(57)【要約】      （修正有）【課題】臓器移植患者に移植後に投与される免疫抑制剤及びプロトンポンプ阻害剤の薬物相互作用及び血中免疫抑制剤濃度変動を予測に関する関連する一塩基多型として、ＣＹＰ３Ａ５＊３、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、ＭＤＲ１のＥｘｏｎ１２に含まれるＳＮＰｓ（Ｃ１２３６Ｔ）、Ｅｘｏｎ２１に含まれるＳＮＰｓ（Ｇ２６７７ＴＡ）、Ｅｘｏｎ２６に含まれるＳＮＰｓ（Ｃ３４３５Ｔ）の６種の一塩基多型の検出において、迅速かつ簡便な検出手段を提供する。【解決手段】６種の一塩基多型を含む核酸領域を一度の操作で同時に増幅するために特定塩基配列からなる核酸増幅用プライマーのセットを用い、さらに６種の一塩基多型検出において一塩基伸長反応を行うために、特定の塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーのセットを用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ＣＹＰ３Ａ５＊３、（２）ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、（３）ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、（４）ＭＤＲ１のＥｘｏｎ１２に含まれる一塩基多型、（５）ＭＤＲ１のＥｘｏｎ２１に含まれる一塩基多型、（６）ＭＤＲ１のＥｘｏｎ２６に含まれる一塩基多型の検出方法であって、
配列番号１〜１２に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーを用いて、標的核酸中の（１）〜（６）の一塩基多型を含む領域を同時に増幅してＤＮＡ産物を得る第１の工程、
第１の工程で得られたＤＮＡ産物を鋳型として、配列番号１３〜１８に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーとハイブリダイズさせて複合体を形成し、該複合体の一塩基伸長用プライマーに標識ヌクレオチドを付加する一塩基伸長反応を行うことにより標識産物を得る第２の工程、
を含む一塩基多型の検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の一塩基多型の検出方法において用いられる、配列番号１〜１２に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーのセット。
【請求項３】
請求項１に記載の一塩基多型の検出方法において用いられる、配列番号１３〜１８に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーのセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一塩基多型の検出方法、並びに前記方法で用いられる核酸増幅用プライマーのセット及び一塩基伸長用プライマーのセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子多型はある個人の特性全体を表すのみならず、様々な疾患や病態の原因や臨床経過に関わるという点で注目を集めている。一塩基多型（以下、ＳＮＰとも言う）は、ヒトには１４２０万以上も認められている遺伝子多型であり、その中には疾患や病態の重症化予測因子として有用であるものがあると考えられている。また近年、一塩基多型を用いて、ある遺伝子の連鎖不均衡のブロック様構造が判明したり、ある一塩基多型と近傍の一塩基多型が連鎖関係をもつことでハプロタイプの多様性が限定されるということが明らかになった。すなわちある個人の多数の一塩基多型を同時に検出することで、その個人の遺伝的背景が判明するようになってきた。  
【０００３】
特に、ＣＹＰ３Ａ５＊３、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、ＭＤＲ１のＥｘｏｎ１２に含まれるＳＮＰ、ＭＤＲ１のＥｘｏｎ２１に含まれるＳＮＰ、ＭＤＲ１のＥｘｏｎ２６に含まれるＳＮＰの６種の一塩基多型は、免疫抑制剤の薬物動態（薬物血中濃度）との関連性が示唆されており、臓器移植領域においては、患者におけるこれらの一塩基多型を事前に検出して個人に応じた適切な投与量を決定するなど、これらの一塩基多型を解析することは非常に有用であると考えられている（非特許文献１〜３）。
【０００４】
従って免疫抑制剤及びプロトンポンプ阻害剤が併用投与された臓器移植患者における薬物相互作用及び血中免疫抑制剤濃度変動の予測は、前記の一塩基多型の全てを検出することが必要であると考えられている。
【０００５】
一塩基多型の解析を行うために、様々な種類の解析方法が考案されてきた。これらには、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（非特許文献４）、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ法（非特許文献５）、一塩基伸長法等の解析方法がある。これらの解析方法は、単一の一塩基多型を複数の患者において解析する際には有用であるが、ある個人における複数の一塩基多型を解析するためには、目的の一塩基多型それぞれについて一連の煩雑な操作を繰り返して行う必要があるため、検出に要する時間が長くなるといった問題を抱えている。臨床応用を踏まえてリアルタイムでこのような一塩基多型解析を行うためには、多種の一塩基多型を迅速かつ簡便に検出可能な一塩基多型解析方法の考案が必要である。
【非特許文献１】細畑ら、日本薬学会第１２７年会要旨集３、９５、２００７
【非特許文献２】佐藤ら、第２４回日本ＴＤＭ学会学術大会、Ｏ２−０２
【非特許文献３】Ｍａｓｕｄａ  Ｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００６；１１２：１８４−１９８
【非特許文献４】Ｈａｙａｓｈｉ Ｋ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ  １９９１； １：３４―３８
【非特許文献５】Ｇｅｒｍｅｒ Ｓ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ  ２０００； １０：２５８―２６６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＣＹＰ３Ａ５＊３、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、ＭＤＲ１のＥｘｏｎ１２に含まれるＳＮＰ、ＭＤＲ１のＥｘｏｎ２１に含まれるＳＮＰ、ＭＤＲ１のＥｘｏｎ２６に含まれるＳＮＰの６種の一塩基多型の検出において、迅速かつ簡便な検出手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意検討の結果、特定のプライマーセットを使用することで、前記６種の一塩基多型を迅速かつ簡便に検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）ＣＹＰ３Ａ５＊３、（２）ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、（３）ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、（４）ＭＤＲ１のＥｘｏｎ１２に含まれる一塩基多型、（５）ＭＤＲ１のＥｘｏｎ２１に含まれる一塩基多型、（６）ＭＤＲ１のＥｘｏｎ２６に含まれる一塩基多型の検出方法であって、配列番号１〜１２に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーを用いて、標的核酸中の（１）〜（６）の一塩基多型を含む領域を同時に増幅してＤＮＡ産物を得る第１の工程、第１の工程で得られたＤＮＡ産物を鋳型として、配列番号１３〜１８に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーとハイブリダイズさせて複合体を形成し、該複合体の一塩基伸長用プライマーに標識ヌクレオチドを付加する一塩基伸長反応を行うことにより標識産物を得る第２の工程、を含む一塩基多型の検出方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、本発明の一塩基多型の検出方法において用いられる、６種の該一塩基多型を含む核酸領域を同時に増幅するための、配列番号１〜１２に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーのセットを提供する。
