(57)【要約】【課題】簡便かつ短時間でＤＮＡマイクロアレイ用の試料の調製等が可能な核酸抽出法を提供する。【解決手段】（ａ）少なくとも１種の核酸を含む試料と少なくとも１種の反復配列をブロッキングする核酸と緩衝液を混合した吸着液を、セルロース誘導体を主成分とする固体材料に接触させ、該固体材料に核酸を吸着させる工程と（ｂ）固体材料を回収液と接触させ、核酸を含む溶出液を得る工程とを含み、前記試料に含まれる核酸が核酸増幅反応で得られたもの、前記試料に含まれる核酸が蛍光物質を結合させたもの、反復配列をブロッキングする核酸がＣｏｔ−１  ＤＮＡであること等が好ましく、前記吸着液にさらにナトリウム塩または水溶性有機溶媒を含有させること、前記（ａ）工程と（ｂ）工程の間に、（ｃ）固体材料を洗浄液で洗浄する工程を含むこと等が好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む核酸抽出法。
（ａ）少なくとも１種の核酸を含む試料と少なくとも１種の反復配列をブロッキングする核酸と緩衝液を混合した吸着液を、セルロース誘導体を主成分とする固体材料に接触させ、該固体材料に核酸を吸着させる工程
（ｂ）固体材料を回収液と接触させ、核酸を含む溶出液を得る工程
【請求項２】
前記試料に含まれる核酸が核酸増幅反応で得られたものである請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項３】
前記試料に含まれる核酸が蛍光物質を結合させたものである請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項４】
前記吸着液にさらにナトリウム塩または水溶性有機溶媒を含有させる請求項１〜３のいずれか記載の核酸抽出法。
【請求項５】
前記（ａ）工程と（ｂ）工程の間に、以下の工程を含む請求項１〜４のいずれか記載の核酸抽出法。
（ｃ）固体材料を洗浄液で洗浄する工程
【請求項６】
反復配列をブロッキングする核酸がＣｏｔ−１  ＤＮＡであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか記載の核酸抽出方法。
【請求項７】
前記試料に含まれる核酸が少なくとも２種である請求項１〜６のいずれか記載の核酸抽出法。
【請求項８】
前記試料に含まれる少なくとも２種の核酸がそれぞれ異なる蛍光物質を結合させたものである請求項７記載の核酸抽出法。
【請求項９】
前記回収液中に、ポリヒドロキシアルコール、ポリアルキレンイミンおよび糖類から選択される、少なくとも一種類の化合物を含有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の核酸抽出方法。
【請求項１０】
ポリヒドロキシアルコールがグリセロール、ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールである請求項９記載の核酸抽出方法。
【請求項１１】
前記糖類が多糖類である請求項９記載の核酸抽出方法。
【請求項１２】
前記多糖類がデキストランまたはキトサンである請求項１１記載の核酸抽出方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）の回収液の液量が、固体材料の体積に対して１倍以上１００倍以下である、請求項１〜１２のいずれか記載の核酸抽出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを用いた染色体解析のための核酸抽出・精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、染色体の解析技術として、特定の染色液を用いて染色体を染色し、光学顕微鏡を用いてその染色パターンから遺伝子の欠失や増幅を検出する、Ｇ染色法やＱ染色法と呼ばれる方法が用いられてきた。これらの方法は染色した染色体を直接観察し変異を検出するため、検出の精度が低くまた、熟練が必要であった。
より定量的に精度良く解析するための手段として、中期染色体を用いるCGH法やＤＮＡマイクロアレイを用いるアレイＣＧＨ法が開発された。
ＣＧＨ法は、中期染色体を対象にしてゲノムDNAの過剰、欠失、増幅などのコピー数異常を定量的に検出する方法である (非特許文献１)。しかし、一般に５〜１０Ｍｂ以上にわたる大きな領域で染色体異常が起こっていないと検出することが出来ない問題点があった（非特許化文献２）。
【０００３】
さらに上記問題点を改良するため、シーケンサーの塩基レベルの解像度と、染色体分析が扱える５〜１０Ｍｂの解像度の間の数１０ｋｂ〜数Ｍｂレベルで起きたゲノム構造異常を検出できるツールとして新しく登場したのが、アレイＣＧＨ法である(非特許文献３)。アレイＣＧＨ法は、ゲノムＤＮＡの断片、例えば、ＢＡＣ(Bacterial Artificial Chromosomes)クローンやＹＡＣ(Yeast Artificial Chromosomes)クローンや合成オリゴヌクレオチドプローブ等の核酸を固体基板上に配置したDNAマイクロアレイを使用する。
比較したい別々の核酸をそれぞれ異なった蛍光物質で染色し、ＤＮＡマイクロアレイ上のプローブに対し同時にハイブリダイゼーションさせたのち、プローブから発するそれぞれの蛍光シグナルの強度比を比較することで、遺伝子のコピー数の差異を検出する方法である。
【０００４】
この方法を用いることで、染色体中の遺伝子領域の増幅、欠失を定量的に高精度で解析することが可能となったが（非特許化文献４）、解析のための試料の調製は、２種類の核酸に対して、それぞれ異なった蛍光色素を導入する（二色法）ため、精製工程が二回必要となり、更に、繰り返し配列をブロックするためにブロッキングＤＮＡを試料に添加した後エタノール沈殿により溶媒置換行い、核酸の濃縮化する必要があるなど、操作が複雑で時間がかかり、高コストの要因ともなっており、診断分野への応用を考えた場合の大きな障害となっていた。
【０００５】
【非特許文献１】A. Kallioniemi et al., Science, 258, 818-821 (1992).
【非特許文献２】稲澤譲治, 水口真希, 臨床検査, 49, 497-502 (2005).
