(57)【要約】【課題】本発明は、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、血球の数を増加させるための医薬組成物を提供することも目的とする。【解決手段】本発明の方法は、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の培養上清中にＴＩＭＰ−３タンパク質を添加することを含む。また、本発明の方法は、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞にＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含むベクターを導入することを含む。さらに、本発明の医薬組成物は、ＴＩＭＰ−３タンパク質、あるいはＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する方法であって、
（１）造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を培養する培養上清中にＴＩＭＰ−３タンパク質を添加する工程、および
（２）当該造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を（１）の培養上清中にて培養する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＴＩＭＰ−３タンパク質が、以下の（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質および／または（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質からなる、請求項１の方法：
（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質が、以下の（ａ）−（ｇ）からなる群より選択される、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性および造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有するタンパク質であり：
（ａ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列から１つまたは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列によりコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるタンパク質；
（ｆ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列から１つまたは数個の塩基の欠失、置換、および／または付加を有する核酸配列によりコードされるタンパク質；並びに、
（ｇ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列によりコードされるタンパク質、
（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質が、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損し、そして造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である、
（ａ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸２４−２７および８９−９０に相当する部分のいずれか１つのまたは複数のアミノ酸残基に欠失、置換および／または付加を有するタンパク質、あるいは
（ｂ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列、配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、または配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列において、配列番号３の塩基７０−８１および塩基２６５−２７０に相当する部分のいずれか１つのまたは複数の塩基に欠失、置換および／または付加を有する核酸配列にコードされるタンパク質、
（ｘは、１−２４から選択されるいずれか１つの整数（１および２４を含む）であり、そして、ｙは、１−７０から選択されるいずれか１つの整数（１および７０を含む）である）。
【請求項３】
ＴＩＭＰ−３タンパク質の培養上清中における濃度が、０．１−１０μｇ／ｍｌである、請求項１または２の方法。
【請求項４】
造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する方法であって、
（１）ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含むベクターを準備する工程、
（２）造血幹細胞または未分化造血前駆細胞に（１）のベクターを導入する工程、および
（３）（２）の造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を培養する工程、
を含む、前記方法。
【請求項５】
前記ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸が、以下の（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸および／または（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸からなる、請求項４の方法：
（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸が、以下の（ａ）−（ｇ）からなる群より選択される、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性および造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有するタンパク質をコードし：
（ａ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列から１つまたは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列によりコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるタンパク質；
（ｆ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列から１つまたは数個の塩基の欠失、置換、および／または付加を有する核酸配列によりコードされるタンパク質；並びに、
（ｇ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列によりコードされるタンパク質、
（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸が、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損し、そして造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする：
（ａ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸２４−２７および８９−９０に相当する部分のいずれか１つのまたは複数のアミノ酸残基に欠失、置換および／または付加を有するタンパク質、あるいは
（ｂ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列、配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、または配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列において、配列番号３の塩基７０−８１および塩基２６５−２７０に相当する部分のいずれか１つのまたは複数の塩基に欠失、置換および／または付加を有する核酸配列にコードされるタンパク質、
（ｘは、１−２４から選択されるいずれか１つの整数（１および２４を含む）であり、そして、ｙは、１−７０から選択されるいずれか１つの整数（１および７０を含む）である）。
【請求項６】
培養期間がおよそ１週間ないしおよそ２週間の間である、請求項１から５のいずれかの方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかの方法により生理学的性質が改善された、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞。
【請求項８】
ＴＩＭＰ−３タンパク質を含んでなる、血球の数を増加させるための医薬組成物。
【請求項９】
前記ＴＩＭＰ−３タンパク質が、以下の（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質および／または（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質からなる、請求項８の医薬組成物：
（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質が、以下の（ａ）−（ｇ）からなる群より選択される、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性および造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有するタンパク質であり：
（ａ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列から１つまたは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列によりコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるタンパク質；
（ｆ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列から１つまたは数個の塩基の欠失、置換、および／または付加を有する核酸配列によりコードされるタンパク質；並びに、
（ｇ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列によりコードされるタンパク質、
（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質が、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損し、そして造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である、
（ａ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸２４−２７および８９−９０に相当する部分のいずれか１つのまたは複数のアミノ酸残基に欠失、置換および／または付加を有するタンパク質、あるいは
（ｂ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列、配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、または配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列において、配列番号３の塩基７０−８１および塩基２６５−２７０に相当する部分のいずれか１つのまたは複数の塩基に欠失、置換および／または付加を有する核酸配列にコードされるタンパク質、
（ｘは、１−２４から選択されるいずれか１つの整数（１および２４を含む）であり、そして、ｙは、１−７０から選択されるいずれか１つの整数（１および７０を含む）である）。
【請求項１０】
ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含んでなる、血球の数を増加させるための医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸が、以下の（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸および／または（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸からなる、請求項１０の医薬組成物：
（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸が、以下の（ａ）−（ｇ）からなる群より選択される、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性および造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有するタンパク質をコードし：
（ａ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列から１つまたは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列によりコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるタンパク質；
（ｆ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列から１つまたは数個の塩基の欠失、置換、および／または付加を有する核酸配列によりコードされるタンパク質；並びに、
（ｇ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列によりコードされるタンパク質、
（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸が、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損し、そして造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする：
（ａ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸２４−２７および８９−９０に相当する部分のいずれか１つのまたは複数のアミノ酸残基に欠失、置換および／または付加を有するタンパク質、あるいは
（ｂ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列、配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、または配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列において、配列番号３の塩基７０−８１および塩基２６５−２７０に相当する部分のいずれか１つのまたは複数の塩基に欠失、置換および／または付加を有する核酸配列にコードされるタンパク質、
（ｘは、１−２４から選択されるいずれか１つの整数（１および２４を含む）であり、そして、ｙは、１−７０から選択されるいずれか１つの整数（１および７０を含む）である）。
【請求項１２】
前記血球が、赤血球、白血球および血小板からなる群のいずれかの血球、またはその組み合わせである、請求項８から１１のいずれかの医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する方法、該方法により作成された造血幹細胞および未分化造血前駆細胞、および血球の数を増加させるための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞は、骨髄中のニッチ（ｎｉｃｈｅ）と呼ばれる微小環境にごくわずかに存在し、自己複製能を有すると共に、赤血球、白血球、および巨核球（血小板）等全ての血液細胞に分化する能力を持った細胞である。血球系の細胞にはそれぞれ固有の寿命があるため、造血幹細胞はこれらの血球を供給し続けるために絶えず分裂・増殖を繰り返している。
