(57)【要約】【課題】本発明の課題は、高転移性胃癌をはじめとする各種癌のマーカーとなりうる遺伝子を同定し、癌の判定法及びそのためのキットや、癌抑制剤のスクリーニング方法を提供することにある。【解決手段】ヒト胃癌細胞株から、高度の腹膜転移能を持つ高転移型ヒト胃癌培養細胞株を作製し、転移能獲得前と獲得後の株とのｍＲＮＡ発現を、エクソンマイクロアレイを用いて網羅的に比較検討した。その結果、細胞接着に関与する遺伝子である、ＢＨＭＴ（betaine-homocysteine methyltransferase）、ＥＰＳＴＩ１（epithelial stromal interaction 1, (breast)）及びＮＥＢＬ（nebulette）の新規エクソン配列を同定した。さらに、上記ＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントが、胃癌細胞及び大腸癌細胞に発現することを見い出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１及び／又は２に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含むことを特徴とするＢＨＭＴ（betaine-homocysteine methyltransferase）のスプライシングバリアント。
【請求項２】
配列番号３に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含むことを特徴とするＥＰＳＴＩ１（epithelial stromal interaction 1, (breast)）のスプライシングバリアント。
【請求項３】
配列番号４〜１２のいずれかに示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域のうち、少なくとも１以上を含むことを特徴とするＮＥＢＬ（nebulette）のスプライシングバリアント。
【請求項４】
患者から採取した生体試料における、請求項１〜３のいずれかに記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出することを特徴とする胃癌又は大腸癌の判定法。
【請求項５】
胃癌が、高転移性胃癌であることを特徴とする請求項４記載の判定法。
【請求項６】
スプライシングバリアントのｍＲＮＡの発現を検出することを特徴とする請求項４又は５記載の判定法。
【請求項７】
患者から採取した生体試料に含まれる、請求項１〜３のいずれかに記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出するための、プライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする胃癌又は大腸癌の判定用キット。
【請求項８】
胃癌が、高転移性胃癌であることを特徴とする請求項７記載の判定用キット。
【請求項９】
胃癌細胞又は大腸癌細胞を、被検物質の存在下で培養し、該培養細胞における、請求項１〜３のいずれかに記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアント発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価することを特徴とする胃癌又は大腸抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
胃癌細胞が、高転移型ヒト胃癌細胞であることを特徴とする請求項９記載の高転移性胃癌抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
高転移型ヒト胃癌細胞が、ＭＫＮ４５Ｐ１４ＧＡであることを特徴とする請求項１０記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
スプライシングバリアントのｍＲＮＡの発現量を検出することを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高転移性胃癌をはじめとする胃癌や大腸癌の判定法とそのためのキット、並びに、上記癌の抑制剤のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、死亡原因の第一位となっている癌においては、その発生機序、診断法、治療法が進歩したにもかかわらず、未だに多くの進行癌を治療できないのが現状である。これを改善するためには、新しい早期診断法と治療法の開発が必要とされている。なかでも胃癌は、日本と東南アジアでは消化管で最も多くみられる悪性腫瘍であり、癌死亡率では、胃癌が世界で第２位を占めている。胃癌の予後は、診断技術や胃癌の治療法の発達により改善しているが、進行癌の治癒的切除の後に起こる再発の主原因は腹膜播種である。胃漿膜にまで浸潤した胃癌の予後は、５年生存率が３５％と低い。また、進行胃癌術後の腹膜播種再発においてはいまだに有効な治療法がなく、５年生存率は５％以下と報告されている。胃癌細胞のこのような悪性の特性のうちで、腹膜への転移は特に複雑な現象であり、多くのステップと多くの遺伝子が関与している。胃癌の腹膜播種には、接着分子、アポトーシス関連遺伝子および他の遺伝子が深く関与しているという報告があるが、胃癌の転移のメカニズム解明には、さらなる研究が必要であるとされている。
【０００３】
胃癌腹膜播種又は腹腔内遊離癌細胞の検出のため、特異性の高い新規マーカーを同定する方法としては、被験者から生体試料を採取するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方の存在を被検者の生体試料から検出するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方が存在する場合には、胃癌由来の転移癌細胞が前記試料中に含まれている可能性が高いと判断するステップとを含む方法により、胃癌由来の転移癌細胞を検出し、これらを胃癌由来の転移癌細胞のマーカーとして使用することによって、胃癌患者の腹膜転移の有無を迅速かつ確実に検出することができ、腹腔内癌化学療法を適用すべきかの決定のための有力な材料を提供することができる方法（例えば、特許文献１）が開発されている。
