(57)【要約】      （修正有）【課題】比較的小さな（分子量が約１０００Ｄａ程度の）分子を、迅速かつ簡単に分離（又は濃縮）できるタンパク質膜を提供する。【解決手段】強健で柔軟な自立性のある超薄（ナノ）若しくは薄い純タンパク質膜は、金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）硝酸塩若しくは塩酸塩の希薄液を中性若しくは弱塩基性ｐＨに保ち、その金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）水酸化物ナノストランドを自発的に形成させ、得られた金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）水酸化物ナノストランドとタンパク質溶液とを混合し、タンパク質と金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）水酸化物ナノストランドとでできたコンポジット・ナノファイバーを得、得られたコンポジット・ナノファイバーの分散液をフィルター上で濾過し、コンポジット・ナノファイバーに含まれるタンパク質を二官能性架橋剤によって架橋させ、上記反応物から金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）水酸化物ナノストランドを除去する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
柔らかで自立性がある超薄（ナノ）の若しくは薄いタンパク質膜であって、前記タンパク質は二官能性の架橋剤で架橋されているタンパク質膜。
【請求項２】
請求項１のタンパク質膜において、膜厚みは１０ｎｍ〜１０μｍで均一であるタンパク質膜。
【請求項３】
請求項１又は２のタンパク質膜において、二官能性の架橋剤がグルタールアルデヒドであるタンパク質膜。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかのタンパク質膜において、前記タンパク質はフェリチン、アポフェリチン、チトクロームｃ、ミオグロビン又はグルコース・オキシダーゼから選ばれるタンパク質膜。
【請求項５】
上記柔らかで自立性がある超薄（ナノ）の若しくは薄いタンパク質膜の製造法であって、以下の工程を含む製造法： 
（１）金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）硝酸塩若しくは塩酸塩の希薄液を中性若しくは弱塩基性ｐＨに保ち、その金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）水酸化物ナノストランドを自発的に形成させる；
（２）得られた金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）水酸化物ナノストランドとタンパク質溶液とを混合し、タンパク質と金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）水酸化物ナノストランドとでできたコンポジット・ナノファイバーを得る；
（３）得られたコンポジット・ナノファイバーの分散液をフィルター上で濾過する；
（４）コンポジット・ナノファイバーに含まれるタンパク質を二官能性架橋剤によって架橋する；そして
（５）上記反応液から金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）水酸化物ナノストランドを除去する。
【請求項６】
請求項５の製造法において、前記二官能性架橋剤としてグルタールアルデヒドを用いるタンパク質膜の製造法。
【請求項７】
請求項５又は６の製造法において、前記タンパク質としてフェリチン、アポフェリチン、チトクロームｃ、ミオグロビン又はグルコース・オキシダーゼを用いるタンパク質膜の製造法。
【請求項８】
一つの層は請求項１〜４のいずれかのタンパク質膜であり、他の一つの層は前記タンパク質膜上に所定の分子を堆積させ、二官能性架橋剤で架橋させて形成させた薄い分子膜である、二層から成る自立性薄膜。
【請求項９】
請求項８の自立性薄膜において、前記所定の分子が末端アミノ基を有するデンドリマーである自立性薄膜。
【請求項１０】
請求項９の自立性薄膜において、前記デンドリマーの分子量が２，０００以上のポリアミドアミンである自立性薄膜。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子量の大きい分子はもとより、比較的小さな分子量（約１０００程度）の分子を迅速かつ単純に分離（又は濃縮）できる「柔らかで自立性がある超薄（ナノ）若しくは薄いタンパク質膜」に関するものである。本発明は、また、上記タンパク質膜の製造法あるいは上記タンパク質膜の応用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、膜（メンブレン）は、海水からの飲料水の製造、産業廃水の浄化、貴重成分の回収、食品・医薬品産業における高分子混合物の濃縮、精製又は分画、そして気体や蒸気の分離のために、実際に広く応用されている。膜は、エネルギー変換システム、人口臓器あるいはドラッグデリバリー（医薬運搬）デバイスにおける重要な構成要素でもある。しかし、分離操作における膜の広範な使用は、高い選択性があって、分離物質の高い純度、操作性の低コスト、及び高透過性をもたらす好ましい組合せの膜を調製すること（即ち、膜の高い流束のみならず、膜面積及び製造コストを削減させること）が困難なため制約があった。膜の高い流量（フラックス）は、膜システムのコストを決定する鍵となる基本性能である。しかし不運にも、従来のポリマー膜材料の選択性が増加するほど、透過性は例外なく減少し、その逆も同様である。そして、流量を上げるために膜厚を減少させると、膜の安定性も劇的に減少する。ポリマーの機械的伸縮性や操作性と、空間的に厳密なゼオライト孔のサイズ選択性とを組み合わせ、先の制約を克服するために有機ポリマーにミクロンサイズの多孔性ゼオライト粒子を添加する試みが探求されてきた(Lai, Z. P. et al, 2003)。しかしながら、この方向での商業化は、ポリマー／ゼオライトの低接着性、不適切な粒子分散及び膜の低流量（低フラックス）によって妨げられてきた。
【０００３】
特異な構造及び形態をもつ新しいナノ構造材料の発展は、ガス分離のために高度に制御可能な選択性及び透過性を有する膜の調製に強力なツールを提供している(Lai, Z. P. et al, 2003; De Vos, R. M. et al, 1998; Merekel, T. C. et al, 2002; Shiflett, M. B. et al, 1999)。今日まで、ナノコンポジット膜の殆どは１００ｎｍよりも大きな厚さで、支持層を有し、それが膜の流量（フラックス）、分離効率、及びマクロスケールの応用（特に液体分離系の応用）をかなり制限している(Holt, J. K. et al, 2006 ; Jirage, K. B. et al, 1997)。超薄（数十ｎｍ程度の厚み）の自立性フィルムは従来から幾つか報告されており（Yang, H. et al, 1996; Mamedov, A. A. et al, 2002; その他）、センサーやアクチュエータに用いられている。しかしながら、これらの分離操作についての報告は、機能性や作業性の欠陥に因るためか無い。但し、例外として、サイズに基づく巨大分子の分離に超薄ナノメンブレンを用いた最初の例に、精確なシリコン堆積とエッチング技術及び高温（約７００℃）熱アニーリングプロセスによって調製された厚み１５ｎｍの自立性シリコン膜を用いたStriemerとその共同研究者の報告があるのみである(Striemer. C. C. et al, 2007)。
【０００４】
本発明者らの研究室では、単純な濾過と剥離技術によって、マイナス電荷の色素分子（非特許文献１参照）、ＤＮＡ（非特許文献２参照）、あるいはプラス電荷の金属水酸化物ナノストランド（非特許文献３参照）でできた繊維性ナノコンポジット構造を有する、マクロスケールで超薄の自立性メソポーラス膜の一般的合成法を開発してきた。しかし不運にも、これらの繊維性ナノコンポジットフィルムは金属水酸化物ナノストランドの化学的安定性が低いために、脆くて簡単に壊れた。そこで、ナノストランドを（ポリアニリンやポリピロール等の）共役ポリマーでコートし、生理的条件下にタンパク質をサイズ選択的に分離するメソポーラスな超薄フィルムを生成させた(Peng, X. S.et al, 2007)。しかし、そのようなフィルムは、ｐＨ４よりも低い酸性溶液条件下では（自身を）支持することができなかった。
【０００５】
【非特許文献１】Luo, Y.-H., Huang, J., Ichinose, I. “Bundle-like assemblies of cadmium hydroxide nanostrands and anionic dyes” J. Am. Chem. Soc. 127, 8296-8297 (2005).
【非特許文献２】Ichinose, I., Huang, J., Lou, Y.-H. “Electrostatic trapping of double-strand DNA by using cadmium hydroxide nanostrands” Nano Lett. 5, 97-100 (2005).
【非特許文献３】Ichinose, I., Kurashima, K., Kunitake. T. “Spontaneous formation of cadmium hydroxide nanostrands in water” J. Am. Chem. Soc. 126, 7162-7163 (2004).
