(57)【要約】【要  約】【課  題】 安全性が高く、食品分野に有利に適用され得る、食用野菜由来のホスホリパーゼＤの製造法と利用法の提供。【解決手段】  原料として、キュウリまたは大根を粉砕し、濾過または、遠心分離により上清を採取する。上清をアセトン等の有機溶媒で処理し、粗酵素を調製する。さらに、例えば塩析、有機溶媒沈殿、透析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、凍結乾燥、等電点電気泳動等の方法を用いることにより、高活性のホスホリパーゼＤを得る。本発明のホスホリパーゼＤにより、極性基交換反応を用いたホスファチジルセリン等を製造することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野菜由来であることを特徴とするホスホリパーゼＤの製造法と利用法
【請求項２】
野菜がキュウリ、大根である請求項１記載のホスホリパーゼＤの製造法と利用法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリパーゼＤ及びその製造法に係り、特に、野菜から見出された、食品分野において広く利用され得るホスホリパーゼＤ並びにそれを大量に生産し得る方法、およびホスホリパーゼＤを用いて天然に微量しか存在しないリン脂質を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ホスホリパーゼＤは、グリセロリン脂質のリン酸ジエステル結合を加水分解して、ホスファチジン酸とアルコールを生じる反応及び極性基をほかの水酸基をもつ化合物と交換する反応（極性基交換反応）の２種類の反応を触媒する酵素である。ホスホリパーゼＤは、広く生物界に分布し、特に微生物由来のものについてはその性状などが詳しく検討されている。近年、細胞内外の情報伝達機構が解明されるに伴い、ホスホリパーゼＡ２，Ｃ及びホスホリパーゼＤが細胞内外の情報伝達の一端を担うことがわかってきた（非特許文献１）。本酵素の市販品としては、植物起源のものとしてキャベツ（特許文献１，２）、微生物起源のものとしてはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ（特許文献３，４）などがある。現在は、微生物由来のホスホリパーゼのみが工業的に利用されている。
【０００３】
しかしながら、そのような従来のホスホリパーゼの生産方式にあっては、各種の問題が内在しており、特に微生物由来のホスホリパーゼにおいては、その一部に病原性が指摘されており、全てのものが安全であると言うことが出来ず、そのため、そのような方式にて得られたホスホリパーゼを食品分野に利用するには、安全性の点において問題を内在するものであった。また、キャベツ以外の野菜のホスホリパーゼに関する先行技術は知られていない。
【非特許文献１】IUBMB Life . Vol.58 No.8 Page.457-461 (2006)
【特許文献１】特表２００５−５０１５５９
【特許文献２】特開２００２−２１８９９１
【特許文献３】特開２００４−２５６４７５
【特許文献４】特開２００５−２６１２８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
かかる状況下、本発明者らは、食用野菜中のホスホリパーゼＤについて検討し、特に、日常食されるきゅうり、大根に、ｐＨ安定性及び熱安定性の良好なホスホリパーゼＤが含まれる知見を得て、本発明を完成するに至ったのである。
【０００５】
従って、本発明の解決課題とするところは、安全性が高く、食品分野に有利に適用され得る、ｐＨ安定性及び熱安定性の良好なホスホリパーゼＤを提供とホスホリパーゼＤを用いたリン脂質の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、野菜が含有するホスホフォリパーゼの作用を鋭意研究した結果、食用野菜のホスホリパーゼを有機溶媒のない反応系でリン脂質に作用させるとき、その中のグリセロリン脂質のリン酸ジエステル結合が加水分解されて、ホスファチジン酸とアルコールを生じる反応及び極性基をほかの水酸基をもつ化合物と交換する反応（極性基交換反応）、すなわちホスホリパーゼＤの活性を有するという知見を得た。
即ち、本発明は、次の［１］、［２］である。
［１］野菜由来のホスホリパーゼＤの製造法と利用法
