(57)【要約】【課題】効率的に、かつ簡便に、４−カンペステノン含有組成物を、あるいは４−カンペステノンを有効成分とし、抗肥満作用を有する組成物を提供すること。【解決手段】カンペステロールを含む固体状培地で糸状菌を培養し、培地中のカンペステロールを４−カンペステノンに変換せしめ、４−カンペステノンへの変換率が５質量％以上である糸状菌発酵物を得ることを特徴とする４−カンペステノン含有組成物の製造方法。糸状菌が、４−カンペステノンへの変換率が５質量％以上のPenicillium属またはAspergillus属に属する糸状菌である。固体状培地として小麦ふすまを利用する。上記の製造方法で得られた抗肥満作用を有する４−カンペステノン含有組成物。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンペステロールを含む固体状培地で糸状菌を培養し、培地中のカンペステロールを４−カンペステノンに変換せしめ、４−カンペステノンへの変換率が５質量％以上である糸状菌発酵物を得ることを特徴とする４−カンペステノン含有組成物の製造方法。
【請求項２】
糸状菌が、４−カンペステノンへの変換率が５質量％以上のPenicillium属またはAspergillus属に属する糸状菌である請求項１の４−カンペステノン含有組成物の製造方法。
【請求項３】
糸状菌が、Penicillium cammenberti、Penicillium roqueforti,Penicillium candidum、Penicillium aurantiogriseum、Penicillium citrinum、Penicillium commune、Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae、Aspergillus tamarii、Aspergillus repens、Aspergillus usamiiのいずれかの種に属する糸状菌である請求項２の４−カンペステノン含有組成物の製造方法。
【請求項４】
固体状培地として小麦ふすまを利用する請求項１、２または３の４−カンペステノン含有組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかの製造方法で得られた抗肥満作用を有する４−カンペステノン含有組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−カンペステノン含有組成物を製造する方法、および得られた抗肥満作用を有する４−カンペステノン含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、先進国では肥満の人の割合が増大しており、この社会的背景において肥満予防および改善という抗肥満作用を有する成分が求められている。
本発明者らは、熱に安定で抗肥満作用を有する成分として、４−カンペステノン（別名；４−カンペステン−３−オン、２４−メチルコレスト−４−エン−３−オン）を見出し、これを含有する油脂組成物を別途出願している（特許文献1）。
４−カンペステノンを得る方法については、天然に存在するものを抽出・分離する方法、カンペステロールを原料に化学的に変換する方法、微生物により生産する方法、酵素を用いて変換する方法が知られている。
天然に４−カンペステノンを含むものとしては、Harrisonia abssinica樹皮（非特許文献１）、Phoenix dactylifera幹（非特許文献２）等が知られている。しかし、天然に存在するものを抽出・分離する方法では、４−カンペステノンの含まれる量は微量であり、抗肥満作用を奏するに十分な量を得ることは困難である。
化学的に変換する方法としては、カンペステロールを原料に、Parishらの選択的酸化法（非特許文献３）にて５−カンペステノンを合成し、これを異性化して得る方法等が知られている。しかし、カンペステロールを原料に化学的に変換する方法では、毒性の強い物質を変換に用いるなど食品の製造方法としては適していないという問題があった。
【０００３】
微生物により生産する方法および酵素を用いて変換する方法は、４−カンペステノンが、カンペステロールにコレステロールオキシダーゼ（cholesterol:oxigen oxidoreductase:EC1.1.3.6）を作用させることで得られることを原理としている。
