(57)【要約】【課題】溶媒を吸収し拡散する構造を有する担体において、検出され得る試薬のうち標的物質の標識となる試薬のみを選択的に密に固定化することができる捕捉体固定担体を提供すること。【解決手段】検体液中の標的物質を検出するための捕捉体固定担体であって、前記標的物質を捕捉するための捕捉体部材と、前記捕捉体部材が固定されている担体とを含んでなり、前記捕捉体部材が少なくとも、前記標的物質に対して親和性を有する捕捉分子と、前記担体を構成する材料に対して親和性を有する担体材料親和性部材とを含み、前記担体が、前記検体液が前記担体内部へ拡散し得る構造を有することを特徴とする捕捉体固定担体。【選択図】図１
2009085831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体液中の標的物質を検出するための捕捉体固定担体であって、
前記標的物質を捕捉するための捕捉体部材と、
前記捕捉体部材が固定されている担体とを含んでなり、
前記捕捉体部材が少なくとも、
前記標的物質に対して親和性を有する捕捉分子と、
前記担体を構成する材料に対して親和性を有する担体材料親和性部材とを含み、
前記担体が、前記検体液が前記担体内部へ拡散し得る構造を有する
ことを特徴とする捕捉体固定担体。
【請求項２】
前記担体材料親和性部材がセルロース結合性ドメインであることを特徴とする請求項１に記載の捕捉体固定担体。
【請求項３】
前記担体材料親和性部材が二酸化珪素親和性ペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の捕捉体固定担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体液中の標的物質を検出するデバイスで使用される捕捉体部材およびバイオセンサー素子に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサーは、生体や生体分子の持つ分子認識能を活用した計測デバイスである。生体内には、互いに親和性のある物質の組み合わせとして、例えば、酵素−基質、抗原−抗体、ＤＮＡ−ＤＮＡ等がある。バイオセンサーは、これらの組み合わせの一方を基材に固定もしくは担持して用いることによって、もう一方の物質を選択的に計測できるという原理を利用している。
【０００３】
近年では、バイオセンサーは医療分野のみならず、環境や食料品等への幅広い応用が期待され、その使用領域を広げるためにも、あらゆる場所に設置あるいは持ち運び可能な小型、軽量、高感度なバイオセンサーが望まれており、その一例として免疫クロマトグラフィーデバイスが広く使用されている。図１に免疫クロマトグラフィーデバイスを用いる分析法の一例を示す。図１に示される方法においては、一般的に当該デバイスの構成は、検体液１１を吸入し、試験部内に導入し試験部内で均一に浸透、拡散させるための試料吸入部８、試料中に含まれる標的物質１０と反応する試薬を含む試薬部（不図示）、標的物質１０と試薬の複合体を展開する展開部、検出可能物質を検出する検出部、過剰の試料液、添加された洗浄液や展開液を吸収し逆流を防止する吸収部９等の各部からなる。展開部および検出部としてはメンブレン７などの担体を用いる。
【０００４】
まずあらかじめ、メンブレン７などの担体表面の検出領域に標的物質の特定の領域（抗原抗体反応の場合はエピトープと呼ばれる）に親和性を有する第一の捕捉分子（抗原抗体反応の場合は一次抗体と呼ばれる）を固定化する。一方、試料吸入部または展開領域には、検出可能な試薬（例えば、金コロイド）で標識し、前記標的物質の特定の領域に親和性を有する第二の捕捉分子を塗布しておく。第一の捕捉分子および第二の捕捉分子は標的物質に対して同時に結合するように通常、標的物質の互いに異なる領域に親和性を有しているものを用いる。次に、検体液を液注入領域に注入する。検体液中に標的物質が含まれている場合、試料吸入部または展開領域に塗布されている第二の捕捉分子と標的物質が反応し、複合体を形成する。前記複合体は展開領域を拡散することにより、検出領域に到達し、担体に固定化されている第一の捕捉分子と接触することによって、標的物質を介して第二の捕捉分子に標識された検出可能な試薬を担体上に固定化することができる。そして、このような担体に固定化された検出可能な試薬の濃度を何らかの手法で測定することで、目的とする標的物質の数、濃度を計算することが可能となる。
【０００５】
このような免疫クロマトグラフィーセンサーにおいては、検出可能な標識となる試薬のにじみを抑制することが検出感度の向上に寄与すると考えられる。試薬のにじみを抑制する技術として、層状無機多孔質材料を用いる試験片に関する発明（特許文献１、２）が開示されている。これらは、検出領域に色素吸着力の高い層状無機多孔質材料を担体表面に配置することで、標的物質の存在により生じる色素を前記層状無機多孔質に吸着させることでにじみを抑制し、感度の向上を期待するものである。
【０００６】
また、捕捉体分子を担体上に固定する場合、官能基を有する材料からなる担体または官能基を導入した担体と捕捉体分子とを反応させることで、捕捉体分子を担体に固定化する化学架橋法が一般的に用いられる。
【特許文献１】特開２００１−０３３４５５号公報
【特許文献２】国際公開第０３／０６７２５８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記発明における色素等の固定は、非特異的な吸着固定であるため検体液中に含まれる夾雑物も固定化することが懸念され、シグナル−ノイズ比が悪くなるという課題がある。
【０００８】
また、官能基を有する材料で構成される担体に化学架橋法によって被固定化材料を固定化する場合、活性化される官能基の領域を制御しなければ、被固定化材料の固定化範囲が大きくなってしまうという課題がある。
【０００９】
よって、本発明の目的は、溶媒を吸収し拡散する構造を有する担体において、検出され得る試薬のうち標的物質の標識となる試薬のみを選択的に密に固定化することができる捕捉体固定担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するための捕捉体固定担体は、以下の通りである。
【００１１】
本発明の捕捉体固定担体は、検体液中の標的物質を検出するための捕捉体固定担体であって、
前記標的物質を捕捉するための捕捉体部材と、
前記捕捉体部材が固定されている担体とを含んでなり、
前記捕捉体部材が少なくとも、
前記標的物質に対して親和性を有する捕捉分子と、
前記担体を構成する材料に対して親和性を有する担体材料親和性部材とを含み、
前記担体が、前記検体液が前記担体内部へ拡散し得る構造を有する
