(57)【要約】  【課題】  ビタミンＤ類の水酸化に関与するポリペプチドをコードするDNA改変体、並びにそれらDNA改変体を保持する形質転換体、およびそれらの形質転換体を用いた水酸化ビタミンＤ誘導体の製造方法の提供。  【解決手段】  ビタミンＤ類の水酸化活性が増強されたポリペプチドをコードするDNA改変体、このDNAによりコードされるポリペプチド、このDNAを担持する自律複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド、このDNAを保持する形質転換体、並びにこの形質転換体を培地で培養し、その培養液から水酸化ビタミンＤ誘導体を採取することを特徴とする水酸化ビタミンＤ誘導体の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜9)からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるDNA改変体。
1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGを、スレオニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
2)塩基217から塩基219にかけての配列GAGを、グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
3)塩基319から塩基321にかけての配列ACCを、スレオニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基412から塩基414にかけての配列ATGを、メチオニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
5)塩基454から塩基456にかけての配列GAGを、グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
6)塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、バリン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
7)塩基646から塩基648にかけての配列GAGを、グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
8)塩基655から塩基657にかけての配列GACを、アスパラギン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
9)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGを、グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
【請求項２】
配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜9)からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるDNA改変体。
1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGを、アルギニン、アラニン、グリシンまたはアスパラギンをコードするコドンに改変した改変部位
2)塩基217から塩基219にかけての配列GAGを、トリプトファン、プロリン、ロイシンまたはグルタミンをコードするコドンに改変した改変部位
3)塩基319から塩基321にかけての配列ACCを、グリシンまたはアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基412から塩基414にかけての配列ATGを、バリンをコードするコドンに改変した改変部位
5)塩基454から塩基456にかけての配列GAGを、グリシン、プロリン、リジンまたはトリプトファンをコードするコドンに改変した改変部位
6)塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、ロイシン、フェニルアラニン、アラニン、メチオニンまたはセリンをコードするコドンに改変した改変部位
7)塩基646から塩基648にかけての配列GAGを、アルギニン、フェニルアラニン、アラニン、メチオニンまたはアスパラギンをコードするコドンに改変した改変部位
8)塩基655から塩基657にかけての配列GACを、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンまたはグルタミン酸をコードするコドンに改変した改変部位
9)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGを、アルギニン、リジン、アスパラギンまたはヒスチジンをコードするコドンに改変した改変部位
【請求項３】
配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜16)からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるDNA改変体。
1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
2)塩基208から塩基210にかけての配列ACGを、グリシンをコードするコドンに改変した改変部位
3)塩基211から塩基213にかけての配列CTGを、アルギニンをコードするコドンに改変し、さらに塩基217から塩基219にかけての配列GAGをトリプトファンをコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基319から塩基321にかけての配列ACCを、グリシンをコードするコドンに改変した改変部位
5)塩基319から塩基321にかけての配列ACCを、アラニンをコードするコドンに改変した改変部位
6)塩基412から塩基414にかけての配列ATGを、バリンをコードするコドンに改変した改変部位
7)塩基454から塩基456にかけての配列GAGをリジンをコードするコドンに改変した改変部位
8)塩基454から塩基456にかけての配列GAGを、トリプトファンをコードするコドンに改変した改変部位
9)塩基454から塩基456にかけての配列GAGを、プロリンをコードするコドンに改変した改変部位
10)塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、ロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
11)塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、セリンをコードするコドンに改変した改変部位
12)塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、フェニルアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
13)塩基646から塩基648にかけての配列GAGを、メチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
14)塩基646から塩基648にかけての配列GAGを、アラニンをコードするコドンに改変した改変部位
15)塩基655から塩基657にかけての配列GACを、アラニンをコードするコドンに改変した改変部位
16)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
【請求項４】
配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜3)で示される改変部位を全て含んでなるDNA改変体。
1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
2)塩基655から塩基657にかけての配列GACを、メチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
3)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
【請求項５】
配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜4)で示される改変部位を全て含んでなるDNA改変体。
1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
2)塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、ロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
3)塩基646から塩基648にかけての配列GAGを、メチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
【請求項６】
請求項１から５までのいずれかの請求項に記載されたDNA改変体によりコードされるポリペプチド。
【請求項７】
請求項１から５までのいずれかの請求項に記載されたDNA改変体を担持する自律複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
【請求項８】
請求項７記載の組み換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体を培地で培養し、培養中または培養後に、増殖した形質転換体とビタミンＤ類とを接触させ、水酸化ビタミンＤ誘導体に変換し、こうして変換された水酸化ビタミンＤ誘導体を採取することを特徴とする水酸化ビタミンＤ誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＤ類の水酸化に関与するポリペプチドをコードするDNAを改変することにより得られる、ビタミンＤ類の水酸化活性が増強されたポリペプチドおよびそれらのポリペプチドをコードするDNA改変体、並びにそれらDNA改変体を保持する形質転換体、およびそれらの形質転換体を用いた水酸化ビタミンＤ誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＤは、主に高等生物において必須とされる脂溶性ビタミン群でコレステロールから生合成される。その生理作用はカルシウムの吸収促進や代謝促進、細胞分化誘導、免疫調節作用など多岐にわたり、生体において重要な役割を果たしている。
【０００３】
ヒトにおけるビタミンＤの生合成の主要な経路は、まずコレステロールから7-デヒドロコレステロール（プロビタミンＤ3）が合成された後、皮膚において紫外線と熱反応からビタミンＤ3がつくられる。ビタミンＤ3は肝臓のミトコンドリアに局在するシトクロムP450(CYP27A1)によって25位の水酸化を受けて25-ヒドロキシビタミンＤ3となる。その後、腎臓の近位尿細管において別のシトクロムP450(CYP27B1)によって、さらに1α位の水酸化を受けて1α,25-ジヒドロキシビタミンＤ3（活性型ビタミンＤ3）がつくられる。この物質が細胞内の受容体（レセプター）に結合することで、生理作用発現に関わる核内の特定の遺伝子の発現調節を行うことが分かっている。
【０００４】
従って、肝臓または腎臓が機能不全に陥ると、正常なビタミンＤ代謝が阻害されることがある。そのような患者では血中の25-ヒドロキシビタミンＤ3や1α,25-ジヒドロキシビタミンＤ3が極度に低下することがあり、治療のためには25-ヒドロキシビタミンＤ3や1α,25-ジヒドロキシビタミンＤ3を投与して補う必要がある。
【０００５】
一方、ビタミンＤ3の水酸化に関与するシトクロムP450遺伝子に変異があることに起因する水酸化機能不全により1α,25-ジヒドロキシビタミンＤ3が不足して起こる先天的なくる病が知られている。のみならず、後天的なくる病や骨粗鬆症を含めて、1α,25-ジヒドロキシビタミンＤ3が不足することで起こる疾患の治療薬として、1α,25-ジヒドロキシビタミンＤ3および同様な生理作用をもつ類縁化合物の重要性は非常に高い。
【０００６】
さらに、ビタミンＤ類はその多様な生理活性から様々な誘導体が薬物の候補として研究され、抗腫瘍薬、乾癬治療薬、免疫賦活薬などの開発にも期待がもたれている。このような観点からビタミンＤ類を誘導体化する一手法として水酸化反応が重要となっている。この場合、水酸化の位置は1α位および25位に限定されず、他の位置の水酸化に高い必要性が生じることもある。以上のように製薬的または創薬的な需要があるため水酸化ビタミンＤ誘導体の製造法を改良し、より効率的で安価に水酸化ビタミンＤ誘導体を製造して供給することが医薬産業から強く望まれてきた。
【０００７】
ビタミンＤ類の中で特に生理活性が強く、価値の高い1α,25-ジヒドロキシビタミンＤ3について言及すると、その製造手法としては、有機合成法、ヒトのシトクロムP450を利用する方法、微生物を利用する方法等が挙げられる。このうち有機合成法ではコレステロールから約20工程を経て合成する製法が知られている（非特許文献１および２参照）。またヒトのシトクロムP450を利用する方法では、関与する遺伝子、発現する技術、シトクロムP450酵素の性質に関する生物学的・生化学的知見の蓄積がある（非特許文献３参照）。しかし、これら二つのいずれの方法も高い製造コストや低い生産性の問題から、実用化には極めて不向きである。
【０００８】
微生物を利用する方法としては放線菌シュードノカルディア・オートトロフィカを変換菌として用いたビタミンＤ3から1α,25-ジヒドロキシビタミンＤ3の製造方法が知られており、この方法は産業的に実用化されている（非特許文献４、非特許文献５、特許文献１および特許文献２参照）。この方法は、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属放線菌を発酵槽において培養した後、ビタミンＤ3を反応基質として培養液に添加し、菌体のもつ水酸化酵素の作用で反応を進行させて、その結果蓄積する1α,25-ジヒドロキシビタミンＤ3を培養液から回収・精製して行うものである。
【０００９】
この方法には、いくつかの問題点がある。変換微生物として生育時間の長い放線菌を用いるため製造期間が比較的長期になってしまう。さらにこの変換菌がもつビタミンＤ3変換作用の中には目的の水酸化反応のみならず、望ましくない副反応も存在する。その副反応として、例えば26位あるいは24位の水酸化などが挙げられる。また基質であるビタミンＤ3や目的生成物である1α,25-ジヒドロキシビタミンＤ3に対する分解活性も存在する。特に1α,25-ジヒドロキシビタミンＤ3の分解は、目的物の蓄積量に直接的に関わる極めて重要な問題である。これに加えて、副産物の存在も変換反応後の培養液からの1α,25-ジヒドロキシビタミンＤ3の回収・精製工程を多くし、結果的に目的物の収量を低下させる。
【００１０】
このような問題点を解決するため、変換菌である放線菌シュードノカルディア・オートトロフィカから水酸化酵素をコードするDNAを取得し、これを生育の速い大腸菌に組込み、得られた形質転換体を用いてビタミンＤ類を水酸化し、水酸化ビタミンＤ誘導体を効率的に生産する方法が提案されている（特許文献３）。この方法は、変換菌として形質転換された大腸菌を用いるため比較的短期間でビタミンＤ類を水酸化することができるが、水酸化酵素そのものの基質選択性が広く副生物の産生を抑制できない、水酸化酵素の比活性が十分でない等の問題点は残っており、依然として形質転換体の水酸化能は、十分満足できる水準にまでは至っていない。このように水酸化ビタミンＤ誘導体を製造するためにさらなる効率的な方法の開発が強く望まれていた。
【００１１】
【特許文献１】特開平2-469号公報
【特許文献２】特開平2-231089号公報
【特許文献３】国際公開（ＷＯ）第2007/138894号パンフレット
【非特許文献１】Kametani T., Furuyama H., Synthesis Med. Res. Rev. 7, 147-171 (1987).
