(57)【要約】【課題】全反射照明を用いた散乱光検出において、適切な受光角度で散乱光を検出することによりＳ／Ｎ比の向上を可能とする。【解決手段】全反射照明を利用する散乱光検出方法において、測定光９の波長の大きさと、被検出物質２を標識する散乱性標識微粒子５の直径の大きさとをほぼ同等にすることによって、指向性を有する散乱光２０を生じさせる。この指向性を有する散乱光２０を、適切な方向から検出する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体プリズム基板の一面からなる検出面に対し、該検出面で全反射条件を満たすように測定光を入射して、該検出面表面にエバネッセント光を発生させ、該検出面に供給された試料中に含まれる散乱性標識微粒子に、前記エバネッセント光が散乱されることで生じる散乱光の量を検出することにより、前記被検出物質の存在量を検出する散乱光検出方法において、
前記測定光の波長λと、前記散乱性標識微粒子の直径Φとが下記式（１）を満たすものであり、
前記散乱光のうち、指向性を有する前記散乱光を検出することを特徴とする散乱光検出方法。
０．２５≦Φ／λ・・・（１）
【請求項２】
前記指向性を有する前記散乱光が、
該散乱光の散乱方向を示すベクトルと、前記測定光の前記検出面に対する入射方向を示すベクトルのうち、該検出面に平行な方向の平行成分ベクトルとがなす角θが、下記式（２）を満たすようなものであることを特徴とする請求項１に記載の散乱光検出方法。
０°≦θ≦６０°・・・（２）
【請求項３】
前記指向性を有する前記散乱光のうち、前記検出面に対して前記誘電体プリズム基板側に進入してきた該散乱光と、前記検出面における前記測定光の反射光とを分離して検出することを特徴とする請求項１または２に記載の散乱光検出方法。
【請求項４】
前記散乱性標識微粒子が、金属微粒子であることを特徴とする請求項１から３いずれかに記載の散乱光検出方法。
【請求項５】
請求項１から４いずれかに記載の散乱光検出方法で使用される散乱光検出装置であって、
前記測定光を発する光源と、
前記検出面を有し、かつ前記測定光が該検出面で全反射条件を満たすような位置に配された前記誘電体プリズム基板と、
前記散乱性標識微粒子による前記エバネッセント光の前記指向性を有する前記散乱光を検出するような位置に配された光検出器と
を備えてなることを特徴とする散乱光検出装置。
【請求項６】
前記誘電体プリズム基板が、前記指向性を有する前記散乱光のうち、前記検出面に対して前記誘電体プリズム基板側に進入してきた該散乱光と、前記検出面における前記測定光の前記反射光とを分離する分離機構を有するものであることを特徴とする請求項５に記載の散乱光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エバネッセント光を利用した散乱光検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質やＤＮＡ等を検出するバイオ測定において、全反射照明を利用した検出方法が注目されている。この検出方法は、屈折率の異なる界面で測定光が全反射する際に界面からしみ出す光、すなわちエバネッセント光と、試料中に含まれる被検出物質あるいはこの被検出物質に付けられている標識との散乱、吸収、発光等の光学的な相互作用を分析ことにより、上記被検出物質の存在またはその量を検出する方法である。
【０００３】
このような検出方法の一例としては、蛍光性標識を用いた蛍光検出方法がある。
【０００４】
蛍光検出方法は、冷却ＣＣＤ等光検出器の高性能化と相まって、バイオ研究には欠かせない道具となっている。また、蛍光性標識に用いる材料においても、特に可視領域では蛍光量子収率の高い蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（蛍光：５２５ｎｍ、蛍光量子収率：０．６）やＣｙ５（蛍光：６８０ｎｍ、蛍光量子収率：０．３）のような実用の目安となる０．２を超える蛍光色素が開発され広く用いられている。さらに、表面プラズモンによる電場の増強を用いて、蛍光信号を増大することにより、１ｐＭ（ピコモーラ）を切るような高感度検出も実現されている。
