(57)【要約】      （修正有）【課題】in vitroにおいて血液中の白血球を捕捉する白血球除去材の白血球除去性能評価を行う際に、白血球の活性化の程度の違いによる個体差・日間差を最小限にし、評価を一定にする方法を提供する。【解決手段】白血球を活性化させる物質が添加された血液成分を白血球除去材に接触させて評価する白血球除去材の性能評価方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球を活性化させる物質が添加された血液成分を白血球除去材に接触させて評価することを特徴とする白血球除去材の性能評価法。
【請求項２】
血液成分と白血球除去材を撹拌しながら接触させることを特徴とする請求項１記載の白血球除去材の性能評価法。
【請求項３】
血液を白血球除去材に通過させて接触させることを特徴とする請求項１または２に記載の白血球除去材の性能評価法。
【請求項４】
白血球除去材が繊維であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の白血球除去材の性能評価法。
【請求項５】
活性化対象とする白血球が好中球および単球であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の白血球除去材の性能評価法。
【請求項６】
白血球を活性化させる物質がリポポリサッカライドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の白血球除去材の性能評価法。
【請求項７】
リポポリサッカライドの血中濃度が7〜70 EU/mLとなることを特徴とする請求項６に記載の白血球除去材の性能評価法。
【請求項８】
該血液がヒト血液であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の白血球除去材の性能評価法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中の白血球を捕捉する白血球除去材の性能評価方法に関する。詳しくは、白血球除去材の評価において、白血球を活性化させるために全血、赤血球、血小板濃厚液に活性化剤を添加することを特徴とする白血球除去材の性能評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、全身性エリトマトーデス、悪性関節リウマチ、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病等の自己免疫性疾患、白血病、癌、炎症性疾患などの治療、又は移植前の免疫抑制の目的で白血球を除去する技術が進歩してきている。これらの技術として様々な血液成分処理カラムが研究され、例えば白血球除去や顆粒球除去を目的としたカラム（特許文献１、２）、白血球と毒素を同時に吸着することを目的としたカラム（特許文献３）等がそれぞれ開発されてきた。これらは、通常、カラム内部にそれぞれ目的とする物質を除去・吸着するための濾過材または吸着担体を有している。これら濾過材または吸着担体としてはこれまで様々な物質、形状のものが用いられてきた。例えば、ポリエステル不織布からなる白血球除去担体（特許文献１）では、複数の繊維径からなる繊維を混合した不織布を作成し、血球の目詰まり解消のため改良が施されている。また、直径２ｍｍ程度の酢酸セルロースビーズからなる吸着担体（特許文献２）も開発されており、顆粒球を選択的に除去することが可能である。しかし、これらの除去材の白血球吸着性能をin vitroで評価する手法については、健常者ボランティア供血と容器内で単純に混合する方法（特許文献４）や入り口と出口を有するモジュール内に白血球除去フィルターを充填し健常者ボランティア供血を流す方法（特許文献５）などがあげられるが、いずれも健常者の血液をそのまま用いているため、患者の血液を反映しているとは言えず、また白血球の活性化の程度も個体差・日間差により変化し、評価が一定しない恐れがあった。
【特許文献１】特開昭６０−１９３４６８号公報
【特許文献２】特開平５−１６８７０６号公報
【特許文献３】特開２００２−１１３０９７号公報
【特許文献４】特開２００２−３２５８３６号公報
【特許文献５】特開２０００−１９７８１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、in vitroにおいて血液中の白血球を捕捉する白血球除去材の白血球除去性能評価を行う際に、白血球の活性化の程度の違いによる個体差・日間差を最小限にし、評価を一定にする方法を実現させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
１．白血球を活性化させる物質が添加された血液成分を白血球除去材に接触させて評価することを特徴とする白血球除去材の性能評価法。
２．血液成分と白血球除去材を撹拌しながら接触させることを特徴とする前記１記載の白血球除去材の性能評価法。