一般に、コレステロールオキシダーゼを生産する微生物に関しては種々のものが知られており、例として、ブレビバクテリウム（Brevibacterium sp.) 、セルロモナス（Cellulomonas sp.）、ノカルジア  エリスロポリス（Nocardia erythropolis)、シュードモナス フルオレツセンス（Pseudomonas fluorescens)、シゾフィラム コミユーン（Schizophyllum commune)、ストレプトマイセス（Streptomyces sp.）、およびミコバクテリウム コレステロリカム（Mycobacterium cholesterolicum)等を挙げることができる。また、コレステロールオキシダーゼはその由来により基質特異性が異なり（非特許文献4）、ステロールの種類により反応性が異なっているため、カンペステロールから４−カンペステノンを効率的に変換する微生物を選択する必要がある。また、これらの従来の方法では、これらのコレステロールオキシダーゼを生産する微生物は、液体培養しかできないことから、培養液または酵素液に、基質であるカンペステロールを溶解させなければならないと考えられる。しかし、カンペステロールは水への溶解度が極めて低いため、４−カンペステノンを効率的に得ることはできなかった。
難水溶性で有機溶媒に可溶な物質を酵素により変換する方法には、水層に有機溶媒を重層して反応させる方法が提案されている（特許文献２、非特許文献５）。しかし、この方法には、（１）界面での反応であるため、界面の面積を増大させる必要があること、（２）反応後に有機溶媒層を分離・回収し、有機溶媒を除去する必要があること、（３）爆発等を防止する必要があるから、工程および装置が複雑化する難点があった。
以上のように、発酵のみの工程で簡便にそのまま喫食可能な状態の４−カンペステノンを得る製造方法は知られていなかった。
【０００４】
【特許文献１】特願2006-251794号
【特許文献２】特開2007-284348号
【非特許文献１】Balde et.al. Plant Med.66: 67-69,2000
【非特許文献２】Fernandez et. al.,Phytochem. 22:2087-2088,1983
【非特許文献３】SyntheticCommunications, 22: 2839-2847,1992
【非特許文献４】北本、日本油化学会誌 46(1):3-14,1999
【非特許文献５】青野、バイオサイエンスとインダストリー 54(5) :                        342-347,1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ステノン類の効率的生産に当たっては、(1)基質となるステロールの水への溶解性が低いため生産効率が低い、(2)溶解性を上げるために有機溶媒等を用いた場合では工程および装置が複雑化する、という課題があった。
そこで、本発明は、効率的に、かつ簡便に、４−カンペステノン含有組成物を、あるいは４−カンペステノンを有効成分とし、抗肥満作用を有する組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、４−カンペステノン含有組成物が、食品として利用しやすい肥満を抑制する素材であることを見いだし、効率的な生産方法を探索した。そして、難水溶性物質であるカンペステロールを基質として、固体状培地に多量に混合させた状態で、カンペステロールから４−カンペステノンに効率的に変換する微生物が存在するのではないかと着想し鋭意検討した。その結果、固体状培地で好適に生育し、これまで知られていなかった、カンペステロールを４−カンペステノンに変換せしめることができる糸状菌を見出し、それを用いて、効率的に、かつ簡便な、４−カンペステノン含有組成物の製造方法を見いだした。    
すなわち、本発明の特徴点の一つは、カンペステロールから４−カンペステノンに効率的に変換する、固体状培地で好適に生育する微生物を見いだしたことに基づくものである。
【０００７】
本発明は、以下の（１）〜（４）の４−カンペステノン含有組成物の製造方法を要旨としている。
（１）カンペステロールを含む固体状培地で糸状菌を培養し、培地中のカンペステロールを４−カンペステノンに変換せしめ、変換後のカンペステロールと４−カンペステノンの質量に対する、４−カンペステノン質量の比率である４−カンペステノンへの変換率が５質量％以上である糸状菌発酵物を得ることを特徴とする４−カンペステノン含有組成物の製造方法。
（２）糸状菌が、該糸状菌による変換後のカンペステロールと４−カンペステノンの質量に対する、４−カンペステノン質量の比率である４−カンペステノンへの変換率が５質量％以上のPenicillium属またはAspergillus属に属する糸状菌である上記の（１）の４−カンペステノン含有組成物の製造方法。
（３）糸状菌が、Penicillium cammenberti、Penicillium roqueforti,Penicillium candidum、Penicillium aurantiogriseum、Penicillium citrinum、Penicillium commune、Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae、Aspergillus tamarii、Aspergillus repens、Aspergillus usamiiのいずれかの種に属する糸状菌である上記（２）の４−カンペステノン含有組成物の製造方法。