【０００３】
このように、造血幹細胞は全ての血球系の細胞系列に分化する特性を有することから、造血幹細胞移植は、再生医療における切り札として期待されている。
造血幹細胞移植により改善することのできる疾患の１つに、急性骨髄性白血病が挙げられる。この疾患は、白血球が悪性腫瘍化して白血病細胞となり、血液または骨髄の中で増殖することにより引き起こされる疾患である。この疾患の治療方法としては、まず患者の主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）の型と同じＨＬＡを有するドナーの骨髄および末梢血等から造血幹細胞を採取する。その後、患者は抗癌剤や放射線照射を受けることにより、体内の白血病細胞は全て死滅する。ここで、その副作用として造血幹細胞もまた死滅し、全身の造血が抑えられるが、先述のドナーから採取した採取液を患者に点滴等により導入するにより、患者の造血能力は回復される。即ち、抗癌剤や放射線照射により患者の有していた白血病細胞および造血幹細胞は死滅するが、その後導入されたドナー由来の造血幹細胞により患者の造血が回復し症状の改善が見られる。
【０００４】
このように、特定の疾患、特に白血病などの造血器腫瘍の治療のために造血幹細胞移植は有用であるが、造血幹細胞は数万細胞に１つ程度しか存在しないといわれており、この細胞をインビトロの系で未分化性、自己複製能および長期骨髄再建能などを保ったまま増殖させることができれば、造血幹細胞のドナーの負担軽減や臍帯血造血幹細胞の応用にも役立つと考えられている。
【０００５】
造血幹細胞の複製・維持および分化・増殖に関与する因子について、これまでにいくつかの知見が得られている。例えば、ＳＣＦ（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）は骨髄支持細胞等から産生され、造血幹細胞の生存・増殖・分化などに必須であることが、ＳＣＦに異常を有する変異マウスを用いた研究により明らかとなっている（非特許文献１）。また、ＴＰＯ（トロンボポエチン）もまた造血幹細胞の増殖に深く関わることがこれまでに明らかとなっている（非特許文献２）。
【０００６】
このように造血幹細胞は骨髄移植などの再生医療の重要な細胞ソースであり、インビトロまたはインビボで造血幹細胞を増幅する試みが多数なされてきた。例えば、インビトロにおける造血幹細胞増殖としては、上記のサイトカインと、ＩＬ−６等の造血幹細胞の増殖に関わるサイトカインを組み合わせることによりインビトロで造血幹細胞を増殖させる方法や、フィーダー細胞としてマウスストローマ細胞のＨＥＳＳ−５と上記のようなサイトカインを用いる方法（非特許文献３）等により、造血幹細胞を数倍まで増幅できることが報告されている。
【０００７】
また、これまでに血球の数を増加させる医薬組成物がいくつか知られている。例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）は赤血球数を増加することが知られており、また顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、好中球の増加促進のために用いられている。このように１つの特定の血球を特異的に分化させる医薬組成物はこれまでにも知られていたが、複数の血球系列を同時に増加させる因子を用いた医薬組成物はこれまでに知られていない。
【０００８】
【非特許文献１】Ｚｓｅｂｏ，  Ｋ．Ｍ．ら  Ｃｅｌｌ，  ６３  ２１３−２２４  （１９９０）
【非特許文献２】Ｋｕ，  Ｈ．ら  Ｂｌｏｏｄ，８７  ４５４４−４５５１  （１９９６）
【非特許文献３】Ａｎｄｏ，  Ｋ．ら  Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２８  ６９０−６９９  （２０００）
【非特許文献４】Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈ  Ｆ．Ｘ．ら  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８９，  ７７−８１  （１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する方法を提供することを目的とする。また、本発明は該方法により作成された造血幹細胞および未分化造血前駆細胞を提供することを目的とする。さらに、本発明は血球の数を増加させるための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意研究に努めた結果、ＴＩＭＰ−３タンパク質またはこれをコードする核酸を使用して、生理学的性質の改善した造血幹細胞および未分化造血前駆細胞を作成するに至り、本発明を想到した。
【００１１】
具体的には、本発明者はまず、５ＦＵ（５−フルオロウラシル）を投与し、骨髄抑制により血球数が減少したマウス骨髄の骨梁表面上に存在する骨芽細胞において、ＴＩＭＰ−３（Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３）の発現量が増加していることを発見した。骨髄の骨梁表面上には造血幹細胞の存在するニッチがあることが知られており、この造血幹細胞ニッチにおけるＴＩＭＰ−３タンパク質の濃度が上昇したことから、ＴＩＭＰ−３の造血幹細胞に対する作用が示唆された。
【００１２】
本発明者は上記発見に基づき、ＦＡＣＳによりソーティングした造血幹細胞に相当するマウスＣＤ３４−ＫＳＬ（ｃ−Ｋｉｔ＋、Ｓｃａ−１＋、Ｌｉｎｅａｇｅ−）細胞に、精製したヒトＴＩＭＰ−３タンパク質を培養上清中に添加して培養した実験を行った。これにより、ＴＩＭＰ−３タンパク質が、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の増殖能を有意に亢進する活性を有することが明らかとなった。また、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の自己複製能に関する実験では、ＴＩＭＰ−３タンパク質を添加した細胞では、自己複製能が維持または亢進されることが明らかとなった。
【００１３】
また、ＴＩＭＰ−３タンパク質と培養したマウスＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、致死量の放射線照射により造血系が破壊されたマウスに移植する実験により、当該細胞がＴＩＭＰ−３と培養していない細胞と同程度またはそれ以上の生着率を有することが明らかとなった。
【００１４】
さらに、ＴＩＭＰ−３タンパク質を発現するプラスミドをマウスに投与することにより、白血球、赤血球および血小板数の増加が観察された。これはプラスミドにより発現したＴＩＭＰ−３タンパク質が造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の増殖能および生存率の亢進を引き起こし、その結果として血球細胞の増加が観察されたものであると思われる。
【００１５】
本発明は、これらのようにＴＩＭＰ−３により造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質が改善されるという知見により想到されたものである。本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これに限定されるものではない。
【００１６】
本発明は、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する方法であって、
（１）造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を培養する培養上清中にＴＩＭＰ−３タンパク質を添加する工程、および
（２）当該造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を（１）の培養上清中にて培養する工程、
を含む、前記方法を提供する。
【００１７】
本発明の好ましい態様において、前記ＴＩＭＰ−３タンパク質は、以下の（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質および／または（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質からなる：
（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、以下の（ａ）−（ｇ）からなる群より選択される、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性および造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有するタンパク質であり：
（ａ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列から１つまたは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列によりコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるタンパク質；
（ｆ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列から１つまたは数個の塩基の欠失、置換、および／または付加を有する核酸配列によりコードされるタンパク質；並びに、
（ｇ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列によりコードされるタンパク質、
（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質が、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損し、そして造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である、
（ａ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸２４−２７および８９−９０に相当する部分のいずれか１つのまたは複数のアミノ酸残基に欠失、置換および／または付加を有するタンパク質、あるいは
（ｂ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列、配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、または配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列において、配列番号３の塩基７０−８１および塩基２６５−２７０に相当する部分のいずれか１つのまたは複数の塩基に欠失、置換および／または付加を有する核酸配列にコードされるタンパク質、
（ｘは、１−２４から選択されるいずれか１つの整数（１および２４を含む）であり、そして、ｙは、１−７０から選択されるいずれか１つの整数（１および７０を含む）である）。
【００１８】
さらに好ましい態様において、前記変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、以下の（ａ）−（ｇ）からなる群より選択される、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損し、そして造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有するタンパク質である：
（ａ）配列番号２のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列から１つまたは数個のアミノ酸残基に欠失、置換、および／または付加を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号４の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列によりコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号４の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるタンパク質；
（ｆ）配列番号４の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列から１つまたは数個の塩基に欠失、置換、および／または付加を有する核酸配列によりコードされるタンパク質；並びに、
（ｇ）配列番号４の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列によりコードされるタンパク質
（ｘは、１−２４から選択されるいずれか１つの整数（１および２４を含む）であり、そして、ｙは、１−７０から選択されるいずれか１つの整数（１および７０を含む）である）。
【００１９】
本発明はまた、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する方法であって、
（１）ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含むベクターを準備する工程、
（２）造血幹細胞または未分化造血前駆細胞に（１）のベクターを導入する工程、および
（３）（２）の造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を培養する工程、
を含む、前記方法を提供する。
【００２０】
好ましい態様において、前記ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸は、以下の（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸および／または（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸からなる：
（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸は、以下の（ａ）−（ｇ）からなる群より選択される、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性および造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有するタンパク質をコードし：
（ａ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列から１つまたは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列によりコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるタンパク質；
（ｆ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列から１つまたは数個の塩基の欠失、置換、および／または付加を有する核酸配列によりコードされるタンパク質；並びに、
（ｇ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列によりコードされるタンパク質、
（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸が、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損し、そして造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有する以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする：
