(57)【要約】【課題】Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸を嫌気又は微好気条件下で生産することのできる菌株、及び該菌株を用いて嫌気又は微好気条件下でＬ−グルタミン酸系アミノ酸を生産する方法を提供する。【解決手段】Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、及びＬ−アルギニンからなる群より選ばれる１又は２以上のＬ−アミノ酸の生産能を有し、かつ、ＮＡＤＨによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大するように改変された細菌を、嫌気又は微好気条件で培地中で培養し、前記Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からＬ−アミノ酸を回収することにより、前記Ｌ−アミノ酸を製造する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、及びＬ−アルギニンからなる群より選ばれる１又は２以上のＬ−アミノ酸の生産能を有し、かつ、ＮＡＤＨによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大するように改変された細菌を、嫌気又は微好気条件で培地中で培養し、前記Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【請求項２】
前記ＮＡＤＨによる阻害を受けないクエン酸シンターゼが、ｐｒｐＣ遺伝子によりコードされるメチルクエン酸シンターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メチルクエン酸シンターゼが、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である請求項２に記載の方法。
（Ａ）配列番号７６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号７６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、クエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
前記ｐｒｐＣ遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
（ａ）配列番号７５の塩基配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号７５の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
前記細菌が、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下するように改変された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増大するように改変された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌が、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下し、かつ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増大するように改変された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌が、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、及びセラチア属からなる群より選ばれる細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌が、エンテロバクター・アグロメランスである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物がコリネ型細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸を生産する細菌及びＬ−グルタミン酸系アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられている。また、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、及びＬ−アルギニンは、調味料、肝機能促進薬、アミノ酸輸液、および総合アミノ酸製剤等として有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（例えば、特許文献４参照）等が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントテア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献５〜７参照）。
【０００３】
近年は、目的物質の発酵生産に、組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献８、９）、又はＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献１０）によって、微生物のＬ−アミノ酸生産効率を向上させることが行われている。Ｌ−グルタミン酸については、例えば、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝子の導入が、コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献１１参照）。またコリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子のエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、又はエシェリヒア属に属する腸内細菌への導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献７参照）。
【０００４】
Ｌ−グルタミン酸以外のＬ−グルタミン酸系アミノ酸、例えばオルニチン及びシトルリン（非特許文献２〜４）、Ｌ−グルタミン（特許文献１２）、Ｌ−プロリン（特許文献１３）、及びＬ−アルギニン（特許文献１４、１５）等も、Ｌ−グルタミン酸と同様に、上記のような微生物を用いた発酵法により製造されている。
【０００５】
発酵法によるＬ−アミノ酸の比生産性は酸素の充足度に依存している（非特許文献５）。そのため、発酵槽あたりの目的物質の生産性は、発酵槽の酸素供給能力に制限される。装置の工夫による酸素供給能力の強化がいろいろ考案されてきた（非特許文献６「発酵ハンドブック（共立出版）」）。しかし、酸素の供給力に生産性が制限されることなく目的物質を発酵生産できる菌株を育種することにより、酸素供給律速を回避し目的物質の生産性を高めるといった試みはこれまで報告されていない。
【特許文献１】米国特許第３，２２０，９２９号明細書
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号明細書
【特許文献３】特公昭３２−９３９３号公報
【特許文献４】特開平５−２４４９７０号公報
【特許文献５】特開２０００−１０６８６９号公報
【特許文献６】特開２０００−１８９１６９号公報
【特許文献７】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献８】米国特許第５，１６８，０５６号明細書
【特許文献９】米国特許第５，７７６，７３６号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，９０６，９２５号明細書
【特許文献１１】特公平７−１２１２２８号公報
【特許文献１２】特開２００２−３００８８７号
【特許文献１３】欧州特許第１１７２４３３号
【特許文献１４】特開２０００−２８７６９３
【特許文献１５】特開２００１−０４６０８２
【非特許文献１】明石邦彦ら著  アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年
【非特許文献２】Lee, Y.-J. and Cho, J.-Y. 2006. Biotechnol. Lett. 28:1849-1856
【非特許文献３】Choi, D. K. et al. 1996. J. Ferment. Bioeng. 81:216-219
【非特許文献４】Plachy, J. 1987. Kvasny Prumysl 33: 73-75
【非特許文献５】P. F. Stanbury, A. Whitaker著  石崎文彬訳  発酵工学の基礎  実験室から工場まで、学会出版センター、169〜190頁、１９８８年
【非特許文献６】「発酵ハンドブック（共立出版）」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸を嫌気又は微好気条件下で生産することのできる菌株を提供すること、及び該菌株を用いて嫌気又は微好気条件下でＬ−グルタミン酸系アミノ酸を生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、嫌気状態では、微生物は基質レベルのリン酸化によりATPを生産し、それに伴って生じるNAD(P)Hなどの中間電子受容体が再酸化され、細胞内での酸化還元バランスが維持されることが非常に重要となると考えた。そして、本発明者らは鋭意研究を行った結果、細菌を、NADHの阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大するように改変することにより、嫌気又は微好気条件下でＬ−グルタミン酸系アミノ酸を生産することができることを見出した。また、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼから選ばれる１又は２以上の酵素の活性を低下させること、あるいは、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を増大させることにより、嫌気又は微好気条件下でのＬ−グルタミン酸系アミノ酸の生産性が一層向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、及びＬ−アルギニンからなる群より選ばれる１又は２以上のＬ−アミノ酸の生産能を有し、かつ、ＮＡＤＨによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大するように改変された細菌を、嫌気又は微好気条件で培地中で培養し、前記Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２）前記ＮＡＤＨによる阻害を受けないクエン酸シンターゼが、ｐｒｐＣ遺伝子によりコードされるメチルクエン酸シンターゼである、前記方法。
（３）前記メチルクエン酸シンターゼが、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質で
ある前記方法。
（Ａ）配列番号７６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号７６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、クエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
（４）前記ｐｒｐＣ遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記方法。
（ａ）配列番号７５の塩基配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号７５の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）前記細菌が、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下するように改変された、前記方法。
（６）前記細菌が、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増大するように改変された、前記方法。
（７）前記細菌が、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下し、かつ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増大するように改変された、前記方法。
（８）前記細菌が、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、及びセラチア属からなる群より選ばれる細菌である、前記方法。
（９）前記細菌が、エンテロバクター・アグロメランスである、前記方法。
（１０）前記微生物がコリネ型細菌である、前記方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、細菌を用いて、嫌気又は微好気条件でＬ−グルタミン酸系アミノ酸を生産することが可能となる。本発明によれば、嫌気又は微好気条件での発酵が可能となるため、発酵装置の酸素供給能力に依存せず、高密度培養による発酵生産が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、嫌気又は微好気条件下でＬ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、及びＬ−アルギニンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸生産能を有する微生物である。これらのアミノ酸は、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸とも呼ばれ、Ｌ−グルタミン酸、又はＬ−グルタミン酸を前駆体として生合成され得るＬ−アミノ酸である。また、本発明細書において、特記しない限り、「Ｌ−アミノ酸」は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、又はＬ−アルギニンを意味する。
【００１１】
本発明の細菌は、具体的には、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、かつ、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大するように改変された細菌である。
【００１２】
本発明の細菌の一形態は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大し、かつ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下するように改変された細菌である。
【００１３】
本発明の細菌の更なる形態は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大し、かつ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増大するように改変された細菌である。
【００１４】
本発明の細菌の更なる形態は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大し、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下し、かつ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増大するように改変された細菌である。
【００１５】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌に、上記のような改変を施すことによって得ることができる。また、上記のように改変された細菌に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与することによっても取得することができる。
【００１６】
「Ｌ−アミノ酸生産能」とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、Ｌ−アミノ酸を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に蓄積する能力をいう。本発明の細菌が生産するＬ−アミノ酸は、１種であってもよく、２種またはそれ以上のＬ−アミノ酸であってもよい。
【００１７】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌としては、本来的にＬ−アミノ酸生産能を有するものであってもよいが、変異法や組換えDNA技術を利用してＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌であってもよく、又、Ｌ−アミノ酸生産能が増大するように改変された細菌であってもよい。
【００１８】
また、酵素の「活性が増大する」とは、もともと該酵素を有している細菌において、該酵素の活性が増大すること、及び、該酵素を有していない細菌に該酵素の活性を付与することの両方を含む。酵素活性が増大するとは、親株や野生株等の非改変株に比べて細胞当たりの酵素分子の数が増加した場合や、酵素分子当たりの活性が上昇した場合などが該当する。なお、比較対象となる野生株としては、例えばエンテロバクター・アエロゲネスではエンテロバクター・アエロゲネスATCC13048などが挙げられる。
【００１９】
さらに、酵素の「活性が低下する」とは、該酵素の活性が野生株又は親株等の非改変株に対して低下していることを意味し、活性が完全に消失していることを含む。
【００２０】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物
以下に、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、及び、本発明で使用することのできるＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。ただし、嫌気条件下で炭素源を消費し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する限り、これらに制限されない。
【００２１】
本発明に用いる細菌の親株としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）、クレブシエラ（Klebsiella）属、ラウルテラ（Raoultella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌や、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属、バチルス（Bacillus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等に属する微生物が挙げられる。γ−プロテオバクテリアは、NCBI（National Center for Biotechnology Information）タキソノミーデータベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=1236&lvl=3&p=mapview&p=has_linkout&p=blast_url&p=genome_blast
&lin=f&keep=1&srchmode=1&unlock）に開示されている分類にしたがって分類される細菌が利用出来る。
【００２２】
γ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌は通性嫌気性菌であり、嫌気条件下での糖の発酵では混合酸発酵やブタンジオール発酵を行なう（The Microbial World 5th Edition 微生物学  培風館  19章）。このとき、主として乳酸、酢酸、コハク酸、蟻酸（又はCO2とH2）、エタノール、ブタンジオールが生成する。最終産物の量比は菌株によって著しく異なる。しかし、基本的には解糖系（エムデンーマイヤーホフ径路）などでの基質レベルのリン酸化によりATPを生産する点、また、その時生じたNAD(P)Hなどの中間電子受容体が再酸化され、細胞内での酸化還元バランスが維持されるように最終産物の量比を調整している点は共通している。
