(57)【要約】【課題】ＤＯＩ及びＤＯＩ誘導体、及びこれらの化合物からなる水溶性の抗酸化物質を提供する。【解決手段】  下記一般式（１）2009062304.tif 000017  （ここで、  Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、アルコキシ基又はチオアルキル基を示し、又はＲ１とＲ２とでケトン、環状ケタール、環状チオケタール又はオキシムを形成してもよく、  Ｘは、それぞれ独立に、Ｏ、ＮＨ又はＳを示し、  Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立に、水素、糖、水溶性合成高分子又は水溶性カルボン酸を示す。）に示す化合物及び抗酸化物質であることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
2009062304.tif 000015
（ここで、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、アルコキシ基又はチオアルキル基を示し、又はＲ１とＲ２とでケトン、環状ケタール、環状チオケタール又はオキシムを形成してもよく、
Ｘは、それぞれ独立に、Ｏ、ＮＨ又はＳを示し、
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立に、水素、糖、水溶性合成高分子又は水溶性カルボン酸を示す。）
に示す化合物であって、２−デオキシ−シロ−イノソースを除くことを特徴とする化合物。
【請求項２】
前記糖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｌ−フコース、シアル酸、Ｄ−グルクロン酸及びＤ−グルコン酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記アルコキシ基は、メトキシ基であることを特徴とする請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−２−デオキシ−シロ−イノソースであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
下記一般式（１）
【化２】
2009062304.tif 000016
（ここで、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、アルコキシ基又はチオアルキル基を示し、又はＲ１とＲ２とでケトン、環状ケタール、環状チオケタール又はオキシムを形成してもよく、
Ｘは、それぞれ独立に、Ｏ、ＮＨ又はＳを示し、
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立に、水素、糖、水溶性合成高分子又は水溶性カルボン酸を示す。）
に示す化合物からなることを特徴とする抗酸化物質。
【請求項６】
前記糖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｌ−フコース、シアル酸、Ｄ−グルクロン酸及びＤ−グルコン酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の抗酸化物質。
【請求項７】
前記アルコキシ基は、メトキシ基であることを特徴とする請求項５又は６に記載の抗酸化物質。
【請求項８】
当該抗酸化物質は、２−デオキシ−シロ−イノソースであることを特徴とする請求項５に記載の抗酸化物質。
【請求項９】
当該抗酸化物質は、４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−２−デオキシ−シロ−イノソースであることを特徴とする請求項５に記載の抗酸化物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化物質に係り、特に、２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）及びＤＯＩ誘導体化合物、並びにこれらの化合物からなる水溶性の抗酸化物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
２−デオキシ−シロ−イノソース（２−ｄｅｏｘｙ−ｓｃｙｌｌｏ−ｉｎｏｓｏｓｅ、ＤＯＩ）は、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素から合成される糖関連物質であって、この２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素遺伝子及びヘキソキナーゼ遺伝子を組み込んで大量発現させた大腸菌や酵母によって生産される有用な工業原料である。本発明者らは、グルコースを原料として、ＤＯＩを大量生産及び大スケールで精製する方法を確立している（特許文献１及び２）。一方、これまでにＤＯＩに酢酸溶媒中でヨウ化水素を作用させることにより、高収率でカテコールに変換できることが報告されている（非特許文献１）。このようなことから、ＤＯＩは、植物資源であるグルコースから、石油化学工業における重要な中間体であるカテコールを合成するための原料として、バイオマス資源の一つの候補となることが期待される。
【０００３】
また、ＤＯＩは、その構造から、グルコースの環内酸素原子を炭素原子に置き換えた５ａ−カルバ−Ｄ−グルコピラノース（カルバグルコース）へと導くことができることが期待される。カルバグルコースは、いわゆる擬似糖と言われるもので、α−グルコシダーゼ又はアミラーゼの阻害剤となることも知られている（非特許文献２及び３）。従って、カルバグルコースを使用して肥満防止剤あるいは糖尿病薬の開発へと進展させることも可能である（非特許文献４）。このようにＤＯＩは、バイオマス原料としてのみならず、医薬品原料としても重要な鍵化合物である。
【０００４】