【非特許文献４】Luo, Y.-H. et al. “Formation of positively charged copper hydroxide nanostrands and their structural characterization” Chem. Mater. 18, 1795-1782 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記した繊維性ナノコンポジットの問題点を解決するために、本発明者らはプラス電荷の金属水酸化物ナノストランドをタンパク質でコートする方法を更に検討した。そして、繊維性コンポジット中のタンパク質をグルタールアルデヒド（ＧＡ）によって共有結合で架橋させ、その後、無機ナノストランドを除去することによって、幸いにも、強健で柔軟な自立性のある超薄（ナノ）若しくは薄い純タンパク質膜を開発することに成功することができた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
〔発明の概要〕
すなわち、本発明は、柔らかで自立性がある超薄（ナノ又はｎｍスケール）若しくは薄いタンパク質膜であって、前記タンパク質は二官能性架橋剤で結合（架橋）されているタンパク質膜を提供する。ここで、本明細書において、“膜”とは“フィルム”と同じ意味であり、“自立性”とは“自己支持性”と同じ意味である。
【０００８】
また、本発明は、上記柔らかで自立性がある超薄（ナノ）若しくは薄いタンパク質膜の製造法も提供する。その製造法は、以下の工程を含んでいる：
（１）金属水酸化物ナノストランドを形成させる工程：すなわち、金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）硝酸塩若しくは塩酸塩の希薄液を中性若しくは弱塩基性ｐＨに保ち、その金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）水酸化物ナノストランドを自発的に形成させる；
（２）タンパク質と上記金属水酸化物ナノストランドでできたコンポジットナノファイバーを得る工程：すなわち、得られた金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）水酸化物ナノストランドとタンパク質溶液とを混合し、タンパク質と金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）水酸化物ナノストランドとでできたコンポジットナノファイバーを得る；
（３）濾過する工程：すなわち、得られたコンポジットナノファイバーの分散液をフィルター上で濾過する；
（４）架橋する工程：すなわち、コンポジットナノファイバーに含まれるタンパク質を二官能性架橋剤によって結合（架橋）する；そして
（５）金属水酸化物を除去する工程：すなわち、上記反応物から金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）水酸化物ナノストランドを除去する。
【０００９】
また、本発明は、上記自立性がある超薄若しくは薄いタンパク質膜のいくつかの応用も提供する。一つの応用として、一つの層は上記タンパク質膜であり、他の一つの層は前記タンパク質膜上に所定の分子を堆積させ、二官能性架橋剤で架橋させて形成させた薄い分子膜である二層から成る自立性薄膜が本発明で提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の、柔らかで自立性がある超薄（ナノ）若しくは薄いタンパク質膜は、新規なものである。（タンパク質としてアポフェリチンを使った）ある例では、得られたタンパク質膜は、厚みが均一な２５ｎｍで、直径が７．５ｃｍであり、直径／厚みの比は３，０００，０００（このような高い比率はかつて報告されたことがない）を示す膜であった。
本発明の、柔らかで自立性がある超薄（ナノ）若しくは薄いタンパク質膜は、小分子量（約１，０００又はそれ以下）の分子のサイズ選択的分離に応用できる。それらは、更には、ｐＨ制御下の分子の効率的分離や、ｐＨを変動させながらの色素分子の可逆的吸着及び脱着にも、非常に高い容量（モル比）をもって応用できる。
本発明の製造法によれば、上記柔らかで自立性がある超薄（ナノ）若しくは薄いタンパク質膜を容易に製造できる。
本発明の、一つの層は上記タンパク質膜であり、他の一つの層は前記タンパク質膜上に所定の分子を堆積させ、二官能性架橋剤で架橋させて形成させた薄い分子膜である二層から成る自立性薄膜は、新規な多層膜であり、上記柔らかい自立性のある超薄（ナノ）若しくは薄いタンパク質膜とは異なった使い方ができるであろう。
【発明の実施の形態】
【００１１】
〔発明の更に詳しい説明〕
先ず、自立性がある超薄（ナノ）若しくは薄いタンパク質膜の製造法を詳細に説明する。本発明の製造法は、上で述べたように、以下の各工程を含んでいる。
（１）金属（Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎ）水酸化物ナノストランドを形成させる工程； 
（２）タンパク質と上記金属水酸化物ナノストランドでできたコンポジットナノファイバーを得る工程； 
（３）濾過する工程； 
（４）架橋する工程；そして
（５）金属水酸化物を除去する工程。
ここで、必ずしも上記順に行なう必要はないが、上記順、すなわち、（１）→  （２）→（３）→（４）→（５）の順がもっとも好ましい。
更には、工程（４）（架橋する工程）の後に、タンパク質と金属水酸化物とでできたコンポジットナノファイバーを剥離する工程を付け加えることもできる。
【００１２】
本発明では色々な種類のタンパク質を使用できる。フェリチン、アポフェリチン、チトクロームｃ、ミオグロビン、及びグルコースオキシダーゼ（言うまでも無く、他のタンパク質を使うことも可能である）を使った例を後に示す。単一のタンパク質に限らず、混合されたタンパク質も使えるが、膜の均一性を期待できる点から単一のタンパク質の使用が好ましい。
【００１３】
自立性がある超薄（ナノ）若しくは薄いタンパク質膜の典型的な製造プロセスのスキームを図１に示した。
最初の工程（金属水酸化物ナノストランドを形成させる工程；ただし、ここでは図示されず）においては、ほかのところで（非特許文献３、４参照）示したようにして、ポリマー様プラス電荷の金属水酸化物ナノストランドを調製した。簡単に述べれば、Ｃｄ、Ｃｕ又はＺｎの硝酸塩（Ｃｄ又はＺｎでは塩酸塩も可）の希釈溶液に、希釈アルカリ液を添加して、ｐＨを中性又は弱アルカリ性（ｐＨ＝６．０−８．５）とし、そのまま室温で数分乃至は一日間放置し、金属水酸化物ナノストランド（その太さ径は約２−３ｎｍ、その長さは数十μｍに達する）を自発的に形成させる。
【００１４】
得られた金属水酸化物ナノストランドをマイナス電荷をもつタンパク質の水溶液と共に所定の時間混合すると、タンパク質と金属水酸化物ナノストランドとでできたコンポジットナノファイバー分散液を生成する。得られた分散液を、孔径が２００ｎｍ（空隙率が約１０％）のポリカーボネート（ＰＣ）膜のようなフィルターの上で濾過し、コンポジットナノ繊維性フィルムを形成させる。次に、得られたフィルムを二官能性架橋剤の溶液（例えば、１０重量％グルタールアルデヒド水溶液）で十分な時間処理し、架橋反応を完了させる。
グルタールアルデヒドを使用した場合の反応は以下の通り。
（化１）
Protein-NH2 + O=CHC3H6HC=O → 
Protein-N=CHC3H6HC=N-protein + 2H2O
グルタールアルデヒドに代えて、他の二官能性架橋剤、例えば、タンパク質の二官能性架橋剤としてよく知られている種々のイミドエステル類、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、あるいはカルボジイミド類を使うこともできる。
【００１５】
図１に、これら架橋されたナノ繊維性コンポジット膜の剥離例が示されている。この剥離のために、上記膜付きフィルターをアルコール（例えば、エタノール）に浸漬させて、自立性を有する架橋膜を得ることができる。  
引き続いて、自立性を有する上記架橋膜を塩酸溶液のような鉱酸水溶液中に浸し、金属水酸化物ナノストランドを除去する。次に、精製水を用いて過剰の金属イオン及び塩酸を洗い去る。このようにして、純粋な（すなわち、金属水酸化物を含まない）、水中に浮遊する自立性タンパク質膜を得ることができる。更に応用若しくは評価するために、これら膜をアルコール中に保存することができる。
【００１６】
タンパク質膜の厚みは、濾過される繊維性コンポジット液の容量を調節することで、１０ｎｍから１０μｍの範囲で容易に制御できる（実施例３、表１参照）。
対象となる材料の迅速且つ簡便な分離（又は濃縮）を行なうために、タンパク質膜の厚みは、好ましくは１５ｎｍ〜１０００ｎｍ、更に好ましくは２０ｎｍ〜１０００ｎｍである。所定濃度の繊維性コンポジットを濾過しようとするとき、タンパク質膜厚み及びその濾過操作の時間は濾過液の容量に直線的に依存する。
タンパク質膜の大きさ（直径）は、制約されない。なぜなら、タンパク質膜の直径は基本的には漏斗の大きさ（内径）によって決まるからである。
【００１７】
上記自立性がある超薄（ナノ）若しくは薄いタンパク質膜は種々の応用がある。上で述べたように、ひとつの応用は、一つの層が上記タンパク質膜であり、他の一つの層が前記タンパク質膜上に所定の分子を堆積させ、二官能性架橋剤で架橋させて形成させた薄い分子膜である二層から成る自立性薄膜の調製である。
ここで、「所定の分子」として、合成高分子のような構造の分かった種々の分子で上記タンパク質膜の通路を通過できない程度に大きい分子量を有する分子を使うことができる。そのような合成高分子として、例えば、末端アミノ基を有するデンドリマーを使うことができる。そして、そのようなデンドリマーとしては、分子量が約２，０００以上（上記タンパク質膜の通路を通過できないような大きさ）のポリアミドアミンが好ましく用いられる。
【実施例】
【００１８】
実施例で用いた材料は、次の通り。ＣｄＣｌ２・２．５Ｈ２Ｏ、Ｃｕ（ＮＯ３）２・３Ｈ２Ｏ、２−アミノエタノール、ダイレクトイェロー  ５０、エバンスブルー、８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸二ナトリウム塩、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、塩化水素（５Ｍ溶液）及びグルタールアルデヒド（５０重量％水溶液）は関東化学から購入した。テトラキス（１−メチルピリジニウム−４−イル）ポルフィン  ｐ−トルエンスルホン酸、８−オクタノイルオキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム塩、銅フタロシアニンテトラスルホン酸四ナトリウム塩、グルコースオキシダーゼ、チトクロームｃ、ミオグロビン、ウマ脾臓フェリチン（７６ｍｇ／ｍｌ溶液）及びアポフェリチン（３８ｍｇ／ｍｌ溶液）はシグマ−アルドリッチ社から購入した。脱イオン水（１８．２ＭΩ）はミリポア社のダイレクト−Ｑ  システムにより製造し、実験全体を通して用いた。自立性膜の調製のために、ポリカーボネート（ＰＣ）膜及び直径２．５ｃｍ、４．７ｃｍ、及び９．０ｃｍのフィルタ（ヌクレポア、ワットマン社）を用いた。アルミナメンブレン（アノディスク、孔径０．２μｍ、直径２．５ｃｍ、厚み６０μｍ）もまたワットマン社から購入した。
【００１９】
使用した器具及び方法は以下の通り。得られた膜は走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ−４８００）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ  １０１０）及びエネルギー分散性Ｘ線分析系を備えた高分解能透過型電子顕微鏡（ＨＲ−ＴＥＭ、ＪＥＭ  ２１００Ｆ）によって特性評価した。ＴＥＭ及びＨＲ−ＴＥＭ観察用のサンプルは、炭素でコートしたグリッドの上にこの自立性膜を移すことにより準備した。ＳＥＭ観察は、Ｈｉｔａｃｈｉ  ｅ−１０３０イオンスパッターを用いて、１０Ｐａの圧力、１０ｍＡの電流密度で、白金層を２ｎｍの厚みにコートした後に行なった。紫外可視吸収スペクトルは、ＳＨＩＭＡＺＵ  ＵＶ−３１５０スペクトロフォトメータを用いて得た。フォトルミネッセンススペクトルは、ＪＡＳＣＯ  ＥＰ−６５００スペクトロフォトメータにより得た。磁性は超伝導干渉デバイスを備える市販の磁気計（ＭＰＭＳ−ＸＬ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｅｓｉｇｎ）を用いて測定した。機械的性質は、ＴｒｉｂｏＩｎｄｅｎｔｅｒ（Ｈｙｓｉｔｒｏｎ社）を用い、シリコン基板付きダイアモンド製Ｂｅｒｋｏｖｉｔｃｈインデンターを使って測定した。分子の大きさは、Ｃｈｅｍ３Ｄウルトラ１０．０（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）により測定した。