【非特許文献３】D. Pinkel et. al., Nat. Genet., 20, 207-211 (1998)
【非特許文献４】井本逸勢, 稲澤譲治, 細胞工学, 23, 355-361 (2004).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、簡便かつ短時間でＤＮＡマイクロアレイ用の試料の調製等が可能な核酸抽出法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的を達成するために、鋭意検討を行った結果、以下の方法を用いることで簡便かつ短時間で核酸マイクロアレイ用の試料の調製等ができることを見出し、本発明の試料を用いたＤＮＡマイクロアレイの解析結果が、従来法に比べ予想外に改良されることを見出した。
本発明は、下記の構成よりなるものである。
【０００８】
（１）以下の工程を含む核酸抽出法。
（ａ）少なくとも１種の核酸を含む試料と少なくとも１種の反復配列をブロッキングする核酸と緩衝液を混合した吸着液を、セルロース誘導体を主成分とする固体材料に接触させ、該固体材料に核酸を吸着させる工程
（ｂ）固体材料を回収液と接触させ、核酸を含む溶出液を得る工程
【０００９】
（２）前記試料に含まれる核酸が核酸増幅反応で得られたものである前記（１）の核酸抽出法。
（３）前記試料に含まれる核酸が蛍光物質を結合させたものである前記（１）の核酸抽出法。
（４）前記吸着液にさらにナトリウム塩または水溶性有機溶媒を含有させる前記（１）〜（３）の核酸抽出法。
【００１０】
（５）前記（ａ）工程と（ｂ）工程の間に、以下の工程を含む前記（１）〜（４）の核酸抽出法。
（ｃ）固体材料を洗浄液で洗浄する工程
【００１１】
（６）反復配列をブロッキングする核酸がＣｏｔ−１  ＤＮＡであることを特徴とする、前記（１）〜（５）の核酸抽出方法。
（７）前記試料に含まれる核酸が少なくとも２種である前記（１）〜（６）の核酸抽出法。
（８）前記試料に含まれる少なくとも２種の核酸がそれぞれ異なる蛍光物質を結合させたものである前記（７）の核酸抽出法。
【００１２】
（９）前記回収液中に、ポリヒドロキシアルコール、ポリアルキレンイミンおよび糖類から選択される、少なくとも一種類の化合物を含有することを特徴とする前記（１）〜（８）の核酸抽出方法。
（１０）ポリヒドロキシアルコールがグリセロール、ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールである前記（９）の核酸抽出方法。
（１１）前記糖類が多糖類である前記（９）の核酸抽出方法。
（１２）前記多糖類がデキストランまたはキトサンである前記（１１）の核酸抽出方法。
【００１３】
（１３）工程（ｂ）の回収液の液量が、固体材料の体積に対して１倍以上１００倍以下である、前記（１）〜（１２）の核酸抽出法。
【００１４】
なお、核酸を含む試料液を多孔質膜等の固体材料に接触させて、試料液に含まれる核酸を、一旦、該固体材料に吸着させてから、該固体材料を別の回収液と接触させて、核酸を含む溶出液を得る場合、特に、該溶出液をそのままＤＮＡマイクロアレイを用いるアレイＣＧＨ解析用のハイブリダイゼーション用溶液に用いる場合には、回収液が可能な限り少量となることが好ましい。
多孔質膜を用いた核酸抽出の場合、核酸抽出量を向上させるためには、膜全体に回収液がまんべんなく行き渡ることが重要である。一方、本発明のように生体材料を溶解することで調製したライセートから核酸を抽出することをも考慮している場合には、ライセート調製時に発生する凝集物が原因となる目詰まり対策を行うことが重要である。さらに、本発明で併用される反復配列をブロッキングする核酸が十分な効果を発揮するためには、添加する量を多くする（通常、解析対象となる核酸の２倍以上）必要があり、目詰まりの問題をより深刻にする原因となっていた。目詰まりを改善する方法として種々の方法を本発明者らは開発してきたが、膜に注目した場合、細孔サイズを大きくすることや膜面積を大きくすることで、この問題点が改善できることを見出してきている。膜面積を大きくすれば、膜厚が一定であれば膜体積も大きくなり、その結果、より多くの回収液量が必要となる。これらのことを考慮し、本発明者らは、目詰まりすることなく、膜面積を大きくし、それに伴って回収液量を増加させないこと、これらを満足する方法の検討を鋭意行った結果、膜厚を薄くすることで、これらの課題を解決するに至った。さらに、膜厚を薄くすると、強度が問題となり、従来一般的に用いられることの多い無機化合物、例えば、二酸化ケイ素を主成分とする固体材料を用いた多孔質膜の場合には、膜厚が薄くなればなるほど強度が低下する問題があった。そこで、本発明者らは、多孔質膜の素材の検討を種々行い、トリアセチルセルロースを主成分とする多孔質膜の表面を懸化することによって、その表面に核酸吸着能を有する水酸基を形成させたセルロース誘導体を主成分とする固体材料である多孔質膜を用いることによって、薄くても十分な強度を得ることに成功し本発明を完成させた。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法を用いることにより、工程数が少なく、容易に短時間で核酸を得ることが出来る。さらに従来法と比べ良好なマイクロアレイ解析結果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の工程は、吸着工程、回収工程から成り立っているが、目的の核酸をマイクロアレイでの解析に供するため、必要に応じて以下の工程を組み合わせることが出来る。
a.解析対象となる核酸を抽出する工程。b.解析対象となる核酸を増幅する工程。c.解析対象となる核酸を標識する工程。d.反復配列をブロッキングする核酸と緩衝液を混合する工程。e.吸着工程後、回収工程の間で、不用物を取り除く洗浄工程。これらの工程は本発明において必ずしも必要な工程ではないが、以下これらの工程の好ましい態様も含めた説明を行う。
【００１７】
＜核酸＞
本発明において「核酸」とは、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖のいずれかもしくはそれらの混合物のいずれでもよく、また、分子量の制限も無い。また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらが修飾されたもの、およびそれらの混合物、いずれのものでも良い。
＜核酸を含む試料＞
本発明において「核酸を含む試料」とは、核酸以外の成分を取り除いた精製核酸試料でも、検体細胞または組織をホモジナイズしたものでも、該ホモジナイズしたものをフェノール処理等で除タンパク処理したものでも、または、電気泳動により分離した後に特定分子量の部分の泳動ゲルを切り出したものでもよい。
【００１８】
また、試料に含まれる核酸は、１種でもよいが、２種以上であっても良い。
また、試料に含まれる核酸が２種以上である例としては、異なる検体試料から抽出した核酸が挙げられる。異なる検体試料とは、例えば、正常細胞とがん細胞の組み合わせ、種類の異なる生物種から得られた細胞、同一種でも異なった個体から得られた細胞、異なる組織から得た細胞、ある刺激、例えば、温度、時間、圧力、薬剤などの細胞外環境を変えたときの細胞、薬剤を注入した細胞と注入していない細胞などのように、元来異なっている細胞もしくはある刺激を加えることによって違いが生じた細胞や試料のことを言う。
【００１９】
＜増幅反応＞
試料は細胞等から調製したＤＮＡをそのまま使用しても良いし、標的配列を含むＤＮＡ領域をＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)等で増幅しても良い。増幅法は、核酸を増幅できるものであればどのような方法でも良い。
【００２０】
また、試料に含まれる核酸は、標識物質で標識化されていてもよい。
