(57)【要約】【課題】安定性の高い２００ｎｍ以下の小さな一枚膜リポソームを用いて、高感度に測定できるアナライトの測定方法を提供する。【解決手段】標識物質内封リポソーム−リガンド複合体とアナライトとを結合させて標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体を形成する複合体形成工程と、前記標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体と標識物質内封リポソームあるいは前記標識物質内封リポソーム−リガンド複合体の一方もしくは両方とを凝集させる凝集工程と、前記凝集工程において未凝集の物質を分離する分離工程と、前記標識物質内封リポソームあるいは前記標識物質内封リポソーム−リガンド複合体の一方もしくは両方が凝集した前記標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体を測定する測定工程と、からなるアナライトの測定方法。【選択図】図１
2009198283.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識物質内封リポソーム−リガンド複合体とアナライトとを結合させて標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体を形成する複合体形成工程と、
前記標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体と標識物質内封リポソームあるいは前記標識物質内封リポソーム−リガンド複合体の一方もしくは両方とを凝集させる凝集工程と、
前記凝集工程において未凝集の物質を分離する分離工程と、
前記標識物質内封リポソームあるいは前記標識物質内封リポソーム−リガンド複合体の一方もしくは両方が凝集した前記標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体を測定する測定工程と、
からなるアナライトの測定方法。
【請求項２】
前記アナライトは、抗原、抗体、核酸の少なくとも１つを含むリガンドと特異的に結合し得るものである、請求項１記載のアナライトの測定方法。
【請求項３】
前記リガンドは、抗原、抗体、核酸の少なくとも１つを含むアナライトと特異的に結合し得るものである、請求項１及び２記載のアナライトの測定方法。
【請求項４】
前記リポソームは、粒径２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の小さな一枚膜リポソームである、請求項１〜３記載のアナライトの測定方法。
【請求項５】
前記リガンドとアナライトの結合反応は、抗原抗体反応である、請求項１〜４記載のアナライトの測定方法。
【請求項６】
前記リガンドとアナライトの結合反応は、核酸のハイブリダイズである、請求項１〜５記載のアナライトの測定方法。
【請求項７】
前記リポソームに内封された標識物質は、電気化学発光、蛍光、化学発光、発色を示す物質を含む、請求項１〜６記載のアナライトの検出方法。
【請求項８】
請求項７記載の電気化学発光を示す物質が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペレリン、ビナフチル、オクタテトラエン、ゲルマニウム粒子、シリコン粒子の少なくとも１つを含む、アナライトの測定方法。
【請求項９】
請求項８記載の配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体であることを含む、アナライトの測定方法。
【請求項１０】
請求項９記載のピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン、金属フェナントロリン錯体の少なくとも１つを含む、アナライトの測定方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、オスミウムの少なくとも１つである、アナライトの測定方法。
【請求項１２】
前記凝集工程は塩（えん）の添加により凝集させる請求項１記載のアナライトの測定方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の塩（えん）は金属元素からなる陽イオンと非金属元素からなる陰イオンとがイオン結合した化学物質であるアナライトの測定方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の塩（えん）濃度として、５０ｍＭ以上であるアナライトの測定方法。
【請求項１５】
リポソームが凝集した該リポソーム−リガンド−アナライト複合体と未凝集のリポソームを分離は、クロマトグラフィーにより分離される、請求項１〜１４載のアナライトの測定方法。
【請求項１６】