【００２０】
〔実施例１〕  本発明のタンパク質膜の調製及び特性評価
（ａ）調製
最初に、ポリマーのようなプラス電荷をもつ水酸化カドミウムナノストランドを文献（非特許文献２−４参照）に記載した方法により調製した。簡単に言えば、希カセイソーダ液又はアミノエタノール溶液（２ｍＭ，２０ｍＬ）を、４ｍＭ硝酸カドミウム水溶液２０ｍＬの中に投じてすばやく混合し、更に数分間撹拌して、水酸化カドミウムナノストランドを調製した。
得られた水酸化カドミウムナノストランド分散液に、タンパク質（フェリチン、アポフェリチン、チトクロームｃ、ミオグロビン、又はグルコースオキシダーゼ）を加え、そして３０分間撹拌した。フェリチンとアポフェリチンの場合は、その混合液は、３．８ｍｇ／ｍＬのタンパク質液１ｍＬと水酸化カドミウムナノストランド分散液２０ｍＬとでできている。チトクロームｃ、ミオグロビン及びグルコースオキシダーゼの場合は、その混合液は、６．４ｍｇ／ｍＬのタンパク質液１ｍＬと水酸化カドミウムナノストランド分散液２０ｍＬとを混ぜてできている。
【００２１】
その混合物の所定量をポリカーボネート膜（濾過に使用した膜／漏斗の直径：３．２ｃｍ）上で、ゲージ圧（差圧）９０ＫＰａのもとに濾過した。次いで、その膜を１０重量％グルタールアルデヒド水溶液中に浸し、室温で１時間、架橋反応させた。これら架橋反応後のナノ繊維性コンポジットフィルムは、フィルム付きＰＣメンブレンをエタノールに浸漬し、剥離して得た。得られた自立性膜を１０ｍＭ塩酸溶液中に３時間浸漬し、無機のナノストランドを除き、次いで、ミリ−Ｑ精製水を用いて過剰のカドミウムイオン及び塩酸を洗い去った。このようにして、５種類の、各々水に浮遊する純粋な自立性タンパク質（フェリチン、アポフェリチン、チトクロームｃ、ミオグロビン、又はグルコースオキシダーゼ）膜を得た。
【００２２】
（ｂ）特性評価
図２は、架橋反応後の、フェリチン／水酸化カドミウムナノストランドのナノ繊維性フィルムのＴＥＭ像であり、この像から繊維性構造が明らであり、また、タンパク質は殆どがナノストランドに沿って集まっていることが分かる。この像で、フェリチンタンパク質は、フェリチンの鉄化合物コアに起因して直径が約８ｎｍの黒点のように見える。水酸化カドミウムナノストランドは（太さ）約２ｎｍの繊維構造のように見える。
図３は、図２で示されたフェリチン／水酸化カドミウムナノストランドのナノ繊維性フィルムから水酸化カドミウムナノストランドを除去した後の、純フェリチン膜のＴＥＭ像である。この像では繊維性構造は消失しており、そのことはナノストランドが完全に除去されたことを意味する。
【００２３】
図４は、直径７．５ｃｍの、自立性があるフェリチン膜の写真の写しである。この膜の直径は濾過に用いた漏斗のサイズに等しい。
【００２４】
ＳＥＭ及びＥＤＸを用いて、水酸化カドミウムナノストランドを除去する前及び後の膜の形態及び組成を更に詳細に調べた。自立性膜を孔径２００ｎｍの陽極アルミナメンブレンの上に移した。
図５は、水酸化カドミウムナノストランドを除去する前のフェリチン／水酸化カドミウムナノストランド膜（厚み：４０ｎｍ）のＳＥＭ断面像（ａ）及びＳＥＭ平面像（ｂ）であり、図６は、水酸化カドミウムナノストランドを除去した後のフェリチン膜（厚み：４０ｎｍ）のＳＥＭ断面像（ａ）及びＳＥＭ平面像（ｂ）である。
図５ａと図６ａとを比べると、膜の厚みに大きな違いはなく、すなわち、ナノストランドを除去した後に膜厚の減少はなかった。これは、ナノストランド除去に起因する崩壊がないことを意味している。しかし、ナノストランド除去後の膜表面は、ナノストランド除去前のそれよりも滑らかになっている（図５ｂと図６ｂとを比較せよ。）
【００２５】
図７は、水酸化カドミウムナノストランドを除去する前及び除去した後の架橋フィルムから記録されたＥＤＸスペクトルを示している。これらのＥＤＸスペクトルは、カドミウム元素が膜から完全に除去されたことを裏付けているが、これは前述のＴＥＭによる検討結果と矛盾していない。天然フェリチン（架橋なし）と本発明で得られた純フェリチン膜の各々のＦＴＩＲスペクトルを図８に示した。特徴的ピークは両者殆ど同じであるが、ピーク強度はフェリチン膜のほうが天然フェリチンよりも強い。ピーク位置が同じであることは、架橋反応のあいだに膜中へ新しい官能基が何も導入されなかったからである。約１６６０ｃｍ−１でのピーク強度の増加は、架橋反応のあいだにおけるＣ＝Ｎ共有結合の形成に由来する(Rozkiewicz, D. I. et al, Chem. Eur. J. 12, 6290-6297,2006)。これらの結果は、タンパク質が変性していないことを示している。
【００２６】
付言すれば、水酸化カドミウムナノストランドは、これを除くことによってタンパク質膜に悪影響を及ぼさないとしても、水酸化カドミウムナノストランドと同様な性質を有し、それよりももっと安全な水酸化銅ナノストランドや水酸化亜鉛ナノストランドのようなナノストランドもまた使うことができ、自立性タンパク質膜を調製できる（データはここに示さないが）。
【００２７】
〔実施例２〕  いろいろな厚み及び直径のタンパク質膜の制御合成
（ａ）調製
濾過時間及び／又は濾過液量を変え、また、用いた膜／漏斗の直径を１．７ｃｍ、３．２ｃｍ又は７．５ｃｍとしたほかは実施例１と同様にして、自立性がある超薄の純タンパク質膜を調製した。結果を表１に示した。
【００２８】
【表１】
2009131725.tif 000002
ここで、Vmixturea  は、フェリチン又はアポフェリチンタンパク質３．８ｍｇ／ｍｌ（他のタンパク質では６．４ｍｇ／ｍｌ）溶液２ｍｌと水酸化カドミウムナノストランド液４０ｍｌとからつくられた混合物を供給源として、そのときの混合物の濾過容量を意味する。タンパク質膜の厚みは、断面ＳＥＭ像から測定した。
【００２９】
（ｂ）特性評価
得られた膜は、肉眼観察（又は写真）と共にＳＥＭ像及びＴＥＭ像（ここには示さず）とによって評価した。これらの結果から、タンパク質膜の厚み及び濾過操作の時間は、濾過液量に直線的に依存することが分かる。これらの例では、１．７ｃｍ、３．２ｃｍ及び７．５ｃｍの三つの直径で薄膜が得られた。そしてまた、フェリチンの場合に１．７ｃｍの直径で最も薄い厚みの４０ｎｍであり、３．２ｃｍ及び７．５ｃｍの直径で各々６０ｎｍの厚みであった。最も厚いものは、１．７ｃｍの直径で濾過時間が１時間のものであり、４０００ｎｍに達した。すなわち、フェリチンの場合は、フェリチン膜の厚みは４０ｎｍから４０００ｎｍまでの範囲で制御可能である。
水酸化カドミウムナノストランド除去前の厚み６０ｎｍ、２００ｎｍ、６００ｎｍ及び４０００ｎｍの膜を比較すると、膜厚みが大きいほどその色は深かった。水酸化カドミウムナノストランドを除去した後も、対応する膜の厚みは殆ど変わらなかった。これは、ナノストランドを除去した後の膜は堅く結合されているのではなく、より多孔性の膜となっていることを示している。
【００３０】
もう一つのタンパク質のアポフェリチンの場合には、得られたアポフェリチン超薄タンパク質膜は、直径７．５ｃｍ（Ｎｏ．１２）のときさえも、２５ｎｍの均一な厚みであった。厚みに対する直径の比率は、３，０００，０００倍にも達した。ＴＥＭ像（ここには示さない）は、その膜がｎｍスケールの非常に柔らかいものであることを示している。この極端なマクロスケールの柔軟性は、直径７．５ｃｍのアポフェリチン自立性膜を先端が０．８ｍｍ穴径のピペット中へ吸い込むことによって裏付けられた。このタンパク質膜が、その面積（大きさ）の８７９０倍も小さな穴を可逆的に通り抜けることができたのは驚くべきことであった。これは、そのタンパク質膜の柔軟かつ極端な薄さに因るものである。
【００３１】
水酸化カドミウムナノストランド除去前及び後の、厚み１５００ｎｍのフェリチン及びアポフェリチン膜の各々の機械的特性を、ダイアモンドＢｅｒｋｏｖｉｔｃｈインデンターを用い、Ｔｒｉｂｏｉｎｄｅｎｔｅｒ（Ｈｙｓｉｔｒｏｎ社）を用いるナノインデンターにより、各々、測定した。これらに対する典型的な負荷−脱負荷曲線を図９に示した。それぞれのサンプルで３回測定し、その平均値を求めた。硬度（Ｈ）及びヤング率を表２に示す。
【００３２】
【表２】
2009131725.tif 000003
a  ポアッソン割合は０．５で、ヤング率の計算に用いた。    
b  n1は測定点のナンバーを示し、n1、n2及びn3は３点での測定を意味する。
c  Avgは３点での測定値の平均値を意味する。
d  (前)は水酸化カドミウムナノストランド除去前を意味する。
e  (後)は水酸化カドミウムナノストランド除去後を意味する。
【００３３】
水酸化カドミウムナノストランド除去前の膜の硬度及びヤング率は、ナノストランド除去後のそれよりも大きいと結論できる。同時に、フェリチン膜の硬度及びヤング率はアポフェリチン膜のそれよりも大きい。ナノストランド除去前後の膜におけるこれらの相違は、タンパク質膜の機械特性の増強が無機成分とタンパク質との間の相互作用から生じていることを示している。同時に、フェリチンにおける鉄化合物はフェリチン膜をアポフェリチン膜よりも高い硬度及びヤング率をもつ膜にしている。フェリチン膜、アポフェリチン膜の硬度及びヤング率の値は、従来報告されたゼラチン、大豆、カゼインあるいはソジウムカゼイネート等のグリオキサール架橋構造の天然タンパク質膜（Vaz, C. M. et al, J. Mater. Sci.: Mater. in Medicine 14, 789-796 ,2003）の値よりも１０倍高く、グルタールアルデヒド架橋構造の大豆タンパク質膜(Chabba, S. et al, J. Mater. Sci. 40, 6263-6273, 2005)よりも４倍高い。
【００３４】
我々は、更には、内径が５ｍｍで外径が７ｍｍのプラスチックチューブの穴を厚み６０ｎｍの膜でシールし、この上に内径が７ｍｍで外径が１０ｍｍの別のプラスチックチューブを連結し、次いで、大きいほうのプラスチックチューブにダイレクトイェローのエタノール溶液を注意深く注ぎ込み、これを垂直に維持した。そのような膜は、２１ｃｍのエタノールカラムを支持できた（これより、明らかなエタノールの透過無しに、膜自体の重量の約１８０，０００倍の重量が支持されたと計算できる）。
【００３５】
フェリチンあるいはアポフェリチン膜からナノストランドが除かれたときの膜は、厚み１５５０ｎｍの膜における肉眼観察では更に柔軟になっている（写真は示さず）。この現象は、ナノストランド除去後のこれらタンパク質膜が酸性及び塩基性のいずれの条件下にも非常に安定であるばかりではなく、アセトン、ベンゼン及びクロロホルムのような有機溶媒にも非常に安定であり、膜を応用する上では望ましい特性である。
【００３６】
〔実施例３〕  分離、濃縮、吸収又は脱着への本発明のタンパク質膜の応用
これら自立性の純タンパク質膜の分離特性を、種々の大きさ、電荷状態及びｐＨ特性をもつ分子の透過を研究することによって、検討した。濾過操作は、９０ｋＰａの圧力下に行なった。その分子（を含む溶液）の容量は２０ｍｌである。流速は、有効面積及び操作時間によって規格化された透過液の容量に等しい。透過特性は、濾過前後の溶液、更には上部液について記録されたＵＶ可視吸収スペクトルによってモニターした。結果を表３にまとめた。
【００３７】
【表３】
2009131725.tif 000004
【００３８】