【０００４】
また、新規な腫瘍マーカーを提供するものであって、既知のＩ型コラーゲンのＣ末端非３重鎖テロペプチド（ＩＣＴＰ）の変動をマーカーにすることを特徴とする、進行胃癌、特にスキルス胃癌の適切な診断マーカー（例えば、特許文献２）や、従来のＲＬＧＳ法に比較して少量のＤＮＡサンプルを用い簡便で、迅速、安価に癌患者の予後が良好か否かを診断することのできる技術を確立するものであって、癌部または非癌部組織検体より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、その割合に基づいて、肝細胞癌、神経膠芽腫、骨髄腫、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、大腸癌、肺細胞癌、腎癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌及び白血病といった癌疾患の予後が良好か否かを判断する方法（例えば、特許文献３）が知られている。
【０００５】
さらに、転移性結腸直腸癌あるいは原発性および／または転移性の胃癌または食道癌をスクリーニング・診断するための試薬、キットおよび方法や、その患者を処置するためにインビボでイメージングするための化合物や組成物、その治療や予防のための薬物、遺伝子療法薬およびアンチセンス化合物を運搬するための組成物、ワクチンおよび方法（例えば、特許文献４）や、細胞の生体エネルギー的指数を作成するため、構造タンパク質およびミトコンドリアの呼吸（それぞれ例えば、ｈｓｐ６０やチトクロームオキシダーゼのサブユニットＩおよびＩＶ）に関して、ミトコンドリアの生体エネルギー的機能のタンパク質（Ｈ＋−ＡＴＰ合成酵素のβ−触媒サブユニットなど）の発現についての研究を使用すること、そしてグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素およびピルビン酸キナーゼＭなどの細胞の解糖経路のタンパク質の発現に関連する前記ミトコンドリア生体エネルギー指数（β−ＡＴＰａｓｅ／ｈｓｐ６０比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩ比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩＶ比）を使用することからなる、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための方法（例えば、特許文献５）等が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３２１１０２号公報
【特許文献２】特開２００１−３３４６０号公報
【特許文献３】特開２００２−１１２７９９号公報
【特許文献４】特表２００３−５３２３８９号公報
【特許文献５】特表２００５−５２６９８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまでに様々な腫瘍マーカーが開発されているが、擬陽性が多く初期の癌の検出が困難であるなど改善の余地が多く残されている。本発明の課題は、高転移性胃癌をはじめとする各種癌のマーカーとなりうる遺伝子を同定し、癌の判定法及びそのためのキットや、癌抑制剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
癌細胞には、旺盛な増殖能を有するだけでなく、血液あるいはリンパ液の流れにのって遠く離れた組織に転移する転移能を有するものが存在し、このような高転移性癌は、最終的には予後不良を引き起こす要因となる。本発明者らは、高い転移能を有する癌細胞に、何らかの遺伝子の「スプライシングパターンの変化」が関与していると仮定し、ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５から、高度の腹膜転移能を持つ高転移型ヒト胃癌培養細胞株ＭＫＮ４５Ｐ１４ＧＡを作製し、転移能獲得前と獲得後の株とのｍＲＮＡ発現を、エクソンマイクロアレイを用いて網羅的に比較検討した。その結果、細胞接着に関与する遺伝子である、ＢＨＭＴ（betaine-homocysteine methyltransferase）の新規エクソンとして配列番号１及び２に示されるＤＮＡ配列を、ＥＰＳＴＩ１（epithelial stromal interaction 1, (breast)）の新規エクソンとして配列番号３に示されるＤＮＡ配列を、ＮＥＢＬ（nebulette）の新規エクソンとして配列番号４〜１２に示されるＤＮＡ配列を同定し、さらに、これらの新規エクソンＤＮＡ配列によりコードされる領域を含むスプライシングバリアントが高転移性株において特異的に強く発現することを見い出した。さらに、発明者らは、胃癌、膵癌、大腸癌、乳癌について、それぞれ十数種類の株化細胞を用いて検討を行った結果、上記ＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントが、胃癌細胞及び大腸癌細胞にも発現することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）配列番号１及び／又は２に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含むことを特徴とするＢＨＭＴ（betaine-homocysteine methyltransferase）のスプライシングバリアントや、（２）配列番号３に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含むことを特徴とするＥＰＳＴＩ１（epithelial stromal interaction 1, (breast)）のスプライシングバリアントや、（３）配列番号４〜１２に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域のうち、少なくとも１以上を含むことを特徴とするＮＥＢＬ（nebulette）のスプライシングバリアントに関する。