【０００５】
しかしながら、蛍光色素は、光を吸収及び発光する性質上、化学構造的に弱いπ結合を有するため、強度の強い光による不可逆的破壊や雰囲気中の酸素やオゾンとの化学反応により変質してしまうという問題がある。これにより、蛍光色素全体から発せられる総蛍光量が経時的に減少する、いわゆる褪色を招いてしまうため、測定光の強度を一定以上あげることが出来ず、高感度化に限界がある。
【０００６】
そこで、全反射照明を利用した検出方法の別の例として、特許文献１および特許文献２に示すような散乱性標識を用いた散乱光検出方法が挙げられる。
【０００７】
散乱光検出方法は、金属微粒子等の散乱性標識によるエバネッセント光の弾性散乱を利用しており、上記のような褪色の問題が存在しない。さらに、蛍光色素を用いた一般的な蛍光検出方法よりも得られる検出光量が大きいため、より高い検出感度が要求されるような場合に用いる方法として利用されている。
【特許文献１】特表平１０−５０６１９０号公報
【特許文献２】特表平８−５００６６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記のような散乱光検出方法において、試料中に含まれる夾雑物や試料供給面の凹凸等により生じるエバネッセント光のノイズ的な散乱光が問題となっている。これは、前述したノイズ的な散乱光が、本来検出対象としている散乱性標識による散乱光に対するノイズとなってしまうために、Ｓ／Ｎ比が低下し散乱光検出の定量性を失わせるためである。
【０００９】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、Ｓ／Ｎ比を向上させ、より高い定量性を備えた散乱光検出方法の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明者は、測定光の波長と散乱性標識微粒子の直径とが同程度の大きさの場合、散乱光が指向性を有することに注目して、本発明に至った。
【００１１】
すなわち、本発明による散乱光検出方法は、誘電体プリズム基板の一面からなる検出面に対し、検出面で全反射条件を満たすように測定光を入射して、検出面表面にエバネッセント光を発生させ、検出面に供給された試料中に含まれる散乱性標識微粒子に、エバネッセント光が散乱されることで生じる散乱光の量を検出することにより、被検出物質の存在量を検出する散乱光検出方法において、
測定光の波長λと、散乱性標識微粒子の直径Φとが下記式（１）を満たすものであり、
上記散乱光のうち、指向性を有する散乱光を検出することを特徴とするものである。  
０．２５≦Φ／λ・・・（１）
【００１２】
そして、本発明による散乱光検出方法において、指向性を有する散乱光は、
散乱光の散乱方向を示すベクトルと、測定光の検出面に対する入射方向を示すベクトルのうち、この検出面に平行な方向の平行成分ベクトルとがなす角θが、下記式（２）を満たすようなものであることが望ましい。  
０°≦θ≦６０°・・・（２）
【００１３】
ここで、「検出面」とは、試料等を供給して接せしめる誘電体プリズム基板のある一面であって、測定光を、この一面で全反射条件を満たすように誘電体プリズム基板を通し入射して、この一面の表面にエバネッセント光を発生させるように配されたものである。
【００１４】
また、「指向性を有する散乱光」とは、測定光の検出面に対する入射方向を示すベクトルのうち、この検出面に平行な方向の平行成分ベクトルが指す方向に指向性を有する散乱光であり、詳細は後述する。
【００１５】
さらに、本発明による散乱光検出方法において、指向性を有する散乱光のうち、検出面に対して誘電体プリズム基板側に進入してきた散乱光と、検出面における測定光の反射光とを分離して検出することが望ましい。
【００１６】
また、本発明による散乱光検出方法において、散乱性標識微粒子は、金属微粒子であることが望ましい。
【００１７】