ことを特徴とする捕捉体固定担体である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、サンドイッチ法における第一の捕捉分子（担体表面の検出領域に固定されるもの）の担体上への固定化範囲を限定し、前記捕捉分子の担体上での拡散、にじみを抑制することで固定化領域の端を明確にし、シグナル−ノイズ比の向上が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
《捕捉体部材》
本発明において、捕捉体部材とは、後述する捕捉分子と担体材料親和性部材の両者を少なくとも一部に含んでなる部材のことである。
【００１４】
《捕捉分子》
本発明において、捕捉分子とは、検体液中の標的物質の選択的な捕捉に係わる物質であり、例えば、検体液中の標的物質と選択的に直接反応する物質（例えば、レセプターや抗体など）、標的物質の反応に係わる物質（例えば、標的物質の反応に選択的に触媒作用をもたらす物質）等である。また、この捕捉分子は、検出の有無や程度の表示に係わる機能、例えば、レセプターが放出する物質や残余の物質と反応し発色する機能等を兼ねるものであってもよい。本発明に使用される捕捉分子には、酵素、糖鎖、触媒、抗体、抗体断片、抗原、核酸、呈色試薬、などが挙げられるがこれに限る物ではない。
【００１５】
尚、本発明の検出対象は、直接捕捉分子が反応する標的物質である必要は無く、間接的に測定できるものでもよい。例えば、検出対象に特異的に存在する標的物質を検出することで測定が可能となる。よって、検出対象は生体物質に限るものではなく、またそのサイズも限定されるものではない。ただし、標的物質は糖、蛋白質、アミノ酸、抗体、抗原や疑似抗原、ビタミン、核酸などの生物に含有される生体物質、及び、その関連物質や人工的に合成された擬似生体物質であることが望ましい。
【００１６】
また、前記捕捉体成分を複合して使用することも可能であり、本発明における捕捉分子として、例えば、複合酵素、抗体−酵素、などの捕捉分子を構成することも可能である。
【００１７】
《担体材料親和性部材》
本発明において担体材料親和性部材とは、捕捉体部材を担体に固定する機能を有する部位として捕捉体部材の一部を構成する材料であって、担体を構成する材料を認識し、担体材料に特異的に吸着する物質であれば特に限定されない。このような材料として、タンパク質の基質結合性ドメインや、材料親和性ペプチドを好適に用いることができる。例えば、担体がセルロース繊維で構成される場合、セルロース結合ドメインを使用することができる。また、担体がシリカゲルで構成される場合、二酸化珪素親和性ペプチドを使用することができる。これらのペプチドはアミノ酸配列が特定されていれば生物工学的手法により調製することができる。セルロース親和性ドメインとは、例えば、セルロース分解酵素であるセルラーゼの基質結合性ドメインであるセルロース結合ドメインを使用することができる。セルロースには大きく分けて、可溶性セルロースと不溶性セルロースが存在する。また、不溶性セルロースには、結晶性セルロースと非結晶性セルロースが存在するため、セルロース結合ドメインには、結晶性のセルロースに結合するドメインと非結晶性のセルロースに結合するドメインが存在することが知られている。本発明において、担体材料親和性部材としてセルロース結合性ドメインを用いる際、前記セルロース繊維が結晶性セルロースに富む場合には結晶性セルロース結合ドメインを、非結晶性セルロースに富む場合には非結晶性セルロース結合ドメインを選択することが好ましい。また、本発明で用いるセルロース結合性ドメインは、前記セルロース結合性ドメイン自体に担体となるセルロースの加水分解作用のないものが好ましい。一方、二酸化珪素親和性ペプチドには非特許文献（Mehmet Sarikaya, Candan Tamerler, Alex K.-Y.Jin, Klaus Schulten, Francois Baneyx: Molecular biomimetics: nanotechnology through biology. Nature materials 2: 577-585, 2003）で報告されている二酸化珪素親和性ペプチドを使用することができる。前記二酸化珪素親和性ペプチドのような材料親和性ペプチドを選択する方法としては、Ｍ１３ファージに代表されるウィルス外殻タンパク質や大腸菌、酵母等の細胞の表面に材料親和性ペプチドを提示する表面提示法が利用できることが知られている。
【００１８】
本発明における担体材料親和性部材である上記セルロース結合性ドメイン又は二酸化珪素親和性ペプチドは、本発明における捕捉体部材中において、前記捕捉分子および自身の機能を損なわない限りにおいて、複数個の繰り返し構造とすることもできる。また、前記捕捉分子と前記担体材料親和性部材間や、担体材料親和性部材の繰り返し構造間は直接繋がっていることもできるし、前記捕捉分子および前記担体材料親和性部材に対して互いに自由度を与えるためにリンカー配列で繋がれていてもいい。リンカー配列は前記捕捉分子及び前記担体材料親和性部材の機能発現を阻害しない限り特に限定されないが、例えば、グリシン（G）、セリン（S）で構成されるGGGGSのような一般的に用いられるリンカー配列を使用することができる。
【００１９】
《親和性》
本発明において親和性があるとは、ある物質に対して特異的に結合する能力があるということである。例えば、セルロース結合性ドメイン（ＣＢＤ）がセルロースに親和性があるとは、ＣＢＤがセルロースに対して特異的に結合する能力があるということである。前記特異的な結合力とは、平衡解離定数（ＫＤ）が1×e-6M以下となる結合力をさす。
【００２０】
以下に、ＣＢＤとセルロースを例として、平衡解離定数を算出する式を記載する。
【００２１】
１/[Ｐ・Ｃ]＝ＫＤ/[Ｐ・Ｃ]ｍａｘ  ×  １/[Ｐ]  +  １/[Ｐ・Ｃ]ｍａｘ
遊離のＣＢＤの濃度：[Ｐ]
セルロース上にあるＣＢＤが結合する領域の濃度：[Ｃ]
セルロースと複合体を形成しているＣＢＤの濃度：[Ｐ・Ｃ]
セルロースと複合体を形成できるＣＢＤの最大濃度：[Ｐ・Ｃ]ｍａｘ
上記式を1/[Ｐ]に対して1/[Ｐ・Ｃ]をプロットすることにより、ＫＤを算出することができる。
【００２２】
《捕捉体部材の構成》
本発明における捕捉体部材の構成としては、前記捕捉分子と担体材料親和性部材が融合した状態の単量体である場合と、各々独立した状態の多量体である場合とが考えられる。
【００２３】