前記リポソーム−リガンド−レセプタ複合体を検出は、電気化学的に検出されるものである、請求項１〜１５記載のアナライトの測定方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の電気化学的検出手段として、電気化学発光により検出されるものである、アナライトの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アナライトの測定方法に関し、より詳細には、リポソーム−リガンド複合体を用いたアナライトの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗原を感度良く検出するために、抗体に酵素で標識したものを用いるＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ−Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）が広く使用されている。一般に、ＥＬＩＳＡ法の分析ステップとしては披検物質のタンパク質のタンパク質との抗原抗体反応、二次抗体との抗原抗体反応、酵素反応による発色反応の３ステップから構成されている。ＥＬＩＳＡ法の検出感度は、概ねタンパク質０．００１〜０．１μｇ程度なので、生体内の極微量の抗原の検出には不向きである。そのため、リポソームによるリポソーム感度増幅法が知られている。
【０００３】
リポソーム感度増幅法は、糖脂質またはリン脂質の脂質二分子膜で形成されたリポソーム内水相に標識物質を内封し、リポソーム表面にリガンドを固定化したリポソーム−リガンド複合体を用いてアナライトを測定する手法である。つまり、リポソーム内水相に数多くの標識物質を内封できるため、シグナルを上昇させることができるため、微量の生体分子であるＤＮＡ、環境汚染物質、癌マーカーのような微量の生体分子の測定が期待され、リポソームに内封する標識物質として、化学発光物質や電気化学発光物質を内封した手法が提案されている（例えば、特許文献１及び２参照。）。
【０００４】
一般的に生体分子のリポソームは、粒径の均一な一枚膜リポソームが用いられる。一枚膜リポソームには、粒径が２０ｎｍ〜２００ｎｍの小さな一枚膜リポソームと２００ｎｍ以上の大きな一枚膜リポソームに大別される。リポソーム粒径が大きくなるに従って、リポソーム内水相の体積が増加するため、多量の標識物質を内封することができる。
【特許文献１】特表２０００−５０９４９４号公報
【特許文献２】特開２００７−１０１３３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記従来の構成では、リポソーム粒径を大きくすると標識剤を多く封入できるので、高感度測定が可能になるが、リポソーム粒径が大きくなると構造的に不安定になり、リポソームの崩壊に繋がる。従って、安定性を考慮する上で、リポソーム粒径を大きくするのには限界があるので、検出感度の向上が抑えられるという課題を有していた。
【０００６】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、リポソーム粒径の大きさによらず、高感度な測定ができるアナライトの測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記従来の課題を解決するために、本発明のアナライトの測定方法は、標識物質内封リポソーム−リガンド複合体とアナライトとを結合させて標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体を形成する複合体形成工程と、前記標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体と標識物質内封リポソームあるいは前記標識物質内封リポソーム−リガンド複合体の一方もしくは両方とを凝集させる凝集工程と、前記凝集工程において未凝集の物質を分離する分離工程と、前記標識物質内封リポソームあるいは前記標識物質内封リポソーム−リガンド複合体の一方もしくは両方が凝集した前記標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体を測定する測定工程とからなることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のリポソームを用いたアナライトの測定方法によれば、安定性の高い粒径２０ｎｍ〜２００ｎｍの標識物質を内封した一枚膜リポソームを作製し、これらのリポソームを凝集させることにより、高感度にアナライトを測定することができる。また、本発明のリポソームを用いたアナライトの測定方法によれば、２０ｎｍ〜２００ｎｍの小さな一枚膜リポソームを用いることで、アナライトとリガンドとの結合反応の立体障害を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本発明のアナライトの測定方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１０】
（実施の形態１）