【非特許文献２】Zunk G-D., Okamura W.H. Norman A.W., Chem. Rev. 95, 1877-1952 (1995).
【非特許文献３】T.Sakakiらの総説,Frontiers in Bioscience,10,119-134,2005
【非特許文献４】J.Sasaki et.al,Applied Microbiology and Biotechnology,38,152-157,1992
【非特許文献５】K.Takeda et.al,J.Ferment.Bioeng.,78,380-382,1994
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、ビタミンＤ類の水酸化酵素の比活性を改善し、水酸化ビタミンＤ誘導体を効率よく生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず特許文献３に開示されたシュードノカルディア・オートトロフィカ  NBRC12743株から取得したビタミンＤ類の水酸化酵素をコードするDNAの塩基配列にランダムに変異を加え、DNA改変体のライブラリーを調製した。そしてその中から大腸菌に組み込んだときに高い水酸化活性を示すDNA改変体を選択し、変異が加えられた部位(改変部位）を多数特定した。さらにこれらの改変部位を組合わせて、さらに機能が高められたDNA改変体を調製した。次にこれらの改変体を含むベクターを大腸菌に組み込んで水酸化活性が強化された水酸化酵素を発現させ、水酸化ビタミンＤ誘導体を効率よく生産できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［９］に関する。
［１］配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜9)からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるDNA改変体。
1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGをスレオニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
2)塩基217から塩基219にかけての配列GAGをグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
3)塩基319から塩基321にかけての配列ACCをスレオニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基412から塩基414にかけての配列ATGをメチオニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
【００１５】
5)塩基454から塩基456にかけての配列GAGをグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
6)塩基466から塩基468にかけての配列GTGをバリン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
7)塩基646から塩基648にかけての配列GAGをグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
8)塩基655から塩基657にかけての配列GACをアスパラギン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
9)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGをグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
【００１６】
［２］  配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜9)からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるDNA改変体。
1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGをアルギニン、アラニン、グリシンまたはアスパラギンをコードするコドンに改変した改変部位
2)塩基217から塩基219にかけての配列GAGをトリプトファン、プロリン、ロイシンまたはグルタミンをコードするコドンに改変した改変部位
3)塩基319から塩基321にかけての配列ACCをグリシンまたはアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基412から塩基414にかけての配列ATGをバリンをコードするコドンに改変した改変部位
【００１７】
5)塩基454から塩基456にかけての配列GAGをグリシン、プロリン、リジンまたはトリプトファンをコードするコドンに改変した改変部位
6)塩基466から塩基468にかけての配列GTGをロイシン、フェニルアラニン、アラニン、メチオニンまたはセリンをコードするコドンに改変した改変部位
7)塩基646から塩基648にかけての配列GAGをアルギニン、フェニルアラニン、アラニン、メチオニンまたはアスパラギンをコードするコドンに改変した改変部位
8)塩基655から塩基657にかけての配列GACをアラニン、セリン、スレオニン、プロリンまたはグルタミン酸をコードするコドンに改変した改変部位
9)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGをアルギニン、リジン、アスパラギンまたはヒスチジンをコードするコドンに改変した改変部位
【００１８】
［３］配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜9)からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるDNA改変体。
1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGをアルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
2)塩基208から塩基210にかけての配列ACGをグリシンをコードするコドンに改変した改変部位
3)塩基211から塩基213にかけての配列CTGをアルギニンをコードするコドンに改変し、さらに塩基217から塩基219にかけての配列GAGをトリプトファンをコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基319から塩基321にかけての配列ACCをグリシンをコードするコドンに改変した改変部位
5)塩基319から塩基321にかけての配列ACCをアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
【００１９】
6)塩基412から塩基414にかけての配列ATGをバリンをコードするコドンに改変した改変部位
7)塩基454から塩基456にかけての配列GAGをリジンをコードするコドンに改変した改変部位
8)塩基454から塩基456にかけての配列GAGをトリプトファンをコードするコドンに改変した改変部位
9)塩基454から塩基456にかけての配列GAGをプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
10)塩基466から塩基468にかけての配列GTGをロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
【００２０】
11)塩基466から塩基468にかけての配列GTGをセリンをコードするコドンに改変した改変部位
12)塩基466から塩基468にかけての配列GTGをフェニルアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
13)塩基646から塩基648にかけての配列GAGをメチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
14)塩基646から塩基648にかけての配列GAGをアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
15)塩基655から塩基657にかけての配列GACをアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
16)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGをアルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
【００２１】
［４］配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜3)で示される改変部位を全て含んでなるDNA改変体。
1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGをアルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
2)塩基655から塩基657にかけての配列GACをメチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
3)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGをアルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
【００２２】
［５］配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜4)で示される改変部位を全て含んでなるDNA改変体。
1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGをアルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
2)塩基466から塩基468にかけての配列GTGをロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
3)塩基646から塩基648にかけての配列GAGをメチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGをアルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
【００２３】
［６］［１］から［５］までのいずれかの項に記載されたDNA改変体にコードされるポリペプチド。
［７］［１］から［５］までのいずれかの項に記載されたDNA改変体を担持する自律複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
［８］［７］記載の組み換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
［９］［８］記載の形質転換体を培地で培養し、培養中または培養後に、増殖した形質転換体とビタミンＤ類とを接触させ、水酸化ビタミンＤ誘導体に変換し、こうして変換された水酸化ビタミンＤ誘導体を採取することを特徴とする水酸化ビタミンＤ誘導体の製造方法。
【００２４】
以下に本願明細書において記載する用語、記号等の意義を説明し、本発明を詳細に説明する。
本願明細書において用いる「ビタミンＤ類」とは、本発明の水酸化酵素により基質として認識され、1α位、25位、その他の炭素に一酸素原子添加を行うことが可能なものを意味し、以下の化合物を包含する。
(1)ビタミンＤ3、ビタミンＤ2などのビタミンＤ類
(2)ビタミンＤ類の前駆体、代謝物、その他の誘導体（この中には、25-ヒドロキシビタミンＤ3、1α-ヒドロキシビタミンＤ3などが含まれる。）
(3)コレスタン系のステロイド類またはその修飾化合物（この中には、コレステロール、7-デヒドロコレステロールなどが含まれる。）
【００２５】
本明細書において用いる「水酸化ビタミンＤ誘導体」とは、本発明の水酸化酵素によって、ビタミンＤ類の1α位、25位、その他の位置の炭素原子に一酸素原子が添加された化合物を意味する。また、本明細書にて用いる「ビタミンＤ類の水酸化酵素活性」とは、ビタミンＤ類を水酸化し、水酸化ビタミンＤ誘導体へ変換する酵素活性を意味する。そして、「ビタミンＤ類の水酸化酵素」とは、ビタミンＤ類の水酸化酵素活性をもつポリペプチドを意味し、「VDH」と略記することもある。さらに、本明細書にて用いる「DNA改変体」とは、構成塩基の削除、変換、付加、挿入などにより修飾されたDNAを意味する。そして「野生型DNA」とは、配列番号１で示されるDNAを意味し、「VDH遺伝子」と言うこともある。「野生型VDH」とは、配列番号１で示されるDNAによりコードされるポリペプチドを意味する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、ビタミンＤ類の水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAを改変し、水酸化酵素機能が向上したポリペプチドをコードするDNAを取得できた。具体的には、ビタミンＤ2の25位水酸化能が向上したもの、ビタミンＤ3の25位水酸化能が向上したもの、宿主大腸菌に組み込んだときにポリペプチドの発現量が増加するもの等、いくつかの特徴的性質をもつDNA改変体を取得できた。さらに、それらのDNAを担持するプラスミド、そのプラスミドで形質転換した形質転換体を作成し、その形質転換体を用いて各種の水酸化ビタミンＤ誘導体を効率よく製造することができた。従って本発明により、産業上極めて有用で、かつ効率のよい水酸化ビタミンＤ誘導体の製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２８】