単量体である場合、捕捉分子と担体材料親和性部材とを遺伝子的に連結した融合タンパク質としての構成が考えられる。具体的には、抗体の抗原捕捉ドメインであるVHドメインとVLドメインをリンカーで繋いだｓｉｎｇｌ  Ｃｈａｉｎ  Ｆｖを捕捉分子として用い、担体材料親和性部材にセルロース結合性ドメインを用いて、これらの融合ポリペプチドを作成し、セルロース担体へ固定される捕捉体部材として用いることが可能である。
【００２４】
一方、捕捉体部材を多量体として用いる場合、遺伝子配列が未知であり上記のように捕捉分子と担体材料親和性部材を一本のポリペプチド鎖とすることが困難な分子を捕捉体部材とする場合に有効である。このような多量体としての捕捉体部材を構成する方法としては、捕捉分子と担体材料親和性部材を、結合能を有する二つの物質の組み合わせを介して多量体とすることができる。前記結合能を有する二つの物質の組み合わせには、例えば、ビオチンとアビジン（ストレプトアビジン）のような組み合わせがある。捕捉分子に配列未知の抗体を用いる場合、前記抗体にビオチンを標識し、担体材料親和性部材として用いられるセルロース結合性ドメインにストレプトアビジンを遺伝子的に連結させた融合タンパク質を用いることで、ビオチンーストレプトアビジンを介して配列未知の抗体とセルロース結合性ドメインを多量体状の捕捉体部材として構成することができる。
【００２５】
《捕捉体固定担体》
本発明における捕捉体固定担体は、捕捉体部材と担体とを少なくとも含んでなる。捕捉体部材は担体上に固定されている。捕捉体部材は上で述べたとおり、捕捉分子と担体材料親和性部材の両者を少なくとも一部に含んでなる部材であり、捕捉分子および担体材料親和性部材にはそれぞれ上述したものを用いることができる。捕捉体固定担体の担体には以下に述べるように、検体液を吸収し、拡散させることができる構造を有する材料を用いる。このような担体はクロマトグラフィー法の固定相として機能するので、この担体材料に標的物質を捕捉可能な捕捉体部材が固定された捕捉体固定担体は、免疫クロマトグラフィーに用いるバイオセンサー素子として好適に用いることができる。捕捉体固定担体は、捕捉体部材が担体に固定された状態で提供されるが、捕捉体部材と担体とを個別に分けて検査用キットとして提供することもできる。検査用キットは、捕捉体部材と担体とを少なくとも含み、捕捉体部材と担体とは個別に分かれている検査用キットである。
【００２６】
《担体》
本発明において、担体とは、上記捕捉分子を固定化する足場となる固相であり、担体内部への検体液の拡散が可能な構造をとることができればよく、担体の表面及び内部に細孔などの微細な間隙を有しているものが挙げられる。そのような構造としては、例えば、多孔質構造体、繊維状構造集合体、微粉末集合体等があげられる。ポーラス（多孔質）材料からなる細孔壁には幅広い材料が適用可能であり、シリカや酸化チタン、アルミナのような金属酸化物や、最近では有機基を細孔壁内に導入した有機−無機ハイブリッド型のポーラス材料の合成も報告されている。また、繊維状構造の集合体としては、ガラス繊維のような無機材料の集合体だけでなく、セルロース繊維のような有機材料の集合体を用いることも可能である。有機性繊維の集合体としては、典型的には織布状の構造を有するものを用いることができる。また、濾紙などの紙片であってもよい。
【００２７】
本発明において多孔質構造体、繊維状構造集合体、微粉末集合体を構成する材料は限定されるものではないが、本発明において使用される捕捉体部材との組み合わせにおいて、前記捕捉体部材に含有される担体親和性部材によって認識され、前記担体親和性部材が結合能を有する材料を使用するものとする。
【００２８】
本発明における担体は、表面及び内部に微細な間隙を有し、担体表面においても検体液の拡散が進むのでクロマトグラフィー法の固定相として好適に用いることができる。また、担体の形状は、基板などの平板状の形状や膜状の形状が好ましいが、これに限定されない。
【００２９】
＜担体への捕捉体部材の固定化＞
本発明の捕捉体固定担体として、担体上および内部に捕捉体部材を固定化する方法として、担体親和性材料による分子認識を利用した固定化を用いることができる。前記分子認識を利用した捕捉体部材の担体への固定化を行うことで、捕捉体部材を含有する溶液を担体に塗布する場合、担体内部に捕捉体部材溶液の溶媒が拡散する際において、溶質である捕捉体部材は、捕捉体部材が有する担体材料親和性部材と担体材料とが作用することによって、溶媒が拡散する範囲よりも塗布した領域近傍において担体材料に固定化され得る。このことにより、前記捕捉体部材含有溶液の担体への塗布領域において、前記溶液の溶媒拡散によるにじみが生じうるが、溶質である捕捉体部材の固定化領域は溶媒拡散領域よりも狭小となり、固定化を望む領域に密に固定することが期待できる（図２）。捕捉分子の塗布領域からの拡散を抑制することによって、前記捕捉体部材固定化領域の端をより明確にすることが期待できる。また複数の標的物質を検出するために、複数の捕捉体部材を同一試験片上に固定化する場合、捕捉体部材の溶出、拡散によって隣接する捕捉体部材とのコンタミネーションが起こる可能性がある。しかし、本発明の捕捉体部材を用いることにより、捕捉体部材の担体上でのにじみ、溶出が抑えられるため、複数の捕捉体部材をより近接して担体に固定化（図３）でき、ハイスループットな検出が期待できる。
【００３０】
上記のようにして捕捉体部材を固定した担体を乾燥させることにより、捕捉体部材の前記担体材料への吸着が強固となることを促すこともできる。また、捕捉体部材の固定化領域に化学架橋剤を塗布することにより、捕捉体部材と前記担体材料及び前記化学架橋剤を共有結合的に相互に反応させ、捕捉体部材の担体材料からの溶出、拡散を抑制することもできる。さらに、捕捉体固定担体をブロッキング剤によって処理することもできる。ブロッキング処理は検体液中に含まれる夾雑物が検出領域において非特異的な吸着を起こすことを抑制することが期待できる。また、ブロッキング処理によって、検体液中に含まれる標的物質が、検出領域外で捕捉体固定担体に非特異的に吸着することを抑制することも期待できる。
【００３１】
＜担体と捕捉体部材の組み合わせ＞
≪セルロース繊維状担体と捕捉体部材≫
本発明で使用される担体材料としてセルロース繊維を用いる場合、捕捉体部材に含有される担体材料親和性部材は、セルロース結合ドメインを使用することができる。前記セルロース結合ドメインは酵素セルラーゼが持つ基質結合部位である。前記酵素セルラーゼは微生物や動物、植物等様々な細胞から単離されるが、本発明において使用されるセルロース結合ドメインとしては、前記酵素セルラーゼの由来は特に限定されず、担体材料となるセルロースに対して親和性を有していれば良く、その親和性が高いものが好ましい。なお、前記セルロース結合ドメインは天然のセルラーゼから単離される配列を用いることもできるし、遺伝子組換えによってセルロースに対する親和性を向上させた変異型セルロース結合ドメインを使用することもできる。
