(57)【要約】      （修正有）【課題】先行技術の不利点が少なくとも部分的に解消された、検体測定のための酵素電気化学センサの提供。とりわけ、該センサは、酵素の特異的および恒久的な固定を保証して高い効率性を有し、よって高い信号生成を達成することができ、且つ簡単に低コストで製造可能にする。【解決手段】流体媒体中の検体を測定するための電気化学センサであって、少なくとも１つの作用電極および少なくとも１つの参照電極を備え、少なくとも前記作用電極が電極マトリクス内に電極触媒の粒子を含み、検体の測定に適した酵素が前記電極触媒の粒子に共有結合する電気化学センサを使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体媒体中の検体を測定するための電気化学センサであって、
少なくとも１つの作用電極および少なくとも１つの参照電極を備え、少なくとも前記作用電極が電極マトリクス内に電極触媒の粒子を含み、
検体の測定に適した酵素が前記電極触媒の粒子に選択的に共有結合することを特徴とする電気化学センサ。
【請求項２】
前記電極触媒が金属酸化物であり、特にＭｎＯ2、ＦｅＯＯＨ、Ｆｅ3Ｏ4、Ｃｒ2Ｏ3、およびＶ2Ｏ5からなる群の金属酸化物から選択されることを特徴とする請求項１記載の電気化学センサ。
【請求項３】
前記電極触媒がＭｎＯ2であることを特徴とする請求項１または２記載の電気化学センサ。
【請求項４】
９０％の電極触媒粒子が０．１μｍから２０μｍ、特に０．５μｍから５μｍの径を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項５】
前記電極触媒粒子が約０．０１Ｕ／ｍｇから約１０Ｕ／ｍｇ、特に約０．１Ｕ／ｍｇから約１０Ｕ／ｍｇの酵素活性を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項６】
前記電極触媒粒子が、酵素が結合される官能化表面を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項７】
前記電極触媒粒子の前記表面が、アミノ基および／またはカルボキシ基で官能化されることを特徴とする請求項６記載の電気化学センサ。
【請求項８】
前記電極触媒粒子の前記表面がアミノシラン、特に３−アミノプロピルトリエトキシシランで官能化されることを特徴とする請求項６または７記載の電気化学センサ。
【請求項９】
前記電極触媒粒子の前記表面がカルボキシシラン、特に３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物で官能化されることを特徴とする請求項６または７記載の電気化学センサ。
【請求項１０】
前記酵素が、電極触媒の官能化表面に直接結合されることを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項１１】
前記酵素が、架橋試薬によって電極触媒の官能化表面に結合されることを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項１２】
前記架橋試薬がスクシニミド、特にジスクシニミジルスベリン酸塩であることを特徴とする請求項１１記載の電気化学センサ。
【請求項１３】
前記電極マトリクスが、約１重量％から約５０重量％、特に約５重量％から約２０重量％の量の電極触媒を含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項１４】
前記電極マトリクスが多孔性形状であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項１５】
前記電極マトリクスがさらに導電性電極材料を含むことを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項１６】
前記酵素が酸化酵素であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項１７】
前記酵素がブドウ糖酸化酵素であることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項１８】
さらに対極を備えることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項１９】
前記対極が導電性材料で被覆されることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項２０】
少なくとも２つの部分を含み、第１の部分は電極を備え、生体適合性のある被覆がされて検体を含有する流体媒体と接触可能であり、第２の部分は流体が近接不可能な領域にあることを特徴とする請求項１〜１９のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項２１】
前記生体適合性のある被覆が、予め作製された膜をセンサ上に適用することにより形成されることを特徴とする請求項２０記載の電気化学センサ。
【請求項２２】
前記生体適合性のある被覆が、ポリマー溶液を適用し、その後乾燥させることにより形成されることを特徴とする請求項２０記載の電気化学センサ。
【請求項２３】
前記ポリマーが、２−メタクリロイルオキシエチル−ホスホリルコリン−コ−ｎ−ブチル−メタクリレートであることを特徴とする請求項２２記載の電気化学センサ。
【請求項２４】
前記生体適合性のある被覆が、約１μｍから約１００μｍ、特に約３μｍから約２５μｍの厚さを有することを特徴とする請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項２５】
前記第２の部分が測定値を登録するためのユニットを備えることを特徴とする請求項２０記載の電気化学センサ。
【請求項２６】
前記第２の部分が、さらに電源と、無線データ転送ユニットから選択された要素と、測定値を表示するための表示部とを備えることを特徴とする請求項２５記載の電気化学センサ。
【請求項２７】