本発明のDNA
本発明者らは、まずシュードノカルディア・オートトロフィカ NBRC12743株のゲノムDNAを鋳型とし、特許文献１に記載された情報に従って適宜設計されたプライマーを用いてPCRを行い、ビタミンＤ類の水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA（配列番号１）を含むDNA断片を取得した。次いで、フェレドキシンをコードするDNA、フェレドキシン還元酵素をコードするDNAおよび大腸菌のリボゾーム結合部位として有効とされるDNA（SD配列）をすべて含むビタミンＤ水酸化酵素発現用プラスミドにこの断片を連結させ、大腸菌においてビタミンＤ類の水酸化酵素活性を発現しうるプラスミドを作製した。得られたプラスミドを用いて、エラープローンPCRにより配列番号１で示されるDNAにランダムな変異が入ったDNA断片を増幅し、ビタミンＤ水酸化酵素発現用プラスミドに連結させ、DNA改変体を含むプラスミドのライブラリーを作製した。次いでこれらライブラリーのプラスミドで形質転換した大腸菌がもつビタミンＤ類の水酸化酵素活性をスクリーニングすることにより、特徴的な水酸化活性をもつポリペプチドをコードする複数のDNA改変体を見出したものである。
【００２９】
こうして得られた本発明のビタミンＤ類の水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA改変体は、下記１で示されるものである。
１．配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜9)からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるDNA改変体。
1-1)塩基208から塩基210にかけての配列ACG（70残基目のアミノ酸に対応）を、スレオニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
1-2)塩基217から塩基219にかけての配列GAG（73残基目のアミノ酸に対応）を、グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
1-3)塩基319から塩基321にかけての配列ACC（107残基目のアミノ酸に対応）を、スレオニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
1-4)塩基412から塩基414にかけての配列ATG（138残基目のアミノ酸に対応）を、メチオニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
1-5)塩基454から塩基456にかけての配列GAG（152残基目のアミノ酸に対応）を、グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
1-6)塩基466から塩基468にかけての配列GTG（156残基目のアミノ酸に対応）を、バリン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
1-7)塩基646から塩基648にかけての配列GAG（216残基目のアミノ酸に対応）を、グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
1-8)塩基655から塩基657にかけての配列GAC（219残基目のアミノ酸に対応）を、アスパラギン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
1-9)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAG（384残基目のアミノ酸に対応）を、グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
【００３０】
本発明のDNA改変体の具体例としては、下記２で示される改変体を挙げられる
２．配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜9)からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるDNA改変体。
2-1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGを、アルギニン、アラニン、グリシンまたはアスパラギンをコードするコドンに改変した改変部位
2-2)塩基217から塩基219にかけての配列GAGを、トリプトファン、プロリン、ロイシンまたはグルタミンをコードするコドンに改変した改変部位
2-3)塩基319から塩基321にかけての配列ACCを、グリシンまたはアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
2-4)塩基412から塩基414にかけての配列ATGを、バリンをコードするコドンに改変した改変部位
2-5)塩基454から塩基456にかけての配列GAGを、グリシン、プロリン、リジンまたはトリプトファンをコードするコドンに改変した改変部位
2-6)塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、ロイシン、フェニルアラニン、アラニン、メチオニンまたはセリンをコードするコドンに改変した改変部位
2-7)塩基646から塩基648にかけての配列GAGを、アルギニン、フェニルアラニン、アラニン、メチオニンまたはアスパラギンをコードするコドンに改変した改変部位
2-8)塩基655から塩基657にかけての配列GACを、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンまたはグルタミン酸をコードするコドンに改変した改変部位
2-9)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGを、アルギニン、リジン、アスパラギンまたはヒスチジンをコードするコドンに改変した改変部位
【００３１】
さらに、上記改変体のうち、特に優れた特長を示す改変体として、下記３で示される改変体を挙げられる
３．配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜16)からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるDNA改変体。
3-1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
3-2)塩基208から塩基210にかけての配列ACGを、グリシンをコードするコドンに改変した改変部位
3-3)塩基211から塩基213にかけての配列CTGを、アルギニンをコードするコドンに改変し、さらに塩基217から塩基219にかけての配列GAGを、トリプトファンをコードするコドンに改変した改変部位
3-4)塩基319から塩基321にかけての配列ACCを、グリシンをコードするコドンに改変した改変部位
3-5)塩基319から塩基321にかけての配列ACCを、アラニンをコードするコドンに改変した改変部位
3-6)塩基412から塩基414にかけての配列ATGを、バリンをコードするコドンに改変した改変部位
3-7)塩基454から塩基456にかけての配列GAGを、リジンをコードするコドンに改変した改変部位
3-8)塩基454から塩基456にかけての配列GAGを、トリプトファンをコードするコドンに改変した改変部位
3-9)塩基454から塩基456にかけての配列GAGを、プロリンをコードするコドンに改変した改変部位
3-10)塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、ロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
3-11)塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、セリンをコードするコドンに改変した改変部位
3-12)塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、フェニルアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
3-13)塩基646から塩基648にかけての配列GAGを、メチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
3-14)塩基646から塩基648にかけての配列GAGを、アラニンをコードするコドンに改変した改変部位
3-15)塩基655から塩基657にかけての配列GACを、アラニンをコードするコドンに改変した改変部位
3-16)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
【００３２】
これらのDNA改変による優れた効果は、以下のa)〜c)にまとめることができる。
a)DNA改変体によりコードされるポリペプチド自体のビタミンＤ類水酸化能が増強されている（水酸化能の比活性が高くなっている）。
b)形質転換した大腸菌が発現するポリペプチド量が増強されている（水酸化酵素量が増加している）。
c)水酸化酵素としてのビタミンＤ3の基質選択性が高い（ビタミンＤ3を水酸化する活性が他のビタミンＤ類に対する活性に比べて高い）。
【００３３】
なお、上記の各DNA改変体がもつ個々の特長は以下のとおりである。
3-1)「塩基208から塩基210にかけての配列ACGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」を組み込んだ形質転換体は、ビタミンＤ2の変換反応において、25-ヒドロキシビタミンＤ2の生成量が増大する。そして、そのDNA改変体がコードするポリペプチドは、ビタミンＤ2の25位水酸化能の比活性が高い。
3-2)「塩基208から塩基210にかけての配列ACGを、グリシンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」を組み込んだ形質転換体は、ビタミンＤ3の変換反応において、25-ヒドロキシビタミンＤ3の生成量が増大する。そして、そのDNA改変体がコードするポリペプチドは、ビタミンＤ3の25位水酸化能の比活性が高い。
3-3)「塩基211から塩基213にかけての配列CTG（71残基目のアミノ酸に対応）を、アルギニンをコードするコドンに改変し、さらに塩基217から塩基219にかけての配列GAGを、トリプトファンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」を組み込んだ形質転換体は、ビタミンＤ2、ビタミンＤ3の各変換反応において、対応する25-ヒドロキシ体の生成量が増大する。そして、そのDNA改変体がコードするポリペプチドは、ビタミンＤ2およびビタミンＤ3の25位水酸化能の比活性がいずれも高い。
【００３４】
3-4)「塩基319から塩基321にかけての配列ACCを、グリシンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」を組み込んだ形質転換体は、ビタミンＤ2の変換反応において、25-ヒドロキシビタミンＤ2の生成量が増大する。
3-5)「塩基319から塩基321にかけての配列ACCを、アラニンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」を組み込んだ形質転換体は、ビタミンＤ3の変換反応において、25-ヒドロキシビタミンＤ3の生成量が増大する。また、そのDNA改変体がコードするポリペプチドは、ビタミンＤ2およびビタミンＤ3の25位水酸化能の比活性がいずれも高い。
3-6)「塩基412から塩基414にかけての配列ATGを、バリンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」を組み込んだ形質転換体は、ビタミンＤ2、ビタミンＤ3の各変換反応において、対応する25-ヒドロキシ体の生成量が増大する。そして、そのDNA改変体がコードするポリペプチドは、ビタミンＤ2およびビタミンＤ3の25位水酸化能の比活性がいずれも高い。
【００３５】