（ａ）配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸２４−２７および８９−９０に相当する部分のいずれか１つのまたは複数のアミノ酸残基に欠失、置換および／または付加を有するタンパク質、あるいは
（ｂ）配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列、配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、または配列番号３の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列において、配列番号３の塩基７０−８１および塩基２６５−２７０に相当する部分のいずれか１つのまたは複数の塩基に欠失、置換および／または付加を有する核酸配列にコードされるタンパク質、
（ｘは、１−２４から選択されるいずれか１つの整数（１および２４を含む）であり、そして、ｙは、１−７０から選択されるいずれか１つの整数（１および７０を含む）である）。
【００２１】
さらに好ましい態様において、前記変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸は、以下の（ａ）−（ｇ）からなる群より選択されるＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損し、そして造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有するタンパク質をコードする：
（ａ）配列番号２のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列から１つまたは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、および／または付加を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号４の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列によりコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号４の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるタンパク質；
（ｆ）配列番号４の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列から１つまたは数個の塩基の欠失、置換、および／または付加を有する核酸配列によりコードされるタンパク質；並びに、
（ｇ）配列番号４の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列によりコードされるタンパク質
（ｘは、１−２４から選択されるいずれか１つの整数（１および２４を含む）であり、そして、ｙは、１−７０から選択されるいずれか１つの整数（１および７０を含む）である）。
【００２２】
本発明の好ましい態様において、培養期間はおよそ１週間ないしおよそ２週間の間である。
また本発明は、上述の方法により生理学的性質が改善された、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を提供する。
【００２３】
好ましい態様において、上述の方法により生理学的性質が改善された造血幹細胞または未分化造血前駆細胞は、移植後の短期および長期骨髄再建能を維持若しくは亢進する、および／または生着率を維持若しくは亢進する能力を有する。
【００２４】
また本発明は、ＴＩＭＰ−３タンパク質を含んでなる、血球の数を増加させるための医薬組成物を提供する。
本医薬組成物の好ましい態様において、前記ＴＩＭＰ−３タンパク質は、以下の（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質および／または（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質からなり、ここで（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質および（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は上記に記載のものと同様とする。
【００２５】
さらに本発明は、ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含んでなる、血球の数を増加させるための医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物の好ましい態様において、前記ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸は、以下の（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸および／または（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸からなり、ここで（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸および（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸は上記に記載のものと同様とする。
【００２６】
さらに、本発明の医薬組成物の好ましい態様において、前記血球は、赤血球、白血球および血小板からなる群のいずれかの血球、またはその組み合わせである。
【００２７】
１）造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する方法
（ｉ）ＴＩＭＰ−３タンパク質を用いる方法。
本発明は、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する方法を提供する。本発明の方法は、
（１）造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を培養する培養上清中にＴＩＭＰ−３タンパク質を添加する工程、および
（２）当該造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を（１）の培養上清中にて培養する工程、
を含む。ここで、前記生理学的性質の改善は、増殖能の亢進、自己複製能の維持または亢進、生存率の亢進、多分化能の維持、短期および長期骨髄再建能の維持または亢進、からなる群より選択されるいずれかの性質の改善、あるいはこれらの組み合わせからなる。
【００２８】
Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ）とはＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１４，ＣＤ１５，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ５６，およびＣＤ２３５ａなどをいい、Ｌｉｎ−とはこれら全ての抗原について陰性であることをいう。Ｌｉｎ−細胞を選択するために、上記全ての抗原に対するビオチン標識した抗体カクテルを造血幹細胞あるいは未分化造血前駆細胞を含む骨髄・末梢血・臍帯血細胞の細胞表面に作用させ、洗浄後の当該細胞に抗ビオチン抗体を表面に有する磁性マイクロビーズを添加する。その後、マイクロビーズに付着した細胞を磁性に基づき、カラムを使用することにより取り除き、Ｌｉｎ−細胞のみを得ることが可能である。このような方法に用いる抗体カクテルおよびマイクロビーズのキットは一般に市販されており、例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから入手可能である。
【００２９】
本明細書において、「造血幹細胞」とは、自己複製能、および赤血球、白血球、および巨核球等全ての血液細胞に分化する多分化能を持ち、数ヶ月以上の長期間にわたり造血を再構築する能力をもった細胞をいう。これまでの研究により、造血幹細胞は、骨髄、末梢血、および臍帯血にごく微量含まれていることが明らかとなっており、これらから採取することが可能である。また、造血幹細胞の表面抗原は、マウスではＣＤ３４−，ｃ−Ｋｉｔ＋，Ｓｃａ−１＋，Ｌｉｎ−、ヒトではＣＤ３４＋あるいはＣＤ３４−，  ＣＤ３８ｌｏｗ／−，  Ｌｉｎ−であるとされており、上記のような部位から採取した細胞群から、これらに対する抗体を用いてＦＡＣＳを用いてソーティングすることが可能である。
【００３０】
また、「未分化造血前駆細胞」とは、造血幹細胞の分化が進み、造血幹細胞の自己複製能を失っているが、多分化能は依然として有している細胞をいう。未分化造血前駆細胞は、造血幹細胞から分化する細胞ではあるが、造血幹細胞とは別の種類の細胞であると考えられている。未分化造血前駆細胞の表面抗原はマウスではＣＤ３４＋，ｃ−Ｋｉｔ＋，Ｓｃａ−１＋，Ｌｉｎ−であるとされており、これらの抗原の発現量に基づきＦＡＣＳによりソーティングすることが可能である。また同様に、ヒト未分化造血前駆細胞についても表面抗原に基づいてＦＡＣＳによりソーティングすることが可能である。
【００３１】
ＦＡＣＳによるソーティングでは、マウス造血幹細胞の発現抗原はＣＤ３４−，Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ）−，ｃ−Ｋｉｔ＋，Ｓｃａ−１＋であることから、抗ＣＤ３４抗体、抗ｃ−Ｋｉｔ抗体および抗Ｓｃａ−１抗体を使用し、ＣＤ３４−，ｃ−Ｋｉｔ＋，Ｓｃａ−１＋，Ｌｉｎ−の細胞分画をソーティングすることが可能である。また、上記のように、ヒト造血幹細胞、並びにヒトおよびマウス未分化造血前駆細胞の発現抗原は、マウス造血幹細胞のものと異なっているが、同様の方法によりＦＡＣＳにてソーティングすることが可能である。このようなＦＡＣＳに使用する機器は当該技術分野では公知であり、例えばＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎより入手可能である。
【００３２】
本明細書において、「生理学的性質を改善する」とは特に限定されないが、好ましくは造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の増殖能を亢進すること、自己複製能を維持または亢進すること、生存率を亢進すること、多分化能を維持すること、短期および長期骨髄再建能を維持または亢進すること、からなる群より選択されるいずれかの性質の改善、あるいはこれらの組み合わせをいう。したがって、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞がこれら１つ以上の性質の改善を有すれば、本発明においては生理学的性質の改善がされたということができる。
【００３３】
「増殖能」とは、細胞が元の性質を失わずに細胞分裂を繰り返すことにより、細胞数を増加する能力のことをいう。細胞の増殖能は、一定期間培養した後の細胞数を比較することにより容易に測定することができる。細胞数の計数は、例えば細胞懸濁液に血球計数盤を用いることによって目視により計数することができる。また、種々の細胞計数装置および血球計算機が市販されており、これを使用することにより細胞を計数してもよい。このような装置は、例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ等から入手可能である。
【００３４】
本発明の方法により、培養上清中に野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質および／または変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質を添加し培養した造血幹細胞および未分化造血前駆細胞は、このような処理をしない細胞に比べて、増殖能が亢進する。限定されるわけではないが、本発明の方法により作成された造血幹細胞または未分化造血前駆細胞は、未処理の造血幹細胞または未分化造血前駆細胞に比べて、好ましくは約１．５倍以上、より好ましくは約１．９倍以上、さらに好ましくは２倍以上、増殖能が亢進する。
【００３５】
「自己複製能」とは、細胞が分裂する際に元の細胞と同じ性質を有する娘細胞を生み出す能力をいう。造血幹細胞の自己複製能は、造血幹細胞の分裂により生じた２つの娘細胞が、自己複製能および全ての血球細胞に分化できる多分化能を有する、造血幹細胞の能力のことをいう。
【００３６】
自己複製能は、例えばコロニー形成アッセイにより測定可能である。コロニー形成アッセイの方法は実施例６に記載するようにして行われる。簡単に概説すると、９６ウェルプレート等の各ウェルに造血幹細胞を１細胞ずつソーティングし、次いで１回分裂をさせる。生じた２個の娘細胞をマイクロマニピュレーター等を用いることにより１つずつに分離し、それぞれの細胞をメチルセルロース培地中に埋めこみ、１週間から１０日程度培養し分化させる。培養に用いるメチルセルロース培地は、１％程度のメチルセルロースを含む、Ｓ−ＣｌｏｎｅまたはαＭＥＭのような造血幹細胞の増殖に適した培地に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＥＰＯ、ＩＬ−３および／またはＩＬ−６等のサイトカイン、並びにウシ血清アルブミンあるいはウシ胎児血清などを加えて調製する。培養後生じた細胞のコロニーを解析し、２つの娘細胞から生じたコロニーのうち少なくとも一方が白血球（好中球、マクロファージなど）、赤血球および巨核球等の全てを有するミックスコロニーであった場合には、これら娘細胞の分裂前の細胞は自己複製能を有していたことが示唆される。一方、２つの娘細胞のいずれもがミックスコロニーを形成しなかった場合は、これら娘細胞の分裂前の細胞は自己複製能を有していなかったことが示唆される。
【００３７】
本発明の方法により作成された生理学的活性の改善した造血幹細胞は、ＴＩＭＰ−３タンパク質または核酸を添加せずに培養した造血幹細胞に比べて自己複製能が維持または亢進されている。限定されるわけではないが、本発明の方法により作成された生理学的活性の改善した造血幹細胞は、好ましくは約１．２倍以上、より好ましくは約１．３倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上、自己複製能が亢進している。
【００３８】
「生存率」とは、一定期間の培養後に生存している細胞の比率をいう。細胞集団における細胞の生存率は、ＦＡＣＳを用いる方法、トリパンブルーを用いて染色する方法など、当該技術分野における通常の知識を用いることによって測定可能である。また、細胞の生存率は、実施例に記載するように目的の細胞を１細胞ずつに分離し、それぞれの細胞について一定期間の培養後に細胞の生死を判定することにより行ってよい。
【００３９】
「多分化能」とは、造血幹細胞においては全ての血球細胞に分化することができる細胞の分化能力をいう。多分化能は、以下のようなコロニー形成アッセイにより測定可能である。造血幹細胞および未分化造血前駆細胞を細胞表面抗原に基づいて９６ウェルプレートに１細胞ずつＦＡＣＳにてソーティングする。次いで、ウェルごとに各種サイトカインを含むメチルセルロース等の半固形培地中で培養し形成されたコロニーの構成細胞を解析することにより行う。形成されたコロニーが好中球、赤血球（赤芽球）、マクロファージおよび巨核球からなるミックスコロニーであった場合には、元となった１つの細胞は多分化能を有していたということが判定できる。また、形成されたコロニーが好中球、赤血球（赤芽球）、マクロファージおよび巨核球からなる群より選択される３つ以下の細胞種からなる場合には、全ての血球細胞に分化する能力は失っており、元となった１つの細胞は多分化能を有していなかったということができる。
【００４０】