［２］野菜がキュウリ、大根である［１］記載のホスホリパーゼＤの製造法と利用法
【０００７】
本発明は、野菜由来のホスホリパーゼＤの製造法と利用法に関するものであり、更に詳しくは、キュウリまたは大根を原料とする、ホスホリパーゼＤの製造法と利用法に関する。本発明のホスホリパーゼＤを用いて、有機溶媒のない反応系で植物リン脂質中の例えばホスファチジルコリンから、ホスファチジン酸やホスファチジルセリン生成させ、アセトンを用いた分画を行うことにより、最終的に、ホスファチジン酸やホスファチジルセリンを高純度、高収率で得る製造法に関するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、食用野菜に含まれるホスホリパーゼＤを、効率的に製造することができる。また、本発明のホスホリパーゼＤがもつ加水分解活性、極性基交換活性を利用して、例えばホスファチジルコリンを原料として、希少なホスファチジン酸やホスファチジルセリンを安全に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明をより具体的に説明する。
本発明の原料となる食用野菜としては、キュウリまたは大根を使用する。本発明に使用するキュウリは、ウリ科キュウリ属のつる性一年草の果実である。インド北部、ヒマラヤ山麓原産で日本では平安時代から栽培されたものである。品種としては、白イボ系 、黒イボ系 、四葉（スーヨー）胡瓜 、四川胡瓜 、馬込半白胡瓜（まごめはんしろきゅうり） 、高井戸節成胡瓜（たかいどふしなりきゅうり） 、加賀太胡瓜（かがふときゅうり） 、聖護院胡瓜（しょうごいんきゅうり） 、毛馬胡瓜（けまきゅうり） 、大和三尺（やまとさんじゃく）およびピクルスキュウリを単独または混合して本発明の原料として使用することができる。本発明に使用する大根は、地中海地方や中東が原産で、古代エジプトから食用としていた記録があり、日本では弥生時代には伝わり、在来種と中国ダイコンの交雑で栽培品種が成立したものである。品種としては、桜島、聖護院、辛味、守口、源助、練馬、三浦、浅尾、宮重そして紅大根が知られており、これらにうちの１種または複数を本発明の原料として使用することができる。
【００１０】
上記のキュウリまたは大根から、ホスホリパーゼＤを調製するためには、まず、原料のキュウリまたは大根を粉砕し、濾過または、遠心分離により上清を採取する。上清をアセトン等の有機溶媒で処理し、粗酵素を調製する。この粗酵素は、ホスホリパーゼＤの粗酵素液としてそのまま利用することもできる。また、常法に従って濃縮、乾燥し、ホスホリパーゼＤの粉末粗酵素として利用することもできる。さらに、ホスホリパーゼＤを濃縮、採取するにあたっては、例えば塩析、有機溶媒沈殿、透析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、凍結乾燥、等電点電気泳動等の方法を、後述するホスホリパーゼＤの理化学的性質を考慮した条件下で採用すればよい。
【００１１】
キュウリまたは大根のホスホリパーゼＤは以下の理化学的性質を有するものである。
（ａ）作用：グリセロリン脂質のリン酸ジエステル結合を加水分解して、ホスファチジン酸とアルコールを生じる。（ｂ）作用：グリセロリン脂質の極性基をほかの水酸基をもつ化合物と交換する（極性基交換反応）。
【００１２】
試験例、実施例を示し、本発明を更に詳細に説明する。
（試験例１）加水分解活性測定法：ホスファチジルパラニトロフェノール３６０ｍｇに、ジエチルエーテル１ｍｌ加え溶解した後、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５），１５ｍｌ、および１０％トリトン×１００を含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５），１５ｍｌを添加し、６０℃で溶液が透明になるまで加温する。これを減圧下でジエチルエーテルを留去し基質保存液（１６ｍＭホスファチジルパラニトロフェノール）とする。基質保存液を、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５）で２ｍＭホスファチジルパラニトロフェノールとなるように希釈したものを基質溶液とし、あらかじめ３７℃で加温する。基質溶液９５０μＬに対してあらかじめ３７℃で加温した酵素液５０μＬを添加後、混合しホスホリパーゼＤの加水分解反応によって遊離してくるパラニトロフェノールを４０５ｎｍの吸光度を測定することおよびパラニトロフェノールのミリモル分子吸光係数１8.４５から、１分間あたりのパラニトロフェノール生成量を換算し、酵素活性値を決定する。