3-7)「塩基454から塩基456にかけての配列GAGを、リジンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」を組み込んだ形質転換体は、ビタミンＤ2、ビタミンＤ3の各変換反応において、対応する25-ヒドロキシ体の生成量が増大する。
3-8)「塩基454から塩基456にかけての配列GAGを、トリプトファンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」がコードするポリペプチドは、ビタミンＤ2の25位水酸化能の比活性が高い。
3-9)「塩基454から塩基456にかけての配列GAGを、プロリンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」がコードするポリペプチドは、ビタミンＤ3の25位水酸化能の比活性が高い。
3-10)「塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、ロイシンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」を組み込んだ形質転換体は、そのDNA改変体がコードするポリペプチドの発現量が増加し、ビタミンＤ3の変換反応において、25-ヒドロキシビタミンＤ3の生成量が増大する。
【００３６】
3-11)「塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、セリンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」を組み込んだ形質転換体は、ビタミンＤ2の変換反応において、25-ヒドロキシビタミンＤ2の生成量が増大する。また、そのDNA改変体がコードするポリペプチドはビタミンＤ2の25位水酸化能の比活性が高い。
3-12)「塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、フェニルアラニンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」がコードするポリペプチドはビタミンＤ3の25位水酸化能の比活性が高い。
3-13)「塩基646から塩基648にかけての配列GAGを、メチオニンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」を組み込んだ形質転換体は、ビタミンＤ2、ビタミンＤ3の各変換反応において、対応する25-ヒドロキシ体の生成量が増大する。
【００３７】
3-14)「塩基646から塩基648にかけての配列GAGを、アラニンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」がコードするポリペプチドは、ビタミンＤ2およびビタミンＤ3の25位水酸化能の比活性がいずれも高い。
3-15)「塩基655から塩基657にかけての配列GACを、アラニンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」を組み込んだ形質転換体は、ビタミンＤ2、ビタミンＤ3の各変換反応において、対応する25-ヒドロキシ体の生成量が増大する。そして、そのDNA改変体がコードするポリペプチドは、ビタミンＤ2およびビタミンＤ3の25位水酸化能の比活性がいずれも高い。
3-16)「塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位をもつDNA改変体」を組み込んだ形質転換体は、ビタミンＤ2、ビタミンＤ3の各変換反応において、対応する25-ヒドロキシ体の生成量が増大する。そして、そのDNA改変体がコードするポリペプチドは、ビタミンＤ2およびビタミンＤ3の25位水酸化能の比活性がいずれも高い。
【００３８】
さらに上記のDNA改変体の改変部位を組合わせて、さらに個々の機能が強化されたDNA改変体を取得することもできる。そのようなDNA改変体の具体例として下記４および５で示される改変体が挙げられる。
【００３９】
４．配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜3)で示される改変部位を全て含んでなるDNA改変体。
1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
2)塩基655から塩基657にかけての配列GACを、メチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
3)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
上記４で示されるDNA改変体は、大腸菌における発現量が野生型DNAの84％と比較的良好に発現し、その上、発現したポリペプチドが示すビタミンＤ2およびビタミンＤ3の25位水酸化能の比活性が野生型VDHに対して高い（それぞれ4.8倍と8.7倍）という特長がある。
【００４０】
５．配列番号１の塩基1から塩基1212までの連続した塩基配列を含んでなるDNAを改変したDNA改変体であって、以下の1)〜4)で示される改変部位を全て含んでなるDNA改変体。
1)塩基208から塩基210にかけての配列ACGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
2)塩基466から塩基468にかけての配列GTGを、ロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
3)塩基646から塩基648にかけての配列GAGを、メチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基1150から塩基1152にかけての配列GAGを、アルギニンをコードするコドンに改変した改変部位
上記５で示されるDNA改変体は、大腸菌における発現量が野生型DNAの43％と発現量が大幅に減少しているが、発現したポリペプチドが示すビタミンＤ2およびビタミンＤ3の25位水酸化能の比活性が野生型VDHに対して著しく高い（それぞれ11.4倍と21.6倍）という特長がある。
【００４１】
本発明のDNA改変体の取得方法は特に限定されない。前述したとおり、シュードノカルディア・オートトロフィカ NBRC12743株のゲノムDNAを鋳型とし、PCRにより配列番号１の配列を含むDNAを取得し、これを用いてエラープローンPCRにより複数の変異を加えたDNA改変体を作成して、それらで形質転換された大腸菌の水酸化活性をスクリーニングして取得することができる。
【００４２】
例えば、上記したVDH遺伝子断片を鋳型として使用し、配列番号１に示したVDH遺伝子のオープンリーディングフレームの全長を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてPCRを行う。反応液中のマンガンイオン濃度やデオキシグアノシン5'-三リン酸(dGTP)の濃度を変化させることにより変異の誘発を操作できる。PCRの反応条件は適宜設定することができ、例えば、94℃で30秒間（変性）、55℃で30秒〜1分間（アニーリング）、72℃で2分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば25サイクル行った後、72℃で7分間反応させる条件などを挙げることができる。増幅されたDNA断片にはランダムに変異が導入されており、適当な宿主中で増幅可能なベクター中にクローニングすることができる。
【００４３】
また、改変部位を指定して特定の塩基部分を置換することも可能である。例えば、置換したいアミノ酸をコードするコドンを中央に含むプライマー(変異-F)とそれに対する相補配列を含むプライマー(変異-R)を作成する。VDH遺伝子の5'末端から下流のDNA断片を増幅するプライマー(VDH-F)とプライマー（変異-R）のセットで完全長VDH遺伝子断片を鋳型としてPCRを行いVDH遺伝子の5'末端から置換挿入部位までを含むDNA断片を増幅する。また、VDH遺伝子の3'末端から上流のDNA断片を増幅するプライマー(VDH-R)とプライマー（変異-F）のセットで完全長VDH遺伝子断片を鋳型としてPCRを行い置換挿入部位からVDH遺伝子の3'末端までを含むDNA断片を増幅する。次にVDH-FとVDH-Rのプライマーセットを用いて上記で調製したVDH遺伝子の5'末端から置換挿入部位までを含むDNA断片と置換挿入部位からVDH遺伝子の3'末端までを含むDNA断片を鋳型としてPCRを行い、置換が導入された完全長VDH遺伝子断片を増幅する。その他、本明細書において開示した配列情報に基づいて全合成することも可能である。
【００４４】
上記したプライマーの調製、DNAライブラリーの構築、DNAライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００４５】
本発明のポリペプチドの取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したポリペプチドでもよいし、遺伝子組み換え技術により作製したものでもよい。遺伝子組み換え技術により作製する場合には、先ず、本明細書に上記したとおり、当該ポリペプチドをコードするDNA改変体を取得する。このDNA改変体を適当な発現系に導入することにより、本発明のポリペプチドを産生することができる。発現系でのポリペプチドの発現については本明細書中において後記する。
【００４６】
本発明の組み換えベクター
本発明のDNA改変体は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自律的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。発現ベクターにおいて本発明のDNAは、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すDNA配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００４７】
本発明の形質転換体およびそれを用いた組み換えポリペプチドの製造
本発明のDNA改変体または組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。本発明のDNAまたは組み換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌または大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。例えば、エレクトロポレーション法は以下のように行うことができる。外来遺伝子が挿入されたプラスミドをコンピテント細胞の懸濁液に加え、この懸濁液をエレクトロポレーション法専用のキュベットに入れ、そのキュベットに高電圧の電気パルスをかける。その後選択培地で培養し、平板寒天培地上で形質転換体を単離する。
【００４８】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、DNA構築物を宿主染色体に組み込んで組み換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。DNA構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組み換えまたは異種組み換えにより行うことができる。
【００４９】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離精製するには、通常のポリペプチドの単離、精製法を用いればよい。
【００５０】
例えば、本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のポリペプチドの単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、SP-Sepharose FF(アマシャムバイオサイエンス社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００５１】
水酸化ビタミンＤ誘導体の製造方法
本発明は、ビタミンＤ類の水酸化酵素活性が向上したポリペプチドをコードするDNA改変体を導入した形質転換体を用い、この形質転換体の存在下でビタミンＤ類を水酸化させることを含む、水酸化ビタミンＤ誘導体の製造方法を包含する。
【００５２】
このような形質転換体の存在下でビタミンＤ類を水酸化させる条件は、以下のとおりである。
まず形質転換体中のビタミンＤ水酸化酵素関連DNA（ビタミンＤ類の水酸化酵素をコードするDNA、フェレドキシンをコードするDNAおよびフェレドキシン還元酵素をコードするDNA）を必要により誘導物質を添加して菌体内で発現させる。これらのDNAが発現した菌体を基質であるビタミンＤ類と接触させ、変換反応をさせる。変換反応の温度は、形質転換体の至適温度を考慮して、適宜決定できる。また反応時間も、水酸化ビタミンＤ誘導体への変換率（反応の進行度合い）等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、２０〜３１℃で、1〜5日が好適である。さらに、反応様式は、バッチ式でも連続式でも、いずれの形式でも実施することができる。