３．血液を白血球除去材に通過させて接触させることを特徴とする前記１または２に記載の白血球除去材の性能評価法。
４．白血球除去材が繊維であることを特徴とする前記１〜３のいずれかに記載の白血球除去材の性能評価法。
５．活性化対象とする白血球が好中球および単球であることを特徴とする前記１〜４のいずれかに記載の白血球除去材の性能評価法
６．白血球を活性化させる物質がリポポリサッカライドであることを特徴とする前記１〜５のいずれかに記載の白血球除去材の性能評価法。
７．リポポリサッカライドの血中濃度が7〜70 EU/mLとなることを特徴とする前記６に記載の白血球除去材の性能評価法。
８．該血液がヒト血液であることを特徴とする前記１〜７のいずれかに記載の白血球除去材の性能評価法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、in vitroにおいて血液中の白血球を捕捉する白血球除去材の白血球除去性能評価を行う際に、健常者ボランティア供血を用いた場合であっても、個体差・日間差を最小限に留めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明でいう白血球除去材とは、血液成分から炎症に直接関与していると考えられる白血球を吸着または除去可能な材料である。また、本発明における血液成分とは、白血球が血清、血漿、培地、緩衝液等に分散した液をさす。
【０００７】
本発明でいう「白血球除去材の性能評価」の「性能」とは、白血球除去材が血液成分から白血球をどの程度除去できるかを示す能力である。具体的には下記のように白血球除去率で示すことができる。
白血球除去率（%）＝｛（除去材接触前の血液成分中白血球数）−（除去材接触後の血液成分中白血球数）｝／（除去材接触前の血液成分中白血球数）×100
本発明で用いる白血球除去材の材質としては、血球にダメージを与えにくいものであれば特に限定はなく各種のものを用いることができ、有機高分子化合物、無機高分子化合物、金属等を用いることができる。その中でも有機高分子化合物は、切断等の加工性に優れるため好ましい素材である。有機高分子化合物の例としてはポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ナイロン６やナイロン６６等のポリアミド、ポリオレフィン、ポリエステルなどが挙げられる。ここでいうポリオレフィンとは、アルケン又はアルキンを単独重合又は共重合させて得られたポリマーを言う。ポリオレフィンの例としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン等の単独重合により得られたポリオレフィン、又はポリプロピレン−ポリエチレン共重合体、ポリブチレン−ポリプロピレン共重合体等の共重合により得られたポリオレフィンが挙げられる。ポリエステルの例としてはポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート及びポリオキシエチレンテレフタレートが挙げられる。中でも、本発明に係る白血球除去材は繊維であることが好ましいので、不織布への成型性や目的とする繊維径を有する繊維となるような加工のしやすさという観点からポリエチレンテレフタレートが好ましい。また上記高分子化合物の単量体からの単独重合体、共重合体、ブロック重合体及び上記高分子化合物のブレンド及びアロイ化したものを含むものや、セルロースもしくはその誘導体又はこれら両方の化合物等の再生繊維及び上記に示した合成高分子化合物とのブレンド、アロイ化したものを含むものなども挙げられるが、オートクレーブにおける耐熱性および不織布作製における形状の制御性という点からポリプロピレン又はポリプロピレン−ポリエチレン共重合体等が好ましい。また本発明でいう白血球除去材は炎症性疾患処置用に用いることも想定しており、この場合、白血球以外にも炎症に作用していると考えられる低分子化合物を同時に除去する機能を付与する目的で、表面を認識分子を化学的に修飾したものであってもよい。この場合は、繊維としては修飾のしやすいポリスチレンが好ましく、さらに繊維の強度を上げるためにはポリプロピレン-ポリスチレンの芯鞘構造の繊維であることが好ましい。更に、除去材が不織布の場合、不織布の形状を保持するために、吸着には関与しないポリプロピレン製などの骨格材繊維を入れてもよい。
【０００８】
本発明に用いる白血球除去材の形状としては、天然繊維、ガラス繊維、織布、編布、不織布、三次元網目状連続組織を有するスポンジ状構造物、多孔質体等が挙げられる。好ましくは、良好な表面積が得られることより不織布及び多孔質体が挙げられるが、これに限定されるものではない。なお、ここで不織布とは、編織によらずに繊維或いは繊維の集合体が結合された布状のものである。
【０００９】
