(57)【要約】      （修正有）【課題】緑内障、高眼圧症または低骨量を示す状態を有する哺乳類を治療するための薬物である（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸に関して、塩、水和物、多形体、結晶性および非結晶性形態など複数の物理的形態を提供する。【解決手段】（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩もしくはその水和物の多形性の結晶性形態もしくは非結晶性形態もしくは非晶質性、それを調製するための方法、それを使用するための方法、およびそれを含有する医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩またはその水和物の結晶性形態。
【請求項２】
結晶性形態が、結晶性形態Ａであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、ＣｕＫα放射線を用いて測定される以下の２θ値、３．２、４．１、２０．２および２０．８を含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項３】
結晶性形態が、結晶性形態Ａであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、ＣｕＫα放射線を用いて測定される以下の２θ値、３．２、４．１、１６．１、２０．２および２０．８を含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項４】
結晶性形態が、結晶性形態Ａであり、
結晶性形態が、結晶性形態１モル当たり水０．５モルを含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項５】
結晶性形態が、結晶性形態Ｂであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、ＣｕＫα放射線を用いて測定される以下の２θ値、３．３および３．６を含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項６】
結晶性形態が、結晶性形態Ｂであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、ＣｕＫα放射線を用いて測定される以下の２θ値、３．３、３．６、７．１、８．４および１３．８を含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項７】
結晶性形態が、結晶性形態Ｂであり、
結晶性形態が、結晶性形態１モル当たり水１．０モルを含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項８】
結晶性形態が、結晶性形態Ｃであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、ＣｕＫα放射線を用いて測定される以下の２θ値、３．６、４．０および１３．３を含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項９】
結晶性形態が、結晶性形態Ｃであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、ＣｕＫα放射線を用いて測定される以下の２θ値、３．５、４．０、５．９、１３．３および１６．９を含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項１０】
結晶性形態が、結晶性形態Ｃであり、
結晶性形態が、結晶性形態１モル当たり水１．０モルを含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項１１】
結晶性形態が、結晶性形態Ｅであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、ＣｕＫα放射線を用いて測定される以下の２θ値、７．０および２１．２を含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項１２】
結晶性形態が、結晶性形態Ｅであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、ＣｕＫα放射線を用いて測定される以下の２θ値、７．０、１４．１、２１．２、２２．３および２８．５を含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項１３】
結晶性形態が、結晶性形態Ｆであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、ＣｕＫα放射線を用いて測定される以下の２θ値、５．５、８．２および１１．０を含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項１４】
結晶性形態が、結晶性形態Ｆであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、ＣｕＫα放射線を用いて測定される以下の２θ値、５．５、８．２、１１．０、１９．２および２７．５を含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項１５】
結晶性形態が、結晶性形態Ｇであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、ＣｕＫα放射線を用いて測定される以下の２θ値、３．２、４．０および７．９を含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項１６】
結晶性形態が、結晶性形態Ｇであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、ＣｕＫα放射線を用いて測定される以下の２θ値、３．２、４．０、７．９、１０．０および１３．１を含有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項１７】
結晶性形態が、結晶性形態Ａであり、
結晶性形態が、百万分率で表される以下の化学シフト、３１．２、３２．１、３３．７および３４．５を有する固体１３Ｃ核磁気共鳴を有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項１８】
結晶性形態が、百万分率で表される以下の化学シフト、３１．２、３２．１、３３．７、３４．５、１７３．２、１７６．３、および１７８．２を有する固体１３Ｃ核磁気共鳴を有する請求項１７に記載の結晶性形態。
【請求項１９】
結晶性形態が、結晶性形態Ａであり、
結晶性形態が、百万分率で表される以下の化学シフト、１７３．２、１７６．３、および１７８．２を有する固体１３Ｃ核磁気共鳴を有する請求項１に記載の結晶性形態。
【請求項２０】
（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩またはその水和物の実質的に純粋な結晶性形態。
【請求項２１】
（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩またはその水和物の単離された結晶性形態。
【請求項２２】
（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩半水和物の結晶性形態Ａ。
【請求項２３】
（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩半水和物の結晶性形態Ａを調製するための方法であって、
（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸を、遊離の酸として、有機溶媒中の水酸化ナトリウムと接触させて、反応混合物を生成すること、
反応混合物を約５０Ｃ〜約９０Ｃの第１の温度まで温め、少なくとも１時間にわたって第１の温度を保つこと、
反応混合物を約１５Ｃ〜約２５Ｃの第２の温度まで冷却すること、および
反応混合物から固体を集めることを含む方法。
【請求項２４】
有機溶媒が、酢酸イソプロピルである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
酢酸イソプロピルが、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸１ｍｍｏｌ当たり約８〜約１２ｍｌで存在し、
水酸化ナトリウムが、水酸化ナトリウムの５０％水溶液であり、
水酸化ナトリウムが、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸１ｍｍｏｌ当たり約１〜約１．３ｍｍｏｌで存在する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
非結晶性形態が、非結晶性形態Ｈであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、ＣｕＫα放射線を用いて測定される以下の２θ値、３．１を含有する（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩またはその水和物の非結晶性形態。
【請求項２７】
非結晶性形態が、百万分率で表される以下の化学シフト、１２５．７、１５１．２、および１７５．８を有する固体１３Ｃ核磁気共鳴を有する請求項２６に記載の非結晶性形態。
【請求項２８】
非晶質性形態が、非晶質性形態Ｉであり、
Ｘ線粉末回折パターンが、実質的に、図６Ｃに示す通りである（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩またはその水和物の非晶質性形態。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロスタグランジンの治療上活性かつ選択的なモジュレーター、具体的には、ＥＰ２の作動薬の多形体、これらの化合物を含む医薬組成物、これらの化合物を調製するための方法ならびに骨障害、緑内障および高眼圧症などのプロスタグランジンの調節に関連している状態を治療するためのそのような化合物の使用に関する。より具体的には、本発明は、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の多形体、この化合物の多形体を含む医薬組成物、これらの多形体を調製するための方法ならびにプロスタグランジンの調節に関連している状態を治療するためのこの化合物の多形体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物開発の過程において、薬物の最も安定な結晶性形態を発見することが重要であると一般的に考えられている。この最も安定な結晶性形態は、最良の化学的安定性、すなわち、製剤における最長の貯蔵寿命を有する可能性が高い形態である。しかしながら、薬物の複数の形態、例えば、塩、水和物、多形体、結晶性および非結晶性形態を有することが有利でもある。異なる物理的形態は異なる利点を提供するため、薬物の理想的な物理的形態は１つではない。最も安定な形態およびそのような他の形態の探索は困難であり、その成果は予測できない。
【０００３】
薬物開発を成功させるには、患者にとって治療上有効な治療であるという特定の要件を満たすことが必要である。これらの要件は、２つの範疇、すなわち、（１）剤形の製造を成功させるための要件および（２）薬物製剤が患者に投与された後の薬物の送達および体内動態を成功させるための要件に分類される。
【０００４】
様々な経路による投与のための多種類の薬物製剤が存在し、異なる製剤にとって最適な薬物形態は、異なっている可能性が高い。上述のように、薬物製剤は、治療を必要としている患者への流通を成功させるのに十分な貯蔵寿命を有していなければならない。さらに、経口用薬物製剤は、経口的に投与された場合に患者の胃腸管で溶解するであろう形態で薬物を提供しなければならない。即時放出性の錠剤、カプセル、懸濁液、またはサシェなどの即時放出性剤形で経口的に投与する場合、投与量の完全な溶解および最適な生物学的利用能を保証するために、高い溶解性を有する薬物塩または薬物形態を有することが一般的に望ましい。一部の薬物、特に、低い溶解性の薬物または湿潤性に乏しい薬物の場合、胃腸管内に投与された場合に結晶性形態よりも高い初期溶解性を一般的に有するであろう非結晶性薬物形態を利用することが有利であることがある。薬物の非結晶性形態は、結晶性形態よりも化学的に安定性が低いことが多い。したがって、剤形製造、包装、貯蔵、および世界中の患者への流通を可能にするのに十分な時間にわたってその効力を維持するのに十分に安定である実用的な製品を提供するのに十分に化学的に安定である非結晶性薬物形態を識別することが有利である。
【０００５】
一方、薬物形態があまり可溶性でない場合によりよく動作する剤形が存在する。例えば、チュアブル錠剤または懸濁液またはサシェの剤形は、薬物に直接舌をさらす。そのような剤形の場合、薬物の部分を固体の状態に保ち、悪い味を最小限に抑えるために、口における薬物の溶解性を最小限に抑えることが望ましい。そのような剤形の場合、低い溶解性の塩または結晶性形態を使用することが望ましいことが多い。
【０００６】
制御放出性の経口用または注射用の、例えば、皮下または筋肉内の剤形の場合、望ましい薬物溶解性は、送達経路、投与量、剤形設計および望ましい放出継続時間の複雑な関数である。高い溶解性を有する薬物の場合、遅い溶解による遅い放出の実現を助けるために、制御放出性剤形のためのより低い溶解性の結晶性の塩または多形体を利用することが望ましいことがある。低い溶解性を有する薬物の場合、制御放出性剤形からの望ましい薬物放出速度を支えるのに十分な溶解速度を実現するために、より高い溶解性の結晶性の塩もしくは多形体、または非結晶性形態を利用することが必要であることがある。
【０００７】
ソフトゼラチンカプセル剤形（「ソフトゲル」）において、薬物は、トリグリセリド油またはポリエチレングリコールなどの少量の溶媒またはビヒクルに溶かされ、ゼラチンカプセルに封入される。この剤形にとって最適の薬物形態は、適切なソフトゲルビヒクルにおいて高い溶解性を有する薬物形態である。一般に、トリグリセリド油により可溶性である薬物形態は、水にあまり可溶性でないであろう。ソフトゲル剤形に適している薬物形態の識別には、様々な塩、多形体、結晶性および非結晶性の形態の研究が必要である。
【０００８】
したがって、薬物形態の望ましい溶解性は、使用目的によって異なり、薬物形態がすべて等価であるとは限らないことが分かる。
【０００９】
ヒトまたは動物の治療法にとって実際に有用である薬物形態の場合、薬物形態は、最小限の吸湿性を示すことが望ましい。極めて吸湿性の薬物を含有する剤形は、保護包装を必要とし、湿潤環境で貯蔵される場合に、変化した溶解を示すことがある。したがって、薬物の非吸湿性の結晶性の塩および多形体を識別することが望ましい。薬物が非結晶性である場合、または溶解性および溶解速度を改善するために非結晶性形態が望まれる場合、他の非結晶性の塩または形態に比べて低い吸湿性を有する非結晶性の塩または形態を識別することが望ましい。
【００１０】
結晶性または非結晶性の薬物は、無水形態で、または水和物もしくは溶媒和物もしくは水和物／溶媒和物として存在することがある。薬物の水和状態および溶媒和状態は、その溶解性および溶解挙動に影響を及ぼす。
【００１１】
薬物の融点は、異なる塩、多形体、結晶性および非結晶性の形態について変わることがある。商業用錠剤プレスでの錠剤の製造を可能にするため、薬物融点は、錠剤製造中の薬物溶融を防ぐために、約６０℃を超え、好ましくは１００℃を超えていることが望ましい。この場合の好ましい薬物形態は、最も高い融点を有する薬物形態である。さらに、直射日光および赤道近くなどの地理的領域で起きる高い環境貯蔵温度において固体剤形中の固体薬物の化学的安定性を保証するために高い融点を有することが望ましい。ソフトゲル剤形が望まれる場合、剤形における薬物の結晶化を最小限に抑えるために、低い融点を有する薬物形態を有することが好ましい。したがって、薬物形態の望ましい融点は、使用目的によって異なり、薬物形態がすべて等価であるとは限らないことが分かる。
【００１２】
薬物の投与量が高い場合、または小さな剤形が望まれる場合、塩、水和物または溶媒和物の選択は、単位重量当たりの効力に影響を及ぼす。例えば、より高い分子量の対イオンを有する薬物塩は、より低い分子量の対イオンを有する薬物塩よりも低いグラム当たりの薬物効力を有するであろう。単位重量当たり最も高い効力を有する薬物形態を選択することが望ましい。
【００１３】
異なる結晶性多形体および非結晶性形態を調製する方法は、薬物によって大きく異なる。これらの方法において、特に、最終合成ステップについて、特に、薬物が、合成の最終ステップで利用される溶媒との溶媒和物として存在する傾向がある場合、毒性が最も少ない溶媒が使用されることが望ましい。好ましい薬物形態は、それらの合成において毒性が少ない溶媒を利用する薬物形態である。
【００１４】
商業規模で良好な錠剤を形成する薬物の能力は、Ｈｉｅｓｔａｎｄ  Ｈ、Ｓｍｉｔｈ  Ｄ．Ｉｎｄｉｃｅｓ  ｏｆ  ｔａｂｌｅｔｉｎｇ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｐｏｗｄｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８４；３８：１４５〜１５９に記載されている錠剤化指数（Ｔａｂｌｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｉｃｅｓ）などの様々な薬物物理的特性によって異なる。これらの指数を用い、優れた錠剤化性能を有する薬物、例えば、アトルバスタチンカルシウムの形態を識別することができる。そのような指数の１つは、脆性を反映する脆性破壊指数（Ｂｒｉｔｔｌｅ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  Ｉｎｄｅｘ）（ＢＦＩ）であり、０（良好−低脆性）から１（不良−高脆性）まで様々である。機械的特性、流動特性および錠剤化性能の他の有用な指数または尺度は、圧縮応力、絶対密度、固相率（ｓｏｌｉｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）、動的圧入硬度、延性、弾性率、低減（ｒｅｄｕｃｅｄ）弾性率、準静的圧入硬度、剛性率、引張強度、妥協（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）引張強度、最高結合指数、最低結合指数、脆性／粘弾性結合指数、歪指数、粘弾性数、内部摩擦の有効角（シェアセル試験から）、凝集性（粉末雪崩試験から）および流動変動性を包含する。多くのこれらの尺度は、３軸油圧プレスを用いて調製されることが好ましい薬物成形体で得られる。これらの尺度の多くは、Ｈａｎｃｏｃｋ  Ｂ、Ｃａｒｌｓｏｎ  Ｇ、Ｌａｄｉｐｏ  Ｄ、Ｌａｎｇｄｏｎ  Ｂ、およびＭｕｌｌａｒｎｅｙ  Ｍ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  Ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ａ  Ｄｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２００２；２４１：７３〜８５にさらに記載されている。
【００１５】
流動に影響を及ぼす薬物形態特性は、錠剤剤形製造にとってだけではなく、カプセル剤、懸濁剤、およびサシェ剤の製造にとっても重要である。
【００１６】
薬物粉末の粒径分布も、特に、粉末流動に対する影響により、製造プロセスに大きな影響を有することがある。異なる薬物形態は、異なる特徴的な粒径分布を有する。
【００１７】
上記の論議から、すべての治療的応用に理想的である薬物形態は存在しないことは明らかである。したがって、様々な製剤において使用することができる様々な独特の薬物形態、例えば、塩、多形体、非結晶性形態を探し求めることが重要である。具体的な製剤または治療的応用のための薬物形態の選択には、上記に記載されているような様々な特性を考慮することが必要であり、特定の応用のための最良の形態は、１つの具体的な重要で良好な性質を有する形態であってよく、一方、他の特性は、許容できるか、または辛うじて許容できるかであってよい。
【００１８】
米国特許第６，４９８，１７２Ｂ１号は、例えば、骨障害の治療に有用であるような化合物（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸を開示している。この出願は、一般論として、薬学的に許容できる塩に言及しており、ナトリウム塩の調製が開示されている。しかしながら、‘１７２特許は、結晶化手順について何ら記載せず、特許は、この化合物の多形体形態についても何ら論議していない。
【００１９】
公開された国際特許出願ＷＯ９９／１９３００およびＷＯ９８／２８２６４は、プロスタグランジン作動薬ならびに局所適用（例えば、骨折または骨切り術の部位への）による骨折および骨切り術の治癒を治療および促進するためのそれらの使用を開示している。
【００２０】
Ｓ．Ｃ．ＭｉｌｌｅｒおよびＳ．Ｃ．Ｍａｒｋｓ，Ｊｒ．、Ｂｏｎｅ  １４、１４３〜１５１（１９９３）は、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）によるイヌ下顎骨の骨膜表面上の新生骨形成の局所刺激を研究し、外側下顎皮質に隣接して骨膜下に埋め込まれた浸透圧ミニポンプと制御放出性ペレット剤による送達を比較した。
【００２１】