前記第２の部分が、電気化学センサとは別の測定値を登録するユニットのためのインターフェースを備えることを特徴とする請求項２０記載の電気化学センサ。
【請求項２８】
複数回の測定用に設計されることを特徴とする請求項１〜２７のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項２９】
完全または部分的に埋め込み可能な装置として設計されることを特徴とする請求項１〜２８のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項３０】
フロースルーセルとして設計されることを特徴とする請求項１〜２８のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項３１】
体液、特に全血、血漿、血清または細胞外組織液の中の検体を測定するための請求項１〜３０のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項３２】
リンゴ酸、アルコール、アンモニウム、アスコルビン酸、コレステロール、システイン、グルコース、グルタチオン、グリセロール、尿素、３−ヒドロキシ酪酸、乳酸、５’−ヌクレオチダーゼ、ペプチド、ピルビン酸、サリチル酸およびトリグリセリドを含む群から選択される検体で、とりわけグルコースを測定するための請求項１〜３１のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の電気化学センサを製造するための工程であって、次の工程を含む：
（ａ）電極触媒粒子を供する工程、
（ｂ）前記電極触媒粒子を酵素で被覆する工程であって、該酵素が電極触媒粒子に共有結合する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた酵素で共有被覆された前記電極触媒粒子と、導電性電極材料および選択的にさらなる物質とを混合する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を処理して電極を形成する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で得られた電極を少なくとも１つのさらなる電極と組み合わせる工程。
【請求項３４】
工程（ｂ）において、前記電極触媒粒子が、まず被覆試薬と、次に架橋試薬と、最後に酵素と反応することを特徴とする請求項３３記載の工程。
【請求項３５】
流体媒体中の検体の測定方法であって、次の工程を含む：
（ａ）前記流体媒体を請求項１〜３２のいずれか１項に記載された電気化学センサと接触させる工程、および
（ｂ）前記電気化学センサにより発生した信号を測定することにより、流体媒体中の検体の有無および／または検体量を測定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学センサ、その製造工程、および該電気化学センサを用いて流体媒体中の検体を測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学分析のための測定システムは、医学的な関連分析方法の重要な要素である。これは、主として、酵素を用いて直接的または間接的に測定可能な検体の測定に関する。継続的または断続的な検体の反復測定を可能にし、生体外ならびに生体内での使用が可能なバイオセンサ、すなわち生物学的要素を備えた測定システムは、検体測定にとりわけ適することが証明されている。生体外バイオセンサは一般的にフロースルーセルで使用され、一方生体内バイオセンサは好ましくは皮下脂肪組織に埋め込まれる。これに関連して、組織内に短期間のみ導入されて皮膚上の測定装置に直接接触する経皮移植と、測定装置とともに組織に外科的に挿入される完全移植とが区別される。
【０００３】
電気化学バイオセンサは、２つ以上の電極を用いることにより検体の測定を可能し、電極のうちの少なくとも１つが、その上にて測定される検体が転換する作用電極である。生物学的要素として酵素を含む電気化学バイオセンサは、作用電極内または作用電極上に酵素を含み、この場合において、たとえば、検体は酵素の基板となることができ、この酵素によって物理化学的に変化（たとえば酸化）し得る。レドックスメディエータは、検体の転換中に放出された電子を作用電極の導電要素上に移動させ、電子の流れにより発生した電気測定信号は、測定された検体濃度に相関する。
【０００４】
自然発生したレドックス対ならびに合成されたレドックス対が、レドックスメディエータとして考えられる。たとえば、フェルドマン（Feldman）らの「Diabetes Technology & Therapeutics 5 (2003), 769-779」に記載されている合成されたレドックスメディエータは、生体内での適用にはあまり適していない。これは、バイオセンサの体内導入時に、合成されたレドックスメディエータは、理論的に体による免疫反応を常に生じ得るためである。しかしながら、レドックスメディエータは、電極構造を通って常に自由に拡散可能でなければならず、電極から出て周辺生物体に渡ることが可能であるため、少なくともこれらの物質の毒性が考慮されなければならず、また必要であれば確認されなければならない。この点は、検体の潜在的な還元流のために体内に入らないことが保証されている場合は、生体外での適用においては関係ない。
【０００５】
したがって、生体内の適用には自然発生したレドックスメディエータを使用する電気化学センサがとりわけ適している。これに関連して、酸素／過酸化水素のリドックス対がとりわけ有利であり、これは最初の要素（酸素）が常に存在するためである。酸素の存在下で酸化酵素の使用による検体の酵素転換において発生した過酸化水素は、電気化学センサの作用電極上において再酸化し、電子の放出およびレドックスメディエータにより発生した電気信号は、もとの酸化型に転換される。この酵素反応速度は、いわゆるピンポン機構にならう（レスコバック（Leskovac）ら、「The International Journal of Biochemistry and Cell Biology 37 (2005)，731-750」）。