本発明中における白血球の活性化とは、主に白血球の組織への遊走、異物への接着・貪食の能力が上昇する現象を指すものである。活性化させる白血球は好中球および単球であることが好ましい。これは白血球除去療法において考えられる炎症性疾患では、炎症の要因となる白血球は主に好中球と単球と考えられるためである。白血球を活性化させる物質としてはfMLP(N−formyl−Methionyl−Leuxyl−Phenylalanine)、LPS（Lipopolysaccharide、リポポリサッカライド）、TNF-α（Tumor Necrosis factor-α）、IL-1（Interleukin-1）、G-CSF（Granulocyte-Colony Stimulating Factor）、GM-CSF（Granulocyte Macrophage - Colony Stimulating Factor）、IL-8（Interleukin-8）、C5aなどが挙げられるが、本発明において除去されるべき白血球は炎症性疾患の病態に近いものであることが好ましいことを考慮すれば、LPSを用いることが最もよいと考えられる。これは、LPSは分子中のリピドA部分の強い炎症性および免疫賦活特性のために、非常に劇的な生物学的作用を有しているため、概してグラム陰性菌感染および他の病気の病因に大いに寄与すると考えられているためである。従って、LPSを健常人血液に添加することで血液を炎症性疾患患者のものに近づけることができる。
【００１０】
白血球を活性化させる物質がLPSである場合、血中濃度は7 EU/mL以上70 EU/mL以下であればよい。これは後の実施例からわかるように、濃度が小さければ充分な活性化が期待できず、白血球除去率の個体差・日間差のバラつきが大きいと考えられるためである。また、活性化の程度およびコストを考慮すれば70 EU/mL以下で充分であると考えられる。従ってLPSの血中濃度は7〜70 EU/mLがよい。
【００１１】
白血球を活性化させる物質を添加したのち、30分以上経過した後に評価することが好ましい。これは白血球が充分活性化するまでは時間を要するためであり、30分で充分活性化すると考えられるためである。
【００１２】
白血球除去性能評価の方法は特に限定しないため、簡便な方法としてはバッチ吸着法が考えられる。即ち、血液を入れて転倒混和させても血液がこぼれないような容器に対象の白血球除去材と血液を入れ、ローテーター等を用いて容器を回転させることによって転倒混和し、白血球除去材と血液を比較的穏やかに接触させる方法である。これをサンプル液とする。この場合、血液だけを容器にいれ同様の転倒混和をさせたものをコントロール液とし、以下の式から吸着率を算出する。
顆粒球吸着率（%）＝｛（コントロール液中の顆粒球数）−（サンプル液中の顆粒球数）｝／（コントロール液中の顆粒球数）×100
単球吸着率（%）＝｛（コントロール液中の単球数）−（サンプル液中の単球数）｝／（コントロール液中の単球数）×100
リンパ球吸着率（%）＝｛（コントロール液中のリンパ球数）−（サンプル液中のリンパ球数）｝／（コントロール液中のリンパ球数）×100
また実際に用いる形態を考慮した評価方法として、白血球除去材を容器に充填したカラムに血液を通液させて接触させる方法も考えられる。即ち、入口と出口を有した容器に白血球除去材を充填し、血液を入口から流入させ出口から流出させる方法である。その後以下の式から通液前の白血球数と通液後の白血球数から吸着率を算出することが出来る。
顆粒球吸着率（%）＝｛（通液前液中の顆粒球数）−（通液後液中の顆粒球数）｝／（通液前液中の顆粒球数）×100
単球吸着率（%）＝｛（通液前液中の単球数）−（通液後液中の単球数）｝／（通液前液中の単球数）×100
リンパ球吸着率（%）＝｛（通液前液中のリンパ球数）−（通液後液中のリンパ球数）｝／（通液前液中のリンパ球数）
×100
【実施例】
【００１３】
以下、実験例により本発明をさらに具体的に説明するが、発明の内容が実施例に限定されるものではない。
36島の海島複合繊維であって、島が更に芯鞘複合によりなるものを次の成分を用いて、紡糸速度800 m/min、延伸倍率3倍の製糸条件で得た。
【００１４】
島の芯成分；ポリプロピレン
島の鞘成分；ポリスチレン90wt%、ポリプロピレン10wt%
海成分；エチレンテレフタレート単位を主たる繰り返し単位とし、共重合成分として５−ナトリウムスルホイソフタル酸3wt%含む共重合ポリエステル
複合比率（重量比率）；芯：鞘：海＝45：40：15
この繊維85 wt%と直径20 μmのポリプロピレン繊維15 wt%からなる不織布を作製した後、この不織布2枚の間にシート状のポリプロピレン製ネット（厚み0.5 mm、単糸径0.3 mm、開口部2 mm角）を挟み、ニードルパンチすることによって3層構造の担体を得た。次に、この不織布を95 ℃、3 wt%の水酸化ナトリウム水溶液で処理し、海成分の「エチレンテレフタレート単位を主たる繰り返し単位とし、共重合成分として５−ナトリウムスルホイソフタル酸3wt%含む共重合ポリエステル」を溶解することによって、芯鞘繊維の直径が5 μmで、嵩密度が0.02 g/cm3の不織布を作製した。