【００１０】
また本発明は、（４）患者から採取した生体試料における、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出することを特徴とする胃癌又は大腸癌の判定法や、（５）胃癌が、高転移性胃癌であることを特徴とする上記（４）記載の判定法や、（６）スプライシングバリアントのｍＲＮＡの発現を検出することを特徴とする上記（４）又は（５）記載の判定法や、（７）患者から採取した生体試料に含まれる、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出するための、プライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする胃癌又は大腸癌の判定用キットや、（８）胃癌が、高転移性胃癌であることを特徴とする上記（７）記載の判定用キットに関する。
【００１１】
さらに本発明は、（９）胃癌細胞又は大腸癌細胞を、被検物質の存在下で培養し、該培養細胞における、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアント発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価することを特徴とする胃癌又は大腸抑制剤のスクリーニング方法や、（１０）胃癌細胞が、高転移型ヒト胃癌細胞であることを特徴とする上記（９）記載の高転移性胃癌抑制剤のスクリーニング方法（１１）高転移型ヒト胃癌細胞が、ＭＫＮ４５Ｐ１４ＧＡであることを特徴とする上記（１０）記載のスクリーニング方法や、（１２）スプライシングバリアントのｍＲＮＡの発現量を検出することを特徴とする上記（９）〜（１１）のいずれかに記載のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により同定された、細胞接着に関与する遺伝子であるＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントは、高転移性胃癌を含む胃癌や大腸癌のマーカーとなりうるものであり、これらのスプライシングバリアントの発現を検出することにより胃癌及び大腸癌の判定が可能である。さらに、胃癌又は大腸癌細胞における上記スプライシングバリアントの発現量を指標として、胃癌又は大腸癌の抑制剤のスクリーニングを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＢＨＭＴ（betaine-homocysteine methyltransferase）の新規スプライシングパターンを示すとともに、ＰＣＲに用いたプライマー（矢印）の位置及びＰＣＲの結果を示す図である。
【図２】ＥＰＳＴＩ１（epithelial stromal interaction 1, (breast)）の新規スプライシングパターンを示すとともに、ＰＣＲに用いたプライマー（矢印）の位置及びＰＣＲの結果を示す図である。
【図３】ＮＥＢＬ（nebulette）の新規スプライシングパターンを示すとともに、ＰＣＲに用いたプライマー（矢印）の位置及びＰＣＲの結果を示す図である。
【図４】本発明のＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントの、正常胃組織及び株化胃癌細胞における発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討した結果を示す図である。図中、ＮＴＣはテンプレートのないネガティブコントロールを示す。
【図５】本発明のＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントの、正常膵臓組織及び株化膵癌細胞における発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討した結果を示す図である。
【図６】本発明のＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントの、正常大腸組織及び株化大腸癌細胞における発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討した結果を示す図である。図中、ＮＴＣはテンプレートのないネガティブコントロールを示す。
【図７】本発明のＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントの、正常乳腺組織及び株化乳癌細胞における発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討した結果を示す図である。図中、ＮＴＣはテンプレートのないネガティブコントロールを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において、スプライシングバリアントとは、ゲノムＤＮＡの一次転写産物である不均質核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）から、イントロンを切除し、エクソン配列を連結して最終的なｍＲＮＡ分子を形成するスプライシング過程において、異なるパターンのスプライシングが起こることにより産生される、特定のＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む異なるｍＲＮＡ、その逆転写物である異なるｃＤＮＡ、及びそれらの翻訳産物である異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し、スプライスバリアントとしての異なるｍＲＮＡは、異なるエクソン・イントロン配列構造、また、場合によっては、異なる転写開始位置をもつこともあり、そのため、異なるスプライシングバリアントｍＲＮＡからは、異なるｃＤＮＡが逆転写され、また、異なるアミノ酸配列を有するタンパク質が翻訳される。上記ｍＲＮＡは、上記タンパク質の製造やｍＲＮＡのアンチセンス鎖からなるスプライシングバリアント検出用プローブの作製に有用であり、上記ｃＤＮＡは上記タンパク質の製造やスプライシングバリアント検出用プライマーセットの作製に有用であり、上記タンパク質は、スプライシングバリアント検出用抗体作製用の抗原として有用である。