（４）固体状培地として小麦ふすまを利用する上記の（１）、（２）または（３）の４−カンペステノン含有組成物の製造方法。
【０００８】
また、本発明は、以下の（５）の抗肥満作用を有する４−カンペステノン含有組成物を要旨としている。
（５）上記の（１）ないし（４）のいずれかの製造方法で得られた抗肥満作用を有する４−カンペステノン含有組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、効率的に、かつ簡便に、４−カンペステノン、あるいは４−カンペステノンを有効成分とし、抗肥満作用を有する組成物を提供することができる。本発明の、カンペステロールを含む固体状培地で糸状菌を培養し、培地中のカンペステロールを４−カンペステノンに変換せしめることを特徴とする、４−カンペステノンを有効成分とし、抗肥満作用を有する糸状菌発酵物の製造方法は、基質として従来よりも格段に高濃度にカンペステロールを培地に添加することができるため、効率的に、かつ簡便に、４−カンペステノンを含有する糸状菌発酵物を製造することができるようになる点で有用である。
【００１０】
本発明でいう抗肥満作用とは、肥満予防作用、または肥満改善作用を指す。肥満予防作用として、体重増加抑制作用、脂肪組織の増加抑制作用が挙げられる。また、肥満改善作用として、体重減少作用、脂肪組織低減作用が挙げられる。
肥満は、ホルモンやサイトカイン等を介して糖尿病等の生活習慣病を引き起こすことが知られている。したがって、本発明品は肥満予防作用や肥満改善作用といった直接的な作用と共に、これらの作用を介して糖尿病・動脈硬化・高脂血症・高血圧・脂肪肝・高尿酸血症・関節炎・睡眠障害・乳癌・前立腺癌等の予防および／または改善作用が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、カンペステロールを含む固体状培地で糸状菌を培養し、培地中のカンペステロールを４−カンペステノンに変換せしめることを特徴とする、４−カンペステノンを有効成分とし、抗肥満作用を有する糸状菌発酵物の製造方法、好ましくはPenicillium属またはAspergillus属に属する糸状菌を用いた糸状菌発酵物の製造方法である。また、本発明はそれらの方法で製造された糸状菌発酵物およびそれを抽出して得られる油脂組成物に関する。
【００１２】
４−カンペステノン（別名；４−カンペステン−３−オン、２４−メチルコレスト−４−エン−３−オン）は下記の式で表される。
【化１】
2009131171.tif 000002
【００１３】
本発明の糸状菌発酵物は、カンペステロールを含有した固体状培地で糸状菌を培養し、培地中のカンペステロールを４−カンペステノンに変換せしめたものをいう。また、必要に応じて発酵物から4−カンペステノンを抽出することもできる。
【００１４】
本発明で用いるカンペステロールとしては、カンペステロールを含有するものであればよく、特に制限されない。例えば、化学合成品のほか、小麦胚芽等の各種植物胚芽類、カンペステロールを含む油脂類、大豆油や菜種油などの植物油製油工程中の副産物である脱臭留出物、また、植物ステロールの濃縮物および精製物も利用できる。
【００１５】
本発明で用いる糸状菌としては、4−カンペステノンを生産する能力を有するPenicillium属またはAspergillus属に属する糸状菌であれば、特に制限されない。例えば以下に挙げるもののうち、いずれかを単独または２種以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは、Penicillium cammenberti、Penicillium roqueforti,Penicillium candidum、Penicillium aurantiogriseum、Penicillium citrinum、Penicillium communeのいずれかの種に属する糸状菌、 Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae、Aspergillus tamarii、Aspergillus repens、Aspergillus usamiiのいずれかの種に属する糸状菌を用いることができる。
【００１６】