厚み６０ｎｍ、直径１．７ｃｍのフェリチン薄膜を用いることによって、分子サイズ選択的な分子の高速分離が達成された。PC/Cu(MW:984.25)やTMPyP dye(MW:1,363.6) 及びCyt. c(MW:13,000)のような大きな分子は、それらの水性媒体から完全に分離された。ANTS分子(MW:650.58) 及び [Fe(CN)6]3+イオン(MW:212)は膜を完全に通過した。ＤＹ（ダイレクトイェロー５０）(MW:956.82)及びＥＢ（エバンスブルー）(MW:960.81)分子は、中性ｐＨにおいて膜を部分的に通過した。しかしながら、ＤＹやＥＢ水溶液のｐＨを変える、すなわち、７より高いｐＨにすると、これらの色素分子はタンパク質膜を完全に通過し、３．１９より低いｐＨにすると、膜通過は阻害された。このようなｐＨ依存性はタンパク質の表面電荷性状に起因している。フェリチン及びアポフェリチンの場合、その等電点はいずれも同じの約４．４である。そのため、４．４よりも低いｐＨのときには膜はプラス電荷であり、マイナス電荷の色素分子を静電力により吸着し、膜孔（チャンネル）が狭まる。ANTS（8.23x7.0x3.17 A3）や[Fe(CN)6]3-（8.7x8.7x8.7 A3）のように分子が十分に小さいと、これらはこの狭まった膜孔（チャンネル）も通過できる。しかしながら、分子の大きさがこの狭まった膜孔（チャンネル）よりも大きいと膜を通過できない。もちろん、分子の大きさが（狭まっていない）膜孔よりも大きいと、どんなｐＨにおいても、その分子は膜を通過できない。ｐＨ１３．０３におけるＰＣ／Ｃｕ分子とＤＹ分子の混合液の透過実験では、ＤＹ分子は膜を完全に通過したのに対して、ＰＣ／Ｃｕ分子は殆ど通過できなかったことが示されている。しかし、（濾過）水の流速はすべてにおいて９０ｋＰａの圧力下で５，０００Lm-2h-1よりも大きかった。大きな分子は膜を通過しないので、希薄液からの濃縮が可能である。
【００３９】
例えば、ＰＣ／Ｃｕ分子溶液について調べた（図１０）。ＰＣ／Ｃｕ分子は、アルミナ膜上の６０ｎｍ厚のフェリチン膜を使い、９０ｋＰａの差圧で吸引することによって、２分以内に１０μＭから２８．８９μＭへと効果的に濃縮できた。濃縮操作の効率をモニターするためにＵＶ可視スペクトルを用いた。操作時間が長くなるほど上側の液は一層青くなったが、濾過液（通過液）にＰＣ／Ｃｕは検出されなかった。濾過液の流速は６６７１．９Lm-2h-1であった。
【００４０】
タンパク質の可逆的電荷特性に起因して、ｐＨがその等電点よりも高いか又は低いと、タンパク質は、異なるｐＨの溶液中において電荷をもつ分子又は粒子に対する吸収剤として用いることができ、ｐＨを変化させることによってこれら電荷をもつ分子又は粒子を他の溶液中へ放出することもできる。この研究のために、色素分子（エバンスブルーとＤＹ）の可逆的吸着及び脱着を検討した。溶液中のエバンスブルー分子の吸着及び脱着に、厚さ３００ｎｍ、直径３．２ｃｍのアポフェリチン膜を用い、その溶液のｐＨを制御した。ｐＨ１．５０のエバンスブルー（１０μＭ）溶液１０ｍＬ中の色素分子は、一日以内にそのタンパク質膜に完全に捕捉された。そして、これら捕捉された分子は、ｐＨ１３．０９のようなアルカリ性では再び液中へ放出された。この捕捉及び放出の過程は、ＵＶ可視スペクトロスコピーでモニターした。
【００４１】
図１１ａは、捕捉操作中のＵＶ可視スペクトルの時間経過の典型例を示している。図１１ｂは原液及び一日後の写真（写し）で、膜によって色素分子が溶液から完全に除去されたことが分かる。これはＵＶ可視スペクトルの結果と一致している。放出の実験結果は、図１２ａ及び図１２ｂに示した。２．５ｈ（１５０ｍｉｎ）後に、エバンスブルー分子の８３．５％が膜から溶液中へ放出された。時間が長くなるにつれ、多くの色素分子が溶液中に放出された。最初の放出サークルの最大速度は９４．５％で、これはＤＹ分子の放出速度（データは示さず）と似たものであった。しかし、その最初の捕捉及び放出サークルの後については、放出効率は後のサークルについて９９．４％であった。捕捉及び放出操作は、アポフェリチン膜の電荷特性のｐＨによる誘発に起因する。（すなわち）溶液のｐＨがアポフェリチンの等電点４．４よりも低いときは、その膜はプラスに帯電し、逆に、溶液のｐＨが４．４よりも高いときは、そのタンパク質膜はマイナスに帯電するであろう。それゆえ、４．４よりも低いｐＨの溶液においては、マイナス電荷の分子は静電力によって膜中に捕捉されるであろう。そうでない（溶液のｐＨが４．４よりも高い）場合は、マイナス電荷の色素分子は反発力によって膜から追いやられるであろう。エバンスブルー溶液のｐＨ１．５０における青色（図１１）及びｐＨ１３．０９における紫色（図１２）は、各々、色素分子自体の色によるものである。
【００４２】
吸着実験のもう一つの例を図１３に示した。１０μＭの８−オクタノイルオキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム塩（ＯＰＴＡＴ）溶液の１０ｍＬをｐＨ１．３９において、厚み３００ｎｍ、径３．２ｃｍのフェリチン膜に吸着させた。フォトルミネッセンス（ＰＬ）スペクトルは、７ｈ後には前記分子は全てフェリチン膜にトラップされて、膜のＰＬ強度は原液のそれよりも強いことが示されている。挿入の写真(コピー)は、膜を３７５ｎｍで励起して得たものである。
【００４３】
〔実施例４〕  二つの層、すなわち、一層がタンパク質膜、他の一層がその上に形成された分子薄膜の二層で構成された自立性薄膜の調製へ向けた、本発明のタンパク質膜の別の応用  
（ａ）タンパク質（アポフェリチン）膜の調製
タンパク質（アポフェリチン）膜の調製方法は、実施例１に記述の方法と同じ。
（ｂ）二つの層、すなわち、一層がタンパク質（アポフェリチン）膜、他の一層がそのタンパク質（アポフェリチン）膜表面上に形成された分子薄膜の二層で構成された自立性薄膜の調製
フィルタとして、孔径２００ｎｍのポリカーボネート膜の上に載せた厚み１．９μｍのアポフェリチン薄膜を吸引濾過系で用いた。デンドリマーＰＡＭＡＭ（ポリアミドアミン）分子（ジェネラル４、分子量：１４２１５、直径：４．５ｎｍ、表面のアミノ基数：６４、シグマ−アルドリッチ社から購入）の２重量％メタノール溶液２ｍｌを９０ｋＰａのゲージ圧（差圧）の下に、前記吸引濾過系で濾過した。濾過でメタノールを除去した後に、ＰＡＭＡＭ（ポリアミドアミン）分子の濾過ケーキを５重量％グルタールアルデヒド水溶液の１ｍｌによって１．５時間架橋反応させた。最後に、得られた膜をメタノール及び水で４回洗浄した。図１４は、１．９μｍ厚みのアポフェリチン膜表面上に形成された４．６μｍ厚みのＰＡＭＡＭ膜の典型的ＳＥＭ像である。
ＰＡＭＡＭ膜の厚みは、ＰＡＭＡＭ溶液の濾過液量によって制御できる。
更には、タンパク質膜に基づく同じ濾過操作及び架橋プロセスを用いることで、その他の分子膜もまた調製することができる。この方法は、例えば分離のような種々の応用のための機能性分子薄膜を構築する単純な方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】超薄（ナノ）若しくは薄くて自立性があるタンパク質膜の典型的製造プロセスを示す模式図。
【図２】架橋反応後の、フェリチン／水酸化カドミウムナノストランドのナノ繊維性フィルムのＴＥＭ平面像。
【図３】図２で示されたフェリチン／水酸化カドミウムナノストランドのナノ繊維性フィルムから水酸化カドミウムナノストランドを除去した後の、フェリチン膜のＴＥＭ平面像。
【図４】直径７．５ｃｍの、自立性があるフェリチン膜の写真の写し。
【図５】（ａ）水酸化カドミウムナノストランドを除去する前の、フェリチン／水酸化カドミウムナノストランド膜（厚み：４０ｎｍ）のＳＥＭ断面像。（ｂ）同、ＳＥＭ平面像。
【図６】（ａ）水酸化カドミウムナノストランドを除去した後のフェリチン膜（厚み：４０ｎｍ）のＳＥＭ断面像。（ｂ）同、ＳＥＭ平面像。
【００４５】
【図７】水酸化カドミウムナノストランドを除去する前（Before）及び除去した後（After）の架橋フィルムから記録されたＥＤＸスペクトル。
【図８】（ｉ）架橋前（no-cross link）、及び（ii）架橋後に水酸化カドミウムナノストランドを除去した後（cross-link remove CdOH）の、膜のＦＴＩＲスペクトル。
【図９】水酸化カドミウムナノストランドがある場合及び無い場合の、フェリチン膜及びアポフェリチン膜の各々の負荷（Loading）−脱負荷（Unloading）曲線の典型例。
【図１０】ＰＣ／Ｃｕに対する濃縮性能を示す典型的ＵＶ−可視スペクトルと写真の写し。
【図１１】アポフェリチン膜（厚み：３００ｎｍ、径：３．２ｃｍ）を使用した場合の、エバンスブルーの吸収（Absorption）を示す典型的ＵＶ−可視スペクトルと写真の写し。
【図１２】アポフェリチン膜（厚み：３００ｎｍ、径：３．２ｃｍ）を使用した場合の、エバンスブルーの脱着（Desorption）を示す典型的ＵＶ−可視スペクトルと写真の写し。
【図１３】フェリチン膜により脱着される蛍光色素分子を示すフォトルミネッセンス（ＰＬ）スペクトルの典型例。挿入の写真(コピー)は、波長３７５ｎｍの光照射の下に撮影。蛍光色素分子（ＯＰＴＡＴ）の構造は、図中の右下に示されている。
【図１４】アポフェリチン膜上に形成されたＰＡＭＡＭ膜（厚み：４．６μｍ）の典型的ＳＥＭ像。（ｂ）は（ａ）中において点線で囲った部分の拡大像を示す。
【符号の説明】
【００４６】
（図９中）１：（Ｃｄ）ナノストランド有りのアポフェリチン
２：（Ｃｄ）ナノストランド無しのアポフェリチン
３：（Ｃｄ）ナノストランド有りのフェリチン
４：（Ｃｄ）ナノストランド無しのフェリチン
【図１】
2009131725.tif 000005
【図２】
2009131725.tif 000006
【図３】
2009131725.tif 000007
【図４】
2009131725.tif 000008
【図５】
2009131725.tif 000009
【図６】
2009131725.tif 000010
【図７】
2009131725.tif 000011
【図８】
2009131725.tif 000012
【図９】
2009131725.tif 000013
【図１０】
2009131725.tif 000014
【図１１】
2009131725.tif 000015
【図１２】
2009131725.tif 000016
【図１３】
2009131725.tif 000017
【図１４】
2009131725.tif 000018
【外国語明細書】
[Title of the Invention]  
A flexible free-standing ultrathin or thin protein membrane, its fabrication method and applications
[Field of the Invention] 
[0001]
This invention relates to a flexible free-standing ultrathin(nano) or thin protein membrane which enables a rapid and simple separation(or condensation) of relatively small(M.W. ca.1,000) molecules as well as large molecules. This invention also relates to a fabrication method of the above protein membrane and relates applications of the above protein membrane.
[Background of the Invention]
[0002]