Ｓ．Ｃ．Ｍａｒｋｓ，Ｊｒ．およびＳ．Ｃ．Ｍｉｌｅｒ、Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌ．１７：５００〜５０５（１９８８）は、１週当たり５００〜２０００μｇの投与量で３週間にわたるＰＧＥ１の局所注入が、イヌの下顎骨における歯槽骨の劇的で局所的な形成を生み出すことを報告した。
【００２２】
Ｍ−Ｓ．ＳｈｉｈおよびＲ．Ｗ．Ｎｏｒｒｄｉｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４８：８２８〜８３０（１９８６）では、横骨折を、成体ビーグル犬の肋骨で外科的に作製し、１０％エタノールＴｒｉｓ−緩衝液ビヒクル０．５ｍｌまたはＰＧＥ１（１０％エタノールＴｒｉｓ−緩衝液中にＰＧＥ１０．２ｍｇを含有する）０．５ｍｌを１０日間にわたって１日２回、骨折部位に直接注射した。ＰＧＥ１の投与は、骨折部位およびその対側整合部位に隣接する骨膜外層上の骨基質形成を誘導するという結論であった。
【００２３】
Ｍ−Ｓ．ＳｈｉｈおよびＲ．Ｗ．Ｎｏｒｒｄｉｎ、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．（１９８６）３９：１９１〜１９７は、手術後１０日間にわたって１日２回、ビーグル犬の頸骨における欠損部位に注射されたＰＧＥ１（１０％エタノール中０．２ｍｇ／ｋｇ）の影響を研究した。局所的にＰＧＥ１を投与されたイヌは、存在する類骨量の増加と共に、より多くの骨膜および皮質の骨内膜性骨形成を有することが判明した。
【００２４】
Ｒ．Ｙａｎｇ、Ｔ．ＬｉｕおよびＳ．Ｌｉｎ−Ｓｈｉａｕ、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．、５２：５７〜６１（１９９３）は、１４日間にわたる左頸骨の骨幹端中への骨内経路を介するプロスタグランジンＥ２の連日注射の影響を検討した。この参考文献によれば、この投与計画は、骨幹端における骨梁の有意な増加をもたらした。
【００２５】
Ｋ．Ｎｏｔｏｙａ他、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２９０：１０５４〜１０６４（１９９９）は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける骨格再生および骨修復に対して局所的に適用された持続放出性マイクロカプセル剤で、新規な骨芽細胞分化促進化合物であるＴＡＫ−７７８の影響を調べた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明の他の実施形態によれば、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩またはその水和物の結晶性形態が提供される。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明のさらに他の実施形態によれば、治療有効量の（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩またはその水和物の結晶性形態、および薬学的に許容できる希釈剤または担体を含む医薬組成物が提供される。
【００２８】
本発明の別の実施形態によれば、緑内障、高眼圧症または低骨量を示す状態を有する哺乳類を治療するための方法であって、治療有効量の（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩またはその水和物の結晶性形態を哺乳類に投与することを含む方法が提供される。
【００２９】
本発明のさらに他の実施形態によれば、哺乳類において骨量を増加および維持するための方法であって、治療有効量の（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩またはその水和物の結晶性形態を哺乳類に投与することを含む方法が提供される。
【００３０】
本発明のさらに別の実施形態によれば、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩半水和物の結晶性形態Ａを調製するための方法であって、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸を、遊離の酸として、有機溶媒中で水酸化ナトリウムと接触させて反応混合物を形成すること、反応混合物を約５０Ｃ〜約９０Ｃの第１の温度まで温め、少なくとも１時間にわたって第１の温度を保つこと、反応混合物を約１５Ｃ〜約２５Ｃの第２の温度まで冷却すること、および反応混合物から固体を集めることを含む方法が提供される。この方法において使用される有機溶媒は、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸１ｍｍｏｌ当たり約８〜約１２ｍｌで存在する酢酸イソプロピルであってよい。この方法において使用される水酸化ナトリウムは、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸１ｍｍｏｌ当たり約１〜約１．３ｍｍｏｌで存在する水酸化ナトリウムの５０％水溶液であってよい。
【００３１】
本発明の他の実施形態によれば、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩またはその水和物の非結晶性形態または非晶質性形態が提供される。
【００３２】
本発明のさらに他の実施形態によれば、治療有効量の（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩またはその水和物の非結晶性形態または非晶質性形態、および薬学的に許容できる希釈剤または担体を含む医薬組成物が提供される。
【００３３】
本発明の別の実施形態によれば、緑内障、高眼圧症または低骨量を示す状態を有する哺乳類を治療するための方法であって、治療有効量の（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩またはその水和物の非結晶性形態または非晶質性形態を哺乳類に投与することを含む方法が提供される。
【００３４】
本発明のさらに他の実施形態によれば、哺乳類において骨量を増加および維持するための方法であって、治療有効量の（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩またはその水和物の非結晶性形態または非晶質性形態を哺乳類に投与することを含む方法が提供される。
【００３５】
化合物「（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸」は、化合物の遊離の酸を指す。
【００３６】
「哺乳類」という用語は、例えば、イヌ、ネコ、雌ウシ、ヒツジ、ウマ、およびヒトを包含する動物を意味する。好ましい哺乳類は、ヒトを包含する。
【００３７】
「実質的に純粋な」という語句は、化合物の総量（すなわち、望ましい多形体および／または塩＋その他の多形体および非晶質性形態、塩および遊離の酸の量）に関して望ましい多形体および／または塩の相対的純度を指す。「実質的に純粋な」多形性形態は、化合物の総量に対して望ましい多形体を少なくとも約９０％含有するべきである。「実質的に純粋な」多形性形態は、望ましい多形体を少なくとも約９５％含有するべきであることが好ましい。本発明の一部の実施形態において、「実質的に純粋な」多形性形態は、望ましい多形体を少なくとも約９９％含有することがある。
【００３８】
「低骨量を示す１種または複数の状態」という語句は、骨量のレベルが、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  Ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ（１９９４）、Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ  ８４３」による基準で定義されているような年齢特異的な正常以下である状態を指す。原発性および続発性骨粗鬆症は、「低骨量を示す１種または複数の状態」に包含される。続発性骨粗鬆症は、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、甲状腺機能亢進症誘発性骨粗鬆症、不動化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）誘発性骨粗鬆症、ヘパリン誘発性骨粗鬆症および免疫抑制誘発性骨粗鬆症を包含する。歯周疾患、歯槽骨喪失、骨切り術後および小児期特発性骨喪失も包含される。「低骨量を示す１種または複数の状態」という語句は、背骨の湾曲、身長の減少および補綴手術などの骨粗鬆症の長期合併症も包含する。
【００３９】
「低骨量を示す１種または複数の状態」という語句は、骨粗鬆症を包含する上記に記載されているような疾患を発症する平均よりも有意に高い確率を有することが知られている哺乳類、例えば、哺乳類（例えば、閉経後の女性、および６０歳を超える男性）も指す。
【００４０】
他の骨量を増加または増強する用途は、骨修復、骨折治癒速度の増加、骨移植手術の完全な置き換え、骨移植成功率の向上、顔面再建、上顎再建、下顎再建、頭蓋顔面再建後の骨治癒、補綴内方成長、椎骨癒合、長骨伸長および脊椎固定術を包含する。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、脊椎固定ケージ、脊椎固定金属製品、内部および外部の骨固定装置、ネジならびにピンなどの当業者に知られている整形外科用装置と併せて使用することもできる。
【００４２】
当業者は、骨量という用語が、実際には、時に（厳密には正しくないが）骨塩密度（ＢＭＤ）と呼ばれる単位面積当たりの骨量を指すことを理解するであろう。
【００４３】
本明細書で使用する「治療すること」、「治療する」または「治療」という用語は、予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）（例えば、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ））、姑息的および治癒的治療を包含する。
【００４４】
「有効量」という用語は、特定の疾患もしくは状態または特定の疾患もしくは状態の症状を改善、軽減もしくは除去するか、または特定の疾患もしくは状態または特定の疾患もしくは状態の症状の発現を予防もしくは遅延する化合物または化合物の組合せの量を意味する。
【００４５】
「患者」という用語は、ヒト、イヌ、ネコおよびウマなどのコンパニオンアニマル、ならびにウシ、ブタおよびヒツジなどの家畜などの動物を意味する。特に好ましい患者は、雄と雌の両方を包含する哺乳類であり、ヒトがより好ましい。
【００４６】
本明細書で使用する「薬学的に許容できる」という用語は、担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または塩が、製剤の他の成分と適合していなければならず、そのレシピエントに対して有害でないことを意味する。
【００４７】
「プロドラッグ」という表現は、投与後、いくつかの化学的または生理学的プロセスを介してｉｎ  ｖｉｖｏで薬物を放出する薬物前駆体である化合物を指す（例えば、生理学的ｐＨにされるか、または酵素作用によりプロドラッグは、望ましい薬物形態へ変換される）。例示的プロドラッグは、切断により、対応する薬物化合物を放出する。
【００４８】
「薬学的に許容できる塩」という表現は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、酪酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、メタンスルホン酸塩および４−トルエン−スルホン酸塩など（であるが、これらに限定されない）アニオン性の塩を指す。この表現は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムまたはプロトン化したベンザチン（Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン）、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグラミン（ｍｅｇｌａｍｉｎｅ）（Ｎ−メチル−グルカミン）、ベネタミン（Ｎ−ベンジルフェネチルアミン）、ピペラジンおよびトロメタミン（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）など（であるが、これらに限定されない）カチオン性の塩も指す。
【００４９】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様および利点は、以下の図面、説明および特許請求の範囲を参照してよりよく理解されていくであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
一般に、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩は、米国特許第６，４９８，１７２Ｂ１号に開示されている方法により調製することができ、その主題は、参照により全体として本明細書に組み込まれるものとする。代替方法として、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩は、以下のスキームＩに記載されている新規な方法により調製することができる。これらの化合物の具体的な多形体を製造するための特定のプロセスは、実験の項に示される。すべての出発化合物は、文献手順によるか、またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯなどの一般的商業ソースから得ることができる。
【００５１】
考察、実施例および調製において、以下の略語が使用される。２Ｂ  ＥｔＯＨ−変性エタノール、ｂｒ−幅広いピーク、℃−セ氏温度、ｄ−二重線、ＤＭＳＯ−ｄ６−重水素化ジメチルスルホキシド、ＥｔＯＡｃ−酢酸エチル、ｅｑｕｉｖ−当量、ｇ−グラム、１Ｈ  ＮＭＲ−プロトン核磁気共鳴、Ｈ２Ｏ−水、ＨＣｌ−塩化水素、Ｈｚ−ヘルツ、ｉＰｒ２Ｎｅｔ−ジイソプロピルエチルアミン（ヒューニッヒ塩基）、ｉＰｒＯＡｃ−酢酸イソプロピル、Ｊ−結合定数（多重線の間隔）、ｋｇ−キログラム、Ｌ−リットル、ｍ−多重線、Ｍ−モル、ＭｅＣｌ２−ジクロロメタン、ｍｇ（ｓ）−ミリグラム、ｍｉｎ−分、ｍＬ−ミリリットル、ｍｍｏｌ−ミリモル、ｍｐ−融点、ＭＰａ−メガパスカル、ＭＳ−マススペクトル、Ｎ−規定濃度、ＮａＨＣＯ３−炭酸水素ナトリウム、ＮａＯＨ−水酸化ナトリウム、ｐｓｉ−毎平方インチ当たりポンド、Ｐｔ／Ｃ−炭素上白金、ＲＴ−室温、ｓ−一重線ピークおよびｔ−三重線ピーク。さらに、以下の考察、実施例および調製において、Ｂｒｕｋｅｒへの言及は、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩの製品を指し、Ｋｅｖｅｘへの言及は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡの製品を指す。
【００５２】
【化１】
2009137934.tif 000002
【００５３】
ステップ１：｛３−［（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジルアミノ）−メチル］−フェノキシ｝−酢酸エチルエステルコハク酸塩（ＩＩ）の調製
５００ｍＬのＰａｒｒ瓶に、２Ｂエタノール（１８０ｍＬ）および５％炭素上白金、５０％水湿（２．００ｇ）を充填した。２Ｂエタノール（２０ｍＬ）中の３−ホルミルフェノキシ酢酸エチル（２０．０ｇ、９６．０６ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液と、続いて、４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジルアミン（１６．８６ｍＬ、９６．０６ｍｍｏｌ、１．０当量）を加えた。混合物を５時間にわたって窒素雰囲気下で室温において攪拌し、その時点で、式Ｉの中間体の生成が完了した。反応容器を５０ｐｓｉ（０．３４４７ＭＰａ）の水素雰囲気下に置き、１８時間にわたって室温において振盪させた。混合物を珪藻土に通して濾過し、濾過ケーキを２Ｂエタノール（４０ｍＬ）で１回洗浄した。濾液を、添加ロートおよびメカニカルスターラーを取り付けた１リットルのフラスコに移した。２Ｂエタノール（１２０ｍＬ）中のコハク酸（１１．３４ｇ、９６．０６ｍｍｏｌ、１．０当量）の温かい溶液を１５分かけて加えた。得られたスラリーを１９時間にわたって室温において攪拌し、次いで、濾過した。固体を２Ｂエタノール（５０ｍＬ）で１回洗浄し、乾燥すると、ＩＩ（３３．１０ｇ、収率７３％）が得られた。融点＝１３８〜１３９℃。元素分析  Ｃ２２Ｈ２９ＮＯ３・Ｃ４Ｈ６Ｏ４の計算値：Ｃ  ６５．９４；Ｈ  ７．４５；Ｎ  ２．９６。実測値：Ｃ  ６５．７４；Ｈ  ７．６２；Ｎ  ２．９９。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  １．２８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、１．３２（ｓ，９Ｈ）、２．５０（ｓ，４Ｈ）、４．０８（ｓ，２Ｈ）、４．１０（ｓ，２Ｈ）、４．２３（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、４．７３（ｓ，２Ｈ）、６．９６〜６．９８（ｍ，１Ｈ）、７．０４〜７．０６（ｍ，２Ｈ）、７．３３〜７．３８（ｍ，３Ｈ）、７．４６〜７．４８（ｍ，２Ｈ）。
【００５４】
ステップ２および３：（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸（Ｖ）の調製
化合物ＩＩ（４８．００ｇ、１０１ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ジクロロメタン（３６０ｍＬ）と１Ｍ水性重炭酸ナトリウム（２４０ｍＬ）の間で分配することにより遊離塩基にした。層を分離し、有機層を水（２４０ｍＬ）で１回洗浄した。層を分離し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５３．４ｍＬ、３０４ｍｍｏｌ、３．０当量）を有機層に加えた。塩化ピリジン−３−スルホニル塩酸塩（ＩＩＩ）（２６．４ｇ、１２３ｍｍｏｌ、１．２当量）およびジクロロメタン（２４０ｍＬ）を別の反応容器に充填し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。遊離塩基／Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン溶液を１．８時間かけて加えた。反応混合物を室温まで温め、１９時間にわたって保ち、その時点で、式ＩＶ（（３−｛［（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ］−メチル｝−フェノキシ）−酢酸エチルエステル）の中間体の生成が完了した。反応混合物を１Ｎ塩酸（３３６ｍＬ）、次いで、１Ｍ水性重炭酸ナトリウム（３３６ｍＬ）で洗浄した。２Ｂエタノール（３８４ｍＬ）を有機層に加え、混合物を、ポット容積が約４００ｍＬになるまで大気圧蒸留した。６Ｎ水酸化ナトリウム（１９．９ｍＬ、１１９ｍｍｏｌ、１．２当量）を加え、混合物を１９時間にわたって室温に保った。濃塩酸（１１．０ｍＬ、１３４ｍｍｏｌ、１．３当量）と、続いて、水（１９２ｍＬ）を加えた。スラリーを室温において５時間にわたって顆粒化し、濾過した。固体を５０：５０  ２Ｂエタノール：水（１４４ｍＬ）、水（１４４ｍＬ）、２Ｂエタノール（１４４ｍＬ）で洗浄し、次いで、乾燥すると、化合物Ｖ（３４．７８ｇ、収率７３％）が得られた。融点＝１５９〜１６０℃。元素分析  Ｃ２５Ｈ２８Ｎ２Ｏ５Ｓの計算値：Ｃ  ６４．０８；Ｈ  ６．０２；Ｎ  ５．９８。実測値  Ｃ  ６４．１３；Ｈ  ６．１１；Ｎ  ５．９９。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １．２１（ｓ，９Ｈ）、４．３１（ｓ，２Ｈ）、４．３３（ｓ，２Ｈ）、４．５４（ｓ，２Ｈ）、６．６５〜６．６９（ｍ，１Ｈ）、６．７１〜６．７４（ｍ，１Ｈ）、６．７５〜６．７６（ｍ，１Ｈ）、７．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．１３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）、７．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、７．５６〜７．５９（ｍ，１Ｈ）、８．１６〜８．１９（ｍ，１Ｈ）、８．８０〜８．８２（ｍ，１Ｈ）、８．９７〜８．９８（ｍ，１Ｈ）、１３．０４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）。
【００５５】
ステップ３Ｒ：（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸（Ｖ）の再結晶