【００２３】
γ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌は、分類学的に非常に近縁である（Harada H. and Ishikawa H. 1997. J. Gen. Appl. Microbiol. 43: 355-361; Kwon S.W. et al. 1997. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある（Gavini, F. et al. 1989. Int. J. Syst. Bacteriol. 39: 337-345）。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（Mergaert, J. et al. 1993. Int. J. Syst. Bacteriol. 43: 162-173 参照）。
【００２４】
エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等が挙げられる。エシェリヒア・コリを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、エシェリヒア・コリK-12株及びその誘導体であるエシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC 47076）、及びW3110株（ATCC 27325）を用いることができる。エシェリヒア・コリK-12株は、1922年にスタンフォード大学で分離されたものであり、λファージの溶原菌であるとともに、F因子を持ち、接合等遺伝的組み換え体の作製が可能である汎用性の高い菌株である。またエシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列は既に決定されており、遺伝子情報も自由に利用出来る。エシェリヒア・コリK-12株や、誘導株を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より入手することができる（住所ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。以下に記載する、ATCC番号が付与された他の菌株についても同様である。
【００２５】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開0952221号に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株やエンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、エンテロバクター・アエロゲネスNBRC 12010株（Biotechnol Bioeng. 2007 Mar 27;98(2):340-348）、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637 (FERM P-21348)株等が挙げられる。また、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637株は、平成19年8月22日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号FERM P-21348として寄託されている。
【００２６】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメラン
ス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２７】
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号)
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２８】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられ、ラウルテラ属細菌としては、ラウルテラ・テリゲナ（Raoultella terrigena）、ラウルテラ・プランティコーラ（Raoultella planticola）が挙げられる。
具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２９】
エルビニア・アミロボーラ  ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ  ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開0955368号)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開0955368号)
ラウルテラ・プランティコーラ  ATCC33531株
尚、AJ13399株及びAJ13410株は、寄託当時はクレブシエラ・プランティコーラとして分類されていたが、現在ではクレブシエラ・プランティコーラはラウルテラ・プランティコーラに分類されている（Drancourt, M. 2001. Int J Syst Evol Microbiol. 51:925-32）。
【００３０】
本発明でいうコリネ型細菌は、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であって、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み（Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W., and Schleifer, K. H. 1991, Int. J. Syst. Bacteriol. 41: 255-260）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。
【００３１】
Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌としては、例えば以下に示すものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）  
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００３２】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム  ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム  ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アルカノリティカム  ＡＴＣＣ２１５１１
コリネバクテリウム・カルナエ  ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）  ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ  ＡＴＣＣ１７９６５
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス  ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・ハーキュリス  ＡＴＣＣ１３８６８
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）  ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）  ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム  ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）  ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９
ブレビバクテリウム・ロゼウム  ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム  ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス  ＡＴＣＣ１９２４０
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）  ＡＴＣＣ６８７１
ブレビバクテリウム・アルバム  ＡＴＣＣ１５１１１
ブレビバクテリウム・セリヌム  ＡＴＣＣ１５１１２
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム  ＡＴＣＣ１５３５４
【００３３】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
上述したような微生物にＬ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための改変の方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増大するように改変する方法を挙げることができる。発現が増大するとは、親株や野生株等の非改変株に比べて細胞当たりの酵素分子の数が増加した場合や、酵素分子当たりの活性が上昇した場合などが該当する。
【００３４】
Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）（gdhA）、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「PEPC」ともいう）(ppc)、ピルビン酸カルボ
キシラーゼ(pyc)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸−ギ酸リアーゼ）(pfl)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ(pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(edd）、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ(eda）、トランスヒドロゲナーゼ（pntAB）などが挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、ＰＥＰＣ又はＧＤＨが好ましく、ＰＥＰＣ及びＧＤＨの両方がより好ましい。
尚、本発明の細菌は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大しており、NADHによる阻害を受けるクエン酸シンターゼを保持している必要はないが、NADHによる阻害を受けるクエン酸シンターゼを保持していてよく、同酵素の活性が増大していても差支えない。
【００３５】
以下に、上記Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増大するように微生物を改変する方法について説明する。
１つ目の方法は、目的遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて宿主微生物を形質転換することにより、該目的遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子を適当なベクター上にクローニングし、得られたベクターを用いて宿主細菌を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高めることができる。目的遺伝子は、例えばエシェリヒア属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌において、既に塩基配列が明らかにされている場合は、その塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体DNAを鋳型にしてPCR法により取得することが可能である。グルタミン酸デヒドロゲナーゼとしては、エシェリヒア・コリgdhA遺伝子（Vallea, F. et al. 1984. Gene 27:193-199）、コリネバクテリウム・グルタミカムgdh遺伝子（Bormann, E. R. et al. 1992. Mol. Microbiol. 6:317-326）が知られており、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとしては、エシェリヒア・コリppc遺伝子（Fujita, N. et al. 1984. J. Biochem.
(Tokyo) 95:909-916）、コリネバクテリウム・グルタミカムppc遺伝子（Eikmanns, B. J. et al. 1989. Mol Gen Genet. 218:330-339）が知られている。クエン酸シンターゼとしては、エシェリヒア・コリgltA遺伝子（Ner, S.S. et al. 1983. Biochemistry. 22:5243-5249）、コリネバクテリウム・グルタミカムgltA遺伝子（Eikmanns B.J. et al. 1994. Microbiology.140 (Pt 8):1817-1828）が知られている。
【００３６】
形質転換に用いるベクターとしては、使用する微生物で自律複製可能なプラスミドが挙げられる。例えば、腸内細菌群に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可能）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可能）等が挙げられる。また、コリネ型細菌用のプラスミドとしては、pAM330(特開昭58-67699号公報)、pHM1519(特開昭58-77895号公報)、pSFK6 (特開2000-262288号公報参照）、pVK7(米国特許出願公開明細書2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特開昭58-192900号公報)、pCG1(特開昭57-134500号公報)、pCG2（特開昭58-35197号公報）、pCG4、pCG11（特開昭57-183799号公報）、pHK4（特開平5-7491号公報）などが挙げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つDNA断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。なお、プラスミドの代わりにファージDNAをベクターとして用いてもよい。
【００３７】
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A. 1970. J. Mol. Biol. 53:159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. et al. 1997. Gene 1:153-167）などが挙げられる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S.N. 1979. Mol. Gen. Genet. 168:111-115; Bibb, M. et al. 1978. Nature 274:398-400; Hinnen, A. et al. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
【００３８】
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物のゲノムDNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物のゲノムDNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、ゲノムDNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（MillerI, J.
H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）により行うことができる。ゲノムDNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させてゲノムDNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主ゲノムに目的遺伝子を組み込むこともできる。ゲノム上に目的遺伝子が転移したことの確認は、その遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００３９】
コピー数は、目的遺伝子の産物の活性を増強できればいずれでもよいが、2コピー以上であることが望ましい。
【００４０】
２つ目の方法は、ゲノムDNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を適切な強さのものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる方法である。例えば、thrプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター、tacプロモーター等がよく用いられるプロモーターとして知られている。コリネ型細菌における高発現型プロモーターとしては、エロンゲーションファクターTu（EF-Tu）遺伝子tufのプロモーター、コシャペロニンGroES-シャペロニンGroEL、チオレドキシンレダクターゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ等をコードする遺伝子のプロモーターが挙げられる (WO2006/028063号公報、EP1697525号公報)。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、GoldsteinとDoiの論文（Goldstein, M. A. and Doi R. H. 1995. Biotechnol. Annu. Rev., 1: 105-128）等に記載されている。
【００４１】
また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、適切な強度のものに改変することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリや、パントエア・アナナティスに用いることが出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載の温度感受性プラスミドpMAN997やその誘導体等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184:
5200-5203）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方
法によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
【００４２】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることが可能である。
【００４３】
以上のような方法によりＬ−グルタミン酸生産に関与する遺伝子の発現が増強大するように改変された微生物としては国際公開WO99/07853号パンフレット、欧州特許第1352966号等に記載された微生物が例示できる。
【００４４】
上記プラスミドまたはゲノム上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターは使用する微生物において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。使用する微生物で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような方法により、クエン酸シンターゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載された微生物が例示できている。
