(57)【要約】【課題】細胞電気生理センサの測定精度を向上させることを目的とする。【解決手段】そしてこの目的を達成するため本発明は、導通孔２２を有する細胞保持板１３を備え、この細胞保持板１３の上面または下面の少なくともいずれか一方において、導通孔２２の外周には溝２４が形成されているものとした。これにより本発明は、溝２４にもダストを分散することができ、結果として細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
導通孔を有する細胞保持板を備え、
この細胞保持板の上面または下面の少なくともいずれか一方において、前記導通孔の外周には溝が形成されている細胞電気生理センサ用センサチップ。
【請求項２】
前記細胞保持板は、シリコン層と二酸化シリコン層との積層体であって、
この二酸化シリコン層は前記細胞保持板の細胞捕捉面となり、
前記溝は前記シリコン層側に形成されている請求項１に記載の細胞電気生理センサ用センサチップ。
【請求項３】
前記細胞保持板の表面には凹部が形成され、
前記導通孔は、前記凹部の最深部から形成されるとともに、
前記溝は、前記細胞保持板の前記凹部形成面と同一面において、この凹部の外周に設けられた請求項１または２に記載の細胞電気生理センサ用センサチップ。
【請求項４】
前記細胞保持板は、シリコン層と二酸化シリコン層との積層体であって、
前記シリコン層の表面には凹部が形成され、
前記導通孔は、前記凹部の最深部から形成されるとともに、
前記溝は、前記シリコン層表面において、前記凹部の外周に設けられた請求項１または２に記載の細胞電気生理センサ用センサチップ。
【請求項５】
前記溝は、
垂直断面が逆テーパ形状である請求項１から４のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ用センサチップ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ用センサチップと、
このセンサチップの前記細胞保持板で仕切られた二つの電解槽と、
これらの電解槽に注入される液体とそれぞれ電気的に接続される電極とを備えた細胞電気生理センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞電気生理センサ用センサチップとこれを用いた細胞電気生理センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
図１０に示すように従来の細胞電気生理センサは、センサチップ１と、このセンサチップ１側面を支持する保持プレート２と、この保持プレート２およびセンサチップ１の上方及び下方にそれぞれ配置された電解槽３、４と、これらの電解槽３、４内にそれぞれ配置された電極５、６とを備え、センサチップ１は導通孔７を有する細胞保持板８を有している。
【０００３】
この細胞電気生理センサは、上方の電解槽３に細胞９と電解液とを注入し、また下方の電解槽４に電解液を充填し、その後この下方の電解槽４内の電解液を吸引等することにより、導通孔７の開口部に細胞９を捕捉することができる。そして電極５、６間の電位差を計測することによって、細胞９が活動する際の細胞９の内外における電位変化、あるいは細胞９の活動によって発生する物理化学的変化を測定することができる。
【０００４】
ここで上記のセンサチップ１は、ドライエッチング等で導通孔７が形成され、次にアルコールや水などの液体で洗浄され、その後乾燥工程を経て保持プレート２に実装されている。
【０００５】
なお、上記細胞電気生理センサと類似する例を開示するものとして下記の特許文献が挙げられる。
【特許文献１】特開２００７−０１０４３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の細胞電気生理センサ用センサチップ１では、細胞電気生理センサの測定精度が低いという課題があった。
【０００７】
その理由は、導通孔７内にダスト１０が溜まるからである。
【０００８】
すなわち、微細な導通孔７内は乾燥に時間がかかる。したがってセンサチップ１を洗浄した後の乾燥工程においては、センサチップ１表面の液滴が乾燥するにつれて、この液滴に混じっていたダスト１０は導通孔７内に残った液滴へと移動し、導通孔７内にダスト１０が集中した状態で乾燥してしまう。