（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸（Ｖ）（２０．０ｇ、４２．７ｍｍｏｌ、１．０当量）およびメチルエチルケトン（３００ｍＬ）を混ぜ合わせ、すべての固体が溶けるまで６０℃まで加熱した。溶液を３５℃まで冷却し、０．４５ミクロンのナイロンフィルターに通して濾過した。フィルターをメチルエチルケトン（２０ｍＬ）ですすいだ。濾液を混ぜ合わせ、約１６０ｍＬのポット容積まで大気圧蒸留により濃縮した。混合物を室温まで冷却し、その時点で、結晶化が始まった。混合物を室温において１９時間にわたって攪拌し、次いで、濾過した。固体をメチルエチルケトン（２０ｍＬで２回、次いで、４０ｍＬで１回）で洗浄し、乾燥すると、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸（ＶＩ）（１５．３０ｇ、収率７７％）が得られた。融点＝１５９．０〜１５９．５℃。元素分析  Ｃ２５Ｈ２８Ｎ２Ｏ５Ｓの計算値：Ｃ  ６４．０８；Ｈ  ６．０２；Ｎ  ５．９８。実測値  Ｃ  ６３．８９；Ｈ  ５．８２；Ｎ  ５．９１。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：上記のステップ２および３と同じ。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、メチルエチルケトン約１．４％の存在も示した。
【００５６】
ステップ４：（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸半水和物形態Ａ（ＶＩＩ）の調製
（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸（ＶＩ）（２０．０ｇ、４２．７ｍｍｏｌ、１．０当量）および酢酸イソプロピル（４００ｍＬ）を反応容器に充填した。５０％水酸化ナトリウム（３．５２０ｇ、４４．０ｍｍｏｌ、１．０３当量）と、続いて、脱イオン水（４．１６５ｇ）を加えた。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸半水和物形態Ａ（ＶＩＩ、２００ｍｇ）をシード材料として加えた。混合物を３０分かけて７０℃まで加熱し、５時間にわたってこの温度に保った。混合物を４時間かけて４０℃まで冷却し、次いで、１時間かけて２０℃まで冷却し、１９時間にわたって顆粒化し、次いで、濾過した。固体を１％水性酢酸イソプロピル（各洗浄液２０ｍＬ）で２回洗浄し、次いで、乾燥すると、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸半水和物形態Ａ（ＶＩＩ、１８．２２ｇ、収率８５％）が得られた。半水和物は、約１２０℃に脱水温度を有し、融点は有していない。元素分析  Ｃ２５Ｈ２７Ｎ２Ｏ５Ｓ・Ｎａ・１／２Ｈ２Ｏの計算値：Ｃ  ６１．２１；Ｈ  ５．５５；Ｎ  ５．７１。実測値  Ｃ  ６０．１９；Ｈ  ５．５５；Ｎ  ５．５６。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １．２１（ｓ，９Ｈ）、４．０７（ｓ，２Ｈ）、４．３１（ｓ，４Ｈ）、６．５９〜６．６１（ｍ，１Ｈ）、６．６４（ｍ，１Ｈ）、６．７１〜６．７４（ｍ，１Ｈ）、７．０１〜７．０９（ｍ，３Ｈ）、７．２２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．５６〜７．５９（ｍ，１Ｈ）、８．１４〜８．１７（ｍ，１Ｈ）、８．７９〜８．８０（ｍ，１Ｈ）、８．９４（ｍ，１Ｈ）。
【００５７】
代替方法として、ステップ４におけるナトリウム塩生成および再結晶は、以下のスキームＩＩに示す手順を用いて行うことができる。
【００５８】
【化２】
2009137934.tif 000003
（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸（ＶＩ）（４７．７ｇ）およびメタノール（５００ｍＬ）を混ぜ合わせた。１Ｎ水酸化ナトリウム（１．０１当量、１０３ｍＬ）を、室温において攪拌しながらゆっくりと加えた。２時間にわたって攪拌した後、混合物を濃縮し、アセトンで５回（毎回３００ｍＬ）およびジクロロメタンで２回（毎回２００ｍＬ）と一緒に共沸させると、非晶質性の泡が得られた。これに、アセトン（５００ｍＬ）および水（１５ｍＬ）を加え、混合物を５０℃まで加熱した。２０分後、材料は極めて粘稠になり、追加のアセトン（２００ｍＬ）を加えた。混合物を室温まで冷却し、濾過した。濾過ケーキを２−プロパノールで洗浄し、高真空下で乾燥すると、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸半水和物形態Ａ（ＶＩＩ、収率７７％）３９ｇが得られた。
【００５９】
粉末Ｘ線回折
（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の結晶性形態Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、およびＧを、それらのＸ線粉末回折パターンにより特徴付けた。すなわち、形態Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、およびＧのＸ線回折パターンを、銅放射線（波長：１．５４０５６Å）を用いるＢｒｕｋｅｒ  Ｄ５０００回折計で行った。管の電圧およびアンペア数は、それぞれ４０ｋＶおよび５０ｍＡに設定した。発散スリットおよび散乱スリットは、１ｍｍに設定し、受光スリットは、０．６ｍｍに設定した。回折された放射線は、Ｋｅｖｅｘ  ＰＳＩ検出器により検出した。３．０から４０°２θまでの２．４°／分（１秒／０．０４°ステップ）におけるθ−２θ連続スキャンを用いた。アルミナ標準品を分析し、機器アラインメントをチェックした。データを集め、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳソフトウェアバージョン７．０を用いて分析した。試料は、石英ホルダーに試料を入れることにより調製した。
【００６０】
本明細書で報告される測定のために使用されるＢｒｕｋｅｒシステムのようなＢｒａｇｇ−Ｂｒｅｎｔａｎｏ機器でＸ線回折測定を行うため、試料を、通常、空洞を有するホルダーの中に入れる。試料粉末をガラススライドまたは同等物により押し付け、ランダムな表面および適切な試料高を確保する。次いで、試料ホルダーを機器の中に入れる。入射Ｘ線ビームを、初めはホルダー面に対して小さな角度で試料に向け、次いで、入射ビームとホルダー面の間の角度を連続的に増加させる円弧に沿って移動させる。そのようなＸ線粉末分析に関連した測定差は、（ａ）試料調製における誤差（例えば、試料高）、（ｂ）機器誤差（例えば、平面試料誤差）、（ｃ）較正誤差、（ｄ）操作者誤差（ピーク位置を決定する場合に存在する誤差を包含する）、および（ｅ）材料の性質（例えば、好ましい配向性および透明度誤差）を包含する様々な要因に起因する。較正誤差および試料高誤差は、同じ方向ですべてのピークのシフトをもたらすことが多い。平面ホルダーを用いる場合の試料高における小さな差は、ＸＲＰＤピーク位置における大きな移動につながるであろう。系統的な研究は、典型的なＢｒａｇｇ−Ｂｒｅｎｔａｎｏ配置でＳｈｉｍａｄｚｕ  ＸＲＤ−６０００を用いると、１ｍｍの試料高差が、１°２θと同じ高さのピークシフトにつながることを明らかにした（Ｃｈｅｎ他；Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、２００１；２６、６３）。これらのシフトは、Ｘ線ディフラクトグラムから識別することができ、シフトについて補正すること（系統的な補正係数をすべてのピーク位置値に適用すること）、または機器を再較正することにより除去することができる。上述のように、ピーク位置を一致させるために系統的な補正係数を適用することにより、様々な機械からの測定値を修正することが可能である。一般に、この補正係数は、Ｂｒｕｋｅｒからの測定ピーク位置を、期待されるピーク位置と一致させるであろうし、０〜０．２°２θの範囲であってよい。
【００６１】
（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の非結晶性形態Ｈを、そのＸ線粉末回折パターンにより特徴付けた。形態ＨについてのＸ線粉末回折パターンを、銅放射線を用いるＳｉｅｍｅｎｓ  Ｄ５０００回折計で作成した。機器に、直線集束Ｘ線管を取り付けた。管の電圧およびアンペア数は、それぞれ３８ｋＶおよび３８ｍＡに設定した。発散スリットおよび散乱スリットは、１ｍｍに設定し、受光スリットは、０．６ｍｍに設定した。回折されたＣｕ  Ｋα１放射線（λ＝１．５４０５６Å）は、Ｋｅｖｅｘ  ＰＳＩ検出器を用いて検出した。３．０から４０°２θまでの２．４°２θ／分（１秒／０．０４°２θステップ）におけるθ２θ連続スキャンを用いた。アルミナ標準品（ＮＩＳＴ標準基準材料１９７６）を分析し、機器アラインメントをチェックした。データを集め、ＢＲＵＫＥＲ  ＡＸＳ  ＤＩＦＦＲＡＣ  ＰＬＵＳソフトウェアバージョン２．０を用いて分析した。試料は、石英ホルダーに試料を入れることにより調製した。ＰＸＲＤピークは、最大ピーク高を用いて手動で選択した。
【００６２】
図１を参照すると、本発明のある実施形態による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ａのディフラクトグラムが示される。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ａは、ＣｕＫα放射線によりＢｒｕｋｅｒ  Ｄ５０００回折計で測定された７％以上の相対強度を有する度２θ、ｄ間隔、および相対強度に関して表される以下のＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる：
【００６３】
【表１】
2009137934.tif 000004
【００６４】
図２を参照すると、本発明のある実施形態による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｂのディフラクトグラムが示される。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｂは、ＣｕＫα放射線によりＢｒｕｋｅｒ  Ｄ５０００回折計で測定された３％以上の相対強度を有する度２θ、ｄ間隔、および相対強度に関して表される以下のＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる：
【００６５】
【表２】
2009137934.tif 000005
【００６６】
図３を参照すると、本発明のある実施形態による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｃのディフラクトグラムが示される。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｃは、ＣｕＫα放射線によりＢｒｕｋｅｒ  Ｄ５０００回折計で測定された５％以上の相対強度を有する度２θ、ｄ間隔、および相対強度に関して表される以下のＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる：
【００６７】
【表３】
2009137934.tif 000006
【００６８】
図４を参照すると、本発明のある実施形態による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｅのディフラクトグラムが示される。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｅは、ＣｕＫα放射線によりＢｒｕｋｅｒ  Ｄ５０００回折計で測定された４％以上の相対強度を有する度２θ、ｄ間隔、および相対強度に関して表される以下のＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる：
【００６９】
【表４】
2009137934.tif 000007
【００７０】
図５を参照すると、本発明のある実施形態による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｆのディフラクトグラムが示される。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｆは、ＣｕＫα放射線によりＢｒｕｋｅｒ  Ｄ５０００回折計で測定された５％以上の相対強度を有する度２θ、ｄ間隔、および相対強度に関して表される以下のＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる：
【００７１】
【表５】
2009137934.tif 000008
【００７２】
次に、図６を参照すると、本発明のある実施形態による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｇのディフラクトグラムが示される。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｇは、ＣｕＫα放射線によりＢｒｕｋｅｒ  Ｄ５０００回折計で測定された６％以上の相対強度を有する度２θ、ｄ間隔、および相対強度に関して表される以下のＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる：
【００７３】
【表６】
2009137934.tif 000009
【００７４】
要約すれば、表７は、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の結晶性形態Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、およびＧについて試料における回折線の度２θおよび相対強度を列挙している：
【００７５】
【表７】
2009137934.tif 000010
【００７６】
（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の６つの結晶性形態のみが知られているため、各形態は、単一のＸ線粉末回折線、線の組合せまたは他の形態のＸ線粉末回折と異なるパターンにより、他の結晶性形態から識別および区別することができる。
【００７７】
例えば、表８は、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、およびＧについての独特なピーク、ならびに２θピークの組合せ、すなわち、各形態に独特である一連のＸ線回折線を列挙している。
【００７８】
【表８】
2009137934.tif 000011
【００７９】
次に、図６Ｂを参照すると、本発明のある実施形態による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の非結晶性形態Ｈのディフラクトグラムが示される。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｈは、ＣｕＫα放射線によりＢｒｕｋｅｒ  Ｄ５０００回折計で測定された６％以上の相対強度を有する度２θ、ｄ間隔、および相対強度に関して表される以下のＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる：
【００８０】
【表９】
2009137934.tif 000012
【００８１】
次に、図６Ｃを参照すると、本発明のある実施形態による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の非晶質性形態Ｉのディフラクトグラムが示される。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｉは、図に示されるようなＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる。
【００８２】
固体核磁気共鳴
次に、図７を参照すると、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ａを、その固体核磁気共鳴スペクトル（ＳＳＮＭＲ）により特徴付けることもできる。すなわち、形態Ａの固体核磁気共鳴スペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ（Ｂｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）Ａｖａｎｃｅ  ＤＳＸ  ５００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計で行った。
【００８３】
１３Ｃ  ＳＳＮＭＲ
化合物約７０ｍｇを、分析される試料のための４ｍｍのＺｒＯスピナーに固く詰め込んだ。一次元１３Ｃスペクトルは、ワイドボアＢｒｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ  Ａｖａｎｃｅ  ＤＳＸ  ５００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計内に配置されたＢｒｕｋｅｒ  ４ｍｍ  ＢＬ  ＣＰＭＡＳプローブで２９３Ｋにおいて１Ｈ−１３Ｃ交差分極マジック角回転（ＣＰＭＡＳ）を用いて周囲圧力にて集めた。試料は、４ｍｍのスピナーにとっての最大規定回転速度に相当する１５．０ｋＨｚにて回転させた。速い回転速度は、スピニングサイドバンドの強度を最小限に抑えた。シグナル感度を最適化するため、交差分極接触時間を２．０ｍｓに調整し、デカップリングパワーを８５ｋＨｚに設定した。炭素スペクトルは、３秒のリサイクルディレイで２，８２０のスキャンを取得した。炭素スペクトルは、その高磁場共鳴が２９．５ｐｐｍに設定されているアダマンタンの外部試料を用いて参照した。
【００８４】
（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ａは、化学シフトが百万分率（ｐｐｍ）で表される以下の固体１３Ｃ核磁気共鳴（ＳＳＮＭＲ）スペクトルにより特徴付けられた：
【００８５】
【表１０】
2009137934.tif 000013
【００８６】
次に、図８を参照すると、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｈを、その固体核磁気共鳴スペクトル（ＳＳＮＭＲ）により特徴付けることもできる。すなわち、形態Ａの固体核磁気共鳴スペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ（Ｂｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）Ａｖａｎｃｅ  ＤＳＸ  ５００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計で行った。
【００８７】
形態Ｈのための１３Ｃ  ＳＳＮＭＲ法
化合物約７０ｍｇを、４ｍｍのＺｒＯ２ローターに固く詰め込んだ。一次元１３Ｃスペクトルは、ワイドボアＢｒｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ  Ａｖａｎｃｅ  ＤＳＸ  ５００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計内に配置されたＢｒｕｋｅｒ  ４ｍｍ  ＢＬ  ＣＰＭＡＳプローブで２９４Ｋにおいて１Ｈ−１３Ｃ交差分極マジック角回転（ＣＰＭＡＳ）を用いて周囲圧力にて集めた。試料は、４ｍｍのローターにとっての最大規定回転速度に相当する１５．０ｋＨｚにて回転させた。速い回転速度は、スピニングサイドバンドの強度を最小限に抑えた。シグナル感度を最適化するため、交差分極接触時間を２．０ｍｓに調整し、デカップリングパワーを８５ｋＨｚに設定した。炭素スペクトルは、５秒のリサイクルディレイで５４００のスキャンを取得した。炭素スペクトルは、その高磁場共鳴が２９．５ｐｐｍに設定されているアダマンタンの外部試料を用いて参照した。
【００８８】
【表１１】
2009137934.tif 000014
【００８９】
本発明の（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の結晶性形態または非結晶性形態または非晶質性形態は、無水形態ならびに水和および溶媒和形態で存在することができる。一般に、水和形態は、非水和形態と等価であり、本発明の範囲内に包含されることが意図されている。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の結晶性形態Ａ、Ｂ、およびＣは、水和物として生じることが好ましいが、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の結晶性形態Ｅ、Ｆ、およびＧは、無水形態として生じることが好ましい。
【００９０】
本発明の（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の結晶性形態または非結晶性形態または非晶質性形態は、等価なＸ線粉末ディフラクトグラム、または固体ＮＭＲスペクトルを有する水和および／または溶媒和の程度にかかわらず、本発明の範囲内にある。
【００９１】
以下の非限定的な実施例は、本発明の化合物を調製するための好ましい方法を例示している。
【実施例】
【００９２】
形態Ａ：（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩
【００９３】
【化３】
2009137934.tif 000015
