(57)【要約】【課題】統計的な推定を用いず、実験的にハプロタイプを検出する方法を提供する。【解決手段】アレル特異的なPCR反応とラムダエキソヌクレアーゼ反応と電気泳動を用いて、ハプロタイプを検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１及び第２の多型部位を有する検体核酸のハプロタイプの検出方法であって、
以下の（１）〜（３）の工程を有することを特徴とする。
（１）第１の多型部位がそれぞれ野生型及び変異型である２種の標的核酸をそれぞれ特異的に増幅する野生型用と変異型用の２種類から選択した１種の順方向プライマーと、第２の多型部位がそれぞれ野生型及び変異型である２種の標的核酸のその相補鎖をそれぞれ特異的に増幅する野生型用と変異型用の２種類から選択した１種の逆方向プライマーと、の２種のプライマーを用いた以下の４つの系で、それぞれ検体核酸をPCR増幅処理する工程
（ａ）前記順方向プライマーと前記逆方向プライマーの５´末端の両方にはリン酸化標識が付されていない第１の系、
（ｂ）前記順方向プライマーにはリン酸化標識が付されておらず、前記逆方向プライマーの５´末端にリン酸化標識が付されている第２の系、
（ｃ）前記順方向プライマーに５´末端にリン酸化標識が付されており、前記逆方向プライマーの５´末端にはリン酸化標識が付されていない第３の系、及び
（ｄ）前記順方向プライマーと前記逆方向プライマーの５´末端の両方にリン酸化標識が付されている第４の系、
（２）前記（１）の各増幅産物に、ラムダエキソヌクレアーゼ処理をすることで５´末端にリン酸化標識を付したプライマーによって増幅された一本鎖核酸の断片化を行う工程。
（３）前記（２）の処理の結果、断片化されずに残った二本鎖核酸の有無をそれぞれの系で検出することでハプロタイプを決定する工程。
【請求項２】
複数の対立遺伝子における多型マーカの中から隣り合わせた多型マーカーの対および複数の対立遺伝子における多型マーカーの中から隣り合わせない多型マーカーの対を、前記第１及び第２の多型部位として選定した請求項１に記載のハプロタイプの決定方法。
【請求項３】
検体核酸が３以上の多型部位を有し、これらの多型部位から２つの多型部位を選択して得られる各組合せについて、前記（１）〜（３）の工程をそれぞれ行って、全てのハプロタイプを決定する請求項１に記載のハプロタイプの決定方法。
【請求項４】
前記検体核酸が２つの染色体に由来する請求項１〜３のいずれかに記載のハプロタイプの決定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は統計的な推定を用いず、実験的にハプロタイプを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハプロタイプとは、単一の染色体上に位置する２つまたはそれ以上のSNPの組み合わせのことを言う。例えば、図１において個体Aのゲノムの遺伝子座１と遺伝子座２とがある場合、一方の染色体上ではA-Tというハプロタイプを持ち、もう一方の染色体上ではA-Gというハプロタイプを持つと言う。近年の研究で、上記ハプロタイプが疾患の発症や薬剤応答性（薬効・副作用）と関係があることが明らかになりつつある。例えば、薬物代謝酵素のN−アセチル化転移酵素２（NAT2）が挙げられる。このNAT２酵素をコードする遺伝子には３ヶ所のSNPが存在するが、２本の染色体のうち少なくとも一本の染色体において、3ヶ所のSNPが全て野生型でないと薬剤に対する副作用のリスクが高まる。したがって、ハプロタイプを正確に検出することは大変重要である。
【０００３】
現在ハプロタイプの解析に用いられるものとして、統計学的にハプロタイプを推定する手法が注目されている。家系データが与えられたときのハプロタイプを決定する手法としては、Linkage Package（例えば、非特許文献１参照）やGENEHUNTER（例えば、非特許文献２参照）のようなソフトウェアがある。一方、家系データが存在しない場合は、Clarkのアルゴリズムやハーディ・ワインバーグ平衡（Hardy-Weinberg equilibrium: HWE）を仮定して遺伝子を数えることによるＥＭアルゴリズムを用いた最尤推定手法（例えば、非特許文献３）など様々なものがある。しかし、これらの方法はあくまでも推定であり、パラメーターの設定によっては結果が異なってくるので、精度が高いと言い切ることはできない。つまり、統計学を利用している限り正確度が100%にはなりえない。
【０００４】
そこで、統計的な推定を用いず、実験的な手法でハプロタイプを検出することが望まれている。現在、SNPを解析する代表的な装置としてシーケンサーとリアルタイムPCRがある。
【０００５】
シーケンサーによるSNP検出では、試料DNAを鋳型にし、ジデオキシ法（サンガー法）によりDNAポリメラーゼで一塩基ずつ長さの異なるDNA断片群が合成される。その際のジデオキシリボヌクレオチドには塩基毎に異なる蛍光が標識されている。このDNA断片群をポリアクリルアミドゲル中で電気泳動させると、長さに応じて分類される。そして、泳動始点から一定の距離の位置をレーザで照射し、そこを通過する蛍光標識DNAの蛍光を測定することにより、通過する順序から塩基配列を決定する。
【０００６】
このような検出工程によって、シーケンサーは全塩基配列を読み取ることが可能な装置ではあるが、装置にかけるまで前処理工程が非常に複雑であり、ある程度熟練した人が実験を行わないと誤った結果が出てしまう場合がある。また、蛍光標識のついたジデオキシリボヌクレオチドは非常に高価であるし、また４種類の蛍光色素を読み取るため、検出機構が複雑になり、高価な装置となってしまう。
【０００７】
一方、リアルタイムPCRにおいては、前処理工程が単純であり、特別な技術を要さず、簡単に正しい結果が得られる。しかし、必要な試薬であるTaqMan Probeは、末端をそれぞれ蛍光物質と消光物質でそれぞれ標識する必要があり、これが高コスト化につながる。SNPを解析する際は、このTaqMan Probeを１SNPあたり二種類用意する必要があり、また標的のSNPそれぞれに対してTaqMan Probeを設計する必要があるため、非常に高価な検出手法となる。さらに、検出する際に２つの波長を持つ光源や検出系を設計する必要があり、装置の機構が複雑となり、自ずと装置コストも高くなる。
【０００８】
その他の多型の解析法としては、PCRの伸長反応工程において、変異部位にヌクレオチド類似体を選択的に取り込ませ、続く限定分解の工程で多型に特有なサイズの生成物を生成し、最後にそれらをサイズ別に分離して多型を決定するという方法がある（特許文献１）。
【０００９】
より詳細に示すと、この方法では前記したように変異部位に対応する塩基の基質に5’→3’エキソヌクレアーゼによる消化に対して抵抗性がある天然型デオキシリボヌクレオチド三リン酸の類似体を用いてPCRを行う。続いて前記類似体が取り込まれたPCR産物を、5’→3’エキソヌクレアーゼで消化して一本鎖セグメントにし、続いて一本鎖DNAを消化する一本鎖DNase酵素を用いて除去し、平滑末端フラグメントを生成させる。すると、多型に応じて異なる産物長を持つ産物ができるため、電気泳動により長さを分離することによって、多型を検出できる。
【００１０】
この方法では、多型によって異なる産物長を生成するための限定分解の工程が、２工程にも渡り、操作が複雑になるという問題点がある。しかし、シーケンサーやリアルタイムPCRに比べて核酸に蛍光標識をする必要がないため、コストは安くなる。
【非特許文献１】G. M. Lathrop et al., "Multilocus linkage analysis in humans: detection of linkage and estimation of recombination," Am. J. Hum. Genet., vol.37, pp.482-498, 1985
【非特許文献２】L. Kruglyak, M. J. Daly, M. P. Reeve-Daly and E. S. Lander, "Parametric and nonparametric linkage analysis: a unified multipoint approach," Am. J. Hum. Genet., vol.58, pp.1347-1363, 1996
【非特許文献３】M. N. Chiano and D. G. Clayton, "Fine genetic mapping using haplotype analysis and the missing problem," Ann. Hum. Genet., vol.62, pp.55-60, 1998