【００１０】
また、本発明は、本発明の一塩基多型の検出方法において用いられる、６種の該一塩基多型を検出するための、配列番号１３〜１８に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーのセットを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、前記（１）〜（６）の６種の一塩基多型を、迅速かつ簡便に検出することが可能となる。また、本発明により、前記の６種の一塩基多型を、高精度に検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、臓器移植患者に移植後に投与される免疫抑制剤及びプロトンポンプ阻害剤の薬物相互作用及び血中免疫抑制剤濃度変動を予測に関する関連する一塩基多型である、ＣＹＰ３Ａ５＊３、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、ＭＤＲ１のＥｘｏｎ１２に含まれるＳＮＰ、ＭＤＲ１のＥｘｏｎ２１に含まれるＳＮＰ、ＭＤＲ１のＥｘｏｎ２６に含まれるＳＮＰの６種の一塩基多型を一度に同時検出する方法である。
【００１３】
ここでＣＹＰ３Ａ５＊３は、ヒトチトクロームＰ４５０ ３Ａ５遺伝子（ＣＹＰ３Ａ５）の一塩基多型の一種で、Ｉｎｔｒｏｎ３に含まれるＡからＧの変異（ｒｅｆ  ＳＮＰＩＤ：ｒｓ７７６７４６）であり、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２またはＣＹＰ２Ｃ１９＊３は、ヒトチトクロームＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子（ＣＹＰ２Ｃ１９）の一塩基多型の一種で、＊２はＥｘｏｎ５に含まれるＧからＡの変異（ｒｅｆ  ＳＮＰＩＤ：ｒｓ４２４４２８５）、＊３はＥｘｏｎ４に含まれるＧからＡの変異（ｒｅｆ  ＳＮＰＩＤ：ｒｓ４９８６８９３）である。また、ＭＤＲ１は細胞膜Ｐ糖タンパク質をコードする遺伝子で、ＭＤＲ１のＥｘｏｎ１２に含まれる一塩基多型（以下、ＭＤＲ１Ｅｘ１２とも言う）、ＭＤＲ１のＥｘｏｎ２１に含まれる一塩基多型（以下、ＭＤＲ１Ｅｘ２１とも言う）、ＭＤＲ１のＥｘｏｎ２６に含まれる一塩基多型（以下、ＭＤＲ１Ｅｘ２６とも言う）は、それぞれｍＲＮＡにおける開始コドンの最初の塩基を１としたときの１２３６番目の塩基に該当する部分のＣからＴの変異、２６７７番目の塩基に該当する部分のＧからＴまたはＡの変異、３４３５番目の塩基に該当する部分のＣからＴの変異である。
【００１４】
本発明の検出方法における第１の工程、及び第２の工程の概略を図１の模式図に示す。第１の工程は、前記（１）〜（６）の６種の一塩基多型を含む核酸領域を増幅するプライマーのセットを用いて、標的核酸中の該一塩基多型を含む領域を一度に同時増幅してＤＮＡ産物を得る工程である。ここでは、配列番号１〜１２に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーのセットを使用する。
【００１５】
本発明の第１の工程について具体的に説明する。
【００１６】
第１の工程は、標的核酸中の該一塩基多型を含む領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）による核酸増幅法により増幅する工程である。増幅用プライマーとして配列番号１〜１２に示す塩基配列からなる増幅用プライマーのセットを用い、患者血液または臓器から得られた標的核酸を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ＣＹＰ３Ａ５＊３、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、ＭＤＲ１Ｅｘ１２、ＭＤＲＥｘ２１、ＭＤＲＥｘ２６を含む核酸領域を一度に同時増幅することが可能となる。
【００１７】
ここで用いる核酸増幅用プライマーとして、配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーはＣＹＰ３Ａ５＊３を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーはＣＹＰ３Ａ５＊３を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーはＣＹＰ２Ｃ１９＊２を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーはＣＹＰ２Ｃ１９＊２を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーはＣＹＰ２Ｃ１９＊３を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーはＣＹＰ２Ｃ１９＊３を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーはＭＤＲ１Ｅｘ１２を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーはＭＤＲ１Ｅｘ１２を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーはＭＤＲ１Ｅｘ２１を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーはＭＤＲ１Ｅｘ２１を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーはＭＤＲ１Ｅｘ２６を含む核酸領域を増幅するフォワードプライマーであり、配列番号１２に示す塩基配列からなるプライマーはＭＤＲ１Ｅｘ２６を含む核酸領域を増幅するリバースプライマーである。
【００１８】
配列番号１〜１２に示す塩基配列からなる核酸増幅用プライマーは、一般に知られているポリヌクレオチドの合成法を適用することで得ることが可能である。
【００１９】
第１の工程で行うＰＣＲ反応の条件は、一般に行われるＰＣＲ反応の条件で良く、例えば、次のような反応条件を用いることが可能である。
【００２０】
・最初の熱変性（９４℃・２分）×１サイクル
・増幅（変性９４℃・３０秒、アニーリング５８℃・３０秒、伸長反応６８℃・１分）×３０サイクル。
【００２１】
次に第２の工程は、第１の工程で得られたＤＮＡ産物を鋳型として、一塩基伸長用プライマーとハイブリダイズさせて複合体を形成し、該複合体の一塩基伸長用プライマーに一塩基多型の塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを付加する一塩基伸長反応を行うことにより標識産物を得る工程である。ここで本発明者らは、前記６種のＳＮＰｓの検出において一塩基伸長反応の効率をそれぞれのＳＮＰ間でほぼ同等にするためには、標識ヌクレオチドの標識の種類と標的核酸としていずれを選択するか、すなわち、ｍＲＮＡと同じ配列をもつプラス鎖またはそれに相補的なマイナス鎖のいずれを鋳型とするかが大きく影響することを新規に見出した。すなわち本発明においては、ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出においてはマイナス鎖を鋳型とするプライマー、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２の検出においてはマイナス鎖を鋳型とするプライマー、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３の検出においてはプラス鎖を鋳型とするプライマー、ＭＤＲ１Ｅｘ１２の検出においてはマイナス鎖を鋳型とするプライマー、ＭＤＲＥｘ２１の検出においてはプラス鎖を鋳型とするプライマー、ＭＤＲＥｘ２６の検出においてはマイナス鎖を鋳型とするプライマー（好ましくは配列番号１８）が適しており、具体的には、ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出においては配列番号１３に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含むプライマー、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２の検出においては配列番号１４に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含むプライマー、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３の検出においては配列番号１５に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含むプライマー、ＭＤＲ１Ｅｘ１２の検出においては配列番号１６に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含むプライマー、ＭＤＲＥｘ２１の検出においては配列番号１７に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含むプライマー、ＭＤＲＥｘ２６の検出においては配列番号１８に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含むプライマーが使用される。