手順：５００ｍＬのジャケット付き反応器に、酢酸イソプロピル（４００ｍＬ）、５０％水性水酸化ナトリウム（３．５２０ｇ）および水（４．１６５ｇ）を充填した。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸（ＶＩ）（２０．０ｇ）と、続いて、シードとしての（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸の形態Ａ（２００ｍｇ）（例えば、上記で、スキームＩＩのプロセスにより調製される）を混合物に充填した。混合物を３０分かけて７０℃まで加熱し、５時間にわたってこの温度において攪拌した。混合物を４時間かけて４０℃まで冷却し、次いで、１時間かけて２０℃まで冷却した。次いで、スラリーを１２時間にわたって２０℃において顆粒化した。スラリーを、ブフナーロート（濾紙）に通して濾過した。濾過ケーキを１％水性酢酸イソプロピル２０ｍＬで２回洗浄し、次いで、窒素を抽気しながら４０〜４５℃において一夜にわたって真空オーブン中で乾燥すると、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩半水和物形態Ａ（ＶＩＩＩ、収率７９％）１６．８４ｇが得られた。
【００９４】
形態Ｂ：（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩
【００９５】
【化４】
2009137934.tif 000016
手順：（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸（ＶＩ）（４．９８ｇ）、酢酸エチル（５９．８ｍＬ）および水（１．３ｍＬ）を混ぜ合わせ、５５℃まで加熱した。酢酸エチル（２０ｍＬ）および水（０．４４ｍＬ）中の２−エチルヘキサン酸ナトリウム（９７％、２．０２５ｇ）の溶液を加えると、澄明な溶液が得られた。溶液を、５５°〜６０℃において１５分間にわたって活性炭で処理し、珪藻土に通して濾過した。濾過ケーキを酢酸エチル／２．２％水５ｍＬで１回洗浄した。濾液は、４０℃であった。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩（ＶＩＩＩ）５０ｍｇをシードとして加え、混合物を室温まで冷却し、１８時間にわたって攪拌した。スラリーを濾過すると、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩３．１ｇが得られた。
【００９６】
濾液を２０ｍＬまで濃縮し、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩（ＶＩＩＩ）をシードし、室温において３時間にわたって攪拌し、濾過すると、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩０．１ｇが得られた。
【００９７】
第２の濾液を濃縮乾固し、室温において水４０ｍＬ中で顆粒化し、濾過し、空気乾燥すると、固体２．４ｇが得られた。これらを酢酸エチル３０ｍＬおよび酢酸エチル１０ｍＬ中の２−エチルヘキサン酸ナトリウム（９７％、１ｇ）の溶液と混ぜ合わせた。混合物を１８時間にわたって室温において攪拌し、濾過し、乾燥すると、非結晶性の固体が得られた。この材料を酢酸エチル４０ｍＬおよび水１ｍＬに溶かし、１８時間まで室温において攪拌した。ヘキサンを、かすみ点に達するまで加え、次いで、混合物を２４時間にわたって攪拌した。粘稠な沈殿が形成し、濾過し、乾燥酢酸エチルで洗浄し、乾燥すると、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩一水和物形態Ｂ（ＩＸ）１．２７ｇが得られた。
【００９８】
形態Ｃ：（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩
【００９９】
【化５】
2009137934.tif 000017
手順：（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩（５０１ｍｇ）および含水ＴＨＦ（２．２％水）５．０ｍＬを混ぜ合わせ、窒素雰囲気下で１時間かけて５０°〜５５℃まで加熱した。懸濁液に、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩４ｍｇをシードし、次いで、室温まで冷却し、６６時間にわたって攪拌した。溶媒を完全に蒸発させると、白色の固体が残った。追加の含水ＴＨＦ（２．２％水）５ｍＬを加え、混合物を５時間にわたって攪拌した。固体を濾過し、４５°〜５０℃において真空下で乾燥すると、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩一水和物形態Ｃ（Ｘ、収率６５．３％）３３３ｍｇが得られた。
【０１００】
形態ＥおよびＦ：（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩
【０１０１】
【化６】
2009137934.tif 000018
手順：（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩をエチレングリコールに溶かし、溶液を、室温においてゆっくりと蒸発させた。１週間後、微細針状晶が生成し、濾過し、空気乾燥し、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩無水形態Ｅ（ＸＩ）として特徴付けた。
【０１０２】
濾液を低容積まで蒸発させ、濾過した。単離された生成物は、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩無水形態Ｆ（ＸＩＩ）として特徴付けた。
【０１０３】
形態Ｇ：（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩
手順：（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩（５０ｍｇ）を、１時間かけて１５５℃まで加熱し、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩形態Ｇを製造した。
【０１０４】
本明細書において識別および記載された（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の６つの結晶性形態（形態Ａ〜Ｇ）の他に、形態Ｈと命名された（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の非結晶性形態も識別された。
【０１０５】
非結晶性（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩（形態Ｈ）の調製
以下の２つの方法を用い、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の非結晶性形態Ｈを調製することができる。
【０１０６】
形態Ｈ、方法１。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の２０〜１００ｍｇ／ｍＬの溶液を、注射用の水に薬物物質を溶かすことにより作製した。溶液を０．２２μの滅菌フィルターで濾過した。溶液をバイアル／シリンジに充填した。バイアル／シリンジを−４５℃において冷凍し、２時間にわたってその温度に保った。凍結乾燥は、１５０ｍτにて（−２０〜２５℃）における一次乾燥と、続く、（２０〜３０℃）における二次乾燥により完了した。得られる固体を貯蔵する。
【０１０７】
形態Ｈ、方法２。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩１グラムを注射用の水１０ｍＬに溶かし、１００ｍｇ／ｍＬ溶液を作製する。溶液を０．２２μの滅菌フィルターで濾過する。溶液０．５ｍＬのアリコートをガラスバイアルに充填する。バイアルを凍結乾燥機に装入する。保管温度を、０．５℃／分の速度で−４５℃まで下げる。保管温度を２時間にわたって−４５℃に保つ。１５０ｍτの真空をかける。保管温度を、０．５℃／分の速度で−２０℃まで上げる。保管温度を２０時間にわたって−１０℃に保つ。保管温度を、０．５℃／分の速度で３０℃まで上げる。１０時間にわたって３０℃に保つ。凍結乾燥プロセスを通して、１５０ｍτの真空を維持する。
【０１０８】
本明細書において識別および記載された（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の６つの結晶性形態（形態Ａ〜Ｇ）および非結晶性形態Ｈの他に、形態Ｉと命名された（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の非晶質性形態も識別された。
【０１０９】
以下の２つの方法を用い、（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の非結晶性形態Ｉを調製することができる。
【０１１０】
形態Ｉ、方法１。非晶質性の（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩は、まず、過剰の結晶性形態Ａを有機溶媒（アセトニトリルまたはジクロロメタン）に加え、７２時間にわたって室温において攪拌することにより調製した。次いで、試料を濾過し、溶液を周囲条件下で室温において蒸発させると、白色の固体が得られ、ＰＸＲＤ分析により非晶質性固体であると決定された。
【０１１１】
形態Ｉ、方法２。非晶質性の（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩は、まず、過剰の結晶性形態Ａを以下の溶媒系（イソプロピルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル、または９７％酢酸エチル／３％水）のうちの１つに加え、７２時間にわたって４０℃において攪拌することにより調製した。次いで、試料を濾過し、溶液を４０℃において蒸発させると、白色の固体が得られ、ＰＸＲＤ分析により非晶質性固体であると決定された。
【０１１２】
上記に記載されている（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の多形性形態は、プロスタグランジン作動薬として有用であり、したがって、そのようなプロスタグランジン作動薬を用いる方法およびそのようなプロスタグランジン作動薬を含有する医薬組成物に有用である。（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の多形性形態は、プロスタグランジンの調節により仲介される状態、特に、ＥＰ２受容体の作動薬により仲介される状態の治療および／または予防に有用である。
【０１１３】
本発明の（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の多形性形態が、放射標識形態で存在することができること、すなわち、前記化合物が、天然において通常見出される原子量または質量数と異なる原子量または質量数を含有する１個または複数の原子を含有することがあることは理解されるであろう。水素、炭素、リン、フッ素および塩素の放射性同位元素は、それぞれ３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆおよび３６Ｃｌを包含する。これらの放射性同位元素および／または他の原子の他の放射性同位元素を含有する本発明の化合物は、本発明の範囲内にある。トリチウム化、すなわち３Ｈ、および炭素−１４、すなわち１４Ｃ、放射性同位元素は、それらの調製の容易さおよび検出能のため特に好ましい。本発明の（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の放射標識多形性形態は、一般的に、当業者によく知られている方法で調製することができる。好都合には、そのような放射標識化合物は、上記のスキームおよび／または実施例に開示されている手順を行い、非放射標識試薬の代わりに、容易に入手可能な放射標識試薬を用いることにより調製することができる。
【０１１４】
当業者は、抗再吸収薬（例えば、プロゲスチン、ポリホスホネート、ビスホスホネート、エストロゲン作動薬／拮抗薬、エストロゲン、エストロゲン／プロゲスチン合剤、Ｐｒｅｍａｒｉｎ（登録商標）、エストロン、エストリオールまたは１７α−もしくは１７β−エチニルエストラジオール）を、本発明の化合物と併せて使用することができることを理解するであろう。
【０１１５】
例示的プロゲスチンは、商業ソースから入手可能であり、アルゲストンアセトフェニド、アルトレノゲスト、酢酸アマジノン、酢酸アナゲストン、酢酸クロルマジノン、シンゲストール、酢酸クロゲストン、酢酸クロメゲストン、酢酸デルマジノン、デソゲストレル、ジメチステロン、ジドロゲステロン、エチネロン、二酢酸エチノジオール、エトノゲストレル、酢酸フルロゲストン、ゲスタクロン、ゲストデン、カプロン酸ゲストノロン、ゲストリノン、ハロプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、レボノルゲストレル、リネストレノール、メドロゲストン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メレンゲストロール、二酢酸メチノジオール、ノルエチンドロン、酢酸ノルエチンドロン、ノルエチノドレル、ノルゲスチメート、ノルゲストメト、ノルゲストレル、フェンプロピオン酸オキソゲストン、プロゲステロン、酢酸キンゲスタノール、キンゲストロン、およびチゲストールを包含する。
【０１１６】
好ましいプロゲスチンは、メドロキシプロゲステロン、ノルエチンドロンおよびノルエチノドレルである。
【０１１７】
例示的な骨再吸収阻害性ポリホスホネートは、米国特許第３，６８３，０８０号に開示されているタイプのポリホスホネートを包含し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。好ましいポリホスホネートは、ジェミナルジホスホネート（ビス−ホスホネートとも呼ばれる）である。チルドロネート二ナトリウムは、特に好ましいポリホスホネートである。イバンドロン酸は、特に好ましいポリホスホネートである。アレンドロネートは、特に好ましいポリホスホネートである。ゾレドロン酸は、特に好ましいポリホスホネートである。他の好ましいポリホスホネートは、６−アミノ−１−ヒドロキシ−ヘキシリデン−ビスホスホン酸および１−ヒドロキシ−３（メチルペンチルアミノ）−プロピリデン−ビスホスホン酸である。ポリホスホネートは、酸、または可溶性のアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩の形態で投与することができる。ポリホスホネートの加水分解性エステルは、同様に包含される。具体例は、エタン−１−ヒドロキシ１，１−ジホスホン酸、メタンジホスホン酸、ペンタン−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸、メタンジクロロジホスホン酸、メタンヒドロキシジホスホン酸、エタン−１−アミノ−１，１−ジホスホン酸、エタン−２−アミノ−１，１−ジホスホン酸、プロパン−３−アミノ−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸、プロパン−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸、プロパン−３，３−ジメチル−３−アミノ−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸、フェニルアミノメタンジホスホン酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメタンジホスホン酸、Ｎ（２−ヒドロキシエチル）アミノメタンジホスホン酸、ブタン−４−アミノ−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸、ペンタン−５−アミノ−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸、ヘキサン−６−アミノ−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸ならびに薬学的に許容できるそれらのエステルおよび塩を包含する。
【０１１８】
特に、本発明の化合物は、哺乳類のエストロゲン作動薬／拮抗薬と組み合わせることができる。本発明の第２の化合物として、任意のエストロゲン作動薬／拮抗薬を使用することができる。エストロゲン作動薬／拮抗薬という用語は、エストロゲン受容体と結合し、骨代謝回転を阻害しかつ／または骨喪失を予防する化合物を指す。特に、エストロゲン作動薬は、本明細書において、哺乳類組織におけるエストロゲン受容体部位と結合し、１つまたは複数の組織においてエストロゲンの作用を模倣することができる化合物と定義される。エストロゲン拮抗薬は、本明細書において、哺乳類組織におけるエストロゲン受容体部位と結合し、１つまたは複数の組織においてエストロゲンの作用をブロックすることができる化合物と定義される。そのような活性は、エストロゲン受容体結合アッセイ、標準的な骨の組織形態計測法および密度測定法、ならびにＥｒｉｋｓｅｎ  Ｅ．Ｆ．他、Ｂｏｎｅ  Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４、１〜７４ページ；Ｇｒｉｅｒ  Ｓ．Ｊ．他、Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｄｕａｌ−Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｖ．Ｒａｄｉｏｌ．、１９９６、３１（１）：５０〜６２；Ｗａｈｎｅｒ  Ｈ．Ｗ．およびＦｏｇｅｌｍａｎ  Ｉ．、Ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．、Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ  Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ  １９９４、１〜２９６ページを包含する標準的アッセイで当業者により容易に決定される。様々なこれらの化合物について、以下に記載および言及する。
【０１１９】
好ましいエストロゲン作動薬／拮抗薬は、米国特許第５，０４７，４３１号に開示されているドロロキシフェン：（フェノール、３（１−（４−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）−２−フェニル−１−ブテニル）−、（Ｅ）−）および関連化合物であり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１２０】
別の好ましいエストロゲン作動薬／拮抗薬は、Ｗｉｌｌｓｏｎ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９９７、１３８、３９０１〜３９１１に開示されている３−（４−（１，２−ジフェニル−ブタ−１−エニル）−フェニル）−アクリル酸である。
【０１２１】
別の好ましいエストロゲン作動薬／拮抗薬は、米国特許第４，５３６，５１６号に開示されているタモキシフェン：（エタナミン、２−（−４−（１，２−ジフェニル−１−ブテニル）フェノキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル、（Ｚ）−２−、２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパントリカルボキシレート（１：１））および関連化合物であり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１２２】
別の関連化合物は、米国特許第４，６２３，６６０号に開示されている４−ヒドロキシタモキシフェンであり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１２３】
好ましいエストロゲン作動薬／拮抗薬は、米国特許第４，４１８，０６８号に開示されているラロキシフェン：（メタノン、（６−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）ベンゾ［ｂ］チエン−３−イル）（４−（２−（１−ピペリジニル）エトキシ）フェニル）−塩酸塩）であり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１２４】
別の好ましいエストロゲン作動薬／拮抗薬は、米国特許第４，９９６，２２５号に開示されているトレミフェン：（エタナミン、２−（４−（４−クロロ−１，２−ジフェニル−１−ブテニル）フェノキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−、（Ｚ）−、２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパントリカルボキシレート（１：１）であり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１２５】
別の好ましいエストロゲン作動薬／拮抗薬は、米国特許第３，８２２，２８７号に開示されているセントクロマン（ｃｅｎｔｃｈｒｏｍａｎ）：（１−（２−（（４−（−メトキシ−２，２，ジメチル−３−フェニル−クロマン−４−イル）−フェノキシ）−エチル）−ピロリジンであり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。レボルメロキシフェンも好ましい。
【０１２６】
別の好ましいエストロゲン作動薬／拮抗薬は、米国特許第４，８３９，１５５号に開示されているイドキシフェン：（Ｅ）−１−（２−（４−（１−（４−ヨード−フェニル）−２−フェニル−ブタ−１−エニル）−フェノキシ）−エチル）−ピロリジノンであり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１２７】