【０００６】
しかしながら、補基質として酸素を要する酵素を用いて検体を測定する際の重大な問題は、初期状態と比較して酸素濃度の一時的な減少が組織内で生じ得、これが従来の生体内バイオセンサの機能に影響し得ることにある。図１は、異なる酸素濃度におけるブドウ糖酸化酵素によるグルコースからグルコノ−δ−ラクトンへの酵素酸化速度を示す。このグラフは、概して、所与の酸素濃度で転換する検体量はグルコース濃度の上昇により減少し、したがって、グルコースに対するブドウ糖酸化酵素の高い結合定数にもかかわらず、曲線は生理学的関連領域の非直線領域にあることを示す（約２５０ｍＭ）。
【０００７】
さらに、図１は、高濃度の検体において、約１ｍＭの酸素濃度まで近似直線が得られないことを示している。しかしながら、水システム、とくに皮下脂肪組織の間質液中に溶解した酸素の生体内濃度は大幅に低い。水は３７℃で約０．２１ｍＭの酸素濃度を有するが、皮下脂肪組織中の期待酸素濃度はわずか０．１ｍＭかそれより少なく、このため各々の場合において曲線が生理的グルコース濃度にて湾曲している。直線方向からのこの逸脱は、生体内バイオセンサにおける不要な一時的な機能特性となる。
【０００８】
したがって、組織内の限られた酸素は、酸素を補基質として必要とする多くの酵素バイオセンサにおいて、電気化学センサの機能曲線の線形性の限定因子となる。原理上、機能曲線の線形性は被覆膜を有する作用電極の使用により改善されるが、該膜は補基質の拡散に比べて検体の拡散をより強力に阻害する。図３は、とりわけ、グルコースの拡散に比べて酸素の拡散を促進するポリウレタンを含む被覆膜を有する酵素バイオセンサの機能曲線を示す（測定値は四角形で示されている）。これは、センサの測定信号が、適当な被覆膜の使用により、約１０ｍＭのグルコース濃度まで略直線を保持可能なことを示す。曲線は高濃度になるとさらに湾曲する。
【０００９】
しかしながら、電気化学センサでの被覆膜の使用はいくつかの問題をともなう。したがって、異なる検体を測定するために使用される電気化学センサは、基質および補基質に異なる拡散を供するために、通常、異なる被覆膜を含まなければならない。同時に、生体内での適用において被覆膜は高い生体適合性を有することが保証されなければならず、このことは相当な技術的要件を必要とし、最終的に製造コストが増加する。
【００１０】
参照電極に対する電気化学センサの作用電極の分極電圧を低下させ、作用電極の測定信号への妨害物質の影響を低減させるために、リドックスメディエータから作用電極の導電要素への電子の移動を促進する電極触媒をさらに使用する電気化学センサがある。このような電極触媒の例として、過酸化水素から酸素への酸化を触媒するコバルトフタロシアニンがある（クロウチ（Crouch）ら、Biosensors and Bioelectronics 21 (2005), 721-718）。この工程において、コバルトフタロシアニン錯体のコバルト（ＩＩ）陽イオンは、陽極での電子放出によりもとの二価状態に転換される前に、過酸化水素によってコバルト（Ｉ）に還元される。
【００１１】
文献から知られる他の電極触媒の他の例として、軟マンガン鉱状の二酸化マンガンがある（キュイ（Cui）ら、Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 1 (2005), 130-135; ルオ（Luo）ら、Biosensors and Bioelectronics 19 (2004), 1295-1300）。二酸化マンガンに対する過酸化水素の触媒酸化作用は詳細には理解されていないが、電極触媒として二酸化マンガンを有する作用電極の電位は、二酸化マンガンを有さない作用電極と比較して数百ｍＶ低い。その結果、測定信号に対するアスコルビン酸塩または尿素などの妨害物質の影響はかなり減少する。
【００１２】
電極触媒を使用する他の理由として、過剰な過酸化水素による酵素への損害がある。この物質が作用電極にて充分迅速に分解されない場合、酵素の変性が生じることがある。この問題に対処するため、たとえば変異により過酸化水素に耐性のある酵素を合成することが文献で提案されている（米国特許出願公開第２００４／０１３７５４７号明細書）。しかしながら、たとえば酵素の特異性など酵素の他の性質に悪影響を及ぼさずに、酵素をそのように変化させることはきわめて困難である。したがって、過酸化水素が発生する転換のための電極触媒の使用は、電極触媒が過酸化水素の酸化効率性を大幅に増加させ、これにより過剰な過酸化水素が電極マトリクスまたはその環境内に発生することを回避するため、上述の方法よりも大幅に優れていると考えられる。
【００１３】
検体の酵素測定における過酸化水素の生成に関連するさらなる問題として、過酸化水素が検体または酸素補基質の阻害剤として作用し得ることがある。この競合的阻害は、過酸化水素濃度に依存し、検体の転換を制限する。したがって、過酸化水素から酸素への再酸化を促進する電極触媒の使用は、検体の転換に関して好ましい効果もある。
【００１４】
電気化学バイオセンサの設計の際はさまざまな要因を考慮しなければならない。したがって、バイオセンサは、測定の酵素制限を回避するために作用電極において充分な量の酵素を有していなければならない（アベル（Abel）ら、Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 7 (1999), 93-100）。さらに、酵素分子は、バイオセンサの全測定期間にわたって作用電極構造に配置されるべきであり、すなわち、酵素は、測定媒体が達する電極領域にて分離または移動すべきではない（ドレッティ（Doretti）ら、Biosensor and Bioelectronics 11 (1996), 363-373）。最後に、酵素はバイオセンサの作用電極において安定すべきである。電気化学バイオセンサでの酵素の熱失活の要因に加え、酵素の安定化の方法は何度も検討されてきた（サラス  バブ（Sarath Babu）ら、Biosensors and Bioelectronics 19 (2004), 1337-1341）。バイオセンサ製造後の酵素の劣化は、最終的にはセンサの制限された寿命となる。