【０００９】
このように導通孔７内にダスト１０が溜まっていると、細胞９の吸引が阻害され、あるいは導通孔７上下間で電気的導通が図りにくくなり、結果として、細胞電気生理センサの測定精度が低下するのであった。
【００１０】
そこで本発明は、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そしてこの目的を達成するため本発明の細胞電気生理センサ用センサチップは、導通孔を有する細胞保持板を備え、この細胞保持板の上面または下面の少なくともいずれか一方において、導通孔の外周には溝が形成されているものとした。
【発明の効果】
【００１２】
これにより本発明は、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００１３】
その理由は、導通孔内に溜まるダストを低減できるからである。
【００１４】
すなわち本発明は、センサチップ洗浄後の乾燥工程において、導通孔だけでなく、この導通孔外周の溝にも液滴が残り、この液滴内にダストが移動する。したがって、ダストを溝へと分散することができ、結果として細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（実施の形態１）
図１の断面図に示すように本発明の一実施の形態における細胞電気生理センサは、センサチップ１１と、このセンサチップ１１の側面外周を支持する保持プレート１２と、この保持プレート１２およびセンサチップ１１の上方および下方に配置され、後述の細胞保持板１３で仕切られた二つの電解槽１４、１５と、それぞれの電解槽１４、１５内に配置された電極１６、１７とを備えている。
【００１６】
そして図２および図３（ｂ）に示すように、センサチップ１１はいわゆるＳＯＩ基板で形成され、シリコン層１８と、このシリコン層１８上に形成された二酸化シリコン層１９とからなる細胞保持板１３と、この細胞保持板１３の二酸化シリコン層１９上に形成されたシリコン層からなる枠体２０とを有している。なお、センサチップ１１の材料としてはＳＯＩ基板の他にシリコン基板でもよく、さらにはガラス基板、樹脂基板等でもよい。
【００１７】
また図２および図３（ａ）に示すように、細胞保持板１３は円板状であり、図２および図３（ｂ）に示すように、枠体２０は円筒状をしている。このようにセンサチップ１１の断面が円形の場合、方向性が無くなるため、保持プレート１２に挿入しやすくなる。
【００１８】
そして本実施の形態では、シリコン層１８の膜厚は約１５μｍ、二酸化シリコン層１９は約２μｍ、枠体２０となるシリコン層が約４００μｍとした。
【００１９】
なお、本実施の形態では、二酸化シリコン層１９の膜厚を約２μｍとすることにより、二酸化シリコン層１９の厚み方向における静電容量が１０ｐＦ以下となり、後述のリーク電流低減に大きく寄与する。
【００２０】
ここで静電容量を小さくするため、二酸化シリコン層１９の膜厚を大きくする必要がある場合も、本実施の形態のようにＳＯＩ基板を用いると、容易に膜厚を１μｍ以上とすることができる。
【００２１】
また本実施の形態では、図３（ｂ）に示すように、細胞保持板１３のシリコン層１８には直径約２０μｍの半球形状の凹部２１が形成されており、この凹部２１の最深部からシリコン層１８と二酸化シリコン層１９との積層体を上下方向に貫く導通孔２２が形成されている。
【００２２】
そして導通孔２２の深さは約７μｍである。ここで直径１０μｍから２０μｍの細胞（図１に示す２３）を捕捉する場合、導通孔２２は、直径が１μｍ〜５μｍ、深さが１μｍ〜１０μｍ程度が好ましい。したがってシリコン層１８の厚みが大きく、導通孔２２のアスペクト比が大きくなる場合は本実施の形態のように、凹部２１を設けて調整すればよい。
【００２３】
なお、本実施の形態では、細胞保持板１３（シリコン層１８、二酸化シリコン層１９）の直径と枠体２０の外径はそれぞれ約７００μｍとした。
【００２４】
そして本実施の形態では、細胞保持板１３のシリコン層１８表面、すなわち凹部２１形成面において、凹部２１および導通孔２２の外周を複数の溝２４が囲っている。
【００２５】