【００３２】
前記セルロース結合ドメインを有する捕捉体部材の構成としては、捕捉分子及び前記セルロース結合ドメインの機能発現を阻害しない構成であれば特に限定されない。前記捕捉分子と前記セルロース結合ドメインは、前記捕捉分子のカルボキシル末端または／及びアミノ末端に直接セルロース結合性ドメインのアミノ末端または／及びカルボキシル末端を融合することにより一つの捕捉体部材とすることができる。上記のように両者を直接融合することも可能であるが、前記捕捉分子、前記セルロース結合性ドメインは夫々独立の三次構造を形成することにより機能を発現するため、夫々を互いに干渉させず機能発現を容易にするために、両者をリンカーで融合することもできる。前記リンカーの配列は特に限定されないが、例えば、GGGGSのような配列が利用できる。また、担体への捕捉体部材の固定化を強固にするために、捕捉体部材に含まれるセルロース結合ドメインの個数を複数個とすることもできる。セルロース結合ドメインの個数が増加することにより、捕捉体部材が担体材料であるセルロース繊維に接触する際に、セルロース結合ドメインがセルロース繊維に接触する確率が増加し、セルロース担体への固定化速度が速くなる、また親和性が向上することによって、より強固に固定化されることが期待できる。その結果、担体材料上において捕捉体部材が固定化したい領域から拡散し、固定化端がにじむことを抑制することが可能となる。
【００３３】
≪ガラス繊維状担体と捕捉体部材≫
本発明で使用される担体材料としてガラス繊維を用いる場合、捕捉体部材に含有される担体材料親和性部材は、二酸化珪素親和性ペプチドを使用することができる。二酸化珪素親和性ペプチドのような材料親和性ペプチドは前記ファージディスプレイのような当該技術分野における既知の方法で取得することが可能である。
【００３４】
前記二酸化珪素親和性ペプチドを有する捕捉体部材の構成としては、捕捉分子及び前記二酸化珪素親和性ペプチドの機能発現を阻害しない構成であれば特に限定されない。前記捕捉分子と前記二酸化珪素親和性ペプチドは、前記捕捉分子のカルボキシル末端または／及びアミノ末端に直接セルロース結合性ドメインのアミノ末端または／及びカルボキシル末端を融合することにより一つの捕捉体部材とすることができる。上記のように両者を直接融合することも可能であるが、前記捕捉分子は固有の三次構造を形成することにより機能を発現するため、前記捕捉分子と前記二酸化珪素親和性ペプチドとを互いに干渉させず機能発現を容易にするために、両者をリンカーで融合することもできる。前記リンカーの配列は特に限定されないが、例えば、GGGGSのような配列が利用できる。また、担体への捕捉体部材の固定化を強固にするために、捕捉体部材に含まれる二酸化珪素親和性ペプチドの個数を複数個とすることもできる。二酸化珪素親和性ペプチドの個数が増加することにより、捕捉体部材が担体材料であるガラス繊維に接触する際に、二酸化珪素親和性ペプチドがガラス繊維に接触する確率が増加し、ガラス繊維担体への固定化速度が速くなる、また親和性が向上することによって、より強固に固定化されることが期待できるため、担体材料上において捕捉体部材を固定する領域から前記捕捉体部材が拡散し、固定化端がにじむことを抑制することが可能となる。
【００３５】
＜検体の検出方法＞
本発明で用いられる捕捉体固定担体は、上記捕捉体部材を前記担体上に固定化する場合に、前記捕捉体部材が前記捕捉体固定担体内部において拡散することを抑制するため、捕捉体部材を含む溶液を担体上に滴下（スポット）した領域に優先的に固定化し、検体液中の水分が担体内部に浸潤し、拡散していく場合においても捕捉体部材は滴下した領域近傍に固定化される。
【００３６】
《標的物質の検出方法》
本発明における捕捉体固定担体を利用した標的物質の検出方法としては、例えば、免疫クロマトグラフィーを用いたサンドイッチ型の検出方法が利用できる。検体液中の標的物質を認識する抗体に検出可能な標識を施すことによって標識化抗体を作成し、前記標識化抗体を前記検体液中に混合することにより、検体液中の標的物質と前記標識化抗体の複合体を形成する。本発明における捕捉体固定担体に、前記複合体を接触させることにより、捕捉体固定担体上にあらかじめ固定された標的物質に親和性を有する捕捉分子と、前記複合体とが標的物質を介して反応する。その結果、本発明の捕捉体固定担体上の検出部位に検出可能な標識が固定され、この標識を検出することにより間接的に検体液中の標的物質の量を測定することが可能である。捕捉分子を有する捕捉体部材を担体上の検出部位となる特定の領域（以下、捕捉体固定領域と記す）に固定する場合、前記複合体を含む溶液を捕捉体固定領域以外の領域に接触させると、担体内部に浸潤し、拡散することで前記複合体は捕捉体固定領域に到達する。前記検出可能な標識としては、金コロイドやラテックス粒子や、蛍光物質、発光物質等が利用可能であり、それらの検知としては目視確認、濃度検出、光の反射や透過によって検知することができる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有するバイオセンサーが得られる範囲で自由に変えることができる。
【００３８】
（実施例１）
本実施例は、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）とセルロース親和性ドメインとの融合ポリペプチドのセルロース担体への固定化例である。
【００３９】
ＧＦＰとセルロース親和性ドメインとの融合ポリペプチドの作成
（１−１）融合ポリペプチドの生産工程
配列１に記載のＧＦＰ（遺伝子配列は配列２に記載）と配列３に記載のセルロース親和性ドメイン（遺伝子配列は配列４に記載）をリンカー（アミノ酸配列及び遺伝子配列は夫々配列５、配列６に記載）を介して融合した融合ポリペプチドをコードする遺伝子を発現するための遺伝子発現ベクターをｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）ベクターをもとに構築する。
【００４０】
上記ポリペプチド（配列７）をコードする遺伝子（配列８）は、遺伝子断片を取得する際によく行われるオーバーラップＰＣＲにより取得する。取得される増幅遺伝子断片の５'末端にはＢａｍＨＩ、３'末端にはＥｃｏＲＩの制限酵素サイトを付加しておき、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのフレームと合うように増幅遺伝子断片を導入する。その後、ＤＮＡシーケンサーにて配列を確認する。
