抑制しようとすれば、通常は発現するはずの当物質による抑制効果も減弱する結果となる。そこで、本発明のように、これら興奮性オピオイド受容体拮抗物質の１種の比較的低濃度と、モルヒネ又は他の両作用性オピオイド作用物質のμ、δ、κ等の亜型とを併用することにより、当作用物質の鎮痛作用を著しく増強し、さらに、エトロフィン又はジヒドロエトロフィンなどの大量かつ単独投与時に得られる、モルヒネの1000培以上の鎮痛効果にも匹敵する効果が、当作用物質を上記のように併用投与する事により得られる。
【００６１】
また、10-6 M 濃度のモルヒネ又は他の両作用性オピオイド作用物質により感覚ニューロンを継続処理（１週間以上の培養）した試料に対し、上述の興奮性オピオイド受容体拮抗物質の１種を低（pM）濃度（10-12 M）で併用することによりオピオイドに対する過感受性（ナロキソンー急発性のAPD延長を含む）の発現を阻止し、さらに、オピオイドの継続的処理後に通常みられるオピオイド効果に対する耐性も阻止することが可能となる。今回の実験パラダイムは、以前にも今回と同じ研究者による培養感覚ニューロンを用いた研究でも応用され、その結果、次のような成績を得た。すなわち、ガングリオシドGM1 と選択的に結合して興奮性GM1ー調節性オピオイド受容体の媒介効果（オピオイドの抑制性効果ではなく）を阻止するとされるコレラ毒ーB亜型（Shen and Crain，Brain Res.，Vol．
531，pp．1-7，1990参照）の 10-7 と、オピオイドの継続投与との併用により、これらニューロンの感受性を人口的に変化させる事ができた。この事実は、オピオイドに対する依存性／習慣性および耐性などが生体内で発現するときの細胞性変化を示唆すると考えられる（Shen and Crain，Brain Res.，Vol．597，pp．74-83，1992参照)。
【００６２】
本発明に従えば、興奮性オピオイド受容体拮抗物質の１種の比較的少量の臨床投与量(例えば、ナルトレキソン、ナロキソン、エトルフィン、ジヒドロエトルフィン又はジプレノルフィン等のいずれかを約 1 mcg)と、モルヒネその他従来の両作用性オピオイド鎮痛剤の 100-1000 mcgとを併用投与することにより、それら鎮痛剤の10 mg 以上を単独投与した際にみられる鎮痛効果と同等の効果が得られ、さらに、それら鎮痛剤の10 mg以上を単独投与した際に通常みられる耐性、身体的依存性その他の興奮性副作用などの発現を軽減または阻止することが可能となる。また、これら興奮性オピオイド受容体拮抗剤をμg 単位で単独投与することにより、内因性オピオイドペプタイドによる鎮痛効果が増強され、その結果、慢性的疼痛が軽減される。
【００６３】
オピエート常習の既往例に対する治療
既往にオピエート、コカイン、又はアルコール等の常習歴を有する例における高度依存性を抑制するための長期的な維持療法として、ナルトレキソンの微量(約 1g)が長期かつ経口投与される。このようなナルトレキソンの微量投与により、オピオイドに対する高度依存性およびオピオイドー誘導のコカイン又はアルコールに対する依存性などの発現に関与する、興奮性オピオイド受容体の持続的活性化が選択的に阻止される。しかも、上記の治療に際しては、ナルトレキソンの大量投与時にみられるような、抑制性オピオイド受容体機能の阻害により発現する身体違和感その他の副作用は認められない。一方、ナルトレキソンの微量(約 1 μg)と、メサドンの低用量とを長期間併用投与することにより、当該薬物に対する依存性を効果的に治療することができる。
【００６４】
本発明を特定の態様に基づいて説明したが、これらは本発明の様々な見地を単に説明したにすぎない。すなわち、上記の態様には多くの変更をなすことができ、また他の変更も本発明の精神および範囲を逸脱しない限り可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
上記の要旨、本発明のさらなる目的および性質は、図面を参照しながら、本発明の現在好適な態様の以下の詳細な説明によりさらに理解されるであろう。
【図１】両作用性オピオイド作用物質のモルヒネ、及び本発明で取り扱ったナルトレキソン、ナロキソン等の化学構造式を示す。ナルトレキソンはナロキソンのN-cyclopropylmethyl 体である。
【図２】侵害受容性感覚ニューロンの活動電位持続時間（APD）に対するエトロフィンの直接的抑制効果、およびモルヒネ投与による興奮性反応（ADPの延長）に対するエトロフィンの阻止効果を示す。エトロフィン投与歴が無い後根神経節（DRG）ニューロンに対し、エトロフィンの低濃度（pMーnM）を急性的に適用すると、濃度依存的、かつ、ナロキソン適用ー回復的に当該ADPが短縮される。これとは対照的に、モルヒネその他の両作用性オピオイド作用物質の場合には、エトロフィンの＜pM濃度により選択的に阻止される程度の、上述のオピオイド作用物質の濃度によりAPDが延長されるが、この延長されたAPD、はモルヒネのnM濃度により選択的に短縮される。
【図３】各種オピオイドの用量ー反応曲線である。エトロイフィン及びジヒドロエトロフィンは共に、本試験で採用した全ての濃度（fMーμM）において、DRGニューロンのAPDに対して濃度依存的な短縮を示すのみであった。これとは対照的にジノルフィンAは（モルヒネ他の両作用性オピオイドと同様に）、低濃度（fMーnM）で濃度依存的にAPDを延長したが、当該APDを短縮させて釣り鐘型の用量ー反応曲線を得るためには、ジノフィリンAのより高濃度（約0.1ー1.0 μM）が必要である。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、モルヒネと低濃度（pM）のジプレノフィリンとの併用により、DRGニューロンにおけるAPDの延長が選択的に阻止されること、すなわち低濃度のモルヒネにより濃度依存的にAPDが著しく短縮されることを示す(エトロフィンのAPD短縮効果とは対照的である)。一方、モルヒネとジヒドロエトロフィンの高濃度（nM）との併用により、抑制性および興奮性オピオイド作用が共に阻止される。
【図５】モルヒネと低濃度（pM）のナルトレキソンとの併用によりDRGニューロンにおけるAPDの延長が同じく選択的に阻止されること、すなわち低濃度のモルヒネニよりAPDが著しく短縮されることを示す。これとは対照的に高濃度のナルトレキソンは抑制性および興奮性オピオイド効果を共に阻止する。
【図６】DRGニューロンに対しモルヒネを継続的に併用すると、興奮性オピオイド受容体に対する各種拮抗物質に対する耐性／依存性の発現が抑制されることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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