(57)【要約】【課題】第８燐酸カルシウム（ＯＣＰ）とアルギン酸ナトリウムとを反応させて得た複合体について、操作性、形態付与性に優れながら細胞接着性に優れた成形体になる骨再生材料を簡単に提供する。【解決手段】ＯＣＰとアルギン酸ナトリウムとを反応させて得た複合体を、遠心分離機を用いて４．１×１０−３ＭＰａまたは３．７×１０−２ＭＰａの圧力で加圧し、これによって平均細孔容積が５．８２０ｃｍ３／ｇから６．１６０ｃｍ３／ｇの範囲の多孔質細孔を有していて、操作性、形態付与性に優れながら細胞接着性に優れた骨再生材料としての成形体を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムと、水溶性高分子または多糖類のなかから選択される少なくとも一種類の化合物とからなる複合体であって、該複合体に、４．１×１０−３ＭＰａから、３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する圧力の範囲で加圧して成形した成形体であることを特徴とする骨再生材料。
【請求項２】
ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムと、水溶性高分子または多糖類のなかから選択される少なくとも一種類の化合物とからなる複合体であって、該複合体を、４．７４７ｃｍ３／ｇと５．８２０ｃｍ３／ｇとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する平均細孔容積から６．１６０ｃｍ３／ｇの範囲の平均細孔容積の多孔質細孔を有するように加圧して成形した成形体であることを特徴とする骨再生材料。
【請求項３】
加圧は遠心分離によるものであることを特徴とする請求項１または２記載の骨再生材料。
【請求項４】
ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムは、第８燐酸カルシウム、非晶質燐酸カルシウム、第二燐酸カルシウムの少なくとも一種類の化合物であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１記載の骨再生材料。
【請求項５】
ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムと、水溶性高分子または多糖類のなかから選択される少なくとも一種類の化合物とからなる複合体からなり、該複合体に、４．１×１０−３ＭＰａから、３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する圧力の範囲で加圧して成形体を得ることを特徴とする骨再生材料の製造方法。
【請求項６】
ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムと、水溶性高分子または多糖類のなかから選択される少なくとも一種類の化合物とからなる複合体からなり、該複合体を、４．７４７ｃｍ３／ｇと５．８２０ｃｍ３／ｇとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する平均細孔容積から６．１６０ｃｍ３／ｇの範囲の平均細孔容積の多孔質細孔を有するように加圧して成形体を得ることを特徴とする骨再生材料の製造方法。
【請求項７】
加圧は遠心分離によるものであることを特徴とする請求項５または６記載の骨再生材料の製造方法。
【請求項８】
ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムは、第８燐酸カルシウム、非晶質燐酸カルシウム、第二燐酸カルシウムの少なくとも一種類の化合物であることを特徴とする請求項５乃至７の何れか１記載の骨再生材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムを用いて生体親和性、細胞接着性に優れた骨再生材料およびその製造方法の技術分野に属するものである。
【背景技術】
【０００２】
今日、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２：以下「ＨＡ」と略記する）の前駆体である第８燐酸カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ：以下「ＯＣＰ」と略記する）は、優れた骨伝導能を有すること（非特許文献１）、破骨細胞による吸収性を有すること（非特許文献２）、そして用量依存的に骨芽細胞の分化を促進すること（非特許文献３）が知られている。そしてＯＣＰとコラーゲンとの複合体は、形態付与性を備えた骨再生材料（人工骨材）であることが知られている（例えば特許文献１参照）。また、ＨＡの前駆体である非晶質燐酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ：以下「ＡＣＰ」と略記する）についてもＯＣＰと同様の性質があることが報告されている（非特許文献４参照）。さらにまた、同じくＨＡの前駆体である第二燐酸カルシウム（第２燐酸カルシウム無水物（ＣａＨＰＯ４：以下「ＤＣＰＡ」と略記する）あるいは第２燐酸カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ：以下「ＤＣＰＤ」と略記する））についてもＯＣＰと同様の性質があることが報告されている（特許文献２及び非特許文献５参照）。
【特許文献１】特開２００６−１６７４４５号公報
【特許文献２】特許第２７８８７２１号公報
【非特許文献１】Ｓｕｚｕｋｉ  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．Ｅｎｇ．Ｍｅｄ．，１６４：３７−５０，１９９１．
【非特許文献２】Ｉｍａｉｚｕｍｉ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．７８：４５−５４，２００６．
【非特許文献３】Ａｎａｄａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．，２００８  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献４】Ｍｅｙｅｒ  ＪＬ，Ｅａｎｅｓ  ＥＤ，ＣＴＩ  １９７８