なお、溝２４は導通孔２２近傍に配置することが好ましいが、極端に近すぎると、逆にダストが気泡の核となり、導通孔２２近傍に気泡を発生させる場合がある。また溝２４を細胞保持板１３の細胞保持面に形成する場合は、溝２４周辺に集まったダストによって細胞２３と導通孔２２との密着性が阻害されることがある。
【００２６】
したがって本実施の形態では、溝２４は、少なくとも凹部２１の外周から被検体となる細胞２３の直径より長く距離を開けて配置した。
【００２７】
なお、同様の理由により、凹部２１を形成しない場合、溝２４は、導通孔２２の外周から被検体となる細胞２３の直径より長く距離を開けて配置することが好ましい。
【００２８】
なお本実施の形態では、溝２４は直径約５μｍ、深さ約３μｍ程度の円柱形であり、細胞保持板１３を貫通していないものとした。
【００２９】
次に本実施の形態における細胞電気生理センサを用いて細胞２３の電気生理活動を測定する方法について述べる。
【００３０】
まず図１に示す上方の電解槽１４内に細胞外液、下方の電解槽１５内に細胞内液を充填し、細胞外液、細胞内液にそれぞれ電極１６、１７を接触させる。
【００３１】
ここで細胞内液とはたとえば哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ+イオンが１５５mＭ、Ｎａ+イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液であり、細胞外液とはＫ+イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ+イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液である。
【００３２】
この状態において電極１６、１７の間で１００ｋΩ〜１０MΩ程度の導通抵抗値を測定することができる。これは細胞外液あるいは細胞内液が導通孔２２に浸透し、２つの電極１６、１７が細胞外液と細胞内液とを介して導通するからである。
【００３３】
次に上方の電解槽１４の上側から細胞２３を投入し、下方の電解槽１５を減圧すると、細胞２３は導通孔２２に引き付けられ、導通孔２２の開口部を塞ぐ。
【００３４】
その後下方の電解槽１５をさらに減圧するか、あるいは下方の電解槽１５側にナイスタチンなどの抗生物質を投与することにより、導通孔２２開口部を塞いでいる部分の細胞膜に孔が開く（ホールセル）。これにより、導通孔２２の上下間では、細胞２３を介してのみ電気的導通が図れる。また細胞２３が導通孔２２開口部に密着保持されていることから、上下の電解槽１４、１５間の電気抵抗は十分に高い１ＧΩ以上の状態となる（ギガシール）。
【００３５】
そして上記のようなギガシール状態を形成した後、細胞２３に物理化学的刺激を印加する。この時この物理化学的刺激に細胞２３が反応し、電気生理活動を行った場合、その活動を電位変化（電流値変化あるいは抵抗値変化等でもよい）として電極１６、１７により検出することができる。
【００３６】
以下に本実施の形態の細胞電気生理センサの製造方法を説明する。
【００３７】
はじめに、センサチップ１１を製造するため、図４に示すような、シリコン層１８、２０Ａの間に二酸化シリコン層１９を挟んだいわゆるＳＯＩ基板を準備する。ＳＯＩ基板は、ＳＩＭＯＸ(Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｙ ＩＭｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＯＸｙｇｅｎ)方式あるいは張り合わせなどによって、予め膜厚１．０μｍ以上の厚い二酸化シリコン層１９が形成されているものを用いた。
【００３８】
次に、細胞保持板（図１の１３）となるシリコン層１８表面を、パターニングされたレジストマスク２５で覆い、ドライエッチングによってシリコン層１８表面に図１に示すような凹部２１を形成し、この凹部２１の最深部からシリコン層１８を貫通し、二酸化シリコン層１９に到達するまで導通孔２２を形成する。
【００３９】
なお、上述の凹部２１を形成する工程では、エッチングガスとして、ＳＦ6やＸｅＦ2、またはこれらの混合ガスなどを用いた。これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけでなく、水平方向へのエッチングも促進する作用があるため、シリコン層１８を半球形状の碗型にエッチングすることができる。