別の好ましいエストロゲン作動薬／拮抗薬は、米国特許第５，４８８，０５８号に開示されている２−（４−メトキシ−フェニル）−３−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェノキシ］−ベンゾ［ｂ］チオフェン−６−オールであり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１２８】
別の好ましいエストロゲン作動薬／拮抗薬は、米国特許第５，４８４，７９５号に開示されている６−（４−ヒドロキシ−フェニル）−５−（４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−ベンジル）−ナフタレン−２−オールであり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１２９】
別の好ましいエストロゲン作動薬／拮抗薬は、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．に譲渡されたＰＣＴ公開ＷＯ９５／１０５１３に、調製の方法と一緒に開示されている４−（２−（２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−イル）−エトキシ）−フェニル）―（６−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−メタノンである。
【０１３０】
他の好ましいエストロゲン作動薬／拮抗薬は、本発明の譲受人に譲渡された米国特許第５，５５２，４１２号に記載されているような化合物を包含し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。その中に記載されている特に好ましい化合物は、
ｃｉｓ−６−（４−フルオロ−フェニル）−５−（４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オール；
（−）−ｃｉｓ−６−フェニル−５−（４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オール；
ｃｉｓ−６−フェニル−５−（４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オール；
ｃｉｓ−１−（６’−ピロロジノエトキシ−３’−ピリジル）−２−フェニル−６−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン；
１−（４’−ピロリジノエトキシフェニル）−２−（４”−フルオロフェニル）−６−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン；
ｃｉｓ−６−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オール；および
１−（４’−ピロリジノレトキシフェニル）−２−フェニル−６−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン
である。
【０１３１】
他のエストロゲン作動薬／拮抗薬は、米国特許第４，１３３，８１４号に記載されている（その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）。米国特許第４，１３３，８１４号は、２−フェニル−３−アロイル−ベンゾチオフェンおよび２−フェニル−３−アロイルベンゾチオフェン−１−オキシドの誘導体を開示している。
【０１３２】
当業者は、骨量増加薬とも呼ばれる他の骨同化薬を、本発明の化合物と併せて使用することができることを理解するであろう。骨量増加薬は、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  Ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ（１９９４）．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ＷＨＯ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ  ８４３」に詳述されているような骨折閾値以上であるレベルまで骨量を増加させる化合物である。
【０１３３】
任意のプロスタグランジン、またはプロスタグランジン作動薬／拮抗薬を、本発明の特定の態様における第２の化合物として使用することができる。当業者は、ＩＧＦ−１、フッ化ナトリウム、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモンの活性フラグメント、成長ホルモンまたは成長ホルモン分泌促進薬も使用できることを理解するであろう。以下の段落は、例示的な本発明の第２の化合物についてより詳細に記載している。
【０１３４】
任意のプロスタグランジンを、本発明の特定の態様における第２の化合物として使用することができる。プロスタグランジンという用語は、骨粗鬆症の治療に有用である天然プロスタグランジンＰＧＤ１、ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＥ１およびＰＧＦ２の類似体である化合物を指す。これらの化合物は、プロスタグランジン受容体に結合する。そのような結合は、標準的アッセイ（例えば、Ａｎ  Ｓ．他、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＥＰ２  Ｓｕｂｔｙｐｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９３、１９７（１）：２６３〜２７０）で当業者により容易に決定される。
【０１３５】
プロスタグランジンは、基本化合物プロスタン酸に関連する脂環式化合物である。基本プロスタグランジンの炭素原子は、カルボン酸炭素原子からシクロペンチル環を経て隣接する側鎖上の末端炭素原子まで連続して付番される。普通、隣接する側鎖は、トランス配向である。シクロペンチル部分のＣ−９におけるオキソ基の存在は、Ｅクラス内のプロスタグランジンを示すが、ＰＧＥ２は、Ｃ１３−Ｃ１４におけるトランス不飽和二重結合およびＣ５−Ｃ６におけるシス二重結合を含有する。
【０１３６】
様々なプロスタグランジンについて以下に記載および言及する。しかしながら、他のプロスタグランジンは当業者に知られているであろう。例示的なプロスタグランジンは、米国特許第４，１７１，３３１号および第３，９２７，１９７号に開示されており、その各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１３７】
Ｎｏｒｒｄｉｎ他、Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ｉｎ  Ｂｏｎｅ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ４１、１３９〜１５０、１９９０は、骨同化性プロスタグランジンの総説である。
【０１３８】
任意のプロスタグランジン作動薬／拮抗薬を、本発明の特定の態様における第２の化合物として使用することができる。プロスタグランジン作動薬／拮抗薬という用語は、プロスタグランジン受容体に結合し（例えば、Ａｎ  Ｓ．他、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＥＰ２  Ｓｕｂｔｙｐｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９３、１９７（１）：２６３〜２７０）、ｉｎ  ｖｉｖｏでプロスタグランジンの作用を模倣する（例えば、骨形成を刺激し、骨量を増加させる）化合物を指す。そのような作用は、標準的アッセイで当業者により容易に決定される。Ｅｒｉｋｓｅｎ  Ｅ．Ｆ．他、Ｂｏｎｅ  Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４、１〜７４ページ；Ｇｒｉｅｒ  Ｓ．Ｊ．他、Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｄｕａｌ−Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｖ．Ｒａｄｉｏｌ．、１９９６、３１（１）：５０〜６２；Ｗａｈｎｅｒ  Ｈ．Ｗ．およびＦｏｇｅｌｍａｎ  Ｉ．、Ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．、Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ  Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ  １９９４、１〜２９６ページ）。様々なこれらの化合物について以下に記載および言及する。しかしながら、他のプロスタグランジン作動薬／拮抗薬は当業者に知られているであろう。例示的なプロスタグランジン作動薬／拮抗薬を以下の通り開示する。
【０１３９】
本発明の譲受人に譲渡された米国特許第３，９３２，３８９号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）は、骨形成活性に有用な２−デスカルボキシ−２−（テトラゾール−５−イル）−１１−デスオキシ−１５−置換−ω−ペンタノルプロスタグランジンを開示している。
【０１４０】
本発明の譲受人に譲渡された米国特許第４，０１８，８９２号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）は、骨形成活性に有用な１６−アリール−１３，１４−ジヒドロ−ＰＧＥ２  ｐ−ビフェニルエステルを開示している。
【０１４１】
本発明の譲受人に譲渡された米国特許第４，２１９，４８３号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）は、骨形成活性に有用な２，３，６−置換−４−ピロンを開示している。
【０１４２】
本発明の譲受人に譲渡された米国特許第４，１３２，８４７号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）は、骨形成活性に有用な２，３，６−置換−４−ピロンを開示している。
【０１４３】
米国特許第４，０００，３０９号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）に、骨形成活性に有用な１６−アリール−１３，１４−ジヒドロ−ＰＧＥ２  ｐ−ビフェニルエステルを開示している。
【０１４４】
米国特許第３，９８２，０１６号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）は、骨形成活性に有用な１６−アリール−１３，１４−ジヒドロ−ＰＧＥ２  ｐ−ビフェニルエステルを開示している。
【０１４５】
米国特許第４，６２１，１００号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）は、骨形成活性に有用な置換シクロペンタンを開示している。
【０１４６】
米国特許第５，２１６，１８３号（その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）は、骨形成活性に有用なシクロペンタノンを開示している。
【０１４７】
フッ化ナトリウムを、本発明の特定の態様における第２の化合物として使用することができる。フッ化ナトリウムという用語は、そのすべての形態のフッ化ナトリウム（例えば、徐放性フッ化ナトリウム、持続放出性フッ化ナトリウム）を指す。持続放出性フッ化ナトリウムは、米国特許第４，９０４，４７８号に開示されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。フッ化ナトリウムの活性は、生物学的プロトコル（例えば、Ｅｒｉｋｓｅｎ  Ｅ．Ｆ．他、Ｂｏｎｅ  Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４、１〜７４ページ；Ｇｒｉｅｒ  Ｓ．Ｊ．他、Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｄｕａｌ−Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｖ．Ｒａｄｉｏｌ．、１９９６、３１（１）：５０〜６２；Ｗａｈｎｅｒ  Ｈ．Ｗ．およびＦｏｇｅｌｍａｎ  Ｉ．、Ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．、Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ  Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ１９９４、１〜２９６を参照）で当業者により容易に決定される。
【０１４８】
骨形態形成タンパク質を、本発明の第２の化合物として使用することができる（例えば、Ｏｎｏ、他、Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ１、Ｂｏｎｅ、１９９６、１９（６）、５８１〜５８８を参照）。
【０１４９】
任意の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を、本発明の特定の態様における第２の化合物として使用することができる。副甲状腺ホルモンという用語は、骨形成を刺激し、骨量を増加させる副甲状腺ホルモン、そのフラグメントまたは代謝産物およびその構造類似体を指す。副甲状腺ホルモン関連ペプチド、ならびに副甲状腺関連ペプチドの活性フラグメントおよび類似体も包含される（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０１４６０を参照）。そのような骨同化機能活性は、標準的アッセイ（例えば、Ｅｒｉｋｓｅｎ  Ｅ．Ｆ．他、Ｂｏｎｅ  Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４、１〜７４ページ；Ｇｒｉｅｒ  Ｓ．Ｊ．他、Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｄｕａｌ−Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｖ．Ｒａｄｉｏｌ．、１９９６、３１（１）：５０〜６２；Ｗａｈｎｅｒ  Ｈ．Ｗ．およびＦｏｇｅｌｍａｎ  Ｉ．、Ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．、Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ  Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ  １９９４、１〜２９６を参照）で当業者により容易に決定される。様々なこれらの化合物について以下に記載および言及する。しかしながら、他の副甲状腺ホルモンは当業者に知られているであろう。例示的な副甲状腺ホルモンは、以下の参考文献に開示されている。
【０１５０】
「Ｈｕｍａｎ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ」、Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｉｎｔ．、３、（Ｓｕｐｐ  １）：１９９〜２０３。
【０１５１】
「ＰＴＨ  １−３４  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｄｅｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｉｎｔ．１：１６２〜１７０。
【０１５２】
任意の成長ホルモンまたは成長ホルモン分泌促進薬を、本発明の特定の態様における第２の化合物として使用することができる。成長ホルモン分泌促進薬という用語は、成長ホルモンの放出を刺激するか、または成長ホルモンの作用を模倣する（例えば、骨量の増加につながる骨形成を高める）化合物を指す。そのような作用は、当業者によく知られている標準的アッセイで当業者により容易に決定される。様々なこれらの化合物は、以下の公開されたＰＣＴ特許出願：ＷＯ９５／１４６６６；ＷＯ９５／１３０６９；ＷＯ９４／１９３６７；ＷＯ９４／１３６９６；およびＷＯ９５／３４３１１に開示されている。しかしながら、他の成長ホルモンまたは成長ホルモン分泌促進薬は当業者に知られているであろう。
【０１５３】
特に、好ましい成長ホルモン分泌促進薬は、Ｎ−［１（Ｒ）−［１，２−ジヒドロ−１−メタンスルホニルスピロ［３Ｈ−インドール−３，４’−ピペリジン］−１’−イル］カルボニル］−２−（フェニルメチルオキシ）エチル］−２−アミノ−２−メチルプロパンアミド：ＭＫ−６７７である。
【０１５４】
他の好ましい成長ホルモン分泌促進薬は、
２−アミノ−Ｎ−（２−（３ａ−（Ｒ）−ベンジル−２−メチル−３−オキソ−２，３，３ａ，４，６，７−ヘキサヒドロ−ピラゾロ−［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）−１−（Ｒ）−ベンジルオキシメチル−２−オキソ−エチル）−イソブチルアミドまたはそのＬ−酒石酸塩；
２−アミノ−Ｎ−（１−（Ｒ）−ベンジルオキシメチル−２−（３ａ−（Ｒ）−（４−フルオロ−ベンジル）−２−メチル−３−オキソ−２，３，３ａ，４，６，７−ヘキサヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）−２−オキソ−エチル）イソブチルアミド；
２−アミノ−Ｎ−（２−（３ａ−（Ｒ）−ベンジル−３−オキソ−２，３，３ａ，４，６，７−ヘキサヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）−１−（Ｒ）ベンジルオキシメチル−２−オキソ−エチル）イソブチルアミド；および
２−アミノ−Ｎ−（１−（２，４−ジフルオロ−ベンジルオキシメチル）−２−オキソ−２−（３−オキソ−３ａ−ピリジン−２−イルメチル−２−（２，２，２−トリフルオロ−エチル）−２，３，３ａ，４，６，７−ヘキサヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）−エチル）−２−メチル−プロピオンアミド
を包含する。
【０１５５】
本明細書に記載されている化合物を調製するのに有用な調製方法の一部は、遠く離れた官能基（例えば、式Ｉの前駆体における第一級アミン、第二級アミン、カルボキシル）の保護を必要とすることがある。そのような保護の必要性は、遠く離れた官能基の性質および調製方法の条件に応じて異なるであろう。そのような保護の必要性は、当業者により容易に決定される。そのような保護／脱保護方法の使用も、当業者の範囲内にある。保護基およびそれらの使用の一般的な説明については、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１を参照されたい。
【０１５６】
本発明の化合物、それらのプロドラッグならびに薬学的に許容できる前記化合物およびプロドラッグの塩はすべて、脊椎動物、例えば、哺乳動物、特にヒトにおいて骨形成を刺激し、骨量を増加させる薬剤として治療的使用に適応している。骨形成は、骨粗鬆症および骨関連障害の発症と密接に関連していることから、これらの化合物、それらのプロドラッグならびに薬学的に許容できる前記化合物および前記プロドラッグの塩は、骨に対するそれらの作用により、骨粗鬆症を予防、阻止および／または回復させる。
【０１５７】
脊椎動物、例えば、哺乳類（例えば、ヒト、特に女性）において低骨量を示す状態（例えば、骨粗鬆症）を治療する際の医薬としての本発明化合物の有用性は、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ、受容体結合アッセイ、サイクリックＡＭＰアッセイおよび骨折治癒アッセイ（それらはすべて、以下に記載される）を包含する従来のアッセイにおいて本発明の化合物の活性により証明される。ｉｎ  ｖｉｏｖアッセイ（当業者の範囲内にある適切な改変を含む）を用い、他の同化薬ならびに本発明のプロスタグランジン作動薬の活性を決定することができる。エストロゲン作動薬／拮抗薬プロトコルを用い、特にエストロゲン作動薬／拮抗薬および他の抗吸収薬の活性を決定することができる（当業者の範囲内にある適切な改変を含む）。以下に記載される組合せおよび逐次処理プロトコルは、本明細書に記載されている同化薬（例えば、本発明の化合物）と抗吸収薬（例えば、エストロゲン作動薬／拮抗薬）の組合せの有用性を証明するのに有用である。そのようなアッセイは、それにより、本発明の化合物（または、本明細書に記載されている他の同化薬および抗吸収薬）の活性を、お互いに対して、および他の知られている化合物の活性と比較することができる手段も提供する。これらの比較の結果は、そのような疾患を治療するために、脊椎動物、例えば、ヒトを包含する哺乳類における用量レベルを決定するのに有用である。
【０１５８】
同化薬ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
骨形成を刺激し、骨量を増加させる同化骨薬の活性は、無処置の雄性または雌性ラット、性ホルモン欠乏の雄性（精巣摘出）または雌性（卵巣切除）ラットでテストすることができる。
【０１５９】