【特許文献１】特表2003-517309
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上述べたとおり、多型を調べる方法は多種類に及ぶ。しかし、これらの装置や方法では２本の染色体情報が１本の染色体情報としてまとめられて検出されるため、１本の染色体情報であるハプロタイプを正確に検出することは困難である。図２に示すように個体Aの遺伝子座1がA/A、遺伝子座２がT/Gという遺伝子型であることが解析された場合、一方のゲノム上のハプロタイプはA-Tであり、もう一方のゲノム上のハプロタイプはA-Gであることが分かる。しかし、個体Bの遺伝子座１にはA/C、遺伝子座2にはT/Gという遺伝子型が解析結果として得られた場合は、この解析結果から個体Bのハプロタイプを判定することは不可能である。つまり、個体Bのハプロタイプが、一方のゲノム上でA-T、他方のゲノム上でC-Gである場合と、一方のゲノムがA-G、他方のゲノムがC-Tである場合とを区別することはできない。
【００１２】
本発明の目的は、統計的な推定を用いず、PCR反応を用いた試験データに基づいて精度よくハプロタイプを検出することが可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明のハプロタイプの決定方法は、
第１及び第２の多型部位を有する検体核酸のハプロタイプの検出方法であって、
以下の（１）〜（３）の工程を有することを特徴とする。
（１）第１の多型部位がそれぞれ野生型及び変異型である２種の標的核酸をそれぞれ特異的に増幅する野生型用と変異型用の２種類から選択した１種の順方向プライマーと、第２の多型部位がそれぞれ野生型及び変異型である２種の標的核酸のその相補鎖をそれぞれ特異的に増幅する野生型用と変異型用の２種類から選択した１種の逆方向プライマーと、の２種のプライマーを用いた以下の４つの系で、それぞれ検体核酸をＰＣＲ増幅処理する工程
（ａ）前記順方向プライマーと前記逆方向プライマーの５´末端の両方にはリン酸化標識が付されていない第１の系、
（ｂ）前記順方向プライマーにはリン酸化標識が付されておらず、前記逆方向プライマーの５´末端にリン酸化標識が付されている第２の系、
（ｃ）前記順方向プライマーに５´末端にリン酸化標識が付されており、前記逆方向プライマーの５´末端にはリン酸化標識が付されていない第３の系、及び
（ｄ）前記順方向プライマーと前記逆方向プライマーの５´末端の両方にリン酸化標識が付されている第４の系、
（２）前記（１）の各増幅産物に、ラムダエキソヌクレアーゼ処理をすることで５´末端にリン酸化標識を付したプライマーによって増幅された一本鎖核酸の断片化を行う工程。
（３）前記（２）の処理の結果、断片化されずに残った二本鎖核酸の有無をそれぞれの系で検出することでハプロタイプを決定する工程。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るハプロタイプの検出法によれば、統計的な推定を用いず、実験的にハプロタイプを検出することが可能である。本発明によれば、考えられうる全てのハプロタイプの組合せを電気泳動のバンドのプロファイルから一意に決定することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の方法では、第１及び第２の２つの多型部位のそれぞれについて、１種の変異がある場合に対して、以下の野生型用及び変異型用の４種のプライマーが用いられる。
（i）第１の多型部位が野生型である標的核酸を増幅するためのプライマー。
（ii）第１の多型部位が変異型である標的核酸を増幅するためのプライマー。
（iii）第２の多型部位が野生型である標的核酸の相補鎖を増幅するためのプライマー。
（iv）第２の多型部位が変異型である標的核酸の相補鎖を増幅するためのプライマー。
【００１６】
これらの４種のプライマーをPCR増幅処理のためのPCR増幅反応系に添加する際に、（i）及び（ii）のプライマーのいずれか一方と、（iii）及び（iv）のプライマーのいずれか一方の５’末端をリン酸化した４種の組合せに基づく以下のPCR反応系を用意する。
（ａ）前記順方向プライマーと前記逆方向プライマーの５´末端の両方にはリン酸化標識が付されていない第１の系、
（ｂ）前記順方向プライマーにはリン酸化標識が付されておらず、前記逆方向プライマーの５´末端にリン酸化標識が付されている第２の系、
（ｃ）前記順方向プライマーに５´末端にリン酸化標識が付されており、前記逆方向プライマーの５´末端にはリン酸化標識が付されていない第３の系、及び
（ｄ）前記順方向プライマーと前記逆方向プライマーの５´末端の両方にリン酸化標識が付されている第４の系、
次に、上記の各PCR反応系において、ハプロタイプの決定対象である検体核酸を用いてPCR増幅を行う（工程１）。次に、各反応系で得られた増幅産物に対して、ラムダエキソヌクレアーゼ処理をすることで５´末端にリン酸化標識を付したプライマーによって増幅された一本鎖核酸の断片化を行う（工程２）。この断片化処理の結果、断片化されずに残った二本鎖核酸の有無をそれぞれの系で検出することでハプロタイプを決定することができる（工程３）。
【００１７】
上記の２つの多型部位を決定するための方法は、プライマーを適宜設計することで、３以上の多型部位を有する検体核酸の隣り合った２つの多型部位、あるいは隣り合わずに離れて存在する２つの多型部位のハプロタイプの決定に用いることができる。従って、検体核酸が３以上の多型部位を有する場合でも、これらの多型部位から２つの多型部位を選択して得られる各２つの多型部位の組合せ毎に、工程（１）〜（３）を行って得られた結果から全ての多型部位に関するハプロタイプを決定することができる。更に、後述するとおり、２つの多型部位でのハプロタイプの決定を、２つの染色体に由来する検体核酸について行うことができ、この２本の染色体での決定方法を上記の３以上の多型部位を有する場合にも適用可能である。
【００１８】
上記の第１及び第２の多型部位としては、複数の対立遺伝子における多型マーカーの中から隣り合わせた多型マーカーの対および複数の対立遺伝子における多型マーカーの中から隣り合わせない多型マーカの対を選定することができる。
【００１９】
上述した本発明に係る基本的な原理を図３から図５を用いて説明する。
【００２０】
図３において、標的核酸３０１は、その相補鎖３０３と二本鎖核酸を構成している。そして、標的核酸３０１は、５´側に第１のＳＮＰ、３´側に第２のＳＮＰを有している。従って、相補鎖３０３は、３´側に核酸３０１の第１のＳＮＰに対応する第３のＳＮＰ、５´側に、核酸３０１の第２のＳＮＰに対応する第４のＳＮＰを有していることとなる。ここで、標的核酸３０１の第１のSNP部位における野生型ヌクレオチドは「C」、変異型ヌクレオチドは「T」とする。また、標的核酸３０１の第２のＳＮＰ部位における野性型ヌクレオチドは「Ｇ」、変異型ヌクレオチドは「Ｔ」とする。従って相補鎖３０３の第３のＳＮＰ部位における野性型ヌクレオチドは「Ｇ」、変異型ヌクレオチドは「Ａ」、第４のＳＮＰ部位における野性型ヌクレオチドは「Ｃ」、変異型ヌクレオチドは「Ａ」となる。
【００２１】
次いで、標的核酸３０１の５´側に位置している第１のSNPに対してアレル特異的な２種類の順方向プライマー３０５、３０７を用意する。第１の順方向プライマー３０５は、5’末端に第１の標識３０９を有し、３’末端に野生型ヌクレオチドの「C」を有する。第２の順方向プライマー３０７は、５’末端に第２の標識３１１を有し、３’末端に変異型ヌクレオチド「T」を有する。ここで、第１の標識３０９と第２の標識３１１とは、互いに異なる標識である。例えば、第１の標識３０９がリン酸標識の場合は、第２の標識３１１は未標識である。一方、第１の標識３０９が未標識の場合は、第２の標識３１１はリン酸標識である。
【００２２】
一方、標的核酸の相補鎖核酸３０３の５’側に位置している第４のSNPに対してアレル特異的な２種類の逆方向プライマー３１３、３１５を用意する。第１の逆方向プライマー３１３は、５’末端に第１の標識３１７を有し、３’末端に野生型ヌクレオチドの「C」を有する。第２の逆方向プライマー３１５は、５’末端に第２の標識３１９を有し、３’末端に変異型ヌクレオチド「A」を有する。ここで、第１の標識３１７と第２の標識３１９とは、互いに異なる標識である。例えば、第１の標識３１７がリン酸標識の場合は、第２の標識３１9は未標識である。一方、第１の標識３１７が未標識の場合は、第２の標識３１９はリン酸標識である。
【００２３】