標識法は、直接標識法、間接標識法のいかなる方法で標識を行っても良い。
試料に含まれる核酸が２種以上である場合は、各核酸をそれぞれ異なった種類の標識物質で標識化することができる。
標識物質としては、特に限定されず、蛍光物質、放射性物質、酵素等があるが、取り扱い上、蛍光物質が好ましい。
【００２１】
＜蛍光物質＞
使用する蛍光物質は、特に限定しないが、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Cy3, Cy5, Cy7、緑色蛍光タンパク質(GFP, Green Fluorescent Protein)、青色蛍光タンパク(BFP,)、黄色蛍光タンパク(YFP)、赤色蛍光タンパク(RFP)Alexa、Acridine、DAPI、Ethidium bromide、SYBR Green、Texas Red、希土類蛍光ラベル剤 (4, 4'-bis(1", 1", 1", 2", 2", 3", 3"-heptafluoro-4", 6"-hexanedion-6"-yl)-chlorosulfo-o-terphenyl(BHHCT))などを用いることが出来る。また、ナノ微粒子、マイクロ微粒子などでも良い。
試料に含まれる核酸が２種である場合は、各核酸をそれぞれ異なった２種類の蛍光色素を用いる二色法で行っても良いし、単色法で行っても良い。単色法で行う場合には、未精製の標識核酸は、二種類以上を混合してから精製するのではなく、それぞれ精製し核酸マイクロアレイ実験を行うものとする。さらに、二色以上の多色法で標識した核酸に対しても本発明の方法を適用することが出来る。
また、非酵素的に標識することも出来る。例えば、ULS arrayCGH Labeling Kit（Kreatech Biotechnology BV社）なども用いることが出来る。
【００２２】
＜反復配列をブロッキングする核酸＞
本発明において、「反復配列をブロッキングする核酸」としては、特に限定されないが、例えば、変性サケ精子ＤＮＡやｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙｄＡ、ｔＲＮＡ、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡ、マウスＣｏｔ−１  ＤＮＡなどが使用できる。その中でもヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡが好ましい。
【００２３】
＜吸着液＞
本発明においては、核酸を含む試料と少なくとも一種の反復配列をブロッキングする核酸と少なくとも緩衝液を混合した吸着液とした後に、該吸着液をセルロース誘導体を主成分とする固体材料に接触させ、該固体材料に核酸を吸着させる。
この場合、緩衝液に、ナトリウム塩、水溶性有機溶媒等を含ませて、核酸を固体材料に吸着させる働きをより向上させた吸着液としてもよい。
また、本発明で言うところの吸着とは、核酸と固体材料との間に、親水性もしくは疎水性相互作用、イオン性相互作用、水素結合、イオン結合、化学反応などのことを指し、フイルター効果による核酸分子の固体材料への引っかかりも含むものとする。
【００２４】
吸着液中にナトリウム塩を加えることは、固体材料への核酸の吸着を促進する観点から好ましい。
本発明で使用することの出来るナトリウム塩とは、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、くえん酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、臭化ナトリウム、ギ酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、乳酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウムのいずれかを用いることが出来る。この中で、特に塩化ナトリウムを好適に用いることが出来る。
ナトリウム塩の濃度は高いほど核酸の吸着量、回収量が増加するので好ましい。しかし、ナトリウム塩の濃度を極端に増加させればさせるほど吸着液中に塩の発生する可能性が高くなる。従って、本発明のナトリウム塩の濃度には上限がある。本発明では、０．１ｍｏｌ／Ｌ〜３ｍｏｌ／Ｌの濃度が最適である。
【００２５】
吸着液中に緩衝液を含ませることは、溶解液のｐＨ変化を防ぐ観点から必要である。緩衝液としては、ｐＨを一定に保つことが出来るものであれば、どの様な緩衝液をも用いることが出来るが、生化学用に一般的に使用されているものが好ましい。例えば、グッド緩衝液を用いることが好ましい。グッド緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ(N,N-bis (2-hydoroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane)、ＭＥＳ(2-Morpholinoethanesulfonic acid)、ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid）、ＰＩＰＥＳ（Piperaxine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamino)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）、ＴＥＳ（N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid）等が挙げられる。
緩衝液の濃度もｐＨを一定に出来る濃度であればどの様な濃度でも良い。好ましくは５ｍｏｌ／Ｌ以下、価格を抑制する観点から、より好ましくは１ｍｏｌ／Ｌ以下が良い。
【００２６】
吸着液は、水溶性有機溶媒を含んでいることが好ましい。吸着液中に水溶性有機溶媒を混合しておくことで、核酸の回収量が増加する。しかし、水溶性有機溶媒の濃度を上げることによって共存する塩の析出が生じやすくなる。また、吸着液の体積を増やすことは同一の核酸量が含まれている場合、回収量の低下をもたらすために限度がある。従って、ある一定量の吸着液体積において、水溶性有機溶媒の濃度を増加させることは、核酸吸着促進作用を持ったナトリウム塩やｐＨを一定に保つための緩衝液の量を減らさなければならないことになる。以上のことから、水溶性有機溶媒の濃度には上限があり、本発明では、吸着液中の水溶性有機溶媒の濃度が４０体積％以上８０体積％以下であることが好ましく、５０体積％以上７０体積％以下が特に好ましい。
吸着液中に加える水溶性有機溶媒の種類は、アセトン、アルコール類、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。中でも、アルコール類が好ましい。アルコール類は、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。とりわけメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体をより好ましく用いることができる。これらの中でも、環境負荷の低減、有毒性の観点からエタノールが特に好ましい。これらの水溶性有機溶媒は単独でも複数組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
吸着液には、不純物として含まれる成分を分解することを目的として、種々の酵素を添加することも出来る。例えば、特定の核酸を除去したい場合には、その特定の核酸の塩基配列を特異的に認識する制限酵素、一本鎖を特異的に認識し切断する酵素、ＲＮＡを分解したい場合にはＲＮａｓｅ、タンパクを除去したい場合にはプロテアーゼ、脂質を除去したい場合にはリパーゼ、糖を除去したい場合には糖分解酵素を添加することも出来る。更に、これらの混合物を用いることも出来る。