「骨髄再建能」とは、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を放射線照射などにより造血することができなくなった成体に移植したときに、移植したこれらの細胞が骨髄に生着し、失われていた造血を回復する能力をいう。ここで、「長期骨髄再建能」とは、移植後少なくとも６ヶ月程度の期間にわたり骨髄再建能を有することをいい、また「短期骨髄再建能」とは、移植後少なくとも３ヶ月程度の期間にわたり骨髄再建能を有することをいう。
【００４１】
骨髄再建能は、放射線照射または薬剤投与等により造血が失われた個体に、造血幹細胞を投与し、その個体の造血が回復し生存することによる、簡便には測定することが可能である。詳細な実験手順は実施例８に記載した。
【００４２】
本明細書でいう「添加」とは、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞等の細胞を培養している培養上清中にタンパク質および／または核酸等を加えることをいう。添加されるタンパク質および／または核酸等は無菌であることが望ましく、これらの物質を無菌状態にする技術は当該技術分野では公知の技術である。例えば、添加する物質が緩衝液等に溶解している場合には、０．２２μｍフィルターを通過させることにより無菌状態にすることができる。
【００４３】
「培養」とは、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞等の細胞を培養培地中において維持・増殖させることをいう。造血幹細胞および未分化造血前駆細胞等の細胞を培養する培地および添加物、並びに培養方法は当該技術分野で公知である。しかしながら、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞を培養する場合、好ましくはこれらの細胞の未分化状態を維持したまま培養する。このような目的のために使用される添加物としては、ＳＣＦ（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）およびＴＰＯ（トロンボポエチン）等のサイトカインがある。また、所望によりＦｌｔ３リガンドおよび／またはＩＬ−６等のサイトカインを添加してもよい。また、これらのサイトカインは、それらの生理的機能を有するならば容易に産生されるように改変された組換え体であってもよい。
【００４４】
好ましい態様において、ＴＩＭＰ−３タンパク質の培養上清中における濃度は、０．１−１０μｇ／ｍｌであり、より好ましくは１−３μｇ／ｍｌである。しかしながら、これらの範囲内にない場合であっても、本発明の効果を有すれば本発明の範囲内である。
【００４５】
本発明における培養期間は、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞等の細胞の性質の変化が起こらない限り、どのような長さであってもよい。好ましい態様において、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞等の細胞の培養期間はおよそ１週間ないしおよそ２週間である。
【００４６】
「ＴＩＭＰ−３（Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３）」とは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の抑制分子であるＴＩＭＰファミリーに属する分子として発見され、効率よくＭＭＰのメタロプロテアーゼ活性を阻害することが知られている。近年になって、ＴＩＭＰ−３はメタロプロテアーゼ阻害活性以外にも生理的活性を有することが明らかとなってきている。例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のシグナルを抑制し血管新生を阻害し、この活性はＴＩＭＰ−３の有するＭＭＰ抑制活性とは独立して起こることが報告されている。しかしながら、本発明前は、ＴＩＭＰ−３が造血関係の細胞、特に造血幹細胞および未分化造血前駆細胞に作用することは知られていなかった。これまでに、ＴＩＭＰ−３はヒト以外にも種々の生物においても知られており、例えば、マウス、ラット、アフリカツメガエル、アカゲザル、ニワトリ、カニクイザル、ウサギおよびウシなどである。これら種々の生物のＴＩＭＰ−３タンパク質およびこれをコードする核酸の配列は、例えばＮＣＢＩのようなデータベースから入手することが可能である。本発明はＴＩＭＰ−３タンパク質またはこれをコードする核酸を利用するものである。本発明で使用されるＴＩＭＰ−３タンパク質またはこれをコードする核酸は、ヒトまたはマウス由来のものが好ましいがこれに限定されるものではない。
【００４７】
好ましい態様において、本発明のＴＩＭＰ−３は、野生型ＴＩＭＰ−３および／または変異型ＴＩＭＰ−３を含む。これら野生型ＴＩＭＰ−３および変異型ＴＩＭＰ−３の定義については以下に詳述する。
【００４８】
公知のヒト野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示すような配列からなる。また公知のマウス野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５に示す配列からなる。いずれも２１１アミノ酸からなり、これらのアミノ酸配列のうち、Ｎ末端側は分泌のためのシグナルペプチドであり、実際にＴＩＭＰ−３タンパク質の機能を有する部位はそれよりもＣ末端側の配列であると考えられる。
【００４９】
シグナルペプチドとは、分泌タンパク質のＮ末端領域に存在する疎水性アミノ酸領域である。シグナルペプチドを有するタンパク質は、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）との相互作用を介して小胞体に付着し、小胞体膜を通過する。その後、シグナルペプチドはシグナルペプチダーゼにより切断され、実際に細胞から分泌されるタンパク質はシグナルペプチド領域を有さない。
【００５０】
シグナルペプチドの厳密な長さを決めることは難しい場合があり、同じタンパク質についても報告によりその長さが異なることもある。本発明に係るヒトＴＩＭＰ−３タンパク質は、例えば、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）においては、全長タンパク質（配列番号１）のアミノ酸１−２３がシグナルペプチドであると記載されている（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿０００３５３）。しかしながら、インターネット上で使用可能なタンパク質ドメイン検索プログラムであるＳＭＡＲＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）によりタンパク質ドメインを検索したところ、ヒトＴＩＭＰ−３タンパク質ではアミノ酸１−１８がシグナルペプチドであると判定された。また、他のドメイン検索プログラムを使用した場合には、シグナルペプチド領域が異なって判定されることも予想される。このように、シグナルペプチド領域は使用するプログラム等によって変化しうることは、当業者が容易に理解するであろう。
【００５１】
以下に詳述するように、野生型ヒトおよびマウスＴＩＭＰ−３タンパク質（配列番号１および配列番号５）のアミノ酸２４−２７は、ＴＩＭＰ−３タンパク質の有するメタロプロテアーゼ活性に重要であると考えられている。したがって、ＴＩＭＰ−３タンパク質のシグナルペプチドのＣ末端は、配列番号１または配列番号５のアミノ酸１−２３より選択されるいずれかのアミノ酸であることが予測される。さらに、シグナルペプチドが除去されていない全長のＴＩＭＰ−３タンパク質は、シグナルペプチドが除去されたＴＩＭＰ−３タンパク質と同様の機能を有することも期待される。
【００５２】
以上から、本発明の一態様において、ＴＩＭＰ−３タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号５または配列番号６のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列を有するタンパク質である（ｘは、１−２４から選択されるいずれか１つの整数（１および２４を含む）である）。好ましくは、ｘは、１９−２４から選択されるいずれか１つの整数（１９および２４を含む）である。より好ましくは、ｘは１９または２４である。
【００５３】
また、本発明において、野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質という場合、上記のような配列番号１または配列番号５のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列（ｘは、１−２４から選択されるいずれか１つの整数（１および２４を含む）である）、を有するタンパク質だけを意図するものではなく、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性および造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有することにより定義される。したがって、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性および造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有すれば、上記アミノ酸配列に対し、１つまたは数個の欠失、置換、および／または付加を有するタンパク質、または８０％以上の同一性を有するタンパク質もまた本発明においては、野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質の範囲内である。
【００５４】
本発明においては、ＴＩＭＰ−３タンパク質のアミノ酸の１つまたは数個の置換は、好ましくは保存的置換により行われる。ここで保存的置換とは、あるアミノ酸残基が生物学的に類似した特性を持つアミノ酸残基に置換されることをいう。保存的置換の例は、１つの脂肪族残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａ）を別の脂肪族残基に置換すること、１つの極性残基を別の極性残基に置換すること（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；またはＧｌｎとＡｓｎ間で置換すること）、または１つの芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒ）を別の芳香族残基に置換することを含む。さらに、保存的置換の例は、活性ドメインの外側のアミノ酸の置換、およびＴＩＭＰ−３タンパク質の二次および／または三次構造を変化させないアミノ酸の置換をも含む。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２００１）等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。
【００５５】
本発明の好ましい態様において、野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性および造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有し、配列番号１または配列番号５のアミノ酸ｘ−２１１のアミノ酸配列（ｘは、１−２４から選択されるいずれか１つの整数（１および２４を含む）である）、に８０％以上の同一性を有し、さらに好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。
【００５６】
アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＳおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００５７】
当業者に用いられる配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【００５８】
さらに、本発明のＴＩＭＰ−３タンパク質は、核酸配列により定義することも可能である。
公知のヒト野生型ＴＩＭＰ−３の核酸は、配列番号３に示す配列からなり、配列番号１のタンパク質をコードする。また公知のマウス野生型ＴＩＭＰ−３の核酸は、配列番号７に示す配列からなり、配列番号５のタンパク質をコードする。この核酸配列もまたシグナルペプチドをコードする部分を含む。配列番号３および配列番号７はいずれも６３６塩基からなり、５’末端付近の塩基がシグナルペプチドをコードし、それよりも３’側の塩基が生理的機能を有するＴＩＭＰ−３タンパク質をコードし、そして６３４−６３６番目の塩基が終止コドンである。
【００５９】
ここで、上述したように、シグナルペプチドの境界はタンパク質によって曖昧な場合があることから、配列番号３および配列番号７の５’末端から、どの塩基までがシグナルペプチドをコードするのかを特定することは困難である。
【００６０】
以下に詳述するように、野生型ヒトおよびマウスＴＩＭＰ−３タンパク質（配列番号１および配列番号５）のアミノ酸２４−２７は、ＴＩＭＰ−３タンパク質の有するメタロプロテアーゼ活性に重要であると考えられており、このアミノ酸をコードする塩基は配列番号および配列番号７では塩基７０−８１である。したがって、ＴＩＭＰ−３タンパク質のシグナルペプチドのＣ末端をコードする塩基は、配列番号３または配列番号７の塩基１−６９より選択されるいずれかの塩基であることが予測される。さらに、シグナルペプチドが除去されていない全長のＴＩＭＰ−３タンパク質も、シグナルペプチドが除去されたＴＩＭＰ−３タンパク質と同様の機能を有することが期待される。
【００６１】
以上から、本発明の一態様において、ＴＩＭＰ−３タンパク質は、配列番号３、配列番号４、配列番号７または配列番号８の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列によりコードされる（ｙは、１−７０から選択されるいずれか１つの整数（１および７０を含む）である）。上述のようにＮＣＢＩデータベースにおいては、シグナルペプチドは配列番号１のアミノ酸１−２３（配列番号３の塩基１−６９によりコードされる）であると記載され、ＳＭＡＲＴプログラムによればアミノ酸１−１８（配列番号３の塩基１−５４によりコードされる）であると判定された。また、ＴＩＭＰ−３タンパク質は、シグナルペプチドを有していても、その正常な機能を有することも期待される。したがって、好ましくは、ｙは、１および５５−７０から選択されるいずれか１つの整数（５５および７０を含む）である。さらに好ましくは、ｙは１、５５または７０である。
【００６２】
本発明において、野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、上記のような、配列番号３または配列番号７の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列（ｙは、１−７０から選択されるいずれか１つの整数（１および７０を含む）である）、によりコードされる。ここで、上記の野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質の定義にしたがい、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性および造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有すれば、上記核酸配列に対し、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、１つまたは数個の欠失、置換、および／または付加を有する核酸配列、および８０％以上の同一性を有する核酸配列、によりコードされるタンパク質もまた本発明においては、野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質の範囲内である。
【００６３】