Today, membranes are widely and practically applied to produce potable water from sea, to clean industrial effluents and recover valuable constituents, to concentrate, purify or fractionate macromolecular mixtures in the food and drug industries, and to separate gases and vapors. They are also key components in energy conversation systems, and in artificial organs and drug delivery devices. Their widespread use in separations has, however, been limited by the difficulty of preparing membranes with the desirable combination of high selectivity, which yields high product purity and low operating costs, and high permeability, which reduces membrane area and capital cost, as well as the high membrane flux. Thus high membrane flux is the key performance criterion that determines the cost of a membrane system. Unfortunately, as the selectivity of conventional polymer membrane materials increases, permeability invariably decreases and vice versa; and as decreasing the thickness to increase the flux, the stability dramatically decreased. Attempts to overcome the first fundamental limitation have explored the addition of micron-sized porous zeolite particles to organic polymers in the hope of combining the mechanical elasticity and processability of polymers with the strong size selectivity characteristic of spatially well-defined zeolite pores(Lai, Z. P. et al, 2003). Commercialization of this approach, however, has been hampered by poor polymer/zeolite adhesion, inadequate particle dispersion and low membrane flux. 
[0003]
The developing of new nanostructured materials with specific configurations and morphology is offering powerful tools for the preparation of membranes with highly controllable selectivity and permeability for gas separation(Lai, Z. P. et al, 2003; De Vos, R. M. et al, 1998; Merekel, T. C. et al, 2002; Shiflett, M. B. et al, 1999). Up to date, nanocomposite membranes are almost keep the thickness more than hundred nanometers and with support layer, which significantly limit the membrane flux, separation efficiency and macroscale application, especially, for liquid separation system(Holt, J. K. et al, 2006 ; Jirage, K. B. et al, 1997) . Even several ultrathin (several tens nanometers thick) free-standing films were reported(Yang, H. et al, 1996; Mamedov, A. A. et al, 2002; others),and used for sensors and actuators, but without any report about their separation performance because of the lack of the functional designation and workability, except that  the first example for using ultrathin nanomembranes for size-based macromolecular separation was carried out by Striemer’ and coworkers by using 15 nm thick free-standing silicon membranes prepared by using precision deposition of silicon and etching techniques and thermal annealing process at high temperature (above 7000C)( Striemer. C. C. et al, 2007). 
[0004]
In our laboratory, we developed a general method to synthesize macroscale ultrathin free-standing mesoporous films with fibrous nanocomposite of negatively charged dye molecules(see non-patent ref. 1), DNA(see non-patent ref. 2), and positively charged metal hydroxide nanostrands(see non-patent ref. 3, non-patent ref. 4) by a simple filtration and peeling off techniques. Unfortunately, these fibrous nanocomposite films were fragile and easily destroyed due to the weak chemical stability of metal hydroxide nanostrands. Therefore, conjugated polymers(polyaniline, polypyrrole) was coated on nanostrands and formed mesoporous thin films for size selective separation of proteins in physiological conditions(Peng, X. S.et al, 2007). However, such film still can not be sustained in the solution with pH lower than 4.
[0005]
[non-patent ref. 1] 
Luo, Y.-H., Huang, J., Ichinose, I. “Bundle-like assemblies of cadmium hydroxide nanostrands and anionic dyes” J. Am. Chem. Soc. 127, 8296-8297 (2005).
[non-patent ref. 2] 
Ichinose, I., Huang, J., Lou, Y.-H. “Electrostatic trapping of double-strand DNA by using cadmium hydroxide nanostrands” Nano Lett. 5, 97-100 (2005).
[non-patent ref. 3] 
Ichinose, I., Kurashima, K., Kunitake. T. “Spontaneous formation of cadmium hydroxide nanostrands in water” J. Am. Chem. Soc. 126, 7162-7163 (2004).
[non-patent ref. 4] 
Luo, Y.-H. et al. “Formation of positively charged copper hydroxide nanostrands and their structural characterization” Chem. Mater. 18, 1795-1782 (2006)
[Disclosure of the Invention]
[Purpose of the Invention]
[0006]
In order to solve the above problems of the fibrous nanocomposite films, we have further studied the coating of positively charged metal hydroxide nanostrands with proteins. And fortunately we have succeeded in developing a robust and flexible free-standing ultrathin(nano) or thin pure protein membrane by covalently cross-linking the proteins in the fibrous composite films by glutaraldehyde (GA) and removing away the inorganic nanostrands. 
[Summary of the Invention]
[0007]
Namely, this invention provides a flexible free-standing ultrathin(nano or nanometer scale) or thin protein membrane in which proteins are cross-linked (bridged) by bifunctional cross-linkers. Here, “membrane” is synonymous with “film”, and “free-standing” is synonymous with “self-supporting” in this specification.
[0008]
This invention also provides a fabrication method for the above free-standing ultrathin or thin protein membrane, whosemethod comprises the following steps:
(1) Step of formation of metal hydroxide nanostrands:a dilute metal(Cd, Cu or Zn) nitrate or chloride solution is kept under neutral or weak basic pH to form spontaneously metal(Cd, Cu or Zn) hydroxide nanostrands.
(2) Step of obtaining composite nanofibers made of protein and the said metal hydroxide nanostrands:the above metal(Cd, Cu or Zn) hydroxide nanostrands and protein solution are mixed to obtain composite nanofibers made of protein and the said metal hydroxide nanostrands;
(3) Step of filtration:the obtained dispersion of composite nanofibers is filtered on a filter.
(4) Step of cross-linkage:proteins contained in the composite nanofibers are cross-linked(bridged) by bifunctional cross-linkers; and
(5) Step of removal of metal hydroxide nanostrands:metal(Cd, Cu or Zn) hydroxide nanostrands are removed from them.