様々な齢（３カ月齢など）の雄性または雌性ラットを試験で使用することができる。ラットは、無処置であるか、または去勢（卵巣切除または精巣摘出）されており、３０日間にわたって様々な投与量（１、３または１０ｍｇ／ｋｇ／日）でプロスタグランジン作動薬を皮下注射または胃管投与される。去勢ラットにおいて、治療は、手術の翌日に（骨喪失を予防する目的で）または骨喪失が既に起きた時点で（骨量を回復する目的で）開始する。試験中、すべてのラットに、水ならびにカルシウム１．４６％、リン０．９９％およびビタミンＤ３４．９６ＩＵ／ｇを含有するペレット市販飼料（Ｔｅｋｌａｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ＃８０６４、Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を自由に摂取させる。すべてのラットに屠殺前１２日目および２日目にカルセイン１０ｍｇ／ｋｇを皮下注射する。ラットを屠殺する。以下のエンドポイントを決定する：
【０１６０】
大腿骨塩測定：
各ラットからの右大腿骨を、剖検時に摘出し、「Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｃａｎ」ソフトウェア（Ｈｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を備えた二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＸＡ、ＱＤＲ１０００／Ｗ、Ｈｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いてスキャンする。スキャン領域サイズは、５．０８×１．９０２ｃｍであり、解像度は、０．０２５４×０．０１２７ｃｍであり、スキャン速度は、７．２５ｍｍ／秒である。大腿骨スキャン画像を分析し、全大腿骨（ＷＦ）、遠位大腿骨幹端（ＤＦＭ）、大腿骨幹軸（ＦＳ）、および近位大腿骨（ＰＦ）の、骨面積、骨塩量（ＢＭＣ）、および骨塩密度（ＢＭＤ）を決定する。
【０１６１】
脛骨組織形態計測分析：
右脛骨を、剖検時に摘出し、筋肉を切り離し、３つの部分に切り分ける。近位脛骨および脛骨幹軸を、７０％エタノール中で固定し、段階的濃度のエタノール中で脱水し、アセトン中で脱脂し、次いで、メタクリル酸メチル（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に包埋する。
【０１６２】
厚さ４および１０μｍで、近位脛骨幹端の前部切片を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ  Ｐｏｌｙｃｕｔ  Ｓミクロトームを用いて切り取る。４μｍの切片を、変法マッソントリクローム染色で染色し、一方、１０μｍの切片は、未染色のままとする。各ラットからの１つの４μｍの切片および１つの１０μｍの切片を、海綿骨組織形態計測のために使用する。
【０１６３】
厚さ１０μｍで、脛骨幹の断面切片を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ  Ｐｏｌｙｃｕｔ  Ｓミクロトームを用いて切り取る。これらの切片を、皮質骨組織形態計測分析のために使用する。
【０１６４】
海綿骨組織形態計測：Ｂｉｏｑｕａｎｔ  ＯＳ／２組織形態計測システム（Ｒ＆Ｍ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、ＴＮ）を、成長板−骨端接合部より１．２ｍｍ〜３．６ｍｍ遠位の近位脛骨幹端の二次海綿骨の静的および動的組織形態計測測定のために使用する。測定を二次海綿骨に限定するため、脛骨幹端領域の最初の１．２ｍｍを除外することが必要である。４μｍの切片を用い、骨体積、骨構造、および骨吸収に関連する指数を測定し、一方、１０μｍの切片を用い、骨形成および骨代謝回転に関連する指数を測定する。
【０１６５】
Ｉ）骨梁の体積および構造に関連する測定および計算：（１）総骨幹端面積（ＴＶ、ｍｍ２）：成長板−骨端接合部より１．２ｍｍ〜３．６ｍｍ遠位の骨幹端面積。（２）骨梁面積（ＢＶ、ｍｍ２）：ＴＶ内の柵状織の総面積。（３）骨梁周囲長（ＢＳ、ｍｍ）：柵状織の総周囲長の長さ。（４）骨梁体積（ＢＶ／ＴＶ、％）：ＢＶ／ＴＶ×１００。（５）骨梁数（ＴＢＮ、＃／ｍｍ）：１．１９９／２×ＢＳ／ＴＶ。（６）骨梁厚（ＴＢＴ、μｍ）：（２０００／１．１９９）×（ＢＶ／ＢＳ）。（７）骨梁間隔（ＴＢＳ、μｍ）：（２０００／１．１９９）×（ＴＶ−ＢＶ）。
【０１６６】
ＩＩ）骨吸収に関連する測定および計算：（１）破骨細胞数（ＯＣＮ、＃）：総骨幹端面積内の破骨細胞の総数。（２）破骨細胞周囲長（ＯＣＰ、ｍｍ）：破骨細胞により覆われた骨梁周囲長の長さ。（３）破骨細胞数／ｍｍ（ＯＣＮ／ｍｍ、＃／ｍｍ）：ＯＣＮ／ＢＳ。（４）破骨細胞周囲長率（％ＯＣＰ、％）：ＯＣＰ／ＢＳ×１００。
【０１６７】
ＩＩＩ）骨の形成および代謝回転に関連する測定および計算：（１）単一カルセイン標識周囲長（ＳＬＳ、ｍｍ）：１回のカルセイン標識で標識された骨梁周囲長の全長。（２）二重カルセイン標識周囲長（ＤＬＳ、ｍｍ）：２回のカルセイン標識で標識された骨梁周囲長の全長。（３）標識間幅（ＩＬＷ、μｍ）：２回のカルセイン標識間の平均距離。（４）石灰化周囲長率（ＰＭＳ、％）：（ＳＬＳ／２＋ＤＬＳ）／ＢＳ×１００。（５）石灰化速度（ｍｉｎｅｒａｌ  ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）（ＭＡＲ、μｍ／日）：ＩＬＷ／標識間隔。（６）骨形成速度／表面基準（ｒｅｆ．）（ＢＦＲ／ＢＳ、μｍ２／ｄ／μｍ）：（ＳＬＳ／２＋ＤＬＳ）×ＭＡＲ／ＢＳ。（７）骨代謝回転速度（ＢＴＲ、％／ｙ）：（ＳＬＳ／２＋ＤＬＳ）×ＭＡＲ／ＢＶ×１００。
【０１６８】
皮質骨組織形態計測：ＢｉｏｑｕａｎｔＯＳ／２組織形態計測システム（Ｒ＆Ｍ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、ＴＮ）を、脛骨幹軸皮質骨の静的および動的組織形態計測のために用いる。総組織面積、骨髄腔面積、骨膜周囲長、内皮質周囲長、単一標識周囲長、二重標識周囲長、ならびに骨膜表面と内皮質表面の両方の標識間幅を測定し、皮質骨面積（総組織面積−骨髄腔面積）、皮質骨面積率（皮質面積／総組織面積×１００）、骨髄面積率（骨髄腔面積／総組織面積×１００）、骨膜および内皮質の標識周囲長率［（単一標識周囲長／２＋二重標識周囲長）／総周囲長×１００］、石灰化速度（標識間幅／間隔）、ならびに骨形成速度［石灰化速度×［（単一標識周囲長／２＋二重標識周囲長）／総周囲長］を計算する。
【０１６９】
統計値
統計値は、ＳｔａｔＶｉｅｗ４．０パッケージ（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を用いて計算することができる。分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定と、続く、フィッシャーのＰＬＳＤ（Ｓｔａｔ  Ｖｉｅｗ、Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｉｎｃ．、１９１８  Ｂｏｎｉｔａ  Ａｖｅ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ９４７０４−１０１４）を用い、群間の差を比較する。
【０１７０】
組換えヒトＥＰ２およびＥＰ４受容体を安定に過剰発現する２９３−Ｓ細胞系におけるｃＡＭＰ上昇の測定
ヒトＥＰ２およびＥＰ４受容体の完全オープンリーディングフレームに相当するｃＤＮＡを、公表された配列（Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｗ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｔ．Ｊ．Ｐｅｐｐｅｒｌ，Ｄ．Ｊ．Ｐｉｅｒｃｅ，Ｋ．Ｌ．Ｂｏｇａｒｄｕｓ，Ａ．Ｍ．Ｄｏｎｅｌｌｏ，Ｊ．Ｅ．Ｆａｉｒｂａｉｒｎ，Ｃ．Ｅ．Ｋｅｄｚｉｅ，Ｋ．Ｍ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｄ．Ｆ．およびＧｉｌ，Ｄ．Ｗ．１９９４  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  ＥＰ２  Ｓｕｂｔｙｐｅ。Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４６：２１３〜２２０；およびＢａｓｔｉｅｎ，Ｌ．、Ｓａｗｙｅｒ，Ｎ．、Ｇｒｙｇｏｒｃｚｙｋ，Ｒ．、Ｍｅｔｔｅｒｓ，Ｋ．、およびＡｄａｍ，Ｍ．１９９４  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ  Ｅ２  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＰ２  Ｓｕｂｔｙｐｅ。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ２６９、１６：１１８７３〜１１８７７）および一次ヒト腎細胞（ＥＰ２）または一次ヒト肺細胞（ＥＰ４）由来のＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型として用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応により作製する。ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、３９８５Ｂ  Ｓｏｒｒｅｎｔｏ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ９２１２１）の多重クローニング部位中にクローニングし、それを用い、リン酸カルシウム共沈を介して２９３−Ｓヒト胚性腎細胞にトランスフェクトする。Ｇ４１８耐性コロニーを拡張させ、特異的［３Ｈ］ＰＧＥ２結合について調べる。高レベルの特異的［３Ｈ］ＰＧＥ２結合を示すトランスフェクタントを、スキャッチャード解析によりさらに特徴付け、ＰＧＥ２についてＢｍａｘおよびＫｄを決定する。化合物スクリーニングのために選択された系は、ＰＧＥ２（ＥＰ２）の場合、細胞当たり約３３８，４００個の受容体およびＫｄ＝１２ｎＭを、およびＰＧＥ２（ＥＰ４）の場合、細胞当たり約２５６，４００個の受容体およびＫｄ＝２．９ｎＭを有する。親の２９３−Ｓ細胞における両受容体の構成的発現は無視できる。細胞は、ウシ胎児血清（最終１０％）およびＧ４１８（最終７００ｕｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ中に維持する。
【０１７１】
２９３−Ｓ／ＥＰ２系および２９３−Ｓ／ＥＰ４系におけるｃＡＭＰ応答は、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋欠乏のＰＢＳ１ｍｌ中で激しく叩くことにより細胞を培養フラスコから引き離し、１×１０６細胞／ｍｌの最終濃度まで無血清ＲＰＭＩを加え、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を１ｍＭの最終濃度まで加えることにより測定する。直ちに、細胞懸濁液１ミリリットルを、個々の２ｍｌのスクリューキャップ微小遠心管に等分し、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９５％にて、蓋を取って１０分間にわたってインキュベートする。次いで、ＤＭＳＯまたはエタノールの最終濃度が１％になるように、テストされる化合物を１：１００の希釈度で細胞に加える。化合物を加えた直後に、管に蓋をし、２回逆さにすることにより混ぜ、１２分間にわたって３７℃においてインキュベートする。次いで、試料を、１０分間にわたって１００℃においてインキュベートすることにより溶解し、直ちに、５分間にわたって氷上で冷却する。細胞残屑を、５分間にわたって１０００×ｇにて遠心分離することによりペレット化し、澄明にしたライセートを新たな試験管に移す。ｃＡＭＰ濃度は、澄明にしたライセートをｃＡＭＰ  ＲＩＡアッセイ緩衝液（キットに包含されている）中で１：１０に希釈した後、市販のｃＡＭＰラジオイムノアッセイキットＲＩＡ（ＮＥＫ−０３３、ＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＮ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、５４９  Ａｌｂａｎｙ  Ｓｔ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ０２１１８）を用いて測定する。通常、１  ｌｏｇの増分で、６〜８種類の濃度のテストすべき化合物で細胞を処理する。ＥＣ５０の計算は、用量反応曲線の直線部分に対する線形回帰分析を用い、計算機で行う。
【０１７２】
プロスタグランジンＥ２受容体との結合についてのアッセイ
膜調製：すべての操作は４℃において行う。プロスタグランジンＥ２１型受容体（ＥＰ１）、２型（ＥＰ２）、３型（ＥＰ３）または４型（ＥＰ４）受容体を発現するトランスフェクトされた細胞を収集し、緩衝液Ａ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ペファブロックペプチド、（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、１０ｕＭ  ホスポラミドン（Ｐｈｏｓｐｏｒａｍｉｄｏｎ）ペプチド、（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１ｕＭペプスタチンＡペプチド、（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１０ｕＭ  エラスタチナールペプチド、（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１００ｕＭアンチパインペプチド、（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）］中に１ｍｌ当たり２００万個の細胞になるように懸濁する。細胞を、２回の１５秒バーストでＢｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ＃２５０、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）による超音波処理により溶解する。溶解しない細胞および残屑を、１０分間にわたって１００×ｇにて遠心分離することにより除去する。次いで、膜を、３０分間にわたって４５，０００×ｇにて遠心分離することにより収集する。ペレット化した膜を、１ｍｌ当たりタンパク質３〜１０ｍｇになるように再懸濁し、ブラッドフォードの方法［Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２、２４８（１９７６）］でタンパク質濃度を決定する。次いで、再懸濁した膜を、使用するまで−８０℃において凍結保存する。
【０１７３】
結合アッセイ：上記のように調製される凍結膜を解凍し、上記の緩衝液Ａ中で１ｍｌ当たりタンパク質１ｍｇになるように希釈する。１容積の膜調製物を、緩衝液Ａ中で、０．０５容積のテスト化合物または緩衝液および１容積の３ｎＭ  ３Ｈ−プロスタグランジンＥ２（＃ＴＲＫ４３１、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）と混ぜ合わせる。この混合物（全容積２０５μＬ）を、２５℃において１時間にわたってインキュベートする。次いで、膜を、Ｔｏｍｔｅｃハーベスター（Ｍｏｄｅｌ  Ｍａｃｈ  ＩＩ／９６、Ｔｏｍｔｅｃ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＴ）を用い、タイプＧＦ／Ｃガラス繊維フィルター（＃１２０５−４０１、Ｗａｌｌａｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に通して濾過することにより回収する。結合した３Ｈ−プロスタグランジンＥ２を有する膜は、フィルターにより捕捉されるが、緩衝液および結合していない３Ｈ−プロスタグランジンＥ２は、フィルターを通過して廃液中に入る。次いで、各試料を［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］３ｍｌで３回洗浄する。次いで、フィルターを、電子レンジ内で加熱することにより乾燥させる。膜に結合している３Ｈ−プロスタグランジンの量を測定するため、乾燥したフィルターを、シンチレーション液と一緒にプラスチックバッグに入れ、ＬＫＢ  １２０５  Ｂｅｔａｐｌａｔｅリーダー（Ｗａｌｌａｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）でカウントする。ＩＣ５０は、特異的に結合した３Ｈ−プロスタグランジンＥ２の５０％を置き換えるのに必要とされるテスト化合物の濃度から決定される。
【０１７４】
完全長ＥＰ１受容体は、Ｆｕｎｋ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９３、２６８、２６７６７〜２６７７２に開示されているように作製する。完全長ＥＰ２受容体は、Ｒｅｇａｎ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１９９４、４６、２１３〜２２０に開示されているように作製する。完全長ＥＰ３受容体は、Ｒｅｇａｎ他、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１９９４、１１２、３７７〜３８５に開示されているように作製する。完全長ＥＰ４受容体は、Ｂａｓｔｉｅｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４、２６９、１１８７３〜１１８７７に開示されているように作製する。これらの完全長受容体を用い、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３およびＥＰ４受容体を発現する２９３Ｓ細胞を調製する。
【０１７５】
ヒトＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３またはＥＰ４プロスタグランジンＥ２受容体を発現する２９３Ｓ細胞は、当業者に知られている方法に従って作製する。通常、公表されている完全長受容体の５’および３’末端に対応するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）プライマーを、上記に開示されているよく知られている方法に従って作製し、ソースとしてのヒト腎（ＥＰ１用）、ヒト肺（ＥＰ２用）、ヒト肺（ＥＰ３用）またはヒト白血球（ＥＰ４用）に由来する全ＲＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲで使用する。ＰＣＲ産物を、ＴＡオーバーハング法によりｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローニングし、クローン化された受容体の同一性をＤＮＡ配列決定により確認する。
【０１７６】
２９３Ｓ細胞（Ｍａｙｏ、Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖ．）に、エレクトロポレーションにより、ｐｃＤＮＡ３中のクローン化された受容体をトランスフェクトする。受容体を発現する安定な細胞系は、Ｇ４１８をトランスフェクトした細胞の選択に続いて確立される。
【０１７７】
最大数の受容体を発現するクローン細胞系は、コンペティターとして非標識ＰＧＥ２を用いるホールセルの３Ｈ−ＰＧＥ２結合アッセイに続いて選択される。
【０１７８】
骨折治癒アッセイ
全身投与後の骨折治癒に対する影響についてのアッセイ
骨折技法：３カ月齢のＳｐｒａｇｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、ケタミンで麻酔する。右の脛骨または大腿骨の近位部分の前内側面に１ｃｍの切開を作製する。以下は、脛骨手術技法について記載している。切開を骨まで到達させ、１ｍｍの孔を、前縁から２ｍｍ内側の脛骨粗面の遠位面から４ｍｍ近位に開ける。骨髄内釘固定は、０．８ｍｍのステンレス鋼管で行う（最大点荷重３６．３Ｎ、最大点剛性６１．８Ｎ／ｍｍ、骨と同じ条件下でテストする）。髄管のリーミングは行わない。標準化された閉鎖骨折を、顎が尖っていない特別に設計された調整可能な鉗子を用いる三点曲げにより、脛腓接合部の２ｍｍ上方に作製する。軟組織の損傷を最小限に抑えるため、骨折の位置をずらさないように注意する。皮膚を、モノフィラメントナイロン縫合糸で閉じる。手術は、無菌条件下で行う。釘固定直後にすべての骨折のラジオグラフをとり、指定した骨幹領域外に骨折のある、または釘の位置がずれているラットは除外する。残りの動物を、骨折治癒をテストするために、１時点につき各サブグループ当たり１０〜１２匹の以下のグループに無作為に分ける。第１グループには、１ｍｌ／ラットでビヒクル（水：１００％エタノール＝９５：５）を連日胃管投与し、一方、他のラットには、１０、２０、４０および８０日間にわたって、テストすべき化合物０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日（１ｍｌ／ラット）を連日胃管投与する。
【０１７９】
１０、２０、４０および８０日目に、各グループからのラット１０〜１２匹を、ケタミンで麻酔し、放血により屠殺する。両方の脛腓骨を切開により摘出し、すべての軟組織をはぎ取る。各グループにつき５〜６匹のラットからの骨を、組織学的分析のために７０％エタノール中に保存し、各グループにつき別の５〜６匹のラットからの骨を、行われるラジオグラフおよび生体力学的テストのために緩衝リンゲル液（＋４℃、ｐＨ７．４）中に保存する。
【０１８０】