一方、本発明による散乱光検出装置は、請求項１から３に記載の散乱光検出方法で使用される散乱光検出装置であって、測定光を発する光源と、検出面を有しかつ測定光がこの検出面で全反射条件を満たすような位置に配された誘電体プリズム基板と、散乱性標識微粒子によるエバネッセント光の指向性を有する散乱光を検出するような位置に配された光検出器とを備えてなることを特徴とするものである。
【００１８】
なお、本発明による散乱光検出装置において、誘電体プリズム基板は、指向性を有する散乱光のうち、検出面に対して誘電体プリズム基板側に進入してきた散乱光と、検出面における測定光の反射光とを分離する分離機構を有するものであることが望ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明による散乱光検出方法によれば、全反射照明を用いた散乱光検出方法において、測定光の波長と散乱性標識微粒子の直径とが同程度の大きさの場合に生じる散乱光の指向性を利用し、この指向性を有する散乱光を主な検出対象として検出している。この結果、散乱光を効率よく検出することができるため、検出の定量性を向上させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明における最良の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００２１】
「散乱光検出方法」
本発明者は、全反射照明を用いた散乱光検出において、測定光の波長と散乱性標識微粒子の直径がほぼ同程度である場合、その散乱される方向により散乱光の強度が異なるという散乱光の指向性を見出した。
【００２２】
図１は、散乱光２０の受光角度θと、Ａｕ微粒子５（直径Φ：１５０ｎｍ、３５０ｎｍ）によるエバネッセント光２２の散乱光２０の強度（図１ａ）およびＳ／Ｎ比（図１ｂ）との関係を示す図である。Ｓ／Ｎ比は、Ａｕ微粒子５が存在しないときの検出信号（ＢＧ信号）に対する散乱光２０の検出信号比で表している。なお、受光角度θは、図２ａに示すように、検出面６ｓに対する測定光９の入射方向を示すベクトル９ｉのうち、この検出面６ｓに平行な方向の平行成分ベクトル９ｉｙと、光検出器１０の法線ベクトル２１がなす角である。ここで、法線ベクトル２１は、上記平行成分ベクトル９ｉｙを含みかつ検出面６ｓに垂直な平面に含まれ、外向き（光検出器１０に対して試料が存在しない側向き）方向のものである。
【００２３】
図１より、直径１５０ｎｍ及び３５０ｎｍ両方のＡｕ微粒子５において、受光角度θが小さくなるほど散乱光２０の強度が増加しおり、Ｓ／Ｎ比も増加しているのがわかる。特に、受光角度θ＝１０°で検出した場合のＳ／Ｎ比は、従来の受光角度（θ＝９０°、図中ｚ方向からの検出）での検出に比べ、Φ＝１５０ｎｍのＡｕ微粒子５を用いた場合ではおよそ２倍、Φ＝３５０ｎｍのＡｕ微粒子５を用いた場合ではおよそ１０倍にまで向上している。
【００２４】
これより、エバネッセント光２２の散乱光２０は、上記ベクトル９ｉｙ方向（すなわち、図２ａ中ｙ方向）に指向性を有しているといえる。ここで、上記「ベクトル９ｉｙ方向」は、エバネッセント光２２の進行方向を表していることから、本発明における「前方方向」と定義する。
【００２５】
さらに、散乱現象における対称性を考慮すれば、散乱光２０の指向性は、図２ｂに示すような円錐面Ｃによって囲まれる方向に拡張できると考えられる。ここで、図２ｂの円錐面Ｃは、頂点を散乱性微粒子５に置き、かつこの頂点を通りベクトル９ｉｙに平行な直線を軸として、前方方向に開いている円錐面である。
【００２６】
次に、測定光の波長と散乱性標識微粒子の種類および直径の関係を調べた結果を以下に示す。
【００２７】
図３、図４、図５は、それぞれ測定波長λが４０５ｎｍ、５３２ｎｍ、６４０ｎｍの場合における、受光角度θとＡｕ、ＡｇおよびＣｕ微粒子（直径Φ：１５０ｎｍ、３５０ｎｍ）によるエバネッセント光の散乱光のＳ／Ｎ比の関係を示す図である。
【００２８】