【００４１】
上記のように構築される遺伝子発現ベクターにて大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１を形質転換する。１６時間インキュベーションを行った後、培養プレートからシングルコロニーをつつき取り、３ｍｌの２×ＹＴ培地（トリプトン；１６wt％、イーストエクストラクト；１０wt％、塩化ナトリウム；５wt％）（終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に植菌して、３７℃で振とう培養（前培養）を行う。１２時間後、その培養物の３ｍｌを２５０ｍｌの２×ＹＴ培地（終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に加え、２８℃で振とう培養を行う。培養液の吸光度ＯＤ600が０．８に達したところで、培養液に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β―Ｄ−ガラクトピラノシド）を添加してポリペプチドの生産を誘導し、１２時間培養する。
【００４２】
（１−２）融合ポリペプチドの精製工程
ＩＰＴＧ誘導した大腸菌を集菌（８，０００×ｇ，２分、４℃）し、１／１０量の４℃リン酸緩衝生理食塩水（（ＰＢＳ）ＮａＣｌ；８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4；１．４４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4；０．２４ｇ、ＫＣｌ；０．２ｇ、精製水；１０００ｍｌ）に再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除く。誘導され発現されたＧＳＴ融合ポリペプチドをグルタチオン・セファロース４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス（株）製）で業者推奨の方法にて精製する。使用するグルタチオン・セファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行う。すなわち、グルタチオン・セファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８，０００×ｇ、１分、４℃）した後、４％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを同量加えて、４℃で１時間処理する。処理後、同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁する。前処理したグルタチオン・セファロース ４０μｌを、無細胞抽出液１ｍｌに添加し、４℃で静かに攪拌する。前記の手順で、ＧＳＴ融合ポリペプチドをグルタチオン・セファロースに吸着させる。吸着後、遠心（８，０００×ｇ、１分、４℃）してグルタチオン・セファロースを回収し、４００μｌのＰＢＳで３回洗浄する。その後、１０ｍＭグルタチオン４０μｌを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合ポリペプチドを溶出する。遠心（８，０００×ｇ、２分、４℃）して上清を回収した後、ＰＢＳに対して透析しグルタチオンを除去し、ＧＳＴ融合ポリペプチドを精製する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＧＳＴ融合ポリペプチドのバンドを確認する。
【００４３】
ＧＳＴ融合ポリペプチドをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製、５Ｕ）を用いて業者推奨の方法にて消化した後、グルタチオン・セファロースに通して前記プロテアーゼとＧＳＴとを除去後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより３２ｋＤａのバンドの確認を行う。
【００４４】
(１−３)融合ポリペプチドの固定化
上記のようにして得られるポリペプチドをセルロース膜にスポットし、溶液の拡散領域を確認する。前記ポリペプチドを固定化したセルロース膜に４６０ｎｍの励起光を照射することにより、５０８ｎｍの蛍光が観測される。前記蛍光が観測される領域が、前記ポリペプチドをセルロース膜に固定化する際に生じる溶液の拡散径に比べ狭小であることが目視確認できる。
【００４５】
（１−４）ＧＦＰの作成
（１−１）、（１−２）で生産、精製した融合ポリペプチドを単独のＧＦＰ（配列１）に変更する以外は、同様の操作を行い、ＧＦＰを得る。ＧＦＰの遺伝子配列は配列２に示す。
【００４６】
（１−５）対照実験：  ＧＦＰの固定化
上記のようにして得られる単独ＧＦＰをセルロース膜にスポットし、溶液の拡散領域を確認する。前記ポリペプチドを固定化したセルロース膜に４６０ｎｍの励起光を照射することにより、５０８ｎｍの蛍光が観測される。前記蛍光が観測される領域が、前記ポリペプチドをセルロース膜に固定化する際に生じる溶液の拡散径と同等であることが確認できる。（１−３）、（１−５）の結果から、ＧＦＰ単独の場合、前記セルロース結合ドメインとの融合ポリペプチドをセルロース膜上にスポットした場合に比べて、緑色蛍光を発する領域が大きく、にじみ、拡散が発生することが確認できる。
【００４７】
上記結果から、セルロース親和性ドメインとの融合ポリペプチドとすることで、ポリペプチドのセルロース担体上での拡散、にじみを抑制でき、固定化領域を限定することが可能となる分子を提供できる。
【００４８】
（実施例２）
本実施例は、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）と二酸化珪素親和性ペプチドとの融合ポリペプチドのガラスフィルターへの固定化例である。
【００４９】
ＧＦＰと二酸化珪素親和性ペプチドとの融合ポリペプチドの作成
（２−１）融合ポリペプチドの生産工程
配列１に記載のＧＦＰ（遺伝子配列は配列２に記載）と配列９に記載の二酸化珪素親和性ペプチド（遺伝子配列は配列１０に記載）をリンカー（アミノ酸配列及び遺伝子配列は夫々配列５、配列６に記載）を介して融合した融合ポリペプチドをコードする遺伝子を発現するための遺伝子発現ベクターをｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）ベクターをもとに構築する。
【００５０】