【００４０】
また上述の導通孔２２を形成する工程では、ＩＣＰプラズマを用い、シリコンのエッチングを促進するガス（以下促進ガスという）と抑制するガス（以下抑制ガスという）を交互に導入した。
【００４１】
ここで抑制ガスとしては例えばＣ4Ｆ8が挙げられる。これにより、促進するガス導入時にはシリコン層１８をエッチングし、抑制ガスの導入時にはエッチングした内壁に保護膜を形成することから、これらのエッチングガスの組み合わせを最適化することによって、エッチングは直線的に進行し、凹部２１の最深部から導通孔２２をほぼ垂直な形状にエッチング加工することができる。
【００４２】
なお、シリコン層１８と二酸化シリコン層１９とはエッチングレートが異なることから、二酸化シリコン層１９はシリコン層１８のエッチング工程において、エッチングストップ層として機能し、所望深さの導通孔２２を高精度に形成することができる。
【００４３】
そしてその後、二酸化シリコンを選択的にエッチングするＣＦ4とＡｒとの混合ガスなどを噴き付け、二酸化シリコン層１９を貫通して導通孔２２を形成する。
【００４４】
次にシリコン層１８上のレジストマスク（図４の２５）を除去し、新たにマスキングをし、シリコン層１８表面をドライエッチングして溝２４を形成する。
【００４５】
このときのドライエッチング工程は、本実施の形態では、前述の導通孔２２形成時のドライエッチング工程と同様に、ＩＣＰプラズマを用い、エッチングを促進するガスと抑制するガスとを交互に導入して形成した。
【００４６】
この時、溝２４が細胞保持板１３を貫通しないよう、エッチングのし過ぎに注意する。溝２４が貫通していると、細胞を吸引する際、溝２４にも細胞が捕捉されてしまい、導通孔２２開口部に効率よく細胞を捕捉できないからである。
【００４７】
なお、溝２４を半球形状に形成する場合は、前述の凹部２１形成時のドライエッチング工程と同様に、エッチングを促進するガスを用いればよい。
【００４８】
次に、枠体２０となるシリコン層（図４の２０Ａ）表面をマスキングし、シリコン層２０Ａ表面からエッチングを促進するガス（促進ガス）と抑制するガス（抑制ガス）とを交互に導入してシリコン層２０Ａをエッチングすると、細胞保持板１３と枠体２０とからなるセンサチップ（図１の１１）を形成することができる。
【００４９】
その後、このセンサチップ１１をＩＰＡ（イソプロプルアルコール）等の洗浄液に含浸させ、６０℃〜８０℃程度に加熱しながら洗浄し、さらにこのセンサチップ１１を室温の純水で洗い流す。
【００５０】
次に、このセンサチップ１１を乾燥させる。この時の乾燥工程は、室温条件下での自然乾燥でもよく、あるいは炉内に入れ、加熱して乾燥させてもよい。
【００５１】
そしてその後、保持プレート１２に貫通孔を形成し、この貫通孔内にセンサチップ１１を挿入し、保持プレート１２の貫通孔内壁とセンサチップ１１外側面とを接着する。
【００５２】
この時の接着方法としては、保持プレート１２が樹脂の場合はＵＶ硬化性接着剤等によって接合することができる。また保持プレート１２がガラスの場合はガラス溶着、あるいはＵＶ硬化性接着剤等によって接合することができる。
【００５３】
本実施の形態における効果を以下に説明する。
【００５４】
本実施の形態の細胞電気生理センサ用センサチップ１１は、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００５５】
その理由は、導通孔２２内に溜まるダストを低減できるからである。
【００５６】
すなわち洗浄工程において、アルコールや水などの液体（洗浄液）には、ドライエッチング工程で用いたレジストマスク（図４の２５）のカスやシリコン層（図４の１８、２０Ａ）の自然酸化皮膜のカスなどがダストとして混じっている。そして乾燥工程においては、センサチップ１１表面の液滴が乾燥するにつれて、この液滴に混じっていたダストは導通孔２２内に残った液体へと引き寄せられ、導通孔２２内にダストが集中した状態で乾燥してしまうことがあった。
【００５７】
このように導通孔２２内にダストが溜まっていると、細胞の吸引が阻害され、あるいは導通孔２２上下間で電気的導通が図りにくくなり、結果として細胞電気生理センサの測定精度が低下するのであった。