【非特許文献５】Ｅｉｄｅｌｍａｎ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．，４１：１８−２６，１９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ところが前記ＯＣＰのコラーゲンとの複合体についてみたときに、前記特許文献１に記載の製造方法では、適切な強度を有し、かつ細胞の増殖に適した平均細孔容積の多孔質細孔を有するように製造するのは困難であり、実用化するにはさらに細胞接着性を高めるための検討が必要であり、ここに本発明が解決せんとする課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、上記の如き実情に鑑みこれらの課題を解決することを目的として創作されたものであって、請求項１の発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムと、水溶性高分子または多糖類のなかから選択される少なくとも一種類の化合物とからなる複合体であって、該複合体に、４．１×１０−３ＭＰａから、３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する圧力の範囲で加圧して成形した成形体であることを特徴とする骨再生材料である。
請求項２の発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムと、水溶性高分子または多糖類のなかから選択される少なくとも一種類の化合物とからなる複合体であって、該複合体を、４．７４７ｃｍ３／ｇと５．８２０ｃｍ３／ｇとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する平均細孔容積から６．１６０ｃｍ３／ｇの範囲の平均細孔容積の多孔質細孔を有するように加圧して成形した成形体であることを特徴とする骨再生材料である。
請求項３の発明は、加圧は遠心分離によるものであることを特徴とする請求項１または２記載の骨再生材料である。
請求項４の発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムは、第８燐酸カルシウム、非晶質燐酸カルシウム、第二燐酸カルシウムの少なくとも一種類の化合物であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１記載の骨再生材料である。
請求項５の発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムと、水溶性高分子または多糖類のなかから選択される少なくとも一種類の化合物とからなる複合体からなり、該複合体に、４．１×１０−３ＭＰａから、３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する圧力の範囲で加圧して成形体を得ることを特徴とする骨再生材料の製造方法である。
請求項６の発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムと、水溶性高分子または多糖類のなかから選択される少なくとも一種類の化合物とからなる複合体からなり、該複合体を、４．７４７ｃｍ３／ｇと５．８２０ｃｍ３／ｇとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する平均細孔容積から６．１６０ｃｍ３／ｇの範囲の平均細孔容積の多孔質細孔を有するように加圧して成型体を得ることを特徴とする骨再生材料の製造方法である。
請求項７の発明は、加圧は遠心分離によるものであることを特徴とする請求項４または５記載の骨再生材料の製造方法である。
請求項８の発明は、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムは、第８燐酸カルシウム、非晶質燐酸カルシウム、第二燐酸カルシウムの少なくとも一種類の化合物であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１記載の骨再生材料の製造方法である。
【発明の効果】
【０００５】
請求項１、２、５または６の発明とすることにより、ハイドロキシアパタイトの前駆体である燐酸カルシウムの水溶性高分子または多糖類との複合体について、操作性、形態付与性に優れながら、細胞接着性に優れた成形体になる骨再生材料を簡単に提供することができる。
請求項３または７の発明とすることにより、遠心分離という簡単な操作で形態付与性を付与した成形体ができることになる。
請求項４または８の発明とすることにより、入手が容易なＨＡの前駆体である燐酸カルシウムを用いて細胞接着性に優れた成形体になる骨再生材料を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は、ＨＡの前駆体である燐酸カルシウムについて、アルギン酸やコラーゲンに代表される水溶性高分子、多糖類の中から選択される少なくとも１種類の化合物と複合体を生成し、該複合体について加圧することで操作性、形態付与性に優れた骨再生材料を生成できるものであり、この場合に、加圧する際の圧力は、３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する圧力から４．１×１０−３ＭＰａの範囲である。圧力が４．１×１０−３ＭＰａよりも小さいと、成形体はボソボソ感が強く脆いものになって形態付与性が乏しくて実用性に欠ける。また３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する圧力を越えると成形体が密になりすぎて細孔の径が小さくなって細胞が入りづらく細胞接着性が低下する。
【０００７】