上記ポリペプチド（配列１１）をコードする遺伝子（配列１２）は、遺伝子断片を取得する際によく行われるオーバーラップＰＣＲにより取得する。取得される増幅遺伝子断片の５'末端にはＢａｍＨＩ、３'末端にはＥｃｏＲＩの制限酵素サイトを付加しておき、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのフレームと合うように増幅遺伝子断片を導入する。その後、ＤＮＡシーケンサーにて配列を確認する。
【００５１】
上記のように構築される遺伝子発現ベクターにて大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１を形質転換する。１６時間インキュベーションを行った後、培養プレートからシングルコロニーをつつき取り、３ｍｌの２×ＹＴ培地（トリプトン；１６wt％、イーストエクストラクト；１０wt％、塩化ナトリウム；５wt％）（終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に植菌して、３７℃で振とう培養（前培養）を行う。１２時間後、その培養物の３ｍｌを２５０ｍｌの２×ＹＴ培地（終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に加え、２８℃で振とう培養を行う。培養液の吸光度ＯＤ600が０．８に達したところで、培養液に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β―Ｄ−ガラクトピラノシド）を添加してポリペプチドの生産を誘導し、１２時間培養する。
【００５２】
（２−２）融合ポリペプチドの精製工程
ＩＰＴＧ誘導した大腸菌を集菌（８，０００×ｇ，２分、４℃）し、１／１０量の４℃リン酸緩衝生理食塩水（（ＰＢＳ）ＮａＣｌ；８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4；１．４４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4；０．２４ｇ、ＫＣｌ；０．２ｇ、精製水；１０００ｍｌ）に再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除く。誘導され発現されたＧＳＴ融合ポリペプチドをグルタチオン・セファロース４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス（株）製）で業者推奨の方法にて精製する。使用するグルタチオン・セファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行う。すなわち、グルタチオン・セファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８，０００×ｇ、１分、４℃）した後、４％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを同量加えて、４℃で１時間処理する。処理後、同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁する。前処理したグルタチオン・セファロース ４０μｌを、無細胞抽出液１ｍｌに添加し、４℃で静かに攪拌する。前記の手順で、ＧＳＴ融合ポリペプチドをグルタチオン・セファロースに吸着させる。吸着後、遠心（８，０００×ｇ、１分、４℃）してグルタチオン・セファロースを回収し、４００μｌのＰＢＳで３回洗浄する。その後、１０ｍＭグルタチオン４０μｌを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合ポリペプチドを溶出する。遠心（８，０００×ｇ、２分、４℃）して上清を回収した後、ＰＢＳに対して透析しグルタチオンを除去し、ＧＳＴ融合ポリペプチドを精製する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＧＳＴ融合ポリペプチドのバンドを確認する。
【００５３】
ＧＳＴ融合ポリペプチドをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製、５Ｕ）を用いて業者推奨の方法にて消化した後、グルタチオン・セファロースに通して前記プロテアーゼとＧＳＴとを除去後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４２ｋＤａのバンドの確認を行う。
【００５４】
(２−３)融合ポリペプチドの固定化
上記のようにして得られるポリペプチドをセルロース膜にスポットし、溶液の拡散領域を確認する。前記ポリペプチドを固定化したガラスフィルターに４６０ｎｍの励起光を照射することにより、５０８ｎｍの蛍光が観測される。前記蛍光が観測される領域が、前記ポリペプチドをガラスフィルターに固定化する際に生じる溶液の拡散径に比べ狭小であることが目視確認できる。
【００５５】
（２−４）ＧＦＰの作成
（２−１）、（２−２）で生産、精製した融合ポリペプチドを単独のＧＦＰに変更する以外は、同様の操作を行い、GFPを得る。
【００５６】
（２−５）対照実験：  ＧＦＰの固定化
上記のようにして得られる単独ＧＦＰをガラスフィルターにスポットし、溶液の拡散領域を確認する。前記ポリペプチドを固定化したガラスフィルターに４６０ｎｍの励起光を照射することにより、５０８ｎｍの蛍光が観測される。前記蛍光が観測される領域が、前記ポリペプチドをガラスフィルターに固定化する際に生じる溶液の拡散径と同等であることが確認できる。（２-３）、（２−５）の結果から、ＧＦＰ単独の場合、前記二酸化珪素親和性ペプチドとの融合ポリペプチドをガラスフィルター上にスポットした場合に比べて、緑色蛍光を発する領域が大きく、にじみ、拡散が発生することが確認できる。
【００５７】
上記結果から、二酸化珪素親和性ペプチドと融合ポリペプチドとすることで、ポリペプチドのガラスフィルター担体上での拡散、にじみを抑制でき、固定化領域を限定することが可能となる分子を提供できる。
【００５８】
(実施例３)
本発明の捕捉分子を固定化した担体を利用した免疫クロマトグラフィーでのHEL（Hen Egg Lysozyme）の検出
（３−１）抗ＨＥＬ抗体断片（HyHEL10）（single chain Ｆｖ  ：  scＦｖ）とセルロース親和性ドメインとの融合ポリペプチドの作成
実施例１のＧＦＰを抗ＨＥＬ抗体断片HyHEL10（アミノ酸配列、遺伝子配列は夫々配列１３、配列１４に示す）に変更する以外は実施例（１-１）、（１-２）と同様の作業を行い、融合ポリペプチドを得る。融合ポリペプチドのアミノ酸配列は配列１５に、前記融合ポリペプチドの遺伝子配列は配列１６に示す。
【００５９】
（３-２）ストレプトアビジンとセルロース親和性ドメインとの融合ポリペプチドの作成