また、核酸と吸着液の混合物が核酸吸着材料を通過した後に、これらの酵素を添加することも出来る。いわゆるオンカラム法を用いることも出来る。
【００２８】
吸着液には、カオトロピック塩を添加することも出来る。カオトロピック塩を添加することにより、タンパクの構造が破壊され、よりタンパクの混入の少ない核酸抽出液を得ることが出来る。
カオトロピック塩としては、特に限定は無く、公知のカオトロピック塩を使用することができる。例えば、カオトロピック塩としては、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、尿素、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、アンモニウムイソチオシアネート、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム等を使用することができる。中でもグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩としては、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（チオシアン酸グアニジン）が挙げられ、中でも塩酸グアニジンまたはグアニジンチオシアン酸塩が好ましい。これらの塩は単独でも、複数組み合わせて用いてもよい。
【００２９】
吸着液には核酸安定化剤を添加することも出来る。本発明で言うところの核酸安定化剤とは、検体中の核酸を安定に存在させることができる試薬のことである。これには、核酸そのものを安定に存在させることが出来る試薬であるとともに、核酸を不安定化、例えば、核酸を分解するようなヌクレアーゼなどの核酸分解酵素による分解作用を低下もしくは完全に阻害させることで、核酸を分解させない試薬をも含むものとする。
ヌクレアーゼ活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還元剤として使用される化合物を用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
【００３０】
＜攪拌工程＞
攪拌工程は、試料核酸と吸着液と反復配列をブロッキングする核酸とを混合する工程である。攪拌方法としては、ボルテックス、機械的往復運動、チューブ内部に突起を持つチューブを用いた攪拌方法、超音波処理、ボルテックス処理とボールとの併用、機械的往復運動とボールとの併用、プロペラを用いた攪拌方法、ペレットペッスル、ピペッティングを用いた攪拌方法などである。
【００３１】
＜機械的往復運動による攪拌＞
本発明で言うところの機械的往復運動による攪拌とは、一定の方向に対して（但し８の字型の様な運動も含む）、容器に対して往復運動を行いながらホモジナイズ処理を行うことを言う。この処理を行う際に、ガラス、ステンレスやジルコニアなどのボールを添加するとよりホモジナイズ処理が進行し、通過時間が短くなるので好適に用いることが出来る。この様な処理を一般的にビーズミル処理という。
【００３２】
＜核酸の吸着＞
以上の工程によって調製した吸着液と試料との混合物を、固体材料に接触させる。この操作により、試料溶液中の核酸が固体材料に吸着される。
本発明の固体材料は、セルロース誘導体を主成分とするものであれば特に限定されないが、好ましくは核酸吸着性多孔性膜であり、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。
【００３３】
本発明で使用する固体材料としては、例えばニトロセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アセチルセルロース等の、セルロース誘導体が挙げられるが好ましくは、アセチルセルロ−スが挙げられ、更にアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物から成る有機高分子の固相を使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物を好ましく使用する事ができる。特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（ 質量比） は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０である事がより好ましい。
【００３４】
特に好ましい、アセチルセルロースから成る固相としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースの表面鹸化物とは、アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物を鹸化処理したものであり、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物も好ましく使用することができる。より好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物を使用することである。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましい。更に好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比は、９０：１０〜５０：５０であることである。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。鹸化処理により得られる固相の鹸化率（表面鹸化率）が５％ 以上１００％以下であることが好ましく、１０％ 以上１００％ 以下であることが更に好ましい。また、水酸基を有する固相の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの固相を鹸化処理することが好ましい。固相は、表裏対称性の多孔性膜であってもよいが、表裏非対称性の多孔性膜を好ましく使用することができる。
【００３５】
ここで、鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したアセチルセルロースの部分は、再生セルロースとなり水酸基が導入される。こうして作成された再生セルロースは、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。本発明において固相として、再生セルロースの固相を用いることが特に好ましい。又、鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲ により、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。
【００３６】
使用する溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。
固体材料は、カートリッジに保持されていることが好ましい。
吸着液と試料との混合物は、複数のカートリッジに分注することもできる。こうすることで、一本のカートリッジに入りきらない多量の試料から核酸を抽出することが出来る。
また、同一のカートリッジに吸着液と試料の混合物を、添加、固体材料通過を何度か繰り返してもよい。
また、前述の加圧送液方式だけではなく、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＳＰ  Ｋｉｔ付属のカートリッジＣＡＳのような、遠心方式も好ましく用いることが出来る。
【００３７】
＜洗浄工程＞
核酸を固体材料に吸着させた後、洗浄液を接触させて固体材料を洗浄することが好ましい。
洗浄工程により、最終的に得られる核酸の純度が向上する。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作を簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰り返すことが好ましい。