【００５８】
これに対し本実施の形態では、図５に示すように、センサチップ１１洗浄後の乾燥工程において、導通孔２２だけでなく、その外周に形成された溝２４内も乾燥が進みにくく、液滴（洗浄液）が残りやすい。したがって、この液滴内にダストが引き寄せられ、溝２４へとダストを分散することができ、導通孔２２内に溜まるダストを低減することができる。そしてその結果、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００５９】
なお、本実施の形態では、図５に示すように、枠体２０を下にしてセンサチップ１１を乾燥させている。その理由は、枠体２０内に液滴が溜まるのを防ぐ為である。ここでこのような向きで乾燥すると、二酸化シリコン層１９よりもシリコン層１８上に液滴が溜まりやすい。したがって本実施の形態では、シリコン層１８上に溝２４を形成することにより、ダストが導通孔２２に集積するのを効率よく抑制することができる。
【００６０】
また本実施の形態では、図１に示すように、細胞保持板１３の下面に半球形の凹部２１を形成することにより、下方の電解槽１５から導通孔２２にかけての流路幅の変化を緩やかにしている。したがって、電解槽１５と導通孔２２間における流体抵抗が小さくなり、液体（細胞内液等）の流動性が向上する。特に、上述の抗生物質を用いた細胞膜に穴を開ける工程（ホールセル）において、薬液が導通孔２２へまわり込み易くなり、細胞２３に迅速に穴を形成することができる。
【００６１】
そしてこのように凹部２１を形成した場合、洗浄後の乾燥工程においては、凹部２１に液体（洗浄液）が溜まりやすい。したがって、本実施の形態のように、凹部２１形成面に溝２４を設け、ダストを分散させることは細胞電気生理センサの測定精度向上に寄与する。
【００６２】
また本実施の形態では、図１に示すように、細胞保持板１３はＳＯＩ基板を用いており、細胞保持面は絶縁体である二酸化シリコン層１９で構成している。したがって、センサチップ１１の上下間におけるリーク電流を低減することができ、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００６３】
なお、リーク電流増大の原因となる浮遊容量は、二酸化シリコン層１９の膜厚に反比例することから、この二酸化シリコン層１９の膜厚を大きくすることによって浮遊容量を抑え、リーク電流をさらに低減することができる。
【００６４】
したがって本実施の形態では、溝２４は二酸化シリコン層１９には形成せず、シリコン層１８側に形成したことにより、二酸化シリコン層１９の膜厚が小さくなるのを回避し、細胞電気生理センサの測定精度を高く維持している。
【００６５】
なお上記実施の形態では、細胞保持板１３の下面（底面）側に溝２４を形成したが、図６に示すように細胞保持面（上面）側に溝２４を形成してもよい。
【００６６】
このように細胞保持面に溝２４を形成することにより、細胞保持面側において、導通孔２２開口部近傍に溜まるダストを低減することができ、細胞２３と導通孔２２開口部との密着性が向上し、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００６７】
さらに細胞捕捉面に凹部２１（図６には図示せず）を形成する場合は、細胞保持面側において、凹部２１内に溜まるダストも低減することができ、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。また溝２４は細胞保持面及び下面両方に形成してもよい。
【００６８】
また本実施の形態では、図３（ａ）に示すように、溝２４は導通孔２２外周を囲むように、所定間隔をあけて点々と配置したが、図７に示すように、輪形の溝となっていてもよく、さらには直線状の溝でもよい。
【００６９】
また溝２４の一部が凹部２１と繋がっていてもよい。この場合、溝２４に斜面を設け、溝２４の外端ほど深く、導通孔２２近傍ほど浅くすれば、ダストは溶媒とともに溝２４の外端に集中し、導通孔２２に溜まるダストを低減することができる。
【００７０】
