(57)【要約】【課題】化学的に細胞融合を行う細胞を融合容器内の微細孔に固定したまま細胞融合液の置換を行い、簡便かつ迅速に融合再生確率を高めるような細胞の処理を可能にする細胞融合装置及び、細胞融合方法を提供する。【解決の手段】細胞融合液導入口及び細胞融合液排出口を備え、細胞融合領域に対向して配置される導電部材からなる一対の電極と、前記一対の電極間に平板状のスペーサーを介して配置され、かつ前記対向して配置された電極の方向に貫通した複数の微細孔を有した平板状の絶縁体からなり、前記絶縁体が前記電極の内いずれか一方の電極の細胞融合領域側の電極面上に配置されている細胞融合容器と、前記一対の電極に交流電圧を印加する交流電源及び、３以上の細胞融合液を切替えて導入する細胞融合液導入切替え機構を有することを特徴とする細胞融合装置及びそれを用いた細胞融合方法を用いる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞融合液導入口及び細胞融合液排出口を備え、細胞融合領域に対向して配置される導電部材からなる一対の電極と、前記一対の電極間に平板状のスペーサーを介して配置され、かつ前記対向して配置された電極の方向に貫通した複数の微細孔を有した平板状の絶縁体からなり、前記絶縁体が前記電極の内いずれか一方の電極の細胞融合領域側の電極面上に配置されている細胞融合容器と、前記一対の電極に交流電圧を印加する交流電源及び、３以上の細胞融合液を切替えて導入する細胞融合液導入切替え機構を有することを特徴とする細胞融合装置。
【請求項２】
前記細胞融合装置を用いて第１の細胞と第２の細胞とを細胞融合領域において融合する際、前記細胞融合領域に前記第１の細胞が入った細胞融合液を導入し、前記交流電圧を印加して前記微細孔内に前記第１の細胞を固定した後、前記細胞融合領域に前記第２の細胞が入った細胞融合液を導入し、前記交流電圧を印加して前記第１の細胞に前記第２の細胞を前記微細孔の位置において接触させ、前記第１の細胞と前記第２の細胞とを化学的に細胞を融合する細胞融合方法であって、前記細胞融合液導入切替え手段を用いて細胞融合処理液が入った細胞融合液を導入する時期を、前記第２の細胞の導入前、前記細胞融合の前および前記細胞融合の後、の少なくとも一の時期とする、細胞融合方法。
【請求項３】
前記細胞融合処理液が入った細胞融合液が２以上であって、前記２以上の細胞融合処理液が入った細胞融合液が全て同じまたは一部異なるまたは全て異なる、のいずれかの細胞融合処理液が入った細胞融合液である、請求項２に記載の細胞融合方法。
【請求項４】
細胞を、細胞膜の流動性を高める物質を加えた細胞融合液に入れて化学的に細胞融合を行うことを特徴とする請求項２〜３のいずれかに記載の細胞融合方法。
【請求項５】
前記細胞膜の流動性を高める物質が、ポリエチレングリコールである、請求項４に記載の細胞融合方法。
【請求項６】
前記細胞融合処理液が入った細胞融合液が特定の成分を含む溶液であり、前記細胞融合処理液が入った細胞融合液の導入により、前記細胞融合領域の細胞融合液中に前記特定の成分を導入する、請求項２〜５のいずれかに記載の細胞融合方法。
【請求項７】
前記細胞融合処理液が入った細胞融合液により、前記細胞融合領域の細胞融合液中の特定の成分を除去する、請求項２〜６のいずれかに記載の細胞融合方法。
【請求項８】
前記特定の成分が、細胞膜の流動性を高める物質である、請求項６または７のいずれかに記載の細胞融合方法。
【請求項９】
前記細胞膜の流動性を高める物質が、ポリエチレングリコールである、請求項８に記載の細胞融合方法。
【請求項１０】
前記特定の成分が酵素である、請求項６〜９のいずれかに記載の細胞融合方法。
【請求項１１】
前記酵素が、シアル酸分解酵素またはプロテアーゼである、請求項１０に記載の細胞融合方法。
【請求項１２】
前記特定の成分がカルシウムイオンである、請求項６〜１１のいずれかに記載の細胞融合方法。
【請求項１３】
前記特定の成分が融合再生確率を高める添加剤である、請求項６〜１２のいずれかに記載の細胞融合方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞融合を効率的に行うための細胞融合装置とそれを用いた細胞融合方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、異なる細胞同士を融合させ１つの交雑細胞とする細胞融合技術として、主にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる化学的細胞融合法（ＰＥＧ法）が用いられているが、この方法では（ｉ）ＰＥＧは細胞に対して強い毒性を持っている、（ｉｉ）融合するにあたりＰＥＧの重合度、添加量などの最適な諸条件を見出すのに手間がかかる、（ｉｉｉ）融合に際して高度な技術が要求され、特定の技術に習熟した人にしか使えない、（ｉｖ）２細胞の接触は偶発的であり、２細胞一対での細胞融合の制御が困難なため融合再生確率が極めて低い、等の解決すべき課題があった。
【０００３】
上記課題を解決するために、ＰＥＧを用いる化学的細胞融合法と、電圧を印加することで細胞を数珠状に整列させて融合させる電気的細胞融合法を組み合わせた方法が報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献４参照）。電気的細胞融合法は、高度な技術が不要で、簡単に効率よく融合させることができ、細胞に与える毒性がなく、高活性をもったままの状態で細胞を融合させることができるという利点がある。
【０００４】
電気的細胞融合法は、１９８１年西ドイツのＺｉｍｍｅｒｍａｎｎが確立したものであり、その原理は次の通りである。すなわち、平行電極間に交流電圧を印加し、そこに細胞を導入すると、細胞は電流密度の高い方へ引き寄せられ数珠状にならぶ。なお、細胞が数珠状にならんだ状態を一般にパールチェーンと呼ぶ。この状態で数μｓｅｃ〜数十μｓｅｃ単位の直流パルス電圧を電極間に印加することにより細胞膜の電気伝導度が瞬間的に低下し、脂質二重層により構成される細胞膜の可逆的乱れとその再構成が行われ、その結果、細胞融合が起こる。
【０００５】
上記の電気的細胞融合法には、主に微小電極法と平行電極法が用いられている。このうち微小電極法は、２細胞一対の細胞融合を顕微鏡で見ながらマイクロマニュピレーターで細胞を拾い集めては直流パルス電圧を印加する方法であり、極めて融合再生確率が高く、微小電極法に用いる電極の例も報告されている（例えば、特許文献２、非特許文献５参照）。しかしながらこの方法は手間のかかる方法であり、その操作は熟練を要す上、大量の細胞を扱う上では実用的とはいえなかった。また平行電極法は、誘電泳動により複数の細胞を数珠状に配列形成させた後、直流パルス電圧を印加することによって細胞融合させる方法であり、その取り扱いは簡単であるが、数珠状になった複数の細胞が細胞融合するためＰＥＧ法と同様に２細胞の接触は偶発的であり、２細胞一対での細胞融合の確実な制御が難しいという課題があった。
【０００６】
また、特許文献１に記載された方法では、細胞を入れたＰＥＧの溶媒を電極間に導入し、電極間に交流電圧を印加し細胞を数珠状にならべることで、細胞を秩序よく配列させることを試みている。しかしながら、細胞は数珠状に連なるものの、その順番を制御することができないため、化学的細胞融合法を単独で用いた場合よりは改善されるものの、依然として２細胞の接触は偶発的であり、２細胞１対での細胞融合の確実な制御が難しいという課題があり、さらなる改善が望まれていた。
【０００７】
また、本質的に細胞に対して強い毒性をもつＰＥＧに細胞が１０分程度（細胞融合時に約５分、遠心分離時に約５分）の時間接するため、細胞の死滅や活性の低下が著しく、融合再生確率が低い（一般に、０．０２％程度）という課題があった。
【０００８】
また、上記化学的細胞融合法、電気的細胞融合法、及び化学的細胞融合法と電気的細胞融合法を組み合わせた方法とも、２種類の細胞を同一成分の細胞融合液内で非特異的に混合して細胞融合を行うため、融合操作中に細胞融合液の成分を目的に応じてコントロールすることは不可能であった。従って、融合再生確率を高めるための幾つかの試みは、常に細胞融合とは別の細胞前処理操作を必要とし、また、細胞融合後の煩雑な洗浄操作を伴いうため、操作が煩雑な上、必要以上に細胞の処理時間が長くなり細胞の活性が低下したり、細胞を損失したりするという課題があった。
【０００９】
例えば、融合再生確率を高める方法として、電気的細胞融合法に用いる細胞融合液中のＣａ濃度を高める事で融合再生確率を向上させた事例が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。一般的に、Ｃａには細胞膜修復作用があるといわれており、Ｃａ濃度を高めて細胞融合する事で融合再生確率が向上する可能性がある。しかしながら、従来の化学的細胞融合法では２種類の細胞を同一の成分の溶液の中で混合状態として細胞融合を行うため、融合再生確率を高めるのに効果的なＣａ濃度のコントロールが難しく、Ｃａ濃度を高めた場合、Ｃａの細胞膜修復作用により融合再生確率が向上する効果もあるが、細胞融合前に細胞同士が凝集を起こし、細胞融合に関与できない細胞が増大するため、結果として融合再生確率が低下してしまうという課題があった。
【００１０】
また別の融合再生確率を高める方法として、細胞融合前にシアル酸分解酵素で細胞を処理することで細胞膜上のシアル酸を分解し、細胞を正の電荷に帯電させることによって細胞融合させる細胞同士の密着度を高め、融合再生確率を向上させた事例が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。しかしこの場合、シアル酸分解反応中に細胞の死滅が起きる他、シアル酸分解処理を行った細胞同士が凝集することで、細胞融合に寄与する細胞数が減少し、結果として融合再生確率が低下してしまうという課題があった。