【００２２】
また、本発明の一塩基多型の検出方法の第２の工程において用いる一塩基伸長用プライマーは、標的核酸中の特定位置の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列であることを特徴とする。例えば、ＣＹＰ３Ａ５＊３おいては、特定位置の塩基がＴまたはＣであるため、これに相補的な標識ヌクレオチド、例えば標識ｄｄＡＴＰまたは標識ｄｄＧＴＰが取り込まれたことにより得られる標識シグナルを判別することにより、特定位置の塩基配列を検出することが可能となる。
【００２３】
第２の工程において、一塩基伸長用プライマーとして配列番号１３〜１８に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーのセットを用い、第１の工程で得られたＤＮＡ産物を鋳型として一塩基伸長反応を行うことにより、ＣＹＰ３Ａ５＊３、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、ＭＤＲ１Ｅｘ１２、ＭＤＲ１Ｅｘ２１、ＭＤＲ１Ｅｘ２６の塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを取り込んだ標識産物を得ることができる。
【００２４】
配列番号１３〜１８に示す塩基配列を伸長プライマー配列部分として含む一塩基伸長用プライマーは、一般に行われるポリヌクレオチドの合成法を適用することで得ることが可能である。
【００２５】
第２の工程での一塩基伸長反応条件は、一般に行われる一塩基伸長反応の条件であれば特に限定されず、例えば、次のような反応条件を用いることが可能である。
【００２６】
・最初の熱変性（９５℃・２分）×１サイクル
・一塩基伸長反応（変性９５℃・２０秒、一塩基伸長反応６０℃・１５秒）×３０サイクル。
【００２７】
第２の工程において付加する標識ヌクレオチドとしては、標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）、即ちｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ若しくはｄｄＵＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、を用いることができる。ジデオキシヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドのデオキシリボースの３’位の水酸基が水素基になっている物質で、ｄＮＴＰの代わりにｄｄＮＴＰが取り込まれるとそれ以上相補鎖が合成されなくなり、特異的なターミネーターの役割を果たす。
【００２８】
標的核酸中の特定位置の塩基配列を検出する場合には、図２に一例を示すように、４種類のｄｄＮＴＰを用い、これらのうち少なくとも１種類には識別可能な標識を付加したｄｄＮＴＰを用いる。一塩基伸長用プライマーから一塩基伸長反応が進行し、特定位置の塩基に相補的なｄｄＮＴＰが取り込まれて塩基伸長反応は一塩基で停止する。この際に取り込まれたｄｄＮＴＰの塩基の種類を、標識の存在の有無を確認して特定することにより、標的核酸中の該特定位置の塩基配列を決定することができる。一塩基伸長反応時に、相互に識別可能な複数の標識をそれぞれｄｄＮＴＰに付加してあれば、取り込まれたそれぞれの標識の存在を測定することにより、１種類から４種類の同時塩基配列分析も可能である。
【００２９】
第２の工程で用いるｄｄＮＴＰに付加する識別可能な標識としては、公知の標識物が使用可能であり、識別可能な標識物としては、例えば、酵素、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質又は発光団などの標識物が挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、シアニン系蛍光色素のほか、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｒ６Ｇ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テキサスレッド等の蛍光物質が挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、３２Ｐ、３５Ｓなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。これらの中でも、酵素への取り込み効率を標識間で一定にするために、シアニン系蛍光色素または半導体微粒子を用いることが好ましい。
【００３０】
シアニン蛍光色素は、酵素の取り込み効率のばらつきを抑えることができることから好ましく用いることができる。シアニン系蛍光色素の好ましい例としては、一般式１〜３で表される化学構造を有しているものが挙げられる。なお一般式１〜３において、ｎは１から３の整数、ＸはＯまたはＣ（ＣＨ３）２、Ｒ及びＲ’はヌクレオチドと結合する際に適宜選択されて用いられる官能基を表す。前記官能基としては、カルボン酸基、アルデヒド基、水酸基、アミノ基またはチオール基などが挙げられ、これらが前記一般式１〜３に示す窒素原子に直接結合されてもよいが、アルキル基を介して結合していれば、ヌクレオチドとの結合反応において上記官能基の立体障害を低減できることから好ましい。また、前記官能基がカルボン酸である場合、ヌクレオチドのアミノ基とアミド化反応により結合できることからより好ましく、カルボン酸がカルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、カルボン酸アジドまたはカルボン酸活性エステル化物であれば、ヌクレオチドとの結合反応性が向上することから、さらに好ましい。
【００３１】
【化１】
2009219439.tif 000002
【００３２】
【化２】
2009219439.tif 000003
【００３３】
【化３】
2009219439.tif 000004
【００３４】
前記一般式１〜３の化学構造を有するシアニン系蛍光色素の具体例としては、異なる励起、蛍光波長をもつＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などが市販されている（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））。Ｃｙ２は一般式１において、Ｘ＝Ｏ、ｎ＝１で表され、Ｃｙ３は一般式１において、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ３）２、ｎ＝１で表され、Ｃｙ５は一般式１において、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ３）２、ｎ＝２で表され、Ｃｙ７は一般式１において、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ３）２、ｎ＝３で表され、Ｃｙ３．５は一般式２おいて、ｎ＝１で表され、Ｃｙ５．５は一般式２おいて、ｎ＝２で表され、Ｃｙ３Ｂは一般式３で表される化学構造を有している。本発明の一塩基多型の検出方法においては、励起、蛍光波長や蛍光シグナルの減衰を考慮すると、特にＣｙ２、Ｃｙ３またはＣｙ５を用いることが好適である。