そして上記第１、第２の順方向プライマー３０５、３０７と、上記第１、第２の逆方向プライマー３１３、３１５とを用いて、標的核酸３０１のPCR増幅を行う。PCR増幅は４つの生化学反応容器内で行われる。
【００２４】
第１の生化学反応容器内では、上記第１の順方向プライマー３０５の第1の標識は未標識であり、上記第２の順方向プライマー３０７の第2の標識はリン酸標識を有する。また、上記第１の逆方向プライマー３１３の第1の標識は未標識であり、上記第2の逆方向プライマー３１５の第2の標識はリン酸標識を有する。
【００２５】
第２の生化学反応容器内では、上記第１の順方向プライマー３０５の第1の標識は未標識であり、上記第２の順方向プライマー３０７の第2の標識はリン酸標識を有する。また、上記第１の逆方向プライマー３１３の第1の標識はリン酸標識を有し、上記第2の逆方向プライマー３１５の第2の標識は未標識である。
【００２６】
第３の生化学反応容器内では、上記第１の順方向プライマー３０５の第1の標識はリン酸標識を有し、上記第２の順方向プライマー３０７の第2の標識は未標識である。また、上記第１の逆方向プライマー３１３の第1の標識は未標識であり、上記第2の逆方向プライマー３１５の第2の標識はリン酸標識を有する。
【００２７】
第４の生化学反応溶液内では、上記第１の順方向プライマー３０５の第1の標識はリン酸標識を有し、上記第２の順方向プライマー３０７の第2の標識は未標識である。また、上記第１の逆方向プライマー３１３の第1の標識はリン酸標識を有し、上記第2の逆方向プライマー３１５の第2の標識は未標識である。
【００２８】
これら前記４つの生化学反応容器内で標的核酸３０１のPCR増幅を行うと、第3のSNP部位にヌクレオチド「G」を有するため、第1の順方向プライマー３０５が伸長される。一方、第２の順方向プライマー３０７は、標的核酸３０１の第１のＳＮＰ部位、及び相補鎖３０３の第３のＳＮＰ部位において相補的なヌクレオチドを有しないため伸長しない。また、第２のＳＮＰ部位にヌクレオチド「Ｇ」を有するため、第１の逆方向プライマー３１３が伸長される。一方、第２の逆方向プライマー３１５は、標的核酸３０１の第２のＳＮＰ部位、及び相補鎖３０３の第４のＳＮＰ部位において相補的なヌクレオチドを有しないため伸長しない。
【００２９】
図４に示す通り、前記標的核酸３０１のPCR増幅を行った際の前記第１の生化学反応容器内においては、第１の標識３０９が未標識である第１の順方向プライマー３０５と、第１の標識３１７が未標識である第１の逆方向プライマー３１３が伸長される。
【００３０】
前記第２の生化学反応容器内においては、第１の標識３０９が未標識である第１の順方向プライマー３０５と、第１の標識３１７がリン酸標識である第１の逆方向プライマー３１３が伸長される。
【００３１】
前記第３の生化学反応容器内においては、第１の標識３０９がリン酸標識である第１の順方向プライマー３０５と、第１の標識３１７が未標識である第１の逆方向プライマー３１３が伸長される。
【００３２】
前記第４の生化学反応容器内においては、第１の標識３０９がリン酸標識である第１の順方向プライマー３０５と、第１の標識３１７がリン酸標識である第１の逆方向プライマー３１３が伸長される。
【００３３】
次いで、前記４つの生化学反応容器内で生成された増幅産物にラムダエキソヌクレアーゼ反応を行う。ラムダエキソヌクレアーゼ反応は５’末端にリン酸標識を有する二本鎖核酸を５’末端から分解していく反応である。したがって、図５に示すとおり前記第１の生化学反応容器内においては、５’末端にリン酸標識を有する増幅産物が存在しないため、分解されない。前記第２の生化学反応容器内においては、5’末端にリン酸標識を有する第1の逆方向プライマーにて伸長された鎖のみが分解される。前記第3の生化学反応容器内においては、５’末端にリン酸標識を有する第1の順方向プライマーにて伸長された鎖のみが分解される。前記第4の生化学反応容器内においては、５’末端にリン酸化標識を有する第1の順方向プライマーにて伸長された鎖と５’末端にリン酸標識を有する第１の逆方向プライマーにて伸長された鎖の両鎖が分解される。
【００３４】
次いで、前記４つの生化学反応容器内において前記ラムダエキソヌクレアーゼ反応を終えた増幅産物を電気泳動にかける。電気泳動のバンドの検出には、ＳＹＢＥＲ  ＧｒｅｅｎＩなどの二本鎖を検出するインタカレーターを使用する。そのため増幅産物が二本鎖を
形成していない場合は、検出されない。したがって前記第1の生化学反応容器内の増幅産物を電気泳動にかけると、バンドが検出される。前記第2の生化学反応容器内の増幅産物を電気泳動にかけると、第1の逆方向プライマーにて伸長された鎖がなく、一本鎖で存在するためバンドは検出されない。前記第３の生化学反応容器内の増幅産物を電気泳動にかけると、第１の順方向プライマーにて伸長された鎖がなく、一本鎖で存在するためバンドは検出されない。前記第４の生化学反応容器内の増幅産物を電気泳動にかけると、ラムダエキソヌクレアーゼによって前記したとおり両鎖とも分解されているため、バンドは検出されない。
【００３５】
電気泳動のバンドが検出された容器内にある、プライマーの５’末端が未標識であるプライマーの３’末端のヌクレオチドが、標的核酸３０１のハプロタイプである。したがって、図３における標的核酸３０１が検体核酸であるとして、その検出を行うと前記第1の生化学反応容器においてのみ電気泳動のバンドが検出されたため、標的核酸３０１の第１のＳＮＰが「Ｃ」を、第２のＳＮＰが「Ｇ」であることが決定される。
【００３６】
（染色体２本の場合）
ヒトは染色体を２本ずつ持っているため、ハプロタイプが２種存在し得る。即ち、図６において、５０１は第１の染色体を構成する核酸であり、５０３は第２の染色体を構成する核酸である。図６では、標的核酸５０１の相補鎖、及び標的核酸５０３の相補鎖は簡略のために不図示とした。そして標的核酸５０１及び標的核酸５０３の各々には、第１のＳＮＰと第２のＳＮＰが存在している。ここで、第１のＳＮＰにおける野生型のヌクレオチドが「Ｃ」、変異型のヌクレオチドが「Ｔ」、第２のＳＮＰにおける野生型のヌクレオチドが「Ｇ」、変異型のヌクレオチドが「Ｔ」であったとする。この場合、ハプロタイプには、下記表１に示した様に１０通りの組み合わせがあり得る。
【００３７】
下記表１中、標的核酸５０１と標的核酸５０３とで、ハプロタイプが一致している場合をホモ検体、不一致の場合をヘテロ検体とよぶ。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
そして前記した本発明に係るハプロタイプの検出方法は、上記表に掲げた１０通りの組み合わせの全てについて、電気泳動解析の結果、バンドが検出された生化学反応容器内に有する５’末端未標識プライマーの３’末端のヌクレオチドの種類によって一意に決定することが可能である。
【００４０】
以下具体的に説明する。
【００４１】
先ず、ホモ検体の場合、即ち、ハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｇ、Ｃ−Ｇ）、（Ｃ−Ｔ、Ｃ−Ｔ）、（Ｔ−Ｇ、Ｔ−Ｇ）および（Ｔ−Ｔ、Ｔ−Ｔ）である場合について説明する。この場合、順方向プライマー３０５、３０７及び逆方向プライマー３１３、３１５を用いて得られるＰＣＲ増幅産物をラムダエキソヌクレアーゼ反応させる。続いて電気泳動を行った結果、バンドが検出された生化学反応容器内に有する両方向の５’末端未標識のプライマーの３’末端のヌクレオチドの種類から、ハプロタイプが明らかとなる。
【００４２】
一方、ヘテロ検体の場合、以下の各ハプロタイプの組合せによって、それぞれ異なる結果を得ることができる。
【００４３】
（Ａ）ハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｇ、Ｃ−Ｔ）の場合
前記各生化学反応容器には、下記２種の増幅産物が存在する。
【００４４】
１）第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｃ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｇ」を有する増幅産物。
【００４５】
２）第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｃ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」を有する増幅産物。
【００４６】
当該ＰＣＲ増幅産物をラムダエキソヌクレアーゼ反応をさせた後、電気泳動を行った際にバンドが検出されるのは、５’末端が未標識で、かつ、３’末端のヌクレオチドと標的核酸のＳＮＰ部位が一致したプライマーが含まれる生化学反応容器からである。したがって、（Ｃ−Ｇ、Ｃ−Ｔ）のハプロタイプを有する場合、バンドが検出されるのは、下記２つの容器からである。