これより、θ＝〜６０°の場合には、従来の受光角度（θ＝９０°）に対するＳ／Ｎ比の向上は、散乱性標識微粒子の種類にはほとんど依存しないことがわかる。一方、散乱性標識微粒子の直径Φに注目してみると、波長λが４０５ｎｍの場合には、１５０ｎｍ、３５０ｎｍどちらの直径Φでも上記のようなＳ／Ｎ比の向上がみられるが、波長λを５３２ｎｍ、６４０ｎｍと長くしていくと、その向上の度合いが小さくなっていくのがわかる。特に、測定光の波長λが６４０ｎｍ、散乱性標識微粒子の直径Φが１５０ｎｍの場合には、上記のようなＳ／Ｎ比の向上は見られなくなっている。すなわち、散乱性標識微粒子の直径Φと測定光の波長λとの比を表すΦ／λの値が、０．２５以上であると、エバネッセント光の散乱光は十分な指向性を示すが、０．２５未満であると、十分な指向性を示さなくなる。
【００２９】
一方、Φ／λの値に上限値は存在せず、例えばΦ／λ＝１００においてもエバネッセント光の散乱光は前方方向に指向性を有する。
【００３０】
なお、これは散乱性標識微粒子の種類には依存しない。
【００３１】
ただし、散乱性標識微粒子の直径Φは、１μｍ以下であることが望ましく、さらには５００ｎｍ以下であることがより望ましい。これは、散乱性標識微粒子の直径が大きすぎると、体積が増え物理的に邪魔になり二次的な散乱（検出対象としている散乱光がさらに散乱される現象）を引き起こすこと、重くなることで沈殿しやすくなり被検出物質をうまく標識できなくなること等の影響によるものである。一方、測定光の波長は、扱いやすさおよびコストの観点から、一般的に用いられているおよそ３２０〜７５０ｎｍ帯域の可視光を用いることが望ましい。以上を考慮すれば、本発明による効果を得るためのより望ましい条件として、Φ／λの値の上限値を、およそ３．１（＝１０００ｎｍ／３２０ｎｍ）とすることができるが、本発明は必ずしもこれに限定されるものではない。
また、図３、図４、図５は、上記のような指向性を有する散乱光の大部分が、およそ下記式（２）で示す範囲に含まれることを示唆している。したがって、対称性を考慮し、本発明において「指向性を有する散乱光」は、軸と母線がなす角θの範囲が下記式（２）で表される図２ｂに示す円錐面Ｃ内を通り放出される散乱光であることがより望ましい。  
０．２５≦Φ／λ・・・（１）
０°≦θ≦６０°・・・（２）
【００３２】
＜第１の実施形態＞
図６は、本実施形態による散乱光検出方法を用いて、被検出物質としての抗原２を含む試料１から、抗原２を検出する場合に用いる散乱光検出装置の概略部分断面図である。
【００３３】
図示の通り、この散乱光検出装置は、測定光９を発する光源８と、この測定光９が検出面６ｓで全反射条件を満たすような位置に配された、測定光９を透過させる材料からなる誘電体プリズム基板６と、検出面６ｓ上に固定された一次抗体３と、検出面６ｓ上に試料１が接するように試料１を保持する試料保持部７と、検出面６ｓに対して試料が供給される側のほぼ前方方向から指向性を有する散乱光２０を効率的に検出するような位置に配された光検出器１０とを備えてなるものである。そして、図中には、試料１中に含まれる抗原２と、直径が測定光９の波長と同程度の大きさの散乱性標識微粒子５と、散乱性標識微粒子５に特異的結合性を付与する二次抗体４も同時に示している。
【００３４】
測定光９は、例えばレーザ光源等から得られる単波長光でも白色光源等から得られるブロード光でもよく、特に制限はない。しかしながら、散乱光の指向性を高める観点から、その波長λは、検出条件に応じて適宜選択し、特に被検出物質２を標識している散乱性標識微粒子５の直径Φと上記式（１）の関係を満たすものとする。さらに、前述した理由により、一般的に用いられているおよそ３２０〜７５０ｎｍ帯域の可視光を用いることが望ましい。
【００３５】
光源８は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また必要に応じて、光源８は、測定光９を検出面６ｓで全反射条件を満たすように誘電体プリズム基板６を通して入射させるために、測定光９を導光するためのミラーやレンズ等の導光系等を適宜組み合わせることが望ましい。
【００３６】
誘電体プリズム基板６は、例えば樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。樹脂製基板を用いた場合には、基板が安価であるという利点があり、ガラス製基板を用いた場合には、不純物や表面凹凸による散乱（この散乱は検出信号に対するノイズとなる）が小さいという利点があるため、用途および検出条件に合わせ適宜選択することが望ましい。誘電体プリズム基板６を樹脂から形成する場合には、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等を用いることができる。