[0009]
This invention also provides some applications of the above free-standing ultrathin or thin protein membrane. As one application, this invention provides thin free-standing films composed of two layers, one of which is the above protein membrane, the other one is a thin molecular membrane which is formed by stacking defined molecules on the said protein membrane and cross-linking with bifunctional cross-linkers.
[Effect of the Invention]
[0010]
The invented flexible free-standing ultrathin(nano) or thin protein membrane is novel. In some case(using apoferritin as protein), the obtained protein membranes showed the films with homogenous thickness of 25 nm, and diameter of 7.5cm, with the ratio of diameter to thickness up to 3,000,000(Such high ratio was not reported before). 
The invented flexible free-standing ultrathin(nano) or thin protein membrane can be applied for size selective separation of molecules having  small molecular weight(ca.1000 or less than 1000). They can be also applied for pH controlling separation of molecules with high efficiency, and pH trigging, reversible adsorption and desorption of dye molecules with very high capacitance of molar ratio. 
According to the invented fabrication method, we can easily fabricate the above flexible free-standing ultrathin(nano) or thin protein membrane.
The invented thin free-standing films composed of two layers, one of which is the above free-standing ultrathin(nano) or thin protein membrane, the other one is a thin molecular membrane are novel multilayer films, and therefore they may be used differently from the invented flexible free-standing ultrathin(nano) or thin protein membrane. 
[Detailed Description of the Invention]
[0011]
Firstly, we explain a fabrication method for the free-standing ultrathin(nano) or thin protein membrane in detail. The invented fabrication method comprises the following steps as mentioned above.
(1) Step of formation of metal(Cd, Cu or Zn) hydroxide nanostrands;
(2) Step of obtaining composite nanofibers made of protein and the said metal hydroxide nanostrands;
(3) Step of filtration;
(4) Step of cross-linkage; and
(5) Step of removal of metal hydroxide nanostrands.
Though we are not needed to process in the above order, but the above order, namely (1)→ (2) → (3) → (4) → (5), is most preferable. 
Furthermore, we can add an additional step of peeling-off of composite nanofibers made of protein and the metal hydroxide nanostrands after (4) step of cross-linkage.
[0012] 
We can widely use various kinds of protein in this invention. Later we show examples using ferritin, apoferritin, cytochrome c, myoglobin and glucose oxidase( needless to say, the other protein can also be used).  Mixed proteins can also be used as well as single protein, but single protein is preferable because we expect a good uniformity of membrane.  
[0013]
A scheme of a typical fabrication process for the free-standing ultrathin(nano) or thin protein membrane was shown in Fig.1. 
In the initial step(i.e. formation of metal hydroxide nanostrands; not illustrated here), polymer-like positively charged metal hydroxide nanostrands are prepared as we described elsewhere(non-patent ref. 3, 4). Briefly, pH of a dilute Cd, Cu or Zn nitrate (otherwise, Cd or Zn chloride) solution is raised up to neutral or weak basic(pH=6.0-8.5) by adding a dilute alkali solution, and kept it at room temperature for several minutes to one day resulting in spontaneous formation of metal hydroxide nanostrands, whose diameter is ca.2-3nm and whose length reaches several tens of micrometers. 
[0014] 
The obtained metal hydroxide nanostrands are mixed with negatively charged protein solution under stirring for defined hours, resulting in dispersion of composite nanofibers made of protein and the metal hydroxide nanostrands. The obtained dispersion is filtered on a filter such as polycarbonate(PC) membrane filter with 200 nm pores (porosity about10%), forming composite nanofibrous films. Then, the films are treated with a solution of bifunctional cross-linkers(such as 10wt% glutaraldehyde aqueous solution) for sufficient hours to complete cross-linkage reaction.
In case of using glutaraldehyde, the reaction is as followed.
Protein-NH2 + O=CHC3H6HC=O → 
Protein-N=CHC3H6HC=N-protein + 2H2O
We can also use other bifunctional cross-linkers, for example, various imidoesters, N-hydroxysuccinimide-esters or carbodiimides which are well known to be bifunctional cross-linkers of proteins, in substitution for glutaraldehyde. 
[0015]
In Fig.1, an example that these cross-linked nanofibrous composite films are peeled off is shown. In order to peel off, we can immerse the above filter with films in alcohol (e.g. ethanol) resulting in forming cross-linked free-standing films. 
Subsequently the above cross-linked free-standing films can be immersed in aqueous mineral acid such as HCl solution to remove the metal hydroxide nanostrands.  Then the excess metal ions and HCl can be washed away using purified water. Thus we can obtain the pure(namely, not containing metal hydroxide) free-standing protein membranes floating in water. We can store these membranes in alcohol for further application and characterization.
[0016] 
The thickness of the protein membrane can be easily controlled from 10nm to 10μm by adjusting the volume of the filtering fibrous composite solution(see Example 3, Table 1). 
In order to execute a rapid and simple separation(or condensation) of target materials, the thickness of the protein membrane is preferably 15nm〜1000nm, and more preferably 20nm〜1000nm. When a defined concentration of the fibrous composite are filtered, the thickness of the protein membrane and the time of the filtering process linearly depend on the filtering volume.
The diameter of the protein membrane is not limited, because the diameter of the film is basically determined by the inner diameter of the filtering funnel.
[0017] 
The above free-standing ultrathin or thin protein membrane has various applications. As described above, one application is a preparation of thin free-standing films composed of two layers, one of which is the above protein membrane, the other one is a thin molecular membrane which is formed by stacking defined molecules on the said protein membrane and cross-linking with bifunctional cross-linkers.
Here, as the defined molecules we can use various defined molecules such as synthetic macromolecules whose molecular weight is large enough not to go through the channels of the above protein membrane. We can use, for example, dendrimers having terminal NH2groups as the said synthetic macromolecules. Then, the dendrimers are preferably polyamidoamine whose molecular weight is over ca.2,000 (large enough not to go through the channels of the above protein membrane).
[Examples]
[0018]
Materials used in the following examples are followed. CdCl2・2.5H2O, Cu(NO3)2・3H2O, 2-aminoethanol, Direct Yellow 50, Evans Blue, 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid disodium salt, K3[Fe(CN)6], hydrogen chloride (5 M solution), glutaraldehyde (50 wt% aqueous solution) were purchased from Kanto Chemical. Tetrakis(1-methylpyridinium-4-yl)porphine p-Toluenesulfonate, 8-octanoyloxypyrene-1, 3, 6-trisulfonic acid trisodium salt, copper phthalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium salt, glucose oxidase, cytochrome c, myoglobin, horse spleen ferritin (76 mg/ml solution), and apoferritin (38 mg/ml solution) were purchased from Sigma-Aldrich. Deionized water (18.2 MΩ) was produced by a Millipore Direct-Q System, and used throughout the experiments. Polycarbonate(PC) membrane and filters (Nuclepore, Whatman) of 2.5 cm, 4.7 cm, and 9.0 cm in diameter were used for the preparation of free-standing films. Alumina membranes (Anodisc, pore size 0.2 μm, diameter 2.5 cm, thickness 60 μm) were also purchased from Whatman.
[0019]
Instruments and methods used are followed. The films were characterized by using a scanning electron microscope (SEM, Hitachi S-4800), a transmission electron microscope(TEM, JEOL 1010), and a high-resolution transmission electron microscopy(HR-TEM, JEM 2100F) equipped with an energy-dispersive X-ray analysis system. The specimens for TEM and HR-TEM observation were prepared by transferring the free-standing film on a carbon-coated TEM grid. SEM observation was conducted after coating 2-nm thick platinum layer by using a Hitachi e-1030 ion sputter at the pressure of 10 Pa and the current density of 10 mA. UV-vis absorption spectra were obtained by using a SHIMAZU UV-3150 spectrophotometer. The photoluminescence spectra were obtained by a JASCO FP-6500 spectrofluorometer. The magnetic properties were measured using a commercial magnetometer with superconducting interference devise(MPMS-XL, Quantum Design). Mechanical properties were measured by using TriboIndenter(Hysitron Inc.), employing a diamond Berkovitch indenter with silicon substrate. The molecular dimensions estimated by a Chem3D ultra 10.0 (Cambridge Scientific Computing). 
[0020]
Example 1  Preparation and characterization of the invented protein membrane
(a)Preparation 
In the initial step, polymer-like positively charged cadmium hydroxide nanostrands were prepared as we described elsewhere(non-patent ref. 2-4). Briefly, cadmium hydroxide nanostrands were prepared by quickly mixing a dilute NaOH or aminoethanol solution(2mM, 20mL) into 20mL of 4mM aqueous cadmium nitrate and stirring for a few minutes.
Protein(ferritin, apoferritin, cytochrome c, myoglobin, or glucose oxidase) was added into the above dispersion of cadmium hydroxide nanostrands and mixed under stirring for 30 mins. In the case of ferritin and apoferritin, the mixture was made of 1 ml, 3.8 mg/ml protein solution and 20 ml cadmium hydroxide nanostrand solution. In the case of cytochrome c, myoglobin, and glucose oxidase, 1 ml, 6.4 mg/ml protein solution mixed with 20 ml cadmium hydroxide nanostrand solution.
[0021]
A certain volume of the mixture was filtered on polycarbonate membranes(diameters of membrane/funnel used for filtration: 3.2 cm) by suction filtering process under gauge pressure(ΔP) of 90KPa. Then, the films were immersed into 10wt% glutaraldehyde aqueous solution and cross linked for 1 hour at room temperature. These cross-linked nanofibrous composite films were peeled off by immersing PC membrane with films in ethanol. The resulting free-standing films were immersed in 10 mM HCl solution for 3 hrs to remove the inorganic nanostrands and then the excess cadmium ions and HCl were washed away using milli-Q water. Thus we obtained five kinds of pure free-standing protein(ferritin, apoferritin, cytochrome c, myoglobin, and glucose oxidase) membranes floating in water respectively. 