・5’末端が未標識で、第1の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｇ」である生化学反応容器１。
・5’末端が未標識で、第1の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器２。
【００４７】
（Ｂ）ハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｇ、Ｃ−Ｔ）の場合
前記各生化学反応容器には、下記２種の増幅産物が存在する。
【００４８】
３）第1のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｃ」、第2のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｇ」を有する増幅産物。
【００４９】
４）第1のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「T」、第2のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｇ」を有する増幅産物。
【００５０】
当該ＰＣＲ増幅産物をラムダエキソヌクレアーゼ反応をさせた後、電気泳動を行った際にバンドが検出されるのは、５’末端が未標識でかつ、３’末端のヌクレオチドと標的核酸のＳＮＰ部位が一致したプライマーが含まれる生化学反応容器からである。したがって、（Ｃ−Ｇ、Ｔ−Ｇ）のハプロタイプを有する場合、バンドが検出されるのは、下記２つの容器からである。
・5’末端が未標識で、第1の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｇ」である生化学反応容器１。
・5’末端が未標識で、第1の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｇ」である生化学反応容器３。
【００５１】
（Ｃ）ハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｇ、Ｔ−Ｔ）の場合
前記各生化学反応容器には、下記２種の増幅産物が存在する。
【００５２】
５）第1のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｃ」、第2のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｇ」を有する増幅産物。
【００５３】
６）第1のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「T」、第2のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「T」を有する増幅産物。
【００５４】
当該ＰＣＲ増幅産物をラムダエキソヌクレアーゼ反応をさせた後、電気泳動を行った際にバンドが検出されるのは、５’末端が未標識でかつ、３’末端のヌクレオチドと標的核酸のＳＮＰ部位が一致したプライマーが含まれる生化学反応容器からである。したがって、（Ｃ−Ｇ、Ｔ−Ｔ）のハプロタイプを有する場合、バンドが検出されるのは、下記２つの容器からである。
・5’末端が未標識で、第1の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｇ」である生化学反応容器１。
・5’末端が未標識で、第1の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器４。
【００５５】
（Ｄ）ハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｔ、Ｔ−Ｇ）の場合
前記各生化学反応容器には、下記２種の増幅産物が存在する。
【００５６】
７）第1のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｃ」、第2のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」を有する増幅産物。
【００５７】
８）第1のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「T」、第2のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「G」を有する増幅産物。
【００５８】
当該ＰＣＲ増幅産物をラムダエキソヌクレアーゼ反応をさせた後、電気泳動を行った際にバンドが検出されるのは、５’末端が未標識でかつ、３’末端のヌクレオチドと標的核酸のＳＮＰ部位が一致したプライマーが含まれる生化学反応容器からである。したがって、（Ｃ−Ｔ、Ｔ−Ｇ）のハプロタイプを有する場合、バンドが検出されるのは、下記２つの容器からである。
・5’末端が未標識で、第1の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器２。
・5’末端が未標識で、第1の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｇ」である生化学反応容器３。
【００５９】
（Ｅ）ハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｔ、Ｔ−Ｔ）の場合
前記各生化学反応容器には、下記２種の増幅産物が存在する。
【００６０】
９）第1のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｃ」、第2のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」を有する増幅産物。
【００６１】
１０）第1のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「T」、第2のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」を有する増幅産物。
【００６２】
当該ＰＣＲ増幅産物をラムダエキソヌクレアーゼ反応をさせた後、電気泳動を行った際にバンドが検出されるのは、５’末端が未標識でかつ、３’末端のヌクレオチドと標的核酸のＳＮＰ部位が一致したプライマーが含まれる生化学反応容器からである。したがって、（Ｃ−Ｔ、Ｔ−Ｔ）のハプロタイプを有する場合、バンドが検出されるのは、下記２つの容器からである。
・5’末端が未標識で、第1の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器２。
・5’末端が未標識で、第1の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器４。
【００６３】
（Ｆ）ハプロタイプの組み合わせが（Ｔ−Ｇ、Ｔ−Ｔ）の場合
前記各生化学反応容器には、下記２種の増幅産物が存在する。
【００６４】
１１）第1のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」、第2のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｇ」を有する増幅産物。
【００６５】
１２）第1のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」、第2のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「T」を有する増幅産物。
【００６６】
当該ＰＣＲ増幅産物をラムダエキソヌクレアーゼ反応をさせた後、電気泳動を行った際にバンドが検出されるのは、５’末端が未標識でかつ、３’末端のヌクレオチドと標的核酸のＳＮＰ部位が一致したプライマーが含まれる生化学反応容器からである。したがって、（Ｔ−Ｇ、Ｔ−Ｔ）のハプロタイプを有する場合、バンドが検出されるのは、下記２つの容器からである。
・5’末端が未標識で、第1の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｇ」である生化学反応容器３。
・5’末端が未標識で、第1の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器４。
【００６７】
以上のとおり、本発明によれば、アレル特異的なＰＣＲとラムダエキソヌクレアーゼ反応と電気泳動解析の結果から、ヘテロ検体のハプロタイプの種類が決定される。
【００６８】
（ターゲットの準備）