図１は、本発明のアナライトの測定手順を示した図である。本発明のアナライトの測定方法は、リポソーム内部に標識物質を内封し、リポソーム表面にリガンドを固定化した標識物質内封リポソーム−リガンド複合体をアナライトの分析試薬として用いる。
【００１１】
（ａ）測定準備
図１（ａ）に示すように、リポソーム表面にリガンドを修飾した標識物質内封リポソームリガンド複合体とアナライトを準備する。
【００１２】
本発明に用いられるリポソーム１は、リン脂質及び糖脂質の少なくともいずれか一方を主要構成成分とした粒径２０ｎｍ〜２００ｎｍの小さな一枚膜リポソームである。リン脂質及び糖脂質は特に限定されるものではなく、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）等が挙げられる。これらリン脂質、糖脂質中の脂肪酸炭素鎖は、炭素原子数が１２〜１８であることが好ましい。また、リポソーム１の表面にリガンド３を固定するために、リン脂質及び糖脂質の一部に抗体修飾基を結合させる。このような物質として、Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）がある。なお、安定性を増すために、必要に応じてリン脂質、糖脂質に対してコレステロールを１０〜５００モル％の割合で加えたり、脂質酸化防止のためα−トコフェロールを加えてもよく、リポソームの特性に応じて適宜加えたりすることができる。
【００１３】
リポソーム１の表面に修飾するリガンド３には、抗体、抗原、ＤＮＡのような核酸が挙げられ、アナライト４と特異的に結合できるものを使用する。
【００１４】
本発明の実施の形態１のリポソーム１に内封する標識物質２には、電気化学発光を示すルテニウム錯体を用いたが、親水性でリポソーム１に内封された標識物質量とアナライト量とが相関のあるシグナルを示すものであれば特に限定されない。このような物質としては、カルボキシフルオロセリンのような蛍光物質、ルミノールのような発光物質、可視域又は紫外域に特異的な吸収帯を有する吸光性化合物などが挙げられる。また、測定方法及び測定条件においても、リポソーム１に内封した標識物質２に応じて適宜定めることができるものとする。
【００１５】
（ｂ）標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体の形成
図１（ｂ）に示すように、標識物質内封抗体修飾リポソームとアナライトとを混合させ、標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体を形成させる。
【００１６】
この際のアナライトは、単に標識物質内封リポソーム−リガンド複合体と結合したものでもよいし、あらかじめ抗原を他の捕捉リガンドと結合させたものと、標識物質内封リポソーム−リガンド複合体とを結合させるサンドイッチ反応を用いてもよく、アナライトに応じて適宜定めることができる。
【００１７】
（ｃ）及び（ｄ）凝集体形成
図１（ｃ）と図１（ｄ）に示すように、標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体に対し、標識物質内封リポソームを凝集させる。
【００１８】
本発明のリポソームの凝集工程は、塩（えん）の添加により誘導される。これは、リポソーム表面に存在する親水基が水中に分散することで水和したリポソームが、ある一定量以上の塩（えん）を加えることで、リポソーム周辺の水分子を奪い取り、その結果、リポソームが集まってくる現象であると考えられる。本発明に用いられる塩（えん）は、マグネシウムイオンやナトリウムイオン、カルシウムイオン等の金属元素からなる陽イオンと塩化物イオンや硫酸イオン、酢酸イオン等の非金属元素からなる陰イオンとがイオン結合した化学物質のことである。このようなものとして、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等がある。
【００１９】
この際に凝集させる標識物質内封リポソームは、反応用液中に存在するアナライトと結合しなかったリガンド−アナライト複合体を凝集させてもよいし、新たに追加させた標識物質内封リポソームを凝集してもよいし、その両方を同時に行ってもよい。ただし、新たに標識物質内封リポソームを追加させる場合は、標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体の形成後に、未結合の標識物質内封リポソーム−リガンド複合体を分離及び除去する必要がある。
【００２０】
（ｅ）及び（ｆ）未反応物の分離及び測定
最後に、図１（ｅ）と図1（ｆ）に示すように、選択的に標識物質内封リポソーム−リガンド−アナライト複合体を分離させ、標識物質に応じた測定を行う。この際の未反応物の分離には、磁気ビーズを用いた分離や固相への固定による分離を用いてもよく、測定手法に応じて適宜定めることができるものとする。
【００２１】
以下、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α：腫瘍壊死因子）をアナライトとして用いた場合の本発明の測定手順を具体的に説明する。
【００２２】