一方、ヒトは、酸素なしでは生きられないが、その一方で酸素の存在形態によっては生体にとって毒として作用することが知られている。このような酸素の有害な状態を引き起こす分子種には、・Ｏ２−（スーパーオキシドラジカル）、・ＯＨ（ヒドロキシラジカル）、Ｈ２Ｏ２（過酸化水素）、一重項酸素（１Ｏ２）などが知られており、これらの分子種は、活性酸素と呼ばれている。近年、活性酸素やフリーラジカルによる酸化ストレスが生活習慣病などのさまざまな疾病や発癌、あるいは老化に大きく関与していることが明らかになってきた。さまざまな疾病に苦しむ現代人にとって、いろいろな種類の活性酸素及びフリーラジカルに応じた抗酸化物質が必要になってきている。
【０００５】
従来から、ポリフェノール類を中心として抗酸化機能を有する食品及び食品添加物が注目されている。ポリフェノール類は、ｐＨによっては水溶性を示すものもあるが、一般に脂溶性であり、水溶性の抗酸化物質としては、アスコルビン酸（ビタミンＣ）など少数に過ぎない。
【０００６】
脂溶性及び水溶性を問わず、抗酸化物質の大きな特徴としては、上記の活性酸素と反応して、活性酸素を消去することが挙げられるが、活性酸素、なかでもスーパーオキシドラジカルなどのラジカル種が抗酸化物質によって消去されるに伴って、ラジカル種を消去した抗酸化物質自体が酸化剤と変化してしまうことも挙げられる。酸化剤に変化した抗酸化物質は、還元状態にある種々の物質との反応性が増してしまい、系内の酸化状態を解消することが困難となる。特に、脂溶性の抗酸化物質の場合、生体内でこのような現象が起きると、脂溶性の抗酸化物質の有する生体内での蓄積性に起因して、生体内の酸化状態が持続してしまい、酸化状態の解消を目的として脂溶性の抗酸化物質を使用することは、困難であると考えられる。
【０００７】
一方、水溶性の抗酸化物質の場合、上記と同じく、活性酸素を消去して、水溶性の抗酸化物質自体も酸化剤に変化してしまうが、脂溶性の抗酸化物質とは異なり、水溶性の抗酸化物質は、脂溶性が低く、尿から排泄されやすく、体内に蓄積しにくい。また、水溶性の抗酸化物質は、酸化剤に変化した脂溶性の抗酸化物質からラジカルを奪うなどして、脂溶性の抗酸化物質の抗酸化能を再生させる役割も知られている。従って、脂溶性の抗酸化物質が十分にその機能を発揮するには、水溶性の抗酸化物質の助けが必要であると言われている。それにも関わらず、水溶性の抗酸化物質としてはビタミンＣやグルタチオンなど極めて少数の物質しか知られておらず、さらなる水溶性の抗酸化物質が求められているのが現状である。
【特許文献１】特開２００６−２６２８４６号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１０９４７９号パンフレット
【非特許文献１】Ｋ．Ｋａｋｉｎｕｍａ、Ｅ．Ｎａｎｇｏ、Ｆ．Ｋｕｄｏ、Ｙ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ及びＴ．Ｅｇｕｃｈｉ著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０００年、４１巻、ｐ．１９３５〜１９３８
【非特許文献２】Ｓ．Ｈｏｒｉｉ、Ｔ．Ｉｗａｓａ、Ｅ．Ｍｉｚｕｔａ及びＹ．Ｋａｍｅｄａ著、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．、１９７１年、２４巻、ｐ．５９−６３
【非特許文献３】Ｙ．Ｋａｍｅｄａ、Ｎ．Ａｓａｎｏ、Ｍ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ、Ｍ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ、Ｋ．Ｍａｔｓｕｉ、Ｓ．Ｈｏｒｉｉ及びＨ．Ｆｕｋａｓｅ著、１９８４年、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．、３７巻、ｐ．１３０１〜１３０７
【非特許文献４】Ｈ．Ｆｕｋａｓｅ及びＳ．Ｈｏｒｉｉ著、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、５７巻、ｐ．３６５１〜３６５８
【非特許文献５】Ｍ．Ｓ．Ｂｌｏｉｓ著、Ｎａｔｕｒｅ、１９５８年、１８１巻、ｐ．１１９９〜１２００
【非特許文献６】Ｅ．Ｆ．Ｅｌｓｔｎｅｒ及びＡ．Ｈｅｕｐｅｌ著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７６年、７０巻、ｐ．６１６〜６２０
【非特許文献７】Ｊ．Ｆ．Ｆ．Ｂｅｎｚｉｅ及びＪ．Ｊ．Ｓｔｒａｉｎ著、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９６年、２３９巻、ｐ．７０−７６
【非特許文献８】Ｂ．Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ、Ｊ．Ｍ．Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ及びＯ．Ｉ．Ａｒｕｏｍａ著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８７年、１６５巻、ｐ．２１５〜２１９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の問題に鑑みてなされたものであって、ＤＯＩ及びＤＯＩ誘導体、及びこれらの化合物からなる水溶性の抗酸化物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明による化合物は、  下記一般式（１）
【化３】
2009062304.tif 000002
（ここで、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、アルコキシ基又はチオアルキル基を示し、又はＲ１とＲ２とでケトン、環状ケタール、環状チオケタール又はオキシムを形成してもよく、
Ｘは、それぞれ独立に、Ｏ、ＮＨ又はＳを示し、
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立に、水素、糖、水溶性合成高分子又は水溶性カルボン酸を示す。）