【００１３】
（試験例２）極性機交換活性測定法：ホスファチジルパラニトロフェノールを１ｍｌあたり１６ｍｇの割合で、ベンゼンに溶解し、基質溶液（２０ｍＭホスファチジルパラニトロフェノール）とする。１サンプルにつき、この基質溶液0.２ｍｌに２Ｍエタノールを含む２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ5.０）溶液0.１ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌの牛アルブミン溶液0.０５ｍｌを混合し、１５分間超音波にて分散し、エマルジョン化する。これを３７℃で５分間加温した後、酵素溶液0.０５ｍｌを加え、反応を開始する。これと平行して、酵素溶液のかわりにパラニトロフェノールを1.０、0.８、0.６、0.４、0.２、0.０μモル含む溶液を各々添加した系列をつくり検量線用試料とする。３７℃、１０分間反応を行った後、１Ｎ塩酸溶液0.１ｍｌを加え反応を停止した後、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液0.１５ｍｌおよびクロロホルム／メタノール＝３／１溶液0.４ｍｌを加え混合後、４℃で１０分間遠心分離する。水相を0.０２ｍｌとり、0.１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ8.０）0.１８ｍｌと混合し、マイクロプレートリーダー等の手段により４０５ｎｍの吸光度を測定する。別途作成した検量線用試料の吸光度値から検量線を作成し、転移反応により遊離したパラニトロフェノール量を換算し、転移活性を決定する。なおこの反応での１ユニットは１分間あたり１マイクロモルのパラニトロフェノールを遊離させる酵素量と定義する。
【００１４】
（試験例３）  リン脂質の定量分析
以下の条件により、原料、反応溶液中のリン脂質含量を測定した。装置；高速液体クロマトグラフィー（アジレント社製、機種モデル１１００）、固定相；シリカゲルカラム（径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）、移動相（溶離液）；アセトニトリル：メタノール：１０ｍＭリン酸二水素アンモニウムの混合溶媒（＝６１２：２８９：１００ｖ／ｖ／ｖ）、検出；紫外線ＵＶ波長２０２ｎｍにおける吸収を測定、分離温度；４０℃、試料量；５μｌ、流出速度；１．５ｍｌ／分。なお予め作成した検量線と試料の紫外吸収強度を比較して、試料中の各種リン脂質含量（重量％）を求めた。なお原料は試料１ｍｇを１ｍｌの前記の溶離液に溶解して分析した。なおまた、反応液の場合は、反応液１ｍｇに精製水５ｍｌ、ｎ−ヘキサン５ｍｌを添加し、１分間撹拌した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。前記の上澄み液を１ｍｌを分離し、エバポレートで溶媒を除去して不揮発成分の重量を求めた。濃度が１ｍｇ／１ｍｌとなるように溶離液を加えて溶解したものを試料として用いた。
【実施例１】
【００１５】
キュウリホスホリパーゼＤの調製：試料のキュウリ（黒イボ系）400gに純水600mlを加え、氷冷下にてワーリングブレンダー（ハイパワーホモジナイザー，広沢鉄工所社製）でホモジナイズ（10,000rpm，1min，5回）した。これをガーゼろ過し、ろ液を遠心分離機（CX-250，Tomy社製）で遠心分離（10,000rpm，4℃，30min）した。得られた上澄液（水抽出画分）を加温（55℃，5min）した後、遠心分離（10,000rpm，4℃，30min）した。得られた上澄液（熱処理画分）に2倍量の冷アセトンを撹拌しながら加え、氷冷下で1時間静置した後、生じた沈殿を遠心分離（10,000rpm，4℃，30min）して回収し、真空凍結乾燥機（VD-800F，Taitec社製）で凍結乾燥した。凍結乾燥物を氷冷させた乳鉢で微粉末にし、得られたパウダーをキュウリホスホリパーゼＤとし、-20℃で保存した。キュウリホスホリパーゼＤの加水分解活性は２０Ｕ／ｇ、極性基交換活性は８０Ｕ／ｇであった。
【実施例２】
【００１６】