本発明のアナライトの測定方法の実施の形態１では、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ及びコレステロールから構成されるリポソーム、標識物質として電気化学発光体であるルテニウム錯体、リガンドとして、ストレプトアビジンを用いた。また、アナライトとして、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ−αを用いた。
【００２３】
まず、以下の手順により標識物質内封リポソーム−リガンド複合体であるＲｕ錯体内封ストレプトアビジン修飾リポソームを調製した。
【００２４】
（１）活性型ＤＰＰＥの調製
ＤＰＰＥ１０μｍｏｌ、ＳＰＤＰ１２μｍｏｌ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）２０μｍｏｌをクロロホルム／無水メタノール＝９：１溶液に溶解し、室温にて２時間攪拌した。２時間攪拌後、リン酸二水素カリウムからなる１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加えて激しく攪拌し、上相を取り除く。ついで蒸留水を加えて激しく攪拌し、上相を取り除き、下相を採取した。採取した下相の溶媒を留去し、１２時間、減圧乾燥し、活性型ＤＰＰＥを得た。
【００２５】
（２）小さな一枚膜リポソームの調製
ナス型フラスコ中で、クロロホルム／無水メタノール＝９：１溶液にそれぞれ溶解したＤＰＰＣ１０μｍｏｌ、活性型ＤＰＰＥ０．０３μｍｏｌ、コレステロール１０μｍｏｌを入れ、エバポレーターにて溶媒を留去し、フラスコ内壁に脂質フィルムを形成した。この脂質フィルムを減圧乾燥した後、標識剤として５ｍＭのルテニウム（Ｒｕ）錯体溶液１ｍＬを注入し、脂質フィルムが形成したナス型フラスコを激しく攪拌し、フラスコ内壁の脂質フィルムを剥がし、Ｒｕ錯体が内封された多重層リポソームを形成した。調製したＲｕ錯体内封多重層リポソームに対し、エクストルーダーを用いて１００ｎｍのフィルターを通すことによりサイジングを行い、ルテニウム錯体内封一枚膜リポソームを調整した。
【００２６】
（３）ＳＰＤＰ修飾ストレプトアビジンの調製
ＳＰＤＰ３．２×１０-6ｍｏｌを無水メタノール５００μＬに溶解させた。そのうち５μＬを１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解させたストレプトアビジン１ｍｇ／ｍＬに加えて、室温にて３０分間、インキュベートした。インキュベートしたストレプトアビジンを１００ｍＭ酢酸緩衝液中（ｐＨ４．５）で２４時間、透析（分画分子量：３５００ダルトン）を行った。
【００２７】
（４）Ｒｕ錯体内封ストレプトアビジン修飾リポソームの調製
透析後のＳＰＤＰ修飾ストレプトアビジンを、５００μＬの酢酸緩衝液にジチオスレイトール（ＤＴＴ）３．９μｇを溶解させたＤＴＴ溶液を添加して、３０分間室温でインキュベートした。その後、ＳＰＤＰ修飾ＢＳＡ抗体をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５で分画し、ＤＴＴ、副生成物ピリジン−２−チオンを除去した（溶出はｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液）。分画したＳＰＤＰ修飾ＢＳＡ抗体を、ルテニウム錯体内封小さな一枚膜リポソームに加えて２４時間室温にてインキュベートした。インキュベートしたルテニウム錯体内封小さな一枚膜リポソームをＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂで分画し、未結合のＳＰＤＰ修飾抗体を除去し、Ｒｕ錯体内封ストレプトアビジン修飾リポソームを得た。得られたＲｕ錯体内封ストレプトアビジン修飾リポソームをマルバーン社製のゼータ電位計で粒径測定したところ、粒径平均値が１２０ｎｍであった。
【００２８】
次に、Ｒｕ錯体内封ストレプトアビジン修飾リポソームが、塩（えん）の添加により凝集することを確認した。調製したＲｕ錯体内封ストレプトアビジン修飾リポソーム溶液５００μＬに対し、それぞれ最終濃度が０ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭとなるように塩化マグネシウム溶液５００μＬを添加し、マルバーン社製のゼータ電位計を用いてＢＳＡ抗体修飾リポソームの粒径の経時変化を測定した。測定結果を表１、図２及び３に示す。
【００２９】
【表１】
2009198283.tif 000003
【００３０】
表１及び図２は、塩化マグネシウム濃度依存のＲｕ錯体内封ストレプトアビジン修飾リポソームの凝集を確認結果である。５０ｍＭ以上の塩化マグネシウムを添加すると、速やかにリポソーム同士が凝集を始め、１００ｍＭ及び２５０ｍＭの塩化マグネシウム添加後のサンプルに関しては、５分後に粒径が２倍近く相当まで凝集した。また、１００ｍＭ以上の塩化マグネシウムの添加後は、リポソームの凝集度合いに差異が無い。従って、塩化マグネシウム濃度を変化することでリポソームの凝集量を制御できる。なお、図２の結果の粒径の経時変化を割り出したゼータ電位計による粒度分布図の一例として、２５０ｍＭの塩化マグネシウム添加によるリポソーム凝集結果を図３に示した。図３に示すように、塩化マグネシウム添加して５分経過すると凝集が進み粒径分布のピーク点が右にシフトしている。これは、リポソームの平均粒径が大きくなったことを示している。