に示す化合物であって、２−デオキシ−シロ−イノソースを除くことを特徴とする。
【００１０】
本発明による化合物において、前記糖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｌ−フコース、シアル酸、Ｄ−グルクロン酸及びＤ−グルコン酸からなる群から選択されることを特徴とする。
【００１１】
本発明による化合物において、前記アルコキシ基は、メトキシ基であることを特徴とする。
【００１２】
本発明による化合物において、４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−２−デオキシ−シロ−イノソースであることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明による抗酸化物質は、  下記一般式（１）
【化４】
2009062304.tif 000003
（ここで、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、アルコキシ基又はチオアルキル基を示し、又はＲ１とＲ２とでケトン、環状ケタール、環状チオケタール又はオキシムを形成してもよく、
Ｘは、それぞれ独立に、Ｏ、ＮＨ又はＳを示し、
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立に、水素、糖、水溶性合成高分子又は水溶性カルボン酸を示す。）
に示す化合物からなることを特徴とする。
【００１４】
本発明による抗酸化物質において、前記糖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｌ−フコース、シアル酸、Ｄ−グルクロン酸及びＤ−グルコン酸からなる群から選択されることを特徴とする。
【００１５】
本発明による抗酸化物質において、前記アルコキシ基は、メトキシ基であることを特徴とする。
【００１６】
本発明による抗酸化物質において、当該抗酸化物質は、２−デオキシ−シロ−イノソースであることを特徴とする。
【００１７】
本発明による抗酸化物質において、４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−２−デオキシ−シロ−イノソースであることを特徴とする。
【００１８】
なお、本発明において、抗酸化物質とは、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素などの活性酸素を消去する物質を総称する用語であって、この抗酸化物質としては、ラジカル消去活性を有する化合物、スーパーオキシドラジカル消去活性を有する化合物、ヒドロキシラジカル消去活性を有する化合物が挙げられる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、抗酸化活性の高い水溶性の化合物及び抗酸化物質が得られる。
【００２０】
また、熱安定性の高い水溶性の化合物及び抗酸化物質が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（本発明による化合物及び抗酸化物質）
抗酸化活性を有する一般的な物質であるアスコルビン酸を例にとると、アスコルビン酸は極めて酸化されやすいことが知られている。即ち、ある化合物が酸化されるということは相手を還元するということである。そのためにアスコルビン酸は、強力な抗酸化剤として知られている。しかしその反面、酸化されやすいということは、不安定であるということであり、利用法も限られている。グルタチオンも、通常は還元型のチオール構造をとっているが、活性酸素種と接触して相手を還元すると自身はジスルフィド結合の酸化型になる。ただし、この酸化型グルタチオンは、体内のグルタチオン還元酵素により直ちに還元型に戻る。
【００２２】
本発明者らは、ＤＯＩが極めて不安定であり、その不安定性の要因は自身が酸化されやすいことにある点に注目し鋭意研究を行った結果、ＤＯＩが強い抗酸化活性を有することを見出した。ただ、ＤＯＩは、酸性領域では安定であるためそのまま使用することもできるが、中性及びアルカリ性領域では極めて不安定である。そこで、本発明者らは、ＤＯＩに化学修飾を施すことにより、抗酸化活性を保持したまま安定性の高いＤＯＩ誘導体へと導くことに成功し、本発明を完成させた。
【００２３】
すなわち、本発明は、特に；
（１）水溶性で有り且つ抗酸化活性を有するＤＯＩ（２−ｄｅｏｘｙ−ｓｃｙｌｌｏ−ｉｎｏｓｏｓｅ）；
（２）ＤＯＩに糖を結合した、より安定性の増した水溶性の抗酸化剤である糖結合ＤＯＩ；及び
（３）ＤＯＩのカルボニル基を保護した、より安定性の増した水溶性の抗酸化剤であるカルボニル基保護ＤＯＩ；
に関する。
【００２４】
本発明による化合物及び抗酸化物質は、下記一般式（１）に示す化合物、及びこの化合物からなることを特徴とする。
【００２５】
【化５】
2009062304.tif 000004
【００２６】
一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、アルコキシ基又はチオアルキル基であってもよく、また、Ｒ１とＲ２とで、ケトン、環状ケタール、環状チオケタール又はオキシムを形成してもよい。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基などの炭素数が１〜１０程度のアルコキシ基、及び２，２，２−トリクロロエトキシ基、ベンジロキシ基、２−ニトロベンジロキシ基など、種々の置換基が結合した炭素数が１〜１０程度のアルコキシ基が挙げられる。チオアルキル基としては、チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基、チオブチル基など、炭素数が１〜１０程度のチオアルキル基、及びチオフェニル基、チオベンジル基などの種々の置換基が結合した炭素数１〜１０程度のチオアルキル基が挙げられる。Ｒ１とＲ２とで環状ケタールを形成した場合、この環状ケタールとしては、例えば、１，３−ジオキサン基、５−メチレン−１，３−ジオキサン基、５，５−ジブロモ−１，３−ジオキサン基、５−（２’−ピリジル）−１，３−ジオキサン基、５−トリメチルシリル−１，３−ジオキサン基、１，３−ジオキソラン基、４−ブロモメチル−１，３−ジオキソラン基、４−（３−ブテニル）−１，３−ジオキソラン基、４−フェニル−１，３−ジオキソラン基などが挙げられる。Ｒ１とＲ２とで環状チオケタールを形成した場合、この環状チオケタールとしては、例えば、１，３−ジチアン基、１，３−ジチオラン基、１，３−オキサチオラン基などが挙げられる。