【００５３】
生成した水酸化ビタミンＤ誘導体の単離および精製は、一般に微生物代謝産物をその培養液から単離するために用いられる分離、精製の方法が利用できる。例えば、メタノール、エタノール、アセトン、ブタノール、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、トルエン等を用いた有機溶媒抽出、ダイヤイオンHP-20などの疎水性吸着樹脂を用いた吸脱着処理、セファデックスLH-20等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィー、もしくは薄層クロマトグラフィーによる吸脱着処理、あるいは逆相カラム等を用いた高速液体クロマトグラフィー等の公知のあらゆる方法がこれにあたる。また、ここに示した方法に特に限定されるものではない。これらの方法を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、目的の水酸化ビタミンＤ誘導体を単離精製することができる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものではない。なお、下記の例中のパーセント(％)は、培地の説明においては重量パーセント、HPLCの移動相の説明においては、容量パーセントを示す。
【００５５】
実施例１  シュードノカルディア・オートトロフィカ(Pseudonocardia autotrophica) NBRC12743株染色体DNAの調製
Ｌ液体培地（1％ポリペプトン、0.5％酵母エキス、0.5％塩化ナトリウム、ｐH7.2）にシュードノカルディア・オートトロフィカ  NBRC12743株を接種し、30℃、3日間培養した。得られた培養液を3000rpm、10分間遠心して菌体を集めた。その菌体からIsoplant DNA isolation kit（ニッポン・ジーン社）を用いて染色体DNAを調製した。
【００５６】
実施例２  VDH発現用ベクター（pETAciBC-SD vector）の構築
プラスミドpDolABC (Biosci. Biotechnol. Biochem,70(6),1379-1385,2006参照)を制限酵素NcoIおよびBamHIで処理し、アシネトバクター(Acinetobacter) SP.OC4株(NITE P-125)由来のフェレドキシンをコードする遺伝子aciBを含むDNA断片を得た。この断片を大腸菌プラスミドベクターpETduet-1(ノバジェン社)のNcoIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをプラスミドAとした。さらに、pDolABCを鋳型とし、プライマーaciC-F（配列番号５４）とaciC-R（配列番号５５）を用いてPCRを行い、アシネトバクター SP.OC4株由来のフェレドキシン還元酵素をコードする遺伝子aciCを含むDNA断片を増幅し、制限酵素BamHIおよびHindIIIで処理した。この断片をプラスミドAのBamHIおよびHindIII部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをプラスミドBとした。次に、プラスミドBの二つのT7プロモーターのうち後ろ側の一つを取り除く為に、プラスミドBを制限酵素EcoRVおよびNotIで処理し、BKL Kit（タカラバイオ社）を用いて平滑化後、T4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをプラスミドCとした。
【００５７】
一方、シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーVDH-2F（配列番号５６）とプライマーVDH-2R（配列番号５７）を用いてPCRを行い、大腸菌のリボゾーム結合部位として有効とされるDNA配列を含むDNA断片を増幅し、制限酵素BglIIおよびBamHIで処理した。この断片をプラスミドCのBglIIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETaciBC-SD vectorとした（図１）。
【００５８】
実施例３  大腸菌でのビタミンＤ2変換系の構築
pETaciBC-SD vectorをNdeIとBamHIにより37℃で4時間消化し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)で精製しDNA断片-1を得た。次に、VDH遺伝子(配列番号１)を増幅するためにプライマーVDH-1F(配列番号２)とVDH-1R(配列番号３)を設計し作成した。次に、この2種のプライマーを用いてシュードノカルディア・オートトロフィカ  NBRC12743株染色体DNAをテンプレートとしてPCR反応を行った。PCR反応は、KOD plus(東洋紡社)とPCR増幅装置(Biometra社T Gradient)を用い、変性を98℃、20秒間、アニーリングを55℃、30秒間、伸長を68℃、2分間行う3段階の反応を25回繰り返した。その結果、約1.2kbpの大きさのDNA断片-2が増幅された。以下、特に記載しない場合PCRは上記の条件で行った。PCR反応にて増幅したDNA断片-2を、反応液からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)によって回収した。このDNA断片-2をNdeIとBglIIにより37℃で4時間消化し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)で精製しDNA断片-3を得た。
【００５９】
DNA断片-1とDNA断片-3をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）を用いて連結し、大腸菌DH5α株（タカラバイオ社）を形質転換した。その後、カルベニシリン（50μg/ml）を含むLB寒天培地（1.0％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、1.0％塩化ナトリウム、1.5％寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（50μg/ml）を含むLB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system(プロメガ社)を用いてプラスミドDNAの精製を行いpETaciBC-SD-vdhを得た。得られたプラスミドを鋳型としてVDH遺伝子塩基配列をDNA塩基配列解析装置(アプライドバイオシステムズ；3130)を用い、4種類のプライマー（配列番号４、５、６、７）を使用して付属のプロトコルに従いダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。その結果、VDH遺伝子に変異がなく、かつVDH遺伝子が目的部位に挿入されていることを確認した。このプラスミドで大腸菌BL21(DE3)を形質転換して大腸菌BL21(DE3)/pETaciBC-SD-vdh株を得た。
【００６０】
96穴ディープウエルプレート（IWAKI社）の各ウエルにカルベニシリン(50μg/ml)を含む1mlのTB培地（1.18％(w/v)ペプトン、2.36％(w/v)酵母エキス、0.94％(w/v) K2HPO4、0.22％(w/v) KH2PO4、0.4％(v/v)グリセロール）を入れ、大腸菌BL21(DE3)/pETaciBC-SD-vdhを植菌した。プレート用シェーカー（SCF-98-8:いわしや社）により30℃、800rpmで14時間培養した。レプリケーターを用いて、96穴ディープウエルプレート（IWAKI社）の各ウエル中にカルベニシリン(50μg/ml)とOvernight autoinduction system1(メルク社)を含む1mlのTB培地へ植菌した。プレート用シェーカー（SCF-98-8:いわしや社）により25℃、800rpmで24時間培養した。3500rpm、10分間の遠心により菌体を沈殿させて上澄みを捨て、500μlの反応液(CV2(50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.4、2％(w/v)グリセロール、50μg/mlカルベニシリン、0.1mM IPTG:Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside)、0.5％(w/v)部分メチル化β-シクロデキストリン、250mg/LビタミンＤ2、2.5％(v/v)DMSO)を加えた。プレート用シェーカー（SCF-98-8:いわしや社）により28℃、800rpmで5時間変換反応をした。500μlのメタノールを添加し、反応を止め、800rpmで5分間攪拌した。4000rpm、10分間の遠心により菌体を沈殿させ、上澄みをHPLC分析用変換サンプルとして保存した。
【００６１】
HPLCの詳しい条件(HPLC分析条件-1)を以下に示す。
分析装置：Agilent 100 series
カラム：J' sphere ODS-H80(YMC,Inc.),75mm x 4.6mmI.D.
移動相：A; イオン交換水
B; アセトニトリル
グラジエント時間設定：0分 移動相A/B =20:80
4.3分 移動相A/B =20:80
4.5分 移動相A/B =0:100
9.5分 移動相A/B =0:100
9.7分 移動相A/B =20:80
10.0分 移動相A/B =20:80
流速：1.5ml/分
検出：UV  265nm
インジェクション容量：10μl
カラム温度：40℃
分析時間：10分
保持時間：25-ヒドロキシビタミンＤ2  3.7分
ビタミンＤ2               9.2分
【００６２】
上記の条件で変換サンプルを分析し、25-ヒドロキシビタミンＤ2が生成していることが示された(図２)。また、96穴プレートの各ウエルで変換活性にばらつきがないことを確認した。
【００６３】
実施例４  VDHランダム変異ライブラリーの作成
Mutagenesis kit (Clontech社)を用いてエラープローンPCRを行い、変異の入ったVDH遺伝子断片の増幅を行った。プライマーVDH-1FとVDH-1R(配列表の配列番号２および３参照)とpETaciBC-SD-vdhを鋳型として用いてPCR反応を行った。PCR反応条件はMutagenesis kitの反応条件3で行った。その結果、約1.2kbpの大きさのDNA断片-4が増幅された。増幅したDNA断片-4を反応液からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)によって回収した。このDNA断片-4をNdeIとBglIIにより37℃で4時間消化し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)で精製しDNA断片-5を得た。DNA断片-1とDNA断片-5をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）を用いて連結し、大腸菌DH5α株（タカラバイオ社）を形質転換した。その後、カルベニシリン（50μg/ml）を含むLB寒天培地（1.0％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、1.0％塩化ナトリウム、1.5％寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。
【００６４】
コロニーPCRにより全ての形質転換株にVDH遺伝子が挿入されたベクターが保持されていることを確認し、3コロニーをカルベニシリン(50μg/ml)を含むLB培地で培養してプラスミドをWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system(プロメガ社)により抽出した。抽出した3種のプラスミド中のVDH遺伝子塩基配列をDNA塩基配列解析装置(アプライドバイオシステムズ；3130)を用い、4種類のプライマー（配列番号４、５、６、７）を使用してプロトコルに従いダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。その結果、1クローン平均3.67箇所の変異が導入されていることが確認された。多数の形質転換株のコロニーが観察された寒天培地上に2mlのLB培地を加えて、スプレッターで菌体を懸濁した。この細胞懸濁液からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system(プロメガ社)を用いてプラスミドを抽出した。この抽出したプラスミドは多様な変異が導入されたVDH遺伝子が挿入されていると考えられ、VDHランダム変異ライブラリー(pETaciBC-SD-vdh-e)として以下の実験に用いた。
【００６５】
実施例５  高活性VDH改変体のスクリーニング