【００４５】
上記したような遺伝子の発現を増強する方法は、後述のNADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼ、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子等にも同様に適用することができる。
【００４６】
さらに、コリネ型細菌にＬ−グルタミン酸生産能を付与する方法として、yggB遺伝子(NCgl 1221；NP_600492 [gi:19552490]）を増幅する方法、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である（WO2006/070944）。
【００４７】
Ｌ−グルタミン酸生産能は、Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK遺伝子を増幅することによっても付与することができる（WO2005/085419）。
【００４８】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（sucA）、イソクエン酸リアーゼ(aceA)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(gadAB)、１−ピロリン−５−カルボキシレートデヒドロゲナーゼ（putA）などが挙げられる。この中では特に、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。
【００４９】
上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法
がある。
【００５０】
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株又は親株などの非改変株と比較することによって確認することができる。例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Reedらの方法（Reed, L. J. and Mukherjee, B. B. 1969. Methods in Enzymology 13: 55-61）に従って測定することができる。
【００５１】
エシェリヒア属細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、特開平5-244970号公報及び特開平7−203980号公報などに記載されている。また、コリネ型細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、国際公開95/34672号パンフレットに記載されている。さらに、エンテロバクター属細菌については、特開2001-333769号公報に開示されている。
【００５２】
尚、本発明においては、Ｌ−グルタミン酸生産菌に限られず、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下していることが好ましい。
【００５３】
例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させるには該酵素のE1oサブユニットをコードするsucA（odhA）遺伝子を改変すればよい。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、例えば、以下の株が挙げられる。
【００５４】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP−4172；フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP-4173；フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP-4174；フランス特許公報9401748号明細書参照) 
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869 OAGN、OA2-2、OAGN2-2 （国際公開パンフレット2006/028298号参照）
エシェリヒア・コリAJ12624（FERM BP-3853）
エシェリヒア・コリAJ12628（FERM BP-3854）
エシェリヒア・コリAJ12949（FERM BP-4881）
ブレビバクテリム・ラクトファーメンタム  ΔS株  （国際公開95/34672号パンフレット参照）
パントエア・アナナティス  AJ13601 (FERM BP-7207  欧州特許公開明細書1078989)
パントエア・アナナティス  AJ13356 (FERM BP-6615 米国特許6.331,419号)
パントエア・アナナティス  SC17sucA (FERM BP-8646  WO2005/085419)
クレブシエラ・プランティコーラ  AJ13410 (FERM BP-6617 米国特許6,197,559号)
【００５５】
また、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損または低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ
13355、AJ13356、及び後述のAJ13601株は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【００５６】
さらに、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、実施例に記載したように、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【００５７】
エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株のsucA遺伝子の部分配列（N末端側及びC末端側）を、配列番号３４、３５に示した。エンテロバクター・アエロゲネスのsucA遺伝子は、これらの配列に基づいて欠損させることができる。
【００５８】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や、細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
【００５９】
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949  (FERM BP-2632：特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照）
【００６０】
Ｌ−グルタミン生産菌
Ｌ−グルタミン生産能を有する微生物として好ましい例は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を強化した細菌、グルタミンシンセターゼ（glnA）活性を強化した細菌、グルタミナーゼ遺伝子を破壊した細菌である（欧州特許出願公開1229121号、1424398号明細書）。グルタミンシンセターゼの活性増強は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ（glnE）遺伝子の破壊、PII制御タンパク質遺伝子（glnB）の破壊によっても達成できる（EP1229121）。また、エシェリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株も好適なＬ−グルタミン生産菌として例示できる（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）。
【００６１】
Ｌ−グルタミン生産能を付与または増強する方法として、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方法 (特開平3-232497)、プリンアナログ耐性及びメチオニンスルホキシド耐性を付与する方法(特開昭61-202694)、α-ケトマレイン酸耐性を付与する方法(特開昭56-151495)などが挙げられる。Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の具体例として、以下の微生物が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573 (FERM P-5492、特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11576 (FERM BP-10381、特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12212 (FERM P-8123、特開昭61-202694)
【００６２】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産能を有する微生物としては、例えば、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持する細菌や、Ｌ−プロリン分解系が弱化した細菌が挙げられる。Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼをコードするDNAを用いて細菌を改変する方法は、DandekarとUratsuの文献（J. Bacteriol. 170, 12: 5943-5945 (1988)）に開示されている。また、Ｌ−プロリン分解系が弱化した細菌を得る方法としては、例えば、プロリンデヒドロゲナーゼ遺伝子に酵素活性を低下させる変異を導入する方法が挙げられる。Ｌ−プロリン生産能を有する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ NRRL B-12403株及びNRRL B-12404株 (英国特許 2075056)、エシェリヒア・コリVKPM B-8012株 (米国特許公開2002-0058315)、および、ドイツ特許3127361号に開示されたプラスミド変異体や、Bloom F.R. らの文献 (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34) に開示されたプラスミド変異体などを保持する菌株が挙げられる。
【００６３】
また、Ｌ−プロリン生産能を有する微生物として好ましいものは、3,4-デヒドロキシプロリン、アザチジン−２−カルボキシレート耐性株であるエシェリヒア・コリ702株（VKPMB-8011）や、702のilvA欠損株である702ilvA株（VKPMB-8012株）や、b2682、b2683、b1242又はb3434遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強したE. coli等も挙げられる（特開2002−300874号公報）。
【００６４】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物としては、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭56-106598号公報参照）等が挙げられる。また、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ237株（ロシア特許出願第2000117677号）も、好適なＬ−アルギニン生産株である。同株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ） にVKPM B-7925の受託番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。237株の誘導体で
、酢酸資化能を向上させたＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ382株（特開2002-017342号公報）を用いることもできる。エシェリヒア・コリ382株は、2000年４月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）にVKPM B-7926の受託番号で寄託されている。
【００６５】
またＬ−アルギニン生産能が付与された微生物として、Ｌ−アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を向上させた微生物を用いることが出来る。例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。N-アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）は、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換されたＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型の遺伝子を用いるとより好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。
【００６６】
コリネ型細菌のＬ−アルギニン生産菌としては、  Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ−アルギニン生産能を有するものであれば特に制限されないが、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭54-44096号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭57-18989号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭62-24075号）；または、Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平2-186995号）等が挙げられる。
【００６７】
また、Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌は、５−アザウラシル、６−アザウラシル、２−チオウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−アザシトシン、６−アザシトシン等に耐性な変異株；アルギニンヒドロキサメート、２−チオウラシルに耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシルに耐性な変異株（特開昭49-126819号）；ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性な変異株（特開昭52-114092号）、メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有する変異株（特開昭52-99289号参）；アルギニンヒドロキサメートに耐性な変異株（特公昭51-6754号）；コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性な変異株（特開昭58-9692号）；アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株（特開昭52-8729号）；アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、及びカナバニン耐性、またはアルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシル耐性の変異株（特開昭53-143288号）；及び、カナバニン耐性の変異株（特開昭53-3586号）等として育種することができる。
Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
【００６８】
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM BP-6892）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（FERM BP-6906）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM BP-6893）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM BP-6894）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）
【００６９】
さらにアルギニンリプレッサーであるArgRを欠損した株(米国特許出願公開2002-0045223号、細胞内のグルタミンシンテターゼ活性を上昇させた株（米国特許出願公開2005-0014236号公報）を使用することが出来る。
【００７０】
Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチンもＬ−アルギニンと生合成経路が共通しており、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）の酵素活性を上昇させることによって、これらの生産能を付与することができる（国際公開2006-35831号パンフレット）。
【００７１】
また、本発明に用いるＬ−アミノ酸生産菌は、固有の生合成系酵素をコードする遺伝子以外に、糖の取り込み、糖代謝（解糖系）、エネルギー代謝に関与する遺伝子が増幅されていてもよい。
【００７２】
糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖系酵素をコードする遺伝子や糖の取り込み遺伝子が挙げられ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;  欧州出願公開877090号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（pfkBfbp;国際公開03/04664号パンフレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum;国際公開01/02545号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開877090号パンフレット）、non-PTSシュクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc;欧州出願公開149911号パンフレット）、シュクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。
【００７３】
エネルギー代謝に関与する遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB;米国特許 5,830,716号明細書）、チトクロムbo型オキシダーゼ（cytochromoe bo type oxidase）遺伝子(cyoB 欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。
【００７４】
また、炭素源としてグリセロールを使用する場合、グリセロールの資化性を高めるために、glpR遺伝子（EP1715056）の発現が弱化されているか、glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa及びtalC遺伝子等のグリセロール代謝遺伝子（EP1715055A）の発現が強化されていてもよい。
【００７５】
＜１−２＞嫌気又は微好気条件でＬ−アミノ酸を生産する細菌
本発明の細菌は、嫌気又は微好気条件でＬ−アミノ酸を生産する細菌である。具体的には、本発明の細菌は、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸の生産能を有し、かつ、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大するように改変された細菌である。
尚、前記したように、細菌がNADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼを有していない場合、同酵素を保持するように改変された微生物は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が非改変株に比べて増大している。