洗浄工程において、洗浄液の使用時の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。
また洗浄工程において、洗浄工程と同時に核酸分離精製カートリッジに器械的な振動や超音波による攪拌を与えることもできる。または遠心分離を行うことにより洗浄することもできる。
【００３８】
洗浄工程において、洗浄液は、水溶性有機溶媒及び水溶性塩の少なくともいずれかを含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、固体材料に核酸と共に吸着した核酸混合物溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、固体材料から核酸は脱離させないが不純物は脱離させる組成であることが必要である。この目的には、核酸はアルコール等の水溶性有機溶媒に対し難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱離させるのに水溶性有機溶媒が適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不純物および不要成分の選択的除去作用を向上することができる。
【００３９】
洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコールを用いることができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノールが挙げられる。プロパノールとしては、イソプロパノール、ｎ−プロパノールのいずれでもよく、ブタノールも直鎖状でも分岐状でもいずれでもよい。これらアルコールは、複数種類を使用することもできる。中でもエタノールを用いることが好ましい。
洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、５〜１００質量％であることが好ましく、５０〜８０質量％であることがより好ましい。
【００４０】
一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、５ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。よりさらに好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、とりわけ、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが好ましい。
【００４１】
洗浄液は、カオトロピック物質を含んでいないことが好ましい。これによって、回収工程においてカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＲＴ−ＰＣＲ反応等を行う場合の酵素反応を阻害するので、後に酵素反応等を行う場合を考慮すると洗浄液にカオトロピック物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性があり有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。
【００４２】
＜回収工程＞
回収液には、ポリヒドロキシアルコール、ポリアルキレンイミンおよび糖類から選択される、少なくとも１種類の化合物を含有することが出来る。
ポリヒドロキシアルコールとしてはグリセロール、ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール及びヘキサントリオールおよびその誘導体が挙げられるが、グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールであることが好ましい。ポリアルキレンイミンとしては、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミンおよびその誘導体等を挙げることができる。糖類としては、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マルチトール、グルコース、フラクトース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、グリコネート、ラクチトール、スクロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸及びこれらの誘導体が挙げられるが、マンニトール、グルコネート、ラクチトール、スクロースであることが好ましい。特に、糖類として多糖類であることが好ましく、デキストラン、キトサンおよびこれらの誘導体であることが好ましい。
【００４３】
更に、回収液には、ｐＨを一定にするための緩衝液、核酸、界面活性剤の中から少なくとも一つを含む水溶液を用いることが出来る。
回収液に添加する緩衝液としては、ｐＨを一定に保つことが出来るものであれば、どの様な緩衝液をも用いることが出来るが、生化学用に一般的に使用されているものが好ましい。例えば、グッド緩衝液を用いることが好ましい。グッド緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ(N,N-bis (2-hydoroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane)、ＭＥＳ(2-Morpholinoethanesulfonic acid)、ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid）、ＰＩＰＥＳ（Piperaxine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamino)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）、ＴＥＳ（N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid）等が挙げられる。
回収液に添加する核酸としては、変性サケ精子ＤＮＡやｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙ ｄＡ、ｔＲＮＡ、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡ、マウスＣｏｔ−１  ＤＮＡなどの核酸成分を用いることが出来る。これらは、非特異的なハイブリダイゼーションやプローブＤＮＡのハイブリダイゼーションやプローブＤＮＡの膜および基盤への吸着を防ぎ、それらの結果としてバックグランドを抑えることができる。
【００４４】
回収液に添加する界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、また、ノニオン性界面活性剤を用いることも出来る。カチオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドが挙げられる。アニオン性界面活性剤として、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、又はセチルピリジニウムクロリド等が挙げられるが、ドデシル硫酸ナトリウムを用いるのが好ましい。ドデシル硫酸ナトリウムは、バックグラウンドを効率よく抑えることが出来る。他に、Ｎ−ラウリルサルコシド、ラウリル硫酸リチウムなどを用いることができる。ノニオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）やＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）を用いることが出来る。また、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドが挙げられる。