【００２７】
また、一般式（１）において、Ｘは、それぞれ独立に、Ｏ、ＮＨ又はＳを示す。なお、環に対するＸの結合の方向は、アキシャルであっても、エカトリアルであってもよい。
【００２８】
また、一般式（１）において、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立に、水素、糖、水溶性合成高分子、水溶性カルボン酸を示す。
【００２９】
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤが糖である場合、この糖としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖が挙げられる。この単糖としては、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトースなどが挙げられる。二糖としては、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、トレハロースなどが挙げられる。オリゴ糖としては、ラフィノース、パノース、メレジトース、ゲンチアノース、スタキオースなどが挙げられる。多糖としては、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、キチン、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチン、キシログルカン、ＬＭペクチン、アルギン酸ナトリウム、ジェランガム、グアーガム、フコイダンなどが挙げられる。なかでも、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの糖は、水溶性を有する点で、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｌ−フコース、シアル酸、Ｄ−グルクロン酸及びＤ−グルコン酸であることが好ましい。一般式（１）において、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤが糖である場合のＸとの結合様式としては、糖の酸素原子と縮合して得られる結合様式であればよく、例えば、ＢがＤ−ガラクトースであり、Ｘ−ＢのＸがＯである場合、ガラクトースの１位の炭素とＸ−ＢのＸとが結合して得たグリコシド結合であってもよい。
【００３０】
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤが水溶性高分子である場合、この高分子としては、分子量が１００，０００以下で水に溶解性を示すものであれば、特に制約はなく、例えば、ポリエチレングリコールが挙げられる。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤが水溶性高分子である場合のＸとの結合様式としては、この水溶性高分子に含まれる二価以上の原子と縮合して得られる結合様式であればよく、例えば、Ｂがポリエチレングリコールであり、Ｘ−ＢのＸがＯである場合、ポリエチレングリコールの末端炭素とＸ−ＢのＸとが結合して得たエーテル結合であってもよい。特に、ポリエチレングリコールと、下記に例示するＤＯＩとで一般式（１）の化合物を得る場合には、ポリエチレングリコールの末端水酸基とＤＯＩの水酸基とが脱水して得たエーテル結合であってもよい。
【００３１】
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤが水溶性カルボン酸である場合、このカルボン酸としては、モノカルボン酸、ジカルボン酸、ピルビン酸などのオキソカルボン酸、その他の脂式カルボン酸が挙げられる。モノカルボン酸としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸などが挙げられる。ジカルボン酸としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸が挙げられる。また、その他、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、アコニット酸、グルタル酸、アジピン酸、アミノ酸、ニトロカルボン酸などが挙げられる。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤが水溶性カルボン酸である場合のＸとの結合様式としては、この水溶性高分子に含まれる二価以上の原子と縮合して得られる結合様式であればよく、例えば、Ｂがギ酸であり、Ｘ−ＢのＸがＯである場合、ギ酸のカルボキシル基とＸ−ＢのＸとが縮合して得たエステル結合であってもよい。
【００３２】
なお、一般式（１）において、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤが水素であり、ＸがＯであり、Ｒ１とＲ２とでケトンを形成した場合、下記式（１−１）に示す２−デオキシ−シロ−イノソースとなる。
【００３３】
【化６】
2009062304.tif 000005
【００３４】
また、一般式（１）において、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤが水素であり、ＸがＯであり、Ｒ１及びＲ２がメトキシ基である場合、下記式（１−２）に示す２Ｌ−（２，４／３，５）−１，１−ジ−Ｏ−メチル−１，１，２，３，４，５−シクロヘキサンヘキソール（ＤＯＩジメチルケタール）となる。