本明細書において使用される、ストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者により、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２００１）に示されている。例えば、中程度にストリンジェントな条件は、ニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０℃ないし６０℃、好ましくは約５０℃での、１×ＳＳＣないし６×ＳＳＣ、好ましくは２×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、例えばスターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。また、例えば、ハイブリダイゼーション溶液が約５０％ホルムアミドを含む場合、上記ハイブリダイゼーション温度は約１５℃ないし２０℃低めとなる。高度にストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者により、容易に決定することが可能である。一般に、高度にストリンジェントな条件は、上記中程度にストリンジェントな条件よりも、より高い温度および／またはより低い塩濃度でのハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件を含む、例えば、約６０℃ないし６５℃での０．１×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件、および／または約６５℃ないし６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件を含む。当業者は温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さなどの要因にしたがい、必要に応じ調整してもよいことを認識するであろう。
【００６４】
また、本発明における野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性および造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有する、上記核酸配列から１つまたは数個の欠失、置換、および／または付加を有する核酸配列によりコードされるタンパク質を含む。好ましい態様において、１つまたは数個の欠失および／または付加によって、コドンの読み枠がずれフレームシフトすることにより、タンパク質の二次構造以上の高次構造は変化しない。しかしながら、フレームシフトの起こる部位がＴＩＭＰ−３タンパク質コード配列の３’末端に近く、タンパク質全体の構造および／または機能に与える影響が小さければフレームシフトを起こす欠失および／または付加も許容されうる。
【００６５】
さらに、本発明における野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性および造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有し、上記核酸配列に８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する核酸配列によりコードされるタンパク質を含む。塩基の同一性は、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、アミノ酸の同一性パーセントについて上述したように、公知のコンピュータープログラムを使用することにより測定することが可能である。
【００６６】
メタロプロテアーゼ阻害活性の評価方法は、当該技術分野で周知のいずれの技術を使用してよい。例えば、メタロプロテアーゼ活性の評価方法が当該技術分野では公知であり、この評価系にＴＩＭＰ−３を添加することにより、メタロプロテアーゼ阻害活性を測定してもよい。例えば、メタロプロテアーゼ活性を評価するザイモグラフィー法は、以下の手順により行われる。ＳＤＳＰＡＧＥに使用するゲルにあらかじめメタロプロテアーゼの基質となるコラーゲンまたはカゼインを溶解しておく。メタロプロテアーゼ活性を測定しようとする試料を電気泳動した後、試料に由来するメタロプロテアーゼがゲル中のコラーゲン等を分解させる。ゲルをクマシーブルー等で染色すると、メタロプロテアーゼ活性に依存して白く色の抜けたバンドを示す。ＴＩＭＰ−３タンパク質のメタロプロテアーゼ阻害活性は、上記ＳＤＳＰＡＧＥに供する試料にＴＩＭＰ−３タンパク質を添加し、電気泳動後の着色量により測定することが可能である。
【００６７】
本発明においては、変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質もまた使用され得る。本明細書における変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質とは、野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質の有するメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損しているが、本発明に関する造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性は欠失していないＴＩＭＰ−３タンパク質をいう。これら変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質の使用は、ＴＩＭＰ−３タンパク質の造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性が、メタロプロテアーゼ阻害活性に依存しないという本発明の発見に基づく。このような変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、特に後述する医薬組成物として使用する場合に、生体内の正常なＭＭＰのメタロプロテアーゼ活性に影響を与えずに、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善することが可能であり、副作用が少ないことが期待されるために好ましい。本発明の変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質には、野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質と同じ配列を有するものであっても、例えば糖鎖修飾の有無等の原因によりメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損しているタンパク質も含まれる。
【００６８】
これまでに、ＴＩＭＰ−３と同じＴＩＭＰファミリーのＴＩＭＰ−１において、そのメタロプロテアーゼ阻害活性に重要なアミノ酸残基が研究されている。Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈ  Ｆ．Ｘ．らは、マトリックスメタロプロテアーゼ−３（ＭＭＰ−３）とＴＩＭＰ−１タンパク質複合体の結晶構造解析によりＴＩＭＰ−１においては、シグナルペプチドが切断された後の、Ｃｙｓ１−Ｔｈｒ２−Ｃｙｓ３−Ｖａｌ４部分およびＳｅｒ６８−Ｖａｌ６９部分が、ＭＭＰ−３の触媒活性のある亜鉛分子に結合することにより、ＴＩＭＰ−１がＭＭＰ−３のメタロプロテアーゼ活性を阻害することを示した（非特許文献４）。したがって、これらのアミノ酸残基に変異を有するＴＩＭＰ−１タンパク質は、ＴＩＭＰ−１タンパク質の通常有するメタロプロテアーゼ活性を欠失している。
【００６９】
ヒトＴＩＭＰ−３タンパク質においては、配列番号１のヒト野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質のアミノ酸配列で、Ｎ末端付近のアミノ酸残基は分泌に関連するシグナルペプチドであるために、これらの部位はヒトＴＩＭＰ−３タンパク質の機能に関することはないと思われる。上記ＴＩＭＰ−１タンパク質のＣｙｓ１−Ｔｈｒ２−Ｃｙｓ３−Ｖａｌ４に対応する部分は、ヒトＴＩＭＰ−３タンパク質ではＣｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号１の２４−２７に相当）であり、これは高度に保存されていると言える。また、ＴＩＭＰ−１タンパク質Ｓｅｒ６８−Ｖａｌ６９に対応する部分は、ヒトＴＩＭＰ−３タンパク質ではＳｅｒ−Ｌｅｕ（配列番号１の８９−９０に相当）であり、これも高度に保存されている。したがって、ヒトＴＩＭＰ−３タンパク質においてこれらのアミノ酸残基の１つまたは複数に欠失、置換または付加等の変異がある場合には、これらはメタロプロテアーゼ阻害活性を有さず、本発明におけるヒト変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質の範囲内である。好ましい態様において、ヒト変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、シグナルペプチドが除去された後の１番目のＣｙｓ（配列番号１の２４番目のＣｙｓ）がＳｅｒに置換している。また、マウスＴＩＭＰ−３タンパク質においては、ヒトＴＩＭＰ−３タンパク質の有するＣｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号１の２４−２７に相当）部分、およびＳｅｒ−Ｌｅｕ（配列番号１の８９−９０に相当）部分は完全に保存されている。したがって、当該部分に変異を有するマウスＴＩＭＰ−３タンパク質もまた、ＭＭＰに対する結合活性が欠損している。好ましい態様において、マウス変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、シグナルペプチドが除去された後の１番目のＣｙｓ（配列番号１の２４番目のＣｙｓ）がＳｅｒに置換している。
【００７０】
上記のようなアミノ酸部位は一例であり、本発明の変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、これらの部位に変異を有さなくとも、ＴＩＭＰ−３タンパク質のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損しており、そして造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有するタンパク質であればどのような変異を有するものであってもよい。したがって、配列番号１の２４−２７または８９−９０のアミノ酸残基以外に変異を有するタンパク質であっても、ＴＩＭＰ−３タンパク質のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損しており、そして造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有するタンパク質は、本発明の変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質の範囲内である。
【００７１】
本発明の好ましい態様において、変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損し、そして造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有する、配列番号１または配列番号５のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列、または配列番号１または配列番号５のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸２４−２７および８９−９０に相当する部分から選択されるいずれか１つのまたは複数のアミノ酸残基に欠失、置換および／または付加を有するタンパク質である（ｘは、１−２４から選択されるいずれか１つの整数（１および２４を含む）である）。置換は好ましくは、保存的置換により行われる。
【００７２】
本発明のさらに好ましい態様において、ヒト変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、配列番号２により定義される。配列番号２は、配列番号１のアミノ酸配列の２４番目のＣｙｓがＳｅｒに置換したものである。また、好ましい態様において、マウス変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、配列番号６により定義される。配列番号６は、配列番号５のアミノ酸配列の２４番目のＣｙｓがＳｅｒに置換したものである。これらのタンパク質は、ＴＩＭＰ−３タンパク質のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損しているが、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有している。配列番号２および配列番号６のアミノ酸配列はシグナルペプチドを有するが、シグナルペプチドを有していても、有していなくても、ＴＩＭＰ−３タンパク質のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠失し、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有している限り、本発明の変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質の範囲内である。
【００７３】
好ましい態様において、変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質には、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損し、そして造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有する、配列番号２または配列番号６のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号２または配列番号６のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列から１つまたは数個のアミノ酸残基に欠失、置換、および／または付加を有するタンパク質、あるいは、配列番号２または配列番号６のアミノ酸ｘ−２１１を含むアミノ酸配列に８０％以上の同一性を有するタンパク質、が含まれる（ｘは、１−２４から選択されるいずれか１つの整数（１および２４を含む）である）。
【００７４】
上記同一性％で規定されるタンパク質は、好ましくは８０％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するタンパク質が含まれる。
【００７５】
さらに本発明の変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、核酸配列により定義することも可能である。即ち、好ましくは、本発明の変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質には、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損し、そして造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有する、上記のメタロプロテアーゼ阻害活性に重要なアミノ酸残基（配列番号１または配列番号５の２４−２７または８９−９０のいずれか）をコードする塩基部分が欠失、置換または付加している核酸配列、上記核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、上記核酸配列から１つまたは数個の欠失、置換、および／または付加を有する核酸配列、および上記核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列、によりコードされるタンパク質が含まれる。
【００７６】