【００１５】
本発明のＢＨＭＴのスプライシングバリアントとしては、配列番号１及び／又は２に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含むものであれば特に制限されないが、例えば、図１に示すように、配列番号１及び２に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントＢＨＭＴ−ａや、配列番号２に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントＢＨＭＴ−ｂを具体的に例示することができる。また、本発明のＥＰＳＴＩ１のスプライシングバリアントとしては、配列番号３に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含むものであれば特に制限されないが、例えば、図２に示すように、配列番号３に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントを具体的に例示することができる。また、本発明のＮＥＢＬのスプライシングバリアントとしては、配列番号４〜１２に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域のうち、少なくとも１以上を含むものであれば特に制限されないが、例えば、図３に示すように、配列番号８〜１１に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントｓｖ３や、配列番号１１に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントｓｖ４や、配列番号５及び８〜１１に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントｓｖ５や、配列番号６及び８〜１１に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントｓｖ６や、配列番号６、８、９及び１１に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントｓｖ７や、配列番号５、８、９及び１１に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントｓｖ８や、既知の２４ｂｐのＤＮＡ配列のによりコードされる領域の下流に配列番号１０及び１１に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントｓｖ９や、配列番号１０及び１１に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントｓｖ１０や、配列番号４及び７〜１１に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントｓｖ１１や、配列番号１２、５、及び８〜１１に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントｓｖ１２や、配列番号４、５、及び８〜１１に示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む新規スプライシングバリアントｓｖ１３を具体的に例示することができる。
【００１６】
本発明の胃癌又は大腸癌の判定法としては、患者から採取した生体試料における、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出することにより胃癌又は大腸癌を判定する方法であれば特に制限されるものではないが、好ましくは、本発明のスプライシングバリアントのうち、２以上の異なる遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出することにより胃癌又は大腸癌を判定する方法、より好ましくは、本発明のスプライシングバリアントのうち、３つの異なる遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出することにより胃癌又は大腸癌を判定する方法である。より具体的には、患者の胃または大腸から採取した生体試料中における、本発明のスプライシングバリアントの発現を検討し、少なくとも１以上の発現が検出された場合に、胃癌又は大腸癌であると判定する。また、本発明の高転移性胃癌の判定法としては、胃癌患者から採取した生体試料における、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出することにより高転移性胃癌を判定する方法であれば特に制限されるものではないが、好ましくは、本発明のスプライシングバリアントのうち、２以上の異なる遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出することにより高転移性胃癌を判定する方法、より好ましくは、本発明のスプライシングバリアントのうち、３つの異なる遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出することにより高転移性胃癌を判定する方法である。より具体的には、胃癌患者から採取した血清、胃癌組織等の生体試料中における、本発明のスプライシングバリアントの発現を検討し、少なくとも１以上の発現が検出された場合に、高転移性胃癌であると判定する。ここで、高転移性胃癌とは、肝臓や腹膜やリンパ節など胃以外の他の臓器・組織に転移する悪性胃癌を意味するものである。また、上記プライシングバリアントの発現を検討する方法としては、ＲＮＡ−ＦＩＳＨ法や、ＲＴ−ＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等のスプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現を検出する方法であっても、ＥＬＩＳＡ法や、免疫染色法や、ウエスタンブロット法等のスプライシングバリアントのタンパク発現を検出する方法であってもよく、複数の検出方法を組み合わせて行うことがより好ましい。