【００１５】
上述の要因を考慮するため、作用電極の電極マトリクスにて酵素を固定することで酵素を安定化する試みがなされ、このことは電気化学バイオセンサでの酵素の適切な固定方法の集中的な探求となった。吸着固定ならびに化学固定が実際には使用されている。しかしながら、吸着固定はさまざまな理由により不都合がある。一方で、吸着固定は、作用電極が酵素に対して不浸透性がある膜で被覆されることを必要とするが、このことはバイオセンサの製造に必要な作業を増加させ、膜に種々の要件を課すこととなる。他方で、前述の電極内での酵素分子の移動は吸着固定の場合には回避することができず、このことはセンサ機能の変更をもたらす。米国特許第５３６８７０７号明細書は、吸着結合酵素を有する作用電極を備え、液体中の鉛イオンのミクロモル量の測定に適したバイオセンサを開示する。該バイオセンサを製造するために、導電材料を含む作用電極の表面がコロイド金で被覆され、その粒子上にて適当な酵素が吸着されて、レドックスメディエータに共有結合可能となる。
【００１６】
とりわけ生体内での適用において軽視すべきでない、酵素の吸着固定を支持する被覆膜を有する電極の他の不都合な点としては、被覆膜の完全な非侵襲性の確認が必要なことである。わずかな膜の欠陥が、電極から環境への酵素の流出と充分なり得るため、とりわけ生体内バイオセンサの場合には膨大な量の確認が必要である。したがって、吸着固定の不利点を考慮すると、酵素を共有結合により電気化学バイオセンサにて固定するか、電極マトリクスにて固定する明確な必要性がある。
【００１７】
特開平１０−６８６５１号公報には、共有結合酵素を有する電極を備えた、グルコースなどの検体を検出するためのセンサが記載されている。この目的のため、導電材料としてＳｎＯ2で被覆された電極の表面は強酸で活性化され、カップリング試薬で官能化されて、最終的に酵素に接触する。
【００１８】
欧州特許出願公開第０２４７８５０号明細書は、検体の電流検出のためのバイオセンサを開示する。これらのセンサは固定化された酵素を有する電極を含み、該酵素は導電性支持体の表面に固定または吸着され、該支持体は樹脂結合炭素または黒鉛粒子の白金多孔層からなるか、あるいはそのような層を含む。この目的のため、白金黒鉛および高分子結合剤製の電極がまず調製され、次にこれらは酵素と接触される。この場合において、酵素は、電極表面への吸着により固定されるか、適当な試薬を使用して高分子結合剤に結合することにより固定される。
【００１９】
導電多孔性電極材料上または電多孔性電極材料内に固定もしくは吸着された酵素を含む電極を有するアンペロメトリックバイオセンサは、欧州特許出願公開第０６０３１５４号明細書にも記載されている。酵素電極を製造するために、たとえば触媒として作用する二酸化マンガンなどの第四周期の遷移金属の酸化物または酸化水和物が、黒鉛および非導電性高分子結合剤とともにペーストにされ、該ペーストが乾燥した後に得られた多孔性電極材料は、第２工程において酵素と接触される。酵素は、グルタルアルデヒドを用いて架橋結合により多孔性材料上または多孔性材料内に固定可能である。
【００２０】
特開平１０−６８６５１号公報、欧州特許出願公開第０２４７８５０号明細書、および欧州特許出願公開第０６０３１５４号明細書に記載された電気化学バイオセンサの主要な不利点は、酵素が酵素なしで予め作製された電極に最初に固定されることである。その結果、酵素が、制御下で電極要素に結合できない問題がある。したがって、グルタルアルデヒドが架橋試薬として使用される場合、酵素が無制御下で電極材料のあらゆる反応要素に結合するのみではなく、相互架橋結合される。さらに、この工程は使用された試薬を有する電極を汚染するため、とりわけ生体内バイオセンサでの使用前に電極が再び完全に洗浄されなければならず、製造の複雑性およびコストを増加する。
【００２１】
米国特許第４９３８８６０号明細書は、フィルムに形成された白金被覆陽極と該陽極に結合された酵素層とを備えた電気化学センサに適した電極を開示している。酵素層は、好ましくは、アミノシランおよびたとえばグルタルアルデヒドなどの適当な架橋剤を使用して白金陽極に結合される。しかしながら、米国特許第４９３８８６０号明細書に記載された電極の不利点は、フィルムである陽極構造のために小さな表面のみが検体の酵素転換に供され、また白金は触媒として使用するには比較的高価な材料であることである。
【発明の開示】
【００２２】
したがって、本発明の目的は、先行技術の不利点が少なくとも部分的に解消された、検体測定のための酵素電気化学センサを提供することであった。とりわけ、該センサは、酵素の特異的および恒久的な固定を保証して高い効率性を有し、よって高い信号生成を達成すべきである。さらに、簡単に低コストでセンサが製造可能であるべきである。
【００２３】
この目的は、流体媒体中の検体を測定するための電気化学センサであって、少なくとも１つの作用電極および少なくとも１つの参照電極を備え、少なくとも前記作用電極が電極マトリクス内に電極触媒の粒子を含み、検体の測定に適した酵素が前記電極触媒の粒子に共有結合する電気化学センサを使用して本発明により達成された。
【００２４】
好ましくは、少なくとも作用電極の電極マトリクスにある金属酸化物が電極触媒として使用される。金属酸化物は、検体を測定するために使用されるレドックスメディエータの転換を触媒可能なあらゆる金属酸化物でよい。より好ましい実施の形態において、使用される電極触媒は、ＭｎＯ2、ＦｅＯＯＨ、Ｆｅ3Ｏ4、Ｃｒ2Ｏ3、およびＶ2Ｏ5からなる群から選択される金属酸化物であり、ＭｎＯ2が特に好ましい。さらに、電極触媒が酸素に対して高い親和性を有することが望ましい。
【００２５】