好ましい態様において、本発明の変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損し、そして造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有する、配列番号３または配列番号７の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列、配列番号３または配列番号７の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、あるいは配列番号３または配列番号７の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列において、配列番号３または配列番号７の塩基７０−８１および塩基２６５−２７０に相当する部分から選択されるいずれか１つのまたは複数の塩基に欠失、置換および／または付加を有する核酸配列にコードされるタンパク質である（ｙは、１−７０から選択されるいずれか１つの整数（１および７０を含む）である）。
【００７７】
この態様は、ＴＩＭＰ−３タンパク質のメタロプロテアーゼ阻害活性に重要なアミノ酸残基（配列番号１の２４−２７または８９−９０のいずれか）をコードする塩基が変異を起こしている。しかしながら、該塩基に変異を有していても、コドンの縮重により、コードされるアミノ酸が変化しなければ、ＴＩＭＰ−３タンパク質のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損しないと考えられる。
【００７８】
さらに好ましい態様において、本発明の変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、配列番号４によりコードされる。配列番号４は、野生型ヒトＴＩＭＰ−３をコードする配列番号３の核酸配列のうち、２４番目のシステインを指定するコドンＴＧＣ（配列番号３の塩基７０−７２）がＴＣＣに変化している。このため、配列番号４によりコードされるＴＩＭＰ−３タンパク質は、Ｃｙｓ（配列番号４によりコードされるタンパク質においては２４番目のＣｙｓ）がＳｅｒに変化している。また、本発明の変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、配列番号８によってもコードされる。配列番号８は、野生型マウスＴＩＭＰ−３をコードする配列番号７の核酸配列のうち、２４番目のシステインを指定するコドンＴＧＣ（配列番号７の塩基７０−７２）がＴＣＣに変化している。このため、配列番号８によりコードされるＴＩＭＰ−３タンパク質は、Ｃｙｓ（配列番号４によりコードされるタンパク質においては２４番目のＣｙｓ）がＳｅｒに変化している。
【００７９】
よって、さらに好ましい態様において、本発明の変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、ＴＩＭＰ−３のメタロプロテアーゼ阻害活性を欠損し、そして造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する活性を有する、配列番号４または配列番号８の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列、配列番号４または配列番号８の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、あるいは配列番号４または配列番号８の塩基ｙ−６３３を含む核酸配列に８０％以上の同一性を有する核酸配列において、配列番号４または配列番号８の塩基７０−８１および塩基２６５−２７０に相当する部分から選択されるいずれか１つのまたは複数の塩基に欠失、置換および／または付加を有する核酸配列にコードされるタンパク質である（ｙは、１−７０から選択されるいずれか１つの整数（１および７０を含む）である）。
【００８０】
上記のような核酸の同一性％で規定される核酸は、好ましくは８０％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。
【００８１】
（ｉｉ）ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を用いる方法。
本発明はまた、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する方法を提供する。本発明の方法は、
（１）ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含むベクターを準備する工程、
（２）造血幹細胞または未分化造血前駆細胞に（１）のベクターを導入する工程、および
（３）（２）の造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を培養する工程、
を含む。
【００８２】
ここで、前記生理学的性質の改善は、増殖能の亢進、自己複製能の維持または亢進、生存率の亢進、多分化能の維持、短期および長期骨髄再建能の維持または亢進からなる群より選択されるいずれかの性質の改善、あるいはこれらの組み合わせからなる。
【００８３】
好ましい態様において、ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸は、（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸および／または（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸からなる。
【００８４】
本明細書において、「野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸」とは、上述のような「野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質」をコードする核酸であればどのような塩基配列を有するものであってもよい。アミノ酸を指定するコドンは当該技術分野では広く知られており、これに基づき野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸は容易に同定可能である。
【００８５】
同様に、本明細書において、「変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸」とは、上述のような「変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質」をコードする核酸であればどのような塩基配列を有するものであってもよい。
【００８６】
本発明における「ベクター」とは、ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸等の所望の核酸を、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の細胞に導入し、その細胞に所望の遺伝子産物を発現させるものであればどのようなものであってもよい。
【００８７】
好ましい態様においては、ベクターは、プラスミド、ウイルスまたはファージ等であり、さらに好ましい態様においてはプラスミドである。プラスミドは、核酸によりコードされているＴＩＭＰ−３タンパク質を発現できるものであればどのようなものでもよい。好ましい態様において、プラスミドは、構成的に発現するプロモーターまたは造血幹細胞若しくは未分化造血前駆細胞においてのみに発現するプロモーターを有する。
【００８８】
インビトロで、生理学的性質の改善した造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を作成する方法に適したプラスミドは、例えばｐｃＤＮＡ３、ｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰおよびｐＭＹｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ等があり、また適したプロモーターとしては、例えばＣＭＶおよびＬＴＲ等がある。このようなプラスミドを造血幹細胞または未分化造血前駆細胞にインビトロで導入する方法は広く知られており、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法などがある。リポフェクション法に使用される試薬は市販されており、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等がある。
【００８９】
また、使用されるウイルスも特に限定されない。しかしながら、好ましい態様において、ウイルスはアデノウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルス等公知のウイルスが使用される。このようなウイルスの作成方法は公知である。
【００９０】
その他、特に明記しない限り、「造血幹細胞」等、他の用語の意義は『（ｉ）ＴＩＭＰ−３タンパク質を用いる方法』の項目で前述した通りである。
【００９１】
２）  １）の方法により作成された、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞
本発明はまた、上記１）の方法により作成された、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞を提供する。本発明の好ましい態様においては、本発明の造血幹細胞および未分化造血前駆細胞は、移植後の短期および長期骨髄再建能を維持若しくは亢進させる、および／または生着率を維持若しくは亢進する能力を有している。
【００９２】
ここで、「造血幹細胞」、「未分化造血前駆細胞」、「骨髄再建能」および「生着率」の用語は、上記の１）の項目におけるものと同義とする。また、「短期骨髄再建能」、「長期骨髄再建能」および「生着率」の測定方法もまた上記の１）の項目におけるものと同じである。
【００９３】
本発明の造血幹細胞または未分化造血前駆細胞は、造血幹細胞移植を必要とする患者に移植することができる。そのような患者は、例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫または多発性骨髄腫などの治療のための放射線照射または化学療法後の、血球が減少した状態を有する。あるいは本発明の造血幹細胞または未分化造血前駆細胞は、重症再生不良性貧血、先天性代謝異常症または先天性免疫不全症の患者に投与・移植することも可能である。
【００９４】
３）血球の数を増加させるための医薬組成物
本発明は、ＴＩＭＰ−３タンパク質を含んでなる血球の数を増加させるための医薬組成物、およびＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含んでなる血球の数を増加させるための医薬組成物を提供する。これは、ＴＩＭＰ−３タンパク質を発現するプラスミドをマウスに投与することにより、白血球、赤血球および血小板数の増加が観察された実験例に基づくものである。プラスミドにより発現したＴＩＭＰ−３タンパク質は造血幹細胞の増殖能および生存率の亢進を引き起こし、その結果として血球細胞の増加が観察されたものであると思われる。
【００９５】
（ｉ）ＴＩＭＰ−３タンパク質を使用する医薬組成物
本発明はまた、ＴＩＭＰ−３タンパク質を含んでなる、血球の数を増加させるための医薬組成物を提供する。本発明のＴＩＭＰ−３タンパク質を含む医薬組成物を成体に投与することにより、骨髄における造血幹細胞ニッチのＴＩＭＰ−３タンパク質濃度が上昇する。上記のように野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質および変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質は、造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善することが本発明により明らかとなっている。これらのことから、本発明のＴＩＭＰ−３タンパク質を有する医薬組成物もまた、インビボで造血幹細胞および未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善することが可能である。このような本発明の医薬組成物により、白血病の治療のための放射線照射後、またはその他の疾患に対する化学療法後における、血球の減少または造血の減少などに対処することが可能になる。また、本発明の医薬組成物は、例えば、造血器腫瘍などに対する化学療法・放射線治療後の血球（白血球、赤血球、血小板）減少状態、再生不良性貧血・骨髄異形成症候群などの造血不全症等の疾患に使用可能である。
【００９６】
好ましい態様において、本発明の医薬組成物に含まれるＴＩＭＰ−３タンパク質は、（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質および／または（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質からなる。本発明の医薬組成物に使用する、「ＴＩＭＰ−３タンパク質」、「野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質」および「変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質」の定義は、上記の「（１）造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する方法」中におけるものと同じである。
【００９７】
本発明の医薬組成物は、好ましくは１またはそれより多くの医薬的に許容できる担体と共に投与可能である。医薬的に許容できる担体は、投与の経路について医薬的に許容できる希釈剤、増量剤、アジュバント、賦形剤、およびビヒクル、ならびに適した分散剤、湿潤剤、および懸濁剤を使用して処方される、水性のまたは油性の懸濁液であってよい。
【００９８】
医薬的に許容できる担体は、一般的に無菌であり、そして発熱性剤がなく、そして水、油、溶媒、塩、糖、および他の炭水化物、乳化剤、緩衝剤、抗菌剤、およびキレート剤を含んでよい。特定の医薬的に許容できる担体および担体に対する活性化合物の比は、組成物の溶解度および化学特性、投与の方式、ならびに標準の医薬実務により決定される。
【００９９】
本発明における「血球」とは、血液中に存在する全ての血液細胞を含み、好ましい態様において、血球は赤血球、白血球および血小板（巨核球）を含む。ここで、白血球は、好中球、好酸球および好塩基球を含む顆粒球、単球、並びにＴ細胞およびＢ細胞を含むリンパ球を含む。
【０１００】
（ｉｉ）ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含むベクターを使用する医薬組成物
本発明はさらに、ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含んでなる、血球の数を増加させるための医薬組成物を提供する。好ましい態様において、本発明の医薬組成物に含まれるＴＩＭＰ−３タンパク質は、（Ａ）野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸および／または（Ｂ）変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸からなる。本発明の医薬組成物に使用する、「野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸」および「変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸」の定義は、上記の「（１）造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する方法」中におけるものと同じである。
【０１０１】
当該医薬組成物を生体内に投与することにより、造血幹細胞ニッチにおけるＴＩＭＰ−３タンパク質の発現が上昇し、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善することが可能である。