【００３７】
一次抗体３および二次抗体４は、抗原２に対する抗体である。使用する抗体は、検出条件（特に抗原２）に応じて適宜選択することができる。一次抗体３の固定方法としては、例えば本実施形態の場合、下記（１）〜（３）のステップからなる方法により、検出面６ｓ上にシランカップリング処理を施し実施することができる。
【００３８】
（１）シランカップリング剤（ＡＰＳ）によるアミノ基の導入
１８ｍｌのＥｔＯＨ、１．９８ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水、２０ｕｌの１Ｎ ＨＣｌをねじ口付試験瓶に入れ、混合後、６０℃にてインキュベータで温める。その後、この試験瓶に２４．３ｍｇのＡＰＳを添加しよく撹拌する。そして、プリズム上に液体を保持するためのキュベットを設け、その中に、上記のＡＰＳ混合溶液を１０ｍｌ分注する。キュベットに液体を入れた状態で、プリズムごと６０℃のインキュベータに入れ、１２分反応させる。その後、ＥｔＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（体積比９：１）でキュベット内の撹拌洗浄を５回行う。そして、キュベット内の液体を全て抜取り、９０℃のインキュベータに入れ、１８０分加熱処理を行う。
【００３９】
APS:3-aminopropyltrimethoxysilane
（２）ジビニルスルホンによる修飾
ねじ口付き試験管に、１０ｍｌの４ｗｔ％ジビニルスルホン溶液と３０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水を加え、よく混合し１％ジビニルスルホン水溶液を作成する。そして、プリズム上のキュベットに上記水溶液を分注し、室温で６０分反応させる。その後、ＭｉｌｌｉＱ水にてキュベット内の撹拌洗浄を５回行う。
【００４０】
（３）一次抗体３の固定
一次抗体３の希釈液をキュベットに分注し、自然乾燥させる。
【００４１】
試料保持部７は、試料１を検出面６ｓに接するように保持でき、試料１中に含まれる標識から散乱される散乱光の検出を妨げないような形状や材料であれば特に制限されるものではない。すなわち、本実施形態においては、散乱光が指向性を示す前方方向から検出を行っているため、例えば図６に示すように、少なくとも散乱光の検出を行う前方方向の部分は光を透過させる材料からなるものが望ましい。また、その他の部分は、光を透過させない材料からなるものが望ましい。これは、意図しない外部からの光を遮断する等の観点からである。
【００４２】
光検出器１０は、試料１中に含まれる標識が散乱する散乱光を定量的に検出するもので、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができる。しかしながら、これに限らず検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。また本実施形態においては、光検出器１０は、検出面６ｓに対して試料が供給される側のほぼ前方方向から指向性を有する散乱光２０を効率的に検出するような位置に配されることが望ましい。特に、光検出器１０の外向きの法線ベクトルが、図２中の平行成分ベクトル９ｉｙを含みかつ検出面６ｓに垂直な平面に含まれることがより望ましい。さらに、上記外向きの法線ベクトルと検出面６ｓのなす角は、上記式（２）で表させる範囲にあることが望ましい。
【００４３】