【００１７】
本発明の胃癌又は大腸癌の判定用キットとしては、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えた胃癌又は大腸癌の判定用キットであれば特に制限されるものではないが、好ましくは、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、２以上の異なる遺伝子のスプライシングバリアントの発現を同時に検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えた判定用キット、より好ましくは、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、３つの異なる遺伝子のスプライシングバリアントの発現を同時に検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えた判定用キットである。また、本発明の高転移性胃癌の判定用キットとしては、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えた高転移性胃癌の判定用キットであれば特に制限されるものではないが、好ましくは、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、２以上の異なる遺伝子のスプライシングバリアントの発現を同時に検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えた判定用キット、より好ましくは、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、３つの異なる遺伝子のスプライシングバリアントの発現を同時に検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えた判定用キットである。
【００１８】
上記本発明のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマーセットとして、具体的には、ＢＨＭＴのスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマーセットとして配列番号１３及び１４に示される塩基配列からなるプライマーセットや、１５及び１６に示される塩基配列からなるプライマーセットを、ＥＰＳＴＩ１のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマーセットとして配列番号１７及び１８に示される塩基配列からなるプライマーセットを、ＮＥＢＬのスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマーセットとして配列番号１９及び２０に示される塩基配列からなるプライマーセットを、それぞれ好適に例示することができる。
【００１９】
上記本発明のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプローブとしては、例えば、ＢＨＭＴのスプライシングバリアントの発現を検出するためのプローブとして配列番号１又は２に示される塩基配列に相当するＲＮＡとハイブリダイズしうるアンチセンス鎖の全部又は一部からなるプローブを、ＥＰＳＴＩ１のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプローブとして配列番号３に示される塩基配列に相当するＲＮＡとハイブリダイズしうるアンチセンス鎖の全部又は一部からなるプローブを、ＮＥＢＬのスプライシングバリアントの発現を検出するためのプローブとして配列番号４〜１２のいずれかに示される塩基配列に相当するＲＮＡとハイブリダイズしうるアンチセンス鎖の全部又は一部からなるプローブを、それぞれ好例として挙げることができるが、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものが好ましく、例えば、これらのプローブは、５’側又は３’側、又はその両方に、上記ＲＮＡと一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プローブとして用いることができ、また、検出しやすいように、任意の配列を付加したものを用いることもできる。
【００２０】
上記標識物としては、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を挙げることができる。
【００２１】