【００１１】
また別の融合再生確率を高める方法として、細胞融合前にプロテアーゼなどの酵素で細胞を処理することで細胞膜上のタンパクを分解し、融合再生確率を向上させた事例が報告されている（例えば、非特許文献３参照）。しかしこの場合も、酵素処理の過程において細胞の凝集や死滅、あるいは細胞の容器への付着が発生し、細胞融合時に処理可能な細胞数が著しく減少するため、結果として融合再生確率が低下してしまうという課題があった。また、細胞融合前または細胞融合後にこれらの酵素成分を除去する煩雑な細胞洗浄操作が必要であった。
【００１２】
以上のように従来の化学的細胞融合法、電気的細胞融合法、及び化学的細胞融合法と電気的細胞融合法を組み合わせた方法とも、融合再生確率を高めるための細胞の前処理や細胞融合後の融合促進剤の除去操作自体がそれぞれ細胞の死滅を引き起こし、結果として得られる融合細胞が少なくなり、よって融合再生確率がむしろ悪くなるという課題があった。
【００１３】
【特許文献１】特開昭６０−９４９０号公報
【特許文献２】特公平７−４０９１４号公報
【非特許文献１】Ｏｈｎｉｓｈｉ，  Ｋ．，  Ｃｈｉｂａ，  Ｊ．，  Ｇｏｔｏ，  Ｙ．，  Ｔｏｋｕｎａｇａ，  Ｔ．，  「Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．」  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．，  １００巻，  ｐ．１８１−１８９，  １９８７年
【非特許文献２】Ｉｇａｒａｓｈｉ，  Ｍ．，  Ｂａｎｄｏ，  Ｙ．，  「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．」  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．，  １３５巻，  ｐ．９１−９３，  １９９０年
【非特許文献３】Ｏｈｎｏ−Ｓｈｏｓａｋｕ，  Ｔ．，  Ｏｋａｄａ，  Ｙ．，  「Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．」  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １２０巻，  ｐ．１３８−１４３，  １９８４年
【非特許文献４】Ｓｔｏｉｃｈｅｖａ，  ＮＧ．，  Ｈｕｉ，  ＳＷ．，  「Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ．」  Ｊ．  Ｍｅｍｂｒ．  Ｂｉｏｌ．，  １４１巻，  ｐ．１７７−１８２，  １９９４年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、かかる従来の実状に鑑みて提案されたものであり、化学的に細胞融合を行う細胞を融合容器内の微細孔に固定したまま細胞融合液の置換を行い、簡便かつ迅速に融合再生確率を高めるような細胞の処理を可能にする細胞融合装置及び、細胞融合方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は上記課題を解決する手段として、細胞融合液導入口及び細胞融合液排出口を備え、細胞融合領域に対向して配置される導電部材からなる一対の電極と、前記一対の電極間に平板状のスペーサーを介して配置され、かつ前記対向して配置された電極の方向に貫通した複数の微細孔を有した平板状の絶縁体からなり、前記絶縁体が前記電極の内いずれか一方の電極の細胞融合領域側の電極面上に配置されている細胞融合容器と、前記一対の電極に交流電圧を印加する交流電源及び、３以上の細胞融合液を切替えて導入する細胞融合液導入切替え機構を有する細胞融合装置を用い、前記細胞融合装置を用いて第１の細胞と第２の細胞とを細胞融合領域において融合する際、前記細胞融合領域に前記第１の細胞が入った細胞融合液を導入し、前記交流電圧を印加して前記微細孔内に前記第１の細胞を固定した後、前記細胞融合領域に前記第２の細胞が入った細胞融合液を導入し、前記交流電圧を印加して前記第１の細胞に前記第２の細胞を前記微細孔の位置において接触させ、前記第１の細胞と前記第２の細胞とを化学的に細胞を融合する細胞融合方法であって、前記細胞融合液導入切替え手段を用いて細胞融合処理液が入った細胞融合液を導入する時期を、前記第２の細胞の導入前、前記細胞融合の前および前記細胞融合の後、の少なくとも一の時期とする、細胞融合方法を用い、これらにより、上記の従来技術の課題を解決することができることを見出し、遂に本発明を完成するに至った。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明の細胞融合装置は、細胞融合液導入口及び細胞融合液排出口を備え、細胞融合領域に対向して配置される導電部材からなる一対の電極と、前記一対の電極間に平板状のスペーサーを介して配置され、かつ前記対向して配置された電極の方向に貫通した複数の微細孔を有した平板状の絶縁体からなり、前記絶縁体が前記電極の内いずれか一方の電極の細胞融合領域側の電極面上に配置されている細胞融合容器と、前記一対の電極に交流電圧を印加する交流電源及び、３以上の細胞融合液を切替えて導入する細胞融合液導入切替え機構を有する。
【００１７】
また本発明の細胞融合方法は、上記細胞融合装置を用いて第１の細胞と第２の細胞とを細胞融合領域において融合する際、前記細胞融合領域に前記第１の細胞が入った細胞融合液を導入し、前記交流電圧を印加して前記微細孔内に前記第１の細胞を固定した後、前記細胞融合領域に前記第２の細胞が入った細胞融合液を導入し、前記交流電圧を印加して前記第１の細胞に前記第２の細胞を前記微細孔の位置において接触させ、前記第１の細胞と前記第２の細胞とを化学的に細胞を融合する細胞融合方法であって、前記細胞融合液導入切替え手段を用いて細胞融合処理液が入った細胞融合液を導入する時期を、前記第２の細胞の導入前、前記細胞融合の前および前記細胞融合の後、の少なくとも一の時期とする、細胞融合方法である。
【００１８】
また、前記細胞融合処理液が入った細胞融合液が２以上であって、前記２以上の細胞融合処理液が入った細胞融合液が全て同じまたは一部異なるまたは全て異なる、のいずれかの細胞融合処理液が入った細胞融合液である、細胞融合方法である。
【００１９】
ここで、化学的に細胞を融合するとは、ポリエチレングリコールのような細胞膜の流動性を高める化学物質を加えた懸濁液に細胞を入れて融合させることを意味し、一般に、細胞膜の流動性が高まった状態で細胞が接触すると膜融合が容易に生じることを利用した細胞融合の一つである。よって、本発明の細胞融合方法は、細胞を、細胞膜の流動性を高める物質を加えた細胞融合液に入れて化学的に細胞融合を行う細胞融合方法であって、上記の細胞膜の流動性を高める物質が、ポリエチレングリコールである、細胞融合方法である。
【００２０】
また本発明の細胞融合方法は、上記の細胞融合処理液が入った細胞融合液が特定の成分を含む溶液であり、細胞融合処理液が入った細胞融合液の導入により、細胞融合領域の細胞融合液中に特定の成分を導入する、細胞融合方法である。
【００２１】
また本発明の細胞融合方法は、上記の細胞融合処理液が入った細胞融合液により、細胞融合領域の細胞融合液中の特定の成分を除去する、細胞融合方法である。
【００２２】
また本発明の細胞融合方法は、上記の特定の成分が、細胞膜の流動性を高める物質であり、また、細胞膜の流動性を高める物質が、ポリエチレングリコールである、細胞融合方法である。
【００２３】
また本発明の細胞融合方法は、上記の特定の成分が酵素であり、当該酵素が、シアル酸分解酵素またはプロテアーゼである、細胞融合方法である。
【００２４】
また本発明の細胞融合方法は、上記の前記特定の成分がカルシウムイオンである、細胞融合方法である。
【００２５】
また本発明の細胞融合方法は、上記の添加剤が融合再生確率を高める添加剤であり、前記添加剤が、カルシウム塩、マグネシウム塩、アミノ酸、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖、フィコール、カルモジュリン、セリシン、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、サイトカイン、リポポリサッカライド、コレステロール、カテキン、血清、ホルモン、動物細胞培養用培地由来の成分の内、少なくともいずれか一つを含む添加剤であることを特徴とする細胞融合方法である。
【００２６】
以下に、図を用いて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２７】
本発明の細胞融合装置は、細胞融合液導入口及び細胞融合液排出口を備え、細胞融合領域に対向して配置される導電部材からなる一対の電極と、前記一対の電極間に平板状のスペーサーを介して配置され、かつ前記対向して配置された電極の方向に貫通した複数の微細孔を有した平板状の絶縁体からなり、前記絶縁体が前記電極の内いずれか一方の電極の細胞融合領域側の電極面上に配置されている細胞融合容器と、前記一対の電極に交流電圧を印加する交流電源及び、３以上の細胞融合液を切替えて導入する細胞融合液導入切替え機構を有する。
【００２８】
ここで、本発明の特徴を説明するために、本発明の細胞融合装置を用いた基本的な細胞融合方法の概略、すなわち２つの細胞を細胞融合領域に導入して細胞融合する方法を図１〜図３を用いて説明する。なおここでの説明は、本発明の基本動作を簡単に説明するために、細胞融合処理液が入った細胞融合液を導入する工程は省略しており、本発明特有の細胞融合方法である、前記細胞融合液導入切替え機構を用いて、細胞融合処理液が入った細胞融合液を導入する時期を、第２の細胞の導入前、細胞融合の前および細胞融合の後、の少なくとも一の時期とする方法についても後述する。