【００３５】
【化７】
2009062304.tif 000006
【００３６】
また、一般式（１）において、Ａ、Ｃ及びＤが水素であり、ＢがＤ−ガラクトースであり、ＸがＯであり、Ｄ−ガラクトースの１位の炭素とＸ−ＢのＸとが結合し、Ｒ１とＲ２とでケトンを形成した場合、下記式（１−３）に示す２Ｌ−（２，４／３，５）−４−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−２，３，４，５−シクロヘキセノンテトロール（Ｇａｌβ１−４ＤＯＩ）となる。
【００３７】
【化８】
2009062304.tif 000007
【００３８】
（本発明による抗酸化物質）
本発明による抗酸化物質は、上記の一般式（１）に示す化合物からなる物質であって、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシラジカルなどの活性酸素を消去するものである。活性酸素を消去する活性、ひいては抗酸化活性と一口に言っても、一般的なラジカルを消去する活性（ＤＰＰＨ法）、鉄の還元を指標とする方法によって得られる還元活性（ＦＲＡＰ法）、スーパーオキサイドを消去する活性（ＳＯＤ法）、ヒドロキシラジカルを消去する活性（デオキシリボース法）など、測定法により活性酸素を消去するメカニズムが異なっている。本発明による抗酸化物質においては、これらの活性を有する物質群を抗酸化物質と総称しており、一般式（１）に包含される化合物のうち、あるひとつの化合物に着目したとき、上記の４つの測定法の全てに優れた活性を有する場合もあり、その他のひとつの化合物に着目したとき、上記の測定法のうち１つの測定法にのみ優れた活性を有する場合もあり得る。いずれの場合であっても、あるひとつの化合物が抗酸化活性のうちのいずれを有するかについては、いずれの測定法において優れた活性を示すかに依存しており、測定法の原理に依存するものである。
【００３９】
なお、ＤＰＰＨ法は、黒紫色を有する１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）が、抗酸化物質によって、ＤＰＰＨ中の窒素ラジカルが消去されて、無色の物質に変化することを利用した測定法であって、下記式（ｉ）で示す機構で進行するものである。
【００４０】
【化９】
2009062304.tif 000008
【００４１】
また、ＦＲＡＰ法は、抗酸化物質の存在下で三価の鉄と２，４，６−トリピリジル−１，３，５−トリアジン（ＴＰＴＺ）との複合体（Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＴＰＴＺ複合体）が、二価の鉄とＴＰＴＺとの複合体（Ｆｅ（ＩＩ）−ＴＰＴＺ複合体；濃青色）に変化することを利用した測定法であって、下記式（ｉｉ）の通り進行するものである。
【００４２】
【化１０】
2009062304.tif 000009
【００４３】
また、ＳＯＤ法は、スーパーオキサイドと抗酸化物質とが反応して分子状の酸素（Ｏ２）に酸化される反応を利用するものであって、この酸化にカップリングさせて、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム・一ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）が還元されて生成する水溶性のＷＳＴ−１ホルマザンを検出する測定法であって、下記式（ｉｉｉ）の通り進行するものである。
【００４４】
【化１１】
2009062304.tif 000010
【００４５】
また、デオキシリボース法は、デオキシリボースが、熱処理下、ヒドロキシラジカルによって酸化分解されて生成するＭＤＡとチオバルビツール酸（ＴＢＡ）とで生成するピンク色のクロモーゲンを検出する測定法であって、抗酸化物質の存在によって、ヒドロキシラジカルが消去され、生成するクロモーゲンの量が減少することを利用したものである。
【００４６】
従って、ＤＰＰＨ法で優れた活性を有する物質については、一般的なラジカルを消去する活性を有する物質（ラジカル消去剤）であり、ＦＲＡＰ法で優れた活性を有する物質については、還元剤であり、ＳＯＤ法で優れた活性を有する物質については、スーパーオキサイドを消去する活性を有する物質（スーパーオキサイドラジカル消去剤）であり、デオキシリボース法で優れた活性を有する物質については、ヒドロキシラジカルを消去する活性を有する物質（ヒドロキシラジカル消去剤）であるともいえる。
【００４７】
＜本発明による化合物及び抗酸化物質の製造方法＞
本発明による化合物及び抗酸化物質の製造方法としては、化学的な合成方法及び生物学的な合成方法並びにこれらの方法を組み合わせた方法等、特に制約はない。なかでも、上記一般式（１）で示す化合物は、下記一般式（２）に示す物質を出発物質として、化学的及び／又は生物学的な方法で合成されてもよい。
【００４８】
【化１２】
2009062304.tif 000011
【００４９】
一般式（２）において、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３及びＯ４は、酸素原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、上記一般式（１）で定義した通りのものを示す。
【００５０】
なかでも、一般式（２）で示す好ましい化合物としては、Ｒ１とＲ２とでケトンを形成した、ＤＯＩ（上記式（１−１））、及びＲ１及びＲ２が共にメトキシ基であるＤＯＩジメチルケタール（上記式（１−２））が挙げられる。
【００５１】