【００４５】
回収液に添加する核酸安定剤としては、核酸そのものを安定に存在させることが出来る試薬であるとともに、核酸を不安定化、例えば、核酸を分解するようなヌクレアーゼなどの核酸分解酵素による分解作用を低下もしくは完全に阻害させることで、核酸を分解させない試薬をも含むものとする。
ヌクレアーゼ活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還元剤として使用される化合物を用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
【００４６】
回収液にデンハルト溶液（フィコール、ポリビニルピロリドン、ウシ血清アルブミンを主成分とする溶液）を添加することもできる。この溶液は、例えばアレイのバックグラウンドノイズを低減させることが出来る。
回収液には、４級アンモニウム塩であるベタインを添加することも出来る。ベタインは、核酸の水素結合に関与し、非特異的なハイブリダイゼーションを抑える作用が報告されている(Biochemistry 32, 137-144(1993))。
【００４７】
回収液には、ＴＭＡＣ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）も添加することが出来る(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1585-1588 (1985)) 。
回収液にはデキストラン硫酸、ホルムアミド、２０×ＳＳＣを含むＭＭ＃１液を用いることが出来る。
【００４８】
又、回収液には、水のみ使用することも出来る。
回収液として、水とｐＨを一定に保持するための緩衝液のみから構成された水溶液を用いることも出来る。
検体から調製した試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調製して核酸の脱離を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μＬであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。
また、回収液の液量は、固体材料の体積に対して１倍以上１００倍以下であることが好ましく、５倍以上５０倍以下であることがより好ましい。
【００４９】
また、目的に応じて回収液の温度を変化させることで簡便に核酸を回収することができる。例えば、回収液の使用時の温度を０〜１０℃にして固体材料からの核酸の脱離を行うことで、核酸分解酵素による核酸の分解を防止する何らかの試薬や特別な操作を加えることなく核酸分解酵素の働きを抑制して、核酸の分解を防ぎ、簡便に、効率よく核酸溶液を得ることができる。
また、回収液の使用時の温度を１０〜３５℃とした場合、一般的な室温で核酸の回収を実施することが出来、複雑な工程を必要とせずに核酸を脱離させて分離精製することができる。
また別の態様としては、回収液の温度を高温、例えば３５〜７０℃とすることで、固体材料からの核酸の脱離を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができる。
【００５０】
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入してもよい。カートリッジを複数本用いる場合には、第１のカートリッジに対して回収液を加え、核酸を溶出させ、この溶出液を第２のカートリッジに加え、再び核酸を溶出させることも出来る。このような操作は、用いたカートリッジの本数分行うことが出来る。これらの操作により、高濃度の核酸を得ることが出来る。また、一つのカートリッジに対して、回収液を加えて核酸を溶出させた後、その溶出液を再び同じカートリッジに加えて、再度核酸を溶出させることも出来る。この様な操作により、一回の操作による核酸の濃度、量よりもより高い濃度、より多い核酸を得ることが出来る。
【００５１】
また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解抑制剤としては、核酸分解酵素の阻害剤が挙げられ、具体的にはＥＤＴＡなどが挙げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。
核酸を固体材料から脱離させる場合の回収液と固体材料との浸漬時間を長くすることで、浸漬時間が短い場合には数回の抽出操作を行わなければ吸着させた核酸が溶出しなかったのが、一回もしくはより少ない回数でより多くの核酸を溶出させることが可能となる。本発明者らが詳細に検討した結果、核酸を抽出する際の浸漬時間が０．１秒以上６００秒以下、好ましくは、６０秒以上３６０秒以下であれば、十分な量の核酸を得ることが出来た。
【００５２】
本発明の核酸抽出法で得られた核酸溶出液は、種々の核酸ハイブリダイゼーションに用いられるが、例えば、マイクロアレイを用いるハイブリダイゼーション法であるアレイＣＧＨ法に適用することが好ましい。
【００５３】
＜マイクロアレイ＞
本発明の核酸抽出法で得られた核酸溶出液が適用できる、核酸マイクロアレイとは、ＤＮＡを固体基盤上に整列させて配置し固定化したものをいう。生体材料、例えば、組織などから抽出したＤＮＡを蛍光物質などの標識化合物で標識化、もしくは、抽出したｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを標識化し、本発明の核酸抽出方法で精製した後、固体基板上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションし、蛍光値などを数値化し、遺伝子の状況を知るもののことを言う。本発明では、基板上に配置した核酸をプローブ核酸とよび、蛍光標識等した核酸をターゲット核酸もしくは標識核酸とよぶ。
【００５４】
本発明において好ましい態様として、標識反応が終了した未精製標識核酸の二種を混合し、ヒトＣｏｔ−１やｔＲＮＡなどの核酸をそれらの溶液に混合した後、前記特許に開示されているセルロース誘導体を主成分とする固体材料を用い、一度に精製を行うことで、核酸標識反応後の精製工程を減らし、従来法と比較して、より短時間、より少ない工程数、より簡便な方法で標識核酸を含む濃縮核酸溶液を調製する方法が挙げられる。
また精製工程を自動化した核酸自動抽出機を好ましく用いることが出来、より簡便で安定して試料を調製することもできる。
【００５５】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
＜精製用試料の調製＞
１．７ｍＬ容マイクロチューブに２１μＬのＭａｌｅ  ＤＮＡを入れ、２．５×Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬ加え、ＢＬＯＣＫ  ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ  ＢＩ−５３５Ａ（株式会社アステック製）上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷した。１０×ｄＣＴＰ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｍｉｘを５μＬ、Ｃｙ−ｄＣＴＰ  Ｂｕｌｋ  Ｐａｃｋ  ２５０ｎｍｏｌを３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを１ｕＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ  ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ  ＢＩ−５３５Ａにて、反応を行った。２時間後、Ｓｔｏｐ  Ｂｕｆｆｅｒを５μＬ添加し、３０秒間攪拌後、スピンダウンを行った(Ｍａｌｅ反応物)。