作成したVDHランダム変異ライブラリーで大腸菌BL21(DE3)を形質転換して大腸菌BL21(DE3)/pETaciBC-SD-vdh-e株のコロニーを多数得た。96穴ディープウエルプレート（IWAKI社）の各ウエルにカルベニシリン(50μg/ml)を含む1mlのTB培地を入れ、大腸菌BL21(DE3)/pETaciBC-SD-vdh-eを植菌した。コントロールとして野生型VDHを発現する大腸菌BL21(DE3)/pETaciBC-SD-vdhも各96穴ディープウエルプレートに8コロニー植菌した。プレート用シェーカー（SCF-98-8:いわしや社）により30℃、800rpmで14時間培養した。レプリケーターを用いて、96穴ディープウエルプレート（IWAKI社）の各ウエル中にカルベニシリン(50μg/ml)とOvernight autoinduction system1(メルク社)を含む1mlのTB培地へ植菌した。前培養の96穴ディープウエルプレートはそのまま−80℃で凍結保存した。
【００６６】
プレート用シェーカー（SCF-98-8:いわしや社）により25℃、800rpmで24時間培養した。3500rpm、10分間の遠心により菌体を沈殿させて上澄みを捨て、500μlの反応液(CV2、0.5％(w/v)部分メチル化β-シクロデキストリン、250mg/LビタミンＤ2、2.5％(v/v)DMSO)を加えた。プレート用シェーカー（SCF-98-8:いわしや社）により28℃、800rpmで5時間変換反応をした。500μlのメタノールを添加し、反応を止め、800rpmで5分間攪拌した。4000rpm、10分間の遠心により菌体を沈殿させ、上澄みをHPLC分析用変換サンプルとして保存した。
【００６７】
HPLC分析条件-1を用いてサンプルの分析を行い、25-ヒドロキシビタミンＤ2の生成量を測定して、野生型VDHに対して相対活性が1.7倍から4.8倍を示す9種の高変換活性のクローンを同定した。それらの高活性を示す大腸菌の形質転換体を2mlのアンピシリン（50μg/ml）を含むLB液体培地で培養し、そこからWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system(プロメガ社)を用いてプラスミドを抽出した。抽出した9種のプラスミド中のVDH遺伝子塩基配列をDNA塩基配列解析装置(アプライドバイオシステムズ；3130)を用い、4種類のプライマー（配列番号４、５、６、７）を使用してプロトコルに従いダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。その結果を表1に示す。
【００６８】
【表１】
2009219379.tif 000002
【００６９】
クローン1に含まれるVDH遺伝子の467残基目のチミンがシトシンへと変異していた。以下同様に、クローン2では646残基目のグアニンがアデニンへ、クローン3では218残基目のアデニンがチミンへ、クローン4では335残基目のアデニンがグアニンへと455残基目のアデニンがグアニンへの二重変異、クローン5では208残基目のアデニンがグアニンへ、クローン6では1151残基目のアデニンがチミンへ、クローン7では412残基目のアデニンがシトシンへ、クローン8では135残基目のシトシンがチミンへと656残基目のアデニンがグアニンへの二重変異、クローン9では26残基目のアデニンがチミンへと99残基目のチミンがシトシンへと319残基目のアデニンがグアニンへの三重変異が導入されていることが示された。
【００７０】
それらのDNAの変異によりクローン1に含まれるVDH遺伝子がコードするアミノ酸配列において156残基目のバリンがアラニンへと置換された。以下同様に、クローン2では216残基目のグルタミン酸がリジンへ、クローン3では73残基目のグルタミン酸がバリンへ、クローン4では112残基目のアスパラギンがセリンへと152残基目のグルタミン酸がグリシンへの二重変異、クローン5では70残基目のスレオニンがアラニンへ、クローン6では384残基目のグルタミン酸がバリンへ、クローン7では138残基目のメチオニンがロイシンへ、クローン8では45残基目のバリンのサイレント変異と219残基目のアスパラギン酸がグリシンへの二重変異、クローン9では9残基目のグルタミン酸がバリンへと33残基目のアスパラギン酸のサイレント変異と107残基目のスレオニンがアラニンへの三重変異が導入されていることが示された。
【００７１】
クローン4については野生型VDHに対する相対活性が3.0倍を示しており、ランダムスクリーニングの結果より112残基目のアスパラギンからスレオニンへのアミノ酸置換体は野生型VDHに対する相対活性が1.4倍であることが示され、これらの結果より活性上昇は152残基目のグルタミン酸からグリシンへのアミノ酸置換が活性向上に主として寄与していることが推測された。また、複数のアミノ酸が置換されているクローン9については9残基目と107残基目のアミン酸置換を分離した一アミノ酸置換体を作成し野生型VDHに対する相対活性を測定した。
【００７２】
(1)Glu9Val置換体の作成
9残基目のグルタミン酸がバリンへ置換されているVDH(Glu9Val)遺伝子を増幅するためにプライマーVDH(E9V)-F(配列番号８)とVDH-1R(配列番号３)を設計し作成した。次に、この2種のプライマーとpETaciBC-SD-vdhをテンプレートとして用いてPCR反応を行った。その結果、約1.2kbpの大きさのDNA断片-6が増幅された。PCR反応にて増幅したDNA断片-6を、反応液からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)によって回収した。このDNA断片-6をNdeIとBglIIにより37℃で4時間消化し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)で精製しDNA断片-7を得た。DNA断片-1とDNA断片-7をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）を用いて連結し、大腸菌DH5α株（タカラバイオ社）を形質転換した。その後、カルベニシリン（50μg/ml）を含むLB寒天培地を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（50μg/ml）を含むLB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system(プロメガ社)を用いてプラスミドDNAの分離精製を行い、9残基目のグルタミン酸がバリンへ置換されているVDHをコードする遺伝子が挿入されているpETaciBC-SD-vdh(E9V)を得た。
【００７３】
(2)Thr107Ala置換体の作成
107残基目のスレオニンがアラニンへ置換されているVDH(Thr107Ala)遺伝子を増幅するためにプライマーVDH(T107A)-F(配列番号９)とVDH(T107A)-R(配列番号１０)を設計し作成した。はじめに、プライマーVDH-1F(配列番号２)とVDH(T107A)-R(配列番号１０)を用い、pETaciBC-SD-vdhをテンプレートとしてPCR反応を行った。その結果、約0.3kbの大きさのDNA断片-8が増幅された。DNA断片-8を反応液からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)によって回収した。次に、プライマーVDH-1R(配列番号３)とVDH(T107A)-F(配列番号９)を用い、pETaciBC-SD-vdhをテンプレートとして用いてPCR反応を行った。その結果、約0.9kbの大きさのDNA断片-9が増幅された。DNA断片-9を、反応液からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)によって回収した。
【００７４】
続いて、VDH(T107)遺伝子を増幅するためにプライマーVDH-1F(配列番号２)とVDH-1R(配列番号３)と上記で調製したDNA断片-8とDNA断片-9をテンプレートとして用いてPCR反応を行った。その結果、約1.2kbの大きさのDNA断片-10が増幅された。DNA断片-10を、反応液からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)によって回収した。このDNA断片-10をNdeIとBglIIにより37℃で4時間消化し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)で精製しDNA断片-11を得た。
【００７５】
DNA断片-1とDNA断片-11をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）を用いて連結し、大腸菌DH5α株（タカラバイオ社）を形質転換した。その後、カルベニシリン（50μg/ml）を含むLB寒天培地を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（50μg/ml）を含む2mlLB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system(プロメガ社)を用いてプラスミドDNAの分離精製を行い、pETaciBC-SD-vdh(T107A)を得た。
【００７６】
作成したpETaciBC-DS-vdh(E9V)とpETaciBC-DS-vdh(T107A)で大腸菌BL21(DE3)を形質転換してそれぞれの形質転換体のコロニーを得た。96穴ディープウエルプレート（IWAKI社）の各ウエルにカルベニシリン(50μg/ml)を含む1mlのTB培地を入れ、大腸菌BL21(DE3)/pETaciBC-SD-vdh(E9V)と大腸菌BL21(DE3)/pETaciBC-SD-vdh(T107A)を植菌した。コントロールとして大腸菌BL21(DE3)/pETaciBC-SD-vdhも同じプレートに植菌した。プレート用シェーカー（SCF-98-8:いわしや社）により30℃、800rpmで14時間培養した。
【００７７】
レプリケーターを用いて、96穴ディープウエルプレート（IWAKI社）の各ウエル中にカルベニシリン(50μg/ml)とOvernight autoinduction system1(メルク社)を含む1mlのTB培地へ植菌した。プレート用シェーカー（SCF-98-8:いわしや社）により25℃、800rpmで24時間培養した。3500rpm、10分間の遠心により菌体を沈殿させて上澄みを捨て、500μlの反応液(CV2、0.5％(w/v)部分メチル化β-シクロデキストリン、250mg/LビタミンＤ2、2.5％(v/v)DMSO)を加えた。プレート用シェーカー（SCF-98-8:いわしや社）により28℃、800rpmで5時間変換反応をした。
【００７８】
500μlのメタノールを添加し、反応を止め、800rpmで5分間攪拌した。4000rpm、10分間の遠心により菌体を沈殿させ、上澄みをHPLC分析用変換サンプルとして保存した。HPLC分析条件-1を用いてサンプルの分析を行い、25-ヒドロキシビタミンＤ2の生成量を測定した。その結果、VDH(E9V)とVDH(T107A)を発現させたクローンの野生型VDHに対する相対活性はそれぞれ0.4倍と1.8倍であった。この結果より107残基目のスレオニンのアラニンへのアミノ酸置換はVDHの高活性化に寄与していることが推測された。
【００７９】
上記の結果より、VDHの活性化に寄与するアミノ酸置換部位として70残基目のスレオニン、73残基目のグルタミン酸、107残基目のスレオニン、138残基目のメチオニン、152残基目のグルタミン酸、156残基目のバリン、216残基目のグルタミン酸、219残基目のアスパラギン酸、384残基目のグルタミン酸の9箇所を候補とした。
【００８０】
実施例６  高活性化候補部位のアミノ酸総置換
(1)70残基目のアミノ酸総置換ライブラリーの作成
70残基目のアミノ酸が総置換されたVDH(70satu)遺伝子を増幅するためにプライマーVDH(70satu)-F(配列番号１１)とVDH(70satu)-R(配列番号１２)を設計し作成した。はじめに、プライマーVDH-1F(配列番号２)とVDH(70satu)-R(配列番号１２)とpETaciBC-SD-vdhをテンプレートとして用いてPCR反応を行った。その結果、約0.2kbの大きさのDNA断片-12が増幅された。DNA断片-12を、反応液からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)によって回収した。
【００８１】
次に、プライマーVDH-1R(配列番号３)とVDH(70satu)-F(配列番号１３)とpETaciBC-SD-vdhをテンプレートとして用いてPCR反応を行った。その結果、約1.0kbの大きさのDNA断片-13が増幅された。増幅したDNA断片-13を、反応液からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)によって回収した。続いて、VDH(70satu)遺伝子を増幅するためにプライマーVDH-1F(配列番号２)とVDH-1R(配列番号３)と上記で調製したDNA断片-12とDNA断片-13をテンプレートとして用いてPCR反応を行った。その結果、約1.2kbの大きさのDNA断片-14が増幅された。PCR反応にて増幅したDNA断片-14を、反応液からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)によって回収した。