一方、前記複合材は、前記加圧することで多孔質細孔を有した成形体になるが、この場合、多孔質細孔は、４．７４７ｃｍ３／ｇと５．８２０ｃｍ３／ｇとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する平均細孔容積から６．１６０ｃｍ３／ｇの範囲であり、６．１６０ｃｍ３／ｇよりも大きいと、成形体はボソボソ感が強く脆いものになって形態付与性が乏しくて実用性に欠け、また４．７４７ｃｍ３／ｇと５．８２０ｃｍ３／ｇとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する平均細孔容積よりも小さいと成形体が密になりすぎて細孔の径が小さくなって細胞が入りづらく細胞接着性が低下する。
【０００８】
これらにおいて加圧手段としては遠心分離機やプレス機等の汎用される適宜の加圧手段を採用できるが、遠心分離機による場合、内部に至るまで均一的な加圧ができることになって好適である。
また、ＨＡの前駆体である燐酸カルシウムは、前述したＯＣＰ、ＡＣＰ、ＤＣＰＡあるいはＤＣＰＤの化合物に代表され、これらＨＡの前駆体である燐酸カルシウムから選択される少なくとも１種類の化合物と水溶性高分子または多糖類とを反応させて複合体を生成することになるが、水溶性高分子としては、例えば、コラーゲン、ポリエチレングリコール、ポリリジン及びポリグルタミン酸等があり、また多糖類としては、例えばアルギン酸、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等がある。そしてこれらから選択された少なくとも１種類の化合物と前述したＨＡの前駆体である燐酸カルシウムとの複合体を形成することになるが、取り扱い易いという観点から、水溶性高分子または多糖類は、ナトリウム塩、またはカリウム塩として反応に用いることが好ましい。
好適な複合体の生成方法は、主に、水溶性高分子または多糖類の水溶液に、カルシウム溶液及びリン酸溶液を添加し、水溶性高分子または多糖類にＨＡの前駆体である燐酸カルシウムを析出させる方法が挙げられる。ＨＡの前駆体である燐酸カルシウムの析出条件は、当業者により適宜設定できるものであり、例えば、ＯＣＰの析出条件は、Ｙ．  Ｈｏｎｄａ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ｂ，  ＤＯＰ  １０．１００２／ｊｂｍｂ，  ｐａｇｅ  ２８１−２８９を参考にすることができる。尚、上述の加圧が遠心分離である場合は、この方法で生成された複合体の脱水行程も兼ねることができる。
【実施例】
【０００９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定して解釈してはならない。
【００１０】
＜実施例１＞
アルギン酸ナトリウム（０．２ｗｔ％）のリン酸緩衝液溶液を調製した。次いで、この溶液を７０℃に保ちつつ、この溶液に０．０８ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液を一定速度で滴下した。その後、析出したスラリーを純水で懸濁した後、３，０００ｒｐｍ、５分の条件で４回遠心分離することにより、スラリーを精製した。この精製物に純水を加えて再度懸濁させた。この懸濁物を、１，０００ｒｐｍ、５分の条件（４．１×１０−３ＭＰａに相当）で遠心分離（微量高速冷却遠心機ＭＸ−３０１Ｓ、遠心半径：８．１ｃｍ、株式会社トミー精工製）して加圧成形して成形体を得た。そして、この成形体を直径４ｍｍ、厚さ０．５ｍｍの専用の型枠で型抜き成型した。この成型物を約１２時間凍結乾燥（ＥＹＥＬＡ，ＦＤＵ−１２００型）した。この凍結乾燥物を、１２０℃、２時間で、乾熱滅菌することにより、ＯＣＰ／アルギン酸複合体の目的とする成形体を製造した。
【００１１】
＜実施例２＞
遠心分離の条件を、１，０００ｒｐｍから３，０００ｒｐｍ（３．７×１０−２ＭＰａに相当）としたこと以外は、実施例１と同様にＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体を製造した。
【００１２】
＜比較例１＞
加圧成形時の遠心分離条件を、１，０００ｒｐｍから５，０００ｒｐｍ（１．０×１０−１ＭＰａに相当）としたこと以外は、実施例１と同様にＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体を製造した。
【００１３】
＜比較例２＞
加圧成形時の遠心分離条件を、１，０００ｒｐｍから１０，０００ｒｐｍ（４．１×１０−１ＭＰａに相当）としたこと以外は、実施例１と同様にＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体を製造した。
【００１４】
＜比較例３＞
加圧成形時の遠心分離条件を、１，０００ｒｐｍから１５，０００ｒｐｍ（９．２×１０−１ＭＰａに相当）としたこと以外は、実施例１と同様にＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体を製造した。
【００１５】
以上の実施例１並びに２、及び比較例１〜３の製造条件は、表１の通りとなる。以下、これらの実施例及び比較例を０．２系と称す。尚、実施例１並びに２、及び比較例１〜３で得られた成形体は、全てＯＣＰ／アルギン酸複合体であることを、ＦＴ−ＩＲ（ＦＲＥＥＸＡＣＴ−ＩＩ，ＨＯＲＩＢＡ）測定と、ＸＲＤ（ＭｉｎｉＦｌｅｘ，株式会社リガク）測定により確認した。
【００１６】
【表１】
2009254547.tif 000002
【００１７】
＜実施例３＞
アルギン酸ナトリウムの濃度を０．２ｗｔ％から、０．４ｗｔ％にした以外は実施例１と同様に行った。
【００１８】
＜実施例４＞
アルギン酸ナトリウムの濃度を０．２ｗｔ％から、０．４ｗｔ％にした以外は実施例２と同様に行った。
【００１９】
＜比較例４＞
アルギン酸ナトリウムの濃度を０．２ｗｔ％から、０．４ｗｔ％にした以外は比較例１と同様に行った。
【００２０】
＜比較例５＞
アルギン酸ナトリウムの濃度を０．２ｗｔ％から、０．４ｗｔ％にした以外は比較例２と同様に行った。
【００２１】
＜比較例６＞
アルギン酸ナトリウムの濃度を０．２ｗｔ％から、０．４ｗｔ％にした以外は比較例３と同様に行った。