【００２９】
本発明の細胞融合方法の手順を図１、図２、図３の順に示す。
【００３０】
図１に示すように、最初に第１の細胞（１８）の入った細胞融合液を細胞融合領域（１）に入れ交流電源（５）に接続する。このとき第１の細胞は、絶縁体（８）に形成された微細孔（９）に向かって移動し固定される。この第１の細胞が微細孔に向かって動くときに作用する力を誘電泳動力（１０）という。図１に示すように誘電泳動力とは、電極間に特定の周波数の交流電圧を印加したとき、上部電極（１４）と微細孔（９）で覆われた下部電極（１５）のように、電気力線（１２）の集中部位があると、その電気力線の集中部位（１２）の方向（すなわち、微細孔の方向）に向かって細胞等の誘電体粒子を動かす力である。一般に誘電泳動力は、誘電体粒子の体積、誘電体粒子の誘電率と溶液の誘電率の差、印加電圧の２乗に比例する。次に、交流電圧を印加したまま誘電泳動力を作用させ続けて微細孔に第１の細胞を固定したまま、第２の細胞（２２）の入った細胞融合液を細胞融合領域に入れる。このとき、図２に示すように第２の細胞は誘電泳動力により第１の細胞の上に固定される。このとき、細胞融合液にポリエチレングリコールのような細胞膜の流動性を高める成分を入れておくと、図３に示すように、第１の細胞及び第２の細胞の接触点で細胞膜が接触し細胞融合が起こり、第１の細胞と第２の細胞との細胞融合が生じて融合細胞（３２）が生成される。このようにすることで、微細孔の位置で第１の細胞と第２の細胞を接触させ、従来の化学的細胞融合法より高い融合再生確率で細胞融合させることができる。この場合、理想的には、１つの第１の細胞に対し１つの第２の細胞が接触して融合した方が高い融合再生確率を得られる。すなわち、１つの微細孔に１つの第１の細胞が固定され、更にその上に１つの第２の細胞が固定された方が高い融合再生確率を得ることができる。
【００３１】
次に、本発明の細胞融合装置の構成について、図を用いて詳しく説明する。
【００３２】
図４は本発明の細胞融合装置の概念図を示した図である。本発明の細胞融合装置は、細胞融合容器（１３）と交流電源（５）、細胞融合液導入切替え手段（１７）で構成されている。
【００３３】
細胞融合容器は、図４に示すように上部電極（１４）と下部電極（１５）の間に、スペーサー（１６）を配置することで細胞融合領域（１）を確保し、微細孔（９）を形成した絶縁体（８）を下部電極の細胞融合領域側に配置した構造を有する。
【００３４】
上部電極と下部電極の材質は導電部材であって化学的に安定な部材であれば特に制限はなく、白金、金、銅などの金属やステンレスなどの合金及び、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ  Ｔｉｎ  Ｏｘｉｄｅ：酸化インジウムスズ）等の透明導電性材料を成膜したガラス基板などでもよいが、細胞融合を観察するには、ＩＴＯなどの透明導電性材料を成膜したガラス基板を電極として用いることが好ましい。上部電極と下部電極の面積等の寸法には特に制限はないが、取り扱いやすいサイズとして、例えば、縦７０ｍｍ×横４０ｍｍ×厚さ１ｍｍ程度のサイズが好ましい。細胞融合容器の上部電極と下部電極には導電線（３）を介して交流電源（５）が接続されている。
【００３５】
スペーサーは、上部電極と下部電極が直接接触しないように設けられ、かつ細胞融合容器に細胞融合液を入れておくスペースを確保するための細胞融合領域を形成する貫通孔を有しているものであり、その材質は絶縁材料であればよく、例えばガラス、セラミック、樹脂等が挙げられる。またスペーサーには、細胞融合容器に細胞を導入、排出するため、細胞を導入する導入流路（２９）及びそれに連通する導入口（１９）と、細胞を排出する排出流路（３０）及びそれに連通する排出口（２０）が設けられている。
【００３６】
また、図４に示す細胞融合容器の導入口には、細胞融合液導入流路（２）を介して細胞融合液導入切替え手段（１７）が接続され、細胞融合液導入切替え手段に、シリンジＡ（４）、シリンジＢ（６）、シリンジＣ（７）、シリンジＤ（３４）が接続されている。ここで、細胞融合液導入切替え手段は、シリンジＡ、シリンジＢ、シリンジＣ、シリンジＤのうちどれか一つのシリンジを選んで、シリンジを細胞融合液導入流路に接続することができればよく、一般的なバルブ（２１）で構成されている。ここで、バルブは図４に示すようにそれぞれのシリンジ毎に取り付けても良い。図４に示す例では、例えばシリンジＡに第１の細胞が入った細胞融合液、シリンジＢに第２の細胞が入った細胞融合液、シリンジＣに第１細胞融合処理液（例えば、ポリエチレングリコール５０％水溶液）が入った細胞融合液、シリンジＤに第２細胞融合処理液（例えば、３００ｍＭマンニトール水溶液）が入った細胞融合液を入れる事ができる。このような構成にすることで、３以上の細胞融合液を切替えて導入することが可能となり、細胞融合液導入切替え手段を用いて細胞融合処理液の入った細胞融合液を導入する時期を、第２の細胞の導入前、細胞融合の前および細胞融合の後、の少なくとも一の時期とすることが可能となる。なお、どれか一つのシリンジを選んでシリンジを細胞融合液導入流路に接続することができればシリンジの数に特に制限はなく、使用する細胞の数、細胞融合処理液が入った細胞融合液の数に応じて適宜設置すればよい。なお後述するが、本発明の効果をえるための最も最良な態様は、細胞融合液切替え機構により切替えられるシリンジのうち少なくとも１つは第１の細胞が入った細胞融合液を入れたシリンジであり、また少なくとも１つは第２の細胞が入った細胞融合液を入れたシリンジであり、また少なくとも１つは、化学的細胞融合を生じさせる成分であるポリエチレングリコールのような細胞膜の流動性を高める成分を含んだ細胞融合液を入れたシリンジであり、また少なくとも１つは、ポリエチレングリコールのような細胞膜の流動性を高める成分を除去することが可能な、細胞の入っていない細胞融合液を入れたシリンジであることが最も好ましい。
【００３７】
なお、細胞融合させる２種の細胞としては、例えばモノクローナル抗体を製造するために用いられる抗体産生細胞とミエローマ細胞との組合せなどであれば良い。
【００３８】
絶縁体（８）には微細孔（９）が形成されている。絶縁体（８）の材質は、例えばガラス、セラミック、樹脂等の絶縁材料であれば特に制限はないが、貫通した微細孔を形成させる必要があることから、樹脂等の比較的加工が容易な材料が好ましい。樹脂に貫通した微細孔を形成する手段としては、形成する微細孔の位置にレーザーを照射する方法や、微細孔の位置に貫通孔を形成するためのピンを有する金型を用いて成形する方法などの既知の方法を用いればよい。また、絶縁体にＵＶ硬化性樹脂などを用いる場合は、微細孔に相当するパターンを描画した露光用フォトマスクを用いて一般的なフォトリソグラフィー（露光）とエッチング（現像）により貫通した微細孔を形成することができる。絶縁体に複数の微細孔を形成する場合は、絶縁体にＵＶ硬化性樹脂を用いて、一般的なフォトリソグラフィーとエッチングによる方法で微細孔を形成することが好ましい。
【００３９】
微細孔の形状や大きさには特に制限はないが、本発明の細胞融合装置を用いた場合、１つの微細孔に１つの細胞を固定した方がより高い融合再生確率を得ることが可能となることから、微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が、微細孔に固定する細胞の直径（細胞により異なるが、１μｍ〜数十μｍ程度）より小さいか、もしくは、細胞の直径の１〜２倍程度の範囲でありかつ微細孔の深さが微細孔に固定する細胞の直径の以下であることが好ましい。
【００４０】
図６に示すように、微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が、微細孔に固定する２つの細胞の直径より大きい場合は、微細孔に第１の細胞及び第２の細胞が複数入ってしまい、第１の細胞と第２の細胞の１対１での細胞融合ができなくなり、融合再生確率が低くなってしまう。しかしながら、図７に示すように、微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が、微細孔に固定する２つの細胞の直径より小さい場合は、第１の細胞と第２の細胞の１対１での細胞融合が可能であり、融合再生確率が高くなる。また、図８に示すように、微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が第１の細胞より１〜２倍程度大きくかつ微細孔の深さが微細孔に固定した第１の細胞の直径より大きい場合は第２の細胞が微細孔に固定された第１の細胞と接触することができずに細胞融合させることができない。しかしながら、図９に示すように、微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が第１の細胞より１〜２倍程度大きくかつ微細孔の深さが微細孔に固定した第１の細胞の直径の以下である場合は１つの第２の細胞と微細孔に固定された１つの第１の細胞が確実に接触するので高い融合再生確率を得ることができる。
【００４１】