【００３５】
半導体微粒子とは、III−V族原子やII−IV族原子から構成される半導体であって、量子ドットとも呼ばれる。量子サイズによって光学特性が変わることが知られており、多色蛍光標識物として用いられている。例えばＺｎＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＩｎＡｓ、ＩｎＰ、ＰｂＳ、Ｓｉ等が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＣｄＳｅは、結晶径を変えるだけで青から赤まで任意の可視光の波長を作り出すことができるので、好ましく用いられる。また、ＺｎＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＩｎＡｓ、ＩｎＰ、ＰｂＳ、Ｓｉ等は、ＺｎＳ、ＣｄＳによりコーティングすると蛍光消光が抑えられることから好ましい。
【００３６】
前記標識物は、プライマーの一塩基伸長反応に影響を与えることがなければ、ｄｄＮＴＰのどの位置に結合させてもよい。例えば、アデニン、グアニンの場合はプリン骨格の７位または８位、シトシンはピリミジン骨格の５位または６位、チミンはピリミジン骨格の６位、ウラシルのピリミジン骨格の５位または６位に結合させることができる。標識物の結合方法としては特に制限はなく、例えばＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）の「ＣｙＤｙｅカタログ」（２２頁）に記載されているような一般的な方法で標識体を結合することができる。また、市販されているＣｙ３標識ｄｄＮＴＰ、Ｃｙ５標識ｄｄＮＴＰ（（株）パーキンエルマージャパン）など、入手可能又は既知の標識物が結合されているｄｄＮＴＰを用いることもできる。
【００３７】
一塩基伸長反応にはポリメラーゼを用いるが、好ましくは耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いる。耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、温度サイクルで変性、アニール、塩基伸長の工程を複数回繰り返すことによって、取り込み効率の向上を図ることができる。より好ましくは、ジデオキシヌクレオチドの取り込み効率の高いことから、Thermo Sequenase DNA Polymerase（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））またはSequenase Version 2.0 T7 DNA Polymerase（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））が用いられる。
【００３８】
本発明における一塩基伸長反応後の標識産物を検出する方法としては様々な方法が適用可能であるが、以下のような支持体による検出法を用いることが可能である。この検出法は、第２の工程で得られた該標識産物中に含まれる一塩基伸長用プライマーと選択的な結合が可能な核酸配列を有する捕捉プローブを用いることにより実施できる。なお、本検出方法においては、一塩基伸長用プライマーは前記配列番号１３〜１８に示す塩基配列からなる伸長プライマー配列部分とともに、標的核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列部分を有していることが好ましい。捕捉プローブとしては、前記タグ配列に相補的な配列を用いることができる。図３に、伸長プライマー配列部分とともにタグ配列を有する一塩基伸長用プライマーを説明するための模式図を示す。ここでいうタグ配列とは、任意に設計した配列で、タグ配列同士がほぼ同じ長さを持ちかつほぼ同じ解離温度を有しさらに標的核酸中に結合しない配列であれば特に限定されない。前記タグ配列を付加したプライマーを利用して得られる標識産物を捕捉する方法は既に開示されており（Ｊ−Ｂ．ファン（J-B. Fan）、ゲノム・リサーチ（Genome Res.）、１０、８５３−８６０、２０００）、図４に一例を示すように、支持体上にタグ捕捉プローブを固定化したバイオチップにより、一塩基伸長反応用プライマーを、タグ捕捉プローブと特異的に結合する塩基配列を有するタグ配列を介して特異的に支持体上に捕捉することができる。
【００３９】
ここで、バイオチップとは、生物の遺伝情報を解析するツールの総称であり、マイクロウェル、マイクロアレイ、ＤＮＡチップ等があげられるがこれに限らない。
【００４０】
本発明において用いることができるバイオチップとしては、特に構造に限定はないが、ノイズが低減し、ハイブリダイゼーション効率をあげる効果があることから、例えば、図５に示すようなカバーと支持体を有し、図６に示すような固定化領域に微細な凹凸構造を有する支持体を用いて、該凹凸構造の凸部上面にタグ捕捉プローブを固定化したバイオチップが好ましい。
【００４１】
前記支持体の材質としては特に制限はないが、例えば、金、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコンゴム、ゲルなどの合成ポリマー、ビーズ、繊維、中空糸などを挙げることができる。好ましくは、成形が容易な合成ポリマーであり、ＰＭＭＡが、図６に示す微細な凹凸構造と組み合わせて好適に用いられる。
【００４２】
支持体の成形としては、ポリマー製の場合、射出成形法、ホットエンボス法などの方法、ガラスやセラミックの場合、サンドブラスト法などの方法を用いることができる。また、シリコンの場合は、半導体プロセスで使用される公知の方法が挙げられる。
【００４３】
支持体の凸部の上面への捕捉プローブの固定化は、支持体がポリマー製である場合、凸部上面を化学処理し、捕捉プローブと結合可能な官能基、例えばアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などを生成させ、これとプローブＤＮＡとを化学結合させることによって行うことができる。例えば支持体がＰＭＭＡ製である場合は、図７に例示するように、アルカリ性溶液及び／又は酸性溶液によって表面処理することにより支持体表面にカルボキシ基を生成させ、図８に例示するように、３’末端をアミノ化した捕捉プローブをこれと化学反応により縮合させることにより、固定化することができる。また、このような官能基の導入は、例えば該表面をプラズマ処理又は放射線処理（例えばγ線、電子線など）するか、これらの処理の後でさらにグラフト重合処理することによって極性基を導入したり、或いは、ポリカチオン（例えばポリーＬ−リシン、シランカップリング剤など）をコートしたりすることによって行うことができる。
【００４４】
本発明において用いることができるバイオチップにおいては、支持体とカバーの間の凹部にはビーズ６を含むことができる（図６）。ビーズ６が存在することによって、液の効率よい攪拌が可能となり、その結果、反応促進効果がもたらされる。ビーズのサイズは、支持体の凹部に複数個のビーズが自由に動きうるようなサイズであれば該凹部の形状に合わせて適宜選択できるが、例えば直径数十〜数百μｍである。ビーズの材質は特に限定されず、例えば、ガラス、セラミック（例えばイットリア安定化ジルコニア）、ステンレス等の金属、ナイロンやポリスチレンなどのポリマーなどが挙げられる。これらの中でも、化学的に安定であり比重も大きいことからセラミックのビーズが好ましい。
【００４５】
本発明において用いることができる前記バイオチップは、通常、固定化領域（スポット）毎に捕捉プローブをそれぞれ一種類ずつ固定化して作製することができる。
【００４６】
本発明において用いるバイオチップ上で、捕捉プローブと一標識を付加された一塩基伸長用プライマーとをハイブリダイゼーションし、余剰物を洗浄することにより、標識産物をバイオチップ上に特異的に捕捉することができる。この場合のハイブリダイゼーションは、一般にはストリンジェントな条件下で行われる。そのような条件は、限定されないが、例えば３０〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液による洗浄を含むことができる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む溶液（ｐＨ７．２）である。
【００４７】