検体由来の核酸の増幅反応（ＰＣＲ）の例を以下に説明する。まず、増幅反応液を用意する。増幅反応液の組成の例を以下に示す。
【００６９】
--PCR溶液組成--
・Expand Long Enzyme Mix (Roche)：0.3μl
・Template Genome DNA：〜5ng
・Forward/Reverse Primer：各0.12μM
・dNTP（10mM）：0.7 μl
・buffer 1：2 μl
・H2O：11.4 μl
合計：20μl
上記組成の反応液を、図２２に示す温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラー（Ｔ3000サーモサイクラー：Ｂｉｏｍｅｔｒａ社）を用い増幅反応を行う。反応終了後、精製用カラム（QUIAGEN QIAquick PCR Purification Kit: QUIGEN社製）を用いてPrimerを除去した後、電気泳動（BioAnalyzer: Agilent社製）により、増幅産物の定量を行う。プライマーは、検出対象のDNAの配列から決定しようとしているハプロタイプを有する部分を増幅可能となるものを、検出対象としてのDNAの配列に応じて設計する。
【００７０】
（アレル特異的PCR）
前述の増幅したPCR産物を用い、アレル特異的PCRを行う。増幅では5’末端リン酸標識あるいは未標識のPrimerを用いてPCRを行う。このときのプロトコルの例を以下に示す。
【００７１】
--PCR溶液組成--
・AmpliTaq Gold (Applied Biosystems)：0.2 μl
・Template Genome DNA：4 ng
・Forward/Reverse Primer：各0.06 μM
・dNTP mix：各0.2 μM
・10xbuffer：2.5 μl
・H2O：16.3 μl
・合計：25 μl
上記組成の反応液を図２３の温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラー（Ｔ3000サーモサイクラー：Ｂｉｏｍｅｔｒａ社）を用い増幅反応を行う。
【００７２】
反応終了後、精製用カラム（QUIAGEN QIAquick PCR Purification Kit: QUIGEN社製）を用いてPrimerを除去した後、電気泳動（BioAnalyzer: Agilent社製）により、増幅産物の定量を行う。
【００７３】
（ラムダエキソヌクレアーゼ反応）
前述のアレル特異的PCR産物に対してラムダエキソヌクレアーゼ反応を行う。この時のプロトコルの例を以下に示す。
【００７４】
--ラムダエキソヌクレアーゼ反応溶液組成--
・アレル特異的PCR産物：〜200ng
・10×Strandase Buffer：1 μl
・Strandase λ Exonuclease(Novagen)：1μl
・合計：10μl
上記組成の反応液を以下のプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い、反応を行う。
--ラムダエキソヌクレアーゼ反応プロトコル--
37℃    20分
70℃    20分
（電気泳動）
前述のラムダエキソヌクレアーゼ反応を行った生成物を電気泳動（BioAnalyzer: Agilent社製）にかけて、バンドの有無を確認する。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）2つの多型部位のハプロタイプ検出法
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
【００７６】
まずターゲットの準備として、CYP２D6領域を特異的に増幅した。ターゲットの準備は先に記載した実施様態例に従った。プライマーは下記２つの配列を用いた。
配列a）5’  GTTATCCCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA  3’
配列b）5’  GCCGACTGAGCCCTGGGAGGTAGGTA  3’
次に第１の多型C100Tおよび第2の多型G310Tのハプロタイプを決定するためのアレル特異的なプライマーの設計を行った。
配列ｃ)  5’  GGGCTGCACGCTACC  3’−C100TW
配列ｄ)  5’  GGGCTGCACGCTACT  3’−C100TM
配列e)  5’  TGTATAAATGCCCTTCTCCAGGAC  3’−G310TW
配列ｆ)  5’  ATGTATAAATGCCCTTCTCCAGGAA  3’−G310TM
ここで第１の順方向プライマーｃ)は、3’末端に多型C100T野生型ヌクレオチド「C」有する。また、第２の順方向プライマーｄ)は、3’末端に多型C100T変異型ヌクレオチド「T」を有する。さらに、第１の逆方向プライマーe)は、3’末端に多型G310T野生型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド「C」を有する。また、第２の逆方向プライマーf)は3’末端に多型G310T変異型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド「A」を有する。
【００７７】
表２に示した各検体に関して上記プライマーを用いてPCR後、精製および電気泳動による定量を行った。精製および電気泳動の各工程は実施様態例に従った。
【００７８】
【表２】
2009232764.tif 000003
【００７９】
上記工程で得られた増幅産物をラムダエキソヌクレアーゼ反応に供した。ラムダエキソヌクレアーゼ反応の各工程は先に記載した実施様態例に従った。また、この工程で得られたラムダエキソヌクレアーゼ反応物を電気泳動にかけて、ハプロタイプの決定を行った。電気泳動解析は先に記載した実施様態例に従った。
【００８０】
以下、各検体に関して得られた解析結果を図示し、ハプロタイプの決定を行う。
【００８１】
（アレル1/1）
図７は、鋳型DNAとしてC100TおよびG310Tの両多型に関して全て野生型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図７に示したとおり、5’末端が未標識で、第1の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｇ」である生化学反応容器１からのみ産物が検出されている。したがって、本検体の第1の多型C100Tは共にCであることがわかる。また、第2の多型G310Tは共にGであることがわかる。以上のことから、本検体のハプロタイプはC-G、C-Gと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００８２】
（アレル10/10）
図８は、鋳型DNAとしてC100TおよびG310Tの両多型に関して全て変異型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図８に示したとおり、5’末端が未標識で、第２の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」、５’末端が未標識で、第２の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器４からのみ産物が検出されている。したがって、本検体の第1の多型C100Tは共にＴであることがわかる。また、第2の多型G310Tは共にＴであることがわかる。以上のことから、本検体のハプロタイプはＴ-Ｔ、Ｔ-Ｔと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００８３】
（アレル10/1）
図９は、鋳型DNAとしてC100Tに関してＣおよびＴ、G310Tに関してＧおよびＴを有する検体を用いた場合の解析結果である。図９に示したとおり、5’末端が未標識で、第１の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｇ」である生化学反応容器１から産物が検出されている。このことから、本検体のハプロタイプの一つはＣ−Ｇであると決定できる。また、5’末端が未標識で、第２の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」、５’末端が未標識で、第２の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器４から産物が検出されている。このことから、本検体のハプロタイプの一つはＴ−Ｔであると決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００８４】