実施例１のＧＦＰをストレプトアビジン（アミノ酸配列、遺伝子配列は夫々配列２５、配列２６に示す）に変更する以外は実施例（１-１）、（１-２）と同様の作業を行い、融合ポリペプチドを得る。融合ポリペプチドのアミノ酸配列は配列２７に、前記融合ポリペプチドの遺伝子配列は配列２８に示す。
【００６０】
（３−３）試験片の作成
（３−１）で取得する融合ポリペプチドを１ｍｇ/ｍｌの濃度となるよう調製する。前記融合ポリペプチド溶液をニップンテクノクラスタ製のＢｉｏＤｏｔ  ＸＹＺ3050とＢｉｏＪｅｔＱｉａｎｔｉ３０００ディスペンサーを用いてＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（ＣＦＳＰ：  ミリポア製）にライン塗布し、テストラインとする。ビオチン化抗ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＲＣＫ社製、Rabbit、Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ）を、（３-２）で作成されるストレプトアビジン-セルロース親和性ドメイン融合ポリペプチド溶液と混合し、ビオチン-ストレプトアビジン結合を介した抗ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体とセルロース親和性ドメインの多量体状の捕捉体部材を作成する。この作成される捕捉体部材はコントロールライン用の部材として使用される。前記テストラインの展開方向後方に、コントロールラインとなるように、前記コントロールライン用捕捉体部材をライン塗布する。室温で１２時間乾燥後、メンブレンの一端をブロッキングバッファー（０.５％カゼイン、５０ｍＭホウ酸（ｐＨ８.５））に浸し、ブロッキングバッファーが上端まで吸い上げられた後、メンブレン全体をブロッキングバッファー中に浸し、３０分静置する。メンブレンを洗浄・安定化バッファー（０.５％スクロース、０.０５%コール酸ナトリウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ7.5））に浸し、穏やかに３０分振とうする。メンブレンをペーパータオル上におき、室温で一晩乾燥させ、サンプル展開・検出用パッドとして調製する。
【００６１】
標識化抗体として用いる、抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体（ＲＣＫ社製、Ｒａｂｂｉｔ−Ｐｏｌｙ、HRP標識）を濃度１ｍｇ/ｍｌに調製し１ｍｌを分取する。この抗体溶液に塗布バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ8.2）、０．０５％  ＰＥＧ20000、５％  スクロース）を２ｍｌ加え、軽く攪拌する。Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ：  ミリポア製）に上記混合液を均等に塗布する。デシケーター中で一昼夜減圧乾燥を行い、コンジュゲートパッドを作成する。
【００６２】
バッキングシート（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）に上記で調製するテストライン、コントロールライン塗布済みのサンプル展開・検出用パッドを、コントロールライン側を上にして貼り付ける。吸水パッド（ミリポア製）をバッキングシートの上端に合わせて貼り付ける。このとき先に添付済みのサンプル展開・検出用パッドと吸水パッドが約５ｍｍ重なるように置く。上記ＨＲＰ標識抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体を塗布済みのコンジュゲートパッドをサンプル展開・検出用パッドと約２ｍｍ重なるようにバッキングシート下端側に置く。サンプルパッド（ＧＦＣＰ：  ミリポア製）をコンジュゲートパッドと約４ｍｍ重なるように、バッキングシートの下端に合わせて貼り付ける。上記のように調製したシートをカッティングモジュールＣＭ４０００（ニップンテクノクラスタ製）で５ｍｍ幅で切断し、ハウジングケースにセットする。
【００６３】
（３-４）ニワトリ卵白リゾチームの検出
ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）を濃度１０μｇ/ｍｌとなるようにサンプルバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ8.0）に溶解する。このＨＥＬ溶液を検体液として、（３-３）で作成する試験片にアプライし、検体液を１５分間展開する。ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア製）を用いて試験片上にＨＥＬを介してテストラインに捕捉されるＨＲＰ標識抗体の検出を行う。本実施例のバイオセンサー素子において捕捉体部材のにじみ、拡散が抑えられるため、テストラインの端が明瞭となり、標的物質を高感度に検出することができる。ニワトリ卵白リゾチームの濃度を１/１０、１/１００とすることで発光強度もＨＥＬの濃度に相関することが確認できる。
【００６４】
(実施例４)
実施例３のセルロース結合ドメインを二酸化珪素親和性ペプチドに変更し、サンプル展開・検出用パッドをＧｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄに変更する以外は、実施例３と同様の構成の試験片に、ＨＥＬ溶液を検体液として展開して評価する。取得される融合ポリペプチドのアミノ酸配列及び、遺伝子配列は配列１７、１８に夫々記す。本実施例のバイオセンサー素子において捕捉体部材のにじみ、拡散が抑えられるため、テストラインの端が明瞭となり、標的物質を高感度に検出することができる。ニワトリ卵白リゾチームの濃度を１/１０、１/１００とすることで発光強度もＨＥＬの濃度に相関することが確認できる。
【００６５】
(実施例５)  複数の抗原を検出