また本発明の細胞融合装置は、１つの微細孔に１つの細胞を固定した方がより高い融合再生確率を得ることが可能となることから、前記した絶縁体に形成される複数の微細孔が、絶縁体の面において、いずれの微細孔からも隣合う微細孔の位置が同じ位置に形成されていること、すなわち図４に示すように、複数の微細孔が絶縁体の面においてアレイ状に形成されていることが好ましい。ここでアレイ状とは、微細孔の縦と横の間隔がほぼ等間隔に配置されていることを意味する。微細孔をアレイ状に配置することで、電極間に印加した電圧によって生じる電界がすべての微細孔にほぼ均等に生じるため、微細孔に細胞が固定される確率も各微細孔で等しくなり、１つの微細孔に１つの細胞を固定できる確率が高くなる。また、１つの微細孔に１つの細胞を固定するためには、アレイ状に形成した微細孔の間隔が狭すぎても広すぎても不適当となることがある。微細孔の間隔が狭すぎる場合は、１つの微細孔に複数の細胞が固定される確率が高くなり結果として細胞の入らない微細孔が生じる確率が高くなることがある。また、微細孔の間隔が広すぎる場合には、微細孔と微細孔の間に細胞が残されてしまい、細胞の入らない微細孔が生じる確率が高くなることがある。従ってより具体的には、微細孔の隣合う間隔が、微細孔に固定する細胞の直径の０．５〜６倍の範囲であることが好ましく、さらには微細孔の間隔が固定する細胞の直径の１〜２倍程度であることがより好ましい。
【００４２】
また、本発明における微細孔の形状は、円状に限定されるものではなく、三角状や四角状などの多角状であっても良い。三角状や四角状などの多角状の場合は角の部分で電気力線の集中の度合いが強められるため、誘電泳動力は円状の微細孔より強くなり細胞が微細孔に固定される確率が高くなるというメリットがある。ただし、微細孔をアレイ状に配置した場合は、前後左右の微細孔からの誘電泳動力が等しく作用する方が、１つに微細孔に１つの細胞を固定できる確率が高くなるので、微細孔の形状は点対称であることが好ましく、さらには正方形であることがより好ましい。
【００４３】
なお図５は、図４の細胞融合容器のＸＸ’断面図を示した概略図である。上部電極（１４）、スペーサー（１６）、絶縁体（８）、下部電極（１５）を図５のように貼り合わせる手段としては、それぞれを接着剤で張り合わせたり、加圧した状態で過熱して融着させる方法や、スペーサーを表面粘着性のあるＰＤＭＳ（ｐｏｌｙ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）やシリコンシートのような樹脂を用いて作製することで圧着することにより貼り合わせる方法など、既知の方法を用いればよい。このようにすることで図５に示した細胞融合領域（１）を形成することができる。
【００４４】
第２の細胞を入れるときは、微細孔に入った第１の細胞よりも微細孔に固定されにくくなるので、第１の細胞の数よりも第２の細胞の数を多く入れることで、第１の細胞と第２の細胞を確実に接触させることができる。ここで、第１の細胞の数が微細孔の数より多いと微細孔に固定されない細胞が存在し結果として細胞融合に関与する細胞の割合が少なくなるので、第１の細胞の数は微細孔の数と同数かそれ以下が好ましい。また、第２の細胞の数が第１の細胞の数より少ないと、第２の細胞と接触できない第１の細胞が存在し結果として細胞融合する２細胞１組の組み合わせが少なくなることがある。一方、第２の細胞の数があまり多すぎると、現実的に細胞を導入できなくなることがあることから、第２の細胞の数は第１の細胞数と同数〜４倍程度の数が好ましい。
【００４５】
次に、本発明の細胞融合装置に用いる交流電源は、例えば、ピーク電圧が１Ｖ〜２０Ｖ程度、周波数１００ｋＨｚ〜３ＭＨｚ程度の正弦波、矩形波、三角波、台形波等の交流電圧を出力できる交流電源であれば特に制限はない。また、本発明の細胞融合装置を用いた場合、１つの微細孔に１つの細胞を固定した方がより高い融合再生確率を得ることが可能となるが、１つの微細孔につき１つの細胞を固定するための交流電圧の波形としては、矩形波であることが好ましい。その理由として、図１１〜図１４に示すように、交流電圧の波形が正弦波（図１１）、三角波（図１２）、台形波（図１３）に比べて、矩形波（図１４）は瞬時に設定したピーク電圧（３１）に到達するため、細胞が微細孔に速やかに動くため、細胞が重なって微細孔に入る確率が低くなり、従って、１つの微細孔につき１つの細胞を固定する確率が高くなる。また、細胞は電気的にコンデンサーと見なすことができ、矩形波のピーク電圧が変化しない間は、微細孔に入った細胞には電流が流れにくくなるため、電気力線が生じにくく、細胞の入った微細孔には誘電泳動力が発生しにくくなるため、一度微細孔に細胞が入ると、別の細胞がその微細孔に入る確率が低くなり、電気力線が生じ誘電泳動力が発生している空の微細孔に、順次、細胞が入っていくためである。
【００４６】
なお、本発明の細胞融合装置に用いる交流電圧の波形は、直流成分を有しないことが好ましい。これは、直流成分により発生した静電気力により細胞が特定の方向に偏った力を受けて移動するため誘電泳動力により細胞を微細孔に固定することが困難になること、また細胞を含有する懸濁液に含まれるイオンが電極表面で電気反応を生じて発熱が起こり、それにより細胞が熱運動を起こすため、誘電泳動力により細胞の動きを制御することができなくなり細胞を微細孔に引き寄せることが困難となるためである。
【００４７】
次に、本発明の細胞融合方法について説明する。
【００４８】
本発明の細胞融合方法は、前記細胞融合装置を用いた細胞融合方法であって、前記細胞融合液導入切替え機構を用いて、前記細胞融合領域に第１の細胞が入った細胞融合液を導入し、前記交流電圧を印加することで前記微細孔内に前記第１の細胞を固定した後、前記細胞融合領域に第２の細胞が入った細胞融合液を導入して、前記交流電圧を印加することで前記第１の細胞に前記第２の細胞を前記微細孔の位置において接触させ、化学的に細胞を融合する細胞融合方法であって、前記細胞融合液導入切替え手段を用いて、細胞融合処理液の入った細胞融合液を導入する時期を、第２の細胞の導入前、細胞融合の前および細胞融合の後、の少なくとも一の時期とする細胞融合方法である。また、本発明の細胞融合方法は、前記細胞融合処理液が入った細胞融合液が２以上であって、前記２以上の細胞融合処理液が入った細胞融合液が全て同じまたは一部異なるまたは全て異なる、のいずれかの細胞融合処理液が入った細胞融合液であっても良い。
【００４９】
また本発明の細胞融合方法は、細胞を、細胞膜の流動性を高める物質を加えた細胞融合液に入れて化学的に細胞融合を行うことを特徴とする細胞融合方法であって、前記細胞膜の流動性を高める物質が、ポリエチレングリコールである事を特徴とする細胞融合方法である。細胞膜の流動性が高まった状態で細胞が接触すると膜融合が容易に生じるので、前述したように微細孔において２細胞一対が接触すれば、２細胞一対での細胞融合が生じる。ここで、細胞膜の流動性を高める物質は、接触した細胞同士に膜融合を起こさせる物質であれば特に制限はないが、例えばポリエチレングリコールやリゾチウムなどがあり、特に、ポリエチレングリコールであることが好ましい。またさらに、平均分子量１０００〜６０００程度のポリエチレングリコールが好ましい。
【００５０】
このような細胞融合方法により、細胞融合させるべきそれぞれの細胞を目的に応じた成分の溶液に懸濁した状態で順次導入し２細胞一対の細胞融合を行い、さらには、それぞれの細胞を導入する前後あるいは細胞融合の前後で、細胞融合に必要な成分を導入したり、細胞融合に不要な成分を除去するための細胞融合処理液の入った細胞融合液を導入することはじめて可能となる。またそれぞれの細胞は、交流電圧により微細孔部に固定されるため、細胞融合液の置換を行うことが可能であり、また細胞融合液の置換に伴う細胞の損失も極めて低く抑えることが、はじめて可能になる。
【００５１】
本発明の発明者らが、特願２００７−０１０８１０として出願した細胞融合方法は、以下の（１）のプロセスである。また、本発明を実施する際の、具体的な細胞融合液や細胞融合液の導入および融合電圧印加の順序については、例えば以下の（２）から（８）のプロセスが挙げられる。本発明では、（２）〜（８）のプロセスの例にのみ限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能である。また、第１の細胞融合液と第２の細胞融合液の成分は同じ成分であってもよいし異なる成分であってもよい。
【００５２】
プロセス（１）：第１の細胞融合液に懸濁した第１の細胞を細胞融合領域に導入し、続いて第２の細胞融合液に懸濁した第２の細胞を細胞融合領域に導入し、微細孔にて２細胞一対で接触させ細胞融合する。
【００５３】
プロセス（２）：第１の細胞融合液に懸濁した第１の細胞を細胞融合領域に導入し、続いて第２の細胞融合液に懸濁した第２の細胞を細胞融合領域に導入し、微細孔にて２細胞一対で接触させた後、特定の成分を含む細胞融合処理液の入った細胞融合液を細胞融合領域に導入することで細胞融合液を置換し、細胞融合する。
【００５４】
プロセス（３）：第１の細胞融合液に懸濁した第１の細胞を細胞融合領域に導入し、特定の成分を含む細胞融合処理液の入った細胞融合液を細胞融合領域に導入することで細胞融合液を置換してから、続いて第２の細胞融合液に懸濁した第２の細胞を細胞融合領域に導入し、微細孔にて２細胞一対で接触させ細胞融合する。
【００５５】
プロセス（４）：第１の細胞融合液に懸濁した第１の細胞を細胞融合領域に導入し、特定の成分を含む細胞融合処理液の入った細胞融合液を細胞融合領域に導入することで細胞融合液を置換し、続いて第２の細胞融合液に懸濁した第２の細胞を細胞融合領域に導入し、微細孔にて２細胞一対で接触させた後、再び特定の成分を含む細胞融合処理液の入った細胞融合液を細胞融合領域に導入することで細胞融合液を置換し、細胞融合する。
【００５６】
プロセス（５）：第１の細胞融合液に懸濁した第１の細胞を細胞融合領域に導入し、続いて第２の細胞融合液に懸濁した第２の細胞を細胞融合領域に導入し、微細孔にて２細胞一対で接触させて細胞融合した後、特定の成分を含む細胞融合処理液の入った細胞融合液を細胞融合領域に導入することで細胞融合液を置換する。