前記方法で捕捉した標識産物中に含まれる標識の存在又はシグナル強度を測定することにより、標識の存在又はシグナル強度を指標として特定位置の塩基配列を解析することができる。
【００４８】
分析したい標的核酸中の特定位置の塩基配列が一塩基である場合には、ｄｄＮＴＰの塩基の種類を、標識の存在の有無を確認して特定することにより、標的核酸中の該特定位置の塩基配列を分析することができる。つまり、特定位置の塩基に相補的なｄｄＮＴＰの標識の存在、即ち相補的なｄｄＮＴＰの標識シグナルが測定されれば、該特定位置に該塩基が存在すると判断することができる。
【００４９】
標的核酸の試料には、血液、尿、唾液等の体液が含まれるが、体液以外の任意の試料を使用し得る。試料が固体であれば、酵素処理、界面活性剤又は有機溶媒の添加等の適切な方法で液体に溶解させればよい。
【００５０】
前記の他にも、本発明の方法を適用する標的核酸の試料は、随意に変更することができる。例えば、細胞を株化して大量培養したり、末梢血を多めに取得したりすることで本方法に必要なヒトゲノムＤＮＡを大量に調製することにより、直接ゲノムＤＮＡ試料とすることができる。また、少量のゲノムＤＮＡを取得し、例えばＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）の試薬キットＧｅｎｏｍｉＰｈｉのようなＷＧＡ法（Whole Genome Amplification）で、非特異的にゲノムＤＮＡを増幅した試料を用いてもよい。また、ＰＣＲ法や、マルチプレックスＰＣＲ法、アシンメトリックＰＣＲ法のようなプライマーを用いて特定の塩基配列を増幅したものを試料としてもよい。特に、ゲノムＤＮＡなどを用いる場合は、予め分析したい特定位置の塩基配列を含む領域をＰＣＲなどで増幅しておいてもよい。例えば、酵素的に増幅する方法により得られた二本鎖試料の場合は、９５℃まで加熱してから４℃に急冷して１本鎖化したり、塩濃度のきわめて低い溶液中で９５℃まで加熱し断片化したり、超音波で断片化したり、制限酵素で切断したりして、１本鎖化及び／又は断片化操作を加えたものを試料としてもよい。
【００５１】
本発明において一塩基伸長用プライマーに取り込まれた標識ヌクレオチドから得られるシグナルから一塩基多型を判定する場合、標識シグナルを普遍的な数値に変換、補正することが好ましい。シグナルの普遍性を失わせる要因としては、標識ｄｄＮＴＰの退色、チューブごとの反応性のばらつき、スキャナーのレーザーパワーなどのばらつき、各実験間に一般的に含まれるばらつきが考えられ、これを補正する方法としては、例えば、各反応溶液中にコントロールシグナルを設定し、コントロールシグナルを１とした各シグナルを使用することができる。より具体的には、標識ヌクレオチドとして標識１（野生型用）及び標識２（変異型用）を使用した場合には、コントロールを１としたときの標識１と標識２のシグナル強度比（Ｒ＝標識１／標識２）を計算し、その比から遺伝子多型（野生型ホモ、ヘテロ、変異型ホモ）を判定することができる。このとき、得られるシグナルは標識１のみ、標識１と２、標識２のみの３パターンが検出されることが想定されており、例数を増やすことによりこれらは３群を形成することになる。ここで、R値の桁を合わせて比較しやすくする目的でＲの代わりに、ｌｏｇ２（Ｒ）を用いても良い。予め３群の平均、分散を得ることにより、新たなサンプルに対してもＲまたはｌｏｇ２（Ｒ）を計算し、どの群に含まれるかをマハラノビス距離などで検定することにより、統計的に一塩基多型の判定を行うことができる。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例によって本発明について更に具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されないものとする。
【００５３】
以下の実施例、比較例に用いた該一塩基多型の存在する遺伝子領域を増幅する増幅用プライマー、及び該一塩基多型を検出するための一塩基伸長用プライマーは、オペロンバイオテクノロジー株式会社に依頼し合成した。
【００５４】
（参考例１）
肝移植患者（ドナー、レシピエント）７５人の患者から得られたＤＮＡを用いて、通常の塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により、ＳＮＰｓの配列を確認し、本方法による遺伝子多型検出結果と比較した。
【００５５】
手順（１）オリゴヌクレオチドの準備
ＣＹＰ３Ａ５＊３を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号１及び２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号３及び４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号５及び６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ＭＤＲ１Ｅｘ１２を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号７及び８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ＭＤＲ１Ｅｘ２１を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号９及び１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ＭＤＲ１Ｅｘ２６を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号１１及び１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００５６】
また、ここでは、特異的なタグ配列が付加されている一塩基伸長用プライマーを用いた。すなわち、ＣＹＰ３Ａ５＊３を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号１９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして、配列番号２０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号２１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ＭＤＲ１Ｅｘ１２を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号２２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ＭＤＲ１Ｅｘ２１を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号２３及び２４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ＭＤＲ１Ｅｘ２６を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして配列番号２５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００５７】
シグナル補正用コントロールとして、コントロール１（ｃｏｎｔ１Ａ、ｃｏｎｔ１Ｇ、ｐｒｉｍｅｒ１）、コントロール２（ｃｏｎｔ２Ｔ、ｃｏｎｔ２Ｃ、ｐｒｉｍｅｒ２）を合成した。ｃｏｎｔ１Ａとして配列番号２６に示す塩基配列からなるヌクレオチド、ｃｏｎｔ２Ｃとして配列番号２７に示す塩基配列からなるヌクレオチド、ｐｒｉｍｅｒ１として配列番号２８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、ｃｏｎｔ２Ｔとして配列番号２９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、ｃｏｎｔ２Ｃとして配列番号３０に示す塩基配列からなるヌクレオチド、ｐｒｉｍｅｒ２として配列番号３１に示す塩基配列からなるヌクレオチドを合成した。ｃｏｎｔ１Ａとｃｏｎｔ１Gは、１００ｍｅｒの任意の塩基配列からなり、中央の一塩基（ＡまたはＧ）以外完全に同じ配列である。ｐｒｉｍｅｒ１は、ｃｏｎｔ１Ａ及びｃｏｎｔ１Ｇの中央の一塩基の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列である伸長プライマー配列部分と、標的核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列部分とからなる。ｃｏｎｔ２Ｔとｃｏｎｔ２Ｃは、１００ｍｅｒの任意の塩基配列からなり、中央の一塩基（ＴまたはＣ）以外完全に同じ配列である。ｐｒｉｍｅｒ２は、ｃｏｎｔ２Ｔ及びｃｏｎｔ２Ｃの中央の一塩基の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列である伸長プライマー配列部分と、標的核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列部分とからなる。