組織学的分析：骨折した骨の組織学的分析のための方法は、ＭｏｓｅｋｉｌｄｅおよびＢａｋ（Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｏｎ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｒａｔｓ：Ａ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ。Ｂｏｎｅ、１４：１９〜２７、１９９３）により以前に公表されている。手短に言うと、骨折側を、骨折線の各側までのこぎりで８ｍｍ切り、脱灰せずにメタクリル酸メチルに包埋し、８μｍの厚さでＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ  Ｐｏｌｙｃｕｔミクロトームで前部切片を切り取る。マッソントリクローム染色した中前部切片（脛骨と腓骨の両方を包含する）を、治療の有無による骨折治癒に対する細胞および組織の応答を可視化するために使用する。シリウスレッド染色した切片を用い、仮骨構造の特徴を立証し、骨折部位における線維性骨と層板骨を区別する。以下の測定を行う：（１）骨折間隙−骨折における皮質骨末端間の最短距離として測定される、（２）仮骨長および仮骨直径、（３）仮骨の総骨体積面積、（４）仮骨面積内組織面積当たりの骨組織、（５）仮骨における線維組織、および（６）仮骨における軟骨面積。
【０１８１】
生体力学的分析：生体力学的分析のための方法は、ＢａｋおよびＡｎｄｒｅａｓｓｅｎ（Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  ｏｎ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｒａｔｓ。Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ４５：２９２〜２９７、１９８９）により以前に公表されている。手短に言うと、生体力学的テストに先立って、すべての骨折のラジオグラフをとる。治癒しつつある骨折の力学的特性を、破壊的三点または四点曲げ手順により分析する。最大点荷重、剛性、最大点荷重時のエネルギー、最大点荷重時の歪み、および最大点応力を測定する。
【０１８２】
局所投与後の骨折治癒に対する影響についてのアッセイ
骨折技法：約２歳の雌性または雄性ビーグル犬を、麻酔下で試験に用いる。横方向の橈骨骨折を、Ｌｅｎｅｈａｎ他（Ｌｅｎｅｈａｎ，Ｔ．Ｍ．；Ｂａｌｌｉｇａｎｄ，Ｍ．；Ｎｕｎａｍａｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．；Ｗｏｏｄ，Ｆ．Ｅ．：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＥＨＤＰ  ｏｎ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｏｇｓ。Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  ３：４９９〜５０７；１９８５）により記載されているような三点曲げの緩徐な連続荷重により作製する。ワイヤを骨折部位に通して引っ張り、骨の完全な解剖学的破壊を保証する。その後、骨折部位へのプロスタグランジン作動薬の局所送達を、１０、１５または２０週間にわたって、徐放性ペレットにより送達される化合物の徐放により、またはペーストゲルの溶液または懸濁液などの適当な製剤中の化合物の投与により行う。
【０１８３】
組織学的分析：骨折した骨の組織学的分析のための方法は、Ｐｅｔｅｒ他（Ｐｅｔｅｒ，Ｃ．Ｐ．；Ｃｏｏｋ，Ｗ．Ｏ．；Ｎｕｎａｍａｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．；Ｐｒｏｖｏｓｔ，Ｍ．Ｔ．；Ｓｅｅｄｏｒ，Ｊ．Ｇ．；Ｒｏｄａｎ，Ｇ．Ａ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ  ｏｎ  ｆｒａｃｔｕｒｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ｄｏｇｓ。Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１４：７４〜７０、１９９６）ならびにＭｏｓｅｋｉｌｄｅおよびＢａｋ（Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｏｎ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｒａｔｓ：Ａ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ。Ｂｏｎｅ、１４：１９〜２７、１９９３）により以前に公表されている。手短に言うと、屠殺後、骨折した側を、骨折線の各側までのこぎりで３ｃｍ切り、脱灰せずにメタクリル酸メチルに包埋し、８μｍの厚さでＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ  Ｐｏｌｙｃｕｔミクロトームで前部切片を切り取る。マッソントリクローム染色した中前部切片（脛骨と腓骨の両方を包含する）を、治療の有無による骨折治癒に対する細胞および組織の応答を可視化するために使用する。シリウスレッド染色した切片を用い、仮骨構造の特徴を立証し、骨折部位における線維性骨と層板骨を区別する。以下の測定を行う：（１）骨折間隙−骨折における皮質骨末端間の最短距離として測定される、（２）仮骨長および仮骨直径、（３）仮骨の総骨体積面積、（４）仮骨面積内組織面積当たりの骨組織、（５）仮骨における線維組織、および（６）仮骨における軟骨面積。
【０１８４】
生体力学的分析：生体力学的分析のための方法は、ＢａｋおよびＡｎｄｒｅａｓｓｅｎ（Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  ｏｎ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｒａｔｓ。Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ４５：２９２〜２９７、１９８９）およびＰｅｔｅｒ他（Ｐｅｔｅｒ，Ｃ．Ｐ．；Ｃｏｏｋ，Ｗ．Ｏ．；Ｎｕｎａｍａｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．；Ｐｒｏｖｏｓｔ，Ｍ．Ｔ．；Ｓｅｅｄｏｒ，Ｊ．Ｇ．；Ｒｏｄａｎ，Ｇ．Ａ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ  Ｏｎ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｂｏｎｅ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｉｎ  Ｄｏｇｓ。Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１４：７４〜７０、１９９６）により以前に公表されている。手短に言うと、生体力学的テストに先立って、すべての骨折のラジオグラフをとる。治癒しつつある骨折の力学的特性を、破壊的三点または四点曲げ手順により分析する。最大点荷重、剛性、最大点荷重時のエネルギー、最大点荷重時の歪み、および最大点応力を測定する。
【０１８５】
エストロゲン作動薬／拮抗薬プロトコル
エストロゲン作動薬／拮抗薬は、骨代謝回転を阻害し、エストロゲン欠乏誘発性骨喪失を予防する化合物の一種である。卵巣切除ラット骨喪失モデルは、閉経後骨喪失のモデルとして広く使用されてきた。このモデルを使用して、骨喪失を予防し骨吸収を阻害する際のエストロゲン作動薬／拮抗薬化合物の有効性をテスト試験することができる。
【０１８６】
様々な齢（５カ月齢など）のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雌性ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を、これらの試験で使用する。実験期間中、ラットを、１匹ずつ２０ｃｍ×３２ｃｍ×２０ｃｍのケージに収容する。すべてのラットに、水ならびにカルシウム０．９７％、リン０．８５％、およびビタミンＤ３１．０５ＩＵ／ｇを含有するペレット市販飼料（Ａｇｗａｙ  ＰｒｏＬａｂ  ３０００、Ａｇｗａｙ  Ｃｏｕｎｔｒｙ  Ｆｏｏｄ，Ｉｎｃ．、Ｓｙｒａｃｕｓｅ、ＮＹ）を自由に摂取させる。
【０１８７】
一群のラット（８〜１０匹）に偽手術をし、ビヒクル（１０％エタノールおよび９０％食塩水、１ｍｌ／日）で経口的に治療し、一方、残りのラットは、両側卵巣切除し（ＯＶＸ）、一定期間（４週間など）にわたってビヒクル（経口）、１７β−エストラジオール（Ｓｉｇｍａ、Ｅ−８８７６、Ｅ２、３０μｇ／ｋｇ、連日皮下注射）、またはエストロゲン作動薬／拮抗薬（連日経口的に５、１０または２０ｍｇ／ｋｇドロロキシフェンなど）で治療する。骨組織における動的変化を調べるため、すべてのラットに屠殺する１２日および２日前にカルセイン（蛍光色素骨マーカー）１０ｍｇ／ｋｇを皮下注射する。４週間の治療後、ラットを屠殺し、剖検する。以下のエンドポイントを決定する。
【０１８８】
体重増加：剖検時の体重−手術時の体重。
【０１８９】
子宮の重量および組織学：剖検中に各ラットから子宮を摘出し、直ちに秤量する。その後、子宮断面組織面積、間質厚、および内腔上皮厚などの組織学的測定のために子宮を処理する。
【０１９０】
総血清コレステロール：血液を、心臓穿刺により採取し、４℃において凝固させ、次いで、１０分間にわたって２，０００ｇにて遠心分離する。血清試料を、高性能コレステロール熱量測定アッセイ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて総血清コレステロールについて分析する。
【０１９１】
大腿骨塩測定：各ラットからの右大腿骨を、剖検時に摘出し、「Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｃａｎ」ソフトウェア（Ｈｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を備えた二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＥＸＡ、ＱＤＲ  １０００／Ｗ、Ｈｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いてスキャンする。スキャン範囲サイズは、５．０８×１．９０２ｃｍであり、解像度は、０．０２５４×０．０１２７ｃｍであり、スキャン速度は、７．２５ｍｍ／秒である。大腿骨スキャン画像を分析し、全大腿骨（ＷＦ）、遠位大腿骨幹端（ＤＦＭ）、大腿骨幹軸（ＦＳ）、および近位大腿骨（ＰＦ）の、骨面積、骨塩量（ＢＭＣ）、および骨塩密度（ＢＭＤ）を決定する。
【０１９２】
近位脛骨幹端海綿骨組織形態計測分析：右脛骨を、剖検時に摘出し、筋肉を切り離し、３つの部分に切り分ける。近位脛骨を、７０％エタノール中で固定し、段階的濃度のエタノール中で脱水し、アセトン中で脱脂し、次いで、メタクリル酸メチル（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に包埋する。厚さ４および１０μｍで、近位脛骨幹端の前部切片を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ  Ｐｏｌｙｃｕｔ  Ｓミクロトームを用いて切り取る。各ラットからの１つの４μｍの切片および１つの１０μｍの切片を、海綿骨組織形態計測のために用いる。４μｍの切片は、変法マッソントリクローム染料で染色し、一方、１０μｍの切片は、未染色のままとする。
【０１９３】
Ｂｉｏｑｕａｎｔ  ＯＳ／２組織形態計測システム（Ｒ＆Ｍ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、ＴＮ）を、成長板−骨端接合部より１．２ｍｍ〜３．６ｍｍ遠位の近位脛骨幹端の二次海綿骨の静的および動的組織形態計測測定のために使用する。測定を二次海綿骨に限定するため、脛骨幹端領域の最初の１．２ｍｍを除外することが必要である。４μｍの切片を用い、骨体積、骨構造、および骨吸収に関連する指数を測定し、一方、１０μｍの切片を用い、骨形成および骨代謝回転に関連する指数を測定する。
【０１９４】
Ｉ．骨梁の体積および構造に関連する測定および計算：
１．総骨幹端面積（ＴＶ、ｍｍ２）：成長板−骨端接合部より１．２ｍｍ〜３．６ｍｍ遠位の骨幹端面積。
２．骨梁面積（ＢＶ、ｍｍ２）：ＴＶ内の柵状織の総面積。
３．骨梁周囲長（ＢＳ、ｍｍ）：柵状織の総周囲長の長さ。
４．骨梁体積（ＢＶ／ＴＶ、％）：ＢＶ／ＴＶ×１００。
５．骨梁数（ＴＢＮ、＃／ｍｍ）：１．１９９／２×ＢＳ／ＴＶ。
６．骨梁厚（ＴＢＴ、μｍ）：（２０００／１．１９９）×（ＢＶ／ＢＳ）。
７．骨梁間隔（ＴＢＳ、μｍ）：（２０００／１．１９９）×（ＴＶ−ＢＶ）。
【０１９５】
ＩＩ．骨吸収に関連する測定および計算：
１．破骨細胞数（ＯＣＮ、＃）：総骨幹端面積内の破骨細胞の総数。
２．破骨細胞周囲長（ＯＣＰ、ｍｍ）：破骨細胞により覆われた骨梁周囲長の長さ。
３．破骨細胞数／ｍｍ（ＯＣＮ／ｍｍ、＃／ｍｍ）：ＯＣＮ／ＢＳ。
４．破骨細胞周囲長率（％ＯＣＰ、％）：ＯＣＰ／ＢＳ×１００。
【０１９６】
ＩＩＩ．骨の形成および代謝回転に関連する測定および計算：
１．単一カルセイン標識周囲長（ＳＬＳ、ｍｍ）：１回のカルセイン標識で標識された骨梁周囲長の全長。
２．二重カルセイン標識周囲長（ＤＬＳ、ｍｍ）：２回のカルセイン標識で標識された骨梁周囲長の全長。
３．標識間幅（ＩＬＷ、μｍ）：２回のカルセイン標識間の平均距離。
４．石灰化周囲長率（ＰＭＳ、％）：（ＳＬＳ／２＋ＤＬＳ）／ＢＳ×１００。
５．石灰化速度（ＭＡＲ、μｍ／日）：ＩＬＷ／標識間隔。
６．骨形成速度／表面基準（ｒｅｆ．）（ＢＦＲ／ＢＳ、μｍ２／ｄ／μｍ）：（ＳＬＳ／２＋ＤＬＳ）×ＭＡＲ／ＢＳ。
７．骨代謝回転速度（ＢＴＲ、％／ｙ）：（ＳＬＳ／２＋ＤＬＳ）×ＭＡＲ／ＢＶ×１００。
【０１９７】
統計値
統計値は、ＳｔａｔＶｉｅｗ４．０パッケージ（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を用いて計算することができる。分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定と、続く、フィッシャーのＰＬＳＤ（Ｓｔａｔ  Ｖｉｅｗ、Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｉｎｃ．、１９１８  Ｂｏｎｉｔａ  Ａｖｅ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ９４７０４−１０１４）を用い、群間の差を比較する。
【０１９８】
組合せ治療および順次治療プロトコル
以下のプロトコルは、当業者により変えることができることは言うまでもない。例えば、無処置の雄性または雌性ラット、性ホルモン欠乏の雄性（精巣摘出）または雌性（卵巣切除）ラットを使用することができる。さらに、様々な齢（１２カ月齢など）の雄性または雌性ラットを試験で使用することができる。ラットは、無処置であるか、または去勢（卵巣切除または精巣摘出）されており、一定期間（２週〜２カ月など）にわたって様々な投与量（１、３または６ｍｇ／ｋｇ／日など）で本発明の化合物などの同化薬を投与し、続いて、一定期間（２週〜２カ月など）にわたって様々な投与量（１、５、１０ｍｇ／ｋｇ／日など）でドロロキシフェンなどの抗吸収薬を投与するか、または一定期間（２週〜２カ月など）にわたって様々な投与量で同化薬と抗吸収薬の組合せ治療を行うことができる。去勢ラットにおいて、治療は、手術の翌日（骨喪失を予防する目的で）または骨喪失が既に起きた時点（骨量を回復する目的で）で開始することができる。
【０１９９】
ラットを、ケタミン麻酔下で屠殺する。以下のエンドポイントを決定する。
【０２００】
大腿骨塩測定は、エストロゲン作動薬／拮抗薬プロトコルで上記に記載されているように行う。
【０２０１】
腰椎骨塩測定：「Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｃａｎ」ソフトウェア（Ｈｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を備えた二重エネルギーＸ線吸収法（ＱＤＲ  １０００／Ｗ、Ｈｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用い、麻酔ラットにおける全腰椎および６個の腰椎（ＬＶ１〜６）の各々の骨面積、骨塩量（ＢＭＣ）、および骨塩密度（ＢＭＤ）を測定。ラットを、ケタミン／ロンパン（４対３の比）の混合物１ｍｌ／ｋｇの腹腔内注射により麻酔し、ラットプラットホーム上に置く。スキャン領域サイズは、６×１．９ｃｍであり、解像度は、０．０２５４×０．０１２７ｃｍであり、スキャン速度は、７．２５ｍｍ／秒である。全腰椎スキャン画像を取得し分析する。骨面積（ＢＡ）、および骨塩量（ＢＭＣ）を測定し、骨塩密度は、全腰椎および６個の腰椎（ＬＶ１〜６）の各々について計算する（ＭＢＣをＢＡで除す）。
【０２０２】
近位脛骨幹端海綿骨組織形態計測分析は、エストロゲン作動薬／拮抗薬プロトコルで上記に記載されているように行う。
【０２０３】
骨梁の体積および構造に関連する測定および計算は、エストロゲン作動薬／拮抗薬プロトコルで上記に記載されているように行う。さらに、骨吸収に関連する測定および計算も、エストロゲン作動薬／拮抗薬プロトコルで上記に記載されているように行う。さらに、骨の形成および代謝回転に関連する測定および計算は、エストロゲン作動薬／拮抗薬プロトコルで上記に記載されているように行う。さらに、得られるデータは、エストロゲン作動薬／拮抗薬プロトコルで上記に記載されている統計操作を用いて分析する。
【０２０４】
腎臓再生アッセイ
腎臓再生におけるプロスタグランジン作動薬の役割は、野生型２９３Ｓ細胞およびＥＰ２をトランスフェクトした２９３Ｓ細胞における骨形態形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）の発現を誘導するプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）またはプロスタグランジン作動薬の能力により検討する。
【０２０５】
方法：２９３Ｓ細胞およびＥＰ２  ２９３Ｓ細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で培養する。ＰＧＥ２またはプロスタグランジン作動薬で処理する１日前に、細胞を、１０ｃｍの皿当たり１．５×１０６個の細胞の密度でプレートする。一般的に、約１６〜２４時間後、細胞単層を、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で１回洗浄し、続いて、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＰＧＥ２（１０−６Ｍ）またはプロスタグランジン作動薬（１０−６Ｍ）の存在下および非存在下で皿当たりＯｐｔｉＭＥＭ１０ｍＬを加える。８、１６および２４時間目に細胞を収集し、ＲＮＡを抽出する。全ＲＮＡ（２０ｍｇ／レーン）のノーザンブロット分析を、３２Ｐ−標識ＢＭＰ−７プローブでブロットを探索することにより行う。ブロットを、３２Ｐ−標識１８ｓリボソームＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによりＲＮＡ負荷について正規化する。ＰＧＥ２およびプロスタグランジン作動薬は、時間依存的にＥＰ２  ２９３Ｓ細胞におけるＢＭＰ−７の発現を誘導する。そのような発現誘導は、親細胞系では一般的に観察されない。腎臓再生におけるＢＭＰ−７の知られている役割を考えると、時間および受容体特異的に２９３Ｓ腎臓細胞におけるＢＭＰ−７発現を誘導するプロスタグランジン作動薬の能力は、腎臓再生におけるプロスタグランジン作動薬の役割を示している。
【０２０６】
本発明の化合物の投与は、本発明の化合物を全身的および／または局所的に（例えば、骨折、骨切り術または整形手術の部位において）送達する任意の方法を介することができる。これらの方法は、経口経路、非経口経路、十二指腸内経路などを包含する。一般的に、本発明の化合物は、経口的に投与されるが、例えば、経口投与が標的にとって不適切である場合、または患者が薬物を経口摂取することができない場合、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、経皮、皮下、経直腸または髄内）を利用することができる。
【０２０７】
化合物は、本発明の化合物またはそれらの組成物の局所適用（例えば、骨折または骨切り術の部位への）により、骨折および骨切り術を治療することおよびそれらの治癒を促進することのために使用される。本発明の化合物は、例えば、適当な溶媒（例えば、ラッカセイ油などの油性溶媒）中の本発明化合物の軟骨成長板への注射によるか、または、切開手術の場合には、骨蝋、脱灰骨粉、ポリマー骨セメント、骨シーラントなどの適当な担体または希釈剤中のそのような化合物のそこへの局所適用により、骨折または骨切り術の部位に適用される。代替方法として、局所適用は、適当な担体または希釈剤中の化合物の溶液もしくは分散液を、ダクロン−メッシュ、ゲル−フォームおよびキールボーン（ｋｉｅｌ  ｂｏｎｅ）、もしくは補綴などの整形外科手術において従来から使用されている固体もしくは半固体のインプラントの表面上または中に、塗布または組み入れることにより行うことができる。
【０２０８】
本発明の化合物は、上記に記載されている同化薬または骨抗吸収薬のうちの１種または複数と組み合わせて、適当な担体または希釈剤中で骨折または骨切り術の部位に局所的に適用することもできる。
【０２０９】