【００７６】
＜１−２−１＞NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性の増強
本発明における「クエン酸シンターゼ」とは、下記反応を触媒する酵素であり、クエン
酸シンターゼの活性とは、この反応を触媒する活性をいう。
【００７７】
アセチル-CoA + オキサロ酢酸 + H2O → クエン酸 + CoA-SH
【００７８】
クエン酸シンターゼの活性は、Shiioら（Shiio I. et al. 1977. J. Biochem. 82:395-405）に記載された方法で測定することができる。具体的には、反応液（70 mM Tris-HCl pH8.0, 0.02mMオキサロ酢酸, 0.05mM アチセル-CoA, 0.05 mM 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) (DNTB)）に酵素液を添加して反応をスタートさせ、412 nm の吸収光度の増加を測定する。遊離するCoAがDNTBと反応してTNB-とCoA-TNBを生成し、TNB-が412 nmの光を吸収する（ε= 13600M-1cm-1）ことから、吸収光度の変化によりアセチル-CoAの減少を定量できる。酵素活性の1ユニットは反応時間（分）当たり1 μmolのCoAが生成する酵素活性と定義できる。
【００７９】
「NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼ」とは、クエン酸シンターゼの活性がNADHの存在により低下しないか、又は、NADHによる阻害を受けるクエン酸シンターゼ、例えばエシェリヒア・コリのgltAによりコードされるクエン酸シンターゼよりも、同じ濃度のNADH存在下での比活性が高いクエン酸シンターゼを意味する。具体的には例えば、精製された酵素を用いて酵素活性を測定したときに、0.2mMのNADH存在下では反応が阻害されないクエン酸シンターゼが挙げられる。または、NADH非存在下でのクエン酸シンターゼ活性に比べて、1mMのNADH存在下でのクエン酸シンターゼ活性の減少が5%以下、好ましくは3%以下であるか、より好ましくは活性が阻害されないクエン酸シンターゼである。NADHに阻害されないクエン酸シンターゼとしては、例えば、以下の細菌が持つクエン酸シンターゼが挙げられる（Weitzman P.D.J. 1981. Adv. Microb. Pysiol. 22:185-244）。
【００８０】
アクロモバクター・リケファシエンス（Acromobacter liquefaciens）
アースロバクター・アトロシアネウス（Arthrobacter atrocyaneus）
アースロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）
アースロバクター・ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）
バチルス・セレウス（Bacillus cereus）
バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）
バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymyxa）
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）
ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）
セルロモナス・セラシア（cellasea）
クロストリジウム・アシディ−ウリチ（Clostridium acidi-urici）
コリネバクテリウム・エクイ（Corynebacterium equi）
コリネバクテリウム・ファシアンス（Corynebacterium fascians）
コリネバクテリウム・ミシガネンセ（Corynebacterium michiganense）
ヘモフィルス・ヴァジナリス（Haemophilus vaginalis）
クルシア・ゾプフイィ（Kurthia zopfii）
ミクロバクテリウム・サーモスファクタム（Microbacterium thermosphactum）
ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）
ミクロコッカス・エスピー．（Micrococcus sp.）
マイコバクテリウム・フレイ（Micobacterium phlei）
マイコバクテリウム・ロドクラス（Micobacterium rhodochrous）
マイコバクテリウム・スメグマティス（Micobacterium smegmatis）
ノカルディア・コラリナ（Nocardia corallina）
ノカルディア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）
シュードモナス・イソジナム（Pseudomonas isodinum）
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）
ストレプトマイセス・ソマリエンシス（Streptomyces somaliensis）
ストレプトマイセス・ヴィリドクロモジェンス（Streptomyces viridochromogens）
【００８１】
NADHによる阻害を受けるクエン酸シンターゼとしては、例えば、以下の細菌が持つクエン酸シンターゼが挙げられる（Weitzman P.D.J. 1981. Adv. Microb. Pysiol. 22:185-244）。
【００８２】
アエロモナス・フォルミカンス（Aeromonas formicans）
アリゾナ・アリゾナエ（Arizona arizonae）
エルヴィニア・ウレドボーラ（Eriwinia uredovora）
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
ハフィニア・アルヴェイ（Hafinia alvei）
クレブシエラ（アエロバクター）・アエロゲネス（Klebsiella (Aerobacter) aerogenes）
クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）
パストレラ・シュードツベルクローシス（Pasteurella pseudotuberculosis）
プロテウス・レットゲリ（Proteus rettgeri）
プロテウス・ヴルガリス（Proteus vulgaris）
サルモネラ・アナタム（anatum）
サルモネラ・コレラ−スイス（cholerae-suis）
サルモネラ・チフィムリウム（typhimurium）
セラチア・マルセセンス（Serrtia marcescens）
チオバチルス Ａ２（Thiobacilus A2）
【００８３】
エシェリヒア・コリのprpC遺伝子によりコードされるメチルクエン酸シンターゼは、クエン酸シンターゼ活性を有し、NADHによる阻害を受けないことが知られており、本発明に好適に使用することができる。
【００８４】
エシェリヒア・コリ W3110株ののprpC遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするメチルクエン酸シンターゼのアミノ酸配列を、配列番号７５、７６に示す。
【００８５】
prpC遺伝子は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼをコードする限り、上記配列を有する遺伝子に限られず、そのホモログであってもよく、yzzD、yahSと名付けられている場合がある。prpC遺伝子ホモログとは、他の微生物由来で、エシェリヒア・コリのprpC遺伝子と高い相同性を有し、かつ、クエン酸シンターゼ活性を持つ遺伝子をいう。他の微生物由来のprpC遺伝子ホモログとしては、配列番号７６のアミノ酸配列全体に対して好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有し、かつ、クエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある
【００８６】
アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Karlin, S. and Altschul, S. F. 1993. Pro. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873）やFASTA（Pearson W.R. 1990. Methods Enzymol. 183:63-98）を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.govbi.nlm.nih.gov参照)。
【００８７】
prpC遺伝子は、コードされるタンパク質がNADHによる阻害を受けないクエン酸シンター
ゼ活性を有する限り、配列番号７６のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有する保存的バリアントをコードする変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、pckA遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００８８】
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、phe,trp,tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、leu,ile,val間で、極性アミノ酸である場合には、gln,asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、lys,arg,his間で、酸性アミノ酸である場合には、asp,glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、ser,thr間でお互いに置換する変異である。より具体的には、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。
【００８９】
さらに、prpC遺伝子は、導入する宿主により遺伝暗号の縮重性が異なるので、prpCが導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にprpC遺伝子は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼをコードする限り、N末端側、及び／又はC末端側が延長したタンパク質、あるいは削られているタンパク質をコードする遺伝子でもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、配列番号７６のアミノ酸配列のＮ末端側50アミノ酸から5アミノ酸、又はＣ末端側50アミノ酸から5アミノ酸が延長又は削除されたタンパク質をコードする遺伝子でもよい。
【００９０】
上記のような保存的バリアントをコードする遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号７５の塩基配列を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、pckA遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばコリネ型細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラープローンPCR(Cadwell,R.C. PCR Meth. Appl.
2, 28(1992))、DNA shuffling(Stemmer,W.P. Nature 370, 389(1994))、StEP-PCR(Zhao,H. Nature Biotechnol. 16, 258(1998))によって、遺伝子組換えにより人工的にprpC遺伝子に変異を導入する方法が挙げられる。
【００９１】
また、prpC遺伝子は、配列番号７５の塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつNADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」と
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼ−ションの洗いの条件である60℃、1×SSC，0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDSさらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００９２】
プローブとして、配列番号７５に相補的な塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、これらの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、300bp程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００９３】
上記遺伝子ホモログ及び保存的変異に関する記載は、本明細書に記載された他の酵素遺伝子についても同様に適用される。
【００９４】
上記のようなNADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性は、前記のＬ−グルタミン酸生合成に関与する酵素と同様にして増大させることができる。
【００９５】
＜１−２−２＞乳酸デヒドロゲナーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、又はアルコールデヒドロゲナーゼの活性の低下
本発明の細菌は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大していることに加えて、さらに、乳酸デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.27）（以下、「LDH」ともいう）、アセトラクテートデカルボキシラーゼ（EC4.1.1.5）（以下、「ALD」ともいう）、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ（EC2.3.1.8）（以下、「PTA」ともいう）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.37）（以下、「MDH」ともいう）、及び、アルコールデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.1）（以下、「ADH」ともいう）から選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下していることが好ましい。
【００９６】
活性を低下させる酵素の組合わせは特に制限されないが、ADHとMDHの一方の活性は低下させないことが好ましい。解糖系によりグルコースからホスホエノールピルビン酸が生成する際に、NAD+がNADHに還元される。アルコールデヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、NADHからNAD+への再酸化に働く。したがって、解糖系で生じたNADHを嫌気又は微好気条件下で再酸化するためには、ADHとMDHの一方の活性は維持されることが好ましいと考えられる。
【００９７】
エシェリヒア・コリのLDH、ALD、PTA、MDH、及びADHは、各々ldh、aldC、pta、mdh、adhE遺伝子によってコードされている。本明細書では、他の細菌のこれらの遺伝子のホモログも、同じ遺伝子名で呼ぶ。
【００９８】
酵素活性を低下させる方法は、上述したα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる方法と同様にして行うことができる。
具体的には例えば、標的酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、ゲノムの該酵素遺伝子に、細胞中の該酵素の活性が低下するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の標的酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変
異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997）。また、遺伝子破壊、例えばコード領域が欠失したような変異型酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、ゲノム上の正常型酵素遺伝子を置換すること、又は、トランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても標的酵素の活性を低下または欠損させることができる。
【００９９】
例えば、標的酵素の活性を低下させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。標的酵素遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、DatsenkoとWannerによって開発された「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号、WO2005/010175）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主中で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【０１００】
変異型遺伝子を得るための遺伝子断片は、例えば、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、目的とする細菌のゲノムＤＮＡを鋳型として用いたPCRによって、取得することができる。エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株のadhE、mdh、ldh、pta、及びaldC遺伝子の部分配列（N末側配列及びC末側配列）は、配列番号３０、３１、３８、３９、４２、４３、４６、４７、５１、及び５２に示した。後述の実施例に示すように、これらの配列に基づいて、各遺伝子を欠損させることができる。
【０１０１】
各々の酵素活性は、野生株又は親株等の非改変株に比べて低下していればよいが、菌体当りの活性として10%以下に低下していることが好ましく、完全に消失していることがより好ましい。
【０１０２】
各々の酵素活性が低下したことは、改変株と非改変株の各々の酵素活性を測定することによって確認することができる。
LDH活性は、例えば、Stolzenbach, F. 1966. Meth. Enzymol. 9:278-288に記載された方法でLDH活性を測定することができる。
ALD活性は、例えば、Juni, E. 1952. J. Biol. Chem. 195:715-726に記載された方法で測定することができる。
PTA活性は、例えば、Klotzsch, H. R. 1969. Meth. Enzymol. 12:381-386）に記載された方法で測定することができる。
MDH活性は、例えば、Banaszak, L. J. and Bradshaw, R. A. 1975．The Enzymes (3rd ed.) 11:369-396に記載された方法で測定することができる。
ADH活性は、例えば、Branden, C.-I et al. 1975. The Enzymes (3rd ed.) 11:103-190に記載された方法で測定することができる。
【０１０３】
また、各酵素の活性は、各酵素をコードする遺伝子のmRNAの量を野生株又は親株等の非改変株と比較することによって確認できる。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、Reverse-Transcriptase  PCR（RT-PCR）が挙げられる（Sambrook, J.