【００５８】
手順（２）タグ補足プローブ固定化用支持体の作製
タグ補足プローブを固定化する支持体を以下のようにして作製した。公知の方法であるＬＩＧＡ（LIthographie Galvanoformung Abformung）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するＰＭＭＡ製のタグ捕捉プローブ固定化用の支持体を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させており、支持体は黒色である。この黒色支持体の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、支持体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００５９】
支持体（図５及び図６の符号１）の形状は、大きさが縦７５ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、支持体の中央部分を除き表面は平坦であった。支持体の中央に、縦１０．０ｍｍ、横１２．５ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．１５ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの凸部を２５６（１６×１６）箇所設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ（２５６箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、２５６個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ３μｍ以下であった。さらに、凹凸部凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．５６ｍｍであった。
【００６０】
手順（３）タグ捕捉プローブの固定化
手順（２）で得たＰＭＭＡ支持体を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、支持体表面にカルボキシル基を生成した。この反応スキームを図７に示す。
【００６１】
配列番号１９〜２５、配列番号２８及び３１を特異的に捕捉するために、９種類のタグ捕捉プローブ（３’末端アミノ化）を、それぞれ純水に０．３ｎｍｏL／μＬの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。支持体に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ＬにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏL／μＬとし、かつ、支持体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍＧ／ｍＬとした。そして、これらの混合溶液をアレイヤー（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ  Ｓｔａｍｐ―ＩＩ）で支持体凸部上面の全てにスポットした。次いで、支持体を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。この反応スキームを図７に示す。
【００６２】
手順（４）カバーの作製、及び装着、ビーズの充填
射出成型法により貫通孔（図５及び図６の符号）を４つ有するカバー（図５及び図６の符号；外周部にオーバーハング構造有り）を作製した。手順（３）で得られたタグ捕捉プローブ（図５及び図６の符号５）を固定化した支持体にＰＤＭＳを塗布し（図５及び図６の符号）、その上に作製したカバー２を装着して４２℃で２時間硬化させ、タグ捕捉プローブを固定化したバイオチップを作製した（図５）。このバイオチップに、カバーの貫通孔４から直径１８０μｍのジルコニアビーズ（図５の符号６；東レ（株）製）を２０ｍｇ装填した（図６）。
【００６３】
手順（５）特定すべき一塩基多型を含む領域のＰＣＲによる増幅
各肝移植患者の血液からＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（プロメガ株式会社）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡは、２０ｎｇ／μＬになるように純水で希釈し、使用するまで−３０℃で凍結保存した。得られた各肝移植患者のゲノムＤＮＡを鋳型として、手順（１）の配列番号１〜１２のプライマーセットを用いて特定すべき一塩基多型を含む領域をＰＣＲにより増幅した。
【００６４】
ＰＣＲにはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績）を用い、メーカー指定の条件で３５サイクルの増幅反応を実施した。もっとも、このＰＣＲは単に標的核酸中の特定領域を増幅することが目的であるため、ＰＣＲの方法や酵素の種類に特段の制限はない。
【００６５】
ここで、ＰＣＲには常法に従い、以下の試薬を含む５０μＬ水溶液を調製した。各ＳＮＰｓを含む領域を増幅するフォワードプライマー（配列番号１，３，５，７，９，１１）：各１５ｐｍｏL、リバースプライマー（配列番号２，４，６，８，１０，１２）：各１５ｐｍｏＬ、１０ｘＢｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ―Ｐｌｕｓ―Ｖｅｒｓ．２：5 μL、２ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ：８μＬ、２５ｍＭＭｇＳＯ４：５μＬ、ＫＯＤ―Ｐｌｕｓ―：１Ｕ、ゲノムＤＮＡ：１００ ｎｇ
また、ＰＣＲは、９４℃・２分、９４℃・３０秒／５８℃・３０秒／６８℃・１分を３０サイクル行い、反応後は４℃で保存した。その後、ＧＦＸ PＣR ＤＮＡ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））により精製し、余剰のｄＮＴＰｓを除いた。
【００６６】
手順（６）特異的なｄｄＮＴＰの取り込み反応
ＰＣＲ産物を一塩基伸長反応の鋳型とし、配列番号１９〜２５の一塩基伸長用プライマーを用いて一塩基伸長反応を行った。
【００６７】
手順（５）で得られたＰＣＲ産物に、配列番号１９〜２５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、Ｃｙ３またはＣｙ５で標識されたｄｄＮＴＰ（Ｃｙ３−ｄｄＮＴＰまたはＣｙ５−ｄｄＮＴＰ）、非標識ｄｄＮＴＰ、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを加え、ｄｄＮＴＰの取り込みを行った。検出したい塩基種がＣまたはＴである場合、Ｃｙ５−ｄｄＵＴＰ、Ｃｙ３−ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰを、検出したい塩基種がＧまたはＡである場合、Ｃｙ５−ｄｄＧＴＰ、Ｃｙ３−ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰを使用した。ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにはサンガー法に広く使用されている改変型Ｔ７  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を使用した。
【００６８】