本発明の胃癌又は大腸癌抑制剤のスクリーニング方法としては、胃癌細胞又は大腸癌細胞を被検物質の存在下で培養し、該培養細胞における、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価する方法であれば特に制限されないが、好ましくは、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、２以上の異なる遺伝子のスプライシングバリアントの発現量を同時に測定する工程を含むスクリーニング方法、より好ましくは、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、３つの異なる遺伝子のスプライシングバリアントの発現を同時に測定する工程を含むスクリーニング方法である。より具体的には、ヒト胃癌培養細胞株又はヒト大腸癌培養細胞株を、抗癌剤、抗癌候補物質、低分子化合物、天然有機高分子物質、天然の動植物の抽出物、ペプチドなどの被検物質の存在下で培養し、該培養細胞における、少なくとも１以上の本発明のスプライシングバリアントの発現量を測定し、スプライシングバリアントの発現量が、被検物質非存在下における場合と比べて有意に減少しているとき、被検物質は胃癌又は大腸癌抑制剤として有用である可能性があるといえる。また、上記本発明のスクリーニング方法に、高転移型ヒト胃癌細胞を用いることにより高転移性胃癌抑制剤のスクリーニングを行うことができる。上記高転移型ヒト胃癌細胞としては、高い転移能を有するヒト胃癌由来の細胞であれば特に制限されるものではないが、例えば、ヒト胃癌培養細胞株（ＭＫＮ４５）を、マウスへの移植を繰り返すことにより作製した、高度の腹膜転移能を持つヒト胃癌培養細胞株（ＭＫＮ４５Ｐ１４ＧＡ）を、好例として挙げることができる。また、上記スプライシングバリアントの発現量を測定する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法や、リアルタイムＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等のスプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現量を測定する方法であっても、ＥＬＩＳＡ法や、ウエスタンブロット法等のスプライシングバリアントのタンパク発現量を測定する方法であってもよく、複数の測定方法を組み合わせて行うことがより好ましい。
【００２２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
１．細胞培養
ヒト胃癌培養細胞株（ＭＫＮ４５）と、同細胞株からマウスへの移植を繰り返すことにより作製した、高度の腹膜転移能を持つヒト胃癌培養細胞株（ＭＫＮ４５Ｐ１４ＧＡ）とを、それぞれ５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
【００２４】
２．エクソンアレイによる解析
各培養細胞より全ＲＮＡを抽出し、Whole Transcript Sense Target Labeling and Control Reagents （Affymetrix社製）を用いてｍＲＮＡの精製、逆転写およびラベル化を行い、GeneChip Exon Array System for Human （Affymetrix社製）によるエクソンレベルでの網羅的遺伝子発現解析を行った。得られたアレイデータの解析はPartek Genomics Suite（Partek社製）を用いて行い、ＭＫＮ４５とＭＫＮ４５Ｐ１４ＧＡにおける遺伝子発
現パターンの違いを比較検討した。
【００２５】
３．スプライシングパターン解析
上記の結果から、ＭＫＮ４５とＭＫＮ４５Ｐ１４ＧＡにおいて異なるスプライシングパターンの存在が示唆された遺伝子に関して、ＲＴ−ＰＣＲを行い、シークエンスを確認した。その結果、細胞接着に関与する遺伝子である、ＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１及びＮＥＢＬの３遺伝子について、ＭＫＮ４５Ｐ１４ＧＡ（高転移能を有する細胞株）においてのみ強い発現が認めれれる新規なスプライシングバリアントの存在することが明らかとなった。上記の遺伝子のスプライシングパターンを図１〜３に示すとともに、ＢＨＭＴの新規エクソンの配列を配列番号１及び２に、ＥＰＳＴＩ１の新規エクソンの配列を配列番号３に、ＮＥＢＬの新規エクソンの配列を配列番号４〜１２にそれぞれ示す。
【００２６】
４．リアルタイムＰＣＲによる発現量の比較
ヒト胃癌培養細胞（ＭＫＮ４５）と、高転移型ヒト胃癌培養細胞（ＭＫＮ４５Ｐ１４ＧＡ）における、新規スプライシングバリアントの発現量をリアルタイムＰＣＲ法により比較した。培養したＭＫＮ４５及びＭＫＮ４５Ｐ１４ＧＡから全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。上記３で同定した新規スプライシングバリアント配列を特異的に増幅するように設計したプライマーを用い、合成したｃＤＮＡを鋳型としたリアルタイムＰＣＲを行った。ＢＨＭＴの新規バリアントＢＨＭＴ−ａを特異的に増幅するプライマーセットの塩基配列を配列番号１３及び１４に、ＢＨＭＴ−ｂを特異的に増幅するプライマーセットの塩基配列を配列番号１５及び１６に、ＥＰＳＴＩ１の新規バリアントを特異的に増幅するプライマーセットの塩基配列を配列番号１７及び１８に、ＮＥＢＬの新規バリアントを特異的に増幅するプライマーセットの塩基配列を配列番号１９及び２０に示す。図１〜３に示すように、リアルタイムＰＣＲの結果から、本研究で同定されたＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１、及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントは、高転移型胃癌細胞ＭＫＮ４５Ｐ１４ＧＡに顕著に発現していることが明らかとなった。
【実施例２】
【００２７】
（胃癌細胞における新規スプライシングバリアントの発現）