さらに好ましくは、Penicillium cammenberti  IAM13796, IAM13797、Penicillium roquefortiPR1, PR3, PR4, PRG2, PRG3, IAM13798、Penicillium candidum PC 22 LYO 50 D, PC ABL LYO 10D, PC HP 6 LYO 10D, PC NEIGE LYO 10D, PC SAM3 LYO 10D, PC TT033, PC VS LYO 2D, PCA 1/PC TT031, PCA 3/PC TT032、Penicillium aurantiogriseum IAM13794、Penicillium citrinum IAM13716, IAM7008、Penicillium commune IAM12158、Aspergillus oryzae RIB430, RIB1029, RIB1103, RIB1119, RIB1142, RIB1163, RIB1197, RIB1204, RIB1213, RIB1341, RIB151, RIB203, RIB303, RIB306, RIB315, RIB40, RIB621, RIB67, RIB1306, RIB336, RIB505, RIB1020, RIB1116, RIB1133, RIB1181, RIB1313, RIB327, RIB4031, RIB408, RIB601, RIB630、Aspergillus sojae RIB1011, RIB1023, RIB1024, RIB1040, RIB1042, RIB1045, RIB1046, RIB1050, RIB1052, RIB1059, RIB1202, RIB1348, RIB1404, RIB1414, RIB401, RIB405, RIB6001, RIB6002, RIB6003, RIB6005, RIB6006, RIB6007, RIB910, RIB919, RIB934, RIB935、Aspergillus tamarii RIB1175, RIB3005, RIB3006, RIB3007, RIB3010, NBRC4099、Aspergillus repens NBRC8914、Aspergillus usamii RIB2501を用いることができる。
【００１７】
特に好ましくは、Aspergillus tamarii RIB1175, RIB3005, RIB3006, RIB3007, RIB3010, NBRC4099を用いることができる。
【００１８】
以上のうち、Penicillium roqueforti PR1, PR3, PR4, PRG2, PRG3、Penicillium
candidum PCA 1/PC TT031, PCA 3/PC TT032, PC TT033はクリスチャンハンセン社の製品である。Penicillium candidum PC 22 LYO 50 D, PC ABL LYO 10D, PC HP 6 LYO 10D, PC NEIGE LYO 10D, PC SAM3 LYO 10D, PC VS LYO 2Dは、ダニスコ社の製品である。RIB菌株は（独）酒類総合研究所から、IAMおよびNBRC菌株は（独）製品評価技術基盤機構から入手できる。４−カンペステノンを生産する能力を有する糸状菌は、ニトロソグアニジンなどの化学物質や、紫外線や放射線、遺伝子組み換えの技術等により改良することができる。
【００１９】
本発明の特徴点の一つは、カンペステロールから４−カンペステノンへの変換率が高く、４−カンペステノンをほとんど資化しない微生物を見いだしたことに基づくものである。なお、カンペステロールから４−カンペステノンへの変換率は、微生物による変換後のカンペステロールと４−カンペステノンの質量に対する、４−カンペステノン質量の比率である。
４−カンペステノンへの変換率としては、５質量％以上、好ましくは１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上、さらに好ましくは２５質量％以上、特に好ましくは３０質量％以上である糸状菌を選択することが望ましい。
【００２０】
本発明で言う固体状培地は、形態が粉末状、粒状、ペレット状、薄片状等の、空隙を有するものが望ましい。培地内部を好気的な条件とすることで、培地の表面だけでなく、培地内部に糸状菌が生育できる点で有利である。用いる培地の種類としては、糸状菌が生育できるものであれば、特に制限されない。例えば、米、大豆、小麦、大麦といった穀類のほか、小麦の外皮である小麦ふすま、大豆の皮といったものも利用できる。中でも、小麦ふすまが4−カンペステノン生産の観点から望ましい。その他、必要に応じて、炭素源、窒素源、微量ミネラルや微量金属等を添加し、糸状菌の生育を調整することができる。
【００２１】
培地の殺菌には、高温蒸気殺菌、紫外線殺菌、焙煎等の、通常行う公知の殺菌技術を適用することができる。
糸状菌の植菌方法は、特に制限されない。胞子または菌糸ないしはそれらの一方あるいは両方が付着したものを、固体状培地に噴霧ないし振り掛けまたは混合すればよい。該糸状菌を一度培養した容器や培養室を培養後そのまま使用すれば、容器等に残存している糸状菌が接触するため、特段上記の糸状菌を添加することなく、４−カンペステノン含有組成物を生産することも可能である。
【００２２】