【００５７】
プロセス（６）：第１の細胞融合液に懸濁した第１の細胞を細胞融合領域に導入し、続いて第２の細胞融合液に懸濁した第２の細胞を細胞融合領域に導入し、微細孔にて２細胞一対で接触させた後、特定の成分を含む細胞融合処理液の入った細胞融合液を細胞融合領域に導入することで細胞融合液を置換して細胞融合し、その後、特定の成分を含む細胞融合処理液の入った細胞融合液を細胞融合領域に導入することで細胞融合液を置換する。
【００５８】
プロセス（７）：第１の細胞融合液に懸濁した第１の細胞を細胞融合領域に導入し、特定の成分を含む細胞融合処理液の入った細胞融合液を細胞融合領域に導入することで細胞融合液を置換してから、続いて第２の細胞融合液に懸濁した第２の細胞を細胞融合領域に導入し、微細孔にて２細胞一対で接触させた後細胞融合し、その後、特定の成分を含む細胞融合処理液の入った細胞融合液を細胞融合領域に導入することで細胞融合液を置換する。
【００５９】
プロセス（８）：第１の細胞融合液に懸濁した第１の細胞を細胞融合領域に導入し、特定の成分を含む細胞融合処理液の入った細胞融合液を細胞融合領域に導入することで細胞融合液を置換してから、続いて第２の細胞融合液に懸濁した第２の細胞を細胞融合領域に導入し、微細孔にて２細胞一対で接触させた後、再び特定の成分を含む細胞融合処理液の入った細胞融合液を細胞融合領域に導入することで細胞融合液を置換してから細胞融合し、再び特定の成分を含む細胞融合処理液の入った細胞融合液を細胞融合領域に導入することで細胞融合液を置換する。
【００６０】
上記プロセス（１）は既に説明したように、本発明の発明者らが、特願２００７−０１０８１０で既に出願した細胞融合方法の最も基本的なプロセスであるあり、２細胞一対での細胞融合をより効率的により確実に実施できる標準の形態である。
【００６１】
上記プロセス（２）〜（８）は、プロセス（１）に任意に細胞融合領域の細胞融合液の置換工程を加えたものである。具体的には、プロセス（２）は２種類の細胞を導入後に、プロセス（３）は第１の細胞を導入後に、プロセス（４）は第１の細胞の導入後および第２の細胞の導入後に、それぞれ細胞融合液の置換工程を加えたものである。さらに、プロセス（５）はプロセス（１）の細胞融合後に、プロセス（６）はプロセス（２）の細胞融合後に、プロセス（７）はプロセス（３）の細胞融合後に、プロセス（８）はプロセス（４）の細胞融合後に、細胞融合液の置換工程をそれぞれ加えたものである。ここで、細胞融合液の置換回数は目的に応じて何回でも繰り返すことができ、複数回置換を繰り返す場合は、その都度異なる成分を含む細胞融合処理液の入った細胞融合液を用いることも可能である。また、特定の細胞融合液で置換を行う際には、細胞を交流電圧により微細孔部に固定しておくことが望ましいが、交流電圧を印加しない状態でも細胞融合液の送液をゆっくりと行うことで、微細孔から細胞を脱離させずに、細胞融合領域の細胞融合液の置換が可能である。
【００６２】
また、上記のような細胞融合液の置換を行う事で、本発明の細胞融合方法は、本発明の細胞融合方法は、細胞融合処理液が入った細胞融合液を特定の成分を含ませた細胞融合液とし、細胞融合液を置換することで、細胞融合領域の細胞融合液中に前記特定の成分を導入してもよいし、逆に、細胞融合処理液が入った細胞融合液により、細胞融合領域の細胞融合液中の特定の成分を除去してもよい。ここで、前記導入する特定の成分及び、除去する特定の成分が、細胞膜の流動性を高める物質であることが好ましく、さらには、細胞膜の流動性を高める物質が、ポリエチレングリコールである事がより好ましい。
【００６３】
以下では、本発明の化学的細胞融合方法を適用した第１の例〜第３の例とその効果についてさらに詳細に説明する。
【００６４】
第１の例は、前述したプロセス（１）またはプロセス（２）またはプロセス（５）を用いて、ポリエチレングリコールのような、細胞融合をすみやかに生じさせるためには必要だが、細胞に対して強い毒性を有する物質と接触させる時間を、細胞融合に必要な最低限の時間にすることで、細胞のダメージを抑制し融合再生確率を向上させた例である。
【００６５】
以下に第１の例においてプロセス（１）を適用した具体例を示す。プロセス（１）においては、まず細胞融合液Ａ（例えば、３００ｍＭのマンニトール水溶液に、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した細胞融合液など）に第１の細胞を懸濁させ、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合領域に導入し、交流電圧を印加して第１の細胞を微細孔に固定する。続いて交流電圧を印加したまま、ポリエチレングリコール５０％水溶液に第２の細胞を懸濁させ、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合領域に導入し、微細孔にて２細胞一対で接触させる。その後、１〜３分程度静置し、細胞膜を流動化させて化学的に細胞融合する。このようにする事で、第１の細胞は、ポリエチレングリコールのような細胞融合をすみやかに生じさせるためには必要だが細胞に対して強い毒性を有する物質、接触する時間が短くなるので、第１の細胞の活性低下を抑える事が可能となり融合再生確率を向上させることが可能となる。
【００６６】
また、以下に第１の例においてプロセス（２）を適用した具体例を示す。プロセス（２）においては、まず細胞融合液Ａ（例えば、３００ｍＭのマンニトール水溶液に、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した細胞融合液など）に第１の細胞を懸濁させ、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合領域に導入し、交流電圧を印加して第１の細胞を微細孔に固定する。続いて交流電圧を印加したまま、同様に細胞融合液Ａに第２の細胞を懸濁させ、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合領域に導入し、微細孔にて２細胞一対で接触させる。その後、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合液としてポリエチレングリコール５０％水溶液を細胞融合領域に導入する。次に、１〜３分程度静置し、細胞膜を流動化させて化学的に細胞融合する。このようにする事で、第１の細胞及び第２の細胞は、ポリエチレングリコールのような細胞融合をすみやかに生じさせるためには必要だが細胞に対して強い毒性を有する物質と接触する時間は、第１の細胞と第２の細胞が接触した後の細胞融合をする数分程度と短くなるので、第１の細胞及び第２の細胞の活性低下を抑えることが可能となり融合再生確率をさらに向上させることが可能となる。
【００６７】
また、以下に第１の例においてプロセス（５）を適用した具体例を示す。プロセス（５）においては、まず細胞融合液Ａ（例えば、３００ｍＭのマンニトール水溶液に、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した細胞融合液など）に第１の細胞を懸濁させ、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合領域に導入し、交流電圧を印加して第１の細胞を微細孔に固定する。続いて交流電圧を印加したまま、ポリエチレングリコール５０％水溶液に第２の細胞を懸濁させ、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合領域に導入し、微細孔にて２細胞一対で接触させる。次に、１〜３分程度静置し、細胞膜を流動化させて化学的に細胞融合する。細胞融合後、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合液Ａを細胞融合領域に導入し、細胞融合領域からポリエチレングリコール５０％水溶液を除去する。このようにする事で、第１の細胞は、ポリエチレングリコールのような細胞融合をすみやかに生じさせるためには必要だが細胞に対して強い毒性を有する物質、接触する時間が短くなるので、第１の細胞の活性低下を抑える事が可能となり、かつ、融合後に細胞に対して強い毒性を有する物質であるポリエチレングリコールを速やかに排除し、融合細胞の活性低下を抑えることができ、さらに融合再生確率を向上させることが可能となる。
【００６８】
すなわち、本発明の細胞融合装置とそれを用いた細胞融合方法により、ポリエチレングリコールのような、細胞融合をすみやかに生じさせるためには必要だが、細胞に対して強い毒性を有する物質と接触させる時間をできるだけ短時間に制御することが初めて可能となる。
【００６９】
また本発明の細胞融合方法は、任意のタイミングで、任意の回数、特定の成分を含ませた細胞融合液を導入することが可能であり、特定の成分としては上記のポリエチレングリコールのような細胞膜の流動性を高める物質以外であってもよく、ポリエチレングリコールのような細胞膜の流動性を高める物質を導入したり除去したりすることに加えて、別の特定の成分を導入したり除去したりしてもよく、例えば細胞表面を改質するシアル酸分解酵素またはプロテアーゼのような酵素や細胞膜修復作用があるカルシウムイオン等であってもよいし、細胞融合を行う細胞の種類に応じて、融合再生確率を高める添加剤であってもよい。ここで一般に、融合再生確率を高める添加剤としては、カルシウム塩やマグネシウム塩などの無機塩、アミノ酸、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖、フィコール、カルモジュリン、セリシン、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、サイトカイン、その他のタンパク質、リポポリサッカライド、ポリエチレングリコール、コレステロール、カテキン、血清、ホルモン、動物細胞培養用培地由来の成分などがある。これらの成分をどのような組み合わせで、どのような濃度で用いても上記の本発明プロセスが適用可能である。