抗ＨＥＬ抗体断片（ＨｙＨＥＬ１０  ｓｃＦｖ）とセルロース結合性ドメインとを融合した融合ポリペプチド１（アミノ酸配列、遺伝子配列は夫々配列１５、配列１６に示す）と、抗Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｕｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）抗体のｓｃＦｖ（アミノ酸配列、遺伝子配列は夫々配列１９、２０に示す）とセルロース結合性ドメインを融合した融合ポリペプチド２（アミノ酸配列、遺伝子配列は夫々配列２１、２２に示す）とを準備する。融合ポリペプチド２は実施例１の（１-１）、（１-２）のＧＦＰを抗ＢＳＡ抗体ｓｃＦｖに変更すること以外は実施例１の（１−１）、（１−２）と同様にして作成する。上記のように作成する融合ポリペプチド１と融合ポリペプチド２を実施例３の（３−２）で行うのと同様にして、サンプル展開・検出用パッドの同一パッド上の異なる領域に固定化する。まず、融合ポリペプチド１を固定化し、その展開方向後方に融合ポリペプチド２を固定化する。さらに、展開方向後方にコントロールラインとなる抗ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＲＣＫ社製）Rabbit、 Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ）をライン塗布し、物理吸着により固定する。室温で１２時間乾燥後、メンブレンの一端をブロッキングバッファー（０.５％カゼイン、５０ｍＭホウ酸（ｐＨ８.５））に浸し、ブロッキングバッファーが上端まで吸い上げられた後、メンブレン全体をブロッキングバッファー中に浸し、３０分静置する。メンブレンを洗浄・安定化バッファー（０.５％スクロース、０.０５%コール酸ナトリウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ7.5））に浸し、穏やかに３０分振とうする。メンブレンをペーパータオル上におき、室温で一晩乾燥させ、サンプル展開・検出用パッドとして調製する。
【００６６】
標識用抗体として用いる、抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体（ＲＣＫ社製、Ｒａｂｂｉｔ−Ｐｏｌｙ、HRP標識）と抗ウシ血清アルブミン抗体（ＲＣＫ社製、Rabbit-Poly, FITC標識）を濃度１ｍｇ/ｍｌに調製し１ｍｌを分取する。この抗体溶液に塗布バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ8.2）、０．０５％  ＰＥＧ20000、５％  スクロース）を２ｍｌ加え、軽く攪拌する。Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ：  ミリポア製）に上記混合液を均等に塗布する。デシケーター中で一昼夜減圧乾燥を行い、コンジュゲートパッドを作成する。
【００６７】
バッキングシート（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）に上記で調製するテストライン、コントロールライン塗布済みのサンプル展開・検出用パッドを、コントロールライン側を上にして貼り付ける。吸水パッド（ミリポア製）をバッキングシートの上端に合わせて貼り付ける。このとき先に添付済みのサンプル展開・検出用パッドと吸水パッドが約５ｍｍ重なるように置く。上記ＨＲＰ標識抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体を塗布済みのコンジュゲートパッドをサンプルパッドと約２ｍｍ重なるようにバッキングシート下端側に置く。サンプルパッド（ＧＦＣＰ：  ミリポア製）をコンジュゲートパッドと約４ｍｍ重なるように、バッキングシートの下端に合わせて貼り付ける。上記のように調製したシートをカッティングモジュールＣＭ４０００（ニップンテクノクラスタ製）で５ｍｍ幅で切断し、ハウジングケースにセットする。
【００６８】
ＨＥＬとＢＳＡの混合溶液を実施例３の（３-４）で使用する検体液の代わりに使用する以外は、実施例３の（３-４）と同様にして展開する。ＨＥＬの検知は実施例３の（３-４）と同様にして行い、ＢＳＡの検知はＦＩＴＣの蛍光を検出する。ＨＥＬ及びＢＳＡの濃度を１/１０、１/１００とすることで発光強度及び蛍光強度もＨＥＬ及びＢＳＡの濃度に相関することが確認できる。本実施例のバイオセンサー素子において捕捉体部材のにじみ、拡散が抑えられるため、テストラインの端が明瞭となるとともに、隣接する捕捉体部材とのコンタミネーションを抑制できる。複数の標的物質に対する捕捉体部材を近接して固定化することが可能となるため、同一試験時間で複数の標的物質の検出が可能となる。
【００６９】
（実施例６）
実施例５で使用する融合ポリペプチド１と、融合ポリペプチド２のセルロース結合ドメインを二酸化珪素親和性ペプチドに変更し、融合ポリペプチド３（アミノ酸配列、遺伝子配列は夫々配列１７、配列１８に示す）及び融合ポリペプチド４（アミノ酸配列、遺伝子配列は夫々配列２１、配列２２に示す）とを準備する。融合ポリペプチド４は実施例１の（１-１）、（１-２）と同様にして作成する。上記のように作成する融合ポリペプチド３と融合ポリペプチド４をサンプル展開・検出用パッドをＧｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄに変更する以外は実施例４で行うのと同様にして同一のサンプル展開・検出用パッド上の異なる領域に固定化し、試験片を作成し、実施例５で評価する方法と同様の手法を用いて評価する。本実施例のバイオセンサー素子において捕捉体部材のにじみ、拡散が抑えられるため、テストラインの端が明瞭となり、複数の標的物質に対する捕捉体部材を近接して固定化することが可能となるため、同一試験時間で複数の標的物質の検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】免疫クロマトグラフィーの一例（ラテラルフロー式）を示す模式図である。
【図２】本発明における捕捉体部材、センサー素子を利用するにじみ防止の機構を示す模式図である。
【図３】複数の捕捉体部材の固定化例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００７１】
１  捕捉抗体
２  コントロール用抗体（二次抗体等）
３  テストライン
４  コントロールライン
５  標識抗体
6  標識剤
7  メンブレン（展開部及び検出部）
8  サンプルパッド（試料吸入部）
9  吸収パッド（吸収部）
10  標的物質
11  検体液
12  捕捉分子のアプライ直後の模式図
13  捕捉分子溶液の拡散模式図
14  溶媒乾燥後の模式図
15  溶媒
16  捕捉体部材
17  担体
18  担体材料親和性部材
19  捕捉分子
20  複数の捕捉体部材の固定化例（ラテラルフロー型）
21  捕捉体部材
22  複数の捕捉体部材の固定化例（アレイ型）
23  捕捉体部材
【図１】
2009085831.tif 000003
【図２】
2009085831.tif 000004
【図３】
2009085831.tif 000005
【配列表】
2009085831000001.app