培養温度は、糸状菌が生育できる温度であれば特に制限されない。通常２０〜４０℃の範囲で、用いる糸状菌の種類によって好適なものを選択すればよい。
培養時間については、所望する４−カンペステノンの量に応じて決定すればよい。特に制限はないが、通常２〜１４日間の範囲で、用いる糸状菌の種類によって好適なものを選択すればよい。
培地中の水分量は、糸状菌が生育できる水分量であれば特に制限されない。固体物に対し、通常５０〜１５０％の範囲で、用いる糸状菌の種類によって好適なものを選択すればよい。
培地中のカンペステロールの濃度は、培地の乾燥質量に対して０．２％以上であればよく、上限は、糸状菌の生育に必要な成分のバランスを考慮し、３０％以下であることが好ましい。
培養中の固体状培地は、静置でもよいが、培地を撹拌すると、4−カンペステノンの生産性をさらに向上することができる。
【００２３】
本発明の糸状菌発酵物は、そのまま喫食することのできる形態である。乾燥して風味豊かな食品とすることも包含される。また、食品または飼料の原料として用いることができる。これらの原料として使用する場合は、乾燥、粉砕などの処理をすると便宜性が向上する。
【００２４】
本発明の４−カンペステノン含有組成物の別の形態としては、本発明の糸状菌発酵物から４−カンペステノンを抽出し、濃縮した形態が例示される。この形態は、本発明の糸状菌発酵物から圧搾、または／そして、非極性物質で抽出して、４−カンペステノン含有抽出物を製造することができる。例えば、（１）糸状菌発酵物から、圧搾装置で圧搾する、（２）エチルアルコールなどのアルコール類や、メチルペンタンやヘキサンなどの炭化水素などの有機溶剤により抽出し、有機溶剤を除去する、（３）超臨界二酸化炭素により抽出することが例示される。この４−カンペステノン含有組成物は、さらに、精製してもよい。精製方法としては、脱ガム、アルカリによる脱酸、白土による脱色、水蒸気蒸留による脱臭等の、通常行う公知の食用油脂製造技術を適用することができる。
本発明の糸状菌発酵物から４−カンペステノンを抽出し、濃縮した形態である４−カンペステノン含有組成物は、油脂、乳化剤、脂肪酸から選ばれる１種または２種以上に溶解、または、分散して、４−カンペステノンを含有する油脂組成物の形態とすることができる。該油脂組成物は、油脂を利用した食品、または、飼料に使用することができる。
【００２５】
本発明の詳細を実施例で説明する。本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
[4−カンペステノンを生産する糸状菌の取得]
500ml三角フラスコに、小麦ふすま１５ｇ、水１５ｇ、植物ステロール0.15ｇ（カーギル社製；カンペステロール２９％含有）を投入し、混合後、オートクレーブ殺菌し、表に示す菌株を植菌し、30℃、1週間静置培養を行い、喫食可能な糸状菌発酵物を得た。表に示す菌株は数が多いので便宜的に表１〜３に分けて見易く示した。
発酵物中の４−カンペステノン含量の分析は、発酵物からクロロホルム抽出したものをガスクロマトグラフィー（GC）で分析した。。
なお、ＧＣ条件は以下の通りである。
カラム：WCOT FUSED SILICA CP-SIL8CB（30m x 0.25mm）
検出：FID（水素炎イオン化型検出器）
温度：注入口 280℃、検出器 290℃、カラム 260℃（50分）→ 10℃/分 → 300℃（5分）
移動相：ヘリウム
内部標準：コレステロール
４−カンペステノンへの変換率は、カンペステロールと４−カンペステノンの合計質量に対する、４−カンペステノン質量の比率により求めた。
ここで、培地に添加したカンペステロールと、培養後のカンペステロールと４−カンペステノンの合計はほとんど変わらないことを確認しており、４−カンペステノン変換率を、カンペステノンからの回収率と同等と考えて良い。
【００２７】
【表１】
2009131171.tif 000003
【表２】
2009131171.tif 000004
【表３】
2009131171.tif 000005
【００２８】
表１〜３が示すように、カンペステロールを２９％含有する植物ステロールを１％添加した培地において、すべてのPenicillium属、 Aspergillus属は、4−カンペステノン生成能を有していることがわかった。糸状菌発酵物の形態で５０ｇ／日を喫食する設計の場合、抗肥満効果を期待することを考えると4−カンペステノンへの変換率が５％以上有する菌株が優れている。中でもAspergillus tamariiに属する菌株が、３０％以上の４−カンペステノンへの変換率を有していた。
【００２９】
[比較例１]
表４に示す菌株を用い、実施例1と同様に糸状菌発酵物を得、発酵物中の4−カンペステノン含量を分析した。
【００３０】
【表４】
2009131171.tif 000006
【００３１】
表４が示すように、Penicillium属、Aspergillus属以外の菌株では、Actinomucor属、Mucor属、Neurospora属、Rhizopus属、Thamnidium属は4−カンペステノンへの変換率が５％以下と低かった。