【００７０】
次に第２の例を説明する。従来の化学的細胞融合法では２種類の細胞を同一の成分の溶液の中で混合状態で細胞融合を行うため、融合再生確率を高めるのに効果的なＣａ濃度のコントロールは困難であった（例えば、上述した非特許文献１参照）。つまり、Ｃａ濃度を高めた場合、Ｃａの細胞膜修復作用により融合再生確率を向上させる効果はあるが、細胞融合前に細胞同士が凝集を起こし、細胞融合に関与できない細胞が増大するため、結果として融合再生確率が低下するという課題があった。しかし、本発明の細胞融合方法においては、前述したプロセス（６）を用いて、細胞融合させるそれぞれの細胞を別々の成分の細胞融合液に懸濁して、個々に細胞融合領域に導入できるため、このような問題を回避することがはじめて可能となる。
【００７１】
以下に第２の例においてプロセス（６）を適用した具体例を示す。プロセス（６）においては、最初に細胞融合領域に導入する第１の細胞は、細胞の凝集を防ぐために低いＣａ濃度の細胞融合液Ａ（例えば、３００ｍＭのマンニトール水溶液に、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した細胞融合液など）に懸濁させ、細胞の凝集を防ぎ、交流電圧を印加することで１つの微細孔に１つの細胞を固定することができる。次に第２の細胞も、細胞の凝集を防ぐために低いＣａ濃度の細胞融合液Ａ（例えば、３００ｍＭのマンニトール水溶液に、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した細胞融合液など）に懸濁させ、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合領域に導入し、交流電圧を印加して微細孔に固定した第１の細胞に対して２細胞一対を効率よく形成させる。その後、細胞融合液導入切替え機構を用いてポリエチレングリコール５０％水溶液を細胞融合領域に導入し、１〜３分静置し細胞膜を流動化させて化学的に細胞融合させる。引き続き、高いＣａ濃度の細胞融合液Ｂ（例えば、３００ｍＭのマンニトール水溶液に、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した細胞融合液など）を細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合領域に導入することで、細胞融合領域に高いＣａ濃度の成分の細胞融合液を入れるとともに細胞融合領域からポリエチレングリコールを除去する。このようにする事で、Ｃａの細胞膜修復作用を効果的に利用し、かつ、融合後に細胞に対して強い毒性を有する物質であるポリエチレングリコールを速やかに排除し、融合細胞の活性低下を抑えることができ、融合再生確率を向上させることが可能となる。
【００７２】
次に第３の例を説明する。細胞融合前にシアル酸分解酵素で細胞を処理することで細胞膜上のシアル酸を分解し、細胞を正の電荷に帯電させることによって細胞融合させる細胞同士の密着度を高め、融合再生確率を向上させた事例が報告されている（例えば、上述した非特許文献２参照）。しかしながら一般に、従来の化学的細胞融合法では細胞融合領域に細胞を導入する前にシアル酸分解酵素で酵素処理を行う必要があり、酵素処理を行っている間に細胞が死滅したり、細胞の活性が低下したり、細胞の損失が生じるほか、シアル酸分解処理を行った細胞同士が凝集することで、細胞融合に寄与する細胞数が減少し、結果として融合再生確率が低下するという課題があった。しかし本発明の細胞融合方法では、前述したプロセス（３）またはプロセス（４）またはプロセス（７）またはプロセス（８）を用いて、細胞融合液の置換が逐次可能であることから、細胞融合領域内で細胞融合前に細胞のシアル酸分解処理を簡便に行い、そのまま続けて細胞融合を行うことが可能である。
【００７３】
以下に第３の例においてプロセス（３）を適用した具体例を示す。プロセス（３）においては、まず第１の細胞を細胞融合液Ａ（例えば、３００ｍＭのマンニトール水溶液に、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した細胞融合液など）に懸濁させ、細胞融合領域に導入し、交流電圧を用いて第１の細胞を微細孔に固定した後、交流電圧を印加した状態で細胞融合液導入切替え機構を用いてシアル酸分解酵素を含む細胞融合液Ａを細胞融合領域に導入し、第１の細胞のシアル酸分解処理を行う。次に、ポリエチレングリコール５０％水溶液に第２の細胞を懸濁させ、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合領域に導入し、交流電圧を印加して微細孔にて２細胞一対で接触させる。その後、１〜３分静置し細胞膜を流動化させて化学的に細胞融合させる。このようにすることで第１の細胞のシアル酸分解酵素による凝集をおさえ、高い融合再生効率を得られる。
【００７４】
以下に第３の例においてプロセス（４）を適用した具体例を示す。プロセス（４）においては、まず第１の細胞を細胞融合液Ａ（例えば、３００ｍＭのマンニトール水溶液に、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した細胞融合液など）に懸濁させ、細胞融合領域に導入し、交流電圧を用いて第１の細胞を微細孔に固定した後、交流電圧を印加した状態で細胞融合液導入切替え機構を用いてシアル酸分解酵素を含む細胞融合液Ａを細胞融合領域に導入し、第１の細胞のシアル酸分解処理を行う。次に、細胞融合液Ａに第２の細胞を懸濁させ、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合領域に導入し、交流電圧を印加して微細孔にて２細胞一対で接触させる。引き続き、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合液としてポリエチレングリコール５０％水溶液を細胞融合領域に導入し、１〜３分程度静置し、細胞膜を流動化させて化学的に細胞融合する。このようにすることで第１の細胞のシアル酸分解酵素による凝集を抑え、かつ、第１の細胞及び第２の細胞は、ポリエチレングリコールのような細胞融合をすみやかに生じさせるためには必要だが細胞に対して強い毒性を有する物質と接触する時間は、第１の細胞と第２の細胞が接触した後の細胞融合をする数分程度と短くなるので、第１の細胞及び第２の細胞の活性低下を抑える事が可能となり融合再生確率をさらに向上させることが可能となる。
【００７５】
以下に第３の例においてプロセス（７）を適用した具体例を示す。プロセス（７）においては、まず第１の細胞を細胞融合液Ａ（例えば、３００ｍＭのマンニトール水溶液に、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した細胞融合液など）に懸濁させ、細胞融合領域に導入し、交流電圧を用いて第１の細胞を微細孔に固定した後、交流電圧を印加した状態で細胞融合液導入切替え機構を用いてシアル酸分解酵素を含む細胞融合液Ａを細胞融合領域に導入し、第１の細胞のシアル酸分解処理を行う。次にポリエチレングリコール５０％水溶液に第２の細胞を懸濁させ、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合領域に導入し、微細孔にて２細胞一対で接触させる。その後、１〜３分程度静置し、細胞膜を流動化させて化学的に細胞融合する。細胞融合後、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合液Ａを細胞融合領域に導入し、細胞融合領域からポリエチレングリコール５０％水溶液を除去する。このようにする事で、第１の細胞のシアル酸分解酵素による凝集を抑え、かつ、融合後に細胞に対して強い毒性を有する物質であるポリエチレングリコールを速やかに排除し、融合細胞の活性低下を抑えることができ、融合再生確率をさらに向上させることが可能となる。
【００７６】
また、以下に第３の例においてプロセス（８）を適用した具体例を示す。プロセス（８）においては、まず第１の細胞を細胞融合液Ａ（例えば、３００ｍＭのマンニトール水溶液に、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した細胞融合液など）に懸濁させ、細胞融合領域に導入し、交流電圧を用いて第１の細胞を微細孔に固定した後、交流電圧を印加した状態で細胞融合液導入切替え機構を用いてシアル酸分解酵素を含む細胞融合液Ａを細胞融合領域に導入し、第１の細胞のシアル酸分解処理を行う。次に細胞融合液Ａに第２の細胞を懸濁させ、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合領域に導入し、微細孔にて２細胞一対で接触させる。引き続き、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合液としてポリエチレングリコール５０％水溶液を細胞融合領域に導入する。次に１〜３分程度静置し、細胞膜を流動化させて化学的に細胞融合する。細胞融合後、細胞融合液導入切替え機構を用いて細胞融合液Ａを細胞融合領域に導入し、細胞融合領域からポリエチレングリコール５０％水溶液を除去する。このようにする事で、第１の細胞のシアル酸分解酵素による凝集を抑えることがで、また、第１の細胞及び第２の細胞は、ポリエチレングリコールのような細胞融合をすみやかに生じさせるためには必要だが細胞に対して強い毒性を有する物質と接触する時間は、第１の細胞と第２の細胞が接触した後の細胞融合をする数分程度と短くなるので、第１の細胞及び第２の細胞の活性低下を抑える事が可能となる。さらに、融合後に細胞に対して強い毒性を有する物質であるポリエチレングリコールを速やかに排除し、融合細胞の活性低下を抑えることがでる。これにより、さらに融合再生確率を向上させることが可能となる。