一塩基伸長反応は、２つの系に分けて行った。チューブ１にはＭＤＲ１Ｅｘ１２、ＭＤＲ１Ｅｘ２１、ＭＤＲ１Ｅｘ２６に含まれるＳＮＰｓとＣＹＰ２Ｃ１９＊３のＳＮＰｓを検出する系（Ｃ／Ｔ判別系）を、チューブ２にはＭＤＲ１Ｅｘ２１とＣＹＰ３Ａ５＊３、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２のＳＮＰｓを検出する系（Ｇ／Ａ判別系）を構築している。それぞれのチューブには、蛍光シグナル補正用コントロールを含む。
【００６９】
蛍光シグナル補正用コントロールは、ｐｒｉｍｅｒ１（配列番号２８）とｃｏｎｔ１Ａ（配列番号２６）、ｃｏｎｔ１Ｇ（配列番号２７）の組み合わせ（チューブ１）と、ｐｒｉｍｅｒ２（配列番号３１）とｃｏｎｔ２Ｔ（配列番号２９）、ｃｏｎｔ２Ｃ（配列番号３０）の組み合わせ（チューブ２）である。チューブ１を例に詳しく説明する。ｃｏｎｔ１Ａとｃｏｎｔ１Gは、１００ｍｅｒの任意の塩基配列からなり、中央の一塩基（ＡまたはＧ）以外完全に同じ配列である。ｐｒｉｍｅｒ１は、ｃｏｎｔ１Ａ及びｃｏｎｔ１Ｇの中央の一塩基の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列である伸長プライマー配列部分と、標的核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列部分とからなる。そのため、ｐｒｉｍｅｒ１はｃｏｎｔ１Ａを鋳型に一塩基伸長した場合はＣｙ５―ｄｄＵＴＰを、ｃｏｎｔ１Ｇを鋳型にした場合はＣｙ３―ｄｄＣＴＰを結合するので、コントロール１のスポットはＣｙ３とＣｙ５の両方のシグナルを与えることになる。蛍光シグナル補正コントロールは全てのサンプルにおいて同量加えているので、理論上は常に同じ蛍光シグナル強度を与えるものであり、チューブ１中の反応を反映する蛍光シグナル強度を与えると考えられる。チューブ２についても同様で、ｃｏｎｔ２Ｔとｃｏｎｔ２Ｃは、１００ｍｅｒの任意の塩基配列からなり、中央の一塩基（ＴまたはＣ）以外完全に同じ配列であり、コントロール２のシグナルがチューブ２中の反応を反映するシグナル値を与える。
【００７０】
ここで、ｄｄＮＴＰｓ取り込み反応には、Ｃ／Ｔ判別系（チューブ１）として、一塩基伸長反応用プライマー：｛ＭＤＲ1Ｅｘ１２プライマー（Ｅｘ１２、配列番号２２）、ＭＤＲ1Ｅｘ２１プライマー（Ｅｘ２１−１、配列番号２３）、ＭＤＲ1Ｅｘ２６（Ｅｘ２６、配列番号２５）、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３プライマー（配列番号１９）｝各０．３ｐｍｏＬ、１０μＭ Ｃｙ３標識ｄｄＣＴＰ：１μＬ、１０μＭ  Ｃｙ５標識ｄｄＵＴＰ：１μＬ、１０μＭ  ｄｄＧＴＰ：１μＬ、１０μＭ  ｄｄＡＴＰ：１μＬ、ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ：２μＬ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：５Ｕ、精製後ＰＣＲ産物２μＬ、ｃｏｎｔ１Ａ（配列番号２６）：５ｎｇ、ｃｏｎｔ１Ｇ（配列番号２７）：５ｎｇ、ｐｒｉｍｅｒ１（配列番号２８）：０．１５ｐｍｏＬを、純粋で２０μLにメスアップしたものを用いた。
【００７１】
ｄｄＮＴＰｓ取り込み反応がＧ／Ａ判別系（チューブ２）としては、一塩基伸長反応用プライマー：｛ＭＤＲ1Ｅｘ２１プライマー（Ｅｘ２１−２、配列番号２４）、ＣＹＰ３Ａ５＊３プライマー（配列番号１９）、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２プライマー（配列番号２０）｝各０．３ｐｍｏＬ、１０μＭ Ｃｙ３標識ｄｄＡＴＰ：１μＬ、１０μＭ  Ｃｙ５標識ｄｄＧＴＰ：１μＬ、１０μＭ  ｄｄＣＴＰ：１μＬ、１０μＭ  ｄｄＴＴＰ：１μＬ、ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ：２μＬ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：５Ｕ、精製後ＰＣＲ産物２μＬ、ｃｏｎｔ２Ｔ（配列番号２９）：５ｎｇ、ｃｏｎｔ２Ｃ（配列番号３０）：５ｎｇ、ｐｒｉｍｅｒ２（配列番号３１）：０．１５ｐｍｏＬを、純水で２０μLにメスアップしたものを用いた。
【００７２】
また、ｄｄＮＴＰｓ取り込み反応は、９５℃・２分、９５℃・２０秒／６０℃・１５秒を３０サイクル行い、反応後は４℃で保存した。
【００７３】
手順（７）ハイブリダイゼーション
手順（６）の取り込み反応液９．６μＬ（Ｃ／Ｔ判別系（チューブ１）反応溶液４．８μＬ、及びＧ／Ａ判別系（チューブ２）反応溶液４．８μＬの混合溶液）を９５℃で５分間熱変性し、氷中で急冷した。これにハイブリダイゼーション用反応溶液を３０．４μＬ加え、マイクロピペットを用いてハイブリダイゼーション用の溶液４０μＬを貫通孔より注入した。その後、封止材としてＰＥＴテープで貫通孔を塞ぎ、チャンバー（ＴａＫａＲa製、ＴａＫａＲａ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ  ５  Ｎｏ．ＴＸ７１１）にセットした。シェイカー（ＥＹＥＬＡ製、Ｍｕｌｔｉ  Ｓｈａｋｅｒ  ＭＭＳ）にチャンバーを固定化し、４２℃、３時間インキュベートした。シェイカーの回転数は２５０ｒｐｍとし、シェイカーの回転面とチャンバーが平衡になるようにした。
【００７４】
インキュベート後、支持体からカバーとＰＤＭＳを脱離後に支持体を洗浄、乾燥した。
【００７５】
手順（８）蛍光シグナル強度の測定
ＤＮＡチップ用のスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ, ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ, Ｂｏｓｔｏｎ, ＭＡ）に手順（７）の処理後の支持体をセットし、蛍光シグナル強度の測定を行った。測定条件は、レーザー出力７０％、フォトマルチプレイヤーを適度に調整した。ここでの蛍光シグナル強度とはスポット内の蛍光シグナル強度の平均値である。
【００７６】
本方法では以下のように各ＳＮＰに対応する蛍光シグナルの色（取り込まれた蛍光標識ｄｄＮＴＰｓ）及び強度から特定位置の塩基配列の分析を行った。まず各反応チューブに一定量加えたコントロールの蛍光シグナル（コントロール１または２）による補正を行った。チューブ１では、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３とＭＤＲ１Ｅｘ１２、２１、２６に含まれる各ＳＮＰｓを検出するために、配列番号１９、２２、２３、２５を捕捉するそれぞれのタグ捕捉プローブを固定化したスポットから得られる各蛍光シグナル強度から、コントロール１のＣｙ３及びＣｙ５の蛍光シグナル強度を１と補正した場合のＲ=Ｃｙ３の蛍光シグナル強度/Ｃｙ５の蛍光シグナル強度を得た。
【００７７】
また、同様にチューブ２は、ＣＹＰ３Ａ５＊３、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２及びＭＤＲ１Ｅｘ２１に含まれるＳＮＰｓを検出するために、配列番号１９、２０、２４を捕捉するそれぞれのタグ捕捉プローブを固定化した各スポットから得られる蛍光強度から、コントロール２のＣｙ３及びＣｙ５の蛍光強度を１と補正した場合のＲ=Ｃｙ３の蛍光シグナル強度/Ｃｙ５の蛍光シグナル強度を得た。
【００７８】
ここで、蛍光シグナル強度の値としてはブランクスポット（スポット溶液のみをスポットした部分）のＣｙ３及びＣｙ５の蛍光シグナル強度を引いた値を用いている。この補正は、遺伝子多型を診断するＣｙ３及びＣｙ５の蛍光シグナル強度を普遍的な数値に変換することを目的としている。Ｃｙ３及びＣｙ５の蛍光シグナル強度の普遍性を失わせる要因としては、Ｃｙ３，Ｃｙ５標識ｄｄＮＴＰの退色、チューブごとの反応性のばらつき、スキャナーのレーザーパワーなどのばらつき、各実験間に一般的に含まれるばらつきが考えられる。この補正によりこれらの要因を加味した数値に変換することができる。
【００７９】
手順（９）各肝移植患者の塩基配列との比較