また本実施の形態では、一枚の細胞保持板１３に対し一つの導通孔２２を形成しているが、導通孔２２は複数個形成してもよい。この場合、溝２４は個々の導通孔２２の外周にそれぞれ形成してもよく、あるいは導通孔２２を所定数毎に区分けし、その一まとめになった導通孔２２の外周に形成してもよい。また溝２４を升目状に形成し、升目の内部に一または所定数の導通孔２２を配置してもよい。
【００７１】
（実施の形態２）
本実施の形態２と実施の形態１との違いは、図８に示すように、溝２４の垂直断面を逆テーパ形状とした点である。すなわち本実施の形態では、図９に示すように、溝２４の内壁と、この溝２４が形成された細胞保持板１３の表面との成す角θが鋭角（９０度未満）となる。
【００７２】
これにより本実施の形態では、溝２４内部に入った液滴の、外気に露出する面積が小さくなり、溝２４内部の液滴が乾燥しにくくなる。したがって、より溝２４へとダストを分散させることができ、結果として細胞電気生理センサの測定精度を向上させることが出来る。
【００７３】
なお、溝２４と細胞保持板１３表面とのなす角θは、上記の理由により鋭角としたが、尚且つ８０度以上とすることが好ましい。角θが小さすぎると、液滴が溝２４内部へとまわり込みにくくなるからである。
【００７４】
すなわち本実施の形態では、図９の角θを８０度以上９０度未満とすることにより、溝２４内への液滴のまわり込みやすさを維持し、かつ溝２４内の液滴の乾燥を抑制できる。
【００７５】
またこの溝２４は、導通孔２２と同様に、ＩＣＰプラズマを用いたドライエッチング加工によって容易に形成することができる。溝２５のテーパ角度は、電圧や圧力、エッチングを促進するガスと、抑制するガスのガス容量や導入時間の比率、それぞれの組成等を変えることにより、適宜調整できる。例えば本実施の形態では、抑制ガスＣＦ4を８５ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｃ／ｍｉｎ（ｓｃｃｍ）、圧力２０ｍＴｏｒｒ、時間７秒の条件下で導入し、また促進ガスＳＦ6を１４０ｓｃｃｍ、アシストガスＯ2１０ｓｃｃｍ、圧力３０ｍＴｏｒｒ、時間１３秒条件下で導入し、エッチングを行った。
【００７６】
なお、溝２４はレーザ加工やその他切削等機械的な加工などでも形成することができるが、本実施の形態ではドライエッチング加工により形成したため、複数個の溝２４を一度に形成することができ、生産性に優れる。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の細胞電気生理センサは、細胞電気生理測定を高精度に行うことにおいて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図
【図２】本発明の実施の形態１におけるセンサチップの斜視図
【図３】（ａ）同センサチップの上面図、（ｂ）同センサチップの断面図（図３（ａ）のＸＸ断面）
【図４】同センサチップの製造工程を示す断面図
【図５】同センサチップの乾燥工程を示す断面図
【図６】本発明の実施の形態１における別の例のセンサチップの断面図
【図７】（ａ）本発明の実施の形態１における別の例のセンサチップの上面図、（ｂ）同センサチップの断面図（図６（ａ）のＸＸ断面）
【図８】本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサの断面図
【図９】同細胞電気生理センサの要部拡大断面図
【図１０】従来の細胞電気生理センサの断面図
【符号の説明】
【００７９】
１１  センサチップ
１２  保持プレート
１３  細胞保持板
１４  電解槽
１５  電解槽
１６  電極
１７  電極
１８  シリコン層
１９  二酸化シリコン層
２０  枠体
２０Ａ  シリコン層
２１  凹部
２２  導通孔
２３  細胞
２４  溝
２５  レジストマスク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2009198180.tif 000007
【図６】
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【図７】
2009198180.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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