【００７７】
なお、第３の例ではシアル酸分解酵素を用いる例を示したが、その他の酵素として、プロテアーゼなどの酵素を用いてもよい。この場合、細胞融合前にプロテアーゼなどの酵素で細胞を処理することで細胞膜上のタンパクを分解し、融合再生確率を向上させることが可能となる。
【発明の効果】
【００７８】
本発明によれば、以下の効果を奏することができる。
（１）本発明の細胞オ融合装置によれば、微細孔にて２細胞一対での細胞融合を確実に行うことができるうえ、２種類の細胞の入った細胞融合液以外に、細胞融合処理液の入った細胞融合液を少なくとも１種類以上、導入することが可能となり、細胞を細胞融合領域にいれ、微細孔に固定したままの状態、細胞融合領域内の細胞融合液の成分を変え、より高い融合再生確率を得られる細胞融合条件に変更することが可能となる。
（２）本発明の細胞融合方法によれば、細胞融合の工程の任意のタイミングで、任意の回数、細胞融合液の成分を変更することが可能となり、より高い融合再生確率を得られる細胞融合条件に変更する事が可能となる。
（３）本発明の細胞融合方法によれば、融合再生確率を高める効果はあるものの、長時間細胞に接していると、細胞が死滅したり、細胞の活性が落ちたり、細胞が凝集したりするような成分を簡便かつ迅速に導入し除去することが可能となり、細胞の損失を防止し、より高い融合再生確率を得ることができる。特に、ポリエチレングリコールのような、化学的細胞融合には必要だが、細胞に対して強い毒性を有する成分を、細胞融合に必要なタイミングで必要十分な時間だけ細胞融合領域に導入したあと速やかに除去することで、より高い融合再生確率を得ることができる。
（４）本発明の細胞融合方法によれば、細胞融合の工程の任意のタイミングで、融合再生確率を高める効果のある成分を簡便かつ迅速に導入することが可能となり、より高い融合再生確率を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７９】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることは言うまでもない。
【００８０】
（実施例１）
図４に実施例１に用いた細胞融合装置の概念図を示す。細胞融合装置は大きく分けて、細胞融合容器（１３）と電源（４）から構成される。細胞融合容器は、図４に示すように上部電極（１４）と下部電極（１５）の間に、スペーサー（１６）を配置し、複数の微細孔をアレイ状に形成した絶縁体（８）をスペーサーと下部電極で挟んだ構造を有する。なお後述するように、微細孔は、下部電極（１５）上に配置した絶縁膜に一般的なフォトリソグラフィーとエッチングにより形成した。
【００８１】
上部電極と下部電極は、縦７０ｍｍ×横４０ｍｍ×厚さ１ｍｍのパイレックス（登録商標）基板に、ＩＴＯを成膜（膜厚１５０ｎｍ）したものを用いた。スペーサーは、縦４０ｍｍ×横４０ｍｍ×厚さ１．５ｍｍのシリコンシートの中央を縦２０ｍｍ×横２０ｍｍにくりぬいた形状にして用いた。また図４に示すように、スペーサーには、細胞融合容器に細胞を導入、排出するため、細胞を導入する導入流路（２９）及びそれに連通する導入口（１９）と、細胞を排出する排出流路（３０）及びそれに連通する排出口（２０）を設けた。さらに図４に示すように、導入口には、細胞融合液導入流路（２）を介して容量１ｍＬのシリンジＡ（４）、容量１ｍＬのシリンジＢ（６）、容量１ｍＬのシリンジＣ（７）、容量１０ｍＬのシリンジＤ（３４）を、細胞融合液導入切替え機構としてのバルブ（２１）をそれぞれ介して接続した。
【００８２】
また、複数の微細孔を有する絶縁体（８）は、図１０に示すフォトリソグラフィーとエッチングによる方法により下部電極に一体形成することで作製した。
【００８３】
まずはじめにＩＴＯ（２３）を成膜したパイレックス（登録商標）ガラス（２４）のＩＴＯ成膜面にレジスト（２５）を２．５μｍの膜厚になるようスピンコーターを用いて塗布し、４５分自然乾燥後、ホットプレートを用いてプリベーク（８０℃、１５分）を行った。レジストにはキシレン系のネガタイプレジストを用いた。次に、縦３０ｍｍ×横３０ｍｍのエリアに、微細孔と微細孔の縦と横の間隔が３０μｍで、縦１０００個×横１０００個のアレイ状に並べた直径φ７μｍの微細孔パターンを描いた露光用フォトマスク（２６）を用いて、ＵＶ露光機にてレジストを露光（２７）し、現像液（３３）で現像した。露光時間と現像時間は、微細孔の深さがレジストの膜厚と等しい２．５μｍになるように調整し、微細孔の底面にＩＴＯが露出するようにした。現像後、ホットプレートを用いてポストベーク（１１５℃、３０分）を行いレジストを固めた。
【００８４】
このようにして作製した上部電極（１４）、スペーサー（１６）、微細孔付き絶縁体一体型下部電極（２８）を図５のように積層し圧着した。図５は、図４に示した細胞融合容器のＸＸ’断面図である。スペーサーであるシリコンシートの表面は粘着性があり、圧着することで各部品は密着し、細胞を含有した細胞融合液を漏れなく細胞融合容器の中に入れることができた。スペーサーをくりぬいた面積が縦２０ｍｍ×横２０ｍｍであることから、この空間に存在する微細孔の数は約４０万個である。
【００８５】
電極間に電圧を印加する電源は、交流電源（５）として信号発生器（エヌエフ回路設計ブロック製、ＷＦ１９６６）、直流パルス電源（６）として細胞融合用電源（ネッパジーン製、ＬＦ１０１）を導電線（３）を介して接続し、交流電源と直流パルス電源は電源切替え機構（７）により電極への接続を切替えられるようにした。
【００８６】
前述した細胞融合装置を用いて、マウスの脾臓細胞（直径約６μｍ）とマウスのミエローマ細胞（直径約１０μｍ）を用いて細胞融合を行った。ミエローマ細胞は細胞融合する前にシアル酸分解酵素で処理したものを用い、マウスの脾臓細胞は、細胞融合領域に導入し微細孔に固定した後、細胞融合領域でシアル酸分解酵素処理した後、細胞融合し融合再生確率を確認した。
【００８７】
まず、マウスから脾臓細胞を取り出した。密閉瓶中にキムタオルを入れ、セボフルラン（丸石製薬製）を用いてマウスを安楽死させた。７０％消毒用エタノールをマウスに十分散布した後、クリーンベンチ内の解剖台に注射針で固定した。次にピンセットで外皮を摘み上げ解剖用ハサミで切り込みを入れ、まず外皮を切り取った。次に新しい別のハサミを用いて内皮を切り開き、脾臓を露出させ、ピンセットを用いて脾臓を体外に引き出しながら、ハサミで脾臓をマウスの体から切断した。５０ｍＬ遠心チューブに１０ｍＬの１０％ＦＢＳ（ウシ血清）を含む動物細胞培養用の培地（以下、培地Ａと称する）を入れておき、その中に脾臓を移して揺り動かし、表面を洗った。次に脾臓をφ９ｃｍスミロン製シャーレの蓋の上に移し、２本のピンセットを用いて、摘出した脾臓の周りに付着した脂肪を除いた。φ９ｃｍスミロン製シャーレ中に１０ｍＬの培地Ａを入れ、４０ｍＬメッシュのセルストレーナ（Ｆａｌｃｏｎ製）中で脾臓を４〜５の小片になるように新しいハサミで切断し、５ｍＬテルモシリンジの尾部の平坦部を用いて脾臓を十分すり潰した。セルストレーナとテルモシリンジの尾部に付着した脾臓細胞は培地Ａで洗い流した。シャーレ中の脾臓細胞の入った懸濁液は５０ｍＬ遠心チューブに移し、シャーレを培地Ａで２回洗浄し、洗浄液も遠心チューブ内で混合した。脾臓細胞の入った懸濁液を１５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離後、上清をアスピレータで吸引し、脾臓細胞のペレットを解きほぐした。次に１ｍＬのＦＢＳ中に解きほぐした脾臓細胞を懸濁した後、赤血球破砕液（ＳＩＧＭＡ製）を９ｍＬ加えてよく混合し、室温で３分間静置し、赤血球の破砕を行った。再び脾臓細胞の入った懸濁液を１５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離後、上清をアスピレータで吸引し、細胞ペレットを解きほぐした後、２０ｍＬの培地Ａに懸濁した。セルストレーナを用いて、５０ｍＬ遠心チューブ中に脾臓細胞の入った懸濁液をろ過し、この脾臓細胞が入った懸濁液の内、１０ｍＬを１５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離後、上清をアスピレータで吸引し、脾臓細胞のペレットを解きほぐした。すぐに１０ｍＬの無血清動物細胞培養用の培地（以下、培地Ｂと称する）に解きほぐした脾臓細胞を懸濁させた後、１５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離し、上清をアスピレータで吸引した後、脾臓細胞のペレットを解きほぐした。
【００８８】
次に３００ｍＭのマンニトール、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの入った２０ｍＬの細胞融合液（以下、細胞融合液Ａと称する）に脾臓細胞を懸濁させた後、１５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離し、上清をアスピレータで吸引した後、脾臓細胞のペレットを解きほぐした。再び少量の細胞融合液Ａに脾臓細胞を懸濁し、セルストレーナを用いて５０ｍＬファルコンチューブ内にろ過を行い、細胞融合液Ａで希釈して、脾臓細胞の最終濃度を０．９×１０６個／ｍＬに調整した脾臓細胞の入った細胞融合液を準備した。なお、３００ｍＭのマンニトールを主成分とする細胞融合液は、細胞の浸透圧とほぼ等張である。