et al. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。また、酵素活性の増大は、酵素タンパク質量が非改変株と比較して増大していることによって確認することができ、例えば抗体を用いてウェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J. et al. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。
【０１０４】
本明細書に記載した他の酵素の活性についても、同様にして増大又は低下していることを確認することができる。
【０１０５】
＜１−２−２＞ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の増強
本発明の細菌は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大していること、又は、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性が増大し、かつ、LDH、ALD、PTA、MDH、及びADHから選ばれる１又は２以上の酵素の活性が低下していることに加えて、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が増大していることが好ましい。
【０１０６】
本発明においてホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）は、ホスホエノールピルビン酸（PEP）から炭酸固定によりオキサロ酢酸（OAA）を生成する反応を可逆的に触媒する酵素である。本発明においてPEPCK活性とは、このPEPからOAAを生成する反応を触媒する活性をいう。本発明に利用するPEPCKは、平衡がPEPからOAAを生産する方向に傾いているものが好ましい。酵素活性は、例えば、Kim等の方法に従い、Sigma Diagnostics ATP Kitを用いて37℃におけるATP生成量を測定する方法で決定できる（Kim, P. et al. 2004. Applied And Environmental Microbiology 70:1238-1241）。
【０１０７】
PEPCK活性は、野生株又は親株等の非改変株と比較して増大していればいずれでもよいが、例えば非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上増大していることが望ましい。
【０１０８】
本発明に使用できるPEPCKをコードする遺伝子としては、アクチノバチルス・サクシノゲネス由来のpckA遺伝子（Genbank Accession No. YP_001343536.1：配列番号７７）、またはこのpckA遺伝子のホモログが挙げられる。pckA遺伝子ホモログとしては、例えば、Haemophilus influenzae（ハエモフィルス・インフルエンザ）のpckA遺伝子（Genbank Accession No. YP_248516.1：配列番号７９）、Pasteurella multocida（パスツレラ・マルトシダ）のpckA遺伝子（Genbank Accession No. NP_246481.1：配列番号８１）、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンスのpckA遺伝子（Genbank Accession No. YP_089485.1：配列番号８３）Yersinia pseudotuberculosis（エルシニア・シュードツベルクローシス）のpckA遺伝子（Genbank Accession No. YP_072243  配列番号８５）、Vibrio cholerae（ビブリオ・コレラ）のpckA遺伝子（Genbank Accession No. ZP_01981004.1：配列番号８７）が挙げられる。これらのpckA遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列番号７８、８０、８２、８４、８６、及び８８に示す。
【０１０９】
配列番号７８、８０、８２、８４、８６、及び８８のアミノ酸配列のアラインメントを図１〜３に示す。また、これらのコンセンサス（共通）配列を配列番号８９に示す。前記pckA遺伝子ホモログには、配列番号８９のアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び配列番号８９のアミノ酸配列に対して、90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子も含まれる。
【０１１０】
pckA遺伝子は、上記のとおり、既にいくつかの配列が明らかにされているので、それら
の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて得ることができる。例えば、配列番号２２及び２３に示すプライマーを用いて、アクチノバチルス・サクシノゲネスの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、アクチノバチルス・サクシノゲネスのpckAのコード領域と、その制御領域を含む隣接領域を取得することができる。アクチノバチルス・サクシノゲネスの具体例としては、130Z（ATCC55618）株が挙げられる。同株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 10801 University Boulevard, Manassas,
VA 20110, United States of America）から入手することができる。他の微生物のpckAのホモログも、同様にして取得され得る。
【０１１１】
本発明の細菌の構築において、NADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼの活性の増強、LDH、ALD、PTA、MDH、又はADHの活性の低下、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の低下のための改変の順序は特に制限されず、どのような順序でもよい。
【０１１２】
＜２＞本発明のＬ−グルタミン酸系アミノ酸の製造方法
本発明の方法は、上記細菌を、嫌気又は微好気条件で培地中で培養し、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法である。
【０１１３】
通常、微生物の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給する好気的条件で培養することが好ましい。一方、本発明の方法では、嫌気又は微好気条件で培養を行う。
【０１１４】
本発明において、「嫌気又は微好気条件」とは、通気をせずに培養すること、又は、培地中の溶存酸素濃度（DO）を低く抑えて培養することを意味する。溶存酸素濃度は、好ましくは0〜1.5 mg/l、より好ましくは0〜1mg/l、さらに好ましくは0〜0.5mg/lである。嫌気又は微好気条件は、例えば、培地への通気量や培地の攪拌を通常よりも低下させること、培養容器を密閉して無通気で培養すること、炭酸ガス等の不活性ガスを培地に通気すること等により、培地中の溶存酸素濃度を調整することによって達成される。
【０１１５】
本発明においては、全培養期間を通じて嫌気又は微好気条件で培養してもよいが、培養期間を、細菌を増殖させる培養期と、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸を生産させる培養期に分け、それぞれ異なる培地又は条件で培養を行ってもよい。例えば、好気的情報、例えば通気及び／又は攪拌下で細菌を増殖させた後、嫌気又は微好気条件下でＬ−グルタミン酸系アミノ酸を生産させてもよい。
【０１１６】
また、細菌を培地で培養するに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接液体培地に接種しても良いが、細菌を予め液体培地で培養（種培養又は前培養）したものを本培養用の培地（発酵培地）に接種するのが好ましい。種培養又は前培養では、通常、好気的条件で培養を行うことが好ましい。前培養は、複数回行ってもよい。
【０１１７】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。
【０１１８】
炭素源としては、細菌が資化してＬ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、又はＬ−アルギニンを生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリ
セロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース、脂肪酸等の炭水化物がよく用いられ、グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール、エタノール等のアルコール類等糖質も用いられる。炭素源は、１種でもよく、２種以上の混合物であってもよい。
【０１１９】
また、上記糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜、粗グリセロールなども使用される。粗グリセロールとしては、、例えばバイオディーゼル燃料生産において産生される粗グリセロールが挙げられる。
【０１２０】
上記炭素源の濃度は特に限定されないが、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、5〜30%（W/V）、好ましくは10〜20%（W/V）の範囲内で発酵が行われる。また、発酵の進行に伴う上記炭素源の減少にあわせ、炭素源の追加添加を行っても良い。
【０１２１】
また、窒素源としては、細菌が資化してＬ−グルタミン酸系アミノ酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、培養時の発泡を抑えるために、培地には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
【０１２２】
培養液のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本培養におけるpHは、通常、pH5〜10、好ましくはpH6〜9.5であることが好ましいので、培養中も必要に応じて培養液のpHはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
【０１２３】
本発明で用いる培地には、上記した炭素源と、炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させ、微好気又は嫌気的条件で培養することができる培地が好ましい。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム等の炭酸塩又は重炭酸塩から供給されるが、必要に応じて炭酸ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、0.001〜5M、好ましくは0.1〜3M、さらに好ましくは1〜2Mの濃度で添加する。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液1L当たり50mg〜25g、好ましくは100mg〜15g、さらに好ましくは150mg〜10gの炭酸ガスを含有させる。
【０１２４】
培養温度は、通常、25℃〜40℃、好ましくは30℃〜37℃である。培養時間は1時間〜168時間が好ましく、3時間〜72時間がより好ましい。
【０１２５】
また、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調製された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、pH5.0〜4.0、好ましくはpH4.5〜4.0、さらに好ましくはpH4.3〜4.0、特に好ましくはpH4.0を挙げることができる。
【０１２６】
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸系アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方
法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【実施例】
【０１２７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。
【０１２８】
〔参考例〕
はじめに、実施例において遺伝子破壊のツールとして使用したプラスミドについて記載する。
【０１２９】
（１）RSF-Red-TER
λのgam、bet及びexoの各遺伝子を発現する新規なヘルパープラスミドRSF-Red-TER（図４）を構築した。RSF-Red-TERの構築スキームを図５に示す。
構築の最初の工程として、RSFsacBPlacMCSベクターをデザインした。そのために、pACYC184プラスミドのcat遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子）、及びバチルス・サブチリスのsacB遺伝子の構造部分を含むＤＮＡ断片を、それぞれ配列番号１、２、３、４のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは各々、さらなるクローニングに必要な、都合のよいBglII、SacI、XbaI、及びBamHI制限酵素部位を5'末端に含んでいる。得られた1.5kbのsacB断片を、先に得たpMW119-PlaclacIベクターのXbaI-BamHI部位にクローニングしpMW-PlaclacIsacBプラスミドを得た。pMW119-PlaclacIベクターは、pMW118-PlaclacIベクターについての記載（Skorokhodova, A.Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)）と同様にして構築した。但し、同ベクターは、pMW218プラスミドの代わりにpMW219からのポリリンカー部位を含んでいる。
【０１３０】
次に、前記の1.0kbのcat断片をBglII及びSacIで処理し、先の工程で得たpMW-PlaclacIsacBプラスミドのBamHI-SacI部位にクローニングした。得られたプラスミドpMW-PlaclacIsacBcatは、PlacUV5-lacI-sacB-cat断片を含んでいる。この断片をRSF1010ベクターにサブクローンするために、pMW-PlaclacIsacBcatをBglIIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、続いてSacIで切断した。pMW-PｌａｃlacIsacBcatプラスミドの3.8kbのBglII-SacI断片を1%アガロースゲルから溶出させ、PstIで切断後末端を平滑化し、さらにSacIで処理したRSF1010ベクターに連結した。ライゲーション混合液でエシェリヒア・コリTG1を形質転換し、クロラムフェニコール（50mg/L）を含むLB培地にプレートした。生育したクローンから単離したプラスミドの制限酵素解析を行い、RSFsacBプラスミドを得た。RSFsacBPlacMCSベクターを構築するために、配列番号５及び６のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pMW119-PlaclacIプラスミドを鋳型として用いて、PlacUV5プロモーターを含むDNA断片をPCRにより増幅した。得られた146bpの断片をSacI及びNotIで消化し、RSFsacBプラスミドのSacI-NotI大断片と連結した。その後、配列番号７及び８のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pKD46プラスミド（Datsenko,