[0022]
(b) characterization
Fig. 2 is TEM image of the ferritin/cadmium hydroxide nanostrands nanofibrous film after cross-linkage and this clearly shows that fibrous structures and the proteins almost assembled along the nanostrands. In this image, the ferritin proteins appear as black dots with diameter about 8 nm due to the iron compound cores of ferritin. The cadmium hydroxide nanostrands appear as about 2 nm fiber structures.
Fig. 3 is TEM image of the pure ferritin membrane after removal of metal hydroxide nanostrands from the ferritin/cadmium hydroxide nanostrands nanofibrous film shown in Fig. 2, and this shows that the fibrous structures were disappeared, which means that the nanostrands were completely removed. 
[0023]
Fig. 4 shows a copy of the photograph of a representative free-standing ferritin membrane with diameters of 7.5 cm.  The diameter of the membrane is equal to the size of the funnel using for filtration.
[0024]
The morphology and composition of the film before and after removal of cadmium hydroxide nanostrands were further examined in detail by using SEM and EDX. Free-standing films were transferred onto anodic alumina membranes with pore size 200 nm. 
Fig. 5 shows (a)cross-sectional and (b)top view SEM image of ferritin/cadmium hydroxide nanostrands film(thickness:40nm) before removal of cadmium hydroxide nanostrands, and Fig. 6 shows (a)cross-sectional and (b)top view SEM image of ferritin membrane(thickness:40 nm) after removal of cadmium hydroxide nanostrands.
Comparing Fig. 5a and Fig. 6a, the thickness of the films didn’t show big difference, namely, there was almost no decrease of thickness after removal of nanostrands. This means that there is no collapse due to the removal of nanostrands. But the surface of the film after removal of nanostrands becomes smoother than that of before removal of nanostrands(compare Fig. 5b and Fig. 6b). 
[0025]
Fig. 7 shows EDX spectra recorded from the cross-linked film before and after removal of cadmium hydroxide nanostrands. These EDX spectra confirmed that the cadmium element was completely removed away from the film which is consistent with the above TEM investigations. The FTIR spectra of native ferritin(no cross-linkage) and the obtained pure ferritin membrane were shown in Fig. 8. The characteristic peaks are almost the same, just the intensity of the peaks of ferritin membrane are stronger than that of native ferritin. The same position of peaks is because no any new functional group was introduced into the membrane during cross-linking process. The increasing of the intensity of the peaks at about 1660 cm-1is originated from C=N covalent bond formation during the cross-linking process(Rozkiewicz, D. I. et al, Chem. Eur. J. 12, 6290-6297,2006). These results indicate that the protein is not denatured. 
[0026]
Additionally, even though cadmium hydroxide nanostrands do not affect the protein membrane due to removal of them, the other more safe nanostrands, such as copper hydroxide nanostrands and zinc hydroxide nanostrands with similar properties to that of cadmium hydroxide nanostrands, were also used successfully to prepare free-standing protein membranes(data were not shown here).
[0027]
Example 2  Controlled synthesis of different thickness and diameter protein membrane
(a) preparation
We prepared ultrathin free-standing pure protein membranes similarly to Example 1 except that the time of the filtering process and/or the filtering volume were varied and that diameters of membrane/funnel used for filtration were 1.7 cm, 3.2 cm and 7.5 cm. The results were shown in Table 1. 
[0028]
Table 1 
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Here, Vmixturea is the volume of the filtered mixture, which was made of 2 ml, 3.8 mg /ml of ferritin or apoferritin protein(or 6.4mg /ml of other protein) solution and 40 ml cadmium hydroxide nanostrands solution. The thickness of protein membrane was measured from the cross-section SEM images.  
[0029]
(b) characterization
The films were characterized by SEM images and TEM images (not shown here) as well as by naked eye’s observation(or photographs).  From these results we can see that the thickness of the protein membrane and the time of the filtering process linearly depend on the filtering volume. In these examples, thin films were synthesized in three diameters, 1.7 cm, 3.2 cm and 7.5 cm. And we also found for ferritin, the thinnest thickness is 40 nm for 1.7 cm, but which is 60 nm for 3.2 and 7.5 cm, respectively. The thickest one can be reach up to 4000 nm for 1.7 cm with one hour filtering time. Namely, in case of ferritin the thickness of ferritin films can be controlled in the range from 40 nm to 4,000 nm.
Comparing the example 60 nm, 200 nm and 600 nm, and 4000 nm thick films before removal of cadmium nanostrands, the thicker the film, the deeper the color was. The thicknesses of the films of corresponding protein films after removal of cadmium hydroxide nanostrands were almost not changed. This indicates that the films were not clasped after removal of nanostrands, resulting more porous films.     
[0030]
In case of another protein, apoferritin, the obtained apoferritin ultrathin protein membranes showed the films with homogenous thickness of 25 nm, even in the case of 7.5cm diameter(No.12). The ratio of diameter to thickness is up to 3,000,000. TEM image(not shown here) indicates the film is very flexible in nanometer scale. The extremely macroscale flexibility was confirmed by the aspiration of this 7.5 cm diameters apoferritin free-standing membranes into a pipette tip with diameter of 0.8 mm. The protein membranes surprisingly could reversibly pass through a holes 8,790 times smaller than its own area. This is due to its flexible and extreme thinness. 
[0031]
The mechanical properties of ferritin and apoferritin filmswith thickness 1550 nm before and after removal of cadmium hydroxide nanostrands were measured by nanoindentation using TriboIndenter(Hysitron Inc.), employing a diamond Berkovitch indenter, respectively. The typical load-unload curves for them were shown in Fig. 9. For each sample, three points were measured and giving the average data. The hardness, H, and Young’s modules were shown in Table 2. 
[0032]
Table 2 
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a the value of Poisson ration is 0.5 and  used for calculating the Young’s module. bn1 means the measurement point number. n1, n2 and n3, means three points are measured. cAvg means average value of that measured from three points. d(before) means before removing cadmium hydroxide nanostrands. e(after) means after removing cadmium hydroxide nanostrands.
[0033]
It can be concluded that hardness and the Young’s modules of films before removal of nanostrands are larger than that of the films after removal of nanostrands. At the same time, the hardness and Young’s modules of ferritin films are larger than that of apoferritin. The difference among the films before and after removal of nanostrands shows that the enhanced mechanical properties of the protein films are originated from interaction between the inorganic components and protein. At the same time, the iron compound in ferritin makes the ferritin film with larger value of hardness and Young’s modules than that of apoferritin film. These values of the hardness and the Young’s modules of ferritin and apoferritin films are ten times larger than that reported of glyoxal cross-linked native protein films, such as gelatin, soy, casein and sodium caseinate(Vaz, C. M. et al, J. Mater. Sci.: Mater. in Medicine 14, 789-796 ,2003), and 4 times as that of glutaraldehyde cross-linked soy protein films(Chabba, S. et al, J. Mater. Sci. 40, 6263-6273, 2005).
[0034]
We additionally did an experiment that a 60 nm thick film was sealed on a plastic tube hole with diameter inner 5 mm and outer diameter 7 mm, then connected with another plastic tube with inner diameter 7 mm and outer diameter 10 mm, and then ethanol solution of directly yellow was carefully filled into the large tube and hold it vertically. It was found that such film can support a column of ethanol of 21.5 cm (it was calculated that about 180,000 times heavier than its own weight was supported without apparent permeation of ethanol). 
[0035]
When the nanostrands were removed from the ferritin or apoferritin film, the film becomes more flexible as seen by naked eye observation of films with 1550 nm thick(photographs not shown). This phenomenon is in agreement with the mechanical properties before and after remove nanostrands. These protein films after removal of nanostrands are very stable under both acid and basic conditions, as well as for organic solvent solution, such as acetone, benzene and chloroform, which are desirable for application. 
[0036]
Example 3  Application of the invented protein membrane to separation, condensation, absorption or desorption
The separation performance of these free-standing ultrathin pure protein membranes were investigated by studying the permeation of molecules with different size, charge states, and pH. The filtration process was carried out under 90kPa pressure. The volume of the molecules is kept as 20 ml. The flux rate is equal to the permeated volume divided by the valid area and the processing time. The permeation performance was monitored by the UV-Vis absorption spectra recorded on the solution before and after filtration, and also the upper solution. The results were summarized in Table 3.
[0037]
Table 3 
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[0038]
High performance size-based selective molecular separation was achieved by using a 60 nm thin, ferritin film with diameter of 1.7cm.  Big molecules, such as PC/Cu(MW:984.25), TMPyP dye(MW:1,363.6) and Cyt. c(MW:13,000) were completely separated from their aqueous solutions. ANTS molecules(MW:650.58) and [Fe(CN)6]3+ ions(MW:212) completely went through such film. DY(direct yellow 50)(MW:956.82), and EB(Evans blue) (MW:960.81) molecules partially permeated through it at neutral pH. However, by changing the pH of DY or EB solutions, these dye molecules completely went through the protein membrane at pH higher than 7 and were forbidden to pass at pH lower than 3.19. These pH dependent performances are due to the surface charge property of the protein. In the case for ferritin and apoferritin, the isoelectric points of them are the same at about pH 4.4. So, when the pH of dye solution is lower than 4.4, the membrane is positively charged, and adsorbs the negatively charged dye molecules through electrostatic interaction, and makes the channels smaller. If the dye molecules are smaller enough, such as ANTS molecules, 8.23x7.0x3.17 A3 and [Fe(CN)6]3-, 8.7x8.7x8.7 A3, they still can go through the smaller channels. However, if the molecule size is bigger than these smaller channels, it can not pass through the film. Of cause, if the dye molecules are bigger than the channels, at any pH, it can not go through the film. At pH 13.03, the permeation of the mixture solution of PC/Cu and DY molecules shows that DY thoroughly permeates through the film, but PC/Cu were almost can’t pass through it.  However, all the flux rates of water are more than 5,000 Lm-2h-1 under pressure of 90 kPa. Due to no permeation of the bigger molecules, they can be concentrated from their diluted solution. 