このように、脂溶性のカンペステロールを溶解することなく固形培地に添加しても、Penicillium属、Aspergillus属は、４−カンペステノンを効率的に変換する能力を有していることがわかった。さらに、実施例１の方法を応用して、自然界から、あるいは、突然変異により、新たな微生物を得て、カンペステロールから４−カンペステノンへ、実施例で例示した微生物よりもさらに効率的に変換する微生物を選別することができると考えられる。
【実施例２】
【００３２】
[培地へのステロール添加量に対する４−カンペステノン生成量]
Aspergillus tamarii RIB3007を用いて、表５に示すように培地へのステロール添加量を変えた以外は実施例1と同様に糸状菌発酵物を得、発酵物中の4−カンペステノン含量を分析した。表４のステロール添加量は、加水前の小麦ふすまを１００としたときの比率として表している。結果を表５に示す。
【００３３】
【表５】
2009131171.tif 000007
【００３４】
表５が示すように、培地へのステロール添加量が多い場合でも４−カンペステノンを生成することができた。
【実施例３】
【００３５】
[培養時の撹拌の効果]
金属トレイに、小麦ふすま１５０ｇ、水１５０ｇ、植物ステロール１．５ｇ（カーギル社製；カンペステロール２９％含有）を投入し、混合後、オートクレーブ殺菌し、Aspergillus tamarii RIB3007を植菌し、30℃、1週間培養を行い、喫食可能な糸状菌発酵物を得た。上記の固体状培地は培養中に1日1回撹拌した。発酵物中の４−カンペステノン含量の分析は、発酵物からクロロホルム抽出したものを実施例1と同様にGCで分析した。結果を表６に示す。
【００３６】
【表６】
2009131171.tif 000008
【００３７】
表６が示すように、固体状培地を撹拌することで４−カンペステノンの生産性を上げることができた。
【実施例４】
【００３８】
[４−カンペステノン生成量の経時変化]
金属トレイに、小麦ふすま１５０ｇ、水１５０ｇ、植物ステロール１．５ｇ（カーギル社製；カンペステロール２９％含有）を投入し、混合後、オートクレーブ殺菌し、Aspergillus tamarii RIB3007を植菌し、30℃、下表の日数の培養を行い、喫食可能な糸状菌発酵物を得た。発酵物中の４−カンペステノン含量の分析は、発酵物からクロロホルム抽出したものを実施例1と同様にGCで分析した。結果を表７に示す。
【００３９】
【表７】
2009131171.tif 000009
【００４０】
表７が示すように、２日間の培養でも４−カンペステノンを生産することができた。
【実施例５】
【００４１】
［パンの製造］
金属トレイに、小麦ふすま１５０ｇ、水１５０ｇ、植物ステロール１．５ｇ（カーギル社製；カンペステロール２９％含有）を投入し、混合後、オートクレーブ殺菌し、Aspergillus tamarii RIB3007を植菌し、30℃、1週間培養を行い、糸状菌発酵物を得た。得られた糸状菌発酵物には、４−カンペステノンが０．２ｇ含まれていた。該糸状菌発酵物をオートクレーブ殺菌し、乾燥後、ミルで粉砕し、４−カンペステノン含有粉末を得た。
上記４−カンペステノン含有粉末
３０質量部、小麦粉 ７０質量部、イースト ２質量部、イーストフード ０．１質量部、食塩 ２質量部、グラニュー糖 ４質量部、水 ７０質量部をミキサーに投入し、低速３分、中速５分混捏後、ショートニング１質量部の混合物を投入し、低速２分、中速３分混捏した。その後、発酵、分割、成型、ホイロ（３８℃、相対湿度８５％、６０分）、焼成（２１５℃、３０分）し、食パンを得た。
【実施例６】
【００４２】
[４−カンペステノン含有油脂組成物の調製]
金属トレイに、小麦ふすま１５０ｇ、水１５０ｇ、植物ステロール１．５ｇ（カーギル社製；カンペステロール２９％含有）を投入し、混合後、オートクレーブ殺菌し、Aspergillus tamarii RIB3007を植菌し、30℃、1週間培養を行い、糸状菌発酵物を得た。得られた糸状菌発酵物には、４−カンペステノンが０．２０ｇ含まれていた。得られた糸状菌発酵物を、２倍量のノルマルヘキサンに室温で２４時間浸漬し、固形物をろ過後、ノルマルヘキサンを除去し、４−カンペステノン含有抽出物を得た。得られた該抽出物５質量部に対して、大豆油〔昭和産業（株）製〕９５質量部を配合し、撹拌機を用いて適宜加熱しながら溶解混合して、４−カンペステノン含有油脂組成物を得た。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明により、４−カンペステノン含有糸状菌発酵物を効率的かつ簡便に提供することができるようになった。４−カンペステノンは抗肥満作用を有するため、肥満の予防ならびに改善に新しい手段を提供するものである。