手順（８）で求めたＲ値については、底２をとったｌｏｇ値に変換し、通常の塩基配列決定方法で得られたデータと比較したところ、各肝移植患者のＳＮＰｓの遺伝子多型のｌｏｇ２(Ｒ）値は、野生型ホモ、ヘテロ、変異型ホモの３群を形成した。各群の平均と分散は表１に示す。ＤＵＮＮＥＴ法による多重比較検定の結果、ｐ値が０．０５より小さく、各群間に有意差があることが確認できた。なお、ＭＤＲ１Ｅｘ２１のＧからＡまたはＴの変異をチューブ２のＧ／Ａ判定系で検出しようとする場合、ＧからＴの変異の場合のみＣｙ３標識ｄｄＡＴＰの蛍光が検出されるため、Ｅｘ２１−２のプライマーではＣｙ３蛍光シグナル強度検出群の１群のみが形成された（図９）。
【００８０】
【表１】
2009219439.tif 000005
【００８１】
（実施例１）
参考例１で得られたデータをもとに、新規の肝移植患者１名のＳＮＰｓの検出、解析した。
【００８２】
まず、参考例１の手順（５）のＰＣＲ増幅後に得られたＤＮＡ試料は一部を電気泳動したところ目的とする領域が各々増幅されていることが確認できた（図１０レーン１）ほか、通常の塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により、ＣＹＰ３Ａ５＊３はＧＡへテロ、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２はＧＡへテロ、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３はＧＧホモ、ＭＤＲ１Ｅｘ１２はＣＣホモ、ＭＤＲ１Ｅｘ２１はＧＴへテロ、ＭＤＲ１Ｅｘ２６はＣＣホモであることを確認した。
【００８３】
次に、参考例１の手順（１）〜（８）に従って求めたＲ値について、底２をとったｌｏｇ値に変換した。得られた各ＳＮＰのｌｏｇ２(Ｒ）（ｘとする）と、参考例１で得られた各群の平均（ｍとする）と分散（ｓとする）を以下の計算式に当てはめて参考例１で得られたそれぞれのグループに対するマハラノビス距離（Ｄとする）を求めた。ｌｏｇ２(Ｒ）値はマハラノビス距離の最も小さいグループに帰属するとし、これによりＳＮＰｓ判定を行った。
計算式：Ｄ＝（ｘ−ｍ）２／ｓ２。
【００８４】
但し、Ｅｘ２１−２によるＭＤＲ１Ｅｘ２１のＳＮＰ検出においては、ＳＮＰがＴに変異している場合のみＣｙ３のシグナルを検出するため、Ｃｙ３のシグナルがコントロールのＣｙ３シグナルを１としたときに０．５以上である場合にのみ、ＧからＴへの変異を検出するシグナルとみなし、Ｒを求めることとした。
【００８５】
各測定値ｌｏｇ２(Ｒ）とマハラノビス距離を表２に示す。ＣＹＰ３Ａ５＊３のｌｏｇ２（Ｒ）は０．６であり、ＧＡヘテロ群とのマハラノビスの距離がもっとも小さいので、ＧＡへテロと判定した。ＣＹＰ２Ｃ１９＊２のｌｏｇ２（Ｒ）は−０．５であり、ＧＡヘテロ群とのマハラノビスの距離がもっとも小さいので、ＧＡへテロと判定した。ＣＹＰ２Ｃ１９＊３のｌｏｇ２（Ｒ）は９．０であり、ＧＧホモ群とのマハラノビスの距離がもっとも小さいので、ＧＧホモと判定した。ＭＤＲ１Ｅｘ１２のｌｏｇ２（Ｒ）は８．９であり、ＣＣホモ群とのマハラノビスの距離がもっとも小さいので、ＣＣホモと判定した。ＭＤＲ１Ｅｘ２１のＣ／Ｔ判定系におけるＥｘ２１−１（配列番号２３）プライマー由来のｌｏｇ２（Ｒ）は８．７であり、ＧＧホモ群とのマハラノビスの距離がもっとも小さいので、ＧＧホモと判定した。さらに、ＭＤＲ1Ｅｘ２１のＧ／Ａ判定系におけるＥｘ２１−２（配列番号２４）プライマー由来のシグナルは、コントロール２のＣｙ３シグナルを１としたときに、１．２であることから、シグナルであると判定し、一塩基多型はＴであると判定した。即ち、ＭＤＲ１Ｅｘ２１は、ＧＴへテロと判定した。ＭＤＲ１Ｅｘ２６のｌｏｇ２（Ｒ）は６．２であり、ＣＣホモとのマハラノビスの距離がもっとも小さいので、ＣＣホモと判定した。以上の結果を表２に示す。
【００８６】
以上の結果より、蛍光シグナル強度による検出結果と通常の塩基配列決定法による結果が一致した。
【００８７】
（比較例１）
一塩基伸長用プライマーを、ＭＤＲ１Ｅｘ２１を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマーとして、Ｅｘ２１−１をＥｘ２１−３（配列番号３２）、Ｅｘ２１−２をＥｘ２１−４（配列番号３３）に変更した以外は実施例１と同様に行った。なお、Ｅｘ２１−３はＥｘ２１−１が鋳型とするＤＮＡ鎖の相補鎖を鋳型とする設計であり、Ｅｘ２１−４はＥｘ２１−２が鋳型とするＤＮＡ鎖の相補鎖を鋳型にする設計となっている。
【００８８】
まず、参考例１の手順（５）のＰＣＲ増幅後に得られたＤＮＡ試料は一部を電気泳動したところ目的とする領域が各々増幅されていることが確認できた（図１０レーン２）。
【００８９】
次に、各ＳＮＰｓのｌｏｇ２（Ｒ）について、参考例１で得られた群とのマハラノビス距離を調べた結果は表２に示す通り、実施例１と同様の判定結果であったが、ＭＤＲ1Ｅｘ２１のＣ／Ｔ判定系におけるＥｘ２１−３プライマー由来のシグナルは、コントロール２のＣｙ５シグナルを１としたときに、０．１であることから、シグナルは検出されなかったものとし、一塩基多型はＧＧホモであると判定したため、ＭＤＲ１Ｅｘ２１において通常の塩基配列決定法による判定と相違することが判明した。
【００９０】
以上の結果から、一塩基伸長反応時に使用する標的核酸の特定位置の塩基として分析するための一塩基伸長用プライマー設計、即ち鋳型とするＤＮＡ鎖の選択が必要であることが明らかとなった。
【００９１】
（比較例２）
ＣＹＰ３Ａ５＊３を増幅するプライマーとして配列番号２から配列番号３４に変更して実施した以外は実施例１と同様に行った。
【００９２】
ＰＣＲ増幅後に得られたＤＮＡ試料は一部を電気泳動したところ、目的とする領域のうち、ＣＹＰ３Ａ５＊３を含む領域のバンドが見られなかった（図１０レーン３）。
【００９３】
次に各ＳＮＰｓのｌｏｇ２（Ｒ）について、参考例１で得られた群とのマハラノビス距離を調べた結果を表２に示す。その結果、ＣＹＰ３Ａ５＊３については蛍光シグナルを検出することができず、ＣＹＰ３Ａ５＊３を含む領域がＰＣＲによって増幅されなかったためであると判断された。
【００９４】
以上の結果から、同時に複数の一塩基多型を含む領域を増幅するためには、一塩基多型を含む領域を増幅するためのプライマーの配列が重要であることが明らかとなった。
【００９５】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】一塩基多型検出における第１工程及び第２工程の模式図である。
【図２】一塩基伸長用プライマーに、特定位置の一塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を例示する模式図である。
【図３】一塩基伸長用プライマーの模式図と、該一塩基伸長用プライマーの標的核酸へのハイブリダイゼーションを例示する模式図である。
【図４】支持体に固定化されたタグ捕捉プローブを用いて、一塩基伸長用プライマーを含む標識産物を特異的に捕捉する工程を例示する模式図である。
【図５】支持体とカバーとを含むタグ捕捉プローブが固定化された本発明のバイオチップの概略を例示する斜視図及び断面図である。
【図６】タグ捕捉プローブが固定化されたバイオチップの一例の断面図である。
【図７】ＰＭＭＡ支持体の表面処理により支持体表面にカルボキシ基を生成させ化学反応スキームである。
【図８】ＰＭＭＡ支持体表面のカルボキシ基とアミノ化プローブＤＮＡとの縮合反応スキームである。
【図９】本発明の検出方法で検出した７５検体の各ＳＮＰｓに対応するｌｏｇ２（Ｒ）プロットである。ＭＤＲ１Ｅｘ１２、ＭＤＲ１Ｅｘ２１、ＭＤＲ１Ｅｘ２６、ＣＹＰ３Ａ５＊３及びＣＹＰ２Ｃ１９＊３ではｌｏｇ２（Ｒ）の値の高い方から、野生型ホモ、ヘテロ、変異型ホモの３群を形成し、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２ではｌｏｇ２（Ｒ）の値の高い方から、変異型ホモ、ヘテロ、野生型ホモの３群を形成することを示す。
【図１０】ＰＣＲ増幅後に得られた試料の電気泳動写真で、Ｍは分子量マーカー、レーン１は実施例１、レーン２は比較例１、レーン３は比較例２でのＰＣＲ増幅後の電気泳動を示す。
【符号の説明】
【００９７】
１  支持体
２  カバー
３  接着層（ＰＤＭＳ）
４  貫通孔
５  支持体に固定化されたタグ捕捉プローブ
６  ビーズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【配列表】
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