本発明による化合物及び抗酸化物質の原料となり得るＤＯＩを製造する方法としては、ブチロシン生産菌バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）において見出されたＤＯＩ合成酵素を組み込んだ大腸菌を用いて大量生産する方法が確立されている。また、本発明者らは、そのようにして得られるＤＯＩを培養液から精製する方法も確立しており（特許文献１及び２）、工業的製造も可能な物質である。ところで、ＤＯＩは、６員環の多価アルコールで、環内にカルボニル基を有する化合物である。水溶液中では、カルボニル基の一部は水分子が結合した水和型の構造をとっている。即ち、ＤＯＩは、水溶液中では、ケト型と水和型の平衡混合物であり、片方の異性体のみを取り出すことはできない。従って、ここでいうＤＯＩ及びその誘導体とは、ケト型と水和型の混合物を指す。
【００５２】
【化１３】
2009062304.tif 000012
【００５３】
本発明による化合物及び抗酸化物質を製造する方法としては、上記の一般式（２）に包含される化合物を出発物質として用いる場合、反応性の異なる保護基を所望するＯ１−Ｈ、Ｏ２−Ｈ、Ｏ３−Ｈ及びＯ４−Ｈのいずれかに導入する選択的保護反応を利用する合成法であってもよい。
【００５４】
なかでも、一般式（２）に包含されるＤＯＩを出発物質として用いる場合、ＤＯＩのカルボニル基を、ジメチルケタール基などの後に水酸基へと導入する保護基と区別可能な保護基へと変換し、残った４つの水酸基を下記の環状アセタール、ケタール系保護基、環状シリルエーテル系保護基により部分保護反応を行い、若しくは位置選択的なエーテル基及びエステル基の導入反応を行い、少なくとも一つの水酸基を有するＤＯＩ誘導体へと導き、一般的な糖受容体であるトリクロロアセトイミデート体、チオグリコシド体、ハロゲン化糖、グリコシルフォスファイトなどを導入する合成法であってもよい。
【００５５】
上記の環状アセタール、ケタール系保護基としては、メチリデン基、エチリデン基、ベンジリデン基、イソプロピリデン基などが挙げられる。また、環状シリルエーテル系保護基としては、ジ−ｔ−ブチルシリレン基、ジアルキルシリレン基、１，３−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサニリデン）基などが挙げられる。
【００５６】
一方、位置選択的なエーテル基及びエステル基の導入反応としては、ビス（トリブチルスズ）オキシドやジブチルスズオキシド等を利用し、環状スズ中間体を形成する反応が挙げられる。
【００５７】
また、本発明による化合物及び抗酸化物質は、一般式（２）に包含されるＤＯＩを出発物質として用いる場合、少なくとも一つの水酸基を有するＤＯＩ誘導体の水酸基を立体反転後、この水酸基へ、トリフルオロメタンスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、メチルスルホニル基等の脱離基を導入し、１位に水酸基を有する糖を求核剤として一般式（１）のＸにＯが含まれる化合物を合成する反応によって製造されてもよい。また、１位にアミノ基又はチオール基を有する糖を反応させる方法で一般式（１）のＸにＳ又はＮＨが含まれる化合物を合成してもよい。
【００５８】
さらに、本発明による化合物及び抗酸化物質は、一般式（２）に包含されるＤＯＩを出発物質として用いる場合、少なくとも１つの水酸基を有するＤＯＩ誘導体の水酸基を酸化しカルボニル基とした後、一位にアミノ基を有する糖と還元的アミノ化反応を行い、イミノ結合を形成する方法で一般式（１）のＸにＮＨが含まれる化合物を合成してもよい。
【００５９】
一方、本発明による化合物及び抗酸化物質は、生物学的な方法で合成されてもよく、例えば、β−ガラクトシダーゼなどの酵素系の触媒とパラニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドなどの酵素系に対応する基質とを用いて合成する方法であってもよい。
【００６０】
なお、下記に示す本発明に係る実施例では、Ｄ−ガラクトースで修飾したＤＯＩの例を挙げたが、本発明では、安定性、水溶性、抗酸化活性に影響を与えない限り、Ｄ−ガラクトースの替わりに、他の糖を用いてＤＯＩを修飾してもよい。また、Ｇａｌβ１−４ＤＯＩの合成に本発明者らは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のβ−ガラクトシダーゼ及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のβ−ガラクトシダーゼを用いたが、他の由来のβ−ガラクトシダーゼを用いてもなんら差し支えない。その場合には、ＤＯＩの４位の水酸基ではなく、他の三つの水酸基のいずれかに糖が結合することもあるが、そのような糖−ＤＯＩ結合物であっても、本発明の機能に影響を与えるものではない。さらに、パラニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドとβ−ガラクトシダーゼの組み合わせではなく、パラニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドとα−ガラクトシダーゼを利用すれば、ガラクトースがα−結合したＤＯＩを合成することも可能である。同様に、グルコースを結合する場合にはどのような由来のα−グルコシダーゼあるいはβ−グルコシダーゼでも構わないし、マンノースを結合する場合には由来を問わずα−あるいはβ−マンノシダーゼを使用することができる。このように、糖供与体と酵素とを適宜組合わせることにより、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｌ−フコース、シアル酸、Ｄ−グルクロン酸、グルコン酸など、任意の糖をα−又はβ−結合で合成することが可能である。またこのような反応は、例示した加水分解酵素による転移反応である必要は無く、糖転移酵素、加リン酸分解酵素を用いても差し支えない。
【００６１】
また、本発明における糖を結合したＤＯＩの抗酸化能は、有機合成化学的合成法であってもなんら変わるものではない。
【００６２】