【００２２】
以上の実施例３並びに４、及び比較例４〜６の製造条件は、表２の通りとなる。以下、これらの実施例及び比較例を０．４系と称す。尚、実施例３並びに４、及び比較例４〜６で得られた成形体は、全てＯＣＰ／アルギン酸複合体であることを、ＦＴ−ＩＲ、（ＦＲＥＥＸＡＣＴ−ＩＩ，ＨＯＲＩＢＡ）測定と、ＸＲＤ（ＭｉＮｉＦｌｅｘ，株式会社リガク）測定により確認した。
【００２３】
【表２】
2009254547.tif 000003
【００２４】
＜実験例１：ＳＥＭ観察＞
各実施例及び比較例のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体の断面の構造を評価した。具体的には、実施例２、比較例１及び比較例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体を、技工用メスで切断した。この切断面の構造について、ＳＥＭ観察（ｅ−ＳＥＭ，株式会社マルトー）により評価した。
【００２５】
図１は、実施例２、比較例１及び比較例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体の切断面のＳＥＭ画像（５００倍）である。高倍率の観察においては、明確な違いは確認できないが、実施例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成型体は、空隙のある部位と、密で空隙のない部位が確認された。一方、比較例１及び比較例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成型体は、ある程度、空隙の分布が、均等になっていることが確認された。
【００２６】
図２は、実施例２、比較例１及び比較例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体の切断面のＳＥＭ画像（１００倍）である。実施例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体は、その構造が、密な部分と、疎な部分が混在したものであることが確認できた。一方、比較例１及び比較例２のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体は、構造が全体的に密になっているのが確認できた。
【００２７】
＜実験例２：細胞接着性の評価＞
各実施例及び比較例のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体の細胞接着性を評価した。具体的には、２４ウェルの細胞非接着性プレートの各ウェルに、実施例１〜４及び比較例１〜６のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体をそれぞれ載置した。４．０×１０４ｃｅｌｌ／２００μＬに調製した骨芽細胞様細胞（マウス骨髄由来間質細胞株：ＳＴ−２）の細胞懸濁液（培地：Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｅａｇｌｅ使用）を、各ウェルに２００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２環境下で、１００ｒｐｍで６時間振盪させた後、３日間細胞培養を行った。そして、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同仁化学株式会社）にて細胞数を計測し、複合体の成型体の細胞接着性を評価した。
【００２８】
その結果を図３に示す。図３の結果によれば、細胞の接着性は、０．２系、０．４系ともに、実施例と比較例とから明らかなように、実施例２および４と比較例１および４とのあいだに差があることが認められ、これを加圧する際の圧力でみた場合には、３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだに差があり、これは加圧する際の圧力が大きくなると、成形した成形体の細孔（空隙）が小さくなって密になり、この結果、細胞が入りづらくなって細胞の接着性が阻害されることによるものと推定される。このことは、細胞の入りやすい径の細孔を与えるための大きい方の加圧条件が３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにあり、この結果、加圧条件は、から４．１×１０−３ＭＰａから、３．７×１０−２ＭＰａと１．０×１０−１ＭＰａとのあいだにある細胞が入りやすい径の細孔を形成する圧力の範囲で加圧するものとなる。
るといえる。
【００２９】
＜実験例３：構造評価＞
実施例及び比較例のＯＣＰ／アルギン酸複合体の成形体の平均細孔容積を水銀圧入法（全自動細孔分布測定装置：ＰｏｒｅＭａｓｔｅｒ  ６０  ユアサアイオニクス株式会社製）により評価した。その結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】
2009254547.tif 000004
【００３１】
表３の結果から、加圧して成形される多孔質細孔は、平均細孔容積として４．７４７ｃｍ３／ｇと５．８２０ｃｍ３／ｇとのあいだに細胞が入りやすい径の細孔を形成するところがあり、ここから平均細孔容積が６．１６０ｃｍ３／ｇの範囲までが形態安定性があって細胞の入りやすい多孔質細孔を形成するものであると言える。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例２、比較例１、２で成形した成形体の切断面の５００倍の電子顕微鏡写真図である。
【図２】実施例２、比較例１、２で成形した成形体の切断面の１００倍の電子顕微鏡写真図である。
【図３】各実施例、比較例で成形した成形体に骨芽細胞様細胞を培養したときの細胞数を示すグラフ図である。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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