そして、図７に示すように、本実施形態による散乱光検出方法は、誘電体プリズム基板６のある一面である検出面６ｓに一次抗体３を固定し、検出面６ｓに対し測定光９を全反射条件を満たすように入射して、この検出面６ｓ表面にエバネッセント光２２を発生させ、検出面６ｓ上の凹凸等によるＢＧ信号を光検出器１０で検出し、その後、抗原２を含む試料１を流して（図７ａ）、この抗原２を一次抗体３に結合させ（図７ｂ）、その後散乱性標識微粒子５で標識されかつ抗原２と特異的に結合する二次抗体４を流し（図７ｃ）、一次抗体３に結合した抗原２に結合させて、いわゆるサンドイッチ方式により散乱性標識微粒子５を検出面６ｓに固定し（図７ｄ）、その後、同様にしてエバネッセント光２２を発生させ、検出面６ｓに固定された散乱性標識微粒子５による、エバネッセント光２２の指向性を有する散乱光２０を光検出器１０によって検出する（図７ｅ）ことを特徴とするものである。
【００４４】
散乱性標識微粒子５の種類は、特に制限なく検出条件によって適宜選択されるが、散乱性および直径制御の観点から、金属微粒子であることが望ましく、さらにはＡｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔからなる群より選択される少なくとも１種以上の金属にて構成される金属微粒子であることがより望ましい。一方、その直径Φは、測定光９の波長λと上記式（１）を満たすものとする。さらに、前述した理由により、１μｍ以下であることが望ましく、さらには５００ｎｍ以下であることがより望ましい。
【００４５】
以下、図６を用いながら本実施形態における作用を示す。  
検出面６ｓ上には、抗原２と特異的に結合する一次抗体３が固定化されている。このときの状態をバックグラウンドとしてＢＧ信号を検出する。その後、試料保持部７の中に試料１が供給され、試料１中の抗原２は一次抗体３に結合し固定される。そして、散乱性標識微粒子５で標識されかつ抗原２と特異的に結合する二次抗体４が流され、二次抗体４が抗原２に結合することによって散乱性標識微粒子５が検出面６ｓに固定される。その後、光源８から発せられる測定光９を、検出面６ｓで全反射条件を満たすように誘電体プリズム基板６を通し入射する。このとき、この検出面６ｓ表面にエバネッセント光２２が発生する。そして、上記検出面６ｓに固定された散乱性標識微粒子５にエバネッセント光２２を照明する。このときの検出信号から上記ＢＧ信号を差し引くことによって、散乱性標識微粒子５により散乱されたエバネッセント光２２の散乱光２０を分析し、抗原２の検出を行うことができる。
【００４６】
ここで、以上の例では、散乱光検出によって実際に存在が確認されるのは散乱性標識微粒子５であるが、基本的に上記工程において、この散乱性標識微粒子５には抗原２が結合しているものと考えて、この散乱性標識微粒子５の存在を確認することにより、間接的に抗原２の存在を確認している。
【００４７】
本実施形態による散乱光検出方法では、測定光９の波長λと散乱性標識微粒子５の直径Φとが上記式（１）を満たす関係にあるため、散乱性標識微粒子５によって生じるエバネッセント光２２の散乱光２０は前方方向に対して指向性を有している。そして、その指向性を有する散乱光２０を前方方向から受光することで、従来の受光方向（図６中上方）から検出を行う場合に比べて、効率的に散乱光２０を検出することができ、Ｓ／Ｎ比を向上させることが可能となる。
【００４８】
そして、上記のようなエバネッセント光２２は、検出面６ｓから数百ｎｍ程度の領域にしか到達しない。この特性により、上記一次抗体３を用いて散乱性標識微粒子５と抗原２の対を検出面６ｓに集約させることにより、意図せず試料１中に残ってしまった不純物９０や浮遊散乱性標識微粒子５’からの散乱等の影響を大幅に低減することができるため、さらなるＳ／Ｎ比の向上が可能となる。
【００４９】
さらに、一次抗体３を用いて散乱性標識微粒子５と抗原２の対を検出面６ｓに集約させることにより、エバネッセント光２２により照明される散乱性標識微粒子５の量を増加させることができる。これにより、多くの散乱光２０を生じさせることができ、結果としてよりＳ／Ｎ比の高い散乱光検出が可能となる。
【００５０】
また、指向性を有する散乱光２０を検出しＳ／Ｎ比を向上させることができるため、表面に凹凸がない等の高価な誘電体プリズム基板を必ずしも必要としないため、低コストで散乱光検出を行うことが可能となる。
【００５１】
以上のように、本実施形態では、散乱光を効率よく検出することができるため、検出の定量性を向上させかつ低コスト化させることが可能となる。