（アレル10/2）
図１０は、鋳型DNAとしてC100Tに関してＣおよびＴ、G310Tに関してＴを有する検体を用いた場合の解析結果である。図１０に示したとおり、5’末端が未標識で、第１の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第２の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器２から産物が検出されている。このことから、本検体のハプロタイプの一つはＣ−Ｔであると決定できる。また、5’末端が未標識で、第２の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」、５’末端が未標識で、第２の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器４から産物が検出されている。このことから、本検体のハプロタイプの一つはＴ−Ｔであると決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００８５】
（アレル2/1）
図１１は、鋳型DNAとしてC100Tに関してＣ、G310Tに関してＧおよびＴを有する検体を用いた場合の解析結果である。図１１に示したとおり、5’末端が未標識で、第１の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｇ」である生化学反応容器１から産物が検出されている。このことから、本検体のハプロタイプの一つはＣ−Ｇであると決定できる。また、5’末端が未標識で、第１の順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第２の逆方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器２から産物が検出されている。このことから、本検体のハプロタイプの一つはＣ−Ｔであると決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【００８６】
本実施例１で示したとおり、本発明の手法で得られる電気泳動のパターンはアレルから予想されるパターンと一致する。従って、本発明を用いることで同一染色体上に存在するSNPの組み合わせを一意に決定することができる。
【００８７】
（実施例２）３箇所の多型のハプロタイプ検出法
実施例２では３箇所の多型のハプロタイプ検出法について示す。多型部位がC100TおよびG214CおよびG310Tからなる場合、C100TとG214Cのペアと、C100TとG310Tのペアと、G214CとG310Tのペアで実施例１に示したようにハプロタイプを検出する。そして、各ペアの結果から総合判断してハプロタイプを決定する。
【００８８】
以下、詳細に説明する。
【００８９】
ターゲットの準備は実施例１と同様に行った。第１の多型C100Tと第3の多型G310Tのアレル特異的なプライマーには実施例１と同じものを使用した。第2の多型G214Cのアレル特異的なプライマーとして、C100Tとのハプロタイプ検出を行うためのプライマー設計を行った。
配列g)  5’  GGTAGGGGAGCCTCAGC  3’−G214CW
配列h)  5’  GGTGGGGCATCCTCAGG  3’−G214CM
次いで、G310Tとのハプロタイプ検出を行うためのプライマー設計を行った。
配列i)  5’  GAGGGCGGCAGAGGTG  3’−G214CW
配列j)  5’  GAGGGCGGCAGAGGTC  3’−G214CM
ここで、C100TとG214Cのハプロタイプを検出する際に、第１の順方向プライマーｃ)は、3’末端に多型C100T野生型ヌクレオチド「C」を有する。第２の順方向プライマーｄ)は、3’末端に多型C100T変異型ヌクレオチド「T」を有する。第１の逆方向プライマーｇ)は、3’末端に多型G２１４C野生型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド「C」を有する。第２の逆方向プライマーh)は3’末端に多型G214C変異型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド「G」を有する。
【００９０】
G214CとG310Tのハプロタイプを検出する際に、第1の順方向プライマーi)は、3’末端に多型G214C野生型ヌクレオチド「G」を有する。第2の順方向プライマーj）は3’末端に多型G214C野生型ヌクレオチド「C」を有する。第1の逆方向プライマーe）は、３’末端に多型G310T野生型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド「C」を有する。第2の逆方向プライマーf）は３’末端に多型G310Tの変異型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド「A」を有する。
【００９１】
C100T、G310Tのハプロタイプを検出する際には実施例１と同様に行った。そして、PCR増幅は、以下のとおり１２個の生化学反応容器内で行われる。
【００９２】
第1から第４までの生化学反応容器には、C100TとG214Cのハプロタイプを検出するためのプライマーを含む。そして、第５から第８までの生化学反応容器には、G214CとG310Tのハプロタイプを検出するためのプライマーを含む。そして、C100T、G310Tのハプロタイプを検出するためのプライマーは実施例１と同様に行った。
【００９３】
第１の生化学反応容器内では、上記５’末端が未標識で3'末端にC100Tの野生型ヌクレオチドを有する順方向プライマーと、上記5'末端がリン酸標識で３’末端にC100Tの変異型ヌクレオチドを有する順方向プライマーを有する。上記５’末端が未標識で3'末端にG214Cの野生型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーと、上記5'末端がリン酸標識で３’末端にG214Cの変異型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーを有する。
【００９４】
第２の生化学反応容器内では、上記５’末端が未標識で３’末端にC100Tの野生型ヌクレオチドを有する順方向プライマーと、上記5'末端がリン酸標識で３’末端にC100Tの変異型ヌクレオチドを有する順方向プライマーを有する。上記５’末端がリン酸標識で3'末端にG214Cの野生型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーと、上記5'末端が未標識で３’末端にG214Cの変異型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーを有する。
【００９５】
第３の生化学反応容器内では、上記５’末端がリン酸標識で3'末端にC100Tの野生型ヌクレオチドを有する順方向プライマーと、上記5'末端が未標識で３’末端にC100Tの変異型ヌクレオチドを有する順方向プライマーを有する。上記５’末端が未標識で3'末端にG214Cの野生型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーと、上記5'末端がリン酸標識で３’末端にG214Cの変異型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーを有する。
【００９６】
第４の生化学反応容器内では、上記５’末端がリン酸標識で３’末端にC100Tの野生型ヌクレオチドを有する順方向プライマーと、上記5'末端が未標識で３’末端にC100Tの野生型ヌクレオチドを有する順方向プライマーを有する。上記５’末端が未標識で３’末端にG214Cの野生型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーと、上記5'末端が未標識で３’末端にG214Cの変異型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーを有する。
【００９７】
第５の生化学反応容器内では、上記５’末端が未標識で3'末端にG214Cの野生型ヌクレオチドを有する順方向プライマーと、上記5'末端がリン酸標識で３’末端にG214Cの変異型ヌクレオチドを有する順方向プライマーを有する。上記５’末端が未標識で3'末端にG310Tの野生型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーと、上記5'末端がリン酸標識で３’末端にG310Tの変異型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーを有する。