ＤＯＩのもう一つの安定化法として、カルボニル基の保護法として知られるジメチルケタール化したＤＯＩを化学的に合成する方法であってもよい。即ち、ＤＯＩをメタノールに溶解し、トリメトキシメタン、トシル酸一水和物を加えて室温で反応を行いジメチルケタール体を得る方法であってもよい。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明について、実施例を挙げて説明する。なお、本発明は、これにより限定されるものではない。また、実施例に使用したＤＯＩは、すべて特許文献１に従い培養及び精製したものを用いた。
【００６４】
（製造例１）
ＤＯＩへのＤ−ガラクトースの付加
下記式（２−１）に示すパラニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌβ−ｐＮＰ）４．４６ｇ（１５ミリモル）を、３５ｍＬの２０％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。
【００６５】
【化１４】
2009062304.tif 000013
【００６６】
この溶液に、１．９ｍｇ（９５Ｕ）のＡ．ｏｒｙｚａｅ由来のβ−ガラクトシダーゼ（５０Ｕ／ｍｇ）と８１８．４ｍｇ（５ミリモル）のＤＯＩとを加え、３７℃で反応を行った。反応開始後１２０分の時点で、沸騰水中で５分間加熱することにより、酵素を完全に失活させた。
【００６７】
このようにして得た反応液３５ｍＬに、酢酸エチル５０ｍＬを加え、分液ロートを用いて振とうすることにより、パラニトロフェノールを除去した。得た水層に、５倍量の水を加え、活性炭カラム（４７ｃｍ×２．５φｃｍ）にアプライし、このカラムに、水、３％エタノール、５％エタノール、１０％エタノール、１５％エタノールを順次２Ｌずつ流し、５つのフラクションを得た。これらの各フラクションについて、ＨＰＬＣ（Ａｓａｈｉ  ｐａｋ社製ＮＨ２−Ｐ５０カラム、７５％アセトニトリルによる溶出）による分析（検出波長：２１５ｎｍ）を行った。その結果、３％エタノール及び５％エタノールで溶出した溶出液に、ピークが観察された。このピークに対応する画分を収集し、濃縮した。その結果、３％エタノール溶出液からは１１３．０ｍｇ、５％エタノール溶出液からは７．６ｍｇの白色粉末をそれぞれ得た。
【００６８】
このようにして得た白色粉末を合わせてシリカゲルによる精製を行った。クロロホルム／メタノール／水の混合溶液（１０：５：１）により溶出した後、クロロホルム／メタノール／水の混合溶液（１０：７：１．５）による溶出液を計４０本（約３ｍＬ／本）分取した。フラクション１８〜２０を集めて濃縮して１５．７ｍｇの粉末を得た。この粉末を用いて行った、１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを図１に示す。その結果、このＮＭＲスペクトルから精製されたＧａｌβ１−４ＤＯＩであることが確認された。
【００６９】
（製造例２）
ＤＯＩのジメチルケタール化
ＤＯＩ（１０．０４ｇ）を、乾燥したトルエンで３回共沸して水分を除去した後、３１０ｍＬのメタノールに溶解し、１６９ｍＬのトリメトキシメタン及び１．２ｇのトシル酸一水和物を加えて撹拌した。２時間半後、炭酸水素ナトリウムにより反応液を中和し、ろ過後に減圧濃縮を行い、１４．５ｇの固形物を得た。これに２５０ｍＬのアセトニトリルを加えて加熱し、熱時ろ過を行った。得られた粗ジメチルケタール体１０．１ｇに１５ｍＬのエタノールを加えて加熱して溶解させた後、２０ｍＬのアセトンを滴下して結晶を析出させた。その結果、ジメチルケタール体５．１ｇと残渣４．７ｇ（純度９５％以上）を得た。得たジメチルケタール体（ＤＯＩジメチルケタール）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２に示す。
【００７０】
（実施例１）
抗酸化活性の測定
抗酸化活性の測定は、アスコルビン酸あるいはカテキンをポジティブコントロールとして、下記の４種類の方法で行った。
【００７１】
ＤＰＰＨラジカル消去法（ＤＰＰＨ法、非特許文献５）
ＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）活性測定法（ＳＯＤ法、非特許文献６）
ＦＲＡＰ（Ｆｅｒｒｉｃ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ）法（非特許文献７）
デオキシリボース法（非特許文献８）
【００７２】
具体的には、ＳＯＤ法以外については、下記の通り、引用した文献の方法を一部修正して行った。また、ＳＯＤ法については、ＳＯＤ測定キット−ＷＳＴ（同仁化学社製）を用いて測定した。結果を表１に示す。
【００７３】
［ＤＰＰＨ法］
測定対象の各化合物をエタノールに溶解して、終濃度が１、５、１０及び２０ｍＭとなるように調製したサンプルと、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ；ＤＰＰＨ）のＴｒｉｓ緩衝液（終濃度５０ｍＭ）とを混合し、室温・暗所で３０分間放置した。放置後、５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。得た吸光度から、下記式に従って、消去率を算出した。
【００７４】
ラジカル消去率（％）＝｛１−（サンプルの吸光度）／（ブランクの吸光度）｝×１００
【００７５】
縦軸にこの消去率を、横軸に測定対象のサンプルの濃度（ｍＭ）をプロットし、近似曲線から求めた直線の一次式の縦軸に５０（％）を代入したときの横軸の値から、ＩＣ５０値（ｍＭ）を算出した。
【００７６】
［ＦＲＡＰ法］
測定対象の各化合物を、１．６ｍＭのＦｅＣｌ３、０．８ｍＭのＴＰＴＺ（２，４，６−ｔｒｉｐｙｒｉｄｙｌ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎｅ）（和光純薬社製）、及び２８３ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）に溶解して、各化合物の終濃度が１、５、１０及び２０ｍＭとなるようにサンプルを調製した。このサンプルを、３７℃で４分間放置した後、得たサンプルの５９３ｎｍの波長における吸光度を測定した。結果は、アスコルビン酸の希釈系列（２、１０、２０及び１００μＭ）を用いて同様に測定して得られる吸光度から線形の回帰直線を作成し、アスコルビン酸の相当量（μＭ）として、算出した。