【００５２】
＜第２の実施形態＞
本実施形態で使用する散乱光検出装置は、図８に示すように、図６に示す第１の実施形態で使用した装置の誘電体プリズム基板６に、指向性を有する散乱光２０のうち、検出面６ｓに対して誘電体プリズム基板６側に進入してきた散乱光２０’と、検出面６ｓにおける測定光９の反射光９ｒとを分離する分離機構２３を備えたものである。そして、光検出器１０は、上記分離機構２３によって分離された散乱光２０’を検出するように配置されている。その他の構成は、第１の実施形態の場合と同様であり、図６に示す第１の実施形態と同等の要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。
【００５３】
本実施形態による散乱光検出方法は、散乱性標識微粒子５を検出面６ｓに固定した後エバネッセント光２２を発生させるまでは第１の実施形態と同様であり、その後、上記散乱性標識微粒子５によって生じる、エバネッセント光２２の指向性を有する散乱光２０のうち、分離機構２３によって、検出面６ｓにおける測定光９の反射光９ｒと分離された、検出面６ｓに対して誘電体プリズム基板６側に進入してきた散乱光２０’を光検出器１０によって検出することを特徴とするものである。
【００５４】
本実施形態においても、第１の実施形態と同様な効果を得ることができる。
【００５５】
さらに、本実施形態では、エバネッセント光２２の指向性を有する散乱光２０のうち、検出面６ｓに対して誘電体プリズム基板６側に進入してきた散乱光２０’を検出している。これにより、血液等の光を透過しにくい試料を用いて検出を行い、検出面６ｓに対して試料１側からでは散乱光２０を検出しにくい場合等において有益となる。
【００５６】
なお、上記すべての実施形態において、抗原抗体反応を用いて説明してきたが、本発明はこれに限られるものではなく、他の特異的結合性を利用した反応を用いても本発明の課題を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】散乱光の受光角度とＡｕ微粒子（直径Φ：１５０ｎｍ、３５０ｎｍ）によるエバネッセント光の散乱光の強度（図１ａ）とＳ／Ｎ比（図１ｂ）の関係を示す図
【図２】本発明において指向性を有する散乱光を規定する概念図
【図３】測定波長が４０５ｎｍの場合における、受光角度θと、Ａｕ、ＡｇおよびＣｕ微粒子（直径：１５０ｎｍ、３５０ｎｍ）によるエバネッセント光の散乱光のＳ／Ｎ比との関係を示す図
【図４】測定波長が５３２ｎｍの場合における、受光角度θと、Ａｕ、ＡｇおよびＣｕ微粒子（直径：１５０ｎｍ、３５０ｎｍ）によるエバネッセント光の散乱光のＳ／Ｎ比との関係を示す図
【図５】測定波長が６４０ｎｍの場合における、受光角度θと、Ａｕ、ＡｇおよびＣｕ微粒子（直径：１５０ｎｍ、３５０ｎｍ）によるエバネッセント光の散乱光のＳ／Ｎ比との関係を示す図
【図６】第１の実施形態における散乱光検出装置を概略的に示す部分断面図
【図７】第１の実施形態における散乱光検出方法を概略的に示す部分断面図
【図８】第２の実施形態における散乱光検出装置を概略的に示す部分断面図
【符号の説明】
【００５８】
１            試料
２            抗原
３            特異的結合物質（一次抗体）
４            二次抗体
５            散乱性標識微粒子
５’          浮遊散乱性標識微粒子
６            誘電体プリズム基板
６ａ          検出面
７            試料保持部
８            光源
９            測定光
１０          光検出器
２０          散乱光
２１          光検出器の法線ベクトル
２２          エバネッセント光
２３          散乱光分離機構
９０          試料中の不純物
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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