本発明によると、電極触媒は粒子状で供され、粒径はそれぞれの要件に応じて変化可能である。本発明の技術的範囲内において、９０％の電極触媒粒子が、通常、０．１μｍから２０μｍの径を有し、０．５μｍから５μｍの径がとりわけ好ましいことが証明されている。どのような場合においても、電極触媒の粒径は、１μｍから５０μｍ、好ましくは５μｍから２０μｍの範囲にある作用電極層の厚さより常に小さくあるべきである。
【００２６】
粒径を使用して電極触媒の有効表面を制御する能力は、特に酵素を用いる官能化においてきわめて重要である。したがって、電極触媒の高い有効表面は酵素の搭載を増加することも可能であり、一般的に作用電極における電極触媒量ならびにその孔率および領域により決定される、ミリグラムあたりで示される電極触媒の単位においてより高い酵素活性となる。本出願において使用される「単位」という語は、標準状態下で毎分１μｍｏｌの基板を転換するために必要な酵素量を示す。本発明の目的のために使用される酵素被覆された電極触媒粒子は、通常、約０．０１Ｕ／ｍｇから約１０Ｕ／ｍｇの酵素活性があり、約０．１Ｕ／ｍｇから約１０Ｕ／ｍｇの酵素活性がとりわけ有利であることが証明されている。
【００２７】
本発明による電気化学センサにおいて、酵素は電極触媒粒子に選択的に共有結合し、とりわけ好ましくは電極マトリクスの他の要素には共有結合しない。電極触媒への酵素の共有結合は、レドックスメディエータから電極の触媒活性領域への拡散経路が小さく保持可能である利点があり、その結果、高効率の作用電極となり、よって電気化学センサの高い信号生成となる。
【００２８】
さらに、電極触媒の再生後、レドックスメディエータは電極触媒にも吸着結合するため、たとえば酸素／過酸化水素システムの場合において、局所的な高酸素活量が電極触媒の表面領域に発生し、これは周辺の測定媒体に向かって減少する。他方で、酵素の電極触媒への共有結合は、酵素に対する再生レドックスメディエータの高い局所的活性となり、たとえば図３に示されるように、検体濃度に関連して発生した測定信号の高い線形性および安定性に反映される（測定値は三角形で示される）。この場合、たとえば組織の血液循環の低下のような環境でのレドックスメディエータの濃度の一時的な低下であっても、測定信号一時的な変化とならない。
【００２９】
最後に、酵素の電極触媒への共有結合は、酵素分子の分離が標準的な測定条件下において生じないため、機能の恒常性を保証する（生理電解質濃度、生理ｐＨ、体温）。したがって、本発明による電気化学センサは、長期間にわたり使用可能で、事実上ドリフトなしで作動する。
【００３０】
酵素を電極触媒の粒子に共有結合させるために、本発明は、好ましい実施の形態において、電極触媒の粒子が官能化された表面を有し、とりわけアミノ基および／またはカルボキシル基で官能化されて酵素が結合する面を有することを想定する。表面は、たとえば電極触媒粒子の表面に官能基を形成するために、適当な試薬で電極触媒粒子を被覆することにより官能化することができ、これによって、酵素が電極触媒粒子に共有結合可能となる。
【００３１】
本発明の技術的範囲において使用される被覆試薬は、一方でたとえば電極触媒のヒドロキシ基などの電極触媒と共有結合し、他方で酵素と共有結合する少なくとも１つの官能基を含む物質である。これは、被覆試薬が少なくとも二官能性であり、すなわち少なくとも２つの官能基を含むことを意味する。電極触媒への共有結合と酵素への共有結合とに使用される被覆試薬の官能基は、同一でも異なっていてもよいが、好ましくは異なったものである。好ましい被覆試薬は、少なくとも１つの適当な官能基をもつシランであり、これによって酵素は被覆試薬に共有結合する。
【００３２】
電極触媒粒子の表面は、より好ましくはアミノシランにより官能化され、これはシリコン−酸素結合を形成しながら電極触媒表面に結合し、同時に電極触媒粒子への酵素の共有結合のための遊離アミノ基を供する。適当なアミノシランは、たとえば３−アミノプロピルトリメトキシシランおよび３−アミノ−プロピルトリエトキシシランを含み、とりわけ３−アミノプロピルトリエトキシシランが好ましい。
【００３３】
代替的に、電極触媒粒子の表面をカルボキシシランで官能化することも可能であり、これはシリコン−酸素結合を形成しながら電極触媒表面に結合し、選択的に加水分解後に、電極触媒粒子への酵素の共有結合のための遊離カルボキシ基を供する。これに関連して、Ｇｅｎｉｏｓｉｌ（登録商標）ＧＦ２０（ワッカー社）として市販されている３−（トリエトキシシリル）−プロピルコハク酸無水物がとりわけ適したシランであることが証明されている。
【００３４】
酵素は、直接的にあるいは架橋試薬を使用して電極触媒粒子の官能化表面に共有結合することが可能である。好ましい実施の形態において、酵素は電極触媒粒子の官能化表面に直接結合する。酵素は、あらゆる様式で電極触媒粒子の官能化表面に結合可能であり、電極触媒粒子および／または酵素の官能化表面の官能基の予備活性を含み得る。官能基は、たとえば官能化電極触媒および／または酵素と適当な活性試薬とを反応させることにより活性可能である。好ましい活性試薬は、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミド、ならびにカルボジイミドとスクシニミドとの組み合わせを含む。本発明の目的のために特に好ましい活性試薬は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシニミドとの組み合わせを含む。
【００３５】
別の好ましい実施の形態において、酵素は架橋試薬によって電極触媒の官能化表面に結合され、該架橋試薬は、電極触媒の官能化表面上の官能基ならびに酵素の官能基と共有反応可能な反応基を有する。特に好ましい反応基があり、これは酵素と電極触媒粒子表面の官能基とを架橋可能にする。上述の機能を満たすことのできるあらゆる試薬が架橋試薬として考えられ、たとえば多官能性アルデヒド、および特にグルタルアルデヒド、ベンゾキノン、ブロモシアン、ヒドラジン、スクシニミド、２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジンなどのジアルデヒドまたはこれらの組み合わせなどがある。スクシニミド、より好ましくはジスクシニミド、および最も好ましくはジスクシニミジルスベリン酸塩（ＤＳＳ）が、架橋試薬として好ましくは使用される。