【００８９】
また、ミエローマ細胞は常に１×１０６個／ｍＬ以下の濃度になるように、φ１５ｃｍ浮遊培養用シャーレ中培地Ａに懸濁し、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーター内で継代したものを用いた。細胞融合の前日、ミエローマ細胞の濃度が２．０×１０５個／ｍＬとなるように培地Ａにミエローマ細胞を懸濁し、φ１５ｃｍ浮遊培養用シャーレ中、培地Ａの液量４０ｍＬをミエローマ培養液とし、３枚培養を行った。ミエローマ培養液をシャーレから遠心チューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清をアスピレータで吸引し、ミエローマの細胞ペレットを解きほぐした。すぐに４０ｍＬの培地Ｂを各チューブに分散するように加えてミエローマ細胞を懸濁させ、１本のチューブにまとめた後、再び１０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離し、上清をアスピレータで吸引してミエローマ細胞のペレットを解きほぐした。すぐに５０ｍＬの培地Ｂを各チューブに分散するように加えてミエローマ細胞を懸濁させ、１本のチューブにまとめた後、再び１０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離し、上清をアスピレータで吸引してミエローマ細胞のペレットを解きほぐした。２０ｍＬの培地Ｂにミエローマ細胞を再懸濁し、１０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離後、上清をアスピレータで吸引し、ミエローマ細胞のペレットを解きほぐした。
【００９０】
次に、４０ｍＬの細胞融合液Ａにミエローマ細胞を再懸濁し、１０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離し、上清をアスピレータで吸引し、ミエローマ細胞のペレットを解きほぐした。再び少量の細胞融合液Ａにミエローマ細胞を懸濁し、セルストレーナを用いて５０ｍＬファルコンチューブ内にろ過を行い、細胞融合液Ａで希釈して、最終濃度を０．８×１０６個／ｍＬに調整したミエローマ細胞の入った細胞融合液を準備した。
【００９１】
上記、脾臓細胞の入った細胞融合液を細胞融合装置のシリンジＡに、シアル酸分解酵素で処理したミエローマ細胞の入った細胞融合液をシリンジＢに入れた。また、分子量４０００のポリエチレングリコール５０％水溶液をシリンジＣに、細胞の入っていない細胞融合液ＡをシリンジＤに入れた。
【００９２】
まずはじめに、上記脾臓細胞の入った細胞融合液を６００μＬ（損失分も考慮すると脾臓細胞数は約４０万個）をシリンジＡを用いて細胞融合領域に導入し、細胞融合領域内で脾臓細胞を十分に沈降させた。次に、交流電源によりピーク電圧５Ｖ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加し、約４０万個の微細孔に、ほぼ１つの微細孔に１つずつ、脾臓細胞をアレイ状に固定した。次に、交流電圧を印加したまま、上記ミエローマ細胞の入った細胞融合液を６００μＬ（細胞の損失分も考慮すると、ミエローマ細胞数は約４０万個）をシリンジＢを用いて細胞融合領域に導入した。この場合、脾臓細胞の数と同数のミエローマ細胞を細胞融合領域に導入したので、微細孔に固定された脾臓細胞の上に、ほぼ１つのミエローマ細胞が接触した状態になっているものと推定される。次に、交流電圧を印加したまま、分子量４０００のポリエチレングリコール５０％水溶液をシリンジＣを用いて細胞融合領域に導入し１分間静置し、化学的に細胞融合した。なおこの間、交流電圧が印加されているので、脾臓細胞とミエローマ細胞は誘電泳動力により押し付けられるので、融合容器をタッピングする必要は無い。次に、交流電圧を印加したまま、細胞の入っていない細胞融合液ＡをシリンジＤを用いて２〜３回、細胞融合領域に導入し、細胞融合領域のポリエチレングリコール水溶液を置換した。そのまま１０分静置したあと細胞融合容器内の細胞懸濁液をＨＡＴ培地（Ｈ：ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、Ａ：アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎｅ）、Ｔ：チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を成分とする培地）に入れ、融合細胞の培養を行った。なお、ＨＡＴ培地は、融合細胞のみを選択的に増殖させる培地である。
【００９３】
細胞懸濁液を入れたＨＡＴ培地をＣＯ２インキュベータに入れて細胞培養を行い６日後に融合細胞をカウントした結果、４４個の融合細胞を確認することができ、融合容器に導入したマウスの脾臓細胞数約４０万個に対して１．１／１００００の融合再生確率を得られた。これは、比較例１に示した通常の化学的細胞融合における融合再生確率０．１２／１００００の約９倍であり、非常に高い融合再生確率を得ることができた。
【００９４】
（比較例１）
比較例１として、ポリエチレングリコールを用いた通常の化学的細胞融合を行った。細胞は、実施例１に用いたマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞を用いた。細胞は、マウス抗体産生細胞（φ５μｍ）とマウスミエローマ細胞（φ１０μｍ）を用いた。マウス抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞を１０：１で混合し、両方の細胞を培地から取り出し、遠心分離で細胞と培地を分離し、取り出した細胞をそれぞれ分子量４０００のポリエチレングリコール５０％水溶液に懸濁させ、１．７×１０７個／ｍＬの密度になるように細胞懸濁液を調整した。
【００９５】
上記細胞懸濁液４０μＬ（マウス抗体産生細胞数：約６０万個、マウスミエローマ細胞数：６万個）を試験管に入れ、１分間かけて試験管の底を軽くたたいた。その後、約５分静置したあと試験管内の細胞懸濁液を５噴火遠心分離し、ＨＡＴ培地に入れた。細胞懸濁液を入れたＨＡＴ培地をＣＯ２インキュベータに入れて細胞培養を行い６日後に融合細胞をカウントした結果、７個の融合細胞を確認することができ、全マウス抗体産生細胞６０万個に対して０．１２／１００００の融合再生確率を得られた。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明における基本的な細胞融合方法の概念を示す第１の図である。
【図２】本発明における基本的な細胞融合方法の概念を示す第２の図である。
【図３】本発明における基本的な細胞融合方法の概念を示す第３の図である。
【図４】本発明における細胞融合装置の概念図及び、実施例１に用いた細胞融合装置の概念図である。
【図５】図４に示したＸＸ’断面図である。
【図６】微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が、微細孔に固定する２つの細胞の直径より大きい場合を示す概念図である。
【図７】微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が、微細孔に固定する２つの細胞の直径より小さい場合を示す概念図である。
【図８】微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が第１の細胞より１〜２倍程度大きくかつ微細孔の深さが微細孔に固定した第１の細胞の直径より大きい場合を示す概念図である。
【図９】微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が第１の細胞より１〜２倍程度大きくかつ微細孔の深さが微細孔に固定した第１の細胞の直径の以下である場合を示す概念図である。
【図１０】一般的なフォトリソグラフィーとエッチング方法の概略図である。
【図１１】本発明に用いる交流電圧の波形の一例として、正弦波の代表的な波形を示した図であり、横軸（Ｘ軸）は時間を示し、縦軸（Ｙ軸）は電圧を示す。
【図１２】本発明に用いる交流電圧の波形の一例として、三角波の代表的な波形を示した図であり、横軸（Ｘ軸）は時間を示し、縦軸（Ｙ軸）は電圧を示す。
【図１３】本発明に用いる交流電圧の波形の一例として、台形波の代表的な波形を示した図であり、横軸（Ｘ軸）は時間を示し、縦軸（Ｙ軸）は電圧を示す。
【図１４】本発明に用いる交流電圧の波形の一例として、矩形波の代表的な波形を示した図であり、横軸（Ｘ軸）は時間を示し、縦軸（Ｙ軸）は電圧を示す。
【符号の説明】
【００９７】
１：細胞融合領域
２：細胞融合液導入流路
３：導電線
４：シリンジＡ
５：交流電源
６：シリンジＢ
７：シリンジＣ
８：絶縁体
９：微細孔
１０：誘電泳動力
１１：電気力線の集中部位
１２：電気力線
１３：細胞融合容器
１４：上部電極
１５：下部電極
１６：スペーサー
１７：細胞融合液導入切替え機構
１８：第１の細胞
１９：導入口
２０：排出口
２１：バルブ
２２：第２の細胞
２３：ＩＴＯ
２４：パイレックス（登録商標）ガラス
２５：レジスト
２６：露光用フォトマスク
２７：露光
２８：現像液
２９：導入流路
３０：排出流路
３１：ピーク電圧
３２：融合細胞
３３：現像液
３４：シリンジＤ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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