[0039]
For example, PC/Cu molecules solution was examined (Fig. 10). PC/Cu molecules could be efficiently concentrated from 10 μM solution to 28.89 μM within 2 min by using a 60 nm thick ferritin membrane on alumina membrane by suck filtration under 90 kPa. UV-vis spectra were used to monitor the efficiency of the concentration performance. Increasing the process time, the upper solution become more and more blue, but there is no detectable PC/Cu in the filtration solution. The flux rate is 6671.9 L・m-2h-1. 
[0040]
The reversible charged properties of the proteins, when the pH is higher or lower than its isoelectric point, they can be used as an absorber for the charged molecules or particles in solution with different pH, and then release them into the other solution by changing the pH. For this study, the reversible absorption and desorption of dye molecules(Evans blue and DY)  were investigated. 300 nm thick and 3.2 cm diameter apoferritin membrane was used for adsorption and desorption of Evans blue molecules in solution by controlling the pH of the solution. The dye molecules in 10 ml, 10 μM, Evans blue solution at pH 1.50 can be completely captured by the protein membrane within 1day. And these captured molecules can be further released in basic solution such as pH 13.09 water. The capturing and releasing process were monitored by Uv-vis spectroscopy. 
[0041]
Fig. 11a shows typical UV-visible spectra recorded during the capturing process with increasing time. Fig. 11b, copies of photographs of original and after one day, clearly show that the dye molecules were completely removed from the solution by the membrane and this was consistent with the Uv-vis result. The releasing performance was shown in Fig. 12a and Fig. 12b. After 2.5 hrs, 83.5% of Evans blue molecules were released from the membrane into the solution. The longer the time, the more amount dye molecules was released into the solution. The maximum rate of the first released circle is 94.5% similar to that of DY molecules(data not shown). But, after the first capture and releasing circle, the release efficiency is 99.4% for the later circles. The capture and release process is due to the pH triggering the charge properties of the apoferritin membrane. When the pH of the solution is lower than that isoelectric of apoferritin pH 4.4, the membrane will be positively charged, contrary, if the pH higher than 4.4, the protein membrane will be negatively charged. Therefore, in the pH of the solution lower than 4.4, negatively charged molecules will be trapped into the membrane through electrostatic interaction, otherwise, the negatively charged dye molecules will be push away from the membrane due to the repulsion force. The blue color(Fig. 11) and purple color color(Fig. 12) of the Evans blue solution with pH 1.50 and 13.09, respectively is due to the dye molecules itself.  
[0042]
Another example for the adsorption performance was shown in Fig.13. Fluorescent dye, 8-octanoyloxypyrene-1, 3, 6-trisulfonic acid trisodium salt (OPTAT), 10 μM, 10 ml solution with pH 1.39, were adsorbed by 300 nm thick, 3.2 cm diameter, ferritin membrane. The photoluminescence (PL) spectra show that after 7 hours, all the molecules were trapped into the ferritin membrane, and the film showed stronger emission than that of the original solution. The inset photo was obtained by exciting the membrane at 375 nm. 
[0043]
Example 4  Another application of the invented protein membrane to preparation of thin free-standing films composed of two layers, the one layer is  the protein membrane, the other layer is a thin molecular membrane formed on it.
(a) Preparation of protein(apoferritin) films: the process of preparation of protein(apoferritin) films was the same as described in the Example 1.
(b)Preparation of thin free-standing films composed of two layers, the one layer is the protein(apoferritin) membrane, the other layer is a thin molecular membrane formed on the protein(apoferritin) membrane surface
A 1.9 micrometer thin apoferritin membrane mounted on a polycarbonate membrane with pore size of 200 nm was used in a suction filtration system as filter.  2 ml, 0.2 wt% dendrimer, PAMAM (Polyamidoamine) molecule (general 4, molecular weight: 14215, diameter: 4.5 nm, surface -NH2groups: 64, purchased from Sigma-Aldrich) methanol solution was filtered on the above system under 90 kPa pressure. After filtering away methanol, PAMAM molecule filter cake was cross-linked by 1 ml, 5wt% glutaraldehyde for 1.5 hrs. Finally, the film was washed by methanol and water four times. Fig.14 shows typical SEM images of a 4.6 micrometer thick PAMAM film formed on a 1.9 micrometer thick apoferritin film surface.  
The thickness of the PAMAM film can be controlled by the filtering volume of PAMAM solution.
Additionally other molecular films also can be prepared by using the same filtering and cross-linking process based on protein membranes. This method provides a simple way to build functional thin molecular films for various applications, such as separation.
[Brief Description of drawings]
[0044]
[Fig. 1] Scheme of a typical fabrication process for the ultrathin(nano) or thin free-standing protein membrane.
[Fig. 2] Top view TEM image of the ferritin/cadmium hydroxide nanostrands nanofibrous film after cross-linkage. 
[Fig. 3] Top view TEM image of the ferritin membrane after removal of cadmium hydroxide nanostrands from the ferritin/cadmium hydroxide nanostrands nanofibrous film shown in Fig. 2. 
[Fig. 4] Copy of a photograph of a free-standing ferritin membrane with a diameter of 7.5 cm.
[Fig. 5] Cross-sectional SEM image of ferritin/cadmium hydroxide nanostrands film(thickness:40 nm) before removal of cadmium hydroxide nanostrands.
[Fig. 6] Cross-sectional SEM image of ferritin membrane(thickness:40 nm) after removal of cadmium hydroxide nanostrands.
[0045]
[Fig. 7] EDX spectra recorded from the cross-linked film before and after removal of cadmium hydroxide nanostrands.
[Fig. 8] FTIR spectra of the film of (i)before cross-linkage and (ii)after cross-linkage followed by removal of cadmium hydroxide nanostrands.
[Fig. 9] Typical loading-unloading curves of ferritin and apoferritin films with and without cadmium nanostrands.
[Fig. 10] Typical UV-visible spectra and copies of photographs showing concentration performance for PC/Cu.
[Fig. 11] Typical UV-visible spectra and copies of photographs showing absorption of Evans Blue by using apoferritin membrane(300nm thick, 3.2cm diameter).
[Fig. 12] Typical UV-visible spectra and copies of photographs showing desorption of Evans Blue by using apoferritin membrane(300nm thick, 3.2cm diameter).
[Fig. 13] Typical photoluminescence spectra showing that the fluorescent dye molecules adsorbed by ferritin membrane. The inset photograph(copy) was taken under irradiated with 375 nm light. The molecular structure was shown in the down inset.   
[Fig. 14] Typical SEM images of a PAMAM membrane(thickness:4.6 micrometer) formed on a apoferritin membrane(thickness:1.9 micrometer) surface. (b) shows magnified image of parts surrounded by dotted line in (a).
[Meaning of symbol]
[0046]
(In Fig.9) 1: Apoferritin with nanostrands
2: Apoferritin without nanostrands
3: Ferritin with nanostrands
4: Ferritin without nanostrands
1. A flexible free-standing ultrathin(nano) or thin protein membrane in which  proteins are cross-linked by bifunctional cross-linkers.
2. The protein membrane according to claim 1, wherein a thickness of membrane is uniform in between 10nm and 10μm.
3. The protein membrane according to claim 1 or 2, wherein bifunctional cross-linker is glutaraldehyde.  
4. The protein membrane according to any one of claim 1-3, wherein protein is selected from ferritin, apoferritin, cytochrome c, myoglobin or glucose oxidase.  
5. A fabrication method for the above free-standing ultrathin or thin protein membrane, whose method comprises the following steps:
(1) A dilute metal(Cd, Cu or Zn) nitrate or chloride solution is kept under neutral or weak basic pH to form spontaneously metal(Cd, Cu or Zn) hydroxide nanostrands.
(2) The above metal(Cd, Cu or Zn) hydroxide nanostrands and protein solution are mixed to obtain composite nanofibers made of protein and the said metal hydroxide nanostrands;
(3) The obtained dispersion of composite nanofibers is filtered on a filter.
(4) Proteins contained in the composite nanofibers are cross-linked by bifunctional cross-linkers; and
(5) Metal(Cd, Cu or Zn) hydroxide nanostrands are removed from them.
6. The fabrication method according to claim 5, wherein glutaraldehyde is used as the said bifunctional cross-linker. 
7. The fabrication method according to claim 5 or 6, wherein protein is selected from ferritin, apoferritin, cytochrome c, myoglobin or glucose oxidase.
8. Thin free-standing films composed of two layers, one of which is any one of protein membrane according to claim 1-4, the other one is a thin molecular membrane which is formed by stacking defined molecules on the said protein membrane and cross-linking with bifunctional cross-linkers.
9. The films according to claim 8, wherein the defined molecules are dendrimers having terminal NH2 groups.
10. The films according to claim 9, wherein the dendrimers are polyamidoamine whose molecular weight is over 2,000.
[Abstract]
[Purpose] A purpose of this invention is to provide a robust and flexible free-standing ultrathin(nano) or thin pure protein membrane which enables a rapid and simple separation(or condensation) of relatively small(M.W.=ca.1,000 Da) molecules.
[Summary] A flexible free-standing ultrathin(nano) or thin protein membrane can be fabricated by a method comprising following steps:
(1) A dilute metal(Cd, Cu or Zn) nitrate or chloride solution is kept under neutral or weak basic pH to spontaneously form metal(Cd, Cu or Zn) hydroxide nanostrands;
(2) The above metal(Cd, Cu or Zn) hydroxide nanostrands and protein solution are mixed to obtain composite nanofibers made of protein and the said metal hydroxide nanostrands;
(3) The obtained dispersion of composite nanofibers is filtered on a filter.
(4) Proteins contained in the composite nanofibers are cross-linked by bifunctional cross-linkers; and
(5) Metal(Cd, Cu or Zn) hydroxide nanostrands are removed from them.
[Typical figure]     Fig.1
[Fig. 1] 
2009131725.tif 000022
[Fig. 2] 
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[Fig. 3]  
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[Fig. 4] 
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[Fig. 5] 
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[Fig. 6] 
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[Fig. 7]
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[Fig. 8] 
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[Fig. 9] 
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[Fig. 10] 
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[Fig. 11] 
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[Fig. 12] 
2009131725.tif 000033
[Fig. 13] 
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[Fig. 14] 
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