K.A., Wanner, B.L., Proc.Nat1.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, (2000)）を鋳型とし用いたPCRにより、λRedαβγ遺伝子、及び転写ターミネーターtL3を含む2.3kbのDNA断片を増幅した。得られた断片をRSFsacBPlacMCSベクターのPvuI-NotI部位にクローニングした。こうして、RSFRedプラスミドをデザインした。
【０１３１】
Red遺伝子のリードスルー転写を排除するために、エシェリヒア・コリのrrnBオペロンのρ−依存性転写ターミネーターを、cat遺伝子とPlacUV5プロモーターとの間に挿入した。そのために、配列番号９及び１０のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、エシェリ
ヒア・コリBW3350の染色体を鋳型として用いたPCRにより、PlacUV5プロモーターとTrrnBターミネーターを含むDNA断片を増幅した。得られたこれらの断片をKpnIで処理して、連結した。その後、配列番号１１及び１２のオリゴヌクレオチドをプライマーとするオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、PlacUV5及びTrrnBの両方を含む0.5kb断片を、増幅した。得られたDNA断片をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、BamHIで切断し、RSF-RedベクターのEcl136II-BamHI大断片と連結した。得られたプラスミドをRSF-Red-TERと命名した。
【０１３２】
（２）RSF-int-xis
遺伝子破壊株から、遺伝子の破壊に用いたプラスミドに由来する抗生物質耐性遺伝子を除去するためのプラスミドとして、RSF-int-xisを構築した。RSF-int-xis構築の材料として、pMW-intxis-tsを用いた。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ(Xis)をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである（WO2007/037460、特開2005-058827）。
【０１３３】
プライマーintxis_f（配列番号１３）とプライマーintxis_R（配列番号１４）、及び、pMW-intxis-tsを鋳型として用いたPCRにより、intxis領域を含むDNA断片を増幅した。得られたDNA断片をNotI及びPvuIで消化し、RSF-Red-TERプラスミドのNotI及びPvuIで消化した大断片と連結した。得られたプラスミドをRSF-int-xisと命名した。
【０１３４】
（３）pMW118-attL-Tc-attR
pMW118-attL-Tc-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子であるTc遺伝子を挿入したプラスミドであり、attL-Tc-attRの順で挿入されている（WO2005/010175、特開2005-58227）。
【０１３５】
（４）pMW118-attL-Km-attR
pMW118-lattL-Km-attRプラスミドは、pMW118-attL-Tc-attRプラスミドから、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子をpUC4Kプラスミド（Vieira, J. and Messing, J., Gene, 19(3): 259-68 (1982)）のカナマイシン耐性遺伝子で置換することによって構築した。そのために、pMW118-attL-Tc-attRプラスミドのEcoRI-PstI大断片を、pUC4KプラスミドのHindIII-PstI(676bp)及びEcoRI-HindIII(585bp)の２つの断片に連結した（WO2005/010175、特開2005-58227）。
【０１３６】
〔実施例１〕prpC遺伝子増幅用プラスミドRSFPPGの構築
Ｌ−グルタミン酸生合成系遺伝子としてppc遺伝子、及びgdh遺伝子（欧州出願公開0999282号明細書）、並びにprpC遺伝子（国際公開2006/051660号パンフレット）を保持するプラスミドRSFPPGを構築した。同プラスミドは、ppc遺伝子、gdh遺伝子及びgltA遺伝子を保持するプラスミドRSFCPG（欧州出願公開1233068号）を材料とし、gltA遺伝子をprpC遺伝子に置換えることにより構築した。
【０１３７】
RSFCPGのgltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するプライマーRSFBgl-2（配列番号１５）とプライマーRSFKpn（配列番号１６）を設計した。このプライマーを用いて、RSFCPGを鋳型にPCRを行い、約14.9kbの断片を取得した。一方、prpCに関してはプライマーcoliprpCBgl-1（配列番号１７）とプライマーcoliprpCKpn（配列番号１８）を用い、E. coli W3110株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、約1.2kbの断片を取得した。両PCR産物をそれぞれBglII、KpnIで処理し、ライゲーション後、E. coli JM109株を形質転換した。出現したコロニーを全て集菌し、混合物としてプラスミドを抽出した。このプラスミド混合物でクエン酸シンターゼ（CS）欠損株であるE. coli ME8330株を形質転換し、50mg/Lウラシル、5mg/Lチアミン-HClを含有するM9最少培地（グルコース5 g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸
一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に塗布した。出現した株よりプラスミドを抽出し、これをRSFPPGとした。出現したコロニーを全て集菌し、混合物としてプラスミドを抽出し、このプラスミド混合物でP. ananatisのＬ−グルタミン酸生産菌であるNP106株を形質転換した。出現したクローンについて中性条件で試験管培養を行い、G106S株と同等のＬ−グルタミン酸収率を示す株をNA1とした。また本菌株よりプラスミドを抽出しこれをprpC, gdh, ppc強化用プラスミドRSFPPGとした。
【０１３８】
前記NP106S株は、パントエア・アナナティスAJ13601株から、同菌株が保有しているエシェリヒア・コリ由来のgltA、ppc、gdhAの各遺伝子を含むプラスミドRSFCPG、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のgltA遺伝子を含むプラスミドpSTVCBを脱落させた株である。また、前記G106S株は、AJ13601株から、pSTVCBのみを脱落させた株である。
【０１３９】
〔実施例２〕pckA増幅用プラスミドの構築
（１）エシェリヒア・コリ MG1655株のスレオニンオペロンプロモーター断片の取得
エシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)のゲノムの全塩基配列（Genbank Accession No. U00096）は既に明らかにされている（Science, 277, 1453-1474 (1997)）。本配列を基にスレオニンオペロン（thrLABC）のプロモーター領域のPCR増幅を行った。5'プライマーとしてSalIサイトを有する配列番号１９に示す合成オリゴヌクレオチド、及び、3'プライマーとして配列番号２０に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC47076, ATCC700926）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、スレオニンオペロンプロモーター断片（A）（配列番号２１）を得た。
【０１４０】
（２）アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z（ATCC55618）株のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子断片の取得
アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株のゲノムの全塩基配列（Genbank Accession No. CP000746）も既に公開されており、PEPCKをコードする遺伝子（遺伝子名pckA）の塩基配列を基にプライマーを設計し、PCR増幅を行った。5'プライマーとして配列番号２２に示す合成オリゴヌクレオチド、及び、3'側プライマーとしてSalIサイトを有する配列番号２３に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、pckA遺伝子断片（B）（配列番号２４）を得た。
【０１４１】
（３）pckA遺伝子増幅用プラスミドpSTV-pckの構築
上記、断片（A）と（B）を鋳型にし、SalIサイトを有した配列番号１９と配列番号２３のプライマーを用いてPCR反応を行い、断片（A）と（B）が結合された遺伝子断片（C）を得た。この遺伝子断片（C）を制限酵素SalIにて処理、精製した産物を、制限酵素SalIで消化したプラスミドベクターpSTV28（宝バイオ社製）に結合して、pckA増幅用プラスミドpSTV28::Pthr::pckA（以下、「pSTV-pck」とも記載する）を構築した。
【０１４２】
〔実施例３〕目的遺伝子欠損株の構築
（１）エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株の目的遺伝子の部分配列の決定
エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株のadhE、sucA、mdh、ldh、pta、及びaldC遺伝子を破壊するために、同株の各遺伝子の部分配列を以下のようにして決定した。
【０１４３】
（Ａ）adhE
E. coliのadhE遺伝子配列を参考にして設計した、配列番号２６及び２７のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ATCC13048ゲノムＤＮＡを鋳型とし、TaKaRa Ex Taq(タカラバイオ社製)DNAポリメラーゼ用いたPCRにより、adhE領域のDNA断片を増幅し、pGEM-T Vector(Promega社製)にクローニングした。インサートの両端をpUC/M13フォワードプライマ
ー（Forward Primer）（配列番号２８）及びリバースプライマー（Reverse Primer）（配列番号２９）を用いてシークエンスし、ATCC13048株adhE遺伝子の部分配列を決定した（N末側配列：配列番号３０、C末側配列：配列番号３１）。
【０１４４】
（Ｂ）sucA
E. coliのsucA遺伝子配列を参考にして設計した、配列番号３２及び３３のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ATCC13048ゲノムＤＮＡを鋳型とし、Pyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いたPCRにより、sucA領域のDNA断片を増幅し、pHSG399(タカラバイオ社製)のSmaIサイトにクローニングした。インサートの両端をpUC/M13フォワードプライマー（配列番号２８）及びリバースプライマー（配列番号２９）を用いてシークエンスし、ATCC13048株sucA遺伝子の部分配列を決定した（N末側配列：配列番号３４ 、C末側配列：配列番号３５）。
【０１４５】
（Ｃ）mdh
E. coliのmdh遺伝子配列を参考にして設計した、配列番号３６及び３７のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ATCC13048ゲノムＤＮＡを鋳型とし、TaKaRa Ex Taq(タカラバイオ社製)DNAポリメラーゼ用いたPCRにより、mdh領域のDNA断片を増幅し、pGEM-T Vector(Promega社製)にクローニングした。インサートの両端をpUC/M13フォワードプライマー（配列番号２８）及びリバースプライマー（配列番号２９）を用いてシークエンスし、ATCC13048株mdh遺伝子の部分配列を決定した（N末側配列：配列番号３８、C末側配列：配列番号３９）。
【０１４６】
（Ｄ）ldh
E. coliのldhA遺伝子配列を参考にして設計した、配列番号４０及び４１のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ATCC13048ゲノムＤＮＡを鋳型とし、TaKaRa Ex Taq(タカラバイオ社製)DNAポリメラーゼを用いたPCRにより、ldh領域のDNA断片を増幅した。得られたPCR断片をDNA Blunting Kit (タカラバイオ社製)で平滑化し 、pHSG399(タカラバイオ社製)のSmaIサイトにクローニングした。インサートの両端をpUC/M13フォワードプライマー（配列番号２８）及びリバースプライマー（配列番号２９）を用いてシークエンスし、ATCC13048株ldh遺伝子の部分配列を決定した（N末側配列：配列番号４２、C末側配列：配列番号４３）。
【０１４７】
（Ｅ）pta
E. coliのpta遺伝子配列を参考にして設計した、配列番号４４及び４５のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ATCC13048ゲノムＤＮＡを鋳型とし、TaKaRa Ex Taq(タカラバイオ社製)DNAポリメラーゼ用いたPCRにより、pta領域のDNA断片を増幅し、pGEM-T Vector(Promega社製)にクローニングした。インサートの両端をpUC/M13フォワードプライマー（配列番号２８）及びリバースプライマー（配列番号２９）を用いてシークエンスし、ATCC13048株pta遺伝子の部分配列を決定した（N末側配列：配列番号４６、C末側配列：配列番号４７）。
【０１４８】
（Ｆ）aldC
文献（Appl. Environ. Microbiol. 54 (1), 38-42 (1988)）に記載されているエンテロバクター・アエロゲネスのaldC遺伝子配列を参考にして設計した、配列番号４８及び４９のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ATCC13048ゲノムＤＮＡを鋳型とし、TaKaRa Ex
Taq(タカラバイオ社製)DNAポリメラーゼ用いたPCRにより、pta領域のDNA断片を増幅し、pT7Blue-2 (Novagen社製)にクローニングした。インサートの両端をpUC/M13フォワードプライマー（配列番号２８）及びT7プロモータープライマー（promoter Primer）リバースプライマー（配列番号５０）を用いてシークエンスし、ATCC13048株aldC遺伝子の部分配列を決定した（N末側配列：配列番号５１(塩基番号48〜50がスタートコドン) 、C末側配
列：配列番号５２（塩基番号５〜７がストップコドン）。
【０１４９】
〔実施例４〕λレッド法による遺伝子破壊株の構築
遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I.,