本発明の範囲内にあるそのような組合せは、任意の順序で同時に、または順次に同時投与することができ、または薬学的に許容できる担体または希釈剤中に上記に記載されているような（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸およびそのナトリウム塩の多形性形態、そのプロドラッグまたは前記化合物もしくは前記プロドラッグの薬学的塩を含む単一医薬組成物を投与することができる。
【０２１０】
例えば、本発明において、骨同化薬を、３カ月〜３年にわたって単独で、または抗吸収薬と組み合わせて、続いて、３カ月〜３年にわたって抗吸収薬を単独で使用することができ、全治療サイクルを繰り返してもよい。代替方法として、骨同化薬を、３カ月〜３年にわたって単独でまたは抗吸収薬と組み合わせて、続いて、患者の人生の残りの期間にわたって抗吸収薬を単独で使用することができる。例えば、１つの好ましい投与様式において、上記に記載されているような（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸およびそのナトリウム塩の多形性形態、またはそのプロドラッグもしくは薬学的に許容できるプロドラッグの塩を１日１回投与することができ、上記に記載されているような第２の化合物（例えば、エストロゲン作動薬／拮抗薬）を、単回投与または複数回投与で連日投与することができる。代替方法として、例えば、別の好ましい投与様式において、２つの化合物を順次に投与することができ、上記に記載されているような（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸およびそのナトリウム塩化合物の多形性形態、そのプロドラッグまたは薬学的に許容できるプロドラッグの塩を、骨折閾値（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  Ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ（１９９４）。Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ。Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ  ８４３」）以上であるレベルまで骨量を増加させるのに十分な期間にわたって１日１回投与することができ、続いて、上記に記載されているような第２の化合物（例えば、エストロゲン作動薬／拮抗薬）を、単回投与または複数回投与で連日投与する。上記に記載されているような第１の化合物は、経口送達などの迅速な送達形態で１日１回投与されることが好ましい。
【０２１１】
いずれにしても、投与される化合物の量およびタイミングは、治療されている対象、苦痛の重症度、投与の様式および処方医師の判断により左右されるであろうことは言うまでもない。したがって、患者間の変動性のため、以下に示す用量は、指針であり、医師は、医師がその患者に適切であると考える治療（例えば、骨量増加）を達成するために薬物の投与量を設定することができる。望まれる治療の程度を考慮する際、医師は、骨量出発レベル、患者の年齢、既存疾患の存在、ならびに他の疾患（例えば、心血管疾患）の存在などの様々な要因のバランスをとらなければならない。
【０２１２】
一般に、骨量を骨折閾値（本明細書で以前に引用されているＷｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙに詳述されているような）以上であるレベルまで増加させるのに十分な量の本発明の化合物が使用される。
【０２１３】
一般に、上記に記載されている本発明において使用される同化薬の有効用量は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０２１４】
以下の段落は、様々な抗吸収薬についての好ましい用量範囲を提供する。
【０２１５】
使用すべき抗吸収薬の量は、骨喪失阻害薬としてのその活性により決定される。この活性は、個々の化合物の薬物動態および上記に記載されているようなプロトコル（例えば、エストロゲン作動薬／拮抗薬プロトコル）を用いる骨喪失の阻害におけるその最小有効投与量対最大有効投与量により決定される。
【０２１６】
一般に、抗吸収薬についての有効用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０２１７】
一般に、プロゲスチンについての有効用量は、１日当たり約０．１〜１０ｍｇであり、好ましい投与量は、１日当たり約０．２５〜５ｍｇである。
【０２１８】
一般に、ポリホスホネートについての有効用量は、標準的アッセイの骨吸収阻害薬としてのその効力により決定される。
【０２１９】
一部のポリホスホネートの連日投与のための範囲は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０２２０】
一般に、本発明の治療、例えば、本発明の骨吸収治療についての有効用量は、本発明のエストロゲン作動薬／拮抗薬について、０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０２２１】
特に、ドロロキシフェンについての有効用量は、０．１〜４０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０２２２】
特に、ラロキシフェンについての有効用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０２２３】
特に、タモキシフェンについての有効用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０２２４】
特に、２−（４−メトキシ−フェニル）−３−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェノキシ］−ベンゾ［ｂ］チオフェン−６−オールについての有効用量は、０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０２２５】
特に、
ｃｉｓ−６−（４−フルオロ−フェニル）−５−（４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オール；
（−）−ｃｉｓ−６−フェニル−５−（４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オール；
ｃｉｓ−６−フェニル−５−（４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オール；
ｃｉｓ−１−（６’−ピロロジノエトキシ−３’−ピリジル）−２−フェニル−６−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン；
１−（４’−ピロリジノエトキシフェニル）−２−（４”−フルオロフェニル）−６−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン；
ｃｉｓ−６−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オール；または
１−（４’−ピロリジノレトキシフェニル）−２−フェニル−６−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン
についての有効用量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０２２６】
特に、４−ヒドロキシタモキシフェンについての有効用量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０２２７】
本発明の化合物は、一般的に、薬学的に許容できるビヒクルまたは希釈剤と一緒に本発明の化合物のうちの少なくとも１つを含む医薬組成物の形態で投与される。したがって、本発明の化合物は、任意の従来型の経口、非経口、直腸または経皮剤形で個々に、または一緒に投与することができる。
【０２２８】
経口投与の場合、医薬組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤などの形態をとることができる。クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよびリン酸カルシウムなどの様々な賦形剤を含有する錠剤は、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチンおよびアカシアなどの結合剤に加えて、デンプン、好ましくはジャガイモまたはタピオカデンプンおよび特定の複雑なケイ酸塩などの様々な崩壊剤と一緒に用いられる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの滑沢剤は、錠剤化目的に極めて有用であることが多い。類似のタイプの固体組成物も、軟質および硬質充填ゼラチンカプセルにおける充填剤として用いられ、これに関する好ましい材料は、ラクトースすなわち乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールも包含する。水性懸濁剤および／またはエリキシル剤が経口投与にとって望ましい場合には、本発明の化合物を、様々な甘味剤、矯味剤、着色剤、乳化剤および／または懸濁化剤、ならびに水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよびそれらの様々な同類の組合せなどの希釈剤と組み合わせることができる。
【０２２９】
非経口投与の目的には、ゴマもしくはピーナッツ油または水性プロピレングリコールの溶液、ならびに対応する水溶性の塩の滅菌水溶液を用いることができる。そのような水溶液は、必要ならば、適切に緩衝されていてもよく、液体希釈剤は、まず初めに十分な食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内注射目的に特に適している。これに関して、用いられる滅菌水性媒体はすべて、当業者によく知られている標準的技法により容易に得ることができる。
【０２３０】
経皮（例えば、局所）投与の目的には、その他の点では上記の非経口溶液に類似した希釈滅菌、水性または部分的水性水溶液（通常、約０．１％〜５％濃度で）が調製される。
【０２３１】
特定の量の活性成分を含む様々な医薬組成物を調製する方法は、当業者に知られているか、または本開示を踏まえて当業者に明らかであろう。医薬組成物を調製する方法の例については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｅｒ、Ｐａ．、第１５版（１９７５）を参照されたい。
【０２３２】
本発明の医薬組成物は、本発明の１つまたは複数の化合物を０．１％〜９５％、好ましくは１％〜７０％含有することができる。いずれにしても、投与すべき組成物または製剤は、治療されている対象の疾患／状態、例えば骨障害を治療するのに有効な量で、ある量の本発明の１つまたは複数の化合物を含有するであろう。
【０２３３】
本発明は、別々に投与することができる活性成分の組合せで治療することによる骨量の増加および維持に関する態様を有することから、本発明は、キット形態で別々の医薬組成物を組み合わせることにも関する。キットは、２つの別々の医薬組成物、すなわち、上記に記載されているような式Ｉの化合物、そのプロドラッグまたは薬学的に許容できる前記化合物もしくは前記プロドラッグの塩および第２の化合物を含む。キットは、分割されたボトルまたは分割されたホイルパケットなどの別々の組成物を含有するための容器手段を含むが、別々の組成物は、単一の分割されていない容器内に含有されていてもよい。通常、キットは、別々の成分を投与するための説明書を含む。キット形態は、別々の成分が、異なる剤形（例えば、経口および非経口）で投与されることが好ましい場合、異なる投与間隔で投与される場合、または処方医師が、組合せの個々の成分の用量設定を望む場合は特に有利である。
【０２３４】
そのようなキットの一例は、いわゆるブリスターパックである。ブリスターパックは、包装産業においてよく知られており、医薬品単位剤形（錠剤、カプセル剤など）を包装するために広く使用されている。一般的に、ブリスターパックは、好ましくは透明なプラスチック材料のホイルで覆われている比較的硬い材料のシートからなる。包装プロセス中に、プラスチックホイルに凹部が形成される。凹部は、包装すべき錠剤またはカプセル剤のサイズおよび形状を有する。次に、錠剤またはカプセル剤は、凹部に入れられ、比較的硬い材料のシートは、凹部が形成された方向から反対のホイルの表面でプラスチックホイルに対して密閉される。結果として、錠剤またはカプセル剤は、プラスチックホイルとシートの間の凹部に密閉される。シートの強度は、凹部上に手で圧力をかけ、それにより凹部の場所で開口部がシートに形成されることにより、錠剤またはカプセル剤をブリスターパックから取り出すことができるような強度であることが好ましい。次いで、錠剤またはカプセル剤は、前記開口部を介して取り出すことができる。
【０２３５】
キット上の記憶補助を、例えば、数字が、そのように定められた剤形を摂取するべき投与計画の日数と一致する錠剤またはカプセル剤に隣接する数字の形態で提供することが望ましいことがある。そのような記憶補助の別の例は、例えば、以下の通り「Ｆｉｒｓｔ  Ｗｅｅｋ，Ｍｏｎｄａｙ，Ｔｕｅｓｄａｙ，．．ｅｔｃ．．．．Ｓｅｃｏｎｄ  Ｗｅｅｋ，Ｍｏｎｄａｙ、Ｔｕｅｓｄａｙ，．．．」など、カード上に印刷されたカレンダーである。記憶補助の他の変形例は、容易に明らかであろう。「１日投与量」は、所与の日に摂取すべき単一の錠剤もしくはカプセル剤またはいくつかの錠剤もしくはカプセル剤であってよい。また、式Ｉ化合物、そのプロドラッグまたは薬学的に許容できる前記化合物もしくは前記プロドラッグの塩の１日投与量は、１個の錠剤またはカプセルからなっていてもよく、一方、第２の化合物の１日投与量は、いくつかの錠剤またはカプセルからなっていてもよく、逆もまた同様である。記憶補助は、これを反映するべきである。
【０２３６】
本発明の別の具体的実施形態において、それらの意図した使用の順序で一度に１日投与量を投薬するように設計されたディスペンサーが提供される。ディスペンサーは、投与計画の順守をさらに容易にするように、記憶補助を備えていることが好ましい。そのような記憶補助の一例は、投薬された１日投与量の数を示すメカニカルカウンターである。そのような記憶補助の別の例は、例えば、最後の１日投与量が摂取された日付を読み出し、かつ／または次の投与量を摂取するべき日付を指摘する液晶読み出し、または可聴式注意喚起シグナルと一体となった電池式マイクロチップメモリーである。
【０２３７】
一般的に、本発明の化合物は、単独で、またはお互いと、もしくは他の化合物と組み合わせて好都合な製剤で投与されるであろう。以下の製剤例は、例示的であるに過ぎず、本発明の範囲を制限することは意図されていない。
【０２３８】
続く製剤において、「活性成分」は、本発明の１種または複数の化合物を意味する。
【０２３９】
製剤１：ゼラチンカプセル剤
硬質ゼラチンカプセル剤は、以下を用いて調製する：
【０２４０】
【表１２】
2009137934.tif 000019
【０２４１】
錠剤製剤は、以下の成分を用いて調製する：
製剤２：錠剤
【０２４２】
【表１３】
2009137934.tif 000020
【０２４３】
成分を混ぜ合わせて圧縮し、錠剤を形成する。
【０２４４】
代替方法として、各々が活性成分を０．２５〜１００ｍｇ含有する錠剤は、以下のように作製する：
製剤３：錠剤
【０２４５】
【表１４】
2009137934.tif 000021
【０２４６】
活性成分、デンプン、およびセルロースを、Ｎｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．シーブに通し、十分に混合する。ポリビニルピロリドンの溶液を、得られる粉末と混合し、次いで、Ｎｏ．１４メッシュＵ．Ｓ．シーブに通す。そのようにして製造した顆粒を、５０℃〜６０℃において乾燥し、Ｎｏ．１８メッシュＵ．Ｓ．シーブに通す。次いで、前もってＮｏ．６０Ｕ．Ｓ．シーブに通したカルボキシメチルセルロースナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、およびタルクを顆粒に加え、混合した後、錠剤機で圧縮すると、錠剤が得られる。
【０２４７】
各々が５ｍｌ投与量当たり活性成分を０．２５〜１００ｍｇ含有する懸濁剤は、以下のように製造する：
製剤４：懸濁剤
【０２４８】
【表１５】
2009137934.tif 000022
【０２４９】
活性成分を、Ｎｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．シーブに通し、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびシロップと混合し、滑らかなペーストを形成する。安息香酸溶液、香料、および着色料を、水の一部で希釈し、攪拌しながら加える。次いで、十分な水を加え、必要な容積にする。
【０２５０】
以下の成分を含有するエアロゾル溶液を調製する：
製剤５：エアロゾル
【０２５１】
【表１６】
2009137934.tif 000023
【０２５２】
活性成分をエタノールと混合し、混合物をプロペラントの一部に加え、３０℃まで冷却し、充填装置に移す。次いで、必要量をステンレス鋼の容器に送り込み、残りのプロペラントで希釈する。次いで、バルブユニットを容器に取り付ける。
【０２５３】
坐剤は、以下のように調製する：
製剤６：坐剤
【０２５４】
【表１７】
2009137934.tif 000024
【０２５５】
活性成分を、Ｎｏ．６０メッシュＵ．Ｓ．シーブに通し、最低限必要な熱を用いて前もって溶融させた飽和脂肪酸グリセリドに懸濁させる。次いで、混合物を、公称２ｇ容量の坐剤鋳型中に注ぎ込み、冷却させる。
【０２５６】
静脈内製剤は、以下のように調製する：
製剤７：静脈内溶液
【０２５７】
【表１８】
2009137934.tif 000025
【０２５８】
上記成分の溶液は、１分当たり約１ｍＬの速度で患者に静脈内投与される。
【０２５９】
上記の活性成分は、薬剤の組合せであってもよい。
【０２６０】
上記は、本発明の例示的実施形態に関しており、以下の特許請求の範囲に示されるような本発明の精神および範囲を逸脱することなく改変を行うことができることが理解されるべきであることは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
【図１】本発明による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ａのディフラクトグラムを示す図である。
【図２】本発明による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｂのディフラクトグラムを示す図である。
【図３】本発明による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｃのディフラクトグラムを示す図である。
【図４】本発明による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｅのディフラクトグラムを示す図である。
【図５】本発明による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｆのディフラクトグラムを示す図である。
【図６】本発明による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｇのディフラクトグラムを示す図である。
【図６Ｂ】本発明による（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩の形態Ｈのディフラクトグラムを示す図である。
【図６Ｃ】本発明による非晶質性の（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩のディフラクトグラムを示す図である。
【図７】（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩、形態Ａの固体１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図である。
【図８】（３−（（（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−（ピリジン−３−スルホニル）−アミノ）−メチル）−フェノキシ）−酢酸ナトリウム塩、形態Ｈの固体１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図である。
【図１】
2009137934.tif 000026
【図２】
2009137934.tif 000027
【図３】
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【図４】
2009137934.tif 000029
【図５】
2009137934.tif 000030
【図６】
2009137934.tif 000031
【図６Ｂ】
2009137934.tif 000032
【図６Ｃ】
2009137934.tif 000033
【図７】
2009137934.tif 000034
【図８】
2009137934.tif 000035
【外国語明細書】
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2009137934000002.pdf
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