【００３６】
作用電極の電極マトリクスは、酵素で共有被覆された電極触媒粒子を、たとえば導電電極材料などの電極マトリクスの他の要素と混合し、得られた混合物を乾燥させることにより生成可能であり、電極マトリクスは、通常、約１重量％から約５０重量％、好ましくは約５重量％から約２０重量％の量の電極触媒を含む。
【００３７】
別の好ましい実施の形態において、電極マトリクスは多孔性の形態である。電極マトリクスの孔率は、特に電極触媒の粒子の大きさおよび他の要素により規定され、高い孔率は電極のより大きな有効表面と関連し、よって測定媒体とのより大きな接触領域に関連する。電極マトリクスを製造するためにたとえばペースト状で供される導電性電極材料は、好ましくは非導電性結合剤、特にたとえばナフィオンなどのペルフルオロポリマーなどの非導電性高分子結合剤と組み合わされた黒鉛および／またはフラーレンなどの導電性固形粒子を含む。
【００３８】
電極触媒粒子に固定された酵素は、好ましくはオキシダーゼであり、特にアルコールオキシダーゼ（１．１．３．１３）、アリールアルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．７）、カテコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１４）、コレステロールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．６）、コリンオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１７）、ガラクトースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．９）、ブドウ糖酸化酵素（ＥＣ１．１．３．４）、グリセロール−３−リン酸塩オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２１）、ヘキソースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．５）、リンゴ酸塩オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．３）、ピラノースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１０）、ピリドキシン−４−オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１２）、またはチアミンオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２３）である。酵素は、特に好ましくはブドウ糖酸化酵素である。
【００３９】
本発明による電気化学センサの参照電極は、作用電極の分極電圧を調節し、本発明の目的に適したあらゆる材料を含む。好ましくは、銀／塩化銀が参照電極として使用される。
【００４０】
さらに、本発明の電気化学センサは、少なくとも１つの作用電極および少なくとも１つの参照電極に加えて、好ましくは貴金属電極の形態で、特に金電極である少なくとも１つの対極を備える。貴金属電極の形態である対極は、好ましくは、特にカーボンペーストである導電性固形粒子を含むペーストなどの適当な導電材料で被覆される。
【００４１】
本発明によると、電気化学センサは、好ましくは２つの部分を含む。検体を含む流体媒体と接触可能な第１の部分は、電極、すなわち作用電極、参照電極および任意的に対極を備える。この部分は、好ましくは生体適合性のある被覆が供されている。生体適合性被覆は、検体の電極マトリクスへの浸透を可能にするが、電極要素が周辺媒体へ出ることを防止する。酵素の電極触媒への共有結合のために酵素が作用電極または電気化学センサから放出しないという事実を考慮すると、生体適合性被覆は多くの適用において必ずしも必要でない。したがって、本発明による電気化学センサは、生体適合性被覆が酵素の障壁でない場合、とりわけ生体内バイオセンサで使用することも可能である。反対に、これに関連して生体適合性被覆を選択することができ、周辺組織および／または血液または血清との最適な相互作用が供される。
【００４２】
生体適合性被覆はさまざまな方法で生成される。好ましい方法は、電気化学センサに適用される予め作製された膜を使用することである。膜はさまざまな手法によりセンサに固定可能であり、接着またはレーザ溶接が好ましいと考えられる。これに関連して予め作製された透析膜が有利であることが証明されており、たとえば欧州特許出願公開第１７１００１１号明細書に開示されている、Ｕｌｔｒａｓｏｎ（登録商標）６０２０（ＢＡＳＦ社）の商品名で市販されているものなど、ポリエーテルスルホン製の透析膜が特に適している。
【００４３】
代替的に、生体適合性被覆は、電気化学センサ上に適当なポリマー溶液を適用し、乾燥させることにより現場で生成可能である。バイオセンサへのポリマーの適用は、好ましくは噴霧、浸漬被覆またはポリマー希釈液の分注により施されるが、これらの方法に限られない。有機溶媒が好ましくは溶媒として使用され、たとえばエタノールなど１００℃以下の沸点を有する有機溶媒で、約０．１重量％から約３０重量％、好ましくは約０．５重量％から約１５重量％のポリマー量を含有する溶液が特に好ましい。この目的に適したポリマーは、特に両性イオン構造と、たとえば２−メタクリロイルオキシエチル−ホスホリルコリン−コ−ｎ−ブチル−メタクリレート（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ）などの模倣細胞表面とを有するポリマーを含む。得られる生体適合性被覆は、通常、約１μｍから約１００μｍ、好ましくは約３μｍから約２５μｍの厚さを有する。