【００８２】
このDNA断片-14をNdeIとBglIIにより37℃で4時間消化し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)で精製しDNA断片-15を得た。DNA断片-1とDNA断片-15をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）を用いて連結し、大腸菌DH5α株（タカラバイオ社）を形質転換した。その後、カルベニシリン（50μg/ml）を含むLB寒天培地を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。多数の形質転換株のコロニーが観察された寒天培地上に2mlのLB培地を加えて、スプレッターで菌体を懸濁した。この細胞懸濁液からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system(プロメガ社)を用いてプラスミドを抽出した。このプラスミドには野生型VDHの70残基目のアミノ酸が総置換されたVDH遺伝子が挿入されていると考えられ、70残基目のアミノ酸総置換ライブラリーpETaciBC-SD-vdh-70satuとして用いることとした。
【００８３】
70残基目以外の8箇所のVDH高活性化に寄与すると推測された箇所のアミノ酸総置換ライブラリーの作成は以下に記すプライマーを用いて同様にして作成した。73残基目のアミノ酸総置換にはプライマーVDH(73satu)-F(配列番号１３)とVDH(73satu)-R(配列番号１４)、107残基目のアミノ酸総置換にはプライマーVDH(107satu)-F(配列番号１５)とVDH(107satu)-R(配列番号１６)、138残基目のアミノ酸総置換にはプライマーVDH(138satu)-F(配列番号１７)とVDH(138satu)-R(配列番号１８)、152残基目のアミノ酸総置換にはプライマーVDH(152satu)-F(配列番号１９)とVDH(152satu)-R(配列番号２０)、156残基目のアミノ酸総置換にはプライマーVDH(156satu)-F(配列番号２１)とVDH(156satu)-R(配列番号２２)、216残基目のアミノ酸総置換にはプライマーVDH(216satu)-F(配列番号２３)とVDH(216satu)-R(配列番号２４)、219残基目のアミノ酸総置換にはプライマーVDH(219satu)-F(配列番号２５)とVDH(219satu)-R(配列番号２６)、384残基目のアミノ酸総置換にはプライマーVDH(384satu)-F(配列番号２７)とVDH(384satu)-R(配列番号２８)を用いた。
【００８４】
作成したアミノ酸総置換ライブラリーをそれぞれVDH73残基目アミノ酸総置換ライブラリー(pETaciBC-SD-vdh-73satu)、VDH107残基目アミノ酸総置換ライブラリー(pETaciBC-SD-vdh-107satu)、VDH138残基目アミノ酸総置換ライブラリー(pETaciBC-SD-vdh-138satu)、VDH152残基目アミノ酸総置換ライブラリー(pETaciBC-SD-vdh-152satu)、VDH156残基目アミノ酸総置換ライブラリー(pETaciBC-SD-vdh-156satu)、VDH216残基目アミノ酸総置換ライブラリー(pETaciBC-SD-vdh-216satu)、VDH219残基目アミノ酸総置換ライブラリー(pETaciBC-SD-vdh-219satu)、VDH384残基目アミノ酸総置換ライブラリー(pETaciBC-SD-vdh-384satu)と名付けた。
【００８５】
(2)70残基目のアミノ酸総置換ライブラリーを用いた高活性クローンのスクリーニング
作成したVDH70残基目アミノ酸総置換ライブラリー(pETaciBC-SD-vdh-70satu)で大腸菌BL21(DE3)を形質転換して大腸菌BL21(DE3)/pETaciBC-SD-vdh-70satu株のコロニーを多数得た。96穴ディープウエルプレート（IWAKI社）2枚の各ウエルにカルベニシリン(50μg/ml)を含む1mlのTB培地を入れ、大腸菌BL21(DE3)/pETaciBC-SD-vdh-70satuを植菌した。各ディープウエルプレートに8コロニー植菌した。プレート用シェーカー（SCF-98-8:いわしや社）により30℃、800rpmで14時間培養した。レプリケーターを用いて、96穴ディープウエルプレート（IWAKI社）2枚の各ウエル中にカルベニシリン(50μg/ml)とOvernight autoinduction system1(メルク社)を含む1mlのTB培地へ植菌した。前培養の96穴ディープウエルプレートはそのまま−80℃で凍結保存した。プレート用シェーカー（SCF-98-8:いわしや社）により25℃、800rpmで24時間培養した。3500rpm、10分間の遠心により菌体を沈殿させて上澄みを捨て、500μlの反応液(CV2、0.5％(w/v)部分メチル化β-シクロデキストリン、250mg/LビタミンＤ2、2.5％(v/v)DMSO)を加えた。プレート用シェーカー（SCF-98-8:いわしや社）により28℃、800rpmで5時間変換反応をした。500μlのメタノールを添加し、反応を止め、800rpmで5分間攪拌した。4000rpm、10分間の遠心により菌体を沈殿させ、上澄みをHPLC分析用変換サンプルとして保存した。
【００８６】
上記に示したHPLC分析条件-1により25-ヒドロキシビタミンＤ2生成量が野生型VDH発現株より増加した8クローンについてアンピシリン（50μg/ml）を含む2ml LB液体培地で培養し、増殖した形質転換大腸菌からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system (プロメガ社)を用いてプラスミドDNAを精製した。得られたプラスミドを鋳型としてVDH遺伝子塩基配列をDNA塩基配列解析装置(アプライドバイオシステムズ；3130)を用い、配列決定用プライマー（配列番号４）を使用してダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。結果を表２に示した。
【００８７】
【表２】
2009219379.tif 000003
【００８８】
この結果より、70残基目のスレオニンがアルギニン、アラニン、グリシン、アスパラギンに置換されたVDH改変体を発現する大腸菌形質転換株が高活性となることが示された。
【００８９】
同様にして、他の8箇所について作成されたアミノ酸総置換ライブラリー(pETaciBC-SD-vdh-73satu、pETaciBC-SD-vdh-107satu、pETaciBC-SD-vdh-138satu、pETaciBC-SD-vdh-152satu、pETaciBC-SD-vdh-156satu、pETaciBC-SD-vdh-216satu、pETaciBC-SD-vdh-219satu、pETaciBC-SD-vdh-384satu)からの高活性クローンのスクリーニングを行った。その結果を表３から表１０に示した。
【００９０】
【表３】
2009219379.tif 000004
【００９１】
【表４】
2009219379.tif 000005
【００９２】
【表５】
2009219379.tif 000006
【００９３】
【表６】
2009219379.tif 000007
【００９４】
【表７】
2009219379.tif 000008
【００９５】
【表８】
2009219379.tif 000009
【００９６】
【表９】
2009219379.tif 000010
【００９７】
【表１０】
2009219379.tif 000011
【００９８】
(3)比活性測定
変異の導入により大腸菌での発現量が変化することが考えられたため、単位酵素あたりのビタミンＤ2水酸化活性およびビタミンＤ3水酸化活性（つまり、比活性）を測定した。
【００９９】
70残基目の高活性アミノ酸置換VDHの比活性測定
上記の70残基目のアミノ酸総置換ライブラリーからスクリーニングした結果、アルギニン、アラニン、グリシン、アスパラギンへのアミノ酸置換体が高活性を示した。これらの改変体VDHを発現させるプラスミド(pETaciBC-SD-vdh-T70R、pETaciBC-SD-vdh-T70A、pETaciBC-SD-vdh-T70G、pETaciBC-SD-vdh-T70N)により大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。得られた大腸菌BL21(DE3)形質転換株をカルベニシリンを含む2mlのTB培地に植菌した。30℃、220rpmで14時間培養した後、カルベニシリンとOvernight autoinduction system 1(メルク社)を含む25mlのTB培地へ250μlの前培養液を接種した。
【０１００】
25℃、220rpmで24時間培養した後、変換試験のために2mlの培養液を試験管にとり、3500rpm、10分間の遠心により菌体を沈殿させて上澄みを捨て、1mlの反応液(CV2、0.5％(w/v)部分メチル化β-シクロデキストリン、250mg/LビタミンＤ2または250mg/LビタミンＤ3、2.5％(v/v)DMSO)を加えた。28℃、220rpmで5時間変換反応を行い1.5mlの酢酸エチルを添加して反応を止めた。30秒間ボルテックスにより攪拌し、3500rpm、10分間の遠心により水相と酢酸エチル相に分離させ、酢酸エチル相をとり、残った水相に0.75mlの酢酸エチルを加えた。30秒間のボルテックスにより攪拌し、3500rpm、10分間の遠心により水相と酢酸エチル相に分離させ、酢酸エチル相をとり、先程得た酢酸エチル相と合わせて、減圧濃縮機により乾固した。そこに200μlのメタノールを添加し、乾固物を溶かした後、HPLC分析用バイアルへ移して、分析まで遮光4℃で保存した。
【０１０１】
変換試験に使用しなかった培養液から4300rpm、10分間の遠心により菌体を沈殿として得た。上澄みを捨てて、培養液に対して5分の1量のCV緩衝液（50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.4、10％(v/v)グリセロール）を加え、5倍濃縮細胞懸濁液を調製した。2mlの5倍濃縮細胞懸濁液に68μl 10X Bug Buster（ノバジェン社）、2μl Benzonase（ノバジェン社）、200μl 40mg/ml Lysozymeを加え、30℃で20分間緩やかに振とうした。7000rpm、10分間の遠心により上清に無細胞抽出液を得た。
【０１０２】
この無細胞抽出液をキャップ付き試験管2本に700μlずつ分け、一方の無細胞抽出液に一酸化炭素を通した。次に、両方の無細胞抽出液にハイドロサルファイトナトリウムを少量添加した。一酸化炭素を通していない方のサンプルの400nmから500nmの吸収スペクトルをベースラインとして、スペクトルフォトメーター（HITACHI社、U-3310 SpectrophotoMeter）で一酸化炭素を通したサンプルの400nmから500nmの吸収をスキャンした。その結果、シトクロムP450に特徴的な450nmのピークを観察し、その吸収から一酸化炭素結合型で還元状態VDHの分子吸光係数を1mMあたり91として培養液中の改変体VDH発現量を計算した。
【０１０３】
変換試験サンプルのHPLC解析による25-ヒドロキシビタミンＤ2および25-ヒドロキシビタミンＤ3の定量により1時間あたりの25-ヒドロキシビタミンＤ2生成量が求まり、一酸化炭素結合スペクトル解析により得られたVDHの発現量から1nmolのVDHあたり、1時間あたりの25-ヒドロキシビタミンＤ2生成量が求まり、この値を比較することにより高活性化VDHの評価を行った。
【０１０４】
表１１と図３に70残基目のアミノ酸置換体の比活性測定の結果を示した。VDH濃度は改変体VDHを誘導した大腸菌形質転換株の培養液中のVDH濃度(nM)を示し、25-ヒドロキシビタミンＤ2および25-ヒドロキシビタミンＤ3生成量は休止菌体反応を5時間行った1mlの反応液中の25-ヒドロキシビタミンＤ2および25-ヒドロキシビタミンＤ3濃度(mg/L)を示した。比活性として、1nmolの改変体VDHが1時間で生成する25-ヒドロキシビタミンＤ2および25-ヒドロキシビタミンＤ3量(μg/hr/nmol of VDH)で示し、コントロール（野生型VDH）に対する比活性の相対活性を示した。アルギニン、アラニン、グリシンへのアミノ酸置換体がビタミンＤ2水酸化活性において1.9倍の比活性を示し、一方、ビタミンＤ3水酸化活性ではグリシンへの置換体が2.1倍の比活性を示し最も高かった。
【０１０５】
【表１１】
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【０１０６】