【０１０２】
本発明のＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含むベクターを使用する医薬組成物は、「（ｉ）ＴＩＭＰ−３タンパク質を使用する医薬組成物」の項目で記載したような１またはそれより多くの医薬的に許容できる担体と共に投与可能である。また、所望によりＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸のプロモーターとしては、構成的に発現するＣＭＶプロモーターのようなプロモーター、または造血幹細胞においてのみ特異的に発現するプロモーターを使用することが可能である。好ましい態様において、本発明の医薬組成物に使用可能なプロモーターとしては、ＣＭＶ、β−ａｃｔｉｎおよびＬＴＲ等が挙げられる。
【０１０３】
本発明の医薬組成物に使用する、「野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質」および「変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質」の定義は、上記の「（１）造血幹細胞または未分化造血前駆細胞の生理学的性質を改善する方法」中におけるものと同じである。
【０１０４】
また本発明の好ましい態様において、ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含むベクターはプラスミド、またはウイルスが挙げられる。好ましい態様において、ベクターは、ｐｃＤＮＡ３，ｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ，およびｐＭＹｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ等が挙げられる。
【０１０５】
このようなベクターの投与方法は、骨髄の造血幹細胞ニッチにベクターが到達するような方法であればどのような投与方法によってもよい。好ましい態様において、静脈注射により投与される。
【０１０６】
また、本発明の医薬組成物により造血幹細胞に対する遺伝子治療もまた可能になる。遺伝子治療とは、遺伝的素因が病気の発症原因となっている場合に、特定の遺伝子クローンを患者の体細胞に導入し、導入された遺伝子が機能を発揮することによって治療する方法である。造血幹細胞などをいったん体外に取り出して遺伝子クローンを導入した後、体内に導入するｅｘ  ｖｉｖｏ法と、生体内の造血幹細胞または未分化造血前駆細胞に遺伝子クローンを直接導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法とがある。
【０１０７】
ｅｘ  ｖｉｖｏ法は、上述したような、インビトロで、生理学的性質の改善した造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を作成する方法であって、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞が野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質および／または変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質を発現するように、造血幹細胞または未分化造血前駆細胞に野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸および／または変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含むベクターを導入し、そして造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を培養することを含む方法により作成された造血幹細胞または未分化造血前駆細胞を生体内に、好ましくは骨髄に移植することにより行うことができる。
【０１０８】
また、ｉｎ  ｖｉｖｏ法は直接生体内にＴＩＭＰ−３タンパク質をコードするベクターを投与することにより行われる。ｉｎ  ｖｉｖｏ法においては、標的とする造血幹細胞または未分化造血前駆細胞が存在する造血幹細胞ニッチ以外の細胞に遺伝子が配送されないように留意すべきである。あるいは、ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸のプロモーターを造血幹細胞または未分化造血前駆細胞あるいはその周辺に存在する細胞においてのみ活性を有するようなものを選択することにより、その他の部位での望まない発現を抑えることができる。
【０１０９】
本発明の好ましい態様において、ＴＩＭＰ−３タンパク質をコードする核酸を含むベクターはｐｃＤＮＡ３で、好ましくは体重１ｋｇあたり１００−２０００μｇ／ｋｇ、より好ましくは５００−１５００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは８００−１２００μｇ／ｋｇ、最も好ましくはおよそ１０００μｇ／ｋｇの用量で投与される。
【発明の効果】
【０１１０】
本発明により、増殖能の亢進、自己複製能の維持または亢進、生存率の亢進、多分化能の維持、短期および長期骨髄再建能の維持または亢進等、生理学的性質の改善した造血幹細胞および未分化造血前駆細胞を作成することが可能となった。本発明により作成された造血幹細胞は、造血幹細胞移植により治療が見込まれる、例えば白血病のような種々の疾患を治療するために使用可能である。
【０１１１】
また、本発明の医薬組成物により、これまで種々のサイトカインを組み合わせても達成が困難であった、血球数を増加させることが可能となった。これにより、輸血による感染症などの合併症のリスクが軽減されるだけではなく、輸血量の減少（赤血球輸血・血小板輸血）にもつながると考えられ、社会問題にもなっている輸血感染症の減少や医療費の抑制に貢献することが考えられる。
【実施例】
【０１１２】
実施例１  マウスにおける５ＦＵ処理後のＴＩＭＰ−３の発現変化
５ＦＵは抗癌剤として知られており、これを腹腔内投与することにより骨髄抑制が起こり、血球細胞が減少することが知られている。次いで、血球細胞の減少に応答して、造血幹細胞の分裂が盛んになることが明らかとなっている。本実施例では造血幹細胞の分裂が盛んな５ＦＵ投与後のマウス骨髄におけるＴＩＭＰ−３の発現量を検討した。
【０１１３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１５０ｍｇ／ｋｇの用量で５ＦＵを腹腔内へ注射により投与した。次いで、それぞれ０，３，６および９日目において、５ＦＵ処理マウスから骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を、実施例４によるようなＦＡＣＳによるソーティングにより単離した。
【０１１４】
骨髄単核細胞からＭｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋ  ２．０  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、全ポリＡ＋ｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、製造業者の説明書にしたがって逆転写した。得られたｃＤＮＡのＰＣＲは、ＴＩＭＰ−３特異的プライマー（Ｆｒ：配列番号９、Ｒｅｖ：配列番号１０）およびＧＡＰＤＨに特異的プライマー（Ｆｒ：配列番号１１、Ｒｅｖ：配列番号１２）を使用して、またＤＮＡポリメラーゼとしてはＥｘＴａｑ−ＨＳ（Ｔａｋａｒａ）を使用して実行した。
ＴＩＭＰ−３  Ｆｒ  ５’−ＴＡＣＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＴＧ−３’
ＴＩＭＰ−３  Ｒｅｖ  ５’−ＴＧＣＡＡＴＴＧＣＡＡＣＣＣＡＧＧＴＧＧ−３’
ＧＡＰＤＨ  Ｆｒ  ５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’
ＧＡＰＤＨ  Ｒｅｖ  ５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’
ＰＣＲ反応後、各試料を１％アガロースゲルを使用した電気泳動に供し、次いでエチジウムブロマイドを使用し染色した。
【０１１５】
結果を図１に示す。５ＦＵによる骨髄抑制後の３日目以降においてＴＩＭＰ−３のｍＲＮＡの発現量が有意に増加していることが明らかとなった。これにより、造血幹細胞の増殖にＴＩＭＰ−３が関与する可能性が示唆された。
【０１１６】
実施例２  マウスにおける放射線照射後のＴＩＭＰ−３の発現変化
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに致死量の放射線照射（９５０Ｒ）をし、それぞれ０，３および５日目において、放射線照射マウスから骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を単離した。次いで、実施例１と同様の方法により、ＴＩＭＰ−３およびＧＡＰＤＨについて発現量を検討した。
【０１１７】
結果を図２に示す。ＴＩＭＰ−３のｍＲＮＡの発現量は、放射線照射後３日目以降において増大していた。
【０１１８】
実施例３  骨髄におけるＴＩＭＰ−３タンパク質の発現部位
実施例３では、実施例１のように５ＦＵで処理したマウスの骨髄中でのＴＩＭＰ−３タンパク質の発現部位をより詳細に検討するために、マウス骨髄細胞を免疫染色により解析した。
【０１１９】
実施例１と同様に５ＦＵで処理した後３日後のマウスの大腿を解剖し、４％パラホルムアルデヒドで固定した後に５％ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０−６．５）を用いて脱灰した。次いで、試料をＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中に包埋し、凍結し、そして５μｍ厚で切片を作成した。切片を５分間メタノール／アセトンで再固定し、ヤギ血清でブロッキングし、そしてヤギ抗ＴＩＭＰ−３（Ｃ−２０）またはオステオポンチン（ＯＰＮ）（Ｐ−１８）ポリクローナル抗体を一次抗体として使用した。緩衝液による洗浄後、二次抗体としてビオチン標識抗ヤギＩｇＧ抗体を使用し染色、さらに緩衝液による洗浄後、３次抗体としてペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを使用し染色した。最後にジアミノベンチジンを反応させ発色を行った。
【０１２０】
結果を図３に示す。オステオポンチン（ＯＰＮ）は骨芽細胞特異的なマーカーとして知られている。上段の染色図により５ＦＵの投与の有無に係わらず、骨の表面において発現していることがわかる。また下段右に示される染色図により、５ＦＵ投与後のマウスでＴＩＭＰ−３タンパク質は骨の表面に沿って発現していることが明らかとなった。一方、５ＦＵを投与しなかったマウス（下段左）においては、ＴＩＭＰ−３タンパク質の発現は見られなかった。これまでの研究により、骨の表面に造血幹細胞の存在する部位（造血幹細胞ニッチ）が存在することが示唆されている。ＴＩＭＰ−３タンパク質は当該部位で発現が上昇していることから、造血幹細胞に影響を与えていることが強く示唆される。
【０１２１】
実施例４  ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の選択
マウス造血幹細胞として知られるＣＤ３４−ＫＳＬ細胞（ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋  Ｌｉｎｅａｇｅ−）を選択するためにマウス骨髄単核球からＬｉｎｅａｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、Ｌｉｎｅａｇｅ＋細胞を取り除いた。さらに、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）等を使用してＣＤ３４−ＫＳＬ細胞をフローサイトメトリーによりソーティングした。使用した抗体はｃ−Ｋｉｔ（ＡＣＫ２）、Ｓｃａ−１（Ｅ１３−１６１．７）、ＣＤ３４（ＲＡＭ３４）であり、これら全てはＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより購入した。これにより、所望のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を得た。
【０１２２】
実施例５  造血幹細胞の増殖に対するＴＩＭＰ−３タンパク質の影響
実施例４のようにソーティングしたＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、１００細胞ずつ丸底９６ウェルプレートのウェルに加えた。本発明の実験系において、細胞培養培地はＳ−ｃｌｏｎｅ  ＳＦ−０３（三光純薬）であり、該培地に０．５％ウシ血清アルブミン、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦおよび５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを添加し使用した。これらのウェルに組換えヒトＴＩＭＰ−３タンパク質（配列番号１の２４−２１１）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を３μｇ／ｍｌ添加する群と、添加しない群に分け、その後６日間培養を続けた。その間、２日に１回の割合で培地を新たなものと交換した。
【０１２３】
６日間の細胞数の変化および５日目における細胞の写真を図４に示す。丸は対照群を、三角はＴＩＭＰ−３添加群を示す。６日目において、ＴＩＭＰ−３タンパク質を添加していない対照ウェルでは１２００細胞程度までしか増殖していなかったのに対し、ＴＩＭＰ−３タンパク質を添加したウェルでは２３００細胞程度まで増殖していた。本実験では、ＴＩＭＰ−３タンパク質により、２３００／１２００＝１．９２倍、増殖能が亢進していた。よって、ＴＩＭＰ−３タンパク質は、造血幹細胞の増殖能を有意に亢進する活性を有することが明らかとなった。
【０１２４】
実施例６  造血幹細胞のコロニー形成（自己複製能）に対するＴＩＭＰ−３タンパク質の影響
実施例６では、造血幹細胞の自己複製能を測定するために、コロニー形成アッセイを行った。具体的には、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｍ３４３４（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用し、添付の説明書にしたがって行った。以下に概要を示す。
【０１２５】
実施例４と同様の方法により採取したＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに１細胞ずつソーティングし、Ｓ−Ｃｌｏｎｅ  ＳＦ−０３に０．５％ウシ血清アルブミン、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを添加した培地で培養した。これにＴＩＭＰ−３タンパク質（配列番号１の２４−２１１）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加する群と添加しない群に分け、それぞれの細胞を１回分裂させた。生じた２個の娘細胞をマイクロマニピュレーターにより１つずつに分離し、それぞれの細胞をメチルセルロース培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｍ３４３４）中に埋めこみ、１週間から１０日程度培養し分化させた。
【０１２６】