【００４４】
電気化学センサの第２の部分は、流体測定媒体に近接不可な領域にあり、好ましくは測定値を登録するためのユニットを備える。より好ましい実施の形態において、第２の部分は、さらにたとえば電池またはアキュムレータなどの電源と、無線データ転送ユニットから選択されたユニットと、測定値を表示するための表示部とを備える。代替的に、第２の部分は、電気化学センサとは別の測定値登録ユニットのためのインターフェースを備え得る。
【００４５】
本発明による電気化学センサは、好ましくは複数回の測定用に設計されており、すなわちセンサは測定される検体の反復測定が可能である。このことは、とりわけ検体の有無および／または検体量の恒常的制御、つまり連続的または非連続的制御が、たとえば透析患者の場合など、たとえば１日以上、特に１週間以上の長期間にわたって行われる場合に望ましい。好ましい実施の形態において、したがって本発明では、電気化学センサはフロースルーセルとして設計され、ここを通って検体を含有する流体が通過する。代替的に、しかしながら、本発明の電気化学センサをたとえば脂肪組織または血管に埋め込み可能な完全または部分的埋め込み可能装置として設計することも可能である。
【００４６】
本発明による電気化学センサは、あらゆる根源に由来する流体媒体中の検体を測定するために使用することができる。好ましい実施の形態において、電気化学センサは、これらに限定されないが、全血、血漿、血清、リンパ液、胆液、脳脊髄液、細胞外組織液、尿を含む体液、ならびに唾液または汗などの腺分泌物中の検体を測定するために使用され、とりわけ全血、血漿、血清および細胞外組織液が好ましいと考えられる。分析を行うために必要な試料の量は、通常、約０．０１μｌから約１００μｌであり、好ましくは約０．１μｌから約２μｌである。
【００４７】
定性的および／または定量的に測定される検体は、あらゆる生物学的または化学物質であり、レドックス反応によって検出可能である。検体は、好ましくは、リンゴ酸、アルコール、アンモニウム、アスコルビン酸、コレステロール、システイン、グルコース、グルタチオン、グリセロール、尿素、３−ヒドロキシ酪酸、乳酸、５’−ヌクレオチダーゼ、ペプチド、ピルビン酸、サリチル酸およびトリグリセリドを含む群から選択される。特に好ましい実施の形態において、本発明の電気化学センサを使用して測定される検体はグルコースである。
【００４８】
さらなる特徴として、本発明は、本発明による電気化学センサを製造するための工程に関し、次の工程を含む：
（ａ）電極触媒粒子を供する工程、
（ｂ）前記電極触媒粒子を酵素で被覆する工程であって、該酵素が電極触媒粒子に共有結合する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた酵素で共有被覆された前記電極触媒粒子と、導電性電極材料および選択的にさらなる物質とを混合する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を処理して電極を形成する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で得られた電極を少なくとも１つのさらなる電極と組み合わせる工程。
【００４９】
本発明による電気化学センサを製造するために、前記で定義された電極触媒の粒子は、好ましくは、まず被覆試薬と反応し、これによって電極触媒の粒子表面が官能化される。次に、官能化した電極触媒粒子を架橋試薬および酵素と反応させることによって、酵素で共有被覆された電極触媒が得られ、該電極触媒粒子は、前記で定義された他の要素と混合することにより電極マトリクスを形成するために処理することができる。
【００５０】
本発明による製造工程は、酵素で被覆された電極触媒の製造が電極の製造とは別に実施可能であるため、実際、特に有利であることが証明されている。さらに、酵素で共有被覆された電極触媒は、電極ペーストの調製のための定義された出発材料を供し、該出発材料は電極ペーストへの導入前に精製可能であるため、完成した電極の後の洗浄が不要である。
【００５１】
さらなる特徴として、本発明は流体媒体中の検体の測定方法に関し、次の工程を含む：
（ａ）流体媒体を本発明による電気化学センサと接触させる工程、および
（ｂ）電気化学センサにより発生した信号を測定することにより、流体媒体中の検体の有無および／または検体量を測定する工程。
【００５２】
検体を測定するために、電気化学センサは、電気化学センサと流体媒体とのあいだの接触を可能にするあらゆる様式で設計することが可能である。したがって、センサは、たとえば、検体を含む媒体が通るフロースルーセルとして設計することが可能である。他方で、センサを拡散センサとして設計することも可能であり、この場合センサと媒体との接触は拡散により行われる。同様に、電気化学センサは、患者の体内に完全または部分的に埋め込む装置として設計することが可能であり、この場合は、血管または組織、とりわけ皮下脂肪組織に埋め込まれる。
【００５３】
測定可能な信号は、検体の有無および／または検体量に応じてセンサから生成される。この信号は、好ましくは、たとえば電流、電圧、抵抗などの電気信号であり、適当な手段を使用して評価または出力される。電気化学センサは、好ましくはアンペロメトリックセンサである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
本発明は、次の図面および実施例によりさらに明確にされる。
【００５５】
実施例１：カルボキシ官能化二酸化マンガンの調製
カルボキシ官能化二酸化マンガンを調製するために、二酸化マンガン（テクニパー社）１．６ｇをトルエン２５６ｍｌに懸濁させ、Ｇｅｎｉｏｓｉｌ(登録商標)ＧＦ２０（ワッカー社）８４ｇが得られた懸濁液に加えられ、反応混合物が窒素雰囲気下で５０℃、５２０ｒｐｍにて２４時間攪拌された。冷却および二酸化マンガンの沈降後、トルエンがデカントされ、残留物が毎度トルエン２５０ｍｌで２回洗浄され、その後アセトン２５０ｍｌで１回洗浄された。水２５０ｍｌがこのようにして得られた官能化二酸化マンガンに加えられ、室温にて２４時間攪拌された。その後、水は遠心分離され、残留物がＣａＣｌ2上で５０℃、真空下にて乾燥されてカルボキシ官能化二酸化マンガン１．５ｍｇを得た。