正常胃組織及び各種株化胃癌細胞におけるＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１、及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した。株化胃癌細胞としては、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ４５Ｐ１４ＧＡ、ＡＺ５２１、ＡＺ５２１ＡＳＣ、ＭＫＮ１、ＭＫＮ７４、ＫＡＴＯＩＩＩ、ＮＣＩ−ＳＮＵ−１６、ＳＮＵ−１６、ＡＧＳ、Ｈｓ７４６Ｔ、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＨＧＣ−２７を用いた。図４に結果を示すように、正常胃組織においては、ＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１、及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントのいずれも発現が認められなかった。一方、ＢＨＭＴの新規スプライシングバリアントは検討したほとんどの胃癌細胞において発現が認められ、また、ＥＰＳＴＩ１、及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントは、いくつかの胃癌細胞において発現が認められた。
【００２８】
（膵癌細胞における新規スプライシングバリアントの発現）
正常膵臓組織、株化正常膵細胞、及び、各種株化膵癌細胞におけるＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１、及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した。株化正常膵細胞としては、ＡＢＣＲＩ５１５を、株化膵癌細胞としては、ＫＰ−１Ｎ、ＫＰ−１ＮＬ、ＫＰ−３、ＫＰ−３Ｌ、ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−１、Ｃａｐａｎ−1、Ｃａｐａｎ−２、ＣＦＰＡＣ−１、ＨＰＡＦ−ＩＩ、ＫＰ−２、ＫＰ−４、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ−１細胞を用いた。図５に結果を示すように、ＢＨＭＴの新規スプライシングバリアントは、膵癌細胞だけでなく正常膵臓組織においても発現が認められた。一方、ＥＰＳＴＩ１及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントは、正常膵臓組織及び株化正常膵細胞での発現は認められなかった。しかし、膵癌細胞におけるＥＰＳＴＩ１の新規スプライシングバリアントの発現は、検討した１３種類の膵癌細胞株のうち、ＫＰ−３Ｌ及びＫＰ−２にしか認められなかった。さらに、ＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントの発現は検討したいずれの膵癌細胞においても認められなかった。
【００２９】
（大腸癌細胞における新規スプライシングバリアントの発現）
正常大腸組織及び各種株化大腸癌細胞におけるＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１、及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した。株化大腸癌細胞としては、ＬＯＶＯ、ＤＬＤ−１、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ９４８、ＳＫ−ＣＯ−１、ＨＣＣ−５６、ＬＳ１２３、ＨＴ１１５、Ｃ１７０、Ｃｏｌｏ７４１、ＳＮＵ−Ｃ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０細胞を用いた。図６に結果を示すように、正常大腸組織においては、ＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１、及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントのいずれも発現が認められなかった。一方、検討したほとんどの大腸癌細胞において、ＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１、及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントの発現が認めらた。
【００３０】
（乳癌細胞における新規スプライシングバリアントの発現）
正常乳腺組織及び各種株化乳癌細胞におけるＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１、及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した。株化膵癌細胞としては、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＨＣＣ３８、Ｔ−４７Ｄ、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＦＭ２２３，ＨＣＣ７０、ＵＡＣＣ−８１２、ＵＡＣＣ−８９３細胞を用いた。図７に結果を示すように、ＢＨＭＴの新規スプライシングバリアントは、正常乳腺組織と乳癌細胞の両方に発現が認められた。一方、ＥＰＳＴＩ１及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントは、正常乳腺組織では発現していなかった。しかし、検討した１３種類の膵癌細胞株のうち、ＥＰＳＴＩ１の新規スプライシングバリアントの発現が認められたのはＭＦＭ２２３細胞のみであり、ＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントの発現が認められたのＭＤＡ−ＭＢ−３６１、Ｈｓ５７８Ｔ、及びＭＦＭ２２３細胞のみであった。
【００３１】
実施例２の結果から、ＢＨＭＴ、ＥＰＳＴＩ１、及びＮＥＢＬの新規スプライシングバリアントは、胃癌（特に高転移性胃癌）及び大腸癌のマーカーとなりうることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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