and Gardner, J. F. 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203）を参考にして実施した。本手法により、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。このPCR産物は、目的遺伝子の5’側の部分配列、抗生物質耐性遺伝子、及び目的遺伝子の3’側の部分配列からなる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組み合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。
【０１５０】
（１）目的遺伝子欠失用PCR産物の調製
抗生物質耐性遺伝子の両端にそれぞれλファージのattL及びattRの配列を付加し、更にその外側にそれぞれ目的遺伝子の上流50〜100bp、下流50〜100bpの配列を付加した遺伝子断片を以下のようにして得た。
【０１５１】
pMW118-attL-Km-attR又はpMW118-attL-Tc-attRを鋳型として、下記表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとし、TaKaRa Ex Taq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、PCRを行なった。得られたPCR反応液にDpnI制限酵素を添加し、反応液に含まれる鋳型DNAを切断後、目的PCR増幅断片をWizard PCR Prep DNA Purification System（Promega社製）を用いて精製した。
【０１５２】
【表１】
2009254323.tif 000003
【０１５３】
（２）遺伝子破壊株の構築法
エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、又は同株に由来する株の遺伝子破壊は、RSF-Red-TERプラスミドを用いて、以下のようにして行った。
【０１５４】
遺伝子を破壊する親株を20μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB培地で終夜培養し、この培養液を20μg/ml クロラムフェニコールと1mM IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノサイド）を含有するLB培地50mLに1/100量接種し、3時間30℃で培養を行った。菌体を集菌し、氷冷した15%グリセロールで2回洗菌した後、最終的に0.2mLの15%グリセロールに懸濁したものをコンピテントセルとして用いた。このコンピテントセルに、上項で調製した目的遺伝子欠失用PCR産物を、GENE PULSER II（BioRad社製）を用いて、電場強度18kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で導入した。細胞懸濁液に、LB培地を添加し、37℃で2時間振盪培養を行った後、LB培地に抗生物質（50μg/mlのカナマイシン又は15μg/mlのテトラサイクリン）を加えた培地に塗布した。出現したコロニーを同培地で純化した後、PCRにより目的遺伝子が抗生物質耐性遺伝子と置換していることを
確認した。確認のPCRに用いたプライマー配列は以下のとおりである。
【０１５５】
【表２】
2009254323.tif 000004
【０１５６】
次に、前記のようにして得られた各組換え株からRSF-Red-TERプラスミドを脱落させるため、これらの株を10%シュークロース及び1mM IPTGを含むLB培地に塗布し、37℃で一晩培養した。出現したコロニーの中から、クロラムフェニコール耐性を欠失した株を、目的株として選択した。
【０１５７】
上記のようして得られた遺伝子破壊株から抗生物質耐性遺伝子を除去する場合は、RSF-int-xisプラスミドを用いた。遺伝子破壊株にRSF-int-xisを電気パルス法で導入し、20μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB培地に塗布後30℃で培養し、RSF-int-xis保持株を得た。得られたプラスミド保持株を、20μg/mlクロラムフェニコール及び1mM IPTGを含有するLB培地で純化し、シングルコロニーを複数得た。得られた株の中から、除去したい抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質耐性が欠失した株を選択した。これらの株は抗生物質耐性遺伝子が除去された株である。次に、得られた株からRSF-int-xisプラスミドを脱落させるため、10%シュークロース及び1mM IPTGを添加したLB培地に塗布し、37℃で一晩培養した。出現したコロニーの中から、クロラムフェニコール耐性を欠失した株を、目的株として選択した。
【０１５８】
（４）P1ファージを用いた遺伝子欠損の形質導入
エンテロバクター・アエロゲネスへのP1トランスダクションの適用が報告されている（Journal of bacteriology (1974) Vol. 118, p. 810-814）。本手法により、遺伝子破壊株から、遺伝子欠損の形質を他の株へ容易に移すことができる。
【０１５９】
（ａ）P1感受性株の選択
P1感受性を付与する対象のレシピエントを、5 mMのCaCl2を添加したLB培地で37℃、一晩振とう培養した。この培養液を5 mMのCaCl2を添加したLB培地5mLに1/100量接種し、2時間37℃で振とう培養した。培養液0.5 mlに、P1cmCmファージライセートを50μl添加後、30℃で１時間静置し、20μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB培地に塗布し30℃で一晩培養した。出現したコロニーを、20μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB培地に接種し、30℃及び37℃で培養した。30℃では生育するが、37℃では生育しない株は、P1cmが溶源化した株である。
【０１６０】
次に、P1Cmが脱落した株を得るために、P1cm溶源化株を30℃、LB液体培地で数時間振とう培養後、LB培地に塗布し、37℃で一晩培養した。出現したコロニーは、P1Cmが脱落した株であり、かつP1ファージ感受性の株である。以上のようにして、P1感受性株を作製した。
【０１６１】
（ｂ）P1ライセートの回収
上記のようにして得られたP1Cmが溶源化した株を、30℃でLB液体培地で静置培養した。
この培養液をLB培地10mlに1/10量接種し、30℃で2時間振とう培養後、42℃で20分、45℃で5分、42℃で20分、及び37℃で2時間振とう培養した。培養液にクロロホルムを適当量添加し、激しく攪拌後、遠心して上清を回収した。得られた溶液を、P1ライセートと呼ぶ。
【０１６２】
（ｃ）P1トランスダクション
ドナー株である遺伝子破壊株から、上記のようにしてP1ライセートを調製した。次に、P1感受性になったレシピエント株を、5 mMのCaCl2を添加したLB培地で一晩37℃で振とう培養した。培養液1mlを遠心して菌体を回収し、1mlのMC バッファー（0.1M MgSO4, 0.005M CaCl2）に懸濁し、0.2 mlずつ分注した。P1ライセートを4通りの量（原液で20μl、2μl、100倍希釈液で20μl、2μl）で添加して、30℃で30分静置してファージを感染させた。30分後、0.4 mlの0.1 Mクエン酸バッファー（pH5.5、NaOHで調整）を添加して、0.1mlずつ選択培地に塗布した。出現したコロニーを同培地で純化した後、PCRにより目的形質が導入されていることを確認した。
【０１６３】
（５）遺伝子破壊株の構築
以下の工程で、プラスミドは電気パルス法で導入した。
【０１６４】
（ａ）ATCC13048 (RSFPPG, pSTV28)
ATCC13048に、RSFPPG及びpSTV28を導入して、ATCC13048 (RSFPPG, pSTV28)株を得た。
【０１６５】
（ｂ）ATCC13048 (RSFPPG, pSTV-pck)
ATCC13048に、RSFPPG及びpSTV-pckを導入して、ATCC13048 (RSFPPG, pSTV-pck)株を得た。
【０１６６】
（ｃ）ATCC13048 (RSFPPG)
ATCC13048にRSFPPGを導入して、ATCC13048 (RSFPPG)株を得た。
【０１６７】
（ｄ）ATCC13048 mdh (RSFPPG)
ATCC13048株からλred法により、mdh遺伝子を欠損した株ATCC13048 mdhを作製し、得られた株にRSFPPGを導入して、ATCC13048 mdh (RSFPPG)株を得た。
【０１６８】
（ｅ）ATCC13048 adhE (RSFPPG)
ATCC13048株からλred法により、sucAを欠損したATCC13048 sucA株を構築した。このATCC13048 sucA株からλred法により、adhEを欠損したATCC13048 sucA adhE株を構築した。得られた株をドナーとし、P1感受性のATCC13048株をレシピエントとするP1トランスダクションにより、adhEを欠損したATCC13048 adhE株を作製した。次に、ATCC13048 adhE株にRSFPPGを導入してATCC13048 adhE (RSFPPG)株を得た。
【０１６９】
（ｆ）ATCC13048 ldh (RSFPPG)
ATCC13048株からλred法により、ldh遺伝子を欠損した株ATCC13048 ldhを作製し、得られた株にRSFPPGを導入して、ATCC13048 ldh (RSFPPG)株を得た。
【０１７０】
（ｇ）ATCC13048 aldC (RSFPPG)
ATCC13048 sucA株からλred法によりaldCを欠損したATCC13048 sucA aldC株を得た。得られた株をドナーとし、P1感受性のATCC13048株をレシピエントとするP1トランスダクションにより、aldCを欠損したATCC13048 aldC株を作製した。次に、ATCC13048 aldC株にRSFPPGを導入してATCC13048 aldC (RSFPPG)株を得た。
【０１７１】
（ｈ）ATCC13048 pta (RSFPPG)
ATCC13048株からλred法により、pta遺伝子を欠損した株ATCC13048 ptaを作製し、得ら
れた株にRSFPPGを導入してATCC13048 pta (RSFPPG)株を得た。
【０１７２】
（ｉ）ATCC13048 aldC ldh (RSFPPG)
ATCC13048 aldC株にP1トランスダクションによりldh欠損形質を導入することで、ATCC13048 aldC ldh株を作製した。ldh欠損形質のドナーには、（ｆ）で作製したATCC13048 ldh株を用いた。次に、ATCC13048 aldC ldh株にRSFPPGを導入してATCC13048 aldC ldh (RSFPPG)株を得た。
【０１７３】
（ｊ）ATCC13048 pta aldC ldh (RSFPPG)
ATCC13048 pta株にP1トランスダクションにより順次aldC、ldh欠損形質を導入して、ATCC13048 pta aldC ldh株を構築した。次に、同株にRSFPPGを導入してATCC13048 pta aldC
ldh (RSFPPG)株を得た。
【０１７４】
（ｋ）ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG)
ATCC13048 pta aldC ldh株にP1トランスダクションによりmdh欠損を導入して、ATCC13048 pta aldC ldh mdh株を構築した。次に、同株にRSFPPGを導入してATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG)株を得た。
【０１７５】
（ｌ）ATCC13048 pta aldC ldh adhE (RSFPPG)
ATCC13048 pta aldC ldh株にP1トランスダクションによりadhE欠損を導入して、ATCC13048 pta aldC ldh adhE株を構築した。次に、同株にRSFPPGを導入してATCC13048 pta aldC ldh adhE (RSFPPG)株を得た。
【０１７６】
（ｍ）ATCC13048 P1s pta aldC ldh mdh (RSFPPG, pSTV-pck) 
ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG)株にpSTV-pckを導入して、ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG , pSTV-pck)株を得た。
【０１７７】
（ｎ）ATCC13048 P1s pta aldC ldh mdh (RSFPPG, pSTV28)
ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG)株にpSTV28を導入して、ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG , pSTV28)株を得た。
【０１７８】
（ｏ）ATCC13048 P1s pta aldC ldh adhE (RSFPPG, pSTV28)
ATCC13048 pta aldC ldh adhE (RSFPPG)株にpSTV28を導入して、ATCC13048 pta aldC ldh adhE (RSFPPG , pSTV28)株を得た。
【０１７９】
（ｐ）ATCC13048 P1s pta aldC ldh mdh (RSFPPG, pSTV28)
ATCC13048 pta aldC ldh adhE (RSFPPG)株にpSTV-pckを導入してATCC13048 pta aldC ldh adhE (RSFPPG , pSTV-pck)株を得た。
【０１８０】
（ｑ）ATCC13048 (RSFCPG)
ATCC13048株にRSFCPG(欧州特許出願公開第0952221号明細書)を導入して、ATCC13048 (RSFCPG)株を得た。
【０１８１】
〔実施例５〕各遺伝子破壊株によるＬ−グルタミン酸生産
（Ａ）嫌気培養でのＬ−グルタミン酸生産の評価法
嫌気培養でのＬ−グルタミン酸生産は、以下のようにして評価した。
各菌株を適切な抗生物質（カナマイシンの場合は50μg/ml、テトラサイクリンの場合は15μg/ml、クロラムフェニコールの場合は20μg/ml）を含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて16時間培養した。その後、各プレートをアネロパック（三菱ガス化学株式会社製
嫌気性菌簡易培養用  品番A-04）に入れ、嫌気条件下、37℃で6時間培養を行った。得
られたプレートの菌体を、700μlの0.8%の食塩水に、51倍希釈でOD600=0.5〜1.5となる様に懸濁した。この菌体懸濁液100μlと、予め炭酸ガスを吹込むことにより培地に溶解している気体を炭酸ガスにて概ね置換した生産培地1mlを、1.5ml容のねじキャップ式マイクロチューブに分注して蓋を締め、嫌気条件下マイクロチューブシェイカーを用いて37℃において24時間又は48時間培養した。以下に生産培地の組成を示す。
【０１８２】
〔Ａ区〕
グルコース                      20  g/L（最終濃度）
硫酸マグネシウム・七水和物        1  g/L
〔Ｂ区〕
硫酸アンモニウム                 10  g/L
リン酸二水素カリウム             1  g/L
硫酸マンガン・五水和物           10 mg/L
硫酸鉄・七水和物                 10 mg/L
Yeast Extract                    2  g/L