２個の娘細胞の培養後、それぞれから生じた細胞を図５に示す。ｎｍＥＭ／ｎｍＥＭは２個の娘細胞から生じたコロニーがいずれも白血球、赤血球および巨核球等の全てを有するミックスコロニーであることを示す。２個の娘細胞から生じたコロニーのうち少なくとも１つがミックスコロニーであることは、元となった１つのＣＤ３４−ＫＳＬ細胞が、自己複製能を有したまま分裂をしたことを示唆する。また、２つの娘細胞のうち１つの細胞もミックスコロニーを形成しなかった場合には、元となった１つのＣＤ３４−ＫＳＬ細胞は、自己複製能を有しなかったことを示唆する。
【０１２７】
対照群の細胞では、７０％程度の造血幹細胞しか自己複製能を有していなかったのに対し、ＴＩＭＰ−３タンパク質を添加した培地中で培養した群ではおよそ９０％の造血幹細胞が自己複製能を有していた。本実験では、９０／７０＝１．３倍程度、ＴＩＭＰ−３タンパク質により自己複製能が亢進した。これにより、ＴＩＭＰ−３タンパク質の存在下で培養することにより、造血幹細胞の自己複製能を維持したまま、あるいは亢進させて造血幹細胞を増殖させることができることが明らかとなった。
【０１２８】
実施例７  造血幹細胞のコロニー形成に対するＴＩＭＰ−３タンパク質の影響
実施例７では、造血幹細胞の自己複製能および生存率を測定するために、実施例５とは異なる系のコロニー形成アッセイを行った。以下に概要を示す。
【０１２９】
実施例４と同様の方法により採取したＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに１細胞ずつソーティングし、ＴＩＭＰ−３タンパク質（配列番号１の２４−２１１）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加する群および添加しない群（対照群）に分け、０．５％ウシ血清アルブミン、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌＴＰＯおよび１％メチルセルロースを添加したＳ−ｃｌｏｎｅ培地で１週間培養した。次いで、培養した細胞に分化培地（１０％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、２Ｕ／ｍｌ  Ｅｐｏ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯを添加したＳ−ｃｌｏｎｅ培地）を加えてコロニー形成能を観察した。
【０１３０】
結果を図６に示す。ＧＥＭＭは好中球、赤血球（赤芽球）、マクロファージおよび巨核球からなるミックスコロニーを示す。対照群では、およそ２０％がミックスコロニーを形成し、また７０％以上細胞は本アッセイを終了するまでに死滅していた。一方、ＴＩＭＰ−３タンパク質を添加した群では、ミックスコロニーの形成率はおよそ３３％程度となり、対照群に比べて有意にミックスコロニー形成が増加していた。これは、ＴＩＭＰ−３タンパク質が、造血幹細胞の分化を抑えて、その多分化能を維持させているためであると考えられる。あるいは、ＴＩＭＰ−３タンパク質は、造血幹細胞のアポトーシスを抑えることにより、結果として、ミックスコロニーの形成を亢進していることも考えられる。後者の理由は、ＴＩＭＰ−３タンパク質を添加した群は、本アッセイ終了までに死滅する細胞の割合が５６％程度であったことからも支持される。
【０１３１】
実施例８  骨髄移植
実施例４と同様の方法により採取したＣ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１マウス由来のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を、およそ１週間またはおよそ２週間、ヒトＴＩＭＰ−３タンパク質（配列番号１の２４−２１１）（３μｇ／ｍｌ）を添加する群およびしない群（対照群）に分け、培養した。次いで、培養した細胞をＬｙ５．２マウス由来の骨髄細胞２×１０５個ずつと混合して、致死量の放射線（９５０ｒａｄｓ）照射したＣ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．２レシピエントマウスに静脈注射により移植した。移植後４，８，１２，２３週目において、末梢血中のＣ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１マウス由来の血球細胞を、抗Ｌｙ５．１抗体を使用したＦＡＣＳにより解析し、その割合を調べることにより、移植細胞の生着率を測定した。それぞれの実験条件について、５個体のマウスを使用して実験を行った。
【０１３２】
結果を図７に示す。ヒトＴＩＭＰ−３タンパク質と１週間培養した群および２週間培養した群で、移植後４，８，１２，２３週目のいずれにおいても対照群と比べて有意な差を示さなかった。このことから、ＴＩＭＰ−３タンパク質で処理した造血幹細胞は、前述のような増殖能の亢進等の生理学的性質の改善が見られるにもかかわらず、実際に移植をした場合でも、対照群と同程度の生着率および短期・長期骨髄再建能を有するということが明らかとなった。
【０１３３】
また、さらに過酷な条件下での造血幹細胞の生着率および長期骨髄再建能を調べるために、二次移植実験を行った。上記のマウスから移植後２４週に骨髄細胞を採取し、２ｘ１０６個ずつレシピエントマウスに移植した。二次移植後４週目および８週目の結果を図８に示す。ヒトＴＩＭＰ−３タンパク質と１週間培養した細胞群では、対照群に比べて生着率が亢進していた。これは、二次移植後４週目および８週目のいずれにおいても観察された。一方、ヒトＴＩＭＰ−３タンパク質と２週間培養した細胞群では、対照群と同程度の生着率となった。これは、１週間培養系ではＴＩＭＰ−３タンパク質は造血幹細胞機能を保つまたは増強することができ、一方、２週間培養系では培養期間が長く、そのために培養中に造血幹細胞の幹細胞機能が失われていったためであると考えられる。
【０１３４】
実施例９  マウスへのＴＩＭＰ−３を発現するプラスミドの投与
実施例１と同様にして、０日目に５ＦＵをＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４）に１５０ｍｇ／ｋｇの用量を腹腔内投与した。次いで、１日目にマウス野生型ＴＩＭＰ−３（ｐｃＤＮＡ３／ＴＩＭＰ−３（配列番号７の塩基１−６３３を含む））、またはマウス変異型ＴＩＭＰ−３を発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３／ＴＩＭＰ−３（Ｃｙｓ１  ｔｏ  Ｓｅｒ：配列番号８の塩基１−６３３を含む））あるいはコントロールプラスミド（ｐｃＤＮＡ３）２０μｇを２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈し、尾静脈から急速静注により投与した。
【０１３５】
その後、２，４，６，８，１０および１２日目において白血球の細胞数を、血球計算機を使用して計数した。実験スケジュールと結果を図９に示す。コントロールプラスミドを投与した対照群では６日目以降で血球数の回復が見られ、一方、野生型ＴＩＭＰ−３および変異型ＴＩＭＰ−３ではいずれも対照群に比べて早い血球の回復が観察された。また白血球の最低値も野生型ＴＩＭＰ−３および変異型ＴＩＭＰ−３注射群で高値であった。このことにより、ＴＩＭＰ−３はインビトロで造血幹細胞の生理学的性質を改善するばかりではなく、インビボにおいても、造血幹細胞の生理学的性質を改善することにより、血球数の増加を促進することが明らかとなった。
【０１３６】
また、同様にしてヘモグロビン値および血小板の細胞数についても計数した。結果を図１０と１１に示す。ヘモグロビン値は、赤血球のターンオーバーがその他の血球細胞に比べて１００日程度と長いため、５ＦＵによる骨髄抑制直後では差が見にくいようである。しかしながら、６日目以降において、野生型ＴＩＭＰ−３タンパク質または変異型ＴＩＭＰ−３タンパク質を発現するプラスミドを投与したマウスでは、ヘモグロビンの減少が遅くなり、８日目には対照群とＴＩＭＰ−３群では２ｇ／ｄｌ程度の差が生じている。この差は臨床的には大きなものであり、ＴＩＭＰ−３は赤血球の増殖についても作用することが明らかとなった。また、血小板については、ＴＩＭＰ−３群では対照群に比べて細胞数が増加したものの、変異型ＴＩＭＰ−３群ではあまり差は見られなかった。
【０１３７】
これらの結果から、ＴＩＭＰ−３タンパク質を発現するプラスミドを投与することにより、造血幹細胞の分裂が盛んになり、造血の回復が早まることが明らかとなった。
これまでに、エリスロポエチンやＧ−ＣＳＦなどのように、ある特定の血球細胞系列のみを増加させる薬剤は知られていた。しかしながら、ＴＩＭＰ−３は少なくとも３系統の血球細胞を増殖させることが可能であり、臨床治療における有用性が期待される。
【０１３８】
実施例１０  マウスの生存延長実験
０日目にＣ５７ＢＬ／６マウス（各群ごとにｎ＝９）に致死量放射線照射（９００Ｒ）を行った。次いで、１日目（放射線照射の２４時間後）にマウス野生型ＴＩＭＰ−３（ｐｃＤＮＡ３／ＴＩＭＰ−３（配列番号７の塩基１−６３３を含む））、またはコントロールプラスミド（ｐｃＤＮＡ３）２０μｇを２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈し、尾静脈から急速静注により投与した。
【０１３９】
その後の各群の生存率を図１２に示す。コントロールプラスミドを投与した対照群では、放射線照射から１０日目で生存率が５０％となり、１５日目には全てのマウスが死亡した。しかしながら、ＴＩＭＰ−３プラスミド投与群では放射線照射から１４日目で生存率が５０％となり、１８日目に全てのマウスが死亡した。実験結果には、統計学的優位差が認められた（ｐ＜０．０５）。このことから、ＴＩＭＰ−３はインビボにおいて造血幹細胞の生理学的性質を改善することにより、血球数の増加を促進し、マウスの生存を延長することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、骨髄抑制によるＴＩＭＰ−３の誘導を示す。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に１５０ｍｇ／ｋｇの５ＦＵを腹腔内に注射し、骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を各時点で回収した。ＲＮＡを抽出し、そして半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＴＩＭＰ−３およびＧＡＰＤＨの発現を調べた。また、下の図は５ＦＵ投与後の白血球数の減少を示す。
【図２】図２は、放射線照射によるＴＩＭＰ−３の誘導を示す。マウスを致死量の放射線照射（９５０Ｒ）で処理し、そしてＢＭＭＮＣを各時点で回収した。ＴＩＭＰ−３の発現を図１と同様に半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより試験した。
【図３】図３は、骨髄造血幹細胞ニッチにおけるＴＩＭＰ−３の誘導を示す。３日間５ＦＵで処理したマウス由来の骨髄の組織染色。オステオポンチン（ＯＰＮ）およびＴＩＭＰ−３発現を茶色で示した。矢頭は骨髄の骨内膜表面でのＴＩＭＰ−３発現を示す。また、青色はヘマトキシリンによる核染色である。
【図４】図４は、ＴＩＭＰ−３により増進された造血幹細胞の増殖を示す。９６ウェルプレートのウェルごとに１００個のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞をソートし、そしてＴＩＭＰ−３（３μｇ／ｍｌ）ありで、またはなしで、幹細胞因子（ＳＣＦ，５０ｎｇ／ｍｌ）およびトロンボポエチン（ＴＰＯ，５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下において培養した。左パネル：増殖曲線；三角はＴＩＭＰ−３タンパク質投与群、丸は対照群を示す。右パネル：５日間培養後の細胞の写真（倍率  ｘ１００）。
【図５】図５は、ＴＩＭＰ−３と培養した造血幹細胞の対娘細胞コロニーアッセイの結果（％）を示す。ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を９６ウェルプレート中へソートし、そしてＴＩＭＰ−３存在下または非存在下で、ＳＣＦおよびＴＰＯと共に培養した。細胞が分裂し、娘細胞対が生成した後、マイクロマニピュレーションにより細胞を分離し、コロニーアッセイに供した。ｎ；好中球、ｍ；マクロファージ、Ｅ；赤血球系細胞、Ｍ；巨核球。コロニー対のパーセンテージを示す。ｎｍＥＭは多能性前駆細胞から生じたコロニーを示す。
【図６】図６は、ＴＩＭＰ−３と培養した造血幹細胞の増進したコロニー形成能を示す。ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞をＴＩＭＰ−３存在下または非存在下で、ＳＣＦおよびＴＰＯと１週間インビトロ培養した。次いで、細胞をコロニーアッセイに供した。灰色はＧＥＭＭ、黒色はＧＥＭ、そして白色はＭｅｇを示す。Ｍｅｇ：巨核球のみ生じたコロニー、ＧＥＭ：好中球、赤血球系細胞およびマクロファージを生じたコロニー、ＧＥＭＭ：好中球、赤血球系細胞、マクロファージおよび巨核球を生じたコロニー。
【図７】図７は、ＴＩＭＰ−３の存在下または非存在下で培養した造血幹細胞の長期骨髄再建能を示す。ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞をＴＩＭＰ−３の存在下または非存在下で、ＳＣＦおよびＴＰＯと１週間培養し、そして２ｘ１０５の競合細胞と同系統の宿主マウスに移植した。末梢血におけるドナー細胞のパーセンテージを各時点で解析した。
【図８】図８は、ＴＩＭＰ−３の存在下または非存在下で培養した造血幹細胞の二次移植における長期骨髄再建能を示す。ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞をＴＩＭＰ−３の存在下または非存在下で、ＳＣＦおよびＴＰＯと１週間または２週間培養し、そして２ｘ１０５の競合細胞と同系統の宿主マウスに移植した。その後、マウス骨髄から骨髄単核球を回収し、再び他のマウスに移植した。二次移植後４週間または８週間での生着率を解析した。
【図９】図９は、５ＦＵで処理後のマウス（各群でｎ＝４）に、流体力学配送法（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）により尾の静脈からＴＩＭＰ−３または変異型ＴＩＭＰ−３（Ｃｙｓ  １  Ｓｅｒ）発現プラスミドを注射した後の白血球数の変化を示す。上：実験スケジュール。下：白血球の細胞数変化のグラフ；菱形は対照群、四角はＴＩＭＰ−３を投与した群、三角は変異型ＴＩＭＰ−３を投与した群を示す。
【図１０】図１０は、５ＦＵで処理後のマウス（各群でｎ＝４）に、流体力学配送法（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）により尾の静脈からＴＩＭＰ−３または変異型ＴＩＭＰ−３（Ｃｙｓ  １−Ｓｅｒ）発現プラスミドを注射した後のヘモグロビン値の変化を示す。菱形は対照群、四角はＴＩＭＰ−３を投与した群、三角は変異型ＴＩＭＰ−３を投与した群を示す。
【図１１】図１１は、５ＦＵで処理後のマウス（各群でｎ＝４）に、流体力学配送法（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）により尾の静脈からコントロールプラスミド、ＴＩＭＰ−３発現プラスミドまたは変異型ＴＩＭＰ−３（Ｃｙｓ  １  Ｓｅｒ）発現プラスミドを注射した後の血小板数の変化を示す。菱形は対照群、四角はＴＩＭＰ−３を投与した群、三角は変異型ＴＩＭＰ−３を投与した群を示す。
【図１２】図１２は、致死量放射線照射（９００Ｒ）後のマウスに、流体力学配送法（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）により尾の静脈からコントロールプラスミドまたはＴＩＭＰ−３発現プラスミドを注射した後のマウスの生存率の変化を示す。破線はＴＩＭＰ−３投与群を、実線は対照群を示す。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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