【００９８】
第６の生化学反応容器内では、上記５’末端が未標識で3'末端にG214Cの野生型ヌクレオチドを有する順方向プライマーと、上記5'末端がリン酸標識で３’末端にG214Cの変異型ヌクレオチドを有する順方向プライマーを有する。上記５’末端がリン酸標識で3'末端にG310Tの野生型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーと、上記5'末端が未標識で３’末端にG310Tの変異型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーを有する。
【００９９】
第７の生化学反応容器内では、上記５’末端がリン酸標識で3'末端にG214Cの野生型ヌクレオチドを有する順方向プライマーと、上記5'末端が未標識で３’末端にG214Cの変異型ヌクレオチドを有する順方向プライマーを有する。上記５’末端が未標識で3'末端にG310Tの野生型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーと、上記5'末端がリン酸標識で３’末端にG310Tの変異型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーを有する。
【０１００】
第８の生化学反応容器内では、上記５’末端がリン酸標識で3'末端にG214Cの野生型ヌクレオチドを有する順方向プライマーと、上記5'末端が未標識で３’末端にG214Cの野生型ヌクレオチドを有する順方向プライマーを有する。上記５’末端が未標識で3'末端にG310Tの野生型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーと、上記5'末端が未標識で３’末端にG310Tの変異型ヌクレオチドを有する逆方向プライマーを有する。
【０１０１】
表３に示した各検体に関して上記プライマーを用いてPCR後、精製および電気泳動による定量を行った。精製および電気泳動の各工程は先に記載した実施様態例に従った。
【０１０２】
【表３】
2009232764.tif 000004
【０１０３】
上記工程で得られた増幅産物をラムダエキソヌクレアーゼ反応に供した。ラムダエキソヌクレアーゼ反応の各工程は先に記載した実施様態例に従った。この工程で得られたラムダエキソヌクレアーゼ反応物を電気泳動にかけて、ハプロタイプの決定を行った。電気泳動解析は先に記載した実施様態例に従った。
【０１０４】
以下、各検体に関して得られた解析結果を図示し、ハプロタイプの決定を行った。
【０１０５】
（アレル1/1）
図１２、１３は、鋳型DNAとしてC100TおよびG214CおよびG310Tの両多型に関して全て野生型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図12は、C100TとG214Cのハプロタイプの解析結果を示す。図１２に示したとおり、5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「G」である生化学反応容器１からのみ産物が検出されている。また、図１３は、G214CとG310Tのハプロタイプの解析結果を示す。図１３に示したとおり、5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「G」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「Ｇ」である生化学反応容器５からのみ産物が検出されている。したがって、本検体の第1の多型C100Tは共にCであることがわかる。第2の多型G214Cは共にGであることもわかる。第3の多型G310Tは共にGであることもわかる。以上のことから、本検体のハプロタイプはC-G-G、C-G-Gと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【０１０６】
（アレル10/10）
図１４、１５は、鋳型DNAとしてC100TおよびG214CおよびG310Tの両多型に関して全て変異型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図1４は、C100TとG214Cのハプロタイプの解析結果を示す。図１４に示したとおり、5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「T」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「G」である生化学反応容器３からのみ産物が検出されている。一方、図１５は、G214CとG310Tのハプロタイプの解析結果を示す。図１５に示したとおり、5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「G」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「T」である生化学反応容器６からのみ産物が検出されている。したがって、本検体の第1の多型C100Tは共にTであることがわかる。また、第2の多型G214Cは共にGであることがわかる。第3の多型G310Tは共にTであることもわかる。。以上のことから、本検体のハプロタイプはT-G-T、T-G-Tと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【０１０７】
（アレル10/1）
図１６、１７は、鋳型DNAとしてC100TおよびG214CおよびG310Tの両多型に関して全て変異型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図1６は、C100TとG214Cのハプロタイプの解析結果を示す。図１６に示したとおり、5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「C」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「G」である生化学反応容器１から産物が検出されている。5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「T」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「G」である生化学反応容器３からも産物が検出されている。
【０１０８】
一方、図１７は、G214CとG310Tのハプロタイプの解析結果を示す。図１７に示したとおり、5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「G」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「G」である生化学反応容器５から産物が検出されている。5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「G」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「T」である生化学反応容器６からも産物が検出されている。
【０１０９】
C100TとG310Tのハプロタイプを検出した図９に示したとおり、5’末端が未標識で、順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「Ｇ」である生化学反応容器１から産物が検出されている。5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器４から産物が検出されている。
【０１１０】
以上のことから総合して判断すると、本検体のハプロタイプはC-G-G、T-G-Tと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【０１１１】
（アレル10/2）
図１８、１９は、鋳型DNAとしてC100TおよびG214CおよびG310Tの両多型に関して全て変異型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図1８は、C100TとG214Cのハプロタイプの解析結果を示す。図１８に示したとおり、5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「C」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「C」である生化学反応容器２から産物が検出されている。5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「T」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「G」である生化学反応容器３からも産物が検出されている。