【００５６】
実施例２：カルボキシ官能化二酸化マンガンへのブドウ糖酸化酵素の結合
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）５００ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミド４００ｍｇ、およびブドウ糖酸化酵素７０ｍｇが、実施例１の乾燥カルボキシ官能化二酸化マンガン１００ｍｇに加えられ、水溶液中で室温にて２４時間攪拌された。固体の沈降後、上澄みが除去され、固体がｐＨ７．４のリン酸カリウムバッファで４回洗浄された。得られた固体を空気中で乾燥させた後、酵素被覆された電極触媒約８５ｍｇが得られ、これは０．０６Ｕ／ｍｇの酵素活性を有するものであった。
【００５７】
実施例３：アミノ官能化二酸化マンガンの調製
３−アミノプロピルトリエトキシシラン（シグマ社）８ｍｌが、６０℃に加熱されたトルエン３２ｍｌ中の二酸化マンガン（テクニパー社）２００ｍｇの完全攪拌された懸濁液に加えられ、混合液がさらに６０℃にて１６時間攪拌された。固体の沈降後、澄んだ上澄みがデカントされ、固体が毎度トルエン３２ｍｌで３回洗浄された。残留した固体は空気中で乾燥され、アミノ官能化二酸化マンガン約１８２ｍｇを得た。
【００５８】
実施例４：架橋試薬としてグルタルアルデヒドを使用したアミノ官能化二酸化マンガンへのブドウ糖酸化酵素の結合
実施例３の乾燥された固体が、ｐＨ７．４のリン酸カリウムバッファ３２ｍｌ、５０ｍＭで１回洗浄され、次にｐＨ７．４のリン酸カリウムバッファ１６ｍｌ、５０ｍＭで処理された。この懸濁液に１０％のグルタルアルデヒド溶液（シグマ社）１６ｍｌが攪拌中に加えられた。反応は２５℃にて１．５時間後に終了された。沈降固体は、毎回ｐＨ７．４のリン酸カリウムバッファ３２ｍｌ、５０ｍＭで３回洗浄され、同一のバッファ１６ｍｌに攪拌中に懸濁され、ｐＨ７．４のリン酸カリウムバッファ５０ｍＭ中のブドウ糖酸化酵素（ロシュ社）０．５ｍｇ／ｍｌの溶液１６ｍｌで混合された。この混合液は２５℃にて３時間攪拌された。固体の沈降後、毎回ｐＨ７．４のリン酸カリウムバッファ１６ｍｌ、５０ｍＭで４回洗浄された。凍結乾燥後、酵素被覆された電極触媒約２００ｍｇが得られ、これは０．１２Ｕ／ｍｇの酵素活性を有するものであった。
【００５９】
実施例５：架橋試薬としてスベリン酸ジサクシンイミジルを使用したアミノ官能化二酸化マンガンへのブドウ糖酸化酵素の結合
ジオキサン２０μｌ中のスベリン酸ジサクシンイミジル０．０２ｍｇと、ｐＨ８．５のリン酸カリウムバッファ２ｍｌ、０．１Ｍ中のブドウ糖酸化酵素０．００８ｍｇが、実施例３の乾燥したアミノ官能化二酸化マンガン２０ｍｇに加えられ、室温にて４時間攪拌された。固体を遠心分離後、毎回ｐＨ８．５のリン酸カリウムバッファ５ｍｌ、０．１Ｍで洗浄され、次にｐＨ８．５のリン酸カリウムバッファ５ｍｌ、０．１Ｍで処理された。凍結乾燥後、酵素被覆された電極触媒約１８．８ｍｇが得られ、これは０．１Ｕ／ｍｇの酵素活性を有するものであった。
【００６０】
実施例６：アンペロメトリックセンサの調製
血液中または皮下脂肪組織中のグルコース測定が可能な３つの電極（作用電極、参照電極および対極）を有する電気化学センサを調製するために、最初に被覆膜を有さない作用電極が調製された。この目的のため、実施例５にしたがってブドウ糖酸化酵素で官能化された二酸化マンガンが、炭素ポリマーペーストＰＥ４０１（アチソン社）およびジエチレングリコールモノブチルエーテルと混合され、得られた混合物は、分注手法により、ポリエステル製のセンサストリップの金表面上に適用され、２５℃の真空中にて乾燥された。このようにして得られた作用電極は、参照電極としての銀／塩化銀電極および対極としての金電極と組み合わされた。伝導路は絶縁された。
【００６１】
実施例７：アンペロメトリックセンサの測定信号の安定性および線形性の測定
実施例６により得られた電気化学センサは、フロースルーチャンバ中のグルコース溶液に浸漬されて７日間測定され、その間グルコース溶液濃度は０から２６ｍＭのあいだで連続的に変更された。図２および図３にこの測定の結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ブドウ糖酸化酵素を酵素として使用し、酸素／過酸化水素を酸素濃度の関数としてのレドックスメディエータとして使用した際のグルコース濃度［ｍＭ］に対してプロットされたグルコースの転換を示す。ＫmappおよびＶmaxappは、ミカエリス−メンテン式によるグルコースの酵素反応速度定数である。
【図２】グルコース濃度が定期的に０から２６ｍＭのあいだで変化された７日間の測定溶液のグルコース濃度測定過程における、本発明による電気化学センサの測定信号［ｎＡ］を時間［秒］に対してプロットしたものを示す。被覆膜を有さない電極が作用電極として使用され、該電極は、電極触媒としてブドウ糖酸化酵素で被覆された二酸化マンガンを含有し、本出願の実施例６にしたがって調製された。
【図３】固定化酵素を有する２つの電気化学センサの測定信号［ｎＡ］を測定溶液のグルコース濃度［ｍＭ］に対してプロットしたものを示す。三角形で示された測定値は本発明による電気化学センサの機能曲線を示し、ここではブドウ糖酸化酵素は作用電極の電気触媒に共有結合され、被覆膜は使用されなかった。四角形で示された測定値は同一の特徴のセンサの機能曲線を示し、ここでは酵素はポリウレタンを含む被覆膜により作用電極内に固定され、共有結合によって電極触媒に結合されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【外国語明細書】
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