同様の操作を、Ｆｅｍａｌｅ  ＤＮＡについて行った（Ｆｅｍａｌｅ反応物）。
このようにして調製した反応物を混合した液５０μｌに、ヒトＣｏｔ−１−ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を５０μｌを加え、精製用試料とした。
【００５７】
＜試料の精製＞
・比較精製物Ａの調整方法（シリカカラムによる精製）
このようにして作成した精製用試料１００μＬにＮＴバッファー２００μＬを添加し、数回ピペッティングを行うことでＮＴバッファーと試料とを攪拌した。この溶液をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（日本ジェネティクス株式会社）に全量添加し、ＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００にセットし、１１０００×ｇで１分間、室温で遠心した。通過液を捨て、洗浄液ＮＴ３バッファーを６００μＬ添加し、再び１１０００×ｇで１分間、室温で遠心した。通過液を捨て、再度、１１０００×ｇで２分間、室温で遠心した。廃液チューブと回収容器とを交換し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカートリッジに回収液として水を５０μＬ添加し、１分間のインキュベーションを行った後、１１０００×ｇで１分間、室温で遠心し、回収チップより比較精製物Ａを得た。本精製に使用したシリカカラムの大きさは、直径５ｍｍ、厚み１ｍｍであった（体積１９．６×１０−９ｍ３）。
【００５８】
・本発明精製物Ａの調整方法（セルロース誘導体による精製）
精製用試料１００μＬに、７０％エタノール、０．５ＭＮａCｌ、５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを含む吸着液を３００μＬ添加し、１５秒間攪拌、数秒のスピンダウンを行った後、固体材料としてＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＳＰ  Ｋｉｔ（富士フイルム株式会社製）付属のカートリッジＣＡＳに全量を添加した。ＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００にＣＡＳをセットし、１００００×ｇにて、１分間、室温で遠心した。ＣＡＳ通過液を捨て、ＣＡＳを再び廃液容器に取り付け、ＣＡＳに６０％エタノール、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含有する洗浄液を７５０μＬ添加した。ＭＸ−３００にＣＡＳをセットし、１００００×ｇにて、１分間、室温で遠心した。ＣＡＳ通過液を捨て、ＣＡＳを再び廃液容器に取り付け、ＣＡＳに６０％エタノール、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含有する洗浄液を７５０μＬ添加した。廃液容器を新しいマイクロチューブと交換し、ＣＡＳをこのマイクロチューブにセット後、回収液として水を６３μＬを添加し。２分間インキュベーションした後、ＭＸ−３００にＣＡＳをセットし、１００００×ｇにて、１分間、室温で遠心し本発明精製物Ａを完成させた。本精製に使用した固体材料の大きさは直径５ｍｍ、厚み８０マイクロメートルであった（体積１．６×１０−９ｍ３）。
【００５９】
＜核酸回収量の定量＞
核酸の定量は、紫外可視分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて測定し、回収量は２６０ｎｍの吸光度から決定した。結果を下記表１に示す。
【００６０】
【表１】
2009284784.tif 000002
【実施例２】
【００６１】
実施例１の比較精製物Ａの調製方法において、最終の回収液を水の代わりにＭＭ＃１バッファー（デキストラン硫酸  １ｇ、ホルムアミド  ５ｍＬ、２０×ＳＳＣ  １ｍＬ）５０μｌを用い、比較精製物Ｂを得た。
同様に、本発明精製物Ａの調製方法において、最終の回収液を水の代わりにＭＭ＃１バッファー（デキストラン硫酸  １ｇ、ホルムアミド  ５ｍＬ、２０×ＳＳＣ  １ｍＬ）５０μｌを用い、本発明精製物Ｂを得た。
実施例１と同様の定量方法により核酸回収量の評価を行った。結果を下記表２に示す。
【００６２】
【表２】
2009284784.tif 000003
【００６３】
以上より、本発明の構成を用いることで、多くの核酸を回収することができること、及び、回収液がMM#1の場合、その差がさらに顕著になることが分かる。
【実施例３】
【００６４】
１．比較試料の作成
＜標識ＤＮＡの調製＞
１．７ｍＬ容マイクロチューブに２１μＬのＭａｌｅ  ＤＮＡを入れ、２．５×Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を２０μＬ加え、ＢＬＯＣＫ  ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ  ＢＩ−５３５Ａ上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、氷上にて１０分間急冷した。１０×ｄＣＴＰ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を５μＬ、Ｃｙ−ｄＣＴＰ  Ｂｕｌｋ  Ｐａｃｋ  （ＧＥヘルスケア製）２５０ｎｍｏｌを３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を１ｕＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ  ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ  ＢＩ−５３５Ａにて、反応を行った。２時間後、Ｓｔｏｐ  Ｂｕｆｆｅｒを５μＬ添加し、３０秒間攪拌後、スピンダウンを行った(Ｍａｌｅ反応物)。
同様の操作を、Ｆｅｍａｌｅ  ＤＮＡについて行った（Ｆｅｍａｌｅ反応物）。さらに、調製後、それぞれに対し次の精製工程を行った。
【００６５】
＜標識ＤＮＡの精製＞
Ｍａｌｅ反応物２７．５μＬにＮＴバッファー１００μＬを添加し、数回ピペッティングを行うことでＮＴバッファーと試料とを攪拌した。この溶液をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（日本ジェネティクス株式会社）に全量添加し、ＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００にセットし、１１０００×ｇで１分間、室温で遠心した。通過液を捨て、洗浄液ＮＴ３バッファーを６００μＬ添加し、再び１１０００×ｇで１分間、室温で遠心した。通過液を捨て、再度、１１０００×ｇで２分間、室温で遠心した。廃液チューブと回収容器とを交換し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカートリッジに水を３〜５０μＬ添加し、１分間のインキュベーションを行った後、１１０００×ｇで１分間、室温で遠心し、回収チップよりＭａｌｅ標識物を得た。Ｆｅｍａｌｅ反応物にも同様の操作をおこないＦｅｍａｌｅ標識物を得た。さらにヒトＣｏｔ−１−ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を５０μｌ加え、これらを混合し、混合精製物とした。
【００６６】
＜エタノール沈殿＞