大根ホスホリパーゼＤの調製：実施例１と同様の方法で、大根（青首）４００ｇを処理し、大根ホスホリパーゼＤを得た。大根ホスホリパーゼＤの加水分解活性は１５Ｕ／ｇ、極性基交換活性は９０Ｕ／ｇであった。大根ホスホリパーゼＤの２ｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の５０ｍＬにて溶解して、それを、同緩衝液にて透析して、脱塩した後、陰イオン交換樹脂（三菱化学株式会社製 DIAION ＨＰＡ７５）を充填したカラムに通して、活性成分（ホスホリパーゼＤ）を吸着せしめ、その後、食塩濃度勾配法にて活性成分を溶出させた。更に、その溶出した活性成分を１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて透析して、脱塩した後、陰イオン交換樹脂（東ソー株式会社製 DEAE TOYOPEARL ６５０Ｍ）を充填したカラムに通して、活性成分を吸着させた後に、食塩勾配法にて、その吸着された活性成分を溶出せしめた。次いで、このようにして得られた活性成分の画分を、更に、疎水性クロマトグラフィー用充填剤（東ソー株式会社製 Butyl TOYOPEARL ６５０Ｍ）を充填したカラムに通して、活性成分を吸着せしめた後、硫酸アンモニウム濃度勾配法にて、その吸着した活性成分を溶出させた。このようにして得られた活性成分の画分を集めて、限外濾過手法にて濃縮した後、ゲル濾過用充填剤（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製 SephacrylＳ−２００）を充填したカラムに通して、ゲル濾過と真空凍結乾燥を行なうことにより、目的とする酵素たる大根ホスホリパーゼＤ精製物０．０２ｇ を得た。大根ホスホリパーゼＤ精製物の加水分解活性は５２５Ｕ／ｇ、極性基交換活性は１３５０Ｕ／ｇであった。すなわち活性回収率は、４０％であった。
【実施例３】
【００１７】
酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）２０ｍｌにセリン（Ｓｅｒと略す。）１０ｇ、塩化カルシウム０．２２２ｇ、実施例２の大根ホスホリパーゼＤ１０ｍｇを溶解し、原料のホスホリポン１００（ナッターマン社製品、ホスホリルコリン純度９５％、ホスファチジルセリンの含有量は０％）、０．２ｇを加えて超音波乳化機（ソニファイヤー、ブランソン社）で均質化した。反応温度４５℃の条件で反応を行った。反応時に経時的にサンプリングして全リン脂質中のホスファチジルセリンの含量を前記の方法で測定しながら、その値が平衡に近づく時間を確認して反応を行った。即ちおよそ平衡に近づく時点が１時間であることを確認し、さらに反応して１時間１５分で反応を終了した。その後、食塩４ｇを添加し溶解して塩析を行った後、デカンテーションにより上層のみを分離し、真空凍結乾燥機（２０℃、８時間）で上層に残った水分を蒸発させてリン脂質０．１９４ｇを得た。反応終了後、得られた油脂リン脂質中のホスファチジルセリンの反応率は、９３．７％となった。なお収率は、９７％であった。得られた製品中のリン脂質含量は、ホスファチジルセリン８８重量％、ホスファチジルコリン４．０重量％、その他のリン脂質６．０重量％であった。
【００１８】
（比較例１）
キュウリの代わりにキャベツ（愛知県産）を用い、実施例１の方法でナスホスホリパーゼＤ精製物を調製した。キャベツホスホリパーゼＤの加水分解活性は１４Ｕ／ｇ、極性基交換活性は７Ｕ／ｇであった。
【００１９】
（比較例２）
大根の代わりにナス（埼玉県産）４００ｇを用い、実施例２の方法でナスホスホリパーゼＤを調製した。ナスホスホリパーゼＤの加水分解活性は９２Ｕ／ｇ、極性基交換活性は１０Ｕ／ｇであった。
【００２０】
（比較例３）
実施例３の大根ホスホリパーゼＤ１０ｍｇの代わりに比較例３のナスホスホリパーゼＤ１０ｍｇを使用して反応を行った。反応終了後、得られた油脂リン脂質中のホスファチジルセリンの反応率は、４６．４％となった。なお収率は、９７％であった。得られた製品中のリン脂質含量は、ホスファチジルセリン８重量％、ホスファチジルコリン４０重量％、その他のリン脂質４８重量％であった。その他のリン脂質の主成分はホスファチジン酸であった。
【００２１】
以上の実施例、比較例から、本発明の方法により高活性のホスホリパーゼＤが得られることがわかる。また、本発明のホスホリパーゼＤは極性基交換反応活性に優れるため、ホスファチジルセリンのような高価なリン脂質の製造に使用できることがわかる。