【００３１】
次に、本発明のアナライトの測定方法を用いて、ＴＮＦ−αを測定する具体的手順を示す。
【００３２】
（１）リポソーム−リガンド−アナライト複合体形成工程
直径４．６μｍのトシル基が活性化された磁気ビーズ（ベリタス社製）２０μＬに対し、
７２μｇ／ｍＬの抗ＴＮＦ−α抗体５００μＬを加え、３７℃で２４時間反応させた。その後、磁気ビーズをＰＢＳＴ［１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．８５％ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０］で数回洗浄した。
【００３３】
３％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液を添加し、３７℃で３時間反応させた。その後、磁気ビーズをＰＢＳＴで数回洗浄し、１ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α溶液を１ｍＬ加え、２５℃で１．５時間反応させた。その後、磁気ビーズをＰＢＳＴで数回洗浄し、７．３μｇ／ｍＬのビオチン標識抗ＴＮＦ−α抗体を５００μＬ加えた。再び、磁気ビーズをＰＢＳＴで数回洗浄し、調整したＲｕ錯体内封ストレプトアビジン修飾リポソームを１ｍＬ加え、２５℃で１時間反応させ、リポソーム−リガンド−アナライト複合体を形成させた。
【００３４】
（２）凝集工程
リポソーム−リガンド−アナライト複合体に対して５０μＬに対して、Ｒｕ錯体内封リポソーム溶液５０μＬ加え、更に２００ｍＭ塩化マグネシウム溶液１００μＬを滴下し、１５分間緩やかに攪拌することで、凝集反応を生じさせた。
【００３５】
（３）分離工程
凝集工程を経たリポソーム−リガンド−アナライト複合体の磁気ビーズを分離し、上清を捨て、１００ｍＭ塩化マグネシウム溶液を２００μＬ加えた。この操作を５度繰り返した。その後、５０μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液を加えた。
【００３６】
（４）測定工程
作用電極の直径３ｍｍの金電極チップの作用電極に３μＬ滴下し、６５℃、１５分間放置した。０．１Ｍリン酸二水素カリウム、０．１Ｍリン酸水素ニカリウム及び０．１ＭＴＥＡからなる電解質溶液８０μＬを滴下し、０Ｖ〜１．３Ｖまで電圧走査し、４秒間の電気化学発光量を測定した。なお、金電極チップは、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成させ、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成したものを用いた。また、電気化学発光量の測定には、光電子倍増管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。
【００３７】
図４にＴＮＦ−αを測定した結果を示す。凝集工程を経ない従来法でＴＮＦ−αを測定した結果と比較すると、発光量の増加は、本発明による方法では９〜１０倍程度になった。従って、本発明による凝集工程を用いることで、従来に比べ発光量が増加することが示された。本発明を用いると、ホトマルのような高精度かつ高感度な検出器を用いなくても、フォトディテェクタやＣＣＤといった簡便な検出器を用いることで、測定機器の小型化を実現することが出来る。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明にかかるリポソームを用いたアナライトの測定方法は、粒径２０ｎｍ〜２００ｎｍの小さな一枚膜リポソームを用いて感度良く測定ができ、抗原やＤＮＡなどの生体物質の測定に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の実施の形態１におけるアナライトの測定方法を示した図
【図２】本発明の実施の形態１における各濃度の塩化マグネシウム存在下のＴＮＦ−α抗体修飾リポソームの凝集の経時変化を示す図
【図３】本発明の実施の形態１における２５０ｍＭ塩化マグネシウム存在下のＴＮＦ−α抗体修飾リポソームの凝集変化を粒度分布で確認した図
【図４】本発明の実施の形態１におけるＴＮＦ−αを測定した図
【符号の説明】
【００４０】
１  リポソーム
２  標識物質
３  リガンド
４  アナライト
【図１】
2009198283.tif 000004
【図２】
2009198283.tif 000005
【図３】
2009198283.tif 000006
【図４】
2009198283.tif 000007