【０１１２】
図１９は、G214CとG310Tのハプロタイプの解析結果を示す。図１９に示したとおり、5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「C」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「T」である生化学反応容器８から産物が検出されている。5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「G」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「T」である生化学反応容器６からも産物が検出されている。
【０１１３】
C100TとG310Tのハプロタイプを検出した図１０に示したとおり、5’末端が未標識で、順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「T」である生化学反応容器２から産物が検出されている。5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｔ」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器４から産物が検出されている。
【０１１４】
以上のことから総合して判断すると、本検体のハプロタイプはC-C-T、T-G-Tと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【０１１５】
（アレル2/1）
図２０、２１は、鋳型DNAとしてC100TおよびG214CおよびG310Tの両多型に関して全て変異型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図２０は、C100TとG214Cのハプロタイプの解析結果を示す。図２０に示したとおり、5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「C」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「G」である生化学反応容器１から産物が検出されている。5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「C」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「C」である生化学反応容器２からも産物が検出されている。
【０１１６】
図２１は、G214CとG310Tのハプロタイプの解析結果を示す。図２１に示したとおり、5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「G」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「G」である生化学反応容器５から産物が検出されている。5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「C」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「T」である生化学反応容器８からも産物が検出されている。
【０１１７】
C100TとG310Tのハプロタイプを検出した図１１に示したとおり、5’末端が未標識で、順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「Ｃ」、５’末端が未標識で、第１の逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「G」である生化学反応容器１から産物が検出されている。5’末端が未標識な順方向プライマーの３’末端のヌクレオチドが「C」、５’末端が未標識な逆方向プライマーの３’末端の相補的なヌクレオチドが「Ｔ」である生化学反応容器２から産物が検出されている。
【０１１８】
以上のことから総合して判断すると、本検体のハプロタイプはC-G-G、C-C-Tと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。
【０１１９】
本実施例２で示したとおり、本発明の手法で得られる電気泳動のパターンはアレルから予想されるパターンと一致する。従って、本発明を用いることで同一染色体上に存在するSNPの組み合わせを一意に決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】ハプロタイプの説明図である。
【図２】ハプロタイプの説明図である。
【図３】本発明に係るハプロタイプの検出原理の説明図である。
【図４】図３に係るPCR増幅により得られる増幅産物の説明図である。
【図５】図４に係るPCR増幅後のラムダエキソヌクレアーゼ処理後の説明図である。
【図６】染色体２本の場合のハプロタイプの説明図である。
【図７】アレル1/1検体の解析結果（C100TとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。
【図８】アレル10/10検体の解析結果（C100TとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。
【図９】アレル10/1検体の解析結果（C100TとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。
【図１０】アレル10/2検体の解析結果（C100TとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。
【図１１】アレル2/1検体の解析結果（C100TとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。
【図１２】アレル1/1検体の解析結果（C100TとG214Cのハプロタイプ）を示す図である。
【図１３】アレル1/1検体の解析結果（G214CとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。
【図１４】アレル10/10検体の解析結果（C100TとG214Cのハプロタイプ）を示す図である。
【図１５】アレル10/10検体の解析結果（G214CとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。
【図１６】アレル10/1検体の解析結果（C100TとG214Cのハプロタイプ）を示す図である。
【図１７】アレル10/1検体の解析結果（G214CとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。
【図１８】アレル10/2検体の解析結果（C100TとG214Cのハプロタイプ）を示す図である。
【図１９】アレル10/2検体の解析結果（G214CとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。
【図２０】アレル2/1検体の解析結果（C100TとG214Cのハプロタイプ）を示す図である。
【図２１】アレル2/1検体の解析結果（G214CとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。
【図２２】ＰＣＲ反応における温度条件を示す図である。
【図２３】ＰＣＲ反応における温度条件を示す図である。
【符号の説明】
【０１２１】
３０１：標的核酸
３０３：標的核酸の相補鎖
３０５：第１の順方向プライマー
３０７：第２の順方向プライマー
３０９：第１の順方向プライマーに修飾される第１の標識
３１１：第２の順方向プライマーに修飾される第２の標識
３１３：第１の逆方向プライマー
３１５：第２の逆方向プライマー
３１７：第１の逆方向プライマーに修飾される第１の標識
３１９：第２の逆方向プライマーに修飾される第２の標識
５０１：第１の染色体を構成する核酸
５０３：第２の染色体を構成する核酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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