上記の方法によって調製した混合精製物に対して、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を１２μＬ、−２０℃のエタノールを３２０μＬ添加し、ゆっくりと混合した後、−８０℃の冷凍庫中で１０分間静置した。次に、４℃に設定した遠心機中に試料をセットし、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心を行った。遠心終了後、沈殿物を除いた上澄みを取り除き、１０分間静置することで、沈殿物中に残存しているエタノールを蒸発させた。
【００６７】
＜試料の前処理＞
上記の試料にＭＭ＃１バッファー（デキストラン硫酸１  ｇ、ホルムアミド  ５ｍＬ、２０×ＳＳＣ  １ｍＬ）を６３μＬ添加し、そのまま３０分間静置することで沈殿物を溶媒に溶解しやすくした。３０分後、沈殿物の入ったマイクロチューブを攪拌し、沈殿物を完全に溶解させマイクロアレイ評価用液（比較試料１）を完成させた。
【００６８】
２．本発明試料の調製
比較試料と同様の操作にてＭａｌｅ反応物、Ｆｅｍａｌｅ反応物を調製し、各々を混合し、混合反応物とした。
＜混合反応物の精製＞
混合反応物５５．５μＬ、ヒトＣｏｔ−１−ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）５０μｌを１．７ｍＬ容マイクロチューブに入れた。ここに、７０％エタノール、０．５ＭＮａCｌ、５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを含む吸着液を３６０μＬ添加し、１５秒間攪拌、数秒のスピンダウンを行った後、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＳＰ  Ｋｉｔ付属のカートリッジＣＡＳに全量を添加した。ＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００にＣＡＳをセットし、１００００×ｇにて、１分間、室温で遠心した。ＣＡＳ通過液を捨て、ＣＡＳを再び廃液容器に取り付け、ＣＡＳに６０％エタノール、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含有する洗浄液を７５０μＬ添加した。ＭＸ−３００にＣＡＳをセットし、１００００×ｇにて、１分間、室温で遠心した。ＣＡＳ通過液を捨て、ＣＡＳを再び廃液容器に取り付け、ＣＡＳに６０％エタノール、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含有する洗浄液を７５０μＬ添加した。廃液容器を新しいマイクロチューブと交換し、ＣＡＳをこのマイクロチューブにセット後、ＭＭ＃１バッファー（デキストラン硫酸  １ｇ、ホルムアミド  ５ｍＬ、２０×ＳＳＣ  １ｍＬ）を６３μＬを添加し。２分間インキュベーションした後、ＭＸ−３００にＣＡＳをセットし、１００００×ｇにて、１分間、室温で遠心しマイクロアレイ評価用液（本発明試料１）を完成させた。
【００６９】
＜ＣＧＨマイクロアレイの前処理＞
ＣＧＨマイクロアレイは、ＢＡＣクローンから調製した遺伝子をＳＰＢＩＯ−２０００（日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社）を用いて、松浪ガラス製の基盤に３２個スポットした。なお、同一の遺伝子を２スポットずつスポットした。
マイクロアレイは、アミノ修飾オリゴＤＮＡ固定マイクロアレイスライド専用  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて、ブロッキング処理を行った。ブロッキング後、沸騰水にマイクロアレイを２分間浸し、ついで、−２０℃の７０％エタノール、−２０℃の８５％エタノール、−２０℃の１００％エタノールに浸し、スピンドライヤー−Ｍｉｎｉ  ＭＯＤＥＬ２３５０（和研薬株式会社）で１分間の遠心を行うことでマイクロアレイを乾燥させた。
【００７０】
＜ハイブリダイゼーション＞
＜試料の前処理＞で調製した試料溶液を７５℃で８分間熱処理を行った。４２℃で３０分以上プレインキュベーションした。このようにしてプレインキュベーションした２枚に対し、比較試料１及び本発明試料１を、それぞれ９０μＬ、ＣＧＨマイクロアレイ上に滴下し、その上にギャップカバーグラス（２４×５０ｍｍ）を載せた。
このスライドグラスと、スライドグラスの乾燥を防ぐために４ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を添加・含浸させたキムタオルとを、それらが互いに接触しないようにタイトボックスＮｏ．１に入れ、４２℃で２４時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００７１】
＜マイクロアレイの洗浄＞
ハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣの溶液にカバーグラスが外れるまで浸した。次に、カバーグラスが外れたスライドガラスを、５０ｍＬ容スミロンチューブ内の４０ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液の中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、１５分間洗浄を行った。次に、５０ｍＬ容スミロンチューブ内の４０ｍＬの２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液の中に入れ、５０℃で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らし、３０分間洗浄を行った。次に、５０ｍＬ容スミロンチューブ内の４０ｍＬのＰＮ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ８．０／０．１％ＮＰ−４０）溶液の中に入れ、室温で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らすことで１５分間洗浄を行った。次に、５０ｍＬ容スミロンチューブ内の４０ｍＬの２×ＳＳＣ溶液の中に入れ、室温で１分間に３０回転のスピードでステージを揺らすことで５分間洗浄を行った。洗浄後、スピンドライヤー−Ｍｉｎｉ  ＭＯＤＥＬ２３５０で１分間の遠心を行うことでマイクロアレイを乾燥させた。
【００７２】
＜データ取り込みとデータ処理＞  
乾燥させたマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングおよび解析を行った。データはノーマライズ処理を行い、ＬｏｇＲａｔｉｏ比をプロットした。
具体的には、ＬｏｇＲａｔｉｏ比は、スキャニングおよび解析で得られた、それぞれのスポットの蛍光値の比（Ｃｙ−３に由来する５３２ｎｍの蛍光強度、及びＣｙ−５に由来する６３５ｎｍの蛍光強度の比）から、Ｌｏｇ２（底を２とする対数値）を計算し、下記常染色体部のＬｏｇＲａｔｉｏ比の平均値が０となるようにノーマライズ処理を施した。
図１，２にそれらの結果を示した。●は常染色体に由来するＭａｌｅ、Ｆｅｍａｌｅに共通の遺伝子、■はＸ染色体に由来する遺伝子である。通常は、ＭａｌｅはＸ染色体を１本、ＦｅｍａｌｅはＸ染色体を２本有するため、常染色体由来のＬｏｇＲａｔｉｏ比に対し、Ｘ染色体由来のＬｏｇＲａｔｉｏ比は１に近いほど好ましい（理想に近い）ものとなる。図１及び図２に示したように、本発明である試料を用いると、比較試料よりも常染色体とＸとの差をはっきりと区別することが出来、より理想に近い値を示すことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】比較試料の液を用いたアレイＣＧＨ評価結果を示す図。
【図２】本発明試料の液を用いたアレイＣＧＨ評価結果を示す図。
【図１】
2009284784.tif 000004
【図２】
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