【００７７】
［デオキシリボース法］
測定対象の各化合物を、５０ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解して、各化合物の終濃度が１、５、１０及び２０ｍＭとなるようにサンプルを調製した。このサンプルを、３７℃で１時間放置し、ＴＢＡ１ｍＬとトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）１ｍＬとを加えて９５℃で２０分間加熱した後、得たサンプルの５３２ｎｍの波長における吸光度を測定した。結果は、測定対象の各化合物を含まないサンプルで得た５３２ｎｍの波長における吸光度（コントロール値）との差異を、コントロール値に対する百分率で表し、縦軸にこの百分率を、横軸に測定対象のサンプルの濃度（ｍＭ）をプロットし、上記の［ＤＰＰＨ法］と同様に、ＩＣ５０値（ｍＭ）を算出した。
【００７８】
【表１】
2009062304.tif 000014
【００７９】
なお、表１中、ａは、測定できなかったことを示し、ｂは、測定しなかったことを示す。
【００８０】
ＤＯＩは、ＤＰＰＨ法及びＳＯＤ法においては、アスコルビン酸と比較するとかなり低い抗酸化活性しか示さなかったが、ＦＲＡＰ法ではアスコルビン酸に匹敵する抗酸化活性を示した。しかしながら、デオキシリボース法では活性測定の途中で１００℃に加熱する操作があるためにＤＯＩが分解してしまい活性を示さなかった。
【００８１】
そこで、本発明者らはβ−ガラクトシダーゼを利用した転移反応によりガラクトースを結合したＧａｌβ１−４ＤＯＩを合成した。用いたβ−ガラクトシダーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来の酵素及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来の酵素であったが、同じ生成物を与えた。得られたＧａｌ結合ＤＯＩの構造解析を行った結果、ＤＯＩの４位水酸基にガラクトースが結合したＧａｌβ１−４ＤＯＩであることが判明した。このＧａｌβ１−４ＤＯＩの抗酸化活性を測定したところ、ＤＰＰＨ法では、ＤＯＩと同程度でアスコルビン酸より大きく下まわったが、ＳＯＤ法ではアスコルビン酸と同程度、デオキシリボース法ではポジティブコントロールのカテキンと同程度の高い抗酸化活性を示した。
【００８２】
本発明の化学修飾ＤＯＩでは、化学修飾によりＤＯＩが安定化するにも関わらず、抗酸化活性の減少は見られず、逆に元のＤＯＩよりも活性が高くなるという現象も見られた。これはＤＯＩが活性測定の反応中に徐々に分解してしまい、その全量が活性を発揮するに至らなかったのに対し、化学修飾ＤＯＩでは測定中の分解が起こらなかったために高い活性を示したものと考えられる。
【００８３】
Ｇａｌβ１−４ＤＯＩ及びジメチルケタール化ＤＯＩ（ＤＯＩジメチルケタール）では、ＳＯＤ法及びデオキシリボース法で活性が高かったが、活性酸素種であるスーパーオキサイドラジカルは体内で発生するためにそれを抑える水溶性の抗酸化剤は貴重である。また、デオキシリボース法はヒドロキシラジカルを抑える活性を見る方法であるが、ヒドロキシラジカルは極めて反応性の高いラジカルであるため、この活性が高いということは極めて重要である。
【００８４】
（実施例２）
熱安定性の測定
ＤＯＩ、及び製造例１で得たＧａｌβ１−４ＤＯＩを、それぞれ２ｍｇ／ｍＬとなるように、重水に溶解してＮＭＲサンプルチューブに入れ、７０℃のオイルバスに浸漬して加熱した。ＤＯＩについては、この加熱を３時間行い、Ｇａｌβ１−４ＤＯＩについては、この加熱を５時間行った。加熱前及び加熱後のＤＯＩ及びＧａｌβ１−４ＤＯＩの各サンプルについて、１Ｈ−ＮＭＲ（周波数２５０ＭＨｚ）スペクトルの測定を行った。結果を、図３及び図４にそれぞれ示す。
【００８５】
ＤＯＩの熱安定性については、図３に示すように、ＤＯＩのメチレン基の水素原子に由来する２〜３ｐｐｍ付近のピーク、及び水酸基の結合した炭素に結合する水素原子に由来する３〜４ｐｐｍ付近のピークが、加熱によって顕著に低下した。また、加熱前にはほとんどみられなかった７ｐｐｍ付近のピークが顕著に増加した。ＤＯＩは、中性溶液において３７℃においては８時間で分解し、あるいは７０℃に加熱すると３時間以内に完全に分解した。これらの結果は、ＤＯＩが熱によって分解し、１，２，４−ヒドロキシベンゼンなどの化合物が得られたことを示すものであって、ＤＯＩの熱安定性が低いことを示すものである。
【００８６】
また、Ｇａｌβ１−４ＤＯＩの熱安定性については、中性溶液中で７０℃で５時間加熱しても顕著な分解生成物は見られず着色も殆どみられなかった。Ｇａｌβ１−４ＤＯＩの熱安定性が高いことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】製造例１で得た１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】製造例２で得た１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】実施例２に従って、サンプルとしてＤＯＩを用いて得た１Ｈ−ＮＭＲスペクトルであって、上段は、加熱前に対応し、下段は、加熱後に対応する。
【図４】実施例２に従って、サンプルとしてＧａｌβ１−４ＤＯＩを用いて得た１Ｈ−ＮＭＲスペクトルであって、上段は、加熱前に対応し、下段は、加熱後に対応する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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