ビオチン                         1 mg/L
(KOHにてpH=6に調製)
〔Ｃ区〕
炭酸カルシウム（日本薬局方）  50  g/L
Ａ区、Ｂ区をそれぞれ115℃、10分オートクレーブ滅菌、Ｃ区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、放冷し、混合する。
【０１８３】
培養後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸及び残糖の濃度をバイオテックアナライザー AS-310 (サクラエスアイ(株))により分析した。また、その他の有機酸量を液体クロマトグラフィーHPLCシステム（L-7100、L-7200、L-7300、L-7400、(株)日立ハイテクノロジーズ、カラムはURUTRON PS-80H（信和化工(株)））により分析した。エタノール及び2,3-ブタンジオールはガスクロマトグラフィー（島津製作所製）により測定した。菌体のODは、0.1Nの塩酸でサンプルを希釈し、培地中の炭酸カルシウムを溶解した後、スペクトロフォトメーターDU800 (Beckman Coulter)を用いて測定した。
【０１８４】
（Ｂ）Ｌ−グルタミン酸生産に対するRSFPPG導入の効果
ATCC13048株、及び、ATCC13048株にRSFCPG又はRSFPPGを導入した株の嫌気条件下でのＬ−グルタミン酸生産を、上記の方法で評価した。消費糖当たりのＬ−グルタミン酸蓄積量の重量収率（以下、同様）を、表３に示す。野性株ATCC13048、及び、RSFCPGプラスミドによりNADHによる阻害を受けるクエン酸シンターゼ(gltA)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(gdh)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)を強化した株(ATCC13048 (PSFCPG))はＬ−グルタミン酸をほとんど蓄積しないが、RSFPPGプラスミドによりNADHによる阻害を受けないクエン酸シンターゼ(prpC)、gdh、及びppcを強化した株(ATCC13048 (PSFPPG))は、Ｌ−グルタミン酸を蓄積した。
【０１８５】
【表３】
2009254323.tif 000005
【０１８６】
（Ｃ）Ｌ−グルタミン酸生産に対する各遺伝子欠損の効果
RSFPPGを保持し、各種遺伝子を欠損した株の嫌気条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積を上
記の方法で評価した。結果を表４に示す。対照に比べて、特にmdh又はptaを欠損した株は有意にＬ−グルタミン酸蓄積が向上した。
【０１８７】
【表４】
2009254323.tif 000006
【０１８８】
（Ｄ）Ｌ−グルタミン酸生産に対する遺伝子欠損の組合わせの効果
次に、複数の遺伝子を欠損した株の嫌気条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積を、上記の方法で評価した。結果を表５に示す。対照に比べて、pta、aldC、及びldhを同時に欠損させた株、又はpta、aldC、ldh、mdhを同時に欠損した株では、有意にＬ−グルタミン酸蓄積が向上した。
【０１８９】
【表５】
2009254323.tif 000007
【０１９０】
ATCC13048 pta aldC ldh mdh (RSFPPG)の培養終了後（18.6mgの糖を消費した）の培地中の成分量を、表６に示す。主に、Ｌ−グルタミン酸、エタノール及び蟻酸を生成していることが分かった。
【０１９１】
【表６】
2009254323.tif 000008
【０１９２】
（Ｅ）pck増強のＬ−グルタミン酸生産に対する効果
次に、pckを増強株の嫌気条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積を、上記の方法で評価した。結果を表７に示す。対照に比べて、pck増強株では有意にＬ−グルタミン酸蓄積が向上した。
【０１９３】
【表７】
2009254323.tif 000009
【０１９４】
（Ｆ）遺伝子欠損株におけるpck増強のＬ−グルタミン酸生産に対する効果
次に、各種遺伝子を欠損し、pckが増強された株の、嫌気条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積を上記の方法で評価した。結果を表７に示す。対照に比べて、pck増強株では有意にＬ−グルタミン酸蓄積が向上した。
【０１９５】
【表８】
2009254323.tif 000010
【０１９６】
〔配列表の説明〕
配列番号１：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号２：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号３：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号４：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号５：PｌａｃＵＶ５プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号６：PｌａｃＵＶ５プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号７：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号８：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号９：PｌａｃＵＶ５プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号10：PｌａｃＵＶ５プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号11：attL増幅用プライマー
配列番号12：attL増幅用プライマー
配列番号13：intxis領域増幅用プライマーintxis_f
配列番号14：intxis領域増幅用プライマーintxis_R
配列番号15：gltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するためのプライマー
配列番号16：gltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するためのプライマー
配列番号17：prpC遺伝子増幅用プライマー
配列番号18：prpC遺伝子増幅用プライマー
配列番号19：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号20：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号21：スレオニンプロモーター遺伝子断片
配列番号22：Actinobacillus succinogenes pckA遺伝子増幅用プライマー
配列番号23：Actinobacillus succinogenes pckA遺伝子増幅用プライマー
配列番号24：Actinobacillus succinogenes ATCC55618 pckA塩基配列
配列番号25：Actinobacillus succinogenes ATCC55618 pckAがコードするアミノ酸配列  配列番号26：Enterobacter aerogens adhE遺伝子増幅用プライマー
配列番号27：Enterobacter aerogens adhE遺伝子増幅用プライマー
配列番号28：pUC/M13フォワードプライマー
配列番号29：pUC/M13リバースプライマー
配列番号30：Enterobacter aerogens ATCC13048 adhE遺伝子5'末端側部分配列
配列番号31：Enterobacter aerogens ATCC13048 adhE遺伝子3'末端側部分配列
配列番号32：Enterobacter aerogens sucA遺伝子増幅用プライマー
配列番号33：Enterobacter aerogens sucA遺伝子増幅用プライマー
配列番号34：Enterobacter aerogens ATCC13048 sucA遺伝子5'末端側部分配列
配列番号35：Enterobacter aerogens ATCC13048 sucA遺伝子3'末端側部分配列
配列番号36：Enterobacter aerogens mdh遺伝子増幅用プライマー
配列番号37：Enterobacter aerogens mdh遺伝子増幅用プライマー
配列番号38：Enterobacter aerogens ATCC13048 mdh遺伝子5'末端側部分配列
配列番号39：Enterobacter aerogens ATCC13048 mdh遺伝子3'末端側部分配列
配列番号40：Enterobacter aerogens ldhA遺伝子増幅用プライマー
配列番号41：Enterobacter aerogens ldhA遺伝子増幅用プライマー
配列番号42：Enterobacter aerogens ATCC13048 ldhA遺伝子5'末端側部分配列
配列番号43：Enterobacter aerogens ATCC13048 ldhA遺伝子3'末端側部分配列
配列番号44：Enterobacter aerogens pta遺伝子増幅用プライマー
配列番号45：Enterobacter aerogens pta遺伝子増幅用プライマー
配列番号46：Enterobacter aerogens ATCC13048 pta遺伝子5'末端側部分配列
配列番号47：Enterobacter aerogens ATCC13048 pta遺伝子3'末端側部分配列
配列番号48：Enterobacter aerogens aldC遺伝子増幅用プライマー
配列番号49：Enterobacter aerogens aldC遺伝子増幅用プライマー
配列番号50：T7プロモータープライマー
配列番号51：Enterobacter aerogens ATCC13048 aldC遺伝子5'末端側部分配列
配列番号52：Enterobacter aerogens ATCC13048 aldC遺伝子3'末端側部分配列
配列番号53：adhE遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号54：adhE遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号55：mdh遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号56：mdh遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号57：pta遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号58：pta遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号59：ldh遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号60：ldh遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号61：sucA遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号62：sucA遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号63：aldC遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号64：aldC遺伝子破壊用断片増幅用プライマー
配列番号65：adhE遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号66：adhE遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号67：mdh遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号68：mdh遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号69：pta遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号70：pta遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号71：ldh遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号72：ldh遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号73：sucA遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号74：sucA遺伝子遺伝子欠失確認用プライマー
配列番号75：Escherichia coli W3110 prpC塩基配列
配列番号76：Escherichia coli W3110 prpCがコードするアミノ酸配列
配列番号77：Actinobacillus succinogenes ATCC55618 pckA塩基配列
配列番号78：Actinobacillus succinogenes ATCC55618 pckAがコードするアミノ酸配列  
配列番号79：Haemophilus influenzae 86-028NP pckA塩基配列
配列番号80：Haemophilus influenzae 86-028NP pckAがコードするアミノ酸配列
配列番号81：Pasteurella multocida subsp. multocida str. PM70 pckA遺伝子
配列番号82：Pasteurella multocida subsp. multocida str. PM70 pckAがコードするアミノ酸配列
配列番号83：Mannheimia succiniciproducens MBEL55E pckA塩基配列
配列番号84：Mannheimia succiniciproducens MBEL55E pckAがコードするアミノ酸配列
配列番号85：Yersinia pseudotuberculosis IP 32953 pckA塩基配列
配列番号86：Yersinia pseudotuberculosis IP 32953 pckAがコードするアミノ酸配列
配列番号87：Vibrio cholerae 623-39 pckA塩基配列
配列番号88：Vibrio cholerae 623-39 pckAがコードするアミノ酸配列
配列番号89：PEPCKコンセンサス（共通）配列
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】各種PEPCKのアミノ酸配列のアラインメントと共通配列を示す図。
【図２】各種PEPCKのアミノ酸配列のアラインメントと共通配列を示す図（続き）。
【図３】各種PEPCKのアミノ酸配列のアラインメントと共通配列を示す図（続き）。
【図４】ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構造を示す図。
【図５】ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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