残り8箇所の高活性アミノ酸置換体についても同様にして比活性測定を行い、その結果を表１２〜１９、図４〜図１１に示した。これらの結果より、9箇所の高活性化に寄与するアミノ酸残基の最適アミノ酸はビタミンＤ2水酸化活性において70残基目がアルギニン、73残基目（71残基目もアルギニンへの置換有り）がトリプトファン、107残基目がアラニン、138残基目がバリン、152残基目がトリプトファン、156残基目がセリン、216残基目がアラニン、219残基目がアラニン、384残基目がアルギニンであった。
【０１０７】
【表１２】
2009219379.tif 000013
【０１０８】
【表１３】
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【０１０９】
【表１４】
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【０１１０】
【表１５】
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【０１１１】
【表１６】
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【０１１２】
【表１７】
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【０１１３】
【表１８】
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【０１１４】
【表１９】
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【０１１５】
実施例７  変異点の組み合わせ
四重アミノ酸置換体(T70R/V156L/E216M/E384R)の作成
四重アミノ酸置換体(T70R/V156L/E216M/E384R)の構築を行った。70残基目のスレオニンがアルギニンへ置換されたVDH遺伝子が挿入されているpETaciBC-SD-VDH(T70R)を鋳型として、プライマーVDH-F（配列番号３）とVDH(V156L)-R（配列番号２９）で約0.45kbのDNA断片-16を増幅した。同様にpETaciBC-SD-VDHを鋳型として、プライマーVDH(V156L)-F（配列番号３０）とVDH(E216M)-R（配列番号３１）で約0.18kbのDNA断片-17を増幅した。同様に384残基目のグルタミン酸がアルギニンへ置換されたVDH遺伝子が挿入されているpETaciBC-SD-VDH(E384R)を鋳型として、プライマーVDH(E216M)-F（配列番号３２）とVDH-R（配列番号３）で約0.56kbのDNA断片-18を増幅した。
【０１１６】
続いて、4箇所のアミノ酸置換が導入された完全長VDH遺伝子を増幅するためにプライマーVDH-1F(配列番号２)とVDH-1R(配列番号３)と上記で調製したDNA断片-16、DNA断片-17とDNA断片-18を鋳型として用いてPCR反応を行った。PCR反応にて増幅したDNA断片-19を、反応液からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)によって回収した。このDNA断片-19をNdeIとBglIIにより37℃で4時間消化し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)で精製しDNA断片-20を得た。DNA断片-1とDNA断片-20をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）を用いて連結し、大腸菌DH5α株（タカラバイオ社）を形質転換した。
【０１１７】
その後、カルベニシリン（50μg/ml）を含むLB寒天培地を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（50μg/ml）を含む2ml LB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system(プロメガ社)を用いてプラスミドDNAの分離精製を行った。こうして野生型VDHの70残基目のスレオニンがアルギニンへ、156残基目のバリンがロイシンへ、216残基目のグルタミン酸がメチオニンへ、384残基目のグルタミン酸がアルギニンへアミノ酸置換された四重アミノ酸置換体VDHを発現するプラスミドpETaciBC-SD-vdh-T70R/V156L/E216M/E384Rを取得した。このベクターで形質転換された大腸菌BL21(DE3)を用いて作成した、VDHの四重アミノ酸置換体をVDH-K1と名付けた。VDH-K1の比活性測定を行いその結果を表２０と図１２に示した。VDH-K1は野生型VDHと比較してビタミンＤ2水酸化活性とビタミンＤ3水酸化活性でそれぞれ11.4倍と21.6倍高い比活性を示した。
【０１１８】
【表２０】
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【０１１９】
三重アミノ酸置換体(T70R/D219M/E384R)の作成
高活性多重改変体を作成するために、まず一箇所の変異で最も比活性の上昇が観察された384残基目のグルタミン酸がアルギニンへの置換を固定して、70残基目のスレオニンをアミノ酸総置換した。384残基目のグルタミン酸がアルギニンへ置換されたVDH遺伝子が挿入されているpETaciBC-SD-VDH(E384R)を鋳型として、プライマーVDH-F（配列番号３）とVDH(T70satu)-R（配列番号１２）で約0.21kbのDNA断片-21を増幅した。また、同じ鋳型を用いてプライマーVDH(T70satu)-F（配列番号１１）とVDH-R（配列番号３）で約1.0kbのDNA断片-22を増幅した。
【０１２０】
続いて、完全長VDH遺伝子を増幅するためにプライマーVDH-1F(配列番号２)とVDH-1R(配列番号３)と上記で調製したDNA断片-21とDNA断片-22を鋳型として用いてPCR反応を行った。その結果、約1.2kbの大きさのDNA断片-23が増幅された。PCR反応にて増幅したDNA断片23を、反応液からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)によって回収した。このDNA断片-23をNdeIとBglIIにより37℃で4時間消化し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)で精製しDNA断片-24を得た。DNA断片-1とDNA断片-23をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）を用いて連結し、大腸菌DH5α株（タカラバイオ社）を形質転換した。
【０１２１】
その後、カルベニシリン（50μg/ml）を含むLB寒天培地を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。多数の形質転換株のコロニーが観察された寒天培地上に2mlのLB培地を加えて、スプレッターで菌体を懸濁し、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system(プロメガ社)を用いてプラスミドを抽出した。こうして野生型VDHの384残基目のグルタミン酸がアルギニンへ置換され、70残基目のスレオニンがアミノ酸総置換されたVDHを発現するプラスミドpETaciBC-SD-vdh-E384R/T70satuを取得した。このベクターで形質転換された大腸菌BL21(DE3)を用いてランダムスクリーニングおよび比活性測定した結果、70残基目のスレオニンがアルギニンへ、384残基目のグルタミン酸がアルギニンへ置換された二重改変体が最も高い比活性を示した。
【０１２２】
続いて三重改変体を作成するためにpETaciBC-SD-VDH(T70R/E384R)を鋳型として、プライマーVDH-F（配列番号３）とVDH(219satu)-R（配列番号２６）で約0.66kbのDNA断片-25を増幅した。また、同じ鋳型を用いてプライマーVDH(219satu)-F（配列番号２５）とVDH-R（配列番号３）で約0.54kbのDNA断片-26を増幅した。
【０１２３】
続いて、完全長VDH遺伝子を増幅するためにプライマーVDH-1F(配列番号２)とVDH-1R(配列番号３)と上記で調製したDNA断片-25とDNA断片-26をテンプレートとして用いてPCR反応を行った。その結果、約1.2kbの大きさのDNA断片-27が増幅された。PCR反応にて増幅したDNA断片-27を、反応液からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)によって回収した。このDNA断片-27をNdeIとBglIIにより37℃で4時間消化し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(プロメガ社)で精製しDNA断片-28を得た。DNA断片-1とDNA断片-28をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）を用いて連結し、大腸菌DH5α株（タカラバイオ社）を形質転換した。
【０１２４】
その後、カルベニシリン（50μg/ml）を含むLB寒天培地を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。多数の形質転換株のコロニーが観察された寒天培地上に2mlのLB培地を加えて、スプレッターで菌体を懸濁し、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system(プロメガ社)を用いてプラスミドを抽出した。こうして野生型VDHの70残基目のスレオニンがアルギニンへ、384残基目のグルタミン酸がアルギニンへ置換され、219残基目のアスパラギン酸がアミノ酸総置換されたVDHを発現するプラスミドのライブラリーpETaciBC-SD-vdhT70R/E384R/D219satuを取得した。
【０１２５】
このベクターで形質転換された大腸菌BL21(DE3)を用いてランダムスクリーニングおよび比活性測定した結果、70残基目のスレオニンがアルギニンへ、219残基目のアスパラギン酸がメチオニンへ、384残基目のグルタミン酸がアルギニンへ置換された三重アミノ酸置換体が最も高い比活性を示した（表２１と図１３）。この三重アミノ酸置換体をVDH-K2と名付けた。VDH-K2は野生型VDHと比較してビタミンＤ2水酸化活性とビタミンＤ3水酸化活性でそれぞれ4.8倍と8.7倍高い比活性を示した。
【０１２６】
【表２１】
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【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】VDH発現用pETaciBC-SD vectorの構造を示す図である。
【図２】大腸菌BL21(DE3)/pETaciBC-SD-vdh株によるビタミンＤ2変換試験における反応液のHPLCチャートを示した図である。
【図３】野生型VDHの70残基目のアミノ酸を置換した各種ポリペプチドがもつビタミンＤ類水酸化活性を野生型VDHに対する比活性として示した図である。
【図４】野生型VDHの73残基目のアミノ酸を置換した各種ポリペプチドがもつビタミンＤ類水酸化活性を野生型VDHに対する比活性として示した図である。
【図５】野生型VDHの107残基目のアミノ酸を置換した各種ポリペプチドがもつビタミンＤ類水酸化活性を野生型VDHに対する比活性として示した図である。
【図６】野生型VDHの138残基目のアミノ酸を置換した各種ポリペプチドがもつビタミンＤ類水酸化活性を野生型VDHに対する比活性として示した図である。
【図７】野生型VDHの152残基目のアミノ酸を置換した各種ポリペプチドがもつビタミンＤ類水酸化活性を野生型VDHに対する比活性として示した図である。
【図８】野生型VDHの156残基目のアミノ酸を置換した各種ポリペプチドがもつビタミンＤ類水酸化活性を野生型VDHに対する比活性として示した図である。
【図９】野生型VDHの216残基目のアミノ酸を置換した各種ポリペプチドがもつビタミンＤ類水酸化活性を野生型VDHに対する比活性として示した図である。
【図１０】野生型VDHの219残基目のアミノ酸を置換した各種ポリペプチドがもつビタミンＤ類水酸化活性を野生型VDHに対する比活性として示した図である。
【図１１】野生型VDHの384残基目のアミノ酸を置換した各種ポリペプチドがもつビタミンＤ類水酸化活性を野生型VDHに対する比活性として示した図である。
【図１２】VDH-K1がもつビタミンＤ類水酸化活性を野生型VDHに対する比活性として示した図である。
【図１３】VDH-K2がもつビタミンＤ類水酸化活性を野生型VDHに対する比活性として示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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