【００１５】
次に、ニトロベンゼン46wt%、硫酸46wt%、パラホルムアルデヒド1wt%、Ｎ−メチロール−α−クロルアセトアミド（以下、NMCAと略す）7 wt%を10℃以下で混合、撹拌、溶解しNMCA化反応液を調製した。このNMCA化反応液を15℃にし、不織布1 gに対し、約40 mLの固液比でNMCA化反応液を加え、水浴中で反応液を15〜20℃に保ったまま2時間反応させた。その後、反応液から不織布を取り出し、NMCA反応液と同量のニトロベンゼンに浸漬し洗浄した。続いて不織布を取り出し、メタノールに浸漬し洗浄を行い、α−クロルアセトアミドメチル化ポリスチレン不織布（中間体１）を得た。また、テトラエチレンペンタミン6.3 g、ｎ−ブチルアミン7.2 gをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）500 mLに溶解した液に、10 gの中間体１を浸し、反応は30℃で3時間行い、DMFで洗浄した後で水洗し、真空乾燥することにより、中間体１から13.9 gのテトラエチレンペンタミン化繊維（以下、吸着体）を得た。
（血球数の測定）
血液中の血球数の測定は、多項目自動血球分析装置XT-1800i（シスメックス株式会社）を用いて行った。ここで、顆粒球数は、好中球数を以て計算した。白血球吸着率は以下の式により算出した。
顆粒球吸着率（%）＝｛（吸着前液中の顆粒球数）−（回収液中の顆粒球数）｝／（吸着前液中の顆粒球数）×100
単球吸着率（%）＝｛（吸着前液中の単球数）−（回収液中の単球数）｝／（吸着前液中の単球数）×100
リンパ球吸着率（%）＝｛（吸着前液中のリンパ球数）−（回収液中のリンパ球数）｝／（吸着前液中のリンパ球数）×100
（実施例１）
上下に血液の出入り口のある円筒状カラム（内径1 cm、高さ1.2 cm）に、吸着体を直径1 cmの円板状に切り抜き積層して充填した（2 mm/枚、6枚積層）。このカラムに37℃で1時間、ヘパリン採血（ヘパリン濃度：30単位/mL、LPS：70 EU/mL）した健常者ボランティアの血液を1.33 mL/minの流量で下から上の向きに室温で通過させた。以後1分ずつ血液を5分まで5回に分けて採取し、血球計算機でそれぞれの血液に残存する白血球数を測定した。除去率は5分までの平均値で表わした。実験は別々の日に計4回行い、各実験ごとに別々の健常者ボランティア血液を用いた。結果を表１に示す。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
表１から、LPSを添加すれば標準偏差がいずれも小さく、個体差の影響を殆ど受けないことがわかる。
（比較例１）
上下に血液の出入り口のある円筒状カラム（内径1 cm、高さ1.2 cm）に、吸着体を直径1 cmの円板状に切り抜き積層して充填した（2 mm/枚、6枚積層）。このカラムに37℃で1時間、ヘパリン採血（ヘパリン濃度：30単位/mL 、LPS：添加せず）した健常者ボランティアの血液を1.33 mL/minの流量で下から上の向きに室温で通過させた。以後1分ずつ血液を5分まで5回に分けて採取し、血球計算機でそれぞれの血液に残存する白血球数を測定した。除去率は5分までの平均値で表わした。実験は別々の日に計4回行い、各実験ごとに別々の健常者ボランティア血液を用いた。結果を表２に示す。
【００１８】
【表２】
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【００１９】
表２から、健常者ボランティア血液をそのまま用いた場合、標準偏差がいずれも大きく、個体差の影響を大きく受けているがわかる。
（実施例２）
上下に血液の出入り口のある円筒状カラム（内径1 cm、高さ1.2 cm）に、吸着体を直径1 cmの円板状に切り抜き積層して充填した（2 mm/枚、7枚積層）。このカラムに37℃で1時間、ヘパリン採血（ヘパリン濃度：30単位/mL、LPS：0、7、70、7000 EU/mL）した健常者ボランティアの血液を1.33 mL/minの流量で下から上の向きに室温で通過させた。以後0.5分ずつ血液を4.5分まで採取し、血球計算機でそれぞれの血液に残存する白血球数を測定した。除去率は4.5分までの平均値で表わした。実験は1人の健常者ボランティア血液を用い、4種類の濃度とも同時におこなった。結果を表３、図１に示す。
【００２０】
【表３】
2009233097.tif 000005
【００２１】
表３、図１から、LPS血中濃度は7 EU/mL以上であれば安定した評価が可能であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】LPS血中濃度と白血球除去率の関係
【図１】
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